Способ применения тромбина и активированного протеина С в качестве антивоспалительных средств
METHOD FOR USE OF THROMBIN AND ACTIVATED PROTEIN C AS ANTI-INFLAMMATORY REMEDIES

Область техники
Настоящее изобретение относится к области сериновых протеаз, в частности, тромбина и активированного протеина С (АПС), являющихся агонистами рецепторов, активируемых протеазами первого типа (PAR-1), для использования в снижении воспалительной активности иммунных клеток при терапии воспалительной реакции. В частности, изобретение относится к терапии воспалительной реакции, возникающих на фоне осложнений сахарного диабета и других метаболических заболеваний, сопровождающихся гипергликемией.
Уровень техники
В настоящем документе описано протективное действие активированного протеина с (АПС) и тромбина в условиях воспаления, развивающегося на фоне диабета. Некоторые текущие подходы к лечению заболеваний, сопровождающихся развитием воспалительных реакций, в качестве сопутствующих препаратов используют ингибиторы тромбина (патент US №6362190 В2), что обусловлено провоспалительным действием тромбина в высоких концентрациях. В нашем исследовании тромбин был использован в низких (до 50 нМ) концентрациях и обладал противоположным эффектом, что является отличительным признаком и основой для текущей заявки.
В физиологических условиях АПС образуется из протеина С путем протеолитического расщепления, например, тромбином. На активацию протеина С требуется время. В нашем изобретении используется уже активированный протеин С, который начинает действовать сразу после добавления к исследуемым иммунным клеткам. Использование антивоспалительного и протективного действия АПС было предложено ранее для защиты нервных клеток от гибели (патент СА №2398929 С). Это применимо для различных неврологических заболеваний, тесно связанных с воспалительными процессами, а именно: при ишемии, болезнях Альцгеймера и Паркинсона, энцефалитах, рассеянном склерозе и других. Наше изобретение нацелено на использование АПС для ингибирования воспалительного процесса именно при терапии сахарного диабета.
Одним из основных проявлений сахарного диабета является высокая концентрация глюкозы в крови - гипергликемия. Длительное увеличение уровня глюкозы приводит к возникновению и развитию в организме патологических процессов, таких как ретинопатии, ангиопатии, нефропатии, диабетическая стопа и др. [Воложин, 2006; Fowler, 2008]. Эти осложнения так же, как и сам диабет характеризуются протеканием воспалительных процессов, в регуляцию которых вовлечены разные типы клеток [Wang et al., 2007; Donath et al., 2011]. В патенте RU №2066550 C1 рассматривается использование АПС как средства, обладающего анальгетическим и противовоспалительным действием. Однако сахарный диабет не рассматривался авторами, как состояние, при котором возможно применять АПС в качестве компонента антивоспалительной терапии. Сохранение антивоспалительного эффекта АПС при сахарном диабете продемонстрировано в наших исследованиях.
Терапевтический подход к лечению псориаза, основанный на антивоспалительных и антиапоптотических свойств АПС, рассмотрен в патенте RU №2662564 С2. Предложенный нами подход к использованию АПС является также профилактической мерой, так как развитие кожных заболеваний в провоспалительных условиях является одной из сопутствующих патологий при сахарном диабете. Сахарный диабет способен усугублять имеющиеся у пациента кожные заболевания, такие как: псориаз, экзема [Cohen AD et al., 2007].
Сущность изобретения
Тромбин является ключевой сериновой протеазой в процессе свертывания крови. Для тромбина показан смещенный агонизм - дозозависимая реализация про- или антивоспалительных свойств. Тромбин в высоких концентрациях реализует негативное влияние на различные ткани, приводя к гибели клеток. Для АПС наоборот, характерна антикоагулянтная активность. АПС осуществляет инактивацию Va и VIIIa факторов системы свертывания крови, что приводит к торможению фазы распространения свертывания крови. Кроме антикоагулянтных свойств для АПС показаны противовоспалительные и антиапоптотические свойства, реализуемые преимущественно через PAR-1, а также участие в стабилизации эндотелия сосудов, стимулировании ангиогенеза.
