СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, ПРОИЗВОДЯЩЕГО МОЛОКО С МОДИФИЦИРОВАННЫМИ КОАГУЛЯЦИОННЫМИ СВОЙСТВАМИ
METHOD FOR IDENTIFYING CATTLE PRODUCING MILK WITH MODIFIED COAGULATION PROPERTIES

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Изобретение относится к сельскому хозяйству и заключается в создании популяции крупного рогатого скота, производящего молоко с желаемыми коагуляционными свойствами.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Ферментная коагуляция молока - это процесс, в результате которого после добавления коагулирующего фермента в сырое молоко оно сворачивается. Способность молока сворачиваться определяет долю молока, которое перерабатывают в сыр. Молоко, которое используют для производства сыра, должно обладать хорошей способностью к коагуляции после добавления в него коагулирующего фермента (химозина). Коагуляционные параметры молока определяют его ценность для сыроизготовления (FitzGerald, The Dairy Products Research Centre, Moorepark, DPRC No.19, 1999). Молоко, которое сворачивается, и в котором формируется творожный сгусток вскоре после добавления коагулирующего фермента, как предполагается, имеет более высокий выход сухой сырной массы, чем молоко с плохими коагуляционными свойствами (Ikonen Т. et al., J. Dairy Sci. 87(2), 458-467, 2004; FitzGerald, The Dairy Products Research Centre, Moorepark, 25 DPRC No.19, 1999). В Эстонии 8% коров в течение лактации по меньшей мере один раз дают молоко, которое не сворачивается (Kubarsepp et al. Proc. 22th Nordic Assoc. Agric. Sci. Congr., Turku, Finland, p.90, 2003). В Финляндии 13% коров породы Finnish Ayrshire дают молоко, которое не сворачивается (Tyriseva et al., Dairy Sci. 87(11), 3958-3966, 2004).
У всех коров молоко обладает различными коагуляционными свойствами. Генетическое усовершенствование коагуляционных свойств молока, возможно, будет служить одним из обоснованных способов повышения эффективности сыроизготовления (Ikonen Т. 35 Academic Diss., University of Helsinki, Department of Animal Science, Publications No. 49, 2000; Ikonen Т. et al., J. Dairy Sci. 87(2), 458-467, 2004). Генетические параметры коагуляции сырого молока изучались лишь в нескольких исследованиях, и полученные результаты зачастую являлись недостоверными из-за небольшого объема использованных данных или из-за пренебрежения важной информацией о родстве животных. Основные условия для генетически обусловленного улучшения коагуляционных свойств молока являются благоприятными благодаря большой изменчивости этих свойств, от 30 до 40% которой являются аддитивно генетическими (Ikonen Т. et al. Agric. Food Sci. Finl. 6:283-10 294, 1997; J. Dairy Sci. 82:205-214, 1999; J. Dairy Sci. 87(2): 458-467, 2004).
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задачей настоящего изобретения является создание популяции молочно-рогатого скота, производящего молоко с модифицированными коагуляционными свойствами, и способы создания такой популяции.
Объектом настоящего изобретения является популяция крупного рогатого скота, производящего молоко со средней плотностью сворачивания более 34,75 мм и средним временем сворачивания менее 7,2 мин.
30
30
Объектом настоящего изобретения является способ выведения популяции крупного рогатого скота, производящего молоко с модифицированными коагуляционными свойствами, согласно которому плотность творожного сгустка и время коагуляции молока замеряются по меньшей мере 3 раза в течение всего периода лактации; для определения значений данных показателей используются многочлены Лежандра, позволяющие построить индивидуальные графики плотности творожного сгустка и времени коагуляции молока, средние значения которых сравниваются с контрольными показателями для идентификации коров, самок-производительниц и самцов-производителей с желаемыми коагуляционными свойствами молока; и способ идентификации самцов-производителей по генотипу каппа-казеина с использованием коров, самок-производительниц и дочерей, производящих молоко с плотностью творожного сгустка Е более 30,43 мм и менее 26,07 мм, при условии, что вычисляется связь между генотипами каппа-казеина и коагуляционными свойствами молока в течение всего периода лактации, и генотипы каппа-казеина используются в качестве дополнительных маркеров для идентификации коров, производящих молоко со средней плотностью творожного сгустка Е, составляющей более 30,43 мм и менее 26,07 мм в течение всего периода лактации.
ТЕРМИНОЛОГИЯ
Коагуляция молока или ферментное сворачивание молока - это процесс, в результате которого после добавления коагулирующего фермента в сырое молоко оно сворачивается.
Молоко с модифицированными коагуляционными свойствами - это молоко всех коров, средняя плотность творожного сгустка которого составляет более 34,75 мм, а среднее время коагуляции - менее 7,2 мин.
Самцы-производители с модифицированными коагуляционными свойствами молока - это самцы-производители, средняя плотность творожного сгустка молока дочерей которых составляет более 29,5 мм, а среднее время коагуляции - менее 8,5 мин.
