ПРИМЕНЕНИЕ ХЕМОКИНА CXCL6 В ПРЕДОТВРАЩЕНИИ ИЛИ ВОССТАНОВЛЕНИИ ХРЯЩЕВЫХ ДЕФЕКТОВ
APPLICATION OF CXCL6 CHEMOKINE DURING PREVENTION OR ELIMINATION OF CARTILAGE DEFECTS

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к формированию хряща и кости in vitro и in vivo, в частности к восстановлению хряща или костно-хрящевых дефектов или к формированию кости или хряща в косметической хирургии. Конкретнее, оно относится к восстановлению и предотвращению суставных дефектов, таких, которые возникают при остеоартрите. Изобретение, кроме того, относится к модулированию дифференциации клеток-предшественников в хондрогенные клетки.
Описание уровня техники
Хемокины представляют собой группу небольших (приблизительно от 8 до 14 кДа), преимущественно основных, структурно связных молекул, которые регулируют клеточную транспортировку различных типов лейкоцитов посредством взаимодействий с субпопуляцией 7-трансмембранных, соединенных с белком G рецепторами. Хемокины играют фундаментальные роли в развитии, гомеостазе и функции иммунной системы и оказывают эффекты на клетки центральной нервной системы, а также на эндотелиальные клетки, которые участвуют в ангиогенезе или ангиостазе. Хемокины делятся на 2 основных подсемейства, СХС и СС, на основании расположения первых двух из четырех консервативных цистеиновых остатков, которые встречаются в белковых последовательностях хемокина; 2 цистеина отделены одной аминокислотой в хемокинах СХС и располагаются по соседству в хемокинах СС. Хемокины СХС, кроме того, подразделяются на типы ELR и не-ELR на основании присутствия или отсутствия последовательности glu-leu-arg (мотив ELR), находящейся по соседству, и N-концевой по отношению к мотиву СХС. Новая система классификации, которая группирует различные хемокины, была предложена Zlotnik and Yoshie (2000, Immunity 12, 121-127) и представлена в таблице 1.
Таблица 1Классификация хемокинов СХС и рецепторов хемокинов (из приведенной выше публикации Zlotnik и Yoshie)
Семейство хемокинов СХС
Систематическое название
Хромосома человека
Лиганд человека
Мышиный лиганд
Рецептор(ы) хемокинов
CXCL1
4q12-q13
GROальфа/M GSA-альфа
GRO/KC?
CXCR2>CXCR1
CXCL2
4q12-q13
GROбета/MG SA-бета
GRO/KC?
CXCR2
CXCL3
4q12-q13
GROгамма/MGSA-гамма
GRO/KC?
CXCR2
CXCL4
4q12-q13
PF4
PF4
Неизвестен
CXCL5
4q12-q13
ENA-78
LIX?
CXCR2
CXCL6
4q12-q13
GCP-2
CKa-3
CXCR1, CXCR2
CXCL7
4q12-q13
NAP-2
Неизвестен
CXCR2
CXCL8
4q12-q13
IL-8
Неизвестен
CXCR1, CXCR2
CXCL9
4q21.21
Mig
Mig
CXCR3
CXCL10
4q21.21
IP-10
IP-10
CXCR3
CXCL11
4q21.21
I-TAC
Неизвестен
CXCR3
CXCL12
10q11.1
SDF-1альфа/бета
SDF-1
CXCR4
CXCL13
4q21
BLC/BCA-1
BLC/BCA-1
CXCR5
CXCL14
Неизвестен
BRAK/стволовой хемокин
BRAK
Неизвестен
CXCL15
Неизвестен
Неизвестен
Легочный хемокин
Неизвестен
Человеческий хемокин GCP 2 был первоначально обнаружен как белок, который экспрессировался в небольших количествах вместе с интерлейкином 8 (IL-8) стимулированными клетками остеосаркомы человека (Proost et al. (1993) Biochemistry 32, 10170-10177). Человеческий ген для GCP-2 кодирует белок из 114 аминокислот.
GCP-2, ранее именовавшийся “SCYB6”, а в соответствии с самой последней терминологией “CXCL6”, проявляет самую сильную аналогию последовательности кодирующей и не кодирующей последовательности с CXCL5 (SCYB5/ENA-78 (аттрактант 78 нейтрофилов, полученный из эпителиальных клеток)).
У людей и коров белок CXCL6 встречается в ряде усеченных на N-конце форм, которые, как представляется, не имеют другой активности при стандартном анализе миграции in vitro (публикация Proost et al. (1993), приведенная выше). До 28 расщепленных на N-конце и/или С-конце вариантов мышиного CXCL6 были выделены из фибробластов и эпителиальных клеток (Wuyts et al. (1999) J. Immunol. 163, 6155-6163; Van Damme et al. (1997) J Leukoc Biol 6, 563-569). Эти усеченные на N-конце варианты мышиного CXCL6 проявляют резкие различия специфической хемотаксической активности в отношении и человеческих, и мышиных нейтрофилов in vitro и in vivo. Сообщается, что CXCL6 представляет собой специфический аттрактант гранулоцитов, не оказывающий хемотаксический эффект на моноциты (приведенная выше публикация Van Damme et al. (1997).
Как указывает его название, CXCL6 представляет собой хемокин СХС. Он относится к подгруппе хемокинов, активирующих нейтрофилы, действующих посредством CXCR1, которые характеризуются расположенной на N-конце последовательностью Glu-Leu-Arg (мотив ELR). Вместе с IL-8 CXCL6 представляет собой единственный содержащий ELR хемокин, который имеет основную аминокислоту в шестом положении после второго цистеина мотива CXC. Wolf et al. ((1998) Eur. J. Immunol. 28, 164-170) показали, что эта основная аминокислота представляет собой важный определяющий фактор для активации CXCR1. Wuyts et al. ((1997), приведенная выше публикация), кроме того, продемонстрировали, что CXCL6 связывается с рецепторами и CXCR1, и CXCR2.
Хемокины в целом были связаны с разрушением хряща в контексте воспалительной реакции, наблюдаемой при ревматоидном артрите. Borzi et al. ((1999) Febs Lett. 455, 235-242) и Pulsatelli et al. ((1999) J. Rheumatol. 26, 1992-2001) описывают экспрессию IL-8, Gro-альфа, МСР-1, RANTES, MIP-1альфа и MIP-1бета в хондроцитах, полученных у здоровых лиц, у пациентов с остеоартритом (ОА) и ревматоидным артритом (RA). Borzi et al. ((2002) Arthritis Rheum. 46, 3201-3211) свидетельствуют о существовании нового катаболического пути, запускаемого хемокинами и их рецепторами, и который ведет к разрушению компонентов матрицы хряща. Стимулирующая регуляция хемокинов в соответствии с данными этих авторов связана с патогенезом и персистенцией заболевания суставов. Votta et al. ((2000) J Cell Physiol. 183, 196-207) свидетельствуют о том, что хемокин СС Скбета 8 играет роль в вовлечении предшественников остеокластов в участки резорбции кости. Остеобласты, с другой стороны, не реагируют на этот хемокин. Alaaeddine et al. ((2001) Arthritis Rheum. 44, 1633-1643) исследовали экспрессию хемокина RANTES (члена семейства СС) и его рецепторов в здоровом хряще и при ОА и приписывали патогенетическую активность этому хемокину. Kanbe et al. ((2002) Arthritis Rheum. 46, 130-137) свидетельствовали о роли хемокина СХС SDF-1 в опосредованном синовиальными клетками разрушении матрицы хряща при RA и OA. Wuyts et al. ((2003) Lab Invest. 83, 23-34) продемонстрировали, что воспалительные цитокины, такие как IL-1, индуцируют экспрессию CXCL6 в хондроцитах, хотя этот уровень экспрессии примерно в 100 раз меньше, чем IL-8.
