Способ дифференциации очагов эндометриоза различной локализации методом прямой масс-спектрометрии
METHOD FOR DIFFERENTIATION OF ENDOMETRIOSIS CENTERS OF DIFFERENT LOCALIZATION BY DIRECT MASS SPECTROMETRY

Изобретение относится к области медицины, а именно - к гинекологии, к способам дифференциации очагов эндометриоза различной локализации от окружающей здоровой ткани методами прямой масс-спектрометрии. Может быть использовано для экспресс-анализа типа ткани при проведении операций гинекологического профиля с целью уточнения локализации очагов эндометриоза как дополнение/замена срочной гистологии.
Наружный генитальный эндометриоз относится к основным гинекологическим патологиям у женщин репродуктивного возраста [1] (каждая десятая женщина в возрасте от 16 до 50 лет). Распространенность данной патологии в последнее время сильно возросла [1]. При эндометриозе клетки подобные по свойствам и функцийм эндометрию обнаруживаются вне слизистой матки, после их удаления более чем в 50% случаев возникают рецидивы [2]. Таким образом в основе эндометриоза - гиперплазия ткани, характеризующаяся ускоренным делением клеток, устойчивостью к апопточеским сигналам, то есть функциональная приближенность к онкологическим процессам [3]. Одним из ключевых интермедиаторов в поддержании физиологического баланса между процессами пролиферации и апоптоза являются липиды [4]. Например, изменения в структуре и функциях сфингомиелинов и фосфатидилхолинов приводит к подавлению апоптотических сигналов и, как следствие, к гиперпластическим процессам (в том числе, возникновению и прогрессированию злокачественных новообразований) [5].
Поэтому изменение липидного профиля ткани при патологии может служить основой для новых, высокоточных и специфичных методов дифференциальной диагностики. Определение молекулярного состава тканей является одной из функций масс-спектрометрии (МС) [6]. Данный метод имеет значительные преимущества по сравнению с традиционными диагностическими инструментами. Такими, как, например, гистологическое исследование. Гистологический анализ занимает больше времени и требует больших усилий, так как необходима предварительная подготовка образца. Кроме того, результаты гистологического исследования в некоторой степени субъективны и достоверность получаемых данных зависит от квалификации и опыта врача. Использование методов экспресс-скрининга тканей с применением масс-спектрометрических детекторов для дифференциальной диагностики эндометриоидных тканей во время операции, позволила бы избежать как удаления здоровых тканей, так и неполного удаления небольших невидимых глазом энометриоидных очагов, то есть снизить вероятность рецидива эндометриоза.
С открытием новых методов молекулярного профилирования тканей на базе масс-спектрометрии с недеструктивной ионизацией, не требующих пробоподготовки, появилась возможность экспрессного профилирования тканей [7,8]. В последнее десятилетие было предложено множество моделей ионных источников для получения масс-спектра с нативного образца. В частности, спрей с бумаги [9], спрей с листа [10], спрей всего организма [11] и электроспрей с ткани [6, 11-15]. Эти методы прямой масс-спектрометрии тканей объединяет быстрота получения масс-спектров при отсутствии пробоподготовки образцов и снижении влияния внешних параметров эксперимента, таких как размер и форма образца ткани. Получаемые в результате характеристические масс-спектры, называемые также "отпечатки пальцев" (fingerprints), каждой ткани позволяют создать классификационную модель для отнесения данной конкретной ткани к норме или патологии, а также деления патологически измененных тканей по степени их трансформации. Следует отметить, что при поиске возможных маркеров гиперпластических процессов при эндометриозе с помощью методов ионизации, применяемых в прямой масс-спектрометрии тканей, удается зарегистрировать преимущественно ионы липидов - их интенсивность в спектре максимальна [16-18]. Таким образом, методы прямой масс-спектрометрии тканей за счет высокой производительности и универсальности позволяют проводить экспресс-диагностику типа ткани в ускоренном режиме непосредственно во время оперативного вмешательства, тем самым дополняя результаты срочного гистологического исследования и уточняя объем оперативного вмешательства. Внедрение предлагаемого метода в клинику позволит снизить рецидивы за счет своевременного обнаружения и удаления измененных тканей, а также сохранить здоровые ткани, что особенно актуально при эндометриоидных кистах яичника у женщин репродуктивного возраста.
