Изменение реакции лимфоцитов крови на апоптозмодулирующие факторы при вирусной инфекции

УДК 616.9-022.6:611-018.5:612.017.112

О. Б. Жукова, Н. В. Рязанцева, В. В. Новицкий,

Т. Т. Радзивил, Л. С. Литвинова, Н. Ю. Часовских

изменение реакции лимфоцитов крови на апоптозмодулирующие факторы при вирусной инфекции

ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Росздрава, Томск

Проведено исследование чувствительности лимфоцитов, полученных от здоровых доноров и пациентов с персистентными вирусными инфекциями (вирусный клещевой энцефалит, вирусные гепатиты В и С), к различным по механизмам действия модуляторам программированной клеточной гибели в условиях in vitro. Выявлено, что при инкубации лимфоцитарных клеток с дексаметазоном, этопозидом и в бессывороточной среде гибель клеток по механизму апоптоза усиливается. Наиболее выраженные изменения наблюдаются у лимфоцитов, полученных от пациентов с вирусной персистенцией. Предполагается, что повышенная чувствительность к апоптогенному влиянию модуляторов, действующих на разные молекулярные мишени индукции апоптоза, обусловлена функциональной неполноценностью иммунокомпетентных клеток в условиях вирусной персистенции.

Ключевые слова: программированная клеточная гибель, лимфоциты, молекулярные механизмы модуляции

Исследование молекулярно-клеточных механизмов реакции живых систем на действие различных повреждающих факторов является одной их важных проблем современной биологии и медицины. Программированная клеточная гибель представляет собой общебиологический процесс, ответственный за поддержание гомеостаза организма путем контроля постоянства численности клеток в многоклеточном организме и элиминации дефектных клеток [1, 2]. Апоптоз как один из видов клеточной смерти играет важную роль в развитии патологических процессов: с его усилением или, наоборот, ингибированием связано возникновение и прогрессирование различных заболеваний [1].

Включение программы гибели клетки зависит от результата действия разнообразных внешних и внутренних факторов. Апоптоз запускается в результате проведения экзогенного сигнала через специализированные мембранные рецепторы, такие как Fas, TNFR1, DR-3, DR-4, DR-5, DR-6 и др. [1, 3]. Апоптотическая гибель может быть реализована также через рецепторы, выполняющие иные функции. К их числу относятся, в частности, рецепторы для цитокинов [2]. Цитокины считаются наиболее многочисленной группой биологически активных веществ, оказывающих влияние на процесс клеточной гибели. Эффект

некоторых цитокинов (№N-7, ^-10) может быть разнонаправленным и зависеть как от типа клеток, так и от их функционального состояния [4]. Классическими индукторами апоптоза являются стероидные гормоны, которые оказывают свое действие через ядерные рецепторы [5]. Ситуация эндогенной модуляции программы гибели клетки может возникнуть при лишении ее ростовых факторов, нарушении межклеточных контактов, накоплении нерепарированных разрывов ДНК, повышении внутриклеточного уровня кальция и др. [2, 3, 6].

Таким образом, условия развития программированной клеточной смерти весьма разнообразны. В зависимости от типа клеток, их функциональных особенностей, вида воздействия один и тот же фактор может как индуцировать, так и подавлять развитие апоптоза. При этом реализации танатогенной программы клетки могут препятствовать различные внутриклеточные регуляторы (белки семейства Bcl-2, продукты гена 1сЬ и др.) [7, 8].

Важным результатом взаимодействия регуляторных факторов с про- и антиапоптотической активностью является способность организма адекватно модулировать процесс гибели своих клеток в неблагоприятных условиях, нарушение которого всегда сопряжено со срывом адаптации

и формированием патологического процесса. Большую группу заболеваний, патогенез которых связан с нарушением программированной клеточной гибели, представляет инфекционная патология. Индукторами апоптоза клеток являются бактериальные токсины и суперантигены, ингибиторами — вирусные протеины, действующие на разных стадиях передачи танато-генного сигнала [9, 10]. Исход инфекции, с одной стороны, связан со способностью возбудителя блокировать апоптотический потенциал клетки-мишени, с другой — с интенсивностью активации процесса физиологической гибели инфицированной клетки как составной части защитного механизма организма [11]. С учетом изложенного выше представляется актуальным дифференцированно оценить характер реакции лимфоцитарных клеток, полученных у здоровых доноров и пациентов с хроническим инфекционным процессом, на действие модуляторов программированной клеточной смерти in vitro.

