Способ получения модифицированного гиалуронана и его применение в медицине, в том числе при эндопротезировании
METHOD FOR SYNTHESIS OF MODIFIED HYALURONAN AND APPLICATION THEREOF IN MEDICINE, INCLUDING IN ENDOPROSTHETICS

Область техники
Настоящее изобретение относится к области производства медицинских изделий, биотехнологии и медицины, в том числе эндопротезирования, а именно к способу получения биополимера на основе модифицированного сополимера гиалуроната натрия и применению его в различных областях медицины.
Уровень техники
Биополимеры на основе полисахаридов и их модифицированных производных, в частности, на основе гиалуроновой кислоты (далее ГК) находят применение в различных областях биотехнологии, медицины, общей и эстетической, в частности хирургической практике и эндопротезировании, они обладают такими важными свойствами, как биодеградируемость в живых тканях с течением времени, а скорость процесса биодеградации зависит от производного ГК или сложной композиции, его включающей. Указанные биополимеры должны отвечать таким важным критериям, как биосовместимость, неиммуногенность, биоинертность и гипоаллергенность. Из уровня техники известно, что в качестве такого биополимера широко распространен полисахарид - гиалуронат натрия, анионный гликозаминогликан.
Гликозаминогликаны (ГАГ) представляют собой линейные полисахариды, образующиеся из повторений дисахаридов, состоящих из аминосахаров - гексозаминов и остатков уроновых кислот (D-глюкуроновой или L-идуроновой). Гиалуроновая кислота (ГК) ([D-глюкуроновая кислота (1-β-3), N-ацетил-D-глюкозамин (1-β-4)]n) (фиг. 1), которая отличается отсутствием сульфатных групп, является биополимером широкого спектра и широко применяется в различных областях медицины. Эта макромолекула чаще всего упоминается как гиалуронан, из-за многих различные форм, которые молекула ГК может принимать в физиологических условиях (форма собственной кислоты, и соли, например гиалуронат натрия) [1].
Этот биополимер широко распространен в природе, будучи идентифицированным в мягких тканях позвоночных (например, суставы, синовиальная жидкость, кожа, стекловидное тело глаза, пуповина) [2], у водорослей [3], у моллюсков [4], и также в культивируемых эукариотических клеточных линиях и некоторых прокариот, где выполняет функцию защитной капсулы, окружающей клетку [5]. ГК, присутствующая у всех позвоночных, является основным компонентом внеклеточного матрикса: в стекловидном теле глаза человека (0,1 мг/мл) и в синовиальной суставной жидкости (3-4 мг/мл).
У позвоночных ГК выполняет широкий спектр функций: в коже она поддерживает гидратацию тканей [8]; в хряще она питает хондроциты, регулирует обмен воды и содержание ионов, поддерживает физические свойства ткани и регулирует взаимодействие клеток хряща с межклеточным субстратом. Биологические эффекты, связанные с взаимодействием ГК-рецептора, вызывают изменения скорости в пролиферация клеток, их миграции и ангиогенез [9, 10]. Кроме того, перепроизводство ГК наблюдается при заболеваниях, связанных с воспалением, фиброзом и раком. В последнее время прямые доказательства свидетельствуют об участии ГК при метастазировании рака [11, 12]. Молярная масса природного гиалуронана варьируется от нескольких сотен Дальтон до 8 млн Дальтон, но среднее значение колеблется в интервале от 1 млн до 2 млн Дальтон.
Гиалуронан, обладая хорошей растворимостью в воде, энергетически стабилен [13] и может существовать в разнообразных конформационных состояниях (вытянутые цепи, расслабленные спирали, стержневидные структуры и др.). Большая способность ГК удерживать воду связана с его гидрофильной химической природой. Такую структуру (Фиг. 2) поддерживают внутримолекулярные водородные связи, которые придают макромолекуле определенную жесткость и способствуют образованию на ее поверхности гидрофобных участков, что делает возможным поперечное связывание соседних молекул ГК, а также его взаимодействие с клеточными мембранами и липидными компонентами. Длинные полимерные молекулы гиалуроновой кислоты, формируют фибриллы, сети, стопки [14]. Вязкоупругая природа относится к реологическому поведению водных растворов ГК, которые проявляют эластичность геля в сочетании с вязкостью жидкости.
Даже при небольших концентрациях гиалуронана происходит внутримолекулярное взаимодействие, возникает упорядоченная и относительно стабильная трехмерная структура в виде пластинок и трубочек, хотя молекулы полисахарида в растворе продолжают находиться в движении [17].
Из-за вышеупомянутых выделенных свойств, разработка и коммерциализация продуктов на основе ГК находятся в непрерывном движении. ГК в основном используется в лечение остеоартроза, в косметике, в офтальмологии, в эстетической медицине, в хирургия и заживление ран, также при местной доставке лекарственных средств и тканевой инженерии [16, 18].
В некоторых из вышеупомянутых областей применения ГК используется в естественном виде, а именно в линейной форме. Однако для многих целей необходимы модификации ГК. Инициируемые в линейной форме поперечные сшивки разделяют на физические (образованные в результате электростатического взаимодействия или водородных связей) и химические (ковалентные связи). Количество ковалентных сшивок оказывает влияние на свойства полученных гидрогелей, такие как степень набухания, механическая прочность и эластичность, проницаемость, характеристики, связанные с миграцией сквозь них лекарственных форм и малых молекул [19].
in vivo
Применение линейных форм ГК в условиях  приводит к скорой потере молекулярной массы, изменению вязкоупругих свойств и структуры в виду нестабильности из-за действия ферментов гиалуронидаз, свободных радикалов и температуры. Для решения вышеупомянутых проблем, можно реализовать подход, основанный на создании поперечных связей внутри и межмолекулярных связей в молекуле полимера ГК. Это обстоятельство уменьшает скорость биодеградации, подразумевает увеличение времени его местонахождения в тканях и его планирование в зависимости от типа модификации. Данные производные могут быть получены с помощью различных реагентов, например, карбодиимидов [US 7879818, US 20070224277], производных дивинилсульфона [US 4582865, US 4605601, US 4636524, EP 0939086], замещенных оксиранов [US 4716224, US 4772419, US 4716154], 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира (БДДЭ) [WO 2013021249, US 4716224], многоатомных спиртов [US 4957744], органических альдегидов [US 4713448, US 5128326, US 4582865], бискарбодиимидов [US 5356883], полимеров карбоновых кислот [EP 0718312], карбонат-замещенного пиридина [EP 2408823], олиго- или полипептида [EP 2094736], производных азиридина [US 20050222081].
