Effect of prenatal hypoxia on radial maze learning in adult male white rats

УДК 616.152.21:618.3-591.513

В.А. Вокина

ВЛИЯНИЕ ПРЕНАТАЛЬНОЙ гипоксии на обучение взрослых белых крыс В РАДИАЛЬНОМ ЛАБИРИНТЕ

Ангарский филиал Восточно-Сибирского научного центра экологии человека СО РАМН - Научноисследовательский институт медицины труда и экологии человека

Рассмотрено влияние острой внутриутробной гипоксии на 13—14 и 18—19 сутки беременности и хронической внутриутробной гипоксии на показатели обучения белых крыс-самцов в радиальном лабиринте. Гипоксию моделировали путем подкожного введения беременным самкам раствора нитрита натрия в дозе 50 мг/кг. При тестировании животных использовалась схема эксперимента для раздельного анализа рабочей и референтной памяти. Обнаружено статистически значимое ухудшение процессов кратковременной и долговременной памяти у животных, подвергавшихся хроническому гипоксическому воздействию и воздействию на 18—19 день эмбриогенеза. Гипоксия на ранних постимплантационных стадиях (13—14 эмбриональные сутки) вызвала менее выраженные нарушения в процессах памяти.

Ключевые слова: внутриутробная гипоксия, долговременная и рабочая память, радиальный лабиринт, белые крысы

EFFECT OF PRENATAL HYPOXIA ON RADIAL MAZE LEARNING IN ADULT MALE WHITE RATS

V.A. Vokina

Angarsk Branch of East Siberian Scientific Center of Human Ecology SB RAMS - Scientific Institute

of Occupational Medicine and Human Ecology, Angarsk

The effects of acute prenatal hypoxia on 13—14 and 18—19 days of pregnancy and chronic prenatal hypoxia on learning in a radial maze were considered. Hypoxia modeled by subcutaneous injection of pregnant females a solution of sodium nitrite in a doze of 50 mg/kg. At testing animals the design of experiment for the separate analysis of the worker and reference memories was used. Statistically significant worsening of processes of short-term and long-term memory at the animals, exposed to chronic hypoxic exposure and impact on day 18—19 of embryogenesis chronic is revealed. Hypoxia on the early postimplantation stages (13—14 embryonic days) has caused less pronounced disturbances in the processes of memory.

Key words: prenatal hypoxia, long-term and working memory, radial maze, white rat

Пренатальная гипоксия является одним из главных патогенных факторов, нарушающих физиологическое развитие у детей, к тому же частота данной патологии не имеет тенденции к уменьшению. Более половины всех случаев расстройств функций ЦНС у детей раннего возраста обусловлено не острой гипоксией в родах, а длительной, хронической гипоксией плода и новорожденного. Гипоксические повреждения эмбрионального мозга могут приводить к гибели или увеличивать риск возникновения психических и нейродегене-ративных заболеваний с возрастом [2, 10].

Многочисленные экспериментальные исследования показали, что гипоксическое воздействие различного генеза в период эмбрионального развития может приводить к патологическим изменениям в ЦНС, при этом большое значение имеет длительность и этап развития, на котором это воздействие применялось [7, 8, 11, 12, 13, 14]. Установлено, что в определенные критические периоды эмбриогенеза действие гипоксии приводит к нарушению поведения, обучаемости и памяти у половозрелых животных. Так, Simonov Z. и соавт. [14] продемонстрировали ухудшение пространственной памяти в лабиринте Морриса у молодых (23 — 32 постнатальный день) и взрослых (100 — 109

день жизни) крыс, вызванное нарушением структур неонатального мозга под воздействием гипоба-рической гипоксии с рождения по 19 день жизни. Латентный период поиска скрытой платформы у животных опытной группы был значительно выше, чем в контроле. Данные изменения подтверждались морфологическими исследованиями, в которых было обнаружено, что в сенсомоторной и моторной коре молодых крыс происходит снижение количества нейрофиламентов и олигодендроцитов, а также задержка созревания нейронов и изменения макроглии в кортексе и гиппокампе.

Вследствие перинатального воздействия гипоксии у экспериментальных животных наблюдались прогрессирующие нарушения функций ЦНС [10, 11]. Так, Ватаева Л.А. с соавт. [3] обнаружили, что при формировании пространственного навыка в водном лабиринте Морриса у самцов обнаруживались последствия пренатальной гипобариче-ской гипоксии на 14—16 сутки, проявляющиеся в ухудшении показателей обучения (снижение латентного периода достижения платформы происходило значительно медленнее, чем в контроле), по мнению авторов, это связано с разнообразными нейрохимическими нарушениями, либо с расстройством регуляции гормональных систем.

