СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ НЕВЫНАШИВАНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ РАННИХ СРОКОВ ИНФЕКЦИОННОГО ГЕНЕЗА
METHOD FOR PREDICTION OF EARLY INFECTIOUS MISCARRIAGE

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, и может быть использовано для прогнозирования угрозы прерывания и невынашивания беременности инфекционно-воспалительного генеза на ранних сроках.
Частота патологии невынашивания составляет от 15 до 25% от общего числа беременностей (Макаров О.В. и соавт., 2008), что приводит не только к медицинским, но и демографическим потерям - в России происходит ежегодно до 170000 самопроизвольных выкидышей, практически теряется каждая пятая беременность (Сидельникова В.М., 2007).
По данным R.L. Goldenberg с соавторами причиной 80% всех прерываний беременности в сроке до 30 недель является внутриматочная инфекция (Goldenberg R.L., Hauth J.C. et al., 2000). Бактериальная инфекция может проникать в плаценту при любом из различных путей инфицирования матки: восходящим путем из нижних отделов генитального тракта либо гематогенным путем (Goncalves L.F., Chaiworapongsa Т., Romero R., 2002).
Вышеизложенные данные о частоте невынашивания беременности и значении инфекционного фактора определяют необходимость разработки прогностических критериев угрозы прерывания беременности инфекционно-воспалительного генеза, что позволит снизить процент плодовых потерь за счет своевременного формирования групп риска и комплекса лечебно-профилактических мероприятий.
На сегодняшний день ранней диагностике и прогнозированию угрожающих состояний беременности посвящено значительное количество работ. При этом просматриваются два основных направления разрабатываемых методик: биохимические и иммунологические, с одной стороны, и инструментальные, с другой. При этом к инструментальным в основном относятся методы УЗИ.
Из первой группы методов известен способ прогнозирования угрозы прерывания беременности в ранние сроки путем определения в периферической крови концентрации фактора, угнетающего миграцию лейкоцитов, до и после однократной иммунизации донорскими лейкоцитами (патент РФ №2014598, 1994). Недостатками являются техническая сложность выполнения, а также невозможность динамического наблюдения за состоянием беременности с помощью этого метода.
Известен способ ранней диагностики невынашивания беременности путем определения в периферической крови относительного содержания нейтрофилов, имеющих на своей поверхности структуры, реагирующие с трофобластическим X-гликопротеидом (патент РФ №2077729, 1997).
Известен способ прогнозирования угрозы невынашивания беременности путем определения содержания периферических Т-лимфоцитов до и после инкубации с АМГФ (патент РФ №2077727, 1997). К недостаткам метода относятся его трудоемкость и неспецифичность.
Известен способ доклинического прогнозирования невынашивания беременности путем определения в плазме крови содержания фибрин-мономерных комплексов. По их величине прогнозируют прерывание беременности в I, II или III триместрах (патент РФ №2123698, 1998). К недостаткам метода относится его неспецифичность.
Известен способ прогнозирования угрозы прерывания беременности по определению концентрации эстриола, плацентарного лактогена и интерлейкина 6 в сыворотке крови (патент РФ №2285926, 2006). Недостатком данных способов является их трудоемкость.
Известен способ прогнозирования невынашивания беременности путем ультразвукового исследования органов малого таза и определения в сыворотке крови прогестерона, хорионического гонадотропина и уровня альфа-2-микроглобулина в сыворотке крови (патент РФ №2004135161, 2006). Недостатком данного способа является его неспецифичность.
Известен способ прогноза невынашивания беременности путем определения содержания цитокинов в периферической крови и слизи цервикального канала у женщин с невынашиванием беременности инфекционного генеза по уровню ИФН-γ и ИЛ-8 в периферической крови и слизи цервикального канала, повышение которых служит маркерами неблагополучия на ранних этапах беременности (Т.Н. Сумеди, Л.В. Ганковская, Е.Н. Долгина и др. Содержание цитокинов в периферической крови и слизи цервикального канала у женщин с невынашиванием беременности инфекционного генеза // Российский журнал иммунологии, 2005 г. - т. 9.- N2. - стр. 93-102). Недостатком данного способа является необходимость проведения исследования 2-х параметров как в периферической крови, так и в цервикальном канале.