105
106
30
Коагуляция или ферментное сворачивание молока - процесс, в результате которого после добавления коагулирующего фермента в сырое молоко оно сворачивается. Ферментное сворачивание молока -процесс, состоящий из трех фаз (Brown, R.J. and Ernstrom С.А., Milk 20 clotting enzymes and cheese chemistry. Part I. Fundamentals of Dairy Chemistry. 3rd ed., N. P. Wong, R. Jenness, M. Keeney, and E. H. Marth, eds. Van Nostrand Reinhold, New York, 609-633, 1988). В течение первой фазы, ферментной фазы, химозин, являющийся коагулирующим ферментом, расщепляет цепи каппа-казеина между Phe-Met связями на пара-каппа-казеин и макропептид. Благодаря этому расщеплению каппа-казеин начинает агрегировать (вторая фаза коагуляции молока). Время образования творожного сгустка (R) - это время, прошедшее с момента добавления коагулирующего фермента до начала образования творожного сгустка. В течение третьей фазы коагуляции молока собравшиеся вместе мицеллы казеина формируют более или менее плотный гель. Плотность творожного сгустка (Е) - это плотность сгустка через 30 мин после добавления коагулирующего фермента. Для производства сыра важно, чтобы молоко сворачивалось быстро, и в нем быстро формировался творожный сгусток после добавления коагулирующего фермента (желательно достигнуть короткого времени образования творожного сгустка и его высокой плотности).
Коагуляционные свойства молока меняются в течение лактации в зависимости от многих факторов (таких как стадии лактации, содержания белка и кальция в молоке, уровня рН, индивидуальных особенностей коровы, количества соматических клеток, состояния тела, породы, вида питания, сезона).
Из-за этого, для того чтобы оценить коагуляционные свойства молока, в рамках настоящего изобретения предлагается построить график коагуляции, описывающий коагуляцию молока в течение продолжительного периода (всего периода лактации), вместо единичных замеров, которые использовались ранее. По графику коагуляции возможно определить средний уровень коагуляции молока коровы на любой конкретный день лактации или период.
В рамках настоящего изобретения предлагаются новые способы определения коагуляционных свойств молока конкретного животного (коров или самцов-производителей, исходя из данных об их дочерях) в течение всего периода лактации, а также возможность создания отборных популяций молочного скота, которые могут быть использованы для получения молока с желаемыми коагуляционными свойствами.
Коагуляционные свойства молока каждой коровы замеряются по меньшей мере 3 раза, по результатам этих замеров строится график, по которому возможно проследить изменение коагуляционных свойств молока конкретной коровы в течение всего периода лактации.
Для этого используют регрессионную модель со случайными коэффициентами:
где
ijk
30
y - j-oe значение Е или логарифм (R) для коровы i фермы k;
k
H - постоянный результат фермы k;
n
P(t) - значение многочлена Лежандра порядка n в стандартный день доения t;
n
in
b и C - коэффициенты модели, рассчитанные исходя из данных;
ijk
ε - случайная погрешность.
В дополнение к результату фермы модель со случайными регрессивными коэффициентами содержит многочлен Лежандра третьего порядка, который включен в модель, как фактор фиксированного результата, а также как фактор случайного эффекта, с целью расчета графика для каждой коровы, отличного от графика по средним значениям. Многочлены Лежандра известны своей гибкостью при моделировании имеющихся данных. Вдобавок при использовании многочленов Лежандра процесс расчета происходит быстрее.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что некоторые конкретные коровы производят молоко с желаемыми коагуляционными свойствами, характеризующимися относительно высокой плотностью творожного сгустка и относительно небольшим временем коагуляции. Например, 7,5% коров в Эстонии дают молоко с такими свойствами (см. Пример 1). Исходя из этих данных, в рамках настоящего изобретения предлагается способ создания популяции молочного скота, производящего молоко с желаемыми коагуляционными свойствами.
Модифицированное молоко согласно настоящему изобретению характеризуется средней плотностью творожного сгустка, составляющей более 34,75 мм и средним временем коагуляции, составляющим менее 7,2 мин (показатели коров контрольной группы), а также средней плотностью творожного сгустка, составляющей более 36 мм и средним временем коагуляции, составляющим менее 6,6 мин (показатели самок-производительниц контрольной группы).
По данным графиков коагуляции для дочерей строят также графики для самцов-производителей, имеющих по меньшей мере 10 дочерей. График коагуляции для самцов-производителей рассчитывается как график, построенный по средним значениям дочерей.
Для сравнения быков необходимо ввести индекс, позволяющий их сортировать. Такой индекс определяется как среднее значение коагуляционных свойств, рассчитанное по сумме значений коагуляционных свойств в течение всего периода лактации, или, проще говоря, как средние значение графика коагуляции для данного быка. То же суммарное значение было использовано для предварительной оценки наследуемости коагуляционных свойств сырого молока.
