Хроматография, как много в этом слове, (к 100-летию открытия М. С. Цвета)

2004 ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. Сер. А. Вып. 2

ИЗ ИСТОРИИ НАУКИ

УДК 543.544

Л. Н. Москвин ^

ХРОМАТОГРАФИЯ, КАК МНОГО В ЭТОМ СЛОВЕ,

Несмотря на то, что к настоящему времени хроматография вошла в нашу жизнь шире, чем какой-либо другой метод, не только в нашей стране, но и в мире едва ли найдешь двух химиков-аналитиков, признанных специалистами в области хроматографических методов, которые вкладывали бы одинаковый смысл в понятие «хроматография».

100-летний юбилей открытия М. С. Цвета является поводом, обязывающим всех его последователей попытаться прийти, наконец, к взаимопониманию. Подобно тому, как он стремился внести ясность в понимание строения хлорофилла с помощью предложенного им метода, необходимо попытаться понять, какой смысл сегодня несет термин «хроматография». При этом отход от буквальной трактовки этого термина самим М. С. Цветом нельзя рассматривать как знак неуважения к памяти о нем. Наоборот, все,- кто хотя бы по литературным источникам знаком с личными качествами этого необыкновенного человека, согласятся с тем, что любое углубление наших представлений об окружающем мире является данью памяти о нем не только как о первооткрывателе хроматографии, но и в целом как о выдающемся ученом -ботанике и химике. Достаточно вспомнить один фрагмент его философского наследия. Он придал более конкретное содержание девизу всех естествоиспытателей, провозглашенному в свое время Г. Галилеем: «Меряйте все, что вы можете измерить, и делайте измеряемым то, что вы не можете сейчас измерить». Этот девиз в формулировке М. С. Цвета звучит так: «Всякий научный прогресс есть прогресс метода» (цит. по [1, с. 252]). Следуя ему, Михаил Семенович всю свою жизнь посвятил созданию метода, который позволил установить химический состав хлорофилла и понять механизм дыхания растений. Но при всей важности решенной им биохимической задачи в хронологию величайших химических открытий XX в. вошел сам хроматографический метод, оказавший влияние на прогресс человечества во всех сферах естественнонаучного познания.

Чтобы найти взаимопонимание в современной трактовке термина «хроматография», необходимо понять причины, которые привели к различным его толкованиям. Истоки этих причин можно найти в истории открытия и развития хроматографии. Отправной точкой открытия хроматографии принято считать 21 марта 1903 г., когда М. С. Цвет выступил с докладом «о новой категории адсорбционных явлений и о применении их к биохимическому анализу» на заседании биологического отделения Варшавского общества естествоиспытателей. Основное внимание в нем он уделил результатам исследований адсорбции хлорофилльных пигментов на адсорбентах различных классов. Один из важнейших выводов этого доклада: «Систематическое изучение адсорбционных явлений позволит выработать на их основании новый метод физического отделения веществ» (цит. по [1, с. 256]).

Необходимо отметить, что сам доклад и сделанные в нем выводы основывались на экспериментальных данных, полученных М. С. Цветом в предыдущие годы в Санкт-Петербурге в лаборатории Лесгафта. Можно только пожалеть, что кафедру ботаники Санкт-Петербургского

© Л. Н. Москвин, 2004

университета в те годы возглавлял проф. Гоби, не сумевший понять важность работ, выполненных Михаилом Семеновичем. В результате Цвету пришлось уехать защищать магистерскую диссертацию в Казань, а Санкт-Петербургский университет оказался в стороне от его великого открытия.

В своем докладе М. С. Цвет рассмотрел три возможные схемы адсорбционного эксперимента. В первой схеме мелкоизмельченный сорбент - инулин помещался в трубчатую воронку. Через слой сорбента для вытеснения воздуха сначала пропускался чистый лигроин, а затем лигроиновый раствор анализируемых пигментов, а далее снова чистый лигроин и лигроин с примесью спирта. По второй схеме порошок сорбента насыпался в пробирку с раствором пигментов, а далее сорбент с выделенньши сорбатами отделялся центрифугированием. И, наконец, в третьем случае, близком ко второму, чтобы улучшить межфазный контакт сорбент растирался до порошкообразного состояния непосредственно в лигроиновом растворе пигментов.

