УЛУЧШЕННЫЙ БЕЛОК СЛИЯНИЯ FVIII И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
IMPROVED FVIII FUSION PROTEIN AND ITS USE

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Эта заявка испрашивает приоритет китайской патентной заявки 201810481941.X, поданной в Китайское патентное ведомство 18 мая 2018 г. под названием «IMPROVED FVIII FUSION PROTEIN AND USE THEREOF», содержание которой полностью включено в данный документ посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к области рекомбинантных белков слияния фактора свертывания крови VIII человека, в частности к полипептиду слияния с пролонгированным периодом полужизни, а также к способу их получения и их применению.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Гемофилия А - это наследственное нарушение свертываемости крови, вызванное недостаточной активностью или дисфункцией фактора свертывания крови VIII (FVIII), при котором добавка активного FVIII является эффективным терапевтическим лечением. Ген FVIII - один из самых длинных клонированных генов, а молекула FVIII - это белковый лекарственный препарат с наибольшей молекулярной массой, используемое в клинической практике. Белок FVIII содержит 6 доменов: три домена Α (Α1, А2, A3), необязательный центральный домен (В-домен) и два домена С (C1, С2). Уровень экспрессии рекомбинантного FVIII in vitro значительно ниже, чем у других генов со схожими свойствами. Например, уровень экспрессии FVIII составляет только 1% от уровня экспрессии FIX. Кроме того, поскольку период полужизни FVIII в крови составляет только 8-12 часов, пациентам с тяжелой формой гемофилии А необходимо проводить профилактическое лечение и вводить его внутривенно (в/в) около 3 раз в неделю.
Гибрид мономера-димера рекомбинантного белка слияния FVIII-Fc (Элокейт), разработанный Bioverativ (США), был одобрен для продажи FDA США в июне 2014 года. Клинические данные демонстрируют, что его период полужизни в организме человека увеличивается только в 1,5-1,7 раза (Dumont JA et al., Blood, 2012, 119: 3024-3030; Powell JS et al., Blood, 2012, 119: 3031-3037), а инъекции необходимы каждые 3-5 дней. Однако в клетках HEK-293, трансфицированных двойным вектором экспрессии rFVIII Fc и Fc, сконструированным Bioverativ, гомодимеры rFVIIIFc не были обнаружены в продуктах экспрессии, как ожидалось, и были экспрессированы только гибридный мономер-димер белка слияния rFVIIIFc и Fc димер. Для этого исследователи компании предположили, что клетка-хозяин не может секретировать гомодимерный белок rFVIIIFc с молекулярной массой около 400 кДа из-за избыточной молекулярной массы гомодимера, или что мономеры rFVIIIFc не могут полимеризоваться из-за стерических затруднений. (Peters RT et al., J Thromb Haemost, 2013, 11(1): 132-41). Можно видеть, что производство белка слияния FVIII в гомодимерной форме довольно сложно.
Для приготовления лекарственных средств длительного действия белковых составов обычно используют полимеры с высокой растворимостью (такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ)) для химической модификации поверхности белковых лекарственных препаратов. Как правило, чем выше скорость модификации, тем очевиднее снижение антигенности и активности белка. Сообщалось о примерах применения полиэтиленгликоля (ПЭГ) для увеличения полужизни FVIII, например, Novonordisk (N8-GP), Bayer (BAY94-9027) и Baxter (Вах 855) все разработали ПЭГилированные продукты FVIII длительного действия, которые вошли в клинические исследования. Однако данные фармакокинетических исследований продемонстрировали, что ПЭГилированный FVIII не имеет значительно продленного периода полужизни (Tiede A et al., J Thromb Haemost. 2013; 11: 670-678); (Coyle Τ et al., Haemophilia. 2012; 18 (Suppl 3): 22); (Turecek PL et al., Hamostaseologie, 2012, 32 Suppl 1: S29-38).
Стратегии разработки белковых лекарственных препаратов длительного действия включают гликозилирование, ПЭГилирование, образование белка слияния с альбумином, трансферрином, Fc, XTEN и так далее. В данное время в коммерческих лекарственных препаратах длительного действия используется только одна из вышеперечисленных стратегий для увеличения периода полужизни белка. В литературе нет сообщений о комбинации двух или более из вышеперечисленных стратегий, особенно о комбинации ПЭГилирования и слияния с белком, и нет сообщающей в литературе о том, что две или более стратегии могут увеличить период полужизни, чем когда адаптируется только одна стратегия.
Больным гемофилией необходимо пожизненное переливание факторов свертывания крови, чтобы остановить кровотечение и предотвратить кровотечение. Поэтому исследователи постоянно ищут факторы свертывания с более длительным периодом полужизни, чтобы уменьшить количество введений. Кроме того, поддержание хорошей биологической активности при увеличении периода полужизни является трудной проблемой, с которой сталкиваются исследователи.
КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ
После многих лет исследований и длительных экспериментов изобретатели обнаружили, что, когда фактор свертывания VIII сливается с партнером по слиянию (таким как сегмент Fc, альбумин, XTEN или трансферрин), и полученный белок слияния дополнительно конъюгирован с полимером, таким как полиалкиленгликоль, например, ПЭГ, включая мПЭГ, который может эффективно улучшать стабильность белка in vivo, особенно когда конъюгированная часть имеет разветвленную структуру и когда молекулярная масса конъюгированной части больше чем или равна 35 кДа, например 40 кДа. На этом и было завершено данное изобретение.
Данное изобретение предоставляет следующие технические решения.
1. Белок слияния фактора свертывания крови VIII, конъюгированный с полиалкиленгликолем, который представляет собой белок слияния фактора свертывания крови VIII, конъюгированный с полиалкиленгликолем, при этом фактор свертывания крови VIII (FVIII) в качестве активного фрагмента прямо или косвенно связан пептидным линкером с партнером слияния для продлевания периода полужизни с образованием белка слияния, и белок слияния дополнительно конъюгирован с полиалкиленгликолем.
2. Белок слияния фактора свертывания крови VIII, конъюгированный с полиалкиленгликолем в соответствии с одним вариантом осуществления данного изобретения, при этом фактор свертывания крови VIII в качестве активной части получен от человека, такой как полноразмерный или усеченный фактор свертывания крови VIII человека (например, фактор свертывания крови VIII с удаленным В-доменом человека); при этом полноразмерный или усеченный фактор свертывания крови VIII человека может содержать 1 или более аминокислотных мутаций при условии, что он все еще сохраняет активность FVIII, например, фактор свертывания крови VIII в качестве активного фрагмента содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1 или 2, или имеет по меньшей мере 90%, 95% или более идентичности с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 1 или 2.
3. Белок слияния фактора свертывания крови VIII, конъюгированный с полиалкиленгликолем в соответствии с другим вариантом осуществления данного изобретения, при этом партнер слияния представляет собой Fc-фрагмент иммуноглобулина, альбумин, трансферрин или XTEN, а партнер слияния получен от, например, человека, предпочтительно, Fc-фрагмента IgG, например, Fc-фрагмента IgG со сниженным эффектом ADCC и/или эффектом CDC и/или повышенной аффинностью связывания с рецептором FcRn, более предпочтительно Fc фрагмент IgG, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из:
(i) аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 3,
(ii) аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4, и
(iii) аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5.
4. Белок слияния фактора свертывания крови VIII, конъюгированный с полиалкиленгликолем в соответствии с некоторыми вариантами осуществления данного изобретения, при этом
полиалкиленгликоль представляет собой полипропиленгликоль или полиэтиленгликоль;
полиалкиленгликоль может иметь кэппирован на конце, например, кэппирован на конце алкоксигруппой, такой как метокси;
полиалкиленгликоль является линейным или разветвленным, предпочтительно разветвленным, например, разветвленным полиэтиленгликолем, особенно разветвленным полиэтиленгликолем с концевыми метоксигруппами;
молекулярная масса полиалкиленгликоля может быть >1, >10, >20,>30, >40, >50, >60, >70, >80, >90, >100, >110, >120, >130, >140, >150 или >160 кДа, например 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 кДа, или между любыми двумя значениями.
5. Белок слияния фактора свертывания крови VIII, конъюгированный с полиалкиленгликолем в соответствии с некоторыми вариантами осуществления данного изобретения, при этом положение конъюгации белка слияния и полиалкиленгликоля находится в случайном или специфическом положении, и положение конъюгирования выбрано из группы, состоящей из свободной аминогруппы, сульфгидрильной группы, сахарной группы и/или карбоксильной группы, предпочтительно свободной аминогруппы.
6. Белок слияния фактора свертывания крови VIII, конъюгированный с полиалкиленгликолем в соответствии с другим вариантом осуществления данного изобретения, при этом модификатор, то есть полиалкиленгликоль или модифицированный полиалкиленгликоль в этом описании, используется для конъюгации, и модификатор может быть в форме активированного сложного эфира, например, модификатор выбирается из модификаторов, представленных формулами (1), (2) и (3):
1
где 0≤m≤6 и m1 предпочтительно равняется 5; и мПЭГ представляет собой группу полиэтиленгликоля с концевыми монометокси;
2
2
3
3
где 0≤m≤6 и m предпочтительно равняется 2; 0≤m≤6 и m предпочтительно равны 1; и мПЭГ представляет собой группу полиэтиленгликоля с концевыми монометокси; или
4
4
где 0≤m≤6 и m предпочтительно равняется 2; и мПЭГ представляет собой группу полиэтиленгликоля с концевыми монометокси.
7. Белок слияния фактора свертывания крови VIII, конъюгированный с полиалкиленгликолем в соответствии с некоторыми вариантами осуществления данного изобретения, при этом активный фрагмент фактора свертывания крови VIII связан с партнером по слиянию через пептидный линкер, и пептидный линкер содержит гибкий пептидный сегмент и/или жесткий пептидный сегмент, например, включая 1, 2, 3, 4, 5 или более жестких пептидных сегментов.