В рамках настоящего изобретения было определено, что 10 дочерей самцов-производителей производили молоко со средней плотностью творожного сгустка выше 29,5 мм и средним временем коагуляции менее 8,5 мин за один день лактации (сравнивали с контрольными показателями самцов-производителей).
Используя способ согласно настоящему изобретению, было установлено, что некоторые конкретные коровы производили в течение всего периода лактации молоко со значительно лучшими коагуляционными свойствами по сравнению с другими (Таблица 3).
Используя способ согласно настоящему изобретению, было установлено, что дочери некоторых самцов-производителей производили молоко в течение всего периода лактации со значительно лучшими коагуляционными свойствами по сравнению с другими коровами (Фиг.1, 2, 3, 4).
2
Используя способ согласно настоящему изобретению, удалось определить, что коэффициент наследуемости h коагуляционных свойств молока (h2=0,55 для времени коагуляции и h2=0,73 для плотности творожного сгустка) является высоким, что является предпосылкой для генетического отбора на основе вышеприведенных свойств (Таблица 1).
Способ согласно настоящему изобретению обеспечивает возможность создания популяции отборного скота для получения молока с желаемыми коагуляционными свойствами.
Настоящее изобретение может применяться с любыми породами и/или гибридами крупного рогатого скота, известными из уровня техники. В изобретении использованы способы оценки племенной ценности крупного рогатого скота для получения молока с желаемыми коагуляционными свойствами, известные профессионалам в данной области.
Оценка коагуляционных свойств молока за весь период лактации отдельных коров включает нижеописанные стадии, на которых:
- каждую из коров в течение периода лактации подвергали забору по меньшей мере 3 образцов молока;
30
- определяли время коагуляции (R) и плотность (Е) творожного сгустка;
30
- значения Е и логарифмические значения R анализировали при помощи регрессивного моделирования со случайными коэффициентами;
- использовали многочлены Лежандра для моделирования плотности творожного сгустка и времени коагуляции молока дочерей самцов-производителей в течение всего периода лактации;
30
- использовали модель со случайными регрессивными коэффициентами для каждой из коров и строили график Е и график R коагуляции, при этом каждый из графиков являлся многочленом третьего типа с коэффициентами в зависимости от коровы;
- находили численные значения коагуляционных свойств, исходя из полученных графиков.
Генетическая оценка самцов-производителей на основе данных о коагуляционных свойствах молока их дочерей в течение всего периода лактации включает следующие стадии, на которых:
30
- дочери каждого самца-производителя подвергались в течение всего периода лактации по меньшей мере трехразовому забору проб молока, в которых замерялись время коагуляции молока (R) и плотность творожного сгустка (Е);
30
- значения Е и логарифмические значения R анализировали с использованием регрессивной модели со случайными коэффициентами;
- использовали многочлены Лежандра для моделирования плотности творожного сгустка и времени коагуляции молока дочерей самцов-производителей в течение всего периода лактации;
30
- используя регрессивную модель со случайными коэффициентами, для каждой коровы рассчитывали графики коагуляции Е и R, при этом каждый индивидуальный график был многочленом третьего порядка с коэффициентами в зависимости от коровы;
- графики коагуляции самцов-производителей были построены по средним значениям графиков коагуляции их дочерей;
30
- показатели самцов-производителей сравнивали с использованием способа ANOVA, примененного к агрегированным значениям Е и R их дочерей.
Популяция крупного рогатого скота, производящего молоко с модифицированными коагуляционными свойствами.
В рамках настоящего изобретения предлагается способ создания популяции крупного рогатого скота, в которой основная часть коров производит молоко с модифицированными коагуляционными свойствами. «Основная часть» в контексте настоящего документа означает, что доля коров, производящих молоко с модифицированными коагуляционными свойствами, а также поддержание существующего соотношения определяются программой разведения.
В общем, популяцию коров, производящих молоко с модифицированными коагуляционными свойствами, физически отделяют от коров, которые не производят такое молоко.
В качестве альтернативы, коровы, производящие молоко с модифицированными коагуляционными свойствами, находятся в том же стаде, что и остальные коровы, но в таком случае они специально обозначаются как коровы, производящие молоко с модифицированными коагуляционными свойствами, при помощи ушных бирок, микрочипов или другими способами идентификации, хорошо известными из уровня техники.
Для удобства такие коровы обозначаются как «сырные коровы». Такое физическое или информационное отделение коров производится в интересах селекционеров для того, чтобы у них была возможность эффективно, удобно и экономически целесообразно перерабатывать молоко для отделения молока с модифицированными коагуляционными свойствами от обычного молока.
Настоящее изобретение может применяться с любыми породами и/или гибридами крупного рогатого скота, известными из уровня техники. В изобретении использованы хорошо известные стандартные способы оценки племенной ценности крупного рогатого скота для получения молока с желаемыми коагуляционными свойствами.
