УСОВЕРШЕНСТВОВАННАЯ ОЧИСТКА ПОЛИСПЕЦИФИЧНЫХ РЕЦЕПТОРОВ
IMPROVED CLEANSING OF POLYSPECIFIC RECEPTORS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к очистке сложных рецепторов, т.е. таких рецепторов, которые способны связываться с несколькими структурами на молекуле, вызывающей тот или иной симптом, такой как аминокислота или углевод. Настоящее изобретение также относится к способам лечения множества метаболических расстройств, при которых биомолекулы из обычной пищи вызывают у пациентов симптомы заболевания.
Предпосылки создания изобретения
Аффинная хроматография представляет собой способ, основанный на взаимодействии между молекулой на хроматографической матрице и связывающим партнером для данной молекулы, что позволяет выбрать субпопуляцию партнеров связывания из большого множества веществ с варьирующей аффинностью в отношении молекулы или из неочищенной смеси, такой как ферментативная биомасса.
Способы, такие как аффинная хроматография, в которых используется связывание между молекулами с целью очистки, анализа, диагностики и т.п., ограничены по своей природе наличием стерических препятствий, вызванных ориентацией молекулы на хроматографической матрице, и из-за чего происходит связывание с матрицей (через молекулу-носитель, спейсер, линкер и т.п.). Следствием этого является то, что только ограниченная часть общего числа молекул в отдельных сайтах связывания открыта для рецептора, который использован для связывания с матрицей, является недоступной для партнеров связывания, которые приводятся в контакт с хроматографической матрицей.
Во многих случаях это не является проблемой, поскольку интерес представляет только конкретная характеристика партнера связывания.
При разработке рецепторов, либо так называемых природных рецепторов, таких как антитела, либо синтетических рецепторов, таких как молекулярно импринтированные полимеры (MIP), выбор/выделение лучших вариантов связывающих рецепторов - молекул антител или MIP частиц, в растворенном или нерастворенном виде, - представляет собой способ улучшения аффинности, специфичности, функциональной способности и т.п. получаемого рецепторного продукта; применительно к MIP см. WO 2007/095949, где описаны способы очистки, позволяющие получать MIP композиции с улучшенной аффинностью связывания и активностью в отношении молекулы-мишени.
Однако существует потребность в дальнейшем улучшении связывающих характеристик композиций, таких как MIP и поликлональные антитела.
Краткое описание сущности изобретения
При получении композиций рецепторов для молекулы-мишени аффинность или авидность связывания с молекулой-мишенью зависит от множества факторов. Относительно крупные рецепторные молекулы, такие как поликлональные антитела и MIP, связываются с более мелкими мишенями на множестве различных дискретных сайтов на данных мишенях, и способ очистки с использованием молекулы-мишени в качестве агента захвата на хроматографической матрице, где молекула-мишень присоединяется через одну определенную функциональную группу, будет приводить к тому, что очищенный продукт не будет в обязательном порядке связываться с данной функциональной группой (поскольку он недоступен для связывания после соединения с матрицей). С другой стороны, сама природа таких рецепторов мультисайтового связывания является такой, что молекулы, полученные после первого цикла очистки, будут включать рецепторы, которые, по меньшей мере, частично связываются с недоступным сайтом из первого цикла очистки. Так, если одна из схем последующих стадий, которые используют такие же молекулы-мишени в качестве агента захвата, но связывание через другую функциональную группу, то можно будет обогатить в дальнейшем такими рецепторами, которые также демонстрируют достаточно высокую аффинность в отношении "скрытого сайта связывания" с первой стадии очистки.
Также будет возможно обогатить рецепторами, которые связываются с "характерной" частью предполагаемой молекулы-мишени, причем на каждой стадии очистки, где функциональная группа скрыта в результате ее связывания с матрицей, при этом рецепторы, которые зависят от скрытой функциональной группы для их связывания, будут исключены из процедуры очистки; так, если молекула-мишень включает нехарактерные функциональные группы, которые совпадают с числом других молекул (как в случае аминокислот, каждая из которых имеет N-конец и C-конец, которые структурно идентичны от одной аминокислоты к другой), то многостадийная процедура очистки, в которой каждая из нехарактерных функциональных групп, в свою очередь, скрыта, должна обеспечивать композицию рецепторов, связывание которых будет действительно характерным для данной молекулы-мишени.
Таким образом, в первом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения композиции, обогащенной рецепторами, которые связываются с агентом, где каждый из указанных рецепторов специфически связывается, по меньшей мере, с двумя дискретными сайтами на указанном агенте, включающему:
(а) обеспечение образца композиции указанных рецепторов,
(b) подвергание указанного образца первой стадии аффинной хроматографии, где указанный агент используют в качестве агента для аффинной очистки и где указанный агент иммобилизируют в твердой или полутвердой фазе посредством связывания с одним из указанных, по меньшей мере, двух дискретных сайтов,
(c) восстановление рецепторов, связавшихся с агентом,
(d) подвергание восстановленных на предшествующей стадии рецепторов, по меньшей мере, одной последующей стадии аффинной хроматографии, где указанный агент используют в качестве агента для аффинной очистки и где указанный агент иммобилизуют в твердой или полутвердой фазе посредством связывания с другим сайтом из указанных, по меньшей мере, двух дискретных сайтов, и восстановление рецепторов, связавшихся с данным агентом,
где на каждой указанной, по меньшей мере, одной последующей стадии аффинной хроматографии указанный другой из указанных, по меньше мере, двух дискретных сайтов отличается от любого сайта из указанных, по меньшей мере, двух дискретных сайтов, который использовали ранее на стадиях b и d для иммобилизации агента в твердой или полутвердой фазе.