8. Белок слияния фактора свертывания крови VIII, конъюгированный с полиалкиленгликолем в соответствии с другим вариантом осуществления данного изобретения, при этом гибкий пептидный сегмент содержит 2 или более аминокислотных остатков, выбранных из глицина, серина, аланина и треонина,
a
b
c
d
предпочтительно, гибкий пептидный сегмент имеет общую формулу (GS)(GGS)(GGGS)(GGGGS), где а, b, с и d являются целыми числами, большими чем или равными 0, и a+b+c+d≥1,
более предпочтительно, гибкий пептидный сегмент имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
9. Белок слияния фактора свертывания крови VIII, конъюгированный с полиалкиленгликолем в соответствии с некоторыми вариантами осуществления данного изобретения, при этом жесткий пептидный сегмент представляет собой карбоксиконцевой пептид β-субъединицы хорионического гонадотропина человека, или жесткий пептидный сегмент содержит не менее 70%, 80%, 90%, 95% или более идентичности карбоксиконцевому пептиду β-субъединицы хорионического гонадотропина человека; жесткий пептидный сегмент может содержать 1, 2 или более сайтов гликозилирования;
предпочтительно, жесткий пептидный сегмент содержит аминокислотную последовательность, выбранную из:
более предпочтительно, пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 15.
10. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество конъюгата по данному изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
11. Способ предотвращения и/или лечения геморрагических заболеваний, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, конъюгата по данному описанию или фармацевтической композиции по данному описанию, при этом геморрагические заболевания предпочтительно выбираются из геморрагических заболеваний у пациентов с врожденным или приобретенным дефицитом FVIII, и спонтанным или хирургическим кровотечением у пациентов с гемофилией А.
12. Способ увеличения периода полужизни фактора свертывания крови VIII, при этом активная часть фактора свертывания крови VIII прямо или косвенно связана пептидным линкером с партнером по слиянию для продления периода полужизни, а затем дополнительно конъюгирована с полиалкиленгликолем.
13. Способ согласно варианту осуществления данного изобретения, в котором партнер слияния представляет собой Fc-фрагмент иммуноглобулина, альбумин, XTEN или трансферрин, а партнер слияния происходит, например, от человека, предпочтительно Fc-фрагмента IgG, например, Fc-фрагмента IgG со сниженным эффектом ADCC и/или эффектом CDC и/или повышенным сродством связывания с рецептором FcRn, более предпочтительно с Fc фрагментом IgG, имеющим аминокислотную последовательность, выбранную из:
(i) аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 3,
(ii) аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4, и
(iii) аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5.
14. Способ согласно некоторым вариантам осуществления данного изобретения, в котором
полиалкиленгликоль представляет собой полипропиленгликоль или полиэтиленгликоль;
полиалкиленгликоль может иметь кэппирован на конце, например, кэппирован на конце алкоксигруппой, такой как метокси;
полиалкиленгликоль является линейным или разветвленным, предпочтительно разветвленным, например, разветвленным полиэтиленгликолем, особенно разветвленным полиэтиленгликолем с концевыми метоксигруппами;
молекулярная масса полиалкиленгликоля может быть >1, >10, >20, >30, >40, >50, >60, >70, >80, >90, >100, >110, >120, >130, >140, >150 или >160 кДа, например 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 кДа, или между любыми двумя значениями.
15. Способ в соответствии с некоторыми вариантами осуществления данного изобретения, в котором конъюгация белка слияния и полиалкиленгликоля происходит в случайном или конкретном положении, и положение конъюгирования выбирается из группы, состоящей из свободной аминогруппы, сульфгидрильной группы, сахарной группы и карбоксильной группы, предпочтительно свободной аминогруппы.
16. Способ в соответствии с другим вариантом осуществления данного изобретения, в котором модификатор, то есть полиалкиленгликоль или модифицированный полиалкиленгликоль в этом описании, используется для конъюгации, и модификатор может быть в форме активированного сложного эфира, более предпочтительно модификатор выбирается из модификаторов, представленных формулами (1), (2) и (3)
где любой модификатор активированной сложноэфирной формы используется для конъюгации, например, модификатор выбран из модификаторов, представленных формулами (1), (2) и (3):
1
1
где 0≤m≤6 и m предпочтительно равняется 5; мПЭГ представляет собой группу полиэтиленгликоля с концевыми монометокси; и молекулярная масса модификатора в формуле (1) составляет между 5 до 60 кДа;
2
2
3
3
где 0≤m≤6, и m предпочтительно равняется 2; 0≤m≤6, и m предпочтительно равно 1; мПЭГ представляет собой группу полиэтиленгликоля с концевыми монометокси; и молекулярная масса модификатора в формуле (2) составляет между 5 до 100 кДа, предпочтительно 40 кДа, 50 кДа, 60 кДа, более предпочтительно 40 кДа;
4
4
где 0≤m≤6 и m предпочтительно равняется 2; мПЭГ представляет собой группу полиэтиленгликоля с концевыми монометокси; и молекулярная масса модификатора в формуле (3) составляет между 5 до 100 кДа.
17. Способ согласно некоторым вариантам осуществления данного изобретения, в котором фактор свертывания крови VIII связан с партнером по слиянию через пептидный линкер, и пептидный линкер содержит гибкий пептидный сегмент и/или жесткий пептидный сегмент, например, включая 1, 2, 3, 4, 5 или более жестких пептидных сегментов.
18. Способ согласно варианту осуществления данного изобретения, в котором гибкий пептидный сегмент содержит 2 или более аминокислотных остатка, выбранных из глицина, серина, аланина и треонина,
a
b
c
d
предпочтительно, гибкий пептидный сегмент имеет общую формулу (GS)(GGS)(GGGS)(GGGGS), где а, b, с и d являются целыми числами, большими чем или равными 0, и a+b+c+d≥1,
более предпочтительно, гибкий пептидный сегмент имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
19. Белок слияния фактора свертывания крови VIII, конъюгированный с полиалкиленгликолем в соответствии с некоторыми вариантами осуществления данного изобретения, при этом жесткий пептидный сегмент представляет собой карбоксиконцевой пептид β-субъединицы хорионического гонадотропина человека, или жесткий пептидный сегмент содержит не менее 70%, 80%, 90%, 95% или более идентичности карбоксиконцевому пептиду β-субъединицы хорионического гонадотропина человека; жесткий пептидный сегмент может содержать 1, 2 или более сайтов гликозилирования;
предпочтительно, жесткий пептидный сегмент содержит аминокислотную последовательность, выбранную из:
более предпочтительно, пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 15.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Для более ясного объяснения вариантов осуществления данного изобретения и технических решений предшествующего уровня техники ниже кратко представлены графические материалы, которые необходимо использовать в вариантах осуществления данного изобретения и предшествующем уровне техники. Очевидно, что графические материалы в нижеследующем описании представляют только некоторые варианты осуществления данного изобретения. Для специалистов в данной области техники другие варианты осуществления данного изобретения могут быть получены на основе этих графических материалов без творческой работы.
На Фиг. 1А продемонстрированы результаты обнаружения FVIII-Fc (FF-0) с помощью SEC-HPLC без модификации мПЭГ.
На Фиг. 1 В продемонстрированы результаты обнаружения FVIII-Fc с помощью SEC-HPLC, модифицированного мПЭГ с молекулярной массой 5 кДа (FF-5L).
На Фиг. 1С продемонстрированы результаты обнаружения FVIII-Fc с помощью SEC-HPLC, модифицированного мПЭГ с молекулярной массой 10 кДа (FF-10L).
На Фиг. 1D продемонстрированы результаты обнаружения FVIII-Fc с помощью SEC-HPLC, модифицированного мПЭГ с молекулярной массой 20 кДа (FF-20L).
На Фиг. 1Е продемонстрированы результаты обнаружения FVIII-Fc с помощью SEC-HPLC, модифицированного мПЭГ с молекулярной массой 30 кДа (FF-30L).
На Фиг. 1F продемонстрированы результаты обнаружения FVIII-Fc с помощью SEC-HPLC, модифицированного мПЭГ с молекулярной массой 40 кДа (FF-40L).
На Фиг. 2А продемонстрированы результаты обнаружения FVIII-Линкер 1-Fc (FL1F-0) с помощью SEC-HPLC без модификации мПЭГ (чистота >99%, агрегация <1%).
На Фиг. 2В продемонстрированы результаты обнаружения FVIII-Ll-Fc с помощью SEC-HPLC, модифицированного мПЭГ с молекулярной массой 20 кДа (FL1F-20L) (чистота >95%, агрегация <5%, несшитый <1%).
На Фиг. 2С продемонстрированы результаты обнаружения FVIII-Ll-Fc с помощью SEC-HPLC, модифицированного линейным мПЭГ с молекулярной массой 30 кДа (FL1F-30L) (чистота >95%, агрегация <5%, несшитый <1%).
На Фиг. 2D продемонстрированы результаты обнаружения FVIII-Ll-Fc с помощью SEC-HPLC, модифицированного линейным мПЭГ с молекулярной массой 40 кДа (FL1F-40L) (чистота >95%, агрегация <5%, несшитый <1%).
На Фиг. 2Е продемонстрированы результаты обнаружения FVIII-Ll-Fc с помощью SEC-HPLC, модифицированного линейным мПЭГ с молекулярной массой 50 кДа (FL1F-50L) (чистота >95%, агрегация <5%, несшитый <1%).
На Фиг. 2F продемонстрированы результаты обнаружения FVIII-Ll-Fc с помощью SEC-HPLC, модифицированного Y-образным мПЭГ с молекулярной массой 40 кДа (FL1F-40Y) (чистота >95%, агрегация <5%, несшитый <1%).
