Влияние температуры хроматографирования на разделение гомологов бензалкония хлорида

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 615.07+615.28

Влияние температуры хроматографирования на разделение гомологов бензалкония хлорида

А.С. Осипов, Е.Б. Нечаева, Е.Л. Ковалёва, О.А. Победин

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 127051, Москва, Россия

Резюме: Исследовано влияние температуры хроматографирования на разделение гомологов бензалкония хлорида на колонках с нитрильными и фенильными сорбентами. Увеличение температуры хроматографирования до 45—60°С позволит сократить время анализа и повысить чувствительность определения гомологов бензалкония хлорида. Повышение температуры анализа не оказывает существенного влияния на разрешение между пиками гомологов бензалкония хлорида. Однако, необходимо отметить, что длительность эксплуатации колонок с нитрильными сорбентами при более высоких температурах (свыше 60°С) требует дополнительного изучения, учитывая возможность гидролиза нитрильных групп при высоких температурах. Так же, как для нитрильных колонок, увеличение температуры улучшает хроматографические параметры разделения для гомологов бензалкония хлорида на фенильных колонках.

Ключевые слова: ВЭЖХ; бензалконий хлорид; температура.

THE IMPACT OF THE TEMPERATURE ON CHROMATOGRAPHIC SEPARATION OF BENZALKONIUM CHLORIDE HOMOLOGS A.S. Osipov, E.B. Nechaeva, E.L. Kovaleva, O.A. Pobedin

Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation, 127051, Moscow, Russia Abstract: The impact of the temperature on chromatographic separation of benzalkonium chloride homologs on nitrile and phenyl sorbent columns was investigated. Increasing the chromatographic temperature up to 45-60°C allows to reduce the analysis time and increase the sensitivity of benzalkonium chloride homologs detection. Increasing the analysis temperature has no significant impact on the resolution between the peaks of benzalkonium chloride homologs. However, it should be noticed that the duration of use for the columns with nitrile sorbents at higher temperatures (above 60°C) require further study, taking into account the possibility of nitrile group hydrolysis at high temperatures. Increasing the temperature of nitrile columns improves the chromatographic separation parameters for benzalkonium chloride homologs on phenyl columns.

Key words: HPLC; benzalkonium chloride; temperature.

Бензалконий хлорид применяется в медицинской практике как антисептическое средство. Применяют бензалконий хлорид главным образом как консервант в глазных каплях, а также в составе комбинированных антисептических средств — пастилок и таблеток для рассасывания при профилактике и лечении бактериальных инфекций полости рта [1]. Бензалконий хлорид представляет собой смесь ал-килбензилдиметиламмоний хлоридов, имеющих общую формулу: /С6Н5СН2К+(СН3);Д/ С1-; где R - от я-С8Н17 до я-С16Н33. Количественное содержание антисептика в препаратах определяют как сумму гомологов. По нормам Фармакопеи США гомологи я-С12Н25 и я-С14Н29 должны составлять не менее 70% от общего содержания алкилбензилдиметиламмоний хлоридов [2]. Субстанции бензалкония хлорида, применяющиеся при производстве глазных капель, как правило, не менее чем на 85-90% состоят из гомологов я-С12Н25 и я-С14Н29. Концентрация антисептика в глазных каплях составляет обычно 0,1 мг/мл. Для количественного определения бензалкония хлорида в препаратах в большинстве случаев применяют методику хроматографирования, приведенную в Европейской и Американской Фармакопеях для определения соотношения гомологов бензалкония хлорида.

Анализ проводят на хроматографических колонках с нитрильными сорбентами в изократическом режиме. Длина хроматографических колонок составляет 250— 300 мм. Следует отметить, что температура хроматографирования в этих фармакопейных методиках не приведена. Значительно реже для количественного определения бензалкония хлорида в глазных каплях применяют условия хроматографирования, приведенные в данных фармакопейных статьях для определения посторонних примесей в бензалкония хлориде. Определение проводят на колонках С18 в градиентном режиме. Подвижная фаза содержит ион-парный реагент — натрия гексансульфонат [2—5]. Необходимо отметить, что условия анализа бензалкония хлорида на нитрильных колонках существенно проще.