Сравнивая различные схемы осуществления адсорбционных процессов, М. С. Цвет отдавал предпочтение первой, считая «особенно поучительным наблюдение адсорбционных явлений при фильтрации через порошок» (цит. по [1, с. 257]). С современных позиций только эта схема и может рассматриваться как хроматографическое разделение. Причем при фильтрации лигроинового раствора пигментов осуществлялся фронтальный хроматографический процесс с отделением практически несорбируемого инулином каротина. При последующей промывке слоя сорбента чистым лигроином или лигроином с добавкой спирта обеспечивался элюент-ный, или, по терминологии Цвета, проявительный, вариант хроматографического процесса с разделением индивидуальных хлорофилльных пигментов: ксантофилла и хлорофиллов «а» и «Ъ». При этом идентификация пигментов производилась по окраске адсорбировавших их слоев сорбента, а для количественного определения спектрофотометрировались соответствующие фракции элюата. -

Таким образом, М. С. Цвет этим докладом и своими последующими пз'бликациями сам заложил внутреннее противоречие в понимании сущности предложенного им метода, в одном случае говоря о «методе физического отделения веществ», а в другом - о методе «адсорбционного анализа». Необходимо особо отметить стремление Цвета независимо от акцента на назначение метода всюду подчеркивать физическую природу процесса адсорбции, лежащего в его основе.

Цвета понять можно, он осознанно стремился к созданию метода разделения и анализа, который не приводил бы к изменению химического состояния аналитов, что было особенно важно для установления состава смеси лабильных компонентов, образующих хлорофилл. Труднее понять тех «хроматографистов», которые и сегодня стремятся сохранить в дефиниции хроматографии эпитет «физический», когда появились и существуют многочисленные варианты хроматографических методов, механизм разделения веществ в которых определяется не физической адсорбцией, а химическими реакциями, например ионообменная, аффинная, лигандо-обменная и хиральная хроматографии. Важно только, чтобы соответствующие реакции были обратимыми.

Следуя логике Цвета в двойственном понимании хроматографии, можно попытаться конкретизировать сущность его открытий с современных позиций. Слово «открытие» сознательно употреблено во множественном числе. Во-первых, Михаил Семенович открыл универсальный процесс разделения веществ за счет различий в их межфазном распределении и как иллюстрацию этого процесса один из возможных методов разделения веществ - жидкостно-адсорбционную хроматографию - «хроматографический адсорбционный анализ», по словам самого Цвета (цит. по [1, с. 254]). Во-вторых, он открыл гибридный метод анализа - жидкостную хроматографию с визуальным детектированием определяемых веществ в стационарной фазе или с их постколоночным определением в элюате. Справедливости ради тем не менее необходимо отметить, что он прекрасно понимал и писал о том, что хроматография - универсальный метод разделения, а соответственно и анализа, приложимый не только к окрашенным веществам - пигментам, но и к бесцветным.

Двойственное понимание хроматографии, с одаой стороны, как метода разделения, а с другой - как метода анализа, прослеживается на всех этапах ее развития. После того как А. Мартин и Р. Синг осуществили хроматографический процесс в системе двух жидких фаз, а позднее в системе жидкость-газ, стало очевидным, что хроматография - это нечто большее, чем адсорбционный анализ или «новый метод физического отделения веществ» за счет различий в их способности адсорбироваться. Можно спорить с Мартином и Сингом, было ли оправданным называть предложенный ими вариант метода распределительной хроматографией. Хроматография М. С. Цвета изначально была распределительной, но только в другой системе фаз, и не распределительной хроматография в принципе быть не может.