Настоящее изобретение основано на открытии антивоспалительных эффектов АПС (10 нМ) и тромбина (50 нМ) в условиях сахарного диабета, гипергликемии и на фоне осложнений сахарного диабета, вызванных воспалительными реакциями. Известно, что у больных диабетом наблюдается существенное изменение системы гемостаза, смещение гемостатического равновесия в сторону прокоагулянтных факторов, которые также способствуют усугублению воспаления. Полученные нами данные указывают на возможность применения АПС и тромбина исследованных концентрациях в терапевтических целях.
Важную роль в возникновении и развитии воспаления, в том числе при диабете, играют тучные клетки (ТК). Они содержат большое количество цитоплазматических гранул, в которых хранятся преформированные медиаторы воспаления. При активации тучных клеток провоспалительными стимулами происходит их дегрануляция, и секреция медиаторов во внеклеточную среду [Silva da et al., 2014]. Уровень дегрануляции служит маркером активации тучных клеток и интенсивности воспалительного процесса.
Высокий уровень глюкозы при диабете потенцирует провоспалительную активность тучных клеток, вызывает изменения в их ультраструктуре, способствует увеличению их количества в организме, высвобождению из гранул провоспалительных цитокинов [Soma et al., 2002, Donath et al., 2011; Shi et al., 2012]. В тоже время, секретируемые тучными клетками вещества способствуют ухудшению диабета, развитию осложнений [Donath et al., 2011; Nagai et al., 2012]. Таким образом, возникает контур с положительной обратной связью.
Как показано ранее, тромбин и АПС, способны регулировать функции тучных клеток и, в частности, секрецию провоспалительных медиаторов. Тромбин и активированный протеин С гидролизуют определенную пептидную связь в N-конце рецептора, что приводит к запуску разных сигнальных путей и клеточных ответов [Mosnier et al., 2012].
Назначение изобретения
Создание способа, который возможно применять в качестве эффективной антивоспалительной терапии для пациентов с сахарным диабетом и другими метаболическими заболеваниями, сопровождающимися стойким увеличением уровня глюкозы в крови.
Технический результат
В настоящем исследовании мы сравнили вклад агонистов PAR-1 - тромбина и АПС в регуляцию секреторной активности тучных клеток и их культивируемых аналогов, клеток линии RBL-2H3, на фоне изолированного и совместного влияния диабета и воспаления. Уровень провоспалительной активности тучных клеток, который может служить показателем интенсивности воспалительного процесса, оценивали по уровню секреции β-гексозаминидазы.
В нашем исследовании показано, что инкубация тучных клеток, полученных от животных с 24-часовым тиогликолат-вызванным воспалением, с тромбин в концентрации 50 нМ в течение 1-го часа снижает уровень секреции β-гексозаминидазы данных клеток на 44,4% (фиг. 1).
В тоже время, инкубация тучных клеток, полученных от животных с 7-ми дневным стрептозотоцин-вызванным сахарным диабетом, с тромбин в концентрации 50 нМ в течение 1-го часа снижает уровень секреции β-гексозаминидазы данных клеток на 70,2% (фиг. 1).
При сочетанном действии воспаления и диабета уровень секреции клеток в присутствии тромбина в той же концентрации снижается на 70,0% (фиг. 1).
В аналогичном эксперименте на клетках линии RBL-2H3 активированный протеин С в концентрации 10 нМ после часовой инкубации с клетками также вызывал снижение уровеня секреции β-гексозаминидазы клетками, культивируемыми в среде с высокой (25 нМ) концентрацией глюкозы в течение 7 дней (модель гипергликемии), на 10,4% (фиг. 2)
Данный антивоспалительный эффект активированного протеина С сохранился для клеток, культивируемых в тех же условиях и дополнительно подвергнутых кальций-вызванной активации (фиг. 2).
