ЦИТОАРХИТЕКТОНИКА ЛИМФОЦИТОВ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ В УСЛОВИЯХ АКТИВАЦИИ И БЛОКАДЫ β-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ

УДК 612.1

М. Ю. Скоркина, М. З. Фёдорова, А. В. Муравьёв

Цитоархитектоника лимфоцитов здоровых доноров в условиях активации и блокады Р-адренорецепторов

Методом полуконтактной АСМ изучена цитоархитектоника лимфоцитов и измерен модуль упругости клеточной поверхности в условиях активации и блокады Р-адренорецепторов in vitro. Установлено увеличение жесткости клеточной поверхности лимфоцитов под влиянием адреналиновой нагрузки и появление большого числа глобулярных выступов со сниженной высотой.

Ключевые слова: лимфоциты, цитоархитектоника, модуль упругости, атомно-силовая спектроскопия, Р-адренорецеторы.

М. Ju. Skorkina, М. Z. Fiodorova, А. V. Muraviov

Cytoarchitecture of Healthy Donors' Lymphocytes in Conditions of Activation and Blockade of P-Adrenoreceptors

With the help of the semicontact atomic-power microscopy method it is studied cytoarchitecture of lymphocytes and the module of elasticity cellular surface in the conditions of activation and blockade P-adrenoreceptors in vitro is measured. Is determined the increase in rigidity cellular surface of lymphocytes under the influence of adrenalinic loading and great number occurrence of globular outsets with decreased height.

Keywords: lymphocytes, cytoarchitecture, the elasticity module, atomic-power spectroscopy, ß-adrenoreceptors.

Введение

Изучение цитоархитектоники клеток крови имеет большой практический интерес, поскольку определяет их функциональную активность, изменяющуюся в ходе жизненного цикла [2]. Несмотря на широкий спектр исследований, посвященных морфологии клеточной поверхности методами растровой электронной микроскопии [4, 6, 7], использование атомно-силовой микроскопии (АСМ) позволяет получать информацию о рельефе и упруго-эластических свойствах клеток [13]. К настоящему моменту изучена морфология лейкоцитов человека и животных [1, 11], проведен количественный анализ упругих свойств ядерных и безъядерных нативных эритроцитов, выявлена инверсия эластических свойств клеток при воздействии фиксаторов [10], построены карты локальной упругости эритроцитов лягушек, которые позволяют идентифицировать структурные трансформации поверхности в условиях активации и блокады адренорецепторов [9]. Согласно данным РЭМ, характерной чертой топографии лимфоцитов является наличие ворсинчатой структуры, которая изменяется при ро-зеткообразовании, бласттрнасформации, культивировании суспензии [2, 4]. Однако данные от-

носительно особенностей тонкой ультраструктурной организации поверхности лимфоцитов и изменения их жесткости при воздействии физиологически активных веществ отсутствуют. Целью выполненного исследования явилось изучение цитоархитектоники лимфоцитов в условиях активации и блокады адренорецепторов.

Материалы и методы исследования

Эксперименты выполнены на периферической крови 50 здоровых доноров в возрасте от 25 до 45 лет. Лейкоциты получали путем центрифугирования цельной стабилизированной ЭДТА крови при 1500 об/мин в течение 10 мин. Удаляли верхний слой плазмы. Собирали нижнюю часть плазмы, богатую лейкоцитами, и лейкоцитарное кольцо. Примесь эритроцитов разрушали 0,83 % раствором хлорида аммония. Клетки дважды отмывали изотоничным буферным раствором (раствор Дульбекко, рН=7,4). Активацию Р-адренорецепторов осуществляли путем инкубации 30 мкл суспензии лимфоцитов в 150 мкл среды КРМ1, содержащей 10-9ммоль/л адреналина, в течение 15 мин при температуре 37°С. Блокаду Р-адренорецепторов осуществляли путем инкубации 30 мкл суспензии лимфоцитов в 150

© Скоркина М. Ю., Фёдорова М. З., Муравьёв А. В, 2011

мкл среды RPMI, содержащей 10" ммоль/л обзи-дана, в течение 15 мин при температуре 37°C. По окончании времени инкубации изучали цитоар-хитектонику клеток крови с использованием атомно-силового микроскопа (АСМ) ИНТЕГРА Вита (конфигурация на базе инвертированного оптического микроскопа Olympus IX-71). Суспензию лимфоцитов наносили на чистые обезжиренные стеклянные подложки, которые помещали во влажную камеру [8] для сохранения их жизнеспособности. Проводили сканирование 25 клеток из каждой опытной и контрольной пробы в полуконтактном режиме с частотой развертки

жесткостью 1,1 Н/м и радиусом закругления 10 нм. На полученных сканах с помощью программного обеспечения "Nova" (Зеленоград, 2009) строили кривые профиля участков поверхности размером 3,5X3,5 мкм (рис. 1), на которых измеряли глубину и ширину кластеров, образовавшихся под влиянием адреналина и обзидана. Кроме того, подсчитывали количество и измеряли высоту глобулярных выступов на поверхности лимфоцитов в контроле и после экспозиционных нагрузок. В качестве контроля использовали клетки, помещенные в аутологичную плазму без нагрузок.