В качестве альтернативы, существует возможность создания популяции рогатого скота, дающего молоко с модифицированными коагуляционными свойствами, в виде электронной базы данных, на бумажных или других информационных носителях.
Идентификация коров, производящих молоко с модифицированными коагуляционными свойствами.
Для того чтобы определить, производит ли конкретная корова молоко с модифицированными коагуляционными свойствами, плотность творожного сгустка и время коагуляции замеряется по меньшей мере три раза в течение лактации. Для этого подходит любой известный способ. У каждой из коров образцы молока берутся индивидуально. Способы забора образцов молока хорошо известны. Образцы молока являются свежими, не замороженными. Определение коагуляционных свойств молока производится способами, известными из уровня техники; данные о плотности творожного сгустка, времени коагуляции и рН молока записываются.
Способы определения плотности творожного сгустка, времени коагуляции и рН молока, а также способы получения результатов в миллиметрах из оптического сигнала описаны в публикациях (Parna, Е. et al., Genetic Improvement of Milk Coagulation Properties. Proc. Of the 8th World Congress of Genetics Applied to Livestock Production. Belo Horizonte, Brazil: Published by Organizing committee of the 8th World Congress of Genetics Applied to Livestock Production, 2006).
Упомянутые выше результаты используются для определения коагуляционных свойств молока конкретных коров при помощи многочленов Лежандра. Таким образом строятся индивидуальные графики плотности творожного сгустка и времени коагуляции для каждой отдельной коровы.
Для того чтобы решить, может ли конкретная корова производить молоко с модифицированными коагуляционными свойствами, при помощи многочленов Лежандра рассчитывают среднюю плотность творожного сгустка и время коагуляции за весь период ее лактации, затем эти данные сравнивают с контрольными показателями.
Контрольные показатели для молока с модифицированным свойствами согласно настоящему изобретению составляют 34,75 мм и 7,2 мин для плотности творожного сгустка и времени коагуляции соответственно. В случае, если индивидуальные показатели выше (плотность творожного сгустка) или ниже (время коагуляции) контрольных показателей, то такая корова признается коровой, дающей молоко с модифицированными коагуляционными свойствами, или «сырной коровой».
В рамках настоящего изобретения предлагается способ определения самок-производительниц в случае, если среднее значение плотности творожного сгустка в течение всего периода лактации превышает 36 мм, а среднее время коагуляции составляет менее 6,6 мин. Для определения племенной ценности используются способы, хорошо известные из уровня техники.
Способы создания популяции крупного рогатого скота, производящего молоко с модифицированными коагуляционными свойствами путем отбора.
В рамках настоящего изобретения предлагается способ создания популяции крупного рогатого скота, производящего молоко с модифицированными свойствами, в котором значительная часть коров производит молоко с модифицированными коагуляционными свойствами. Согласно данному способу коагуляционные свойства молока определяются вышеуказанным способом, и коровы, производящие молоко с модифицированными коагуляционными свойствами, отделяются от коров, не производящих молоко с модифицированными коагуляционными свойствами. Отделение производится способом физической сегрегации или не физически, по данным о каждой корове (электронные базы данных, бумажные и т.п. носители). Для создания популяции коров, производящих молоко с модифицированными коагуляционными свойствами, может быть отсмотрено любое количество коров.
В рамках настоящего изобретения предлагается способ определения самок-производительниц, производящих молоко с модифицированными коагуляционными свойствами, основанный на использовании контрольных показателей самок-производительниц; и способ выведения потомства от этих самок-производительниц, которое также будет производить молоко с модифицированными коагуляционными свойствами. Способ содержит по меньшей мере трехразовый забор образцов молока у потенциальных самок-производительниц в течение всего периода лактации, определение коагуляционных свойств и построение коагуляционных графиков. Самки-производительницы, которых путем сравнения с контрольными показателями определяют как самок-производительниц, производящих молоко с модифицированными коагуляционными свойствами, подвергаются осеменению самцами-осеменителями, которые считаются самцами-производителями с модифицированными коагуляционными свойствами по данным о коагуляционных свойствах молока их дочерей, или молодыми бычками, племенная ценность которых не определена; впоследствии определяются коагуляционные свойства молока потомства этих самок-производительниц.
Обычно потомство с желаемыми свойствами отделяется от остальных коров, что приводит к увеличению доли молочных коров, производящих молоко с модифицированными коагуляционными свойствами. Стандартные способы выведения, использованные для осуществления настоящего изобретения, хорошо известны из уровня техники (См., например, Falconer & Mackay, Introduction to Quantitative Genetics, fourth edition. Longman, Essex, UK, 1996; Kinghorn et al., Use of New Technologies. TWYnam Press, 2001). Все дочери самцов-производителей с высокими генетическими показателями, чья сперма широко используется, тестируются для определения коагуляционных свойств их молока. Так как наследуемость коагуляционных свойств высока, при разведении рекомендуется использовать самцов-производителей, у которых много дочерей, производящих молоко с модифицированными коагуляционными свойствами, и осеменять их спермой тех коров, которые производят молоко с модифицированными коагуляционными свойствами. Таким образом, возрастает доля коров, молоко которых обладает модифицированными коагуляционными свойствами.