Из вышеизложенного очевидно, что на сегодняшний день основными недостатками способов прогнозирования невынашивания беременности являются неспецифичность и трудоемкость.
Известен способ определения в сыворотке крови беременных с сексуально-трансмиссивными и условно-патогенными инфекциями ИЛ-12 и ИЛ-10 (О.В. Шитова, Э.Ю. Хагина, Н.А. Осна и др. Уровень ИЛ-10 и ИЛ-12 у беременных с сексуально-трансмиссивными и условно-патогенными инфекциями // Медицинская иммунология, 1999 г. - т.1. - N2. - cтp.94). Повышение уровня ИЛ-12 рассматривается авторами как фактор риска осложнений течения беременности. Однако в данной работе не даны практические рекомендации по прогнозированию невынашивания беременности. Другим недостатком данного способа является то, что для повышения точности прогнозирования исследуется 2 маркера ИЛ-10 и ИЛ-12.
Известен способ прогнозирования акушерской патологии, путем обследования беременной (патент №2339954, 27.11.2008), отличающийся тем, что в сыворотке крови женщины в 1 триместре беременности определяют содержание фактора роста плаценты (ФРП) и сосудисто-эндотелиального фактора роста (СЭФР) с последующим расчетом коэффициента их соотношения и при его величине, равной 2, прогнозируют синдром задержки роста плода (СЗРП); при величине, равной 3, прогнозируют гестоз; равной 4 - преждевременные роды.
Недостатки данного метода: сложность, возможность использования только в специализированных учреждениях на соответствующем оборудовании.
Данный способ принят нами за прототип.
Указанные недостатки устраняются в заявляемом способе.
Задача изобретения - разработать простой, эффективный способ прогноза неблагоприятного исхода угрожающего прерывания I триместра беременности воспалительно-инфекционной этиологии для назначения своевременных лечебных мероприятий.
Поставленная задача решается тем, что в крови беременной в ранние сроки определяют уровень sFlt-1. При уровне в сыворотке крови sFlt-1 0,389 нг/л и ниже прогнозируют в ранние сроки беременности развитие угрожающих явлений течения беременности, с неблагоприятным исходом.
Заявляемый способ позволяет повысить чувствительность и специфичность выявления признаков невынашивания в ранние сроки. Нами выявлен маркер, позволяющий с высокой чувствительностью (88,24%) и специфичностью (77,78%) прогнозировать развитие угрозы прерывания беременности инфекционно-воспалительного генеза на доклиническом уровне в ранние сроки. Это позволит своевременно назначить превентивное лечение и, тем самым, снизить процент невынашивания.
Наличие у беременной урогенитальной инфекции многими авторами рассматривается как фактор риска развития фетоплацентарной недостаточности (Тютюнник В.Л., 2002). Воспалительные заболевания органов малого таза имеют особое значение в генезе невынашивания беременности. Их частота у пациенток с данной патологией достигает 55-77% (Краснопольский В.И. и соавт., 2004). К особенностям акушерско-гинекологических инфекций в современных условиях следует отнести преобладание условно-патогенных микроорганизмов - нормальных представителей аутофлоры, при этом анаэробная флора (бактероиды, пептококки, пептострептококки) нередко выявляется в ассоциации с аэробами (энтерококки, кишечная палочка) (Радзинский В.Е., Димитрова В.И., 2009).
