СПОСОБ ОКРАСКИ МАЗКОВ КРОВИ ДЛЯ МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ И ФАЗ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК
METHOD OF STAINING BLOOD SMEARS FOR MICROSCOPIC DETERMINATION OF STRUCTURAL ORGANISATION OF CELL PHASE ACTIVITY

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к ветеринарии и медицине, в частности к способу окраски мазков крови для микроскопического определения структурной организации и фаз активности клеток, и может быть использовано в цитофизиологии, цитопатологии и цитогенетике, а также рекомендовано к применению при проведении гематологических исследований при определении функционального состояния клеток крови.
Уровень техники
Известен способ окраски мазков крови, который заключается в том, что для приготовления мазков крови их фиксируют раствором Никифорова, окрашивание проводят двумя красителями, в качестве которых берут гематоксилин Эрлиха и эозин-натрий, сначала мазки помещают в выдержанный в герметичной емкости в течение 360 дней раствор гематоксилина Эрлиха на 2-3 мин, после чего погружают их в емкость с водопроводной водой на 1-2 мин до посинения мазков, затем мазки высушивают фильтровальной бумагой и помещают в 1%-ный водный раствор эозина-натрия на 1-2 мин, промывают окрашенные мазки дистиллированной водой в течение 8-10 с и высушивают на воздухе (Патент RU №2304776 «Способ окраски мазков крови» / В.И. Трухачев, В.В. Родин, В.В. Михайленко, А.А. Дергунов / МПК G01N 33/48, G01N 1/30 опубл. 20.08.2007).
Недостатками данного способа являются:
- отсутствие возможности выявления зон ядрышковых организаторов в связи с неспецифичностью красителя;
- более высокая трудоемкость и экономическая затратность способа.
Известен способ окраски мазков крови, заключающийся в том, что мазки фиксируют и окрашивают опусканием их по 4-5 раз в течение одной секунды в растворы анионового красителя - 0,5%-ного раствора эозина, а затем в катионовые красители - 0,5%-ный раствор азура и отдельно в 0,5%-ный раствор метиленового синего. Способ позволяет ускорить окраску мазков и повысить качество мазков для микроскопического исследования (Патент RU №2081404, «Способ окраски мазков крови» / С.А. Позов, И.И. Коломысов / МПК, G01N 1/30, G01N 1/28, опубл. 10.06.1997).
Недостатком данного способа является:
- отсутствие возможности выявления зон ядрышковых организаторов, что не позволяет судить о функциональной активности клеток.
Известен способ окраски мазков крови, заключающийся в том, что мазки крови термически фиксируют при 160-180°С, окрашивают 0,25%-ным водным раствором эозина в течение 110-130 с, споласкивают водой, а затем окрашивают 0,2%-ным водным раствором диазагемицианинового бензтиазолового 50-70 с (Патент RU №2044295 «Способ окраски мазков крови» / В.В. Роговин, С.И. Цикалов, И.Г. Хан, С.П. Титова // МПК G01N 1/30 опубл. 20.09.1995).
Недостатком данного способа является отсутствие возможности выявления зон ядрышковых организаторов в связи с неснецифичностью красителя.
3
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятый авторами за прототип является способ окраски препаратов по методике Хоуэлла и Блэка с небольшими модификациями, направленный на выявление зон ядрышковых организаторов. Клетки фиксируют холодной смесью метанола и ледяной уксусной кислоты (3:1) в течение 30 мин. Далее клетки отмывают последовательно (по 3 смены): 50%-ным, 30%-ным этанолом, проточной, дистиллированной водой, высушивают на воздухе. Для окрашивания препаратов готовят два раствора: первый включает 2% желатины и 1% (w/w) муравьиной кислоты на бидистиллированной воде; второй - 50% AgNO на бидистиллированной воде. На чистое предметное стекло наносят одну каплю раствора желатины и две капли раствора нитрата серебра. На каплю помещают покровное стекло клетками вниз. Окрашивание проводят во влажной камере, в термостате при 60°С. Время окраски варьирует от 4 до 11 мин. Контроль за интенсивностью окрашивания проводится визуально, с помощью оптического микроскопа МБИ-3 (объектив ×10, окуляр ×10). Окрашенные стекла промывают дистиллированной водой до тех пор, пока вода не становится прозрачной. Затем, для того чтобы избежать обесцвечивания препаратов с течением времени, стекла с клетками помещают на 30 с в 5%-ный раствор гипосульфита натрия, затем стекла промывают водой, обезвоживают в спиртах и заключают в канадский бальзам (см. способ окраски препаратов по методике Хоуэлла и Блэка, Howell M., Black D.A. 1980. Controlled silverstaining of nucleolus organiser regions with a protective colloidal developer. A 1-step method. Experientia. V.36, P.1014-1015).