Silvestri et al. ((2003) Rheumаtology 42, 14-18) описывают экспрессию хемокиновых рецепторов, но не самих хемокинов, при воспалительном артрите и остеоартрите. Указывается, что активность хемокинов склоняет баланс хрящевого гомеостаза в сторону разрушения. ЕР 08044865 предлагает применение CXCL6 в качестве лекарственного средства при воспалительных состояниях, тогда как патент США №6410268 указывает на возможное применение антагонистов GCP-2 при лечении воспалительных заболеваний, таких как RA. В последнем документе, кроме того, предлагается применение GCP-2 для стимуляции заживления ран при лечении фибротических заболеваний, таких как ОА.
Недавно была установлена роль хемокинов в миграции типов клеток, которые не связаны с лейкоцитами. Как указано выше, был описан хемотаксический эффект Скбета 8 на предшественники остеокластов (Votta et al. (2000) J Cell Physiol. 183, 196-207). Doitsidou et al. ((2003) Cell 11, 647-59), и Wright et al. ((2002) J Exp Med. 195, 1145-1154) продемонстрировали роль SDF-1 и его рецептора CXCR4 в миграции соответственно примордиальных зародышевых клеток и гематопоэтических стволовых клеток. King et al. ((2000) Blood 97, 1534-1542 и (2001) J. Immunol 164, 3774-3782) описывают резкое увеличение гематопоэтической активности после амино-концевого усечения CXCL2 (GroBeta) и продемонстрировали, что этот усеченный вариант может мобилизовать гематопоэтические стволовые клетки. В патенте США №6410268 предполагается возможная роль в мобилизации стволовых клеток при использовании CXCL6, в частности стволовых клеток костного мозга, которые можно применять в лечении рака и лейкоза.
Краткое описание сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к вовлечению хемокина CXCL6 в формирование кости или хряща in vitro или in vivo, например, в косметической хирургии и, в частности, к восстановлению или предотвращению хрящевых или костно-хрящевых дефектов, конкретнее дефектов суставной поверхности. Более конкретно, оно относится к применению CXCL6 и клеточных популяций с хондрогенными свойствами, которые экспрессируют хемокин CXCL6 при формировании in vitro или in vivo хряща или кости, например, в косметической хирургии или при лечении дефектов суставных поверхностей, таких как остеоартрит.
Настоящее изобретение основано на данных о том, что дифференциация стволовых клеток в клетки, формирующие хрящ, резко снижается или блокируется антителами против хемокинового рецептора CXCR1 и, в меньшей степени, антителами против хемокинового рецептора CXCR2, и, в частности, блокированием и CXCR1, и CXCR2, указывая на то, что хемокины и один или несколько путей передачи сигналов хемокинов участвуют в дифференциации в клетки, продуцирующие хрящ или кость. Кроме того, было обнаружено, что клеточные популяции, которые имеют потенциал формирования устойчивого хряща, воспроизводимо экспрессируют хемокин CXCL6 как положительный маркер. Еще одни обнаруженные данные настоящего изобретения заключаются в том, что CXCL6 участвует в восстановлении костно-хрящевых дефектов. Таким образом, в отличие от участия хемокинов в разрушении хряща, как описано в предшествующем уровне техники, настоящее изобретение относится к применению CXCL6 или клеток, экспрессирующих CXCL6, в формировании хряща или кости in vitro или in vivo и в восстановлении хрящевых или костно-хрящевых дефектов.
В соответствии с настоящим изобретением применение хемокина CXCL6 описано при лечении или предотвращении хрящевого или костно-хрящевого дефекта, дефекта тканей, связанных с суставом, и дефектов других тканей волоконно-хрящевой природы, таких как межпозвонковые диски, а также при формировании кости или хряща при других показаниях, например, косметической хирургии. Конкретнее, настоящее изобретение относится к стимуляции формирования гиалинового хряща (и подлежащей кости) при хрящевом или костно-хрящевом дефекте, используя CXCL6.
Первый аспект настоящего изобретения описывает CXCL6 для получения лекарственного средства для содействия формированию кости или хряща in vivo или in vitro. В частности, настоящее изобретение описывает CXCL6 для предотвращения или лечения хрящевого или костно-хрящевого дефекта. Источник CXCL6 в соответствии с этим аспектом изобретения может быть или натуральным, рекомбинантным, или синтетическим. Соответственно настоящее изобретение описывает композицию, включающую CXCL6, для применения при содействии формированию кости или хряща in vivo или in vitro. В частности, описана композиция, включающая CXCL6 для предотвращения или лечения хрящевого или костно-хрящевого дефекта. В соответствии с определенным вариантом осуществления этого аспекта изобретения такая композиция, включающая CXCL6, может, кроме того, включать хондрогенные клетки, т.е. клетки, способные продуцировать устойчивый гиалиновый хрящ, и/или клетки-предшественники хондрогенных клеток. Альтернативно, CXCL6 вводится посредством генной терапии.
В соответствии со вторым аспектом изобретения описывается, что применение клеток, эспрессирующих CXCL6, конкретнее хондрогенных клеток, эспрессирующих CXCL6, содействует формированию кости и/или хряща in vivo или in vitro. В частности, описывается применение клеток, эспрессирующих CXCL6, конкретнее хондрогенных клеток, эспрессирующих CXCL6, в лечении или предотвращении хрящевого или костно-хрящевого дефекта. Соответственно настоящее изобретение описывает композицию, включающую клетки, конкретнее хондрогенные клетки, экспрессирующие CXCL6, для применения в качестве лекарственного средства для содействия формирования кости или хряща in vivo, конкретнее для применения в предотвращении и лечении хрящевого или костно-хрящевого дефекта или для получения лекарственного средства для предотвращения или лечения хрящевого или костно-хрящевого дефекта.
В соответствии с частным вариантом осуществления настоящего изобретения хондрогенные клетки, экспрессирующие CXCL6, выделяются из соединительной ткани, конкретнее из синовиальной оболочки.
Альтернативно, в соответствии с другим аспектом изобретения клетки, экспрессирующие CXCL6, получают внесением в подходящие клетки, конкретнее клетки соединительной ткани, инородной ДНК, кодирующей CXCL6, под контролем подходящего промотора.
В соответствии с частным аспектом настоящего изобретения, клетки, экспрессирующие CXCL6, включают в матрицу для применения при стимуляции формирования кости или хряща in vivo или in vitro или в лечении костно-хрящевых дефектов.
Альтернативно, в соответствии с другим аспектом настоящего изобретения фармацевтические композиции, включающие одно или несколько соединений, способных индуцировать эндогенную экспрессию CXCL6 хондрогенными клетками, используются для стимуляции формирования хряща или кости in vivo и, в частности, при лечении или предотвращении хрящевых или костно-хрящевых дефектов.
Настоящее изобретение относится к применению CXCL6 и/или клеток, экспрессирующих CXCL6, или соединений, индуцирующих эндогенную экспрессию CXCL6, необязательно в комбинации с хондрогенными клетками или хондрогенными клетками-предшественниками, для стимуляции формирования кости или хряща in vitro или in vivo или при лечении или предотвращении хрящевых или костно-хрящевых дефектов. В соответствии с частным аспектом настоящего изобретения CXCL6 и/или клетки, экспрессирующие CXCL6 (или дНК), или соединения, индуцирующие эндогенную экспрессию CXCL6, вводятся местно для стимуляции формирования кости или хряща или для лечения хрящевых или костно-хрящевых дефектов, конкретнее дефектов суставной поверхности. В соответствии с другим частным аспектом настоящего изобретения такой дефект суставной поверхности не связан с воспалением, такой как дефект суставной поверхности, наблюдающийся при остеоартрите.
