УСТРОЙСТВО И СПОСОБ ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ СПЕКТРОВ СОБСТВЕННОГО ИЗЛУЧЕНИЯ ЖИДКИХ ОБРАЗЦОВ В ИНФРАКРАСНОМ ДИАПАЗОНЕ
DEVICE AND METHOD FOR MEASUREMENT OF SPECTRA OF OWN RADIATION OF LIQUID SAMPLES IN INFRARED RANGE

Область техники
Изобретение относится к области биологии и биотехнологии, а именно к устройствам и способам для исследования жидких биологических образцов при измерении их спектров собственного излучения в инфракрасном диапазоне и может быть использовано для анализа химического состава и молекулярной структуры жидких образцов без внешнего облучения.
Уровень техники
Для разработки новых эффективных материалов, необходимо фундаментальное понимание молекулярных механизмов функционирования на химическом, физическом, биологическом уровнях организации, которое может быть достигнуто путем измерения их ИК спектров.
Разработка новых материалов оказывается непростой задачей, что ведет к необходимости разрабатывать различные подходы к ее решению. Для структурных молекулярных исследований применяют методы ИК спектроскопии, основанной на анализе спектров собственного излучения образцов.
В уровне техники известен патент США (US5075552, McClelland et al. December 24, 1991), в котором описано устройство и метод для измерения спектров собственного излучения образцов.
Недостатком известного решения является необходимость нагрева образца и невозможность анализа жидкостей, что ограничивает круг подходящих для измерения образцов и условий проведения измерений.
Известен патент США (US7218396, Fichet Р et al. May 15, 2007), в котором описан способ измерения эмиссионных спектров жидкостей. Недостатком является необходимость воздействовать на образец мощным лазерным излучением, что может приводить к изменениям в образце на химическом уровне.
Наиболее близким к рассматриваемому изобретению является устройство для анализа химических и биологических материалов, описанное в заявке США (US 20040259234, Chou М. et al. December 23, 2004). В заявке описано устройство для измерения спектров собственного излучения химических и биологических образцов. Устройство содержит спектрометр, регистрирующий пассивное излучение от образца, телескоп или другое оптическое устройство, холодное устройство, расположенное в поле зрения спектрометра, зеркало. Образец расположен между спектрометром и холодным устройством на горизонтальной пластине, размещенной между холодным устройством и зеркалом.
Недостатками данного устройства являются: влияние внешней температуры на результат измерений, отсутствие возможности контроля толщины слоя образца, а также изменение толщины образца и концентрации растворенных веществ за счет испарения капли размером 5 мкм или тонкого слоя, нанесенного на поверхность открытой пластины, в процессе измерения.
Таким образом, в данной области техники существует потребность в новых устройствах и способах их применения, основанных на других технических решениях для выполнения недорогого и эффективного скрининга молекулярной структуры различных жидких биологических образцов при серийно-поточных исследованиях.
Задачей изобретения является создание устройства и способа измерения для ИК спектроскопии при регистрации собственного излучения жидкостей.
-1
Технический результат состоит в том, что новая конструкция устройства и способ его применения разработаны таким образом, что позволяет проводить высокочувствительный спектральный анализ жидких образцов (истинных растворов, коллоидных систем, в том числе биологических образцов в жидком виде) в инфракрасном диапазоне (от 4000 до 15 см) без воздействия внешнего излучения, которое может приводить к изменениям в образце.
Сущность изобретения
Для достижения вышеуказанных целей объектами изобретения являются устройство и способ для измерения спектров собственного излучения жидких образцов в инфракрасном диапазоне.
