ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЕ ГУМИНОВОЕ СРЕДСТВО
ANTI-INFLAMMATORY HUMIC AGENT

Изобретение относится к области медицины и фармацевтики, а именно к гуминовым препаратам, и может найти применение в комплексной терапии воспалительных заболеваний.
Гуминовые кислоты, фульвокислоты оказывают на любой живой организм мощное воздействие благодаря богатому составу. В них содержится полный набор аминокислот, макро- и микроэлементов, минералов, а также полисахариды природного происхождения, витамины, пептиды, жирные кислоты, полифенолы, кетоны, катехины и т.д. Всего около 70 полезных компонентов. Такой насыщенный состав объясняет положительные биологические эффекты гуминовой кислоты (см. https://fb.ru/article/288472/guminovyie-kislotyi-chto-eto-takoe-i-kak-oni-vliyayut-na-organizm).
Известно, что гуминовые кислоты способны стимулировать некоторые функции нейтрофилов человека. Для препаратов на основе гуминовых и гуминовоподобных веществ выявлена антивирусная активность, например, для симплексного вируса герпеса - HSV. Гуминовые соединения могут быть использованы в качестве микробиоцидов, профилактических средств против распространения ВИЧ/СПИД. Были исследованы цитотоксические и антивирусные свойства гуминовых кислот и фульвокислот, выделенных из угля и торфа. Исследования показали, что все изученные соединения были малотоксичными и обладали достаточно высоким ингибирующим эффектом в отношении ВИЧ-инфекции (А.И. ПОПОВ, В.Н. ЗЕЛЕНКОВ, Т.В. ТЕПЛЯКОВА Биологическая активность и биохимия гуминовых веществ. Часть 2. Медико-биологический аспект (обзор литературы). Вестник Российской Академии Наук, 2016/5, с. 9-15). Было показано, что Оксигумат повышает активность Th-1 клеток и уменьшает продукцию цитокинов Th-2 клетками [Mariette et al., 2002]. Наблюдаемая стимуляция пролиферации лимфоцитов человека была связана с повышением продукции ИЛ-2 и экспрессией ИЛ-2 рецепторов вместе с уменьшением количества ИЛ-10 под действием Оксигумата [Joone et al., 2003]. In vivo показано, что пероральный прием гуминовых веществ улучшает параметры врожденного иммунитета у экспериментальных животных: происходит усиление антибактериальной активности сыворотки крови, фагоцитарной активности, активности лизозима и бактериальной агглютинации [Sanmiguel et al., 2016]. Это делает гуминовые вещества потенциальными продуктами для разработки многомишеневых иммуноактивных микробицидов.
Исследования в области разработок новых биологически активных соединений показали, что гуминовые вещества различного генеза обладают иммуномодулирующим и противовоспалительным действиями, что позволяет использовать их для профилактики и лечения хронических дерматозов, атопических дерматитов, аллергических ринитов и других заболеваний, сопровождающихся воспалительными и аллергическими реакциями. Перспективным является применение гуминовых веществ как противогрибковых, противовирусных средств. Противовоспалительная активности гуминовых кислот изучена на моделях острого и хронического воспаления. Возможный механизм противовоспалительного действия объясняется способностью гуминовых кислот снижать генерацию кислородных радикалов и уменьшать потребление кислорода активированными фагоцитами (И.А. Савченко и др. БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ: ПЕРСПЕКТИВЫ И ПРОБЛЕМЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ В МЕДИЦИНЕ (ОБЗОР). Журнал Медиаль, №1 (23) апрель, 2019, с. 54-60, DOI: http://dx.doi.org/10.21145/2225-0026-2019-1-54-60).
Противовоспалительное действие гуминовых соединений связано с их способностью обратимо ингибировать избыточный синтез интерлейкина-1β гиперактивированными макрофагами, нивелировать усиленный выход нейтрофильных гранулоцитов из костномозгового депо в кровь, уменьшать потребление кислорода активированными фагоцитами с последующим снижением генерации кислородных радикалов, что в конечном счете приводит к уменьшению выраженности воспалительной реакции (Полуянова И.Е. Биологическая активность гуминовых веществ, получаемых из торфа, и возможности их использования в лечебной практике. Международные обзоры: клиническая практика и здоровье, №4, 2017, с. 114-122).
Из уровня техники известно применение водорастворимых гуминовых кислот, выделенных из верхового магелланикум торфа, со среднечисленной молекулярной массой 4871,2 Да, среднемассовой молекулярной массой 18755,3, полидисперсностью 3,9 и медианой 9558,3 Да, в качестве средства, стимулирующего развитие реакций Th1-зависимого типа иммунного ответа путем регулирования баланса активации провоспалительных свойств макрофагов, секретирующих цитокины ИЛ-1β, ИЛ-12 и ФНО-α, и противовоспалительных свойств макрофагов, которые продуцируют ИЛ-10 цитокины (патент RU 2716504, 12.03.2020). Недостатком известного решения является то, что содержит только узкую фракцию гуминовых кислот и не содержит других активных компонентов гуминовых веществ.
