Цитокиновая регуляторная сеть

Медицинская Иммунология 2003, Т.5, №3-4 © 2003, СПб РО РААКИ

ЦИТОКИ НОВАЯ РЕГУЛЯТОРНАЯ СЕТЬ

ВЛИЯНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО И-1Р (БЕТАЛЕЙКИНА) НА ЦИТОХРОМ Р450-ЗАВИСИМЫЕ МОНООКСИГЕНАЗНЫЕ АКТИВНОСТИ В ПЕЧЕНИ КРЫС

Ахматов А.Т.. Симбирцев А.С.*, Сибиряк С.В.

Всероссийский Центр глазной и пластической хирургии М3 РФ, Уфа, Россия; *НИИОЧП, Санкт-Петербург, Россия

В последние годы все больше возрастает интерес к препаратам рекомбинантных цитокинов как средствам высокоэффективной иммуномодулирующей терапии. Многие цитокины, в первую очередь это провоспалитель-ные цитокины (ТОТ, 1Ь-1, 1Ь-6) обладают полимодаль-ной активностью и помимо характерного для каждого из цитокинов специфического иммунотропного эффекта, участвуют в регуляции множества биологических функций организма. Первоначально для №N01 и (3, а затем и для других цитокинов (1Ь-1, ЮТ, 11,-6,1Ь-11,1Ь-2 и 1Шу), экспериментальными исследованиями была показана способность угнетать активность цитохром Р450-зави-симых монооксигеназ в печени и, как следствие, изменять биотрансформацию широкого круга ксенобиотиков, включая лекарственные препараты. Имеются немногочисленные клинические наблюдения, свидетельствующие о нарушении фармакометаболизирующей функции печени в условиях цитокинотерапии. В настоящей работе было изучено влияние рекомбинантного 1Ь-1р (беталейкина) наэтоксирезоруфин-О-деетилазную (ЭРОД) и бензилок-сирезоруфин-О-дебензилазную (БРОД) активности в печени крыс. Беталейкин вводили внутрибрюшинно, однократно, в дозе 104 МЕ на 100 г массы животного и спустя 24 часа оценивали монооксигеназные активности в субмитохондриальной фракции (12000 g) гомогенатов печени. Результаты представлены в таблице 1.

Беталейкин при однократном введении вызывал существенное угнетение ЭРОД-активности, которая является “маркерной” активностью АЬ-рецептор-зависимой изоформы цитохрома Р450 СУР1А1, метаболизирующей полициклические планарные химические соединения. БРОД-активность, отражающая монооксигенирование изоформами цитохрома Р450 СУР2В1/2, также снижалась, хотя статистически значимые отличия получены

лишь при расчете активности на 1г массы печени. Полученные данные свидетельствуют, что беталейкин при однократном введении угнетает биотрансформацию ксенобиотиков в печени и может изменять фармакологическую активность лекарственных препаратов, применяемых на фоне цитокинотерапии. Дальнейшие исследования в этом направлении представляются весьма перспективными и позволят дать более полную фармакологическую характеристику препаратов рекомбинантных цитокинов.

СПЕКТР И ИНТЕНСИВНОСТЬ СИНТЕЗА ИНДУЦИРОВАННЫХ «МЫШИНЫМ» И ХОЛЕРНЫМ ТОКСИНАМИ ЦИТОКИНОВ, РЕГУЛИРУЮЩИХ АПОПТОТИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС

Васильева Г.И.. Козловский В.Н.,

Мишанькин М.Б., Мишанькин Б.Н.

Научно-исследовательский противочумный институт, Ростов-на-Дону, Россия

Ранее нами установлено, что «мышиный» токсин (МТ) чумного микроба и холерный токсин являются суперантигенами (Мишанькин и др., 1997; Васильева и др., 2002). Принимая во внимание, что в патогенезе иммунопатологических реакций, обусловленных суперантигенами, существенное значение имеет апоптоз, и учитывая роль цитокинов в регуляции апоптотическо-го процесса, мы изучили способность МТ и ХТ стимулировать синтез цитокинов, защищающих клетку от развития апоптоза или, наоборот, индуцирующих его развитие. Проведенные исследования показали, что оба препарата являются активными индукторами синтеза цитокинов, но их цитокиновые профили различаются. МТ, являясь антигеном чумного микроба - внутриклеточного паразита, активирует в первую очередь Т-хелперы 1 типа (ТЫ) и соответственно стимулирует синтез 1Ь-2, ТОТ-а, ^Ы-у, 1Ь-12, а ХТ, будучи антигеном холерного вибриона, для которого характерна внеклеточная локализация — Т-хелперы 2 типа (ТЬ2) и цитокины 1Ь-4, 5, 6. Таким образом, МТ и ХТ вызывают соответственно ТЫ и ТЬ2 типы цитокинового ответа. Вместе с тем, оба токсина способны индуцировать синтез цитокинов, нехарактерных для вызываемых их

