СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ОСТРОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ПОЧЕК
METHODS FOR TREATMENT OF ACUTE KIDNEY INJURY

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США №62/404390, поданной 5 октября 2016 г. Описание вышеупомянутой заявки включено во всей своей полноте в данную заявку посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способам лечения человека с острым повреждением почек.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Острое повреждение почек (ОПП), ранее известное как острая почечная недостаточность (ОПН), представляет собой клинический синдром, характеризующийся быстрым ухудшением функции почек, которое развивается в течение нескольких суток. Основной характеристикой ОПП является внезапное уменьшение скорости клубочковой фильтрации (СКФ), приводящее к удержанию в организме азотистых продуктов метаболизма (мочевины, креатинина). Если принимать в расчет все население земного шара, то ежегодно на один миллион человек приходится 170-200 тяжелых случаев ОПП. В настоящее время отсутствует специфическое лечение для доказанного ОПП. Найдено несколько лекарств для профилактического ослабления токсического и ишемического экспериментального 01111, что подтверждено более низкими уровнями креатинина в сыворотке крови, уменьшением повреждения тканей и более быстрым восстановлением функции почек в разных животных моделях. Данные лекарства включают антиоксиданты, блокаторы кальциевых каналов, диуретики, вазоактивные вещества, факторы роста, противовоспалительные агенты и так далее. Однако изучение данных лекарства в клинических исследованиях показало, что они не оказывают благоприятного воздействия, и их использование в медицинской практике для лечения ОПП не было одобрено. Лечение же ОПП после того, как данное заболевание уже развилось, представляет собой еще более трудную задачу.
Соединения, описанные в данной заявке, представляют собой типичные модуляторы активируемого пролифераторами пероксисом рецептора-дельта (PPARδ). PPARδ представляет собой ядерный рецептор, который способен регулировать митохондриальный биосинтез. Показано, что модуляция активности PPARδ может быть использована для лечения заболеваний.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящее время установлено, что (R)-3-метил-6-(2-((5-метил-2-(6-(трифторметил)пиридин-3-ил)-1H/-имидазол-1-ил)метил)фенокси)гексановая кислота, соединение, представленное следующей структурней Формулой:
уменьшает повреждение почек в крысиной модели острого заболевания почек (смотри Пример 2). Конкретно, Соединение А значительно снижает уровень креатинина в плазме, улучшает функцию почек и уменьшает уровень NGAL (липокалина, ассоциированного с желатиназой нейтрофилов), раннего биомаркера повреждения почек, при внутривенном введении через четыре часа после индукции ишемического реперфузионного повреждения почек у лабораторных крыс.
Также установлено, что Соединение В, представленное следующей структурней Формулой:
уменьшает повреждение почек в крысиной модели острого заболевания почек (смотри Пример 3). Конкретно, Соединение В значительно снижает уровень креатинина в плазме и улучшает функцию почек при пероральном введении через четыре часа после индукции ишемического реперфузионного повреждения почек у лабораторных крыс.
В данной заявке описаны способы лечения острого повреждения почек, основанные на вышеизложенных результатах.
Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения человека с острым повреждением почек. Данный способ включает внутривенное введение пациенту эффективного количества Соединения А или его фармацевтически приемлемой соли.
Другой вариант осуществления данного изобретения относится к способу лечения человека с острым повреждением почек. Данный способ включает введение пациенту эффективного количества Соединения В или его фармацевтически приемлемой соли. Согласно одному варианту осуществления изобретения Соединение В вводят перорально; согласно другому варианту осуществления изобретения данное соединение вводят внутривенно.
Еще один вариант осуществления данного изобретения относится к способу лечения человека с острым повреждением почек. Данный способ включает введение пациенту эффективного количества Соединения С:
или его фармацевтически приемлемой соли. Согласно одному варианту осуществления изобретения Соединение С вводят перорально; согласно другому варианту осуществления изобретения данное соединение вводят внутривенно.
Другой вариант осуществления данного изобретения относится к Соединению А, или его фармацевтически приемлемой соли, для применения в лечении человека с острым повреждением почек путем внутривенного введения.
Еще один вариант осуществления данного изобретения относится к Соединению В, или его фармацевтически приемлемой соли, для применения в лечении человека с острым повреждением почек. Согласно одному варианту осуществления изобретения Соединение В предназначено для перорального введения; согласно другому варианту осуществления изобретения Соединение В предназначено для внутривенного введения.
Еще один вариант осуществления данного изобретения относится к Соединению С, или его фармацевтически приемлемой соли, для применения в лечении человека с острым повреждением почек. Согласно одному варианту осуществления изобретения Соединение С предназначено для перорального введения; согласно другому варианту осуществления изобретения Соединение С предназначено для внутривенного введения.
