СПОСОБЫ ВЫДЕЛЕНИЯ, КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ ПОПУЛЯЦИЙ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ДЛЯ АДОПТИВНОЙ ТЕРАПИИ

+
+
1. Способ обогащения CD4- или CD8-T-клеток, где способ включает:
+
+
(a) проведение в замкнутой системе первого отбора, где указанный первый отбор включает обогащение одного типа из (i) CD4-клеток и (ii) CD8-клеток из образца, содержащего первичные T-клетки человека, где обогащение, таким образом, позволяет получать первую популяцию отобранных клеток и популяцию неотобранных клеток; и
+
+
(b) проведение в замкнутой системе второго отбора, где указанный второй отбор включает обогащение другого типа из (i) CD4-клеток и (ii) CD8-клеток из популяции неотобранных клеток, где обогащение, таким образом, позволяет получать вторую популяцию отобранных клеток,
+
+
где способ позволяет получать обогащенную композицию, которая обогащена CD4-клетками и CD8-клетками и содержит клетки первой популяции отобранных клеток и клетки второй популяции отобранных клеток.
+
+
+
+
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий (c) комбинирование клеток первой популяции отобранных клеток и клеток второй популяции отобранных клеток, таким образом, получая обогащенную композицию, и/или где CD4- и CD8-клетки в обогащенной композиции находятся в инициирующем культуру соотношении CD4-клеток и CD8-клеток.
3. Способ по п. 2, где указанное комбинирование проводят в замкнутой системе.
4. Способ получения генетически сконструированных T-клеток, где способ включает:
+
+
(a) проведение в замкнутой системе первого отбора, где указанный первый отбор включает обогащение одного типа из (i) CD4-клеток и (ii) CD8-клеток из образца, содержащего первичные T-клетки человека, где обогащение, таким образом, позволяет получать первую популяцию отобранных клеток и популяцию неотобранных клеток; и
+
+
(b) проведение в замкнутой системе второго отбора, где указанный второй отбор включает обогащение другого типа из (i) CD4-клеток и (ii) CD8-клеток из популяции неотобранных клеток, где обогащение, таким образом, позволяет получать вторую популяцию отобранных клеток;
(c) инкубацию инициирующей культуру композиции, которая содержит клетки первой популяции отобранных клеток и клетки второй популяции отобранных клеток, в емкости для культивирования в стимулирующих условиях, получая, таким образом, стимулированные клетки; и
(d) введение в стимулированные клетки, полученные в (c), генетически сконструированного антигенного рецептора,
+
+
где способ, таким образом, позволяет получать результирующую композицию, содержащую CD4-T-клетки и CD8-T-клетки, экспрессирующие генетически сконструированный антигенный рецептор.
+
+
+
+
5. Способ по п. 4, дополнительно включающий перед этапом (c) комбинирование клеток первой и второй популяций выбранных клеток с получением инициирующей культуру композиции, и/или где CD4- и CD8-клетки в инициирующей культуру композиции присутствуют в инициирующем культуру соотношении CD4-клеток и CD8-клеток.
6. Способ по п. 5, где указанное комбинирование проводят в замкнутой системе.
7. Способ по любому из пп. 1-6, где один или несколько этапов проводят в автоматизированном режиме, и/или где замкнутая система является автоматизированной.
+
+
8. Способ по любому из пп. 2-7, где инициирующее культуру соотношение CD4- и CD8-клеток составляет от или приблизительно от 10:1 до или приблизительно до 1:10, от или приблизительно от 5:1 до или приблизительно до 1:5 или от или приблизительно от 2:1 до или приблизительно до 1:2.
+
+
9. Способ по любому из пп. 2-8, где инициирующее культуру соотношение CD4- и CD8-клеток составляет или приблизительно составляет 1:1.
10. Способ по любому из пп. 2-6, где образец получают у человека и:
+
+
+
+
инициирующее культуру соотношение CD4- и CD8-клеток отличается от соотношения CD4- и CD8-клеток в образце, полученном у индивидуума; и/или
+
+
+
+
инициирующее культуру соотношение CD4- и CD8-клеток является по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, или по меньшей мере на 50% большим или меньшим, чем соотношение CD4- и CD8-клеток в образце, полученном у индивидуума.
11. Способ по любому из пп. 1-10, где обогащение клеток в первом и/или втором отборах включает проведение положительного отбора или отрицательного отбора на основе экспрессии поверхностного клеточного маркера.
