Стволовые стромальные клетки костного мозга: экспериментальные исследования и применение в клинике

Медицинская Иммунология

2004, Т. 6, Ко 3-5 © 2004, СПб РО РААКИ

СТВОЛОВЫЕ СГРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ КОСТНОГО МОЗГА: ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ В КЛИНИКЕ

Чайлахян Р.К., Герасимов Ю.В.

ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Ключевые слова: стромальные клетки, аутотрансплантация, восстановление кости и хряща

Кроветворная и лимфоидная ткани представляют собой гетерогенную популяцию клеток, состоящую из собственно кроветворных и лимфоидных клеток и стромальных элементов. Стромальный компонент этих органов представлен различными типами клеток. Главным клеточным типом стромы костного мозга являются ретикулярные клетки, находящиеся в тесном контакте с гемопоэтическими элементами, а также эндотелиальные клетки, клетки эндоста, адвентиций крупных сосудов, оболочки нервных клеток и жировые клетки. Другим важным компонентом структурной организации стромаль-ного микроокружения является внеклеточный матрикс, синтезируемый стромальными клетками, через который они опосредуют свое действие на кроветворные клетки-предшественники. Он представлен различными типами коллагена, фибронектином, гемонектином, ламинином и протеогликанами, включая гепаран-сульфат, хондриотин-сульфат и глюкуроновую кислоту.

В начале 70-х годов были выполнены циклы исследований, выявивших роль стромальных элементов в формировании и функционировании микроокружения. Вопрос о том, есть ли в кроветворной ткани особые клетки, определяющие специфику микроокружения, или она зависит от совокупности всех клеток, составляющих ткань, удалось решить на модели гетеротопной трансплантации костного мозга и лимфоидных органов. Этот экспериментальный прием — пересадка фрагментов костного мозга

Адрес для переписки:

Чайлахян Рубен Карпович 123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 18,

ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, лаборатория иммуноморфологии тел. (095) 193-61-02, факс (095) 193-61-93 Г-тай: info@riem.rn

в несвойственное (гетеротопное) их развитию место, например, под кожу, в мышцу, в переднюю камеру глаза или под капсулу почки, известен более 100 лет. В результате пересадки образуется косточка с меду-лярной полостью заполненной костным мозгом. Однако механизм развития гетеротопных костномозговых органов был выяснен лишь недавно. Протипи-ровав клетки таких органов у радиационных химер, толерантных животных, а также животных, различающихся по секс-антигенам, удалось установить, что вновь образованные кроветворные органы представляют собой химерные структуры, где строма принадлежит донору, а репопулирующие на нее кроветворные и лимфоидные клетки реципиенту [10]. Это свидетельствует, что формирование гетеротопного костномозгового органа — результат приживления не кроветворных, а стромальных клеток, причем новообразованная стромальная ткань заставляет репопулирующие на нее кроветворные клетки-предшествен-ники дифференцироваться в тех же направлениях, что и на территории исходного костного мозга. Таким образом, можно говорить о переносе стромой инструкций для дифференцировки кроветворных клеток. Показано, что при трансплантации в одинаковые условия разных фрагментов костного мозга - жирового и красного, жировой костный мозг дает опять же жировой, а красный - кость с кроветворящим костным мозгом. Стромальная линия клеток при этом не пополняется за счет стволовых кроветворных клеток, т.е. является самостоятельной, гистогенетически независимой линией клеток [ 4,18].

Какие же именно клетки стромы ответственны за перенос кроветворного и лимфоидного микроокружения? Ответ на этот вопрос удалось получить благодаря разработанному в лаборатории иммуноморфологии НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи методу избирательного клонирования, с помощью которого впервые была выявлена уникальная категория стромаль-

ных клеток, а именно - клоногенные стромальные клетки-предшественники, свойства которых предопределяют основные характеристики микроокруже-ния[16]. Стромальные механоциты составляют не более 1-3% среди клеток костного мозга и в суспензии кроветворных клеток они сильно разобщены клетками других типов. При эксплантации взвеси костномозговых клеток в монослойные культуры через 10-12 дней в них образуются видимые невооруженным глазом дискретные колонии, состоящие из нескольких тысяч фибробластов.

