Способ отмывания криоконсервированных-оттаянных тромбоцитов от ограждающего раствора
METHOD FOR WASHING CRYOPRESERVED-THAWED PLATELETS FROM THE ENCLOSING SOLUTION

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической и производственной трансфузиологии, и может быть использовано для снижения токсического влияния криоконсерванта на организм реципиента при проведении заместительной терапии криоконсервированным концентратом тромбоцитов (ККТ).
Заместительная терапия концентратом тромбоцитов (КТ) является важнейшим методом лечения тяжелой тромбоцитопении и купирования связанных с ней кровотечений. Ежегодно в мире наблюдается увеличение потребности в трансфузиях КТ на 5-7%. В связи с тем, что срок хранения нативного КТ ограничен 5-7 днями, своевременное обеспечение этой трансфузионной средой в ургентных ситуациях или при необходимости индивидуального подбора тромбоцитов по фенотипу может быть невыполнимо. Криоконсервирование КТ позволяет значительно удлинить срок их хранения, создать резерв HLA- и HPA- типированных тромбоцитов, проводить карантинизацию, уменьшив риск передачи гемотрансмиссивных инфекций [1].
Долгосрочное хранение КТ в условиях низких и ультранизких температур стало возможным благодаря введению в биологические системы ограждающих растворов - криопротекторов, обладающих способностью предупреждать повреждение клеток и обеспечивать их жизнеспособность и функционально полноценное состояние после замораживания-отогревания. К наиболее распространенным криопротекторам относятся диметилсульфоксид (ДМСО) и диметилацетамид (ДМАЦ), позволяющие сохранять морфологические и функциональные свойства более 80% клеток [2]. Несмотря на то, что токсические дозы этих веществ достаточно высоки: для ДМСО ЛД50 - 3,8 г/кг, для ДМАЦ - 4,2 г/кг [3], в литературе описаны случаи токсического влияния значительно меньших концентраций криопротекторов на организм [4,5]. Для снижения побочных эффектов предложены методы уменьшения концентрации криопротектора в конечном продукте.
Известен способ удаления криопротектора из суспензии тромбоцитов [6], согласно которому во взвесь с целью замещения криопротектора при температуре (20,0±2,0)°С добавляют равный объем аутологичной плазмы с кислым цитратом декстрозы в конечной концентрации 10%. Полученную суспензию центрифугируют при 4000g в течение 10 минут. Супернатант удаляют. Для получения определенной концентрации клеток к осадку тромбоцитов добавляют необходимый объем аутологичной плазмы и ресуспендируют. Недостатками этого способа является снижение уровня сохранности функциональных свойств тромбоцитов вследствие дополнительного введения антикоагулянта [7], травмирование клеток во время центрифугирования, плотного "упаковывания" клеток в осадке, а также увеличение потерь тромбоцитов посредством адгезии части из них к стенкам контейнера и образование устойчивых агрегатов.
Наиболее близким способом является снижение концентрации криопротектора разведением оттаянного ККТ в добавочном растворе с контролем концентрации ДМСО, но данный способ требует применения специального "устройства для криоконсервирования тромбоцитов и подготовки тромбоцитов к трансфузии" [8].
Заявляемый способ предполагает замену разведения криопротектора, на его удаление из ККТ центрифугированием с изъятием супернатанта и ресуспендированием раствором SSP+. При применении данного приема не требуется добавление к клеточной взвеси плазмы, что позволяет снизить частоту побочных эффектов и аллергических реакций [9]. Предлагаемый способ обеспечивает сохранность количества и функциональных свойств тромбоцитов.
ПРИМЕР ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СРЕДСТВА
Оттаивание ККТ осуществляют непосредственно в отделении, где выполняется процедура отмывания от криопротектора. Контейнер с замороженными тромбоцитами немедленно помещают в камеру аппарата SAHARA-MAXITHERM, обеспечивающего быстрое и безопасное размораживание пакета с гемокомпонентом. В меню аппарата выбирают быстрый режим подогрева. ККТ автоматически подогревается до 37°С, после чего содержимое переводят в пустой стерильный контейнер, используя аппарат стерильного соединения трубок TCSD II (Швейцария). С целью уменьшения объема исходного продукта производят центрифугирование в рефрижераторной центрифуге при 5300 g в течение 8 минут при 20°С. Далее контейнер помещают в плазма-экстрактор (фракционатор крови «ФК-01») для удаления надосадка. В пакет с полученным осадком тромбоцитов добавляют раствор SSP+ в соотношении 1:20. На шейкере SIA «Elmi» (Латвия) производят суспендирование полученной взвеси до однородного состояния при режиме 180 вращений/мин в течение 10 мин при температуре (20,0±2,0)°С. Контейнер, содержащий однородную взвесь тромбоцитов в растворе SSP+, помещают в рефрижераторную центрифугу, где проводится разделение смеси при частоте 5300 g в течение 8 минут при 20°С. После проведения центрифугирования контейнер помещают в плазма-экстрактор для удаления надосадочной жидкости в пакет-спутник. К магистрали контейнера с полученным осадком тромбоцитов при помощи аппарата стерильного соединения трубок TCSD II добавляют раствор SSP+в соотношении 1:10. На шейкере тщательно перемешивают содержимое пакета до однородной суспензии в режиме 180 вращений в минуту в течение 10 мин. при температуре (20,0±2,0)°С, после чего отмытый ККТ (ОККТ) готов к использованию.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальные исследования выполнены на базе отделения трансфузиологии и процессинга ГСК, лабораторий клеточных технологий и патоморфологии, отдела организации и сопровождения научных исследований ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России.
