ФУКОИДАНСОДЕРЖАЩИЕ микрокапсулы, сформированные реакцией MАЙЯРА на различных носителях

БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

«НАУКА. ИННОВАЦИИ. ТЕХНОЛОГИИ», № 4, 2017

УДК 615.322 Супрунчук В.Е. [Suprunchuk V.E.], Денисова Е.В. [Denisova E.V.]

фукоидансодержащие

микрокапсулы, сформированные реакцией mайяра на различных носителях

Fucoidan-containing microcapsules formed on different matrices with the use of the maillard reaction

В данной работе исследуется возможность формирования многослойных микрокапсул на носителях различной природы, таких как мезопористые ватеритные частицы СаСОз и полистирольные частицы, в качестве биополимеров - фукоидан и бычий сывороточный альбумин (БСА). Оценка размеров была осуществлена методами динамического рассеяния света (ДРС) и сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ), форма - методами оптической микроскопии и СЗМ. В результате работы установлены условия формирования микрокапсул с применением реакции Майяра, а также зависимость размера микрокапсул от природы носителя.

In this paper, we investigate the possibility of forming multi-layered microcapsules containing fucoidan on matrices of different nature. As carriers was used vaterite meso-porous CaCO3 particles and polystyrene particles. As biopolymers have been used fucoidan and bovine serum albumin (BSA). Measuring the size of the obtained microcapsules was carried out using the method of dynamic light scattering (DLS) and scanning probe microscopy (SPM). Optical microscopy and SPM was used to establish the shape of the microcapsules. The work has also identified conditions for the formation of microcapsules with the use of the Maillard reaction and the dependence of the size of the microcapsules of the nature of the media.

Ключевые слова: реакция Майяра, фукоидан, БСА, микрокапсулы. Key words: the Maillard reaction, fucoidan, BSA, microcapsule.

Введение

В настоящее время существует множество методов получения микрокапсул на основе природных полимеров. Они получили широкое применение в области биотехнологии, косметологии, фармакологии и медицины, что связано с высокой биодоступностью исходных компонентов. Использование микрокапсул как системы доставки позволяет повысить эффективность действия лекарственных веществ за счет оптимизации их биораспределения и токсикодинамики. С их помощью возможна доставка ферментов при энзимотерапии. Благодаря развитию генной инженерии, в микрочастицы осуществляется капсуляция не только лекарственных веществ, но и генов, которые помогут в лечении наследственных заболеваний.

«НАУКА ИННОВАЦИИ. ТЕХНОЛОГИИ»

.Северо-Кавказский федеральный университет

Формирование микрокапсул и микрочастиц на основе природных полимеров осуществляется в виде различных типов межмолекулярных взаимодействий, приводящих к созданию определенных видов связей. Известно, что возможно образование связей как ковалентной природы, так и не ковален-тной, формирование которых происходит в результате электростатического взаимодействия между биополимерами, несущими противоположные заряды. Микрочастицы могут быть образованы при смешивании растворов двух полисахаридов.

Так нековалентное взаимодействие положительно заряженного хитоза-на и несущего отрицательный заряд фукоидана приводит к образованию ко-нъюгатов, получивших название «фукосферы» [9]. Для выравнивания распределения микрочастиц по размерам раствор полисахаридов обрабатывают ультразвуком.

Примером микрочастиц, основанных на ковалентном взаимодействии являются БСА/фукоидан конъюгаты, сформированные с помощью реакции Майяра. Kim D. с соавторами [3] проводили реакцию при 60 °С в течение 96 ч. С помощью гель-хроматографии и электрофореза (SDS-PAGE) было доказано наличие ковалентных связей. Кроме того, определено количественное соотношение исходных компонентов: на 1 моль БСА приходится 1,5-2 моль фукоидана. Ковалентная конденсация по реакции Майяра улучшает эмульгирующие свойства, повышает устойчивость частиц к тепловой денатурации и стабильность при низких значениях рН (~ 5) [4].