В тоже время ни активированный протеин С, ни тромбин в наших экспериментах не оказывали статистически значимых эффектов на уровень спонтанной секреции β-гексозаминидазы тучными клетками, полученными от животных без воздействий, или клетками линии RBL-2H3, культивированными в нормальных условиях (фиг. 1, фиг. 2).
Таким образом, сериновые протеазы гемостаза, тромбин и активированный протеин С (АПС) в определенных нами концентрациях могут быть рассмотрены в качестве действующего вещества для препарата антивоспалительный терапии в условиях сахарного диабета, а также осложнений сахарного диабета, связанных с развитием и протеканием воспалительных процессов.
Краткое описание графического материала
В графическом материале, который иллюстрирует варианты выполнения изобретения:
на фиг. 1 показано сравнение нормированных к уровню секреции в контроле (без каких-либо воздействий) уровней секреции бета-гексозаминидазы тучными клетками как в присутствии тромбина в концентрации 50 нМ, так и без него, для групп клеток, полученных от животных без воздействия или с вызванным воспалением, или с экспериментальным диабетом, или с сочетанным действием данных факторов;
на фиг. 2 показано сравнение нормированных к уровню секреции в контроле (без каких-либо воздействий) уровней секреции бета-гексозаминидазы тучными клетками линии RBL-2H3 как в присутствии активированного протеина С в концентрации 10 нМ, так и без него, для групп клеток без воздействия или с вызванной активацией (модель воспаления), или с экспериментальной гипергликемией, или с сочетанным действием данных факторов;
Подробное описание изобретения
Объекты исследования.
В экспериментах in vivo были использованы самцы крыс линии Wistar в возрасте 3-4 месяцев, массой 250-300 грамм. Животные содержались в виварии кафедры Физиологии человека и животных при температуре 23°С, стандартном суточном цикле освещенности (12 ч/12 ч), сухой корм и вода животным предоставлялись ad libitum. Все эксперименты с животными выполняли в соответствии с этическими принципами и нормативными документами, рекомендованными Европейским научным фондом (ESF) и Декларацией о гуманном отношении к животным.
Эксперименты in vitro были проведены на клетках линии RBL-2H3 (Rat Basophilic Leukemia cell line), культивируемых аналогах тучных клеток.
Модель экспериментального диабета, вызванного введением стрептозтоцина.
Экспериментальный диабет первого типа вызывали однократным введением стрептозотоцина (Sigma, США) интраперитонеально в дозе 60 мг/кг. Данная методика индукции диабета используется во многих исследованиях. Введение стрептозотоцина в перитонеальную полость вызывает увеличение концентрации глюкозы в крови до 25 мМ уже через 2 дня [Coutinho и др., 2014; Dashtban, Sarir, Omidi, 2016; Zhao и др., 2016] Раствор стрептозотоцина в концентрации 30 мг/мл готовили в 0,1 М цитратном буфере, рН 4,2, непосредственно перед введением. Животных лишали корма за 8 часов до введения раствора и на 4 часа после инъекции (суммарное время голодания - 12 часов). Контрольным животным вводили 0.2 мл цитратного буфера. Уровень глюкозы в крови измеряли через неделю после введения стрептозотоцина при помощи глюкометра (OK Biotech Co. Ltd, Тайвань). Животное считали вошедшим в диабет, если уровень глюкозы в крови превышал 16,7 мМ (300 мг/дл).
Модель острого перитонита, вызванного введением тиогликолата.
Экспериментальный перитонит вызывали однократным введением раствора тиогликолата (Sigma-Aldrich, США) в перитонеальную полость животного. Применение тиогликолата в качестве агента, вызывающего воспаление, описано в большом количестве исследований [Dugina и др., 2003; Hekking и др., 2003; Umarova и др., 2006]. Для приготовления 4% раствора тиогликолата использовали фосфатно-солевой буфер (PBS, Biorad, США) следующего состава (в мМ): 137 NaCl, 2,7 KCl, 10 Na2HPO4, 1,76 KH2PO4, рН 7.4. Перед добавлением к тиогликолату фосфотно-солевой буфер пропускали через антибактериальный фильтр (0,22 мкм, GE Water & Process Technologies, США) Раствор тиогликолата готовили непосредственно перед введением. Для индукции перитонита животным интраперитонеально вводили 5 мл, если масса животного не превышала 300 грамм, либо 10 мл (масса животного больше 300 грамм) раствора тиогликолата. Контрольные животные получали фосфатно-солевой буфер, пропущенный через антибактериальный фильтр, объем которого рассчитывался аналогично.
