СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПОЛИМЕРОВ ИЗ ГИДРОЛИЗАТОВ КЕРАТИНСОДЕРЖАЩЕГО СЫРЬЯ И БИОПОЛИМЕРЫ, ПОЛУЧЕННЫЕ ЭТИМ СПОСОБОМ
METHOD OF PRODUCING BIOPOLYMERS FROM HYDROLYSATES OF KERATIN-CONTAINING MATERIAL AND BIOPOLYMERS OBTAINED USING SAID METHOD

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для получения биополимеров из кератинсодержащего сырья.
На современном этапе развития промышленности биоконверсия возобновляемого сырья становится все более актуальной задачей. При эффективном использовании методов биоконверсии становится возможным производство новых продуктов с добавленной стоимостью из малоценных сырьевых ресурсов. Анализ мирового рынка биотехнологий показывает низкий уровень развития высокоэффективных технологий переработки отходов различного происхождения. В первую очередь это касается отходов животноводческой отрасли агропромышленного комплекса, основная масса которых подвергается захоронению на свалках. Например, существующие технологии переработки кератинсодержащих отходов (шерсть, перо, рога, копыта и т.д.) являются ресурсо- и энергозатратными, а получаемые кормовые добавки - продуктами с очень низкой добавочной стоимостью.
Все больший интерес во всем мире вызывает создание и исследование биополимеров, что связано с ухудшением экологической обстановки. Одним из основных достоинств данных материалов является возможность биодеградации. Биополимеры могут быть использованы при создании различных упаковок, для нужд агропромышленного комплекса и т.д. Однако наиболее перспективным направлением их использования являются различные области медицины, в том числе создание систем доставки лекарств.
Задачей изобретения является разработка нового способа биосинтетической и биокаталитической конверсии возобновляемого сырья в полезные продукты с высокой добавленной стоимостью, а именно биополимеры, которые могут быть внедрены в различных отраслях медицины: стоматологии, пластической хирургии и т.д.
В качестве исходного материала для получения биополимеров используют белковые гидролизаты кератинсодержащего сырья.
Белковые гидролизаты кератинсодержащего сырья, например пера, получают путем гидротермической обработки в соответствии со следующими технологическими параметрами гидротермического гидролиза:
- исходная влажность пера - 55%;
- температура нагрева - 190-200°С;
- продолжительность нагрева - 90 сек.
Далее проводится ферментативный гидролиз при температуре 55°С и начальном значении рН реакционной среды 7,2, что соответствует рН- и термооптимумам ферментного препарата Novo-Pro D. Реакционная среда содержала 0,5% сульфита натрия в качестве компонента для расщепления дисульфидных связей в молекуле кератина. Полученный гидролизат представляет собой белково-пептидную смесь.
Для получения биополимеров могут быть использованы коммерчески доступные белковые гидролизаты, такие как Nutrilan keratin W (Cognis), Keratek Pep (Croda) и др.
Одним из основных критериев для выбора белковых гидролизатов кератинсодержащего сырья для получения биополимеров является молекулярно-массовое распределение белково-пептидной фракции, представленное в таблице 1.
Таблица 1
Молекулярно-массовое распределение белково-пептидной фракции белковых гидролизатов кератинсодержащего сырья
Относительное содержание фракций с
соответствующими диапазонами молекулярных масс, %
>10кДа
3-10 кДа
<3 кДа
6 - 7
57 - 59
34 - 36
Преобладающими в составе ферментативных гидролизатов кератинсодержащего сырья являются компоненты с молекулярной массой 3-10 кДа. Их относительная доля составляет 57,6-58,5%. Содержание низкомолекулярных компонентов (М.в. <3 кДа) варьирует в пределах 34,3-36,3%, высокомолекулярных белковых компонентов (М.в. >10 кДа) - 6,1-7,3%. Следует отметить высокую воспроизводимость молекулярно-массового распределения ферментативных гидролизатов кератинсодержащего сырья.
