Способ динамического контроля эффективности лечения цервикальных интраэпителиальных поражений шейки матки с помощью суппозиториев на основе дииндолилметана
METHOD FOR DYNAMIC CONTROL OF EFFICIENCY OF TREATMENT OF CERVICAL INTRAEPITHELIAL LESIONS OF CERVIX UTERI BY MEANS OF DIINDOLYLMETHANE-BASED SUPPOSITORIES

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу динамического контроля лечения цервикальных интраэпителиальных поражений шейки матки.
В Российской Федерации в 2013 году злокачественные новообразования шейки матки составили 5,3% в структуре онкологической заболеваемости женской популяции (115 случаев на 100 тыс. населения) (Злокачественные новообразования в России в 2012 году (заболеваемость и смертность). / Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. М.: ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздрава России, 2014. 250 с. http://www.oncology.ru/service/stetistics/malignant_tumors/2012.pdf.).
Злокачественной прогрессии в РШМ предшествуют диспластические изменения эпителия шейки матки. Особо важное значение в возникновении дисплазии шейки матки принадлежит вирусу папилломы человека (ВПЧ). Он проникает в базальные клетки эпителия через механические и другие микроповреждения кожи и слизистых оболочек. Предрасполагающим фактором являются травматические повреждения шейки матки, возникшие после родов или абортов. В настоящее время идентифицировано более 100 различных типов ВПЧ. Среди типов ВПЧ-инфекции выделяют группы различного онкологического риска. Так, к низкому онкологическому риску относят ВПЧ 6, 11, 40, 42, 43, 44 и 61 типов; к среднему риску - 30, 33, 35, 39, 45, 52, 56, 58; к высокому риску - 16, 18 и 31 типы вируса.
Вирусный геном в инфицированных клетках может существовать как в эписомальной (при доброкачественных поражениях), так и в интегрированной в геном форме (характерна для карцином). Эписомальная фаза нужна для репликации вируса и сборки вириона. Эта фаза гистологически характеризуется как цервикальная интраэпителиальная неоплазия легкой степени (CIN 1), ассоциированная как с ВПЧ высокого, так и низкого онкогенного риска. Дальнейший патологический процесс сопровождается переходом CIN 1 в среднюю и тяжелую степень цервикальной интраэпителиальной неоплазии (CIN 2 и CIN 3), ассоциированные с ВПЧ высокого онкогенного риска, когда вирусная ДНК встраивается в геном эпителиальных клеток. Начинается экспрессия вирусных онкобелков E6 и E7, которые контролируют опухоль-супрессорные белки и гены, ответственные за нормальный клеточный цикл.
Подтверждено, что ВПЧ увеличивает риск малигнизации, однако инфицирование эпителиальных клеток ВПЧ является необходимым, но недостаточным условием для развития РШМ.
Фактором развития неопластических процессов в тканях шейки матки являются гормональные нарушения в результате сдвига в метаболизме эстрогенов в сторону преобладания 16α-гидроксиэстрона (16α-OHE1). Метаболит 16α-OHE1 в эстрогензависимых тканях органов женской репродуктивной системы многократно усиливает экспрессию эстроген-зависимых генов. В то же время 2-гидроксиэстрона (2-OHE1) обладает антипролиферативными свойствами и индуцирует апоптоз. Многочисленные экспериментально-клинические исследования доказали необходимость поддержания баланса между метаболитами 2-OHE1/16α-OHE1 в соотношении 2:1.
К факторам развития фоновых и предраковых заболеваний шейки матки относятся также воспалительные заболевания гениталий, которые приводят к образованию эрозированных участков. Заживление таких участков происходит за счет разрастания эпителия в цервикальном канале. Инфекции, передаваемые половым путем (ИППП), могут являться теми факторами, которые активизируют функционально неактивный вирус. Показана также роль иммунных нарушений, характерных для развития цервикальных дисплазий.
Применение профилактических вакцин против ВПЧ пока находится на ранних стадиях экспериментальной проверки и опубликованные данные исследований зачастую противоречивы (Franco Е., Harper D. Vaccination against human papillomavirus infection: a new paradigm in cervical cancer control, 2005 Vaccine. 23(17-18): 2388-94).