Табл. 1. ВЛИЯНИЕ БЕТАЛЕЙКИНА НА ЭРОД- И БРОД-АКТИВНОСТИ В СУБМИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ФРАКЦИИ ГОМОГЕНАТОВ ПЕЧЕНИ КРЫС

ЭРОД - активность

Г руппа животных пмоль/мин/мг нмоль/мин/г пмоль/мин/мг нмоль/мин/г

Белка массы органа белка массы органа

Беталейкин (п = 6) 2,53 ± 0,08* 8,37 ± 0,56* 3,89 ± 0,31 12,67 ±0,65*

Контроль (п = 6) 3,07 ±0,18 11,39 ±1,00 4,65 ± 0,30 17,49 ±0,62

*- различия статистически значимы (Р < 0,05). Использован Г-критерий Стьюдента для независимых признаков.

возбудителями типов иммунного ответа (МТ - IL-10, а XT - TNF-a), что свойственно СА, которые, стимулируя одновременно синтез цитокинов Thl и Th2 типа, вызывают неадекватный иммунный ответ и формирование имммунопатологических реакций. Оба токсина наряду с лимфокинами индуцируют синтез монокинов IL-1 и TNF-a макрофагами. Этот эффект более выражен у XT. Представленные результаты позволяют предположить, что апоптогенный эффект обоих токсинов обусловлен в первую очередь их способностью индуцировать синтез TNF-a. Кроме того, IL-10, синтез которого активно стимулируется МТ, блокирует антиапоп-тозный эффект ряда препаратов (Сох, Austin, 1997), а апоптогенному эффекту XT способствует IL-6, синтез которого им индуцируется. Следует отметить, что апоптогенный эффект XT может быть опосредован и вызываемой им блокадой синтеза IL-2. Так, по нашим данным, XT in vivo ингибирует продукцию IL-2 лимфоцитами пейеровых бляшек и мезентериальных лимфоузлов. Одновременно наблюдается практически полное подавление рецепции IL-2, что индуцирует так называемый «пассивный апоптоз», или «апоптоз по умолчанию», свойственный клеткам с высоким уровнем дифференциации, когда апоптотический процесс развивается не под влиянием индуцирующего сигнала, а при недостатке определенных сигналов, в том числе, цитокинов, препятствующих реализации внутренней программы клеточной гибели. Что касается других цитокинов, синтез которых запускается МТ и XT, то они могут в одних случаях выступать как защитники клетки от апоптоза, а в других - индуцировать его. Положительный эффект активации имеет место в тех случаях, когда клетка обеспечена всеми необходимыми для ее пролиферации и дифференцировки медиаторами и рецепторами. В случае отсутствия какого-нибудь сигнала или рецептора наступает апоптоз, как, например, при блокаде IL-2 и его рецепции. Представленные результаты дают основание предположить, что одним из возможных механизмов апоптогенной активности МТ и XT является их способность индуцировать или блокировать синтез/продукцию регулирующих апоптоз цитокинов.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований

ИММУНОКОРРЕКЦИЯ С ПОМОЩЬЮ СВЕРХМАЛЫХ ДОЗ АНТИТЕЛ КЦИТОКИНАМ: ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ И КЛИНИЧЕСКИЕАСПЕКТЫ

Мартюшев-Поклад А.В.. Шерстобоев Е.Ю., Пашинский В.Г., Сергеева С.А., Эпштейн О.И.

