Получение липосомальных форм модифицированных пиримидиновых нуклеозидов и изучение их антибактериальных свойств

Получение липосомальных форм модифицированных пиримидиновых нуклеозидов и изучение их антибактериальных свойств

И. Л. КАРПЕНКО', Г. М. СОРОКОУМОВА2, И. Г. СУМАРУКОВА3,

С. К. ГАЙДУКЕВИЧ2, М. А. ЗАРЕЦКАЯ2, О. В. ЕФРЕМЕНКОВА3*, Л. А. АЛЕКСАНДРОВА'

' Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН, Москва

2 Московский технологический университет, Институт тонких химических технологий, Москва

3 Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе, Москва

Development of Liposomal Forms of Modified Pyrimidine Nucleosides and Investigation of Their Antibacterial Properties

I. L. KARPENKO', G. M. SOROKOUMOVA2, I. G. SUMARUKOVA3, S. K. GAYDUKEVICH2, M. A. ZARETSKAYA2, O. V. EFREMENKOVA3, L. A. ALEXANDROVA'

' V. A. Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow

2 Moscow Technological University, Institute of Fine Chemical Technologies, Moscow

3 Gause Institute of New Antibiotics, Moscow

Созданы комплексы различного состава фосфохолин-кардиолипин-производные 2'-дезоксиуридина, что позволило получить водорастворимую форму аналогов нуклеозидов с установленной ранее противотуберкулёзной активностью. Установлено, что полученные липосомы эффективно проникают в клетки, а возрастание цитотоксичности, свидетельствует об увеличении накопления нуклеозида в клетках. Этот результат подтверждает возможность применения липосомальных форм для доставки малорастворимых соединений в клетки для дальнейшего изучения их эффективности. Показано, что введение модифицированных нуклеозидов в липосомальной форме в бактериальные клетки не влияет на рост последних.

Ключевые слова: липосомы, модифицированные пиримидиновые нуклеозиды, фосфолипиды, цитотоксичность, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium smegmatis.

Different phosphocholine-cardiolipin-2'-deoxyuridine inclusion complexes were developed, that allowed to compose a water-soluble form of nucleoside analogues with previously defined antituberculosis activity. It was found that the resulting liposomes effectively penetrated to the cells. The increase of cytotoxicity was undoubtedly indicative of accumulation of the nucleoside in the cell culture. The result proved the ability of the liposomes for delivery of the low-soluble compounds to the cells for further investigation of their efficacy. It was shown that treatment of the bacterial cells with the liposomes of the modified nucleosides did not affect the bacterial growth.

Key words: liposomes, modified pyrimidine nucleosides, phospholipids, cytotoxicity, Mycobacterium tuberculosis, M.smegmatis.

Введение

Согласно статистическим данным, в Российской Федерации наблюдается высокий уровень заболевания туберкулёзом [1]. Интенсивное применение в терапии туберкулёза препаратов первого и второго рядов привело к возникновению большого количества штаммов Mycobacterium tuberculosis, обладающих либо множественной (МЛУ) либо широкой (ШЛУ) лекарственной устойчивостью к препаратам и, вследствие этого, к значительным осложнениям при лечении [2]. В

© Коллектив авторов, 2016

Адрес для корреспонденции: ФГБНУ «НИИНА», Москва 119021, ул. Б. Пироговская, 11. НИИНА им. Г. Ф. Гаузе. E-mail: ovefr@yandex.ru.

связи с этим чрезвычайно актуальными являются как поиск новых лекарственных препаратов, активных в отношении резистентных штаммов патогена, так и разработка эффективных способов их доставки.

Липосомы представляют собой замкнутые сферические структуры, содержимое которых отделено от окружающей среды фосфолипидным бислоем. Важным достоинством липосомальных форм лекарственных соединений является возможность осуществления внутриклеточной доставки малорастворимых лекарственных субстанций. Липосомы (как мультиламмелярные, так и одноламмелярные везикулы) активно используются в лекарственных формах уже существующих противотуберкулёзных препаратов, в частности, в

аэрозолях [3—6]. Поскольку природные фосфо-липиды активируют антимико бактериальный врождённыш иммунный ответ [3], липосомаль-ные формы препаратов часто более эффективны, чем водные растворы или таблетированные формы последних [6]. Включение препаратов в липо-сомы приводит к увеличению растворимости и улучшению фармакокинетических характеристик, позволяющему понизить применяемую дозу препарата. Для противотуберкулёзных лекарственный препаратов показано также, что включение их в липосомы снижает токсичность, позволяет пролонгировать их действие и обеспечивает доставку препарата в инфицированные макрофаги организма хозяина, которые способны к слиянию с липосомами [7—10]. В отечественной и зарубежной литературе приводятся варианты эффективных липосомальных лекарственных форм для рифампицина и изониазида [10—13], а также и для рифабутина [14].