Таким образом, если линейная форма ГК используется для подкожных инъекций, то полезный эффект быстро проходит в определенный период времени. Модифицированная форма ГК, напротив, менее восприимчива к химическому и ферментативному гидролизу, показывает длительную устойчивость в естественных условиях, таким образом пролонгирует полезный эффект от применения [16]. Процессы модификации, особенно сшивки, значительно улучшают специфические механические свойства материала [16].
Однако стоит упомянуть, что в результате использования сшивающих агентов различной природы, существует необходимость их своевременной дезактивации, поскольку в результате деградации полимера они могут высвобождаться с сохранением токсичных свойств.
Полипропиленгликоль (ППГ) является нетоксичной, прозрачной и бесцветной жидкостью без запаха, которая широко используется в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности в качестве прямой и непрямой добавки. Жидкость имеет низкое давление пара и вязкость. Коммерческий полипропиленгликоль обычно получают из воды и пропиленоксида, полученных из органических и неорганических источников.
Управление по контролю за продуктами и лекарствами США присвоило полипропиленгликолю статус GRAS (общепризнанный как безопасный), поскольку он легко метаболизируется в организме человека в виде углеводов. В пищевой и фармацевтической индустрии ППГ используются уже более 50 лет. Инертное химическое вещество служит растворителем и стабилизатором, так как оно не реагирует и не изменяет ингредиенты конечного продукта.
Таким образом, разработка новых подходом к созданию биополимеров (гелей) на основе модифицированной ГК является актуальной и важной задачей.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является разработка нового эффективного способа получения биополимера на основе модифицированного пространственно-сшитого сополимера гиалуроната натрия, способствующего полноценной замене эндопротезируемой биологической жидкости с сохранением основных природных свойств, включая структурную и транспортную функции.
Техническим результатом настоящего изобретения является разработка нового эффективного способа получения биополимера на основе модифицированного сополимера гиалуроната натрия, способствующего наиболее полноценной замене эндопротезируемой биологической жидкости с сохранением основных природных свойств, включая структурную и транспортную функции. Указанный способ получения биополимера хорошо масштабируем, позволяет получать гипоаллергенный биополимер с высокой степенью чистоты и низким уровнем содержания эндотоксинов, то есть характеризующегося низкой токсичностью. Кроме того, указанный способ позволяет осуществлять регулировку создания поперечной сшивки с тем, чтобы получить биополимер с пространственной структурой, способный удерживать и/или высвобождать белки, то есть осуществлять депонирующую транспортную функцию. Биополимер, полученный заявленным способом, может найти широкое применение в медицине, в том числе хирургии и эндопротезировании, ортопедии, травматологии, офтальмологии, эстетической медицине.
Указанный технический результат достигается за счет осуществления способа получения биополимера на основе модифицированного сополимера гиалуроната натрия, включающий следующие стадии:
- создание поперечных ковалентных связей между остатками D-глюкуроновой кислоты и D-N-ацетилглюкозамина, входящих в состав гиалуроната натрия, посредством введения двух и более сшивающих агентов различных молекулярных масс, в различном соотношении в основной среде, каждый из которых представляет собой (полипропиленгликоль)диглицидиловый эфир;
- остановка стадии создания поперечных ковалентных связей и связывание свободных эпоксидных групп посредством добавления глицина.
В частных вариантах воплощения изобретения каждый сшивающий агент характеризуются молекулярную массу, имеющую значение в диапазоне от 500 до 8000 Да.
В частных вариантах воплощения изобретения мольное соотношение гиалуроната натрия и сшивающих агентов составляет 1:200 - 1:600. В более конкретных вариантах воплощения изобретения мольное соотношение гиалуроната натрия и сшивающих агентов составляет 1:400.
В частных вариантах воплощения изобретения после стадии добавления глицина реакционную смесь перемешивают при температуре 4-25°С и в течение 10-12 часов.
В частных вариантах воплощения изобретения полученную реакционную смесь после стадии остановки и связывания эпоксидных групп нейтрализуют до значения pH 7,0±0,5, подвергают диализу в проточной системе с физиологическим фосфатным буфером, где pH принимает значение 7,3±0,2.
6
6
В частных вариантах воплощения изобретения молекулярная масса гиалуроната натрия составляет от 1×10 Да до 2×10 Да.
В частных вариантах воплощения изобретения стадию создания поперечных ковалентных связей осуществляют в диапазоне температур от 0°С до 10°С.
В частных вариантах воплощения изобретения стадию создания поперечных ковалентных связей осуществляют в течение 18-22 часов.
В частных вариантах воплощения изобретения сшивающие агенты могут вводится одновременно, последовательно или через промежуток времени, в частности, промежуток времени составляет 3-5 часов.
В частных вариантах воплощения изобретения молярная масса получаемого биополимера не превышает 5000 кДа.
Настоящее изобретения также включает биополимер на основе модифицированного сополимера гиалуроната натрия, предназначенный для использования в качестве эндопротеза синовиальной жидкости и полученный способом по изобретению. В частных вариантах воплощения изобретения молярная масса биополимера не превышает 5000 кДа. В частных вариантах воплощения изобретения биополимер имеет степень сшивки 10±3%.
Подробное раскрытие настоящего изобретения
Краткое описание чертежей.
Фигура 1. Структурная формула мономерного звена молекулы гиалуронана.
Фигура 2. Структурная формула тетрамера молекулы гиалуроновой кислоты в водном окружении в растворе.
Фигура 3. Химическая схема модификации гиалуронана посредством ППГДЭ для двух молекулярных масс.
Фигура 4. Общая структурная формула сшивающего агента ППГДЭ.
Фигура 5. Взаимодействие свободной эпоксидной группы с глицином.
Фигура 6. Анализ цитотоксичности методом МТТ образца «Гируанана плюс» (HA) и образца биополимера (X1), полученного способом по изобретению. По оси Y указана безразмерная величина: индекс цитотоксичности (ЦИ), выражающегося в частном от деления количества клеток в опыте на количество клеток в контроле.
