ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus thuringiensis var.thuringiensis N800/15 В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНТОМОЦИДНОГО БИОПРЕПАРАТА
BACTERIAL STRAIN Bacillus thuringiensis varthuringiensis N800/15 AS AGENT FOR PREPARING ENTOMOCIDAL BIOPREPARATION

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к микробиологическим средствам защиты сельскохозяйственных, лекарственных и лесных культур от вредных насекомых, т.е. обладающих энтомоцидным действием.
Известно, что в качестве энтомопатогенов используют штаммы-продуценты битоксибацеллина, а именно Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis 202, 98 и 620, способные образовывать два энтомоцидных токсина: белковые кристаллы эндотоксина, освобождающегося из клеток в процессе лизиса их оболочек, и водорастворимый экзотоксин нуклеотидной природы, продуцируемый в процессе вегетативного роста культуры (Н.В.Кандыбин, Н.М.Барбашова, А.А.Стусь, Л.Н.Кузнецова. Сравнительная эффективность трех штаммов Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis /Бюл. ВНИИСХМ №53, Л., 1990, с.44-46). В результате сравнения биологической и энтомоцидной активности этих трех штаммов было выявлено, что штаммы 98 и 620 превосходят по энтомоцидной активности штамм 202.
1
Штамм Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis 98 (BtH 98) выделен из погибшей куколки капустной совки, является продуцентом энтомоцидного эндотоксина, хранится в коллекции «ВНИИгенетика» под №ЦМПЛ В-2452.
1
Штамм BtH 98 обладает достаточно высокой энтомоцидной активностью против колорадского жука и других вредных насекомых (прототип).
1
Битоксибациллин получают культивированием штамма BtH 98 на питательной среде, содержащей фосфорнокислый аммоний, сернокислый магний, хлористый кальций, крахмал кукурузный и кормовые дрожжи, зеленую патоку, при аэрации в течение 48 ч, титр спор в культуральной жидкости 3,5-3,75 млрд/мл, содержание экзотоксина 0,5 мг/мл. В полученную культуральную жидкость вносят 1% натрия хлористого и высушивают. Получают Битоксибациллин, в котором содержится спор 65-72 млрд/г и 1% экзотоксина.
1
Недостатком штамма Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis 98 (BtH 98) является то, что он быстро теряет энтомоцидную активность при хранении.
1
Битоксибациллин на основе штамма BtH 98 получают в сухой форме, в связи с чем, его производство является энергоемким и затратным из-за проведения операции сушки. Кроме того, высокие температуры при сушке оказывают губительное влияние на кристаллы эндотоксина, разрушая их, что приводит к снижению энтомоцидной активности Битоксибациллина.
Задачей заявляемого изобретения является выявление штамма на основе экологически безопасной бактерии из группы Bacillus thuringiensis, пригодного для создания высокоэффективного энтомоцидного препарата в жидкой форме против массовых насекомых-фитофагов, вредителей сельскохозяйственных и лесных культур и сохраняющего свою энтомоцидную активность при длительном хранении.
Задача решается тем, что в качестве средства для получения энтомоцидного препарата используют штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis №800/15.
1
Штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis №800/15 (BtH 800/15) выделен из трупов личинок колорадского жука в Ленинградской области и депонирован 20.03.2006 г. в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (ВКСМ) ГНУ ВНИСХМ под регистрационным №611 в группе споровых микроорганизмов, что подтверждается справкой о депонировании от 02.07.2010 г. (Справка прилагается). Штамм характеризуется следующими свойствами.
Культурально-морфологические свойства.
Грамположительные подвижные палочки, перитрихи, вегетативные клетки одиночные или в виде коротких цепочек по 2-4 клетки в цепочке. Величина клеток односуточной культуры на рыбном агаре (РА) составляет (2,5-3,0) × (0,8-0,9) мкм. На 3-4 сутки роста на РА в клетках образуются споры овальной формы, расположенные субтерминально, размером (1,1-1,3)×(0,8-0,9) мкм и параспоральные включения эндоксина (кристаллы) правильной бобовидной формы размером 1,1-1,3 мкм.
На РА через 48 ч при 26-28°С культура образует плоские колонии серовато-белого цвета округлой формы с неровным краем, поверхность мелкозернистая, диаметр колонии 22-24 мм. Штамм растет при температуре 20-34°С (opt 26-32°С) и при показателе кислотности среды рН 6,4-8,0 (opt 6,8-7,2). На рыбном бульоне (РБ) через 24 ч растет с образованием пленки (вуали).