Еще один вариант осуществления данного изобретения относится к применению Соединения А, или его фармацевтически приемлемой соли, для изготовления лекарства, предназначенного для лечения человека с острым повреждением почек путем внутривенного введения.
Еще один вариант осуществления данного изобретения относится к применению Соединения В, или его фармацевтически приемлемой соли, для получения лекарства, предназначенного для лечения человека с острым повреждением почек. Согласно одному варианту осуществления изобретения Соединение В предназначено для перорального введения; согласно другому варианту осуществления изобретения, Соединение В предназначено для внутривенного введения.
Еще один вариант осуществления данного изобретения относится к применению Соединения С, или его фармацевтически приемлемой соли, для получения лекарства, предназначенного для лечения человека с острым повреждением почек. Согласно одному варианту осуществления изобретения Соединение С предназначено для перорального введения; согласно другому варианту осуществления изобретения Соединение В предназначено для внутривенного введения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигуры 1 а, б и в представляют собой гистограммы, показывающие терапевтический эффект введенного внутривенно Соединения А, оцениваемый с использованием крысиной модели острого повреждения почек. Гистограмма 1а показывает уровни креатинина (мг/дл) в плазме крыс через 24 ч после повреждения почек. Столбики слева направо представляют уровни креатинина в плазме крыс без повреждения почек, которым внутривенно вводили носитель, и в плазме крыс с повреждением почек, которым внутривенно вводили носитель, 0,3 мг/кг массы тела Соединения А, 1 мг/кг массы тела Соединения А и 3,0 мг/кг массы тела Соединения А. Аналогично гистограмма 16 показывает уровни клиренса креатинина, которые позволяют оценить функциональное состояние почек или СКФ (скорость клубочковой фильтрации), через 24 ч после повреждения почек, и гистограмма 1в показывает уровни NGAL (липокалина, ассоциированного с желатиназой нейтрофилов) в моче через 48 ч после повреждения почек. NGAL является ранним биомаркером повреждения почек, часто используемым в медицинской практике.
Фигуры 2 а и б представляют собой гистограммы, показывающие терапевтический эффект Соединения В, оцениваемый с использованием крысиной модели острого повреждения почек. Гистограмма 2а показывает уровни креатинина (мг/дл) в плазме крыс через 24 ч после повреждения почек. Столбики слева направо представляют уровни креатинина в плазме крыс, подвергнутых плацебо-операции, которым вводили носитель в дозе 30 мг/кг, в плазме крыс с острым повреждением почек, которым вводили носитель в дозе 30 мг/кг, и в плазме крыс с острым повреждением почек, которым вводили Соединение В в дозе 30 мг/кг.Аналогично гистограмма 26 показывает уровни клиренса креатинина, которые позволяют оценить функциональное состояние почек или СКФ (скорость клубочковой фильтрации).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В данном изобретении предложены способы лечения острого повреждения почек у человека, нуждающегося в таком лечении. Такие способы включают введение эффективного количества Соединения А, Соединения В или Соединения С, или фармацевтически приемлемой соли Соединения А, Соединения В или Соединения С, человеку, нуждающемуся в таком введении. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения Соединение А, Соединение В или Соединение С, или фармацевтически приемлемую соль Соединения А, Соединения В или Соединения С, вводят после того, как у человека разовьется острое повреждение почек. Соединение А предпочтительно вводить внутривенно.
В контексте данного описания термин "острое повреждение почек" или "ОПП", ранее известный как "острая почечная недостаточность " или "ОПН", относится к острому клиническому синдрому, характеризующемуся быстрым ухудшением функции почек, который вызывается рядом факторов, таких как ослабление почечного кровотока, гломерулонефрит, использование нефротоксических антибиотиков и противораковых агентов.
Острое повреждение почек определяют как внезапное снижение функции почек, данное заболевание может быть диагностировано на основе выявления у пациента изменения одного или более чем одного из следующих показателей: уровня креатинина в сыворотке крови, скорости клубочковой фильтрации или уровня диуреза. Например, острое повреждение почек может характеризоваться уровнем креатинина в сыворотке крови, превышающем по меньшей мере в 1,5 раза базовый уровень, который определяют как уровень креатинина в сыворотке крови пациента, измеренный не более 7 суток назад. Например, пациент, имеющий острое повреждение почек, может показывать уровень креатинина в сыворотке крови, который превышает базовый уровень в 1,5-1,9 раза, 2,0-2,9 раза или в 3,0 или более раз. Альтернативно острое повреждение почек может характеризоваться нарастанием креатинина в сыворотке крови по меньшей мере на 0,3 мг/дл или по меньшей мере на 0,4 мг/дл.
