Влияние модифицированного глиального нейротрофического фактора (GDNF) на регенерацию эпителиального и эпителиально-стромального дефектов роговицы в эксперименте

влияние модифицированного глидльного нЕйротрофичЕского фактора (GDNF) нА РЕГЕнЕРАЦиЮ эпителиального и эпитЕлидльно-стромдльного дефектов роговицы в эксперименте

Н.А. Гаврилова 1, А.В. Ревищин 2, С.А. Борзенок13, О.Ю. Комова 1, М.Б. Агаммедов 1, Х.Д. Тонаева 3, Д.С. Островский 3, Г.В. Павлова 2

1 Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова, Москва, Россия

2 Институт биологии гена РАН, Москва, Россия

3 Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» им. С.Н. Федорова, Москва, Россия

Impact modified glial-derived neurotrophic factor (GDNF) for regeneration of epithelial and epithelial-stromal corneal defect in the experiment

NA. Gavrilova 1, A.V. Revischin 2, S.A. Borzenok 13,O.J. Komova 1, M.B. Agammedov1, H.D. Tonaeva 3, D.S. Ostrovsky 3, G.V. Pavlova 2

1 A.I. Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry, Moscow, Russia

2 Institute of Gene Biology of RAS, Moscow, Russia

3 S.N. Fedorov Eye Microsurgery Interdisciplinary Science and Technology Complex, Moscow, Russia

Цель работы — изучить влияние модифицированного глиального нейротрофического фактора (9й1\1Р) на процесс заживления эпителиального и эпителиально-стромального повреждений роговицы в эксперименте на мышах линии С57В1У6Л.

После эпителиального и эпителиально-стромального повреждений производили инстилляции кондиционированной среды, полученной в результате культивирования клеток НЕК293, содержащих конструкцию с геном 9й1\1Р без пре- и пропоследовательностей. Контролем служила среда, кондиционированная нетрансфицированными клетками. Оценивали площадь эпителиального дефекта роговицы и частоту формирования эрозий роговицы, развивающихся на фоне эпителиального дефекта. Для иммуногистохимического исследования роговицы после эпителиально-стромального повреждения использовали антитела к цитокератину 5/18, с-Ме^ коллагену IV типа, фосфо-Е1Ж1/2, фосфоЛ1\1К1/2, Ю67, Вс12, ОАР43, Т1МР-1, ТСР-р, Вах и ММР9.

Площадь эпителиального дефекта роговицы глаз животных экспериментальной группы в разные периоды времени в течение суток после деэпителизации была меньше, чем в контроле. Частота формирования эрозий роговицы в экспериментальной группе после деэпителизации наблюдалась в 30—35%, в контроле — в 80—85% случаев. Иммуногисто-химическое исследование роговицы после эпителиально-стромального повреждения показало, что 9й1\1Р стимулировал пролиферативную активность эпителиальных клеток и кератоцитов, способствовал активной эпителиальной миграции и адгезии эпителиальных клеток, оказывал анти-апоптотический и антифибротический эффекты, принимал активное участие в формировании стромального нервного сплетения.

Полученные результаты свидетельствуют об эффективности применения модифицированного 9й1\1Р при повреждениях роговицы и необходимости проведения дальнейших исследований с целью разработки и тестирования методов терапевтического использования препаратов на основе данного нейротрофического фактора.

Ключевые слова: повреждение роговицы, глиальный нейротрофический фактор.

Objective is to study the effect of modified glial-derived neurotrophic factor (GDNF) on healing of epithelial and epithelial-stromal corneal lesions in mice C57BL / 6J.

After corneal damage the instillations of supernatant conditioned by HEK293 cells expressed GDNF gene construction without pre- and pro- sequences were produced. For control, a medium conditioned by not transfected cells was used. We assessed the area of corneal epithelial defect and corneal erosion rate, developing after the epithelial defect. The immunohistochemical study using antibodies against cytokeratin 5/18, c-Met, collagen IV, phospho-ERK1/2, phospho-JNK1/2, Ki67, Bcl2, GAP43, TIMR-1, TGF-p, Bax, and MMP 9 was performed.

The area of corneal epithelial defect in the eyes of experimental animals within one day after damage was smaller than in the control. Frequencies of corneal erosions formed in the eyes of experimental animals after damage was observed in 30-35% and 80-85% of cases in the experimental and control groups, respectively. Immunohistochemical studies using these antibodies showed that GDNF stimulated the proliferative activity of epithelial cells and keratinocytes, contributed to active migration and adhesion of epithelial cells, had anti-apoptotic and antifibrotic effects, took an active part in the formation of stromal nerve plexus.

The results indicate the hopefulness of therapeutic application of the modified GDNF after corneal injury and the need for further research to develop and test methods for the therapeutic use of drugs on the basis of this neurotrophic factor.

