ВАРИАНТЫ АЛЬБУМИНА

1. Способ получения полипептида, который является вариантом альбумина, его фрагментом или слитым полипептидом, содержащим данный вариант альбумина или его фрагмент, и обладает измененным сродством связывания с FcRn по сравнению со сродством связывания с FcRn у контрольного альбумина, его фрагмента или слитого полипептида, причем способ включает стадии:
(a) получение нуклеиновой кислоты, кодирующей исходный альбумин, который по меньшей мере на 80% идентичен последовательности SEQ ID NO: 2;
(b) модифицирование последовательности из стадии (а) так, чтобы она кодировала полипептид, который является вариантом альбумина, его фрагментом или слитым полипептидом, содержащим данный вариант альбумина или его фрагмент, содержащий одно или несколько изменений по одному или нескольким положениям, соответствующим положениям в SEQ ID NO: 2, выбранным из: (а) любой из позиций 75-91 (предпочтительно 83); (b) любой из позиций 492-538; (с) позиций 505, 531, 524, 472, 108, 190, 197 и 425; (d) любой из позиций 186-201; (е) любой из позиций 457-472; (f) любой из позиций 414-426; (g) любой из позиций 104-120; (h) любой из позиций 144-150; (i) любой из позиций 30-41, (j) любой из позиций 550-585, (k) любой из позиций 276, 410 и 414, на одно или несколько из числа А, С, D, Е, F, G, H, I, К, L, M, N, P, Q, R, S, Т, V, W, Y; при этом,
если полипептид содержит одно или несколько изменений, выбранных из:
(i) группы, состоящей из позиций 417, 464, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 и 584;
(ii) вставки или замены на Cys по одному или нескольким положениям из группы, состоящей из позиций 34, 38, 40, 75, 76, 80, 82, 83, 86, 90, 104, 113, 115, 116, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 538, 550, 560, 562, 564, 565, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585;
(iii) изменений по одному или нескольким положениям из числа 91, 200, 461, 514, 558, 559, 567, разрушающих дисульфидную связь; и/или
(iv) D63N, Е82К, Е84К, D87N, L90P, К106Е, R114G, Е119К, V146E, Н464А, H464N, C201F, D494N, Е501К, Е503К, Е505К, Н510А, I513N, D518N, К525Е, Е529К, V533M, Н535А, К536Е, I537N, D550G, D550A, V557M, К560Е, D563N, Е565К, Е570К, К573Е, K574N, К574Е, К584Е;
то полипептид также содержит одно или несколько изменений в положениях, выбранных из группы, состоящей из позиций 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 276, 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583, 585, и/или стоп-кодон, вставленный или замещенный в положении, выбранном из позиций 497-585;
(c) введение модифицированной последовательности из стадии (b) в подходящие клетки-хозяева;
(d) культивирование клеток в подходящей культуральной среде в условиях, ведущих к экспрессии полипептида; и
(e) выделение полипептида из культуральной среды;
при этом полипептид обладает измененным сродством связывания с FcRn и/или измененным временем полужизни в плазме по сравнению с временем полужизни у исходного альбумина, контрольного альбумина либо его фрагмента или слитого полипептида.
2. Способ по п.1, при этом, если полипептид содержит одно или несколько изменений, выбранных из (ii) группы, состоящей из позиций 34, 38, 40, 75, 76, 80, 82, 83, 86, 90, 91, 104, 113, 115, 116, 200, 461, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 514, 538, 550, 558, 559, 560, 562, 564, 565, 567, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585, или группы, состоящей из позиций 82, 114, 119, 464, 201, 505, 510, 513, 533, 535, 536, 550, 560, 563, 565, 573, 574; то полипептид также содержит одно или несколько изменений в положениях, выбранных из группы, состоящей из позиций 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 39, 41, 77, 78, 79, 81, 84, 85, 87, 88, 89, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 117, 118, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 201, 276, 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 472, 497, 502, 507, 508, 509, 511, 513, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 561, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583, и/или стоп-кодон, вставленный или замещенный в положении, выбранном из позиций 497-585.
