ИЗМЕРЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ АНАЛИТА
ANALYTE CONCENTRATION MEASUREMENT

Область применения изобретения
Настоящее изобретение относится к измерению концентрации аналита на основе диффузии, которое ослабляет действие факторов, мешающих диффузии.
Предпосылки создания изобретения
Для измерения/определения концентрации аналита в пробах текучей среды, например в цельной крови, применяются электрохимические датчики, такие как полоски для самоконтроля глюкозы крови (SMBG). Однако их точность может снижаться под действием факторов, мешающих диффузии (DIF), которые влияют на перенос массы аналита в испытуемых текучих средах, например гематокрита крови (Hct), поскольку эритроциты блокируют пути диффузии аналита (например, глюкозы). Для соблюдения требований к точности приборов необходимо разработать технологии, ослабляющие DIF.
Ослабление DIF подразделяется на активные подходы и пассивные подходы. Первые заключаются в применении чувствительных к DIF сигналов, чтобы получить «измерения» DIF, которые затем применяются для коррекции DIF. Трудность активных подходов состоит в том, что для них требуются дополнительные механизмы, такие как дополнительные элементы полосок, дополнительные этапы измерения, дополнительные компоненты/части устройства/измерителя. Напротив, в пассивных подходах применяются сигналы, нечувствительные к DIF, или сигналы с несущественным влиянием DIF на измерение аналита.
В патенте US8105478B2 описан способ выбора длины импульсов для измерения концентрации редокс-активного вещества как медиатора в молекулярно-биологической системе обнаружения, в которой приемлемые потенциалы прикладываются к рабочему электроду, чтобы вызвать, по меньшей мере, один из процесса окисления и процесса восстановления, которые происходят в окислительно-восстановительной реакции. Этот способ включает в себя импульс потенциала рабочего электрода с попеременным образованием фаз измерения и фаз выравнивания; выбор такой длины импульса в фазе измерения, чтобы к концу импульса емкостный ток был относительно мал по сравнению с током Фарадея; и выбор такой длины импульса в фазе выравнивания, чтобы к концу импульса градиент концентрации выравнивался так, чтобы к началу последующей фазы измерения изменение концентрации медиатора, вызванное расходованием медиатора на само измерение, возвращалось с максимальным возможным приближением к исходному уровню.
Изложение сущности изобретения
Согласно настоящему изобретению предложен способ сокращения или ослабления действия DIF в способе определения концентрации аналита с применением окислительно-восстановительной реакции в электрохимической ячейке, которая имеет, по меньшей мере, два электрода, один из которых представляет собой рабочий электрод, причем, по меньшей мере, один электрод открыт для, по меньшей мере, одного медиатора электронного транспорта; с применением, по меньшей мере, одного цикла импульсов, при этом каждый цикл имеет первый потенциал и второй потенциал; и при этом способ содержит этапы, на которых: прилагают первый потенциал для запуска фазы накопления, которая стимулирует накопление градиента концентрации медиатора на рабочем электроде или рядом с ним с концентрацией, которая снижается к основному объему раствора; прилагают второй потенциал для запуска фазы измерения и расходования установленного градиента концентрации медиатора; и измеряют силу тока, связанного со вторым потенциалом каждого цикла, во время расходования установленного градиента концентрации. Измеренную величину тока можно применять для расчета концентрации аналита.
Путем стимуляции установления градиента концентрации медиатора с концентрацией, которая снижается к основному объему раствора, на рабочем электроде во время фазы накопления в цикле определения глюкозы чувствительность по току к Hct снижается, тогда как чувствительность по току к глюкозе усиливается.
Градиент концентрации может постепенно и непрерывно снижаться к основному объему раствора. Альтернативно градиент концентрации может колебаться, в то же время по существу снижаясь к основному объему раствора.
По меньшей мере, один электрод может быть покрыт, по меньшей мере, одним медиатором электронного транспорта. Альтернативно или дополнительно электрод может находиться в растворе, который включает в себя, по меньшей мере, один медиатор электронного транспорта, и, значит, открыт для, по меньшей мере, одного медиатора электронного транспорта.
В фазе накопления на рабочем электроде может происходить восстановление, а в фазе измерения на рабочем электроде может происходить окисление. Альтернативно в фазе накопления на рабочем электроде может происходить окисление, а в фазе измерения на рабочем электроде может происходить восстановление в зависимости от природы окислительно-восстановительной реакции с участием аналита и медиатора (-ов). Как известно в данной области, от состояния медиатора (окисленный или восстановленный) зависит процесс, который должен происходить в фазе накопления перед тем, как произойдет гетерогенная реакция на поверхности электрода: восстановление или окисление. Следует также понимать, что в ряду окислительно-восстановительных реакций возможно применение более чем одного медиатора.