Биохимические свойства.
Факультативный анаэроб. Желатину разживает на 5-е сутки, казеин расщепляет, молоко пептонизирует с подщелачиванием через 24-28 ч, затем подкисляет и обесцвечивает лакмус. На среде Кларка образует ацетилметилкарбонил (АМК).
Гидрализует крахмал, использует цитраты, пигмента и уреазы не образует. Индол и сероводород не использует, редуцирует нитраты в нитриты.
Расщепляет глюкозу, маннозу, левулезу, сахарозу, мальтозу, целлобиозу, глицерин и салицин с образованием кислоты. Не использует галактозу, арабинозу, ксилозу, рамнозу, лактозу, раффинозу, маннит, сорбит, дульцит, инозит, инулин.
Антигенные свойства.
Дает положительную реакцию жгутикового антигена с типовой сывороткой Bacillus thuringiensis var. thuringiensis H-1 в разведении 1:6400.
Штамм идентифицирован согласно этой реакции, а также по классификации Bacillus thuringiensis (1962, 1967, 1990) H.de Barjack.
2
5
Штамм устойчив к производственным фагам: К, М, Н, Э-5, И-77, Д-Д.
Штамм малотоксичен для теплокровных животных.
Штамм растет на питательных дрожжеполисахаридных средах; хранится в лиофилизированном состоянии или на косяках РА в пробирках при 4-5°С с периодическими пересевами один раз в 6 мес.
1
Штамм BtH 800/15 обладает выраженными энтомоцидными свойствами и перспективен в качестве средства для производства биопрепарата для защиты сельскохозяйственных культур от массовых насекомых-фитофагов.
1
На основе этого штамма BtH 800/15 разработана технология производства нового энтомоцидного биопрепарата, названного авторами Битоксин.
Пример получения Битоксина.
Сначала в колбах (1 л) готовили дрожжеполисахаридную питательную среду следующего состава, %:
Кукурузная мука
1,5-2,4
Кормовые дрожжи
3,0-3,5
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
0,5-0,6
MgSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
0,02-0,04
CaCl<sub>2</sub>×2H<sub>2</sub>O
0,15-0,20
Вода водопроводная
до 100.
1
С помощью щелочи (например, 10% NaOH) довели рН среды до 7,4-7,8. Потом эту питательную среду разлили по 30-50 мл в колбы Эрленмейера емкостью 750 мл и стерилизовали в течение 40 мин при 120-122°С. После стерилизации рН среды составляло 6,8-7,2. Подготовленную питательную среду охлаждали и засевали культурой штамма BtH 800/15.
1
1
Для засева среды в колбах служит споровая культура штамма BtH 800/15, полученная смывом 5-10 мл физ. раствора на пробирку с культурой на скошенном агаре. Полученную взвесь с культурой штамма взбалтывали до получения гомогенной суспензии и вносили в колбы с подготовленной питательной средой из расчета 0,3-0,5 мл суспензии на 30-50 мл среды. Засеянные колбы помещали на качалку при 200-220 об/мин и 28-30°С на 56-72 ч до полного высыпания спор и кристаллов эндоксина (проверку осуществляли мироскопированием). Выращенную в колбах культуральную жидкость штамма BtH 800/15 использовали для засева среды в ферментерах.
В качестве питательной среды для ферментеров может быть использована любая дрожжеполисахаридная среда, оптимально - того же состава, который был использован для получения культуральной жидкости в колбах, т.е. на основе кормовых дрожжей и кукурузной муки (состав указан выше).
При этом сначала в водопроводную воду, прогретую до 40°С, засыпали при постоянном перемешивании все остальные ингредиенты, полученную взвесь нагревали до 80°С и выдерживали в течение 30 мин, после чего рН доводили до 7,8-8,0 и среду стерилизовали в течение 1 ч при 140°С.
1
Простерелизованную питательную среду для ферментера охлаждали до 30-35°С и вносили в нее культуральную жидкость штамма BtH 800/15, заранее выращенную в колбах, из расчета 0,7-1,0% культуральной жидкости от объема питательной среды в ферментере.
