СПОСОБ СТИМУЛИРОВАНИЯ ОБРАЗОВАНИЯ И РАЗВИТИЯ МИКРОКЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ В УСЛОВИЯХ IN VITRO
METHOD FOR STIMULATING FORMATION AND DEVELOPMENT OF POTATO MICROTUBERS IN VITRO

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии, а именно к получению микроклубней от размножаемых и культивируемых в условиях in vitro растений картофеля.
Микроклубни являются важнейшим современным технологическим этапом выращивания элитного семенного материала картофеля. Их получение возможно осуществить с помощью нескольких способов, одним из основных является получение микроклубней картофеля в условиях in vitro. Стерильная изолированная меристемная культура растительных тканей позволяет оздоровить их от латентной патогенной грибной и бактериальной микробиоты, длительное время культивировать и сохранять ценные генотипы, а также получать одномерные растения.
Основной задачей массового производства микроклубней картофеля является снижение экономических затрат при их получении и повышение коэффициента размножения растений.
Большинство отечественных практических исследований в области получения микроклубней картофеля в условиях in vitro посвящены оптимизации состава питательных сред (органических и минеральных компонентов питания, биологически активных веществ), а также особенностям осуществления основных биотехнологических приемов (черенкования микропобегов, их высадке на среду, дальнейшей пересадке, выбору сосудов для культивирования в стерильных условиях и др.) с целью уменьшение затрат труда и материальных ресурсов [1-3].
При этом не менее важной задачей является подбор оптимальных физических условий культивирования микрорастений - прежде всего, особенностей светового режима (уровень освещенности, спектральный состав света) и температуры воздуха, которые можно в определенных интервалах изменять и поддерживать для увеличения показателей роста, развития и продуктивности растений.
В связи с этим, не установлено прямого существующего прототипа предлагаемому способу стимулирования образования микроклубней картофеля в условиях in vitro. Наиболее близким способом служит изобретение RU 2715604 C1 (A01G 31/00, A01G 22/25, опубл. 03.02.2020), описывающее способ получения оздоровленных миниклубней картофеля, выращенных из меристемных растений, которое включает одновременное воздействие на растения картофеля потоком красно-оранжевого излучения в расширенном диапазоне 600-700 нм и синего излучения в диапазоне 420-450 нм. Техническим результатом изобретения RU 2715604 С1 является увеличение количества оздоровленных миниклубней картофеля [4]. Существенной отличительной особенностью данного изобретения является ограниченность применения способа, предлагаемого только для использования в аэрогидропонной установки. Согласно данному способу, меристемные растения картофеля в течение первых 28 дней выращивают в пробирках, высаживают их в адаптационный модуль аэрогидропонной установки для предварительного доращивания, а затем помещают в основной модуль. Воздействие на растения картофеля рекомендуемыми диапазонами излучения осуществляют только начиная с 44-го дня выращивания в основном модуле аэрогидропонной установки. В целом, отдельные учитываемые технологические особенности являются недостатком способа и ограничивают его эффективность, так как стимуляцию растений картофеля излучением указанного спектрального состава осуществляют только на этапе активного клубнеобразования, что не позволяет индуцировать зачатки клубеньков на более раннем этапе корнеобразования. Другим недостатком способа из изобретения RU 2715604 С1 является невозможность его использования в стерильной культуре in vitro для стимулирования роста, развития и продуктивности микрорастений.
2
Суть предлагаемого нами способа состоит в том, что микрочеренки картофеля высаживают на стандартную питательную среду Мурасиге-Скуга (MS) и сначала выдерживают в темноте при +4…+5°С в течение 5 суток для максимальной синхронизации митотических делений, а затем культивируют в течение 10 суток при +24…+25°С и воздействии искусственными источниками освещения (светодиодными лампами) с интенсивностью спектральных линий 70-310 мВт/м в диапазоне длин волн 640-670 нм при уровне освещенности 2400-2600 лк, после чего данный цикл повторяют еще дважды. Экспериментально было установлено, что это позволяет ускорить рост и развитие микрорастений картофеля в условиях in vitro, увеличить у них суммарную площадь листьев, число главных и придаточных корней и как результат - повысить количество и массу образующихся микроклубней.