Фигура 7. Морфология клеток перитонеального экссудата (М1 и М2 соответствует популяция макрофагов, Ly - лимфоцитам):
(А) в контроле;
(Б) после в/б введения образца «Гируанана плюс» (HA);
(В) после в/б введения образца биополимера (Х1), полученного способом по изобретению.
Фигура 8. Депонирование НА (А) и Х1 (Б) в жировых клетках через 7 дней после подкожного введения. НА и Х1 мечены родамином В (красный), ядра окрашены синим. Шкала 37 мкм.
Фигура 9. Захват макрофагами перитонеальной полости образца НА (А) или Х1 (Б) через 7 дней после в/б введения филлеров. Макрофаги окрашены антителами с CD11b (зеленый), филлеры окрашены родамином В (красный), ядра окрашены синим. Шкала 5-6 мкм.
Фигура 10. Биораспределение образца НА (А-В) и Х1 (Д-З) через 10 дней после в/б введения 200 мкл образца с родамином В (красный). А, Д жировая ткань, шкала 17 мкм; Б, Е - почки, шкала 17 мкм (на врезке шкала 120 мкм); В, Ж - печень, шкала 30 мкм, З - печень, шкала 111 мкм; Г - печень, интактная мышь. Синим окрашены ядра клеток.
Фигура 11. Биодеградация образца НА (А) и Х1 (Б) клетками кожи человека (линия HaCaT) на 9 день культивирования сфероидов. Шкала 22 мкм. Сфероиды получены на антиадгезивной подложке.
Фигура 12. Биодеградация НА (А, В) и Х1 (Б, Г) в мышах линии A/Sn через 20 дней после введения внутрибрюшинно (А, Б) или в область жировой подушки №3 мыши. Шкала 45 мкм. Ядра окрашены Хехст (синий), мембраны клеток - фаллоидином (зеленый).
Фигура 13. Наличие флуоресцентного сигнала в области родамина (FL2) в спленоцитах мышей линии A/Sn через 20 дней после введения внутрибрюшинно (А, Б) или в область жировой подушки №3 (В, Г).
Определения и термины
Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые термины, использованные в настоящем описании изобретения.
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
В описании данного изобретения термин «расщепление или деполимеризация» относится к структурным изменениям биополимера (гиалуроната) из-за воздействия экологических, химических или термических факторов, которые влекут за собой уменьшение средней молекулярной массы биополимера, в том числе при автоклавировании, приводящем к изменению реологических свойств.
in vitro
В описании данного изобретения термин «деградация» относится к изменению физико-химических свойств, происходящему в результате действия температур, кислот, или щелочей, а также действию ферментов , в частности, гиулуронидазой. Деградация биополисахаридов, происходит в основном посредством расщепления гликозидных связей кислотно-каталитическим гидролизом.
in vivo
В описании данного изобретения термин «биодеградация» относится к изменению физико-химических свойств, происходящему в течение определенного времени, в результате воздействия факторов иммунной системы и ферментативной активности межтканевой и межклеточной среды, куда был помещен имплантат .
Термин «молекулярная масса (средний молекулярный вес)» - это средняя статистическая величина относительных молекулярных масс макромолекул, составляющих биополимер.
Термин «олигомер» в данном документе относится к молекуле в виде цепочки из небольшого количества одинаковых составных звеньев.
Термин «мономер» в данном документе относится к молекуле (дисахарид), элементарной структурной единице из которой состоит биополимер в результате ее выстраивания в цепочку с многократным повторением.
В описании данного изобретения термины «гиалуронан» относится к несульфатированному гликозаминогликану, который представляет собой линейный, неразветвленный полимер, построенный из повторяющегося дисахаридного фрагмента гиалуроновой кислоты, состоящей из D-глюкуронида-β-(1,3)-(N-ацетил)-глюкозамина и соединенной β (1-4) гликозидной связью.
3
5
2
3
2
n
3
5
(Полипропиленгликоль)диглицидиловый эфир - доступный и удобный в использовании, безопасный сшивающий агент, общая формула - CHO-OCH(CH)CH)-CHO (фиг. 4), где мономерами для дистанцирования цепей ГК являются молекулы полипропиленгликоля, с молярными массами от 500 до 800 0000 Да.
Осуществление изобретения
Streptococcus, Bacillus subtilis
Способ получении биополимера на основе модифицированного сополимера гиалуроната натрия согласно изобретению заключается в создании поперечных ковалентных простых эфирных связей между остатками D-глюкуроновой кислоты и D-N-ацетилглюкозамина, входящих в состав гиалуроната натрия, в результате введения двух и более сшивающих бифункциональных агентов - (полипропиленгликоль)диглицидиловых эфиров (ППГДЭ) с различными молярными массами и в разных пропорциях в основной среде (фиг. 3). Основным сырьем для процесса служит гиалуроновая кислота, ее натриевая соль может быть получена, в частности, методом биотехнологического синтеза на основе бактериальных штаммов (). После процесса химической сополимеризации полученную реакционную смесь нейтрализуют до показателя pH около 7, оставшиеся свободные эпоксидные группы дезактивируют глицином (фиг. 5), затем полученный биополимер подвергают проточному диализу, гомогенизируют и после розлива по стеклянным флаконам или шприцам предварительного заполнения, стерилизуют паром. Использование стадии дезактивация эпоксидных групп глицином позволяет получить безопасный продукт, характеризующийся низкой токсичностью. При этом в ходе стадии диализа остатки глицина удаляются.
6
6
Исходным сырьем для осуществления способа по изобретению служит фармакопейно чистый гиалуронат натрия с молекулярной массой в диапазоне от 1×10 Да до 2×10 Да. Затем гиалуронан растворяют в растворе гидроксида натрия, что является необходимым условием для реакции с ППГДЭ и уменьшения конечной вязкости раствора, что в свою очередь улучшает реологические свойства раствора и делает возможным его равномерное перемешивание и гомогенизацию.
Сшивающие агенты ППГДЭ по отдельности, или смесь в определенной пропорции добавляют к раствору гиалуроната натрия, реакцию ведут в интервале температур от 0°С до 10°С. Реакция на каждой стадии (в том числе на стадии растворения ГК, стадии сшивки (создания поперечных связей), стадии остановки реакции, нейтрализации и диализа) длится не более 24 ч.
