Новые представления о механизмах действия доксорубицина и озона на злокачественные клетки печени

новые представления действия доксорубицина и на злокачественные клетки ПЕН1

DOI: 10.17691/stm2017.9.2.18 УДК 616.36-006.6:612.014.464+615.2.244 Поступила 22.12.2016 г.

А.В. Алясова, д.м.н., профессор кафедры онкологии1;

И.Г. Терентьев, д.м.н., профессор, зав. кафедрой онкологии, проректор по научной раб С.Н. Цыбусов, д.м.н., профессор, зав. кафедрой оперативной хирургии и топографической

проректор по учебной работе1;

М.В. Ведунова, д.б.н., директор Института биологии и биомедицины2;

Т.А. Мищенко, к.б.н., старший научный сотрудник ЦНИЛ1;

К.А. Шахова, к.б.н., ассистент кафедры клинической лабораторной диагностики1;

К.Н. Конторщикова, д.б.н., профессор, зав. кафедрой клинической лабораторной диагностики1

Нижегородская государственная медицинская академия, Н. Новгород, 603005, пл. Минина и Пожарского, 10/1;

Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского,

Н. Новгород, 603950, пр. Гагарина, 23

Цель исследования — экспериментально подтвердить схожесть пусковых механизмов действия озона и доксорубицина на культуре злокачественных клеток печени человека.

Материалы и методы. В экспериментах на культуральной среде изучали влияние химиопрепарата доксорубицина, озона и их сочетаний на злокачественные клетки печени (SK-HEP-1).

Результаты. Установлено сходное повышение показателей свободнорадикального окисления при действии озона и доксору-бицина как изолированно, так и в сочетании. Их введение во всех вариантах повышало также содержание фермента каспазы-3, при этом уровни каспазы-3 были существенно выше при введении доксорубицина. Полученные результаты показывают новые механизмы влияния озона и доксорубицина на жизнеспособность и морфологические изменения в злокачественных клетках печени: активация свободнорадикального окисления вызывает в этих клетках изменения как некротические, так и апоптотические — через увеличение количества каспаз.

Ключевые слова: злокачественные клетки печени; озон; доксорубицин; каспаза.

Как цитировать: Alyasova A.V., Terentiev I.G., Tsybusov S.N., Vedunova M.V., Mishchenko Т.А., Shakhova K.A., Kontorshchikova K.N. Novel notions of the mechanisms of action of doxorubicin and ozone on malignant hepatic cells. Sovremennye tehnologii v medicine 2017; 9(2): 145-149, https://doi.org/10.17691/stm2017.9.2.18

English

Novel Notions of the Mechanisms of Action of Doxorubicin and Ozone on Malignant Hepatic Cells

АМ. Аlyasova, MD, DSc, Professor, Department of Oncology1;

I.G. Terentiev, MD, DSc, Professor, Head of the Department of Oncology, Vice-Rector on Scientific Work1; S.N. Tsybusov, MD, DSc, Professor, Head of the Department of Operative Surgery and Topographic Anatomy, Vice-Rector for Academic Affairs1;

WI.V. Vedunova, DSc, Director of the Institute of Biology and Biomedicine2; Т.А. Wlishchenko, PhD, Senior Researcher, Central Research Laboratory1; KA Shakhova, PhD, Tutor, Department of Clinical Laboratory Diagnosis1; K.N. Kontorshchikova, DSc, Professor, Head of the Department of Clinical Laboratory Diagnosis1

1Nizhny Novgorod State Medical Academy, 10/1 Minin and Pozharsky Square, Nizhny Novgorod, 603005, Russian Federation;

2Lobachevsky State University of Nizhni Novgorod, 23 Prospect Gagarina, Nizhny Novgorod, 603950, Russian Federation

Для контактов: Конторщикова Клавдия Николаевна, e-mail: kontclin@mail.ru

The aim of the investigation was to verify the similarity of triggering mechanisms of ozone and doxorubicin action on the culture of human malignant hepatic cells.

Materials and Methods. The effect of chemotherapeutic agent doxorubicin, ozone and their combination on malignant hepatic cells (SK-HEP-1) has been studied experimentally on the culture medium.

Results. A similar increase of free radical oxidation has been established to occur under the action of ozone and doxorubicin both separately and in combination. Their introduction in all variants elevated also the content of caspase-3 enzyme, and the levels of caspase-3 were substantially higher than in doxorubicin introduction. The results obtained show new mechanisms of ozone and doxorubicin effect on the viability and morphological alterations in malignant hepatic cells: activation of free radical oxidation induces necrotic and apoptotic changes in these cells via the increase of caspase quantity.

