СПОСОБЫ ОБНАРУЖЕНИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ В ОРГАНЕ ИЛИ СИСТЕМЕ ОРГАНОВ
METHODS FOR PATHOLOGICAL CHANGES DETECTION IN ORGAN OR SYSTEM OF ORGANS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной патентной заявки США №61/476591, поданной 18 апреля 2011 г., предварительной патентной заявки США №61/478766, поданной 25 апреля 2011 г., и предварительной патентной заявки США №61/546431, поданной 12 октября 2011 г., описание которых полностью включено в настоящую заявку посредством ссылок.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении предложены способы раннего неинвазивного и минимально инвазивного обнаружения патологических изменений в системах органов, конкретных органах, тканях и/или клетках путем количественного определения в биологических жидкостях микроРНК, присутствующих в повышенной концентрации в определенной системе органов/органе/ткани/типе клеток.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Общепризнано, что лечение любого заболевания осуществляется легче и более эффективно при максимально ранней диагностике основной патологии. Для некоторых заболеваний ранний диагноз (желательно до появления четких клинических симптомов) является критически важным из-за перехода патологии в более запущенную, иногда необратимо, стадию. Например, одной из основных проблем для разработки лекарств и лечения болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваний является их позднее клиническое проявление и диагностика из-за высоких компенсационных возможностей головного мозга. В результате эти заболевания обычно диагностируют, когда многие нейроны уже мертвы, и в настоящее время лучшим сценарием является профилактика ухудшения при патологии, а не реальное восстановление. Еще одним примером являются онкологические заболевания (рак), поскольку лечение метастатической стадии указанных заболеваний является гораздо более проблематичным, чем лечение первичной опухоли. Существует множество других патологий такого рода, но, опять же, лечение любого заболевания более эффективно при его ранней диагностике.
Существует несколько основных типов клинических анализов: (i) генетические анализы, которые помогают предсказать предрасположенность к определенному заболеванию; (ii) скрининговые тесты, которые применяют к крупным популяциям для раннего выявления заболевания, предпочтительно до его клинического проявления; (iii) диагностические анализы, которые применяют у людей с клиническими симптомами заболевания или при обнаружении патологии в скрининговом тесте; (iv) молекулярные прогностические тесты, которые должны позволять прогнозировать исход заболевания и чувствительность к лекарствам.
Скрининговые тесты наиболее важны для раннего обнаружения заболевания. Это верно не только для спонтанных заболеваний, но и для генетически обусловленных патологий, для которых высокая вероятность развития заболевания прогнозируется на основании генетического тестирования. В идеале все должны проходить регулярный скрининг на все возможные опасные для жизни и многие другие заболевания. Предпринимались многочисленные попытки разработки анализов для ранней диагностики различных заболеваний, и в определенных группах риска осуществляют различные скрининговые тесты. Например, для людей старше 50 лет рекомендуется периодическая колоноскопия. Для раннего обнаружения рака шейки матки и предстательной железы рекомендуются мазки из шейки матки для женщин и анализ PSA для мужчин, соответственно. Главным преимуществом этих тестов является специфичность к заболеванию, однако в то же время это является их серьезным недостатком, поскольку каждый анализ выявляет только одну конкретную патологию. Вместе с тем, существуют сотни заболеваний человека, и трудно представить, что для всех указанных патологий будут разработаны такие специфичные скрининговые тесты. Кроме того, даже в случае разработки специфичных тестов для ранней диагностики всех заболеваний человека весьма маловероятно, что такие тесты будут использоваться для скрининга, особенно для относительно редких заболеваний, из-за экономических факторов. Поскольку скрининговые тесты для каждого конкретного заболевания предназначены для обследования крупных популяций, их специфичность и предсказательная ценность положительного результата (PPV) очень важны. Например, если скрининг-тест для выявления относительно распространенного заболевания (1:10000) обладает 100% чувствительностью и 99% специфичностью, что почти недостижимо, и обследуется 1 миллион человек, 100 случаев заболевания будут обнаружены правильно, однако для приблизительно 10000 человек будут получены ложноположительные результаты. Очевидно, такой результат вызовет эмоциональный дистресс у указанных людей, а также значительные финансовые затраты на дополнительные анализы.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Как указано в разделе "Уровень техники" выше, в данной области техники существует большая потребность в разработке новых скрининговых тестов. Согласно текущей парадигме для разработки скрининговых тестов и их клинического применения, одной из главных особенностей такого теста должна быть его высокая специфичность к заболеванию. Вместе с тем, как указано выше, существуют сотни заболеваний, и скрининг каждого конкретного заболевания практически невозможен. Настоящее изобретение предлагает значительный сдвиг парадигмы: разработку и реализацию одного или небольшого количества универсальных скрининговых тестов (УСТ), специфически выявляющих патологию любой конкретной системы органов, органа, ткани и/или типа клеток, без диагностики конкретного заболевания. Такие УСТ следует периодически выполнять для любого заданного субъекта на ранней, предпочтительно клинически бессимптомной стадии, а затем можно использовать более специфические тесты для постановки более конкретного диагноза. УСТ, описанные в настоящем документе, могут улучшить диагностику и лечение заболеваний, а также значительно снизить расходы на медицинское обслуживание. Кроме того, УСТ, описанные в настоящем документе, могли бы улучшить направленность анализов для выявления редких заболеваний за счет их применения к значительно меньшим популяциям, предварительно отобранным с помощью УСТ, и, таким образом, повысить их экономическую эффективность.
Поскольку УСТ будет использоваться для крупных популяций (предпочтительно всего населения), его первой важной особенностью является минимальная инвазивность. Настоящее изобретение обеспечивает регистрацию различных физиологических и патологических процессов в конкретных органах, тканях и даже типах клеток путем анализа соответствующих биомаркеров в биологических жидкостях, которые могут быть получены неинвазивными или минимально инвазивными способами, например, в плазме/сыворотке, моче или слюне. Во-вторых, УСТ не должен быть основан на индуцирующих факторах патогенеза заболеваний, поскольку их слишком много. В-третьих, для возможности широкого применения, УСТ не должен быть слишком дорог; это, в частности, означает, что в нем должно использоваться ограниченное количество типов биомаркеров, анализ которых можно осуществлять с помощью одной и той же методики.
Биомаркеры, применяемые в УСТ, должны обладать набором параметров, которые обеспечивают их пригодность для тестов такого типа:
1. Специфичность или высокая концентрация в определенных клетках/тканях/органах (например, по меньшей мере, в 5 раз более высокая концентрация, чем в других клетках/тканях/органах).
2. Способность секретироваться в межклеточное пространство и проходить через различные барьеры в организме.
3. Наличие в детектируемых количествах в биологических жидкостях, которые могут быть получены с минимальной инвазивностью.
4. Стабильность.
5. Возможность обнаружения с высокой чувствительностью и специфичностью при относительно низкой стоимости.
Для УСТ можно использовать следующие классы молекул:
1. Белки.
2. мРНК и фрагменты мРНК.
3. микроРНК.
4. Фрагменты ДНК
5. Метилирование ДНК.
6. Липиды.
7. Углеводы.
Однако, некоторые из этих потенциальных тканеспецифических биомаркеров обладают серьезными недостатками, которые делают их использование непрактичным или даже невозможным. Например, метилированные ДНК, липиды и углеводы не обладают достаточной специфичностью для различения различных типов тканей и клеток. Кроме того, фрагменты ДНК появляются во внеклеточном пространстве и в крови главным образом из умирающих клеток (Lichtenstein et al., Ann. New York Acad. Sci. 2001, 945: 239-249) и, таким образом, циркулирующую вне клеток ДНК нельзя использовать для выявления этапов патологических состояний, которые не сопровождаются гибелью клеток. Белки и мРНК являются более подходящими кандидатами для УСТ ввиду их более высокой тканеспецифичности/обогащенности (присутствия в ткани в повышенном количестве по сравнению с другимим тканями) (Diez-Roux et al., PLOS Biology. 2011, 9: е1000582). Однако мРНК являются крупными молекулами, они легко разрушаются нуклеазами, и поэтому в кровотоке появляются только короткие фрагменты этих молекул. Это не исключает их использования в качестве биомаркеров для УСТ, но усложняет разработку теста. Белки являются хорошими кандидатами, но текущие методы их обнаружения значительно менее чувствительны, чем методы обнаружения нуклеиновых кислот.Кроме того, многие белки являются крупными молекулами и не могут проходить через клеточную мембрану и другие барьеры.
В настоящем изобретении предложено применение микроРНК-биомаркеров в УСТ по следующим причинам: микроРНК являются небольшими молекулами, они могут присутствовать во внеклеточном пространстве, проходить через барьеры мозга, почек и плаценты, присутствуют в различных биологических жидкостях, являются стабильными, а существующие методы их анализа являются высокоспецифичными и чувствительными. Самое главное, микроРНК представляют собой большой класс различных молекул, причем, по меньшей мере, некоторые микроРНК присутствуют в повышенной концентрации в некоторых системах органов, органах, тканях или клетках, таким образом обеспечивая молекулярные маркеры для всех частей тела.
МикроРНК представляют собой класс некодирующих РНК, чей конечный продукт (зрелые микроРНК) представляют собой функциональные молекулы РНК размером приблизительно 22 нуклеотида. Они играют важную роль в регуляции генов-мишеней путем связывания с комплементарными областями матричных транскриптов для репрессии их трансляции или регуляции разрушения (Griffiths-Jones Nucleic Acids Research, 2006, 34, Database issue: D140-D144). Часто мишенью одной микроРНК могут являться несколько мРНК, и одна мРНК может регулироваться несколькими микроРНК, адресно воздействующими на различные участки 3’-нетранслируемой области. При связывании с мРНК, микроРНК может осуществлять регуляцию экспрессии генов и продукции белка за счет воздействия на трансляцию и стабильность мРНК (например, Baek et al.. Nature, 2008, 455: 64; Selbach et al.. Nature. 2008, 455: 58; Ambros, Nature. 2004, 431: 350-355; Bartel, Cell. 2004, 116: 281-297; Cullen, Virus Research. 2004, 102: 3-9; He et al. Nat. Rev. Genet. 2004, 5:522-531; и Ying et al.. Gene. 2004, 342:25-28). Существуют другие классы менее изученных малых РНК (см. обзор Kim, Mol. Cells, 2005, 19: 1-15). Многие микроРНК являются специфическими по отношению к или сверхэкспрессируются в определенных органах/тканях/клетках (см., например, Hua et al., BMC Genomics 2009, 10: 214; Liang et al., BMC Genomics. 2007. 8: 166; Landgrafet al., Cell. 2007, 129: 1401-1414; Lee et al., RNA, 2008, 14: 35-42) Из-за своего небольшого размера микроРНК могут пересекать гематоэнцефалический, почечный и плацентарный барьеры и проникать в биологические жидкости, где они являются достаточно стабильными (Rosenfeld et al.. Nature Biotech. 2008, 26: 462-469; Mitchell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008, 105: 10513-10518; Chen et al., Cell Res. 2008, 18: 997-1006; Chim et al., Clin. Chem. 2008, 54: 482-490; De Smaele et al., Brain Res. 2010, 1338: 100-111; Fichtlscherer et al., Circ. Res. 2010, 107: 677-684; Scholer et al., Exp.Hematol. 2010, 38: 1126-1130). Предложен анализ микроРНК, специфичных по отношению к клеткам/тканям, в биологических жидкостях для обнаружения гибели клеток in vivo (патентная публикация США №20090081640; Laterza et al., Clin Chem. 2009, 55: 1977-1983). В ряде исследований продемонстрирована повышенная концентрация в кровотоке внеклеточной микроРНК, содержание которой повышено в клетках печени (Zhang et al., Clin Chem. 2010, 56: 1830-1838; Xu et al., Mol Carcinogenesis. 2011, 50: 136-142). Например, уровень микроРНК 122а, содержание которой повышено в печени, возрастает в сыворотке больных с гепатитом и гепатоцеллюлярной карциномой, и авторы пришли к выводу, что из-за указанной отсутствия специфичности для определенного заболевания указанные микроРНК нельзя использовать в качестве биомаркеров для ГЦК (Zhang et al., Clin Chem. 2010, 56: 1830-1838; Li et al., Cancer Res. 2010, 70: 9798-9807). В противоположность этому, настоящее изобретение показывает, что такая неспецифичность к заболеванию указанной микроРНК, характеризующейся повышенным содержанием в определенном органе/ткани/клетке, является существенным преимуществом при их применении в качестве биомаркеров для разработки УСТ.
Экспрессия и концентрации микроРНК регулируются различными физиологическими и патологическими сигналами. Некоторые из микроРНК характерны для конкретной патологии, например, гипоксии (Loscaizo, J. Clin. Invest. 2010, 120: 3815-3817; Pocock, Pflugers Arch. 2011, 461: 307-315), воспаления (Tili et al., Int. Rev. Immunol. 2009, 28: 264-284; Davidson-Moncada et al., Ann. NY Acad. Sci. 2010, 1183: 183-194; Roy and Sen, Physiol. Genomies. 2011, 43: 557-565), или канцерогенеза (Budhu et al., J. Hematol.Oncol. 2010, 3: 37; Zen and Zhang, Med. Res. Rev. 2012, 32: 326-348). Это явление обуславливает целесообразность применения таких микроРНК в качестве биомаркеров в УСТ согласно настоящему изобретению. Повышение концентрации указанных микроРНК в биологических жидкостях указывает на наличие соответствующей общей патологии в организме без локализации в конкретном органе, ткани или типе клеток. Вообще говоря, указанный подход аналогичен подходу, предлагаемому выше для микроРНК, присутствующей в высокой концентрации в определенном органе/ткани: микроРНК, присутствующая в высокой концентрации в определенном органе/ткани, помогает обнаружить патологию в указанном органе или ткани; с другой стороны, микроРНК, характерная для конкретной общей патологии, помогает обнаружить наличие этой патологии в организме без указания на конкретный пораженный орган/ткань. Комбинированное использование микроРНК-биомаркеров, присутствующих в высокой концентрации в системе органов, органе, ткани или типе клеток, и микроРНК-биомаркеров, характерных для конкретной общей патологии, обеспечит более точный диагноз, а именно наличие конкретной патологии в определенном органе или ткани или типе клеток. Например, повышенные концентрации микроРНК, характерных для гипоксии в плазме, в комбинации с повышенной концентрацией микроРНК, характеризующейся повышенным содержанием в сердце, обеспечит более конкретный диагноз ишемии сердца, полученный с использованием УСТ.
Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ обнаружения патологии в любой системе органов у субъекта, причем указанный способ включает:
а. измерение уровней микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в указанной системе органов, в образце биологической жидкости, полученном у субъекта;
b. измерение уровней заранее выбранной нормирующей микроРНК в том же образце биологической жидкости, полученном у субъекта;
с. расчет отношений уровней микроРНК, измеренных на этапах (а) и (b);
d. сравнение отношений уровней микроРНК, рассчитанных на этапе (с), с соответствующими контрольными отношениями, и
е. (i) идентификацию субъекта как имеющего патологию конкретной системы органов, в случае, когда отношения уровней микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в указанной системе органов, и соответствующих нормирующих микроРНК, рассчитанные на этапе (с), выше, чем соответствующие контрольные отношения, или (ii) идентификацию указанного субъекта как не имеющего патологии указанной системы органов, в случае, когда отношения уровней микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в указанной системе органов, и соответствующих нормирующих микроРНК, рассчитанные на этапе (с), не выше, чем соответствующие контрольные отношения.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ обнаружения патологии системы органов у пациента, причем указанный способ включает:
а. измерение уровня по меньшей мере одной микроРНК, характеризующейся повышенным содержанием в указанной системе органов, в образце биологической жидкости, полученном у субъекта;
b. измерение уровня нормирующей микроРНК в том же образце биологической жидкости, полученном у субъекта;
с. расчет отношения уровней микроРНК, измеренных на этапах (а) и (b);
d. сравнение отношения уровней микроРНК, рассчитанного на этапе (с), с соответствующим контрольным соотношением, и
е. (i) идентификацию субъекта как имеющего патологию указанной системы органов, в случае, когда отношение уровней микроРНК, рассчитанное на этапе (с), выше, чем соответствующее контрольное отношение, или (ii) идентификацию указанного субъекта как не имеющего патологии указанной системы органов, в случае, когда отношение уровней микроРНК, рассчитанное на этапе (с), не выше, чем соответствующее контрольное отношение.
