АНТИТЕЛО К EPHA2
ANTIBODY TO EPHA2

Область техники
Настоящее изобретение относится к антителу, которое обладает ингибирующим действием по отношению к злокачественной трансформации клеток и/или росту опухолевых клеток. Более конкретно, настоящее изобретение относится к антителу к EPHA2 и фармацевтической композиции, содержащей это антитело.
Предшествующий уровень техники
EPHA2 представляет собой рецепторную тирозинкиназу c молекулярной массой 130 кДа и один трансмембранный домен (Molecular and Cellular Biology, 1990, vol. 10, p. 6316-6324). EPHA2 содержит лигад-связывающий домен и два фибронектиновых домена 3 типа, располагающиеся в N-концевой внеклеточной области, и тирозинкиназный домен, и домен α-мотива стерильности (SAM), располагающиеся в C-концевой внутриклеточной области.
В качестве лигандов EPHA2 известны белки эфрины, от эфрина-A1 до эфрина-А5, заякоренные на плазматической мембране посредством GPI (Annual Review of Neuroscience, 1998, vol. 21, p. 309-345). Связывание лиганда с EPHA2 приводит к активированию тирозинкиназного домена и фосфорилированию остатков тирозина, присутствующих во внутриклеточной области EPHA2, что обеспечивает передачу сигнала внутрь клетки. Также описано, что EPHA2, связанный с лигандом, интернализируется внутрь клетки посредством эндоцитоза и с течением времени расщепляется протеосомой (Molecular Cancer Research, 2002, vol. 1, p. 79-87).
Было описано, что высокая экспрессия EPHA2 клинически проявляется множеством злокачественных опухолей, в частности, раком молочной железы, злокачественной опухолью пищевода, злокачественной опухолью предстательной железы, злокачественной опухолью желудка, немелкоклеточным раком легких, злокачественной опухолью толстого кишечника и мультиформной глиобластомой (Cancer Research, 2001, vol. 61, p. 2301-2306; International Journal of Cancer, 2003, vol. 103, p. 657-663; The Prostate, 1999, vol. 41, p. 275-280; American Journal of Pathology, 2003, vol. 163, p. 2271-2276; Cancer Science, 2005, vol. 96, p. 42-47; Clinical Cancer Research, 2003, vol. 9, p. 613-618; Oncology Reports, 2004, vol. 11, p. 605-611; и Molecular Cancer Research, 2005, vol. 3, p. 541-551). Также описано, что: для злокачественной опухоли пищевода у пациентов с экспрессией EPHA2 существует тенденция к метастазированию опухоли с высокой частотой в региональные лимфоузлы, к большому количеству метастазов в лимфоузлах и к низкой степени дифференцировки опухоли, и к низкому показателю выживаемости в течение пяти лет (International Journal of Cancer, 2003, vol. 103, p. 657-663); в случае немелкоклеточного рака легких у пациентов с повышенной экспрессией EPHA2 имеется тенденция к низким показателям безрецидивной выживаемости и к подверженности рецидивам, в частности, метастазам в головной мозг (Clinical Cancer Research, 2003, vol. 9, p. 613-618); а в случае злокачественной опухоли толстого кишечника, у пациентов с экспрессией EPHA2 существует тенденция к появлению метастазов в печени, к инвазии опухоли в лимфатические сосуды и к метастазированию в лимфоузлы, и многие пациенты с поздней клинической стадией злокачественной опухоли являются положительными по экспрессии EPHA2 (Oncology Reports, 2004, vol. 11, p. 605-611).
Кроме того, описано, что при введении генов EPHA2 в клетки, незлокачественные клетки приобретают фенотип злокачественных опухолей, такой как способность к свободному росту клеток, способность к образованию тубулярных структур в матриксе и способность к росту клеток in vivo (Cancer Research, 2001, vol. 61, p. 2301-2306), и злокачественные клетки обладают повышенной инвазивностью во внеклеточном матриксе (Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004, vol. 320, p. 1096-1102; и Oncogene, 2004, vol. 23, p. 1448-1456). Кроме того, описано, что: инвазивность или свободный рост клеток злокачественной опухоли и рост опухоли in vivo ингибируются посредством выключения экспрессии EPHA2, используя миРНК (Oncogene, 2004, vol. 23, p. 1448-1456; и Cancer Research, 2002, vol. 62, p. 2840-2847); а инвазивность, свободный рост и способность злокачественных клеток к образованию тубулярных структур ингибируются посредством активирования EPHA2, используя в виде слитых белков его лиганд эфрин-A1 и Fc-область IgG человека и таким образом, вызывая деградацию EPHA2 посредством эндоцитоза (Cancer Research, 2001, vol. 61, p. 2301-2306; Molecular Cancer Research, 2005, vol. 3, p. 541-551; и Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004, vol. 320, p. 1096-1102).
С другой стороны, описано, что EPHA2 экспрессируется не только в злокачественных клетках, но также в пределах опухолей или в окружающих их кровеносных сосудах (Oncogene, 2000, vol. 19, p. 6043-6052). Описано, что у мышей сигналы EPHA2 участвуют в ангиогенезе, индуцированном эфрином-A1 и, в частности, EPHA2, экспрессирующийся в сосудистых эндотелиальных клетках, необходим для образования сосуда или выживания сосудистых эндотелиальных клеток (Journal of Cell Science, 2004, vol. 117, p. 2037-2049). Также описано, что слитые белки внеклеточной области EPHA2 и Fc-области IgG человека ингибируют ангиогенез in vivo и демонстрируют противоопухолевый эффект (Oncogene, 2002, vol. 21, p. 7011-7026).
Моноклональные антитела пригодны не только в качестве диагностических лекарственных средств, но также в виде терапевтических лекарственных средств. Моноклональные антитела, активно используют, в частности, при лечении злокачественных опухолей, и моноклональные антитела к рецепторным тирозинкиназам, таким как HER2 и EGFR или к внеклеточным областям CD20, используют при лечении злокачественных опухолей и они демонстрируют превосходный эффект (The New England Journal of Medicine, 2007, vol. 357, p. 39-51; Oncogene, 2007, vol. 26, p. 3661-3678; и Oncogene, 2007, vol. 26, p. 3603-3613). Механизм действия моноклональных антител, используемых при лечении злокачественных опухолей, включает индукцию апоптоза и ингибирование сигналов роста. Кроме того, считается, что очень важную роль также играет их действие, опосредованное через иммунный ответ, такой как ADCC или CDC. Действительно, описано, что при введении антител к HER2 (трастузумаб) или антител к CD20 (ритуксимаб), они оказывают более слабое противоопухолевое действие на ксенотрансплантаты голых мышей (nude), которые дефектны по FcγR, необходимому для индукции ADCC, по сравнению с голыми мышами без дефекта по FcγR (Nature Medicine, 2000, vol. 6, p. 443-446). Так же описано, что антитела к CD20 (ритуксимаб), при введении антител, оказывают более слабое противоопухолевое действие на мышей с недостаточностью комплемента, которая вызвана введением яда кобры, по сравнению с мышами без недостаточности комплемента (Blood, 2004, vol. 103, p. 2738-2743).
Для EPHA2 описано, что агонистические моноклональные антитела к EPHA2 с активностью индукции фосфорилирования остатков тирозина EPHA2 и активностью индукции деградации EPHA2 также как и лиганды ингибируют способность к свободному росту клеток линии рака молочных желез и способность клеток формировать тубулярные структуры во внеклеточном матриксе (Cancer Research, 2002, vol. 62, p. 2840-2847). Также описано, что агонистические моноклональные антитела к EPHA2, которые распознают эпитоп на EPHA2, выявляемый чаще в злокачественных клетках, чем в незлокачественных клетках, и обладают активностью индукции фосфорилирования остатков тирозина EPHA2 и активностью индукции деградации EPHA2, проявляют противоопухолевое действие in vivo (Cancer Research, 2003, vol. 63, p. 7907-7912; и заявка WO 03/094859). С другой стороны, у Kiewlich et al. описано, что их моноклональные антитела к EPHA2 обладали активностью индукции фосфорилирования остатков тирозина EPHA2 и активностью индукции деградации EPHA2, но не имели противоопухолевого действия in vivo (Neoplasia, 2006, vol. 8, p. 18-30).
Кроме того, в заявке WO 2006/084226 описаны моноклональные антитела к EPHA2 LUCA19, SG5, LUCA40 и SPL1, полученные посредством иммунизации мышей злокачественными клетками и описано, что среди этих антител: LUCA19 и SG5 не влияют на фосфорилирование остатков тирозина EPHA2; LUCA40 ингибирует рост злокачественных клеток in vitro; а LUCA19, SG5, и LUCA40 интернализируются внутрь злокачественных клеток в присутствие антитела к антителам мыши, меченого токсином (сапорином). В документе также описано, что LUCA40 и SPL1 проявляют противоопухолевое действие in vivo. Однако остается невыясненным обладают ли эти антитела агонистической активностью или нет.
Несмотря на эти исследования, все еще неизвестным является эпитоп для антитела к EPHA2, которое проявляет противоопухолевое действие in vivo. Ранее не было нигде описано, что определенная аминокислотная последовательность во внеклеточной области EPHA2 пригодна в качестве эпитопа для моноклонального антитела, предназначенного для противораковой терапии.
Даже антитела к одним и тем же антигенам отличаются по своим свойствам, в зависимости от различий в эпитопах или в своих последовательностях. Кроме того, вследствие этого различия в своих свойствах, антитела, при введении людям, будут вызывать различный клинический ответ относительно эффективности действия лекарственного средства, частоте терапевтического ответа, побочных эффектов, частоте проявления устойчивости к лекарственному средству и т.д.
Таким образом, лекарственное средство с лучшими клиническими свойствами также может отличаться в зависимости от пациента. Во многих случаях, такие свойства являются неизвестными до фактического введения лекарственного средства. Таким образом, крайне необходимо разработать лекарственное средство с новым механизмом действия. Также крайне необходимо разработать антитело к EPHA2, обладающее свойствами, отличающимися от свойств традиционных антител.
Описание изобретения
Задачи, подлежащие решению посредством изобретения
Целью настоящего изобретения является разработка антитела к EPHA2.
Дополнительной целью настоящего изобретения является разработка фармацевтической композиции и т.п., содержащей антитело к EPHA2, обладающее терапевтическим действием на злокачественную опухоль.
Дополнительной целью настоящего изобретения является разработка способа получения антитела.
Дополнительной целью настоящего изобретения является разработка способа ингибирования роста опухоли, с использованием антитела и т.д.
Средства решения задач
Авторы настоящего изобретения провели необходимые исследования для достижения целей и таким образом успешно получили новое моноклональное антитело к EPHA2, которое не обладает активностью индуцирования фосфорилирования остатков тирозина EPHA2 и обладает активностью ADCC и активностью CDC по отношению к злокачественным клеткам, экспрессирующим EPHA2. Кроме того, авторы настоящего изобретения исследовали эпитоп для этого антитела и в результате впервые обнаружили, что антитело, которое связывается с областью, включающей два домена фибронектина 3 типа, представленные в EPHA2, С-концевой домен, обладает превосходной противоопухолевой активностью in vivo. Настоящее изобретение выполнено на основе этих открытий.
Конкретно настоящее изобретение включает:
(1) антитело, распознающее эпитоп, который распознается антителом, продуцируемым гибридомой SH348-1 (FERM BP-10836);
(2) антитело по (1), где антитело обладает следующими свойствами a)-d):
a) не обладает способностью к фосфорилированию остатков тирозина EPHA2;
b) обладает активностью ADCC по отношению к клеткам, экспрессирующим EPHA2;
c) обладает активностью CDC по отношению к клеткам, экспрессирующим EPHA2; и
d) обладает противоопухолевой активностью in vivo;
(3) антитело по (1), где антитело обладает следующими свойствами a)-e):
a) не обладает способностью к фосфорилированию остатков тирозина EPHA2;
b) демонстрирует эффект снижения уровня белка EPHA2;
c) обладает активностью ADCC по отношению к клеткам, экспрессирующим EPHA2;
d) обладает активностью CDC по отношению к клеткам, экспрессирующим EPHA2; и
e) обладает противоопухолевой активностью in vivo;
(4) антитело, которое специфично связывается с полипептидом, состоящим из последовательности аминокислот, соответствующей аминокислотам с No. от 426 до 534 в SEQ ID NO: 8 в списке последовательностей;
(5) антитело, которое специфично связывается с полипептидом, состоящим из последовательности аминокислот, соответствующей аминокислотам с No. от 426 до 534 в SEQ ID NO: 8 в списке последовательностей и обладает следующими свойствами, от a) до d):
a) не обладает способностью к фосфорилированию остатков тирозина EPHA2;
b) обладает активностью ADCC по отношению к клеткам, экспрессирующим EPHA2;
c) обладает активностью CDC по отношению к клеткам, экспрессирующим EPHA2; и
d) обладает противоопухолевой активностью in vivo;
(6) антитело, которое специфическим образом связывается с пептидом, состоящим из последовательности аминокислот, соответствующей аминокислотам с No. от 426 до 534 в SEQ ID NO: 8 в списке последовательностей и обладает следующими свойствами, от a) до е):
a) не обладает способностью к фосфорилированию остатков тирозина EPHA2;
b) демонстрирует эффект снижения уровня белка EPHA2;
c) обладает активностью ADCC по отношению к клеткам, экспрессирующим EPHA2;
d) обладает активностью CDC по отношению к клеткам, экспрессирующим EPHA2; и
e) обладает противоопухолевой активностью in vivo;
(7) антитело по любому из (1)-(6), где антитело специфическим образом связывается с пептидом, состоящим из последовательности аминокислот, соответствующей аминокислотам с No. 439 до 534 в SEQ ID NO: 8 в списке последовательностей;
(8) антитело по любому из (1)-(7), где антитело ингибирует фосфорилирование остатков тирозина EPHA2, индуцированное лигандом EPHA2;
(9) антитело по любому из (1)-(7), где антитело не ингибирует связывание лиганда EPHA2 с EPHA2, но ингибирует фосфорилирование остатков тирозина EPHA2, индуцированное лигандом EPHA2;
(10) антитело, которое специфично связывается с полипептидом, состоящем из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 8 в списке последовательностей, где антитело имеет аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID No: 59, 61 и 63 в списке последовательностей или аминокислотные последовательности с делецией, заменой или вставкой одной или нескольких аминокислот в аминокислотных последовательностях в качестве участков, определяющих комплементарность в вариабельной области тяжелой цепи и антитело имеет аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID No: 65, 67 и 69 в списке последовательностей, или аминокислотные последовательности с делецией, заменой или вставкой одной или нескольких аминокислот в аминокислотных последовательностях, в качестве участков, определяющих комплементарность в вариабельной области легкой цепи;
(11) антитело, которое специфично связывается с полипептидом, состоящим из последовательности аминокислот, представленных в SEQ ID NO: 8 в списке последовательностей, характеризующееся следующим 1) и 2):
1) имеющее пептид тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот, представленную общей формулой (I):
1
1
2
2
3
3
4
-FRH-CDRH-FRH-CDRH-FRH-CDRH-FRH-(I)
1
1
2
2
3
3
4
где FRH обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, содержащую от 18 до 30 аминокислот; CDRH обозначает аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 59 в списке последовательностей или аминокислотную последовательность с делецией, заменой или вставкой одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности; FRH обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 14 аминокислот; CDRH обозначает аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 61 в списке последовательностей или аминокислотную последовательность с делецией, заменой или вставкой одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности; FRH обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 32 аминокислот; CDRH обозначает аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 63 в списке последовательностей или аминокислотную последовательность с делецией, заменой или вставкой одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности; и FRH обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 11 аминокислот, где эти аминокислоты связаны друг с другом пептидными связями; и
2) имеющее полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную общей формулой (II):
1
1
2
2
3
3
4
-FRL-CDRL-FRL-CDRL-FRL-CDRL-FRL-(II)
1
1
2
2
3
3
4
где FRL обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 23 аминокислот; CDRL обозначает аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 65 в списке последовательностей, или аминокислотную последовательность с делеций, заменой или вставкой одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности; FRL обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 15 аминокислот; CDRL обозначает аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 67 в списке последовательностей; FRL обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 32 аминокислот; CDRL обозначает аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 69 в списке последовательностей или аминокислотную последовательность с делецией, заменой или вставкой одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности; и FRL обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 10 аминокислот, где эти аминокислоты связаны друг с другом посредством пептидных связей;
(12) антитело, которое распознает эпитоп, распознаваемый антителом, продуцируемым гибридомой SH357-1 (FERM BP-10837);
(13) антитело по (12), где антитело обладает следующими свойствами, представленными от a) до d):
a) не обладает способностью к фосфорилированию остатков тирозина EPHA2;
b) обладает активностью ADCC по отношению к клеткам, экспрессирующим EPHA2;
c) обладает активностью CDC по отношению к клеткам, экспрессирующим EPHA2; и
d) обладает противоопухолевой активностью in vivo;
(14) антитело, которое специфическим образом связывается с пептидом, состоящим из последовательности аминокислот, соответствующей аминокислотам с No. 426 до 534 в SEQ ID NO: 8 в списке последовательностей и обладающее следующими свойствами, от a) до e):
a) не обладает способностью к фосфорилированию остатков тирозина EPHA2;
b) не демонстрирует эффект снижения уровня белка EPHA2;
c) обладает активностью ADCC по отношению к клеткам, экспрессирующим EPHA2;
d) обладает активностью CDC по отношению к клеткам, экспрессирующим EPHA2; и
e) обладает противоопухолевой активностью in vivo;
(15) антитело по любому из (12)-(14), где антитело специфическим образом связывается с пептидом, состоящим из последовательности аминокислот, соответствующей аминокислотам с No. от 439 до 534 в SEQ ID NO: 8 в списке последовательностей;
(16) антитело по любому из (12)-(15), где антитело ингибирует фосфорилирование остатков тирозина EPHA2, индуцированное лигандом EPHA2;
(17) антитело по любому из (12)-(15), где антитело не ингибирует связывание лиганда EPHA2 с EPHA2, но ингибирует фосфорилирование остатков тирозина EPHA2, индуцированное лигандом EPHA2;
(18) антитело, которое специфическим образом связывается с полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8 в списке последовательностей, где антитело имеет аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID No: 71, 73 и 75 в списке последовательностей, или аминокислотные последовательности с делецией, заменой или вставкой одной или нескольких аминокислот в аминокислотных последовательностях, в виде участков, определяющих комплементарность в вариабельной области тяжелой цепи и где антитело имеет аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID No: 77, 79 и 81 в списке последовательностей, или аминокислотные последовательности с делецией, заменой или вставкой одной или нескольких аминокислот в аминокислотных последовательностях, в виде участков, определяющих комплементарность в вариабельной области легкой цепи;
(19) антитело, которое специфично связывается с полипептидом, состоящим из последовательности аминокислот, соответствующим SEQ ID NO: 8 в списке последовательностей, характеризующееся следующим 1) и 2):
1) имеющее пептид тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот, представленную общей формулой (I):
1
1
2
2
3
3
4
-FRH-CDRH-FRH-CDRH-FRH-CDRH-FRH-(I)
1
1
2
2
3
3
4
где FRH обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, содержащую от 18 до 30 аминокислот; CDRH обозначает аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 71 в списке последовательностей или аминокислотную последовательность с делецией, заменой или вставкой одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности; FRH обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 14 аминокислот; CDRH обозначает аминокислотную последовательность представленную в SEQ ID NO: 73 в списке последовательностей или аминокислотную последовательность с делецией, заменой или вставкой одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности; FRH обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 32 аминокислот; CDRH обозначает аминокислотную последовательность представленную в SEQ ID NO: 75 в списке последовательностей или аминокислотную последовательность с делецией, заменой или вставкой одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности; и FRH обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 11 аминокислоты, где эти аминокислоты связаны друг с другом посредством пептидных связей; и
2) имеющее полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную общей формулой (II):
1
1
2
2
3
3
4
-FRL-CDRL-FRL-CDRL-FRL-CDRL-FRL-(II)
1
1
2
2
3
3
4
где FRL обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 23 аминокислоты; CDRL обозначает аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 77 в списке последовательностей или аминокислотную последовательность с делецией, заменой или вставкой одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности; FRL обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 15 аминокислот; CDRL обозначает аминокислотную последовательность представленную в SEQ ID NO: 79 в списке последовательностей или аминокислотную последовательность с делецией, заменой или вставкой одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности; FRL обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 32 аминокислот; CDRL обозначает аминокислотную последовательность представленную в SEQ ID NO: 81 в списке последовательностей или аминокислотную последовательность с делецией, заменой или вставкой одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности; и FRL обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 10 аминокислот, где эти аминокислоты связаны друг с другом посредством пептидных связей;
(20) антитело по любому из (1)-(19), характеризующееся тем, что антитело представляет собой гуманизированное антитело;
(21) антитело по любому из (1)-(19), характеризующееся тем, что антитело представляет собой антитело человека;
(22) антитело по любому из (1)-(19), характеризующееся тем, что антитело представляет собой антитело IgG;
(23) антитело по любому из (1)-(9) и (12)-(17), характеризующееся тем, что антитело представляет собой любое, выбранное из Fab, F(ab')2, Fv, scFv, диатела, линейного антитела и полиспецифического антитела;
(24) антитело, продуцируемое гибридомой SH348-1 (FERM BP-10836);
(25) антитело, продуцируемое гибридомой SH357-1 (FERM BP-10837);
(26) антитело, содержащее следующее 1) и 2):
1) полипептид тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 1 до 119 в SEQ ID NO: 35 в списке последовательностей или полипептид тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 1 до 119 в SEQ ID NO: 39 в списке последовательностей; и
2) полипептид легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот, соответствующую аминокислотам с No. от 1 до 112 в SEQ ID NO: 37 в списке последовательностей или полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 1 до 112 в SEQ ID NO: 41 в списке последовательностей;
(27) антитело, содержащее следующие 1) или 2):
1) полипептид тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 1 до 119 в SEQ ID NO: 35 в списке последовательностей и полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 1 до 112 в SEQ ID NO: 37 в списке последовательностей; и
2) полипептид тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 1 до 119 в SEQ ID NO: 39 в списке последовательностей и полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность соответствующую аминокислотам с No. от 1 до 112 в SEQ ID NO: 41 в списке последовательностей;
(28) антитело, содержащее следующие 1) и 2):
1) полипептид тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 35 в списке последовательностей или полипептид тяжелой цепи, содержащий аминокислотная последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 39 в списке последовательностей; и
2) полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 37 в списке последовательностей или полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 41 в списке последовательностей;
(29) антитело, содержащее следующие 1) или 2):
1) полипептид тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 35 в списке последовательностей и полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность представленную в SEQ ID NO: 37 в списке последовательностей; и
2) полипептид тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 39 в списке последовательностей и полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 41 в списке последовательностей;
(30) антитело, полученное посредством гуманизации антитела по любому из (24)-(29);
(31) антитело, содержащее следующие 1) и 2):
1) полипептид тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 20 до 468 в SEQ ID NO: 107 в списке последовательностей или полипептид тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 20 до 468 в SEQ ID NO: 115 в списке последовательностей; и
2) полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 21 до 239 в SEQ ID NO: 91 в списке последовательностей или полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 21 до 239 в SEQ ID NO: 99 в списке последовательностей;
(32) антитело, содержащее следующие 1) или 2):
1) полипептид тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 20 до 468 в SEQ ID NO: 107 в списке последовательностей и полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 21 до 239 в SEQ ID NO: 91 в списке последовательностей; и
2) полипептид тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 20 до 468 в SEQ ID NO: 115 в списке последовательностей и полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 21 до 239 в SEQ ID NO: 99 в списке последовательностей;
(33) антитело, содержащее следующие 1) и 2):
1) полипептид тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 20 до 468 в SEQ ID NO: 139 в списке последовательностей или полипептид тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 20 до 468 в SEQ ID NO: 147 в списке последовательностей; и
2) полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 21 до 239 в SEQ ID NO: 123 в списке последовательностей или полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 21 до 239 в SEQ ID NO: 131 в списке последовательностей;
(34) антитело, содержащее следующие 1) или 2):
1) полипептид тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 20 до 468 в SEQ ID NO: 139 в списке последовательностей и полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 21 до 239 в SEQ ID NO: 123 в списке последовательностей; и
2) полипептид тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 20 до 468 в SEQ ID NO: 147 в списке последовательностей и полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 21 до 239 в SEQ ID NO: 131 в списке последовательностей;
(35) A Fab, F(ab')2, Fv, scFv, диатело, линейное антитело или полиспецифическое антитело, полученные из антител по любому из (24)-(34);
(36) любой один полипептид, выбранный из группы, состоящей из следующих 1)-20):
1) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 1 до 119 в SEQ ID NO: 35 в списке последовательностей;
2) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 1 до 119 в SEQ ID NO: 39 в списке последовательностей;
3) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 1 до 112 в SEQ ID NO: 37 в списке последовательностей;
4) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 1 до 112 в SEQ ID NO: 41 в списке последовательностей;
5) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 20 до 468 в SEQ ID NO: 107 в списке последовательностей;
6) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 20 до 468 в SEQ ID NO: 115 в списке последовательностей;
7) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 20 до 138 в SEQ ID NO: 107 в списке последовательностей;
8) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 20 до 138 в SEQ ID NO: 115 в списке последовательностей;
9) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 21 до 239 в SEQ ID NO: 91 в списке последовательностей;
10) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 21 до 239 в SEQ ID NO: 99 в списке последовательностей;
11) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 21 до 134 в SEQ ID NO: 91 в списке последовательностей;
12) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 21 до 134 в SEQ ID NO: 99 в списке последовательностей;
13) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 20 до 468 в SEQ ID NO: 139 в списке последовательностей;
14) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 20 до 468 в SEQ ID NO: 147 в списке последовательностей;
15) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 20 до 138 в SEQ ID NO: 139 в списке последовательностей;
16) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 20 до 138 в SEQ ID NO: 147 в списке последовательностей;
17) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 21 до 239 в SEQ ID NO: 123 в списке последовательностей;
18) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 21 до 239 в SEQ ID NO: 131 в списке последовательностей;
19) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 21 до 134 в SEQ ID NO: 123 в списке последовательностей; и
20) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 21 до 134 в SEQ ID NO: 131 в списке последовательностей;
(37) мышиная гибридома SH348-1 (FERM BP-10836);
(38) мышиная гибридома SH357-1 (FERM BP-10837);
(39) Фармацевтическая композиция, характеризующаяся тем, что она содержит по меньшей мере одно антитело, выбранное из антител по (1)-(35);
(40) Фармацевтическая композиция для лечения злокачественных опухолей, характеризующаяся тем, что она содержит по меньшей мере одно антитело, выбранное из антител по (1)-(35);
(41) Способ ингибирования роста опухоли у млекопитающего, где способ включает введение любого антитела, выбранного из группы, состоящей из антител по (1)-(35), (39) и (40);
(42) Способ ингибирования роста опухоли по (41), характеризующийся тем, что опухоль представляет собой опухоль, экспрессирующую EPHA2;
(43) Полинуклеотид, кодирующий антитело или полипептид по любому из (1)-(36);
(44) Клетка-хозяин, трансформированная полинуклеотидом по (43); и
(45) Способ получения антитела с использованием клетки-хозяина по (44).
