ДИАГНОСТИРОВАНИЕ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ (ХОБЛ)
DIAGNOSING CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASE (COPD)

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способам диагностирования ХОБЛ у человека.
Уровень техники
Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) является одной из основных причин смерти во всем мире. В 2020 ишемическая болезнь сердца и нарушение мозгового кровообращения будут являться причиной самой высокой смертности среди населения в мире. Показатели распространения и госпитализации значительно изменились в течение последних лет. Некоторые исследования показали сильную корреляцию между табакокурением и развитием ХОБЛ, хотя не у каждого курильщика развиваются клинические признаки ХОБЛ (Higenbottam Т et al. (1980) Lancet 315: 409-411). Патогенез характеризуется закупоркой дыхательных путей вследствие изменения дыхательных путей и аберрантного воспаления. ХОБЛ включает хронический бронхит и эмфизему, при этом оба эти состояния характеризуются разрушением ткани. Ограничение дыхания медленно прогрессирует, приводя к одышке и ограничению возможности физической нагрузки. Однако нарушение не ограничивается легкими, так как у пациентов с ХОБЛ есть высокий риск развития системных нарушений, включая сердечно-сосудистые болезни. Диагностирование нарушения проходимости дыхательных путей согласно рекомендациям Глобальной инициативы по хронической обструктивной болезни легких (GOLD) требует применения спирометрии. Отношение FEV1/FVC (объем форсированного выдоха за одну секунду/форсированная жизненная емкость), составляющее после приема бронхорасширяющего средства (постбронходилататорное отношение) меньше чем 70%, указывает на необратимое нарушение дыхания и, следовательно, считается главным параметром при диагностировании ХОБЛ (Global Strategy for Diagnosis, Management, and Prevention of COPD. Global Initiative For Chronic Obstructive Lung Disease, 2007, www.goldcopd.com). В настоящее время пациентов классифицируют по GOLD стадиям согласно данным спирометрии и клиническим проявлениям. Обнаружение сывороточных маркеров, определяющих активность болезни, представляет собой особый интерес в процессе диагностирования и лечения.
Несмотря на то что курение широко признано как главный фактор риска развития ХОБЛ, описание специфического патологического процесса и вовлеченных механизмов остается неясным. По-видимому, в инициации воспалительного ответа на табачный дым участвует окислительный стресс паренхимы легких. Нейтрофилы и макрофаги, как часть врожденного иммунитета, считались важнейшими в процессе перестройки (ремоделировании) при ХОБЛ. Этот процесс ремоделирования представляет собой результат индукции хронического апоптоза в легких пациентов при ХОБЛ или у курильщиков. Апоптоз имеет отношение к морфологическому изменению, которое проявляется в "активной смерти" клеток, включая сжатие клетки, «блеббинг» (пузырение) мембраны, конденсацию хроматина и фрагментацию ДНК. Апоптоз охватывает альвеолярные и бронхиальные эпителиальные клетки, а также эндотелиальные клетки в паренхиме. Контролируемый апоптоз представляет собой необходимый и крайне важный процесс для клеточного гомеостаза. Однако избыточный «запуск» апоптоза и повышенная смена альвеолярных клеток может привести к разрушению ткани.
При иммуногистохимических исследованиях легочной ткани, полученной от пациентов с ХОБЛ, были обнаружены воспалительные инфильтраты, состоящие из Т-лимфоцитов и макрофагов, с различным количеством тучных клеток, нейтрофилов и эозинофилов. Наступление иммунных реакций показывает, что отсутствие равновесия между клетками Т-хелперами 1 типа (ТН1) и Т-хелперами 2 типа (ТН2) имеет значение в воспалительном ответе при различных болезнях. Исследования выявили преобладающий ТН1-цитокиновый паттерн при инфильтрирующем интерстициальном воспалении, связанном с ХОБЛ. Эпителий дыхательный путей является основным компонентом иммунной реакции, вырабатывающим провоспалительные цитокины, включая фактор некроза опухоли альфа (TNFα) и интерлейкин-1 бета (IL-1β), и хемокины. Эпителиальные клетки легких также модулируют острое обострение и реакции на патогены, которые представляют собой обычные явления у пациентов, страдающих от ХОБЛ.
Единственным методом, применяемым в клинической практике для диагностирования ХОБЛ, является спирометрия, которая представляет собой легочный функциональный тест, измеряющий функцию легких, в частности измеряющий количество (объем) и/или скорость (поток) воздуха, который пациент может вдохнуть и выдохнуть. Однако подобные тесты также используются для диагностирования других легочных болезней, таких как астма и фиброз легких. Следовательно, такой метод не может функционировать как единственный тест для надежного диагностирования ХОБЛ. Поэтому врачи также рассматривают такие симптомы, как одышка, хронический кашель или выработка мокроты, и/или историю воздействия факторов риска для диагностирования ХОБЛ. Очевидно, что применение таких методов при диагностировании ХОБЛ или распознавании различных форм ХОБЛ может приводить к ошибочному диагнозу, в результате пациенту не может быть предложен самый лучший вид лечения непосредственно от начала болезни.
Поэтому целью настоящего изобретения является предоставление способов и средств, которые сделают возможным однозначное диагностирование ХОБЛ у человека с самого начала заболевания или даже определение риска развития ХОБЛ у человека.
Настоящее изобретение относится к способу диагностирования хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) у человека или риска развития у человека ХОБЛ, включающему стадии:
- предоставления образца от человека,
- определения количества расщепленного каспазами цитокератина-18 (ссСК-18), гистонов, белка теплового шока 27 (HSP27), белка теплового шока 70 (HSP70) и/или белка теплового шока 90 альфа (HSP90 альфа) в указанном образце,
- диагностирования ХОБЛ, когда количество ссСК-18, гистонов, HSP27, HSP70 и/или HSP90 альфа является увеличенным по сравнению с количеством ссСК-18, гистонов, HSP27, HSP70 и/или HSP90 альфа у здоровых людей, или
- диагностирования риска развития ХОБЛ, когда количество ссСК-18, гистонов, HSP27, HSP70 является уменьшенным по сравнению с количеством ссСК-18, гистонов, HSP70 у здоровых людей.
Оказалось, что концентрация ссСК-18, гистонов, HSP27, HSP70 и/или HSP90 альфа в образце, взятом у человека, может выполнять функцию маркера, который позволяет диагностировать ХОБЛ, в частности стадии I/II и III/IV ХОБЛ у указанного субъекта. Маркеры позволяют определить даже риск развития ХОБЛ у человека в будущем. Не все люди, которые рассматриваются, как подвергающиеся риску развития ХОБЛ из-за их образа жизни (например, люди подвергающиеся воздействию дыма, курильщики и т.д.), заболеют ХОБЛ. Поэтому определение, что у человека есть риск развития ХОБЛ, очень важно для предотвращения ХОБЛ.
Маркеры, применяемые в способе настоящего изобретения, можно использовать отдельно или в комбинации, в результате чего можно определить дополнительное количество рецептора 4 интерлейкина-1 (ST2), при котором ставится диагноз ХОБЛ, когда количество ST2 является увеличенным по сравнению с количеством ST2 у здоровых людей, или при котором диагностируется риск развития ХОБЛ, когда количество ST2 является уменьшенным по сравнению с количеством ST2 у здоровых людей. Предпочтительные комбинации затрагивают ST2 и ссСК-18, ST2 и гистоны, ссСК-18 и гистоны, ST2, HSP27, HSP70 и/или HSP90 альфа.
1
1
Для классификации тяжести ХОБЛ используют спирометрические параметры. Эти параметры дают возможность классифицировать тяжесть ХОБЛ по четырем стадиям (см. таблицу А). Спирометрия имеет существенное значение для диагностики и дает пригодное описание тяжести патологических изменений при ХОБЛ. Для определения стадий ХОБЛ с I по IV используют специальные спирометрические точки разделения (например, постбронходилататорное отношение FEV/FVC<0,70 или FEV<80, 50 или 30% от нормы (расчетной)).