2
2
2
2
2
Альтернативно острое повреждение почек может характеризоваться скоростью клубочковой фильтрации менее 90 мл/мин/1,73 м. Например, пациент, имеющий острое повреждение почек, может показывать скорость клубочковой фильтрации 60-89 мл/мин/1,73 м, 30-59 мл/мин/1,73 м, 15-29 мл/мин/1,73 м или менее 15 мл/мин/1,73 м.
Альтернативно острое повреждение почек может характеризоваться уровнем диуреза у пациента менее 0,5 мл/кг в течение 6 ч, менее 0,5 мл/кг в течение 12 ч, менее 0,3 мл/кг в течение 12 ч или анурией в течение 12 часов или более.
Острое повреждение почек может сочетаться со специфическими заболеваниями почек (например с острым интерстициальным нефритом, острыми гломерулярными и васкулитными поражениями почек); неспецифическими состояниями (например с ишемией, токсическим повреждением); а также с внепочечной патологией (например с преренальной азотемией и острой постренальной нефропатией, обусловленной затруднением оттока мочи). Пациент одновременно может иметь более одного из данных состояний, и, что еще более важно, эпидемиологические данные поддерживают точку зрения, что даже легкое обратимое ОПП имеет серьезные клинические последствия, включая повышенный риск смерти. Кроме того, поскольку проявления и клинические последствия ОПП с преимущественно почечной этиологией и преимущественно внешней этиологией (внешний стресс на почки) могут быть довольно похожи (даже неразличимы), синдром ОПП включает как прямое повреждение почек, так и острое ухудшение функции.
Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения пациент, который получает лечение по поводу ОПП, имеет диабет, первичную почечную недостаточность, нефритический синдром, атеросклеротическое заболевание, сепсис, гипотонию, гипоксию, миоглобинурию-гематурию или заболевание печени. Согласно другим вариантам осуществления изобретения пациент является пожилым, беременным, хирургическим пациентом или ранее получал нефротоксический агент.
Согласно конкретному варианту осуществления изобретения пациент, который получает лечение по поводу ОПП, является хирургическим пациентом. Соответственно, согласно некоторым вариантам осуществления изобретения, соединение по изобретению вводят хирургическому пациенту после операции.
Согласно другому варианту осуществления изобретения пациент, который получает лечение по поводу ОПП, получал нефротоксический агент. Нефротоксический агент представляет собой лекарство или химическое вещество, способное вызывать ОПП. Лекарства или химические вещества, способные вызывать острое повреждение почек, включают цисплатин, гентамицин, цефалоридин, циклоспорин, амфотерицин, четыреххлористый углерод, трихлорэтилен и дихлорацетилен, но не ограничены ими.
Фактически пациента с ОПП, вызванным любым из состояний, упомянутых в предыдущих трех абзацах, можно лечить Соединением А, Соединением В или Соединением С, или фармацевтически приемлемой солью Соединения А, Соединения В или Соединения С, в соответствии с описанными способами по изобретению.
В описанных способах по изобретению можно применять фармацевтически приемлемые соли Соединения А, Соединения В и Соединения С. Термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к фармацевтическим солям, которые по результатам медицинской оценки подходят для использования в контакте с тканями человека и низших животных, не обладают чрезмерной токсичностью, не вызывают раздражения и аллергической реакции и соответствуют разумному соотношению польза/риск. Фармацевтически приемлемые соли хорошо известны в данной области техники. Например, S. М. Berge с соавторами описывает фармакологически приемлемые соли в J. Pharm. Sci., 1977, 66, 1-19. Соли, образованные путем присоединения кислот, например соляной кислоты, бромистоводородной кислоты, фосфорной кислоты, азотной кислоты, серной кислоты, уксусной кислоты, бензолсульфоновой кислоты, бензойной кислоты, метансульфоновой кислоты, пара-толуолсульфоновой кислоты и меглюминовой кислоты, и путем присоединения оснований, например аммониевые соли, соли щелочных металлов (такие как соли натрия и калия), соли щелочноземельных металлов (такие как соли магния и кальция) и соли органических оснований (такие как меглюминовые и L-лизиновые соли).
Фармацевтические композиции и их введение
Соединение А, Соединение В или Соединение С, или фармацевтически приемлемую соль Соединения А, Соединения В или Соединения С, можно применять в комбинации с другими агентами с известным благоприятным действием на ОПП.