НПФ «Материа Медика Холдинг», Москва, Россия; НИИ фармакологии, Томск, Россия

Известно, что антитела к цитокину при парентеральном введении ингибируют активность цитокина, на чем основано их лечебное применение (например, препарат инф-ликсимаб). В проведенных ранее экспериментах было показано, что антитела к эндогенным регуляторным молекулам при введении в сверхмалых дозах (СМД), не блокируют, а модифицируют физиологическую активность соответствующей молекулы (Эпштейн, Штарк, Воробьева, 1998).

Настоящая серия исследований была направлена на выявление модифицирующих эффектов СМД (эквивалентная концентрация 10'24 массовых долей) ан-

тител к ключевым провоспалительным цитокинам (TNF-a и IFN-у) и определение возможности их лечебного применения.

При пероральном ежедневном курсовом введении (0,2 мл раствора) интактным мышам и на фоне вызванной цик-лофосфаном иммуносупрессии СМД анти-IFN-y оказывали стимулирующее воздействие на все эффекторные звенья иммунного ответа: антителопродукцию, реакцию гиперчувствительности замедленного типа, функцию NK клеток и фагоцитоз. На фоне введения анти-IFN-y значительно повышалась как спонтанная (в 3-8 раз, р<0,001), так и стимулированная фитогемагглютинином 20 мкг/мл (на 10%, р<0,05) выработка Т лимфоцитами (спленоцитами) эндогенного IFN-y. При этом повышалась функциональная активность не только Тх1 (оцениваемая по IFN-y), но и Тх2: спонтанная продукция IL-4 - 1,4-3 раза (р<0,05), а ФГА-стимулированная IL-4 и IL-10 - на 50-80% (р<0,05). Таким образом, вводимые перорально СМД анти-IFN-y стимулировали все звенья иммунной системы, прежде всего, за счет индукции эндогенного IFN-y. В мышиных моделях инфекции вируса гриппа и вируса герпеса HSV-2 курсовое перо-ральное введение СМД анти-IFN-y оказывало профилактическое и лечебное действие: снижалась концентрация вируса гриппа в легких и концентрация HSV-2 - в головном мозге, повышалась выживаемость.

Клинические исследования подтвердили противовирусные и иммуномодулирующие свойства препарата на основе СМД анти-IFN-y (Анаферон детский, АФД): он оказывает лечебный и профилактический эффект при гриппе и других ОРВИ. Показано, что АФД положительно влияет на интерфероновый статус (восстанавливает адекватную выработку лимфоцитами эндогенных IFN-y и a/Р) и позволяет предупреждать развитие в период ре-конвалесценции вторичного иммунодефицита.

При экспериментальном исследовании СМД анти-TNF-a, входящие в состав препарата Артрофоон (АФ), вводили в виде курса per os крысам за 1 сутки до и 12 суток после индукции иммунного воспаления (инъекцией полного адъюванта Фрейнда под плантарный апоневроз). АФ оказывал, прежде всего, системный противовоспалительный эффект, выразившийся уже на 3 сутки в снижении лейкоцитоза. Анальгетический эффект АФ (латентное время реакции, модель горячей пластины) был значимым уже через 3 ч после индукции воспаления. АФ обладал выраженной анальгетической активностью и при профилактическом введении (модель уксусных корчей). Локальный антиэкссудативный эффект при иммунном воспалении проявился, начиная с 8 суток.

В 6-месячном исследовании эффективности и безопасности АФ у больных ревматоидным артритом (РА), в том числе с суставно-висцеральной и осложненными формами РА, пероральное введение препарата (4-8 таб-леток/сут) приводило к статистически достоверному улучшению 5 из 8 клинических показателей заболевания: болевого индекса (у 86,7% пациентов), длительности утренней скованности (у 93,3%), суставного индекса Ричи (у 80%), индекса припухлости и окружности пораженных суставов (у 60%), уровня С-реактивного белка (у 80% пациентов). В группе АФ не отмечено клинических или лабораторных изменений, требовавших уменьшения дозы АФ или временную его отмену. По эффективности и безопасности АФ превзошел препарат сравнения диклофенак (100 мг/сут).

Интересно, что в модели перевиваемой (в количестве 106 клеток) меланомы В-16 у мышей линии С57В1/6, полу-

чавших анти-TNF-a, наблюдалось достоверное снижение частоты метастазирования, количества и площади метастазов.

