Оценка влияния заместителей в гетерофункциональных производных 1,2,4-триазинохиназолинтоиуксусной кислоты на биолюминесценцию бактерий

Вестник Томского государственного университета. Химия. 2016. № 4 (6). С. 39-49

БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НЕОРГАНИЧЕСКИХ И ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ

УДК 54.061: 54.066: 57.087.1 DOI: 10.17223/24135542/6/4

С.Л. Сафронюк, Т.В. Крамарь, М.В. Назаренко

Медицинская академия имени С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ имени В.И. Вернадского»

Оценка влияния заместителей в гетерофункциональных производных 1,2,4-триазинохиназолинтиоуксусной кислоты на биолюминесценцию бактерий

Произведена оценка биологической активности производных 1,2,4-триазинохиназолинтиоуксусной кислоты биолюминесцентным методом. Выявлена корреляция между структурой и биологическим эффектом. В результате проведенных исследований определен общий вид структуры с наиболее выраженной токсичностью в отношении люминесцентного штамма бактерии Photobacterium leiognathi Sh1.

Ключевые слова: биолюминесценция; люминесцентные бактерии; гетерофункциональные производные; 1,2,4-триазинохинахолинтиоуксусные кислоты.

Введение

В связи с современными требованиями экологической безопасности перед учёными различных специальностей - химиками, биологами, фармакологами - стоит задача разработки биологически активных препаратов, обладающих, наряду с минимальной опасностью для человека и окружающей среды, эффективным целевым действием [1]. Для этого было организовано много проектов по предсказанию биологической активности, основанные как на статистическом анализе частоты встречаемости функциональных групп (PASS) [2], так и на соответствии определенного набора физико-химических дескрипторов вещества наблюдаемым биологическим эффектам при их действии (MATRIX) [3]. Однако при поиске и создании новых лекарственных средств наряду с развитием скрининговых систем все большее значение приобретают рациональные подходы, основанные на исследовании зависимости биологической активности химических соединений от молекулярной структуры. Взаимосвязь «структура - активность» (Structure - Activity relationship - SAR; Quantitative Structure - Activity Relationship - QSAR) может быть использована для предсказания биологического действия нетестированных соединений с целью отбора более пер-

спективных химических структур для последующих углубленных исследований [4].

Цель исследования - произвести оценку биологической активности производных 1,2,4-триазинохиназолинтиоуксусной кислоты (ЫКУ) биолюминесцентным методом; определить заместители, введение которых в структуру исследуемых соединений изменяет биологический эффект и/или его силу в отношении светящихся бактерий.

Материалы и методы

Тест-объектами в работе выступали различные производные 1,2,4-триазинохиназолинтиоуксусной кислоты, синтезированные на кафедре фармацевтической химии Запорожского государственного медицинского университета. Структурная формула представлена на рис. 1 [5].

Рис. 1. Общая формула исследуемых производных R - ОН, CnHmOxFyNzBrq; R1 - F, Cl, Br, I, H, O-СНз, C6H6; R2, R3 - F, Cl, Br, I, H

Оценку растворимости NKV проводили визуально согласно методике оценки прозрачности и степени мутности жидкостей в компараторе [6]. Приготовление растворов осуществляли путем взвешивания 5 мг каждого образца на аналитических весах ВЛР - 200 (Госметр, Россия) или отбором 5-50 мкм3 механическим дозатором переменного объема (Proline, Biohit, Финляндия) в пробирки 1,5 мл типа Эппендорф (с замком Safe-Lock, бесцветные, Eppendorf, Германия) с последующим добавлением растворителя или дисперсионной среды. Растворитель - диметилсульфоксид (ДМСО) (Таурус, Россия), оптимальный органический растворитель для проведения скринингового биотестирования веществ при различных условиях [7]. Дисперсная среда - 2,5-3%-ный (масса/объем) раствор натрия хлорида

(НПФ «Невский химик», Россия). Полученную систему интенсивно перемешивали с помощью вибрационной мешалки (ВМ-2, Россия) в течение 1015 мин.

