СПОСОБ ОЦЕНКИ РИСКА ХРОНИЧЕСКИХ АУТОИММУННЫХ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ
METHOD FOR ASSESSING THE RISK OF CHRONIC AUTOIMMUNE INFLAMMATORY PROCESSES

Область использования. Изобретение относится к биофизике, биологии и медицине, а именно к диагностике обменных нарушений, интоксикации организма при различных заболеваниях, в том числе - наследственных, генетических, экологических, аутоиммунных, включая заболевания почек, печени, желудочно-кишечного тракта, центральной нервной системы, сосудов. Оценка обменных нарушений при остроте патологии и в период ремиссии необходима для поиска эффективных патогенетически оправданных средств лечения, снижения тяжести течения, развития осложнений и для профилактики хронических аутоимунных воспалительных процессов.
Уровень техники. Известны неинвазивные способы определения хронических воспалительных заболеваний при нарушении обмена и патологии почек по появлению микропротеинов, «средних молекул» в моче, в том числе в разовых порциях. Однако определение общего количества микропротеинов затруднительно, а отдельные их фракции исследуются только с помощью дорогостоящих наборов реактивов и на специальном высокочувствительном оборудовании (радио-иммунный анализ, иммуноферментный анализ). В то же время знание о количестве и составе фракций экскретируемых микропротеинов дает возможность установить не только патогенез заболевания, но и риск его развития еще на доклинической стадии.
Не менее важным показателем нарушения обменных процессов в моче является повышенное содержание «средних молекул», но суммарная экскреция дает только общее представление о наличии изменений, а исследование состава выделяемых с мочой средних молекул - дорогостоящая и длительная процедура, еще недостаточно отработанная как технически, так и с точки зрения диагностической значимости.
Исследования, проведенные в НИЦ Курчатовский институт являются обоснованием актуальности предложенного способа [N. Novikova, М. Kovalchuk, N. Stepina, R. Gaynutdinov, E. Chukhrai and E. Yurieva. Distinct effect of xenobiotics on the metal-binding properties of protein molecules // Journal of synchrotron radiation. - 2015. - T. 22. - №.4. - C. 1001-1007]. Представляем данные результаты. Для определения влияния продуктов нарушенного обмена веществ на белковые молекулы, проведены рентгеновские измерения методом стоячих рентгеновских волн на монослоях белковых молекул, сформированных на поверхности жидкости в ленгмюровской ванне. В качестве эндогенного токсина была выбрана мочевина - наиболее известный «уремический» токсин. Повышение уровня мочевины в крови происходит в результате резкого снижения азотвыделительной функции почек при хронической почечной недостаточности, терминальная (не совместимая с жизнью) концентрация мочевины составляет 0,035 М. Нарушение микроэлементного баланса в организме является одним из ранних симптомов, наблюдающихся при хронической почечной недостаточности. Так анемия с недостатком железа возникает при концентрации мочевины в крови начиная с 0,01 Моль/л. С увеличением уровня мочевины и потери белка с мочой симптомы микроэлементозов нарастают.
В исследованиях, проведенных в НИЦ Курчатовский институт, дозы мочевины (0,09-0,17 М) были значительно меньше тех концентраций, которые используются в биологических экспериментах для денатурации белков (8-9 М), что обусловило сохранение электрофоретических и большую часть функциональных свойств белковых молекул. По результатам этих исследований было установлено, что предварительная обработка белка токсикантами (продукты перекисного окисления, мочевина, в повышенных количествах по сравнению с физиологическими, а также тяжелые металлы) резко увеличивают лигандные свойства белковых молекул, изменяя их конформацию и активируют абсорбцию МЭ из воды высокой степени очистки. С увеличением доз токсиканта (в пределах до денатурирующих) в растворе количество инкорпорированных в белках МЭ возрастает. Накопление ионов металлов в белках, обработанных мочевиной (а также другими токсикантами) связано с тем, что под действием"мочевины происходит изменение пространственного расположения отдельных пептидных фрагментов белковой макромолекулы. Такие конформационные изменения приводят к увеличению доступности аминокислотных остатков с функциональными группами, которые обладают высокой способностью координировать ионы металлов.