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения экспрессия CXCL6 используется в качестве маркера фенотипической стабильности хондроцитов, т.е. для мониторинга способности клеточной популяции хондроцитов продуцировать устойчивый гиалиновый хрящ in vivo. Таким образом, в соответствии с этим аспектом изобретения, экспрессию CXCL6 можно использовать в качестве маркера для идентификации хондрогенной клеточной популяции, подходящей для применения при стимуляции формирования хряща или кости in vivo или in vitro или при лечении и предотвращении хрящевых дефектов.
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения один или несколько хемокиновых путей используются для модулирования дифференциации клеток-предшественников. Таким образом, изобретение описывает применение лигандов или ингибиторов рецепторов CXCR1 и/или CXCR2 для модуляции дифференциации клеток-предшественников в клетки, продуцирующие хрящ и кость. Конкретнее, в соответствии с настоящим изобретением лиганды каждого или обоих рецепторов CXCR1-2 используются для стимуляции дифференциации в клетки, продуцирующие хрящ, тогда как ингибиторы используются для ингибирования дифференциации в клетки, продуцирующие хрящ.
Конкретный вариант осуществления представляет собой стимуляцию дифференциации хемокином, связывающимся с рецептором CXCR1 (и/или CXCR2). Конкретнее, CXCL6 используется для индукции дифференциации клеток-предшественников в клетки, формирующие хрящ и/или кость. Таким образом, в соответствии с этим вариантом осуществления изобретения CXCL6 используется для стимуляции дифференциации клеток-предшественников in vitro или in vivo и необязательно вводится в костно-хрящевой дефект в комбинации с клетками-предшественниками хондрогенных клеток («хондрогенных клеток-предшественников»).
Изобретение, кроме того, относится к способу индукции или восстановления дифференциации популяции клеток-предшественников в хондроциты in vitro, причем указанный способ включает стадию введения CXCL6 в такую популяцию клеток-предшественников.
Применение CXCL6 показано для поддержания и/или восстановления устойчивой хондрогенной популяции, т.е. популяции, способной продуцировать устойчивый гиалиновый хрящ.
Изобретение также относится к способу выявления соединения или смеси соединений (такого как, например, растительный экстракт) для стимуляции формирования хряща и кости in vivo, причем указанное соединение или смесь соединений модулирует передачу сигналов CXCL6, и указанный способ включает стадии контакта клеточной популяции с перспективным соединением или смесью соединений и определения уровня модифицированной экспрессии CXCL6. Клеточная популяция может представлять собой любой тип клеток, который экспрессирует CXCL6, конкретнее популяция клеток выбрана из группы, состоящей из хондроцитов, предшественников хондроцитов и предков хондроцитов. Необязательно способ включает дополнительную стадию определения одного или нескольких морфологических или молекулярных параметров указанной популяции клеток хондроцитов, предшественников хондроцитов или предков хондроцитов.
Подробное описание изобретения
Используемый в настоящем описании термин «CXCL6» относится к хемокину, также именуемому SCYB6 (6 член подсемейства В малых индуцируемых цитокинов), или GCP-2 (гранулоцитарный хемотаксический белок 2) (№ NP 002984 и Р80162 в Genbank). Он включает и белок полной длины, и модифицированные варианты, такие как усеченные на N-конце и/или С-конце варианты белка при том ограничении, что указанные модифицированные белки сохраняют хемотаксическую активность в отношении клеток, благоприятных для восстановления хряща (и прилегающей кости), таких как хондроциты и клетки-предшественники хондроцитов. Усечения могут представлять собой, но не ограничиваются, усечения натурально встречающихся сплайсинговых вариантов и/или процессированных форм. Возможные N- и/или С-концевые усечения включают усечения, описанные Wuyts et al. ((1999) J. Immunol. 163, 6155-6163). Модификации CXCL6 в соответствии с настоящим изобретением также включают модификации, при которых мотив ELR был модифицирован или подвергнут делеции до уровня, где привлечение лейкоцитов не происходит, и те модифицированные варианты, в которых была модифицирована основная аминокислота в положении 6 после второго цистеина мотива СХС. Используемый в настоящем описании термин «CXCL6» относится к натуральному (например, полученному из надосадочной жидкости клеток, которые естественно экспрессируют CXCL6), рекомбинантному и синтетическому вариантам хемокина. Предпочтительным вариантом осуществления CXCL6 представляет собой CXCL6 из 75 аминокислот, как описано в публикации Wuyts et al. ((1997), как указано выше). CXCL6, указанный в настоящем изобретении, может, кроме того, включать продукты слияния CXCL6 или его биологически активной части с необязательно расщепляемыми участками, с метками или доменами для выявления или очистки.
Средства для получения или продукции CXCL6 описаны в данной области. Их примеры кратко обобщены далее в настоящем описании, причем приведенные публикации включены в настоящее описание в качестве ссылки. GCP-2 млекопитающих можно получить культивированием образца клеток млекопитающих, который стимулирован для продукции цитокина, и очисткой CXCL6 из среды. Четырехэтапная процедура выделения для очистки CXCL6 среди других хемокинов из кондиционированной среды трансфицированных клеток представлена в публикации (Wuyts et al. (1997) Methods Enzymol 287, 13-33). Методики рекомбинантной ДНК, известные специалисту в данной области на время изобретения, такие как экспрессия в прокариотических и эукариотических системах экспрессии (дрожжи, бакуловирус, клетки млекопитающих), можно использовать для продукции CXCL6. Froyen et al. ((1997) Eur J Biochem 243, 762-769) описывают экспрессию CXCL6 в периплазме E. Coli. Экспрессия CXCL6 в клетках COS и в системе экспрессии бакуловируса описана в патенте США №6410268. Биологически активный CXCL6 можно также получить химическим синтезом с последующим введением дисульфидных мостиков (приведенная выше ссылка на публикацию Wuyts et al. (1997). Способы получения CXCL6, кроме того, описаны в документе ЕР 0804486.
Используемый в настоящем описании термин «хемокин» относится к небольшому полипептиду с молекулярной массой примерно от 8000 до 14000, который способен направить движение клеток, таких как лейкоциты (по данным приведенного выше обзора Zlotnik and Yoshie (2000).
«Хемотаксис» относится к движению клеток в ответ на химическое соединение (т.е. хемокин), посредством чего клетки или привлекаются (положительный хемотаксис) или отталкиваются (отрицательный хемотаксис) указанным химическим соединением. В данной области были описаны различные способы измерения хемотаксиса. Хемотаксис можно измерить под агарозой, как описано, например, Nelson ((1975) J. Immunol. 115, 1650-1656), при котором тестируемый образец (т.е. хемотаксическое соединение) вводится в агарозу, а потенциально реагирующие клетки вводятся на определенное расстояние от них. Хемотаксический эффект тестируемого образца определяется микроскопическим измерением расстояния миграции клеток в агарозе. Включаются отрицательные (т.е. не содержащие хемоаттрактант) и положительные (например, fMLP, известный хемоаттрактант) контроли для исключения соответственно ложноположительных и отрицательных результатов. Альтернативно, хемотаксическую активность можно измерить, используя микрокамеру (такую как описанная Falk et al. ((1980) J Immunol Methods. 33, 239-247). Нижний отсек микрокамеры загружается тестируемым образцом, в то время как верхний отсек заполняется средой, содержащей клетки. Нижний и верхний отсеки разделены поликарбонатной мембраной с размером пор 5 мкм. После периода инкубации мембрану удаляют, фиксируют и окашивают, и хемотаксический эффект тестируемого образца определяется балльной оценкой количества клеток, которые мигрировали через мембрану. И снова включаются положительный и отрицательный контроли. Другие способы измерения хемотаксической активности соединений, такие как инъекция in vivo, описаны в данной области.
