ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА
THERAPEUTIC ANTIBODIES

Область изобретения
Изобретение относится к области терапевтических антител.
Уровень техники
Протеолиз каждого из белков комплемента С3-С5 приводит к образованию аминоконцевых катионных фрагментов с сигнальными молекулами, которые называются анафилотоксинами. Наиболее мощный из них, С5а, вызывает самые обширные ответы. Учитывая компоненты воспалительной реакции, такие как маргинация (краевое стояние) и инфильтрация лейкоцитов, высвобождение связанных с гранулами протеолитических ферментов, образование активированного кислорода и радикалов-производных азота, изменения в кровотоке и капиллярная утечка, а также способность гладких мышц сокращаться, молекула С5а является «полным» провоспалительным медиатором. На уровнях от субнаномолярного до наномолярного молекула С5а вызывает хемотаксис всех миелоидных линий (нейтрофилов, эозинофилов и базофилов, макрофагов и моноцитов) и сосудистую проницаемость, которая заметно усиливается простагландинами и циркулирующими лейкоцитами. Более высокие наномолярные концентрации вызывают дегрануляцию и активацию NADPH-оксидазы. Эта широта биологической активности контрастирует с другими медиаторами воспаления. С5а участвует в патогенезе различных заболеваний, включая ревматоидный артрит, псориаз, сепсис, реперфузионное повреждение и респираторный дистресс-синдром взрослых (Gerard and Gerard, 1994; Murdoch and Finn, 2000).
Активности С5а опосредованы связыванием С5а с его рецептором (C5aR). C5aR принадлежит семейству рецепторов, связанных с G-белком, с семью трансмембранными доменами. C5aR является высокоаффинным рецептором к С5а с Kd примерно 1 нМ и располагается на нескольких различных типах клеток, включая лейкоциты. Число рецепторов на каждой клетке является чрезвычайно высоким, до 200000 сайтов на одном лейкоците. Биологическая активация рецептора происходит в диапазоне, насыщающем связывание.
Структура C5aR соответствует семейству рецепторов с семью трансмембранными доменами, где за внеклеточным N-концом следуют семь трансмембранных спиралей, соединенных межспиральными доменами, которые чередуются как внутриклеточные и внеклеточные петли, заканчиваясь внутриклеточным С-концевым доменом. C5aR содержит расширенный N-концевой внеклеточный домен. Этот большой N-концевой домен является типичным для рецепторов, связанных с G-белками, которые связывают пептиды, включая семейства рецепторов IL-8 и fMet-Leu-Phe (FMLP).
Ингибирование ответов С5а антагонистами C5aR снижает острый воспалительный ответ, опосредованный через С5а, не затрагивая другие компоненты комплемента. С этой целью пептидные антагонисты C5aR и антитела против рецептора С5а были описаны ранее (Watanabe et al., 1995; Pellas et al., 1998; Konteatis et al., 1994; Kaneko et al., 1995; Morgan et al., 1993). Например, WO 95/00164 описывает антитела, направленные против М-концевого пептида (остатки 9-29) C5aR. WO 03/062278 также описывает антитела, направленные против C5aR. Три из этих мышиных антител были названы 7F3, 6С12 и 12D4. Было показано, что эти антитела обладают превосходными свойствами, такими как очень эффективное блокирование связывания С5а с его рецептором, остановка С5а-направленной миграции нейтрофилов in vitro и профилактика воспаления на животных моделях. Для контроля хронических заболеваний может быть необходимым введение антитела в повторных отборах в течение нескольких месяцев или лет.Тем не менее, одним недостатком введения мышиных антител является то, что иммунная система человека может образовывать свои собственные антитела, направленные против мышиного антитела (НАМА-реакция). НАМА-ответ может нейтрализовать мышиные антитела путем быстрого удаления их из крови, тем самым предотвращая связывание мышиного антитела с его мишенью. Чтобы избежать развития НАМА-реакции, была принята одна стратегия для «гуманизации» («очеловечивания») мышиного антитела путем замены «чужих» остатков на участках, не связывающих эпитоп, на человеческие последовательности.
Основной проблемой процедур гуманизации была потеря аффинности к антигену (Jones et al., 1986), в некоторых случаях в 10 раз или более, особенно когда антиген является белком (Verhoeyen et al., 1988). Потеря любой аффинности, конечно, крайне нежелательна. По меньшей мере это означает, что в организм пациента должно быть введено большее количество гуманизированного антитела при более высокой стоимости и более высоком риске побочных эффектов. Еще более важно, что антитело со сниженной аффинностью может иметь более слабые биологические функции, такие как лизис комплемента, антителозависимая клеточная цитотоксичность или нейтрализация вируса. Не смотря на эти трудности, успешная гуманизация антител против человеческого C5aR была описана в WO 2009/103113.
На протяжении многих лет было разработано множество стратегий для дальнейшего снижения риска любых нежелательных побочных реакций от введения пациентам антител, включая снижение вероятности образования антител против лекарства у пациентов путем создания «полностью» человеческих антител.
Даже сегодня идентификация антител, пригодных для терапевтического применения, является сложной задачей. Поэтому альтернативные и/или улучшенные антагонисты C5aR, которые могут быть использованы в диагностических и/или терапевтических способах, сохраняют большой интерес.
Сущность изобретения
Данное изобретение относится к анти-C5aR-антителам и их применению в диагностических и/или терапевтических способах. Изобретатели выявили ряд антител, связывающих человеческий C5aR, которые в нескольких аспектах функционально превосходят антитела к C5aR, описанные ранее.
Как показано в данном документе, изобретатели выявили ряд человеческих антител, которые связываются с человеческим C5aR (hC5aR) и могут вытеснять hC5a, связанный с hC5aR, и ингибировать hC5a-опосредованную миграцию нейтрофилов. Кроме того, изобретатели успешно преобразовали нечеловеческие остатки, присутствующие в каркасной области одного из этих анти-hC5aP-антител, в остатки зародышевой линии человека без влияния на активность антитела.
Кроме того, изменяя Fc-область, изобретатели создали анти-hC5aP-антитело, которое не вызывает фагоцитоз, ADCC или CDC in vitro. Детали изобретения будут очевидны из описания примерных воплощений.
Аспект данного изобретения относится к антителу, в котором вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где указанные последовательности CDR включают одну из следующих групп последовательностей: SEQ ID 1, 2 и 3, SEQ ID 9, 10 и 11, SEQ ID 17, 18 и 19, SEQ ID 25, 26 и 27, или варианты каждой из указанных последовательностей, где 1, 2 или 3 аминокислоты замещены другими аминокислотными остатками.
Аспект данного изобретения относится к антителу, в котором вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где указанные последовательности CDR включают одну из следующих групп последовательностей: SEQ ID 5, 6 и 7, SEQ ID 13, 14 и 15, SEQ ID 21, 22 и 23, SEQ ID 29, 30 и 31, или варианты каждой из указанных последовательностей, где 1, 2 или 3 аминокислоты замещены другими аминокислотными остатками.
Аспект данного изобретения относится к человеческому антителу, специфически связывающемуся с hC5aR, где указанное антитело связывает предпочтительно вторую внеклеточную петлю hC5aR.
Аспект данного изобретения относится к антителу, специфически связывающемуся с hC5aR, где Fc-область антитела была модифицирована по сравнению с IgG1, IgG2, IgG4 и референсными последовательностями IgG4/G2 для уменьшения способности антител индуцировать фагоцитоз, ADCC и/или CDC через взаимодействие с рецептором Fcgamma (FcγR). В конкретном воплощении Fc-область антитела представляет собой IgG1, а в другом конкретном воплощении Fc-область содержит одну или более чем одну из следующих групп точечных мутаций:
I) N297Q и/или
II) L234A и L235E и/или
III) G236R и L328R и/или
IV) N297Q, L234A и L235E и/или
V) N297Q, L234A, L235E и G237A и/или
VI) L234A, L235E, G237A, АЗЗО и P331S
В другом аспекте изобретение относится к применению антител в соответствии с изобретением для лечения иммунологического заболевания или нарушения.
В другом аспекте данное изобретение относится к способу лечения заболевания или нарушения, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтического количества антитела, описанного в данном документе.
В другом аспекте данное изобретение относится к способу лечения или профилактики нарушения у субъекта, причем способ включает введение субъекту антитела изобретения. В одном воплощении нарушение представляет собой иммунопатологическое нарушение, такое как аутоиммунное заболевание.
Другие аспекты и воплощения изобретения будут очевидны из приведенного здесь описания, включая примерные воплощения. Как следует из описания, изобретение предусматривает новые терапевтические антитела с различными выгодами и преимуществами, охарактеризованными в данном документе.
Краткое описание графических материалов
На фиг.1 показаны выравнивания вариабельных областей выбранных моноклональных антител, выделенных и охарактеризованных в приложении.
На фиг.2 показана специфичность связывания выбранных антител м мышиными/человеческими химерами C5aR. Связывание 32F3A6, 35F12A2 и 35F32A3 с химерным человеческим/мышиным C5aR по сравнению со связыванием референсного антитела Q. Химерные рецепторы показаны схематично. Области, полученные из человеческого и мышиного C5aR, показаны тонкой линией и жирной линией, соответственно.
На фиг.3 показаны выравнивания вариабельных областей из одного антитела с тяжелой и легкой вариабельными последовательностями ближайшего антитела человеческой зародышевой линии. «/» обозначает «разрыв в последовательности», например, между V-, D- или J-сегментами.
Фиг.4. Клинические показатели для трех групп испытуемых, получающих однократную нагрузочную дозу (стрелка) 0,5, 1,5 или 10 мг/кг внутрибрюшинно через 5 дней после установленного воспаления, на модели с переносом сыворотки K/BxN-hC5aR-KO/KI, с последующим введением 9 ежедневных доз 0,25, 0,5 или 2 мг/кг, соответственно, со столбцами ошибок, представляющими ±SD. За контроли принимали IgG1 3G12.
Фиг.5. Экспрессия белка С5а в синовиальной жидкости пациентов с псориатическим артритом и остеоартритом (контроли). Уровень С5а был значительно повышен в группе пациентов с псориатическим артритом (р=0,001; критерий Манна-Уитни).
Фиг.6. Полуколичественный анализ экспрессии белка C5aR при болезни Крона и язвенном колите. Экспрессия белка C5aR была исследована с помощью иммуногистохимии и проанализирована с помощью теста Крускала-Уоллиса с последующим множественным сравнением с помощью критерия Данна в GraphPad Prism 5, и Р<0,05 считали значимым. Р<0,05; ** Р<0,01; *** Р<0,001.
Определения
Если не указано иное, то рекомбинантный белок, клеточная культура и иммунологические методики, используемые в данном изобретении, являются стандартными процедурами, хорошо известными специалистам в данной области. Такие методики описаны и разъяснены в литературе в таких источниках как J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 и 1996), и F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols в Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley- Interscience (1988, включая все обновления вплоть до настоящего времени), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), и J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols в Immunology, John Wiley and Sons (включая все обновления вплоть до настоящего времени).
Используемые в данном документе термины «С5а-рецептор», «C5aR», «C5aRI» или «человеческий C5aR» и их варианты относятся к человеческому рецептору 1 компонента комплемента 5, который также известен в данной области как рецептор анафилатоксина С5а и антиген CD88. C5aR принадлежит к семейству рецепторов, связанных с G-белком, с семью трансмембранными доменами, и связывает С5а (Gerard and Gerard, 1991). Пример аминокислотной последовательности человеческого C5aR представлен в SEQ ID №41, тем не менее, специалисту в данной области будет ясно, что в природе существуют аллельные варианты этой молекулы, которые также охватываются термином «C5aR». Различные домены человеческого C5aR определены следующим образом:
аминокислоты 1-37: N-конец внеклеточного домена,
аминокислоты 38-61: трансмембранный домен,
аминокислоты 62-71: внутриклеточный домен,
аминокислоты 72-94: трансмембранный домен,
аминокислоты 95-110: внеклеточный домен - внеклеточная петля 1,
аминокислоты 111-132: трансмембранный домен,
аминокислоты 133-149: внутриклеточный домен,
аминокислоты 150-174: трансмембранный домен,
аминокислоты 175-206: внеклеточный домен - внеклеточная петля 2,
аминокислоты 207-227: трансмембранный домен,
аминокислоты 228-242: внутриклеточный домен,
аминокислоты 243-264: трансмембранный домен,
аминокислоты 265-283: внеклеточный домен - внеклеточная петля 3,
аминокислоты 284-307: трансмембранный домен,
аминокислоты 308-350: - С-конец внутриклеточного домена.
Термин «лечение», используемый в данном документе, относится к медикаментозной терапии любого человека или животного, нуждающегося в этом. Ожидается, что указанный субъект прошел медицинский осмотр врачом или ветеринаром, который поставил предварительный или окончательный диагноз, который указывал бы, что применение указанного специфического лечения будет полезно для здоровья указанного человека или животного. Сроки и цель указанного лечения могут варьировать от одного лица к другому в зависимости от состояния здоровья субъекта. Таким образом, указанное лечение может быть профилактическим, паллиативным, симптоматическим и/или терапевтическим. С точки зрения данного изобретения профилактическое, паллиативное, симптоматическое и/или терапевтическое лечение может представлять отдельные аспекты изобретения.
В отношении терапевтического лечения термин «субъект», используемый в данном документе, означает любых животных, в частности млекопитающих, таких как люди, лошади, коровы, собаки и кошки, и может, при необходимости, быть использовано взаимозаменяемо с термином «пациент». Предпочтительно субъектом является человек. Используемые в данном документе термины «лечение», «лечить» или «леченный» и их вариации включают введение терапевтически эффективного количества антитела изобретения, достаточного для снижения или устранения по меньшей мере одного симптома заболевания.
Используемые в данном документе термины «профилактический» или «профилактика» или их вариации относятся к защите субъекта от развития по меньшей мере одного симптома заболевания, или к снижению тяжести симптомов нарушения.
Используемый в данном документе термин «воздействие на клетку» относится к такому предоставлению антитела, чтобы оно могло контактировать/связывать человеческий C5aR при условии, что C5aR присутствует на клетке.
Термин «50 процентов эффективной концентрации» (сокращенно «ЕС50») представляет собой концентрацию антитела изобретения, которая требуется для 50 процентов данного эффекта молекулы, на которую нацелено антитело (например, ингибирующее/замещающее связывание человеческого С5а с человеческим C5aR). Специалисту в данной области следует понимать, что более низкое значение ЕС50 соответствует более сильному антителу.
Используемый в данном документе термин «ингибирование» относится к значительному снижению и, возможно, полной отмене определенной активности. Предпочтительно, определенная активность снижается или ингибируется по меньшей мере на 50 процентов, более предпочтительно по меньшей мере на 75 процентов и даже более предпочтительно по меньшей мере на 90 процентов.
В данном описании слово «содержат» или его вариации, такие как «содержит» или «содержащий», следует понимать как включающие указанный элемент, число или этап, или группу элементов, чисел или этапов, но не исключающее любой другой элемент, число или этап, или группу элементов, чисел или этапов.
В одном воплощении молекула состоит по существу из определенной последовательности.
В другом воплощении молекула состоит из определенной последовательности.
В одном воплощении молекула, такая как последовательность антитела или ДНК, является выделенной молекулой. Термин «выделенное антитело» относится к антителу, которое было отделено и/или извлечено из другого/других компонента(ов) его природной среды и/или очищено из смеси компонентов в его природной среде.
Термин «антитело», используемый в данном документе, включает целые антитела и любые антигенсвязывающие фрагменты (т.е. «антигенсвязывающую часть») или их одинарные цепи. Антитела полной длины (или целые антитела) содержат четыре полипептидные цепи, две тяжелые цепи (Н) и две легкие цепи (L), связанные друг с другом дисульфидными мостиками. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи (СН). Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи (CL). Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, СН1, СН2 и СН3. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенной в данном документе как LCVR или VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, CL. VH- и VL-области также могут быть подразделены на области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR, complementarity determining region), которые перемежаются более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR, framework region).
Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных в направлении от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (Clq) классической системы комплемента.
Используемый в данном документе термин «антитело» используется для описания целых антител или их антигенсвязывающих фрагментов (т.е. «антигенсвязывающей части») или их одиночных цепей, которые специфически связываются с соответствующим антигеном. Примеры антигенсвязывающих фрагментов включают Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, F(ab)S, Fv (как правило, VL- и VH-домены одной ветви антитела), одноцепочечный Fv (scFv; см., например, Bird et al., Science 1988; 242:423-426; и Huston et al. PNAS 1988; 85:5879-5883), dsFv, Fd (как правило, VH- и СН1-домен) и dAb (как правило, VH-домен); VH-, VL-, VhH- и V-NAR-домены; моновалентные молекулы, содержащие одиночную VH- и одиночную VL-цепь; миниантитела, двух-, трех-, четырехвалентные антитела и каппа-антитела (см., например, III et al., Protein Eng 1997; 10: 949-57); верблюжий IgG; IgNAR; a также один или более чем один выделенный CDR или функциональный паратоп, где изолированные CDR или антигенсвязывающие остатки или полипептиды могут быть ассоциированы или связаны друг с другом с тем, чтобы сформировать функциональный фрагмент антитела. Различные типы фрагментов антител были описаны и рассмотрены, например, в Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005:23, 1126-1136; WO 2005040219, и в опубликованных патентных заявках США 20050238646 и 20020161201.
Термины «область, определяющая комплементарность» («CDR») или «гипервариабельная область», используемые в данном документе, относятся к аминокислотным остаткам антитела, ответственным за связывание антигена. CDR, как правило, состоят из аминокислотных остатков 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (Н1), 50-65 (Н2) и 95-102 (НЗ) в вариабельном домене тяжелой цепи (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, №публикации NIH 91-3242) и/или тех остатков из «гипервариабельной петли» (остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (НЗ) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987; 196:901-917). Как правило, нумерация аминокислотных остатков в этой области осуществляется по способу, описанному Kabat et al., см. выше. Такие фразы, как «положение по Кабату», «остаток Кабата» и «в соответствии с Кабатом» в данном документе относятся к этой системе нумерации для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи. При использовании системы нумерации Кабата фактическая линейная аминокислотная последовательность пептида может содержать меньше аминокислот или дополнительные аминокислоты, соответствующие укорочению или вставке в FR или CDR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать аминокислотные вставки (остаток 52а, 52b и 52 с в соответствии с Кабатом) после остатка 52 в CDR H2, и вставленные остатки (например, остатки 82а, 82b и 82 с и т.д. в соответствии с Кабатом) после остатка 82 в FR тяжелой цепи. Нумерация остатков по Кабату может быть определена для данного антитела путем выравнивания областей гомологии последовательности антитела со «стандартной» последовательностью, пронумерованной по Кабату.
Термины «остатки каркасной области» или «остатки FR» относятся к тем аминокислотным остаткам VH или VL, которые не входят в CDR, как они определены в данном документе.
Фрагмент антитела, способный к кристаллизации («Рс-область»/«Рс-домен»), представляет собой «хвостовую» область антитела, которая взаимодействует с рецепторами на клеточной поверхности, называемыми Fc-рецепторами, а также с некоторыми белками системы комплемента.
Моноклональные антитела обычно получают путем слияния клеток миеломы с клетками селезенки от мыши, которая была иммунизирована нужным антигеном. Человеческие моноклональные антитела могут быть получены от трансгенных животных (например, мышей или других подходящих видов), кодирующих человеческие антитела. Альтернативно, рекомбинантные моноклональные антитела могут быть сделаны с применением технологий, называемых клонированном репертуара или фаговым/дрожжевым дисплеем. Инженерия рекомбинантного антитела включает применение вирусов или дрожжей вместо мышей для создания антитела.
Термин «гуманизированное антитело», используемый в данном документе, относится к химерному человеческому/нечеловеческому антителу, которое содержит последовательности, обычно по меньшей мере минимальные области, определяющие комплементарность (CDR-последовательности), полученные из нечеловеческой зародышевой последовательности иммуноглобулина. Таким образом, гуманизированное антитело является человеческим иммуноглобулином (реципиентное антитело), в котором остатки из гипервариабельной области реципиента заменены остатками гипервариабельной области нечеловеческого вида (донорного антитела), например мыши, крысы, кролика или примата, с нужной специфичностью, аффинностью и силой.
Гуманизированные антитела, которые содержат по меньшей мере CDR-области, не полученные из человеческих зародышевых последовательностей, также могут упоминаться как «химерные антитела», если гены легкой и тяжелой цепи антитела были сконструированы, как правило, путем генной инженерии, из генов вариабельной и константной области иммуноглобулина, полученного от других видов. Например, вариабельные сегменты генов из моноклонального мышиного антитела могут быть соединены с человеческими константными сегментами.
