СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ УСИЛЕНИЯ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЭФФЕКТОВ ИНТЕРЛЕЙКИНА 10
METHODS AND COMPOSITIONS FOR INTENSIFYING ANTI-INFLAMMATORY EFFECTS OF INTERLEUKIN 10

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001]
По этой Международной заявке PCT испрашивается приоритет Предварительной Патентной заявки США No. 62/326082, поданной 22 апреля 2016 г.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0002]
Это изобретение относится к способам и композициям для ослабления деактивации передачи провоспалительных сигналов посредством экспрессии, в дополнение к пептиду интерлейкина 10 (IL-10), пептида рецептора IL-10 типа 1 (IL-10R1). Способы находят применение в лечении множества состояний, включая, но без ограничения, нейропатическую боль; симптомы, ассоциированные с рассеянным склерозом, повреждением спинного мозга, ALS, нейровоспалением, артритом и другими заболеваниями суставов, так же как аутоиммунными заболеваниями.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ДЛЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0003]
В следующем обсуждении описаны конкретные статьи и способы с целью описания уровня техники и введения. Ничего из содержащегося в настоящем описании не следует рассматривать как «признание» предшествующего уровня техники. Заявители явно оставляют право демонстрировать, когда это целесообразно, что статьи и способы, на которые ссылаются в настоящем описании, не составляют предшествующий уровень техники по применимым положениям, установленным действующим законодательством.
[0004]
2
2
Воспаление ассоциировано с высвобождением усиливающих боль провоспалительных цитокинов и радикалов, таких как HO и NO. Чтобы ограничить воспаление и повреждение, противовоспалительные цитокины, такие как интерлейкин-10, также высвобождаются; например, в воспаленных тканях, уровень IL-10 повышается до концентраций, достаточных для перекрывания избыточного воспаления. Предшествующие исследования показали, что управляемая плазмидой экспрессия интерлейкина-10 человека (hlL-10) является антиаллодинической при инъекции интратекально в моделях на грызунах нейропатической боли (см. Watkins, USSN 14/066581) и рассеянного склероза (MS) (см. Watkins, et al., USSN 14/370,724), так же как интраартикулярно у крупных животных либо с естественным (собаки), либо с хирургически индуцированным (лошади) остеоартритом (OA) (см. Chavez, et al., USSN 14/905915). Исследования для допуска IND до клинических исследований, проведенные в течение последних нескольких лет, обеспечили убедительное доказательство того, что этот способ лечения хронической боли, вероятно, является как безопасным, так и эффективным у человека. В ходе этих исследований, однако, стало ясным, что IL-10 проявляет максимальную эффективность передачи сигналов, когда присутствует в концентрациях ниже 1 нг/мл, и что увеличение концентраций IL-10 парадоксальным образом приводит к понижающей регуляции IL-10. В данной области существует необходимость в способах и композициях, которые могут преодолевать понижающую регуляцию передачи сигналов IL-10 для достижения более сильной опосредованной IL-10 супрессии воспаления, которая не является зависимой от дозы. Настоящее изобретение нацелено на эту необходимость.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0005]
Это изобретение относится к способам и композициям для определения зависимой от дозы понижающей регуляции IL-10 посредством экспрессии, в дополнение к пептиду интерлейкина-10 (IL-10), пептида рецептора IL-10 типа 1 (IL-10R1) (в настоящем описании «экспрессирующий IL-10/IL-10R1 вектор») в антигенпредставляющей клетке. Способы находят применение в лечении хронической или нейропатической боли; симптомов и физиологического повреждения, ассоциированных с рассеянным склерозом, повреждением спинного мозга, нейровоспалением, ALS и артритом, и другими заболеваниями суставов; так же как аутоиммунных заболеваний.
[0006]
Таким образом, настоящее изобретение относится в одном варианте осуществления к способу лечения воспаления у субъекта, включающему экспрессию из одного или нескольких векторов на основе бактерии, вируса, фага, космиды или искусственной хромосомы пептида интерлейкина-10 (IL-10) и пептида рецептора интерлейкина-10 типа 1 (IL-10R1) в антигенпредставляющих клетках у субъекта. В некоторых аспектах этого варианта осуществления, пептид IL-10, экспрессированный в антигенпредставляющих клетках, содержит мутацию в шарнирной области пептида IL-10, и в некоторых аспектах, пептид IL-10 содержит мутацию, где фенилаланин в положении 129 последовательности IL-10 дикого типа заменен на серин, треонин, аланин или цистеин. В некоторых предпочтительных аспетах, фенилаланин в положении 129 последовательности дикого типа заменен на серин.
[0007]
В некоторых вариантах осуществления, пептиды IL-10 и IL-10R1 экспрессируются с одного вектора, и в некоторых аспектах, вектор представляет собой вирусный вектор, представляющий собой аденоассоциированный вирусный вектор, или вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор. В некоторых аспектах, кодирующие последовательности IL-10 и IL-10R1 транскрибируются в форме одной мРНК, и вектор содержит кодирующую последовательность для внутреннего участка связывания рибосомы между кодирующими последовательностями IL-10 и IL-10R1 или кодирующую последовательность для саморасщепляющегося пептида 2a между кодирующими последовательностями IL-10 и IL-10R1.
[0008]
В некоторых вариантах осуществления, воспаление вызвано нейропатической или хронической болью, и один или несколько векторов доставляют посредством интратекальной инъекции. В других вариантах осуществления, воспаление вызвано MS, и один или несколько векторов доставляют посредством интратекальной инъекции. В других вариантах осуществления, воспаление вызвано аутоиммунным заболеванием, и один или несколько векторов доставляют посредством интратекальной инъекции. В следующих вариантах осуществления, воспаление локализовано в суставе, и один или несколько векторов доставляют посредством интраартикулярной инъекции. В других вариантах осуществления, воспаление представляет собой нейровоспаление.
[0009]
in vitro
В некоторых вариантах осуществления, антигенпредставляющие клетки выбраны из группы из монобластов, моноцитов, астроцитов, олигодендроцитов, микроглии, макрофагов, В-клеток, дендритных клеток, пенистых клеток, лимфобластов и В-лимфоцитов. В некоторых аспектах этого варианта осуществления, антигенпредставляющие клетки отбирают у субъекта, подлежащего лечению, трансдуцируют одним или несколькими векторами и вводят обратно субъекту; однако, в некоторых аспектах, антигенпредставляющие клетки стабильно трансформируют одним или несколькими векторами и поддерживают в культуре.
[00010]
Другие варианты осуществления по изобретению относятся к одиночному вирусному или бактериальному экспрессирующему вектору, содержащему кодирующие области для интерлейкина 10 (IL-10) и рецептора интерлейкина 10 типа 1 (IL-10R1). В некоторых аспектах этого варианта осуществления, вектор представляет собой вирусный вектор, который содержит один промотор, управляющий транскрипцией пептидов IL-10 и IL-10R1, и кроме того, содержит саморасщепляющийся пептид 2a, расположенный между кодирующей областью пептида IL-10 и кодирующей областью пептида IL-10R1.
[00011]
Эти и другие аспекты и применения по изобретению описаны в подробном описании.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[00012]
Фигура 1 представляет собой график абсолютного порога (г) в зависимости от суток после инъекции для результатов, полученных при инъекции крыс с использованием AAV-9-hIL-10 в модели нейропатической боли с использованием хронической компрессии.
[00013]
Фигура 2 представляет собой график абсолютного порога (г) в зависимости от суток после инъекции для результатов, полученных при инъекции крыс с использованием смеси 1:1 AAV9-hIL-10 и AAV9-hIL10R1 в модели нейропатической боли с использованием хронической компрессии.
[00014]
Фигура 3 представляет собой график показателя двигательной активности в зависимости от времени после начала моторных симптомов (суток) для результатов, полученных для интратекально инъецированных крыс с использованием IL-10, инкапсулированного в микрочастицы PLGA (круги), у крыс с рецидивирующе-ремиттирующим EAE. Показатели двигательной активности: 0=норма; 1=паралич кончика хвоста; 2=паралич всего хвоста; 3=слабость задней конечности; 4=паралич задней конечности; 5=полный паралич задней конечности; 6 - частичный паралич передней конечности. N=6 на группу.
[00015]
Нафигуре 4 показаны результаты микроинъекции плазмиды IL-10 в головной мозг нормальных мышей и в воспалительной модели синдрома Дауна на мышах (Dp 16).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определения
[00016]
Если не указано иное, все технические и научные термины, применяемые в настоящем описании, имеют такое же значение, какое является общепринятым для специалиста в области, к которой относится это изобретение. Полное содержание всех публикаций, опубликованных патентных заявок и патентов, упомянутых в настоящем описании, приведено в качестве ссылки с целью описания и раскрытия устройств, моделей на животных, составов и способов, которые можно использовать в связи с описанным в настоящее время изобретением.
[00017]
В рамках изобретения, «антигенпредставляющая клетка» относится к любой из различных клеток, которые экспонируют антиген в комплексе с комплексами главного комплекса гистосовместимости класса II (MHC) на своей поверхности (представление антигена) и которые экспрессируют рецептор IL-10 типа 2 (IL-10R2). Антигенпредставляющие клетки по настоящему изобретению включают, но без ограничения, астроциты, олигодендроциты, микроглию, макрофаги, В-клетки, дендритные клетки и их предшественники.
[00018]
Термин «противовоспалительный», в рамках изобретения, относится к уменьшению действия или продукции одного или несколько провоспалительных цитокинов, продуцированных нервами, нейронами, глиальными клетками, эндотелиальными клетками, фибробластами, мышцами, иммуноцитами или другими типами клеток.
[00019]
Термин «противовоспалительный цитокин», в рамках изобретения, относится к белку, уменьшающему действие или продукцию одного или нескольких провоспалительных цитокинов или белков, продуцируемых нервами, нейронами, глиальными клетками, эндотелиальными клетками, фибробластами, мышцами, иммуноцитами или другими типами клеток. Воспалительные цитокины и белки включают, без ограничения, интерлейкин-1-бета (IL-1(3), фактор некроза опухоли-альфа (TNF-α), интерлейкин-6 (IL-6), индуцируемую синтетазу оксида азота (iNOS) и т.п. Представляющий интерес противовоспалительный цитокин по настоящему изобретению представляет собой интерлейкин-10 (IL-10), полноразмерные молекулы и фрагменты IL-10, так же как модифицированные пептиды IL-10, включая молекулы и фрагменты с делециями, добавлениями и заменами (либо консервативными, либо неконсервативными по природе), в нативной последовательности, при условии, что противовоспалительный цитокин является терапевтически эффективным. Модификации могут являться планомерными, например, посредством сайт-направленного мутагенеза, или могут являться случайными, например, посредством мутаций хозяев, продуцирующих белки, или ошибок из-за амплификации ПЦР. Соответственно, активные белки являются, как правило, в основном гомологичными исходной последовательности, например,белки являются, как правило, более чем на 70% идентичными исходной последовательности.
[00020]
Термин «аутоиммунное заболевание», в рамках изобретения, относится к патологическому состоянию, возникающему из-за аномального иммунного ответа организма против веществ и тканей, в норме присутствующих в организме.