Key words: malignant hepatic cells; ozone; doxorubicin; caspase.

В проведенных ранее экспериментах [1] на лабораторных животных (крысах), которым перевивался штамм рака молочной железы, исследовалось влияние на опухоль химиопрепарата доксорубицина, озона и их комбинированного введения. Полученные результаты продемонстрировали, что сочетанное воздействие низких терапевтических концентраций озона в составе озонированного физиологического раствора и доксорубицина оказывало наиболее выраженный деструктивный эффект на опухоль. Использование озонированного физиологического раствора потенцировало противоопухолевую активность доксорубицина, что проявлялось в выраженном угнетении мито-тической активности опухолевых клеток и снижении числа их жизнеспособных элементов. Исследование ИК-спектров тканей опухоли, печени, легких, мозга животных-опухоленосителей [2] также подтвердило более высокий терапевтический эффект сочетанного действия доксорубицина и озона.

Продолжением исследований явились эксперименты на культуре нормальных клеток печени Chang liver и злокачественных клеток печени SK-HEP-1 человека [3]. Установлено, что введение озона в культуральную среду оказывает сходный с доксорубицином выраженный цитостатический эффект на жизнеспособность клеток, что подтверждалось морфологическими данными о необратимых изменениях в структуре клеточных элементов некротического или апоптотиче-ского происхождения. Несмотря на доказательный материал по жизнеспособности и патоморфозу злокачественных клеток под действием анализируемых факторов, внутриклеточный механизм запуска гибели клеток остается неясным. Про доксорубицин известно, что это цитостатик антрациклинового ряда с ан-тимитотическим и антипролиферативным действием. Механизм действия препарата объясняют его реакцией с ДНК, образованием свободных радикалов и прямым воздействием на мембраны клеток с подавлением синтеза нуклеиновых кислот. В плане активации свободнорадикальных реакций действие доксоруби-цина может быть сопоставимо с действием озона как сильного окислителя, регулирующего про- и антиокси-дантный баланс [4-6].

Другим возможным механизмом, запускающим гибель клеток, является ферментативный путь с

участием каспаз. Каспазы — это семейство аспар-татспецифических цистеиновых протеаз, они присутствуют во всех клетках, взаимодействие этих протеаз с олигомерными рецепторами ведет к их активации. Активные каспазы могут запускать протеолитический каскад, расщепляющий белки, необходимые для выживания. Конечным итогом сигнального пути является активация контролируемой гибели клеток — апоптоз. Каспазы, вовлеченные в апоптоз, делятся на ини-циаторные и эффекторные. Одной из эффекторных каспаз является каспаза-3, расщепляющая субстрат на карбоксильном конце по остаткам аспартата. Ингибирование процесса апоптоза может приводить к развитию онкологических заболеваний [7].

Исходя из результатов собственных исследований и данных литературы можно предположить сопоставимость пусковых механизмов действия озона и доксо-рубицина внутри клеток.

Цель исследования — экспериментально подтвердить схожесть пусковых механизмов действия озона и доксорубицина на культуре злокачественных клеток печени человека.

Материалы и методы. Эксперименты проводили на культивированных клетках аденокарциномы печени человека SK-HEP-1, морфология — эпителио-подобная, культивирование осуществляли в среде «Игла МЕМ» с солями «Эрла» («ПанЭко», Россия) с добавлением 10% сыворотки эмбриональной телячьей («ПанЭко», Россия) и 1% заменимых аминокислот («ПанЭко», Россия), оптимальная плотность — (2,0-4,0)-106 кл./см2. Поддержание жизнеспособности клеток осуществлялось в СО2-инкубаторе при 5% содержании СО2. После 3-5 пассажей клетки рассаживали на 48- или 6-луночные планшеты. При достижении 60% монослоя среду, в которой клетки выращивались, заменяли на испытуемые среды. Первая среда готовилась добавлением химиопрепарата доксорубицина в дозе 0,004 мг; вторая — введением 150 мл кислорода; третья — введением 150 мл озоно-кислородной смеси с концентрацией озона 25 мг/л; четвертая — введением 150 мл кислорода и 0,004 мг доксорубицина; пятая — введением 150 мл озоно-кислородной смеси и 0,004 мг доксорубицина. Дозы доксорубицина и озона определены в эксперименте на животных при оценке патоморфоза злокачественной опухоли [1].