Преимущества изобретения
В настоящем изобретении успешно получено новое моноклональное антитело к EPHA2, которое не обладает активностью индукции фосфорилирования остатков тирозина EPHA2 и обладает активностью ADCC и активностью CDC по отношению к злокачественным клеткам, экспрессирующим EPHA2. Кроме того, обнаружено, что антитело обладает великолепной противоопухолевой активностью in vivo.
Кроме того, разработана фармацевтическая композиция для лечения злокачественных опухолей, содержащая это антитело.
Краткое описание рисунков
Фиг.1 представляет собой рисунок, демонстрирующий результаты Вестерн-блоттинга, демонстрирующие наличие или отсутствие активности индукции посредством антитела к EPHA2 фосфорилирования остатков тирозина EPHA2. Фиг.1A) представляет собой рисунок, демонстрирующий результаты, полученные в отсутствие перекрестно-связывающего антитела, где в верхней части показаны результаты для антитела 4G10, а в нижней части показаны результаты для антитела к EPHA2 (D7). На фиг.1B) представлен рисунок, на котором показаны результаты, полученные в присутствие перекрестно-связывающего антитела, где в верхней части представлены результаты для антитела 4G10, а в нижней части показаны результаты для антитела к EPHA2 (D7);
На фиг.2 представлен рисунок, на котором показаны результаты Вестерн-блоттинга, показывающие наличие или отсутствие активности индукции снижения уровня белка EPHA2 посредством антитела к EPHA2. На фиг.2A) представлен рисунок, на котором показаны результаты, полученные в отсутствие перекрестно-связывающего антитела, где в верхней части показаны результаты для антитела к EPHA2 (D7), а в нижней части показаны результаты для антитела к β-актину. На фиг.2B) представлен рисунок, на котором показаны результаты, полученные в присутствие перекрестно-связывающего антитела, где в верхней части представлены результаты для антитела к EPHA2 (D7), а в нижней части показаны результаты для антитела к β-актину;
На фиг.3 представлены графики, показывающие наличие или отсутствие у антитела к EPHA2 активности ADCC по отношению к различным клеточным линиям. На графике "**" обозначает значение P<0,01, а "***" обозначает значение P<0,001. На фиг.3A) представлен график, на котором показана активность ADCC по отношению к клеткам MDA-MB-231. На фиг.3B) представлен график, на котором показана активность ADCC по отношению к клеткам A549. На фиг.3С) представлен график, на котором показана активность ADCC по отношению к клеткам PC-3;
На фиг.4 представлены графики, на которых показано наличие или отсутствие CDC активности антитела к EPHA2 по отношению к различным клеткам. На графике "***" обозначает значение P<0,001. На фиг.4A) представлен график, на котором показана активность CDC SH348-1 по отношению к клеткам MDA-MB-231. На фиг.4B) представлен график, на котором показана активность CDC SH348-1 по отношению к клеткам A549. На фиг.4С) представлен график, на котором показана активность CDC SH348-1 по отношению к клеткам PC-3. На фиг.4D) представлен график, на котором показана активность CDC SH357-1 по отношению к клеткам MDA-MB-231. На фиг.4E) представлен график, на котором показана активность CDC SH357-1 по отношению к клеткам A549. На фиг.4F) представлен график, на котором показана активность CDC SH357-1 по отношению к клеткам PC-3;
На фиг.5A) представлен рисунок, на котором показан расчет доменной структуры EPHA2 и положений EPHA2-ECD, FNIII-NC, FNIII-N и FNIII-C в EPHA2, которые представляют собой пептиды для определения эпитопа. На рисунке лиганд-BD обозначает лигад-связывающий домен, FN3 обозначает домен фибронектина 3 типа, TM обозначает трансмембранную область, Trk киназа обозначает тирозинкиназный домен и SAM обозначает SAM домен;
На фиг.5B) представлен график, на котором показано наличие или отсутствие связывающей активности антитела к EPHA2 с EPHA2-ECD, FNIII-NC, FNIII-N и FNIII-C;
На фиг.6A) представлен график, на котором показана противоопухолевая активность SH348-1 по отношению к клеткам MDA-MB-231, трансплантированных мышам;
На фиг.6B) представлен график, на котором показана противоопухолевая активность SH357-1 по отношению к клеткам MDA-MB-231, трансплантированных мышам. На графике планки погрешности обозначают стандартную погрешность (n=9);
На фиг.7A) представлен график, на котором показана связывающая активность SH348-1 с полипептидом внеклеточной области EPHA2;
На фиг.7B) представлен график, на котором показана связывающая активность SH357-1 с полипептидом внеклеточной области EPHA2;
Фиг.7C) представляет собой диаграмму, демонстрирующую связывающую активность Ab96-1 с полипептидом внеклеточной области EPHA2;
На фиг.8 представлен график, на котором показана лиганд-связывающая ингибиторная активность SH348-1, SH357-1 и Ab96-1;
На фиг.9 представлен график, на котором показано, что SH348-1 и SH357-1 обладают активностью ингибирования фосфорилирования остатков тирозина EPHA2, зависящего от эфрина-А1;
На фиг.10 представлен график, на котором показана схема делеционных мутантов EPHA2 для идентификации эпитопа;
На фиг.11A) представлен рисунок, на котором показана способность SH348-1 взаимодействовать с делеционными мутантами EPHA2;
На фиг.11B) представлен рисунок, на котором показано детектирование делеционных мутантов EPHA2 в фиг.11A) на PVDF мембране;
На фиг.11C) представлен рисунок, на котором показана способность SH357-1 взаимодействовать с делеционными мутантами EPHA2;
На фиг.11D) представлен рисунок, на котором показано детектирование делеционных мутантов EPHA2 в фиг.11С) на PVDF мембране;
На фиг.12A) представлен график, на котором показана связывающая активность hSH348-1-T1 с полипептидом внеклеточной области EPHA2;;
На фиг.12B) представлен график, на котором показана связывающая активность hSH348-1-T3 с полипептидом внеклеточной области EPHA2;;
На фиг.12C) представлен график, на котором показана связывающая активность hSH357-1-T1 с полипептидом внеклеточной области EPHA2;
На фиг.12D) представлен график, на котором показана связывающая активность hSH357-1-T3 с полипептидом внеклеточной области EPHA2;
На фиг.13A) представлен график, на котором показана способность к конкурентному ингибированию hSH348-1-T1 и hSH348-1-T3 по отношению к связывающему антиген SH348-1;
На фиг.13B) представлен график, на котором показана конкурентная ингибиторная активность hSH357-1-T1 и hSH357-1-T3 по отношению к связывающему антиген SH357-1;
На фиг.14A) представлен график, на котором показана активность ингибирования зависимого от эфрина-A1 фосфорилирования остатков тирозина EPHA2 посредством hSH348-1-T1 или hSH348-1-T3; и
На фиг.14B) представлен график, на котором показана активность ингибирования зависимого от эфрина-A1 фосфорилирования остатков тирозина EPHA2 посредством hSH357-1-T1 или hSH357-1-T3.
Лучший вариант осуществления изобретения
1. Определения
В настоящем описании термины "злокачественная опухоль" и "опухоль" используют в одинаковом значении.
В настоящем описании термин "ген" включает не только ДНК, но также ее мРНК, кДНК и ее кРНК. Таким образом, термин "ген EPHA2" в настоящем изобретении относится к ДНК, мРНК, кДНК и кРНК EPHA2.
В настоящем описании термин "полинуклеотид" используют в том же значении, что и нуклеиновая кислота, и он также включает ДНК, РНК, зонды, олигонуклеотиды и праймеры.
В настоящем описании термины "полипептид" и "белок" используют, не проводя различий между ними.
В настоящем описании термин "клетка" также включает клетки особи животного и культивируемые клетки.
В настоящем описании термин "злокачественная трансформация клеток" обозначает, что клетки демонстрируют патологический рост, например, теряют чувствительность к контактному торможению или демонстрируют свободный рост клеток. Клетки, демонстрирующие подобный патологический рост обозначают как "злокачественные клетки".
В настоящем описании белок, обладающий эквивалентными функциями по отношению к активности злокачественной трансформации и/или активности клеточного роста или подобный EPHA2, также обозначают как EPHA2.
В настоящем описании термин "фосфорилирование остатков тирозина" означает, что тирозиновые остатки, содержащиеся в аминокислотной последовательности пептида, фосфорилируют. Являются ли остатки тирозина фосфорилированными или нет, можно определить, например, исходя из сродства пептида к антителу к фосфотирозину (например, Анти-Фосфотирозин, рекомбинантный конъюгат HRP 4G10 (произведено Millipore (Upstate), #16-184)). Тирозиновые остатки можно определять как фосфорилированные, если пептид связывается с антителом.
В настоящем описании термин "способность к фосфорилированию тирозиновых остатков EPHA2" относится к способности к фосфорилированию тирозиновых остатков в аминокислотной последовательности EPHA2. Обладает антитело или нет способностью индуцировать фосфорилирование тирозиновых остатков EPHA2 можно определять, например, посредством инкубирования антитела и EPHA2 и дальнейшего исследования наличия или отсутствия сродства EPHA2 к антителу к фосфотирозину.
В настоящем описании выражение "снижение уровня экспрессии белка EPHA2" обозначает, что уровень белка EPHA2 снижен. Обладает или нет антитело эффектом снижения уровня белка EPHA2 можно определить, например, посредством инкубирования антитела и EPHA2 и с последующим определением уровня EPHA2.
В настоящем описании термин "лиганд EPHA2" относится к веществу, которое способно выполнять функцию лиганда EPHA2. Конкретные примеры таковых могут включать белки эфрины, от эфрина-A1 до эфрина-А5, заякоренные на плазматической мембране посредством GPI (Annual Review of Neuroscience, 1998, vol. 21, p. 309-345).
В настоящем описании термин "цитотоксичность" относится к любому патологическому изменению в клетках и определяет не только прямое повреждение клетки, но также любое структурное или функциональное повреждение в клетках, такое как расщепление ДНК, димеризацию оснований, хромосомный разрыв, повреждение митотического аппарата и снижение различных ферментативных функций.
В настоящем описании термин "цитотоксическая активность" относится к активности, которая обуславливает цитотоксичность.
В настоящем описании ADCC является синонимом антителозависимой клеточной цитотоксичности и относится к реакции, вследствие которой клетки, несущие рецептор Fcγ, присоединяются с помощью рецепторов Fcγ к Fc областям антител, связанных с поверхностными антигенами на клетках-мишенях и уничтожают клетки-мишени. Активность ADCC также обозначают антителозависимой цитотоксической активностью и относят к активности, которая обуславливает реакцию. Активность ADCC можно измерять способами, обычно применяемыми специалистами в данной области и можно измерять, например, согласно способу, описанному в настоящем описании в пунктах 3)-2 примера 3.
В настоящем описании термин "CDC" является синонимом комплементзависимой цитотоксичности. Активность CDC относится к активности, которая обуславливает комплементзависимую цитотоксичность. Активность CDC можно измерять способами, обычно применяемыми специалистами в данной области и можно измерять, например, согласно способу, описанному в настоящем описании в пунктах 3)-3 примера 3.
В настоящем описании выражение "обладает противоопухолевой активностью in vivo" обозначает наличие активности ингибирования или снижения роста опухоли у особей животных-носителей опухолей. Действительно ли антитело к EPHA2 "обладает противоопухолевой активностью in vivo" или нет можно определять способами, обычно используемыми специалистами в данной области, и можно также определять, например, следующим способом: соответствующую дозу антитела к EPHA2 интраперитонеально вводят мышам в опухолевые клетки (например, клетки MDA-MB-231, трансплантированные подкожно голым мышам) (например, BALB/cAJc1-nu/nu; полученные в CLEA Japan, Inc.) в качестве тестируемого вещества и в зависимости от времени, сравнивают изменения в размере опухоли у голых мышей и контрольных мышей, которым не вводили антитело к EPHA2. Антитело к EPHA2, в качестве тестируемого вещества, можно определять как "имеющее противоопухолевую активность in vivo", когда объем опухоли у экспериментальных мышей значительно меньше, чем у контрольных.
1
2
3
1
2
3
Как известно, каждая из тяжелых и легких цепей молекулы антитела имеет три определяющие комплементарность области (CDR). В настоящем описании, области, определяющие комплементарность антитела, представлены областями CDRH, CDRH и CDRH для областей, определяющих комплементарность тяжелой цепи и CDRL, CDRL и CDRL для областей, определяющих комплементарность легкой цепи.
В настоящем описании термин "эпитоп" обозначает неполный пептид EPHA2, обладающий антигенными и/или иммуногенными свойствами in vivo у животных, предпочтительно, млекопитающих, более предпочтительно у мышей или людей. Эпитоп в виде неполного пептида EPHA2, обладающий антигенными свойствами, можно определять способами, хорошо известными специалистам в данной области, такими как иммунологический анализ и можно определять, например, в соответствии со следующим способом, в котором получают различные неполные последовательности EPHA2. Для получения неполных последовательностей можно использовать способы синтеза олигопептидов, известные в данной области. Например, ряд последовательно укороченных с C- или N-конца полипептидов EPHA2 надлежащей длины получают, используя способы рекомбинации генов, хорошо известные специалистам в данной области. Затем изучают способность антител вступать в реакцию с этими полипептидами. Приблизительно определяют участок распознавания и затем синтезируют укороченные пептиды. Можно исследовать реакционную способность этих пептидов, тем самым определяя эпитоп.
1. Описание EPHA2
(1) Ген EPHA2
Нуклеотидная последовательность гена EPHA2 и его аминокислотная последовательность зарегистрированы в GenBank как рецептор EPH A2 (регистрационные номера No: NM_004431 и NP_004422, соответственно). Кроме того, нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания (ORF) в гене EPHA2 описана в SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей. Аминокислотная последовательность ORF описана в SEQ ID NO: 2 в списке последовательностей.
В связи с этим, EPHA2 также включает белки, которые состоят из аминокислотной последовательности, полученной посредством замены, делеции или вставки одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности EPHA2, и которые обладают биологической активностью, эквивалентной этому ферменту.
(2) Сайт-специфическая экспрессия гена EPHA2 в злокачественной опухоли.
Описано, что ген EPHA2 высоко экспрессирован во многих злокачественных опухолях, в частности, при раке молочной железы, злокачественной опухоли пищевода, раке предстательной железы, злокачественной опухоли желудка, немелкоклеточном раке легких, раке толстого кишечника и мультиформной глиобластоме.
В частности, можно измерять уровень экспрессии EPHA2 в каждой клетке и/или каждой ткани, тем самым определяя степень злокачественной трансформации и/или роста злокачественных клеток, которые могут объясняться сверхэкспрессией EPHA2 у тестируемых субъектов.
Кроме того, средство, которое ингибирует уровень экспрессии и/или активности EPHA2 обладает активностью ингибирования злокачественной трансформации клеток и/или роста злокачественных клеток, связанных с EPHA2.
Таким образом, тестируемые средства контактируют с клетками, экспрессирующими EPHA2 и средство, которое ингибирует уровень экспрессии и/или активности EPHA2 можно тем самым отбирать для скрининга на противоопухолевое средство.
В связи с этим, миРНК против EPHA2 ингибирует экспрессию EPHA2 и может использоваться в качестве противоопухолевого средства. миРНК против EPHA2 можно получать: конструированием на основе нуклеотидной последовательности мРНК EPHA2, РНК, содержащей частичную последовательность мРНК EPHA2 (смысловая РНК) и РНК, содержащей нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности РНК (антисмысловая РНК); синтезом РНК способом химического синтеза, по существу известным в данной области; и гибридизацией обеих полученных РНК. Предпочтительно, последовательность из одного или нескольких нуклеотидов, называемая липкой последовательностью, должна связываться с 3'-концом каждой смысловой или антисмысловой РНК, представляющих собой миРНК. Длину липкой последовательности, в частности, не ограничивают, поскольку она защищает РНК от нуклеаз. Можно использовать любую последовательность, предпочтительно от 1 до 10 нуклеотидов, более предпочтительно от 1 до 4 нуклеотидов, даже более предпочтительно 2 нуклеотида.
2. Антитело к EPHA2
(1) Получение антигена
Примеры антигенов для получения антител к EPHA2 по настоящему изобретению могут включать полноразмерный полипептид EPHA2 и его неполные полипептиды и, более конкретно, могут включать полноразмерный полипептид EPHA2 и предпочтительно, внеклеточную область полипептида EPHA2 (состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам с No. 1-534 в SEQ ID NO: 8 в списке последовательностей), более предпочтительно, неполный полипептид внеклеточной области полипептида EPHA2, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. 426-534 в SEQ ID NO: 8 в списке последовательностей, даже более предпочтительно неполный полипептид внеклеточной области полипептида EPHA2, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. 439-534 в SEQ ID NO: 8 в списке последовательностей, и производные, полученные добавлением произвольной аминокислотной последовательности или носителя для этих последовательностей. Дополнительные примеры таковых могут включать полипептиды, состоящие из последовательных неполных аминокислотных последовательностей из по меньшей мере 6 аминокислот и производные, полученные добавлением произвольной аминокислотной последовательности или носителя к этим последовательностям.
Таким образом, полноразмерный полипептид EPHA2 или его неполные полипептиды, использующиеся в качестве антигена, можно получать, обеспечивая экспрессию гена EPHA2 или генов неполных полипептидов в клетках-хозяевах способами генетической инженерии.
EPHA2 для применения можно очищать напрямую из опухолевых тканей человека или опухолевых клеток. Кроме того, полноразмерный полипептид EPHA2 или его неполные полипептиды можно синтезировать in vitro или получать, обеспечивая производство полипептидов в клетках-хозяевах способами генетической инженерии.
В генетической инженерии, гены, кодирующие EPHA2 или его неполные полипептиды, включают, в частности, в векторы, способные экспрессировать EPHA2 или его неполные полипептиды, и EPHA2 или его неполные полипептиды можно затем синтезировать в раствор, содержащий ферменты, субстраты и энергетические вещества, необходимые для транскрипции и трансляции. Альтернативно, вместе с этим, для получения желаемого белка клетки-хозяева других прокариот или эукариот можно трансформировать и обеспечивать экспрессию EPHA2 или его неполных полипептидов.
кДНК неполных полипептидов EPHA2 можно получать, например, так называемой полимеразной цепной реакцией (в дальнейшем обозначаемой как "ПЦР"), способом, в котором ПЦР выполняют, используя в качестве матриц кДНК библиотеки, экспрессирующие EPHA2 и определенные праймеры для амплификации кДНК EPHA2 или ДНК, кодирующей неполный полипептид (смотри Saiki, R.K., et al. Science (1988) 239, p. 487-489).
Примеры полипептидного синтеза in vitro включают в качестве неограничивающих примеров Rapid Translation System (RTS), произведенную Roche Diagnotics Corp.
Примеры прокариотических клеток-хозяев включают Escherichia coli и Bacillus subtilis. Для трансформации этих клеток-хозяев интересующими генами, клетки-хозяева трансформируют плазмидными векторами, содержащими репликон, т.е., участок начала репликации и регуляторную последовательность, полученные из видов, совместимых с хозяевами. Кроме того, предпочтительно, векторы должны иметь последовательность, которая может обеспечивать фенотипический признак (фенотип), избирательно для трансформированных клеток.
Эукариотические клетки-хозяева включают клетки позвоночных, насекомых, дрожжей и т.п. Например, в качестве клеток позвоночных часто используют клетки линии COS обезьяны (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p. 175-182, ATCC CRL-1650), мышиные фибробласты NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658) и линии клеток яичников китайского хомячка, дефектные по дигидрофолатредуктазе (клетки CHO, ATCC CCL-61) (Urlaub, G. и Chasin, L.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, p. 4126-4220), хотя клетки позвоночных не ограничиваются ими.
Полученные таким образом трансформанты можно культивировать стандартными способами, и в культуре они способны к внутриклеточному или внеклеточному производству интересующего полипептида.
Среду, используемую для культивирования можно выбрать соответствующим образом, в зависимости от выбранных клеток-хозяев, из состава различных обычно используемых сред. Для Escherichia coli, например, среду LB, необязательно дополненную антибиотиком (например, ампициллином) или можно использовать IPTG.
Рекомбинантный белок, внутриклеточно или внеклеточно продуцируемый трансформантами в культуре, можно выделять и очищать различными способами выделения, используя физические свойства белка, химические свойства белка или т.п.
В качестве примера можно привести, в частности, способы обработки традиционными средствами для осаждения белка, ультрафильтрацию, различные способы жидкостной хроматографии, такие как хроматография на молекулярных ситах (гель-фильтрация), адсорбционная хроматография, ионообменная хроматография, аффинная хроматография и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), диализ и их комбинации.
Кроме того, рекомбинантный белок, подлежащий экспрессии, можно связать с 6 остатками гистидина, для эффективной очистки посредством этого интересующего белка на колонке для аффинной хроматографии с никелем.
Комбинируя эти способы, интересующий полипептид можно легко получать в больших количествах, с высоким выходом и высокой степенью чистоты.
Антитело по настоящему изобретению можно получать иммунизацией животных антигеном в соответствии со стандартным способом и получая антитела, продуцируемые in vivo, с последующей очисткой.
Кроме того, продуцирующие антитела клетки, которые производят антитело к EPHA2, подвергают слиянию с миеломными клетками в соответствии со способом, известным в данной области (например, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p. 495-497; и Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, p. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)), тем самым создавая гибридомы, из которых также можно получать моноклональные антитела.
(2) Получение моноклонального антитела к EPHA2
Примеры антител, которые специфично связываются с EPHA2, могут включать моноклональные антитела, которые специфично связываются с EPHA2. Способ получения антител описан ниже.
Для получения моноклонального антитела необходимо осуществление следующего процесса:
(a) стадия очистки биополимеров, используемых в качестве антигенов,
(b) стадия иммунизации животных антигенами посредством инъекции, затем отбор крови у животных, исследование титра антитела для определения времени спленэктомии и затем получение продуцирующих антитела клеток,
(c) стадия получения миеломных клеток (далее обозначаемых как "миеломы"),
(d) стадия осуществления клеточного слияния между продуцирующими антитела клетками и миеломами,
(e) стадия выбора гибридомной группы, которая продуцирует интересующее антитело,
(f) стадия разделения на отдельные клоны клеток (клонирование),
(g) стадия культивирования гибридом для получения в больших количествах моноклональных антител или выращивание животных с трансплантированной гибридомой,
(h) стадия исследования биологической активности и специфичности связывания моноклональных антител, полученных таким образом или исследования свойств в качестве реагентов для мечения и т.д.
Далее подробно, в соответствии с этими стадиями, будет описан способ получения моноклональных антител, хотя получение антител не ограничено этим способом. Например, кроме клеток селезенки и миеломы, можно использовать другие продуцирующие антитела клетки.
(a) Очистка антигенов
EPHA2 или его неполные полипептиды, получаемые описанным выше способом, можно использовать в качестве антигенов.
Кроме того, можно также использовать в качестве антигенов неполные пептиды белков по настоящему изобретению, которые синтезируют химическим способом, используя фракции плазматических мембран, полученные из рекомбинантных соматических клеток, экспрессирующих EPHA2 или сами рекомбинантные соматические клетки, экспрессирующие EPHA2, в соответствии со способом, хорошо известным специалистам в данной области.
(b) Получение продуцирующих антитела клеток
Антигены, полученные в стадии (a) смешивают с адъювантами, хорошо известными специалистам в данной области, например, полным или неполным адъювантом Фрейнда или другими вспомогательными средствами, такими как калий алюминий сульфат, и экспериментальных животных иммунизируют этими иммуногенами. Животных, которых используют при получении гибридомы способами, известными в данной области, можно без проблем использовать в качестве экспериментальных животных. В частности, например, можно использовать мышей, крыс, коз, овец, коров и лошадей. Однако в качестве животных, подлежащих иммунизации, используют предпочтительно мышей или крыс, с точки зрения легкой доступности миеломных клеток, подлежащих слиянию, с выделенными продуцирующими антитела клетками и т.д.
Кроме того, фактически используемые линии мышей и крыс конкретно не ограничены. Например, можно использовать мышей таких линий, как A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BR, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB и 129 и крыс таких линий, как Low, Lewis, Sprague-Dawley, ACI, BN и Fischer.
Этих мышей и крыс можно получать, например, из учреждений по выращиванию/поставкам экспериментальных животных, таких как CLEA Japan, Inc. и Charles River Laboratories Japan, Inc.
Среди этих линий, особенно предпочтительными в качестве животных, подлежащих иммунизации, являются мыши линии BALB/c и крысы линии Low из соображений совместимости слияния с миеломными клетками, как описано ниже.
Кроме того, также предпочтительно используют мышей, обладающих нарушенным биологическим механизмом удаления аутоантитела, т.е., мышей с аутоиммунным заболеванием, учитывая антигенную гомологию между людьми и мышами.
Предпочтительно, чтобы в период иммунизации возраст этих мышей или крыс составлял от 5 до 12 недель, более предпочтительно от 6 до 8 недель.
Для иммунизации животных EPHA2 или его рекомбинантными антигенами можно использовать способы, известные в данной области, подробно описанные, например, в Weir, D.M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), и Kabat, E.A. and Mayer, M.M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964).
