КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВИРУСНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЖИВОТНЫХ
COMPOSITION FOR TREATING VIRAL DISEASES IN ANIMALS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Изобретение относится к ветеринарии, конкретно к композициям и способам усиления терапевтических эффектов рекомбинантных интерферонов, и может быть использовано при приготовлении препаратов рекомбинантного интерферона, необходимых для лечения различных вирусных заболеваний животных.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Интерфероны - это группа биологически активных белков, синтезируемых лимфоцитами в ходе защитной реакции на чужеродные агенты - вирусную инфекцию, бактерии, паразиты - антигенное или митогенное воздействие. Интерфероны секретируются во внеклеточную жидкость и через специфические рецепторы действуют на другие клетки, в которых инициируется комплекс последовательных внутриклеточных реакций, приводящих к индукции ряда ферментов и белков (таких как протеиназа Р, олигоаденилатциклаза и др.), которые повышают сопротивляемость клеток к чужеродным агентам. В результате действия интерферонов подавляется репликация вируса в инфицированных клетках, усиливается фагоцитарная активность макрофагов и увеличивается специфическая цитотоксичность лимфоцитов к клеткам-мишеням. В определенных условиях интерферон способен также препятствовать развитию злокачественных новообразований.
Интерфероны можно разделить на два главных типа. У интерферонов типа I один общий рецептор IFN-alpha (IFNAR), состоящий из альфа-субъединицы (IFNAR1) и короткой или длинной бета-субъединицы (IFNAR2) (M.S.Kunzi and P.P.Rowe (2001) in J.J.Oppenheim et al. (eds) Cytokine Reference, v.1, pp.627-639). У млекопитающих к этому типу относятся четыре вида интерферонов - альфа, бета и омега и тау. Интерфероны типа II связываются с рецептором IFNGR и представлены только одним видом - интерфероном гамма.
Все до сих пор изученные млекопитающие имеют гены, кодирующие интерфероны альфа, бета и гамма. Интерфероны омега и тау представлены только у некоторых видов животных. Многие типы клеток млекопитающих, такие как фибробласты, клетки эпителия и эндотелия, лимфоидные клетки и астроциты, способны продуцировать бета-интерферон. Тогда как альфа-интерферон синтезируется в основном лимфоцитами в ответ на вирусную инфекцию (M.S.Kunzi and P.P.Rowe (2001) in J.J.Oppenheim et al. (eds) Cytokine Reference, v.1, pp.627-639). Гамма-интерферон, известный как иммунный интерферон, продуцируется главным образом активированными Т-клетками и NK-клетками (G.R. Stark (1998) Annu. Rev. Biochem. 67, 227-264).
У всех млекопитающих наиболее широко представлены интерфероны вида альфа, а у некоторых групп животных - также омега и тау (R.M.Roberts et. al. (1998) J. Interferon Cytok. Res. 19(4), 427). Эти интерфероны кодируются генами, лишенными интронов, и образуют обширные семейства. Например, у кошек было выявлено 14 генов интерферонов альфа и 13 генов интерферонов омега (см. GenBank). У собаки было найдено 8 генов интерферонов альфа (Т. Osamu et al. (2005) J. Vet. Med. Sci. 67(10), 1059-1062). Внутри семейств белки очень похожи (процент гомологии достигает 90%). Между белками, входящими в различные семейства, гомология ниже и составляет примерно 70%. Интерфероны различаются главным образом наличием инсерции в несколько аминокислотных остатков на С-конце интерферонов омега (R.M.Roberts, L.Liu, A.Alexenko (1997) Nucl. Acids Res. Mol. Biol. 56, 287-325). У грызунов и человека функциональный бета-интерферон кодируется только одним геном.