Данный способ окраски имеет следующие недостатки:
- более высокая трудоемкость операций при окрашивании;
- имеет более длительный процесс окраски;
- отсутствует возможность морфологической идентификации клеток.
Раскрытие изобретения
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа окраски мазков крови для микроскопического определения структурной организации и фаз активности клеток, обладающего сокращением времени получения больших и малых партий качественно окрашенных мазков крови, в которых возможно изучение зон ядрышковых организаторов для определения функциональной активности клеток крови (см. табл.1-4).
Технический результат, который может быть достигнут с помощью предлагаемого изобретения, сводится к сокращению времени и повышению качества окрашивания мазков, с возможностью выявления и последующей оценки параметров зон ядрышковых организаторов.
2
3
Технический результат достигается с помощью способа окраски мазков крови для микроскопического определения структурной организации и фаз активности клеток, включающего приготовление мазка из периферической крови с предварительной фиксацией метиловым спиртом, высушивание, промывание дистиллированной водой, с последующим помещением в раствор KCl в соотношении 0,57 г KCl на 100 мл дистиллированной HO в течение 20 мин, и промывание дистиллированной водой, при этом дополнительно готовят смесь растворов, приготовленных ex tempore, содержащую раствор «А», включающий 50% раствора азотнокислого серебра, в количестве 5 г AgNO + 5 мл дистиллированной воды, и раствор «В», включающий 2% раствора желатины на 1% растворе муравьиной кислоты в количестве: 15,8 мл дистиллированной воды + 0,2 мл 100% муравьиной кислоты + 4,0 мл 10% желатины, затем смешивают растворы «А» и «В» в количестве по 5 мл каждый, в темноте, и в полученную смесь погружают мазки крови на 20 мин, в темноте, в термостате, при температуре 37°С, с последующим погружением мазков на 2-3 с в дистиллированную воду, затем выдерживают дважды по 8 мин в 5% растворе тиосульфата Na, в темноте, в термостате, при температуре 37°С, промывают последовательно водопроводной водой и дистиллированной водой, проводят доокраску в краске Романовского в течение 30 мин, вновь промывают водопроводной водой, высушивают мазки на воздухе, заключают в канадский бальзам и покрывают покровным стеклом.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет при проведении гематологических исследований в медицине и ветеринарии проводить экспресс-анализ изменения структуры и фаз функциональной активности клеток крови, давать заключения об интенсивности и стабильности физиологических процессов, выявлять признаки, определяющие прогноз заболевания.
2
3
Сущность способа окраски мазков крови для микроскопического определения структурной организации и фаз активности клеток заключается в следующем. Приготовленные мазки из периферической крови предварительно фиксируют метиловым спиртом, высушивают под вытяжкой и промывают дистиллированной водой. Помещают в раствор KCl (0,57 г KCl на 100 мл дистиллированной НО) на 20 мин. Затем промывают дистиллированной водой. Помещают в смесь растворов, приготовленных ех tempore. Раствор «А» - 50% раствор азотнокислого серебра (5 г AgNO + 5 мл дистиллированной воды). Раствор «В» - 2% раствор желатины для лабораторных работ на 1% растворе муравьиной кислоты (15,8 мл дистиллированной воды + 0,2 мл 100% муравьиной кислоты + 4,0 мл 10% желатины для лабораторных работ). Смешивают раствор «А» (5 мл) и «В» (5 мл) в темноте, и в полученную смесь погружают мазки крови на 20 мин, в темноте, в термостате, при температуре 37°С. После этого мазки погружают на 2-3 с в дистиллированную воду, потом выдерживают дважды по 8 мин в 5% растворе тиосульфата Na, в темноте, в термостате, при температуре 37°С. Промывают водопроводной водой, затем дистиллированной водой. Проводят доокраску краской Романовского в течение 30 мин. Промывают водопроводной водой и высушивают мазки на воздухе. Затем заключают мазки в канадский бальзам и покрывают покровным стеклом. Проводят микроскопию мазков с целью определения и оценки параметров зон ядрышковых организаторов.