«Хемоаттрактант» относится к химическому соединению, которое индуцирует миграцию клетки в направлении указанного химического соединения.
Используемый в настоящем описании термин «реагирующая клетка» относится к клетке, которая или привлекается, или отталкивается хемокином. Конкретнее, в контексте настоящего изобретения реагирующая клетка представляет собой клетку, которая привлекается или отталкивается CXCL6.
Используемый в настоящем описании термин «устойчивый гиалиновый хрящ» относится к хрящу без признаков сосудистой инфильтрации (т.е. лишенной васкуляризации) фиброзной ткани или формирования кости внутри хряща.
«Фенотипическая стабильность» относится к поддержанию способности клетки организовать или реорганизовать in vivo структуру специфической ткани, или исходной ткани, из которой были взяты клетки, или из другой ткани, в которой формирование клеток принудительно вызывалось в определенных условиях.
Фенотипически стабильный хондроцит относится к хондроциту, который сохраняет свою способность формировать устойчивый гиалиновый хрящ (также именуемый «устойчивостью хондроцитов»). Клеточная суспензия или популяция фенотипически стабильных хондроцитов относится к способности клеточной суспензии или популяции продуцировать устойчивый гиалиновый хрящ in vivo, например, на экспериментальной модели продукции хряща. Предпочтительно модель включает инъекцию клеточной суспензии млекопитающему (in vivo), такому как мышь с иммунодефицитом, и оценку во временной рамке в 3 нед. формирования хрящевого имплантата, посредством чего формируется гиалиновый хрящ, когда хрящевой имплантат не проявляет признаков сосудистой инвазии или формирования кости внутри хряща. Пример такого анализа описан в документе WO 01/24833, включенном в настоящее описание в качестве ссылки.
«Хондрогенный» относится к способности содействовать или стимулировать рост хряща. Когда используемый в настоящем описании термин «хондрогенная» связан с молекулой, то он относится к способности вещества при нанесении на клетки, такие как хондроциты, и на клетки, которые сами дифференцируются в хондроциты, прямо или косвенно содействовать или стимулировать формирование хряща этими клетками.
«Хондрогенные клетки» представляют собой клетки, способные продуцировать устойчивый гиалиновый хрящ.
Используемый в настоящем описании термин «соединительная ткань» относится к любой из ряда структурных тканей в организме млекопитающего, включая кость, хрящ, связку, сухожилие, мениск, дерму, гиподермис, мышцу, жировую ткань, суставную капсулу.
Используемый в настоящем описании термин «клетка-предшественник» относится к клетке, обладающей способностью подвергаться дифференциации для выполнения специфической функции. Конкретнее, в контексте настоящего изобретения, клетка-предшественница хондрогенной клетки представляет собой клетку-предшественницу, способную подвергаться дифференциации в клетку, способную продуцировать устойчивый гиалиновый хрящ (также именуемую «хондрогенной клеткой-предшественником»).
Используемый в настоящем описании термин «клеточная популяция, экспрессирующая CXCL6» относится к клеточной популяции, где, по меньшей мере, 70%, предпочтительно 80%, предпочтительно 85%, конкретнее 90% или необязательно 95% или более клеток экспрессируют CXCL6. Клетки, экспрессирующие CXCL6, внутри такой популяции можно идентифицировать способами, известными в данной области, такими как флюоресцентная автоматизированная сортировка клеток (FASC).
Используемый в настоящем описании термин «маркер фенотипической стабильности хондроцитов» относится к мРНК или белку, экспрессия которых у популяции коррелируется с фенотипической стабильностью хондроцитов, т.е. способностью указанной клеточной популяции продуцировать гиалиновый хрящ (как подробно указано в настоящем описании).
Используемый в настоящем описании термин «лиганд» CXCR1 или CXCR2 относится к молекуле, способной активировать рецепторы CXCR1 и/или CXCR2. Лиганды рецепторов CXCR1 и/или CXCR2 описаны в данной области и включают хемокины (CXCR1-8) и их производные, а также синтетические молекулы, такие как те, которые представлены в патенте США №6515001, но не ограничиваются ими.
«Ингибитор» CXCR1 и/или CXCR2 относится к молекуле, способной ингибировать активацию рецептора CXCR1 и/или CXCR2. Такие ингибиторы включают ингибиторные антитела (такие как имеющиеся в продаже) и синтетические антагонисты, такие как те, которые описаны в патентах США №6300325, 6548499, 6566387, но не ограничиваются ими.
Используемый в настоящем описании термин «хрящевой дефект» относится к дефекту, который включает разрушение хряща (также именуемое как хрящевой дефект). Конкретные хрящевые дефекты, предусмотренные в контексте настоящего изобретения, представляют собой дефекты суставной поверхности. Дефекты суставной поверхности могут быть результатом физической травмы одного или нескольких суставов, или они могут быть вызваны генетическими или экологическими факторами. Чаще всего, но не исключительно, такой хрящевой дефект возникает в коленном суставе и вызван, например, травмой, нестабильностью связок, вывихом конечности, менискэктомией, несостоятельными процедурами ацинозной или мозаичной пластики или первичным расслаивающим остеохондритом. В соответствии с конкретным вариантом осуществления настоящего изобретения дефект суставной поверхности возникает в контексте остеоартрита (ранний остеохондрит или костно-хрящевые дефекты). Хрящевой дефект именуется костно-хрящевым дефектом, когда имеется поражение суставного хряща и подлежащей (подхрящевой) кости. Обычно костно-хрящевые дефекты появляются на специфических опорных участках на концах бедренной кости и большеберцовой кости и задней части надколенной чашечки. Хрящевые дефекты в контексте настоящего изобретения следует также понимать как включающие те состояния, где восстановление хряща и/или кости требуется в контексте хирургии, такой как косметическая хирургия (например, носа, ушей), но не ограничивается ею. Таким образом, хрящевые дефекты могут возникать в любой части тела, где прервано образование хряща или где хрящ поврежден или отсутствует вследствие генетического дефекта, конкретнее, где хрящ важен для структуры или функционирования органа (например, таких структур, как мениски, ухо, нос, гортань, трахея, бронхи, структуры сердечных клапанов, часть ребер, синхондрозы, имплантаты).
Настоящее изобретение, кроме того, относится к применению CXCL6 при лечении и предотвращении дефектов, связанных с суставами тканями (например, менисками, связками), таких как разрывы менисков или разрушение менисков, разрывы связок, но не ограничиваются ими. Это лечение может представлять собой лечение, одновременно проводимое с классическим лечением, для ускорения или улучшения процесса заживления и качества восстановления. Кроме того, дефекты других тканей с аналогичной волоконно-хрящевой структурой, такие как межпозвонковые диски, считаются находящимися в пределах объема притязаний настоящей заявки.
Используемый в настоящем описании термин «ген» относится к любой последовательности ДНК, включающей несколько функционально связанных фрагментов ДНК, таких как промотор, 5' нетранслируемая область (5'UTR), кодирующая область (которая может кодировать или может не кодировать белок), и нетранслируемая 3' область (3'UTR), включающая сайт полиаденилирования. Обычно в растительных клетках 5'UTR, кодирующая область, и 3'UTR транскрибируются в РНК, в которой в случае гена, кодирующего белок, кодирующая область транслируется в белок. Ген может включать дополнительные фрагменты ДНК, такие как, например, интроны. Термин «чужеродный», относящийся к гену или последовательности ДНК, присутствующей в клетке, в контексте этого изобретения используется для указания того, что ген или последовательность ДНК естественно не обнаруживается в этом генном локусе в клетке.
