СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ ОСНОВЫ ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕД
METHOD OF PREPARING CULTURE BASE FOR MICROBIOLOGICAL MEDIA

Изобретение относится к технологии приготовления питательных сред и может быть использовано для культивирования широкого спектра микроорганизмов.
Известны питательные основы для большинства микробиологических сред, являющиеся белковыми гидролизатами, содержащие комплекс веществ, необходимых для нормального роста и размножения микробной популяции (см. Н.Л.Утевский. Медицинская микробиология и микробиологическая техника. Медгиз, Москва, 1961, с.83-93., Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных болезней. Под ред. Н.Н.Жукова-Вережникова, Медгиз, Москва, 1962, т.1, с.342-354, А.П.Красильников. Микробиологический словарь-справочник. Минск, 1986, с.232-233).
Известен способ получения белковой питательной основы из мяса рыбы путем его автоклавирования (см.Известия ТИНРО, 1951, т.ХХХ1У, с.233-235).
Недостатком данного способа является жидкая форма питательной основы, что исключает возможность длительного использования и хранения.
Известны способы получения питательных основ путем ферментативного гидролиза мяса рыбы (см. заявка на патент №2003113779 "Добавка к питательной среде для культуры животной клетки" 2004 г. C12N 5/02, заявка на патент №2003119514 "Питательная среда для выделения гемокультур", 2004 г. C12N 1/20, C12Q 1/04, заявка на патент №2004100515 "Питательная среда для накопления энтеробактерий" 2005 г. C12N 1/20, C12Q 1/04, заявка на патент №2005101369 "Питательная среда для обнаружения и предварительной идентификации Escherichia coli" 2006 г., C12N 1/20, C12Q 1/00).
Недостатками указанных способов являются трудоемкость технологического процесса, его длительность и большое количество операций.
Наиболее близким техническим решением является способ получения питательной основы микробиологических сред путем ферментативного гидролиза мяса рыбы в течение 20 ч, очистки гидролизата при различных значениях рН, фильтрации и высушивания (см. патент РФ №2232187 "Способ получения питательной основы микробиологических сред" 2004 г., C12N 1/20, A23J 1/04).
Недостатком данного способа является большое количество технологических операций в ходе предварительной подготовки сырья к гидролизу, длительность процесса (около 20 ч).
Технической задачей заявленного изобретения является упрощение процесса производства основы для микробиологических сред и сокращение его длительности, при этом используется такое нетрадиционное сырье, как овариальная жидкость осетровых видов рыб.
Поставленная задача решается способом, при котором для получения питательной основы для микробиологических сред предусматривают отбор овариальной жидкости осетровых рыб V стадии зрелости, ее фильтрацию, гомогенизацию овариальной жидкости осетровых рыб V стадии зрелости, нагрев до температуры 35-40°С, высушивание на распылительной сушки при температуре на выходе 80-110°С, окружной скорости дискового распылителя 110-180 м/с, с последующим охлаждением до комнатной температуры.
Овариальная жидкость является побочным продуктом прижизненного получения овулировавшей икры V стадии зрелости от живых производителей осетровых рыб. При овуляции фолликулярные клетки, покрывающие зрелые яйца (икринки), разрушаются и за счет их цитоплазматического содержимого, а также за счет активной и пассивной фильтрации из кровеносных сосудов яичника жидкой фракции и белковых компонентов крови в полости яичника образуется жидкость, называемая овариальной. ОЖ представляет собой прозрачную густую жидкость от серого до серо-розового цвета, по своей консистенции являющуюся золем.
Использование биологической среды природного происхождения - ОЖ, в которой содержатся все необходимые для жизнедеятельности микроорганизмов компоненты - жиры, углеводы, белки, аминокислоты, микро- и макроэлементы, витамины (табл.1), позволяет без дополнительных технологических операций получить питательную среду. По всем приведенным в таблице показателям ОЖ соответствует требованиям, предъявляемым к питательным средам.
