Оценка полиморфизма гена пролактина у коров молочных пород

Разведение, селекция, генетика

УДК 636.22/.28.082.12

Оценка полиморфизма гена пролактина у коров молочных пород

М.И. Селионова,1 Л.В. Кононова,1 О.В. Сычёва2

1 Всероссийский научно-исследовательский институт овцеводства и козоводства - филиал ФГБНУ «Северо-Кавказский федеральный научный аграрный центр»

2 ФГБОУВО «Ставропольский государственный аграрный университет»

Аннотация. В последние годы изучение полиморфизма стало одним из наиболее актуальных направлений как фундаментальной генетики, так и прикладных исследований. Для молочного животноводства значительный интерес представляет ген пролактина (PRL). Участвуя в инициации и поддержании лактации у млекопитающих, пролактин может являться эвентуальным генетическим маркером молочной продуктивности крупного рогатого скота, а как следствие - дополнительным критерием отбора при селекции. Методом ПЦР-ПДРФ (полиморфизм длин рестрикцион-ных фрагментов) был исследован полиморфизм гена пролактина у коров красной степной, швиц-кой и красно-пёстрой пород (п=83). Установлена как внутри-, так и межпородная особенность ал-лельного полиморфизма гена пролактина. Использование статистического метода Харди-Вайнберга и расчёта критерия соответствия Пирсона %2 для выявления отклонений эмпирического распределения частот генотипов у исследуемых пород скота позволило констатировать, что в популяции коров красно-пёстрой породы наблюдается статистически достоверный сдвиг генетического равновесия в сторону желательного ВВ-генотипа локуса гена пролактина. Полученные данные о наличии полиморфизма по гену пролактина в стадах коров швицкой, красной степной и красно-пёстрой пород можно использовать для совершенствования генофонда молочного скота в направлении увеличения молочной продуктивности и улучшения качества получаемой продукции.

Ключевые слова: коровы, молочные породы, швицкая порода, красная степная порода, красно-пёстрая порода, полиморфизм, ген, пролактин, ПЦР-ПДРФ, генотип, частота встречаемости.

Введение.

Современные успехи молекулярной генетики сделали возможным распознавать гены, связанные с качественными и количественными продуктивными признаками крупного рогатого скота. Выявление желательных аллельных вариантов таких генов позволяет дополнительно к принятым методам отбора и подбора животных проводить селекцию с использованием маркеров на уровне ДНК.

Изучение генотипической структуры «искусственной популяции» является важнейшим условием для поддержания её равновесия и хозяйственной ценности. Среди целого ряда генов, влияющих на молочную продуктивность и качество молока, имеется достаточно обширная группа генов, привносящих наибольший вклад в формирование и функционирование этих качеств. Одним из них, по существу, генетических маркеров, является ген пролактина [1, 2].

Пролактин - один из универсальных гормонов гипофиза с точки зрения его биологической функциональности. Ему принадлежит определяющая роль в лактогенезе, где основное его действие - стимуляция развития молочных желез и лактации. Он действует на альвеолы молочных желез и отвечает за синтез основных компонентов молока, включая белки, лактозу и липиды. Про-лактин участвует в каждой стадии экспрессии генов молочного белка, то есть транскрипции, стабилизации мРНК, трансляции и посттрансляционной модификации белков.

Ген пролактина у крупного рогатого скота состоит из пяти экзонов и четырех интронов, место локализации - 23 хромосома. На основании анализа последовательности кДНК гена bPRL четырёх различных клонов было установлено семь возможных нуклеотидных замен. Одной из них является «молчащая» А^ замена в экзоне III гена, возникающая в кодоне для 103 аминокислоты и приводящая к появлению полиморфного RaI-сайта [3, 4].

28 Разведение, селекция, генетика

Ген пролактинового рецептора имеет 2 аллельных варианта: PRLA и PRLB. Установлено, что аллель PRLB обусловливает более высокое содержание белка в молоке, лучшие коагуляцион-ные свойства молока и больший выход сыра. По данным многих исследователей, коровы с генотипом BB по гену пролактина являются наиболее обильномолочными и жирномолочными, а также имеют самый высокий выход белка и молочного жира [5-7].