Во втором аспекте, настоящее изобретении относится к способу получения композиции, обогащенной рецепторами, которые связываются с агентом, где каждый из указанных рецепторов специфически связывается, по меньшей мере, с двумя дискретными сайтами на указанном агенте, включающий получение, по меньшей мере, двух композиций способом первого аспекта настоящего изобретения и затем объединение указанных, по меньшей мере, двух композиций, с получением композиции, обогащенной рецепторами, которые связывают агент, где такой же агент используют на стадиях b и d при получении, по меньшей мере, двух композиций и где:
(i) комбинация дискретных сайтов в агенте, которые используют для иммобилизации в твердой или полутвердой фазе, чтобы получить каждую из указанных, по меньшей мере, двух композиций, различается, по меньшей мере, для двух композиций, и/или
(ii) последовательное расположение, в котором дискретные сайты в агенте используют для иммобилизации в твердой или полутвердой фазе, чтобы получить каждую из указанных, по меньшей мере, двух композиций, различается при получении, по меньшей мере, двух из указанных, по меньшей мере, двух композиций.
В третьем аспекте, настоящее изобретение относится к способу лечения, ослабления или профилактики заболевания, выбранного из группы, состоящей из фенилкетонурии (PKU, болезнь Фоллинга), гиперфенилаланинемии (HPA), алкаптонурии (черная моча), тирозинемии, гипертирозинемии, тяжелой псевдопаралитической миастении, гистидинемии, урокановой ацидурии, болезни мочи с запахом кленового сиропа (MSUD), изовалериановой ацидемии (недостаточности по изовалерил-KoA-дегидрогеназе), гомоцистинурии, пропионовой ацидемии, метилмалоновой ацидемии, глютаровой ацидурии типа 1 (GA-1) и галактоземии, включающему введение в желудочно-кишечный тракт пациента, нуждающегося в этом, эффективного количества композиции молекулярно импринтированных полимеров (MIP), причем указанная композиция способна связываться с агентом, вызывающим симптом указанного заболевания. Относительно указанного аспекта, им является композиция MIP для применения в таком способе.
Наконец, в четвертом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтической композиции, включающему получение композиции при использовании способа по первому или второму аспекту настоящего изобретения и затем смешивание данной композиции с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем.
Подробное описание настоящего изобретения
Определения
Термин "рецептор" в контексте настоящего описания означает вещество, которое проявляет аффинность в отношении и способно специфически связываться с представляющим интерес агентом, который представляет собой мишень. Данный термин охватывает своим определением то, что обычно называется молекулами биологического рецептора, но также и другие молекулы, которые проявляют способность к специфическому связыванию, такие как антитела и молекулярно импринтированные полимеры. Качество специфического связывания в данном контексте весьма важно и фактически исключает вещества, которые связываются с большим числом неродственных мишеней; однако не исключается перекрестная реактивность рецептора для связывания с, казалось бы, неродственными молекулами, поскольку эта особенность требует наличия общего структурного элемента в двух указанных мишенях, которые связываются рецептором. Обычно, специфическое связывание характеризуется более высокой аффинностью связывания в отношении мишени, чем с одной или несколькими другими нерелевантными молекулами, которые используются в качестве отрицательных контролей в тесте на связывание.
“Молекулярно импринтированный полимер (MIP) представляет собой полимер, включающий полости (или пустоты), которые, по меньшей мере, частично, соответствуют одной или нескольким матричным молекулам, которые были введены в мономерную матрицу, включающую поперечно сшитые мономеры перед полимеризацией. Полученный после полимеризации полимер включает множество полостей, которые соответствуют по форме матричной молекуле. Обычно, MIP собирают в небольшие частицы, что облегчает удаление матрицы и оставляет полость открытой для взаимодействия с молекулой-мишенью, которая похожа на матричную молекулу или идентична ей. В настоящем описании и формуле изобретения термин MIP в основном относится к любой форме MIP (как растворимых, так и нерастворимых), и это означает, что термины “MIP", относящиеся как к единственному, так и к множественному числу, используются взаимозаменяемо, применительно к выражению MIP-частицы, одна или несколько, соответственно.
Следует понимать, что некоторые MIP, очищенные или используемые в настоящем изобретении, представляют собой нерастворимые молекулы/структуры, что имеет место, например, в случае MIP, полученных согласно принципам, приведенным в WO 2007/095949. Такие MIP особенно хорошо подходят в качестве фармацевтических средств для применения в желудочно-кишечном тракте, поскольку их нерастворимость ограничивает или предотвращает их дальнейшее проникновение в организм (например, в кровоток) из желудочно-кишечного тракта. Иными словами, при пероральном введении нерастворимые MIP, используемые в настоящем изобретении, будут по существу ограничены областью желудочно-кишечного тракта, пока не будут выведены с фекалиями.
Однако MIP, очищенные согласно подходам, представленным в данном описании, также могут быть растворимыми MIP, которые подходят для множества вариантов их применения, когда нет особой необходимости ограничивать действие MIP областью желудочно-кишечного тракта.
"Антитело" представляет собой растворимую биомолекулу, которая продуцируется и секретируется B-лимфоцитами в ответ на иммунологический признак. В контексте настоящего описания этот термин в основном используется для обозначения поликлональных антител, т.e. смеси антител, продуцируемых несколькими клонами B-лимфоцитов. Данный термин может также означать антитела или фрагменты антитела, кодируемые и связываемые фаговыми частицами, которые используются в методе фагового дисплея. Антитела, очищенные согласно настоящему изобретению, могут относиться к любому классу антител и могут представлять собой, например, антитела класса IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Кроме того, антитела, отличные от антител человека, такие как одноцепочечные антитела (такие как антитела верблюда или ламы), также входят в область определения данного термина.