Источником углерода, необходимого для роста микроорганизмов в питательных средах, в ОЖ служат углеводы, а также углерод, входящий в состав азотсодержащих соединений (белков, пептонов, аминокислот и др.). Потребности в азоте могут удовлетворяться за счет присутствующего в ОЖ нативного животного белка, пептонов, аминокислот и других азотсодержащих веществ (пуриновые и пиримидиновые основания, мочевина и др.).
Кроме белковых компонентов питательные среды должны содержать макроэлементы (фосфор, кальций, магний, натрий, железо) и микроэлементы (марганец, цинк, медь, хром и др.). Все эти элементы содержатся в ОЖ; они необходимы для многих биосинтетических процессов, однако потребность в них у разных видов микроорганизмов неодинакова. Так, например, марганец и железо требуются для кишечной палочки и возбудителей чумы, а калий - для молочнокислых бактерий. Марганец, кальций, магний, калий и железо стимулируют рост сибиреязвенной палочки, а магний, железо и марганец - рост бруцелл.
Для культивирования микроорганизмов, особенно патогенных, необходимо наличие в среде так называемых факторов роста и прежде всего водорастворимых витаминов. Хотя бактерии не используют эти вещества как пластический или энергетический материал, тем не менее они являются обязательными компонентами питательных сред, т.к. их отсутствие тормозит образование многих ферментов.
Другие факторы роста в ОЖ представлены аминокислотами. Отдельные аминокислоты (L-цистин, D-пироглутаминовая кислота и др.) способны стимулировать рост одних микроорганизмов и, наоборот, угнетать рост других. Важным условием хорошего роста микроорганизмов наряду с присутствием необходимых питательных веществ является оптимальная концентрация водородных и гидроксильных ионов. В ОЖ этот показатель имеет значения рН 7,4-8,9, которые обеспечивают интенсивный рост практически всех микроорганизмов. Большинство из них лучше растут на питательной среде со слабощелочной реакцией (рН 7,2-7,4). Исключением являются холерный вибрион, оптимум роста которого находится в щелочной зоне (рН 8,5-9,0), и возбудитель туберкулеза, нуждающийся в слабокислой реакции (рН 6,2-6,8).
Нормальное протекание важнейших физико-химических процессов в микробных клетках обеспечивается изотоничностью для них питательной среды, соответствующей 0,5% (5‰) раствору натрия хлорида. По этому показателю ОЖ также пригодна для использования в качестве питательной среды.
Охлаждение сухого препарата до комнатной температуры является необходимым условием при его использовании для приготовления питательной основы для микробиологических сред. В случае нарушения этого условия и удаления препарата из реактора в горячем состоянии он в силу адгезивных свойств будет слипаться, поглощать влагу и приобретать комковатую структуру. В результате снизятся качественные характеристики конечного продукта, ухудшится его растворимость.
Одним из существенных требований, предъявляемых к питательным средам, служит их стерильность, что позволяет выращивать чистые культуры микробов. Это условие в случае использования ОЖ также полностью выполняется, т.к. она стерилизуется в процессе распылительной сушки при получении сухого препарата. В такой форме ОЖ сохраняется в течение длительного времени, обеспечивает получение питательной основы стандартного качества и, наконец, в сухом виде ее удобно использовать для приготовления жидких и твердых питательных сред.