[00021]
«Хроническая боль», в рамках изобретения, относится к боли, персистирующей дольше, чем временные рамки естественного выздоровления, ассоциированного с конкретным типом повреждения или процессом заболевания.
[00022]
Термин «контрольные последовательности» ДНК обозначает в совокупности промоторные последовательности, сигналы полиаденилирования, последовательности терминации транскрипции, вышележащие регуляторные домены, точки начала репликации, внутренние участки связывания рибосом, энхансеры и т.п., которые совместно обеспечивают репликацию, транскрипцию и трансляцию кодирующей последовательности в клетке-реципиенте. Не все из этих типов контрольных последовательностей должны присутствовать, при условии, что выбранная кодирующая последовательность является способной к репликации, транскрипции и трансляции в подходящей клетке-хозяине.
[00023]
in vivo
«Кодирующая последовательность», например, IL-10 или IL-10R1, или последовательность, которая «кодирует» IL-10 или IL-10R1, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется (в случае ДНК) и транслируется (в случае мРНК) в полипептид при помещении под контроль подходящих контрольных последовательностей. Границы кодирующей последовательности определяют посредством нуклеотидов, соответствующих инициирующему кодону на амино-конце, и нуклеотидов, соответствующих стоп-кодону трансляции на карбокси-конце.
[00024]
Термины «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» терапевтической композиции микрочастиц, используемой в способах по изобретению, относятся к нетоксичному, но достаточному количеству терапевтической композиции микрочастиц для обеспечения желательного ответа, такого как уменьшение боли, уменьшение воспаления, облегчение симптомов, вызванных воспалительными заболеваниями, и/или предотвращение физиологического повреждение из-за воспалительного заболевания, и/или облегчение симптомов, вызванных, например, MS, хронической болью, воспалением суставов, нейровоспалением и аутоиммунными заболеваниями. Точное количество необходимой терапевтической противовоспалительной композиции по настоящему изобретению можно менять от субъекта к субъекту, в зависимости от вида, возраста и общего состояния субъекта, тяжести состояния, подвергаемого лечению, конкретного экспрессирующего IL-10/IL-10R1 вектора, подлежащего доставке, способа введения и т.п. Параметры дозирования для настоящих способов представлены в настоящем описании; однако, оптимизацию подходящего «эффективного» количества в любом индивидуальном случае может осуществлять специалист в данной области посредством способов, указанных в настоящем описании, и общепринятых экспериментов.
[00025]
Термин «наполнитель» относится к инертному веществу, добавленному к фармацевтической композиции по изобретению для дополнительного облегчения введения терапевтической композиции микрочастиц. Примеры наполнителей, без ограничения, включают солевой раствор, карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара и типы крахмала, производные целлюлозы, желатин, гиалуроновую кислоту, необязательно, в составе с поверхностно-активным средством, плюроник F-68, растительные масла и полиэтиленгликоли.
[00026]
«in vitro»
The термин относится к событию, происходящему в искусственном окружении, например, в пробирке или реакционном сосуде, в культуре клеток и т.д., а не внутри организма.
[00027]
Термин «сустав» относится к анатомической структуре, в которой встречаются две кости, включая связки, соединяющие кости друг с другом, сухожилия, прикрепляющие мышцы к костям, суставную сумку, синовиальную сумку и синовиальную оболочку. Суставы, которые можно лечить способами по настоящему описанию, включают неподвижные, шарнирные, цилиндрические или шаровидные суставы.
[00028]
Термин «воспаление суставов» или «боль в суставах» относится ко всем типам артрита, вызванного воспалением, где ревматоидный артрит, остеоартрит являются наиболее распространенными, так же как к другим состояниям, вызванным воспалением суставов, включая тендинит, бурсит, воспаление связок, синовит, подагру и системную красную волчанку.
[00029]
В рамках изобретения, термин «рассеянный склероз» или «MS», относится к прогрессирующему, нейродегенеративному заболеванию центральной нервной системы, которое возникает наиболее часто в рецидивирующей/ремиттирующей форме, при которой за периодом демиелинизации следует период функционального восстановления. Стадия восстановления включает ремиелинизацию посредством миграции и созревания клеток-предшественников олигодендроцитов или предшествующих олигодендроцитам клеток. Однако, по мере прогрессирования заболевания, ремиелинизация проходит неудачно с прогрессирующей потерей функций. Возможные объяснения неудачи ремиелинизации интактных аксонов включают дефекты привлечения клеток-предшественников олигодендроцитов к участку демиелинизации или дефекты дифференцировки клеток-предшественников олигодендроцитов до миелинизирующих олигодендроцитов. Несмотря на то, что исследования показывают, что оба аспекта биологии клеток-предшественников олигодендроцитов изменены при MS, молекулярные механизмы, координирующие эти процессы в центральной нервной системе взрослых, понятны не полностью, но, как известно, индуцируют воспаление.
[00030]
Термин «ядерная нацеливающая последовательность» относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая функционирует для улучшения эффективности экспрессии противовоспалительного цитокина а клетке.
[00031]
«Функционально связанные» относится к расположению элементов, при котором описанным таким образом компонентам придают такую конфигурацию, чтобы они осуществляли свою обычную функцию. Таким образом, контрольные последовательности, функционально связанные с кодирующей последовательностью, являются способными вызывать экспрессию кодирующей последовательности. Контрольные последовательности не обязательно должны быть непрерывными с кодирующей последовательностью, при условии, что они функционируют для управления ее экспрессией. Таким образом, например, введение нетранслируемых, хотя и транскрибируемых, последовательностей может присутствовать между промоторной последовательностью и кодирующей последовательностью, и промоторную последовательность все еще можно считать «функционально связанной» с кодирующей последовательностью.
[00032]
Термин «промотор» используют в настоящем описании в его обычном смысле для обозначения нуклеотидной области, содержащей регуляторную последовательность ДНК, где регуляторная последовательность, происходящая из гена, является способной связывать РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию нижележащей (в 3'-направлении) кодирующей последовательности. Промоторы для транскрипции могут включать «индуцируемые промоторы» (где экспрессию полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с промотором, индуцируют посредством аналита, кофактора, регуляторного белка и т.д.), «репрессируемые промоторы» (где экспрессию полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с промотором, индуцируют посредством аналита, кофактора, регуляторного белка и т.д.) и «конститутивные промоторы».
[00033]
С целью описания относительного положения нуклеотидных последовательностей в конкретной молекуле нуклеиновой кислоты на протяжении настоящей заявки, например, когда конкретная нуклеотидная последовательность описана как расположенная «выше», «ниже», «на 3-штрих (3')» или «на 5-штрих (5')» относительно другой последовательности, следует понимать, что это представляет собой положение последовательности на «смысловой» или «кодирующей» цепи молекулы ДНК, которое обозначают как общепринятое в данной области.
[00034]
Термин «исследовательский инструмент», в рамках изобретения, относится к любым способам по изобретению, в которых используют терапевтическую композицию микрочастиц для научного исследования, либо академического, либо коммерческого по характеру, включая разработку других фармацевтических и/или биологических лекарственных средств. Исследовательские инструменты по изобретению не предназначены, чтобы являться лекарственными средствами или являться субъектом разрешения регулирующего органа; вместо этого, исследовательские инструменты по изобретению предназначены, чтобы облегчать исследования и способствовать таким научно-исследовательским работам, включая любые работы, проводимые с намерением получить информацию для поддержки заявки на регистрацию в регулирующий орган.
[00035]
В рамках изобретения, термин «селективный маркер» относится к гену, введенному в клетку, в частности, в контексте этого изобретения, в клетки в культуре, который придает признак, подходящий для искусственного отбора. Общее применение селективных маркеров хорошо известно обычным специалистам в данной области.
[00036]
Термины «субъект», «индивидуум» или «пациент» можно использовать взаимозаменяемо в настоящем описании, и они относятся к позвоночному, предпочтительно, млекопитающему.
[00037]
Термин «терапевтическая композиция» или «терапевтическая противовоспалительная композиция», в рамках изобретения, относится к композиции экспрессирующего IL-10/IL-10R1 вектора, обладающего способностью уменьшать концентрацию и/или воспалительное действие воспалительных цитокинов. Терапевтические композиции по настоящему изобретению можно использовать для лечения, например, MS, хронической боли, воспаления суставов, нейровоспаления и аутоиммунных заболеваний, как измерено в любой из известных моделей на животных или посредством оценки, проведенной у человека.
[00038]
«Обработка» или «лечение» воспаления включает: (1) уменьшение воспаления или обеспечение возникновения воспаления с меньшей интенсивностью у субъекта, который может являться предрасположенным к воспалению, но еще не испытывает или не проявляет симптомов, (2) подавление воспаления, т.е.,остановка развития или обращения симптомов, или физиологического повреждения, вызванного воспалением, или (3) уменьшение или обращение физиологического повреждения, возникающего в результате воспаления.
[00039]
«Вектор» представляет собой репликон, такой как плазмида, фаг, вирусная конструкция, космида, бактериальная искусственная хромосома, искусственная хромосома человеческого происхождения или искусственная хромосома дрожжей, в который можно вставлять другой фрагмент гетерологичной ДНК. Векторы в настоящем описании используют для трансдукции и экспрессии пептидов IL-10 и IL-10R1.
[00040]
Animal Models of Movement Disorders
Using Animal Models in Biomedical Research
Handbook of Experimental Immunology,
Proteins: Structures and Molecular Properties
Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual;
Molecular Cloning: A Laboratory Manual
Biochemistry,
«Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach»
Lehninger, Principles of Biochemistry,
Biochemistry,
В практическом осуществлении способов, описанных в настоящем описании, можно использовать, если не указано иначе, общепринятые способы и описания из органической химии, технологии полимеров, молекулярной биологии (включая рекомбинантные способы), клеточной биологии, биохимии и технологии секвенирования, которые находятся в компетенции специалистов, практикующих в данной области. Конкретные примеры подходящих способов можно получить со ссылкой на примеры в настоящем описании. Однако, конечно, можно использовать также другие эквивалентные общепринятые способы. Такие общепринятые способы и описания можно обнаружить в стандартных лабораторных руководствах, таких как LeDoux (Ed.) (2005), (Academic Press); Chow, et al., (2008), (World Scientific Publishing Co.); Weir and Blackwell (Eds.), Vols. I-IV (Blackwell Scientific Publications); Creighton (1993), (W.H. Freeman and Company); Sambrook and Russell (2006), и Sambrook and Russell (2002), (both from Cold Spring Harbor Laboratory Press); Stryer, L. (1995) Fourth Ed. (W.H. Freeman); Gait (1984), (IRL Press); Nelson and Cox (2000), Third Ed. (W. H. Freeman); и Berg et al. (2002) Fifth Ed. (W.H. Freeman); полное содержание всех из которых приведены в настоящем описании в качестве ссылки для всех целей.
[00041]
Следует отметить, что в рамках изобретения и в прилагаемой формуле изобретения, неконкретизированные и конкретизированные формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если контекст явно не требует иного.