Из этих способов иммунизации, конкретно проиллюстрирован предпочтительный в настоящем изобретении способ, как описано ниже.
Конкретно, животным вначале внутрикожно или интраперитонеально вводят фракции мембранных белков, которые используют в качестве антигенов или клетки, которые экспрессируют антигены.
Однако предпочтительным является комбинированное использование обоих способов введения, для увеличения эффективности иммунизации. Эффективность иммунизации можно увеличивать, в частности, осуществляя внутрикожное введение в первых иммунизациях и интраперитонеальное введение в более поздних иммунизациях или только в самой последней иммунизации.
Схема введения антигенов различается, в зависимости от вида животных, подлежащих иммунизации, их индивидуальных различий и т.д. Как правило, антигены вводят предпочтительно из расчета 3-6 доз в интервале от 2 до 6 недель, более предпочтительно из расчета 3-4 доз в интервале от 2 до 4 недель.
Кроме того, дозы антигенов различаются в зависимости от вида животных, подлежащих иммунизации, их индивидуальных различий и т.д. и представляют, как правило, величину порядка 0,05-5 мг, предпочтительно 0,1-0,5 мг.
Повторную иммунизацию проводят 1-6 неделями позже, предпочтительно 2-4 неделями позже, более предпочтительно 2-3 неделями позже, от означенного введения антигена.
В связи с этим, дозы антигенов при повторной иммунизации различаются в зависимости от вида животных, их размера и т.д. и представляют, как правило, величину порядка 0,05-5 мг, предпочтительно 0,1-0,5 мг, более предпочтительно 0,1-0,2 мг, например, для мышей.
1-10 сутками позже, предпочтительно 2-5 сутками позже, более предпочтительно 2-3 сутками позднее от повторной иммунизации, клетки селезенки или лимфоциты, содержащие продуцирующие антитела клетки, в стерильных условиях выделяют из животных, подлежащих иммунизации.
В этом способе измеряют титр антител, и животных, обладающих значимо увеличенным титром антител можно использовать в качестве источников продуцирующих антитела клеток, тем самым увеличивая эффективность последующих способов.
Примеры способов измерения титра антител, которые используют в настоящем документе, могут включать, но не ограничиваются ими, RIA и ELISA.
Измерение титра антител по настоящему изобретению можно осуществлять способами, как описано далее, например, в соответствии с ELISA.
Во-первых, очищенные или частично очищенные антигены абсорбируют на поверхности твердой фазы, такой как 96-луночные планшеты для ELISA. Кроме того, на поверхность твердой фазы без абсорбированного антигена наносят белки, не являющиеся антигенами, например, бычий сывороточный альбумин (далее обозначаемый как "БСА"). Поверхности промывают и затем подвергают взаимодействию с серийно разведенными образцами (например, мышиной сыворотки) в качестве первичных антител, таким образом, антитела в образцах связываются с антигенами.
Кроме того, в качестве вторичных антител к ним добавляют меченые ферментом антитела к мышиным антителам, так что вторичные антитела связываются с мышиными антителами. После промывания, к ним добавляют субстраты для фермента и, например, измеряют изменение поглощения, обусловленное развитием окрашивания, основанного на деградации субстрата, подсчитывая, тем самым, титр антител.
Продуцирующие антитела клетки можно отделять от этих селезеночных клеток или лимфоцитов согласно способам, известным в данной области (например, Kohler et al., Nature (1975) 256, p. 495; Kohler et al., Eur. J. Immunol. (1977) 6, p. 511; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550; и Walsh, Nature, (1977) 266, p. 495).
Например, для клеток селезенки можно выбрать общий способ, который включает разделение образца клеток на плоские фрагменты, фильтрование их сквозь сито из нержавеющей стали и затем на основании этого, разделения продуцирующих антитела клеток посредством погружения в минимальную поддерживающую среду Игла (MEM)
(C) Получение миеломных клеток (далее обозначаемых как "миеломы")
Миеломные клетки, использующиеся при слиянии клеток, конкретно не ограничены, и их можно выбрать для применения соответствующим образом из клеточных линий, известных в данной области. Однако предпочтительно используют линии, дефектные по HGPRT (гипоксантингуанинфосфорибозилтрансфераза), для которых отлажены способы селекции, из расчета удобства гибридомного отбора из слитых клеток.
Их конкретные примеры включают: полученные у мышей X63-Ag8 (X63), NS1-ANS/1 (NS1), P3X63-Ag8.U1 (P3U1), X63-Ag8.653 (X63.653), SP2/0-Ag14 (SP2/0), MPC11-45.6TG1.7 (45.6TG), FO, S149/5XXO и BU.1; полученные у крыс 210.RSY3.Ag.1,2.3 (Y3); и полученные у человека U266AR (SKO-007), GM1500.GTG-A12 (GM1500), UC729-6, LICR-LON-HMy2 (HMy2) и 8226AR/NIP4-1 (NP41).
Такие линии, дефектные по HGPRT, можно получать, например, в Американской коллекции типовых культур (ATCC).
7
Эти клеточные линии пересевают в подходящую среду, например, среду с 8-азагуанином [среда RPMI-1640, дополненная глутамином, 2-меркаптоэтанолом, гентамицином и эмбриональной телячьей сывороткой (далее обозначаемый как "ЭТС") и дополнительно дополненная 8-азагуанином], модифицированную по способу Исков среду Дульбекко (далее обозначаемая как "IMDM") или модифицированную Дульбекко среду Игла (далее обозначаемая как "DMEM") и за 3-4 суток до слияния клеток пересевают в обычную среду [например, среду ASF104 (произведено Ajinomoto Co., Inc.), содержащую 10% ЭТС]. В сутки слияния получают клетки в количестве 2×10 или более.
(d) Слияние клеток
Слияние между продуцирующими антитела клетками и миеломными клетками можно проводить соответствующим образом в условиях, которые не сильно снижают показатели клеточной выживаемости, известными в данной области способами (например, Weir, D.M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987); и Kabat, E.A. and Mayer, M.M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964)).
Например, в качестве таких способов можно использовать химический способ, который включает смешивание продуцирующих антитела клеток и миеломных клеток в растворе высококонцентрированного полимера (например, полиэтиленгликоля) и физический способ, в котором используют электростимуляцию.
Из этих способов ниже конкретно проиллюстрирован химический способ.
В частности, когда в качестве полимера в высококонцентрированном полимерном растворе используют полиэтиленгликоль, продуцирующие антитела клетки и миеломные клетки смешивают в растворе полиэтиленгликоля, обладающего молекулярной массой от 1500 до 6000, предпочтительно от 2000 до 4000, при температуре от 30 до 40°C, предпочтительно от 35 до 38°C, в течение от 1 до 10 минут, предпочтительно от 5 до 8 минут.
(e) Отбор гибридомной группы
Способ для отбора гибридом, полученных слиянием клеток конкретно не ограничен и обычно используют способ отбора HAT (гипоксантин-аминоптерин-тимидин) (Kohler et al., Nature (1975) 256, p. 495; и Milstein et al., Nature (1977) 266, p. 550).
Этот способ эффективен для получения гибридом, с использованием линии миеломных клеток, дефектных по HGPRT, которые не способны выжить в аминоптерине.
Конкретно, не слитые клетки и гибридомы можно культивировать в среде HAT, тем самым обуславливая сохранение и рост только гибридом, которые устойчивы к аминоптерину.
(f) Разделение на отдельные клоны клеток (клонирование)
В качестве способов клонирования гибридом, например, можно использовать известные в данной области способы, такие как клонирование в метилцеллюлозе, в мягкой агарозе и способы лимитирующих разведений (смотри например, Barbara, B.M. and Stanley, M.S.: Selected Method in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Company, San Francisco (1980)). Среди этих способов особенно предпочтительным является способ лимитирующих разведений.
В этом способе на микропланшет высевают питающие клетки, такие как линии фибробластов, полученные из зародышей крыс или нормальных мышиных клеток селезенки, тимуса или асцитных клеток.
С другой стороны, гибридомы предварительно разводят в среде до 0,2-0,5 клеток/0,2 мл. Этот раствор, содержащий плавающие в нем разведенные гибридомы, добавляют в концентрации 0,1 мл/лунку, и гибридомы можно непрерывно культивировать в течение приблизительно 2 недель, при этом приблизительно 1/3 среды заменяют на свежую, через регулярные интервалы (например, интервал в 3 суток), таким образом, выращивая клоны гибридом.
Для лунок с заметным титром антител клонирование повторяют от 2 до 4 раз, например, способом лимитирующих разведений, и клоны, у которых стабильно наблюдают титр антител можно отбирать в качестве гибридомных линий, продуцирующих моноклональные антитела к EPHA2.
Примеры гибридомных линий, клонированных таким образом, могут включать гибридому SH348-1 и гибридому SH357-1. Гибридома SH348-1 и гибридома SH357-1 депонированы 8 июня 2007 года в International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (адрес: Tsukuba Central 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba, Ibaraki, Japan). Гибридома SH348-1 обозначена как SH348-1 с регистрационным номером FERM BP-10836, а гибридома SH357-1 обозначена как SH357-1 с регистрационным номером FERM BP-10837.
В настоящем описании, антитело, продуцируемое гибридомой SH348-1, обозначено как "SH348-1", а антитело, продуцируемое гибридомой SH357-1, обозначено как "SH357-1".
(g) Получение моноклональных антител посредством культивирования гибридом
Отобранные таким образом гибридомы можно культивировать, для эффективного получения, таким образом, моноклональных антител. Перед культивированием предпочтительно, чтобы гибридомы продуцирующие представляющее интерес моноклональное антитело подвергались скринингу.
Для такого скрининга можно выбрать способы, по существу известные в данной области.
Измерение титра антител по настоящему изобретению можно осуществить, например, посредством ELISA, как описано в пункте (b).
Гибридомы, полученные способом, как описано выше, можно подвергнуть криоконсервированию в жидком азоте или в морозильнике при -80°C или ниже.
Кроме того, полностью клонированные гибридомы можно несколько раз пересеивать в среде HT (среда HAT за исключением аминоптерина) и затем культивировать в обычной среде, которую после этого заменяют.
Крупномасштабное культивирование осуществляют посредством ротационного культивирования, с использованием больших культуральных сосудов или культивирования с постоянным перемешиванием.
Супернатант, полученный в данном крупномасштабном культивировании, можно очищать способами, хорошо известными специалистам в данной области, такими как гель-фильтрация с получением моноклональных антител, которые специфично связываются с белком по настоящему изобретению.
Кроме того, гибридомы можно интраперитонеально инъецировать мышам той же линии (например, BALB/c) или мышам Nu/Nu и выращивать с получением асцитных жидкостей, содержащих большие количества моноклональных антител по настоящему изобретению.
Чтобы получать асцитные жидкости в больших количествах перед интраперитонеальным введением предварительно (от 3 до 7 суток перед введением) вводят минеральное масло, такое как 2,6,10,14-тетраметилпентадекан (пристан).
6
7
Например, мышам той же линии, что и гибридомы, предварительно интраперитонеально инъецируют иммуносупрессирующее средство для инактивации T-клеток. Через 20 суток, в среде без сыворотки обеспечивают растворение от 10 до 10 клеток гибридомного клона (0,5 мл) и этот раствор интраперитонеально вводят мышам. Как правило, асцитные жидкости у мышей собирают, когда накопившаяся асцитная жидкость приводит к увеличению брюшной полости.
Этим способом получают моноклональные антитела с концентрацией приблизительно в 100 раз большей, чем в культуральном растворе.
Моноклональные антитела, полученные этим способом, можно очищать способами, описанными, например, в Weir, D.M.: Handbook of Experimental Immunology, Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978).
Их конкретные примеры включают осаждение сульфатом аммония, гель-фильтрацию, ионообменную хроматографию и аффинную хроматографию.
Для очистки в качестве подходящих способов можно также использовать коммерчески доступные наборы для очистки моноклональных антител (например, MAbTrap GII Kit; производства Pharmacia Inc.) и т.п.
Полученные таким образом моноклональные антитела обладают высокой антигенной специфичностью к EPHA2.
(h) Анализ моноклональных антител
Изотипы и подкласс моноклональных антител, полученных таким образом, можно определять, как описано далее.
Во-первых, примеры способов распознавания включают способ Оухтерлони, ELISA и RIA.
Способ Оухтерлони пригоден, но требует способа концентрирования для моноклональных антител с низкой концентрацией.
С другой стороны, при использовании ELISA или RIA, супернатант культуры непосредственно реагирует с антигеном, адсорбированным на твердой фазе и, кроме того, в качестве вторичных антител можно использовать антитела соответствующие различным иммуноглобулиновым изотипам и подклассам, тем самым определяя изотип или подкласс моноклональных антител.
Кроме того, в качестве более пригодных способов также можно использовать коммерчески доступные наборы для распознавания (например, Mouse Typer Kit; производства Bio-Rad Laboratories, Inc.) и т.п.
Кроме того, количественную оценку белка можно определить согласно способу Фолина-Лоури (Folin-Lowry) и способу расчета, используя показатель поглощения при 280 нм [1,4 (OD280) = 1 мг/мл иммуноглобулина].
(3) Другие антитела
Антитело по настоящему изобретению включает моноклональное антитело к EPHA2, а также генетические рекомбинантные антитела, искусственно модифицированные с целью, например, снижения ксеноантигенного действия на людей, например, химерные антитела, гуманизированные антитела и антитела человека. Эти антитела можно получать известными способами.
Примеры химерного антитела включают антитело с вариабельными и константными областями, полученными от видов, отличающихся друг от друга и конкретно, включает химерное антитело, содержащее вариабельные области мышиного происхождения и константные области человека, соединенные вместе (смотри Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851-6855, (1984)).
Примеры гуманизированного антитела могут включать антитело, содержащее антитело человека с определяющими комплементарность областями (CDR), замененными на соответствующие области других видов (смотри Nature (1986) 321, p. 522-525) и антитело, содержащее антитело человека с последовательностями CDR и некоторыми аминокислотными остатками каркасной области, замененными на соответствующие последовательности CDR и некоторые аминокислотные остатки других видов посредством "пересадки CDR" (смотри WO 90/07861 и US 6972323).
Дополнительные примеры антитела по настоящему изобретению могут включать антитело человека. Антитело человека к EPHA2 обозначает антитело человека только с последовательностью гена антитела, полученной из хромосомы человека. Антитело человека к EPHA2 можно получать способами с использованием мышей, продуцирующих антитело человека, имеющих фрагмент хромосомы человека, содержащий гены H и L цепей антитела человека (смотри например, Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p. 133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, p. 3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, p. 69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; и Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, p. 722-727).
Для получения таких трансгенных животных, конкретно, генетических рекомбинантных животных, у которых эндогенные локусы тяжелой и легких цепей иммуноглобулинов у не являющихся человеком млекопитающих разрушены, и вместо этого им введены локусы тяжелой и легких цепей иммуноглобулинов человека посредством векторов на основе искусственной дрожжевой хромосомы (YAC) или подобных, можно получать посредством получения нокаутных и трансгенных животных и скрещивания этих животных.
Кроме того, эукариотические клетки трансформируют посредством кДНК, кодирующей как тяжелые, так и легкие цепи антитела человека, предпочтительно векторами, содержащими кДНК, способами генетической рекомбинации, и трансформированные клетки, продуцирующие генетические рекомбинантные моноклональные антитела человека, также можно культивировать, получая, таким образом, антитела из супернатанта культуры.
Для этого в качестве хозяев можно использовать, например, эукариотические клетки, предпочтительно клетки млекопитающих, такие как клетки CHO, лимфоциты и миеломы.
Кроме того, также известны способы получения антител человека, выбранных из библиотек антител человека, экспонированных на фаге (смотри например, Wormstone, I.M. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), p. 2301-2308; Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics и Proteomics (2002), 1 (2), p. 189-203; и Siriwardena, D. et al., Ophthalmology (2002) 109 (3), p. 427-431).
Например, можно использовать способ фагового дисплея, который включает осуществление экспрессии вариабельных областей антитела человека в виде одноцепочечного антитела (scFv) на поверхности фага и отбор фагов, связывающих антигены (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p. 1105-1116).
Кроме того, также можно использовать другой способ фагового дисплея, который включает осуществление экспрессии Fab-фрагмента (антигенсвязывающий фрагмент) антитела человека и отбор фагов, связывающих антигены (WO 97/08320 и WO 01/05950).
Гены фагов, отобранных по признаку связывания с антигеном можно анализировать, определяя, таким образом, последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области антитела человека, связывающиеся с антигенами.
Когда определяют последовательность ДНК scFv или Fab, связывающихся с антигенами, из нее получают последовательности CDR и можно получать и вводить подходящим хозяевам экспрессирующие векторы с этими последовательностями, с последующей экспрессией генов с получением антител человека (WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, p. 433-455, и Nature Biotechnology (2005) 23 (9), p. 1105-1116).
Гены антител можно временно выделять, а затем вводить подходящим хозяевам для получения антител. В этом случае, походящих хозяев и экспрессирующие векторы можно комбинировать для применения.
В случае использования в качестве хозяев эукариотических клеток, можно использовать клетки животных, растительные клетки и эукариотические микроорганизмы.
Примеры клеток животных могут включать (1) клетки млекопитающих, например, клетки линии COS обезьяны (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p. 175-182, ATCC CRL-1650), мышиные фибробласты NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658) и линии, дефектные по дигидрофалатредуктазе (Urlaub, G. and Chasin, L.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, p. 4126-4220) клеток яичников китайского хомячка (клетки CHO, ATCC CCL-61).
Кроме того, для использования, этих хозяев также можно модифицировать, чтобы экспрессировать антитела с модифицированной структурой цепи сахаров и увеличенной активностью ADCC (антителозависимая цитотоксическая активность) или активностью CDC. Примеры таких хозяев могут включать клетки CHO, содержащие включенные в них гены, которые кодируют молекулы антител, и продуцирующие композиции антител, в которых цепи сахаров с N-ацетилглюкозамином, не связанным с фукозой, на их восстанавливающих концах, занимают 20% или более цепей сахаров, соединенных N-гликозидом комплексного типа, связывающих Fc-области антитела (смотри WO 02/31140).
При использовании прокариотических клеток их примеры могут включать Escherichia coli и Bacillus subtilis.
Ген представляющего интерес антитела вводят в эти клетки посредством трансформации, а трансформированные клетки культивируют in vitro с получением антител.
Изотип антител по настоящему изобретению не ограничен и их примеры включают IgG (IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), IgM, IgA (IgA1 или IgA2), IgD и IgE и могут предпочтительно включать IgG и IgM.
Кроме того, антитело по настоящему изобретению может представлять собой фрагмент антитела с антигенсвязывающим участком антитела или его модифицированной формой.
Примеры фрагмента антитела включают Fab, F(ab')2, Fv, одноцепочечный Fv (scFv), содержащий тяжелую и легкую цепь Fv, связанные подходящим линкером, диатело, линейное антитело и полиспецифическое антитело, образованное фрагментами антител.
Кроме того антитело по настоящему изобретению может представлять собой полиспецифическое антитело, обладающее специфичностью, по меньшей мере, для двух различных антигенов.
Подобная молекула обычно связывает два антигена (т.е., биспецифическое антитело). "Полиспецифическое антитело" по настоящему изобретению относится к антителу со специфичностью для многих (например, трех) антигенов.
Полиспецифическое антитело, используемое в качестве антитела по настоящему изобретению, может представлять собой полноразмерное антитело или фрагмент такого антитела (например, F(ab')2 биспецифическое антитело). Биспецифическое антитело можно получать посредством связывания тяжелых и легких цепей (пары HL) двух антител или также можно получать посредством слияния гибридом, продуцирующих моноклональные антитела, отличные друг от друга, с получением биспецифического антитела, продуцируемого слитыми клетками (Millstein et al., Nature (1983) 305, p. 537-539).
Антитело по настоящему изобретению может являться одноцепочечным антителом (также обозначаемым как scFv). Одноцепочечное антитело получают посредством соединения V областей тяжелой и легкой цепи антитела через полипептидный линкер (Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113 (Rosenberg and Moore ed., Springer Verlag, New York, p. 269-315 (1994)); и Nature Biotechnology (2005), 23, p. 1126-1136).
Способы получения одноцепочечного антитела хорошо известны в данной области (смотри например, патенты США № 4946778, 5260203, 5091513, и 5455030). Для scFv, V области тяжелой и легкой цепи соединяют линкером, который не образует конъюгат, предпочтительно полипептидным линкером (Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988), 85, p. 5879-5883). V области тяжелой и легкой цепи в scFv можно получать из такого же антитела или можно получать из других антител.
Например, в качестве пептидного линкера для соединения V областей используют произвольный одноцепочечный пептид из 12-19 остатков.
ДНК, кодирующую scFv получают: амплифицируя, в качестве матриц, полноразмерные последовательности или неполные последовательности (кодирующие желаемые аминокислотные последовательности) ДНК, кодирующей тяжелую цепь или V область тяжелой цепи антитела и ДНК, кодирующей его легкую цепь или V область легкой цепи, способом ПЦР, используя пары праймеров, сконструированных для их обоих концов; и впоследствии дополнительно амплифицируя ДНК, кодирующую пептидную линкерную часть в сочетании с парой праймеров, сконструированных для связи соответствующим образом обоих концов линкерной последовательности с последовательностями тяжелой и легкой цепи.
Кроме того, после получения ДНК, кодирующей scFv, можно получать экспрессирующие векторы, содержащие ДНК и хозяев, трансформированных экспрессирующими векторами стандартными способами. Кроме того, используя хозяев, можно стандартными способами получать scFv.
Для этих фрагментов антител, их гены получают и экспрессируют таким же образом, как выше, и можно обеспечивать продукцию фрагментов антител хозяевами.
Антитело по настоящему изобретению может представлять собой поликлональное антитело, которое является смесью множества антител к EPHA2, отличающихся аминокислотными последовательностями. Один из примеров поликлонального антитела может включать смесь множества антител, отличающихся по CDR. Культивируют смесь клеток, продуцирующих антитела, отличающиеся друг от друга, и в качестве таких поликлональных антител можно использовать очищенные от культуры антитела (смотри WO 2004/061104).
Также в качестве модифицированной формы антитела можно использовать антитела, полученные посредством связывания антитела по настоящему изобретению с различными молекулами, такими как полиэтиленгликоль (PEG).
Кроме того, антитело по настоящему изобретению может представлять собой конъюгат этих антител, образованный с другими лекарственными средствами (иммуноконъюгат). Примеры такого антитела могут включать конъюгаты, полученные посредством связывания этих антител с радиоактивными веществами или соединениями, имеющими фармакологическое действие (Nature Biotechnology (2005) 23, p. 1137-1146).
Полученные антитела можно очищать до гомогенного состояния. В выделении и очистке антител можно использовать любой способ выделения/очистки, используемый для обычных белков.
Антитела можно выделять и очищать, выбирая и комбинируя, соответствующим образом, например, использование колонок для хроматографии, фильтры, ультрафильтрацию, высаливание, диализ, электрофорез в полиакриламидном геле для препарата и изоэлектрофокусирование (способы очистки и исследования свойств белков: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); и антител: A Laboratory Manual. Ed Harlow и David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), однако, способ выделения/очистки не ограничен ими.
Примеры хроматографии включают аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гель-фильтрацию, обращено-фазовую хроматографию и адсорбционную хроматографию.
Эти способы хроматографии можно осуществлять, используя жидкостную хроматографию, такую как ВЭЖХ или FPLC.
Примеры колонок, используемых в аффинной хроматографии, включают колонки с белком A и белком G.
Примеры колонок на основе колонки с белком A включают Hyper D, POROS, Sepharose F.F. (Pharmacia Inc.).
Кроме того, антитела можно также очищать на основе их аффинности к антигенам, используя антиген, иммобилизованный на носителе.
3. Свойства антитела по настоящему изобретению
Антитело по настоящему изобретению к EPHA2, полученное посредством способа, обладает следующими свойствами:
(1) одно антитело по настоящему изобретению имеет следующие свойства от a) до e):
a) не обладает способностью к фосфорилированию остатков тирозина EPHA2;
b) обладает активностью ADCC по отношению к клеткам, экспрессирующим EPHA2;
c) обладает активностью CDC по отношению к клеткам, экспрессирующим EPHA2;
d) обладает противоопухолевой активностью in vivo; и
e) специфично связывается с полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам с No. 426-534 в SEQ ID NO: 8 в списке последовательностей.
Примеры антитела, обладающего подобными свойствами, могут включать любое антитело, выбранное из группы, состоящей из следующих 1)-8):
1) SH348-1,
2) антитело, которое распознает эпитоп, распознаваемый антителом, продуцируемым гибридомой SH348-1 (FERM BP-10836),
3) антитело с аминокислотными последовательностями, представленными SEQ ID No: 59, 61 и 63 в списке последовательностей в качестве определяющих комплементарность областей в вариабельной области тяжелой цепи, и с аминокислотными последовательностями, соответствующими SEQ ID No: 65, 67 и 69 в списке последовательностей в качестве определяющих комплементарность областей в вариабельной области легкой цепи,
4) антитело, характеризующееся следующими i) и ii):
i) имеющее пептид тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот, представленную общей формулой (I):
1
1
2
2
3
3
4
-FRH-CDRH-FRH-CDRH-FRH-CDRH-FRH-(I)
1
1
2
2
3
3
4
где FRH обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из от 18 до 30 аминокислот; CDRH обозначает аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 59 в списке последовательностей; FRH обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 14 аминокислот; CDRH обозначает аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 61 в списке последовательностей; FRH обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 32 аминокислот; CDRH обозначает аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 63 в списке последовательностей; и FRH обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 11 аминокислот, где эти аминокислоты связаны друг с другом посредством пептидных связей; и
ii) имеющее полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную общей формулой (II):
1
1
2
2
3
3
4
-FRL-CDRL-FRL-CDRL-FRL-CDRL-FRL-(II)
1
1
2
2
3
3
4
где FRL обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 23 аминокислот; CDRL обозначает аминокислотная последовательность, представленную SEQ ID NO: 65 в списке последовательностей; FRL обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 15 аминокислот; CDRL обозначает аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 67 в списке последовательностей; FRL обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 32 аминокислот; CDRL обозначает аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 69 в списке последовательностей; и FRL обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 10 аминокислот, где эти аминокислоты связаны друг с другом посредством пептидных связей.