Метод выделения тучных клеток из брюшной полости крыс.
За основу методики выделения перитонеальных тучных клеток была взята технология выделения, описанная [, Thon, 1959] в модификациях [Babkina и др., 2015; Makarova и др., 2006; Бабкина и др., 2016]. Методика была частично изменена и адаптирована под настоящее исследование.
Животных наркотизировали хлороформом, декапитировали и обескровливали. В брюшную полость вводили 10 мл (через 24 часа после индукции воспаления) 145 мМ раствора NaCl, содержащего 10 мМ HEPES (рН 7.4), брюхо мягко массировали 1-2 мин. Перитонеальную жидкость собирали, клетки помещали в лед на время проведения работы, а затем центрифугировали в течение 5 мин при 157 G, предварительно отобрав 10 мкл для покраски и подсчета клеток. Супернатант отбрасывали, осадок суспендировали в 2 мл буфера. Тучные клетки животных без воспаления очищали на двухступенчатом градиенте фиколла (35% и 25%) центрифугированием при 4°С и 250 G в течение 10 минут. Для выделения тучных клеток животных с вызванным перитонитом использовали градиент фиколла (28.6% и 21.8%), центрифугировали при 4°С и 294 G в течение 17 минут. Двухступенчатый градиент фиколла готовили следующим образом: на слой 35% фиколла (3 мл) наносили 2 мл 25% фиколла, растворенного в Na-HEPES буфере (рН 7.4), содержащего 145 мМ NaCl, сывороточный альбумин (1 мг/мл) и глюкозу (2 мг/мл). Градиент фиколла 28.6% и 21.8% готовили аналогично. Пул тучных клеток при центрифугировании концентрируется на границе раздела растворов фиколла. Клетки осторожно собирали пипеткой из 25% фиколла, переносили в пробирку со сбалансированным раствором (5 мл) и промывали. Сбалансированный раствор (рН 7.4) использовали следующего состава (в мМ): NaCl 145, HEPES 10, KCl 5, CaCl2 1, MgCl2 1, глюкозы 5, 0.1% сывороточного альбумина. После каждого промывания клетки центрифугировали по 10 мин при 250, 210 и 174 G соответственно. Осадок тучных клеток после последнего промывания ресуспендировали в малом объеме сбалансированного раствора (0,5 мл). Подсчет тучных клеток проводили в камере Горяева, предварительно окрашивали клетки толуидиновым синим. Краситель смешивали с суспензией клеток в соотношении 1:1. После 10 минут подсчитывали количество клеток в пяти больших квадратах. По формуле n(кл/мл)=N*50*2*1000, где N - количество клеток в пяти больших квадратах, рассчитывали концентрацию клеток в полученной суспензии. После подсчета клеточную взвесь разделяли на пробы и разводили сбалансированным раствором, исходя из необходимого количества клеток в эксперименте.
Экспериментальное воздействие.