Обнаруженные в модельных экспериментах на белковых пленках факты повышения неспецифической связывающей способности белковых молекул под действием токсикантов (в том числе мочевины), послужили основанием для предположения об изменении элементного состава белков, модифицированных различными токсикантами, которые накапливаются в организме при хронических обменных заболеваниях. Такими токсикантами становятся как патологические продукты обмена (гомоцистеин, средние молекулы), так и физиологические продукты обмена в повышенных дозах (мочевина, мочевая кислота, гормоны, нейромедиаторы, продукты перекисного окисления), а также различные ксенобиотики, включая лекарственные препараты. Под действием таких эндогенных и экзогенных факторов может происходить изменение конформации белковых макромолекул с раскрытием новых адсорбционных центров, что в свою очередь будет приводить к заметному увеличению способности белка связывать ионы металлов. В результате этих изменений снижаются функциональные свойства белковых молекул, они становятся «чужеродными» для организма. К «чужеродным» белкам (антигенам) в организме образуются антитела, которые могут осаждаться в тканях в виде комплекса антиген-антитело с развитием воспалительного процесса на иммунной основе (воспаление сосудов при атеросклерозе).
Кроме того, белковые молекулы с измененной конформацией, несущие на себе захваченные МЭ, могут выключаться из физиологических процессов и удаляться из организма через различные выделительные системы, в частности с мочой. Наблюдаемая при этом потеря МЭ сама по себе является крайне нежелательным процессом и в большинстве случаев требует заместительной терапии (железодефицитная анемия). К сожалению, определение содержания наиболее востребованных МЭ - железа и цинка, в моче не всегда доступно из-за низкой чувствительности приборов, не говоря уже о менее представленных МЭ в организме (кобальт, медь, марганец).
Таким образом, результаты экспериментального определения действия токсикантов на белковые молекулы со значительным повышением связывания МЭ из окружающей среды подтверждают возможность комплексной качественной и количественной оценки эндогенной интоксикации и высокого риска аутоиммунных воспалительных процессов при обменных нарушениях в организме, в том числе и до клинической манифестации развития патологии.
В норме за сутки у человека с мочой выделяется 40-70 мг белка, при почечных заболеваниях эта величина возрастает до 1-2 г. В настоящее время используется метод определения экскретируемых белков с мочой в два этапа: индикаторными полосками с тетрабромфенолом-blue и количественно (с сульфосалициловой кислотой и др.) в случае положительной реакции на индикаторных полосках (не менее 1-2 г/л при нефротическом синдроме). Значительная протеинурия свидетельствует о уже существующем поражении гломерулярной фильтрации и/или транспортной системы белков в проксимальных канальцах почек. Ограниченная чувствительность и специфичность методов определения белков в моче препятствует выявлению микропротеинурии (до 300-500 мг в сутки), которая может быть критерием риска патологии еще до ее клинических проявлений.
Техническим результатом, на который направлено изобретение, является повышение чувствительности, информативности, а также доступности по экономическим и трудозатратным факторам комплекса способа для фракционной и количественной характеристики микропротеинурии как показателя степени риска хронических аутоиммунных воспалительных процессов при обменных нарушениях.
Для достижения указанного результата предложен способ оценки риска хронических аутоиммунных воспалительных процессов, характеризующийся тем, что осаждают микропротеины с помощью ацетона из суточной мочи при времени контакта с ацетоном не более 5-6 минут, определяют количество и фракционный состав микропротеинов в осадке и проводят анализ связанных с микропротеинами микроэлементов (МЭ), в качестве которых выбирают металлы Fe и/или Zn, и в случае увеличения микропротеинурии выше 100 мг за сутки и при повышении относительного содержания связанных с микропротеинами МЭ в 2-7 раз по сравнению с нормой устанавливают наличие риска хронических аутоиммунных воспалительных процессов.
На чертежах показаны:
Фиг. 1. Результаты исследований белков мочи с помощью электрофореза (на агарозном геле) у пациента с задержкой психомоторного развития.
Фиг. 2. Результаты исследований белков мочи с помощью электрофореза (на агарозном геле) у пациента с синдромом Элерса-Данло.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ.