Техническим результатом предлагаемого способа является увеличение продуктивности растений картофеля в условиях in vitro при образовании ими микроклубней. Технический результат достигается оптимизацией спектрального состава источников искусственного излучения при культивировании растений, а также чередованием трех циклов, состоящих из 5-дневной темновой фазы при действии низкой положительной температуры (+4…+5°С) и 10-девной световой фазы при температуре +24…+25°С и с соблюдением стандартного суточного фотопериода культуральных комнат «день/ночь» 16/8 ч.
Предлагаемый способ экономически выгоден за счет использования современных светодиодных источников искусственного освещения с высокой энергоэффективностью и длительным сроком службы, а также отсутствием необходимости их контроля оператором при условии использования автоматического режима регулировки параметров их работы.
Выбор оптимального спектрального состава источников искусственного излучения связан с биологическими особенностями растений. Рост и развитие растений обеспечиваются за счет первичных процессов ассимиляции пластических веществ в результате фотосинтеза и их дальнейшего расходования при протекании реакций обмена веществ.
а
а
а
Для выбора оптимального спектрального диапазона источников искусственного излучения следует учитывать особенности поглощения света различными фотосинтетическими пигментами растений, в первую очередь хлорофиллами  и b. Хлорофилл а является основным фотосинтетическим пигментом, хлорофилл b - вспомогательным, составляя около 30% от содержания хлорофилла  и увеличиваясь при адаптации к недостаточному уровню освещенности. Совместное функционирование хлорофиллов  и b позволяет растению увеличить спектральный диапазон поглощения и повысить эффективность фотосинтетических реакций. Нормальному функционированию хлорофиллов как главных пигментов фотосинтеза будет способствовать наличие у источника освещения синей (400-500 нм) и красной (620-680 нм) областей спектра.
В течение длительного времени наиболее распространенными типом источника искусственного освещения при культивировании растений in vitro являлись трубчатые люминесцентные лампы из-за их доступности и относительной энергоэффективности. В последнее десятилетие широкое распространение получили светодиодные источники освещения различной конструкции (модульные блок-светильники, трубчатые лампы, ленточные и др.), в том числе при оснащении ими стеллажей культуральных комнат, отделов первичной адаптации и доращивания микрорастений в нестерильных условиях.
Использование светодиодных светильников в качестве источников искусственного освещения растений является перспективным направлением из-за их сравнительно небольшой стоимости, технологичности, высокой энергоэффективности и наиболее продолжительному среди всех типов ламп сроку работоспособности.
Сравнение спектральных кривых различных источников искусственного освещения на фитостеллажах - люминесцентных и светодиодных ламп -показывает значительное различие их спектральных характеристик. Для всех типов и моделей ламп отмечен локальный максимум в синей области спектра - 436 нм у люминесцентных и 448 нм у светодиодных. У светодиодных ламп холодного белого света и всех люминесцентных ламп общего назначения (вне зависимости от цветовой температуры) отсутствует локальный максимум в красном диапазоне спектра и интенсивность излучения в данной области минимальна, при этом у них отмечено наличие локального максимума в зеленом диапазоне излучения - 548 нм у люминесцентных и 573 нм у светодиодных.
Ни одна из различных типов и моделей ламп, используемых для освещения растений, не идентична естественному солнечному спектру. Спектр солнечного излучения видимого диапазона характеризуется сравнительно выровненной интенсивностью излучения всех основных диапазонов длин волн, а множество их локальных максимумов незначительно отличаются по величине интенсивности от соседних.
Для повышения эффективности фотосинтеза при полном искусственном освещении или частичной досветке растений в последнее десятилетие были разработаны различные модели светодиодных фитоламп, характеризующихся наличием локальных максимумов в синем и красном диапазонах спектра излучения.
Наибольшую перспективу для использования в качестве источников искусственного освещения фитостеллажей с растениями in vitro представляют модули светодиодов с раздельными секциями белого, красного и синего цветов, что позволяет целенаправленно управлять их спектральными характеристиками. Независимое управление с помощью микроконтроллера каждой из отдельных секций светодиодов позволяет задавать и регулировать локальные максимумы спектральных кривых в различных вариантах освещения. Использование светодиодных модульных ламп X-bright FitoLED (или их технологических аналогов) способствует целенаправленному оперативному управлению спектральным составом излучения с возможностью программной независимой регулировки уровня интенсивности трех типов светодиодов (красных, синих и белых).