12. Способ по п. 11, где обогащение клеток в первом и/или втором отборах включает отрицательный отбор, который включает обеднение клеток, экспрессирующих не принадлежащий T-клеткам поверхностный маркер.
13. Способ по п. 12, где не принадлежащий T-клеткам маркер включает CD14.
+
+
14. Способ по любому из пп. 1-13, где обогащение клеток в первом или втором отборах включает проведение ряда этапов положительного или отрицательного отбора на основе экспрессии поверхностного клеточного маркера или маркеров с обогащением CD4- или CD8-клеток.
15. Способ по любому из пп. 1-14, где обогащение клеток в первом и/или втором отборах включает основанный на иммуноаффинности отбор.
+
+
16. Способ по п. 15, где основанный на иммуноаффинности отбор проводят посредством контакта клеток с антителом, способным к специфическому связыванию с поверхностным клеточным маркером и выделения клеток, связанных с антителом, таким образом, проводя положительный отбор, или выделение клеток, не связанных с антителом, таким образом, проводя отрицательный отбор, где выделенные клетки обогащены CD4-клетками или CD8-клетками и антитело иммобилизовано на магнитной частице.
17. Способ по любому из пп. 1-13, где первый отбор и второй отбор проводят в раздельных емкостях для разделения, которые функционально связаны.
18. Способ по п. 17, где емкости для разделения функционально связаны посредством трубок.
+
+
19. Способ по любому из пп. 15-18, где основанный на иммуноаффинности отбор проводят посредством контакта клеток с антителом, иммобилизованным на аффинном хроматографическом матриксе или связанным с ним, где указанное антитело способно к специфическому связыванию с поверхностным клеточным маркером, с проведением положительного или отрицательного отбора CD4- или CD8-клеток.
20. Способ по п. 19, где:
антитело дополнительно содержит одного или нескольких партнеров по связыванию, способных к формированию обратимой связи со связывающим реагентом, иммобилизованном на матриксе, в соответствии с чем антитело в течение указанного контакта обратимо связывается с указанным матриксом; и
клетки, экспрессирующие поверхностный клеточный маркер, специфически связанные антителом на указанном матриксе, можно выделять из матрикса посредством разрушения обратимого связывания между связывающим реагентом и партнером по связыванию.
21. Способ по п. 17, где:
партнер по связыванию выбран из числа биотина, аналога биотина и пептида, способного к связыванию со связывающим реагентом; и
связывающий реагент выбран из числа стрептавидина, аналога или мутеина стрептавидина, авидина и аналога или мутеина авидина;
партнер по связыванию содержит последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO:6; и/или
связывающий реагент представляет собой мутеин стрептавидина содержащий последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO: 12, 13, 15 или 16.
23. Способ по любому из пп. 19-21, дополнительно включающий после контакта клеток в образце с аффинным хроматографическим матриксом в первом отборе и/или втором отборе применение конкурирующего реагента для разрушения связи между партнером по связыванию и связывающим реагентом, таким образом, выделяя выбранные клетки из матрикса.
24. Способ по п. 23, где конкурирующий реагент представляет собой биотин или аналог биотина.
off
-5
-1
25. Способ по любому из пп. 20-24, где константа скорости диссоциации (k) антитела или антител в первом и/или втором отборах для связывания антитела и поверхностного клеточного маркера составляет более или приблизительно более 3×10 сек.
d
-3
-7
-7
-10
26. Способ по любому из пп. 20-25, где антитело или антитела в первом и/или втором отборах обладают аффинностью к поверхностному клеточному маркеру с константой диссоциации (K) в диапазоне приблизительно от 10 до 10 или в диапазоне приблизительно от 10 до приблизительно 10.
27. Способ по любому из пп. 20-26, где хроматографический матрикс в первом и/или втором отборах упакован в емкости для разделения, которая представляет собой колонку.
6
6
6
6
28. Способ по п. 19-27, где аффинный хроматографический матрикс адсорбирует и/или способен к отбору по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 50×10 клеток/мл, 100×10 клеток/мл, 200×10 клеток/мл или 400×10 клеток/мл.
29. Способ по любому из пп. 19-28, где первый и второй этапы отбора включают применение аффинного хроматографического матрикса, и относительные количества матрикса, применяемого на первом и втором этапах отбора, достаточны для достижения инициирующего культуру соотношения.
+
30. Способ по любому из пп. 1-29, где обогащение CD4-клеток включает положительный отбор на основе поверхностной экспрессии CD4.
+
31. Способ по любому из пп. 1-29, где обогащение CD8-клеток включает положительный отбор на основе поверхностной экспрессии CD8.