3. Способ по п.1, при этом контрольным является HSA (SEQ ID No: 2) либо его фрагмент или слитый полипептид, содержащий HSA или его фрагмент, наиболее предпочтительно SEQ ID NO: 2.
4. Способ по любому из пп.1-3, при этом изменения представляют собой замены.
5. Полипептид, который является вариантом альбумина, его фрагментом или слитым полипептидом, содержащим данный вариант альбумина или его фрагмент, и обладает измененным сродством связывания с FcRn по сравнению со сродством связывания с FcRn у исходного альбумина, контрольного альбумина, его фрагмента или слитого полипептида, содержащего данный исходный альбумин, контрольный альбумин или его фрагмент, причем полипептид содержит одно или несколько изменений по одному или нескольким положениям, соответствующим положениям в SEQ ID NO: 2, выбранным из позиций: (а) 75-91 (предпочтительно 83); (b) 492-538; (с) 505, 531, 524, 472, 108, 190, 197 и 425; (d) 186-201; (e) 457-472; (f) 414-426; (g) 104-120; (h) 144-150; (i) 30-41, (j) 550-585, (k) любой из 276, 410 и 414, на одно или несколько из числа А, С, D, E, F, G, H, I, К, L, M, N, Р, Q, R, S, Т, V, W, Y; при этом,
если полипептид содержит одно или несколько изменений, выбранных из:
(i) группы, состоящей из позиций 417, 464, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 и 584;
(ii) вставки или замены на Cys по одному или нескольким положениям из группы, состоящей из позиций 34, 38, 40, 75, 76, 80, 82, 83, 86, 90, 104, 113, 115, 116, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 538, 550, 560, 562, 564, 565, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585;
(iii) изменений по одному или нескольким положениям из числа 91, 200, 461, 514, 558, 559, 567, разрушающих дисульфидную связь; и/или
(iv) группы, состоящей из позиций D63N, Е82К, Е84К, D87N, L90P, К106Е, R114G, Е119К, V146E, Н464А, H464N, C201F, D494N, Е501К, Е503К, Е505К, Н510А, I513N, D518N, К525Е, Е529К, V533M, Н535А, К536Е, I537N, D550G, D550A, V557M, К560Е, D563N, Е565К, Е570К, К573Е, K574N, К574Е, К584Е;
то полипептид также содержит одно или несколько изменений в положениях, выбранных из группы, состоящей из позиций 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 276, 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583, 585, и/или стоп-кодон, вставленный или замещенный в положении, выбранном из позиций 497-585.
6. Полипептид по п.5, при этом контрольным является HSA (SEQ ID No: 2) либо его фрагмент или слитый полипептид, содержащий HSA или его фрагмент, наиболее предпочтительно SEQ ID NO: 2.
7. Полипептид по п.6, при этом изменения представляют собой замены.
8. Полипептид по п.5, обладающий большим сродством связывания с FcRn и/или большим временем полужизни, чем исходный альбумин, контрольный альбумин, его фрагмент или слитый полипептид, содержащего данный исходный альбумин, контрольный альбумин или его фрагмент.
9. Полипептид по п.5, обладающий меньшим сродством связывания с FcRn и/или меньшим временем полужизни, чем исходный альбумин, контрольный альбумин, его фрагмент или слитый полипептид, содержащего данный исходный альбумин, контрольный альбумин или его фрагмент.
10. Полипептид по любому из пп.5-9, содержащий одно или несколько дополнительных изменений, обеспечивающих конъюгируемую тиоловую группу на полипептиде.
11. Полипептид по любому из пп.5-9, при этом последовательность полипептида идентична SEQ ID NO: 2 больше чем на 80%, предпочтительно больше чем на 90%, более предпочтительно больше чем на 95%, более предпочтительно больше чем на 96%, еще более предпочтительно больше чем на 97%, более предпочтительно больше чем на 98% и наиболее предпочтительно больше чем на 99%.
12. Полипептид по любому из пп.5-9, при этом фрагмент составляет по меньшей мере 20 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 50 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 100 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 200 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 300 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере 400 аминокислот и наиболее предпочтительно по меньшей мере 500 аминокислот.