Краткое описание чертежей и иных материалов
В таблице 1 дан способ окраски мазков крови для микроскопического определения структурной организации и фаз активности клеток, количество ОЯОР в ядрах эритроцитов у гусей разных возрастов, шт.
В таблице 2 - то же, площадь ОЯОР в ядрах эритроцитов гусей разных возрастов, мкм кв.
В таблице 3 - то же, количество ОЯОР в ядрах эритроцитов у уток разных возрастов, шт.
В таблице 4 - то же, площадь ОЯОР в ядрах эритроцитов уток разных возрастов, мкм  кв.
Осуществление изобретения
Примеры конкретного осуществления способа окраски мазков крови для микроскопического определения структурной организации и фаз активности клеток
2
3
Пример 1. С целью окрашивания взята партия в размере 30 мазков. Окраску осуществляют следующим образом. Приготовленные мазки из периферической крови предварительно фиксируют метиловым спиртом, высушивают под вытяжкой и промывают дистиллированной водой. Помещают в раствор KCl (0,57 г KCl на 100 мл дистиллированной НО) на 20 мин. Затем промывают дистиллированной водой. Помещают в смесь растворов, приготовленных ex tempore. Раствор «А» - 50% раствор азотнокислого серебра (5 г AgNO + 5 мл дистиллированной воды). Раствор «В» - 2% раствор желатины для лабораторных работ на 1% растворе муравьиной кислоты (15,8 мл дистиллированной воды + 0,2 мл 100% муравьиной кислоты + 4,0 мл 10% желатины для лабораторных работ). Смешивают раствор «А» (5 мл) и «В» (5 мл) в темноте, и в полученную смесь погружают мазки крови на 15 мин, в темноте, в термостате, при температуре 30°С. После этого мазки погружают на 2-3 с в дистиллированную воду, потом выдерживают дважды по 5 мин в 5% растворе тиосульфата Na, в темноте, в термостате, при температуре 37°С. Промывают водопроводной водой, затем дистиллированной водой. Высушивают мазки на воздухе. Затем заключают мазки в канадский бальзам и покрывают покровным стеклом. Проводят микроскопию мазков с целью определения и оценки параметров зон ядрышковых организаторов.
При анализе полученных данных отмечено следующее:
- зоны ядрышковых организаторов слабо визуализируются, а также были нечеткими;
- определение параметров зон ядрышковых организаторов было затрудненно;
- со временем качество мазка ухудшилось, что ухудшило визуализацию зон.
2
3
Пример 2. С целью окрашивания взята партия в размере 30 мазков. Окраску осуществляют следующим образом. Приготовленные мазки из периферической крови предварительно фиксируют метиловым спиртом, высушивают под вытяжкой и промывают дистиллированной водой. Помещают в раствор KCl (0,57 г KCl на 100 мл дистиллированной НО) на 20 мин. Затем промывают дистиллированной водой. Помещают в смесь растворов, приготовленных ex tempore. Раствор «А» - 50% раствор азотнокислого серебра (5 г AgNO + 5 мл дистиллированной воды). Раствор «В» - 2% раствор желатины для лабораторных работ на 1% растворе муравьиной кислоты (15,8 мл дистиллированной воды + 0,2 мл 100% муравьиной кислоты + 4,0 мл 10% желатины для лабораторных работ). Смешивают раствор «А» (5 мл) и «В» (5 мл) в темноте, и в полученную смесь погружают мазки крови на 20 мин, в темноте, в термостате, при температуре 37°С. После этого мазки погружают на 2-3 с в дистиллированную воду, потом выдерживают дважды по 8 мин в 5% растворе тиосульфата Na, в темноте, в термостате, при температуре 37°С. Промывают водопроводной водой, затем дистиллированной водой. Высушивают мазки на воздухе. Затем заключают в канадский бальзам и покрывают покровным стеклом. Проводят микроскопию мазков с целью определения и оценки параметров зон ядрышковых организаторов, при этом в таблицах 1-4 представлены примеры определения ОЯОР в ядрах эритроцитов у гусей разных возрастов, шт.; площадь ОЯОР в ядрах эритроцитов гусей разных возрастов, мкм кв.; количество ОЯОР в ядрах эритроцитов у уток разных возрастов, шт.; площадь ОЯОР в ядрах эритроцитов уток разных возрастов, мкм кв.
