Антагонистическая активность молочных культур Lactobacillus acidophilus по отношению к тест-штаммам Escherichia coli

УДК 543.472.3

А.Н. Иркитова, Я.Р. Каган, Г.Г. Соколова Антагонистическая активность молочных культур Lactobacillus acidophilus по отношению к тест-штаммам Escherichia coli

A.N. Irkitova, Ja.R. Kagan, G.G. Sokolova Antagonistic Activity of Dairy Cultures Lactobacillus Acidophilus in Relation to Test-strains Escherichia Coli

Установлено, что все исследованные штаммы L.acidophilus проявляют антагонистический эффект к тест-штаммам E. rnli. Нейтрализация молочной кислоты ослабляет антагонистический эффект. Тест-штамм E. rnli А-1, выделенный из творога, значительно более устойчив к угнетающему действию L.acidophilus по сравнению с коллекционным штаммом Pb-6. Ключевые слова: Lactobacillus acidophilus, Escherichia coli, антагонизм, молочная кислота.

It is established that all investigated strains L.acidophilus show antagonistic effect to test-strains E. rnli. Neutralization of dairy acid weakens antagonistic effect. Test-strain E. mli A-1 allocated from cottage cheese is more stable against oppressing action of L.acidophilus in comparison with collection strain Pb-6.

Key words: Lactobacillus acidophilus, Escherichia coli, antagonism, lactic acid.

Селектированные штаммы Lactobacillus acidophilus используют для приготовления пробиотических продуктов. Одним из обязательных условий отбора таких штаммов является наличие у них выраженной антагонистической активности по отношению к вредной микрофлоре кишечника. Антагонизм обусловлен продуцированием молочной кислоты, которая сама по себе обладает определенным бактерицидным действием и, кроме того, вызывает снижение рН среды до значений, неблагоприятных для многих видов микроорганизмов. Помимо молочной кислоты, некоторые штаммы L.acidophilus продуцируют перекись водорода (известную как сильный антисептик) и другие пере-кисные соединения [1, с. 37], а также специфические полипептиды (бактериоцины), различающиеся по силе и спектру антибиотического действия [2, с. 20]. Для пробиотических целей представляют интерес штаммы ацидофильной палочки, обладающие специфическим антагонизмом.

Цель данного исследования - сравнить антагонистическое действие коллекционных штаммов L.acidophilus на тест-штаммы Escherichia coli в условиях нейтрализации молочной кислоты, продуцируемой лактобациллами, и без нее.

Материалы и методы исследования. В работе использовали 11 штаммов L.acidophilus из коллекции лаборатории микробиологии СибНИИ сыроделия, в том числе 3 дубликата промышленного штамма Ер 317/402 («Нарине»), поступившие в коллекцию

из разных источников. Тест-штаммами кишечной палочки служили коллекционный штамм Pb-6 и дикий штамм А-1, выделенный нами из образца коммерческого творога.

Культуры ацидофильных палочек поддерживали периодическими перевивками (1 раз в 14 суток) в стерильное обезжиренное молоко с инкубацией при температуре 37 °С до образования сгустка (1820 час.), а культуры тест-штаммов E.coli - перевивками с такой же периодичностью в модифицированный бульон Богданова [3, с. 213] с инкубацией в течение 17 часов при температуре 37 °С. Между перевивками все выросшие культуры хранили в холодильнике при температуре 4-6 °С.

Для учета численности клеток в культурах ацидофильных палочек использовали чашечный метод (модифицированный агар Богданова, глубинный посев серийных 10-кратных разведений проб, инкубация в течение 24 часов при температуре 37 °С, подсчет колоний, выросших на чашке с подходящим разведением).

Численность клеток E. coli в пробах устанавливали путем посева серийных 10-кратных разведений проб в пробирки с жидкой селективной средой Кесслера с поплавками, инкубации посевов в течение 24 час. при температуре 37 °С, учета бактериального роста в пробирках по наличию газа в поплавках и определения наиболее вероятного числа клеток (НВЧ) в пробах по таблице МакКреди [4, с. 73].

