Способ получения флуоресцеин-5-изотиоцианата
METHOD FOR OBTAINING FLUORESCEIN-5-ISOTHIOCYANATE

Предлагаемое изобретение относится к области органической химии, относящейся к хиноидным ксантеновым красителям, замкнутым в кольце, и непосредственно касается производных флуоресцеина, а именно флуоресцеин-5- изотиоцианата - соединения, которое может быть применено в медицине в качестве иммунофлуоресцентного красителя, используемого при изготовлении люминесцирующих сывороток и как флуоресцентный метчик белка для быстрой диагностики вирусных инфекций.
Известно, что в медицине для быстрой диагностики вирусных инфекций применяется иммунофлуоресцентное окрашивание, которое основано на взаимодействии антигена с антителами, меченными флуорохромом, находящимися в клетках или тканях. Вспышки инфекционных заболеваний, появление новых видов заразных болезней, а в последнее время возвращение так называемых «старых» инфекций определяют неспокойную эпидемическую обстановку в мире. Генетическая изменчивость циркулирующих штаммов, внутрибольничные инфекции, бактерионосительство, трудности в обеспечении и применении иммунобиологических препаратов требуют усиления работы в области иммунопрофилактики и иммунотерапии. Недостаточное внимание к этим проблемам неминуемо приводит к подъему инфекционной заболеваемости. Для быстрой диагностики вирусных инфекций применяется иммунофлуоресцентное окрашивание. Прямой метод иммунофлуоресценции основан на взаимодействии антител, меченых флуорохромом, с антигеном, которых находится в клетке или тканях. [Степанов А.В., Осина Н.А., Майорова Н.В. «Оптимизация технологической схемы производства препаратов для генной диагностики особо опасных инфекционных болезней методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов» Биология, иммунология. Проблема особо опасных инфекций. 2017, 3, 105-109].
Практика показала, что одними из наиболее распространенных флуоресцентных меток, вводимых в нуклеотиды являются производные флуоресцеина [Sinshemer I. Iapodic V.Burck. J.Anal.Biochem., 57, 227, 1974; Riggs J.L.,Seiwald R.J., Rurckhaster, 1958 Isotiocyanate compounds as fluorescent labelling agents for immine serum //, Am. J. Pathology, 34(6) 1081-91; M.M. Riggs J.L.,Seiwald R.J., Rurckhaster, 1958 Isotiocyanate compounds as fluorescent labelling agents for immine serum //, Am. J. Pathology, 34(6) 1081-91; M.M. Огивецкая-Пищурина и др., Известия Академии наук, Серия биологическая 1963, 441-444.; В.Н.Глушко, Блохина Л.И., Садовская Н.Ю. Исследования по получению флуоресцеин-5-изотиоцианата - флуоресцентного наномаркера для создания биосенсоров // Российский химический журнал. 2014. - Т. 58. - №1. - С. 40-45. (РИНЦ)].
Как известно, флуоресцеин как таковой не достаточно стабильное соединение, поэтому его используют в качестве исходного продукта для синтеза его производных, являющихся устойчивыми индикаторами. В микробиологической практике для флуоресцентной метки белка широко применялся хлоргидрат флуоресциин-5-изотиоцианат. Однако неудобство в его использовании заключается в том, что при его применении необходимо переводить его в нейтральное соединение, что усложняет процесс его применения. Кроме того, хлоргидрат флуоресциин-5-изотиоцианата не достаточно устойчивое соединение. Поэтому предпочтительным для указанных целей является использование нейтрального флуоресцеин-5-изотиоцианата, имеющего следующую структурную формулу:
Флуоресцеин-5-изотиоцианат в известной пyбликaции (Riggs J.L.,Seiwald R.J., Rurckhaster, 1958 Isotiocyanate compounds as fluorescent labelling agents for immine serum //, Am. J. Pathology, 34(6) 1081-91//) предлагают получать следующим образом: к сухому ацетону (5 мл), содержащему тиофосген (3 г), прибавляют при 20°С аминофлуоресцеин (1 г), суспензированный в сухом ацетоне (5 мл), перемешивают реакционную массу в течение 1 часа, выдерживают несколько часов в холодильнике, осадок отфильтровывают и промывают петролейным эфиром. Выход и качество получаемого продукта в публикации не указаны. Основные недостатки данного способа, как и предыдущего - довольно низкий выход, использование в большом количестве пожароопасных растворителей.