В данной работе рассматривается возможность формирования полых микрокапсул на носителях органической и неорганической природы, с последующим использованием для капсуляции биологически активных веществ. В качестве носителей использовали полистирольные микросферы и высокопористые ватеритные частицы СаСО3, основным достоинством последних является возможность их разрушения в мягких условиях. В качестве биополимеров выбрали фукоидан и БСА. Фукоидан бурых водорослей является высокосульфатированным гетерополисахаридом, обладающим ан-тикоагулятным [8], иммуномодулирующим [2], противовоспалительным [5] и другими биологически активными свойствами. Кроме того, он способен модифицировать свойства поверхности клетки. Фукоидан в оболочке микрочастицы может взаимодействовать с макрофагами [6]. Высокосульфати-рованный фукоидан увеличивает миграцию эндотелиальных клеток и усиливает образование сети микрососудов [7]. Низкомолекулярный фукоидан существенно увеличивает жизнеспособность клеток 7F2, способствует ос-теогенной дифференцировке, установленной in vitro [1]. Однако, несмотря на обширные возможности применения фукоидана, остается малоизученным его использование в качестве компонента микрокапсул, применяемых для доставки лекарственных средств.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

Фукоидансодержащие микрокапсулы, сформированные реакцией Майяра.

Оценка размеров была осуществлена методами динамического рассеяния света (ДРС) и сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ), форма - методами оптической микроскопии и СЗМ.

Материалы исследования

Известно несколько способов получения микрочастиц СаСО3, в том числе имеющих различную полиморфную модификацию. В данной работе было осуществлено приготовление мезопористых ватеритных микросфер СаСО3, полученных при смешивании эквимолярных растворов Na2CO3 и CaCl2 по методике [10]. Для этого к 10 мл 0,33 М Na2CO3 при постоянном перемешивании на магнитной мешалке прикапывали в течение нескольких минут 10 мл 0,33 М CaCl2. Полученные микросферы дважды промывали водой, сушили при 60-65 °С до сохранения постоянной массы. Затем вносили в раствор БСА (1 мг/л) до конечной концентрации 0,5% при постоянном перемешивании. Полученную суспензию использовали для приготовления микрокапсул I (МК I). Для формирования микрокапсул II (МК II) использовали аналогичную систему, где частицы СаСО3 были заменены на синтетические полистирольные микросферы (Hirschberg an der Bergstrasse, Германия). Дальнейшее формирование микрокапсул осуществлялось по оптимизированной методике, описанной в работе [11]. Для этого к 1 мл суспензии, содержащей БСА и частицы СаСО3/ полистирольные частицы, при постоянном перемешивании на магнитной мешалке вносили такой же объем 1,5 % раствора фукоидана в фосфатном буфере (рН 7,4), повышали температуру до 60-65 °С. Центрифугировали (3,500 х g, 30 мин), промывали дистиллированной водой. Вносили 1 мл БСА (1 мг/л) при 60-65 °С, промывали. Каждое нанесение повторяли 5 раз. Затем микрокапсулы обрабатывали 0,1 М HCl для удаления ядра, доводя рН до 4. МК II дополнительно обрабатывали ТГФ в течение 12 ч. После чего оба образца центрифугировали (3,500 х g, 30 мин) и промывали.

Размер полученных микрокапсул после удаления ядра оценивали методом ДРС и методом СЗМ. Исследование с помощью ДРС осуществляли на спектрометре PHOTOCOR COMPLEX ((ООО «Антек-97», Россия). Программное обеспечение FAST Version 2.8.3. (Alango Ltd.) осуществляет расчет по формуле Стокса-Эйнштейна, что позволяет получить оптимальное распределение по размерам микрочастиц. Возможность изменения диаметра микрокапсул после удаления матрицы определяли на оптическом микроскопе Motic со встроенной цифровой камерой DM-111 при увеличении 100 х 0,65.

Обсуждение результатов

В работе были получены мезопористые микросферы СаСО3 диаметром 2-5 мкм, что согласуется с данными работы [13], где отмечается наличие фракции субмикронного размера (315,000 ± 0,200 мкм). При получении частиц СаСО3 нами так же была обнаружена часть микросфер сущес-

«НАУКА ИННОВАЦИИ. ТЕХНОЛОГИИ»

.Северо-Кавказский федеральный университет

Рис. 1. Профиль распределения микрокапсул по размеру, полу-

ченный методом ДРС где: а - МК I; б - МК II.

Таблица 1. РАЗМЕРЬ! ФУКОИДАНСОДЕРЖАщИХ МИКРОКАПСУЛ,

определенные методом сзм и ДРС

Природа носителя

Метод измерения

Размер микрокапсул, мкм

МК I МК II

Фракция A Фракция Б Фракция А Фракция Б

дрс

2,380 ± 0,670 6,800 ± 0,400

0,370 ± 0,065 4,208 ± 0,130

сзм

0,256 ± 0,150

0,230 ± 0,110

БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

. Фукоидансодержащие микрокапсулы, сформированные реакцией Майяра..

твенно меньшего размера (0,215 ± 0,080 мкм). Установленный экспериментально размер полистирольных микрочастиц составил 0,150 ± 0,120 мкм.