Аналоги нуклеозидов успешно применяются для терапии вирусныгх инфекций (ВИЧ, герпеса, гепатитов и др.) [15]. В начале этого столетия была впервые продемонстрирована их способность ингибировать рост микобактерий (в том числе M.tuberculosis) in vitro [16], а затем показано подавление роста M.tuberculosis отрицательно-заряженными фосфолипидами (ОЗФ) [17, 18]. Весьма перспективным в этой связи представляется объединение этих двух подходов.

Целью данной работы являлось изучение влияния ОЗФ в составе липосом на антибактериальную активность и цитотоксичность последних, а также получение липосомальных форм модифицированных пиримидиновых нуклеозидов, обладающих противотуберкулёзной активностью, и определение вносимых ими изменений в эти показатели.

Материал и методы

Объект исследования. Объектами исследования быши 5-ал-килоксиметильные и (4-алкил-1,2,3-триазол-1-ил)-метильные производные 2'-дезоксиуридина (рис.1), синтезированные по описанным методикам [19, 20]; большие одноламеллярные везикулы (БОЛВ) на основе фосфолипидов (ФЛ) и комплексы, образуемые за счёт включения аналогов нуклеозидов в состав БОЛВ. Для создания БОЛВ применяли фосфатидилхолин (ФХ) из сои — LipoidS 100 (LipoidGmbH, Германия) 97% чистоты; отрицательно заряженные фосфолипиды (ОЗФ) — фосфа-тидную кислоту (ФК) и фосфатидил глицин (ФГ), полученные методом перефосфатидилирования ФХ [21], динатриевую соль кардиолипина (КЛ) из сердца крупного рогатого скота, (AvantiPolarLipids, США). Использовали БОЛВ, образованные различно заряженными липидами в соотношениях 4:1, 2:1; 1:1; 1:2 и 1:4 и БОЛВ на основе ФХ и флуоресцентномеченного ФХ (1-олеоил-2-[12-[(7-нитро-2-1,3-бензоксидиазол-4-ил)ами-но]додеканоил]^п-глицеро-3-фосфохолина (NBD PC Ex/Em 460/534 нм) в соотношении 19:1

Оборудование Липосомы получали при помощи экстру-дера LiposoFast-Basic (Avestin, Inc., США) с двумя микрошприцами (Hamilton, Швейцария) на 1 мл каждый, с использованием поликарбонатных фильтров Nuclepore (Whatman, США) с диаметром пор 100 нм.

Гель-фильтрацию проводили на колонке illustra NAP 5 Sephadex G-25 DNAGrade (GEHealthcare, Великобритания).

Спектры в видимой и ультрафиолетовой областях регистрировали на спектрофотометре UV 1700 PharmaSpec (Shimadzu, Япония).

Результаты МТТ-теста определяли на планшетном риде-ре Chameleon

Штаммы микроорганизмов. В качестве тест-штаммов для определения антимикробной активности использовали 3 коллекционных штамма бактерии Mycobacterium smegmatis ВКПМ Ac 1339; Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

Культуры клеток. Для определения цитотоксичности производных 2'-дезоксиуридина и фосфолипидов и изучения проникновения БОЛВ в клетки использовали перевиваемые культуры клеток: аденокарциномы лёгких А549 из коллекции ИМБ РАН и макрофаги мыши J774 из коллекции ИБХ РАН. Клетки выращивали в среде DMEM (Gibœ, Life Technologes, США) c 10% эмбриональной сывороткой телёнка (HyClone, Великобритания).

Получение БОЛВ. Навеску липида (ФХ, ФК, ФГ и КЛ) массой 20 мг растворяли в спирте и упаривали при 34°С. Полученную липидную пленку диспергировали в 1 мл фосфатно-со-левого буфера (рН 7,4) и перемешивали на Vortex до полного перехода липида со стенок колбы в водный раствор. В случае приготовления БОЛВ из ФК применяли технику четырёхкратного замораживания мультиламмелярных везикул МЛВ с помощью жидкого азота с последующим их оттаиванием. Далее методом экструзии дисперсии МЛВ через поликарбонатный фильтр с размером пор 100 нм получали липидные БОЛВ.

Липосомы с добавление флуоресцетномеченого фосфо-липида NBD-PC получали по вышеприведённой методике.

Стоковая концентрация всех исследованных липидов составляла 20 мг/мл.