Цель работы: исследование влияния температуры на разделение гомологов бензалкония хлорида на хроматографических колонках с нитрильными и фе-нильными сорбентами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работу проводили на хроматографе «Agilent», серии 1100 (Agilent Technologies, США). В работе использовали колонки: Hypersil BDS Cyano 150x3,0 мм, 5 мкм (Thermo Scientific, США), Zorbax SB-CN 150x4,6 мм,

5 мкм, Zorbax Eclipse XDB-CN 150x4,6 мм, 5 мкм (Agilent Technologies, США), Ace 3 Phenyl 150x4,6 мм, 3 мкм (Advanced Chromatography Technologies, Шотландия), Zorbax SB-Phenyl 150x4,6 мм, 3,5 мкм. (Agilent Technologies, США). Применяли подвижную фазу: 100 мМ натрия ацетат в воде (рН 5,0) — ацетонитрил в соотношении 50:50 (для нитрильных колонок), либо 40:60 (для фенильных колонок). Детектирование осуществляли при 254 нм. Скорость потока элюента -0,5 мл/мин или 1,2 мл/мин. Ввод образцов — 10 или 20 мкл в зависимости от диаметра колонок. Анализ бензалкония хлорида проводили при температурах 20, 30, 40, 50 и 60 °С.

В работе использовали стандартный образец бен-залкония хлорида (USP Benzalkonium Chloride RS) Фармакопеи США с содержанием действующего вещества (суммы гомологов) 10,0%. Навеску стандартного образца разводили водой до концентрации 2 мг/мл, затем до концентрации 0,05 мг/мл подвижными фазами.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Некоторые параметры хроматографирования бен-залкония хлорида на нитрильных колонках приведены в табл. 1. При выполнении анализа на колонке Hypersil BDS Cyano повышение температуры хрома-

тографирования от 20 до 60 °С сокращает время анализа в 1,9 раз (рис. 1 и 2). Эффективность колонки увеличивается, соответственно, от 1,14 раз (для гомолога С16) до 1,39 раз (для гомолога С12). Высоты пиков (а, следовательно, и чувствительность определения) возрастают от 1,97 до 2,07 раз. Повышение температуры не оказывает существенного влияния на разрешение между пиками гомологов бензалкония хлорида (табл. 1). Следует отметить, что на колонке с сорбентом 1вгЪах ББ-СЫ наблюдаются большие времена удерживания гомологов бензалкония хлорида по сравнению с другими нитрильными колонками.

Увеличение температуры анализа улучшает хроматографические параметры разделения для всех гомологов бензалкония хлорида. Однако вопрос о длительности эксплуатации колонок с нитрильными сорбентами при более высоких температурах (свыше 60 °С) требует дополнительного изучения, учитывая возможность гидролиза нитрильных групп при высоких температурах.

Необходимо отметить, что хроматографические колонки с нитрильными и фенильными сорбентами обладают определенной схожестью в условиях об-ращенно-фазовой хроматографии. Это обусловлено возможностью специфической сорбции за счет п-п взаимодействиями между п-связями функциональ-

Рис. 1. Хроматограмма стандартного образца бензалкония хлорида Условия анализа: колонка Иуретї ВББ Суапо 150*3,0мм, 5мкм; подвижная фаза: 100 мМ натрия ацетат в воде (рН 5,0) - ацетонитрил (48:52); скорость потока - 0,5мл/мин; детектирование при 254 нм. Температура разделения 20°С.

1 - гомолог П-С12Н25,

2 - гомолог П-С14Н29,

3 - гомолог п-С^Нзз

Рис. 2. Хроматограмма стандартного образца бензалкония хлорида Условия анализа: колонка Иуретї ВББ Суапо 150*3,0мм, 5мкм; подвижная фаза: 100 мМ натрия ацетат в воде (рН 5,0) - ацетонитрил (48:52); скорость потока - 0,5мл/мин; детектирование при 254 нм. Температура разделения 60 °С.

