Современные молекулярно-генетические методы исследования в эпидемиологическом надзоре за ВИЧ-инфекцией

СОВРЕМЕННЫЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОМ НАДЗОРЕ ЗА ВИЧ-ИНФЕКЦИЕЙ

Н.Н. Зайцева,

Е.И. Ефимов,

Н.Н. Носов,

О.В. Парфенова,

О.Ю. Пекшева,

ФБУН «Нижегородский

научно-исследовательский

институт эпидемиологии

и микробиологии

им. академика И.Н. Блохиной»

Зайцева Наталья Николаевна -e-mail: prokaids@sinn.ru

В обзоре представлен анализ данных по применению современных перспективных лабораторных и IT технологий с целью совершенствования системы эпидемиологического мониторинга за ВИЧ-инфекцией, диагностики и лечения ВИЧ-позитивных пациентов. Показано, что современные молекулярно-генетические методы исследования позволяют осуществлять динамическое слежение в рамках эпидемиологического надзора за циркулирующими вариантами вируса и уровнем их генетической изменчивости, оценивать эффективность лечения, устойчивость популяции к инфицированию, прогнозировать развитие эпидемии в дальнейшем.

Ключевые слова: ВИЧ-инфекция, молекулярно-генетические методы исследования,

резистентность, эпидемиологический надзор.

This review presents an analysis of data on the use of modern laboratory and advanced IT technologies to improve the system of epidemiological monitoring of HIV infection, diagnosis and treatment of HIV - positive patients.

Shown that modern molecular genetic research techniques allow dynamic tracking under surveillance for circulating virus variants and their level of genetic variability to assess the effectiveness of treatment, resistance to infection population , predict the development of the epidemic in the future.

Key words: HIV-infection, molecular genetic methods, resistance,

epidemiological surveillance.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АРВП - антиретровирусные препараты

АРТ - антиретровирусная терапия

ВААРТ - высокоактивная антиретровирусная терапия

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ВН - вирусная нагрузка

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ИБ - иммуноблот

ИФА - иммуноферментный анализ

ЛУ - лекарственная устойчивость

МСМ - мужчины, имеющие секс с мужчинами

ПАВ - психоактивные вещества

ПЦР, PCR - полимеразная цепная реакция

ПИН - потребители инъекционных наркотиков

РГЧЗТ - реакция гиперчувствительности

замедленного типа РНК - рибонуклеиновая кислота

ВВЕДЕНИЕ

ВИЧ-инфекция - инфекционная патология, имеющая пандемическое распространение. До настоящего времени эпидемия продолжает свое развитие, несмотря на все усилия, принимаемые по ее сдерживанию. Осуществление эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией являет-

ся основным аспектом для определения стратегии противодействия эпидемии и оценки эффективности мероприятий по профилактике, диагностике и лечению ВИЧ-инфекции [1].

Современный подход к проведению эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией может быть в значительной мере усовершенствован путем сравнительного изучения генетических свойств вируса с применением методов молекулярной биологии, что является чрезвычайно важным этапом в развитии профилактической медицины [2]. Новые молекулярно-генетические методы исследования инфекционных заболеваний, в том числе и ВИЧ-инфекции, позволяют значительно расширить объемы научных данных о взаимодействии генома человека и вируса иммунодефицита человека.

Использование молекулярно-генетических методов исследования для изучения этиологического фактора эпидемического процесса в системе эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией позволяет оптимизировать и эпидемиологическую диагностику в части слежения за ходом развития эпидемического процесса на территории, и расшифровку эпидемических очагов с определением источника инфекции, путей и факторов заражения, уровня восприимчивости контактных лиц и скорости протекания инфекционного процесса в организме больного [3].

Вместе с тем, необходимо отметить, что молекулярно-эпидемиологический мониторинг субтипов ВИЧ и резистентных штаммов вируса иммунодефицита человека, и особенно первичнорезистентных, до настоящего времени не имеет системного характера. Необходимо объединение усилий различных учреждений, занимающихся проблемами резистентности ВИЧ, и консолидация данных, а так же существует необходимость в создании дополнительной нормативной базы по надзору за ЛУ ВИЧ.

В настоящем аналитическом обзоре представлены данные о современных молекулярно-генетических методах исследования, применяемых в профилактике, диагностике, лечении ВИЧ-инфекции, изучении генетических свойств микро- и макроорганизма, позволяющих объяснить, в частности, феномен лекарственной устойчивости ВИЧ к АРВП, с одной стороны, а с другой, резистентность лиц с генотипом ССR532 к инфицированию ВИЧ (гомозиготный вариант) и уменьшению скорости репликации вируса, а значит снижению активности инфекционного процесса в организме (гетерозиготный вариант). Показано, что современные молекулярно-генетические методы исследования вносят значительный вклад в совершенствование системы эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией, что определяет научно-практическую значимость и актуальность настоящего обзора.

1. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИЧ-ИНФЕКЦИИ

Постановка лабораторного диагноза «ВИЧ-инфекция» во всех странах мира осуществляется на основании повторного положительного результата ИФА или быстрого серологического теста, подтвержденного в реакции ИБ [4, 5, 6]. Исключение составляют регионы с высокой распространенностью ВИЧ-инфекции, где вместо ИБ разрешено подтверждение с использованием третьего ИФА [7]. В целом, стандартное лабораторное обследование по выявлению инфицирования ВИЧ, в том числе и в России, проводится в два последовательных этапа: скрининговый и верификационный [5, 6].

Скрининговое исследование включает тестирование методом ИФА с использованием комбинированных тестов, способных выявлять одновременно в образцах крови антитела к ВИЧ-1 и 2, а также антиген р24 ВИЧ-1 [5, 6] с обязательным до- и послетестовым консультированием.

Верификационное исследование - это подтверждение специфичности положительных результатов, полученных при скрининге, методом ИБ.

Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции может осуществляться только при использовании сертифицированных стандартизованных диагностических тест-систем (наборов), разрешенных к использованию на территории Российской Федерации в установленном порядке [5, 6, 8, 9].

Плановые лабораторные исследования и их кратность в период диспансерного наблюдения за ВИЧ-позитивным пациентом, как до назначения, так и в период проведения АРТ, должны соответствовать утвержденному стандарту оказания медицинской помощи [10]. Объем плановых обследований зависит от стадии болезни. Внеплановые обследования проводятся по назначению лечащего врача при появлении признаков прогрессирования ВИЧ-инфекции или развитии сопутствующих заболеваний. При оказании стационарной медицинской помощи, в отличие от амбулаторной, кратность лабораторных обследований несколько другая и должна соответствовать стандарту специализированной медицинской помощи [11].

Применение стандартных лабораторных тестов для определения наличия антител/антигена к ВИЧ позволяет установить факт заражения вирусом, но не дает представления об интервале времени, прошедшем после этого события. Между тем вопросы об определении давности заражения ВИЧ, источника инфицирования, путей и факторов передачи, границ очагов инфекции, генетической изменчивости вируса возникают в самых разных ситуациях, поводом для их выяснения могут послужить проведение эпидемиологического расследования, оценка эпидемической ситуации в определенной группе риска или регионе, назначение специфического лечения и оценка приверженности терапии.

В связи с этим, на основе молекулярно-генетических тестов, был создан дополнительный алгоритм лабораторной диагностики, регламентированный различными нормативными документами и позволяющий охарактеризовать геном вируса, количество вирусного материала, различить клинические стадии ВИЧ-инфекции, определить наличие лекарственной устойчивости ВИЧ к АРВП и прочее [5, 6, 8, 9, 10, 11].

2. ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В НАДЗОРЕ ЗА ВИЧ-ИНФЕКЦИЕЙ

2.1. ПЦР - полимеразная цепная реакция - метод избирательного синтеза нуклеиновых кислот in vitro, с помощью которого можно получить определенную последовательность ДНК в количестве, превышающем исходное в несколько миллионов раз [12]. Все методы, кроме ПЦР, выявляют в исследуемой пробе то количество искомого объекта, которое имеется. ПЦР позволяет за счет повторяющихся циклов синтеза увеличить количество выявляемого патогена, после чего проводится его детекция.

Существует четыре метода детекции продуктов амплификации ПЦР, применяемых в диагностических лабораториях: гель-электрофорез, гибридизационно-фермент-ный анализ (ГиФА), флуоресцентная детекция после проведения реакций (FLASH) и флуоресцентная детекция во

время проведения реакций (Real-Time PCR). Преимущество отдаётся Real-Time PCR, поскольку этот способ позволяет избежать проблему контаминации ампликонами. Помимо этого существенно сокращается время проведения анализа (6-8 часов) [12, 13].