5) SH357-1,
6) антитело, которое распознает эпитоп, распознаваемый антителом, продуцируемым гибридомой SH357-1 (FERM BP-10837),
7) антитело с аминокислотными последовательностями, представленными SEQ ID No: 71, 73 и 75 в списке последовательностей в качестве определяющих комплементарность областей в вариабельной области тяжелой цепи и с аминокислотными последовательностями, соответствующими SEQ ID No: 77, 79 и 81 в списке последовательностей в качестве определяющими комплементарность областей в вариабельной области легкой цепи,
8) антитело по любому из (5)-(7), характеризующееся следующим i) и ii):
i) имеющее пептид тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот, представленную общей формулой (I):
1
1
2
2
3
3
4
-FRH-CDRH-FRH-CDRH-FRH-CDRH-FRH-(I)
1
1
2
2
3
3
4
где FRH обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из от 18 до 30 аминокислотных последовательностей; CDRH обозначает аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 71 в списке последовательностей; FRH обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 14 аминокислот; CDRH обозначает аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 73 в списке последовательностей; FRH обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 32 аминокислот; CDRH обозначает аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 75 в списке последовательностей; и FRH обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 11 аминокислот, где эти аминокислоты связаны друг с другом посредством пептидных связей; и
ii) имеющее полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную общей формулой (II):
1
1
2
2
3
3
4
-FRL-CDRL-FRL-CDRL-FRL-CDRL-FRL-(II)
1
1
2
2
3
3
4
где FRL обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 23 аминокислот; CDRL обозначает аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 77 в списке последовательностей; FRL обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 15 аминокислот; CDRL обозначает аминокислотная последовательность, представленную SEQ ID NO: 79 в списке последовательностей; FRL обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 32 аминокислот; CDRL обозначает аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 81 в списке последовательностей; и FRL обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 10 аминокислот, где эти аминокислоты связаны друг с другом посредством пептидных связей.
(2) другое антитело по настоящему изобретению имеет следующие свойства от a) до f):
a) не обладает способностью к фосфорилированию остатков тирозина EPHA2;
b) демонстрирует эффект снижения уровня белка EPHA2;
c) обладает активностью ADCC по отношению к клеткам, экспрессирующим EPHA2;
d) обладает активностью CDC по отношению к клеткам, экспрессирующим EPHA2;
e) обладает противоопухолевой активностью in vivo; и
f) специфично связывается с полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам с No. от 426 до 534 в SEQ ID NO: 8 в списке последовательностей.
Примеры антитела, обладающего такими свойствами могут включать любое антитело, выбранное из группы, состоящей из следующих 1)-4):
1) SH348-1,
2) антитело, которое распознает эпитоп, распознаваемый антителом, продуцируемым гибридомой SH348-1 (FERM BP-10836),
3) антитело с аминокислотными последовательностями, представленными SEQ ID No: 59, 61 и 63 в списке последовательностей в качестве определяющих комплементарность областей в вариабельной области тяжелой цепи и с аминокислотными последовательностями, представленными SEQ ID No: 65, 67 и 69 в списке последовательностей в качестве определяющих комплементарность областей в вариабельной области легкой цепи,
4) антитело, характеризующееся следующими i) и ii):
i) имеющее пептид тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот, представленную общей формулой (I):
1
1
2
2
3
3
4
-FRH-CDRH-FRH-CDRH-FRH-CDRH-FRH-(I)
1
1
2
2
3
3
4
где FRH обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из от 18 до 30 аминокислот; CDRH обозначает аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 59 в списке последовательностей; FRH обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 14 аминокислот; CDRH обозначает аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 61 в списке последовательностей; FRH обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 32 аминокислот; CDRH обозначает аминокислотная последовательность, представленную SEQ ID NO: 63 в списке последовательностей; и FRH обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 11 аминокислот, где эти аминокислоты связаны друг с другом посредством пептидных связей; и
ii) имеющее полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную общей формулой (II):
1
1
2
2
3
3
4
-FRL-CDRL-FRL-CDRL-FRL-CDRL-FRL-(II)
1
1
2
2
3
3
4
где FRL обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 23 аминокислот; CDRL обозначает аминокислотная последовательность, представленную SEQ ID NO: 65 в списке последовательностей; FRL обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 15 аминокислот; CDRL обозначает аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 67 в списке последовательностей; FRL обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 32 аминокислот; CDRL обозначает аминокислотная последовательность, представленную SEQ ID NO: 69 в списке последовательностей; и FRL обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 10 аминокислот, где эти аминокислоты связаны друг с другом посредством пептидных связей.
(3) другое антитело по настоящему изобретению обладает следующими свойствами от a) до e):
a) не обладает способностью к фосфорилированию остатков тирозина EPHA2;
b) не демонстрирует эффект снижения уровня белка EPHA2;
c) обладает активностью ADCC;
d) обладает активностью CDC;
e) обладает противоопухолевой активностью in vivo; и
f) специфически связывается с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. от 426 до 534 в SEQ ID NO: 8 в списке последовательностей.
Примеры антитела, обладающего подобными свойствами, могут включать любое одно антитело, выбранное из группы, состоящей из следующих 1)-4):
1) SH357-1,
2) антитело, которое распознает эпитоп, распознаваемый антителом, продуцируемым гибридомой SH357-1 (FERM BP-10836),
3) антитело с аминокислотными последовательностями, представленными SEQ ID No: 71, 73 и 75 в списке последовательностей в качестве определяющих комплементарность областей в вариабельной области тяжелой цепи и с аминокислотными последовательностями представленными в SEQ ID No: 77, 79, и 81 в списке последовательностей в качестве определяющих комплементарность областей в вариабельной области легкой цепи,
4) антитело, обладающее следующими свойствами i) и ii):
i) имеющее пептид тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот, представленную общей формулой (I):
1
1
2
2
3
3
4
-FRH-CDRH-FRH-CDRH-FRH-CDRH-FRH-(I)
1
1
2
2
3
3
4
где FRH обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из от 18 до 30 аминокислот; CDRH обозначает аминокислотная последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 71 в списке последовательностей; FRH обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 14 аминокислот; CDRH обозначает аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 73 в списке последовательностей; FRH обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 32 аминокислот; CDRH обозначает аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 75 в списке последовательностей; и FRH обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 11 аминокислот, где эти аминокислоты связаны друг с другом посредством пептидных связей; и
ii) имеющее полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, представленную общей формулой (II):
1
1
2
2
3
3
4
-FRL-CDRL-FRL-CDRL-FRL-CDRL-FRL-(II)
1
1
2
2
3
3
4
где FRL обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 23 аминокислот; CDRL обозначает аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 77 в списке последовательностей; FRL обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 15 аминокислот; CDRL обозначает аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 79 в списке последовательностей; FRL обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 32 аминокислот; CDRL обозначает аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 81 в списке последовательностей; и FRL обозначает произвольно выбранную аминокислотную последовательность, состоящую из 10 аминокислот, где эти аминокислоты связаны друг с другом посредством пептидных связей.
4. Фармацевтическое средство, содержащее антитело к EPHA2
Антитело к EPHA2 по настоящему изобретению пригодно в качестве фармацевтического средства, в частности, фармацевтическая композиция предназначена для лечения злокачественных опухолей или в качестве антитела для иммунологической диагностики таких заболеваний.
Предпочтительные примеры видов злокачественных опухолей могут включать, но не ограничиваются ими, рак молочной железы, злокачественную опухоль пищевода, рак предстательной железы, злокачественную опухоль желудка, немелкоклеточный рак легких, рак толстого кишечника и мультиформную глиобластому.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество антитела к EPHA2 и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, растворитель, эмульгатор, консервант и/или адъювант.
Предпочтительно, фармацевтически используемые средства, которые являются подходящими для фармацевтической композиции по настоящему изобретению, должны быть нетоксичными в используемой дозе или вводимой концентрации для индивидуумов, которые получают фармацевтическую композицию.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать фармацевтическое средство для изменения, поддержания или сохранения pH, осмотического давления, вязкости, прозрачности, цвета, изотоничности, стерильности, стабильности, скорости растворения, скорости замедленного высвобождения, всасываемости или проницаемости.
Примеры фармацевтического вещества могут включать, но не ограничиваются ими, следующее: аминокислоты, такие как глицин, аланин, глутамин, аспарагин, аргинин и лизин; противомикробные средства; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, сульфат натрия и бисульфит натрия; буферы, такие как фосфатный, цитратный и боратный буферы, гидрокарбонат и растворы трис-HCl; заполнители, такие как маннит и глицин; хелатирующие средства, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА); комплексообразователи, такие как кофеин, поливинил пирролидин, β-циклодекстрин и гидроксипропил-β-циклодекстрин; наполнители, такие как глюкоза, манноза и декстрин; моносахариды, дисахариды, глюкоза, манноза и другие углеводороды, такие как декстрин; красители; ароматизаторы; разбавители; эмульгаторы; гидрофильные полимеры, такие как поливинил пирролидин; низкомолекулярные полипептиды; солеобразующие противоионы; антисептики, такие как хлорид бензалкония, бензойная кислота, салициловая кислота, тимеросал, фенетиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота и пероксид водорода; растворители, такие как глицерин, пропиленгликоль и полиэтиленгликоль; сахарные спирты, такие как маннит и сорбит; суспендирующие средства; поверхностно-активные вещества, такие как PEG, сорбитановый сложный эфир, полисорбаты, такие как полисорбат 20 и полисорбат 80, тритон, трометамин, лецитин и холестерин; средства, усиливающие стабильность, такие как сахароза и сорбит; средства, увеличивающие эластичность, такие как хлорид натрия, хлорид калия, маннит и сорбит; носители; разбавители; эксципиенты; и/или фармацевтические адъюванты.
Количество этих добавляемых фармацевтических средств предпочтительно в количестве от 0,01 до 100 раз, конкретно, от 0,1 до 10 раз больше, чем масса антитела к EPHA2.
В данном контексте, настоящее изобретение также включает фармацевтическую композицию, содержащую иммунолипосому, включающую антитело к EPHA2 в липосоме или антитело к EPHA2, связанное с липосомой (патент США № 6214388).
Предпочтительный состав фармацевтической композиции в препарате может должным образом определять специалист в данной области, в зависимости от соответствующего заболевания, применяемого пути введения и т.д.
Эксципиенты или носители в фармацевтической композиции могут являться жидкими или твердыми. Подходящие эксципиенты или носители могут представлять собой воду для инъекций, физиологический раствор, цереброспинальную жидкость или другие средства, как правило, используемые при парентеральном введении.
В качестве носителя также можно использовать нейтральный физиологический раствор или физиологический раствор, содержащий сывороточный альбумин. Фармацевтическая композиция также может содержать буфер трис (pH 7,0-8,5) или ацетатный буфер (pH 4,0-5,5), а также сорбит или другие соединения. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению получают в лиофилизированной или жидкой форме в качестве подходящего лекарственного средства с выбранной композицией и необходимой чистотой.
Фармацевтическую композицию, содержащую антитело к EPHA2, также можно получать в лиофилизированной форме, используя подходящий эксципиент, такой как сахароза.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно получать для парентерального введения или также можно получать для всасывания в желудочно-кишечном тракте.
Состав и концентрацию препарата можно устанавливать в зависимости от способа введения. Если антитело к EPHA2, содержащееся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, обладает более высокой аффинностью к EPHA2, т.е. более высокой аффинностью (низким значением Kd) к EPHA2 относительно константы диссоциации (значение Kd), то лекарственное средство, содержащее это антитело, может являться эффективным для людей в низкой дозе. На основании этих результатов также можно определять дозу фармацевтической композиции по настоящему изобретению для человека.
Доза антитела к EPHA2 для людей, как правило, может составлять приблизительно от 0,1 до 100 мг/кг один раз в течение от 1 до 180 суток.
Примеры лекарственной формы фармацевтической композиции по настоящему изобретению включают инъекции, включающие капли, суппозитории, назальные средства, сублингвальные средства и средства, всасываемые трансдермально.
Введение фармацевтической композиции по настоящему изобретению может ингибировать рост опухолей, экспрессирующих EPHA2.
Примеры
Далее настоящее изобретение будет описано более конкретно со ссылкой на примеры. Однако следует понимать, что настоящее изобретение ими не ограничено.
В примерах далее, если не указано иначе, способы, относящиеся к генетической инженерии осуществляли способами, описанными в "Molecular Cloning" (Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., опубликовано Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) или способами, описанными в других экспериментальных справочниках, используемых специалистами в данной области или в соответствии с инструкциями, включенными в коммерчески доступные реагенты или используемые наборы.
(Пример 1) Получение плазмиды
1)-1 Получение векторов, экспрессирующих EPHA2 человека
1)-1-1 Получение векторов, экспрессирующих полноразмерный EPHA2 человека
кДНК, кодирующую EPHA2 человека, амплифицировали посредством реакции ПЦР, используя кДНК, синтезированную с тотальной РНК, полученной из SK-OV-3 клеток, в качестве матрицы, и набор праймеров:
Праймер 1: 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcggggatcggaccgagagcgagaag-3'
(в списке последовательностей последовательность ID No. 3); и
Праймер 2: 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcctagatggggatccccacagtgttcacctggtcctt-3'
(в списке последовательностей последовательность ID No. 4).
Продукт ПЦР включали в pDONR221 (произведено Invitrogen Corp.) с использованием BP Clonase (произведено Invitrogen Corp.) для получения начального вектора. Терминирующий кодон удаляли из гена EPHA2 в начальном векторе, используя систему сайт-специфического мутагенеза GeneTailor (произведено Invitrogen Corp.) и набор праймеров:
Праймер 3: 5'-ctgtggggatccccatcgacccagctttc-3' (в списке последовательностей последовательность ID No. 5); и
Праймер 4: 5'-gatggggatccccacagtgttcacctggtc-3' (в списке последовательностей последовательность ID No. 6).
Реакцию рекомбинации между полученным начальным вектором и pcDNA-DEST40 Gateway Vector (произведено Invitrogen Corp.) осуществляли с использованием LR Clonase (произведено Invitrogen Corp.) для получения pcDNA-DEST40-EPHA2 (данный вектор имеет нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 7 в списке последовательностей, между attB1 и attB2 последовательностями). Кроме того, последовательность области ORF гена EPHA2, клонированная в данный вектор, представлена нуклеотидами с No. от 33 до 2960 в SEQ ID NO: 7 в списке последовательностей. Кроме того, аминокислотная последовательность EPHA2 представлена в SEQ ID NO: 8 в списке последовательностей.
1)-1-2 Получение экспрессирующего вектора для внеклеточной области EPHA2
кДНК, кодирующую полипептид внеклеточной области человеческого EPHA2 (состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам с No. от 1 до 534 в SEQ ID NO: 8 в списке последовательностей; далее, сокращенная до "EPHA2-ECD") амплифицировали посредством реакции ПЦР с использованием набора праймеров:
Праймер 5: 5'-aaaaagcttatggagctccaggcagcccgc-3' (в списке последовательностей последовательность ID No. 9); и
Праймер 6: 5'-aaagggccctcagttgccagatccctccgg-3' (в списке последовательностей последовательность ID No. 10).
Полученный продукт ПЦР расщепляли HindIII и ApaI и клонировали в участок HindIII/ApaI pcDNA3,1 (далее, итоговый вектор сокращают до "pcDNA3.1-EPHA2-ECD"; и в описании далее и в рисунках, рекомбинантный белок, экспрессируемый "pcDNA3.1-EPHA2-ECD" обозначают как "rEPHA2-ECD").
1)-1-3 Получение экспрессирующих векторов укороченных белков EPHA2
Для создания векторов, экспрессирующих область, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам с No. от 315 до 540 в SEQ ID NO: 8 в списке последовательностей EPHA2 (далее обозначаемую как "FnIII-NC"), область, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам с No. от 315 до 430 такового (далее обозначаемую как "FnIII-N") или область, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам с No. от 426 до 540 такового (далее обозначаемой как "FnIII-C"), проводили реакции ПЦР с pcDNA-DEST40-EPHA2 в качестве матриц, с использованием каждого набора праймеров:
Набор праймеров для амплификации FnIII-NC:
Праймер 7: 5'-gcaggcttcatcgaaggtcgtgggcgggcacctcaggacccag-3' (в списке последовательностей последовательность ID No. 11); и
Праймер 8: 5'-gtacaagaaagctgggtgctagccgccaatcaccgccaag-3' (в списке последовательностей последовательность ID No. 12);
Набор праймеров для амплификации FnIII-N:
Праймер 7, и
Праймер 9: 5'-gtacaagaaagctgggtgctaggcagtacggaagctgcgg-3' (в списке последовательностей последовательность ID No. 13);
Набор праймеров для амплификации FnIII-C:
Праймер 10: 5'-gcaggcttcatcgaaggtcgtgggagcttccgtactgccagtg-3' (в списке последовательностей последовательность ID No. 14); и
Праймер 8.
Для добавления участков attB1 и attB2 к обоим концам полученных продуктов ПЦР, проводили реакцию ПЦР с каждым продуктом ПЦР в качестве матрицы, используя набор праймеров:
Праймер 11: 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcatcgaaggtcgtggg-3' (в списке последовательностей последовательность ID No. 15); и
Праймер 12: 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggt-3' (в списке последовательностей последовательность ID No. 16).
Продукты ПЦР, полученные этим способом, встраивали в pDONR221, с использованием BP Clonase для получения начальных векторов. Реакции рекомбинации между каждым начальным вектором и целевым вектором, полученным посредством расщепления участков NdeI и BamHI pET15b (произведено Novagen) ферментами рестрикции, с “затуплением” расщепленных участков и последующим лигированием кассеты рамки считывания C.1 Gateway Vector Conversion System (произведено Invitrogen Corp.) в “затупленные” участки, осуществляли с использованием LR Clonase с целью получения экспрессирующих векторов (далее рекомбинантные белки, экспрессируемые посредством FnIII-NC-, FnIII-N- и FnIII-C-встроенных экспрессирующих векторов обозначают как rFnIII-NC, rFnIII-N и rFnIII-C, соответственно).
1)-2 Получение экспрессирующего вектора внеклеточной области человеческого EPHB2
кДНК, кодирующую EPHB2 человека, получали посредством реакции ПЦР с использованием кДНК, синтезированной на суммарной РНК, полученной из клеток HCC70 в качестве матрицы и набора праймеров:
Праймер 13: 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcgccccgggaagcgcagcc-3' (в списке последовательностей последовательность ID No. 17); и
Праймер 14:
5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcctaaacctccacagactgaatctggttcatctg-3' (в списке последовательностей последовательность ID No. 18).
Нуклеотидная последовательность кДНК EPHB2 человека представлена SEQ ID NO: 19 в списке последовательностей. Аминокислотная последовательность такового представлена SEQ ID NO: 20 в списке последовательностей. Реакцию ПЦР проводили, используя набор праймеров для амплификации кДНК, кодирующей внеклеточную область EPHB2 человека (область, состоящая из аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам с No. от 1 до 542 в SEQ ID NO: 20 в списке последовательностей) (далее сокращенной до "EPHB2-ECD"):
Праймер 15: 5'-aaaaagcttatggctctgcggaggctgggg-3' (в списке последовательностей последовательность ID No. 21); и
Праймер 16: 5'-aaagatatctcatggcaacttctcctggat-3' (в списке последовательностей последовательность ID No. 22).
Полученный продукт ПЦР расщепляли HindIII и EcoRV и клонировали в участок HindIII/EcoRV pcDNA3.1 (далее итоговый вектор сокращают до "pcDNA3.1-EPHB2-ECD"; и в описании далее и в рисунках, рекомбинантный белок экспрессируемый "pcDNA3.1-EPHB2-ECD" обозначают как rEPHB2-ECD).
1)-3 Получение экспрессирующего вектора ERBB2 человека
Проводили реакцию ПЦР с коллекцией клонов человека (произведено STRATAGENE, #C33830) в качестве матрицы, используя набор праймеров:
Праймер 17: 5'-caccatggagctggcggccttg-3' (в списке последовательностей последовательность ID No. 23); и
Праймер 18: 5'-tcccactggcacgtccagacc-3' (в списке последовательностей последовательность ID No. 24).
Полученный продукт ПЦР встраивали в pENTR/D-TOPO (произведено Invitrogen Corp.), используя pENTR Directional TOPO Cloning kit (произведено Invitrogen Corp.) для получения начального вектора. Для репарации мутаций, вызванных аминокислотными заменами, начальный вектор расщепляли EcoRI и среди полученных фрагментов фрагмент, содержащий последовательность, полученную из pENTR/D-TOPO, лигировали со вторым наибольшим фрагментом (приблизительно 1,6 т.п.н.) среди фрагментов, полученных посредством расщепления EcoRI Human clone collection (произведено STRATAGENE, #C14640). Реакции рекомбинации между полученным начальным вектором и pcDNA-DEST40 Gateway vector осуществляли, используя LR Clonase с целью получения pcDNA-DEST40-ERBB2 (вектор имеет нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 25 в списке последовательностей, между последовательностями attB1 и attB2).
(Пример 2) Получение моноклонального антитела
2)-1 Получение антигена
2
Для экспрессии EPHA2-ECD, клетки FreeStyle 293-F (произведено Invitrogen Corp.) трансфицировали pcDNA3.1-EPHA2-ECD, используя 293fectin (произведено Invitrogen Corp.) и культивировали при 37°C в 8% CO в течение 5 суток. После культивирования, супернатант культуры собирали посредством центрифугирования и использовали в качестве источника для очистки rEPHA2-ECD. Полученный супернатант культуры диализовали против 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5, используя диализную трубку с предельной величиной по молекулярной массе 15000, далее фильтровали через фильтр (0,45 мм, PES) и затем наносили на HiPrep 16/10 Q XL (произведено GE Healthcare Bio-Sciences Corp.), уравновешенную 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5. Элюирование осуществляли в линейном градиенте концентрации NaCl (20 мМ трис-HCl, pH 7,5, 0-1M NaCl). Аликвот элюированных фракций подвергали разделению посредством SDS-электрофореза в полиакриламидном геле (далее сокращенного до "SDS-PAGE"). Затем гель окрашивали Кумасси бриллиантовым голубым (далее сокращенного до "CBB-окрашенный") для подтверждения наличия фракций, содержащих rEPHA2-ECD. Далее фракции, содержащие rEPHA2-ECD, объединяли и наносили на HiLoad 26/60 Superdex 200 пг (произведено GE Healthcare Bio-Sciences Corp.), уравновешенную PBS. После элюирования с PBS, аликвот элюированных фракций подвергали разделению в SDS-PAGE. Далее гель окрашивали CBB для подтверждения наличия фракций, содержащих rEPHA2-ECD. Фракции, содержащие rEPHA2-ECD, объединяли и использовали в качестве антигена для иммунизации, и антигена для детерминации эпитопа. Концентрацию белков измеряли, используя реагент для исследования белков BCA (произведено PIERCE).
2)-2 Иммунизация
Использовали мышей линии BALB/cAnNCrlCrlj в возрасте от 4 до 6 недель (Charles River Laboratories Japan, Inc.). В сутки 0, смесь 50 мкг rEPHA2-ECD и полного адъюванта Фрейнда H37 Rv (произведено Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (1:1 в пересчете на объемное отношение) подкожно вводили мыши в область спины. Кроме того, смесь 50 мкг rEPHA2-ECD и TiterMax Gold Adjuvant (произведено Sigma-Aldrich, Inc.) (1:1 в пересчете на объемное отношение) подкожно вводили в область спины другой особи. На 22 и 36 сутки, смесь 50 мкг rEPHA2-ECD и неполного адъюванта Фрейнда (произведено Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (1:1 в пересчете на объемное отношение) подкожно вводили в область спины каждой мыши. На 53 сутки, 50 мкг rEPHA2-ECD интраперитонеально вводили каждой мыши. На 56 сутки, выделяли селезенки мышей и использовали в получении гибридомы.
2)-3 Получение гибридомы
Для получения гибридом проводили слияние клеток между клетками селезенки и клетками мышиной миеломы P3X63Ag8U.1, используя PEG4000 (произведено IBL (Immuno-Biological Laboratories, Co., Ltd.)). Супернатант культуры полученных гибридом использовали для скрининга гибридом, продуцирующих антитело к EPHA2.
2)-4 Скрининг антител
2)-4-1 Получение клеток, экспрессирующих ген, кодирующий антиген
4
2
2
2
Клетки линии 293T высевали в количестве 5×10 клеток/см на планшет, покрытый коллагеном I типа (произведено IWAKI) и культивировали в течение ночи при 37°C в 5% CO в DMEM, содержащем 10% ЭТС. На следующий день клетки 293T трансфицировали pcDNA-DEST40-EPHA2 или pcDNA-DEST40-ERBB2, используя в качестве контроля Липофектамин 2000 (произведено Invitrogen Corp.) и дополнительно инкубировали в течение ночи при 37°C в 5% CO. На следующий день трансфицированные клетки 293T обрабатывали трипсином, затем промывали DMEM, содержащим 10% ЭТС, и затем суспендировали в PBS, содержащем 5% ЭТС. Полученную клеточную суспензию использовали в ELISA на основе клеток и в проточно-цитометрическом анализе.
2)-4-2 ELISA на основе клеток
2
2
Клеточную суспензию, полученную в пункте 2)-4-1 центрифугировали и супернатант удаляли. Затем клетки 293T, экспрессирующие EPHA2 и клетки 293T, экспрессирующие ERBB2, раздельно суспендировали, посредством добавления супернатанта культуры гибридомы и инкубировали при 4°C в течение 1 часа. Клетки в лунках дважды промывали PBS, содержащим 5% ЭТС. Далее клетки суспендировали, добавляя конъюгированные с пероксидазой антитела козы против IgG мыши (произведено Millipore (Chemicon), #AP181P), разведенные в 500 раз PBS, содержащим 5% ЭТС, и инкубировали при 4°C в течение 1 часа. Клетки в лунках дважды промывали PBS, содержащим 5% ЭТС. Далее раствор для проявления цвета OPD (o-фенилендиамин дигидрохлорид (произведено Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) и HO растворяли до концентрации 0,4 мг/мл и 0,6% (об./об.), соответственно, в растворе OPD (0,05M трицитрат натрия, 0,1M натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный, pH 4,5)), добавляли из расчета 100 мкл/лунка. Цветную реакцию осуществляли перемешиванием и останавливали посредством добавления 1M HCl из расчета 100 мкл/лунка. Клетки осаждали посредством центрифугирования, и затем супернатант раскапывали в новый 96-луночный плоскодонный микропланшет. Измеряли поглощение при 490 нм, используя спектрофотометр для чтения планшетов (ARVO, PerkinElmer). При отборе гибридом, продуцирующих антитела, которые специфично связываются с EPHA2, представленным на поверхности клеточной мембраны, положительными по продукции антитела к EPHA2 были выбраны гибридомы, образующие супернатант культуры, который демонстрирует более высокое поглощение для клеток 293T, экспрессирующих EPHA2, чем для клеток 293T, экспрессирующих ERBB2 (контрольные).