Способы определения самцов-производителей с модифицированными коагуляционными свойствами.
В рамках настоящего изобретения предлагается способ определения самцов-производителей с модифицированными коагуляционными свойствами на основе оценки коагуляционных свойств молока их дочерей за весь лактационный период. Способ включает определение коагуляционных свойств молока дочерей самцов-производителей с использованием способов, описанных выше, в течение всего периода лактации, построение коагуляционных графиков и определение самцов-производителей на основе коагуляционных графиков их дочерей. Коагуляционные показатели самцов-производителей сравниваются с контрольными показателями, и самцы-производители, чьи показатели превышают контрольные значения, считаются самцами-производителями с модифицированными коагуляционными свойствами молока. Определение племенной ценности коагуляционных свойств самцов-производителей проводится хорошо известными из уровня техники способами.
30
30
Способ идентификации генотипа коров, самок-производительниц и самцов-производителей, исходя из данных их дочерей, производящих в течение всего периода лактации молоко со средней плотностью творожного сгустка, составляющей более Е>30,43 и менее Е<26,07.
В рамках настоящего изобретения предлагается способ генетической оценки коагуляционных свойств молока крупного рогатого скота за весь период лактации с использованием генетических маркеров. Идентификация таких генетических маркеров дает возможность проводить отбор при помощи этих маркеров, тем самым обеспечивая возможность идентификации крупного рогатого скота, являющегося носителем желаемых или нежелательных маркеров. В этом случае нет необходимости проводить оценку самцов-производителей, основываясь на данных об их дочерях. Также существует возможность активно использовать носителей желаемых маркеров или не использовать носителей нежелательных маркеров в разведении в качестве самок-производительниц или самцов-производителей.
30
30
Не существует возможности идентификации крупного рогатого скота, производящего молоко с модифицированными коагуляционными свойствами, используя маркер генотипа каппа-казеина, так как не обнаружено взаимосвязи между различными генотипами каппа-казеина и значениями коагуляционных свойств молока; однако в рамках настоящего изобретения возможно использование генотипа каппа-казеина в качестве дополнительного маркера для определения коров, производящих молоко с коагуляционными свойствами в среднем лучше (Е>30,43; ВВ генотип) или в среднем хуже (Е<26,07; ЕЕ и АЕ генотипы).
Способ в общем включает:
1) определение коров, производящих молоко с модифицированными и не модифицированными коагуляционными свойствами;
2) получение ДНК крупного рогатого скота;
3) анализ полиморфизма образца.
Связь между полиморфизмом каппа-казеина и коагуляционными свойствами молока хорошо известна из уровня техники. В рамках настоящего изобретения предлагается возможность использовать генотип каппа-казеина как маркер для оценки коагуляционных свойств молока за весь период лактации. Известна стандартная методология определения связи между полиморфизмом и любым свойством.
Настоящая методология включает:
1) оценку коагуляционных свойств молока коров, производящих молоко с модифицированными и не модифицированными коагуляционными свойствами;
2) получение ДНК крупного рогатого скота;
3) анализ генотипа каппа-казеина с использованием стандартных способов (Sabre D., Molekulaargeneetilise informatsiooni kasutamise 25 võimalusi tõuaretuses. Väitekiri põllumajandusteaduste magistrikraadi taotlemiseks loomakasvatuse erialal. Tartu, 83 1k., 2003).
Весь статистический анализ был выполнен с использованием систем SAS (SAS, Cary, NC, USA) (Пример 3). Для определения генотипа возможно использование коровы, быка или теленка на любой стадии репродуктивности.
В рамках настоящего изобретения предлагается возможность определения коагуляционных свойств молока за весь период лактации коров и быков-производителей (по данным их дочерей) в соответствии с построенными коагуляционными графиками.
Для определения коагуляционных свойств молока в рамках настоящего изобретения используется коагуляционный график, описывающий уровень коагуляции молока в течение продолжительного периода - используется весь период лактации вместо одноразовых замеров, использовавшихся до настоящего времени.
По коагуляционному графику возможно определить средний уровень коагуляции молока коровы на любой конкретный день лактации или период.
В рамках настоящего изобретения предлагается возможность создания популяции крупного рогатого скота (физически или на информационном носителе), производящего молоко с модифицированными коагуляционными свойствами, причем молоко всех коров будет иметь желаемые коагуляционные свойства, вне зависимости от породы крупного рогатого скота.