Известны способы определения микропротеинов, не выявляемых в моче обычными клиническими лабораторными методами [см. например, Лефковиц И., Пернис Б. Иммунологические методы исследования. - М.: Мир, 1988. - 520 с.]. Такие специальные методы основаны на выявлении отдельных фракций микропротеинов с помощью специфических антител путем радиоиммунного или иммуноферментного анализа. Основной недостаток таких методов заключается в необходимости больших финансовых и трудозатрат, а также использования дорогостоящего оборудования, при этом удается провести анализ только для одной белковой фракции.
Предложенное в настоящем «Способе» фракционирование микропротеинов, осажденных ацетоном, с помощью электрофореза (в частности Serba, 4115 Hidrogel 5 proteinur) позволяет изучать сразу 3 класса белков мочи: тубулярные (молекулярная масса 21-45 кДА), микроальбумины (молекулярная масса 60-70 кДА) и глобулярные (молекулярная масса более 70 кДА). Причем в тубулярной фракции присутствуют экскретируемые бета и альфа микроглобулины, миоглобин и другие микропротеины, свидетельствующие о наличии высокого риска нарушения функции почек.
Использование белков, сконцентрированных в 20-40 раз с помощью осаждения мочи ацетоном, упрощает определение общего количества белка в моче, а также позволяет изучать белковые фракции в динамике наблюдения пациента для контроля за нарушением обменных процессов, высокого риска хронических воспалительных процессов и эффективностью лечебных мероприятий. Важнейшим преимуществом предложенного нами «Способа» является возможность значительно увеличить предел определения МЭ, инкорпорированных на белках, как за счет концентрирования белка, так и за счет устранения солей макроэлементов (Са, K и другие), которые остаются в надосадочной жидкости и которые в обычных исследованиях могут накладываться на пики от МЭ, снижая эффективность методов определения МЭ в моче.
В диагностический комплекс «Способа» входят следующие этапы: 1) осаждение белков ацетоном; 2) качественная и количественная характеристика осажденных белков; 3) качественное и количественное определение содержания МЭ в выделенных белках: приготовление растворов для анализа, установление распределения МЭ в компонентах мочи, разработка расчета суточного количества. Определение нормативных показателей у здоровых детей.
Пункт 1. Концентрирование белков мочи осуществляется следующим образом: аликвота из суточной мочи (собранной на холоду) освобождается от форменных элементов и солевых кристаллов центрифугированием 2-3 мин (2 тыс.об./с), из центрифугата берется количество мочи, соответствующее 1/250-1/500 части суточного количества, к которому добавляется охлажденный до 8-10°С ацетон (в соотношении 1:2) и центрифугируется после перемешивания в течение 3 мин.
Пункт 2. Надосадочная жидкость сливается, осадок подсушивается на воздухе, растворяется в 0,2-0,3 мл физраствора и используется для электрофоретического разделения на фракции на агарозном геле. Подсушенный белковый осадок при необходимости сохраняется в закрытых емкостях при температуре минус 10-20 гр. до одного года. Общее количество белков и их фракций определяется по суммарной площади фракций под электрофорезной кривой по калибровочной кривой на альбумин.
Пункт 3. Исследование количества и качества МЭ в осадке и надосадочной жидкости (моча + ацетон без белка) при необходимости для контроля содержания МЭ проводится в соответствии с методом их определения на конкретном приборе. При использовании метода рентгено-флуоресцентного анализа в геометрии полного внешнего отражения белок растворяется в разведенной азотной кислоте (1:1). Для химического (наборы фирмы Sentinel, Италия), а также для атомно-абсорбционного определения МЭ -белок растворяется в минимальном количестве дистиллированной воды, учитывается степень разведения. При определении МЭ в осажденных белках и надосадочной жидкости (моча + ацетон), а также в нативной моче (выпаривание), было установлено, что все количество МЭ мочи находится в связанном с белками состоянии и отсутствует в надосадочной жидкости после осаждения белков ацетоном.