1
13
1
1
1
13
Основной особенностью изобретения является возможность точно контролировать (в частности, посредством метода одномерной (H, C) и двумерной (H-H COSY, H-C HSQC) спектроскопии ЯМР, а также посредством спектров комбинационного светорассеяния) условия реакции полимеризации, что позволит получать производные гиалуронана, обладающими уникальными свойствами, пространственной структурой молекулярной сети, влияющей на белковое взаимодействие, а именно с возможностью контролировать обмен и высвобождение белков. Способ по изобретению позволяет точно изменять реологические свойства полученного биополимера для обеспечения выполнения природных функций, протезируемой биологической жидкости, в частности, как эндопротез синовиальной жидкости с сохранением свойств беспрепятственного проникновения в губчатую межклеточную структуру хряща для доставки питательных компонентов хондроцитам. Другими словами, способ согласно настоящему изобретению позволяет получить биополимер с определенным размером пор, которые обеспечивают транспорт белков. Таким образом, способ по изобретению позволяет получить биополимер, который характеризуется не только необходимыми реологическими свойствами, но и транспортными функциями аналогичными для биологических жидкостей, в частности синовиальной жидкости.
1
13
1
1
1
13
1
13
Скорость взаимодействия гиалуроновой кислоты и эпоксидных групп сшивающих агентов не является линейной характеристикой. Необходимый процент сшивки, в частности 10±3 %, согласно способу по изобретению контролировался посредством методов ЯМР, таких как: H-ЯМР, С-ЯМР, H-H COSY, H-CHSQC, H-CHMBC. Таким образом, способ по изобретению позволяет промышленно получать биополимер с воспроизводимыми физико-химическим характеристиками, с возможностью контроля структуру и количества свободных эпоксидных групп.
Основным преимуществом данного способа (двойной сшивки) является возможность получать близкие по реологическим свойствам к биологической жидкости человека биополимеры, при этом контролируя среднюю молекулярную массу полученных полимерных сшитых цепей. Например, при замене синовиальной жидкости на биополимер, полученный способом по изобретению, не происходит изменение локомоции сустава, куда был помещен эндопротез синовиальной жидкости, и нет препятствий для проникновения в межклеточное пространство, а именно в поры хрящевой ткани. В связи с чем нет прерывания питания хрящевой ткани при данного рода терапии.
Биополимер на основе модифицированного гиалуроната натрия по изобретению является биосовместимым, неиммуногенным, более устойчивым к ферментативному расщеплению, чем немодифицированный гиалуронан, что позволяет использовать его в различных областях общей медицины, в частности:
1) в ревматологии, ортопедии и травматологии в качестве средства для внутрисуставного введения пролонгированного действия при терапии остеоартрозов дегенеративно-дистрофического и постравматического генеза различной локализации (не только крупных суставов, а именно коленного и тазобедренного, но более мелких, таких как плечевой и локтевой суставы). При внутрисуставных инъекциях сшитых и линейных форм ГК обнаружено, что гиалуронан оказывает терапевтическое воздействие при остеоартрите. Несколько исследований были проведены для изучения эффектов, показывающих, что ГК способна подавлять дегенерация хряща, обеспечивать защиту мягких тканей поверхностей суставов, нормализует реологические свойства синовиальной жидкости и приводит к снижению болевого восприятия [20, 21, 18].
2) в офтальмологии в качестве активного ингредиента для увлажнения глаз, также биополимер по изобретению может быть использован при хирургическом лечении офтальмологических заболеваний, травм глаза, повреждений роговицы в качестве вископротектора, протектора клеток эндотелия при операциях;
3) в качестве депонирующего агента для инъекционной имплантации в пораженную ткань, или орган с последующим высвобождением биологически активных веществ и лекарственных средств: как малых молекул, так и терапевтических биополимеров, в частности, пептидной природы;
4) в эстетической медицине в качестве кожных наполнителей по безоперационному увеличению мягких тканей, в том числе для сглаживания морщин и увеличения объема мягких тканей, такие как губы и грудь.
5) в косметике в качестве увлажняющего компонента. Использование биополимера, полученного способом по изобретению, может способствовать увлажнению кожи и таким образом восстанавливать эластичность, уменьшая тем самым глубину морщин. Кроме того, указанный биополимер может стимулировать эпидермальные клетки к пролиферации и делению, а также способствовать защите коже человека от ультрафиолетового излучения.
6) применение при местной доставке лекарств.
Реализацию способа получения сополимера с межмолекулярной и внутримолекулярной сшитой структурой можно продемонстрировать на следующих примерах.
Пример 1.
3
3
В колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, объемом 50 мл поместили 25 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 1,3 г гиалуроната натрия. Смесь оставили перемешиваться в течение 3 ч при +20°С (160 об/мин). Затем к реакционной смеси добавили 1,5 мл ППГДЭ (M=1500 Да, ρ = 1,10 г/см) и 4,0 мл ППГДЭ (M=640 Да, ρ = 1,06 г/см). Реакцию проводили еще в течение 20 ч при перемешивании (160 об/мин, +4°С).
2
2
4
2
4
Реакцию остановили добавлением 0,2 г глицина, предварительно растворенного в 1 мл ddHO (стерильная ультрачистая вода) и оставляли перемешиваться в течение 10 ч при +4°С (30 об/мин). Полученный биополимер нейтрализовали раствором 1 М соляной кислоты до рН 7,0, затем перенесли в диализный мешок (Viking, 12 кДа). Биополимер диализовали, меняя 4 раза физиологический фосфатный буфер (PBS, 1 л, 2 мМ NaHPO/NaHPO, 145,5 мМ NaCl, pH 7,2±0,2). Полученный продукт довели необходимым количеством буфера до концентрации 20 мг/мл. Полученный биополимер перемешивали посредством верхнеприводной мешалки еще в течение 2 ч при 30 об/мин для его полной гомогенизации при температуре +4°С.
Пример 2.
