Исследования наностуктур биологического происхождения и биологически значимых наносекундных процессов методами компьютерного моделирования. (обзор основных направлений и результатов исследований лаборатории биомоделирования)

УДК 539.19+544.534+612.822.3

В. Е. Стефанов

ИССЛЕДОВАНИЯ НАНОСТУКТУР БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И БИОЛОГИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ НАНОСЕКУНДНЫХ ПРОЦЕССОВ МЕТОДАМИ КОМПЬЮТЕРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ.

Санкт-Петербургский университет, кафедра биохимии биолого-почвенного факультета

В данной статье поставлена задача познакомить читателя с основными направлениями работ и результатами исследований лаборатории биомоделирования, образованной на кафедре биохимии на рубеже нового столетия. Это время заслужило противоречивые по многим позициям оценки. По хорошо известным причинам проведение экспериментальных исследований стало весьма затруднительным, а в ряде случае и просто невозможным. Вместе с тем интенсивная и экстенсивная компьютеризация всех сфер деятельности, и, в первую очередь, науки, создала техническую и идеологическую базу для ком -пьютерных экспериментов в областях науки, где реальные физические эксперименты особенно дорогостоящи и технически трудно осуществимы. Из этих противоречивых обстоятельств и родилась сначала идея лаборатории биомоделирования, а затем и она сама.

Было бы некорректно утверждать, что лаборатория трудится исключительно на виртуальном поле. Ее сотрудники выполняют и реальные эксперименты, используя приборную базу других лабораторий, в том числе и за рубежом. Многие исследования были проведены совместно с коллегами, сотрудничающими с нами в рамках договоров

о творческом содружестве. Наряду с развитием новейшего направления, о котором в основном и пойдет речь, сотрудники лаборатории проводят исследования и в более традиционных направлениях. Характерной чертой таких работ, однако, является использование подходов моделирования. Так, дальнейшее развитие получили работы по моделированию ферментативной кинетики и разработке теоретических методов анализа кинетических моделей. Подана заявка на патентование метода тестирования загрязнения окружающей среды, основанного на энзиматической модели. Проведены экспериментальны работы по синтезу и кристаллографическому анализу химической модели мембраны, выполнены эксперименты по изучению процессов самосборки тубу-лина с использованием фемтосекундной лазерной спектроскопии, ЯМР-спектроскопии и электронной микроскопии. Важным направлением в работе является разработка и использование методов биоинформатики в изучении структуры белков. Некоторые исследования в этой области были доведены до состояния продукта, который может быть использован непосредственно в учебном процессе. Ссылки на учебные и научные публикации приведены в конце статьи.

© В. Е. Стефанов, 2009

Однако хотелось бы остановиться на направлении, которое в самое последнее время получило в лаборатории преимущественное развитие, а именно познакомить читателя с результатами исследований наностуктур биологического происхождения и биологически значимых наносекундных процессов методами компьютерного моделирования. Более детальная информация может быть почерпнута из опубликованных материалов, приведенных в списке литературы.

Исследование наноструктур биомолекулярного происхождения. Механизм самосборки тубулина в микротрубочки. Наноструктуры, основанные на биологических макромолекулах, с разветвленными каналами передачи сигналов в будущем смогут конкурировать с углеродными и кремниевыми материалами для нанотехнологий. Важный класс таких наноструктур является продуктом динамически контролируемой сборки димеров тубулина. Построенные из тубулина нанотрубки, называемые микротрубочками, образуют высокоорганизованную сеть передачи сигнала в живых клетках. GTP прочно связан с N-сайтом а-субъединицы тубулина, а связь этой молекулы с Е-сайтом Р-субъединицы лабильна и сопровождается гидролизом GTP. Связь Р-субъединицы с комплексом Mg2+GTP запускает процесс образования микротрубочек, внутренний диаметр которых составляет 12-13 нм. Механизмы, контролирующие эти процессы, не вполне ясны. Их выяснение, с одной стороны, позволит по-новому подойти к пониманию базовых процессов, лежащих в основе механизмов памяти, обучения и сознания, с другой — будет способствовать выработке новых подходов к нанотехнологии.

Теоретический анализ показал, что из-за особенностей электронной структуры тубулин как G-белок может быть активен и в отсутствие Mg2+, и подтвердил эту гипотезу, зафиксировав вызываемую облучением его самосборку в микротрубочки in vitro в среде, не содержащей Mg2+, при этом использовался метод «возбуждение-зондирование» и фемтосекундная спектроскопия. Можно предположить, что тубулиновые нанотрубки возникают в физиологическом растворе, содержащем GTP, благодаря взаимодействию сольватных оболочек неполимеризованных субъединиц тубулина. Известно, что сольватная оболочка белков включает слой «биологической воды» толщиной 0,7 нм, прочно связанной с белком водородными связями. Именно она отвечает за уникальные свойства тубулина, в том числе способность образовывать нанотрубки. В «биологической воде» аккумулируются электроны, при этом важно, что в димере тубулина есть внутреннее электрическое поле (« 10-3 V/см), направленное от а- к Р-субъединице. Был предложен физический механизм сборки микротрубочек, основанный на сформулированных предпосылках. Молекулярное моделирование выявило в молекуле тубулина провода из кольцевых резонансных электронных структур (остатки триптофана, тирозина, гистидина и фенилаланина), участвующих в электронном транспорте. Эти провода (электронная цепь) связаны с комплексом GTP, который как триггер запускает электронный ток. Триггер выключен в отсутствие Mg2+ и включен в его присутствии. Связывание Mg2+ с GTP-сайтом в форме Mg2+(H2O)4 переводит комплекс в триплетное состояние. Комбинированные QM/MM (квантовая химия/ молекулярная механика) расчеты системы тубулин + водная оболочка показали возможность триплет-синглетных (T-S) переходов в наносекундном диапазоне.