Наличие множества подвидов интерферонов альфа и омега поднимает вопрос об их функциональных различиях. Действительно, в ряде работ была обнаружена разница в активности интерферонов по отношению к различным видам вирусов (W.-S.Yeow et al. (1998) J. Immunol. 160, 2932-2939; G.R.Foster et al. (1996) J. Interferon Cytok. Res. 16, 1027-1033; R.Wonderling et al. (2002) Veterin. Immun. Immunopath. 89, 13-27).
Интерфероны можно характеризовать по ингибированию цитопатологического действия вируса на клетки (Rubinstein. Familletti, and Pestka, J. Virol., 37: 755 (1981); Armstrong. "Cytopathic Effect Inhibition Assay for Interferon: Microculture Plate Assay," in Methods in Enzymology, 78: 381-387 (1981); Familletti, Rubinstein, and Pestka, "A Convenient and Rapid Cytopathic Effect Inhibition Assay for Interferon," in Methods in Enzymology, 78: 387-394 (1981)). Одна единица активности интерферона определяется как количество интерферона, снижающее индуцированный вирусом цитопатологический эффект на 50%, и калибруется по международному референс-стандарту в международных единицах.
Важно разделять препараты интерферона по способу их получения, что обуславливает различие в их составе, а следовательно, в тех эффектах, которые они будут вызывать в организме. Лейкоцитарные интерфероны получают путем стимуляции непатогенными вирусами, двухцепочечными РНК и т.п. донорских лейкоцитов. Фактически, таким образом получают смесь всех подвидов альфа-интерферонов, содержание которых в препарате варьирует от нескольких процентов до 90%, в зависимости от технологии очистки и концентрирования. При применении щадящих методов очистки удается получить комплексные препараты, обогащенные медиаторами клеточных взаимодействий, цитокинами. Основным недостатком такого способа получения интерферонов является вероятность загрязнения конечного продукта вирусами, такими как вирусы гепатита, иммунодефицита и др. В настоящее время более перспективным признан способ получения интерферона микробиологическим синтезом. Рекомбинантные интерфероны получают путем экспрессии гена, кодирующего интерферон, в составе плазмиды прокариотических клеток. Препараты являются очень гомогенными по составу и содержат белок, соответствующий определенному подтипу интерферона (Рафальский В.В. Клиническое применение интерферонов).
Для лечения вирусных заболеваний у собак (чума плотоядных, болезнь Адески, парвовирусный энтерит, вирусный гепатит) широко используется генноинженерный интерферон для ветеринарии миксоферон, представляющий собой смесь альфа, бета и гамма интерферонов человека. Однако лечение экзогенным геноинженерным интерфероном (миксофероном) является недостаточно эффективным: являясь чужеродным белковым препаратом, миксоферон может вызывать явления анафилоксии и иммунодепрессии. Кроме того, учитывая различную чувствительность групп и штаммов вирусов к интерферону, не всегда удается ввести извне количества интерферона, достаточные для подавления персистенции вируса и не вызывающие анафилактического шока.
Неоднократно предпринимались попытки использования интерферонов в виде смесей (например, патент № WO 0039280 (А2), CN 1935256 (A), RO 118842 (В), CN 1449740 (A), RU 0002327486 27.06.2008 С1). Однако вызывает удивление тот факт, что в описаниях изобретений очень часто отсутствует указание на источник происхождения интерферонов, что делает невозможным интерпретацию результатов экспериментов, приводимых в примерах. Как уже было сказано, препараты лейкоцитарных интерферонов содержат много других белков сыворотки крови, в том числе и цитокинов. Не исключено, что эти белки (не интерфероны), сами по себе или в сочетании с другими белками (в том числе и с интерферонами), могут вызывать биологические эффекты, описываемые авторами. В отличие от этого препараты рекомбинантных интерферонов гомогенны по составу, и поэтому эффекты, получаемые от их комбинирования (смешивания), строго воспроизводимы и могут быть приписаны именно интерферонам, входящим в композицию.
Одним из факторов, ограничивающих широкое применение препаратов интерферона в ветеринарии, является наличие у них побочных эффектов, зависящих от величины дозы и продолжительности терапии.