1 - гомолог П-С12Н25,

2 - гомолог П-С14Н29,

3 - гомолог П-С1Н3

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Ведомости НЦЭСМП

Таблица 1

ВРЕМЕНА УДЕРЖИВАНИЯ И РАЗРЕШЕНИЕ МЕЖДУ ПИКАМИ ГОМОЛОГОВ БЕНЗАЛКОНИЯ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ТЕМПЕРАТУРАХ ХРОМАТОГРАФИРОВАНИЯ*

Наименование колонки; температура анализа Время удерживания, мин Разрешение между пиками Разрешение между пиками гомологов

гомолога С12 гомолога С14 гомолога С16 и С14 С14 и С16

Hypersil BDS Cyano 150x3,0 мм, 5 мкм 20°С 8,65 11,72 15,88 4,43 6,01

Hypersil BDS Cyano 150x3,0 мм, 5 мкм 30°С 7,56 10,04 13,37 4,34 5,87

Hypersil BDS Cyano 150x3,0 мм, 5 мкм 40°С 6,61 8,63 11,32 4,18 5,65

Hypersil BDS Cyano 150x3,0 мм, 5 мкм 50°С 5,82 7,46 9,65 4,09 5,52

Hypersil BDS Cyano 150x3,0 мм, 5 мкм 60°С 5,24 6,62 8,41 3,95 5,29

Zorbax SB-CN 150x4,6 мм, 5 мкм 20°С 19,50 30,18 44,22 3,98 6,44

Zorbax SB-CN 150x4,6 мм, 5 мкм 50°С 11,75 17,69 27,48 4,5 6,34

Zorbax Eclipse XDB-CN 150x4,6 мм, 5 мкм 20°С 9,48 12,90 18,20 3,86 6,36

Zorbax Eclipse XDB-CN 150x4,6 мм, 5 мкм 50°С 6,55 8,61 11,76 3,68 6,10

*средняя величина пяти определений для каждого условия хроматографирования

Таблица 2

ВРЕМЕНА УДЕРЖИВАНИЯ И РАЗРЕШЕНИЕ МЕЖДУ ПИКАМИ ГОМОЛОГОВ БЕНЗАЛКОНИЯ ПРИ ХРОМАТОГРАФИРОВАНИИ НА ФЕНИЛЬНЫХ КОЛОНКАХ*

Наименование колонки; Время удерживания, мин Разрешение между пиками Разрешение между

температура анализа гомолога С12 гомолога С14 гомолога С16 гомологов С12 и С14 пиками гомологов С14 и С16

Zorbax SB-Phenyl 150x4,6 мм, 3,5 мкм 20°С 15,55 25,79 46,09 4,33 9,83

Zorbax SB-Phenyl 150x4,6 мм, 3,5 мкм 50°С 10,38 16,65 29,04 4,58 9,88

Ace 3 Phenyl 150x3,0 мм, 3 мкм 20°С 6,70 9,91 15,76 4,38 10,03

Ace 3 Phenyl 150x3,0 мм, 3 мкм 50°С 5,14 7,29 10,97 6,77 10,46

*средняя величина пяти определений для каждого условия хроматографирования

ных групп сорбентов и системами сопряженных двойных связей или нитрогрупп анализируемых соединений [8—10]. Молекулы гомологов бензалкония хлорида содержат фенильные группировки, это позволяет предположить, что и колонки с фенильными сорбентами также могут быть применены для анализа данного антисептика. В таблице 2 приведены результаты хроматографирования бензалкония хлорида на этих колонках. Так же, как для нитрильных колонок, увеличение температуры улучшает хроматографические параметры разделения для гомологов бензалкония хлорида на фенильных колонках. Аналогично колонке Zorbax SB-CN, на колонке Zorbax SB-Phenyl наблюдаются большие времена удерживания гомологов бензалкония хлорида, что, вероятно, вызвано

ЛИТЕРАТУРА______________________________________________________

1. Машковский МД. Лекарственные средства. 16-е изд. М.: Новая волна; 2010.

2. The United States Pharmacopoeia 37. National Formulary 32. Monograph: Benzalkonium Chloride.

3. The United States Pharmacopoeia 37. National Formulary 32. Monograph: Benzalkonium Chloride Solution.

4. European Pharmacopoeia. Edition 8.2: Monograph: Benzalkonium Chloride.

5. European Pharmacopoeia. Edition 8.2: Monograph: Benzalkonium Chloride Solution.

6. Ноздрин КВ, Великородный АА, Осипов АС, Родионова ГМ. Оптимизация условий хроматографирования бутилгидроксианизола и бутилгидрокситолуола при совместном присутствии. Фармация 2007; 5: 7-10.

