СПОСОБ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ПОЛУЧЕНИЯ ПЕНТА-N-АЦЕТИЛХИТОПЕНТАОЗЫ
METHOD FOR ENZYME PRODUCTION OF PENTA-N-ACETYLCHITOPENTAOSE

Изобретение относится к области биохимического синтеза, а непосредственно к способу получения хитоолигосахаридов. Известен способ получения хитоолигосахаридов путем фрагментации биополимера хитина, выделенного из природных источников (панцири ракообразных, кутикула насекомых, клеточные стенки грибов) (Cabrera J.C., Van Cutsem P. Preparation of chitooligosaccharides with degree of polymerization higher than 6 by acid or enzymatic degradation of chitosan // Biochemical engineering Journal. 2005. V.25. P.165-172). Недостатками известного способа являются его высокая стоимость и трудоемкость, поскольку он предполагает очистку, фракционирование и последующее определение структуры полученных продуктов. Известен способ получения хитоолигосахаридов посредством химического синтеза (Boons G.J. Strategies in oligosaccharide synthesis // Tetrahedron. 1996. V.52, P.1095-1121). Недостатками известного способа являются многоэтапность процесса синтеза, а также необходимость стабилизировать полученные промежуточные продукта синтеза, что делает нецелесообразным получение хитоолигосахаридов со степенью полимеризации более трех остатков N-ацетилглюкозамина. Наиболее близким предлагаемому изобретению является способ получения хитоолигосахаридов, заключающийся в биосинтезе с помощью генетически модифицированных бактерий Escherichia coli, несущих плазмиду с клонированным геном NodC, который кодирует рекомбинантный фермент N-ацетилглюкозаминилтрансферазу бактерий Azorhizobium caulidans, Rhizobium leguminosarum, Rhizobium meliloti, который принимается за прототип (US №20090082307, Мкл A61K 31/715, C12P 19/18, A01N 43/04, A61P 3/10, A61P 9/00, A61P 31/04, A61P 31/12, A61P 25/00, A61P 35/00, A01P 21/00, C07H 1/00, 2009). Недостатком известного способа является невозможность получения олигомеров хитина, состоящих более чем из четырех остатков N-ацетилглюкозамина.
Решаемая изобретением задача - биологический синтез более длинных олигомеров хитина с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, кодируемого геном NodC почвенной бактерии Mesorhizobium loti 1803. Заявленный способ позволяет осуществить биосинтез олигомеров хитина с определенной химической структурой - пента-N-ацетилхитопентаозы - in vivo из предшественника N-ацетилглюкозамина в клетках Escherichia coli DH5α с помощью рекомбинантного фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы бактерии Mesorhizobium loti 1803.
Поставленная задача решается тем, что способ ферментативного получения олигомеров хитина, предполагающий биосинтез этих соединений in vivo из предшественника N-ацетилглюкозамина в культуре бактерий Escherichia coli DH5α высокой плотности с помощью экспрессируемого в клетках этих бактерий рекомбинантного фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803, отличается тем, что при биосинтезе in vivo получают олигомеры хитина, состоящие из пяти остатков N-ацетилглюкозамина, для осуществления биосинтеза in vivo олигомеров хитина проводят выделение, клонирование и экспрессию в Escherichia coli DH5α гена NodC Mesorhizobium loti 1803, кодирующего N-ацетилглюкозаминилтрансферазу, амплифицикацию гена NodC осуществляют с помощью специфичных (подходящих для последовательности гена NodC) праймеров и Pfu-полимеразы, в качестве матрицы для амплификации генов NodC используют ДНК, выделенную из штамма Mesorhizobium loti 1803, депонированного в коллекции ВНИИСХМ, в результате получают продукт амплификации размером 1300 п.о., амплифицированный ген NodC Mesorhizobium loti 1803 (NodC) клонируют в векторе pUC19 по сайтам BamH и EcoR1 с сохранением рамки считывания, таким образом, получают плазмиду pUC19-NodC, содержащую полноразмерный ген NodC, кодирующий N-ацетилглюкозаминилтрансферазу, и используют полученную плазмиду для экспрессии гена NodC в бактериях Escherichia coli DH5α, в векторе pUC19 ген NodC находится под контролем промотора b-галактозидазы (промотор гена lacZ), экспрессию N-ацетилглюкозаминилтрансферазы (NodC) осуществляют в штамме Escherichia coli DH5α после индукции изопропил-β-D-тиогалактозидом, при культивировании бактерий Escherichia coli DH5α, несущих плазмиду pUC19-NodC со встроенным геном NodC Mesorhizobium loti 1803, в присутствии предшественника N-ацетилглюкозамина синтезируют пента-N-ацетилхитопентаозу, количество синтезированной пента-N-ацетилхитопентаозы с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803 составляет около 0,1-0,5 грамма на литр бактериальной культуры, с помощью метода масс-спектрометрии осуществляют анализ синтезированного вещества, который подтверждает, что синтезированное вещество является пента-N-ацетилхитопентаозой.
