ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННАЯ ВАКЦИНА

1. Персонализированная противораковая вакцина, содержащая рекомбинантный поксвирус, кодирующий один или более чем один неопептид.
2. Персонализированная противораковая вакцина по п. 1, в которой указанный рекомбинантный поксвирус принадлежит к роду Orthopoxvirus и предпочтительно представляет собой вирус осповакцины.
3. Персонализированная противораковая вакцина по п. 2, в которой указанный рекомбинантный поксвирус представляет собой дефектный по репликации вирус осповакцины, такой как MVA (модифицированный вирус осповакцины Анкара).
4. Персонализированная противораковая вакцина по любому из пп. 1-3, в которой каждый из указанного одного или более чем одного неопептида, кодируемого рекомбинантным поксвирусом, содержит по меньшей мере одну опухолеспецифичную мутацию.
5. Персонализированная противораковая вакцина по п. 4, в которой по меньшей мере 60% указанных неопептидов содержат миссенс-мутацию или мутацию со сдвигом рамки считывания.
6. Персонализированная противораковая вакцина по п. 5, в которой по меньшей мере 60% указанных неопептидов содержат миссенс-мутацию.
7. Персонализированная противораковая вакцина по любому из пп. 1-6, в которой указанный один или более чем один неопептид имеет длину от 16 до 90 аминокислотных остатков, предпочтительно от 17 до 85 аминокислотных остатков и, более предпочтительно, от 18 до 80 аминокислотных остатков.
8. Персонализированная противораковая вакцина по любому из пп. 5-7, в которой указанные неопептиды, содержащие миссенс-мутацию, имеют длину от 18 до 29 остатков, и указанные неопептиды, содержащие мутацию со сдвигом рамки считывания, имеют длину от 30 до 80 аминокислотных остатков.
9. Персонализированная противораковая вакцина по любому из пп. 5-8, в которой по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90% неопептидов, имеющих миссенс-мутацию, несут замененную аминокислоту в центральном положении.
10. Персонализированная противораковая вакцина по любому из пп. 1-9, в которой несколько и предпочтительно все неопептиды экспрессируются рекомбинантным поксвирусом в виде одного или более чем одного слияния и, предпочтительно, одного или более чем одного слияния из 2-15 неопептидов.
11. Персонализированная противораковая вакцина по п. 10, в которой указанное слияние не содержит какого-либо ТМ (трансмембранного) сегмента.
12. Персонализированная противораковая вакцина по п. 10 или 11, в которой указанное слияние дает отрицательный индекс в отношении гидрофобности.
13. Персонализированная противораковая вакцина по любому из пп. 10-12, в которой указанное слияние демонстрирует индекс гидропатичности, равный или меньший 0,1.
14. Персонализированная противораковая вакцина по любому из пп. 10-13, в которой рекомбинантный поксвирус кодирует 2 или 3 слияния, где:
каждое слияние содержит от 5 до 10 неопептидов;
каждое слияние содержит линкеры, предпочтительно длиной 3 аминокислоты, на N-конце первого неопептида и между каждым неопептидом;
каждое слияние содержит сигнальный пептид на N-конце указанного слияния; и
каждое слияние возможно содержит метку на С-конце указанного слияния; и
каждое слияние:
демонстрирует общий отрицательный индекс гидрофобности и/или общий индекс гидропатичности, равный или меньший 0,1, и
не содержит какого-либо потенциального ТМ сегмента.
15. Персонализированная противораковая вакцина по любому из пп. 1-14, в который указанный рекомбинантный вирус представляет собой рекомбинантный MVA, содержащий от одной до трех кассет - каждая для экспрессии слияния из 5-10 неопептидов - под транскрипционным контролем промотора вируса осповакцины, выбранного из группы, состоящей из p11k7.5, pH5R, р7.5К и pB2R.
16. Персонализированная противораковая вакцина по любому из пп. 1-15, в который указанный рекомбинантный поксвирус дополнительно кодирует один или более чем один терапевтический ген, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из суицидных и иммуностимулирующих генов.