+
CM
32. Способ по любому из пп. 1-29, где один из первого и второго отборов, который включает обогащение CD8-клеток, дополнительно включает обогащение центральных T-клеток памяти (T); и/или обогащение клеток, экспрессирующих маркер, выбранных из числа CD28, CD62L, CCR7, CD127 и CD27.
33. Способ по любому из пп. 1-32, где:
+
+
первый отбор включает обогащение CD8-клеток, а второй отбор включает обогащение CD4-клеток; и
CM
первый отбор дополнительно включает обогащение центральных T-клеток памяти (T) и/или обогащение клеток, экспрессирующих маркер, выбранный из числа CD28, CD62L, CCR7, CD127 и CD27.
CM
34. Способ по п. 32, или 33, или 35, где обогащение центральных T-клеток памяти (T) и/или обогащение клеток, экспрессирующих маркер, включает:
+
отбор из первой и/или второй популяции выбранных клеток, которая обогащена CD8-клетками, клеток, экспрессирующих CD62L; и/или
+
отбор из первой и/или второй популяции выбранных клеток, которая обогащена CD8-клетками, клеток, экспрессирующих CD27; и/или
+
отбор из первой и/или второй популяции выбранных клеток, которая обогащена CD8-клетками, клеток, экспрессирующих CCR7; и/или
+
отбор из первой и/или второй популяции выбранных клеток, которая обогащена CD8-клетками, клеток, экспрессирующих CD28; и/или
+
отбор из первой и/или второй популяции выбранных клеток, которая обогащена CD8-клетками, клеток, экспрессирующих CD127.
35. Способ по любому из пп. 1-32, где:
+
+
первый отбор включает обогащение CD4-клеток, а второй отбор включает обогащение CD8-клеток; и
CM
второй отбор дополнительно включает обогащение центральных T-клеток памяти (T).
36. Способ по п. 35, где:
+
+
(i) первый отбор включает обогащение CD4-клеток посредством положительного отбора на основе поверхностной экспрессии CD4, получая, таким образом, первую отобранную популяцию, которая обогащена первичными CD4-T-клеткАми человека, и образец с неотобранными клетками;
+
CM
CM
(ii) второй отбор включает обогащение CD8-клеток и дополнительно включает обогащение второго выбранного образца центральными T-клетками памяти (T), где обогащение центральных T-клеток памяти (T) включает:
CM
отрицательный отбор для обеднения клеток, экспрессирующих поверхностный маркер, присутствующий на наивных T-клетках, и положительный отбор клеток, экспрессирующих поверхностный маркер, присутствующий на центральных T-клетках памяти (T) и не присутствующий в другой субпопуляции T-клеток памяти; или
CM
положительный отбор клеток, экспрессирующих поверхностный маркер, присутствующий на центральных T-клетках памяти и не присутствующий на наивных T-клетках, и положительный отбор клеток, экспрессирующих поверхностный маркер, присутствующий на центральных T-клетках памяти (T) и не присутствующий в другой субпопуляции T-клеток памяти;
+
CM
получая, таким образом, первичные CD8-T-клетки человека, обогащенные клетками T.
37. Способ по п. 36, где:
маркер, присутствующий на наивных T-клетках, включает CD45RA; и
CM
CM
обогащение центральных T-клеток памяти (T) включает отрицательный отбор с обеднением клеток, экспрессирующих CD45RA, и положительный отбор клеток, экспрессирующих поверхностный маркер, присутствующий на центральных T-клетках памяти (T) и не присутствующий в другой субпопуляции T-клеток памяти.
38. Способ по п. 37, где:
поверхностный маркер, присутствующий на центральных T-клетках памяти и не присутствующий на наивных T-клетках, включает CD45RO;
CM
CM
обогащение центральных T-клеток памяти (T) включает положительный отбор клеток, экспрессирующих CD45RO и положительный отбор клеток, экспрессирующих поверхностный маркер, присутствующий на центральных T-клетках памяти (T) и не присутствующий в другой субпопуляции T-клеток памяти.
CM
39. Способ по любому из пп. 36-38, где поверхностный маркер, присутствующий на центральных T-клетках памяти (T) и не присутствующий в другой субпопуляции T-клеток памяти, выбран из группы, состоящей из CD62L, CCR7, CD27, CD127 и CD44.
CM
40. Способ по п. 39, где поверхностный маркер, присутствующий на центральных T-клетках памяти (T) и не присутствующий в другой субпопуляции T-клеток памяти, представляет собой CD62L.