13. Слитый полипептид, включающий полипептид по любому из пп.5-12 и полипептид-партнер по слиянию, выбранный из терапевтических, профилактических, диагностических, визуализирующих или других полезных молекул.
14. Конъюгат, включающий полипептид по любому из пп.5-13 и партнера по конъюгации.
15. Конъюгат по п.14, при этом партнером по конъюгации является терапевтическая, профилактическая, диагностическая, визуализирующая или другая полезная молекула.
16. Ассоциат, включающий полипептид по любому из пп.5-13 и терапевтическую, профилактическую, диагностическую, визуализирующую или другую полезную молекулу.
17. Наночастицы или микрочастицы, содержащие полипептид по любому из пп.5-12, слитый полипептид по п.13, конъюгат по п.14 или 15 либо ассоциат по п.16.
18. Композиция, содержащая полипептид, слитый полипептид, конъюгат, ассоциат либо наночастицы или микрочастицы по любому из пп.5-17, при этом у полипептида, слитого полипептида, конъюгата, ассоциата либо наночастиц или микрочастиц сродство связывания с FcRn больше, чем сродство связывания с FcRn у композиции, содержащей соответствующий исходный альбумин, контрольный альбумин, его фрагмент или слитый полипептид, конъюгат, ассоциат либо наночастицы или микрочастицы, содержащей данный исходный альбумин, контрольный альбумин либо его фрагмент или слитый полипептид.
19. Композиция по п.18, у которой сродство связывания полипептида, слитого полипептида, конъюгата, ассоциата либо наночастиц или микрочастиц с FcRn больше, чем сродство связывания HSA с FcRn.
D
D
D
D
D
D
20. Композиция по п.18, при этом у варианта полипептида, слитого полипептида, конъюгата, ассоциата либо наночастиц или микрочастиц коэффициент связывания с FcRn составляет менее 0,9×K для FcRn у HSA, более предпочтительно менее 0,5×K для FcRn у HSA, более предпочтительно менее 0,1×K для FcRn у HSA, еще более предпочтительно менее 0,05×K для FcRn у HSA, еще более предпочтительно менее 0,02×K для FcRn у HSA и наиболее предпочтительно менее 0,01×K для FcRn у HSA.
21. Композиция по п.18, содержащая полипептид или слитый полипептид по любому из пп.5-13, конъюгат по п.14 или 15, ассоциат по п.16 либо наночастицы или микрочастицы по п.17, которая дополнительно содержит соединение, содержащее домен связывания антител (ABD) и терапевтическую, профилактическую, диагностическую, визуализирующую или другую полезную молекулу.
22. Композиция по любому из пп.18-21, содержащая фармацевтически приемлемый носитель.
23. Применение полипептида или слитого полипептида по любому из пп.5-13, конъюгата по п.14 или 15, ассоциата по п.16 либо наночастиц или микрочастиц по п.17 либо композиции по любому из пп.18-22 для изменения сродства связывания с FcRn или времени полужизни, предпочтительно в плазме, у терапевтической, профилактической, диагностической, визуализирующей или другой полезной молекулы.
24. Применение по п.23, при этом сродство связывания с FcRn повышается относительно сродства связывания с FcRn у контрольного HSA (SEQ ID NO: 2) либо его фрагмента, слитого полипептида, конъюгата, ассоциата, наночастиц или микрочастиц.
25. Применение по п.23, при этом сродство связывания с FcRn снижается относительно сродства связывания с FcRn у контрольного HSA (SEQ ID NO: 2) либо его фрагмента, слитого полипептида, конъюгата, ассоциата, наночастиц или микрочастиц.
26. Способ изменения сродства связывания с FcRn или времени полужизни, предпочтительно в плазме, у молекул, который включает:
(a) если молекула представляет собой полипептид, то слияние или конъюгирование молекулы с полипептидом по любому из пп.5-12 или с конъюгатом по п.14 или 15; ассоциирование молекулы с полипептидом по любому из пп.5-13 или с конъюгатом по п.14 или 15; включение молекулы в ассоциат по п.16, в наночастицы или микрочастицы по п.17 или в композицию по любому из пп.18-22;
(b) если молекула не представляет собой полипептид, то конъюгирование молекулы с полипептидом по любому из пп.5-13 или с конъюгатом по п.14 или 15; ассоциирование молекулы с полипептидом по любому из пп.5-13 или с конъюгатом по п.14 или 15; включение молекулы в ассоциат по п.16, в наночастицы или микрочастицы по п.17 или в композицию по любому из пп.18-22.
