Хлорохин-гель, способ его изготовления и применения
CHLOROQUINE GEL, METHOD FOR ITS MANUFACTURE AND APPLICATION

Область техники
Настоящее изобретение относится к сфере биофармацевтики, или конкретнее, описывает хлорохин-гель, предназначенный для лечения инфекций наружных половых органов и других дефектов кожи, способ его изготовления и применения.
Уровень техники
Репродуктивные инфекции, также известные как заболевания, передающиеся половым путем, представляют собой группу заболеваний, при которых основным способом передачи является половой контакт. Более 20 инфекционных заболеваний, вызываемых сексуальным поведением, включены в категорию репродуктивных инфекций на международном уровне. С 80-х годов 20 века число мигрирующего населения увеличилось, изменилась концепция сексуальных отношений, увеличилось количество случаев небезопасных половых контактов. Количество инфекций половых органов и инфекций, передаваемых половым путем, в Китае продолжает увеличиваться, распространяясь от побережья до материка, от городов до сельских районов, приобретая серьезные масштабы. Согласно статистике, сегодня в Китае насчитывается около 400 000 больных СПИДом, ВИЧ-инфекция составляет примерно один случай на тысячу. Каждый день порядка 100 человек заражаются инфекцией, при этом, главным образом, передача происходит половым путем, распространяясь от групп повышенного риска к простым людям. Согласно статистике, за последнее время число заболеваний половыми инфекциями в Китае растет с каждым годом. Уровень заболеваемости половыми инфекциями во многих областях занимает второе и третье место, заболеваемость инфекциями нижних половых путей среди замужних женщин достигает 50%. 70% женщин в течение жизни как минимум один раз болели вульвовагинальным кандидозом, среди них 5-10% женщин имеют рецидивирующий вагинальный кандидоз, а 90% женщин инфицировались вирусом папилломы человека. Распространение половых инфекций происходит настолько быстро, что становится трудно контролировать социальные и общественные проблемы со здоровьем, которые стали серьезной угрозой во всем мире, поэтому эффективная профилактика и лечение половых инфекций стали очень серьезной и неотложной задачей.
Задачей современной медицины в лечении половых инфекций является борьба с возбудителями болезней. При профилактике и лечении, из-за разнообразия патогенных микроорганизмов, вызывающих инфекции половых органов, в сочетании с их изменчивостью и лекарственной устойчивостью, становится чрезвычайно трудно использовать антибиотики для предотвращения половых инфекций. В настоящее время в клинической практике основное лечение инфекций наружных половых органов основано на применении антибиотиков или дезинфицирующих средств. Однако дезинфицирующие средства используются лишь в отдельных случаях по причине того, что они вызывают раздражение слизистой оболочки и разрушают вагинальную среду. При бактериальных инфекциях половых органов лечение антибиотиками часто приводит к резистентности и побочным эффектам. Поэтому разработка новых высокоэффективных препаратов с антибактериальным и противовирусным действием имеет большое значение для эффективной профилактики и лечения инфекций наружных половых органов.
Хлорохин уже давно используется в качестве лекарственного средства для профилактики и лечения малярийного плазмодия, а также часто используется в экспериментах генной трансфекции для повышения эффективности трансфекции. Исследования в пробирках показали, что высокие концентрации хлорохина обладают эффектом подавления и уничтожения криптококковых бактерий, и нет никакой разницы в влиянии хлорохина на разные виды криптококка; в то же время хлорохин может усиливать анти-криптококковую способность амфотерицина В и обладает антибактериальным действием в синергии с амфотерицином В. В настоящее время целый ряд исследований посвящен активности хлорохина против ВИЧ. Исследования показали, что хлорохин обладает широким спектром действия против ВИЧ, он не только эффективен против лабораторного штамма B эволюции ВИЧ-1, но также эффективен против первичных изолятов A, B, C, D и E эволюции ВИЧ-1. Основным механизмом действия хлорохина на ВИЧ, по всей видимости, является подавление гликозилирования оболочечного белка вируса gp120, что приводит к тому, что новые вирионы обладают сильно пониженной инфекционностью. В то же время, исследования показывают, что хлорохин является веществом, проникающим в мембрану аминохинина, может быть вставлен в двухцепочечную ДНК и изменить форму двойной спирали ДНК путем разматывания. Бактериологические исследования показывают, что хлорохин может действовать как интеркалирующий агент, например, как оранжевый акридини бромистый этидий, для селективного подавления ковалентных связей в малых плазмидах ДНК. С помощью изменения суперспиральной плотности ДНК и, вследствие этого, закрытия суперспирали, достигается подавление роста бактерий и клеток вирусных инфекций. ДНК вируса папилломы человека (ВПЧ), вызывающего рак шейки матки, является плазмидом, представляющим собой сложное суперспиральное соединение ДНК, и проводит репликацию ДНК и транскрипцию РНК. С другой стороны, было доказано, что хлорохин подавляет плазмидную ДНК и влияет на активность ДНК-полимеразы, изменяя суперспиральную плотность ДНК-плазмиды. Было доказано, что из-за слабощелочного характера хлорохин вызывает митохондриальную дисфункцию, такую как накопление эндосом/лизосом, изменение pH и возможный апоптоз. Кроме того, было доказано, что хлорохин реактивирует инактивированный р53 (деградация ВПЧ / инактивация Р53), связывает с меланином (меланин вырабатывается в том же слое кожи, где происходит и репликация ВПЧ: базальный слой кожи) и предотвращает высвобождение ионов железа (энергетическая зависимость железного катализатора и ВПЧ во время репликации). Железо необходимо для репликации ДНК, железо выполняет роль электронного катализатора при транспортировке и накапливании кислорода. Однако при этом железо является важнейшим веществом, необходимым для выживания патогенных микроорганизмов и репликации вирусов. Подавление частиц железа также является важным механизмом уничтожения хлорохином вирусов и клеток с вирусной инфекцией.
На данный момент нет лекарственных препаратов наружного применения на основе хлорохина, особенно не вызывающих раздражения и с широким спектром лечебного действия. В клинической практике хлорохин в основном используется для лечения острых приступов малярии и контроля симптомов малярии. Также его можно применять при лечении печеночного амебиаза, клонорхоза, парагонимоза, болезней соединительной ткани и т.д. В том числе, может быть использован для лечения болезней светочувствительности, таких как эритема солнечных ожогов. Для лечения малярии, как правило, используются большие дозы таблеток и инъекций, а курс лечения достаточно длительный, что может вызывать тяжелую побочную реакцию со стороны желудочно-кишечного тракта и кожи; к тому же хлорохин оказывает определенное раздражающее воздействие на кожу, что может привести к повреждениям кожи и различным кожным высыпаниям. Следовательно, в настоящее время основной проблемой стал вопрос уменьшения раздражения хлорохином, уменьшения побочных эффектов и повышения ценности применения хлорохина за счет изменения лекарственной формы.