В контексте настоящего описания термин “молекула-мишень" относится к любой молекуле, с которой рецептор может специфически связываться, и обычно означает молекулу, с которой, как предполагается, очищенные рецепторы должны связываться, что и является конечной целью использования рецепторов. Термин "молекула-мишень" в настоящем описании используется взаимозаменяемо с термином "агент", при обсуждении связывания рецептора с таким "агентом", хотя следует отметить, что термин "агент", используемый применительно к способу по настоящему изобретению, необязательно должен быть идентичен молекуле-мишени, скорее, агент достаточно часто представляет собой миметик или производное молекулы-мишени, который используется на стадиях очистки, обсуждающихся в данном описании. Агент может составлять, например, часть более крупной молекулы, в сравнении с молекулой-мишенью, например, если предполагаемая молекула-мишень представляет собой аминокислоту, то соответствующий аминокислотный остаток, формирующий часть белка или пептида, также может быть полезен в качестве агента на стадиях b и d. Так, например, процесс очистки может быть разработан таким образом, чтобы обогащать рецепторами, которые связывают аминокислотный остаток, где на одной стадии в процессе очистки применяется пептид, в котором аминокислота находится на C-конце, и где на другой стадии применяется аминокислота в N-конце пептида, и в таком случае, данный агент представляет собой вещество, используемое на стадиях очистки, тогда как молекула-мишень рассматривается как одно из веществ, которые эффективно связываются обогащенными рецепторами.
Аналогично, "матричная молекула" обычно идентична молекуле-мишени/агенту, но может быть также их миметиком или производным (т.е. молекула, имеющая, по меньшей мере, частично, идентичность 3D структуре и профилю, которая подходит для молекулы-мишени - миметик может быть составлен, например, фрагментом молекулы-мишени). Матрица выполняет функцию "генератора" пустот в структуре MIP, которые впоследствии могут связывать молекулу-мишень.
Следует также отметить, что обогащенные рецептором композиции (например, композиции MIP) могут демонстрировать специфическое связывание с другими молекулами, отличными от тех, которые используются в качестве матриц, или тех, которые используются в качестве агентов в способе по настоящему изобретению. Поэтому такие композиции рецепторов могут использоваться в библиотеках для скрининга, проводимого с целью выявления связывания с потенциальными (и необязательно родственными) молекулами-мишенями. Этот подход можно сравнить с методом фагового дисплея, в котором фаги, экспрессирующие молекулы рецептора (например, из библиотеки антител), показывают, что связывают молекулы иного происхождения, нежели антиген, который исходно использовался для связывания молекул рецептора. Например, на 6-й Международной конференции по молекулярному импринтингу, проходившей 9-12 августа 2010 года в Новом Орлеане (6th International Meeting on Molecular Imprinting, August 9-12, 2010, New Orleans, LA), Д-р Ecevit Yilmaz (SE) представил опубликованные данные по MIP, которые проявляют перекрестную реактивность в отношении молекул, очень отличающихся по структуре от молекулы матрицы, которая первоначально использовалась в способе синтеза MIP. Кроме того, Д-р Yilmaz представил родовые библиотеки MIP, которые могут использоваться для идентификации полимерных композиций, с аффинностью в отношении специфической молекулы-мишени. После такой идентификации, выбранный полимер может быть подвергнут аффинной очистке, описанной в настоящем изобретении, и таким образом получен MIP с более высокой активностью, чем исходные неочищенные MIP.
Термин "аффинная хроматография" означает любой способ очистки рецептора, где специфическое связывание между рецептором и связывающим партнером осуществляется с использованием агента для аффинной очистки, связанного с твердой подложкой (такой как хроматографическая матрица), который захватывает данное вещество. Конкретные примеры, известные в данной области, включают способ аффинной очистки с использованием антител в качестве агентов захвата, связанных с хроматографическими шариками, для очистки антигенов, которые связывают антитела. Следует понимать, что способы аффинной очистки, применяемые согласно настоящему изобретению, представляют собой такие способы, которые применимы для MIP частиц, обладающих обсуждаемыми в данном описании характеристиками. Следовательно, конкретный способ аффинной очистки нерастворимых MIP может представлять собой адсорбцию на слой вспененного адсорбента (EBA), известную специалистам в данной области.
"Твердая или полутвердая фаза" в контексте настоящего описания означает любой материал, который может быть использован для фиксации агента захвата путем ковалентного или нековалентного связывания. Следовательно, любой материал (пластические полимеры, сахара, металлы, стекло, оксид кремния, каучук и т.п.), который традиционно используется при получении хроматографических материалов, может служить в качестве твердой фазы. Материал твердой фазы может содержать подходящие функциональные группы, которые обеспечивают связывание агента захвата с данным материалом. Такие дериватизированные материалы известны специалистам в области хроматографической очистки белков и других макромолекул. Кроме того, твердая фаза может иметь любую физическую форму, которая позволяет осуществлять захват относительно крупных и нерастворимых частиц, таких как MIP (в сравнении с отдельными макромолекулами, такими как белки). Следовательно, твердая фаза может быть представлена в форме волокон (предпочтительно полых), хроматографической матрицы (предпочтительно, матрицы, подходящей для EBA), шариков (предпочтительно таких, которые могут быть отделены под воздействием магнитного поля) или в любой другой приемлемой форме, см., например, приведенное ниже описание.
Олигонуклеотид представляет собой короткую последовательность нуклеотидов, обычно имеющих длину самое большее 30 нуклеотидов, в частности самое большее 25, самое большее 20, самое большее 19, самое большее 18, самое большее 17, самое большее 16, самое большее 15, самое большее 14, самое большее 13, самое большее 12, самое большее 11 нуклеотидных остатков. Данный термин относится как к олигонуклеотидам РНК, так и к олигонуклеотидам ДНК.