Точное количество вводимого соединения, которое обеспечивает получение субъектом "эффективного количества" соединения, зависит от способа введения, типа и тяжести заболевания и/или состояния и от характеристик субъекта, таких как общее состояние здоровья, возраст, пол, масса тела и переносимость лекарства. Специалист в данной области техники способен определить подходящие дозы в зависимости от указанных и других факторов. Термин "эффективное количество" означает количество, которое после введения субъекту приводит к благоприятным или желаемым результатам, включая клинические результаты, например подавляет, устраняет или ослабляет симптомы состояния, по поводу которого субъект получает лечение, по сравнению с контролем. Например, эффективное количество может составлять от 0,1 мг до приблизительно 50 г в сутки.
Термины "вводить", "процесс введения", "введение" и тому подобное в контексте данного описания относятся к методикам, которые могут быть использованы, чтобы обеспечить доставку композиций к желаемому месту биологического воздействия. Данные методики включают, без ограничения, интраартикулярное (в суставы), внутривенное, внутримышечное, внутриопухолевое, интрадермальное, интраперитонеальное, подкожное, пероральное, местное, интратекальное, ингаляционное, трансдермальное, ректальное введение и тому подобное. Обычно используют пероральное и внутривенное введение, например в том случае, когда состояние, которое лечат, представляет собой острое повреждение почек. Методики введения, которые могут быть использованы с агентами и способами, описанными в данной заявке, можно найти, например, в книге Goodman и Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, текущее издание; Pergamon и  Pharmaceutical Sciences (текущее издание), Mack Publishing Co., Easton, Pa.
Фармацевтические композиции, применяемые в описанных способах по изобретению, включают Соединение А, Соединение В или Соединение С, или фармацевтически приемлемую соль Соединения А, Соединения В или Соединения С, и обычно по меньшей мере одно дополнительное вещество, такое как эксципиент, известное терапевтическое средство, отличное от соединений согласно настоящему изобретению, и их комбинации.
Фармацевтические композиции, применяемые в описанных способах по изобретению, получают в виде препарата, совместимого с предполагаемым путем его введения. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения композицию получают с использованием стандартных методик в виде фармацевтической композиции, адаптированной для внутривенного, подкожного, внутримышечного, перорального, интраназального или местного введения человеку.
Введение терапевтических агентов в виде внутривенного препарата хорошо известно в фармацевтической индустрии. Внутривенные препараты содержат фармацевтически активный агент (например Соединение А, Соединение В или Соединение С, или фармацевтически приемлемую соль Соединения А, Соединения В или Соединения С), растворенный в фармацевтически приемлемом растворителе или растворе, таких как стерильная вода, нормальные физиологические растворы, раствор Рингера с лактатом или другие солевые растворы, например раствор Рингера. Препарат должен поддерживать абсолютную стабильность активного(ых) ингредиента(ов), кроме того, изготовление препарата должно быть затратно-эффективным. Все эти факторы в конечном счете определяют успешность и пригодность внутривенного препарата в целом.
Пероральный препарат обычно получают в виде прессованного препарата, например в форме таблетки или пилюли. Таблетка может содержать, например, приблизительно 5-10% активного ингредиента (например Соединения А, Соединения В или Соединения С, или фармацевтически приемлемой соли Соединения А, Соединения В или Соединения С), приблизительно 80% наполнителей, разрыхлителей, смазывающих веществ, скользящих веществ и связующих веществ и 10% соединений, которые обеспечивают легкое разрыхление, дезагрегирование и растворение таблетки в желудке или кишечнике. Пилюли могут быть покрыты сахаром, лаком или воском для маскировки вкуса.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Синтез (R)-3-метил-6-(2-((5-метил-2-(6-(трифторметил)пиридин-3-ил)-1H-имидазол-1-ил)метил)фенокси)гексановой кислоты (Соединение А)
Схема:
Синтез этил (R)-6-бром-3-метилгексаноата:
3
2
4
В круглодонной колбе объемом 1 л раствор этил (R)-6-гидрокси-3-метилгексаноата (65,0 г, 373,56 ммоль) в дихлорметане (650 мл) обрабатывали PBr (101,0 г, 373,56 ммоль) при комнатной температуре (RT). Данную реакционную смесь перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. После завершения реакции (контролировали путем ТСХ (тонкослойной хроматографии)) реакционную смесь разбавляли водой (500 мл) и экстрагировали диэтиловым эфиром (3×500 мл). Органический экстракт отделяли и сушили над безводным NaSO. Растворитель удаляли при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (57,12 г).
