Способ трансплантации биокомпозитных сфероидов для обеспечения возможности восстановления целостности кости при дефектах, размеры которых превышают критические
METHOD OF TRANSPLANTING BIOCOMPOSITE SPHEROIDS TO ENSURE THE POSSIBILITY OF RESTORING THE INTEGRITY OF THE BONE IN CASE OF DEFECTS THAT EXCEED THE CRITICAL SIZE

Область техники
Изобретение относится к области медицины, а именно к тканевой инженерии, регенеративной медицине, стоматологии, пластической хирургии, травматологии и ортопедии.
Уровень техники
Восстановление дефекта кости критического размера остается одной из главной клинической ортопедической проблемой. Дефекты кости критического размера технически определены как те, которые не заживают спонтанно естественным путем. Критический дефект может возникать как в случае случайного события (травма, остеомиелит), хирургическая операции, так и преднамеренно (экспериментальные исследования на лабораторных животных). Для большинства костей существуют критические дефекты, но для каждой они свои и отличаются как по объему, так и по конфигурации. При наличии критического дефекта полная регенерация кости без стимуляции невозможна.
Технологии направленной регенерации тканей с успехом используются в пародонтологии, имплантологии и челюстно-лицевой хирургии. В качестве барьеров для предотвращения прорастания в зону дефекта соединительной ткани широко применяются мембраны, чем создается пространство для формирования костной ткани. Достаточно давно сформулированы основные принципы применения биологических барьерных мембран: биосовместимость, интеграция с костной тканью, препятствие прорастанию соединительной ткани или эпителия, ограничение проникновения бактерий, формирование пространства благоприятного для органотипической регенерации костной тканей при заполнении дефекта остеопластическим материалом. При этом, мембраны не должны оказывать негативного воздействия на процессы гистотипической регенерации, а в идеальном варианте – оптимизировать их.
Иванов С. Ю., Бонарцев А.П., Гажва Ю.В.и др/ Разработка и доклинические исследования изолирующей мембраны на основе сополимера поли-3-оксибутирата-со-3-оксивалерата для направленной костной регенерации// Биомедицинская химия, 2015 том 61, вып. 6, с. 717-723
В настоящее время всё чаще в практике хирургической стоматологии и пародонтологии применяются методики направленной костной регенерации с использованием различных остеопластических материалов и изолирующих мембран. Разработано большое количество таких мембран, которые отличаются по происхождению (ксеногенные или синтетические), по способности подвергаться биодеструкции (резорбируемые и нерезорбируемые), по прочности (мягкие и каркасные). Основная роль мембран заключается в создании надежного механического и тканевого барьера между зоной костной регенерации и окружающими мягкими тканями (). В качестве барьерных мембран применяют различные материалы, в том числе коллаген, политетрафторэтилен (ПТФЭ), внеклеточный матрикс дермы, декальцинированная компактная костная ткань, полигидроксибутират, полиуретан, гиалуроновые кислоты, обогащенная тромбоцитами плазма, мембраны из полилактид-ко-ε-капролактона (PLCL), альгинат натрия и другие вещества в различных комбинациях.
Илизаров Г. А., Шрейнер А. А., Имерлишвили И. А. / Кортикальный дефект трубчатой кости как модель для изучения остеогенных свойств костного мозга диафиза// Гений ортопедии. –  1995. – № 1. – С. 18–20
Известна одна из первых моделей изоляции костного мозга после удаления костной ткани вокруг него с помощью целлоидиновой пленки. В опытных сериях изучали влияние изоляции зоны дефекта от параоссальных тканей посредством целлоидиновой пленки, которую укладывали между обнаженным костным мозгом, после удаления окружающей КМ компактной костной ткани, и мягкими тканями, перекрывая на 5-7 мм во всех направляениях зону дефекта. Целлоидиновая пленка устраняла возможности внедрения параоссальных тканей в дефект и разрастания фиброзной ткани ().
