Способ выделения карбоксилэстеразы семенной плазмы человека
METHOD OF EXTRACTING CARBOXYL ESTERASE OF HUMAN SEED PLASMA

Изобретение относится к области медицины, а именно биохимии, и может быть использовано, в частности, для выделения карбоксилэстеразы семенной плазмы человека.
(
В практике известен способ выделения карбоксилэстеразы семенной плазмы, основанный на сочетании преципитации сульфатом аммония, гель-фильтрации, ионообменной хроматографии и изоэлектрического фокусирования  Биохимическое и иммунохимическое изучение белков семенной плазмы человека. НиколаевА.А. автореферат дис. ... доктора медицинских наук / Астрахань, 1994) .
Недостатками этого метода являются:
трудоемкость;
длительность проведения;
невысокий выход продукта
недостаточная чистота конечного продукта.
Целью представленного изобретения является повышение чистоты конечного продукта, упрощение и ускорение способа очистки карбоксилэстеразы семенной плазмы.
Указанный технический результат достигается тем, что семенную плазму человека смешивают с  анионообменным тойоперлом, уравновешенным трис-НС1 буфером далее полученную смесь центрифугируют и собирают надосадочную жидкость, затем через колонку иммобилизованного лектина бобов солодки гладкой, пропускали весь объем полученной на предшествующей стадии, далее колонку промывают 1М раствором хлорида натрия, забуференного трис-НCl буфером, а затем элюируют, связанную на колонке карбоксилэстеразу семенной плазмы человека 0,1 М раствором лактозы в боратном буфере рН=9,0.
Очистку карбоксилэстеразы семенной плазмы проводили по предлагаемому способу.  В работе использовали семенную плазму, которая отделялась центрифугированием от сперматозоидов (5000g, 15 мин) и хранилась в замороженном виде  при -30С без добавления консервантов и ингибиторов протеолиза. Таким образом было накоплено 1200,0 мл семенной плазмы, которая далее использовалась для выделения карбоксилэстеразы семенной плазмы.
На первой стадии очистки семенную плазму смешивали с 10 mM Tris-HCl,буфер pH 7,4 в соотношении 1:1, полученную смесь смешивали с анионообменным тойоперлом ДЭАЕ, в соотношении 4:1 или 5:1 и инкубировали  в течении 30 минут. Через 1 час указанную смесь центрифугировали в течение 5-10 минут при 500 об/мин. Образовавшийся осадок ионообменника промывали 4-5 кратным объемом стартового буфера, который также отделяли центрифугированием. Полученные надосадочные жидкости объединяли и использовали на следующей стадии очистки.
На следующей  стадии очистки карбоксилэстеразы семенной плазмы человека использовали объединенную надосадочную жидкость. Нами обнаружена способность лектина бобов солодки  гладкой  (Glycyrrhiza glabra) преципитировать термостабильную эстеразу семенной плазмы человека. На рисунке (Фиг. 1. Преципитация препаратов карбоксилэстеразы семенной плазмы человека лектином бобов солодки гладкой. 1 - препарат карбоксилэстеразы семенной плазмы человека (65 мкг/мл); 2 – термостабильная фракция семенной плазмы; 3 – преципитат 50% сульфата аммония из термостабильной фракции семенной плазмы.; 4 - фракция, после аффинной хроматографии. Агаровый гель содержит полуочищенный лектин бобов солодки гладкой в конечной концентрации  0,50 мг на 100 мл агара.   окраска на общий белок кумаси блю.) показана преципитация фракций поэтапной очистки карбоксилэстеразы семенной плазмы человека по сравнению со стандартным препаратом, полученным по способу, описанному в прототипе в агаровом геле, содержащем лектин бобов солодки  гладкой. Образцы № 2,3,4 стандартизованы по уровню общего белка и приведены по концентрации его к уровню в стандартном препарате карбоксилэстеразы семенной плазмы человека – 65 мкг/мл.
Снижение диаметра колец преципитации обусловлено повышением степени очистки карбоксилэстеразы семенной плазмы человека и уменьшением количества балластных белков, способных преципитироваться лектином бобов солодки гладкой.
Заключительная стадия очистки карбоксилэстеразы семенной плазмы человека представляет собой аффинную хроматографию карбоксилэстеразы семенной плазмы человека на иммобилизованном лектине бобов солодки гладкой. Через колонку (1,5х12см) лектин-сефарозы, уравновешенную трис-НCl буфером, пропускали весь объем полученной на предшествующей стадии, фракции Далее колонку промывали 1М раствором хлорида натрия, забуференного трис-НCl буфером, а затем элюировали, связанную на колонке карбоксилэстеразу семенной плазмы человека 0,1 М раствором лактозы в боратном буфере рН=9,0. Полученный элюат диализовали и концентрировали до приемлемого объема.
