СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНА
METHOD FOR DETERMINING CHOLESTEROL

Изобретение относится к области электрохимических методов анализа, в частности к определению содержания свободного холестерина в образце сыворотки или плазмы крови с использованием платинового электрода и растворенного в апротонном растворителе катализатора электрохимического окисления холестерина. Изобретение может быть использовано в медицине, в частности при диагностике заболеваний сердца, сосудов, почек, печени и обмена веществ.
Недостатками используемых в настоящее время методов определения холестерина являются: низкая надежность и стабильность ферментов и их высокая стоимость (ферментативные методы), высокая погрешность в определении цвета окрашенного комплекса (калориметрические методы), высокие требования к квалификации персонала и высокая стоимость соответствующего оборудования (ВЭЖХ и МС).
+
Известен способ определения холестерина, при котором используют растворенный в диметилформамиде бромид калия, выступающий в качестве электрокатализатора, и платиновый дисковый рабочий электрод. В результате наложения на рабочий электрод потенциала в приэлектродном пространстве протекает электрохимическая реакция окисления бромида калия с образованием химически активного иона Вr, который окисляет растворенный холестерин. Концентрацию холестерина определяют, измеряя ток окисления электрокатализатора в отсутствии и в присутствии холестерина в раствор (Wei-Hung Chiang [и др.]. Amperometric detection of cholesterol using an indirect electrochemical oxidation method // Steroids. 2011. №14(76). C. 1535-1540).
Недостатком известного способа является неселективность определения холестерина вследствие высокой реакционной способности электрокатализатора, способного окислять не только холестерин, но и другие компоненты сыворотки или плазмы крови.
Известен способ определения холестерина, при котором используют полимеры с молекулярными отпечатками (ПМО) в виде самоорганизующихся монослоев, селективно сорбирующие холестерин, в качестве неподвижной фазы в ВЭЖХ (Matsumoto H.S.H., Ota L, Nagaoka Т. Detection of Skin Cholesterol by a Molecularly Imprinted Electrode // Journal of Flow Injection Analysis. 2008. №1 (25). C. 81-84).
Недостатками известного способа являются использование дорогого и сложного в эксплуатации оборудования, большое время анализа.
Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, служит способ определения холестерина, при котором в качестве чувствительного и селективного элемента используют фермент -оксидазу, селективно катализирующую реакцию окисления холестерина кислородом с образованием пероксида водорода, превращающимся в свою очередь в воду под действием фермента пероксидазы. Концентрацию холестерина определяют, измеряя электрохимический сигнал от пероксидазы после ее реакции с пероксидом водорода в присутствии холестерина (White & Bolbot, 2002, заявка на патент US 2005/0056551, опубл. 17.03.2005). Для определения концентрации холестерина используют зависимость тока окисления пероксидазы от концентрации холестерина в растворе.
Недостатками известного метода являются необходимость использования нестойких, дорогостоящих ферментов, требующих особых условий хранения и необходимость предварительных операций по модификации ферментами рабочего электрода.
Технический результат, достигаемый при реализации изобретения -упрощение метода анализа, повышение его чувствительности, достоверности, универсальности.
Заявляемый способ определения холестерина включает селективное извлечение холестерина из пробы с применением полимеров с молекулярными отпечаткам, электрохимическое окисление холестерина с использованием растворенного в апротонном растворителе электрокатализатора, измерение тока окисления катализатора при наложении на рабочий электрод потенциала в отсутствии и в присутствии холестерина в растворе.
От прототипа способ отличается тем, что в качестве электрокатализатора используют неорганические соединения, растворенные в апротонных средах (например, ацетонитрил и диметилформамид). При этом в качестве катализатора может быть использован хлорид кобальта (II) или хлорид никеля (И) или тиоцианат калия, а в качестве рабочего электрода - платиновый дисковый электрод или платиновая проволока.
Предпочтительно для селективного выделения холестерина из исследуемой пробы плазмы или сыворотки крови ее инкубируют с магнитными наночастицами или наночастицами оксида кремния, покрытыми полимерами с молекулярными отпечатками (ПМО) холестерина, отделяют эти наночастицы с сорбированным холестерином с помощью магнита или центрифуги, соответственно, и редиспергируют в апротонном растворителе, при этом холестерин из ПМО десорбируется в апротонный растворитель.
Концентрация холестерина в исследуемой пробе может быть определена по разнице токов окисления, генерируемых электрокатализатором в отсутствии и в присутствии десорбированного из ПМО холестерина на поверхности рабочего электрода при наложении потенциала.
Указанный технический эффект достигается тем, что в качестве электрокатализатора используют растворенные в апротонном растворителе неорганические соединения, способные катализировать реакцию окисления холестерина, при этом концентрация холестерина определяется путем измерения тока окисления электрокатализатора в присутствии холестерина. В качестве селективного элемента используют магнитные наночастицы или наночастицы оксида кремния, покрытые ПМО холестерина, способные избирательно сорбировать молекулы холестерина и десорбировать их в апротонный растворитель, а
Указанные отличительные признаки существенны. Достоверность, точность и универсальность определения достигается за счет использования электрокатализатора, позволяющего окислять неэлектроактивный холестерин. Использование магнитных наночастиц или наночастиц оксида кремния, покрытых полимером с молекулярными отпечатками, обеспечивает за счет наноразмеров частиц и высокой специфичности высокую селективность анализа. При этом обеспечивается полное отделение магнитных наночастиц или наночастиц оксида кремния, покрытых полимером с молекулярными отпечатками, от пробы сыворотки или плазмы крови за счет воздействия магнитного поля или центробежной силы, что исключает влияние других компонентов крови на точность и достоверность результатов анализа.