В ферментере процесс культивирования проводили при следующих условиях:
- температура культивирования 28-30°С;
- скорость вращения мешалки 200-220 об/мин;
2
- давление в аппарате 0,4-0,5 кгс/см;
- режим подачи воздуха:
возд
среды
с 0 до 12 ч - 0,2 V / V/мин;
возд
среды
с 12 до 24 ч - 0,5 V / V/мин;
возд
среды
с 24 до 42 ч - 0,8-1,0 V / V/мин;
возд
среды
с 42 ч - до окончания ферментации - 0,5 V / V/мин.
1
То есть процесс ферментации проводили в условиях высокой аэрации и заканчивали при достижении содержания в полученном препарате 80-85% свободных спор и кристаллов эндотоксина при их соотношении 1:1. При этом титр штамма BtH 800/15 в полученном жидком препарате составлял не менее 3,8-4,0 млрд.спор/мл при отсутствии посторонней микрофлоры и вирулентного фага.
1
Таким образом? был получен биопреперат на основе штамма BtH 800/15 (Битоксин), представляющий собой жидкость, легко разбавляемую водой до необходимой рабочей концентрации, удобной для применения серийной опрыскивающей аппаратуры. Производство препарата на заводах, биофабриках в регионах потребителя не потребует затрат на его перевозку и доставку на большие расстояния. Так как Битоксин является жидким, технология производства препарата не требует также больших энергозатрат для проведения операции высушивания.
1
Были проведены лабораторные испытания эффективности препарата на основе штамма BtH 800/15 - Битоксина по отношению к массовым насекомым-фитофагам сельскохозяйственных культур.
1
1
Так, например, лабораторные определения энтомоцидной активности препарата на основе штамма BtH 800/15 (Битоксина) проводили на личинках колорадского жука 2-го возраста. При этом корм (листья картофеля) обрабатывали Битоксином в разведениях 1:20; 1:100; 1:500, что соответствует концентрациям 5,0; 1,0; 0,2%, обеспечивающим гибель тест-объекта от 30 до 95%. В каждый вариант опыта сажали по 25 личинок колорадского жука 2-го возраста (в трехкратной повторности). Для сравнения в опытах при тех же условиях использовали препарат на основе штамма-прототипа BtH 98 (Битоксибациллин жидкий, без сушки), при тех же концентрациях. В контроле корм обрабатывали водой. Учет гибели личинок колорадского жука проводили на 7 день.
1
1
Были проведены также лабораторные испытания энтомоцидной активности Битоксина (препарата на основе штамма BtH 800/15) на гусеницах 2-го возраста непарного шелкопряда. Опыты проводили в стеклянных банках объемом 0,8 л. При этом корм (ветки яблони с листьями) обрабатывали Битоксином в пяти концентрациях: 2,0; 1,0; 0,5; 0,25; 0,125%. В каждый вариант опыта сажали по 25 гусениц непарного шелкопряда 2-го возраста (в трехкратной повторности). Для сравнения в опытах при тех же условиях использовали препарат на основе штамма-прототипа BtH 98 (Битоксибациллин жидкий, без сушки) в тех же концентрациях. В контроле корм обрабатывали водой. Учет гибели гусениц непарного шелкопряда проводили на 7 день.
Опыты по определению содержания экзотоксина в препарате Битоксин оценивали на личинках комнатной мухи по следующей методике.
1
Препарат на основе штамма BtH 800/15 (Битоксин) в количестве 20 мл центрифугировали 15 мин при 8000 об/мин. Полученный фугат автоклавировали при давлении 0,1 МПа и температуре 105°С в течение 20 мин. Затем готовили разведения препарата: 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32, что соответствует концентрациям 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 мкл/г корма (каждую - трехкратно).
Для испытания в стеклянную банку вместимостью 200 мл вносили:
- 2 мл препарата Битоксин соответствующего разведения;
- 11 мл 2,5%-ной водной суспензии сухого молока;
- 7 г стерилизованных пшеничных отрубей.
1
В контроле вместо Битоксина использовали препарат на основе штамма - прототипа BtH 98 (Битоксибациллин жидкий, без сушки) в тех же концентрациях. Корм с соответствующими разведениями препарата в каждой банке тщательно перемешивали и помещали туда по 25 личинок комнатной мухи. Активность экзотоксина оценивали по количеству погибших личинок комнатной мухи на 8 день опыта.
50
По результатам опытов для каждого из них был определен показатель ЛК-доза препарата (в %, в мкл/г корма, …), которая вызывает 50% гибели насекомых.