Микросфера лекарственного вещества является формой микросферического объекта, образованного путем дисперсии или адсорбции лекарственного вещества в высокомолекулярной полимерной матрице. Микросферы обладают свойствами длительного высвобождения или нацеливания, что помогает значительно повышать удобство и соблюдение режима приема лекарств для пациента, имеют очевидные преимущества в клинической практике и являются наиболее перспективной лекарственной формой. Кроме того, микросферы имеют достаточно высокую добавленную стоимость и большие перспективы на рынке; в последние годы в сфере фармацевтических исследований они стали наиболее актуальными.
Сущность изобретения
- решение проблемы несовершенства вышеуказанных имеющихся технологий и создание хлорохиновых нано-микросфер с использованием натурального высокомолекулярного соединения в качестве носителя микросфер. Процесс изготовления микросфер прост, побочные эффекты продукта низкие, синергетический эффект хлорохина и носителя микросферы полностью проявлен, а противовоспалительный, антибактериальный и противовирусный эффект очевиден. Уменьшение раздражения кожи хлорохином, стимулирование заживления ран и контроль скорости высвобождения лекарственных средств решает проблему слабого антибактериального эффекта имеющихся микросфер и высокого раздражения от хлорохина.
- создание способа изготовления хлорохиновых нано-микросфер, подходящих для наружных половых органов и других дефектов кожи.
- внедрение нового способа применения хлорохиновых нано-микросфер.
- создание продукта для профилактики и лечения инфекций наружных половых органов и/или других дефектов кожи.
Вышеуказанные цели настоящего изобретения могут быть достигнуты с помощью следующих технических решений:
Хлорохиновые нано-микросферы включают водорастворимый носитель нано-микросферы и хлорохин или производное хлорохина.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что объединение водорастворимого носителя нано-микросферы с хлорохином или производными хлорохина для создания хлорохиновых нано-микросфер характеризуется длительным временем действия, мукоадгезивностью, локальной удерживающей способностью и самостоятельной расщепляемостью. В то же время уменьшается раздражающее действие хлорохина, не раздражаются наружные половые органы, что решает проблему серьезных побочных эффектов и неудобства использования существующих методов лечения половых инфекций, эффективно устраняются побочные эффекты и лекарственная резистентность к хлорохину; нано-микросферы по настоящему изобретению могут эффективно предотвращать или лечить инфекции наружных половых органов и другие кожные заболевания, такие как вагинит, плоские бородавки и др., могут создавать значительный синергетический эффект; позволяют не только расширять сферу применения хлорохина, но также уменьшать резистентность к лекарственным препаратам, появившуюся вследствие злоупотребления существующими антибактериальными препаратами.
Способ изготовления нано-микросфер включает следующие шаги:
S1. После растворения носителей водорастворимых нано-микросфер добавляют хлорохин или производное хлорохина, равномерно перемешивают до водной фазы, при этом соотношение массы хлорохина или производного хлорохина и массы носителей водорастворимых нано-микросфер не превышает 1:3;
S2. К основе масляной фазы добавляют эмульгатор в качестве масляной фазы; при добавлении водной фазы к масляной фазе объемное соотношение водной фазы и масляной фазы составляет 1:1-6; с помощью эмульгирования  при 10000-20000 об/мин в течение 10-30 минут получается эмульсия нано-микросферы;
S3. К эмульсии нано-микросферы добавляют осаждающий реактив и после равномерного перемешивания оставляют в покое в течение 2-8 минут, затем дегидрируют, очищают на центрифуге при высокой скорости и сушат для получения хлорохиновой наносферы.
Оптимальное соотношение массы хлорохина или производных хлорохина и массы водорастворимого носителя нано-микросферы составляет от 1:3 -1:5.
Наиболее оптимальное соотношение массы хлорохина или производных хлорохина и массы водорастворимого носителя нано-микросферы составляет 1: 3.
Оптимально, чтобы производное хлорохина были выбраны из одного или нескольких видов гидроксихлорохина, хлорохина фосфата или хлорохина сульфата.
Оптимальный коэффициент нагрузки хлорохина или производных хлорохина - 3,0-21,6%.
Наиболее оптимальный коэффициент нагрузки хлорохина или производных хлорохина - 12,5%.
Оптимально, чтобы водорастворимые носители нано-микросфер были выбраны из одного или нескольких видов водорастворимого хитозана, водорастворимого каррагинана или водорастворимого крахмала.
Оптимально, чтобы водорастворимый носитель нано-микросферы представлял собой водорастворимый хитозан.
Наиболее оптимально, чтобы водорастворимый хитозан имел степень деацетилирования от 80 -95% и средневязкостную молекулярную массу от 3000 -5000.
Оптимальное объемное соотношение водной фазы и масляной фазы, описанное на этапе S2, составляет 1:3.
Оптимальные условия высокоскоростного центрифугирования, описанного на этапе S3, составляют 1500-2000 об/мин при центрифугировании в течение 5-10 минут.
Наиболее оптимальные условия высокоскоростного центрифугирования, описанного на этапе S3, составляют 1500 об/мин при центрифугировании в течение 10 минут.
Оптимально на этапе S3 в эмульсию нано-микросферы добавлять осаждающий агент со скоростью 1-5 капель в секунду.
Оптимальное объемное соотношение эмульгатора и осаждающего агента составляет 1-1,5:30-50.
Наиболее оптимальное объемное соотношение эмульгатора и осаждающего агента составляет 1:50.
Оптимальная основа масляной фазы - растительное масло; осаждающий агент - щелочная органическая фаза.
Оптимальная щелочная органическая фаза - смешанный раствор гидроокиси натрия и н-пропанола.
Наиболее оптимальный pH щелочной органической фазы - 8,5-10,0.
Еще более оптимальный pH щелочной органической фазы - 9,0.
Оптимально, чтобы растительное масло было выбрано из одного или нескольких видов растительных масел, таких как кукурузное масло, оливковое масло, арахисовое масло, соевое масло, рапсовое масло и др.
Оптимально, чтобы эмульгатор был выбран из одного или нескольких видов Tween-20, Tween-80 и Span 80.
В сферу защиты настоящего изобретения также входят применение хлорохиновых нано-микросфер при изготовлении антибактериальных и/или противовирусных препаратов и их использование при изготовлении продуктов для профилактики и лечения инфекций наружных половых органов и/или других дефектов кожи.
Препараты, содержащие хлорохиновые нано-микросферы, могут в значительной степени уменьшать раздражение кожи хлорохином, способствовать заживлению ран, замедленному высвобождению, одновременно с этим улучшать его биологическую активность, подходят для лечения инфекций наружных половых органов и других кожных заболеваний.
Инфекции наружных половых органов включают вирусный вагинит, остроконечную кондилому, бактериальный вагиноз, грибковый инфекционный вагинит или трихомонадный вагинит.
Другие кожные заболевания включают плоские бородавки, бородавки, вызванные инфекцией ВПЧ на негенитальном участке.
Хлорохиновые нано-микросферы оказывают эффективное лечебное действие на вирусный вагинит, остроконечную кондилому, бактериальный вагиноз, грибковый инфекционный вагинит и трихомонадный вагинит, а также на плоские бородавки и бородавки, вызванные инфекцией ВПЧ на негенитальном участке.