Кроме первого и второго потенциалов к электроду (-ам) могут прикладываться дополнительные потенциалы. Такие дополнительные потенциалы могут прикладываться перед первым потенциалом или после второго потенциала. К примеру, перед приложением, по меньшей мере, одного цикла импульсов возможно приложение стартового потенциала, причем стартовый потенциал прикладывают с незамкнутой цепью или потенциал по существу не вызывает окислительно-восстановительную реакцию на электродах. Возможно приложение стартового потенциала перед приложением каждого цикла импульсов. Во всех случаях второй потенциал должен следовать немедленно за первым потенциалом так, чтобы за фазой накопления, которая стимулирует накопление градиента концентрации, немедленно следовала фаза измерения.
Второй потенциал выполнен таким образом, что после расходования установленного градиента концентрации медиатора образуется другой градиент концентрации медиатора (устанавливается обратный градиент концентрации), но с концентрацией, которая возрастает к основному объему раствора.
0
0
Величины первого потенциала и второго потенциала могут быть симметричными относительно потенциала, который вызывает протекание по существу нулевого тока (Е). Величины первого потенциала и второго потенциала могут быть асимметричными относительно Е.
Продолжительности первого потенциала и второго потенциала могут быть одинаковыми. Продолжительности первого потенциала и второго потенциала могут быть разными. Продолжительности первого потенциала и второго потенциала могут быть менее чем 10 минут, предпочтительно менее чем 1 минута и наиболее предпочтительно менее чем 5 секунд. Продолжительности первого потенциала и второго потенциала могут составлять от 5 до 100% от общего времени каждого цикла импульсов.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложено контрольно-измерительное устройство для определения концентрации аналита с применением окислительно-восстановительной реакции в электрохимической ячейке, которая имеет, по меньшей мере, два электрода, один из которых является рабочим электродом, причем, по меньшей мере, один электрод открыт для, по меньшей мере, одного медиатора электронного транспорта; с применением, по меньшей мере, одного цикла импульсов, при этом каждый цикл имеет первый потенциал и второй потенциал; при этом измеритель выполнен с возможностью: приложения первого потенциала для запуска фазы накопления, которая стимулирует накопление градиента концентрации медиатора на рабочем электроде или рядом с ним, с концентрацией, которая снижается к основному объему раствора; приложения второго потенциала для запуска фазы измерения и расходования установленного градиента концентрации медиатора; и измерения силы тока, связанного со вторым потенциалом каждого цикла. Контрольно-измерительное устройство предпочтительно выполнено с возможностью расчета концентрации аналита с применением измеренной величины силы тока.
В фазе накопления может происходить восстановление, а в фазе измерения может происходить окисление. Альтернативно в фазе накопления может происходить окисление, а в фазе измерения может происходить восстановление в зависимости от природы окислительно-восстановительной реакции с участием аналита и медиатора (-ов). Следует также понимать, что в ряду окислительно-восстановительных реакций возможно применение более чем одного медиатора.
Второй потенциал может быть таким, что после расходования установленного градиента концентрации медиатора образуется другой градиент концентрации медиатора, но с концентрацией, которая возрастает к основному объему раствора.
0
0
Величины первого потенциала и второго потенциала могут быть симметричными относительно потенциала, который вызывает протекание по существу нулевого тока (Е). Величины первого потенциала и второго потенциала могут быть асимметричными относительно Е.
Продолжительности первого потенциала и второго потенциала могут быть одинаковыми. Продолжительности первого потенциала и второго потенциала могут быть разными. Продолжительности первого потенциала и второго потенциала могут быть менее чем 10 минут, предпочтительно менее чем 1 минута и наиболее предпочтительно менее чем 5 секунд. Продолжительности первого потенциала и второго потенциала могут составлять от 5 до 100% от общего времени для каждого цикла импульсов.