Стадия 1: Синтез N-(проп-2-ин-1-ил)-6-(трифторметил)никотинамида:
В круглодонной колбе объемом 100 мл перемешиваемый раствор 6-(трифторметил)никотиновой кислоты (3 г, 15,70 ммоль) и проп-2-ин-1-амина (1,05 г, 18,84 ммоль) в диметилформамиде (ДМФА: 50 мл) обрабатывали 1-[бис(диметиламино)метилен]-1Н-1,2,3-триазоло[4,5-b]пиридиния 3-оксида гексафторфосфатом (7,2 г, 18,84 ммоль) и триэтиламином (3,1 мл, 23,55 ммоль) при комнатной температуре в атмосфере азота. Полученную реакционную смесь перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре. После завершения реакции (контролировали путем ТСХ) реакционную смесь разбавляли холодной водой, и выпавшее в осадок твердое вещество собирали путем фильтрования, промывали водой и сушили при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (2,6 г, 72,6%).
1
+
3
H ЯМР (300 МГц, CDCl): δ 9.08 (d, J=2.1 Гц, 1H), 8.32 (dd, J=8.4, 2.4 Гц, 1H), 7.78 (d, J=7.8 Гц, 1H), 6.62 (уш. s, 1H), 4.30-4.28 (m, 2Н), 2.33 (t, J=2.4 Гц, 1H). ЖХ-МС (жидкостная хроматография/масс-спектрометрия) (ESI+ (ионизация электрораспыление в режиме положительных ионов), m/z): 229,2 (М+Н).
Стадия 2: Синтез 5-(1-(2-метоксибензил)-5-метил-1Н-имидазол-2-ил)-2-(трифторметил)пиридина:
3
4
В повторно герметизируемой пробирке объемом 50 мл раствор N-(проп-2-ин-1-ил)-6-(трифторметил)никотинамида (1,0 г, 4,38 ммоль) и 2-метоксифенилбензил амина (1,2 г, 8,77 ммоль) в толуоле (10 мл) обрабатывали трифторметансульфонатом цинка (0,16 г, 0,43 ммоль) при комнатной температуре в атмосфере азота. Данную реакционную смесь нагревали в течение 12 ч при 120°С. После завершения реакции (контролировали путем ТСХ) реакционную смесь разбавляли водой и экстрагировали EtOAc (3×20 мл). Органический экстракт промывали насыщенным раствором NaHCO, солевым раствором и сушили над безводным Na2SO. Данный раствор концентрировали при пониженном давлении, и полученный остаток очищали путем колоночной хроматографии на силикагеле (элюирование с использованием 25% EtOAc в гексанах) с выходом указанного в заголовке соединения (0,8 г, 52,6%).
1
3
Н ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 8.79 (s, 1H), 8.07 (d, J=8.1 Гц, 1H), 7.68 (d, J=8.1 Гц, 1H), 7.31 (t, J=8.4 Гц, 1H), 7.09 (s, 1H), 6.94-6.87 (m, 2Н), 6.56 (d, J=7.5 Гц, 1H), 5.16 (s, 2Н), 3.87 (s, 3Н).
+
ЖХ-МС (ESI+, m/z): 348,3 (М+Н).
Стадия-3: Синтез 2-((5-метил-2-(6-(трифторметил)пиридин-3-ил)-1Н-имидазол-1-ил) метил)фенола:
3
3
2
4
В круглодонной колбе объемом 100 мл раствор 5-(1-(2-метоксибензил)-5-метил-1Р-имидазол-2-ил)-2-(трифторметил)пиридина (0,8 г, 2,31 ммоль) в дихлорметане (300 мл) обрабатывали добавляемым по каплям BBr (0,8 мл, 2,31 ммоль) при 0°С. Данную реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре. После завершения реакции (контролировали путем ТСХ) реакционную смесь подщелачивали (рН ~9) водным раствором NaHCO и экстрагировали этилацетатом (EtOAc). Органический экстракт сушили над безводным NaSO и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (0,5 г, 65,1%).
1
6
Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d): δ 9.92 (s, 1H), 8.83 (s, 1H), 8.12 (d, J=8.1 Гц, 1H), 7.94 (d, J=8.1 Гц, 1H), 7.12 (d, J=6.9 Гц, 1H), 7.02 (s, 1H), 6.87 (d, J=7.8 Гц 1H), 6.73 (t, J=7.2 Гц, 1H), 6.37 (d, J=7.2 Гц, 1H), 5.20 (s, 2Н), 2.15 (s, 3Н).
+
ЖХ-МС (ESI+, m/z): 334,3 (М+Н).
