НУКЛЕОТИДЫ, КОДИРУЮЩИЕ ФАКТОР IX

1. Полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность Фактора IX, в котором:
(i) нуклеотидная последовательность Фактора IX содержит кодирующую последовательность, которая кодирует белок Фактора IX или его фрагмент;
(ii) часть кодирующей последовательности является оптимизированной по кодонам;
(iii) указанная часть кодирующей последовательности, которая является оптимизированной по кодонам, имеет по меньшей мере 1100 нуклеотидов в длину;
(iv) в части, которая является оптимизированной по кодонам, по меньшей мере 60% кодонов выбраны из группы, состоящей из ТТС, CTG, АТС, GTG, GTC, AGC, ССС, АСС, GCC, ТАС, САС, СAG, ААС, AAA, AAG, GAC, TGC, AGG, GGC и GAG;
(v) часть, которая является оптимизированной по кодонам, содержит меньшее число CpG по сравнению с соответствующей частью SEQ ID NO 9;
(vi) данный полинуклеотид дополнительно содержит регуляторный элемент транскрипции, содержащий:
(a) промотор А1АТ или фрагмент промотора А1AT; и/или
(b) энхансер HCR или фрагмент энхансера HCR; и
(vii) нуклеотидная последовательность Фактора IX содержит кодон, который кодирует лейцин, в положении, соответтвующем положению 384 Фактора IX дикого типа.
2. Полинуклеотид по п. 1, в котором указанная оптимизированная по кодонам часть кодирующей последовательности, оптимизирована по кодонам для экспрессии в человеческой печени.
3. Полинуклеотид по п. 1 или 2, в котором:
(i) полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью Фактора IX, экспрессируется в клетках человеческой печени на более высоких уровнях по сравнению с эталонной нуклеотидной последовательностью Фактора IX дикого типа; и/или
(ii) часть кодирующей последовательности, которая является оптимизированной по кодонам, имеет по меньшей мере 800, по меньшей мере 900, по меньшей мере 1100, меньше, чем 1500, меньше, чем 1300, меньше, чем 1200, от 800 до 1500, от 900 до 1300, от 1100 до 1200 или около 1191 нуклеотида в длину; и/или
(iii) часть кодирующей последовательности, которая является оптимизированной по кодонам, содержит 1, 2, 3, 4, 5 или все из следующих:
a) экзон 3 или часть из по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, меньше, чем 25, от 10 до 25, от 15 до 25 или от 20 до 25 нуклеотидов экзона 3;
b) экзон 4 или часть из по меньшей мере 80, по меньшей мере 90, по меньшей мере 100, меньше, чем 114, от 80 до 114, от 90 до 114 или от 100 до 114 нуклеотидов экзона 4;
c) экзон 5 или часть из по меньшей мере 90, по меньшей мере 100, по меньшей мере 110, меньше, чем 129, от 90 до 129, от 100 до 129 или от 110 до 129 нуклеотидов экзона 5;
d) экзон 6 или часть из по меньшей мере 150, по меньшей мере 180, по меньшей мере 200, меньше, чем 203, от 150 до 203, от 180 до 203 или от 200 до 203 нуклеотидов экзона 6;
e) экзон 7 или часть из по меньшей мере 70, по меньшей мере 80, по меньшей мере 90, по меньшей мере 100, меньше, чем 115, от 70 до 115, от 80 до 115, от 90 до 115 ил и от 100 до 115 нуклеотидов экзона 7; и/или
f) экзон 8 или часть из по меньшей мере 400, по меньшей мере 450, по меньшей мере 500, меньше, чем 548, от 400 до 548, от 450 до 548 или от 500 до 548 нуклеотидов экзона 8; и/или
(iv) часть кодирующей последовательности, которая является оптимизированной по кодонам, содержит часть из по меньшей мере 20 нуклеотидов экзона 3, часть из по меньшей мере 100 нуклеотидов экзона 4, часть из по меньшей мере 110 нуклеотидов экзона 5, часть из по меньшей мере 180 нуклеотидов экзона 6, часть из по меньшей мере 100 нуклеотидов экзона 7 и часть из по меньшей мере 500 нуклеотидов экзона 8; и/или
(v) часть кодирующей последовательности, которая является оптимизированной по кодонам, содержит экзон 3, экзон 4, экзон 5, экзон 6, экзон 7 и экзон 8; и/или
(vi) часть кодирующей последовательности, которая является оптимизированной по кодонам, содержит часть экзона 2, и данная часть экзона 2 имеет меньше, чем 160, меньше, чем 150, меньше, чем 100, меньше, чем 75, меньше, чем 60, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, от 20 до 160, от 30 до 150, от 30 до 100, от 40 до 75 или около 56 нуклеотидов в длину; и/или
(vii) часть кодирующей последовательности, которая является оптимизированной по кодонам, содержит часть экзона 2, которая имеет от 30 до 100 нуклеотидов в длину.