Антагонистическую активность исследуемых штаммов L. acidophilus оценивали по степени подавления роста тест-штаммов E. coli в жидкой селективной среде Кесслера в присутствии обычных или нейтрализованных молочных культур ацидофильных палочек с учетом соотношения клеток L. acidophilus/ E. coli. Анализ проводили следующим образом: в пробирки с жидкой селективной средой Кесслера, засеянные серийными 10-кратными разведениями того или иного тест-штамма E. coli, одновременно с засевом тест-штаммов вносили по 1 мл индивидуальной 24-часовой обычной или нейтрализованной молочной культуры исследуемого штамма ацидофильной палочки. Инкубацию и определение НВЧ тест-штаммов E. coli осуществляли, как описано выше. О степени антагонистической активности L. acidophilus судили по минимальному соотношению антагонист/тест-культура, при котором происходило полное подавление роста тест-культуры.

Контролем служил посев серийных 10-кратных разведений тест-культуры E. coli в пробирки с жидкой селективной средой Кесслера с поплавками, инкубация посева в течение 24 час. при температуре 37 °С.

Нейтрализацию кислых продуктов метаболизма (молочной кислоты) в молочных культурах исследуемых штаммов L. acidophilus проводили, смешивая 20 мл 24-часовой молочной культуры с 1 мл стерильного 10% раствора NaOH.

Активную кислотность проб измеряли с помощью рН-метра-милливольтметра рН-410 производства НПКФ «АКВИЛОН», титруемую кислотность, выражаемую в градусах Тернера (°Т), методом титрования по ГОСТ3624-67.

Результаты исследований

1. Исходная численность клеток антагониста и тест-штамма

Предварительно установлено, что в суточных молочных культурах исследуемых штаммов L. acidophilus содержалось от 8,6107 (штамм 630) до 1,3109 (штамм В-842) КОЕ/мл. Таким образом, при постановке опыта по определению антагонистической активности в пробирки со средой Кесслера, засеянные различными разведениями тест-штаммов E. coli, в среднем попадало 108 КОЕ того или иного штамма-антагониста (плюс продукты их метаболизма, содержащиеся в 1 мл культуральной жидкости). В свою очередь, определение численности клеток (НВЧ) в 24-часовых бульонных культурах использованных в работе двух тест-штаммов E. coli показало, что они близки по этому показателю и содержат около 108 клеток/мл. Следовательно, при посеве в среду Кесслера в пробирки попадало в зависимости от разведения от 108 до 101 клеток кишечной палочки. Эти данные использовались для расчета минимального соотношения клеток (далее МСК) антагониста/тест-культуры,

при котором наблюдалось полное подавление роста тест-штамма E. coli.

2. Активная и титруемая кислотности 24-часовых молочных культур ацидофильных палочек до и после нейтрализации

Результаты определения активной и титруемой кислотности 24-часовых молочных культур исследуемых штаммов L. acidophilus до и после их нейтрализации раствором NaOH показали, что штаммы L. acidophilus существенно различаются по кислотообразующей способности. Добавление к 24-часовым молочным культурам заданного количества щелочи (1 мл 10% раствора Na0H/20 мл культуры) привело к более или менее полной нейтрализации молочной кислоты только у 3 штаммов ацидофильной палочки (Угличский, Ер 317/402-1 и Омский), тогда как у остальных штаммов отмечено изменение рН культуральной жидкости в щелочную сторону (табл. 1).

3. Антагонистическая активность ацидофильных палочек до нейтрализации

Все исследованные штаммы L. acidophilus проявляли антагонистический эффект по отношению к тест-штаммам E. coli в разной степени (табл. 2). В варианте с тест-штаммом E. coli Pb-6 большинство штаммов ацидофильной палочки (7 из 11) были наиболее активны: они полностью подавляли тест-штамм уже при соотношении 1:1 (МСК=1). В варианте с тест-штаммом E. coli А-1 4 из 11 штаммов ацидофильной палочки подавляли тест-штамм при соотношении 1:1 (МСК=1).

Следует отметить, что 2 из 3-х дубликатов штамма Ер 317/402 проявили одинаковую антагонистическую активность и полностью подавляли оба тест-штамма E. mli при соотношении 1:1 (МСК=1). Третий дубликат Ер 317/402-3 проявил себя слабее, несмотря на самую высокую титруемую кислотность среди дубликатов этого штамма.