Таблица А
Спирометрическая классификация ХОБЛ (согласно www.goldcopd.com). Тяжесть на основе постбронходилататорного FEV1
Стадия I: легкая
FEV<sub>1</sub>/FVC<0.70
FEV<sub>1</sub> 80% от нормы
Стадия II: умеренная
FEV<sub>1</sub>/FVC<0.70
50% FEV<sub>1</sub><80% от нормы
Стадия III: тяжелая
FEV<sub>1</sub>/FVC<0.70
30% FEV<sub>1</sub><50% от нормы
Стадия IV: очень тяжелая
FEV<sub>1</sub>/FVC<0.70
FEV<sub>1</sub><30% от нормы или FEV<sub>1</sub><50% от нормы плюс хроническая дыхательная недостаточность
1
2
2
2
FEV: объем форсированного выдоха за одну секунду; FVC: форсированная жизненная емкость дыхательная недостаточность: парциальное давление кислорода в артериальной крови (PaO) меньше чем 8,0 кПа (60 мм Hg), при или без парциального давления углекислого газа в артериальной крови CO (PaCO) больше чем 6,7 к Па (50 мм; Hg), в то время как вдыхаемый и выдыхаемый воздух соответствует давлению на уровне моря.
Способы определения FEV1 и FVC, которые можно использовать для систематизирования ХОБЛ (см. таблицу А), хорошо известны в данной области техники (см. например, Eaton Т, et al. Chest (1999) 116: 416-23; Schermer TR, et al. Thorax (2003); 58: 861-6; Bolton CE, et al. Respir Med (2005) 99: 493-500).
Влияние ХОБЛ на отдельного пациента зависит не только от степени ограничения потока дыхания, но также от тяжести симптомов (главным образом, одышки и пониженной способности переносить физическую нагрузку). Между степенью ограничения потока воздуха и наличием симптомов имеется только ограниченная взаимосвязь. Характерными симптомами ХОБЛ являются хроническая и прогрессирующая одышка и выработка мокроты. Хронический кашель и выработка мокроты могут предшествовать развитию ограничения потока воздуха много лет. Эта модель дает единственную возможность идентифицировать курильщиков и других людей, подверженных риску развития ХОБЛ, и вмешаться, когда болезнь еще не является главной проблемой здоровья.
С другой стороны, существенное ограничение потока воздуха может развиться без хронического кашля и выработки мокроты. Несмотря на то что ХОБЛ определяется по ограничению потока воздуха, на практике решение прибегнуть к медицинской помощи (что и дает возможность поставить диагноз) обычно определяется влиянием отдельного симптома на образ жизни пациента.
1
1
Стадия I: Легкая стадия ХОБЛ - характеризуется умеренным ограничением потока воздуха (FEV/FVC<0,70; FEV 80% от нормы). Симптомы хронического кашля и выработка мокроты могут присутствовать, но не всегда. На этой стадии индивидуум обычно не подозревает, что его или ее легочная функция является ненормальной.
1
1
Стадия II: Умеренная стадия ХОБЛ - характеризуется ухудшением ограничения потока воздуха (FEV/FVC<0,70; 50% FEV<80% от нормы), при напряжении развивается нехватка воздуха, а также иногда наблюдается кашель и выработка мокроты. Это стадия, при которой пациенты обычно обращаются за медицинской помощью из-за хронических респираторных симптомов или обострения болезни.
1
1
Стадия III: Тяжелая стадия ХОБЛ - характеризуется дополнительным ухудшением ограничения потока воздуха (FEV/FVC<0,70; 30% FEV<50% от нормы), бóльшим затруднением дыхания, пониженной способностью к физической нагрузке, усталостью и частыми обострениями, которые почти всегда оказывают влияние на качество жизни пациентов.
1
1
1
2
2
2
2
1
Стадия IV: Очень тяжелая стадия ХОБЛ - характеризуется тяжелым ограничением потока воздуха (FEV/FVC<0.70; FEV<30% от нормы или FEV<50% от нормы плюс наличие хронической дыхательной недостаточности). Дыхательная недостаточность определяется как парциальное давление в артериальной крови O (РаО) меньше чем 8,0 кПа (60 мм Hg), при или без парциального давления в артериальной крови CO (PaCO) больше чем 6,7 кПа (50 мм Hg), в то время как вдыхаемый и выдыхаемый воздух соответствует давлению на уровне моря. Дыхательная недостаточность также может оказывать влияние на сердце, например приводить к легочному сердцу (недостаточности правых отделов сердца). Клинические признаки легочного сердца включают повышение яремного венозного давления и мягкие отеки лодыжек (пастозность). Пациенты могут иметь Стадию IV: Очень тяжелую ХОБЛ, даже если FEV составляет >30% от нормы, всякий раз, когда присутствуют эти осложнения. На этой стадии качество жизни значительно ухудшается и обострения болезни могут быть опасными для жизни.
Термин "подверженный риску развития ХОБЛ" при использовании в описании относится к группе людей, которые подвергаются опасности со стороны окружающей среды или которые могут иметь генетическую предрасположенность к развитию ХОБЛ. Факторы, которые способствуют формированию ХОБЛ, включают генетическую предрасположенность, воздействие частиц, подобных табачному дыму, производственной пыли (органической и неорганической), загрязнение воздуха внутри помещений в результате нагревания и приготовления пищи биомассой в плохо вентилируемых жилых помещениях и загрязнение воздуха вне помещений, рост и развитие легкого, окислительный стресс, пол, возраст, респираторные инфекции, социально-экономическое положение, питание и сочетанные заболевания. Люди, подверженные риску развития ХОБЛ, могут страдать от хронического кашля, хронической выработки мокроты и иметь нормальную спирометрию. Однако люди, страдающие от этих симптомов, неизбежно двигаются дальше до ХОБЛ на стадии I.
При использовании в описании термин "здоровый человек" относится к человеку, который не страдает от ХОБЛ или другой легочной болезни. Более того, у этих людей не было какой-либо тяжелой болезни легких на протяжении жизни. Также в термин "здоровые люди" не включаются люди, которые регулярно подвергаются факторам риска, подобным дыму или другим вредным токсичным веществам.
Согласно настоящему изобретению количество маркеров у "здоровых людей" обусловливается определением количества этих маркеров по меньшей мере у 5, 10, 15 или 20 "здоровых субъектов".
Так как маркеры ХОБЛ, определяемые с помощью способа согласно настоящему изобретению, находятся в крови, используемым образцом согласно настоящему изобретению является кровь, сыворотка или плазма. Этот тип образцов можно получить от человека известными в данной области техники способами.
Для того чтобы специфически определить количество рецептора 4 интерлейкина-1 (ST2), расщепленного каспазами цитокератина-18 (ссСК-18) и гистонов, белка теплового шока 27 (HSP27), белка теплового шока 70 (HSP70) и/или белка теплового шока 90 альфа (HSP90 альфа) в образце, предпочтительно использовать способы, которые задействуют антитела, направленные на указанные маркеры ХОБЛ. Подходящими способами с использованием антител являются иммуноанализы, которые предпочтительно выбирают из группы, состоящей из твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), радиоиммунологического анализа и вестерн-блота.
Термин "антитело" при использовании в описании относится к моноклональным и поликлональным антителам или их фрагментам, способным связываться с антигеном. Другие антитела и фрагменты антител, такие как рекомбинантные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела, фрагменты антител, такие как Fab или Fv фрагменты, а также фрагменты, выбранные путем скрининга библиотек фаговых дисплеев, и тому подобные также пригодны для описанных здесь способов.