Термин "производное олигонуклеотида" означает в контексте настоящего описания дериватизированные олигонуклеотиды, скелет которых по существу такой же, как и в олигонуклеотиде, но в рибозную часть введены химические изменения, и, соответственно, в область определения данного термина входят такие молекулы, которые включают в свою последовательность нуклеотиды LNA (нуклеотиды закрытой нуклеиновой кислоты). Однако указанные производные олигонуклеотидов могут быть также миметиками олигонуклеотидов, такими как PNA (пептидо-нуклеиновые кислоты).
Варианты осуществления первого аспекта настоящего изобретения
Как отмечалось выше, первый аспект относится к способу получения композиции, обогащенной рецепторами, которые связывают агент, где указанные рецепторы, каждый, специфически связывается, по меньшей мере, с двумя дискретными сайтами на указанном агенте, включающему:
(а) обеспечение образца, включающего указанные рецепторы,
(b) подвергание указанного образца первой стадии аффинной хроматографии, где указанный агент используют в качестве агента для аффинной очистки и где указанный агент иммобилизируют в твердой или полутвердой фазе посредством связывания с одним из указанных, по меньшей мере, двух дискретных сайтов,
(c) восстановление рецепторов, связавшихся с агентом,
(d) подвергание рецепторов, восстановленных на предшествующей стадии, по меньшей мере, одной последующей стадии аффинной хроматографии, где указанный агент используют в качестве агента для аффинной очистки и где указанный агент иммобилизируют в твердой или полутвердой фазе посредством связывания с другим из указанных, по меньшей мере, двух дискретных сайтов, и восстановление рецепторов, связавшихся с данным агентом,
где на каждой указанной, по меньшей мере, одной следующей стадии аффинной хроматографии указанный другой из указанных, по меньшей мере, двух дискретных сайтов отличается от любого из указанных, по меньшей мере, двух дискретных сайтов, который использовали ранее на стадиях b и d для иммобилизации агента в твердой или полутвердой фазе.
Таким образом, данный принцип дает возможность обогащения исходной композиции такими рецепторами, которые связываются со структурами на агенте и которые соответствуют как доступной части на агенте в первом цикле аффинной хроматографии, так и доступной части на агенте во втором и последующих циклах аффинной хроматографии.
Как отмечалось выше, указанный агент может быть частью более крупной молекулы, одним таким практическим примером является ситуация, когда молекула-мишень представляет собой аминокислоту, такую как фенилаланин (или другую аминокислоту, см., например, приведенное ниже описание), а также короткими пептидами, которые включают данную аминокислоту. Для реализации возможности обогащения рецепторами, которые оптимально связывают аминокислоту, можно создать, например, дипептид, в котором данная аминокислота присутствует в качестве N-концевого аминокислотного остатка, и затем связать такой пептид с твердой или полутвердой фазой на первой стадии очистки. Для дальнейшего обогащения, дипептид, в котором данная аминокислота уже является C-концевым остатком, можно связать с твердой или полутвердой фазой через N-конец на следующей стадии очистки. На объединенной стадии будет иметься обогащенная композиция, содержащая такие рецепторы, которые связывают части аминокислоты, которые вовлечены не только в пептидные связи или составляют свободный N- или C-конец.
Данные рецепторы обычно выбирают из группы, состоящей из молекулярно импринтированных полимеров (MIP) и поликлональных антител, где желательно получить обогащенную смесь таких молекул, но указанные рецепторы также могут представлять собой популяцию фаговых частиц, которые экспрессируют на своих поверхностях фрагменты антител. По существу, технология затем включает проведение двух раундов пэннинга против агента захвата, который имеет разную ориентацию в указанных двух раундах. Таким образом, настоящим изобретением найдено специальное использование для тех ситуаций, когда рецептор имеет относительно большую площадь контактирования, в сравнении с плотностью релевантных площадей поверхности на молекуле-мишени.
Способ по первому аспекту применим в тех ситуациях, когда рецепторы выбирают из растворимых или нерастворимых MIP, и в одном варианте осуществления указанные рецепторы представляют собой нерастворимые MIP. В другом варианте осуществления указанные рецепторы представляют собой растворимые MIP.
В некоторых вариантах осуществления указанные рецепторы представляют собой моноспецифические поликлональные антитела. Термин "моноспецифический" в контексте настоящего описания означает, что различные антитела, составляющие поликлональное антитело, все, специфически связывают один и тот же агент.
Аффинная хроматографии может быть проведена методами, известным специалистам в данной области. Так, например, аффинная хроматография может включать использование системы псевдоожиженного слоя, такой как адсорбция на слой вспененного адсорбента; что особенно полезно в тех случаях, когда рецепторы представляют собой нерастворимые суспендированные молекулы. Однако аффинная хроматография может быть также проведена традиционной колоночной хроматографией (включая методы ВЭЖХ и FPLC (жидкостная экспресс-хроматография белков)), которые особенно хорошо подходят для случая растворимых рецепторов.
3
+
В описанных выше вариантах осуществления данный агент может представлять собой химическое вещество, имеющее формулу HN-CH(R)-COO-, такое как аминокислота, или данный агент может представлять собой пептид, включающий самое большее 5 аминокислотных остатков. Обычно, указанную аминокислоту выбирают из фенилаланина, тирозина, гистидина, лейцина, метионина, изолейцина, триптофана, треонина, валина и лизина. Кроме того, данный пептид, как правило, представляет собой такой пептид, который включает в своей последовательности, по меньшей мере, одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из фенилаланина, тирозина, гистидина, лейцина, метионина, изолейцина, триптофана, треонина, валина и лизина. В конкретных вариантах осуществления такие аминокислоты присутствуют в пептиде как его N-концевая и/или C-концевая аминокислота.