Keywords:

factor.

corneal lesion, glial-derived neurotrophic

Введение

По данным Всемирной организации здравоохранения, патология роговицы является причиной слепоты 5% населения мира. Из 314 млн пациентов 45 млн абсолютно слепые, из них 8,4 млн — дети [1].

e-mail: lkorochkin@mail.ru

Одно из ведущих мест среди причин слепоты и слабовидения занимают рецидивирующие деструктивные процессы роговицы. Для решения данной проблемы безусловный интерес представляют ней-ротрофические факторы и, в частности, глиальный

нейротрофический фактор (glial cell-derived neurotrophic factor, GDNF). В исследованиях на клеточных культурах было установлено, что GDNF через многокомпонентную систему рецепторов стимулирует пролиферативную активность эпителиальных клеток и кератоцитов [2—4]. Система включает рецептор семейства GDNF альфа-1 (GDNF family receptor alpha 1, GFRa-1), рецептор с тирозинкиназной активностью (receptor tyrosine kinase, RET), MAP-киназный каскад сигнальных путей (mitogen-activated protein kinase, MAPK), регулируемый внеклеточным сигналом, ERK1/2 киназу (extracellular signal-regulated kinase 1/2, ERK1/2) и Jun-N-концевую киназу (Jun N-terminal kinase 1/2, JNK1/2). Кроме того, GDNF способствует регенерации интрастромального и субэпителиального нервных сплетений роговицы после ее повреждения [5]. Однако имеющихся на сегодняшний день данных не достаточно для четкого представления о влиянии GDNF на регенеративный процесс в роговице. В частности, известно, что при повреждении роговицы увеличивается экспрессия трансформирующего фактора роста ß-1 (Transforming growth factor ß-1, TGF-ß1), повышается активность TGF-ß1, индуцируемого фос-форилирования JNK, и экспрессия фактора роста соединительной ткани, участвующего в процессах фиброзирования [6—8]. В связи с тем, что GDNF способен индуцировать фосфорилирование ERK и JNK, важно исключить возможное потенцирование неблагоприятных эффектов подобного рода при его применении.

В процессах повреждения и регенерации роговицы значительную роль играют матричные металло-протеиназы (matrix metalloproteinase, MMP) и их ингибиторы (tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMP) [9, 10]. MMP при повреждениях регулируют процессы ремоделирования внеклеточного матрик-са, в частности, ММР9 отвечает за деградацию поврежденного матрикса в процессе эпителизации и за ремоделирование стромы после ее завершения [11, 12]. Известно, что у пациентов с рецидивирующими эрозиями роговицы значительно повышен уровень ММР9. Предполагается, что с этим связан процесс деградации вновь образующейся базаль-ной мембраны, т.е. избыточная экспрессия фермента может иметь патологические последствия [13]. В эксперименте при рецидивирующих эрозиях роговицы было выявлено, что повышение уровня ММР9 приводило к деградации a6ß4-интегрина и, соответственно, нарушению процессов миграции эпителиальных клеток и адгезии их к базальной мембране [14]. Так как GDNF в ряде случаев увеличивает экспрессию MMP9, с нашей точки зрения важно исключить возможное проявление неблагоприятных эффектов при его применении при повреждении роговицы.

В лаборатории нейрогенетики и генетики развития Института биологии гена РАН были получены и исследованы генетические конструкции, содержащие модифицированный ген gdnf — без пре- и пропоследовательностей. Культуральная среда, кондиционированная клетками, трансфи-цированными разработанными генными конструкциями, позитивно влияла на жизнеспособность и рост нервных отростков в культуре эмбриональных спинальных ганглиев, демонстрируя усиленные по сравнению с полноразмерной молекулой свойства GDNF [15].

Целью данной работы стало определение влияния модифицированного GDNF на процесс регенерации эпителиального и эпителиально-стромального повреждений роговицы в эксперименте.

Материал и методы

Работу проводили на половозрелых самцах мышей линии C57BL/6J с экспериментальными моделями эпителиального и эпителиально-стромального повреждений роговицы. При проведении исследований руководствовались требованиями «Международных рекомендаций по проведению медико-биологических исследований с использованием животных». Все процедуры выполняли в соответствии с международными правилами обращения с животными (National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, NIH Publications No. 80023, 1996).

Получение культуральной среды

с модифицированным GDNF

В качестве исследуемого препарата использовали кондиционированную среду, которую получали при культивировании клеток линии HEK293 (Human Embryonic Kidney 293 cells), трансфицированных плазмидным вектором, содержащим модифицированный ген GDNF без пре- и про-последовательностей под цитомегаловирусным (CMV) промотором. Клетки линии НЕК293 сразу после трансфекции с помощью реагента ExGen 500 (Fermentas, США) по протоколу фирмы-производителя, рассевали в 25 см2 флаконы (Costar, США) и инкубировали 24 ч. в среде DMEM (Панэко, РФ), при 37°С в атмосфере 5% СО2. Затем кондиционированную среду отбирали из чашек, фильтровали через 0,22 мкм фильтр, замораживали и хранили при -20°С до использования. Контролем служила кондиционированная среда после культивирования интактных клеток линии HEK293.

