СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ТКАНИ ПРЕСНОВОДНОГО МОЛЛЮСКА
METHOD OF FRESH-WATER SHELLFISH TISSUE CULTIVATION

Изобретение относится к области клеточных и тканевых технологий, может найти применение для тканевого культивирования беспозвоночных, в частности пресноводных моллюсков, и может быть использовано в биотехнологии, медицине, а также в научно-исследовательской работе для получения культуры клеток и тканей.
Известен способ получения эмбриональных клеток устриц, где эмбрион выращивают до стадии трохофоры, обрабатывают раствором коллагеназы и гиалуронидазы, подвергая затем механической обработке. Далее клетки культивируют в морской воде с добавлением гемолимфы, водорослевого гидролизата, устричного эмбрионального экстракта 10% эмбриональной сывороткм теленка (Brewstev E. Nicholson В. In vitro maintenance of amoebocytes from the American oyster. Crassostrea virglnica.-J. Fich.Ros. Board. Can. 1979. 36. 461-467)). Недостатком данного способа является недостаточное время переживания культуры клеток - всего две недели, невозможность культивирования ткани пресноводных моллюсков, отличительной особенностью которых является их обитание в сильно загрязненных водоемах рек.
2+
2+
Известен способ получения эмбриональных клеток морского двустворчатого моллюска, где отдельные клетки получают диссоциацией эмбрионов 0,1%-ным раствором коллагеназы (производство ТИВОХ ДВО РАН) на искусственной морской воде без ионов Са и Mg при температуре 6-10°С (авт. св. СССР 1745767). Этот способ приемлем для узкого круга клеток морских беспозвоночных животных. Недостатком его является высокая концентрация коллагеназы 1 мг/мл, что может быть объяснено использованием грубоочищенного фермента. Это, по-видимому, является одной из причин снижения доли жизнеспособных клеток к концу культивирования (60%).
Известен способ культивирования мантийной ткани брюхоногого моллюска (WO 89/02919), заключающийся в выделении мантийной ткани для культивирования in vitro, промывки морской водой, содержащей антибиотики (пенициллин, стрептомицин). Обработанную мантийную ткань переносили в обогащенную диоксидом углерода или кислородом сложную питательную среду, содержащую неорганические соли, аминокислоты, витамины и факторы роста, гормоны, антибиотики, экстракты животной сыворотки и глюкозу. Поддерживали рН среды в пределах 6,6-8,9 за счет замещения старой питательной среды новой. Замещение проводили через каждые 3 дня.
Известен способ подготовки ткани мантии морского моллюска для стерильного культивирования, который сводится к полосканию тканей мантии несколько раз в стерильной морской воде и двукратной среде L-15, не содержащей никаких антибиотиков [Endon M., Hasegawa Y. Culture of mantle epithelial cells expressing shell matrix proteins from scallop Patinopecten yessoensis. Fisheries Science 2006; 72, p.1277-1285 J. После такой подготовки ткань мантии помещают в стерильную питательную среду для дальнейшего культивирования. Недостатком известного способа является то, что в данной системе в период дезинфекции тканей отсутствуют какие-либо антибиотики, что может привести к контаминации культуры ткани.
Известен способ подготовки ткани мантии морского моллюска для стерильного культивирования, который сводится к двукратному полосканию ткани мантии в среде L-15, содержащей 500 мг/л стрептомицина и 50 мг/л пенициллина, и трехкратной обработке поверхности ткани мантии 70% этанолом. Затем ткани мантии помещают в стерильный питательный раствор DMEM, содержащую дополнительно 10% эмбриональную телячью сыворотку с добавлением антибиотиков (пенициллина и стрептомицина), для дальнейшего культивирования. Смену среды осуществляли каждые 3-4 дня [Chen S.N., Wen C.M. Establishment of cell lines derived from oyster, Crassostrea gigas Thunberg and hard clam, Meretrix lusoria Roding. Methods Cell Sci. 1999; 21:183-192]. Недостатком известного способа является необеспеченность необходимой стерилизации и дезинфекции, т.к. среда для полоскания и стерилизации ткани мантии содержит недостаточный качественный и количественный набор антибиотиков. Кроме того, ткани мантии подвергаются жесткому воздействию антибиотиков и 70% этанола, что приводит к потере жизнеспособности ткани мантии.