17. Способ получения персонализированной противораковой вакцины по п. 1, включающий стадию идентификации одного или более чем одного неопептида, подходящего для кодирования рекомбинантным поксвирусом, где указанный один или более чем один неопептид содержит по меньшей мере одну опухолеспецифичную мутацию.
18. Способ по п. 17, где указанный способ включает стадию идентификации, включающую следующие подстадии а)-г):
а) экстрагирование ДНК из указанного образца опухоли и указанного неопухолевого образца,
б) выбор областей-мишеней, предпочтительно полных кодирующих областей генома (экзом),
в) секвенирование указанных областей-мишеней (например, экзома) из указанной экстрагированной ДНК и
г) идентификация одной или более чем одной опухолеспецифичной мутации посредством сравнения последовательностей ДНК, полученных из указанных образцов опухоли и неопухолевых образцов.
19. Способ по п. 18, в котором указанный образец опухоли представляет собой биопсию опухоли, предпочтительно содержащую не больше, чем 20% опухолевых клеток, и где указанный неопухолевый образец представляет собой биологическую жидкость, цитологический материал или биопсию.
20. Способ по любому из пп. 17-19, в котором указанная стадия идентификации дополнительно включает по меньшей мере одну из следующих дополнительных подстадий д) - и):
д) ранжирование потенциального(ных) неопептида(дов) по их уровням экспрессии в опухоли либо на уровне транскрипции мРНК, либо на уровне трансляции белка;
е) отбор неаутоэкспрессируемой(мых) опухолеспецифичной(ных) мутации(ций);
ж) прогнозирование иммунного потенциала неоэпитопа(пов), содержащегося(щихся) в указанном(ных) неопептиде(дах);
з) прогнозирование присутствия потенциальных(ного) ТМ сегмента(тов) в самих неоэпитопах и/или слияниях неопептидов, содержащих несколько неопептидов;
и) ранжирование потенциального(ных) неопептида(дов) и/или слияния(ний) неопептидов по их степени гидрофобности и, в частности, отбор неопептида(дов) и/или слияния(ний) неопептидов таким образом, что указанный(ные) неопептид(ды) и/или слияние(ния) неопептидов демонстрирует(ют) отрицательный общий индекс гидрофобности и/или общий индекс гидропатичности, равный или меньший 0,1.
21. Способ по п. 20, где указанный способ дополнительно включает стадию получения указанного рекомбинантного поксвируса.
22. Способ по п. 21, в котором молекула(лы) нуклеиновой кислоты, кодирующая(щие) указанный один или более чем один неопептид, подлежащая(щие) вставке в геном рекомбинантного поксвируса, организуется(ются) в одной или более чем одной экспрессионной кассете под контролем подходящих регуляторных элементов, обеспечивающих экспрессию у субъекта.
23. Способ по п. 21 или 22, в котором указанная(ные) молекула(лы) нуклеиновой кислоты или экспрессионная(ные) кассета(ты), кодирующая(щие) указанный один или более чем один неопептид, вставляется(ются) в геном родительского поксвируса с образованием указанного рекомбинантного поксвируса, и предпочтительно, где указанный родительский поксвирус содержит ген флуоресцентного репортера, клонированный в месте вставки, который отбирается на молекулу(лы) нуклеиновой кислоты или экспрессионную(ные) кассету(ты), кодирующую(щие) неопептид.
24. Способ по п. 23, в котором указанный флуоресцентный репортер выбран из группы, состоящей из GFP (зеленый флуоресцентный белок), eGFP (усиленный зеленый флуоресцентный белок), флуоресцентного белка AmCyan 1 и mCherry.
25. Способ по п. 24, в котором указанная стадия получения указанного рекомбинантного поксвируса включает дополнительную стадию расщепления эндонуклеазой, способной генерировать по меньшей мере один двухнитевой разрыв в указанной нуклеотидной последовательности флуоресцентного репортера, но в которой указанная эндонуклеаза не расщепляет поксвирусный геном.