В тех вариантах осуществления, где указанный агент является пептидом, он, как правило, представляет собой дипептид, трипептид, тетрапептид или пентапептид.
В некоторых других вариантах осуществления первого и второго аспектов настоящего изобретения, описанных выше, агент является углеводом, таким как разветвленный или линейный олигосахарид, имеющий самое большее 10 моносахаридных единиц. Так, в некоторых вариантах осуществления углевод выбран из моносахарида, дисахарида и трисахарида. В частности, представляющим интерес углеводом является D-галактоза и лактоза.
Кроме того, агент также может представлять собой жирную кислоту или липид; и в данном случае, агентом является липид, который выбирают обычно из группы, состоящей из холестерина, триглицерида и желчной кислоты или ее соли.
Далее, агентом может быть олигонуклеотид или производное олигонуклеотида, такой как олигонуклеотид или производное олигонуклеотида, выбранные из группы, состоящей из олигонуклеотида РНК, олигонуклеотида ДНК, олигонуклеотида LNA, олигонуклеотида PNA и олигонуклеотидной смеси. В некоторых вариантах осуществления указанный олигонуклеотид или производное олигонуклеотида представлено олигонуклеотидной смесью, которая включает, по меньшей мере, одну рибо- или дезоксирибонуклеотидную единицу и, по меньшей мере, одну LNA или PNA нуклеотидную единицу.
Во всех указанных выше вариантах осуществления, альтернативно, вместо методов аффинной хроматографии может применяться реакция агглютинации. В таких вариантах осуществления первого аспекта настоящего изобретения выделение рецепторов достигается реакцией агглютинации, в которой рецепторы формируют "мостик" между несколькими целевыми агентами.
Практический подход
Описанный в настоящем изобретении способ отбора/выделения может включать применение колонки, заполненной хроматографической средой (матрицей), выполненной из нерастворимого материала (конкретные примеры включают поперечно сшитые полисахариды, полистирол, стекло и т.п.), где молекула (агент) связывается (обычно) посредством ковалентной связи через функциональную группу с матрицей. Как отмечалось выше, указанный агент может представлять собой аминокислоту, пептид, углевод, холестерин, желчную кислоту, триглицерид, жирную кислоту и т.п. Раствор или суспензию рецепторных структур наносят на хроматографическую среду (на колонку или в систему вспененного адсорбента), при этом рецепторные структуры или рецепторные молекулы с наибольшей аффинностью в отношении открытой части агента будут связываться с агентом на хроматографической среде в процессе отбора, и элюированный из колонки приведет к получению субпопуляции рецепторных структур или молекул с более высокой аффинностью и более высокой производительностью, чем исходный материал.
Если проводится второй отбор на выбранных рецепторных структурах или молекулах из первого отбора, но уже в сочетании с агентом, связанным с хроматографической средой, с ориентацией, отличной от первого отбора, образуется новая субпопуляция рецепторных структур или молекул, которые распознают обе ориентации агента. Такие двойные или тандемные отобранные рецепторные структуры или молекулы будут соединяться со свободными, несвязанными молекулами агента с более высокой аффинностью, специфичностью и производительностью, чем субпопуляция рецепторных структур или молекул, полученных в результате первого отбора.
Одним таким примером является очистка популяции MIP, которые представляют собой продукт полимеризации с фенилаланином в качестве мишени. Фенилаланиновые MIP, полученные Piletsky и соавт. (Piletsky, S.A, Andersson, H, and Nicholls, I.A. Polymer Journal, 37 (2005) 793-796), содержат три потенциальные точки для взаимодействия, специфичные для мишени: фенильное кольцо, аминогруппа и карбоксильная группа. При последующем отборе или в ходе следующего процесса очистки с использованием метода адсорбции на слой вспененного адсорбента (EBA) в ходе хроматографии с использованием фенилаланина в качестве аффинного агента, молекула фенилаланина может быть связана с EBA средой, либо через аминогруппу, либо через карбоксильную группу (или, в принципе, это возможно также через фенильную группу, если она содержит реакционно-способную группу). Однако указанные MIP могут, как это схематически показано в работе Piletsky, содержать связывающие полости, которые взаимодействуют с фенильной группой плюс аминогруппа, с фенильными группами плюс карбоксильная группа, с аминогруппой плюс карбоксильная группа или с фенильной группой плюс и аминогруппа, и карбоксильная группа, одновременно. Если фенилаланиновые MIP очищать с использованием адсорбции на слой вспененного адсорбента или другого способа, который позволяет проводить очистку нерастворимых частиц на основе аффинности в отношении молекулы-мишени, и молекулу-мишень иммобилизовать на хроматографической матрице, например, через аминогруппу фенилаланина, то в этом случае будут отобраны MIP, которые обладают наилучшей аффинностью одновременно как в отношении фенильного кольца, так и в отношении карбоксильной группы. Такая субпопуляция MIP может содержать другую субпопуляцию MIP, которые преимущественно содержат связывающие полости, способные взаимодействовать также с фенильным кольцом и аминогруппой. Эта суб-субпопуляция должна содержать связывающие полости, которые могут взаимодействовать одновременно с фенильным кольцом, карбоксильной группой и аминогруппой. Такое связывание, вовлекающее все 3 функциональные группы, должно, как ожидается, характеризоваться более высокой аффинностью и более высокой селективностью и привести к получению MIP с более высокой аффинностью связывания, чем те MIP частицы, которые преимущественно содержат сайты связывания, распознающие только две из трех возможных точек взаимодействия, т.e. дискретных сайтов связывания.