Известно, что интерфероны бета и гамма являются видоспецифичными. Однако интерфероны альфа, омега и тау обнаруживают противовирусную активность на гетерологичных животных клетках (M.Kubes, N.Fuchsberger, R.V.H.Pollock (1994) J. Interferon Res. 14, 57-59; L.Liu et al. (1996) Biochim. Biophys. Acta 1294, 55-62). Тем не менее, эффективность долговременной терапии экзогенными интерферонами у вирус-инфецированных животных проблематична, поскольку уже в течение нескольких недель у них нарабатываются нейтрализующие антитела, делающие дальнейшее лечение интерферонами невозможным (N.S.Zeidner et al. (1990) Antimicrob. Agents Chemother. 34(9), 1749-1756).
Описание композиций для лечения вирусных заболеваний животных, содержащих смеси рекомбинантных видоспецифичных интерферонов животных, в патентной базе данных отсутствует.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задачей изобретения является увеличение терапевтической эффективности рекомбинантных интерферонов и уменьшение на этой основе лечебных доз интерферонов.
7
Сущность изобретения состоит в том, что в способе усиления терапевтического эффекта интерферона животному вводят эндогенный рекомбинантный интерферон в количестве от 1 до 1×10 ME в день, где интерферон представляет собой смесь рекомбинантных интерферонов одного подвида альфа или омега или же смесь рекомбинантных интерферонов разных подвидов альфа и омега.
Вследствие усиления терапевтического эффекта интерферона лечебный эффект может быть достигнут с меньшим количеством каждого рекомбинантного интерферона, чем обычные лечебные дозы. Поэтому, используя настоящее изобретение, становится возможным снизить стоимость лечения и минимизировать потенциальные побочные эффекты, связанные с большими терапевтическими дозами рекомбинантного интерферона, и, тем не менее, достичь терапевтического эффекта.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Предлагаемая композиция для лечения вирусных заболеваний животных содержит:
- два подвида рекомбинантного интерферона альфа, или же
- два подвида рекомбинантного интерферона омега, или же
- два подвида рекомбинантных интерферонов альфа и омега, смешанных в равных молярных пропорциях.
В способе усиления терапевтического эффекта интерферона смесь рекомбинантных интерферонов может применяться в различных дозированных лекарственных формах, включая водные растворы и порошки. Фармацевтические ингредиенты, которые могут быть использованы в составе лекарственных форм, могут включать буферы, соли и стабилизаторы.
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры демонстрируют изобретение.
Пример 1. Введение смеси рекомбинантных интерферонов альфа усиливает их антивирусный эффект на клеточных линиях кошки (Fells catus).
2
Антивирусный эффект смеси интерферонов оценивали по ингибированию цитопатологического эффекта следующих вирусов: вируса везикулярного стоматита, вируса калицивироза кошек, вируса инфекционного перитонита кошек и герпес вируса кошек на клеточных линиях кошки CRFK и FCWF-4 (Armstrong, Methods in Enzymol., v.78 (PtA), pp.381-387 (1981)). Испытуемые композиции приготавливали либо из порошкообразных лиофилизатов, либо из водных растворов интерферонов альфа №2 (GenBank: AAM78029) и №7 (GenBank: BAC75983), смешанных в различных молярных пропорциях 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1 и 1:1 в ацетатном буфере, содержащем соль NaCl и стабилизаторы декстран и сорбитол. Смесь интерферонов вносили в клеточную культуру, которую выдерживали в течение суток в CO-инкубаторе с 5% содержанием углекислоты, 95% влажности при 37,5°С. Среду декантировали, а клетки обрабатывали вирусом и инкубировали 72 часа до развития цитопатологического эффекта в тех же условиях, что и ранее. Способность смеси интерферонов ингибировать индуцированный вирусом цитопатологический эффект оценивали в терминах конечных титров интерферона. За конечный титр интерферона принимали величину, обратную к разбавлению, которая обеспечивала 50% защиту клеток в каждом из трех независимых опытов. Полученные данные свидетельствуют, что введение смеси интерферонов альфа значительно усиливало антивирусный эффект интерферона. Наибольший эффект клеточной защиты был достигнут при равном соотношении интерферонов альфа №2 и 7 в смеси. При этом действующая суммарная концентрация смеси интерферонов была в 1.45 раза меньше, чем в контроле, где каждый из подвидов интерферонов использовался в отдельности.