3
Наиболее близким способом культивирования мантийной ткани пресноводного моллюска к заявляемому является способ культивирования клеток и ткани пресноводных моллюсков, заключающийся в извлечение цельных эксплантов мантийной ткани из нативного пресноводного моллюска, отмывании ткани и ее стерилизации с последующим незамедлительным переносом ткани в охлажденный до 4°С изотонический раствор, содержащий в качестве антибиотиков Амфотерицин В и Канамицин, затем в переносе подготовленных эксплантов в питательную среду для культивирования ткани DMEM, содержащую дополнительно 10% эмбриональную бычью сыворотку и в качестве антибиотиков пенициллин и стрептомицин, в смене питательной среды каждые 3-4 дня (Bank S.K., Jena J.K., and Janaki Ram. СаСО crystallization in primary culture of mantle epithelial cells of freshwater pearl mussel. Science, vol. 86, NO.5,2004, p.730-733).
При этом проводят извлечение цельных эксплантов мантийной ткани из нативного пресноводного моллюска. Перед забором тканей мантии все хирургические инструменты стерилизуют. Раковины моллюсков вскрывают перерезанием заднего и переднего аддукторов. Стерильным ватным тампоном, смоченным 70% этанолом, однократно, удаляют избыток слизи с нативной ткани мантии моллюска. Затем от каждой створки отделяют всю ткань мантии в виде целого экспланта и незамедлительно переносят в стерильный 50 мл флакон со стерильным охлажденным до 4°С изотоническим соляным раствором. Отмывают полученные тканевые экспланты в стерильном охлажденном изотоническом растворе с антибиотиками - Амфотерицином В 2,8 мг/л и Канамицином 200 мг/л. Возможно введение в изотонический раствор пенициллина, стрептомицина и гентомицина. Далее, все манипуляции с тканями моллюска проводят под ламинаром. Ткани мантии переносят в чашку Петри на льду с охлажденным изотоническим раствором и тщательно полощут. После ткань мантии переносят в новые чашки Петри в минимальное количество изотонического раствора, удаляют избыток слизи с поверхности эксплантов. Для этой цели используют стерильные ватные палочки, слегка смоченные в стерильном изотоническом растворе. Три последующих отмывания ткани мантии проводят в чашках Петри на льду в стерильном изотоническом растворе с добавлением антибиотиков. Подготовленные таким образом эксплантаты переносят в питательную среду для культивирования ткани DMEM, содержащую дополнительно 10% эмбриональную бычью сыворотку с добавлением антибиотиков (пенициллина 200 мг/л и стрептомицина 200 мг/л). Осуществляют смену среды каждые 3-4 дня. Активное культивирование продолжается 7-10 дней, на 38-40 день наблюдались кристаллы арагонита.
Недостатком известного способа является недостаточное время культивирования, уменьшение функциональной активности ткани за счет возникновения на поверхности мантийной ткани плесневелых и дрожжевых грибов, невозможность культивирования ткани пресноводных моллюсков, отличительной особенностью которых является их обитание в сильно загрязненных водоемах рек.
Технической задачей данного изобретения является получение ткани для длительного культивирования мантии пресноводного моллюска в стерильных условиях при полном предотвращении заражения культуры ткани дрожжевыми и плесневыми грибами с сохранением функциональной активности ткани.
Поставленная цель может быть достигнута за счет использования способа культивирования клеток и ткани пресноводных моллюсков, заключающегося в извлечение цельных эксплантов мантийной ткани из нативного пресноводного моллюска, отмывании ткани и ее стерилизации с последующим незамедлительным переносом ткани в охлажденный до 4°С изотонический раствор, содержащий антибиотики, в том числе амфотерицин В, в переносе подготовленных эксплантатов в питательную среду для культивирования ткани DMEM, содержащую дополнительно 10% эмбриональную бычью сыворотку и антибиотики, например пенициллин и стрептомицин, в смене питательной среды каждые 3-4 дня. При подготовке эксплантатов в изотонический раствор дополнительно вводят флуконазол в количестве 100-130 мг/л, при этом общее количество антибиотиков в изотоническом растворе составляет 2540-2610 мг/л и соотношение амфотерицина к флуконазолу составляет (0,7-0,85):1, промывку в изотоническом растворе проводят трехкратно по 5-7 мин.
Данное изобретение позволяет получить ткани мантии пресноводного моллюска для длительного культивирования в стерильных условиях с сохранением функциональной активности ткани и способностью образовывать арагонит in vitro. Доля жизнеспособных клеток к концу культивирования составила 98%.