Простота, высокая чувствительность и специфичность метода ПЦР позволили ему получить широкое распространение как в науке, так и в лабораторной и клинической практике [13], и, в частности, применительно к ВИЧ-инфекции. В настоящее время ПЦР используется не только для диагностики ВИЧ-инфекции, но и при оценке активности инфекционного процесса, контроле за применением АРТ и степени приверженности АРТ у ВИЧ-инфицированных пациентов, что регламентируется стандартами оказания медицинской помощи [5, 8, 10]. Также методом ПЦР (как начальным этапом метода секвениро-вания) производят амплификацию участка ДНК, последовательность которой требуется определить в дальнейшем.

2.2. Секвенирование - метод, предоставляющий возможность выявлять минимальные изменения (единичные замены нуклеотидов) и определять точную нуклеотидную последовательность интересующих участков ДНК.

Данный метод перешел из категории научных методов в недалеком прошлом в практическую лабораторную практику сегодня и позволяет получить информацию обо всех нуклеотидных заменах в выбранном фрагменте генома ВИЧ, в том числе о мутациях, вызывающих устойчивость к АРВП [9, 10, 11].

Существуют два метода определения устойчивости ВИЧ к препаратам - генотипический и фенотипический.

При генотипировании проводят анализ последовательности генома ВИЧ, выделенного от пациента в сравнении с референсной последовательностью «дикого»/чувстви-тельного ко всем препаратам вируса [9]. Мутации ВИЧ определяют как отличия в аминокислотных последовательностях по сравнению с референсным штаммом.

При фенотипировании проводят сравнение выращенных культур изолятов вируса, полученных от пациента, с референс-вариантами вируса в присутствии или отсутствии различных антиретровирусных препаратов. С помощью фенотипического метода можно количественно оценить чувствительность ВИЧ к АРВ-препаратам. Для этого определяют репликацию ВИЧ в культурах клеток с возрастающими концентрациями АРВ-препаратов и сравнивают ее с репликацией дикого штамма вируса [7].

Данный метод не нашел широкого применения в медицинской практике в силу своей затратности и сложности проведения.

Кроме этого, на основе секвенирования разработана методика для определения тропизма вирусной популяции, позволяющая определить тропность вируса и, соот-

ветственно, разработать соответствующее и адекватное лечение пациента. В отличие от определения резистентности, где уровень устойчивости определяется отдельными мутациями, при определении тропизма ВИЧ используют всю последовательность петли V3 гена Env, конформа-ция которой и определяет тропизм ВИЧ.

2.3. Метод проточной цитофлюорометрии

Ведущее иммунологическое нарушение в организме больного ВИЧ-инфекцией - это дезорганизация клеточного иммунитета с резким снижением хелперной функции, осуществляемой СД4-позитивными лимфоцитами [5, 14].

Именно СД4 антиген Т-лимфоцитов играет ключевую роль в развитии механизмов иммунного повреждения при ВИЧ-инфекции, поскольку является основным рецептором для проникновения вируса в организм человека. Степень поражения тех или иных клеток, несущих СД4 рецепторы, зависит от плотности этих рецепторов на мембране клеток. Наиболее высока плотность СД4 на Т-хелперной субпопуляции лимфоцитов, что во многом и определяет патогенез болезни [14].

Измерение уровня СД4-лимфоцитов позволяет судить о глубине развившегося иммунодефицита. Это стандартное исследование, проводимое для оценки вероятности про-грессирования ВИЧ-инфекции, поскольку уменьшение количества СД4-лимфоцитов является одним из основных маркеров, обуславливающих развитие вторичных заболеваний [6, 14].

Ранние методы исследования субпопуляций лимфоцитов были трудоемки и малоинформативны. Автоматизированные технологии для иммунофенотипи-рования впервые появились в конце 70-х годов двадцатого века. Первые проточные цитометры имели один лазер, и для подсчета абсолютного количества СД4-клеток использовалось общее количество лейкоцитов и процент лимфоцитов, полученных на гематологическом анализаторе (двухплатформенный метод). В дальнейшем разработка моноклональных антител и развитие технологии проточной цитометрии обеспечили новые подходы к идентификации субпопуляций лейкоцитов и проведению иммунологического мониторинга с внедрением одно-платформенной технологии определения абсолютного количества клеточных субпопуляций, позволяющей определять как процентное, так и абсолютное содержание различных клеток без использования данных гематологического анализатора [5]. В проточном цитометре клетки друг за другом проходят через лазерный луч, при этом анализатор измеряет два типа параметров - параметры светорассеяния и параметры флюоресценции, таким образом, сочетая принцип работы флюоресцентного микроскопа и автоматического гематологического анализатора.

Проточная цитометрия - это один из наиболее высокочувствительных и объективных методов определения различных популяций и субпопуляций лимфоцитов, позволяющий оценивать как эффективность применения антире-тровирусной терапии, так и степень прогрессирования заболевания [5, 6].

Молекулярно-генетический и иммунологический мониторинг ВИЧ-инфекции осуществляется с использованием набора реагентов, разрешенных к использованию на территории Российской Федерации в установленном порядке (таблица 1). 3. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В НАДЗОРЕ ЗА ПОПУЛЯЦИЕЙ ВОЗБУДИТЕЛЯ (ВИЧ) 3.1. Определение провирусной ДНК ВИЧ ДНК диагностика ВИЧ-инфекции основана на обнаружении провирусной ДНК в клетках крови методом ПЦР. Одним из показаний к проведению данного теста является выявление ВИЧ в инкубационном периоде. ПЦР-диагностика позволяет определять наличие ВИЧ в период так называемого «серонегативного окна», и первой из лабораторных маркеров ВИЧ-инфекции выступает про-вирусная ДНК ВИЧ с помощью метода ПЦР, которая выявляется на 7-11-й день от момента инфицирования, что очень важно в ряде ситуаций, требующих постановки

ТАБЛИЦА 1.

Наборы реагентов для мониторинга ВИЧ-инфекции

эпидемиологического диагноза именно в этот период времени [7, 14]. Кроме этого, данный тест показан при раннем выявлении ВИЧ-инфекции у детей с перинатальным контактом по ВИЧ, поскольку в крови этих детей циркулируют материнские антитела к вирусу иммунодефицита человека до 18 месяцев жизни [1], поэтому традиционные серологические методы диагностики не дают адекватных результатов. Тестирование применяется также в случае сомнительного результата ИБ [5, 8, 14].

3.2. РНК диагностика

РНК диагностика ВИЧ-инфекции (определение ВН) используется для количественного измерения концентрации вируса в крови [5, 8, 14]. Концентрация РНК ВИЧ измеряется в количестве копий РНК ВИЧ в миллилитре крови. Большинство применяемых в клинической практике тест-систем позволяет определить нагрузку от 20 копий/мл и даже ниже. Такая чувствительность методики необходима в связи с современным взглядом на динамику ВН в процессе лечения. После начала терапии наблюдается быстрое снижение уровня РНК ВИЧ в течение 1-4 недель, отражающее действие лекарственных препаратов на ВИЧ - как на свободные вирионы в плазме, так и на ВИЧ в первично инфицированных лимфоцитах СД4. Далее следует второе снижение ВН, оно более длительное, менее выраженное и отражает эффективность

Название Производитель Область применения

ViroSeq Abbot, US Генотипирование ВИЧ. Выявление мутаций лекарственной резистентности ВИЧ к АРТ

АмплиСенс HIV-Resist-Seq ФБУН ЦНИИЭ, РФ Определение тропизма и выявление мутаций лекарственной резистентности ВИЧ к АРТ

Trugene Siemens, AG Выявление мутаций лекарственной резистентности ВИЧ к АРТ

Ампли Сенс ВИЧ-Монитор-FRT ИнтерЛабСервис, РФ Количественное определение РНК ВИЧ в плазме крови

ВИЧ ГЕН количественный ДНК-технология, РФ Количественное определение РНК ВИЧ в плазме крови

AmpLicor HIV1 Тест (для ручного ПЦР-анализа) «Хоффман-Ла Рош», США Количественное определение РНК ВИЧ в плазме крови

Cobas AmpLicor HIV1 Тест (для автоматического анализатора «Кобас Ампликор») «Хоффман-Ла Рош», США Количественное определение РНК ВИЧ в плазме крови

AMPLIPREP PHS/PHM monitor (для автоматического анализатора «Кобас Амплипреп») «Хоффман-Ла Рош», США Количественное определение РНК ВИЧ в плазме крови

Реал Тайм ВИЧ-1 Ниармедик, РФ Количественное определение РНК ВИЧ в плазме крови

РеалБест ВИЧ Вектор Бест, РФ Количественное определение РНК ВИЧ в плазме крови

«LCx HIV RNA Quantitative assay» Эббот, Швейцария Количественное определение РНК ВИЧ в плазме крови

Ампли Сенс-ДНК-ВИЧ-FL ИнтерЛабСервис, РФ Определение провирусной ДНК ВИЧ в лейкоцитах крови

Ампли Сенс Геноскрин HLA B 5701-FL ИнтерЛабСервис, РФ Выявление аллели 5701 локуса В главного комплекса гистосовместимости человека

- MuLtitest CD3/CD8/CD45/CD4 Trucout Ce; - MuLtitest CD45/CD16+56/CD45/CD19 Trucout Ce Becton Dickinson, US Мониторинг количества CD4, CD8 и CD19 лимфоцитов

противовирусного действия препаратов на зараженные макрофаги, дендритные клетки лимфатических фолликулов. Максимальный противовирусный эффект ожидается через 4-6 месяцев. Вирусная нагрузка, наряду с определением количества лимфоцитов СД4, является важным «барометром» эффективности терапии ВИЧ [6, 8, 9].