К настоящему изобретению относятся препараты для профилактики и лечения инфекций наружных половых органов и/или других дефектов кожи, включающие хлорохин или производное хлорохина, а также один или несколько видов водорастворимого хитозана, водорастворимого каррагинана или водорастворимого крахмала.
Оптимальное соотношение массы хлорохина или производных хлорохина и массы водорастворимого хитозана, водорастворимого каррагинана или водорастворимого крахмала не более 1/3.
Наиболее оптимальное соотношение массы хлорохина или производных хлорохина и массы водорастворимого хитозана, водорастворимого каррагинана или водорастворимого крахмала - 1:3-1:5.
Самое оптимальное соотношение массы хлорохина или производных хлорохина и массы водорастворимого хитозана, водорастворимого каррагинана или водорастворимого крахмала - 1:3.
Кроме того, в наиболее благоприятном варианте реализации настоящего изобретения препараты для профилактики и лечения инфекций наружных половых органов и/или других дефектов кожи содержат хлорохиновые нано-микросферы.
Наиболее оптимальное содержание хлорохиновых нано-микросфер - от 1 - 6% от общей массы продукта
Кроме того, в наиболее благоприятном варианте реализации настоящего изобретения препарат представляет собой гель, мазь, крем, шипучую таблетку, вагинальную таблетку, капсулу, пленку или суппозиторий.
Препараты по настоящему изобретению можно перерабатывать в полутвердые препараты, такие как гели, кремы и др., или твердые препараты, такие как таблетки, шипучие таблетки и др.; препараты по настоящему изобретению могут значительно улучшать горький вкус самого хлорохина, убирать раздражение кожи, способствовать заживлению ран, оказывать эффект медленного высвобождения и одновременно с этим повышать биологическую активность хлорохина.
Кроме того, в наиболее благоприятном варианте реализации настоящего изобретения препараты находятся в гелеобразном состоянии.
По сравнению с предшествующим уровнем технологий преимущества настоящего изобретения состоят в следующем:
(1) Используемый в настоящем изобретении водорастворимый носитель нано-микросферы в сочетании с хлорохином является препаратом для наружного применения и обладает бактерицидными и противовирусными свойствами, проявляет заметный синергетический эффект, а также оказывает очевидное очищающее и убивающее действие на различные бактерии и вирусы. Препарат имеет очищающее и ухаживающее свойство для мужских и женских наружных половых органов, уменьшает воспалительные реакции наружных половых органов и помогает предотвращать раздражение кожи, вызванное хлорохином. Он не оказывает раздражающего действия на слизистую влагалища и половой член, обладает мукоадгезивностью, локальной задержкой и способностью к саморасщеплению, способен не только предотвращать бактериальную и вирусную инфекцию, но и способствовать заживлению микроран. Может быть использован для лечения инфекций наружных половых органов и бородавок, особенно для гигиенического ухода за наружными половыми органами до и после полового акта. Эффект очевидный, также имеется эффект свежести и комфорта.
(2) Настоящее изобретение, главным образом, включает водорастворимый носитель нано-микросферы в сочетании с синергистом хлорохином в качестве основного компонента. Состав лекарства стабилен, лекарство принимает форму микросфер, которые продлевают время пребывания лекарственного средства на больном участке; вследствие этого, время действия увеличивается, а биодоступность и терапевтический эффект лекарственного средства повышаются. Способ его получения прост, он легко синтезируется, не имеет токсических побочных эффектов, безопасен, легко адаптируется к производству новых лекарственных средств и открывает новое направление в разработке и применении антибактериальных и противовирусных лекарственных препаратов.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 Хлорохинхитозановые нано-микросферы.
Фиг. 2 Стандартная кривая для определения хлорохина в высокоэффективной жидкой фазе.
Фиг. 3 Определение содержания хлорохина в хлорохинхитозановых микросферах в высокоэффективной жидкой фазе.
Фиг. 4 Высвобождение лекарства из хлорохинхитозановых нано-микросфер и хлорохиновых микросфер.
Фиг. 5 Гладкая стеклянная плоскость для наблюдения за различными пропорциями гелевых продуктов (гелевые продукты с 1 по 4 номер, хлорохинфосфат: соотношение массы хитозана составляет 1:5, 1:3, 1:1, 1:0,5 соответственно, из которых 5 номер представляет собой гелевый продукт из чистого хитозана).
Фиг. 6 Текучесть гелевых продуктов в разных соотношениях на гладкой стеклянной поверхности в течение 1 минуты (гелевые продукты с 1 по 4 номер, хлорохинфосфат: соотношение массы хитозана составляет 1:5, 1:3, 1:1, 1:0,5 соответственно, из которых 5 номер представляет собой гелевый продукт из чистого хитозана).
Фиг. 7 Результаты окрашивания H-E во время испытания на раздражение кожи; при этом группа А: контрольная группа, пустая гелевая основа, Фиг. А1 (сторона испытуемого объекта), Фиг. А2 (сторона отрицательного контроля); группа B: хлорохинхитозановый нано-микросферный гель, группа 1, соотношение массы хлорохинфосфата и массы хитозана составляет 1:3, Фиг. B1 (сторона испытуемого объекта), Фиг. B2 (сторона отрицательного контроля); группа C: хлорохинхитозановый нано-микросферный гель, группа 2, соотношение массы хлорохинфосфата и массы хитозана составляет 1:5, Фиг. C1 (сторона испытуемого объекта), Фиг. C2 (сторона отрицательного контроля); группа D: хлорохинхитозановый нано-микросферный гель, группа 3, соотношение массы хлорохинфосфата и массы хитозана составляет 1:0,5, Фиг. D1 (сторона испытуемого объекта), Фиг. D2 (сторона отрицательного контроля); группа E: группа хлорохинфосфатного геля, Фиг. E1 (сторона испытуемого объекта), Фиг. E2 (сторона отрицательного контроля).
Фиг. 8 Результаты окрашивания H-E во время испытания животных на вагинальный герпес; при этом Фиг. A - чистая контрольная группа; Фиг. B - типовая контрольная группа; Фиг. C - хлорохинхитозановый нано-микросферный гель, группа 1, соотношение массы хлорохинфосфата и массы хитозана 1:3; Фиг. D - хлорохинхитозановый нано-микросферный гель, группа 2, соотношение массы хлорохинфосфата и массы хитозана составляет 1:0,5; Фиг. E - группа хлорохинфосфатного геля.
Фиг. 9 Результаты окрашивания H-E во время испытания на ВПЧ-остроконечную кондилому у животных; при этом Фиг. A - типовая контрольная группа; Фиг.B - хлорохинхитозановый нано-микросферный гель, группа 1, соотношение массы хлорохинфосфата и массы хитозана составляет 1:3; Фиг. C - хлорохинхитозановый нано-микросферный гель, группа 2, соотношение массы хлорохинфосфата и массы хитозана составляет 1:0,5; Фиг. D - группа хлорохинфосфатного геля.