Флуконазол - 2-(2,4-дифторфенил)-1,3-бис(1,2,4-триазол-1-ил)-пропан-2-ол. Представитель нового класса триазольных противогрибковых средств является селективным ингибитором синтеза стеролов в клетке грибов. Препарат активен при микозах, вызванных Candida spp., Micosporum spp., Trichoptiton spp. и другими грибами (Машковский М.Д. Лекарственные средства, М. 2001, стр. 356).
Амфотерицин В - полиеновый антибиотик, продуцируемый актиномицетом streptomyces nodosus (Машковский М.Д. Лекарственные средства, М. 2001, стр 356). Является мощным противогрибковым средством, действующим фунгицидно в отношении многих патогенных грибов - возбудителей различных заболеваний. Действует препарат непосредственно на проницаемость клеточных мембран грибов.
Пример 1. Получение первичной культуры ткани мантии пресноводного моллюска.
После извлечения из раковины моллюска ткани мантии ее незамедлительно переносят для промывания в стерильном охлажденном (4°С) изотоническом растворе, в качестве которого используют раствор Хенкса без фенолового красного. Качественный и количественный состав раствора приведен в таблице 1. Затем проводят стерилизацию ткани от бактерий и грибковой контаминации путем трехкратного промывания длительностью по 5-7 минут, в отдельных случаях по 15 мин, в стерильном охлажденном (4°С) растворе Хенкса с антибиотиками (2540-2610 мг/л) при дополнительном введении флуконазола в количестве 100-130 мг/л при соотношении амфотерицина В к флуконазолу (0,7-0,85):1. Количественный и качественный состав антибиотиков приведен в табл.2.
Таблица 1. Состав раствора Хенкса (1х).
Компоненты
мг/л
Неорганические соли
CaCl<sub>2</sub>
140
KCl
400
КН<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
60
MgSO<sub>4</sub>
97,67
NaHCO<sub>3</sub>
350
NaCl
8000
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
47,88
Другие компоненты
D-глюкоза
1000
Таблица 2. Набор антибиотиков в составе раствора Хенкса
Препарат
Концентрация
Пенициллин G
1000 мг/л
Стрептомицин
1000 мг/л
Канамицина сульфат
250 мг/л
Гентамицин
120 мг/л
Флуконазол
100-130 мг/л
Амфотерицин
70-110 мг/л
2
Образцы тканей мантии моллюска переносят в стерильные чашки Петри 6 см в диаметре для дальнейшего культивирования на твердой подложке и добавляют по 3-5 мл стерильной питательной среды DMEM, которую дополняли 10%-ной эмбриональной бычьей сывороткой и антибиотиками пенициллином 200 мг/л и стрептомицином 200 мг/л. В контрольном опыте стерилизацию ткани от бактерий и грибковой контаминации проводили аналогично, но раствор Хенкса содержал 203 мг/л антибиотиков (пенициллина 100 мг/л и стрептомицина 100 мг/л, амфотерицина 2,8-3,0 мг/л). При этом не добавляли флуконазол. Культивирование ткани мантии проводят в 5% CO при температуре 22-25°С. Уже в первые сутки после инициации культуры ткани мантии моллюска происходила миграция разных типов клеток: эпителиальных, клеток Лейдига, фибробластов. Цвет ткани мантии моллюска в норме светло-кремовый и при культивировании in vitro является показателем жизнеспособности. При отмирании ткани мантии приобретают темно коричневый или серый цвета. Таким образом, экспланты ткани мантии в количестве 20 штук культивировали в течение 70-71 дня. За время культивирования опытной группы не было отмечено ни бактериальной, ни особенно грибковой контаминации. В 18 образцах на 21 день явно наблюдался процесс биокристаллизации арагонита. В отличие, контрольная группа эксплантов ткани мантии моллюска в количестве 20 штук за время культивирования в течение 7-10 дней была поражена плесневыми и дрожжевыми грибами в 18 из 20 вариантов эксплантов ткани мантии. Количество жизнеспособных клеток в исследуемых образцах 97-99%, в контроле - 65%.
Пример 2. Получение первичной культуры жаберных полосок пресноводного моллюска.
