ВАКЦИНА ИНАКТИВИРОВАННАЯ КОМБИНИРОВАННАЯ ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА, ПАРАГРИППА-3, РЕСПИРАТОРНО-СИНЦИТИАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ, ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ И ПАСТЕРЕЛЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
INACTIVATED COMBINED VACCINE AGAINST INFECTIOUS RHINOTRACHEITIS, PARAFLU-3, RESPIRATORY SYNCYTIAL DISEASE, VIRAL DIARRHEA AND PASTEURELLOSIS OF CATTLE

Изобретение относится к области вирусологии, биотехнологии и ветеринарии и касается создания новых вакцин, которые могут быть использованы для предупреждения инфекционных болезней крупного рогатого скота (КРС), сопровождающихся нарушением респираторных функций различной степени тяжести.
Респираторные болезни КРС представляют собой группу разнородных патологий, обусловленных чрезвычайным множеством различных факторов как инфекционной, так и неинфекционной природы, включая генетическую предрасположенность, нарушение санитарно-гигиенических норм содержания и кормления, воздействие стрессовых факторов. По широте распространения, смертности, вынужденному убою, недополучению привесов заболевания органов дыхания особенно у телят значительно превалируют над всеми остальными болезнями и наносят колоссальный экономический ущерб. В отдельных хозяйствах гибель телят в совокупности с вынужденным убоем достигает 40-55%, а окупаемость корма у больных и переболевших животных снижается в 2-3 раза.
Массовые респираторные заболевания КРС в последние годы проявляются как смешанные вирусные и вирусно-бактериальные инфекции, отличающиеся особенно злокачественным течением, которое трудно диагностировать, так как вторичная бактериальная инфекция "маскирует" первичное вирусное заболевание.
Установлено, что основную роль в возникновении респираторных болезней у молодняка КРС играют вирусы инфекционного ринотрахеита (ИРТ), парагриппа-3 (ПГ-3), вирусной диареи (ВД) и респираторно-синтициальный вирус (PC), циркулирующие в хозяйствах в различных сочетаниях. Из бактериальных возбудителей в развитии респираторных заболеваний у животного обычно участвуют пастереллы двух видов: Pasteurella multocida и Mannheimia haemolytica (Pasteurella haemolytica), которые способствуют осложнениям бронхопневмонии у восприимчивых животных и выступают при этом как секундарная микрофлора.
Общим недостатком большинства известных вакцин, предназначенных для использования против массовых инфекционных респираторных заболеваний крупного рогатого скота и телят, является их низкая эффективность в результате ограниченного антигенного спектра действия, отсутствие системной направленности, а также отсутствие в составе вакцин бактериальных антигенов, что часто приводит к развитию летального исхода у больных животных.
4,5
6,5
4,0
6,0
5,0
7,0
Известна вакцина "ТРИВАК (ВИЭВ)" для профилактики инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3 и вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота, содержащая антигены из аттенуированных штаммов вирусов инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3 и диареи - болезни слизистых. В качестве штаммов вирусов вакцина содержит штамм Herpes virus bovis "ТК-А(ВИЭВ)В-2" с активностью 10-10 ТЦД50/мл, штамм Virus diarrhea - mucosal disease bovinum "BK-1(B-1)N 28" с активностью 10-10 ТЦД50/мл, штамм Paramyxovirus "ПТК-45/86" с активностью 10-10 ТЦД50/мл (Патент RU №2111011, A61K 39/295, опубл. 20.05.1998).
Недостатком данной вакцины является низкая защита поголовья КРС от пневмогастроэнтеритов вследствие неполноценности антигенного состава входящих в нее компонентов и сложных взаимодействий вирусов, из которых она изготовлена.
7,5
8,5
3
6,5
7,5
3
50/
50/
Известна также комбинированная вакцина против вирусных пневмогастроэнтеритов крупного рогатого скота и телят, содержащая адъювант и инактивированные суспензии вирусов инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, ротавирусной и коронавирусной инфекции в титре 10-10 ТЦДсм, инактивированные суспензии вирусов парагриппа-3 и респираторно-синцитиальной инфекции - в титре 10-10 ТЦДсм, взятые в вакцине в объемном соотношении 1:1:1:1:0,5:0,5 соответственно (Патент RU №2261111, A61K 39/295, опубл. 27.09.2005).
Однако входящие в состав известной вакцины штаммы вирусов не обеспечивают формирование иммунитета по отношению к разным подтипам и основным антигенным вариантам эпизоотических штаммов возбудителей, циркулирующих в хозяйствах, и, как следствие этого, известная вакцина является недостаточно эффективной. Кроме того, известная вакцина не позволяет достигнуть высокого уровня титров антител в крови коров и в молозиве, выпаиваемом новорожденным телятам.
Известна вакцина против пастереллеза животных, содержащая инактивированную бактериальную суспензию Pasteurella multocida серологических вариантов А, В, D из штаммов №1231, 681, Т-80 с активностью растворимых поверхностных антигенов в реакции пассивной гемагглютинации как 1:256-4096, 1:512-8192, 1:256-4096, и адъювант - эмульгатор 139 и минеральное масло Маркол 52, взятые в массовом соотношении 1:10-12 (Патент RU №2311199, A61K 39/102, опубл. 27.11. 2007).
Недостатком вакцины против пастереллеза животных является то, что она не обеспечивает иммунологическую защиту животных от инфекционных бронхопневмоний вирусной этиологии ввиду отсутствия в вакцине вирусных антигенов. Кроме того, вакцина обладает сравнительно невысокой иммуногенной активностью при высоком содержании балластных веществ и реактогенностью, обуславливающей сенсибилизацию организма животных.
Известна вакцина против вирусных болезней крупного рогатого скота, характеризующихся респираторным синдромом, содержащая аттенуированные вирусы инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи; парагриппа-3 и инактивированные клетки бактерий Pasteurella multocida и Pasteurella haemolytica (Патент US №3634587, C12K 5/00, опубл. 11.01.1972).
Однако данная вакцинная композиция характеризуется низкой противоэпизоотической эффективностью, обусловленной тем, что используемые для ее изготовления штаммы обладают антигенными и иммунобиологическими отличиями по сравнению с аналогичными характеристиками эпизоотических возбудителей, циркулирующих на территории России и стран СНГ.
Кроме того, применение живых вакцин, содержащих неинактивированные антигены вирусов инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи, категорически противопоказано для стельных коров и новорожденных телят из-за возможности гомологичной рекомбинации вакцинного и полевого штаммов вируса, ведущей к обострению инфекций, абортам и даже гибели отдельных животных.
