СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ПОЛИФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ КЛАССА СТИЛЬБЕНОВ ПИНОСИЛЬВИНА И МЕТИЛПИНОСИЛЬВИНА ИЗ ОТХОДОВ ПЕРЕРАБОТКИ СОСНЫ
METHOD FOR RECOVERING POLYPHENOL STILBENE COMPOUNDS PINOSYLVIN AND METHYLPINOSYLVIN FROM PINE WASTE

Изобретение относится к способам переработки растительного сырья, представляющего собой измельченную древесину сосны, с целью выделения из него биологически активных веществ, в частности полифенольных соединений класса стильбенов - пиносильвина и метилпиносильвина. Изобретение может быть использовано при производстве продуктов для химической и фармацевтической промышленности, сельского хозяйства и других областей экономики. Сущность метода заключается в том, что измельченную древесину сучковой зоны сосны экстрагируют водным раствором изопропилового спирта для получения экстракта, из которого затем удаляют растворитель с получением конечной смеси, содержащей пиносильвин и метилпиносильвин.
Указанные соединения являются весьма перспективными лекарственными соединениями, производство которых, несмотря на широкий фармакологический потенциал, пока нигде в мире не освоено. Использование отходов деревоперерабатывающих предприятий в качестве сырья для получения позволит увеличить степень переработки древесины, снизить нагрузку на окружающую среду и улучшить экономические и экологические показатели этой отрасли. Пиносильвины являются близкими структурными аналогами такого широко представленного на мировом рынке препарата, как Ресвератрол. При этом многие из исследованных фармакологических характеристик пиносильвина и метилпиносильвина (противогрибковый эффект, адъювантная активность и др.) оказались не хуже таковых для Ресвератрола. Применительно к соединениям, которые известны на российском рынке, можно отметить, что антиоксидантные свойства пиносильвина не уступают активности дигидрокверцетина, являющегося ключевым компонентом многих коммерческих продуктов. Таким образом, выделение пиносильвина и метилпиносильвина из сучковых зон древесины сосны является перспективным методом утилизации отходов ее переработки.
Известен способ экстракции измельченных сучковых зон хвойных деревьев с помощью полярных растворителей или их смесей (Н.Э. Нифантьев, Д.В. Яшунский, В.М. Меньшов, Ю.Е. Цветков, Д.Е. Цветков. «Способ выделения секоизоларицирезинола и дигидрокверцетина из древесины (варианты)», RU 2359666, 27.06.2009), ориентированный на выделение лигнинасекоизоларицирезинола и флавоноидадигидрокверцетина. Этот способ, однако, не позволяет выделять полифенольные соединения группы стильбенов, а именно пиносильвин и метилпиносильвин.
Известна работа WillforStefanetal. (US 20080124414, 29.05.2008), относящаяся к использованию экстрактов из сучковых зон древесины различных пород деревьев в качестве антиоксидантов, в которой раскрывается способ получения таких экстрактов, содержащих в том числе и соединения из группы стильбенов, путем обработки измельченного материала полярными растворителями или их смесями.
Более подробное описание аналогичного способа, определяемого как способ выделения фенольных соединений и ювабионов, дано теми же авторами в международной заявке WO 02/098830, опубликованной 12.12.2002 (патентные аналоги RU 2004100110, 10.04.2005; US 2004199032, 07.10.2004; EP 1295539 B1, 22.04.2009). Данная работа представляется наиболее близким аналогом (прототипом) настоящего изобретения, поскольку раскрывает, в частности, получение экстрактов, содержащих пиносильвин и метилпиносильвин из сучковых зон древесины сосны. Предлагаемый авторами способ предусматривает двухстадийную экстракцию измельченных сучковых зон древесины сосны, в частности вида Pinus sylvestris, в специальном экстракторе (ASE-apparatus, AcceleratedSolventExtractor), обеспечивающем получение высоких температур и давления, где первая стадия экстракции предназначена для удаления липофильных соединений и осуществляется путем обработки материала гексаном (при температуре 90°C и давлении 13,8 МПа), а вторая обеспечивает извлечение гидрофильных компонентов путем обработки высушенного продукта первого этапа смесью полярных растворителей ацетон:вода (или упоминаемая в описании смесь этиловый спирт:вода) в объемном соотношении компонентов 95:5 (при температуре 100°C и давлении 13,8 МПа) с последующим отделением экстракта.