Таблица 1. Классификация, хроматографических методов разделения веществ по агрегатному состоянию фаз и их роли в хроматографическом процессе

Системы фаз Роль фаз в хроматографическом процессе и их агрегатное состояние Хроматографические методы Открытие и начало развития метода

Стационарная (неподвижная) фаза или фазы Подвижная фаза

Твердое тело-жидкость Твердое тело Жидкость Жидкостно-твердофазная: жидкостно-адсорбционная ионообменная аффинная, гель-фильтрационная (эксклюзионная) лигандообменная жидкостно-абсорбционная с обращенной стационарной фазой 1903 1938 1951 1959 1961 1969

Жидкость-жидкость Полярная жидкость Неполярная жидкость Жидкостно-жидкостная (ЖЖХ) со стационарной полярной фазой -1941

Неполярная жидкость Полярная жидкость ЖЖХ с обращенными фазами

Твердое тело-газ Твердое тело Газ, Газоадсорбционная 1950

Жидкость- Жидкость Газ Газожидкостная 1952

газ Газ Жидкость Жидкостно-газовая 1981

Твердое тело - флюид Твердое тело Сверхкритическая среда (флюид) Сверхкритическая (флюидная) 1962

\

После работ А. Мартина и Р. Синга начинает вырисовываться первый основной общепризнанный сегодня классификационный признак хроматографических методов: система фаз, в которой осуществляется хроматографический процесс. Но потребовалось еще несколько десятилетий, чтобы формирование основных направлений хроматографии, характеризуемых агрегатным состоянием контактирующих фаз и их ролью в хроматографическом процессе, подошло к логическому завершению (табл. 1). Последней из перечисленных в этой таблице методов была открыта жидкостно-газовая хроматография (ЖГХ). Сначала этот вариант хроматографических методов был реализован экспериментально [2]. А через год после публика-

Таблица 2. Классификация хроматографических методов разделения в зависимости от конкретной схемы осуществления . хроматографического процесса

Характеристические признаки схемы

Эпитет к термину «хроматография» при характеристике метода разделения

Геометрия пространства, в пределах которого осуществляется хроматографи-ческий процесс

Степень дисперсности или толщина пленки стационарной фазы

Направление относительного перемещения фаз

I

Схема изменения состава подвижной фазы

Механизм взаимодействия разделяемых веществ со стационарной фазой

Колоночная, плоскостная (тонкослойная, бумажная), капиллярная

Классическая, высокоэффективная

Обычная (прямоточная), противоточ-ная, двухмерная

Зонная, фронтальная, вытеснительная

Адсорбционная, ионообменная, аффинная, хиральная и т.п.

ции с экспериментальными доказательствами возможности осуществления ЖГХ появилось ее теоретическое предсказание [3]. Таким образом, к началу 80-х годов XX в. стало окончательно ясно, что любому из возможных сочетаний фаз в двухфазных системах соответствуют определенные хроматографические методы. При этом возможны самые различные, далеко не только физические механизмы взаимодействия разделяемых веществ со стационарной фазой, которые являются дополнительными классификационными признаками хроматографических методов разделения веществ: адсорбционная, ионообменная, лигандообменная, эксклюзионная, аффинная, ион-парная и другие разновидности хроматографии. Интересно отметить, что, рас- • сматривая единственный адсорбционный механизм удерживания разделяемых веществ, Михаил Семенович тем не менее предвидел возможность появления новых хроматографических методов, отличающихся механизмом удерживания. Одно из своих первых сообщений о хроматографии в 1909 г. он закончил словами: «... дальнейшее исследование механизма адсорбции позволит усовершенствовать ее аналитическое применение - позволит выработать для разных практических задач определенные адсорбционно-аналитические приемы» (цит. по [1, с. 258]).

Отсюда следует одно из наиболее адекватных толкований термина «хроматография» как универсальной схемы и процесса разделения веществ за счет различий в их распределении между фазами. Индивидуальность каждому методу разделения в рамках этой универсальной схемы придают характеристики агрегатного состояния фаз и механизма удерживания разделяемых веществ стационарной фазой (табл. 2). Сущность самой хроматографической схемы разделения веществ заключается в следующем. Она подразумевает относительное перемещение контактирующих фаз в ограниченном пространстве в условиях, когда одна из них -стационарная - постоянно находится в диспергированном состоянии или в виде пленки на поверхности стенок, ограничивающих это пространство. Относительное перемещение может происходить в цилиндрической колонке, заполненной диспергированной стационарной фазой, в плоском слое, образованном этой фазой, и, наконец, в капилляре или в узком зазоре между двумя плоскопараллельными стенками, на внутренней поверхности которых нанесена пленка стационарной фазы. Одна из фаз может быть неподвижной или обе будут находиться в движении. В любом случае в результате такого перемещения обеспечивается многократное последовательное перераспределение веществ между взаимно перемещающимися фазами и, как следствие различий в коэффициентах распределения этих веществ, проявляются различия в скоростях движения их фронтов или дискретных зон.

