О поисках алкалоидоносных растений в Предуралье

О поисках алкалоидоносных растений в Предуралье

О.Н.Немерешина, к.б.н., Оренбургская ГМА; Н.Ф. Гусев, д.б.н., А.А. Гладышев, соискатель, Оренбургский ГАУ

Из всего многообразия растений на сегодняшний день лишь менее пяти процентов мировой флоры исследовано на содержание биологически активных веществ (БАВ), ещё в меньшей степени изучена фармакологическая активность фитопрепаратов. Поэтому во всем мире под эгидой Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) постоянно ведётся работа по поиску новых источников природных биологически активных веществ [1]. В Российской Федерации, несмотря на богатство флоры, в последние десятилетия работы ресурсоведческого характера почти прекращены, хотя их актуальность бесспорна.

Препараты растительного происхождения занимают достойное место среди средств профилактики и лечения многих заболеваний [1, 2, 3]. В сырье лекарственных растений содержатся витамины, полифенолы, азотсодержащие соединения, микроэлементы, пектины, камеди, слизи, аминокислоты и другие соединения, влияющие на процессы метаболизма, повышающие иммунитет и сопротивляемость организма инфекциям, способствующие нейтрализации и выведению токсичных соединений [1, 3, 4]. Повсеместное распространение многих лекарственных растений, относительная дешевизна полученных из них препаратов и высокая физиологическая активность комплекса биологически активных (действующих) веществ — всё это достойно самого пристального внимания исследователей и производителей лечебных и профилактических средств.

Нами была поставлена задача исследовать наличие и провести идентификацию азотсодержащих соединений в надземных органах (траве) вероники длиннолистной — Veronica longifolia L. семейства норичниковые — Scrophulariaceae Juss., широко распространённой в Евразии [5] и на территории Урала, в частности [5, 6, 7].

Объекты, методы и результаты исследования.

Растения рода Veronica L. семейства Scrophulariaceae Juss. имеют обширный ареал в Евразии [5, 6, 7] и широко применяются в современной фитотерапии в народной медицине России и странах зарубежья [3, 8, 9].

Veronica longifolia L. — многолетнее травянистое растение, эвмезофил, с округлым прямостоячим стеблем высотой 60—120 см и линейноланцетными, неравнопильчатыми листьями. В Предуралье произрастает на влажных лугах, в поймах рек, среди кустарников, приречных ольшаниках и ивняках, в колках и пониженных элементах рельефа.

Выбор объекта обусловлен следующими причинами:

— широким распространением V. longifolia L. в регионе Урала;

— применением препаратов V. longifolia L. в фитотерапии, гомеопатии и народной медицине ряда стран Европы и Азиатского континента;

— недостаточной изученностью биологических особенностей, химического состава и ограниченностью сведений об эколого-ценотической приуроченности вида.

Препараты V. longifolia L. в народной медицине применяются для лечения воспалительных процессов на коже, гнойников, язв, опрелостей, как ранозаживляющее и кровоостанавливающее средство [3, 8]. Препараты из сырья V. longifolia L. проявляют антимикробную активность в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов [8].

В химическом отношении V. longifolia L. изучена недостаточно. Известно, что в растении содержатся флавоноиды, иридоиды, фенолокисло-ты [4]. Ранее в сырье некоторых видов Veronica L. нами был обнаружен холин [8]. Исходя из принципа филогенетического родства растений мы решили исследовать сырье V. longifolia L. на наличие холина и других азотистых веществ.

Растительное сырье V. 1ощ^о11а Ь. заготавливали в фазу цветения видов, с 1998 по 2009 гг., преимущественно в районах лесостепного и степного Предуралья. Исследование на содержание азотистых веществ проводили методами, принятыми в Институте биохимии АН РФ и ВИЛР (Москва) [2, 10]. Изучению подвергали отдельные органы и всю надземную часть (траву) растений, собранных в период цветения в типичных местообитаниях (табл. 3).

Азотсодержащие (азотистые) вещества представляют группу соединений основного характера, имеющих сложный состав и часто встречающихся в растительных организмах. Качественный анализ водно-спиртовых извлечений из сырья V. 1о^1/оИа Ь. выявил присутствие в них азотсодержащих соединений.

Испытание на присутствие азотсодержащих соединений основного характера проводили с использованием общеалкалоидных реактивов (табл. 1) [2, 10, 11, 12]. Качественные реакции проводили в пробирках и на часовых стёклах, наблюдая выпадение осадка или опалесценцию в растворах.