2)-4-3 Проточно-цитометрический анализ
Для исключения ложноположительных результатов при ELISA на основе клеток, антитела, продуцируемые гибридомой, определенной как положительная в ELISA на основе клеток, дополнительно проверяли на специфичность их связывания с EPHA2 посредством проточной цитометрии. Клеточную суспензию, полученную в абзаце 2)-4-1 центрифугировали и удаляли супернатант. Затем раздельно суспендировали клетки 293T, экспрессирующие EPHA2, и клетки 293T, экспрессирующие ERBB2, добавляя супернатант гибридомной культуры, и инкубировали при 4°C в течение 1 часа. Клетки в лунках дважды промывали PBS, содержащим 5% ЭТС. Далее клетки суспендировали, добавляя "Конъюгированную с флуоресцеином фракцию IgG козы к IgG мыши" (Целая Молекула) (произведено ICN Pharmaceuticals, Inc., #55493), разведенную в 1000 раз PBS, содержащим 5% ЭТС, и инкубировали при 4°C в течение 1 часа. Клетки дважды промывали PBS, содержащим 5% ЭТС, и затем ресуспендировали в PBS, содержащим 5% ЭТС, и дополнительно содержащим 2 мкг/мл 7-аминоактиномицина D (произведено Invitrogen Corp. (Molecular Probes)), с последующим анализом, используя проточный цитометр (FC500, Beckman Coulter, Inc.). Данные анализировали, используя Flowjo (Tree Star, Inc.). Мертвые клетки, положительные по 7-аминоактиномицину D исключали, посредством установки гейта (окна). Затем отображали в виде гистограмм интенсивность флуоресценции FITC в живых клетках. Гибридомы, продуцирующие образцы, которые на гистограмме интенсивности флуоресценции в клетках 293T, экспрессирующих EPHA2, предоставлены более сильной интенсивностью флуоресценции, чем на гистограмме для клеток 293T, экспрессирующих ERBB2, представленных в качестве контрольных, признавали в качестве гибридом, продуцирующих антитела к EPHA2.
2)-5 Разделение гибридом на отдельные клоны
Гибридомы, продуцирующие антитела к EPHA2, разводили в среде ClonaCell-HY Selection Medium D (произведено StemCell Technologies, #03804) и культивировали, и образованные клоны отбирали в виде отдельных клонов. Отобранные клоны культивировали раздельно и исследовали их активность связывания с EPHA2, используя супернатанты культуры тем же образом, как в абзаце 2)-4-3, для определения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к EPHA2 (SH348-1, SH357-1, Ab57-1, Ab65-1, Ab96-1, Ab100-1, Ab105-1, Ab106-13, Ab136-1, Ab148-1, Ab151-4, Ab230-1, Ab373-1 и Ab382-1).
2)-6 Подтверждение связывающей активности моноклонального антитела для линии злокачественных клеток
Связываются или нет моноклональные антитела, полученные в абзаце 2)-5, со злокачественными клетками, высоко экспрессирующими EPHA2, исследовали посредством проточно-цитометрического способа тем же образом, как в абзаце 2)-4-3. Линию злокачественных клеток молочной железы человека (MDA-MB-231), линию злокачественных клеток легких человека (A549) и линию злокачественных клеток предстательной железы человека (PC-3) использовали вместо трансфицированных клеток 293T. В результате подтвердилось, что все проверенные моноклональные антитела связываются с этими линиями злокачественных клеток.
2)-7 Определение изотипа моноклонального антитела
Изотипы моноклональных антител определяли, используя набор Mouse monoclonal isotyping (произведено AbD Serotec). В результате, изотипы представляли собой IgG1 (Ab57-1 и Ab230-1), IgG2a (SH348-1, SH357-1, Ab65-1, Ab96-1, Ab100-1, Ab136-1, Ab148-1 и Ab151-4) и IgG2b (Ab105-1, Ab106-13, Ab373-1 и Ab382-1).
2)-8 Получение моноклонального антитела
Моноклональные антитела очищали из асцитических жидкостей мышей, которым трансплантировали гибридомы или из супернатанта гибридомной культуры (далее обозначаемой как "источник для очистки антител").
7
Мышиные асцитные жидкости получали, как указано далее: во-первых, мышей линии BALB/cAJcl-nu/nu в возрасте от 7 до 8 недель (CLEA Japan, Inc.) подвергали действию пристана (произведено Sigma-Aldrich, Inc.). Приблизительно 3 неделями позже, интраперитонеально трансплантировали гибридомы, отмытые физиологическим раствором, в количестве 1×10 клеток/мышь. Через 1-2 недели, асцитные жидкости, накопленные в брюшной полости, собирали, затем подвергали стерилизации через 0,22-мкм фильтр и использовали в качестве источника для очистки антител.
Супернатант гибридомной культуры получали, используя CELLine (произведено BD Biosciences). Гибридомы культивировали по инструкциям производителя, за исключением того, что использовали в качестве среды ClonaCell-HY Growth Medium E (произведено StemCell Technologies, #03805). Собранный супернатант фильтровали через 0,45-мкм фильтр и использовали в качестве источника для очистки антител.
Антитела очищали, используя колонку для аффинной хроматографии rPA50, содержащую рекомбинантный белок A (произведено RepliGen Corp.), иммобилизованный на Formyl-Cellulofine (произведено Seikagaku Corp.) (далее сокращено до "Formyl-Cellulofine с белком А") или HiTrap MabSelect SuRe (произведено GE Healthcare Bio-Sciences Corp.). Для Formyl-Cellulofine с белком А, источник для очистки антител разводили в три раза связывающим буфером (3M NaCl, 1,5M глицин, pH 8,9) и наносили на колонку, которую затем промывали связывающим буфером, с последующей элюцией 0,1M лимонной кислотой, pH 4,0. С другой стороны, для HiTrap MabSelect SuRe, источник для очистки антител наносили на колонку, которую затем промывали PBS, с последующей элюцией 2M аргинин-HCl, pH 4,0. Элюированное антитело нейтрализовали и затем заменяли буфер на PBS.
Концентрации антител определяли посредством элюирования антитела, связанного с POROS G 20 мкм Column, PEEK, 4,6 мм×100 мм, 1,7 мл (Applied Biosystems) и измерением поглощения элюата (О.П. 280 нм). В частности, образец антитела, разведенного в PBS наносили на POROS G 20 мкм, уравновешенную уравновешивающим буфером (30,6 мМ натрия фосфат однозамещенного 12-водного, 19,5 мМ первичного кислого фосфата калия, 0,15M NaCl, pH 7,0). Колонку промывали уравновешивающим буфером и затем элюировали антитело, связанное с колонкой, элюэнтом (0,1% (об./об.) HCl, 0,15M NaCl). Измеряли площадь пика поглощения элюата (О.П. 280 нм) и рассчитывали концентрацию по следующему уравнению:
Концентрация образца антитела (мг/мл) = (Площадь пика образца антитела)/(площадь пика контроля (IgG1 человека)) × Концентрацию контроля (мг/мл) × кратность разведения.
Кроме того, концентрацию эндотоксина, содержащегося в полученных антителах, измеряли, используя набор Endospecy ES-50M (Seikagaku Corp., #020150) и набор Endotoxin Standard CSE-L (Seikagaku Corp., #020055), и подтвердили наличие 1 ЕЭ/мг или ниже. Полученные в результате антитела использовали в последующих экспериментах.
(Пример 3) Свойства SH348-1 и SH357-1
3)-1 Исследование активности индукции фосфорилирования тирозиновых остатков EPHA2 и активности индукции снижения уровня белка EPHA2 у антитела к EPHA2.
5
2
2
2A
1
1
1
2
2
2
3)-1-1 Получение клеточных лизатов, стимулированных антителами. MDA-MB-231 клетки, суспендированные в RPMI1640, содержащим 10% ЭТС, 50 единиц/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (далее сокращено до "RPMI1640, содержащий 10% ЭТС (с антибиотиками)") высевали в количестве 6×10 клеток/лунка в 6-луночный планшет и культивировали в течение ночи при 37°C в 5% CO. На следующий день среду выливали и добавляли RPMI1640. Клетки дополнительно культивировали в течение ночи при 37°C в 5% CO. На следующий день SH348-1, SH357-1, изотипический контроль IgG мыши (в описании далее и на рисунках сокращен до "mIgG2a"; произведено R&D Systems, Inc., #MAB003) в качестве изотипического контрольного антитела, рекомбинантную химеру Эфрин-A1/Fc мыши (в описании далее и на рисунках, сокращено до "Эфрин-A1/Fc"; произведено R&D Systems, Inc., #602-A1-200) в качестве растворимого лиганда EPHA2 и рекомбинантный человеческий Fc IgG (в описании далее и на рисунках, сокращено до "hGFc"; произведено R&D Systems, Inc., #110-HG-100) в качестве контрольного белка для растворимого лиганда, раздельно разводили RPMI1640 до концентрации, показанной на фиг.1 или 2 (SH348-1, SH357-1 и mIgG2a: 10 мкг/мл или 50 мкг/мл на фиг.1A и 50 мкг/мл на фиг.2A, Эфрин-A1/Fc и hGFc: 1 мкг/мл на фиг.1 и 2). Полученный в результате раствор добавляли к клеткам MDA-MB-231 после удаления среды и инкубировали при 37°C в 5% CO в течение заданного времени в 5% CO. Кроме того, в экспериментах в присутствие перекрестно-связывающего антитела, в качестве перекрестно-связывающего антитела SH348-1, SH357-1 или mIgG2a и антитела козы, специфичные к фрагменту Fcγ IgG мыши (мин X Hu, Bov, Hrs Sr Prot) (произведено Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., #115-005-071) каждые смешивали с RPMI1640 до концентрации 10 мкг/мл или 50 мкг/мл (фиг.1B) и 50 мкг/мл (фиг.2B). Полученный в результате раствор после удаления среды добавляли к клеткам MDA-MB-231 и инкубировали при 37°C в 5% CO в течение заданного времени. В заданное время удаляли супернатант и лизировали клетки, добавляя буфер для лизиса 1×Cell (произведено Cell Signaling Technology, Inc.), содержащий 1 мМ PMSF (произведено Sigma-Aldrich, Inc.), и центрифугировали при 15000 об./мин. в течение 5 минут. Супернатанты клеточных лизатов использовали в качестве образцов в иммунопреципитации и Вестерн-блоттинге. Концентрации белков в образце измеряли, используя реагент для исследования белков BCA (произведено PIERCE).
3)-1-2 Проверка активности индукции фосфорилирования тирозиновых остатков EPHA2
Для образования иммунопреципитата EPHA2, во-первых, 8 мкг клона D7 к Eck/EphA2 (в описании далее и на рисунках сокращенного до "антитело к EPHA2 (D7)"; произведено Millipore (Upstate), #05-480) добавляли к 25 мкл суспензии с магнитными частицами с белком G (произведено NEW ENGLAND BioLabs, Inc.) на образец и смесь перемешивали посредством перевертывания при 4°C в течение 2 часов.
Далее к смеси добавляли ЭТС до конечной концентрации 10% и смесь дополнительно перемешивали посредством перевертывания при 4°C в течение 30 минут. Частицы промывали три раза 1×буфером для лизиса клеток, содержащим 1 мМ PMSF. Затем к ним добавляли 200 мкг супернатантов клеточного лизата, полученных в абзаце 3)-1-1, и смеси перемешивали посредством перевертывания в течение ночи при 4°C. На следующий день частицы промывали три раза 1×буфером для лизиса клеток, содержащим 1 мМ PMSF. Далее буфер SDS-Sample (56,3 мМ Tris-HCl, pH 6,8, 1,8% (масс./об.) SDS, 9% глицерин, 0,72M 2-меркаптоэтанол, 0,045 мг/мл бромфенолового синего) добавляли к частицам и смеси нагревали при 98°C в течение 5 минут. Белки, диссоциировавшие с частиц разделяли посредством SDS-PAGE.
Для осуществления Вестерн-блоттинга, белки с гелей переносили на мембраны из поливинилидендифторида (далее сокращено до "PVDF-мембрана"; с размером пор 0,45 мкм; произведено Millipore). После переноса, PVDF-мембраны блокировали посредством встряхивания в блокирующем растворе (один пакет порошка Block Ace (произведено Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. (Snow Brand Milk Products Co., Ltd.)) растворяли в 100 мл сверхчистой воды, куда затем добавляли Tween 20 и азид натрия до конечных концентраций 0,1% (об./об.) и 0,02% (масс./об.), соответственно). Во-первых, для определения образовавшегося иммунопреципитата EPHA2, PVDF-мембраны, блокированные таким образом, погружали в раствор антитела (D7) к EPHA2, разведенного до 0,25 мкг/мл блокирующим раствором и встряхивали при комнатной температуре в течение 1 часа. PVDF-мембраны промывали в течение 10 минут три раза TBST (50 мМ трис-HCl, pH 8,0, 138 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 0,1% (об./об.) Tween 20). Далее PVDF-мембраны погружали в раствор связанного с HRP целого Ab овцы к Ig мыши (произведено GE Healthcare Bio-Sciences Corp.), разведенном в 3000 раз с TBST и встряхивали при комнатной температуре в течение 30 минут. PVDF-мембраны дополнительно промывали TBST в течение 10 минут три раза. Далее, на пленке для хемилюминесценции детектировали сигналы, с использованием ECL Plus (произведено GE Healthcare Bio-Sciences Corp.).
2
2
3
2
Далее, для удаления антител с этих PVDF-мембран, PVDF-мембраны пропитывали раствором для удаления (50 мМ трис-HCl, pH 6,8, 2% (масс./об.) SDS, 100 мМ 2-меркаптоэтанол) и встряхивали при 55°C в течение 30 минут. Далее PVDF-мембраны погружали в раствор для гашения (TBST, содержащий 1% (об./об.) HO и 0,1% (масс./об.) NaN), затем перемешивали при комнатной температуре в течение 20 минут и дополнительно промывали TBST в течение 10 минут три раза. Для определения фосфорилированного состояния тирозиновых остатков EPHA2, эти PVDF-мембраны блокировали посредством встряхивания в блокирующем растворе без азида натрия (один пакетик порошка Block Ace растворяли в 100 мл сверхчистой воды, куда затем добавляли Tween 20 до конечной концентрации 0,1% (об./об.)). Далее PVDF-мембраны погружали в раствор конъюгированного с HRP рекомбинантного 4G10 к фосфотирозину (на фигурах сокращено до "4G10 антитело"; произведено Millipore (Upstate), #16-184) разведенного в 10000 раз блокирующим раствором без азида натрия, и встряхивали при комнатной температуре в течение 1 часа. PVDF-мембраны промывали TBST в течение 10 минут три раза, и затем дополнительно промывали HO в течение 5 минут три раза. Сигналы детектировали на пленке для хемилюминесценции, используя ECL Plus.
В результате, при добавлении растворимого лиганда Эфрин-A1/Fc, тирозиновые остатки EPHA2 были фосфорилированы в течение 10 минут. В отличие от этого, эффект индукции фосфорилирования тирозиновых остатков EPHA2, наблюдаемый у лиганда, не наблюдали при добавлении антител SH348-1 и SH357-1 в концентрации 10 мкг/мл или 50 мкг/мл во все заданные интервалы времени (10 минут, 30 минут и 60 минут) (фиг.1A). Аналогично, эффект индукции фосфорилирования тирозиновых остатков EPHA2, наблюдаемый у лиганда, не наблюдали в присутствие антитела SH348-1 и SH357-1 даже в присутствие перекрестно-связывающего антитела (фиг.1B).
3)-1-3 Проверка активности индукции снижения уровня белка EPHA2
10 мкг супернатантов клеточных лизатов, полученных в абзаце 3)-1-1, разделяли посредством SDS-PAGE. Затем белки из геля переносили на PVDF-мембраны и подвергали Вестерн-блоттингу, используя антитело (D7) к EPHA2 и, в качестве контроля для примера уровня белка, моноклональное антитело к β-актину, клон AC-15 (в описании далее и на фигурах, сокращенного до "антитело к β-актину"; произведено Sigma-Aldrich, Inc., #A-5441). В частности, после переноса, PVDF-мембраны блокировали посредством встряхивания в блокирующем растворе и затем разрезали бритвой, по центру в области молекулярной массы 70 кДа на две части. PVDF-мембраны, содержащие белки в 70 кДа или более, погружали в раствор антитела (D7) к EPHA2, разведенного до 0,25 мкг/мл блокирующим раствором, тогда как PVDF-мембраны, содержащие белки в 70 кДа или меньше, погружали в раствор антитела к β-актину, разведенного в 1000 раз блокирующим раствором. Каждую PVDF-мембрану встряхивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Каждую PVDF-мембрану промывали TBST в течение 10 минут три раза. Далее каждую PVDF-мембрану погружали в раствор связанного с HRP целого Ab овцы к Ig мыши, разведенного в 3000 раз TBST и встряхивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Каждую PVDF-мембрану промывали TBST в течение 10 минут три раза. Затем детектировали сигналы, используя ECL Plus и NightOWL LB983 (Berthold Technologies GmBH & Co. KG). Далее количественно определяли интенсивность сигнала от полос, используя Gel-Pro Analyzer Version 4,5 для Windows (зарегистрированный торговый знак; Media Cybernetics, Inc.).
В результате добавления растворимого лиганда Эфрин-A1/Fc наблюдали значимое снижение в уровне белка EPHA2 (фиг.2A и 2B). При добавлении антитела SH348-1, как в присутствие, так и в отсутствие перекрестно-связывающего антитела, наблюдали снижение в уровне белка EPHA2, хотя и более слабое, чем при действии лиганда (фиг.2A и 2B). С другой стороны, для антитела SH357-1 почти не наблюдали изменений в уровне белка EPHA2, независимо от присутствия или отсутствия перекрестно-связывающего антитела (фиг.2A и 2B).
Чтобы проанализировать уровень белка EPHA2 после 24 часов с момента добавления SH348-1, рассчитывали среднее значение {интенсивность сигнала полосы EPHA2/интенсивность сигнала полосы β-актина} из трех экспериментальных значений, с поправкой на образец, в который не добавлены лиганд/антитело. В результате, после 24 часов с момента добавления SH348-1 значение составляло 70% в отсутствие перекрестно-связывающего антитела и 69% в присутствие перекрестно-связывающего антитела, в то время как после 24 часов с момента добавления mIgG2a значение определено как 100%.
3)-2 активность ADCC
3)-2-1 Получение эффекторных клеток
nu
7
У голых мышей линии CAnN.Cg-Foxn1/CrlCrlj (Charles River Laboratories Japan, Inc.) в стерильных условиях извлекали селезенку. Извлеченную селезенку гомогенизировали двумя предметными стеклами и подвергали гемолизу, используя BD Pharm Lyse (произведено BD Biosciences, #555899). Полученные клетки селезенки суспендировали в RPMI1640 без фенолового красного (произведено Invitrogen Corp.), содержащим 10% эмбриональную телячью сыворотку, Ultra-low IgG (произведено Invitrogen Corp.) (далее сокращено до "среда для ADCC") и пропускали через клеточное сито (величина пор 40 мкм; произведено BD Biosciences). Затем подсчитывали количество живых клеток, посредством исключающего теста с трипановым синим. Суспензию клеток селезенки центрифугировали и затем удаляли среду. Клетки ресуспендировали в среде для ADCC до плотности живых клеток равной 1,5×10 клеток/мл и использовали в качестве эффекторных клеток.
3)-2-2 Получение клеток-мишеней
6
5
2
Клетки MDA-MB-231, A549 или PC-3 обрабатывали трипсином. Клетки промывали RPMI1640, содержащим 10% ЭТС, и затем ресуспендировали в RPMI1640, содержащим 10% ЭТС. Каждую клеточную линию (4×10 клеток) смешивали с хромом-51 (5550 кБк), подвергали стерилизации через 0,22-мкм фильтр и сразу же метили при 37°C в 5% CO в течение 1 часа. Меченые клетки промывали три раза средой для ADCC и ресуспендировали в среде для ADCC до концентрации 2×10 клеток/мл для получения клеток-мишеней.
51
3)-2-3 Анализ высвобождения Cr
5
7
2
Клетки-мишени (2×10 клеток/мл) раскапывали по 50 мкл/лунка в 96-луночный микропланшет с U-образным дном. К ним добавляли 50 мкл SH348-1, SH357-1 или изотипического контрольного антитела (mIgG2a), разведенных средой для ADCC до 2,5 мкг/мл (в исчислении конечной концентрации после добавления эффекторных клеток) и инкубировали при 4°C в течение 1 часа. Добавляли туда 100 мкл эффекторных клеток (1,5×10 клеток/мл) и инкубировали в течение ночи при 37°C в 5% CO. На следующий день супернатант отбирали в Luma-планшет (произведено PerkinElmer). Дозу высвобождаемых гамма лучей измеряли, используя счетчик гамма-излучения. Степень клеточного лизиса, связанного с активностью ADCC, рассчитывали по следующему уравнению:
Степень лизиса клеток (%) = (A-B)/(C-B)×100
A: количество импульсов в лунках с образцами
B: среднее (n=3) количество импульсов при спонтанном высвобождении (лунки, куда не были добавлены антитело/эффекторная клетка). Вместо антитела и эффекторных клеток добавляли 50 мкл и 100 мкл, соответственно, среды для ADCC. Прочие процедуры проводили тем же способом, что и в лунках с образцами.
C: среднее (n=3) количество импульсов при максимальном высвобождении (лунки, содержащие клетки-мишени, растворенные в детергенте). Вместо антитела добавляли 50 мкл среды для ADCC и вместо эффекторных клеток добавляли 100 мкл среды для ADCC, содержащей 2% (об./об.) тритон-X100. Прочие процедуры проводили тем же способом, что и в лунках с образцами.
На фиг.3 показано среднее значение из трех экспериментов, где планка погрешности обозначает стандартное отклонение, и значение P рассчитывали посредством теста Стьюдента. В результате для антитела SH348-1 показана активность клеточного лизиса 8,2%, 9,1% и 4,7% по отношению к клеткам MDA-MB-231 (фиг.3A), клеткам A549 (фиг.3B) и клеткам PC-3 (фиг.3C), соответственно. Для антитела SH357-1 показана активность клеточного лизиса 8,8%, 13,0% и 9,0% по отношению к клеткам MDA-MB-231 (фиг.3A), клеткам A549 (фиг.3B) и клеткам PC-3 (фиг.3C), соответственно. Эти результаты показали, что оба антитела имеют активность ADCC по отношению к клеткам MDA-MB-231, клеткам A549 и клеткам PC-3.
3)-3 активность CDC
2
2
Клетки MDA-MB-231, A549 или PC-3, суспендированные в RPMI1640, содержащем 10% ЭТС (с антибиотиками) высевали из расчета 5000 клеток/лунка на 96-луночный микропланшет и культивировали в течение ночи при 37°C в 5% CO. На следующий день, к ним добавляли SH348-1, SH357-1 или изотипическое контрольное антитело (mIgG2a), разведенные RPMI1640, содержащим 10% ЭТС (c антибиотиками) до 25 мкг/мл (в пересчете на конечную концентрацию после добавления компонентов системы комплемента) и инкубировали при 4°C в течение 1 часа. Туда добавляли разведенный RPMI1640 до 30% компонент системы комплемента кролика (произведено CEDARLANE, #CL3051) из расчета конечной концентрации 5%, затем инкубировали при 37°C в 5% CO в течение 1 часа и дополнительно оставили стоящим при комнатной температуре в течение 30 минут. Чтобы измерить жизнеспособность клеток, реагент для анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo Luminescent (произведено Promega Corp.) добавляли в количестве, равном количеству культурального раствора и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем измеряли количество излученного света, используя спектрофотометр для чтения планшетов. Жизнеспособность клеток рассчитывали по следующему уравнению:
Жизнеспособность клеток (%) = (a-b)/(c-b)×100
a: количество излученного света от лунок с образцами
b: среднее (n=8) количество излученного света в качестве фона (лунки, в которые не добавлены клетки/антитело). Вместо посеянных клеток добавляли RPMI1640, содержащую 10% ЭТС (с антибиотиками), в количестве, равном количеству клеточной суспензии и вместо антитела добавляли RPMI1640, содержащую 10% ЭТС (с антибиотиками), в количестве, равном разведению антитела. Прочие процедуры проводили тем же способом, что и в лунках с образцами.
c: среднее (n=3) количество излученного света от лунок, в которые не добавлено антитело. Вместо антитела добавляли RPMI1640, содержащую 10% ЭТС (с антибиотиками), в количестве равном количеству разведения антитела. Прочие процедуры проводили тем же способом, что и в лунках с образцами.
На фиг.4 показано среднее значение из трех экспериментов, где планка погрешности обозначает стандартное отклонение, и значение P рассчитывали посредством критерия Стьюдента. В результате, антитело SH348-1 индуцировало 44%, 31%, и 41% снижение жизнеспособности клеток MDA-MB-231 (фиг.4A), клеток A549 (фиг.4B) и клеток PC-3 (фиг.4C), соответственно, в присутствие компонента системы комплемента. Антитело SH357-1 также индуцировало 65%, 60% и 65% снижение показателей жизнеспособности клеток MDA-MB-231 (фиг.4D), клеток A549 (фиг.4E) и клеток PC-3 (фиг.4F), соответственно, в присутствие компонента системы комплемента. Эти результаты показали, что оба антитела имеют активность CDC по отношению к клеткам MDA-MB-231, клеткам A549 и клеткам PC-3.
