СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ И/ИЛИ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ОСТРОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ПОЧЕК
METHOD FOR ACUTE KIDNEY DAMAGE DIAGNOSTICS AND/OR PREDICTION

Область техники
В целом, настоящее изобретение относится к области биомедицины, в частности, к способу диагностирования и/или прогнозирования острого повреждения почек.
Уровень техники
Основной причиной послеоперационного нарушения функции трансплантата при пересадке почек является острый тубулярный некроз (ОТН). Кроме того, ОТН способствует повышенной частоте развития острого отторжения, развитию хронического отторжения и снижению срока жизнеспособности трансплантата (Pannu et al., 2008). Увеличение потребности в органах в последние годы влечет за собой применение органов от субоптимальных доноров, включая асистолических и старых доноров, что значительно повышает процент развития послетрансплантационного ОТН, болезненности трансплантата и нарушения его функционального восстановления. Это увеличивает общую экономическую стоимость почечного трансплантата для системы здравоохранения. Необходимо отметить, что согласно последним статистическим данным Национальной организации трансплантации (НОТ) в Испании реализуется приблизительно 2200 почечных трансплантатов в год, и более 4 ООО пациентов остаются в списке ожидающих (Dominguez-Gil and Pascual. 2008). С другой стороны, ОТН является наиболее распространенной морфологической манифестацией острой почечной недостаточности (ОПН), в том числе, ишемического происхождения (Kellum et al., 2008). В современном мире ОПН представляет собой одну из наиболее серьезных проблем среди почечных заболеваний из-за высокой смертности (приблизительно 50%). Приблизительно 30% всех случаев ОПН возникает у пациентов, оказавшихся в реанимации в результате полиорганного поражения. В связи с этим смертность достигает 80% (Chertow et al., 2005). Развитие ОПН также является одним из наиболее распространенных осложнений после операций на сердце, приблизительно 30000/год которых выполняют в Испании, и более чем 1% из них в нашем госпитале. В сущности, у всех прооперированных пациентов развивается определенная степень ОПН (Yates and Stafford-Schmit, 2006). От тяжести этой послеоперационной ОПН зависит долгосрочное лечение пациентов, приводящее к смертности, достигающей 60% в данных случаях, требующих диализа после кардиохирургии (Takar et al., 2005; Candela-Toha et al., 2008). Как трансплантация почек, так и кардиохирургия представляют собой два квазиэкспериментальных случая для исследования ОТН человека, поскольку известны момент и продолжительность ишемического стимула, которые к тому же могут быть мониторируемы. Вся эта статистика заболеваемости/смертности существенно не изменилась в последние десятилетия, и до сих пор не существует эффективной терапии для предотвращения и/или уменьшения ОТН во всех случаях. Это в значительной степени объясняется отсутствием маркеров почечного повреждения - более точных, чем определение сывороточного креатинина и мочевины, применяемое до сих пор. Эти классические маркеры не отражают напрямую повреждение клеток, или того, в какой части почечной ткани (канальцы или эндотелий) возникает повреждение; они являются только параметрами, свидетельствующими об изменении почечной функции в результате повреждения (Vaidya et al., 2008). Фактически, не исключено, что пациенты с субклиническим повреждением почек не выявляются, поскольку, по существу, не происходит значительного изменения уровней сывороточного креатинина и мочевины. Таким образом, в последние годы проводят многочисленные исследования с целью идентификации и проверки достоверности новых маркеров ОПН, таких как NGAL, IL18, KIM, Cystatin С, VEGF или CXCL10, которые, по-видимому, служат хорошими маркерами в популяции детей без существенных патологий, но не в популяции взрослых (Vaidya et al., 2008).
Почечная ишемия, гиповолемия и отравления представляют собой наиболее частые случаи развития ОТН. Снижение тока крови и как результат гипоксия ткани, приводит к повреждению на уровне проксимального тубулярного эпителия, вызывает быстрое уменьшение гломерулярного фильтрата, изменяет проницаемость сосудов и стимулирует воспалительный ответ, увеличивающий повреждение ткани (Thurman et al., 2007). Степень и величина ишемического повреждения зависит от тяжести и
продолжительности ишемии. При сублетальной ишемии можно наблюдать отслоение клеток проксимального эпителия, многие из которых жизнеспособны, в полость канальца. При продолжительной ишемии длительная гипоксия ткани и воспалительный ответ, в числе прочего, увеличивают повреждения эпителия и сосудов с гибелью клеток в кортико-медуллярной зоне почки. С другой стороны, сосудистый отдел также повреждается после ишемии. Фактически, повреждение эндотелия в значительной мере способствует острому повреждению почек, а также поддержанию его в течение времени. Начальные изменения в перитубулярном токе в течение ишемии и начальная реперфузия ассоциированы с нарушением морфологии эндотелия и функции, что способствует утрате функции барьера, воспалению и прокоагулирующей активности. При средней продолжительности описано снижение плотности капилляров, благоприятствующее развитию хронического повреждения почек как прямого результата начальной ишемии (Basile 2007). Для устранения ОТН, запускаются механизмы, способствующие восстановлению тканей: деление клеток и дифференциация неповрежденных эпителиальных тубулярных клеток. В последние годы, некоторые исследования продемонстрировали, что заживлению тубулярного некроза после ишемии могут способствовать не только неповрежденные эпителиальные клетки сами по себе, которые дедифференцируются и пролиферируют, но и почечные плюрипотентные клетки и даже внепочечные плюрипотентные клетки - такие, как клетки костного мозга (Lin 2008). Однако участие стволовых клеток в восстановлении ишемического повреждения подвергается сомнению, хотя общепринято, что восстановлению существенно способствуют неповрежденные проксимальные тубулярные клетки и реваскуляризация паренхимы. Предполагается, что в этом последнем процессе также будут участвовать эндотелиальные родительские клетки, мобилизованные после ишемии (Becherucci et al., 2009).