Наиболее близким аналогом является вакцина инактивированная комбинированная против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, респираторно- синцитиальной болезни, вирусной диареи и пастереллеза телят «КОМБОВАК-Р», которая изготавливается из инактивированных штаммов вирусов инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной болезни крупного рогатого скота и двух видов пастерелл: Pasteurella multocida (серовары А, В, D) и Pasteurella haemolitica (Наставление по применению вакцины инактивированной комбинированной против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, респираторно- синцитиальной болезни, вирусной диареи и пастереллеза телят КОМБОВАК-Р, утвержденное Департаментом ветеринарии 30.03.2007 г.).
Недостатком известной комбинированной вакцины является относительно невысокий титр инфекционной активности входящих в ее состав вирусных суспензий, в результате чего в прививной дозе не обеспечивается необходимое количество протективных антигенов против указанных болезней.
Задачей изобретения является разработка безопасной комбинированной (поливалентной) вакцины, содержащей сбалансированные в антигенном и иммуногенном отношении вирусные и бактериальные антигены, которая позволит создать напряженный иммунитет против наиболее значимых возбудителей болезней, сопровождающихся поражением органов респираторного тракта, и обеспечить, таким образом, сохранность молодняка и продуктивность взрослых животных.
Еще одной задачей является получение новых производственных штаммов вирусов ИРТ, ПГ-3, PC и ВД, обладающих широким антигенным спектром, высокой антигенной и иммуногенной активностью не только в нативном виде, но и после инактивации стабильно сохраняющих свои свойства и пригодных для создания инактивированных комбинированных вакцин различной валентности.
Технический результат изобретения заключается в расширении арсенала комбинированных вакцин против инфекционных болезней, сопровождающихся поражением респираторного тракта, а также в повышении стабильности, антигенной и иммуногенной активности комбинированной вакцины и создании напряженного и длительного иммунитета у привитых животных и родившихся телят против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, респираторно-синцитиальной болезни, вирусной диареи и пастереллеза крупного рогатого скота.
Технический результат изобретения достигается за счет использования в составе вакцины новых производственных штаммов вирусов инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, респираторно-синцитиальной болезни и вирусной диареи КРС с широким антигенным спектром, а также за счет создания синергетической композиции поливалентной вакцины при объединении новых производственных штаммов вирусов с известными вакцинными штаммами пастерелл.
Сущность изобретения заключается в следующем:
Предлагаемая инактивированная комбинированная вакцина против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, респираторно-синцитиальной болезни, вирусной диареи и пастереллеза крупного рогатого скота, содержащая активное вещество и целевые добавки, отличается тем, что в качестве активного вещества она содержит смесь инактивированной суспензии штамма вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота ГКВ №2333, семейства Herpesviridae, подсемейства Alphaherpesviridae; инактивированной суспензии штамма вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота ГКВ №2334, подсемейства Paramixovirinae, рода Paramixovirus; инактивированной суспензии штамма вируса респираторно-синцитиальной болезни крупного рогатого скота ГКВ №2335, подсемейства Pneumoviridae, рода Pneumovirus; инактивированной суспензии штамма вируса диареи крупного рогатого скота ГКВ №2336, семейства Flaviviridae, рода Pestivirus, инактивированной суспензии клеток бактерий Pasteurella multocida серовара А штамма 1231, инактивированной суспензии клеток бактерий Pasteurella multocida серовара В штамма 656, инактивированной суспензии клеток бактерий Pasteurella multocida серовара D штамма Т-80, инактивированной суспензии клеток бактерий Mannheimia haemolytica (Pasteurella haemolytica) штамма 169, в эффективном количестве.
Термин «эффективное количество» означает количество активного вещества, которое при введении коровам и/или телятам обеспечивает индукцию специфического иммунного ответа достаточного уровня в организме животных с последующим предупреждением от заболевания и симптомов заболевания, подлежащих профилактике.
Входящие в состав комбинированной вакцины штамм вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота ГКВ №2333, семейства Herpesviridae, подсемейства Alphaherpesviridae, штамм вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота ГКВ №2334, подсемейства Paramixovirinae, рода Paramixovirus, штамм вируса респираторно-синцитиальной болезни крупного рогатого скота ГКВ №2335, подсемейства Pneumoviridae, рода Pneumovirus, и штамм вируса диареи крупного рогатого скота ГКВ №2336, семейства Flaviviridae, рода Pestivirus, являются новыми производственными штаммами и впервые используются в составе вакцинных препаратов.
Термин «производственный штамм» означает вакцинный штамм, изученный по своим биологическим свойствам, стабильный при хранении и пересевах, безвредный после инактивирования или аттенуирования для животного, хорошо адаптированный к системе культивирования, обладающий высокой антигенной и иммуногенной активностью как для чувствительной лабораторной модели, так и для естественно восприимчивых животных, а также характеризующийся широким антигенным спектром, доминирующим над эпизоотическими штаммами возбудителя.
Производственный штамм вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота ГКВ №2333 депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии РАМН, имеет регистрационный номер депонента ГКВ №2333 и характеризуется следующими признаками и свойствами.
Источник происхождения:
Источником получения нового производственного штамма вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота является вирусный штамм В-25 (авторское название), выделенный в 1991 г. из носового смыва теленка с респираторным синдромом, который прошел 35 последовательных пассажей в перевиваемых культурах клеток КРС.
Морфологические свойства:
Штамм ГКВ №2333 относится к семейству Herpesviridae, подсемейство Alphaherpesviridae. При электронном микроскопическом исследовании методом негативного контрастирования вируссодержащего культурального материала обнаружены вирионы, характерные для вируса инфекционного ринотрахеита КРС, размером 150-200 нм и состоящие из капсида кубической симметрии и покрывающей его внешней оболочки. Капсид имеет 162 призматических полых капсомера. Нуклеокапсид формируется внутри ядра, где образуются включения типа А.
Антигенные свойства:
Штамм ГКВ №2333 проявляет высокую антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации, обладает широким антигенным спектром и доминирует по отношению к полевым штаммам.
Введение морским свинкам штамма ГКВ №2333 вируса ИРТ ведет к формированию гуморального иммунного ответа к различным штаммам и полевым изолятам вируса ИРТ (табл.1).
Табл.1
Перекрестная антигенная активность штамма ГКВ №2333 вируса ИРТ
Штамм/изолят вируса ИРТ для РН
Титр вируснейтрализующих антител в сыворотке крови морских свинок, иммунизированных штаммом ГКВ №2333 вируса ИРТ*, М±m
ГКВ №2333
142,1±24,2
В-25
84,4±13,8
Изолят №1702
76,1±23,9
Изолят №2105
87,3±12,5
Изолят №1320
111,4±26,5
* здесь и далее в таблицах приведены обратные значения титра антител
Биотехнологические характеристики:
50
3
Штамм ГКВ №2333 хорошо размножается в первичных и перевиваемых культурах клеток (почки, тестикулы), полученных из тканей и органов крупного рогатого скота. В указанных культурах клеток вирус накапливается в титре 7,5-8,5 lg ТЦД/см.