50
Значение ЛК рассчитывали по формуле Кербера (см., например, монографию «ЭКОЛОГИЯ BACILLUS THURINGIENSIS» авторов В.Ф.Патыка, Т.И.Патыка, Киев, изд. ПГАА, 2007 г., 217 стр.):
50
м
1
lgЛК=lgC-σ(ΣL-0,5),
м
где С - максимальная апробируемая концентрация;
σ - логарифм отношения каждой предыдущей концентрации к последующей (логарифм кратности разведений);
1
ΣL - сумма отношений числа насекомых, которые погибли от данной концентрации, к общему числу насекомых, которые подверглись действию этой концентрации.
50
1
1
Полученные в указанных опытах значения ЛК для препарата на основе штамма BtH 800/15 (Битоксина) и препарата на основе штамма - прототипа BtH 98 (Битоксибациллина), характеризующие их энтомоцидную активность, представлены в таблице 1.
Таблица 1.
Биологическая активность препаратов на основе BtH<sub>1</sub>
ЛК<sub>50</sub>, %, для L<sub>2</sub>
ЛК<sub>50</sub>, %, для L<sub>2</sub>
Содержание экзотоксина:
Препарат
колорадского жука
непарного шелкопряда
ЛК<sub>50</sub>, мкл/г корма для L<sub>2</sub>
комнатной мухи
Препарат на основе
штамма BtH<sub>1</sub> 98
0,51
0,42
6,82
(Битоксибациллин -
прототип)
Новый препарат
на основе
0,24
0,2
3,05
штамма BtH<sub>1</sub> 800/15
(Битоксин)
1
1
Из приведенных в таблице 1 данных следует, что препарат на основе штамма BtH 800/15 (Битоксин) по энтомоцидной активности для личинок колорадского жука и гусениц непарного шелкопряда в 2,1 раза активнее препарата на основе штамма - прототипа BtH 98 (Битоксибациллина), а по содержанию экзотоксина он превосходит его в 2,24 раза.
1
1
Кроме того, были проведены лабораторные опыты по сохранению энтомоцидной активности штаммов BtH 800/15 и BtH 98 после их длительного хранения. Результаты опытов приведены в таблице 2.
Таблица 2.
Биологические характеристики штаммов BtH<sub>1</sub> после их длительного хранения
Показатели
Исходные значения
Через 1 год
Через 2 года
Штамм
BtH<sub>1</sub> 98
BtH<sub>1</sub> 800/15
BtH<sub>1</sub> 98
BtH<sub>1</sub> 800/15
BtH<sub>1</sub> 98
BtH<sub>1</sub> 800/15
Титр спор, млрд/мл
2,11
4,0
2,05
3,92
1,98
3,8
Содержание экзотоксина: ЛК<sub>50</sub>, мкл/г корма для L<sub>2 </sub>комнатной мухи
5,04
2,9
5,4
3,0
6,4
3,05
Энтомоцидная активность: ЛК<sub>50</sub>, %, для L<sub>2 </sub>колорадского жука
0,54
0,28
0,58
0,29
0,62
0,3
1
1
1
1
Из данных, приведенных в таблице 2, видно, что через 2 года хранения энтомоцидная активность штамма - прототипа BtH 98 в отношении колорадского жука уменьшилась на 15%, а у штамма BtH 800/15 - только на 7%, что подтверждает возможность его длительного хранения. При этом через 2 года хранения штамм BtH 800/15 на 92% технологичнее штамма - прототипа BtH 98, а по содержанию экзотоксина и энтомоцидной активности в отношении колорадского жука в 2,1 раза превосходит его.
1
Эффективность препарата на основе штамма BtH 800/15 (Битоксина) была также проверена в полевых условиях в хозяйствах Ленинградской области: ГП ОПХ «Каложицы», ОПХ «Суйда» и ОПХ «Предпортовый», на картофеле против колорадского жука. Результаты полевых опытов в хозяйствах Ленинградской области приведены в таблице 3.
Таблица 3.
Эффективность препарата на основе штамма BtH<sub>1</sub> 800/15 на картофеле против колорадского жука в хозяйствах Лен.обл.