4. Антагонистическая активность ацидофильных палочек после нейтрализации

Нейтрализация культур привела к заметному ослаблению ингибирования тест-штаммов кишечной палочки у всех исследованных штаммов L. acidophilus за исключением штаммов Угличский и Омский, однако в целом не изменила порядок распределения исследуемых штаммов по степени проявления ими антагонистической активности (табл. 3).

Штамм Угличский сохраняет 100% антагонистический эффект к обоим тест-штаммам E. rnli как при нейтрализации молочной кислоты, так и без ее нейтрализации.

В целом следует отметить, что в обоих экспериментах тест-штамм E. rnli А-1, выделенный из творога, значительно более устойчив к угнетающему действию L. acidophilus по сравнению с коллекционным штаммом Pb-6. Это может быть связано с тем, что

штамм А-1 выделен из естественной среды обитания, степенью устойчивости к заквасочным пробиотиче-

к которой он хорошо адаптирован, и обладает высокой ским культурам, в том числе к L. acidophilus.

Таблица 1

Активная и титруемая кислотности 24-часовых молочных культур ацидофильных палочек до и после нейтрализации раствором NaOH

№ Штамм L. acidophilus Активная кислотность, ед. рН Титруемая кислотность, оТ

до нейтрализации после нейтрализации до нейтрализации после нейтрализации

1 97 3,75 4,85 230 70

2 630 4,25 4,90 130 70

3 Угличский 3,90 6,60 180 50

4 Омский 3,60 6,00 190 52

5 Ер 317/402-1 3,60 6,30 200 40

6 Ер 317/402-2 3,79 5,59 190 68

7 Ер 317/402-3 3,60 5,70 210 50

8 ВМ-2 3,65 4,80 230 70

9 НВМ-3 3,75 5,10 210 60

10 В-842 3,90 5,70 190 69

11 В-845 3,55 5,70 220 70

Таблица 2

Антагонистическая активность L. acidophilus в отношении E. rnli без нейтрализации молочной кислоты

Таблица 3

Антагонистическая активность L. acidophilus в отношении E. rnli при нейтрализации молочной кислоты

№ Штамм L. acidophilus Минимальное соотношение клеток антагонист/тест-культура E. тН, вызывающее полное подавление роста тест-культуры

Pb-6 А-1

1 97 <10‘ 102

2 Угличский <10' <10‘

3 630 103 104

4 В-842 <10‘ 103

5 В-845 <10‘ 102

6 ВМ-2 102 104

7 НВМ-3 102 103

8 Омский <10‘ <10‘

9 Ер 317/402 - 1 <10‘ <10‘

10 Ер 317/402 - 2 <10‘ <10‘

11 Ер 317/402 -3 102 104

№ Штамм L. acidophilus Минимальное соотношение клеток антагонисти/тест-культура E. тН, вызывающее полное подавление роста тест-культуры

Pb-6 А-1

1 97 102 104

2 Угличский <10‘ <10‘

3 630 104 107

4 В-842 106 108

5 В-845 106 107

6 ВМ-2 103 105

7 НВМ-3 103 106

8 Омский <10‘ 101

9 Ер 317/402 - 1 102 103

10 Ер 317/402 - 2 106 107

11 Ер 317/402 - 3 106 107

Таким образом, антагонистический эффект ацидофильной палочки во многом обусловлен выделением ею молочной кислоты, создающей неблагоприятные

условия для кишечной палочки. Антагонистический эффект сохраняется при нейтрализации молочной кислоты, но степень этого эффекта значительно понижается.

Библиографический список

1. Jack M., Wood B.J.B., Berry D.R. Evidence for the involvement of thiocyanate in the inhibition of Candida albicans by Lactobacillus acidophilus // Microbios. - 1990. - №250.

2. Машенцева Н.Г. Скрининг молочнокислых микроорганизмов - продуцентов бактериоцинов, перспективных для использования в мясной промышленности // Биотехнология. - 2006. - №6.

3. Иркитова А.Н., Каган Я.Р., Сергеева И.Я. Свойства, экологические аспекты и практическое значение ацидофиль-

ной палочки. Систематика и культивирование // Актуальные проблемы техники и технологии переработки молока. -Вып. 8. - Барнаул, 2001.

4. Методические рекомендации по организации производственного микробиологического контроля на предприятиях молочной промышленности (с атласом значимых микроорганизмов). МР 2.3.2.2327-08. 2008. ГНУ ВНИИМС. 184 с.