Рекомендуемый способ хранения:
В лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 60°С.
Периодичность освежения:
Один раз в три года в перевиваемой культуре клеток почки теленка МДВК (далее - культура клеток МДВК).
Дополнительные сведения о штамме:
Штамм ГКВ №2333 не контаминирован посторонней микрофлорой. Тестируется с помощью референс-сыворотки (GB).
Реактогенность - штамм ГКВ №2333 реактогенными свойствами не обладает.
Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при последовательных пассажах в культуре клеток МДВК в течение 10 пассажей (срок наблюдения).
Патогенность - выражена.
Контагиозность - выражена.
Онкогенность - отсутствует.
Производственный штамм вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота ГКВ №2334 депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии РАМН, имеет регистрационный номер депонента ГКВ №2334 и характеризуется следующими признаками и свойствами.
Источник происхождения:
Источником получения нового штамма производственного вируса парагриппа-3 КРС является вирусный штамм В-19 (авторское название), выделенный в 1990 г. из носового смыва теленка с признаками ринита в культуре клеток почки теленка, который прошел 67 последовательных пассажей в культуре клеток МДВК
Морфологические свойства:
Штамм ГКВ №2334 относится к порядку Paramixoviridae, подсемейству Paramixovirinae, роду Paramixovirus. При электронном микроскопическом исследовании методом негативного контрастирования вируссодержащего культурального материала обнаружены вирионы, характерные для вируса ПГ-3: полиморфной слегка овальной формы, размер вириона варьирует от 150 до 250 нм. Вирион состоит из оболочки и внутреннего компонента, который представлен рибонуклеопротеидной спиралью.
Антигенные свойства:
Штамм ГКВ №2334 проявляет высокую антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации, обладает широким антигенным спектром и доминирует по отношению к полевым штаммам.
Введение морским свинкам штамма ГКВ №2334 вируса ПГ-3 ведет к формированию гуморального иммунного ответа к различным штаммам и полевым изолятам вируса ПГ-3 (табл.2).
Табл.2
Перекрестная антигенная активность штамма ГКВ №2334 вируса ПГ-3
Штамм/изолят вируса ПГ-3 для РН
Титр вируснейтрализующих антител в сыворотке крови морских свинок, иммунизированных штаммом ГКВ №2334 вируса ПГ-3, М±m
ГКВ №2334
322,4±18,5
В-19
276,2±36,7
Изолят №543
111,4±26,5
Изолят №486
161,1±25,6
Биотехнологические характеристики:
50
3
Штамм ГКВ №2334 хорошо размножается в первичных и перевиваемых культурах клеток (почки, легкие), полученных из тканей и органов крупного рогатого скота. В указанных культурах клеток вирус накапливается в титре 7,5-9,0 lg ТЦД/см.
Рекомендуемый способ хранения:
В лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 60°С.
Периодичность освежения:
Один раз в три года в культуре клеток МДВК.
Дополнительные сведения о штамме:
Штамм ГКВ №2334 не контаминирован посторонней микрофлорой.
Тестируется с помощью референс-сыворотки (GB).
Реактогенность - штамм ГКВ №2334 реактогенными свойствами не обладает.
Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при последовательных пассажах в культуре клеток МДВК в течение 10 пассажей (срок наблюдения).
Патогенность - выражена.
Контагиозность - выражена.
Онкогенность - отсутствует.
Производственный штамм вируса диареи крупного рогатого скота ГКВ №2336 депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии РАМН, имеет регистрационный номер депонента ГКВ №2336 и характеризуется следующими признаками и свойствами.
Источник происхождения:
Источником получения нового производственного штамма вируса диареи ГКВ №2336 является вирусный штамм СТ-89 (авторское название), выделенный в 1989 г. из содержимого кишечника телят с признаками диареи в культуре клеток почки новорожденного теленка, который прошел 82 последовательных пассажа в перевиваемой культуре клеток МДВК.
Морфологические свойства:
Штамм ГКВ №2336 относится к семейству Flaviviridae, роду Pestivirus. При электронном микроскопическом исследовании методом негативного контрастирования вируссодержащего культурального материала обнаружены вирионы, характерные для вируса диареи КРС, размером 40-60 нм и состоящие из нуклеокапсида икосаэдрической симметрии и наружной липопротеидной оболочки.
Антигенные свойства:
Штамм ГКВ №2336 проявляет высокую антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации, обладает широким антигенным спектром и доминирует по отношению к полевым штаммам.
Введение морским свинкам штамма ГКВ №2336 вируса диареи КРС ведет к формированию гуморального иммунного ответа к различным штаммам и полевым изолятам вируса ВД (табл.3).
Табл.3
Перекрестная антигенная активность штамма ГКВ №2336 вируса ВД
Штамм/изолят вируса ВД для РН
Титр вируснейтрализующих антител в сыворотке крови морских свинок, иммунизированных штаммом ГКВ №2336 вируса ВД, М±m
ГКВ №2336
374,8±31,6
СТ-89
107,6±24,5
Изолят №865
168,9±21,3
Изолят №1204
337,7±26,8
Изолят №663
174,8±22,4
Имеет тесное антигенное родство с вирусами классической чумы свиней и пограничной болезни овец.
Биотехнологические характеристики:
7,5
8,5
3
50
Штамм ГКВ №2336 хорошо размножается в первичной культуре клеток почки телят (эмбрионов коров) и в культуре клеток МДВК. В указанных культурах клеток вирус накапливается в титре 10-10 ТЦЦ/см.
Рекомендуемый способ хранения:
В лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 60°С.
Периодичность освежения:
Один раз в три года в культуре клеток МДВК.
Дополнительные сведения о штамме:
Штамм ГКВ №2336 не контаминирован посторонней микрофлорой. Тестируется с помощью референс-сыворотки (GB) и в тест-системе ПЦР.
Реактогенность - штамм ГКВ №2336 реактогенными свойствами не обладает.
Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при последовательных пассажах в культуре клеток МДВК в течение 10 пассажей (срок наблюдения).
Патогенность - выражена.
Контагиозность - выражена.
Онкогенность - отсутствует.
Производственный штамм вируса респираторно-синцитиальной болезни крупного рогатого скота ГКВ №2335 депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии РАМН, имеет регистрационный номер депонента ГКВ №2335 и характеризуется следующими признаками и свойствами.
Источник происхождения:
Источником получения нового штамма производственного вируса PC КРС является вирусный штамм 89 (авторское название), выделенный в 1989 г. из носовых смывов телят с признаками ринита и пневмонии в культуре клеток почки эмбриона коровы, который прошел 72 последовательных пассажа в культуре клеток МДВК.