Нормирующая микроРНК, которую можно применять в двух вышеуказанных способах, может являться, например, микроРНК, повсеместно встречающейся в организме, микроРНК, экспрессируемой во многих органах, экспрессия которой, однако, понижена в указанной системе органов, или экспериментально выбранной микроРНК, присутствующей в указанной системе органов в высокой концентрации.
Контрольное отношение уровней микроРНК, используемых в двух вышеуказанных способах, может быть заранее определенным стандартом (например, определенным с использованием популяции контрольных субъектов [например, совпадающих по возрасту с субъектом, подвергаемым диагностике] без патологий соответствующей системы органов) или отношением уровней этих же мРНК в обработанных аналогичным образом образцах биологической жидкости этого же субъекта, полученных в прошлом.
В одном варианте реализации вышеуказанные способы включают определение двух или более отношений микроРНК.
В еще одном варианте реализации вышеуказанных способов микроРНК, характеризующаяся повышенным содержанием в системе органов, выбрана из микроРНК, перечисленных ниже в Таблице 2.
В еще одном варианте реализации вышеуказанных способов указанная система органов является центральной нервной системой, а пара микроРНК/нормирующая микроРНК выбрана из микроРНК, перечисленных ниже в Таблице 4.
В еще одном варианте реализации вышеуказанных способов указанная система органов является дыхательной системой, а пара микроРНК/нормирующая микроРНК выбрана из микроРНК, перечисленных ниже в Таблице 5.
В дополнительном варианте реализации вышеуказанных способов указанная система органов является желудочно-кишечным трактом (ЖКТ), а пара микроРНК/нормирующая микроРНК выбрана из микроРНК, перечисленных ниже в Таблице 7.
В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ обнаружения патологии в любом органе у субъекта, причем указанный способ включает:
а. измерение уровней микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в различных органах, в образце биологической жидкости, полученном у субъекта;
b. измерение уровней заранее выбранной нормирующей микроРНК в том же образце биологической жидкости, полученном у субъекта;
с. расчет отношений уровней микроРНК, измеренных на этапах (а) и (b);
d. сравнение отношений уровней микроРНК, рассчитанных на этапе (с), с соответствующими контрольными отношениями, и
е. (i) идентификацию субъекта как имеющего патологию конкретного органа, в случае, когда отношения уровней микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в указанном органе, и соответствующих нормирующих микроРНК, рассчитанные на этапе (с), выше, чем соответствующие контрольные отношения, или (п) идентификацию указанного субъекта как не имеющего патологии указанного органа, в случае, когда отношения уровней микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в указанном органе, и соответствующих нормирующих микроРНК, рассчитанные на этапе (с), не выше, чем соответствующие контрольные отношения.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ обнаружения патологии органа у пациента, причем указанный способ включает:
а. измерение уровня по меньшей мере одной микроРНК, характеризующейся повышенным содержанием в указанном органе, в образце биологической жидкости, полученном у субъекта;
b. измерение уровня нормирующей микроРНК в том же образце биологической жидкости, полученном у субъекта;
с. расчет отношения уровней микроРНК, измеренных на этапах (а) и (b);
d. сравнение отношения уровней микроРНК, рассчитанного на этапе (с), с соответствующим контрольным соотношением, и
e. (i) идентификацию субъекта как имеющего патологию указанного органа, в случае, когда отношение уровней микроРНК, рассчитанное на этапе (с), выше, чем соответствующее контрольное отношение, или (ii) идентификацию указанного субъекта как не имеющего патологии указанного органа, в случае, когда отношение уровней микроРНК, рассчитанное на этапе (с), не выше, чем соответствующее контрольное отношение.
Нормирующая микроРНК, которую можно применять в двух вышеуказанных способах, может являться, например, микроРНК, повсеместно встречающейся в организме, микроРНК, экспрессируемой во многих органах, экспрессия которой, однако, понижена в указанном органе, или экспериментально выбранной микроРНК, присутствующей в указанном органе в высокой концентрации.
Контрольное отношение уровней микроРНК, используемых в двух вышеуказанных способах, может быть заранее определенным стандартом (например, определенным с использованием популяции контрольных субъектов [например, совпадающих по возрасту с субъектом, подвергаемым диагностике] без патологий соответствующего органа) или отношением уровней этих же мРНК в обработанных аналогичным образом образцах биологической жидкости этого же субъекта, полученных в прошлом.
В одном варианте реализации два вышеуказанных способа включают определение двух или более отношений микроРНК.
В еще одном варианте реализации двух вышеуказанных способов микроРНК, характеризующаяся повышенным содержанием в органе, выбрана из микроРНК, перечисленных ниже в Таблицах 1 и 2.
В еще одном варианте реализации двух вышеуказанных способов указанный орган является органом желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), а пара микроРНК/нормирующая микроРНК выбрана из микроРНК, перечисленных ниже в Таблице 9.
В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ обнаружения патологии в любой ткани у субъекта, причем указанный способ включает:
а. измерение уровней микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в различных тканях, в образце биологической жидкости, полученном у субъекта;
b. измерение уровней нормирующей микроРНК в том же образце биологической жидкости, полученном у субъекта;
с. расчет отношений уровней микроРНК, измеренных на этапах (а) и (b);
d. сравнение отношений уровней микроРНК, рассчитанных на этапе (с), с соответствующими контрольными отношениями, и
e. (i) идентификацию субъекта как имеющего патологию конкретной ткани, в случае, когда отношения уровней микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в указанной ткани, и соответствующих нормирующих микроРНК, рассчитанные на этапе (с), выше, чем соответствующие контрольные отношения, или (ii) идентификацию указанного субъекта как не имеющего патологии указанной ткани, в случае, когда отношения уровней микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в указанной ткани, и соответствующих нормирующих микроРНК, рассчитанные на этапе (с), не выше, чем соответствующие контрольные отношения.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ обнаружения патологии ткани у пациента, причем указанный способ включает:
а. измерение уровня по меньшей мере одной микроРНК, характеризующейся повышенным содержанием в указанной ткани, в образце биологической жидкости, полученном у субъекта;
b. измерение уровня нормирующей микроРНК в том же образце биологической жидкости, полученном у субъекта;
с. расчет отношения уровней микроРНК, измеренных на этапах (а) и (b);
d. сравнение отношения уровней микроРНК, рассчитанного на этапе (с), с соответствующим контрольным соотношением, и
e. (i) идентификацию субъекта как имеющего патологию указанной ткани, в случае, когда отношение уровней микроРНК, рассчитанное на этапе (с), выше, чем соответствующее контрольное отношение, или (ii) идентификацию указанного субъекта как не имеющего патологии указанной ткани, в случае, когда отношение уровней микроРНК, рассчитанное на этапе (с), не выше, чем соответствующее контрольное отношение.
Нормирующая микроРНК, которую можно применять в двух вышеуказанных способах, может являться, например, микроРНК, повсеместно встречающейся в организме, микроРНК, экспрессируемой во многих тканях, экспрессия которой, однако, понижена в указанной ткани, или экспериментально выбранной микроРНК, присутствующей в указанной ткани в высокой концентрации.
Контрольное отношение уровней микроРНК, используемых в двух вышеуказанных способах, может быть заранее определенным стандартом (например, определенным с использованием популяции контрольных субъектов [например, совпадающих по возрасту с субъектом, подвергаемым диагностике] без патологий соответствующей ткани) или отношением уровней этих же мРНК в обработанных аналогичным образом образцах биологической жидкости этого же субъекта, полученных в прошлом.
В одном варианте реализации два вышеуказанных способа включают определение двух или более отношений микроРНК.
В еще одном варианте реализации двух вышеуказанных способов микроРНК, характеризующаяся повышенным содержанием в ткани, выбрана из микроРНК, перечисленных ниже в Таблицах 1 и 2.
В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ обнаружения патологии любого типа клеток у субъекта, причем указанный способ включает:
а. измерение уровней микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в клетках указанного типа в образце биологической жидкости, полученном у субъекта;
b. измерение уровней нормирующей микроРНК в том же образце биологической жидкости, полученном у субъекта;
с. расчет отношений уровней микроРНК, измеренных на этапах (а) и (b);
d. сравнение отношений уровней микроРНК, рассчитанных на этапе (с), с соответствующими контрольными отношениями, и
е. (i) идентификацию субъекта как имеющего патологию конкретного типа клеток, в случае, когда отношения уровней микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в клетках указанного типа, и соответствующих нормирующих микроРНК, рассчитанные на этапе (с), выше, чем соответствующие контрольные отношения, или (п) идентификацию указанного субъекта как не имеющего патологии указанного типа клеток, в случае, когда отношения уровней микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в клетках указанного типа, и соответствующих нормирующих микроРНК, рассчитанные на этапе (с), не выше, чем соответствующие контрольные отношения.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ обнаружения патологии типа клеток у пациента, причем указанный способ включает:
а. измерение уровня по меньшей мере одной микроРНК, характеризующейся повышенным содержанием в клетках указанного типа, в образце биологической жидкости, полученном у субъекта;
b. измерение уровня нормирующей микроРНК в том же образце биологической жидкости, полученном у субъекта;
с. расчет отношения уровней микроРНК, измеренных на этапах (а) и (b);
d. сравнение отношения уровней микроРНК, рассчитанного на этапе (с), с соответствующим контрольным соотношением, и
e. (i) идентификацию субъекта как имеющего патологию указанного типа клеток, в случае, когда отношение уровней микроРНК, рассчитанное на этапе (с), выше, чем соответствующее контрольное отношение, или (ii) идентификацию указанного субъекта как не имеющего патологии указанного типа клеток, в случае, когда отношение уровней микроРНК, рассчитанное на этапе (с), не выше, чем соответствующее контрольное отношение.
Нормирующая микроРНК, которую можно применять в двух вышеуказанных способах, может являться, например, микроРНК, повсеместно встречающейся в организме, микроРНК, экспрессируемой во клетках многих типов, экспрессия которой, однако, понижена в клетках указанного типа, или экспериментально выбранной микроРНК, присутствующей в клетках указанного типа в высокой концентрации.
Контрольное отношение уровней микроРНК, используемых в двух вышеуказанных способах, может быть заранее определенным стандартом (например, определенным с использованием популяции контрольных субъектов [например, совпадающих по возрасту с субъектом, подвергаемым диагностике] без патологий соответствующего типа клеток) или отношением уровней этих же мРНК в обработанных аналогичным образом образцах биологической жидкости этого же субъекта, полученных в прошлом.
В одном варианте реализации два вышеуказанных способа включают определение двух или более отношений микроРНК.
В еще одном варианте реализации двух вышеуказанных способов микроРНК, характеризующаяся повышенным содержанием в клетках определенного типа, выбрана из микроРНК, перечисленных ниже в Таблицах 1 и 2.
Вышеописанные способы можно комбинировать. Например, за обнаружением патологии системы органов может следовать определение пораженного органа и/или ткани и/или типа клеток, и т.д.
Любой из описанных выше способов может также дополнительно включать определение того, является ли указанная патология онкологическим заболеванием или воспалением, причем указанный способ включает:
а. измерение уровня по меньшей мере одной микроРНК, ассоциированной с онкологическим заболеванием, в образце биологической жидкости, полученном у субъекта;
b. измерение уровня по меньшей мере одной микроРНК, ассоциированной с воспалением, в том же образце биологической жидкости, полученном у субъекта;
с. измерение уровня по меньшей мере одной микроРНК, характеризующейся повышенным содержанием в указанной системе органов, органе, ткани или типе клеток, в том же образце биологической жидкости, полученном у субъекта;
d. измерение уровня по меньшей мере одной нормирующей микроРНК в том же образце биологической жидкости, полученном у субъекта;
е. вычисление попарных отношений уровней микроРНК, измеренных на этапах (а), (b), (с) и (d) (например, соотношений а/b, а/с, a/d, b/c, b/d, и c/d);
f. сравнение отношений уровней микроРНК, рассчитанных на этапе (е), с соответствующими заранее определенными соотношениями, характерными для рака и воспаления, и
g. (i) определение того, что указанная патология является онкологическим заболеванием, в случае, когда отношение уровней микроРНК, рассчитанное на этапе (е), находится в заранее определенном диапазоне, характерном для рака, или (п) определение того, что указанная патология является воспалением, в случае, когда отношение уровней микроРНК, рассчитанное на этапе (е), находится в заранее определенном диапазоне, характерном для воспаления.
В еще одном варианте реализации вышеуказанного способа микроРНК, ассоциированная с онкологическим заболеванием и воспалением, выбраны из микроРНК, перечисленных ниже в Таблице 3.
В еще одном варианте реализации вышеуказанного способа указанная патология связана с легкими, а пары микроРНК выбраны из микроРНК, перечисленных ниже в Таблице 6.
В еще одном варианте реализации вышеуказанного способа указанная патология связана с желудочно-кишечным трактом (ЖКТ), а пары микроРНК выбраны из микроРНК, перечисленных ниже в Таблице 8.
В еще одном варианте реализации вышеуказанного способа указанная патология связана с дыхательной системой или желудочно-кишечным трактом (ЖКТ), а пары микроРНК выбраны из микроРНК, перечисленных ниже в Таблице 11.
Аналогичный способ можно применить для различения (дифференциальной диагностики) рака или воспаления от гипоксии.
Любой из вышеперечисленных способов может сопровождаться последующим проведением специфичного для заболевания диагностического теста у субъекта.
Любой из вышеописанных способов может сопровождаться последующим введением терапевтического средства субъекту, у которого была диагностирована патология.
Любой из вышеописанных способов может сопровождаться включением субъекта в группу клинических испытаний (это можно применять как к субъектам с диагностированной патологией, так и к субъектам с диагнозом отсутствия патологии).
Вышеописанные способы по изобретению можно применять для обнаружения патологий у любого субъекта, включая субъектов, у которых нет клинических симптомов, свидетельствующих о патологии указанной системы органов, или органа, или ткани, или типа клеток.
В отдельном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ идентификации соединения, пригодного для замедления прогрессирования или лечения патологии системы органов, или органа, или ткани, или типа клеток, включающий:
а. измерение уровня по меньшей мере одной микроРНК, характеризующейся повышенным содержанием в указанной системе органов, или органе, или ткани, или типе клеток, в одном или большем числе образцов биологических жидкостей, взятых у субъекта, страдающего указанной патологией указанной системы органов, или органа, или ткани, или типа клеток, где указанный(е) образец(цы) биологической жидкости берут перед введением тестируемого соединения;
b. измерение уровня нормирующей микроРНК в том(тех) же образце(ах) биологической жидкости, полученном у субъекта перед введением тестируемого соединения;
с. расчет отношения уровней микроРНК, измеренных на этапах (а) и (b) для каждого образца биологической жидкости, взятого у субъекта, перед введением тестируемого соединения;
d. измерение уровня той же микроРНК, что и на этапе (а), в одном или большем числе образцов биологических жидкостей, взятых у субъекта, после введения тестируемого соединения;
е. измерение уровня той же нормирующей микроРНК, что и на этапе (b), в том(тех) же образце(ах) биологической жидкости, взятых у субъекта, после введения тестируемого соединения;
f. расчет отношения уровней микроРНК, измеренных на этапах (d) и (е) для каждого образца биологической жидкости, взятого у субъекта, после введения тестируемого соединения;
g. сравнение отношений уровней микроРНК, рассчитанных на этапах (с) и (f), и
h. (i) идентификацию тестируемого соединения как пригодного для замедления прогрессирования или лечения указанной патологии указанной системы органов или органа или тканей или типа клеток, в случае, когда отношение уровней микроРНК, рассчитанное на этапе (f), ниже, чем соотношение уровней микроРНК, рассчитанное на стадии (с); (ii) идентификацию тестируемого соединения как непригодного для замедления прогрессирования или лечения указанной патологии указанной системы органов или органа или тканей или типа клеток, в случае, когда отношение уровней микроРНК, рассчитанное на этапе (f), не ниже, чем соотношение уровней микроРНК, рассчитанное на стадии (с).