Краткое описание графических материалов
Различные аспекты изобретения будут далее описаны только в качестве примера и со ссылкой на следующие ниже чертежи, на которых:
на Фиг. 1 показано переключение окислительно-восстановительных реакций на двух электродах через управляющий потенциал;
red
на Фиг. 2 показано развитие градиента концентрации M (восстановленного медиатора) на рабочем электроде Е1 с переключением окислительно-восстановительной реакции по Фиг. 1;
на Фиг. 3 показана форма измерительного сигнала и форма контрольного сигнала, прикладываемого к электродам электрохимической ячейки;
на Фиг. 4 показана чувствительность по току к глюкозе в зависимости от времени измерения для различных проб, снятая с применением форм сигнала по Фиг. 3, где числами в условных обозначениях показаны уровни Hct в процентах; и
на Фиг. 5 показаны процентные отклонения от чувствительности по току к глюкозе при номинальном Hct через 0,3 секунды в четырех импульсах окисления с формами сигнала по Фиг. 3, где числами в условных обозначениях показано число импульсов в формах сигнала по Фиг. 3.
Подробное описание чертежей
Настоящее изобретение ослабляет влияние DIF на сигналы тока путем переключения и управления окислительно-восстановительными реакциями на рабочем и противоположном электродах электрохимических датчиков с применением медиаторов. Это выполняется посредством создания более высокой концентрации медиатора около рабочего электрода, чем в основном объеме пробы, во время фазы накопления так, что образуется градиент концентрации медиатора при начале каждой фазы измерения. Идеально, градиент концентрации медиатора распространяется в основной объем пробы, по меньшей мере, на 10 нм от рабочего электрода. Градиент концентрации медиатора не должен достигать противоположного электрода, и поэтому идеально, если максимальное распространение градиента медиатора меньше, чем расстояние между рабочим и противоположным электродами. Во многих практических воплощениях предпочтительно, чтобы к окончанию фазы накопления и началу фазы измерения градиент концентрации медиатора не распространялся дальше середины расстояния между рабочим и противоположным электродами.
На Фиг. 1 показан один цикл импульсов и стартовые соответствующие реакции окисления-восстановления в электрохимической тест-полоске с двумя электродами: рабочим электродом Е1 и противоположным электродом Е2. Два электрода покрыты слоем реагента, который содержит медиатор электронного транспорта (М) и фермент (Enz). Для измерения с полоской рабочий и противоположный электроды, Е1 и Е2 соответственно, контактируют с пробой цельной крови, и между двумя электродами прикладывается электрический потенциал (напряжение). Это приводит к окислительно-восстановительным реакциям как в крови (гомогенные окислительно-восстановительные реакции), так и на поверхностях двух электродов (гетерогенные окислительно-восстановительные реакции).
red
ox
0
red
0
ox
0
0
При гетерогенных окислительно-восстановительных реакциях одновременно происходит окисление на одном электроде и восстановление на другом. На Фиг. 1 потенциал прикладывается как ряд волн (импульсов) квадратной формы. Окислительно-восстановительные реакции на двух электродах переключаются путем изменения импульсов от потенциала восстановления (E) к потенциалу окисления (E). Это возможно сделать через управление величиной потенциала и, при необходимости, полярностью. E представляет собой потенциал с по существу нулевыми окислительно-восстановительными реакциями (ни восстановления, ни окисления). Отклонение (разность) между E и E, а также отклонение между E и E может быть одинаковым (т. е. симметричным относительно E, как показано на Фиг. 1) или разным.
Как показано на Фиг. 1, при потенциале E
окисленный медиатор (M
) осуществляет восстановление на рабочем электроде E1 (реакция 3), тогда как восстановленный медиатор (M
) осуществляет окисление на противоположном электроде Е2 (реакция 2). В то же время глюкоза (Gluc) реагирует с M
при участии фермента (Enz) с получением M
в крови (реакция 1). В результате M
«накапливается» у рабочего электрода Е1 (обе реакции 1 и 3 образуют M
) до концентрации C
, превышающей C
(начальная концентрация M
), и устанавливается градиент концентрации M
со снижением концентрации M
от поверхности рабочего электрода Е1 к основному объему раствора (см. Фиг. 2А и 2В). Градиент концентрации M
можно выразить как C
=(C
- C
)/d
. Чем больше C
, тем больше M
удерживается вблизи от поверхности электрода.
red
ox
red
ox
red
red
red
i
0
red
red
red
red
g
i
0
i
g
red
g
red
g
Кроме зависимости от скоростей реакций 1 и 3 (Фиг. 1), которые пропорциональны концентрации глюкозы, C зависит от Hct. Чем выше Hct, тем медленнее происходит диффузия M от поверхности электрода и значит, тем большее значение C устанавливается во время импульса восстановления.
