Способ получения наноразмерной фитосомальной системы
METHOD OF PRODUCING A NANOSCALE PHYTOSOME SYSTEM

Изобретение относится к фармации, а точнее к технологии получения новой лекарственной формы - фитосомы.
Фитосомы относятся к инновационным способам доставки лекарственных средств. В этих структурах водорастворимые растительные компоненты вступают в реакцию с фосфолипидами, при достижении равновесия между гидрофильными и гидрофобными радикалами, увеличивается способность преодоления липидного слоя клеточных мембран и растворения в желудочно-кишечных жидкостях. Особый интерес представляют фитосомы с флавоноидами из-за широкого спектра фармакологической активности этих соединений. Однако гидрофильность данного класса существенно снижает их проницаемость через кожный барьер и всасывание в желудочно-кишечный тракт, следовательно, снижается биодоступность флавоноидов и оказываемый эффект. В связи с этим актуальным является вопрос разработки простого и быстрого способа получения фитосомы, состоящей из активного компонента - кверцетина и фосфолипидов сои.
На сегодняшний день известны фитосомы с экстрактами гинкго билоба, расторопши, виноградных косточек, боярышника, зеленого чая и женьшеня (An overview of phytosomes as an advanced herbal drug delivery system / Jagruti Patela, et al. / Asian journal of pharmaceutical sciences. - 2009. - 4(6). - p. 363-371.).
Известны комплексы индивидуальных флавоноидов с фосфотидилхолином или фосфатидилсерином таких как кверцетин, рутин, гиперозид. В литературе присутствуют данные о фитосомах, включающих силимарин и соевый лецитин; экстракт расторопши пятнистой с экстрактом эхинацеи с липидной частью, представленной фосфатидилхолином или ресвератролом с фосфотидилхолин (Phytosomes - a review / Nagasamy Venkatesh Dhandapani, et al. // International journal of pharma sciences. - 2014. - Vol. 4. - №4. - p. 622-625).
Технология получения фитосом предполагает включение фосфолипидов (таких как фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин) в стандартизованные растительные экстракты (Phytosome and liposome: the beneficial encapsulation systems in drug delivery and food application / Nayyer Karimi, et al. // Applied food biotechnology. - 2015. - 2(3). P. 17-27).
Известен следующий способ получения фитосомы. Фитосомы получают реакцией взаимодействия между 1-2 молями фосфолипида с 1 молем активного растительного компонента (флавоноиды или терпеноиды) в апротонном растворителе (диоксан, ацетон, метиленхлорид, этилацетат). Затем комплекс выделяют путем выпаривания растворителя в вакууме или осаждением с реагентом, таким как алифатические углеводороды, путем лиофилизации, или методом распылительной сушки. Наиболее оптимальное соотношение компонентов в фитосоме 1:1 [5, 10, 16].
(R)
В литературе встречается ряд методик получения фитосом. Например, для образования комплекса силимарина с соевым фосфатидилхолином 1:1 поступают следующим образом: к раствору 5 г силимарина в 100 мл ацетона добавляют 8 г реактива "Липоид S 100 ", при перемешивании при комнатной температуре. После полной солюбилизации, реакционную смесь концентрируют в вакууме до объема 30 мл и приливают к 300 мл лигроина, при перемешивании. Осадок отстаивают в течение ночи, затем его отделяют фильтрованием, промывают лигроином и сушат в вакууме при 40°С. Выход составляет 11,2 г комплекса. При изучении спектральных характеристик полученного фитосомального комплекса было установлено, что удельный показатель поглощения составляет 170,2 при 288 нм (растворитель - метанол) (Bombardelli, Ezlo Via Ripamonti. Pharmaceutical and cosmetic compositions containing complexes of flavanolignans with phospholipids European Patent, no. 0300282 B1, 1992.).