Экспериментальные модели эпителиального

и эпителиально-стромального дефектов роговицы

Для моделирования эпителиального дефекта животным под наркозом (внутрибрюшинная инъекция кетамина 100 мг/кг и ксилазина 5 мг/кг) в центре роговицы легким прижатием трепанов диаметром 1,5 (5 животных) и 2,5 мм (5 животных) наносилась метка, в пределах которой после окрашивания 0,01% раствором флюоресцеина (Sigma, США) удаляли эпителий с помощью скарификационного ножа. Для моделирования эпителиально-стромального дефекта в центре роговицы трепаном 1,5 мм производился разрез до 1/2 стромы, в пределах которого после окрашивания 0,01% раствором флуоресцеина удаляли эпителий с элементами 1/2 стромы роговицы (10 животных).

После создания экспериментальной модели 2 раза в сут. проводили инстилляции в оба глаза каждого животного 0,3% раствора офлоксацина (флоксала) (Синтез, Россия). Кроме того, в один глаз (экспериментальная группа) вносили по 1 капле среды, кондиционированной трансфицированными HEK293 (расчетная доза GDNF - 0,01 мг в 1 капле), а в другой глаз (контроль) — по 1 капле среды инкубирования интактных клеток. Инстилляции указанными средами осуществляли каждые 3 ч. в течение 24 и 48 ч. при эпителиальном и эпителиально-стро-мальном дефектах, соответственно, а затем каждые

6 ч. в течение последующего наблюдения (3 нед. в случае эпителиальных, 10 сут. в случае эпители-ально-стромальных дефектов).

В ходе эксперимента у животных в течение 1 сут. после повреждения проводили анализ площади эпителиального дефекта роговицы. Для этого роговицу окрашивали флюоресцеином и фотографировали с помощью фотощелевой лампы BX 900, Haag-Streit IM (Швейцария). Область, окрашенную флуоресцеи-ном, измеряли с использованием программного обеспечения ImageJ.

У мышей при наличии эпителиального дефекта в центре роговицы через две недели после повреждения спонтанно развиваются эрозии в другой области, в основном в назальном квадранте. У животных с эпителиальным дефектом оценивали частоту формирования эрозий, наблюдая за состоянием роговицы в течение 3 нед.

В случае эпителиально-стромального дефекта роговицы эрозии не развиваются, так как вследствие повреждения базальной мембраны активируется a6ß4-интегрин, который стимулирует эпителиальную миграцию и формирование гемидесмосом, связывающих эпителиальные клетки с базальной мембраной [16]. В этой связи животных выводили из эксперимента на 5 сут. (5 животных) и на 10 сут. (5 животных), после чего проводили иммуногистохимическое исследование их роговицы.

Иммуногистохимическое исследование

Роговицу с прилежащей склерой отделяли от глазного яблока и фиксировали в 4% растворе формальдегида, приготовленном на физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS, pH 7,3), в течение 24 ч. при 4°С. После пропитки в 30% растворе сахарозы в PBS в течение 1 ч. роговицы замораживали в криостате. Срезы толщиной 10 мкм размещали на предметных стеклах с полилизиновым покрытием и высушивали при комнатной температуре в течение 24 ч. Срезы, окруженные гидрофобной полоской, 1 ч. инкубировали в 2% растворе нормальной сыворотки крови осла (Jackson ImmunoResearch, США) в PBS с добавлением детергента Triton X-100 (Sigma, США) при комнатной температуре. Затем срезы покрывали раствором первичных антител в том же растворителе в течение ночи при 4°С. После промывки в PBS срезы в течение 1 ч. инкубировали в растворах ослиных антител к иммуноглобулинам животных-хозяев первичных антител, конъюгированных с флуоресцентными красителями Cy2 и Texas red. Срезы покрывали глицерином и покровными стеклами и анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus CX-41 с флуоресцентной насадкой и цифровой фотокамерой Nikon D5300 (КНР). «Неинформированный оператор» анализировал одинаково экспонированные цифровые микрофотографии и оценивал уровень экспрессии исследованных антигенов в эпидермальных и стромальных компонентах роговицы по 5-балльной шкале. Различия в интенсивности иммуногистохимической окраски между роговицами контрольной и экспериментальной групп оценивали по средним баллам оценки. Достоверность различий определяли с помощью одностороннего критерия ANOVA, применяя программу GraphPad-Prism.

В работе использовали кроличьи антитела к рецептору GDNF GFRa1, кроличьи антитела к анти-апоптозному фактору Bcl2 и его антагонисту Bax,

мышиные антитела к металлопротеиназе ММР9 и цитокератинам 5 и 18 типов (Abcam, Великобритания), мышиные антитела к ERK1/2, JNK1/2, фосфо-ERK1/2 и фосфо^К1/2, козьи антитела к TGF-ß, TIMP1 и c-Met (Santa Cruz, США), а также кроличьи антитела к белковому маркеру пролиферации Ki67 (Novocastra, Великобритания).