3
3
В колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, объемом 50 мл поместили 25 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 2 г гиалуроната натрия. Смесь оставили перемешиваться в течение 3 ч при +10°С (160 об/мин). Затем к реакционной смеси добавили 1,0 мл ППГДЭ (M=1500 Да, ρ = 1,10 г/см) и 4,0 мл ППГДЭ (M=640 Да, ρ = 1,06 г/см). Реакцию проводили еще в течение 24 ч при перемешивании (160 об/мин, +10°С).
2
2
4
2
4
Реакцию остановили добавлением 0,4 г глицина, предварительно растворенного в 1 мл ddHO и оставляли перемешиваться в течение 12 ч при +4°С (30 об/мин). Полученный биополимер нейтрализовали раствором 1 М соляной кислоты до рН 7,0, затем перенесли в диализный мешок (Viking, 12 кДа). Биополимер диализовали, меняя 4 раза физиологический фосфатный буфер (PBS, 1л, 2 мМ NaHPO/NaHPO, 145,5 мМ NaCl, pH 7,2±0,2). Полученный продукт довели необходимым количеством буфера до концентрации 30 мг/мл. Полученный биополимер перемешивали посредством верхнеприводной мешалки еще в течение 2 ч при 30 об/мин для его полной гомогенизации при температуре +4°С.
Пример 3.
3
3
В колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, объемом 50 мл поместили 25 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 0,9 г гиалуроната натрия. Смесь оставили перемешиваться в течение 3 ч при +20°С (160 об/мин). Затем к реакционной смеси добавили 2,0 мл ППГДЭ (M=1500 Да, ρ = 1,10 г/см) и 4,0 мл ППГДЭ (M=640 Да, ρ = 1,06 г/см). Реакцию проводили еще в течение 18 ч при перемешивании (160 об/мин, +10°С).
2
2
4
2
4
Реакцию остановили добавлением 0,2 г глицина, предварительно растворенного в 1 мл ddHO и оставляли перемешиваться в течение 10 ч при +4°С (30 об/мин). Полученный биополимер нейтрализовали раствором 1 М соляной кислоты до рН 7,0, затем перенесли в диализный мешок (Viking, 12 кДа). Биополимер диализовали, меняя 4 раза физиологический фосфатный буфер (PBS, 1л, 2 мМ NaHPO/NaHPO, 145,5 мМ NaCl, pH 7,2±0,2). Полученный продукт довели необходимым количеством буфера до концентрации 15 мг/мл. Полученный Биополимер перемешивали посредством верхнеприводной мешалки еще в течение 2 ч при 30 об/мин для его полной гомогенизации при температуре +4°С.
Пример 4.
3
3
В колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, объемом 50 мл поместили 25 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 1,4 г гиалуроната натрия. Смесь оставили перемешиваться в течение 3 ч при +20°С (160 об/мин). Затем к реакционной смеси добавили 3,0 мл ППГДЭ (M=1500 Да, ρ = 1,10 г/см) и 4,0 мл ППГДЭ (M=640 Да, ρ = 1,06 г/см). Реакцию проводили еще в течение 18 ч при перемешивании (160 об/мин, +4°С).
2
2
4
2
4
Реакцию остановили добавлением 0,2 г глицина, предварительно растворенного в 1 мл ddHO и оставляли перемешиваться в течение 10 ч при +4°С (30 об/мин). Полученный биополимер нейтрализовали раствором 1 М соляной кислоты до рН 7,0, затем перенесли в диализный мешок (Viking, 12 кДа). Биополимер диализовали, меняя 4 раза физиологический фосфатный буфер (PBS, 1л, 2 мМ NaHPO/NaHPO, 145,5 мМ NaCl, pH 7,2±0,2). Полученный продукт довели необходимым количеством буфера до концентрации 20 мг/мл. Полученный биополимер перемешивали посредством верхнеприводной мешалки еще в течение 2 ч при 30 об/мин для его полной гомогенизации при температуре +4°С.
Пример 5.
3
3
В колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, объемом 50 мл поместили 25 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 1,4 г гиалуроната натрия. Смесь оставили перемешиваться в течение 3 ч при +20°С (160 об/мин). Затем к реакционной смеси добавили 0,2 мл ППГДЭ (M=1500 Да, ρ = 1,10 г/см) и 4,0 мл ППГДЭ (M=640 Да, ρ = 1,06 г/см). Реакцию проводили еще в течение 18 ч при перемешивании (160 об/мин, +4°С).
2
2
4
2
4
Реакцию остановили добавлением 0,2 г глицина, предварительно растворенного в 1 мл ddHO и оставляли перемешиваться в течение 10 ч при +4°С (30 об/мин). Полученный биополимер нейтрализовали раствором 1 М соляной кислоты до рН 7,0, затем перенесли в диализный мешок (Viking, 12 кДа). Биополимер диализовали, меняя 4 раза физиологический фосфатный буфер (PBS, 1л, 2 мМ NaHPO/NaHPO, 145,5 мМ NaCl, pH 7,2±0,2). Полученный продукт довели необходимым количеством буфера до концентрации 20 мг/мл. Полученный биополимер перемешивали посредством верхнеприводной мешалки еще в течение 2 ч при 30 об/мин для его полной гомогенизации при температуре +4°С.
Пример 6.
3
3
В колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, объемом 50 мл поместили 12,5 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 0,65 г гиалуроната натрия. Смесь оставили перемешиваться в течение 3 ч при +20°С (160 об/мин). Затем к реакционной смеси добавили 1,5 мл ППГДЭ (M=1500 Да, ρ = 1,10 г/см), реакцию проводили в течение 6 ч при перемешивании. Далее дополнительно в реакционный объем поместили смесь 12,5 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 0,65 г гиалуроната натрия, оставили перемешиваться в течение часа (160 об/мин, +4°С). Затем добавили 4,0 мл ППГДЭ (M=640 Да, ρ = 1,06 г/см). Реакцию проводили еще в течение 20 ч при перемешивании (160 об/мин, +4°С).