В результате исследований установлено, что максимальное количество азотистых веществ локализовано в листьях V. 1о^1/оИа Ь. В связи с участием азотистых веществ биохимических процессов в растениях нами предпринята попытка установить подлинность этих соединений в растительном сырье.

Изучение качественного состава азотистых веществ в траве V. 1о^1/оИа Ь. проводили методом восходящей хроматографии на бумаге по несколько изменённому методу определения азотистых веществ в растениях [10, 13, 14]. Измельчённое сырьё (трава) исчерпывающе экстрагировали этанолом на кипящей водяной бане. Полученное извлечение фильтровали, растворитель отгоняли, а остаток растворяли в

горячей воде и смешивали с нейтральной окисью алюминия. Смесь высушивали на воздухе и переносили на колонку с окисью алюминия, внесённой с помощью этанола. Вымывание веществ проводили этанолом до отрицательной реакции на алкалоиды. Растворитель отгоняли, а сухой остаток растворяли в минимальном количестве этанола и хроматографировали восходящим способом на бумаге марки FN <^Шгак» в системе I — бутанол — уксусная кислота — вода 4:1 : 5 (БУВ 415) и в системе II — уксусная кислота — вода (15 : 85). Хроматограммы высушивали, просматривали в УФ-свете и проявляли реактивом Драгендорфа. При этом на хроматограммах обнаружено по два пятна, одно из которых по значению Rf 0,32 и 0,81 и окраске хромогенными реактивами соответствует холину, взятому в качестве «свидетеля» (табл. 2).

В результате проведённых исследований установлено, что алкалоидоносность V. Іо^і/оііа Ь. обусловлена присутствием азотистых веществ основного характера, в частности аминоспир-та — холина:

холин

Холин (2-оксиэтил-триметилааммоний), относящийся к витаминам группы В, является биологически активным веществом, из которого

2. Хроматографическая характеристика азотистых веществ из травы Veronica longifolia L.

Значение Rf

Наименование препарата и системы

I II

Холин - основание 0,32 0,81

Вещество (основание) из травы 0,32 0,80

1. Результаты исследования Veronica longifolia L. на содержание азотсодержащих веществ

Название растений Иссле- дуемая часть Оценка содержания алкалоидов

реактив Бушарда реактив Вагнера реактив Майера а вр ио У  і § ра р раствор танина реактив Зонненштейна реактив Бертрана е І.8 ра теда ит л результаты исследований

Вероника трава + + сл сл + ++ + + ++

длиннолистная листья + + + + ++ +++ ++ - ++

(Veronica стебли сл сл 0 0 сл сл 0 - сл

longipholia L.) соцветия сл сл 0 0 + ++ + - +

Обозначения:

---отсутствие сведений;

0 — отсутствие веществ, вытяжка от прибавления реактива осталась прозрачной; сл — следы, отмечено появление опалесценции;

+ — небольшой осадок от первых двух капель реактива;

++ — осадок, появляющийся от прибавления одной капли реактива;

+++ — обильный осадок, появляющийся от прибавления одной капли реактива

Рис. - УФ-спектр рейнеката холина, выделенного из травы Veronica longifolia L.

3. Содержание холина в траве Veronica longifolia L.

Местообитание и географическое положение Содержание, годы

1998 2000 2008

Среднее Предуралье (зона южной тайги) Южное Предуралье (степная зона) 0,41±0,02 0,33±0,03 0,48±0,06 0,38±0,03 0,50±0,03

в организме синтезируются фосфатидилхолины (лецитины) и сфингомиэлины, метионин, а также нейромедиатор ацетилхолин [15].

Холин — важный фактор в питании человека и животных. Его недостаток в организме приводит к серьёзным нарушениям работы печени, почек, щитовидной железы и нервной системы. Препараты, содержащие холин, широко применяют для лечения и профилактики заболеваний печени и атеросклероза. В литературе отмечается влияние препаратов холина на память, регуляцию уровня инсулина в крови [1, 8, 14].

Учитывая терапевтическую активность холина, мы решили выделить его из сырья V. ¡ощ1-/оНа Ь. с целью дальнейшей идентификации и количественного определения в зависимости от фаз развития растений и экологических условий.

Для количественного определения холина в сырье V. ¡о^/оНа Ь. применяли методы гравиметрии [10] и фотоэлектроколориметрии [15].

Метод гравиметрии наиболее старый, громоздкий и довольно трудоёмкий. Тем не менее, этот метод позволяет полностью идентифицировать полученные соединения современными методами исследования (температуру плавления веществ, хроматографию и спектрофотометрию). Метод основан на реакции с рейнекатом аммония и получении рейнеката холина. С рейнека-том аммония реагируют многие органические

основания, но эти рейнекаты, кроме холина, растворимы в щелочной среде [14]. Температура плавления полученного рейнеката равна 255—257° (с разложением), что соответствует рейнекату холина [12].

