ЖИДКИЙ СОСТАВ ПОЛИПЕПТИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ FC-ДОМЕН ИММУНОГЛОБУЛИНА
LIQUID COMPOSITION OF POLYPEPTIDES CONTAINING FC DOMAIN OF IMMUNOGLOBULIN

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к водному составу, включающему TNFR:Fc, способам получения композиции, способам введения и наборам, содержащим таковую.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Фактор некроза опухоли представляет собой полипептидный цитокин, вовлеченный в воспаление и острофазный ответ. TNF-альфа присутствует в больших количествах у индивидуумов с ревматоидным артритом или болезнью Крона. Прямое ингибирование TNF-альфа биологическими средствами обеспечило значительные успехи в лечении ревматоидного артрита и подтвердило внеклеточное ингибирование данного провоспалительного цитокина в качестве эффективной терапии. Одним таким биологическим средством является этанерцепт.
2
3
1
Этанерцепт (TNFR:Fc) представляет собой димерный слитый белок, состоящий из внеклеточной лиганд-связывающей части 75 килодальтонного (р75) рецептора фактора некроза опухоли человека (TNFR), присоединенной к Fc-части IgGl человека. Fc-компонент этанерцепта состоит из СН-домена, СН-домена и шарнирной области, при этом СН-домен отсутствует. Его получают посредством технологии рекомбинантной ДНК в системе экспрессии клеток млекопитающих яичника китайского хомячка. Он состоит из 934 аминокислот и имеет наблюдаемый молекулярный вес приблизительно 150 килодальтон.
Как правило, белки имеют очень короткое время полужизни и подвергаются денатурации (как, например, агрегации, диссоциации и адсорбции на поверхности флаконов) в результате воздействия различных факторов, таких как неблагоприятные температуры, граница раздела вода-воздух, высокое давление, физическая/механическая нагрузка, органические растворители и микробная контаминация. Как следствие, денатурированный белок теряет свойственные ему физико-химические свойства и физиологическую активность. Денатурация белков часто является необратимой, и поэтому белки, после того как денатурируют, могут не восстановить свои нативные свойства к первоначальному состоянию.

В биофармацевтическом производстве долговременное хранение белков, полученных с использованием технологии рекомбинантной ДНК в водных составах, как правило, представляет собой сложную задачу. Чтобы преодолеть проблему стабильности белков в водных составах, терапевтические белковые продукты делают более стабильными посредством лиофилизации (сушка вымораживанием). Лиофилизированные продукты обычно сопровождаются стерильными водными средами для восстановления. После восстановления составы типично имеют короткие полезные сроки годности, даже при хранении при низких температурах (например, 5°C). Примерами TNF-альфа ингибиторов, которые доступны в продаже в лиофилизированной форме, являются Enbrel и Remicade, причем обе композиции следует восстанавливать перед применением.
Обычные практики для улучшения полипептидной стабильности могут направляться на изменение концентрации элементов в составе или добавление наполнителей для модификации состава.
В US5580856 раскрывается стабилизация высушенных белков от потери биологической активности в составах путем добавления стабилизатора восстановления при повторной гидратации высушенного белка. Набор для получения состава путем растворения высушенной композиции в растворителе, содержащем стабилизатор восстановления, также описывается.
В US 6171586 раскрывается стабильный водный фармацевтический состав, включающий терапевтически эффективное количество антитела, не подвергнутого предварительной лиофилизации, буфер, поддерживающий рН в диапазоне от приблизительно 4,5 до приблизительно 6,0, поверхностно-активное вещество и полиол, вместе с применениями для такого состава.
ЕР 1314437 относится к изобретению стабилизированных препаратов, содержащих антитело в глициновом буфере и/или гистидиновом буфере, а также обеспечивает способы получения белоксодержащего стабилизированного препарата, включающего регулирование pH с помощью основной аминокислоты или производного основной аминокислоты или их соли.
В ЕР 1478394 сообщается об изобретении, которое относится к водной фармацевтической композиции, подходящей для долгосрочного хранения полипептидов, содержащих Fc-домен иммуноглобулина, способам получения, способам введения и наборам, содержащим таковую.