Морфологические свойства:
Штамм ГКВ №2335 относится к порядку Paramixoviridae, подсемейству Pneumoviridae, роду Pneumovirus. При электронном микроскопическом исследовании методом негативного контрастирования вируссодержащего культурального материала обнаружены вирионы, характерные для респираторно-синцитиального вируса КРС, размером 200-300 нм и состоящие из нуклеокапсида спиральной симметрии и наружной липопротеидной оболочки, на поверхности которой имеются выступы длиной 8-12 нм.
Антигенные свойства:
Штамм ГКВ №2335 проявляет высокую антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации, обладает широким антигенным спектром и доминирует по отношению к полевым штаммам.
Введение морским свинкам штамма ГКВ №2335 вируса PC ведет к формированию гуморального иммунного ответа к различным штаммам и полевым изолятам вируса PC (табл.4).
Табл.4
Перекрестная антигенная активность штамма ГКВ №2335 вируса PC
Штамм/изолят вируса PC для РН
Титр вируснейтрализующих антител в сыворотке крови морских свинок, иммунизированных штаммом ГКВ №2335 вируса PC, M±m
ГКВ №2335
162,5±22,8
PC-89
81,6±22,5
Изолят №124
62,3±16,4
Антигенно связан с PC вирусом человека.
Биотехнологические характеристики:
50/
3
Штамм ГКВ №2335 хорошо размножается в первичной культуре клеток почки телят (эмбрионов коров) и в культуре клеток МДВК. В указанных культурах клеток вирус накапливается в титре 6,5-7,0 lg ТЦДсм
Рекомендуемый способ хранения:
В лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 60°С.
Периодичность освежения:
Один раз в три года в культуре клеток МДВК.
Дополнительные сведения о штамме:
Штамм не контаминирован посторонней микрофлорой. Тестируется с помощью референс-сыворотки (GB).
Реактогенность - штамм ГКВ №2335 реактогенными свойствами не обладает.
Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при последовательных пассажах в культуре клеток МДВК в течение 10 пассажей (срок наблюдения).
Патогенность - выражена.
Контагиозность - выражена.
Онкогенность - отсутствует.
6,5
3
50
В составе комбинированной вакцины против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, респираторно-синцитиальной болезни, вирусной диареи и пастереллеза крупного рогатого скота инактивированные вирусные суспензии штаммов ГКВ №2333, ГКВ №2334, ГКВ №2335 и ГКВ №2336 содержатся с титром инфекционной активности каждого вируса не менее 10ТЦД в 1 см вакцины.
Инактивацию вирусных суспензий осуществляют любым известным способом, например, путем добавления формалина или димера этиленимина (ДЭИ).
8,5-9,0
3
7,0-7,5
3
7,5-8,5
3
7,5-8,5
3
7,0-7,5
3
7,5-8,5
3
6,5-7,0
3
50
50
50
50
50
50
50
В составе предлагаемой вакцины вирусные суспензии штаммов могут быть использованы в любых сочетаниях по объему, например, при титре инфекционной активности штаммов ГКВ №2333, ГКВ №2336, ГКВ №2334 - 10 ТЦЦ/см и штамма ГКВ №2335 - 10 ТЦД/см вирусные суспензии смешивают в соотношении по объему 1:1:1:1 (смесь №1); или при титре инфекционной активности штаммов ГКВ №2333, ГКВ №2334 - 10ТЦД/см, штамма ГКВ №2336 - 10 ТЦД/см, штамма ГКВ №2335 - 10 ТЦД/см вирусные суспензии смешивают в соотношении по объему 2,5:2,5:1:1 (смесь №2); или при титре инфекционной активности штаммов ГКВ №2333, ГКВ №2336, ГКВ №2334 - 10 ТЦД/см и штамма ГКВ №2335 - 10 ТЦД/см вирусные суспензии смешивают в соотношении по объему 2:1,5:1,5:1,5 (смесь №3). При этом следует отметить, что увеличение или уменьшение объема в два раза одного из компонентов не оказывает значительного влияния на антигенную активность готовой вакцины.
Используемые для изготовления пастереллезного компонента комбинированной вакцины штаммы Pasteurella multocida (штамм 1231 (серовар А), штамм 656 (серовар В), штамм Т-80 (серовар D)) и Mannheimia haemolytica (Pasteurella haemolytica) (штамм 169) известны и используются в различных сочетаниях при изготовлении вакцин и сывороток против пастереллеза животных (см. например, авторское свидетельство SU №1792708, патенты РФ №2118169, 2191598, 2246316, 2304442 и др.). Однако нами было установлено, что при объединении известных штаммов пастерелл в предлагаемой по изобретению комбинации с новыми производственными штаммами вирусов наблюдается образование синергетической композиции, проявляемой в увеличении напряженности и длительности иммунитета к вирусному и пастереллезному компонентам вакцины.
В составе предлагаемой вакцины инактивированные суспензии клеток бактерий Pasteurella multocida (штамм 1231 (серовар А), штамм 656 (серовар В), штамм Т-80 (серовар D)) и Mannheimia haemolytica (Pasteurella haemolytica) (штамм 169) содержатся в равных соотношениях с конечной концентрацией не менее 3 млрд микробных клеток в 1 см вакцины.
Инактивацию суспензий клеток пастерелл осуществляют любым известным способом, например, путем добавления формалина, содержащего не менее 37% формальдегида.
Согласно изобретению комбинированная вакцина также содержит одну или более приемлемую в ветеринарии целевую добавку.
Термин "целевая добавка" означает любые приемлемые в ветеринарии фармацевтические компоненты, которые традиционно используются для обеспечения сохранности антигенов в процессе технологической переработки, приготовления конечной рецептурной формы или последующего хранения и тому подобное.
В качестве целевой добавки комбинированная вакцина может содержать растворитель, адъювант, солюбилизирующий агент, разбавитель, консервант, стабилизатор, антибактериальное и противогрибковое средства, изотонический агент, агент, задерживающий всасывание, и тому подобное. Разбавители могут включать дистиллированную воду, физиологический раствор, солевой раствор, декстрозу, этанол, глицерин и тому подобное. Изотонические агенты могут включать, наряду с другими, хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Стабилизаторы включают альбумин, сахарозу, желатозу, обезжиренное молоко и т.д.
Адъюванты включают вещества неспецифически усиливающие иммунный ответ к антигенам и могут быть минерального происхождения - гидрат окиси алюминия, фосфат алюминия, алюминиево-калиевые квасцы; растительного происхождения - сапонин (Квил-А); адъюванты на основе минеральных и неминеральных масел; синтетический адъювант - мурамилдипептид и др.
В качестве целевой добавки предлагаемая вакцина преимущественно содержит адъювант, например, гидрат окиси алюминия или смесь гидрата окиси алюминия с сапонином.