К числу недостатков способа-прототипа следует отнести, во-первых, низкий выход пиносильвина и метилпиносильвина (для Pinus sylvestris он составляет, соответственно, 1,1 и 1,0% от сухого веса сучковых зон); во-вторых, не оптимальный выбор полярных растворителей и/или их соотношения, следствием чего является необходимость предварительного удаления липофильных соединений, и, в-третьих, использование дорогостоящей аппаратуры и высокую энергоемкость процесса, которые в конечном итоге повышают стоимость целевого продукта.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа выделения пиносильвина и метилпиносильвина из древесины сосны, лишенного указанных недостатков. Решение поставленной задачи достигается за счет проведения экстракции сучковых зон древесины сосны в один этап, предусматривающий применение в качестве экстрагента водного изопропилового спирта (смеси воды и изопропилового спирта) при содержании воды в интервале 25-35%, и осуществление процесса без повышения давления и температуры.
Получение результата в этом случае определяется способностью изопропилового спирта, смешиваясь с водой в указанных соотношениях, образовывать гомогенную смесь, хорошо растворяющую пиносильвин и метилпиносильвин и обеспечивающую набухание древесины и оптимальный массообмен экстрагента и экстракта внутри волокон без дополнительного нагревания материала (при комнатной температуре). Особенностью экстракции в найденных условиях является также то, что при используемом содержании воды в экстрагенте липофильные экстрактивы древесины в нем не растворяются, что позволяет отказаться от описанной в прототипе дополнительной стадии обработки гексаном для удаления липофильных соединений и последующей сушки материала.
При экстрагировании смесями с большим, чем 35%, содержанием воды наблюдается увеличение извлечения из сучковой массы нецелевых водорастворимых компонентов, в особенности производных углеводов, что в дальнейшем усложняет очистку пиносильвина и метилпиносильвина. Кроме того, поскольку растворимость в воде стильбеноидов незначительна, то при увеличении воды в экстрагенте выше указанной верхней границы содержание пиносильвина и метилпиносильвина в экстракте снижается.
В процессе создания изобретения нами было экспериментально установлено, что при экстракции водным изопропанолом с меньшим, чем 25%, содержанием воды или при ее отсутствии, выход экстрагируемых пиносильвина и метилпиносильвина уменьшается. Это следует рассматривать как неожиданный результат, так как очищенные целевые соединения лучше растворимы в чистом изопропиловом спирте, чем в его смеси с водой.
При получении пиносильвина и метилпиносильвина заявляемым методом удается повысить выход смеси названных продуктов (в сравнении с прототипом) примерно в 1,7 раза, а метилпиносильвина в составе указанной смеси более чем в 2,5 раза, что является основным техническим результатом изобретения, а также упростить способ за счет исключения предварительной экстракции липофильных соединений гексаном и удешевить его вследствие отказа от дорогостоящего оборудования и проведения процесса без дополнительного повышения температуры и давления, что следует рассматривать как дополнительные технические результаты.
Ниже приведены примеры, снабженные сопроводительными чертежами (Фиг.1 и Фиг.2), на которых представлены хроматограммы экстрактов, полученных в примерах 1 и 5 соответственно.
Пример 1.
Экстракция измельченной массы сучковых зон сосны 75%-ным водным изопропиловым спиртом.
В качестве сырья для отбора материала (сучковых зон древесины сосны) были использованы отходы лесозаготавливающего предприятия в Ивановской области. Специально определение вида сосны полученных на предприятии промышленных древесных отходов не проводилось, т.к., с одной стороны, корректная классификация, требующая привлечения морфологических признаков целого растения, была невозможной, а с другой, - такое определение представлялось в данном случае не обязательным в силу того, что в европейской части РФ массово произрастает практически только сосна вида Pinus sylvestris (сосна обыкновенная), и, соответственно, материал лесозаготавливающей и деревообрабатывающей промышленности на указанной территории, по существу, полностью представлен этим видом сосны (http://ru.wikipedia.org;http://www.tdecologica.ru/info/porody_derevev). Таким образом, применительно к использованным в изобретении отходам производства, очевидным было, по меньшей мере, полное преобладание в них вида Pinus sylvestris.
