Ферментативный синтез душистых веществ

В. С. Гамаюрова, М. Е. Зиновьева, Е. В. Елизарова

ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ ДУШИСТЫХ ВЕЩЕСТВ

Изучена возможность синтеза эфиров изоамилового спирта: изоамил-пропионата, изоамилбензоата, изоамилабиетата, изоамилсалицилата, изо-амилвалерата, с помощью панкреатической липазы в неводных средах. Подобраны оптимальные условия синтеза изоамилвалерата с помощью панкреатической липазы: среда для проведения реакции - гексан, соотношение кислота: спирт 1:4, содержание воды не более 0,2%, температура 30°С, отсутствие перемешивания.

Сложные эфиры, обладающие запахом, широко применяются в различных отраслях пищевой промышленности: в качестве ароматизаторов во фруктовых сиропах, кондитерских и молочных изделиях и т.д. [1,2]. В последнее время для их получения все чаще используют ферментативный синтеза, в виду того, что он не требует применения высоких температур, давления, в отличие от химического способа, и выход целевого продукта достаточно высок. Наиболее подходят для синтеза сложных ароматических эфиров липолити-ческие ферменты. Для осуществления процессов синтеза целесообразно использовать неводные среды, так как в водной среде реакции протекают очень медленно и выход продукта минимален [3,4].

Целью данной работы являлось изучение синтеза душистых веществ с помощью панкреатической липазы в неводных средах.

Экспериментальная часть

В типичном эксперименте концентрация кислоты составляла 0,1 М, концентрация спирта изменялась от 0,1 до 1 М/л. Фермент добавляли из расчета 10 мг/мл. Методика эксперимента: к сухому или увлажнённому (количество добавленной воды изменялось от 0.2 до 1%) ферментному препарату добавляли раствор реагентов в одном из органических растворителей (гексане, гек-сан+диэтиловый эфир или бензол+хлороформ). Полученную суспензию тщательно перемешивали и выдерживали в течение 16-24 часов, как без перемешивания, так и с перемешиванием.

Количество образовавшегося эфира определяли титриметрическим методом по изменению количества кислоты в системе. Титрование проводили спиртовым раствором щёлочи (0.1 N раствором ЫзОИ) до устойчивой розовой окраски с фенолфталеином в качестве индикатора при температуре 20°С. В контрольный образец вносили ферментный препарат непосредственно перед проведением титрования.

Результаты и их обсуждение

На первом этапе работы была исследована возможность синтеза изоамиловых эфиров следующих кислот: абиетиновой, салициловой, бензойной, пропионовой и валериановой. Реакцию вели в течение 24 часов, без перемешивания при температуре 30°С. Данные приведены в таблице 1.

Первоначально в качестве среды реакции был выбран гексан. Как показывают предыдущие исследования, гексан является хорошей средой реакции для проведения синтеза с участием панкреатической липазы самых разнообразных эфиров: цетилового, децилового, этилового спиртов, глицерина и т.д.

Таблица 1 - Душистые вещества, синтезированные с помощью панкреатической липазы в неводных средах

Душистые вещества Запах Область Выход в среде, %

применения Г ексан Гексан: ди-этиловый эфир

Изоамил- пропионат Сладкий, фруктовый, ноты абрикоса, ананаса Отдушки различного назначения, пищевые ароматические эссенции 74±2,0 36±2,5 66±2,0

Изоамил- валерат Фруктовый, цветочный Пищевая и парфюмерная промышленности 88±2,0 72±2,5 73±2,0

Изоамил- бензоат Цветочный с фруктовой и амбровой нотами Парфюмерные композиции и отдушки, а также пищевые ароматические эссенции - 35±2,0 -

Изоамил- абиетата Слабый Фиксатор запаха - 56±2,5 -

Изоамил- салицилат Травянистоцветочный, пряный, ноты клевера, орхидеи, стойкий Различные парфюмерные композиции и отдушки широкого назначения - 40±2,5 -

