ПРИМЕНЕНИЕ ФЕРМЕНТА РИБОНУКЛЕАЗЫ Bacillus pumilus В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРА ФИТОПАТОГЕННЫХ ВИРУСОВ
USE OF ENZYME OF RIBONUCLEASE Bacillus pumilus AS INHIBITOR OF PHYTOPATHOGENIC VIRUS

Предлагаемое изобретение относится к области биохимии и микробиологии, может быть использовано в сельском хозяйстве, а именно растениеводстве, для защиты растений от вирусной инфекции.
Известен фермент, панкреатическая рибонуклеаза, обладающий ингибиторной активностью в отношении фитопатогенных вирусов, способностью инактивировать вирусы, замедлять или предотвращать размножение вирусов [1]. Недостатком [1] использования панкреатической рибонуклеазы в качестве противовирусного средства являются ограниченная доступность необходимого для получения панкреатической рибонуклеазы исходного сырья животного происхождения и трудности выделения известного фермента (панкреатической рибонуклеазы) из тканей и органов животного.
Известен фермент бактериальная нуклеаза Serratia marcescens с ингибиторной активностью в отношении фитопатогенных вирусов, рекомендованная к применению для оздоровления картофеля от вирусов [2]. Недостатком [2] является наличие ограничений в производстве и использовании необходимых для получения бактериальной нуклеазы Serratia marcescens трансгенных растений с целью применения (фермента) в растениеводстве и сельскохозяйственном производстве. Ограничения связаны с недостаточной изученностью проблемы безопасности применения трансгенных растений, весьма ограниченным количеством допущенных к производству (использованию как сырья для получения фермента) сортов трансгенных растений и дороговизной осуществления технологии трансгенеза. Другим недостатком является наличие условной патогенности применяемого продуцента фермента [2] - штамма бактерий Serratia marcescens. Недостатки существенно ограничивают область применения аналога [2], например - для защиты растений, используемых для получения продуктов питания.
Наиболее близким по существу заявляемого технического решения, выбранного заявителем в качестве прототипа, является применение продуцируемой бактериями Bacillus amyloliquefaciens гуанилспецифичной РНКазы (структурного гомолога заявляемой РНКазы В. pumilus) в способе защиты растений от патогенов, например - фитопатогенных вирусов [3]. Недостатком прототипа [3] является ограниченность области применения препарата в сельскохозяйственной практике и растениеводстве. Ограниченность применения прототипа, где ген микробного фермента встроен в хромосомную ДНК растений табака и/или картофеля, вызвана наличием ограничений (лимитированием) применения трансгенных растений в сельском хозяйстве.
Целью предлагаемого изобретения является разработка средства защиты растений от вирусных инфекций и профилактики заболеваний, обладающего расширенной областью применения, высокой эффективностью защиты, экологической безопасностью и безвредностью для человека, животных, растений.
Цели достигают тем, что в качестве ингибитора развития вирусов - средства защиты растений от вирусных инфекций и профилактики заболеваний - используют продуцируемый бактериями Bacillus pumilus внеклеточный фермент - бактериальную рибонуклеазу Bacillus pumilus.
- Фермент РНКазу Вр применяют в качестве ингибитора РНК-фитопатогенных вирусов вегетирующих растений.
- Фермент РНКазу Вр применяют в качестве ингибитора РНК-фитопатогенных вирусов семян растений.
- Фермент РНКазу Вр применяют для ингибирования патогенных вирусов табака.
- Фермент РНКазу Вр применяют для ингибирования патогенных вирусов картофеля.
- Фермент РНКазу Вр применяют для ингибирования патогенных вирусов томатов.
- Фермент РНКазы Вр применяют для ингибирования патогенных вирусов клевера.
- Фермент РНКазу Вр применяют для ингибирования патогенных вирусов гороха.
- Фермент РНКазу Вр применяют для ингибирования патогенных вирусов вики.
- Фермент РНКазу Вр применяют для ингибирования патогенных вирусов люцерны.
- Фермент РНКазу Вр применяют для ингибирования патогенных вирусов фасоли.