+
+
CM
N
41. Способ по любому из пп. 32-40, где популяция CD8-клеток в обогащенной композиции или инициирующей культуру композиции содержит по меньшей мере 50% центральных T-клеток памяти (T) или содержит менее 20% наивных T-клеток (T) или содержит по меньшей мере 80% CD62-клеток.
+
+
42. Способ обогащения CD4- и CD8-T-клеток, где способ включает приведение клеток образца, содержащего первичные T-клетки человека, в контакт с первым иммуноаффинным реагентом, который специфически связывается с CD4, и вторым иммуноаффинным реагентом, который специфически связывается с CD8, в инкубируемой композиции, в условиях, при которых иммуноаффинные реагенты специфически связываются с молекулами CD4 и CD8, соответственно, на поверхности клеток в образце; и
+
+
выделение клеток, связанных с первым и/или вторым иммуноаффинными реагентами, получая, таким образом, обогащенную композицию, содержащую CD4-клетки и CD8-клетки в инициирующем культуру соотношении, где:
+
+
+
+
первый и/или второй иммуноаффинные реагенты присутствуют в инкубируемой композиции в обеспечивающих субоптимальный выход концентрациях, в соответствии с чем обогащенная композиция содержит менее 70% от общего количества CD4-клеток в инкубируемой композиции и/или менее 70% CD8-клеток в инкубируемой композиции, таким образом, получая композицию, обогащенную CD4- и CD8-T-клетками.
43. Способ получения генетически сконструированных T-клеток, где способ включает:
(a) обогащение первичных T-клеток человека из образца, содержащего первичные T-клетки человека, включающее:
приведение клеток указанного образца в контакт с первым иммуноаффинным реагентом, который специфически связывается с CD4, и вторым иммуноаффинным реагентом, который специфически связывается с CD8, в инкубируемой композиции, в условиях, при которых иммуноаффинные реагенты специфически связываются с молекулами CD4 и CD8, соответственно, на поверхности клеток в образце; и
+
+
выделение клеток, связанных с первым и/или вторым иммуноаффинными реагентами, получая, таким образом, обогащенную композицию, содержащую CD4-клетки и CD8-клетки в инициирующем культуру соотношении, где:
+
+
первый и/или второй иммуноаффинные реагенты присутствуют в инкубируемой композиции в обеспечивающих субоптимальный выход концентрациях, в соответствии с чем обогащенная композиция содержит менее 70% от общего количества CD4-клеток в инкубируемой композиции и/или менее 70% CD8-клеток в инкубируемой композиции; и
(b) инкубация клеток обогащенной композиции в инициирующей культуру композиции в емкости для культивирования в стимулирующих условиях, получая, таким образом, стимулированные клетки, где клетки находятся или по существу находятся в инициирующем культуру соотношении; и
+
+
(c) введение в стимулированные клетки после (b) генетически сконструированного антигенного рецептора, получая, таким образом, результирующую композицию, содержащую CD4-T-клетки и CD8-T-клетки, экспрессирующие генетически сконструированный антигенный рецептор.
44. Способ по п. 42 или 43, где обогащение первичных T-клеток человека проводят в замкнутой системе.
+
+
45. Способ по любому из пп. 42-44, где первый и второй иммуноаффинные реагенты находятся в инкубируемой композиции в обеспечивающей субоптимальный выход концентрации, в соответствии с чем обогащенная композиция содержит менее 70% от общего количества CD4-клеток в инкубируемой композиции и менее 70% от общего количества CD8-клеток в инкубируемой композиции.
46. Способ по любому из пп. 42-45, где:
+
первый иммуноаффинный реагент находится в инкубируемой композиции в обеспечивающей субоптимальный выход концентрации, в соответствии с чем обогащенная композиция содержит менее 60%, менее 50%, менее 40%, менее 30% или менее 20% от общего количества CD4-клеток в инкубируемой композиции; и/или
+
второй иммуноаффинный реагент находится в инкубируемой композиции в обеспечивающей субоптимальный выход концентрации, в соответствии с чем обогащенная композиция содержит менее 60%, менее 50%, менее 40%, менее 30% или менее 20% от общего количества CD8-клеток в инкубируемой композиции.
9
+
47. Способ по любому из пп. 42-46, где образец содержит по меньшей мере 1×10 CD3-T-клеток.