Помимо биодоступности степень гидролиза кератинового сырья определяет растворимость получаемых гидролизатов и их совместимость с различными матрицами. Гидролизаты кератина со средневесовой молекулярной массой менее 4 кДа, как правило, хорошо растворимы в воде в широком диапазоне рН, водно-спиртовых смесях, глицерине и совместимы с различными ПАВ. Гидролизаты кератина с более высокой средневесовой молекулярной массой характеризуются меньшей растворимостью, особенно в присутствии в среде органических растворителей.
Еще одним критерием выбора белковых гидролизатов кератинсодержащего сырья для получения биополимеров является характеристика их аминокислотного состава.
При характеристике аминокислотного состава гидролизатов кератинсодержащего сырья определяют содержание свободных и общих аминокислот. Общее содержание аминокислот (за исключением триптофана, цистина и метионина) определяют с использованием аминокислотного анализатора после предварительного кислотного гидролиза в стандартных условиях. Метионин и цистин определяют в форме метионин-сульфона и цистеиновой кислоты с использованием предварительной окислительной обработки реакционной смеси надмуравьиной кислотой и последующего кислотного гидролиза. Содержание триптофана определяют спектрофотометрическим методом (см. Fletouris, D.J., Botsoglou, N.A., Papageorgiou, G.E., Mantis, A.J. Rapid-Determination of Tryptophan in Intact Proteins by Derivative Spectrophotometry // Journal of Aoac International - 1993.- V. 76.- N. 6.- P.1168-1173). Результаты анализа содержания свободных аминокислот в гидролизатах кератинсодержащего сырья представлены в таблице 2.
Следует отметить, что содержание свободных аминокислот в гидролизатах кератинсодержащего сырья довольно невелико - 3,0-3,1 г/100 г белка (2,8-2,9%). Таким образом, основными компонентами низкомолекулярной фракции (М.в. <3 кДа) гидролизатов являются не свободные аминокислоты, а различные пептиды. Среди свободных аминокислот максимальным содержанием в гидролизатах характеризуются серин и лизин. На их долю суммарно приходится 2/3 от общего содержания свободных аминокислот в исследуемых гидролизатах кератинсодержащего сырья.
Таблица 2
Содержание свободных аминокислот (г/100 г белка) в белковых гидролизатах кератинсодержащего сырья
Аминокислота
г/100 г белка
Глицин
0,08 - 0,10
Алании
0,13 - 0,16
Серин
0,68 - 0,75
Треонин
0,07 - 0,08
Цистин
0,00
Метионин
0,01
Аспарагин
0,11 - 0,12
Аспарагиновая кислота
0,13 - 0,15
Глутамин
0,08 - 0,09
Глутаминовая кислота
0,11 - 0,12
Пролин
0,02
Лизин
1,26 - 1,36
Аргинин
0,03 - 0,04
Гистидин
0,01
Валин
0,02 - 0,03
Изолейцин
0,01 - 0,02
Лейцин
0,08 - 0,09
Тирозин
0,02 - 0,03
Фенилаланин
0,02 - 0,03
Триптофан
0,01
Данные по общему содержанию аминокислот в белковых гидролизатах кератинсодержащего сырья приведены в таблице 3. Среди аминокислот наиболее высоким содержанием в исследуемых гидролизатах характеризуются глутаминовая кислота (15,1 - 15,3 г/100г белка), серин (14,3 - 14,4 г/100 г белка), аспарагиновая кислота (9,3-9,5 г/100 г белка), лейцин (8,5-8,6 г/100 г белка), пролин (7,4-7,7 г/100 г белка). Высокое содержание данных аминокислот, особенно серина, является характерной особенностью кератиновых белков.