В качестве прототипа предлагаемого метода взят способ, описанный в [6], согласно которому методом электрораспыления с ткани продемонстрирована возможность классификации тканей на примере опухолевых тканей мозга - менингиомы и астроцитомы. Были идентифицированы некоторые характерные липиды для различных опухолей. Авторы сами отмечают, что классификация тканей не являлась целью данной работу, поэтому получены лишь предварительные результаты по возможным маркерным липидам. Недостатком данной работы является очень малая выборка образцов (несколько образцов для каждого типа опухоли) и, как следствие, отсутствие какой-либо статистической обработки результатов. Классификационные модели также не строились. Данные факторы не позволяют предложить какой-либо воспроизводимый подход для дифференциации патологической ткани от здоровой, и последующего использования в хирургии для уточнения локализации очагов эндометриоза. Кроме того, авторы рассматривали только различные формы онкологических новообразований, к которым эндометриоидные очаги не относятся.
Задачей, решаемой изобретением, является способ дифференциации очагов эндометриоза различной локализации методом прямой масс-спектрометрии отличающийся тем, что за время в пределах 5 минут определяют липидный профиль ткани, с точностью не более 5 м.д. (ррm) без предварительной подготовки образца, с помощью метода OPLS-DA и с использованием OPLS модели, построенной на основании уровней следующих липидов: фосфатидилхолины (PC 38:4, PC 36:3, PC 36:4, PC 38:3, PC 38:5, PC 0-38:5, PC 36:1), этаноламины (РЕ 0-36:5, РЕ 36:4, РЕ 36:1, РЕ О-38:6, РЕ 0-38:5, РЕ 38:5, РЕ 0-40:5, РЕ 40:7) и сфингомиелины (SM 34:1, SM 36:1, SM 34:2, SM 42:3, SM 42:2) - рассчитывают оценочный параметр (ОП); при значении 1<ОП<0 делают заключение о том, что данная ткань является очагом эндометриоза, при значении 0<ОП<1 делают заключение о том, что данная ткань является эутопическим эндометрием.
Поставленная задача решается предлагаемым способом, состоящим из стадии обучения системы: получение масс-спектров высокого разрешения тканей с известным гистологическим диагнозом (не менее 50 образцов) с помощью прямой масс-спектрометрии методом электрораспыления с ткани без предварительной подготовки, в режиме положительных и отрицательных ионов на коммерческом масс-спектрометре с разрешением более 10000 и точностью определения массы не хуже, чем 5-10 ррm, проведение многомерного анализа данных методом дискриминантного анализа ортогональных проекций на скрытые структуры (OPLS-DA) с последующей группировкой пиков на основе информации об интенсивности пиков масс-спектра каждого образца ткани с предварительным масштабированием по Парето, оценке вариабельности пиков, позволивших дифференцировать различные ткани, согласно результатам OPLS-DA метода, построении статистической классификационной OPLS-DA модели выделением нескольких компонент (от двух до четырех), позволяющих отличить эктопический эндометрий от эутопического эндометрия, оценку чувствительности и специфичности данной классификационной модели, а также ожидаемой точности классификации новых данных для определения диагностической ценности модели, анализ важности вклада независимых переменных в проекции (VIP), полученные в OPLS-DA моделях для выявления компонент, наиболее существенных для создания фенотипической классификации в исследовании, идентификации этих компонентов в соответствии с их точными массами и МС/МС спектрами. Построение OPLS-DA модели осуществляется следующим способом:
(1) Методом PCА рассчитывается А главных компонент матрицы ковариаций размером m×р
PCA
где Т - m×А матрица счетов, a W - р×А матрица нагрузок с ортонормальными столбцами.
(2) Рассчитывается n×А матрица предсказательных счетов Т=XW, которые являются координатам строк X по отношению к ортонормальному базису W.
(3) Рассчитывается n×р матрица остатков
ху
T
T
Е=X - TW=X - XWW
orth
ху
T
(4) Рассчитывается w - наиболее существенное значение нагрузки РСА(ТЕ).
(5) Из X последовательно удаляется структурированный шум
(6) Для получения дополнительных ортогональных компонентов повторить шаги (4), (5).
(7) Построить PLS модель из Y и отфильтрованной X.