При анализе полученных данных отмечено следующее:
- зоны ядрышковых организаторов визуализирутся четко;
- определение параметров зон ядрышковых организаторов доступно в световом микроскопе;
- время хранения мазков не влияло на качество визуализации зон.
2
3
Пример 3. С целью окрашивания взята партия в размере 30 мазков. Окраску осуществляют следующим образом. Приготовленные мазки из периферической крови предварительно фиксируют метиловым спиртом, высушивают под вытяжкой и промывают дистиллированной водой. Помешают в раствор KCl (0,57 г KCl на 100 мл дистиллированной HO) на 20 мин. Затем промывают дистиллированной водой. Помешают в смесь растворов, приготовленных ex tempore. Раствор «А» - 50% раствор азотнокислого серебра (5 г AgNO + 5 мл дистиллированной воды). Раствор «В» - 2% раствор желатины для лабораторных работ на 1% растворе муравьиной кислоты (15,8 мл дистиллированной воды + 0,2 мл 100% муравьиной кислоты + 4,0 мл 10% желатины для лабораторных работ). Смешивают раствор «А» (5 мл) и «В» (5 мл) в темноте, и в полученную смесь погружают мазки крови на 25 мин, в темноте, в термостате, при температуре 60°С. После этого мазки погружают на 2-3 с в дистиллированную воду, потом выдерживают дважды по 10 мин в 5% растворе тиосульфата Na, в темноте, в термостате, при температуре 37°С. Промывают водопроводной водой, затем дистиллированной водой. Высушивают мазки на воздухе. Затем заключают в канадский бальзам и покрывают покровным стеклом. Проводят микроскопию мазков с целью определения и оценки параметров зон ядрышковых организаторов.
При анализе полученных данных отмечено следующее:
- перекрашивание зон ядрышковых организаторов;
- отмечается чрезмерное затемнение изображения, что затрудняет исследование зон ядрышковых организаторов.
2
3
Пример 4. С целью окрашивания взята партия в размере 30 мазков. Окраску осуществляют следующим образом. Приготовленные мазки из периферической крови предварительно фиксируют метиловым спиртом, высушивают под вытяжкой и промывают дистиллированной водой. Помещают в раствор KCl (0,57 г KCl на 100 мл дистиллированной НО) на 20 мин. Затем промывают дистиллированной водой. Помешают в смесь растворов, приготовленных ex tempore. Раствор «А» - 50% раствор азотнокислого серебра (5 г AgNO + 5 мл дистиллированной воды). Раствор «В» - 2% раствор желатины для лабораторных работ на 1% растворе муравьиной кислоты (15,8 мл дистиллированной воды + 0,2 мл 100% муравьиной кислоты + 4,0 мл 10% желатины для лабораторных работ). Смешивают раствор «А» (5 мл) и «В» (5 мл) в темноте, и в полученную смесь погружают мазки крови на 20 мин, в темноте, в термостате, при температуре 37°С. После этого мазки погружают на 2-3 с в дистиллированную воду, потом выдерживают дважды по 8 мин в 5% растворе тиосульфата Na, в темноте, в термостате, при температуре 37°С. Промывают водопроводной водой, затем дистиллированной водой. Проводят доокраску сафранином Т в течение 24 ч. Промывают водопроводной водой и высушивают мазки на воздухе. Проводят обезвоживание спиртами. Затем заключают мазки в канадский бальзам и покрывают покровным стеклом. Проводят микроскопию мазков с целью определения и оценки параметров зон ядрышковых организаторов.