/ \

\

\

V \

/ \ / \ \ \

\ \ i ; \

5 х ;

\ /

а "Д.......

\

s !

<> :/, I (* 1 •> Plane, fjm О ? 5 3 О 3 5

Рис. 1. Кривая профиля поверхности лимфоцита в аутологичной плазме

2).

Используя метод эластографии, измеряли модуль Юнга, количественно характеризующий жесткость поверхности. В основе этого метода лежит измерение степени деформации поверхности образца при взаимодействии его с вершиной зонда АСМ [12]. Количественно модуль Юнга оценивали по экспериментальным силовым кривым, снятым с поверхности клеток при проведении процедуры силовой спектроскопии. Для расчета модуля Юнга использовали модель Герца, которая рассматривает взаимодействие жесткой полусферы АСМ-зонда и плоскости биологического образца [22]. Получаемые в эксперименте силовые кривые преобразовывали из системы координат D-z к системе F-Ah, где D - ток рассогласования фотодиода, z - расстояние, на которое перемещается кантилевер пьезосканером АСМ при подводе к поверхности [5], затем пере-

водили сигнал рассогласования фотодиода в силу взаимодействия зонда и образца по формуле [16]:

а

's,oft

где к11р - коэффициент жесткости АСМ-зонда, 08ой - ток рассогласования фотодиода, полученный на биологическом образце, а - тангенс угла наклона на линейном участке силовой кривой.

Модуль Юнга системы образец-игла рассчитывали по формуле [17]:

р= 3

где Б - сила, действующая на образец, Я - радиус закругления зонда, АЬ - глубина проникновения зонда в поверхность образца, Е - модуль Юнга.

Для работы с клетками крови использовали модифицированные АСМ-зонды в виде полусфер с радиусом закругления 2,5 мкм [14].

Полученные экспериментальные данные статистически обработаны. Достоверность различий

определяли с использованием 1>критерия Стью-дента.

Результаты исследования и их обсуждение

На поверхности лимфоцитов в плазме выявлены глобулярные выступы и впадины в виде кластеров (рис. 2).

IJfB

эА

дин

Jv5

Рис. 2. ЭБ-скан участка лимфоцита в аутологичной плазме: 1 - глобулярные выступы; 2 - впадины Размеры кластеров резко варьировали, в связи с чем они были разделены на 4 группы (табл. 1).

Таблица 1

Цитоархитектоника лимфоцитов в условиях активации и блокады ß-адренорецепторов_

Типы структур Кластеры Глобулярные выступы

глубина, нм | ширина, нм высота, нм | количество, шт.

Контроль

1 группа 8,0±0,68 171,0±15,89 41,3±3,68 36±0,98

2 группа 15,9±1,25 296,0±7,21

3 группа 22,3±1,32 184,0±11,51

4 группа 43,5±1,05 290,0±10,0

Адреналин

1 группа 5,6±0,15* | 63,7±1,1* | 17,5±0,53* | 46±1,1*

Обзидан

1 группа 6,8±0,4 85,2±2,4* 75,7±8,8* 35±0,56

2 группа 17,4±1,8 123,7±1,5*

*- статистически достоверные различия между значениями в контроле и после адреналиновой / обзидановой нагрузок по критерию Стьюдента при р<0,05.

Большую часть поверхности лимфоцитов (около 40 %) занимали мелкие кластеры 1 группы. Около 28 % приходилось на кластеры 2 группы и 22 и 11 % соответственно составляли структуры 3-й и 4-й групп. После адреналиновой нагрузки наблюдали сглаживание рельефа лимфоцитов. Уменьшалась глубина и ширина кластеров 1 группы соответственно на 43 и 168 % (р<0,05), исчезали структуры 2-4 групп.

Под влиянием обзидана глубина кластеров 1 и 2 групп существенно не изменилась, но при этом заметно уменьшилась их ширина, соответственно на 100,7 и 38,2 % (р<0,05) по сравнению с

контролем. Кластеров 3 и 4 групп после воздействия обзидана не выявлено.