О когнитивных нарушениях после пренатальной гипоксии сообщали также Н.М. Дубровская и И.А. Журавин и соавт. [4, 5, 6]. По их данным, при воздействии нормобарической гипоксии на 13,5 и 18,5 эмбриональные сутки у молодых и взрослых животных было зафиксировано достоверное

рефлексу, нарушение долговременной и кратковременной памяти в восьмилучевом лабиринте по сравнению с животными контрольной группы. В экспериментальных группах уменьшалось количество животных, хорошо обучившихся длительное время давить на поршень для добывания пищи предпочитаемой передней конечностью. Тогда как количество животных, неспособных обучаться данному инструментальному рефлексу, увеличивалось в 1,7 раза. Этот факт вполне согласуется с морфологическими данными, которые свидетельствовали о патологических изменениях, связанных с разрывом и выпадением элементов сети нейронов, наблюдавшимися у экспериментальных животных на всех сроках исследования.

Наиболее вероятной причиной сдвигов в поведении животных может являться изменение морфофункциональной организации ЦНС, вызываемое нарушением процессов пролиферации, миграции или дифференцировки нейробластов тех отделов мозга, которые закладываются во время действия патологического фактора [8]. В нашем исследовании были выбраны три периода воздействия гипоксии на самок крыс во время беременности: 13 — 14 день, относящийся к предплодному (эмбриональному) периоду, когда в головном мозге активно протекают основные гистогенетические процессы (деление клеток и их миграция); 18 — 19 день, относящийся к плодному (постимплантаци-онному) периоду, когда уровень пролиферации клеток в мозге снижается и ускоряются процессы их созревания и дифференцировки и хроническое воздействие с 10 по 19 день беременности.

Целью настоящей работы было изучение влияния гемической внутриутробной гипоксии на память и способности к обучению в радиальном лабиринте у животных в постнатальном онтогенезе.

МЕТОДИКА

Работа выполнена на 24 беспородных белых крысах-самках и 42 самцах их половозрелого потомства. Фиксированный срок беременности определяли общепринятым методом по наличию сперматозоидов во влагалищных мазках. Беременных самок подвергали воздействию нитрита натрия

или хроническому воздействию с 10 по 19 день беременности. Часть самок получала инъекции

Достигшие половозрелого возраста самцы, рожденные экспериментальными самками, были распределены в 4 группы: в 1-ую группу вошли животные, подвергавшиеся хроническому пренатальному гипоксическому воздействию с 10 по

19 день беременности; II и III группу составляли крысы, перенесшие острую гемическую гипоксию на 13 — 14 и 18 — 19 эмбриональные сутки соответственно; IV группа — животные от контрольных самок. Крысята всех групп были отсажены от матерей и разделены по полу на 30 день жизни.

В возрасте 3-х месяцев проводили обучение крыс в радиальном лабиринте в течение 9 дней. Эксперимент проводился в отдельной комнате при искусственном освещении. Используемый радиальный лабиринт состоял из центральной камеры, диаметром 34 см, и 8 радиально расходящихся рукавов одинакового размера, длиной 86 см и шириной 10 см. Установка была поднята на высоту 70 см над уровнем пола. Животных обучали искать пищу в 4-х открытых рукавах лабиринта, при этом 4 других все время оставались закрытыми и непод-крепляемыми. После 24 ч пищевой депривации группу животных из домашней клетки помещали на 10 — 20 минут в лабиринт, где были рассыпаны кормовые гранулы (используемые в качестве подкрепления при тестировании) для привыкания животных к установке и снижения их интереса к новой обстановке. На следующий день крыс по одной помещали в лабиринт, позволяя им зайти во все подкрепленные отсеки и съесть корм. На третий день пищевое подкрепление помещали в кормушках, располагавшихся в конце только ранее открытых лучей лабиринта и все отсеки открывали, при этом в поиске пищи животное имело возможность зайти в любой из них. Животному позволяли выполнить 4 посещения подкрепляемых или 8 любых рукавов, после чего животное извлекали из установки. Заход только в ранее открытые отсеки, где пищи уже не было, классифицировался как ошибка рабочей памяти. Заход в отсек, который

памяти. Тестирование проводили в течение 9 дней. Критерий обученности считали достигнутым, если животное в течение двух дней совершало не больше одной ошибки, посетив при этом все четыре подкрепленных рукава. Для оценки влияния пренатальной гипоксии регистрировали следующие показатели обучения и памяти:

1) количество ошибок рабочей памяти;

2) количество ошибок референтной памяти;

3) число последовательно посещенных подкрепляемых рукавов;

4) число животных, достигших критерия обученности.