Таким образом, желательным является обеспечение жидких составов TNFR:Fc с улучшенной стабильностью при охлаждении и по меньшей мере умеренной стабильностью при нормальных комнатных температурах, а также избежание затруднения и возможности ошибок вследствие процедуры восстановления.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение обеспечивает новый жидкий состав, включающий TNFR:Fc, который проявляет долгосрочную стабильность при 4°C и комнатных температурах. В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает состав, состоящий из полипептида, содержащего Fc-домен иммуноглобулина, и ингибитора агрегации, где ингибитор агрегации выбирают из группы, состоящей из аспарагиновой кислоты, фенилаланина, глутаминовой кислоты, аланина, гистидина и лизина. В другом аспекте состав включает полипептид, содержащий Fc-домен иммуноглобулина, ингибитор агрегации, буфер, неионное поверхностно-активное вещество, полиол, стабилизатор, модификатор тоничности и хелатирующее средство. Буферную систему нового состава выбирают из группы, состоящей из фосфата натрия, гистидина, фосфата калия, цитрата натрия или калия, малеиновой кислоты, ацетата аммония, трис-(гидроксиметил)-аминометана (tris), ацетата и диэтаноламина или их комбинации.
В еще одном аспекте состав включает ионное поверхностно-активное вещество, выбранное из группы, состоящей из неионного поверхностно-активного вещества на основе полисорбата и неионного поверхностно-активного вещества на основе полоксамера или их комбинации.
Полиол состава дополнительно выбирают из группы, состоящей из сахарозы, трегалозы, мальтозы, маннита, ксилита, мальтита и сорбита или их комбинации. Стабилизатор состава выбирают из группы, состоящей из EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), HEDTA (гидроксиэтилендиаминтриуксусная кислота), NTA (нитрилотриуксусная кислота), DTPA (диэтилентриаминпентаацетат) и лимонной кислоты или их комбинации.
Кроме того, состав предусматривает модификатор тоничности, выбранный из группы, состоящей из хлорида натрия, хлорида калия, сульфата натрия или их комбинации.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает полипептид, содержащий Fc-домен иммуноглобулина, выбранный из группы, состоящей из моноклонального антитела, слитого белка и TNFR:Fc.
Состав настоящего обретения охватывает TNFR:Fc, включающий аспарагиновую кислоту, натрий-калиевый фосфатный буфер, лизин, хлорид натрия, сахарозу, полисорбат 20 и динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, где TNFR:Fc присутствует в концентрации от 10 мг/мл до 100 мг/мл.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На фигуре 1а (невосстанавливающий) и на фигуре lb (восстанавливающий)
показано сравнение паттерна деградации составов этанерцепта с различными ингибиторами агрегации, выдержанных при 40°С в нулевой день.
Дорожка 1: лекарственный препарат сравнения
Дорожка 2: F-1, как указано в таблице 1
Дорожка 3: F-2, как указано в таблице 1
Дорожка 4: F-3, как указано в таблице 1
Дорожка 5: F-4, как указано в таблице 1
На фигуре 2а (невосстанавливаюший) и на фигуре 2b (восстанавливающий)
показано сравнение паттерна деградации составов этанерцепта с различными ингибиторами агрегации, выдержанных при 40°C в течение 1 месяца.
Дорожка 1: лекарственный препарат сравнения
Дорожка 2: F-1, как указано в таблице 1
Дорожка 3: F-2, как указано в таблице 1
Дорожка 4: F-3, как указано в таблице 1
Дорожка 5: F-4, как указано в таблице 1
На фигуре 3а (невосстанавливаюший) и на фигуре 3b (восстанавливающий)
показано сравнение паттерна деградации составов этанерцепта с различными ингибиторами агрегации, выдержанных при 47°C в течение 16 часов.
Дорожка 1: лекарственный препарат сравнения
Дорожка 2: F-3, как указано в таблице 1
Дорожка 3: F-1, как указано в таблице 1
Дорожка 4: маркер
На фигуре 4 показано сравнение паттерна деградации составов этанерцепта с различными ингибиторами агрегации, выдержанных при 55°C в течение 24 часов.
Дорожка 1: лекарственный препарат сравнения
Дорожка 2: F-3, как указано в таблице 1
Дорожка 3: F-1, как указано в таблице 1
Дорожка 4: маркер
На фигуре 5а (невосстанавливаюший) и на фигуре 5b (восстанавливающий) показано сравнение паттерна деградации составов этанерцепта с лизином в качестве стабилизатора, выдержанных при 40°C в течение 7 дней.
Дорожка 1: лекарственный препарат сравнения
Дорожка 2: F-5, как указано в таблице 1
Дорожка 3: F-3, как указано в таблице 1
Дорожка 4: маркер
На фигуре 6а (невосстанавливающий) и на фигуре 6b (восстанавливающий)
показано сравнение паттерна деградации составов этанерцепта, выдержанных при 40°C в нулевой день, для проверки эффекта EDTA.