Но как показали проведенные исследования, синтез в гексане протекал успешно только для изоамилвалерата и изоамилпропионата. Выход этих эфиров в гексане составлял 88% и 74%, соответственно. Синтез остальных эфиров практически не осуществлялся из-за низкой растворимости кислот в гексане. В связи с этим было принято решение использовать в качестве среды реакции смесь гексана с диэтиловым эфиром в соотношении 1:1 и смесь бензола с хлороформом (1:1). Результаты исследований показывают, что в смеси гексана с диэтиловым эфиром успешно протекал синтез всех исследованных эфиров. Наиболее высокий выход во всех средах наблюдался для изоамилвалерата.

На втором этапе работы был более подробно исследован синтез изоамилвалерата в среде гексана.

Соотношение реагентов оказывает существенное влияние на протекание любой химической реакции. Влияние на синтез изоамилвалерата соотношения реагентов показано в таблице 2. Как видно из таблицы 2, при повышении содержания спирта в среде выход эфи-

ра плавно увеличивается, достигая максимума, при соотношении кислота: спирт 1:4. В этих условиях выход изоамилвалерата составил 94%. При дальнейшем увеличении количества спирта в смеси наблюдалось снижение выхода продукта. Очевидно, это связано с ингибированием фермента избытком субстрата - изоамилового спирта.

Таблица 2 - Соотношение субстратов при синтезе изоамилвалерата

Соотношение Кислота : спирт Выход продукта, %

1:1 88±1,0

1:1,2 89±2,0

1:1,5 90±2,0

1:2 90±2,0

1:3 91±1,5

1:4 94±0,5

1:5 91±1,5

1:6 88±4,0

1:7 87±1,5

1:8 85±0,5

1:10 84± 1,5

Известно, что температура оказывает существенное влияние на каталитическую активность фермента. В органических средах ферменты могут проявлять активность при экстремально высоких и низких температурах. Например, как показывают данные [5] максимальная активность липазы из поджелудочной железы свиньи в реакции синтеза сложных эфиров в среде гексана наблюдалась при температуре -3°С. Та же липаза в среде бензола проявляла высокую каталитическую активность при температуре 100°С [6].

Влияние температуры на синтез изоамилвалерата показано на рисунке 1 Низкая температура оказывала резкое ингибирующее действие на процесс (рис.1). Эфир в этих условиях не синтезировался. Но данные также показывают, что даже незначительное увеличение температуры до 5°С резко ускоряет процесс. Выход эфира при температуре 5°С составил 77%. Весьма интересно, что оптимальной температурой для синтеза изоамилвалерата в гексане оказалась температура 30°С.Тогда как в водной среде оптимальной температурой действия липазы, является температура 37°С.

Поскольку скорость протекания реакции и количество целевого продукта зависит от ряда факторов, прежде всего от активности биокатализатора и соотношения реагентов в субстратной смеси, оптимальное соотношение водной и неводной частей реакционной среды устанавливается экспериментально. Поэтому было изучено влияние экзогенно добавленной воды в систему на синтез изоамилвалерата. Влияние содержания воды на синтез эфира показано на рисунке 2.

Температура, С

Рис. 1 - Влияние температуры на синтез изоамилвалерата

н

и

о

£р

С

о

й

3

РР

Содержание воды, %

Рис. 2 - Влияние воды в системе на синтез изоамилвалерата

Как видно из результатов исследования при добавлении воды в количестве 0,2 % происходило уменьшение выхода продукта. Выход изоамилвалерата снижался, но незначительно и стабилизировался при концентрации воды 0,6% на уровне выхода эфира 88%, при дальнейшем увеличении концентрации воды, последняя не оказывает заметного воздействия на выход эфира.

Исходя из приведенных данных, процесс следует вести без добавления воды. Того количества воды, которое содержит исходный ферментный препарат (-10^12 %) достаточно для проявления его максимальной каталитической активности.