Вирусную нагрузку следует определять каждые 3-4 месяца во время лечения, чтобы убедиться, что она сохраняется на уровне ниже 50 копий/мл [9]. В ходе исследований нуклеотидных последовательностей ВИЧ было установлено, что при уровне менее 50 копий/мл нет активной репликации вируса, а значит, не происходит формирование резистентных штаммов [8]. Небольшие подъемы ВН от неопределяемого уровня до 50-200 копий/мл могут наблюдаться и без развития устойчивых штаммов вируса, но тем не менее, в случае таких «всплесков» следует убедиться в приверженности пациента режиму лечения [8].

Динамика ВН у детей, инфицированных перинатально, отличается от динамики виремии у ВИЧ-инфицированных взрослых. В первую очередь, у детей сохраняется высокий уровень виремии в течение длительного времени. Установлено, что у детей с низким уровнем ВИЧ РНК при рождении (^10 000 копий/мл) наблюдалось его резкое возрастание к 2 месяцам жизни. У большинства новорожденных с высокой вирусной нагрузкой (^100 000 копий/мл) динамика показателей варьирует и при отсутствии лечения медленно снижается в течение нескольких лет [7, 14].

Тестирование на ВН проводится:

- при первичной оценке стадии выявленной ВИЧ-инфекции,

- перед началом АРТ,

- у ВИЧ-инфицированных беременных за 4 недели до предполагаемых родов,

- у ВИЧ-инфицированных, состоящие на диспансерном учете, в том числе и получающих АРТ, согласно стандартам [5, 8, 14].

3.3. Циркуляция субтипов ВИЧ-1

Основными методами для определения субтипов ВИЧ являются как секвенирование образцов и последующий анализ данных в международных базах данных нуклеотидных последовательностей ВИЧ, так и метод сравнительной оценки электрофоретической подвижности гете-родуплексов [9].

Информация о субтипах ВИЧ-1 должна приниматься во внимание при проверке диагностической эффективности постоянно появляющихся новых версий молекулярно-диагностических тестов, поскольку следует обязательно знать, какие варианты вируса и в каких соотношениях циркулируют в стране, учитывая высокую степень генетической изменчивости ВИЧ [15]. Кроме того, данные мони-

торинга генетических вариантов ВИЧ-1 широко используются в практической эпидемиологии как при осуществлении долгосрочного прогноза развития эпидемии, так и при проведении локальных эпидемиологических расследований и с некоторой степенью уверенности позволяют определить источник инфекции и эпидемиологические связи между входящими в состав очага лицами [16].

Информация о вариантах ВИЧ-1, доминирующих в различных регионах и разных группах риска, необходима при разработке стратегии специфической профилактики и лечения ВИЧ-инфекции. Наконец, выявление новых подтипов ВИЧ-1 имеет фундаментальное значение, расширяя представление о механизмах, лежащих в основе изменчивости вируса. Изучение закономерностей распределения субтипов, появление новых вариантов ВИЧ-1 имеет большое значение для понимания закономерностей развития эпидемий [17, 18].

Согласно принятой в 1999 году номенклатуре ВИЧ-1, которая основана, прежде всего, на филогенетическом анализе полноразмерных геномов вирусов, выделены три независимые группы вирусов - М(тат), О(ои^ег) и ^поп^/поп О) [19].

Большинство известных в настоящее время изолятов ВИЧ-1 относится к группе М, определяющей в настоящее время пандемию ВИЧ-инфекции. Группы О и N немногочисленны, и вирусы, относящиеся к этим группам, выявлены в основном у жителей африканских стран [20].

Географическое распределение субтипов ВИЧ-1 группы М неоднородно [21]. В различных странах мира могут доминировать разные субтипы вируса [1, 22]. Кроме этого, существуют циркулирующие «рекомбинантные формы» (CRF), представляющие собой вирусы, геном которых представлен нуклеотидными последовательностями, принадлежащими к вирусам разных субтипов [19, 23, 24].

Самыми распространенными на Земном шаре являются вирусы субтипа С [20, 24, 79]. Представители всех субтипов ВИЧ-1 обнаружены в странах Центральной Африки, однако доминируют там вирусы субтипов А и С. В странах Западной Европы и Америки, в Австралии и Японии, напротив, преобладает субтип В, а в странах Юго-Восточной Азии и Таиланде наибольшее распространение получила рекомбинантная форма CRF01 АЕ [22, 25]. В России до настоящего времени циркулируют преимущественно варианты ВИЧ-1 группы М. В данной группе выделяют как минимум 11 субтипов (А1, А2, В, С, D, F1, F2, G, Н, .1, К) [17, 26, 27].

Широко распространенными субтипами ВИЧ-1 являются А, В, С, в меньшей степени, D, F, G. Субтипы Н, .1, К встречаются существенно реже, по-видимому, или, являясь относительно «молодыми» или из-за изолированности популяций, где они первоначально возникли [28].

Несмотря на то, что в любой стране мира или группе риска теоретически возможно обнаружение любого субтипа ВИЧ-1, в действительности вирусы некоторых субтипов были выделены далеко не во всех странах или группах риска. Существование субтипов ВИЧ-1 на определенной территории связано не только с определенными закономерностями генетической изменчивости группы М, но и с эпидемиологическими особенностями пандемии ВИЧ-1-инфекции [18, 29, 30, 31, 32, 33].

Хотя в литературе отсутствуют достоверные данные о связи субтипов ВИЧ-1 с путями передачи, наблюдаются некоторые закономерности, например, в принадлежности субтипа В при инфицировании группы МСМ у лиц, инфицированных при гетеросексуальных контактах, чаще всего обнаруживаются субтипы С, D, Е [34].

Нозокомиальная вспышка ВИЧ-инфекции на юге России в 1989 году была вызвана субтипом G. Во всех районах России, кроме Калининградской области, у ПИН был обнаружен субтип А ВИЧ-1, наиболее часто встречаемый у наркопотребителей в Украине. В России не А варианты составляют менее 15% всех случаев [17, 18, 27]. Таким образом, применение генотипирования с целью проведения эпидемиологического расследования на территории России ограничено, поскольку более 87% всех случаев вызвано вариантами одного субтипа А. В связи с этим в практике эпидемиологического расследования случаев заражения ВИЧ-инфекцией все чаще стал применяться филогенетический анализ ВИЧ.

3.4. Филогенетический анализ ВИЧ

Филогенетический анализ - изучение эволюционного порядка дивергенции близких по структуре или функциям геномов вируса путем сравнения их нуклеотидных последовательностей и расчета генетической дистанции между парами последовательностей, отражаемых в виде филогенетического дерева [2]. Проведение филогенетического исследования позволяет определить, в том числе различия между вариантами вируса внутри одного субтипа. Этот метод может применяться для эпидемиологического анализа, в том числе и при криминалистическом расследовании передачи ВИЧ для исключения или подтверждения эпидемиологической связи между образцами донора и реципиента. При проведении данного исследования необходимым условием является корректный отбор исследуемых образцов донора и реципиента и контрольной группы сравнения. При этом нужно понимать, что полученная на филогенетическом дереве генетическая близость сравниваемых образцов предполагаемого донора и реципиента не может быть рассмотрена как 100% доказательство факта прямого инфицирования.

Впервые филогенетический анализ ВИЧ в качестве дополнительного доказательства был использован в 1990

году при расследовании американским CDC нозокоми-ального случая передачи ВИЧ, известного под названием «дело дантиста из Флориды» (Centers for Disease Control and Prevention. HIV/AIDS Surveillance Report), получив в дальнейшем значительное применение в мире. В настоящее время данный вид исследования в России не является рутинным в силу своей сложности проведения и в основном используется при расследовании сложных, с точки зрения эпидемиологии, случаев заражения. В целом, результаты филогенетического анализа являются важным дополнением и объективным доказательством установления возможного источника инфекции при проведении эпидемиологических расследований [5].

3.5. Выявление мутаций устойчивости ВИЧ к антиретро-вирусным препаратам

Появление новой эпидемиологической задачи - слежение за распространением штаммов ВИЧ-1, устойчивых к действию лекарственных препаратов - создало новую точку приложения диагностических тестов [35, 36, 37]. Для определения лекарственной устойчивости ВИЧ наибольшее распространение получили молекулярно-генетиче-ские тесты, основанные на секвенировании ДНК [9, 14].