Во втором примере фенилаланиновые MIP частицы измельчают до такого размера, чтобы они стали растворимыми. В этом случае отдельные MIP частицы будут иметь меньше связывающих полостей, в сравнении с более крупными частицами MIP, а также открывается возможность того, что данная частица будет содержать преимущественно один тип связывающих полостей, т.e. либо связывающие полости, которые могут взаимодействовать со всеми функциональными группами на молекуле фенилаланина, либо связывающие полости, которые взаимодействуют только с двумя функциональными группами на молекуле фенилаланина, и т.п. Как и в варианте первого примера, когда за первой очисткой, где фенилаланин иммобилизован на хроматографической матрице через аминогруппу, следовала вторая очистка, где фенилаланин иммобилизован на хроматографической матрице через карбоксильную группу, получаемая суб-субпопуляция будет преимущественно содержать связывающие полости, которые могут взаимодействовать как с фенильной группой, так и с карбоксильной группой, и с аминогруппой. В том случае, когда указанные MIP растворимы, проводимая хроматография необязательно будет включать хроматографию с адсорбцией на слой вспененного адсорбента, но это может быть обычная хроматография с упакованным слоем.
В третьем примере, получают антитела против антигена со сложным набором эпитопов и с высокой степенью стерехимии, например, с использованием моно- или дисахарида. Когда такой сахаридный агент связывают с хроматографической матрицей для аффинной очистки антитела, только часть всего набора эпитопов открыта для взаимодействия. Субпопуляция молекул антитела, которые очищают с использованием агента в указанной ориентации, может также содержать другую субпопуляцию молекул антитела, распознающую комбинацию эпитопов, которые открыты в указанной ориентации, плюс набор эпитопов, которые открыты, когда агент имеет другую ориентацию. Такая вторая субпопуляция может быть отобрана, если первую субпопуляцию нанести на вторую хроматографическую колонку с сахаридным агентом, связанным в другой ориентации. Такая вторая субпопуляция может обладать более высокой аффинностью, более высокой селективностью и более высокой аффинностью связывания, чем первая субпопуляция и исходные неочищенные антитела.
Варианты осуществления второго аспекта настоящего изобретения
Способ по настоящему изобретению, описанный в контексте первого аспекта, приводит к получению обогащенной композиции рецепторов, которые связываются с зоной поверхности на агенте-мишени, включающем связывающие полости, определяемые всеми теми функциональными группами, которые использовались на каждой из стадии хроматографии.
Однако нельзя исключить того, что фракция желаемых рецепторов с мультисайтами связывания исключается на первой стадии хроматографирования из-за конкуренции с рецепторами, которые впоследствии исключаются, поскольку они не могут связываться с обоими релевантными дискретными сайтами связывания на агенте.
Для того чтобы в полной мере использовать связывающие полости на мишени, при получении обогащенной композиции рецепторов согласно принципам настоящего изобретения, в качестве одного из удачных подходов следует рассматривать параллельное проведение нескольких процедур аффинной хроматографии на каждой стадии, где в различных процедурах применяется связывание агента с хроматографической матрицей через разные дискретные сайты на агенте, после чего материал, обогащенный на первой стадии, подвергают обработке на последующих стадиях, все также с различными дискретными сайтами связывания, которые использовались в процедурах постадийно. Наконец, объединяют обогащенные композиции, полученные в каждом из таких "рукавов" в последовательной серии стадий очистки. При этом порядок выполнения каждой из хроматографических стадий гарантирует, что не происходит непреднамеренного исключения рецепторов, которые фактически способны связываться с желаемой крупной областью на агенте.
В одном простом варианте такого подхода используется связывание агента через две разные функциональные группы: образец, содержащий молекулы рецептора, расщепляют на две части, и обе части подвергают обработке способом первого аспекта настоящего изобретения, но порядок проведения хроматографических стадий меняют на обратный; наконец, объединяют две полученные обогащенные фракции.
В целом, можно сказать, что второй аспект настоящего изобретения относится к способу получения композиции, обогащенной рецепторами, которые связываются с агентом, где каждый из указанных рецепторов специфически связывается, по меньшей мере, с двумя дискретными сайтами на указанном агенте, включающему получение, по меньшей мере, двух композиций способом, соответствующим первому аспекту настоящего изобретения и любому его варианту осуществления, и последующее объединение указанных, по меньшей мере, двух композиций, с получением композиции, обогащенной рецепторами, которые связываются с данным агентом, где такой же агент используют на стадиях b и d при получении указанных, по меньшей мере, двух композиций, и где
(i) комбинация дискретных сайтов в агенте, которые используют для иммобилизации в твердой или полутвердой фазе, чтобы получить каждую из указанных, по меньшей мере, двух композиций, различается для указанных, по меньшей мере, двух композиций, и/или
(ii) последовательное расположение, в котором дискретные сайты на агенте используют для иммобилизации в твердой или полутвердой фазе, чтобы получить каждую из указанных, по меньшей мере, двух композиций, различается при получении указанных, по меньшей мере, двух композиций.
Предпочтительные варианты осуществления данного аспекта включают такие, в которых используют такие же дискретные сайты на агенте для иммобилизации, проводимой при получении указанных, по меньшей мере, двух композиций, где число указанных, по меньшей мере, двух композиций равно числу, по меньшей мере, двух дискретных сайтов,и где последовательное расположение, в котором указанные дискретные сайты используют для иммобилизации в твердой или полутвердой фазе, чтобы получить каждую из указанных, по меньшей мере, двух композиций, уникально для каждой из указанных, по меньшей мере, двух композиций. Обычно, число дискретных сайтов равно 2 или 3.