Чтобы подтвердить наличие базальной мембраны, производилось исследование с кроличьими антителами к ламинину и a6ß4-интегрину (Abcam, Великобритания). Для оценки реиннервации срезы инкубировали с куриными антителами к GAP43 (Acris Antibodies, Германия).

Результаты

Макроскопические данные

Площадь эпителиального дефекта роговицы через 6, 12 и 21 ч. при 1,5 мм деэпителизации в экспериментальной группе составляла 62, 30 и 5% от исходной площади, через 1 сут. наблюдалась полная эпителизация роговицы. В контроле площадь дефекта через те же промежутки времени составляла 70, 55 и 25%, через 1 сут. — 6% (рис. 1А). При деэпителизации диаметром 2,5 мм площадь эпителиального дефекта роговицы через 12 и 24 ч. составляла в экспериментальной группе 50 и 8%, в контроле — 70 и 25% от исходной площади (рис. 1Б).

Формирование эрозий роговицы в экспериментальной группе после деэпителизации диаметром 1,5 и 2,5 мм наблюдалось в 30 и 35% случаев, соответственно, в контроле — в 80 и 85%.

Иммуногистохимическое исследование

После эпителиально-стромального повреждения в базальном слое эпителия лимбальной зоны роговицы в обеих группах была выявлена позитивная реакция с антителами к GFRa1, что доказывает наличие рецепторов GDNF.

Интенсивность реакции с антителами к общим ERK1/2 и JNK1/2 в экспериментальной группе не отличалась от контроля. Реакция с антителами к фосфо-ERK1/2 в первой группе была более интенсивной в эпителии, а к фосфо-JNK1/2 в строме роговицы на 5 и 10 сут. после повреждения (рис. 2).

Полученные результаты свидетельствуют о повышении пролиферативной активности эпителиоцитов и кератоцитов через MAP-киназный каскад сигнальных путей. Выраженная позитивная реакция в экспериментальной группе на 5 и 10 сут. с антителами к Ki67 являлась подтверждением пролиферативной активности эпителиальных клеток и кератоцитов: на 5 сут. Ю67-иммунопозитивными были 14,9±2,3% клеток стромы и 5,2±2,0% клеток эпителия, тогда как в контроле — 4,7±1,4% и 1,0±0,4%, соответственно; на 10 сут. в экспериментальной группе — 6,5±2,1% клеток стромы и 2,2±0,3% клеток эпителия, в контроле — 1,6±0,4% клеток стромы, а в эпителии Ю67+-кпетки не определялись. Различия между группами были статистически значимы (p<0,05).

В экспериментальной группе на 5 сут. была показана более выраженная, по сравнению с контролем, позитивная реакция с антителами к цитокератинам 5 и 18 типов во всех слоях сформированного эпителия, что свидетельствует об активной экспрессии свойственных ему типов промежуточных микрофи-ламентов, его функциональной зрелости и физиологическом характере эпителизации (рис. 2, 3).

12 ч.

24 ч.

А

Б

Рис. 1. Размеры эпителиальных дефектов роговицы в экспериментальной (I) и контрольной (II) группах в течение первых суток после повреждения: А — при начальной деэпителизации диаметром 1,5 мм, Б — при начальной деэпителизации диаметром 2,5 мм

Эпителий роговицы, 5 сут.

Эпителий роговицы, 10 сут.

т I

р £НК1/2рШК1/2 СК5+18 с-Мег Вс|2 Вах ММР9 Т1МР-1 ТСЦ1 р ЕЯК1/2 р^К1/2 СК5+18 с-Мй Вс|2 Вах ММР9 Т1МР-1 ТвР-Р

Строма роговицы, 5 сут.

Строма роговицы, 10 сут.

I    _  I

р ERKl/2pJNKl/2 СК5+18 с-Ме1 Вс12 Вах ММР 9 Т1МР-1 ТбР-Р

р ERKl/2pJNKl/2 СК5+18 с-Ме1 Вс12 Вах ММР 9 Т1МР-1 ТвР-р

II

0

II

Рис. 2. Результаты балльной оценки интенсивности иммуногистохимической реакции эпителия и стромы роговицы с антителами к ММР9, цитокератинам 5 и 18 типов, рЕ1Ж1/2, р Л1МК1/2, ТСР-р, ТМР1, с-Ме^ Вс12 и Вах на 5 и 10 сут. после эпителиально-стромального повреждения в экспериментальной (I) и контрольной (II) группах

Рис. 3. Экспрессия цитокератинов 5 и 18 типов в роговице экспериментальной (А) и контрольной (Б) групп через 5 и 10 сут. после эпителиально-стромального повреждения. Иммунофлуоресцентное исследование. Масштабный отрезок — 50 мкм

В контрольной группе на 5 сут. реакция с антителами к цитокератинам 5 и 18 типов в эпителии роговицы была неравномерно позитивной, что коррелирует с неравномерностью процесса эпителиза-ции. Наблюдаемая позитивная реакция в базальной мембране и поверхностных слоях стромы могла быть обусловлена активной эпителиальной миграцией с формированием содержащих эпителиальные клетки полостей (псевдокист). На 10 сут. в экспериментальной группе, в отличие от контроля, наблюдалась полная эпителизация роговицы (рис. 2, 3).