Другой известный способ получения флуоресцеин-5-изотиоцианата осуществляют взаимодействием 5-аминофлуоресцеина с тиофосгеном (тиокарбонилхлорид) в среде ацетона в присутствии углекислого кальция-реагента, удаляющего хлористый водород. Исходные реагенты - 5-аминофлуоресцеин, тиофосген, углекислый кальций используются в данном способе соответственно в мольном соотношении 1:1,1:3,5. Образовавшиеся в качестве побочного продукта соли кальция отфильтровывают. Однако они содержат значительное количество основного продукта, который из солей экстрагируют ацетоном, затем ацетоновый раствор упаривают, обрабатывают образовавшейся масляный осадок петролейным эфиром. Выход выделенного технического целевого продукта составляет 52,7% от теоретического. Для применения его в качестве микробиологического красителя его дополнительно перекристаллизовывают из смеси ацетона с петролейным эфиром. Выход целевого чистого продукта 30-35% вес, чистота порядка 95%.(Sinshemer I. Iapodic V.Burck. J.Anal.Biochem., 57, 227, 1974). Основные недостатки данного способа: довольно низкий выход, использование пожароопасных растворителей в большом количестве.
Аналогом вышеописанного способа является известный способ получения флуоресцеин-5-изотиоцианата, в котором для снижения пожароопасности процесса, повышения его эффективности в качестве реагента, связывающего хлористый кальций, используют амиды или третичные амины, а образовавшуюся реакционную массу обрабатывают водой. Исходными продуктами в данном способе, как и в предыдущем, являются 5-аминофлуоресцеин и тиофосген. (SU 633879, С09В 11/08, С09К 11/06, 1978). Полученный данным способом флуоресцеин-5-изотиоцианат нейтральный является хроматографически чистым продуктом, содержащим 95-96% основного вещества. Выход целевого продукта составляет 60-75% от теории при расчете на исходный 5-аминофлуоресцеин. Основной недостаток данного способа - недостаточно высокий выход целевого продукта, а также недостаточно высокая чистота целевого продукта, не удовлетворяющая требованиям, предъявляемым к реагентам, применяемым при иммунофлуоресцентном окрашивании.
Для получения реагента, удовлетворяющего требованиям, предъявляемым к иммунофлуоресцентным красителям, используемым для быстрой диагностики вирусных инфекций предлагается Способ получения флуоресцеин-5-изотиоцианата, осуществляемый реакцией взаимодействия 5-аминофлуоресцеина с серосодержащим соединением, в котором в качестве серосодержащего соединения используется сероуглерод, а реакция взаимодействия 5-аминофлуоресцеина с сероуглеродом проводится в присутствии триэтиламина при их мольном соотношении, соответственно, равном 0,048:0,25:0,4, при этом при осуществлении реакции первоначально смешивается сероуглерод и триэтиламин в среде пиридина, после чего к образовавшемуся раствору при 0°С добавляется раствор аминофлуоресцеина в пиридине или диметилформамиде и полученная реакционная масса перемешивается при этой же температуре в течение 4,5-5,5 часов и затем смешивается с водным раствором, содержащим 0,05 моля соли тяжелого металла, выбранного из группы: свинец, медь, висмут, полученный раствор подкисляется до рН 6,5-7 и выпавший осадок отфильтровывают, промывают дистиллированной водой и сушат, после чего его экстрагируют кипящим ацетоном, ацетоновый экстракт упаривают, охлаждают, отфильтровывают и промывают хлороформом. Оптимально экстракция проводится кипящим ацетоном 2-4 раза и в качестве солей тяжелых металлов оптимально используются азотнокислый свинец или сернокислая медь, или азотнокислый висмут.
В основе предлагаемого способа получения флуоресцеин-5-изотиоцианата лежит известная реакция взаимодействия 5-аминофлуоресцеина с серосодержащим соединением, в котором в качестве серосодержащего соединения используется сероуглерод. Ниже приводится механизм и схема синтеза флуоресцеин-5-изотиоцианата предлагаемым способом:
2
5
3
+
Согласно приведенной схеме, 5-аминофлуоресцеин реагирует с сероуглеродом в присутствии триэтиламина с образованием триэтиламмониевой соли флуоресцеиндитиокарбаминовой кислоты (CHN(S)-S(CH)NH, которая под действием соли тяжелого металла с последующим нагреванием превращается во флуоресцеин-5-изотиоцианат.
Как и в аналогах в качестве исходного продукта используется 5-аминофлуоресцеин. Вторым исходным продуктом в предлагаемом способе является сероуглерод, легко превращаемый под воздействием триэтиламина в триэтиламмониевую соль дитиокарбаминовой кислоты. Катализирующую роль в образовании конечного продукта играют соли тяжелых металлов, которые образуют промежуточные соединения, легко и без образования побочных продуктов переводимые в конечное соединение.