Варианты осуществления третьего аспекта настоящего изобретения
Третий аспект настоящего изобретения относится к способу лечения, ослабления или профилактики заболевания, выбранного из группы, состоящей из фенилкетонурии (PKU, болезнь Фоллинга (Falling's disease)), гиперфенилаланинемии (HPA), алкаптонурии (черная моча), тирозинемии, гипертирозинемии, тяжелой псевдопаралитической миастении, гистидинемии, урокановой ацидурии, болезни мочи с запахом кленового сиропа (MSUD), изовалериановой ацидемии (недостаточность по изовалерил-KoA-дегидрогеназе), гомоцистинурии, пропионовой ацидемии, метилмалоновой ацидемии, глютаровой ацидурии типа 1 (GA-1) и галактоземии, включающему введение в желудочно-кишечный тракт пациента, нуждающегося в этом, эффективного количества композиции молекулярно импринтированных полимеров (MIP), где указанная композиция способна связываться с агентом, вызывающим симптом указанного заболевания.
Известно множество врожденных нарушений обмена веществ, при которых дисфункция в метаболизме природных аминокислот приводит к накоплению патологических концентраций метаболитов или самих аминокислот. Для людей, страдающих такими заболеваниями, необходимо следить за принимаемой ежедневно пищей, с тем чтобы избежать накопления указанных метаболитов.
Конкретным примером является болезнь, известная как фенилкетонурия. Индивидуумы, страдающие этим заболеванием, имеют недостаточность по ферменту фенилаланингидроксилаза (PAH). Этот фермент необходим для метаболизации аминокислоты фенилаланина в аминокислоту тирозин, что означает, что фенилаланин накапливается у пациентов и превращается в свой метаболит фенилпируват. При отсутствии лечения, это состояние может вызвать проблемы в развитии головного мозга, ведущие к прогрессирующей задержке умственного развития и к другим неврологическим проблемам. В настоящее время фенилкетонурию лечат с использованием диеты с низким содержанием фенилаланина, которую часто объединяют с такими режимами лечения, которые направлены на снижение уровня фенилаланина в крови, с тем чтобы достичь безопасного и нетоксичного диапазона концентраций. Снижение содержания фенилаланина до безопасного уровня может быть достигнуто за счет сочетания диеты с низким содержанием фенилаланина и соответствующего медикаментозного лечения.
Настоящее изобретение относится к привлекательной альтернативе существующим в настоящее время режимам лечения. При пероральном введении композиции MIP (обычно, нерастворимых MIP, которые из-за своей нерастворимости определенно не пройдут через слизистую желудочно-кишечного тракта), которые специфически связываются с фенилаланином и короткими пептидами, содержащими фенилаланин, при этом можно избежать или снизить поступление в кровоток токсичных количеств фенилаланина. Также, присутствие в желудочно-кишечном тракте таких MIP будет "тормозить" свободный фенилаланин, не допуская его прохода через желудочно-кишечный тракт (просто за счет лучшей способности связывать фенилаланин в желудочно-кишечном тракте), что снижает его концентрацию в крови.
Этот особый принцип, как правило, применим для множества других заболеваний, при которых происходит накопление свободных аминокислот и/или их метаболитов из-за недостаточности по ферменту метаболизма. В принципе, при таком подходе может использоваться любая композиция нерастворимых MIP, но, как показано в WO 2007/095949, конкретная композиция нерастворимых MIP содержит значительные количества MIP, которые не связываются с желаемой молекулой-мишенью, и, как следствие, такие композиции должны вводиться в очень больших количествах, тогда как композиции, полученные способами, описанными в WO 2007/095949, или полученные способами настоящего изобретения, будут более эффективны, поскольку они по существу не содержат таких MIP, которые не способны связываться. Конкретной привлекательной особенностью композиций MIP, полученных согласно настоящему изобретению (а также таких, которые получены согласно WO 2007/095949), является тот факт, что такие MIP связывают не только свободную аминокислоту, но также короткие пептиды, которые включают релевантную аминокислоту в своей аминокислотной последовательности. Так, один важный вариант осуществления третьего аспекта настоящего изобретения заключается в том, что указанная композиция MIP по существу не содержит таких MIP, которые не связывают вызывающий симптом агент.
Следовательно, лечение указанных ниже врожденных нарушений обмена веществ путем перорального введения MIP, которые связываются с соответствующими мишенями (т.e. с агентом, вызывающим заболевание) предпочтительно осуществляют с использованием композиций нерастворимых MIP, полученных согласно способам, описанным в 2007/095949, и более предпочтительно, нерастворимых MIP, полученных способами 1-го и 2-го аспектов настоящего изобретения, включая все их варианты.