На 5 сут. в области базальной мембраны в экспериментальной группе была выявлена равномерная позитивная реакция с антителами к коллагену IV типа, который способствует адгезии эпителиальных клеток, в контроле реакция была неравномерной.

В экспериментальной группе на том же сроке в эпителии была выявлена более интенсивная по-

зитивная реакция с антителами к с-Ме^рецептору фактора роста гепатоцитов (рис. 2, 4). Известно, что фактор роста гепатоцитов (НОР) с паракринным механизмом действия секретируется в клетках стромы роговицы и взаимодействует с с-Ме^рецептором эпителиальных клеток. Под воздействием НЭР-конвертирующего белка, вырабатываемого при повреждении роговицы, НЭР секретируется более активно [17—19]. В результате связывания НЭР с с-Ме^рецептором и активирования МАР-киназного (Е1Ж1/2) и фосфатидилинозитол-3-киназного (Р!3К/АКТ) путей реализуется его антиапоптотиче-ский механизм действия и активируются процессы пролиферации и миграции эпителиальных клеток [20—23]. Наличие позитивной реакции к с-Мet в строме роговицы в контроле на 5 и 10 сут. может быть также связано с процессом активной эпителиальной миграции в строму и ее ремоделированием.

Рис. 4. Экспрессия с-Мet в роговице экспериментальной (А) и контрольной (Б) групп через 5 и 10 сут. после эпителиально-стромального повреждения. Иммунофлуоресцентное исследование. Масштабный отрезок — 50 мкм

Реакция с антителами к Вс12 в эпителии роговицы в экспериментальной группе была более интенсивной, чем в контроле, как на 5, так и на 10 сут. после повреждения (рис. 2, 5). Напротив, реакция с антителами к Вах в эпителии роговицы была более выраженной в контрольной группе. Наличие высокого уровня антиапоптозных маркеров в экспериментальной и проапоптозных в контрольной группах может свидетельствовать об антиапоптотическом эффекте Эй^ (рис. 2, 6).

Реакция с антителами к матриксной ММР9 на 5 и 10 сут. была более интенсивной в эпителии роговицы в контроле. ММР9 способствует разрушению базальной мембраны и, как было сказано выше, может приводить к деградации абр4-интегрина, нарушению процессов миграции эпителиальных клеток и механической адгезии их к базальной мембране (рис. 7).

Реакция с антителами к ингибитору металлопро-теиназ Т1МР-1 была более выраженной в эпителии, базальной мембране и прилежащих слоях стро-мы роговицы глаз контрольной группы на 5 сут. и во всех слоях стромы на 10 сут. Для нормального гомеостаза в тканях необходимо сбалансированное взаимодействие ММР и Т1МРэ, а любое нарушение этого баланса может привести к избыточной или недостаточной деградации внеклеточного матрикса. Избыток Т1МР1 в контроле, таким образом, может свидетельствовать об аномальном накоплении ма-трикса, что наблюдается при процессах, связанных с фиброзом.

Слабая реакция с антителами к ТЭГ-р была выявлена в роговице глаз экспериментальной группы, более интенсивная — в контроле на 5 и 10 сут., что подтверждает более выраженный процесс фибрози-рования в контрольной группе.

А

Б

Рис. 5. Экспрессия Вс12 в роговице экспериментальной (А) и контрольной (Б) групп через 5 и 10 сут. после эпителиально-стромального повреждения. Иммунофлуоресцентное исследование. Масштабный отрезок — 50 мкм

Рис. 6. Экспрессия Вах в роговице экспериментальной (А) и контрольной (Б) групп через 5 и 10 сут. после эпителиально-стромального повреждения. Иммунофлуоресцентное исследование. Масштабный отрезок — 50 мкм

Рис. 7. Экспрессия ММР9 (красный) и ОАР43 (зеленый) в роговице экспериментальной (А) и контрольной (Б) групп через 10 сут. после эпителиально-стромального повреждения. Иммунофлуоресцентное исследование. Масштабный отрезок — 50 мкм

В экспериментальной группе на 10 сут. в строме роговицы выявлено значительно большее количество ЭАР43-иммунопозитивных нервных волокон, чем в контроле: 1150±336 и 376±156 волокон на 1 мм2 среза, соответственно. Это свидетельствует об интенсификации процесса формирования стро-мального нервного сплетения под влиянием ОйЫР (рис. 7). Различия между группами по реакции на ЭАР43 были статистически значимы (р<0,05).