Определение резистентности ВИЧ к АРВ-препаратам является важным ориентиром при назначении терапии, позволяет объяснить причину неэффективности лечения и назначить оптимальную комбинацию препаратов, являясь, таким образом, ключевым фактором в определении новых стратегий лечения [38, 39, 40, 41].

Согласно рекомендациям ВОЗ [42], наиболее адекватным способом оценки частоты передачи штаммов, имеющих мутации лекарственной устойчивости ВИЧ-1 (геноти-пирование), является подсчет случаев их обнаружения в популяции лиц, зараженных недавно, т. е. в течение последних 6-12 месяцев (такую лекарственную устойчивость ВИЧ называют первичной) [2, 9], и у лиц, применяющих АРТ при неэффективности последней. Поскольку в организме пациентов, первично инфицированных «диким» чувствительным штаммом ВИЧ, но приобретших устойчивый вариант вируса в результате применения АРТ, отмена терапии может быстро привести к восстановлению исходной ситуации, когда преобладает чувствительный вирус, а устойчивый перестает выявляться. Именно поэтому все рекомендации подчеркивают важность назначения тестирования на фоне продолжения приема предположительно неэффективного препарата [6, 8, 9].

Для оценки вероятности заражения первично устойчивым штаммом ВИЧ в течение нескольких последних лет в развитых странах проводятся эпидемиологические исследования, позволяющие оценить степень распространенности мутаций резистентности среди естественно циркулирующих штаммов ВИЧ в каждом регионе мира [7, 43,

44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51]. Полученные данные вносят определенный вклад в совершенствование системы эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией, а также позволяют оценить степень эффективности АРТ.

Согласно методическим рекомендациям Минздравсоцразвития РФ [9], обследованию для определения устойчивости ВИЧ подлежат ВИЧ-инфицированные при неэффективности ВААРТ, если нет других явных причин неэффективности терапии (нарушения приема АРВ-препаратов, нарушения всасывания препаратов). Вирусологическими критериями неэффективности терапии являются отсутствие снижения концентрации РНК ВИЧ до недетектируемого уровня через 24 недели лечения при отсутствии перерывов в приеме препаратов, а также выявление РНК ВИЧ в двух определениях с интервалом в один месяц после исходной супрессии до недетектируемого уровня. Обследованию также подлежат ВИЧ-инфицированные пациенты в период острой инфекции перед началом АРТ, если заражение произошло от партнера с неэффективной АРТ. В остальных случаях острой инфекции проведение исследования до начала терапии не рекомендуется до тех пор, пока уровень первичной резистентности в регионе не достигнет 5% [9].

3.6. Исследование тропизма с использованием геноти-пической методики вариантов ВИЧ субтипа А

В основе определения тропизма ВИЧ-1 к корецепторам методом генотипирования лежит секвенирование области гена env, кодирующего петлю V3, основную детерминанту клеточного тропизма, от строения которой и зависит тропность к корецепторам.

Проникновение ВИЧ-1 в чувствительные клетки организма хозяина является важнейшим этапом размножения вируса и, следовательно, одной из основных мишеней терапии ВИЧ-инфекции [52]. Основным условием проникновения ВИЧ-1 в клетку-мишень является наличие на ее мембране двух рецепторов: рецептора CD4 и специфического ко-рецептора, который бывает двух типов -CCR5 и CXCR4 [22, 53, 54, 55, 56]. При этом существуют различные популяции вируса, которые классифицируются в соответствии с ко-рецептором (CCR5 или CXCR4), используемым для проникновения в клетки хозяина [57, 58, 59, 60].

Вирусные популяции, содержащие вирус, проникающий в клетку в результате взаимодействия с ко-рецептором CCR5, классифицируют как ССR5-тропные (или R5-тропные). Вирусные популяции, содержащие вирус, проникающий в клетку в результате взаимодействия с ко-рецептором CXCR4, классифицируют как CXCR4-тропные (или Х4-тропные), вирусные популяции с обоими типами вируса (CCR5 и CXCR4) классифицируют как популяции двойного тропизма, когда вирус может про-

никать в клетку CD4 либо через ко-рецептор CCR5, либо через ко-рецептор CXCR4 [61, 62, 63, 64, 65, 66, 67]. Кроме того, вирусная популяция, состоящая из смеси R5-тропных, Х4-тропных и/или вирусов с двойным тропизмом, носит название смешанной.

Установлено, что со временем пациенты, получавшие лечение ранее, склонны вырабатывать устойчивость ко многим лекарствам против ВИЧ, и, возможно, по совпадению у них оказывается повышенная вероятность появления вируса CXCR4 [64]. Таким образом, считают, что вирус CXCR4 является более «вредным» для клеток CD4 и может ускорить начало СПИДа, например, в результате нарастающего снижения количества клеток CD4 [58]. Соответственно, проблема состояла в том, что лекарственное средство, которое ингибирует только проникновение в клетки CD4 CCR5-тропного вируса, может принести определенный вред пациентам, инфицированным вирусной популяцией, использующей CXCR4, в плане предоставления дополнительных клеточных мишеней для СХСР4-тропного вируса, давая, таким образом, возможность для увеличения ВН и снижения количества клеток CD4.

Маравирок - лекарственный препарат, являющийся антагонистом рецепторов хемокинов, относится к новому классу АРВП, который ингибирует проникновение ВИЧ посредством блокировки ко-рецептора CCR5 и показан для лечения пациентов, инфицированных CCR5-тропным ВИЧ [54, 58, 65].

Маравирок не назначают при he-CCR5-тропизме (то есть СХСR4-тропизме, двойном/смешанном тропизме), так как считается, что маравирок или любой другой антагонист CCR5 эффективен только в случае преобладания в организме пациента CCR5-тропных вирусов. Поскольку смена тропизма к ко-рецептору происходит в неопределенный момент, необходимо определять тропизм вируса к ко-рецептору до начала лечения этими препаратами [58, 65]. Это позволяет избежать ненужных затрат и дополнительных рисков для пациента, а также позволяет в конечном итоге снизить риск передачи вируса другим людям.

Поскольку основным недостатком генотипического подхода в молекулярно-генетических тестах является сложная интерпретация результатов, то решением этой проблемы стала разработка программ, которые позволяют сопоставлять данные, полученные от пациента, с международными и российскими базами данных о профилях устойчивости и интерпретации результатов генотипиро-вания, а также использования полученных результатов в эпидемиологическом надзоре за ВИЧ-инфекцией [9, 68].

В частности: а) база данных Стэнфордского университета (Стэнфордский университет, медицинский факультет, кафедра инфекционных болезней, 1998 г.), рекомендованная

ВОЗ (http://hivdb.stanford.edu/) [9, 68], является информационным порталом о ЛУ ВИЧ, содержащим список мутаций к ингибиторам протеазы, обратной транскрипта-зы, интегразы и ингибиторам слияния, являющейся программой для эпидемиологического надзора за передачей штаммов ВИЧ, содержащих мутации ЛУ, является электронной базой данных историй болезни пациентов; б) Российская база данных устойчивости ВИЧ (ЦНИИЭ, г.Москва), являющаяся «зеркалом» сервиса по анализу мутаций Стэнфорда на русском языке (http:/hivresist.pcr. ru) [68]; в) база данных Eurosist (инициирована Европейской комиссией, 2006 г.), также доступная на русском языке, позволяющая осуществлять подбор оптимальной для данного пациента антиретровирусной терапии с учетом дополнительных данных о пациенте (http:/ eurosist.org); г) база Geno2pheno (http:geno2pheno.org) (институт информатики Макса Планка и Университетский госпиталь, г. Кельн, 2000 г.), содержащая список мутаций к ингибиторам протеазы, обратной транскриптазы, инте-гразы, а так же позволяющая сделать вывод в отношении тропизма ВИЧ к корецептору путем анализа генетической последовательности, кодирующей участок V3; д) база REGA HIV-1 & 2, использующаяся при проведении геноти-пирования и субтипирования ВИЧ с процентным содержанием гомологии с субтипом и возможностью построения филогенетического дерева; е) база COMET HIV-1/2 (http:/comet.retrovirology.lu) (Центральный госпиталь. Национальный центр инфекционных болезней, лаборатория ретровирусов. Люксембург, 2010 г.) так же, как и REGA HIV-1 & 2, используется для генотипирования и субтипирования ВИЧ. В целом все эти системы для интерпретации полученных результатов составляют основу биоинформационных методов, опирающихся на базы данных с результатами фенотипирования и генотипирования штаммов, выделенных из образцов крови пациентов [68].

4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

Современные молекулярно-генетические методы исследования позволяют получать знания о геноме человека и об особенностях его иммунной системы. Это является шагом к развитию персонализированной медицины, позволяющей изучить уникальные особенности организма каждого конкретного человека. В частности, проведенные исследования подтвердили важную роль «второго рецептора» ВИЧ - CCR5 - не только как «помощника» ВИЧ при проникновении в клетку, но также влияние его на естественное течение и эффективность терапии ВИЧ-инфекции [58]. Кроме этого, эпидемиологические исследования установили значимую связь аллели HLA-B*5701 главного комплекса гистосовместимости с РГЧ к абакавиру [69].