[00042]
Когда приведен диапазон значений, понятно, что каждое промежуточное значение между верхним и нижним пределом этого диапазона и любое другое указанное или промежуточное значение в этом указанном диапазоне включено в изобретение. Верхние и нижние пределы этих меньших диапазонов можно независимо включать в меньшие диапазоны, и они также включены в изобретение, с учетом любого конкретно исключенного предела в указанном диапазоне. Когда указанный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие любой из двух или оба из этих включенных пределов, также включены в изобретение.
[00043]
В следующем описании, многочисленные конкретные детали приведены для обеспечения более полного понимания настоящего изобретения. Однако, специалисту в данной области понятно, что настоящее изобретение можно осуществлять на практике без одной или нескольких из этих конкретных деталей. В других случаях, хорошо известные признаки и способы, хорошо известные специалистам в данной области, не описаны, чтобы избегать затруднения понимания изобретения.
Способы по изобретению
[00044]
Настоящее изобретение относится к способам лечения заболеваний и состояний, ассоциированных с воспалением, посредством введения субъекту вектора, экспрессирующего последовательность, кодирующую интерлейкин-10 (IL-10), и последовательность, кодирующую рецептор интерлейкина-10 типа 1 (IL-10R1). В предпочтительных вариантах осуществления, пептиды IL-10 и IL-10R1 экспрессируются с одного экспрессирующего вектора; однако, в альтернативных вариантах осуществления, кодирующие последовательности IL-10 и IL-10R1 экспрессируются с различных экспрессирующих векторов. В некоторых вариантах осуществления, экспрессирующий IL-10/IL-10R1 вектор(ы) вводят субъекту посредством, например, интратекального введения (для лечения, например, хронической боли, нейровоспаления, MS или аутоиммунных заболеваний) или посредством интраартикулярной инъекции (для лечения воспаления суставов). В других вариантах осуществления, экспрессирующий IL-10/IL-10R1 вектор вводят субъекту посредством клеточной терапии; то есть экспрессирующий IL-10/IL-10R1 вектор сначала используют для трансфекции или трансдукции антигенпредставляющих клеток - включая антигенпредставляющие клетки, отобранные у субъекта - затем антигенпредставляющие клетки вводят субъекту. Способы по настоящему изобретению можно использовать для лечения воспаления и физиологического повреждения, вызванного воспалением, ассоциированным с любым заболеванием или состоянием, включая, но без ограничения, хроническую боль, MS, аутоиммунные заболевания, нейровоспаление и воспаление суставов.
[00045]
Обнаружено, что значительной супрессии большого спектра медиаторов воспаления можно достигать посредством действия противовоспалительного цитокина интерлейкина 10 (IL-10). IL-10 является естественным продуктом как астроцитов, так и микроглии, и связывается с рецепторами, экспрессированными этими клетками, обеспечивая аутокринную регуляцию локализованных воспалительных ответов, образуемых этими клетками. Из-за комплексного характера воспаления, любое средство со способностью восстанавливать нормальную функцию микроглии должно являться способным к нацеливанию на множество различных подсистем одновременно. IL-10 формирует тройной комплекс с двумя рецепторами: IL-10R1 и IL-10R2; связываясь в первую очередь с IL-10R1 (Ding et al., J. Immunol., 167(12):6884-92 (2001)), где этот комплекс затем привлекает IL-10R2. IL-10R2 представляет собой более распространенную и менее избирательную передающую сигналы субъединицу, чем IL-10R1, которая также образует комплексы с IL-22 и его первичным рецептором (Kotenko et al., J. Biol. Chem., 276(4):2725-32 (2001)). IL-10R1 присутствует на низких уровнях в клеточной мембране антигенпредставляющих клеток и подвергается повышающей регуляции посредством передачи сигналов IL-10 и посредством медиаторов воспаления, подобных LPS (Ledeboer et al., Eur. J. Neurosci., 16(7): 1175-85 (2002)). Повышающая регуляция усиливает передачу сигналов через рецептор IL-10R2, активирующую нижестоящие эффекторные молекулы, такие как JAK1, TYK2 и STAT 1 и STAT 3, и усиливает передачу сигналов опосредованно через PI3K-AKT. Эта скоординированная передача сигналов является ответственной за противовоспалительный эффект IL-10, так же как за его способность стимулировать продукцию IgG и пролиферацию В-клеток, несмотря на то, что он осуществляет понижающую регуляцию представления антигена на антигенпредставляющих клетках, таких как макрофаги и T-клетки. Когда IL-10 осуществляет сверхстимуляцию клеток-мишеней, индуцируются два члена класса из восьми белков, называемых супрессорами передачи сигналов цитокинов (SOCS) (Ding et al., J. Immunol., 170(3):1383-91 (2003), Kazi et al., Cell Mol. Life Sci., 71(17):3297-3310 (2014)). SOCS1 и SOCS3 индуцируются посредством IL-10 зависимым от концентрации образом, но SOCS1 специфически ингибирует передачу сигналов IL-10 (Ding et al. 2003, выше), и IL-10R1 подвергается убиквитинилированию посредством SOCS3, убиквитин-лигазы E3, таким образом, понижающей регуляции связанного с мембраной IL-10R1 посредством протеасомного нацеливания (Wei et al., J. Interferon Cytokine Res., 26(5):281-90 (2006)). Авторы настоящего изобретения обнаружили, что в концентрации, превышающей приблизительно 0,5 нг/мл, IL-10 парадоксальным образом ингибирует свою собственную активность. Без связи с теорией, это ингибирование может объяснять, почему опосредованная вирусами экспрессия IL-10, хотя и конститутивная, оказывает ранний терапевтический эффект на нейропатическую боль, которая прекращается довольно быстро, в то время как интратекально введенная плазмида IL-10 обеспечивает вплоть до 12 недель эффекта. То есть, это является феноменом, объясняющим, почему очень высокие уровни индуцированных аденовирусом концентраций IL-10 в спинномозговой жидкости (~10 нг/мл) приводят к отсутствию терапевтического эффекта на боль, в отличие от более сильного эффекта на боль намного меньших концентраций IL-10 в спинномозговой жидкости (~150 пг/мл), наблюдаемых после инъекции плазмиды IL-10. Настоящее изобретение, таким образом, относится к терапии второго поколения, которая очень сильно расширяет терапевтическое окно IL-10 посредством совместной экспрессии IL-10 с его первичным рецептором IL-10R1 для обеспечения конститутивной аутокринной передачи сигналов на антигенпредставляющих (положительных по IL-10R2 клетках).
[00046]
Изобретение в общем относится к способам и терапевтическим противовоспалительным композициям для лечения воспалительных заболеваний и состояний, так же как симптомов и физиологического повреждения, ассоциированных с воспалительными заболеваниями. Изобретение относится также к использованию способов и терапевтических противовоспалительных композиций по изобретению в исследовании воспалительных заболеваний, включая идентификацию лекарственных средств, малых молекул и/или биологических средств, которые можно использовать в сочетании в «коктейле» с терапевтическими композициями по настоящему изобретению. Способы включают стадию введения субъекту экспрессирующего IL-10/IL-10R1 вектора, содержащего кодирующую последовательность IL-10 и кодирующую последовательность IL-10R1. Экспрессирующие IL-10/IL-10R1 векторы по настоящему изобретению, как правило, суспендируют в разбавителе для получения терапевтической композиции. Противовоспалительные терапевтические композиции могут состоять из одного «голого» бактериального вектора или вирусного вектора, способного экспрессировать кодирующие последовательности как IL-10, так и IL-10R1, и трансформировать или трансдуцировать антигенпредставляющие клетки у субъекта, двух бактериальных или вирусных векторов, где один вектор кодирует пептид IL-10, и вектор кодирует пептид IL-10R1, инкапсулированных векторов или трансдуцированных антигенпредставляющих клеток, экспрессирующих IL-10 и IL-10R1.
Векторы и компоненты векторов
[00047]
Экспрессирующий IL-10/IL-10R1 вектор, используемый в некоторых вариантах осуществления способов по настоящему изобретению, содержит бактериальный остов (плазмидную ДНК) или вирусный остов; кодирующую последовательность IL-10; кодирующую последовательность IL-10R1; необязательно, по меньшей мере одну ядерную нацеливающую последовательность на 5'- (выше), 3'- (ниже) или обоих концах кодирующей последовательности IL-10 и/или кодирующей последовательности IL-10R1; внутренний участок связывания рибосомы (IRES) или саморасщепляющийся пептид; и по меньшей мере один промотор и одну или несколько других контрольных последовательностей ДНК. Несмотря на то, что вариант осуществления, где пептиды IL-10 и IL-10R1 экспрессируются с одного вектора, является предпочтительным и представляет собой вариант осуществления, подробно описанный в настоящем описании, следует понимать, что пептид IL-10 и пептид IL-10R1 можно кодировать на отдельных векторах и совместно доставлять непосредственно субъекту или в антигенпредставляющую клетку-реципиента, которую затем доставляют субъекту. Необязательно, экспрессирующий IL-10/IL-10R1 вектор содержит также одну или несколько маркерных последовательностей, чтобы обеспечивать отбор трансформированных клеток во время получения экспрессирующего IL-10/IL-10R1 вектора или после доставки в антигенпредставляющие клетки-реципиенты.
[00048]
F129S
Экспрессирующий IL-10/IL-10R1 вектор содержит по меньшей мере одну кодирующую последовательность IL-10. IL-10 можно использовать в форме дикого типа, или IL-10 может представлять собой мутантный IL-10. Один из представляющих особенный интерес мутантов IL-10 содержит одну или несколько мутаций, вызывающих замены, добавления или делеции аминокислот по сравнению с IL-10 дикого типа в «шарнирной» области белка IL-10. Белок IL-10 человека представляет собой гомодимер, где каждый мономер содержит шесть альфа-спиралей A→F, длина которых составляет 21, 8, 19, 20, 12 и 23 аминокислот, соответственно. Спирали A→D одного мономера нековалентно взаимодействуют со спиралями E и F второго мономера, формируя нековалентный V-образный гомодимер. «Шарнирная» область, намеченная для мутаций в соответствии с настоящим изобретением, содержит две аминокислоты между альфа-спиралями D и E в одном или обоих мономерах IL-10 дикого типа. Например, описаны мутантные белки IL-10 крысы и человека, в которых фенилаланин в положении 129 последовательности дикого типа заменен на остаток серина. (См., например,Sommer, et al., WO2006/130580 и Milligan, et al., Pain, 126:294-308 (2006).) Полученный мутантный IL-10 обозначен как IL-10. Другие замены для фенилаланина дикого типа в положении аминокислоты 129 могут представлять собой, например,треонин, аланин или цистеин. Таким образом, настоящее изобретение в другом аспекте относится к одной или нескольким заменам в положении аминокислоты 129 или в других аминокислотах внутри шарнирной области белка IL-10.
[00049]
IL-10R1 (эталонная последовательность для человека в NCBI: NP_001549.2) представляет собой гликопротеин с одним трансмембранным доменом, экспрессированный на поверхности клеток определенных типов, главным образом, антигенпредставляющих клеток. IL-10R1 связывает IL-10 и является необходимым для биологической активности IL-10. Связывание IL-10 с его рецепторами на поверхности клеток активирует путь передачи сигналов JAK-STAT. После взаимодействия лиганд-рецептор, Jakl (ассоциированный с IL-10R1) и Tyk2 (ассоциированный с IL-10R2), члены семейства ассоциированных с рецепторами тирозинкиназ Janus (JAK), фосфорилируются. IL-10R1 подвергается протеасомной деградации после убиквитинилирования посредством SOCS3.