На Фиг. 3А продемонстрированы результаты обнаружения исходного раствора hFVIII-Fc (FF-0) с помощью SDS-PAGE без модификации мПЭГ до и после обмена с G25 (Н представляет восстанавливающие условия, F представляет невосстанавливающие условия).
На Фиг. 3В продемонстрированы результаты обнаружения (невосстановления) hFVIII-Fc с помощью SDS-PAGE, поперечно сшитого с мПЭГ с различными молекулярными массами (от FF-5L до FF-40L).
На Фиг. 3С продемонстрированы результаты обнаружения (восстановления) hFVIII-Fc с помощью SDS-PAGE, поперечно сшитого с мПЭГ с различными молекулярными массами (от FF-5L до FF-40L).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Чтобы определить цели, технические решения и преимущества данного описания более ясно, нижеследующее дополнительно подробно описывает данное описание со ссылкой на графические материалы и варианты осуществления данного изобретения. Очевидно, что описанные варианты осуществления данного изобретения являются только частью вариантов осуществления данного изобретения, а не всеми вариантами осуществления данного изобретения. На основе вариантов осуществления данного изобретения все другие варианты осуществления данного изобретения, полученные специалистами в данной области без творческой работы, должны подпадать под объем защиты данного описания.
Термин «фактор свертывания крови VIII», также называемый фактором VIII или FVIII, относится к большому и сложному гликопротеину, в основном продуцируемому клетками печени. Термин «активный фрагмент фактора свертывания крови УШ» относится к фрагменту белка слияния по данному изобретению, который проявляет активность FVIII. Природный FVIII человека состоит из 2351 аминокислот, включая сигнальный пептид, а также из нескольких различных доменов, определяемых гомологией: три домена А, один домен В и два домена С в порядке NH2-A1-A2-B-A3-C1-С2-СООН. В крови FVIII секретируется в виде гетеродимера, состоящего из двух цепей (расщепленных на границе В-А3), которые связаны ионами двухвалентных металлов. Цепь А1-А2-В называется тяжелой цепью (НС), а цепь А3-С1-С2 называется легкой цепью (LC).
Молекулы эндогенного фактора VIII циркулируют в организме в виде пула молекул с В-доменами разного размера. Постепенное ферментативное расщепление В-домена может происходить in vivo, приводя к образованию пула молекул с В-доменами разного размера. Обычно считается, что возникновение расщепления в положении 740 (здесь вырезается последняя часть В-домена) связано с активацией тромбина.
«Фактор свертывания крови VIII» в данном описании может относиться к природной последовательности дикого типа (такой как SEQ ID NO: 1), а также его вариантам, например, вариантному белку, полученному путем замен, делеций или вставок одной или более аминокислот, при сохранении активности фактора свертывания крови VIII.
В одном из вариантов осуществления данного изобретения, фактор свертывания крови VIII представляет собой молекулу с удаленным В-доменом, при этом оставшиеся домены по существу соответствуют аминокислотам 1-745 и 1640-2332 в SEQ ID NO: 1. Кроме того, молекула с удаленным В-доменом по данному описанию может иметь небольшие отличия от последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2, то есть оставшиеся домены (т.е. три домена А и два домена С) могут иметь замены, добавления или делеций одной или более аминокислот на основе аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2, например, имеют 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более аминокислотных различий или около 1%, 2%, 3%, 4% или 5% отличия от последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2. Такие различия могут изменять связывающую способность фактора VIII с различными другими компонентами (такими как LRP, множественные рецепторы, другие факторы свертывания крови, поверхность клетки), или вводить и/или устранять гликозильные группы, сохраняя при этом основную активность фактора VIII.
Термин «партнер слияния» относится к полипептиду, который слит с целевым полипептидом (полипептид, период полужизни которого желательно увеличить). Партнер слияния может изменять свойства слитого белка с помощью множества различных механизмов, таких как увеличение периода полужизни целевого полипептида in vivo.
В одном из вариантов осуществления данного изобретения, партнер слияния задерживает клиренс FVIII in vivo за счет взаимодействия с неонатальным рецептором Fc (FcRn). В одном из вариантов осуществления данного изобретения, партнер слияния представляет собой Fc-участок иммуноглобулина (Fc-участок), альбумин, трансферрин, XTEN или их часть. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения, Fc IgG является предпочтительным из-за его относительно длительного периода полужизни.
Домен Fc также можно модифицировать для изменения его функций, таких как связывание комплемента и/или связывание с определенными рецепторами Fc. Мутации в положениях 234, 235 и 237 в домене Fc IgG обычно приводят к снижению связывания с рецепторами FcyRI, а также могут приводить к снижению связывания с рецепторами FcyRIIa и FcyRIII. Такие мутации не изменяют связывание с рецептором FcRn, что способствует продлению периода полужизни циркуляции в кровотоке за счет путей эндоцитоза и рециркуляции. Предпочтительно, модифицированный домен Fc IgG гибридного белка в данном описании содержит одну или более таких мутаций, некоторые мутации (L234A, L235E и G237A) приводят к снижению аффинности к определенным рецепторам Fc, а другие (A330S и P331S) приводят к снижению C1q-опосредованного связывания комплемента.
Термин «полиалкиленгликоль» представляет собой гидрофильный полимер, который конъюгирован в определенном положении с фактором свертывания крови VIII и/или партнером слияния в данном описании. Полиалкиленгликоль может быть линейным или разветвленным и может содержать один или более независимо выбранных полимерных фрагментов. Предпочтительно полиалкиленгликоль представляет собой полиэтиленгликоль (включая его форму с концевыми метоксигруппами, м-ПЭГ), полипропиленгликоль (включая mPPG) и т.д.
m
Полиалкиленгликоль в данном описании может быть полиэтиленгликолем (ПЭГ) и может быть линейным или разветвленным. Основная цепь разветвленного полимера хорошо известна в данной области техники. Обычно разветвленный полимер имеет центральную разветвленную часть ядра и одну или более цепей линейного полимера, соединенных с центральным разветвленным ядром. В данном описании предпочтительно используется разветвленная форма ПЭГ. В одном варианте осуществления данного изобретения, разветвленный полиэтиленгликоль может быть представлен общей формулой R(-PEG-OH), где R представляет собой часть ядра, такую как глицерин или пентаэритрит, a m представляет собой количество плечей/ветвей.
В варианте осуществления данного изобретения, количество ветвей в разветвленном ПЭГ (таком как мПЭГ) равно 2, поэтому он также называется ПЭГ «Υ-типа» (например, мПЭГ), то есть разветвленный ПЭГ, содержащий два ПЭГ, или разветвленный ПЭГ содержащий линейный метокси-ПЭГ.
Примеры других подходящих полимеров включают, но не ограничиваются ими, другие полиалкиленгликоли (например, полипропиленгликоль (PPG), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля), полиоксиэтилированные полиолы, олефиновый спирт, полив инилпирролидон, полигидроксипропилметакриламид, поли([α]-гидроксикислота), поливиниловый спирт, полифосфазен, полиоксазолин, поли-N-акрилоилморфолин и сополимеры, терполимеры и их смеси.
В варианте осуществления данного изобретения, используется модификация ПЭГ (т.е. конъюгация) и более предпочтительно модификация мПЭГ, при этом модификация находится в случайном или определенном положении, и положение модификации выбрано из группы, состоящей из свободной аминогруппы, сульфгидрильной группы, сахарной группы и/или карбоксильной группы, предпочтительно свободной аминогруппы.
В конкретном варианте осуществления данного изобретения, модификатор, то есть полиалкиленгликоль или модифицированный полиалкиленгликоль в данном изобретении, используемый для случайной модификации свободной аминогруппы, может быть выбран из мПЭГ-SS (метоксиполиэтиленгликоль- сукцинимидилсукцинат), мПЭГ-SC (метоксиполиэтиленгликоль-сукцинимидилкарбонат), мПЭГ-SPA (метоксиполиэтиленгликоль-сукцинимидилпропионат) и мПЭГ-SG (метоксиполиэтиленгликоль-сукцинимидилглутарат) и так далее. Для N-концевой модификации выбирается один из мПЭГ-ALD (метоксиполиэтиленгликоль-ацетальдегид), мПЭГ-pALD (метоксиполиэтиленгликоль-пропиональдегид) и мПЭГ-bALD (метоксиполиэтиленгликоль-бутиральдегид) и так далее. Модификаторы мПЭГ-SS, мПЭГ-SC, мПЭГ-SPA, мПЭГ-SG, мПЭГ-ALD, мПЭГ-pALD, мПЭГ-bALD являются линейными или разветвленными.
В конкретном варианте осуществления данного изобретения, модификатор, используемый для случайной модификации свободных сульфгидрильных групп, представляет собой мПЭГ-мал (метоксиполиэтиленгликоль-малеимид), мПЭГ-OPSS (метоксиполиэтиленгликольортопиридилдисульфид), мПЭГ-винилсульфон (метоксиполиэтиленгликоль-винилсульфон) и мПЭГ-тиол (метоксиполиэтиленгликоль-тиол) и др.
В конкретном варианте осуществления данного изобретения, модификатор, используемый для случайной модификации сахарной группы и/или карбоксильной группы, представляет собой мПЭГ-ZH (метоксиполиэтиленгликоль-гидразид).
В варианте осуществления данного изобретения, модификатор для модификации имеет структуру, продемонстрированную в формуле (1):
1
1
где 0≤m≤6 и m предпочтительно равняется 5; и мПЭГ представляет собой группу полиэтиленгликоля с концевыми монометокси. Модификатор, представленный формулой (1), имеет молекулярную массу 5-60 кДа (кДа, килодальтон), предпочтительно 40 кДа. Предпочтительно, в одном из вариантов осуществления данного изобретения, модификатор, представленный формулой (1), используется для случайной модификации мПЭГ по свободной аминогруппе.
