Липопероксидация и взаимодействие тромбин фибриноген

УДК 612.115.12

ЛИПОПЕРОКСИДАЦИЯ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТРОМБИН — ФИБРИНОГЕН

© 2005 г. М. К. Умутбаева

Государственная медицинская академия, г. Тюмень

От интенсивности липопероксидации в значительной мере зависит состояние биомембран, следовательно, структурно-функциональное состояние клеток [7, 10]. Многочисленные патологические процессы протекают с изменением скорости липопероксидации [9], в частности с ускорением процесса, и нередко сопровождаются активацией гемостаза [11, 13], что реализуется преимущественно через тромбоциты [15], функциональная активность которых сопряжена с системой синтеза простагландинов. Антиоксиданты благоприятно влияют на гемостаз, уменьшая напряжение системы, способствуя снижению частоты тромботических осложнений при гипероксидации [20, 22]. На этом основании предложено использовать антиоксиданты для коррекции гемостати-ческих сдвигов при некоторых патологических состояниях [14].

Изучая связь гемостаз — липопероксидация, обычно оценивали отдельные показатели гемокоагуляции в сочетаниях, не позволяющих судить о скорости взаимодействия между тромбином и фибриногеном, определяющей наклонность к гипер- или гипокоагуляции [3, 5]. Не всегда контролировали активность тромбоцитов [19], чутко реагирующих на сдвиги липопероксидации [15], часто не оценивали антиоксидантную активность [21].

Широкое распространение синдрома гипероксидации [10] требует уточнения характера связи между липопероксидацией и гемостазом, особенно на уровне интегрального показателя — интенсивности взаимодействия тромбин — фибриноген, отражающего темпы внутрисосу-дистого свертывания крови [3, 5].

Цель настоящей работы — уточнить представления о роли липопе-роксидации во влиянии на интегральный показатель напряженности гемостаза — интенсивность взаимодействия тромбина с фибриногеном.

Материалы и методы

Моделируя ускорение липопероксидации, вводили порознь этинил-эстрадиол, левоноргестрел, тироксин и ацетат свинца — соединения, отличающиеся по характеру влияния на метаболизм, но сходные в способности активировать перекисное окисление липидов [7, 13]. Опыты проводили на белых крысах (315 особей со средней массой тела (170 ± 15) г). Для угнетения липопероксидации вводили тиреостатики (мерказолил или 6-метилтиоурацил) и антиоксиданты (димефосфон, селмевит). Определяли в разные сроки от начала воздействия в тромбоцитах показатели, характеризующие липопероксидацию (содержание диеновых конъюгат, продуктов, взаимодействующих с тиобарбитуратом) и антиоксидантный потенциал (скорость окисления и период индукции). Использованы известные приемы исследования [18].

При экспериментальных воздействиях, модифицирующих липопероксидацию и антиоксидантный потенциал, изменяется общая свертывающая активность крови, прокоагулянтная активность тромбоцитов и уровень продуктов взаимодействия между тромбином и фибриногеном: активация липопероксидации ускоряет это взаимодействие, угнетение — замедляет. Рост общей свертываемости крови при ускорении липопероксидации и взаимодействия тромбин — фибриноген сменяется гипокоагуляцией потребления. Антиоксиданты ослабляют влияние на гемостаз воздействий, активирующих липоперокси-дацию.

Ключевые слова: липопероксидация, взаимодействие тромбин — фибриноген, коагуляционная активность тромбоцитов, общая свертываемость крови.

Одновременно определяли активированное время рекальцификации (АВР) и активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) плазмы, количество тромбоцитов в периферической крови [4], общую коагуляционную активность тромбоцитов [16], спонтанную агрегацию и АДФ-индуцированную агрегацию [8], факторы Р3 и Р4 [2], содержание продуктов деградации фибрина (ПДФ) [17], растворимых комплексов мономерного фибрина (РКМФ) и D-димеров [4] — показателей интенсивности взаимодействия между тромбином и фибриногеном. Определяли в плазме крови тиреоидные гормоны Т3 и Т4 (радиоиммунный метод с набором «рио-ЕЗ-ПГ» и «рио-Т4-ПГ»).