В разное время было предложено множество консервативных и деструктивных методов лечения патологических состояний шейки матки. Общепринятыми методами лечения CIN являются такие хирургические методики, как радиоволновая эксцизия, холодно-ножевая конизация, лазерная абляция или криотерапия. Однако при их использовании происходят повреждения шейки матки, которые могут негативно повлиять на фертильность женщины, а также существует риск высокого процента рецидивов после их применения. Из консервативных способов широкое применение нашли химические коагулянты, такие как Солковагин. Механизм действия препарата обусловлен морфофункциональным отличием многослойного плоского и эктопического цилиндрического эпителия. Цилиндрический эпителий намного больше, чем плоский многослойный эпителий, восприимчив к раствору, в состав которого входят азотная и уксусная кислоты, дигидрат щавелевой кислоты и гексагидрат нитрата цинка. С помощью этого достигается избирательное влияние на измененные ткани шейки матки, не вызывая нарушений в окружающем здоровом многослойном плоском эпителии. Глубина действия препарата на ткани обеспечивает разрушение патологически измененного участка. Эффективность лечения этим препаратом при неосложненных формах псевдоэрозии у молодых нерожавших женщин составляет 74,3% (Костава М.Н. Эффективность лечения фоновых заболеваний шейки матки у молодых нерожавших женщин «Солковагином» и низкоинтенсивным лазером. - М., 1994. - 24 с.).
Часто для лечения ВПЧ и ассоциированных с ним заболеваний используются препараты α-интерферона (α-IFN). Однако в большинстве случаев даже длительная интерферонотерапия не приводит к стабильному клиническому эффекту, что может быть обусловлено повышенным уровнем экспрессии онкобелка E7, внутриклеточно инактивирующего фактор регуляции интерферона, который включает транскрипцию генов, кодирующих синтез противовирусных белков.
В настоящее время клиницисты стараются придерживаться этиопатогенетической терапии, которая позволяет воздействовать на этиологический фактор - ВПЧ, а также блокировать основные механизмы канцерогенеза.
Исходя из этого, задачей изобретения стала разработка динамического контроля нового способа лечения интраэпителиальных поражений шейки матки, обладающего повышенной эффективностью и снижением или исключением негативного воздействия побочных эффектов.
Задачей изобретения является разработка динамического способа контроля лечения цервикальных интраэпителиальных поражений шейки матки при применении препарата «Цервикон-ДИМ» на основе активной субстанции 3,3'-дииндолилметан в лекарственной форме «суппозитории вагинальные» в дозировке 200 мг/сут в течение 6 месяцев и включает контроль эффективности с использованием кольпоскопического исследования пораженных участков шейки матки через 6 и 12 месяцев терапии.
Указанный способ лечения обеспечивает длительный противорецидивный эффект на протяжении не менее года после окончания терапии, а также стимулирует иммунную систему, в том числе общий и местный иммунитет слизистой оболочки влагалища. Кроме того, данный способ способствует ускорению эпителизации после проведения деструктивной терапии по поводу цервикальной интраэпителиальной неоплазии. Контроль над эффективностью проводимой терапии предраковых состояний осуществляется с использованием кольпоскопических методов. Критерием эффективности проведенной терапии служит устранение аномальной кольпоскопической картины, к признакам которой относятся атрофия эпителия, атипические сосуды, лейкоплакия или кератоз, мозаика и пунктация на фоне ацето-белого эпителия в йод-негативной зоне. Использование заявленного способа контроля лечения цервикальных интраэпителиальных поражений шейки матки позволяет достоверно оценить эффективность и скорость наступления лечебного эффекта.