(n+1)
(8) Чтобы классифицировать новый образец, х, сначала необходимо отфильтровать ортогональные компоненты вариации, а затем рассчитать оценочный параметр
где
OPLS
T
-1
T
β=(XX)XY
Важно заметить, что большинство из выявленных методом прямой масс-спектрометрии веществ являются липидами и определение различий в их экспрессии является достаточным, чтобы отличить эктопический эндометрий от эутопического.
На Фиг. 1 показана схема получения масс-спектров тканей после хирургической операции для последующего статистического классификационного анализа. Образцы, замороженные в жидком азоте непосредственно после операции, хранятся при -75°С. Для масс-спектрометрического анализа отрезается небольшой кусок ткани (приблизительно 2×1×1 мм), размораживается и фиксируется на игле в источнике ионов. На образец ткани с помощью насоса хроматографа подается постоянный поток растворителя. Растворитель необходим для экстракции, десорбции и ионизации молекул, входящих в состав ткани. За счет приложенного напряжения между иглой и входом в масс-спектрометр из растворителя формируется конус Тейлора, с острия которого срываются заряженные капли, содержащие экстрагированные молекулы образца. В результате распада этих капель, происходящего за счет испарения и кулоновского отталкивания, происходит десольватация и ионизация молекул. Получившиеся в результате описанного процесса ионы, попадают в масс-спектрометр, который выдает масс-спектр, характерный для данной ткани.
На Фиг. 2 приведены примеры масс-спектров различных образцов эндометрия (эктопического и эутопического) одного пациента, зарегистрированных в режиме положительных ионов: (а) эутопический эндометрий; (б) эндометриоидная киста яичника; (в) эндометриоз брюшины малого таза. Более 1100 ионов в образце детектируются при выбранном пороге интенсивности равном 200 условных единиц. Наиболее интенсивные пики соответствуют липидам.
На Фиг. 3 приведены примеры масс-спектров различных образцов эндометрия одного пациента, зарегистрированных в режиме отрицательных ионов: (а) эутопический эндометрий; (б) эндометриоидная киста яичника; (в) эндометриоз брюшины малого таза. Более 300 пиков в диапазоне масс от 400 до 1000 детектируются выше порога интенсивности равного 20 условных единиц.
2
2
2
2
На Фиг. 4 приведены графики счетов, полученные на основании OPLS-DA анализа МС данных по относительной интенсивности ионов, зарегистрированных в режиме положительных ионов, для эктопического и эутопического эндометрия. Статистическая модель OPLS-DA характеризуется значениями R=0,88 и Q=0,64. Второй параметр свидетельствует о хорошей прогнозирующую способность для классификации ткани в случаях отделения эндометриомы яичников от эутопического эндометрия. Статистическая модель OPLS-DA для отделения перитонеального эндометриоза от эутопического эндометрия имела еще лучшую точность при дифференцировке тканей, что следует из значений R=0,96 и Q=0,80.
На Фиг. 5 приведены графики счетов OPLS-DA анализа, построенные согласно МС данным по относительной интенсивности ионов, зарегистрированных в режиме положительных ионов, для эктопического и эутопического эндометрия. Данная модель также демонстрирует высокую точность дифференцировки эктопического от эутопического эндометрия и может использоваться как дополнение к модели по МС данным, полученным для положительных ионов.
На Фиг. 6 приведено сравнение относительных уровней липидов, наиболее существенных для классификации эндометриоидных тканей. Набор липидов определен с помощью анализа важности переменной в проекции (variable importance in projection - VIP) по результатам OPLS-DA обработки масс-спектрометрических данных, полученных для образцов эутопического и эктопического эндометрия тридцати пациентов в соответствии с предлагаемым методом анализа в (а) режиме положительных ионов; (б) режиме отрицательных ионов. Для режима отрицательных ионов приведены только фосфоэтаноламины, так как они дают дополнительную информацию к данным, полученным в режиме положительных ионов.