В рельефе клеток были идентифицированы шероховатости в виде глобулярных выступов. Под влиянием адреналина количество глобул на участке поверхности возрастало (рис. 3 а), а их высота снижалась на 136% (р<0,05) по сравнению с контролем. При воздействии блокатора Р-адренорецепторов обзидана высота глобул увеличивалась на 45 % (р<0,05), а их общее количество (рис. 3 б) на участке поверхности не изменялось по сравнению с контролем (см. табл. 1).

Рис. 3. ЭБ-скан участка мембраны лимфоцита: а - после адреналиновой нагрузки, б - после воздействия обзидана

Под влиянием адреналина возрастал модуль вера уменьшалась на 122 % (р<0,05) по сравне-упругости (модуль Юнга) лимфоцитов на 36,4 % нию с контролем (табл. 2). Обзидан существенно (р<0,05), при этом глубина погружения кантиле- не изменял жесткость клеточной поверхности.

Таблица 2

Модуль Юнга лимфоцитов в условиях активации и блокады в-адренорецепторов_

Параметры Плазма Адреналин Обзидан

Модуль Юнга, ¡¡Pa 3,5±0,2 5,5±0,4* 2,8±0,3

Глубина погружения канти-левера, нм 345,2±37,6 155,1±23,5* 468,5±54,6

*- статистически достоверные различия между значениями в контроле и после адреналиновой / обзидановой нагрузок по критерию Стьюдента при р<0,05.

Модуль Юнга характеризует способность поверхности сопротивляться упругим деформациям, возникающим при заданной величине напря-

жений [15], следовательно, чем больше его значения, тем меньше упругие деформации и выше жесткость клеток [20]. Увеличение жесткости

лимфоцитов после адреналиновой нагрузки происходило одновременно с изменениями ее рельефа, в частности, исчезали кластеры и появлялись глобулярные выступы. В условиях блокады Р-адренорецепторов количество глобулярных выступов не изменялось, но высота их возрастала, а жесткость клеток практически не отличалась от значений в контроле. Не исключено, что увеличение жесткости лимфоцитов после адреналиновой нагрузки связано с появлением большого количества глобулярных выступов со сниженной высотой, что может изменить функциональные свойства клеток. Согласно экспериментальным данным [3] катехоламины (адреналин, норадреналин и др.) в концентрации 10-6 М стимулируют агрегацию эритроцитов и адгезию лейкоцитов. Природа установленного феномена состоит в триггерной функции Р-

адренорецепторов, активированных адреналином, которые запускают механизм клеточной адгезии лейкоцитов к эндотелиальной стенке посредством молекул CD62 (L-селектин) на ранней стадии диапедеза и CD11a (интегрин) при экст-равазии лейкоцитов [18]. Повышенная адгезия «жестких» клеток к сосудистой стенке в организме может спровоцировать длительные остановки кровотока, приводящие к нарушению микроциркуляции и ухудшению оксигенации тканей [19, 21].

Таким образом, под влиянием адреналина возрастает жесткость мембран, которая сопровождается изменениями в цитоархитектонике клеток в виде увеличения количества глобулярных выступов и уменьшения разнородности кластеров на поверхности лимфоцитов.

Библиографический список

1. Гущина, Ю. Ю. Исследования различий морфологических параметров клеток крови человека методом сканирующей зондовой микроскопии [Текст] / Ю. Ю. Гущина, С. К. Плескова, М. В. Звонкова // Поверхность. Рентгеновские, синхронные и нейтронные исследования. - 2005. - №1. - С. 48-53.

2. Демин, С. Ю. Основные типы и жизненные формы периферических и ФГА-стимулированных лимфоцитов человека, выявляемые in vitro [Текст] / С. Ю. Демин // Цитология. - 2003.- Т.45, № 11. -С.1149-1159.

3. Замышляева, М. В. Патогенетические механизмы и сигнальные пути изменений агрегаций эритроцитов и адгезии лейкоцитов при нарушениях сосудистого тонуса и воспалении [Текст] : автореф. дисс. ... к. м. н. / М. В. Замышляева. - Москва, 2007. - 24 с.

4. Козинец, Г. М. Поверхностная архитектоника клеток периферической крови [Текст] / Г. М. Козинец, Ю. Симоварт. - Таллин : Валгус, 1984. - 116 с.

5. Лебедев, Д. В. Измерение модуля Юнга биологических объектов в жидкой среде с помощью специального зонда атомно-силового микроскопа [Текст] / Д. В. Лебедев, А. П. Чукланов, А. А. Бухараев, О. С. Дружинина // Письма в ЖТФ. - 2009. - Т. 35. Вып. 8. - С. 54-61.