Способы получения моноклональных, так же как и поликлональных антител, хорошо известны (Harlow E. et al., 1988. Antibodies. New York: Cold Spring Harbour Laboratory). Поликлональные антитела индуцируют в разных видах животных, включая, но не ограничиваясь этим, мышь, кролика, козу, овцу, осла, верблюда и лошадь, с использованием методов стандартной иммунизации и кровопускания. Кровь животных с высокими титрами фракционируют с помощью обычных методов высаливания, например преципитацией сульфатом аммония, и специфические фракции иммуноглобулинов отделяют с помощью последовательной аффинной хроматографии на колонках с протеин-А-сефарозой и лептин-сефарозой в соответствии со стандартными способами. Затем очищенные поликлональные, так же как и моноклональные антитела, характеризуют на специфичность. Такую характеристику осуществляют с помощью стандартных методов, используя меченные изотопными маркерами белки, такие как радиоизотоп или биотин, при конкуренции с повышенными уровнями немеченых вероятных перекрестных реактантов для связывания антител. Исследования связывания дополнительно оценивают с помощью других стандартных методов, таких как общепринятый электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и методы вестерн-иммуноблотинга при восстановительных и невосстановительных условиях.
Моноклональные антитела получают в соответствии с общепринятыми стандартными лабораторными методами ("Practice and Theory of Enzyme Immunoassays" by P.Tijssen (hi Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Eds: R.H.Burdon and P.H.van Kinppenberg; Elsevier Publishers Biomedical Division, 1985)), которые основаны на исходной методике Kohler и Milstein (Kohler G., Milstein C. Nature 256: 495, 1975). Этот метод осуществляют путем извлечения клеток селезенки из иммунизированных животных и иммортализацией клеток, продуцирующих антитела, путем слияния с клетками миеломы или путем трансформации вирусом Эпштейна-Барра, а затем скрининга клонов, экспрессирующих желаемые антитела, хотя также используют другие методы, известные в данной области техники. Антитела также получают с помощью других подходов, известных специалистам в данной области техники, включая, но не ограничиваясь этим, иммунизацию специфическими ДНК.
Предпочтительно используемые иммунологические анализы основываются на методах, которые применяют иммобилизованные антитела, способные специфически связываться с представляющим интерес антителом, или антигены, связанные с твердой подложкой. Иммобилизованное антитело связывают или соединяют с различными твердофазными подложками, используя стандартные методы нековалентного или ковалентного связывания, в зависимости от необходимых аналитических и/или твердофазных условий разделения. Твердая подложка может иметь форму пробирок, бусин, микрочастиц, фильтровальной бумаги, мембран, стеклянных фильтров, магнитных частиц, стеклянных или кремниевых чипов, или можно использовать другие материалы и подходы, известные специалистам в данной области техники. Использование микрочастиц, в частности магнитных частиц, которые непосредственно покрыты антителами (магнитные частицы-иммобилизованное антитело), или частиц, которые помечены универсальным связывающим агентом (например, авидин или антивидовое антитело), пригодно для значительного сокращения времени инкубации при анализе. Эти подходы вместе с другими альтернативными подходами, известными в данной области техники, позволяют завершить исследование в течение нескольких минут без ограничения необходимой чувствительности.
Обнаружение использованного для выявления антигена антитела, которое способно специфически связываться с представляющим интерес антигеном, является или прямым обнаружением связи с молекулой-репортером, или косвенным обнаружением с помощью вторичной системы обнаружения. Последняя основывается на нескольких различных принципах, известных в данной области техники, включая распознавание антитела мечеными антивидовыми антителами, и другие формы иммунологического или неиммунологического соединения и системы обнаружения сигнала амплификации (например, технология биотин-стрептавидин). Подход сигнальной амплификации используют для того, чтобы значительно увеличить чувствительность анализа и низкий уровень воспроизводимости и производительность. Метка, используемая для прямого или непрямого соединения с антителом, представляет собой любую различимую молекулу-репортер. Примерами подходящих меток являются метки, которые широко используются в области иммунологических и неиммунологических систем обнаружения, такие как флуорофоры, люминесцентные метки, металлические комплексы и радиоактивные метки, а также частицы, которые можно обнаружить с помощью других подходящих реагентов, таких как ферменты, или различные комбинации прямых или непрямых меток, например ферментов с люминогенными субстратами.
Для диагностирования ХОБЛ или риска развития ХОБЛ полезно определить разграничительные уровни, выше или ниже которых болезнь может быть диагностирована. Количество рецептора 4 интерлейкина-1 (ST2) в образцах крови здорового человека находится в пределах от 50 до 150 пг/мл, предпочтительно от 60 до 140 пг/мл, более предпочтительно от 70 до 130 пг/мл.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения количество расщепленного каспазами цитокератина-18 (ссСК-18) в образцах крови здорового человека находится в пределах от 200 до 350 U(единиц)/л, предпочтительно от 200 до 330 U/л, более предпочтительно от 250 до 300 U/л, определяется как новый эпитоп М30 цитокератина-18.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения количество белка теплового шока 27 (HSP27) в образцах крови здорового человека находится в пределах от 1500 до 2500 пг/мл, предпочтительно от 1600 до 2400 пг/мл, более предпочтительно от 1700 до 2300 пг/мл.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения количество белка теплового шока 70 (HSP70) в образцах крови здорового человека находится в пределах от 50 до 200 пг/мл, предпочтительно от 70 до 190 пг/мл, более предпочтительно от 80 до 180 пг/мл.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения количество белка теплового шока 90 альфа (HSP90 альфа) в образцах крови здорового человека находится в пределах от 10000 до 15000 пг/мл, предпочтительно от 11000 до 14500 пг/мл, более предпочтительно от 12000 до 14000 пг/мл.
Согласно дополнительному варианту осуществления настоящего изобретения количество гистонов в образцах крови здорового человека на 20-50% ниже, предпочтительно на 25-40% ниже, чем в образцах крови человека, страдающего от ХОБЛ.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения устанавливают диагноз ХОБЛ, когда количество рецептора 4 интерлейкина-1 (ST2), расщепленного каспазами цитокератина-18 (ссСК-18), гистонов, HSP27, HSP70 и/или HSP90 альфа, в образце является повышенным по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 20% по сравнению с количеством ST2, ссСК-18, гистонов, HSP27, HSP70 и/или HSP90 альфа у здоровых людей. Разумеется, количество ST2, ссСК-18, гистонов, HSP27, HSP70 и/или HSP90 альфа также может быть увеличено по меньшей мере на 15%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%.
Диагноз риска развития ХОБЛ предпочтительно устанавливают, когда количество рецептора 4 интерлейкина-1 (ST2), расщепленного каспазами цитокератина-18 (ссСК-18) и/или гистонов, в образце снижен по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 20% по сравнению с количеством ST2, ссСК-18 и/или гистонов у здорового человека. Конечно, количество ST2, ссСК-18 и/или гистонов также может быть снижено по меньшей мере на 15%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%.
Способ согласно настоящему изобретению также подходит для другого вида млекопитающих, при котором млекопитающее предпочтительно выбирают из группы, состоящей из лошадей, собак, кошек и крупного рогатого скота.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу проведения различия между стадией I/II ХОБЛ и стадией III/IV ХОБЛ у человека, включающему стадии:
- предоставления образца от человека, страдающего от ХОБЛ,
- определения количества расщепленного каспазой цитокератина-18 (ссСК-18), гистонов, белка теплового шока 27 (HSP27), белка теплового шока 70 (HSP70) в указанном образце,
- диагностирования стадии I/II ХОБЛ, когда количество ссСК-18, гистонов и/или HSP27 является сниженным по сравнению с количеством ссСК-18, гистонов, и/или HSP27, определенным в образце от человека, страдающего от ХОБЛ на стадии III/IV, и/или когда количество HSP70 является увеличенным по сравнению с количеством HSP70, определенным в образце от человека, страдающего от ХОБЛ на стадии III/IV, или
- диагностирования стадии III/IV ХОБЛ, когда количество ссСК-18, гистонов и/или HSP27 является увеличенным по сравнению с количеством ссСК-18, гистонов и/или HSP27, определенным в образце от человека, страдающего от ХОБЛ на стадии I/II, и/или когда количество HSP70 является сниженным по сравнению с количеством HSP70, определенным в образце от человека, страдающего от ХОБЛ на стадии I/II.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения дополнительно определяют количество рецептора 4 интерлейкина-1 (ST2), при котором диагностируют ХОБЛ на стадии I/II, когда количество ST2 является увеличенным по сравнению с количеством ST2, определенным в образце от человека, страдающего от ХОБЛ на стадии III/IV, или при котором диагностируют ХОБЛ на стадии III/IV, когда количество ST2 является уменьшенным по сравнению с количеством ST2, определенным в образце от человека, страдающего от ХОБЛ на стадии I/II.