-4
Далее в таблице 1. показаны этапы очистки карбоксилэстеразы семенной плазмы человека. Предложенный способ повышает эффективность(повышает выход конечного продукта на 52%), сокращает время и упрощает очистку карбоксилэстеразы семенной плазмы человека по сравнению со способом (Биохимическое и иммунохимическое изучение белков семенной плазмы человекаНиколаевА.А. автореферат дис. ... доктора медицинских наук / Астрахань, 1994).   В прототипе очистка состоит из 5 этапов, а в нашем из 2. Главное преимущество нашего способа заключается в применении аффинной хроматографии, на малоизученном лектине растительного происхождения из бобов солодки гладкой. Этот лектин  обладает высоким сродством к галактозосодержащим гликопротеинам. По нашим данным константа диссоциации лактозы с этим лектином составляет 1,34х10мМ
Это позволяет однократно повысить степень очистки в 175 раз.
Самое главное, в отличие от прототипа, наш способ позволяет связать всю массу карбоксилэстеразы семенной плазмы человека, а не повторять многократно операцию хроматографии, выделяя за один сеанс не более 0,1 мг препарата.
На рис.2 (Фиг.2. Электрофорез в полиакриламидном геле. А – семенная плазма человека; В – фракция после осаждения сульфатом аммония из водно-солевого экстракта; С - карбоксилэстераза семенной плазмы– фракция после аффинной хроматографии). показано, что препарат карбоксилэстеразы семенной плазмы человека гомогенен при электрофоретическом контроле чистоты.
На фиг3. ( Фиг.3 Высокоэффективная жидкостная хроматография очищенного препарата карбоксилэстеразы семенной плазмы человека. Колонка Нуклеосил С-18. 123,0х4,3мм. Элюция 0,1% ТФУ и градиент ацетонитрила от 0 до 60% за 50 мин, скорость потока 1мл/мин.) показано, что препарат карбоксилэстеразы семенной плазмы человека гомогенен при электрофоретическом и хроматографическом контроле чистоты.
Ниже приводятся результаты апробации.
Пример №1.
На первой стадии выделения семенную плазму человека центрифугируют далее смешивают с  анионообменным тойоперлом, уравновешенным трис - НС1 буфером в соотношении 4:1, а через 1 час полученную смесь центрифугируют в течение 10 мин при 500g, собирая надосадочную жидкость. Образовавшийся осадок ионообменника промывали 4 кратным объемом стартового буфера, который также отделяли центрифугированием. Полученные надосадочные жидкости объединяли и использовали на следующей стадии очистки.  Заключительная стадия очистки карбоксилэстеразы семенной плазмы человека представляет собой аффинную хроматографию карбоксилэстеразы семенной плазмы человека на иммобилизованном лектине бобов солодки гладкой. Через колонку (1,5х12см) лектин-сефарозы, уравновешенную трис-НCl буфером, пропускали весь объем полученной на предшествующей стадии, фракции.  Далее колонку промывали 1М раствором хлорида натрия, забуференного трис-НCl буфером, а затем элюировали, связанную на колонке карбоксилэстеразу семенной плазмы человека 0,1 М раствором лактозы в боратном буфере рН=9,0. Полученный элюат диализовали и концентрировали до приемлемого объема (18 мл).
Пример №2
На первой стадии очистки семенную плазму смешивали с 10 mM Tris-HCl,буфер pH 7,4 в соотношении 1:1, полученную смесь смешивали с анионообменным тойоперлом ДЭАЕ, в соотношении 5:1 и инкубировали  в течении 30 минут. Через 1 час указанную смесь центрифугировали в течение 5 минут при 500 об/мин. Образовавшийся осадок ионообменника промывали 5 кратным объемом стартового буфера, который также отделяли центрифугированием. Полученные надосадочные жидкости объединяли и использовали на следующей стадии очистки. Заключительная стадия очистки карбоксилэстеразы семенной плазмы человека представляет собой аффинную хроматографию карбоксилэстеразы семенной плазмы человека на иммобилизованном лектине бобов солодки гладкой. Через колонку (1,5х12см) лектин-сефарозы, уравновешенную трис-НCl буфером, пропускали весь объем полученной на предшествующей стадии, фракции.  Далее колонку промывали 1М раствором хлорида натрия, забуференного трис-НCl буфером, а затем элюировали, связанную на колонке карбоксилэстеразу семенной плазмы человека 0,1 М раствором лактозы в боратном буфере рН=9,0. Полученный элюат диализовали и концентрировали до приемлемого объема (16 мл).
Предложенный нами способ :
- повышает чистоту конечного продукта;
-повышает эффективность (повышает выход конечного продукта на 45%);
-сокращает время выделения карбоксилэстеразы семенной плазмы человека;
-упрощает выделение карбоксилэстеразы семенной плазмы человека.