Получение БОЛВ, содержащих C-5-модифицированные 2'-дезоксиуридины (НЗ). БОЛВ:НЗ получали экструзией дисперсии мультиламеллярных везикул, состоящих из различных липидов и модифицированных нуклеозидов, через поликарбонатные фильтры с диаметром пор 100 нм. Навеску 20 мг ФХ растворяли в этаноле и добавляли 200 мкл стокового раствора НЗ в этаноле (5 мг/мл). Смесь упаривали при температуре 34 °С. Далее получали БОЛВ из ФХ:НЗ (20 мг/мл ФХ:1 мг/мл НЗ) по вышеприведенной методике. Для определения концентрации и степени включения НЗ в липосомы проводили гель-фильтрацию липосомальных форм НЗ через колонку illustra NAP 5, заполненную сорбентом Sephadex G-25. На слой сорбента наносили 500 мкл образца БОЛВ с НЗ (0,5 мг НЗ). Фракции элюировали фосфатно-солевым буфером (pH 7,4), при этом НЗ в составе липосом выходил в первой фракции объёмом 1,5 мл (выход БОЛВ с колонки контролировали спектрофотометрически при длине волны 750 нм), а НЗ, не включившийся в липосомы — во второй фракции объёмом 1,5 мл (отсутствие липосом во фракции контролировали при длине волны 450 нм). Для определения степени включения НЗ в липосомы разрушали липосомальную фракцию этанолом, добавляя к 10 мкл фракции 990 мкл этанола. Полноту разрушения липосом контролировали спектрофотометричес-ки при длине волны 450 нм. Далее измеряли оптическую плотность разрушенной липосомальной фракции при длине волны 265—266 нм. Чтобы определить количество не включившегося в липосомы НЗ, измеряли оптическую плотность неразбавленной фракции при длине волны 276—279 нм. Затем рассчитывали степень включения и загрузку НЗ в липосомы.

Определение цитотоксического эффекта. Определение цитотоксичности проводили методом МТТ-теста [22] в трёх повторах. При определении цитотоксичности производных 2'-дезоксиуридина использовали их растворы в ДМСО в стоковой концентрации 20 мг/мл.

Определение локализации БОЛВ в культурах клеток. Для определения локализации БОЛВ в клетках использовали флуо-

Рис. 1. Структура 5-алкилоксиметильных (1) и 5 алкилтриазолилметильных (2) производных 2'-дезоксиури-дина.

ресцетномеченый фосфолипид NBD-PC. Липосомы, содержащие NBD-PC в концентрации 0,5 мг/мл добавляли к культурам клеток А549 и J774 и инкубировали в течение 20 ч. Далее культуру клеток промывали фосфатно-солевым буфером (рН 7,4), добавляли к клеткам среду DMEM без содержания фенолового красного и краситель NucBlue (30 мкл/мл среды), связывающийся с ядерной ДНК. Затем определяли локализацию липо-сом методом флуоресцентной микроскопии.

Определение антимикробной активности. Для стерилизации растворов использовали мембраны с диаметром пор 0,22 мкм MILLEXGP фирмы MILLIPORE IRELAND. В жидкую питательную среду вносили 10%/об исходных растворов соединений. При выборе тест-штаммов для определения антибиотических свойств исследуемых веществ учитывали их способность расти в присутствии 10% указанной смеси (контроль роста). Эксперименты проводили в соответствии с ранее разработанными для каждого микроорганизма методиками [23].

Результаты и обсуждение

Как сообщалось нами ранее [16, 24, 25], 5-ал-килоксиметильные и (4-алкил-1,2,3-триазол-1-ил)-метильные производные 2'-дезоксиуридина (рис. 1) и 5-(1-алкинилильные) производные кар-боциклических нуклеозидов [26] проявили высокую противотуберкулёзную эффективность на двух штаммах M.tuberculosis — лабораторном H37Rv и клиническом изоляте с МЛУ MS-115 (устойчивом к действию 5 противотуберкулёзных

препаратов 1-й линии). Максимальная активность была показана для соединений 1с и 2Ь и составляла на обоих штаммах 10—20 мкг/мл. Было продемонстрировано также ингибирование роста ряда грамположительных бактерий и грибов [27].

Ранее нами было также показано [18], что отрицательно-заряженные фосфолипиды в высоких концентрациях (выше 335 мкМ) ингибируют рост и вызывают гибель клеток грамотрицатель-ных (Е.соН БЬ21(БЕ3) и грамположительных (ЫЛиЪггси1о$1$ И37Яу) бактерий. Мы полагали, что включение аналогов нуклеозидов в состав ли-посом позволит повысить их растворимость и, возможно, увеличить их биодоступность.

В настоящей работе были получены липосо-мы, сформированные на основе как положительно-заряженного фосфолипида (ФХ), так и ряда отрицательно-заряженных (ФК, ФГ, КЛ) фосфо-липидов, проварьировали соотношение ФХ:ОЗФ. Полученные образцы были охарактеризованы методом динамического и электрофоретического рассеяния света, при этом определяли гидродинамический диаметр наночастиц (ё), полидисперсность системы (РБ1) и дзета-потенциал (поверхностный заряд) липосом (табл. 1).