методика

Для получения лимфоцитов использовали стабилизированную гепарином (25 Ед/мл) венозную кровь, взятую у 58 пациентов (36 мужчин и 22 женщины в возрасте от 18 до 45 лет) с длительной вирусной персистенцией, вызванной возбудителями гепатита В (18 человек), гепатита С (24 больных), клещевого энцефалита (16 пациентов), а также у 23 практически здоровых доноров с сопоставимыми характеристиками по полу и возрасту. Верификация диагноза у обследованных больных проводилась на основании данных клинико-эпидемиологического, инструментального, серологического (иммуно-ферментный анализ) и молекулярно-генетического (полимеразная цепная реакция) методов исследования.

Апоптоз оценивали с помощью аннексино-вого теста в 18-часовой культуре лимфоцитов периферической крови [12]. Выделенные в стерильных условиях на градиенте плотности Ficoll-Paque («Pharmacia», Швеция) клетки (5^105 клеток/мл) культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10 % инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 0,3 мг/мл L-глутамина, 10 мМ HEPES («Flow», Великобритания), 100 мкг/мл гентамицина при температуре 37 °С и 5 % СО2. Для изучения чувствительности лимфоцитарных клеток к индукторам апоптоза в отдельные пробы

добавляли 10-4 моль/мл синтетического глюко-кортикоида дексаметазона («KRCA», Словения) или 10-6 моль/мл ингибитора топоизомеразы II этопозида («Rhone-Poulenc Rorer», Франция) либо проводили культивирование лимфоцитов в бессывороточной среде.

После 18-часовой инкубации клетки отмывали и в течение 15 мин ресуспендировали в аннексиновом буфере («Caltag», США), содержащем аннексин V, меченный флюоресцеин изотиоцианатом (ФИТЦ). Анализ образцов клеточных суспезий проводили на проточном цитометре Epics XL («Beckman Coulter», Франция) с аргоновым лазером на основе определения трех параметров: малого углового светорассеяния (FSC), характеризующего размер клетки, бокового светорассеяния (SSC), отражающего цитоплазматические особенности клетки, и показателя зеленой флюоресценции ФИТЦ (530 нм). Проводили гейтинг популяции лимфоцитов в координатах FSC и SSC. Использовали автоматическое программное обеспечение и методы сбора и анализа данных с высоким разрешением (1024 канала).

Полученные данные обрабатывали методами вариационной статистики. Достоверность различий средних величин оценивали с помощью непараметрических критериев Манна - Уитни (для независимых выборок) и Вилкоксона (для зависимых выборок). Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05.

Результаты

При исследовании реализации программированной клеточной гибели лимфоцитов в аннексиновом тесте были установлены разнонаправленные изменения апоптотической реакции лимфоцитарных клеток, полученных у пациентов с длительной вирусной персис-тенцией. Так, уровень апоптоза в интактной культуре лимфоцитов у пациентов с гепатитом В не отличался от аналогичного показателя у здоровых лиц ( см. таблицу). При персистенции возбудителя гепатита С было зарегистрировано достоверное снижение содержания апоптозных клеток, что, по-видимому, является результатом поломки естественной реализации программируемой клеточной гибели. Сохранение жизнеспособности инфицированных лимфотропным вирусом гепатита С клеток является условием, способствующим персистенции вируса в организме [13]. Обнаружено, что длительное пре-

бывание антигена вируса клещевого энцефалита (КЭ) в организме сопровождается повышением процента лимфоцитарных клеток, вступивших в апоптоз (см. таблицу). Чрезмерная гибель клеток, осуществляющих реализацию противовирусного иммунитета, обусловливает неадекватность иммунного ответа и формирование хронического течения патологического процесса [1, 13]. Таким образом, на фоне хронической вирусной инфекции апоптотическая реакция иммунокомпетентных клеток претерпевает изменения, направленность которых определяется молекулярными особенностями возбудителя.

После инкубации лимфоцитов крови, полученных от пациентов с персистентными вирусными инфекциями, в условиях воздействия различных модуляторов апоптоза (дексаметазон, этопозид, лишение ростовых факторов) характер апоптотической реакции претерпевал выраженные изменения. Культивирование исследуемых клеток в бессывороточной питательной среде, лишенной ростовых факторов, индуцировало гибель более половины лимфоцитов здоровых доноров и более 75 % лимфоцитарных клеток, полученных от пациентов с длительной вирусной персистенцией (см. таблицу). Известно, что дефицит факторов роста воспринимается клеткой как сигнал к апоптозу: происходят дефосфорилирование проапоптотического белка Bad, внедрение его в наружную мембрану митохондрий, высвобождение цитохрома С и последующая активация каспазы-9 через Apaf-1-зависимый механизм [8]. Кроме того, недостаток некоторых интерлейкинов, например IL-3, вызывает перемещение мономерного проапоптозного белка Bax из цитоплазмы в наружную мембрану митохондрий, что также приводит к выходу цитохрома С и гибели клетки [7].