Термин «человеческое антитело», используемый в данном документе, включает антитела, имеющие вариабельные области, в которых и каркасная область, и CDR-области получены из человеческих иммуноглобулиновых зародышевых последовательностей. Следует отметить, что такие антитела, тем не менее, могут включать аминокислотные остатки, которых нет в человеческих зародышевых иммуноглобулиновых последовательностях, в результате мутаций, происходящих при созревании in vivo или in vitro. Кроме того, если антитело содержит константную область, то константная область также получена из человеческих иммуноглобулиновых зародышевых последовательностей. Человеческие антитела изобретения могут, тем не менее, включать аминокислотные остатки, не закодированные человеческими иммуноглобулиновыми зародышевыми последовательностями (например, мутации, введенные случайно или путем сайт-специфического мутагенеза in vitro или путем соматических мутаций in vivo). Тем не менее, термин «человеческое антитело», используемый в данном документе, не включает антитела или альтернативные антигенсвязывающие области, в которых CDR-последовательности получены из зародышевой линии других видов млекопитающих, таких как мышь, и были привиты в человеческие каркасные последовательности (см. «гуманизированное антитело» выше). Человеческое антитело может быть человеческим моноклональным антителом. Такое человеческое моноклональное антитело может быть получено с помощью гибридомы, которая содержит В-клетку, полученную из трансгенного животного, например, из трансгенной мыши, имеющей геном с человеческим трансгеном тяжелой цепи и трансгеном легкой цепи, слитую с иммортализованной клеткой. Человеческие антитела могут быть выделены из библиотек последовательностей, построенных на подборке человеческих зародышевых последовательностей, также диверсифицированных с разнообразием природных и синтетических последовательностей. Человеческие антитела могут быть получены in vitro путем иммунизации лимфоцитов человека с последующей трансформацией лимфоцитов вирусом Эпштейна-Барр. Последовательность человеческого антитела может быть идентифицирована, что позволяет получать антитела с помощью рекомбинантных способов.
Кроме того, гуманизированные, человеческие и полностью человеческие антитела могут содержать остатки, которые не встречаются в антителе-реципиенте или в антителе-доноре. Эти изменения сделаны для дальнейшего улучшения производительности антител.
Термин «производные антитела» относится к любой модифицированной форме антитела, например, к конъюгату антитела и другому агенту или антителу.
Термин «антиген» относится к молекулярной единице, используемой для иммунизации иммунокомпетентного позвоночного для производства антитела, которое распознает антиген. В данном описании термин «антиген» используется в более широком смысле и, как правило, включает молекулы-мишени, которые специфически распознаются антителом, таким образом, включает фрагменты или имитирующие молекулы, используемые в процессе иммунизации для повышения антитела, или такие молекулы, которые используются для скрининга после иммунизации, а также молекулы, используемые для скрининга в тех случаях, когда антитела получены альтернативными способами, такими как скрининг фагового дисплея.
Термин «эпитоп» используется в данном документе в контексте молекулярного взаимодействия между «антигенсвязывающим полипептидом», таким как антитело, и соответствующим ему «антигеном». Как правило, «эпитоп» относится к области или участку на антигене, с которым специфически связывается антитело, т.е. к области или участку, который физически контактирует с антителом. Белковый эпитоп может включать аминокислотные остатки на антигене, которые непосредственно участвуют в связывании с антителом (также называемые иммунодоминантным компонентом эпитопа), и другие аминокислотные остатки, которые непосредственно не участвуют в связывании, такие как аминокислотные остатков антигена, которые эффективно блокируются антителом (другими словами, аминокислотный остаток на «поверхности исключенного из растворителя объема» и/или «посадочное место» антитела). Данный антиген может содержать ряд различных эпитопов, которые могут включать, без ограничения, линейные пептидные антигенные детерминанты, конформационные антигенные детерминанты, которые состоят из одной или более несмежных аминокислот, расположенных рядом друг с другом в нативной (зрелой) конформации; и посттрансляционные антигенные детерминанты, которые состоят, полностью или частично, из молекулярных структур, ковалентно присоединенных к антигену, таких как углеводные группы.
Из того факта, что описания и определения эпитопов в зависимости от используемой методики картирования эпитопов получают с различными уровнями детализации, следует, что сравнение эпитопов для различных антител на одном и том же антигене может проводиться на различных уровнях детализации.
Термины «связывание», «специфическое связывание» и «специфичность связывания» используются в данном документе для описания селективности антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
Антитела в соответствии с изобретением могут специфически связывать C5aR, что указывает, что антитело имеет значительно более низкую аффинность к другим антигенам, где значительное снижение может быть снижением аффинности по меньшей мере в 2 раза, или в 5 раз, или в 10 раз. Антитело также может быть видоспецифичным, например, антителом, которое специфически связывается с высокой аффинностью с человеческим C5aR, но не с мышиным C5aR.
D
D
a
on
d
off
D
a
d
D
d
a
Термин «аффинность связывания» в данном документе используется для обозначения силы нековалентного взаимодействия двух молекул, например антитела или его фрагмента и антигена. Термин «аффинность связывания» используется для описания одновалентных взаимодействий (внутренняя активность). Аффинность связывания двух молекул, например антитела или его фрагмента и антигена, через моновалентное взаимодействие может быть количественно оценена путем определения константы диссоциации (K). В свою очередь, K может быть определена путем измерения кинетики формирования и диссоциации комплекса, например способом SPR. Константы скоростей, соответствующие ассоциации и диссоциации одновалентного комплекса, называются константой скорости ассоциации k (или k) и константой скорости диссоциации k (или k), соответственно. K связана с k и k через уравнение K=k/k.
d
D
D
Кроме того, «аффинность» относится к силе связывания между одним сайтом связывания молекулы (например, антитела) и лигандом (например, антигеном). Аффинность молекулы Х к лиганду Y представлена константой диссоциации (K), которая представляет собой концентрацию Y, которая потребуется, чтобы занять сочетающие участки половины молекул X, присутствующих в растворе. Меньший Кд указывает на более сильное или более аффинное взаимодействие, и для заполнения сайтов необходима меньшая концентрация лиганда. Аналогичным образом, специфичность взаимодействия можно оценить путем определения и сравнения значений K для взаимодействия, представляющего интерес, например для специфического взаимодействия между антителом и антигеном, со значением K для взаимодействия, не представляющего интерес.
D
D
Как правило, K антитела по отношению к мишени будет в 2 раза, предпочтительно в 5 раз, более предпочтительно в 10 раз меньше, чем K по отношению к другим, не целевым, молекулам, таким как неродственный материал или сопроводительный материал в окружающей среде или контроле. Более предпочтительно Ко будет в 50 раз меньше, например в 100 раз меньше или в 200 раз меньше; еще более предпочтительно в 500 раз меньше, например в 1000 раз меньше или 10000 раз меньше.
D
Значение этой константы диссоциации можно определить напрямую с помощью хорошо известных способов и вычислить даже для сложных смесей с помощью таких способов, как изложенные, например, в Caceci et al. (Byte 9:340-362, 1984). Например, K может быть установлен в анализе связывания с использованием двойного нитроцеллюлозного фильтра, такого который описан в Wong & Lohman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5428-5432, 1993). Для оценки связывающей способности лигандов, таких как антитела, с мишенями в данной области известны другие стандартные анализы, включая, например, ИФА, вестерн-блоттинг, радиоиммунологический анализ и проточную цитометрию. Кинетику связывания и аффинность связывания антитела также можно оценить с помощью стандартных анализов, известных в данной области, таких как поверхностный плазменный резонанс (SPR).
D
D
D
Можно проводить анализ конкурентного связывания, в котором связывание антитела с мишенью сравнивают со связыванием мишени другим лигандом этой мишени, например другим антителом. Концентрация, при которой происходит 50% ингибирование, называется Ki. В идеальных условиях Ki эквивалентна K. Значение Ki никогда не будет меньше, чем K, поэтому измерение Ki можно удобно заменить получением верхнего предела K.
Как будет понятно специалисту в данной области, термин «авидность» относится к общей силе взаимодействия между двумя молекулами, такими как антитело и антиген. Авидность зависит как от аффинности, так и от валентности взаимодействий.
Дальнейшие анализы для определения функциональности данных антител могут включать анализ на основе клеток, которые являются специфическими для данного антигена и эффекта связывания антитела.
Термин «идентичность», известный в данной области, относится к взаимосвязи последовательностей двух или более полипептидов, определенной путем сравнения последовательностей. В данной области «идентичность» также означает степень аффинности полипептидных последовательностей, определенную по количеству совпадений между строками двух или более аминокислотных остатков. «Идентичность» измеряет процент совпадений в меньшей из двух или более последовательностей с пробелами для выравнивания (если таковые имеются), рассматриваемых определенной математической моделью или компьютерной программой (т.е. «алгоритмами»). Идентичность родственных полипептидов можно легко вычислить известными способами. Такие способы включают, но не ограничиваясь ими, те, которые описаны в Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; и Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073(1988).
Предпочтительные способы определения идентичности разработаны так, чтобы получить самое большое совпадение анализируемых последовательностей. Способы определения идентичности описаны в общедоступных компьютерных программах. Предпочтительные компьютерные программы для определения идентичности двух последовательностей включают программный пакет GCG, в том числе GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN и FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215. 403-410 (1990)). Программа BLASTX общедоступна в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) и в других источниках (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., см. выше). Для определения идентичности также может быть использован хорошо известный алгоритм Смита-Уотермана.
Например, с помощью компьютерного алгоритма GAP (Genetics Computer Group, Университет штата Висконсин, Мэдисон, Висконсин) два полипептида, для которых должен быть определен процент идентичности последовательностей, выравнивают для оптимального совпадения их соответствующих аминокислот («интервал совпадения», определенный с помощью алгоритма). В сочетании с алгоритмом используется штраф за открытие делеции (который рассчитывается как 3-кратная средняя диагональ; «средняя диагональ» является средним значением диагонали используемой матрицы сравнения; «диагональ» является оценкой или числом, присваиваемым каждому точному совпадению аминокислоты с конкретной матрицей сравнения) и штраф за удлинение делеции (который обычно равен {(1/10) части} штрафа за открытие делеции), а также матрица сравнения, такая как РАМ 250 или BLOSUM 62. Стандартная матрица сравнения (см. Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp.3 (1978) for the РАМ 250 comparison matrix; Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 89, 10915-10919 (1992) также используется алгоритмом.
Предпочтительные параметры для сравнения пептидной последовательности являются следующими:
Алгоритм: Needleman et al., J. Mol. Biol. 48. 443-453 (1970); Матрица сравнения: BLOSUM 62 из Henikoff et al., PNAS USA 89, 10915-10919 (1992); штраф за открытие делеции: 12, штраф за удлинение делеции: 4, порог подобия: 0.
Программа GAP используется с указанными выше параметрами. Вышеупомянутые параметры являются параметрами по умолчанию для сравнения пептидов (наряду с отсутствием штрафа за концевые делеции) с использованием алгоритма GAP.
«Консервативная аминокислотная замена» может включать замену одного аминокислотного остатка на другой аминокислотный остаток, так что это не сильно влияет или вообще не влияет на полярность или заряд аминокислотного остатка в этой позиции. Примером этого могут служить следующие группы аминокислот, где замены одной аминокислоты другой аминокислотой в той же группе считаются консервативными заменами: гидрофильные: Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Тре. Алифатические: Val, Ile, Leu, Met. Основные: Lys, Arg, His. Ароматические: Phe, Tyr, Trp. Кроме того, любой остаток часто может быть замещен аланином.
Кроме того, при необходимости, неприродные аминокислоты или химические аналоги аминокислот могут быть введены в качестве замены или добавления в антитело и/или иммуноглобулиновую цепь данного изобретения. Такие аминокислоты включают, но не ограничиваясь ими, D-изомеры обычных аминокислот, 2,4-диаминомасляную кислоту, а-аминоизомасляную кислоту, 4-аминомасляную кислоту, 2-аминомасляную кислоту, 6-аминогексановую кислоту, 2-аминоизомасляную кислоту, 3-аминопропионовую кислоту, орнитин, норлейцин, норвалин, гидроксипролин, саркозин, цитраллин, гомоцитруллин, цистеиновую кислоту, третбутилглицин, третбутилаланин, фенилглицин, циклогексилаланин, бета-аланин, фтор-аминокислоты, спроектированные аминокислоты, такие как бета-метиламинокислоты, Са-метиламинокислоты, Na-метиламинокислоты и аминокислотные аналоги в целом.
Мутантные аминокислотные последовательности антитела и/или иммуноглобулиновой цепи данного изобретения могут быть получены путем введения соответствующих нуклеотидных замен в нуклеиновую кислоту данного изобретения или путем синтеза нужного полипептида in vitro. Такие мутанты включают, например, делеции, вставки или замены остатков в аминокислотной последовательности. Для получения конечной конструкции может использоваться комбинация делеции, вставки и замены при условии, что конечный полипептидный продукт обладает нужными характеристиками. Мутантные (измененные) полипептиды могут быть получены с помощью любой методики, известной в данной области. Например, полинуклеотид изобретения может быть подвергнут мутагенезу in vitro. Такие методики мутагенеза in vitro включают субклонирование полинуклеотида в подходящий вектор, трансформация вектором штамма-«мутатора», такого как Е. coli XL-I red (Stratagene), и размножение трансформированных бактерий в течение подходящего числа поколений. Продукты, полученные из мутированной/измененной ДНК, можно легко определить с помощью методик, описанных в данном документе для определения того, есть ли у них рецептор-связывающая и/или -ингибирующая активность.
При конструировании мутантных аминокислотных последовательностей расположение сайта мутации и природа мутации будут зависеть от характеристики), которые нужно изменить. Сайты для мутаций могут быть изменены по отдельности или в серии, например, путем (1) замещения сначала консервативных аминокислот, а затем более радикальной селекции в зависимости от полученных результатов, (2) удаления целевого остатка, или (3) вставки других остатков, смежных с сайтом локализации.
Делеции в аминокислотной последовательности обычно находятся в диапазоне от примерно 1 до 15 остатков, более предпочтительно от примерно 1 до 10 остатков и обычно от примерно 1 до 5 смежных остатков.
Описание
Изобретатели определили несколько аспектов, имеющих отношение к функциональности и эффективности биологической терапии и конкретных антител, и основной областью данного изобретения являются антитела для лечения воспалительных заболеваний путем ингибирования связывания С5а с C5aR.
Аспект данного изобретения относится к одной или более чем одной серии антител, которые характеризуются их функциональностью и/или аминокислотной последовательностью CDR, вариабельной области тяжелых цепей и легких цепей и/или последовательности Fc-домена.
В одном воплощении антитело представляет собой полноразмерное антитело, включающее стандартные для антитела домены и области.
В одном воплощении антитело представляет собой фрагмент антитела, такие фрагменты могут быть получены с использованием обычных рекомбинантных методик и методик белковой инженерии. Фрагменты антител изобретения могут быть получены путем усечения, например, путем удаления одной или более чем одной аминокислоты с N- и/или С-конца полипептида. Фрагменты также могут быть получены путем введения одной или более чем одной внутренней делеции. Антитело изобретения может быть (или может содержать) фрагмент любого из антител, на котором основано данное изобретение. Антитело изобретения может быть (или может содержать) антигенсвязывающей частью одного из этих антител или его вариантом. Например, антитело изобретения может быть Fab-фрагментом одного из этих антител или его вариантом, или оно может быть одноцепочечным антителом, полученным из одного из этих антител, или его вариантом.
Антитела изобретения могут происходить из разных видов, включая млекопитающих, таких как мыши, крысы, кролики, свиньи или приматы. Антитело может быть антителом грызуна, и более конкретно антителом мыши. Альтернативно антитело может происходить от немлекопитающих, например, от курицы. Антитело также может быть гуманизированным антителом или человеческим антителом.
Антитело изобретения может обладать способностью конкурировать с другим антителом изобретения в связывании с C5aR, описанным в данном документе. Такие перекрестно конкурирующие антитела могут быть определены на основе их способности к перекрестной конкуренции с известным антителом изобретения в стандартных анализах связывания. Такая перекрестная конкуренция может подтвердить, что эти два антитела связываются с одинаковыми, перекрывающимися или аналогичными эпитопами.
Человеческие антитела
Как описано в приведенных здесь примерах, авторы изобретения выявили ряд анти-C5aR-антител, полученных от трансгенных мышей, включающих локусы человеческого зародышевого иммуноглобулина. Антитела выделяли в виде моноклональных гибридомных антител и оценивали характеристики связывания. Как уже упоминалось, C5aR представляет собой GPCR с семью трансмембранными доменами, и получить растворимую форму, которая сохраняла бы нативную конформацию, не представляется возможным. В целях повышения человеческих антител, которые блокируют связывание hC5a с hC5aR, трансгенных мышей иммунизировали клетками, экспрессирующими нативный hC5aR. Тем не менее, блокирующие антитела было очень трудно получить, и авторами изобретения было выполнено 32 слияния, пока не было выявлено человеческое антитело с желательными блокирующими свойствами. Из 35 слияний и скрининга более 100000 гибридомных супернатантов было получено в общей сложности 11 блокирующих антител.
Кроме того, из-за природы hC5aR не удалось определить аффинность антител стандартным анализом Biacore, и поэтому были проведены анализы на основе функциональных hC5aR-зависимых показаний, в которых были определены значения IC50 и ЕС50, как описано в примере 2 и примере 7.
В одном аспекте данное изобретение относится к человеческому антителу, связывающему C5aR, и также предпочтительно, чтобы указанное антитело специфически связывало hC5aR, так что связывание с hC5aR сильнее, чем связывание с C5aR от других видов, таких как, в частности, мышиный C5aR. В одном воплощении предпочтительно, чтобы указанное антитело связывалось со второй внеклеточной петлей C5aR, и более предпочтительно со второй петлей человеческого C5aR. В одном воплощении антитело связывается со второй внеклеточной петлей человеческого C5aR, но не связывается со второй внеклеточной петлей мышиного C5aR. В других воплощениях антитело в соответствии с изобретением может связывать вторую внеклеточную петлю C5aR только в нативной конформации.
Функциональность анти-C5aR-антитела зависит от способности указанного антитела значительно ингибировать или уменьшать связывание С5а с C5aR.
В одном воплощении данное изобретение относится к человеческому антителу, связывающему C5aR, или к антителу, описанному в данном документе определенной последовательностью (см. ниже), где указанное антитело способно существенно ингибировать или уменьшать связывание С5а с C5aR. Это может быть определено с помощью анализа вытеснения (SPA), описанного в примере 2, из которого могут быть определены значения IC50. Как видно из таблицы 1,11 выделенных и описанных антител имеют концентрацию IC50 ниже 50 нМ. В другом воплощении изобретения антитело способно к замещению пС5а в SPA-анализе с IC50 ниже 50 нМ, например ниже 40 нМ, например ниже 30 нМ, например ниже 20 нМ, например ниже 10 нМ, например ниже 5 нМ или даже ниже 4 нМ, или IC50 ниже 3 нМ или даже ниже 2,5 нМ или 2,0 нМ.
В других анализах оценивали способность анти-C5aR-антител ингибировать С5а-зависимую миграцию человеческих нейтрофилов, и некоторые из идентифицированных человеческих антител оказались более сильными ингибиторами С5а-опосредованной миграции нейтрофилов, чем описанное ранее C5aR-антитело (Q от WO 2009/103113). В одном воплощении изобретение, таким образом, относится к антителу, описанному в данном документе определенной последовательностью (см. ниже), или человеческому антителу, связывающему C5aR, где указанное антитело способно существенно ингибировать миграцию нейтрофилов человека. В одном воплощении антитело ингибирует миграцию до менее 50%, менее 40%, менее 30%, менее 20% или менее 10% по сравнению с уровнем миграции, наблюдаемым в присутствии 10 нМ С5а, но не наблюдаемым в присутствии анти-C5aR-антитела. В одном таком воплощении миграцию измеряют через 30 минут в присутствии 10 нМ С5а и антитела по сравнению с уровнем миграции, наблюдаемом через 30 мин в присутствии 10 нМ С5а и без антитела. Альтернативно способность антитела ингибировать миграцию нейтрофилов может быть выражена с помощью значения IC50, основанного на тех же условиях. В одном таком воплощении IC50 составляет менее 2,5 мкг/мл, например менее 2,5 мкг/мл, например менее 1,5 мкг/мл, например менее 1,2 мкг/мл или даже менее 1,0 мкг/мл.
В качестве альтернативы стандартному анализу Biacore функциональные возможности hC5aR-антител можно определить с помощью анализа конкурентного связывания на нейтрофилах, как описано в примере 7. Эта функциональность относится к аффинности антитела, измеряемой в анализе конкурентного связывания лиганда, но также может рассматриваться измерение авидности взаимодействия. Изобретение в одном воплощении относится к антителу, описанному в данном документе определенной последовательностью (см. ниже), или к человеческому антителу, связывающему C5aR, где аффинность или авидность антитела, измеренная в анализе конкурентного связывания лиганда на нейтрофилах, составляет менее 0,80 нМ, 0,70 нМ, 0,60 нМ, например, менее 0,50 нМ, 0,45 нМ, 0,40 нМ или 0,35 нМ.
Еще один вариант для характеризации антитела был разработан с использованием анализа кальциевого потока, когда измеряется способность антитела ингибировать активацию С5а-индуцированных нейтрофилов ex vivo, что также описано в примере 7. В еще одном воплощении изобретение относится к антителу, описанному в данном документе определенной последовательностью (см. ниже), или человеческому антителу, связывающему C5aR, где IC50, определенный в анализе кальциевого потока, составляет менее 7,0 мкг/мл, например менее 5,0 мкг/мл, например менее 2,5 мкг/мл.