Таблица 1. Характеристика «пустых» БОЛВ различного липидного состава

Липидный состав БОЛВ Гидродинамический диаметр БОЛВ, нм Полидисперсность системы Дзета-потенциал БОЛВ

ФХ 151,2+42,3 0,142 - 1,52+0,8

ФК 135,5+33 0,127 - 36,4+2,5

ФГ 96+18,9 0,130 - 27,7+1,5

КЛ 124+24,2 0,102 - 43,3+3,1

ФХ/ФК (1:1) 145,5+33 0,130 - 20,5+2,6

ФХ/ФГ (1:1) 126,4+30 0,133 -18,3+2,4

ФХ/КЛ (1:1) 130,6+35 0,125 -22,8+2,5

Рис. 1. Проникновение БОЛВ состава ФХ^Вй-РС в культуру клеток А549.

а - клетки, содержащие БОЛВ-ФХ:ЫВЭ-РС; Ь - клетки, окрашенные ЫисВ!ие; с- наложение изображений с различным окрашиванием.

Анализ табл. 1, показывает, что все исследуемые БОЛВ представляют собой системы гомогенных наночастиц размером менее 200 нм, имеющие отрицательный заряд, не превышающий величины 46 мВ.

Проникновение липосом в культуры клеток А549 и 1774 (для последних результаты аналогичны и не представлены) и их локализацию определяли методом флуоресцентной микроскопии. Для этого были использованы БОЛВ, состоящие из ФХ и его флуоресцентномечено-го аналога: 1-олеоил-2-[12-[(7-нитро-2-1,3-бензоксидиазол-4-ил)амино] додеканоил] -вп-глицеро-3-фосфохолина (КББ-РС). При этом, наиболее контрастные изображения получались при соотношении ФХ^ББ-РС — 19:1 (рис. 2, a). Из рис. 2, a следует, что БОЛВ эффективно проникает в клетки, а применение красителя №сБ1ие, связывающегося с ядерной ДНК (рис. 2, Ь), позволило выявить локализацию БОЛВ в цитоплазме (рис. 2, с).

Существенной характеристикой соединений, применяемых в терапии, является их цитоток-сичность. Комплекс БОЛВ с НЗ мог существенно влиять на увеличение цитотоксичности как аналога нуклеозида, за счёт увеличения биодоступности, так и липосом, за счёт изменения ряда характеристик последних. Цитотоксичность синтезированных соединений определяли на культурах клеток А549 и 1774. Поскольку растворимость исследованных нами производных 2'-дезоксиуридина в воде составляет не более 1 мкг/мл, при проведении МТТ-теста и определении их активности на ряде патогенов были использованы растворы соединений в ДМСО. Значение ЦД50 составило >100 мкг/мл, что соответствует ЦД50, описанным в литературе соединениям, проявляющих антибактериальную активность [28].

Цитотоксичность БОЛВ из ФХ и БОЛВ смешанного состава также оценивали на культурах клеток А549 и 1774. БОЛВ из ФХ:ФЛ получали в четырёх различных соотношениях 2:1, 1:1, 1:2, 1:4 (табл. 2).

БОЛВ-ФХ в концентрациях 50—70 мкг/мл проявляли пролиферативный эффект, что подтверждает литературные данные и результаты, полученные нами на предварительном этапе работы. При соотношении ФХ:ОЗФ — 4:1, 2:1 и 1:1 также наблюдался пролиферативный эффект в диапазоне 70—300 мкг/мл концентраций, что видимо обусловлено высокой концентрацией ФХ (данные не приводятся).

Увеличение количества включённого отрицательно-заряженного фосфолипида хотя и приводило к возрастанию цитотоксичности, однако позволяло купировать пролиферацию клеток. Наиболее явно эта зависимость проявилась для

Таблица 2. Значения ЦД50 для трёх серий БОЛВ, включающих фосфатидилхолин

Культура клеток ФХ:ФГ, ФХ:ФК, ФХ:КЛ, ФХ

ЦЦ50*, мкг/мл ЦЦ50*, мкг/мл ЦЦ50*, мкг/мл ЦЦ50*, мкг/мл П/эф**

1:1 1:2 1:1 1:2 1:1 1:2 1:4

А549 J774 800 1000 800 1000 450 300 1000 450 600 1000 300 70 250 Н.о >400 30—60 >600 50—320

Примечание. * — ЦД50 - доза препарата, подавляющая рост неинфицированной культуры клеток на 50%; ** - про-лиферативный эффект (концентрации БОЛВ из ФХ, при которых наблюдается пролиферация клеток).