4.1. Изучение распространенности мутантного аллеля Р^5Д32

Рядом автором было показано, что к мутациям, способным в гомозиготном состоянии определять устойчивость к ВИЧ-инфицированию, в частности, относится делеция в гене, направляющем синтез хемокинового рецептора 0^5, обозначаемая Д32 [2, 63, 70, 71].

В то время как лица, имеющие гомозиготный вариант мутации Д32, обладают почти полной устойчивостью, у гетерозиготных пациентов инфицирование все-таки происходит, но СПИД развивается медленнее, на два-три года позже [3, 61, 72, 73]. Кроме Д32 в гене CCR5 и прочих генов семейства хемокинов (CCR2, SDF1) обнаружены и другие мутации. Некоторые из них тоже снижают темпы инфицирования, но в существенно меньшей степени, чем 0^5Д32 [54, 66, 72].

Распространение делеционного варианта гена ССR5 в значительной степени варьирует среди народов мира. Изучение распространенности мутантного аллеля ССR5Д32 показало, что у лиц европеоидной расы он встречается с частотой 2-12% в гетерозиготном состоянии и с частотой 1% - в гомозиготном, этот показатель у лиц другой расы существенно ниже [65]. Так, у афроамериканцев его обнаруживают в гетерозиготном состоянии с частотой, не пре-выщающей 2%. Анализ репрезентативных выборок, полученных от коренного населения в Японии, Центральной Африке, Венесуэле, вообще не позволил выявить лиц, гомозиготных по этому аллелю [20]. В Тайланде поиск делеционного аллеля ССR5Д32 проводили среди 860 наркоманов, лишь 6 их них оказались гетерозиготными, гомозигот в итоге не выявлено [20, 65].

В России мутация ССR5Д32 распространена достаточно широко, среди русских гетерозиготный генотип встречается с частотой 17-24%, гомозиготный 1-2% [2]. Генотип ССR5 обеспечивает 99,9%-ю степень защиты от ВИЧ-инфекции при гетеросексуальных контактах, при передаче ВИЧ от матери ребенку. Анализ, проведенный в Испании [44], позволил выявить повышенную частоту встречаемости гетерозиготного генотипа ССR5Д32 среди ВИЧ-инфицированных наркопотребителей, так называемых «непрогрессоров» (nonprogressors), т. е. в течение 10-12 лет не проявлявших клинических признаков ВИЧ-инфекции. Среди ВИЧ-инфицированных потребителей ПАВ в России не было обнаружено лиц, имеющих в своем геноме делецию ССR5 в гомозиготном состоянии, что косвенно свидетельствует в пользу предположения о резистентности лиц с таким генотипом к ВИЧ-инфекции даже при парентеральном пути заражения, связанном с употреблением наркотиков. Частота встречаемости гомозигот ССR5Д32 в контрольной группе здоровых доноров, представленных жителями Москвы, составила 0,6%, что

сравнимо со значениями, характерными для населения других европейских стран [2].

4.2. Выявление аллели 5701 локуса В главного комплекса гистосовместимости человека

Изучение генома человека с помощью современных молекулярно-генетических тестов особенно важно при изучении побочных явлений от приема АРВП у ВИЧ-инфицированных, что достаточно часто встречается в клинической практике. Так, абакавир - нуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы является эффективным антиретровирусным препаратом. В последние годы абакавир широко используется в России, а также комбинированные препараты кивекса и тризивир, в состав которых входит абакавир. Недостатком использования абака-вира является развитие аллергической реакции гиперчувствительности замедленного типа, характеризующейся множественными осложнениями (лихорадка, кожная сыпь, апатия, желудочно-кишечные расстройства, боли в мышцах и суставах, затруднение дыхания) и возможным смертельным исходом при повторном применении препарата. РГЗТ - ранний и потенциально ограничивающий терапию побочный эффект [74], соответственно, данный тест, в плане скринингового тестирования, целесообразно проводить перед началом терапии.

Установлено, что гиперчувствительность к абакавиру коррелирует с гаплотипом главного комплекса гистосов-местимости, а именно с наличием аллели HLA-B*5701 [69]. Данная аллель отвечает за генетическую (врожденную) непереносимость абакавира и его аналогов, вызывая РГЗТ, подтверждение которой является положительным результатом специального кожного теста.

Принцип тестирования основан на выделении тотальной ДНК человека, проведении амплификации участка локуса В главного комплекса гистосовместимости и участка гена в-глобина человека методом Real-Time PCR. По разным данным гиперчувствительность к абакавиру наблюдается примерно у 5-8% пациентов в течение первых шести недель после начала терапии [75]. В исследованиях в Австралии и США с участием более 5000 человек было показано, что на гиперчувствительность к абакавиру может влиять этническое происхождение. Частота встречаемости HLA-B*5701 варьирует в разных популяциях: 5-8% у латиноамериканцев, 4-7% у азиатов, менее 1% у африканцев [76]. В России различные исследования показали, что частота встречаемости аллеля HLA-B*5701 (4,465,18%) совпадает с литературными данными о распространенности последнего среди европеоидов [77, 78].

4.3. Определение уровня СД4-лимфоцитов

Проведение иммунологического мониторинга является

неотъемлемым условием в оказании стандартов меди-

цинской помощи ВИЧ-инфицированным [5, 6, 8, 10, 11]. Это самый надежный прогностический показатель темпа прогрессирования заболевания, а также критерий для принятия решений в отношении назначения АРТ и профилактики оппортунистических инфекций [5, 14].

Оценка динамики уровня СД4-лимфоцитов в процессе лечения является критерием его эффективности. Увеличение этого уровня или, по крайней мере, отсутствие достоверного (более чем на 30%) его снижения через 4 недели после лечения говорит о ее эффективности [5, 14].

У взрослых пациентов, находящихся в латентной стадии заболевания (3-я стадия), уровень СД4-лимфоцитов обычно превышает 0,5х109 (500 клеток в мкл). Стойкое падение СД4 ниже этого уровня приводит к переходу ВИЧ-инфекции в стадию 4А. А снижение ниже 0,35х109 (350 клеток в мкл) и 0,2х109 (200 клеток в мкл) - в стадию 4Б и 4В соответственно. Дальнейшее прогрессирование иммунодефицита ведет к уменьшению показателя ниже 0,05х109 (50 клеток в мкл) вплоть до полного исчезновения СД4-клеток. Указанные цифры носят ориентировочный характер, поскольку снижение количества СД4-клеток, как правило, несколько опережает клиническое прогрессирование заболевания. С другой стороны, иногда больные с очень низким (0,2х109 (200 клеток в мкл) или даже 0,1х109 (100 клеток в мкл) живут в течение нескольких лет [14].

При интерпретации иммунологических показателей у детей младше 6 лет следует учитывать возрастные особенности. С учетом возрастных изменений иммунологических показателей была разработана шкала клинических и иммунологических показателей для определения стадии ВИЧ-инфекции у детей (таблица 2).

ТАБЛИЦА 2.

Иммунологические критерии оценки состояния иммунитета у детей [14]

Абсолютное и относительное содержание

Иммунная СД4 лимфоцитов

категория До 12 мес. 1-5 лет 6-12 лет

% % %

Нет иммуносупрессии >1500 >25 >1000 >25 >500 >25

Умеренная иммуносупрессия 7501499 15-24 500-999 15-24 200-499 15-24

Выраженная иммуносупрессия <750 <15 <500 <15 <200 <15

Хотя абсолютные показатели СД4, определяющие уровень иммуносупрессии, изменяются с возрастом, процент СД4 клеток, соответствующий определенной иммунной категории, остается постоянным. Таким образом, относительный показатель СД4 более достоверно отражает степень прогрессирования заболевания, чем абсолютный [14]. Так же, как у взрослых, количество СД4 клеток у ВИЧ-инфицированных детей уменьшается по

мере развития болезни, и их уровень определяет серьезность прогноза заболевания.

Количество лимфоцитов СД4 следует определять каждые 6 месяцев, если АРТ не проводится, и каждые 3-4 месяца на фоне лечения [5, 8]. Если результат определения не соответствует ожидаемому диапазону значений, исследование нужно повторить. Значимым считается изменение абсолютного количества лимфоцитов СД4 на 30% и изменение их процентного содержания на 3% [5, 8]. Обычно через 4-8 недель после максимальной нагрузки на фоне терапии количество лимфоцитов СД4 увеличивается на 50 кл/мкл, а затем повышается на еще 50-100 клеток в течение года. После прекращения АРТ количество лимфоцитов СД4 обычно снижается, через 3-4 месяца оно может уменьшиться на 100-150 клеток/ мкл.