Для проведения экспериментальных исследований из ККТ и ОККТ отобрали 15 образцов, замороженных и хранившихся при - 196°С с ДМАЦ для оценки их биологических и химических характеристик. В пробах измеряли концентрацию водородных ионов потенциометрическим методом на анализаторе "Эксперт - 001" сразу после оттаивания и через 2 часа хранения при температуре 20,0±2,0°С. Представленные результаты свидетельствуют о значимом увеличении рН ОККТ по сравнению с ККТ (р<0,05), приближающимся к физиологическим показателям, в результате ресуспендирования раствором SSP+, рН которого 7,35 (табл. 1).
9
9
Сохранность тромбоцитов до и после отмывания определяли по их количеству в конечном продукте, морфологическим характеристикам. Количество тромбоцитов в ККТ составило (1291,0±497,0) × 10 /л., в ОККТ -(1413,5±594,4) × 10/л, (р>0,05). При цитологическом исследовании установлено, что после отмывания в ККТ снижалось содержание тромбоцитов с измененной морфологией (вытянутые и веретеновидные формы) с 16,75% в ККТ до 4,3% в ОККТ, число микроагрегатов в 1 поле зрения уменьшалось с 0,65% до 0,13%; в ОККТ исчезали макроформы тромбоцитов и нити фибрина.
9
При исследовании влияния ККТ и ОККТ на изменение вязко-эластических свойств сгустка крови у пациентов с тяжелой тромбоцитопенией (менее 15,0 × 10/л) in vitro определено, что добавление ККТ и ОККТ в эквивалентных дозах приводило к улучшению вязко-эластических свойств сгустка крови - укорочению интервала R, увеличению угла а и максимальной амплитуды (МА), увеличению плотности сгустка (G), причем по показателю укорочения интервала R ОККТ показал лучшие результаты (табл. 2).
Предложенный способ отмывания ККТ от криопротектора путем повторного центрифугирования и ресуспендирования в растворе SSP+ позволяет минимизировать побочные эффекты трансфузий ККТ, связанные с токсичностью криоконсервирующего раствора, а также обеспечить сохранность количества и функциональных свойств тромбоцитов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Применение криоконсервированного концентрата тромбоцитов при глубокой тромбоцитопении / А.В. Лянгузов, С.В. Игнатьев, Ф.С. Шерстнев, С.В. Утемов, [и др.] // Трансфузиология. - 2020. - Т. 21, №1 - с. 20-29.
2. Инструкция по криоконсервированию клеток крови. - М., 1995. - 44 с.
3. Костяев А.А., Мартусевич А.К., Андреев А.А. Токсичность криопротекторов и криоконсервантов на их основе для компонентов крови и костного мозга (обзорная статья) // Научное обозрение. Медицинские науки. - 2016. - №6. - С.54-74.
4. Galvao J, Davis В, Tilley М, Normando Е, Duchen MR, Cordeiro MF. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 2014 Mar; 28(3):1317-30. doi: 10.1096/fj.13-235440.
5. Gong W, Liu X, Zhu B. Dimethylacetamide-induced occupational toxic hepatitis with a short term recurrence: a rare case report. J Thorac Dis. 2016 Jun; 8(6):E408-11. doi: 10.21037/jtd.2016.04.44.
6. [3], [Beaujean Fr., Leforestier Ch., Mannoni P. // Cryo-Letters. - 1979. -Vol.1. -P.98-103.
7. Hester J.P., Ventura G.J. // Abstract book of 3-rd International Congress of World Apheresis Assotiation. Amsterdam, the Motherlands. - 1996. -P. 103.
8. Патент №2623864 С Российская Федерация, МПК A01N 1/02. Способ подготовки криоконсервированных тромбоцитов для трансфузии: №2016124198: заявл. 20.06.2016: опубл. 29.06.2017 / И.В. Высочин, М.С. Макаров, Е.Н. Кобзева [и др.].
9. Yanagisawa R. Preventing adverse reactions in pediatric transfusions using washed platelet concentrate. Pediatr Int. 2021 Apr; 63(4):391-403. doi: 10.1111/ped.14572.