[00050]
В некоторых вариантах осуществления, вектор может представлять собой бактериальный, фаговый или космидный вектор. В бактериальном векторе можно использовать любой бактериальный остов, известный специалисту в данной области. Обычно выбираемые остовы представляют собой те, в которых, например, присутствуют или отсутствуют соответствующие участки рестрикции для обеспечения простоты клонирования, которые можно легко получать и выделять, которые не являются иммуногенными, и т.п. Иллюстративные векторы, которые можно использовать, включают, но без ограничения, векторы, полученные из рекомбинантной ДНК бактериофага, плазмидной ДНК или космидной ДНК. Например, можно использовать плазмидные векторы, такие как pBR322, pUC 19/18, pUC 118, 119, и серии векторов M13 mp. Бактериофаговые векторы могут включать λgt10, λgt11, λgtl8-23, λZAP/R и серии бактериофаговых векторов EMBL. Космидные векторы, которые можно использовать, включают, но без ограничения, pJB8, pCV 103, pCV 107, pCV 108, pTM, pMCS, pNNL, pHSG274, COS202, COS203, pWE15, pWE16 и серии векторов типа харомиды 9. Дополнительные векторы включают бактериальные искусственные хромосомы (BAC), основанные на функциональной обеспечивающей фертильность плазмиде (F-плазмиде), искусственные хромосомы дрожжей (YAC) и конструкции ДНК, полученные из ДНК бактериофага P1 (PAC).
[00051]
В альтернативных вариантах осуществления, вектор представляет собой вирусный вектор. Как правило, пять наиболее общеупотребительных классов вирусных систем, используемых в генотерапии, можно распределить по категориям на две группы, в зависимости от того, интегрируют ли их геномы в хроматин клетки-хозяина (онкоретровирусы и лентивирусы) или персистируют в ядре клетки преимущественно в форме внехромосомных эписом (аденоассоциированный вирус, аденовирусы и вирусы герпеса).
[00052]
Retroviridae
Одной из систем вирусной доставки, которую можно использовать с конструкциями для экспрессии IL-10 по настоящему изобретению, является система на основе вирусов из семейства . Ретровирусы содержат одноцепочечные РНК-вирусы животных, отличающиеся двумя уникальными признаками. Во-первых, геном ретровируса является диплоидным, состоящим из двух копий РНК. Во-вторых, эту РНК транскрибирует ассоциированный с вирионом фермент обратная транскриптаза в двухцепочечную ДНК. Эта двухцепочечная ДНК, или провирус, может затем интегрировать в геном хозяина и передаваться от родительской клетки к клеткам-потомкам в форме стабильно интегрированного компонента генома хозяина.
[00053]
В некоторых вариантах осуществления, лентивирусы являются предпочтительными членами семейства ретровирусов для использования по настоящему изобретению, в частности, в вариантах осуществления, в которых трансдуцированные антигенпредставляющие клетки представляют собой терапевтическую противовоспалительную композицию, которую вводят субъекту. Лентивирусные векторы часто псевдотипируют с гликопротеинами вируса везикулярного стоматита (VSV-G) и получают из вируса иммунодефицита человека (HIV), этиологического агента синдрома приобретенного иммунодефицита человека (СПИД); вируса висна-маэди, вызывающего энцефалит (висна) или пневмонию у овец; вируса инфекционной анемии лошадей (EIAV), вызывающего аутоиммунную гемолитическую анемию и энцефалопатию у лошадей; вируса иммунодефицита кошек (FIV), вызывающего иммунодефицит у кошек; вируса бычьего иммунодефицита (BIV), вызывающего лимфаденопатию и лимфоцитоз у крупного рогатого скота; и вируса иммунодефицита обезьян (SIV), вызывающего иммунодефицит и энцефалопатию у нечеловекообразных приматов. Векторы на основе HIV, как правило, сохраняют <5% исходного генома, и <25% генома включено в упаковывающие конструкции, что минимизирует возможность получения компетентного по обратной репликации HIV. Биобезопасность дополнительно увеличена посредством разработки самоинактивирующихся векторов, содержащих делеции регуляторных элементов в нижележащей последовательности длинных концевых повторов, исключающие транскрипцию сигнала упаковки, необходимого для мобилизации вектора. Основным преимуществом использования лентивирусных векторов является то, что перенос генов является персистирующим в большинстве типов тканей или клеток.
[00054]
Parvoviridae
Parvoviridae
В другом варианте осуществления настоящего изобретения, используют вирусы из семейства .  содержит семейство небольших одноцепочечных, безоболочечных ДНК-вирусов с геномами длиной приблизительно 5000 нуклеотидов. В члены семейства включен аденоассоциированный вирус (AAV), зависимый парвовирус, который по определению требует совместной инфекции с другим вирусом (как правило, аденовирусом или вирусом герпеса) для инициации и поддержания продуктивного инфекционного цикла. В отсутствие такого вируса-помощника, AAV все еще является компетентным для инфекции или трансдукции клетки-мишени путем опосредованных рецептором связывания и интернализации, проникая в ядро как не делящихся, так и делящихся клеток.
[00055]
Аденовирусы (Ad) представляют собой относительно хорошо охарактеризованную однородную группу вирусов, включающую более 50 серотипов. См., например, Международную заявку PCT No. WO 95/27071. Аденовирусы представляют собой имеющие средний размер (90-100 нм), безоболочечные (без внешнего липидного бислоя), икосаэдрические вирусы, состоящие из нуклеокапсида и двухцепочечного линейного ДНК-генома. Существует 57 описанных серотипов у человека, которые являются ответственными за 5-10% инфекций верхних дыхательных путей у детей, а также, за множество инфекций у взрослых. Их классифицируют как группу I согласно схеме классификации вирусов по Балтимору, что означает, что их геномы состоят из двухцепочечной ДНК, и они являются самыми крупными безоболочечными вирусами. Из-за их большого размера, они способны к транспорту посредством эндосом (т.е., слияние оболочек не является необходимым). Вирион имеет также уникальный «шип» или нить, ассоциированные с каждым пентонным основанием капсида, что способствует прикреплению к клетке-хозяину посредством коксаки-аденовирусного рецептора на поверхности клетки-хозяина. Геном аденовируса представляет собой линейную, не сегментированную двухцепочечную (дц) ДНК, составляющую между 26 и 45 т.п.о., теоретически позволяющую вирусу переносить от 22 до 40 генов. Хотя это значительно больше, чем для других вирусов в его группе по Балтимору, он все еще остается очень простым вирусом и сильно зависит от клетки-хозяина для выживания и репликации. После того, как вирус проникает в клетку-хозяина, эндосома окисляется, что изменяет топологию вируса, вызывая диссоциацию компонентов капсида. С помощью клеточных микротрубочек, вирус транспортируется в комплекс ядерной поры, где аденовирусная частица разбирается. Затем высвобождается вирусная ДНК, которая может проникать в ядро через ядерную пору. После этого ДНК вступает в ассоциацию с молекулами гистонов. Таким образом, может происходить экспрессия вирусных генов, и могут образовываться новые вирусные частицы.
[00056]
В отличие от лентивирусов, аденовирусная ДНК не интегрирует в геном и не подвергается репликации в ходе деления клетки. Сконструированы также рекомбинантные векторы на основе аденовирусов, в частности, векторы с уменьшенным потенциалом для рекомбинации и образования вируса дикого типа. См. Международные заявки PCT No. WO 95/00655 и WO 95/11984.
[00057]
in vivo
Другие вирусные или невирусные системы, известные специалисту в данной области, также можно использовать для доставки экспрессирующих IL-10/IL-10R1 векторов по настоящему изобретению субъекту, включая, но без ограничения, аденовирусно-транспозонные векторы с делецией генов, которые стабильно поддерживают кодируемые вирусом трансгены  посредством интеграции в клетки-хозяева (см. Yant, et al., Nature Biotech. 20:999-1004 (2002)); системы, полученные из вируса Синдбис или вируса леса Семлики(см. Perri, et al., J. Virol. 74(20):9802-07 (2002)); системы, полученные из вируса болезни Ньюкасла или вируса Сендай; или мини-кольцевые ДНК-векторы, лишенные бактериальных последовательностей ДНК (см. Chen, et al., Molecular Therapy. 8(3):495-500 (2003)). Мини-кольцевая ДНК, как описано в Публикации патента США No. 2004/0214329, описывает векторы, обеспечивающие постоянно высокие уровни транскрипции нуклеиновой кислоты.
[00058]
В дополнение к кодирующим последовательностям IL-10 и IL-10R1, ядерные нацеливающие последовательности могут присутствовать в экспрессирующих IL-10/IL-10R1 векторах по настоящему изобретению. Ядерные нацеливающие последовательности представляют собой последовательности, способствующие экспрессии белков, кодируемых кодирующей последовательностью IL-10 и кодирующей последовательностью IL-10R1. Например, в одном аспекте, ядерные нацеливающие последовательности могут связываться с белками-шаперонами для ядерного транспорта, облегчающими поглощение плазмидной ДНК ядром клетки. Такие последовательности включают, но без ограничения, рассеянные (или диспергированные) повторы ДНК или повторяющиеся последовательности, такие как мобильные генетические элементы, фланкирующие или концевые повторы, такие как длинные концевые повторы (LTR) в геномах ретровирусов, таких как SV40, тандемные повторы и инвертированные концевые повторы (ITR) из геномов вирусов, таких как аденоассоциированный вирус и аденовирус. В других аспектах, ядерные нацеливающие последовательности представляют собой последовательности, действующие для связывания факторов транскрипции для импорта в ядро, такие как энхансерные последовательности.
[00059]
В дополнение к остову вектора, кодирующим последовательностям IL-10 и IL-10R1 и, необязательно, одной или нескольким ядерным нацеливающим последовательностям, экспрессирующий IL-10/IL-10R1 вектор по настоящему изобретению содержит одну или несколько контрольных последовательностей ДНК, таких как промоторные последовательности, сигналы полиаденилирования, последовательности для терминации транскрипции, вышележащие регуляторные домены, точкам начала репликации, внутренние участки связывания рибосом и т.п., которые совместно обеспечивают репликацию, транскрипцию и трансляцию кодирующих последовательностей IL-10/IL-10R1 в клетке-реципиенте. Не все из этих контрольных последовательностей должны всегда присутствовать, при условии, что кодирующие последовательности IL-10/IL-10R1 являются способными к репликации, транскрипции и трансляции в соответствующей клетке-хозяине.