При необходимости в качестве целевой добавки предлагаемая вакцина может содержать консервант мертиолят натрия в количестве 1:10000.
Хотя специалист в данной области может легко определить количество и концентрацию адъювантов и добавок, которые можно использовать в контексте настоящего изобретения, настоящее изобретение относится к композициям, включающим предпочтительно от 20 до 30 об.% адьюванта.
В предпочтительном варианте вакцина содержит 6%-ный гель гидрата окиси алюминия в количестве 20 об.% и сапонин в количестве 0,05 об.%, что соответствует 12 г гидрата окиси алюминия и 500 мг сапонина в 1 л вакцины.
Нижеследующие примеры рецептур являются чисто иллюстративными и не ограничивают рамки настоящего изобретения.
Вакцина инактивированная комбинированная против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, респираторно-синцитиальной болезни, вирусной диареи и пастереллеза крупного рогатого скота представляет собой жидкость светло-красного цвета, при хранении образуется рыхлый сероватый осадок, легко разбивающийся в гомогенную взвесь при встряхивании.
Вакцина стабильна и сохраняет исходную активность при температуре 2-8°С не менее 18 месяцев (срок наблюдения).
3
3
3
С целью профилактики респираторных болезней полученную вакцину вводят внутримышечно стельным животным дважды: первый раз - за 50-60 сут до отела, второй раз - через 14-21 сут после первой иммунизации (не позднее 30 дней до отела) в дозе 3 см. Телят в возрасте 30 сут и старше вакцинируют дважды с интервалом 20-25 сут в дозе 2 см. Животных старше 4-месячного возраста вакцинируют дважды внутримышечно в дозе 3 см с интервалом 14-21 сут. Ревакцинацию проводят однократно в той же дозе, каждые 6 мес.
Вакцина апробирована на крупном рогатом скоте в неблагополучных хозяйствах. Эта апробация подтверждает безвредность препарата и его противоэпизоотическую эффективность, проявляемую в усилении иммунизирующей активности компонентов инактивированной вакцины. Вакцинация повышает иммунитет у матерей и защищает потомство в период эмбрионального развития и в постнатальный период. При этом индуцируемый иммунный ответ характеризовался высокой специфичностью по отношению к разным подтипам и основным антигенным вариантам эпизоотических штаммов возбудителей, циркулирующих в хозяйствах.
Защитный уровень антител у животных, привитых данной вакциной, сохранялся не менее 8 мес у взрослых животных и 6 мес у молодняка в возрасте до 1 года, колостральный иммунитет-до 1,5 месяцев.
Изобретение иллюстрируется, но не ограничивается следующими примерами.
Пример 1. Получение инактивированной комбинированной вакцины против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, респираторно-синцитиальной болезни, вирусной диареи и пастереллеза КРС.
Вакцину готовят из новых производственных штаммов вируса инфекционного ринотрахеита ГКВ №2333, вируса парагриппа-3 ГКВ №2334, респираторно-синцитиального вируса ГКВ №2335, вируса диареи ГКВ №2336 (вирусный компонент) и известных вакцинных штаммов пастерелл Pasteurella multocida (штамм 1231 (серовар А), штамм 656 (серовар В), штамм Т-80 (серовар D)), Mannheimia haemolytica (Pasteurella haemolytica) (штамм 169) (пастереллезный компонент).
Технологический процесс состоит из следующих основных стадий: стадии получения вирусного компонента, стадии получения пастереллезного компонента, объединение полученных вирусного и пастереллезного компонентов, добавление адъюванта, смешивание всех компонентов вакцины с последующей расфасовкой готового продукта.
А. Стадия получения вирусного компонента комбинированной вакцины.
Изготовление вирусного компонента комбинированной вакцины включает раздельные этапы получения вирусных суспензий из посевных материалов штаммов вируса инфекционного ринотрахеита ГКВ №2333, вируса парагриппа-3 ГКВ №2334, респираторно-синцитиального вируса ГКВ №2335 и вируса диареи ГКВ №2336; определения инфекционной активности каждой вирусной суспензии, инактивацию вируссодержащих культуральных жидкостей каждого штамма и их объединение.
Стадия получения вирусных суспензий согласно изобретению основывается на системе посевных материалов (seed lot system), при которой последовательные серии продукции получают из главного посевного материала (master seed lot) при определенном количестве пересевов (пассажей). В текущем производстве рабочий посевной материал (working seed lot) готовится из главного посевного материала. Готовый продукт производят из рабочего посевного материала, при этом число пересевов из главного посевного материала не должно превышать значения, установленного при клинических испытаниях вакцин, исходя из требований безопасности и эффективности.
Процесс получения системы посевных материалов каждого штамма вируса включает несколько этапов:
- приготовление культуры клеток;
- проведение пассажей вируса;
- получение вирусной суспензии;
- промежуточный контроль штамма вируса;
- лиофилизация, замораживание или инактивация штамма вируса;
- контроль штамма вируса.
Штаммы вирусов инфекционного ринотрахеита ГКВ №2333, парагриппа-3 ГКВ №2334, респираторно-синцитиального ГКВ №2335 и вирусной диареи ГКВ №2336 выращивают отдельно в перевиваемой культуре клеток почки теленка МДВК.
50
3
Накопление вирусов в культуре клеток оценивают по цитопатическому эффекту. Титр вирусов вычисляют по методу Рида и Менча и выражают в lg ТЦД/см.
50
3
Накопление вирусов в культуре клеток оценивают по цитопатическому эффекту, накопление вируса ПГ-3 также по гемагглютинирующей активности с использованием эритроцитов морской свинки. Титр вирусов вычисляют по методу Рида и Менча и выражают в lg ТЦД/см.
7,5
9,0
3
6,5
7,5
3
50
50
При достижении титра вирусов инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи и парагриппа-3 до значений 10-10 ТЦД/см, а вируса респираторно-синцитиальной инфекций - 10-10 ТЦД/см, полученный вируссодержащий материал каждого штамма очищают от балластных примесей центрифугированием или любым другим известным методом.
Далее суспензии вирусов инактивируют раствором формалина, содержащим не менее 37% формальдегида. Полноту инактивации оценивают по отсутствию размножения вирусов в чувствительной культуре клеток в течение четырех пассажей.
6,5
3
50
Инактивированные суспензии вирусов объединяют с таким расчетом, чтобы в каждой серии титр инфекционной активности каждого из штаммов составлял не менее 10ТЦД/см.