Используемый в настоящем описании термин «промотор» относится к области ДНК, последовательность которой распознается (прямо или косвенно) ДНК-зависимой РНК полимеразой во время инициации транскрипции, и которая включает сайт инициации транскрипции, сайты связывания для факторов инициации транскрипции и РНК полимеразы. Промотор может также включать сайты связывания для других регуляторных белков, таких как усилители или ингибиторы транскрипции.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения CXCL6 используется в качестве лекарственного средства в комбинации с хондрогенными клетками или хондрогенными клетками-предшественниками. Клетки-предшественники хондрогенных клеток включают стволовые клетки, которые можно получить из различных тканей, включая костный мозг, или пупочный канатик. Особенно подходящими в качестве хондрогенных клеток-предшественников являются скелетные клетки-предшественники, такие как клетки, полученные из синовиальной оболочки, которые способны дифференцироваться в клетки, продуцирующие хрящ, такие как клетки, описанные в документе WO 01/25402.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, клетки, экспрессирующие CXCL6, используются для восстановления хрящевых или костно-хрящевых дефектов. Необязательно, клетки, экспрессирующие CXCL6, представляют собой хондрогенные клетки. Хондрогенные клетки для использования в контексте настоящего изобретения можно получить расселением клеток, полученных из небольшой биопсии хряща. Клетки, экспрессирующие CXCL6, для использования при лечении и/или предотвращения хрящевого или костно-хрящевого дефекта, могут быть аутологичными (собственными) или аллогенными, которые могут быть или от члена семьи (родственника), или от одного или нескольких неродственных доноров. Такие клетки могут быть свежевыделенными, культивированными или пассированными.
Экспрессию CXCL6 можно контролировать по уровню мРНК или белка с использованием методик, описанных в данной области. Экспрессию или отсутствие экспрессии можно, необязательно, подтвердить сравнением экспрессии CXCL данной популяции клеток или клетками с экспрессией положительного контроля (например, структурного белка, такого как бета-актин) и отрицательного контроля. Необязательно, экспрессию CXCL6 можно количественно охарактеризовать как соотношение между экспрессией CXCL6 и экспрессией отрицательного маркера фенотипической стабильности хондроцитов, такого как ALK-1 для хондроцитов (как описано в документе WO 01/24833, включенном в настоящее описание в качестве ссылки).
Альтернативно, клетки, экспрессирующие CXCL6, можно получить или эндогенную экспрессию клеток, экспрессирующих CXCL6, можно дополнить введением последовательности, кодирующей CXCL6, под контролем подходящего промотора. Последовательности ДНК, кодирующие CXCL6, были описаны в данной области, такие как последовательности ДНК, описанные в патенте США №6410268, но не ограничиваются ими. Подходящие промоторы для регуляции экспрессии последовательности ДНК, кодирующие CXCL6, были описаны в данной области и включают конститутивные и индуцируемые промоторы. Различные типы клеток можно использовать в соответствии с этим аспектом изобретения. Предпочтительно клетки, подлежащие использованию для лечения или предотвращения хрящевого или костно-хрящевого дефекта, представляют собой клетки, которые являются хондрогенными (такие как хондроциты), или которые могут развиться в хондрогенные клетки (клетки-предшественники, стволовые клетки). Введение чужеродной ДНК в эти клетки было описано в данной области (см., например, публикацию Eiges et al. (2001) Curr Biol 11, 514-518 и патент США №6413511).
В соответствии с другим аспектом изобретения продукция CXCL6 стимулируется эндогенно в суставе введением соединения, способного индуцировать продукцию CXCL6 клетками, продуцирующими CXCL6. Предпочтительно это соединение представляет собой соединение, способное индуцировать CXCL6 в хондрогенных клетках, таких как хондроциты. Соединения, способные индуцировать продукцию CXCL6 в хондроцитах in vitro, описаны в данной области и включают IL-1бета (интерлейкин-1бета), LPS (липополисахарид и поли rl:rC. Альтернативные соединения, способные стимулировать экспрессию CXCL6 хондрогенными клетками, можно идентифицировать классическими экспериментами индукции. Хондрогенные клетки или клетки-предшественники, инкубированные в присутствии одного или нескольких перспективных соединений, могут быть подвергнуты скринингу для выявления измененной экспрессии CXCL6 (RT-PCR, окрашивание антител) и/или морфологических параметров (клеточная морфология, гистологическое окрашивание) или молекулярных параметров (экспрессии маркеров клетками-предшественниками, положительно или отрицательно связанными с хондрогенной способностью клеток-предшественников, или маркеров, положительно или отрицательно связанных с устойчивостью хондроцитов, зрелых хондроцитов после дифференциации клеток-предшественников или созревания хондрогенных клеток). Аналогичные процедуры скрининга могут выполняться для анализа эффекта соединений на экспрессию CXCL6 в остеогенных клетках. Следовательно, настоящее изобретение предоставляет способ скрининга для выявления соединений, которые модулируют хондрогенный и/или остеогенный потенциал клеток.
Альтернативно, конструкт-репортер с промотором CXCL6 функционально связан с геном-репортером (таким как люцифераза, LacZ, зеленый флюоресцентный белок, хлорамфеникол-трансфераза). После введения соединений идентифицируются измененные (пониженные или повышенные) уровни экспрессии гена-репортера. Эти анализы репортера можно выполнять in vitro в анализе транскрипции/трансляции, или его можно выполнить in vivo после трансфекции конструкта-репортера в любую линию клеток, но предпочтительно в линию клеток или клеточную популяцию, полученную из соединительной ткани или из хряща.
И in vivo, и in vitro анализы обеспечивают возможность крупномасштабного скрининга библиотек соединений для выявления их эффекта на экспрессию CXCL6 и связанное с ней формирование хряща и/или кости.
Применение соединений, которые оказывают подавляющую регуляцию на уровни экспрессии и/или активность передачи сигналов CXCL6, может использоваться при лечении расстройств, связанных с повышенной активностью или повышенной пролиферацией хондроцитов. Эти соединения можно идентифицировать указанными выше способами скрининга. Другие подходящие соединения для подавляющей регуляции передачи сигналов CXCL6 включают антисмысловую РНК или двухнитевую РНК (иРНК) для CXCL6 или одного из его рецепторов, антител или фрагментов антител против CXCL6 или против одного из его рецепторов. Альтернативно, могут использоваться растворимые рецепторы или части CXCL6, или части одного из его рецепторов, которые связываются или с лигандом, или с рецептором, и в последующем нарушают взаимодействие между лигандом и рецептором.
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения, CXCL6 используется для формирования кости и хряща in vitro. Он используется при продукции аутологичных трансплантатов хряща или кости для реконструктивной хирургии. Продуцирующие хрящ клетки или предшественники продуцирующих хрящ клеток культивируются in vitro, необязательно на матрице или в геле, в присутствии CXCL6 для формирования синтетического подобного хрящу материала, который имплантируется в последующем в хрящевой дефект. Способы формирования хряща и кости in vitro описаны в данной области (такие как способы, описанные в документах WO 01/68811, WO 97/18842, WO 02/070030, патентах США №5786217, 5723331 и WO 98/32333, но не ограничиваются ими).