4. Полинуклеотид по любому из пп. 1-3, в котором:
(i) часть кодирующей последовательности, которая является оптимизированной по кодонам, содержит меньше, чем 40, меньше, чем 20, меньше, чем 18, меньше, чем 10, меньше, чем 5 или меньше, чем 1 CpG; и/или
(ii) часть кодирующей последовательности, которая является оптимизированной по кодонам, не содержит CpG.
5. Полинуклеотид по любому из пп. 1-4, в котором в части кодирующей последовательности, которая является оптимизированной по кодонам:
(i) а) по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5 кодонов, которые кодируют фенилаланин, заменен(ы) ТТС по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
b) по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65% или по меньшей мере 70% кодонов, которые кодируют фенилаланин, представляют собой ТТС;
c) по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65% или по меньшей мере 70% кодонов, которые кодируют фенилаланин, представляют собой ТТС, а остальные представляют собой ТТТ; и/или
d) кодоны, которые кодируют фенилаланин, представляют собой ТТС, за исключением случая, где следующий кодон начинается c G; и/или
(ii) а) по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15 или по меньшей мере 16 кодонов, которые кодируют лейцин, заменены CTG по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
b) по меньшей мере 90% или по меньшей мере 94% кодонов, которые кодируют лейцин, представляют собой CTG; и/или
c) по меньшей мере 90% или по меньшей мере 94% кодонов, которые кодируют лейцин, представляют собой CTG, а остальные представляют собой СТС; и/или
(iii) а) по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11 или по меньшей мере 12 кодонов, которые кодируют изолейцин, заменены АТС по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
b) по меньшей мере 1 кодон АТС заменен(ы) АТТ по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа, где следующий кодон начинается с G;
c) по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70% или по меньшей мере 75% кодонов, которые кодируют изолейцин, представляют собой АТС;
d) по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70% или по меньшей мере 75% кодонов, которые кодируют изолейцин, представляют собой АТС, а остальные представляют собой АТТ; и/или
e) кодоны, которые кодируют изолейцин, представляют собой АТС, за исключением ситуации, где следующий кодон начинается c G; и/или
(iv) а) по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20 или по меньшей мере 25 кодонов, которые кодируют валин, заменены GTG по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
b) по меньшей мере 1 кодон, который кодирует валин, заменен(ы) GTC по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
c) по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% кодонов, которые кодируют валин, представляют собой GTG; и/или
d) по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% кодонов, которые кодируют валин, представляют собой GTG, а остальные представляют собой GTC; и/или
(v) а) по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12 или по меньшей мере 13 кодонов, которые кодируют серии, заменены AGC по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
b) по меньшей мере 1, по меньшей мере 2 или по меньшей мере 4 кодона, который(рые) кодирует(ют) серии, заменен(ы) ТСТ по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа; где следующий кодон начинается с G;
c) по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65% или по меньшей мере 70% кодонов, которые кодируют серии, представляют собой AGC; и/или
d) по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65% или по меньшей мере 70% кодонов, которые кодируют серии, представляют собой AGC, а остальные представляют собой ТСТ или ТСС; и/или
(vi) а) по меньшей мере 1, по меньшей мере 2 или по меньшей мере 5 кодонов, который(рые) кодирует(ют) пролин, заменен(ы) ССС по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
b) по меньшей мере 1 кодон, который(рые) кодирует(ют) пролин, заменен(ы) ССТ по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа, где следующий кодон начинается с G;
c) по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55% или по меньшей мере 60% кодонов, которые кодируют пролин, представляют собой ССС;
d) по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55% или по меньшей мере 60% кодонов, которые кодируют пролин, представляют собой ССС, а остальные представляют собой ССА или ССТ; и/или