Полученные данные подтверждают способность СМД антител к цитокинам при пероральном введении не блокировать, а модулировать их активность, и это свойство может быть использовано для создания эффективных и безопасных лекарственных средств.

ПРОДУКЦИЯIL-1 ИИ-6ЭНТЕРОЦИТАМИ ТОНКОГО КИШЕЧНИКА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ АНТИГЕНОВ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА

Омельченко Н.Д.

Научно-исследовательский противочумный институт, Ростов-на-Дону, Россия

Учитывая участие энтероцитов тонкого кишечника в реализации местных иммунных реакций, мы проанализировали способность этих клеток продуцировать про-воспалительные цитокины IL-1 и IL-6 под влиянием антигенов холерного вибриона.

Установлено, что при воздействии на энтероциты тонкого кишечника интактных мышей липополисаха-рида (ЛПС) холерного вибриона, холерного токсина (XT) или целых микробных клеток (м.к.) в культуральных супернатантах этих клеток определяются существенно превышающие контрольный уровень количества IL-6. При этом стимуляции продукции IL-1 обнаружено не было. На фоне сниженной в сравнении с показателями интактных животных продукции IL-1 эпителиоцитами тонкой кишки в результате иммунизации XT дополнительное воздействие на энтероциты in vitro целыми м.к. холерного вибриона не приводит к изменению синтетической активности этих клеток. Аналогичное воздействие на энтероциты очищенного ЛПС Vibrio cholerae обеспечивает на 3-и сутки после иммунизации повышение в сравнении с контролем продукции IL-1. Однако в дальнейшем дополнительный стимулирующий эффект ЛПС холерного вибриона не проявляется, а продукция IL-1 не отличается от контроля. Дополнительная стимуляция ш vitro примированных XT энтероцитов с помощью самого токсина сопровождается еще большим угнетением продукции IL-1 в культуре клеток кишечного эпителия во все сроки исследования.

При оценке продукции IL-6 наблюдалась другая картина. Иммунизация XT вызывала повышенную продукцию этого интерлейкина. Дополнительное воздействие целыми м.к., и ЛПС холерного вибриона приводило к тому, что синтетическая активность энтероцитов была равна контрольному уровню или, что значительно чаще, превышала его.

В то же время введение в модельную систему IFN-y обусловливало снижение уровня IL-6 в супернатантах энтероцитов.

Таким образом, энтероциты тонкого кишечника могут способствовать развитию воспалительных реакций в кишечнике, блокируя формирование адекватного иммунного ответа за счет своего вклада в цитокиновый дисбаланс, гиперпродуцируя IL-6, способный, как известно, нарушать инициальные фазы иммунного ответа. При этом в роли иммунокорректора может выступать IFN-y, отменяющий стимуляцию синтеза и продукции провоспали-тельных цитокинов энтероцитами под влиянием Аг холерного вибриона.

ПРОДУКЦИЯ ЦИТОКИНОВ ЭРИТРОИДНЫМИ ЯДРОСОДЕРЖАЩИМИ КЛЕТКАМИ ФЕТАЛЬНОЙ ПЕЧЕНИ И КОСТНОГО МОЗГА ЧЕЛОВЕКА

Сенников С.В., ИнжелевскаяТ.В., Крысов С.В., Денисова В.В., Козлов В.А.