Заявителем не выявлены источники информации, содержащие сведения о технических решениях, идентичных заявленному изобретению, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «новизна».
Предлагаемый способ ферментативного получения олигомеров хитина обеспечивает биологический синтез более длинных олигомеров хитина с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803. Заявленный способ позволяет осуществить биосинтез олигомеров хитина с определенной химической структурой - пента-N-ацетилхитопентаозы - in vivo из предшественника N-ацетилглюкозамина в клетках Escherichia coli DH5α. Поставленная задача решается тем, что ферментативный синтез олигомеров хитина осуществляют из предшественника N-ацетилглюкозамина в культуре бактерий Escherichia coli высокой плотности с помощью рекомбинантного фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803, контролирующего синтез этих соединений. Сущность заявленного способа поясняется с помощью рисунков:
рисунок 1. Амплификация гена NodC Mesorhizobium loti 1803, кодирующего N-ацетилглюкозаминилтрансферазу (А). Клонирование в векторе pUC19 и рестрикционный анализ полученных клонов (Б), рисунок 2. Экспрессия фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803 в клетках Escherchia coli DH5α, несущих плазмиду pUC19-NodC, рисунок 3. Анализ продуктов ферментативной реакции, катализируемой N-ацетилглюкозаминилтрансферазой Mesorhizobium loti 1803 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, рисунок 4. Анализ структуры продукта, синтезированного с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803, методом масс-спектрометрии (MALDI-TOF), рисунок 5. Название и структура олигомера хитина, синтезированного с помощью фермента Mesorhizobium loti 1803.
Предлагаемый способ включает биосинтез in vivo из предшественника N-ацетилглюкозамина в культуре бактерий Escherichia coli DH5α высокой плотности с помощью рекомбинантного фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803, контролирующего синтез этих соединений, отличается тем, что при биосинтезе in vivo используют фермент, контролирующий синтез олигомеров, состоящих из пяти остатков N-ацетилглюкозамина. Для осуществления биосинтеза in vivo олигомеров хитина проводят выделение, клонирование и экспрессию в Escherichia coli DH5α гена NodC Mesorhizobium loti 1803, кодирующего N-ацетилглюкозаминилтрансферазу, амплифицикацию гена NodC осуществляют с помощью специфичных (подходящих для последовательности гена NodC) праймеров и Pfu-полимеразы, в качестве матрицы для амплификации гена NodC используют ДНК, выделенную из штамма Mesorhizobium loti CIAM 1803, депонированного в коллекции ВНИИСХМ, в результате получают продукт амплификации размером 1300 п.о. (рисунок 1), амплифицированный ген NodC Mesorhizobium loti 1803 (NodC) клонируют в векторе pUC19 по сайтам BamH и EcoR1 с сохранением рамки считывания, таким образом, получают плазмиду pUC19-NodC, содержащую полноразмерный ген NodC, кодирующий N-ацетилглюкозаминилтрансферазу, и используют полученную плазмиду для экспрессии гена NodC в бактериях Escherichia coli DH5α, в векторе pUC19 ген NodC находится под контролем промотора b-галактозидазы (промотор гена lacZ), экспрессию N-ацетилглюкозаминилтрансферазы (NodC) осуществляют в штамме Escherichia coli DH5α после индукции изопропил-β-D-тиогалактозидом (рисунок 2), при культивировании бактерий Escherichia coli DH5α, несущих плазмиду pUC19-NodC со встроенным геном NodC Mesorhizobium loti 1803, в присутствии предшественника N-ацетилглюкозамина синтезируют пента-N-ацетилхитопентаозу (рисунок 3), количество синтезированной пента-N-ацетилхитопентаозы с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803 составляет около 0,1-0,5 грамма на литр бактериальной культуры, с помощью метода масс-спектрометрии осуществляют анализ синтезированного вещества (рисунок 4), который подтверждает, что синтезированное вещество является пента-N-ацетилхитопентаозой (рисунок 5).