Таблица 3
Содержание общих аминокислот (г/100 г белка) вбелковых гидролизатах кератинсодержащего сырья
Аминокислота
г/100 г белка
Глицин
5,62 - 5,81
Алании
6,93 - 7,05
Серин
14,28 - 14,41
Треонин
5,21 - 5,31
Цистин
2,14 - 2,36
Метионин
0,32 - 0,39
Аспарагиновая кислота
9,34 - 9,48
Глутаминовая кислота
15,08 - 15,27
Пролин
7,39 - 7,72
Лизин
2,24 - 2,31
Аргинин
5,53 - 5,79
Гистидин
0,74 - 0,83
Валин
6,49 - 6,66
Изолейцин
5,98 - 6,00
Лейцин
8,48 - 8,59
Тирозин
2,20 - 2,37
Фенилаланин
5,12 - 5,37
Триптофан
0,63 - 0,71
Установлено, что преобладающими в составе белковых гидролизатов кератинсодержащего сырья являются компоненты с молекулярной массой 3 - 10 кДа, средняя молекулярная масса составляет 4,70-4,79 кДа. В составе белкового гидролизата кератинсодержащего сырья идентифицировано 119 различных пептидов, размером от 5 до 20 а.о. Предшественниками для 45% пептидов, идентифицированных в составе белкового гидролизата кератинсодержащего сырья, являются различные виды кератина, являющиеся ключевым белком пера птицы. Для остальных пептидов предшественниками являются белки, связанные с β-кератином, гистоновые белки, белки теплового шока, коллаген α-2(I), β-субъединица гемоглобина и ряд других.
Основные характеристики гидролизата кератинсодержащего сырья приведены выше. В гидролизате содержатся свободные аминокислоты и полипептиды. В том числе, аминокислоты, которые могут участвовать в реакции, катализируемой лакказой.
Лакказа (n-дифенол: кислородоксидоредуктаза, КФ 1.10.3.2) - фермент, катализирующий реакцию восстановления молекулярного кислорода до воды, минуя стадию образования перекиси водорода с сопутствующим окислением субстрата донора электронов. Лакказы относятся к классу медьсодержащих оксидаз наряду с такими ферментами, как аскорбатоксидаза, церулоплазмин, билирубин оксидаза и феноксазимсинтаза. Лакказа является ферментом, представляющим интерес не только с фундаментальной точки зрения, но и с практической.
Лакказы широко распространены в природе, что может объясняться разнообразием выполняемых ими физиологических функций. Наиболее изученной растительной лакказой является фермент, выделенный из лакового дерева Rhus vernicifera. Кроме него частично охарактеризованы лакказы из других растений: Rhus succedanea, Acer pseudoplatanus, Pinus taeda, Populus euramericana, Liriodendron tulipifera, Nicotiana tobacco и др.
В животном царстве лакказы обнаружены в насекомых, таких как Bombyx, Calliphora, Diploptera, Drosophila, Lucilia, Manduca, Musca, Orycetes, Papilio, Phormia, Rhodnius, Sarcophaga, Schistocerca и Tenebrio.
Большинство описанных в литературе лакказ выделены из высших грибов. Лакказы обнаружены в базидиомицетах, аскомицетах и дейтеромицетах, однако наиболее эффективными продуцентами лакказы являются представители базидиомицетов, относящихся к грибам возбудителям белой гнили древесины.
В ходе реакции, катализируемой лакказой, происходит окисление донора электронов (в данном случае тирозина) и восстановление молекулярного кислорода до воды. Для восстановления одной молекулы кислорода требуется 4 электрона. Раствор гидролизата представляет собой смесь различных полипептидов и аминокислот, потенциально являющихся субстратами для лакказы, при этом детекция реакции оптическими методами (по изменению спектра) невозможна, поэтому реакцию детектировали амперометрически с использованием платинового электрода Кларка по потреблению растворенного молекулярного кислорода. Одним из важных преимуществ данной методики является возможность наблюдения за реакцией в режиме реального времени.
Получение биополимеров
Предварительно был определен диапазон концентраций гидролизата для проведения реакции. Считается, что субстратом для лакказы является аминокислотный остаток тирозина. Общее содержание тирозина в гидролизате 2,2 г на 100 г гидролизата, т.е. для получения раствора гидролизата с концентрацией тирозина 1 мМ нужно растворить 8,33 г сухого гидролизата в объеме 1 литр. Для окисления 1 мМ тирозина необходимо 0,25 мМ молекулярного кислорода, что практически совпадает с концентрацией кислорода в дистиллированной воде при температуре 25°С и нормальном атмосферном давлении.
