Способ для диагностирования рака яичников на основе набора генов длинных некодирующих РНК
METHOD FOR DIAGNOSING OVARIAN CANCER BASED ON A SET OF GENES OF LONG NON-CODING RNA

Настоящее изобретение относится к области молекулярной и клинической онкологии, и касается системы маркеров для диагностики рака яичников путем оценки статуса метилирования набора генов длинных не кодирующих белок РНК (нкРНК): SSTR5-AS1, KCNK15-AS1 и MAGI2-AS3. Заявленный способ, основанный на анализе метилирования набора из трех генов длинных нкРНК, позволяет со 100%-ой специфичностью и почти со 100%-ой чувствительностью диагностировать рак яичников. Выявление метилирования хотя бы одного из генов данного набора в предположительно пораженной раком ткани яичников позволяет с высокой достоверностью диагностировать рак яичников у данной пациентки.
Рак яичников (РЯ) - наиболее злокачественное онкогинекологическое заболевание у женщин. РЯ протекает практически бессимптомно вплоть до запущенных стадий, осложненных метастазированием и образованием асцита [1]. Для своевременной диагностики РЯ необходимо открытие новых более эффективных молекулярных маркеров. Длинные некодирующие белок РНК (нкРНК) отмечены как важные регуляторы клеточных процессов и потенциальные биологические маркеры онкологических заболеваний, включая РЯ [2]. Эпигенетические маркеры, включая метилирование супрессорных генов и профили метилирования генов микроРНК перспективны в диагностике рака, в частности рака яичников [3].
Нами обнаружено гиперметилирование целого ряда генов длинных нкРНК в опухолях больных РЯ в отличие от парных гистологически нормальных тканей яичников от тех же пациенток и в отличие от тканей яичников «доноров» (людей, умерших от неонкологических заболеваний). Анализ метилирования трех генов SSTR5-AS1, KCNK15-AS1 и MAGI2-AS3, для которых гиперметилирование в опухолях РЯ обнаружено нами ВПЕРВЫЕ, мы предлагаем использовать как способ для диагностирования РЯ.
Ранее в патенте США (U.S. Pat. No. 7,507,536 (2009)) был предложен набор генов (TM4SF11, TNFRSF10B, RUNX3, ACTN1, FANCG) для диагностики и прогноза рака яичников [4]. Выявление метилирования хотя бы в одном маркере этой группы генов рассматривается как выявление предрасположенности к возникновению РЯ. Значения клинической чувствительности и специфичности для данной системы не приведены.
В другом патенте США (U.S. Pat. No. 9,410,956 (2016)) описаны маркеры для идентификации рака яичников и предсказания клинической картины заболевания, основанные на анализе изменений экспрессии группы генов микроРНК [5]. Аберрантная экспрессия 4 микроРНК (miR-214, -199а*, -200а и -100) была выявлена примерно в половине или более случаев РЯ, преимущественно на поздних стадиях и при высокой степени анаплазии. Значения клинической чувствительности и специфичности для данной системы не приведены.
В качестве ближайшего аналога рассмотрим патент РФ (RU 2703399 С1, 16.10.2019), в котором описан способ для диагностики рака яичников, основанный на анализе метилирования группы генов микроРНК (miR-124a-3, -129-2, -193а, -107) [6]. Этот способ позволяет диагностировать рак яичников со 100%-специфичностью и с клинической чувствительностью 87%.
Задача заявляемого изобретения - расширить арсенал способов диагностирования рака яичников за счет применения новых маркеров на основе генов длинных нкРНК.
