Исследование резистентности молочнокислых бактерий к низкотемпературной обработке

УДК 664

С. В. Китаевская

ИССЛЕДОВАНИЕ РЕЗИСТЕНТНОСТИ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ К НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ ОБРАБОТКЕ

Ключевые слова: молочнокислые бактерии, замороженные тестовые полуфабрикаты, хлебобулочные изделия.

Обоснованы перспективные направления применения криорезистентных микроорганизмов для повышения качества хлебобулочных изделий на основе замороженных тестовых полуфабрикатов. Изучена устойчивость молочнокислых бактерий к низкотемпературной обработке. Выявлены перспективные штаммы для применения их в качестве стартовых культур в криотехнологии хлебобулочных изделий.

Keywords: lactic acid bacteria, frozen dough, bread.

Justified promising application areas of cryoresistance microorganisms to improve the quality of bakery products on the basis offrozen dough products. Studied resistance of lactic acid bacteria for low temperature processing. Identified promising strains for use as starter cultures in the production of bakery products.

Введение

В последние десятилетия мировая пищевая индустрия интенсивно использует достижения криогенных технологий, позволяющих получать полуфабрикаты, а также готовую продукцию, сохраняющие свои качественные характеристики в течение длительного периода хранения.

В настоящее время данная технология получает все большее распространение и используется при производстве обычных и специальных сортов пшеничного и ржано-пшеничного хлеба, пиццы, слоеных изделий, сдобы и т. п.

Исследователи выделяют две основные проблемы при длительном хранении теста в замороженном состоянии: ослабление структуры теста, приводящее к низкому объему хлеба и грубой структуре его мякиша, а также снижение бродильной активности микрофлоры теста, проявляющееся в длительном его созревании при расстойке [1-5].

Многие работы в области производства хлебобулочных изделий на основе замороженных полуфабрикатов посвящены изучению

криорезистентных свойств различных штаммов дрожжей [2,3,6]. Однако в научно-технической литературе отсутствуют данные о воздействии процессов замораживания, хранения и дефростации тестовых полуфабрикатов на жизнеспособность клеток молочнокислых бактерий. Как известно, качество ржаных и ржано-пшеничных сортов хлеба обусловливает совместная жизнедеятельность дрожжей и молочнокислых бактерий.

В связи с вышеизложенным исследование криорезистентных свойств молочнокислых бактерий, а также поиск штаммов, устойчивых к низкотемпературной обработке, является важной производственной задачей.

На сегодняшний день проводятся исследования по селекции активных рас дрожжей и молочнокислых дрожжей, применяемых в криогенной технологии хлеба и хлебобулочных изделий. Изучение физиологических и биохимических особенностей данных микроорганизмов создают предпосылки для организации отдельных этапов технологического

процесса, направленных на улучшение качества и расширение ассортимента продукции.

С целью получения биопрепаратов высокой физиологической и биохимической активности для криогенной технологии хлеба необходимо изучение основных стрессовых воздействий на микроорганизмы, влияющих на их выживаемость -процессов замораживания, хранения и последующей дефростации.

Целью настоящей работы явилось изучение изменения качественного и количественного состава молочнокислой микрофлоры при

низкотемпературной обработке.

Материалы и методы исследования

Объектами исследования служили тестовые ржано-пшеничные полуфабрикаты, а также культуры молочнокислых бактерий р. Lactobacterium: Lmb. casei, Lmb. plantarum, Lmb. bavaricus, Lbm. acidophilum и Lmb. fermentum, выделенные из природных источников, микрофлора которых сформирована естественным путем [7].

Замораживание тестовых полуфабрикатов проводили в диапазоне температур, широко применяемого в практике хлебопечения - от минус 10 до минус 30 оС.

С целью получения посевного материала микроорганизмы культивировали на жидкой среде MRS. Посевы культивировали при 35 оС до достижения клеток середины экспоненциальной фазы роста. Время достижения клеток середины экспоненциальной фазы для каждого штамма микроорганизма устанавливали экспериментальным путем. Далее отделяли клетки от культуральной жидкости центрифугированием при 6000 g в течение 20 мин. Бактериальную массу отмывали от среды физиологическим раствором (0,8 %). Замораживание культур осуществляли при температуре минус 18 оС и хранили в замороженном виде в течение 2, 24 часов или 1 недели в зависимости от целей эксперимента.

По истечении срока хранения экспериментальные образцы подвергали дефростации при комнатной температуре (20оС).

Подсчет числа жизнеспособных биохимически активных клеток микроорганизмов после замораживания, хранения и последующей дефростации осуществляли макрокультуральным методом (при исследовании тестовых полуфабрикатов) и методом микрокультурально-ингибиторного анализа (при анализе суспензий молочнокислых бактерий).