Скрининг биологической активности производили с использованием биолюминесцентного метода [8], позволяющего неспецифически, независимо от механизма действия химических веществ определять их концентрацию по биологическому эффекту на морские светящиеся бактерии [9]. При анализе производных NKV использовали люминесцентные бактерии Photobacterium leiognathi Sh1 [10, 11], выделенные из Азовского моря, входящие в состав коллекции светящихся бактерий Медицинской академии имени С.И. Георгиевского Крымского федерального университета имени В.И. Вернадского. Детальное изучение этого штамма выявило его высокую чувствительность к действию химических веществ различной структуры и биологической активности [11, 12]. Культивирование, пролонгирование жизнедеятельности и получение чистых культур клеток проводили с использованием микробиологических подходов [13] на жидких и плотных питательных средах (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия).

Для определения интенсивности биолюминесценции бактерий в методике использовали биохемилюминометр БХЛ-06 (Нижний Новгород, Россия). Биологический эффект исследуемых образцов анализировали с использованием двух подходов в тестировании:

- Острое действие (токсичность) образцов определяли путем внесения в кюветы люминометра, при смешивании 0,8-0,9 мл тестируемого раствора в 2,5-3%-ном (масса/объем) растворе натрия хлорида и 50 мкм3 бактериальной суспензии. Регистрировали изменение интенсивности биолюминесценции в течение 10-15 мин с использованием самописца. Результаты представляли в виде зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации вещества [14]:

I = I/I0 х 100%,

где Ii - интенсивность биолюминесценции в присутствии вещества; I0 -интенсивность биолюминесценции в контроле.

- Хроническое действие (токсичность) определяли по эффекту тестируемого объекта на рост и биолюминесценцию светящихся бактерий. В кюветы люминометра вносили 0,8-0,9 мл 3%-ного (масса/объем) раствора хлорида натрия, 5-50 мкм3 тестируемого образца, 50 мкм3 суспензии светящихся бактерий и 20-50 мкм3 стерильной среды для светящихся бактерий. Помещали в термостат (ТС-80М, Россия) при температуре 30°С на 16 ч. Измерение биолюминесценции и обработку результатов проводили аналогично методике определения острого действия [Там же].

Результаты и обсуждение

Определение заместителей в ряду производных 1,2,4-триазинохиназол-интиоуксусных кислот проводилось по 2D структурам молекул, описанных

в методиках синтеза [5]. В качестве основной цепи соединений выбрали гетероцикл 6-((2-оксо-3-фенил-2Н-[1,2,4]триазино [2,3 -с]хиназолин-6-ил) тио)ацетамид. В результате определили: циклические радикалы (адамантан, азапен, бицикло[2,2,1]гептан (норборан)), ароматические радикалы (анизол, трифлюоробензен), гетероциклические радикалы (1-метилпирроллидон, 3-метилпипередин, 5-метилизоксазол, триметилмор-фолин), галоген-радикалы (бром, йод, фтор, хлор) и карбоксильная группа. Выделенные заместители содержали фармакофорные группы или их комбинации с циклическими, ароматическими или гетероциклическими фрагментами. В свою очередь адамантан, азепан, бицикло[2,2,1]гептан, анизол, трифлюоробензен, 1-метилпирроллидон, 3-метилпипередин, 5-метилизоксазол, триметилморфолин, бром, йод, фтор, хлор сами по себе обладают антибактериальными свойствами, связанными с физико-химическими особенностями молекул и атомов [16-22]. Повышение активности системы флавиновых ферментов с образованием перекиси водорода вместо воды и/или нарушение синтеза воска, входящего в состав клеточной стенки, оказывала карбоксильная группа, что вызывало наиболее сильное снижение люминесценции бактерий.

Для оценки биологической активности производных 1,2,4-триа-зинохиназолинтиоуксусной кислоты исследовали возможность получения истинных растворов (ИР) гомологов в анализируемой пробе, поскольку измерения интегрального светового потока проводятся в жидкой фазе [15]. Вначале исследовали возможность порошков ККУ с ДМСО образовывать ИР. Мониторинг солюбилизации производных при нормальных условиях (25±0,1°С, 101,3±0,1 кПа) показал следующее: 12 субстанций растворимы в ДМСО с образованием ИР, 30 соединений сформировали суспензии. Для 30 систем-суспензий производили нагрев до 60±0,1°С в течение 60 мин во избежание изменении в физико-химических свойствах синтезированных структур, а растворимость оценивалась через каждые 15 мин согласно указанной ранее методике [6]. По истечении одного часа выдержки бинарных систем (суспензий) при 60±0,1°С 6 производных ККУ не произвели переход из суспензионного в истинный тип раствора. После охлаждения образцов до комнатной температуры ИР вещества ККУ-64 преобразовался в суспензию. Результаты оценки растворимости производных представлены в табл. 1.