7. Нечаева ЕБ, Осипов АС, Демина НБ. Анализ лекарственных препаратов из группы органических нитратов на хроматографических колонках с различными типами сорбентов. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии 2008; 4: 47-50.

8. Осипов АС, Орлов ЕН. Применение нитроалканов для анализа примесей в лекарственных препаратах нитратов изосорбида методом ВЭЖХ. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии 2010; 11: 28-32.

ОБ АВТОРАХ:_____________________________________________________

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Российская Федерация, 127051, Москва, Петровский бульвар, 8.

Осипов Алексей Сергеевич. Главный эксперт лаборатории химикофармацевтических препаратов № 2, канд. биол. наук.

Нечаева Екатерина Борисовна. Заместитель начальника Испытательного центра экспертизы качества лекарственных средств, канд. фарм. наук. Ковалёва Елена Леонардовна. Заместитель директора Центра экспертизы и контроля готовых лекарственных средств, д-р фарм. наук.

Победин Олег Александрович. Ведущий эксперт лаборатории химикофармацевтических препаратов № 2, канд. фарм. наук.

особенностями эндкепирования поверхности этих сорбентов (табл. 1 и 2).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Поввышение температуры хроматографирования до 45—50 °С позволяет сократить время анализа и повысить чувствительность определения бензалкония хлорида в глазных каплях. Наряду с нитрильными колонками, хроматографические колонки с фениль-ными сорбентами также могут быть использованы для разделения гомологов бензалкония хлорида. При количественном определении бензалкония хлорида длина хроматографической колонки может быть уменьшена до 150 мм, что дополнительно сокращает время анализа.

REFERENCES______________________________________________________

1. Mashkovsky MD. The medicines. 16th ed. Moscow: Novaya volna; 2010 (in Russian).

2. The United States Pharmacopoeia 37. National Formulary 32. Monograph: Benzalkonium Chloride.

3. The United States Pharmacopoeia 37. National Formulary 32. Monograph: Benzalkonium Chloride Solution.

4. European Pharmacopoeia. Edition 8.2: Monograph: Benzalkonium Chloride.

5. European Pharmacopoeia. Edition 8.2: Monograph: Benzalkonium Chloride Solution.

6. Nozdrin KV, Velikorodny AA, Osipov AS, Rodionova GM. Optimization of chromatographic conditions of butylhydroxyanisole and butylhydroxy-toluene in the co-presence. Farmatsiya 2007; 5: 7-10 (in Russian).

7. Nechaeva EB, Osipov AS, Demina NB. Analysis of medicines from the group of organic nitrates on chromatographic columns with different types of sorbent. Voprosy biologicheskoy, meditsinskoy i farmatsevtiches-koy himii 2008; 4: 47-50 (in Russian).

8. Osipov AS, Orlov EN. Application of nitroalkanes for analysis of impurities in pharmaceuticals isosorbide nitrates by HPLC method. Voprosy biologicheskoy, meditsinskoy i farmatsevticheskoy himii 2010; 11: 28-32 (in Russian).

AUTHORS:________________________________________________________

Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation, 8 Petrovsky Boulevard, Moscow, 127051, Russian Federation.

Osipov AS. Chief expert of laboratory of chemical and pharmaceutical products № 2. Candidate of Biological Sciences.

Nechaeva EB. Deputy chief of Test center of quality expertise of medicines. Candidate of Pharmaceutical Sciences.

Kovaleva EL. Deputy Director of Center of expertise and control of finished pharmaceutical products. Doctor of Pharmaceutical Sciences.

Pobedin OA. Leading expert of laboratory of chemical and pharmaceutical products № 2. Candidate of Pharmaceutical Sciences.

АДРЕС ДЛЯ ПЕРЕПИСКИ:

Осипов Алексей Сергеевич; Osipov@expmed.ru

Статья поступила 07.04.2014 г. Принята к печати 12.05.2014 г.

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