После подсчета концентрации выделенных тучных клеток их распределяли по отдельным пробам по 50 тыс. клеток на пробу (объем пробы составлял 250 мкл). Для оценки влияния агонистов PAR-1 на функционирование тучных клеток их инкубировали в течение 1 часа при 37°С в присутствии АПС (10 нМ) и тромбина (50 нМ и 100 нМ). После добавления агонистов пробы перемешивали. В контрольную пробу агонистов не добавляли. После инкубации с агонистами PAR-1 пробы ставили в лед на 10 минут, затем центрифугировали при 157 G в течение 5 минут для того, чтобы осадить клетки. Супернатант отбирали для последующей оценки выделившихся β-гексозаминидазы и гистамина. Отобранные образцы до начала анализа помещали в лед или замораживали при - 20°С, если анализ проводили в другой день. Для разрушения клеток их ресуспендировали в 0,1% растворе Тритона Х-100, приготовленном на сбалансированном растворе (см. метод выделения тучных клеток). Клетки инкубировали с Тритоном в течение 15 минут при 37°С, а затем центрифугировали при 1576 G в течение 10 минут. Супернатант отбирали для оценки оставшихся в клетках β-гексозаминидазы и гистамина. Отобранные образцы замораживали при -20°С, если анализ проводили в другой день.
Метод определения β-гексозаминидазы, секретируемой перитонеальными тучными клетками и клетками линии RBL-2H3.
Для определения β-гексозаминидазы использовали метод, предложенный [Schwartz, Austen, Wasserman, 1979], в нашей модификации. Степень секреции перитонеальных тучных клеток и клеток линии RBL-2H3 определяли по расщеплению специфического хромогенного субстрата - 4-нитрофенил-N-ацетил-β-D-глюкозаминида. Субстрат в концентрации 4 мМ, растворенный в 0,04 М цитратном буфере (рН 4.5), содержащем 0.9% NaCl добавляли в соотношении 1:1 к полученным образцам. Инкубацию с субстратом проводили в 96-луночном плейте в течение 2 часов при температуре 40°С. Реакцию останавливали добавлением равного объема 0.2 М Глицин-NaOH (рН 10.7) буфера. После добавления стоп-реагента раствор получал ярко-желтую окраску, интенсивность которой была пропорциональна содержащемуся в нем количеству β-гексозаминидазы. Оптическую плотность образцов измеряли на спектрофотометрически измеряли на иммуноферментном анализаторе «Униплан» АИФР-01 (ЗАО «Пикон», Россия) при λ=405 нм.
Количество секретированной β-гексозаминидазы выражали в процентном отношении фермента в данной аликвоте клеток и вычисляли по формуле:
УО=X/(X+Y)*100%, где УО - уровень секреции, X - оптическая плотность образца, содержащего фермент, выделившийся во время инкубации клеток с агонистами, Y - оптическая плотность образца, содержащего фермент, выделившийся после разрушения клеток.
Ведение клеточной линии RBL-2H3.
В работе были использованы клетки линии RBL-2H3 - культивируемые аналоги тучных клеток. Эта линия клеток была получена из крыс линии Вистар с химически индуцированной базофильной лейкемией. Клетки обладают способностью к дегрануляции, т.е. высвобождению ряда веществ, связанных с иммунными реакциями (гистамин, β-гексозаминидаза) и используются в качестве культивируемых аналогов тучных клеток [Baumgartner и др., 1994; Wolfe и др., 1996].
2
Клетки выращивали на культуральных матрасах 25 см на среде α-МЕМ (ПанэКо, Россия), содержащей 0,5 mM L-glutamine, 10% инактивированную эмбриональную бычью сыворотку (HI-FBS) и 100 U/mL пенициллина/стрептомицина ("Gibco", США). Клетки пассировали один раз в три дня, кратность рассева 1:4-1:8. Пересев клеток производили следующим образом: полностью сливали культуральную среду, заменяя ее на раствор Версена (ПанэКо, Россия). После двукратной промывки клеток, полностью сливали раствор и заливали по 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА (Sigma) и оставляли в инкубаторе при 37°С на 7 минут. Далее добавляли до 5 мл среды α-МЕМ, суспендировали, смывая клетки со стенки матраса. После чего полностью отбирали клеточную суспензию и 1/4 часть суспензии возвращали обратно на матрас. Оставшуюся часть клеток рассеивали на 96- и 48-луночные плейты и на стекла (glassbottom) для дальнейших экспериментов. В дальнейшем клетки линии RBL-2H3 росли в инкубаторе при 37°С и 5% CO2; смену среды производили раз в 2-3 дня. За 24 часа перед экспериментом среду в плейтах заменяли на бессывороточную. После 15-18 пассажей, способность к дегрануляции (секреции гистамина) уменьшается.