Дорожка 1: без EDTA
Дорожка 2: с EDTA
Дорожка 3: маркер
На фигуре 7а (невосстанавливающий) и на фигуре 7b (восстанавливающий)
показано сравнение паттерна деградации составов этанерцепта, выдержанных при 40°C в течение 3 дней.
Дорожка 1: без EDTA
Дорожка 2: с EDTA
Дорожка 3: маркер
На фигуре 8а, фигуре 8b и фигуре 8 с показан профиль DSC составов этанерцепта с различными буферами и их солью.
На фигуре 9 показаны сравнительные средние точки перехода составов (F6-F8). На фигуре 10 показана сравнительная биоактивность конечной нерасфасованной лекарственной субстанции и RMP
На фигуре 11 показан сравнительный распад в соответствии с SE=HPLC в F6, F8 и RMP.
На фигуре 12 показан сравнительный профиль HIC F8 и RMP, выдержанных при -20°C в течение 3 месяцев
На фигуре 13 показан сравнительный профиль HIC F8 и RMP, выдержанных при ±±3°C в течение 3 месяцев
На фигуре 14 показан сравнительный профиль HIC F8 и RMP, выдержанных при 25±2°C в течение 3 месяцев
На фигуре 15 показан сравнительный профиль HIC F8 и RMP, выдержанных при 40°C в течение 3 месяцев
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящий фармацевтический состав включает очищенный полипептид, буфер, ингибиторы агрегации, модификаторы тоничности, стабилизаторы, поверхностно-активные вещества, хелатирующие средства и, факультативно, с консервантом, в подходящих их комбинациях.
Для применения в терапии моноклональные антитела применяют в высокой концентрации, а высокая концентрация белка, как известно, увеличивает агрегацию. В одном аспекте ингибиторы агрегации требуются в композициях состава для поддержания продукта в нативном состоянии, а также биологически активным с улучшенным сроком хранения и условиями хранения. Существует несколько аминокислот, которые действуют как ингибиторы агрегации путем увеличения поверхностного натяжения, избирательного связывания или гидратации и избирательного взаимодействия.
Ингибиторы агрегации снижают склонность полипептида к образованию агрегатов. Аминокислоты, подобные аспарагиновой кислоте, фенилаланину, глутаминовой кислоте, аланину, гистидину и лизину, действуют, снижая агрегацию содержащего Fc-домен полипептида в составе в течение продолжительных периодов, и являются предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения.
В другом аспекте для поддержания pH состава требуются буферы. Буферная система настоящего изобретения включает фосфатный буфер, бикарбонатный буфер, сукцинатный буфер, ацетатный буфер, цитратный буфер, аминокислоты, TRIS-буфер либо отдельно, либо в подходящей комбинации, предоставляя необходимый диапазон pH от 5,5 до 7,5.
В настоящем изобретении поверхностно-активное вещество применяют, чтобы предотвратить адсорбцию TNFR:Fc на поверхности флакона, ампулы, карпулы, картриджа или шприца. Поверхностно-активные вещества понижают поверхностное натяжения белкового раствора, тем самым предотвращая его адсорбцию или агрегацию на гидрофобной поверхности. Предпочтительные поверхностно-активные вещества настоящего изобретения включают неионное поверхностно-активное вещество на основе полисорбата и сополимер полиоксиэтилена, поливинилпирролидон либо отдельно, либо в комбинации.
В одном варианте осуществления стабилизаторы, применяемые в настоящем изобретении, выбирают из группы, которая состоит из: аминокислот, таких как глицин, аланин, лизин, пролин, серии и т.п., а также их солей либо отдельно, либо в комбинации, моносахаридов, таких как глюкоза и манноза и подобных им либо отдельно, либо в комбинации, дисахаридов, таких как сахароза, трегалоза и мальтоза и подобных им либо отдельно, либо в комбинации, сахарных спиртов, таких как манит и сорбит и подобных им либо отдельно, либо в комбинации, и полисахаридов, таких как декстран, полиэтиленгликоль и подобных им либо отдельно, либо в комбинации.
Подразумевается, что модификатор тоничности представляет собой молекулу, которая вносит вклад в осмоляльность раствора. Осмоляльность фармацевтической композиции предпочтительно регулируют, чтобы максимально увеличить стабильность действующего ингредиента, а также снизить до минимума дискомфорт для пациента при введении. Примеры модификаторов тоничности, подходящих для модификации осмоляльности, включают без ограничений аминокислоты (аргинин, цистеин, гистидини и т.п.), соли (хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция и т.п.) и/или сахариды (сахароза, глюкоза, маннит и подобные им).