ГУ НИИ Клинической иммунологии СО РАМН, Новосибирск, Россия

Известно, что клетки эритроидного ряда мышей различного происхождения (фетальная печень, селезенка новорожденных и взрослых мышей, костный мозг) обладают имму-норегуляторными свойствами. Установлена способность эритроидных ядерных клеток (ЭЯК) мышей экспрессировать мРНК широкого спектра цитокинов, а также продемонстрирована продукция таких медиаторов, как ПТЧ-у и СМ-С5Р. Показано, что продукция цитокинов эритроидными клетками мышей может меняться в онтогенезе и под действием различных факторов (введение фенилгидразина, гипоксия, культивирование клеток с эритропоэтином). Вместе с тем способность эритроидных клеток человека синтезировать иммуно-регуляторные цитокины до настоящего времени практически не изучалась. В связи с этим целью настоящей работы было сравнительное изучение уровня продукции цитокинов ЭЯК человека на разных стадиях онтогенеза, а именно, ЭЯК, выделенными из фетальной печени (ФП) и костного мозга (КМ) человека. Используя методы негативной и позитивной селекции, мы выделяли популяцию ЭЯК, на 98-100% состоящую из ЭЯК. Кондиционную среду от ЭЯК (1х106кл/мл) получали после 24-часового культивирования. Определение уровня продуцирующихся цитокинов в кондиционной среде от ЭЯ К производили электрохемилюминесцентным методом. Нами было показано, что ЭЯК, выделенные из КМ человека, продуцируют достоверно больше 1Ь-2,1РТС-у и ТСР-(31 по сравнению с продукцией этих белков ЭЯК из ФП. ЭЯК ФП продуцировали достоверно больше П.-1Р в сравнении с ЭЯК КМ. По уровню продукции 1Ь-4,1Ь-6,11-10, ЮТ-сх ЭЯК из ФП и КМ достоверных различий найдено не было. Известно, что все перечисленные белки в той или иной степени обладают способностью влиять на пролиферативную, диффе-ренцировочную и апоптотическую активность клеток предшественников и бластных форм. Интересным представляется факт повышенной продукции 1ИР ЭЯК ФП. Этот цито-кин играет важную роль в под держании ранних кроветворных предшественников, что, несомненно, важно в период пренатального развития человеческого организма. Известно, что 1Ь-2 и ПТ^Г-у являются ингибиторами пролиферации эритроидных клеток. Повышенная их продукция ЭЯК КМ в условиях нормального кроветворения может обеспечивать определенный уровень пролиферации гемопоэтических предшественников, выход эритроцитарной массы и функциональное состояние иммунокомпетентных клеток. Высокая продукция ТРФ-Р1 ЭЯК КМ, возможно, связана со способностью цитокина повышать дифференцировочную активность клеток вплоть до терминальной дифференцировки эритроб-ластов, а также повышать продукцию гемоглобина и ГлА. Во взрослом КМ необходимо постоянно поддерживать высокие уровни дифференцировочной активности ЭЯК и созревание их до эритроцитов. Таким образом, эритроидные клетки человека являются клетками-продуцентами широкого спектра гемо-иммунорегуляторных цитокинов и участвуют в формировании цитокиновой регуляторной сети. Полученные данные о различиях в уровне продукции цитокинов ЭЯК ФП и ЭЯК КМ взрослых доноров, дает нам представление об особенностях регуляторной активности эритроидных клеток на разных этапах онтогенетического развития.

ЭКСПРЕССИЯ ИЗОФОРМ МРНК ГЕНА IL-4 И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНОГО HIL-4D2

Силков А.Н.. ГавриленкоВ. А.. Денисова В.В., Гришина Л.В., Сенников С.В., Козлов В.А.

ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск

Вариант мРНК гена IL-4 человека с делецией второго экзона, вследствие альтернативного сплайсинга, был описан Alms W.J. с соаторами в1996 году. Тогда же рекомбинантный hIL-482 был охарактеризован как естественный антагонист hIL-4 по эффектам на моноциты, Т- и В-клетки человека.

Цель настоящей работы - исследовать экспрессию сплайс-вариантов мРНК гена IL-4 в мононуклеарных клетках периферической крови (МНК) и эритроидных клетках человека и оценить биологическую активность рекомбинантного hIL-482 в культуре МНК человека.

Экспрессию мРНК оценивали методом полуколиче-ственной ревертированной конкурентной ПЦР. Пролиферативную активность МНК определяли по включению 3Н-тимидина стандартным методом. Уровень продукции IgE определяли ИФА методом. Рекомбинантный белок hIL-482 был любезно предоставлен Л.Р. Птицыным, ГНЦ РФ ГосНИИ «Генетика», Москва.

Проведено исследование и оценена динамика экспрессии полноразмерной (IL-4) и сплайсированной (IL-452) форм мРНК в МНК у здоровых доноров и при ряде заболеваний: бронхиальная астма, ревматоидный артрит, аллергический ринит. Обнаружено изменение в соотношении мРНК IL-452/IL-4 при патологических состояниях. В культуре МНК, стимулированных КонА, пик экспрессии мРНК IL-452 и максимальное значение соотношения IL-482/IL-4 отмечается через два часа после внесения митогена.