Дополнительные анализы ех vivo могут быть использованы для определения способности антитела ингибировать или нейтрализовать созревание С5а-индуцированных нейтрофилов на основе вторичных эффектов, таких как экспрессия CD11b и CD62L. CD11b и CD62L являются маркерами созревания нейтрофилов, так как они подвергаются повышающей и понижающей регуляции, соответственно, при активации С5а/C5aR-взаимодействия.
Это влияние было определено в анализе повышающей регуляции CD11b. В одном воплощении данное изобретение относится к антителу, описанному в данном документе определенной последовательностью (см. ниже), или к человеческому антителу, связывающему C5aR, где IC50, определенный в анализе повышающей регуляции CD11b, составил менее 3,5 мкг/мл, например 3,0 мкг/мл, например менее 2,5 мкг/мл, например менее 2,0 мкг/мл или, например, 1,5 мкг/мл, или даже менее 1,0 мкг/мл.
Кроме того, было определено влияние антитела в анализе понижающей регуляции CD62L. В одном воплощении данное изобретение относится к антителу, описанному в данном документе определенной последовательностью (см. ниже), или к человеческому антителу, связывающему C5aR, где IC50, определенный в анализе понижающей регуляции CD62L, составляет менее 1,8 мкг/мл, например менее 1,5 мкг/мл, например менее 1,2 мкг/мл или даже менее 1,0 мкг/мл.
Четыре моноклональных антитела были выбраны для секвенирования, чтобы определить последовательность вариабельных областей и, в частности, последовательностей CDR. Выравнивание последовательностей представлено на фиг.1, и последовательности также включены в сопроводительный список последовательностей.
Список последовательностей включает следующие последовательности, относящиеся к выделенным антителам:
SEQ ID 1-3: Vh 35F32A3 CDR 1-3
SEQ ID 4: Vh 35F32A3
SEQ ID 5-7: VI 35F32A3 CDR 1-3
SEQ IDS: VI 35F32A3
Аналогично SEQ ID 9-16 описывает 32F3A6
Аналогично SEQ ID 17-24 описывает 35F12A2
Аналогично SEQ ID 25-32 описывает 35F24A3
Антитела, определяемые, вариабельными, областями или последовательностями CDR
Антитело в соответствии с изобретением, таким образом, может быть определено на основании последовательностей CDR, последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей и незначительных модификаций, которые могут быть выполнены специалистом в данной области без изменения функциональности антитела. Они включают аминокислотные замены, делеции или вставки одного или более, например одного, двух или трех аминокислотных остатков в каждой из последовательностей CDR.
В одном аспекте изобретение относится к антителу, связывающему C5aR, определенному последовательностями CDR-областей, где вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, выбранные из следующих групп:
a) SEQ ID 1, 2 и 3, где ни одной, одна, две или три указанные последовательности содержат 1, 2 или 3 аминокислотные замены на другой аминокислотный остаток; и
b) SEQ ID 9, 10 и 11, где ни одной, одна, две или три указанные последовательности содержат 1, 2 или 3 аминокислотные замены на другой аминокислотный остаток; и
c) SEQ ID 17, 18 и 19, где ни одной, одна, две или три указанные последовательности содержат 1, 2 или 3 аминокислотные замены на другой аминокислотный остаток; и
d) SEQ ID 25, 26 и 27, где ни одной, одна, две или три указанные последовательности содержат 1, 2 или 3 аминокислотные замены на другой аминокислотный остаток.
В одном воплощении изобретение относится к антителу, связывающему C5aR, определенному последовательностями CDR-областей, где вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3;
где указанная последовательность содержит SEQ ID 1, 9, 17, 25 или одну из указанных последовательностей, где 1, 2 или 3 аминокислоты заменены на другие аминокислотные остатки; и
где указанная CDR2-последовательность содержит SEQ ID 2, 10, 18, 26 или одну из указанных последовательностей, где 1, 2 или 3 аминокислоты заменены на другие аминокислотные остатки; и
где указанная CDR3-последовательность содержит SEQ ID 3, 11, 19, 27 или одну из указанных последовательностей, где 1, 2 или 3 аминокислоты заменены на другие аминокислотные остатки.
В одном воплощении изобретение относится к антителу, связывающему C5aR, определенному последовательностями CDR-областей, где вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, выбранные из следующих групп:
a) SEQ ID 5, 6 и 7, где ни одной, одна, две или три указанные последовательности содержат 1, 2 или 3 аминокислотные замены на другой аминокислотный остаток; и
b) SEQ ID 13, 14 и 15, где ни одной, одна, две или три указанные последовательности содержат 1, 2 или 3 аминокислотные замены на другой аминокислотный остаток; и
c) SEQ ID 21, 22 и 23, где ни одной, одна, две или три указанные последовательности содержат 1, 2 или 3 аминокислотные замены на другой аминокислотный остаток; и
d) SEQ ID 29, 30 и 31, где ни одной, одна, две или три указанные последовательности содержат 1, 2 или 3 аминокислотные замены на другой аминокислотный остаток.
В одном аспекте изобретение относится к антителу, связывающему C5aR, определенному последовательностями CDR-областей, где вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3;
где указанная последовательность содержит SEQ ID 5, 13, 21, 29 или одну из указанных последовательностей, где 1, 2 или 3 аминокислоты заменены на другие аминокислотные остатки; и
где указанная CDR2-последовательность содержит SEQ ID 6, 14, 22, 30 или одну из указанных последовательностей, где 1, 2 или 3 аминокислоты заменены на другие аминокислотные остатки; и
где указанная CDR3-последовательность содержит SEQ ID 7, 15, 23, 31 или одну из указанных последовательностей, где 1, 2 или 3 аминокислоты заменены на другие аминокислотные остатки.
В одном воплощении изобретение относится к антителу, где CDR вариабельной области тяжелой цепи содержат SEQ ID 1, 2 и 3 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делециями и/или вставками, и где CDR вариабельной легкой цепи содержат SEQ ID 5, 6 и 7 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делециями и/или вставками.
В одном воплощении изобретение относится к антителу, где CDR вариабельной области тяжелой цепи содержат SEQ ID 9, 10 и 11 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делециями и/или вставками, и где CDR вариабельной легкой цепи содержит SEQ ID 13, 14 и 15 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делециями и/или вставками.
В одном воплощении изобретение относится к антителу, где CDR вариабельной области тяжелой цепи содержат SEQ ID 17, 18 и 19 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делециями и/или вставками, и где CDR вариабельной легкой цепи содержит SEQ ID 21, 22 и 23 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делециями и/или вставками.
В одном воплощении изобретение относится к антителу, где CDR вариабельной области тяжелой цепи содержат SEQ ID 25, 26 и 27 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делециями и/или вставками, и где CDR вариабельной легкой цепи содержит SEQ ID 29, 30 и 31 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делециями и/или вставками.
Воплощение изобретение, таким образом, связано с антителом, где вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где указанные CDR-последовательности содержат одну из следующих групп последовательностей; SEQ ID 1, 2 и 3, SEQ ID 9, 10 и 11, SEQ ID 17, 18 и 19, SEQ ID 25, 26 и 27 или указанные последовательности, содержащие до двух замен, делеций и/или вставок в каждой последовательности, и где вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где указанные CDR-последовательности содержат одну из следующих групп последовательностей; SEQ ID 5, 6 и 7, SEQ ID 13, 14 и 15, SEQ ID 21, 22 и 23, SEQ ID 29, 30 и 31 или указанные последовательности, содержащие до двух замен, делеций и/или вставок в каждой последовательности.
Воплощение изобретение, таким образом, связано с антителом, где вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где указанные CDR-последовательности содержат одну из следующих групп последовательностей; SEQ ID 1, 2 и 3, SEQ ID 9, 10 и 11, SEQ ID 17, 18 и 19, SEQ ID 25, 26 и 27 или указанные последовательности, содержащие до одной замены, делеций и/или вставки в каждой последовательности, и где вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где указанные CDR-последовательности содержат одну из следующих групп последовательностей; SEQ ID 5, 6 и 7, SEQ ID 13, 14 и 15, SEQ ID 21, 22 и 23, SEQ ID 29, 30 и 31, или указанные последовательности, содержащие до одной замены, делеций и/или вставки в каждой последовательности.
Воплощение изобретения, таким образом, связано с антителом, где вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где указанные CDR-последовательности содержат одну из следующих групп последовательностей; SEQ ID 1, 2 и 3, SEQ ID 9, 10 и 11, SEQ ID 17, 18 и 19, SEQ ID 25, 26 и 27, и где вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где указанные CDR-последовательности содержат одну из следующих групп последовательностей; SEQ ID 5, 6 и 7, SEQ ID 13, 14 и 15, SEQ ID 21, 22 и 23, SEQ ID 29, 30 и 31.
Воплощение изобретения относится к антителу, где вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит последовательность, по меньшей мере на 80, 85, 90 или 94% идентичную SEQ ID №4, 12, 20 или 28.
В одном воплощении изобретение относится к антителу, где вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит последовательность, по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентичную SEQ ID №4, 12, 20 или 28.
Аспект изобретения относится к антителу, где вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит последовательность, по меньшей мере на 80, 85, 90 или 94% идентичную SEQ ID №8, 16, 24 или 32.
В одном воплощении изобретение относится к антителу, где вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит последовательность, по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентичную SEQ ID №8, 16, 24 или 32.
Воплощение изобретение, таким образом, связано с антителом, где вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит последовательность, по меньшей мере на 80, 85, 90 или 94% идентичную SEQ ID №4, 12, 20 или 28, и/или где вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит последовательность, по меньшей мере на 80, 85, 90 или 94% идентичную SEQ ID №8, 16, 24 или 32.
В одном воплощении изобретение относится к антителу, где вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит последовательность, по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентичную SEQ ID №4, и/или где вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит последовательность, по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентичную SEQ ID №8.
В одном воплощении изобретение относится к антителу, где вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит последовательность, по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентичную SEQ ID №12, и/или где вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит последовательность, по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентичную SEQ ID №16.
В одном воплощении изобретение, таким образом, относится к антителу, где вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит последовательность, по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентичную SEQ ID №20, и/или где вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит последовательность, по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентичную SEQ ID №24.
В одном воплощении изобретение, таким образом, относится к антителу, где вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит последовательность, по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентичную SEQ ID №28, и/или где вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит последовательность, по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентичную SEQ ID №32.
В одном воплощении изобретение относится к антителу, где вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит последовательность, по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентичную SEQ ID №39, и/или где вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит последовательность, по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентичную SEQ ID №40.
В одном воплощении изобретение представляет собой антитело, где вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела определяется SEQ ID №39, и/или где вариабельная область легкой цепи указанного антитела определяется SEQ ID №40.
Во время созревания антител могут иметь место спонтанные мутации в каркасной области, как описано в данном документе в примере 6 и 7, вариабельную область одного из выделенных моноклональных антител сравнивали с человеческими зародышевыми последовательностями антитела, чтобы определить ближайшие человеческие зародышевые последовательности для вариабельной тяжелой и легкой цепей. Для того чтобы свести к минимуму риск иммунологической реакции, было принято решение о дальнейшей оптимизации антитела путем введения точечных мутаций в каркасной области для получения антитела с человеческой зародышевой последовательностью в каркасных областях, что, как видно из экспериментов, не влияет на функциональность антитела.
В одном воплощении данное изобретение относится к антителу, определенному последовательностью, идентичной вариабельной области референсного антитела, описанного в данном документе выше, в котором вариабельная область тяжелой цепи и/или легкой цепи указанного антитела содержит одну или более чем одну мутацию в каркасной области. В соответствии с изобретением может быть привлекательным введение одной или более чем одной мутации для повышения идентичности с ближайшей зародышевой человеческой последовательностью, хотя другие мутации также могут быть рассмотрены. В одном воплощении такие мутации являются консервативными мутациями.
Антитела, определяемые Fc-областью
Fc-область позволяет антителам активировать иммунную систему, и антитела могут быть спроектированы таким образом, чтобы они включали модификации в Fc-области, как правило, для изменения одного или более чем одного из функциональных свойств, таких как время полужизни в сыворотке, фиксация комплемента, Fc-рецепторное связывание, стабильность белка и/или антигензависимая клеточная цитотоксичность, или отсутствие таковых. Кроме того, антитело изобретения может быть химически модифицировано (например, путем присоединения к антителу одной или более чем одной химической группировки) или модифицировано таким образом, чтобы изменилось его гликозилирование, опять же для изменения одного или более чем одного из функциональных свойств антитела.
Один аспект данного изобретения относится к антителу, связывающему C5aR, или к антителу, описанному в данном документе определенной последовательностью (см. ниже), в котором у Fc-области снижена или отменена аффинность связывания с одним или более чем одним FcγR.
В одном воплощении изобретение относится к антителу, связывающему C5aR, Предпочтительно человеческий C5aR, описанный в данном документе, или к антителу, описанному в данном документе определенной последовательностью (см. ниже), в котором у Fc-области снижена аффинность связывания с одним или более чем одним FcyR.
В одном воплощении антитело изобретения демонстрирует сниженную аффинность связывания с одним или более чем одним FcyR по сравнению с референсными последовательностями IgG1, IgG2, IgG2/4 или Fc IgG4, определенными SEQ ID №33, 34, 35 и 36, соответственно. Так как конкретные аминокислотные остатки могут быть ответственны за взаимодействие с FcyR, и эффекты опосредуются через них, то может быть выгодным применение антитела, в котором такие специфические аминокислотные остатки Fc-области были заменены другой аминокислотой.
В одном воплощении указанная Fc-область включает одну или более чем одну точечную мутацию по сравнению с референсными последовательностями IgG1, IgG2, IgG4/G2 или IgG4Fc, определенными SEQ ID 33, 34, 35 и 36, соответственно, что уменьшает аффинность к одному или более чем одному рецептору Fcγ или компонентам комплемента.
Для того чтобы оценить результат введения точечных мутаций в Fc-область, оценивали эффекторные функции для серии анти-C5aR-антител, как описано в примере 4. Был проведен анализ фагоцитоза для определения роли Fc-области в способности анти-hC5aR-антител индуцировать фагоцитоз нейтрофилов (экспрессирующих hC5aR) человеческими моноцитами. Как видно из таблицы 2, несколько Fc-вариантов снижают уровень фагоцитоза, индуцированного анти-C5aR-антителами, в описанном анализе.
В одном воплощении антитело в соответствии с изобретением существенно не индуцирует фагоцитоз нейтрофилов in vitro, и это означает, что уровень фагоцитоза существенно не превышает фоновый, измеренный в отсутствие анти-C5aR-антитела. В одном воплощении антитело не приводит к какой-либо определяемой индукции фагоцитоза. Анализ для оценки уровня фагоцитоза может быть выполнен с использованием человеческих нейтрофилов, как описано в примере 4.
В альтернативных анализах оценивали способность анти-ПС5аР-антител индуцировать ADCC (антителозависимую клеточную цитотоксичность) и CDC (комплементзависимую цитотоксичность). Анализы были проведены для того, чтобы проверить способность Fc-вариантов опосредовать истощение клеток через ADCC- или CDC-зависимые механизмы, и предполагается, что они могут имитировать активности in vivo.
В анализах использовали клетки, экспрессирующие hC5aR, в качестве клеток-мишеней и эффекторных клеток (обедненные моноцитами РМВС) или сыворотки, содержащие комплемент, чтобы вызвать ответы, как описано в примере 4.
В одном воплощении антитело в соответствии с изобретением не вызывает существенной индукции ADCC, и это означает, что уровень ADCC существенно не превышает фоновый, измеренный в отсутствие анти-C5aR-антитела. В одном воплощении антитело не приводит к какой-либо выявляемой индукции ADCC, т.е. уровень ADCC не превышает фоновый.
В одном воплощении антитело в соответствии с изобретением не вызывает существенной индукции CDC. В одном воплощении антитело не приводит к какой-либо выявляемой индукции CDC, т.е. уровень CDC не превышает фоновый.
В одном воплощении антитело в соответствии с изобретением включает и Fc-область, в которой последовательность была модифицирована для изменения эффекторной клеточной функции или функций. Модификация Fc-последовательности может быть получена путем точечных мутаций в аминокислотной последовательности. Fc-область тяжелой цепи может быть последовательностью IgG1, IgG2, IgG4 или химерной IgG2/4. Референсные последовательности определены в списке последовательностей следующим образом; IgG1 по SEQ ID №33, IgG2 по SEQ ID №34, IgG2/4 по SEQ ID №35, и IgG4 по SEQ ID №36.
В одном воплощении Fc-область представляет собой IgG1 (SEQ ID №33), IgG2 (SEQ ID №34), IgG2/4 (SEQ ID №35) или IgG4 (SEQ ID №36), с одной или более чем одной из следующих точечных мутаций:
а. Е233Р
b. L234A или V234A или F234L или F234V
с. L235E или L235A
d. G236R или G236A
e. G237A
f. S239D
g. S254W
h. N297Q
i. L328R
j. A330S
k. P331S
I. I332E
Разница между Fc-вариантами состоит в их способности взаимодействовать с FcγR или компонентами системы комплемента, как описано выше. Различия последовательностей в Fc-области также влияют на структуру и гибкость антитела, что также может влиять на функцию антитела. Как описано в примере бив таблице 3, изобретатели также показали, что анти-ПСбаР-антитела, в которых Fc-область имеет тип IgG1 с дополнительными точечными мутациями или без них, являются более сильными ингибиторами hC5aR-опосредованных эффектов, чем соответствующие антитела с Fc-областью типа IgG4. Соответственно, воплощение данного изобретения относится к любому из антител, определенных в данном документе, с Fc-областью изотипа IgG1 или, по меньшей мере, с шарнирной частью Fc-области изотипа IgG1.
В одном воплощении Fc-область IgG1 содержит от 1 до 10 аминокислотных замен по сравнению с референсной Fc-последовательностью IgG1, определенной в SEQ ID №33. Предпочтительно, чтобы Fc-области содержали меньше мутаций, например от 1 до 8 аминокислотных замен в пределах аминокислот с 231 по 240, или например, от 1 до 5 аминокислотных замен в пределах аминокислот с 328 по 334. Аминокислотные замены предпочтительно выбирают среди замен, которые уменьшают способность антитела значительно индуцировать фагоцитоз нейтрофилов, ADCC и/или CDC in vitro, как описано выше.
В одном воплощении Fc-область антитела представляет собой IgG1 с одной или более чем одной из следующих точечных мутаций:
a) N297Q и/или
b) L234A и/или
c) L235E или L235A и/или
d) G236R или G236A и/или
e) G237A и/или
f) L328R и/или
g) A330S и/или
h) P331S.
В одном воплощении Fc-область антитела представляет собой IgG1 с одной или более чем одной из следующих групп точечных мутаций:
a) N297Q и/или
b) L234A и L235E и/или
c) L234A и G236R и/или
d) L235E и G236R и/или
e) L234A, L235E и G236R и/или
f) G236R и L328R и/или
g) N297Q, L234A и L235E и/или
h) N297Q, L234A, L235E и G236R и/или
i) N297Q, L234A, L235E и G237A и/или
j) L234A, L235E, G237A, A330S и P331S.
k) N297Q, L234A, L235E, G237A, A330S и P331S.
В одном воплощении Fc-область антитела представляет собой IgG1 с одной или более чем одной из следующих точечных мутаций:
a) N297Q и/или
b) L234A и L235E и/или
c) G236R и L328R и/или
d) N297Q, L234A и L235E и/или
e) N297Q, L234A, L235E и G237A и/или
f) L234A, L235E, G237A, A330S и P331S.
Специалистам в данной области будет понятно, что точечные мутации в каркасной области тяжелой и легкой цепей могут быть введены на основе стандартных критериев для замещения аминокислотных остатков в пределах объема данного изобретения. Функциональные анализы, описанные в данном документе, могут использоваться для подтверждения того, что такие мутации не влияют на функциональность антитела.
Как видно из вышеизложенного, специфичность связывания определенных антител обеспечивается вариабельными областями, или CDR, и понятно, что различные типы антител, обладающие аналогичной антигенсвязывающей областью, охватываются данным изобретением.
В одном воплощении изобретения антитело представляет собой полноразмерное антитело. В одном воплощении изобретения антитело представляет собой фрагмент антитела или одноцепочечное антитело. В одном воплощении антитело представляет собой моноклональное антитело. В одном воплощении антитело представляет собой человеческое, мышиное, крысиное, кроличье, свиное или антитело примата. В одном воплощении антитело представляет собой мышиное или человеческое антитело. В одном воплощении антитело представляет собой человеческое антитело. В одном воплощении антитело представляет собой гуманизированное антитело. Как описано в разделе определений данной заявки, гуманизированное антитело содержит по меньшей мере CDR-области, полученные не из человеческой зародышевой последовательности. Как следует из вышеприведенного, человеческое антитело может содержать одну или более чем одну точечную мутацию по сравнению с зародышевой последовательностью, но, как правило, считается, что последовательность должна по меньшей мере в каркасной области или Fc-области иметь по меньшей мере 95% идентичность с человеческими зародышевыми последовательностями.