2
2
4
2
4
Реакцию остановили добавлением 0,2 г глицина, предварительно растворенного в 1 мл ddHO и оставляли перемешиваться в течение 10 ч при +4°С (30 об/мин). Полученный биополимер нейтрализовали раствором 1 М соляной кислоты до рН 7,0, затем перенесли в диализный мешок (Viking, 12 кДа). Биополимер диализовали, меняя 4 раза физиологический фосфатный буфер (PBS, 1л, 2 мМ NaHPO/NaHPO, 145,5 мМ NaCl, pH 7,2±0,2). Полученный продукт довели необходимым количеством буфера до концентрации 20 мг/мл. Полученный биополимер перемешивали посредством верхнеприводной мешалки еще в течение 2 ч при 30 об/мин для его полной гомогенизации при температуре +4°С.
Пример 7.
3
3
В колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, объемом 50 мл поместили 12,5 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 1,00 г гиалуроната натрия. Смесь оставили перемешиваться в течение 3 ч при +20°С (160 об/мин). Затем к реакционной смеси добавили 1,5 мл ППГДЭ (M=1500 Да, ρ = 1,10 г/см), реакцию проводили в течение 6 ч при перемешивании. Далее дополнительно в реакционный объем поместили смесь 12,5 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 0,40 г гиалуроната натрия, оставили перемешиваться в течение часа (160 об/мин, +4°С). Затем добавили 4,0 мл ППГДЭ (M=640 Да, ρ = 1,06 г/см). Реакцию проводили еще в течение 20 ч при перемешивании (160 об/мин, +4°С).
2
2
4
2
4
Реакцию остановили добавлением 0,2 г глицина, предварительно растворенного в 1 мл ddHO и оставляли перемешиваться в течение 10 ч при +4°С (30 об/мин). Полученный биополимер нейтрализовали раствором 1 М соляной кислоты до рН 7,0, затем перенесли в диализный мешок (Viking, 12 кДа). Биополимер диализовали, меняя 4 раза физиологический фосфатный буфер (PBS, 1л, 2 мМ NaHPO/NaHPO, 145,5 мМ NaCl, pH 7,2±0,2). Полученный продукт довели необходимым количеством буфера до концентрации 20 мг/мл. Полученный биополимер перемешивали посредством верхнеприводной мешалки еще в течение 2 ч при 30 об/мин для его полной гомогенизации при температуре +4°С.
Пример 8.
3
3
В колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, объемом 50 мл поместили 12,5 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 0,65 г гиалуроната натрия. Смесь оставили перемешиваться в течение 3 ч при +20°С (160 об/мин). Затем к реакционной смеси добавили 3,0 мл ППГДЭ (M=1500 Да, ρ = 1,10 г/см), реакцию проводили в течение 6 ч при перемешивании. Далее дополнительно в реакционный объем поместили смесь 12,5 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 0,65 г гиалуроната натрия, оставили перемешиваться в течение часа (160 об/мин, +4°С). Затем добавили 4,0 мл ППГДЭ (M=640 Да, ρ = 1,06 г/см). Реакцию проводили еще в течение 20 ч при перемешивании (160 об/мин, +4°С).
2
2
4
2
4
Реакцию остановили добавлением 0,2 г глицина, предварительно растворенного в 1 мл ddHO и оставляли перемешиваться в течение 10 ч при +10°С (30 об/мин). Полученный биополимер нейтрализовали раствором 1 М соляной кислоты до рН 7,0, затем перенесли в диализный мешок (Viking, 12 кДа). Биополимер диализовали, меняя 4 раза физиологический фосфатный буфер (PBS, 1л, 2 мМ NaHPO/NaHPO, 145,5 мМ NaCl, pH 7,2±0,2). Полученный продукт довели необходимым количеством буфера до концентрации 20 мг/мл. Полученный биополимер перемешивали посредством верхнеприводной мешалки еще в течение 2 ч при 30 об/мин для его полной гомогенизации при температуре +5°С.
Пример 9.
3
3
В колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, объемом 50 мл поместили 25 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 0,9 г гиалуроната натрия. Смесь оставили перемешиваться в течение 4 ч при +10°С (160 об/мин). Затем к реакционной смеси добавили 4,0 мл ППГДЭ (M=1500 Да, ρ = 1,10 г/см) и 2,5 мл ППГДЭ (M=640 Да, ρ = 1,06 г/см). Реакцию проводили еще в течение 24 ч при перемешивании (160 об/мин, +10°С).
2
2
4
2
4
Реакцию остановили добавлением 0,2 г глицина, предварительно растворенного в 1 мл ddHO и оставляли перемешиваться в течение 10 ч при +4°С (30 об/мин). Полученный биополимер нейтрализовали раствором 1 М соляной кислоты до рН 7,0, затем перенесли в диализный мешок (Viking, 12 кДа). Биополимер диализовали, меняя 4 раза физиологический фосфатный буфер (PBS, 1л, 2 мМ NaHPO/NaHPO, 145,5 мМ NaCl, pH 7,2±0,2). Полученный продукт довели необходимым количеством буфера до концентрации 15 мг/мл. Полученный биополимер перемешивали посредством верхнеприводной мешалки еще в течение 2 ч при 30 об/мин для его полной гомогенизации при температуре +4°С.
Пример 10.
3
3
В колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой, объемом 50 мл поместили 25 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия и 1,95 г гиалуроната натрия. Смесь оставили перемешиваться в течение 3 ч при +20°С (160 об/мин). Затем к реакционной смеси добавили 1,0 мл ППГДЭ (M=1500 Да, ρ = 1,10 г/см) и 4,5 мл ППГДЭ (M=640 Да, ρ = 1,06 г/см). Реакцию проводили еще в течение 24 ч при перемешивании (160 об/мин, +4°С).
2
2
4
2
4
Реакцию остановили добавлением 0,2 г глицина, предварительно растворенного в 1 мл ddHO и оставляли перемешиваться в течение 12 ч при +4° С (30 об/мин). Полученный биополимер нейтрализовали раствором 1 М соляной кислоты до рН 7,0, затем перенесли в диализный мешок (Viking, 12 кДа). Биополимер диализовали, меняя 4 раза физиологический фосфатный буфер (PBS, 1л, 2 мМ NaHPO/NaHPO, 145,5 мМ NaCl, pH 7,2±0,2). Полученный продукт довели необходимым количеством буфера до концентрации 30 мг/мл. Полученный биополимер перемешивали посредством верхнеприводной мешалки еще в течение 2 ч при 30 об/мин для его полной гомогенизации при температуре +4ºС.
