Сенсорный элемент на основе наночастиц золота для определения кардиомаркёров

Биомедицина • № 3,2011, C. 46-49

Localization of Brodmana fields of human cerebral cortex projections on a scalp surface

N.N. Karkischenko, A.A. Vartanov, A.V. Vartanov, D.B. Chaivanov

In this paper we develop method of localizing projections of cortical areas on a scalp surface. Method uses co-planar stereotaxic atlas as a model of a human brain. Result is given in angular coordinates, which makes it invariant to the differences of a head size.

Key words: Brodman area, transcranial neurostimulation, neuronavigation

Сенсорный элемент на основе наночастиц золота для определения кардиомаркёров

A.A. Шумков, Е.В. Супрун, В.В. Шумянцева, А.И. Арчаков

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт биомедицинской химии В.Н. Ореховича РАМН, Москва

Контактная информация: Андрей Алексеевич Шумков тел.: + 7(499)-246-58-20; факс: +7(499)-245-08-57, sumkov&Jist.ru

Разработан метод определения кардиомаркёра тропонина I с помощью инверсионной вольтампе-рометрии (ИВА). Метод основан на регистрации сигнала золотых наночастиц (АиНЧ) на электродах с иммобилизованными антителами к тропонину I. Достоверный предел обнаружения тропонина I составил 3.46 нг/мл - 32 нг/мл (147 рМ- 1.36 нМ).

Ключевые слова: кардиомаркеры, инверсионная вольтамперометрия, золотые наночастицы, тропо-нин I, антитела.

Одной из основных причин смерти и инвалидности во всем мире продолжают оставаться болезни сердца. Некроз миокарда сопровождается появлением в крови специфичных биомаркёров - белков, высвобождающихся при разрушении миоцитов: миоглобина, сердечного тропонина и специфичных ферментов - кре-атинкиназы, лактатдегидрогеназы и др. [1]. В настоящее время биологические маркеры широко используются в кардиологии для диагностики острого коронарного синдрома, повреждения функции миокарда, а также для оценки прогноза

заболевания и развития осложнений. Однако, несмотря на это, не существует «идеального» кардиального маркера, который был бы высокочувствителен и информативен на ранних стадиях развития патологического процесса [2]. Тропонин I и Т специфические маркёры повреждения ткани миокарда: их обнаружение в сыворотке крови является индикатором повреждения миокарда, и, следовательно, оба белка имеют большой потенциал в качестве определяемых сердечных биомаркёров [3, 4]. При инфаркте миокарда на 4-6 ч. количество тропонина I

начинает увеличиваться, и максимальная концентрация достигается через 12-24 ч [4]. Для селективного определения тропонина I использовали антитела (Ат) к данному белку. Тропонин Т и I электронеактивные белки распределены в диапазоне потенциалов от -600 до +600 мВ, что делает невозможным прямое определение их в плазме крови по электрохимическим параметрам.

Цель исследования

Разработать методику определения тропонина I в плазме крови по регистрации сигнала АиНЧ на поверхности электрода с помощью ИВА.

Материалы и методы

Оборудование и реактивы

Электрохимические измерения были выполнены с использованием потенцио-стата «PGSTAT12 Autolab»

с различной концентрацией [5]. АиНЧ получали путём электролиза из тетрах-лорзолотой кислоты (НАиС14) при потенциале -500 мВ и временем электронанесения 180 - 600 с.

Приготовление иммуносенсоров

На рабочую поверхность печатного графитового электрода модифицированного АиНЧ, полученного в ходе электросинтеза, наносили 1мкл 0.1М ДДАБ и высушивали в течение 15 мин. Затем на рабочую поверхность наносили 1 мкл раствора Ат к тропонину I (120 нг/мкл) и высушивали в течение 20 мин. Приготовленный иммуносенсор оставляли на ночь в холодильнике при температуре 4°С.

Определение тропонина I с помощью иммуносенсоров

На рабочую поверхность иммуносенсора наносили 1мкл плазмы крови здоровых или больных доноров ОИМ. Связывание белка со специфическими Ат проводилось при 37 °С в течение 50 мин. в термостате. Электрод перед измерением сигнала помещали в электрохимическую ячейку с 1мл ФБ(0.1МКН2Р04 +50 мМ NaCl), рН=7,4 на 30 мин. при 37° С.

Электрохимические измерения

Сенсорный элемент после 30-ми-нутной отмывки при 37°С закрепляли в электрохимической ячейке. Фоновая кривая (а) снималась в диапазоне сканирования от - 600 мВ до 600 мВ, v = 50 мВ/c, затем подавали потенциал +1,2 В, 30 с и регистрировали сигнал (Ь) в этом же диапазоне потенциалов. Аналитическим сигналом нам служила высота катодного пика восстановления АиНЧ, рассчитывающаяся по получен-

ной ВАГ (ЛН= Нсигнал - Нфон) с использованием программы СРЕ^ к по-тенциостату «Аи1:о1аЬ».

Результаты и их обсуждение

Было исследовано влияние температуры и времени инкубации на интенсивность сигнала, получаемого от АиНЧ. На рис. 1 показан график зависимости величины сигнала от температуры и времени инкубации.

