СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЭСТРОГЕНЗАВИСИМЫХ ОПУХОЛЕЙ
AGENT FOR TREATING OESTROGEN-DEPENDENT CANCER

Изобретение относится к медицине и касается средства для лечения эстрогензависимых опухолей.
Секоизоларицирезинол относится к природным полифенолам класса лигнанов, широко известных в качестве фитоэстрогенов - агентов, способных воздействовать на эстрогеновый рецептор (ER) клеток. Лигнаны обнаружены в самых разнообразных растениях [1], включая большинство съедобных, в которых они биосинтезируются по фенилпропаноидному пути, определяющего и биосинтез растительного полимера лигнина [2]. Особенно много лигнанов обнаружено в семенах льна, сезама и тыквы, а также в некоторых орехах. В последнее время проведены исследования, показавшие большое содержание лигнанов самого разнообразного строения в сучковых зонах хвойных деревьев [3, 4].
Фитоэстрогенами (ФЭ) названы соединения, которые имеют структурное сходство с 17β-эстрадиолом (Е2), природным лигандом эстрагеновых рецепторов (ERα и ERβ [5, 6]) на поверхности клеточной мембраны, и способные связываться с указанными рецепторами, проявляя при этом эстрогенное действие. Эстрогенную активность способны проявлять различные типы природных соединений, наиболее изученными из которых являются три класса фитоэстрогенов: изофлавоноиды, лигнаны и в меньшей степени куместраны. Изофлавоноиды присутствуют в большом количестве в соевых бобах и продуктах на основе переработки сои. Наиболее хорошо охарактеризованными изофлавоноидами являются генистеин и дайдзеин, воздействие этих соединений на человека происходит в основном через потребление соевых продуктов.
Изофлавоноиды также присутствуют в ягодах, зернах и орехах, даже в вине, но все же их наибольшее содержание - в сое и других бобовых [7]. Необходимо также отметить, что изофлавоноиды содержатся в сое и других их источниках в виде биологически мало активных производных - гликозидов, простых эфиров, сложных эфиров и других. Высвобождение из них активных несвязанных форм изофлавоноидов происходит при переваривании пищи, а в некоторых случаях и при ферментативной обработке при ее приготовлении, например, в случае таких соевых продуктов, как мисо или темпе. Отметим, что высвобождение изофлавоноидов при переваривании соевых продуктов эффективно происходит под воздействием специальных видов кишечной микрофлоры, носителями которой являются только 30-50% людей [8, 9].
Природные органические соединения класса лигнанов широко представлены в растениях и их плодах, где они формируют элементы клеточных стенок. Наиболее известными лигнанами являются секоизоларицирезинол, 7-гидроксиматаирезинол, матаирезинол, пинорезинол, ларицирезинол и другие соединения [10]. Лигнаны более распространены в различных растительных продуктах, чем изофлавоноиды. Наиболее известным их источником является льняное семя, которое содержит лигнаны в достаточно высоких концентрациях, но в виде глюкозилированных производных. Другими природными источниками лигнанов и их производных являются ягоды, орехи, фрукты, хлеб и овощи.
Экспериментальные исследования показали, что ФЭ могут играть существенную роль в торможении инициации и развития рака молочной железы и рака предстательной железы, а также в ряде других патологических состояний. Постулируется, что антиканцерогенные свойства обусловлены антиэстрогеной активностью ФЭ, в особенности, их способностью связываются с эстрогеновыми рецепторами (ER), при этом они вызывают незначительный ответ по сравнению с эндогенными эстрогенами. Кроме того, ФЭ способны вызвать эстроген-независимые противоопухолевые эффекты, такие как подавление ангиогенеза, индукция апоптоза, ингибирование ароматазы, также проявляют высокую антиоксидантную активность [11-14]. Нативные растительные лигнаны очень слабо связываются с ER, но продукты их метаболизма, особенно энтеролактон (ENL) обладают способностью ингибировать взаимодействие ER и его лиганда 17-β-эстрадиола [15]. ФЭ могут подавлять и экспрессию фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и другие факторы роста [16].
Эпидемиологические исследования влияния потребление лигнанов на риск развития рака молочной железы показали защитный эффект данной группы ФЭ, особенно у женщин в пременопаузе [17, 18]. Исследование [19] показало, что потребление суммы лигнанов (матаирезинол, секоизоларицирезинол, ларицирезинол, пинорезинол и других) приводит к снижению риска рака предстательной железы на 15%.
Фитоэстрогены (ФЭ) приняты за базовый объект данного изобретения.