Этанерцепт имеет склонность к фрагментации во время хранения, так что требуется какой-нибудь ингибитор фрагментации для приготовления оптимальной композиции состава для этанерцепта. Известно, что EDTA оказывает влияние на предотвращение фрагментации во многих продуктах, таких как интерферон, алемтузумаб и т.д., его применяют в настоящем составе.
Хелатирующие средства стабилизируют или предотвращают реагирование свободных ионов металлов с представляющим интерес белком. Примеры хелатирующих средств, которые можно применять в настоящем изобретении, включают без ограничений EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), HEDTA (гидроксиэтилендиаминтриуксусная кислота), NTA (нитрилотриуксусная кислота), DTPA (диэтилентриамин пентаацетат) и лимонную кислоту.
Консервант относится к композиции или веществу, добавляемому к составу для действия в качестве бактериостатического средства. TNFR:Fc-содержащий состав с консервантом настоящего изобретения предпочтительно соответствует установленным законом или нормативным рекомендациям в отношении эффективности консервантов, чтобы представлять собой рентабельный продукт универсального применения предпочтительно для людей. Консерванты, применяемые в настоящем изобретении, выбирают из группы, состоящей из фенола, м-крезола, п-крезола, о-крезола, хлоркрезола, алкилпарабена (метил, этил, пропил, бутил и т.п.), хлорида бензетония, дегидроацетата натрия или тиомерсала либо отдельно, либо в их комбинации. Однако в настоящем изобретении применение консерванта является факультативным, и предпочтительно при разработке многодозовых составов.
Новый термостабильный водный состав TNFR:Fc, описанный в настоящем изобретении, имеет следующие преимущества:
1. Подразумевает применение ингибитора агрегации, который предотвращает агрегацию слитого белка во время долговременного хранения.
2. Подразумевает применение стабилизатора, который предотвращает нежелательные расщепления во время долговременного хранения.
3. Обеспечивает лучшую стабильность водного состава для поддержания его активности в течение длительного периода времени, чтобы гарантировать надлежащий срок хранения.
4. Обеспечивает лучшую стабильность водного состава даже при повышенных температурах.
Следующие примеры иллюстрируют фармацевтические композиции, описанные в настоящем изобретении, а также средства осуществления настоящего изобретения для получения стабильного водного фармацевтического состава TNFR:Fc. Примеры ни в коей мере не должны рассматриваться как ограничения объема настоящего изобретения.
Пример 1
Скрининг и отбор ингибиторов агрегации Скрининг ингибиторов при 40°С
Изучали состав этанерцепта с различными ингибиторами агрегации, такими как лизин, аспарагиновая кислота, глицин и пролин. Данные составы также содержали другие наполнители согласно подробным данным, приведенным в таблице 1. Образцы и RMP инкубировали при 40°C в течение одного месяца, а затем анализировали с помощью SDS-PAGE. SDS-PAGE применяли в качестве аналитической методики, которая может разделять диссоциированные и высокомолекулярные соединения от нативного белка на основе молекулярного веса. Вследствие сильной склонности к агрегации в случае высокой концентрации моноклональных антител и слитых белков для оценки ковалентных агрегатов использовали невосстанавливающий SDS-PAGE. Поскольку в слитых белках, а также моноклональных антителах присутствует много дисульфидных связей, фрагментацию белков проверяли восстанавливающим SDS PAGE.
SDS-PAGE гель (фиг.1a, 1b, 2а и 2b) разных составов демонстрирует агрегацию и фрагментацию этанерцепта через один месяц при 40°C.
Таблица 1:
Определение ингибитора агрегации
№ п/п
Компоненты
№ состава
F1
F2
F3
F4
1.
Этанерцепт
50 мг
50 мг
50 мг
50 мг
2.
Сахароза
20 мг
20 мг
20 мг
20 мг
3.
Фосфатный буфер
25 мМ
25 мМ
25 мМ
25 мМ
4.
DL-Аспарагиновая
20 мМ
-
-
-
кислота
5.
L-Лизин моногидрат
-
20 мМ
-
-
6.
Глицин
-
-
20 мМ
-
7.
Пролин
-
-
-
20 мМ
8.
Хлорид натрия
100 мМ
100 мМ
100 мМ
100 мМ
9.
Полисорбат 20
0,2 мг
0,2 мг
0,2 мг
0,2 мг
10.