Конкретные варианты осуществления
Ниже более подробно будут описаны способы реализации настоящего изобретения, однако, они абсолютно не накладывают никаких ограничений по данному изобретению. Все простые модификации или замены способов, шагов и условий входят в область настоящего изобретения; при отсутствии особых указаний, в примерах реализации используются общепринятые технические средства, хорошо известные специалистам в данной области.
При отсутствии особых пояснений, используемые в следующих примерах реагенты и материалы - Шигоу.
Пример 1. Изготовление хлорохинхитозановых нано-микросфер.
1. Метод изготовления.
S1. Взвесить 3 г водорастворимого хитозана, добавить в 100 мл воды, после его растворения добавить 1,0 г хлорохинфосфата, равномерно перемешать до водной фазы; при этом степень деацетилирования водорастворимого хитозана составляет 80%, его средневязкостная молекулярная масса равна 5000;
S2. Отмерить 300 мл кукурузного масла в качестве основы масляной фазы, добавить к основе масляной фазы 1 мл эмульгатора Tween-20 в качестве масляной фазы; водную фазу добавить к масляной фазе, объемное соотношение водной фазы и масляной фазы составляет 1:3, для получения эмульсии нано-микросферы проводить эмульгирование при 15000 об/мин в течение 30 мин;
S3. Используя в качестве осаждающего агента смешанный раствор гидроокиси натрия и н-пропанола, сначала взять 10 мл н-пропанола и добавить несколько капель насыщенного раствора гидроокиси натрия, чтобы довести рН до 9. После равномерного перемешивания добавлять в нано-микросферную эмульсию со скоростью от 1 до 5 капель в секунду, контролировать объемное соотношение эмульгатора и осаждающего агента на уровне 1:50, оставить в покое на 5 минут и добавить необходимое количество н-пропанола для дегидрации; после центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 минут, промывки и просушки получаются хлорохинхитозановые нано-микросферы.
2. Характеристики продукта.
(1) Полученные хлорохинхитозановые нано-микросферы показаны на Фиг. 1, диаметр их частиц от 100 до 800 нм.
(2) Как показано на Фиг. 2 и Фиг. 3, после проверки высокоэффективной жидкой фазы коэффициент нагрузки хлорохина в хлорохинхитозановых микросферах составляет 12,5%.
Пример 2. Изготовление хлорохинхитозановых нано-микросфер.
1. Метод изготовления.
S1. После растворения водорастворимого хитозана в воде, добавить гидроксилхлорохин, равномерно перемешать до водной фазы, контролировать соотношение массы гидроксилхлорохина и массы водорастворимого хитозана на уровне 1:5; при этом степень деацетилирования водорастворимого хитозана составляет 90%, средневязкостная молекулярная масса - 3000;
S2. Отмерить 300 мл кукурузного масла в качестве основы масляной фазы, добавить к основе масляной фазы 1 мл эмульгатора Tween-20 в качестве масляной фазы; водную фазу добавить к масляной фазе, объемное соотношение водной фазы и масляной фазы составляет 1:1, для получения эмульсии нано-микросферы проводить эмульгирование при 10000 об/мин в течение 30 мин;
S3. Используя в качестве осаждающего агента смешанный раствор гидроокиси натрия и н-пропанола, сначала взять 10 мл н-пропанола и добавить несколько капель насыщенного раствора гидроокиси натрия, чтобы довести рН до 8,5. После равномерного перемешивания медленно добавлять в нано-микросферную эмульсию, контролировать объемное соотношение эмульгатора и осаждающего агента на уровне 1,5:50, оставить в покое на 2 минуты и добавить необходимое количество н-пропанола для дегидрации; после центрифугирования при 2000 об/мин в течение 5 минут, промывки и просушки получаются хлорохинхитозановые нано-микросферы, размеры их частиц составляют 200-800 нм, а коэффициент нагрузки хлорохина составляет 10,3%.
Пример 3. Изготовление хлорохинхитозановых нано-микросфер.
1. Способ изготовления.
S1. После растворения водорастворимого хитозана в воде, добавить хлорохинсульфат, равномерно перемешать до водной фазы, контролировать соотношение массы хлорохинсульфата и массы водорастворимого хитозана на уровне 1:7; при этом степень деацетилирования водорастворимого хитозана составляет 90%, средневязкостная молекулярная масса - 4000;
S2. Взять оливковое масло в качестве основы масляной фазы, добавить к основе масляной фазы эмульгатор Tween-80 в качестве масляной фазы; водную фазу добавить к масляной фазе, объемное соотношение водной фазы и масляной фазы составляет 1:6, для получения эмульсии нано-микросферы проводить эмульгирование при 20000 об/мин в течение 10 мин;
S3. Используя в качестве осаждающего агента смешанный раствор гидроокиси натрия и н-пропанола, сначала взять н-пропанол и добавить несколько капель насыщенного раствора гидроокиси натрия, чтобы довести рН до 10. После равномерного перемешивания медленно добавлять в нано-микросферную эмульсию, контролировать объемное соотношение эмульгатора и осаждающего агента на уровне 1,5:30, оставить в покое на 8 минут и добавить необходимое количество н-пропанола для дегидрации; после центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 минут, промывки и просушки получаются хлорохинхитозановые нано-микросферы, средний размер их частиц составляет 400 нм, а коэффициент нагрузки хлорохина составляет 8,6%.
Пример 4. Изготовление хлорохинхитозанового нано-микросферного геля.
1. Состав геля:
Хлорохинхитозановые нано-микросферы
1%
Карбоксиметиловая целлюлоза
2%
Этилпарабен
0,2%
Глицерин
30%
Мятное масло
0,1%
Дистиллированная вода
Добавляется до 100%
2. Способ изготовления включает следующие этапы:
(1) Изготовление микросфер: в соответствии с этапами изготовления хлорохинхитозановых нано-микросфер из примера 1;
(2) Взять 20 г карбоксиметиловой целлюлозы, добавить 300 г глицерина по составу, 2 г этилпарабена, равномерно перемешать и после того как смесь набухнет, использовать ее в качестве гелевой основы; взять 10 г хлорохинхитозановых нано-микросфер, растворить в 100 мл воды, порционно добавить в гелевую основу и перемешать; добавить 1 мл мятного масла и добавить воды до 1000 мл. Антибактериальный и противовирусный хлорохинхитозановый нано-микросферный гель для наружных половых органов готов.
3. Изтоговление простого хлорохинового геля тем же методом, сравнение скорости высвобождения хлорохина из хлорохинхитозанового нано-микросферного геля и хлорохинового геля.
Как показано на Фиг. 4, хлорохинхитозановый нано-микросферный гель может выделять хлорохин медленно и плавно. Хлорохинхитозановый нано-микросферный гель, изготовленный по настоящему изобретению, не имеет свойства внезапного высвобождения на раннем этапе, при этом среда практически не влияет на скорость высвобождения, демонстрирует хорошие результаты медленного высвобождения, способствует непрерывному высвобождению лекарственного средства после наружного применения.