Важная роль в регуляции апоптоза отводится гормонам, в частности глюкокортикоидам. Известно, что чувствительность лимфоцитарных клеток к проапоптотическому действию глюкокортикоидов зависит от стадии клеточной дифференцировки. Пре-Т-клетки и пре-В-клетки, незрелые тимоциты, определенные субпопуляции зрелых лимфоцитов (№<-клетки, цитотоксические Т-лимфоциты), а также незрелые В-лимфоциты претерпевают апоптоз под влиянием глюкокортикоидов в физиологических дозах. Зрелые Т- и В-лимфоциты нечувствительны к действию глюкокортикоидов [2]. Полученные результаты демонстрируют изменение чувствительности зрелых лимфоцитов к проапоптотическому влиянию стероидных гормонов, наиболее выраженное при вирусной персистенции. Так, инкубирование лимфоцитов пациентов с персистенцией вирусов гепатита В, С и клещевого энцефалита в полной культуральной среде с добавлением дексаметазона приводило к значительному обогащению лимфоцитарной популяции апоптотическими клетками (см. таблицу). Действие глюкокортикоидов опосредовано специфическими внутриклеточными рецепторами. Ядерные рецепторы регулируют экспрессию большого количества генов, активизируя или подавляя генную транскрипцию. Чувствительными к действию кортикостероидов являются гены, регулирующие клеточный цикл, особенно переход G1-периода в S-фазу [5]. Кроме того, под влиянием данных гормонов повышается экспрессия кальмоду-лина, увеличивается концентрация внутриклеточного цАМФ, резко возрастает уровень образования активных форм кислорода. К тому же апоптотическая гибель клеток, опосредованная действием глюкокортикоидов, возможно,

Содержание апоптотических лимфоцитов периферической крови (в %) у здоровых лиц и у пациентов с длительной вирусной персистенцией в условиях культивирования in vitro

с модуляторами апоптоза

Условия культивирования Здоровые доноры Пациенты с длительной вирусной персистенцией

Вирус гепатита В Вирус гепатита С Вирус клещевого энцефалита

Интактная культура 11,23±1,02 8,89±1,65 6,32±1,43* 21,83±1,67*

Бессывороточная среда инкубации 54,04±4,31 + 92,50±5,40*+ 90,19±1,53*+ 75,00±2,37*+

Инкубация с дексаметазоном 53,82±3,47+ 95,15±4,85*+ 83,30±3,82*+ 91,06±1,81*+

Инкубация с этопозидом 55,94±4,33+ 90,35±1,34*+ 89,83±1,07*+ 80,43±3,11*+

Примечание. *— р<0,05 по сравнению с аналогичными показателями у здоровых доноров, + - р<0,05 по сравнению с уровнем апоптоза в интактной культуре клеток; достоверных различий между исследуемыми параметрами в культурах лимфоцитов при инкубации в бессывороточной среде, с дексаметазоном и с этопозидом не выявлено.

реализуется через митохондриальный путь в условиях снижения трансмембранного потенциала, поступления цитохрома С в цитозоль и активации каспазы-9 [7].

Индукция апоптоза может реализоваться вследствие возникновения источника сигнала внутри самой клетки. Такая ситуация складывается при накоплении нерепарированных разрывов ДНК в результате снижения активности системы репарации, что было показано нами ранее [14, 15]. Одним из ферментов репарации ДНК является топоизомераза II. Этот белок участвует в формировании структур ДНК высшего порядка - суперспирализованных петель [6]. При добавлении в культуральную среду цитостатического препарата этопозид, обладающего ингибирующей активностью в отношении топоизомеразы II, с последующей инкубацией в ней лимфоцитов крови здоровых лиц и пациентов с хронической вирусной пер-систенцией нами отмечалось увеличение численности лимфоцитарных клеток, находящихся на ранних стадиях реализации программы гибели клетки (см. таблицу). При блокировании топо-изомеразы II нарушаются процессы репарации поврежденных участков ДНК, происходит остановка митоза на стадии G2, что приводит к запуску апоптотических реакций в результате невозможности полноценной транскрипции генов, содержащих дефекты в матрице [6].

заключение

Таким образом, применение in vitro индукторов апоптоза (дефицит сывороточных ростовых факторов, дексаметазон, этопозид) независимо от молекулярного механизма их действия приводило к достоверному увеличению числа апоп-тотических лимфоцитарных клеток. При этом наиболее выраженные изменения наблюдались при исследовании лимфоцитов, полученных у пациентов с хроническими вирусными инфекциями. Повышенная по сравнению с нормой чувствительность лимфоцитов, полученных от пациентов с длительной вирусной персис-тенцией, к разнообразным проапоптогенным стимулам свидетельствует о функциональной неполноценности иммунокомпетентных клеток, способствующей поддержанию хронического течения патологического процесса.