В варианте осуществления данного изобретения, модификатор для модификации имеет структуру, продемонстрированную в формуле (2):
2
2
3
3
где 0≤m≤6 и m предпочтительно равняется 2; 0≤m≤6 и m предпочтительно равняется 1; и мПЭГ представляет собой группу полиэтиленгликоля с концевыми монометокси. Модификатор, представленный формулой (2), имеет молекулярную массу 5-60 кДа, предпочтительно 40 кДа. Предпочтительно, в одном из вариантов осуществления данного изобретения, модификатор, представленный формулой (2), используется для случайной модификации мПЭГ по свободной аминогруппе.
В варианте осуществления данного изобретения, модификатор для модификации имеет структуру, продемонстрированную в формуле (3):
4
4
где 0≤m≤6 и m предпочтительно равняется 2; и мПЭГ представляет собой группу полиэтиленгликоля с концевыми монометокси. Модификатор, представленный формулой (3), имеет молекулярную массу 5-60 кДа, предпочтительно 40 кДа. Предпочтительно, в одном из вариантов осуществления данного изобретения, модификатор, представленный формулой (3), используется для случайной модификации мПЭГ по свободной сульфгидрильной группе.
Размер остова полимера может варьироваться, но типичный диапазон размеров полимеров (таких как ПЭГ, мПЭГ, PPG или mPPG) составляет от около 0,5 кДа до около 160 кДа, например от около 1 кДа до около 100 кДа. Более конкретно, размер каждого гидрофильного полимера, конъюгированного в данном описании, в основном варьируется в следующих диапазонах: от около 1 кДа до около 80 кДа, от около 2 кДа до около 70 кДа; от около 5 кДа до около 70 кДа; от около 10 кДа до около 60 кДа, от около 20 кДа до около 50 кДа; от около 30 кДа до около 50 кДа или от около 30 кДа до около 40 кДа. Следует понимать, что эти размеры представляют собой приблизительные значения, а не точные измерения, как известно в данной области техники.
В конкретном варианте осуществления данного изобретения, размер ПЭГ или мПЭГ, используемые в данном описании, составляет более 35 кДа (т.е. не менее чем 35 кДа), предпочтительно не менее чем 40 кДа, не менее чем 45 кДа, не менее чем 50 кДа, не менее чем 55 кДа, не менее чем 60 кДа, не менее чем 65 кД или не менее чем 70 кДа, например, молекулярная масса конкретно составляет 40 кДа, 50 кДа, 60 кДа, 70 кДа, 80 кДа, 90 кДа, 100 кДа, 110 кДа, 120 кДа, 130 кДа, 140 кДа, 150 кДа или 160 кДа.
Термин «улучшенный период полужизни циркуляции» означает, что молекулы по данному описанию имеют измененный период полужизни циркуляции (период полужизни плазме), предпочтительно увеличенный период полужизни циркуляции по сравнению с фактором VIII дикого типа. Период полужизни циркуляции предпочтительно увеличивается по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере 15%, предпочтительно по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 25%, предпочтительно по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 35%, предпочтительно по меньшей мере 40%, предпочтительно по меньшей мере 45%, предпочтительно по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 55%, предпочтительно по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 65%, предпочтительно по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95%, предпочтительно по меньшей мере 100%, более предпочтительно по меньшей мере 125%, более предпочтительно по меньшей мере 150%, более предпочтительно по меньшей мере 175%, более предпочтительно по меньшей мере 200%, и более предпочтительно по меньшей мере 250% или 300%. Еще более предпочтительно, чтобы период полужизни циркуляции молекулы увеличивался по меньшей мере на 400%, 500%, 600% или даже 700%.
Термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает, но не ограничивается ими: физиологический раствор, буфер, глюкозу, воду, глицерин, этанол и их комбинации. Как правило, фармацевтический препарат должен подходить для способа введения. Фармацевтическая композиция по данному изобретению может быть изготовлена в форме инъекции, например, обычными способами с физиологическим раствором или водным раствором, содержащим глюкозу и другие адъюванты. Фармацевтическая композиция должна производиться в асептических условиях. Количество вводимого активного ингредиента является терапевтически эффективным. Фармацевтический препарат по данному изобретению также может быть приготовлен в виде препарата с замедленным высвобождением.
Примеры
Пример 1
Получение и очистка мПЭГ-модифицированного белка слияния hFVIII 1,1. Получение мПЭГ-модифицированного белка слияния hFVIII
1.1.1 Серии плазмид для экспрессии белка слияния hFVIII были сконструированы в соответствии с технологией молекулярного клонирования, хорошо известной специалистам в данной области техники, и плазмиды для экспрессии были соответственно трансфицированы в DHFR-дефицитные клетки СНО (см. Патент США 4818679) для экспрессии каждого белка слияния hFVIII (таблица 1). Для конкретных стадий получения белка слияния см. китайский патент ZL201610692838.0, который полностью включен в данный документ посредством ссылки во всей его полноте.
означает, что линкер образован путем соединения жесткого пептидного сегмента, показанного в SEQ ID NO: 11 с С-концом гибкого пептидного сегмента, показанного в SEQ ID NO: 6.
1.1.2. Бульон ферментации каждого белка слияния в 1.1.1 центрифугировали, фильтровали и затем подвергали аффинной хроматографии/хроматографии гидрофобного взаимодействия/ионообменной хроматографии/эксклюзионной хроматографии для получения пяти белков слияния hFVIII FF-0, FL1F-0, FL2F-0, F (полноразмерный) L1F'-0 и F (полноразмерный) L2F"- 0, для которых обнаружение с помощью SEC-HPLC показало, что агрегация составляла менее чем 5%. Пять белков слияния hFVIII были соответственно составлены в исходные растворы белков слияния hFVIII с концентрацией белка 0,95 мг/мл.
1.1.3. 5 мл каждого из пяти исходных растворов белка слияния hFVIII, приготовленных в 1.1.2, подвергали хроматографии на молекулярных ситах G25 (GE Healthcare). Конкретный процесс заключался в следующем.
2
Приготовление буфера: 20 мМ Hepes, 0,1 Μ NaCl, 5,0 мМ CaCl, 0,02% Твин 8,0, рН 7,0;
Хроматография
(1) Равновесие: хроматографическая колонка была уравновешена 3-кратным объемом колонки связывающего буфера до тех пор, пока рН и проводимость не стали такими же, как у буфера, и скорость потока была стабильной на уровне 150 см/ч.
(2) Загрузка образца: скорость потока контролировалась на уровне 150 см/ч.
(3) Равновесие: хроматографическая колонка была уравновешена 3-кратным объемом колонки буфера до тех пор, пока рН и проводимость не стали такими же, как у буфера, и скорость потока была стабильной на уровне 150 см/ч.
(4) Равновесие: хроматографическая колонка уравновешивается буфером, и пики собирались с А280/А260 более чем 1,8.
(5) Очистка хроматографической колонки in situ: колонку очищали в обратном порядке с 0,2 Μ NaOH в объеме в 1,5 раза превышающим объем колонки при скорости потока 60 см/ч и нейтрализовали буфером.
(6) Хранение хроматографической колонки: после эксперимента колонку очищали очищенной водой в объеме в 3 раза превышающей объем колонки, при скорости потока 100 см/ч, а затем хранили с 2-кратным объемом колонки 20% этанола.
Концентрация ультрафильтрации: концентрировали исходные растворы пяти белков слияния hFVIII (FF-0, FL1F-0, FL2F-0, F (полноразмерный) L1F'-0 и F (полноразмерный) L1F''- 0) после обмена G25 путем ультрафильтрации с помощью фильтрующей пробирки для ультрафильтрации для 50 кДа, и концентрировали центрифугированием при 3800 об/мин, 4°С до концентрации белка предпочтительно 1,5 мг/мл.
1.1.4. Требуемый мПЭГ-SC (линейный L-образный мПЭГ-SC со структурой, показанной в формуле (1) с молекулярной массой 5 кДа, 10 кДа, 20 кДа или 30 кДа, 40 кДа, соответственно, и разветвленный Y-образный мПЭГ-SC со структурой, показанной в формуле (2), с молекулярной массой 40 кДа) (Beijing jenkem Technology Co., Ltd.) взвешивали в соответствии с молярным отношением белка слияния hFVIII к мПЭГ-SC, равным 1:10-1:100. Его добавляли к концентрированному белку слияния hFVIII после ультрафильтрации в 1.1.3 и давали реагировать в течение 4 часов. Затем для прекращения реакции добавляли гистидин в 10-кратном молярном соотношении к субстрату белку слияния hFVIII, чтобы получить белок слияния hFVIII, модифицированный мПЭГ-SC, с различными молекулярными массами. Количество и состав некоторых модифицированных продуктов показаны в Таблице 2 ниже.
1.2 Очистка мПЭГ-модифицированного белка слияния hFVIII.
1.2.1. Каждый белок слияния hFVIII, модифицированный мПЭГ, полученный согласно 1.1.4. Примера 1, подвергали хроматографии на молекулярных ситах S200 (GE Healthcare) соответственно. Конкретный процесс заключался в следующем.
2
Приготовление буфера: 20 мМ гистидин, 0,1 Μ NaCl, 5,0 мМ CaCl, 0,02% Твин 8,0, рН 7,0.
Хроматография
(1) Равновесие: хроматографическая колонка была уравновешена 3-кратным объемом колонки связывающего буфера до тех пор, пока рН и проводимость не стали такими же, как у буфера, и скорость потока контролировалась на уровне 150 см/ч.
(2) Загрузка образца: скорость потока образца контролировалась на уровне 150 см/ч.