Животные всех групп содержались в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище. Все исследования проводились в соответствии с принципами и нормативными документами, рекомендованными Европейским научным фондом (ESF) и Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным.

Полученные материалы исследований обработаны методами непараметрической (критерии Манна — Уитни и двусторонний критерий Фишера) статистики с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows 5.5. Результаты

представлены в виде медианы и интерквартильного интервала.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При обучении крыс в радиальном лабиринте выявлено ухудшение памяти у всех животных с грузом внутриутробной гипоксии. Однако более выраженным оказалось влияние острой гипоксии, перенесенной животными на 18—19 день эмбрионального развития. Количество животных в этой группе, достигших критерия обученности, состав-

ляло 12,5 % от общего количества животных, что значительно ниже, чем в контрольной группе — 69% (р = 0,02). Снижение числа ошибок рабочей и референтной памяти у крыс данной группы происходило значительно медленнее и на 8 и 9 сутки тестирования статистически значимо отличалось от контрольных крыс. Число последовательных посещений подкрепляемых рукавов в группе крыс с гипоксией на 18—19 день эмбриогенеза в последний день тестирования было снижено (р = 0,01) по сравнению с данным показателем в контрольной группе (рис. 1).

Число последовательно посещенных подкрепляемых рукавов

4

3.5 3

2.5 2

1.5 1

0,5

0

V VI VII

дни тестирования

Контроль  Гипоксия хроническая иГипоксия на 13-14день шГипоксия на 18-19день

Количество ошибок референтной памяти

3.5 3

2.5 2

1.5 1

0,5

0

¡1

1-

1

і і:;:;

IV

V VI VII

дни тестирования

VIII

IX

Контроль н Гипоксия хроническая  Гипоксия на 13-14 день  Гипоксия на 18-19 день

Количество ошибок рабочей памяти

1,2

1

0,8

0,6

0,4

0,2

0

V VI VII

дни тестирования

VIII

IX

Контроль  Гипоксия хроническая нГипоксия на 13-14день шГипоксия на 18-19день

Рис. 1. Показатели обучения крыс в радиальном лабиринте: * - различия статистически значимы по сравнению с контролем при р < 0,05 (критерий Манна - Уитни).

В группе животных с грузом хронической внутриутробной гипоксии наблюдалось большее количество ошибок рабочей памяти и снижение количества последовательно посещенных подкрепляемых рукавов, по сравнению с контролем, что свидетельствовало о снижении у этих животных способности к обучению и нарушениях в процессах кратковременной памяти. Количество обученных животных в данной опытной группе составило лишь 30 %.

Внутриутробная гипоксия на ранних постим-плантационых стадиях (13—14 эмбриональные сутки) также вызывала нарушения в процессах памяти, однако менее выраженные, чем при гипоксии на 18—19 день эмбриогенеза. Животные данной группы совершали больше ошибок рабочей памяти в последние дни тестирования, вместе с тем число животных, достигших критерия обученности (50 %), не имело статистически значимых отличий по сравнению с животными контрольной группы.

Таким образом, моделирование внутриутробной гипоксии нитритом натрия в различные периоды эмбриогенеза вызывало нарушение процессов памяти и обучаемости у половозрелого потомства. Согласно результатам исследования, проведенного Васильевым Д.С. ссоавт. [1], последствия деструктивного воздействия максимальны в случае совпадения времени воздействия с периодом интенсивной пролиферации и миграции

Полученные нами данные, напротив, указывают на то, что гипоксическое воздействие на более поздних сроках эмбрионального развития также крайне негативно сказывалось на процессах памяти и способности животных к обучению. В данном случае, по-видимому, особое значение приобретает не только период, но и тип гипоксического воздействия, которое в исследовании Васильева Д.С. было экзогенного характера. Введение нитрита натрия беременным самкам вызывает гемическую и тканевую формы гипоксии, так как под действием этого яда происходит не только образование метгемо-глобина, но и разобщение процессов окисления и фосфорилирования. Разумеется, такая смешанная форма гипоксии может оказать более выраженное повреждающее действие, чем изолированный вид гипоксии, так как возрастает вероятность срыва ряда компенсаторно-приспособительных реакций.