Важно подчеркнуть, что ацетон (наравне с эндогенными токсикантами, являющимися продуктами нарушенного обмена веществ) также может вызывать конформационные изменения белковых молекул, продуктов нарушенного обмена веществ. Для определения оптимальных условий выделения белков из мочи с помощью ацетона были выполнены дополнительные исследования, посвященные изучению влияния длительности контакта ацетона с выделяемыми белками на способность белковых молекул связывать МЭ. Использовался способ рентгено-флуоресцентного анализа в геометрии полного внешнего отражения, измерения проводили на лабораторном спектрометре PICOFOX (Bruker, Германия). Определяли элементный состав белков, осажденных ацетоном, в зависимости от времени инкубирования с ацетоном. Исследовались микропротеины суточной мочи двух пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями (проба (1) и проба (2)), а также коммерчески доступные белки: альбумин, гемоглобин и гамма-глобулин, выделяемые ацетоном из водного раствора (концентрации 1 г/л). Каждый выделенный белок исследовался в трех вариантах: 1) осаждение и центифугирование с быстрым освобождением от надосадочной смеси в течение 5-6 минут; 2) осаждение ацетоном в течение 30 минут; и 3) осаждение ацетоном в течение 60 минут.
В таблице 1 «Изменение элементного состава микропротеинов суточной мочи в зависимости от времени контакта с ацетоном для двух пациентов (проба 1 и проба 2) с сердечно-сосудистой патологией» (в скобках приведена норма) представлены результаты определения МЭ в микропротеинах мочи двух пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями (2 пробы) при воздействии ацетона в зависимости от времени контакта. У обоих пациентов количество микропротеинов было увеличено в 2-3 раза по сравнению с нормой - 100 мг и 110 мг по сравнению с 40-70 мг за сутки. Согласно данным, приведенным в таблице 1, при увеличении времени воздействия ацетона на белок снижается способность белка удерживать инкорпорированные ранее МЭ и происходит дальнейшая модификация белковых молекул в сторону денатурации. Причем эффект усиливается при увеличении времени контакта.
Кроме того, в таблице 1 показано, что в обеих пробах концентрация МЭ (в первую очередь Fe, Zn) в микропротеинах мочи в 3-4 раза выше, чем в норме. При кратком контакте с ацетоном (3-5 минут) концентрация МЭ в белках из 1/500 части суточной мочи была сопоставима в двух представленных порциях, а при удлинении времени контакта с ацетоном происходило снижение МЭ в обоих случаях. Таким образом в уже измененных молекулах белков в организме с нарушенным обменом длительное действие ацетона обусловило дальнейшие изменения конформации белков в сторону денатурации и потери способности удерживать МЭ.
В таблице 2 «Изменение элементного состава коммерчески доступных белков в зависимости от времени контакта с ацетоном» представлены результаты изменения удержания МЭ белковыми молекулами (выделенными из водного раствора с помощью ацетона) без предварительной обработки какими-либо токсикантами. Показано, что при кратковременном контакте ацетона с раствором альбумина (5 и 30 минут) концентрация МЭ практически не изменилась, а через 60 мин концентрация Fe, Zn, Cl - значительно повысилась, что свидетельствует об относительной толерантности альбумина к действию ацетона. Согласно полученным данным конформационная (без денатурации) перестройка молекул альбумина началась после 30 минут контакта с ацетоном, что привело к увеличению количества инкорпорированных МЭ. В пробе с гемоглобином повышение концентрации МЭ (Zn, Cu) наблюдалось уже после 30 минут контакта с ацетоном и сохранялось через 60 минут. Однако концентрация МЭ практически не менялась в пробах с гамма-глобулином с увеличением времени контакта с ацетоном. Полученные результаты свидетельствуют о различии чувствительности отдельных белков к действию ацетона.
А - альбумин, Hb - гемоглобин, Гл - гамма-глобулин.
Суммируя представленные в таблицах 1 и 2 результаты, можно сделать заключение о необходимости ограничения времени контакта осаждаемого белка с ацетоном в процессе выделения.