Для работы использовали гидролизат из пера птицы, который был получен в виде сухого порошка. Технологический процесс получения гидролизата и его характеристика в целом описаны выше. Растворы гидролизата готовили по навеске. Концентрация гидролизата указывается в виде концентраций аминокислотных остатков тирозина, так как именно они участвуют в реакции радикальной полимеризации. Эта концентрация практически совпадает с концентрацией пептидов в растворе, что следует из среднего содержания остатков тирозина на пептид. 5 г гидролизата на 100 мл раствора соответствует концентрации аминокислотных остатков тирозина [tyr] = 6 мМ.
Для активации радикальных процессов полимеризации использовали высокоредокспотенциальную лакказу из Т. hirsuta. Данный ферментный препарат представляет собой раствор фермента в 50 мМ калий-фосфатном буферном растворе рН 6,0-7,0. Концентрация препарата фермента составляла 1,8-2,2 мг/мл. Концентрация фермента лакказы в реакционной среде во всех экспериментах составляла 1,5-3 мкг на 1 мл. Активность используемого препарата лакказы должна составлять не менее 1,2 - 1,5 мккат/мг белка (Катал (кат) - единица измерения активности катализатора в системе СИ. Если присутствие катализатора увеличивает скорость химической реакции на один моль в секунду, то активность данного количества данного катализатора равна одному каталу).
2
Измерение активности лакказы проводили амперометрически по убыли кислорода при следующих условиях: 0,1 М Na-ацетатный буфер (рН=4,5), 25°С, [ABTS] = 500 мкМ, [O] = 270 мкМ.
Степень гомогенности ферментного препарата должна составлять не менее 95% (или 90%) электрофоретической чистоты.
Для проведения полимеризации лакказу добавляют в количестве 5-10 мкг на 50 мл раствора белкового гидролизата (20-60%-ной концентрации по массе).
Для получения биополимеров из белковых гидролизатов кератинсодержащего сырья используют лакказу и сшивающий агент - водный раствор глутарового альдегида. Глутаровый альдегид представляет собой жидкость желтоватого цвета с характерным запахом и содержанием действующего вещества 25%. Глутаровый альдегид вносится в реакционную смесь в количестве 1,5, 10 или 20 масс.%.
Получение растворов белкового гидролизата и обработка лакказой
Белковый гидролизат растворяют в дистилированной водой в концентрациях 20 - 60 масс.%. После полного растворения белкового гидролизата в раствор вносят лакказу в дозировке 1,5-3 мкг/мл. Для проведения ферментативной реакции растворы, обработанные лакказой, перемешивают при температуре 25-50°С в течение 0,5-1 часа. Для увеличения эффективности работы фермента лакказы перемешивание проводится в открытой посуде со свободным доступом атмосферного кислорода.
Добавление сшивающего агента
К предварительно обработанным лакказой растворам белкового гидролизата добавляют необходимое количество 25% водного раствора глутарового альдегида. Итоговая концентрация глутарового альдегида в растворе белкового гидролизата должна составлять 20 - 1 масс.%. Полученную смесь растворов белкового гидролизата и глутарового альдегида ставят на перемешивание при температуре 25-50°С в течение 1 часа.
Высушивание
Смесь, полученную в ходе предыдущего этапа методики, переливают на твердую подложку и оставляют сушиться при комнатной температуре в течение 200 часов (при толщине раствора не более 2 см)
Высушенные образцы полимеров можно хранить при комнатной температуре.
Примеры
Пример 1.
Получение биополимера из 40 масс% раствора белкового гидролизата с добавлением 5 масс% глутарового альдегида.
Белковый гидролизат в виде сухого порошка хранят с минимальным доступом влаги в герметичных пакетах при температуре не выше+5°С.
К 3 г белкового гидролизата добавляют 3 мл дистилированной воды. Перемешивают на магнитной мешалке при температуре 50°С 60 мин до получения вязкого раствора насыщенного коричневого цвета.
В полученный раствор вносят 4 мкл раствора лакказы с концентрацией 2 мг/мл в 50 мМ калий-фосфатном буферном растворе, рН 6,5.
Для проведения ферментативной реакции растворы, обработанные лакказой, перемешивают при температуре 50°С в течение 60 мин. Для увеличения эффективности работы фермента лакказы перемешивание проводят в открытой посуде со свободным доступом атмосферного кислорода.