В еще одном варианте реализации вышеуказанного способа указанная патология является онкологическим заболеванием или воспалением или гипоксией, а микроРНК выбрана из микроРНК, перечисленных ниже в Таблице 3.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу определения токсичности соединения (например, тестируемого соединения в клинических исследованиях) или фактора окружающей среды (например, аллергена, курения, УФ, радиации, асбеста и т.д.), для системы органов, или органа, или ткани, или типа клеток у субъекта, не имеющего патологии указанной системы органов, или органа, или ткани, или типа клеток, причем указанный способ включает:
а. измерение уровня по меньшей мере одной микроРНК, характеризующейся повышенным содержанием в указанной системе органов, или органе, или ткани, или типе клеток, в одном или большем числе образцов биологических жидкостей, взятых у субъекта, подвергающегося воздействию соединения или фактора окружающей среды;
b. измерение уровня нормирующей микроРНК в том(тех) же образце(ах) биологической жидкости, полученном у субъекта перед воздействием соединения или фактора окружающей среды;
с. расчет отношения уровней микроРНК, измеренных на этапах (а) и (b) для каждого образца биологической жидкости, взятого у субъекта, перед воздействием соединения или фактора окружающей среды;
d. измерение уровня той же микроРНК, характеризующаяся повышенным содержанием в указанной системе органов, или органе, или ткани, или типе клеток, в одном или большем числе образцов биологических жидкостей, взятых у субъекта после воздействия соединения или фактора окружающей среды;
е. измерение уровня той же нормирующей микроРНК в том(тех) же образце(ах) биологической жидкости, полученном у субъекта после воздействия соединения или фактора окружающей среды;
f. расчет отношения уровней микроРНК, измеренных на этапах (d) и (е) для каждого образца биологической жидкости;
g. сравнение отношений уровней микроРНК, рассчитанных на этапах (с) и (f), и
h. (i) определение того, что соединение или фактор окружающей среды не является токсичным для указанной системы органов или органа или тканей или типа клеток, в случае, когда отношение уровней микроРНК, рассчитанное на этапе (f), не выше, чем соотношение уровней микроРНК, рассчитанное на стадии (с); (ii) определение того, что соединение или фактор окружающей среды токсичны для указанной системы органов или органа или тканей или типа клеток, в случае, когда отношение уровней микроРНК, рассчитанное на этапе (f), выше, чем соотношение уровней микроРНК, рассчитанное на стадии (с).
В одном варианте реализации два вышеуказанных способа включают определение двух или более отношений микроРНК.
В еще одном варианте реализации двух вышеуказанных способов микроРНК, характеризующаяся повышенным содержанием в системе органов, или органе, или ткани, или типе клеток, выбрана из микроРНК, перечисленных ниже в Таблицах 1 и 2.
В одном варианте реализации двух вышеуказанных способов указанная система органов является центральной нервной системой, а пара микроРНК/нормирующая микроРНК выбрана из микроРНК, перечисленных ниже в Таблице 4.
В одном варианте реализации двух вышеуказанных способов указанная система органов является дыхательной системой, а пара микроРНК/нормирующая микроРНК выбрана из микроРНК, перечисленных ниже в Таблице 5.
В одном варианте реализации двух вышеуказанных способов указанная система органов является желудочно-кишечным трактом (ЖКТ), а пара микроРНК/нормирующая микроРНК выбрана из микроРНК, перечисленных ниже в Таблице 7.
Каждый из этапов измерения в вышеописанных способах не обязательно следует выполнять в специфическом вышеперечисленном порядке.
Субъекты, используемые в способах согласно настоящему изобретению, включают, например, людей, домашних животных и подопытных животных, используемых для моделирования заболеваний. Неограничивающие примеры микроРНК-биомаркеров и нормирующих микроРНК, пригодных для применения в вышеописанных способах согласно настоящему изобретению, приведены, например, ниже в Таблицах 1-11.
Неограничивающие примеры образцов биологических жидкостей, которые можно использовать в способах согласно настоящему изобретению, включают, например, мочу, плазму и сыворотку крови. Если используют мочу, то предпочтительно, чтобы образец мочи находился в мочевом пузыре в течение менее 4 часов.
Неограничивающие примеры способов определения уровня микроРНК в способах согласно настоящему изобретению, включают, например, гибридизацию, ОТ-ПЦР и прямое секвенирование.
В некоторых вариантах реализации способы согласно настоящему изобретению включают (например, в качестве начального этапа) этап получения образца биологической жидкости у объекта.
В одном варианте реализации (применительно к любому из вышеописанных способов согласно настоящему изобретению) указанный способ также включает этап снижения или устранения разрушения микроРНК. Неограничивающие примеры способов снижения или устранения разрушения микроРНК включают, например, добавление ингибитора РНКазы, обработку гуанидинхлоридом, обработку гуанидинизотиоцианатом, обработку N-лауроилсаркозином, обработку додецилсульфатом натрия (ДСН) и их комбинацию.
В связи с вышеописанными способами диагностики и скрининга настоящее изобретение также обеспечивает различные наборы, включающие один или более наборов праймеров и/или зондов, специфически обнаруживающих микроРНК-мишень. Такие наборы могут дополнительно включать наборы праймеров и/или зондов, специфически обнаруживающие нормирующую микроРНК. Неограничивающие примеры комбинаций праймеров или зондов в наборах представляют собой:
1. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-1, 22, 30а-3р, 30е-3р, 133а, 133b, 197, 208а, 208b, 221, 222, 302а, 302 с, 367, 378, 499-5р и 30е*.
2. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-1, 22, 95, 133а, 133b, 140 и 206.
3. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-15b, 18b, 21, 34b, 126, 135b, 142-3р, 142-5р, 146, 146b-5p, 155, 199b-5p, 200 с, 205, 211, 223, 224, 302b, 375, 449a, 449b, 450b-5p, 486, 492, 522, 566, 574-3р, 620, 650, 766 и 886-5р.
4. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-34b, 135b, 146, 146b, 147b, 155, 199b-5p, 200b, 200с, 205, 219-5p, 223, 302b и 375.
5. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-30е-3p, 122а, 130b, 136, 148а, 194, 376с, 455-3p, 518b, 616, 801, 885-5p, 17*, 30d* и 194*.
6. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-10a, 10b, 30а-3p, 30с, 107, 135а, 135b, 184, 187, 190, 194, 196b, 200a, 204, 211, 324-5p, 489, 500, 501-5р, 502-3p, 502-5р, 503, 506, 508-3p, 508-5р, 509-3p, 509-5р, 510, 532-5р, 768-3p, 886-3p, 886-5р, 891а, 10b*, 30а*, 30с-2*, 30е*, 200a*, 200b*, 424* и 500*.
7. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-Let-7g, 18, 23b, 26a, 26b, 27b, 28, 106b, 143, 145, 152, 218, 221, 223, 296, 374, 422b и 451.
6. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-10b, 30, 99а, 139-3p, 139-5р, 193а-5р, 196а, 224, 335, 365, 378/378*, 422b, 494, 518d-3p, 642a-3p, 708, 10b* и 335*.
7. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-let-7a, 10b, 26а, 30а-3p, 30а-5р, 125b, 126, 145, 146, 195, 196a-2, 196b, 205, 206, 335, 339-5p, 378, 516-5р, 517с, 519с, 520g, 520h, 525 и 1246.
8. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-Let-7a, let-7b, let-7c, 10b, 17-3p, 26а, 100, 125а, 125b, 127, 195, 199а-5р, 202, 214, 298, 382, 503, 672, 741, 742, 883-3p, 199а* и 202*.
9. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-10а, 10b, 31, 34b, 34с, 135а, 135b, 424 и 449.
10. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-Let-7c, 10b, 26а, 99а, 100, 125а-5р, 125b, 130а, 140, 143, 145, 195, 196b, 199b, 204, 214, 222, 939 и 199*.
11. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-Let-7a, let-7c, let-7g, 10b, 100, 101, 125а-5р, 125b, 130а, 134, 140, 143, 145, 186, 195, 196b, 197, 199а, 199b, 204, 214, 218, 222, 320, 424, 497, 154* и 199а*.
12. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-Let-7c, 1, 23b, 24, 27b, 28, 34a, 99а, 100, 125b, 130а, 143, 145, 147b, 187, 188-3p, 199b-5p, 205, 214, 222, 328, 373, 410, 455-5р и 490-3p.
13. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-15b, 34a, 34b, 34с, 127, 134, 135а, 135b, 187, 202, 204, 370, 372, 376а, 382, 424, 449, 465a-5p, 465b-5p, 506, 508, 509, 510, 514, 517а, 517с, 871-5р, 871-3p, 888, 202* и 888*.
14. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из семейства miR-Let-7, 10a, 17, 18а, 19а, 19b, 20a, 92, 21, 22, 23а, 24, 27а, 27b, 29а, 31, 34a, 98, 100, 106а, 126, 130а, 133а, 143, 145, 146а, 199а-3р, 210, 221, 222, 345, 365, 382, 409-3p, 431, 484, 495, 532-5р, 939, 27а*, 30а*, 30е*, 93*, 126*, 130b* и 222*.
15. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-15a, 15b, 126, 139, 142-3p, 142-5р, 146, 150, 155, 181a, 181b, 181d, 223, 302b и 342.
16. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-15a, 15b, 17-5р, 20b, 106а, 106b, 142-3p, 142-5р, 146, 149, 150, 155, 181a, 181b, 181с, 182, 183, 205, 213 и 342.
17. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-Let-7g, 15а, 20b, 21, 106b, 140, 142-3p, 146, 146b, 150, 181b, 181d, 342 и 431.
18. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-Let-7g, 9, 15а, 15b, 17, 19b, 20a, 31, 106а, 124a, 124b, 128a, 137, 142-3p, 146b-5p, 150, 186, 191, 197, 222, 223, 328, 342-3p, 423, 431, 454, 484, 766, 27* и 223*.
19. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-142-3p, 146а, 155, 181а, 205, 223 и 424.
20. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-142, 150 и 342.
21. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-Let-7i, 1, 7, 135а, 135b, 206 и 345.
22. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-Let-7g, 7, 15а, 26b, 27a, 99b, 124, 127, 132, 134, 137, 139, 152, 181а, 187, 195, 192, 202, 299, 302b, 323, 324-3p, 324-5р, 328, 330-3p, 331, 335, 340, 365, 369-3p, 375, 379, 382, 409-5р, 429, 431, 432, 455-5р, 483-5р, 514, 126*, 182* и 202*.
23. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-7, 18а, 21, 29а, 34а, 103, 127-3p. 129-3p, 130b, 134, 135а, 135b, 136, 141, 148а, 182, 183, 184, 192, 193а-3р, 193а-5р, 195, 199a-3p, 199a-5p, 200b, 200с, 204, 216a, 216b, 217, 224, 340, 365, 367, 374a, 374b, 375, 376а, 376с, 379, 382, 383, 429, 432, 451, 455-5р, 485-5р, 487b, 497, 539, 543, 642, 758, 939, 130b*, 136*, 183*, 200b* и 493*.
24. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-7, 9, 21, 127-3p, 130b, 184, 195, 216a, 216b, 217, 376а, 376с, 497, 939 и 493*.
25. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-31, 141, 143, 145, 147b, 192, 194, 200a, 200b, 200bN, 200с, 200cN, 215, 219-2-3p, 321, 375, 378, 422а, 429, 450b-5p, 487a, 490-3p, 492, 504, 565, 574-3p, 622, 650, 801, 143* и 200b*.
26. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-31, 141, 143, 192, 194, 200a, 200b, 200bN, 200с, 200cN, 215, 321, 375 и 429.
27. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-31, 106а, 106b, 143, 145, 148а, 203, 205, 210, 211 и 221.
28. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-7, 26а, 26b, 29с, 31, 106а, 106b, 124b, 130b, 141, 145, 148а, 182, 188, 192, 197, 203, 375 и 650.
29. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-Let-7a, 7, 9, 96, 98, 99a, 103, 107, 124a, 125a, 125b, 127, 128a, 132, 134, 135a, 137, 138, 149, 153, 154,181a, 181b, 181с, 182, 183, 184, 204, 211, 212, 213, 218, 219, 221, 222, 299-3p, 299-5р, 323-3p, 324-5р, 328, 329, 330, 331, 335, 337, 338, 342, 346, 369-3p, 369-5р, 370, 379, 381, 382, 383, 409-3p, 411, 425, 432, 433-5р, 485-3p, 485-5р, 487b, 488, 491-5p, 494, 495, 496, 504, 539, 541, 543, 584, 656, 668, 758, 874, 889, 935, 939, 1193, 1197 и 9*.
30. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-7, 9, 98, 124a, 125a, 125b, 128a, 132, 134, 135a, 137, 138, 154, 182, 183, 213, 218, 323-3p, 329, 337, 369-3p, 369-5р, 370, 381, 382, 409-3p, 425, 433-5р, 483-3p, 485-5р, 487b, 494, 495, 496, 541, 543, 656, 668, 874, 889, 935, 939 и 9*.
31. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-9, 124a, 125a, 125b, 128a, 132, 134, 181с, 212, 213, 222, 330-3p, 338-5р, 342, 381, 382, 425, 433 и 491-5p.
32. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-9, 96, 99a, 103, 124a, 125b, 128a, 132, 134, 137, 138, 181a, 181b, 212, 219, 221, 222, 324-5р, 328, 330, 331, 335-5р, 338, 369-3p, 381, 382, 383, 425, 433-5р, 485-5р и 491-5p.
33. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-7, 124a, 128a, 132 и 212.
34. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-9, 103, 124a, 125b, 128, 132, 134, 137, 138, 181a, 181b, 181с, 204, 212, 213, 218, 338, 381, 382, 425, 432 и 489.
35. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-103, 134, 138, 182, 183, 222, 323-3p, 369, 381 и 382.
36. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-218, 219, 338, 451 и 486.
37. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-7, 132, 212, 213 и 328.
38. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-34b, 135b, 146, 146b-5p, 155, 199b-5p, 200с, 205, 223, 302b и 375.
39. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-15b, 18b, 21, 126, 142-3p, 142-5р, 224, 449а, 449b, 450b-5p, 486, 492, 522, 566, 574-3p, 650, 766 и 886-5р.
40. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-147b, 200b и 219-5р.
41. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-31, 130b, 136, 141, 143, 145. 148a, 192, 203, 215, 375, 376с, 429, 455-5р и 650.
42. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-106а, 106b, 205 и 210 и 221.
43. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-7, 26а, 26b, 26с, 106а, 106b, 124b, 182, 188 и 197.
44. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-194, 200a, 200b, 200с и 321.
45. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-147b, 194, 200a, 200b, 200с, 219-3p, 378, 450-5р, 487а, 490-3p, 492, 504, 565, 574-3p, 622, 801, 143* и 200b*.
46. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-122a, 194, 518b, 616, 801, 885-5p, 17*, 30d* и 194*.
47. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-7, 18а, 21, 29а, 34а, 103, 127-3p, 129-3p, 134, 135а, 135b, 182, 183, 184, 193а-3р, 193а-5р, 195, 199а-3р, 199а-5р, 200b, 200с, 204, 216а, 216b, 217, 224, 340, 365, 367, 374a, 374b, 376a, 379, 382, 383, 432, 451, 485-5p, 487b, 497, 539, 543, 642, 758, 939, 130b*, 136*, 183*, 200b* и 493*.
48. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-1, 22, 95, 133а, 133b, 140 и 206.
49. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-Let-7a, 7, 9, 124а, 125а, 125b, 128a, 132, 134, 135а, 137, 138, 181а, 181с, 182, 184, 211, 212, 213, 218, 219, 222, 323-3p, 338-5р, 369, 381, 382, 425, 433-5р, 485-5p, 491-5р, 539, 541, 543, 656, 874, 935 и 9*.
50. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-7, 9, 98, 124а, 125а, 125b, 128a, 132, 134, 135а, 137, 138, 154, 182, 183, 213, 218, 323-3p, 329, 337, 369-3p, 369-5р, 370, 381, 382, 409-3p, 425, 433-5р, 483-3p, 485-5р, 487b, 494, 495, 496, 541, 543, 656, 668,874, 889, 935, 939 и 9*.
51. праймеры или зонды, специфичные к miR-330-3p и miR-342.
52. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-96, 99а, 103, 181b, 221, 324-5р, 328, 330, 331,335-5р и 383.
53. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-103, 181b, 204, 432 и 489.
54. праймеры или зонды, специфичные к miR-103 и miR-183.
55. праймеры или зонды, специфичные к miR-451 и miR-486.
56. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-22, 133а, 221, 222 и 30е*.
57. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-1, 30а-3p, 30е-3p, 133b, 197, 208а, 208b, 302а, 302с, 367, 378 и 499-5р.
58. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-Let-7, 10а, 17, 18а, 19а, 19b, 20а, 21, 23а, 24, 27а, 27b, 29a, 31, 34а, 92, 98, 100, 106а, 126, 130а, 143, 145, 146а, 199а-3р, 210, 345, 365, 382, 409-3p, 431, 484, 495, 532-5р, 939, 27а*, 30а*, 93*, 126*, 130b* и 222*.
59. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-Let-7a, Let-7c, 10b, 26a, 100, 125а, 125b, 130а, 140, 143, 145, 195, 196b, 199a, 199b, 204, 214, 222, 424, 517с и 199а*.
60. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-10a, 31, 34b, 34с, 135а, 135b и 449.
61. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-Let-7b, 127, 202, 298, 382, 503, 672, 741, 742, 883-3p и 202*.
62. праймеры или зонды, специфичные к miR-99a и miR-939.
63. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-Let-7g, 101, 134, 186, 197, 218, 320, 497 и 154*.
64. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-126, 146, 205, 206, 335, 339-5p, 378, 516-5р, 519с, 520g, 520h, 525 и 1246.
65. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-7, 127 и 493*.
66. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-Let-7i, 1, 135а, 135b, 206 и 345.
67. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-Let-7g, 15а, 26b, 27а, 99b, 124, 132, 134, 137,139, 152, 181а, 187, 195, 192, 202, 299, 302b, 323, 324-3p, 324-5р, 328, 330-3p, 331, 335, 340, 365, 369-3p, 375, 379, 382, 409-5р, 429, 431, 432, 455-5р, 483-5р, 514, 126*, 182* и 202*.
68. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-9, 21, 130b, 184, 195, 216a, 216b, 217, 376а, 376с, 497 и 939.
69. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-15a, 15b, 142-3p, 142-5р, 146, 150, 181а, 181b, 181d, 205, 342 и 423.
70. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-126, 139, 155, 223 и 302b.
71. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-17-5p, 20b, 106a, 106b, 149, 155, 181с, 182, 183 и 213.
72. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-Let-7g, 20b, 21, 106b, 140, 146b и 431.
73. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-Let-7g, 9, 17, 19b, 20a, 31, 106a, 124а, 124b, 128a, 137, 186, 191, 197, 222, 223, 328, 431, 454, 484, 766, 27* и 223*.
74. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-155, 223 и 424.
75. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из семейства miR-Let-7, 10b, семейства 17-92, 21, 29а, 31, 34а, 106a, b, 126, 146a, b, 155, 184, 195, семейства 200/141, 210, 373, 375, 423-5р, 451 и 486.
76. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-21, 31, 34а, 125-5р, 125b, 126, 146a, b, 150, 155, 221, 222 и 223.
77. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере двум микроРНК, выбранным из группы, состоящей из miR-270, 373 и 424.
78. (i) праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере одной микроРНК, выбранной из группы, состоящей из miR-128, miR-132 и miR-874, и (ii) праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере одной микроРНК, выбранной из группы, состоящей из miR-9, miR-181a, miR-491-5p и miR-141.
79. (i) праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере одной микроРНК, выбранной из группы, состоящей из miR-134, miR-323-3p и miR-382, и (ii) праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере одной микроРНК, выбранной из группы, состоящей из mir-127 и miR-370.
80. (i) праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере одной микроРНК, выбранной из группы, состоящей из miR-34b, miR-486-5p и miR-192, и (ii) праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере одной микроРНК, выбранной из группы, состоящей из miR-142-5р, miR-146b-5p, miR-155, miR-223 и miR-409-3p.
81. праймеры или зонды, специфичные к miR-34b и miR-155.
82. праймеры или зонды, специфичные к miR-146b-5p и к по меньшей мере одной из miR-486b-5p и miR-192.
83. (i) праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере одной микроРНК, выбранной из группы, состоящей из miR-192, miR-194, miR-203 и miR-215, и (ii) праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере одной микроРНК, выбранной из группы, состоящей из miR-30е-3p, miR-145 и miR-148a.
84. (i) праймеры или зонды, специфичные к miR-215 и (ii) праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере одной микроРНК, выбранной из группы, состоящей из miR-30е-3p, miR-194 и miR-203.
85. (i) праймеры или зонды, специфичные к miR-203 и (ii) праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере одной из miR-148a и miR-192.
86. (i) праймеры или зонды, специфичные к miR-194 и (ii) праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере одной из miR-148a и miR192.
87. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере одной паре микроРНК, выбранной из группы, состоящей из miR-194/miR-145, miR-194/miR148a, miR-194/miR-30e-3p, miR-215/miR-203, miR-203/miR-30e-3p, miR-203/miR148a, miR-192/miR-145, miR-192/miR148a и miR-192/miR-30e-3p.
88. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере одной паре микроРНК, выбранной из группы, состоящей из miR-192/miR-126, miR-155/miR-126, miR-145/miR-126, miR-155/miR-30e-3p, miR-192/miR-30e-3p, miR-155/miR-409-3p, miR-486-5p/miR-17-5p, miR-155/miR-17-5p, miR-192/miR-17-5p, miR-146b-5p/miR-31, miR-155/miR-31, miR-192/miR-31, miR-486-5p/miR-155, miR-192/miR-155, miR-145/miR-155, miR-146b-5p/miR-155, miR-486-5p/miR-203, miR-192/miR-203, miR-145/miR-203, miR-192/miR-215 и miR-155/miR-215.
89. праймеры или зонды, специфичные к по меньшей мере одной паре микроРНК, выбранной из группы, состоящей из miR-17-5p/miR-155, miR-192/miR-155, miR-215/miR-155, miR-192/miR-30e-3p, miR-155/miR-30e-3p и miR-146b-5p/miR-30e-3p.
Наборы по изобретению, дополнительно включающие средства для выделения или очистки микроРНК.
Наборы по изобретению, дополнительно включающие инструкции по применению.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фигуры 1А-С являются графиками, на которых показано сравнение концентрации микроРНК в плазме пациентов с УКН (УКН) и БА (БА) и контрольных субъектов соответствующего возраста (АМС). Концентрации miR-7 (A), miR-132 (В), miR-874 (С) нормировали по miR-141. Здесь и на других графиках типа "ящик с усами" "ящик" означает распределение 50% результатов, а столбик выше и ниже "ящика" означает 80% результатов. Точки указывают на значения анализа, расположенные за пределами 80% данных. Медианное значение анализов указано линией внутри "ящика". Нормированные концентрации микроРНК представлены на оси ординат в относительных единицах (логарифмическая шкала).
Фигуры 2А-Е являются графиками, на которых показано сравнение концентраций микроРНК в плазме пациентов с УКН и БА (БА) и контрольных субъектов соответствующего возраста. Концентрации miR-7 (A), miR-128 (В), miR-132 (С), miR382 (D), miR-874 (Е) нормировали по miR-9.
Фигуры 3A-Е являются графиками, на которых показано сравнение концентраций микроРНК в плазме пациентов с УКН и БА и контрольных субъектов соответствующего возраста. Концентрации miR-132 (A), miR-134 (В), miR-323-3p (С), miR-382 (D) и miR-874 (Е) нормировали nomiR-127-3p.
Фигуры 4A-G являются графиками, на которых показано сравнение концентраций микроРНК в плазме пациентов с УКН и БА и контрольных субъектов соответствующего возраста. Концентрации miR-7 (А), miR-128 (В), miR-132 (С), miR-134 (D), miR323-3p (Е), miR-382 (F) и miR-874 (G) нормировали по miR-181a.
Фигуры 5А-Н являются графиками, на которых показано сравнение концентраций микроРНК в плазме пациентов с УКН и БА и контрольных субъектов соответствующего возраста. Концентрации miR-7 (A), miR-125 (В), miR-128 (С), miR-132 (D), miR-134 (Е), miR323-3p (F), miR382 (G) и miR-874 (Н) нормировали по miR-370.
Фигуры 6А-Н являются графиками, на которых показано сравнение концентраций микроРНК в плазме пациентов с УКН и БА и контрольных субъектов соответствующего возраста. Концентрации miR-7 (A), miR-125 (В), miR-128 (С), miR-132 (D), miR-134 (E), miR323-3p (F), miR-382 (G) и miR-874 (H) нормировали по miR-491-5p.
На Фигурах 7А-С показаны кривые отношений правильного и ложного обнаружения сигналов (ROC) анализа различий между пациентами с УКН (УКН) и контрольных субъектов соответствующего возраста (АМС), полученные для miR-128 (А), miR-132 (В) и miR-874 (С), нормированных по miR-491-5p. Указаны значения площади под ROC-кривой (ППК). Чувствительность, специфичность и точность для каждой пары биомаркер/нормирующая микроРНК рассчитаны для точки "отсечки" (обозначенной как точка на каждом графике); точка отсечки является соотношением биомаркера/нормирующей микроРНК, при котором образец с равной вероятностью может принадлежать группам АМС или УКН.
На Фигурах 8А-С показан анализ кривых отношений правильного и ложного обнаружения сигналов (ROC) различий между пациентами с УКН (УКН) и контрольных субъектов соответствующего возраста (АМС), полученные для miR-134 (А), miR-323-3p (В) и miR-382 (С), нормированных по miR-370. Указаны значения площади под ROC-кривой (ППК). Чувствительность, специфичность и точность для каждой пары биомаркер/нормирующая микроРНК рассчитаны для точки "отсечки" (обозначенной как точка на каждом графике); точка отсечки является соотношением биомаркера/нормирующей микроРНК, при котором образец с равной вероятностью может принадлежать группам АМС или УКН.
На Фигурах 9A-F показан анализ связей между miR128 и miR-132 (А), miR-128 и miR-874 (В), miR-132 и miR-874 (С), miR-134 и miR-323-3p (D), miR-134 и miR-382 (E), и miR-382 и miR-323-3p (F). Сравнивали значения Ct различных пар биомаркеров были сопоставлены и рассчитывали коэффициенты ранговой корреляции Спирмена г наряду с 95% доверительными интервалами (MIN и МАХ).
Фигуры 10A-D являются графиками, на которых показано сравнение концентраций характеризующихся повышенным содержанием в легких биомаркеров miR-34b и miR-486-5p в плазме пациентов с астмой и пневмонией по сравнению с некурящими контрольными субъектами (А и В) и в плазме пациентов с ХОБЛ и НМРЛ по сравнению с курящими контрольными субъектами (С и D). Концентрации микроРНК-биомаркеров нормировали по miR-409-3p, экспрессирующейся во многих органах, но характеризующейся пониженной экспрессией в легких.
Фигуры 11А-Н являются графиками, на которых показано сравнение концентраций характеризующихся повышенным содержанием в легких биомаркеров miR-34b и miR-486-5p в плазме пациентов с астмой и пневмонией (PNA) по сравнению с некурящими контрольными субъектами. Концентрации микроРНК-биомаркеров нормировали по другим микроРНК, характеризующимся повышенным содержанием в легких: А, В - miR-155; С, D - miR-146b-5p; E, F - miR-223; G, H - miR-142-5p.
Фигуры 12А-Н являются графиками, на которых показано сравнение концентраций характеризующихся повышенным содержанием в легких биомаркеров miR-34b и miR-486-5p в плазме пациентов с ХОБЛ и НМРЛ по сравнению с курящими контрольными субъектами. Концентрации микроРНК-биомаркеров нормировали по miR-409-3p или микроРНК, характеризующимся повышенным содержанием в легких: А, В - miR-155; С, D - miR-146b-5p; E, F - miR-223; G, Н - miR-142-5p; I, J - miR-409-3p.
Фигуры 13A-J являются графиками, на которых показано сравнение концентраций miR-192 в плазме пациентов с астмой и пневмонией (PNA) по сравнению с некурящими контрольными субъектами (А-Е) и в плазме пациентов с ХОБЛ и НМРЛ по сравнению с курящими контрольными субъектами (F-J). Концентрации микроРНК-биомаркеров нормировали по miR-409-3p, экспрессирующейся во многих органах, но характеризующейся пониженной экспрессией в легких, или микроРНК, характеризующимся повышенным содержанием в легких: А, F - miR-409-3p; В, G - miR- 155; С, Н - miR-146b-5p; D, I - miR-223; E, J - miR-142-5p.
Фигуры 14А-С являются графиками, на которых показано сравнение концентраций биомаркеров miR-34b (А), miR-486-5p (В) и miR-192 (С) в плазме пациентов с астмой, пневмонией (PNA), ХОБЛ и НМРЛ по сравнению с комбинированной (некурящие и курящие) группой контрольных субъектов. Концентрации микроРНК-биомаркеров нормировали по miR-409-3p (А) или miR-223 (В) и miR-146b-5p (С), характеризующимся повышенным содержанием в легких.
Фигуры 15А-С являются графиками, на которых показано сравнение концентраций биомаркеров miR-34b, miR-486-5p и miR-192 в плазме всех пациентов с воспалительными заболеваниями легких (астмой, пневмонией и ХОБЛ) по сравнению с пациентами с НМРЛ. Концентрации микроРНК-биомаркеров нормировали по различным микроРНК, характеризующимся повышенным содержанием в легких: А - miR-155; В, С - miR-146b-5p.
Фигуры 16А-М являются графиками, на которых показано сравнение концентраций miR-192 (А, E, I), miR-194 (В, F, J), miR-203 (С, G, К) и miR-215 (D, Н, L), характеризующихся повышенным содержанием в органах желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) в плазме пациентов с раком пищевода (ЕС), желудка (GC) и ободочной и прямой кишки (CRC) и болезнью Крона (CD) по сравнению с контролем. Концентрации микроРНК-биомаркеров нормировали по повсеместно распространенной miR-409-3p или другим микроРНК, характеризующимся повышенным содержанием в ЖКТ: A-D - miR-30е-3p; Е-Н - miR-148a; I-L - miR-145. A-L: пациенты с указанными заболеваниями по сравнению с контролем; М: график, показывающий сравнение концентраций miR-203 и miR-192 в плазме пациентов со всеми исследованными патологиями ЖКТ (патология) по сравнению с контролем. Все концентрации микроРНК-биомаркеров нормировали по повсеместно распространенной miR-409-3p и выразили в относительных единицах (логарифмическая шкала).