При отработке оптимальных условий определения микроэлементного состава выделенных из мочи микропротеинов была проверена также возможность исследования проб микропротеинов, негидролизованных азотной кислотой. Оказалось, что такой прием не дает преимущества в связи с неоднородностью распределения белка по поверхности прободержателя. В связи с этим был использован прием, рекомендованный производителями прибора: гидролиз белкового осадка в минимальных количествах азотной кислоты, составные части которой (молекулярная масса менее 16) не мешают определению МЭ (молекулярная масса более 30). Исследование влияния на гидролиз выделенных белков концентрации азотной кислоты показало возможность использования разведенной (1:1) кислоты в количестве 50-100 микролитров для полного и быстрого гидролиза таких белков. Помимо указанного метода исследования МЭ в выделенных белках оказалось возможным использование химических методов их определения с помощью наборов. В связи с тем, что железо и цинк содержатся в биологических жидкостях в наиболее высоких концентрациях по сравнению с другими МЭ и их легче всего исследовать в клинических условиях, было предложено проводить расчет коэффициента мкМоль МЭ/мг белка по одному из этих катионов. В сыворотке крови такой коэффициент для железа и цинка составляет 0,005-0,020.
В таблице 3 показано относительное содержание металлов (Fe и Zn) в микропротеинах (мкМоль МЭ/мг белка) в суточной моче как критерий степени эндогенной интоксикации при различной патологии у детей без признаков патологии почек.
КМП - кардиомиопатии, См Э-Д - симптом Элерса-Данло, РПЗ - рахитоподобное заболевание, НОГ - несовершенный остеогенез, ЗПР - задержка психомоторного развития, СмМн - синдром Марфана.
Примеры осуществления изобретения. Концентрирование белка мочи проводится следующим способом: к 2-4 мл мочи из суточного количества (1/500-1/250 часть мочи из расчета 2-4 мл на 1 л) добавляется 4-8 мл охлажденного до 4-8°С ацетона, аликвоты перемешиваются и центрифугируются 3-4 минут при 2 тыс.об/мин. Надосадочная жидкость сливается, осадок подсушивается на воздухе, растворяется в 0,2 мл физраствора и используется для электрофоретического разделения на фракции на агарозном геле. При необходимости хранения осажденных белков высушенные пробы сохраняют в закрытых емкостях при минус 10-20°С до одного года. Общее количество осажденных белков можно определить взвешиванием на аналитических весах, либо по калибровочной кривой для количественного определения в пересчете на альбумин. В таких же порциях осажденных белков (из 1/250-1/500 части суточного количества мочи) определяется содержание МЭ с помощью соответствующих приборов.
Пример 1. Мария Л., 6 лет, задержка психомоторного развития. Находилась в отделении генетики на обследовании по поводу микрогематурии (эритроциты 1-2 в п/зр., лейкоциты 1-3 в п/зр.), удельная плотность мочи 1018, рН - 5 - кислая, (500 мл/сутки) определяется значительное количество гемоглобина в моче, а также гликозаминогликанов и липидов, отмечается выраженное снижение антиоксидантной защиты (10% при норме более 50%). Признаки интоксикации. Белок в моче не определяется (диагностические полоски). При осаждении ацетоном, при концентрировании мочи в 20 раз - определяется микропротеинурия в размере 125 мг/сутки. Белковые фракции: тубулярные - 26,5%, альбумин - 52,3%, гломерулярные - 21,2% (фиг. 1). Таким образом, у ребенка имеют место все фракции белков мочи («смешанный» тип микропротеинурии). Экскреция МЭ повышена, соотношение МЭ/белок: для железа - 0,12 (норма до 0,067) и для цинка - 0,2 (норма до 0,067) мкг МЭ /мг белка. Таким образом, у ребенка с задержкой психомоторного развития имеются признаки обменных нарушений - микропротеинурия и микроэлементурия, риск развития аутоиммунной нефропатии.