Распределение частот генотипов и аллелей по RaI-полиморфизму гена bPRL у крупного рогатого скота изучалось многими исследователями, но зачастую результаты противоречивы и требуют более детального изучения. В одних исследованиях выявлено преобладание гетерозиготного генотипа AB, в других работах установлено преобладание аллеля A, в некоторых - аллеля В [8, 9]. Ряд авторов указывает на положительную связь генотипов АА и AB с удоем и белковомолочно-стью в стадах чёрно-пёстрой, голштино-фризской и бурой швицкой пород [10]. Иные, обратные зависимости, установлены для коров красно-пёстрой породы [11].

Участвуя в инициации и поддержании лактации у млекопитающих, пролактин может служить эвентуальным генетическим маркером молочной продуктивности крупного рогатого скота, а как следствие - дополнительным критерием отбора при селекции. B связи с этим исследование популяции коров по гену пролактина представляется актуальным.

Цель исследования.

Установить полиморфизм, определить частоту встречаемости генотипов и аллельных вариантов в гене пролактина исследуемых пород скота молочного направления продуктивности.

Материалы и методы исследования.

Объект исследования. Коровы швицкой, красной степной и красно-пёстрой пород.

Обслуживание животных и экспериментальные исследования были выполнены в соответствии с инструкциями и рекомендациями Russian Regulations, 1987 (Order No. 755 on 12.08.1977 the USSR Ministry of Health) and «The Guide for Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press Washington, D.C. 1996)». При выполнении исследований были предприняты усилия, чтобы свести к минимуму страдания животных и уменьшения количества используемых образцов.

Схема эксперимента. Исследования на наличие однонуклеотидного полиморфизма в гене PRL были проведены на трёх группах крупного рогатого скота. Первая группа - коровы красной степной породы (n=20), вторая - швицкой (n=28), третья - красно-пёстрой (n=35).

Экспериментальная часть работы выполнялась в лаборатории иммуногенетики и ДНК-технологий Всероссийского научно-исследовательского института овцеводства и козоводства-филиала Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Северо-Кавказский федеральный научный аграрный центр».

ДНК из цельной крови коров была выделена с использованием наборов реагентов Diatom™ DNA Prep 100 согласно инструкции, предоставленной фирмой-производителем.

Оборудование и технические средства. Наборы реагентов Diatom™ DNA Prep 100 (ООО Лаборатория «Изоген», г. Москва). Наборы «GenPakR PCR Core» (ООО Лаборатория «Изоген», Россия), четырёхканальный программируемый термостат «Терцик» (фирма «ДНК-технология», Россия). Эндонуклеаза RSaI (ООО «СибЭнзим-М», Россия).

Амплификацию гена пролактина проводили на наборах «GenPakR PCR Core» на четырёх-канальном программируемом термостате «Терцик» по следующей ПЦР-программе: «горячий старт» - 5 минут при +95 °С; +30 циклов: денатурация - 30 секунд при +95 °С, отжиг - 30 секунд при +63 °С, синтез - 30 секунд при +72 °С, достройка - 10 минут при +72 °С с использованием следующих праймеров производства компании ООО «Синтол» (Россия): PRL - f: 5' - CGA GTC CTT ATG AGC TTG ATT CTT- 3' PRL - r: 5' - GCC TTC CAG AAG TCG TTT GTT TTC- 3'

Для контроля прохождения реакции, а также оценки качества и концентрации ПЦР-продуктов проведён электрофорез в 1,5 %-ном агарозном геле. Длина амплифицированного фрагмента гена PRL составила 156 п.н. В качестве маркера молекулярных масс использован GenPak DNA Markers M 50 (Изоген).

Разведение, селекция, генетика 29

Для рестрикции амплифицированного участка гена РКЬ была использована эндонуклеаза RSaI в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя.

При расщеплении продуктов амплификации были идентифицированы следующие генотипы: АА - 156 п.н.; ВВ - 82; 74 п.н. (желательный генотип); АВ - 156; 82 и 74 п.н.

Статистическая обработка. Частота встречаемости генотипов была определена по форму-

ле(1):

п

Р = ~ (1),

N

где р - частота определения генотипа,

п - количество особей, имеющих определённый генотип, N - общее число особей.