Таблица 3. Определение антибактериальной активности в отношении БОЛВ из ФХ:КЛ** на основе отрицательно-заряженных фосфолипидов на M.smegmatis, E.coli и P.aeruginosa

Тест-микроорганизмы Контроль * БОЛВ из ФХ:КЛ**, мкг/мл

250 500 750

M.smegmatis ВКПМ Ac 1339 + E.coli ATCC 25922 + P.aeruginosa ATCC 27853 +++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

Примечание. * - по 0,9 мл зараженной среды; 10 мг/мл. ** - исходная концентрация БОЛВ в физиологическом растворе -

Таблица 4. Характеристика полученных липосомальных форм НЗ

Состав ЛС Масса ФХ, мг Масса НЗ, мг Масса НЗ в ЛС, мг Степень включения, % Загрузка НЗ, %

ФХ:1

ФХ:2

20 20 40 80 20 30 80

0,94+0,03

3,68 0,78 0,88 3,6

94+3

препарат не формируется* препарат не формируется ** 92 78 88 90

4,7+0,2

4,6 3,9 2,9 4,5

Примечание. * - НЗ не растворяется; ** - НЗ выпадает в осадок.

БОЛВ из ФХ:КЛ. Поскольку, как указывалось выше, ранее была показана анти-микобактери-альная активность липосом на основе ОЗФ, в частности, кардиолипина [18], мы применили его для создания комплекса БОЛВ с НЗ.

Для изучения эффекта включения кардиоли-пина в состав БОЛВ мы определили активность БОЛВ из ФХ:КЛ состава 4:1 на двух различных бактериях — Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa и на непатогенном представителе микобак-терий — штамме Mycobacterium smegmatis, часто используемым в качестве модели при поиске антитуберкулёзных препаратов (табл. 3).

Показано, что БОЛВ (ФХ:КЛ) такого состава не подавляли рост испытанных микроорганизмов. Кроме того, рост M.smegmatis ВКПМ Ac 1339 и E.coli ATCC 25922 на средах со всеми тремя ли-посомами был эффективнее, по сравнению с контролем, что согласуется с пролиферативным эффектом, показанным на культурах клеток. Более того, на M.smegmatis наблюдалась зависимость доза — активность роста.

Вследствие полученных данных по токсичности и активности как липосом, так и производных 2'-дезоксиуридина при изучении эффективности БОЛВ, содержащих аналоги

нуклеозидов, мы использовали ФХ и КЛ в соотношениях 1:1, 1:2 и 1:4, в концентрациях выше 30 мкг/мл.

Исходя из данных по активности и цитоток-сичности нуклеозидов 1 и 2, их содержание в исходном комплексе должно было составлять не менее 1 мг/мл. Нашей задачей было определить концентрацию липида, позволяющего добиться оптимального включения вещества в БОЛВ (табл. 4).

Размер липосом, определённый методом динамического светорассеивания, составлял 200—235 нм. Из табл. 3 видно, что рассмотренные 5-модифицированные производные 2'-дез-оксиуридина хорошо включаются в БОЛВ из ФХ (степень включения находится в интервале от 78 до 97 %), причём оптимальное массовое соотношение липиды:НЗ составляет 20:1. При соотношениях липиды:НЗ (5:1 или 10:1 по массе) препарат НЗ на стадии получения водной дисперсии мультиламеллярных везикул не формировался. Часть НЗ не солюбилизирова-лась и оставалась в осадке.

При получении липосом на основе ФХ и КЛ в соотношении 2:1; 1:1; 1:2 и 1:4 по массе концентрация нуклеозида составляла 1 мг/мл, а количест-

20 30 40 50

Концентрация фосфатидилхолина, мг/мл

Рис. 3. Эффективности включения производных 2-дезоксиуридина в БОЛВ при соотношении ФХ:КЛ 2:1.

во липида варьировали для того, чтобы добиться максимального включения вещества в липосомы (полученные данные представлены на рис. 3).

Результаты эксперимента показали, что во всех исследованных вариантах, оптимальным по эффективности включения модифицированного нуклеозида в липосомы было соотношение ФЛ:НЗ 20:1. При этом увеличение доли отрицательно заряженных фосфолипидов не приводило к существенному увеличению включения модифицированных нуклеозидов в липосомы.