Рибонуклеазу Bacillus pumilus получают [2], например следующим путем.
2
2
4
2
4
На питательной среде высевают и выращивают (культивируют) бактерии Bacillus pumilus. Бактерии выращивают на питательной среде, например, содержащей (в %): пептон - 2.0, CaCl×2HO - 0.01, MgSO×7HO - 0.03, NaCl - 0.3, MnSO - 0.01, pH 8.5. Культивирование проводят при температуре плюс 30°C. Содержащую бактерии питательную среду (культуральную жидкость) в количестве 5 л подкисляют серной кислотой до pH 2.6 и освобождают от клеток (бактерий), например, центрифугированием при 5000 об/мин, получают свободную от бактерий культуральную жидкость - супернатант.
6
В разведенный в 2 раза супернатант культуральной жидкости добавляют 15 г фосфоцеллюлозы, которая предварительно обработана 0.1 молярным (далее по тексту - М) уксусной кислотой, pH 2.8, для сорбции на фосфоцеллюлозу фермента РНКазы. Для этого раствор перемешивают, например - в течение 0.5 часа на мешалке, смесь отстаивают и декантируют фосфоцеллюлозу с сорбированным белком, затем фосфоцеллюлозу помещают в хроматографическую колонку, промывают 0.01 молярным (далее по тексту - М) Na-ацетатным буфером, pH 5.2 и колонку с фосфоцеллюлозой уравновешивают 0.025 М Na-фосфатом, pH 7.0. Затем РНКазу элюируют с сорбента 0.15 М Na-фосфатным буфером, pH 7.0. Фракции с максимальной рибонуклеазной активностью объединяют, подкисляют уксусной кислотой до pH 5.2, разводят дистиллированной водой в 3 раза и пропускают через колонку с диэтиламиноэтилцеллюлозой (ДЭАЭ-целлюлозой), уравновешенной 0.05 М Na-ацетатным буфером при pH 5.2. На ДЭАЭ-целлюлозе в этих условиях сорбируются примесные белки, а раствор с рибонуклеазой выходит из колонки, не сорбируясь на ионообменнике. Далее раствор с рибонуклеазой помещают на колонку с фосфоцеллюлозой P-II (Watman, Англия), уравновешенной 0.05 М Na-ацетатным буфером, pH 5.2. Колонку после сорбции фермента промывают тем же буфером, уравновешивают 0.05 М Na-фосфатным буфером, pH 7.0 и элюируют с фосфоцеллюлозы 0.2 М Na-фосфатным буфером, pH 7.0. Собранные активные фракции фермента РНКазы пропускают через хроматографическую колонку с фосфоцеллюлозой P-II, уравновешенной 0.05 М Na-ацетатом, и элюируют 0.2 М Na-фосфатом, pH 7.5. Препарат фермента обессоливают, например, на хроматографической колонке (5×10 см) с сорбентом сефадексом G-25 fine фирмы (Pharmacia, Швеция), уравновешенным 0.01 М ацетатом аммония, pH 5.5. После обессоливания получают гомогенный (чистый) фермент, который затем высушивают (лиофилизируют) и высушенный порошок фермента (рибонуклеаза Bacillus pumilus) используют в работе. Рибонуклеаза Bacillus pumilus (далее по тексту - РНКаза Вр), представляет собой термостабильный фермент - эндорибонуклеазу, препарат которой имеет удельную активность - 1,3×10 ед./мг белка. Этот фермент - белок, который быстро разлагается в природе, нетоксичен для человека, животных, растений.
Ингибирующее действие фермента - рибонуклеазы Bacillus pumilus (РНКаза Вр) - подтверждают, например, следующим путем. В нескольких чистых пробирках высушенную РНКазу растворяют в дистиллированной воде, например - до конечных концентраций (фермента) 1, 10 и 100 мкг/мл (см. ниже) и в последующем применяют. Действие фермента проявляется в различных условиях применения. Примеры применения РНКазы Вр приводятся далее.
Пример 1. Действие РНКазы Вр на болезнетворный для растений, например - массово возделываемых сельскохозяйственных культур - картофеля и табака вирус PVX. Испытание выполняют, например, с использованием растений табака.