(3) Равновесие: хроматографическая колонка была уравновешена 3-кратным объемом колонки буфера до тех пор, пока рН и проводимость не стали такими же, как у буфера, и скорость потока контролировалась на уровне 150 см/ч.
(4) Равновесие: хроматографическая колонка уравновешивается буфером, и пики собирались с А280/А260 более чем 1,8.
(5) Очистка хроматографической колонки in situ: колонку очищали в обратном порядке с 0,2 Μ NaOH в объеме в 1,5 раза превышающим объем колонки при скорости потока 60 см/ч и нейтрализовали буфером.
(6) Хранение хроматографической колонки: после эксперимента колонку очищали очищенной водой в объеме в 3 раза превышающей объем колонки, при скорости потока 100 см/ч, а затем хранили с 2-кратным объемом колонки 20% этанола.
1.2.2. Хроматографические продукты, полученные согласно 1.2.1. подвергали анионной хроматографии Source 15Q (GE Healthcare).
Приготовление буфера
2
2
Связывающий буфер: 20 мМ гистидин, 0,1 Μ NaCl, 5,0 мМ CaCl, 0,02% Твин 8,0, рН 7,0; буфер для элюирования: 20 мМ гистидин, 2,0 Μ NaCl, 5,0 мМ CaCl, 0,02% Твин 8. 0, рН 7,0; CIP: 0,5М NaOH.
Хроматография
(1) Равновесие: хроматографическая колонка была уравновешена 3-кратным объемом колонки связывающего буфера до тех пор, пока рН и проводимость не стали такими же, как у буфера, и скорость потока контролировалась на уровне 150 см/ч.
(2) Загрузка образца: скорость потока была равномерной на уровне 150 см/ч.
(3) Равновесие: хроматографическая колонка была уравновешена 3-кратным объемом колонки связывающего буфера до тех пор, пока рН и проводимость не стали такими же, как у буфера, и скорость потока контролировалась на уровне 150 см/ч.
(4) Элюирование: Образец элюировали буфером В в 20 раз превышающим объем колонки с линейным градиентом 0-100% при равномерной скорости потока 100 см/ч. Пики элюирования с А280/А260 более чем 1,8 собирали в отдельные пробирки и подвергали определению с помощью SEC-HPLC.
(5) Очистка хроматографической колонки in situ: колонку очищали в обратном порядке с 0,5 Μ NaOH в объеме в 1,5 раза превышающим объем колонки при скорости потока 60 см/ч и нейтрализовали связывающим буфером.
(6) Хранение хроматографической колонки: после эксперимента колонку очищали очищенной водой в объеме в 3 раза превышающей объем колонки, при скорости потока 100 см/ч, а затем хранили с 2-кратным объемом колонки 20% этанола.
1.3.2. Обнаружение при помощи SEC-HPLC.
Хроматографические продукты, полученные в 1.2.2. подвергали обнаружению при помощи SEC-HPLC.
Колонка: G3000/G4000; Скорость потока: 0,5 мл/мин; Длина волны обнаружения: 280 нм; Температура колонки: 25°С; Объем инъекции: 100 мкл (количество инъекции: 20 мкг); Мобильная фаза: 0,30 Μ хлорида натрия, 0,02 Μ имидазола, 0,01 Μ хлорида кальция, 25 ч/млн Твин 80, 10% этанола, рН 7,0; Время запуска: 35-50 мин.
Результаты обнаружения от FF-0 до FF-40L показаны на Фиг. 1A-1F. Результаты обнаружения от FL1F-0 до FL1F-50L и FL1F-40Y показаны на Фиг. 2A-2F. Эти результаты показывают, что для FL1F-0 до FL1F-60L чистота составляет >95%, полимер составляет <5%, а количество несшитых частиц составляет <1%.
1.2.4. Обнаружение при помощи гель-электрофореза в SDS-PAGE.
Продукты, полученные согласно 1.2.2. подвергали обнаружению с помощью SDS-PAGE.
(1) Приготовление геля. 1 × Трис-глициновый буфер для электрофореза: SDS 0,4 г, трис-основа 1,21 г, глицин 7,5 г и бидистиллированная вода чтобы довести до 400 мл.
5% стекирующий гель: бидистиллированная вода 4,1 мл, 1М трис-HCl (рН 6,8) 0,75 мл, 30% (мас./об.) полиакриламид 1 мл, 10% (мас./об.) персульфат аммония 60 мкл, 10% (мас./об.) SDS 60 мкл, TEMED 6 мкл.
6% разделяющий гель: бидистиллированная вода 4,9 мл, 1,5 Μ Трис-HCl (рН 8,8) 3,8 мл, 30% (мас./об.) полиакриламид 6 мл, 10% (мас./об.) персульфат аммония 150 мкл, 10% (мас./об.) SDS 150 мкл, TEMED 6 мкл.
(2) 5 × буфер для загрузки белка: глицерин 5 мл, 1М трис-HCl (рН 6,8) 2,5 мл, бромфеноловый синий 0,05 г, SDS 1 г, бидистиллированная вода чтобы довести до 10 мл, хранимая при 4°С, и 0,5 мл β-меркаптоэтанола добавляли перед использованием.
(3) Подготовка образца: образец для тестирования смешивали с равным объемом буфера для загрузки. Для восстановления SDS-PAGE добавляли 0,1 мг/мл 2-меркаптоэтанола в том же объеме, что и образец, а для невосстанавливаемого SDS-PAGE 2-меркаптоэтанол не добавляли. После того, как образец был смешан с буфером для загрузки, его нагревали в кипящей воде в течение 10 минут.
(4) Электрофорез: 10 мкл тестируемого образца и белковый маркер загружали в лунки геля соответственно и подвергали электрофорезу при напряжении 60 В. После того, как краситель бромфеноловый синий попал в разделяющий гель, напряжение увеличивали до 120 В, пока краситель бромфеноловый синий не достигал дна разделяющего геля, затем электропитание отключали.
(5) Окрашивание: гель SDS-PAGE осторожно удаляли и помещали в пластиковую коробку, содержащую окрашивающий раствор кумасси бриллиантовый синий, а затем коробку помещали в микроволновую печь для нагревания в течение 1 минуты.
(6) Обесцвечивание: окрашенный гель SDS-PAGE помещали в обесцвечивающий раствор и обесцвечивали при встряхивании, обесцвечивающий раствор меняли каждые 2 часа и прекращали после появления прозрачной полосы, видимой невооруженным глазом.
(7) Запись: готовый гель SDS-PAGE фотографировали или сушили и хранили. На Фиг. 3а-3с показаны результаты обнаружения FF-5L в FF-40L с помощью SDS-PAGE.
Пример 2
Непрямое определение активности in vitro белка слияния мПЭГ-модифицированного hFVIII с помощью анализа хромогенного субстрата
Анализ хромогенного субстрата использовали для определения активности мПЭГ-модифицированного белка слияния hFVIII, полученного в Примере 1. Использовали набор ChromogenixCoatest FVIII (Chromogenix, Ref. K824086). Принцип обнаружения представляет собой: после активации тромбином, в присутствии фосфолипидов и ионов кальция, FVIIIa связывается с FLXa с образованием ферментного комплекса, который может активировать фактор X, чтобы преобразовать его в его активную форму Ха, тогда активный Ха может, в свою очередь, расщеплять свой специфический хромогенный субстрат (S-2765) и высвобождает хромофор pNA. Измеряя количество pNA при 405 нм, можно определить активность FXa, которая прямо пропорциональна количеству FXa. Поскольку содержание фактора ГХа и фактора X в системе избыточно, активность FXa напрямую связана только с содержанием FVIIIa. Результаты непрямого определения биологической активности FVIII с помощью анализа хромогенного субстрата представлены в Таблице 3.
Пример 3
Определение титра фактора VIII человека.
Анализ для определения титра фактора свертывания VIII, используемый в данном описании, также упоминается как одностадийный анализ свертывания. Конкретные шаги, относятся к третьей части Китайской фармакопеи (версия 2010 г.). Одностадийный анализ свертывания на биологическую активность FVIII был основан на способности корректировать плазму с дефицитом FVIII для продления времени свертывания. Использовали набор плазмы с дефицитом фактора свертывания VIII (кат. № OTXW17) от фирмы Siemens (Германия). Анализ выполняли как: во-первых, концентрат фактора VIII Международного стандартного стандарта ВОЗ 8-го международного стандартного вещества (кат. No. 07/350) с известным титром разбавляли до 4 МЕ/мл, а затем подвергали градиентному разбавлению для достижения различных титров (МЕ/мл); эти стандартные образцы были смешаны с плазмой, дефицитной по FVIII, для измерения активированного частичного тромбопластинового времени (АРТТ); для построения стандартной кривой использовали линейную регрессию логарифма титра (МЕ/мл) активного стандартного раствора FVIII против логарифма соответствующего времени(времен) свертывания; затем исследуемый образец разбавляли и смешивали с плазмой, дефицитной по FVIII, и проводили измерение АРТТ. Путем подбора стандартной кривой можно определить активность образцов FVIII, и специфическая активность в МЕ/мг образцов FVIII была рассчитана. Результаты представлены в Таблице 4.
Таблица 3 и Таблица 4 показывают, что биологическая активность FL1F-40Y, FL2F-40Y, F(полноразмерный) L1F'-40Y и F(полноразмерный) L2F''-40Y, измеренная с помощью анализа хромогенного субстрата и одностадийного анализа свертывания ниже, чем у Элокейт/FL1F-0/FL2F-0 без модификации мПЭГ. Это связано с влиянием модификации мПЭГ на пространственную структуру модифицированного белка, и другие мПЭГ-модифицированные белки (например, PEG-INTRON, Pegfilgrastim) в предшествующем уровне техники показывают аналогичные результаты. Неожиданно белки слияния FVIII Fc, модифицированные мПЭГ 40 кДа или выше, все еще могут сохранять относительно высокую активность. Кроме того, последующие эксперименты верифицировали, что период полужизни этих белков значительно продлен.