Результаты исследований обработаны методом вариационной статистики для малых рядов наблюдений с вычислением средней арифметической (М), ее средней ошибки (m), среднеквадратического отклонения (ст). Для оценки достоверности отличий рассчитывали доверительный коэффициент Стьюдента (t) и величину вероятности (р). Различия оценивали как достоверные при значениях степени вероятности < 0,05. Графический анализ полученных данных проводили в системе Microsoft Graf (приложение MS Word 98).

Результаты и обсуждение

Тиреостатик мерказолил вводили крысам ежедневно при кормлении в 8—9 ч утра (12 мг/кг). Пробы крови брали на 4, 6, 12 и 15-й день.

Из данных табл. 1 видно, что на 12-й день введения мерказолила выявляется тенденция к гипокоагуляции, падает интенсивность липопероксидации и активность тромбоцитов, увеличивается антиоксидант-ный потенциал.

К концу опыта интенсивность липопероксидации

уменьшилась, антиоксидантный потенциал возрос, снизилась общая коагуляционная активность тромбоцитов, высвобождения факторов Р3 и Р4, спонтанная и АДФ-индуцируемая агрегация, общая свертываемость (удлинение АВР и АЧТВ) и замедлилось взаимодействие между тромбином и фибриногеном (снижение содержания ПДФ, РКМФ и D-димеров, рост числа тромбоцитов). Изменения сопровождались снижением уровня тиреоидных гормонов в кровотоке.

При введении более сильного тиреостатика (6-ме-тилтиоурацил, 300 мг/кг) прирост массы тела и массы щитовидной железы был значительнее, а содержание Т3 и Т4 упало в плазме заметнее, чем при введении мерказолила к тому сроку, следовательно, развился более глубокий гипотиреоз. Изменения липопероксидации и гемостаза имели такую же направленность, но были значительнее, особенно на 30-й день.

Следовательно, со снижением интенсивности липопероксидации и ростом антиоксидантной активности усиливается снижение общей свертываемости крови и торможение взаимодействия между тромбином и фибриногеном (по всем показателям). Степень сдвигов пропорциональна снижению уровня тиреоидных гормонов — изменению, первично спровоцированному в этих опытах.

При введении антиоксидантов димефосфона или селмевита (комплекс витаминов с антиоксидантной активностью) сдвиги липопероксидации происходят в противоположных направлениях, отражая снижение скорости переокисления липидов. Уменьшались показатели активности тромбоцитов, общая свертываемость крови и содержание продуктов взаимодействия тромбин — фибриноген.

Таблица 1

Липопероксидация, активность тромбоцитов общая и агрегационная, общая свертываемость крови, фибриногенемия, продукты взаимодействия тромбин — фибриноген, содержание Т3 и Т4 в плазме в разные сроки введения мерказолила

Показатели Контроль 4-й день 6-й день 12-й день 15-й день

Диеновые конъюгаты, А/мг липида 0,05±0,003 0,06±0,007 0,06±0,004 0,07±0,01 0,02±0,002*

Продукты, реагирующие с тиобарбитуратом, ед./мг липида 0,77±0,06 0,72±0,055 0,70±0,06 0,66±0,05* 0,56±0,02*

Период индукции, мин/мл 45,4±2,1 47,5±2,9 48,2±2,4 50,9±1,4* 56,3±1,1*

Скорость окисления, мм3/мин 0,75±0,06 0,72±0,05 0,74±0,04 0,69±0,06* 0,64±0,03*

Тромбоциты, тыс./мкл 762±22 769±28 820±27 743±22 991±17*

Общая коагуляционная активность, % 91,2±2,3 93,1±3,3 87,6±3,4 82,4±3,4* 77,9±1,6*