(R)
Вторым примером может служить методика получения фитосомы силибина с соевым фосфатидилхолином в соотношении 1:2. К суспензии, содержащей 4,82 г (0,010 моль) силибина в 75 мл диоксана добавляют при перемешивании 15,4 г (0,020 моль) "Липоид S 100 ". Через 4 часа реакционную смесь лиофилизируют. Выход составил 20 г комплекса светло-желтого цвета с удельным показателем поглощения равным 106 при 288 нм в растворе метанола (Bombardelli, Ezlo Via Ripamonti. Pharmaceutical and cosmetic compositions containing complexes of flavanolignans with phospholipids European Patent, no. 0300282 B1, 1992.)..
(R)
3
Для получения комплекс силибин с соевого фосфатидилхолина 1:0,3 раствор силибина в диоксане (2,41 г (0,005 моль) силибина на 100 мл диоксана) обрабатывают при 60°С реактивом "Липоид S 100 " массой 0,770 г (0,001 моль) в течение 1 часа. Реакционную смесь упаривают досуха в вакууме и остаток переносят в 100 мл хлороформа. Избыток силибина, присутствующий в виде осадка, удаляют фильтрованием, а маточный раствор, содержащий комплекс выпаривают досуха в вакууме. Полученный остаток, сушат при 30°С под вакуумом. Выход составляет 2,3 г комплекса, в виде белого желтоватого порошка. Удельный показатель поглощения метанольного раствора полученного комплекса равен 300 при 288 нм (СНОН) (Bombardelli, Ezlo Via Ripamonti. Pharmaceutical and cosmetic compositions containing complexes of flavanolignans with phospholipids European Patent, no. 0300282 B1, 1992.).
Методика получения фитосомы экстракта гинкго билоба с соевым фосфатидилсерином заключается в следующем: 1,87 кг 20% фосфатидилсерина суспендируют в 17,5 л этилацетата при комнатной температуре. Добавляют сухой экстракт гинкго билоба (0,65 кг) и перемешивают. Суспензию выдерживают в течение 1 часа при перемешивании при кипячении с обратным холодильником, затем фильтруют при 70-75°С и концентрируют при давлении окружающей среды до получения мягкого осадка. Осадок сушат при 40°С в течение 48 часов. Выход продукта: 2,23 кг комплекса экстракт гинкго билоба-фосфатидилсерин (Патент №2006127272/15, 27.09.2009. Мораццони Паоло, Петрини Орландо, Скоули Эндрю, Кеннеди Дэвид. Применение комплексов гинкго для усиления когнитивных функций и снижения умственного утомления // Патент России №2368385. 2005.).
Интерес представляют фитосомы с индивидуальными флавоноидами, поскольку из-за разнообразия фармакологических эффектов этих соединений, можно существенно расширить ассортимент лекарственных средств, обладающих хорошей биодоступностью.
Описан способ получения фитосомы кверцетина с фофотидилхолином и холестерином с использованием метода тонкослойной гидратации с различным молярным отношением кверцетина, фосфатидилхолина и холестерина. Кверцетин и фосфотидилхолин растворяют в метаноле, а холестерин - в дихлорметане. Смесь помещают в круглодонную колбу и упаривают на роторном испарителе при 45°С до образования пленки. Затем с помощью вакуумной сушки полностью удаляют органические растворители. Дополнительно готовый липидый тонкий слой подвергают воздействию потока газообразного азота и выдерживают в течение ночи при комнатной температуре, чтобы обеспечить полное удаление органических растворителей. Пленку увлажняют дистиллированной водой в роторном аппарате при 45°С. Для уменьшения размера фитосомы применяют: диспергирование в ультразвуковой ванне с при 45°С, гомогенизацию в центрифуге с 20000 оборотов в минуту и метод ультразвуковой обработки (Malay K Das. Design and evaluation of phyto-phospholipid complexes (phytosomes) of rutin for transdermal application / Malay K Das, Bhupen Kalita // Journal of applied pharmaceutical science. - 2014. - Vol. 4. - (10). p. 51-570); (Nano phytosomes of quercetin: a promising formulation for fortification of food products with antioxidants / Solmaz Rasaie, et al. // Pharmaceutical sciences. - 2014. - 20. - p. 96-101).