8,5-9,0
3
7,0-7,5
3
7,5-8,5
3
7,5-8,5
3
7,0-7,5
3
7,5-8,5
3
6,5-7,0
3
50
50
50
50
50
50
50
При этом вирусные суспензии штаммов могут быть использованы в любых сочетаниях по объему, например, при титре инфекционной активности штаммов ГКВ №2333, ГКВ №2336, ГКВ №2334 - 10 ТЦД/см и штамма ГКВ №2335 - 10 ТЦД/см вирусные суспензии смешивают в соотношении по объему 1:1:1:1 (смесь №1); или при титре инфекционной активности штаммов ГКВ №2333, ГКВ №2334 - 10ТЦД/см, штамма ГКВ №2336 - 10 ТЦД/см, штамма ГКВ №2335 - 10 ТЦД/см вирусные суспензии смешивают в соотношении по объему 2,5:2,5:1:1 (смесь №2); или при титре инфекционной активности штаммов ГКВ №2333, ГКВ №2336, ГКВ №2334 - 10 ТЦД/см и штамма ГКВ №2335 - 10 ТЦД/см вирусные суспензии смешивают в соотношении по объему 2:1,5:1,5:1,5 (смесь №3).
Б. Стадия получения пастереллезного компонента комбинированной вакцины.
Культуры пастерелл Pasteurella multocida (штамм 1231 (серовар А), штамм 656 (серовар В), штамм Т-80 (серовар D)), Mannheimia haemotytica (Pasteurella haemolytica) (штамм 169) выращивают отдельно, используя питательные среды на основе перевара Хоттингера с рН 7,9-8,0 и содержанием аминного азота не менее 178-180 мг%. Культивирование проводят при температуре 37°С±1°С в течение 8-10 часов. Культивирование проводят до максимального накопления поверхностных растворимых антигенов в среде роста, определяемого по уровню титров в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА).
3
Далее полученные культуры объединят в соотношении 1:1:1:1, добавляют формалин до концентрации 0,3%. Полученную смесь инактивированных суспензий клеток концентрируют ультрафильтрацией до получения бакмассы с содержанием 100 млрд микробных клеток в 1 см и более.
В. Стадия объединения вирусного и пастереллезного компонентов комбинированной вакцины.
Вариант 1.
Инактивированные суспензии вирусов, приготовленные на стадии А, смешивают в установленном соотношении в зависимости от титра инфекционной активности вирусной суспензии каждого штамма (смесь №1), тщательно перемешивают. Затем добавляют 6%-ный гель гидроокиси алюминия (ГОА) в количестве 20% от общего объема, добавляют сапонин в концентрации 500 мг/л и консервант мертиолят натрия в концентрации 1:10000, тщательно перемешивают.
К инактивированной бактериальной суспензии клеток смеси штаммов пастерелл, приготовленной на стадии Б., добавляют мертиолят натрия в концентрации 1:10000 в качестве консерванта, затем смешивают с 6%-ным ГОА (20% от общего объема), тщательно перемешивают.
50
3
Смешивают вирусную и бактериальную части препарата с таким расчетом, чтобы концентрация вирусных антигенов в готовой вакцине составила не менее 6,5 lg ТЦД, пастерелл - не менее 3 млрд м.кл. в 1 см.
Вариант 2.
Инактивированные суспензии вирусов, приготовленные на стадии А, смешивают в установленном соотношении в зависимости от титра инфекционной активности вирусной суспензии каждого штамма (смесь №2), тщательно перемешивают. Затем добавляют 6%-ный гель гидроокиси алюминия (ГОА) в количестве 20% от общего объема, добавляют сапонин в концентрации 500 мг/л и консервант мертиолят натрия в концентрации 1:10000, тщательно перемешивают.
К инактивированной бактериальной суспензии клеток смеси штаммов пастерелл, приготовленной на стадии Б., добавляют 6%-ный ГОА (20% от общего объема) и тщательно перемешивают.
50
3
Смешивают вирусную и бактериальную части препарата с таким расчетом, чтобы концентрация вирусных антигенов в готовой вакцине составила не менее 6,5 lg ТЦД, пастерелл - не менее 3 млрд м.кл. в 1 см.
Вариант 3.
Инактивированные суспензии вирусов, приготовленные на стадии А, смешивают в установленном соотношении в зависимости от титра инфекционной активности вирусной суспензии каждого штамма (смесь №3), тщательно перемешивают. Затем добавляют 6%-ный гель гидроокиси алюминия (ГОА) в количестве 30% от общего объема, тщательно перемешивают.
К инактивированной бактериальной суспензии клеток смеси штаммов лептоспир, приготовленной на стадии Б., добавляют 6%-ный ГОА (30% от общего объема) и тщательно перемешивают.
50
3
Смешивают вирусную и бактериальную части препарата с таким расчетом, чтобы концентрация вирусных антигенов в готовой вакцине составила не менее 6,5 lg ТЦД, пастерелл - не менее 3 млрд м.кл. в 1 см.
50
3
Смешивают вирусную и бактериальную части препарата с таким расчетом, чтобы концентрация вирусных антигенов в готовой вакцине составила не менее 6,5 lg ТЦД, пастерелл - не менее 3 млрд м.кл. в 1 см.
Полученные варианты инактивированной комбинированной вакцины против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, респираторно-синцитиальной болезни, вирусной диареи и пастереллеза крупного рогатого скота имеют компонентный состав, приведенный в табл.5
Табл.5
Содержание ингредиентов в жидкой смеси, об.%
Ингридиент
Титр, lg ТЦД<sub>50</sub>/см<sup>3</sup>
Содержание в жидкой смеси, об.%
Вариант 1
Вариант 2
Вариант 3
Вирус ИРТ
7,5-8,5
-
25
20
8,5-9,0
17,5
-
-
Вирус ПГ-3
7,5-8,5
-
25
15
8,5-9,0
17,5
-
-
Вирус PC
6,5-7,0
-
-
15
7,0-7,5
17,5
10
-
Вирус ВД
7,5-8,5
-
-
15
8,5-9,0
17,5
10
-
Суспензия клеток штаммов пастерелл
-
9,94
9,94
5,0
ГОА (6%-й гель)
-
20
20
30
Сапонин
-
0,05
0,05
-
Мертиолят натрия
-
0,01
0,01
-
Пример 2. Оценка антигенной активности комбинированной вакцины на экспериментальных моделях.
Для определения антигенной активности комбинированной вакцины по изобретению в качестве экспериментальной модели используют лабораторных животных, при этом для оценки антигенной активности вирусных компонентов вакцины используют морских свинок массой 350-400 г, пастереллезного компонента - кроликов массой 3-3,5 кг и белых мышей массой 16-18 г.
Формируют группы по 10 животных в каждой: 3 опытные группы и 1 контрольную (морские свинки), 3 опытные группы и 1 контрольную (кролики).
3
3
3
3
3
Морских свинок опытных групп иммунизируют исследуемой вакциной однократно в дозе 0,25 см; 0,5 см и 1,0 см соответственно, кроликов - двукратно с интервалом 30-35 суток в первый раз в дозе 1,5 см, второй раз в дозе 3,0 см. При этом вакцину вводят морским свинкам и кроликам внутримышечно. Животных контрольных групп не иммунизируют.