Пример 5. Изготовление хлорохинхитозанового нано-микросферного геля
1. Состав геля:
Хлорохинхитозановые нано-микросферы
5%
Карбоксиметиловая целлюлоза
0,5%
Этилпарабен
0,5%
Глицерин
30%
Мятное масло
0,1%
Дистиллированная вода
Добавляется до 100%
2. Способ изготовления включает следующие этапы:
(1) Изготовление микросфер: в соответствии с этапами изготовления хлорохинхитозановых нано-микросфер из примера 1;
(2) Взять карбоксиметиловую целлюлозу, добавить глицерин по составу, добавить 800 мл воды, равномерно перемешать и после того как смесь набухнет, использовать ее в качестве гелевой основы; взять хлорохинхитозановые нано-микросферы, растворить в 100 мл воды, порционно добавить в гелевую основу и перемешать; растворить этилпарабен в 50 мл воды 80-85°C, подождать, пока температура опустится ниже 40°C, добавить в гелевую основу, равномерно перемешать; добавить мятное масло, воды до 1000 мл. Антибактериальный и противовирусный хлорохинхитозановый нано-микросферный гель для наружных половых органов готов.
3. В соответствии с вышеуказанными этапами, остальные технологические условия остаются неизменными, изменение соотношения массы хлорохинфосфата и массы хитозана для приготовления геля 1, 2, 3, 4; одновременно с этим, в соответствии с этапами изготовления, приведенными в примерах, остальные технологические условия остаются неизменными, хлорохин или его производноене добавляются, чистый хитозан используется в качестве основного активного ингредиента для изготовления геля 5, как показано в следующей таблице:
Таблица 1. Результаты изготовления геля в нано-микросферах с разным соотношением хлорохина и хитозана.
Соотношение массы хлорохинфосфата и массы хитозана
Свойства и форма
pH
Вязкость (mp/s)
Содержание активного хлорохина (%)
Гель 1
1:5
Светло-желтый полупрозрачный гель, однородная текстура, с легким ароматом мяты, может стекать в виде столбика
4,27
11868
0,84
Гель 2
1:3
Бежевый полупрозрачный гель, однородная текстура, с легким ароматом мяты, может стекать в виде столбика
4.08
9246
1.67
Гель 3
1:1
Бежевая непрозрачная паста с легким ароматом мяты с мелкими частицами
3.97
6217
2.50
Гель 4
1:0,5
Темно-желтая непрозрачная паста, с легким ароматом мяты, с крупными частицами
3.77
5890
5.03
Гель 5
Чистый хитозан
Оранжевый прозрачный гель с легким ароматом мяты, однородная текстура
4.79
20969
0
На Фиг. 5 показана форма гелевых продуктов в разных пропорциях на гладкой стеклянной поверхности (гелевые продукты от №1 до №4, хлорохинфосфат: пропорция хитозана составляет 1:5, 1:3, 1:1, 1:0,5, из которых №5 является чистым хитозаном); текучесть гелей с разными пропорциями в течение 1 минуты на гладкой стеклянной поверхности показана на Фиг. 6.
При испытаниях было обнаружено, что, когда соотношение хлорохинфосфата и хитозана составляет 1:1 или 1:0,5, изготовленный гель имеет неоднородную текстуру, содержит мелкие частицы и обладает недостаточной текучестью. Когда соотношение хлорохинфосфата и хитозана составляет 1:5 или 1:3, гель имеет однородную текстуру, рН подходит для вагинального и кожного приема лекарств, вязкость, цвет и запах соответствуют потребностям разных людей, продукт со стабильным содержанием хлорохина. Однако, когда соотношение массы хлорохинфосфата и массы хитозана составляет 1:5, содержание хлорохина достаточно низкое, и присутствует определенное снижение лекарственного эффекта. Таким образом, когда соотношение массы хлорохинфосфата и массы хитозана составляет 1:3, характеристики продукта гораздо лучше.
Пример 6. Испытание на раздражение кожи хлорохинхитозанового нано-микросферного геля.
1. Метод испытания.
2
(1) В качестве объекта эксперимента использовались новозеландские кролики, по методу сопоставления кожи на левой и правой сторонах одного тела, соответственно, на испытуемых участках кожи с правой и левой стороны рисовался иероглиф «» (площадь около 3,0 см × 3,0 см). 1,0 г испытуемого вещества вводили с левой стороны в дозе 9 см/штука, каждый раз площадь нанесения составляла 3,0 см × 3,0 см, и 1,0 г белого вазелина вводили с правой стороны в качестве стороны отрицательного контроля. Каждой группе животных вводили один раз в день в течение 28 дней подряд.
Испытуемые группы:
Группа A: контрольная группа, пустая гелевая основа,
Группа B: 1 группа - хлорохинхитозановый нано-микросферный гель, соотношение массы хлорохинфосфата и массы хитозана - 1: 3,
Группа C: 2 группа - хлорохинхитозановый нано-микросферный гель, соотношение массы хлорохинфосфата и массы хитозана - 1: 5,
Группа D: 3 группа - хлорохинхитозановый нано-микросферный гель, соотношение массы хлорохинфосфата и массы хитозана - 1: 0,5,
Группа E: группа хлорохинфосфатного геля.
Каждый раз до нанесения, а также каждый раз через 1 час после удаления лекарства, затем через 1 час, 24 часа, 48 часов, 72 часа и 14 дней после последнего удаления лекарства на 28-й день, необходимо наблюдать и регистрировать покраснения и отеки во всех местах наблюдения каждой группы животных, а также проводить оценку имеющихся покраснений и отеков. Одновременно с этим необходимо наблюдать, имеются ли в местах введения лекарства пигментация, кровоточащие пятна, грубая или тонкая кожа, и записывать время их возникновения и уменьшения.
(2) На 14-й день после последнего удаления лекарственного средства все пять групп животных подвергаются гистопатологическому исследованию левой и правой сторон кожи в местах введения лекарства.
2. Результаты.
(1) Результаты наблюдения за кожей каждой группы
Результаты испытаний:
На стороне отрицательного контроля (правая сторона) не наблюдалось значительного раздражающего ответа на испытуемых участках кожи животных каждой тестируемой группы в каждый момент наблюдения. Следовательно, можно судить, что продуктом отрицательного контроля является белый вазелин с отрицательным результатом.
Группа A: явной раздражающей реакции в каждый момент времени наблюдения обнаружено не было, поэтому можно судить, что чистая гелевая основа не оказывает раздражающего действия на кожу.
Группа B: во время визуального осмотра между первым и 12-м днем кожа со стороны испытуемого участка (левая сторона) у животных в 6 из 6 случаев показала легкое покраснение или отек. Никаких явных отклонений в местах введения лекарства животным во всех случаях с 12-го дня до момента аутопсии не наблюдалось, результаты гистопатологического исследования  за последние 72 часа и 14 дней показали, что у животных в 2 из 6 случаев был легкий отек на испытуемом кожном участке, у остальных не было выявлено явных отклонений. Таким образом, можно судить, что лекарственный препарат слегка усилил механическое раздражение после повреждения кожи.