Частота встречаемости аллелей была рассчитана по формуле (2):

2пАА+пАВ 2пВВ+пАВ

РА =- и =- 2,

где р - частота аллеля А, q - частота аллеля В; N - общее число особей;

пАА, пАВ, пВВ - число особей с данным генотипом.

По закону Харди-Вайнберга рассчитали ожидаемое распределение генотипов в исследуемых популяциях.

Величина %2 (критерий соответствия Пирсона) выражается любым положительным числом от 0 до да и была определена по формуле (3):

т = Ъ—-— (3),

"Е

где Нф - фактически наблюдаемое количество генотипов,

Н£ - теоретически ожидаемое количество генотипов. Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием программы «BюStat» (Апа^ой 1пс., США).

Результаты исследования.

ДНК-диагностикой с использованием ПЦР-ПДРФ выявлено наличие полиморфизма в ло-кусе гена РКЬ у исследованных молочных пород крупного рогатого скота. Полиморфизм представлен двумя аллелями: А и В с разной частотой встречаемости (табл. 1).

Таблица 1. Частоты аллелей гена PRL у коров молочных пород

Порода животных п Частота аллелей Частота генотипов

А В АА АВ ВВ

Красная степная 20 0,70 0,30 0,50 0,40 0,10

Швицкая 28 0,73 0,27 0,54 0,39 0,07

Красно-пёстрая 35 0,29 0,71 0,23 0,11 0,66

Общей характерной особенностью для исследуемого поголовья (п=83) оказалась низкая частота встречаемости аллеля В и высокая - аллеля А в красной степной и швицкой породах. Доля желательного для селекции аллеля В варьировала от 0,27 у коров швицкой породы до 0,30 - у коров красной степной, что можно считать сравнительно равномерным распределением данного аллеля. Максимально часто (0,70-0,73) встречался аллель А у коров анализируемых пород. Выявленная тенденция нашла отражение в частоте встречаемости генотипов как гомозиготных (АА, ВВ), так и гетерозиготных (АВ).

30 Разведение, селекция, генетика

Среди тестированных коров швицкой и красной степной пород в 7-10 % случаев присутствовал предпочтительный генотип ВВ. Отмечена практически одинаковая частота встречаемости гетерозиготного варианта АВ в исследованных группах животных - 39 и 40 % соответственно. Можно предположить, что увеличение фактического количества гетерозигот способствует большей вероятности получения животных желательного генотипа.

Для коров красно-пёстрой породы характерно иное распределение как аллелей, так и генотипов. Доля желательного для селекции аллеля В составила 0,71, а аллеля А - 0,29. В данной группе коров в локусе гена PRL выявлено 23 % животных с генотипом АА, 11 % - АВ и 66 % - ВВ.

Вычислением генетической сбалансированности уровня полиморфности у изучаемых пород молочного скота на основе учёта степени гомо-, гетерозиготности отмечено некоторое своеобразие генетической структуры, выразившееся в определённой вариабельности изучаемых показателей (табл. 2).

Таблица 2. Генетическая структура выборки коров молочных пород

Показатель Порода

красная степная швицкая красно-пёстрая

Гомозиготы (n) 12 17 31

Гетерозиготы (n) 8 11 4

Hobs 0,667 0,647 0,129

Hex 0,724 0,651 0,691

PRL x2 0,045 0,001 18,148

Са, % 58 61 59

Na 1,72 1,65 1,7

V, % 44,2 40,9 42,4

ТГ - 0,057 Ф<Т - 0,004 Ф<Т - 0,562 Ф<Т

Установлено, что уровень гомозиготности (Ca) в локусе гена пролактина был наибольшим (61 %) в группе коров швицкой породы, 59 % - в выборке красно-пёстрой и наименьшим (58 %) - в группе коров красной степной породы.

Число эффективно действующих аллелей (уровень полиморфности локуса, Na) является величиной, обратной степени гомозиготности. Как известно, чем выше степень гомозиготности, тем меньше число эффективных аллелей в генотипах и тем значительнее уменьшается генетическое разнообразие в популяции. Таким образом, наибольшее число Na (1,72) выявлено в группе коров красной степной породы, наименьшее (1,65) - в группе коров швицкой породы.