Раскрытые в описании маркеры ХОБЛ также применимы для проведения различия между людьми, страдающими от ХОБЛ на стадии I/II и ХОБЛ на стадии III/IV, как определено выше. Установление различия между этими стадиями ХОБЛ важно для определения лечения. Например, для пациентов с немногими или периодическими симптомами (стадия I и II) достаточно применения ингаляционного бронходилататора кратковременного действия при необходимости контролировать одышку. Если в распоряжении нет ингаляционного бронходилататора, следует рассмотреть регулярное лечение с помощью медленно высвобождающегося теофиллина. Людям, у которых одышка в течение повседневной деятельности не уменьшается, несмотря на лечение по мере необходимости короткодействующими бронходилататорами, рекомендуется добавить регулярное лечение с применением длительно действующего ингаляционного бронходилататора. У людей, страдающих от ХОБЛ на стадии III/IV, регулярное лечение ингаляционными глюкокортикостероидами снижает частоту обострений и улучшает состояние здоровья. У этих людей регулярное лечение ингаляционными глюкокортикостероидами следует добавлять к длительно действующим ингаляционным бронходилататорам. В отношении людей, страдающих от ХОБЛ на стадии III/IV, следует рассматривать вопрос о хирургических видах лечения и/или длительном лечении кислородом, если имеет место хроническая дыхательная недостаточность.
Контрольные значения, которые позволяют провести различие между стадиями I/II и III/IV ХОБЛ, можно оценить путем определения соответствующих количеств ST2, ссСК-18, гистонов, HSP27 и/или HSP70 в пуле образцов, полученных от людей, страдающих от ХОБЛ на стадиях I/II и III/IV. Такой пул может включать образцы, полученные по меньшей мере от 5, предпочтительно по меньшей мере от 10, более предпочтительно по меньшей мере от 20 людей, страдающих от ХОБЛ, и у которых различные стадии ХОБЛ были диагностированы альтернативными методами (например, с помощью спирометрии).
ХОБЛ I/II может быть диагностирована у человека, когда количество HSP27 в образце указанного субъекта находится в пределах между 2600 и 3300 пг/мл, предпочтительно между 2700 и 3200 пг/мл. Если количество HSP27 в образце человека находится в пределах между 3400 и 5500 пг/мл, предпочтительно между 3500 и 5000 пг/мл, более предпочтительно между 3600 и 4500 пг/мл, ставится диагноз ХОБЛ III/IV.
ХОБЛ I/II может быть диагностирована у человека, когда количество ST2 в образце указанного субъекта находится в пределах между 160 и 400 пг/мл, предпочтительно между 170 и 380 пг/мл, более предпочтительно между 180 и 350 пг/мл. Дополнительно ХОБЛ I/II может быть диагностирована, когда количество ST2 больше чем 160, предпочтительно больше чем 170, более предпочтительно больше чем 180 пг/мл в указанном образце.
ХОБЛ I/II и ХОБЛ III/IV может быть диагностирована, когда количество HSP70 в образце человека составляет по меньшей мере 250 пг/мл, предпочтительно по меньшей мере 300 пг/мл.
ХОБЛ I/II и ХОБЛ III/IV может быть диагностирована, когда количество HSP90 альфа в образце человека составляет по меньшей мере 15000 пг/мл, предпочтительно по меньшей мере 16000 пг/мл.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу мониторинга течения хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) у человека, включающему стадии:
- предоставления образца от человека,
- определения количества расщепленного каспазой цитокератина-18 (ссСК-18), гистонов, белка теплового шока 27 (HSP27) и/или белка теплового шока 70 (HSP70) в указанном образце,
- сравнения количества ссСК-18, гистонов, HSP27 и/или HSP70 в образце указанного человека с количеством ссСК-18, гистонов, HSP27 и/или HSP70 в образце от указанного человека, определенным в предыдущем образце указанного человека.
Раскрытые в описании маркеры также можно использовать, чтобы контролировать течение ХОБЛ и лечение ХОБЛ. Такой способ касается сравнения количества ссСК-18, гистонов, HSP27 и/или HSP70 в образцах, полученных от человека в разные промежутки времени. Полученные с помощью указанного способа результаты позволяют врачу назначить соответствующее лечение.
Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируется следующими фигурами и примерами, однако без ограничения этим:
фиг.1 показывает концентрации в сыворотке растворимого цитокератина-18, расщепленного апоптоз-специфическими каспазами, определенные при помощи антител М30 (+/-SEM);
фиг.2 показывает измеренные значения оптической плотности (OD) циркулирующих гистон-связанных-ДНК фрагментов в образцах сыворотки (+/-SEM);
фиг.3 показывает уровни каспазы-1/ICE в образцах периферической сыворотки обследуемых пациентов (+/-SEM);
фиг.4 показывает концентрации в сыворотке растворимого ST2, достигающие максимума у пациентов с ХОБЛ I-II (+/-SEM);
фиг.5 показывает, что IL-10 в образцах сыворотки не наблюдается различия между исследуемыми группами (+/-SEM);
фиг.6 показывают корреляцию между концентрациями в сыворотке ICE и числом пачко-лет пациентов (a), циркулирующими гистон-связанными-ДНК фрагментами и уровнями ICE в сыворотке (b), FEV1%VC и сывороточным расщепленным каспазами цитокератином-18 (c) и противовоспалительными маркерами ST2 и IL-10 (d) соответственно; R - коэффициент ранговой корреляции Спирмана;
фиг.7 (а, b, с, d, e, f) показывают уровни в сыворотке белков теплового шока и 20S протеасом, определенные в системном кровотоке пациентов и контролях. Результаты: выражены как среднее значение +/-SEM;
фиг.8а-8d показывают непараметрические корреляции между HSP27, HSP70 и воспалительным цитокином IL-6 и параметр легочной функции FEW1%VC; R - коэффициент корреляции;
фиг.9 представляет рабочую характеристическую кривую (ROC), показывающую чувствительность и специфичность HSP27 и HSP70 для установления диагноза ХОБЛ в исследуемой популяции курящих.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Материалы и методы
Пациенты
Всего в это контрольное исследование было включено 64 пациента. Было исследовано четыре группы: здоровые добровольцы (n=15), курильщики без ХОБЛ (n=14), пациенты со стадией ХОБЛ от легкой до умеренной (n=19) и пациенты с тяжелой или очень тяжелой стадией ХОБЛ (n=16). Характеристики пациентов описаны в таблице 1.
