УСТРОЙСТВО МОНИТОРИНГА ПОСТРАНСТВЕННОГО СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ И ЕЕ КОМПОНЕНТОВ

Область техники
Техническое решение относится к медицине и биологии и может быть использовано, в частности, для диагностических и исследовательских целей при определении характеристик свертывания крови и ее компонентов, а также в биотехнологии и в фундаментальных биологических исследованиях.
Предшествующий уровень техники
Исследования свертывания крови и ее компонентов представляют большой практический интерес, поскольку не только позволяют диагностировать отдельные заболевания, но и оценивать активность препаратов, влияющих на параметры свертывания. Из уровня техники известны устройства для определения скорости свертывания, как цельной крови, так и ее плазмы. Однако до сегодняшнего дня данное исследование проводилось в гомогенной системе с постоянным перемешиванием. За счет того, что весь объем плазмы от момента начала эксперимента и до его окончания постоянно перемешивается, все факторы свертывания, образующиеся в процессе формирования сгустка плазмы, гомогенно распределяются по всему пространству исследуемой пробы, и поэтому образование сгустка идет одновременно во всем объеме исследуемой пробы. Это по своей физиологической сути принципиально отличается от тех условий, в которых сгусток образуется в живом организме.
Из уровня техники известно устройство для мониторинга пространственного образования фибринового сгустка, раскрытого в международной заявке РСТ/СН2007/000543 (международная публикация WO 2009/055940, кл. G01N 33/49, опубл. 07.05.2009). Устройство включает кюветную сборку, состоящую из кюветы и вставки с активатором свертывания, иммобилизованным на нижней грани вставки. Кюветная сборка размещается в держателе, который включает термостат для термической стабилизации кюветы и приспособления для удерживания кюветы в термостате. Термостат заполнен текучей средой, которая, по меньшей мере, частично прозрачна. Известное устройство позволяет реализовать способ, в котором регистрируется процесс образования фибринового сгустка, являющегося конечным продуктом работы системы свертывания, и не обеспечивает возможность регистрации процесса образования и пространственного распределения других факторов свертывания, которые регулируют процесс пространственного роста фибринового сгустка.
Наиболее близким аналогом заявляемого решения можно назвать устройство для исследования характеристик свертывания крови и ее компонентов (патент RU 2395812, кл. G01N 33/49, опубл. 27.07.2010), содержащее термостатируемую, заполненную текучей средой камеру, в которую помещена кювета с исследуемым образцом и вставкой, на которой иммобилизован активатор свертывания, средства освещения для освещения содержимого кюветы и образующегося у нижнего края вставки сгустка, цифровую камеру, при этом указанное устройство соединено с компьютером для обработки полученных данных.
В качестве недостатков указанного устройства можно назвать образование пузырьков газа в исследуемых образцах и в текучей среде в области регистрации при нагреве исследуемых образцов в термостатируемой камере, которые искажают сигнал светорассеяния от образовавшегося фибринового сгустка. Кроме того устройство содержит источники освещения только одной длины волны, например, красного света, что не позволяет исследовать пространственно-временное распределение протеолитических ферментов, например, флуоресцентными методами одновременно с исследованием образования фибринового сгустка.
Существо заявляемого решения
Технический результат, который может быть получен при реализации данного технического решения, заключается в повышении точности и достоверности определения параметров пространственного свертывания крови или ее компонентов, необходимых для диагностирования ряда заболеваний крови, а также возможность определения дополнительных параметров, не исследуемых ранее.
Задача, на решение которой направлено заявляемое устройство, состоит в том, чтобы исключить влияние пузырьков газа в исследуемом образце и в термостатируемой текучей среде на сам исследуемый процесс (например, свертывание крови) и на процесс обработки зарегистрированных данных, что оказывает влияние на чистоту эксперимента и точность полученных результатов, а также получение новой информации о процессе свертывания и его отдельных параметров.
Указанная задача была решена за счет создания устройства мониторинга пространственного свертывания крови и ее компонентов, которое включает термостатируемую камеру, заполненную текучей средой, внутри которой установлена кювета для размещения в ней образца исследуемой среды, по меньшей мере, одно средство освещения и средство регистрации, при этом, оно снабжено световой ловушкой, сформированной за счет геометрии внутренних поверхностей термостатируемой камеры, и средством регулировки давления, соединенным с термостатируемой камерой или кюветой.
А также тем, что оно содержит, по меньшей мере, одно дополнительное устройство освещения.
А также тем, что оно содержит оптические элементы, направляющие, фокусирующие и осуществляющие спектральную коррекцию освещения.
А также тем, что оно дополнительно содержит средство управления средствами освещения, регистрации и регулировки давления, выполненное с возможностью синхронизации работы указанных средств.
А также тем, что оно дополнительно соединено со средством обработки результатов исследований.