МикроРНК представляют собой эндогенно кодируемые РНК небольшого размера (22-25 нуклеотида), способные распознавать матричные РНК и, таким образом, негативно регулировать экспрессию белков среди РНК-индуцируемых сайленсинг-комплексов (RISC) за счет полной или частичной комплементарности со своими мишенями - мРНК (Chang and Mendel1, 2007). У человека более чем 700 из них уже клонировано, и, согласно биоинформатическим прогнозам, все из них могут контролировать экспрессию более чем 30% всех белков (Filipowicz et al., 2008). Большинство транскрибируется посредством RNA Pol II с отдельных генов или с транскрибируемых полицистронов, для некоторых из них в одно и то же время. Они образуются в виде более длинных пре-микроРНК, процессируемых в ядре посредством рибонуклеазы III (Drosha), попадают в цитоплазму за счет экспортин-5- и Ran-ГТФ-зависимых механизмов и здесь окончательно процессируются посредством другой рибонуклеазы III (Dicer) до своей зрелой формы (Rana 2007). Их функция является существенной для большого разнообразия процессов, включающих эмбриональное развитие, ответ на стресс или точную регуляцию физиологических процессов и, следовательно, поддержание гомеостаза в организме. Важно отметить, что профиль экспрессии микроРНК является специфичным для типа клеток и может изменяться в зависимости от стимула, так что определенное содержание в клетках одинаковых микроРНК будет определять их формирование в направлении определенного типа клеток (Bartel 2009). По этой причине дерегуляция определенных микроРНК была отмечена среди механизмов, ответственных за развитие патологий, таких, как рак (Bartels and Tsongalis, 2009), аутоиммунные заболевания (Sonkoly and Pivarcsi 2008), диабет (Zhou et al., 2008) или сосудистые патологии (Urbich et al., 2008), и микроРНК подходят на роль точных биомаркеров развития многих из них. Кроме того, совсем недавно было продемонстрировано, что микроРНК являются быстрыми и точными ключевыми регуляторами клеточного ответа в присутствии любого типа стимула, включая недостаток питательных веществ и гипоксию (Ivan et al., 2008). С другой стороны, также было продемонстрировано, что эти микроРНК вместе с мРНК могут быть секретированы или получены клетками в виде микрочастиц (микровезикулы тромбоцитов; экзосомы опухолевых клеток; эктосомы нейтрофилов (Valadi et al., 2007). Так, они могут быть определены в жидкостях тела, таких как кровь, моча или плевральная жидкость. Фактически, установлено, что периферическая кровь здоровых индивидуумов может содержать микрочастицы в концентрации 5-50 мг/мл, которая будет повышаться в случае пациентов с различными патологиями (Hunter et al., 2008). Это позволит провести достоверный мониторинг развития этих патологий при помощи образцов, полученных посредством наименее инвазивных методов (взятие крови или сбор мочи (Gilad 2008)). МикроРНК, выявленные в моче, в том числе miR-127, показали высокую стабильность, даже при агрессивных условиях (Melkonyan et al., 2008). Учитывая, что дерегуляция микроРНК может вызывать различные патологии, их рассматривают в качестве новых мишеней для терапевтического воздействия. Фактически, разработаны инструменты для модулирования их экспрессии: пре-микроРНК для повышения их экспрессии и антагомиры (анти-микроРНК) для их ингибирования, с очень обнадеживающими результатами на различных экспериментальных моделях in vitro и in vivo (Krutzfeld et al., 2006; Care et al., 2007; Van Rooij et al., 2008), хотя их эффективность в качестве терапевтической стратегии для людей еще должна быть подтверждена.
В отношении роли микроРНК при ответе на ишемию была определена их экспрессия при фокальной церебральной ишемии у крыс, установлена взаимосвязь между экспрессией miR-145 и церебральным нарушением (Dharap et al., 2009). При ишемии сердца miR-100 и miR-133, вероятно, участвуют в механизме повреждения сердца (Sucharov С, et al., 2008). Также при ишемии печени у людей в качестве медиатора повреждения была выявлена miR-223 (Yu et al., 2008). В то же время, miR-126 и miR-210 описаны как ключевые промоторы ангиогенеза, неоваскуляризации и восстановления тканей в ответ на различные стимулы, включая гипоксию (Suarez and Sessa, 2009; Fasanaro et al., 2008; van Solingen et al., 2008). До настоящего времени микроРНК, изменяющиеся в зависимости от RI (резистивный индекс) почек, не были описаны в литературе, но, несомненно, положено начало предположениям об их возможном применении в качестве биомаркеров при ренальных патологиях, включая таковые, вовлекающие нарушения в регуляцию кровяного давления (Liang М et al., 2009). В другом контексте, идентифицированы некоторые микроРНК, ассоциированные с иммунным отторжением при почечной трансплантации (Sui et al., 2008).