Динатриевая соль EDTA
1 мМ
1 мМ
1 мМ
1 мМ
Было обнаружено, что F2 и F4 подвергались большей деградации по показателю агрегации, а также фрагментации, но не наблюдали большого отличия по показателю агрегатов и фрагментов для F1 и F3. Поскольку не наблюдалось значительного отличия в примесях при данной температуре, оба (F1 и F3) состава дополнительно изучали при более высоких температурах, чтобы увеличить кинетику деградации, а также деграданты.
Скрининг ингибиторов агрегации при 47°C и 55°C
Чтобы установить наилучший ингибитор агрегации между аспарагиновой кислотой (F1) и глицином (F3), оба состава оценивали при 47°C, а также при 55°C. Результаты указывают, что глицин (F3) демонстрирует более сильную деградацию по показателю агрегации, а также фрагментации по сравнению с аспарагиновой кислотой (F1) при обеих протестированных температурах, т.е. 47°C в течение 16 часов (фиг.3a и 3b) и 55°C в течение 24 часов (фиг.4). Состав, содержащий глицин, также демонстрирует одну дополнительную полосу фрагмента (фиг.3b) в восстанавливающих условиях при 47°C; 16 часов.
Показано, что аспарагиновая кислота эффективна против агрегации, а также фрагментации при всех температурах без какой-либо дополнительной полосы по сравнению с лекарственным препаратом сравнения (RMP). Дополнительная полоса, наблюдаемая в составе, содержащем глицин, могла вносить вклад в иммуногенность.
Комбинация наполнителей (лизин+аспарагиновая кислота)
Чтобы поддерживать pH состава F3, содержащего аспарагиновую кислоту (как показано, является эффективной при всех температурах, как видно выше), добавляли лизиновый буфер. Как лизин, так и аспарагиновую кислоту применяли в концентрации 10 мМ, так как предполагается, что данные аминокислоты будут иметь более высокую стабильность при эквимолярных концентрациях. Состав композиции приводится в таблице 1а:
Таблица 1а:
состав F5
№ п/п
Компоненты
Композиция F5
1.
Этанерцепт
50 мг
2.
Сахароза
20 мг
3.
Фосфатный буфер
25 мМ
4.
Аспарагиновая кислота
10 мМ
5.
Лизин моногидрат
10 мМ
6.
Хлорид натрия
100 мМ
7.
Полисорбат 20
0,2 мг
8.
Динатриевая соль EDTA
1 мМ
Состав, содержащий лизин в комбинации с аспарагиновой кислотой (F5), продемонстрировал меньшую фрагментацию по сравнению с составом без лизина (F3), как видно на фигуре 5а и 5b.
Пример 2
Эффект EDTA
Эффект EDTA проверяли на составе F3 при 40°С в течение 3 дней и анализировали с помощью SE-HPLC, так как эксклюзионная хроматография разделяет белки и связанные с ними примеси на основании их размера. Данная методика пригодна для обнаружения агрегации и фрагментации этанерцепта, и результаты приводятся ниже в таблице 2.
Также применяли SDS-PAGE для сравнения паттерна агрегатов и фрагментов (фигура 5а, 5b, 6а и 6b).
Таблица 2:
Результаты SE-HPLC составов, показывающие влияние EDTA
Тип
Нулевой день
40°C в течение 3 дней
без EDTA
с EDTA
без EDTA
с EDTA
Димер
2,20
2,40
1,62
2,18
Олигомеры
0,0007
0
0,005
0,0
Деграданты
0,003
0,39
1,39
0,82
Чистота
97,79
97,21
96,98
97,00
Было обнаружено, что F3 имеет более низкую скорость деградации по сравнению с таковой состава без EDTA согласно результатам SE-HPLC, в особенности по показателю фрагментов.
С помощью SDS-PAGE обнаружено, что F3 имеет меньшие количества низкомолекулярных полос после воздействия на образцы при 40°C в течение 3 дней. Следовательно, EDTA играет важную роль в предотвращении фрагментации этанерцепта.