Одним из макрокультуральных методов анализа числа живых клеток является метод высева на плотные среды с последующим подсчетом числа колониеобразующих единиц (чашечный метод Коха). Разведения готовили в 0,8 %-ном водном растворе NaCl. Из соответствующих разведений проводили посев на агаризованную среду MRS глубинным способом в чашки Петри в трех повторностях. Посевы инкубировали в термостате при 35 оС в течение 3-5 суток.

Сущность микрокультурально-ингибиторного метода заключается в ингибировании клеточного деления антибиотиком - налидиксовой кислотой, которая является ДНК-гиразой. Данная кислота вызывает отрицательное суперспиральное

закручивание двойной спиральной молекулы ДНК, блокируя ее репликацию, что приводит к образованию вытянутых форм бактерий.

К исследуемой культуре клеток в жидкой среде вносили раствор налидиксовой кислоты и инкубировали при оптимальной температуре (35 оС) в течение 24 часов. Далее при микроскопировании в иммерсионной системе проводили подсчет удлиненных и увеличенных в объеме живых клеток молочнокислых бактерий. Подсчет производили в пяти полях зрения.

Результаты исследований и обсуждение

чувствительными к воздействию замораживания оказывались клетки данных родов молочнокислых бактерий, и, напротив, для р. Lactobacillus - чем ниже была температура замораживания среды, тем выше сохранялась их жизнеспособность.

Таким образом, показано, что, используя отрицательные температуры можно регулировать состав молочнокислых бактерий в полуфабрикатах ржано-пшеничного хлеба, увеличивая процентное содержание клеток р. Lactobacillus - активных участников брожения полуфабрикатов, и снижая количество клеток р. Pediococcus и р. Leuconostoc -загрязнителей хлебопекарного производства.

На рис. 1 представлены данные об изменении видового состава молочнокислых бактерий р. Lactobacillus при температуре замораживания ржано-пшеничного теста минус 30оС. а

L. plantarum

L. delbruckii ML. fermenti

L. brevis UL.buchneri

О степени влияния отрицательных температур на жизнеспособность молочнокислых бактерий ржано-пшеничного теста судили по проценту выживаемости клеток после снятия низкотемпературного воздействия на тестовые заготовки. Полученные результаты, характеризующие изменение количества

жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий родов Lactobacillus, Pediococcus и Leuconostoc в ржано-пшеничном тесте, представлены в табл.1.

Таблица 1 - Влияние температуры замораживания на жизнеспособность клеток молочнокислых бактерий

Температура, ОС Количество жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий, %

p.Lactobacillus p.Pediococcus p.Leuconostoc

-10 56,9 56,1 54,7

-15 68,2 44,9 49,0

-20 80,8 37,3 46,2

-25 83,9 29,9 38,5

-30 87,7 20,8 32,1

Установлено, что низкотемпературная обработка значительно влияет на жизнеспособность клеток р. Pediococcus и р. Leuconostoc в тестовых заготовках. Следует отметить, что чем ниже была температура замораживания, тем более

Рис. 1 - Соотношение жизнеспособных клеток р. Lactobacillus в тесте: а) до замораживания б) после замораживания

Установлено, что наименее

чувствительными к низкотемпературному воздействию оказались клетки L. plantarum и L. fermenti, в отличие от клеток L. brevis, L. delbruckii и L. buchneri.

Подготовка клеток микроорганизмов к замораживанию должна проводиться с учетом их физиологического состояния. Криорезистентность микроорганизмов может варьировать в зависимости от стадии их развития в результате изменения свойств клеток, связанных с метаболизмом, структурной организацией и составом клеточных мембран [8,10].

Установлено, что клетки, находящиеся в стационарной фазе роста, более устойчивы к повреждающему действию низкотемпературной обработки, чем клетки, находящиеся в экспоненциальной фазе роста. Это объясняется тем, что в период экспоненциального роста в клетках активируются процессы метаболизма: превалируют клетки, редуплицирующие свою ДНК, увеличивается количество РНК, интенсифицируется синтез белка, активируется транспорт веществ через

б

мембраны. В этот период снижается модуль упругости клеточных стенок, повышается проницаемость мембран. Более высокая криоустойчивость бактерий в стационарной фазе роста объясняется снижением интенсивности обменных процессов, функциональной активности клеток.

Большой интерес представляет изучение влияния отрицательных температур на культуры молочнокислых бактерий в период их большей чувствительности к действию неблагоприятных факторов. Исследование влияния криовоздействия проводили на культурах, достигших середины экспоненциальной фазы развития: клетки отбирали через 4-6 часов культивирования в зависимости от вида микроорганизмов.

Исследуемые образцы в виде суспензии клеток молочнокислых бактерий с титром клеток в диапазоне 2,0-109-2,5-109 КОЕ/см3 подвергали замораживанию при температуре минус 18-20 оС. Степень влияния отрицательных температур на физиологическую активность молочнокислых бактерий оценивали по проценту выживаемости клеток после снятия низкотемпературного воздействия. Результаты исследования представлены на рис. 2.