Все вышеизложенное подтверждает необходимость
идентификации и проверки достоверности новых более точных биомаркеров развития почечного повреждения, служащих признаком того, какой участок ткани и в какой степени разрушается и/или восстанавливается, определение чего является более быстрым, легким и не требует биопсии у пациента.
Описание изобретения
Таким образом, в первом аспекте настоящего изобретения предложен способ диагностирования и/или прогнозирования острого повреждения почек, предусматривающий анализ образца от пациента с целью определения уровня экспрессии по меньшей мере одной микроРНК, выбранной из miR-127, miR-12 6, miR-210 и miR-101, и сравнение упомянутого уровня со значением контроля, где изменение упомянутого уровня свидетельствует о повреждении почки.
В частности, в одном аспекте настоящего изобретения анализируемый образец от пациента представляет собой кровь. В частности, в другом аспекте настоящего изобретения образец представляет собой сыворотку. В другом аспекте настоящего изобретения образец представляет собой мочу.
В частности, в другом аспекте диагностирование и/или прогнозирование острого повреждения почек выполняют посредством определения уровня экспрессии только miR-127 или в сочетании по меньшей мере с одной микроРНК, выбранной из miR-126, miR-210 и miR-101.
В частности, в одном аспекте снижение уровня экспрессии сывороточной miR-127 в отношении значения контроля свидетельствует об остром повреждении почек.
В частности, в одном аспекте повышение уровня экспрессии miR-127 в моче в отношении значения контроля свидетельствует об остром повреждении почек.
В частности, в одном аспекте диагностирование и/или прогнозирование острого повреждения почек выполняют посредством определения уровня экспрессии только miR-12 6 или в сочетании по меньшей мере с одной микроРНК, выбранной из miR-127, miR-210 и miR-101.
В частности, в одном аспекте снижение уровня экспрессии сывороточной miR-12 6 в отношении значения контроля свидетельствует об остром повреждении почек.
В частности, в одном аспекте диагностирование и/или прогнозирование острого повреждения почек выполняют посредством определения уровня экспрессии только miR-210 или в сочетании по меньшей мере с одной микроРНК, выбранной из miR-127, miR-126 и miR-101.
В частности, в одном аспекте повышение уровня экспрессии сывороточной miR-210 в отношении значения контроля свидетельствует об остром повреждении почек.
В частности, в одном аспекте снижение уровня экспрессии miR-210 в моче в отношении значения контроля свидетельствует об остром повреждении почек.
В частности, в одном аспекте диагностирование и/или прогнозирование острого повреждения почек выполняют посредством определения уровня экспрессии только miR-101 или в сочетании по меньшей мере с одной микроРНК, выбранной из miR-127, miR-126 и miR-210.
В частности, в одном аспекте, повышение уровня экспрессии сывороточной miR-101 в отношении значения контроля свидетельствует об остром повреждении почек.
В настоящем изобретении «острое повреждение почек» относится к повреждению почек с ишемической этиологией, как первичному, так и вторичному, например, представляет собой случай повреждения почек в результате отравления или в результате применения рентгеноконтрастных средств, и в любом случае, исключая хроническое повреждение почек.
В частности, в одном аспекте настоящего изобретения экспрессию микроРНК определяют посредством ПЦР. В частности, в одном аспекте, экспрессию микроРНК определяют посредством количественной ПЦР. В частности, в одном аспекте экспрессию микроРНК определяют посредством мультиплексной ПЦР.
В частности, в другом аспекте настоящего изобретения экспрессию микроРНК определяют посредством полных РНК-микрочипов.
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к набору для диагностирования и/или прогнозирования острого повреждения почек, содержащему пробы и праймеры, необходимые для выполнения способа по настоящему изобретению.
В частности, в одном аспекте настоящего изобретения набор содержит пробы и праймеры, необходимые для определения уровня экспрессии по меньшей мере одной микроРНК, выбранной из miR-127, miR-126, miR-210 и miR-101.
В частности, в другом аспекте настоящего изобретения набор содержит РНК-микрочип.
Описание фигур
Фигура 1 изображает экспрессию miR-12 6 в НК-2 проксимальных тубулярных клетках человека, подвергшихся протоколу гипоксии/реоксигенации. NX: клетки при нормальных условиях в отношении наличия кислорода (нормоксия, 21%) и наличия питательных веществ (полная среда с 10% ЭБС (эмбриональная бычья сыворотка)) СС: клетки контроля, подвергнутые ограничению по питательным веществам (клетки в свободной от питательных веществ среде). Hyp: клетки, подвергшиеся ограничению по питательным веществам и кислороду в течение 6 ч (1% кислорода, свободная от питательных веществ среда); R-3, R-6, R-24 ч: клетки после 6 ч гипоксии снова при нормальных условиях: наличие кислорода и питательных веществ.