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения экспрессию CXCL6 можно использовать в качестве маркера способности размноженных хондрогенных клеток или клеточных популяций формировать устойчивый гиалиновый хрящ in vivo и, необязательно, для выбора фенотипически устойчивых хондроцитов в пределах размноженной клеточной популяции. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением хондрогенные клетки или клеточные популяции, в частности клеточные популяции хондроцитов, можно идентифицировать, как способные продуцировать устойчивый гиалиновый хрящ на основании того, экспрессируется ли CXCL6 указанными клетками или клеточными популяциями, или нет. Необязательно, идентификацию можно проводить на основании присутствия CXCL6 и одного или нескольких других маркеров. Дополнительные маркеры могут представлять собой или положительные маркеры (т.е. маркеры, положительно связанные с фенотипической устойчивостью хондроцитов) или отрицательные маркеры (отрицательно связанные с фенотипической устойчивостью хондроцитов, такие как маркеры, раскрытые в документе WO 01/24833). Необязательно, идентификацию можно проводить на основании соотношения между экспрессией CXCL6 и экспрессией отрицательного маркера фенотипической устойчивости хондроцитов для этой клеточной популяции (такого как ALK-1 для популяции хондроцитов). Предпочтительно это соотношение составляет 2:1 или более, или предпочтительно 5:1 или более. Применение маркеров фенотипической устойчивости хондроцитов представляет интерес для разнообразных видов применения, включая контроль качества и выбор клеточной популяции для использования при предотвращении или восстановлении костно-хрящевых дефектов (таких как трансплантация аутологичных клеток (АСТ)), мониторинге пассажа размножением хондрогенных клеток пассажем и для идентификации условий культивирования, подходящих для получения или поддержания фенотипической устойчивости хондроцитов. Такие виды применения и способы применения такого положительного маркера фенотипической устойчивости хондроцитов (например, в сериях ДНК или фрагментах ДНК для рутинного выявления) описаны в документе WO 01/24833.
В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения CXCL6 можно использовать для поддержания фенотипической устойчивости хондроцитов клеточной популяции хондроцитов или можно использовать для восстановления фенотипической устойчивости хондроцитов добавлением CXCL6 и восстановлением пути передачи сигналов к клеточной популяции, которая утратила свою фенотипическую устойчивость хондроцитов. В соответствии с изобретением введение CXCL6 в среды для культивирования клеток обеспечивает то, что клетки сохранят свою способность продуцировать устойчивый гиалиновый хрящ in vivo.
Аналогичным образом, было обнаружено, что передача сигналов CXCL6 существенна для дифференциации клеток-предшественников в хондроциты. Введение CXCL6 в среды для культивирования клеток обеспечит соответствующую дифференциацию клеток-предшественников в хондроциты. Альтернативно, CXCL6 используется для восстановления пути передачи сигналов популяций предшественников хондроцитов, которые утратили их способность дифференцироваться в хондроциты.
CXCL6 и/или клетки, продуцирующие CXCL6, и/или соединения, индуцирующие CXCL6, в соответствии с настоящим изобретением применяются в качестве фармацевтической композиции при лечении хрящевых или костно-хрящевых дефектов. Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением относится к композиции, включающей CXCL6 и/или клетки, продуцирующие CXCL6 и/или соединения, индуцирующие CXCL6, если требуется, с подходящим фармацевтическим носителем.
Необязательно, фармацевтическая композиция настоящего изобретения может, кроме того, включать соединения, которые содействуют продукции хряща (и, если необходимо, подлежащей кости), т.е. хондрогенные соединения, такие как трансформирующие ростовые факторы и костные морфогенные белки, но не ограничиваются ими.
Используемый в настоящем описании термин «подходящий фармацевтический носитель» относится к носителю, подходящему для медицинских или ветеринарных целей, не являющемуся токсичным или иначе неприемлемым. Такие носители хорошо известны в данной области и включают солевой раствор, солевой раствор с буфером, декстрозу, воду, глицерин, этанол и их комбинации. Композиция должна соответствовать способу введения.
Терапевтическое применение настоящего изобретения включает введение композиции, включающей CXCL6 или клетки, продуцирующие CXCL6, местно в виде аппликации, имплантата или устройства. При введении терапевтическая композиция для применения в настоящем изобретении представлена предпочтительно в лишенной пирогенов, физиологически приемлемой форме. Кроме того, композиция может быть желательно инкапсулирована или инъецирована в вязкой форме для доставки к участку повреждения хряща (и подлежащей кости). Другие терапевтически используемые средства могут также быть включены в композицию, как описано выше, могут быть альтернативно или дополнительно введены одновременно или последовательно с композицией изобретения. Предпочтительно для формирования хряща композиция должна включать матрицу, способную доставлять белки CXCL6 к участку повреждения хряща.
Используемый в настоящем описании термин «матрица» относится к субстрату, который может быть наложен на хрящевой или костно-хрящевой дефект. Ее функция может представлять собой функцию «носителя» биологических молекул, таких как CXCL6, в соответствии с настоящим изобретением, но сама матрица может также нести восстановительную функцию. Таким образом, в соответствии с одним вариантом осуществления ее размер и форма соответствует хрящевому или костно-хрящевому дефекту, так что дефект восстанавливается. Матрица может быть сконфигурирована в виде листка или иметь суживающуюся к одному концу форму. Матрица может быть изготовлена из любого подходящего материала, включая синтетический полимерный материал и молотые вещества. Примерами матриц являются биологически разлагаемые и химически чистые сульфат кальция, трикальцийфосфат, гидроксиапатит, полимолочная кислота, полигликолевая кислота и полиангидриды. Другие потенциальные материалы являются биологически разлагаемыми и биологически хорошо определенными, такими как костный или дермальный коллаген. Другие матрицы состоят из чистых белков или компонентов внеклеточной матрицы. Другие потенциальные матрицы являются биологически не разлагаемыми и химически чистыми, такими как агломерированный гидроксиапатит, биологическое стекло, алюминаты или другие керамические материалы. Матрицы могут быть составлены из комбинаций любых из указанных выше типов материала. Матрица может также иметь неопределенную форму и быть изготовлена из нетвердого материала или подобна гелю. Предпочтительно матрица является биологически разлагаемой. Матрица может быть или поперечно сшитой, или нет, в зависимости от применения. Примеры матриц описаны в патенте США №6514514, включенном в настоящее описание в качестве ссылки. В соответствии с конкретным вариантом осуществления настоящего изобретения матрица обеспечивает возможность введения CXCL6 при градиенте концентрации в костно-хрящевой дефект. Градиент концентрации может соответствовать вариабельной степени восстановления, необходимой в дефекте, и/или для перехода хряща (низкой концентрации) в кость (высокой концентрации). Градиенты концентрации CXCL6 могут наноситься, например, использованием матриц с градиентом размера пор. Заполнение такой матрицы полимеризируемым раствором с CXCL6 приведет к градиенту концентрации CXCL6.
Терапевтическое применение соединений, индуцирующих CXCL6 или CXCL5, в соответствии с настоящим изобретением также включает наложение посредством системы доставки, обеспечивающей возможность контролируемого высвобождения. Это может быть достигнуто выбором соответствующих полимерных носителей, таких как, например, полиэфиры, полиаминокислоты, поливинилпирролидон, сополимеры этилена-винилацетата, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, протаминсульфат и им подобные. Скорость высвобождения препарата и длительность действия можно также регулировать включением активного ингредиента в частицы, например микрокапсулы, полимерного вещества, такого как гидрогели, полимолочная кислота, гидроксиметилцеллюлоза, полиметилметакрилат и другие полимеры, известные специалисту в данной области. Такие способы включают коллоидные системы доставки лекарственного средства, подобные липосомам, микросферам, микроэмульсиям, наночастицам, нанокапсулам и т.д. В зависимости от пути введения фармацевтическая композиция, включающая соединения, индуцирующие CXCL6 или CXCL5, изобретения, может потребовать защитных покрытий.