Пример 3
Эффект буферов
Составы этанерцепта с фосфатным буфером и гистидиновым буфером, представленные в таблице 3 (F6 и F7), хранили при 50°C в течение 2 дней и анализировали с помощью SE-HPLC и дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). DSC представляет собой методику, применяемую для определения термодинамической стабильности белков. Этанерцепт имеет три перехода, при этом Tm1 соответствует TNFR, Tm2 соответствует CH2-домену и Tm3 соответствует CH3-домену Fc-части (более высокая Tm указывает на более высокую стабильность)
Таблиц 3:
Определение компонента буфера
№ п/п
Компоненты
№ состава
F6
F7
1
Сахароза
20 мг
-
2
Трегалоза
-
20 мг
3
Лизин моногидрат
10 мМ
-
4
Глицин
-
25 мМ
5
Аспарагиновая кислота
10 мМ
5 мМ
6
Хлорид натрия
100 мМ
100 мМ
7
Полисорбат 20
0,2 мг
0,2 мг
8
Динатриевая соль EDTA
1 мМ
1 мМ
9
Фосфатный буфер
25 мМ
-
10
Гистидин
-
10 мМ
Таблица 4:
Результаты SE-HPLC для определения компонента буфера
№состава
Агрегаты, %
Фрагменты, %
Степень чистоты; %
F6-день 0
1,4
0
98,6
F7-день 0
1,6
0,1
98,3
F6-день 2
12,5
0
87,5
F7-день 2
21,6
0
78,4
Композиция с фосфатным буфером в качестве буферного средства согласно результатам SE-HPLC имела высокую чистоту и меньше агрегатов по сравнению с составами, содержащими гистидиновый буфер
Согласно DSC-анализу средние точки перехода первого и второго пика перехода фосфатного буфера на около 1°C и 2°C, соответственно, выше таковых состава с гистидиновым буфером. Средняя точка пика третьего перехода почти одинакова в обоих буферах.
Поскольку фосфатный буфер, как наблюдали, имел более низкую скорость деградации по сравнению с гистидиновым буфером, что подтверждается с помощью результатов SE-HPLC, и высокую термодинамическую стабильность, подтвержденную DSC-анализом, фосфатный буфер является предпочтительным в качестве подходящей буферной системы.
Пример 4
Определение буферной соли
Буферные соли (натрия и калия) повергали скринингу на самого лучшего подходящего кандидата по показателю стабильности.
Фосфатный буфер в комбинации его солей, т.е. натрия/калия, применяли для необходимой стабильности белка. В таблице 5 кратко излагаются комплектации комбинаций, применяемые для отбора кандидата на самый лучший состав.
Таблиц 5:
Определение буферной соли комбинации и ее концентрации
№ п/п
Компоненты
F8
1
Сахароза
20 мг
20 мг
2
Лизин моногидрат
10 мМ
10 мМ
3
Аспарагиновая кислота
10 мМ
10 мМ
4
Хлорид натрия
100 мМ
100 мМ
5
Полисорбат 20
0,2 мг
0,2 мг
6
Динатриевая соль EDTA
1 мМ
1 мМ
7
Одноосновный фосфат натрия
11 мМ
11 мМ
8
Двухосновный фосфат натрия
13 мМ
-
9
Двухосновный фосфат калия
-
19 мМ
Термодинамическую стабильность композиций определяли способами DSC. Агрегацию и фрагментацию в соответствующее время хранения оценивали при помощи SE-HPLC. Результаты представлены в таблице 6 и таблице 7.
Таблица 6:
Эксперимента ильные результаты DSC отобранных комбинаций
№ п/п
Составы
Tm1
Tm2
Tm3
1
RMP
57,5
70,4
82,3
2
F6
57,7
70,1
82,7
3
F8
58,3
70,1
82,3
Таблица 7:
Результаты SE-HPLC для оптимизации буферных солей
Изучаемая температура
Продолжительность
Составы
(дни)
RMP
F6
F8
50°С
0
98,4
98,6
98,6
2
81,4
86,1
87,5
3
75,9
неделали
80,9
Согласно результатам SE-HPLC композиция с солью калия имела высокую чистоту по сравнению с составами, содержащими соль натрия.
Согласно DSC-анализу средняя точка перехода первого пика перехода соли калия на около 1°C выше таковой композиции исключительно с солью натрия. Средние точки второго и третьего пика перехода почти одинаковы у обеих солей.
Поскольку наблюдали, что комбинация солей натрия-калия имела более низкую скорость деградации по сравнению с солью натрия отдельно, что подтверждается результатами SE-HPLC, и высокую термодинамическую стабильность, подтвержденную DSC-анализом, комбинацию солей натрия-калия выбрали в качестве подходящей буферной системы.