<b>Мишень</b>
<b>Симптом</b>
<b>Ссылка</b>
L-фенилаланин
Фенилкетонурия (PKU)Гиперфенилаланинемия
Chapter 77(1): Hyperphenylalaninemia: Hyperphenylalaninemia (HPA) Phenylalanine Hydroxylase Deficiency
L-фенилаланин
Алкаптонгурия
Chapter 92(2): Alcaptonuria
L-фенилаланин и
Тирозинемия
Chapter 79<sup>(1)</sup>: Hypertyrosinemia
L-тирозин
Гипертирозинемия
L-гистидин
Тяжелая псевдопаралитическая миастения
Chapter 91<sup>(1)</sup>: Disorders of 6- and γ-Amino Acids in Free and Peptide-Linked Forms
L-гистидин
Гистидинемия и урокановая ацидурия
Chapter 80<sup>(1)</sup>: Disorders of Histidine Metabolism
L-лейцин
Болезнь мочи с запахом кленового сиропа (MSUD)
Chapter 87<sup>(1)</sup>: Maple Syrup Urine Disease (Branched-Chain Ketoaciduria)
L-лейцин
Изовалериановая ацидемия(недостаточность по изовалерил-KoA-дегидрогеназе)
Chapter 93<sup>(2)</sup>: Branched Chain Organic Acidurias
L-метионин
Гомоцистинурия
Chapter 88<sup>(1)</sup>: Disorders of Transsulfuration
L-изолейцин,
Пропионовая ацидемия
Chapter 94<sup>(2)</sup>: Disorders of Propionate and Methylmalonate Metabolism
L-валин,
Метилмалоновая ацидемия
L-метионин и L-треонин
L-триптофан иL-лизин
Глютаровая ацидурия типа 1 (GA-1)
Chapter 95<sup>(2)</sup>: Organic Acidemias Due to Defects in Lysine Oxidation: 2-Ketoadipic Acidemia and Glutaric Acidemia
D-галактоза
Галактоземия
Chapter 72<sup>(3)</sup>: Galactosemia
Источник: OMMBID - The Online Metabolic & Molecular Bases of Inherited Disease - (1)Part 8: AMINO ACIDS, (2)Part 9: ORGANIC ACIDS, (3)Part 7: CARBOHYDRATES
Таким образом, в одном варианте осуществления третьего аспекта настоящего изобретения, указанное заболевание представляет собой фенилкетонурию (PKU) и вызывающим симптом агентом является L-фенилаланин.
В другом варианте осуществления третьего аспекта настоящего изобретения, указанное заболевание представляет собой гиперфенилаланинемию (HPA) и вызывающим симптом агентом является L-фенилаланин.
В другом варианте осуществления третьего аспекта настоящего изобретения, указанное заболевание представляет собой алкаптонурию и вызывающим симптом агентом является L-фенилаланин.
В другом варианте осуществления третьего аспекта настоящего изобретения, указанное заболевание представляет собой тирозинемию и вызывающим симптом агентом является L-фенилаланин и/или L-тирозин.
В другом варианте осуществления третьего аспекта настоящего изобретения, указанное заболевание представляет собой гипертирозинемию и вызывающим симптом агентом является L-фенилаланин и/или L-тирозин.
В другом варианте осуществления третьего аспекта настоящего изобретения, указанное заболевание представляет собой тяжелую псевдопаралитическую миастению и вызывающим симптом агентом является L-гистидин.
В другом варианте осуществления третьего аспекта настоящего изобретения, указанное заболевание представляет собой гистидинемию и вызывающим симптом агентом является L-гистидин.
В другом варианте осуществления третьего аспекта настоящего изобретения, указанное заболевание представляет собой урокановую ацидурию и вызывающим симптом агентом является L-гистидин.
В другом варианте осуществления третьего аспекта настоящего изобретения, указанное заболевание представляет собой болезнь мочи с запахом кленового сиропа и вызывающим симптом агентом является L-лейцин.
В другом варианте осуществления третьего аспекта настоящего изобретения, указанное заболевание представляет собой изовалериановую ацидемию (недостаточность по изовалерил-KoA-дегидрогеназе) и вызывающим симптом агентом является L-лейцин.
В другом варианте осуществления третьего аспекта настоящего изобретения, указанное заболевание представляет собой гомоцистинурию и вызывающим симптом агентом является L-метионин.
В другом варианте осуществления третьего аспекта настоящего изобретения, указанное заболевание представляет собой пропионовую ацидемию и вызывающим симптом агентом является L-изолейцин и/или L-валин и/или L-метионин и/или L-треонин.
В другом варианте осуществления третьего аспекта настоящего изобретения, указанное заболевание представляет собой метилмалоновую ацидемию и вызывающим симптом агентом является L-изолейцин и/или L-валин и/или L-метионин и/или L-треонин.
В другом варианте осуществления третьего аспекта настоящего изобретения, указанное заболевание представляет собой глютаровую ацидурию типа 1 (GA-I) и вызывающим симптом агентом является L-триптофан и/или L-лизин.
И, наконец, в одном из вариантов осуществления третьего аспекта настоящего изобретения, указанное заболевание представляет собой галактоземию и вызывающим симптом агентом является D-галактоза и/или лактоза.
Режим дозирования будет зависеть от конкретной композиции MIP и от ее точно определенной способности связывать релевантный агент, вызывающий заболевание, количества такого вызывающего симптом агента, подлежащего удалению средствами лечения, и от состояния и возраста индивидуума, проходящего такое лечение. Средний специалист в данной области сможет определить соответствующие параметры дозирования для любого такого рода случая.
Что касается самой композиции, то MIP частицы, полученные согласно настоящему изобретению, могут быть включены в нее в суспендированной или солюбилизированной форме или в любой другой форме, обычно подходящей для перорального введения. В некоторых вариантах осуществления указанные MIP частицы просто суспендируют в воде, необязательно при внесении современных добавок для улучшения вкуса (для пероральных композиций), цвета, запаха, консистенции/текстуры, высвобождения, распределения и т.п. Возможен также вариант введения MIP в пищевые продукты и напитки, которые получают путем простого смешивания.
Варианты осуществления четвертого аспекта настоящего изобретения
Настоящее изобретение также относится к получению фармацевтической композиции, где указанный способ включает получение композиции согласно способу первого или второго аспектов настоящего изобретения, и затем смешивание данной композиции с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем. Фармацевтическую композицию удобно получают таким образом, чтобы она была приемлема для перорального введения, что будет связано с применением на практике, когда композиция содержит нерастворимые частицы MIP. Однако если композиция содержит поликлональные антитела или растворимые частицы MIP, препарат будет соответствовать стандартам, применяемым при получении фармацевтических средств для парентерального введения.