Известен аналог заполнения дефекта костно-пластическим материалом с закрытием области регенерации кости специальной мембраной. Изоляция зоны пластики резорбируемой мембраной снижает риск преждевременной резорбции биоматериала, влияет на сокращение сроков костной регенерации (Иванов С.Ю., Ломакин М.В., Панин A.M. и др. Синус-лифтинг и варианты субантральной имплантации//Российский стоматологический журнал. – 2000. – № 4. – С. 16–21; Мушеев И.У., Олесова В.Н., Фромович О. З. Практическая дентальная имплантология// Руководство, - 2-е доп. изд. -Москва.: Локус Станди -2008-497 стр.). Этот процесс называется методом направленной костной регенерации (Guided Bone Regeneration).
Из уровня техники известно применение барьерной изолирующей мембраны «ОСТЕОПЛАСТ» при направленной костной регенерации критических костных дефектов (Иванов С. Ю., Зайцев А. Б., Ямуркова Н. Ф. и др/ Исследование барьерной функции коллагеновой мембраны «Остеопласт» при заживлении костных дефектов в эксперименте/ Современные технологии в медицине, 2011 – 3 – с.35-38).
Многочисленные публикации свидетельствуют, что проблема полноценного восстановления анатомической целостности кости и функциональной состоятельности костной ткани в случае критического дефекта продолжает оставаться актуальной.
Раскрытие изобретения
Задача настоящего изобретения состоит в разработке нового способа восстановления (заживления) костного дефекта, превышающего критический размер (критический костный дефект).
de novo
Технический результат данного изобретения заключается в разработке нового и эффективного способа восстановления (заживления) костного дефекта, превышающего критический размер (критический костный дефект) позволяющего восстановить костную ткань в области дефекта . Способ по изобретению основан на применении клеточных сфероидов и барьерной мембраны, причем указанный способ характеризуется отсутствием неблагоприятных последствий, а именно способ предотвращает избыточное врастание фиброзной ткани в дефект, препятствующее образованию новой костной ткани, а также способ предотвращает развитие новообразованного атипичного регенерата - соединительнотканного рубца и не сопровождается возникновением механических препятствий в виде рубцовой ткани, кроме того способ обеспечивает эффективное сращения отломков кости путем транслантационной регенерации костной ткани через приживленные пересаженные сфероиды. При этом указанный способ не предполагает использования каких-либо дополнительных матриц, каркасов, крупных блоков костнопластических материалов и характеризуется более быстрым периодом восстановления костной ткани (например, по сравнению с использованием аллогенных и ксеногенных костнопластических материалов), в частности до 6 месяцев.
Достижение указанного технического результата обеспечивается при осуществлении способа восстановления костного дефекта, размеры которого превышают критические, включающего следующие этапы:
а)
стабилизация костных опилов или отломков в области дефекта по направлению друг к другу с помощью установки аппарата внешней фиксации,
б)
установка мембраны, имеющей отверстия, в область костного дефекта;
в)
через 5-8 дней введение трансплантата на основе клеточных сфероидов через отверстия в мембране с помощью иглы аппликатора в пространство костного дефекта.
б)
В частных вариантах воплощения изобретения перед стадией  на концы костных опилов или отломков устанавливаются биорезорбируемые вставки (заглушки), которые не закрывают костномозговой канал и препятствуют образованию замыкательных костных пластин. В частных вариантах воплощения изобретения вставки (заглушки) выполнены из прессованного коллагена.
В частных вариантах воплощения изобретения мембрана является резорбируемой. В некоторых вариантах воплощения изобретения мембрана представляет собой коллагеновую мембрану, децеллюлизированную и лиофилизированную аллогенную или ксеногенную надкостницу.
В частных вариантах воплощения изобретения отверстия в мембране имеют диаметр до 0,8 см. В некоторых вариантах воплощения изобретения отверстия в мембране могут составлять до 20% от общей площади поверхности всей мембраны.
2
В частных вариантах воплощения изобретения на 4-6 см площади поверхности мембраны имеется одно отверстие.
б)
В частных вариантах воплощения изобретения при установке мембраны на стадии  она фиксируется по краям шовными рассасывающимися нитями.