6. Новицкий, В. В. Особенности поверхностной архитектоники лимфоцитов периферической крови у больных туберкулезом легких [Текст] / В. В. Новицкий // Клиническая лабораторная диагностика. - 2007. - № 10. - С. 3-6.

7. Новодержкина, Ю. К. Конфигурация и поверхность клеток крови в норме и патологии [Текст] / Ю. К. Новодержкина, З. Г. Шишканова, Г. И. Козинец. - М. : Триада-Фарм, 2004. - 152 с.

8. Пат.2398234 Российская Федерация, МПК G01N33/49 Способ исследования нативных клеток [Текст] / Федорова М. З., Чернявских С. Д., Скорки-

на М. Ю., Сладкова Е. А., Забиняков Н. А. Заявитель и патентообладатель БелГУ. - № 2009125268, заявл. 01.07.2009; опубл. 27.08.2010.

9. Скоркина, М. Ю. Методика оценки морфомет-рических параметров нативных клеток крови с использованием атомно-силовой микроскопии [Текст] / М. Ю. Скоркина, С. Д. Чернявских, М. З. Федорова, Е. А. Сладкова, Н. А. Забиняков // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - Т.150, №2. - С. 273-275.

10. Скоркина, М. Ю. Сравнительная оценка мор-фофункциональных характеристик нативных и фиксированных эритроцитов [Текст] / М. Ю. Скоркина, М. З. Федорова, С. Д. Чернявских, Е. А. Сладкова, Н. А. Забиняков // Цитология. - 2011. - Т.53, № 1. - С. 17-21.

11. Федорова, М. З. Использование атомно-силовой микроскопии для оценки морфометрических показателей клеток крови [Текст] / М. З. Федорова [и др.] // Биофизика. - 2008. - Т.53, №6. - С. 555-558.

12. Alonso, J.L. Felling the forces: atomic force microscopy in cell biology [Text] / J.L. Alonso, W.H. Goldman // Life Sci. - 2003. - V. 72. - P. 2553-2560.

13. A-Hassan, E. Microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy / E. A-Hassan, N.P. D'Costa, S. Nageswaran, C.N. Schoenberger, J.H. Hoh [Text] // Biophys. J. - 1998. - V. 74 (3). - P. 1564-1578.

14. Benoit, M. Measuring cell adhesion force with the atomic force microscope at the molecular level [Text] / M. Benoit, H. E. Gaub // Cell tissues organs. - 2002. -V. 172. - P. 174-189.

15. But, H-J. Capillary forces between soft, elastic spheres [Text] / H-J. But, W. Jon, P. Barnes, A. Campo // Soft Matter. - 2010. - V. 6. - P.5930-5936.

16. Butt, H.E. Force measurements with the atomic force microscopy: technique, interpretation and applica-

tion [Text] / H.J. Butt, B. Capella // Surf. Sci. Rep. -2005. - V. 59. - P. 1-152.

17. Capella, B. Force distance curves by atomic force microscopy [Text] / B. Capella, G. Dietlr // Surf. Sci. Rep. - 1999. - V. 34. - P. 1-104.

18. Coupade, C. ß2-Adrenergic receptor-dependent sexual dimorphism for murine leukocyte migration / C. Coupade, A.S. Brown, P.F. Dazin, J.D. Levine, P.G. Green [Text] // J Neuroimmunol. - 2007. - V.186 (1-2). -P. 54-62.

19. Dong, C. Mechanics of leukocyte deformation and adhesion to endothelium in shear flow / C. Dong, J. Cao, E.J. Struble [Text] // Ann. Biomad. Eng. - 1998. -V. 27 (3). - P. 298-312.

20. Pera, I. Using the atomic force microscope to study the interaction between two solid supported lipid bilayers and the influence of Synaptin I / I. Pera, R. Stark, M. Kappl., H. Butt, F. Benfenati [Text] // Boiphysical J. -2004. - V. 87. Issue 4. - P. 2446-2455.

21. Ritter, L.S. Leukocyte accumulation and hemodynamic changes after stroke / L.S. Ritter, J.A. Orozco, P.M. Coull, P.F. McDonagh [Text] // Stroke. - 2000. - V. 31. - P. 1153-1161.

Takeuchi, M. Structure of the erythrocyte membrane skeleton as observed by atomic force microscopy [Text] / M. Takeuchi, H. Miyamoto, Y. Sako, H. Komizu, A. Ku-sumi // Biophys. J. -1998. - V. 74. - P. 2171-2183.