Сравнительный анализ уровня наблюдаемой (Hobs) и ожидаемой (Hex) гетерозиготности свидетельствует о неоднозначности характера его распределения в исследуемом поголовье молочного скота. Если у швицкой и красной степной пород разница между наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготностью - небольшая, и тест гетерозиготности (ТГ), свидетельствующий об уровне генетического разнообразия популяции, в исследуемых стадах в локусе гена пролактина составил -0,004 в швицкой породе, -0,057 - в красной степной породе, то -0,562 - у животных красно-пёстрой породы, при этом Hobs=0,129, а Hex=0,691.

Для оценки значимости селективного различия между генотипами, обусловленного действием естественного отбора или селекции, необходимо проверить соответствие фактических частот генотипов теоретически ожидаемым согласно закону Харди-Вайнберга, для чего был рассчитан критерий соответствия Пирсона (табл. 3).

Величина %2 зависит от числа степеней свободы. Расчёт критерия %2 проводили при уровне значимости Р > 0,99. Значение %2 для швицкой породы составило 0,001 и 0,045 - для красной степной, что значительно меньше, чем стандартное значение %2=9,2 при данном уровне значимости.

Разведение, селекция, генетика

Таблица 3. Значения критерия Пирсона, х2 по гену PRL

Порода животных n Фактически наблюдаемое распределение генотипов Теоретически ожидаемое распределение генотипов Критерий Пирсона, х2

АА АВ ВВ АА АВ ВВ

Красная степная Швицкая Красно-пёстрая 20 10 8 2 9,80 8,40 1,80 0,045 28 15 11 2 14,92 11,04 2,04 0,001 35 8 4 23 2,86 14,30 17,84 18,148

Следовательно, генное равновесие в данных выборках не нарушено. В группе коров красно-пёстрой породы %2=18,148, это свидетельствует о том, что в данной популяции генное равновесие нарушено (фактическое распределение генотипов не соответствует теоретически ожидаемому).

Обсуждение полученных результатов.

Исследования, проведённые на разных породах крупного рогатого скота молочного направления продуктивности, также показывают различающие частоты аллелей и генотипов по гену пролактина [12, 13].

Результаты исследований М.А. Леоновой, Л.В. Гетманцевой и А.В. Усатова по изучению генетической структуры коров красной степной породы по гену пролактина выявили полиморфизм и наличие следующих генотипов АА, AG и GG с частотой 6,3; 31,2 и 62,5 % соответственно [14].

Нами на основании проведённых исследований установлено, что частота А-аллеля гена пролактина у коров красной степной и швицкой пород значительно превышает частоту В-аллеля. Частота доминирующего генотипа составляет 54 % у швицкого скота и 50 % - у коров красной степной породы. Можно предположить, что достаточно большое количество гетерозигот в стаде (39-40 %) будет способствовать в дальнейшем получению животных желательного генотипа. Аналогичные результаты были получены в работах Alfonso E. и соавторов, проведённых на американо-швейцарском типе коров, где преобладал аллель А с частотой 87,7 % [15].

В выборке коров красно-пёстрой породы выявлена обратная закономерность: наименьшая концентрация аллеля А - 29 % и наибольшая - аллеля В - 71 %. Отмечается преобладание В-ал-леля над аллелем А в 2,45 раза. Для гомозиготного, желательного для селекции ВВ-генотипа, характерна высокая частота встречаемости (0,66), при этом гомозиготный АА-вариант присутствовал с частотой 0,23, а гетерозиготный АВ - 0,11.

Использование статистического метода Харди-Вайнберга и метода %2 для выявления отклонений эмпирического распределения частот генотипов у коров исследуемых пород позволило констатировать, что в популяции коров крупного рогатого скота красно-пёстрой породы наблюдается статистически достоверный сдвиг генетического равновесия в сторону желательного ВВ-генотипа локуса гена пролактина.

Расхождения между фактически наблюдаемыми частотами генотипов и теоретически ожидаемыми не случайны. Причиной этого может быть давление искусственного отбора, в результате которого в популяции животных красно-пёстрой породы произошло нарушение генного равновесия в сторону преобладания ВВ-генотипа.