При одновременном движении обеих фаз в разных направлениях проявляются различия и в направлениях движения фронтов или зон. И собственно методом разделения оказывается один из возможных вариантов схемы осуществления хроматографического процесса в приложении к конкретной системе фаз. Говоря о множестве схем осуществления хроматографического процесса, нельзя не вспомнить о предвидении М. С. Цвета, писавшего: «Абсолютно количественного разделения в фазных системах одним приемом достигнуть нельзя, но ведь никакой способ разделения не является абсолютным» (цит. по [1, с. 234]). Эта мысль фактически является предсказанием возможности появления множества «приемов осуществления процессов разделения в фазных системах», что мы и имеем сегодня (табл. 2).

Толкование хроматографии как универсальной многовариантной схемы разделения веществ оставляет место и для второго аналитического толкования этого термина, как общей гибридной схемы анализа (Hy-phenated Method). Существуют два основных варианта общей схемы хроматографического анализа, дополняющие препаративную схему, которая на первых этапах развития хроматографии также иногда рассматривалась как аналитическая. Эта схема предполагает сбор отдельных фракций элюата и проведение их последующего (постколоночного) анализа ,в самостоятельном независимом эксперименте. Первая из двух основных аналитических схем, которую обычно называют элюентной, предусматривает хроматографи-ческое разделение и последующее определение разделенных веществ в потоке элюата. Вторая из основных схем - хроматографическое разделение с определением веществ в хроматографи-ческой колонке или в плоском слое непосредственно в стационарной фазе.

Как известно, развитие элюентной схемы хроматографического анализа, ставшей теперь основной, началось с создания газового хроматографа, в котором были совмещены принципы хроматографического разделения и детектирования разделенных веществ в потоке газа. Сейчас, особенно молодым ученым, кажется, что газовая хроматография существовала всегда. Появление газового хроматографа относится только к середине 50-х годов XX в.

Несмотря на широкое распространение газовых, а теперь и жидкостных хроматографов, принципы функционирования которых основаны на элюентной схеме анализа, нельзя не отметить, что бариант схемы хроматографического анализа, основанный на детектировании разделенных веществ в элюате, имеет один общий недостаток. Концентрация веществ в элюате обычно в несколько раз меньше, чем в стационарной фазе, а именно тем меньше, чем больше коэффициент распределения в условиях элюирования вещества из колонки. Вынужденное разбавление при элюировании приводит к закономерному увеличению пределов обнаружения при элюентной схеме хроматографического анализа по сравнению с теми, которые могли бы быть достигнуты при детектировании аналитов непосредственно в стационарной фазе.

Поэтому схема хроматографического анализа с определением веществ в стационарной фазе непосредственно в хроматографической колонке или в плоском слое представляется более предпочтительной. Эта схема пока используется сравнительно редко, что объясняется ограниченными техническими возможностями детектирования непосредственно в стационарной фазе. Во всех видах пленарной (плоскостной) хроматографии, где такую схему детектирования реализовать значительно проще, чем в колоночной, ей отдается предпочтение. В последнее время наметилась тенденция распространения сферы применения данной схемы и в колоночной хроматографии с использованием в первую очередь люминесцентных методов детектирования. На новом этапе развития хроматографии фактически происходит возврат к «цветовскому» варианту наблюдения хроматограммы непосредственно на колонке. Однако вместо визуального наблюдения на качественном уровне определяют содержание веществ в разделенных зонах с выдачей количественных результатов. Следуя логике М. С. Цвета и смысловому содержанию термина, именно эта схема хроматографического анализа является проявительной хроматографией.