Фигуры 17A-G являются графиками, на которых показано сравнение отношений концентраций различных микроРНК в плазме пациентов со всеми типами рака (пищевода, желудка и ободочной и прямой кишки) по сравнению с пациентами с болезнью Крона. A: miR-215/miR-30e-3p; В: miR-203/miR-148a; С: miR-194/miR-148a; D: miR-192/miR-203; E: miR-215/miR-203; F: miR-215/miR-194; G: miR-194/miR-192.
На Фигурах 18А-I показано сравнение отношений концентраций различных микроРНК в плазме пациентов с раком определенных органов желудочно-кишечного тракта. А-С: рак пищевода (ЕС) по сравнению с раком желудка (GC); D-F: рак желудка (GC) по сравнению с раком ободочной и прямой кишки (CRC); G-I: рак пищевода (ЕС) по сравнению с раком ободочной и прямой кишки (CRC). A: miR-194/miR-145; В: miR- 194/miR-148a; С: miR-194/miR-30e-3p; D: miR-215/miR-203; E: miR-203/miR-30e-3p; F: miR-203/miR-148a; G: miR-192/miR-145; H: miR-192/miR-148a; I: miR-192/miR-30e-3p.
Фигуры 19A-W являются графиками, на которых показано сравнение отношений концентраций различных микроРНК в плазме всех пациентов с заболеваниями желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) (болезнью Крона и раком пищевода, желудка и ободочной и прямой кишки) по сравнению с пациентами с заболеваниями дыхательной системы (астмой, пневмонией, ХОБЛ, НМРЛ). A-U: одна пара биомаркер/нормирующая микроРНК (А - miR-192/miR-126; В - miR-155/miR-126; С - nnR-145/miR-126; D - miR-155/miR-30е-3p; Е - miR-192/miR-30e-3p; F - miR-155/miR-409-3p; G - miR-486-5p/miR-17-5p; H - miR-155/miR-17-5p; I - miR-192/miR-17-5p; J - miR-146b-5p/miR-31; К - miR-155/miR-31; L - miR-192/miR-31; M - miR-486-5p/miR-155; N - miR-192/miR-155; O - miR-145/miR-155; P - miR-146b-5p/miR-155; Q - miR-486-5p/miR-203; R - miR-192/miR-203; S - miR-145/miR-203; Т - miR-192/miR-215; U - miR-155/miR-215). V: график, на котором показано сравнение отношений miR-486-5p/miR-155 и miR-145/miR-155 в плазме пациентов со всеми патологиями ЖКТ по сравнению со всеми заболеваниями дыхательной системы. W: Анализ кривой зависимость количества верно классифицированных положительных объектов от количества неверно классифицированных отрицательных объектов (ROC) различий между пациентами с заболеваниями ЖКТ и дыхательной системы с использованием пар микроРНК, представленных на Фиг.V. Указаны значения площади под ROC-кривой (ППК). Чувствительность, специфичность и точность для каждой пары биомаркер/нормирующая микроРНК рассчитаны для точки "отсечки", являющейся соотношением биомаркера/нормирующей микроРНК, при котором образец с равной вероятностью может принадлежать группам ЖКТ или дыхательной системы.
Фигуры 20А-Н являются графиками, на которых показано сравнение отношений концентраций различных микроРНК в плазме всех пациентов с воспалительными заболеваниями (астмой, пневмонией, ХОБЛ и болезнью Крона) по сравнению с пациентами с раком (пищевода, желудка, ободочной и прямой кишки и немелкоклеточным раком легких). A-F: одна пара биомаркер/нормирующая микроРНК (А - miR-17-5p/miR-155; В - miR-192/miR-155; С - miR-215/miR-155; D - miR-192/miR-30e-3p; E - miR-155/miR-30e-3p; F - miR-146b-5p/miR-30e-3p.G: график, на котором показано сравнение отношений miR-146b-5p/miR-155 и miR-146b-5p/miR-30e-3p в плазме пациентов со всеми воспалительными заболеваниями по сравнению со всеми типами рака. Н: Анализ кривой зависимость количества верно классифицированных положительных объектов от количества неверно классифицированных отрицательных объектов (ROC) различий между пациентами с раком и воспалительными заболеваниями с использованием пар микроРНК, представленных на Фиг.G. Указаны значения площади под ROC-кривой (ППК). Чувствительность, специфичность и точность для каждой пары биомаркер/нормирующая микроРНК рассчитаны для точки "отсечки", являющейся соотношением биомаркера/нормирующей микроРНК, при котором образец с равной вероятностью может принадлежать группам пациентов с воспалительными заболеваниями или раком.
Фигуры 21А-В являются схемами, на которых показаны процедуры обучения биомаркеров (А) и классификации (В) патологий.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ И30БРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение основано на идее сдвига парадигмы в области клинического скрининга и диагностики от скрининговых тестов, специфичных по отношению к конкретному заболеванию, к универсальному(ым) скрининговому(ым) тесту(ам) (УСТ), обнаруживающему патологию конкретной системы органов, например, желудочно-кишечного тракта, нервной, кроветворной систем и т.д., или конкретного органа или ткани или типа клеток, но неспецифического по отношению к заболеванию. Кроме того, такой тест позволит различить некоторые общие типы патологических процессов, например, воспалительные заболевания и опухоли. После обнаружения патологии можно применить тесты, специфичные для заболевания, для определения более конкретного диагноза. Такой(ие) тест(ы) также можно применять для скрининга лекарственных средств, а также для оценки токсичности различных соединений и факторов окружающей среды (например, при разработке лекарственных средств или клинических испытаниях). Настоящее изобретение основано на использовании содержания в биологических жидкостях микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в системе органов, органе, ткани и/или клетках определенного типа, в качестве биомаркеров патологии органа и/или ткани и/или клеток, описании основы для выделения таких микроРНК и способах интерпретации УСТ. УСТ по изобретению может также включать микроРНК-биомаркеры некоторых общих патологических процессов, например, гипоксии, воспаления, канцерогенеза и т.д.
Настоящее изобретение обеспечивает новые неинвазивные или минимально инвазивные способы раннего, предпочтительно до появления клинических проявлений, обнаружения патологических изменений (без определения конкретного заболевания) в системе органов или в конкретном органе/ткани/типе клеток у индивидуума, причем указанный способ включает определение уровней микроРНК, характеризующейся повышенным содержанием в системе органов/органе/ткани, в биологической жидкости (например, плазме, сыворотке, моче, слюне или другой биологической жидкости) указанного субъекта по сравнению с контролем. Конкретнее, указанный способ включает:
а. измерение уровней микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в различных системах органов/органах/тканях/клетках определенных типов, в образце биологической жидкости, полученном у субъекта;
b. измерение уровней заранее выбранной нормирующей микроРНК в том же образце биологической жидкости, полученном у субъекта;
с. расчет отношений уровней микроРНК, измеренных на этапах (а) и (b);
d. сравнение отношений уровней микроРНК, рассчитанных на этапе (с), с соответствующими контрольными отношениями, и
е. (i) идентификацию субъекта как имеющего патологию конкретной системы органов/органа/ткани/типа клеток, в случае, когда отношения уровней микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в указанной системе органов, и соответствующих нормирующих микроРНК, рассчитанные на этапе (с), выше, чем соответствующие контрольные отношения, или (ii) идентификацию указанного субъекта как не имеющего патологии указанной системы органов/органа/ткани/типа клеток, в случае, когда отношения уровней микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в указанной системе органов, и соответствующих нормирующих микроРНК, рассчитанные на этапе (с), не выше, чем соответствующие контрольные отношения.
В случае положительного результата по патологии, после такого УСТ следует выполнить тесты, специфичные по отношению к различным известным патологиям системы органов/органа/ткани/типа клеток, идентифицированных с помощью УСТ.
Настоящее изобретение также обеспечивает способы выбора потенциальных микроРНК-биомаркеров. Для отражения патологических изменений в конкретной системе органов, органе, ткани или типе клеток такие биомаркеры должны быть, во-первых, характеризоваться повышенным уровнем в одной из указанных систем органов, органов или тканей, а во-вторых, их концентрация в биологических жидкостях должна быть достаточно высокой для возможности обнаружения. Хотя в настоящее время идентифицированы не все микроРНК, и профили экспрессии многих из них в органах/тканях неизвестны, опубликованных данных (см., например, Hua et al., BMC Genomics 2009, 10: 214; Liang et al., BMC Genomics. 2007, 8: 166; Landgraf et al., Cell. 2007, 129: 1401-1414; Lee et al., RNA, 2008, 14:35-42; http://ferrolab.dmi.unict.it/iniro/;http://mips.helmholtz-muenchen.de/phenomir/) достаточно для того, чтобы сформулировать основные принципы выбора потенциальных биомаркеров:
1. Повышенное содержание в системе органов/органе/ткани/клетках определеннго типа. Хотя содержание некоторых микроРНК значительно повышено в определенном органе или ткани, например, miR-122 в печени и miR-124 в головном мозге, микроРНК, на 100% специфичные для одного органа или ткани, неизвестны. Разумеется, чем выше количество микроРНК в данной системе органов/органе/ткани/типе клеток по сравнению со всеми другими системами органов/органами/тканями/типами клеток, тем больше ее потенциал как биомаркера. Практически, если концентрация микроРНК в одном органе, по меньшей мере, в 4-5 раз выше, чем в других, их можно выбрать в качестве потенциальных биомаркеров для УСТ. Для многих органов можно найти сведения о таких микроРНК в литературе (см., например, Hua et al., BMC Genomics 2009, 10: 214; Liang et al., BMC Genomics. 2007, 8: 166; Landgrafet al.. Cell. 2007, 129: 1401-1414; Lee et al., RNA 2008, 14: 35-42; http://ferrolab.dmi.unict.it/miro/; http://mips.helmholtz-muenchen.de/phenoinir/). В Таблице 1 представлены микроРНКхарактерихующимися повышенным содержанием в различных органах, согласно многочисленным опубликованным данным. Видно, что содержание некоторых микроРНК повышено в различных органах одной системы. Это особенно характерно для органов желудочно-кишечного тракта, нервной, половой и кроветворной систем (Таблица 2). Применение этих микроРНК позволяет разработать тест, обнаруживающий патологию этих систем, но не конкретного органа. В то же время существуют микроРНК, характеризующиеся повышенным содержанием в одном-двух органах системы, и указанные микроРНК можно применять в тестах, способных точнее определить локализацию патологии. Список указанных микроРНК представлен в третьем столбце Таблицы 2. Существуют также микроРНК, характеризующиеся повышенным содержанием в двух или даже большем количестве органов, которые обычно развиваются в ходе эмбриогенеза из одних и тех же типов клеток. В таких случаях увеличение концентрации микроРНК в биологических жидкости нельзя интерпретировать однозначно. Однако комбинация нескольких микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в различных наборах органов, решает эту проблему, и настоящее изобретение также включает компьютерные методики анализа данных, полученных с применением таких нескольких микроРНК. Важно также отметить, что повышенное содержание микроРНК во втором органе не оказывает значительного влияния на результаты теста, если шансы на появление указанных микроРНК в биологических жидкостях низки. Например, многие микроРНК характеризуются повышенным содержанием (помимо других органов) в коже, но если указанные микроРНК расположены в эпидермисе, шансы на их появление в крови из кожи очень низки, и их можно применять в способе согласно настоящему изобретению.
2. Уровень экспрессии микроРНК: Разработка тестов является более легкой, а их чувствительность-более высокой, если концентрация потенциальных микроРНК-биомаркера(ов) в системе органов/органе/ткани/клетках-мишенях достаточно велика, так что можно ожидать появления большего количества молекул микроРНК-биомаркера в биологических жидкостях. Таким образом, если есть выбор между многими потенциальными микроРНК-биомаркерами, следует выбрать указанные микроРНК, которые не только характеризуются повышенным количеством в объекте-мишени, но и экспрессируются с высокой интенсивностью (например, >1000 копий на клетку). Это особенно важно для небольших органов или их частей или конкретных типов клеток в органах, например, островковых р-клетках. Это не означает, что микроРНК, которые экспрессируются не столь интенсивно, нельзя применять при разработке УСТ, однако для обнаружения микроРНК, экспрессирующихся на низком уровне, могут потребоваться большие объемы жидкости и более чувствительные способы количественного определения микроРНК. В то же время, поскольку концентрация микроРНК в биологической жидкости также зависит от эффективности ее секреции из клеток во внеклеточное пространство и транспорта в биологическую жидкость (см. следующий раздел), для экспериментального выделения наиболее перспективных биомаркеров необходимо проанализировать как можно больше микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в системах органов/органах/тканях/типах клеток.
3. Секреция микроРНК. Существует много путей появления внеклеточных микроРНК в биологических жидкостях (Hunter et al., PLoS ONE. 2008, 3: e3694; Wang et al.. Nucleic Acids Res. 2010, 38: 7248-7259; Pigati et al., PLoS ONE. 2010, 5: e13515; Gupta et al., Circ. Cardiovasc. Genet. 2010, 3: 484-488; Iguchi et al., Commun. Integr. Biol. 2010, 3: 478-481; Kosaka et al., J. Biol. Chem. 2010, 285: 17442-17452). МикроРНК могут появляться во внеклеточном пространстве и затем в биологических жидкостях в результате: (i) гибели клетки и повышения проницаемости клеточной мембраны; (ii) разрушения некоторых клеточных компартментов, например, аксонов, дендритов и шипиков нейронов; (iii) экзоцитоза (Skog et al. Nat Cell Biol, 2008, 10: 1470-1476); (iv) blebbing (Charras et al, Biophys. J. 2008, 94: 1836-1853; Fackler, Grosse, J. Cell Biol. 2008, 181: 879-884); (v) секреции микроРНК в свободном или связанном с белком состоянии (Wang et al.. Nucleic Acids Res. 2010, 38: 7248-7259). Последний механизм обеспечивает попадание более 50% бесклеточной микроРНК во внеклеточную среду из живых клеток. Секреция микроРНК является селективной, и соотношения различных концентраций микроРНК в клетках и внеклеточной среде различны. Селективность секреции микроРНК очень важна для отбора потенциальных биомаркеров. Поскольку механизмы секреции микроРНК из здоровых клеток и при развитии патологии (Rabinowits et al. Clin Lung Cancer, 2009, 10: 42-46) не исследованы, необходимо проанализировать большее количество микроРНК, учитывая, что некоторые из них, выглядящие перспективными вследствие высокой экспрессии и повышенного содержания (обогащенности) в органе/ткани-мишени, могут секретироваться на низком уровне, и наоборот. Кроме того, недавно продемонстрировано, что некоторые микроРНК, например, miR-451 и miR-1246, секретируемые из здоровых клеток на очень низком уровне, могут значительно эффективнее секретироваться из патологических клеток (Pigati et al. PLoS ONE, 2010, 5: е13515). Указанные микроРНК также можно использовать для анализа в качестве потенциальных биомаркеров, даже если они не характеризуются высокой обогащенностью в конкретной системе органов, органе или ткани, так как их комбинация с более специфичными по отношению к органу/ткани микроРНК обеспечит дополнительную информацию, полезную для выявления патологии.
Важно помнить, что многие микроРНК еще не обнаружены, а профили экспрессии многих недавно открытых микроРНК в различных тканях не исследованы. Кроме того, многие органы, ткани и особенно типы клеток не были исследованы на экспрессию известных микроРНК. Таким образом, хотя возможна разработка УСТ для многих органов и тканей на основе уже опубликованных данных, дополнительные поиски новых биомаркеров повысят информативность УСТ. Во-первых, следует проанализировать профили экспрессии всех известных микроРНК в различных системах органов/органах/тканях/типах клеток с целью определения новых микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в системе органов/органе/ткани (например, методом ОТ-ПЦР, которая в настоящее время является наиболее чувствительной и стабильной методикой количественного измерения микроРНК). Во-вторых, следует проанализировать профили экспрессии всех вновь открытых микроРНК, как описано выше. В-третьих, поскольку все органы состоят из различных типов клеток, следует дополнительно проанализировать экспрессию микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в конкретных органах, с целью поиска типа клеток, в которых наблюдается повышенное содержание указанных микроРНК. В настоящее время лучшей методикой для проведения такого исследования является гибридизация in situ (ISH). Такая информация, доступная в настоящее время для различных микроРНК, включена в Таблицы 1 и 2. Например, информация о микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в Р-клетках поджелудочной железы, включена в дополнение к микроРНК, характеризующимся повышенным содержанием в поджелудочной железе, как и информация повышенном содержании некоторых микроРНК в нейронах, расположенных в различных областях головного мозга.