В рамках настоящего изобретения предлагается возможность идентифицировать потенциальных самок-производительниц, производящих молоко с модифицированными коагуляционными свойствами.
В рамках настоящего изобретения предлагается возможность идентифицировать самцов-производителей, имеющих дочерей, производящих молоко с желаемыми коагуляционными свойствами.
В рамках настоящего изобретения предлагается потомство, производящее молоко с желаемыми коагуляционными свойствами.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1 - время коагуляции молока (R) во время лактации:
среднее значение, полученное по данным дочерей 7 самцов-производителей.
30
Фиг.2 - плотность творожного сгустка (Е) во время лактации: среднее значение, полученное по данным дочерей 7 самцов-производителей.
30
30
Фиг.3 - площадь (S_Е) под кривой прогнозируемого графика плотности творожного сгустка (Е): средние показатели по быкам.
Фиг.4 - площадь (S_R) под кривой прогнозируемого графика времени коагуляции молока (R): средние показатели по быкам.
Фиг.5 - доля генотипов каппа-казеина у популяции коров породы Estonian Holstein.
30
Фиг.6 - лактационные графики плотности творожного сгустка (Е) генотипов каппа-казеина.
Фиг.7 - лактационные графики времени коагуляции (R) генотипов каппа-казеина.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
30
30
Коровы, самки-производительницы и самцы-производители, исходя из информации об их дочерях, производящих молоко с модифицированными коагуляционными свойствами, были идентифицированы способами, составляющими объект настоящего изобретения. Впоследствии создавали популяцию крупного рогатого скота, производящего молоко с модифицированными коагуляционными свойствами, и определяли коров, самок-производительниц и самцов-производителей, исходя из информации об их дочерях, производящих молоко со средней плотностью творожного сгустка, составляющей более Е>30,43 и менее Е<26,07. Впоследствии определяли генотип каппа-казеина самок-производительниц и дочерей самцов-производителей, определяли связь между генотипом каппа-казеина и коагуляционными свойствами молока за весь период лактации.
Пример 1
Определение коагуляционных свойств молока (плотности творожного сгустка и времени коагуляции) и определение конкретных коров, исходя из коагуляционных свойств молока.
Исходя из коагуляционных свойств молока конкретных коров, строили графики коагуляции для каждой коровы, затем их использовали для определения коагуляционных свойств молока за весь период лактации коровы, и таким образом, идентифицировали коров с наилучшими коагуляционными показателями.
Процедура исследования.
1) Определение коагуляционных свойств молока.
30
Коагуляционные свойства молока каждой коровы, участвовавшей в эксперименте, определялись по меньшей мере 3 раза в течение всего периода лактации. Перед определением коагуляционных свойств сычужной сыворотки образцы подвергались воздействию температуры сычужного свертывания (35°С). Сычужный фермент (Milase MRS 750 IMCU/ml; CSK Food Enrichment B.V., Нидерланды), использовавшийся в эксперименте, был разведен в соотношении 1:100 (v/v) дистиллированной водой, и 0,2 мл этого раствора добавляли в 10 мл молока. Коагуляционные параметры молока (время коагуляции сычужной сыворотки (R), плотность творожного сгустка (Е)) определяли при помощи оптиграфа (Ysebaert, Frepillon, Франция; настройки оптиграфа: R наклон = 1,784 и R смещения = -2,303) при температуре 350°С. Для определения плотности творожного сгустка сигнал оптиграфа регистрировали в течение 30 минут после добавления сычужного фермента. Электрические параметры, полученные с оптиграфа, были переведены в миллиметры (Parna, Е. et al., Genetic Improvement of Milk Coagulation Properties. Proc. Of the 8th World Congress of Genetics Applied to Livestock Production. Belo Horizonte, Brazil: Published by Organizing committee of the 8th World Congress of Genetics Applied to Livestock Production, 2006).
2) Определение конкретных коров, основанное на коагуляционных свойствах молока за весь период лактации.
Для каждой коровы, подвергавшейся забору образцов по меньшей мере 3 раза в день, по данным о коагуляционных свойствах молока за весь коагуляционный период был построен график коагуляции. Для этого использовали регрессионную модель со случайными коэффициентами:
где
ijk
30
y - j-oe значение Е или логарифм (R) для коровы i фермы k;
k
H - постоянный результат фермы k;
n
P(t) - значение многочлена Лежандра порядка n в стандартный день доения t;
n
in
b и C - коэффициенты модели, рассчитанные исходя из данных;
ijk
ε - случайная погрешность.
В дополнение к результату фермы модель со случайными регрессивными коэффициентами содержит многочлен Лежандра третьего порядка, который включен в модель как фактор фиксированного результата, а также как фактор случайного эффекта, с целью расчета графика для каждой коровы, отличного от графика по средним значениям. Многочлены Лежандра известны своей гибкостью при моделировании имеющихся данных. Вдобавок при использовании многочленов Лежандра процесс расчета происходит быстрее. Весь статистический анализ проводили с использованием системы SAS (SAS, Cary, NC, USA).