Развивающиеся при внутриутробном инфицировании воспалительные изменения в плаценте способствуют нарушению созревания ворсин, возникновению очагов хорионамнионита, базального децидуита, приводят к комплексу изменений в фетоплацентарной системе, вызывая хроническую гипоксию плода и задержку его роста. Персистируя длительное время, бактериальная инфекция может приводить к изменению ангиогенной структуры инфицированных клеток за счет собственно инфекционных антигенов, включаемых в структуру поверхностных мембран, так и за счет образования новых клеточных антигенов, детерминированных клеточным геномом (Макацария А.Д., Долгушина Н.В. и соавт., 2002). Срыв адаптационно-компенсаторных механизмов при реализации инфекции сопровождается развитием деструктивных процессов и, как следствие, накоплением продуктов нарушенного метаболизма и жизнедеятельности микробов и токсинов. Воспалительный фактор повреждает клетки и ткани, приводит к нарушению их жизнедеятельности, что сопровождается активацией и высвобождением протеиназ, увеличением концентрации продуктов перекисного окисления липидов и свободных жирных кислот, гипоксией (Кан Н.Е., 2004). Повреждение эмбриона инфекционным агентом на 4-12 неделях беременности связано с проникновением микроорганизмов через хорион, сопровождающееся эмбриотоксическим и тератогенным эффектом.
В первом триместре беременности хорион реагирует только на те микроорганизмы, которые повредили наружный слой и проникли в децидуальное или плацентарное ворсинчатое пространство (Abrahams V.M., Bole-Aldo P., Kim Y.M., 2004). По мнению М. Plaisier, существует корреляционная связь между васкуляризацией децидуальной оболочки и экспрессией ангиогенных факторов, а также частотой самопроизвольных абортов (Plaisier М., Dennert I., Rost E., 2009).
Сосудисто-эндотелиальный фактор (СЭФР) является сильным индуктором ангиогенеза, он взаимодействует с рецептором-1 (СЭФР-Р1, Flt-I, VEGF-R1). Во время беременности формируется также растворимый вариант Flt-I (sFlt-I), который связывается с СЭФР и, таким образом, ограничивает его активность (Maynard S.E., Min J. et al., 2003).
sFlt-1 продуцируется различными тканями, включая плаценту, он связывает СЭФР и ФРП в сыворотке крови, редуцируя их биодоступность. Несвязанные СЭФР и ФРП существуют как свободные молекулы и имеют растворимые рецепторы, облегчающие их транспорт через мембраны (Не Y., Smith S.K. et al., 1999). Точная функция sFlt-1 до сих пор остается предметом дискуссий (Ferrara N., Gerber H.P., Le Couter J. et al., 2003). Есть мнение, что sFlt-1 играет важную роль в потерях беременностей (Girardi G., Yarilin D. et al., 2006).
Дальнейшее изучение роли ангиогеннных факторов и их рецепторов способно не только расширить наши представления об имплантации, но и прогнозировать развитие угрозы прерывания беременности.
В наше исследование вошли пациентки, у которых были исключены все факторы невынашивания (АФС, эндокринная патология, генетические нарушения, патология формы матки), за исключением инфекционно-воспалительной этиологии невынашивания.
Наши данные свидетельствуют о том, что ведущую роль в развитии осложнений беременности в I триместре играет инфекция, передаваемая половым путем (табл.1). При ее отсутствии на первый план выходит условно-патогенная флора (чаще коринебактерии и актиномицеты). Причем значение имеет не конкретный возбудитель, а сочетание различных возбудителей.