red
ox
ox
red
red
red
i
0
zero
red
0
g
После изменения E на E гетерогенные окислительно-восстановительные реакции на обоих электродах переключаются (см. Фиг. 1). В случае применения импульса окисления (потенциал E) для измерения глюкозы, концентрацию глюкозы определяют путем измерения скорости реакции 5, например, посредством измерения силы тока. Скорость реакции 5 пропорциональна M, доступному у поверхности рабочего электрода Е1. Реакция 5 протекает с достаточно высокой скоростью, чтобы вызвать более быстрое расходование M, чем поступление (через диффузию) на поверхность рабочего электрода Е1. Это означает, что со временем концентрация M падает от C через C и, наконец, до C (см. пунктирную линию градиента концентрации на Фиг. 2С). После того как концентрация M на поверхности рабочего электрода Е1 снижается меньше C, C становится отрицательным, и скорость реакции 5 снижается со временем в виде модели, описываемой уравнением Коттрелла (см. ниже), а измерение глюкозы зависит от Hct.
i
n -
F -
A -
D -
t
C
2
2
3
0
Здесь  представляет собой скорость реакции 5, выраженную в величине силы тока (амперах);  число электронов, переносимых в гетерогенной окислительно-восстановительной реакции;  константу Фарадея (96 485 кулон/моль);  площадь электрода (см);  коэффициент диффузии(см/с);- время испытания (с); и  - начальную концентрацию реагента (моль/см).
g
red
red
red
red
За тот промежуток времени, когда C является положительным, скорость реакции 5 зависит от диффузии M и градиента концентрации M, установленного во время предыдущего импульса восстановления. Повышение Hct снижает диффузию M, но повышает градиент концентрации M. Следовательно, влияние Hct на измерение глюкозы компенсируется действием переключения окислительно-восстановительной реакции. Для использования преимущества такого компенсированного измерения силу тока следует измерять только в фазе расходования градиента концентрации, т. е. когда расходуется градиент концентрации. После фазы расходования, когда концентрация медиатора падает ниже начального уровня (т. е. уровня перед фазой накопления), ток становится зависимым от Hct.
red
Установления градиента концентрации M во время фазы накопления возможно достичь разными путями, включая, без ограничений, управление величиной потенциала и/или полярностью приложенных импульсов, управление соотношением эффективной поверхности обоих электродов, управление временем импульсов, управление соотношением компонентов и количества в слое реагента или любую их комбинацию. В приведенных ниже примерах для стимуляции накопления градиента концентрации медиатора с последующим расходованием установленного градиента концентрации медиатора на рабочем электроде применяется величина потенциала приложенных импульсов. Однако возможны и другие методы управления накоплением и расходованием концентрации медиатора.
red
На Фиг. 3 показана форма контрольного сигнала W69 и форма измерительного сигнала W70. Различие между формой измерительного сигнала W70 и формой контрольного сигнала W69 состоит в том, что форма измерительного сигнала W70 имеет большую величину потенциала для импульсов восстановления (импульсы 2, 4, 6, 8), чем форма контрольного сигнала W69, что способствует установлению градиента концентрации Mна рабочем электроде Е1 во время этих импульсов (см. Фиг. 1).
Как импульсы окисления, так и импульсы восстановления в форме измерительного сигнала имеют завышенный потенциал. Это означает, что потенциал имеет такую величину, которая достаточна, чтобы окислительно-восстановительные реакции на электродах подчинялись диффузии медиатора и/или аналита к электроду. Величины импульсов окисления и восстановления выбраны и управляются с принятием во внимание электрохимических свойств медиатора и электродов. Как импульсы окисления, так и импульсы восстановления могут иметь положительные, отрицательные или нулевые потенциалы.
0
0
Каждая форма сигнала по Фиг. 3 имеет 9 импульсов квадратной формы. На рабочем электроде Е1 импульсы 2, 4, 6, 8 вызывают восстановление (отрицательный ток на Фиг. 4), а импульсы 3, 5, 7, 9 вызывают окисление (положительный ток на Фиг. 4). Импульс 1 - это стартовый импульс, который прикладывается однократно перед началом повторных циклов импульсов (т. е. он не является частью повторного цикла импульсов). Импульс 1 - это импульс с заниженным потенциалом, при котором скорость окислительно-восстановительных реакций на электродах подчиняется кинетике гетерогенных окислительно-восстановительных реакций, чтобы допустить гидратацию/растворение слоя реагента на полоске (потенциал этого импульса равен Eили близок к E, чтобы свести к минимуму окислительно-восстановительную реакцию как на рабочем электроде Е1, так и на противоположном электроде Е2). Импульс 1 также может быть приложен при незамкнутой цепи.