Таблица 1
Клинические характеристики (тяжесть нарушения дыхания определяли с помощью теста по функции легких [LFT] у всех субъектов; ХОБЛ пациенты, удовлетворяющие GOLD диагностическому критерию в отношении ХОБЛ). Данные представлены как среднее значение (+/- среднее квадратическое отклонение), если не установлено иначе
Категория субъекта
Здоровые
Здоровые курильщики
ХОБЛ GOLD I-IV
ХОБЛ GOLD I и II
ХОБЛ GOLD III и IV
Количество (N)
15
14
35
19
16
Мужчин/Женщин
10/5
7/7
20/15
10/9
10/6
Возраст
57,20
56,64
59,60
60,68
58,31
Функция легких
-
FVC (L)
4,55
3,84
2,80
3,33
2,14
FEV1 (%)
105,37
94,40
52,76
70,21
30,67
FEV1/VC (%)
76,80
75,95
51,18
61,74
37,80
МЕР 50 (%)
100,67
87,64
27,29
39,42
11,93
MEF 25 (%)
103,53
75,71
29,71
37,37
20,00
История курения
Никогда не курили
15
0
0
0
0
Бывшие курильщики
0
3
7
4
3
Теперешние курильщики
0
11
28
15
13
Пачко-год
0
34 (25,2)
45,8 (30,6)
47,3 (29,7)
44,0 (32,6)
Вес тела (кг)
71,6 (13,9)
76,4 (8,6)
80,4 (21,6)
79,7 (16,7)
81,1 (27,2)
Рост тела (см)
172,710,9)
168,7 (8,1)
169,2 (10,5)
167,7 (12,1)
171,2 (7,9)
Использованные сокращения: ХОБЛ: Хроническая обструктивная болезнь легких, FEV1: объем форсированного выдоха за одну секунду; FVC: форсированная жизненная емкость; GOLD: Глобальная инициатива по хронической обструктивной болезни легких, MEF: максимальный поток экспирации.
2
2
Критериями невключения были следующие - острое обострение, как определено рекомендациями Всемирной организации здравоохранения и Глобальной инициативы по хронической обструктивной болезни легких (GOLD; www.goldcopd.com), или применение иммуномодулирующих лекарственных препаратов в течение минувших 14 дней, история болезни, связанная с астмой, аутоиммунными болезнями, другими существенными болезнями легких (например, раком легких, известным дефицитом а1-антитрипсина), или какими-либо известными сердечно-легочными сопутствующими заболеваниями. Измеряли вес и рост (Seca; Vogel and Halke, Германия) и определяли индекс массы тела (BMI). Параметры функции легких (FEV1, FVC, отношение FEVLFVC) измеряли на той же самой модели спирометра (AutoboxV6200, SensorMedics, Австрия). Измерения проводили перед и, если встречался критерий нарушения дыхания, через 15-30 минут после 200 мкг сальбутамола. Анализ газов в артериальной крови (PaO, PaCO) проводили в состоянии покоя, тогда как анализ дыхания комнатным воздухом - в положении «сидя». Измерение газов в артериальной крови осуществляли с помощью газового анализатора ABL 510 (Radiometer, Дания). Результаты выражены как абсолютные значения, и как проценты от значений в норме (расчетных) для возраста, пола и роста согласно расчетам Европейского сообщества угля и стали (Quanje PH et al. Eur Respir J Suppi 16 (1993): 5-40). Расчетные нормальные значения были получены из эталонных значений Австрийского общества легочной медицины (Hamoncourt К et al., Osterreich Arztetg. 37 (1982): 1640-1642). Образцы крови отбирали во время оценки легочной функции. Сыворотку получали после центрифугирования, а аликвоты хранили замороженными при -20°С до дальнейшего исследования.
Определение количества расщепленного каспазами цитокератина-18 (ссСК-18)
Уровни неоэпитопа М30 цитокератина-18 измеряли в образцах, используя набор М30-Apoptosense ELISA (Peviva, Швеция). Коротко, данный анализ ELISA использует антитела, узнающие неоэпитоп, доступный после индуцированного апоптозом расщепления цитокератина-18. Уровни антигена М30 могут быть измерены в единицах на литр (U/л), при этом 1U/л эквивалентна 1,24 пмоль синтезированного пептида мотива распознавания М30 согласно производителю. Чувствительность ELISA была установлена 25U/л. В пределах анализа и между анализами воспроизводимость метода была <10%. Концентрации в сыворотке вычисляли путем сравнения значений OD образцов со значениями OD стандартных разведении.
Определение гистон-связанных-ДНК-фрагментов в сыворотке
Для определения количественного содержания в сыворотке комплексов ДНК-гистон использовали коммерческий набор ELISA (Roche Applied Science, Германия). Образцы инкубировали в 96-луночных планшетах для микротитрования вместе с биотин-конъюгированными мышиными моноклональными антигистоновыми антителами (клон Н11-4) и мышиными моноклональными анти-ДНК антителами, конъюгированными с пероксидазой (клон МСА-33), в течение двух часов при комнатной температуре. После промывки лунок добавили раствор ABTS к каждой лунке. За ферментативной реакцией наблюдали до тех пор, пока не достигалось достаточное формирование цвета, и снимали показания с планшетов при 405 нм. Значения OD вычисляли путем вычитания значений OD пустых лунок из среднего значения опытных лунок.
Определение количества каспазы-1/ICE в сыворотке
Для определения содержания растворимой каспазы-1/ICE в образцах сыворотки использовали коммерчески доступный набор для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) (BenderMedSystems, Австрия). Планшеты для микротитрования, предварительно покрытые моноклональными антителами к человеческой ICE, инкубировали вместе с пробным материалом или разведенными стандартными концентрациями (400 пг/мл - 6,25 пг/мл, семь этапов разведения) при комнатной температуре в течение 1,5 часов. Планшеты промыли три раза буфером для промывки и добавили поликлональную кроличью ICE антисыворотку на 30 минут. После другой стадии промывки на 30 минут наносили конъюгат пероксидазы хрена. Лунки промыли, а для обнаружения ферментативной активности использовали раствор субстрата тетраметилбензидина (ТМВ). Реакцию останавливали с помощью серной кислоты (2 N). Показания с планшетов снимали при 450 нм на счетчике Wallac Multilabel 1420 (PerkinElmer, США). Концентрации вычисляли путем сравнения значений оптической плотности (OD) образцов со значениями OD известных концентраций стандартов.
Определение количества рецептора 4 интерлейкина-1/ST2
Для определения содержания в образцах сыворотки рецептора 4 интерлейкина-1 4/ST2 (ST2) использовали коммерчески доступный твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) (R&D Systems, США). Планшеты для микротитрования были предварительно покрыты иммобилизованными антителами к человеческому ST2. Затем планшеты промывали и блокировали. Образцы и стандартные разведения (2000 пг/мл до 31,25 пг/мл) инкубировали при комнатной температуре. Для обнаружения использовали биотинилированные козлиные античеловек IL-1 R4 антитела. После добавления стрептавидина, коньюгированного с пероксидазой хрена, для обнаружения ферментативной активности использовали раствор субстрата ТМВ. Реакцию останавливали серной кислотой (1 N). Снимали показания с планшетов при 450 нм на счетчике Wallac Multilabel 1420 (PerkinElmer, США). Концентрации вычисляли путем сравнения значений оптической плотности (OD) образцов со значениями OD известных концентраций стандартов.
Определение количества интерлейкина-10
Для определения уровней интерлейкина-10 (IL-10) в образцах сыворотки, полученных после центрифугирования цельной крови, использовали метод ELISA (BenderMedSystems, Австрия). 96-луночные планшеты покрывали моноклональными антителами, направленными против специфического антигена, и инкубировали в течение ночи при 4°С. После стадии промывки планшеты блокировали при помощи assay буфера в течение двух часов. После другой стадии промывки образцы и стандарты с определенными концентрациями антигена инкубировали, как описано у производителя. Затем планшеты промывали и инкубировали с фермент-связанными поликлональными антителами. Раствор субстрата ТМВ наносили после соответствующего времени инкубации и другой стадии промывки. Затем наблюдали за формированием цвета при помощи счетчика Wallac Multilabel 1420 (PerkinElmer, США). Полученные значения OD сравнивали со стандартной кривой, вычисленной из значений OD стандартов с известными концентрациями антигена.