[00060]
В частности, экспрессирующие IL-10/IL-10R1 векторы по настоящему изобретению содержат по меньшей мере один промотор, управляющий транскрипцией кодирующих последовательностей IL-10 и I1-10R1. В предпочтительных вариантах осуществления, этот промотор является конститутивным промотором. Термин «конститутивный», при упоминании со ссылкой на промотор, означает, что этот промотор управляет транскрипцией функционально связанной последовательности нуклеиновой кислоты в отсутствие специфического стимула (например, теплового шока, химических веществ, света и т.д.). Как правило, конститутивные промоторы являются способными управлять экспрессией кодирующей последовательности по существу в любой клетке и в любой ткани. Промоторы, используемые для транскрипции пептидов IL-10/I1-10R1, предпочтительно, представляют собой конститутивные промоторы, такие как промоторы генов убиквитина, CMV, β-актина, гистона H4, EF-1α или PGK, контролируемые РНК-полимеразой II, или промоторные элементы, контролируемые РНК-полимеразой I. В предпочтительных вариантах осуществления, используют промоторные элементы, контролируемые РНК-полимеразой III, такие как промоторы U6 (U6-1, U6-8, U6-9, например), промотор H1, промотор 7SL, промоторы Y человека (hY1, hY3, hY4 и hY5), промотор MRP-7-2 человека, промотор аденовируса VA1, human промоторы тРНК человека, промоторы рибосомальной РНК 5s, так же как функциональные гибриды и комбинации любых из этих промоторов.
[00061]
В альтернативных вариантах осуществления, кодирующие последовательности IL-10/I1-10R1 могут находиться под контролем индуцируемого промотора, например, при контролируемой тетрациклином активации транскрипции, когда транскрипцию обратимо включают (Tet-On) или выключают (Tet-Off) в присутствии антибиотика тетрациклина или его производного, такого как доксицилин. В системе Tet-Off, экспрессию генов под контролем отвечающих на тетрациклин элементов можно репрессировать посредством тетрациклина и его производных. Тетрациклин связывается с чувствительным к тетрациклину белком транс-активатором, что делает его неспособным связываться с последовательностями отвечающих на тетрациклин элементов, предотвращая трансактивацию контролируемых отвечающими на тетрациклин элементами генов. В системе Tet-On, с другой стороны, чувствительный к тетрациклину белок транс-активатор является способным инициировать экспрессию, только если он связан с тетрациклином; таким образом, введение тетрациклина или доксицилина инициирует транскрипцию пептидов IL-10/I1-10R1. Другой индуцируемой промоторной системой, известной в данной области, является система экспрессии генов, зависимая от рецептора эстрогенов. По сравнению с системой Tet, система с рецептором эстрогенов не настолько строго контролируется; однако, поскольку система Tet зависит от транскрипции и последующей трансляции гена-мишени, система Tet является не такой быстродействующей, как система с рецептором эстрогенов.
[00062]
Способы по настоящему изобретению описаны для совместной экспрессии пептидов IL-10 и IL-10R1 в одной и той же антигенпредставляющей клетке. Для обеспечения этого, специалист в данной области может использовать ряд способов, включая совместную трансфекцию двух или более плазмид, использование многонаправленных или двунаправленных промоторов или, предпочтительно, получение бицистронных или мультицистронных векторов. В отличие от промоторов, образующих уникальные транскрипты мРНК для каждого экспрессируемого гена, мультицистронные векторы одновременно экспрессируют два или более отдельных пептида - в этом случае, пептиды IL-10 и IL-10R1 - с одной и той же мРНК. Трансляция у эукариот обычно начинается с 5'-кэпа, так что только одно событие трансляции происходит для каждой мРНК. Однако, некоторые бицистронные векторы обладают преимуществом элемента, называемого внутренним участком связывания рибосомы (IRES), для обеспечения инициации трансляции из внутренней области мРНК.
[00063]
Альтернативно, «саморасщепляющиеся» пептиды 2A можно использовать вместо элементов IRES в мультицистронных векторах. Саморасщепляющиеся пептиды являются короткими (приблизительно 20 аминокислот) и образуют эквимолярные количества для множества генов из одной и той же, одиночной, мРНК. «Расщепление» происходит между остатками глицина и пролина, обнаруженными на C-конце саморасщепляющегося пептида, расположенного между кодирующими областями двух различных пептидов. Распространенные саморасщепляющиеся пептиды 2A включают пептиды T2A, P2A, E2A и F2A.
[00064]
Необязательно, вектор по настоящему изобретению содержит также ген селективного маркера, например, кодирующий устойчивость к антибиотику. Маркерные гены для использования по настоящему изобретению включают, но без ограничения рецептор фактора роста нервов человека (детектируемый с использованием моноклонального антитела (MAb), такой как описано в Патенте США No. 6365373); укороченный рецептор фактора роста человека (детектируемый с использованием MAb); мутантную дигидрофолатредуктазу человека (DHFR; доступен флуоресцентный субстрат MTX); секретируемую щелочную фосфатазу (SEAP; доступен флуоресцентный субстрат); тимидилатсинтазу человека (TS; придает устойчивость к противораковому средству фтордезоксиуридину); глутатион-S-трансферазу-альфа человека (GSTA1; конъюгирует глутатион с агентом бусульфаном, избирательно алкилирующим стволовые клетки; хемопротективный селективный маркер для клеток CD34+); антиген клеточной поверхности CD24 для гематопоэтических стволовых клеток; ген CAD человека для придания устойчивость к N-фосфонацетил-L-аспартату (PALA); ген-1 множественной лекарственной устойчивости человека (MDR-1; поверхностный белок P-гликопротеин, обеспечивающий отбор по увеличенной устойчивости к лекарственному средству или обогащение посредством FACS); CD25 человека (IL-2a; детектируемый с использованием MAb-FITC); метилгуанин-ДНК-метилтрансферазу (MGMT; обеспечивающую отбор посредством кармустина); и цитидин-дезаминазу (CD; обеспечивающую отбор посредством Ara-C). Можно использовать также селективные маркеры устойчивости к лекарственному средству, такому как пуромицин, гигромицин, бластицидин, G418, тетрациклин. Кроме того, с использованием сортировки FAC, любой ген флуоресцентного маркера можно использовать для положительного отбора, так же как можно использовать хемилюминесцентные маркеры (например, метки Halotag) и т.п.
[00065]
.
de novo
de novo
Когда предусмотрена доставка экспрессирующего IL-10/IL-10R1 вектора непосредственно субъекту посредством интратекальной или интраартикулярной инъекции, экспрессирующий IL-10/I1-10R1 вектор, предпочтительно, основан на вирусе, как описано вышеОднако, в вариантах осуществления, где трансформированные или трансдуцированные антигенпредставляющие клетки вводят субъекту, как более подробно описано ниже,предусматривают также, что выбранные антигенпредставляющие клетки можно модифицировать для получения искусственных хромосом человека, экспрессирующих пептиды IL-10 и IL-10R1. Полностью функциональные искусственные хромосомы человека обеспечивают несколько преимуществ по сравнению с системами доставки на основе вирусов, включая увеличенный размер полезной нагрузки, тот факт, что поддержание вне хромосом позволяет избегать потенциального повреждения клетки-хозяина и транскрипционного выключения введенных генов, и возможных иммунологических осложнений. В настоящее время, существует несколько способов конструирования искусственных хромосом человека, включая способ «сверху вниз», способ «снизу вверх», получение мини-хромосом и индукцию образования хромосом . Способ формирования искусственных хромосом «снизу вверх» основан на опосредованном клетками формировании хромосом после трансфекции пермиссивной линии клеток с использованием клонированных α-сателлитных последовательностей, которые содержат подходящие для типичной клетки-хозяина центромеры и ген(ы) селективного маркера, в присутствии или в отсутствие теломерной и геномной ДНК. (Протоколы и подробное описание этих способов см., например, в Henning, et al., PNAS USA, 96:592-97 (1999); Grimes, et al., EMBO Rep. 2:910-14 (2001); Mejia, et al., Genomics, 79:297-304 (2002); и Grimes, et al., Mol. Ther., 5:798-805 (2002).) Способ получения искусственных хромосом «сверху вниз» включает последовательные циклы случайного и/или направленного укорочения предсуществующих плеч хромосомы для получения упрощенной искусственной хромосомы, содержащей центромеру, теломеры и точки начала репликации ДНК. (Протоколы и подробное описание этих способов см., например, в Choo, Trends Mol. Med., 7:235-37 (2001); Barnett, et al., Nuc. Ac. Res., 21:27-36 (1993); и Katoh, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 321:280-90 (2004).). Полученные «сверху вниз» искусственные хромосомы конструируют оптимальным образом для удаления природных экспрессируемых генов и модифицируют для содержания последовательностей ДНК, позволяющих сайт-специфическую интеграцию последовательностей ДНК-мишеней в укороченную хромосому, опосредованную, например, сайт-специфическими ДНК-интегразами.
[00066]
de novo
Третьим способом получения искусственных хромосом, известным в данной области, является модификация природных мини-хромосом. Этот способ получения, как правило, включает индуцированную облучением фрагментацию хромосомы, содержащей функциональную, например, человеческую, неоцентромеру, имеющую функции центромеры, но лишенной α-сателлитных последовательностей ДНК и модифицированной для удаления не являющейся необходимой ДНК. (Протоколы и подробное описание этих способов см., например, в Auriche, et al., EMBO Rep. 2:102-07 (2001); Moralli, et al., Cytogenet. Cell Genet, 94:113-20 (2001); и Carine, et al., Somat. Cell Mol. Genet., 15:445-460 (1989).). Как и для других способов получения искусственных хромосом, сконструированные мини-хромосомы можно модифицировать для содержания последовательностей ДНК, позволяющих сайт-специфическую интеграцию последовательностей ДНК-мишеней, таких как последовательности IL-10 и IL-10R1. Четвертый способ получения искусственных хромосом включает индуцированное  образование хромосом посредством направленной амплификации специфических сегментов хромосом. Этот способ включает крупномасштабную амплификацию перицентромерных/рибосомальных областей ДНК, расположенных на акроцентрическиххромосомах. Амплификацию запускают посредством совместной трансфекции избытка ДНК, специфической для перицентрической области хромосом, такой как рибосомальная РНК, вместе с последовательностями ДНК, позволяющими сайт-специфическую интеграцию, например, кодирующих последовательностей IL-10 и IL-10R1 а также селективного маркера устойчивости к лекарственному средству, которые интегрируют в перицентрические области хромосом. (Протоколы и подробное описание этих способов см., например, в Csonka, et al., J. Cell Sci 113:3207-16 (2002); Hadlaczky, et al., Curr. Opini. Mol. Ther., 3:125-32 (2001); и Lindenbaum and Perkins, et al., Nuc. Ac. Res., 32(21):el72 (2004).) В ходе 'того процесса, нацеливание на перицентрические области акроцентрическиххромосом с использованием совместно трансфицированной ДНК индуцирует крупномасштабную амплификацию хромосомной ДНК, дупликацию/активацию центромерных последовательностей, и последующие разрыв и разделение дицентрических хромосом, с получением в результате искусственной хромосомы на основе «разорванной» сателлитной ДНК, содержащей множественные участки сайт-специфической интеграции.
Доставка
[00067]
in vivo,
in vitro
ex vivo
.
in vivo
in-vitro
Экспрессирующие IL-10/IL-10R1 векторы можно вводить субъекту либо либо (что называют также )Введениевключает введение экспрессирующих IL-10/IL-10R1 векторов непосредственно субъекту, и введение включает введение антигенпредставляющих клеток, модифицированных для совместной экспрессии IL-10 и IL-10R1, субъекту.