Результаты оценки коагуляционных свойств молока коров, участвовавших в эксперименте, представлены в Таблице 3. Плотность творожного сгустка коров с более хорошими показателями (n=43) была выше плотности творожного сгустка остальных коров (n=533) на 31,6%, а время коагуляции молока на 22,7% меньше (средняя плотность творожного сгустка на 305 день лактации составила более 10 606 мм и среднее время коагуляции - менее 2206 мин). 7,5% коров принадлежат к данной категории. Такие коровы могут быть использованы при создании популяции коров, производящих молоко с модифицированными коагуляционными свойствами.
Увеличение плотности творожного сгустка до 41,7% было достигнуто, когда средняя плотность творожного сгустка за 305 дней лактации составляла 11000 мм (в группе коров с лучшими показателями было 8 животных, а в другой группе - 568 коров), а снижение времени коагуляции до 28,4% было достигнуто при среднем времени менее 2016. 1,4% коров принадлежали к этой категории. Такие коровы с лучшими коагуляционными свойствами молока могут быть использованы для разведения как самки-производительницы. В случае с большей популяцией, в которой группа коров с лучшими показателями состояла из 192 коров (33,3% популяции), а группа с более плохими показателями состояла из 384 коров, плотность творожного сгустка коров первой группы превышала показатели второй группы на 27,2%, а время коагуляции было короче на 19,2%.
Пример 2
Определение самцов-производителей по коагуляционным свойствам молока их дочерей.
Исследование было проведено с целью определения наследуемости коагуляционных свойств по данным дочерей самцов-производителей и идентификации самцов-производителей с лучшими коагуляционными свойствами. Значение наследуемости было равно 0,73 для плотности творожного сгустка и 0,55 для времени коагуляции. Плотность творожного сгустка лучшего самца была на 26,4% выше, а время коагуляции на 20% меньше, по сравнению с худшим самцом. Мы можем сделать вывод о том, что генетический фактор влияет на плотность творожного сгустка и время коагуляции, а генетическая изменчивость самцов-производителей позволяет использовать для отбора самцов-производителей с лучшими показателями плотности творожного сгустка и/или более коротким временем коагуляции.
30
На Фиг.1 показаны графики среднего времени коагуляции молока дочерей самцов-производителей, в коагуляционных свойствах молока которых было зарегистрировано по меньшей мере одно значимое изменение. По этим графикам возможно проследить изменения коагуляционных свойств самцов-производителей, исходя из данных об их дочерях в течение периода лактации. Вариативность времени коагуляции была значительно ниже в начале лактации по сравнению с окончанием лактации - тенденция к довольно быстрому росту за первые 100 дней лактации затем сменялась более стабильными индивидуальными изменениями времени коагуляции. В общем, возможно сказать, что показатели времени коагуляции молока проявляли тенденцию к повышению в течение всего периода лактации. На Фиг.2 представлены графики плотности творожного сгустка, которые были построены по тем же принципам, что и графики времени коагуляции. У каждого быка, участвовавшего в эксперименте, было зарегистрировано по меньшей мере одно значимое изменение плотности творожного сгустка, отличное от других выбранных быков. В начале лактационного периода наблюдался спад в показателях плотности творожного сгустка, который сменился ростом через 50 дней лактации. Такая перемена была характерна для всех самцов-производителей, так как их графики были схожих форм. На Фиг.3 представлены средние показатели S_Е потомства различных самцов-производителей, которые значительно различаются, также были зарегистрированы и статистически разные (Р<0.05) средние показатели. При распределении самцов-производителей по группам в соответствии с этим индикатором самцы-производители с более высокими средними показателями были отобраны в лучшую группу.
На Фиг.4 представлены средние показатели S_R, исходя из показателей потомства самцов-производителей, которое отличалось вариативностью, также были зарегистрированы статистически разные (Р<0.05) средние показатели. Разница между наиболее высоким и наиболее низким средним значением достигала почти 600 мин. Самцы-производители с наиболее низким значением показателя считались лучшими.
По графикам коагуляции для дочерей были построены графики для быков, имеющих по меньшей мере 10 дочерей, участвовавших в эксперименте. График коагуляции для конкретного быка рассчитывался по усредненным показателям его потомков. Для сравнения быков необходим индикатор, позволяющий провести сортировку этих быков. Таким индикатором служило общее значение коагуляционных свойств за 305 дней лактации. Для того чтобы получить значение коагуляционных свойств за один день, общее значение делили на 305.
30
Наследуемость коагуляционных свойств определяли по общему значению вышеуказанного индикатора. Быки сравнивались по методу ANOVA, применявшегося с агрегированными значениями Е и R дочерей быков. Анализу по методу ANOVA были подвергнуты 344 дочерей 17 быков. Сравнение результатов быков было проведено при помощи теста Бонферрони. Показатели изменений и наследуемости оценивались по методу ANOVA, принимая во внимание фиксированный результат конкретной фермы. Весь статистический анализ был проведен с использованием системы SAS (SAS, Cary, NC, USA).