Одним из аспектов изобретения является устройство, которое состоит из спектрометра, узла формирования холодного фона, зеркала, кюветы и дополнительно содержит измерительный узел, жидкостной термостат, контроллер, соединенный с компьютером. При этом спектрометр обеспечивает возможность Фурье - преобразования сигнала и содержит вакуумированный корпус с входным окном, с размещенным в корпусе охлажденным детектором. Оптическая ось между детектором, зеркалом и узлом формирования холодного фона проходит через измерительный узел, размещенный в термостатируемой кювете, которая закреплена на внешней поверхности корпуса возле входного окна спектрометра. Узел формирования холодного фона дополнительно снабжен плоским термостатом, соединенным с жидкостным термостатом обеспечивающим стабилизацию температуры черной пластины в диапазоне от 0 до +100°С. Пластина выполнена с неотражающим в инфракрасном диапазоне покрытием. Термостатируемая кювета выполнена с возможностью обеспечения быстрой регулировки толщины слоя исследуемого жидкого образца за счет смены толщины прокладки в измерительном узле между первым и вторым спектральным окном узла.
Другой аспект конструкции устройства связан с выбором параметров оптических окон в измерительном узле, в зависимости от типа жидкости, которые выполняют из материала входящего в группу, состоящую из: алмаза, фторида кальция, кремния, кварца, KRS-5, KRS-6, бромида калия, йодида цезия, хлорида натрия, полиэтилена высокого давления, селенида цинка.
Другой аспект конструкции устройства связан с выбором материала прокладок, который выбирают из: фторопласта, полиэтилена, полистирола, полипропилена.
Следующим аспектом изобретения является способ для измерения спектров собственного излучения жидких биологических образцов в инфракрасном диапазоне с использованием черной пластины для формирования холодного фона, содержит этапы, на которых:
-1
- определяют спектральную область в диапазоне от 4000 до 15 см и температуру жидкого биологического образца при измерении спектра в пределах диапазона от 0 до +100°С;
- измеряют спектр излучения фона черной пластины в определенной спектральной области и значении температуры черной пластины соответствующей температуре жидкого биологического образца, с возможностью термостатирования черной пластины в диапазоне от 0 до +100°С, при этом спектр излучения черной пластины измеряют не менее 10 раз для установления диапазона вариаций базовой линии спектров, где спектр наименьшей интенсивности запоминают в компьютере для последующего сравнения;
- отключают термостатирование черной пластины и заливают ее жидким азотом для охлаждения;
- устанавливают кювету в держатель, размещенный возле входного окна спектрометра, и подключают кювету к термостату для осуществления возможности термостатирования жидкого биологического образца при выбранной температуре в диапазоне от 0 до +100°С;
4
4
- с учетом типа растворителя, используемого для формирования жидкого биологического образца, устанавливают толщину рабочего слоя исследуемого жидкого образца с помощью прокладки, которую устанавливают в измерительной кювете между первым и вторым спектральными окнами, при этом тип растворителя, входит в группу, состоящую из воды, хлороформа, жидкого углеводорода, ДМСО, CCl, где толщина прокладки при использовании воды составляет от 4 до 20 мкм, где толщина прокладки при использовании хлороформа и ДМСО составляет от 5 до 30 мкм, где толщина прокладки при использовании жидких углеводородов составляет от 10 до 200 мкм, где толщина прокладки при использовании CCl в качестве растворителя составляет от 50 до 2000 мкм и проводят измерение спектра;
- проводят сравнение спектра излучения фона черной пластины и спектра жидкого биологического образца, где в случае меньшей интенсивности спектра жидкого образца во всей спектральной области по отношению интенсивности спектра черной пластины увеличивают толщину рабочего слоя исследуемого жидкого образца, за счет набора прокладок;
- проводят измерение спектра собственного излучения образца с достаточным количеством повторов от 1 до 50 и продолжительностью каждого повтора от 1 секунды до 1 часа, обеспечивающих требуемый уровень сигнал/шум, при этом данные спектров собственного излучения образца сохраняются в компьютере, при этом осуществляется возможность корректировки спектров излучения за счет учета частичного поглощения светового потока окнами кюветы и их собственного излучения.
Перечень фигур Фиг. 1 Структурная схема устройства
Фиг. 2 Вид сечения кюветы с установленным измерительным узлом.
Фиг. 3 Результат эксперимента по измерению спектра собственного излучения вазелинового масла с разными толщинами образа при +25°С.
2
2
Фиг 4. Разностные спектры излучения суспензии DMPC (1 мг/мл в DO) и DO при двух значениях температуры в области полосы валентных колебаний С=O групп.