ДИМ обладает противоопухолевым действием в эстроген-зависимых органах и тканях, в том числе в ткани шейки матки. Ключевыми индукторами внутриклеточных пролиферативных сигналов в таких клетках являются эстрогены и факторы роста. ДИМ обладает выраженным антиэстрогенным эффектом, стимулируя образование антипролиферативного 2-OHE1. В многочисленных исследованиях удалось продемонстрировать многообразие противоопухолевой активности ДИМ и его метаболического предшественника индол-3-карбинола (И3К) в ВПЧ-трансформированных клетках эпителия. Было показано, что in vitro и in vivo ИЗК и ДИМ блокирует эстрадиол-зависимую индукцию онкогена E7 и препятствует гормон-зависимой пролиферации инфицированных клеток; нормализует метаболизм эстрадиола в клетках; индуцирует апоптотические процессы ВПЧ-инфицированных клеток, вызывая избирательную гибель клеток с опухолевыми свойствами; проявляет иммуномодулирующие свойства (стимулируя IFNγ-зависимые сигнальные каскады). Результаты поиска в данном направлении позволили применить и оценить клиническую эффективность длительного применения суппозиториев вагинальных, содержащих в качестве активного вещества дииндолилметан (препарат «Цервикон-ДИМ», патент на изобретение РФ №2552332, опубл. 10.06.2015). Препарат представляет собой суппозитории вагинальные, содержащие в качестве активной субстанции 3,3'-дииндолилметан (DIM), липофильную основу, содержащую твердый кондитерский жир, поливинилпирролидон и бутилгидроксианизол или бутилгидрокситолуол.
Пример 1. Моделирование эрозии (дисплазии) шейки матки.
Эксперименты in vivo проводились на белых беспородных крысах-самках (4-6 лет), полученных из питомника Рапполово, г. Санкт-Петербург.
Длительность карантина (акклиматизационного периода) для всех животных составляла 14 дней. Клетки с животными были помещены в отдельные комнаты. Животные содержались при 12-часовом режиме освещения, температуре 20-25°C, относительной влажности 50-70% и свободном доступе к корму и воде.
Крыс перед нанесением ожога наркотизировали кетамином в дозе 30 мг/кг внутримышечно. Во влагалище вводили стеклянную воронку, во внутреннюю часть которой вносили разогретый до 100°C медный стержень и через отверстие в цилиндрической части воронки вызывали ожог шейки матки (2-3 с, во избежание потери температуры стержня). После ожога в это же отверстие вводили 2 капли 5% водного раствора едкого натра для изменения кислотной среды влагалища. Лечение начинали через сутки; при этом препараты вносились во влагалище: Солковагин - в объеме 3 капель, а Цервикон-ДИМ (0,1 г) - в виде полоски в дозе 100 мг/кг курсом 7 дней.
Отмечали динамику регенерации и гистологическую картину. Кроме этого, в периферической крови общепринятыми способами определяли показатели выраженности воспалительных процессов (количество лейкоцитов, содержание лимфоцитов и нейтрофилов, СОЭ, СРБ и фибриноген) (см. таблицу 2).
Для гистологического исследования крыс умерщвляли декапитацией в динамике и после окончания эксперимента. Контрольных крыс умерщвляли тем же способом. Шейку матки фиксировали в 10% формалине и после спиртовой проводки заливали в парафин. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином. Срезы изучали под биологическим микроскопом МБИ-6.
При гистологическом исследовании шейки матки у крыс после аппликации Цервикон-ДИМ наблюдалась полная эпителизация поверхности эрозии. Эпителий, покрывающий слизистую шейки, был многослойным плоским неороговевающим. Воспалительная инфильтрация в подслизистом слое отсутствовала. В подслизистом слое были видны коллагеновые соединительнотканные волокна и единичные полиморфноядерные лейкоциты и капилляры. В то время как наблюдение за течением эрозивно-воспалительного процесса у животных без лечения показало, что имеет место некробиоз эпителия, отек и инфильтрация полиморфно ядерными лейкоцитами подслизистого слоя. Клеточные границы эпителия влагалищной части матки были неразличимыми, ядра пикнотичными и деформированными. Местами эпителий отсутствовал, наблюдалась его дисплазия.
Также было проанализировано длительное применение Цервикон-ДИМ у пациентов с генитальными кондиломами. Исследование подтвердило способность препарата элиминировать неонкогенные типы вируса.