Выращивают растения табака Nicotiana tabacum L. Выращивают в постоянных условиях, например - в горшочках со стерильной почвой, при температуре плюс 20±2°C, относительной влажности воздуха 60-80%, длительности освещения (фотопериода) 16 час в сутки, при освещенности 9000 люкс (лк).
Для опыта используют взрослые здоровые (незараженные) растения, которые в ходе испытаний инфицируют вирусом PVX. Для инфицирования вирусом PVX растений табака Nicotiana tabacum готовят растительный сок из ранее зараженных (вирусом PVX) растений. Листья размельчают, сок отжимают, разводят дистиллированной водой (1:1) и сразу используют для заражения растений в возрасте 40 суток. Сок с вирусами наносят кистью на листья исследуемых здоровых растений и заражают их. Действие заявляемого фермента (препарата РНКазы Вр) определяют путем обработки зараженных растений этим препаратом, например - следующим образом.
В отдельных горшочках высевают семена и вышеописанным путем выращивают растения табака Nicotiana tabacum, например - по 6 растений в горшочке. Для обработки растений готовят раствор препарата фермента. Берут 100 мл дистиллированной воды, например - с температурой плюс 22°C, в воду добавляют, например, в количестве 10 мг лиофилизированного (высушенного) препарата РНКазы Вр, перемешивают воду чистой стеклянной палочкой до полного растворения препарата и получают раствор.
Раствором РНКазы Вр в концентрации 100 мкг/мл обрабатывают две группы растений табака Nicotiana tabacum - первую группу (3 горшочка, по 10 растений в горшочке) за 48 час (2 суток) и вторую группу (3 горшочка по 10 растений в горшочке) - за 30 мин до их (растений) инфицирования вирусом PVX вышеописанным путем. Через 120 часов (5 суток) после инфицирования растений определяют содержание вируса в растительном соке листьев табака из первой и второй групп растений.
Содержание вируса PVX в растениях определяют известным путем, например - с использованием антител к вирусу PVX. Инфицированное растение срезают, получают его растительный сок, например - с помощью пресса фирмы «VEB Zucht-und Versuchsfeldmechanisieruhg Nordhausen». Растительный сок, содержащий вирусы, инкубируют в течение 10 минут при плюс 42°C и затем его (сок) центрифугируют, например - 20 минут при 5000 об/мин на центрифуге К-23. Надосадочную жидкость разливают по нескольким чистым пробиркам и разводят в 2, 4, 8, 16, … 64 раза. На чистом предметном стекле микроскопа перемешивают по капле вируссодержащей суспензии и раствора антител к вирусу PVX (1 мкг антител в 1 мл 0,025 М фосфатного буферного раствора, pH 8.0). Взаимодействие вирусов PVX с антителами (реакцию агглютинации) наблюдают под микроскопом. Наибольшее разведение (с наименьшей концентрацией фермента), при котором еще наблюдают наличие агглютинации, фиксируют как конечную (последнюю) действенную степень разведения заявляемого фермента. Из 15 повторностей находят среднее значение разведения
ср
(Х.) и определяют эффект ингибирования. Получают данные о содержании вируса в опыте (растения заражают вирусом и обрабатывают ферментом) и контроле (растения заражают вирусом, но не обрабатывают ферментом).
Полученные данные выражают в процентах, при этом за 100% принимают содержание вируса в контрольных растениях, которые заражали, но не обрабатывали ферментом. Содержание вирусов в зараженных вирусом и обработанных ферментом растениях выражают в % от контроля (100%). Разница между ними означает степень ингибирования развития вирусов.
При предварительной обработке растений заявляемой рибонуклеазой (как за 48,0 час так и за 0,5 час) до инфицирования, после инфицирования наблюдают существенное (более 90%) подавление вирусной инфекции в растениях, Таблица 1, Таблица 2, Таблица 3.