Статистические методы
Для подсчета всех результатов использовали программное обеспечение SPSS Software (SPSS Inc., США). Значение р<0,05 считалось статистически значимым. Попарное сравнение между группами проводили с помощью U-Теста Манна-Уитни. Корреляции вычисляли с использованием коэффициента корреляции Спирмена. Результаты не корректировали для множественных сравнений.
Результаты
Индуцированный апоптозом, расщепленный каспазами цитокератин-18, был увеличен у пациентов с ХОБЛ.
Были продемонстрированы повышенные уровни неоэпитопа М30 в сыворотке у пациентов с ХОБЛ I-II (294,96 U/л [87,81-502,11], р=0,008) и ХОБЛ III-IV (464,86 U/л [79,69-850,03], р=0,001) по сравнению с содержанием в сыворотке здоровых курильщиков (119,67 U/л [93,85-145,49]). «Здоровые контроли» показали немного повышенные уровни М30 (284,08U/л [64,26-503,90], но это различие не было статистически значимым (фиг.1).
Содержание гистон-связанных-ДНК-фрагментов было повышено у пациентов с тяжелой или очень тяжелой стадией ХОБЛ.
Среднее значение OD у пациентов с ХОБЛ III-IV было определено на уровне 0,43 [0,26-0,60]. Этот уровень статистически значимо различался от уровней гистонов в сыворотке «здоровых контролей» (0,27[0,12-0,42], р=0,037) и курильщиков без ХОБЛ (0,26[0,08-0,45], р=0,022). Пациенты с ХОБЛ I-II имели повышенные уровни гистон-связанных-ДНК-фрагментов в сыворотке (0,40[0,22-0,59]), хотя не было статистического эффекта по сравнению с другими группами (фиг.2).
Уровни каспазы-1/ICE в сыворотке не показали статистически значимого различия.
Концентрации ICE в образцах сыворотки составляли 84,86 пг/мл ([64,85-104,87], 95% доверительный интервал [CI]) для «здоровых контролей» и 102,76 пг/мл [56,59-148,93] для курильщиков без ХОБЛ. Пациенты с ХОБЛ GOLD на стадии I-II показали умеренно высокое среднее содержание 114,56 пг/мл [78,98-150,14], а пациенты с ХОБЛ III-IV имели средний уровень в сыворотке 111,87 пг/мл [82,21-141,53], сравнимый с ХОБЛ I-II. Не наблюдалось значимого различия между какими-либо группами (фиг.3).
Уровни ST2 в сыворотке повышены у пациентов с ХОБЛ.
Обнаружены повышенные уровни ST2 в сыворотке у пациентов с ХОБЛ I-II (251,80 пг/мл [45,74-457,85], р=0,031) по сравнению с содержанием в сыворотке здоровых курильщиков (94,01 пг/мл [11,57-176,46]). Сравнение всех других групп не показало значимых различий «здоровые контроли» (99,86 пг/мл [41,86-157,86]), ХОБЛ III-IV (127,24 пг/мл [51,72-202,75]) (фиг.4).
Статистически значимого различия уровней IL-10 в сыворотке не обнаружено.
Концентрации IL-10 в образцах сыворотки составляли 8,84 пг/мл ([-6,14-23,81]) для «здоровых контролей» и 10,25 пг/мл [-3,84-24,34] для курильщиков без ХОБЛ. Пациенты с ХОБЛ GOLD на стадии I-II показали содержание 11,57 пг/мл [-8,49-31,62], а пациенты с ХОБЛ III-IV имели более низкий уровень в сыворотке 0,63 пг/мл [-0,71-1,97]. Не наблюдалось значимого различия между какими-либо группами (фиг.5).
Заключение
Хроническая обструктивная болезнь легких характеризуется хроническим воспалением легочной ткани и сопутствующим повреждением других систем органов. Полагают, что этот процесс запускается в основном в результате многих лет табакокурения. Можно видеть сильную корреляцию между числом пачко-лет и концентрацией в сыворотке провоспалительной каспазы-1 ICE (ICE), показывающую прямое влияние привычки к курению на системный воспалительный ответ (фиг.6a). Повышенные уровни апоптоз-специфического растворимого ссСК-18 и гистон-связанных-ДНК-фрагментов (гистонов) можно обнаружить у пациентов с ХОБЛ GOLD I-II и GOLD III-IV (фиг.1, 2). Содержание в сыворотке биологически активного белка ICE значительно коррелировало с уровнями гистонов (фиг.6b). В апоптотических клетках активация эндонуклеосом приводит к распаду ДНК и генерирует длинные фрагменты хроматина, богатые HI короткие олигонуклеосомы и мононуклеосомы, называемые гистонами, которые не прикрепляются к ядру. По-видимому, высвобождение апоптоз-специфического гистон-ДНК-комплекса является результатом постоянного ремоделирования вследствие активации иммунитета.
Патогенез ХОБЛ связан с дегенерацией легочной ткани из-за повышенной активации и передачи проапоптотических сигналов врожденной и адаптивной иммунной системы у пациентов, подверженных болезни. Хроническое воспаление приводит к повышенным уровням ICE, протеазы с Cys285, служащим в качестве каталитического остатка, которая расщепляет биологически неактивный предшественник IL-1β (21 kDa) при Asp116-Ala117, чтобы произвести зрелую форму IL-1β (17,5 kDa). Активный фермент состоит из двух неидентичных субъединиц (р10 и р20), обе из которых имеют существенное значение для ферментативной активности и, следовательно, играют важнейшую роль в апоптозе различных клеток, включая эндотелиальные и эпителиальные клетки. Апоптотический цикл приводит к освобождению клеточных промежуточных филаментов, таких как цитокератин-18 (СК-18). СК-18 представляет собой основной компонент промежуточных филаментов и широко экспрессируется эпителиальными и эндотелиальными тканями. В апоптотических клетках СК-18 фосфорилируется, и микрофиламенты быстро агрегируют. Различные условия клеточного стресса увеличивают реорганизацию цитоплазматических микрофиламентов, а также полимеризацию измененного СК-18. В результате происходит опосредованное каспазами расщепление СК-18 во время апоптоза, что приводит к образованию специфического неоэпитопа, распознаваемого антителом М30. Специфичность связывания этого антитела относится исключительно к продуктам апоптотической дегенерации СК-18 (расщепленного каспазами СК-18 [ссСК-18]). Интересно, что присутствие растворимого ссСК-18 было связано с ухудшением легочной функции согласно классификации ХОБЛ с использованием рекомендаций GOLD (фиг.6c).
Вышеприведенные данные показывают зависимую от апоптоза дегенерацию легких по образцам сыворотки. Расщепление цитокератина-18 и высвобождение ссСК-18 в кровоток происходит с прогрессией болезни и может быть использовано для контролирования болезни у пациента.
Предыдущие исследования продемонстрировали преобладание ТН1-среды цитокинов у пациентов с ХОБЛ. Поскольку известно, что воспаление всегда сопровождается секрецией белков, имеющих противовоспалительные свойства, таких как IL-10, был исследован другой белок, как известно, имеющий отношение к врожденной иммунной системе и названный T1/ST2. Полагают, что эта растворимая молекула модулирует иммунные ответы, связанные с ТН1/ТН2. Наблюдалось значительное увеличение уровней противовоспалительного ST2 в сыворотке у пациентов с ХОБЛ на стадии I&II, но не с тяжелой стадией ХОБЛ. Эти наблюдения показывают, что при ХОБЛ наблюдается повышение маркеров, характерных для активации иммунитета, и регуляция, подобная аутоиммунным болезням, сепсису и специфическим болезням легких, например фиброзу и астме.