Стандартные квантово-химические расчеты, основанные на адиабатическом приближении, запрещают пересечение траекторий T-S (спиновый запрет), но это не относится к неадиабатическим процессам, для которых ядерная и электронная волновые функции не разделены. Более того, для большого ансамбля спин уже не является интегралом движения для индивидуальных молекулярных компонентов системы, но сохраняется его суммарное значение для всей системы; в данном случае это электронная цепь (или

их совокупность), замыкающаяся на М§2+(Ы20)40ТР. Роль М§2+ заключается в попеременном переводе комплекса в состояние с неспаренными (триплетное) и спаренными (синглетное) спинами электронов, которые, согласно нашим расчетам, занимают самую высокую и самую низкую зоны электронной проводимости системы тубулин-вода. Косвенным путем такая функция М§2+ была установлена в наших экспериментах по фемтосекундному лазерному возбуждению ОТР-сайта тубулина в отсутствие М§2+, приводившему к мгновенному образованию микротрубочек

Можно предположить, что под действием лазерного облучения в ОТР-сайте возбуждались переходы электронов, которые инициировали Т-Б процесс в системе тубулин-вода, подобно тому, как это происходит под действием М§2+. В макромолекулах (в данном случае в белке) электронный ток, инициируемый электронными переходами, благодаря сильному взаимодействию с окружающей сольватной оболочкой не диссипирует. Напротив, он может значительно усилен за счет нелинейных эффектов, обусловленных взаимодействием белка с водной оболочкой, что показал модельный анализ системы тубулин-вода в слабом внешнем поле. Электрическое поле этой системы возрастает на несколько порядков благодаря нелинейным поляризационным эффектам. Так, напряженность внутреннего поля тубулина составляет примерно 10-3 К/см, а результирующего поля на 7-8 порядков больше.

Таким образом, можно предположить, что движущей силой сборки тубулина является инициируемые некоторым стимулом (М§2+, облучение) процессы в сольватной оболочке белка, многократно усиленные за счет нелинейных эффектов. Взаимодействие электрического поля сольватной оболочки активированной молекулы тубулина с полями других молекул тубулина обеспечивает их ориентацию, способствующую их дальнейшей агрегации в микротрубочки. Полагаем, что описанные явления могут лежать в основе универсального механизма образования биомолекулярных наноструктур.

Моделирование в изучении биологических мембран. Взаимодействие мембраны с биологически активными молекулами. Было проведено модельное исследование взаимодействия с мембраной оксида азота (II), — биологически чрезвычайно активной молекулы, регулирующей ряд важнейших физиологических функций. N0 — это малый незаряженный относительно стабильный свободный радикал с одним неспаренным электроном. Проникновение N0 через мембраны может обеспечивать свободная трансмембранная диффузия. В пользу этого говорит слабая полярность молекулы N0 (дипольный момент 0,17 Б), соответственно, хорошая растворимость в неполярных растворителях. Таким образом, N0 должен хорошо растворяться в липидном бислое мембран. На молекулярном уровне механизм N0 с биомембранами практически не исследован. Компьютерное моделирование процесса диффузии N0 производили через модельную биологическую мембрану при помощи метода молекулярной динамики, что позволило в сочетании и сравнении с методами натурного эксперимента добиваться значимых результатов. Построение системы, моделирование и анализ результатов осуществлялись при помощи программного пакета Огошао8 3.0. Была использована жидкостно-мозаичная модель участка биологической мембраны, состоящей из двух фосфолипидных компонентов: фосфатидилэтаноламина и фосфатидилхолина. Эту модель можно считать первым приближением однородного участка реальной мембраны, свободного от белков. Построению собственно мембраны предшествовало построение молекулы липидов и оксида азота (II), которые преоптими-зировались с помощью квантовомеханического метода MND0 в программе ЫурегСЬеш 7.0 с целью получения конфигурации, отвечающей минимуму потенциальной энергии. После этого 140 молекул фосфатидилхолина и 60 молекул фосфатидилэтаноламина были выстроены в бислой. Молекулы распределялись между собой равномерно, чтобы избежать

длительного времени моделирования с целью «перемешать» их. После построения бислоя он был подвергнут сжатию для устранения пустот между молекулами, далее в рассматриваемый объем было добавлено 6590 молекул воды. Процесс контролировался визуально с помощью пакета УМБ.

Полученная таким образом система моделировалась в МБ с целью достижения состояния равновесия, сначала при постоянном объеме на интервале 500 пс, затем — при постоянном давлении на интервале 900 пс, в обоих случаях при постоянной температуре 298 К, в результате чего была получена равновесная мембрана с энергией около —4-106 кДж/моль. После этого были добавлены 10 молекул оксида азота (II) и проводилось окончательное моделирование полученной системы при постоянных температуре и давлении длительностью 2400 пс. По результатам визуального наблюдения динамики углубления молекул N0 в бислой мембраны, а также из анализа зависимостей координат центров масс молекул N0 от времени удалось установить, что к моменту времени примерно 1200 пс все молекулы погрузились в бислой мембраны. На протяжении промежутка времени, предшествующего данному моменту, последовательно наблюдалось: разворачивание молекул N0 приблизительно по нормали к плоскости мембраны, преимущественно атомом кислорода к поверхности мембраны; разворот молекул параллельно поверхности мембраны; по мере углубления в область неполярных ацильных «хвостов» фосфолипидов — вновь преимущественное ориентирование по нормали, атомом азота в сторону поверхности. Эти эффекты можно объяснить, рассматривая молекулу N0 как нежесткий диполь, находящийся в поле заряженных групп на поверхности мембраны. Тот факт, что по мере проникновения молекул N0 в поверхностный слой мембраны происходит их разворачивание параллельно ее плоскости, хорошо согласуется с тем, что в биологических мембранах фосфохолиновые и фосфоэтаноламиновые остатки фосфолипидов, которые в первом приближении также можно рассматривать как диполи, также ориентированы параллельно поверхности.