Пример 2. Введение смеси рекомбинантных интерферонов омега усиливает их антивирусный эффект на клеточных линиях кошки (Felis catus).
Антивирусный эффект смеси интерферонов оценивали так же, как описано в примере 1. Так же как и ранее, введение смеси интерферонов омега значительно усиливало антивирусный эффект интерферона. Наибольший эффект клеточной защиты был достигнут при равном соотношении интерферонов омега №1 (GenBank: ABD78704) и омега №2 (GenBank: ABD78705) в смеси. При этом действующая суммарная концентрация смеси интерферонов была в 1.6 раза меньше, чем в контроле, где каждый из подвидов интерферонов использовался в отдельности.
Пример 3. Введение смеси рекомбинантных интерферонов альфа и омега усиливает их антивирусный эффект на клеточных линиях кошки (Felis catus).
Антивирусный эффект смеси интерферонов оценивали так же, как описано в примере 1. Введение смеси интерферонов омега значительно усиливало антивирусный эффект интерферона. Наибольший эффект клеточной защиты был достигнут при равном соотношении интерферонов альфа №2 (GenBank: AAM78029) и омега №1 (GenBank: ABD78704) в смеси. При этом действующая концентрация смеси интерферонов была в 1.7 раза меньше, чем в контроле, где каждый из подвидов интерферонов использовался в отдельности.
Пример 4. Введение смеси рекомбинантных интерферонов альфа усиливает их антивирусный эффект на клеточных линиях собаки (Canisfamiliaris).
2
Антивирусный эффект смеси интерферонов оценивали по ингибированию цитопатологического эффекта вируса везикулярного стоматита и герпес вируса собаки на клеточных линиях собаки MDCK, A72 и Cf2Th (Armstrong, Methods in EnzymoL, v.78 (PtA), pp.381-387 (1981)). Испытуемые композиции приготавливали либо из порошкообразных лиофилизатов, либо из водных растворов интерферонов альфа №1 (NCBI: NP_001006655.1) и альфа №8 (NCBI: NP_001007131.1), смешанных в различных молярных пропорциях 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1 и 1:1 в ацетатном буфере, содержащем соль NaCl и стабилизаторы декстран и сорбитол. Смесь интерферонов вносили в клеточную культуру, которую выдерживали в течение суток в CO-инкубаторе с 5% содержанием углекислоты, 95% влажности при 37,5°С. Среду декантировали, а клетки обрабатывали вирусом и инкубировали 72 часа до развития цитопатологического эффекта в тех же условиях, что и ранее. Способность смеси интерферона альфа ингибировать индуцированный вирусом цитопатологический эффект оценивали в терминах конечных титров интерферона. За конечный титр интерферона принимали величину, обратную к разбавлению, которая обеспечивала 50% защиту клеток в каждом из трех независимых опытов. Полученные данные свидетельствуют, что введение смеси интерферонов альфа значительно усиливало антивирусный эффект интерферона. Наибольший эффект клеточной защиты был достигнут при равном соотношении интерферонов альфа №1 (NCBI: NP_001006655.1) и 8 (NCBI: NP_001007131.1) в смеси. При этом действующая суммарная концентрация смеси интерферонов была в 1.8 раза меньше, чем в контроле, где каждый из подвидов интерферонов использовался в отдельности.
Вышеприведенные сведения подтверждают возможность осуществления заявляемого способа с достижением технического результата.