Последняя работа показывает, что Toll-подобные рецепторы (TLR) функционируют у млекопитающих как рецепторы, распознающие передачу сигнала о присутствии микробных компонентов клеткам врожденного иммунитета. Сообщалось по меньшей мере о 10 членах TLR-семейства млекопитающих, причем каждый TLR показывает различную специфичность к характерным участкам микробов. Связывание лигандов активации, например липополисахарида (LPS), с TLR вызывает активацию NF-кВ, приводя к выработке и высвобождению провоспалительных цитокинов. Считается общепринятым, что предварительная экспозиция к LPS уменьшает чувствительность ко второму контакту с LPS, приводя к пониженной выработке многочисленных цитокинов и у грызунов, и у людей. Молекулярные механизмы TLR-индуцированной толерантности могут затрагивать понижающую регуляцию TLR4-MD2 комплекса, что может приводить к пониженной TLR-передаче сигналов. Более того, было показано, что экспрессия IRAK-М и IRAK-1, а также супрессора передачи сигналов цитокинов (SOCS-1), связана с толерантностью к эндотоксинам.
Некоторые исследования предполагают важную роль члена семейства ST2 рецептора Toll/IL-1 (TIR) в индукции толерантности к эндотоксинам. ST2 экспрессируется клетками ТН2, тучными клетками и макрофагами. Было показано, что он активируется после LPS-стимуляции и регулирует экспрессию цитокинов на модели острого повреждения легких. Секреция ST2 при возникновении ХОБЛ действует как отрицательный регулятор TLR4- и IL-1R-передачи сигналов через разрушение (секвестрацию) MyD88. В клиническом контексте это может означать, что системный T1/ST2 функционирует как защитный сывороточный белок для того, чтобы препятствовать разрушению легких вследствие сверхактивной адаптивной и врожденной иммунной системы. Этому выводу соответствовало наблюдение, что T1/ST2 значительно коррелировал с уровнями IL-10 в сыворотке в исследованных когортах пациентов.
Результаты показывают, что у пациентов с ХОБЛ наблюдается повышенный апоптоз и высвобождение ссСК-18 и гистон-ДНК-комплекса в системный кровоток. Кроме того, был обнаружено повышенное количество растворимого T1/ST2 у пациентов с ХОБЛ I и II по сравнению со здоровыми курильщиками. Повышенные уровни противовоспалительного ST2 на ранних стадиях ХОБЛ возможно могут являться отрицательной обратной связью для контролирования хронического воспалительного ответа. Более того, продемонстрировано, что растворимый ICE значительно коррелировал с историей курения (пачко-год), показывая «запуск» воспаления, обусловленный вредными летучими веществами. Установленные сывороточные маркеры служат для опознавания пациентов с риском развития и прогрессирования ХОБЛ.
Пример 2
Материалы и методы
Пациенты
Группа пациентов, использованная в этом примере, была идентична группе пациентов, использованной в примере 1.
Белки теплового шока 27, 60 и 70
Уровни HSP27, HSP60 и HSP70 определяли, используя адаптированные наборы для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) для количественного определения внутриклеточного HSP (Duoset IC; R&D Systems, США). 96-луночные титрационные микропланшеты покрывали на ночь при 4°С иммобилизованными антителами в концентрации 1 мкг/мл. После блокирования планшетов к лункам добавили образцы сыворотки и стандартные белки в разных концентрациях. После стадии промывки к каждой лунке добавили антитела, меченные биотином, и инкубировали в течение 1 часа. Планшеты промыли и добавили стрептавидин-HRP. Цветную реакцию проводили при помощи тетраметилбензидина (ТМВ; Sigma, США) и останавливали кислым стоп-реагентом. Оптическую плотность измеряли при 450 нм на ELISA ридере.
Белок теплового шока 90 альфа
Уровни Н8Р90 альфа в сыворотке измеряли при помощи коммерчески доступного, готового к употреблению набора ELISA (Stressgen, США). Коротко, образцы сыворотки и стандарты инкубировали в 96-луночных титрационных микропланшетах, предварительно покрытых антителами античеловек HSP90. После стадии промывки добавили анти-Н8Р90:НКР-конъюгированные антитела, и планшеты инкубировали в течение 24 часов. Планшеты промыли и добавили субстрат ТМВ. Изменение цвета останавливали кислым стоп-реагентом, а оптическую плотность определяли при 450 нм. Количество белка в каждом образце вычисляли по стандартной кривой значений оптической плотности, построенной для известных уровней HSP90. Чувствительность ELISA была 50 пг/мл; устанавливали вариабельность результатов одного анализа менее чем 10% согласно производителю.
20S Протеасома
Титрационные микропланшеты инкубировали в течение ночи при 4°С с моноклональными антителами против α6-субъединицы 20S протеасомы (Biomol, США). Планшеты промывали и блокировали в течение 1 часа с помощью 1% BSA в растворе фосфатного буфера. Добавили образцы сыворотки и разные концентрации стандартного белка (Biomol), затем планшеты запечатывали и инкубировали в течение 24 часов при 4°С. Добавили кроличьи поликлональные антитела к субъединицам α/β протеасомы 20S (Biomol), которые служат как антитела обнаружения, после стадии промывки планшеты инкубировали вместе с ослиным антикроличьим IgG, меченным пероксидазой (Jackson ImmunoResearch, Великобритания), в течение следующих 2 часов. В качестве контрольного субстрата служил тетраметилбензидин. Реакцию останавливали добавлением 1 N серной кислоты. Показания с планшетов снимали при 450 нм с помощью счетчика Wallac Multilabel 1420 (PerkinElmer, США).
Интерлейкин-6
Уровни IL-6 в сыворотке определяли при помощи коммерчески доступного набора ELISA (BenderMedSystems, Австрия). Исследования проводили в соответствии с инструкциями производителя. Показания с планшетов снимали при 450 нм на ELISA ридере, а содержание IL-6 вычисляли путем сравнения значения оптической плотности образцов со значениями оптической плотности известных концентраций IL-6.
Статистические методы
Для подсчета всех результатов использовали программное обеспечение SPSS Software (SPSS Inc., США). Значение р<0,05 считалось статистически значимым. Попарное сравнение между группами проводили с помощью U-Теста Манна-Уитни. Корреляции вычисляли с использованием коэффициента корреляции Спирмена.
Результаты
HSP27
Уровни HSP27 составляли 2042,57пг/мл [1599,58-2485,57] (среднее значение [95% доверительный интервал]) у «здоровых контролей», 2199,64 [1641,52-2757,75] у здоровых курильщиков, 2862,62 [2280,49-3444,74] при ХОБЛ GOLD I-II и 3717,58 [3079,35-4355,81] при ХОБЛ GOLD III-IV. Статистически значимые различия были обнаружены между «здоровыми контролями» и ХОБЛ I-II (р=0,025), «здоровыми контролями» и ХОБЛ III-IV (р<0,001), здоровыми курильщиками и ХОБЛ III-IV (р=0,001) и ХОБЛ I-II и ХОБЛ III-IV (р<0,001) (фиг.7а).
HSP60
Уровни HSP60 в сыворотке составляли 1836,69 пг/мл [153,30-3520,08] у «здоровых контролей», 4378,40 [-3851,48-12608,28] у здоровых курильщиков, 3497,42 [-1561,38-8556,23] при ХОБЛ GOLD I-II и 531,81 [132,57-931,05] при ХОБЛ GOLD III-IV. Не было обнаружено статистически значимых различий между группами (фиг.7b).
HSP70
Уровни HSP70 в сыворотке составляли 140,50 пг/мл [67,97-213,04] у «здоровых контролей», 108.50 [43.30-173.69] у здоровых курильщиков, 454,29 [327,05-581,52] при ХОБЛ GOLD I-II и 437,92 [143,41-732,42] при ХОБЛ GOLD III-IV. Статистически значимые различия были обнаружены между «здоровыми контролями» и ХОБЛ I-II (р<0,001), «здоровыми контролями» и ХОБЛ III-IV (р=0,009), здоровыми курильщиками и ХОБЛ I-II (р<0,001), здоровыми курильщиками и ХОБЛ III-IV (р<0,001) (фиг.7с).