26. Способ по п. 25, в котором указанная эндонуклеаза выбрана из группы, состоящей из нуклеаз с цинковыми пальцами (ZFN), эффекторных нуклеаз, подобных активатору транскрипции (TALEN), нуклеаз кластерных коротких палиндромных повторов, разделенных регулярными промежутками (CRISPR)/Cas9, и рестрикционных ферментов с уникальным сайтом расщепления в пределах гена флуоресцентного репортера.
27. Способ по любому из пп. 21-26, в котором указанная стадия получения рекомбинантного поксвируса обеспечивает получение указанного рекомбинантного поксвируса самое большее за 4 недели, предпочтительно самое большее за 3 недели, с отношением рекомбинантного к родительскому, составляющим от 2 до 0,05.
28. Способ по любому из пп. 17-27, где указанный способ дополнительно включает стадию изготовления, где указанная стадия изготовления включает стадию амплификации в подходящей клетке-продуценте в подходящем масштабе, стадию выделения продуцированного рекомбинантного поксвируса из культуры клеток и возможную стадию очистки выделенного рекомбинантного поксвируса.
29. Способ по п. 28, в котором указанная клетка-продуцент представляет собой фибробласты эмбриона курицы (CEF).
30. Способ по п. 28 или 29, в котором указанная стадия выделения продуцированного рекомбинантного поксвируса включает стадию лизиса, в которой мембрана клетки-продуцента разрушается, предпочтительно с использованием высокоскоростного гомогенизатора.
31. Способ по любому из пп. 28-30, в котором указанная стадия очистки включает стадию фильтрования тангенциальным потоком (TFF).
9
9
10
32. Способ по любому из пп. 28-31, в котором в указанной стадии изготовления достигается продукция по меньшей мере 10 БОЕ (бляшкообразующая единица), желательно по меньшей мере 5×10 БОЕ и предпочтительно приблизительно 10 БОЕ или более для персонализированной противораковой вакцины.
33. Персонализированная противораковая вакцина по любому из пп. 1-16 или полученная согласно способу по любому из пп. 17-32, где указанная персонализированная противораковая вакцина представляет собой композицию, содержащую терапевтически эффективное количество указанного рекомбинантного поксвируса и фармацевтически приемлемого носителя.
7
9
34. Персонализированная противораковая вакцина по п. 33, в которой указанное терапевтически эффективное количество для индивидуальных доз составляет от приблизительно 5×10 БОЕ до приблизительно 10 БОЕ.
35. Персонализированная противораковая вакцина по любому из пп. 33 или 34 для применения у субъекта, нуждающегося в этом, для лечения рака или предупреждения его рецидива у субъекта.
36. Персонализированная противораковая вакцина для применения по п. 35, где указанный рак представляет собой солидную опухоль.
37. Персонализированная противораковая вакцина для применения по п. 36, где указанный рак представляет собой рак мозга, такой как, например, астроцитомы, эмбриональные опухоли, герминомы, атипическая тератоидная/рабдоидная опухоль центральной нервной системы, краниофарингиома, эпендимома, глиома и глиобластома, а также рак головы и шеи.
38. Персонализированная противораковая вакцина для применения по п. 36, где указанный рак представляет собой рак легкого и, в частности, NSCLC (немелкоклеточный рак легкого) с особым предпочтением в отношении аденокарциномы, плоскоклеточной карциномы и крупноклеточной карциномы.
39. Персонализированная противораковая вакцина для применения по п. 36, где указанный рак представляет собой рак яичника.
40. Персонализированная противораковая вакцина для применения по любому из пп. 35-39, где указанную персонализированную противораковую вакцину вводят пациенту посредством внутривенных, подкожных, внутримышечных или внутриопухолевых инъекций.
41. Персонализированная противораковая вакцина для применения по любому из пп. 35-40, где указанную персонализированную противораковую вакцину вводят в сочетании с одной или более чем одной дополнительной противораковой терапией/ями, которые имеют пользу в лечении рака.