В результате проведения анализа гидродинамического диаметра многослойных микрочастиц методом ДРС было выявлено наличие двух фракций как для МК I, так и для МК II. При этом следует отметить, что размеры микрокапсул порядка нескольких нанометров, имеющие малый вклад в изменение интенсивности (менее 5%), отбрасывали. Первая фракция имеет микронный (Фракция В), вторая - субмикронный размер (Фракция А) (рис. 1).

Диаметр микрокапсул фракции В для МК I и МК II составил 6,800 ± 0,400 и 4,208 ± 0,130 соответственно (табл. 1).

В результате работы установлено, что фракция А МК II, имеет схожие размеры при измерении методом СЗМ и ДРС, составляет 0,230 ± 0,110 и 0,370 ± 0,065 соответственно. При сравнении измерений фракции А МК I наблюдаются более высокие показатели для метода ДРС (2,380 ± 0,670), в отличии от СЗМ (0,256 ± 0,150) (рис. 2).

Данное увеличение параметров объясняется тем, что в методе ДРС частицы схожих размеров плохо различимы, но в тоже время вклад в интенсивность для частиц разного размера различен (с увеличением размера вклад в

Основной

Основной

Основной

Основной о

- со

Основной во

Основной

Основной

Основной

I...

0,11 0,12 0,13 0,14 0,15 0,16 0,17 0,18 0,19 0,20 0,21 0,22 0,24 0,25 0,26 0,27 0,28 0,30 0,32 0,39 0,46 0,52 0,53 Размер частиц, мкм

Основной

Основной

Основной

Основной

Основной_ ф

Основной я

.. I.

Основной

Основной

0,12 0,13 0,14 0,15 0,16 0,17 0,18 0,19 0,20 0,21 0,22 0,23 0,25 0,26 0,27 0,29 0,31 0,33 0,42 0,62 0,75 Размер частиц, мкм

Рис. 2. Профиль распределения микрокапсул по размеру, полу-

ченный методом СЗМ

где: а - МК I; б - МК II.

«НАУКА. ИННОВАЦИИ. ТЕХНОЛОГИИ»

.Северо-Кавказский федеральный университет

интенсивность увеличивается). Поэтому данные показатели могут свидетельствовать о присутствии некоторых количеств более крупных микрокапсул. Кроме того, измерение с помощью метода ДРС проводится в растворе, что приводит к росту размера за счет формирования гидратной оболочки.

Согласно данным оптической микроскопии и СЗМ установлено, что микрокапсулы МК I и МК II имеют форму, близкую к сферической, что согласуется с результатами, полученными в работе [3].

Выводы

1) В результате работы реакцией Майяра получены многослойные микрокапсулы на основе природных полимеров (БСА/фукоидан) на носителях неорганической (СаС03) и органической (полистирол) природы.

2) Осуществлена оценка размеров полученных микрокапсул методами ДРС и СЗМ.

3) Методом ДРС в обеих системах МК I и МК II была установлена полидисперсность и выявлено наличие двух фракций (А и В).

4) Фракция А МК I имеет схожие размеры при измерении методами СЗМ и ДРС.

5) Метод ДРС при измерении фракции А МК II дает более высокие показатели в отличие от СЗМ.

6) Согласно данным полученным оптической микроскопии и СЗМ, установлено, что микрокапсулы МК I и МК II имеют форму, близкую к сферической.

7) Исследование размера частиц методом СЗМ для крупной фракции нецелесообразно в связи с трудностью прохождения зонда по их поверхности.

Библиографический список

1. Hwang P. A. et al. The brown seaweed Sargassum hemiphyllum exhibits a-amylase and a-glucosidase inhibitory activity and enhances insulin release in vitro // Cytotechnology. - 2015. - Т. 67, №. 4. - С. 653-660.

2. Khil'chenko S. R. et al. Immunostimulatory activity of fucoidan from the brown alga Fucus evanescens: role of sulfates and acetates //Journal of Carbohydrate Chemistry. - 2011. - Т. 30, №. 4-6. -С. 291-305.

3. Kim D. Y., Shin W. S. Characterisation of bovine serum albumin-fucoidan conjugates prepared via the Maillard reaction //Food chemistry. - 2015. - Т. 173. - С. 1-6.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

Фукоидансодержащие микрокапсулы, сформированные реакцией Майяра.

4. Kim D. Y., Shin W. S. Functional improvements in bovine serum albumin-fucoidan conjugate through the Maillard reaction //Food chemistry. - 2016. - Т. 190. - С. 974-981.