Одной из важнейших задач в комплексном изучении выявленной категории стромальных клеток-предшественников являлось определение природы колоний фибробластов, вырастающих в монослой-ных культурах. Необходимо было выяснить, являются ли колонии клеточными клонами, и, соответственно, все клетки, входящие в состав колоний, потомками одной колониеобразующей клетки, или они образуются в результате пролиферации нескольких клеток. Полученные доказательства клональной природы колоний, в том числе и с помощью хромосомного анализа делящихся клеток в отдельных колониях и в штаммах, полученных из индивидуальных колоний, позволило определить содержание этих клеток в органах кроветворения и иммунитета, изучить изменение их численности при различных патологических состояниях организма или воздействиях на организм (облучение, иммунизация, кровопускание, травма) [1,2,3,7].

Наиболее важным свойством клоногенных стромальных клеток-предшественников является их способность переносить специфическое микроокружение. Действительно, при гетеротипной трансплантации под капсулу почки костномозговых штаммов стромальных фибробластов кроликов на месте трансплантации формируется полноценный кроветворный орган, в котором представлены все ростки кроветворения [8]. Трансплантация же селезеночных штаммов приводит, соответственно, к формированию лимфоидных органов, где заселяющие их В — лимфоциты проходят весь путь своего гистогенеза вплоть до антителообразующих клеток [9]. Подобной способностью переносить специфическое микроокружение обладают не только штаммы стромальных фибробластов, полученные от нескольких десятков или сотен клеток-предшественников, но и отдельные клоны или моноклональные штаммы костного мозга [9 ].

Концентрация стромальных клеток-предшественников в органах гемо- и лимфопоэза у различных животных и человека колеблется от 1-5х10'4 в костном мозге, до 10'7 в лимфоузлах. Исследования, проведенные на различных экспериментальных животных, показали, что концентрация клеток образующих колонии фибробластов (КОКф) не является видоспецифичной и изменяется в течение жизни жи-

вотного [12,13]. Количество их больше в первые недели жизни, но уже к концу первого года падает в несколько раз. Связанное с возрастом снижение содержания КОКф коррелирует со снижением остеогенного потенциала суспензии клеток костного мозга, выявляемого по их способности образовывать кость в диффузионных камерах.

Стромальные фибробласты, входящие в состав колоний, после обработки трипсином легко снимаются со стекла или пластика. Они поддаются многократному пассированию, образуя диплоидные штаммы стромальных клеток. После 1 пассажа количество выросших фибробластов было в 3-7 тысяч раз больше, чем число стромальных предшественников в эк-сплантированной взвеси. К XVIII пассажу численность фибробластов в штамме составляла 9-13 триллионов, т.е. за 2-3 месяца клетки проходили 37-39 удвоений, что говорит об огромном пролиферативном потенциале этих клеток [15,17].

При трансплантации диплоидных штаммов костномозговых фибробластов 1-П пассажа в диффузионные камеры, системы непроницаемой для клеток, в них образуется костная ткань [16]. Это свидетельствует, что клетки с остеогенными потенциями сохраняются в культурах. Следует отметить, что трансплантация фибробластов в диффузионные камеры большего объема, приводила к образованию в них как костной, так и хрящевой тканей, имеющих типичную морфологию и гистохимические свойства [17].

Ответ на вопрос, происходит ли размножение остеогенных клеток в процессе культивирования, был получен в опытах, в которых брали лишь часть клеток из последовательных пассажей разных штаммов и испытывали их остеогенные потенции, помещая в диффузионные камеры. При образовании кости в таких камерах можно утверждать, что в камеру была помещена, по крайней мере, одна остеогенная единица. Результаты показали, что во всех испытанных пассажах, включая XVIII, сохранялась костеобразовательная способность штаммов. При этом количество остеогенных единиц возрастало. В отдельных пассажах превышение составляло более чем в 1000 раз, если даже считать, что каждая колониеобразующая клетка была остеогенной. Эти данные означают, что остеогенные клетки размножаются в культурах, т.е. самоподдерживаются в составе диплоидных штаммов [17].

Анализ дифференцировочных потенций 29 моноклональных штаммов костномозговых стромальных фибробластов в закрытой системе диффузионных камер показал, что 47 % штаммов способны строить костную ткань, а в камерах большего объема 25 % штаммов наряду с костной образуют и хрящевую ткань. Эти исследования явились первым экспериментальным доказательством наличия во взрослом организме общего предшественника для костной и хрящевой тканей. Этот вывод правомерен, посколь-

ку в каждой камере, где одновременно сформировалась костная и хрящевая ткани, находились потомки одной клоногенной стромальной клетки. Обе ткани имели типичную морфологию [14,15,17].