Исследованная в работе среда представляет собой гетерогенную систему, и перемешивание может положительно сказаться на процессе за счет увеличения скорости диффузии субстратов и продуктов реакции к границе раздела фаз. Однако результаты исследования показали, что перемешивание не оказывало положительного влияния, как следовало бы ожидать. Выход эфира в отсутствии перемешивания был выше, чем в системах с перемешиванием. По-видимому, перемешивание нарушает целостность частиц фермента, приводит к усилению ингибирующего действия органической среды на фермент. Данные приведены в таблице 3.

Таблица 3 - Влияние перемешивания на синтез изоамилвалерата

Условия проведения Выход эфира Выход эфира по Выход эфира по

процесса по истечении истечении истечении

16 часов, % 20 часов, % 24 часов, %

С перемешиванием 86 ± 0,5 92± 0,5 92 ± 0,5

Без перемешивания 92 ± 0,5 94 ± 0,5 94 ± 0,5

Как видно из представленных данных, уменьшение времени реакции до 20 часов, не приводит к уменьшению выхода продукта. Проведение реакции в течение 16 часов также дает высокий выход эфира, в случае с перемешиванием 92%, без перемешивания 86%.

Возможность повторного использования ферментного препарата в процессе синтеза снижает, с экономической точки зрения, затраты на проведение процесса. Были проведены исследования повторного использования фермента. Результаты приведены в таблице 4.

Таблица 4 - Повторное использование фермента

Выход эфира при первом использовании фермента, % Выход эфира при втором использовании фермента, % Выход эфира при третьем повторном использовании фермента, %

94 ± 0,5 92 ± 0,5 89 ± 0,5

Как видно из полученных результатов опыта неоднократное применение фермента в реакциях синтеза эфира незначительно сказывается на его каталитической активности. Если при первичном использовании панкреатической липазы выход изоамилвалерата составил 94%, то при вторичном 92%. При использовании этого же фермента в третий раз выход составил 89%. Как видно из представленных данных даже после третьего использования фермента выход снижается незначительно, всего на 5%.

Таким образом, изучена возможность синтеза эфиров изоамилового спирта: изо-амилпропионата, изоамилбензоата, изоамилабиетата, изоамилсалицилата, изоамилвалера-та, с помощью панкреатической липазы в неводных средах. Подобраны оптимальные условия синтеза изоамилвалерата с помощью панкреатической липазы: среда для проведения

реакции - гексан, соотношение кислота: спирт 1:4, содержание воды не более 0,2%, температура 30°С, отсутствие перемешивания.

Литература

1. БратусИ.Н. Химия дущистых веществ. - М.: Агропромиздат, 1992. - 240с.

2. Исагулянц В.И. Синтетические душистые вещества. - М.: Мир, 1936. - 590с.

3. Hwang S. // Biotechnol. Lett. - 1994. - V. 16, №14. - P. 379 - 384.

4. Claon P. A. Lipase - catalyzed synthesis of terpene esters by transesterification in n- hexane / P. A

Claon, C. C. Akoh // Biotechnol. Lett. - 1994. - 16, №3. - P. 235 - 240.

5. Philipi M. C. Enantioselective hydrolysis and transesterification from porcine pancreas / M. C. Philipi,

J. A. Jongejan, J. A. Duine // Biotechnol. And Bioeng. - 1993. - V. 21, №2. - P. 158 - 172.

6. Ю.Л. Хмельницкий. Конструирование биокаталитических систем в органических средах с малым содержанием воды/ Ю.Л. Хмельницкий, А.В. Левашов, Н.Л. Клячко, К. Мартинек // Биотехнология.- 1988г. - Т. 4, № 3. - С. 292-309.

© В. С. Гамаюрова - д-р хим. наук, проф., зав. каф. промышленной биотехнологии КГТУ; М. Е. Зиновьева, Е. В. Елизарова