В частных вариантах воплощения изобретения после установки мембраны полость между мембраной и костным дефектом заполняется питательной средой F12, аутологичной обогащенной тромбоцитами плазмой, аутологичной сывороткой крови, альгинатным гелем или их смесью. В некоторых вариантах воплощения изобретения после установки мембраны полость между мембраной и костным дефектом заполняется смесью альгинатного геля с питательной средой F12. В других частных вариантах воплощения изобретения соотношение альгинатного геля с питательной средой F12 составляет 1:1 - 1,5:1.
В частных вариантах воплощения изобретения сфероиды представляют собой сфероиды на основе клеток надхрящницы собственного реберного хряща субъекта, сфероиды на основе аутологичных клеток надкостницы субъекта, сфероиды на основе аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и измельченной частично деминерализованной аллогенной кости или их смесь.
В частных вариантах воплощения изобретения сфероиды представляют собой смесь сфероидов на основе аутологичных клеток надкостницы субъекта и сфероидов на основе аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и измельченной частично деминерализованной аллогенной кости в соотношении 1:3.
В частных вариантах воплощения изобретения сфероиды представляют собой смесь сфероидов на основе клеток надхрящницы собственного реберного хряща субъекта, сфероидов на основе аутологичных клеток надкостницы субъекта и сфероидов на основе аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга с ядром в центральной части в виде  измельченной частично деминерализованной аллогенной кости (биокомпозитный сфероид) в соотношении 0,5:1:2.
В частных вариантах воплощения изобретения сфероиды на основе клеток надхрящницы имеют размер 250-450 мкм. В частных вариантах воплощения изобретения сфероиды на основе аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и измельченной частично деминерализованной аллогенной кости имеют размер 250-600 мкм. В частных вариантах воплощения изобретения сфероиды на основе аутологичных клеток надкостницы субъекта имеют размер 200-450 мкм.
В частных вариантах воплощения изобретения трансплантат включает несущий раствор. В некоторых вариантах воплощения изобретения трансплантат включает (массовый %):
- клеточные сфероиды
50 - 65%;
- несущий раствор
35 - 50%.
В частных вариантах воплощения изобретения несущий раствор представляют собой аутологичную плазму, аутологичную сыворотку крови, питательную среду F12 или их смесь.
В частных вариантах воплощения изобретения костный дефект является дефектом трубчатой кости.
В частных вариантах воплощения изобретения трансплантат на основе клеточных сфероидов дополнительно включает пористые гранулы гидроксиапатита трикальцийфосфата с рамером 0,25-0,5 мм.
Краткое описание чертежей.
Фигура 1.
Конструкция вставки (заглушки) на опил кости (высота ободка, в частности, составляет 2-4 мм, диаметр меньше диаметра костномозгового канала).
Фигура 2.
Микрофотография гистологического среза биокомпозитного сфероида по изобретению (окраска по Маллори). В центре фрагмент деминерализованной аллокости, вокруг микроткань, сформированная ММСК КМ.
Определение и термины
Различные термины, относящиеся к объектам настоящего изобретения, используются выше и также в описании и в формуле изобретения. Если иное не оговаривается, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же самое значение, которое понятно для специалистов в данной области. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.
«включает»
«включающий»
В описании данного изобретения термины  и  интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
ткань
В описании данного изобретения термин «» относится к системе клеток и неклеточных структур, обладающих общностью строения, в ряде случаев общностью происхождения, и специализированные на выполнении определенных функций.
дефект
Используемый в данном документе термин «» относится к костной ткани, если она отсутствует, уменьшено ее количество или она иначе повреждена. Дефект костей может быть результатом заболевания, лечения заболевания или травмы. «Критический костный дефект» это повреждение кости, при котором костное сращение невозможно спонтанно, то есть при котором естественным путем кость органотипично с восстановлением своей анатомической целостности не регенерирует, а костномозговой канал закрывается замыкательными пластинами.
«трансплантат»
«трансплантация»
Используемый в данной заявке термин  относится к сфероидам, а термин  — это процесс пересадки указанных сфероидов в организм субъекта для устранения дефекта кости.
«сфероиды»
Используемый в данной заявке термин  относится к плотно упакованным клеточным агрегатам шарообразной формы, сформированных путем трехмерного культивирования. Их важным свойством является способность к взаимной адгезии и последующему тканевому слиянию, а также к адгезии к элементам внеклеточного матрикса реципиента. Тканевые (клеточные) сфероиды имеют тканеподобное строение – часто называют трехмерными микротканями, максимизирующими межклеточные взаимодействия.