Задача решена путем:
- разработки заявляемого способа диагностики рака яичников на основе анализа уровня метилирования набора из трех генов длинных нкРНК (SSTR5-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3), который позволяет выявлять РЯ путем обнаружения метилирования, по крайней мере, у одного гена из этого набора
Диагностику рака яичников осуществляют по методу:
Берут образцы ткани яичников у лиц, обследуемых для выявления онкологического заболевания или с установленным диагнозом. Выделение и очистку ДНК из образцов ткани яичников проводят методом фенол-хлороформенной экстракции. Качество и точную концентрацию ДНК определяют спектрофотометрически по соотношению оптической плотности при длинах волн 260 и 280 нм. Анализ уровня метилирования генов длинных нкРНК проводят с применением бисульфитной конверсии ДНК и количественной метил-специфичной ПЦР (qMSP) с детекцией в реальном времени, как описано в работе [7]. Для оценки значимости различий применяют непараметрический критерий Манна-Уитни.
Различия считают значимыми при p<0.05. Расчеты проводят в системе для статистического анализа данных IBM SPSS Statistics 22. Статус метилирования каждого гена в каждом образце опухолей РЯ и нормальных тканей яичников пост-мортальных «доноров» оценивают с применением порогового уровня. Для набора генов длинных нкРНК рассчитывают специфичность и чувствительность набора маркеров методом ROC-анализа.
Пример 1. Анализ уровня метилирования трех генов длинных нкРНК SSTR5-AS1, KCNK15-AS1 и MAGI2-AS3, используемых в заявляемом способе для диагностики рака яичников.
Для анализа метилирования каждого гена используют две пары праймеров, специфичных как к метилированному, так и к неметилированному аллелю (Таблица 1). Используют набор реактивов «qPCRmix-HS SYBR» по протоколу фирмы Евроген. Амплификацию проводят в системе Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR Detection System (США) в соответствии с прилагаемым к прибору протоколом. Полноту конверсии ДНК определяют с помощью контрольного локуса АСТВ с использованием олигонуклеотидов специфичных к неконвертированной матрице [7]. Для сравнительного анализа эффективности амплификации также применяют локус АСТВ с использованием олигонуклеотидов, специфичных к конвертированной матрице. В качестве контролей для неметилированных аллелей используют коммерческий препарат ДНК #G1471 (Promega, США). В качестве позитивного контроля 100%-ого метилирования используют коммерческий препарат ДНК #SD1131 (Thermo Scientific, США). Соотношение уровней метилирования и их значимость оценивают с применением непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия считают значимыми при р<0.05. Уровень метилирования 3 генов днРНК SSTR5-AS1, KCNK15-AS1 и MAGI2-AS3 определен в 18 образцах нормальных яичников от пост-мортальных лиц без онкопатологии в анамнезе (Таблица 2) и в 44 образцах опухолей рака яичников (Таблица 3).
Пример 2. Оценка статуса метилирования 3 генов длинных нкРНК SSTR5-AS1, KCNK15-AS1 и MAGI2-AS3 в образцах рака яичников с учетом порогового уровня. Для выявления факта гиперметилирования исследуемых генов длинных нкРНК SSTR5-AS1, KCNK15-AS1 и MAGI2-AS3 в опухолях рака яичников (РЯ) был выбран пороговый уровень, который рассчитывался для каждого гена на основании данных, полученных для «доноров» (Таблица 2). Пороговый уровень равен N(mean) + 2SD, где N(mean) - средний уровень метилирования в норме («доноры»), SD - стандартное отклонение [8]. Для двух генов (SSTR5-AS1 и MAGI2-AS3) гиперметилирование установлено во всех 44 образцах опухолей РЯ (Таблица 3). Для гена KCNK15-AS1 отмечено снижение уровня ниже порогового в единственном образце (#29) из 44 образцов РЯ (Таблица 3).
Пример 3. Оценка чувствительности и специфичности заявляемого способа для диагностики рака яичников на основе набора маркеров {SSTR5-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3).