На 21 сутки после инъекции вакцины у морских свинок берут кровь и отделяют сыворотку, которую затем исследуют на наличие вирусспецифических антител.
50
Антигенную активность вирусного компонента вакцины оценивают по уровню вирусспецифических антител к вирусам ИРТ, ПГ-3, PC и ВД. Титр антител определяют в реакции нейтрализации (РН), которую проводят в 96-луночных планшетах по стандартной методике методом двукратных разведений испытуемой сыворотки против рабочей дозы каждого вируса 100 ТЦД/лунка.
Вируснейтрализующий титр исследуемой сыворотки выражают как предельное ее разведение, ингибирующее развитие ЦПД вируса в 50% зараженных культур клеток.
Иммуногенную активность пастереллезного компонента определяют по превентивной активности сыворотки крови вакцинированных кроликов для белых мышей.
3
50
Для этого через 14 суток после второй инъекции вакцины у кроликов отбирают пробы крови, полученные сыворотки крови смешивают в равных объемах и сборную пробу вводят подкожно 10-ти белым беспородным мышам в дозе 0,5 см. Через сутки 10 иммунизированных и 10 контрольных мышей заражают вирулентным штаммом Р. multocida №1231 (серовар А) в дозе 5 LD. Срок наблюдения 10 суток.
Результаты исследования представлены в табл.6, которые свидетельствуют, что по антигенной и иммуногенной активности комбинированная вакцина против ИРТ, ПГ-3, PC, ВД и пастереллеза крупного рогатого скота превосходит существующие аналоги. Так, предлагаемая вакцина уже через 21 сутки после иммунизации обеспечивает выработку специфических антител ко всем компонентам препарата в высоком титре: к вирусу ИРТ - 1:154,0; к вирусу ПГ-3 - 1:180,0; к вирусу PC - 196,5; к вирусу ВД - 1:165,3, превентивная активность сыворотки крови кроликов составляла не менее 90%.
Животные контрольной группы на протяжении всего опыта были серонегативны к вирусам ИРТ, ПГ-3, PC, ВД и пастереллам.
Табл.6
Антигенная активность комбинированной вакцины против инфекционного ринотрахеита, парагрипна-3, респираторно-синцитиальной болезни, вирусной диареи и пастереллеза крупного рогатого скота на экспериментальных моделях
Группа жив-х
Титр антител в сыворотке крови морских свинок
Номер серии
Превентивная активность сыворотки крови кроликов к пастереллам %
Доза препарата, см<sup>3</sup>
Титр вируснейтрализующих антител, М±m
ИРТ
ПГ-3
PC
ВД
I
0,25
0
42,2±7,1
59,7±7,2
55,7±16,4
1
90
II
0,5
157,6±28,6
,274,4±25,3
194,0±26,7
168,9±24,4
2
100
III
1,0
78,8±19,6
119,4±15,7
207,9±28,1
157,6±28,6
3
100
контроль
-
0
0
0
0
0
0
Пример 3. Оценка стабильности комбинированной вакцины в процессе хранения.
Испытание стабильности комбинированной вакцины, полученной по примеру 1, проводят на экспериментальных животных - морских свинках и кроликах. При этом для оценки стабильности антигенной активности вирусных компонентов вакцины используют морских свинок, пастереллезного компонента - кроликов.
3
3
Для этого вакцину вводят через 6, 12 и 18 мес хранения при температуре 4°С морским свинкам однократно в дозе 0,5 см. Через 21 сут после вакцинации сыворотку крови животных отбирают для исследования. Кроликов вакцинируют дважды с интервалом 30-35 суток в дозе 1,5 и 3,0 смсоответственно. Через 14 суток после второй инъекции вакцины у кроликов отбирают пробы крови, полученные сыворотки крови смешивают в равных объемах и определяют превентивную активность сыворотки крови для белых мышей.
Стабильность вирусного компонента вакцины оценивают в РН по отсутствию снижения титра антител ниже установленного уровня (1:16), пастереллезного - по сохранению превентивной активности (должно быть не менее 90% выживших белых мышей) при хранении вакцины при +4°С в течение 18 месяцев.
Результаты испытания представлены в табл.7.
Табл.7
Изменение антигенной активности комбинированной вакцины в процессе хранения
Сроки хранения
Антигенная активность вакцины к вирусным антигенам
Иммуногенная активность вакцины к пастереллам
ИРТ
ПГ-3
PC
ВД
Превентивная активность сыворотки крови вакцинированных кроликов для белых мышей, % выживших животных
При изготовлении
157,6±28,6
274,4±25,3
194,0±26,7
168,9±24,4
90
6 мес
137,2±22,8
256,0±32,4
168,9±21,8
157,6±28,6
100
12 мес
103,9±18,1
207,9±28,1
119,4±15,7
137,2±22,8
80
18 мес
78,8±19,6
168,9±24,4
78,9±19,6
119,4±15,7
70
Пример 4. Производственное испытание экспериментальных серий комбинированной вакцины в опытах на коровах.
Испытание проводят на коровах и телках случного возраста в хозяйствах с высоким уровнем респираторных заболеваний телят, неблагополучных по инфекционному ринотрахеиту, парагриппу-3, респираторно-синцитиальной болезни, вирусной диарее и пастереллезу крупного рогатого скота.
При этом животных делят на 2 группы: опытную и контрольную, по 20 голов в каждой группе.
3
Животным опытной группы комбинированную вакцину, полученную по примеру 1, вводят внутримышечно стельным животным в дозе 3,0 смдвукратно с интервалом 14-21 сут, второй раз не позднее, чем за 30 дней до отела.
В контрольной группе животных не вакцинируют.
Для определения напряженности и продолжительности иммунитета у всех животных берут кровь до вакцинации и через 1, 2, 4, 6, 8 и 12 месяцев после вакцинации.
50
Эффективность вакцинации оценивают по уровню вируснейтрализующих антител в сыворотке крови коров и к пастереллам по превентивной активности сыворотки крови вакцинированных животных для белых мышей, зараженных 5 LD вирулентного штамма пастерелл.
Результаты испытаний представлены в табл.8.
Табл.8
Оценка активности вакцины против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, респираторно-синцитиальной болезни, вирусной диареи и пастереллеза крупного рогатого скота в опыте на коровах
Сроки исследований
Антигенная активность вакцины к вирусным антигенам
Иммуногенная активность вакцины к пастереллам
ИРТ
ПГ-3
PC
ВД
Превентивная активность сыворотки крови вакцинированных кроликов для белых мышей, % выживших животных
Опытная группа
До вакцинации
57,3±6,6
54,9±5,2
15,2±5,3
28,6±2,2
20
1 мес п/вакц.