Фармацевтические составы
Данное изобретение также включает фармацевтические композиции/составы, содержащие фармацевтически приемлемый носитель и полипептид или антитело в соответствии с изобретением, а также наборы, включающие такие композиции.
Антитело в соответствии с изобретением может в одном аспекте изобретения быть собранным в состав в виде фармацевтической композиции. Такая фармацевтическая композиция может быть получена на основе общих знаний в данной области, например в Pharmacopeia или Remington.
В одном воплощении фармацевтическая композиция в соответствии с изобретением содержит антитело, описанное в данном документе, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Состав может быть в виде водной композиции или сухой композиции, которую восстанавливают в воде или водной буферной композиции перед введением.
Фармацевтическая композиция антител в соответствии с изобретением может содержать соль и/или буфер, например как композиция, описанная в WO 2011/104381.
В другом воплощении фармацевтическая композиция антител в соответствии с изобретением может быть пригодной для многократного применения, например, как композиции, описанные в WO 2011/147921.
Способ лечения
Аспект данного изобретения относится к способу лечения или профилактики нарушения у субъекта, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтического количества антитела, описанного в данном документе. Как описано в предыдущих публикациях, таких как WO 2009/103113, анти-C5aR-антитела могут использоваться/подходить для лечения различных заболеваний и нарушений. Воплощение изобретения, таким образом, относится к способу лечения иммунологического заболевания или нарушения, в частности, воспалительного заболевания. Пример 8 в данном документе также подтверждает это, демонстрируя функциональность анти-C5aR-антитела в соответствии с изобретением на мышиной модели артрита. Примеры 9-11 демонстрируют повышающую регуляцию C5aR в образцах ткани от пациентов с псориатическим артритом, болезнью Крона и язвенным колитом. Также показано, что анти-C5aR-антитело может ингибировать клеточную миграцию PMN, индуцированную синовиальной жидкостью от пациентов с псориатическим артритом.
Способ лечения может быть направлен на лечение заболевания или нарушения, но в отношении некоторых заболеваний, включая иммунологические и воспалительные заболевания, такие как хроническое заболевание или нарушение, облегчение одного или более симптомов также считается лечением, которое может быть значительным улучшением для субъекта, даже если будет получено только частичное облегчение симптомов, или если эффект является только временным или частичным.
Способ в соответствии с изобретением включает лечение одного или более чем одного заболевания, включая, но не ограничиваясь ими, ревматоидный артрит (RA), псориаз, псориатический артрит, системную красную волчанку (SLE), волчаночный нефрит, сахарный диабет I типа, болезнь Грейвса, воспалительные заболевания кишечника заболевание (IBD), болезнь Крона (CD), язвенный колит (UC), синдром раздраженного кишечника, рассеянный склероз (MS), аутоиммунный миокардит, болезнь Кавасаки, ишемическую болезнь сердца, хроническую обструктивную болезнь легких (COPD), интерстициальное заболевание легких, аутоиммунный тиреоидит, склеродермию, системный склероз, остеоартрит, атопический дерматит, витилиго, болезнь «трансплантат против хозяина», синдром Шегрена, аутоиммунный нефрит, синдром Гудпасчера, хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию, АМСА-ассоциированный васкулит, увеит, склеродермию, буллезный пемфигоид, болезнь Альцгеймера, амиотрофический боковой склероз, хорею Гентингтона, муковисцидоз, подагру, возрастную макулярную дегенерацию, аллергию, астму и другие аутоиммунные заболевания, которые являются результатом острого или хронического воспаления. В другом воплощении заболевание или нарушение представляет собой острое или хроническое воспаление, где нарушение может быть аутоиммунным заболеванием. В одном воплощении нарушение представляет собой ревматоидный артрит (RA), псориатический артрит, системную красную волчанку (SLE), волчаночный нефрит, воспалительное заболевание кишечника (IBD), включая болезнь Крона (CD) или язвенный колит (UC), или синдром раздраженного кишечника. В других воплощениях нарушение представляет собой RA или SLE. Помимо хронических заболеваний анти-C5aR-антитела могут быть актуальны в связи с острыми состояниями, такими как трансплантация, ишемическое/реперфузионное повреждение (например, острый инфаркт миокарда, инсульт), сепсис (например, SIRS, MODS, ALI), атеросклероз и внутримозговое кровоизлияние (ICH).
В другом аспекте данное изобретение относится к антителу, выделенному антителу или композиции антитела, описанной в данном документе, для лечения заболевания или нарушения. В другом воплощении указанное антитело, выделенное антитело или композиция антитела используется для лечения одного или более чем одного заболевания и нарушения, описанного ранее в данном документе в связи со способом лечения.
Аспект данного изобретения относится к применению антитела, выделенного антитела или композиции антитела, описанной в данном документе, для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания или нарушения, где заболевание или нарушение может быть таким, как описано ранее в данном документе в связи со способом лечения.
Режим введения
Антитело изобретения можно вводить парентерально, например, внутривенно, внутримышечно, подкожно. Альтернативно, антитело изобретения можно вводить непарентеральным путем, например, перорально или местно. Антитело изобретения можно вводить профилактически. В предпочтительном воплощении антитело вводят внутривенно или подкожно.
Дозировка и время введения, по-видимому, будут зависеть от различных факторов, включая заболевание/нарушение или симптомы, представляющие интерес, а также от рассматриваемого субъекта. Как правило, ожидается, что антитело будет вводиться в дозах от 0,010 мг/кг до 4-6 мг/кг. Аналогичным образом дозировка антитела также будет зависеть от конкретного субъекта и болезненного состояния указанного субъекта, но желательно в соответствии с изобретением использовать лечение, при котором антитело (или композицию антитела) вводят субъекту один раз в неделю или каждые две недели или даже с более длительными интервалами, например, один раз в месяц.
Антитело изобретения можно вводить по требованию, т.е. антитело может вводиться, например, на основе опыта пациентов, например, когда возникают конкретные симптомы или когда количество конкретных биомаркеров достигает заданного уровня.
Конкретная комбинированная терапия
Антитела изобретения могут быть введены совместно с одним или более чем одним терапевтическим агентом или составом. Другой агент может быть агентом, который усиливает эффекты антител изобретения. Другой агент может быть предназначен для лечения других симптомов или состояний пациента. Например, другой агент может представлять собой анальгетик, иммунодепрессант или противовоспалительный агент.Другой агент может представлять собой другое моноклональное антитело, например одно из тех, которые описаны в международных патентных заявках WO 2008/022390 и WO 2009/103113.
Комбинированное введение двух или более агентов может быть достигнуто несколькими различными способами. В одном воплощении антитело и другой агент можно вводить вместе в одной композиции. В другом воплощении антитело и другой агент можно вводить в отдельных композициях как часть комбинированной терапии. Например, модулятор может вводиться до, после или одновременно с другим агентом.
Антитела в соответствии с данным изобретением могут быть введены вместе с другими лекарственными средствами (например, метотрексатом, дексаметазоном и преднизолоном) и/или другими биологическими препаратами. В одном воплощении в соответствии с изобретением антитело может быть введено вместе с одним или более чем одним терапевтическим агентом(ами), выбранным из класса антиревматоидных агентов с АТС-кодом M01C и иммунодепрессантов с АТС-кодом L04, описанных в WO 2009/103113, включая, но не ограничиваясь ими, азатиоприн, хлорохин, гидроксихлорохин, циклоспорин, D-пеницилламин, соли золота (ауротиомалат натрия, auranofm), лефлуномид, метотрексат, миноциклин, сульфасалазин и циклофосфамид, глюкокортикостероиды, микофеноловую кислоту или мофенолат и такролимус, и в отдельном воплощении один или более чем один из плакенила, азулфидина и метотрексата, дексаметазона и/или преднизона.
В другом примере антитела данного изобретения также могут быть использованы в комбинации с другими антителами (например, в комбинации с антителами, которые связывают рецепторы хемокинов, включая, но не ограничиваясь ими, CCR2 и CCR3) или с анти-TNF или другими противовоспалительными агентами или с существующими продуктами плазмы крови, такими как коммерчески доступный гамма-глобулин и иммуноглобулиновые продукты, используемые в профилактическом или терапевтическом лечении. Антитела данного изобретения могут быть использованы в виде отдельно вводимых композиций, даваемых в сочетании с антибиотиками и/или противомикробными агентами.
Антитела соответственно могут вводиться в сочетании с агентами, такими как агенты, которые уже используются при аутоиммунитете, включая, но не ограничиваясь ими, иммуномодуляторы, такие как IFN-бета, Оренция™ (CTLA4-Ig), Хумира™ (анти-TNF), Цимзия™ (анти-TNF, ПЭГ Fab), Тизабри™ (а4-интегрин-МКА), Симпони™, Ритуксан/МабТера™, Актемра/РоАктемра™, Кинерет™, Раптива, Устекимумаб, нестероидные противовоспалительные препараты (NSAID), такие как Асприн™, Ибупрофен™ и т.д., кортикостероиды, противоревматические препараты модифицирующие течение болезни (DMARD), такие как Плакенил™, Азулфидин™, Метотрексат™ и т.д., Копаксон™ (глатирамера ацетат), Гиления™ (финголимод), антибиотики, такие как Флагил™, Ципро™, местные (применяемые на коже) лекарства, в том числе местные кортикостероиды, крема с аналогами витамина D (Довонекс™), местные ретиноиды (Тазорак™), увлажнители, местные иммуномодуляторы (такролимус и пимекролимус), каменноугольную смолу, антралин и другие, а также световая терапия, такая как PUVA UVB и CellCept™ (микофенолят мофетил) может быть объединена с лечением антителами в соответствии с изобретением.
Возможно, что субъект, подлежащий лечению, уже получает лечение одним или более чем одним другим препаратом, и в этом случае антитело изобретения может быть добавлено к указанному режиму лечения.
Способ изготовления антитела
Антитело может быть получено различными способами, известными в данной области, главным образом на основе гибридомных клонов для продукции антитела или экспрессии антитела в рекомбинантном хозяине, при этом второй вариант описан в WO 2010/000864. На основании знаний в данной области может быть сконструирована нуклеотидная последовательность, кодирующая нужную цепь антитела, и использована для рекомбинантной экспрессии антитела, где тяжелая и легкая цепи могут экспрессироваться из одного или двух отдельных полинуклеотидов.
Данное изобретение в другом аспекте относится к одному или более чем одному выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептидную последовательность цепи антитела, описанного в данном документе.
Другое воплощение относится к клетке-хозяину, содержащей один или более чем один полинуклеотид, кодирующий полипептидную последовательность(и) цепи антитела, описанного в данном документе.
Кроме того, изобретение относится к процессу получения антитела в соответствии с изобретением, включающему культивирование клетки-хозяина, описанной выше, в условиях, поддерживающих экспрессию одной или более чем одной полипептидной последовательности цепи антитела. Процесс также может включать вариант, когда цепи антитела кодируются с помощью двух отдельных открытых рамок считывания на одном непрерывном полинуклеотиде, и, возможно, когда антитело выделяют из культуры указанной клетки-хозяина.
Данное изобретение может быть описано с помощью следующих воплощений, но не ограничиваясь ими.
Воплощения
1. Антитело, в котором вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3,
где указанная CDR1-последовательность содержит SEQ ID 1 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делециями или вставками, и/или
где указанная CDR2-последовательность содержит SEQ ID 2 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делециями или вставками, и/или
где указанная CDR3-последовательность содержит SEQ ID 3 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делециями или вставками.
2. Антитело, в котором вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит CDR1-, CDR2- и CDR3-последовательности, где указанные CDR-последовательности содержат SEQ ID 1, 2 и 3 или варианты указанных последовательностей, где 1, 2 или 3 аминокислоты заменены на другие аминокислотные остатки.
3. Антитело, в котором вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит CDR1-, CDR2- и СОК3-последовательности, где указанные CDR-последовательности идентичны SEQ ID 1, 2 и 3.
4. Антитело, в котором вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит CDR1-, CDR2- и CDR3-последовательности,
где указанная CDR1-последовательность содержит SEQ ID 5 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делениями или вставками, и/или
где указанная CDR2-последовательность содержит SEQ ID 6 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делециями или вставками, и/или
где указанная CDR3-последовательность содержит SEQ ID 7 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делениями или вставками.
5. Антитело, в котором вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит CDR1-, CDR2- и CDR3-последовательности, где указанные CDR-последовательности содержат SEQ ID 5, 6 и 7 или варианты указанных последовательностей, где 1, 2 или 3 аминокислоты заменены на другие аминокислотные остатки.
6. Антитело, в котором вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит CDR1-, CDR2- и CDR3-последовательности, где указанные CDR-последовательности идентичны SEQ ID 5, 6 и 7.
7. Антитело, в котором вариабельная область тяжелой цепи определена как любое из воплощений 1, 2 или 3, и где вариабельная область легкой цепи определена как любое из воплощений 4, 5 или 6.
8. Антитело, в котором вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит CDR1-, CDR2- и CDR3-последовательности,
где указанная CDR1-последовательность содержит SEQ ID 9 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делециями или вставками, и/или
где указанная CDR2-последовательность содержит SEQ ID 10 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делениями или вставками, и/или
где указанная СОК3-последовательность содержит SEQ ID 11 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делециями или вставками.
9. Антитело, в котором вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит CDR1-, CDR2- и CDR3-последовательности, где указанные CDR-последовательности содержат SEQ ID 9, 10 и 11 или варианты указанных последовательностей, где 1, 2 или 3 аминокислоты заменены на другие аминокислотные остатки.
10. Антитело, в котором вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит CDR1-, CDR2- и CDR3-последовательности, где указанные CDR-последовательности идентичны SEQ ID 9, 10 и 11.
11. Антитело, в котором вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит CDR1-, CDR2- и CDR3-последовательности,
где указанная CDR1-последовательность содержит SEQ ID 13 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делециями или вставками, и/или
где указанная CDR2-последовательность содержит SEQ ID 14 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делениями или вставками, и/или
где указанная CDR3-последовательность содержит SEQ ID 15 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делениями или вставками.
12. Антитело, в котором вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит CDR1-, CDR2- и CDR3-последовательности, где указанные CDR-последовательности содержат SEQ ID 13, 14 и 15 или варианты указанных последовательностей, где 1, 2 или 3 аминокислоты заменены на другие аминокислотные остатки.
13. Антитело, в котором вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит CDR1-, CDR2- и CDR3-последовательности, где указанные CDR-последовательности идентичны SEQ ID 13, 14 и 15.
14. Антитело, в котором вариабельная область тяжелой цепи определена как любое из воплощений 8, 9 или 10, и где вариабельная область легкой цепи определена как любое из воплощений 11,12 или 13.
15. Антитело, в котором вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит CDR1-, CDR2- и CDR3-последовательности,
где указанная CDR1-последовательность содержит SEQ ID 17 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делениями или вставками, и/или
где указанная СОК2-последовательность содержит SEQ ID 18 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делециями или вставками, и/или
где указанная CDR3-последовательность содержит SEQ ID 19 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делениями или вставками.
16. Антитело, в котором вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит CDR1-, CDR2- и CDR3-последовательности, где указанные CDR-последовательности содержат SEQ ID 17, 18 и 19 или варианты указанных последовательностей, где 1, 2 или 3 аминокислоты заменены на другие аминокислотные остатки.
17. Антитело, в котором вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит CDR1-, CDR2- и CDR3-последовательности, где указанные CDR-последовательности идентичны SEQ ID 17, 18 и 19.
18. Антитело, в котором вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит CDR1-, CDR2- и CDR3-последовательности,
где указанная CDR1-последовательность содержит SEQ ID 21 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делециями или вставками, и/или
где указанная CDR2-последовательность содержит SEQ ID 22 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делециями или вставками, и/или
где указанная CDR3-последовательность содержит SEQ ID 23 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делециями или вставками.
19. Антитело, в котором вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит CDR1-, CDR2- и CDR3-последовательности, где указанные CDR-последовательности содержат SEQ ID 21, 22 и 23 или варианты указанных последовательностей, где 1, 2 или 3 аминокислоты заменены на другие аминокислотные остатки.
20. Антитело, в котором вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит CDR1-, CDR2- и CDR3-последовательности, где указанные CDR-последовательности идентичны SEQ ID 21, 22 и 23.
21. Антитело, где вариабельная область тяжелой цепи определена как любое из воплощений 15, 16 или 17, и где вариабельная область легкой цепи определена как любое из воплощений 18, 19 или 20.
22. Антитело, в котором вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит CDR1-, CDR2- и CDR3-последовательности,
где указанная CDR1-последовательность содержит SEQ ID 25 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делениями или вставками, и/или
где указанная CDR2-последовательность содержит SEQ ID 26 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делециями или вставками, и/или
где указанная CDR3-последовательность содержит SEQ ID 27 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делециями или вставками.
23. Антитело, в котором вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит CDR1-, CDR2- и CDR3-последовательности, где указанные CDR-последовательности содержат SEQ ID 25, 26 и 27 или варианты указанных последовательностей, где 1, 2 или 3 аминокислоты заменены на другие аминокислотные остатки.
24. Антитело, в котором вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит CDR1-, CDR2- и CDR3-последовательности, где указанные CDR-последовательности идентичны SEQ ID 25, 26 и 27.
25. Антитело, в котором вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит CDR1-, CDR2- и CDR3-последовательности,
где указанная CDR1-последовательность содержит SEQ ID 29 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делециями или вставками, и/или
где указанная CDR2-последовательность содержит SEQ ID 30 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делециями или вставками, и/или
где указанная CDR3-последовательность содержит SEQ ID 31 или указанную последовательность с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, делециями или вставками.
26. Антитело, в котором вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит CDR1-, CDR2- и CDR3-последовательности, где указанные CDR-последовательности содержат SEQ ID 29, 30 и 31 или варианты указанных последовательностей, где 1, 2 или 3 аминокислоты заменены на другие аминокислотные остатки.
27. Антитело, в котором вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит CDR1-, CDR2- и CDR3-последовательности, где указанные CDR-последовательности идентичны SEQ ID 29, 30 и 31.
28. Антитело, в котором вариабельная область тяжелой цепи определена как любое из воплощений 22, 23 или 24, и где вариабельная область легкой цепи определена как любое из воплощений 25, 26 или 27.
29. Антитело, в котором вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит последовательность, по меньшей мере на 80, 85, 90 или 94% идентичную SEQ ID №4, 12, 20 или 28.
30. Антитело по воплощению 0, где вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит одну или более чем одну мутацию в каркасной области.
31. Антитело по воплощению 0, где указанные мутации являются консервативными.
32. Антитело по воплощению 0, где указанные мутации увеличивают идентичность с ближайшей человеческой зародышевой последовательностью.
33. Антитело по воплощению 0, где вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела определяется SEQ ID №39.
34. Антитело, в котором вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит последовательность, по меньшей мере на 80, 85, 90 или 94% идентичную SEQ ID №8, 16, 24 или 32.
35. Антитело по воплощению 0, где вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит одну или более чем одну мутацию в каркасной области.
36. Антитело по воплощению 0, где указанные мутации являются консервативными.
37. Антитело по воплощению 0, где указанные мутации увеличивают идентичность с ближайшей человеческой зародышевой последовательностью.
38. Антитело по воплощению 0, где вариабельная область легкой цепи указанного антитела определяется SEQ ID №40.
39. Антитело, в котором вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит последовательность, по меньшей мере на 80, 85, 90 или 94% идентичную SEQ ID №4, 12, 20 или 28, и где вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит последовательность, по меньшей мере на 80, 85, 90 или 94% идентичную SEQ ID №8, 16, 24 или 32.
40. Антитело по воплощению 0, где последовательность указанной вариабельной области тяжелой цепи по меньшей мере на 96%, например на 97%, например на 98% или, например, на 99% идентична SEQ ID №4, 12, 20 или 28, и где последовательность указанной вариабельной области легкой цепи по меньшей мере на 96%, например на 97%, например на 98% или, например, на 99% идентична SEQ ID №8, 16, 24 или 32.
41. Антитело по воплощению 0 или 0, где вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит одну или более чем одну мутацию в каркасной области, и/или где вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит одну или более чем одну мутацию в каркасной области.
42. Антитело по воплощению 0, где указанные мутации являются консервативными.
43. Антитело по воплощению 0, где указанные мутации увеличивают идентичность с ближайшей человеческой зародышевой последовательностью.
44. Антитело по воплощению 0, где вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела определяется SEQ ID №39, и/или где вариабельная область легкой цепи указанного антитела определяется SEQ ID №40.
45. Антитело по любому из предыдущих воплощений, где указанное антитело связывает C5aR.
46. Антитело по любому из предыдущих воплощений, где указанное антитело является полноразмерным антителом или фрагментом антитела или одноцепочечным антителом.
47. Антитело по любому из предыдущих воплощений, где указанное антитело является моноклональным антителом.
48. Антитело по любому из предыдущих воплощений, где указанное антитело является человеческим, мышиным, крысиным, кроличьим, свиным или антителом примата.
49. Антитело по любому из предыдущих воплощений, где указанное антитело является мышиным или человеческим антителом.