Фигура 2 изображает экспрессию miR-210 в НК-2 проксимальных тубулярных клетках человека, подвергшихся протоколу гипоксии/реоксигенации. NX: клетки при нормальных условиях в отношении наличия кислорода (нормоксия, 21%) и наличия питательных веществ (полная среда с 10% ЭБС) СС: клетки контроля, подвергшиеся ограничению по питательным веществам (клетки в среде свободной от питательных веществ). Hyp: клетки, подвергшиеся ограничению по питательным веществам и кислороду (кислород 1%, свободная от питательных веществ среда); R-3, R-6, R-24 ч: клетки снова при нормальных условиях наличия кислорода и питательных веществ.
Фигура 3 изображает экспрессию miR-101 в НК-2 проксимальных тубулярных клетках человека, подвергшихся протоколу гипоксии/реоксигенации. NX: клетки при нормальных условиях в отношении наличия кислорода (нормоксия, 21%) и наличия питательных веществ (полная среда с 10% ЭБС) СС: клетки контроля, подвергшиеся ограничению по питательным веществам (клетки в свободной от питательных веществ среде). Hyp: клетки, подвергшиеся ограничению по питательным веществам и кислороду (кислород 1%, свободная от питательных веществ среда); R-3, R-6, R-24 ч: клетки снова при нормальных условиях наличия кислорода и питательных веществ.
Фигура 4 изображает экспрессию miR-127 в НК-2 проксимальных тубулярных клетках человека, подвергшихся протоколу гипоксии/реоксигенации. NX: клетки при нормальных условиях в отношении наличия кислорода (нормоксия, 21%) и наличия питательных веществ (полная среда с 10% ЭБС) СС: клетки контроля, подвергшиеся ограничению по питательным веществам (клетки в свободной от питательных веществ среде). Hyp: клетки, подвергшиеся ограничению по питательным веществам и кислороду (кислород 1%, свободная от питательных веществ среда); R-3, R-6, R-24 ч: клетки снова при нормальных условиях наличия кислорода и питательных веществ.
Фигура 5 изображает экспрессию miR-101 в NRK-52E проксимальных тубулярных клетках крысы, подвергшихся протоколу гипоксии/реоксигенации. NX: клетки при нормальных условиях в отношении наличия кислорода (нормоксия, 21%) и наличия питательных веществ (полная среда с 10% ЭБС) СС: клетки контроля, подвергшиеся ограничению по питательным веществам
(клетки в свободной от питательных веществ среде). Hyp: клетки, подвергшиеся ограничению по питательным веществам и кислороду (кислород 1%, свободная от питательных веществ среда); R-15 мин, R-30 мин, R-1 ч, R-3 ч, R-6 ч, R-24 ч: клетки снова при нормальных условиях наличия кислорода и питательных веществ.
Фигура 6 изображает экспрессию miR-127 в NRK-52E проксимальных тубулярных клетках крысы, подвергшихся протоколу гипоксии/реоксигенации. NX: клетки при нормальных условиях в отношении наличия кислорода (нормоксия, 21%) и наличия питательных веществ (полная среда с 10% ЭБС). СС: клетки контроля, подвергшиеся ограничению по питательным веществам
(клетки в свободной от питательных веществ среде). Hyp: клетки, подвергшиеся ограничению по питательным веществам и кислороду (кислород 1%, свободная от питательных веществ среда); R-15 мин, R-30 мин, R-1 ч, R-3 ч, R-6 ч, R-24 ч клетки снова при нормальных условиях наличия кислорода и питательных веществ.
Фигура 7 изображает экспрессию miR-101 в НМЕС эндотелиальных клетках человека, подвергшихся протоколу гипоксии/реоксигенации. NX: клетки при нормальных условиях в отношении наличия кислорода (нормоксия 21%) и наличия питательных веществ (полная среда с 10% ЭБС). СС: клетки контроля, подвергшиеся ограничению по питательным веществам (клетки в свободной от питательных веществ среде). Hyp: клетки, подвергшиеся ограничению по питательным веществам и кислороду (кислород 1%, свободная от питательных веществ среда); R-15 мин, R-30 мин, R-1 ч, R-3 ч, R-24 ч: клетки снова при нормальных условиях наличия кислорода и питательных веществ.
Фигура 8 изображает экспрессию miR-127 в НМЕС эндотелиальных клетках человека, подвергшихся протоколу гипоксии/реоксигенации. NX: клетки при нормальных условиях в отношении наличия кислорода (нормоксия, 21%) и питательных веществ (полная среда с 10% ЭБС). СС: клетки контроля, подвергшиеся ограничению по питательным веществам (клетки в свободной от питательных веществ среде). Hyp: клетки, подвергшиеся ограничениям по питательным веществам и кислороду (кислород 1%, свободная от питательных веществ среда); R-15 мин, R-30 мин, R-1 ч, R-3 ч, R-24 ч: клетки снова при нормальных условиях наличия кислорода и питательных веществ.
Фигура 9 изображает экспрессию miR-210 в НМЕС эндотелиальных клетках человека, подвергшихся протоколу гипоксии/реоксигенации. NX: клетки при нормальных условиях в отношении наличия кислорода (нормоксия, 21%) и питательных веществ (полная среда с 10% ЭБС). СС: клетки контроля, подвергшиеся ограничению по питательным веществам (клетки в свободной от питательных веществ среде). Hyp: клетки, подвергшиеся ограничениям по питательным веществам (кислород 1%, свободная от питательных веществ среда); R-15 мин, R-30 мин, R-1 ч, R-3 ч, R-24 ч: клетки снова при нормальных условиях наличия кислорода и питательных веществ.