Таким образом, можно утверждать, что особенности полиморфизма гена пролактина обусловлены породной принадлежностью коров. Анализ генетической структуры популяции молочных коров свидетельствует о неоднозначности распределения предпочтительных для селекции аллелей.

Выводы.

Использование молекулярно-генетических методов позволило определить генетическую структуру исследуемого поголовья красной степной, швицкой и красно-пёстрой пород молочного скота.

32 Разведение, селекция, генетика

Практическая значимость данных исследований, прежде всего, в том, что они позволяют решить ряд прикладных задач селекции, одной из которых является выявление генетических маркеров, сопряжённых с молочной продуктивностью. Полученные данные о наличии полиморфизма по гену пролактина в стадах коров швицкой, красной степной и красно-пёстрой пород можно использовать для совершенствования генофонда молочного скота в направлении повышения молочной продуктивности и улучшения качества получаемой продукции.

Литература

1. Горлов И.Ф., Сычева О.В., Кононова Л.В. Бета-казеин: известный, но не познанный // Молочное и мясное скотоводство. 2016. № 6. С. 18-19.

2. Сычева О.В., Кононова Л.В. Повышение молочной продуктивности и качества молока под контролем генетических маркеров // Современное экологическое состояние природной среды и научно-практические аспекты рационального природопользования: II междунар. науч.-практ. ин-тернет-конф. ФГБНУ «Прикаспийский НИИ аридного земледелия». С. Соленое Займище, 2017. С. 1422-1424.

3. New insights into the prolactin-Rsal (PRL-Rsal) locus in Chinese Holstein cows and its effect on milk performance traits / C.H. Dong, X.M. Song, L. Zhang, J.F. Jiang, J.P. Zhou and. Y.Q. Jiang // Genetics and Molecular Research. 2013. V. 12. № 4. P. 5766-5773.

4. Use of the Bovine Prolactin Gene (bPRL) for estimating genetic variation and milk production in aboriginal Russian breeds of Bos Taurus / I.V. Lazebnaya, O.E. Lazebny, S.R. Khatami, G.E. Sulimova // Prolactin, Edited by Gyorgy M. Nagy and Bela E. Toth. Rijeka: INTECH. 2013. P. 35-52.

5. Генотипирование холмогорского и голштинского скота по генам пролактина и сомато-тропина / И.Е. Багаль, И.Ю. Павлова, Я.А. Хабибрахманова, Л.А. Калашникова, В.Л. Ялуга // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. 2014. № 5. С. 11-13.

6. Полиморфизм генов гормона роста bGH и пролактина bPRL и изучение его связи с процентным содержанием жира в молоке у коров костромской породы / И.В. Лазебная, О.Е. Лазебный, М.Н. Рузина, Г.А. Бадин, Г.Е. Сулимова // Сельскохозяйственная биология. 2011. № 4. С. 46-51.

7. Полиморфизм генов CSN3, bPRL и bGH у коров костромской породы в связи с показателями молочной продуктивности / А.В. Перчун, И.В. Лазебная, С.Г. Белокуров и др. // Фундаментальные исследования. 2012. № 11. С. 304-308.

8. Молочная продуктивность коров холмогорской породы с разными генотипами молочных белков / И.Е. Багаль, Я.А. Хабибрахманова, Л.А. Калашникова, В.Л. Ялуга // Молочное и мясное скотоводство. 2015. № 7. С. 6-9.

9. Полиморфизм генов гормона роста и пролактина в связи с признаками качества молока у крупного рогатого скота ярославской породы / И.В. Лазебная, О.Е. Лазебный, В.Ф. Максименко, Г.Е. Сулимова // Сельскохозяйственная биология. 2012. № 2. С. 39-44.

10. Chung E.R., Rhim T.J., Han S.K. Associations between PCR-RFLP markers of growth hormone and prolactin genes and production traits in dairy cattle // Korean Journal of Animal Science. 1996. 38: 321-336.

11. Alipanah M., Kalashnikova L., Rodionov G. Association of prolactin gene variants with milk production traits in Russian Red Pied cattle // Iranian Journal of Biotechnology. 2007. 5(3): 158-161.