2
В предлагаемом способе культивирование микрорастений картофеля в условиях in vitro в период световой фазы осуществляют в течение 10 суток при +24…+25°С и воздействии искусственным светом с интенсивностью спектральных линий 70-310 мВт/м в диапазоне длин волн 640-670 нм при уровне освещенности 2400-2600 лк. При этом для нормального роста и развития растений соблюдают стандартный суточный фотопериод в культуральных комнатах «день/ночь» 16/8 ч. Все регулировки параметров светового режима осуществляются в автоматическом режиме.
Помимо спектрального состава источников излучения, не менее важными признаками являются световой и температурный режимы при культивировании растений.
Рост тканей и органов растений осуществляется благодаря митотическим делениям клеток меристематически активных зон побега и корня. Для повышения эффективности регуляторного действия света на растущие ткани растений необходимо увеличить интенсивность деления их клеток. Этого можно добиться с помощью управляемой синхронизации митотических делений. Действие ряда неблагоприятных физических факторов (низкого уровня освещенности, пониженных температур и др.), особенно при совместном сочетании, позволяет временно приостановить массовое деление растительных клеток на относительно продолжительный период [5]. К моменту возвращения благоприятных условий большинство меристематических клеток будут находиться в предсинтетическом периоде митотического цикла и на стадии профаз, а затем начнут практически синхронно делиться.
Данный эффект широко применяется при индукции экспериментального мутагенеза и полиплоидии у растений для увеличения образования измененных (мутантных) клеток. При культивировании растений в условиях in vitro холодовая и темновая предобработка эксплантов и микропобегов применяется гораздо реже, в основном для решения аналогичных задач при их дальнейшей обработке мутагенами или амитотиками в стерильной культуре.
Взаимное сочетание выбранных спектральных характеристик источников искусственного излучения и использование циклов меняющихся температурно-световых режимов культивирования в предлагаемом способе является инновационным приемом и позволяет ускорить рост и развитие микрорастений картофеля в условиях in vitro, увеличив у них суммарную площадь листьев, фотосинтетический потенциал, и как результат - повысить количество и массу образующихся микроклубней.
Примеры конкретного применения.
Пример 1.
В идентичных условиях in vitro культивировали микрорастения сортов картофеля Вектор и Скороплодный. В качестве источников освещения фитостеллажей были выбраны светодиодные модульные лампы X-bright FitoLED с возможностью программной независимой регулировки уровня интенсивности трех типов светодиодов (красных, синих и белых) для целенаправленного управления спектральным составом излучения.
Установлено, что дополнительное использование продолжительной темновой фазы в течение 5 суток при культивировании микрорастений картофеля в условиях in vitro на достоверном уровне повышает у них количество митотически делящихся клеток в меристематических зонах побега и корня. У сорта Вектор через 24 ч после окончания темновой фазы и размещения микрорастений под светодиодными лампами отмечено увеличение митотического индекса, определяемого по отношению количества делящихся клеток к общему количеству изученных клеток, в 2,5 раза, у сорта Скороплодный - в 1,6 раза (фиг. 1). В контроле растения освещались в аналогичном режиме, но без использования продолжительной темновой фазы.
Пример 2.
В идентичных условиях in vitro культивировали микрорастения сортов картофеля Вектор и Скороплодный. Для исключения влияния комплекса физических, химических и биологических факторов (температура воздуха, уровень освещенности, состав компонентов искусственной питательной среды, возраст материнских клубней и др.) на рост, развитие микрорастений картофеля в условиях in vitro и их дальнейшее микроклубнеобразование, все параметры культивирования в экспериментах были идентичными.
Микрочеренки картофеля были высажены на стандартную питательную среду Мурасиге-Скуга - MS [6].
Различие между вариантами состояло только в спектральном составе света и режиме искусственного освещения микрорастений картофеля в условиях in vitro.
В контроле (контроль 1 и 2) использовали люминесцентные лампы OSRAM L36W/765 Cool Daylight. В экспериментальных вариантах для оптимизации параметров искусственного освещения стеллажей были использованы светодиодные модули X-bright FitoLED (в количестве 6 шт.на одну полку) с различными режимами работы белого, красного и синего светодиодов и их взаимных сочетаний. В качестве регулируемого микроконтроллером параметра режима освещения каждого из модулей служил показатель интенсивности излучения соответствующего светодиода, выраженный в процентах от его максимального уровня. Во всех режимах освещенность растений составляла 2400-2600 люкс.