Сущность изобретения поясняется фигурами.
На фигуре 1 изображены циклические вольтамперограммы, зарегистрированные на платиновом дисковом электроде в растворе хлорида кобальта (II) и перхлората лития в ацетонитриле, где: 1 - циклическая вольтамперограмма, зарегистрированная на фоне; 2 - циклическая вольтамперограмма, зарегистрированная на пробе в отсутствии хлорида кобальта (II) в растворе; 3 - циклическая вольтамперограмма, зарегистрированная на пробе в присутствии хлорида кобальта в растворе; 4 - циклическая вольтамперограмма, зарегистрированная после введения добавки.
На фигуре 2 изображены циклические вольтамперограммы, зарегистрированные на платиновой проволоке (рабочий электрод) в растворе хлорида никеля (II) и перхлората лития в диметилформамиде, где: 1 - циклическая вольтамперограмма, зарегистрированная на фоне; 2 - циклическая вольтамперограмма, зарегистрированная на пробе; 3 - циклическая вольтамперограмма, зарегистрированная после введения добавки.
На фигуре 3 изображены циклические вольтамперограммы, зарегистрированные на платиновом дисковом электроде в растворе тиоцианата калия и перхлората лития в диметилформамиде, где: 1 - циклическая вольтамперограмма, зарегистрированная на фоне; 2 - циклическая вольтамперограмма, зарегистрированная на пробе; 3 - циклическая вольтамперограмма, зарегистрированная после введения добавки.
Заявляемый способ иллюстрируется следующими примерами. Пример 1.
Анализируемую пробу сыворотки крови инкубируют в течение 20 минут с магнитными наночастицами, покрытыми полимером с молекулярными отпечатками холестерина. После инкубации наночастицы с сорбированным на них холестерином отделяют с использованием внешнего магнитного поля и диспергируют с применением ультразвукового облучения в растворе хлорида кобальта (II) в ацетонитриле. В полученный раствор помещают платиновый дисковый электрод, электрод сравнения и вспомогательный электрод и накладывают на рабочий электрод потенциал, при котором происходит электрохимическое окисление хлорида кобальта (II). В качестве сигнала, характеризующего содержание холестерина в анализируемой пробе, используют прирост тока окисления хлорида кобальта (II) в присутствии холестерина относительно тока окисления хлорида кобальта (II) в отсутствии холестерина (фиг.1). В пробе обнаружено 6.1 мМ холестерина.
Пример 2.
Анализируемую пробу плазмы крови инкубируют в течение 20 минут с наночастицами оксида кремния, покрытыми полимером с молекулярными отпечатками холестерина. После инкубации наночастицы с сорбированным на них холестерином отделяют с использованием центрифуги и диспергируют с применением ультразвукового облучения в растворе хлорида никеля (И) в диметилформамиде. В полученный раствор помещают платиновую проволоку (рабочий электрод), электрод сравнения и вспомогательный электрод и накладывают на рабочий электрод потенциал, при котором происходит электрохимическое окисление хлорида никеля (II). В качестве сигнала, характеризующего содержание холестерина в анализируемой пробе, используют прирост тока окисления хлорида никеля (И) в присутствии холестерина относительно тока окисления хлорида никеля (II) в отсутствии холестерина (фиг. 2). В пробе обнаружено 5.2 мМ холестерина.
Пример 3.
Анализируемую пробу сыворотки крови инкубируют в течение 20 минут с магнитными наночастицами, покрытыми полимером с молекулярными отпечатками холестерина. После инкубации наночастицы с сорбированным на них холестерином отделяют с использованием внешнего магнитного поля и диспергируют с применением ультразвукового облучения в растворе тиоцианата калия в диметилформамиде. В полученный раствор помещают платиновый дисковый электрод, электрод сравнения и вспомогательный электрод и накладывают на рабочий электрод потенциал, при котором происходит электрохимическое окисление хлорида тиоцианата калия. В качестве сигнала, характеризующего содержание холестерина в анализируемой пробе, используют прирост тока окисления тиоцианата калия (по второй ступени) в присутствии холестерина относительно тока окисления тиоцианата калия (по второй ступени) в отсутствии холестерина (фиг. 3). В пробе обнаружено 4.5 мМ холестерина.
Из полученных данных видно, что при использовании предложенного способа определения свободного холестерина существенно упрощается процедура анализа, а также повышается его чувствительность, достоверность и универсальность.
Преимущество заявляемого способа перед известными состоит в том, что использование неорганических электрокатализаторов и полимеров с молекулярными отпечатками позволяет значительно упростить и улучшить правильность определения аналита.