Заявляемое устройство схематически представлено на фиг.1.
Заявляемое устройство содержит термостатируемую камеру 1, выполненную с возможностью регулировки температуры, заполненную текучей средой. При этом возможно обеспечить различные виды термостатирования, включая водяное термостатирование и воздушное термостатирование, а также для термостатирования может использоваться гель, но при этом следует учитывать, что среда должна быть прозрачна для излучения. В предпочтительном варианте термостатирование - водяное. При термостатировании поддерживается постоянная температура. Внутри указанной камеры 1 размещена кювета 2. Кювета 2 может быть выполнена, по меньшей мере, с одним каналом 3. В канале 3 размещают образец исследуемой среды. Образец исследуемой среды может представлять собой биологическую жидкость млекопитающего (человека или животного), такую как плазма крови, цельная кровь, например, плазма, бедная или обогащенная тромбоцитами. Кроме того образец может содержать смеси очищенных природных, синтетических или рекомбинантных белков и/или другие препараты/реагенты, обладающие гемостатической активностью. В указанной кювете 2 может быть размещена вставка 4, с нанесенным на ее нижнем торце веществом, способствующим инициации исследуемого процесса, например, запуску свертывания. В качестве вещества, способствующего инициации процесса свертывания, может быть использован: белок, так называемый - тканевый фактор (тромбопластин), иммобилизованный различными способами на торцевую поверхность вставки 4 или непосредственно на внутреннюю поверхность кюветы 2 в заданном заранее месте; а также другие материалы организменного происхождения, представляющие собой препараты клеток и тканей. В качестве активатора можно использовать и другие тромбогенные вещества: стекло; каолин, пластик и т.п.
Известные из уровня техники устройства имеют значимый недостаток, а именно, получение искаженных параметров мониторинга, который вызван образованием пузырьков газа, как в образце, так и в текучей среде в термостатируемой камере 1 при их нагреве. С целью устранения указанного недостатка авторами было предложено обеспечить заявляемое устройство средством 5 регулировки давления и поддержания его стабильным во время проведения исследования. Для этого средство 5 регулировки давления сообщают с термостатируемой камерой 1. Средство 5 регулировки давления, в частном случае его выполнения, может представлять собой воздушный насос, подключенный через обратный клапан к внутренней (герметизируемой) части термостатируемой камеры 1, и датчик давления, измеряющий давление в указанной камере 1. На основе показаний датчика давления средство управления (на фиг.1 не показано) осуществляет управление воздушным насосом (включает/выключает). Насос подключен к темростатируемой камере 1 посредством магистрали давления например, трубок, в которую встроен обратный клапан, препятствующий возможному стравливанию давления из термостатирующей камеры 1 через воздушный насос. Клапан может быть пассивным механическим или электромеханическим, регулируемым средством управления. После герметизации термостатируемой камеры 1 и по команде средства управления насос включается и начинается набор давления в камере 1, далее он отключается при достижении заданного давления, измеряемого датчиком. В процессе проведения исследования давление поддерживается на заданном уровне путем включения/выключения насоса при падении давления ниже заданного уровня.
В процессе поддержания давления обеспечивают герметичность термостатируемой камеры 1. Герметичность может быть обеспечена, например, при помощи средства герметизации 6 внутренней части термостатируемой камеры 1. Средство герметизации может представлять собой крышку, колпачок, задвижку или иное известное средство. При этом средство герметизации 6 может быть механическим, закрываемым оператором, или электромеханическим, работающим по командам средства управления.
Кроме того, можно создавать давление непосредственно в кювете 2. Тогда средство 5 регулировки давления обеспечивает подачу давления в кювету 2 и магистраль давления (трубки) соединяется с указанной кюветой.
Было установлено, что устранение пузырьков возможно при избыточном давлении по отношении к атмосферному, предпочтительно от 0,2 до 0,5 атм., и поддержании его таковым на протяжении всего времени проведения исследования.
Термостатируемая камера 1 снабжена прозрачным окном 7, через которое, по меньшей мере, одним средством освещения 8 освещают исследуемый образец, а также образующийся в нем сгусток. В качестве средств освещения могут быть использованы светодиоды, или любые другие источники излучения требуемого спектрального диапазона (например, лампы с оптическими фильтрами). Изображение растущего сгустка (светорассеяние от сгустка) фиксируется средством регистрации 9, например, цифровой фотокамерой, снабженной объективом 10. Для повышения качества регистрируемого изображения (отношения сигнал/фон), а также для мониторинга дополнительных параметров свертывания в термостатируемой камере 1 выполняется световая ловушка 11. Указанная световая ловушка 11 служит для ослабления фонового излучения. Фоновое излучение представляет собой все излучение, кроме излучения рассеянного в направлении средства регистрации сгустком, или иной исследуемой структурой, рассеивающей свет. Световая ловушка может быть выполнена различным способом, в частности, сформирована за счет определенной геометрии внутренних поверхностей термостатируемой камеры, в частности, в виде усеченного конуса. Также она может быть сформирована за счет придания внутренним поверхностям камеры светопоглощающих свойств, например за счет чернения и придания им определенной шероховатости. Геометрия и оптические свойства световой ловушки 11 были подобраны таким образом, чтобы обеспечивать многократное переотражение и поглощение фонового излучения.
