Изучение штаммового состава Y-вируса картофеля из различных регионов Российской Федерации и Беларуси

УДК:635.21:632.38

Изучение штаммового состава У-вируса картофеля из различных регионов Российской Федерации и Беларуси

A.И. УСКОВ, доктор сельскохозяйственных наук, зав. отделом (e-mail: korenevo2000@mail.ru) Ю.А. ВАРИЦЕВ, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник

B.А. БИРЮКОВА, кандидат биологических наук,

зав. лабораторией П.А. ГАЛУШКА, кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник Г.П. ВАРИЦЕВА, старший научный сотрудник

И.В. ШМЫГЛЯ, старший научный сотрудник

Д.В. КРАВЧЕНКО, кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник

Всероссийский научно-исследовательский институт картофельного хозяйства им. А.Г. Лорха, ул. Лорха, 23, пос. Красково, Московская обл., 140051, Российская Федерация

Y-вирус картофеля (YBK), вызывающий тяжелые формы мозаики стеблей и листьев, а также некрозы клубней, - наиболее опасный и экономически важный патоген картофеля, поражение которым приводит к значительным потерям урожая и ухудшению его качества. На сегодняшний день в мировой научной литературе большое внимание уделяется изучению популяционной структуры и распространению изолятов Y-вируса в различных регионах мира. В 2008 г. была создана специальная Международная организация по его изучению (PVYwide Organization) для координации работ в этом направлении. Цель наших исследований - изучение штаммового состава Y-вируса картофеля, распространенного на территории Российской Федерации и Республики Беларусь. Штаммовая диагностика Y-вируса картофеля имеет определенные трудности вследствие высокой рекомбинантной способности его изолятов. Исследования проводили в 2015-2016 гг. во ВНИИКХ. Для «О определения серологического родства О изучаемых изолятов использовали PVY°/C сч и PVYN - специфичные моноклональные §? антитела (Agdia, США). Молекулярную z идентификацию изолятов осуществляли s при помощи ОТ-ПЦР, используя специфи-^ ческие праймеры и реагенты °°° «Агро-Ч диагностика» (Россия). Предварительную ле штаммовую принадлежность определяли м на основе анализа совокупности резуль-Ф татов исследований серологического и

молекулярного родства изолятов с использованием критерия Lorenzen. В процессе скрининга 656образцов семенного картофеля было выявлено 116 сортообразцов, зараженных Y-вирусом. В результате дифференциации выделенных изолятов по иммунологическим свойствам с помощью моноклональных антител и составу ампликонов ДНК, образующихся в результате мультиплексного ОТ-ПЦР, в одном сортообразце идентифицирован изолят, относящиеся к группе обычных штаммов - YBKO, в 19 сортообразцах -изоляты, относящиеся к подгруппе YBK NTN рекомбинантных штаммов кольцевого некроза клубней картофеля, в 35 сорто-бразцах - изоляты, относящиеся к подгруппе YBKN:O рекомбинантных штаммов, и в 53 сортообразцах идентифицировано наличие смеси изолятов подгрупп YBKNTN и YBKNO.

Ключевые слова: Y-вирус картофеля, изоляты Y-вируса картофеля, группы штаммов Y-вируса картофеля, иммуно-ферментныйанализ(ИФА), моноклональные антитела, ОТ-ПЦР, мультиплексный ОТ-ПЦР

Для цитирования: Изучение штаммового состава Y-вируса картофеля из различных регионов Российской Федерации и Беларуси / А.И. Усков, Ю.А. Варицев, В.А. Бирюкова, П.А. Галушка, Г.П. Ва-рицева, И.В. Шмыгля, Д.В. Кравченко // Земледелие. 2016. №8. С. 36-38.

По данным многолетнего мониторинга, проводимого Испытательной лабораторией ВНИИКХ, по оценке скрытой зараженности вирусами более 300 тыс. образцов картофеля, выращиваемого в различных регионах Российской Федерации,более 80 % заражений приходится на векторно распространяемые М- и Y-вирусы [1]. При этом наиболее опасный и экономически значимый патоген, не-сомненноД вирус картофеля (Potato virus Y - PVY), вызывающий тяжелые формы мозаики стеблей и листьев, а также некрозы клубней, что приводит к значительному недобору урожая и ухудшению его потребительских свойств [2].

Штаммовая диагностика Y-вируса картофеля имеет определенные трудности вследствие высокой ре-комбинантной способности изолятов патогена. Генетически разделяют два основных штамма PVY: ординарный (PVY0), выявляемый реакцией сверхчувствительности (СВЧ) на индика-

торах с генами Ny и Nc (в последнем случае именуется штаммом акропе-тального некроза - PVY°), и некротический (PVY™), не реагирующий с генами Ny и Nc, но вызывающий системные некрозы на табаке, имеющем ген Rk. Эти штаммы различаются и по серологическим свойствам. В посадках картофеля они вызывают полосчатую и морщинистую мозаики стеблей и листьев [3].