Проводили оценку агрегативной устойчивости полученных систем, растворов ККУ в ДМСО, после внесения в 2,5-3%-ный (масса/объем) раствор натрия хлорида - оптимальный для жизнедеятельности тест-штамма бактерий, который выступал в качестве дисперсной среды при биолюминесцентном скрининге. Изменения дисперсности регистрировали как в предыдущей серии экспериментов по исследованию растворимости ККУ в ДМСО. В итоге при введении в пробу 5 мкм3 систем исследуемых гомологов 25 соединений давали видимый осадок. При добавлении 25 мкм3 получили только 3 ИР. При внесении 50 мкм3 только вещества с кодовыми названиями ККУ-35 и ККУ-40 не выпали в осадок.

Т а б л и ц а 1

Результаты оценки растворимости производных №КУ

Название вещества Свойства Номер ЖУ

29, 55, 57, 60, 63, 65 30, 32, 42, 43, 44, 45, 47, 48, 50, 53, 59, 61 31, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 49, 51, 52, 54, 56, 58, 67, 69, 70 34, 40, 68, 71 46, 62 64 66

Окраска раствора Прозрачный, соломенно-же1 желто-коричневый, о пый, лимонный, ранжевый

Растворимость При 25±0,1°С - + - - - - -

При нагревании до 60±0,1°С в течение 15 мин - + + - - - -

30 мин - + + - + - -

45 мин - + + + + + -

60 мин - + + + + + +

При охлаждении до 25±0,1°С после нагревания - + + + + - +

Примечание. «+» - производное образует ИР с ДМСО при указанных условиях; «-» -производное не образует ИР с ДМСО при указанных условиях.

В результате использованных подходов для получения ИР ККУ в ДМСО показали, что из 42 исследуемых субстанций получение ИР семи производных (ЖУ-29, ЖУ-55, ЖУ-57, ЖУ-60, ЖУ-63, ЖУ-64, ККУ-65) оказалось невозможным (в искомых условиях) при исходной концентрации 5 мг/мл. По полученным данным 95% порошков ККУ при внесении в заданные условия для проведения скрининга биологической активности с использованием биолюминесцентного метода образовывали суспензии. В результате для достижения наиболее сопоставимых условий с методикой тестирования на P. Leiognathi БЫ [15] при исследовании производных ККУ вводили дополнительный фактор перемешивания в методологию острого и хронического подхода к биотестированию.

Результаты скрининга биологической активности с использованием биолюминесцентного метода представлены на рис. 2. По данным [8-10, 14], как ингибирование биолюминесценции, так и ее активирование более чем на 50% связано с проявлением токсичности. На основании полученных данных все ККУ условно можно разделить на 4 группы по уровню токсичности и/или эффективно действующей концентрации, изменяющей (для данной группы веществ - ингибирующей) интенсивность люминесценции на 50% (ЭК50).

В первую группу «нейтральные вещества» ЭК50 свыше 0,25 мг/мл вошли представители ЖУ № 29, 33, 34, 36, 38, 40, 56, 57, 59, 62, 63, 68, 69. Вторая группа, «слабые ингибиторы» (ЭК50 от 0,175 до 0,25 мг/мл), состоит из ККУ № 30, 32, 35, 37, 39, 55, 61. Третья группа, «умеренные ингибиторы» (ЭК50 от 0,05 л до 0,1 мг/мл), состоит из ЖУ № 31, 58, 60, 64, 65, 66, 70, 71. Четвертая группа, «сильные ингибиторы» (ЭК50 меньше 0,025 мг/мл), состоит из ЖУ № 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 67.

При оценке данных острой и хронической биологической активности с использованием биолюминесцентного метода анализа выявили корреляционную зависимость к ингибированию люминесценции в обоих подходах к тестированию (рис. 3).