+
+
+
+
48. Способ по любому из пп. 42-47, где концентрация одного из первого и второго иммуноаффинных реагентов в инкубируемой композиции является большей, чем другого, в соответствии с чем большая концентрация обуславливает более высокий выход в обогащенной композиции одного из типов CD4-клеток или CD8-клеток, соответственно, по сравнению с выходом другого типа CD4- или CD8-клеток, таким образом, обеспечивая в обогащенной композиции получение инициирующего культуру соотношения.
49. Способ по п. 48, где:
концентрация одного из первого и второго иммуноаффинных реагентов является более высокой, по сравнению с концентрацией другого из первого и второго иммуноаффинных реагентов, по меньшей мере в 1,2 раза, 1,4 раза, 1,6 раза, 1,8 раза, 2,0 раза, 3,0 раза, 4,0 раза, 5,0 раз, 6,0 раз, 7,0 раз, 8,0 раз, 9,0 раз или 10 раз; и/или
более высокий выход в обогащенной концентрации является более высоким в 1,2 раза, 1,4 раза, 1,6 раза, 1,8 раза, 2,0 раза, 3,0 раза, 4,0 раза, 5,0 раз, 6,0 раз, 7,0 раз, 8,0 раз, 9,0 раз или 10 раз.
+
+
50. Способ по любому из пп. 42-49, где инициирующее культуру соотношение CD4- и CD8-клеток составляет от или приблизительно от 10:1 до или приблизительно до 1:10, от или приблизительно от 5:1 до или приблизительно до 1:5 или составляет от или приблизительно от 2:1 до или приблизительно до 1:2.
+
+
51. Способ по любому из пп. 42-50, где инициирующее культуру соотношение CD4- и CD8-клеток составляет или приблизительно составляет 1:1.
52. Способ по любому из пп. 42-51, где:
+
+
+
+
инициирующее культуру соотношение CD4- и CD8-клеток отличается от соотношения CD4- и CD8-клеток в образце, полученном у индивидуума; и/или
+
+
+
+
инициирующее культуру соотношение CD4- и CD8-клеток по меньшей мере на 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 50% больше или меньше, чем соотношение CD4- и CD8-клеток в образце, полученном у индивидуума.
+
+
53. Способ по любому из пп. 42-52, где более 95% или более 98% клеток в инициирующей культуру композиции представляют собой CD4-клетки и CD8-клетки.
54. Способ по любому из пп. 42-53, где каждый из иммуноаффинных реагентов содержит антитело.
55. Способ по п. 54, где антитело иммобилизовано на внешней поверхности сферы.
56. Способ по п. 55, где сфера представляет собой магнитную гранулу.
57. Способ по п. 55 или 56, где:
антитело содержит одного или нескольких партнеров по связыванию, способных к формированию обратимой связи со связывающим реагентом, иммобилизованным на сфере, в соответствии с чем антитело обратимо иммобилизовано на указанной сфере; и
способ после контакта клеток в образце с первым и вторым иммуноаффинными реагентами дополнительно включает применение конкурирующего реагента для разрушения связи между партнером по связыванию и связывающим реагентом, таким образом, обеспечивая отделение выбранных клеток от сферы.
58. Способ по п. 57, где:
партнер по связыванию выбран из числа биотина, аналога биотина, или пептида, способного к связыванию со связывающим реагентом; и
связывающий реагент выбран из числа стрептавидина, аналога или мутеина стрептавидина, авидина, аналога или мутеина авидина.
59. Способ по п. 58, где:
партнер по связыванию содержит пептид, содержащий последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO:6 и/или
связывающий реагент представляет собой мутеин стрептавидина, содержащий последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO: 12, 13, 15 или 16.
связывающий реагент представляет собой мультимер, содержащий один или несколько мономеров стрептавидина или мутеина стрептавидина; и
60. Способ по п. 58 или 59, где:
связывающий реагент представляет собой мультимер, содержащий один или несколько мономеров стрептавидина или мутеина стрептавидина; и
партнер по связыванию представляет собой пептид, содержащий в последовательном расположении по меньшей мере два модуля, где каждый способен к обратимому связыванию по меньшей мере с одним мономером связывающего реагента.
61. Способ по п. 60, где партнер по связыванию содержит последовательность аминокислот, приведенную в любой из SEQ ID NO: 7-10.