Исследование выполнено в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по при-

оритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006 годы» (государственные контракты № 02.442.11.7004, 02.445.11.7110 и 02.445.11.7419), а также при финансовой поддержке Совета по грантам при Президенте Российской Федерации для поддержки ведущих научных школ Российской Федерации, гранты № НШ-1051.2003.4, НШ-4153.2006.7).

changes in evaluation of blood lymphocytes reaction on apoptosis-modulating factors in viral infection

O. B. Zhukova, N. V. Ryazantseva,

V. V. Novitsky, T. T. Radzivil, L. S. Litvinova, N. Yu. Chasovskih

A complex investigation was performed to estimate sensitivity of lymphocytes obtained from healthy donors and patients with persistent viral infections (viral tick-borne encephalitis, viral hepatitis B and C) to modulators of programmed cell death with different mechanism of action in vitro. It was shown that after incubation of lymphocyte cells with dexamethasone, etopozide and in serum-lacking medium apoptotic cell death increases. The most significant changes occur in lymphocytes from patients with viral persistence. It was supposed that high sensitivity of immune cells to apoptotic influence of modulators affecting different molecular targets of apoptosis induction is determined by functional inferiority of lymphocytes in conditions of viral persistence.

Литература

1. Барышников А. Ю. Иммунологические проблемы апоптоза / А. Ю. Барышников, А. В. Шишкин - М., 2002. - 320 с.

2. Ярилин А. А. Апоптоз: природа феномена и его роль в норме и при патологии // Актуальные проблемы патофизиологии / Под ред. Б. Б. Мороза. - М., 2001. -С. 13-56.

3. Самуилов В. И., Алескин А. В., Лагунова Е. М. Программированная клеточная гибель // Биохимия. -2000. - Т. 65, № 8. - С. 1032-1041.

4. Потапнев М. П. Апоптоз клеток иммунной системы и его регуляция цитокинами // Иммунология. -2002. - № 4. - С. 237-243.

5. Wuchter C., Ruppert V., Schrappe M., et al. In vitro susceptibility to dexamethasone- and doxorubicin-induced apoptotic cell death in context of maturation stage, responsiveness to interleukin 7, and early cytoreduction in vivo in childhood T-cell acute lymphoblastic leukemia // Blood. - 2002. - Vol. 99, № 11. - P. 4109-4115.

6. Clifford B., Beljin M., Stark G. R., et al. G2 arrest in response to topoisomerase in inhibitors. The role of p53 // Cancer Res. - 2003. - Vol. 63. - P. 4074-4081.

7. Kim M., Sgagias M., Deng X., et al. Apoptosis induced by adenovirus-mediated p14ARF expression in U2OS osteosarcoma cells is associated with increased Fas expression // Biochem. Biophys. Res. Commun. -2004. - Vol. 320, № 1. - P. 138-144.

8. Festjens N., Gurp M., Loo G., et al. Bcl-2 family members as sentinels of cellular integrity and role of mitochondrial intermembrane space proteins in apoptotic cell death // Acta Haematologica. - 2004. - Vol. 111. - P. 7-27.

9. Bellows D. S., Howell H., Pearson C., et al. Epstein-Barr virus BALF-1 is a Bcl-2-like antagonist of the herpesvirus antiapoptotic Bcl-2 proteins // J. Viral. -2002. - Vol.76, № 5. - P. 2469-2479.

10. Kluck R. M., Bossy-Wetzel E., Green D. R., et al. The release of cytochrome c from mitochondria: a primary site for Bcl-2 regulation of apoptosis // Sci. - 1997. - Vol. 275. - P. 1132-1136.

11. Рязанцева Н. В., Новицкий В. В., Жукова О. Б. и др. Вирусиндуцированная дизрегуляция программируемой гибели иммунокомпетентных клеток: адаптация или

патология? // Успехи физиол. наук. - 2005. - Т. 36, № 3. - С. 33-44.

12. Van Engeland M., Nieland L. J. W., Ramaekers F. C. S., et al. Annexin V-affinity assay: a review on an apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure // Cytometry. - 1998. - Vol. 31. - P. 1-9.

13. Жукова О. Б., Рязанцева Н. В., Новицкий В. В. и др. Модуляция апоптоза лимфоцитов крови как способ выживания вируса гепатита С // Иммунология. - 2005. -Т. 26, № 2. - С. 79-83.

14. Рязанцева Н. В., Жукова О. Б., Новицкий В. В. и др. Активность ДНК-репарационной системы лимфоцитов периферической крови у пациентов с хронической вирусной персистенцией // Эпидемиология и вакцинопрофи-лактика. - 2003. - Т. 13, № 6. - С. 27-29.

15. Рязанцева Н. В., Жукова О. Б., Новицкий В. В. и др. Структурные и функциональные особенности лимфоцитов у пациентов с хроническим носительством антигена вируса клещевого энцефалита // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2002. - Т. 134, № 11. - С. 547-550.