Если согласиться с высказанными соображениями, возникает ряд неожиданных следствий. Во-первых, очевидно, что проявительную хроматографию нельзя отождествлять с элюентной или элюционной, соответствующей первому варианту схемы хроматографического анализа, когда детектирование разделенных веществ осуществляется в потоке подвижной фазы. Во-

Таблица 3. Классификация хроматографических методов анализа в зависимости от используемого варианта схемы анализа

Характеристические признаки варианта схемы

Эпитет к термину «хроматография» при обозначении метода хроматографичес-

кого анализа

Агрегатное состояние подвижной фазы или химическая форма определяемых веществ

Определение в стационарной или в подвижной фазе

Газовая, жидкостная, ионная

Проявительная, элюентная

вторых, принятое многими «хроматографистами» рассмотрение в одной классификационной группе проявительной, фронтальной и вытеснительной хроматографии становится алогичным. Термины «проявительная» и «элюентная» являются признаками хроматографических методов анализа. Термины «фронтальная» и «вытеснйтельная» характеризуют различные варианты схемы хроматографического разделения. Все встает на свои места, если разделить эту группу «подвидов» хроматографических методов на две. В случае хроматографических методов анализа логично говорить о проявительной и элюентной хроматографии. Характеризуя же хроматографические методы разделения, можно говорить о зонной, фронтальной или вытеснительной хроматографии. Смысловое содержание термина «зонная» практически не нуждается в комментариях. Он широко используется в методологии разделения веществ, например «зонный электрофорез» как схема электрофоретического разделения. Термины «фронтальная» и «вытеснйтельная» при этом сохраняют свой первоначальный смысл.

Проведенный методологический анализ позволяет увидеть, что термин «хроматография» сохранил двойственный смысл, близкий к авторскому. Но если М. С. Цвет говорил об адсорбционных методах разделения и анализа, то к настоящему времени в подтверждение плодотворности его исходных идей необходимо признать существование двух параллельно развивающихся направлений в хроматографии: с одной стороны, это создание и совершенствование методов разделения веществ на принципах различий не только в адсорбции, но и в любом другом межфазном распределении, с другой - гибридных методов анализа. Каждое из этих направлений имеет множество вариантов, приводящих к многообразию конкретных методических решений: методов разделения и методов анализа. Так, число хроматографических методов разделения, характеризуемых агрегатным состоянием фаз и механизмом удерживания веществ стационарной фазой, перечисленных в табл. 1, существенно расширяется за счет множества вариантов самой схемы осуществления хроматографического процесса (см. табл. 2).

Для исчерпывающего обозначения хроматографических методов анализа необходимы все характеристические признаки лежащих в их основе методов разделения и соответствующие признаки самой схемы анализа. Но, как правило, в аналитической хроматографии для обозначения методов оказывается достаточно признаков схемы анализа (табл. 3).

В заключение хотелось бы еще раз подчеркнуть, что предлагаемая попытка систематизации наших знаний о хроматографии является данью памяти ее первооткрывателя М. С. Цвета и стремлением облегчить взаимопонимание между, с одной стороны, специалистами в области препаративной хроматографии - радиохимиками, биохимиками и другими специалистами, в основном заинтересованными в хроматографических методах разделения, и, с другой -хроматографистами-аналитиками, привыкшими к пониманию хроматографии как метода или совокупности методов анализа.

Summary

Moskvin L.N. Chromatography. So many in this word... (in the memory of 1G0-anniversary the M. S. Tsvet's discovery).

Historical motives of different points of views on chromatography are investigated: as the method of separation and as the method of analysis. The compromise variant of treating the term chromatography, as universal process of substances separation by the differences in its between phases distribution, and as Hy-phenated method of analysis, unifying the chromatographic methods of separation and the methods of flow detection.

Литература

1. Сенченкова E. M. M. С. Цвет - создатель хроматографии. M., 1997. 2. Москвин Jl. Н., Гумеров М. Ф., Горшков А. И. // Докл. АН СССР. 1982. Т. 265, № 2. С. 378-385. 3. Giddings J. С., Myers М. N.// J. of high resolution Chromatography h Chromatography communication. 1983. Vol. 6. P. 381-382.

Статья поступила в редакцию 24 октября 2003 г.