Группа C: во время визуального осмотра между первым и 12-м днем кожа со стороны испытуемого участка (левая сторона) у животных в 6 из 6 случаев показала легкое покраснение или отек. Никаких явных отклонений в местах введения лекарства животным во всех случаях с 12-го дня до момента аутопсии не наблюдалось, результаты гистопатологического исследования через 72 часа и 14 дней показали, что у животных в 6 из 6 случаев не было выявлено явных отклонений на испытуемых участках кожи. Таким образом, можно судить, что легкое раздражение является механическим раздражением после повреждения кожи.
Группа D: в 4 из 6 случаев со стороны испытуемого участка (левая сторона) на 12-й день отмечались покраснение или отек. Во время введения лекарства отпадали струпья, поверхность кожи не могла полностью зажить во время отпадения струпьев. После последнего удаления лекарственного средства через 72 часа рана в значительной степени затянулась.
Группа E: в 4 из 6 случаев со стороны испытуемого участка (левая сторона) на 11-й день началось растрескивание поврежденных участков, с тенденцией растяжения кнаружи. В месте введения лекарства покраснение или отек стали более очевидными, чем на предыдущем этапе. Струпья непрерывно образовывались и отваливались, поверхность кожи во время отпадения струпьев не могла полностью зажить, была значительная разница со стороной отрицательного контроля на правой стороне одного тела. Результаты гистопатологического исследования через 72 часа и 14 дней после последнего удаления лекарства показали, что в 6 из 6 случаеву животных были выявлены явные отклонения на участках введения препарата, а в 3 случаях через 72 часа при аутопсии были выявлены очевидные повреждения: утолщение эпидермиса, нарушение соединительной ткани эпидермиса, фиброплазия, воспалительная клеточная инфильтрация, рубцы в эпидермисе, части эпидермального слоя впали, структура нечеткая; в 3 случаях через 14 дней при аутопсии были обнаружены частичные утолщения кожи, нарушение соединительной ткани эпидермиса, фиброплазия вместе с воспалительной клеточной инфильтрацией.
Из приведенных выше результатов эксперимента видно, что в поврежденную кожу новозеландского кролика многократно вводилось лекарство, при этом хлорохинхитозановый нано-микросферный гель оказывал меньшее раздражающее воздействие на поврежденную кожу, чем хлорохинфосфатный гель (общий препарат наружного применения); если говорить о хлорохинхитозановом нано-микросферном геле, то чем ниже пропорция хлорохина/нано-микросферного носителя, тем меньше раздражение кожи и тем лучше проходит восстановление поврежденной кожи после прекращения введения лекарства. Хлорохин гель может привести к усугублению повреждения кожи. В случае полного восстановления на стороне отрицательного контроля кожа на стороне хлорохин-геля не может нормально восстанавливаться, через 14 дней после прекращения введения лекарства кожа на стороне хлорохин-геля в некоторой степени восстановилась, разница была очевидной. Это указывает на то, что хлорохин оказывает раздражающее действие на поврежденную кожу, а хлорохинхитозановые микросферы могут значительно снижать это раздражающее действие, что может быть связано с антибактериальным и противовоспалительным действием самого хитозана, способствующего заживлению ран.
(2) Результаты патологической проверки.
Группа A: Как показано на Фиг. A1 (сторона пустой основы) и Фиг. A2 (сторона отрицательного контроля) Фиг. 7, эпидермис кожи, дерма и придаточная структура не повреждены, воспалительная клеточная инфильтрация и расширение мелких сосудов отсутствуют.
Группа B: Фиг. B1 (хлорохинхитозановый нано-микросферный гель) и Фиг.B2 (сторона отрицательного контроля) Фиг. 7. Фиг. B2 показывает, что эпидермис кожи, дерма и придаточная структура не повреждены, воспалительная клеточная инфильтрация и расширение мелких сосудов отсутствуют. По сравнению со стороной отрицательного контроля, на рисунке B1 показано, что небольшой участок эпидермиса очагового характера данной группы слегка утолщился, и можно увидеть небольшое количество клеточной воспалительной инфильтрации.
Группа C: Фиг. С1 (сторона хлорохинхитозанового нано-микросферного геля) и Фиг. С2 (сторона отрицательного контроля) Фиг.7. Фиг. C2 показывает, что эпидермис кожи, дерма и придаточная структура не повреждены, воспалительная клеточная инфильтрация и расширение мелких сосудов отсутствуют. На Фиг. С1 видно, что часть эпидермального слоя кожи данной группы слегка утолщена, количество клеточных слоев значительно увеличено и распространяется на дерму; нарушение соединительной ткани эпидермиса вместе с воспалительной клеточной инфильтрацией.
Группа D: Фиг. D1 (сторона хлорохинхитозанового нано-микросферного геля) и Фиг. D2 (сторона отрицательного контроля) Фиг. 7. Фиг. D2 показывает, что эпидермис кожи, дерма и придаточная структура не повреждены, воспалительная клеточная инфильтрация и расширение мелких сосудов отсутствуют. По сравнению со стороной отрицательного контроля, Фиг.D1 показывает, что часть эпидермального слоя кожи данной группы слегка утолщен, количество клеточных слоев значительно увеличено и наблюдается небольшое количество воспалительной клеточной инфильтрации.
Группа E: Фиг. E1 (сторона хлорохин-геля) и Фиг. E2 (сторона отрицательного контроля) Фиг.7. На стороне отрицательного контроля эпидермис кожи, дерма и придаточная структура не повреждены, воспалительная клеточная инфильтрация и расширение мелких сосудов отсутствуют, в то время как частично на участках кожи со стороны хлорохин геля имеются струпья, а эпидермис значительно утолщен; часть струпьев тесно связана с подкожной тканью, эпидермис впалый, структура нечеткая, имеется большое количество воспалительной клеточной инфильтрации вместе с фиброплазией; количество фолликулов в дерме значительно снижено; однако в мышечном слое и подкожной ткани явных отклонений не обнаружено.
Приведенные выше результаты патологического теста показывают, что хлорохинхитозановый нано-микросферный гель имеет очевидные преимущества по сравнению с хлорохин гелем по степени раздражения, а также заживления после прекращения приема препарата. В каждой группе хлорохинхитозановых микросфер чем ниже доля носителя в хлорохиновых нано-микросферах, тем меньше раздражающая реакция на кожу.
Результаты всестороннего наблюдения за кожей и патологические результаты показали, что раздражающий ответ хлорохинхитозанового нано-микросферного геля на кожу был значительно меньше, чем у хлорохин-геля, это означает, что хлорохинхитозановые нано-микросферы значительно уменьшают раздражающее побочное действие хлорохина на кожу и в определенной степени способствуют заживлению ран. Когда соотношение массы хлорохина и массы хитозана не превышает 1:3, раздражающее действие относительно невелико, а содержание лекарственного средства самое высокое.
Пример 7. Испытание на герпесный вагинит у животных.
1. Метод испытания.
Использование хлорохинхитозанового нано-микросферного геля, полученного в примере 1, в испытании на герпесный вагинит у животных.