Таким образом, среди выявленных нами клоногенных стромальных клеток-предшественников имеется категория клеток, которая по своим пролиферативным и дифференцировочным потенциям являются претендентами на роль стволовых клеток стромальной ткани костного мозга. Они соответствуют требованиям предъявляемым к стволовым клеткам: обладают высоким пролиферативным потенциалом, самоподдерживаются в процессе пролиферации и дифференцируются в нескольких направлениях.

Теоретические разработки проблемы остеогенных клеток-предшественников и создание экспериментальной модели восстановления целостности костной ткани позволили создать и внедрить в клинику метод замещения костных дефектов путем аутотрансплантации остеогенных клеток костного мозга, выращенных вне организма [6]. Процесс лечения предусматривает следующие этапы: 1.Получение трепаната костного мозга и передача его в лабораторию. 2. Выделение и размножение в культурах остеогенных клеток. 3. Обратная трансплантация, выращенных в культурах клеток в область дефекта кости больного, чей костный мозг был использован для культивирования.

Трепанат костного мозга получают из гребня тазовой кости под местным обезболиванием, для чего больной на одни сутки поступает в стационар. Если больной до проведения обратной трансплантации клеток нуждается в дополнительном обследовании и лечении (например, при остеомиелите), он остается в клинике и ему проводится необходимое лечение.

Время культивирования, т.е. получения необходимого числа остеогенных клеток, зависит от величины дефекта, который предстоит заполнить. В среднем этот срок равен 1-1,5 месяцам.

За 1-2 дня до операции больной вновь поступает в клинику. Заключительный этап включает подготовку трансплантата и саму операцию аутотрансплантации. Выращенные остеогенные клетки в определенной концентрации помещают в пористые губки приготовленные из аллогенного губчатого костного матрикса. Такие эластичные губки с ориентацией пор свойственной костной ткани, после сжатия быстро приобретающие исходную форму, обладают отличной всасывающей способностью, что является важным моментом для сбора и удержания выращенных клеток и последующей обратной трансплантации их в область дефекта. Пересаженные фрагменты губчатого матрикса с клетками определяют величину и форму кости, которую образуют заполнившие его клетки. Вновь образованная кость в дальнейшем подвергается ремоделированию и хорошо

встраивается в структуру костного органа.

Методика аутотрансплантации и ведения больного в послеоперационном периоде зависят от характера патологии, времени ее возникновения, состояния функции конечности и возраста больного. Признаки выраженного остеогенеза наступают через 1,5-2 месяца после проведенной трансплантации.

Пластика костного дефекта (или полости) данным способом обладает рядом преимуществ перед другими методами. Во-первых, в область регенерации, где обычно имеет место дефицит остеогенных клеток, помещается большое количество клеток с высокими костеобразовательными потенциями; во-вто-рых, помимо остеогенных трансплантат не содержит примеси других клеток; в-третьих, метод высокоэффективен, сокращает сроки лечения, способствует быстрому и равномерному заполнению костей полноценным костным регенератом. Это позволяет проводить лечение тяжелого контингента больных с ложными суставами, несросшимися переломами и хроническим остеомиелитом.

Всего данным методом было пролечено более 50 больных в возрасте от 25 до 52 лет. После получения травмы больные лечились гипсовой повязкой, внут-рикостным остеосинтезом и различными аппаратами. В клинику поступили через 6-9 месяцев после получения травмы и лечения. У всех больных был получен трепанат костного мозга и отправлен в лабораторию для культивирования. Через 1-1,5 месяца была произведена обратная трансплантация, выращенных in vitro, аутологичных остеогенных клеток-предшественников. Губчатый костный матрикс, заполненный костномозговыми фибробластами, помещался в пазы на уровне ложного сустава, несросше-гося перелома или в костный дефект, образованный остеомиелитическим очагом.

Не менее актуальной является проблема лечения повреждений хряща и их последствий, т.е. восстановление целостности гиалинового хряща крупных суставов, которая сегодня приобретает все большую значимость как в медицинском, так и социальном аспекте. Достижения современной травматологии и ортопедии, в частности, компрессионно-дистракци-онный метод, позволили клиницистам в определенной степени влиять на скорость и качество репара-тивных процессов костной ткани и привели к существенному улучшению результатов лечения.

В то же время, прогресс в области суставной патологии был достигнут в значительной мере благодаря созданию и усовершенствованию искусственных суставов и по сути дела не приблизил нас к решению вопроса о регенерационных возможностях компонентов синовиальной среды сустава и наиболее важного из них - суставного хряща. Статистика утверждает, что при травмах коленного сустава в 50-60% случаев артроскопия выявляет повреждение мыщелков и надколенника, не проникающие в под-

лежащую кость. Приблизительно такой же процент случаев повреждения хряща отмечается при травмах других крупных суставов. Эта категория патологии объединена под общим названием хондропатии.