Все перечисленные способы требуют задействования большого числа устройств и реактивов; они длительны и трудоемки; нет данных, подтверждающих достаточную однородность по размерам получаемых фитосом.
Техническим результатом предложенного изобретения является упрощение и ускорение процесса получения наноразмерной фитосомальной системы, содержащей кверцетин с высокой однородностью по размерам.
Технический результат достигается тем, что способ получения наноразмерной фитосомальной системы с узким распределением частиц по размерам включает экстракцию семян сои в смеси хлороформ-этанол при воздействии в течение 20 минут ультразвуком с частотой 22 кГц, кипячение полученного экстракта, после остывания добавление в полученный экстракт 1% раствора кверцетина в 95% этиловом спирте и последующее отделение этанольного слоя, на который воздействуют ультразвуком частотой 44 кГц в течение 20-30 минут.
Способ осуществляется следующим образом.
Точную навеску воздушно-высушенных семян сои массой около 2 г помещают в коническую колбу, приливают 50 мл смеси хлороформ - этанол 1:1 и экстрагируют в течение 20 минут под действием ультразвука частотой 22 кГц. Обработка ультразвуком обеспечивает разрушение клеточных стенок и облегчает в последующем выделение фосфолипидов, а также сокращает время экстракции. При дальнейшем увеличении времени экспонирования ультразвуком выход продукта не повышается. Затем колбу соединяют с обратным холодильником и содержимое кипятят, поддерживая слабое кипение в течение 20 мин для более полной экстракции фосфолипидов. После остывания, полученный экстракт помещают в делительную воронку, приливают 50 мл 1% раствора кверцетина в спирте этиловом с концентрацией 95% и интенсивно встряхивают. Отделяют этанольный слой, который подвергают воздействию ультразвуком частотой 44 кГц в течение 20 минут. За это время в результате ультразвукового дробления получают частицы с узким распределением по размерам.
Пример. Точную навеску воздушно- высушенных семян сои массой 2,0822 г поместили в коническую колбу, прилили 50 мл смеси хлороформ - этанол 1:1 и экстрагировали в течение 20 минут под действием ультразвука частотой 22 кГц. Затем колбу соединили с обратным холодильником и кипятили, поддерживая слабое кипение в течение 20 минут для более полной экстракции фосфолипидов. После остывания, полученный экстракт помещали в делительную воронку, приливали 50 мл 1% раствора кверцетина в спирте этиловом с концентрацией 95% и интенсивно встряхивали. Этанольный слой отделяли и подвергали воздействию ультразвуком частотой 44 кГц в течение 20 минут.
На фиг. 1 показаны абсорбционные спектры фитосомальной наносистемы 1 и липидного экстракта 2. На фиг 2 представлена кривая распределения фитосом по размерам.
Анализ спектров поглощения раствора, содержащего фитосомы 1 и раствора липидной фракции 2 (фиг. 1) показал, что при длине волны 254 нм на спектре поглощения липидного экстракта 2 имеется максимум поглощения, свойственный сложно-эфирным группам. После получения фитосомальной наносистемы 1 этот максимум поглощения исчезает (А=0), что свидетельствует об образовании комплекса между фосфатидилхолином и флавоноидами.
Средний размер полученных фитосом, определенный методом динамического рассеяния (кросс- корреляции фотонов), равен 5 нм. Распределение частиц по размерам - от 2 до 12 нм. Это подтверждает то, что полученные фитосомы относятся к наночатицам (фиг. 2).
Согласно данным литературы нано- и микроразмерные формы отличаются большей биодоступностью.
Предложенный способ позволяет ускорить и упростить процесс получения наноразмерной фитосомальной системы и обеспечивает высокую однородность получаемых частиц по размерам.