Исследования токсичности биополимера по изобретению
Одной из основных проблем с использованием диглициловых эфиров в создании поперечных связей в ГК является наличие оксирановых групп, оставшихся после технологического цикла приготовления биополимера. В настоящем изобретении предлагается введение дополнительной стадии, включающей в себя обработку реакционной массы сшитого биополимера раствором глицина, данный этап позволяет остановить реакцию полимеризации в короткие сроки и дополнительно решить вопрос свободных эпоксидных групп, обуславливающих токсичность получаемого биополимера, поскольку в результате изомеризации оксирановые группы изомеризуются с образованием альдегида, что и определяет токсичность биополимера. В результате глицин, как нуклеофильный агент, присоединяется и блокирует эпоксидную группу. Используя данную технологию полученный сшитый биополимер не обладает токсическим действием.
Были проведены испытания на токсичность в сравнении с аналогом эндопротеза синовиальной жидкости, содержащим только раствор ГК без сшивки, «Гируан плюс». Также результатом испытаний стало описание влияния препарата на иммунную систему мыши и предоставление данных с показателями изменения маркерных клеток, воспалительных реакциях, депонирующего эффекта препарата и предположение путей выведения.
В данном эксперименте исследовали токсичность и биораспределение имплантата «Гируан плюс» (HA) - препарат, содержащий ГК без химической модификации в концентрации 10 мг/мл, фосфатно-физиологический буфер, а также препарата эндопротеза синовиальной жидкости ESL-HA-PPEGDE-1 (X1) - препарат, приготовленный согласно способу по изобретению, представляющий собой раствор 10 мг/мл сшитого биополимера (получен согласно примеру 2 настоящего документа), фосфатно-физиологический буфер.
Вязкостные свойства.
Оба препарата вязкие, прозрачные, полностью растворимы в воде, в виде равномерных капель проходят через иглу 30Gx1/2''.
Токсичность
.
in vitro
Для оценки токсичности препараты разводили в 8 раз и оценивали методом МТТ на линии клеток карциномы поджелудочной железы Т3М4. Результаты эксперимента показали, что оба препарата низкотоксичны (фиг.6).
Токсичность
.
in vivo
in vivo
Токсичность  оценивали на мышах линии A/Sn. Филлеры вводили мышам внутрибрюшинно иглой 30G в объемах 50, 100, 150 и 200 мкл на мышь. Мышей выводили из эксперимента через 7, 8 и 10 дней. Забирали перитонеальный экссудат и селезенки. Оценивали количество и субпопуляционный состав клеток в экссудате и селезенках. Для сравнения использовали интактную мышь. Результаты исследований показали, что количество клеток и субпопуляционный состав в брюшной полости находится в пределах нормы (фиг.7, Таблица 1).
Таблица 1. Субпопуляционный состав перитонеального экссудата на 7 сутки после в/б введения препарата «Гируан плюс» (HA) или препарата по изобретению (Х1).
Контроль
HA
HA
X1
X1
Норма
Объем геля, включающего биополимер, мкл
0
200
50
200
50
0
Количество, млн
2
1.5
1.5
1
1.5
1-3
Макрофаги M1, %
19
31
29
47
18
15-50
Макрофаги M2, %
8
8
10
10
11
5-15
Лимфоциты, %
61
47
47
44
53
50-75
Анализ количества и субпопуляционного состава селезенки показал незначительные изменения, также находящиеся в пределах нормы (Таблица 2). Наблюдается снижение отношения CD4/CD8, однако это также в пределах нормы. Различий между образцами HA и X1 не выявили.
Таблица 2. Субпопуляционный состав селезенки на 7 сутки после внутрибрюшинного введения препарата «Гируан плюс» (HA) или препарата по изобретению (Х1).
Контроль
HA
HA
X1
X1
Р
Объем геля, включающего биополимер, мкл
200
50
200
50
Количество, млн
72
68
62
58
80
>0.05
CD4
14
12
13
12
13
>0.05
CD8
9
10
12
10
16
>0.05
CD4/CD8
1.6
1.2
1.1
1.2
0.8
>0.05
CD19
55
56
56
50
47
>0.05
CD62L<sup>high</sup>/CD44<sup>low</sup>
71
72
72
63
68
>0.05
CD62L<sup> low</sup>/CD44<sup>high</sup>
12
12
11
14
13
>0.05
Биораспределение препаратов эндопротеза синовиальной жидкости (ЭСЖ).
В ходе проведения данного эксперимента изучали биораспределение препаратов эндопротеза синовиальной жидкости при подкожном и внутрибрюшинном введении геля с включением флуоресцентной метки родамина В. Мышам вводили филлеры подкожно (п/к) в объеме 50 мкл под лапу №3 или внутрибрюшинно (в/б) в объеме 200 мкл. Мышей выводили из эксперимента через 8 и 10 дней. В месте инъекции (п/к или в/б) свободный гель не обнаруживался. Забирали печень, селезенку, почки, мышцы и жировую ткань. Результаты проведенных экспериментов показали, что основным депо являются жировые клетки (фиг.8). При в/б введении часть геля уносится макрофагами в региональные лимфоузлы (фиг. 9) и селезенку, откуда гель попадает в печень и почки (фиг.10). Остатки выводятся через мочу (почки) и кал (печень) (Таблица 3). Различий по биораспределению между образцами HA и X1 не выявили.
Биоразложение эндопротеза синовиальной жидкости (ЭСЖ).
in vitro
Биоразложение эндопротеза синовиальной жидкости изучали в 3D культуре  на клетках линии кератиноцитов человека HaCaT. Результат проведенных исследований показал, что образцы захватываются клетками и сохраняются в них не менее 10 дней без значительного гидролиза (фиг. 11).
Биодеградация эндопротеза синовиальной жидкости (ЭСЖ)
:
in vivo
Часть мышей выводили из эксперимента через 20 дней, забирали жировую ткань из места инъекций (брюшной полости и в области подкожного введения). Анализ жировой ткани осуществляли с помощью гистологии. Результаты проведенных исследований показали, что через 20 дней в брюшной полости и в области подкожного введения образцов частично гидролизуются, но достоверно детектируются (фиг. 12).