Изменения геометрии мембраны оценивались по двум параметрам: средней площади поверхности на молекулу фосфолипида и толщине мембраны. Сравнение средних площадей на молекулу для равновесной мембраны без N0 и мембраны после 2400 пс моделирования с N0 дает значения 0,488 и 0,492 нм2 соответственно; в то же время толщина мембраны, оцениваемая величиной 4,5 нм, почти не меняется. Это может свидетельствовать в пользу некоторого «разрыхления» мембраны при диффузии через нее молекул оксида азота (II). Толщина бислоя остается неизменной, что возможно только в том случае, когда средний объем, приходящийся на молекулу фосфолипида, увеличивается. Значения площади на молекулу сопоставимы с наблюдаемыми в эксперименте. Для оценки скорости процесса диффузии N0 через бислой были вычислены их суммарный коэффициент диффузии Б, его нормальная составляющая Б2, а также коэффициент латеральной диффузии, составившие соответственно: Б [N0] = 0,149-10-5 (см2/с) и Бху [N0] = 0,120-10-5 (см2/с) (с усреднением по всему интервалу); Бг1 [N0] = 0,224-10-5 (см2/с) и Б22[Ы0] = 0,101 -10-5 (см2/с) (с усреднением на участках от 0 до 1200 пс и от 1200 до 2400 пс соответственно). Полученные значения хорошо согласуются с данными по диффузии оксида азота (II) в водных растворах, липопротеинах низкой плотности и эритроцитарных мембранах. Особый интерес представляет то, что, судя по значению коэффициента латеральной диффузии, молекулы N0 проявляют выраженную латеральную подвижность.

Аналогичный подход был использован для изучения поведения кортагена — тетрапептида (Л1а-01и-Л8р-Рго) — над поверхностью модельной липидной мембраны нервной клетки и внутри нее. При этом были построены 2- и 3-компонентные бислойные модели

мембран нервных клеток, состоящих из молекул фосфатидилхолина ФТХ, фосфатиди-лэтаноламина ФТЭ, фосфатидилсерина ФТС и молекул воды. Расчеты 3-компонентной мембраны, включающей противоионы Na+ для нейтрализации отрицательных зарядов ФТС, показали, что в ней присутствует область с высокой концентрацией ФТС. При размещении кортагена над поверхностью мембраны наблюдается его перемещение из области с высокой концентрацией ФТС в область ее низкой концентрации. Анализ взаимодействия кортагена с 2-компонентной мембраной (ФТХ, ФТЭ) показывает, что при его размещении над мембраной он образует «дугу», гидрофобные концы которой обращены к мембране, а гидрофильная середина к воде, при этом его основные перемещения осуществляются вдоль поверхности мембраны в первые 2,2 нс, в дальнейшем его движение затормаживается образованием водородных связей с фосфолипидами. Исследование диффузии кортагена Ala-Glu-Asp-Pro через модельную 2-компонентную мембрану показывает, что за время счета 10 нс пептид в основном активно мигрировал под поверхностью мембраны вдоль нее. Структура самого пептида напоминает «дугу», образованную им над поверхностью мембраны, но развернутую наоборот, при этом оказывается, что Ala направлен в гидрофобную часть мембраны, N-конец и Asp развернуты «наверх» в сторону водной фазы, Glu и Pro располагаются параллельно поверхности мембраны. Эти работы продолжаются. Методами компьютерного моделирования исследуются взаимодействия с мембраной такого важного для фармакологии класса веществ как пиразины.

Механизм латерального переноса энергии в мембране. С помощью методов квантовой химии исследовались предпосылки для реализации постулированного механизма латерального переноса энергии в биомембране на основе синтезированной из изобутил-2-аминоэтилфосфат-гидрохлорида ее кристаллической модели. Кристаллы ИФЭА воспроизводят центральную область модели биомембран, а асимметрия протонов в системах водородных связей обеспечена введением гидрохлорида. Структура была расшифрована прямым методом с последующим Фурье-синтезом и уточнена полноматричным методом наименьших квадратов. Элементарная ячейка содержит два бислоя, каждый из которых содержит три зоны водородных связей. Центральные зоны образованы атомами водорода С-№Н3-групп ИФЭА и атомами хлора. Симметрично расположены еще две зоны — линейные системы из HO-P=O-групп (центральные фрагменты каждой молекулы), сформированные трансляционно-связанными молекулами ИФЭА-HCl.