110 100

90 80

70 '60

"50 40

30 20

10

^—ь

: Ч Ж- I

' V п---- -у+

• ч

г-ж

О. 11

0 0,025 0,05 0,075 ОД 0,125 0,15 0,175 0,2 0,225 0,25

С, мг/мл

Рис. 2. Интенсивности люминесценции от концентрации производного ЫКУ в пробе. I - «нейтральные вещества»; II - «слабые ингибиторы»; III - «умеренные ингибиторы»;

IV - «сильные ингибиторы»

Рис. 3. Корреляция ингибирования свечения по группам

Сравнение структуры и биоактивности тестируемых веществ выявило ряд зависимостей, влияющих на силу ингибирующего эффекта свечения соединения в отношении тест-культур бактерий. Увеличение токсического действия непосредственно связано с изменением числа галогенов от 1 до

6 единиц в структуре соединения с учетом индивидуальных физико-химических свойств атомов в ряду йод, бром, хлор, фтор. К примеру, сила ингибирования свечения производного ККУ, содержащего в своей структуре два атома фтора, меньше, чем аналогичный эффект, оказываемый ККУ, содержащим один атом хлора. Замещение атома водорода на галоген в 9-м положении, относительно основной гетероциклической цепи 1,2,4-триазинохиназолинтиоуксусной кислоты, характеризует более сильным снижением люминесценции, чем в 10-м. Удлинение углеродной цепи в радикалах на одну метильную или метокси-группу приводит к снижению токсического воздействия ККУ. Определили, что производные 1,2,4-триазинохиназолинтиоуксусной кислоты являются более сильными ингибиторами бактериальной люминесценции, чем тиоацетамиды 1,2,4-триазинохиназолина. В свою очередь, среди 1,2,4-триазино-[2,3-с]хиназо-лин-6-илтиоацетамидов сила токсического действия увеличивается, если в ацетамидном участке (Я, см. рис. 1) производили замещение водорода на фармакофорные группы или их комбинации с циклическими, ароматическими или гетероциклическими фрагментами. Определен общий вид структуры среди тестируемых ККУ с наиболее выраженной способностью к ингибированию люминесценции штамма Р. Leiognathi - 2-((9-Я:-10-Я2-3-(4-Я3-фенил)-2-оксо-2Н-[1,2,4]триазино[2,3-с]хиназолин-6-ил)тио)ук-сусные кислоты (рис. 4). Вне зависимости от заместителей Я1, Я2, Я3 сила токсического действия составила 80±10% от контрольных значений люминесценции для производных.

В результате проведенных исследований определен общий вид структуры с наиболее выраженной токсичностью 2-((10-Я1-9-Я2-3-(4-Я3-фенил)-

О

Рис. 4. Схема производных ЫКУ с наибольшим ингибирующим действием Я1 - Е, С1, Бг, I, Н, О-СН3; Я2, Я3 - Е, С1, Бг, I, Н [7,5 см]

Выводы

2-оксо-2Н-[1,2,4]триазино[2,3-с]хиназолин-6-ил)тио)уксусной кислоты, согласно рис. 4. Определены группы, влияющие на силу биоцидного действия производных 1,2,4-триазинохиназолинтиоуксусной кислоты. Полученные результаты дают основу для создания фрагментных дескрипторов, которые вместе с физико-химическими дескрипторами позволят выстроить количественные модели SAR и QSAR в ряду производных 1,2,4-триазино-хиназолинтиоуксусной кислоты.

Литература

1. Кирлан С. А. Моделирование и прогноз свойств биологически активных гетероцик-

лических соединений на основе связи «структура-активность-токсичность : дис. ... д-ра хим. наук. Уфа, 2011. 302 с.

2. Соломонов Б.Н., Седов H.A. Метод расчета энергий гиббса гидрофобного эффекта и

специфического взаимодействия неэлектролитов в водных растворах // Журнал физической химии. 2008. Т. 83, № 7. С. 1259-1263.

3. Смирнов И.В. Новые подходы к оценке взаимосвязи электронного строения и спе-

цифической активности лекарственных веществ на примере производных сульфо-нилбензойной кислоты : дис. ... д-ра мед. наук. Барнаул, 2012. 270 с.

4. Габриелян Л.И. Исследование взаимосвязей между молекулярной структурой и гепа-

тозащитной активностью химических соединений : дис..... канд. биол. наук. М.,

2005. 117 с.

5. Nosulenko I.S., Voskoboynik O.Yu., Berest G.G., Safronyuk S.L., Kovalenko S.I., Kats-

ev An.V., Sinyak R.S., Palchikov V.O. Synthesis and antiviral activity of [(9-R1-10-R2-3-R2-ОXO-2H-[1,2,4]-triazino[2,3-с]QUINAZOLIN-6-YL)thio] acetamides derivatives with the fragments of carcass amines // Журнал оргатчно! та фармацевтично! шмй. 2014. Т. 1, № 12. С. 17-27.