e) кодоны, которые кодируют пролин, представляют собой ССС, за исключением случая, где следующий кодон начинается с G; и/или
(vii) а) по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8 или по меньшей мере 10 кодонов, которые кодируют треонин, заменен АСС по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
b) по меньшей мере 1 или по меньшей мере 2 кодона, который(рые) кодирует(ют) треонин, заменен(ы) ACT по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа, где следующий кодон начинается с G;
c) по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50% или по меньшей мере 55% кодонов, которые кодируют треонин, представляют собой АСС;
d) по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50% или по меньшей мере 55% кодонов, которые кодируют треонин, представляют собой АСС, а остальные представляют собой ACT; и/или
e) кодоны, которые кодируют треонин, представляют собой АСС, за исключением случая, где следующий кодон начинается c G; и/или
(viii) а) по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3 или по меньшей мере 4 кодона, который(рые) кодирует(ют) аланин, заменен(ы) GCC по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
b) по меньшей мере 1, по меньшей мере 2 или по меньшей мере 3 кодона, который(рые) кодирует(ют) аланин, заменен(ы) GCT по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа, где следующий кодон начинается с G;
c) по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40% или по меньшей мере 43% кодонов, которые кодируют аланин, представляют собой GCC;
d) по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40% или по меньшей мере 45% кодонов, которые кодируют аланин, представляют собой GCC, а остальные представляют собой GCT; и/или
е) кодоны, которые кодируют аланин, представляют собой GCC, за исключением случая, где следующий кодон начинается с G; и/или
(ix) а) по меньшей мере 1 или по меньшей мере 2 кодона, который(рые) кодирует(ют) тирозин, заменен(ы) ТАС по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
b) по меньшей мере 1 кодон ТАС заменен(ы) ТАТ по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа, где следующий кодон начинается с G;
c) по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45% или по меньшей мере 48% кодонов, которые кодируют тирозин, представляют собой ТАС;
d) по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45% или по меньшей мере 48% кодонов, которые кодируют тирозин, представляют собой ТАС, а остальные представляют собой ТАТ; и/или
e) кодоны, которые кодируют тирозин, представляют собой ТАС, за исключением случая, где следующий кодон начинается с G; и/или
(x) а) по меньшей мере 1 кодон, который(рые) кодирует(ют) гистидин, заменен(ы) САС по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
b) по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60% или по меньшей мере 65% кодонов, которые кодируют гистидин, представляют собой САС;
c) по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60% или по меньшей мере 65% кодонов, которые кодируют гистидин, представляют собой САС, а остальные представляют собой CAT; и/или
d) кодоны, которые кодируют гистидин, представляют собой САС, за исключением случая, где следующий кодон начинается с G; и/или
(xi) а) по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5 кодонов, который(рые) кодирует(ют) глутамин, заменен(ы) CAG по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
b) по меньшей мере 1 кодон CAG заменен(ы) САА по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
c) по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85% или по меньшей мере 90% кодонов, которые кодируют глутамин, представляют собой CAG; и/или
d) по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85% или по меньшей мере 90% кодонов, которые кодируют глутамин, представляют собой CAG, а остальные представляют собой САА; и/или
(xii) а) по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5 кодонов, который(рые) кодирует(ют) аспарагин, заменен(ы) ААС по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
b) по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65% или по меньшей мере 70% кодонов, которые кодируют аспарагин, представляют собой ААС;
c) по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65% или по меньшей мере 70% кодонов, которые кодируют аспарагин, представляют собой ААС, а остальные представляют собой ДАТ; и/или