Стадия-4: Синтез этил (R)-3-метил-6-(2-((5-метил-2-(6-(трифторметил)пиридин-3-ил)-1Н-имидазол-1-ил)метил)фенокси)гексаноата:
2
3
2
4
В круглодонной колбе объемом 50 мл перемешиваемый раствор 2-((5-метил-2-(6-(трифторметил)пиридин-3-ил)-1H-имидазол-1-ил)метил)фенола (0,5 г, 1,50 ммоль) в ДМФА (10 мл) обрабатывали KCO (0,41 г, 3,00 ммоль) и этил (R)-6-бром-3-метилгексаноатом (0,710 г, 3,00 ммоль) при комнатной температуре в атмосфере азота. Полученную реакционную смесь нагревали при 60°С в течение 12 ч. После завершения реакции (контролировали путем ТСХ) реакционную смесь гасили путем добавления охлажденной до 0°С воды и экстрагировали этилацетатом (75 мл × 3). Объединенный органический экстракт промывали солевым раствором, сушили над безводным NaSO и концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток очищали путем колоночной хроматографии на силикагеле (градиентное элюирование с использованием 15-30% EtOAc в гексанах) с выходом указанного в заголовке соединения (0,45 г, 61,3%).
Выход: 0,45 г (61,3%).
+
ЖХ-МС (ESI+, m/z): 491,0 (М+Н).
Стадия-5: Синтез (R)-3-метил-6-(2-((5-метил-2-(6-(трифторметил)пиридин-3-ил)-1Н-имидазол-1-ил)метил)фенокси)гексановой кислоты (Соединение А):
В круглодонной колбе объемом 250 мл перемешиваемый раствор этил (R)-3 -метил-6-(2-((5-метил-2-(6-(трифторметил)пиридин-3-ил)-1H-имидазол-1-ил)метил)фенокси)гексаноата (0,45 г, 0,92 ммоль) в смеси тетрагидрофурана (ТГФ: 5 мл), этанола (2,5 мл) и воды (2,5 мл) обрабатывали гидроксида лития моногидратом (16,0 г, 74,33 ммоль) при комнатной температуре. Данную реакционную смесь перемешивали в течение 12 ч при комнатной температуре. После завершения реакции (контролировали путем ТСХ) реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток промывали EtOAc, разбавляли холодной водой и подкисляли (рН ~5) путем добавления 1 н. НС1. Твердое вещество собирали путем фильтрования и сушили при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (0,166 г, 39,2%).
1
6
H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d): δ 11.96 (уш. s, 1H), 8.79 (s, 1H), 8.05 (d, J=8.0 Гц, 1H), 7.90 (d, J=8.0 Гц, 1H), 7.24 (t, J=7.6 Гц, 1H), 7.02 (d, J=8.4 Гц, 1H), 7.00 (s, 1H), 6.84 (t, J=7.6 Гц, 1H), 6.43 (d, J=7.2 Гц, 1H), 5.21 (s, 2Н), 3.98 (t, J=6.0 Гц, 2Н), 2.19-2.14 (m, 1H), 2.13 (s, 3Н), 2.03-1.94 (m, 1H), 1.85-1.80 (m, 1H), 1.68-1.66 (m, 2Н), 1.38-1.36 (m, 1H), 1.28-1.18 (m, 1H), 0.85 (d, J=6.4 Гц, 3Н).
19
6
F ЯМР (400 МГц, ДМСО-d): δ -66,46.
+
ЖХ-МС (ESI+, m/z): 462,3 (М+Н).
ВЭЖХ: 95,11% (210 нм).
Получение меглюминовой соли Соединения А
Для получение меглюминовой соли Соединения А использовали две разные методики. Методика 1
Соединение А (102,7 мг) смешивали с меглюмином (43,7 мг) и 2-пропанолом (2 мл) в стеклянной пробирке объемом 4 мл. Пробирку герметично закрывали крышкой, и содержимое обрабатывали ультразвуком в течение 20 мин при 25°С и затем перемешивали в течение 60 мин при 50°С. Затем пробирку переносили на новую плиту смесителя, и суспензию, находящуюся в пробирке, перемешивали при 25°С.
Методика 2
Соединение А (102,2 мг) смешивали с меглюмином (43,2 мг) и ацетонитрилом (2 мл) в стеклянной пробирке объемом 4 мл. Пробирку герметично закрывали крышкой, и содержимое обрабатывали ультразвуком в течение 20 мин при 25°С и затем перемешивали в течение 60 мин при 50°С. Затем пробирку переносили на новую плиту смесителя, и суспензию, находящуюся в пробирке, перемешивали при 25°С.