5. Lee S. H. et al. Anti-inflammatory effect of fucoidan extracted from Ecklonia cava in zebrafish model // Carbohydrate polymers. -2013. - Т. 92, № 1. - С. 84-89.

6. Lira M. C. B. et al. Cytotoxicity and cellular uptake of newly synthesized fucoidan-coated nanoparticles // European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics. - 2011. - Т. 79, № 1. -С. 162-170.

7. Marinval N. et al. 0024: Angiogenesis potentialized by highly sulfated fucoidan: role of the chemokines and the proteoglycans // Archives of Cardiovascular Diseases Supplements. - 2015. - Т. 7, № 2. - С. 148.

8. Nagumo T., Nishino T. Fucan sulfates and their anticoagulant activities // Polysaccharides in medicinal applications. - 1996. -С. 545-574.

9. Sezer A. D., Akbuga J. Fucosphere—new microsphere carriers for peptide and protein delivery: preparation and in vitro characterization // Journal of microencapsulation. - 2006. - Т. 23, № 5. - С. 513-522.

10. Volodkin D.V., Larionova N.I., Sukhorukov G.B. Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating // Bio-macromolecules. - 2004. - Т. 5. - № 5. - С. 1962-1972.

11. Супрунчук В.Е., Денисова Е.В. Белок-полисахаридные микрокапсулы, сформированные на матрицах различной природы // Наука. Инновации. Технологии. - № 2. - Ставрополь: Изд-во СКФУ, 2017. - С. 199-207.

12. Шолина Е.А., Филатова Л.Ю., Киржанова Е.А., Балабушевич Н.П Полиэлектролитная система доставки лекарственных средств с использованием муцина // Актуальные вопросы биологической химии и физики. - 2016. - № 2. - С. 82-86.

References

1. Hwang P. A. et al. The brown seaweed Sargassum hemiphyllum exhibits a-amylase and a-glucosidase inhibitory activity and enhances insulin release in vitro // Cytotechnology. - 2015. - T. 67, № 4. -C. 653-660.

2. Khil'chenko S. R. et al. Immunostimulatory activity of fucoidan from the brown alga Fucus evanescens: role of sulfates and acetates // Journal of Carbohydrate Chemistry. - 2011. - T. 30. № 4-6. -C. 291-305.

3. Kim D. Y., Shin W. S. Characterisation of bovine serum albumin-fucoidan conjugates prepared via the Maillard reaction //Food chemistry. - 2015. - T. 173. - C. 1-6.

4. Kim D.Y., Shin W.S. Functional improvements in bovine serum

«НАУКА. ИННОВАЦИИ. ТЕХНОЛОГИИ»

Северо-Кавказский федеральный университет

albumin-fucoidan conjugate through the Maillard reaction //Food chemistry. - 2016. - T. 190. - C. 974-981.

5. Lee S. H. et al. Anti-inflammatory effect of fucoidan extracted from Ecklonia cava in zebrafish model // Carbohydrate polymers. -2013. - T. 92, №. 1. - C. 84-89.

6. Lira M. C. B. et al. Cytotoxicity and cellular uptake of newly synthesized fucoidan-coated nanoparticles // European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics. - 2011. - T. 79, № 1. - C. 162-170.

7. Marinval N. et al. 0024: Angiogenesis potentialized by highly sulfated fucoidan: role of the chemokines and the proteoglycans //Archives of Cardiovascular Diseases Supplements. - 2015. - T. 7, № 2. - C. 148.

8. Nagumo T., Nishino T. Fucan sulfates and their anticoagulant activities // Polysaccharides in medicinal applications. - 1996. - C. 545574.

9. Sezer A. D., Akbuga J. Fucosphere - new microsphere carriers for peptide and protein delivery: preparation and in vitro characterization // Journal of microencapsulation. - 2006. - T. 23, № 5. - C. 513522.

10. Volodkin D.V., Larionova N. I., Sukhorukov G. B. Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating //Biomacromol-ecules. - 2004. - T. 5. - № 5. - C. 1962-1972.

11. Suprunchuk E.V., Denisova E.V. Protein-polysaccharide microcapsules formed on the matrix of different nature // Science. Innovation. Technology. - №. 2. - Stavropol: NCFU, 2017. - P. 199-207.

12. Salina E.A., Filatova L.Y., Kirzhanova E.A., Balabushevich N.G. Polyelectrolyte delivery system for medicines using the mucin // Topical issues of biological physics and chemistry. - 2016. - № 2. -P. 82-86.