Процесс технологичен, не энергоемок, так как при его осуществлении не требуется применение высоких температур и сложного оборудования, не требует применения больших объемов растворителей и токсичных реагентов.
Для проведения заявляемого способа подобраны температурные и временные режимы, а также оптимальные соотношения реагентов, а именно, мольное соотношение аминофлуоресцеин сероуглерод: триэтиламин составляет 0,048:0,25:0,4. Добавляемый каталитический водный раствор, содержащий 0,05 моля соли тяжелого металла, выбранного из группы: свинец, медь, висмут.
Предлагаемое изобретение иллюстрируется ниже приведенными примерами.
Пример 1. В четырехгорлую круглодонную колбу емкостью 0,5 л, снабженную механической мешалкой, газоотводной трубкой, термометром и капельной воронкой загружают 15 мл (0,25 м) сероуглерода, 56 мл (0,4 м) триэтиламина и 40 мл пиридина. К полученному раствору при 0°С прикапывают раствор 16,8 г (0,048 м) 5-аминофлуоресцеина в 200 мл пиридина. Реакционную массу при этой температуре перемешивают 5,5 часа, затем выливают в трехлитровую коническую колбу, содержащую раствор 16,6 г (0,05 м) азотнокислого свинца в 2400 мл дистиллированной воды и подкисляют уксусной кислотой до рН 6,5-7. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают 300 мл дистиллированной воды и сушат в вакуум-эксикаторе над фосфорным ангидридом. Сухой осадок экстагируют четыре раза по 100 мл кипящего ацетона. Объединенный ацетоновый экстракт упаривают до объема 150 мл, охлаждают и отфильтровывают, промывают 100 мл охлажденного хлороформа.
Выход флуоресцеин-5-изотиоцианата составляет 13,2 г (70%).
Содержание основного вещества более 99%.
Пример 2. В четырехгорлую круглодонную колбу емкостью 0,5 л, снабженную механической мешалкой, газоотводной трубкой, термометром и капельной воронкой загружают 15 мл (0,25 м) сероуглерода, 56 мл (0,4 м) триэтиламина и 40 мл пиридина. К полученному раствору при 0°С прикапывают раствор 16,8 г (0,048 м) 5-аминофлуоресцеина в 200 мл диметилформамида. Реакционную массу при этой температуре перемешивают 5 часов, затем выливают в трехлитровую коническую колбу, содержащую раствор 8,0 г (0,05 м) сернокислой меди в 2400 мл дистиллированной воды и подкисляют уксусной кислотой до рН 6,5-7. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают 300 мл дистиллированной воды и сушат в вакуум-эксикаторе над фосфорным ангидридом. Сухой осадок экстагируют 2 раза по 100 мл кипящего ацетона. Объединенный ацетоновый экстракт упаривают до объема 150 мл, охлаждают и отфильтровывают, промывают 100 мл охлажденного хлороформа.
Выход флуоресцеин-5-изотиоцианата составляет 13,7 г (73%) Содержание основного вещества более 99%.
Пример 3. В четырехгорлую круглодонную колбу емкостью 0,5 л, снабженную механической мешалкой, газоотводной трубкой, термометром и капельной воронкой загружают 15 мл (0,25 м) сероуглерода, 56 мл (0,4 м) триэтиламина и 40 мл пиридина. К полученному раствору при 0°С прикапывают раствор 16,8 г (0,048 м) 5-аминофлуоресцеина в 200 мл пиридина. Реакционную массу при этой температуре перемешивают 4,5 часа, затем выливают в трехлитровую коническую колбу, содержащую раствор 19,75 г (0,05 м) висмута азотнокислого, в 2400 мл дистиллированной воды и подкисляют уксусной кислотой до рН 6,5-7. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают 300 мл дистиллированной воды и сушат в вакуум-эксикаторе над фосфорным ангидридом. Сухой осадок экстагируют 2 раза по 200 мл кипящего ацетона, ацетоновый экстракт упаривают до объема 150 мл, охлаждают и отфильтровывают, промывают 100 мл охлажденного хлороформа.
Выход флуоресцеин-5-изотиоцианата составляет 13,5 г (72%). Содержание основного вещества более 99%.
Получение целевого продукта подтверждены физико-химическими методами (спектром ГЖХ и спектром поглощения).
Спектр поглощения флуоресцеин -5-изотиоцианата в 0,05 м растворе двузамещенного фосфата натрия имеет  493 нм максимум поглощения.
Полученный флуоресцеин-5-изотиоцианат имеет максимум люминесценции