Таблица 1
Действие заявляемого фермента - РНКазы Вр на вирус-Х (PVX) табака. 100% - содержание вируса в контрольных растениях, зараженных, но не обработанных ферментом. Среднеквадратичное отклонение σ≤10
Варианты
Ингибирование вируса PVX, %
Обработка растений табака ферментом за 48,0 час (двое суток) до инфицирования
93 (93% растений невосприимчивы к инфекции)
Обработка растений ферментом за 0,5 час до инфицирования
94 (94% растений невосприимчивы к инфекции)
Таблица 2
Действие заявляемого фермента - РНКазы Вр на вирус-Х (PVX) картофеля. 100% - содержание вируса в контрольных растениях, зараженных, но не обработанных ферментом. Среднеквадратичное отклонение σ≤10
Варианты
Ингибирование вируса PVX, %
Обработка растений картофеля ферментом за 48,0 час (двое суток) до инфицирования
91 (91% растений невосприимчивы к инфекции)
Обработка растений ферментом за 0,5 час до инфицирования
93 (93% растений невосприимчивы к инфекции)
Таблица 3
Действие заявляемого фермента - РНКазы Вр на вирус-Х (PVX) томатов. 100% - содержание вируса в контрольных растениях, зараженных, но не обработанных ферментом. Среднеквадратичное отклонение σ≤10
Варианты
Ингибирование вируса PVX, %
Обработка растений томатов ферментом за 48,0 час (двое суток) до инфицирования
90 (90% растений невосприимчивы к инфекции)
Обработка растений ферментом за 0,5 час до инфицирования
91 (91% растений невосприимчивы к инфекции)
Таким образом, заявляемый фермент РНКаза Вр вызывает (Таблица 1) существенное (91-94%) подавление развития вирусной инфекции в растениях. То есть при обработке раствором фермента РНКаза Вр растений табака за 0,5 час до инфицирования вирусом 94% растений невосприимчивы к вирусной инфекции, восприимчивы - 6% растений. Кроме того, заявляемый фермент в течение достаточного для практического применения времени (48 часов) сохраняет способность ингибирования вирусов - 93% растений невосприимчивы к вирусной инфекции, восприимчивы - 7% растений.
Аналогичные результаты получены после воздействия заявляемого фермента - РНКазы Вр на вирус-Х (PVX) картофеля, томата, см. Таблицы 2 и 3.
Это свойство фермента - подавление (ингибирование) развития вирусной инфекции и/или делающее растения невосприимчивыми к вирусной инфекции - характеризует его (фермент) в качестве полезного для сельскохозяйственной деятельности средства защиты сельскохозяйственных культур от вирусной инфекции.
Полученные результаты ингибирования вирусов заявляемым препаратом и прототипом показаны в Примере 2.
Пример 2. Ингибиторное действие заявляемой РНКазы Вр в сравнении с прототипом - РНКазой Bacillus amyloliquefaciens (РНКаза Ва).
Применяют концентрацию каждого из сравниваемых (заявляемого и прототипа) ферментов, которая (концентрация) в конечном разведении обеспечивает одинаковую каталитическую активность растворов для обработки растений (РНКаза Вр 100 мкг/мл, РНКаза Ва 100 мкг/мл), Таблица 4.
Рибонуклеазная активность показана в столбце «ВАРИАНТЫ» Таблицы 4. Для обработки препаратами готовят опытные растения и растворы испытуемых препаратов, например - аналогично Примеру 1. Обработку растений табака Nicotiana tabacum растворами различных нуклеаз проводят за 1 час до инокуляции вирусом-Х картофеля (PVX). Определение вируса PVX в растениях выполняют, например, аналогично Примеру 1.
Таблица 4
Влияние рибонуклеаз на развитие вируса-Х (PVX) при размножении вируса в растениях табака Nicotiana tabacum. Среднеквадратичное отклонение данных σ≤10.
Варианты
Ингибирование вируса PVX, %
РНКаза Bacillus pumilus (заявляемая), 100 мкг/мл (1300 ед./мл)
91 (91% растений невосприимчивы к инфекции)
РНКаза Bacillus amyloliquefaciens (прототип), 100 мкг/мл (1300 ед./мл)
77 (77% растений невосприимчивы к инфекции)
Фермент РНКаза Вр вызывает (Таблица 4) существенное подавление развития вирусной инфекции. То есть при обработке раствором фермента РНКазы Вр растений табака в 91% растений вирусная активность оказалась подавленной. И только в 9% растений вирусная активность сохранилась.