Задачей настоящего изобретения является получение гуминового средства, содержащего широкий спектр гуминовых веществ и обладающего противовоспалительной активностью, без использования химических реагентов.
Техническим результатом заявленного изобретения является получение противовоспалительного гуминового средства, содержащего широкий спектр гуминовых веществ и не имеющего химических примесей, которое может быть использовано в области медицины и фармацевтики.
Указанный технический результат достигается за счет того, что заявленное гуминовое средство, обладающее противовоспалительной активностью, содержит воду и гуминовые вещества, полученные из гуминосодержащего сырья, выбранного группы, включающей леонардит, лигнин, уголь, торф и/или сапропель, методом ультразвукового диспергирования при температуре 30-80°С и давлении 0,05-0,8 МПа, при этом масса гуминовых веществ составляет от 1 до 20 мас. %, а гуминовые вещества включают гуминовые и фульво-кислоты и их соли, а также гидрохинон в количестве, не превышающем 3 мас. % от массы гуминовых веществ.
Также предлагается применение полученного гуминового средства для лечения и/или профилактики воспалительных заболеваний.
Для получения заявленного средства использовали предварительно измельченное сырье (леонардит, лигнин, уголь, торф, сапропель) в смеси с водой, которое помещали в ультразвуковую установку. Помещенную в ультразвуковую установку смесь гуминосодержащего сырья с водой нагревали до 30-80°С, и при достижении требуемой температуры производили обработку ультразвуком при давлении 0,05-0,8 МПа. После ультразвуковой обработки раствор охлаждали до комнатной температуры. Полученное средство разбавляли водой до содержания гуминовых веществ, составляющего от 1 до 20 мас. %.
Исследование состава полученного средства проводили методом ГХ-МС на анализаторе «Хроматэк», состоящем из газового хроматографа «Хроматэк-Кристал 5000» и жидкостного дозатора ДАЖ-2М. Для идентификации дериватов использовали автоматическую базу поиска и идентификации данных хромато-масс-спектрометрии NIST17MS Library.
Условия исследования:
Результаты исследования приведены в табл. 1
Согласно приведенным данным в состав заявленного средства, помимо гуминовых и фульвокислот, входят также фенольные производные, в частности гидрохинон, флаваноиды (хризин) и другие активные вещества. Следовательно, заявленное средство характеризуется широким спектром активных веществ.
Исследование на токсичность.
Определение показателей острой токсичности включало эксперименты на мышах. Животные распределялись по группам случайным образом методом рандомизации. В качестве критериев приемлемости рандомизации считали отсутствие внешних признаков заболеваний и гомогенность групп по массе тела (±10%). Введение препарата осуществляли внутрижелудочно в возрастающих дозах по Литчфилду-Уилкоксону. Наивысшая доза была лимитирована максимально возможным объемом введения препарата. Для исследования каждой дозы препарата использовались группы по 10 животных разного пола. Период наблюдения составлял 14 суток. При введении препарата в дозах 4000-8000 мг/кг (по гуминовой кислоте) у животных выявлено изменение реакции на взятие в руки, изменение дыхания, двигательной активности, и тонуса мускулатуры, у некоторых животных наблюдалось изменение консистенции кала. При введении препарата в дозе до 4000 мг/кг (по гуминовой кислоте) все животные выжили, при введении препарата в концентрации 6000 мг/кг (по гуминовой кислоте) погибло 5 животных из 10, а при введении препарата в дозе 8000 мг/кг (по гуминовой кислоте) погибло 8 животных из 10. Выжившие животные удовлетворительно перенесли интоксикацию и по окончании действия препарата на протяжении 14 дней наблюдения, признаков отсроченного влияния не отмечено. Признаков пролонгированной клинической интоксикации отмечено не было. Динамика массы тела опытных животных не отличалась от контроля. По окончании периода наблюдения - на 14 день, был произведен забой выживших животных с целью определения возможных патологических изменений после однократного приема препарата. Осмотр опытной и контрольных групп показал, что все животные в них были нормально упитаны, имели правильное телосложение, гладкий и блестящий волосяной покров, блестящие, обычной окраски слизистые оболочки, чистые и опрятные естественные отверстия. При макроскопическом исследовании внутренних органов каких-либо особенностей не было выявлено. Анализ величин массовых коэффициентов не выявил каких-либо достоверных отличий между группами животных, получавшими разные дозы препарата. Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что полученные препарат можно отнести к V классу, т.е. практически нетоксичных лекарственных веществ.
Исследование противовоспалительной активности заявленного средства.