Как в методике 1, так и в методике 2 перемешивание при 25°С продолжали в течение 2 суток, затем оба образца центрифугировали, супернатанты удаляли, и твердое вещество сушили на воздухе.
Получение гидрата меглюминовой соли Соединения А
В кругл одонной колбе объемом 500 мл перемешиваемый раствор Соединения А (20 г, 43,33 ммоль) в смеси ТГФ (100 мл) и воды (100 мл) обрабатывали меглюмином (8,45 г, 43,33 ммоль) при 0°С. Полученную реакционную смесь перемешивали в течение 6 ч при комнатной температуре. Затем реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении, и полученное твердое вещество сушили при пониженном давлении (3 ч) с выходом указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества (28,5 г, 98,95%).
1
3
H ЯМР (400 МГц, CDOD): δ 8.75 (s, 1H), 8.02 (d, J=8.4 Гц, 1H), 7.82 (d, J=8.0 Гц 1H), 7.26 (t, J=8.4 Гц, 1H), 7.03 (s, 1H), 6.99 (d, J=8 Гц, 1H), 6.85 (t, J=7.6 Гц, 1H), 6.50 (d, J=7.6 Гц, 1H), 5.25 (s, 2Н), 4.09-3.99 (m, 3Н), 3.97-3.77 (m, 2Н), 3.74-3.61 (ш, 3Н), 3.29-3.06 (m, 2Н), 2.64 (s, 3Н), 2.22 (s, 3Н), 2.18-2.14 (m,1H), 1.99-1.94 (m, 2Н), 1.83-1.75 (m, 2Н), 1.51-1.38 (m, 1H), 1.32-1.22 (m, 1H), 0.86 (d, J=6.0 Гц, 3Н).
19
3
F ЯМР (400 МГц, CDOD): δ -69,39.
31
43
3
4
8
2
Элементный анализ: рассчитано для CHFNO⋅НО: С, 55,18; Н, 6,72; N, 8,30.
Найдено: С, 54,95; Н, 6,89; N, 8,07.
Влажность (по Карлу Фишеру): 2,33%.
Пример 2
Соединение А уменьшает ишемически-реперфузионное повреждение при внутривенном введении в животной модели острого повреждения почек
Животные, хирургическое вмешательство и дозы. В данных экспериментах использовали самцов крыс линии Sprague-Dawley с массой тела приблизительно 280-300 г, которым обеспечивали неограниченный доступ к стандартному корму и воде. Крыс (n=8/группу) анестезировали с использованием изофлурана и помещали вентральной поверхностью тела на нагреваемую хирургическую платформу с температурным контролем. На дорсальной поверхности тела делали кожный разрез, обнажая обе почки через боковые разрезы. В области ворот обеих почек накладывали зажимы для пережатия сосудов, окклюзия продолжалась 45 мин. Через 45 мин зажимы удаляли, убеждались, что реперфузия почек прошла успешно, и затем на хирургические разрезы накладывали швы. Животных в хирургической плацебо-группе (n=4 крысы) подвергали аналогичному хирургическому вмешательству, за тем исключением, что не накладывали окклюзионные зажимы. Препарат Соединения А получали в день введения в виде прозрачного раствора гидрата меглюминовой соли Соединения А (1,5 молярного эквивалента Соединения А) в 5% декстрозе. Соединение А вводили в/в (внутривенно) через хвостовую вену в дозе 3 мг/кг, 1 мг/кг или 0,3 мг/кг через 4 ч после того, как животные выходили из наркоза после операции и плацебо-операции, и контрольным животным с ишемически-реперфузионным повреждением (ИРП) аналогичным образом вводили носитель.
2
Забор крови. Через двадцать четыре (24) часа после реперфузии во всех группах забирали кровь из ретроорбитального синуса в пробирки с антикоагулянтом KЭДТА, используя для легкого анестезирования животных изофлуран. Плазму отделяли путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 мин при 4°С.
Забор мочи. Как только животные восстанавливались после хирургического вмешательства, все исследуемые группы помещали в метаболические клетки, и собирали мочу в течение 24 или 48 ч. Тщательно измеряли объем мочи, и затем образцы центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин при 4°С для удаления осадка.