В то же время, при обработке инфицированных растений прототипом, количество растений с подавленной вирусной активностью существенно меньше (77%), а вирусная активность сохранилась у 23% растений.
Таким образом, заявляемый фермент, по сравнению с прототипом, существенно лучше ингибирует вирусную активность, то есть проявляет лечебное действие против вируса PVX, вызывающего снижающее урожайность картофеля и табака заболевание.
Оба фермента, заявляемый и прототип, обладающие рибонуклеазной активностью, проявляют ингибирующее действие по отношению к вирусу-Х табака и картофеля при системном размножении их (вирусов) в организме растения-хозяина - табака. Эффект ингибирования у заявляемого фермента выше (в среднем на 15%), чем у прототипа, что обуславливает экономический эффект при масштабировании процесса.
Пример 3. Действие РНКазы Вр на вирус RCMV крапчатости красного клевера, особо опасного для сельскохозяйственной культуры - гороха Pisum sativum. Поэтому горох используют в качестве модельного растения. Горох выращивают в условиях, описанных в Примере 1 для растений табака.
ср
Инфицирование растения вирусом крапчатости красного клевера (RCMV) проводят (аналогично Примеру 1) через 240 час (10 суток) после посева гороха Pisum sativum, когда полностью развился первый лист (гороха). Растения гороха обрабатывают водным раствором РНКазы Вр в концентрациях 50 мкг/мл и 100 мкг/мл за 96 час (4 суток) до заражения вирусом, с интервалом в 24 часа, одновременно с заражением и через 24 ч после заражения. Через 10 дней после инфицирования растительный сок анализируют на содержание вирусов. Для определения вируса используют серологический тест, который выполняют, например, следующим путем. После 10-дневного системного размножения вируса растения срезают. Из срезанных растений получают сок, как это описано в Примере 1. Сок фильтруют, к 500 мкл фильтрата добавляют 500 мкл хлороформа и смесь интенсивно перемешивают в течение 3 мин на шейкере. Затем смесь центрифугируют на центрифуге К-23 в течение 15 мин при 3000 об/мин. С использованием разлитой в чистые пробирки водной фазы смеси выполняют разведения, которые проводят с использованием 0,85% NaCl. Антигенсодержащие пробы (разведения) в объеме 200 мкл осторожно наслаивают на раствор, содержащий антитела к данному вирусу (1 мкг антител в 1 мл 0,025 М фосфатного буферного раствора, pH 8.0, содержащего 10% глицерин). В результате, после взаимодействия антител с антигенами, на границе раздела двух фаз образуется кольцо преципитата. Определяют последнюю действенную степень разведения (как в Примере 1) антигенсодержащего раствора, при которой образуется кольцо преципитации. Опыты проводят многократно, например - в 10 повторностях (горшках), в каждом горшке - по 10 растений гороха (Таблица 5). Для каждой повторности (1 горшок с 10 растениями) определяют последнюю степень разведения, находят среднее значение для 10 горшков (Х.). Эффект ингибирования определяют, как это описано для вируса PVX в Примере 1.