Описание изобретения
При исследовании спектров собственного излучения жидких образцов с использованием холодного фона было обнаружено, что часто спектры излучения либо обладают низким отношением сигнал/шум, либо наблюдается сильное искажение спектральных полос излучения. Причем наблюдаемые погрешности спектров зависят как от типа образца, так и от температуры образца. В связи с этим возникла необходимость решения технической задачи, связанной с поиском оптимальных решений в конструкции устройства и технологии его применения для получения ИК спектров собственного излучения жидких биологических образцов в заданных условиях.
С этой целью была проанализирована физическая сущность наблюдаемого явления собственного излучения образцов. Каждый образец, обладающий поглощением в инфракрасной области, способен излучать на тех же частотах. Дело в том, что поглощение обеспечивается наличием колебательных уровней соответствующей энергии, при переходе на которые с основного уровня происходит поглощение квантов с частотами, удовлетворяющими правилу частот Бора. Также при наличии ненулевой заселенности возбужденных уровней при изучаемых температурах происходят излучательные переходы на основной уровень, что и обеспечивает собственное излучение образца. Для образцов в конденсированном состоянии (жидком и твердом) полосы поглощения сильно уширены. Для широких полос наблюдается сдвиг максимума полос излучения в сторону меньших частот, по сравнению со спектром поглощения из-за уменьшения заселенности колебательных уровней с ростом энергии (частоты квантов излучения).
Было установлено, что при увеличении толщины образца, спектр излучения которого необходимо измерить, наблюдается некий максимальный уровень интенсивности излучения для каждой частоты. Согласно описанному теоретическому обоснованию наблюдаемого излучательного процесса можно установить, что этот спектр с максимально возможной интенсивностью излучения является спектром абсолютно черного тела при температуре излучающего образца. Это было подтверждено экспериментально. Очевидно, что при увеличении толщины образца до некоторого предельного значения холодный фон уже не будет выполнять роль экрана теплового излучения, поскольку образец сам по себе станет излучать как абсолютно черное тело. То есть необходимо подбирать толщину образца таким образом, чтобы этого не происходило.
В связи с этим часто невозможно качественно измерить спектр излучения образца, не обладая критериями, на основании которых можно осознанно выбрать условия измерения. Для оптимизации процесса измерения спектров собственного излучения в способ измерения были введены дополнительные этапы по сравнению с прототипом. К ним относится: этап измерения спектра абсолютно черного тела при заданной температуре, этап корректировки длины оптического пути через исследуемый жидкостной образец и этап корректировки измеренных спектров излучения для учета влияния окон кюветы, поскольку окна могут поглощать часть излучения образца, а также сами быть источником излучения. При этом этап корректировки длины оптического пути за счет изменения толщины исследуемого образца, связан с анализом соотношений между уровнем спектрального сигнала образца в сравнении со спектром излучения абсолютно черного тела.
Структурная схема устройства для измерения инфракрасных спектров собственного излучения жидких образцов без внешнего возбуждения приведена на фиг. 1. Устройство, содержит: вакуумный ИК спектрометр с Фурье-преобразованием (1) с высокочувствительным охлаждаемым детектором (2), кювету (8), в которую устанавливают измерительный узел (19) с образцом, зеркало (7), узел формирования холодного фона (14), жидкостный термостат (10), контроллер (12), компьютер (13).
-1
Узел (14) формирования холодного фона состоит из резервуара (3) выполненного из материала с низкой теплопроводностью, например, пенопласта в который заливают жидкий азот (4). В нижней части резервуара (3) устанавливается пластина (5), покрытая черным материалом. Пластина (5) формирует холодный фон, минимизирующий попадание теплового излучения в спектрометр вместе с излучением от образца. Пластина (5) выполнена с неотражающим в ИК диапазоне черным покрытием, выполненным из мелкопористой резины или сажи. В состав узла (14) формирования холодного фона входит плоский термостат (6), представляющий собой плоскую полую емкость с двумя штуцерами для ввода и вывода прокачиваемой жидкости, подающейся из термостата (10). В качестве термостатирующей жидкости может выступать вода, спирт, силиконовое масло. Сформированный холодный фон расположен на одной оптической оси (15) с зеркалом (7), кюветой (8), детектором спектрометра (2), а его площадь такова, чтобы полностью перекрыть входную апертуру спектрометра. Излучение попадает в ИК спектрометр (1) через входное окно (9), с высоким коэффициентом пропускания в необходимом интервале инфракрасного диапазона от 4000 до 15 см.