62. Способ по любому из пп. 57-61, где конкурирующий реагент представляет собой биотин или аналог биотина.
off
-5
-1
63. Способ по любому из пп. 42-63, где константа скорости диссоциации (k) антитела или антител в первом и/или втором отборах для связывания между антителом и поверхностным клеточным маркер составляет более или приблизительно более 3×10 сек.
d
-3
-7
-7
-10
64. Способ по любому из пп. 42-63, где антитело или антитела в первом и/или втором отборах обладают аффинностью с константой диссоциации (K) в диапазоне приблизительно от 10 до 10 или с константой диссоциации в диапазоне приблизительно от 10 до приблизительно 10.
65. Способ по любому из пп. 42-63, где один или несколько этапов проводят в автоматизированном режиме, и/или где замкнутая система является автоматизированной.
66. Способ по любому из пп. 2, 3 и 5-41, включающий:
+
+
определение до проведения первого отбора и/или второго отбора соотношения CD4- и CD8-T-клеток в образце; и
+
+
+
+
корректировки на основе соотношение CD4- и CD8-T-клеток в образце первого и/или второго отборов с получением композиции, содержащей CD4-клетки и CD8-клетки в инициирующем культуру соотношении.
67. Способ по п. 66, где:
первый и/или второй отборы включает основанный на иммуноаффинности отбор, включающий аффинный хроматографический матрикс; и
корректировка первого и/или второго отборов включает выбор количества аффинного хроматографического матрикса в первом и/или втором отборах, достаточного для получения инициирующего культуру соотношения.
68. Способ по любому из пп. 42-65, включающий:
+
+
определение до приведения клеток образца в контакт с первым и вторым иммуноаффинным реагентом соотношения CD4- и CD8-T-клеток в образце; и
+
+
+
+
выбор на основе соотношения CD4- и CD8-T-клеток в образце концентрации первого и/или второго иммуноаффинных реагентов с получением обогащенной композиции, содержащей CD4-клетки и CD8-клетки в инициирующем культуру соотношении.
+
+
69. Способ по любому из пп. 1-68, где способ приводит к результирующей композиции, содержащей соотношение CD4- и CD8-клеток, которое составляет от или приблизительно от 2:1 до или приблизительно до 1:5.
+
+
70. Способ по п. 69, где соотношение CD4- и CD8-клеток в результирующей композиции составляет 1:1 или приблизительно составляет 1:1.
71. Способ по любому из пп. 1-70, где образец получают у индивидуума.
72. Способ по п. 71, где индивидуум представляет собой индивидуума, которому вводят указанные подвергнутые генетической инженерии T-клетки или клетки для адоптивной клеточной терапии.
73. Способ по п. 72, где индивидуум представляет собой индивидуума, отличного от индивидуума, которому вводят указанные подвергнутые генетической инженерии T-клетки или клетки для адоптивной терапии.
74. Способ по любому из пп. 1-73, где образец представляет собой кровь или получаемый из крови образец.
75. Способ по любому из пп. 1-74, где образец представляет собой образец лейкоцитов.
76. Способ по любому из пп. 1-75, где образец представляет собой образец после афереза, образец мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) или образец после лейкафереза.
77. Способ по любому из пп. 4-41 или 43-76, где инкубацию композиция в емкости для культивирования в стимулирующих условиях проводят до, в течение и/или после введения генетически сконструированного антигенного рецептора.
78. Способ по любому из пп. 4-41 или 43-76, где инкубацию композиция в емкости для культивирования в стимулирующих условиях проводят до, в течение и после введения генетически сконструированного антигенного рецептора.
79. Способ по любому из пп. 4-41 или 43-78, где стимулирующие условия включают условия, в которых пролиферируют T-клетки композиции.
80. Способ по любому из пп. 4-41 или 43-79, где стимулирующие условия включают средство, способное к активации одного или нескольких доменов внутриклеточной сигнализации одного или нескольких компонентов комплекса TCR.
81. Способ по п. 80, где один или несколько компонентов комплекса TCR содержат дзета-цепь CD3.
82. Способ по любому из пп. 4-41 или 43-81, где стимулирующие условия включают присутствие антитела к CD3 и антитела к CD28, антитела к 4-1BB и/или цитокина.
83. Способ по п. 82, где антитело к CD3 и/или антитело к CD28 находятся на поверхности твердой подложки.
84. Способ по п. 83, где цитокин включает IL-2, IL-15, IL-7 и/или IL-21.
85. Способ по любому из пп. 4-41 или 43-84, где генетически сконструированный антигенный рецептор включает T-клеточный рецептор (TCR) или функциональный не являющийся TCR антигенный рецептор.
86. Способ по п. 85, где рецептор специфически связывается с антигеном, экспрессируемым клетками подлежащего лечению заболевания или патологического состояния.