Вторую часть остатка на фильтре мы растворяли в ацетоне и использовали для получения основания холина путём обработки раствора сульфатом серебра [12]. Полученное основание холина растворяли в этаноле и хроматографировали восходящим способом на бумаге марки КЫ-1 ^Шгак) в нескольких системах растворителей. После проявления реактивом Драгендорфа на всех хроматограммах проявлялось одно фиолетовое пятно, соответствующее холину (табл. 3).

Для подтверждения подлинности рейнеката холина было проведено его спектрофотометрическое исследование на спектрофотометре СФ-4А. Как показывает адсорбционный спектр (рис.), максимум поглощения рейнеката холина находится в областях 400—410 и 525 нм, а минимум — 365—370 и 450 нм, что соответствует параметрам поглощения рейнеката холина, полученного из чистого холина-хлорида [12].

Фотоэлектроколометрический метод определения холина в растительном сырье основан на образовании окрашенного соединения холина с солью Рейнеке (рейнекат аммония). Этот метод менее трудоёмок, более точен, позволяет работать с малыми навесками (0,5—1,0 г) и определять минимальное количество веществ в растительном сырье.

Количественное определение холина в навеске сырья проводили с использованием рей-неката аммония, образующего с исследуемым веществом окрашенные комплексы [12, 15]. Содержание холина в экстракте рассчитывали по калибровочной кривой, полученной для чистого холин-хлорида.

Содержание холина в траве V longifolia произрастающей в степной зоне, несколько выше, чем в зоне тайги (табл. 3).

Выводы

1. «Алкалоидоносность» Veronica longifolia L. обусловлена содержанием азотсодержащего вещества основного характера — холина.

2. Уровень содержания холина в растениях Veronica longifolia L. Южного Предуралья несколько выше по сравнению с районами Среднего Предуралья.

Литература

1. Муравьёва Д. А., Самылина И.А., Яковлев Г.П. Фармакогнозия: учебник. 4-е изд., иерераб., доп. М.: Медицина, 2002. 656 с.

2. Государственная Фармакопея СССР. 11-е изд. М.: Медицина, 1990. Вып.2. 400 с.

3. Махлаюк В.П. Лекарственные растения в народной медицине. М.: Нива России, 1992. 478 с.

4. Каримова С.Г. Предварительное химическое изучение некоторых видов сем. Норичниковых, произрастающих в Башкирии // Растительные ресурсы. 1969. Т. 5. Вып. 1. С. 47.

5. Еленевский А.Г. Систематика и география вероник СССР и прилежащих стран. М.: Наука, 1978. 259 с.

6. Горчаковский П.Л., Шнурова Е.А., Князев М.С. и др. Определитель сосудистых растений Среднего Урала. М.: Наука, 1994. 525 с.

7. Рябинина З.Н., Князев М.С. Определитель сосудистых растений Оренбургской области. М.Товарищество науч. изд. КМК, 2009. 758 с.

8. Гусев Н.Ф. К алкалоидоносности вероники дубравной // Межвузовский сб. научных трудов: Изд. Пермского гос. ун-та, 1981. С. 53-55.

9. Хайдав Ц., Алтангимит Б., Варламова Г.С. Лекарственные растения в монгольской медицине. Утан-Батор: АН МР, 1985. 390 с.

10. Ермаков А.И., Арасимович В.В., Смирнова-Иконникова М.И. и др. Методы биохимического исследования растений. 2-е изд. Л.: Колос, 1972. 456 с.

11. Katone K. Nehary guogynoveny cholintartalma // Acta pharmaceutica Hungarica. 1958. № 5—6. C. 245.

12. Tulus M.R., Ulubelen A. Choline und Acetylchoün in den Blattern von Digitalis ferruginea L. // Arch. Pharm. 1961. Bd 294, H. 1. S. 11-17.

13. Хайс И., Мацек K. Хроматография на бумаге. М., 1962. 851 с.

14. Swiatek L., Luczak S. Izolacja i identyfikacja niektorych skladnikow ziela przetacznika dlugolistnego (Veronica longifolia L.) i przetacznika blotnego (Veronica scutellata L.) // Acta pol. Pharm. 1980. T. 37. № 5. S. 567-572.

15. Kakac B., Vejdelek I. Handbuch der Kolorimetrie. Jena., 1962. Band 1. S. 899-906.