СПОСОБЫ ОЧИСТКИ ОДНОДОМЕННЫХ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИХ МОЛЕКУЛ

1. Способ выделения или очистки однодоменной антигенсвязывающей (SDAB) молекулы, которая содержит одну или более молекул нанотела, из смеси, содержащей SDAB молекулу и одно или более загрязняющих веществ, включающий:
приведение смеси в контакт с носителем на основе белка А или катионообменным носителем в условиях, которые позволяют SDAB молекуле связываться с носителем или абсорбироваться на носителе;
удаление одного или более загрязняющих веществ и
селективное элюирование SDAB молекулы с носителя,
где указанная SDAB молекула не имеет комплементарного вариабельного домена антитела или Fc-области иммуноглобулина.
2. Способ по п.1, где стадия удаления одного или более загрязняющих веществ включает промывку связавшегося носителя в условиях, когда SDAB молекула остается связанной с носителем.
3. Способ по п.1, где смесь приводят в контакт с носителем на основе белка А.
4. Способ по п.1, где стадия удаления одного или более загрязняющих веществ включает промывку связавшегося носителя по меньшей мере одним буфером для промывки белка А, где указанный буфер для промывки белка А содержит от примерно 100 до примерно 175 мМ NaCl и от примерно 40 до примерно 60 мМ Трис при рН в диапазоне от примерно от 7 до 7,5.
5. Способ по п.1, где стадия селективного элюирования SDAB молекулы с носителя включает элюирование адсорбированной SDAB молекулы по меньшей мере одним белок А-элюирующим буфером, где указанный белок А-элюирующий буфер содержит от примерно 5 до примерно 50 мМ NaCl и от примерно 5 мМ до примерно 100 мМ глицина при рН 4,0 или меньше.
6. Способ по п.1, дополнительно включающий одну или более из: гидроксиапатитной хроматографии, катионообменной хроматографии, аффинной хроматографии, эксклюзионной хроматографии, хроматографии гидрофобного взаимодействия, металл-аффинной хроматографии, диафильтрации, ультрафильтрации, вирусной инактивации или фильтрации для удаления вирусов.
7. Способ по п.1, где загрязняющие вещества в смеси содержат один или более из высокомолекулярных белковых агрегатов, белков клетки-хозяина, ДНК или вымытого белка А.
8. Способ по п.1, где SDAB молекула очищена по меньшей мере до 90% чистоты или выше.
9. Способ по п.1, где носитель на основе белка А содержит смолу с иммобилизованным рекомбинантным или выделенным полноразмерным стафилококковым белком A (SpA) или его функциональным вариантом.
10. Способ по п.9, где полноразмерный SpA содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11, представленную на фиг.4А, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную ей.
11. Способ по п.9, где функциональный вариант SpA содержит по меньшей мере домен В SpA или вариант домена В, имеющий один или более замещенных аспарагиновых остатков.
12. Способ по п.11, где функциональный вариант SpA содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, представленную на фиг.4В, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную ей.
13. Способ по п.1, где смесь приводят в контакт с катионообменным носителем.
14. Способ по п.13, включающий:
приведение смеси, содержащей SDAB молекулу и одно или более загрязняющих веществ, в контакт с катионообменной (СЕХ) смолой, где СЕХ смола демонстрирует емкость по меньшей мере примерно 40 г/л;
обеспечение протекания SDAB молекулы через носитель, промывание носителя по меньшей мере одним буфером для промывки катионообменника и
элюирование SDAB молекулы буфером для элюции.
15. Способ по п.13, где проводимость среды для кондиционирования (СМ), используемой для загрузки колонки, составляет от примерно 12 до 9 мСм/см, и рН в условиях загрузки корректируют до величины, равной или меньшей примерно 4,5.
16. Способ по п.13, где буфер для элюции соответствует примерно 50 мМ хлорида натрия или меньше и имеет рН от примерно 5,5 до 7,2.
17. Способ по п.13, дополнительно включающий приведение смеси в контакт с гидроксиапатитной смолой и селективное элюирование SDAB молекулы с гидроксиапатитной смолы.
18. Способ по п.17, включающий предварительную обработку смеси уравновешивающим буфером и обеспечение протекания предварительно обработанной смеси через гидроксиапатитную смолу.
19. Способ по п.18, где стадия приведения смеси в контакт с гидроксиапатитной смолой и стадии элюции осуществляют в буферных растворах, содержащих от примерно 1 до 20 мМ фосфата натрия и от примерно 0,2 до 2,5 М хлорида натрия при рН от примерно 6,4 до 7,6.