Во второй половине ХХ в. в результате рекомбинации РНК ординарного и некротического штаммов появился крайне патогенный штамм PVYNTN, вызывающий кольцевые некрозы клубней картофеля [4]. Как показали результаты исследований, некоторые рекомбинантные изоляты одновременно сочетают свойства нескольких штаммов Y-вируса картофеля. Так, выделенные первоначально в Европе (PVY™-™ Вилга) и Северной Америке (PVYN:0) штаммы, обладая серологическим родством с ординарным штаммом PVY0, одновременно вызывали кольцевые некрозы клубней картофеля [5, 6].

На сегодняшний день в мировой научной литературе большое внимание уделяется изучению популяционной структуры и распространению изолятов Y-вируса при возделывании картофеля в различных регионах мира. В 2008 г была создана специальная Международная организация по изучению Y-вируса картофеля (PVYwide Organization)) в целях координации исследований в этом направлении. В Российской Федерации и Республике Беларусьтрадиционно сосредоточены значительные площади посадок семенного и товарного картофеля. В связи с этим цель наших исследований - изучение штаммового состава Y-вируса картофеля, распространенного на территории этих государств.

Исследования проводили в 20152016 гг. на репродукционном материале, поступающем для тестирования в испытательную лабораторию ВНИИКХ из различных регионов Российской Федерации, и при мониторинге образцов супер-суперэлиты в тестовом питомнике ВНИИКХ.

Для определения серологического родства изучаемых изолятов использовали PVY°/C и PVYN-специфичные моноклональные антитела (Agdia, США). Молекулярную идентификацию изолятов осуществляли при помощи ОТ-ПЦР, используя специфические праймеры и реагенты ООО «Агродиа-гностика» (Россия).

Все исследования проводили на ростках после проращивания клубней при комнатной температуре. Каждый клубень в клонах анализировали

отдельно. Предварительную штам-мовую принадлежность определяли на основе анализа совокупности результатов исследований серологического и молекулярного родства изолятов с использованием критерия Lorenzen [7].

Предварительно с использованием поликлональных антител (ВНИИКХ) было протестировано 656 сортоо-бразцов с визуальными признаками наличия PVYи отобрано 116 клонов (по 1 клубню) с положительной реакцией на Y-вирус картофеля, в том числе 34 клона с моноинфекцией.

На следующем этапе исследований провели предварительное разделение изолятов по серологическому родству к ординарному и некротическому штаммам в иммунологической реакции с моноклональ-ными антителами PVY°/C и PVYN. Было выявлено, что 41 % анализируемых образцов проявлял серологическое родство к ординарному штамму Y-вируса картофеля, 34 % - к некротическому, у 20 % образцов наблюдали положительную реакцию на моноклональные антитела к обо-

им штаммам PVY и 4 % образцов не реагировали со специфическими антителами.

Следует отметить, что у российских образцов серологическое родство к ординарному штамму достигало 47 %, к некротическому -29 %. В образцах, поступивших из Беларуси, напротив, превалировали изоляты с положительной реакцией на моноклональные антитела к некротическому штамму PVY(40 %), а доля изолятов с положительной реакцией на антитела к ординарному штамму составляла 34 %.

Дальнейшее разделение проводили на основе мультиплексного анализа продуктов ОТ-ПЦР по _огеп2еп [7]. Окончательную идентификацию штаммов осуществляли с учетом результатов иммунологического анализа. В итоге в исследуемых образцах предварительно было выявлено три штамма Y-вируса картофеля: ординарный - РУУ°, некротический - РУУ™ и рекомбинант-ный - РУУ° (табл. 1).

Ординарный штамм РУУ° был выявлен всего в одном клоне образца

Жигулевский-12, поступившем на анализ из Московской области. Он характеризовался положительной реакцией на моноклональные антитела к РУУ°/С и наличием ПЦР продуктов размером 689 и 267 п.н.

Как правило, к некротическому штамму РУУ™ относили изоляты с положительной реакцией на моноклональные антитела к РУУ и наличием мультиплексов 452 и 181 п.н. Вместе с тем ряд клонов образцов Жуковский ранний 1-2 и Крепыш 1-4 (Московская область), а также Янтарь 18-1 (Приморский край), характеризовавшиеся присутствием фрагментов амплификации размером 452 и 181 п.н. и отнесенные к некротическому штамму РУУ™, положительно реагировали на антитела к РУУ°/С.

К рекомбинантному штамму РУУМ:°относили изоляты, проявившие серологическое родство к ординарному штамму (положительная реакция на антитела к РУУ°/С) и обладающие мультиплексами 689 и 181 п.н. В то же время два клона образца Даренка 15-1 (Пензенская область) и один клон образца Скарб-

1.Идентификация изолятов Y-вируса картофеля

Регион, сортообразец Иммунологическая реакция Результаты ОТР-ПЦР Число изолятов, шт.