[00068]
Предпочтительным способом доставки для лечения воспаления суставов является инъекция в сустав (интраартикулярная инъекция), где иглой для подкожных инъекций проводят инъекцию в пораженный сустав для доставки дозы терапевтической противовоспалительной композиции по настоящему изобретению. При лечении хронической или нейропатической боли, MS, нейровоспаления или аутоиммунного заболевания, интратекальное введение является предпочтительным. Интратекальная инъекция включает инъекцию терапевтической противовоспалительной композиции в позвоночный канал или субарахноидальное пространство, так что она достигает спинномозговой жидкости.
[00069]
in vitro,
in vitro
Альтернативно, при трансдукции желательные антигенпредставляющие клетки-реципиенты, предпочтительно, отбирают у субъекта, трансформируют или трансдуцируют экспрессирующим IL-10/IL-10R1 вектором и повторно вводят субъекту (то есть, антигенпредставляющие клетки являются аутологичными). Альтернативно, однако, сингенные или ксеногенные антигенпредставляющие клетки (например, из разработанной линии антигенпредставляющих клеток, уже стабильно трансформированных экспрессирующим IL-10/IL-10R1 вектором) можно трансформировать или трансдуцировать для доставки субъекту. Антигенпредставляющие клетки или их предшественники, которые можно трансформировать или трансдуцировать, включают любые клетки из семейства моноцитов, включая монобласты, моноциты, астроциты, олигодендроциты, микроглию, макрофаги, В-клетки, дендритные клетки, пенистые клетки, лимфобласты и В-лимфоциты. Предшественники антигенпредставляющих клеток можно трансдуцировать и культивировать в недифференцированном состоянии, затем подвергать дифференцировке  перед доставкой субъекту.
[00070]
Экспрессирующий IL-10/IL-10R1 вектор можно доставлять в антигенпредставляющие клетки, подлежащие модификации, любым способом, известным в данной области. Термины трансфекция и трансформация относятся к поглощению экзогенной нуклеиновой кислоты, например, экспрессирующего вектора, клеткой-хозяином, независимо от того, экспрессируются фактически или нет какие-либо кодирующие последовательности. Многочисленные способы трансфекции известны специалисту в данной области, например, посредством опосредованной агробактериями трансформации, трансформации протопластов (включая опосредованную полиэтиленгликолем (PEG) трансформацию, электропорацию, слияние протопластов и слияние микроклеток), опосредованной липидами доставки, липосомы, электропорации, сонопорации, микроинъекции, бомбардировки частицами и опосредованной нитевидными кристаллами карбида кремния трансформации, и их комбинаций; непосредственного поглощения с использованием фосфата кальция; опосредованного полиэтиленгликолем (PEG) поглощения ДНК; липофекции; слияния микроклеток; систем носителей на основе липидов; или других пригодных способов. Успешную трансфекцию, как правило, распознают посредством детекции присутствия транскриптов генов IL-10/IL-10R1 или пептидов IL-10/IL-10R1 в трансфицированной клетке.
[00071]
,
Поскольку вирусные векторы представляют собой предпочтительный вариант осуществления изобретения, антигенпредставляющие клетки предпочтительно трансдуцируют с использованием вирусного вектора. Использование вирусной инфекции является уникальным в том, что используют преимущества природных средств вируса для введения его генетического материала в клетку для переноса представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты в клетку. Как обсуждали вышепримеры вирусов, модифицированных и применяемых для таких способов, включают аденовирусы, аденоассоциированные вирусы и ретровирусы. В общем, представляющие интерес молекулы нуклеиновой кислоты можно клонировать в вирусный геном. После репликации и упаковки вирусного генома, полученная вирусная частица является способной к доставке представляющей интерес нуклеиновой кислоты в клетку посредством механизма проникновения вируса. Обычно, вирусный геном сначала делают дефектным по репликации посредством манипуляций с нуклеиновой кислотой перед добавлением представляющей интерес нуклеиновой кислоты. Полученный вирусный геном или вирусный вектор требует использования вируса-помощника или системы для упаковки для завершения сборки вирусной частицы и высвобождения из клетки.
[00072]
Degradable Aliphatic Polyesters,
Если экспрессирующие IL-10/IL-10R1 векторы предназначены для непосредственного введения субъекту, посредством, например, интратекальной или интраартикулярной инъекции, экспрессирующие векторы можно, необязательно, инкапсулировать для доставки. Способы инкапсуляции экспрессирующего IL-10/ IL-10R1 вектора меняются в зависимости от типа используемых микрочастиц, и такие способы описаны, например, в Chavez, et al., USSN. 14/905915. Микрочастицы могут состоять из любого биоразлагаемого полимера. Для успешного использования в качестве биоразлагаемого полимера в составах для контролируемой доставки лекарственного средства по настоящему изобретению, материал должен быть химически инертным и свободным от вымываемых примесей. В идеале, полимер также имеет подходящую физическую структуру, с минимальным нежелательным старением, и легко поддается переработке. Некоторые из этих материалов включают поли(2-гидроксиэтилметакрилат), поли(N-винилпирролидон), поли(метилметакрилат), поли(виниловый спирт), поли(акриловую кислоту), полиакриламид, сополимер(этилен-винилацетат), поли(этиленгликоль) и поли(метакриловую кислоту). Особенно полезные биоразлагаемые полимеры по настоящему изобретению включают полилактиды (PLA), полигликолиды (PGA), сополимеры(лактид-гликолид) (PLGA), полиангидриды, поликапролактон, поли-3-гидроксибутират и полиортоэфиры. Такие биоразлагаемые полимеры подробно охарактеризованы, и их можно включать в составы для проявления желательных свойств деградации, как известно в данной области (см., например,Edlund & Albertsson, pp. 67-112 (2002), Barman, et al., J. of Controlled Release, 69:337-344 (2000); Cohen, et al., Pharmaceutical Res., (8): 713-720 (1991)).
[00073]
В одном конкретном варианте осуществления изобретения, полимер содержит сополимер(лактид-гликолид) (PLGA). PLGA представляет собой сополимер, который используют во множестве одобренных FDA терапевтических устройств, благодаря его биоразлагаемости и биосовместимости. В зависимости от соотношения лактида к гликолиду, используемого для полимеризации, можно получать различные формы PLGA: их обычно идентифицируют применительно к использованному соотношению мономеров (например,PLGA 75:25 обозначает сополимер, состав которого представляет собой 75% (молярных процентов) молочной кислоты и 25% (молярных процентов) гликолевой кислоты). PLGA деградирует посредством гидролиза его сложноэфирных связей в присутствии воды. Показано, что время, необходимое для деградации PLGA, связано с соотношением мономеров, используемым при получении: чем выше содержание звеньев гликолида, тем меньше время, требуемое для деградации. Исключением из этого правила является сополимер с соотношением мономеров 50:50, для которого показана более быстрая деградация (приблизительно два месяца). Кроме того, для полимеров, кэпированных на конце сложными эфирами (в отличие от свободной карбоновой кислоты), показаны более длительные периоды полужизни применительно к деградации. Альтернативно, экспрессирующий IL-10/IL-10R1 вектор можно инкапсулировать в партии микрочастиц, имеющих различные профили высвобождения; например, 10% экспрессирующего вектора, подлежащего доставке, можно инкапсулировать в микрочастицы, имеющие, например, профиль высвобождения от одних суток до четырех недель; 30% экспрессирующего вектора, подлежащего доставке, можно инкапсулировать в микрочастицы, имеющие, например, профиль высвобождения от трех недель до шести недель; 30% экспрессирующего вектора, подлежащего доставке, можно инкапсулировать в микрочастицы, имеющие, например, профиль высвобождения от шести недель до десяти недель; и 30% экспрессирующего вектора, подлежащего доставке, можно инкапсулировать в микрочастицы, имеющие, например, профиль высвобождения от восьми недель до двенадцати недель. В таком варианте осуществления, можно использовать один тип биоразлагаемого полимера, но использовать в составах с различными профилями высвобождения; альтернативно, можно использовать различные биоразлагаемые полимеры, имеющие различные характеристики высвобождения.
[00074]
После получения микрочастиц, их суспендируют в пригодном разбавителе для получения терапевтической композиции для введения животному. Такие разбавители (или наполнители) включают любое лекарственное средство, которое само не индуцирует продукцию антител, опасных для индивидуума, которому вводят композицию, и которое можно вводить без излишней токсичности. Фармацевтически приемлемые разбавители могут содержать сорбит, квасцы, декстран, сульфат, большие полимерные анионы, любое из различных соединений TWEEN, и жидкости, такие как вода, солевой раствор, глицерин или этанол, масляные и водные эмульсии, или адъюванты, такие как адъювант Фрейнда.
[00075]
Поскольку способы и терапевтические противовоспалительные композиции по изобретению не приводят к значительной индукции иммунного ответа или предельно допустимой дозе у субъектов, их можно использовать и/или вводить, как необходимо для терапевтического эффекта. То есть, терапевтическую противовоспалительную композицию можно доставлять приблизительно каждые 30-90 суток (или как необходимо в соответствии, например, с типом вектора (бактериальный, вирусный (интегративный или нет), искусственная хромомсома) и профилем деградации биоразлагаемого полимера), как необходимо для терапевтического эффекта для кратковременной терапии. Например, когда длительная терапия является желательной, терапевтическую композицию можно доставлять приблизительно каждые 90 суток, как необходимо для терапевтического эффекта в течение более, чем одного года; и если необходимо, на протяжении жизни субъекта.
[00076]
Диапазоны дозирования терапевтических противовоспалительных композиций, используемыхв способах по настоящему изобретению, меняют от субъекта к субъекту, в зависимости от вида, возраста и общего состояния субъекта, тяжести состояния, подвергаемого лечению, и конкретного экспрессирующего IL-10/IL-10R1 вектора, подлежащего доставке, способа введения и т.п. Например, диапазоны дозирования включают терапевтически эффективную дозу при 10-1000 нг ДНК вектора на кг, 20-500 нг ДНК вектора на кг, 25-250 нг ДНК вектора на кг, или 50-100 нг ДНК вектора на кг, в зависимости от желательной продолжительности и анатомической локализации инъекции.
[00077]
Экспрессирующие IL-10/IL-10R1 векторы или микрочастицы, содержащие экспрессирующие IL-10/IL-10R1 векторы, используемые в способах по настоящему изобретению, можно вводить совместно в «коктейле» с другими лекарственными средствами, которые можно использовать в лечении воспаления, включая, но без ограничения, глюкокортикоиды; метотрексат; гидроксихлорохин; сульфасалазин; лефуномид; средства против TNF, такие как этанерцепт, инфликсимаб и адалимумаб; абатацепт; нестероидные противовоспалительные средства (NSAID); ацетат глатирамера и интерферон B, митоксантрон и натализумаб. Кроме того, экспрессирующие IL-10/IL-10R1 векторы, используемые в способах по настоящему изобретению, можно вводить совместно с клетками, такими как стволовые клетки, подвергнутые биоинженерии для экспрессии экспрессирующего IL-10/IL-10R1 вектора. В общем, любой способ, известный в данной области, можно использовать для мониторирования успеха лечения у человека, включая как клинические, так и фенотипические показатели.