87. Способ по любому из пп. 85 или 86, где антигенный рецептор представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR).
88. Способ по п. 87, где CAR содержит внеклеточный антигенраспознающий домен и домен внутриклеточной сигнализации, содержащий содержащую ITAM последовательность и домен внутриклеточной сигнализации T-клеточной костимулирующей молекулы.
89. Способ лечения, где указанный способ включает:
+
+
(a) получение результирующей композиции, содержащей CD4-T-клетки и CD8-T-клетки, полученных способом по любому из пп. 1-88; и
(b) введение клеток результирующей композиции индивидууму.
90. Способ по п. 89, где образец, из которого выделяют клетки, получают у индивидуума которому вводят клетки.
91. Композиция клеток, получаемых способом по любому из пп. 1-88.
92. Композиция по п. 91, содержащая фармацевтически приемлемый носитель.
93. Способ лечения, где указанный способ включает введение индивидууму композиции клеток по п. 91 или 92.
94. Способ по п. 93, где генетически сконструированный антигенный рецептор специфически связывается с антигеном, ассоциированным с заболеванием или патологическим состоянием.
95. Способ лечения по п. 94, где заболевание или патологическое состояние представляет собой злокачественную опухоль.
96. Композиция по п. 91 или 92 для применения при лечении заболевания или патологического состояния у индивидуума.
97. Применение композиции по п. 91 или 92 для получения лекарственного средства для лечения заболевания или нарушения у индивидуума.
98. Композиция по п. 96 или применение по п. 97, где генетически сконструированный антигенный рецептор специфически связывается с антигеном, ассоциированным с заболеванием или патологическим состоянием.
99. Композиция или применение по любому из пп. 96-98, где заболевание или патологическое состояние представляет собой злокачественную опухоль.
100. Замкнутая аппаратная система для очистки клеток-мишеней, содержащая:
a) первый аффинный хроматографический матрикс, содержащий иммобилизованное в нем первое связывающее средство, где это связывающее средство специфически связывается с первым поверхностным клеточным маркером, присутствующим на первом типе клеток; где указанный первый аффинный матрикс не содержит второго связывающего средства, которое специфически связывается со вторым поверхностным клеточным маркером, где:
первый аффинный хроматографический матрикс функционально связан с резервуаром для хранения, содержащим образец клеток, посредством первого функционального соединения, где указанное первое функциональное соединение может обеспечивать прохождение клеток из резервуара для хранения к первому аффинному хроматографическому матриксу; и
первый аффинный хроматографический матрикс функционально связан с выходной емкостью посредством второго функционального соединения;
b) второй аффинный хроматографический матрикс, содержащий иммобилизованное в нем второе связывающее средство, где это второе связывающее средство специфически связывается со вторым поверхностным клеточным маркером, присутствующим на втором типе клеток, где:
первый аффинный хроматографический матрикс посредством третьего функционального соединения функционально связан со вторым аффинным хроматографическим матриксом, где указанное третье функциональное соединение может обеспечивать прохождение клеток, прошедших через первый аффинный хроматографический матрикс и не связавшихся с первым связывающим средством, со вторым аффинным хроматографическим матриксом;
второй аффинный хроматографический матрикс посредством четвертого функционального соединения функционально связан с выходной емкостью, где четвертое функциональное соединение может обеспечивать прохождение клеток, связавшихся и элюируемых из первого и/или второго аффинных хроматографических матриксов; и
второй аффинный хроматографический матрикс посредством пятого функционального соединения функционально связан с емкостью для отходов, где пятое функциональное соединение может обеспечивать прохождение клеток, прошедших через первый аффинный хроматографический матрикс и не связавшихся с первым связывающим средством и прошедших через второй аффинный хроматографический матрикс и не связавшихся со вторым связывающим средством;
c) выходную емкость; и
d) емкость для отходов,
где система сконфигурирована для осуществления в замкнутой системе сбора в выходной емкости, в одной композиции, (i) клеток, связавшихся и выделенных из первого аффинного хроматографического матрикса, и (ii) клеток, прошедших и не связавшихся с первым аффинным хроматографическим матриксом и связавшихся и выделенных из второго аффинного хроматографического матрикса.
101. Замкнутое устройство по п. 100, где одно или несколько из указанных функциональных соединений включают трубки, соединяющие резервуар для хранения, первый аффинный хроматографический матрикс, второй аффинный хроматографический матрикс и/или емкость для культивирования.