Средство регистрации 9, в свою очередь, электрически и информационно связано со средством 13 обработки результатов эксперимента, в качестве которого может служить компьютер. Средство освещения и средство регистрации выполнены с возможностью их регулировки средством управления (на фиг.1 не показано).
Появление хромогенных, а затем и флуорогенных субстратов позволило получить новую информацию о механизмах работы системы свертывания. При добавлении указанного субстрата в исследуемый образец, содержащий протеолитический фермент, последний отщепляет от субстрата сигнальную метку. Метка либо меняет оптическую плотность исследуемого образца (окрашивающий субстрат), либо способна флуоресцировать при освещении (флуорогенный субстрат) Из пространственного распределения сигнала метки можно получить пространственное распределение соответствующего протеолитического фермента, используя уравнения типа реакция-диффузия-конвекция.
При использовании флуорогенных субстратов заявляемое устройство снабжают, по меньшей мере, одним дополнительным средством освещения 12, для освещения образца исследуемой среды в заданные моменты времени возбуждающим излучением для возбуждения сигнала флуоресценции метки. Средство освещения 12 обеспечивает подачу излучения, предпочтительно перпендикулярно стенке кюветы 2 через оптические элементы, направляющие, фокусирующие и осуществляющие спектральную коррекцию излучения, например, посредством зеркала 14, а также фильтров 15 эмиссии и 16 возбуждения, через окно 7 в термостатируемой камере 1. В качестве средства освещения 12 используют источники УФ излучения, например, светодиоды УФ спектра. Фильтр возбуждения обеспечивает выделение спектра флуоресценции метки из спектра средства освещения 12.
Устройство работает следующим образом. В термостатируемой камере 1 устанавливают и поддерживают температуру на заданном уровне, и размещенная в нем кювета 2 равномерно прогревается. Перед проведением исследования, в кювете 2 размещают исследуемый образец, например, тестируемую плазму. После того как температура установится одинаковой по всему объему образца и конвекционные потоки в нем прекратятся, в кювету погружают вставку 4 таким образом, чтобы тромбогенное вещество, нанесенное на торец этой вставки 4, пришло в соприкосновение с образцом и инициировало запуск исследуемого процесса свертывания. Закрывают термостатируемую камеру 1 герметизирующим средством 6 и устанавливают избыточное давление в камере посредством работы средства 5 регулировки давления. В процессе исследования световая ловушка 11 обеспечивает эффективное поглощение излучения прошедшего за плоскость кюветы 2, за счет своей геометрии и поверхностных свойств, обеспечивающих многократное переотражение излучения стенками ловушки и его постепенное поглощение, таким образом, что отраженное излучение не попадает обратно в область регистрации кюветы 2 и во входную апертуру объектива 10. Через прозрачное окно 7 и объектив 10 на средство регистрации 9 начинают поступать изображения растущего в кювете 2 сгустка. Далее оцифрованные изображения поступают в память средства 13 обработки результатов для дальнейшей цифровой обработки.
При добавлении в исследуемый образец, например, флуорогенных субстратов образец освещают в заданные моменты времени средством освещения 12 для возбуждения сигнала флуоресценции метки и регистрируют пространственное распределение сигнала флуоресценции метки в образце устройством регистрации 9. При помощи специально разработанного программного обеспечения средство управления средствами освещения и регистрации включает средство освещения 8 и/или 12 лишь на то короткое время, когда осуществляется процесс съемки. Такой режим работы средств освещения, уменьшает эффект фотовыцветания метки субстрата. Одновременно с освещением метки субстрата, освещают образец исследуемой среды средством освещения 8 и регистрируют оптические характеристики исследуемого образца, выбранные из группы, состоящей из пространственного распределения светорассеяния, пространственного распределения светопропускания в образце или их комбинации. Тем самым регистрируют пространственное распределение параметров свертывания крови, в частности, пространственное распределение фибрина. Следует отметить, что длина волны освещения подбирается в соответствии со спектром возбуждения метки в случае исследования флуоресценции, либо в соответствии со спектром светорассеяния и спектром чувствительности средства регистрации при регистрации светорассеяния.
Таким образом, предлагаемое устройство позволяет более точно и более детально исследовать все фазы процесса свертывания во времени и пространстве, что повышает точность и достоверность проведения клинических анализов исследуемых образцов, как в норме, так и при различных патологиях.