К предварительно обработанным лакказой растворам белкового гидролизата добавляют 1,6 мл 25% раствора глутарового альдегида. Полученную смесь ставят на перемешивание при температуре 50°С в течение 1 часа, после чего полученные в итоге растворы переливают на твердую подложку и оставляют сушиться при комнатной температуре в течение 200 часов (при толщине раствора не более 2 см). Высушенные образцы полимеров можно хранить при комнатной температуре.
Пример 2.
Получение биополимера из 20 масс.% раствора белкового гидролизата с добавлением 10 масс.% глутарового альдегида.
Белковый гидролизат в виде сухого порошка хранят с минимальным доступом влаги в герметичных пакетах при температуре не выше +5°С.
К 3 г белкового гидролизата добавляют 11,4 мл дистилированной воды. Перемешивают на магнитной мешалке при температуре 25°С в течение 30 мин.
В полученный раствор вносят 11 мкл раствора лакказы с концентрацией 2 мг/мл в 50 мМ калий-фосфатном буферном растворе, рН 6,5.
Для проведения ферментативной реакции растворы, обработанные лакказой, перемешивают при температуре 25°С в течение 1 часа. Для увеличения эффективности работы фермента лакказы перемешивание проводится в открытой посуде со свободным доступом атмосферного кислорода.
К предварительно обработанным лакказой растворам белкового гидролизата добавляют 6,4 мл 25% раствора глутарового альдегида. Полученную смесь ставят на перемешивание при температуре 25°С в течение 1 часа. Полученные в итоге растворы переливают на твердую подложку и оставляют сушиться при комнатной температуре в течение 200 часов (при толщине раствора не более 2 см). Высушенные образцы полимеров можно хранить при комнатной температуре.
Пример 3.
Получение биополимера из 40 масс.% раствора белкового гидролизата с добавлением 1 масс.% глутарового альдегида.
Белковый гидролизат в виде сухого порошка хранят с минимальным доступом влаги в герметичных пакетах при температуре не выше +5°С.
К 3 г белкового гидролизата добавляют 4,2 мл дистилированной воды. Перемешивают на магнитной мешалке при температуре 25°С в течение 30 мин.
В полученный раствор вносят 5 мкл раствора лакказы с концентрацией 2 мг/мл в 50 мМ калий-фосфатном буферном растворе, рН 6,5.
Для проведения ферментативной реакции растворы, обработанные лакказой, перемешивают при температуре 25°С в течение 1 часа. Для увеличения эффективности работы фермента лакказы перемешивание проводится в открытой посуде со свободным доступом атмосферного кислорода.
К предварительно обработанным лакказой растворам белкового гидролизата добавляют 0,32 мл 25% раствора глутарового альдегида. Полученную смесь ставят на перемешивание при температуре 25°С в течение 1 часа. Полученные в итоге растворы переливают на твердую подложку и оставляют сушиться при комнатной температуре в течение 200 часов (при толщине раствора не более 2 см). Высушенные образцы полимеров можно хранить при комнатной температуре.
Пример 4.
Получение биополимера из 60 масс.% раствора белкового гидролизата с добавлением 1 масс.% глутарового альдегида.
Белковый гидролизат в виде сухого порошка хранят с минимальным доступом влаги в герметичных пакетах при температуре не выше +5°С.
К 3 г белкового гидролизата добавляют 1,8 мл дистилированной воды. Перемешивают на магнитной мешалке при температуре 50°С в течение 60 мин.
В полученный раствор вносят 2,5 мкл раствора лакказы с концентрацией 2 мг/мл в 50 мМ калий-фосфатном буферном растворе, рН 7,0.
Для проведения ферментативной реакции растворы, обработанные лакказой, перемешивают при температуре 50°С в течение 1 часа. Для увеличения эффективности работы фермента лакказы перемешивание проводится в открытой посуде со свободным доступом атмосферного кислорода.