20. Способ по п.18, где уравновешивающий буфер содержит от примерно 1 до 20 мМ фосфата натрия, от примерно 0,01 до 2,0 М хлорида натрия, от примерно 0 до 200 мМ аргинина, от примерно 0 до 200 мМ HEPES при рН от примерно 6,2 до 8,0.
21. Способ по п.1, где очищенная SDAB молекула содержит менее 10% высокомолекулярных агрегатов.
22. Способ по п.1, где SDAB молекула представляет собой трехвалентную биспецифическую молекулу, состоящую из одноцепочечного полипептидного слияния двух верблюжьих вариабельных районов, которые связываются с TNFα, и одного верблюжьего вариабельного района, который связывается с HSA.
23. Способ по п.1, где SDAB молекула содержит по меньшей мере одну SDAB молекулу, которая связывается с TNFα, и содержит три CDR, имеющих аминокислотную последовательность: SEQ ID NO:2 (DYWMY (CDR1)), SEQ ID NO:3 (EINTNGLITKYPDSVKG (CDR2)) и SEQ ID NO:4 (SPSGFN (CDR3)) или имеющих CDR, которая отличается менее чем 2 консервативными аминокислотными заменами от одной из указанных CDR.
24. Способ по п.1, где SDAB молекула содержит по меньшей мере одну SDAB молекулу, которая связывается с TNFα и содержит вариабельную область, имеющую аминокислотную последовательность из аминокислот примерно от 1 до 115 из SEQ ID NO:1, представленной на фиг.2, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, представленной на фиг.2.
25. Способ по п.24, где SDAB молекула содержит по меньшей мере одну SDAB молекулу, которая связывается с HSA и содержит три CDR, имеющих аминокислотную последовательность: SFGMS (CDR1; SEQ ID NO:5), SISGSGSDTLYADSVKG (CDR2; SEQ ID NO:6) и/или GGSLSR (CDR3; SEQ ID NO:7), или имеющих CDR, которая отличается менее чем 2 консервативными аминокислотными заменами от одной из указанных CDR.
26. Способ по п.25, где SDAB молекула содержит по меньшей мере одну SDAB молекулу, которая связывается с HSA и содержит вариабельную область, имеющую аминокислотную последовательность из аминокислот примерно от 125 до 239 из SEQ ID NO:1, представленной на фиг.2, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, представленной на фиг.2.
27. Способ или процесс получения рекомбинантной однодоменной антигенсвязывающей (SDAB) молекулы, которая содержит одну или более молекул нанотела, при котором:
берут клетку-хозяина млекопитающего, содержащую нуклеиновую кислоту, которая кодирует рекомбинантную SDAB молекулу;
поддерживают клетку-хозяина в условиях, при которых экспрессируется рекомбинантная SDAB молекула;
получают смесь рекомбинантной SDAB молекулы и одного или более загрязняющих веществ;
очищают или выделяют рекомбинантную SDAB молекулу из указанной смеси с использованием хроматографии на основе белка А или катионообменной хроматографии,
где указанная стадия очистки или выделения включает приведение смеси в контакт с носителем в условиях, которые позволяют SDAB молекуле связываться или абсорбироваться носителем;
удаление одного или более загрязняющих веществ и
селективное элюирование SDAB молекулы с носителя, посредством этого получение препарата элюированной SDAB молекулы,
где указанная SDAB молекула не имеет комплементарного вариабельного домена антитела или Fc-области иммуноглобулина.
28. Способ по п.27, при котором препарат элюированной SDAB молекулы дополнительно подвергают одной или более стадиям хроматографии, выбранной из гидроксиапатитной хроматографии, аффинной хроматографии, хроматографии эксклюзионной, хроматографии гидрофобного взаимодействия, металл-аффинной хроматографии, диафильтрации, ультрафильтрации или фильтрации для удаления вирусов.
29. Способ по п.27, дополнительно включающий приготовление препарата рекомбинантной SDAB молекулы в виде фармацевтической композиции.
30. Способ по п.1, дополнительно включающий концентрирование элюированной SDAB молекулы до заранее выбранного целевого объема.
31. Способ по п.30, где стадию концентрирования осуществляют путем выполнения стадии ультрафильтрации/диафильтрации в присутствии гистидинового буфера или Трис-буфера.
32. Способ по любому из пп.1-31, где SDAB молекулу концентрируют по меньшей мере до примерно 80 г/л - 350 г/л.
33. SDAB молекула, очищенная способом по любому из пп.1-32.
34. Фармацевтическая композиция, содержащая SDAB молекулу по п.33.
35. Способ лечения или предупреждения заболевания у субъекта, включающий введение субъекту SDAB молекулы по п.33 в количестве, эффективном для лечения и предупреждения указанного заболевания.