СПОСОБЫ ВЫСОКОПАРАЛЛЕЛЬНОГО И ТОЧНОГО ИЗМЕРЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

1. Способ идентификации последовательностей, которые происходят из спаренных цепей двухцепочечного фрагмента нуклеиновой кислоты, причем способ включает:
растворение множества двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты в водном растворе;
распределение раствора во множество компартментов, причем маловероятно, что компартмент содержит два или более двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты, продукты амплификации которых выравниваются с одинаковой эталонной геномной последовательностью;
копирование и амплификацию обеих цепей компартментализированных двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты посредством осуществления ПЦР;
прикрепление одной или нескольких последовательностей ДНК специфических в отношении компартмента меток к амплифицированным копиям ДНК, что приводит в результате к прикреплению одинаковой метки или набора меток к копиям обеих цепей двухцепочечного фрагмента нуклеиновой кислоты;
объединение компартментов, содержащих амплифицированные меченые копии ДНК;
секвенирование всех амплифицированных меченых копий ДНК или их субпопуляции; и
идентификацию последовательностей, которые происходят из спаренных цепей двухцепочечного фрагмента нуклеиновой кислоты, на основании наличия общей последовательности ДНК специфической в отношении компартмента метки или набора меток.
2. Способ по п. 1, в котором сравнение последовательностей, происходящих из спаренных цепей двухцепочечного фрагмента нуклеиновой кислоты, обеспечивает возможность уменьшения ошибок при определении последовательности двухцепочечного фрагмента нуклеиновой кислоты.
3. Способ по п. 2, в котором уменьшение ошибок при определении последовательности нуклеиновой кислоты применяют для идентификации малораспространенных вариантов последовательностей в смеси последовательностей нуклеиновой кислоты.
4. Способ по п. 1, в котором двухцепочечные фрагменты нуклеиновой кислоты представляют собой РНК.
5. Способ по п. 1, в котором двухцепочечные фрагменты нуклеиновой кислоты представляют собой ДНК.
6. Способ по п. 1, в котором двухцепочечные фрагменты нуклеиновой кислоты представляют собой геномную ДНК.
7. Способ по п. 1, в котором двухцепочечные фрагменты нуклеиновой кислоты представляют собой геномную бесклеточную ДНК, полученную из крови.
8. Способ по п. 1, в котором двухцепочечные фрагменты нуклеиновой кислоты представляют собой геномную ДНК, полученную из опухолевой ткани.
9. Способ по п. 1, в котором двухцепочечные фрагменты нуклеиновой кислоты представляют собой геномную ДНК, полученную из зафиксированной формалином, залитой в парафин опухолевой ткани.
10. Способ по п. 1, в котором двухцепочечные фрагменты нуклеиновой кислоты содержат геномную ДНК, с которой были лигированы синтетические адаптерные молекулы.
11. Способ по п. 10, в котором синтетическая адаптерная молекула содержит по меньшей мере один из следующих компонентов: ДНК, РНК, модифицированные основания и модификации олигонуклеотидов, не обнаруживающиеся во встречающихся в естественных условиях нуклеиновых кислотах.
12. Способ по п. 11, в котором синтетические адаптерные молекулы содержат частично двухцепочечную ДНК, которая содержит одну или несколько известных пар несоответствующих оснований перед амплификацией, что обеспечивает возможность отслеживания происхождения амплифицированных копий либо верхней цепи, либо нижней цепи ДНК.
13. Способ по п. 1, в котором двухцепочечный фрагмент нуклеиновой кислоты имеет спаривание комплементарных оснований по всей длине обеих цепей или вдоль части длины обеих цепей.
14. Способ по п. 1, в котором водный раствор компартментализируют в водные капли в масле.
15. Способ по п. 1, в котором водный раствор компартментализируют в камеры с применением твердых разделяющих сред, полужидких разделяющих сред или твердых и полужидких разделяющих сред.
16. Способ по п. 1, в котором существует менее чем 10% вероятность того, что компартмент содержит два или более двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты, продукты амплификации которых выравниваются с одинаковой эталонной геномной последовательностью.
17. Способ по п. 1, в котором существует менее чем 1% вероятность того, что компартмент содержит два или более двухцепочечных фрагментов нуклеиновой кислоты, продукты амплификации которых выравниваются с одинаковой эталонной геномной последовательностью.
18. Способ по п. 1, в котором компартментализированные двухцепочечные фрагменты нуклеиновой кислоты амплифицируют посредством ПЦР с применением одной или нескольких пар праймеров, которые нацелены на специфические геномные последовательности.