К предварительно обработанным лакказой растворам белкового гидролизата добавляют 0,21 мл 25% раствора глутарового альдегида. Полученную смесь ставят на перемешивание при температуре 50°С в течение 1 часа. Полученные в итоге растворы переливают на твердую подложку и оставляют сушиться при комнатной температуре в течение 200 часов (при толщине раствора не более 2 см). Высушенные образцы полимеров можно хранить при комнатной температуре.
Пример 5.
Получение биополимера из 60 масс.% раствора белкового гидролизата с добавлением 5 масс.% глутарового альдегида.
Белковый гидролизат в виде сухого порошка хранят с минимальным доступом влаги, в герметичных пакетах при температуре не выше +5°С.
К 3 г белкового гидролизата добавляют 1,0 мл дистилированной воды. Перемешивают на магнитной мешалке при температуре 50°С в течение 60 мин.
В полученный раствор вносят 1,5 мкл раствора лакказы с концентрацией 2 мг/мл в 50 мМ калий-фосфатном буферном растворе, рН 7,0.
Для проведения ферментативной реакции растворы, обработанные лакказой, перемешивают при температуре 50°С в течение 1 часа. Для увеличения эффективности работы фермента лакказы перемешивание проводится в открытой посуде со свободным доступом атмосферного кислорода.
К предварительно обработанным лакказой растворам белкового гидролизата добавляют 1,1 мл 25% раствора глутарового альдегида. Полученную смесь ставят на перемешивание при температуре 50°С в течение 1 часа. Полученные в итоге растворы переливают на твердую подложку и оставляют сушиться при комнатной температуре в течение 200 часов (при толщине раствора не более 2 см). Высушенные образцы полимеров можно хранить при комнатной температуре.
Пример 6.
Получение биополимера из 20 масс.% раствора белкового гидролизата с добавлением 20 масс.% глутарового альдегида.
Белковый гидролизат в виде сухого порошка хранят с минимальным доступом влаги в герметичных пакетах при температуре не выше +5°С.
К 2 г белкового гидролизата добавляют 0,5 мл дистилированной воды. Перемешивают на магнитной мешалке при температуре 50°С в течение 60 мин.
В полученный раствор вносят 1,0 мкл раствора лакказы с концентрацией 2 мг/мл в 50 мМ калий-фосфатном буферном растворе, рН 6,0.
Для проведения ферментативной реакции растворы, обработанные лакказой, перемешивают при температуре 50°С в течение 1 часа. Для увеличения эффективности работы фермента лакказы перемешивание проводится в открытой посуде со свободным доступом атмосферного кислорода.
К предварительно обработанным лакказой растворам белкового гидролизата добавляют 8,4 мл 25% раствора глутарового альдегида. Полученную смесь ставят на перемешивание при температуре 50°С в течение 1 часа. Полученные в итоге растворы переливают на твердую подложку и оставляют сушиться при комнатной температуре в течение 200 часов (при толщине раствора не более 2 см). Высушенные образцы полимеров можно хранить при комнатной температуре.
Пример 7.
Получение биополимера из 20 масс.% раствора белкового гидролизата с добавлением 1 масс.% глутарового альдегида.
Белковый гидролизат в виде сухого порошка хранят с минимальным доступом влаги в герметичных пакетах при температуре не выше +5°С.
К 3 г белкового гидролизата добавляют 11,4 мл дистилированной воды. Перемешивают на магнитной мешалке при температуре 25°С в течение 30 мин.
В полученный раствор вносят 11,5 мкл раствора лакказы с концентрацией 2 мг/мл в 50 мМ калий-фосфатном буферном растворе, рН 6,5.
Для проведения ферментативной реакции растворы, обработанные лакказой, перемешивают при температуре 25°С в течение 30 мин. Для увеличения эффективности работы фермента лакказы перемешивание проводится в открытой посуде со свободным доступом атмосферного кислорода.
К предварительно обработанным лакказой растворам белкового гидролизата добавляют 0,64 мл 25% раствора глутарового альдегида. Полученную смесь ставят на перемешивание при температуре 25°С в течение 1 часа. Полученные в итоге растворы переливают на твердую подложку и оставляют сушиться при комнатной температуре в течение 200 часов (при толщине раствора не более 2 см). Высушенные образцы полимеров можно хранить при комнатной температуре.