Важным свойством заявляемого способа и набора маркеров для диагностики рака яичников является высокая клиническая чувствительность и специфичность. Так как метилирование 3 маркеров этого набора не выявлено ни в одном из 18 исследованных образцов доноров (таблица 3), то есть ложноположительные результаты не обнаружены, можно утверждать о возможности использовать заявляемый способ и набор маркеров для диагностики рака яичников со 100%-специфичностью. При этом отсутствие метилирования в опухолях РЯ среди 44 пациенток выявлено только у одного из маркеров и только в единственном образце (№29) (1/44, 2,3%), а в 88% случаев метилирование выявлено и в этом маркере тоже. В соответствии с этими данными, клиническая чувствительность и специфичность заявляемого способа и набора маркеров для диагностирования рака яичников, рассчитанная методом ROC-анализа, составляют 98% и 100%), соответственно, величина AUC (Area Under the ROC Curve) составила 0,989. Таким образом, заявляемый способ позволяет диагностировать рак яичников с 98%-ой клинической чувствительностью и со 100%-специфичностью, то есть строго специфично - у пациенток истинно больных раком яичников. Анализ характеристик набора маркеров методом ROC-анализа показан на Фигуре (Графике). Согласно параметрам, оценивающим набор маркеров (в частности - критерий > 0), достаточно выявления метилирования хотя бы одного из трех маркеров данного набора для диагностирования злокачественных опухолей яичников у пациентки.
Заявляемый способ для диагностирования рака яичников характеризуются тем, что
- Позволяет диагностировать рак яичников с высокой 98%-ой клинической чувствительностью и 100%-специфичностью при величине AUC, характеризующей надежность отобранного набора маркеров, близкой к единице (0,989). Рассмотренный ближайший аналог (RU 2703399 С1, 16.10.2019) [6] позволяет диагностировать рак яичников с меньшей чувствительностью (87%) и при меньшей величине AUC (0,936).
Цитированные источники научно-технической информации:
1. Braga ЕА, Fridman MV, Kushlinskii NE. Molecular Mechanisms of Ovarian Carcinoma Metastasis: Key Genes and Regulatory MicroRNAs. Biochemistry (Mosc). 2017 May; 82(5):529-541. doi: 10.1134/S0006297917050017. PMID: 28601063.
2. Braga EA, Fridman MV, Moscovtsev AA, Filippova EA, Dmitriev AA, Kushlinskii NE. LncRNAs in Ovarian Cancer Progression, Metastasis, and Main Pathways: ceRNA and Alternative Mechanisms. Int J Mol Sci. 2020 Nov 23; 21(22):8855. doi: 10.3390/ijms21228855. PMID: 33238475.
3. Dong, A., Lu, Y., Lu, B. (2016) Genomic/Epigenomic Alterations in ovarian carcinoma: translational insight into clinical practice, J. Cancer, 7, 1441-1451.
4. U.S. Pat. No. 7,507,536 (2009) Van Criekinge et al. Methylation markers for diagnosis and treatment of ovarian cancer.
5. U.S. Pat. No. 9,410,956 (2016) Cheng; Jin Q. Micro-RNA profiling in ovarian cancer.
6. Логинов В.И., Ходырев Д.С., Брага Э.А., Бурденный A.M., Пронина И.В., Филиппова Е.А., Казубская Т.П. Способ для диагностики рака яичников на основе группы генов микроРНК. Патент на изобретение RU 2703399 С1, 16.10.2019. Заявка №2018138755 от 02.11.2018.
7. Hattermann K., Mehdorn Н.М., Mentlein R., Schultka S., Held-Feindt J. A methylation-specific and SYBR-green-based quantitative polymerase chain reaction technique for 06-methylguanine DNA methyltransferase promoter methylation analysis. Analytical Biochemistry. 2008. Vol. 377, N 1, 62-71. doi 10.1016/j.ab.2008.03.014.
8. Lehmann U, Berg-Ribbe I, Wingen LU, Brakensiek K, Becker T, Klempnauer J, Schlegelberger B, Kreipe H, Flemming P. Distinct methylation patterns of benign and malignant liver tumors revealed by quantitative methylation profiling. Clin Cancer Res. 2005 May 15; 11(10):3654-60. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-04-2462