d) кодоны, которые кодируют аспарагин, представляют собой ААС, за исключением случая, где следующий кодон начинается с G; и/или
(xiii) а) по меньшей мере 5, меньшей мере 7, по меньшей мере 8 или по меньшей мере 9 кодонов, которые кодируют лизин, заменены AAG по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
b) по меньшей мере 1 кодон AAG заменен(ы) AAA по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
c) по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% кодонов, которые кодируют лизин, представляют собой AAG; и/или
d) по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% кодонов, которые кодируют лизин, представляют собой AAG, а остальные представляют собой AAA; и/или
(xiv) а) по меньшей мере 1, меньшей мере 2, по меньшей мере 3 или по меньшей мере 4 кодона, который(рые) кодирует(ют) аспартат, заменен(ы) GAC по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
b) по меньшей мере 1 кодон GAC заменен(ы) GAT по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа, где следующий кодон начинается с G;
c) по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50% или по меньшей мере 60% кодонов, которые кодируют аспартат, представляют собой GAC;
d) по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50% или по меньшей мере 60% кодонов, которые кодируют аспартат, представляют собой GAC, а остальные представляют собой GAT; и/или
e) кодоны, которые кодируют аспартат, представляют собой GAC, за исключением случая, где следующий кодон начинается с G; и/или
(xv) а) по меньшей мере 15, меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или по меньшей мере 26 кодонов, которые кодируют глутамат, заменен GAG по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
b) по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% кодонов, которые кодируют глутамат, представляют собой GAG; и/или
c) по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% кодонов, которые кодируют глутамат, представляют собой GAG, а остальные представляют собой GAA; и/или
(xvi) а) по меньшей мере 5, меньшей мере 6, по меньшей мере 7 или по меньшей мере 8 кодонов, которые кодируют цистеин, заменен TGC по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
b) по меньшей мере 1 кодон TGC заменен(ы) TGT по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа, где следующий кодон начинается с G;
c) по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50% или по меньшей мере 55% кодонов, которые кодируют цистеин, представляют собой TGC;
d) по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50% или по меньшей мере 55% кодонов, которые кодируют цистеин, представляют собой TGC, а остальные представляют собой TGT; и/или
e) кодоны, которые кодируют цистеин, представляют собой TGC, за исключением ситуации, где следующий кодон начинается с G; и/или
(xvii) кодоны, которые кодируют триптофан, представляют собой TGG; и/или
(xviii) а) по меньшей мере 5, по меньшей мере 8, по меньшей мере 10 или по меньшей мере 11 кодонов, которые кодируют аргинин, заменены AGG по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
b) по меньшей мере 1 кодон, который(рые) кодирует(ют) аргинин, заменен(ы) AGA по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
c) по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70% или по меньшей мере 75% кодонов, которые кодируют аргинин, представляют собой AGG; и/или
d) по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70% или по меньшей мере 75% кодонов, которые кодируют аргинин, представляют собой AGG, а остальные представляют собой AGA; и/или
(xix) а) по меньшей мере 5, меньшей мере 10, по меньшей мере 12 или по меньшей мере 13 кодонов, которые кодируют глицин, заменены GGC по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
b) по меньшей мере 5, меньшей мере 6, по меньшей мере 7 или по меньшей мере 8 кодонов, которые кодируют глицин, заменены GGG по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа, где следующий кодон начинается с G;
c) по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55% или по меньшей мере 60% кодонов, которые кодируют глицин, представляют собой GGC;
d) по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55% или по меньшей мере 60% кодонов, которые кодируют глицин, представляют собой GGC, а остальные представляют собой GGG; и/или
e) кодоны, которые кодируют глицин, представляют собой GGC, за исключением ситуации, где следующий кодон начинается c G.