Частицы деминерализованной кости в составе сфероидов по изобретению, в частности, представляют собой костнопластический материал Перфоост.
Адгезивная культура
- клеточная культура, состоящая из пластик-адгезивных клеток, способных посредством своих рецепторов прикрепляться к культуральному пластику или стеклу.
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК)
in vitro
костного мозга — гетерогенная популяция клеток стромы костного мозга, способная к дифференцировке в клетки, имеющие мезенхимальное происхождение: адипоциты, остеоциты, хондроциты, а также в особых условиях  в клетки эктодермального и энтодермального фенотипа.
В настоящем документе трансплантат в некоторых вариантах воплощения изобретения может дополнительно содержать гидроксиапатит трикальцийфосфат ГАП-99Г — гранулы, в виде пористых гранул размером 0,25-0,5 мм (ООО «НПК «Полистом»), в количестве 1-10% от массы суспензии. Трансплантат по изобретению может включать от 1-10 мас. % указанных пористых гранул.
2
Альгинатный гель в настоящем документе, в частности, может быть получен способом, описанным в Stevens M.M., Marini R.P., Schaefer D. et al./ In vivo engineering of organs: the bone bioreactor/Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Aug 9;102 (32):11450-5. В частности, гелеобразование может быть инициировано путем смешивания 2% (вес/объем) альгината натрия (FMC BioPolymer) в 30 мМ Hepes, содержащем 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl, с равным объемом раствора, содержащего 75 мМ CaCl в 10 мМ Hepes, содержащего 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl с использованием стерильного Y-образного смесителя. Гель отверждается в течение 1 мин и имеет модуль Юнга 0,17 МПа. В состав геля может быть добавлены факторы роста (TGF-β1 и FGF-2, R & D Systems), включены в состав в концентрации 10 нг/мл.
Подробное раскрытие изобретение
Прежде всего, при осуществлении способа по изобретению проводится стадия стабилизации костных отломков с помощью аппарата внешней фиксации, а именно костные отломки устанавливаются в направлении друг к другу, после чего следует установка мембраны с отверстиями. После первой операции по стабилизации костных отломков с помощью аппарата внешней фиксации (в частности, «Комплект аппаратов спице-стержневых для чрескостного остеосинтеза длинных и коротких трубчатых костей АСС-ЧК-"ГЭП ЦИТО" с набором инструментов для их установки (по типу Г.А. Илизарова) ("Аппарат Илизарова")») и установки мембраны с отверстиями, в течение периода времени от 5 до 8 суток в отграниченной мембраной зоне - внутри полости - формируется соединительнотканный регенерат - грануляционная ткань, проникающая внутрь полости через отверстия в мембране. Установка мембраны, имеющей отверстия, в область костного дефекта осуществляется для частичного отграничения полости дефекта от регенерирующих параоссальных тканей.
2
Для реализации способа по изобретению возможно использование любой резорбируемой мембраны, в частности, мембрана может представлять собой коллагеновую мембрану, в частности, мембрану «Остеопласт» или OSSIX Plus (Datum Dental), децеллюлизированную и лиофилизированную аллогенную или ксеногенную надкостницу, в которой делаются специальные отверстия диаметром до 0,8 см. В частных вариантах воплощения изобретения мембрана характеризуется наличием одного (1) отверстия на 4-6 см площади поверхности мембраны. Отверстия могут составлять до 20% от общей площади поверхности всей мембраны.
Указанные отверстия необходимы для дозирования (ограничения) врастания параоссальных тканей в пространство дефекта кости, так как эти ткани несут с собой новообразованные сосуды, которые будут необходимы для формирования сосудистой сети в костном регенерате, поскольку, как правило, сосудов со стороны костного мозга от обломков костей совершенно недостаточно, особенно если речь идет о старом или ослабленном модельном животном или о взрослом человеке. Однако избыточное количество параоссальных тканей в дефекте между костными отломками ведет к образованию соединительнотканного рубца в области регенерации, что создает препятствие для костной регенерации и отломки костей не сращиваются в единое целое (кость).