Цитотоксичность синтезированных комплексов оценивали методом МТТ-теста на культурах клеток A549. Включение слабо растворимых аналогов нуклеозидов в состав липосомальных комплексов увеличивало степень их проникновения и накопления в культурах клеток, что приводило к уменьшению цитотоксической дозы как фос-фолипида, так и аналога нуклеозида. Для комплекса, содержащего ФХ:КЛ в соотношении 1:1 с включённым аналогом нуклеозида, значение ЦД50 достигалось при концентрации ФХ:КЛ 500

ЛИТЕРАТУРА

1. Couvin D., Rastogi N. Tuberculosis — A global emergency: tools and methods to monitor, understand, and control the epidemic with specific example of the Beijing lineage. Tuberculosis (Edinb). 2015; 95: Suppl 1: S177—189.

2. TBDRUGS (Database of Drugs for Tuberculosis, version 1.0). Available from URL: http://bic.icmr.org.in/tbdrugs/tb_browse_name.php

3. Greco E. Santucci M.B., Sali M., De Angelis F.R., Papi M., De Spirito M., Delogu G., Colizzi V., Fraziano M. Natural lysophospholipids reduce Mycobacterium tuberculosis-induced cytotoxicity and induce anti-mycobacterial activity by a phagolysosome maturation-dependent mechanism in A549 type II alveolar epithelial cells. Immunology 2010; 129: 125—132.

4. Greco E., Quintiliani G., Santucci M.B., Serafino A., Ciccaglione A.R., Marcantonio C., Papi M., Maulucci G., Delogu G., Martino A., Goletti D., Sarmati L., Andreoni M., Altieri A., Alma M., Caccamo N., Di Liberto D., De Spirito M., Savage N.D., Nisini R., Dieli F., Ottenhoff T.H, Fraziano M. Janus-faced liposomes enhance antimicrobial innate immune response in Mycobacterium tuberculosis infection PNAS 2012; 109: 21: E1360—1368.

5. Delogu G., Sali M., Rocca S., Quintiliani G., Santucci M.B., Greco E., Cabibbo A, Mariani F., Colizzi V., Fadda G., Fraziano M. Lysophosphatidic

мкг/мл и содержании НЗ 25 мкг/мл. Увеличение уровня кардиолипина в БОЛВ до 1:2 и 1:4 приводило к увеличению цитотоксичности до концентраций 250 мкг/мл ФХ:КЛ: 12,5 мкг/мл НЗ и 200 мкг/мл ФХ:КЛ: 10 мкг/мл НЗ, соответственно.

Изучение антибактериальной активности полученных липосомальных комплексов, содержащих производные 2'-дезоксиуридина, проведённое на различных тест-штаммах бактерий (Е.еоН, Р.авгщтоза и M.smegmatis) практически соответствовало данным, приведённым в табл. 3, что показывает отсутствие ингибирую-щего действия липосомальных комплексов на данные бактерии.

Заключение

Таким образом, созданы комплексы различного состава фосфохолин-кардиолипин—произ-водные 2'-дезоксиуридина, что позволило получить водорастворимую форму аналога нуклеозида. Показано, что образованные липосомы эффективно проникают в клетки, а возрастание цитотоксичности свидетельствует об увеличении накопления нуклеозида в клетках. Этот результат подтверждает возможность применения липосомальных форм для доставки малорастворимых соединений в культуры клеток для дальнейшего изучения их эффективности. Однако введение в бактериальные клетки модифицированных нуклеозидов с установленной противотуберкулёзной активностью в липосомальной форме никак не влияло на рост последних. Возможным объяснением этого явления может быть наличие двух противоположных эффектов — ингибирования роста нуклеозидами и стимуляция роста фосфолипидами. Наложение этих факторов может приводить к кажущемуся отсутствию влияния нуклеозидов на рост клеток.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ №15-04-05116 и №14-04 00755.

acid enhances antimycobacterial response during in vivo primary Mycobacterium tuberculosis infection. Cell Immunol 2011; 271: 1—4.

6. Misra A., HickeyA.J., Rossi C., Borchard G., Terada H., Makino K., Fourie P.B., Colombo P. Inhaled drug therapy for treatment of tuberculosis.Tuberculosis (Edinb). 2011; 91: 1: 71—81.

7. Pandey R., Khuller G.K. Antitubercular inhaled therapy: opportunities, progress and challenges. J Antimicrob Chemother. 2005; 55: 4: 430—435.

8. Khuller G.K., Kapur M., Sharma ¿.Liposome technology for drug delivery against mycobacterial infections. Curr Pharm Des 2004; 10: 26: 3263— 3274.

9. Pandey R., Sharma S., Khuller G.K. Oral solid lipid nanoparticle-based antitubercular chemotherapy. Tuberculosis (Edinb) 2005; 85: 5—6: 415— 420.

10. Vyas S.P., Kannan M.E., Jain S., Mishra V., Singh P. Design of liposomal aerosols for improved delivery of rifampicin to alveolar macrophages. Int J Pharm 2004; 269: 1: 37—49.