Спонтанная агрегация, % 5,8±0,30 5,6±0,34 5,2±0,31 5,2±0,32 4,1±0,11*

АДФ-агрегация, % 61,5±1,47 63,1±2,4 60,9± 1,48 64,6± 1,49 55,0±1,1*

Фактор Р3 , % 91,1±2,4 90,1±2,4 90,0±2,2 89,9±2,6 82,0±1,3*

Фактор Р4 , с 3,2±0,04 2,9±0,03 3,1±0,02 3,0±0,04 2,2±0,03*

АВР, с 55,8±1,7 54,5± 1,8 55,1± 1,7 58,9±1,9 62,9±1,0*

АЧТВ, с 40,0 ±1,1 41,3 ±1,2 42,1± 1,1 42,7 ±1,3 47,6±0,6*

Фибриноген, г/л 2,3±0,13 2,2±0,11 2,4±0,17 3,1±0,09* 3,6±0,10*

ПДФ, мг% 16,1±1,6 15,8± 1,4 17,0± 1,7 16,8±1,1 14,0±0,6*

РКМФ, мкг/мл 25,5±0,8 24,9±0,9 23,9±1,2 21,9±0,9 20,1±0,6*

Б-димеры, мкг/мл 0,18±0,006 0,17±0,008 0,14±0,009 0,13±0,009 0,09±0,002*

Т3, нмоль/л 1,59±0,30 1,66±0,19 1,54±0,18 1,21±0,11* 0,79±0,08*

Т4, пмоль/л 65,2±5,1 64,2±3,4 57,1±3,3 50,2±2.0* 26,7±2,9*

Примечание. * — здесь и в табл. 2 — достоверные отличия от контроля.

В следующих экспериментах изучали гемостаз и липопероксидацию при гипертиреоидных состояниях, создаваемых введением тироксина (Т4). Использовали ранее апробированную дозу Т4 — 1,5 мг/кг [1, 12], вводя ее при кормлении. Крысы, получавшие Т4, к 15-му дню потеряли (37,4 + 2,0) % от массы тела (среднесуточная потеря — (3,7 + 0,04) г, в контроле за то же время масса тела увеличилась до (172 ± 11,3) г (среднесуточная прибавка — (1,54 ± 0,03) г на особь).

Уже на 3-й день введения Т4 липопероксидация активировалась, остальные показатели не изменились (табл. 2).

На 5-й день активированы тромбоциты (рост общей коагуляционной и агрегационной активности, рост уровня факторов Р3 и Р4), повысилась общая свертываемость (укорочение АВР и АЧТВ), появились признаки интенсификации взаимодействия тромбин — фибриноген (рост уровня ПДФ, РКМФ и D-димеров).

На 10-й день сдвиги усилились и обнаружилось снижение числа тромбоцитов.

К 15-му дню еще заметнее усилилась липоперокси-дация и активировались тромбоциты, общая свертываемость понизилась (удлинение АВР и АЧТВ), ускорилось взаимодействие между тромбином и фибриногеном (дальнейший рост уровня ПДФ, РКМФ и D-димеров), уменьшилось число тромбоцитов.

При введении Т4 в дозе (15 мг/кг), вызывающей тиреотоксикоз, получены данные, идентичные по направленности найденным при гипертиреозе, однако динамика их появления иная. Так, уже на 5-й день были заметны признаки гиперкоагуляции (укорочение АВР и АЧТВ), на 10-й день обнаружилось снижение общей свертывающей активности (удлинение АВР и АЧТВ), существеннее активирована к этому сроку липопероксидация, заметнее возросла активность

тромбоцитов, а также высвобождения факторов Р3 и Р4. К 15-му дню развилась выраженная картина гипокоагуляции потребления (удлинены АВР и АЧТВ, значительно повышены уровни ПДФ, РКМФ и D-димеров, усугубилась тромбоцитопения, выявилась гипофибриногенемия), как это находили у больных с диффузным токсическим зобом [9].