Общее время испытания для 9 импульсов в этом эксперименте было рассчитано на 6,25 секунды, но можно закончить измерение за 5 секунд (т. е. без импульсов 8 и 9) или менее. Формы сигнала прикладывались к полоске с применением потенциостата так, что положительный потенциал приводил к окислению, а отрицательный/нулевой потенциал приводил к восстановлению на рабочем электроде Е1. Для измерения глюкозы используется ток окисления (т. е. ток положительного импульса, полученный при реакции 5, показанной на Фиг. 1). Методы определения концентрации глюкозы с применением измерения тока во время окислительно-восстановительной реакции хорошо известны в данной области и поэтому не будут описаны подробно.
Результаты лабораторных измерений динамики токов W69 и W70 показаны на Фиг. 4. Верхний ряд и нижний ряд на Фиг. 4 показывают графики чувствительности по току к глюкозе (т. е. ток в амперах, полученный на один мг/дл глюкозы) в зависимости от времени испытания при пяти целевых концентрациях глюкозы (TG) для W69 и W70 соответственно. Для каждой целевой концентрации глюкозы одну и ту же пробу крови измеряли при W69 и W70. Каждая линия на графиках представляет среднюю величину чувствительности по току из 6 повторностей. Каждый график показывает пять средних величин чувствительности по току при пяти целевых уровнях Hct (от 20% до 60%).
На Фиг. 4 показано, что на каждом графике W69 видны явные разделения между линиями положительных импульсов (измерительных импульсов). Больший Hct соответствует меньшей чувствительности по току. Это указывает на то, что измерительный ток W69 чувствителен к изменениям Hct. Напротив, на графиках W70 разделение между линиями исчезает или значительно уменьшается, т. е. действие Hct как DIF эффективно уравновешивается.
red
При W70 достигается значительно более высокая чувствительность по току по сравнению с W69, т. е. W70 имеет повышенную чувствительность по току к глюкозе по сравнению с W69. Улучшение чувствительности по току является двояким: 1) линии W70 на Фиг. 4 имеют большую величину, чем линии W69; 2) линии W70 каждого импульса имеют одинаковую или близкую величину (при наложении друг на друга перекрываются), тогда как линии каждого импульса W69 снижаются со временем, т. е. W70 сохраняет чувствительность по току за время испытания, а W69 не сохраняет. Это объясняется тем, что установленный градиент концентрации M во время импульса восстановления приводит к усилению реакции 5 в последующем импульсе окисления.
На Фиг. 5 также показано ослабление влияния Hct, причем процентное отклонение представляет разность в чувствительности по току между интересующим Hct и номинальным Hct (определяемым здесь как 42% и имеющим нулевое отклонение). В качестве примера взята чувствительность по току в точке 0,3 секунды импульсов окисления 3, 5, 7, 9 (см. Фиг. 3). Для результатов W69 отклонение от номинального Hct остается в диапазоне от около 20% до -20% с повышением Hct. Напротив, для результатов W70 отклонение от номинального Hct сокращалось до диапазона менее чем ± 10%.
В описанном выше варианте осуществления применяется управление величиной импульсов, чтобы стимулировать установление градиента концентрации. Однако ослабления DIF и, в особенности, ослабления Hct возможно достичь другими средствами. К примеру, это можно сделать, повышая отношение эффективной поверхности противоположного электрода Е2 к рабочему электроду Е1, или увеличивая продолжительность импульсов в фазе накопления. Действительно, можно применить любой метод, который стимулирует накопление градиента концентрации медиатора на рабочем электроде Е1.
В настоящем изобретении предложен простой и эффективный метод ослабления действия DIF, обеспечивая измерение, независимое от Hct. Возможно применение этого способа в существующих приборах без внесения изменений в тест-полоски.
Специалисту в данной области будет понятно, что в пределах области изобретения возможны варианты описанных конструкций. Например, хотя изобретение описано со ссылкой на тест-полоску только с двумя электродами, изобретение может быть равным образом применимо к тест-полоскам с тремя или более электродами. Равным образом, тогда как в конкретных проводимых измерениях был использован только один стартовый импульс, можно прилагать стартовый импульс перед каждым циклом накопительных и измерительных импульсов. Соответственно, предшествующее описание конкретного варианта осуществления выполнено путем описания примера и не накладывает никаких ограничений. Специалисту в данной области будет ясно, что можно вносить малые модификации без существенного изменения описанных рабочих процессов.