Таблица 5
Влияние РНКазы Вр на системное развитие вируса крапчатости красного клевера (RCMV) в растениях гороха Pisum sativum. Среднеквадратичное отклонение σ≤10
Варианты
Ингибирование вируса (в %)* в результате обработки растений РНКазой Вр в зависимости от времени нанесения фермента на растения (в сутках)
Время обработки растения ферментом до инфицирования вирусом (для профилактики)
В момент инфицирования
После инфицирования
За 4 сутки
3 сутки
2 сутки
1 сутки
0 (момент инфицирования)
Через 1 сутки
Обработка РНКазой Вр 50 мкг/мл
58*
65*
71*
82*
50*
0
Обработка РНКазой Вр, 100 мкг/мл
50*
75*
83*
91*
79*
29*
* (% растений невосприимчивы к инфекции)
Таблица 6
Влияние РНКазы Вр на системное развитие вируса крапчатости красного клевера (RCMV) в растениях вика (Vicia sativa). Среднеквадратичное отклонение σ≤10
Варианты
Ингибирование вируса (в %)* в результате обработки растений РНКазой Вр, в зависимости от времени нанесения фермента на растения (в сутках)
Время обработки растения ферментом до инфицирования вирусом (для профилактики)
В момент инфицирования
После инфицирования
За 4 сутки
3-сутки
2 сутки
1-сутки
0 (момент инфицирования)
Через 1 сутки
Обработка РНКазой Вр 50 мкг/мл
45*
59*
68*
79*
55*
15*
Обработка РНКазой Вр, 100 мкг/мл
57*
70*
79*
93*
70*
31*
* (% растений невосприимчивы к инфекции)
Таким образом, максимальное ингибирование вируса заявляемой РНКазой Вр наблюдают (Таблицы 5 и 6), когда раствором фермента в концентрации 100 мкг/мл предварительно обрабатывают растения в период от одного до двух суток (от 24 до 48 час) до инфицирования вирусом. То есть раствор фермента является средством профилактики вирусного заболевания вегетирующих растений.
Пример 4. Раствором РНКазы Вр обрабатывают семена гороха. Для этого готовят (как в Примере 1) растворы с различными концентрациями РНКазы Вр в диапазоне изменения концентраций: 10, 50, 100, 1000 мкг/мл. До посева в почву семена (по 100 шт для каждой концентрации) гороха замачивают, например - в течение 8 час, в 120 мл раствора РНКазы Вр каждой концентрации. Производят посев обработанных заявляемым ферментом РНКазы Вр семян гороха, например - в стерильный влажный слой грунта. Дожидаются всхода растений гороха. Растения используют, как в Примере 1, с заражением растений вирусом крапчатости красного клевера (RCMV) и выявляют результативность действия заявляемого фермента на вирусы. Результативность действия определяют как в Примере 1. Наблюдают подавление инфицирования вирусами RCMV у растений, выросших из обработанных ферментом РНКазы Вр семян (гороха) на 24-62%, в зависимости от концентрации фермента. В условиях примера максимальное ингибирование наблюдают при концентрации фермента 100 мкг/мл.
Пример 5. Влияние РНКазы Вр на развитие вируса люцерны (AMV), вызывающего опасное заболевание сельскохозяйственной культуры - табака Nicotiana tabacum L.
В опытах вместо люцерны используют моделирующее растение - табак Nicotiana tabacum L. Растения табака выращивают в условиях, как в Примере 1. Растения табака Nicotiana tabacum обрабатывают РНКазой Вр (100 мкг/мл) за 48 час (2 суток) до инфицирования вирусом люцерны (AMV), фермент готовят и наносят на растения способом, например, аналогичным в Примере 1. Инфицирование растений табака вирусом AMV проводят так же, как заражение растений табака вирусом PVX в Примере 1. Содержание вируса AMV определяют путем использования серологического теста, например, аналогично Примеру 3, в растениях табака через 144 час (6 суток) после заражения в первично инфицированных листьях и через 288 час (12 суток) после заражения во вторично инфицированных листьях (системное размножение вируса в этих растениях) (Табл.7).
Таблица 7
Действие РНКазы Вр на развитие вируса люцерны (AMV) при системном размножении вируса в растении-хозяине Nicotiana tabacum L. Среднеквадратичное отклонение σ≤5.
Вариант
Ингибирование вирусов в инфицированныхлистьях
Заявляемая РНКаза Вр, концентрация 100 мкг/мл
60%
Известно, что торможение развития вируса люцерны при инокуляции других растений-хозяев системного размножения, например - табака, крайне затруднительно и неэффективно. То есть, если произошло заражение одного растения табака, то предотвратить заражение других растений, распространение болезни и иные негативные последствия практически невозможно. Результаты ингибирования репродукции вируса AMV в растениях табака РНКазой Вр на 60% (Таблица 7) представляются весьма успешными по сравнению с другими противовирусными препаратами.