50. Антитело по любому из предыдущих воплощений, где указанное антитело является человеческим антителом или гуманизированным антителом.
51. Антитело по любому из предыдущих воплощений, где указанное антитело является человеческим антителом.
52. Человеческое антитело, связывающее C5aR.
53. Антитело по любому из предыдущих воплощений, где указанное антитело связывает человеческий C5aR.
54. Антитело по любому из предыдущих воплощений, где указанное антитело связывает вторую внеклеточную петлю C5aR.
55. Антитело по любому из предыдущих воплощений, где указанное антитело связывает вторую внеклеточную петлю человеческого C5aR.
56. Антитело по любому из предыдущих воплощений, где указанное антитело связывает человеческий C5aR, но не связывает мышиный C5aR.
57. Антитело по любому из предыдущих воплощений, где указанное антитело связывает вторую внеклеточную петлю человеческого C5aR, но не связывает вторую внеклеточную петлю мышиного C5aR.
58. Антитело по любому из предыдущих воплощений, где указанное антитело связывает вторую внеклеточную петлю человеческого C5aR только в нативной конформации.
59. Антитело по любому из предыдущих воплощений, где антитело значительно ингибирует или устраняет связывание С5а с человеческим C5aR.
60. Антитело по любому из предыдущих воплощений, где антитело способно вытеснять С5а в SPA-анализе с IC50 ниже 10 нМ или ниже 5 нМ, или предпочтительно ниже 3 нМ.
61. Антитело по любому из предыдущих воплощений, где антитело значительно ингибирует миграцию человеческих нейтрофилов in vitro.
62. Антитело по любому из предыдущих воплощений, где антитело уменьшает миграцию до менее 50%, менее 40%, менее 30%, менее 20%, менее 15%, или менее 10% при измерении через 30 минут в присутствии 10 нМ С5а в сравнении с уровнем миграции, наблюдаемым через 30 минут в присутствии 10 нМ С5а и в отсутствие антитела, или где IC50 в тех же условиях составляет 2,5 мкг/мл, например ниже 2,5 мкг/мл, например ниже 1,5 мкг/мл, например ниже 1,2 мкг/мл или даже ниже 1,0 мкг/мл.
63. Антитело по любому из предыдущих воплощений, где аффинность антитела, измеряемая в конкурентном анализе связывания на нейтрофилах, составляет менее 0,80 нМ, например менее 0,50 нМ или 0,35 нМ.
64. Антитело по любому из предыдущих воплощений, которое нейтрализует С5а-индуцированную активацию нейтрофилов ex vivo с IC50, определяемой в анализе кальциевого потока, менее 7,0 мкг/мл, например менее 5,0 мкг/мл, например менее 2,5 мкг/мл.
65. Антитело по любому из предыдущих воплощений, которое ингибирует С5а-индуцированное созревание нейтрофилов ех vivo с
а. IC50, определяемой в анализе повышающей регуляции CD11b, менее 3,5 мкг/мл, например менее 2,5 мкг/мл, например менее 1,5 мкг/мл или даже менее 1,0 мкг/мл или
b. IC50, определяемой в анализе понижающей регуляции CD62L, менее 1,8 мкг/мл, например менее 1,5 мкг/мл, например менее 1,2 мкг/мл или даже менее 1,0 мкг/мл..
66. Антитело, связывающее C5aR, где Fc-область имеет сниженную аффинность/сниженное связывание с одним или более чем одним Fcγ-рецептором по сравнению с Fc-референсными последовательностями IgG1, IgG2, IgG4 или IgG4/G2, определяемыми SEQ ID №33, 34, 35 и 36, соответственно.
67. Антитело по любому из предыдущих воплощений, где Fc-область включает одну или более чем одну точечную мутацию по сравнению с Fc-референсными последовательностями IgG1, IgG2, IgG4 или IgG4/G2, определяемыми SEQ ID №33, 34, 35 и 36 соответственно, что уменьшает аффинность к одному или более чем одному Fcy-рецептору.
68. Антитело по любому из предыдущих воплощений, которое значительно не индуцирует фагоцитоз нейтрофилов in vitro.
69. Антитело по любому из предыдущих воплощений, которое значительно не индуцирует ADCC in vitro.
70. Антитело по любому из предыдущих воплощений, которое значительно не индуцирует CDC in vitro.
71. Антитело по любому из предыдущих воплощений, где Fc-область представляет собой IgG1 (SEQ ID №33), IgG2 (SEQ ID №34), IgG2/4 (SEQ ID №35) или IgG4 (SEQ ID №36), с одной или более чем одной из следующих точечных мутаций:
а. Е233Р
b. L234A или V234A или F234L или F234V
с. L235E или L235A
d. G236R или G236A
е. G237A
f. N297Q
g. L328R
h. A330S
i. P331S
72. Антитело по любому из предыдущих воплощений, где Fc-область представляет собой IgG1 или мутант IgG1.
73. Антитело по любому из предыдущих воплощений, где Fc-область представляет собой Fc-мутант IgG1 с 1-10 аминокислотными заменами по сравнению с Fc-референсной последовательностью IgG1, определенной в SEQ ID №33.
74. Антитело по любому из предыдущих воплощений, где Fc-область представляет собой Fc-мутант IgG1 с 1-8 аминокислотными заменами в пределах аминокислот с 231 по 240, где Fc-референсная последовательность IgG1 определена в SEQ ID №33.
75. Антитело по любому из предыдущих воплощений, где Fc-область представляет собой Fc-мутант IgG1 с 1-5 аминокислотными в пределах аминокислот с 328 по 334, где Fc-референсная последовательность IgG1 определена в SEQ ID №33.
76. Антитело по любому из предыдущих воплощений, где Fc-область антитела представляет собой IgG1, с одной или более чем одной из следующих групп точечных мутаций
а. N297Q и/или
b. L234A и L235E и/или
с. G236R и L328R и/или
d. N297Q, L234A и L235E и/или
е. N297Q, L234A, L235E и G237A и/или
f. L234A, L235E, G237A, A330S и P331S
77. Антитело по любому из предыдущих воплощений 0-0, где указанное антитело является полноразмерным антителом фрагментом антитела или одноцепочечным антителом.
78. Антитело по любому из предыдущих воплощений, где указанное антитело является моноклональным антителом.
79. Антитело по любому из предыдущих воплощений, где указанное антитело является человеческим, мышиным, крысиным, кроличьим, свиным или антителом примата.
80. Антитело по любому из предыдущих воплощений, где указанное антитело является мышиным или человеческим антителом.
81. Антитело по любому из предыдущих воплощений, где указанное антитело является человеческим антителом или гуманизированным антителом.
82. Антитело по любому из предыдущих воплощений, где указанное антитело является человеческим антителом.
83. Антитело по любому из предыдущих воплощений для лечения иммунологического заболевания или нарушения.
84. Антитело по воплощению 0, где нарушение является воспалительным заболеванием.
85. Антитело по воплощению 0, где нарушение является острым или хроническим воспалением.
86. Антитело по воплощению 0, где нарушение является аутоиммунным заболеванием.
87. Антитело по любому из воплощений 0-0, где антитело вводят внутривенно или подкожно.
88. Антитело по любому из предыдущих воплощений 0-0, где антитело вводят в дозах от 0,010 мг/кг до 6 мг/кг.
89. Антитело по любому из предыдущих воплощений 0-0, где антитело вводят один раз в неделю или каждые 2 недели.
90. Антитело по любому из предыдущих воплощений 0-0, где антитело вводят в сочетании с другим лекарственным препаратом.
91. Антитело по любому из предыдущих воплощений 0-0, где заболевание или нарушение представляет собой ревматоидный артрит (RA), псориатический артрит, системную красную волчанку (SLE), волчаночный нефрит, воспалительное заболевание кишечника (IBD), болезнь Крона (CD), язвенный колит (UC) или синдром раздраженного кишечника.
92. Антитело по любому из предыдущих воплощений 0-0, где пациент получает лечение другим лекарственным препаратом, таким как метотрексат.
93. Способ лечения или профилактики нарушения у субъекта, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтического количества антитела по любому из воплощений 1-82.
94. Способ по воплощению 0, где нарушение представляет собой иммунологическое заболевание или нарушение.
95. Способ по воплощению 0 или 0, где антитело вводят внутривенно или подкожно.
96. Способ по любому из воплощений 0-0, где антитело вводят в дозах от 0,010 мг/кгдо 6 мг/кг.
97. Способ по любому из воплощений 0-0, где антитело вводят один раз в неделю или каждые 2 недели.
98. Способ по любому из воплощений 0-0, где антитело вводят в сочетании по меньшей мере с одним другим лекарственным препаратом.
99. Способ по любому из воплощений 0-0, где нарушение представляет собой иммунопатологическое нарушение, например аутоиммунное заболевание.
100. Способ по любому из воплощений 0-0, где субъектом является пациент, страдающий ревматоидным артритом (RA), псориатическим артритом, системной красной волчанкой (SLE), волчаночным нефритом, воспалительным заболеванием кишечника (IBD), болезнью Крона (CD), язвенным колитом (UC) или синдромом раздраженного кишечника.
101. Способ по любому из воплощений 0-0, где пациент получает лечение другим лекарственным препаратом.
102. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по любому из воплощений 1-0, возможно в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
103. Фармацевтическая композиция по воплощению 0 в форме водного состава или сухого состава, который восстанавливают в воде/водном буфере перед введением.
104. Выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептидную последовательность(и) антитела по любому из воплощений 1-0.
105. Клетка-хозяин, содержащая один или более чем один полинуклеотид по воплощению 0.
106. Процесс получения антитела по любому из воплощений 1-0, включающий культивирование клетки-хозяина по воплощению 0 в условиях, поддерживающих экспрессию одной или более чем одной полипептидной последовательности указанного антитела.
107. Процесс по воплощению 0, где тяжелая и легкая цепи закодированы двумя отдельными рамками считывания на одном непрерывном полинуклеотиде.
108. Процесс по воплощению 0 или 0, также включающий восстановление указанного антитела из культуры клетки-хозяина.
109. Применение антитела по любому из воплощений 1-82 для изготовления лекарственного препарата.
110. Применение антитела по любому из воплощений 1-82 для изготовления лекарственного препарата для лечения иммунопатологического заболевания или нарушения, такого как ревматоидный артрит (RA), псориатический артрит, системная красная волчанка (SLE), волчаночный нефрит, воспалительное заболевание кишечника (IBD) или синдром раздраженного кишечника.
Примеры
Пример 1: Создание человеческих анти-ПС5аК-антител
Иммунизация и скрининг
Как правило, получение антител против GPCR является трудоемким, потому что получить растворимый белок, имеющий правильную нативную конформацию, очень трудно. Традиционно для иммунизации используют клетки со сверхэкспрессией GPCR, но ответ образующихся антител, как правило, является очень неспецифическим, из-за чего трудно определить антитела, которые имеют необходимый профиль, т.е. в состоянии блокировать связывание лиганда и сигнализацию GPCR. Действительно, авторы обнаружили, что очень сложно получить человеческие анти-hC5aR-антитела, которые могли бы блокировать связывание С5а с C5aR, и был применен ряд стратегий иммунизации, пока эти антитела не были идентифицированы.
Мышей HuMab (Medarex) иммунизировали мышиными клетками L1.2 (линия мышиной В-клеточной лимфомы) с высокой экспрессией человеческого C5aR (примерно 80000 копий на клетку) (Lee et al Nat. Biotechnol, 2006; 10:1279-1284), и спленоциты из иммунизированных мышей использовали для клеточных гибридов с применением стандартных процедур. В связи с отсутствием растворимого hC5aR супернатанты нельзя было проанализировать в стандартном анализе ELISA, и поэтому был разработан анализ связывания на основе клеток. Супернатанты от полученных гибридом анализировали на предмет связывания с трансфицированной крысиной клеточной линией (RBL), стабильно экспрессирующей большое число (примерно 1000000 копий на клетку) нативного hC5aR с помощью анализа FACS, описанного в WO 2008/022390. Как правило, гибридомные супернатанты инкубировали со смесью нетрансфицированных клеток (меченных CellTracker) и ПСбаР-трансфицированных клеток, или нейтрофилов от hC5aR knock-out/knock-in (KOKI) мышей (WO 2005/ 060739), и инкубировали с АРС-конъюгированным козлиным противочеловеческим F(ab')2 IgG (IgG-APC). Были выявлены супернатанты, связывающиеся с hC5aR-трансфицированными клетками, но не с нетрансфицированными клетками, и анти-пСбаК-продуцирующие гибридомы субклонировали и анализировали на предмет связывания с человеческими нейтрофилами и нейтрофилами, полученными из костного мозга KOKI-мышей (данные не показаны). Анти-пС5аР-антитела очищали из гибридомных супернатантов с использованием белок А-сефарозы и стандартных протоколов.
Пример 2: Выявление и характеризация анти-hC5aR-антител
Как упоминалось выше, процесс получения человеческих анти-hCSaR-антител были проблематичным, и было выполнено 32 слияния, пока hC5a/hC5aR-блокирующие антитела не были выявлены. Из 35 слияний и скрининга более 100000 гибридомных супернатантов было выявлено только 11 клонов, которые могли блокировать связывание hC5a с hC5aR. Анализы, использованные при характеризации антител, описаны далее. Референсное антитело (референсное антитело Q) описано в WO 2009/103113. Кроме того, в примере 7 описаны другие анализы, подходящие для определения аффинности и функциональности в анализе кальциевого потока и в анализе повышающей регуляции CD11b.
Анализ с вытеснением
125
125
125
125
Сцинтилляционной анализ сближения (SPA) применяли для того, чтобы определить силу анти-hC5aR-антител в замещении hC5a, связанного с hC5aR. Подробное описание SPA приведено в патенте US 4568649 и в протоколах, предоставленных производителем (Amersham Biosciences). Вкратце, фрагменты мембран, несущих рецепторы, очищенных из клеток RBL-hCSaR, связывали со сцинтиллирующими микрочастицами, покрытыми агглютинином зародышей пшеницы (WGA). После добавления меченного радиоактивным изотопом hC5a (I) связывание с рецепторами приводит к эмиссии света из частиц. Специфично для SPA-принципа, радиоактивные изотопы и частицы только в непосредственной близости друг от друга будут излучать свет. Т.е. только радиоактивно меченный hC5a, связанный с рецептором, находится достаточно близко к WGA-частице, чтобы образовывать свет. Таким образом, количество излучаемого света отражает количество рецептор-связанного I-hC5a. Анализ является конкурентным анализом, в котором анти-hC5aR/немеченый hC5a конкурирует с трейсером в связывании с рецепторами. В этом анализе фиксированное количество I-меченого С5а добавляется к WGA-частицам и C5aR-рецепторам, в результате чего излучается определенное количество света, измеряемое как число импульсов в минуту (срт). Если добавляется немеченный С5а или анти-C5aR, то связывание его с рецепторами вызовет меньшее число срт за счет вытеснения I С5а.% вытеснения рассчитывали следующим образом:
S: Образец
125
Smax: Неспецифическое связывание. Измеряется путем добавления немеченого hC5a в количестве, достаточном для вытеснения специфически связанного I-hC5a.
So: Максимальное связывание. Немеченый hC5a не добавляется.
125
Значение IC50 определяют как концентрацию, которая замещает 50% С5а. Значение срт поддерживается постоянным между экспериментами, следовательно, значения IC50 относятся как десятки трейсеров с течением времени. Способность человеческих анти-hC5aR-антител замещать I-hC5a (IC50) была определена, и данные представлены в таблице 1.
Анализ миграции нейтросЬилов (хемотаксиса)
Способность антител ингибировать hC5a (или mC5a)-зависимую миграцию нейтрофилов анализировали в камере Бойдена. Нейтрофилы, выделенные из крови человека или животного, окрашивали кальцеином, вносили в верхний отсек камеры Бойдена и смешивали с антителами. hC5a или mC5a вносили в нижний отсек камеры Бойдена, и они выступали в качестве хемоаттрактанта для нейтрофилов. Способность нейтрофилов мигрировать в нижний отсек определяли путем подсчета числа окрашенных кальцеином нейтрофилов, проходящих через 3 или 5 мкм мембрану Fluoroblok.
2
4
3
2
4
4
2
2
2
Человеческие PMN (полиморфноядерные лейкоциты; гранулоциты) получали из образцов крови человека, помещенных в пробирки, содержащие EDTA. Клетки крови отделяли путем центрифугирования крови (4 части) через градиент фиколла Ficoll-Paque PLUS (GE Health Care) (3 части) в течение 30 мин (400 д) при комнатной температуре. PMN-содержащий слой суспендировали в PBS (фосфатном буферном растворе), содержащем декстран-500 (Sigma), в течение 1 ч, чтобы удалить загрязняющие эритроциты. Супернатант центрифугировали в течение 5 мин (250 g) при комнатной температуре и оставшиеся эритроциты осмотически лизировали с помощью 0,2% NaCl в течение 55 сек. Раствор делали изотоническим с помощью 1,2% NaCl+PBS и центрифугировали при 250 g в течение 5 мин, после чего повторяли осмотический лизис.После центрифугирования PMN ресуспендировали в реакционной смеси (RM): HBSS (кат. №14175 Gibco) содержит NaCl 137 мМ, KCl 5,3 мМ, NaHPO 0,33 мМ, NaHCO 4 мМ, KHPO 0,44 мМ, глюкозу 5 мМ; дополнен MgSO⋅7HO 0,4 мМ, MgCl, 0,5 мМ, CaCl 0,5 мМ, HEPES 20 мМ. Плотность клеток определяли с помощью NucleoCounter (Chemometec). Суспензия PMN содержала более 95% нейтрофилов, что оценивали путем микроскопии образцов, окрашенных по Гимзе.
6
6
Загрузка PMN: кальцеин, AM, (Fluka) растворяли в DMSO (диметилсульфоксид) и разводили в 1000 раз в RM с клетками (2×10 клеток на мл) с получением концентрации 10 мкМ. Суспензию инкубировали в течение 30 мин в инкубаторе при температуре 37°С, и затем промывали 3 раза в RM, чтобы удалить избыток кальцеина. Наконец, клетки ресуспендировали в RM (4×10 клеток/мл).

5
Миграцию оценивали по методике камеры Бойдена с использованием 96-луночной FluoroBlok с размером пор 3 мкм (кат. №351161. BD Falcon (VWR)). Верхнюю камеру, т.е. вставки, содержащие мембрану Fluoroblok, покрывали фибриногеном человека (кат. №F3879-1G, Sigma) в PBS 1 мг/мл при 37°С в течение 2 часов. После промывания мембраны блокировали с помощью раствора, содержащего 2% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS. После еще одного промывания с помощью RM в каждую лунку добавляли загруженные 10-кальцеином PMN с hC5aR-антителами или без них и помещали в планшет-ресивер (нижний отсек), который содержал контрольный раствор или хемоаттрактант hC5a (Sigma, C5788). Каждая группа состояла по меньшей мере из 6 лунок. После этого планшет измеряли при 485/538 нм, 37°С, каждые 5 мин в течение 60 мин в планшетном ридере (SpectraMAX, Molecular Devices, или Fluoroscan, Thermo Labsystems). Значение на 30 мин в относительных единицах флуоресценции использовали в качестве меры миграции.
Построение кривой. Способность антител ингибировать миграцию выражали с помощью IC50, определенной с помощью GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc.)
Таблица 1 включает данные из анализа вытеснения и анализа хемотаксиса, в которых анализировалась способность 10 мкг/мл человеческих моноклональных антител ингибировать hC5a-зависимую (10 нМ) миграцию человеческих нейтрофилов. Полученное значение в отсутствие антитела было установлено на 100. Данные собирали от трех доноров. Средние значения входят в таблицу 1. Эти три моноклональных антитела 32F3A6, 35F12A2 и 35F32A3 показали в обоих анализах высокую активность, которая была равна или немного превышала активность контрольного антитела. Референсным антителом является Q, описанное в WO 2009/103113.
Таблица 1
Функциональные характеристики анти-hC5aR-антител
Антитело
Вытеснение hC5a (SPA) IC50 (нМ)
Миграция человеческих нейтрофилов (в % по сравнению с миграцией в отсутствие антитела).
35F32A3
0,95
11
32F3A6
1,90
2
35F12A2
2,04
19
35F24A3
2,97
30
35F16A2
3,90
22
35F3A1
10,7
38
35F34A1
18,6
35
35F6A1
22,9
ND
34F12A5
32,1
>70
35F33A1
33,4
>70
34F12A3
46,6
>70
hC5a
4,1
100
Реф. AT Q
3,7
20-21
Характеризация CDR-последовательностей анти-hC5aR-МКА
Вариабельные области анти-ПС5аР-антител 35F32A3, 32F3A6, 35F12A2 и 35F24A3 рекомбинантно клонировали, и нуклеотидные и аминокислотные последовательности характеризовали с помощью стандартных способов. Аминокислотные последовательности включены в фиг.1 и сопутствующий список последовательностей.