Способ был реализован на масс-спектрометре Maxis Impact qTOF (BrukerDaltonics, Bremen, Germany), который имеет типичный для современных масс-спектрометров входной интерфейс для работы с источниками ионизации при атмосферном давлении. Для получения стабильного электрораспыления с ткани необходимо установить оптимальные параметры, которые зависят от модели прибора. В случае масс-спектрометра Maxis Impact использовались следующие параметры: на ткань подается в постоянном режиме водно-метанольный раствор (1/9) со скоростью 1 мкл/мин насосом Dionex хроматографической системы; расстояние между образцом и входом в масс-спектрометр около 5-10 мм; приложенный потенциал между тканью и входным капилляром масс-спектрометра 4,2 кВ. Сигнал от ткани записывается в течение 3 минут после выравнивания общего ионного тока (TIC). Схема МС анализа следующая: регистрация масс-спектров положительных ионов в течение 3 минут; 3 минуты анализа с помощью тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) для дальнейшей идентификации ионов; 3 минуты регистрация в режиме отрицательных ионов; 3 минуты DDA анализа в режиме отрицательных ионов. Масс-спектры регистрируются с частотой 2 Гц, то есть 360 спектров за 3 минуты. Диапазон масс m/z 400-1000. Тандемная МС проводится методом результат-зависимого анализа - DDA - со следующими параметрами: три наиболее интенсивных пика выбираются после полного сканирования всего диапазона масс и подвергаются фрагментации посредством столкновительной диссоциации с энергией 35 eV, время исключения иона из анализа составило 1 минуту.
Возможность реализации заявляемого метода с получением заявленного технического результата иллюстрируют нижеследующие примеры анализа тканей для демонстрации воспроизводимости метода, возможности дифференциации тканей эндометрия, идентификации возможных маркерных веществ для классификации типа ткани, сравнение с классическими рутинными методами анализа тканей.
В качестве ПРИМЕРА 1, демонстрирующего воспроизводимость метода получения масс-спектров тканей на Фиг. 2 и 3 приведены масс-спектры эктопического и эутопического эндометрия одного пациента в положительной и отрицательной модах. Обнаруживается воспроизводимая разница в распределении относительной интенсивности пиков. Относительное стандартное отклонение интенсивности пика составляет менее 5% для одного куска ткани и около 5-10% для близлежащих кусков ткани одного типа.
В качестве ПРИМЕРА 2, демонстрирующего возможности работы метода для дифференциации образцов биологических тканей, приведены масс-спектры эндометрия (Фиг. 2 и 3), полученные при оперативном вмешательстве по поводу наружного генитального эндометриоза в ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России на масс-спектрометре Maxis Impact qTOF (BrukerDaltonics, Bremen, Germany),c использованием предлагаемого метода. Дифференциация тканей и идентификация возможных маркерных молекул опирается, в том числе, на спектры тандемной масс-спектрометрии, полученные при столкновительной диссоциации ионов в автоматическом режиме, что делает существенным стабильный ионный ток (здесь более 10 минут), обеспечиваемый постоянным потоком растворителя, подаваемого на образец.
В качестве ПРИМЕРА 3 для демонстрации возможности предлагаемого метода приведена Таблица 1 со списком идентифицированных липидов, полученная путем обработки масс-спектров положительных ионов, аналогичных представленному на Фиг. 2.
В качестве ПРИМЕРА 4 показана возможность классификации тканей эктопического и эутопического эндометрия. В результате построения OPLS-DA модели для МС данных, полученных в режиме положительных ионов, (Фиг. 4) были выделены две главные компоненты и разработан оценочный параметр (ОП), позволяющий отличить эндометриоидную кисту яичника (-1<ОП<0) от эутопического эндометрия (0<ОП<1), и четыре главные компоненты для перитонеального эндометриоза (-1<ОП<0) и эутопического эндометрия (0<ОП<1).
2
2
2
2
2
2
Созданная статистическая модель при анализе эндометриоидной кисты яичника и эутопического эндометрия позволяет описать 0,88 данных с использованием латентных переменных (R). По результатам перекрестной проверки значение Q для модели составило 0,64. Данная величина показывает ожидаемую точность классификации неизвестных тканей. У модели для перитонеального эндометриоза и эутопического эндометрия соответствующие величины составили R=0,96, Q=0,80, что говорит о высокой значимости и возможной диагностической ценности модели. Приведенные на Фиг. 5 графики счетов статистических моделей OPLS-DA, созданных по МС данным, полученным в режиме отрицательных ионов, демонстрирует меньшую точность дифференцировки эктопического от эутопического эндометрия (в частности, для перитонеального эндометриоза и эутопического эндометрия - R=0,82, Q=0,51, но благодаря комплементарности данных, зарегистрированных в режимах положительных и отрицательных ионов, может использоваться как дополнение к модели OPLS-DA по масс-спектрометрическим данным положительной ионов.