1000 г измельченной массы сучковых зон сосны экстрагировали 10 л 75%-ного водного изопропилового спирта при 20°C при перемешивании в течение 24 часов. Экстракт отделяли фильтрованием и упаривали досуха. Получали 124 г экстракта, содержащего 36 г смеси пиносильвина и метилпиносильвина в соотношении 1:2.2, которое определялось с помощью ВЭЖХ по методу, опубликованному ранее [Э.Е. Нифантьев и др., ЖОХ, 76 (2006) 161-163]. При этом аликвоты растворов (10 мкл) анализировали посредством ВЭЖХ на колонке Ultrasphere ODS (5 мкм, 4.6 мм×25 см; Beckman) в системе ацетонитрил (20%) - вода, содержащей 1 мл/л трифторуксусной кислоты при скорости потока 0.8 мл/мин с использованием УФ-детектора (254 нм).
На Фиг.1 показан профиль элюции компонентов, полученных описанным выше способом экстрактов. Следует отметить, что «картина» хроматографического разделения стильбенов в данном случае демонстрирует наличие в экстрактах значительных количеств только ПС и МПС, что из 2 «промышленных» видов сосны (sylvestris и sibirica), представленных в РФ, является характерным признаком именно сосны обыкновенной (табл.5 в WO 02/098830; Schanz S. et al., FEBS Lett. 1992 Nov 16; 313(1):71-4, реферат; Lindberg L., Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 01.03.2004, реферат). Количественная характеристика содержания пиносильвина и метилпиносильвина в экстрактах проводилась по калибровочным кривым, полученным при хроматографическом анализе аналитически чистых образцов пиносильвина и метилпиносильвина.
Пример 2.
Экстракция измельченной массы сучковых зон сосны 50%-ным водным изопропиловым спиртом.
1000 г измельченной массы сучковых зон сосны экстрагировали 10 л 50%-ного водного изопропилового спирта при 20°C при перемешивании в течение 24 часов. Экстракт отделяли фильтрованием и упаривали досуха. Получали 153 г экстракта, содержащего 34 г смеси пиносильвина и метилпиносильвина в соотношении 1:2.2. Анализ содержания пиносильвина и метилпиносильвина проводился методом ВЭЖХ как описано в примере 1.
Пример 3.
Экстракция измельченной массы сучковых зон сосны 65%-ным водным изопропиловым спиртом.
1000 г измельченной массы сучковых зон сосны экстрагировали 10 л 65%-ного водного изопропилового спирта при 20°C при перемешивании в течение 24 часов. Экстракт отделяли фильтрованием и упаривали досуха. Получали 120 г экстракта, содержащего 35 г смеси пиносильвина и метилпиносильвина в соотношении 1:2.2. Анализ содержания пиносильвина и метилпиносильвина проводился методом ВЭЖХ как описано в примере 1.
Пример 4.
Экстракция измельченной массы сучковых зон сосны изопропиловым спиртом.
1000 г измельченной массы сучковых зон сосны экстрагировали 10 л изопропилового спирта при 20°C при перемешивании в течение 24 часов. Экстракт отделяли фильтрованием и упаривали досуха. Получали 70 г экстракта, содержащего 27 г смеси пиносильвина и метилпиносильвина в соотношении 1:2.2. Анализ содержания пиносильвина и метилпиносильвина проводился методом ВЭЖХ как описано в примере 1.
Пример 5.
Экстракция 75%-ным водным изопропиловым спиртом измельченной массы сучковых зон сосны сибирской (Pinus sibirica).
10 г измельченной массы сучковых зон древесины сосны экстрагировали 100 мл 75%-ного водного раствора изопропилового спирта при 20°C в течение 24 часов при постоянном перемешивании. Экстракт отделяли фильтрованием и упаривали досуха.
Было получено 1,1 г экстракта, содержащего 0,12 г метилпиносильвина по данным анализа ВЭЖХ, выполненного как описано в примере 1. Пиносильвин указанным методом в экстракте не определялся; при этом, как показывает профиль элюции, представленный на фиг.2, основным компонентом, принадлежащим группе стильбенов, был дигидрометилпиносильвин, что соответствует данным, приводимым в прототипе (см. табл.5 в WO 02/098830), и является дополнительным свидетельством того, что промышленные отходы, использованные в примерах 1-4 для препаративного выделения ПС+МПС, не содержат сколько-нибудь значимых примесей сосны кедровой (Pinus sibirica).