Количество отверстий зависит от возраста пациента и способности параоссальных тканей формировать грануляционную ткань с сосудами и проникать в окружающие пространства. У ослабленных пациентов такая способность снижена. При этом важно обеспечить врастание сосудов из параоссальных тканей, заполнить пространство дефекта сфероидами и не дать избыточно разрастись параоссальным тканям и сформировать атипичный регенерат - соединительнотканный рубец в пространстве между отломками костей.
В некоторых частных вариантах воплощения изобретения (в частности, в случае больших дефектов более двух диаметров поверхности отломков или опилов костей (поперечного размера) костей) на опилы или отломки костей могут одеваться специальные вставки (заглушки), в частности, из прессованного коллагена, которые предотвращают формирование замыкательной костной пластинки (Фигура 1).
В отличие от известных способов заживления костных дефектов, превышающих критический размер, в настоящем изобретении для заполнения костного дефекта используются остеогенные клеточные сфероиды, клетки в составе сфероидов обладают высоким пролиферативным потенциалом и под воздействием индукторов дифференцировки способны к повышению транскрипции генов остеобласт-специфических белков и проявляют остеогенные свойства.
Далее следует вторая стадия, в ходе которой с помощью иглы для аспирации костного мозга (без дополнительных отверстий в стенках иглы) через отверстия в мембране вводим с помощью этой иглы-аппликатора суспензию на основе клеточных сфероидов (трансплантат), причем суспензия может содержать аутологичную плазму, обогащенную собственными тромбоцитами субъекта, или питательную среду F12, в частных вариантах воплощения изобретения в суспензии 50-65 масс. % – клеточные сфероиды, 35-50 масс.% - несущий раствор (аутологичная плазма, либо питательная среда F12). По 0,5 – 5 мл суспензии в один прокол, по одному проколу в каждое отверстие мембраны. Игла может перемещаться путем вкола-выхода и вкола под другим углом, для максимального заполнения сфероидами объема под мембраной. Другие отверстия в мембране помогают перераспределить гидродинамическое давление, передаваемое шприцом на суспензию сфероидов внутри полости ограниченной этой мембраной. Дополнительно тактильно контролируем силу сопротивления поршня шприца надавливанию, при возрастании сопротивления прекращаем нагнетание суспензии сфероидов под мембрану. Трансплантация сфероидов проводиться так, чтобы грануляционная ткань была равномерно заполнена островками из сфероидов, а сами сфероиды были уложены на всем протяжении между открытыми костномозговыми каналами костей. Операция может проводиться под местной анестезией без дополнительных разрезов через транскожные пункции. Игла вводиться под разными углами, для равномерного заполнения суспензией на основе сфероидов пространства с грануляционной тканью, ограниченного мембраной.
Примеры осуществления изобретения
Клеточные сфероиды.
Сфероиды согласно настоящему изобретению относится к клеточным агрегатам шарообразной формы, сформированных из живых клеток путем трехмерного культивирования. Их важным свойством является способность к взаимной адгезии и последующему тканевому слиянию, а также к адгезии к элементам внеклеточного матрикса. В частности, сфероиды по изобретению могут представлять собой клеточные сфероиды на основе клеток надхрящницы собственного реберного хряща субъекта. В частных вариантах воплощения изобретения размер таких сфероидов составляет 250-450 мкм. Способ получения таких сфероидов приводится ниже в примере 1.
Пример 1.
0
2
Для получения первичной культуры выделенные из надхрящницы клетки высевают в пластиковые флаконы с культуральной средой следующего состава: ДМЕМ (или ДМЕМ/Ф12) 450 мл, L-глутамин 292 мг, эмбриональная телячья сыворотка 50 мл, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, при 100% влажности, температуре 37С, 5% СО (данная среда и условия используются на всех этапах последующего культивирования).
Субкультивирование монослойной культуры хондропрогениторных клеток осуществляют до третьего пассажа со сменой среды каждые 2-3 дня.