Многочисленные исследования когнитивных функций животных, подвергавшихся внутриутробной гипоксии, направлены на изучение последствий именно острого гипоксического воздействия. И действительно, при острой гипоксии возникает кислородное голодание, прежде всего, тканей головного мозга — коры головного мозга, мозжечка, высших подкорковых центров, что, по-видимому, приводит к более негативным последствиям. В свою очередь, хроническое воздействие в период эмбриогенеза может привести к функциональным и органическим изменениям в тканях, при этом их причиной может являться не только недостаток

кислорода. Расстройство гемодинамики влечет за собой нарушение доставки в ткани и органы энергетических веществ и веществ, необходимых для синтеза тканевых белков и их комплексов, а также несвоевременное удаление из тканей продуктов обмена веществ.

По нашему мнению, наблюдаемые в настоящем исследовании когнитивные нарушения у экспериментальных животных вследствие перенесенной острой и хронической гемической гипоксии могут возникать вследствие изменений функций гиппокампа, а также других структур, причастных к обучению на фоне отклонений в медиаторном и гормональном обменах.

ВЫВОДЫ

1. Пренатальная гипоксия, вызванная введением нитрита натрия, вызывает нарушения в процессах кратковременной и долговременной памяти и способности к обучению у взрослых животных.

2. Хроническое гипоксическое воздействие и воздействие на 18— 19 день эмбриогенеза способствует более выраженным нарушениям когнитивных функций, чем на более ранних постимпланта-ционых стадиях.

ЛИТЕРАТУРА

1. Васильев Д.С. Формирование конечного мозга крыс после нарушения эмбрионального развития, вызванного пренатальной гипоксией:

2. Васильев Д.С. и др. Пренатальная гипоксия нарушает формирование нервной ткани базальных ганглиев мозга в онтогенезе крысы // Рос. физиол.

С.У159- 160.

3. Ватаева Л.А. и др. Обучение в водном лабиринте Морриса самок и самцов крыс, подвергавшихся воздействию гипоксии в различные сроки пренатального периода развития // Ж. эвол.

С. 530-533.

4. Дубровская Н.М., Потапов Д.О., Туманова Н.Л. Влияние пренатальной гипоксии на развитие крыс в постнатальном онтогенезе // Вест.

5. Дубровская Н.М. и др. Влияние ингибитора а-секретазы, метабилизирующей предшественник амилоидного пептида, на формирование памяти у крыс // Ж. высшей нерв, деятельности. — 2005. —

6. Журавин И.А., Дубровская Н.М., Туманова Н.Л. Постнатальное физиологическое развитие крыс после острой пренатальной гипоксии //

7. Журавин И.А. и др. Формирование клеточных механизмов обучения и памяти в онтогенезе млекопитающих зависит от условий эмбрионального развития // Нейрохимия: Фунд. и приклад.

Критические периоды развития головного мозга // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. — 2000. — №86. - С. 1418-1425.

9. Маклакова А.С. и др. Сравнительный анализ отдаленных последствий пренатальной гипоксии, проведенной в периоды прогестации и раннего

10. Пальчик А.Б., Шабанов Н.П. Гипоксически-ишемическая энцефалопатия новорожденных: руководство для врачей. — СПб.: Питер, 2000. — 140 с.

11. Трофимова Л.К. и др. Поведение половозрелых белых крыс, подвергнутых антенатальной прерывистой гипоксии в период раннего органо-

генеза: гендерные отличия // Из. Рос. акад. наук.

12. Nyakas С., BuwaldaB., Luiten P. Hypoxia and

13. Nyakas C. et al. Life-spanning behavioral and adrenal dysfunction induced by prenatal hypoxia in the rat is prevented by the calcium antagonist nimo-

P. 746-753.

14. Simonova Z. etal. Postnatal hypobaric hypoxia in rats impairs water maze learning and the morphology of neurons and macroglia in cortex and hip-

р. 195-205.

Сведения об авторе

Вокина Вера Александровна - младший научный сотрудник лаборатории токсикологических исследований, аспирант Ангарского филиала ВСНЦ экологии человека СО РАМН - НИИ медицины труда и экологии человека