11. Курунов Ю.Н., Каледин В.И., Попова H.A., Пантелеева А.Г.Эффек-тивность липосомальной формы рифампицина при лечении экспериментального туберкулёза мышей. Проблемы туберкулёза. 1992; 1—2: 13—15. / Kurunov Ju.N., Kaledin V.I., Popova N.A., Panteleeva A.G. Jeffektivnost' liposomal'noj formy rifampicina pri lechenii jeksperimen-

tal'nogo tuberkuljoza myshej. Problemy tuberkuljoza. 1992; 1—2: 13—15. [in Russian]

12. Гуревич Г.Л., Березовская Л.Н., Мануйлов К.К. Особенности фарма-кокинетики рифампицина, включенного в липосомы, у крыс при внутритрахеальном введении Антибиотики и химиотер 1992; 37; 7: 25—28. / Gurevich G.L., Berezovskaja L.N., Manujlov K.K. Osobennosti farmakokinetiki rifampicina, vkljuchennogo v liposomy, u krys pri vnutri-traheal'nom vvedenii Antibiotiki i khimioter 1992; 37; 7: 25—28.

13. Labana S, Pandey R, Sharma S., Khuller G.K. Chemotherapeutic activity against murine tuberculosis of once weekly administered drugs (isoni-azid and rifampicin) encapsulated in liposomes. Int J Antimicrob Agents 2002; 20: 4: 301—304.

14. Gaspar M. M, Neves S, Portaels F, Pedrosa J, Silva M. T, Cruz M. E. Therapeutic efficacy of liposomal rifabutin in a Mycobacterium avium model of infection.Antimicrob Agents Chemother 2000; 44: 9: 2424—2430.

15. De ClercqE.Human viral diseases: what is next for antiviral drug discovery? Curr Opin Virol 2012; 2: 572—579.

16. Шмаленюк Э. P., Кочетков С. H, Александрова Л. А. Новые ингибиторы роста M.tuberculosis на основе модифицированных пиримиди-новых нуклеозидов и их аналогов. Успехи химии 2013; 82: 896—915. / Shmalenjuk Je. R, Kochetkov S. N, Aleksandrova L. A. Novye ingibitory rosta M.tuberculosis na osnove modificirovannyh pirimidinovyh nukleozi-dov i ih analogov. Uspehi himii 2013; 82: 896—915. [in Russian]

17. Андреевская С.Н., Смирнова Т.Г., Жогина Ю.А., Смирнова .И., Мику-лович Ю.Л., Сорокоумова Г.М., Черноусова Л.Н., Селищева А.А., Швец В.И. Влияние экзогенного кардиолипина на рост и жизнеспособность Mycobacterium tuberculosis H37Rv in vitro. Доклады Академии наук 2010; 434: 5: 705—708. / Andreevskaja S.N., Smirnova T.G., Zhogina Ju.A, Smirnova T.G., Mikulovich Ju.L, Sorokoumova G.M., Chernousova L.N., Selishheva A.A., Shvec V.I. Vlijanie jekzogennogo kardiolipina na rost i zhiznesposobnost' Mycobacterium tuberculosis H37Rv in vitro. Doklady Akademii nauk 2010; 434: 5: 705—708. [in Russian]

18. Sosunov V., Mischenko V., Eruslanov B, Svetoch E, Shakina Y, Stern N.,Majorov K, Sorokoumova G, Selisheva A., Apt A. Activity of bacteri-ocins and their complexes with liposomes. J Antimicrob Chemother 2007; 59: 5: 919—925.

19. Иванов М.А., Карпенко И.Л., Черноусова Л. Н, Андреевская С.Н., Смирнова Т.Г., Александрова Л.А. Синтез и биологические свойства 5'-арилфосфонатов а-тимидинаБиоорган. Химия 2013; 39: 6: 718— 727. / Ivanov M.A., Karpenko I.L., Chernousova L. N, Andreevskaja S.N., Smirnova T.G., Aleksandrova L.A. Sintez i biologicheskie svojstva 5'-arilfos-fonatov а-timidinaBioorgan. Himija 2013; 39: 6: 718—727. [in Russian]

20 Шмаленюк Э.Р., Карпенко И.Л., Черноусова Л.Н., Чижов А.О., Смирнова Т.Г., Андреевская С.Н., Александрова Л.А. Новые 5-модифици-рованные производные 2'-дезоксиуридина: синтез и противотуберкулезная активность. Известия Академии наук. Серия химическая. 2014; 5: 1197-1200. / Shmalenjuk Je.R, KarpenkoI.L., ChernousovaL.N.,

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:

Карпенко И.Л. — с.н.с. ФГБНУ «Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН , Москва Сорокоумова Г.М. — к.х.н., доцент кафедры биотехнологии и бионанотехнологии ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий им. М. В. Ломоносова», Москва