По окончании всех экспериментов клетки подвергли криоконсервации в ростовой среде, содержащей 5-8% DMSO, по 2×106 клеток в ампуле. Жизнеспособность после криоконсервации 80% (окраска трипановвым синим на нулевом пассаже).
Экспериментальное воздействие на клетки линии RBL-2H3.
Моделирование экспериментальной гипергликемии осуществляли выращиванием клеточной культуры в среде, содержащей глюкозу в концентрации 4.5 г/л (25 мМ), в течение всего времени эксперимента (>4 дней). Контрольную группу клеток содержали в среде с концентрацией глюкозы 1 г/л (5,5 мМ). Воспаление моделировали инкубацией клеток с форболовым эфиром (РМА) в концентрации 50 нМ и кальциевым ионофором (А23187) в концентрации 50 нМ в течение 24 часов при температуре 37°С. Для оценки влияния АПС и тромбина на уровень секреции клеток RBL-2H3 в течение часа при 37°С проводили их инкубацию с исследуемыми веществами. После инкубации клетки помещали на лед для остановки реакции. Последующий анализ высвобождения β-гексозаминидазы проводили аналогично описанному выше протоколу для тучных клеток.
Статистическая обработка данных.
Статистический анализ проводили, используя программу GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Исключение выпадающих значений проводили на основе теста ROUT (Q=1%). Для проверки распределений на нормальность использовали тесты D'Agostino & Pearson normality test и Shapiro-Wilk normality test. В случае, если количества полученных значений не было достаточно для проведения теста на нормальность, распределение считали нормальным. В литературе присутствует большое количество данных, указывающих на то, что при больших выборках величина секреции тучными клетками как гистамина, так и β-гексозаминидазы имеет нормальное распределение. [Умарова и др., 2011; Tang, 2012; Fukuishi и др., 2014] Данные текущего исследования представляли как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Число n в каждой группе - количество независимых экспериментов. Различия между группами считали при помощи Т-теста для несвязанных выборок, применяя поправку Уэлча (Welch's correction) при неравенстве дисперсий выборок, или однофакторного дисперсионного анализа (one-way ANOVA) с поправкой Даннетта (Dunnett) для множественных сравнений. Различия считали достоверными при р<0,1.
Список статей
1. Бабкина И.И. и др. Новый синтетический пептид защищает нейроны от гибели, вызванной токсическим воздействием активированных тучных клеток, через рецептор, активируемый протеазами // Биологические мембраны Журнал мембранной и клеточной биологии. 2016. Т. 33. №1. С. 70-79.
2. Воложин А.И. Патофизиология / под ред. А.И. Воложин, Г.В. Порядин., М.: Академия, 2006. С. 256.
3. Умарова Б.А. и др. Влияние пептида PGP на секрецию β-гексозаминидазы и гистамина перитонеальными тучными клетками крыс in vitro // Биологические мембраны. 2011. Т. 28. №4. С. 262-266.
4. Babkina I. et al. Anti-inflammatory effect of non-canonical peptideagonist of Par-1 on rat mast cells resembles activated protein С action // J. Thromb. Haemost. 2015. T. 13. C. 613.
5. Baumgartner R. et al. Studies with transfected and permeabilized RBL-2H3 cells reveal unique inhibitory properties of protein kinase С gamma. // Mol. Biol. Cell. 1994. T. 5. №4. C. 475-484.
6. Cohen AD et al., Psoriasis and the metabolic syndrome. Acta dermatovenereologica. 2007 Oct 15; 87(6): 506-9.
7. Coutinho D.C.O. et al. Activation of angiotensin-converting enzyme 2 improves cardiac electrical changes in ventricular repolarization in streptozotocin-induced hyperglycaemic rats // Europace. 2014. T. 16. №11. C. 1689-1696.