Обсуждение

В результате исследования на экспериментальной модели эпителиального дефекта роговицы установлено, что кондиционированная среда культивирования клеток НЕК293, продуцирующих модифицированный ОйЫР, стимулирует процесс эпителизации и сокращает частоту формирования эрозий после деэпителизации.

В результате клинико-морфологического исследования на экспериментальной модели эпителиаль-но-стромального дефекта роговицы доказано, что применение ОйЫР стимулирует не только эпители-зацию, но и способствует восстановлению стромы роговицы. Через систему рецептора ЭРПа-1 и МАР-киназный каскад сигнальных путей ОйЫР стимулирует пролиферативную активность эпителиальных клеток и кератоцитов за счет активного фосфори-лирования Е1Ж1/2 в эпителии и умеренного фосфо-рилирования Л\1К1/2 в строме. Полученные результаты подтверждают данные работ, проведенных на клеточных культурах, в которых было установлено, что ОйЫР через ЭРПа-1 и МАР-киназный каскад сигнальных путей стимулирует пролиферативную активность эпителиальных клеток и кератоцитов [2—4].

ОйЫР является представителем надсемейства ТЭР-р, одного из надсемейств нейротрофических

факторов [24]. В связи с этим, механизмы действия ОйЫР и ТЭР-р обладают, в определенной степени, синергизмом. Помимо канонического каскада БтаС-белков ТЭР-р, также как и ОйЫР, активирует МАР-киназный каскад сигнальных путей и стимулирует клеточную пролиферацию [25]. Как было сказано выше, при повреждении роговицы увеличивается экспрессия ТЭР-Р1 и повышается активность ТЭР-р1-индуцированного фосфорилирования ЛЫК [6—8]. Стимулируя формирование внеклеточного матрикса, пролиферацию фибробластов и их дифференциров-ку в миофибробласты, ТЭР-р играет ключевую роль в процессах фиброзирования. Было установлено, что при стромальном повреждении роговицы и увеличении экспрессии ТЭР-р в эпителии и строме роговицы, увеличивается количество фибробластов, объем внеклеточного матрикса и развивается фиброз, при применении же антител к ТЭР-р процесс фиброзирования сокращается [26, 27]. Наличие слабой реакции с антителами к ТЭР-р в роговице экспериментальной группы свидетельствует о слабом ингибирующем влиянии ОйЫР на экспрессию ТЭР-р (этим также может быть обусловлено умеренное фосфорилирование ЛЫК1/2 в строме роговицы) и его антифибротическом механизме действия. Кроме этого, антифибротический механизм действия ОйЫР обеспечивается за счет ингибирования Т!МР1 и предотвращения избыточного накопления внеклеточного матрикса.

ОйЫР стимулирует в эпителии роговицы экспрессию с-Ме^рецептора, который играет важную роль в процессах эпителизации. Установлено, что при повышенной экспрессии с-Ме^рецептора в роговице, связанной с RAV-с-Met трансдукцией роговицы, сокращается время эпителизации при повреждении [28] и, наоборот, у с-Met мутантных мышей нарушается процесс реэпителизации при повреждениях

кожи [29]. В результате взаимодействия с-Ме^ рецептора с НЭР, который активируется при повреждении [17—19], могут быть реализованы его основные механизмы действия — антиапоптотический и активации процессов пролиферации и миграции эпителиальных клеток [20—23]. Кроме того ЭРМР, предотвращая процесс эпителиальной миграции в строму роговицы, обеспечивает нормальный характер регенерации.

В результате равномерного активного формирования коллагена IV типа в области базальной мембраны ЗйЫР способствует адгезии эпителиальных клеток. В результате нейтрализации ММР9 ЗйЫР предотвращает ее возможные негативные эффекты — деградацию вновь образующейся базальной мембраны, нарушение процессов миграции эпителиальных клеток и механической адгезии их к базальной мембране [13, 14]. При использовании культивированных аллогенных фибробластов в коллагеновом геле при ожоговых дефектах роговицы авторами было также установлено, что снижение экспрессии ММР9 способствует процессу регенерации [30].

В процессе эпителизации при применении модифицированного ЗйЫР в эпителии роговицы активно экспрессируются цитокератины 5 и 18 типов. Установлено, что в норме в эпителии роговицы, как в центре, так и на периферии равномерно интенсивно экспрессируются цитокератины 3, 5 и 14 типов и незначительно меньше в центре, чем на периферии — цитокератины 18 типа [31]. Цитокератины принадлежат к семейству промежуточных микрофиламен-тов и поддерживают целостность эпителия роговицы за счет механической прочности самих клеток и формирования межклеточных контактов. В связи с этим, полученные результаты свидетельствуют о повышении прочности эпителиального слоя в процессе его формирования в присутствии ЗйЫР.

О выраженном антиапоптотическом действии  й1\1Р в процессе эпителизации роговицы свидетельствует повышение уровня антиапоптозного фактора Вс12 и снижение уровня проапоптозного Вах. Для процессов как физиологического обновления эпителия, так и его регенерации при повреждении необходимо наличие баланса между этими факторами в роговице [32].