Таблица 3. Анализ биораспределения препарата «Гируан плюс» (HA) и препарата по изобретению (Х1) на 7-10 день после введения подкожно под лапу №3 (sc) или внутрибрюшинно (ip).
Время забора
7 дней
8 дней
10 дней
Введение
sc
sc
sc
sc
ip
ip
ip
ip
Филлер
HA
HA
X1
X1
HA
Х1
HA
X1
Объем геля, включающего биополимер, мл
50*
200
50
200
50
200
50
200
Печень
50
155
58
60
70
67
70
24
Почки
23
116
13
28
5
51
82
29
Моча
nd
504
nd
392
59
80
57
50
ЖКТ
0
0
0
0
0
0
0
0
Легкие
0
0
0
0
0
0
0
0
Желчь
0
0
0
0
0
0
0
0
Селезенка
0
0
0
0
0
0
0
0
Кровь
0
0
0
0
0
0
0
0
*Органы гомогенизировали в физрастворе, добавляли равный объем 70% этилового спирта, экстрагировали родамин В в течение 12 часов, центрифугировали при 15 тыс об/мин 20 мин, осветленные надосадки переносили в планшеты и измеряли флуоресценцию на ридере при длине волны 525 нм. Приведены данные по средней интенсивности флюоресценции (MFI) за вычетом контроля для интактной мыши. Данные не нормированы на вес органов.
Гидролиз в тканях ассоциирован с захватом дебриса макрофагами, его гидролизом и частичным транспортом его в селезенку (фиг. 13) и в печень. Различий по гидролизу и транспорту образцов не было.
Таким образом, проведенные исследования показали, что препараты «Гируан плюс» (HA) и препарат по изобретению ESL-HA-PPEGDE-1 (X1) не отличаются по токсичности, биораспределению и биоразложению, путям выведения полупродуктов и продуктов биораспада. Как следствие можно сделать вывод о том, что способ согласно данному изобретению позволяет получить такой же низкотоксичный биополимер на основе модифицированного сополимера гиалуроната натрия, как и сам гиалуронат.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.
Список литературы, которая включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылок:
1. Balazs E.A. and Gibbs D.A. The rheological properties and biological function of hyaluronic acid // Chem Mol Biol Intercell Matrix. - 1970. - Vol. 3. - P. 1241-1245.
2. Balazs E.A., Leshchiner E., Larsen N.E. and Band P. Applications of hyaluronan and its derivates / Gebelein CG (ed) Biotechnological polymers. Technomic, Lancaster. - 1993. - P. 41-65.
3. De Angelis P.L. Hyaluronan synthases: fascinating glycosyltransferases from vertebrates, bacterial pathogens, and algal viruses // Cell. Mol. Life. Sci. - 1999. - Vol. 56. - P. 670-682.
4. Volpi N. and Maccari F. Purification and characterization of hyaluronic acid from the mollusc bivalve Mytilus galloprovincialis // Biochimie. - 2003. - Vol. 85. - P. 619-625.
5. O'Regan M., Martini I., Crescenzi F., De Luca C., Lansing M. Molecular mechanisms and genetics of hyaluronan biosynthesis // Int. J. Biol. Macromol. - 1994. - Vol. 16. - No. 6. - P. 283-286.
6. Toole B.P. Hyaluronan in morphogenesis // J. Intern. Med. - 1997. - Vol. 242. - No. 1. - P. 35-40.
7. Marcellin E., Chen W., Nielsen L.K. Microbial hyaluronic caid biosynthesis in Microbial production of biopolymers and polymers precursors application and perspectives // Caisters academic press. - 2009. - Vol. 7. - P. 163-179.
8. Bettelheim F.A. and Popdimirova N. Hyaluronic acid-synergetic glycosaminoglycan // Curr. Eye. Res. - 1992. - Vol. 11. - P. 411-419.
9. Goldberg R.L. and Toole B.P. Hyaluronate inhibition of cell proliferation // Arthritis Rheum. - 1987. - Vol. 30. - P. 769-778.
10. Alho A.M. and Underhill C.B. The hyaluronate receptor is referentially expressed on proliferating epithelial cells // J. Cell. Biol. - 1989. - Vol. 108. - P. 1557-1565.
11. Stern R. Hyaluronan metabolism: a major paradox in cancer biology // Pathol. Biol. - 2005. - Vol. 53. - No. 7. - P. 372-382.
12. Heldin P. Importance of hyaluronan biosynthesis and degradation in cell differentiation and tumour formation // Braz. J. Med. Biol. Res. - 2003. - Vol. 36. - No. 8. - P. 967-973.
13. Scott J.E. Secondary structures in hyaluronan solutions: chemical and biological implications. The biology of hyaluronan // Ciba Found. Symp. - 1989. - Vol. 143. - P. 6-15.
14. Хабаров В.Н., Бойков П.Я., Селянин М.А. Гиалуроновая кислота: получение, свойства, применение в биологии и медицине. - М., Практическая медицина, 2012. - 224 с.
15. Lapcik L., Lapcik L. Hyaluronan: preparation, structure, properties and applications // Chem. Rev. - 1998. - Vol. 98. - No. 8. - P. 2663-2684.
16. Brown M.B., Jones S.A. Hyaluronic acid: a unique topical vehicle for the localized delivery of drugs to the skin // J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. - 2005. - Vol. 19. - No. 3. - P. 308-18.
P. Streptococcus
17. Белодед А.В. Микробиологический синтез и деградация гиалуроновой кислоты бактериями : дис. канд. биол. наук. - М., 2008. - С. 174.
18. Girish K.S., Kemparaju K. The magic glue hyaluronan and its eraser hyaluronidases: a biological review. Life Sciences. - 2007. - Vol. 80. - P. 1921-1943.
19. Lolvmcin A.M., Peppcis N.A. Molecular analysis of interpolymer complexation in graft copolymer networks // Polymer. - 2000. - Vol.41. - No. 1. - P. 73-80.
20. Altman R.D. Intra-articular sodium hyaluronate in the osteoarthritis of the knee // Semin. Arthritis. Rheum. - 2000. - Vol.41. - No. 30. - P. 11-18.
21. Uthman I., Raynauld J.P., Haraoui B. Intra-articular therapy of osteoarthritis // J. Postgrad. Med. - 2003. - Vol.41. - No. 79. - P. 449-453.