8. Dashtban M., Sarir H., Omidi A. The effect of Prosopis farcta beans extract on blood biochemical parameters in streptozotocin-induced diabetic male rats. // Adv. Biomed. Res. 2016. T. 5. №1. C. 116.
9. Donath M., Shoelson S. Type 2 diabetes as an inflammatory disease // Nat. Rev. Immunol. 2011. V. 11. P. 98-107.
10. Dugina T.N. et al. Activation of mast cells induced by agonists of proteinase-activated receptors under normal conditions and during acute inflammation in rats // Eur. J. Pharmacol. 2003. T. 471. №2. C. 141-147.
11. Fowler M.J. Microvascular and Macrovascular Complications of Diabetes // Clin. Diabetes. 2008. V. 26. P. 77-82.
12. Fukuishi N. et al. Does β-Hexosaminidase Function Only as a Degranulation Indicator in Mast Cells? The Primary Role of β-Hexosaminidase in Mast Cell Granules. // J. Immunol. 2014. T. 193. №4. C. 1886-94.
13. Hekking L.H.P. et al. Mesothelial cell transplantation in models of acute inflammation and chronic peritoneal dialysis. // Petit. Dial. Int. 2003. T. 23. №4. C. 323-30.
14. Makarova A.M. et al. Effect of activated protein С on secretory activity of rat peritoneal mast cells // Bull. Exp. Biol. Med. 2006. T. 142. №4. C. 403-405.
15. Mosnier L., et al. Biased agonism of protease-activated receptor 1 by activated protein С caused by noncanonical cleavage at Arg46 // Blood. 2012. V. 120. P. 5237-5246.
16. Nagai K., et al. High glucose increases the expression of proinflammatory cytokines and secretion of TNFα and β-hexosaminidase in human mast cells // Eur. J. Pharmacol. 2012. V. 687. P. 39-45.
17. Schwartz L.B., Austen K.F., Wasserman S.I. Immunologic Release of β-Hexosaminidase and β-Glucuronidase from Purified Rat Serosal Mast Cells // J. Immunol. 1979. T. 123. №4.
18. Shi M. a, Shi G.P. Different roles of mast cells in obesity and diabetes: lessons from experimental animals and humans // Front Immunol. 2012. V. 3. P. 1-7.
19. Silva E.Z.M. da, Jamur M.C., Oliver C. Mast Cell Function: A New Vision of an Old Cell // J. Histochem. Cytochem. 2014. V. 62. P. 698-738.
20. Soma J., Sugawara Т., Huang Y.-D., Nakajima J., Kawamura M. Tranilast slows the progression of advanced diabetic nephropathy. // Nephron. 2002. V. 92. P. 693-698.
21. Tang J.-M. Studies on the Degranulation of RBL-2H3 Cells Induced by Traditional Chinese Medicine Injections // Chin. Med. 2012. T. 03. №04. C. 200-208.
22. Umarova B.A. et al. The role of protective effects of proline-containing peptides (PGP, PG, and GP) in contractile dysfunction of mesenteric lymphatic vessels in rats with experimental acute peritonitis // Bull. Exp. Biol. Med. 2006. T. 142. №3. C. 279-282.
23.  В., Thon I.-L. Isolation of "biologically intact" mast cells // Exp. Cell Res. 1959. Т. 18. №3. C. 512-520.
24. Wang A.L., et al. AGEs mediated expression and secretion of TNF alpha in rat retinal microglia // Exp. Eye Res. 2007. V. 84. P. 905-913.
25. Wolfe P.C. et al. Differential effects of the protein kinase С activator phorbol 12-myristate 13-acetate on calcium responses and secretion in adherent and suspended RBL-2H3 mucosal mast cells // J. Biol. Chem. 1996. T. 271. №12. C. 6658-6665.
26. Zhao J. et al. Thalidomide Promotes Morphine Efficacy and Prevents Morphine-Induced Tolerance in Rats with Diabetic Neuropathy // Neurochem. Res. 2016. T. 41. №12. C. 3171-3180.