Пример 4
Фармакодинамический тест с использованием модели кровотечения из пересеченной хвостовой вены у мышей с гемофилией А.
В этом примере время полужизни каждого из мПЭГ-модифицированных белков слияния hFVIII у мышей с гемофилией А (мыши НА) сравнивали с помощью экспериментов по пересечению хвостовой вены (TVT).
4,1. В соответствии с методами, описанными в литературе, самцов мышей НА в возрасте 10-12 недель (приобретенных в Шанхайском Южном центре модельных биологических исследований) случайным образом делили на группы по 12 мышей в каждой группе. Мышам вводили лекарственные средства, то есть белки слияния, модифицированные мПЭГ, по данному изобретению или положительный контроль Элокейт через хвостовую вену в дозе 15 МЕ/кг соответственно. Через 48 часов после введения лекарственного средства хвост был измерен и помечен канюлей с внутренним диаметром 2,7 мм, и выполнено пересечение левой боковой вены хирургическим лезвием с прямым краем калибра 11. После пересечения хвост сразу помещали в пробирку, содержащую 13 мл предварительно нагретого физиологического раствора, и записывали время кровотечения. После остановки кровотечения (отсутствие очевидного кровотечения из разреза) хвост мыши вынимали из пробирки с физиологическим раствором, а затем мышь помещали на грелку при 37°С для поддержания температуры тела, стараясь не прикасаться к ране. После того, как мышь просыпалась, ее помещали в клетку с белой бумагой на дне, каждое животное в отдельную клетку. Белую бумагу или клетку заменяли после каждого наблюдения, чтобы определить степень кровотечения. Подсчитывали выживаемость мышей в течение 48 часов и количество повторных кровотечений в течение 12 часов (подсчитывали всего 12 часов, и многократное кровотечение в течение одного часа считали одним кровотечением) после пересечения хвоста. Результаты представлены в Таблице 5.
2
Частота повторного кровотечения относится к доле мышей с повторным кровотечением в течение периода эксперимента. Уровень тяжелого кровотечения относится к доле мышей с тяжелым кровотечением (+++) или множественными умеренными кровотечениями (++) в течение 12-часового периода. Среди них к умеренному кровотечению (++) относится: на белой бумаге много пятен крови с площадью покрытия не менее чем 30%, а пятна крови не очень яркого цвета, но лужа крови большой площади (площадь >3 см); к тяжелому кровотечению (+++) относятся: на белой бумаге много пятен крови с площадью покрытия не менее чем 30%, пятна крови яркого цвета, и есть лужи крови с большой площадью; в некоторых случаях, даже если зона покрытия мала, мышей можно считать имеющими сильное кровотечение, когда мыши теряют много крови, диапазон движений уменьшается, а белая бумага сильно пропитана кровью.
Результаты показывают, что по сравнению с группами Элокейт/РЫР-0/РЬ2Р-0 без модификации мПЭГ, группой FL1F-40Y, группой FL2F-40Y, группой Р(полноразмерный) L1F'-40Y и группой Р(полноразмерный) L2F''-40Y группа имеет уровень выживаемости 83,3%, 75,0%, 83,3% и 83,3% соответственно, что значительно выше, чем у других групп. Кроме того, в этих группах частота повторных кровотечений в течение 12 часов и частота сильных кровотечений значительно ниже, чем в других группах. Следовательно, FL1F-40Y, FL2F-40Y, Р(полноразмерный) L1F'-40Y и Р(полноразмерный) L2F''-40Y обеспечивают более длительное время защиты в модели пересечения хвостовой вены у мышей с гемофилией А.
4,2. Тот же метод, описанный в 4.1, использовали для проведения эксперимента TVT на самцах мышей НА в возрасте 10-12 недель, 12 мышей в группе, через 84 часа после введения лекарственного препарата. Результаты представлены в Таблице 6.
Результаты показывают, что по сравнению с Элокейт и другими группами без модификации ПЭГ, группа FL1F-40Y, группа FL2F-40Y, группа F (полноразмерный) L1F'-40Y и группа F (полноразмерный) L2F''- 40Y частота выживаемости составляет 66,7%, 75,0%, 75,0% и 75,0% соответственно, что значительно выше, чем в других группах, а частота повторного кровотечения значительно снижена. Таким образом, FL1F-40Y, FL2F-40Y, F (полноразмерный) L1F'-40У и F (полноразмерный) L2F''-40У по-прежнему демонстрируют определенный эффект на предотвращение кровотечения в модели пересечения хвостовой вены у мышей с гемофилией А 84 ч после приема препарата.
4.3. Тот же метод, что описан в 4.1, использовали для проведения эксперимента TVT на мышах НА в возрасте 10-12 недель, 20 мышей (10 самцов и 10 самок)/группа через 90 часов после введения лекарственного препарата. Результаты представлены в Таблице 7.
Результаты показывают, что FL1F-50L имеет аналогичную выживаемость и частоту повторного кровотечения по сравнению с группой Elocateate без модификации ПЭГ. Поскольку экспериментальные животные не однополые, экспериментальные результаты не сравниваются с другими экспериментами с однополыми животными.
4.4. Тот же метод, описанный в 4.1, использовали для проведения эксперимента TVT на самцах мышей НА в возрасте 10-12 недель, 12 мышей/группа, через 96 часов после введения лекарственного препарата. Результаты представлены в Таблице 8.
Результаты показывают, что по сравнению с группой Элокейт без модификации ПЭГ, FL1F-40Y/FL2F-40Y имеет немного улучшенную частоту выживаемости и значительно снижает частоту повторного кровотечения в течение 12 часов. FL1F-40Y/FL2F-40Y значительно улучшили частоту выживаемости по сравнению с другими группами и значительно снизили частоту повторного кровотечения в течение 12 часов по сравнению с другими группами. Следовательно, группы FL1F-40Y/FL2F-40Y имеют более длительное время предотвращения, чем другие группы в модели мышей с пересечением хвостовой веной А.
Вышеупомянутые являются только предпочтительными вариантами осуществления данного изобретения и не предназначены для ограничения данного изобретения. Любая модификация, эквивалентная замена или улучшение, выполненные в соответствии с духом и принципом данного изобретения, должны быть включены в объем защиты данного изобретения.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Beijing Furen Ruihui Biomedical Research Institute Co., Ltd. etc.
<120> УЛУЧШЕННЫЙ БЕЛОК СЛИЯНИЯ FVIII И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
<130> OP190320
<160> 15
<170> PatentIn версия 3.2
<210> 1
<211> 2332
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
1               5                   10                  15
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
20                  25                  30
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
35                  40                  45
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
50                  55                  60
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
65                  70                  75                  80
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
85                  90                  95
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100                 105                 110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115                 120                 125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130                 135                 140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145                 150                 155                 160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165                 170                 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180                 185                 190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
195                 200                 205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210                 215                 220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225                 230                 235                 240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245                 250                 255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
260                 265                 270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275                 280                 285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290                 295                 300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305                 310                 315                 320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325                 330                 335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340                 345                 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355                 360                 365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370                 375                 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385                 390                 395                 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405                 410                 415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420                 425                 430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435                 440                 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450                 455                 460
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465                 470                 475                 480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
485                 490                 495
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
500                 505                 510
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
515                 520                 525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530                 535                 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545                 550                 555                 560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565                 570                 575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
580                 585                 590
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
595                 600                 605
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610                 615                 620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625                 630                 635                 640
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
645                 650                 655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
660                 665                 670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
675                 680                 685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
690                 695                 700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705                 710                 715                 720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
725                 730                 735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg
740                 745                 750
Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp Ile Glu Lys
755                 760                 765
Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys Ile Gln Asn
770                 775                 780
Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser Pro Thr Pro
785                 790                 795                 800
His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr Glu Thr Phe
805                 810                 815
Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn Ser Leu Ser
820                 825                 830
Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly Asp Met Val
835                 840                 845
Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu Lys Leu Gly
850                 855                 860
Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys Val Ser Ser
865                 870                 875                 880
Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn Leu Ala Ala
885                 890                 895
Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met Pro Val His
900                 905                 910
Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys Ser Ser Pro
915                 920                 925
Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu Asn Asn Asp
930                 935                 940
Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu Ser Ser Trp
945                 950                 955                 960
Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe Lys Gly Lys
965                 970                 975
Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala Leu Phe Lys
980                 985                 990
Val Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr  Asn Lys Thr Ser Asn  Asn Ser Ala
