СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКСЕНИЧНОЙ КУЛЬТУРЫ ВЫСШИХ ВОДНЫХ РАСТЕНИЙ
METHOD FOR AXENIC CULTURE OF HIGH WATER PLANTS PRODUCTION

Изобретение относится к биохимии, физиологии и биотехнологии растений и может быть использовано в технологии получения аксеничных культур высших водных растений, например семейства рясковых, при помощи поверхностной стерилизации.
Высшие водные растения, в частности аксеничные культуры высших водных растений, применяются в качестве модельного объекта в лабораторных исследованиях, а также в биотехнологии для последующей трансформации и культивирования в качестве продуцента ценных продуктов (белков, полисахаридов, пигментов, метаболитов) и биологически активных соединений. В естественных условиях поверхность водных растений ассоциирована с эпифитной микрофлорой, тогда как (в большинстве случаев) биотехнологические протоколы предполагают работу с аксеничной культурой - моновидовой популяцией растений, свободной от поверхностной и сопутствующей микрофлоры.
Известен способ получения аксеничной культуры Lemna aequinoctialis, включающий поверхностное воздействие стерилизующим агентом на исходную культуру, при этом воздействие осуществляют погружнием исходной культуры в стерилизующий агент, в качестве которого последовательно используют раствор хлорида ртути и 50% этанола /L.Yin, Y.Zhou, X.Fan, R.Lu Inductin of Phytohelatins in Lemna aequinoctialis in Response to Cadmium Exposure // Bull.Eniron.Contam. Toxicol, 2002, V.68; P.5-568/. Однако в связи с особенностями состава и строения эпидермальных тканей большинство водных растений - макрофитов очень чувствительны к обработке этанолом, нарушающей поверхностный защитный гидрофобный слой. Это приводит к значительному снижению жизнеспособности растений.
Наиболее близким к заявляемому , является способ стерилизации растений из семейства рясковых, предложенный в 1980 г. английскими авторами D. Bowker, A. Duffield, P. Denny /David W Bowker, Antony N. Duffield, Patrick Denny. Methods for the isolation, sterilization and cultivation of Lemnaceae // Freshwater Biology, 1980, V.10; P.385-388/. По данному методу в качестве стерилизующего агента используют раствор гипохлорита натрия (содержание доступного хлора 10-14%). Растения, отобранные для стерилизации (около 200 штук), промывают стерильной дистиллированной водой (минимальный объем 500 мл), затем инокулируют в подготовленную аликвоту дезинфектанта. Обработку дезинфицирующим агентом проводят до визуально выраженного побеления листецов, после чего каждое растение отдельно переносят в питательную среду для выявления в процессе культивирования наличия бактериальных и водорослевых контаминаций.
Данный способ обработки имеет низкую эффективность и не обеспечивает стабильной жизнеспособности единичных выживших поверхностно стерилизованных аксеничных растений. Кроме того, следует особо отметить высокую токсичность гипохлорита в отношении целого ряда высших водных растений, приводящую к потере репродуктивной способности и/или их быстрой гибели. В связи с этим все описанные в литературе методы поверхностной стерилизации высших растений малопригодны для обработки целых растений и в основном применяются для стерилизации эксплантов (тканевых фрагментов либо семян) растений и последующего получения каллусных культур с целью их дальнейшей регенерации, что значительно увеличивает затрачиваемое время и усложняет процедуру.
Задачей данного изобретения является получение аксеничной культуры высших водных растений путем поверхностной стерилизации целых растений, минуя этап получения каллуса и без дополнительной обработки антибактериальными препаратами.
Технический результат заключается в повышении выживаемости и процента выхода растений, свободных от поверхностной и сопутствующей микрофлоры, при упрощении технологии обработки.
Поставленная задача решается тем, что в способе получения аксеничной культуры высших водных растений, включающем поверхностное воздействие стерилизующим агентом на исходную культуру, при этом воздействие осуществляют погружением исходной культуры в стерилизующий агент, согласно изобретению, в качестве стерилизующего агента используют йод-поливинилпирролидон (йодоповидон), при этом воздействие осуществляют в течение 5-15 мин.
Кроме того, в качестве стерилизующего агента в данном изобретении используется йод-поливинилпирролидон (йодоповидон), содержащий от 9% до 12% активного йода (йодоповидон 30/06; кат.№25655-41-8, производства BASF, Германия) с конечной концентрацией свободного йода 0,02-0,03%. В качестве исходной культуры берут популяцию (группу) целых вегетирующих высших водных растений.
Из уровня техники известно использование в качестве стерилизующего агента йод-поливинилпирролидона (йодоповидона). В частности, известен способ получения аксеничных эксплантов морских водорослей, который включает предварительную обработку образцов 0,1-1%-ным раствором жидкого бытового детергента (0,1-1% domestic liquid detergent) в течение 5-10 мин, последующую инкубацию в 0,1%-2% йодоповидоне в течение 2-7 мин. Исключение бактериальных контаминаций достигается обработкой смесью антибиотиков в течение длительного периода времени (от 4 до 96 ч). Смесь антибиотиков включает пенициллин, стрептомицина сульфат, канамицин, нистатин и неомицин (1-5%) в стерильной морской воде / Patent number: 6858430, Filing date: Sep 7, 2000; Issue date: Feb 22, 2005; Inventors: Chennur Radhakrishna Reddy, Om Prakash Mairh, Gurn Rajakrishna Kumar, Kuruppan Eswaran, Peddi Venkata Subba Rao, Kalpana Harish Mody, Pushpito Kumar Ghosh; Application number: 6858430; U.S. Classification - 435/420: International Classification - C12N 005/00; C12N 005/02/. Однако данный способ предназначен для получения аксеничных эксплантов бурых морских водорослей с учетом их морфологических и физиолого-биохимических особенностей и не может быть перенесен на высшие водные растения, в частности представителей семейства рясковых. Особо следует отметить, что использованные авторами коммерческие препараты йод-поливинилпирролидона (йодоповидона) не обеспечивают полного освобождения от микробных, грибных и иных контаминаций и требуют дополнительной обработки смесями антибиотиков различного спектра действия. Эти смеси являются крайне токсичными для высших водных растений и приводят к значительному снижению их жизнеспособности и, следовательно, к снижению выхода аксеничных растений.