Состояния, подлежащие лечению
[00078]
Поскольку композиции и терапевтические противовоспалительные композиции по настоящему изобретению преодолевают понижающую регуляцию IL-10 для достижения сильной опосредованной IL-10 супрессии воспаления, они, таким образом, являются эффективными для лечения ряда заболеваний и состояний. Например, способы и терапевтические противовоспалительные композиции по настоящему изобретению можно использовать для лечения симптомов и повреждений, вызванных рассеянным склерозом (MS). MS представляет собой хроническое, часто истощающее аутоиммунное заболевание центральной нервной системы. Это заболевание поражает приблизительно 2,5-3 миллионов людей во всем мире, и ~400000 людей в США, с постановкой диагноза 200 людям в неделю. На время начала, у ~85% пациентов присутствует рецидивирующе-ремиттирующее заболевание (RRMS), у 10% - первично-прогрессирующее заболевание (PPMS), и у 5% - прогрессирующе-рецидивирующее заболевание (PRMS). Полное неврологическое восстановление обычно происходит после первого приступа RRMS, однако, у ~50% из этих пациентов в течение 10-летнего периода накапливаются все более стойкие неврологические расстройства при последующих рецидивах, и заболевание переходит во вторично-прогрессирующую фазу, которая становится все более инвалидизирующей. Клинические симптомы MS являются очень изменчивыми от пациента к пациенту. Список симптомов включает нарушение когнитивной функции, потерю зрения, слабость, спастичность, отсутствие координации, нарушение баланса, утомляемость, половую дисфункцию, дисфункцию кишечника и мочевого пузыря, парестезию и боль. Клинически значимую боль испытывают так много, как 65% пациентов в ходе течения заболевания, и она представляет собой один из наиболее инвалидизирующих, хотя и недостаточно признанных и часто подвергаемых неадекватному лечению симптомов. Боль обычно является нейропатической, и может иметь изменчивый характер в зависимости от вовлеченных поврежденных нейронов. Следует отметить также, что боль является выраженным симптомом MS, который плохо поддается лечению современными лекарственными средствами.
[00079]
В дополнение к MS, другие состояния, опосредованные потерей миелина, можно лечить с использованием способов и терапевтических противовоспалительных композиций по настоящему изобретению. Эти состояния включают нейровоспаление (т.е., нейровоспаление, вызванное трисомией 21), состояния ишемической демиелинизации, состояния воспалительной демиелинизации, лейкодистрофии у детей, мукополисахаридоз, перинатальную геморрагию зародышевого матрикса, церебральный паралич, перивентрикулярную лейкомаляцию, индуцированные облучением состояния и подкорковую лейкоэнцефалопатию различной этиологии, так же как психические заболевания, такие как шизофрения. Состояния ишемической демиелинизации включают кортикальный инсульт, лакунарный инфаркт, постгипоксическую лейкоэнцефалопатию, диабетическую лейкоэнцефалопатию и гипертензивную лейкоэнцефалопатию. Состояния воспалительной демиелинизации включают рассеянный склероз, болезнь Шильдера, поперечный миелит, неврит зрительного нерва, поствакцинальный энцефаломиелит и постинфекционный энцефаломиелит. Состояния лейкодистрофии у детей включают заболевания лизосомального накопления (например,болезнь Тея-Сакса), болезнь Канавана, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера и глобоидно-клеточную лейкодистрофию Краббе. Примером мукополисахаридоза является болезнь Слая. Индуцированные облучением состояния включают индуцированную облучением лейкоэнцефалопатию и индуцированный облучением миелит. Этиологические причины подкорковой лейкоэнцефалопатии включают HIV/СПИД, травму головы и состояния множественного инфаркта.
[00080]
Кроме того, способы и терапевтические противовоспалительные композиции по настоящему изобретению можно использовать также для лечения воспаления суставов в колене, локте, запястье, лодыжке, бедре, плече или спине. Состояния, поддающиеся лечению посредством способов и терапевтических противовоспалительных композиций по настоящему изобретению, включают ревматоидный артрит и остеоартрит, так же как тендинит, бурсит, воспаление связок, синовит, подагру и системную красную волчанку.
[00081]
Еще одним применением способов и терапевтических противовоспалительных композиций по настоящему изобретению является лечение аутоиммунных заболеваний. Аутоиммунные заболевания представляют собой атаку иммунной системы хозяина на специфические мишени в тканях хозяина, приводящую к критической потере функций и патологическим симптомам. Классическим примером этого феномена является присутствие у пациентов с миастениейантител, нацеленных на никотиновый ацетилхолиновый рецептор, присутствующий в нейромышечном соединении. Поскольку этот рецептор является настолько важным для передачи сигналов от моторных нейронов в мышцы, такие антитела вызывают частичный паралич и другие виды нейромышечной недостаточности. Неясно, почему возникают такие аутоантитела, однако единственным лечением с какой-либо эффективностью являлся плазмаферез; то есть замена фракции плазмы крови для уменьшения концентрации в кровотоке патологического антитела. Несмотря на то, что во многих случаях идентифицированы доминантные антитела, объясняющие специфическую патологию заболевания, не существовало реального прогресса в лечении таких заболеваний. Это может быть частично из-за того, что исследователи настаивали на фокусировании на патогенных антителах и их эффектах, вместо того, чтобы думать об аутоиммунных заболеваниях как о нарушении толерантности.
[00082]
Иммунную толерантность определяют как ограниченный ответ на введение антигена у животных, ранее сероположительных по антителам против этого антигена. Адаптивную иммунную систему можно обучить игнорировать данный антиген посредством подвергания животного воздействию повышающихся доз антигена. Это называют десенсибилизацией и используют в первую очередь у человека для лечения аллергии различных видов, например, аллергии на арахис. Однако, это является медленным и ненадежным процессом, часто неэффективным. Насколько реакционноспособной иммунная система является по отношению к конкретному антигену, частично регулируется равновесием между реакционноспособными, цитотоксическими B- и T-лимфоцитами и более недавно открытыми регуляторными B- и T-клетками. Стимуляция этих клеток с использованием IL-10 индуцирует переключение от цитотоксического до толерантного фенотипа. Фактически, это переключение приводит к секреции IL-10 из этих самых клеток, называемых регуляторными B- и T-клетками. Таким образом, прогнозируют, что подвергание T- и B-клеток воздействию экзогенного IL-10 индуцирует толерантность к антигенам. На практике, однако, получение концентрации экзогенного IL-10 в правильной концентрации для эффекта этого перехода является сложным. Прогнозируют, что комбинированная экспрессия IL-10 и IL-10R1 в этих клетках индуцирует переключение фенотипа, которое является до некоторой степени независимым от концентрации IL-10.
[00083]
Аутоиммунные заболевания, которые можно лечить или облегчать с использованием способов и терапевтических противовоспалительных композиций по настоящему изобретению, включают, но без ограничения миокардит, волчаночный нефрит и другие волчаночные нарушения, интерстициальный цистит, аутоиммунный гепатит, очаговую алопецию, приобретенный буллезный эпидермолиз, болезнь Аддисона, сахарный диабет типа 1, болезнь Грэйва, глютенчувствительную целиакию, болезнь Крона, язвенный колит, апластическую анемию и другие анемии, анкилозирующий спондилит, синдром Фелти, псориатический артрит, системную волчанку, синдром Шницлера, фибромиалгию, миастению, синдром Гийена-Барре, миастенический синдром Ламберта-Итона, аутоиммунную ретинопатию, синдром Когана, офтальмопатию Грейвса, склерит, болезнь Меньера, синдром Черджа-Стросс, болезнь Кавасаки, ревматоидный васкулит и узелковый полиартериит. Кроме того, состояния, общие для аутоиммунных заболеваний, такие как синдром хронической усталости, комплексный регионарный болевой синдром, эозинофильный эзофагит, гастрит, синдром POEMS, феномен Рейно, первичный иммунодефицит и гангренозная пиодермия, можно лечить с использованием способов и терапевтических противовоспалительных композиций по настоящему изобретению.
[00084]
Дополнительные объекты, преимущества и новые признаки этого изобретения будут очевидны специалистам в данной области после рассмотрения следующих их примеров, которые не являются ограничивающими. В примерах, процедуры, которые конструктивно сведены к практике, описаны в настоящем времени, и процедуры, проведенные в лаборатории, приведены в прошедшем времени.
ПРИМЕРЫ
[00085]
Следующие примеры приведены, чтобы предоставить специалисту в данной области полное раскрытие и описание того, как осуществлять и использовать настоящее изобретение, и как не предназначены для ограничения объема того, что авторы изобретения рассматривают как свое изобретение, так и не предназначены для того, чтобы представлять или выражать то, что приведенные ниже эксперименты представляют собой все или единственные проведенные эксперименты. Специалисту в данной области понятно, что можно осуществлять различные варианты и/или модификации изобретения, как показано в конкретных вариантах осуществления, без отклонения от сущности или объема изобретения, как описано в широком смысле. Настоящие варианты осуществления, таким образом, во всех отношениях следует рассматривать как иллюстративные, а не ограничивающие.
[00086]
Предприняты усилия для обеспечения точности применительно к используемым числам (например,количествам, температуре и т.д.), однако следует учитывать некоторые ошибки эксперимента и отклонения. Если не указано иначе, части представляют собой части по массе, молекулярная масса представляет собой среднемассовую молекулярную массу, температура приведена в градусах Цельсия, и давление составляет атмосферное или около него.
Пример 1 - Экспрессирующие векторы
[00087]
XT-250 представляет собой экспрессирующую плазмиду, которая содержит кДНК IL-10 крысы, используемую в этих исследованиях просто потому, что rIL-10 привлекается рецептором IL-10R1 крысы значительно лучше, чем IL-10 человека (hIL-10). XT-250, подобно ее эквиваленту с hIL-10 - XT-150 -, представляет собой раствор ДНК в D-маннозе. Независимо от вида, все из использованных кДНК IL-10 содержат точечную мутацию, приводящую к замене аминокислоты, F129S, которая, как обнаружено, приводит к значительно более длительной продолжительности эффективности в моделях боли (Milligan et al., Pain, 126(l-3):294-308 (2006)). Остов плазмиды содержит ген устойчивости к канамицину, промотор CMV, (интрон β-гллобина, полиA гормона роста и 2 AAV2 ITR. Эту плазмиду использовали также для получения векторов AAV9.
[00088]
LV02 представляет собой экспрессирующую плазмиду, которая содержит вышеуказанные контрольные элементы с кДНК ниже промотора CMV, содержащей кодирующую последовательность hIL-10R1, за которой следует кодирующая последовательность 2a, саморасщепляющегося пептида, и hIL-10. Тестовая трансфекция клеток HT-1080 выявила поверхностную экспрессию IL-10R1 и секрецию IL-10 в среду (2,1 нг/мл).