3)-4 Определение эпитопа
3)-4-1 Получение укороченных полипептидов EPHA2 (rFnIII-NC, rFnIII-N и rFnIII-C)
Escherichia coli BL21 и Escherichia coli Origami (DE3) (произведено Novagen) раздельно трансформировали экспрессирующей плазмидой, полученной в абзаце 1)-1-3 и культивировали в среде LB, с добавлением 50 мкг/мл ампициллина (произведено Sigma-Aldrich, Inc.). Экспрессию укороченных полипептидов EPHA2 индуцировали, используя систему самоиндукции для BL21 (произведено Novagen) и добавление 0,5 мМ IPTG для Origami (DE3). Бактериальные клетки собирали посредством центрифугирования при 6000 об./мин. в течение 20 минут, затем суспендировали в буфере для гомогенизации (50 мМ трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 0,1% (об./об.) тритон-X100, 10% (об./об.) глицерин) и затем на льду подвергали действию ультразвука. Супернатант собирали посредством центрифугирования при 14000 об./мин. в течение 15 минут и наносили на 0,5 мл Ni-NTA (произведено Invitrogen Corp.). Ni-NTA промывали промывающим буфером (50 мМ трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 50 мМ имидазол, 10% (об./об.) глицерин), с последующим элюированием буфером для элюции (50 мМ трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 400 мМ имидазол, 10% (об./об.) глицерин). Элюированные образцы дополнительно очищали посредством колонки для хроматографии гель-фильтрацией (Superdex 75 10/300; произведено GE Healthcare Bio-Sciences Corp.), используя PBS в качестве растворителя. Белковые концентрации полученных рекомбинантных белков измеряли, используя Protein Assay (произведено Bio-Rad Laboratories, Inc).
3)-4-2 Получение внеклеточной области полипептида EPHB2 (rEPHB2-ECD)
2
Чтобы экспрессировать EPHB2-ECD, клетки FreeStyle 293-F трансфицировали pcDNA3.1-EphA2-ECD, используя 293fectin, и культивировали при 37°C в 8% CO в течение 72 часов. После культивирования, культуральный раствор собирали посредством центрифугирования и использовали в качестве источника для очистки rEPHB2-EСD. Полученный супернатант культуры диализовали против 20 мМ трис-HCl, pH 7,5, используя диализную трубку с предельной величиной по молекулярной массе 15000, затем фильтровали через фильтр (0,45 мкм, PES), и затем наносили на HiPrep 16/10 Q XL, уравновешенную 20 мМ трис-HCl, pH 7,5. Элюцию проводили в линейном градиенте концентрации NaCl (20 мМ трис-HCl, pH 7,5, 0-1M NaCl). Аликвот элюированных фракций разделяли в SDS-PAGE. Далее гель окрашивали CBB для подтверждения наличия фракций, содержащих rEPHB2-ECD. Далее фракции, содержащие rEPHB2-ECD, объединяли и наносили на HiLoad 26/60 Superdex 200 пг, уравновешенную PBS. После элюирования PBS, аликвот фракций элюции разделяли в SDS-PAGE. Далее гель окрашивали CBB для подтверждения наличия фракций, содержащих rEPHB2-ECD. Фракции, содержащие rEPHB2-ECD, объединяли и использовали в качестве антигена для определения эпитопа. Концентрацию белка измеряли, используя реагент для анализа белков BCA.
3)-4-3 Определение связывающих сайтов в антигенах посредством ELISA
rEPHA2-ECD, rFnIII-NC, rFnIII-N, rFnIII-C или контрольный белок rEPHB2-ECD разводили PBS до 1 мкг/мл, затем раскапывали по 100 мкл/лунку на иммунопланшет (произведено Nunc, #442404) и инкубировали в течение ночи при 4°C, тем самым абсорбируя белок на планшете. На следующий день, раствор из лунок удаляли и раствор Block Ace (один пакетик порошка Block Ace растворяли в 100 мл сверхчистой воды), разведенный в 4 раза PBS, раскапывали по 200 мкл/лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Раствор из лунок удаляли и затем добавляли 50 мкл/лунку SH348-1, SH357-1 или изотипического контрольного антитела (mIgG2a), разведенных до 5 мкг/мл буфером для разведений (PBS, 0,05% (об./об.) Tween 20). Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Далее удаляли раствор из лунок и лунки дважды промывали буфером для разведения. Добавляли по 50 мкл/лунку антитело козы к IgG мыши, конюгированное с пероксидазой, разведенное в 3000 раз буфером для разведений и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Раствор из лунок удаляли, и лунки дважды промывали буфером для разведения. Затем проводили цветную реакцию, с перемешиванием, добавляя раствор для проявления цвета OPD из расчета 100 мкл/лунка. После развития окрашивания, цветную реакцию останавливали добавлением 1M HCl из расчета 100 мкл/лунка. Измеряли поглощение при 490 нм, используя спектрофотометр для чтения планшетов.
На фиг.5A показан расчет доменной структуры EPHA2 (NCBI CDD version 2,11, CBS TMHMM Server v.2,0) и расположение EPHA2-ECD, FnIII-NC, FnIII-N и FnIII-C в EPHA2. Лиганд-BD обозначает лигад-связывающий домен, FN3 обозначает домен фибронектина типа 3, TM обозначает трансмембранную область, Trk киназа обозначает тирозинкиназный домен, и SAM обозначает SAM домен.
Получали рекомбинантные белки внеклеточной области EPHA2 (EPHA2-ECD), области, содержащей два домена фибронектина типа 3 (FnIII-NC), области, содержащей N-концевой домен фибронектина типа 3 (FnIII-N), и области, содержащей C-концевой домен фибронектина типа 3 (FnIII-C), и исследовали их связывающую активность в отношении SH348-1 и SH357-1. В результате, антитела SH348-1 и SH357-1 демонстрировали связывающую активность в отношении rEPHA2-ECD, rFnIII-NC и rFnIII-C (фигура 5B). Таким образом, для антител SH348-1 и SH357-1 показано связывание с областью аминокислот от 426 до 534, содержащей C-концевой домен фибронектина типа 3 (аминокислотная последовательность соответствующая аминокислотам с No. 426-534 в SEQ ID NO: 8 в списке последовательностей).
(Пример 4) Противоопухолевый эффект in vivo
6
Клетки MDA-MB-231 отделяли от культурального флакона посредством обработки с трипсином и затем суспендировали в RPMI1640, содержащем 10% ЭТС (с антибиотиками). После центрифугирования удаляли супернатант. Клетки дважды промывали той же средой, что описана выше, затем суспендировали в BD Matrigel Basement Membrane Matrix (произведено BD Biosciences) и подкожно трансплантировали в концентрации 5×10 клетки/мышь в область спины 6-недельных мышей BALB/cAJcl-nu/nu ((CLEA Japan, Inc.). Если сутки трансплантации обозначают как сутки 0, SH348-1 или SH357-1 интраперитонеально вводили в дозе 500 мкг/мышь на 9, 16, 23 и 30 сутки. В том же объеме (500 мкл), что и объем антитела, интраперитонеально вводили PBS в качестве контроля. Объем опухоли измеряли на 9, 13, 16, 20, 23, 28, 30, 34 и 37 сутки для исследования противоопухолевого эффекта, относимого за счет введения антител. В результате, рост опухоли значительно ингибировали у групп, которым вводили SH348-1 и SH357-1, по сравнению с группой, которой вводили PBS (в объеме опухоли, по сравнению с группой, которой вводили PBS на 37 сутки, для SH348-1 и SH357-1 значения P для обоих составляли P<0,001; значения P рассчитывали посредством критерия Стьюдента). Кроме того, степень ингибирования роста опухоли (= 100-(среднее значение объемов опухолей у группы, которой вводили антитело)/(среднее значение объемов опухолей у группы, которой вводили PBS)×100) на 37 сутки составляла 89,5% для SH348-1 и 84,1% для SH357-1. Их интенсивные противоопухолевые эффекты наблюдали in vivo (фиг.6A и 6B).
Из 14 моноклональных антител к EPHA2, исследованных на наличие у них противоопухолевых эффектов, оказываемых на мышей с трансплантированными клетками MDA-MB-231, наличие эффективности показали только для антител SH348-1 и SH357-1, связывающихся с FnIII-C (Таблица 1).
<u>Таблица 1</u>
АНТИТЕЛО
АКТИВНОСТЬ СВЯЗЫВАНИЯ С АНТИГЕНОМ
ИНГИБИТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ НА ОПУХОЛЕВЫЙ РОСТ (IN VIVO)
rEPHA2-ECD
rFnIII-NC
rFnIII-N
rFnIII-C
SH348-1
+
+
-
+
+
SH357-1
+
+
-
+
+
Ab 57-1
+
+
+
-
-
Аb 65-1
+
-
-
-
-
Аb 96-1
+
-
-
-
-
Ab 100-1
+
-
-
-
-
Аb 105-1
+
-
-
-
-
Аb 106-13
+
-
-
-
-
Ab 136-1
+
-
-
-
-
Аb 148-1
+
-
-
-
-
Ab 151-4
+
-
-
-
-
Ab 230-1
+
+
+
-
-
Ab 373-1
+
-
-
-
-
Ab 382-1
+
-
-
-
-
Эти результаты показали, что SH348-1 и SH357-1 представляют собой антитела, которые распознают ранее неописанный эпитоп, (аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с No. 426-534 в SEQ ID NO: 8 в списке последовательностей) и проявляют противоопухолевый эффект. Кроме того, показали, что область, с которой связываются SH348-1 или SH357-1, служит в качестве перспективной мишени для противоопухолевых моноклональных антител, нацеленных на EPHA2.
(Пример 5) Идентификация генов антител SH348-1 и SH357-1
Для определения N-концевых аминокислотных последовательностей тяжелой и легкой цепи антител SH348-1 и SH357-1 мыши к EPHA2 человека, аликвоту раствора, содержащего SH348-1 или SH357-1, очищенных в абзаце 2)-8 разделяли в SDS-PAGE. Белки, разделенные таким образом в геле, переносили с геля на PVDF-мембрану (величина пор 0,45 мкм; произведено Invitrogen Corp.). PVDF-мембрану промывали промывающим буфером (25 мМ NaCl, буфер с 10 мМ бората натрия, pH 8,0), затем окрашивали посредством погружения в окрашивающий раствор (50% метанол, 20% уксусная кислота, 0,05% Кумасси бриллиантовый голубой) в течение 5 минут, и затем обесцвечивали 90% метанолом. Области полос, соответствующие тяжелой и легкой цепям (тяжелая цепь: полоса с меньшей подвижностью, легкая цепь: полоса с большей подвижностью), визуализированные на PVDF-мембране, вырезали и предпринимали попытку идентифицировать соответствующие им N-концевые аминокислотные последовательности автоматическим способом Эдмана (смотри Edman, P., et al. (1967) Eur. J. Biochem. 1, 80), используя Procise (зарегистрированная торговая марка) cLC Protein Sequencer Model 492cLC (Applied Biosystems). Для тяжелой цепи SH348-1 не смогли идентифицировать аминокислотную последовательность посредством способа. Таким образом, удаляли N-концевую пироглутаминовую кислоту, используя пироглутамат-аминопептидазу Pfu (произведено TAKARA BIO INC.), и затем проводили ту же процедуру, как описано выше, для идентификации аминокислотной последовательности, начиная со второй аминокислоты с N-конца.
В результате, аминокислотная последовательность (начиная со второй аминокислоты с N-конца) полосы, соответствующей тяжелой цепи SH348-1 представляла собой
I-Q-L-V-Q-S-G-P (SEQ ID NO: 26 в списке последовательностей).
N-концевая аминокислотная последовательность полосы, которая соответствует легкой цепи SH348-1 представляла собой
D-V-L-M-T-Q-S-P-L-S-L (SEQ ID NO: 27 в списке последовательностей).
N-концевая аминокислотная последовательность полосы, соответствующей тяжелой цепи SH357-1 представляла собой
Q-I-Q-L-V-Q-S-G-P (SEQ ID NO: 28 в списке последовательностей).
N-концевая аминокислотная последовательность полосы, соответствующей легкой цепи SH357-1 представляла собой
D-V-L-M-T-Q-T-P-L-S-L-P-V-S-L-G-D-Q-A (SEQ ID NO: 29 в списке последовательностей).
Эти аминокислотные последовательности сравнивали с аминокислотными последовательностями антител в базе данных, полученной Kabat et al. (смотри Kabat, E.A. et al., (1991) в Seguences of Proteins of Immunological Interest Vol. I и II, U.S. Department of Health and Human Services). В результате, подтип тяжелой цепи SH348-1 (цепь γ2a) являлся смешанным, и подтип легкой цепи представлял собой легкую цепь каппа II. Кроме того, подтип тяжелой цепи SH357-1 (цепь γ2a) определили как смешанный, и подтип легкой цепи определили как легкая цепь каппа II.
Таким образом, синтезировали следующие олигонуклеотидные праймеры, которые гибридизовали соответственно с 5'-концевой областью гена антитела, который кодирует область, относящуюся к данным подтипам мыши и с его 3'-концевой областью, содержащей стоп-кодон (смотри Kabat et al., ibid; Matti Kartinen et al. (1988) 25, 859-865; и Heinrich, G. et al. (1984) J. Exp. Med. 159, p. 417-435):
5'-cagatccagttggtgcagtctggacct-3' (DB3F1: список последовательностей последовательность ID No. 30)
5'-aagatatctcatttacccggagtccgggagaa-3' (MIG2AEVR1: в списке последовательностей последовательность ID No. 31)
5'-aagaattcatgaagttgcctgttagg-3' (MK19EIF1: в списке последовательностей последовательность ID No. 32)
5'-aagatatcttaacactcattcctgttgaagct-3' (KEVR1: в списке последовательностей последовательность ID No. 33)
Для клонирования кДНК, кодирующей тяжелые и легкие цепи SH348-1 и SH357-1, получали мРНК из гибридом, которые продуцируют SH348-1 или SH357-1, используя набор для очистки мРНК Quick Prep (произведено GE Healthcare Bio-Sciences Corp., #27-9254-01). С каждой мРНК, полученной таким образом, амплифицировали кДНК, кодирующую тяжелую или легкую цепь каждого антитела, используя набор для ПЦР RNA TaKaRa One Step (AMV) (произведено TAKARA BIO INC., #RR024A) и набор праймеров для синтеза тяжелой цепи (комбинация DB3F1 и MIG2AEVR1) или набор праймеров для синтеза легкой цепи (комбинация MK19EIF1 и KEVR1). Такие кДНК, амплифицированные посредством ПЦР, клонировали, используя набор для клонирования Zero Blunt TOPO PCR (произведено Invitrogen Corp.). Определяли каждую из клонированных нуклеотидных последовательностей легкой и тяжелой цепи, используя анализатор последовательностей генов ("ABI PRISM 3700 DN Analyzer; Applied Biosystems" или "Applied Biosystems 3730xl Analyzer; Applied Biosystems"). Для реакции секвенирования использовали GeneAmp 9700 (Applied Biosystems).
Установленная нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующей тяжелую цепь SH348-1 соответствует SEQ ID NO: 34 в списке последовательностей, а ее аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 35. Нуклеотидная последовательность кДНК кодирующей легкую цепь SH348-1 соответствует SEQ ID NO: 36 в списке последовательностей, а ее аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 37 в списке последовательностей. Нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующей тяжелую цепь SH357-1 соответствует SEQ ID NO: 38 в списке последовательностей, а ее аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 39. Нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующей легкую цепь SH357-1 соответствует SEQ ID NO: 40 в списке последовательностей, а ее аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 41. Последовательности, соответствующие нуклеотидам с No. от 1 до 27 и от 1327 до 1350 в SEQ ID NO: 34, последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. от 637 до 660 в SEQ ID NO: 36, последовательности, соответствующие нуклеотидам с No. от 1 до 27 и от 1327 до 1350 в SEQ ID NO: 38, и последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. от 637 до 660 в SEQ ID NO: 40 представляют собой последовательности, полученные от праймеров.
Кроме того, аминокислотные последовательности этих тяжелых и легких цепей анализировали, сопоставляя с аминокислотными последовательностями антител в базе данных, полученной Kabat et al. (смотри Kabat, E.A., et al. (1991) в "Sequence of Proteins of Immunological Interest Vol. I and II"; U.S. Department of Health and Human Services). В результате показали, что тяжелая цепь SH348-1 имеет аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам вариабельной области с No. от 1 до 119 в SEQ ID NO: 35 в списке последовательностей и имеет аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам константной области с No. от 120 до 449, там же. Кроме того, показали, что легкая цепь SH348-1 имеет аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам вариабельной области с No. от 1 до 112 в SEQ ID NO: 37 в списке последовательностей и имеет аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам константной области с No. от 113 до 219, там же.
Показали, что тяжелая цепь SH357-1 имеет аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам вариабельной области с No. от 1 до 119 в SEQ ID NO: 39 в списке последовательностей и имеет аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам константной области с No. от 120 до 449, там же. Кроме того, показали, что легкая цепь SH357-1 имеет аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам вариабельной области с No. от 1 до 112 в SEQ ID NO: 41 в списке последовательностей и имеет аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам константной области с No. от 113 до 219, там же.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи SH348-1, соответствует SEQ ID NO: 42 в списке последовательностей, а ее аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 43. Нуклеотидная последовательность, кодирующая константную область тяжелой цепи SH348-1, соответствует SEQ ID NO: 44, а ее аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 45. Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи SH348-1 соответствует SEQ ID NO: 46 в списке последовательностей, а ее аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 47. Нуклеотидная последовательность, кодирующая константную область легкой цепи SH348-1, соответствует SEQ ID NO: 48, а ее аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 49. Последовательности, соответствующие нуклеотидам с No. от 1 до 27 в SEQ ID NO: 42, последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. от 970 до 993 в SEQ ID NO: 44, и последовательности, соответствующие нуклеотидам с No. 301 до 324 в SEQ ID NO: 48, представляют собой последовательности, полученные из праймеров.
Кроме того, нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи SH357-1, соответствует SEQ ID NO: 50 в списке последовательностей, а ее аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 51. Нуклеотидная последовательность, кодирующая константную область тяжелой цепи SH357-1, соответствует SEQ ID NO: 52, а ее аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 53. Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи SH357-1, соответствует SEQ ID NO: 54 в списке последовательностей, а ее аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 55. Нуклеотидная последовательность, кодирующая константную область легкой цепи SH357-1, соответствует SEQ ID NO: 56, а ее аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 57. Последовательности, соответствующие нуклеотидам с No. от 1 до 27 в SEQ ID NO: 50, последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. от 970 до 993 в SEQ ID NO: 52, и последовательности, соответствующие нуклеотидам с No. от 301 до 324 в SEQ ID NO: 56 представляют собой последовательности, полученные от праймеров.
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
Кроме того, положения и последовательности CDR в каждой из аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепи анализировали и определяли сравниванием гомологии с аминокислотными последовательностями антител в базе данных, полученной Kabat et al. (смотри Kabat, E.A., et al. (1991) ibid). В соответствии с этим документом, даже отличающиеся антитела имеют каркасные области, которые обладают практически равной аминокислотной длиной и в них наблюдают наличие сходства аминокислотной последовательности в вариабельных областях, если они находятся в одинаковом субтипе. С другой стороны, CDR представляют собой специфические последовательности, фланкированные этими каркасными областями. Таким образом, аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей анализировали путем сравнения с аминокислотными последовательностями тяжелой и легкой цепей того же субтипа. В результате определили, что CDR в тяжелой цепи SH348-1 имеет аминокислотные последовательности, соответствующие аминокислотам с No. от 26 до 35 в SEQ ID NO: 35 в списке последовательностей (CDRH), аминокислотам с No. от 50 до 66 там же (CDRH) и аминокислотам с No. от 99 до 108 там же (CDRH). Определили, что CDR в легкой цепи SH348-1 имеет аминокислотные последовательности, соответствующие аминокислотам с No. от 24 до 39 в SEQ ID NO: 37 в списке последовательностей (CDRL), аминокислотам с No. от 55 до 61 там же (CDRL) и аминокислотам с No. от 94 до 102 там же (CDRL). Определили, что CDR в тяжелой цепи SH357-1 имеет аминокислотные последовательности, соответствующие аминокислотам с No. от 26 до 35 в SEQ ID NO: 39 в списке последовательностей (CDRH), аминокислотам с No. от 50 до 66 там же (CDRH) и аминокислотам с No. от 99 до 108 там же (CDRH). Определили, что CDR в легкой цепи SH357-1 имеет аминокислотные последовательности, соответствующие аминокислотам с No. от 24 до 39 в SEQ ID NO: 41 в списке последовательностей (CDRL), аминокислотам с No. от 55 до 61 там же (CDRL) и аминокислотам с No. от 94 до 102 там же (CDRL).
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
Нуклеотидная последовательность, кодирующая CDRHSH348-1, соответствует SEQ ID NO: 58 в списке последовательностей, а ее аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 59. Нуклеотидная последовательность, кодирующая CDRHSH348-1, соответствует SEQ ID NO: 60, а ее аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 61. Нуклеотидная последовательность, кодирующая CDRH SH348-1, соответствует SEQ ID NO: 62, а ее аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 63. Нуклеотидная последовательность, кодирующая CDRLSH348-1, соответствует SEQ ID NO: 64, а ее аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 65. Нуклеотидная последовательность, кодирующая CDRL SH348-1, соответствует SEQ ID NO: 66, а ее аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 67. Нуклеотидная последовательность, кодирующая CDRL SH348-1, соответствует SEQ ID NO: 68, а ее аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 69. Кроме того, нуклеотидная последовательность, кодирующая CDRHSH357-1, соответствует SEQ ID NO: 70, а ее аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 71. Нуклеотидная последовательность, кодирующая CDRH SH357-1, соответствует SEQ ID NO: 72, а ее аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 73. Нуклеотидная последовательность, кодирующая CDRH SH357-1, соответствует SEQ ID NO: 74, а ее аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 75. Нуклеотидная последовательность, кодирующая CDRL SH357-1, соответствует SEQ ID NO: 76, а ее аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 77. Нуклеотидная последовательность, кодирующая CDRL SH357-1, соответствует SEQ ID NO: 78, а ее аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 79. Нуклеотидная последовательность, кодирующая CDRL SH357-1, соответствует SEQ ID NO: 80, а ее аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 81.
(Пример 6) Активность связывания антитела к EPHA2 с внеклеточной областью EPHA2
Раствор полипептида внеклеточной области EPHA2 (произведено R&D Systems, Inc., #3035-A2-100) или бычьего сывороточного альбумина, в качестве контроля (в описании далее и на фигурах, сокращенного до "БСА"), разведенный PBS до 1 мкг/мл наносили из расчета 100 мкл/лунка на иммунопланшет (произведено Nunc, #442404) и инкубировали в течение ночи при 4°C, тем самым абсорбируя белок на планшете.
-4
-3
-2
-1
На следующий день раствор из лунок удаляли, и раствор Block Ace (один пакетик порошка Block Ace (произведено Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. (Show Brand Milk Products Co., Ltd.)) растворяли в 100 мл сверхчистой воды), разведенный PBS в 4 раза наносили из расчета 200 мкл/лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Лунки промывали дважды буфером для разведения (PBS, 0,05% (об./об.) Tween 20). Далее, раздельно разводили PBS SH348-1, SH357-1 и Ab96-1 до концентрации 1,25×10 мкг/мл, 1,25×10 мкг/мл, 1,25×10 мкг/мл, 1,25×10 мкг/мл, 1,25 мкг/мл, 12,5 мкг/мл, или 125 мкг/мл и полученный раствор (содержащий 0,05% (об./об.) (конечная концентрация) Tween 20) добавляли из расчета 100 мкл/лунка.
Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Далее раствор из лунок удаляли, и лунки дважды промывали буфером для разведения. Антитело козы к IgG мыши, конъюгированное с пероксидазой (произведено Millipore (Chemicon), #AP181P), разведенное в 1000 раз буфером для разведения, добавляли из расчета 100 мкл/лунка и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Раствор из лунок удаляли, и лунки дважды промывали буфером для разведения. Далее проводили цветную реакцию с перемешиванием, добавляя раствор для проявления цвета OPD из расчета 100 мкл/лунка. После развития окрашивания, цветную реакцию останавливали, добавляя 1M HCl из расчета 100 мкл/лунку. Измеряли поглощение при 490 нм, используя спектрофотометр для чтения планшетов (фиг.7).
На фиг.7A) показаны результаты для SH348-1, на фиг.7B) показаны результаты для SH357-1 и на фиг.7C) показаны результаты для Ab96-1. На каждом графике, поглощение показано как среднее ± стандартное отклонение (n=3). Более сильное поглощение обозначает более сильную активность связывания. Как показано на графиках, все антитела SH348-1, SH357-1 и Ab96-1, не проявляющие аффинности для БСА, демонстрируют, что они специфично связываются с внеклеточной областью EPHA2.
(Пример 7) Влияние антитела к EPHA2 на связывание лиганда
2A
1
1
Полипептид внеклеточной области EPHA2 (произведено R&D Systems, Inc., #3035-A2-100), иммобилизованный на иммунопланшете получают способом, описанным в примере 6. Лунки иммунопланшета дважды промывали буфером для разведения. Далее добавляли SH348-1, SH357-1, Ab96-1 или изотипический контроль IgG мыши (в описании далее и на фигурах, сокращенного до "mIgG2a"; произведено R&D Systems, Inc., #MAB003) в качестве изотипического контрольного антитела, разведенные буфером для разведения до 10 мкг/мл или 50 мкг/мл по 100 мкл/лунка. Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Далее добавляли рекомбинантную химеру Эфрин-A1/Fc мыши (в описании далее и на фигурах, сокращенного до "Эфрин-A1/Fc"; произведено R&D Systems, Inc., #602-A1-200) в качестве растворимого лиганда или рекомбинантный Fc IgGчеловека (в описании далее и на фигурах, сокращенного до "hGFc"; произведено R&D Systems, Inc., #110-HG-100) в качестве отрицательного контроля белка для растворимого лиганда до конечной концентрации 1 мкг/мл и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа.
Далее по способу, описанному в примере 6, раствор из лунок удаляли, и лунки промывали буфером для разведения. Добавляли в них конъюгированные с пероксидазой антитела козы аффинной степени чистоты (AffiniPure), специфичные к фрагменту Fcγ IgG человека (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., #109-035-098). Цветную реакцию проводили, используя раствор для проявления цвета OPD. Измеряли поглощение при 490 нм, используя спектрофотометр для чтения планшетов (фиг.8).