Анализ полученных данных показал, что во всей группе мазков на 80% произошло вымывание краски спиртами, вследствие чего определить ядрышковые организаторы и провести морфологическую идентификацию клеток крови не представлялось возможным.
2
3
Пример 5. С целью окрашивания взята партия в размере 30 мазков. Окраску осуществляют следующим образом. Приготовленные мазки из периферической крови предварительно фиксируют метиловым спиртом, высушивают под вытяжкой и промывают дистиллированной водой. Помещают в раствор KCl (0,57 г KCl на 100 мл дистиллированной НО) на 20 мин. Затем промывают дистиллированной водой. Помешают в смесь растворов, приготовленных ex tempore. Раствор «А» - 50% раствор азотнокислого серебра (5 г AgNO + 5 мл дистиллированной воды). Раствор «В» - 2% раствор желатины для лабораторных работ на 1% растворе муравьиной кислоты (15,8 мл дистиллированной воды + 0,2 мл 100% муравьиной кислоты + 4,0 мл 10% желатины для лабораторных работ). Смешивают раствор «А» (5 мл) и «В» (5 мл) в темноте, и в полученную смесь погружают мазки крови на 20 мин, в темноте, в термостате, при температуре 37°С. После этого мазки погружают на 2-3 с в дистиллированную воду, потом выдерживают дважды по 8 мин в 5% растворе тиосульфата Na, в темноте, в термостате, при температуре 37°С. Промывают в водопроводной воде, затем дистиллированной водой. Проводят доокраску бриллиантовым зеленым в течение 2 мин. Промывают водопроводной водой и высушивают мазки на воздухе. Затем заключают мазки в канадский бальзам и покрывают покровным стеклом. Проводят микроскопию мазков с целью определения и оценки параметров зон ядрышковых организаторов.
При анализе полученных данных выявлено, что при доокраске бриллиантовым зеленым все клеточные структуры приобрели интенсивно зеленую окраску. Вследствие чего изучение параметров ядрышковых организаторов представлялось не возможным.
2
3
Пример 6. С целью окрашивания взята партия в размере 30 мазков. Окраску осуществляют следующим образом. Приготовленные мазки из периферической крови предварительно фиксируют метиловым спиртом, высушивают под вытяжкой и промывают дистиллированной водой. Помещают в раствор KCl (0,57 г KCl на 100 мл дистиллированной НО) на 20 мин. Затем промывают дистиллированной водой. Помещают в смесь растворов, приготовленных ex tempore. Раствор «А» - 50% раствор азотнокислого серебра (5 г AgNO + 5 мл дистиллированной воды). Раствор «В» - 2% раствор желатины для лабораторных работ на 1% растворе муравьиной кислоты (15,8 мл дистиллированной воды + 0,2 мл 100% муравьиной кислоты + 4,0 мл 10% желатины для лабораторных работ). Смешивают раствор «А» (5 мл) и «В» (5 мл) в темноте, и в полученную смесь погружают мазки крови на 20 мин, в темноте, в термостате, при температуре 37°С. После этого мазки погружают на 2-3 с в дистиллированную воду, потом выдерживают дважды по 8 мин в 5% растворе тиосульфата Na, в темноте, в термостате, при температуре 37°С. Промывают водопроводной водой, затем дистиллированной водой. Проводят доокраску краской Романовского в течение 30 мин. Промывают водопроводной водой и высушивают мазки на воздухе. Затем заключают мазки в канадский бальзам и покрывают покровным стеклом. Проводят микроскопию мазков с целью определения и оценки параметров зон ядрышковых организаторов.