После третьего пассажа клетки снимают с пластиковых флаконов трипсином/ЭДТА. Полученную клеточную взвесь отмывают от трипсина/ЭДТА, в том числе с помощью среды ДМЕМ с 10% сывороткой с последующим центрифугированием (10 минут при 200g) и переносят в 81-луночные агарозные планшеты с диаметром лунки 800 мкм в концентрации до 1,6 млн клеток на планшет, где в лунках из культивированных клеток начинают формироваться сфероиды.
Сфероидов пребывают в лунках на протяжении до 21 суток со сменой среды каждые 2-3 дня.
2
Для трансплантации сфероидов их собирают из планшетов и переносят в пробирку, где они осаждаются на дно без дополнительного центрифугирования. После этого сфероиды помещают в шприц и трансплантируют субъекту в зону дефекта через иглу или аппликатор, диаметром не менее 1 мм.
Кроме того, сфероиды по изобретению могут представлять собой клеточные сфероиды на основе культивированных аутологичных мультипотентных стромальных клеток костного мозга субъекта, содержащие частицы измельченной аллогенной деминерализованной кости (фигура 2). В некоторых вариантах степень деминерализации аллогенной кости составляет не более 30 %, более конкретно 10 - 30 %. В частных вариантах воплощения изобретения размер таких сфероидов от 250 до 600 мкм. В частных вариантах воплощения изобретения сфероиды содержат частицы аллогенной деминерализованной кости с диаметром от 50 до 250 мкм. Способ получения таких сфероидов приводится ниже в примере 2.
Пример 2.
В качестве источника остеогенных клеток для производства сфероидов согласно настоящему изобретению используется костный мозг самого пациента, который является источником мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга. При этом, в настоящем изобретении биоматериал, то есть частицы деминерализованной кости субъекта, заключены в оболочку из собственных клеток, то есть мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга. С одной стороны клетки биокомпозитного сфероида взаимодействую с индуктором их дифференцировки, с другой защищают биокомпозит – аллогенную кость от быстрого лизиса, реакции организма на инородное тело.
Суспензия частиц измельченной аллогенной деминерализованной кости получали путем измельчения готовых деминерализованных костных блоков, подготовленных для клинического применения в виде костных блоков из аллогенной кости - костнопластического материала.
5
2.
3
2
0
2
2
Выделение и культивирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (ММСК КМ) осуществляют следующим образом. ММСК КМ были выделены из заднего подвздошного гребня здоровых мужчин-доноров (43 ± 5 лет) путем пункции аспирационной иглы и аспирации 25 мл костного мозга в шприц-контейнер. Аспират промывали модифицированной Дульбекко средой Игла с низким содержанием глюкозы с 10% предварительно протестированной фетальной бычьей сывороткой. Мононуклеарные клетки выделяли с использованием градиента плотности Percoll (Sigma-Aldrich), высевали на пластик для тканевой культуры с плотностью 1,8 × 10 клеток на смв среде, содержащей 10 нг/мл фактора роста фибробластов-2, и культивировали при 37°С с 5% СО. Неадгезивные клетки удаляли при смене культуральной среды через 4 дня. Адгезивные клетки, первичные ММСК КМ, культивировали в течение еще 10-14 дней со сменой среды каждые 3 дня. Затем их повторно высевали при 4×10 клеток на см и расширяли до 3-го пассажа: высевали в пластиковые флаконы с культуральной средой следующего состава: ДМЕМ (или ДМЕМ/Ф12) 450 мл, L-глутамин 292 мг, эмбриональная телячья сыворотка 50 мл, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, при 100% влажности, температуре 37С, 5% СО (данная среда и условия используются на всех этапах последующего культивирования).
После третьего пассажа клетки снимают с пластиковых флаконов трипсином/ЭДТА. Полученную клеточную взвесь отмывают от трипсина/ЭДТА, в том числе с помощью среды ДМЕМ с 10% сывороткой с последующим центрифугированием (10 минут при 200g), клеточную суспензию смешивают с суспензией из 90 частиц измельченной деминерализованной аллогенной кости и переносят в 81-луночные агарозные планшеты с диаметром лунки 800 мкм в концентрации до 1,6 млн клеток на планшет, где в лунку как правило попадает одна частица кости, и приблизительно равные количества культивированных клеток костного мозга, внутри агарозных лунок начинают формироваться сфероиды, в центре которых оказывается частица аллогенной кости.