В качестве ПРИМЕРА 5 приведены данные (Фиг. 6) по веществам, важным для классификации эктопического и эутопического эндометрия. Такие вещества характеризуются наибольшими VIP значениями, полученными в результате OPLS-DA анализа МС данных. Такими веществами являются липиды и их окисленные формы (Таблица 1). На Фиг. 6а представлено относительное содержание 12 липидов с максимальным значением VIP для модели, построенной по данным, полученным в режиме положительных ионов. На Фиг. 6б представлены уровни наиболее значимых фосфоэтаноламинов (РЕ) для модели, построенной по отрицательным ионам, без указания фосфатидилхолинов (PC) и сфингомиелинов (SM), поскольку эти же липиды значимы и в OPLS-DA модели для положительных ионов. То есть на Фиг. 6б приведены данные только по липидам, которые принадлежат к классу РЕ и дополнительно появляются в масс-спектре. Представленность большинства маркерных липидов в тканях эндометриоидных кист яичника и эндометриоза брюшины практически не различается в отличие от таковой в эутопическом эндометрии.
2
2
В качестве ПРИМЕРА 6 приведено сравнение информативности предлагаемого метода дифференциации тканей эктопического и эутопического эндометрия с классическим методом на основе глубокого исследования липидома экстракта ткани с помощью жидкостной хроматографии с масс-спектрометрической детекцией. Сравнение проведено на материалах, полученных от 25 пациенток ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Предлагаемый в изобретении дифференциации тканей эндометрия метод обнаружил сравнимую с классическим подходом точность (R=0,46, Q=0,74 против 0,47 и 0,82). В обоих случаях маркерные вещества для дифференциации тканей относились к липидам трех классов: РЕ, PC и SM. Таким образом, предлагаемый метод дифференциации тканей эндометрия демонстрирует точность, сравнимую с классическими методами масс-спектрометрии, но при этом занимает значительно меньшее время - несколько минут в сравнении с часами.
Фиг.1. Схема получения масс-спектров тканей после хирургической операции для последующего статистического классификационного анализа.
Фиг. 2. Примеры масс-спектров положительных ионов образцов эндометрия: (а) эутопический эндометрий; (б) эндометриоидная киста яичника; (в) эндометриоз брюшины малого таза.
Фиг. 3. Примеры масс-спектров отрицательных ионов образцов эндометрия: (а) эутопический эндометрий; (б) эндометриоидная киста яичника; (в) эндометриоз брюшины малого таза.
Фиг. 4. Графики счетов OPLS-DA анализа масс-спектрометрических данных, полученных в режиме положительных ионов для эктопического и эутопического эндометрия: А) перитонеальный эндометриоз (область 1) и эутопический эндометрий (область 2); Б) капсула эндометриоидной кисты яичника (область 1) и эутопический эндометрий (область 2); В) эктопический эндометрий (перитонеальный эндометриоз, капсула эндометриоидной кисты яичника - область 1) и эутопический эндометрий (область 2).
Фиг. 5. Графики счетов OPLS-DA анализа масс-спектрометрических данных, полученных в режиме отрицательных ионов для эктопического и эутопического эндометрия: А) перитонеальный эндометриоз (область 1) и эутопический эндометрий (область 2); Б) капсула эндометриоидной кисты яичника (область 1) и эутопический эндометрий (область 2); В) эктопический эндометрий (перитонеальный эндометриоз, капсула эндометриоидной кисты яичника - область 1) и и эутопический эндометрий (область 2).
Фиг. 6. Сравнение относительных уровней липидов наиболее важных для классификации эктопического (1,2) и эутопического эндометрия (3). Представленные наборы веществ получены в результате анализа предлагаемым методом материалов от тридцати пациентов в (А) режиме положительных ионов, (Б) режиме отрицательных ионов.
Список литературы
1. Адамян Л.В., Андреева Е.Н., Аполихина И.А., Беженаръ В.Ф., Геворкян М.А., Гус А.И. и др. Эндометриоз: диагностика, лечение, реабилитация. Федеральные клинические рекомендации по ведению больных. 2013; с. 2-9.