Пример 2. Исследование воздействия на генитальные кондиломы.
Были проведены также исследования на пациентах с диагнозом «генитальная остроконечная кондилома». Диагностика проводилась на основании цитологического, гистологического исследования биоптатов, определения антител к ВПЧ и обнаружения ДНК ВПЧ и онкобелка E7. Из 25 пациентов группы генитальные кондиломы примерно в 90% случаев ассоциировались с другими урогенитальными инфекциями. Примерно 10% ранее лечились методом электрокоагуляции. 15 пациентам вводили 2 раза в день свечи по примеру 2 и 10 пациентам свечи по примеру 1 в течение 10 недель -12 недель до того, как генитальные бородавки разрешились. При контрольном осмотре через полтора года рецидива остроконечных кондилом в основной группе не было, у 3 пациенток отмечен рецидив. Назначено дополнительное лечение с увеличением дозы.
Пример 3. Проведение плацебо-контролируемого многоцентрового клинического исследования эффективности и безопасности препарата Цервикон-ДИМ (суппозитории вагинальные) в лечении цервикальной интраэпителиальной неоплазии.
Исследовалась частота рецидивов при длительной терапии препаратом Цервикон-ДИМ, а именно определялась доля пациенток с отсутствием рецидивов в течение 3, 6 и 18 месяцев (таблица 3), а также доля пациенток, у которых произошла элиминация клеток, содержащих вирусную ДНК (ПЦР-теста) в конце периода терапии (6 месяцев). Пациенткам контрольной группы была проведена терапия плацебо (таблица 4).
По данным ПЦР-диагностики ВПЧ-инфекции общая эффективность проведенной противовирусной терапии в группе, пациентки которой принимали Цервикон-ДИМ, составила около 30%. Также имеется более высокая эффективность терапии Цервикон-ДИМом для предотвращения рецидива цервикальной интраэпителиальной неоплазии по сравнению с группой плацебо: 93,5% к концу 3 месяца и 100% к концу 6 месяца. Отдаленное наблюдение показало, что достигнутый лечебный эффект сохраняется на протяжении года: не было зарегистрировано рецидивов в группе, получавшей Цервикон-ДИМ, при том, что их число в группе плацебо достигло 45,2%.
Таким образом, было подтверждено, что длительная терапия препаратом Цервикон-ДИМ способствует элиминации папилломавирусной инфекции у пациенток с цервикальной интраэпителиальной неоплазией, предотвращение рецидива заболевания и его возможной прогрессии в рак шейки матки.
Пример 4. Хронические вирусные инфекции обычно связаны с нарушением работы иммунной системы. Результаты исследования влияния препарата Цервикон-ДИМ на выраженность иммунодефицитного состояния, индуцированного эмоциональным стрессом, изучали на модели стрессирования мышей путем помещения в условия скученности (таблица 5).
Как видно из таблицы 5, скученность животных в течение 10 дней приводит к подавлению гуморального иммунного ответа (числа АОК и титра ГА), подавлению завершенности фагоцитоза и скорости очищения крови от инертных частиц туши. Все перечисленные нарушения индуцированы стрессом. 14-дневное интравагинальное введение препарата в дозе 1000 мг/кг/сут предотвращает эти нарушения.
Пример 5. У пациенток из примера 3 был изучен уровень секреторного иммуноглобулина класса A (sIgA) во влагалищном отделяемом. Уровень sIgA определялся методом иммуноферментного анализа с использованием тест-систем производства ЗАО «Вектор-Бест». Расчет содержания sIgA производился на 1 г общего белка, определяемого по биуретовой реакции. Исходный уровень sIgA составил в группе плацебо - 210±43 мкг/г, а в группе пациенток, получающих Цервикон-ДИМ в дозе 200 мг/сут - 223±37 мкг/г (M±m). После 6 месяцев терапии уровень sIgA составил в группе плацебо - 239±68 мкг/г, а в группе пациенток, получающих Цервикон-ДИМ в дозе 200 мг/сут - 326±55 мкг/г (отличия значимы, p<0,001 по тесту Стьюдента).