Характеризация специфичности связывания
Для определения связывающей области C5aR использовали химерные конструкции человеческого-мышиного C5aR. Химерные рецепторы временно экспрессировали в клетках НЕК, и связывание отдельных антител определяли с помощью FACS, как было описано ранее в WO 2008/022390, за исключением изменения клеточной линии. Связывание 32F3A6, 35F32A3 и 35F12A2 зависело от человеческой последовательности внеклеточной петли 2, в то время как человеческий N-конец был необязательным (фиг.2).
Пример 3. Создание Fc-вариантов

Четыре подкласса человеческих IgG (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) имеют более 95% гомологии в Fc-областях, но показывают существенные различия в шарнирной области. Fc-область опосредует эффекторные функции, такие как антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и комплементзависимую цитотоксичность (CDC). В ADCC Fc-область антитела связывается с активирующими Fc-рецепторами (FcyR) на поверхности иммунных эффекторных клеток, таких как натуральные киллеры и моноциты, что приводит к фагоцитозу или лизису клеток-мишеней. В CDC Fc-область связывается с комплементом в месте, отличном от FcγR-связывающих сайтов, и антитела убивают клетки-мишени, вызывая каскад комплемента на поверхности клетки. Различные изоформы IgG имеют различные уровни эффекторных функций, увеличивающиеся в порядке IgG4<IgG2<IgG1<IgG3. Ряд Fc-вариантов IgG, которые содержат вариабельную область референсного антитела Q, были получены с помощью сайт-направленного мутагенеза с использованием набора QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (кат. №200518, Stratagene) и охарактеризованы, как описано в примере 4.
Пример 4: Характеризация эффекторных функций Fc-вариантов
Аффинность связывания Fc-вариантов с FcgR
Аффинность Fc-вариантов к FcγR определяли с помощью измерений поверхностного плазменного резонанса (SPR), которые проводили на приборе BIAcore Т100 с использованием сенсорного чипа СМ5 (GE). Fc-варианты иммобилизовали на проточных ячейках с помощью химической реакции аминного связывания. Для кинетического SPR-измерения аффинности FcγR к Fc-вариантам в качестве анализируемых веществ использовали His-FcγR и вводили их в проточные ячейки в HBS-EP-буфере. Высокоаффинный рецептор FcγRI вводили со скоростью потока 40 мкл/мин, время контакта составляло 180 сек, а время диссоциации 300 сек. Другие FcγR вводили со скоростью потока 50 мкл/мин, временем контакта 30 сек и временем диссоциации 120 сек. Поверхности чипа регенерировали с помощью раствора, содержащего 10 мМ NaOH и 500 мМ NaCl. Аффинности (значения Kd) перечислены в таблице 2А.
IgG
Fc-область антитела
FcγRI
FcγRIIA (131R)
FcγRIIA (131H)
FcγRIIB
FcγRII (158F)
FcγRIII (158V)
IgG1
L234A, L235E, G237A, A330S и P331S
-
-
-
2,10E-6
-
-
N297Q, L234A, L235E, G237A
-
-
-
<sup>-</sup>
-
-
N297Q, L234A, L235E
-
-
-
-
-
-
G236R, L328R
-
-
-
-
-
-
L234A, L235E
nd<sup>a</sup>
nd<sup>a</sup>
nd<sup>a</sup>
nd<sup>a</sup>
nd<sup>a</sup>
0,96E-6
N297Q
0,36Е-6
-
-
-
-
-
IgG1 референс
6,64Е-10
0,95E-6
0,64E-6
0,42E-6
0,33E-6
0,07E-6
IgG2
N297Q
-
nd<sup>a</sup>
nd<sup>a</sup>
-
-
-
IgG2 референс
-
2.79E-6
0,22E-6
1,54E-6
-
1,50E-6
IgG2/4<sup>(1)</sup>
N297Q
-
-
-
-
-
-
V234A, G236A
-
-
-
5,34E-6
-
-
IgG2/IgG4 референс
-
nd<sup>a</sup>
1,03E-6
1,83E-6
-
-
IgG4<sup>(2)</sup>
N297Q, F234L, L235A
nd<sup>a</sup>
-
-
-
-
-
N297Q, Е233Р, F234V,
-
-
-
-
-
-
L235A
Е233Р, F234V, L235A
0,38Е-6
-
<sup>-</sup>
nd<sup>3</sup>
<sup>-</sup>
nd<sup>a</sup>
N297Q
0,13Е-6
-
-
<sup>-</sup>
-
-
IgG4<sup>(2)</sup> референс
2,71 Е-9
0.80Е-6
3,52Е-6
1,08Е-6
<sup>-</sup>
nd<sup>a</sup>
a
Таблица 2А. Краткое изложение результатов, полученных в анализе аффинности Fc-вариантов к FcγR (Kd в М). (- = нет связывания; 0 = без изменений в связывании; nd=Kd не рассчитывается из-за слишком слабого связывания). (1) Fc-вариант IgG2/IgG4, содержащий СН1 и нижнюю шарнирную область из IgG2, a остальные СН2-СН3 из IgG4; (2) IgG4-мутант с точечной мутацией S228P.
Анализ фагоцитоза
Для выявления Fc-вариантов со сниженной или отмененной способностью опосредовать фагоцитоз нейтрофилов был проведен анализ фагоцитоза in vitro. Анализ фагоцитоза, описанный далее, включает мечение человеческих нейтрофилов, выделенных из периферической крови человека (клетки-мишени для фагоцитоза), флуоресцентной меткой, CMFDA, и добавление их в культуру человеческих моноцитов, также выделенных из периферической крови человека. CMFDA-меченные нейтрофилы предварительно покрывали анализируемыми моноклональными антителами (или PBS), и после инкубации с человеческими моноцитами определяли число CD14/СМРОА-дважды положительных моноцитов с помощью FACS. Результаты для различных Fc-вариантов представлены в таблице 2 В.
Все испытанные антитела включают вариабельные области антитела Q, описанного в WO 2009/103113 и используемого в качестве референсного антитела ранее.
Было обнаружено, что и моноциты, и макрофаги способны опосредовать антителозависимый фагоцитоз нейтрофилов, а также был проведен анализ фагоцитоза с обоими типами клеток. Результаты были качественно схожи в обоих анализах, но так как анализ макрофагов был более вариабельным, то анализ в основном проводили с использованием моноцитов.
Получение человеческих моноцитов
7
6
6
2
Человеческие моноциты и лимфоциты выделяли из периферической венозной крови, собранной у здоровых добровольцев в пробирки с EDTA в качестве антикоагулянта (К2Е, BD Biosciences, кат. №367525), путем градиента центрифугирования перколла. Из 100 мл крови, как правило, получали примерно 8-20×10 мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС). По меньшей мере 3 объема dPBS добавляли к изолированным клеткам, которые затем центрифугировали при 100 д в течение 10 мин при комнатной температуре (RT). После удаления супернатанта слой лимфоцитов/моноцитов ресуспендировали в таком же объеме смеси dPBS: культуральной среды с соотношением 50:50, как на предыдущем этапе, и снова центрифугировали при 100 д в течение 10 мин при комнатной температуре. Супернатант удаляли и слой лимфоцитов/моноцитов ресуспендировали в культуральной среде до плотности 1-2×10 клеток/мл. Ресуспендированные клетки высевали в 6-луночные планшеты для тканевых культур (Corning, Costar, кат. №3516) по 2 мл в лунку с плотностью 4×10клеток/лунку и инкубировали в течение 2 часов при 37°С в 5% СО. Неприкрепленные клетки (лимфоциты и мертвые клетки) удаляли путем аспирации, а прикрепленные клетки (моноциты) промывали четыре раза в 1 мл культуральной среды (RPMI 1640 (Invitrogen-GIBCO, кат. №11875) + 10% FCS (Invitrogen-GIBCO, кат. №16000) инактивированного нагреванием до 56°С в течение 30 мин + 25 мМ Hepes (Invitrogen-GIBCO, кат. №15630) + 1% Pen/Strep (Invitrogen-GIBCO, кат. №15070)), с нежным откручиванием перед аспирацией промывочной среды. После промывания моноцитов, полученных из крови, в каждую лунку добавляли 1 мл свежей культуральной средой. Клетки соскабливали с одной лунки и суспендировали в культуральной среде для оценки количества моноцитов в каждой лунке.
Получение человеческих нейтрофилов
7
7
6
7
Человеческие нейтрофилы выделяли из периферической венозной крови, собранной у здоровых доноров, используя градиент центрифугирования перколла, и окрашивали с помощью CellTracker™ Green (5-хлорметилфлуоресцеин диацетат, CMFDA). Из 100 мл крови, как правило, получали примерно 10-20×10нейтрофилов. Окрашивание проводили путем растворения CellTracker™ Green CMFDA в DMSO до конечной концентрации 10 мМ. Нейтрофилы ресуспендировали с плотностью 1×10 клеток/мл в dPBS и добавляли CMFDA до конечной концентрации 2 мкМ. Клетки и краситель инкубировали в течение 15 мин при 37°С. Избыток красителя удаляли путем промывания клеток 3 раза с помощью 10 мл dPBS (центрифугируя со скоростью 300 д в течение 5 мин при комнатной температуре). Подсчет клеток проводили после последнего этапа промывания. Нейтрофилы, меченные CMFDA, повторно суспендировали с плотностью 2×10клеток/мл в dPBS и инкубировали с антителом (конечная концентрация 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10 или 100 мкг/мл) или PBS (для контроля без антитела). В некоторых анализах (как указано) этап инкубации нейтрофилов с антителом также включал 4 мг/мл человеческого IgG. Клетки с антителами инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Нейтрофилы дважды промывали dPBS после центрифугирования со скоростью 300 g в течение 5 минут при комнатной температуре и ресуспендировали в культуральной среде до плотности 1×10 клеток/мл.
FACS-анализ
5
6
5
2
Нейтрофилы, меченные CMFDA и предварительно покрытые антителами (полученные, как описано выше), добавляли к моноцитам (описанным выше) в нужной концентрации в 1 мл культуральной среды. Общий объем в каждой лунке 6-луночного планшета составлял 2 мл. В некоторых анализах (как указано) культуральная среда также содержала 4 мг/мл человеческого IgG. Обычно использовалось соотношение нейтрофилов и моноцитов 5:1. Если число прикрепленных моноцитов было меньше 4×10 на лунку, то добавляли 2×10нейтрофилов (т.е. соотношение нейтрофилов и моноцитов превышало 5:1). Если число моноцитов превышало 4×10, то добавляли в пять раз больше нейтрофилов, чтобы сохранить соотношение нейтрофилов и моноцитов 5:1. Культуры инкубировали в течение 1 часа при 37°С в инкубаторе с 5% CO.
После инкубации среду аспирировали, чтобы удалить неприкрепленные и непоглощенные нейтрофилы. Прикрепленные моноциты промывали (с мягким откручиванием) три раза с помощью 1 мл/лунку культуральной среды. Моноциты собирали в 15 мл пробирки, соскабливая клетки в культуральной среде из лунок с помощью Cell Scrapers (Corning, кат. №СР3010). Клетки центрифугировали при 300 g в течение 5 мин при комнатной температуре и супернатант удаляли. Осадок клеток ресуспендировали в 160 мкл 1% (вес/объем) параформальдегида в PBS для фиксации перед FACS.
+ve
Образцы анализировали на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciences). Нейтрофилы, меченные CMFDA, выявляли и измеряли в FL-1 (канал флуоресценции 1) с помощью изотиоцианата флуоресцеина (FITC), а моноциты выявляли путем окрашивания образца, содержащего только моноциты, с помощью меченного фикоэритрином анти-CD14, который измеряли в FL-2 (канал флуоресценции 2). Моноцитарный гейт (область изучаемых клеток) определяли с помощью профилей FSC (прямого рассеяния) против SSC (бокового рассеяния) образца, содержащего только моноциты, и расширяли (по осям FSC и SSC), чтобы включить те моноциты, размер которых увеличился во время инкубации. Этот гейт исключал область профилей FSC против SSC, содержащую нейтрофилы, которая была определена по профилям FSC против SSC в образце, содержащем только нейтрофилы. Степень фагоцитоза рассчитывали как процент моноцитов FL-1 в общем моноцитарном гейте.
+ve
+ve
Фоновым уровнем неспецифического фагоцитоза был процент моноцитов FL- в образце, содержащем CMFDA-меченные нейтрофилы, не покрытые антителом (образец «без антитела»). Фон вычитали из каждого образца с антителом перед тем, как данные (% моноцитов FL-1 в зависимости от концентрации антитела) вводили в Prism (v4.0c, GraphPad Software Inc) для построения графиков. Данные подвергали нелинейной регрессии с использованием сигмоидального дозозависимого ответа (с переменным наклоном), т.е. 4-параметрического логистического уравнения, с целью определения значений ЕС50 при необходимости.
Данные представлены в таблице 2 В. «-» означает отсутствие выявляемого фагоцитоза, а с «+» по «++++» обозначают с низкой до высокой степени фагоцитоза, измеренного в анализах.
Анализы ADCC (антителозависимой клеточной цитотоксичности) и CDC (комплементзависимой цитотоксичности)
Следующие анализы in vitro были проведены для того, чтобы проанализировать способность Fc-вариантов опосредовать истощение клеток через ADCC- или CDC-зависимые механизмы.
Клетки-мишени
В этих анализах клетками-мишенями были экспрессирующие hC5aR клетки Ramos клона Е2 или человеческие нейтрофилы. Экспрессирующие hC5aR клетки Ramos клона Е2 получали путем стабильной трансфекции клеток Ramos клона Е2 вектором для экспрессии у млекопитающего, кодирующим hC5aR, с использованием стандартных процедур. Полученная клеточная линия экспрессировала высокие уровни человеческого C5aR (в 5-7 раз выше, чем на человеческих нейтрофилах) и CD20. Человеческие нейтрофилы получали так, как описано выше в связи с анализом фагоцитоза.
4
6
6
4
2
Клетки-мишени окрашивали флуоресцентным красителем клеточной мембраны, РКН-26. Необходимое число клеток-мишеней (5×10/образец/лунка×4) разводили до 15 мл в dPBS и центрифугировали со скоростью 1200 об/мин в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем клетки ресуспендировали в 2 мкМ РКН-26 (100 мкл раствора на каждые 1×10 клеток-мишеней). Мечение проходило при комнатной температуре в течение ровно 3 минут, после чего добавляли равный объем инактивированной нагреванием FCS (или инактивированной нагреванием человеческой сыворотки (Millipore), чтобы остановить реакцию мечения. Ровно через 1 мин добавляли RPMI до общего объема 15 мл. Клетки центрифугировали, как описано выше, и ресуспендировали в 2×10 клеток/мл в среде для анализа. Для покрытия антителом аликвоты РКН-26-меченых клеток-мишеней (25 мкл, т.е. 5×10) помещали в лунки стерильного 96-луночного планшета с U-образным дном, содержащие 25 мкл 200 мкг/мл антитела, разведенного в среде для анализа (конечная концентрация 100 мкг/мл), и инкубировали при 37°С в 5% CO в течение 30 мин.
Эффекторные клетки
6
7
2
2
Эффекторными клетками были РМВС, обедненные моноцитами, от здоровых доноров. РМВС получали так, как описано выше. Ресуспендированные клетки (лимфоциты/моноциты) высевали в 6-луночные планшеты для тканевых культур (Corning) по 2 мл/лунку с плотностью примерно 4×10 клеток/лунку или в колбы Т75 (Corning) по 20 мл на колбу и инкубировали в течение 2 часов при 37°С в 5% CO. Неприкрепленные клетки (в том числе лимфоциты и NK-клетки) удаляли путем аспирации и центрифугировали со скоростью 100 g в течение 10 мин при комнатной температуре. Клетки ресуспендировали в 20 мл среды, содержащей 100 нг/мл рекомбинантного человеческого IL-2, для увеличения числа лимфоцитов и натуральных киллеров. Клетки инкубировали в течение ночи при 37°С в 5% CO. На следующий день клетки центрифугировали при 1400 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем ресуспендировали в среде для анализа до плотности 2,5×10 клеток/мл для использования в качестве эффекторных клеток в ADCC-анализе.
ADCC-анализ
2
После мечения клеток-мишеней с помощью РКН-26 и покрытия антителом, 100 мкл эффекторных клеток или 100 мкл среды для анализа (контроль, только клетки-мишени) добавляли непосредственно к 50 мкл клеток-мишеней. Образцы инкубировали в течение еще 3 часов при 37°С в 5% CO. Образцы переносили в 1,2 мл микротитровальные FACS-пробирки, содержащие 10 мкл 10 мкМ красителя для определения жизнеспособности To-Pro-3 (TP-3) до конечной концентрации примерно 625 нМ, и анализировали образцы с помощью FACS. На графике FSC против SSC все клетки за исключением дебриса были гейтированы. Гейтированные клетки анализировали на FL-2 против FSC, и FL-2-положительные клетки (т.е. РКН-26-меченные клетки-мишени) гейтировали. Данные FACS анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Inc. v6.3.4).
+ve
+ve
+ve
+ve
Специфическую ADCC рассчитывали путем вычитания среднего % ТР3 «Только мишени» (А) из среднего % ТР3 «Мишени+эффекторы» (В) соответствующих образцов после вычитания среднего % ТР3 «Только мишень без антитела» (С) и среднего % ТР3 «Мишени+эффекторы без антитела» (D), соответственно, т.е.
Результаты, представленные в таблице 2 В, были получены с использованием в качестве эффекторной клеточной популяции человеческих РВМС, обедненных моноцитами и стимулированных IL-2, преимущественно NK-клеток, но включая В-клетки, Т-клетки и дендритные клетки. Клетками-мишенями были трансфицированные клетки линии Ramos E2, экспрессирующие hC5aR и CD20, что позволяло использовать анти-CD20-антитело ритуксимаб в качестве положительного контроля. Результаты находятся в диапазоне от «+++», что обозначает Fc-вариант, индуцирующий ADCC с эффективностью, равной ритуксимабу, «+/-», что обозначает Fc-вариант, для которого наблюдалось высокая степень вариации донора, и до «-», что обозначает Fc-вариант, для которого не было обнаружено никакой существенной индукции ADCC. Fc-вариант, опосредующий увеличение ADCC (IgG1_S239D, I332E) (Chu SY, Vostiar I, Karki S et al; Mol Immunol, 2008, 45(15):3926-3933) был включен в анализ в качестве положительного контроля.
CDC-анализ
Fc-варианты также анализировали на их способность индуцировать CDC. Эксперимент проводили в основном так, как описано для анализа ADCC, за исключением того, что эффекторные клетки были заменены человеческой сывороткой.
6
6
6
6
2
Клетки-мишени, такие как клетки Ramos Е2 (2×10 клеток/мл) в среде с 3% кроличьей сывороткой с комплементом, смешивали с равным объемом 2× раствора антитела (200 мкг/мл), содержащего 3% кроличью сыворотку с комплементом, в 96-луночном планшете с U-образным дном для культивирования тканей. В дублирующие лунки, содержащие 25 мкл клеток Ramos Е2 (2×10 клеток/мл), вносили 25 мкл 2× раствора антител (200 мкг/мл) в среде без комплемента. Ряд из трех лунок содержал 25 мкл клеток Ramos Е2 (2×10 клеток/мл) плюс 25 мкл среды для анализа (образцы «без антитела») в 3% кроличьей сыворотке с комплементом. Еще один ряд из 3 лунок содержал 25 мкл клеток Ramos Е2 (2×10клеток/мл) плюс 25 мкл среды для анализа (образцы «без антитела») без комплемента. Перед инкубацией в каждую лунку добавляли 100 мкл среды для анализа с 3% кроличьей сывороткой с комплементом или без нее, как требуется. Образцы инкубировали в течение 3 часов при 37°С в 5% CO.
Определение жизнеспособности клеток-мишеней
Флуоресцентный краситель для определения жизнеспособности То-Pro-3 (Molecular Probes) добавляли к каждому образцу непосредственно перед анализом путем проточной цитометрии. Конечная концентрация То-Pro-3 в каждое пробирке составляла примерно 62,5 нМ. To-Pro-3-положительные (ТР3+) клетки определяли как нежизнеспособные или лизированные.
Проточная цитометрия и анализ данных
Образцы анализировали на FACSCalibur (BD Biosciences), и полученные данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo (v6.3.4, TreeStar Inc.). В точечном графике FSC против SSC, гейтирующем все клетки за исключением дебриса, для каждого образца было собрано 5000 событий клеток-мишеней. В канале FL-4 была создана гистограмма гейтированных клеток-мишеней, которая показала уровень поглощения клетками То-Pro-3. В каждом образце определяли число ТРЗ+клеток (т.е. нежизнеспособных клеток) - они были определены как клетки в правой части основного пика - и выражали это число в процентах от общего числа клеток-мишеней в образце.
Образцы, исследованные в трех экземплярах, могли быть отнесены к одной из 4 категорий, А, В, С и D, как показано в разделе «Обзор категорий» далее.
Обзор категорий
Клетки-мишени, инкубированные:
100 мкг/мл антитела
Без антитела
Без комплемента
А
В
С кроличьей сывороткой с комплементом
С
D
Категории проанализированных образцов
Для каждого образца, который содержал антитело, реакции проводили с комплементом или без него. Образцы, содержащие антитело без комплемента, давали фоновый уровень антитело-специфического лизиса. Образцы в категориях В и D давали фоновый уровень неспецифического лизиса в отсутствие либо антитела, либо и антитела, и комплемента.