Заявленная питательная основа может использоваться для культивирования микроорганизмов, что подкрепляется тем фактом, что она содержит все необходимые для жизнедеятельности микроорганизмов компоненты. Использование простейших инфузорий Стилонихия митилус для определения биологической активности питательной основы также не должно вызывать серьезных возражений. Во-первых, эти простейшие относятся к микроорганизмам-сапрофитам (Утевский Н.А.Медицинская микробиология и микробиололгическая техника. М., Медгиз, 1961). Как и для паразитарных форм простейших (дизентирийная амеба, лейшмании, трихомонады и др.) для их культивирования необходима питательная среда со всеми жизненно важными компонентами. Для инфузорий стилонихий таким питательным субстратом служат пекарские дрожжи, которые, как известно, содержат весь необходимый комплекс биологически важных соединений и элементов. В заявке суспензия пекарских дрожжей используется в качестве эталонной среды. Как показали сравнительные испытания, овариальная жидкость по биологической активности существенно превосходит эталонную среду. Из этого следует, что овариальная жидкость намного богаче и сбалансированнее по химическому составу, чем дрожжи и поэтому может служить питательной основой для выращивания большого спектра микроорганизмов.
Следует отметить, что заявленная питательная основа не является дифференциально-диагностической или селективной средой. Они, как известно, готовятся путем добавки к питательной основе специальных соединений, химических элементов или индикаторов с целью выделения или определения видовой принадлежности микроорганизма.
Приемы и режимы осуществления способа позволяют упростить процесс производства основы питательных сред и сократить его длительность с 20 ч по известному способу до 1 ч по предлагаемому способу.
Овариальная жидкость осетровых рыб. Основные показатели
Общий хим.состав
Витамины
Макро- и микроэл.
Аминокислоты
Наименование показателя
Значение
Наимен. показателя
Значение, мг/100 г
Наимен. показателя
Значение, Мг/л
Наимен. показателя
Значение, г/100 г белка
Сухие вещества, %
0,9-1,8
С
2,27-5,77
Натрий
787,4-825,5
Метионин,
1,8-2,3
Влага, %
98,2-99,1
B1
0,22-0,52
Фосфор
20,97-29,75
Лизин
7,9-8,4
Жир, %
0,07-0,10
В2
1,26-2,34
Калий
543,0-1819,0
Треонин
5,0-5,4
Углеводы, %
0,78-1,08
В5 (РР)
0,34-0,88
Кальций
399,2-425,1
Валин
5,0-5,5
Белок, %
0,29-0,97
В6
0,58-0,74
Магний
255,5-600,4
Изолейцин
4,1-4,6
Белок на сухое вещ-во, %
35,1-48,6
Железо
16,7-21,0
Лейцин
8,5-9,1
Общий азот, %
0,046-0,155
Медь
6,3-10,0
Тирозин
5,0-5,2
НБА, %
0,004-0,049
Марганец
0,4-0,6
Фенилаланин
4,9-5,5
РН
7,4-8,9
Цинк
12,19-12,32
Гистидин
3,5-4,0
Соленость, %о
10-16
Хром
0,012-0,018
Аргинин
4,6-5,6
Плотность, г/см<sup>3</sup>
1,004-1,007
Аспаргин. к-та
9,8-10,8
Серин
4,9-5,3
Глутамин. к-та
4,4-4,8
Пролин
4,8-5,2
Глицин
14,6-16,1
Аланин
5,2-5,5
Цистин
0,2-0,3
Способ осуществляется следующим образом.
При получении питательной основы для микробиологических сред берут ОЖ осетровых рыб V стадии зрелости, которую перед обработкой фильтруют, а затем гомогенизируют и подвергают термической обработке до температуры 35-40°С, при этом высушивание ведут с помощью распылительной сушки при температуре воздуха на выходе 80-110°С, окружной скорости дискового распылителя 110-180 м/с, с последующим охлаждением полученного сухого препарата до комнатной температуры, препарат расфасовывают и хранят при температуре +2 - +5°С.