Таблица 1.
МикроРНК, характеризующиеся повышенным содержанием в различных органах и тканях человека.
Орган/Ткань/Клетка
МикроРНК, характеризующиеся повышенным содержанием в органе/ткани
Сердце
1, 22,30а-3p, 30е-3p, 133а, 133b,197, 208а, 208b, 221, 222, 302а, 302с, 367, 378, 499-5р, 30е*
Опорно-двигательная система
1, 22, 95, 133а, 133b, 140, 206
Легкие
15b, 18b, 21, 34b, 126, 135b, 142-3p, 142-5р, 146, 146b-5p, 155, 199b-5p, 200с, 205, 211, 223, 224, 302b, 375, 449a, 449b, 450b-5p, 486, 492, 522, 566, 574-3p, 620, 650, 766, 886-5р.
Трахея
34b, 135b, 146, 146b, 147b, 155, 199b-5p, 200b, 200с, 205, 219-5р, 223, 302b, 375
Печень
30е-3p, 122а, 130b, 136, 148а, 194, 376с, 455-3p, 518b, 616, 801, 885-5p, 17*,30d*, 194*
Почки
10a, 10b, 30а-3p, 30c, 107, 135a, 135b, 184, 187, 190, 194, 196b, 200a, 204, 211, 324-5p, 489, 500, 501-5р, 502-3p, 502-5р, 503, 506, 508-3p, 508-5р, 509-3p, 509-5р, 510, 532-5р, 768-3p, 886-3p, 886-5р, 891а, 10b*, 30а*, 30с-2*, 30е*, 200a*, 200b*, 424*, 500*
Мочевой пузырь
Let-7g, 18, 23b, 26a, 26b, 27b, 28, 106b, 143, 145, 152, 218, 221, 223, 296, 374, 422b, 451
Жировая ткань
10b, 30, 99а, 139-3p, 139-5р, 193а-5р, 196а, 224, 335, 365, 378/378*, 422b, 494, 518d-3p, 642a-3p, 708, 10b*, 335*
Молочная железа
let-7a, 10b, 26a, 30а-3p, 30а-5р, 125b, 126, 145, 146, 195, 196a-2, 196b, 205, 206, 335, 339-5p, 378, 516-5р, 517с, 519с, 520g, 520h, 525, 1246
Яичники
Let-7a, let-7b, let-7c, 10b, 17-3p, 26a, 100, 125a, 125b, 127, 195, 199a-5p, 202, 214, 298, 382, 503, 672, 741, 742, 883-3p, 199а*, 202*
Фаллопиевы трубы
10a, 10b, 31, 34b, 34с, 135a, 135b, 424, 449
Матка
Let-7c, 10b, 26a, 99а, 100, 125а-5р, 125b, 130а, 140, 143, 145, 195, 196b, 199b, 204, 214, 222, 939, 199*
Шейка матки
Let-7a, let-7c, let-7g, 10b, 100, 101, 125а-5р, 125b, 130а, 134, 140, 143, 145, 186, 195, 196b, 197, 199а, 199b, 204, 214, 218, 222, 320, 424, 497, 154*, 199а*
Предстательная железа
Let-7c, 1, 23b, 24, 27b, 28, 34a, 99а, 100, 125b, 130а, 143, 145,147b, 187, 188-3p, 199b-5р, 205, 214, 222, 328, 373, 410, 455-5р, 490-3p
Яички
15b, 34a, 34b, 34c, 127, 134, 135a, 135b, 187, 202, 204, 370, 372, 376a, 382, 424, 449, 465a-5p, 465b-5p, 506, 508, 509, 510, 514, 517а, 517с, 871-5р, 871-3p, 888, 202*, 888*
Сосудистая система
Семейство Let-7, 10a, кластер 17-92 (17, 18a, 19a, 19b, 20a, 92), 21, 22, 23a, 24, 27a, 27b, 29a, 31, 34a, 98, 100, 106а, 126, 130а, 133а, 143, 145, 146а, 199а-3р, 210, 221, 222, 345, 365, 382, 409-3p, 431, 484, 495, 532-5р, 939, 27a*, 30а*, 30е*, 93*, 126*, 130b*, 222*
Селезенка
15a, 15b, 126, 139, 142-3p, 142-5р, 146, 150, 155, 181a, 181b, 181d, 223, 302b, 342
Тимус
15a, 15b, 17-5p, 20b, 106а, 106b, 142-3p, 142-5р, 146, 149, 150, 155, 181a, 181b, 181с, 182, 183, 205, 213, 342
Лимфатические узлы
Let-7g, 15a, 20b, 21, 106b, 140, 142-3p, 146, 146b, 150, 181b, 181d, 342,431
Периферические лимфоциты
Let-7g, 9, 15a, 15b, 17, 19b, 20a, 31, 106а, 124a, 124b, 128a, 137, 142-3p, 146b-5p, 150, 186, 191, 197, 222, 223, 328, 342-3p, 423, 431, 454, 484, 766, 27*, 223*
Т-клетки
142-3p, 146а, 155, 181a, 205, 223, 424
B-клетки
142, 150, 342
Щитовидная железа
Let-71, 1, 7, 135a, 135b, 206, 345
Надпочечники
Let-7g, 7, 15a, 26b, 27a, 99b, 124, 127, 132, 134, 137, 139, 152, 181a, 187, 195, 192, 202, 299, 302b, 323, 324-3p, 324-5р, 328, 330-3p, 331, 335, 340, 365, 369-3p, 375, 379, 382, 409-5р, 429, 431, 432, 455-5р, 483-5р, 514, 126*, 182*, 202*
Поджелудочная железа
7, 18a, 21, 29a, 34a, 103, 127-3p, 129-3p, 130b, 134, 135a, 135b, 136, 141, 148а, 182, 183, 184, 192, 193а-3р, 193а-5р, 195, 199а-3р, 199a-5p, 200b, 200с, 204, 216а, 216b, 217, 224,340, 365, 367, 374a, 374b, 375, 376a, 376с, 379, 382, 383, 429, 432, 451, 455-5р, 485-5р, 487b, 497, 539, 543, 642, 758, 939, 130b*, 136*, 183*, 200b*, 493*
β-клетки поджелудочной железы
7, 9, 21, 127-3p, 130b, 184, 195, 216а, 216b, 217, 376a, 376с, 497, 939, 493*
Толстая кишка
31, 141, 143, 145, 147b, 192, 194, 200а, 200b, 200bN, 200с, 200cN, 215, 219-2-3p, 321, 375, 378, 422а, 429, 450b-5p, 487a, 490-3p, 492, 504, 565, 574-3p, 622, 650, 801, 143*, 200b*
Гонкая кишка
31, 141, 143, 192, 194, 200a, 200b, 200bN, 200с, 200cN, 215, 321, 375,429
Пищевод
31, 106a, 106b, 143, 145, 148a, 203, 205, 210, 211, 221
Желудок
7, 26a, 26b, 29с, 31, 106а, 106b, 124b, 130b, 141, 145, 148a, 182, 188, 192, 197, 203, 375, 650
Головной мозг
Let-7a, 7, 9, 96, 98, 99a, 103, 107, 124a, 125a, 125b, 127, 128a, 132, 134, 135a, 137, 138, 149, 153, 154, 181a, 181b, 181с, 182, 183, 184, 204, 211, 212, 213, 218, 219, 221, 222, 299-3p, 299-5р, 323-3p, 324-5р, 328, 329, 330, 331, 335, 337, 338, 342, 346, 369-3p, 369-5р, 370, 379, 381, 382, 383, 409-3p, 411, 425, 432,433-5р, 485-3p, 485-5p, 487b, 488, 491-5p, 494, 495, 496, 504, 539, 541, 543, 584, 656, 668, 758, 874, 889, 935, 939, 1193, 1197,9*
Головной мозг, обогащенность в синапсах, аксонах дендритах, шипиках
7, 9, 98, 124a, 125a, 125b, 128a, 132, 134, 135a, 137, 138, 154, 182, 183, 213, 218, 323-3p, 329, 337, 369-3p, 369-5р, 370, 381, 382, 409-3p, 425, 433-5р, 483-3p, 485-5р, 487b, 494, 495, 496, 541, 543, 656, 668, 874, 889, 935, 939, 9*
Кора
9, 124a, 125a, 125b, 128a, 132, 134, 181с, 212, 213, 222, 330-3p, 338-5р, 342, 381, 382, 425, 433, 491-5p
Гиппокамп
9, 96, 99a, 103, 124a, 125b, 128a, 132, 134, 137, 138, 181a, 181b, 212, 219, 221, 222, 324-5р, 328, 330, 331, 335-5р, 338, 369-3p, 381, 382, 383, 425, 433-5р, 485-5р, 491-5p
Гипоталамус
7, 124a, 128a, 132, 212
Мозжечок
9, 103, 124a, 125b, 128, 132, 134, 137, 138, 181a, 181b, 181с, 204, 212, 213, 218, 338, 381, 382, 425, 432, 489
Миндалевидное тело
103, 134, 138, 182, 183, 222, 323-3p, 369, 381, 382,
Спинной мозг
218, 219, 338, 451, 486
Гипофиз
7, 132, 212, 213, 328
Существует несколько уровней или поколений УСТ. Первый из них может быть разработан для систем организма человека (желудочно-кишечного тракта, мочеполовой системы, головного мозга, сердечно-сосудистой системы и т.д.). Следующий уровень тестирования может быть сосредоточен на органах, тканях, типах клеток и т.д. В зависимости от клинических потребностей и экономических преимуществ, существуют, по меньшей мере, два возможных варианта УСТ и их практического применения: (i) во-первых, можно выполнить УСТ для систем организма человека, а затем, если обнаружена патология в одной или нескольких системах, выполнить тесты для органов/тканей указанных систем; (ii) во-вторых, можно непосредственно выполнять УСТ для органа/ткани/типа клеток в целях скрининга.
Все органы и ткани состоят из нескольких типов клеток различного происхождения, с различными функциями и возможными патологиями. Хотя настоящее изобретение ориентировано главным образом на уровень органов, тканей и их систем, при доступности достаточной информации о профилях экспрессии микроРНК в различных типах клеток тот же подход можно использовать для разработки УСТ для различных типов клеток. В настоящее время такая информация получена для β-клеток поджелудочной железы (Таблицы 1 и 2), что позволяет включить микроРНКхарактеризующиеся повышенным содержанием в β-клетках, в УСТ, например, для раннего выявления диабета 1 типа. Кроме того, доступны микроРНК-маркеры для В- и Т-лимфоцитов также доступны, и их включение в УСТ полезно для раннего выявления патологий, в которые вовлечены эти типы клеток.
Таблица 2
МикроРНК, характеризующиеся повышенным содержанием в системах органов и конкретных органах.
Системы организма человека
МикроРНК-биомаркеры
Повышено содержание в органе
Дыхательная система
34b, 135b, 146, 146b-5p, 155, 199b-5p, 200с, 205, 223, 302b, 375
Легкие: 15b, 18b, 21, 126, 142-3p, 142-5р, 224, 449а, 449b, 450b-5p, 486, 492, 522, 566, 574-3p, 650, 766, 886-5р
Трахея: 147b, 200b, 219-5p
Пищеварительная система (желудочно-кишечный тракт)
31, 130b, 136, 141, 143, 145, 148a, 192, 203, 215, 375, 376с, 429, 455-5р, 650
Пишевод: 106а, 106b, 205, 210, 221
Желудок: 7, 26a, 26b, 26с, 106а, 106b, 124b, 182, 188, 197,
Тонкая кишка: 194, 200а, 200b, 200с, 321
Толстая кишка: 147b, 194, 200а, 200b, 200с, 219-3p, 378, 450-5р, 487а, 490-3p, 492, 504, 565, 574-3p, 622, 801, 143*, 200b*
Печень: 122а, 194, 518b, 616, 801, 885-5p, 17*, 30d*, 194*
Поджелудочная железа: 7, 18а, 21, 29а, 34а, 103, 127-3p, 129-3p, 134, 135а, 135b, 182, 183, 184, 193а-3р, 193а-5р, 195, 199а-3p, 199а-5р, 200b, 200с, 204, 216а, 216b, 217, 224, 340, 365, 367, 374a, 374b, 376a, 379, 382, 383, 432, 451, 485-5p, 487b, 497, 539, 543, 642, 758, 939, 130b*, 136*, 183*, 200b*, 493*
Опорно-двигательная система
1, 22, 95, 133a, 133b, 140, 206
Нервная системамикроРНК, характеризующиеся повышенным содержанием в синапсах, аксонах, дендритах, шипиках
Let-7a, 7, 9, 124а, 125а, 125b, 128а, 132, 134, 135а, 137, 138, 181а, 181с, 182, 184, 211, 212, 213, 218, 219, 222, 323-3p, 338-5р, 369, 381, 382 425, 433-5р, 485-5р, 491-5р, 539, 541, 543, 656, 874, 935,9*
Кора: 330-3p, 342Гиппокамп: 96. 99а, 103, 181b, 221, 324-5p, 328, 330, 331, 335-5p, 383
Гипоталамус: специфические микроРНК не обнаружены
Мозжечок: 103, 181b, 204, 432, 489
7, 9, 98, 124а, 125а, 125b, 128a, 132 134, 135а, 137, 138, 154, 182, 183 213, 218, 323-3p, 329, 337, 369-3p 369-5р, 370, 381, 382, 409-3p, 425 433-5р, 483-3p, 485-5р, 487b, 494 495, 496, 541, 543, 656, 668, 874 889, 935, 939, 9*
Миндалевидное тело: 103, 183
Спинной мозг: 451, 486
Гипофиз: 328
Сердечно-сосудистая (кровеносная) система
22, 133a, 221, 222, 30е*
Сердце: 1, 30а-3p, 30е-3p, 133b, 197, 208a, 208b, 302a, 302с, 367, 378, 499-5р
Сосудистая система: Let-7, 10a, 17, 18а, 19a, 19b, 20a, 21, 23а, 24, 27а, 27b, 29a, 31, 34а, 92, 98, 100, 106а, 126, 130а, 143, 145, 146а, 199а-3р, 210, 345, 365, 382, 409-3p, 431, 484, 495, 532-5р, 939, 27а*, 30а*, 93*, 126*, 130b*, 222*
Мочевыделитель-ная система
не обнарущено МикроРНК характеризующихся повышенные содержанием и в почках, и е мочевом пузыре.