6. Полинуклеотид по любому из пп. 1-5, в котором часть кодирующей последовательности, которая является оптимизированной по кодонам, содержит кодоны, кодирующие фенилаланин, лейцин, изолейцин, валин, серии, пролин, треонин, аланин, тирозин, гистидин, глутамин, аспарагин, лизин, аспартат, глутамат, цистеин, триптофан, аргинин и глицин, и в данной части, оптимизированной по кодонам:
a) по меньшей мере 5 кодонов, кодирующих фенилаланин, заменены ТТС по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
b) по меньшей мере 16 кодонов, которые кодируют лейцин, заменены CTG по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
c) по меньшей мере 12 кодонов, которые кодируют изолейцин, заменены АТС по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
d) по меньшей мере 25 кодонов, которые кодируют валин, заменены GTG по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
e) по меньшей мере 13 кодонов, которые кодируют серии, заменены AGC по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
f) по меньшей мере 5 кодонов, которые кодируют пролин, заменены ССС по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
g) по меньшей мере 10 кодонов, которые кодируют треонин, заменены АСС по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
h) по меньшей мере 4 кодона, которые кодируют аланин, заменены GCC по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
i) по меньшей мере 2 кодона, которые кодируют тирозин, заменены ТАС по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
j) по меньшей мере 1 кодон, который кодирует гистидин, заменен(ы) САС по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
k) по меньшей мере 5 кодонов, которые кодируют глутамин, заменены CAG по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
l) по меньшей мере 5 кодонов, которые кодируют аспарагин, заменены ААС по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
m) по меньшей мере 9 кодонов, которые кодируют лизин, заменены AAG по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
n) по меньшей мере 4 кодона, которые кодируют аспартат, заменены GAC по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
о) по меньшей мере 26 кодонов, которые кодируют глутамат, заменены GAG по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
р) по меньшей мере 8 кодонов, которые кодируют цистеин, заменены TGC по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа;
q) кодонами, которые кодируют триптофан, являются TGG;
r) по меньшей мере 11 кодонов, которые кодируют аргинин, заменены AGG по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа; и
s) по меньшей мере 13 кодонов, которые кодируют глицин, заменены GGC по сравнению с эталонной последовательностью Фактора IX дикого типа.
7. Полинуклеотид по любому из пп. 1-6, в котором часть кодирующей последовательности, которая является оптимизированной по кодонам, содержит кодоны, кодирующие фенилаланин, лейцин, изолейцин, валин, серии, пролин, треонин, аланин, тирозин, гистидин, глутамин, аспарагин, лизин, аспартат, глутамат, цистеин, триптофан, аргинин и глицин, и в данной части, оптимизированной по кодонам:
a) по меньшей мере 70% кодонов, которые кодируют фенилаланин, представляют собой ТТС;
b) по меньшей мере 94% кодонов, которые кодируют лейцин, представляют собой CTG;
c) по меньшей мере 75% кодонов, которые кодируют изолейцин, представляют собой АТС;
d) по меньшей мере 95% кодонов, которые кодируют валин, представляют собой GTG;
e) по меньшей мере 70% кодонов, которые кодируют серии, представляют собой AGC;
f) по меньшей мере 60% кодонов, которые кодируют пролин, представляют собой ССС;
g) по меньшей мере 55% кодонов, которые кодируют треонин, представляют собой АСС;
h) по меньшей мере 43% кодонов, которые кодируют аланин, представляют собой GCC;
i) по меньшей мере 48% кодонов, которые кодируют тирозин, представляют собой ТАС;
j) по меньшей мере 65% кодонов, которые кодируют гистидин, представляют собой САС;
k) по меньшей мере 90% кодонов, которые кодируют глутамин, представляют собой CAG;
l) по меньшей мере 70% кодонов, которые кодируют аспарагин, представляют собой ААС;
m) по меньшей мере 95% кодонов, которые кодируют лизин, представляют собой AAG;
n) по меньшей мере 60% кодонов, которые кодируют аспартат, представляют собой GAC;
о) по меньшей мере 95% кодонов, которые кодируют глутамат, представляют собой GAG;
р) по меньшей мере 55% кодонов, которые кодируют цистеин, представляют собой TGC;
q) кодоны, которые кодируют триптофан, представляют собой TGG;
r) по меньшей мере 75% кодонов, которые кодируют аргинин, представляют собой AGG; и
s) по меньшей мере 60% кодонов, которые кодируют глицин, представляют собой GGC.