PVY° PVYn мультиплекс штамм PVY по Lorenzen

689 п.н. 452 п.н. I 267 п.н. I 181 п.н.

Московская область

Крепыш-4 3+ + + N:O 3

2+ 4+ + + + NTN + N:O 5

Жигулевский-12 + + + O 1

5+ + + N:O 5

Фиолетовый 1-11 2+ + + NTN 2

6+ 6+ + + + NTN + N:O 6

Фаворит 1-6 + + + N:O 1

+ 3+ + + + NTN + N:O 4

Жуковский ранний1-2 + + + + NTN 2

3+ 3+ + + + NTN + N:O 3

Крепыш 1-4 + + + N:O 1

+ + + NTN 1

Пензенская область

Даренка 15-1 2+ 2+ + + N:O 2

+ + + NTN 1

3+ 3+ + + + NTN + N:O 5

Утенок 15-2 7+ + + N:O 7

Приморский край

Янтарь 18-1 4+ + + N:O 4

+ + + NTN 1

+ + + + + NTN + N:O 1

Свердловская область +

Браво 3+ + + NTN 1

5+ + + + NTN + N:O 7

Республика Беларусь

Лилея 4-3 3+ + + N:O 3

2+ 4+ + + + NTN + N:O 5

Бриз-19 3+ 5+ + + + NTN + N:O 6

Журавинка-24 5+ + + N:O 6

+ + + + + NTN + N:O 2

Уладар-21 5+ + + NTN 5

3+ 3+ + + + NTN + N:O 3

Лилея-22 5+ + + NTN 5

2+ 2+ + + + NTN + N:O 2

Скарб-23 3+ + + + N:O 3

+ + + NTN 1

2+ + + + + NTN + N:O 2

Волат 4-6 + + + N:O 1

+ + + + + NTN + N:O 2

Ы (D 3 ü

(D

д

(D

5

(D

00 О О)

2. Популяционная структура и распространениеизолятовУ-вируса картофеля из различных регионов Российской Федерации и Беларуси

Регион Проанализировано образцов, шт. Отобрано клонов с PVY, шт. Идентифицировано изолятов, шт.

PVY0 PVY40 PVYNTN PVYNTN +PVYN0

Московская область 352 34 1 10 5 18

Пензенская область 16 16 - 9 1 5

Приморский край 8 8 8 — 4 1 1 1

Беларусь 112 50 — 13 11 22

Всего 656 116 1 36 19 53

23 (Беларусь), отнесенные к PVYN:O по наличию ПЦР продуктов размером 689 и 181 п.н., в иммунологической реакции реагировали одновременно с моноклональными антителами как к ординарному, так и некротическому штаммам.

В наших исследованиях почти половина (48,6 %) изучаемых изолятов была представлена смесью некротического PVYNTN и рекомбинантного PVYN:O штаммов. Для этой группы образцов было характерно наличие фрагментов ДНК размером 689, 452 и 181 п.н. и положительная реакция одновременно на моноклональные антитела к PVY°/C и PVYN.

В целом в результате дифференциации изучаемых изолятов Y-вируса картофеля по серологическим свойствам и мультиплексному составу РНК в одном сортообразце был идентифицирован ординарный штамм PVY0, в девятнадцати - штамм кольцевого некроза клубней PVYNTN, в тридцати шести - рекомбинантный штамм PVYN:0 и в пятидесяти трех сортоо-бразцах - одновременно два штамма PVYNTN и PVYN:0 (табл. 2).

Таким образом, на территории ряда регионов Российской Федерации, обладающих выраженным континентальным климатом, среди выделенных образцов с моно-штаммовой инфекцией отмечено значительное преобладание рекомбинантного штамма PVYN:0, распространение которого в среднем почти в 3 раза больше, чем у некротического штамма PVYNTN, а в отдельных регионах, например, в Пензенской области, рекомбинантный штамм встречается в 9 раз чаще, чем некротический.

В материале, поступившем для анализа из Беларуси, которая отличается более мягким и влажным климатом, выявлено значительное распространение штамма кольцевого «о некроза клубней PVYNTN. В 11 из 24 бе-о лорусских образцов с моноинфекци-Ф ей

| Литература. о

4

§ 1. Усков А..И., Шишкина О.А., Варицев

5 Ю.А. и др. Совершенствование схемы (V) лабораторного контроля фитопатогенов в

оригинальном семеноводстве картофеля // Состояние и перспективы инновационного развития современной индустрии картофеля. - Чебоксары: КУП ЧР «Агро-Инновации», 2013. С.114-118.