В развернувшейся дискуссии невозможность восстановления суставного хряща при его неполнослойном повреждении авторы связывают с неспособностью хондроцитов вступать в митоз, продукции ими ингибиторов для пролиферации менее дифференцированных клеток, с понижением процессов обмена и особенностями питания.

Многочисленные методы лечения от медикаментозных, механических, физических до пересадки в область поврежденного хряща биологических трансплантатов (надкостницы, надхрящницы) не достигали желаемого результата. В отдельную группу можно выделить методы лечения основанные на пересадке хондроцитов выращенных in vitro. Трансплантация эмбриональных или гомологичных хондроцитов приводит к неминуемуму их отторжению. В то же время ряд исследователей предполагают, что структурные особенности матрикса определяют своеобразие иммунологических свойств хряща и гомотрансплантат, содержащий живые хрящевые клетки не рассасывается. Это объясняется невозможностью проникновения из матрикса хряща антигенов трансплантата к иммунокомпетентным клеткам хозяина и в свою очередь контакта гуморальных факторов клеток хозяина с клетками трансплантата. Пересадка аутологичных хондроцитов, полученных из так называемой «некритической или неконтактной зоны» здорового сустава и их размножение in vitro, предполагает нанесение дополнительной травмы. К тому же не ясно, способны ли высокодифференцированные хондроциты, полученные из небольшого фрагмента хряща, пройти необходимое число митозов и образовать клеточную массу необходимую для трансплантации и последующего замещения дефекта.

Предлагаемый нами метод восстановления гиалинового хряща суставов основан на схожем биотехнологическом принципе - трансплантации в сустав аутологичных клеток, выращенных вне организма [13]. Предположение, что во взрослом организме имеется общая клетка-предшественник для костной и хрящевой тканей высказывалось многими исследователями. Полученные нами экспериментальные данные явились первыми в мире, которые подтвердили это предположение. При исследовании диффе-ренцировочных потенций штамма, состоящего из потомков одной стромальной клетки-предшествен-ника было показано, что они способны формировать как костную, так и хрящевую ткани. Именно это обстоятельство позволило нам разработать в эксперименте, а затем апробировать в клинике метод восстановления гиалинового хряща суставов при их неполнослойном повреждении, полученном в результате

механической травмы. С этой целью в сустав с поврежденным хрящом трансплантировали стромаль-ные клетки-предшественники, выделенные из костного мозга больного и размноженные вне организма. Аутотрансплантация этих клеток при подобной патологии хряща приводила к полному замещению дефекта истинно гиалиновым хрящом.

Продолжительность культивирования, т.е. получения необходимого для трансплантации числа клеток, как и в случае с восстановлением целостности кости зависит от величины дефекта хряща. Положительный эффект достигается через 2-3 месяца после трансплантации клеток и соответствующего лечения.

Предложенные нами методы восстановления костной и хрящевой тканей содержат теоретическое, экспериментальное и клиническое обоснование, являются приоритетными, не имеющими аналогов в мировой медицинской практике. Проведенные операции являются первыми, использующие обратную трансплантацию аутологичных остео- и хондроген-ных клеток-предшественников, выращенных вне организма.

Принципы предложенных биотехнологических методов лечения являются универсальными и могут быть использованы как для восстановления гиалинового хряща суставов, так и для лечения больных с дефектами костной ткани различной локализации (травматология, ортопедия, нейрохирургия, череп-но-лицевая хирургия, стоматология-имплантало-гия).

Список литературы

1. Владимирская Е.Б. Изучение колониеобразующей активности стромы костного мозга у детей, больных острым лейкозом. // Проблемы гематологии и переливания крови. — 1977, №11. — С.28-31.

2. Герасимов Ю.В., Чайлахян Р.К. Влияние кю-ретажа костномозговой полости на костномозговые стромальные клетки-предшественники. //Бюл.экс-пер.биол.мед.. — 1979. — т. 86., №9. — С. 362-365.

3. Герасимов Ю.В., Чайлахян Р.К., Лациник Н.В., Куралесова А.И.,Генкина Е.Н., Чайлахян М.Р. Динамика численности клоногенных стромальных клеток-предшественников в кроветворных и лимфоидных органах при регенерации костного мозга // Известия АН.Серия Биологическая. — 2001. — №6,- С.693-703.