Таблица 1
Структура ИППП в обследуемых клинических группах
Возбудители ИППП
Клинические группы
I группа (n=18)
Пациентки, с осложненным течением беременности (n=152)
С. trachomatis<sup>∗</sup>
1 (5,6%)
63 (41,45%)
М. hominis
-
54 (35,53%)
Т. vaginalis<sup>∗∗</sup>
-
26 (17,1%)
N. gonorrhoeae
-
-
Условно-патогенная флора<sup>∗∗</sup>
17 (94,4%)
128 (84,21%)
<sup>∗</sup> - диагноз установлен по результатам как минимум 2-х анализов на Chlamydia trachomatis
<sup>∗∗</sup> - при значимой степени роста (>10<sup>3</sup>)
С момента инвазии трофобласта и начала формирования плаценты происходит активное разрастание ее сосудистого русла. Этому способствуют ангиогенные субстанции, которые выделяются как в организме матери, так и формирующимся фето-плацентарным комплексом. В случае нарушений кровотока в маточно-плацентарно-плодовом комплексе развиваются осложнения беременности вплоть до ее замирания. Факторы ангиогенеза начинают продуцироваться на ранних этапах роста плода еще до начала формирования плаценты и ремоделирования материнских сосудов. К настоящему времени известно, что, помимо регуляции процессов ангиогенеза, большинство этих факторов регулируют дифференцировку и пролиферацию клеток, что проявляется в их влиянии на инвазию трофобласта (Никитина Л.А., Демидова Е.М. и соавт., 2007).
В нашей работе прогностически значимым маркером является sFlt-1, позволяющий до начала терапии угрожающих явлений прерывания беременности ранних сроков предполагать отсутствие эффекта от проводимой терапии, что требует повышенного внимания к этим пациентам.
Таблица 2
Содержание sFlt-1 (нг/мл) в сыворотке крови женщин обследуемых клинических групп
Факторы роста
Клинические группы
I группа (n=18)
II группа (n=35)
III группа (n=18)
VI группа (n=17)
sFlt-1
0,558 (0,440; 0,692)
0,389<sup>∗∗</sup> (0,292; 0,657)
0,220<sup>oo</sup> (0,130; 0,612)
0,214<sup>∗</sup> (0,187; 0,266)
Условные обозначения статистически обоснованных различий р<0,01
<sup>∗</sup> - с показателями женщин I группы
<sup>∗∗</sup> - с показателями женщин IV группы
Условные обозначения статистически обоснованных различий р<0,05
<sup>оо</sup> - с показателями женщин I группы
Все обследованные разделены на 4 клинические группы (табл.2). В группу контроля (I группа) вошли беременные с физиологическим течением гестации (n=18). Вторая (II) группа сформирована из беременных с угрозой прерывания, беременность у которых была сохранена (n=35) в результате проведения адекватно терапии. Третью (III) группу составили пациентки, поступившие в гинекологическое отделение с диагнозом «неразвивающаяся беременность» (n=18) с благоприятным исходом в результате проведения адекватно терапии. Четвертая (IV) группа сформирована из женщин (n=17), поступивших в гинекологическое и отделение патологии беременности с признаками угрозы прерывания, у которых, несмотря на проводимую сохраняющую терапию, беременность остановилась в развитии, т.е. с неблагоприятным исходом.
Поскольку обследуемые группы были однородны, для наглядности представления результатов обследования на ИППП и неспецифическую флору решено было объединить II, III и IV группы в одну. Помимо этого, ретроспективно по результатам наблюдения по программе «Акушерский мониторинг» проанализированы 82 амбулаторных карт наблюдения пациенток с неразвивающимися беременностями и беременностями с угрозой прерывания воспалительной этиологии в период с 2004 по 2009 год. Таким образом, общее количество больных составило 152.
При анализе концентрации sFlt-1 в сыворотке крови установлено, что у пациенток с угрозой прерывания и пролонгированием беременности (II группа) его уровень достоверно (р<0,01) выше (более чем 1,8 раза) по сравнению с женщинами с угрожающими явлениями и неразвивающейся беременностью в последующем (IV группа).
Резкое снижение sFlt-1 в сыворотке крови отмечено у всех пациенток исследуемых групп по отношению к контрольной группе. При неразвивающейся беременности выявлено достоверное снижение содержания sFlt-1 (р<0,05) по сравнению с группой контроля в 2,5 раза. В группе пациенток с угрожающими явлениями и неразвивающейся беременностью в последующем было наиболее выраженное, в 2,6 раза падение уровня sFlt-1 (р=0,001) по сравнению с группой контроля. При угрожающих явлениях и сохранении беременности отмечено наименее выраженное, статистически незначимое (р=0,143) снижение концентрации sFlt-1 в сыворотке крови по отношению к группе норма.