Примеры осуществления способа
ож
Пример 1. У производителей осетровых рыб V стадии зрелости отбирают ОЖ в количестве 1 л. Для удаления взвешенных частиц ее фильтруют через фильтр диаметром пор 50-70 мкм, гомогенизируют со скоростью 50-60 об/сек для получения однородности образов, нагревают до температуры 37°С для снижения вязкости и с целью стандартизации качества конечного продукта ОЖ высушивают с помощью распылительной сушки при окружной скорости дискового распылителя 140 м/с, температуре сушильного агента на входе 240°С, на выходе 95°С. В результате получают 7,5 г сухого препарата с содержанием сухого вещества 94,75% (выход составляет 0,758%). Перед применением полученный сухой препарат растворяют в дистиллированной воде. Препарат полностью растворяется, не образуя осадка. Раствор используется для выращивания культуры микроорганизмов инфузорий Stylonichia mytilus. По их темпу роста оценивается биологическая активность, которую определяют при лимитирующем уровне сухого вещества - это количество, которое полностью утилизируется микрооргнизмами в течение фиксированного времени (мин, час, сутки), обеспечивая логарифмический рост культуры. Биологическая активность сухого препарата ОЖ (БА) определяется по относительному приросту общей численности инфузорий за сутки и рассчитывается по формуле:
ож
0
БА=ΣΔN/ΣN,
t
0
где ΣΔN - разность между общей конечной численностью инфузорий в 5 микроаквариумах (ΣN) и общей начальной численностью инфузорий в 5 микроаквариумах (ΣN).
ож
ож
э
э
ож
ож
э
Об уровне биологической активности раствора сухого препарата ОЖ (К) судят по соотношению относительного прироста численности инфузорий в растворе (БА) и в эталонной среде (БА) - суспензии пекарских дрожжей с концентрацией сухого вещества 0,4 г/л. БА рассчитывается по той же формуле, что и БА. Пекарские дрожжи выбраны в качестве эталона по той причине, что они, как и ОЖ, содержат все компоненты, необходимые для роста микроорганизмов - витамины, ферменты, гормоны, минеральные соли, белки, аминокислоты, углеводы и жиры. По биологической ценности белок дрожжей приближается к белку животного происхождения. Кроме того, дрожжи имеют стабильный состав, т.к. производятся в соответствии с действующим национальным стандартом. Величина соотношения БА/БА, равная или больше 1, указывает на высокий уровень биологической активности ОЖ.
Образцы раствора сухого препарата ОЖ и эталонной среды с концентрацией сухого вещества 0,4 г/л вносят в количестве 100 мкл в 10 микроаквариумов (по 5 на каждый образец). Перед добавлением образцов в микроаквариумы вносят суспензию инфузорий таким же объемом (100 мкл) в количестве 5-10 штук, после чего инкубируют в течение суток.
ож
э
Через сутки подсчитывают численность инфузорий в каждом микроаквариуме и рассчитывают БА и БА по вышеприведенной формуле.
э
0
t
э
Общий прирост клеток (в 5 микроаквариумах) в эталонной среде (ΣΔN) составил 163 клетки (ΣN=42 клетки и ΣN=205 клеток) и, следовательно, БА равнялась 3,9.
ож
0
t
ож
Общий прирост клеток (в 5 микроаквариумах) в растворе сухого препарата ОЖ (ΣΔN) составил 267 клеток (ΣN=39 клеток и ΣN=306 клеток) и, следовательно, БА равнялась 6,8.
Относительный прирост численности инфузорий в растворе сухого препарата (6,8) превышает таковой в эталонной среде (3,9) в 1,74, что указывает на высокий уровень биологической активности сухого препарата ОЖ, полученного предлагаемым способом.
Пример 2. Отличается от примера 1 тем, что ОЖ высушивают при начальной температуре распыляемой жидкости 40°С. Полученный сухой препарат растворяется полностью без остатка. Относительный прирост численности инфузорий в растворе препарата составляет 7,1 и превышает таковой в эталонной среде (3,9) в 1,82 раза. Это указывает на высокий уровень биологической активности сухого препарата.
Пример 3. Отличается от примера 1 тем, что ОЖ высушивают при начальной температуре распыляемой жидкости 35°С. Полученный сухой препарат растворяется полностью без остатка. Относительный прирост численности инфузорий в растворе концентрата составляет 6,7 и превышает таковой в эталонной среде (3,9) в 1,72 раза. Это указывает на высокий уровень биологической активности сухого препарата.