995                 1000                 1005
Thr Asn  Arg Lys Thr His Ile  Asp Gly Pro Ser Leu  Leu Ile Glu
1010                 1015                 1020
Asn Ser  Pro Ser Val Trp Gln  Asn Ile Leu Glu Ser  Asp Thr Glu
1025                 1030                 1035
Phe Lys  Lys Val Thr Pro Leu  Ile His Asp Arg Met  Leu Met Asp
1040                 1045                 1050
Lys Asn  Ala Thr Ala Leu Arg  Leu Asn His Met Ser  Asn Lys Thr
1055                 1060                 1065
Thr Ser  Ser Lys Asn Met Glu  Met Val Gln Gln Lys  Lys Glu Gly
1070                 1075                 1080
Pro Ile  Pro Pro Asp Ala Gln  Asn Pro Asp Met Ser  Phe Phe Lys
1085                 1090                 1095
Met Leu  Phe Leu Pro Glu Ser  Ala Arg Trp Ile Gln  Arg Thr His
1100                 1105                 1110
Gly Lys  Asn Ser Leu Asn Ser  Gly Gln Gly Pro Ser  Pro Lys Gln
1115                 1120                 1125
Leu Val  Ser Leu Gly Pro Glu  Lys Ser Val Glu Gly  Gln Asn Phe
1130                 1135                 1140
Leu Ser  Glu Lys Asn Lys Val  Val Val Gly Lys Gly  Glu Phe Thr
1145                 1150                 1155
Lys Asp  Val Gly Leu Lys Glu  Met Val Phe Pro Ser  Ser Arg Asn
1160                 1165                 1170
Leu Phe  Leu Thr Asn Leu Asp  Asn Leu His Glu Asn  Asn Thr His
1175                 1180                 1185
Asn Gln  Glu Lys Lys Ile Gln  Glu Glu Ile Glu Lys  Lys Glu Thr
1190                 1195                 1200
Leu Ile  Gln Glu Asn Val Val  Leu Pro Gln Ile His  Thr Val Thr
1205                 1210                 1215
Gly Thr  Lys Asn Phe Met Lys  Asn Leu Phe Leu Leu  Ser Thr Arg
1220                 1225                 1230
Gln Asn  Val Glu Gly Ser Tyr  Asp Gly Ala Tyr Ala  Pro Val Leu
1235                 1240                 1245
Gln Asp  Phe Arg Ser Leu Asn  Asp Ser Thr Asn Arg  Thr Lys Lys
1250                 1255                 1260
His Thr  Ala His Phe Ser Lys  Lys Gly Glu Glu Glu  Asn Leu Glu
1265                 1270                 1275
Gly Leu  Gly Asn Gln Thr Lys  Gln Ile Val Glu Lys  Tyr Ala Cys
1280                 1285                 1290
Thr Thr  Arg Ile Ser Pro Asn  Thr Ser Gln Gln Asn  Phe Val Thr
1295                 1300                 1305
Gln Arg  Ser Lys Arg Ala Leu  Lys Gln Phe Arg Leu  Pro Leu Glu
1310                 1315                 1320
Glu Thr  Glu Leu Glu Lys Arg  Ile Ile Val Asp Asp  Thr Ser Thr
1325                 1330                 1335
Gln Trp  Ser Lys Asn Met Lys  His Leu Thr Pro Ser  Thr Leu Thr
1340                 1345                 1350
Gln Ile  Asp Tyr Asn Glu Lys  Glu Lys Gly Ala Ile  Thr Gln Ser
1355                 1360                 1365
Pro Leu  Ser Asp Cys Leu Thr  Arg Ser His Ser Ile  Pro Gln Ala
1370                 1375                 1380
Asn Arg  Ser Pro Leu Pro Ile  Ala Lys Val Ser Ser  Phe Pro Ser
1385                 1390                 1395
Ile Arg  Pro Ile Tyr Leu Thr  Arg Val Leu Phe Gln  Asp Asn Ser
1400                 1405                 1410
Ser His  Leu Pro Ala Ala Ser  Tyr Arg Lys Lys Asp  Ser Gly Val
1415                 1420                 1425
Gln Glu  Ser Ser His Phe Leu  Gln Gly Ala Lys Lys  Asn Asn Leu
1430                 1435                 1440
Ser Leu  Ala Ile Leu Thr Leu  Glu Met Thr Gly Asp  Gln Arg Glu
1445                 1450                 1455
Val Gly  Ser Leu Gly Thr Ser  Ala Thr Asn Ser Val  Thr Tyr Lys
1460                 1465                 1470
Lys Val  Glu Asn Thr Val Leu  Pro Lys Pro Asp Leu  Pro Lys Thr
1475                 1480                 1485
Ser Gly  Lys Val Glu Leu Leu  Pro Lys Val His Ile  Tyr Gln Lys
1490                 1495                 1500
Asp Leu  Phe Pro Thr Glu Thr  Ser Asn Gly Ser Pro  Gly His Leu
1505                 1510                 1515
Asp Leu  Val Glu Gly Ser Leu  Leu Gln Gly Thr Glu  Gly Ala Ile
1520                 1525                 1530
Lys Trp  Asn Glu Ala Asn Arg  Pro Gly Lys Val Pro  Phe Leu Arg
1535                 1540                 1545
Val Ala  Thr Glu Ser Ser Ala  Lys Thr Pro Ser Lys  Leu Leu Asp
1550                 1555                 1560
Pro Leu  Ala Trp Asp Asn His  Tyr Gly Thr Gln Ile  Pro Lys Glu
1565                 1570                 1575
Glu Trp  Lys Ser Gln Glu Lys  Ser Pro Glu Lys Thr  Ala Phe Lys
1580                 1585                 1590
Lys Lys  Asp Thr Ile Leu Ser  Leu Asn Ala Cys Glu  Ser Asn His
1595                 1600                 1605
Ala Ile  Ala Ala Ile Asn Glu  Gly Gln Asn Lys Pro  Glu Ile Glu
1610                 1615                 1620
Val Thr  Trp Ala Lys Gln Gly  Arg Thr Glu Arg Leu  Cys Ser Gln
1625                 1630                 1635
Asn Pro  Pro Val Leu Lys Arg  His Gln Arg Glu Ile  Thr Arg Thr
1640                 1645                 1650
Thr Leu  Gln Ser Asp Gln Glu  Glu Ile Asp Tyr Asp  Asp Thr Ile
1655                 1660                 1665
Ser Val  Glu Met Lys Lys Glu  Asp Phe Asp Ile Tyr  Asp Glu Asp
1670                 1675                 1680
Glu Asn  Gln Ser Pro Arg Ser  Phe Gln Lys Lys Thr  Arg His Tyr
1685                 1690                 1695
Phe Ile  Ala Ala Val Glu Arg  Leu Trp Asp Tyr Gly  Met Ser Ser
1700                 1705                 1710
Ser Pro  His Val Leu Arg Asn  Arg Ala Gln Ser Gly  Ser Val Pro
1715                 1720                 1725
Gln Phe  Lys Lys Val Val Phe  Gln Glu Phe Thr Asp  Gly Ser Phe
1730                 1735                 1740
Thr Gln  Pro Leu Tyr Arg Gly  Glu Leu Asn Glu His  Leu Gly Leu
1745                 1750                 1755
Leu Gly  Pro Tyr Ile Arg Ala  Glu Val Glu Asp Asn  Ile Met Val
1760                 1765                 1770
Thr Phe  Arg Asn Gln Ala Ser  Arg Pro Tyr Ser Phe  Tyr Ser Ser
1775                 1780                 1785
Leu Ile  Ser Tyr Glu Glu Asp  Gln Arg Gln Gly Ala  Glu Pro Arg
1790                 1795                 1800
Lys Asn  Phe Val Lys Pro Asn  Glu Thr Lys Thr Tyr  Phe Trp Lys
1805                 1810                 1815
Val Gln  His His Met Ala Pro  Thr Lys Asp Glu Phe  Asp Cys Lys
1820                 1825                 1830
Ala Trp  Ala Tyr Phe Ser Asp  Val Asp Leu Glu Lys  Asp Val His
1835                 1840                 1845
Ser Gly  Leu Ile Gly Pro Leu  Leu Val Cys His Thr  Asn Thr Leu
1850                 1855                 1860
Asn Pro  Ala His Gly Arg Gln  Val Thr Val Gln Glu  Phe Ala Leu
1865                 1870                 1875
Phe Phe  Thr Ile Phe Asp Glu  Thr Lys Ser Trp Tyr  Phe Thr Glu
1880                 1885                 1890
Asn Met  Glu Arg Asn Cys Arg  Ala Pro Cys Asn Ile  Gln Met Glu
1895                 1900                 1905
Asp Pro  Thr Phe Lys Glu Asn  Tyr Arg Phe His Ala  Ile Asn Gly
1910                 1915                 1920
Tyr Ile  Met Asp Thr Leu Pro  Gly Leu Val Met Ala  Gln Asp Gln
1925                 1930                 1935
Arg Ile  Arg Trp Tyr Leu Leu  Ser Met Gly Ser Asn  Glu Asn Ile
1940                 1945                 1950
His Ser  Ile His Phe Ser Gly  His Val Phe Thr Val  Arg Lys Lys
1955                 1960                 1965
Glu Glu  Tyr Lys Met Ala Leu  Tyr Asn Leu Tyr Pro  Gly Val Phe
1970                 1975                 1980
Glu Thr  Val Glu Met Leu Pro  Ser Lys Ala Gly Ile  Trp Arg Val
1985                 1990                 1995
Glu Cys  Leu Ile Gly Glu His  Leu His Ala Gly Met  Ser Thr Leu
2000                 2005                 2010
Phe Leu  Val Tyr Ser Asn Lys  Cys Gln Thr Pro Leu  Gly Met Ala
2015                 2020                 2025
Ser Gly  His Ile Arg Asp Phe  Gln Ile Thr Ala Ser  Gly Gln Tyr
2030                 2035                 2040
Gly Gln  Trp Ala Pro Lys Leu  Ala Arg Leu His Tyr  Ser Gly Ser
2045                 2050                 2055
Ile Asn  Ala Trp Ser Thr Lys  Glu Pro Phe Ser Trp  Ile Lys Val
2060                 2065                 2070
Asp Leu  Leu Ala Pro Met Ile  Ile His Gly Ile Lys  Thr Gln Gly
2075                 2080                 2085
Ala Arg  Gln Lys Phe Ser Ser  Leu Tyr Ile Ser Gln  Phe Ile Ile
2090                 2095                 2100
Met Tyr  Ser Leu Asp Gly Lys  Lys Trp Gln Thr Tyr  Arg Gly Asn
2105                 2110                 2115
Ser Thr  Gly Thr Leu Met Val  Phe Phe Gly Asn Val  Asp Ser Ser
2120                 2125                 2130
Gly Ile  Lys His Asn Ile Phe  Asn Pro Pro Ile Ile  Ala Arg Tyr
2135                 2140                 2145
Ile Arg  Leu His Pro Thr His  Tyr Ser Ile Arg Ser  Thr Leu Arg
2150                 2155                 2160
Met Glu  Leu Met Gly Cys Asp  Leu Asn Ser Cys Ser  Met Pro Leu
2165                 2170                 2175
Gly Met  Glu Ser Lys Ala Ile  Ser Asp Ala Gln Ile  Thr Ala Ser
2180                 2185                 2190
Ser Tyr  Phe Thr Asn Met Phe  Ala Thr Trp Ser Pro  Ser Lys Ala
2195                 2200                 2205
Arg Leu  His Leu Gln Gly Arg  Ser Asn Ala Trp Arg  Pro Gln Val
2210                 2215                 2220
Asn Asn  Pro Lys Glu Trp Leu  Gln Val Asp Phe Gln  Lys Thr Met
2225                 2230                 2235
Lys Val  Thr Gly Val Thr Thr  Gln Gly Val Lys Ser  Leu Leu Thr
2240                 2245                 2250
Ser Met  Tyr Val Lys Glu Phe  Leu Ile Ser Ser Ser  Gln Asp Gly
2255                 2260                 2265
His Gln  Trp Thr Leu Phe Phe  Gln Asn Gly Lys Val  Lys Val Phe
2270                 2275                 2280
Gln Gly  Asn Gln Asp Ser Phe  Thr Pro Val Val Asn  Ser Leu Asp
2285                 2290                 2295
Pro Pro  Leu Leu Thr Arg Tyr  Leu Arg Ile His Pro  Gln Ser Trp
2300                 2305                 2310
Val His  Gln Ile Ala Leu Arg  Met Glu Val Leu Gly  Cys Glu Ala
2315                 2320                 2325
Gln Asp  Leu Tyr
2330
<210> 2
<211> 1438
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 2
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
1               5                   10                  15
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
20                  25                  30
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
35                  40                  45
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
50                  55                  60
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
65                  70                  75                  80
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
85                  90                  95
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100                 105                 110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115                 120                 125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130                 135                 140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145                 150                 155                 160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165                 170                 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180                 185                 190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
195                 200                 205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210                 215                 220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225                 230                 235                 240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245                 250                 255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
260                 265                 270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275                 280                 285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290                 295                 300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305                 310                 315                 320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325                 330                 335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340                 345                 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355                 360                 365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370                 375                 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385                 390                 395                 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405                 410                 415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420                 425                 430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435                 440                 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450                 455                 460