Рис. 2 - Влияние процессов замораживания, хранения и дефростации на выживаемость клеток молочнокислых бактерий

Полученные результаты свидетельствуют о неустойчивости клеток молочнокислых бактерий к низким температурам. Согласно литературным данным, основными повреждениями, приводящими к гибели молочнокислых бактерий при замораживании, являются повреждение мембран и стенок бактерий, а также нарушение биосинтетических процессов в клетках [9,10].

Установлено, что повреждение клеток и инактивация части микробной популяции происходит не только во время замораживания, но и в процессе хранения. При хранении замороженных образцов в течение 2 часов выживаемость клеток составляет 2565 %, в течение 24 часов - 15-40 %, в течение 1 недели - 10-20 % в зависимости от вида и штамма молочнокислых бактерий.

Возможным объяснением этого является наличие ассоциированных с клетками экзополимеров -

белков и полисахаридов - синтезируемых микроорганизмами на всех стадиях развития и используемых в стрессовых условиях в качестве внутреннего источника резервного питания для поддержания жизнедеятельности. Кроме того, данные научно-технической литературы

свидетельствуют о том, что экзополимеры, в частности полисахариды, обладают

криопротекторным действием и непосредственно через физические и химические взаимодействия с клеточными структурами и макромолекулами защищают клетки от повреждающего воздействия отрицательных температур [8-11]. С течением времени запасы экзополимеров в среде постепенно исчерпываются, что ведет к инактивации части микробной популяции.

Таким образом, с увеличением времени хранения бактериальных концентратов в замороженном состоянии количество

физиологически активных клеток бактерий постепенно снижается. Следует заметить, что вид молочнокислых бактерий L. casei показал более высокую криорезистентность по сравнению с видами L. bavaricus, L. acidophilus, L. fermenti и L. plantarum.

Изучение влияния низкотемпературного воздействия на клетки молочнокислых бактерий показало, что данные микроорганизмы являются крайне чувствительными к такому стрессовому воздействию.

В связи с этим исследования в области низких температур необходимо направить на поиск новых или усовершенствование уже существующих методов замораживания, хранения и последующей дефростации как культур молочнокислых бактерий, так и полуфабрикатов хлебопекарного производства.

Литература

1. Лабутина, Н.В. Технология производства хлебобулочных изделий из замороженных полуфабрикатов. - Смоленск: Универсум, 2004. -236 с.

2. Китаевская, C.B. Биотехнологические основы использования криорезистентных микро-организмов в хлебопечении/ С.В. Китаевская, О.А. Решетник. -Казань: Изд-во КГТУ, 2006. - 268 с.

3. Ribotta, P.D. Frozen dough in Bakery Products: Science and Technology, edited by Y.H. Hui. -Ames (USA) Blackwell Publishing/ P.D. Ribotta, A.E. Leon, M.C. Anon. -2006. -P. 381-390.

4. Selomulyo, V.O. Frozen bread dough: Effect of freezing storage and dough improvers/V.O. Selomulyo, W. Zhou//Journal of Cereal Science. -2007. -45. -P. 1-17.

5. Китаевская, C.B. Применение ферментных препаратов в технологии хлебобулочных изделий на основе замороженных полуфабрикатов / С.В. Китаевская, О.А. Решетник //Вестник Казанского технологического университета. - 2013. - №24. - С. 91-94.

6. Пономарева О. И. Штамм хлебопекарных дрожжей ЛВ-

3, устойчивый к воздействию низкой температуры /О. И. Пономарева [и др.] // Хлебопечение России. - 2005. - №

4. - С. 14-16

7. Китаевская, C.B. Современные тенденции отбора и идентификации пробиотических штаммов молочнокислых бактерий / С.В. Китаевская //Вестник

Казанского технологического университета. - 2012. - №17. - С. 184-188.

8. Беккер М. Е. Анабиоз микроорганизмов / М. Е. Беккер, Б. Э. Дамберг, А. И. Рапопорт. - Рига: Зинанте, 1981. - 253 с.

9. Цуцаева А. А. Криобиология и биотехнология. - Киев: Наука думка, 1987. - 216 с.

10. Опарин Ю. Г. Повреждение и защита биомакромолекул при замораживании и лиофилизации // Биотехнология. - 1996. - № 7. - С. 3-13.

11. Zhao G. Effect of protective agents, freezing temperature, rehydration media on viability of malolactic bacteria subjected to freeze-drying / G. Zhao, G. Zhang // J. of Appl. Microbiol. - 2005. - V. 99. - № 2. - Р. 333-340.

© С. В. Китаевская - к.т.н., доцент кафедры ТПП КНИТУ, kitaevskayas@mail.ru.

© S. V. Kitaevskaya, Ph.D., assistant professor. Dep technology of food products of the Institute of Food Production and Biotechnology KNRTU, kitaevskayas@mail.ru.