э
ож
э
Пример 4. Отличается от примера 1 тем, что ОЖ высушивают при начальной температуре распыляемой жидкости 30°С. Полученный сухой препарат растворяется неполностью, образуя после отстаивания осадок. Относительный прирост численности инфузорий в растворе препарата (без осадка) составляет 3,7, что несколько ниже БА. Падение соотношения БА/БА объясняется тем, что в результате уменьшения общей вязкости при температуре 30°С снижается дисперсность среды в сушильной камере и в конечном итоге качество продукта.
ож
э
ож
э
Пример 5. Отличается от примера 1 тем, что ОЖ высушивают при начальной температуре распыляемой жидкости 42°С. При этой температуре происходит частичная денатурация белка и как результат - изменение физических свойств среды, уменьшение дисперсности частиц высушиваемого продукта и снижение его качества. Полученный сухой препарат растворяется с образованием осадка. БА составляет 2,8, что существенно ниже БА. Величина соотношения БА/БА ниже 1, что свидетельствует о том, что при нагревании ОЖ выше 40°С и денатурации белка происходит ухудшение качества сухого препварата.
ож
ож
э
Пример 6. Отличается от примера 1 тем, что ОЖ высушивают при окружной скорости дискового распылителя 100 м/с. При этом режиме сушки снижается дисперсность частиц высушиваемого продукта и ухудшается его качество. Об этом свидетельствуют низкие величины БА(3,2) и БА/БА (0,82).
ож
ож
э
Пример 7. Отличается от примера 1 тем, что ОЖ высушивают при окружной скорости дискового распылителя 190 м/с. При этом режиме достигается высокая дисперсность частиц высушиваемого продукта, что обеспечивает высокое качество. На это указывают высокие значения БА (7,3) и БА/БА (1,87). Однако эти значения практически не отличаются от таковых примера 5. Следовательно, увеличение окружной скорости дискового распылителя выше 180 м/с не влияет на качество конечного продукта и поэтому нерационально.
ож
ож
э
Пример 8. Отличается от примера 1 тем, что ОЖ высушивают при окружной скорости дискового распылителя 110 м/с. При этом режиме сушки снижается дисперсность частиц высушиваемого продукта, его растворимость и, соответственно, ухудшается качество. Об этом свидетельствуют низкие величины БА (3,2) и БА/БА (0,82).
ож
ож
э
Пример 9. Отличается от примера 1 тем, что ОЖ высушивают при окружной скорости дискового распылителя 160 м/с. При этом режиме достигается высокая дисперсность частиц высушиваемого продукта, что обеспечивает высокое качество. На это указывают высокие значения БА (7,3) и БА/БА (1,87). Однако эти значения практически не отличаются от таковых примера 5. Следовательно, увеличение окружной скорости дискового распылителя выше 140 м/с не влияет на качество конечного продукта и поэтому нерационально.
ож
ож
э
Пример 10. Отличается от примера 1 тем, что ОЖ высушивают при температуре воздуха на выходе 85°С. Повышение температуры на выходе из сушильной камеры до определенного предела уменьшает средний размер частиц концентрата, повышает дисперсность продукта, его качество и в конечном итоге интенсифицирует процесс сушки. Полученный сухой концентрат растворяется полностью без остатка. Значения БА и БА/БА соответственно равняются 6,9 и 1,77, что свидетельствует о высоком качестве продукта.
ож
ож
э
Пример 11. Отличается от примера 1 тем, что ОЖ высушивают при температуре воздуха на выходе 110°С. Полученный сухой концентрат растворяется с небольшим остатком, что обусловлено снижением дисперсности частиц и увеличением их среднего диаметра вследствие набухания. Значения БА и БА/БА снижаются по сравнению с примерами 8 и 9 соответственно до 6,1 и 1,56, что указывает на ухудшение качества продукта.