Пример 5
Препарат слитого белка TNFR:Fc с ингибиторами агрегации L-аспарагиновой кислотой и лизином
Все компоненты, приведенные в таблице 8, за исключением полисорбата 20 растворяли в 80% воды, и их тщательно смешивали с помощью непрерывного перемешивания. Полисорбат 20 добавляли в раствор, получая конечную концентрацию 0,2 мг/мл. Объем буферной смеси доводили до 90% водой. pH доводили до 6,3 любой подходящей кислотой/основанием, и объем доводили до 100% водой. Буферную смесь фильтровали, и нерасфасованную лекарственную субстанцию этанерцепта разводили в требуемой концентрации с помощью этой отфильтрованной буферной смеси. Состав этанерцепта анализировали с помощью SE-HPLC, SDS-PAGE и HIC в нулевое время и через 1, 2 и 3 месяца хранения при -20°C, 5±3°C, 25±2°C. HIC разделяет белки на основании гидрофобности. Пик 1 в HIC выявляет фрагменты, пик 2 соответствует активному димеру этанерцепта, а пик 3 соответствует агрегатам. Пик перед пиком 1, наблюдаемый в некоторых случаях, соответствует укороченным примесям.
Также проверяли биоактивность образцов. Способ основан на принципе нейтрализации цитотоксического эффекта. TNF-α вызывает цитотоксический эффект на клеточной линии L929 (соединительная ткань мыши). TNFR:Fc специфично нейтрализует цитотоксическую активность TNF-α дозозависимым способом. Биоактивность RMP составляет 1,7 миллиона единиц на мг. Результаты представлены в таблице 9.
Настоящий фармацевтический состав получали путем добавления ингибиторов агрегации к очищенному полипептиду, как описывается выше. Кроме того, при необходимости могут добавляться буфер, модификатор тоничности, поверхностно-активное вещество, ингибитор фрагментации и дополнительный наполнитель. Специалисту в данной области будет понятно, что комбинирование различных компонентов, которые следует включить в композицию, можно осуществлять в любом соответствующем порядке, а именно, буфер может добавляться первым, средним или последним, а также модификатор тоничности может также добавляться первым, средним или последним. Специалисту в данной области также будет понятно, что некоторые из данных химических веществ несовместимы при определенных комбинациях и, соответственно, легко заменяются другими химическими веществами, которые обладают похожими свойствами, но совместимы с рассматриваемой смесью.
Таблица 8
№ п/п
Ингредиент
Концентрация
1.
TNPR:Fc
50,0 мг/мл
2.
Однозамещенный фосфат натрия
1,5 мг/мл
3.
Вторичный кислый фосфат калия
3,3 мг/мл
4.
Лизин
1,5 мг/мл
5.
Хлорид натрия
5,8 мг/мл
6.
Полисорбат 20
0,1 мг/мл
7.
Сахароза
20 мг/мл
8.
Аспарагиновая кислота
1,3 мг/мл
9.
Динатриевая соль EDTA
0,37 мг/мл
а) Тест на стабильность водного состава TNFR:Fc
Биологические тесты осуществляли в соответствии с нормами Европейской фармакопеи.
- SDS-PAGE [Агрегация (невосстанавливаюший) и фрагментация (восстанавливающий)]
Вследствие сильной склонности к агрегации в случае высокой концентрации моноклональных антител и слитых белков для оценки ковалентных агрегатов применяли невосстанавливающий SDS-PAGE. Поскольку TNFR связывается с шарнирной областью Fc посредством дисульфидной связи и поскольку в Fc и TNFR присутствует много дисульфидных связей, фрагментацию белков проверяли восстанавливающим SDS PAGE.
- SE-HPLC (агрегация и фрагментация)
Так как эксклюзионная хроматография разделяет белки и связанные с ними примеси на основании их размера, вышеупомянутая методика была пригодна для обнаружения агрегации и фрагментации этанерцепта.
- HIC (агрегация, фрагментация, укорачивание и неправильное сворачивание)
HIC разделяет белки на основании гидрофобности. Пик 1 в HIC выявляет фрагменты, пик 2 соответствует активному димеру этанерцепта, а пик 3 соответствует агрегатам. Пик перед пиком 1, наблюдаемый в некоторых случаях, соответствует укороченным примесям. Профили эталонов в HIC, выявляющие пик 1, пик 2 и пик 3, приводятся, соответственно, на фигуре 12 (-20°C после 3 месяцев), на фигуре 13 (5±3°C после 3 месяцев), на фигуре 14 (25±2°C после 3 месяцев).
- Дифференциальная сканирующая калориметрия (DSC)
DSC представляет собой методику, применяемую для определения термодинамической стабильности белка. Этанерцепт имеет три перехода, и на фигуре 9 указывается, что Tm1 соответствует TNFR, Tm2 соответствует СН2-домену и Tm3 соответствует СН3-домену Fc-части (более высокая Тт указывает на более высокую стабильность).