Пример 6. Действие РНКазы Вр на вирус RCMV крапчатости красного клевера Раствор РНКазы Вр (1 мкг/мл и 10 мкг/мл) готовят и наносят, например, аналогично Примеру 1, на правую сторону листьев фасоли Phaseolus vulgaris за 96 часов (4 суток), 1 час до или одновременно с инокуляцией всего растения вирусом крапчатости красного клевера (RCMV). Инфицирование вирусом RCMV правой стороны листьев фасоли проводят, например, аналогично Примеру 1 для вируса PVX картофеля. Левые стороны листьев растения обрабатывают дистиллированной водой. Контроль представляют собой растения, которые инфицируют, но не обрабатывают ферментом (100%). Через 6 дней после заражения вирус RCMV образует на растениях фасоли очаги инфекции в форме локальных некротических пятен. Их число выражает степень заражения или участки локальной репликации вируса. Каждый вариант ставят в 10-ти повторностях (Табл. 8).
Таблица 8
Действие РНКазы Вр на образование локальных некрозов вируса крапчатости красного клевера (RCMV) на листьях фасоли Phaseolus vulgaris.
Варианты
Ингибирование локальных некрозов после обработки левой (Л) половины листьев растений дистиллированной водой и правой (П) половины листьев растений растворами РНКазы Вр в %*
за 96 часов до инокуляции вирусом
за 1 час до инокуляции вирусом
одновременно с инокуляцией вирусом
Л (без РНКазы)
П (с РНКазой)
Л (без РНКазы)
П (с РНКазой)
Л (без РНКазы)
П (с РНКазой)
РНКаза 1 мкг/мл
51*
95*
100*
100*
52*
100*
РНКаза 10 мкг/мл
94*
100*
100*
100*
70*
100*
(% растений невосприимчивы к инфекции). 100% - количество некрозов зараженного растения без обработки РНКазой.
Таким образом, обработка раствором РНКазы Вр одной из сторон листовой пластины фасоли с высокой достоверностью существенно уменьшает число очагов инфекции как на обработанных, так и на необработанных ферментом сторонах листа при низких концентрациях фермента (1-10 мкг/мл). Предлагаемый ингибитор фитовирусов наиболее эффективен при локальном развитии вируса на хозяине, чем при его системном размножении в организме растения. Ингибирующие дозы фермента РНКазы при локальных некрозах десятикратно ниже (10 мкг/мл), чем ингибирующие дозы при системном размножении - 100 мкг/мл.
Примеры 1, 2, 3, 4, 5, 6 показывают и доказывают, что РНКаза Вр обладает ярко выраженным ингибирующим действием по отношению к РНК-геномным болезнетворным фитовирусам.
Заявляемый фермент РНКаза Вр наиболее полезен при защите от локальной инфекции, менее - при системном размножении вирусов в растениях. Действующие концентрации при защите от системной инфекции составляют 100 мкг/мл, т.е. 1300 ед. активности/мл, а при острой (локальной) инфекции - 1 мкг/мл, т.е. 10 ед. активности/мл. Максимальный эффект применения РНКазы Вр проявляется при предварительной обработке растений раствором фермента до инфицирования вирусом. Фермент диффундирует в соседние необработанные ткани растения. Обработка семян, просто и доступно осуществимая в условиях сельскохозяйственной практики, также способствует развитию устойчивости растений к вирусной инфекции. Фермент нетоксичен для человека, животных и растений. Кроме того, фермент РНКаза Вр обладает высокой стабильностью свойств при воздействии внешних факторов - нагрева, изменения pH среды действия, способностью к длительному хранению, например - в лиофилизированном состоянии. Высокая стабильность свойств фермента при хранении обеспечивает возможность его транспортировки в различные регионы и стабильность результатов его применения в различных условиях и целях. Например - для профилактики вирусной инфекции в условиях практики сельского хозяйства, когда растущие растения обрабатывают раствором ингибитора за несколько дней до возможного заражения вирусом (Примеры 1, 2, 3, 4, 5, 6). Или для лечения вирусных заболеваний растений, когда листья уже зараженных растений обрабатывают раствором ингибитора (Пример 3) или ингибитор вносят одновременно в сроки возможного заражения фитопатогенным вирусом (Пример 3). Кроме того, показано, что ингибитор хорошо диффундирует в соседние необработанные ткани растения (Пример 6). Это свойство заявляемого фермента существенно упрощает процесс обработки растений на больших площадях с целью профилактики вирусных заболеваний. То есть под защитой от заболевания оказываются части растения, которые по каким-либо причинам, например - из-за крупного размера капель раствора фермента из опрыскивателя, оказались лишенными прямого контакта с защитным препаратом. Действие ингибитора проявляется как в случае острой инфекции (локальные некрозы (Пример 6), так и в случае системного размножения (Примеры 1, 2, 3, 4, 5). При этом ингибирующие дозы фермента в первом случае (острой инфекции) примерно 100-кратно ниже (10-15 ед./мл), чем во втором (системное размножение) - 1000-1500 ед./мл.