На фиг. 2 представлена структура кюветы (8). В состав кюветы (8) входит измерительный узел (19) состоящий из первого (16) и второго (17) оптических окон и прокладки (18). Толщина прокладки (18) определяет длину оптического пути, проходящего через исследуемый жидкий образец. Смена толщины прокладки (18) позволяет оптимизировать процедуру подбора такой толщины образца, при которой достигается набольшая интенсивность излучения интересующей спектральной полосы, при этом она не превышает такую толщину образца, при которой появляются искажения спектра. Сборку измерительного узла (19) производят при размещении кюветы в горизонтальном положении. При этом в зону размещения узла устанавливают первое окно (16). На следующем этапе на поверхность первого окна устанавливают прокладку (18) и дозатором наносят раствор образца в зону, сформированную внутренним объемом прокладки (18). Затем на прокладку устанавливают второе окно (17) и с помощью гайки (22), в которой сформировано отверстие, через которое проходит световой поток (15), далее стягивают первое (16) и второе (17) окна вместе с прокладкой (18) и исследуемым образцом.
При толщинах прокладки (18) меньше оптимальной наблюдается снижение интенсивности излучения, что приводит к снижению отношения сигнал/шум. При слишком больших толщинах прокладки (18) происходит существенное самопоглощение на частотах с наибольшей интенсивностью излучения, в результате излучение не полностью доходит до детектора (2) и регистрируются полосы с измененной формой, что приводит к потере информативности спектров. В спектрах излучения есть максимально возможное излучение для каждой частоты, которое определяется излучением абсолютно черного тела при данной температуре. Для получения информативных спектров в заданном интервале частот и заданной температуре проведения эксперимента подбирается такая толщина, чтобы интенсивность излучения была близка, но не перекрывалась со спектром излучения абсолютно черного тела. Толщину прокладки (18) выбирают в пределах от 2 мкм до 2 мм. Прокладка (18) может быть выполнена из материала, входящего в группу, состоящую из: фторопласта, полиэтилена, полистирола, полипропилена Конструкция кюветы (8) в которую входит измерительный узел (19) выполнена таким образом, что первое (16) и второе (17) оптические окна являются сменными, что позволяет использовать разные материалы для достижения наилучших спектральных характеристик в необходимом спектральном интервале.
Для достижения высокого пропускания излучения (желательно более 95%) в требуемом диапазоне частот первое (16) и второе (17) окна могут быть сделаны из следующих материалов, входящих в группу, состоящую из: алмаза, фторида кальция, кремния, кварца, KRS-5, KRS-6, бромида калия, йодида цезия, хлорида натрия, полиэтилена высокого давления, селенида цинка.
В теле кюветы (8) выполнена полость, в которой крепится измерительный узел (19) и выполнен канал (21) для прокачки теплоносителя (вода, водно-спиртовой раствор, силиконовое масло), поступающего из термостата (10) для термостатирования измерительного узла (19) в заданном диапазоне от 0 до +100°С. Управление термостатом (10) производят от контроллера (12), связанного с компьютером (13). Кювета (8) устанавливается в держатель (20), закрепленный с внешней стороны спектрометра (1). При этом центр измерительного узла (19) совпадает с оптической осью (15) между детектором (2) спектрометра (1), зеркалом (7) и узлом (14) формирования холодного фона. Тело кюветы (8) может быть выполнено из стали, бронзы, латуни, дюралюминия. Устройство работает следующим образом.