Сумарукова И.Г. — н.с., ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе», Москва

Chizhov A.O., Smirnova T.G., Andreevskaja S.N., Aleksandrova L.A. Novye 5-modificirovannye proizvodnye 2'-dezoksiuridina: sintez i protiv-otuberkuleznaja aktivnost'. Izvestija Akademii nauk. Serija himicheskaja. 2014; 5: 1197—1200. [in Russian]

21. Бергельсон Л.Д., Дятловицкая Э.В., Молотковский Ю.Г. Препаративная химия липидов. Под ред. Л.Д. Бергельсон, Э.В. Дятловицкая. М.: Наука, 1981; 259. / Bergel'son L.D., Djatlovickaja Je.V, Molotkovskij Ju.G. Preparativnaja himija lipidov. Pod red. L.D. Bergel'son, Je.V. Djatlovickaja. M.: Nauka, 1981; 259. [in Russian]

22. Niks M, Otto M. Towards an optimized MTT assay. J Immunol Methods. 1990; 130: 1: 149—151.

23. Маланичева И.А., Козлов Д.Г., Сумарукова И.Г., Ефременкова О.В., Зенкова В.А., Катруха Г.С., Резникова М.И., Тарасова О.Д., Синеокий С.П., Эль-Регистан Г.И. Антимикробная активность представителей вида Bacillus megaterium. Микробиология 2012; 81: 2: 196—204. / Malanicheva I.A., Kozlov D.G., Sumarukova I.G., Efremenkova O.V., Zenkova V.A., Katruha G.S., Reznikova M.I., Tarasova O.D., Sineokj S.P., Jel'-Registan G.I. Antimikrobnaja aktivnost' predstavitelej vida Bacillus megaterium. Mikrobiologija 2012; 81: 2: 196—204. [in Russian]

24. Shmalenyuk E.R., Chernousova L.N., Karpenko I.L., Kochetkov S.N., Smirnova T.G., Andreevskaya S.N., Efremenkova O.V., Alexandrova L.A. Inhibition of Mycobacterium tuberculosis strains H37Rv and MDR MS-115 by a new set of C5 modified pyrimidine nucleosides. Bioorg.Med. Chem. 2013; 21: 4874—4884.

25. Александрова Л.А., Шмаленюк Э.Р., Кочетков С.Н., Ерохин ВВ., Смирнова Т.Г., Андреевская С.Н., Черноусова Л.Н. Новые 5 модифицированные пиримидиновые нуклеозиды — ингибиторы роста ми-кобактерий. Acta Naturae 2010; 3: 89—92. / Aleksandrova L.A., Shmalenjuk Je.R., Kochetkov S.N., Erohin V.V., Smirnova T.G. , Andreevskaja S.N., Chernousova L.N. Novye 5 modificirovannye pirimidi-novye nukleozidy — ingibitory rosta mikobakterij. Acta Naturae 2010; 3: 89—92. [in Russian].

26. Matyugina E, Khandazhinskaya ,A., Chernousova, L., Andreevskaya S., Smirnova T., Chizhov A., Karpenko I., Kochetkov S., Alexandrova L.The synthesis and antituberculosis activity of 5'-nor carbocyclic uracil derivatives. Bioorg Med Chem 2012; 20: 6680—6686.

27. Александрова Л.А., Ефременкова О.В., Андронова В.Л., Галегов Г.А., Сольев П.Н., Карпенко И.Л., Кочетков С.Н. (4-алкил-1,2,3-триазол-1-ил)метильные производные 2'-дезоксиуридина — ингибиторы роста бактерий и вирусов. Биоорган. Химия 2016; 42: 6: 746—754. / Aleksandrova L.A., Efremenkova O.V., Andronova V.L., Galegov G.A., Sol'ev P.N., Karpenko I.L., Kochetkov S.N. (4-alkil-1,2,3-triazol-1-il)metil'nye proizvodnye 2'-dezoksiuridina — ingibitory rosta bakterij i virusov. Bioorgan. Himija 2016; 42: 6: 746—754. [in Russian]

28. Rai D., Johar M, Manning T., Agraval B., Kunimoto D.Y., Kumar R. Design and studies of novel 5-substituted alkylpyrimidene nucleosides as potent inhibitors of mycobacteria. J med Chem. 2005; 48: 22: 7012—1017.

Гайдукевич С.К. — студент магистратуры ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий им. М. В. Ломоносова» Москва Зарецкая М.А.. — студент магистратуры ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий им. М. В. Ломоносова» Москва Ефременкова О.В. — руководитель сектора, ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе», Москва

Александрова JI.A. — с.н.с. ФГБНУ «Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН, Москва