На фиг.8 показано поглощение, как среднее ± стандартное отклонение (n=3). Антитело Ab96-1 даже в концентрации 10 мкг/мл сильно ингибировало связывание лиганда EPHA2 эфрин-A1 с EPHA2. В отличие от этого, антитела SH348-1 и SH357-1, даже добавленные в концентрации 50 мкг/мл (пять концентраций Ab96-1), не ингибировали связывание Эфрин-A1/Fc с EPHA2. Эти результаты показали, что антитела SH348-1 и SH357-1 не ингибируют связывание Эфрин-A1/Fc с EPHA2.
(Пример 8) Проверка активности ингибирования антитела к EPHA2 по отношению к зависимому от эфрин-A1 фосфорилированию тирозиновых остатков EPHA2
8)-1 Получение клеточных лизатов
5
2
2
2
Клетки MDA-MB-231, суспендированные в RPMI1640, содержащим 10% ЭТС, 50 единиц/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (далее, сокращенного до "RPMI1640, содержащий 10% ЭТС (с антибиотиками)") высевали из расчета 2,5×10 клеток/лунка на 12-луночный планшет и культивировали в течение ночи при 37°C в 5% CO. Затем среду из лунок удаляли и в них вновь добавляли RPMI1640. Клетки дополнительно культивировали в течение ночи при 37°C в 5% CO. Затем среду из лунок удаляли и только RPMI1640 или RPMI1640, содержащую антитело (mIgG2a, SH348-1 или SH357-1) в концентрации 10 мкг/мл или 50 мкг/мл добавляли в каждую лунку и предварительно инкубировали при 37°C в 5% CO в течение 1 часа.
1
В лунки только с добавленным RPMI1640, предварительно проинкубированные таким образом, добавляли 1/50 объема Эфрин-A1/Fc или hGFc (конечная концентрация 1 мкг/мл) или RPMI1640 в том же объеме (на фиг.9, представленную (-)). Кроме того, в лунки с добавленными mIgG2a, SH348-1 или SH357-1, добавляли 1/50 объема Эфрин-A1/Fc (конечная концентрация 1 мкг/мл).
2
Плашки дополнительно инкубировали при 37°C в 5% CO в течение 15 минут. После удаления супернатанта, для лизиса клеток добавляли туда 1×буфер для лизиса клеток (произведено Cell Signaling Technology, Inc.) содержащий 1 мМ PMSF (произведено Sigma-Aldrich, Inc.) и коктейль ингибиторов протеаз (произведено Sigma-Aldrich, Inc., #P8340) (далее, сокращенного до PPCLB). Лизаты центрифугировали при 15000 об./мин. в течение 5 минут, и полученные супернатанты использовали как образцы для иммунопреципитации. Концентрацию белка в образцах измеряли, используя реагент для анализа белков ВСА (произведено PIERCE).
8)-2 Детекция фосфорилированной формы EPHA2 посредством иммунопреципитации
Добавляли 25 мкл суспензии магнитных частиц с белком G (произведено NEW ENGLAND BioLabs, Inc.) на образец и 4 мкг антитела к EphA2 (произведено Santa Cruz Biotechnology, Inc., #sc-924), и смесь переворачивали для перемешивания при 4°C в течение 2 часов. Далее к ней добавляли ЭТС до конечной концентрации 10% и смесь дополнительно переворачивали для перемешивания при 4°C в течение 30 минут. Далее частицы промывали PPCLB. Далее к ним добавляли 200 мкг супернатантов клеточного лизата, полученных в абзаце 8)-1 и смеси переворачивали для смешивания в течение ночи при 4°C.
На следующий день частицы три раза промывали PPCLB. Далее к частицам добавляли буфер для образцов SDS (56,3 мМ Tris-HCl, pH 6,8, 1,8% (масс./об.) SDS, 9% глицерин, 0,72M 2-меркаптоэтанол, 0,045 мг/мл бромфеноловый синий), и смеси прогревали при 98°C в течение 5 минут. Белки, диссоциировавшие с частиц разделяли в SDS-PAGE.
Белки переносили с геля на PVDF-мембрану (величина пор 0,45 мкм; произведено Millipore). PVDF-мембрану блокировали встряхиванием в блокирующем растворе без азида натрия (один пакетик порошка Block Ace растворяли в 100 мл сверхчистой воды, куда затем добавляли Tween 20 в конечной концентрации 0,1% (об./об.)).
2
Для определения фосфорилированной формы тирозиновых остатков EPHA2, PVDF-мембрану погружали в раствор Анти-Фосфотирозина, рекомбинантного HRP-конъюгата 4G10 (произведено Upstate, #16-184), разведенного в 10000 раз блокирующим раствором без азида натрия и оставляли для реакции при комнатной температуре в течение 1 часа. PVDF-мембрану промывали три раза в течение 10 минут с TBST (50 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 138 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 0,1% (об./об.) Tween 20) и затем дополнительно промывали HO три раза в течение 5 минут. На пленке для хемилюминесценции детектировали сигналы, с использованием ECL Plus (произведено GE Healthcare Bio-Sciences Corp.).
2
2
3
Далее, для детекции иммунопреципитированного EPHA2, присутствующего на этой PVDF-мембране, PVDF-мембрану после детекции фосфорилированной формы тирозиновых остатков EPHA2 погружали в раствор для удаления (50 мМ Tris-HCl, pH 6,8, 2% (масс./об.) SDS, 100 мМ 2-меркаптоэтанол) и встряхивали при 55°C в течение 30 минут. Затем PVDF-мембрану погружали в раствор для гашения (TBST содержащим 1% (об./об.) HO и 0,1% (масс./об.) NaN) и встряхивали при комнатной температуре в течение 20 минут для удаления антитела на PVDF-мембране. PVDF-мембрану промывали TBST три раза в течение 10 минут и блокировали в блокирующем растворе (один пакетик порошка Block Ace растворяли в 100 мл сверхчистой воды, куда затем добавили Tween 20 и азид натрия до конечных концентраций 0,1% (об./об.) и 0,02% (масс./об.), соответственно). Далее PVDF-мембрану погружали в раствор антитела к EphA2 (произведено Santa Cruz Biotechnology, Inc., #sc-924), разведенного в 4000 раз блокирующим раствором и оставляли для реакции при комнатной температуре в течение 1 часа. PVDF-мембрану промывали TBST три раза в течение 10 минут. Далее PVDF-мембрану погружали в раствор связанного с HRP антитела к IgG кролика (произведено Cell Signaling Technology, Inc., #7074), разведенного TBST в 10000 раз и оставляли для реакции при комнатной температуре в течение 30 минут. Далее эту PVDF-мембрану промывали TBST три раза в течение 10 минут. Далее на пленке для хемилюминесценции детектировали сигналы, с использованием ECL Plus.
Растворимый лиганд Эфрин-A1/Fc, индуцирующий фосфорилирование тирозиновых остатков EPHA2, не ингибировали изотипическим контрольным антителом mIgG2a, но ингибировали, зависящим от дозы образом, при добавлении антитела SH348-1 и SH357-1 (фиг.9).
Эти результаты показали, что антитела SH348-1 и SH357-1 не ингибируют связывание лиганда эфрина-A1 с EPHA2, но ингибируют индуцируемое лигандом фосфорилирование тирозиновых остатков EPHA2.
(Пример 9) Идентификация эпитопа для антитела к EPHA2
Получали делеционных мутантов EPHA2, содержащих участок, указанный на фиг.10, и определяли участок связывания с SH348-1 или SH357-1.
9)-1 Получение делеционных мутантов EPHA2
Для экспрессии делеционных мутантов EPHA2 в виде белков, имеющих GST-Tag и His-Tag, добавленные к N-концу и S-Tag, добавленный к C-концу, синтезировали следующие праймеры, и фрагменты генов, амплифицированные способом, указанным далее, клонировали в pET-49b (+) (произведено Novagen):
5'-attaggatccgagcttccgtactgccagtgtc-3' (праймер N1: последовательность ID No. 82)
5'-attaggatccgccccccaaggtgaggct-3' (праймер N2: последовательность ID No. 83)
5'-attaggatccggtcacttaccgcaagaagggaga-3' (праймер N3: последовательность ID No. 84)
5'-attaggatccggtccaggtgcaggcactgacg-3' (праймер N4: последовательность ID No. 85)
5'-aattaagcttgccgccaatcaccgccaagtt-3' (праймер C1: последовательность ID No. 86)
5'-aattaagcttgttgccagatccctccggggac-3' (праймер C2: последовательность ID No. 87)
5'-aattaagcttcaggtaggtggtgtctggg-3' (праймер C3: последовательность ID No. 88)
5'-aattaagcttctcgtacttccacactcggc-3' (праймер C4: последовательность ID No. 89)
Каждый участок амплифицировали посредством реакции ПЦР, используя pcDNA-DEST40-EPHA2 в качестве матрицы и набор праймеров: праймеры N1 и C1 для участка, состоящего из аминокислотной последовательности соответствующей аминокислотам с No. 426-540 в SEQ ID NO: 8 в списке последовательностей (далее, обозначаемый как "m1"); праймеры N1 и C2 для участка, состоящего из аминокислотной последовательности соответствующей аминокислотам с No. 426-534 там же (далее, обозначаемый как "m2"); праймеры N1 и C3 для участка, состоящего из аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам с No. 426-504 там же (далее, обозначаемый как "m3"); праймеры N1 и C4 для участка, состоящего из аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам с No. 426-470 там же (далее, обозначаемый как "m4"); праймеры N2 и C2 для участка, состоящего из аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам с No. 439-534 там же (далее, обозначаемый как "m5"); праймеры N3 и C2 для участка, состоящего из аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам с No. 471-534 там же (далее, обозначаемый как "m6"); праймеры N4 и C2 для участка, состоящего из аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам с No. 505-534 там же (далее, обозначаемый как "m7"); праймеры N2 и C3 для участка, состоящего из аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам с No. 439-504 та же (далее, обозначаемый как "m8"); и праймеры N2 и C4 для участка, состоящего из аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам с No. 439-470 там же (далее, обозначаемый как "m9"). Полученные ПЦР продукты расщепляли BamHI и HindIII и субклонировали в участок BamHI/HindIII pET-49b (+).
9)-2 Экспрессия делеционных мутантов EPHA2
Escherichia coli BL21 (DE3) трансформировали плазмидной ДНК, сконструированной в абзаце 9)-1 или, в качестве отрицательного контроля, pET-49b (+). Полученные трансформанты культивировали в среде LB, дополненной 30 мкг/мл канамицина (произведено Invitrogen Corp.). Экспрессию делеционных мутантов индуцировали, используя систему самоиндукции (произведено Novagen). Бактериальные клетки собирали посредством центрифугирования и промывали PBS. Затем бактериальные клетки подвергали лизису раствором 2% SDS, содержащим 1 мМ PMSF и коктейль ингибиторов протеаз (произведено Sigma-Aldrich, Inc., #P8340). Супернатант собирали посредством центрифугирования и использовали в идентификации эпитопа.
Уровень экспрессии белков (содержащих полученную с GST-Tag, His-Tag и S-Tag pET-49b (+) и линкерные элементы для их соединения; в описании далее и на фигурах обозначаемых как "Vec"), экспрессированных в лизате бактериальных клеток Escherichia coli, трансформированных pET-49b (+) оценивали способом, описанным далее. Серии разведений лизата бактериальных клеток, экспрессирующих Vec, и серии разведений маркера белков с 6x His (произведено QIAGEN) раздельно растворяли в буфере для образцов с SDS и прогревали при 98°C в течение 5 минут. Далее белки разделяли в SDS-PAGE и белки в геле переносили на PVDF-мембрану. PVDF-мембрану блокировали в TBST, содержащем 5% БСА. Далее PVDF-мембрану погружали в раствор Penta-His, конъюгат HRP (произведено QIAGEN), разведенный в 1000 раз TBST, содержащий 5% БСА, и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 1 часа. Эту PVDF-мембрану промывали TBST три раза в течение 10 минут. Далее детектировали сигналы, используя ECL Plus. Интенсивность сигнала сравнивали между сериями разведений лизата бактериальных клеток, экспрессирующих Vec, и сериями разведений маркера белков с 6x His, и концентрацию белка Vec, полученного из лизата бактериальных клеток, экспрессирующих Vec, оценивали по уровню белка в полосе, содержащей маркер белков с 6x His. Делеционные мутанты EPHA2 с количеством, показывающим реакционную способность, эквивалентную 20 нг Vec в Вестерн-блоттинге с использованием моноклонального антитела S-Tag (Novagen) использовали в последующем эксперименте по идентификации эпитопа.
9)-3) Идентификация эпитопа
Клеточные лизаты, содержащие делеционные мутанты EPHA2, полученные в абзаце 9)-2 растворяли в буфере для образцов с SDS и прогревали при 98°C в течение 5 минут. Образцы, полученные в результате, разделяли в SDS-PAGE и белки в геле переносили на PVDF-мембраны. После переноса PVDF-мембраны блокировали встряхиванием в блокирующем растворе (один пакетик порошка Block Ace растворяли в 100 мл сверхчистой воды, куда затем добавляли Tween 20 и азид натрия в конечных концентрациях 0,1% (об./об.) и 0,02% (масс./об.), соответственно). Затем эти PVDF-мембраны оставляли в течение ночи при 4°C в блокирующем растворе, содержащем 2 мг/мл SH348-1 или SH357-1, для реакции. Эти PVDF-мембраны промывали TBST три раза в течение 10 минут и дополнительно подвергали реакции при комнатной температуре в течение 30 минут в растворе связанного с HRP целого Ab овцы к Ig мыши, разведенного в 5000 раз TBST. Впоследствии, PVDF-мембраны промывали TBST три раза в течение 10 минут. Далее на пленке для хемилюминесценции детектировали сигналы, используя ECL Plus.
Затем PVDF-мембраны выдерживали в растворе для удаления (50 мМ трис-HCl, pH 6,8, 2% (масс./об.) SDS, 100 мМ 2-меркаптоэтанол), затем встряхивали при 55°C в течение 30 минут, и затем промывали TBST три раза в течение 10 минут. Эти PVDF-мембраны блокировали в блокирующем растворе и затем промывали TBST три раза в течение 10 минут. PVDF-мембраны выдерживали в растворе моноклонального антитела S-Tag, разведенного в 10000 раз TBST, и оставляли для реакции при комнатной температуре в течение 30 минут. The PVDF-мембраны промывали TBST три раза в течение 10 минут. Затем, PVDF-мембраны выдерживали в растворе связанного с HRP целого Ab овцы к Ig мыши, разведенного в 5000 раз TBST, и оставляли для реакции при комнатной температуре в течение 30 минут. Далее PVDF-мембраны промывали TBST три раза в течение 10 минут. Затем на пленке для хемилюминесценции детектировали сигналы, используя ECL Plus.
В результате, оба антитела SH348-1 (фиг.11A) и SH357-1 (фиг.11C) проявляли активность связывания только с m1, m2 и m5. Кроме того, в этом способе, делеционные мутанты EPHA2 присутствовали в почти одинаковом количестве на каждой из PVDF-мембран (SH348-1: фиг.11B, SH357-1: фиг.11D). Эти результаты показали, что антитела SH348-1 и SH357-1 связываются с участком, состоящим из аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам с No. 439-534 в SEQ ID NO: 8 в списке последовательностей аминокислотной последовательности EPHA2.
(Пример 10) Конструирование гуманизированного антитела
10)-1 Конструирование гуманизированного антитела SH348-1
10)-1-1 Молекулярное моделирование вариабельных областей SH348-1.
1
2
3
1
2
3
Молекулярное моделирование вариабельных областей SH348-1 проводили по гомологичному моделированию (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). Первичные последовательности (доступны пространственные структуры, полученные из рентгеновской кристаллической структуры) вариабельных областей иммуноглобулинов человека, зарегистрированные в базе данных белков (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007)) сравнивали с вариабельными областями SH348-1, определенными в примере 5. В результате, 2JEL и 1A4J выбрали, соответственно, как последовательности, обладающие максимальной гомологией последовательности с вариабельными областями легкой и тяжелой цепи SH348-1. Пространственные структуры каркасных областей получали на основе "каркасной модели", полученной посредством комбинирования координат 2JEL и 1A4J, соответствующих легкой и тяжелой цепям SH348-1. Для CDR SH348-1, CDRL, CDRL, CDRL, CDRH и CDRH соответствовали кластерам 16A, 7A, 9A, 10A и 10A, соответственно, по классификации Thornton et al. (J. Mol. Biol., 263, 800-815, (1996)). CDRH классифицировали в e (9) D по правилам H3 (FEBS letters 399, 1-8 (1996)). Впоследствии, типичную конформацию каждого CDR включали в каркасную модель.
В заключение, для получения вероятных, с точки зрения энергии, молекулярных моделей вариабельных областей SH348-1, проводили расчет энергии для исключения невыгодных атомных взаимодействий. Эти способы выполняли, используя коммерчески доступную программу Prime для прогнозирования белковой пространственной структуры и программу координатного поиска MacroModel (Schrödinger, LLC).
10)-1-2 Конструирование аминокислотной последовательности гуманизированного SH348-1
Гуманизированные антитела SH348-1 конструировали согласно “пересадке CDR” (Proc. Natl. Acad. Sci. 86 USA 1002 9-10033 (1989)). Акцепторные антитела выбирали, исходя из гомологии аминокислот в каркасных областях. Последовательности каркасных областей SH348-1 сравнивали со всеми каркасными областями человека, зарегистрированными в базе данных Kabat (Nuc. Acid Res. 29, 205-206 (2001)), включающей аминокислотные последовательности антител. Антитело GSD2B5B10'CL выбирали в качестве акцептора из-за того, что оно имеет 72%, максимальную гомологию последовательности между их каркасными областями. Аминокислотные остатки каркасных областей в GSD2B5B10'CL выравнивали с соответствующими аминокислотными остатками в SH348-1 для выявления положений, между ними, где использовали различные аминокислоты. Положения этих остатков анализировали, с использованием модели пространственной структуры SH348-1, сконструированной таким образом. Затем, выбирали аминокислотные остатки донора, подлежащие пересадке на акцептор, в соответствии с критериями, предоставленными Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 86 USA 1002 9-10033 (1989)). Гуманизированные последовательности SH348-1 обуславливали посредством переноса некоторых выбранных остатков донора на акцепторное антитело GSD2B5B10'CL. В результате, гуманизированные последовательности двух видов легких цепей и двух видов тяжелых цепей получали, как описано далее. Далее, вариабельные и константные области и CDR классифицировали, исходя их базы данных аминокислотных последовательностей антител, полученной Kabat и др.
10-1-3) Гуманизация легкой цепи SH348-1
10-1-3-1) Тип hSH-348-T1L легкой цепи:
Гуманизированную легкую цепь SH348-1 конструировали посредством замещения аминокислот с No. 2 (валин), 3 (лейцин), 14 (серин), 15 (лейцин), 17 (аспарагиновая кислота), 18 (глутамин), 50 (лизин), 79 (аргинин), 88 (лейцин), 105 (глицин), 109 (лейцин) и 114 (аланин) вариабельной области легкой цепи SH348-1, приведенной в SEQ ID NO: 37 списка последовательностей на изолейцин, валин, треонин, пролин, глутаминовую кислоту, пролин, глутамин, лизин, валин, глутамин, валин и треонин, соответственно, и обозначали как "тип легкой цепи hSH348-T1L".
1
2
3
Нуклеотидная последовательность, кодирующая тип легкой цепи hSH348-1-T1L соответствует SEQ ID NO: 90 в списке последовательностей, и ее аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 91. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 1-60 в SEQ ID NO: 90 представляет собой сигнальную последовательность секреции. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 61-402, там же, представляет собой вариабельную область. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 403-717, там же, представляет собой константную область. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 130-177, там же, представляет собой CDRL. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 223-243, там же, представляет собой CDRL. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 340-363, там же, представляет собой CDRL.
1
2
3
Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 1-20 в SEQ ID NO: 91 списка последовательностей представляет собой сигнальную последовательность секреции. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 21-134, там же, представляет собой вариабельную область. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 135-239, там же, представляет собой константную область. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 44-59, там же, представляет собой CDRL. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 75-81, там же, представляет собой CDRL. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 114-121, там же, представляет собой CDRL.
1
2
3
Кроме того, нуклеотидная последовательность, кодирующая CDRLлегкой цепи типа hSH348-1-T1L, соответствует SEQ ID NO: 92 в списке последовательностей, его аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 93, нуклеотидная последовательность CDRL соответствует SEQ ID NO: 94 в списке последовательностей, его аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 95, нуклеотидная последовательность CDRL соответствует SEQ ID NO: 96 в списке последовательностей, и его аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 97.
10-1-3-2) Тип hSH348-T3L легкой цепи:
Гуманизированную легкую цепь SH348-1 конструировали посредством замещения аминокислот с No. 14 (серин), 15 (лейцин), 17 (аспарагиновая кислота), 18 (глутамин), 50 (лизин), 79 (аргинин), 88 (лейцин), 105 (глицин), 109 (лейцин) и 114 (аланин) вариабельной области легкой цепи SH348-1, приведенной в SEQ ID NO: 37 списка последовательностей на треонин, пролин, глутаминовую кислоту, пролин, глутамин, лизин, валин, глутамин, валин и треонин, соответственно, и обозначали как "тип hSH348-1-T3L легкой цепи".
1
2
3
Нуклеотидная последовательность, кодирующая тип hSH348-1-T3L легкой цепи соответствует SEQ ID NO: 98 в списке последовательностей, и ее аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 99. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 1-60 в SEQ ID NO: 98 представляет собой сигнальную последовательность секреции. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 61-402, там же, представляет собой вариабельную область. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 403-717, там же, представляет собой константную область. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 130-177, там же, представляет собой CDRL. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 223-243, там же, представляет собой CDRL. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 340-363, там же, представляет собой CDRL.
1
2
3
Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 1-20 в SEQ ID NO: 99 списка последовательностей представляет собой сигнальную последовательность секреции. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 21-134, там же, представляет собой вариабельную область. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 135-239, там же, представляет собой константную область. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 44-59, там же, представляет собой CDRL. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 75-81, там же, представляет собой CDRL. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 114-121, там же, представляет собой CDRL.
1
2
3
Кроме того, нуклеотидная последовательность, кодирующая CDRLлегкой цепи типа hSH348-1-T3L, соответствует SEQ ID NO: 100 в списке последовательностей, и его аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 101, нуклеотидная последовательность CDRL соответствует SEQ ID NO: 102 в списке последовательностей, его аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 103, нуклеотидная последовательность CDRL соответствует SEQ ID NO: 104 в списке последовательностей, и его аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 105.
10-1-4) Гуманизация тяжелой цепи SH348-1
10-1-4-1) Тип hSH348-1-T1H тяжелой цепи:
Гуманизированную тяжелую цепь SH348-1 конструировали посредством замещения аминокислот с No. 2 (изолейцин), 9 (пролин), 11 (лейцин), 16 (глутаминовая кислота), 17 (треонин), 20 (изолейцин), 38 (лизин), 43 (лизин), 46 (лизин), 68 (фенилаланин), 69 (аланин), 70 (фенилаланин), 71 (серин), 72 (лейцин), 73 (глутаминовая кислота), 76 (аланин), 80 (фенилаланин), 82 (глутамин), 83 (изолейцин), 84 (аспарагин), 85 (аспарагин), 87 (лизин), 88 (аспарагин), 93 (треонин), 95 (фенилаланин), 114 (треонин) и 115 (лейцин) вариабельной области тяжелой цепи SH348-1, представленной в SEQ ID NO: 43 списка последовательностей на валин, аланин, валин, серин,серин, валин, аргинин, глутамин, глутаминовая кислота, валин, треонин, изолейцин, треонин, аланин, аспарагиновую кислоту, треонин, тирозин, глутаминовую кислоту, лейцин, серин, серин, аргинин, серин, валин, тирозин, лейцин и валин, соответственно, и обозначали как "тип hSH348-1-T1H тяжелой цепи.
1
2
3
Нуклеотидная последовательность, кодирующая тип hSH348-1-T1H тяжелой цепи соответствует SEQ ID NO: 106 в списке последовательностей, и его аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 107. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 1-57 в SEQ ID NO: 106 представляет собой сигнальную последовательность секреции. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 58-414, там же, представляет собой вариабельную область. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 415-1404, там же, представляет собой константную область. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 148-162, там же, представляет собой CDRH. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 205-255, там же, представляет собой CDRH. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 352-381, там же, представляет собой CDRL.
1
2
3
Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 1-19 в SEQ ID NO: 107 списка последовательностей представляет собой сигнальную последовательность секреции. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 20-138, там же, представляет собой вариабельную область. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 139-468, там же, представляет собой константную область. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 50-54, там же, представляет собой CDRH. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 69-85, там же, представляет собой CDRH. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 118-127, там же, представляет собой CDRH.
1
2
3
Кроме того, нуклеотидная последовательность, кодирующая CDRHтяжелой цепитипа hSH348-1-T1H, соответствует SEQ ID NO: 108 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность такового соответствует SEQ ID NO: 109, нуклеотидная последовательность CDRH соответствует SEQ ID NO: 110 в списке последовательностей, его аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 111, нуклеотидная последовательность CDRH соответствует SEQ ID NO: 112 в списке последовательностей и его аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 113.
10-1-4-2) Тип hSH348-1-T3H тяжелой цепи:
Гуманизированную тяжелую цепь SH348-1 конструировали посредством замещения аминокислот с No. 9 (пролин), 11 (лейцин), 16 (глутаминовая кислота), 17 (треонин), 20 (изолейцин), 38 (лизин), 43 (лизин), 73 (глутаминовая кислота), 76 (аланин), 80 (фенилаланин), 82 (глутамин), 83 (изолейцин), 84 (аспарагин), 85 (аспарагин), 87 (лизин), 88 (аспарагин), 93 (треонин), 95 (фенилаланин), 114 (треонин) и 115 (лейцин) вариабельных доменов тяжелой цепи SH348-1, представленной в SEQ ID NO: 43 списка последовательностей на аланин, валин, серин, серин, валин, аргинин, глутамин, аспарагиновую кислоту, треонин, тирозин, глутаминовую кислоту, лейцин, серин, серин, аргинин, серин, валин, тирозин, лейцин и валин, соответственно, и обозначали как "тип hSH348-1-T3H тяжелой цепи".