Фигура 10 изображает экспрессию miR-12 6 в НМЕС эндотелиальных клетках человека, повергшихся гипоксии/реоксигенации. NX: клетки при нормальных условиях в отношении наличия кислорода (нормоксия, 21%) и питательных веществ (полная среда с 10% ЭБС). СС: клетки контроля, подвергшиеся ограничению по питательным веществам (клетки в свободной от питательных веществ среде). Hyp: клетки, подвергшиеся ограничениям по питательным веществам и кислороду (кислород 1%, свободная от питательных веществ среда); R-15 мин, R-30 мин, R-1 ч, R-3 ч, R-24 ч: клетки снова при нормальных условиях наличия кислорода и питательных веществ.
Фигура 11 изображает экспрессию сывороточной miR-127 пациентов с диагнозом острая почечная недостаточность (ОПН) ишемической этиологии. Контроль: экспрессия микроРНК у здоровых пациентов, равная 1. Показатели экспрессии у пациентов соотносят с этим показателем. 0 ч, и 3 дня: периоды времени, в которые брали образцы от пациента при начале ОПН (0 ч) и позднее при ее развитии (3 дня).
Фигура 12 изображает экспрессию miR-127 в моче пациента с диагнозом острая почечная недостаточность (ОПН) ишемической этиологии. Контроль: экспрессия микроРНК у здоровых пациентов, равная 1. Показатели экспрессии у пациентов соотносят с этим показателем. 0 ч, и 3 дня: периоды времени, в которые берут образец от пациента, при начале ОПН (0 ч) и позднее при ее развитии (3 дня).
Фигура 13 изображает экспрессию сывороточной miR-12 6 пациента с диагнозом острая почечная недостаточность (ОПН) ишемической этиологии. Контроль: экспрессия микроРНК у здоровых пациентов, равная 1. Показатели экспрессии у пациента соотносят с этим показателем. 0 ч и 3 дня: периоды времени, в которые берут образец от пациента при начале ОПН (0 ч) и позднее при ее развитии (3 дня).
Фигура 14 изображает экспрессию сывороточной miR-210 пациентов с диагнозом острая почечная недостаточность (ОПН) ишемической этиологии. Контроль: экспрессия микроРНК у здоровых пациентов, равная 1. Показатели экспрессии пациентов соотносят с этим показателем. День 0, день 1, день 2, день 3, день 7: периоды времени, в которые берут образец от пациента, при начале ОПН (0 ч) и позднее при ее развитии.
Фигура 15 изображает экспрессию miR-210 в моче пациентов с диагнозом острая почечная недостаточность (ОПН) ишемической этиологии. Контроль: экспрессия микроРНК у здоровых людей, равная 1. Показатели экспрессии пациента соотносят с этим показателем. День 0, день 1, день 2, день 3, день 7: периоды времени, в которые берут образец от пациента, при начале ОПН (0 ч) и позднее при ее развитии.
Фигура 16 изображает экспрессию сывороточной miR-101 пациентов с диагнозом острая почечная недостаточность (ОПН) ишемической этиологии. Контроль: экспрессия микроРНК у здоровых людей, равная 1. Показатели экспрессии пациента соотносят с этим показателем. День 0, день 1, день 2, день 3, день 7: периоды времени, в которые берут образец от пациента, при начале ОПН (0 день) и позднее при ее развитии.
Фигура 17 изображает экспрессию miR-101 в образцах сыворотки a: пациентов, относящихся к группе IA, b: пациентов, относящихся к группе IB, и c: пациентов, относящихся к группе II.
Фигура 18 изображает экспрессию miR-127 в образцах сыворотки a: пациентов, относящихся к группе IA, b: пациентов, относящихся к группе IB, и c: пациентов, относящихся к группе II.
Фигура 19 изображает экспрессию miR-126 в образцах сыворотки a: пациентов, относящихся к группе IA, b: пациентов, относящихся к группе IB, и c: пациентов, относящихся к группе II.
Фигура 20 изображает экспрессию miR-210 в образцах сыворотки a: пациентов, относящихся к группе IA, b: пациентов, относящихся к группе IB, и c: пациентов, относящихся к группе II.
Подробное описание изобретения
При помощи чипов было установлено, что микроРНК: miR-127, miR-126, miR-210 и miR-101 на модели HR, не показывающей RI, экспрессировались различными путями так, что каждая из этих микроРНК, поодиночке или в сочетании выступала в качестве маркера повреждения почек.
Пример 1: Экспрессия микроРНК в линии клеток, подвергшихся гипоксии/реоксигенации.
2
Следующие клетки (НК2: проксимальные тубулярные клетки человека, NRK-52E: проксимальные тубулярные клетки крысы и НМЕС: эндотелиальные клетки микрососудов человека) культивировали в соответствующих устройствах, содержащих специфическую сыворотку, антибиотики и факторы роста. Клетки хранили при 37°C, при влажной атмосфере и 5% СO.