Половая система (женская)
Let-7a, Let-7c, 10b, 26a, 100, 125а 125b, 130а, 140, 143, 145, 195, 196b 199a, 199b, 204, 214, 222, 424, 517с, 199а*
Фаллопиевы трубы: 10a, 31, 34b, 34c, 135a, 135b, 449Яичники: Let-7b, 127, 202, 298, 382, 503, 672, 741, 742, 883-3p, 202*Матка: 99а, 939Шейка матки: Let-7g, 101, 134, 186, 197, 218, 320, 497, 154*Молочная железа: 126, 146, 205, 206, 335, 339-5р, 378, 516-5р, 519c, 520g, 520h, 525, 1246
Эндокринная тсисема
7, 127, 493*
Щитовидная железа: Let-7i, 1, 135a, 135b, 206, 345Надпочечники: Let-7g, 15а, 26b, 27a, 99b, 124, 132, 134, 137, 139, 152,181а, 187, 195, 192, 202, 299, 302b, 323, 324-3p, 324-5р, 328, 330-3p, 331, 335, 340, 365, 369-3p, 375, 379, 382, 409-5р, 429, 431, 432, 455-5р, 483-5р, 514, 126*, 182*, 202*β-клетки поджелудочной железы: 9, 21, 130b, 184, 195, 216a, 216b, 217, 376а, 376с, 497, 939
Кроветворная система
15а, 15b, 142-3p, 142-5р, 146, 150, 181а, 181b, 181d, 205, 342, 423
Селезенка: 126, 139, 155, 223, 302b
Тимус: 17-5p, 20b, 106a, 106b, 149, 155, 181с, 182, 183, 213
Лимфатические узлы: Let-7g, 20b, 21, 106b, 140, 146b, 431
Мононуклеарные клетки периферической крови: Let-7g, 9, 17, 19b, 20a, 31, 106a, 124а, 124b, 128а, 137, 186, 191, 197, 222, 223, 328, 431, 454, 484, 766, 27*, 223* Т-клетки: 155, 223, 424
В-клетки: специфические микроРНК не обнаружены
Хотя настоящее изобретение ориентировано на разработку и применение УСТ для раннего выявления патологий, независимо от их характера, однако тесты, специфичные для конкретной системы органов, органа, ткани или типа клеток тест(ы) могут также включать микроРНК-биомаркеры, повышение экспрессии которых характерно для наиболее распространенных общих патологий, например, гипоксии, воспаления и рака (Таблица 3). Ожидается, что в ближайшее время будет описано значительное количество потенциальных микроРНК-биомаркеров указанных патологий.
Таблица 3.
Список микроРНК, изменение уровня которых характерно для распространенных патологий
МикроРНК
Патология
Семейство Let-7
Рак
10b
Рак
Семейство IP-92
Рак
21
Рак, воспаление
29a
Рак
31
Рак, воспаление
34a
Рак, воспаление
106a, b
Рак
125a-5p
Воспаление
125b
Воспаление
126
Рак, воспаление
146a, b
Рак, воспаление
150
Воспаление
155
Рак,воспаление
184
Рак
195
Рак
Семейство 200/141
Рак
210
Рак
221
Воспаление
222
Воспаление
223
Воспаление
270
Гипоксия
373
Рак, гипоксия
375
Рак
423-5р
Рак
424
Гипоксия
451
Рак
486
Рак
Сводная информация о различных пригодных для использования микроРНК-биомаркерах и нормирующих микроРНК, описанных в Примерах ниже, приведена в следующих Таблицах:
Таблица 4
Пары биомаркер/нормирующая микроРНК для УКН/БА
Номер
Биомаркер
Нормирующие микроРНК
1
miR-128
miR-9, miR-181a, miR-491-5p, miR-141
2
miR-132
miR-9, miR-181a, miR-491-5p, miR-141
3
miR-874
miR-9, miR-181a, miR-491-5p, miR-141
4
miR-134
mir-127, miR-370
5
miR-323-3p
mir-127, miR-370
6
miR-382
mir-127, miR-370
7
Все микроРНК-биомаркеры
Средние, или некоторые, или все нормирующие микроРНК
Таблица 5
Пары биомаркер/нормирующая микроРНК для заболеваний дыхательной системы
Номер
Биомаркер
Нормирующие микроРНК
1
miR-34b
miR-142-5p, miR-146b-5p, miR-155, miR-223, miR-409-3p
2
miR-486-5p
miR-142-5p, miR-146b-5p, miR-155, miR-223, miR-409-3p
3
miR-192
miR-142-5p, miR-146b-5p, miR-155, miR-223, miR-409-3p
Таблица 6
Пары биомаркер/нормирующая микроРНК для дифференцирования НМРЛ и воспалительных заболеваний легких
Номер
Биомаркер
Нормирующие микроРНК
1
miR-34b
miR-155
2
miR-486b-5p
miR-146b-5p
3
miR-192
miR-146b-5p
Таблица 7
Пары биомаркер/нормирующая микроРНК для заболеваний ЖКТ
Номер
Биомаркер
Нормирующие микроРНК
1
miR-192
miR-30е-3p, miR-145, miR-148a
2
miR-194
miR-30е-3p, miR-145, miR-148a
3
miR-203
miR-30е-3p, miR-145, miR-148a
4
miR-215
miR-30е-3p, miR-145, miR-148a
Таблица 8
Пары биомаркер/нормирующая микроРНК для дифференцирования болезни Крона и рака ЖКТ
Номер
Биомаркер
Нормирующие микроРНК
1
miR-215
miR-30е-3p, miR-194, miR-203
2
miR-203
miR-148a
3
miR-194
miR-148a, miR192
4
miR-192
miR-203
Таблица 9
Пары микроРНК, соотношение которых можно применять для дифференцирования рака различных органов ЖКТ
Номер
Сравниваемые типы рака
Пары микроРНК
1
Пищевода и желудка
miR-194/miR-145, miR-194/miR148a, miR-194/miR-30е-3p
2
Желудка и ободочной и прямой кишки
miR-215/miR-203, miR-203/miR-30e-3p, miR-203/miR148a
3
Пищевода и ободочной и прямой кишки
miR-192/miR-145, miR-192/miR148a, miR-192/miR-30e-3p
Таблица 10
Пары микроРНК, соотношение которых можно применять для дифференцирования патологий дыхательной системы и ЖКТ
Номер
Пары микроРНК
1
miR-192/miR-126
2
miR-155/miR-126
3
miR-145/miR-126
4
miR-155/miR-30e-3p
5
miR-192/miR-30e-3p
6
miR-155/miR-409-3p
7
miR-486-5p/miR-17-5p
8
miR-155/miR-17-5p
9
miR-192/miR-17-5p
10
miR-146b-5p/miR-31
11
miR-155/miR-31
12
miR-192/miR-31
13
miR-486-5p/miR-155
14
miR-192/miR-155
15
miR-145/miR-155
16
miR-146b-5p/miR-155
17
miR-486-5p/miR-203
18
miR-192/miR-203
19
miR-145/miR-203
20
miR-192/miR-215
21
miR-155/miR-215
Таблица 11
Пары микроРНК, соотношение которых можно применять для дифференцирования воспалительных патологий и рака дыхательной системы и ЖКТ
Номер
Пары микроРНК
1
miR-17-5p/miR-155
2
miR-192/miR-155
3
miR-215/miR-155
4
miR-192/miR-30e-3p
5
miR-155/miR-30e-3p
6
miR-146b-5p/miR-30e-3p
Примеры подходящих способов измерения уровня микроРНК в биологических жидкостях включают гибридизацию с селективными зондами (например, с помощью нозерн-блоттинга, проточной цитометрии с использованием гранул, олигонуклеотидного микрочипа [микроматрицы] или гибридизации в растворе, например, набора для обнаружения микроРНК Ambion mirVana mima Detection Kit), обнаружение на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) (например, полимеразной цепной реакции с использованием обратной транскрипции и структур типа "стебель-петля" [ОТ-ПЦР], технологии матриц на основе количественной ПЦР [qPCR-матриц]), или прямое секвенирование посредством одной из технологий секвенирования следующего поколения (например, секвенирования малых РНК Helicos, miRNA BeadArray (Illumina), Roche 454 (FLX-Titanium) и ABI SOLiD). Обзор дополнительных способов, пригодных для применения, см., например, в Chen et al., BMC Genomics, 2009, 10: 407; Kong et al., J Cell Physiol. 2009; 218: 22-25. Поскольку многие ткане-Уоргано-специфические микроРНК присутствуют в биологических жидкостях в значительно более низких концентрациях, чем повсеместно распространенные микроРНК, а скрининг-тест должен быть способен обнаруживать ранние изменения, ассоциированные с заболеванием, которые могут быть относительно небольшими, важно использовать, по меньшей мере, на стадии доказательства принципа, наиболее чувствительную и устойчивую методику измерения уровня микроРНК. В настоящем изобретении на протяжении исследований использовали ОТ-ПЦР, обнаруживающую большее количество микроРНК в плазме и значительно более надежную, чем различные методики на основе матриц. Это не исключает применения других методик анализа микроРНК в полученном клиническом тесте.
В некоторых вариантах реализации микроРНК очищают перед количественной оценкой. МикроРНК можно выделить и очистить из биологических жидкостей различными способами, в том числе с помощью коммерческих наборов (например, набора miRNeasy [Qiagen], набора для выделения РНК MirVana RNA isolation kit [Ambion/ABI], miRACLE [Agilent], набора для выделения высокочистой микроРНК High Pure miRNA isolation kit [Roche] и набора для очистки микроРНК miRNA Purification kit [Norgen Biotek Corp.]), выделения с тризолом (см. Пример 1 ниже), концентрирован™ и очистки на анионообменников, магнитных гранулах, покрытых РНК-связывающими веществами, или адсорбции некоторых микроРНК на комплементарных олигонуклеотидах.
В некоторых вариантах реализации снижают или устраняют разрушение микроРНК в образцах биологических жидкостей и/или во время очистки малых РНК. Способы, подходящие для снижения или устранения разрушения микроРНК включают, без ограничения, добавление ингибиторов РНКаз (например, RNasin Plus [Promega], SUPERase-In [ABI] и т.д.), применение гуанидинхлорида, гуанидинизотиоцианата, N-лауроилсаркозина, додецилсульфата натрия (ДСН) или их комбинации. Кроме того, при работе с образцами мочи риск разрушения микроРНК может быть понижен, если образец провел в мочевом пузыре мало времени (например, менее 4 часов).
Ослабление разрушения микроРНК в образцах биологических жидкостей особенно важно, когда до количественной оценки микроРНК требуется хранение и транспортировка образца.
Настоящее изобретение также обеспечивает несколько подходов для нормировки концентраций микроРНК, обнаруженных в биологических жидкостях. Для учета возможных потерь данной микроРНК во время очистки, потенциального ингибирования при ОТ-ПЦР, примесей микроРНК, происходящих из гибнущих или поврежденных клеток крови или мочи во время выделения и обработки образца, изменений при почечной фильтрации и т.д., можно применять различные способы нормировки экспериментальных данных. Например, в настоящем изобретении можно использовать один или более следующих способов нормировки:
a) Можно синтезировать синтетические олигонуклеотиды-микроРНК (например, микроРНК, отсутствующие в клетках человека) и использовать их в качестве контроля потерь при очистке и ингибировании при ОТ-ПЦР (путем их добавления в образцы биологических жидкостей перед очисткой микроРНК).
b) Концентрацию микроРНК-мишени можно нормировать по одной из повсеместно распространенных микроРНК (например, miR-16, miR-30е, miR-103 и др.), малых ядрышковых РНК (мякРНК), U6-малых ядерных РНК (U6 РНК).
c) Еще один подход основан на нормировке концентраций микроРНК-мишени по микроРНК, экспрессирующейся в ряде тканей, но не в ткани-мишени. Например, miR-10a и miR-141 экспрессируются в головном мозге при значительно более низком уровне, чем в других органах, а miR-409-3p экспрессируется в легких при значительно более низком уровне, чем в других тканях. Такой подход уменьшает шансы изменения нормирующей микроРНК вследствие патологии мишени.
d) Концентрацию микроРНК-мишени также можно нормировать по микроРНК в другом(их) органе(ах) (например, микроРНК, характеризующейся повышенным содержанием в сердце, можно нормировать по микроРНК, характеризующаяся повышенным содержанием в толстой кишке или головном мозге и наоборот).
e) Нормировка микроРНК-мишени по другой микроРНК, характеризующейся повышенным содержанием в том же органе, ткани или системе органов может быть эффективна, если биомаркер и нормирующая микроРНК экспрессируются в различных типах клеток или различных органах одной и той же системы.
f) Нормировка микроРНК-мишени по другой микроРНК из того же органа и ткани, если их экспрессия и/или секреция осуществляются при патологии по-разному.
g) Нормировку микроРНК-мишени по микроРНК, характеризующейся повышенным содержанием в ткани, можно применять, например, если изменения в экспрессии и/или секреции микроРНК-мишени характерны для конкретной патологии (рак, воспаление, и т.д.), однако, указанная микроРНК не характеризуется повышенным содержанием в исследуемом органе/ткани. В таком случае нормировка по микроРНК, характеризующейся повышенным содержанием в ткани, может помочь в связи с патологией конкретного органа или системы органов.
h) Нормировка по среднему значению нескольких нормирующих микроРНК или, если выполняется анализ многих, например, >15, микроРНК - нормировка по среднему значению всех тестируемых микроРНК.
i) Для учета изменений при почечной фильтрации (при работе с образцами мочи) концентрацию микроРНК в моче можно нормировать по уровню креатинина и/или альбумина.
Расчет нормировки вместе с дальнейшей обработкой данных можно выполнить с помощью программного обеспечения для УСТ, состоящего из трех компонентов:
- Система управления базами данных (СУБД) используется для доступа и обслуживания К-базы и 1-базы. Она может являться одной из отраслевых стандартных систем, например, SQL-сервером, Oracle, MySQL, и т.д, но не ограничиваться ими.
- Приложение для разработки скрининг-теста(ов), используемое на стадии исследования. Функции этого приложения включают выбор правильной микроРНК и конструирование D-множеств, создание множеств для патологий и т.д. Указанное приложение является автономным и включает: (i) пользовательский интерфейс для ввода/проверки данных в К-базе и 1-базе и контроля выполнения алгоритма; (ii) обработку данных для обучения и классификации на стадии разработки; (iii) сервисные программы для проверки целостности D-множества, и т.д.; (iv) скрипты для создания таблиц/проверки/модификации К-базы и I-базы. Алгоритм обработки данных (алгоритм 1) включает компоненты обучения и классификации.
- Приложение для обработки результатов скрининг-теста при клиническом применении УСТ. Функции этого приложения включают тренировку на больших наборах данных и классификацию реальных данных скрининг-теста. Указанное приложение может быть автономным или веб-приложением и включает: (i) пользовательский интерфейс для ввода/проверки данных в 1-базе и контроля выполнения алгоритма; (ii) обработку данных для обучения и/или классификации данных субъекта; (iii) скрипты для создания таблиц/проверки/модификации К-базы и 1-базы; указанные таблицы отличаются от таблиц в приложении для разработки скрининг-теста. Алгоритм обработки данных (алгоритм 2), как и алгоритм 1, включает обучение и классификацию и может отличаться от алгоритма 1.
Как подробнее обсуждается в разделе «Примеры» ниже, предлагаемый подход валидировали путем анализа микроРНК в плазме пациентов с различными заболеваниями нескольких органов.
1. Нервная система:
a) УКН (умеренное когнитивное нарушение);
b) Болезнь Альцгеймера (БА).
2. Желудочно-кишечный тракт:
a) Рак пищевода;
b) Рак желудка;
c) Рак толстой кишки;
d) Болезнь Крона.
3. Дыхательная система:
а) Астма;
b) Пневмония;
c) ХОБЛ (Хроническая обструктивная болезнь легких);
d) Рак легких.
Для выбора биомаркеров и нормирующих микроРНК плазменные концентрации многих микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в соответствующих органах или системах органов, анализировали методом ОТ-ПЦР. В качестве потенциальных нормирующих микроРНК также анализировали повсеместно распространенные микроРНК и микроРНК, экспрессирующиеся в ряде органов, но слабо экспрессирующиеся в исследуемых органах. Все микроРНК, исследованные в соответствующих органах или системах органов, тестировали в качестве потенциальных биомаркеров и нормирующих микроРНК, и комбинации, обеспечивавшие статистически значимое различие между патологией и соответствующими контролями, выбрали в качестве наиболее перспективных.