8. Полинуклеотид по любому из пп. 1-7, в котором часть кодирующей последовательности, которая является оптимизированной по кодонам, содержит кодоны, кодирующие фенилаланин, лейцин, изолейцин, валин, серии, пролин, треонин, аланин, тирозин, гистидин, глутамин, аспарагин, лизин, аспартат, глутамат, цистеин, триптофан, аргинин и глицин, и в данной части, оптимизированной по кодонам:
a) по меньшей мере 70% кодонов, которые кодируют фенилаланин, представляют собой ТТС, а остальные представляют собой ТТТ;
b) по меньшей мере 94% кодонов, которые кодируют лейцин, представляют собой CTG, а остальные представляют собой СТС;
с) по меньшей мере 75% кодонов, которые кодируют изолейцин, представляют собой АТС, а остальные представляют собой АТТ;
d) по меньшей мере 95% кодонов, которые кодируют валин, представляют собой GTG;
e) по меньшей мере 70% кодонов, которые кодируют серии, представляют собой AGC;
f) по меньшей мере 60% кодонов, которые кодируют пролин, представляют собой ССС, а остальные представляют собой ССА или ССТ;
g) по меньшей мере 55% кодонов, которые кодируют треонин, представляют собой АСС, а остальные представляют собой ACT;
h) по меньшей мере 43% кодонов, которые кодируют аланин, представляют собой GCC, а остальные представляют собой GCT;
i) по меньшей мере 48% кодонов, которые кодируют тирозин, представляют собой ТАС, а остальные представляют собой ТАТ;
j) по меньшей мере 65% кодонов, которые кодируют гистидин, представляют собой САС, а остальные представляют собой CAT;
k) по меньшей мере 90% кодонов, которые кодируют глутамин, представляют собой CAG, а остальные представляют собой САА;
l) по меньшей мере 70% кодонов, которые кодируют аспарагин, представляют собой ААС, а остальные представляют собой ДАТ;
m) по меньшей мере 95% кодонов, которые кодируют лизин, представляют собой AAG, а остальные представляют собой AAA;
n) по меньшей мере 60% кодонов, которые кодируют аспартат, представляют собой GAC, а остальные представляют собой GAT;
о) по меньшей мере 95% кодонов, которые кодируют глутамат, представляют собой GAG, а остальные представляют собой GAA;
р) по меньшей мере 55% кодонов, которые кодируют цистеин, представляют собой TGC, а остальные представляют собой TGT;
q) кодоны, которые кодируют триптофан, представляют собой TGG;
r) по меньшей мере 75% кодонов, которые кодируют аргинин, представляют собой AGG, а остальные представляют собой AGA; и
s) по меньшей мере 60% кодонов, которые кодируют глицин, представляют собой GGC, а остальные представляют собой GGG.
9. Полинуклеотид по любому из пп. 4-8, в котором эталонная последовательность Фактора IX дикого типа представляет собой SEQ ID NO 9 или SEQ ID NO 19.
10. Полинуклеотид по любому из пп. 1-9, в котором регуляторный элемент транскрипции содержит печенеспецифичный промотор.
11. Полинуклеотид по любому из пп. 1-10, в котором фрагмент промотора А1АТ имеет:
(i) по меньшей мере 100, по меньшей мере 120, по меньшей мере 150, по меньшей мере 180, меньше, чем 255, от 100 до 255, от 150 до 225, от 150 до 300 или от 180 до 255 нуклеотидов в длину; и/или
(ii) от 150 до 300 нуклеотидов в длину.
12. Полинуклеотид по любому из пп. 1-11, в котором фрагмент энхансера HCR представляет собой:
(i) фрагмент из по меньшей мере 80, по меньшей мере 90, по меньшей мере 100, меньше, чем 192, от 80 до 192, от 90 до 192, от 100 до 250 или от 117 до 192 нуклеотидов в длину; и/или
(ii) от 100 до 250 нуклеотидов в длину.
13. Полинуклеотид по любому из пп. 1-12, в котором:
(i) регуляторный элемент транскрипции является по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,8% или на 100% идентичным SEQ ID NO 6; и/или
(ii) регуляторный элемент транскрипции имеет последовательность SEQ ID NO 6.
14. Полинуклеотид по любому из пп. 1-13, где:
(i) данный полинуклеотид содержит энхансер, который является по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,8% или на 100% идентичным SEQ ID NO 13; и/или
(ii) данный полинуклеотид содержит энхансер, который является по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,8% или на 100% идентичным SEQ ID NO 13; и/или
(iii) данный полинуклеотид содержит энхансер SEQ ID NO 13; и/или
(iv) данный полинуклеотид содержит промотор, который является по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,8% или на 100% идентичным SEQ ID NO 14; и/или
(v) данный полинуклеотид содержит промотор, который является по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,8% или на 100% идентичным SEQ ID NO 14; и/или
(vi) данный полинуклеотид содержит промотор SEQ ID NO 14.