27. Способ по п.26, при этом молекула представляет собой терапевтическую, профилактическую, диагностическую, визуализирующую или другую полезную молекулу.
28. Полипептид, слитый полипептид, конъюгат, ассоциат, наночастицы или микрочастицы либо их композиция по любому из пп.5-22, при этом полипептид, слитый полипептид, конъюгат, ассоциат, наночастицы или микрочастицы либо композиция включает одну или несколько молекул, выбранных из числа тех, что описаны здесь.
29. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид или слитый полипептид по любому из пп.5-13.
30. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.29.
31. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.29 или вектор по п.30.
32. Клетка-хозяин по п.31, где клеткой-хозяином является эукариотическая, предпочтительно дрожжевая (как-то Saccharomyces cerevisiae) клетка или клетка млекопитающих (как-то СНО или НЕК) либо растительная клетка (как-то рисовая).
33. Способ профилактики, лечения или диагностики, включающий введение субъекту полипептида, слитого полипептида, конъюгата, композиции, ассоциата, наночастиц или микрочастиц либо полинуклеотида по любому из пп.5-22 или 28-29.
34. Способ получения полипептида, который является вариантом альбумина, его фрагментом или слитым полипептидом, содержащим вариант альбумина или его фрагмент, и обладает измененным сродством связывания с FcRn по сравнению со сродством связывания с FcRn у контрольного альбумина, его фрагмента или слитого полипептида, включающий стадии:
(a) идентификацию положений одного или нескольких аминокислотных остатков, важных для связывания альбумина с FcRn, у альбумина либо его фрагмента или альбуминовой части слитого полипептида, содержащего альбумин или его фрагмент путем:
(i) получения трехмерной структуры (модели) альбумина, как-то остатков 1-585 HSA (SEQ ID No. 2);
(ii) получения трехмерной структуры (модели) FcRn, причем структура выполняется при рН, равном или меньше 6,3;
(iii) использования структуры альбумина (i) и структуры FcRn (ii) для моделирования структуры комплекса, образующегося при связывании альбумина с FcRn, получая при этом модель стыковки;
(iv) использования модели стыковки для идентификации тех аминокислотных остатков у альбумина, которые взаимодействуют с FcRn или влияют на взаимодействие альбумина с FcRn;
(b) получение нуклеиновой кислоты, кодирующей данный полипептид;
(c) модифицирование нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (b), так, чтобы по одному или нескольким аминокислотным остаткам, расположенным в положениях, установленных на стадии (а), были изменения;
(d) экспрессирование модифицированной нуклеиновой кислоты в подходящих клетках-хозяевах; и
(e) выделение полипептида.
35. Способ по п.34, при этом предусмотренная трехмерная структура (модель) FcRn выполняется при рН от 3,7 до 4,7.
36. Способ по п.34, при этом контрольным является HSA (SEQ ID No: 2) либо его фрагмент или слитый полипептид, содержащий HSA или его фрагмент, наиболее предпочтительно SEQ ID NO: 2.
37. Способ по п.34, при этом изменения представляют собой замены.
38. Способ по любому из пп.34-37, при этом стадия (а) дополнительно включает:
(v) сравнение первичной структуры и/или третичной структуры второго альбумина (например, не альбумина человека) с первичной структурой и/или третичной структурой альбумина из стадии (i) для идентификации аминокислот, эквивалентных аминокислотам, идентифицированным на стадии (iv); и/или
(vi) получение полипептида, содержащего одно или несколько изменений, идентифицированных на стадии (iv) или (v), и проверка (например, посредством анализа сродства связывания) того, что у полученного полипептида изменилось сродство связывания с FcRn по сравнению со сродством связывания с FcRn у альбумина из стадии (i).