Исследования проведены на белых крысах самцах со средней массой тела 320,0±5,0 г. Для моделирования экссудативного воспаления осуществляли субплантарное введение в одну из задних конечностей 3,0% водного раствора формалина в объеме ОД мл. Исследуемое на предмет противовоспалительной активности заявленное гуминовое средство (далее ГС) вводили за 1 час до введения формалина в виде 0,1% водного раствора в дозе 1,0 мг/кг однократно перорально.
Критериями оценки противовоспалительных свойств заявленного ГС являлись:
1 - наличие антиэкссудативной активности;
2 - наличие жаропонижающей активности - оценивали по способности предотвращать повышение температуры тела; и
3 - способность предотвращать сдвиг лейкоцитарной формулы влево.
3
Для оценки противовоспалительной активности через 1 и 3 часа после введения формалина осуществляли измерение объема конечности онкометрическим способом, объем конечности выражали в см. Для определения наличия жаропонижающей активности проводили измерения ректальной температуры тела при помощи электронного термометра. Для подтверждения наличия противовоспалительной активности осуществляли приготовление мазков крови для подсчета лейкоцитарной формулы.
Оценку эффективности проводили путем сравнения абсолютных и относительных данных в опытных и контрольных группах между исходными и последующими показателями. Математическая обработка результатов проводилась в соответствии с общепринятыми методами медико-биологической статистики с определением достоверности изменений при помощи t-критерия Стьюдента.
В результате исследований определили следующее. Объем здоровой конечности исходно в среднем для контрольной и опытной групп составил 1,92±0,03 см3. Введение раствора формалина в контрольной группе сопровождалось достоверным увеличением объема конечности, что свидетельствует о развитии местного экссудативного воспалительного процесса - через 1 час на 19,6% и через 3 часа на 12,0% по отношению к исходным значениям объема для контрольной группы. На фоне введения заявленного ГС отмечали уменьшение отека через 1 час на 12,2% и через 3 часа на 24,7%.
Средняя исходная температура тела соответствовала значениям нормы для здоровых животных и составила в среднем 36,6±0,22°С. Гипертермическая воспалительная реакция в контрольной группе животных была выявлена через 24 часа после введения раствора формалина и характеризовалась достоверным повышением ректальной температуры на 3,6% (37,5±0,62°С) по отношению к исходным значениям. Применение ГС согласно изобретению в дозе 1,0 мг/кг способствовало снижению температуры тела через 3 часа на 5,1% и через 24 часа на 8,4% по отношению к контролю.
Состав лейкоцитарной формулы у здоровых животных был представлен следующим соотношением: юные нейтрофилы 0,10±0,08%, палочкоядерные нейтрофилы 2,40±0,45%, сегментоядерные нейтрофилы 21,7±2,07%, эозинофилы 0,15±0,10%, базофилы 1,30±0,17%, моноциты 3,60±0,14% и лимфоциты 67,0±3,9%. Указанные показатели соответствуют значениям средней видово-возрастной нормы для взрослых здоровых крыс.
В контрольной группе наблюдалось значительное повышение количества нейтрофилов по отношению к здоровым животным - сегментоядерных на 6,90% (достоверно, Р<0,05), юных на 1,53% и палочкоядерных на 1,64% (Р<0,05) при снижении процентного количества лимфоцитов на 9,4% (Р<0,01), что свидетельствует о наличии нейтрофильного лейкоцитоза со сдвигом лейкоцитарной формулы влево и свидетельствует о системной реакции лимфоидной системы крови на воспалительный процесс.
На фоне применения ГС изобретения наблюдалось относительное снижение количества юных и палочкоядерных нейтрофилов на 0,8% и 0,92%, сегментоядерных на 8,2% (Р<0,01). Данный результат косвенно подтверждает способность ГС обеспечивать снижение степени выраженности воспалительного процесса.
В результате проведенных исследований установлено, что заявленное ГС при введении в дозе 1,0 мг/кг обладает противовоспалительной активностью при местном экссудативном воспалении. Жаропонижающая активность ГС подтверждается способностью снижать субфебрильную температуру, являющуюся системным проявлением воспалительного процесса. Антиэкссудативная активность ГС проявляется уменьшением степени выраженности индуцированного раствором формалина отека конечности. Противовоспалительные свойства ГС объективно подтверждаются способностью предотвращать сдвиг лейкоцитарной формулы влево, т.е. снижать миграцию незрелых форм лейкоцитов в очаг воспаления.
Таким образом, заявленное гуминовое средство имеет высокую биологическую активность, которая проявляется в уменьшении чрезмерных воспалительных реакций. Следовательно, заявленное средство может использоваться в качестве противовоспалительного средства для профилактики и лечения воспалительных заболеваний, что подтверждает достижение заявленного технического результата.