В эритроидных клетках человека в фетальной печени и нормальном костном мозге помимо полноразмерной формы мРНК IL-4 показана экспрессия мРНК IL-452 на уровне, сопоставимом с таковым в МНК.

При изучении биологической активности рекомбинат-ного белка IL-452 было показано, что стимулированная rhIL-4 (5 нг/мл) пролиферация МНК дозозависимо снижалась при внесении в культуру rhIL-482 (100 и 500 нг/ мл). На фоне дополнительной стимуляции митогенами, КонА (5 мкг/мл) или ЛПС (10 мкг/мл), рекомбинантный hIL-482, также проявлял себя как антагонист полноразмерного hIL-4. При исследовании эффекта, оказываемого hIL-482 на синтез IgE in vitro, выявлено, что полноразменная фома IL-4 значительно усиливает продукцию IgE, а рекомбинантный белок hIL-482 достоверно снижает эффективность этой стимуляции.

Таким образом, нами впервые установлено, что в экспрессии гена IL-4 в эритроидных клетках в фетальной печени и костном мозге принимают участие механизмы альтернативного сплайсинга с образованием наряду с полноразмерной формой мРНК, сплайс-формы с делецией 2 экзона. В МНК человека соотношение мРНК IL-452/IL-4 изменяется под воздействием митогенов и при патологических состояниях.

Рекомбинантный hIL-482 имеет специфическую активность, проявляющуюся в снижении эффектов, оказываемых IL-4, и может быть применен в дальнейших исследованиях для выяснения его роли в регуляции реакций иммунитета, контролируемых IL-4.

БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ИНТЕРЛЕЙКИНА 18

Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Храпов Е.А., Курамшин Д.Х., Лыков А.П., Ведина Л.В., Филипенко МЛ., Сенников С.В., Власов В.В., Козлов В.А.

ГУ НИИ Клинической иммунологии СО РАМН, Институт биоорганической химии СО РАН, Новосибирск, Россия

В настоящее время одним из перспективных направлений в области иммунофармакологии является цитокинотерапия. Именно на использование рекомбинантных форм цитокинов возлагаются большие надежды в лечении многих заболеваний, так как эти лекарственные препараты являются естественными аналогами регуляторных молекул, обладающих специфическими эффектами на различные типы клеток. Одним из таких перспективных препаратов является цитокин IL-18 (или IGIF - IFNy-inducing factor). IL-18 - это цитокин, продуцируемый активированными макрофагами и Купферовскими клетками печени, является ранним индуктором Thl-типа. IL-18 стимулирует продукцию INF-y, TNF-ct, GM-CSF, IL-2 иммунокомпетентными клетками и сдвигает баланс цитокинов в пользу клеточного иммунитета.

Целью настоящего этапа исследования было получение рекомбинантного человеческого IL-18 (pIL-18) и исследование его биологической активности. Материалы и методы. Экспрессия рекомбинантного человеческого IL-18, несущего N-концевой Н186-домен, осуществлена в клетках E.coli. Тестирование биологической активности pIL-18 проводилось на мононуклеарных клетках периферической крови человека (МНК ПК), содержание TNF-a и IFN-y определяли электрохемилюминесцентным методом, продукция окислов азота (N0) тестировалась колориметрическим методом (реагент Грейсса), эксперименты in vivo проводились на мышах линии CBF1(CBA х C57BL6).

Установлено, что pIL-18 в концентрации 40 ng/ml не влияет на спонтанную и митоген-индуцированную пролиферативную активность МНК ПК. Спонтанная продукция TNF-a, IFN-y МНК ПК человека достоверно повышается при культивировании в присутствии pIL-18. Также показано, что pIL-18 достоверно стимулирует продукцию TNF-a Кон А, активированными МНК ПК. При изучении продукции окислов азота (N0) МНК ПК человека установлено, что pIL-18 достоверно стимулирует их продукцию в МНК и смешанной культуре лимфоцитов. В наших исследованиях установлено, что при добавлении в СКЛ человека pIL-18 происходит изменение соотношения СД-4 и СД8 клеток в пользу CD4 . При тестировании биологической активности IL-18 in vivo в экспериментальных моделях на мышах установлено, что его 10-кратное введение мышам в суммарной дозе 10 мкг приводит к стимуляции гуморального иммунного ответа, что выражалось в достоверном увеличении относительного и абсолютного количества антителообразующих клеток на Т-зависимый антиген (эритроциты барана) и выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа.