Анализ креатинина в плазме и моче выполняли с использованием полностью автоматизированного клинического биохимического анализатора (Siemens Dimension Xpand Plus Integrated Chemistry System). Уровень NGAL в моче анализировали с использованием набора BioPorto ELISA. Клиренс креатинина рассчитывали следующим образом:
Анализ данных и статистический анализ
Для построения графиков и статистического анализа использовали программу GraphPad Prism версии 6.05. Во всех группах тестировали нормальность распределения данных по креатинину с использованием критерия нормальности  ( omnibus normality test) и критерия нормальности Шапиро-Уилка. Статистическую достоверность (р<0,05) определяли с использованием стандартного однофакторного ANOVA (дисперсионного анализа) и последующего множественного сравнения по критерию Даннета, используя ИРП-группу в качестве контрольной группы. **р<0,01, ***р<0,001 и ****р<0,0001 vs. ИР- носитель.
Результаты: Полученные данные показаны на Фигуре 1. Соединение А, введенное в/в через 4 ч после ишемии, уменьшало повреждение почек. Соединение А значительно снижало уровень креатинина в плазме, улучшало функцию почек и уменьшало уровень NGAL, раннего биомаркера повреждения почек, при введении в дозе 0,3 мг/кг, 1 мг/кг или 3 мг/кг.
Пример 3
Соединение В уменьшает ишемически-реперфузионное повреждение при пероральном введении в животной модели острого повреждения почек
Животные, хирургическое вмешательство и дозы. В данных экспериментах использовали самцов крыс линии Sprague-Dawley с массой тела приблизительно 280-300 г, которым обеспечивали неограниченный доступ к стандартному корму и воде. Крыс (n=8/группу) анестезировали с использованием изофлурана и помещали вентральной поверхностью тела на нагреваемую хирургическую платформу с температурным контролем. На дорсальной поверхности тела делали кожный разрез, обнажая обе почки через боковые разрезы. В области ворот обеих почек накладывали зажимы для пережатия сосудов, окклюзия продолжалась 45 мин. Через 45 мин зажимы удаляли, убеждались, что реперфузия почек прошла успешно, и на хирургические разрезы накладывали швы. Животных в хирургической плацебо-группе (n=4 крысы) подвергали аналогичному хирургическому вмешательству, за тем исключением, что не накладывали окклюзионные зажимы. Препарат Соединения В получали в день введения в виде суспензии в 0,25%-ной натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, 0,25%-ном Твине 80 в очищенной воде. Соединение В вводили перорально в дозе 30 мг/кг через 4 ч после того, как животные выходили из наркоза после операции и плацебо-операции, и контрольным животным с ишемически-реперфузионным повреждением (ИРП) аналогичным образом вводили носитель.
2
Забор крови. Через двадцать четыре (24) часа после реперфузии во всех группах забирали кровь из ретроорбитального синуса в пробирки с антикоагулянтом KЭДТА, используя для легкого анестезирования животных изофлуран. Плазму отделяли путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 мин при 4°С.
Забор мочи. Как только животные восстанавливались после хирургического вмешательства, все исследуемые группы помещали в метаболические клетки, и собирали мочу в течение 24 ч. Тщательно измеряли объем мочи, и затем образцы центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин при 4°С для удаления осадка.
Анализ креатинина в плазме и моче выполняли с использованием полностью автоматизированного клинического биохимического анализатора (Siemens Dimension Xpand Plus Integrated Chemistry System). Клиренс креатинина рассчитывали следующим образом:
Анализ данных и статистический анализ
Для построения графиков и статистического анализа использовали программу GraphPad Prism версии 6.05. Во всех группах тестировали нормальность распределения данных с использованием критерия нормальности  ( omnibus normality test) и критерия нормальности Шапиро-Уилка. Данные, подчиняющиеся нормальному распределению, анализировали с использованием непарного, двустороннего t-критерия. Данные с распределением, отличным от нормального, анализировали с использованием критерия Манна-Уитни (непараметрического). Статистическую достоверность определяли уровнем значимости р<0,05 группы ИРП-носитель при сравнении с группой, которой вводили соединение. **р<0,01 и ***р<0,001 vs. ИР-носитель.
Результаты: Соединение В, введенное через 4 ч после ишемии, уменьшало повреждение почек. Соединение В (Фигура 2) снижало уровень креатинина в плазме и улучшало функцию почек при пероральном введении. Гистограмма а показывает, что уровни креатинина (мг/дл) в плазме крыс через 24 ч после повреждения почек снижаются при пероральном введении. Столбики слева направо представляют уровни креатинина в плазме крыс, подвергнутых плацебо-операции, которым вводили носитель, в плазме крыс с острым повреждением почек, которым вводили носитель, и в плазме крыс с острым повреждением почек, которым вводили Соединение В в дозе 30 мг/кг (Фигура 2 а). Аналогично гистограмма б показывает уровни клиренса креатинина, которые позволяют оценить функциональное состояние почек или СКФ (скорость клубочковой фильтрации) (Фигура 2 б).