Методами РСА установлена моноклинная сингония (пространственная группа I 2/a), дифрактометрически уточнены параметры элементарной ячейки. Экспериментально определены положения тяжелых атомов (С, P, O, N и Cl). Особое внимание уде -лено системам линейных водородных связей, образованных центральными фрагментами (HO-P = O-группы) и направленных вдоль оси b. Поскольку вдоль оси а два типа молекул (рис. 1, а, б) чередуется, то происходит чередование направления систем водородных связей: вверх — вниз (рис. 2). При этом в образовании систем из HO-P=O-групп участвуют только молекулы, связанные симметрией. Проведенный предварительный анализ показал, что синтезированные структуры можно использовать с целью изучения предпосылок для процессов латерального переноса зарядов. Для последующего более строгого анализа методом молекулярной механики произвели оптимизацию геометрии структуры кристалла, используя программы GULP (General Utility Lattice Program).

Оптимизация геометрии кристаллической структуры ИФЭА-HCl проводилась в нескольких вариантах: оптимизация положения только тех атомов, координаты которых были определены с большой экспериментальной погрешностью (оптимизация с фиксированными атомами) (1); Полная оптимизация положения всех атомов (2); Полная оптимизация

Ні4 Н11 О1

Н ш .

СЬ1

Н16

іШ:

# с4~ н9Т

Н1° # <Г*Ж С2"

Н7 Н1 ^2

Молекула А

СЬ1'

Н11

ІС4'

Н16^^|Гс?

н^ЯНА' О47 р1

С2'

Н17'

Молекула А'

Рис. 1. Два типа молекул изобутил-2-аминоэтилфосфат-гидрохлорида формирующие кристаллическую модель мембраны

1_

0,86

Рис. 2. Системы водородных связей из Н0-Р=0-групп в кристалле изобутил-2-аминоэтилфосфата

гидрохлорида Вдоль оси Ь элементарная ячейка повторена три раза.

структуры, предполагающая переход протона от одной молекулы к соседней по направлению водородной связи между ними, которая проводилась в двух вариантах: с переносом протонов обоих типов молекул А и А' и с переносом протона только для молекулы А'.

Данные расчетов по методу ММ свидетельствуют о том, что полностью оптимизированная геометрия незначительно отличается от геометрии частично оптимизированной структуры. Основное отличие между ними состоит в ориентации изопропильного радикала молекулы А.

Энергия полностью оптимизированной структуры оказалась на 15 ккал/моль ниже энергии «экспериментальной» структуры (1) в расчете на одну молекулу ИФЭА-НС1, что несколько больше, чем следовало бы ожидать, исходя из точности параметризации

Н

17

Н

AMBER. Различие в энергиях полностью оптимизированных структур составило менее 1 ккал/моль в расчете на одну молекулу ИФЭА-HCl, что находится в пределах предполагаемой погрешности метода ММ. Это может косвенно подтверждать возможность переноса протона с одной молекулы на другую через водородную связь. Следует заметить, что водородная связь между молекулами A заметно искажена, в то время как водородная связь между молекулами A' имеет нормальный вид как до, так и после перемещения протона. Можно предположить, что перенос протона в кристалле ИФЭА-HCl более легко может осуществляться посредством молекулы A'. В дальнейшем были выполнены квантовохимические расчеты электронной структуры модели с использованием неограниченного метода Хартри-Фока (программа CRYSTAL 98).

По результатам квантово-химических расчетов оказалось, что более низкой полной энергии соответствует та геометрия кристалла, которая была подвергнута оптимизации с фиксированными атомами. Значения энергии конфигурации с переносом двух протонов заметно выше (на 5 еВ), чем энергия полностью оптимизированной с помощью молекулярной механики конформации. В то же время энергия конформации с переносом только одного протона для молекулы А' ниже энергии той же конформации на 1 еВ. Таким образом, данные квантовохимических расчетов согласуются с результатами ММ, указывающими на возможность переноса протонов вдоль линии водородных связей, по крайней мере, в случае молекулы А'.

По данным квантово-химических расчетов наиболее ионный характер имеют атомы водорода, входящие в состав фосфатных групп, причем величина заряда превышает 0,5, что указывает на склонность таких протонов к ионизации. Эти данные указывают на наличие физических предпосылок для реализации механизма латерального переноса энергии в мембране. В настоящее время в нашем распоряжении имеется и уже охарактеризована кристаллографически еще одна модель мембранной структуры, построенная из другого аналога природного фосфолипида — изобутилфосфохолина, которую планируем также проанализировать квантовохимическими методами. В дальнейших исследованиях предполагаем построить и проанализировать более сложные, а именно двух- и более компонентные модели мембраны, с целью физического обоснования механизмов латерального переноса энергии в этой важнейшей надмолекулярной структуре клетки.

Квантовохимический анализ нуклеотидов. Исследование структуры про-тонированной формы цАМФ и цГМФ с целью их докинга в протеинкиназу. Непосредственное участие цАМФ в регуляции ряда важнейших клеточных процессов путем лиганд-рецепторного связывания с соответствующими сайтами белков стало стимулом создания методологии докинга, заключающейся в помещении лиганда (в данном случае циклического нуклеотида) в связывающий сайт изучаемого белка с помощью специальных компьютерных программ. Предпосылкой успешного проведения докинга является полная оптимизация геометрии молекулы циклического нуклеотида. Такие исследования были проведены в лаборатории биомоделирования.