В контроле 2, отличающемся от основного контроля (контроль 1) трехкратным использованием продолжительной темновой фазы в течение 5 суток, увеличение суммарной площади листьев на их микропобегах составило 10% у сорта Вектор и 17% - у сорта Скороплодный. При использовании светодиодного освещения спектром с повышенной интенсивностью излучения в красной области отмечено увеличение суммарной площади листьев на микропобегах картофеля in vitro - у сорта Вектор на 29%, сорта Скороплодный на 33% в сравнении с основным контролем (контроль 1). При трехкратном чередовании продолжительной темновой фазы в течение 5 суток и дальнейшего светодиодного освещения микрорастений картофеля данным спектром суммарная площадь их листьев на побегах увеличилась у сорта Вектор на 48%, Скороплодный - на 63% (фиг. 3).
Аналогичный эффект увеличения количественных показателей отмечен для образующихся микроклубней на данных растениях.
У картофеля сорта Вектор освещение микрорастений в условиях in vitro спектром с повышенной интенсивностью излучения в красной области способствовало (вариант LED) увеличению массы микроклубней на 26% в сравнении с основным контролем (спектр без интенсивной красной области), а при трехкратном чередовании продолжительной темновой фазы в течение 5 суток и дальнейшего освещения данным спектром с повышенной интенсивностью излучения в красной области - увеличивается на 57%. Количество образующихся микроклубней в расчете на одно растение возрастает соответственно на 14% и 64% в сравнении с контролем 1. При этом в контроле 2 с трехкратным использованием продолжительной темновой фазы в течение 5 суток, увеличение массы микроклубней составило лишь 9% от уровня контроля 1, а их количества - 5% (фиг. 4).
У картофеля сорта Скороплодный в аналогичных вариантах (LED и LED с темновой фазой) в сравнении с контролем 1 масса микроклубней увеличивается соответственно на 21% и 40%, а их количество в расчете на одно растение возрастает на 23% и 44%. При этом в контроле 2 увеличение массы микроклубней составило только 5% от уровня контроля 1, а их количества - 4% (фиг. 5).
Таким образом, при практическом процессе микроклонального размножения картофеля и его дальнейшего микроклубнеобразования наиболее эффективен вариант с трехкратным чередованием продолжительной темновой фазы в течение 5 суток и дальнейшего светодиодного освещения спектром с повышенной интенсивностью излучения в красной области.
Для заявленного способа, в том виде, как он охарактеризован в изложенной формуле изобретения, нет препятствий его осуществления на практике с использованием современных технических средств. Таким образом, заявленное изобретение соответствует условию «промышленная применимость».
Предлагаемый способ позволяет существенно повысить количество и массу получаемых в условиях in vitro микроклубней картофеля.
Список использованной литературы
1. Анисимов Б.В., Смолеговец Д.В., Смолеговец В.М., Инновации в системе клонального микроразмножения картофеля // Картофель и овощи. - 2008. - №4. - С. 26-27.
2. Технологический процесс производства оригинального, элитного и репродукционного семенного картофеля. Практическое руководство / Общ. ред. A.M. Малько, Б.В. Анисимов; ФГБУ «Россельхозцентр», ФГБНУ ВНИИКХ. - М., 2017 - 64 с.
3. Современные технологии производства семенного картофеля. Практическое руководство / Анисимов Б.В., Симаков Е.А., Жевора С.В. и др.; под общ. ред. Б.В. Анисимова. - Чебоксары, 2018. - 48 с.
4. Патент РФ №2715604 на изобретение «Способ стимуляции миниклубней картофеля» / авторы: Романова М.С, Новиков О.О., Хаксар Е.В., Леонова Н.И., Кравец А.В. Зарегистрирован в госреестре полезных моделей РФ 02.03.2020. Заявка №2019117728 от 07.06.2019. Опубликовано: 02.03.2020. Бюл. №7. 2020. Патентообладатель: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий Российской академии наук (СФНЦА РАН).
5. Лаврский А.Ю. Влияние некоторых физических факторов на процессы митоза / А.Ю. Лаврский, И.А. Лебединский, Н.А. Четанов, А.Ф. Кузаев, О.А. Артамонова // Вестник Пермского государственного гуманитарно-педагогического университета. Серия №2. Физико-математические и естественные науки. - Пермь, 2013. - С. 38-44.
6. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - Vol. 15, №13. - P. 473-497.