HSP90 aльфa
Уровни HSP90 aльфa в сыворотке составляли 13133,78 пг/мл [9791,40-16476,15] у «здоровых контролей», 12827,91 [10838,21-14817,62] у здоровых курильщиков, 17884,50; [13307,14-22461,85] при ХОБЛ GOLD I-II и 17273,02 [12573,96-21972,08] при ХОБЛ GOLD III-IV. Статистически значимые различия были обнаружены между «здоровыми контролями» и ХОБЛ I-II (р=0,025) и «здоровыми контролями» и ХОБЛ III-IV (р=0.049) (фиг.7d).
20S Протеасома
Уровни 20S протеасом в сыворотке составляли 194,78 пг/мл [164,94-224,62] у «здоровых контролей», 188,25 [159,26-217,25] у здоровых курильщиков, 172,33 [133,78-1210,88] при ХОБЛ GOLD I-II и 187,50 [145,54-229,46] при ХОБЛ GOLD III-IV. Не было обнаружено статистически значимых различий между группами (фиг.7е).
Интерлейкин-6
Уровни IL-6 в сыворотке составляли 5,18 пг/мл [0,17-10,19] у «здоровых контролей», 1,65 [-0,11-3,42] у здоровых курильщиков, 7,14 [1,19-13,09] при ХОБЛ GOLD I-II и 2,99 [0,99-5,00] при ХОБЛ GOLD III-IV. Статистически значимые различия были обнаружены между здоровыми курильщиками и ХОБЛ I-II (р=0.017).
Корреляционные и регрессионные модели
Корреляции между HSP, FEV1%VC и IL-6 представлены на фиг.8а-8d. В одномерных моделях логистической регрессии, включающих только здоровых курильщиков и пациентов с ХОБЛ, HSP27 имел площадь под кривой (AUC) на рабочей характеристической кривой (ROC) 0,763 (0,624-0,902: 95% доверительный интервал; р=0,004), и HSP70 показал AUC 0,885 (0.786-0,983: 95% доверительный интервал; р<0,001). Все другие переменные не показали значимых результатов при одномерном логистическом регрессивном анализе (фиг.9).
Заключение
У пациентов, страдающих от хронической обструктивной болезни легких, имеет место прогрессирующее воспаление бронхиальных дыхательных путей, малых дыхательных путей и паренхимы легких. Биопсия легких показывает массивную инфильтрацию околобронхиальной ткани нейтрофилами, макрофагами и лимфоцитами как части врожденной и адаптивной иммунной системы. Полагают, что активация этих клеток ведет к ремоделированию ткани легких. Медленно прогрессирующий процесс ремоделирования ткани сопровождается разрушением значительного количества клеток. Полагают, что при ХОБЛ оба эндогенных фактора, включая нейтрофилы и цитотоксические Т-клетки, а также экзогенные стимулы, подобные табачному дыму, способствуют разрушению ткани. Однако прекращение курения не изменяет расстройство воспалительного ответа.
Индукция воспалительных сигналов и повышенная сменяемость клеток приводит к стимулированию внутриклеточных белков теплового шока и увеличенному высвобождению их во внеклеточную окружающую среду. В этом примере может быть продемонстрировано значительное увеличение HSP27 в образцах сыворотки, взятых из периферического кровотока пациентов, страдающих от ХОБЛ, по сравнению со здоровыми курильщиками. HSP27 функционирует как механизм репарации, нацеленный на стабильность и правильное посттрансляционное свертывание внутриклеточных белков, а также предотвращение апоптотической гибели клеток. О повышенных уровнях HSP27 в сыворотке сообщалось при воспалительных расстройствах, включая острый коронарный синдром и хроническую аллогенную нефропатию. Экспрессия HSP27 вызывается как ответ на стрессовые события. Окончание острого «запуска» приводит к снижению концентраций HSP27 до нормальных уровней. Таким образом, HSP27 стимулируется только тогда, когда необходимы его цитопротекторные свойства. Интересно, что результаты показали непрерывное увеличение концентраций HSP27 в сыворотке с увеличением тяжести болезни и сильную корреляцию с провоспалительным сывороточным IL-6. Этот эффект может быть следствием повышенного разрушения ткани особенно на поздних стадиях ХОБЛ и распространения воспалительной болезни на другие системы органов, что приводит к системной утечке HSP27 в сосудистое ложе. Как правило, HSP27 действует как антиапоптотический медиатор, и его можно рассматривать как эндогенную иммуносупрессорную попытку контролировать чрезмерное воспаление в клинических ситуациях при ХОБЛ. Кроме того, содержание HSP27 в сыворотке показало высокую чувствительность и специфичность для того, чтобы устанавливать наличие ХОБЛ на модели логистической регрессии.
Роль внеклеточного HSP60 хорошо не определена. Представленные здесь данные не дают какого-либо подтверждения, что HSP60 является ключевым элементом в патогенезе ХОБЛ. Концентрации в сыворотке HSP60 не коррелировали с уровнями других HSP.
Уровни в сыворотке HSP70 были повышены у пациентов на ранних и поздних GOLD стадиях ХОБЛ. Было подтверждено четырехкратное повышение в группе GOLD I-II по сравнению с курильщиками без симптомов. HSP70 представляет собой внутриклеточный шаперон, который высвобождается во внеклеточное пространство после клеточной смерти или посредством различных путей секреции. Сообщалось, что внеклеточный HSP70 активирует клетки врожденной и адаптивной иммунной системы и стимулирует выработку цитокинов. Были обнаружены повышенные концентрации растворимого HSP70 в образцах при ХОБЛ. Значения достигают максимума в группе с ХОБЛ I-II, указывая на состояние обширной иммунной активации в основном на ранних стадиях болезни. Кроме того, уровни HSP70 значительно коррелируют с уровнями HSP27, HSP90 альфа и IL-6 и являются, таким образом, частью системного "сигнала опасности", сопровождающего активацию иммунитета при ХОБЛ. Более того, содержание HSP27 в сыворотке показало высокую чувствительность и специфичность для того, чтобы устанавливать наличие ХОБЛ на модели логистической регрессии.
Растворимый HSP90 aльфa был значительно активирован в периферическом кровотоке в группах с ХОБЛ по сравнению со здоровыми некурильщиками. Повышенные уровни HSP90 aльфa ранее были описаны при аорто-коронарном шунтировании с использованием искусственного кровообращения и при заживлении ран после гипоксии. HSP90 был также охарактеризован как центральный фактор в антиген-презентации Т-лимфоцитам посредством молекул II класса главного комплекса гистосовместимости (MHCII). В кратком обзоре данных мы приходим к выводу, что повышенные уровни внеклеточного Н8Р90 альфа при ХОБЛ вызывают существенный ответ адаптивной иммунной системы, запускающий возможный аутореактивный ответ на аутоантиген. Эта функция Н8Р90 альфа также может изменить иммуногенность связанного антигена. Следовательно, Н8Р90 альфа имеет иммуномодулирующее действие через перекрестную презентацию связанных пептидов в отношении молекул главного комплекса гистосовместимости.
Внеклеточное сывороточное содержание 20S протеасом не было статистически увеличено или уменьшено в изученных когортах. Уровни оставались ниже 200 нг/мл во всех группах и, по-видимому, имеют второстепенное значение в прогрессировании ХОБЛ.
Подводя итог, у пациентов с ХОБЛ могут быть обнаружены повышенные концентрации в сыворотке растворимых иммуномодулирующих белков теплового шока 21, 70 и 90 альфа. Эта утечка в сосудистое ложе, по меньшей мере, отчасти обусловлена непрерывной активацией иммунной системы при ухудшении ХОБЛ посредством эндогенного и экзогенного пусковых механизмов. Кроме того, HSP27 и HSP70 показали отличные статистические тенденции, чтобы служить в качестве диагностических маркеров для обнаружения обструкции дыхательных путей на ранних стадиях ХОБЛ.