15. Полинуклеотид по любому из пп. 1-14, в котором кодон, который кодирует аминокислоту в положении, соответствующем положению 384 Фактора IX дикого типа, представляет собой СТХ, где X представляет собой любой нуклеотид, возможно, где X представляет собой С или G.
16. Полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность Фактора IX, где нуклеотидная последовательность Фактора IX содержит кодирующую последовательность, которая кодирует белок Фактора IX или его фрагмент, и где часть данной кодирующей последовательности не является последовательностью дикого типа.
17. Вирусная частица, содержащая рекомбинантный геном, содержащий полинуклеотид по любому из пп. 1-16.
18. Вирусная частица по п. 17:
(i) которая представляет собой AAV (аденосателлитный вирус), аденовирусную или лентвирусную вирусную частицу; и/или
(ii) которая представляет собой вирусную частицу AAV; и/или
(iii) где рекомбинантный геном дополнительно содержит:
a) ITR (инвертированный концевой повтор) AAV2;
b) последовательность поли А;
c) ориджин репликации; и/или
d) два разрешимых ITR; и/или
(iv) где данный рекомбинантный геном является одноцепочечным.
19. Вирусная частица по п. 17 или 18, где при трансдукции в клетки Huh7, данная вирусная частица экспрессирует белок Фактора IX или его фрагмент, имеющий большую активность Фактора IX, чем активность Фактора IX, экспрессируемого от вирусной частицы, содержащей нуклеотидную последовательность Фактора IX SEQ ID NO 12 и регуляторный элемент транскрипции SEQ ID NO 7.
20. Полинуклеотид по любому из пп. 1-16 или вирусная частица по любому из пп. 17-19, в которой фрагмент Фактора IX имеет по меньшей мере 200, по меньшей мере 250, по меньшей мере 300, от 200 до 415, от 250 до 415 или от 300 до 415 аминокслот в длину.
21. Композиция, содержащая полинуклеотид по любому из пп. 1-16 или 20 или вирусную частицу по любому из пп. 17-20 и фармацевтически приемлемый эксципиент.
22. Полинуклеотид по любому из пп. 1-16 или 20, вирусная частица по любому из пп. 17-20 или композиция по п. 21 для применения в способе лечения.
23. Полинуклеотид, вирусная частица или композиция для применения по п. 22, где данный способ лечения включает введение пациенту эффективного количества полинуклеотида по любому из пп. 1-16 или 20, вирусной частицы по любому из пп. 17-20 или композиции по п. 21.
24. Полинуклеотид, вирусная частица или композиция для применения по п. 22 или 23, где:
(i) способ лечения представляет собой способ лечения гемофилии; и/или
(ii) способ лечения представляет собой способ лечения гемофилии В; и/или
(iii) пациент имеет антитела или ингибиторы к Фактору IX.
25. Полинуклеотид по любому из пп. 1-16 или 20, вирусная частица по любому из пп. 17-20 или композиция по п. 21 для применения в достижении стабильного уровня активности Фактора IX по меньшей мере 20% у пациента, имеющего гемофилию В, возможно, где достижение стабильного уровня активности Фактора IX включает введение пациенту указанных полинуклеотида, вирусной частицы или композиции.
26. Полинуклеотид по любому из пп. 1-16 или 20, вирусная частица по любому из пп. 17-20 или композиция по п. 21 для применения в лечении гемофилии В, включающем введение пациенту указанных полинуклеотида, вирусной частицы или композиции в эффективной дозе для достижения у пациента стабильного уровня активности Фактора IX по меньшей мере 20%.