Анализ полученных данных позволил сделать вывод о том, что 85% процентов мазков успешно окрашены и в них можно изучать как структуры клетки, так и ядрышковые организаторы. Предложенный способ окраски превосходит наиболее часто применяемый способ окраски для выявления ядрышковых организаторов по Хоуэлл и Блэку (см. Howell, Black, 1980) тем, что наряду с изучением ядрышковых организаторов появилась возможность исследовать и остальные структуры клетки, при этом способ существенно сокращает затраты времени, связанные с окраской.
Таким образом, на основании вышеприведенных примеров выявлено, что наиболее оптимальными являются примеры 2 и 6, по которым возможно изучение зон ядрышковых организаторов для определения функциональной активности клеток крови, при этом в таблицах 1-4 представлены примеры определения ОЯОР в ядрах эритроцитов у гусей разных возрастов, шт.; площадь ОЯОР в ядрах эритроцитов гусей разных возрастов, мкм кв.; количество ОЯОР в ядрах эритроцитов у уток разных возрастов, шт.; площадь ОЯОР в ядрах эритроцитов уток разных возрастов, мкм кв.
Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:
- сокращение времени окрашивания;
- способ позволяет получить мазки высокого качества окрашивания;
- способ позволяет визуализировать ядрышковые организаторы одновременно с остальными структурами клетки.
Таблица 1
Количество ОЯОР в ядрах эритроцитов у гусей разных возрастов, шт.
Этап эксперимента
Экспериментальны группы
самцы, М±m (n=300)
самки, М±m (n=300)
1 сутки
6,22±0,12
8,23±0,14##
1 месяц
10,02±0,12**
9,55±0,11**##
3 месяца
7,90±0,09**
7,68±0,08**
6 месяцев
11,45±0,11**
11,52±0,10**
9 месяцев
9,92±0,11**
8,92±0,09**##
12 месяцев
9,00±0,08**
9,10±0,09
Примечание: статистическая значимость различий с более ранним сроком: * - р<0,05, ** - р<0,01; с самцами одного срока: # - р<0,05, ## - р<0,01.
Таблица 2
Площадь ОЯОР в ядрах эритроцитов гусей разных возрастов, мкм кв.
Этап эксперимента
Экспериментальные группы
самцы, М±m (n=300)
самки, М±m (n=300)
1 сутки
0,293±0,009
0,404±0,007##
1 месяц
0,382±0,009**
0,425±0,011##
3 месяца
0,368±0,007
0,356±0,010**
6 месяцев
0,297±0,007**
0,262±0,008**##
9 месяцев
0,343±0,012**
0,337±0,011**
12 месяцев
0,234±0,008**
0,244±0,009**
Примечание: статистическая значимость различий с более ранним сроком: * - р<0,05, ** - р<0,01; с самцами одного срока: # - р<0,05, ## - р<0,01.
Таблица 3
Количество ОЯОР в ядрах эритроцитов у уток разных возрастов, шт.
Этап эксперимента
Экспериментальны группы
самки, М±m (n=300)
самцы, М±m (n=300)
1 сутки
5,12±0,14
6,14±0,07##
1 месяц
7,86±0,08**
8,75±0,09**##
3 месяца
6,37±0,12**
6,91±0,11**##
6 месяцев
10,80±0,07**
11,74±0,09**##
9 месяцев
11,14±0,09**
10,43±0,11**##
12 месяцев
11,06±0,10
11,59±0,13**##
Примечание: статистическая значимость различий с более ранним сроком: * - р<0,05, ** - р<0,01; с самками одного срока: # - р<0,05, ## - р<0,01.
Таблица 4
Площадь ОЯОР в ядрах эритроцитов уток разных возрастов, мкм кв.
Этап эксперимента
Экспериментальные группы
самки, М±m (n=300)
самцы, М±m (n*300)
1 сутки
0,384±0,008
0,337±0,007##
1 месяц
0,664±0,009**
0,372±0,009**##
3 месяца
0,469±0,008**
0,527±0,011**##
6 месяцев
0,431±0,010**
0,391±0,008**##
9 месяцев
0,435±0,011
0,414±0,010
12 месяцев
0,378±0,007**
0,330±0,008**##
Примечание: статистическая значимость различий с более ранним сроком: * - р<0,05, ** - р<0,01; с самками одного срока: # - р<0,05, ## - р<0,01.