19. Способ по п. 1, в котором компартментализированные двухцепочечные фрагменты нуклеиновой кислоты амплифицируют посредством ПЦР с применением одной или нескольких пар праймеров, которые нацелены на лигированные адаптерные последовательности.
20. Способ по п. 1, в котором специфическую в отношении компартмента метку или специфический в отношении компартмента набор меток можно применять для того, чтобы отличать копии ДНК, которые амплифицируются внутри разных компартментов.
21. Способ по п. 1, в котором специфические в отношении компартмента метки последовательности ДНК включают в последовательности праймеров и прикрепляют к амплифицированным копиям ДНК при ПЦР с применением указанных праймеров.
22. Способ по п. 1, в котором компартменты содержат, в среднем, менее чем 10 специфических в отношении компартмента меток на компартмент.
23. Способ по п. 1, в котором компартменты содержат, в среднем, 2-3 специфические в отношении компартмента метки на компартмент.
24. Способ по п. 1, в котором субпопуляцию амплифицированных меченых копий ДНК выбирают для секвенирования посредством способов обогащения мишенью, таких как гибридный захват или захват в растворе.
25. Способ прикрепления одной или нескольких последовательностей ДНК специфических в отношении компартмента меток к копиям целевых молекул ДНК, которые распределены среди множества компартментов, причем способ включает:
получение водного раствора, содержащего множество молекул разведенного олигонуклеотида-матрицы (DTO), причем молекулы DTO содержат вырожденную или частично вырожденную последовательность метки, фланкированную общими последовательностями;
распределение раствора во множество компартментов;
копирование и амплификацию молекул DTO посредством ПЦР с применением праймеров, которые нацелены на общие последовательности в молекулах DTO, что дает в результате множество клональных копий DTO, которые имеют одинаковую последовательность метки, внутри компартмента; и
применение клонально амплифицированных копий DTO в качестве праймеров для прикрепления одной или нескольких последовательностей специфических в отношении компартмента меток к копиям целевых молекул ДНК внутри компартмента.
26. Способ по п. 25, в котором концентрацию молекул DTO корректируют перед компартментализацией таким образом, чтобы такие компартменты содержали, в среднем, менее чем 10 молекул DTO на компартмент до амплификации.
27. Способ по п. 25, в котором концентрацию молекул DTO корректируют перед компартментализацией таким образом, чтобы такие компартменты содержали, в среднем, 2-3 молекулы DTO на компартмент до амплификации.
28. Способ по п. 25, в котором специфичность амплификации DTO повышают посредством применения праймеров, которые не могут удлиняться до тех пор, пока блокирующий элемент не будет удален при гибридизации праймера с полностью или частично комплементарной цепью ДНК.
29. Способ по п. 25, в котором целевые молекулы ДНК разводят в том же растворе, что и молекулы DTO перед компартментализацией.
30. Способ по п. 25, в котором праймеры, применяемые для амплификации молекул DTO, разводят в том же растворе, что и молекулы DTO перед компартментализацией.
31. Способ по п. 25, в котором праймеры, применяемые для амплификации молекул DTO, имеют неравную концентрацию, что приводит в результате к получению одноцепочечных копий DTO, которые являются доступными для гибридизации с целевыми молекулами ДНК.
32. Способ параллельного количественного определения целевых РНК из множества образцов, причем способ включает:
получение множества образцов РНК;
синтез праймеров с применением стратегии модульного синтеза олигонуклеотидов, причем синтез приостанавливают после создания множества разных мишень-специфических праймеров, затем частично синтезированные праймеры смешивают и дозируют во множество отдельных объемов, а затем синтез возобновляют с добавлением по меньшей мере последовательности уникальной специфической в отношении образца метки к смеси праймеров в каждом отдельном объеме;
применение праймеров, полученных посредством модульного синтеза, для присвоения специфических в отношении образца меток комплементарным ДНК, которые скопировались с целевых РНК в соответствующих соотношениях в каждом образце в ходе обратной транскрипции;
объединение в пул и очистку меченых комплементарных ДНК из всех образцов;
отдельную амплификацию каждой комплементарной ДНК-мишени посредством ПЦР с детекцией по "конечной точке";
объединение в пул и секвенирование продуктов амплификации; и
подсчет количества специфических в отношении образца меток, ассоциированных с разными последовательностями-мишенями для определения относительной распространенности целевых РНК во всех образцах.