234,7±31,1
241,8±18,8
201,1±18,7
412,4±26,9
80
2 мес п/вакц.
209,1±16,2
233,2±25,3
233,4±42,3
412,5±18,2
100
4 мес п/вакц.
1б8,9±24,4
194,0±26,7
168,9±21,8
337,8±24,9
100
6 мес п/вакц.
157,6±28,6
119,4±15,7
137,2±22,8
274,4±25,3
80
8 мес п/вакц.
84,4±12,5
103,9±18,1
97,0±18,6
256,0±32,4
60
12 мес п/вакц.
55,7±10,9
90,5±20,3
45,3±11,5
78,9±19,6
40
Контрольная группа
-
52,0±13,8
48,5±12,4
18,4±10,2
35,1±8,6
10
Результаты исследования показывают, что иммунизация коров комбинированной вакциной по изобретению вызывает формирование выраженного иммунного ответа ко всем антигенам, входящим в состав вакцины, продолжительностью не менее 8 месяцев.
Пример 5. Производственное испытание экспериментальных серий комбинированной вакцины в опытах на телятах.
Для определения профилактической эффективности комбинированной вакцины, полученной по примеру 1, отбирают 60 телят в возрасте 30-40 сут, рожденных от невакцинированных матерей.
Формируют 3 группы по 20 голов в каждой: 2 опытных и контрольную.
3
Телятам опытных групп исследуемую комбинированную вакцину вводят внутримышечно в дозе 1,0 и 2,0 см. Ревакцинацию проводят через 20-25 сут после первой иммунизации в тех же дозах.
Телятам контрольной группы вакцину не вводят.
50
Перед каждым введением препарата и через 21 сутки после 2-й вакцинации у всех животных берут кровь и определяют уровень вирусспецифических антител в сыворотке крови в РН, а также превентивную активность сыворотки крови вакцинированных телят для белых мышей, зараженных 5 LD вирулентного штамма пастерелл. Результаты испытаний представлены в табл.9.
Табл.9
Уровень специфических антител в сыворотке крови телят, иммунизированных комбинированной вакциной по изобретению
Группа животных
Доза вакцины, см<sup>3</sup>
Титр вируснейтрализующих антител, М±m
К возбудителю
До вакцинации
Через 21 сут после 1-й вакцинации
Через 21 сут после 2-й вакцинации
Опытная группа
I
1,0
ИРТ
6,1±3,0
12,5±1,1
85,7±3,1
ПГ-3
5,7±6,9
18,3±5,2
117,1±17,9
PC
5,9±2,9
28,3±4,2
123,1±24,9
ВД
2,6±2,1
53,7±15,1
401,7±38,0
Пастереллы*
0
40
60
II
2.0
ИРТ
7,0±8,8
76,0±9,4
205,0±33,7
ПГ-3
5,0±9,5
36,5±8,7
294,0±24,5
PC
5,4±2,5
42,5±5,7
184,0±23,5
ВД
5,0±7,3
96,0±21,9
664,0±52,9
Пастереллы*
0
70
100
Контрольная группа
III
-
ИРТ
5,7±6,9
0
0
ПГ-3
5,4±2,5
0
0
PC
2,6±2,1
0
0
ВД
5,9±2,9
0
0
Пастереллы*
0
0
0
* К пастереллам определяют превентивную активность сыворотки вакцинированных телят для белых мышей, зараженных 5 ЛД<sub>50</sub>
3
Данные табл.9 свидетельствуют о том, что иммунизация телят обеих опытных групп вакциной по изобретению приводит к формированию выраженного иммунного ответа и статистически достоверному приросту антител и превентивной активности сыворотки крови вакцинированных животных (Р<0,01). Максимальное содержание антител ко всем вирусам регистрируют на 21-е сутки после второй вакцинации каждой из двух испытуемых доз вакцины. Наиболее высокий титр вируснейтрализующих антител выявляется у телят при введении вакцины в дозе 2 см. Максимальная превентивная активность также выражена у телят той же опытной группы.
Пример 6. Оценка колострального иммунитета у новорожденных телят.
В экспериментах используют 7-14-дневных телят, рожденных от стельных коров, иммунизированных комбинированной вакциной по изобретению, контролем служат телята аналогичного возраста, полученные от невакцинированных коров.
Все опытные и контрольные телята своевременно получают молозиво от своих матерей в течение первых двух часов после рождения и содержатся в одинаковых условиях.
50
Оценку колострального иммунитета проводят путем определения титра специфических антител в сыворотке крови всех опытных и контрольных животных и к пастереллам по превентивной активность сыворотки крови вакцинированных телят для белых мышей, зараженных 5 LD вирулентного штамма пастерелл.
Результаты испытания представлены в табл.10.
Табл.10
Оценка колострального иммунитета вакцины против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, респираторно-синцитиальной болезни, вирусной диареи и пастереллеза крупного рогатого скота в опыте на телятах
Возраст новорожденных телят, недель
Антигенная активность вакцины к вирусным антигенам
Иммуногенная активность вакцины к пастереллам
ИРТ
ПГ-3
PC
ВД
Превентивная активность сыворотки крови вакцинированных кроликов для белых мышей, % выживших животных
Опытная группа
1
169,5±25,6
155,3±32,1
125,3±31,1
340,8±15,6
100
2
125,6±26,0
123,1±24,9
115,3±26,3
205,5±29,7
70
4
85,7±3,1
96,0±21,9
76,0±9,4
185,5±20,7
50
6
42,5±5,7
78,9±19,6
53,7±15,1
117,1±17,9
40
Контрольная группа
1
35,6±9,8
42,9±3,3
8,9±2,6
16,9±5,3
10
2
28,3±4,2
18,3±5,2
0
12,5±1,1
0
4
0
0
0
0
0
6
0
0
0
0
0
В результате исследования установлено, что вакцинация стельных коров исследуемой вакциной обеспечивает создание колострального иммунитета у телят, полученных от вакцинированных животных и получавших своевременно молозиво от своих матерей. Формирование колострального иммунитета подтверждается высокими титрами специфических антител к вирусным компонентам и превентивной активностью к пастереллам, которые сохранялись на протяжении всего срока наблюдения.
Таким образом, проведенные эксперименты свидетельствуют, что инактивированная комбинированная вакцина против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, респираторно-синцитиальной болезни, вирусной диареи и пастереллеза крупного рогатого скота в соответствии с изобретением имеет определяющее преимущество перед другими известными вакцинами по спектру специфической защиты и эффективности действия для восприимчивой группы животных, длительности напряженного иммунитета, безвредности для стельных животных и новорожденных телят, по стабильности сохранения биологических свойств, в т.ч. антигенной и иммуногенной активности на протяжении 18 месяцев (срок наблюдения). Вакцина экологически безопасна, не вызывает диссеминации патогенных агентов во внешнюю среду.