2
2
2
Линии клеток, описанные выше, подвергали протоколу гипоксии/реоксигенации. А именно, линии клеток подвергали изменениям в давлении кислорода и в наличии питательных веществ. Для этой цели применяли два различных инкубатора: гипоксия в герметичном инкубаторе при 37°C, перфузируемом при помощи 5% СO, 1% 02, 94% N; реоксигенация в стандартном инкубаторе при 37°C, при помощи 5% СO. Клетки растили до конфлюэнции и сыворотку отбирали за 24 часа до гипоксии. В течение гипоксии клетки хранили в минимальной среде, свободной от сыворотки (HBSS), с низкой концентрацией глюкозы или производных. В течение реоксигенации применяли полную среду (Saenz-Morales et al., 2006). Время гипоксии для всех образцов составляло 6 часов, а время реоксигенации было различным (15 мин-72 ч). Все эксперименты in vitro повторяли по меньшей мере 3 раза.
Затем определяли экспрессию различных микроРНК в линиях клеток посредством ПЦР, для этой цели и после экстракции общей РНК из образцов жидкостей (сыворотка или моча) и их титрования, 50 нанограмм каждой из них применяли для реакции обратной транскрипции (ОТ) в 15 микролитрах. Для этого этапа применяли специальные коммерческие праймеры (праймеры «стебель-петля»). Эти праймеры были специфичны к каждой микроРНК. Смесь после ОТ использовали для реакции амплификации при помощи способа количественной ПЦР (кПЦР). В данной реакции, проводимой в 10 микролитрах, применяли 1 микролитр всей реакционной смеси после ОТ и специфичные праймеры для каждой микроРНК, а также пробу Taqman с флуоресцентной меткой и гасителем. Все реагенты, оба праймера и реакционные смеси с ферментами и нуклеотидами для ОТ и ПЦР были изготовлены Applied Biosystems. Были получены следующие результаты.
Как приведено на Фигуре 1, уровни экспрессии miR-126, сильно зависели от наличия питательных веществ и кислорода, поскольку ограничение по тому и другому в значительной мере снижало ее экспрессию относительно нормальных условий. Экспрессию микроРНК восстанавливали в течение реоксигенации, при которой клеткам возвращали кислород и питательные вещества. Следовательно, снижение экспрессии miR-126 свидетельствовало о недостаточности питательных веществ и кислорода для проксимальных тубулярных клеток, являющейся признаком ишемии почек. С другой стороны, учитывая, что на 3 ч реоксигенации было зафиксировано сильное повреждение эпителия in vitro, низкая экспрессия этой микроРНК свидетельствовала о повреждении проксимального тубулярного эпителия после ишемии.
Как приведено на Фигуре 2, уровни экспрессии miR-210, так же как miR-126, сильно зависели от наличия питательных веществ и кислорода, поскольку ограничение и по тому и по другому значительно снижало ее экспрессию относительно нормальных условий. Экспрессию микроРНК восстанавливали в течение реоксигенации, при которой клеткам возвращали кислород и питательные вещества. Снижение miR-210 свидетельствовало о недостаточности питательных веществ и кислорода для проксимальных тубулярных клеток, являющейся признаком, как и в случае с miR-126, ишемии почек. С другой стороны, учитывая, что на 3 ч реоксигенации было зафиксировано повреждение эпителия in vitro, низкая экспрессия miR-210 свидетельствовала о повреждении проксимального тубулярного эпителия после ишемии.
Как приведено на Фигуре 3, экспрессия miR-101 в условиях гипоксии была повышенной по сравнению с условиями нормоксии.
Экспрессия этой микроРНК снова нормализовалась при реоксигенации, где наличие кислорода и питательных веществ было вновь нормализовано. Повышение экспрессии этой микроРНК в проксимальных клетках в условиях гипоксии свидетельствовало об ишемии почек.
Как приведено на Фигуре 4, экспрессия miR-127 в условиях гипоксии была повышенной по сравнению с условиями нормоксии. Экспрессия этой микроРНК значительно снижалась при реоксигенации, повышаясь снова на 24 ч реоксигенации, при восстановлении эпителиального монослоя. Таким образом, повышение экспрессии miR-127 в проксимальных клетках в условиях гипоксии свидетельствовало об ишемии почек. Снижение ее ранней экспрессии при реоксигенации свидетельствовало об ишемическом повреждении, и ее последующее повышение свидетельствовало о восстановлении эндотелия.
Как приведено на Фигуре 5, экспрессия miR-101 быстро нормализовалась при реоксигенации, при которой наличие кислорода и питательных веществ вновь нормализовано, даже если уровни экспрессии оставались выше, чем в условиях нормоксии в этих клетках крысы. Повышение экспрессии данной микроРНК в проксимальных клетках в условиях гипоксии свидетельствовало об ишемии почек. Ее новое повышение на 24 ч реоксигенации свидетельствовало о восстановлении эпителиального монослоя.
Как приведено на фигуре 6, и также как в НК-2 клетках (тубулярных клетках человека), экспрессия miR-127 была повышенной в условиях гипоксии, при которой наличие питательных веществ и кислорода ограничено, по сравнению с условиями нормоксии. Экспрессия данной микроРНК быстро нормализовалась при реоксигенации, при которой кислород и питательные вещества вновь доступны. Повышение экспрессии данной микроРНК в проксимальных клетках в условиях гипоксии свидетельствовало об ишемии почек.