В заявляемом решении технический результат достигается за счет использования в качестве стерилизующего агента йодоповидона 30/06, маркировка характеризует степень полимерности поливинилпирролидона и допустимые потери активного йода в процентах. Параметрами, обеспечивающими данные свойства, являются особенности технологии синтеза препарата, защищенные рядом патентов.
Выбор стерилизующего агента основан на результатах проведенных экспериментов, в которых использовались растворы различных стерилизующих агентов, обычно применяемые в физиологии растений и смежных областях (см. таблица 1, которая демонстрирует эффективность использования дезинфектантов для стерилизации рясковых растений на примере растений вольфии бескорневой Wolffia arrhiza). Показано, что при проведении общепринятых процедур стерилизации вольфия оказалась неустойчивой к большинству стерилизующих агентов в рекомендуемых концентрациях. Применение же более низких концентраций было неэффективным, поскольку сохранялась сопутствующая микрофлора. Выбранный агент характеризуется высокой стабильностью и способностью сохранять длительное время активность по сравнению с другими препаратами, в т.ч. йодсодержащими. Иодоповидон 30/06 производства BASF, обладая широким спектром антимикробного действия, отличается высокой устойчивостью: его водные растворы устойчивы при температуре 41°C в течение 3 месяцев, потери йода в этих условиях составляют менее 5% (Техническая информация фирмы «BASF», 1997. - 21 с.). Использование в качестве стерилизующего агента других йодсодержащих препаратов, полученных по иным технологиям (Патент на изобретение DE №1028300, Патенты на изобретение US №2900305, 2826532, 3028300, 3898326), не обеспечивает заявленного результата, т.к. они демонстрируют быструю потерю активности йода.
Раствор йодоповидона 30/06 в заявляемом способе демонстрирует выраженный стерилизующий эффект, предположительно за счет адсорбции йод-поливинилпирролидонового комплекса к поверхности растений, где и локализуется эпифитная микрофлора, обеспечивая при этом высокую локальную концентрацию активного йода. Кроме того, к токсичному действию йода, помимо эпифитной бактериофлоры, крайне чувствительны большинство грибов и водорослей, особенно сине-зеленых, также зачастую ассоциированных с поверхностью водных растений. Важно отметить, что в отличие от раствора йода, поливинилпирролидон (йодоповидон), как полимер, действует поверхностно, без повреждения растительных тканей.
Способ заключается в том, что растения вольфии бескорневой (Wolffia arrhiza) промывают стерильной водой, затем обрабатывают 0,025% (в пересчете на свободный йод) стерилизующим раствором в течение не менее 5 мин при осторожном перемешивании. Затем 5-7 раз отмывают стерильной водой от стерилизующего агента и рассаживают на чашки Петри с минеральной полужидкой средой, обеспечивающей жизнедеятельность культуры. В качестве такой среды может быть использована, например, среда Гамборга В-5, разведенная в 5 раз и содержащая 0,8% агара (Serva). Все манипуляции с растениями проводят в стерильном боксе аналогично работе с бактериальными культурами, используя обожженную петлю. Были проведены эксперименты с использованием различной длительности обработки, результаты которых представлены в таблице 2. Из таблицы следует, что оптимальный результат достигается при обработке стерилизующим агентом в течение 5-15 мин.
Оценку эффективности метода стерилизации проводили следующим образом.
После 3-4 суток роста по результатам визуального анализа отбирали зеленые здоровые растения и пересаживали в пробирки, содержащие жидкую минеральную среду - по одному растению в каждую пробирку. Через 7 и 14 суток роста стерильность полученных культур проверяли, используя ряд селективных сред: минеральную среду с глюкозой, МПА, сусловый агар, а также МПА с глюкозой и среду Горбенко. Аксеничность растений вольфии бескорневой (Wolffia arrhiza) оценивали на твердых и полужидких средах по отсутствию роста бактерий, грибов и низших водорослей вокруг рассаженных одиночных растений, в высеянных аликвотах растительных гомогенатов и минеральных сред после культивирования растений.
Таблица 2
Дезинфектант и время обработки
Первичный результат
Конечный результат обработки - % аксеничных растений после 4 недель культивирования
Йодоповидон 30/065 мин
Выживание растений - 100%
56%
Йодоповидон 30/0615 мин
Выживание растений - 100%
63%
Йодоповидон 30/06 30 мин
Выживание растений - 80%
95%
Гипохлорит 5 мин
Выживание растений - 20%
Микрофлора отсутствует, все растения побелели (погибли).
Гипохлорит 15 мин
Выживание растений - 15%
Микрофлора отсутствует, все растения побелели (погибли).
Таким образом, заявляемый способ характеризуется получением аксеничной культуры целых высших водных растений без дополнительной обработки антибактериальными препаратами. Он позволяет обеспечить поверхностную стерилизацию целого растения, не вызывая при этом значительного угнетения жизненных функций. Подобный подход позволяет исключить трудоемкий и длительный этап получения эксплантов и их проведение через каллусную культуру с последующей регенерацией, что в значительной степени упрощает процедуру получения аксеничных культур и обеспечивает высокий и стабильный выход жизнеспособных растений.