102. Замкнутое устройство по п. 101, где трубки соединены с задвижкой, клапаном или зажимом.
103. Замкнутая аппаратная система по любому из пп. 100-102, где:
+
+
(a) первый аффинный хроматографический матрикс представляет собой один из аффинного к CD4-клеткам хроматографического матрикса или аффинного к CD8-клеткам хроматографического матрикса; и
+
+
(b) второй аффинный хроматографический матрикс представляет собой другой из аффинного к CD4-клеткам хроматографического матрикса или аффинного к CD8-клеткам хроматографического матрикса.
104. Замкнутая аппаратная система по любому из пп. 100-103, дополнительно содержащая:
d) третий аффинный хроматографический матрикс, содержащий иммобилизованное в нем третье связывающее средство, где это связывающее средство специфически связывается с третьим поверхностным клеточным маркером, в соответствии с чем третье связывающее средство способно к связыванию клеток, экспрессирующих третий поверхностный клеточный маркер, где:
третье функциональное соединение дополнительно функционально связывает третий аффинный хроматографический матрикс с первым матриксом:
третий аффинный хроматографический матрикс посредством шестого функционального соединения функционально связан с выходным контейнером так, что шестое функциональное соединение может обеспечивать прохождение клеток, связавшихся и выделенных из первого матрикса и связавшихся и выделенных из третьего матрикса, в выходной контейнер; и
пятое функциональное соединение дополнительно функционально связывает третий аффинный хроматографический матрикс с контейнером для отходов так, что пятое функциональное соединение может обеспечивать прохождение клеток, прошедших и не связавшихся с третьей колонкой, в контейнер для отходов.
105. Замкнутая аппаратная система по любому из пп. 100-103, дополнительно содержащая:
d) третий аффинный хроматографический матрикс, содержащий иммобилизованное в нем третье связывающее средство, где это связывающее средство специфически связывается с третьим поверхностным клеточным маркером, вследствие чего третий аффинный хроматографический матрикс способен к связыванию клеток, экспрессирующих третий поверхностный клеточный маркер, где
второе функциональное соединение дополнительно функционально связывает третий аффинный хроматографический матрикс с первым матриксом и с выходным контейнером так, что второе функциональное соединение может обеспечивать прохождение клеток, связавшихся и выделенных из первого матрикса и связавшихся и выделенных из третьего матрикса, в выходной контейнер.
106. Замкнутая аппаратная система по п. 104 или 105, где:
первый аффинный хроматографический матрикс содержит, связывающее средство, которое специфически связывается с CD8;
втор аффинный хроматографический матрикс содержит, связывающее средство, которое специфически связывается с CD4; и
CM
третий аффинный хроматографический матрикс содержит связывающее средство, которое специфически связывается с маркером, экспрессированном на центральных T-клетках памяти (T).
107. Замкнутая аппаратная система по п. 106, где связывающее средство третьего аффинного хроматографического матрикса селективно связывается с поверхностным клеточным маркером, выбранным из числа CD62L, CD45RA, CD45RO, CCR7, CD27, CD127 и CD44.
108. Замкнутая аппаратная система по любому из пп. 100-107, где один или несколько или все аффинные хроматографические матриксы дополнительно функционально связаны с резервуаром для элюирующего буфера, содержащим один или несколько конкурирующих реагентов.
109. Замкнутая аппаратная система по любому из пп. 100-107, где конкурирующий реагент представляет собой один или несколько из группы, состоящей из биотина, аналога биотина и пептида, способного к связыванию с хроматографическим матриксом.
110. Замкнутая аппаратная система по любому из пп. 100-107, где один или несколько или все из третьего, четвертого или шестого функциональных соединений дополнительно содержат камеру для удаления конкурирующего средства.
111. Замкнутая аппаратная система по п. 110, где камера для удаления конкурирующего средства дополнительно содержит связывающий реагент.
112. Замкнутая аппаратная система по п. 111, где связывающий реагент включает один или несколько из группы, состоящей из стрептавидина, аналога или мутеина стрептавидина, авидина и аналог или мутеина авидина.
113. Замкнутая аппаратная система по любому из пп. 100-112, где один или несколько или все связывающие средства представляют собой антитело.
114. Замкнутая аппаратная система по п. 113, где антитело представляет собой Fab.
115. Замкнутая аппаратная система по любому из пп. 100-113, где один или несколько или все связывающие средства обратимо связываются с аффинным хроматографическим матриксом.
116. Способ по любому из пп. 17-41 или 54-88, где антитело представляет собой Fab.