Ранее была исследована структура аниона цАМФ с использованием методов рентгеноструктурного анализа, ядерно-магнитного резонанса, а также путем расчетов. Структура протонированной формы цАМФ оставалась неизученной. Однако подобная форма может реализовываться в белковом окружении протонированной формы, что определило интерес к ней. Помимо структуры цАМФ, была изучена структура протонированной формы молекулы цГМФ. Обе молекулы имеют сходное строение и сродство к одним и тем же центрам связывания в структурах различных белков и сравнительный анализ обоих нуклеотидов представляется целесообразным. Кроме анализа структур молекул цАМФ и цГМФ,

необходимого для проведения последующего докинга, определены значения энтальпий гидролиза этих циклических нуклеотидмонофосфатов. Энтальпия гидролиза цАМФ, полученная ранее экспериментально калориметрическим методом, варьирует от 26 до 14 ккал/моль. Экспериментальные оценки энтальпии гидролиза цГМФ вдвое ниже значений для цАМФ, что представляется физически малообоснованным.

Исходные структуры циклических нуклеотидов цАМФ и цГМФ на первом этапе были оптимизированы с помощью полуэмпирического квантово-химического метода MNDO. Окончательную оптимизацию геометрических параметров этих молекул производили ab initio методом Хартри-Фока-Рутаана с использованием атомных гауссовых базисных наборов 6-31G (d) и подтверждали анализом их колебательных частот. Все неэмпирические расчеты велись на основе пакетов квантово-химических программ GAMESS и Gaussian 94W.

Исходя из данных о существовании двух (син и анти) конформаций цАМФ и цГМФ, был проанализирован потенциальный барьер вращения азотистого основания относительно гликозидной связи. При этом заданные значения торсионного угла O6-C7-N8-C17 фиксировались, а затем проводилась полная оптимизация геометрических параметров молекул. Помимо зависимости потенциальной энергии цАМФ от положения азотистого основания, также анализировалось изменение конформации фу-ранозного кольца, характеризующееся углом псевдовращения P. Угол псевдовращения рассчитывали через значения торсионных углов, построенных на атомах фуранозного кольца т0, т0 , тх , т2, т3 и т4 (рис. 3). Все вычисления проводились в газовой фазе при 0 °K.

Оценка энтальпии гидролиза цАМФ и цГМФ проводилась с использованием полученных в ходе геометрической оптимизации полных энергий син- и анти-конформаций анализируемых циклических нуклеотидмонофосфатов. Кроме того, была выполнена полная оптимизация геометрических параметров молекул аденозинмонофосфата (АМФ), гуанозинмонофосфата (ГМФ) и воды. Расчеты также проводились в газовой фазе при 0 °К методом Хартри-Фока-Рутаана с использованием атомных гауссовых базисных функций 6-31G (d), при этом так же, как в случае с циклическими нуклеотидмонофосфатами, исследовалась возможность существования син- и анти-конформаций АМФ и ГМФ. В итоге, энтальпии гидролиза цАМФ и цГМФ определялись как разность полных энергий АМФ (ГМФ) и воды, с одной стороны, и цАМФ (цГМФ) — с другой. В ходе вычислений предполагалось, что циклический нуклеотидмонофосфат в син-, анти-конформации гидролизуется до соответствующего нуклеотидмонофосфата также в син-, анти-конформации. Полная оптимизации геометрии молекулы цАМФ привела к двум устойчивым конформациям (сини анти-), характеризующимся значениями гликозидного торсионного угла (O6-C7-N8-C17) 68,5° и -173,0° соответственно Син-конформация протонированной формы цАМФ энергетически более выгодна (на 2,3 ккал/моль).

При анализе син-конформации цАМФ было обнаружено, что фуранозное кольцо находится в С3'-эндо-С4'-экзо состоянии (P = 40,7°), причем атом С3' выступает вверх

Рис. 3. Схема протонированной формы цАМФ, поясняющая расчет углов псевдовращения фуранозного кольца

над плоскостью кольца на 0,3 А, а атом С4' смещен вниз на 0,37 А. В случае реализации анти-конформации цАМФ направление смещения углеродных атомов остается тем же (P = 25O), однако величины смещения изменяются: 0,57 А и 0,11 А для С3' и С4' атомов соответственно. Что касается фосфатного кольца, то для аниононной формы получена конформация типа «кресло», тогда как для протонированной формы этой молекулы более характерна твист-конформация. В ходе работы анализировался потенциальный барьер вращения азотистого основания относительно гликозидной связи. Минимальная высота барьера составляет около 6 ккал/моль, что примерно в 10 раз превышает энергию теплового движения (kT) при 300 OK, а следовательно, свободный переход из одной конформации цАМФ в другую при физиологических условиях невозможен.

Согласно имеющимся данным, существует две анти-конформации аниона цАМФ: А (O6-C7-N8-d7=-149O, O6-С7-N8-С9=30O) и B (O6-C7-N8-d7=-174O, O6-С7-N8-С9 = 1Р). Данные автора показывают, что конформация молекулы цАМФ ближе к B-форме. Однако, когда торсионные углы O6-C7-N8-d7 и С19-С7-Ы8-С17 принимают значения соответствующие A-форме, происходит изменение угла псевдовращения рибозного кольца, что в определенных условиях (например, при наличии белкового окружения) может приводить к стабилизации А-конформации. Отмеченные выше закономерности имеют место и в случае протонированной формы цГМФ. Син-конформация цГМФ (O6-C7-N8-d7 = 67,Р, С19-С7-Ы8-С17 = -54,0O) более выгодна энергетически (на 2,2 ккал/моль). Ей свойственно твист-состояние фосфатного кольца и С3'-эндо-С4'-экзо конформация рибозы (P = 40,5O), при этом смещение атома C3' над плоскостью фуранозного кольца составляет

0,31 А; атом С4' смещен вниз на 0,37 А. Менее устойчивая анти-конформация цГМФ (O6-C7-N8-d7 = -161,3o, С19-С7-Ы8-С17 = 80,5O) также характеризуется твист-состоянием фосфатного кольца и С3 '-эндо-С4'-экзо состоянием рибозы (P = 29,9O), однако, C3' и C4' атомы смещены на 0,5 А вверх и на 0,19 А вниз относительно плоскости кольца соответственно.