Кроме этого, исследованиями по изучению уровня и скорости снижения СД4лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных лиц с различными путями передачи вируса установлена более высокая скорость снижения уровня клеток у лиц, инфицированных парентерально, по сравнению с лицами, заразившимися при половых контактах [14].

Поскольку постулат «Лечение как профилактика» находит все большее подтверждение в плане значительного снижения риска инфицирования от ВИЧ-позитивного человека, принимающего АРТ, применение современных методов, позволяющих контролировать приверженность АРТ, оценивать вирусологические и иммунологические критерии эффективности терапии, вносит значительный вклад в существующую систему эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией.

Таким образом, достижения в области использования молекулярно-генетических методов исследований как дополнительных источников информации позволили получить более полные характеристики популяций ВИЧ и человека, изучить особенности их взаимодействия, улучшить эпидемиологическую диагностику как в отдельных эпидемических очагах, так и на территории в целом. Внедрение данных методов в информационную и диагностическую подсистемы существующей системы эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией позволяет использовать их для оценки биологического и социального факторов эпидемического процесса, поскольку результаты молекулярно-генетического мониторинга при работе в очагах ВИЧ-инфекции используются для установления источника возбудителя инфекции, путей и факторов передачи, а также степени эффективности терапии.

Кроме этого, внедрение молекулярно-генетических исследований в существующую систему эпидемиологи-

ческого надзора за ВИЧ-инфекцией, как дополнение к серологическому мониторингу, позволит осуществлять динамическое слежение за циркулирующими вариантами вируса и уровнем их генетической изменчивости для оценки устойчивости популяции к инфицированию и прогнозированию развития эпидемии в дальнейшем.

ЛИТЕРАТУРА

1. Покровский В.В. Эпидемиология и профилактика ВИЧ-инфекции/ СПИД. М. 1996. 248 с.

Pokrovskij V.V. Jepidemiologija i profilaktika VICh-infekcii/SPID. M. 1996. 248 s.

2. Бобкова М.Р. Молекулярно-генетические методы в изучении эпидемиологии инфекций, возбудители которых передаются парентеральным путем : автореф. дисс. ... д-ра. биол. наук. М., 2002. 42 с.

Bobkova M.R. Molekuljarno-geneticheskie metody v izuchenii jepidemiologii infekcij, vozbuditeli kotoryh peredajutsja parenteral'nym putem : Avtoref. diss. ...d-ra biol. nauk. M., 2002.42 s.

3. Зверев С.Я. Научное обоснование механизма развития эпидемического процесса ВИЧ-инфекции на основе молекулярно-генетических исследований: автореф. дисс. ... д-ра мед. наук. Пермь, 2010. 46 с.

ZverevS.Ja.Nauchnoeobosnovaniemehanizmarazvitijajepidemicheskogo processa VICh-infekcii na osnove molekuljarno-geneticheskih issledovanij : avtoref. diss.... d-ra med. nauk. Perm', 2010. 46s.

4. Методическое письмо «Правила постановки диагноза ВИЧ-инфекции», №5922-РХ от 10.08.2007. М. 2007.

Metodicheskoe pis'mo «Pravila postanovki diagnoza VICh-infekcii», №5922-RH ot 10.08.2007. M. 2007.

5. Методическое письмо «Проведение лабораторного обследования на ВИЧ-инфекцию (в том числе исследование иммунитета и вирусной нагрузки при ВИЧ-инфекции)». № 4174-РХ от 04.08.2006. М. 2006.

Metodicheskoe pis'mo «Provedenie laboratornogo obsledovanija na VICh-infekciju (v tom chisle issledovanie immuniteta i virusnoj nagruzki pri VICh-infekcii)». № 4174-RH ot 04.08.2006. M. 2006.

6.Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.1.5.2826-10 «Профилактика ВИЧ-инфекции», М,. 2011.

Sanitarno-jepidemiologicheskie pravila SP 3.1.5.2826-10 «Profilaktika VICh-infekcii», M,. 2011.

7. Бобкова М.Р., Лаповок И.А. Лабораторные методы дифференциальной диагностики острой, ранней и текущей ВИЧ-инфекции. Клиническая лабораторная диагностика. 2007. № 12. С.25-32.

Bobkova M.R. Lapovok I.A. Laboratornye metody differencial'noj diagnostiki ostroj, rannej i tekushhej VICh-infekcii. Klinicheskaja laboratornaja diagnostika. 2007. № 12. S.25-32.

8. Методические рекомендации «Диспансерное наблюдение за пациентами с ВИЧ-инфекцией», №7124-РХ от 29.12.2006. М. 2006.

Metodicheskie rekomendacii «Dispansernoe nabljudenie za pacientami s VICh-infekciej», №7124-RH ot 29.12.2006. M. 2006.

9. Методические рекомендации «О проведении надзора за циркуляцией генетических вариантов вируса иммунодефицита человека, включая циркуляцию штаммов, резистентных к антиретровирусным препаратам» № 5956-РХ от 06.08.2007. - М. 2007.

Metodicheskie rekomendacii «O provedenii nadzora za cirkuljaciej geneticheskih variantov virusa immunodeficita cheloveka, vkljuchaja cirkuljaciju shtammov, rezistentnyh k antiretrovirusnym preparatam» № 5956-RH ot 06.08.2007. M. 2007.

10. Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 09.07. 2007 г № 474 «Об утверждении стандарта медицинской помощи больным болезнью, вызванной ВИЧ».

Prikaz Ministerstva zdravoohranenija i social'nogo razvitija Rossijskoj Federacii ot 09.07. 2007 g № 474 «Ob utverzhdenii standarta medicinskoj

pomoshhibol'nym bolezn'ju, vyzvannoj VICh».

11. Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 09,07, 07 г № 475 «Об утверждении стандарта медицинской помощи больным болезнью, вызванной ВИЧ» (при оказании специализированной помощи).

Prikaz Ministerstva zdravoohranenija i social'nogo razvitija Rossijskoj Federacii ot 09,07, 07 g № 475 «Ob utverzzhdenii standarta medicinskoj pomoshhi bol'nym bolezn ju, vyzvannoj VICh» (pri okazanii specializirovannoj pomoshhi).

12.Бобкова М.Р. ПЦР в диагностике и лечении ВИЧ-инфекции / Пособие для врачей-лаборантов. М. 1999.

Bobkova M.R. PCR v diagnostike i lechenii VICh-infekcii / Posobie dlja vrachej-laborantov. M. 1999.

13. Херсонская А.М. Оснащение современной лаборатории. Справочник заведующего КДЛ. 2007. № 11.

Hersonskaja A.M. Osnashhenie sovremennoj laboratorii. Spravochnik zavedujushhego KDL. 2007. № 11.

14.Вирус иммунодефицита человека - медицина. Руководство для врачей / под редакцией Н.А. Белякова и А.Г. Рахмановой // 3-е изд.-СПб.: Балтийский медицинский образовательный центр, 2012. 656 с.

Virus immunodeficita cheloveka - medicina. Rukovodstvo dlja vrachej / Pod redakciej N.A. Beljakova i A.G. Rahmanovoj // 3-e izd.-SPb.: Baltijskij medicinskij obrazovatel'nyj centr, 2012. 656 s.

15.Казеннова Е.В., Бобков А.Ф., Покровский В.В. Опыт использования метода сравнительной оценки электрофоретической подвижности гетеро-дуплексов (НМА) для генотипирования вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в России. Клиническая лабораторная диагностика. 2004 № 6. С. 39-42.

Kazennova E.V., Bobkov A.F., Pokrovskij V.V. Opyt ispol'zovanija metoda sravnitel'noj ocenki jelektroforeticheskoj podvizhnosti geterodupleksov (NMA) dlja genotipirovanija variantov VICh-1, cirkulirujushhih v Rossii. Klinicheskaja laboratornaja diagnostika. 2004. № 6. S. 39-42.

16.Фельдблюм И.В. и др. Новые технологии в организации эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией в условиях наркозависимого типа эпидемического процесса. Метод. рекомендации. Пермь. 2002. Ч. 2. 38 с.

Fel'dbljum I.V. i dr. Novye tehnologii v organizacii jepidemiologicheskogo nadzora za VICh-infekciej v uslovijah narkozavisimogo tipa jepidemicheskogo processa. Metod. rekomendacii. Perm'. 2002. Ch. 2.38 s.

17. Бобков А.Ф. и др. Молекулярно-генетическая характеристика ВИЧ-1 на территории России. Вестник РАМН. 2002. № 8. С. 40-42.

Bobkov A.F. i dr. Molekuljarno-geneticheskaja harakteristika VICh-1 na territorii Rossii. Vestnik RAMN. 2002. № 8. S. 40-42.

18. Бобков А.Ф. и др. Генетическая характеристика вариантов вируса иммунодефицита человека 1-го типа, вызвавших эпидемию среди наркоманов в странах СНГ. Вопросы вирусологии. 1998. № 6. C. 253-256.