Как приведено на Фигуре 7, и также как в проксимальных тубулярных клетках, экспрессия miR-101 была повышена в условиях гипоксии по сравнению с условиями нормоксии. Экспрессия данной микроРНК сохранялась высокой при реоксигенации, при которой снова нормализовали наличие кислорода и питательных веществ, и экспрессия нормализовалась на 24 ч реоксигенации. Повышение экспрессии данной микроРНК в эндотелиальных клетках в условиях гипоксии свидетельствовало об ишемии почек. Ее высокая экспрессия при реоксигенации была ассоциирована с состоянием активации эндотелия (провоспалительной), экспрессия нормализовалась на 24 ч.
Как приведено на Фигуре 8, также как в проксимальных тубулярных клетках, экспрессия miR-127 была повышенной в условиях гипоксии, при которой наличие питательных веществ и кислорода было ограничено, по сравнению с условиями нормоксии. Экспрессия данной микроРНК сохранялась высокой при реоксигенации, при которой кислород и питательные вещества были доступны, и начинала нормализоваться на 24 ч реоксигенации. Повышение экспрессии данной микроРНК в эндотелиальных клетках в условиях гипоксии свидетельствовало об ишемии почек. Ее высокая экспрессия при реоксигенации была ассоциирована с состоянием активации эндотелия (провоспалительной), экспрессия нормализовалась на 24 ч.
Как приведено на Фигуре 9, и в отличие от этой микроРНК, микроРНК в проксимальных тубулярных клетках, экспрессия miR-210 дискретно повышалась в условиях гипоксии, по сравнению с условиями нормоксии. Экспрессия данной микроРНК сохранялась высокой при гипоксии и резко снижалась на 24 ч реоксигенации. Повышение экспрессии данной микроРНК в эндотелиальных клетках в условиях гипоксии свидетельствовало об ишемии почек. Также как miR-127, и miR-101, ее экспрессия при реоксигенации была ассоциирована с состоянием активации эндотелия (провоспалительной), экспрессия нормализовалась на 24 ч.
Как приведено на Фигуре 10, экспрессия miR-126 дискретно повышалась в условиях гипоксии, при которых наличие питательных веществ и кислорода было ограничено, по сравнению с условиями нормоксии. И она повышалась очень значительно на 1 ч реоксигенации, когда кислород и питательные вещества были доступны. Затем, экспрессия данной микроРНК была нормализована. Повышение экспрессии данной микроРНК в эндотелиальных клетках в условиях гипоксии свидетельствовало об ишемии почек. Столь значительное повышение на 1 ч реоксигенации было однозначно ассоциировано с состоянием максимальной активации эндотелия (провоспалительной).
Пример 2: Экспрессия микроРНК у пациентов с диагнозом острая почечная недостаточность.
Исследование образцов от пациентов выполняли по проспективному пути. После разрешения пациентов или их юридических представителей посредством соответствующей формы информированного согласия и предварительного утверждения исследования этическим комитетом по клинически исследованиям нашего госпиталя у групп пациентов, описанных ниже, брали образцы крови и мочи, а также почечные биоптаты в случае трансплантата.
Образцы пациентов после трансплантации почки
Анализировали образцы от 50 пациентов после трансплантации (от пациентов с почечным трансплантатом de novo и с различными режимами иммуносупрессии), организованных в две группы:
I. 25 пациентов с функцией трансплантата в ближайшем восстановительном периоде II. 25 пациентов с отсроченной функцией трансплантата Образцы крови и мочи брали на 1, 7, 15, 30 день после трансплантации почки, и в эти дни посредством кОТ-ПЦР определяли экспрессию микроРНК, подлежащих исследованию.
В случае дисфункции трансплантата биопсию проводили на седьмой день и повторяли каждые 7-10 дней до фазы разрешения ОПН. В случае подозрения на отторжение и после подтверждения посредством биопсии, этих пациентов исключали.
В случае пациентов после трансплантации, была собрана и определена следующая информация:
- характеристики реципиента: возраст, пол и время диализа.
- характеристики донора: тип донора (смерть мозга, остановка сердца), возраст, пол, необходимость в вазоактивных лекарственных препаратах и последний креатинин.
- характеристики трансплантата: периоды тепловой, холодовой ишемии и анастомоза. HLA-совместимость и иммуносупрессия.
- функция трансплантата на 2, 4 и 12 неделях.
Образцы крови собирали в 8 мл пробирки VACUETTE («z serum sep clot activator»), которые центрифугировали на 2500 об/мин в течение 10 минут.
Отделенную сыворотку собирали посредством центрифугирования, готовили аликвоты и хранили в соответствии с критериями BioBank госпиталя Ramon and Cajal (в анонимных пробирках, с уникальным кодом при -80°C).
Образцы мочи собирали в стандартные сосуды для мочи или брали из хранилища проб, центрифугировали на 2500 об/мин в течение 10 минут для удаления осадка и других остатков, делили на аликвоты и хранили в соответствии с критериями BioBank госпиталя Ramon and Cajal (в анонимных пробирках с уникальным кодом при -80°C).