Из культивированных аутологичных или аллогенных живых клеток костного мозга (мультипотентные стромальные клетки костного мозга) в условиях 3D культивирования внутри агарозных лунок диаметром 800 мкм формируются клеточные сфероиды диаметром от 250 до 600 мкм, причем в центре формирующегося сфероида оказывается частица измельченного деминерализованного костного матрикса диаметром от 50 до 250 мкм.
В лунку заливается суспензия живых культивированных клеток в смеси с суспензией измельченного частично деминерализованного аллогенного костного матрикса. В течение 3-7 суток в агарозной лунке в условиях трехмерного культивирования формируется тканевой сфероид из клеток и вновь синтезированного внеклеточного матрикса, в центральной части которого расположена частица деминерализованного костного матрикса. Клетки и матрикс окружают частицу кости и образуют тканеинженерный конструкт, устойчивый к механическим воздействиям. Осаждение клеток и костных частиц из суспензий происходит под действием сил гравитации в условиях трехмерного культивирования и при возможном недолгом покачивании культуральных чашек.
Сфероидов пребывают в лунках на протяжении до 8 суток со сменой среды каждые 2-3 дня.
2
Для трансплантации сфероидов их собирают из планшетов и переносят в пробирку, где они осаждаются на дно без дополнительного центрифугирования. После этого сфероиды помещают в шприц и трансплантируют субъекту в зону дефекта через иглу или аппликатор, диаметром не менее 1 мм.
Кроме того, сфероиды по изобретению могут представлять собой клеточные сфероиды на основе аутологичных клеток надкостницы субъекта. В частности, размер таких клеточных сфероидов составляет 200-450 мкм. В некоторых частных вариантах воплощения изобретения размер сфероидов составляет 250 мкм. Способ получения таких сфероидов описывается ниже в примере 3.
Пример 3.
В качестве источника клеток скелетных соединительных тканей для производства сфероидов согласно настоящему изобретению используются клетки внутреннего слоя надкостницы, являющиеся для скелетных соединительных тканей камбиальной зоной, поставляющей прогениторные и стволовые клетки для физиологической и репаративной регенерации, следовательно, содержащая большее количество прогенеторных клеток.
Забор клеток надкостницы осуществляется малоинвазивным методом. Проводится местная анестезия кожи, подкожной клетчатки и надкостницы. Через меленький разрез, достигаем надкостницы, с помощью иглы с физиологическим раствором отделяем надкостницу от ребра, наполняем пространство между компактной костью ребра и его надкостницей, а затем аккуратно иссекаем лоскут – надкостницу. Выделение клеток из надкостницы производили путем предварительного механического выскабливания внутреннего слоя надкостницы с последующей ферментативной диссоциацией кусочков тканей этого слоя до единичных клеток.
0
2
Для получения первичной культуры выделенные из надкостницы клетки высевают в пластиковые флаконы с культуральной средой следующего состава: ДМЕМ (или ДМЕМ/Ф12) 450 мл, L-глутамин 292 мг, эмбриональная телячья сыворотка 50 мл, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, при 100% влажности, температуре 37С, 5% СО (данная среда и условия используются на всех этапах последующего культивирования).
Субкультивирование монослойной культуры прогениторных клеток скелетных соединительных тканей осуществляют до третьего - четвертого пассажа со сменой среды каждые 2-3 дня.
После последнего пассажа клетки снимают с пластиковых флаконов трипсином/ЭДТА. Полученную клеточную взвесь отмывают от трипсина/ЭДТА, в том числе с помощью среды ДМЕМ с 10% сывороткой с последующим центрифугированием (10 минут при 200g) и переносят в 81-луночные агарозные планшеты с диаметром лунки 800 мкм в концентрации до 1,4 миллионов клеток на планшет, где в лунках из культивированных клеток начинают формироваться сфероиды.
Сфероидов пребывают в лунках на протяжении до 7 суток со сменой питательной среды каждые 2-3 дня.