6. Определение прозрачности и степени мутности жидкостей. Государственная фарма-

копея. 1984. Vol. XII(1). С. 680-681.

7. Кацев А.М., Шандровская А.С., Абдураманова Э.Р. Оптимизация выбора органиче-

ских растворителей для проведения скринингового биотестирования лекарственных веществ // Запорожский медицинский журнал. 2011. Т. 13. № 1. С. 83-86.

8. Roda A., Guardigli M., Mishelini E. [et al.] Peer reviewed: analytical bioluminescence and

chemiluminescence // Anal. Chem. 2003. Vol. 75, No. 25. P. 462-470.

9. Кацев А.М., Сафронюк С.Л., Цокало И.Е., Шереметьева А.В., Стародуб Н.Ф. Оценка

применимости биолюминесцентного анализа при определении активности лекарственных препаратов // Ветеринарна бютехнолопя. 2013. № 22. С. 188-195.

10. Дерябин Д.Г. Бактериальная биолюминесценция: фундаментальные и прикладные аспекты. М. : Наука, 2009. 248 с.

11. Кацев А.М., Макемсон Дж. Идентификация светящихся бактерий, выделенных из Черного и Азовского морей // Ученые записки ТНУ им. В.И. Вернадского. Сер. «Биология, химия». 2006. Вып. 19, № 4. С. 111-116.

12. Katsev A.M., Wegrzyn G., Szpilewska H. Effects of hydrogen peroxide on light emission by various strains of marine luminescent bacteria // J. Basic Microbiol. 2004. V. 44, No. 3. P. 178-184.

13. Воробьёв А.А., Кривошеин Ю.С., Широбоков В.П. Медицинская и санитарная микробиология : учеб. пособие. М., 2003. 464 с.

14. Кацев А.М., Скамрова Г.Б., Евстигнеев М.П Изучение биологического действия комбинаций ДНК-интеркаляторов с кофеином на люминесцентные бактерии // Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского. Сер. «Биология, химия». 2014. Вып. 27 (66), № 2. С. 186-195.

15. Методика визначення токсичност води на бактерiях Photobacterium phosphoreum (Cohn) Ford // Свидетельство № 224. 01. 13. 194/2002, выданное Уральским НИИ метрологии, а также согласно КНД 211. 1. 4. 060-97.

16. Leonova M.V., Golovin E.V., Shiriaev A.K., Savinova O.V., Klimochkin Yu.V., Skomo-rohov M.Yu., Kuznetsov S.A. Aminoderivatives of adamantine with antiviral activity against influenza viruses. Pat. of Russian Federation № 2401263.

17. Buagergen R., Burry B., Burry M., Kazella P., Erber J. M., Ler P., Nizato P., Raymon P., Verner J. Benzene derivatives, methods of their preparation and pharmaceutical composition with their content. Pat. of Russian Federation № 2248964. Application Date: 08.06.2000, Publication Date: 10.09.2003.

18. Bernardon J.-M. Bicyclic aromatic compounds and baised on them composition. Pat. of Russian Federation № 2188190.

19. Слепенькин А.В. Метаболизм адамантана и его производных бактериями рода Pseudomonas, несущими плазмиду биодеградации : дис. ... канд. биол. наук. Пущи-но, 2000. 141 с.

20. Исаханян А.У., Геворгян Г.А., Арутюнян Н.С., Токмаджян Г.Г., Пароникян Р.В., Татевосян А.А., Шахатуни А.А. Синтез и некоторые биологические свойства йод-метилатов аминоалкиловых эфиров замещенных уксусных и пропионовых кислот // Химико-фармацевтический журнал. 2013. № 9. С. 29-32.

21. Кнунянц И.Л. Химическая энциклопедия. М., 1988. Т. 1. 623 с.

22. Калюкова Е.Н. Свойства неметаллов и их соединений : учеб. пособие. Ульяновск, 2002. 112 с.