Подробный метод испытания: было отобрано несколько подходящих для наблюдения морских свинок Hartley, случайным образом были отобраны 10 животных в качестве пустой контрольной группы (A). Остальные животные были смоделированы с помощью герпесного вагинита. После моделирования животные были разделены на 5 групп:
Группа A: чистая контрольная группа,
Группа B: модельная группа,
Группа С: группа 1 - хлорохинхитозановый нано-микросферный гель, соотношение массы хлорохинфосфата и массы хитозана составляет 1: 3,
Группа D: группа 2 - хлорохинхитозановый нано-микросферный гель, соотношение массы хлорохинфосфата и массы хитозана составляет 1: 0,5,
Группа Е: хлорохинфосфатный гель;
В каждой группе по 10 животных, лекарство вводили вагинально. Пустой контрольной группе и модельной контрольной группе вводили 0,9% хлористого натрия, группе С, группе D и группе E давали соответствующие тестовые препараты один раз в день, каждой группе вводили непрерывно в течение 2 недель. Через 14 дней введения препарата на следующий день брали ткани слизистой оболочки влагалища, проводили фиксацию и парафиновую заливку непрерывными срезами 4 мкм. После окрашивания гематоксилин-эозином (HE) под микроскопом наблюдали патологическое состояние тканей слизистой оболочки влагалища.
2. Результаты.
(1) Патологическая проверка.
Группа A: Результаты чистой контрольной группы показаны на Фиг. A Фиг. 8. Структура эпителиальных клеток слизистой влагалища чистой контрольной группы целостная, кровеносные сосуды собственного слоя не расширены, нет воспалительной клеточной инфильтрации.
Группа B: Результаты модельной контрольной группы показаны на Фиг. B Фиг. 8. В нижнем собственном слое слизистой оболочки влагалища модельной контрольной группы наблюдалось большое количество воспалительных клеточных инфильтраций, нарушенная рыхлая соединительная ткань, очевидный отек.
Группа C: Результаты группы 1 - хлорохинхитозановый нано-микросферный гель, с соотношением массы хлорохинфосфата и массы хитозана 1: 3, показаны на Фиг. С Фиг. 8. Соединительная ткань серозного слоя увеличилась, расположение нарушено, очевидный отек, сопровождаемый небольшим количеством воспалительных клеточных инфильтраций.
Группа D: Результаты группы 2 - хлорохинхитозановый нано-микросферный гель, с соотношением массы хлорохинфосфата и массы хитозана 1: 0,5, показаны на Фиг. D Фиг. 8. Нижний слой слизистой оболочки имел очевидный отек, соединительная ткань серозного слоя увеличилась, расположение нарушено, очевидный отек, можно увидеть воспалительные клеточные инфильтрации.
Группа E: Результаты с хлорохинфосфатным гелем показаны на Фиг. E Фиг. 8. Локальные эпителиальные клетки слизистой влагалища были деформированы и стали некротичными, структура рыхлой соединительной ткани нижнего слоя слизистой оболочки слегка нарушена с явным отеком и воспалительной клеточной инфильтрацией.
(2) Результаты патологических изменений при гистологическом исследовании животных
Таблица 2. Статистическая таблица патологических изменений при гистологическом исследовании животных.
Группа
Патологическое изменение
Влагалище
Нарушение структуры рыхлой соединительной ткани постоянного слоя, отек
Утолщение серозной оболочки, отек
Воспалительная клеточная инфильтрация основного слоя
Чистая контрольная группа A
-
10/10
10/10
10/10
±
0/10
0/10
0/10
+
0/10
0/10
0/10
++
0/10
0/10
0/10
+++
0/10
0/10
0/10
Модельная контрольная группа B
0/10
2/10
2/10
±
2/10
3/10
4/10
+
5/10
3/10
2/10
++
3/10
2/10
2/10
+++
0/10
0/10
0/10
Хлорохинхитозановый нано-микросферный гель, группа C
4/10
9/10
4/10
±
3/10
0/10
3/10
+
2/10
0/10
3/10
++
1/10
1/10
0/10
+++
0/10
0/10
0/10
Хлорохинхитозановый нано-микросферный гель, группа D
2/10
8/10
5/10
±
2/10
0/10
4/10
+
3/10
1/10
1/10
++
3/10
0/10
0/10
+++
0/10
1/10
0/10
Хлорохинфосфат - группа E
1/10
6/10
4/10
±
3/10
0/10
4/10
+
1/10
3/10
2/10
++
410
0/10
0/10
+++
1/10
1/10
0/10
Примечание: «-» означает отсутствие явных отклонений; «±» означает очень легкие повреждения; «+» означает легкие повреждения; «++» означает умеренные повреждения, «+++» означает серьезные повреждения.
Приведенные выше результаты показывают, что хлорохинхитозановый нано-микросферный гель значительно улучшает вагинит, вызванный вирусом герпеса, по сравнению с хлорохиновым гелем. Сравнение степени воспаления в каждой группе: модельная контрольная группа > группа E хлорохинфосфат > хлорохинхитозановый нано-микросферный гель, группа D > хлорохинхитозановый нано-микросферный гель, группа C > чистая контрольная группа. Кроме того, комплексное использование хлорохина и хитозана может значительно улучшить отек влагалища, а результаты схожи со степенью воспаления. Это показывает, что комплексное применение хлорохинхитозановых микросфер привело к значительному увеличению терапевтического эффекта.
Пример 8. Лечение остроконечной кондиломы, вызванной ВПЧ.
1. Метод испытания.
Было отобрано несколько пригодных к наблюдению лысых мышей, самцы и самки поровну, ВПЧ-инфицированная ткань было напрямую инокулирована под кожу лысых мышей. Процедура трансплантации проходила строго по принципам стерильной хирургической операции. Через 5-6 дней после инокуляции лысых мышей с успешно инокулированными участками случайным образом разделили на 4 группы в зависимости от массы тела и пола:
Группа A: Модельная контрольная группа,
Группа B: хлорохинхитозановый нано-микросферный гель, группа 1, с соотношением массы хлорохинфосфата и массы хитозана 1: 3,
Группа C: хлорохинхитозановый нано-микросферный гель, группа 2, с соотношением массы хлорохинфосфата и массы хитозана 1: 0,5,
Группа D: хлорохинфосфатный гель,
В каждой группе по 6 животных, самцы и самки поровну. Модельной контрольной группе давали белый вазелин, остальным группам соответствующие гели. Животным в каждой группе наносили препарат на кожу, размер области нанесения составлял около 2 см × 2 см. Лекарство давалось один раз в день, при каждом нанесении время воздействия составляло 6 часов, после 6 часов препарат удалялся с кожи, препарат наносился непрерывно в течение 14 дней. Через 14 дней нанесения препарата на следующий день вырезались бородавки, проводилась фиксация и парафиновая заливка непрерывными срезами 4 мкм. После окрашивания гематоксилин-эозином (HE) под микроскопом наблюдали патологическое состояние структуры бородавки.