Энтальпия гидролиза цАМФ составила 15,5 и 18,8 ккал/моль, а цГМФ — 15,0 и 17,9 ккал/моль для син- и анти-конформаций циклических нуклеотидмонофосфатов соответственно. При этом если в случае цАМФ полученные величины хорошо согласовывались с имеющимися литературными данными, то для цГМФ расхождение оказывается значительным. Проведенные оценки не показали значительного различия между энтальпиями гидролиза цАМФ и цГМФ, в то время как экспериментальные расчеты энтальпии гидролиза цГМФ в 1,5 раза ниже по сравнению с цАМФ. В силу сходства структур цАМФ и цГМФ результаты квантово-химических расчетов представляются более обоснованными. В настоящее время с использованием приведенных выше данных проводятся исследования по докингу циклических нуклеотидов в соответствующие сайты протеинкиназ.

Компьютерное моделирование возможного пути распада нуклеозидтрифосфата до нуклеозидмонофосфата. Было проведено компьютерное моделирование возможных путей протекания распада нуклеозидтрифосфата, сопряженного с синтезом одиночной цепи ДНК. При этом с учетом результатов квантовохимического анализа предложен ион-радикальный механизм распада нуклеозидтрифосфата до нуклеозидмонофосфата как альтернативный механизм для сопряжения распада нуклеозидтрифосфата с процессом синтеза одиночной цепи ДНК. Считается, что энергия, необходимая для преодоления барьера реакции, черпается из энергии, выделяемой в ходе гидролиза нуклеозидтрифосфата (NTP). Это медленная реакция с энергетическим барьером в 20 25 ккал/моль

сопровождается появлением достаточно инертных ионных форм, включая однозарядный нуклеозидмонофосфат, НЫМР-, который в случае полного депротонирования в кислой среде превращается в двухзарядную форму NМP2- (МР2- = PO42-).

Для инициирования процесса распада КТР необходимо присутствие катиона М§2+, роль которого не вполне ясна. Единственным объяснением до до сих пор считалась поляризационная модель, в соответствии с которой М§2+ за счет хелатирования N ТР способствует дополнительной поляризации Р-О связей у и в фосфатных групп трифосфата и тем самым ускоряет процесс гидролиза в 2-3 раза. В водной среде М§2+ преимущественно хелати-рует О1 и О2 атомы; хелатирование О2 и О3 атомов менее предпочтительно. Частично это обусловлено стерическими факторами, поскольку при хелатировании О1 и О2 атомов М§2+ формирует, скорее, октаэдрическую (четыре молекулы воды и два атома кислорода,

О1 и О2) нежели тетраэдрическую (две молекулы воды и два атома кислорода, О1 и атома кислорода, О1 и О2) структуру. К сожалению, поляризационная модель не в состоянии объяснить новые экспериментальные факты, указывающие на появление в растворе однозарядного катиона М§+, присутствие которого в качестве промежуточного продукта регистрируют при синтезе ДНК, а также в процессах фосфорилирования. Образование М§+ указывает на существование радикального механизма распада МТР, при котором двухзарядные катионы М§2+ способны, хотя бы на некотором этапе процесса, восстанавливаться до однозарядных катионов, превращая МТР в радикал. В данной работе показана возможность распада молекулы ОТР по ион-радикальному механизму, предполагающему начальное хелатирование М§2+ атомов О2 и О3, с образованием неустойчивой тетраэдрической конфигурации. Результаты основаны на квантово-химических расчетах по методу молекулярной динамики с использованием функционала плотности Б3ЬУР в базисе 6-31О** при постоянной температуре Т = 310 К и принципиально применимы к другим нуклеозидтрифосфатам (ЛТР, СТР, ТТР и ЦТР), поэтому в дальнейшем будем использовать общее обозначение №ГР.

Различие в механизме распада МТР (гидролитический или ион-радикальный в присутствии М§2+) обусловлено спиновым состоянием. Молекула МТР может находиться в низкоэнергетическом синглетном (5) или высокоэнергетическом триплетном (Т) состоянии. Расчеты показывают, что различие в полной энергии между состояниями, отвечающими двум оптимизированным геометриям Т и 5, АЕ*°‘, составляет внушительную величину 37,4 ккал/моль. В отсутствие внешнего воздействия обе конфигурации, Т и 5, достаточно устойчивы. Однако их геометрии существенно разнятся. В Т-конфигурации терминальная у-фосфатная группа повернута на 36,3° по часовой стрелке, а Р-фосфатная — на 8,9° против часовой стрелки по сравнению с положением, которое занимают эти группы в 5-конфигурации. Вращения являются причиной того, что Т-конфигурация оказывается более напряженной, чем 5-конфигурация, при этом они мало влияют на длины связей г [Рр-От]. Однако они приводят к непропорциональному увеличению расстояний О1-О2 и О2-О3 (Аг [О1-О2] = 0,39 А; Аг [О2-О3] = 0,12 А, что сказывается на способности хелатирования магнием атомов О1-О2 и О2-О3. Так, хелатирование О1-О2 становится невозможным, а хелатирование О2-О3 возможно лишь при формировании магнием тетраэдрической, а не октаэдрической структуры. Отметим, что в случае 5-конфигурации М§ формирует октаэдрическую структуру.