Таким образом, установлено, что полученный рекомбинантный белок обладает биологической активностью, описанной ранее для pIL-18. В настоящее время проводятся дальнейшие эксперименты по изучению его биологического действия.

АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ СПЛАЙСИНГ МРНК 11.-4 И 11.-6 МЫШИ

О. П. Яценко1, М. Л. Филипенко2, Е. А. Храпов2,

Е. Н. Воронина2, С. В. Сенников1, В. А. Козлов1.

1 ГУ НИИ Клинической иммунологии СО РАМН, 2Институт биоорганической химии СО РАН, Новосибирск, Россия.

П.-4 и П.-6 являются цитокинами, участвующими в модулировании иммунного ответа. Ген 11.-4 экспрессируется у человека в виде двух форм мРНК: полноразмерной формы и изоформы, образующейся в результате альтернативного сплайсинга второго экзона, названной 1Ь-4а2 мРНК. Установлено, что соответствующий белок является естественным антагонистом 1Ь-4 и характеризуется тканеспецифической экспрессией. Для 11.-6 показано существование четырех различных транскриптов, свойства которых в настоящее время подробно изучаются. Целью настоящего исследования был поиск изоформ мРНК П.-4 и 11.-6 в клетках мыши и изучение особенностей их экспрессии.

На основании нуклеотидных последовательностей генов мыши нами были сконструированы олигонуклео-тидные праймеры для селективной амплификации фрагментов двух вариантов мРНК Н.-4 и разработана система праймеров «вложенной» ПЦР для выявления возможных вариантов мРНК П.-6.

Методом ПЦР с использованием данных праймеров на кДНК полученной из КонА-стимулированных спле-ноцитов мыши, мы обнаружили фрагменты кДНК соответствующие мРНК П.-4 и 1Ь-4а2. Интересно, что при стимуляции КонА имела место индукция мРНК обеих форм И.-4, в то время как в нестимулированных сплено-цитах и при стимуляции Т-независимым антигеном (ЬРБ) детектировалась только кДНК полноразмерного Н.-4. При анализе тканеспецифичности экспрессии

мРНК 1Ь-4а2 обнаружены ее минорные количества в тимусе, легких, мышечной ткани, клетках кишечника, плей-еровых бляшках, лимфатических узлах, костном мозге, печени, селезенке и плаценте. При изучении кинетики экспрессии мРНК 11.-4 и П.-4а2 в культурах спленоци-тов мыши, мы обнаружили, что максимальный уровень мРНК П.-432 наблюдался через 3 часа с последующим резким падением уровня экспрессии. При этом с помощью конкурентной количественной ПЦР нами было показано, что на пике индукции уровень мРНК полноразмерной формы был в 14 раз выше, чем уровень мРНК II.-4а2.

Кроме того, в селезенке мышей после иммунизации эритроцитами барана в дозе 4x109 и в плаценте нами обнаружены два новых варианта мРНК 1Ь-6: П.-6а5 с де-лецией участка экзона 5, размером 58 п.н. и 1Ь-6аЗ с делецией экзона 3, размером 114 п.н. В результате трансляции мРНК 11.-635 может образовываться полипептид размером 165 аминокислот (против 211 аминокислот полноразмерной формы) с делецией С-концевого домена содержащего Б-спираль. Делеция экзона 3 в мРНК 1Ь-6йЗ не приводит к сбою рамки считывания, и трансляция данной мРНК может давать белок размером 173 аминокислоты, у которого полностью отсутствует АВ-петля. Экспрессия мРНК П.-6а5, вероятно, имеет видоспецифический характер, а мРНК Н.-6аЗ возможно экспрессируется и у других видов, включая человека.

Таким образом, нами установлено, что ген П.-4 у мыши экспрессируется в виде полноразмерной и альтернативной (без 2 экзона) форм мРНК, как и у человека. В ходе стимуляции спленоцитов митогенами соотношение мРНК 11.-4 к мРНК П.-4а2 уменьшается. Впервые обнаружено существование двух альтернативных форм мРНК П.-6. Мы детектировали 1Ь-6аЗ и 11.-685 в селезенке мыши после иммунизации высокой дозой эритроцитов барана и в плаценте.