-1
На первом этапе определяют спектральную область в диапазоне от 4000 до 15 см и температуру жидкого биологического образца при измерении спектра в пределах диапазона от 0 до +100°С. Далее измеряют спектр излучения фона черной пластины в определенной спектральной области и значении температуры черной пластины соответствующей температуре жидкого биологического образца, с возможностью термостатирования черной пластины в диапазоне от 0 до +100°С, при этом спектр излучения черной пластины измеряют не менее 10 раз для установления диапазона вариаций базовой линии спектров, где спектр наименьшей интенсивности запоминают в компьютере для последующего сравнения.
На следующем этапе отключают термостатирование черной пластины (6) и заливают ее жидким азотом для охлаждения, а также устанавливают кювету (8) с закрепленным в ней измерительным узлом (19) заполненным жидким образцом в держатель, размещенный возле входного окна спектрометра, и подключают кювету к термостату для осуществления возможности термостатирования жидкого биологического образца при выбранной температуре в диапазоне от 0 до +100°С.
4
4
Далее с учетом типа растворителя, используемого для формирования жидкого биологического образца, устанавливают толщину рабочего слоя исследуемого жидкого образца с помощью прокладки (18), которую устанавливают в измерительной кювете между первым (16) и вторым (17) спектральными окнами, при этом тип растворителя, входит в группу, состоящую из воды, хлороформа, жидкого углеводорода, ДМСО, CCl, где толщина прокладки при использовании воды составляет от 4 до 20 мкм, где толщина прокладки при использовании хлороформа и ДМСО составляет от 5 до 30 мкм, где толщина прокладки при использовании жидких углеводородов составляет от 10 до 200 мкм, где толщина прокладки при использовании CCl в качестве растворителя составляет от 50 до 2000 мкм и проводят измерение спектра.
На следующем этапе проводят сравнение спектра излучения фона черной пластины и спектра жидкого биологического образца, где в случае меньшей интенсивности спектра жидкого образца во всей спектральной области по отношению интенсивности спектра черной пластины увеличивают толщину рабочего слоя исследуемого жидкого образца за счет набора прокладок. Измерение спектра собственного излучения образца проводят с достаточным количеством повторов от 1 до 50 и продолжительностью каждого повтора от 1 секунды до 1 часа, обеспечивающих требуемый уровень сигнал/шум, при этом данные спектров собственного излучения образца сохраняются в компьютере.
На заключительном этапе осуществляется возможность корректировки спектров излучения за счет учета частичного поглощения светового потока окнами кюветы и их собственного излучения. С учетом этого каждый измеренный спектр излучения корректируется следующим образом:
s
I - скорректированный спектр излучения изучаемого раствора;
exp
I - измеренный спектр излучения образца в кювете на холодном фоне (нескорректированный);
w
I - спектр излучения окна кюветы на холодном фоне;
s
T - спектр пропускания образца;
w
T - спектр пропускания окна кюветы.
w
s
w
w
w
s
w
s
w
w
Член I * T * T формулы (1) позволяет вычесть из измеренного спектра излучения вклад излучения фона, прошедшего через первое окно (I), ослабленное прохождением через слой образца (I*T) и через второе окно (I*T*T). Знаменатель T в преобразовании (1) учитывает то, что излучение образца ослабляется, проходя через выходное окно кюветы.
w
s
w
w
s
w
Для реализации корректировки необходимо получать дополнительные спектры: I, T, T. При этом спектр I измеряется путем установки в держатель (20) одного спектрального окна, идентичного тому, которое используется в кювете (8), и измерению его спектра излучения с использованием холодного фона и с теми же параметрами (спектральный диапазон, разрешение, температура), как и спектры излучения. Спектры пропускания T, T измеряются на спектрометре в стандартном трансмиссионном режиме с теми же параметрами (спектральный диапазон, разрешение, температура), как и спектры излучения.