Таким образом, учитывая достоверность различий, уровень sFlt-1 в сыворотке крови 0,389 нг/мл, определяемый до начала терапии, является маркером неблагоприятного прогноза для развития беременности.
Подробное описание способа и примеры его клинического использования
Всем больным проводят стандартное клинико-лабораторное обследование крови, мочи, нативных влагалищных мазков, исследование факторов свертывания крови.
Уровень sFlt-1 в сыворотке крови определяют методом иммуноферментного анализа наборами фирмы BENDER MEDSYSTEMS (Европа).
Промывочный буфер, растворы стандартов, стрептавидин-пероксидазного конъюгата, субстрат готовият согласно инструкции к набору.
В лунку-бланк вносят 100 мкл раствора для разведения стандартов, в лунки для построения стандартной кривой вносят по 100 мкл приготовленных стандартных проб, в остальные лунки добавляют по 50 мкл буфера для разведения и по 50 мкл раствора биотилированных антител к sFlt-1 человека. Инкубируют планшет при комнатной температуре в течение 2 часов на шейкере ST 3 (Латвия).
По окончании инкубации промывают лунки планшета промывочным буфером 4 раза на промывочном устройстве для микропланшетов ELISA WASHER HUMAN (USA). Во все лунки вносят по 100 мкл раствора стрептавидин-пероксидазного конъюгата и инкубируют планшет 1 час при комнатной температуре на шейкере ST 3 (Латвия). Затем проводят промывку, как описано выше.
Во все лунки вносят по 100 мкл раствора субстрата и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут. Останавливают цветную реакцию добавлением 100 мкл стоп-реагента в каждую лунку. Измерение оптической плотности при 450 нм и обсчет результатов проводят на фотометре MULTILABEL COUNTER 1420 (Финляндия). В компьютерное обеспечение прибора вводят численные значения концентраций sFlt-1 в стандартных растворах и получают после измерения концентрацию sFlt-1 в опытных пробах. Полученные результаты умножают на фактор разведения (2) и выражают уровень sFlt-1 в сыворотке крови пациента в нг/мл.
Пример 1. Пациентка О-ва И.А., 32 лет. Обследовалась по программе «Акушерский монитиринг» ФГУ РНИИ акушерства и педиатрии, амбулаторная карта от 16.10.08 г. Повторнобеременная. Диагноз: Беременность 9-10 недель. Отягощенный акушерско-гинекологический анамнез.
После информированного согласия взята кровь из вены для определения уровня sFlt-1. Концентрация sFlt-1 составила 0,394 нг/мл. Полученный результат у данной беременной позволяет прогнозировать физиологическое течение беременности.
Определение содержания sFlt-1 в сыворотке крови осуществляли иммуноферментным методом с использованием наборов (BENDER MEDSYSTEMS (Европа) в соответствии с протоколом фирмы-производителя. В каждом наборе содержались контрольные образцы для оценки вариабельности, которая при определении не превышала sFlt-1 10%.
У данной пациентки беременность благополучно пролонгировалась и завершилась родами в сроке 38-39 недель. Данный клинический пример подтверждает возможность прогнозирования физиологического течения беременности.
Пример 2. Пациентка З-ва Е.В., 40 лет, находилась на стационарном лечении в ОПБ ФГУ РНИИ акушерства и педиатрии со 02.04.09 г. по 24.04.2009 г. Повторнобеременная. Диагноз: Беременность 10-11 недель. Угрожающий аборт. ВРТ ЭКОСМ. ОАГА. Хламидиоз. Полип цервикального канала.
При плановом обследовании было проведено определение в сыворотке крови содержания sFlt-1. Уровень sFlt-1 соответствовал 0,389 нг/мл. По данной величине обследуемого параметра можно прогнозировать неблагоприятный исход беременности.