2
Для трансплантации сфероидов их собирают из планшетов и переносят в пробирку, где они осаждаются на дно без дополнительного центрифугирования. После этого сфероиды помещают в шприц и трансплантируют субъекту в зону дефекта через иглу или аппликатор, с диаметром не менее 1 мм.
Пример осуществление способа по изобретению.
2
За 30-40 дней до начала лечения экспериментального повреждения кости у кролика производиться забор аутологичных клеток костного мозга, надхрящницы реберного хряща, надкостницы ребра или большеберцовой кости для формирования биокомпозитных сфероидов или сфероидов из клеток надкостницы и надхрящницы. При травматическом дефекте длинной трубчатой кости накладывается аппарат внешней фиксации на поврежденный сегмент конечности для стабилизации костных отломков по направлению друг к другу. Через оперативный доступ обнажается область дефекта кости, отломки кости окружаются мембраной, например коллагеновой барьерной мембраной OSSIX Plus (Datum Dental). Из расчета 1 (одно) отверстие на площадь 4-6 см площади поверхности мембраны, в мембране проделывается, в частности, с помощью ножниц, одно сквозное отверстие диаметром 0,8 см. Эти отверстия должны быть расположены так, чтобы к ним наиболее коротким путем чрезкожно мог был быть осуществлен доступ с помощью иглы для аспирации костного мозга из тазовых костей под местной анестезией, причем отверстия не должны быть расположены под линией хирургического шва, который остается после установки мембраны и послойного ушивания раны. При установке мембрана сворачивается в форме приближенной к внешней форме костного отломка, как правило мембрана сворачивается в цилиндрической форме, причем в частных вариантах воплощения изобретения мембрана может быть установлена в несколько слоев (несколько туров). Цилиндр, образованный мембраной, обматывается по краям шовными рассасывающимися нитями (например, Vicryl (Викрил), Safil (Сафил), Polysorb (Полисорб) или PGA-Resorba (ПГА-Резорба)), мембрана прижимается нитями к наружной поверхности кости, прилежащей к краю опила кости, завязываются над мембраной фиксирующие узлы.
Stevens M.M., Marini R.P., Schaefer D. et al./ In vivo engineering of organs: the bone bioreactor/Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Aug 9;102 (32):11450-5
Полость, образованная мембраной, должна быть заполнена, в частности, питательной средой F12 (Панэко), аутологичной обогащенной тромбоцитами плазмой, аутологичной сывороткой крови или альгинатным гелем (примеры такого геля описаны в ) для сохранения формы цилиндра. Указанная полость может быть заполнена смесью альгинатного геля с питательной средой F12, в частности, в соотношении 1:1 или 1,5:1. Возможна замена F12 на аутологичную обогащенную тромбоцитами плазму или аутологичную сыворотку крови.
Через 5-8 суток формируется из параоссальных тканей грануляционная ткань, которая проникает вместе с сосудами через отверстия в мембране в полость, образуемую турами мембраны. Чрезкожно под местной анестезией с помощью игл для аспирации костного мозга (для аспирации костного мозга из подвздошной кости без поперечных прорезей на конце иглы) проводиться пункция кожи и мягких тканей. Скользящим движением по поверхности мембраны концом иглы нащупывается отверстие в мембране, игла вводиться вглубь - в пространство ограниченное опилами костей и мембраной. Через шприц подается суспензия сфероидов. Важно, чтобы сфероиды прилежали к открытому костномозговому каналу. Весь объем костного дефекта, ограниченного мембраной, заполняется сфероидами, причем сфероиды могут подаваться по мере извлечения иглы из грануляционной ткани в несколько приемов (игла делает канал, который при извлечении последней заполняется сфероидами). Этот прием позволяет наполнить грануляционную ткань остеогенными сфероидами. В частных предпочтительных вариантах воплощения изобретения применяется суспензия сфероидов, в которой используется смесь сфероидов из надхрящницы, надкостницы, и биокомпозитных сфероидов в соотношении 0,5:1:2.
Аппарат внешней фиксации снимается по мере минерализации костного регенерата и приобретения костью способности нести механическую нагрузку. Как правило, период восстановления костного дефекта составляет до 6 месяцев.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.