//////////////////////^^^^

146 СТМ J 2017 — том 9, №2 А.В. Алясова, И.Г. Терентьев, С.Н. Цыбусов, М.В. Ведунова, Т.А. Мищенко, К.А. Шахова, К.Н. Конторщикова

При озонировании культуральной среды озо-но-кислородная газовая смесь поступала со скоростью 1 л/мин в течение 5 мин из генератора озона («Квазар», Россия). Через 48 ч культивирования клеточная среда убиралась, клетки промывались полифосфатным буфером PBS (pH=7,4) и заливались 250 мл смеси Версен (0,02%):трипсин (0,25%) (3:1). Через 10 мин инкубации в СО2-инкубаторе клетки пи-петировали и добавляли в каждую лунку по 250 мл 8% формальдегида. После этого подсчитывали количество клеток на автоматическом анализаторе Septer (Millipore, Великобритания).

Для проведения анализа на активность свободно-радикального окисления клеточную суспензию трижды промывали забуференным физиологическим раствором и замораживали при -20°. Перед началом исследования проводили ее размораживание и гомогенизацию. Интенсивность свободнорадикального окисления оценивали по параметрам индуцированной железом и перекисью водорода хемилюминесценции на аппарате БХЛ-07 (Н. Новгород, Россия): Imax — максимальная интенсивность свечения, S — светосумма хемилюминесценции за 30 с [8]. Содержание продуктов перекисного окисления липидов — первичных диеновых конъюгатов (ДК), триеновых конъюгатов (ТК), конечных оснований Шиффа (ОШ) определяли в гептан-изопропанольных фракциях по методу И.А. Волчегорского [9]. Количество фермента каспа-зы-3 оценивали методом иммуноферментного анализа Human Caspase-3 Instant ELISA (ThermoFisher Scientific, США) и рассчитывали на количество клеток в мл (содержание клеток — 5-106/мл).

Полученные результаты были обработаны с помощью пакета прикладных программ Biostat и представлены в виде М±о, где М — среднее арифметическое, о — среднеквадратичное отклонение. Достоверность различий средних определяли по t-критерию Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при уровне значимости p<0,05.

Результаты. Введение в культуральную среду для выращивания клеток аденокарциномы печени человека SK-HEP-1 доксорубицина (табл. 1) сопровожда-

Таблица 1

Показатели хемилюминесценции гомогената злокачественных клеток печени SK-HEP-1 человека

Культуральная среда Показатели хемилюминесценции

Imax, имп./с S за 30 с, мВ

Интактные клетки

на стандартной среде 128,6±11,7 338,7±21,4

Доксорубицин 336,4±21,8* 867,6±49,3*

Кислород 143,6±26,8 386,9±51,1

Озон 327,4±43,4* 843,8±62,1*

Доксорубицин + кислород 245,3±55,2* 676,8±56,1*

Доксорубицин + озон 289,6±23,9* 683,1±61,2*

* — различия статистически значимы по сравнению с ин-тактными клетками (р^0,05).

лось статистически значимым повышением уровней показателей 1тах — в 2,7 раза и S — в 2,5 раза, что указывало на активацию свободнорадикальных реакций под действием цитостатика. Озонирование куль-туральной среды сходным с доксорубицином образом активировало свободнорадикальные реакции и проявлялось увеличением 1тах в 2,6 раза и S — в 2,5 раза. Сочетанное введение в культуральную среду доксорубицина и кислорода, а также доксорубицина и озона статистически значимо не снижало высокие уровни показателей 1тах и S, характерные для среды с док-сорубицином, и составляло для 1тах 1,8 и 2,2 раза, а для S — 2,1 и 2,5 раза соответственно.

Таким образом, предположение о том, что одним из механизмов, вызывающих снижение жизнеспособности злокачественных клеток печени и их морфологические изменения [3], являются свободнорадикальные реакции, запускаемые как окислителем, так и токсичным соединением доксорубицином, подтверждалось. Дополнительным доказательством этому явились данные по изучению уровней продуктов перекисного окисления липидов (табл. 2).

Самые выраженные изменения в показателях, характеризующих активность перекисного окисле-

Таблица 2

Содержание продуктов перекисного окисления липидов в злокачественных клетках печени SK-HEP-1 человека, отн. ед.

Продукты перекисного окисления липидов Интактные Кислород озон Доксорубицин Кислород + озон + доксорубицин доксорубицин

ДК 0,06±0,005 0,05±0,001 0,71±0,12* 0,22±0,08* 0,21±0,040* 0,37±0,11*

ТК 0,03±0,001 0,02±0,0025 0,41±0,11* 0,14±0,011* 0,13±0,012* 0,15±0,09*

ОШ 4,43±1,71 2,36±0,49 25,78±3,05* 33,0±4,20* 15,53±3,09* 29,73±3,11*

ОШ ДК+ТК 49,0±9,1 33,7±10,07 23,0±8,1 91,2±11,4* 46,0±13,2 58,3±8,9*

* — различия статистически значимы по сравнению с интактными клетками (р^0,05).