Анализ ЭДР43 иммунопозитивных структур показал, что ЗйЫР значительно ускоряет восстановление стромального нервного сплетения после эпители-ально-стромального дефекта роговицы. Известно, что для жизнеспособности различных нейрональных популяций необходимо наличие синергизма между  й1\1Р и другими факторами — нейротрофическим фактором головного мозга для сенсорных нейронов, выделенных из нодозных и височных ганглиев, цилиарным нейротрофическим фактором для фоторецепторов, инсулиноподобным фактором роста 1 для мотонейронов, ТЭР-р для эмбриональных куриных ганглиев [33—36]. По результатам наших исследований использование ЗйЫР при эпителиаль-но-стромальном дефекте роговицы ингибирует уровень экспрессии в роговице ТЭР-р. В этой связи, для восстановления стромального нервного сплетения наличие ТЭР-р или не требуется, или его незначительного количества достаточно, как для жизнеспособности куриных цилиарных нейронов [37].

Выводы

1. Модифицированный ЗйЫР стимулирует процесс эпителизации и сокращает частоту формирования эрозий после деэпителизации роговицы.

2. Модифицированный ЗйЫР стимулирует проли-феративную и миграционную активность эпителиальных клеток и процесс эпителизации, предотвращает процесс деградации вновь образующейся базальной мембраны, способствует адгезии к ней эпителиальных клеток, проявляет антифибротические и анти-апоптотические свойства, стимулирует восстановление стромального нервного сплетения.

3. Полученные результаты свидетельствуют об эффективности применения кондиционированной среды культивирования клеток НЕК293, продуцирующих модифицированный ЗйЫР, при повреждениях роговицы. Однако необходимы дальнейшие исследования с целью разработки и тестирования методов терапевтического использования препаратов на основе данного нейротрофического фактора.

Благодарности

Работа выполнялась при финансировании гранта РНФ № 14-15-00942.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Мороз З.И. Современные направления хирургического лечения патологии роговицы. В: Аветисов С.Э., Акопян В.С., Белоглазов В.Г. и др., редакторы. Сб. тезисов докладов IX Съезда офтальмологов России, 2010 июнь 16-18; Москва, Россия. Москва: Изд-во «Офтальмология»; 2010. с. 298-9.

2. You L., Kruse F.E., Volcker H.E. Neurotrophic factors in the human cornea. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2000; 41(3): 692-702.

3. You L., Ebner S., Kruse F.E. Glial cell-derived neurotrophic factor tGDNF) —Induced migration and signal transduction in corneal epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2001; 42(11): 2496-504.

4. Hanke M., Kruse F., Paulista M. et al. Use of GDNF for treating corneal defects. US patent 20030166537A1. 2003 Sept 4.

5. Namavari A., Chaudhary S., Sarkar J. et al. In vivo serial imaging of regenerating corneal nerves after surgical transection in transgenic thy1-YFP mice. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2011; 52: 8025-32.

6. Chang Y., Wu X.Y. The role of c-Jun N-terminal kinases 1/2 in transforming growth factor beta(1)-induced expression of connective tissue growth factor and scar formation in the cornea. J. Intern. Med. 2009; 37: 727-36.

7. Chang Y., Wu X.Y. JNK1/2 siRNA inhibits transforming-growth factor-beta1-induced connective tissue growth factor expression and fibrotic function in THSFs. Mol. Cell. Biochem. 2010; 335: 83-9.

8. Shi L., Chang Y., Yang Y. et al. Activation of JNK signaling mediates connective tissue growth factor expression and scar formation in corneal wound healing. PLoS One 2012; 7(2): e32128.

9. Reviglio V.E., Hakim M.A., Song J.K. et al. Effect of topical fluoroquinolones on the expression of matrix metalloproteinases in the cornea. BMC Ophthalmol. 2003; 3: 1-10.

10. Mulholland B., Tuft S.J., Khaw P.T. Matrix metalloproteinase distribution during early corneal wound healing. Eye 2005; 19: 584-8.

11. Sivak J.M., Fini M.E. MMPs in the eye: emerging roles for matrix metalloproteinases in ocular physiology. Prog. Retin. Eye Res. 2002; 21: 1-14.

12. Wong T.T., Sethi C., Daniels J.T. et al. Matrix metalloproteinases in disease and repair processes in the anterior segment. Surv. Ophthalmol. 2002; 47: 239-56.

13. Ramamurthi S., Rahman M.Q., Dutton G.N. et al. Pathogenesis, clinical features and management of recurrent corneal erosions. Eye 2006; 20: 635-44.

14. Pal-Ghosh S., Blanco T., Tadvalkar G. et al. MMP9 cleavage of the p4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice. J. Cell Sci. 2011; 124: 2666-75.