Авторский коллектив:

Сафронюк Сергей Леонидович, ассистент кафедры медицинской и фармацевтической химии Медицинской академии имени С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ имени В. И. Вернадского» (г. Симферополь, Россия). E-mail: pharmalab01@mail.ru

Крамарь Татьяна Вадимовна, студентка 4-го курса 2-го медицинского факультета специальности «Лечебное дело» Медицинской академии имени С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ имени В.И. Вернадского» (г. Симферополь, Россия). E-mail: kramarva@gmail.com

Назаренко Мария Викторовна, ассистент кафедры медицинской и фармацевтической химии Медицинской академии имени С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ имени В. И. Вернадского» (г. Симферополь, Россия). E-mail: maryn1988@gmail.com

Tomsk State University Journal of Chemistry, 2016, 4 (6), 39-49. DOI: 10.17223/24135542/6/4

S.L. Safronyuk, T.N. Kramar, M.V. Nazarenko

Crimean Federal University V.I. Vernadsky, Medical Academy S.I. Georgievsky

The influence of substituents in the heterofunctional derivatives of 1,2,4-triazinohinazolin thioacetic acid on bioluminescent bacteria

Substituents were identified in the structure of test compounds: cyclic radicals (adamantane, azapen, norborane), aromatic radicals (anisole, trifluorobenzene), heterocyclic radicals (1-methyl pyrrolidone, trimethyl morfolin), halogen radicals (bromine, iodine, fluorine, chlorine), and a carboxyl group. Correlation between the structure and the biological effect was found.

An assessment of the biological activity of 1,2,4-triazinohinazolin thioacetic acid (NKV) was created by a bioluminescent method. Results of screening the biological activity divided conditionally all NKV into 4 groups by level of toxicity: 'neutral substance' with > EC50 of 0.25 mg/ml; 'weak inhibitor' with EC50 of 0.175-0.25 mg/ml;

'moderate inhibitor' with EC50 of 0.05-0.1 mg/ml; and 'strong inhibitor' with EC50 < 0.025 mg/ml.

The study defined the general form of the structure with the most severe toxicity: 2-((10-R1-9-R2-3-(4-R3-phenyl)-2-oxo-2H-[1,2,4]triazino[2,3-c]quinazolin-6-yl)thio)acetic acid.

Keywords: bioluminescence; luminescent bacteria; heterofunctional derivatives; 1,2,4-triazinohinazolin thioacetic acid.

References

1. Kirlan S.A. Modelirovanie I prognoz svoystv biologicheski aktivnykh geterociklicheskikh

soedineniy na osnove svyazi «struktura-aktivnost'-toksichnost'» [Thesis for the degree of Doctor of Science]. Ufa; 2011:302. In Russian.

2. Solomonov B.N., Sedov I.A. A method for calculating the Gibbs energies of hydrophobic

effects and specific interactions of nonelectrolytes in aqueous solutions. Russian Journal of Physical Chemistry A. 2008;82(7):1110-1114.

3. Smirnov I.V. Novye podhodyk ocenke vzaimosvyazi elektronnogo stroeniya I specifich-

eskoy aktivnosti lekarstvennykh veshchestv na primere proizvodnykh sulfonilbenzoinoy kisloty [Thesis for the degree of Doctor of Science]. Barnaul; 2012:270. In Russian.

4. Gabrielyan L.I. Issledovanie vzaimosvyazey mezhdu molekulyarnoy strukturoy I gepato-

zashchitnoy aktivnost 'u khimicheskikh soedineniy [Thesis for the degree of Doctor of Science]. Moscow; 2005:117. In Russian.

5. Nosulenko I.S., Voskoboynik O.Yu., Berest G.G., Safronyuk S.L., Kovalenko S.I., Katsev

An.V., Sinyak R.S., Palchikov V.O. Synthesis and antiviral activity of [(9-R1-10-R2-3-R2-OXO-2 H-[1,2,4]-triazino[2,3- C]quinazolin-6-yl)thio] acetamides derivatives with the fragments of carcass amines. Журнал оргатчног та фармацевтичноi xiMii [Journal of Organic and Pharmaceutical Chemistry]. 2014;12(1):17-27.

6. Opredelenie prozrachnosti I stepeni mutnosti gidkostey. Gosudarstvennaya farmakopeya.

1984;XII(1):680-681

7. Katsev А. M., Shandrovskaya A.S., Abduramanova E.P. Optimizaciya vybora organich-

eskikh rastvoriteley dlya provedeniya skriningovogo biotestirovaniya lekarstvennykh veshchestv. Zaporozhskiy medicinskiy zhurnal [Zaporozhye Medical Journal]. 2011;13(1):83-86

8. Roda A., Guardigli M., Michelini E., Mirasoli M., Pasini P. Peer reviewed: analytical bio-

luminescence and chemiluminescence. Analytical chemistry. 2003;75(21):462A-470A.