Для всех из них запрашивали разрешение BioBank посредством концессионного соглашения. Запрашивали максимум
500 микролитров, поскольку авторы изобретения оптимизировали технологию амплификации микроРНК на образцах обеих жидкостей объемом 100-200 микролитров, посредством количественной ПЦР, для этой цели и после экстракции общей РНК из образцов жидкостей (сыворотка или моча) и их титрования 50 нанограмм каждой из них применяли для реакции обратной транскрипции (ОТ) в 15 микролитрах. Для этого этапа применяли специальные коммерческие праймеры (праймеры «стебель-петля»). Эти праймеры были специфичны к каждой микроРНК. Материал после ОТ брали для реакции амплификации количественным способом (кПЦР). Для данной реакции, проводимой в 10 микролитрах общего объема, использовали 1 микролитр всей реакционной смеси после ОТ и специфичные праймеры для каждой микроРНК, а также пробу Taqman с флуоресцентной меткой и гасителем. Все реагенты, оба праймера и реакционные смеси с ферментами, а также нуклеотиды для ОТ и ПЦР были получены от Applied Biosystems.
Обработку образцов сыворотки и мочи пациентов перед экстракцией всей РНК выполняли следующим образом: аликвоту 100-200 микролитров сыворотки или мочи, обрабатывали протеиназой К (0,65 миллиграмм/миллилитр) инкубировали при 56°C, 1 ч. Затем, выполняли первую экстракцию при помощи фенол/хлороформа (5:1), и водную фазу обрабатывали при помощи High Pure miRNA isolation Kit (Roche), в соответствии с инструкциями производителя.
Образцы пациентов после кардиохирургии:
Анализировали образцы от 50 пациентов, организованных в следующие группы:
- IA: 10 взрослых пациентов, прооперированных планово с искусственным кровообращением (ИК) и с низким риском развития ОПН, т.е. пациентов с показателем от 0 до 2 согласно системе Thakar5 или от 0 до 1 согласно упрощенной SRI6.
- IB: 10 впервые прооперированных пациентов-детей с врожденным пороком сердца и с ИК.
- II: 15 планово прооперированных взрослых пациентов с ИК, с измененной основной почечной функцией и показателями>5 согласно системе Thakar5 или ≥3 согласно SRI6.
- III: 15 планово прооперированных взрослых пациентов с ИК, с нормальной основной почечной функцией и с такими же показателями, как и в предыдущей группе.
Для каждого пациента выполняли определение микроРНК для следующих моментов времени:
- перед операцией
- на 2 ч реанимации
- на 24 ч, 48 ч и 72 ч после операции
- на 7 день (необязательно для групп IA и IB)
Как приведено на Фигуре 11, экспрессия miR-127 была значительно ниже у здоровой контрольной группы. Снижение экспрессии данной микроРНК в сыворотке пациентов свидетельствовало об ишемическом повреждении почек или ОПН. Эти данные коррелируют с данными, приведенными на Фигуре 18.
Как приведено на Фигуре 12, ив соответствии со снижением в сыворотке, экспрессия miR-127 повышалась значительно у здоровой контрольной группы. Снижение экспрессии данной микроРНК в сыворотке пациентов и ее соответствующее повышение в моче служило признаком раннего диагноза ишемического повреждения почек или ОПН.
Как приведено на фигуре 13, уровни экспрессии сывороточной miR-126, значительно сниженные во время возникновения ишемического повреждения почек и сильно повышенные на 24 ч, впоследствии нормализовались. Это свидетельствовало о том, что снижение экспрессии данной микроРНК в сыворотке пациентов являлось признаком раннего диагноза ишемического повреждения почек или ОПН. Ее повышение на 24 ч свидетельствовало об активации эндотелия после ишемии, ассоциированной с последующей воспалительной реакцией, как было показано на модели in vitro. Эти данные коррелируют с данными, приведенными на фигуре 19.
Как приведено на фигуре 14, экспрессия сывороточной miR-210, значительно повышенная во время возникновения ишемического повреждения почек, поддерживалась первые 24 ч, с тем, чтобы нормализоваться впоследствии. Эти данные свидетельствовали о том, что повышение экспрессии данной микроРНК в сыворотке пациентов служило ранним диагностическим маркером ишемического повреждения почек или ОПН.
Как приведено на Фигуре 15, экспрессия miR-210 в моче, значительно повышенная на 48 ч, впоследствии нормализовалась. Принимая во внимание, что при повышении экспрессии данной микроРНК в НК-2 клетках наблюдалось восстановление эпителия в экспериментальной модели, это означало, что повышение экспрессии данной микроРНК на 48 ч в моче пациентов свидетельствовало о начале восстановления после ишемического повреждения почек. Эти данные коррелируют с данными, приведенными на фигуре 20.
Как приведено на фигуре 16, экспрессия miR-101 была значительно повышена в начале по сравнению с группой здорового контроля, но при дальнейшем развитии значительная экспрессия по сравнению с группой здорового контроля не наблюдалась. Это означало, что повышение экспрессии данной микроРНК в сыворотке пациентов служило ранним диагностическим маркером ишемического повреждения почек. Эти данные коррелируют с данными, приведенными на фигуре 17.