Таким образом, результаты опытов свидетельствуют, что угнетению липопероксидации и снижению прокоагулянтной активности тромбоцитов сопутствует торможение взаимодействия тромбин — фибриноген. Это согласуется с наблюдениями [12], выявившими рост толерантности к тромбину при гипотиреозе и вторичную гиперкоагуляцию при гипертиреозе и тиреотоксикозе.

В целом показано, что активации свободнорадикальных процессов сопутствует активация гемостаза, как это обнаружено ранее [9], и установлено, что существенным является ускорение процесса взаимодействия тромбина с фибриногеном, видимо обусловливающее снижение устойчивости к тромбину при введении прооксидантов [20].

Кроме рассмотренных выше, проведены опыты с введением этинилэстрадиола, левоноргестрела, свинца, димефосфона и селмевита. Результаты этих опытов, а также часть данных из табл. 1 и 2 представлены на рисунке, где приведена степень изменения важнейших показателей взаимодействия тромбин — фибриноген (содержание ПДФ и РКМФ) и показателя содержания вторичных продуктов липопероксида-ции, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ось ординат). В качестве аргумента приведены воздействия или состояния, ими вызываемые (рассмотренные данные получены при наибольшей продолжительности опытов). На рисунке видно, что при одинаковой интенсивности липопероксидации (по содержанию

Таблица 2

Прокоагулянтная активность и липопероксидация в тромбоцитах, содержание индикаторов взаимодействия тромбин — фибриноген, общая свертываемость крови при гипертиреозе

Показатели Контроль 3-й день 5-й день 10-й день 15-й день

Диеновые конъюгаты, А/мглипида 0,05±0,003 0,06±0,006* 0,11±0,007* 0,13±0,011* 0,14±0,005*

Диеновые конъюгаты, А/мг липида 0,77±0,06 0,81±0,06 0,82±0,08* 0,85±0,08* 0,95±0,07

Продукты, реагирующие с тиобарбитуратом, ед./мг липида 45,4±2,1 42,0±1,9* 42,3±2,4* 40,2±1,5* 33,2±1,0*

Период индукции, мин/мл 762±22 747±25 790±19 608±17 576±26*

Скорость окисления, мм3/мин 0,75±0,06 0,85±0,08* 0,89±0,06* 0,92±0,07* 0,98±0,05*

Тромбоциты, тыс./мкл 91,2±1,3 92,8±1,6 93,7±1,2* 99,0±3,2* 100±1,7*

Общая коагуляционная активность тромбоцитов, % 5,8±0,30 5,7±0,31 6,6±0,27* 6,7±0,31* 7,2±0,23*

Спонтанная агрегация, % 61,5±1,47 64,1±0,40 66,8±0,41* 68,9±0,40* 73,4±0,41*

АДФ-агрегация, % 91,1±2,4 91,2±2,5 94,3±2,0* 95,8±2,3* 99,6±1,8

Фактор Р3 , % 3,1±0,04 3,3±0,04 4,2±0,02* 4,4±0,03* 4,5±0,03*

Фактор Р4 , с 55,8±1,7 53,7± 1,3 49,1±1,1* 52,0±1,6* 56,6±1,3*

АВР, с 40,0 ±1,1 38,0±1,1 35,2±1,0* 39,8±1,4 47,9±?,7*

АЧТВ, с 16,1±1,6 17,2± 1,6 20,0±1,8* 21,62±1,8* 25,6±0,8*

Фибриноген, г/л 2,3±0,13 2,1±0,12 2,3±0,17 1,9±0,09* 1,4±0,11*

ПДФ, мг% 16,1±1,6 17,2± 1,6 20,0±1,1* 21,62±1,2* 25,6±1,3*

РКМФ, мкг/мл 25,5±0,8 26,7±0,8 29,6±0,4* 31,3±1,0* 34,9±1,1*

Б-димеры, нг/мл 0,19±0,090 0,22±0,008* 0,23±0,009* 0,26±0,012* 0,27±0,010*

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Гипотиреоз Димефосфон ШСелмевит Гипертиреоз  Левоноргестрел  Свинец