Лечение, включающее введение CXCL6, можно также получить экспрессией CXCL6 in vivo, т.е. посредством генной терапии. Так, например, клетки от пациента могут быть подвергнуты методам генной инженерии полинуклеотидом (ДНК или РНК), кодирующим полипептид CXCL6 ex vivo, причем подвергнутые методам генной инженерии клетки затем вводятся пациенту, подлежащему лечению полипептидом. Такие способы хорошо известны в данной области. Например, клетки от пациента могут быть модифицированы методами генной инженерии, известными в данной области, использованием ретровирусной частицы, содержащей РНК, кодирующую полипептид настоящего изобретения. Альтернативно, векторы (такие как инфекционные вирусные частицы или не вирусные частицы, такие как липосомы или мицеллы), включающие ДНК, кодирующую CXCL6, можно использовать для генной инженерии клеток, экспрессирующих CXCL6, in vivo, в соответствии со способами, описанными в данной области. Применение генной терапии в ортопедии описано (обзор Evans & Robbins (2000) Orthop Nurs 19, 16-22), и способы генной терапии с использованием CXCL6 можно найти в патенте США №6410268. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения клетки, подвергнутые методам генной инженерии для экспрессии CXCL6, или векторы для введения ДНК in vivo вводятся местно в среду подлежащего лечению хрящевого или костно-хрящевого дефекта.
Изобретение также предоставляет фармацевтическую упаковку или набор, включающий один или несколько контейнеров, заполненных одним или несколькими ингредиентами фармацевтических композиций изобретения. Приложенной к такому контейнеру (контейнерам) может быть уведомление в форме, предписанной правительственным агентством, регулирующим изготовление, применение или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, причем уведомление отражает утверждение агентством изготовления, применения или продажи для введения людям. Кроме того, полипептиды или клетки настоящего изобретения можно использовать в сочетании с другими терапевтическими соединениями.
Используемый в настоящем описании термин «включающий» следует интерпретировать как определяющий присутствие указанных признаков, целых величин, стадий, реагентов или компонентов, на которые имеются ссылки, но не мешает присутствию или добавлению одного или нескольких признаков, целых величин, стадий или компонентов или их групп. Так, например, нуклеиновая кислота или белок, включающий последовательность нуклеотидов или аминокислот, может включать больше нуклеотидов или аминокислот, чем действительно приведенный, т.е. быть встроенным в более крупную нуклеиновую кислоту или белок. Химерный ген, включающий последовательность ДНК, которая функционально или структурно определена, может включать дополнительные последовательности ДНК и т.д.
Краткое описание чертежей
Следующие примеры, не предназначенные для ограничения изобретения конкретными описанными вариантами осуществления, можно понять в сочетании с сопровождающими, включенными в настоящее описании в качестве ссылки чертежами, в которых:
Фиг.1: Воздействие блокировки пути СХС-хемокина на дифференциацию hMSC в хондрогенные клетки. Инкубация клеток без добавок (контроль) или с TGF-бета, антитела к рецептору CXCR1 или CXCR2 (αCXCR1, αCXCR2), растворимый рецептор CXCR1 или CXCR2 (CXCR1-2) или растворимый рецептор + TGF-бета. Ось Y представляет OD (оптическую плотность), измеренную по окрашиванию алцианом синим всех срезов микромассы, указывающих на формирование хряща.
Фиг.2: Макроскопический поперечный разрез зоны костно-хрящевого дефекта в контроле (А) и после обработки CXCL6 (В)
Фиг.3: Общий вид продольного разреза зоны костно-хрящевого дефекта после окрашивания гематоксилином-эозином в контроле (А) и после обработки CXCL6 (В)
ПРИМЕРЫ
Пример 1 - Вовлечение хемокинов в дифференциацию человеческих мезенхимальных стволовых клеток (MSC)
Было описано, что человеческие MSC, полученные из костного мозга, могут стимулироваться TGF-бета для дифференциации в клетки, продуцирующие хрящ (Mackay et al. (1998) Tissue Eng 4, 415-28). Для оценки вовлечения хемокинов СХС в этом процессе дифференциации осадок микромассы мезенхимальных стволовых клеток, полученных из синовиальной оболочки, высевают в среду, содержащую 10% сыворотку, инактивированную нагреванием. Через 3 ч добавляют 485 мкл среды SF. На следующий день среду SF обновляют и антитела и ростовые факторы добавляют в 100х растворах (5 мкл/лунку): или TGF-бета (5 нг/мл), антитела к CXCR1 или CXCR2 (конечная концентрация 5 г/мл), или растворимый CXCR1 и 2. Способность этих клеток продуцировать хрящ измеряют окрашиванием алцианом синим всех срезов микромассы и выявлением окрашивания по O.D. Результаты представлены на фиг.1.
Как видно из фиг.1, имеется некоторая спонтанная дифференциация стволовых клеток в клетки, продуцирующие хрящ, в отсутствие добавления ростовых факторов, но это в значительной степени усиливается добавлением TGF-бета. Добавление антител против CXCR1 и, в меньшей степени, антител против CXCR2 ингибирует спонтанную дифференциацию в хондрогенные клетки, хотя добавление растворимого рецептора CXCR1 и 2 ингибирует дифференциацию, вызванную TGF-бета. Более того, было обнаружено, что добавление CXCL6 (100 нг/мл) вместе с антителами к CXCR1 и 2 восстанавливает дифференциацию, свидетельствуя о том, что существует конкуренция между CXCL6 и антителами к рецептору. Эти данные указывают на участие СХС-хемокинов в дифференциации мезенхимальных стволовых клеток в хондрогенные клетки.
Пример 2 - Экспрессия CXCL6 в клеточных популяциях, которые являются фенотипически устойчивыми
6
Эти пулы человеческих хрящевых хондроцитов получают из суставного хряща от людей-доноров, не страдавших каким-либо суставным заболеванием. Вкратце, получают срезы полной толщины хряща и помещают их в сбалансированный солевой раствор Хэнкса (“HBSS”) (доступный от Life Technologies) с добавлением пенициллина, стрептомицина и амфотерицина В (Life Technologies). После двух промываний в HBSS в течение 5 мин при 37°С хрящ тонко измельчают и помещают в стерильный 0,2% раствор неочищенной коллагеназы (Life Technologies) в модифицированной по Дульбеко среде Игла (“DMEM”) с высоким содержанием глюкозы (Life Technologies), содержащий 10% FBS (фетальную телячью сыворотку) (Biowittaker), пенициллин, стрептомицин и амфотерицин В. После инкубации в течение ночи при 37°С клетки дважды промывают в культуральной среде - DMEM с добавкой 10% FBS, 100 единиц/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл амфотерицина В - и подсчитывают тестом исключения трипана синего для поправки на количество жизнеспособных клеток. Полученные клетки культивируют в монослое. После первого пассажа (РО) 2 аликвотных количества (5×10 леток в каждом) инъецируют in vivo для определения устойчивости хондроцитов, как описано в документе WO 01/24833. Меньшее аликвотное количество используют для получения экстракта РНК, а остальное количество высевают повторно. Общее количество РНК подвергают обратной транскрипции, используя Thermoscript (имеющийся от компании Life Technologies) и используют для полуколичественного анализа PCR. После 5-го пассажа 2 образца помещают в агарозные культуры с низкой точкой плавления, систему, которая, как известно, приводит к восстановлению экспрессии коллагена II типа лишенными дифференциации хондроцитами. Через 2 мес. формирование колоний было обильным, и культуры собирают для экстракции РНК. Полуколичественный анализ RT-PCR проводят для выявления экспрессии CXCL6.