Вариант обработки
Площадь обработки, га
Норма расхода препарата, л/га
Норма расхода рабочей жидкости
Средняя численность вредителя (экз. на 1 растение)
Эффективность обработки, % на день учета
л/га
До обработки
День учета
7
14
7
14
ГП ОПХ «Каложицы»
Битоксин
3
15
300
26,7
1,0
1,6
96,4
95,9
Контроль (без обработки)
0,25
-
-
19,3
30,4
25,1*
Увеличение числ. вредителя на 30%
ОПХ «Суйда»
Битоксин
2
12
400
28,4
1,5
0,9
94,7
96,8
Контроль (без обработки
0,25
-
-
26,4
36,7
34,6*
Увеличение числ. вредителя на 31%
ОПХ «Предпортовый»
Битоксин
3
15
400
30,2
3,0
0,8
90,0
97,4
Контроль (без обработки)
0,25
-
-
23,4
28,1
30,9
Увеличение числ. вредителя на 37%
Примечание: * - часть личинок ушла в почву.
1
Приведенные в таблице 3 данные подтверждают высокую энтомоцидную активность Битоксина - препарата на основе штамма BtH 800/15.
1
Препарат на основе штамма BtH 800/15 (Битоксин) безопасен для теплокровных животных.
1
Вирулентность, диссеминация, токсичность и токсигенность штамма BtH 800/15 были изучены в соответствии с Методическими указаниями Минздрава СССР №4263-87, №2620-82 и с учетом рекомендаций ВОЗ (Бюлл. ВОЗ, 1981, №6, стр.20-27) на беспородных белых крысах и беспородных белых мышах.
1
2
6
7
8
9
6
7
8
9
Вирулентность и диссеминацию штамма BtH 800/15 изучали при однократном введении суточной агаровой культуры в физиологическом растворе в желудок белым мышам и белым крысам в дозах по 10, 10, 10 и 10 и внутрибрюшинно по 10, 10, 10 и 10 микробных клеток на животное. В опыте использовали по 12 животных на дозу (6 самцов и 6 самок). В период наблюдения клинических симптомов заболевания животных не наблюдалось, гибель отсутствовала. Через 30 суток после введения культуры микроорганизмов, животных умерщвляли ингаляцией CO и методом отпечатков делали посев из крови и внутренних органов (легких, печени, почек и селезенки) на чашки Петри с агаризованной средой. Рост культуры в высевах из органов животных при обоих способах введения не был обнаружен.
1
7
8
9
Токсичность штамма BtH 800/15 оценивали путем внутрибрюшинного введения мышам взвеси агаровой культуры микроорганизмов, приготовленной на стерильном физиологическом растворе и инактивированной нагреванием при 60°С в течение 30 минут в концентрациях 10, 10 и 10 микробных клеток на животное (по 6 особей на дозу).
1
50
Токсигенность штамма BtH 800/15 изучали на мышах путем внутрибрюшинного и внутрижелудочного введения стерильного фильтрата культураль-ной жидкости (фильтрация через фильтр Millipor с размером пор 0,22 мкм) 3-х и 7 суточных культур в дозах 0,3 мл, 0,6 мл и 1,0 мл (по 6 особей на дозу). Животным контрольных групп вводили стерильную жидкую питательную среду в таких же объемах. Гибели мышей не было. ЛД не была установлена. При обоих способах введения она превышает 1,0 мл на животное для 3-х и 7-ми суточных культуральных жидкостей.
1
1
То есть по показателям вирулентности, диссеминации, токсичности и ток-сигенности штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis №800/15 (BtH 800/15) не патогенен для теплокровных животных и, в соответствии с Методическими указаниями Минздрава №2620-82 и №4263-87, штамм BtH 800/15 относится к 4 классу опасности (малоопасен) и удовлетворяет требованиям, предъявляемым к промышленным микроорганизмам.
Результаты по безопасности данного биопрепарата согласуются с мировой практикой широкого использования биоинсектицидов на основе штаммов бактерий группы Bacillus thuringiensis.
1
1
Таким образом, на основании вышеизложенного можно утверждать, что препарат жидкой формы на основе штамма BtH 800/15 (Битоксин) обладает высокой энтомоцидной активностью против опасных массовых вредителей - насекомых-фитофагов, характеризуется безопасностью для человека и теплокровных животных, а также что штамм BtH 800/15 сохраняет свою энтомоцидную активность при длительном хранении.
1
А это, в свою очередь, характеризует штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis №800/15 (BtH 800/15) как перспективный в качестве средства для производства энтомоцидного биопрепарата.