Пример 2 -
Обосновывающие данные
[00089]
Следует отметить,что для IL-10 показана некоторая предпочтительность в отношении видоспецифичности. Например, IL-10 мыши не взаимодействует с рецептором IL-10 человека, хотя IL-10 человека связывается с рецептором IL-10 мыши, и IL-10 человека слабо связывается с рецептором IL-10 крысы. По этой причине, IL-10 крысы (rIL-10), как правило, использовали в экспериментах на крысах, и IL-10 человека (hIL-10) использовали в исследованиях на мышах, собаках и лошадях. Тот факт, что hIL-10 активирует рецептор IL-10 крысы только при высоких концентрациях, является очень полезным признаком, поскольку совместная экспрессия IL-10R1 человека в тканях-мишенях крысы приводит к полному ответу на IL-10 человека. Для упрощения доставки, сконструированы аденоассоциированные вирусы (AAV), кодирующие rIL-10, hIL-10, или hIL-10R1. Серотип 9 выбран, поскольку AAV9 очень хорошо распределяется при интратекальной инъекции и трансдуцирует широкое множество клеток, включая антигенпредставляющие клетки, такие как астроциты, которые сами экспрессируют IL-10R1. Как показано на фиг. 1, AAV9-hIL-10 является антиаллодиническим в модели нейропатической боли с использованием хронической компрессии (CCI) на крысах, однако, эффект проходит. Однако, смесь 1:1 AAV9-hIL-10 и AAV9-hIL10R1 приводит к стабильному прекращению аллодинии в этой модели (Фиг. 2), в соответствии с гипотезой, что комбинированная экспрессия IL-10 и IL-10R1 позволяет намного более высокое интратекальное дозирование, чтобы приводить к широко распространенной супрессии воспаления через области спинного мозга и белого вещества мозга. Пустые круги=AAV9-hIL-10Rl; закрашенные круги=AAV9-hIL-10+XR-101; закрашенные квадраты=AAV9-hIL-10Ra+AAV9-hIL-10.
[00090]
Для упрощения введения двух кДНК, сконструирован бицистронный вектор, в котором промотор EFlα управляет экспрессией hIL-10R1 и hIL-10. Первичный продукт трансляции содержит саморасщепляющийся пептид 2a. Когда этой плазмидой временно трансфицировали клетки HT-180, hIL-10 легко детектировали в среде посредством ELISA (R&D Systems) при приблизительно 2 нг/мл. Кроме того, поверхностный IL-10R1 детектировали посредством иммунофлуоресценции в трансфицированных, но не в контрольных клетках.
[00091]
Обнаружено, что основанный на плазмиде перенос гена IL-10 в крысах с рецедивирующе-ремиттирующим EAE являлся эффективным (Sloane et al., Brain, Behavior and Immunity, 23(1):92-100 (2009)). В этом исследовании, плазмиду, инкапсулированную в микрочастицы PLGA, инъецировали интратекально в момент времени, когда паралич хвоста уже возник (Фиг. 3). Примечательно, что IL-10 обращал паралич хвоста и уничтожал подобную MS патологию. Показатели двигательной активности: 0=норма; 1=паралич кончика хвоста; 2=паралич всего хвоста; 3=слабость задней конечности; 4=паралич задней конечности; 5=полный паралич задней конечности; 6 - частичный паралич передней конечности. N=6 на группу.
Пример 3-Обработка экспрессирующим IL-10/IL-10R1 вектором для оценки нарушения двигательной способности
[00092]
Крысам, обработанным с использованием MOG для индукции патологии, подобной мягкому рецидивирующе-ремиттирующему MS, инъецировали интратекально дозы плазмиды IL-10, как показано ранее, эффективные в этой модели (Sloane et al. 2009), в момент времени, когда симптомы, такие как паралич хвоста, были заметны. В дополнение к плазмиде IL-10, отдельные когорты крыс подвергали дозированию равных количеств почти идентичной плазмиды, в которой кДНК IL-10 заменена на кассету IL-10/IL-10R1, названную LV02. Целью этого 30-суточного эксперимента являлось определение того, действует ли LV02 лучше, чем XT-250 (только экспрессия IL-10) в более высоких дозах. При низких дозах плазмиды (3 мкг), ожидали небольших различий между двумя составами. Однако, при высоких дозах (~100 мкг), когда наблюдают потерю эффективности XT-250, ожидали продолжения эффективности LV02.
[00093]
Взрослых самцов крыс Dark Agouti (250-300 г; Envigo) можно использовать для индукции EAE посредством внутрикожной инъекции 35 мкг MOG в 0,01 M Na-ацетате (pH 3,0), эмульгированного в неполном адъюванте Фрейнда (соотношение 1:1). Приблизительно через 1 неделю после инъекции, у крыс показаны прогрессирующее нарушение двигательной функции (и аллодиния), начинающиеся с паралича хвоста (показатель двигательной активности=1), которые в конечном счете достигали показателя 7, при котором их подвергали эвтаназии. Однако, в этот промежуточный период животные испытывали спонтанное улучшение перед рецидивом. Крыс (N=5 на группу) подвергали интратекальной инъекции (через поясничные позвонки 4/5; L4/5) либо XT-250, либо LV02 в объеме приблизительно 40 мкл, когда у них проявлялся паралич хвоста. Группы из 5 крыс подвергали инъекции с использованием PBS (контроль) или ДНК (1, 3, 7, 10, 30 или 100 мкг) либо XT-250, либо LV02. У животных оценивали показатели нарушения двигательной функции в течение следующих 30 суток.
Пример 4 - Обработка экспрессирующим IL-10-IL10R1 вектором для оценки уменьшения супраспинальных повреждений
[00094]
Проводят эксперимент по установке диапазона дозирования, в котором достигают дозы LV02, при которых сохраняется эффективность в отношении нарушения двигательной функции, однако супраспинальные повреждения значимо уменьшаются (H&E), и демиелинизация уменьшается (Luxol Fast Blue). LV02, XT-250 или PBS инъецируют интратекально крысам с EAE (N=5 на группу) в наивысших дозах, как обнаружено, являющихся эффективными в экспериментах, проводимых в примере 3. Прижизненную фазу этого эксперимента завершают, когда животные возвращаются к показателю 0 (норма), обычно <2 недель. Образцы CSF отбирают у наивных животных, у тех же животных на время введения LV02 и непосредственно перед перфузией/фиксацией. Животных подвергают перфузии с использованием PBS, за которым следует PBS/4% параформальдегид. Спинной мозг и головной мозг переносят в криопротектор (30% сахароза в PBS) перед получением срезов. Срезы (40 микрон) спинного мозга (продольные) и головного мозга (фронтальные) окрашивают гематоксилином-эозином (H&E) для идентификации очагов и инфильтратов лимфоцитов. Прилежащие срезы окрашивают Luxol Blue для идентификации зон демиелинизации. Срезы окрашивают также по IL-10R1 человека (Millipore # 06-1067), Ibal (микроглия), GFAP (астроциты), и NeuN (нейроны). Посредством совместного окрашивания с использованием антител против MHC-II идентифицируют активацию антигенпредставляющих клеток. На каждом уровне спинного мозга (поясничном, грудном, шейном), подсчитывают очаги, идентифицированные посредством H&E в продольных срезах. Подобным образом, срезы из ствола головного мозга, мозжечка, затылочной коры и лобной коры оценивают в баллах по присутствию очагов посредством H&E. Значимого (по t-критерию для одной выборки) уменьшения очагов ожидают в спинном мозге как для XT-250, так и для LV02, по сравнению с контролем с PBS. Если LV02 действует лучше, чем XT-250, в областях ствола головного мозга и белого вещества коры головного мозга, должно быть детектировано значительное различие в количестве очагов на срез.
Пример 5 - Обработка экспрессирующим IL-10/IL-10R1 вектором для оценки биораспределения
[00095]
Оцениваютбиораспределение плазмидной ДНК в головном мозге при различных дозах LV02. Этот эксперимент разработан для понимания того, каким образом плазмида распределяется через области белого вещества и спинного мозга с течением времени. Наивысшую целесообразную дозу LV02 (300 мкг) инъецируют интратекально через L4/5 нативных крыс (N=3 на временную точку). Ткани выделяют из спинного мозга (поясничного, грудного, шейного), головного мозга, затылочной коры и лобной коры через 4 час, 7 и 30 суток после инъекции. ДНК выделяют из этих тканей и подвергают количественной ПЦР. Этот эксперимент выявляет, каким образом LV02 распределяется в головном мозге, и персистирует ли она в течение длительного периода.
Пример 6-Статистический анализ
[00096]
Все статистические сравнения показателей нарушения двигательной функции и данных иммуногистохимического анализа рассчитывали с использованием статистического программного обеспечения. Показатели нарушения двигательной функции анализируют посредством непараметрического критерия суммы рангов Уилкоксона. Повторные статистические измерения ANOVA исследуют групповые эффекты на протяжении временных точек, тестированных в ходе экспериментов. Иммуногистохимические маркеры можно анализировать посредством статистического анализа двустороннего t-критерия.
Пример 7: Детекция нейровоспаления в модели синдрома Дауна на мышах
[00097]
В другом примере (Фигура 4), с использованием инъекции экспрессирующей плазмиды, кодирующей IL-10F129S мыши, в головной мозг нормальных мышей и мышей, сконструированных для имитации синдрома Дауна (dp 16), показали, что сверхэкспрессия IL-10 очень сильно уменьшала экспрессию мРНК IL-10R1, что поддерживает другие данные как по обнаружениям в лаборатории авторов изобретения, так и по опубликованным обнаружениям (см., например, Ding, et al., J Immunol 167(12): 6884-6892 (2001)). На фигуре 2 показаны уровни мРНК передающего сигналы рецептора IL-10 (IL-10R1). По сравнению с контролем без инъекции, обработка pДНК-IL10 очень сильно супрессировала экспрессию гена IL-10R1 в головном мозге мышей как дикого типа, так и с синдромом Дауна.
[00098]
Вышеуказанное просто иллюстрирует принципы изобретения. Понятно, что специалист в данной области способен разрабатывать различные аранжировки, которые, несмотря на то, что явно не описаны или не показаны в настоящем описании, воплощают принципы изобретения и включены в его содержание и объем. Более того, все примеры и условные выражения, процитированные в настоящем описании, принципиально предназначены, чтобы помочь читателю в понимании принципов изобретения и концепций, вносимых авторами изобретения для продвижения уровня техники, и должны рассматриваться без ограничения такими конкретно указанными примерами и условиями. Более того, все утверждения в настоящем описании, перечисляющие принципы, аспекты и варианты осуществления по изобретению, так же как их конкретные примеры, предназначены для включения как структурных, так и функциональных их эквивалентов. Кроме того, подразумевают, что такие эквиваленты включают как известные в настоящее время эквиваленты, так и эквиваленты, которые будут разработаны в будущем, т.е., любые разработанные элементы, осуществляющие такую же функцию, вне зависимости от структуры. Объем настоящего изобретения, таким образом, не является ограниченным иллюстративными вариантами осуществления, показанными и описанными в настоящем описании. Вместо этого, объем и содержание настоящего изобретения заключены в прилагаемой формуле изобретения. В следующей ниже формуле изобретения, если не использован термин «средство», ни один из признаков или элементов, перечисленных в ней, не следует интерпретировать как ограничения «средство плюс функция» в соответствии с 35 U.S.C. 112, 6.