Bobkov A.F. i dr. Geneticheskaja harakteristika variantov virusa immunodeficita cheloveka 1-go tipa, vyzvavshih jepidemiju sredi narkomanov v stranah SNG. Voprosy virusologii. 1998. № 6. S. 253-256.

19. Robertson D. et al. A reference guide to HIV-1 classification // HIV Sequence Database, Los Alamos National Laboratory. Los Alamos, N.M. 2000.

20. Morison L. The global epidemiology of HIV/AIDS/ L. Morison. Br. Med. Bull. 2000. Vol. 58. Р. 7-18.

21.Heyndrickx L. Simplified strategy for detection of recombinant human immunodeficiency virus type I group M isolates by gag/env heteroduplex mobility assay/L. Heyndrickxetal. J.Virol. 2000. V. 74. P. 363-370.

22. Jenkins C, Robalino D.A. HIV/AIDS in the Middle East and North Africa : The Costs of Inaction. Washington: World Bank, 2003.

23. Бобков А.Ф. и др. Нуклеотидные последовательности генов и изоля-тов вируса иммунодефицита человека типа 1, выявленных в России: обнаружение новых рекомбинантных вариантов. Вопросы вирусологии. 2000. № 6. С. 17-20.

Bobkov A.F. i dr. Nukleotidnye posledovatel'nosti genov i izoljatov virusa immunodeficita cheloveka tipa 1, vyjavlennyh v Rossii: obnaruzhenie novyh rekombinantnyh variantov. Voprosy virusologii. 2000. № 6. S. 17-20.

24. Peeters M. Recombinant HIV sequences: their role in global epidemic HIV/M.

Peeters //Sequence Database, Los Alamos National Laboratory. Los Alamos, N.M. 2000.

25. Kuiken С. Nucleotide alignment of HIV-1/SIV cpz complete genomes / С. Kuiken et al. // HIV Sequence Compendium. 2000. Los Alamos. Р. 216-318.

26. Бобков А.Ф., Казеннова Е.В., Селимова Л.М Молекулярная и вирусологическая специфика эпидемии ВИЧ-инфекции в России и странах СНГ. Вестник РАМН. 2003. № 12. С. 83-85.

Bobkov A.F., KazennovaE.V., Selimova L.M. Molekuljarnaja i virusologicheskaja specifika jepidemii VICh-infekcii v Rossii i stranah SNG. Vestnik RAMN. 2003. № 12. S.83-85.

27. Бобков А.Ф. и др. Субтипы ВИЧ-1 в России в 1987-1998 гг. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1999. № 1. С. 43-45.

Bobkov A.F. i dr. Subtipy VICh-1 v Rossii v 1987-1998 gg. Zhurnal mikrobiologii, jepidemiologii i immunobiologii. 1999. № 1. S. 43-45.

28. Kazennova E.V. et al. Distribution of HIV-1 genetic subtypes among HIV-infected individuals in prisons in Russia. XIV International AIDS Conference. Barcelona, Spain, 2002. Abstract Р. 10868.

29 .Аликина Ю.И., Суханова А.Л. и др. Два варианта субтипа А ВИЧ-1 в Пермской области. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2006. № 1. С. 39-43.

Alikina Ju.I., Suhanova A.L. i dr. Dva varianta subtipa A VICh-1 v Permskoj oblasti. Jepidemiologija i infekcionnye bolezni. 2006. № 1. S. 39-43.

30. Казеннова Е.В., Бобков А.Ф. Подтипы вируса иммунодефицита человека 1 типа: классификация, происхождение и распространение в Европе. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2003. № 1. С. 90-96.

Kazennova E.V., Bobkov A.F. Podtipy virusa immunodeficita cheloveka 1 tipa: klassifikacija, proishozhdenie i rasprostranenie v Evrope. Zhurnal mikrobiologii, jepidemiologii i immunobiologii. 2003. № 1. S. 90-96.

31. Турбина Г.И., Соломенцева М.Л., Кириллова Л.Д., Никитина Л.Д., ГараевМ.М. Эпидемиологическая характеристика ВИЧ-инфекции на территории Липецкой области в период 1993-2005 гг. Вопросы вирусологии. 2 0 0 6. № 6. С 19-22.

Turbina G.I., Solomenceva M.L., Kirillova L.D., Nikitina L.D., Garaev M.M. Jepidemiologicheskaja harakteristika VICh-infekcii na territorii Lipeckoj oblasti v period 1993-2005 gg. Voprosy virusologii. 2006. № 6. S. 19-22.

32. Ханина Т.А. Биологические свойства вариантов ВИЧ-1, циркулирующих среди наркоманов на территории России. Вопросы вирусологии. 2005. № 4 . С. 24-28.

Hanina T.A. Biologicheskie svojstva variantov VICh-1, cirkulirujushhih sredi narkomanov na territorii Rossii. Voprosy virusologii. 2005. № 4. S. 24-28.

33.Alikina Y.I. Characterization of HIV-1 genetic subtypes among IDUs in Perm region of Russia / Y.I. Alikina et al. //XV International AIDS Conference. Bangkok, Thailand, 2004. Abstract. Р. 3413.

34. Суханова А.Л. и др. Варианты вируса иммунодефицита человека 1 типа, обнаруженные в России среди инфицированных половым путем. Вопросы вирусологии. 2004. № 4. С. 4-7.

Suhanova A.L. i dr. Varianty virusa immunodeficita cheloveka 1 tipa, obnaruzhennye v Rossii sredi inficirovannyh polovym putem. Voprosy virusologii. 2004. № 4. S. 4-7.

35. Ghosn J., Pellegrin I., Gourjard C. et al. Guidelines for Surveillance of HIV Drug Resistance. Geneva: Word Health Organization, 2003.

36.Kuiken C.L. Foley В., Hahn B.H. et al. Human retroviruses and AIDS: a compilation and analysis of nucleic and amino acid sequences. Los Alamos National Laboratory. 2003.

37. Victoria A. Johnson. Update of the Drug Resistance Mutations in HIV-1: December 2010. Top HIV Med. 2010 V. 18 (5). Р. 156-163.

38. Baxter J.D. et al. A randomized study of antiretroviral management based on plasma genotypic antiretroviral resistance testing in patients failing therapy. 2000. AIDS- 14:F83-93.

39. Durant J. et al. Drug resistance genotyping in HIV-1 therapy: the VIRADART randomized controlled trail. Lancet. 1999. V. 353. Р. 2195-2199.

40. Hirch M.S. et al. 2000. Antiretroviral drug resistance testing in adult

HIV-1 infection: recommendation of an International AIDS Society-USA Panel. Jama 283:2417-2426.

41. Zolopa A.R. et al. HIV-1 genotypic resistance patterns predict response to saquinavir-ritonavir therapy in patients in whom previous protease inhibitor therapy had failed. Ann Intern Med. 1999. V. 131. Р. 813-821.

42. WHO Regional Office for Europe. HIV infection epidemiology:Sentinel Surveillance and Risk FactorsA Comparative Study in the Russian Federation, Azerbaijasn and Republic of Moldova. Copengagen, WHO-Euro, 2004.

43. Aghokeng A.F. et al. Virological outcome and patterns of HIV-1 drug resistance in patients with 36 months' antiretroviral therapy experience in Cameroon. Journal of the International AIDS Society. 2013. 16:18004.

44. Beatriz de Felipeet al. Prevalence and resistance mutations of non-B HIV-1 subtypes among immigrants in Southern Spain along the decade 20002010. Virology Journal. 2011.8:416.

45.Buckton A.J. et al. HIV type-1 drug resistance in treatment-nave patients monitored using minotory species assays: a systematic review and meta-analysis. Journal Antivir Ther. 2011. V. 16 (1). Р. 9-16.

46.Clare L. et al. Prevalence and predictors of antiretroviral drug resistance in newly diagnosed HIV-1 infection. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2007. V. 59. Р. 517-524.

47.Diane Descampset al. Increasing prevalence of transmitted drug resistance mutations and non-B subtype circulation in antiretroviral-naive chronically HIV-infected patients from 2001 to 2006/2007 in France. J Antimicrob Chemother. 2010. V. 65. Р. 2620-2627.

48. Eric J. Commentary on the role of treatment-related HIV compensatory mutations on increasing virulence: new discoveries twenty years since the clinical testing of protease inhibitors to block HIV-1 replication. Arts BMC Medicine. 2012. V. 10:114.

49. Iarikov D.E., Irizarry-Acosta M., MartorellC., HoffmanR. P. , Skiest D. J. Low prevalence of primary HIV resistance in Western Massachusetts. Journal of the International Association of Physicians in AIDS Care. 2010. V. 9 (4). Р. 227-231.

50. Vinogradova A. et al. Short communication: molecular epidemiology of HIV type 1 in the republic of Dagestan, Russian federation: virtually uniform circulation of subtype A, former soviet union variant, with predominance of the V77IPR subvariant. AIDS Research and Human Retroviruses. 2010. V. 26(4). Р. 395-400.