Беременной назначен курс комплексной сохраняющей терапии. По окончании лечения данная пациентка была выписана с пролонгированной беременностью.
Данный клинический пример подтверждает возможность прогнозирования неблагоприятного исхода беременности и применения адекватной акушерской тактики для его предотвращения.
Пример 3. Пациентка К-ва Е.Р., 35 лет, находилась на стационарном лечении в ОПБ РНИИ акушерства и педиатрии. Диагноз: Беременность 11-12 недель. Угрожающий аборт. Полип цервикального канала. Эндоцервицит.
Проведено определение в сыворотке крови содержания sFlt-1, его уровень соответствовал 0,214 нг/мл. Такая величина исследуемого маркера позволяет прогнозировать неразвивающуюся беременность с неблагоприятным исходом.
При сроке гестации 12 недель у данной пациентки была диагностирована неразвивающаяся беременность, несмотря на проводимую сохраняющую терапию.
Данный клинический пример подтверждает возможность прогнозирования неразвивающейся беременности.
Таким образом, клиническая апробация заявляемого способа подтверждает его прогностическую ценность.
Для решения поставленных задач было проведено обследование беременных женщин в сроке до 12 недель с угрозой прерывания беременности инфекционно-воспалительного генеза, а также пациентки с физиологическим течением беременности. Последовательность и кратность исследований у каждой беременной были одинаковыми.
При обследовании беременных использовали общепринятые методы: сбор анамнеза, жалоб, осмотр, общелабораторные исследования. При сборе анамнеза особое внимание обращалось на наследственный и семейный анамнез, паритет родов, абортов, перенесенные гинекологические заболевания и оперативные вмешательства. Выяснялся характер менструальной функции до наступления беременности, наличие у женщины соматических заболеваний и эндокринной патологии. Из обследования были исключены пациентки с выявленными иными причинами невынашивания беременности: эндокринной, генетической патологией, АФС, патологией формы матки.
Нами установлено, что уровень sFlt-1 в сыворотке крови у пациенток с угрозой прерывания беременности и благоприятным исходом выше по сравнению с женщинами с угрожающими явлениями и неблагоприятным исходом. Резкое снижение sFlt-1 в сыворотке крови отмечено у всех пациенток исследуемых групп по отношению к контрольной группе. При неразвивающейся беременности выявлено снижение содержания sFlt-1 по сравнению с группой контроля. В случаях пациенток с угрожающими явлениями прерывания беременности с неблагоприятным исходом было наиболее выраженное падение уровня sFlt-1 по сравнению с группой контроля. При угрожающих явлениях и сохранении беременности отмечено наименьшее снижение sFlt-1.
Полученные результаты указывают, что физиологическое развитие беременности происходит при высоком уровне sFlt-1 в сыворотке крови. Прерывание беременности и неразвивающаяся беременность протекают при низких значениях данного показателя, несмотря на проводимую терапию.
Статистическая обработка исходных рядов признаков осуществлялась с использованием лицензионных пакетов AtteStat 7.3, MedCalc, Microsoft Excel 2003, Statistica 6.0.
Чувствительность метода определения sFlt-1 составляет 88,24% при удовлетворительной специфичности - 77,78%. Предсказательная ценность положительного теста 78,9%, предсказательная ценность отрицательного теста составляет 87,5%.
Преимущества заявляемого метода по сравнению с известными
Преимуществом заявляемого метода состоит в том, что у беременных инфекционно-воспалительного генеза на основании высокочувствительных современных лабораторных маркеров производится прогнозирование невынашивания беременности с целью раннего назначения адекватной терапии.
В клинической практике это позволит снизить угрозу перинатальных потерь за счет своевременного выявления беременных группы риска и начала адекватных лечебных мероприятий.
Заявляемый способ прогнозирования невынашивания беременности ранних сроков инфекционно-воспалительного генеза апробирован на достаточном по объему клиническом материале и может быть рекомендован к применению в акушерских стационарах.