2. Шпаар Д., Быкин А., Дрегер Д. и др. Картофель / под ред. Д.Шпаара. Торжок: ООО «Вариант», 2004. 466 с.

3. Сорока С.В., Блоцкая Ж.В., Вабище-вич В.В. Вирусы и вирусные болезни сельскохозяйственных культур: монография / науч. ред. Р.В.Гнутова. Несвиж: Несвиж. укрупн. тип., 2009. 128 с.

4. Вайдеманн Х.Л., Шпаар Д., Блоцкая Ж.В. Новый опасный штамм вируса Y картофеля в Европе // Известия Академии аграрных наук Республики Беларусь. 1999. №1. С.48-51.

5. Visser J.C., Bellstedt D.U., Pirie M.D. The Recent Recombinant Evolution of a Major Crop Pathogen Potato virus Y// Р1_оБ ONE. 2012. V.7 (11). e50631.

6. Genetic diversity of the ordinary strain of Potato virus Y (PVY) and origin of recombinant PVY strains / A.V. Karasev, X. Hu, C.J. Brown, C. Kerlan, O.V. Nikolaeva, J.M. Crosslin, S.M. Gray // Phytopathology. 2011. Vol. 101.№ 7. Pр. 778-785.

7. A multiplex PCR assay to characterize Potato virus Y isolates and identify strain mixtures / J.H. Lorenzen, Piche L.M., Gudmestad N.C., Meacham T., Shiel P. // Plant Dis. 2006. V. 90. Pр. 935-940.

Study of the Strain Composition of Potato Virus Y from Different Regions of the Russian Federation and Belarus

A.I. Uskov, Yu.A.Varitsev, V.A. Biryukova, P.A. Galushka, I.V. Shmiglay, G.P. Varitseva, I.V. Shmyglya, D.V. Kravchenko

All-Russian Potato Research Institute, ul. Lorkha, 23, pos. Kraskovo, Moskovskaya obl., 140051, Russian Federation

Summary. Potato virus Y (PVY), which causes a severe form of mosaic of stems and leaves, as well as necrosis of tubers, is the most dangerous and economically important pathogen of potato that leads to the significant yield losses and impairs the quality. Today in the world scientific literature much attention is paid to the study of the population structure and distribution of PVY isolates during the cultivation of potato in different regions of the world. In 2008 there was created a special in-

ternational organization for the study of PVY(PVYwide Organization) to coordinate researches in this direction. The purpose of our research was to study the strain composition of potato virus Y, spread on the territory of the Russian Federation and the Republic of Belarus. The strain diagnosis of PVY has certain difficulties due to the high recombinant ability of isolates of the pathogen. The study was carried out in 2015-2016 in the A.G. Lorkh All-Russian Research Institute of Potato Farming. To determine the serological relationship of studied isolates it was used PVYO/C and PVYN, which are the specific monoclonal antibodies (Agdia, USA). Molecular identification of isolates was carried out using RT-PCR with using specific primers and reagents of OOO "Agrodiagnostika" (Russia). Preliminary strain affiliation was determined on the basis of the analysis of aggregate research results of serological and molecular relatedness of isolates using Lorenzen criterion. In the process of screening of 656 samples of seed potato, it was revealed 116 samples with potato Y-virus. As a result of the differentiation of isolates by serological properties with the help of monoclonal antibodies and by the composition of DNA amplicons, formed as a result of multiplex RT-PCR, an isolate, pertained to the group of common strains - PVYO, was identified in one variety sample. In 19 samples it was identified isolates, pertained to the sub-group PVYNTN of the recombinant strains of ring necrosis of potato tubers. We also identified isolates from the sub-group PVYN:O of recombinant strains in 35 samples. Is was established the presence of the mixture of isolates of the sub-groups PVYNTN and PVYN:O in 53 samples.

Key words: potato virus Y, isolates of PVY, groups of PVY strains, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), monoclonal antibodies, RT-PCR, multiplex RT-PCR.

Author Details: A.I. Uskov, D. Sc. (Agr.), head of division (e-mail: korene-vo2000@mail.ru); Yu.A.Varitsev, Cand. Sc. (Biol.), leading research fellow; V.A. Biryukova, Cand. Sc. (Biol.), head of laboratory; P.A. Galushka, Cand. Sc. (Agr.), senior research fellow; G.P. Varitseva, senior research fellow; I.V. Shmiglay, senior research fellow; D.V. Kravchenko, Cand. Sc. (Agr.), senior research fellow.

For citation: Uskov A.I., Varitsev Yu.A., Biryukova V.A., Galushka P.A., Shmiglay I.V., Varitseva G.P., Shmyglya I.V., Kravchen-ko D.V. Study of the Strain Composition of Potato Virus Y from Different Regions of the Russian Federation and Belarus. Zemledelie. 2016. No.8. Pp. 36-38