51.Weinstock H.S. et al. The epidemiology of antiretroviral drag resistance among drug-naive HIV-1- infected persons in 10 US cities. Journal of Infectious Diseases. 2004. V. 189 (12). Р. 2174-2180.

52. Lame J. The phisiological relevance of CD4 receptor down-modulation during HIV infection. Current HIV Research. 2003. V. 1. P. 167-184.

53.Bennetts B.H. et al. The CCR5 deletion mutation fails to protect againstmultiple sclerosis. Human Immunology. 1997. V. 58. P. 52-59.

54. Berger EA, Murphy P.M., FarberJ.M. Chemokine receptors as HIV-1 coreceptors: Roles in viral entry, tropism, and disease. Annu. Rev. Immunol. 1999. V.17. P. 657-700.

55. Jiang C. et al. Infection by a Human Immunodeficiency Virus with Atypical Coreceptor Tropism. J Virol. 2011. V. 10.

56. Wang Z.X. et al. CXCR4 sequences involved in coreceptor determination of human immunodeficiency virus type-1 tropism. Unmasking of activity with M-tropic Env glycoproteins. J. Biol. Chem.1998. V. 273. P. 15007-15015.

57. Шадрина М.И. и др. Анализ делеции 32 пн в гене рецептора хемоки-нов CCR5 у лиц, инфицированных ВИЧ-1 из г. Москвы. Генетика -2000. Т. 36. № 5 С. 718-720.

Shadrina M.I. i dr. Analiz delecii32 pn vgene receptora hemokinov CCR5 u lic, inficirovannyh VICh-1 iz g. Moskvy. Genetika -2000. T. 36. № 5. S. 718-720.

58. Dragic T. An overview of the determinants of CCR5 and CXCR4 co-receptor function. J. of Gen. Virol. 2001. V. 82. P. 1807-1814.

59. Dragic Т., Trkola А, Lin S.W. et al Amino-terminal substitutions in the CCR5 coreceptor impair gpl20 binding and human immunodeficiency virus type 1 entry. J. Virol. 1998. V. 72. P. 279-285.

60. Voevodin A. A survey for 32 nucleotide deletion in the CCR-5 chemokine receptor gene (deltacer-5) conferring resistance to human

immunodeficiency virus type 1 in different ethnic groups and in chimpanzees. J. Med.Virol. 1998. V. 55. P. 147-151.

61. Асеев М.В. и др. Популяционные особенности частот мутации гена хемокинового рецептора CCR5, определяющего чувствительность к вирусу СПИДа. Генетика. 1997. Т. 33. № 3 . С. 1724-1726.

Aseev M.V. i dr. Populjacionnye osobennosti chastot mutacii gena hemokinovogo receptora CSR5, opredeljajushhego chuvstvitel'nost'k virusu SPIDa.Genetika. 1997. T. 33. № 3. S. 1724-1726.

62. Носик М.Н., Мацевич Г.Р. Хемокиновые рецепторы ВИЧ-1 и их роль в патогенезе СПИДа. Вопросы вирусологии. 2002. № 1. С. 4-9.

Nosik M.N., Macevich G. R. Hemokinovye receptory VICh-1 i ih rol' v patogeneze SPIDa. Voprosy virusologii. 2002. № 1. S. 4-9.

63. Хоффман К., Рокштро Ю.К. Лечение ВИЧ-инфекции 2009. М. 2010. 648 с.

Hoffman K, Rokshtro Ju.K. Lechenie VICh-infekcii2009. M. 2010. 648 s.

64.CXCR4 Coreceptor Utilization. J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 1343.

65. Dean M. et al. Genetic restriction of HIV-1 infection and progression to AIDS by a deletion allele of the CCR5 structural gene. Science. 1996. V. 273. P. 1856-1862.

66. He J. et al. CCR3 and CCR5 are co-receptors for HIV-1 infection of microglia. Nature. 1997. V. 385. P. 645-649.

67. Pollakis G. Abebe A., Kliphuis A. et al. Phenotypic and genotypic comparisons of CCR5- and CXCR4-tropic human immunodeficiency virus type 1 biological clones isolated from subtype C-infected individuals. J. Virol. 2004. V. 78. P. 2841-2852.

68. Куевда Д.А., Мызникова А.И. Электронная база данных устойчивости ВИЧ к антиретровирусным препаратам // Материалы VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием-2010. Т. 1. С. 49-52.

Kuevda D.A., Myznikova A.I. Jelektronnaja baza dannyh ustojchivosti VICh k antiretrovirusnym preparatam // Materialy VII Vserossijskoj nauchno-prakticheskoj konferencii s mezhdunarodnym uchastiem - 2010. T. 1. S.

49-52.

69. MallalS. et al. Association between presence of HLA-B*5701, HLA DE7, and HLA-DQ3 and hypersensitivity to HIV-1 reverse-transcriptase inhibitor abacavir. Lancet. 2002. V. 2. № 359 (9308). Р. 727-32.

70. Рябов Г.С., Казеннова Е.В., ЗверевС.Я., Покровский В.В., Бобков А.Ф. Генетический полиморфизм и ВИЧ-инфекция: генотип CCR5 32/CCR5 32 обеспечивает высокий уровень устойчивости при парентеральной передаче вируса // Материалы научно-практической конференции «ВИЧ-инфекция и вирусные гепатиты с парентеральным механизмом заражения: эпидемиология, профилактика, диагностика, клиника, лечение». Суздаль, 2001. С.

50-51.

Rjabov G.S., Kazennova E.V., Zverev S.Ja., Pokrovskij V.V., Bobkov A.F. Geneticheskij polimorfizm i VICh-infekcija: genotip CCR5&32/CCR5&32 obespechivaet vysokij uroven' ustojchivosti pri parenteral'noj peredache virusa // Materialy nauchno-prakticheskoj konferencii «VICh-infekcija i virusnye gepatity s parenteral'nym mehanizmom zarazhenija: jepidemiologija, profilaktika, diagnostika, klinika, lechenie». - Suzdal', 2001. - S. 50-51.

71.Ryabov G.S. et al. The homozigous CCR5&32 genotype accounts for high resistance of some injecting drug users (IDUs) to HIV-1 infection //8-th European Conference on Clinical Aspects and Treatment of HIV-infection. Athens, Greece, 2001. Abstract P. 31.

72. Ryabov G.S. et al. The role CCR5delta32, CCR2-641 and CCR5-59029A/G alleles in HIV-1 parenteral transmission among IDUs in Russia //XV International AIDS Conference. Bangkok, Thailand, 2004. Abstract. Р. 616.

73. Ibe S., Sugiura W. Clinical significance of HIV reversetranscriptase inhibitor-resistance mutations. Future Microbiology. 2011. V. 6 (3). Р. 295-315.

74.Dando T.M., Scott L.J. Abacavir plus lamivudine: a review of their combined use in the management of HIV infection. Drugs. 2005. V. 65. Р. 285302.

75. Symonds W. et al. Risk factor analysis of hypersensitivity reaction to abacavir. Clin Ther. 2002. V. 24. Р. 565-73.

76.Christine A Hughes et al. Abacavir hypersensitivity Reaction: an Update. The Annals of Pharmacoterapy. 2008. V. 42.

77. Лебедева Н.Н., Серков И.Л., Орлова-Морозова Е.А., Пронин А.Ю. Оценка частоты встречаемости аллеля 5701 локуса В главного комплекса гистосовместимости человека HLA-B*5701 среди ВИЧ-инфицированных Московской области // Сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагно-стика-2010». М. 2010. Т.1. С.57-59.

Lebedeva N.N., Serkov I.L., Orlova-Morozova E.A., Pronin A.Ju. Ocenka chastoty vstrechaemosti allelja 5701 lokusa V glavnogo kompleksa gistosovmestimosti cheloveka HLA-B*5701 sredi VICh-inficirovannyh Moskovskoj oblasti. Sbornik trudov VII Vserossijskoj nauchno-prakticheskoj konferencii s mezhdunarodnym uchastiem «Molekuljarnaja diagnostika-2010».-M. 2010. T. 1. S.57-59.

78. Саламов Г.Г. и др. Сравнительный анализ наличия аллеля HLA-B*5701 и клинических проявлений в группе пациентов, принимающих абакавир/ кивексу // Сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2010». М. 2010. Т. 1. С. 77-79.

Salamov G.G. i dr. Sravnitel'nyj analiz nalichija allelja HLA-B*5701 i klinicheskih projavlenij v gruppe pacientov, prinimajushhih abakavir/kiveksu // Sbornik trudov VII Vserossijskoj nauchno-prakticheskoj konferencii s mezhdunarodnym uchastiem «Molekuljarnaja diagnostika-2010». M. 2010. T. 1. S. 77-79.

79.Rodenburg С. et al. Near full-length clones and reference sequences from subtype C isolates of HIV Type 1 from three different continents. AIDS Res. Hum. Retrovir. 2001. V. 17. № 2. Р. 161-168.