Процент ТР3+-нежизнеспособных клеток-мишеней (% лизиса) рассчитывали для каждого образца с 3% комплементом и для каждого образца без комплемента. Для каждого антитела и контроля «без антитела» данные получены как среднее трех образцов.
1/2/3
Для расчета специфической CDC-активности для каждого антитела, антитело-специфический лизис в отсутствие комплемента (средний % лизиса в образцах «А») вычитали из % лизиса образца с антителом и комплементом (образцы «C») перед вычитанием неспецифического фонового лизиса. Неспецифический фоновый лизис представлял собой лизис в образцах «без антитела» с комплементом (средний % лизиса в образцах «D») минус лизис в образцах «без антитела» без комплемента (средний % лизиса в образцах «В»). Fc-вариант, опосредующий повышенную CDC (IgG1_S254W) (W008030564) был включен в анализ в качестве положительного контроля.
Статистический анализ выполняли в GraphPad Prism (v4.0), чтобы определить, имеются ли значимые различия между группами. Специфическую CDC-активность каждого образца из всех 4 анализов вводили в таблицу в соответствии с используемым антителом. Группы сравнивали с помощью параметрического теста: однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом множественного сравнения Тьюки.
Результаты представлены в таблице 2В. Результаты находятся в диапазоне от «+++», что обозначает Fc-вариант, индуцирующий CDC с эффективностью, равной мутанту IgG1 S254W. «+/-», что обозначает Fc-вариант, для которого наблюдалось высокая степень вариации, и до «-», что обозначает Fc-вариант, для которого не было обнаружено никакой существенной индукции CDC
Таблица 2В
Активность Fc-вариантов в анализе эффекторных функций на основе клеток
IgG
Fc-область антитела
Фагоцитоз
ADCC
CDC
IgG1
L234A_L235E_G237A_A330S_P331S
<sup>-</sup>
-/+
-
N297Q_L234A_L235E_G237A
-
++
-
N297Q_L234A_L235E
-
++
-
G236R_L328R
-
+++
-
L234A_L235E
+
+++
-
N297Q
++
+
-
IgG1 reference
+++
+++
-
S239DJ332E
+++
+++
-
S254W
++++
+++
+++
IgG2
N297Q
-
++
-
IgG2 референс
++
-
-
IgG2/4<sup>(1)</sup>
N297Q
-
-
-
V234A_G236A
-
-
-
IgG2/IgG4 референс
+
-
-
IgG4 (S228P)<sup>(2)</sup>
N297Q_F234L_L235A
-
-/+
-
N297Q_E233P_F234V_L235A
-
-
-
E233P_F234V_L235A
+
-
-
N297Q
+
-/+
-
L235A
++
+
-/+
F234L_L235A
++
+
/+
IgG4 референс
+++
+
/+
Краткое изложение результатов, полученных из анализов Fc-вариантов в анализах фагоцитоза, ADCC и CDC. (- = нет эффекторной функции;+ = эффекторная функция). (1) IgG2/IgG4 Fc-вариант, содержащий СН1 и нижнюю шарнирную область из IgG2, а остальные СН2-СН3 из IgG4; (2) мутация S228P, введенная в Fc-область IgG4, чтобы исключить образование полуантител.
Пример 5: Характеризация силы Fc-вариантов анти-hC5aR-антитела
Для того чтобы проверить, влияют ли мутации в Fc-области на способность антител ингибировать связывание hC5a с hC5aR и hC5a-опосредованную миграцию нейтрофилов, соответственно, различные Fc-варианты тестировали в анализах с вытеснением и миграцией, описанных выше. Анализ миграции нейтрофилов проводили, как описано выше, за исключением того, что используемые PMN были мышиными, выделенными из мышей hCSaR-KO/KI (knock-out по рецептору mC5a/knock-in по человеческому C5aR, WO 2005060739). Клетки получали следующим образом. PMN костного мозга выделяли из бедренных костей и большеберцовых костей двух мышей hC5aR-KO/KI. Клетки костного мозга смывали из костей с помощью PBS, затем клеточную суспензию фильтровали через Cell Strainer (BD Falcon, 352350; нейлоновая сеть 70 мкм) в 50 мл пробирку и центрифугировали (10 мин, 1600 об/мин). Клетки ресуспендировали в среде и осторожно наслаивали поверх 3 мл Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare) в стерильной 15 мл пробирке. После центрифугирования в течение 20 минут при 600 g при комнатной температуре выделяли осадок нейтрофилов/эритроцитов. Эритроциты лизировали с помощью лизирующего буфера (Sigma, R7757; 8,3 г/л хлорида аммония в 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5) в течение 1 мин. После двух повторов центрифугирования и промывания клеточный осадок ресуспендировали в реакционной смеси. Суспензия содержала более 95% нейтрофилов по оценке путем микроскопии образцов, окрашенных по Гимзе. Вариабельная область тестируемых антител была идентична вариабельной области референсного антитела Q. Данные приведены в таблице 3.
2
2
Значительная разница в способности Fc-вариантов ингибировать связывание hC5a с hC5aR наблюдалась в SPA-анализе (табл.3, колонка 1). IgG1-версию референсного антитела Q анализировали вместе с дополнительными вариантами Fc-области IgG, и данные показали, что Fc-варианты IgG1 в целом ингибировали связывание hC5a более сильно, чем Fc-варианты IgG4 и IgG2/IgG4. F(ab’)-фрагмент референсного антитела Q также был включен в анализ и ингибировал связывание hC5a в той же степени, что и полноразмерное референсное антитело Q (IgG4). Эти результаты показали, что шарнирная область имеет важное значение для способности антител ингибировать связывание hC5a, и это представление подтверждается тем фактом, что F(ab’)-фрагменты были способны ингибировать миграцию нейтрофилов в той же степени, что и референсное антитело Q (табл.3). Также было обнаружено, что варианты IgG1 более мощно ингибируют миграцию нейтрофилов, чем IgG, включающие шарнирные области из IgG2 или IgG4 (табл.3, колонка 2).
Большая сила IgG1-версий референсного антитела Q по сравнению с IgG4-версиями может быть связана с повышенной авидностью вследствие повышенной гибкости шарнирной области IgG. Для изучения этого анализировали связывание IgG1- и IgC4-версий референсного антитела Q с человеческими нейтрофилами с помощью FACS. Данные показали, что IgG1-версия связывалась с нейтрофилами с более высокой авидностью, чем IgC4-версия. Данные не представлены.
Все вместе эти данные подтверждают, что увеличение гибкости в шарнирных областях IgG1 способствует повышению связывания с hC5aR, что приводит к повышению силы.
Таблица 3
Влияние Fc-вариантов на связывание hC5a (SPA) и миграцию нейтрофилов к hC5a
Fc-область антитела
Вытеснение hC5a (SPA)
Ингибирование миграции человеческих нейтрофилов
IgG4
++
++
IgG1
+++
Н.о.
IgG1 (L234A_L235E_G237A_A330S_P331 S)
+++
+++
IgG1 (S239D, I332E)
+++
++++
IgG2/4
+
Н.о.
IgG2/4 (V234A, G236A)
+
+
референсное антитело Q как F(ab)<sub>2</sub>
++
++
(+ = Низкая активность, ++ = средняя активность, +++/+ высокая).
Пример 6. Создание и характеризация «полностью» человеческих анти-hC5aR-антител.
Из анализов, описанных в примере 2, антитело 32F3A6 было выбрано для дальнейших исследований. В ходе рекомбинантного клонирования этого антитела было выявлено семь мутаций в каркасной области VH, которые отличали ее от человеческих зародышевых последовательностей, в то время как в каркасной области LC точечные мутации не были найдены (фиг.3). Мутации были обнаружены путем выравнивания последовательностей VH и VL из 32F3A6 со всеми доступными человеческими зародышевыми последовательностями.
Для того чтобы получить антитела, еще более подобные человеческим, семь точечных мутаций в VH-области 32F3A6 были подвергнуты обратному мутированию с заменой на человеческие зародышевые остатки и привиты в Fc-область IgG1, включая пять мутаций L234A_L235E_G237A_A330S_P331S, которые, как было показано, отменяют индукцию фагоцитоза, ADCC и CDC, как описано выше. Соединение называется 32F3A6 GL.
Силу обратно мутированного антитела сравнивали с силой исходного антитела, и между 32F3A6 или 32F3A6 GL не наблюдалось никакой разницы в способности ингибировать связывание hC5a с hC5aR (анализирована в SPA), как и в способности ингибировать ПС5а-опосредованную миграцию нейтрофилов (данные не представлены).
Способность полностью человеческих антител, описанных выше, индуцировать фагоцитоз нейтрофилов, ADCC или CDC оценивали, как описано в примере 4, и результаты приведены в таблице 4.
Результаты, относящиеся к специфической ADCC, включенные в таблицу 4, были получены с использованием человеческих РВМС, обедненных моноцитами, в качестве эффекторных клеток, и человеческих нейтрофилов в качестве клеток-мишеней.
Таблица 4
Fc-опосредованные клеточные эффекторные функции анти-C5aR-антител. «-» обозначает отсутствие выявляемой эффекторной функции, а от «+» до «+++» обозначает от низкого до высокого уровня эффекторной функции, измеренной в анализах, описанных в примере 4. H.o. (не определено)
Соединение
Фагоцитоз
Специфическая ADCC
Специфическая CDC
PBS в качестве контроля
H.o.
Вариабельная область
Fc-область
3G12 (нерелевантный антиген)
IgG1
+
32F3A6 GL
IgG-IAEASS
-
+
-
32F3A6 GL
IgG1
+
+++
H.o.
Sigma
IgG4
H.o.
+
H.o.
Как ранее наблюдалось, 5 точечных мутаций в Fc-области IgG1 отменяли фагоцитоз, ADCC и CDC по сравнению с Fc-областью IgG1 дикого типа.
Пример 7. Дальнейшая характеризация человеческого анти-hCSaR-антитела (32F3A6 GL)
Для дальнейшего выяснения функциональности определенных антител и для определения аффинности и силы, проводили дополнительные анализы с использованием одного из анти-СбаК-антител по сравнению с референсным антителом Q. Аффинность определяли в анализе конкурентного связывания лиганда на нейтрофилах человека. Эта функциональность относится к аффинности антитела, которая измеряется в анализе конкурентного связывания лиганда, но также может быть рассмотрено измерение авидности взаимодействия. Анализы ex vivo измеряют способность антител нейтрализовать С5а-опосредованные действия в условиях in vitro. Анализы силы измеряют нейтрализацию С5а-индуцированного кальциевого потока, повышающую регуляцию рецептора CD11b и понижающую регуляцию CD62L, соответственно, на нейтрофилах человека. Полученные для 32F3A6GL данные приведены в таблице 5.
Измерения аффинности
Выделение нейтрофилов из свежей человеческой крови
Кровь разводили в соотношении 1:1 в PBS+2% FBS и наслаивали на Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare №17-1440-03) в соотношении 3 части Ficoll и 4 части крови (15 мл Ficoll и 20 мл крови в 50 мл пробирке), а затем расслаивали путем центрифугирования при 400 g в течение 30 минут при комнатной температуре. Путем аспирации осторожно удаляли промежуточную полосу РВМС. Гранулоциты, наслоенные на уплотненные эритроциты, аспирировали с помощью пластиковой пипетки Пастера. Гранулоциты и эритроциты переносили и осаждали в новой 50 мл пробирке. Осадок разводили до 40 мл с помощью 1×PBS, добавляли 10 мл 4% раствора декстрана 500 (Sigma, 31392) в PBS (соотношение 1:5) и осторожно перемешивали путем переворачивания. Через 20-30 мин полученный супернатант, богатый гранулоцитами, переносили в новую пробирку и центрифугировали при 250 g в течение 5 минут при комнатной температуре. Примесные эритроциты удаляли путем осмотического лизиса, ресуспендируя осадок клеток в 7,5 мл 0,2% NaCI и осторожного перемешивая в течение 55-60 секунд. Затем добавляли 17,5 мл 1,2% NaCl, и затем разводили до 50 мл с помощью PBS и центрифугировали при 250 g в течение 5 мин. Этот этап повторяли один раз. Затем клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл реакционной смеси (dPBS/RPMI). Жизнеспособность и число клеток контролировали с помощью NucleoCounter.
Анализ конкурентного связывания на нейтрофилах
2
2
2
2
6
5
125
125
Человеческие нейтрофилы очищали, промывали и ресуспендировали в буфере для связывания (50 мМ HEPES, рН 7,5, 1 мМ CaCl, 5 мМ MgCl и 0,5% бычьего сывороточного альбумина (FractionV Ig G free)) до плотности примерно 5×10 клеток/мл. Для каждого образца 40 мкл клеточной суспензии (1×10клеток/лунку) засевали в 96-луночный планшет с V-образным дном (Greiner, кат.№651101). Конкурентные исследования проводили с использованием 12 концентраций конкурирующего немеченого лиганда в полулогарифмическом разведении, начиная с 1 мкМ как самой высокой концентрации. 40 мкл антитела добавляли с учетом конечного анализируемого объема 120 мкл. 40 мкл радиолиганда [I]-hC5a (Perkin Elmer, кат. №NEX250) добавляли ко всем образцам за исключением фонового контроля. Конечная концентрация радиолиганда в анализе составляла 1 нМ, а конечный объем составлял 120 мкл. Все образцы анализировали в трех повторах и инкубировали в течение 4 ч при 4°С. Затем клетки собирали путем центрифугирования при 1200 об/мин при 4°С в течение 2 мин и промывали три раза в 100 мкл промывочного буфера (50 мМ HEPES, рН 7,5, 1 мМ CaCl, 5 мМ MgCl, 150 мМ NaCl и 0,5% бычьего сывороточного альбумина (FractionV Ig G free)). Наконец, клетки ресуспендировали в 30 мкл промывочного буфера и переносили в OptiPlate (Perkin Elmer, кат. №6005290) и в каждую лунку добавляли 150 мкл MicroScint 20 (Perkin Elmer, кат. №6013621). Планшеты закрывали, хорошо перемешивали и считали на калиброванном счетчике Top Counter с задержкой 1 ч. Общее количество радиоактивного лиганда, добавленного к образцу, определяли в отдельном планшете. Общее число импульсов в каждом образце выражали как нормированные значения в процентах, где 100% соответствует максимальному уровню импульсов, когда добавляется 1 нМ []I-hC5a и не добавляется холодовое антитело, а 0% соответствует неспецифическому связыванию, определенному в присутствии 1 мкМ холодового hC5a. Данные анализировали с помощью нелинейной регрессии, используя PRISM (GraphPad).
Анализ кальциевого потока
7
6
6
Окрашивание человеческих нейтрофилов клеточным красителем Fluo-4 AM Нейтрофилы центрифугировали и промывали в PBS, затем ресуспендировали 1×10 клеток/мл в красителе Cell Dye и инкубировали при комнатной температуре в течение 40 мин в темноте. Клетки центрифугировали и промывали (для удаления избытка красителя), снова центрифугировали и ресуспендировали в 2×10 клеток/мл в буфере Cell Buffer. Клетки (0,5 мл) аликвотировали в нестерильные стеклянные FACS-пробирки - по одной пробирке для каждого образца - и хранили при комнатной температуре и использовали в течение двух часов. Каждый образец содержал 1×10 нейтрофилов.
Анализ
6
Анализ кальциевого потока проводили следующим образом. Вкратце, 1×10 нейтрофилов, загруженных Fluo-4 AM, в 0,5 мл буфера Cell Buffer анализировали на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciences) с гейтированием нейтрофилов по х-оси FSC против y-оси SSC. Для измерения флуоресценции нейтрофилов после добавления различных реагентов в пробирки (например, антител, С5а, иономицина - растворенные в 10× конечной концентрации в буфере Cell Buffer вместо I-MGB или C-MGB) использовали канал FL-1 (FITC). Флуоресценцию образца измеряли непрерывно, получая значения средней интенсивности флуоресценции (MFI) каждую секунду. Эти данные сохраняли в файл CellQuest (BD Biosciences) и передавали в Excel (Microsoft) и Prism (v4.0c, GraphPad Software Inc.) для дальнейшей обработки и анализа. Порядок добавления реагентов к нейтрофилам и время инкубации варьируют в зависимости от типа проводимого анализа.
Анализ нейтрализации С5а
6
2+
Были подготовлены 10x 3-кратные серийные разведения антител с концентрацией в пределах от 1000 мкг/мл до 1,37 мкг/мл. Загруженные Fluo-4 AM нейтрофилы (1×10 в 0,5 мл буфера Cell Buffer) инкубировали с 50 мкл 10х раствора антитела (конечная концентрация антитела в пробирке: 100-0,137 мкг/мл) в течение 10 мин при комнатной температуре. Клетки с антителом анализировали путем FACS в течение примерно 60 сек для определения базальной флуоресценции. Затем добавляли 50 мкл 10 нМ С5а, чтобы получить конечную концентрацию примерно 1 нМ, и еще в течение примерно 60 сек продолжали измерение флуоресценции. Если антитело блокировало С5а-индуцированную высвобождение Са, то пика флуоресценции не было. Если антитело не нейтрализовало С5а, то имелся пик флуоресценции. Наконец, добавляли 50 мкл 1 мкг/мл иономицина до конечной концентрации 0,1 мкг/мл и продолжали измерение флуоресценции еще в течение примерно 60 с, чтобы гарантировать, что все клетки отвечают.
Повышающая регуляция рецептора CD11b
Условия анализа
Следующие условия были разработаны, чтобы определить способность выявленных антител нейтрализовать С5а-индуцированную активацию нейтрофилов путем измерения изменения экспрессии CD11b.
2
2
2
Анти-C5aR-антитело и изотипическое контрольное антитело разводили в PBS до 2х конечной концентрации в 3-кратном серийном разведении (от 600 до 0,003387 мкг/мл) и по 50 мкл вносили в лунки 96-луночных планшетов с U-образным дном в двух повторах. 50 мкл аликвоты цельной гепаринизированной крови добавляли в каждую лунку. Четыре набора контрольных лунок (в двух повторах) содержали только 50 мкл PBS и 50 мкл крови. Планшеты инкубировали в течение 20 мин при 37°С в инкубаторе с 5% CO. Для активации нейтрофилов 50 мкл человеческого С5а в конечной концентрации 10 или 100 нм, как задано, добавляли в лунки, содержащие антитело, и в один набор контрольных лунок без антитела. PBS (50 мкл) вносили во второй набор контрольных лунок без антитела. Форболмиристатацетат (РМА) в конечной концентрации 5 мкг/мл вносили в третью группу контрольных лунок без антитела. Планшеты снова инкубировали в течение 20 мин при 37°С в инкубаторе с 5% СО. Наконец, 50 мкл смеси анти-CD11b-PE (BD Biosciences, кат. №555388), разведенного 1/50 в PBS (конечная концентрация 1/200), добавляли во все лунки (за исключением 4-го набора из двух контрольных лунок без антитела и без С5а или РМА - эти образцы давали базальные значения MFI). Планшеты снова инкубировали в течение 20 мин при 37°С в инкубаторе с 5% CO, затем центрифугировали в течение 3 мин при 2000 об/мин для осаждения клеток крови. Супернатант (150 мкл) удаляли, и осадки ресуспендировали в 200 мкл лизирующего раствора 1х FACS Lysis Solution для лизиса эритроцитов. Через 5 мин при комнатной температуре планшеты снова центрифугировали, 200-225 мкл супернатанта удаляли, а осадки ресуспендировали в 160 мкл 1х лизирующего раствора для FACS. Клетки переносили в микротитровальные пробирки для анализа путем проточной цитометрии.
FACS и анализ данных
Проточный цитометр FACSCalibur (BD Biosciences) устанавливали с параметрами компенсации, определенными для каналов FL-2. Образцы гейтировали так, чтобы исключить мертвые клетки и дебрис. Нейтрофилы определяли как имеющие высокую FSC и SSC и гейтрированные. Рассчитывали среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) гейтрированных нейтрофилов в канале FL-2 (CD11b-PE).
Результаты выражали в процентах от максимальной экспрессии CD11b с вычитанием фона. Максимальная экспрессия CDUb (MaxCDUb) представляла собой среднюю MFI нейтрофилов, инкубированных с С5а, но без антитела. Минимальной (фоновой) экспрессией CD11b (MinCD11b) была средняя MFI нейтрофилов, инкубированных без С5а и без антитела. Для расчета % максимальной экспрессии CD11b для каждого образца использовали формулу:
образца
образца
мин
макс
мин
% Маx=(МFI-МFI)/(МFI-МFI)×100
Данные вносили в GraphPad Prism (v4.0), и для расчета ЕС50 строили сигмоидальную кривую доза-реакция (переменный наклон), т.е. 4-параметрическое логистическое уравнение с использованием нелинейной регрессии.
Понижающая регуляция CD62L-рецептора
Настройки анализа
Следующие условия были разработаны, чтобы определить способность выявленных антител нейтрализовать С5а-индуцированную активацию нейтрофилов путем измерения изменения экспрессии CD62L.