Указанные обстоятельства, по мнению заявителя, подтверждают соответствие заявленного технического решения критерию «изобретательский уровень».
Возможность реализации предлагаемого изобретения подтверждается проведенными экспериментами и иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
1.1. Конструирование экспрессионной плазмиды.
Для конструирования экспрессионной плазмиды pUC19-NodC последовательность гена NodC Mesorhizobium loti 1803 амплифицировали методом полимеразной цепной реакции с использованием специфических праймеров, в состав которых вводили сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoR1. Для амплификации использовали ризобиальную ДНК штамма ризобий Mesorhizobium loti 1803. Продукты амплификации очищали с помощью набора GIAEX II Gel Extraction Kit и клонировали в плазмиду pUC19 с использованием соответствующих эндонуклеаз рестрикции и Т4 ДНК-лигазы.
1.2. Условия для экспрессии фермента в клетках Escherichia coli DH5α
600
Экспрессию рекомбинантного фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Mesorhizobium loti 1803 осуществляли в клетках Escherichia coli DH5α. Клетки штамма Escherichia coli DH5α трансформировали плазмидой pUC19-NodC. Несколькими свежими рекомбинантными колониями инокулировали 100-500 мл среды LB - 10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl (рН 7.0), содержащей ампициллин (100 мкг/мл), и растили при температуре 37°С, 220 об/мин на орбитальном шейкере до достижения культурой оптической плотности OD=0,6. Экспрессию генов рекомбинантных белков индуцировали добавлением изопропил-β-D-тиогалактозида до конечной концентрации 1 мМ.
Пример 2.
2.1. Синтез хитоолигосахаридов in vivo.
600
Для синтеза хитоолигосахаридов in vivo бактериальные культуры выращивали в среде LB при температуре 37°С с добавлением ампициллина в концентрации 100 мг/л до достижения оптической плотности OD=0,6, затем производили индукцию экспрессии белка посредством добавления изопропил-β-D-тиогалактозида. Далее в качестве источника углерода добавляли глицерол в концентрации 160 г/л и N-ацетилглюкозамин в концентрации 1 г/л в качестве субстрата для синтеза хитоолигосахаридов. Синтез хитоолигосахаридов осуществляли в клетках Escherichia coli DH5α. Выделение и очистку хитоолигосахаридов проводили из 100 мл 24- или 48-часовой бактериальной культуры. Клетки были осаждены в течение 20 минут при 3000 g, затем ресуспендированы в маленьком объеме (2 мл) и подвергнуты кипячению в течение 30 минут. При этом происходил выход синтезированных хитоолигосахаридов в культуральную среду. Хитоолигосахариды были адсорбированы на активированном угле в течение 20 минут. Смыв хитоолигосахаридов с угля проводили этиловым спиртом 50% и 70%.
2.2. Разделение и идентификация хитоолигосахаридов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии. Идентификацию и разделение хитоолигосахаридов проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонке с аминофазой SUPELCOSIL™ LC-NH2 с использованием в качестве жидкой фазы системы ацетонитрил:вода (70%:30%). Структуру полученных соединений проверяли с помощью метода масс-спектрометрии.