12. New insights into the prolactin-RsaI (PRL-RsaI) locus in Chinese Holstein cows and its effect on milk performance traits / C.H. Dong, X.M. Song, L. Zhang, J. Jiang, F. Jiang // Genetic and Molecular Research. 2013. November. 12(4): 5766-5773.

13. Khaizaran Z., Al-Razem F. Analysis of selected milk traits in Palestinian Holstein-Friesian cattle in relation to genetic polymorphism // Journal of Cell and Animal Biology 2014 April. Vol. 8(5). P. 74-85.

14. Леонова М.А., Гетманцева Л.В., Усатов А.В. Роль гена пролактина и его рецептора в формировании признаков продуктивности сельскохозяйственных животных // Генетика и разведение животных. 2014. № 4. С. 37-39.

Разведение, селекция, генетика

15. Polymorphism of the prolactin gene (PRL) and its relationship with milk production in American Swiss cattle / Е. Alfonso, R. Rojas, G. Herrera, C. Lemus et al. // African Journal of Biotechnology. 2012.10 April. Vol. 11(29). P. 7338-7343.

Селионова Марина Ивановна, доктор биологических наук, профессор РАН, директор Всероссийского научно-исследовательского института овцеводства и козоводства-филиала ФГБНУ «Северо-Кавказский ФНАЦ», 355017, г. Ставрополь, переулок Зоотехнический, 15, тел.: (8652)37-10-39

Кононова Лидия Валентиновна, кандидат сельскохозяйственных наук, доцент, ведущий научный сотрудник лаборатории иммуногенетики и ДНК-технологий, Всероссийский научно-исследовательский институт овцеводства и козоводства-филиала ФГБНУ «Северо-Кавказский ФНАЦ», 355017, г. Ставрополь, переулок Зоотехнический, 15, тел.: (8652)71-70-08, e-mail: konono-va-lidij@mail.ru

Сычёва Ольга Владимировна, доктор сельскохозяйственных наук, профессор, заведующая кафедрой технологии производства и переработки сельскохозяйственной продукции ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный аграрный университет», 355017, г. Ставрополь, переулок Зоотехнический, 12, тел.: (8652)28-61-69, e-mail: olga-sycheva@mail.ru

Поступила в редакцию 22 февраля 2018 года

UDC 636.22/.28.082.12

Selionova Marina Ivanovna1, Kononova Lidia Valentinovna1, Sycheva Olga Vladimirovna2

1 All-Russian Scientific Research Institute of Sheep and Goat Production - a branch of the North-Caucasian Federal Scientific Agrarian Center, e-mail: kononova-lidij@mail.ru

2 FSBEIHE «Stavropol State Agrarian University», e-mail: olga-sycheva@mail.ru Evaluation of polymorphism of prolactin gene in dairy cows

Summary. In recent years, the study of polymorphism has become one of the priority directions in both fundamental genetics and applied researches. For dairy farming, prolactin gene (PRL) is of considerable interest. Participating in the initiation and maintenance of lactation in mammals, prolactin may be the eventual genetic marker of dairy productivity of horned cattle, and as a consequence, as an additional selection criterion for breeding. By RFLP (restriction fragment length polymorphism) method, polymorphism of prolactin gene was studied in cows of Red Steppe, Schwitz and Red Spotted breeds (n=83). Both intra- and interbreeding peculiarities of allelic polymorphism in prolactin gene were established. The use of Hardy-Weinberg statistical method and calculation of Pearson fitting criterion (%2) for revealing deviations of the empirical frequency distribution in genotypes of the studied cattle breeds made it possible to state that a statistically significant shift of genetic balance towards the designed BB-genotype in the locus of prolactin gene in a population of Red Spotted horned cattle is observed. The obtained data on polymorphism according to prolactin in cow herds of the Schwitz, Red Steppe and Red Spotted breeds can be used to improve the gene pool of dairy cattle in the direction of increasing milk productivity and improving thequality of the products.

Key words: cows, dairy breeds, Schwitz breed, Red Steppe Breed, Red Spotted breed, polymorphism, gene, prolactin, RFLP, genotype, frequency of incidence.