Хелатирование магнием О2-О3 с образованием тетраэдрически координированного комплекса [М§2+(Н2О)2]-№ТР4- предполагает, что образующийся комплекс находится в высокоэнергетическом состоянии и нестабилен. Он сразу претерпевает внутримолекулярную окислительно-восстановительную реакцию, при которой электрон с МТР4- переходит на М§2+, образуя комплекс {[М§+(Н2О)2-№ТР3-]}, который в течение 5 пс распадается. Весь процесс протекает в соответствии с уравнением (1):

[М§2+

Рис. 4. Ион-радикальный механизм распада комплекса [Mg(H2O)2-GTP]2 — (момент времени после

начала МБ БЕТ:В3ЬУР расчета 5,00 пс)

Продуктами реакции оказываются две ионные формы Р03-, атомарный кислород О и два радикала — нуклеозидмонофосфат •КМР - и Mg+

^^^+

где Н5О2+ отвечает цунделевскому катиону, а Н — атомарному водороду. Радикальная форма «ЫМР- предполагает ее дальнейшее участие в полимеризационном процессе-синтезе цепи ДНК в соответствии с

г = 1 п; N = А, ^ С, Т, и,

где (Н) означает связанный с О3, атом водорода, способный отщепляться от одной из реагирующих «ЫМР- в ходе г-ой ступени радикальной полимеризации. Совокупность реакций (3) представляет собой известную в органической химии полимеризацию в форме «живых цепей», катализируемую металлокомплексом, в данном случае магниевым.

Два атома водорода (реакции 2 и 3) и атомарный кислород образуют молекулу воды. Таким образом, атом магния выступает в качестве классического катализатора: первоначально он в форме двухзарядного катиона взаимодействует с КТР, затем в составе комплекса [Mg2+(H20)2NTP4-] восстанавливается до однозарядного катиона и тем самым окисляет NTP4- до №ГР3-, а затем снова окисляется до двухзарядного катиона. Комплекс [Mg+(H20)2NTP3-] представляет собой бирадикал, состоящий из радикала •Mg+(H20)2 и радикала «ОТР3-. В силу этого реакцию (1) можно рассматривать как распад радикала «ШГ3-, катализируемый магниевым комплексом.

Такая реакция маловероятна в водном растворе, поскольку «приготовление» высокоэнергетического T-состояния NTP требует быстрого и значительного подвода энергии извне, осуществляемого, например, в проведенном нами эксперименте при действии фемтосекундного лазера. Однако реакция возможна в клеточной среде, где №ГР часто связана с белками (например, с ДНК-полимеразами), способными заметно понизить расщепление и даже инвертировать его. Рассмотренный ион-радикальный механизм распада №ГР и ионный механизм, основанный на гидролизе, предполагают различный спиновый контроль реакций. Прямым доказательством существования радикального механизма синтеза одиночной цепи ДНК могли бы стать эксперименты по динамической поляризации ядер 31Р, постановку которых мы предполагаем осуществить в будущем.

Основные публикации лаборатории биомоделирования Монографии

1. Камышенцев М. В., Стефанов В. Е. Грипп. Путь решения проблемы. СПб. 2002. 240 с.

2. Самоорганизация сложных молекул. Свойства структур разного уровня организации. 2008. СПб. 246 с. (Коллективная монография под редакцией проф. В. И. Короткова).

Учебные пособия

1. Стефанов В. Е., Тулуб А. А. Введение в квантовую биологию. Методы компьютерного моделирования в анализе биомолекулярных систем. СПб., 2006. 75 с.

2. Стефанов В. Е., Мавропуло-Столяренко Г. Р. Анализ структуры белков методами биоинформатики. СПб., 2007. 145 с.

3. Стефанов В. Е., Петрова Т. А., Лянгузов А. Ю. Методы компьютерного моделирования и анализ ферментативной кинетики. СПб., 2007. 102 с.

Статьи

1. Васьков Ю. И., Стефанов В. Е. Сравнительный анализ ГТФ-связывающих сайтов тубули-на // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2004. Вып. 2. С. 58-67.

2. Васильев В. Ю., Калацкий Ю. М., Петрова Т. А., Стефанов В. Е. Способ определения интегральной загрязненности окружающей среды // Заявка на патент № 2007135540. Приоритет от 26. 09. 2007

3. Калацкий Ю. М., Стефанов В. Е., Агеева О. Г., Васильев В. Ю. Оценка загрязненности объектов окружающей среды с помощью хемилюминесцентной ферментативной тест-системы // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2004. Вып. 3. С. 84-87.

4. Камышенцев М. В., Шабанов П. Д., Стефанов В. Е. Роль клеточного метаболизма в фармакологической модуляции респираторно-вирусной инфекции // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. 2002. Т. 1. С. 29-44.

5. Малицкий А. А., Щеголев Б. Ф., Стефанов В. Е., МакКи М. Л., Хавинсон В. Х. Исследование взаимодействия тетрапептида А1а^1и-А8р-Рго с модельной липидной мембраной нервной клетки методом молекулярной динамики // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2008. Вып. 3. С. 86-92.

6. Рогачева О. Н., Стефанов В. Е., Щеголев Б. Ф. Сравнительный анализ структуры и энтальпии гидролиза молекул цАМФ и цГМФ методами квантовой химии // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2007. Вып. 2. С. 86-92.