Ингибирующее действие заявляемого фермента в отношении фитопатогенных вирусов не ограничивается растениями, использованными в Примерах 1-6, и распространяется на другие растения тех же (использованных в примерах) семейств. Например, аналогичный Примеру 1 результат проявляется в отношении растений семейства пасленовых (лат. Solanaceae) - двудольных спайнолепестных растений, содержащего много съедобных и культивируемых видов, таких как картофель, баклажан, табак и томат. Аналогичный Примеру 3 результат проявляется в отношении растений семейства бобовых.
Достоинством предполагаемого изобретения является и то, что заявляемый фермент рибонуклеаза Bacillus pumilus (РНКаза Вр) - продукт жизнедеятельности природных почвенных сапрофитных бактерий, быстро разлагается в природной среде и поэтому экологически безопасен.
Приведенные примеры применения предлагаемого изобретения показывают его полезность для профилактики инфекционных вирусных заболеваний и борьбы с уже случившимися заболеваниями вирусного происхождения, например - распространенными в сельскохозяйственном и декоративном растениеводстве.
Применение предлагаемого фермента рибонуклеаза Bacillus pumilus - ингибитора фитопатогенных вирусов способствует предупреждению заболеваний, а при их появлении - устранению заболеваний на ранних стадиях, когда лечение наиболее эффективно, производится с меньшей затратой лечебных препаратов, труда и времени работников, с наименьшим ущербом для здоровья растений - по сравнению с лечением болезней в поздней, запущенной стадии.
Предлагаемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как при определении уровня техники не обнаружено средство, которому присущи признаки, идентичные всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.
Способ диагностики имеет изобретательский уровень, поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками данного изобретения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат.
Заявленное техническое решение можно реализовать в промышленных масштабах при культивировании растений, необходимых в производстве продуктов питания для людей и для животноводства, посредством использования известных стандартных технических устройств и оборудования. Это соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям.
ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ИСТОЧНИКИ
1. Мартынова Р.В. Ингибирующее действие панкреатической рибонуклеазы на фитопатогенные вирусы // Биологические исследования на Дальнем Востоке. Владивосток: ДВНЦ АН СССР, 1975. - С.149-152.
2. Леонова Н.С., Салганик Р.И. Применение бактериальной эндонуклеазы для оздоровления картофеля от вирусов / Сибирский вестник сельскохозяйственной науки, 1991, №5, С.25-28.
3. Pakniat-Jahromy A, Behjatnia SA, Dry IB, Izadpanah K, Rezaian MA. / A new strategy for generating geminivirus resistant plants using a DNA betasatellite/split barnase construct. // J Virol Methods. 2010; 170(1-2): 57-66.
4. Lännenpää M, Hassinen M, Ranki A, Hölttä-Vuori M, Lemmetyinen J, Keinonen K, Sopanen T. I Prevention of flower development in birch and other plants using a BpFULL1::BARNASE construct // Plant Cell Rep. 2005 May; 24(2): 69-78.
5. Лещинская И.Б., Балабан Н.П., Шарипова Ф.Р., Знаменская Л.В. Способ получения внеклеточной щелочной рибонуклеазы. Патент 1314670 RU от 19 января 1993 г.