Ранее был предложен метод выделения ФЭ (-)-секоизоларицирезинола (ФЭС, структура показана на Рис.1) из сучковых зон древесины лиственницы и пихты [20]. Проведенные исследования in vitro на культуре гормонзависимых клеток рака молочной железы человека MCF-7 [21] показали перспективность данного соединения для лечения эстрогензависимых опухолей в форме недозированного порошка (рассыпки).
Указанное средство принято в качестве прототипа (П). Оно имеет следующие недостатки:
1. Неудобство употребления - необходимую дозу (1,2 г) отвешенную вручную, помещают в стакан с крахмальным киселем (около 100 г), перемешивают и принимают в один прием.
2. Невозможность приема большого объема порошка в сухом виде. Очень горький вкус, происходит залипание порошка в глотке, пищеводе при залипании его водой. Это приводит к тошноте и рвоте у больного.
3. Невозможность автоматического дозирования. Порошок имеет очень плохую сыпучесть, слипается, электризуется, что не позволяет его дозировать ни на одной имеющейся автоматической линии.
Целью изобретения является устранение описанных недостатков и создание лекарственной формы, противоопухолевая активность которой повышает активность прототипа.
Поставленная цель достигается тем, что средство на основе ФЭС для лечения эстрогензависимых опухолей, дополнительно содержит в составе крахмал, тальк и стеарат магния.
Состав:
(-)-Секоизоларицирезинол - (96,66-96,77) мас.%
Крахмал - (2,85-2,95) мас.%
Тальк - (0,285-0,295) мас.%
Стеарат магния - (0,092-0,101) мас.%
Крахмал используется в качестве разрыхлителя, т.е. способствует распадаемости гранул. Тальк и стеарат кальция позволяют избежать залипания смеси на оборудовании, что позволяет точно дозировать препарат. Применяемые в заявляемом средстве дополнительные вещества разрешены в медицинской практике и выпускаются отечественной промышленностью [22].
Для иллюстрации приведен Рис.1, на котором показано строение природного лигнана (-)-секоизоларицирезинола.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами:
Пример 1.
(-)-Секоизоларицирезинол - 95,00 мг (96,77%)
Крахмал - 2,80 мг (2,85%)
Тальк - 0,28 мг (0,285%)
Стеарат магния - 0,09 мг (0,092%)
(здесь и далее везде указаны массовые проценты).
Пример 2.
(-)-Секоизоларицирезинол - 100,00 мг (96,71%)
Крахмал - 3,00 мг (2,9%)
Тальк - 0,30 мг (0,29%)
Стеарат магния - 0,10 мг (0,097%)
Пример 3.
(-)-Секоизоларицирезинол - 105,00 мг (96,66%)
Крахмал - 3,20 мг (2,95%)
Тальк - 0,32 мг (0,295%)
Стеарат магния - 0,11 мг (0,101%)
Заявляемое средство представляет собой гранулы в желатиновых капсулах.
1
57
6
Определена биологическая активность заявляемого средства по сравнению с прототипом. Биологические исследования проводились на мышах-самках гибридах BDF и мышах-самках линии CBl массой тела 20-21 грамм (доноры опухолевого материала). Перед опытом мышей ранжировали по группам (n=15-16). Одну группу мышей с опухолью оставляли без специфического воздействия и считали контрольной (n=16). Основные группы (n=15) получали лечение прототипом (П), другие заявляемым средством (ЗС).
Опухолевая модель
57
6
Использован штамм аденокарциномы молочной железы Са755 - неметастазирующей опухоли, которая обладает гормональной зависимостью (<20 Фмолей РЭ на клетку) [23]. Уровень РЭ определяет поддержание и длительное пассирование опухоли только на самках. После размораживания содержимое ампулы имплантировали 2-м мышам-самкам линии CBL (доноры). После верификации стандартных характеристик роста опухоли навтором пассаже опухоль от доноров извлекали и использовали для приготовления прививочного материала. Инокулят готовили ex tempore в питательной среде 199 и трансплантировали мышам-гибридам самкам BDF1 под кожу бока по 50 мг опухолевой ткани в 0,5 мл 10% взвеси. Все исследования выполнены в соответствии с рекомендованной методикой [24]. В опытах использован 3-й пассаж in vivo.
Проведение лечения. Дозы (-)-секоизоларицирезинола рассчитаны индивидуально на мышь. Основные группы получали П или ЗС перорально (р/о) ежедневно в течение 5 или 10 дней в разовой дозе 250 мг/кг в 1%-ном растворе крахмального клейстера. Мыши контрольной группы получали перорально 1%-ный раствор крахмального клейстера в режиме ежедневного введения в течение 5 или 10 дней. Взвесь с ЗС вводили мышам в желудок в соответствующих индивидуальным дозам объемах каждой мыши с помощью металлического зонда один раз в сутки. Лечение проводили на 3-7 сутки после перевивки опухоли.