- In vitro биоанализ (биоактивность)
Способ основан на принципе нейтрализации цитотоксического эффекта. TNF-a вызывает цитотоксический эффект на клеточной линии L929 (соединительная ткань мыши). TNFR:Fc специфично нейтрализует цитотоксическую активность TNF-α дозозависимым способом (фигура 10). Биоактивность RMP составляет 1,7 миллиона единиц на мг.
Аспекты в отношении стабильности водного состава отражены в таблице 9.
Таблица 9
Аналитические параметры для жидкого состава этанерцепта в нулевое время и после хранения при 5°C, 25°C и -20°C в течение 1, 2 и 3 месяцев
Анализ
Нулевое время
1 месяц
2 месяца
3 месяца
-20°C
5±3°C
25±2°C
-20°C
5±3°C
25±2°C
-20°C
5±3°C
25±2°C
-20°C
5±3°C
25±2°C
Агрегация с
помощью SE-HPLC
1,4%
1,4%
1,4%
1,7%
1,2%
1,4%
1,8%
1,1%
1,7%
1,7%
1,1%
1,9%
Фрагментация с
0%
0%
0%
0,1%
0,1%
0,2%
0,05%
0,2%
0,4%
0,0%
0,1%
0,5%
помощью SE-HPLC
HIC-пик 1
0%
0%
0%
Не
Не
Не
0,21%
0,28%
0,90%
0,81%
0,5%
1,4%
тести-
тести-
тести-
ровали
ровали
ровали
HIC-пик 2
93,7%
93,7%
93,7%
Не
Не
Не
93,1%
94,1%
92,8%
93,8%
93,6%
92,9%
тести-
тести-
тести-
ровали
ровали
ровали
HIC-пик 3
6,3%
6,3%
6,3%
Не
Не
Не
6,7%
5,7%
6,3%
5,4%
5,9%
5,7%
тести-
тести-
тести-
ровали
ровали
ровали
Пример 6
Тест на стабильность жидкого состава TNFR:Fc при 40°С
Получили жидкий состав, включающий этанерцепт, с композицией, приведенной в таблице 8. Составленный раствор стерилизовали с использованием 0,2 мкм фильтра под ламинарным воздушным потоком и хранили при 40°C в течение 1 месяца. Состав анализировали с помощью SE-HPLC, SDS-PAGE и HIC (фигура 15) в нулевое время, на 7 день, 15 день, 21 день и 1 месяц хранения при 40°C, и также проверяли биоактивность. Результаты представлены в таблице 10.
Таблица 10:
Результаты тестов на стабильность для состава этанерцепта
Нулевое
7 дней
15 дней
21 день
1 месяц
Анализ
время
40°C
40°C
40°C
40°C
40°C
Агрегация с
1,4%
1,9%
2,4%
3,7%
5,7%
помощью SE-
HPLC
Фрагментация с
0%
0,3%
0,5%
0,6%
1,1%
помощью SE-
HPLC
HIC-пик 1
0%
Не
Не
Не
2,7%
тестировали
тестировали
тестировали
HIC-пик 2
93,7%
Не
Не
Не
90,0%
тестировали
тестировали
тестировали
HIC-пик 3
6,3%
Не
Не
Не
7,2%
тестировали
тестировали
тестировали
Пример 7
Тест на стабильность жидкого состава TNFR:Fc при 50°C
Получили жидкий состав, включающий этанерцепт, с композицией, приведенной в таблице 8. Составленный раствор стерилизовали с использованием 0,2 мкм фильтра под ламинарным воздушным потоком и хранили при 50°C в течение 3 дней. Состав анализировали с помощью SE-HPLC, SDS-PAGE и HIC в нулевое время и после 2 дней и 3 дней хранения при 50°C.Результаты представлены в таблице 11.
Таблиц 11:
Результаты тестов на стабильность для состава этанерцепта (50°C)
Нулевое
2 дня
3 дня
Анализ
время
50°C
50°C
50°C
Агрегация с помощью SE-HPLC
1,4%
12,5%
19,1%
Фрагментация с помощью SE-
0%
0%
0%
HPLC
HIC-пик 1
0%
0%
0%
HIC-пик 2
93,7%
92,6%
84,9%
HIC-пик 3
6,3%
7,4%
15,1%
Новые составы слитого белка получали с использованием подходящей комбинации буфера, ингибиторов агрегации, модификаторов тоничности, стабилизаторов, поверхностно-активных веществ, хелатирующих средств, а также, факультативно, с консервантом, в подходящих их комбинациях.
Полученный с помощью указанного изобретения состав включает эффективное количество биологически активного TNFR:Fc, который применяют при лечении воспалительных заболеваний у людей. Они предпочтительно применяются в качестве инъецируемых водных растворов.