Степень сдвигов содержания продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), продуктов деградации фибрина (ПДФ) и растворимых комплексов мономерного фибрина (РКМФ) при угнетении липопероксидации мер-казолилом (гипотиреоз) и антиоксидантами (димефосфон и селмевит), при активации тироксином, левоноргестрелом и свинцом (прооксиданты), в % к контрольным значениям

^Ь5-5 53

35 34 34

_26

-44-

11 10

"22 22-----------------------20"

СВ

ТБК

ПДФ

РКМФ

вторичных продуктов переокисления — ТБК-продук-ты) уровень индикаторов взаимодействия тромбин — фибриноген (ПДФ и РКМФ), отражающий интенсивность внутрисосудистого свертывания крови, также примерно одинаков и что высоким содержаниям ТБК-продуктов во всех экспериментах соответствуют большие концентрации ПДФ и РКМФ.

Выводы

1. Ускорению липопероксидации сопутствует рост прокоагулянтных свойств тромбоцитов и гиперкоагуляция, что ранее находили при некоторых других воздействиях, модулирующих свободнорадикальные процессы.

2. Существенная особенность активации гемостаза при интенсификации процесса липопероксидации — ускорение непрерывно осуществляющегося свертывания крови, что, как это находили при экзогенной ги-пертромбинемии [1, 5], может вести к гипокоагуляции потребления.

3. При угнетении липопероксидации замедляется взаимодействие между тромбином и фибриногеном, что объясняет увеличение толерантности к тромбину, описанное ранее [6].

4. Введение антиоксидантов позволяет ограничить интенсивность взаимодействия тромбина с фибриногеном, следовательно, уменьшить напряжение в системе гемостаза.

Список литературы

1. Алборов Р. Г. Состояние пероксидации липидов и гемостаза при гипер- и гипотиреозах в эксперименте / Р Г. Алборов, А. И. Волков, О. П. Мысник // Научн. вестник ТГМА. — 2000. — № 4. — С. 16.

2. Балуда В. П. Лабораторные методы исследования системы гемостаза / В. П. Балуда, З. С. Баркаган, Е. Д. Гольдберг и др. — Томск: ТГУ, 1980. — 310 с.

3. Баркаган З. С. Геморрагические заболевания и синдромы / З. С. Баркаган. — М.: Медицина, 1988. — 528 с.

4. Баркаган З. С. Основные методы лабораторной диагностики нарушений системы гемостаза / З. С. Баркаган, А. П. Момот. — Барнаул, 1998. — 127 с.

5. Бокарев И. Н. Тромбозы, предтромботические состояния, тромбофилии и гиперкоагуляция / И. Н. Бокарев // Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром. Проблемы лечения. — М., 2000. — С. 39—43.

6. Бышевский А. Ш. Клетки крови в реализации связи перекисного окисления липидов и гемостаза / А. Ш. Бышевский, С. Л. Галян, И. А. Дементьева и др. // Проблемы физиологии и патологии гемостаза (Труды проблемной комиссии при Межведомственном научном совете по гематологии и трансфузиологии РАМН). — Барнаул, 2000. — С. 156—163.

7. Владимиров Ю.А. Свободнорадикальное окисление липидов и физические свойства липидного слоя биологических мембран / Ю.А. Владимиров // Биофизика. — 1987. — № 5. — С. 830—844.

8. Габбасов З. А. Новый высокочувствительный метод анализа агрегации тромбоцитов / З. А. Габбасов, Е. Г. Попов и др. // Лаб. дело. — 1989. — С. 15—18.

9. Галян С. Л. Защитный эффект аспирина на фоне введения витаминов-антиоксидантов / С. Л. Галян, А. А. Вакулин, И. А. Дементьева // Научный вестник ТГУ Биология. — 1997. — № 2. — С. 50—53.

10. Кадочникова Г. Д. Исследование влияния антиоксидантов ряда фенолов, тиолов, аминов на физико-химические закономерности перекисного окисления моделей липидов возрастающей сложности: Автореф. дис. ... д-ра биол. наук / Г. Д. Кадочникова. — Тюмень, 2002. — 42 с.