а
Оценка эффективности лечения. После окончания лечения у всех мышей троекратно каждые 5 дней измеряли объемы опухолей, на каждый срок рассчитывали средний объем по формуле Vcp=×b×с и общепринятый показатель торможения роста опухоли ТРО, %=(Vo-Vk)/(Vk)×100, где Vo и Vk величина Vcp в опыте и в контроле, соответственно. В качестве минимального критерия эффективности использовали скрининговый показатель ТРО≥50% длительностью не менее недели.
Таблица.
Результаты биоконтроля ЗС на аденокарциноме молочной железы Са755
Группа
Разовая доза*
Средний объем опухоли на сутки после трансплантации опухоли
ТРО % на сутки после окончания лечения
12
17
22
1
6
11
Контроль
0,3 мл
1518 [988÷2048]
4091 [3018÷5164]
8196 [5934÷10458]
-
-
-
П
250 мг/кг
410 [236÷584]
942 [509÷1375]
4262 [2427÷6097]
73**
48**
ЗС
250 мг/кг
308 [152÷464]
729 [66÷1392]
2042 [875÷3208]
80**
82**
75**
Примечания: *введение субстанции в 1% растворе крахмального клейстера ежедневно на 3-12 дни после трансплантации опухоли; суммарная доза 2500 мг/кг;
**различия с контролем достоверны (р<0,05).
Установлено, что ЗС в разовой дозе 250 мг/кг при ежедневном 10-кратном пероральном введении вызывает длительное достоверное ТРО=80-82-75% (p<0,05) в течение 11 дней после окончания лечения. П, из которой приготовлено ЗС, в разовой дозе 250 мг/кг при ежедневном 10-кратном пероральном введении вызывает достоверное, но заметно менее выраженное ТРО=73-77-48% (p<0,05) в течение того же периода наблюдения, особенно на 11-й день.
Заявляемое средство получают следующим образом:
Прототип увлажняют 5% крахмальным клейстером. После увлажнения протирают через сито с размером пор 0,67 мм и сушат на воздухе 24 часа (до высыхания). Высушенные гранулы просеивают через сито с размером пор 1,0 мм для разделения слипшихся гранул. Гранулят опудривают смесью, приготовленной путем тщательного смешения талька, крахмала и стеарата кальция. Далее на сите с размером пор 0,2 мм отсеивают мелкую пыль (остатки опудривающей смеси) для обеспечения точности дозирования. Полученными гранулами наполняют капсулы на капсулонаполняющей машинке.
Преимущества заявляемого средства для лечения эстрогензависимых опухолей заключаются в следующем:
1. Удобно в употреблении - лекарственная форма в виде гранул в желатиновых капсулах.
2. Капсулу можно запивать водой без побочных эффектов (тошноты и рвоты при приеме капсул не наблюдается).
3. Лекарственная форма точно дозирована.
4. Технология приготовления гранул в желатиновых капсулах может быть легко воспроизведена на любом отечественном предприятии фармацевтического профиля.
5. Биологическая активность заявляемого средства превышает эффективность прототипа.
Литература
1. Umezawa Т. Phylogenetic distribution of lignan producing plants. // Wood res. - 2003 - 90 - P.27-110.
2. Moss G.P. Nomenclature of lignans and neolignans (IUPAC Recommendations 2000). // Pure Appl. Chem. - 2000 - 72 - P.1493-1523.
3. Holmbom В., Eckerman C., Eklund P., Hemming J., Nisula L., Reunanen M., Sjöholm R., Sundberg A., Sundberg K., Willför S. Knots in trees - A new rich source of lignans. // Phytochemistry Reviews - 2003 - 2 - P.331-340.
4. Holmbom В., Willfoer S., Hemming J., Pietarinen S., Nisula L., Eklund P., Sjoeholm R. Knots in Trees: A Rich Source of Bioactive Polyphenols. // in D.S. Argyropoulos Ed., Materials, Chemicals, and Energy from Forest Biomass, ACS Symposium Series. - 2007 - 954(22) - P.350-362.
5. Adams N.R. Detection of the effects of phytoestrogens on sheep and cattle. // J. Anim. Sci. - 1995 - 73 - P.1509-1515
6. Adlercreutz H., Mousavi Y., Clark J., Höckersted K., Hämäläinen E.K., Wähälä K., Mäkelä Т., Hase Т.. Dietary phytoestrogens and cancer: in vitro and in vivo studies. //J. Steroid Biochem. Mol. Biol. - 1992 - 41 - P.331-337.