1
2
3
Нуклеотидная последовательность, кодирующая тип hSH348-1-T3H тяжелой цепи, соответствует SEQ ID NO: 114 в списке последовательностей, и его аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 115. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 1-57 в SEQ ID NO: 114 представляет собой сигнальную последовательность секреции. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 58-414, там же, представляет собой вариабельную область. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 415-1404, там же, представляет собой константную область. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 148-162, там же, представляет собой CDRH. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 205-255, там же, представляет собой CDRH. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 352-381, там же, представляет собой CDRL.
1
2
3
Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 1-19 в SEQ ID NO: 115 списка последовательностей, представляет собой сигнальную последовательность секреции. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 20-138, там же, представляет собой вариабельную область. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 139-468, там же, представляет собой константную область. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 50-54, там же, представляет собой CDRH. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 69-85, там же, представляет собой CDRH. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 118-127, там же, представляет собой CDRH.
1
2
3
Кроме того, нуклеотидная последовательность, кодирующая CDRH тяжелой цепи типа hSH348-1-T3H, соответствует SEQ ID NO: 116 в списке последовательностей, его аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 117, нуклеотидная последовательность CDRH соответствует SEQ ID NO: 118 в списке последовательностей, его аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 119, нуклеотидная последовательность CDRH соответствует SEQ ID NO: 120 в списке последовательностей и его аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 121.
10)-2 Конструирование гуманизированного антитела SH357-1
10)-2-1 Молекулярное моделирование вариабельной области SH357-1
1
2
3
1
2
3
2JEL и 1A4J выбирали как последовательности, имеющие максимальную гомологию последовательности с вариабельными областями легкой и тяжелой цепи SH357-1, соответственно, тем же способом, как в абзаце 10)-1-1. CDRL, CDRL, CDRL, CDRH и CDRH соответствовали кластерам 16A, 7A, 9A, 10A и 10A, соответственно. CDRH классифицировали в e(9)D.
10)-2-2 Конструирование аминокислотной последовательности для гуманизированного SH357-1
В качестве акцептора выбирали антитело GSD2B5B10'CL, тем же способом, как в абзаце 10)-1-2, и обуславливали последовательность гуманизированного SH357-1. В результате, гуманизированные последовательности двух типов легких цепей и двух типов тяжелых цепей получали, как показано далее.
10-2-3) Гуманизация легкой цепи SH357-1
10-2-3-1) Тип hSH357-1-T1L легкой цепи:
Гуманизированная легкая цепь SH357-1, сконструирована посредством замещения аминокислот с No. 2 (валин), 3 (лейцин), 7 (треонин), 14 (серин), 15 (лейцин), 17 (аспарагиновая кислота), 18 (глутамин), 50 (лизин), 88 (лейцин), 105 (глицин), 109 (лейцин) и 114 (аланин) легкой цепи SH357-1, представленной в SEQ ID NO: 41 списка последовательностей, на изолейцин, валин, серин, треонин, пролин, глутаминовую кислоту, пролин, глутамин, валин, глутамин, валин и треонин, соответственно, обозначали как "тип hSH357-1-T1L легкой цепи".
1
2
3
Нуклеотидная последовательность, кодирующая тип hSH357-1-T1L легкой цепи, соответствует SEQ ID NO: 122 в списке последовательностей, и его аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 123. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 1-60 в SEQ ID NO: 122, представляет собой сигнальную последовательность секреции. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 61-402, там же, представляет собой вариабельную область. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 403-717, там же, представляет собой константную область. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 130-177, там же, представляет собой CDRL. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 223-243, там же, представляет собой CDRL. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 340-363, там же, представляет собой CDRL.
1
2
3
Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 1-20 в SEQ ID NO: 123 списка последовательностей представляет собой сигнальную последовательность секреции. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 21-134, там же, представляет собой вариабельную область. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 135-239, там же, представляет собой константную область. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 44-59, там же, представляет собой CDRL. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 75-81, там же, представляет собой CDRL. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 114-121, там же, представляет собой CDRL.
1
2
3
Кроме того, нуклеотидная последовательность, кодирующая CDRLлегкой цепи типа hSH357-1-T1L, соответствует SEQ ID NO: 124 в списке последовательностей, его аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 125, нуклеотидная последовательность CDRL соответствует SEQ ID NO: 126 в списке последовательностей, его аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 127, нуклеотидная последовательность CDRL соответствует SEQ ID NO: 128 в списке последовательностей, и его аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 129.
10-2-3-2) Тип hSH357-1-T3L легкой цепи:
Гуманизированную легкую цепь SH357-1 сконструированную посредством замещения аминокислот с No. 7 (треонин), 14 (серин), 15 (лейцин), 17 (аспарагиновая кислота), 18 (глутамин), 50 (лизин), 88 (лейцин), 105 (глицин), 109 (лейцин) и 114 (аланин) легкой цепи SH357-1, представленной в SEQ ID NO: 41, на серин, треонин, пролин, глутаминовую кислоту, пролин, глутамин, валин, глутамин, валин и треонин, соответственно, обозначали как "тип hSH357-1-T3L легкой цепи".
1
2
3
Нуклеотидная последовательность, кодирующая тип hSH357-1-T3L легкой цепи соответствует SEQ ID NO: 130 в списке последовательностей, и его аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 131. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 1-60 в SEQ ID NO: 130, представляет собой сигнальную последовательность секреции. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 61-402, там же, представляет собой вариабельную область. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 403-717, там же, представляет собой константную область. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 130-177, там же, представляет собой CDRL. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 223-243, там же, представляет собой CDRL. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 340-363, там же, представляет собой CDRL.
1
2
3
Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 1-20 в SEQ ID NO: 131 списка последовательностей представляет собой сигнальную последовательность секреции. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 21-134, там же, представляет собой вариабельную область. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 135-239, там же, представляет собой константную область. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 44-59, там же, представляет собой CDRL. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 75-81, там же, представляет собой CDRL. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 114-121, там же, представляет собой CDRL.
1
2
3
Кроме того, нуклеотидная последовательность, кодирующая CDRLлегкой цепи типа hSH357-1-T3L, соответствует SEQ ID NO: 132 в списке последовательностей, его аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 133, нуклеотидная последовательность CDRL соответствует SEQ ID NO: 134 в списке последовательностей, его аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 135, нуклеотидная последовательность CDRL соответствует SEQ ID NO: 136 в списке последовательностей, и его аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 137.
10-2-4) Гуманизация тяжелой цепи SH357-1
10-2-4-1) Тип hSH357-1-T1H тяжелой цепи:
Гуманизированную тяжелую цепь SH357-1 конструировали посредством замещения аминокислот с No. 2 (изолейцин), 9 (пролин), 11 (лейцин), 16 (глутаминовая кислота), 17 (треонин), 20 (изолейцин), 38 (лизин), 43 (лизин), 46 (лизин), 68 (фенилаланин), 69 (аланин), 70 (фенилаланин), 71 (серин), 72 (лейцин), 73 (глутаминовая кислота), 76 (аланин), 82 (глутамин), 83 (изолейцин), 85 (аспарагин), 87 (лизин), 88 (аспарагин), 93 (серин), 95 (фенилаланин), 114 (треонин) и 115 (лейцин) вариабельной области тяжелой цепи SH357-1, представленной в SEQ ID NO: 51 списка последовательностей, на валин, аланин, валин, аланин, серин, валин, аргинин, глутамин, глутаминовую кислоту, валин, треонин, изолейцин, треонин, аланин, аспарагиновую кислоту, треонин, глутаминовую кислоту, лейцин, серин, аргинин, серин, валин, тирозин, лейцин и валин, соответственно, и обозначали как "тип hSH357-1-T1H тяжелой цепи".
1
2
3
Нуклеотидная последовательность, кодирующая тип hSH357-1-T1H тяжелой цепи соответствует SEQ ID NO: 138 в списке последовательностей, и его аминокислотная последовательность соответствует SEQ ID NO: 139. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 1-57 в SEQ ID NO: 138, представляет собой сигнальную последовательность секреции. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 58-414, там же, представляет собой вариабельную область. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 415-1404, там же, представляет собой константную область. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 145-162, там же, представляет собой CDRH. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 205-255, там же, представляет собой CDRH. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 352-381, там же, представляет собой CDRL.
1
2
3
Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 1-19 в SEQ ID NO: 139 списка последовательностей представляет собой сигнальную последовательность секреции. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 20-138, там же, представляет собой вариабельную область. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 139-468, там же, представляет собой константную область. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 49-54, там же, представляет собой CDRH. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 69-85, там же, представляет собой CDRH. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 118-127, там же, представляет собой CDRH.
1
2
3
Кроме того, нуклеотидная последовательность, кодирующая CDRHтяжелой цепи типа hSH357-1-T1H соответствует SEQ ID NO: 140 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность такового соответствует SEQ ID NO: 141, нуклеотидная последовательность CDRH соответствует SEQ ID NO: 142 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность такового соответствует SEQ ID NO: 143, нуклеотидная последовательность CDRH соответствует SEQ ID NO: 144 в списке последовательностей, и аминокислотная последовательность такового соответствует SEQ ID NO: 145.
10-2-4-2) Тип hSH357-1-T3H тяжелой цепи:
Гуманизированную тяжелую цепь SH357-1 конструировали посредством замещения аминокислот с No. 9 (пролин), 11 (лейцин), 16 (глутаминовая кислота), 17 (треонин), 20 (изолейцин), 38 (лизин), 43 (лизин), 73 (глутаминовая кислота), 76 (аланин), 82 (глутамин), 83 (изолейцин), 85 (аспарагин), 87 (лизин), 88 (аспарагин), 93 (серин), 95 (фенилаланин), 114 (треонин) и 115 (лейцин) вариабельной области тяжелой цепи SH357-1, представленной в SEQ ID NO: 51 на аланин, валин, аланин, серин, валин, аргинин, глутамин, аспарагиновую кислоту, треонин, глутаминовую кислоту, лейцин, серин, аргинин, серин, валин, тирозин, лейцин и валин, соответственно, и обозначали как "тип hSH357-1-T3H тяжелой цепи".
1
2
3
Нуклеотидная последовательность, кодирующая тип hSH357-1-T3H тяжелой цепи соответствует SEQ ID NO: 146 в списке последовательностей, и аминокислотная последовательность такового соответствует SEQ ID NO: 147. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 1-57 в SEQ ID NO: 146 представляет собой сигнальную последовательность секреции. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 58-414 там же, представляет собой вариабельную область. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 415-1404, там же, представляет собой константную область. Нуклеотидная последовательность, соответствующая нуклеотидам с No. 145-162, там же, представляет собой CDRH. Нуклеотидная последовательность соответствующая нуклеотидам с No. 205-255, там же, представляет собой CDRH. Нуклеотидная последовательность соответствующая нуклеотидам с No. 352-381, там же, представляет собой CDRL.
1
2
3
Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 1-19 в SEQ ID NO: 147 списка последовательностей представляет собой сигнальную последовательность секреции. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 20-138, там же, представляет собой вариабельную область. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 139-468, там же, представляет собой константную область. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 49-54, там же, представляет собой CDRH. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 69-85, там же, представляет собой CDRH. Аминокислотная последовательность, соответствующая аминокислотам с No. 118-127, там же, представляет собой CDRH.
1
2
3
Кроме того, нуклеотидная последовательность, кодирующая CDRHтяжелой цепи типаhSH357-1-T3H, соответствует SEQ ID NO: 148 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность такового соответствует SEQ ID NO: 149, нуклеотидная последовательность CDRH соответствует SEQ ID NO: 150 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность такового соответствует SEQ ID NO: 151, нуклеотидная последовательность CDRH соответствует SEQ ID NO: 152 в списке последовательностей, и аминокислотная последовательность такового соответствует SEQ ID NO: 153.
(Пример 11) Получение гуманизированного антитела к EPHA2
Для измерения активности гуманизированного SH348-1 и гуманизированного SH357-1, плазмиды с тяжелыми и легкими цепями гуманизированного антитела к EPHA2, полученного в примере 10, конструировали, как показано далее.
11)-1 Конструирование экспрессирующих векторов для гуманизированного антитела к EPHA2
11)-1-1 Получение универсального экспрессирующего вектора для легкой цепи гуманизированного антитела (pEF6/KCL)
Синтезировали ген, кодирующий сигнальную последовательность легкой цепи антитела человека, и константную область легкой цепи (k цепь) Ig человека, описанный в SEQ ID NO: 154 в списке последовательностей (Invitrogen Corp.; служба по синтезу искусственных генов) и расщепляли ферментами рестрикции NheI и PmeI. Расщепленный фрагмент ДНК встраивали в участок NheI/PmeI вектора pEF6/V5-HisB (Invitrogen Corp.) для конструирования универсального экспрессирующего вектора для легкой цепи гуманизированного антитела (pEF6/KCL).
11)-1-2 Получение универсального экспрессирующего вектора для тяжелой цепи гуманизированного антитела (pEF1/FCCU-1)
Синтезировали ген, кодирующий сигнальную последовательность тяжелой цепи антитела человека и константную область IgG1 человека, описанный в SEQ ID NO: 155 в списке последовательностей (Invitrogen Corp.; служба по синтезу искусственных генов) и расщепляли ферментами рестрикции NheI и PmeI. Расщепленный фрагмент ДНК встраивали в участок NheI/PmeI вектора pEF1/myc-HisB (Invitrogen Corp.) для конструирования универсального экспрессирующего вектора для H цепи гуманизированного антитела (pEF1/FCCU-1).
11)-1-3 Экспрессирующие векторы для типов hSH348-1-T1L и hSH348-1-T3L легкой цепи
Синтезировали каждую из ДНК, содержащую ген, кодирующий вариабельную область легкой цепи типа hSH348-1-T1L или hSH348-1-T3L, представленные в SEQ ID NO: 156 и 157 списка последовательностей, слитую с сигналом секреции (Invitrogen Corp., служба синтеза искусственных генов) и расщепляли ферментами рестрикции NdeI и BsiWI. Полученные в результате фрагменты ДНК раздельно встраивали в участки универсального вектора для экспрессии легкой цепи гуманизированного антитела (pEF6/KCL), предварительно расщепленного ферментами рестрикции NdeI и BsiWI, тем самым создавая экспрессирующие векторы для легкой цепи типа hSH348-1-T1L и hSH348-1-T3L. Полученные экспрессирующие векторы обозначали как "pEF6/KCL/hSH348-1-T1L" и "pEF6/KCL/hSH348-1-T3L", соответственно.
11)-1-4 Конструирование экспрессирующих векторов для hSH348-1-T1H и hSH348-1-T3H типов тяжелой цепи
Синтезировали каждую из ДНК, содержащую ген, кодирующий вариабельную область hSH348-1-T1H или hSH348-1-T3H типов тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 158 и 159, соответственно, списка последовательностей (Invitrogen Corp., служба синтеза искусственных генов) и расщепляли ферментом рестрикции BlpI. Полученные в результате фрагменты ДНК раздельно встраивали в участки универсального вектора для экспрессии H цепи гуманизированного антитела (pEF1/FCCU-1), предварительно расщепленного ферментом рестрикции BlpI, тем самым создавая экспрессирующие векторы для hSH348-1-T1H и hSH348-1-T3H типов тяжелой цепи. Полученные экспрессирующие векторы обозначали как "pEF1/FCCU/hSH348-1-T1H" и "pEF1/FCCU/hSH348-1-T3H", соответственно.
11)-1-5 Конструирование экспрессирующих векторов для hSH357-1-T1L и hSH357-1-T3L типов легкой цепи
Синтезировали каждую из ДНК, содержащую ген, кодирующий вариабельную область hSH357-1-T1L или hSH357-1-T3L типов легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 160 или 161 списка последовательностей, соответственно, слитую с сигналом секреции (Invitrogen Corp., служба синтеза искусственных генов) и расщепляли ферментами рестрикции NdeI и BsiWI. Полученные в результате фрагменты ДНК раздельно встраивали в участки универсального вектора для экспрессии L цепи гуманизированного антитела (pEF6/KCL), предварительно расщепленного ферментами рестрикции NdeI и BsiWI, тем самым создавая экспрессирующие векторы для легкой цепи типа hSH357-1-T1L и hSH357-1-T3L. Полученные экспрессирующие векторы обозначали как "pEF6/KCL/hSH357-1-T1L" и "pEF6/KCL/hSH357-1-T3L", соответственно.
11)-1-6 Конструирование экспрессирующих векторов для hSH357-1-T1H и hSH357-1-T3H типов тяжелой цепи
Синтезировали каждую из ДНК, содержащую ген, кодирующий вариабельную область hSH357-1-T1H или hSH357-1-T3H типов тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 162 или 163 списка последовательностей, соответственно (Invitrogen Corp., служба синтеза искусственных генов) и расщепляли ферментом рестрикции BlpI. Полученные в результате фрагменты ДНК раздельно встраивали в участки универсального вектора для экспрессии H цепи гуманизированного антитела (pEF1/FCCU-1), предварительно расщепленного ферментом рестрикции BlpI, тем самым создавая экспрессирующие векторы для hSH357-1-T1H и hSH357-1-T3H типов тяжелой цепи. Полученные экспрессирующие векторы обозначали как "pEF1/FCCU/hSH357-1-T1H" и "pEF1/FCCU/hSH357-1-T3H", соответственно.
11)-2 Получение гуманизированного антитела
9
2
1,2×10 клеток линии 293 FreeStyle в логарифмической фазе роста высевали в 1,2 л свежей среды для экспрессии FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.) и культивировали со встряхиванием (125 об./мин.) в инкубаторе при 37°C в 8% CO. 12 мг полиэтиленимина (Polyscience #24765) растворяли в 40 мл среде Opti-Pro SFM (произведено Invitrogen Corp.) и оставляли при комнатной температуре в течение 5 минут. Плазмиду для экспрессии H цепи (0,6 мг) и плазмиду для экспрессии L цепи (1,8 мг), полученные с использованием набора PureLink HiPure Plasmid (Invitrogen Corp.), суспендировали в 40 мл среды Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.). Таким образом, 40 мл раствора экспрессирующей плазмиды, смешанной с OptiPro SFM, добавляли к 40 мл раствора полиэтиленимина, смешанного с OptiPro SFM, оставляли при комнатной температуре в течение 5 минут и дополнительно оставляли при комнатной температуре в течение 5 минут. Далее 80 мл смешанного раствора полиэтиленимина, экспрессирующей плазмиды и OptiPro SFM добавляли к клеточной суспензии 293 FreeStyle и продолжали культивирование со встряхиванием. После культивирования в течение 7 суток при 37°C в 8% CO2, собирали супернатант культуры.
11)-3 Очистка гуманизированного антитела
Супернатант культуры, полученный в абзаце 11)-2, фильтровали через фильтр Disposable Capsule (Advantec MFS Inc., #CCS-045-E1H) и затем очищали посредством колонки для аффинной хроматографии с белком A. Супернатант культуры наносили на колонку MabSelect SuRe HiTrap, 1 мл (произведено GE Healthcare Bio-sciences Corp.), уравновешенную PBS и промывали PBS. Далее на нее наносили раствор 2M аргинина (pH 4,0), для сбора, тем самым, фракций, содержащих антитело. pH доводили до 7 и фракции, содержащие антитело, наносили на колонку для обессоливания HiPrep (26/10, 50 мл) (GE Healthcare Bio-sciences Corp.), предварительно уравновешенную PBS. После замены на PBS, фракции, содержащие антитело, пропускали через 0,2-мкм фильтр, чтобы получить очищенные образцы.
Концентрацию антитела определяли, элюируя антитела, связанные с колонкой POROS G 20 мкм, PEEK, 4,6 мм×100 мм, 1,7 мл (произведено Applied Biosystems) и измеряя поглощение элюата (O.D. 280 нм), с последующим сравнением площади пика с контролем (IgG1 человека).
Гуманизированное антитело SH348-1, полученное комбинацией между pEF6/KCL/hSH348-1-T1L и pEF1/FCCU/hSH348-1-T1H, обозначали как "hSH348-1-T1"; и гуманизированное антитело SH348-1, полученное комбинацией между pEF6/KCL/hSH348-1-T3L и pEF1/FCCU/hSH348-1-T3H, обозначали как "hSH348-1-T3".
Кроме того, гуманизированное антитело SH357-1, полученное комбинацией между pEF6/KCL/hSH357-1-T1L и pEF1/FCCU/hSH357-1-T1H, обозначали как "hSH357-1-T1"; и гуманизированное антитело SH357-1, полученное комбинацией между pEF6/KCL/hSH357-1-T3L и pEF1/FCCU/hSH357-1-T3H, обозначали как "hSH357-1-T3".
(Пример 12) Подтверждение связывающей активности гуманизированного антитела к EPHA2 с антигеном
Способность антител hSH348-1-T1, hSH348-1-T3, hSH357-1-T1 и hSH357-1-T3 к связыванию с антигеном подтверждали по способу, описанному в примере 6, за исключением того, что в качестве вторичного антитела использовали конъюгированные с пероксидазой антитела козы аффинной степени чистоты (AffiniPure), специфичные к фрагменту Fcγ IgG человека (произведено Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., #109-035-098).
На графиках фиг.12A)-12D), поглощение показано как среднее±стандартное отклонение (n=3). В результате, для всех гуманизированных антител hSH348-1-T1, hSH348-1-T3, hSH357-1-T1 и hSH357-1-T3 к EPHA2 подтверждали наличие связывающей активности с внеклеточной областью EPHA2.
(Пример 13) Измерение конкурентной ингибирующей активности по отношению к связыванию SH348-1 или SH357-1 с EPHA2
Конкурентную ингибирующую активность hSH348-1-T1 и hSH348-1-T3 по отношению к связыванию SH348-1 с EPHA2, а также конкурентную ингибирующую активность hSH357-1-T1 и hSH357-1-T3 по отношению к связыванию SH357-1 с EPHA2 измеряли способом, описанным далее.
Моноклональные антитела SH348-1 и SH357-1 мыши биотинилировали по отдельности, используя набор для биотинилирования EZ-Link Sulfo-NHS-LC (произведено Thermo Fisher Scientific K.K., #21435), по протоколу, включенному в набор (далее биотинилированные SH348-1 и SH357-1 обозначали как "bSH348-1" и "bSH357-1", соответственно). Концентрации bSH348-1, bSH357-1 и немеченых антител (SH348-1, SH357-1, hSH348-1-T1, hSH348-1-T3, hSH357-1-T1, hSH357-1-T3 и Ab96-1), используемых в эксперименте по конкурентному ингибированию, измеряли, используя реагент для анализа белков ВСА (произведено PIERCE).
Полипептид внеклеточной области EPHA2 (произведено R&D Systems, Inc., #3035-A2-100) разводили PBS до 0,5 мкг/мл, затем наносили по 100 мкл/лунка на иммунопланшет (произведено Nunc, #442404), и инкубировали в течение ночи при 4°C, для абсорбции, тем самым, белка на планшете. На следующий день, лунки один раз промывали буфером для разведения (PBS, 0,05% (об./об.) Tween 20). Затем, раствор Block Ace (один пакетик порошка Block Ace растворяли в 100 мл сверхчистой воды), разведенный PBS в 4 раза, наносили по 200 мкл/лунка и инкубировали при комнатной температуре в течение 4 часов. Раствор из лунок удаляли. Затем смешанные растворы биотинилированных антител (5 мкг/мл) и различные концентрации (0 мкг/мл, 1 мкг/мл, 5 мкг/мл, 25 мкг/мл, 50 мкг/мл и 125 мкг/мл) немеченых антител (растворитель: PBS, содержащий 0,05% (об./об.) (конечная концентрация) Tween 20) по отдельности наносили по 100 мкл/лунка и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Лунки промывали дважды буфером для разведения (PBS, 0,05% (об./об.) Tween 20). Затем, конъюгат стрептавидина с пероксидазой хрена (произведено GE Healthcare Bio-Sciences Corp., #RPN1231V), разведенный в 500 раз буфером для разведения, добавляли по 100 мкл/лунка и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Раствор из лунок удаляли, и лунки промывали дважды буфером для разведения. Затем проводили цветную реакцию с перемешиванием, добавляя раствор для проявления цвета OPD по 100 мкл/лунка. После развития окрашивания цветную реакцию останавливали, добавляя 1M HCl по 100 мкл/лунка. Измеряли поглощение при 490 нм, используя спектрофотометр для чтения планшетов.
В результате, поглощение в лунках, куда был добавлен только bSH348-1 или bSH357-1, составляло 0,780±0,016 и 0,978±0,007 (среднее±стандартное отклонение (n=3)), соответственно.
На графиках фиг.13A) и 13B), поглощение показано как среднее±стандартное отклонение (n=3). Связывание SH348-1 или SH357-1 с EPHA2 не ингибировалось Ab96-1, отличающегося, на основании этого, по эпитопу. С другой стороны, показали, что связывание SH348-1 с EPHA2 ингибируется самим антителом SH348-1 или его гуманизированными антителами hSH348-1-T1 и hSH348-1-T3 (фиг.13A). Аналогично, показали, что связывание SH357-1 с EPHA2 подлежит ингибированию самим антителом SH357-1 или его гуманизированными антителами hSH357-1-T1 и hSH357-1-T3 (фиг.13B).
(Пример 14) Ингибирующее действие гуманизированного антитела к EPHA2 на зависимое от эфрин-A1 фосфорилирование тирозиновых остатков EPHA2
Способность гуманизированного антитела к EPHA2 к ингибированию фосфорилирования тирозиновых остатков EPHA2, зависящего от эфрин-A1, исследовали по способу, описанному в примере 8. В результате, все антитела hSH348-1-T1, hSH348-1-T3, hSH357-1-T1 и hSH357-1-T3 показали сохранность активности ингибирования фосфорилирования тирозиновых остатков EPHA2, индуцированное Эфрин-A1/Fc (фиг.14).
Промышленная применимость
Антитело к EPHA2 по настоящему изобретению обладает противоопухолевой активностью. Фармацевтическую композицию, содержащую антитело к EPHA2, можно использовать в качестве противоракового средства.