ния липидов в культуре злокачественных клеток, наблюдались в клетках, находящихся в среде с док-сорубицином. Уровни ДК в этих клетках увеличивались почти в 4 раза, ТК — в 4,5 раза, ОШ — в 4 раза. Коэффициент ОШ/(ДК+ТК), представляющий собой количественное отношение конечных продуктов к первичным, повысился в 2 раза, что свидетельствовало о сдвиге реакций в сторону накопления жестких токсичных ОШ, вызывающих повреждение клеточных мембран. Озонирование культуральной среды статистически значимо увеличивало в клетках содержание ДК в 11,8 раза, ТК — в 13,3 раза, ОШ — в 4,5 раза, коэффициент ОШ/(ДК+ТК) снижался по сравнению с исходным уровнем в 2 раза, что свидетельствовало о преобладании первичных продуктов перекисно-го окисления липидов и, следовательно, об активно продолжающемся процессе на этапах инициации. Сочетанное введение доксорубицина с кислородом и доксорубицина с озоном практически не вызывало различий по уровням ДК и ТК, в то время как для уровней ОШ и коэффициента ОШ/(ДК+ТК) (см. табл. 2) более значимые различия наблюдались при сочетании доксорубицина и озона. Высокие уровни ОШ и коэффициента ОШ/ДК+ТК свидетельствуют о накоплении конечных продуктов перекисного окисления, которые могут повреждать клетки, что может отражаться на показателях жизнеспособности и морфологии клеток.

Помимо повреждающего действия свободнора-дикального окисления на внутриклеточные структуры нельзя исключать губительного действия ферментов, вызывающих апоптоз. Одним из таких ферментов является каспаза-3. В нашем исследовании оценивалось содержание данного фермента в гомогенате клеток, содержащихся на культуральных средах, в которые вводили доксорубицин, озон, кислород и их сочетания. Самая высокая концентрация каспазы-3 отмечалась при воздействии на злокачественные клетки доксорубицином (4,76±0,06 пг/мл), она в 30 раз превышала содержание фермента в клетках интактной серии (<0,16 пг/мл). Данный факт явился подтверждением высокой апоптотической активности доксорубицина, выявляемой при морфологических исследованиях. Озонирование среды для культивирования клеток увеличивало количество каспазы в 11 раз (1,82±0,01 пг/мл). При смене среды для выращивания клеток на среду, содержащую доксорубицин и озон, количество каспазы увеличивалось в 13 раз (2,04±0,03 пг/мл), а на среду, содержащую доксорубицин и кислород, — в 16,6 раза (2,67±0,02 пг/мл).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что основной причиной запуска апоптотического процесса в наших экспериментах со злокачественными клетками, которые содержатся в средах, подвергшихся воздействию доксорубицина или окислителей, служит повышение уровней каспазы-3. В свою очередь увеличение концентрации каспазы, скорее всего, является следствием активации свободнорадикального окисления под действием как доксорубицина, так и озона.

Заключение. Введение в культуральную среду для выращивания клеток доксорубицина или озона активирует в злокачественных клетках печени процессы свободнорадикального окисления, что сопровождается увеличением продуктов липопероксидации. Их введение повышает концентрацию фермента каспазы-3 как при изолированном, так и при сочетанном действии, при этом в случае использования доксорубицина повышение количества каспазы-3 более существенно. Активация свободнорадикального окисления вызывает как некротические, так и апоптотические изменения в клетках культуры печени — через увеличение количества каспаз.

Финансирование исследования. Работа не финансировалась никакими источниками.

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.

Литература/References

1. Алясова А.В., Конторщикова К.Н., Терентьев И.Г., Иванова И.П., Кузнецов С.С., Сазанов А.И. Влияние низких терапевтических концентраций озонированного физиологического раствора на терапевтический патоморфоз опухоли в эксперименте. Современные технологии в медицине 2010; 4: 27-32. Alyasova A.V., Kontorshickova K.N., Terentiev I.G., Ivanova I.P., Kuznetsov S.S., Sazanov A.I. Influence of the ozonized physiologic salt solution low therapeutic concentrations on a tumor therapeutic pathomorphosis in experiment. Sovremennye tehnologii v medicine 2010; 4: 27-32.