2
После извлечения жабр моллюска их промывают в стерильном охлажденном (4°С) растворе Хенкса без фенолового красного. Затем проводят стерилизацию жабр от бактерий путем трехкратного промывания длительностью по 15 минут в стерильном охлажденном (4°С) растворе Хенкса с антибиотиками (2540-2610 мг/л) при дополнительном введении флуконазола в количестве 100-130 мг/л при соотношении (0,7-0,85):1. Стерильными ножницами разделяют жабры на полоски шириной 5-10 мм. Чистые образцы жаберных полосок моллюска переносят в стерильные чашки Петри 6 см в диаметре для дальнейшего культивирования и добавляют по 3-5 мл стерильной питательной среды DMEM, которую дополняют стерильными добавками - антибиотиками и 10%-ной эмбриональной бычьей сыворотки - аналогично примеру 1. В контрольном опыте стерилизацию жаберных полосок моллюска от бактерий и грибковой контаминиции промывали аналогично, раствор Хенкса содержал 203 мг/л антибиотиков, включая амфотерицин 2,8 мг/л. В раствор Хенкса не добавляли флуконазол. Культивирование ткани мантии проводят в 5% СО при температуре 22-25°С.Уже в первые сутки после инициации культуры жаберных полосок моллюска происходила интенсивная миграция эпителиальных клеток. Цвет ткани жаберных полосок моллюска в норме светло-кремовый с легким желтоватым оттенком и при культивировании in vitro является показателем жизнеспособности. При отмирании жаберные полоски приобретают темно-коричневый или серый цвета. Таким образом, жаберные полоски в количестве 15 штук культивировали в течение 68-70 дней. За время культивирования не было отмечено ни бактериальной, ни особенно грибковой контаминации, в отличие от контрольной группы жаберных полосок моллюска в количестве 15 штук, где за время культивирования плесневыми грибами было поражено 15 жаберных полосок.
Раствор Хенкса предложенного состава и используемый для стерилизации при культивировании тканей и клеток мантии пресноводного моллюска позволяет значительно сократить риск появления в культуре плесневых грибов и тем самым увеличить продолжительность культивирования тканевых эксплантов, что является необходимым условием для процесса биокристаллизации арагонита in vitro.
В таблицу 3 сведены обобщенные данные, полученные из проведенных экспериментов (примеры 1 и 2).
Таблица 3.
Образцы
Состав изотонического р-ра
Время экспозиции, мин
Длительность культив. дни
Фунгистатическое и фунгицидное дейст-е, %
Амф.:флук.
Общее кол-во антибиотиков, мг/л
Кол-во флуконазола, мг/л
1
0,2:1
350
100
15
38
61
2
0,7:1
2540
100
5
71
100
3
0.7:1
2585
120
6
70
100
4
0.85:1
2610
130
7
70
100
5
1:1
2610
140
7
37
85
6
1.2:1
2610
110
10
18
82
Низкие концентрации амфотерицина В по отношению к флуконазолу (0,2-0,4:1) оказывают в лучшем случае фунгистатическое действие, приостанавливая инфекцию культуры на определенный момент. Высокие концентрации амфотерицина В (1-1,2):1 токсичны для живых тканей и клеток и поэтому начинают подавлять жизнеспособность тканевых образцов, что приводит к уменьшению дней культивации образца. Оптимальными значениями амфотерицина по отношению к флуконазолу являются (0.7-0,85):1.
Совокупность заявленных технических решений при культивировании ткани и клеток пресноводного моллюска, а именно в присутствии флуконазола в количестве 100-130 мг/л, используемое количество антибиотиков в изотоническом растворе 2540-2610 мг/л, соотношение амфотерицин: флуконазол (0,7-0,85):1, трехкратная промывка образцов по 5-7 мин, позволяют значительно сократить риск появления в культуре дрожжевых и плесневых грибов и тем самым увеличить продолжительность культивирования тканевых эксплантов, что является необходимым условием процесса биокристаллизации арагонита in vitro.
Применение высоких доз антибиотиков является оправданным средством борьбы с внешним поверхностным бактериальным загрязнением тканей мантии. Экспериментально было доказано, что данные концентрации антибиотиков с учетом времени экспозиции в них позволяют сохранить функциональную активность ткани мантии, и механическое снятие слизи не нарушает целостность эпителия мантии, в пользу чего свидетельствуют эксперименты по кристаллизации мантией пресноводного моллюска кристаллов арагонита в культуре ткани мантии.
Таким образом, применение способа культивирования ткани мантии позволяет получить стерильные препараты для длительного культивирования, что позволяет изучать функциональную активность ткани мантии в культуре и дает возможность проводить длительные эксперименты.