АиНЧ ¿42 АнНЧ №3 Инкубация 50 инн 37*С Отмывка 5 минут 25*С

80 Инкубация 30 мин 37*С Отмывка 5 минут 25°С

60 “АиНЧ №1 Инкубации 15 мин 25*С Отмывка 5 мнпут 25*С

40 “

20 -

1 1 1

1 2 3

временем электронанесения. Величина ОСО для АиНЧ, полученных со временем электронанесения 180 с, составила 10%, а для 600 с - 15%. По этим данным были выбраны оптимальными условия получения электродов с АиНЧ: время электролиза 180 с, время инкубации -50 мин. при температуре 37°С, объём ДДАБ - 1 мкл.

АиНЧ

1=600 с

$

Я 160

в

о

¡н

О

§ 100

3

ва

АиНЧ 1=180 с

БОАВ

гМ

АиНЧ <г= 180 с V =2и1

ОБАВ ^

АиНЧ (=600 с V =2ц1

оолв ^

Рис. 1. Зависимость высоты катодного пика восстановления АиНЧ с разным временем термообработки: 1) АиНЧ №1 инкубация 1=15 мин. 25°С отмывка 1=5 мин. 25°С 2) АиНЧ №2 инкубация 1=15 мин. 37°С отмывка 1=5 мин. 25°С 3) АиНЧ №3 инкубация 1=45 мин. 37°С отмывка 1=5 мин. 25°С.

С увеличением температуры и времени инкубации электрохимический сигнал от АиНЧ увеличивается. С целью установления оптимального времени электронанесения и объёма ДДАБ был проведён следующий эксперимент: были взяты электроды с разным временем электронанесения (180 с и 600 с) и разным объемом ДДАБ (1 мкл и 2 мкл) (рис. 2).

Как видно из представленного рисунка, электрохимический сигнал, получаемый от АиНЧ с 1 мкл, больше, чем для 2 мкл. Это связано с тем, что поверхностно-активные вещества снижают интенсивность сигнала АиНЧ при измерении методом ИВА. Было рассчитано относительное стандартное отклонение (ОСО) для АиНЧ с разным

Рис. 2. Зависимость высоты катодного пика восстановления АиНЧ при различных модификациях электродов АиНЧ, полученных в ходе электролиза.

Метод инверсионной вольтамперо-метрии основан на катодном электрохимическом растворении определяемого вещества после предварительного концентрирования. Избирательное связывание тропонина I обеспечивалось с помощью Ат, иммобилизованных на электрод. На рис. 3 показан график зависимости концентрации тропонина I для

140

«

120

ев

Ы

X 100

к

о

и

=1

О 60 £

я 40

н

о

ы 20

-а

4

Контроль 2 Контроль 1

Контроль 3

ОИМ

2.88 нг/мл ОИМ

образец 2 3.46 нг/мл

образец 3 5.09 нг/мл

ОИМ образец 4 18 нг/мл ОИМ

образец 1

32 нг/мл

ч-

Рис. 3. Концентрационная зависимость тропонина I для здоровых доноров и доноров с ОИМ.

здоровых доноров и доноров больных ОИМ. Как видно из представленного рисунка, образцы плазмы крови больных доноров ОИМ и образцы плазмы крови здоровых доноров достоверно различаются между собой, также наблюдается концентрационная зависимость: чем

больше белка в плазме крови, тем интенсивность сигнала, получаемая от АиНЧ, меньше.

Заключение

Были разработаны условия получения нанопокрытия АиНЧ и электрохимический метод определения электроне-активного белка на примере тропонина

I. Интенсивность сигнала АиНЧ, регистрируемая методом ИВА, зависит от концентрации тропонина I в плазме крови. Диапазон достоверно определяемых концентраций тропонина I составляет 3,46 - 32 нг/мл (0.14 рМ - 134 рМ).

Список литературы

1. Будников Г.К. Химический анализ в медицинской диагностике // М. - Наука. 2010.

2. Дементьева И.И. и др. Сердечный белок, связывающий жирные кислоты, в оценке повреждений миокарда в кардиологии и кардиохирургии// Врач скорой помощи, 2010. 1. Р. 53-58.

3. Mahmarian J.J. The troponin conundrum: clarification through stress myocardial perfusion SPECT// J Nucl Cardiol. 2007. 14(1). P. 6-8.

4. McDonnell B. et al. Cardiac biomarkers and the case for point-of-care testing// Clin Biochem. 2009. 42(7-8). P. 549-61.

5. Suprun E. et al. Electrochemical nanobiosensor for express diagnosis of acute myocardial infarction in undiluted plasma// Biosens Bioelectron. 2010. 25(7). P. 1694-8.

Sensing device based on gold nanoparticles for detection of cardiac biomarkers

A.A. Shumkov, E.V. Suprun, V.V. Shumyantseva, A.I. Archakov

We developed electrochemical method for the determination of cardiac markers troponin I in blood plasma. This approach based on registration of gold nanoparticles on the electrode surface by means of cathodic stripping voltammetry. Electrode surface was modified with antibodies to cardiac troponin I. Sensitivity of proposed method corresponds to 3.46 ng / ml - 32 ng / ml (147 pM - 1.36 nM).

Key words: cardiac markers, stripping voltammetry, gold nanoparticles, troponin I, antibodies.