2. Красникова О.В., Гордецов А.С., Конторщикова К.Н., Крылов В.Н., Сазанов А.И. Изменение параметров ИК-спектров биологических тканей животных-опухоленоси-телей на фоне совместного введения доксорубицина и озона. Современные технологии в медицине 2011; 3: 8387. Krasnikova O.V., Gordetsov А^., Kontorstchikova K.N., Krylov V.N., Sazanov А.1. The change of infrared spectrum parameters of biological tissues of animals-carriers of tumours against the background of combined administration of doxorubicin and ozone. Sovremennye tehnologii v medicine 2011; 3: 83-87.

3. Alyasova A.V., Vedunova M.V., Mishchenko T.A., Terentyev I.G., Tsybusov S.N., Kontorshchikova K.N. Effect of ozone and doxorubicin on the viability and morphology of malignant hepatic cells. Sovremennye tehnologii v medicine 2016; 8(2): 84-89, http://dx.doi.org/10.17691/stm2016.8.2.12.

4. Конторщикова К.Н. Перекисное окисление липидов при коррекции гипоксических нарушений физико-химическими факторами. Автореф. дис. ... докт. биол. наук. Н. Новгород; 1992. Kontorshchikova K.N. Perekisnoe okislenie lipidov pri korrektsii gipoksicheskikh narusheniy fiziko-khimicheskimi faktorami. Avtoref. dis. ... dokt. biol. nauk [Lipid peroxidation during the correction of hypoxic disorders by physico-chemical factors. DSc Thesis]. Nizhny Novgorod; 1992.

5. Масленников О.В., Конторщикова К.Н., Шахов Б.Е. Руководство по озонотерапии. Н. Новгород: Издательство "Исток"; 2015; 345 c. Maslennikov O.V., Kontorshchikova K.N., Shakhov B.E. Rukovodstvo po ozonoterapii [Guidelines on ozone therapy]. Nizhny Novgorod: Izdatel'stvo "Istok"; 2015; 345 p.

6. Конторщикова К.Н., Перетягин С.П. Закономерность формирования адаптационных механизмов орга-

//////////////////////^^^^

148 СТМ J 2017 — том 9, №2 А.В. Алясова, И.Г. Терентьев, С.Н. Цыбусов, М.В. Ведунова, Т.А. Мищенко, К.А Шахова, К.Н. Конторщикова

низмов млекопитающих при системном воздействии низкими терапевтическими дозами озона. Диплом на открытие 309. 2006. Kontorshchikova K.N., Peretyagin S.P. Zakonomernost' formirovaniya adaptatsionnykh mekhanizmov organizmov mlekopitayushchikh pri sistemnom vozdeystvii nizkimi terapevticheskimi dozami ozona [Principles governing formation of adaptive mechanisms of mammal organisms under systemic exposure to low therapeutic ozone doses]. Diplom na otkrytie No.309 [Diploma for Discovery 309]. 2006.

7. Сарвилина И.В., Каркищенко В.Н., Горшкова Ю.В. Междисциплинарные исследования в медицине. М: Техносфера; 2007; c. 139-145. Sarvilina I.V., Karkishchenko V.N., Gorshkova Yu.V. Mezhdistsiplinarnye issledovaniya v meditsine [Interdisciplinary investigations in medicine]. Moscow: Tekhnosfera; 2007; p. 139-145.

8. Кузьмина Е.И., Нелюбин А.С., Щенникова М.К. Применение индуцированной хемилюминесценции для оценок свободнорадикальных реакций в биологических

субстратах. В кн.: Межвузовский сборник биохимии и биофизики микроорганизмов. Горький; 1983; c. 179— 183. Kuz'mina E.I., Nelyubin A.S., Shchennikova M.K. Primenenie indutsirovannoy khemilyuminestsentsii dlya otsenok svobodnoradikal'nykh reaktsiy v biologicheskikh substratakh. V kn.: Mezhvuzovskiy sbornik biokhimii i biofiziki mikroorganizmov [Application of induced chemiluminescency for assessing free radical reactions in biological substrates. In: Intercollegiate book on biochemistry and biophysics of microorganisms]. Gor'kiy; 1983; p. 179-183.

9. Волчегорский И.А., Налимов А.Г., Яровинский Б.Г., Лифшиц Р.И. Сопоставление различных подходов к определению продуктов ПОЛ в гептан-изопропанольных экстрактах крови. Вопросы медицинской химии 1989; 1: 127-131. Volchegorskiy I.A., Nalimov A.G., Yarovinskiy B.G., Lifshits R.I. Comparison of various approaches to determination of LPO products in heptane-isopropanol extracts of blood. Voprosy meditsinskoy khimii 1989; 1: 127-131.