7. Cтефанов В. Е. Моделирование в структурно-функциональном анализе биомолекулярных систем // Биохимические и молекулярно-биологические основы физиологических функций. Нервная система. Вып. 37. СПб., 2004. С. 112-140.

8. Стефанов В. Е., Калацкий Ю. М., Васильев В. Ю. Материалы научной конференции «Экология Санкт-Петербурга и окрестностей. СПб., 2005. С. 225-228.

9. Стефанов В. Е., Сурма С. В., Хрусталева Р. С., Щеголев Б. Ф., Цырлин В. А. Воздействие слабых электромагнитных полей на биологические объекты // 3-я Междунар. науч.-практ. конф. «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности». СПб., 2007. Т. 9. С. 214-216.

10. Стефанов В. Е., Тулуб А. А. Облучение электронами раствора тубулина in vinro приводит к сборке тубулина в микротрубочки в отсутствие катионов магния // Докл. РАН 2003. Т. 392. С. 129-131.

11. Стефанов В. Е., Тулуб А. А. Ион-радикальный механизм распада нуклеозидтрифосфата до ну-клеозидмонофосфата под воздействием катиона Mg 2+ и радикальная природа синтеза одиночной цепи ДНК // Докл. РАН 2007. Т. 414. С. 270-272.

12. Сурма С. В., Щеголев Б. Ф., Стефанов В. Е. Магнитовакуумная биология // Нейрогуморальные механизмы регуляции функций в норме и патологии. Минск., 2007. С. 344-348.

13. Тулуб А. А, Стефанов В. Е. Кофакторная активность иона магния обусловлена его тетраэдрической конфигурацией в каталитическом центре // Докл. РАН. 2001. Т. 377. C. 705-708.

14. Тулуб А. А., Стефанов В. Е., Скалецкий Е. К. Миграция протонов в стопке молекул тирозина под воздействием иона магния и электрического поля. Математическая модель // Биофизика. 2001. Т. 46. С. 581-587.

15. Evarestov R. A., Stefanov V. E., Karasev V. A., Bandura A. N. Quantum chemical calculation of crystalline model of biomembrane // Int. J. Quant. Chem. 2004. Vol. 96. P. 106-115.

16. Karasev V. A., Demchenko E. P., Stefanov V. E. The topological coding of polymers and protein structure prediction // Mathematical Chemistry. 2000. Vol. 6. P 295-345.

17. Karasev V. A., Fundamensky V. S., Bannova I. I., Franke V. D., Stefanov V. E. Crystallization of the Isobuthylphosphocholine-Cholesterol-Isobutanol (1-3-3) Complex and Its Investigation by X-ray Analysis: Modeling of the membrane structure // Biochim. Biophys. Acta. 2000. Vol.1466. P. 23-38.

18. Karasev V. A., Stefanov V. E. Topological nature of the genetic code // J. Theor. Biol. 2001. Vol. 209, P. 303-317.

19. Karasev V. A., Luchinin V. V., Stefanov V. E. Topological Coding: Towards New Materials for Molecular Electronics.” Advanced Functional Materials // Advanced Functional Materials. 2002. Vol. 12. P. 461-469.

20. Karasev V. A., Luchinin V. V., Stefanov V. E. Symmetry and spatial structure of the canonical set of amino acids // Fourth International Conference on Bioinformatics of genome regulation and structure. BGRS’2004, Novosibirsk, 2004.Vol.1. P. 278-281.

21. Karasev V. A., Luchinin V. V., Stefanov V. E A dodecahedron-based model of spatial representation of the canonical set of amino acids // Series in Mathematical Biology and Medicine. New Jersey; London, 2005. Vol. 8. P. 482-493.

22. Stefanov V. E., Kalatsky Yu. M., Vasiliev V. Yu. Cellular test-system is a new tool for integral assessment of environmental pollution // Proceedings of Environmental Science and Technology. 2005. Vol. 1 (2). P. 34-38.

23. Stefanov V. E., Tulub A. A. Migration of protons in a chain of tyrosine residues // Int. J. Quant. Chem. 2001.Vol. 84. P. 409-415.

24. Stefanov V. E., Tulub A. A. Mechanisms of biological effects of metals mediated by interactions with nucleotide cofactors of proteins // Metals Ions in Biology and Medicine. Vol. 7. Paris, 2002. P 89-93.

25. Stefanov V. E., Tulub A. A. 195Pt NMR-Fourier spectroscopy in the analysis of the mechanismof the cytostatic activity of platinum complexes // NATO Science Series: II: Mathematics, Physics and Chemistry. Dordrecht Hardbound. 2002. Vol. 76. P. 615-624.

26. Tulub A. A. Stefanov V. E. Cisplatin stops tubulin assembly into microtubules. A new insight into the mechanism of antitumor activity of platinum complexes // Int. J. Biol. Macromol. 2001. Vol. 28. P. 191-198.

27. Tulub A. A., Stefanov V. E. Activation of Tubulin Assembly into Microtubules upon a Series of Repeated Femtosecond Laser Impulses // J. Chem. Phys. 2004. Vol. 121. P. 11345-11350.

28. Tulub A A., Stefanov V. E. Triplet-Singlet Spin Communication between DNA Nucleotides serves the basis for Quantum Computing // Chem. Phys. Lett. 2007. Vol. 436. P. 258-262.

29. Tulub A. A., Stefanov V. E. New horizons of adenosinetriphosphate energetics arising from interaction with magnesium cofactor // Europ. Biophys. J. 2008. Vol. 37. P. 1309-1316.