2. Результаты.
Патологический осмотр выявил:
(1) Результаты по бородавкам в группе A показали: у всех животных наблюдались бородавки, структура эпителиальных клеток бородавок не была повреждена, частично можно было наблюдать впалые пустые клетки.
Как показано на Фиг.А Фиг.9, бородавки: вокруг ядра локальных эпителиальных клеток имеются явные вакуоли, клеточное ядро очевидно. (H-E окрашивание × 200).
(2) Результаты по бородавкам в группе B показали: в 6 случаях были замечены бородавки. При этом в двух случаях (03, 04; 2/6) наблюдалась частичная дегенерация и некроз эпителиальных клеток бородавок и небольшое количество вогнутых пустых клеток; в 4 случаях (01, 02, 05, 06; 4/6) эпителиальные клетки тканей бородавок не были повреждены, частично можно было наблюдать вогнутые пустые клетки.
Как показано на Фиг. В Фиг. 9, бородавки: вокруг ядра локальных эпителиальных клеток имеются явные вакуоли, клеточное ядро очевидно. (H-E окрашивание × 200).
(3) Результаты по бородавкам в группе С показали: в 6 случаях были замечены бородавки. При этом в трех случаях (03, 04, 05; 3/6) наблюдалась частичная дегенерация и некроз эпителиальных клеток бородавок и небольшое количество вогнутых пустых клеток; в 3 случаях (01, 02, 06; 3/6) эпителиальные клетки тканей бородавок не были повреждены, частично можно было наблюдать вогнутые пустые клетки.
Как показано на Фиг. С Фиг. 9, бородавки: вокруг ядра локальных эпителиальных клеток имеются явные вакуоли, клеточное ядро очевидно. (H-E окрашивание × 200).
(4) Результаты по бородавкам в группе D показали: в 6 случаях были замечены бородавки. При этом в 4 случаях (01, 02, 03, 04; 4/6) наблюдалась частичная дегенерация и некроз эпителиальных клеток бородавок и небольшое количество вогнутых полых клеток; в 2 случаях (05, 06; 2/6) эпителиальные клетки тканей бородавок не были повреждены, частично можно было наблюдать вогнутые полые клетки.
Как показано на Фиг. D Фиг. 9, бородавки: гиперкератозис клеток бородавок, под эпидермисом можно увидеть чешуйчатый эпителий, дегенерацию и некроз локальных эпителиальных клеток, частично можно было наблюдать вогнутые полые клетки.
Результаты показывают, что хлорохин имеет свойство очищения бородавок от ВПЧ-инфицированных клеток, и с увеличением содержания хлорохина количество полых ВПЧ-инфицированных клеток уменьшается. Группа хлорохинового геля (группа D) очевидно удаляет инфицированные клетки, однако может вызывать локальную дегенерацию и некроз тканей. По сравнению с чистым хлорохиновым гелем, хлорохинхитозановый гель одновременно защищает кожу и уменьшает количество инфицированных клеток.
Пример 9. Уничтожение или подавление различных патогенных влагалищных микроорганизмов.
Хлорохинхитозановый нано-микросферный гельиз примера 6 (группа B: хлорохинхитозановый нано-микросферный гель с соотношением массы хлорохинфосфата и массы хитозана 3:1) был протестирован на внешнюю антибактериальную активность. 20 г гелевого продукта добавляли к 100 мл буферной жидкости с pH 7,0 (отрицательный контроль без испытуемой пробы) до полного растворения. Было добавлено 1 мл, 0,5 мл, 0,25 мл и 0,125 мл буферной жидкости испытуемой пробы с pH 7,0 в питательную среду с соответствующими штаммами для пластинчатой разводки. Было проведено оживление синегнойной палочки, кандиды альбиканса, кишечной палочки, золотисто-желтого стафилококка, концентрация бактерий составляла 100 КОЕ/мл, бактериологической петлей были инокулированы все питательные среды, через 5-7 дней после культивации началось наблюдение.
Результаты теста на внешнюю антибактериальную активность: хлорохинхитозановый нано-микросферный гель в различных концентрациях может подавлять рост синегнойной палочки, кандиды альбиканса, кишечной палочки, золотисто-желтого стафилококка. Чем выше концентрация, тем выше степень подавления бактерий. При этом чувствительность кандиды альбиканса и золотисто-желтого стафилококка выше.
Результаты показывают, что хлорохинхитозановый нано-микросферный гельоказывает хорошее ингибирующее действие на различные бактерии, но чувствительность при этом имеет различия.
Настоящее изобретение объединяет хлорохин с хитозаном, которые оказывают синергетическое ингибирующее действие на различные вагинальные патогенные микроорганизмы. Лекарственное средство по настоящему изобретению может убивать или ингибировать действие множества вагинальных патогенных микроорганизмов, таких как, золотистый стафилококк (SA), синегнойная палочка, бета-гемолитический стрептококк (ST), кандида альбиканс (CA), уреаплазма уреалитикум (Uu), влагалищная трихомонада, а также бактериоды фрагилис, вирус простого герпеса 2 типа (HSV-2). Кроме того, лекарственное средство по настоящему изобретению может ингибировать адгезию патогенов к эпителиальным клеткам влагалища хозяина, а также предотвращать и лечить различные вагиниты, такие как вагинит кандида альбиканс, трихомонадный вагинит, бактериальный вагиноз, генитальный герпес и др. инфекции наружных половых органов.
Пример 10. Предварительные результаты клинических исследований.
В исследовании по использованию хлорохинхитозановых нано-микросфер участвовали 10 женщин с вагинитом, вызванным кандидозной инфекцией. В ходе лечения выяснилось, что никаких побочных эффектов и отрицательных реакций зафиксировано не было. После 6 месяцев наблюдения также не было обнаружено никаких побочных эффектов и отрицательных реакций, к тому же, суммарный эффективный показатель в группе, получавшей хлорохинхитозан, был значительно выше, чем в группе, получавшей только хлорохин, на 30%.
Настоящее изобретение применялось для лечения 30 случаев бородавок, вызванных ВПЧ-инфекцией. После 2-3 недель лечения было обнаружено, что в 30 случаях у больных бородавки отпадали естественным образом без каких-либо побочных реакций.
Хлорохиновые нано-микросферы по данному изобретению имеют хороший эффект в лечении вирусного вагинита, остроконечной кондиломы, бактериального вагиноза, грибкового вагинита или трихомонадного вагинита и др. инфекций наружных половых органов, а также плоских бородавок, бородавок, вызванных ВПЧ-инфекцией в негенитальных областях и др. кожных инфекций.
Очевидно, что вышеописанные примеры реализации настоящего изобретения являются лишь пояснением к настоящему изобретению и не ограничивают способы его реализации. Специалисты в данной области могут сделать свои модификации на основе приведенных выше описаний. В данном случае нет необходимости и нет возможности подсчитать все способы реализации. Как правило, любые модификации, равноценные замены и улучшения, сделанные в рамках основной идеи и принципов настоящего изобретения, должны быть включены в область защиты правового требования настоящего изобретения.