Пример 2. Дмитрий Т., 16 лет. Наблюдается в стационаре с диагнозом синдром Элерса-Данло (нарушение соединительно-тканного, коллагенового обмена, с гиперподвижностью суставов, пролапсом митрального клапана). В анализах суточной мочи (1900 мл) микрогематурия (эритроциты 6-7 в поле зрения, лейкоциты 0-2 в поле зрения), удельная плотность мочи 1022, рН 5 - кислая, определяется значительное количество гемоглобина в моче, а также гликозаминогликанов, липидов, средних молекул с мочой экскретируются железо и цинк в 5 и 8 раз превышающие, средне-нормальные показатели. Соотношение МЭ/белок: для железа - 0,1 и для цинка - 0,2 (норма до 0,067) мкг МЭ/мг белка. Белок микрочипами в моче не определяется. При осаждении ацетоном - микропротеинурия составляет 120 мг/сутки. Фракции: тубулярная - 7,7%, альбумин - 71,4%, гломерулярная - 20,9% (фиг. 2). Таким образом, значительно преобладает фракция альбумина и гаммаглобулинов, в моче имеются признаки эндогенной интоксикации, микропротеинурия и микроэлементурия, риск хронической аутоиммунной нефропатии.
Пример 3. Даниил М., 16 лет, наблюдался в стационаре по поводу тахикардии, неприятных ощущений в области сердца, быстрой утомляемости, которые отмечаются в течение последних 4-5 лет. Установлен диагноз гипертрофическая кардиомиопатия. В биохимических анализах крови имеют место признаки нарушения обменных процессов: повышение активности щелочной фосфатазы, лактатдегидрогеназы, липипротеинов низкой плотности и снижение липипротеинов высокой плотности, значительное повышение содержания в крови всех трех видов натрийуретических пептидов - ANP, BNP, CNP, оксида азота и др. В суточной моче - единичные лейкоциты, немного плоского эпителия, белок микрочипами не определяется, повышена экскреция средних молекул. Микропротеины, выявленные с помощью осаждения ацетоном, составили 184 мг за сутки. Фракции: тубулярная - 2,5%, альбумин - 90,5%, глобулярная - 7% - селективная микропротеинурия. Отмечено повышение экскреции МЭ, соотношение. МЭ/белок составляли 0,11 для железа и 0,2 для цинка (норма до 0,067) мкг. МЭ/мг белка, что значительно превышает норму, особенно для цинка. Таким образом, у ребенка с кардиомиопатией и обменными нарушениями с эндогенной интоксикацией имеет место значительное повышение микропротеинов и МЭ в моче, которые могут поддерживать хронический гипертрофический процесс в сердечно-сосудистой системе, служить неинвазивным методом контроля за течением заболевания и эффективностью лечения и использоваться для изучения патогенеза данного заболевания, контроля за риском аутоиммунного воспалительного процесса в сердечно-сосудистой системе (атеросклероз).
Пример 4. Александр К, 14 лет. Наблюдался в стационаре с жалобами на боли в сердце, быструю утомляемость, мышечную слабость, снижение аппетита, веса. Изменения в состоянии отмечаются с 7 летнего возраста. Установлен диагноз дилятационная кардиомиопатия. В анализах крови выявлено значительное повышение содержания натрийуретических пептидов, особенно ANP, эндотелина, миокардиальной креатинкиназы и др., что свидетельствует о выраженном нарушении обменных процессов. В суточной моче (600 мл) единичный плоский эпителий, рН кислая, повышена экскреция средних молекул, белки в моче с помощью индикаторных полосок не определяются, а при осаждении ацетоном составили 178 мг/24 часа (фракции тубулярная - 2,3 альбумин - 84,4 глобулярная - 13,3%), железо 0,45 мг и цинк - 2 мг/24 часа. Соотношение МЭ/белок - для железа 0,07, для цинка - 0,3 (норма до 0,067), что значительно превышает норму, особенно для цинка. Таким образом, у ребенка отмечено нарушение обменных процессов, признаки эндогенной интоксикации с повышением экскреции L микропротеинов, перегруженных МЭ при хроническом деструктивном процессе в сердце, с риском аутоиммунного воспалительного процесса в сердечно-сосудистой системе.
Пример 5. Белки, выделенные ацетоном из мочи ребенка с кардиомиопатией были использованы для изучения провоспалительного действия на коже предплечья у 5 добровольцев по аналогии с реакцией Пирке. Во всех случаях на второй-третий день развилась выраженная воспалительная реакция, в одном случае с аллергическим компонентом, доказывающими провоспалительные (антигенные) свойства выделенных белков.