Приведенный выше анализ CD11b был адаптирован для обнаружения CD62L с помощью конъюгированного антитела, распознающего CD62L (BD Biosciences, кат. №559772). Детали эксперимента, специфичные для CD62L, приведены ниже.
FACS и анализ данных
Проточный цитометр FACSCalibur (BD Biosciences) устанавливали с параметрами компенсации, определенными для канала FL-4. Образцы гейтировали так, чтобы исключить мертвые клетки и дебрис. Нейтрофилы определяли как имеющие высокую FSC и SSC и гейтрированные. Рассчитывали среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) гейтрированных нейтрофилов в канале FL-4 (CD62L-APC).
Результаты выражали в процентах от максимальной экспрессии CD62L с вычитанием фона. Максимальная экспрессия CD62L (MaxCD62L) представляла собой среднюю MFI нейтрофилов, инкубированных без С5а и без антитела. Минимальной (фоновой) экспрессией CD62L (MinCD62L) была средняя MFI нейтрофилов, инкубированных с С5а, но без антитела. Для расчета % максимальной экспрессии CD62L для каждого образца использовали формулу:
образца
образца
мин
макс
мин
% Маx=(МFI МFI)/(МFI-MFI)×100
Данные вносили в GraphPad Prism (v4.0), и для расчета ЕС50 строили сигмоидальную кривую доза-реакция (переменный наклон), т.е. 4-параметрическое логистическое уравнение с использованием нелинейной регрессии.
Результаты описанных выше исследований обобщены далее в таблице 5.
Таблица 5
Данные, полученные в анализе аффинности, анализе кальциевого потока, анализах CD11b и CD62L
Аффинность Анализ конкурентного связывания лиганда
IC50 Анализ кальциевого потока
IC50 Повышающая регуляция CD11b
IC50 Понижающая регуляция CD62L
32F3A6 GL
0,34 нМ
1,8 м кг/мл
0,7 м кг/мл
0,5 м кг/мл
Референсное антитело Q
0,84 нМ
7,3 м кг/мл
3,6 м кг/мл
1,9 м кг/мл
2+
Эти данные подтверждают, что 32F3A6 GL ингибирует действие С5а дозозависимым образом. Ингибирование высвобождения Са из нейтрофилов усиливается с увеличением концентрации 32F3A6 GL и с более высокой эффективностью, чем референсное антитело Q, что показано низким значением IC50.
Аналогичным образом, 32F3A6 GL также более эффективен в анализах регуляции CD11b и CD62L, чем референсное антитело Q, демонстрируя в 4-5 раз более высокую активность, чем референсное антитело Q.
Дальнейшее тестирование 32F3A6 GL в анализе миграции нейтрофилов (хемотаксиса) также показало дозозависимость с IC50 1,0 мкг/мл.
Пример 8. Мышиная модель артрита in vivo
Влияние in vivo испытывали на модели K/BxN у мышей hC5aR KO/KI (WO 2009/103113 и Lee et al, Nat Biotechnol. 2006 Oct; 24(10): 1279-84). У мышей K/B×N спонтанно развивается аутоиммунно-подобное заболевание, опосредованное циркулирующим антителом против GPI (аутоантигена глюкозо-6-фосфатизомеразы). Сыворотка от мышей K/BxN с артритом вызывала заболевание у других линий мышей со многими признаками человеческого RA, включая хроническое прогрессирующее заболевание с разрушением суставов.
Животные
Трансгенные мыши с человеческим C5aR KO/KI (C57BL/6; H-2b; человеческий C5aR+/+ мышиный C5aR-/-; аббревиатура линии: H5Rtg) в возрасте 8-27 недель.
Сыворотка K/B×N
Для получения сыворотки для экспериментов самцов мышей KRNtg скрещивали с самками мышей NOD. Потомство F1 (8-10-недельного возраста), несущее трансген KRN, у которых развивалось воспаление суставов, умерщвляли, и кровь собирали путем сердечной пункции. Через 2 часа инкубации при 37°С и центрифугирования в течение 10 мин при 4000 об/мин собирали сыворотку. Сыворотку от нескольких мышей объединяли, аликвотировали и хранили при -80°С. Всем мышам вводили одну и ту же партию сыворотки К/ВхМ.
Индукция и оценка артрита
Воспалительный артрит вызывали у мышей-реципиентов H5Rtg путем введения 150 мкл сыворотки K/BxN внутрибрюшинно на день 0 и день 2. Прогрессирование болезни контролировали ежедневно путем измерения размера лап и проведения клинической оценки на основе степени воспаления в передних и задних лапах и голеностопных суставах. Изменение среднего размера лапы со дня 0 рассчитывали следующим образом. Толщину (в мм) голеностопа на обеих задних лапах измеряли ежедневно с использованием кронциркуля. Среднее значение от одного или двух измерений каждой задней лапы было средним дневным размером лапы (PS). Средний размер лапы в день 0 вычитали из среднего дневного размера лапы, чтобы получить среднее изменение размера лапы (ДРЗ) для каждого дня эксперимента. Клинический показатель рассчитывали для каждой лапы каждой мыши на основании системы оценки, показанной в Таблице 6. Оценки от 4 лап суммировали и получали общий клинический показатель (CS) для каждой мыши в каждый день эксперимента.
Таблица 6
Система клинической оценки артрита
Оценка
Признак
0
Нормальный сустав
1
слабое/умеренное увеличение сустава и/или один опухший палец
2
опухший сустав или опухшие два или больше двух пальцев
3
Значительное увеличение всех частей лапы или всех пяти пальцев
Чтобы определить, какие мыши вступят в фазу лечения на 5-й день, для каждой мыши рассчитывали «оценку RA» путем умножения клинической оценки на изменение размера лапы со дня 0 (в мм). Как правило, в стадию лечения исследования вводили только тех мышей, которые имели оценку RA более 0,7.
Терапевтическое лечение 32F3A6 GL
После начала заболевания (день 0) мышам KO/KI hC5aR вводили нагрузочную дозу 32F3A6 GL на 5-й день, и затем 9 ежедневных доз. Нагрузочные дозы составляли 10, 1,5 и 0,5 мг/кг, а ежедневные дозы составляли 2, 0,5 и 0,25 мг/кг. Клинические оценки (среднее +/- SD) для каждой группы, получающей лечение, показаны на фиг.4. Лечение NNC0215-0384 давало дозозависимое уменьшение воспаления по сравнению с мышами, получавшими нерелевантное контрольное антитело. Аналогичный эффект наблюдался на основании изменений среднего размера лапы (не показано).
Пример 9. Уровень экспрессии С5а у пациентов с псориатическим артритом
С5а измеряли в образцах синовиальной жидкости от 11 пациентов с псориатическим артритом и от 12 пациентов с остеоартритом в качестве контроля. Следовали протоколу из коммерческого набора С5а ELISA (BD OptEIA™, Human С5а ELISA Kit II (BD Biosciences; cat. No.557965)). Данные представлены на фиг.5 и обобщены в таблице 7 ниже. Уровень С5а был значительно повышен в группе пациентов с псориатическим артритом (р=0,001; Манна-Уитни), указывая, что С5а может быть ведущим элементом воспаления синовиальной оболочки при псориатическом артрите.
Таблица 7
Уровни обнаружения С5а в синовиальной жидкости от контрольных и пациентов с псориатическим артритом
Контроли (пациенты с остеоартритом)
Пациенты с псориатическим артритом
Средний уровень С5а (±SEM)
7,989±0,6999
64,17±34,53
Пример 10. Экспрессия C5aR в синовиальной оболочке у пациентов с псориатическим артритом
Слайды тканевых матриц (ТМА), содержащие фиксированные в формалине и залитые парафином синовиальные биоптаты от пациентов с PsA (n=9) и в пределах нормы (n=5), были получены от Biochain Institute Inc. / BioCat GmbH, Гейдельберг, Германия. Один образец PsA получен при сотрудничестве с Dr. Bliddal (Frederiksberg Hospital, Дания) и Dr. See (Gentofte Hospital, Дания). Все человеческие материалы были получены с информированного согласия доноров или их близких родственников, а также с одобрения соответствующих местных этических комитетов BioCat Ge, персональная связь; Cambridge BioSciences, Информация о поставщике: Tissue Supply Network (www. bioscience.co.uk). Образцы от докторов Bliddal/Soe были получены в соответствии с этическим разрешением №Н-4-2009-117. Были использованы следующие антитела: мышиное моноклональное противочеловеческое антитело C5aR (R&D Systems, MAB3648 клон 347214 (IgG2a)). Изотипический специфический контроль мышиного IgG2a (Dako, X0943, клон DAK-G05). Биотин-конъюгированное ослиное противомышиное Jackson ImmunoReseach (715-065-150).
2
2
Иммуногистохимию проводили следующим образом. Срезы депарафинизировали в ксилоле и регидратировали в понижающих концентрациях спирта. Извлечение антигена проводили в Tris-EGTA-буфере (10 мМ; 0,5 мМ), рН 9,0 в микроволновой печи в течение 15 мин. Эндогенную пероксидазную активность блокировали 3% HO, а эндогенный биотин блокировали путем инкубации с блокирующими растворами для авидина и биотина в течение 10 мин, соответственно, в зависимости от производителя. Неспецифическое связывание блокировали путем инкубации с TBS, содержащим 3% обезжиренное молоко, 7% ослиную сыворотку, 3% человеческую сыворотку и 3,2 мг/мл поли-Ьлизина (PLL), в течение 30 мин. Первичные и вторичные антитела разводили в Tris-буфере, содержащем 0,5% обезжиренного молока, 7% ослиной и 3% человеческой сыворотки, и инкубацию проводили в течение ночи при 4°С и 60 мин при комнатной температуре, соответственно. Первый этап амплификации проводили путем инкубации с пероксидазным набором Vectastain ABC, разводили в 0,1 М Tris-HCl-буфере (рН 7,5), содержащем 0,5% блокирующего реагента Du Pont (TNB) в течение 30 мин, после чего проводили второй этап амплификации с инкубацией в биотинилированном тирамиде в течение 6 мин. Окончательную амплификацию проводили путем дополнительной инкубации с пероксидазным набором Vectastain ABC, разведенным, как описано выше, в течение 30 мин. Хромогенную реакцию проводили с помощью диаминобензидина. Ядра контрастно окрашивали гематоксилином и срезы регидратировали, очищали в ксилоле и заливали с помощью Eukitt. Оценку ТМА на предмет экспрессии белка C5aR в RA, ОА и нормальной синовиальной оболочке выполняли вслепую. Для оценки срезов использовали микроскоп Olympus BX51, оснащенный цифровой камерой DP70 (Olympus Denmark A/S; Баллеруп, Дания).
Результаты
C5aR-иммуноположительные клетки были обнаружены в свободном порядке в лимфоидных агрегатах в подлежащем слое синовиальной оболочки у 8 из 10 пациентов с псориатическим артритом, и в строме у 10 из 10 пациентов с псориатическим артритом. В контролях не наблюдалось окрашивание C5aR в этих отделах синовиальной оболочки (0/5). C5aR-иммуноположительные синовиоциты были обнаружены у 4 из 5 контролей, а также у 10 из 10 пациентов с псориатическим артритом. Результаты суммированы в таблице 8 ниже.
Таблица 8
Обнаружение C5aR<sup>+</sup>-клеток в нормальной синовиальной оболочке и синовиальной оболочке от пациентов с псориатическим артритом. Р-значение (точный критерий Фишера) для разницы между экспрессией C5aR у пациентов с псориатическим артритом и экспрессией в нормальной синовиальной оболочке: 0,007 (лимфоидные агрегаты) и 0,0003 (строма)
Отделы синовиальной оболочки
Нормальные
Пациенты с псориатическим артритом
Инфильтрирующие C5aR+клетки в лимфоидных агрегатах в подлежащем слое синовиальной оболочки
0/5
8/10
C5aR+клетки в строме
0/5
10/10
C5aR+синовиоциты
4/5
10/10
Пример 11. Ингибирование миграции нейтрофилов, индуцированной синовиальной жидкостью от пациентов с псориатическим артритом, действием анти-C5aR.
Анализ миграции нейтрофильных гранулоцитов (хемотаксис)
Способность антител ингибировать hC5a-зависимую миграцию человеческих найтрофильных гранулоцитов (человеческих PMN (полиморфноядерных лейкоцитов)) анализировали в камере Бойдена с использованием 96-луночной системы BD FluoroBlok insert system.
2
4
3
3
4
4
2
2
2
Человеческие PMN получали из образцов человеческой крови, помещенных в пробирки, содержащие EDTA. Клетки крови отделяли путем центрифугирования крови (4 части) через градиент Ficoll-Paque PLUS (GE Health Care) (3 части) в течение 30 мин (400 д) при комнатной температуре. Слой, содержащий PMN, суспендировали в PBS (буферный фосфатный раствор), содержащем декстран-500 (Sigma), в течение 1 ч, чтобы удалить загрязняющие эритроциты. Супернатант центрифугировали в течение 5 мин (250 д) при комнатной температуре и оставшиеся эритроциты осмотически лизировали с помощью 0,2% NaCl в течение 55 сек. Раствор делали изотоническим с помощью 1,2% NaCl+PBS и центрифугировали при 250 g в течение 5 мин, затем повторяли осмотический лизис. После центрифугирования PMN ресуспендировали в реакционной смеси (RM): HBSS (кат. №14175 Gibco) содержит NaCl 137 мМ, KCl 5,3 мМ, NaHPO 0,33 мМ, NaHCO 4 мМ, КНРО 0,44 мМ, глюкозу 5 мМ; дополнен MgSO⋅7НО 0,4 мМ, MgCl, 0,5 мМ, CaCl 0,5 мМ, HEPES 20 мМ. Плотность клеток определяли с помощью NucleoCounter (Chemometec). Суспензия PMN содержала более 95% нейтрофилов, что оценивалось путем микроскопии образцов, окрашенных по Гимзе.
6
6
Загрузка PMN: кальцеин, AM, (Fluka) растворяли в DMSO (диметилсульфоксид) и разводили в RM 1000X с клетками (2×10 клеток на мл) с получением концентрации 10 мкМ. Суспензию инкубировали в течение 30 мин в инкубаторе при температуре 37°С и затем промывали 3 раза с помощью RM, чтобы удалить избыток кальцеина. Наконец клетки ресуспендировали в RM (4×10клеток/мл).
Человеческую синовиальную жидкость (SF) получали от двух пациентов с псориатическим артритом путем пункции коленного сустава. После удаления клеток путем центрифугирования образцы замораживали и хранили при -80°С. Для экспериментов с миграцией образцы размораживали и разводили в два раза с помощью RM, содержащей 0,2% EDTA.
5
Миграцию оценивали по методике камеры Бойдена с использованием 96-луночных FluoroBlok с размером пор 3 мкм (кат. №351161. BD Falcon (VWR)). Верхняя камера, т.е. вставки, содержащие мембрану Fluoroblok, была покрыта фибриногеном человека (кат. №F3879-1G, Sigma) в PBS 1 мг/мл при 37°С в течение 2 часов. После промывания мембраны блокировали с помощью раствора, содержащего 2% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS. После еще одного промывания с помощью RM в каждую лунку вносили 10 кальцеин-нагруженных PMN с ПС5аР-антителами (100 мкг/мл) или без них и помещали в планшет-ресивер (нижняя камера), который содержал контрольный раствор или раствор хемоаттрактанта (hC5a (Sigma, или образцы синовиальной жидкости)). Каждая группа состояла из 4-6 лунок. Количественную оценку миграции клеток проводили путем измерения флуоресценции клеток в нижней камере. Поскольку мембрана FluoroBlok эффективно блокирует прохождение света 490-700 нм, то флуоресценция от клеток, которые не вошли в нижнюю камеру, не обнаруживается при 485/530 нм. Планшет анализировали при длинах волн возбуждения/эмиссии 485/538 нм, 37°С, каждые 5 минут в течение 60 мин во флуоресцентном планшетном ридере с возможностью регистрации сигнала со дна (SpectraMax, Molecular Devices, или Fluoroscan, Thermo Labsystems).
Миграцию оценивали по значениям флуоресценции на 60 мин, выраженным в относительных единицах флуоресценции. В таблице 9 миграция в присутствии изотипического антитела принята за 100% и рассчитана способность анти-С5аР-антитела ингибировать миграцию. Миграция явно ослаблялась ПС5аР-антителом. Миграция, вызванная 10 нМ hC5a, ингибировалась на 83%. Значения для трех образцов SF составляли: 15%, 70% и 48%. Результаты показывают, что C5aR-антитело ингибирует хемоаттрактивный эффект SF от пациентов псориатическим артритом.
Таблица 9
Миграция PMN в ответ на hC5a или синовиальную жидкость от трех пациентов с псориатическим артритом и ее ингибирование hC5aR-антителом (референсное антитело Q). Все значения нормированы\по миграции, полученной при инкубации с изотипическим антителом
hC5a (10 нМ С5а)
Образец SF от донора 1
Образец SF от донора 1
Образец SF от донора 1
Изотипическое антитело
100
100
100
100
Анти-C5aR
17
85
30
52
Пример 12. Экспрессия C5aR в кишечнике у пациентов с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом
Образцы ткани кишечника в пределах нормы (n=14), от пациентов с язвенным колитом (n=21) и болезнью Крона (n=25) получали из Cambridge Bioscience (Кембридж, Великобритания). Все человеческие материалы были получены с информированного согласия доноров или их близких родственников, а также одобрения соответствующих местных этических комитетов Cambridge BioSciences, Информация о поставщике: Tissue Supply Network (www. bioscience. co.uk). Используемые антитела и иммуногистохимический протокол описаны в примере 9.
Полуколичественная оценка
+
C5aR-иммуноположительные клетки (C5aR) полуколичественно оценивали следующим образом:
+
Лимфоидные компартменты слизистой оболочки оценивали по отдельности: слизистая оболочка (М): компартмент интраэпителиальных лимфоцитов (IEL) (поверхностный эпителий), собственная пластина и фолликул-ассоциированный эпителий (FAE). Подслизистый слой (SM): изолированные (одиночные) лимфоидные фолликулы (ILF), Пейеровы бляшки (подвздошная кишка)/IEL толстой кишки (толстый кишечник) и изолированные инфильтрирующие лимфоциты. Наружный мышечный слой (ME): IEL и изолированные инфильтрирующие лимфоциты. Каждый компартмент оценивали по шкале 0-4: 0, нет, 1 малое; 2 умеренное, 3 большое и 4 избыточное число C5aR-клеток. Накопленные оценки рассчитывали для каждого слоя кишечника (М, SM, ME) и в общем (M+SM+ME) для всего кишечника. Макс.оценка: М=12, SM=12, ME=8 и для всего кишечника 32. Полуколичественную оценку иммуногистохимических данных для экспрессии белка C5aR анализировали с помощью анализа Крускала-Уоллиса с последующим проведением множественного сравнения с помощью критерия Данна в GraphPad Prism 5. Р<0,05 считали значимым.
Результаты
CSaR-положительные нейтрофилы и подобные миелоидным клетки были обнаружены в компартменте интраэпителиальных лимфоцитов, в фолликул-ассоциированном эпителии и в качестве одиночных клеток в собственной пластине слизистой оболочки у 23 из 25 пациентов с CD, 19 из 21 пациентов с UC и у 7 из 14 нормальных образцов кишечника (Р-значения (точный критерий Фишера) 0,005 и 0,015, соответственно). Кроме того, C5aR-положительные клетки были обнаружены в пейеровых бляшках/лимфоидных фолликулах толстой кишки; в изолированных (одиночных) лимфоидных фолликулах и в качестве одиночных клеток подслизистой у 21 из 25 пациентов с CD и у 18 из 21 пациентов с UC по сравнению с 7 из 14 нормальных образцов кишечная (Р-значения (точный критерий Фишера) 0,03 и незначимое, соответственно). Наконец, C5aR-положительные клетки были обнаружены как инфильтрирующие наружный мышечный слой у пациентов с CD и UC, а также в нормальном кишечнике. Результаты представлены на фиг.6 и приведены в таблице 10. На основании полуколичественного анализа было установлено, что C5aR значительно выше экспрессирован в кишечнике пациентов с CD (P<0,01) и UC (Р<0,05) по сравнению с нормальным кишечником во всей стенке кишечника, т.е. общей оценкой всех трех слоев кишечника (слизистой оболочки, подслизистой основы и наружного мышечного слоя).
Таблица 10
Экспрессия C5aR в кишечнике у пациентов с болезнью Крона и язвенным колитом по сравнению с нормальным кишечником
Экспрессия C5aR в
Диагноз
Слизистой оболочке
Подслизистой основе
Наружном мышечном слое
Норма
7/14
7/14
8/14
Болезнь Крона
23/25
21/25
19/25
Язвенный колит
19/21
18/21
11/21
Хотя некоторые детали изобретения были проиллюстрированы и описаны в данном документе, многие модификации, замещения, изменения и эквиваленты будут приходить на ум специалистами в данной области. Таким образом, следует понимать, что прилагаемые воплощения предназначены для охвата всех таких модификаций и изменений, которые попадают в рамки истинной сущности изобретения.