9. Katsev А. M., Safronuk S.L., Tsokalo I.E., Sheremet'eva A.V., Starodub N.F. Otsenka

primenimosti bioluminestsentnogo analyza pri opredelenii aktivnosti lekarstvennykh pre-paratov. Veterinarnaya biotehknologiya. 2013;22:188-195.

10. Deryabin D.G. Bakterialnaya bioluminestsentsiya: fundamentalnye Iprikladnye aspekty. Moscow: Science, 2009. P. 248. In Russian.

11. Katsev A.M., Makemson J. Identifikatsiya svetyashchikhsya bakteriy, vydelennykh iz Chernogo I Azovskogo morey. Uchenye zapiski Tavricheskogo natsionalnogo universi-teta im. V.I. Vernadskogo. Seriya: Biologiya, khimiya. 2006; 19(58),4:111-116. In Russian.

12. Katsev A.M., Wegrzyn G., Szpilewska H. Effects of hydrogen peroxide on light emission by various strains of marine luminescent bacteria. J. Basic Microbiol. 2004;44(3):178-184.

13. Vorob'ev A.A., Krivognein Yu.S., Shirobokon V.P. Meditsinskaya I sanitarnaya mikro-biologiya. Uchebnoe posobie. Moscow: 2003;464. In Russian.

14. Katsev A.M., Skamrova G.B., Evstigneev M.P. Izuchenie biologicheskogo deystviya kombinatsiy DNK-interkalyatorov s kofeinom na luminestsentnye bakterii. Uchenye

zapiski Tavricheskogo natsional 'nogo universiteta im. V.I. Vernadskogo. Seriya: Biologi-ya , khimiya. 2014;27(2):186-195. In Russian.

15. Metodika viznachennja toksichnosti vodi na bakterijah Photobacterium phosphoreum (Cohn) Ford // Svidetel'stvo № 224. 01. 13. 194/2002, vydannoe Ural'skim NII metrologii, a takzhe soglasno KND 211. 1. 4. 060-97. In Russian.

16. Patent RU 2401263 Aminoderivatives of adamantine with antiviral activity against influenza viruses. Leonova M. V., Golovin E. V., Shiriaev A. K., Savinova O. V., Klimochkin Yu. V., Skomorohov M. Yu. Kuznetsov S. A.

17. Patent RU 2248964 Benzene derivatives, methods of their preparation and pharmaceutical composition with their content. Buagergen R., Burry B., Burry M., Kazella P., Erber J. M., Ler P., Nizato P., Raymon P., Verner J. Application Date: 08.06.2000, Publication Date: 10.09.2003.

18. Patent RU2188190 Bicyclic aromatic compounds and baised on them composition. Ber-nardon J.-M.

19. Slepen'kin A. V. Metabolizm adamantana i ego proizvodnyh bakterijami roda Pseudomonas, nesushhimi plazmidu biodegradacii [Thesis for the degree of Doctor of Science]. Pushhino; 2000:141. In Russian.

20. Isahanjan A.U., Gevorgjan G.A., Arutjunjan N.S., Tokmadzhjan G.G., Paronikjan R.V., Tatevosjan A.A., Shahatuni A.A. Sintez i nekotorye biologicheskie svojstva jodmetilatov aminoalkilovyh jefirov zameshhennyh uksusnyh i propionovyh kislot. Himiko-farmacevticheskij zhurnal. 2013;9:29-32. In Russian.

21. Knunjanc I.L. Himicheskaja jenciklopedija. Moskva. 1988. Part 1. P. 623. In Russian.

22. Kaljukova E.N. Svojstva nemetallov i ih soedinenij: uchebnoe posobie, Ul'janovsk. 2002. 112 s. In Russian.

Information about authors:

Safronyuk Sergey L., Crimean Federal University V.I. Vernadsky, Medical Academy S.I. Georgievsky

(Simferopol, Russian Federation). E-mail: pharmalab01@mail.ru

Kramar Tatyana N., Crimean Federal University V.I. Vernadsky, Medical Academy S.I. Georgievsky

(Simferopol, Russian Federation). E-mail: kramarva@gmail.com

Nazarenko Maria V., Crimean Federal University V.I. Vernadsky, Medical Academy of S.I. Georgievsky (Simferopol, Russian Federation). E-mail: maryn1988@gmail.com