27. Полинуклеотид, вирусная частица или композиция для применения по п. 25 или п. 26, где:
(a) уровень активности Фактора IX является стабильным после по меньшей мере 10 недель, по меньшей мере 15 недель, по меньшей мере 20 недель, по меньшей мере 30 недель, по меньшей мере 40 недель или по меньшей мере 50 недель с момента введения полинуклеотида, вирусной частицы или композиции;
(b) данный пациент представляет собой пациента, который трудно поддается лечению Фактором IX, имеющим меньшую активность, чем активность Фактора IX, экспрессируемого от вирусной частицы, содержащей (i) нуклеотидную последовательность Фактора IX SEQ ID NO 4 или 5 и (ii) регуляторный элемент транскрипции SEQ ID NO 6;
(c) данный пациент представляет собой пациента, который трудно поддается лечению полипептидом Фактора IX, который экспрессируется на меньшем уровне, чем кодируемый, нуклеотидной последовательностью, содержащей (i) нуклеотидную последовательность Фактора IX SEQ ID NO 4 или 5 и (ii) регуляторную последовательность транскрипции SEQ ID NO 6;
(d) полинуклеотид, вирусная частица или композиция вводится в дозе эффективной для достижения стабильного уровня активности Фактора IX по меньшей мере 20% у пациента, имеющего гемофилию В;
11
11
11
12
11
11
(e) полинуклеотид, вирусная частица или композиция вводится в дозе по меньшей мере 4,5×10 векторных геномов (vg) на кг или в дозе меньше, чем 5×10 vg/кг, или в дозе от 4,5×10 до 1×10 vg/кг, или в дозе от 4,5×10 до 4,9×10 vg/кг, возможно, где данная доза определяется посредством количественного определения числа векторных геномов с использованием кПЦР (количественная полимеразная цепная реакция), возможно где в кПЦР используются праймеры, которые связываются с промоторной областью, возможно где данная промоторная область представляет собой промоторную область трансгенной кассеты;
(f) полинуклеотид или вирусная частица, которая вводится, продуцируется из клетки млекопитающего и/или обладает характеристиками, которые возникают из-за применения клеток млекопитающих, продуцирующих вирусный вектор, и отличаются от векторов, продуцируемых в клетках насекомых, продуцирующих вирусный вектор (например, бакуловирусная система);
(g) стабильный уровень активности Фактора IX представляет собой стабильный уровень активности Фактора IX по меньшей мере 25% или по меньшей мере 30%, возможно где стабильный уровень активности Фактора IX представляет собой стабильный уровень активности Фактора IX по меньшей мере 35%, возможно где стабильный уровень активности Фактора IX составляет по меньшей мере или около 40%;
(h) уровень активности Фактора IX составляет по меньшей мере 20% в момент времени по меньшей мере 50 недель или около 52 недель после введения полинуклеотида, вирусной частицы или композиции, возможно где уровень активности Фактора IX поддерживается на уровне по меньшей мере 20% в течение длительного периода по меньшей мере 40 недель непосредственно перед данным моментом времени;
(i) уровень активности Фактора IX составляет по меньшей мере 25% в момент времени по меньшей мере 50 недель или около 52 недель после введения полинуклеотида, вирусной частицы или композиции, возможно где уровень активности Фактора IX поддерживается на уровне по меньшей мере 25% в течение длительного периода по меньшей мере 40 недель непосредственно перед данным моментом времени;
(j) активность Фактора IX составляет по меньшей мере 40% в момент времени по меньшей мере 50 недель или около 52 недель после введения полинуклеотида, вирусной частицы или композиции, возможно где уровень активности Фактора IX поддерживается на уровне по меньшей мере 40% в течение длительного периода по меньшей мере 40 недель непосредственно перед данным моментом времени;
(k) активность Фактора IX измеряется с использованием анализа свертывания для определения активности Фактора IX в образце крови от пациента, возможно где в анализе свертывания используется набор SynthASil;
(l) активность Фактора IX измеряется посредством отбора у пациента образца крови и с использованием анализа свертывания для определения активности Фактора IX в данном образце крови, возможно где в анализе свертывания используется набор SynthASil™;
(m) анализ свертывания представляет собой одноэтапный анализ свертывания, возможно где в данном одноэтапном анализе свертывания используется набор SynthASil™; и/или
(n) данное применение включает совместное введение стероида, возможно где данный стероид представляет собой преднизолон.