7. Kurzer M.S., Xu X. Dietary phytoestrogens. // Annu. Rev. Nutr. - 1997 - 17 - P.353-381.
8. Setchell K.D., Brown N.M., Desai P.B., Zimmer-Nechimias L., Wolfe В., Jakate A.S., Creutzinger V., Heubi J.E. Bioavailability, disposition, and dose- response effects of soy isoflavones when consumed by healthy women at physiologically typical dietary intakes. //J. Nutr. - 2003 - 133 - P.1027-1035.
9. Lampe J., Karr S., Hutchins A., Slavin J. Urinary equol excretion with a soy challenge: influence of habitual diet.// PSEBM - 1998 - 217 - P.335-339
10. Heinonen S., Nurmi Т., Liukkonen K., Poutanen K., Wahala K., Deyama Т., et al. In vitro metabolism of plant lignans: new precursors of mammalian lignans enterolactone and enterodiol. // J. Agric. Food Chem. - 2001 - 49(7) - P.3178-3186.
11. Dixon R. Phytoestrogens. // Annu. Rev. Plant Biol. - 2004 - 55 - P.225-261.
12. Magee P., Rowland I. Phytoestrogens, their mechanism of action: current evidence for a role in breast and prostate cancer. // Br. J. Nutr. - 2004 - 9(4) - P.513-531.
13. Wang L.-Q. Mammalian phytoestrogens: enterodiol and enterolactone. // J. Chromatography - 2002 - 777 - P.289-309.
14. Wang W., Ayella A., Jiang Y., Ouyang P., Qu H. Wheat lignans: promising cancer preventive agents. // in: Wheat Antioxidants, Ed. Yu L. John Wiley & Sons, Inc., - 2008 - P.264-272.
15. Mueller S.O., Simon S., Chae K., Metzler M., Korach K.S. Phytoestrogens and their human metabolites show distinct agonistic and antagonistic properties on estrogen receptor alpha (ERalpha) and ERbeta in human cells. // Toxicol. Sci. - 2004-80(1) - P.14-25.
16. Ravindranath M.H., Muthugounder S., Presser N., Viswanathan S. Anticancer therapeutic potential of soy isoflavone, genistein.// Adv. Exp. Med. Biol. - 2004 - 546 - P.121-165.
17. Linseisen J., Piller R., Hermann S., Chang-Claude J. Dietary phytoestrogen intake and premenopausal breast cancer risk in a German casecontrol study. // Int. J. Cancer - 2004 - 110(2)- P.284-290.
18. McCann S.E., Moysich K.B., Freudenheim J.L., Ambrosone C.B., Shields P.G. The risk of breast cancer associated with dietary lignans differs by CYP17 genotype in women. // J. Nutr. - 2002 - 132(10) - P.3036-3041.
19. Hedelin M., Klint C, Chang E., Bellocco R., Johansson J.E., Andersson S.O., et al. Dietary phytoestrogen, serum enterolactone, and risk of prostate cancer: the Cancer Prostate Sweden Study. // Cancer Causes Control - 2005 - 17 - P.169-180.
20. Нифантьев Н.Э., Яшунский Д.В., Меньшов B.M., Цветков Ю.Е., Цветков Д.Е. Способ выделения секоизоларицирезинола и дигидрокверцетина из древесины (варианты).// Патент РФ 2359666 (выдан 27.06.2009; приоритет 29.03.2007).

21. О.С. Жукова, М.В. Киселевский, А.Е. Щербаков, Л.В. Фетисова, Д.В. Яшунский, Д.Е. Цветков, В.М. Меньшов и Н.Э. Нифантьев «Исследование действия лигнана из Abies sibirica ("Кнотолан") на рост гормонозависимых клеток рака молочной железы линии MCF7 in vitro». II Клеточные технологии в биологии и медицине, 2010. - N2. - С.78-81.
22. Государственная Фармакопея СССР, XI Издание, Москва, 1998, выпуск 2, С.143
23. Калишьян М.С. Трещалина Е.М., Седакова Л.А. и др. Эффективности неоадъювантной химиотерапии по схеме адриамицин + циклофосфамид в сочетании с бинаной каталитической системой терафтал + аскорбиновая кислота на модели рака молочной железы мышей Са-755. // Российский биотерапевтический журнал, 2009. - N 3. - С.51-54.
24. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под общей ред. Р.У. Хабриева. - 2 изд., перераб. и доп. - М.: ОАО изд. «Медицина», 2005 г. - 832 с.