2. Адамян А.В., Сонова М.М., Логинова О.Н., Тихонова Е.С., Яроцкая Е.Л., Зимина Э.В. и др. Сравнительный анализ эффективности диеногеста и лейпрорелина в комплексном лечении генитального эндометриоза. Проблемы репродукции. 2013; 4:33-38.
3. Dmowski W.P., Ding J., Shen J., Rana N., Fernandez B.B., Braun D.P. Apoptosis in endometrial glandular and stromal cells in women with and without endometriosis. Hum Reprod. 2001; 16:1802-8.
4. Vouk K., Hevir N., Ribic-Pucelj M., Haarpaintner G., Scherb H., Osredkar J., et al. Discovery of phosphatidylcholines and sphingomyelins as biomarkers for ovarian endometriosis. Human Reprod. 2012; 27:2955-65.
5. Huang C, Freter C. Lipid Metabolism, Apoptosis and Cancer Therapy. Int. J. Mol. Sci. 2015; 16:924-949.
6. KononikhinA., Zhvansky E., Shurkhay V., Popov I., Bormotov D., Kostyukevich Y. et al. A novel direct spray-from-tissue ionization method for mass spectrometric analysis of human brain tumors. Anal Bioanal Chem. 2015; 407:7797-7805.
7. Rosana M. Alberici, Rosineide C. Simas, Gustavo B. Sanvido,  Priscila M. Lalli, Mario Benassi, Ildenize B. S. Cunha, Marcos N. Eberlin. Ambient mass spectrometry: bringing MS into the "real world". //Anal Bioanal Chem (2010) 398:265-294.
8. Gross,  Ambient Mass Spectrometry (2011). In Gross,  Mass Spectrometry: A Textbook.(pp.621-649). Springer-Verlag Berlin Heidelberg.
9. Wang H et al. (2010) Paper spray for direct analysis of complex mixtures using mass spectrometry. Angew Chem 122(5):889-892.
10. Liu J et al (2011) Leaf spray: direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Anal Chem 83(20):7608-7613.
11. Нu, В., Wang, L., Ye, W.-C, Yao, Z.-P.: In Vivo and Real-time Monitoring of Secondary Metabolites of Living Organisms by Mass Spectrometry. Scientific reports. 3,2104 (2013).
12. Liu, J., Cooks, R.G., Ouyang, Z.: Biological Tissue Diagnostics Using Needle Biopsy and Spray Ionization Mass Spectrometry. Analytical chemistry. 83, 9221-9225 (2011).
13.,Wei, Y., Chen, L., Zhou, W., Chingin, K., Ouyang, Y., Zhu, Т., Wen, H., Ding, J., Xu, J., Chen, H.: Tissue spray ionization mass spectrometry for rapid recognition of human lung squamous cell carcinoma. Scientific reports. 5, 10077 (2015).
14. Zhang, H., Gu, H., Yan, F., Wang, N., Wei, Y., Xu, J., Chen, H.: Direct characterization of bulk samples by internal extractive electrospray ionization mass spectrometry. Scientific reports. 3,2495(2013).
15. Zhang, H., Zhu, L., Luo, L., Wang, N., Chingin, K., Guo, X., Chen, H.: Direct Assessment of Phytochemicals Inherent in Plant Tissues Using Extractive Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Journal of agricultural and food chemistry. 61, 10691-10698 (2013).
16. Chagovets, V., Kononikhin, A., Starodubtseva, N., Kostyukevich, Y., Popov, I., Frankevich, V., Nikolaev, E.: Peculiarities of data interpretation upon direct tissue analysis by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. European journal of mass spectrometry. 22, 123-126 (2016).
17. Bodzon-Kulakowska, A., Cichon, Т., Golec, A., Drabik, A., Ner, J., Suder, P.: DESI-MS as a tool for direct lipid analysis in cultured cells. Cytotechnology. 67, 1085-1091 (2015).
18. Abbassi-Ghadi, N., Jones, E.A., Gomez-Romero, M., Golf, O., Kumar, S., Huang, J., Kudo, H., Goldin, R.D., Hanna, G.B., Takats, Z.: A Comparison of DESI-MS and LC-MS for the Lipidomic Profiling of Human Cancer Tissue. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27, 255-264 (2016).