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465                 470                 475                 480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
485                 490                 495
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
500                 505                 510
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
515                 520                 525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530                 535                 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545                 550                 555                 560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565                 570                 575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
580                 585                 590
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
595                 600                 605
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610                 615                 620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625                 630                 635                 640
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
645                 650                 655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
660                 665                 670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
675                 680                 685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
690                 695                 700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705                 710                 715                 720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
725                 730                 735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His
740                 745                 750
Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile
755                 760                 765
Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp
770                 775                 780
Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys
785                 790                 795                 800
Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly
805                 810                 815
Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser
820                 825                 830
Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser
835                 840                 845
Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu
850                 855                 860
Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr
865                 870                 875                 880
Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile
885                 890                 895
Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe
900                 905                 910
Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His
915                 920                 925
Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe
930                 935                 940
Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro
945                 950                 955                 960
Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln
965                 970                 975
Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr
980                 985                 990
Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn  Met Glu Arg Asn Cys  Arg Ala Pro
995                 1000                 1005
Cys Asn  Ile Gln Met Glu Asp  Pro Thr Phe Lys Glu  Asn Tyr Arg
1010                 1015                 1020
Phe His  Ala Ile Asn Gly Tyr  Ile Met Asp Thr Leu  Pro Gly Leu
1025                 1030                 1035
Val Met  Ala Gln Asp Gln Arg  Ile Arg Trp Tyr Leu  Leu Ser Met
1040                 1045                 1050
Gly Ser  Asn Glu Asn Ile His  Ser Ile His Phe Ser  Gly His Val
1055                 1060                 1065
Phe Thr  Val Arg Lys Lys Glu  Glu Tyr Lys Met Ala  Leu Tyr Asn
1070                 1075                 1080
Leu Tyr  Pro Gly Val Phe Glu  Thr Val Glu Met Leu  Pro Ser Lys
1085                 1090                 1095
Ala Gly  Ile Trp Arg Val Glu  Cys Leu Ile Gly Glu  His Leu His
1100                 1105                 1110
Ala Gly  Met Ser Thr Leu Phe  Leu Val Tyr Ser Asn  Lys Cys Gln
1115                 1120                 1125
Thr Pro  Leu Gly Met Ala Ser  Gly His Ile Arg Asp  Phe Gln Ile
1130                 1135                 1140
Thr Ala  Ser Gly Gln Tyr Gly  Gln Trp Ala Pro Lys  Leu Ala Arg
1145                 1150                 1155
Leu His  Tyr Ser Gly Ser Ile  Asn Ala Trp Ser Thr  Lys Glu Pro
1160                 1165                 1170
Phe Ser  Trp Ile Lys Val Asp  Leu Leu Ala Pro Met  Ile Ile His
1175                 1180                 1185
Gly Ile  Lys Thr Gln Gly Ala  Arg Gln Lys Phe Ser  Ser Leu Tyr
1190                 1195                 1200
Ile Ser  Gln Phe Ile Ile Met  Tyr Ser Leu Asp Gly  Lys Lys Trp
1205                 1210                 1215
Gln Thr  Tyr Arg Gly Asn Ser  Thr Gly Thr Leu Met  Val Phe Phe
1220                 1225                 1230
Gly Asn  Val Asp Ser Ser Gly  Ile Lys His Asn Ile  Phe Asn Pro
1235                 1240                 1245
Pro Ile  Ile Ala Arg Tyr Ile  Arg Leu His Pro Thr  His Tyr Ser
1250                 1255                 1260
Ile Arg  Ser Thr Leu Arg Met  Glu Leu Met Gly Cys  Asp Leu Asn
1265                 1270                 1275
Ser Cys  Ser Met Pro Leu Gly  Met Glu Ser Lys Ala  Ile Ser Asp
1280                 1285                 1290
Ala Gln  Ile Thr Ala Ser Ser  Tyr Phe Thr Asn Met  Phe Ala Thr
1295                 1300                 1305
Trp Ser  Pro Ser Lys Ala Arg  Leu His Leu Gln Gly  Arg Ser Asn
1310                 1315                 1320
Ala Trp  Arg Pro Gln Val Asn  Asn Pro Lys Glu Trp  Leu Gln Val
1325                 1330                 1335
Asp Phe  Gln Lys Thr Met Lys  Val Thr Gly Val Thr  Thr Gln Gly
1340                 1345                 1350
Val Lys  Ser Leu Leu Thr Ser  Met Tyr Val Lys Glu  Phe Leu Ile
1355                 1360                 1365
Ser Ser  Ser Gln Asp Gly His  Gln Trp Thr Leu Phe  Phe Gln Asn
1370                 1375                 1380
Gly Lys  Val Lys Val Phe Gln  Gly Asn Gln Asp Ser  Phe Thr Pro
1385                 1390                 1395
Val Val  Asn Ser Leu Asp Pro  Pro Leu Leu Thr Arg  Tyr Leu Arg
1400                 1405                 1410
Ile His  Pro Gln Ser Trp Val  His Gln Ile Ala Leu  Arg Met Glu
1415                 1420                 1425
Val Leu  Gly Cys Glu Ala Gln  Asp Leu Tyr
1430                 1435
<210> 3
<211> 227
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 3
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20                  25                  30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35                  40                  45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50                  55                  60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85                  90                  95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100                 105                 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115                 120                 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130                 135                 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145                 150                 155                 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165                 170                 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180                 185                 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195                 200                 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210                 215                 220
Pro Gly Lys
225
<210> 4
<211> 223
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 4
Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
1               5                   10                  15
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr
20                  25                  30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
35                  40                  45
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
50                  55                  60
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
85                  90                  95
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile
100                 105                 110
Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
115                 120                 125
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
130                 135                 140
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
145                 150                 155                 160
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser
165                 170                 175
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
180                 185                 190
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu
195                 200                 205
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210                 215                 220
<210> 5
<211> 229
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 5
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1               5                   10                  15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20                  25                  30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35                  40                  45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50                  55                  60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65                  70                  75                  80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85                  90                  95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100                 105                 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115                 120                 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130                 135                 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145                 150                 155                 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165                 170                 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180                 185                 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195                 200                 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210                 215                 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 6
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> синтетический
<400> 6
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
<210> 7
<211> 27
<212> БЕЛОК
<213> синтетический
<400> 7
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20                  25
<210> 8
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> синтетический
<400> 8
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 9
<211> 37
<212> БЕЛОК
<213> синтетический
<400> 9
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20                  25                  30
Gly Gly Gly Gly Ser
35
<210> 10
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> синтетический
<400> 10
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 11
<211> 33
<212> БЕЛОК
<213> синтетический
<400> 11
Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu
1               5                   10                  15
Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro
20                  25                  30
Gln
<210> 12
<211> 28
<212> БЕЛОК
<213> синтетический
<400> 12
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg
1               5                   10                  15
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
20                  25
<210> 13
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> синтетический
<400> 13
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser
1               5                   10
<210> 14
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> синтетический
<400> 14
Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
1               5                   10
<210> 15
<211> 55
<212> БЕЛОК
<213> синтетический
<400> 15
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Lys
20                  25                  30
Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser
35                  40                  45
Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
50                  55
<---