11. Мирсаева Г. Х. Влияние ПОЛ на сосудисто-тромбо-цитарный гемостаз в раннем восстановительном периоде ишемического инсульта / Г. Х. Мирсаева, Р Л. Ишметова, Ф. Х. Камилов, Н. Т. Ахметова // Тромбы, кровоточивость и болезни сосудов. — 2002. — № 1. — Приложение 1.

— С. 92—93.

12. Мысник О. Ф. Зависимость гемостатических сдвигов при разных тиреоидных состояниях от интенсивности процессов перекисного окисления липидов: Автореф. дис. ... канд. биол. наук / О. Ф. Мысник. — Тюмень, 2001. — 22 с.

13. Ральченко И. В. Гемокоагуляционные сдвиги при тромбинемии на фоне витаминов-антиоксидантов /

И. В. Ральченко // Материалы конф. биохимиков Урала и Западной Сибири. — Уфа, 1998. — С. 21—22.

14. Рудзевич А. Ю. Коагуляционный и тромбоцитарный гемостаз при физиологической беременности и родоразре-шении кесаревым сечением, коррекция курантилом и сел-мевитом: Автореф. дис. ... канд. мед. наук / А. Ю. Рудзевич.

— Пермь, 2000. — 22 с.

15. Соловьев В. Г. Роль тромбоцитов, эритроцитов и сосудистой стенки в регуляции тромбинемии: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук / В. Г. Соловьев. — Челябинск, 1997. — 44 с.

16. Способ количественного определения общей коагуляционной активности тромбоцитов: Пат. 2061953 / Бы-шевский А. Ш., Соловьев В. Г., Селиванова И. В.; опубл. 10.06.96, Бюл. № 16.

17. Способ определения содержания продуктов деградации фибрина в плазме: А.с. 1659855 / Бышевский А. Ш., Мухачева И. А., Шафер В. М.; опубл. 30.06.91, Бюл. № 24.

18. Ушкалова В. Н. Комплексный анализ липидов крови спектрофотометрическим, флуорометрическим и кинетическим методами / В. Н. Ушкалова, Н. В. Иоанидис,

З. М. Деева и др. // Лаб. дело. — 1987. — № 6. — С. 446—460.

19. Цирук Ю.И. Коррекция витаминами-антиоксидантами гемокоагуляционных нарушений у беременных с ге-стозом: Автореф. дис. ... канд. мед. наук / Ю. И. Цирук. — Омск, 1998. — 20 с.

20. Шаповалов П. Я. Влияние эстрогена (этинилэстра-диола) и гестагена (левоноргестрела) на гемостаз /

П. Я. Шаповалов // Тромбоз, гемостаз и реология. — 2000. — № 2 (2). — С. 28—33.

21. Шаповалов П. Я. Гемостаз при назначении ригеви-дона на фоне угнетения компливитом перекисного окисления липидов / П. Я. Шаповалов, Т. Д. Арсаева // Тромбоз, гемостаз и реология. — 2001. — № 1 (5) — Приложение. — С. 141 — 144.

22. Шевлюкова Т. П. Морфофункциональные свойства тромбоцитов у беременных и родильниц с поздним гестозом / Т.П. Шевлюкова // Акуш. и гинекол.-инфо. — М., 2000. — № 1. — С. 12.

LIPIDPEROXIDATION AND INTERACTION THROMBIN — FIBRINOGEN

M. K. Umutbaeva

State medical academy, Tyumen

Is experimentally shown, that at influences slowing down or accelerating peroxydation of lipid s limited or raises accordingly intensity of constant intravascular coagulation of a blood. It is expressed by down stroke or body height of the contents of products of interaction of thrombin with fibrinogen

— products of degradation of a fibrin, solvable complexes of a monomeric fibrin and D-dimers.

Key words: peroxidation of lipid, interaction thrombin-fibrinogen, activity of platelets, general coagulability of blood.