Анализ микросерии выявляет, что CXCL6 экспрессируется в свежевыделенных (FI) хондроцитах и культивированных хондроцитах при РО. CXCL6 подвергается подавляющей регуляции, когда эти клетки после ряда пассажей теряют свою способность формирования хряща на модели у «голых» мышей. Таким образом, экспрессия CXCL6 хондрогенными клетками связана со способностью формировать гиалиновый хрящ.
Пример 3 - Экспериментальная модель костно-суставного восстановления, вызванного CXCL6
Целью данного эксперимента была демонстрация эффекта CXCL6 при восстановлении больших костно-хрящевых дефектов.
Животные: Использовали 7 взрослых, не лактирующих и не беременных коз породы Saanen (4 в группе лечения и 3 контроля). Возраст всех коз составлял 2 года или более, и они были получены из сертифицированных фирм, отрицательных по САЕ (вирусу козьего артрита и энцефалита).
Структура эксперимента
После обследования перед анестезией и премедикацией (ксилазин 0,2 мг/кг + атропин 0,02 мг/кг внутримышечно, введения антибиотиков: ампициллина 10 мг/кг и обезболивающих средств: фентанила 0,1 мг/кг внутримышечно) у коз проводили общую анестезию, используя кетамин (2 мг/кг) и мидазолам (0,5 мг/кг). Общую анестезию поддерживали ингаляционной анестезией изофлюраном и кислородом. Состояние животных контролировали по ЭКГ и МАР (среднему артериальному давлению) и в магистраль для венозных вливаний вводили 0,9% NaCl.
Костно-хрящевой дефект размером 6×6 мм создавали в центральной части левого медиального мыщелка бедренной кости. Дефект создавали следующим образом:
- В положении лежа на правом боку со свободно свисающей согнутой левой лапой.
- Проводили обычное бритье, дезинфекцию и обкладывание хирургическим бельем области коленного сустава.
- Делали разрез кожи длиной около 7 см непосредственно медиальнее связки коленной чашечки.
- Обеспечивали прямой срединный доступ к коленному суставу посредством небольшой артротомии медиальнее сразу за связкой коленной чашечки с удалением части жировой подушечки Хоффа.
- Создавали костно-хрящевой дефект глубиной 6 мм в центральной части медиального мыщелка бедренной кости с использованием бура диаметром 6 мм.
- Дефект сушили марлевым тампоном.
Костный дефект заполняли кусочком рассасываемой желатиновой губки (Spongostan™ - 0,6 см × 0,6 см × 0,6 см - насыщенной PBS (солевым раствором с фосфатным буфером)), которая служила в качестве носителя. Все дефекты плотно закрывали лоскутом надкостницы, пришитым к хрящу.
Животным экспериментальной группы 80-100 мкл человеческого CXCL6 (0,025 мкг/мкл, R&D Systems, Europe) инъецировали под лоскут, и они впитывались желатиновой губкой. Контрольным животным инъекции не проводили.
Рану закрывали в 4 слоя и лапу иммобилизировали в пращевидной повязке.
При необходимости в послеоперационном периоде обеспечивали дополнительное введение 0,1 мг/кг фентанила внутримышечно.
Животных держали в пращевидной повязке в течение 3 нед. (упор на конечность был невозможен), после чего обеспечивали возможность свободного движения. Ежедневно проводили клиническую оценку и обработку раны. Кожные швы удаляли через 2 нед. после операции. До умерщвления животных содержали отдельно в небольших клетках (1,1 м × 1,8 м).
Животных умерщвляли через 13 нед. после операции, если не возникали осложнения, которые требовали эвтаназии на гуманных основаниях. Эвтаназию коз проводили внутривенной инъекцией Т61 (0,1 мл/кг). После удаления кожи синовиальную жидкость в стерильных условиях собирали и из оперированного, и из противоположного коленного сустава. Левый и правый коленные суставы резецировали и сохраняли в формальдегиде. Синовиальную биопсию выполняли на обоих коленных суставах, которые также сохранялись в формальдегиде.
Клинические оценки, лабораторные тесты и наблюдение
4
Перед операцией и во время умерщвления брали образцы крови и мочи. Образцы крови тестировали для выявления множественных факторов (гемоглобина, гематокрита, количества эритроцитов, среднего объема эритроцитов, среднего содержания гемоглобина в эритроцитах, средней концентрации корпускулярного гемоглобина, ширины распределения объема эритроцитов, количества лейкоцитов + лейкоцитарной формулы, количество эозинофилов, ретракции тромбоцитов, Fe, фибриногена + соотношения тромбопластина/фибриногена, Na, K, Cl, Ca, PO, Mg, мочевины, тромбопластин + электрофорез, ферментов AST, GGT, AP, LDH). Мочу исследовали на присутствие эритроцитов и белка. Синовиальную жидкость после умерщвления проверяли подсчетом клеток, определением тромбопластина, кристаллов, бактериологии.
Критерии оценки
Перед умерщвлением суставы животных оценивали на наличие мышечной атрофии, анализ походки при ходьбе.
Оценка восстановления хрящевого дефекта основывалась и на оптическом, и на гистологическом анализе синовиальной биопсии. Гистологический анализ синовиальной жидкости проводили окрашиванием гематоксилином и эозином, мыщелков - окрашиванием гематоксилином и эозином, окрашиванием толуидином синим и окрашиванием сафранином О.
Оценку и градацию в баллах окрашенных гистологических препаратов проводили слепым методом. Использовали следующие критерии:
- Тканевая морфология (тип хряща, если он имеет место)
- Наличие воспаления
- Структурная целостность (наличие колончатой организации)
- Группировка хондроцитов
- Образование костно-хрящевой метки
- Подхрящевое формирование кости
- Архитектура поверхности
- Латеральная интеграция (наличие или отсутствие соединения на одном или обоих концах трансплантата)
- Основная интеграция
Результаты
На фиг.2 и 3 демонстрируют различие восстановления, происходящего в коленных суставах, обработанных CXCL6, по сравнению с дефектами, в которые не добавляли CXCL6. Видно, что в отсутствие CXCL6 визуализируется зона суставного дефекта, и она состоит главным образом из фиброхряща. В дефектах, обработанных CXCL6, имеется восстановление гиалинового хряща и подлежащей кости. Обзор критериев оценки суставного дефекта, обработанного CXCL6, и суставного дефекта, не обработанного CXCL6, представлен в таблице 2.
Таблица 2
Критерии
Костно-хрящевой дефект + спонгостан + надкостница
Костно-хрящевой дефект + спонгостан + надкостница + хемокин
Морфология ткани
Преимущественно фиброхрящ
Преимущественно гиалиновый хрящ
Структурная целостность
Начало колончатой организации
Начало колончатой организации
Группировка хондроцитов
Отсутствие кластеров
Отсутствие кластеров
Формирование костно-хрящевой метки
<25%
76-90%
Подхрящевое формирование кости
Нет
Хорошее
Архитектура поверхности
Незначительная волокнистость или неравномерность
Нормальная
Латеральная интеграция
Соединенная на одном конце
Соединенная на обоих концах
Основная интеграция
91-100%
91-100%
Воспаление
Нет
Нет
При биопсии суставного дефекта, в который добавляли CXCL6, наблюдалось почти полное заполнение костного дефекта вновь сформированной подхрящевой костью, сверху покрытой хрящом от подобного гиалиновому до гиалинового. Хрящевой слой был тоньше, чем окружающий хрящ, ввиду смещения кверху передней части кости. У контролей дефект был заполнен смешанной тканью, состоящей из коллагенового носителя, хряща, фиброзной ткани, кровеносных сосудов и некоторого количества костной ткани.