4. Иванов-Смоленский А.А., Чайлахян Р.К., Герасимов Ю.В., Горская Ю.Ф., Куралесова А.И., Лациник Н.В. Происхождение стромальных механоци-тов костного мозга по данным их типирования по изоантигенам и хромосомным маркерам. // Онтогенез. - 1978. - т.9, №13. -С. 245-252.

5. Лациник Н.В., Горская Ю.Ф., Грошева А.Г. и др. Содержание стромальных колониеобразующих клеток ( КОКф) в костном мозге мышей и клональ-

ная природа образуемых ими колоний. // Онтогенез. - т.17, №1. - С. 27-35.

6. Осепян И.А., Чайлахян Р.К., Гарибян Э.С., Айвазян В.П. Лечение несросшихся переломов ложных суставов и дефектов длинных костей трансплантацией аутологичных костномозговых фибробластов, выращенных in vitro и имплантированных в АГМ. / / Ортопедия, травматология и протезирование. — 1987. - т.9. - С. 59-61.

7. Панасюк А.Ф., Лурия Е.А. Образование колоний фибробластов в культурах клеток периферической крови.//Бюл. экспер. биол. мед. — 1970. — №11. -С. - 96-98.

8. Сидорович С.Ю., Лациник Н.В. Содержание клоногенных стромальных клеток-предшественни-ков в кроветволрных органах морских свинок разного возраста. // Бюл. экспер. биол. мед. — 1978. — №7. - С. 96-98.

9. Фриденштейн А.Я., Лациник Н.В., Куралесова А.И., Чайлахян Р.К., Горская Ю.Ф. Клетки-переносчики кроветворного микроокружения // Сб. Итоги науки и техники. Иммунология. — 1983. — т. 12. — С.5-28.

10. Фриденштейн А.Я., Петракова К.В., Куралесова А.И., Фролова Г.П. Клетки-предшественники для остеогенной и кроветворной тканей. Анализ ге-теротопных трансплантатов костного мозга.// Цитология. - 1968. - т.Х, №5. - -С.557-567.

11. Фриденштейн А.Я., Чайлахян Р.К., Лалыки-на К.С. О фибробластоподобных клетках в культурах кроветворной ткани морских свинок. // Цитология. - 1970. - т.12, №9. - С.1147-1155.

12. Фриденштейн А.Я., Чайлахян.Р.К., Лациник Н.В., Панасюк А.Ф., Кейлис-Борок И.В. Стромаль-ные клетки, ответственные за перенос микроокружения в кроветворной и лимфоидной ткани. // Пробл. гемат.перелив. крови. — 1973. — №10. — С.14-23.

13. Чайлахян Р.К. Клеточные технологии в травматологии. V научно-практическая конференция. “ Современные тенденции комплексной диагностики и лечение заболеваний скелетно-мышечной системы.11 Сборник докладов. — Москва 2004 -С.245-248.

14. Чайлахян Р.К., Герасимов Ю.В., Куралесова А.И., Лациник Н.В., Генкина Е.Н., Чайлахян М.Р. Пролиферативные и дифференцировочные потенции индивидуальных клонов стромальных клеток-предшественников костного мозга. // Известия АН. Серия Биологическая. — 2001. — №6,

- С. 682-692.

15. Чайлахян Р.К., Герасимов Ю.В., Фриденштейн А.Я. Содержание в костном мозге остеогенных клеток-предшественников и их размножение в культурах. // Бюл. экспер. биол. мед. — 1984. — №11. — С. 605-607.

16. Чайлахян Р.К., Лалыкина К.С.. Спонтанная и индуцированная дифференцировка костной ткани в популяции фибробластоподобных клеток, полученных из длительных монослойных культур костного мозга и селезенки. // ДАН СССР. — 1969. — т.187, №2. - С. 473-479.

17. Friedenstein A.J., Chailakhyan R.K., Gerasimov Ju.V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. // Cell Tissue Kinet. - 1987. - P.263-272.

18. Friedenstein A.J., Ivanov-Smolenski A.A., Chailakhyan R.K., Gerasimov Ju.V. Origin of bone marrow stromal mechanocytes in radiochimeras fnd heterotopic transplants. // Exp. Hematol.. — 1978. — V

6, N 3. - P.440-444.

19. Simmons P., Torok-Sorb B. Identification of stromal cell-precursors in human bone marrow by a novel monoclonal anti-body, STRO-1. // Blood. — 1991.

- V.78.N1. P.55-62.