Пример 3
Определение генотипа крупного рогатого скота для определения коагуляционных свойств в течение 305 дней лактации
Исследование проводилось с целью определить генотип каппа-казеина и дать средний дневной прогноз касательно коагуляционных свойств молока и взаимосвязи между коагуляционными свойствами в течение всего периода лактации и генотипом каппа-казеина. При помощи по меньшей мере трехразового определения коагуляционных свойств молока каждой коровы в течение лактационного периода было определено, что возможно построить специальный график коагуляции, который позволит определить конкретную корову по коагуляционным свойствам ее молока; т.е. вышеназванный график может использоваться для определения коров с наилучшими коагуляционными свойствами.
Определяли генотип каппа-казеина для каждой коровы (из крови выделяли ДНК) и, используя способы статистического анализа, определяли, существует ли связь между коагуляционными свойствами за весь период лактации и генотипом каппа-казеина. Все 15 статистических анализов были проведены с использованием системы SAS (SAS, Cary, NC, USA).
На Фиг.6 представлены графики средней плотности творожного сгустка, построенные по средним прогнозированным графикам коров с соответствующим генотипом. Была зарегистрирована статистически значимая (Р<0,001) разница между средними значениями плотности творожного сгустка за весь период лактации для различных генотипов. Очевидно преимущество генотипов с В-аллелями. Различия в течение лактации были зарегистрированы для всех генотипов, но у генотипа BE была зарегистрирована тенденция к более быстрому росту в конце лактации по сравнению с другими генотипами.
На Фиг.7 представлены лактационные графики времени коагуляции молока, построенные по тому же принципу, что и графики среднего времени коагуляции коров с соответствующим генотипом каппа-казеина. Не было зарегистрировано каких-либо отличий во времени коагуляции
+ в течение периода лактации у разных генотипов; в течение всего периода лактации все 35 генотипов проявляли общую тенденцию к росту.
2
- компонент изменчивости у быков;  - компонент изменчивости, вызванный случайной погрешностью; h - наследуемость.
Из таблицы 3 следует, что генетическая изменчивость у быков довольно высока по сравнению с остаточной изменчивостью коагуляционных свойств. По этой причине показатели наследуемости также высоки, хотя они могут быть получены с довольно большими среднеквадратическими ошибками.
Наиболее часто встречается генотип АА, и доля А-аллеля очень высока по сравнению с В и Е аллелями (Фиг.5). Суточная плотность творожного сгустка значительно отличается между генотипами, и наиболее высокие ее показатели были зарегистрированы у генотипа ВВ, а наиболее низкие - у генотипа АЕ. Суточное время коагуляции не отличалось значительно между генотипами, так наиболее низкие показатели были зарегистрированы у генотипа BE, а наиболее высокие - у генотипа АА (Таблица 4).
Таблица 4
Частота встречаемости генотипов каппа-казеина и аллелей, суточный прогноз коагуляционных свойств
Генотип
Аллель
АА
АВ
АЕ
ВВ
BE
А
В
Е
Число коров
311
162
45
18
8
0,76
0,19
0,05
Частота
0,57
0,30
0,08
0,03
0,02
Среднее значение Е<sub>30</sub> (мм)
26,07<sup>a</sup>
29,06<sup>b</sup>
25,09<sup>a</sup>
30,43<sup>b</sup>
27,21<sup>ab</sup>
Среднее значение R (мин)
9,25
9,13
9,10
8,98
8,93
<sup>аb</sup> Средние значения с разными верхними индексами значительно различаются (Р<0,05).
Наилучшие показатели плотности творожного сгустка за весь период лактации были зарегистрированы для генотипа каппа-казеина ВВ, а наихудшие - для генотипов АЕ и ЕЕ. Так как молоко коров, имеющих Е-аллели каппа-казеина, обладало наихудшими коагуляционными свойствами, то крупный рогатый скот, имеющий Е-аллели каппа-казеина, не предлагается использовать в качестве самцов-производителей и самок-производительниц.
Полученные результаты могут быть использованы при выборе маркеров для определения плотности творожного сгустка за весь период лактации, но генотип каппа-казеина не влияет на время коагуляции за весь период лактации.
30
30
Генотипы каппа-казеина не могут быть использованы для идентификации коров, производящих молоко с модифицированными коагуляционными свойствами, так как они не превышают контрольных показателей модифицированных коагуляционных свойств. Однако они могут использоваться как дополнительные маркеры для определения коров, которые производят молоко с более высокой плотностью творожного сгустка (Е>30,43; ВВ-генотип) или более низкой плотностью творожного сгустка (Е<26,07; ЕЕ-генотип и АЕ-генотип).