Пример №1
2
-1
На фиг. 3 показаны спектры собственного излучения вазелинового масла, измеренные описанным выше способом (материал окон CaF толщиной 6 мм), при четырех толщинах образца: 3, 20, 40, 120 мкм. Раствор образца вносили с помощью автоматической пипетки с объемом дозирования от 10 до 100 мкл. Снятие спектра проводили при температуре кюветы +25°С. Данные эксперимента приведены на фиг. 3 Из фиг. 3 видно, что спектральные полосы образца толщиной 3 мкм обладают малой интенсивностью, что прямо связано с низким качеством спектра по параметру сигнал/шум. Спектральные полосы масла толщиной 20 мкм характеризуются большей интенсивностью. При 40 мкм полосы излучения обладают еще большей интенсивностью, однако в полосе 1460 см начинает проявляться искажение вблизи ее максимума. При толщине образца 120 мкм обе полосы содержат явные искажения. Из четырех представленных спектров наиболее информативным является спектр образца толщиной 20 мкм, поскольку он близок к спектру абсолютно черного тела, но не совпадает с ним ни в одной точке в области собственных спектральных полос и, следовательно, не содержит искажений.
Представленные данные примера 1 наглядно демонстрируют важность использования спектра излучения абсолютно черного тела как ориентира для подбора оптимальных условий измерения спектров собственного излучения. Не имея спектра абсолютно черного тела, часто невозможно понять, что полосы излучения попадают в зашкаливающую область и являются искаженными. Также без этого невозможно понять, насколько можно увеличивать толщину образца, для повышения уровня сигнала без риска получить искажения в спектре.
Пример №2
-1
-1
На фиг. 4 показаны спектры 1,2-dimiristoylphosphatidylcholine (DMPC) в дейтерированной воде при двух значениях температуры 10 и 35 С.Из практики абсорбционной ИК спектроскопии известно [R. N. Lewis, А. Н. McElhaney, W. Pohle, Н.H. Mantsch, "Components of the carbonyl stretching band in the infrared spectra of hydrated 1,2-diacylglycerolipid bilayers: a reevaluation," Biophys. J. 67 (4), 2367-2375 (1994). https://doi.org/10.1016/S0006-3495(94)80723-4], что полоса колебаний С=O групп фосфолипидов в водных растворах состоит из двух перекрывающихся полос, соответствующих колебаниям гидратированных (1727 см) и дегидратированных (1742 см) групп. В зависимости от фазового состояния фосфолипида степень гидратации меняется, что дает возможность по ИК спектрам делать выводы о фазовых характеристиках фосфолипидов в различных условиях. Поскольку температура фазового перехода гель-жидкий кристалл для DMPC в воде составляет 24°С [J. F. Nagle and D.A. Wilkinson, "Lecithin bilayers. Density measurement and molecular interactions," Biophys. J. 23 (2), 159-175 (1978). doi: 10.1016/S0006-3495(78)85441-1], то выбранные два значения температуры соответствуют двум разным фазовым состояниям: гель при 10°С и жидкий кристалл при 35°С.
-1
Как видно из фиг.4, при 35°С положение максимума полосы смещено (на 6 см) в сторону меньших частот по сравнению с 10°С.Это полностью объясняется фактом большей гидратации С=O групп DMPC в состоянии жидкого кристалла, по сравнению с гелем [R. N. Lewis, А. Н. McElhaney, W. Pohle, Н. Н. Mantsch, "Components of the carbonyl stretching band in the infrared spectra of hydrated 1,2-diacylglycerolipid bilayers: a reevaluation," Biophys. J. 67 (4), 2367-2375 (1994). https://doi.org/10.1016/S0006-3495(94)80723-4].
Таким образом, данный пример демонстрирует важность точной установки температуры при работе с биологическими образцами, которая реализуется устройством.
Промышленная применимость Предлагаемое устройство предназначено для определения молекулярной структуры жидких биологических образцов, имеющих фундаментальное, промышленное или медицинское значение. Устройство и способ рассчитаны на подбор оптимальных условий для наиболее информативного анализа практически любых жидких биологических образцов, таких как истинные растворы, суспензии, эмульсии, взвеси, гели, растворы химических веществ, биологических молекул в объемах 0,2-1000 мкл для дальнейшего использования в серийно-поточной спектроскопии.
-8
-10
Учитывая высокую чувствительность (10-10 Вт) и высокое отношение сигнал/шум, метод ИК эмиссионной спектроскопии может иметь существенные преимущества перед классическим методом ИК абсорбционной спектроскопии при анализе молекулярных структур.