15. Kust N., Panteleev D., Mertsalov I. et al. Availability of pre- and pro-regions of transgenic GDNF affects the ability to induce axonal sprout growth. Mol. Neurobiol. 2015; 51(3): 1195-205.

16. Blanco-Mezquita J.T., Hutcheon A.E., Stepp M.A. et al. aVpB integrin promotes corneal wound healing. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2011; 52: 8505-13.

17. Wilson S.E., Walker J.W., Chwang E.L. et al. Hepatocyte growth factor, keratinocyte growth factor, their receptors, fibroblast growth factor receptor-2 and the cells of the cornea. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1993; 34: 2544-61.

18. Wilson S.E., Chen L., Mohan R.R. et al. Expression of HGF, KGF, EGF and receptor messenger RNAs following corneal epithelial wounding. Exp. Eye Res. 1999; 68(4): 377-97.

19. Wilson S.E, Liang Q., Kim W.J. Lacrimal gland HGF, KGF, and EGF mRNA levels increase after corneal epithelial wounding. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1999; 40: 2185-90.

20. Chandrasekher G., Kakazu A.H., Bazan H.E. HGF- and KGF-induced activation of PI-3K/p70 sB kinase pathway in corneal epithelial cells: its relevance in wound healing. Exp. Eye Res. 2001; 73: 191-202.

21. Kakazu A., Chandrasekher G., Bazan H.E. HGF protects corneal epithelial cells from apoptosis by the PI-3K/Akt-1/Bad- but not the ERK1/2-mediated signaling pathway. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2004; 45: 3485-92.

22. Sharma G.D., He J., Bazan H.E. p38 and ERK1/2 coordinate cellular migration and proliferation in epithelial wound healing: evidence of cross-talk activation between MAP kinase cascades. J. Biol. Chem. 2003; 278: 21989-97.

23. Sharma G.D., Kakazu A., Bazan H.E. Protein kinase C alpha and epsilon differentially modulate hepatocyte growth factor-induced proliferation and migration. Exp. Eye Res. 2007; 85(2): 289-97.

24. Kingsley D.M. The TGF-beta superfamily: new members, new receptors, and new genetic tests of function in different organisms. Genes Dev. 1994; 8:133-46.

25. Shi Y., Massague J. Mechanisms of TGF-p signaling from cell membrane to the nucleus. Cell 2003; 113(6): 685-700.

26. Jester J.V., Barry-Lane P.A., Petroll W.M. et al. Inhibition of corneal fibrosis by topical application of blocking antibodies to TGF beta in the rabbit. Cornea 1997; 16(2): 177-87.

27. Wu X.Y., Yang Y.M., Guo H. et al. The role of connective tissue growth factor, transforming growth factor p1 and Smad signaling pathway in cornea wound healing. Chin. Med. J. 2006; 119(1): 57-62.

28. Saghizadeh M., Kramerov A.A., Yu F.X. et al. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-Met gene. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2010; 51(4): 1970-80

29. Chmielowiec J., Borowiak M., Morkel M. et al. c-Met is essential for wound healing in the skin. J. Cell Biol. 2007; 177: 151-62

30. Гундорова Р.А., Макарова П.В., Терских В.В. и др. Разработка технологии лечения дефектов роговицы методом трансплантации культивированных аллогенных фибробластов в коллагеновом геле (экспериментальное исследование). Российский офтальмологический журнал 2013; 1: 64-8.

31. Merjava S., Neuwirth A., Tanzerova M. et al. The spectrum of cytokeratins expressed in the adult human cornea, limbus and perilimbal conjunctiva. Histol. Histopathol. 2011; 26: 323-31.

32. Robertson D.M., Ladage P.M, Yamamoto N. et al. Bcl-2 and Bax regulation of corneal homeostasis in genetically altered mice. Eye Contact Lens 2006; 32(1): 3-7.

33. Erickson J.T., Brosenitsch T.A., Katz D.M. Brain-derived neurotrophic factor and glial cell line-derived neurotrophic factor are required simultaneously for survival of dopaminergic primary sensory neurons in vivo. J. Neurosci. 2001; 21: 581-9.

34. Ogilvie J.M., Speck J.D., Lett J.M. Growth factors in combination, but not individually, rescue rd mouse photoreceptors in organ culture. Exp. Neurol. 2000; 161: 676-85.

35. Bilak M.M., Kuncl R.W. Delayed application of IGF-I and GDNF can rescue already injured postnatal motor neurons. Neuroreport 2001; 12: 2531-5.

36. Bengtsson H., Soderstrom S., Kylberg A. et al. Potentiating interactions between morphogenetic protein and neurotrophic factors in developing neurons. J. Neurosci. Res. 1998; 53: 559-68.

37. Peterziel H., Unsicker K., Krieglstein K. TGFp induces GDNF responsiveness in neurons by recruitment of GFRa1 to the plasma membrane. J. Cell Biol. 2002; 159(1): 157-67.

Поступила: 29.02.2016