Нервная система
Раннее обнаружение умеренных когнитивных нарушений (УКН) и болезни Альцгеймера (БА) использовали для проверки предлагаемого подхода к разработке скринингового теста для нервной системы. БА является наиболее распространенным нейродегенеративным заболеванием, включающим большую группу патологий, вызванных метаболическими изменениями в клетках головного мозга, утратой синапсов и других компартментов нейронов, и, наконец, гибелью нейронов (см. обзор Neurodegenerative diseases: From Molecular Concepts to Therapeutic Targets. Editors: R. von Bemhardi, N.C. Inestrosa, Nova Publishers, 2008). БА характеризуется сокращением нейритов, транспортными дефектами аксонов, синаптической дисфункцией, утратой синапсов, и, наконец, гибелью нейронов в некоторых специфических областях головного мозга, например, гиппокампе и коре (см., например, Crews, Masliah, Human Mol Gen., 2010, 19: R12-R20; Bredesen, Molecular Neurodegeneration 2009, 4: 27; Nimmrich and Ebert, Rev Neurosci. 2009, 20: 1-12; Yoshiyama et al., Neuron. 2007, 53: 337-351; Wishartet al., J Neuropathol Exp Neurol. 2006, 65: 733-739; Gylys et al., Neurochem Int. 2004; 44: 125-131; Conforti et al., Trends Neurosci. 2007, 30: 159-166; Revuelta, et al. Am J Alzheimers Dis Other Demen 2008, 23: 97-102).
Первый симптоматическая стадия БА, проявляющаяся умеренными клиническими симптомами, представляет собой УКН, обычно определяемые как промежуточное состояние между нормальным старением и деменцией (DeCarIi, Lancet Neurol., 2003, 2: 15-21; Stephan et al., Alzheimer’s Res Therapy, 2009, 1: 1-9; Apostolova et al.. Human Brain Mapping, 2010, 31: 786-797). УКН является гетерогенным синдромом, который может привести к разным результатам. До 40% пациентов с УКН возвращаются к нормальному состоянию (Larrieu et al.. Neurology, 2002, 59: 1594-1599; Brooks, Loewenstein, Alzheimer’s Res Therapy, 2010, 2: 28-36), и исследования аутопсии показывают, что у значительной части пациентов с УКН отсутствуют доказательства БА-патологии (Jicha et al., Arch Neurol, 2006, 63: 674-681; Khan, Alkon, Neurobiol. Aging, 2010, 31: 889-900). Приблизительно у 60% пациентов УКН переходит в деменцию с частотой 10-15% в год (Petersen et al., Arch Neurol. 2001, 58: 1985-1992; Apostolova et al., Human Brain Mapping, 2010, 31: 786-797). Хотя БА является наиболее частой причиной деменции, приблизительно у 20% пациентов с УКН, прогрессирующим до деменции, диагностируют не БА, а другие нейродегенеративные заболевания, например, сосудистую деменцию, деменцию с тельцами Леви, хорею Хантингтона, болезнь Паркинсона и другие виды деменции (Jicha et al., Arch Neurol, 2006, 63: 674-681; Stephan et al., Alzheimer’s Res Therapy, 2009, 1: 1-9).
Таким образом, обнаружение УКН и БА путем анализа циркулирующих микроРНК поддерживает идею разработки органо/системо-специфического теста различных патологий. Как подробно обсуждается в Примерах по отношению к выбору биомаркеров и нормирующих микроРНК, концентрация многих микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в головном мозге, в том числе в нейритах/синапсах, в плазме пациентов с УКН и БА и контрольных субъектов соответствующего возраста исследовали методом ОТ-ПЦР. Все выбранные микроРНК тестировали в качестве потенциальных биомаркеров и нормирующих микроРНК, и комбинации, обеспечивавшие статистически значимое различие между патологией и соответствующими контролями, выбрали в качестве наиболее перспективных. Данные показали, что наиболее эффективными потенциальными биомаркерами являются микроРНК нейритов/синапсов, а наиболее эффективными нормирующими микроРНК являются другие микроРНК, характеризующиеся повышенным содержанием в головном мозге, хотя для нормировки также можно применять и другие микроРНК. Два семейства биомаркеров, семейство miR-132 и семейство miR-134, а также несколько нормирующих микроРНК продемонстрировали наиболее высокую чувствительность (84%-92%) и специфичность (84%-90%) при обнаружении УКН. Высокая корреляция между членами семейства miR-134 может легко объясняться тем, что все члены этого семейства, а именно miR-134, miR-323-3p и miR-382, принадлежат к одному кластеру и экспрессируются в клетках одного типа. Тесные связи между членами семейства miR-132, а именно miR-128, miR-132 и miR-874, не были описаны ранее. Интересно также, что семейства биомаркеров miR-132 и miR-134 дают лучшие результаты с разными нормирующими микроРНК. Семейство miR-132 работает лучше, чем семейство miR-134, с нормирующими miR-491-5p, miR-181a, miR-9 и miR-141. С другой стороны, семейство miR-134 демонстрирует лучшие результаты, чем семейство miR-132, с нормирующими miR-370 и miR-127.
Таким образом, гетерогенный УКН-синдром и БА можно обнаружить с помощью анализа внеклеточных циркулирующих микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в головном мозге, в образцах плазмы.
Так как различные области мозга вовлечены в различные нейродегенеративные заболевания, приводящие к развитию деменции (Geldmacher & Whitehouse, Neurology. 1997, 48: S2-9; Levy & Chelune, J Geriatr Psychiatry Neurol. 2007 20: 227-238; Gong & Lippa, Am J Alzheimer’s Dis Other Demen, 2010, 25: 547-555) и вследствие различающихся профилей экспрессии микроРНК в различных областях головного мозга (Landgrafet al.. Cell. 2007, 129: 1401-1414; The miR-Ontology Data Base: http://ferrolab.dmi.uiiict.it/miro/). анализ других микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в головном мозге, может помочь при дифференциальной диагностике изменений и процессов, вызванных различными патологиями нейронов в головном мозге.
Желудочно-кишечный тракт
Образцы плазмы пациентов с 1 и 2 стадией рака трех органов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) (пищевода, желудка и толстой кишки) и с болезнью Крона (воспалительное заболевание кишечника, которое может поражать любую часть желудочно-кишечного тракта) использовали для проверки предлагаемого подхода к разработке скрининг-теста для ЖКТ. Измеряли плазменные концентрации микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в ЖКТ или в конкретных органах ЖКТ, например, miR-215, характеризующейся существенно повышенным содержанием в толстой кишке и тонкой кишке, и miR-203, характеризующейся повышенным содержанием в пищеводе и, в меньшей степени, в желудке, а также повсеместно встречающейся miR-30е-3p. Для поиска наиболее перспективных комбинаций биомаркер/нормирующая микроРНК рассчитывали соотношения всех возможных пар микроРНК. Полученные данные продемонстрировали, что miR-192, miR-194, miR-203 и miR-215 являются наиболее эффективными биомаркерами, a miR-145, miR-148a и miR-30е-3p являются наиболее эффективными нормирующими микроРНК. Соотношения биомаркеров/нормирующих микроРНК эффективно позволяли отличать пациентов со всеми изученными заболеваниями от контрольных субъектов. МикроРНК-203, характеризующаяся существенно повышенным содержанием в пищеводе и желудке, особенно эффективна при обнаружении рака этих органов, а микроРНК-215, характеризующаяся существенно повышенным содержанием в толстой кишке, наиболее эффективна при дифференциальной диагностике пациентов с раком толстой кишки и болезнью Крона с контрольными субъектами. Комбинацию двух или более соотношений биомаркер/нормирующая микроРНК можно использовать для повышения специфичности и чувствительности. Например, miR-192 и miR-203, нормированные по miR-30е-3p, позволяли эффективно дифференцировать пациентов со всеми патологиями ЖКТ и контрольных субъектов с 94% чувствительностью и 100% специфичностью. Важно, что все протестированные опухоли соответствовали 1 или 2 стадиям, что означает, что предлагаемый способ можно эффективно использовать для скрининга и ранней диагностики. Затем подробнее сравнивали пары различных видов рака, а также болезнь Крона по сравнению со всеми видами рака ЖКТ. В результате были найдены следующие соотношения биомаркеров/нормирующих микроРНК, позволяющие различать конкретные патологии:
1. Болезнь Крона от рака пищевода, желудка и ободочной и прямой кишки: miR-194/miR-148; miR-215/miR-30e-3p; miR-215/miR-194; miR-203/miR-148a; miR-192/miR-203; miR-215/miR-203 и miR-194/miR-192.
2. Рак пищевода от рака желудка: miR-194/miR-145; miR194/miR-148a; miRl 94/miR-30e-3p.
3. Рак пищевода от рака ободочной и прямой кишки: miR-192/miR-145; miR192/miR-148a; miRl 92/miR-30e-3p.
4. Рак желудка от рака ободочной и прямой кишки: miR-203/30е-3p; miR-203/miR-148a; miR-215/miR-203.
Таким образом, анализ плазменной концентрации микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в органах ЖКТ, эффективен при: (i) обнаружении опухолей и воспалительных заболеваний, например, болезни Крона, в пищеводе, желудке и толстой кишке; (ii) дифференциальной диагностике воспалительного заболевания и рака; (iii) дифференциальной диагностике онкологических заболеваний, локализованных в различных органах ЖКТ.
Дыхательная система
Образцы плазмы пациентов с четырьмя заболеваниями, а именно, астмой, пневмонией, хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) и немелкоклеточным раком легких (НМРЛ, стадии 1-4) использовали для проверки предложенного подхода к разработке скрининг-теста для дыхательной системы. Поскольку включенные в исследование пациенты с астмой и пневмонией были некурящими, а пациенты с ХОБЛ и НМРЛ были курильщиками, образцы плазмы также отобрали в двух различных контрольных группах - курящих и некурящих. Измеряли плазменные концентрации микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в легких, и miR-409-3p, присутствующей во многих органах, но характеризующейся пониженной экспрессией в легких. Как описано выше для ЖКТ, для поиска наиболее перспективных комбинаций биомаркер/нормирующая микроРНК рассчитывали соотношения всех возможных пар микроРНК.
Обнаружено, что miR-34b и miR-486-5p, характеризующиеся существенно повышенным содержанием в легких, являлись эффективными биомаркерами, которые при нормировке по miR-409-3p позволяли отличать пациентов с астмой и пневмонией от некурящих контрольных субъектов, а пациентов с ХОБЛ и НМРЛ - от курящих контрольных субъектов. Другими эффективными нормирующими микроРНК являлись miR-142-5p, miR-146b-5p, miR-155 и miR-223, характеризующиеся повышенным содержанием в легких, потенциально вследствие их подавления при патологиях легких (Liu X. et al. Clin. Cancer Res. 2009, 15: 1177-1183; Miko E. et al., Exp.Lung Res. 2009, 35:646-664; Halappanavar S. et al. Toxicology 2011, 285: 133-141; Heegaard NH et al. Int. J. Cancer, 2012, 130: 1378-1386). Как ни странно, miR-192 также проявила себя как эффективный биомаркер патологии легких. Поскольку показано, что эта микроРНК также являлась эффективным биомаркером заболеваний ЖКТ, разумно предположить, что экспрессия или/и секреция miR-192 увеличивается вследствие развития процессов воспаления или опухоли (Benjamin H. et al., J. Mol. Diagn. 2010, 12: 771-779; Lan HY. Clin. Exp.Pharmacol. Physiol. 2011 Dec. 28 [в печати]; Luzna P. et al. Diagn. Pathol. 2011, 6:114; Wu Q. et al. J. Biomed. Biotechnol. 2011, Epub May 26; Zhou J. et al., J. Clin. Oncol. 2011, 29: 4781-4788).
Поскольку соотношения микроРНК-биомаркер/нормирующая микроРНК не отличались для курящих и некурящих контрольных субъектов, указанные четыре патологии сравнивали с объединенной контрольной выборкой (курящих и некурящих субъектов). Полученные данные продемонстрировали, что пациентов при всех четырех анализируемых патологиях можно эффективно дифференцировать с помощью такого объединенного контроля с использованием различных наборов микроРНК-биомаркеров и нормирующих микроРНК, например miR-34b, нормированной по miR-409-3p, miR-486-5p, нормированной по miR-223, или miR-192, нормированной по miR-155. Кроме того, существовали другие эффективные наборы микроРНК-биомаркеров и нормирующих микроРНК.
Кроме того, исследовали возможность использования различных комбинаций микроРНК-биомаркеров и нормирующих микроРНК для дифференциальной диагностики НМРЛ и таких воспалительных заболеваний как астма, пневмония и ХОБЛ. Результаты показали, что больных с НМРЛ можно было эффективно отличить от пациентов с воспалительными заболеваниями, с использованием соотношений miR-34b к miR-155, miR-486-5p к miR-146b-5p или к miR-142-5p, miR-192 к miR-146b-5p.Кроме того, существовали другие эффективные комбинации микроРНК-биомаркеров и нормирующих микроРНК.
Таким образом, патологии дыхательной системы можно эффективно путем измерения внеклеточных циркулирующих микроРНК в плазме, если в качестве биомаркеров и/или нормирующих микроРНК используют микроРНК, характеризующиеся повышенным содержанием в легких. Некоторые комбинации биомаркер/нормирующая микроРНК также могут эффективно дифференцировать больных раком с больными с воспалительными заболеваниями легких.
Распознавание патологий различных систем органов
-ΔCt
Для проверки представлений о том, что тест, основанный на измерении в биологической жидкости микроРНК, характеризующейся повышенным содержанием в конкретном органе, способен обнаруживать субъектов с патологией конкретной системы органов, необходимо продемонстрировать, что существуют комбинации микроРНК, позволяющие различать патологии различных систем органов. Как подробно описано в Примерах, микроРНК выделяли из образцов плазмы, полученных от пациентов с заболеваниями ЖКТ (болезнью Крона и раком пищевода, желудка и ободочной и прямой кишки) и дыхательной системы (астмой, пневмонией, ХОБЛ и НМРЛ). Анализировали концентрации микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в легких, и микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в ЖКТ, а также нескольких микроРНК, указанных в патологические процессы различных органов. Кроме того, в исследование включили повсеместно распространенные miR-30е-3p и miR-409-3p в качестве потенциальных нормирующих микроРНК. Концентрации каждой микроРНК нормировали по miR-30е-3p и miR-409-3p, а также друг по другу, преобразовывали в относительное количество (RQ) микроРНК согласно протоколу ABI (2), и сравнивали профили микроРНК, характерные для пациентов с заболеваниями легких и ЖКТ. Данные продемонстрировали, что многие пары микроРНК эффективно различали пациентов с заболеваниями дыхательной системы и ЖКТ: miR-192/miR-126; miR-155/miR-126; miR-145/miR-126; miR-155/miR-30e-3p; miR-192/miR-30e-3p; miR-155/miR-409-3p; miR-486-5p/miR-17-5p; miR-155/miR-17-5p; miR-192/miR-17-5p; miR-146b-5p/miR-31; miR-155/miR-31; miR-192/miR-31; miR-486-5p/miR-155; miR-192/miR-155; nuR-145/miR-155; miR-146b-5p/miR-155; 486-5p/miR-203; miR-192/miR-203; miR-145/miR-203; miR-192/miR-215; miR-155/miR-215.
Комбинация из двух пар микроРНК повышает точность теста. Например, комбинация соотношений miR-145/miR-155 и miR-486-5p/miR-155 позволяла дифференцировать пациентов со всеми патологиями ЖКТ и пациентов с заболеваниями дыхательной системы с 95% чувствительностью, 90% специфичностью и 93% точностью.
Распознавание различных патологий в различных системах органов
Вследствие характерных изменений в экспрессии и секреции некоторых микроРНК во время воспалительных заболеваний и развития рака в различных органа предположили, что анализ их концентрации в биологических жидкостях можно применять для дифференциальной диагностики указанных патологий. Для очистки микроРНК использовали те же образцы плазмы и анализировали те же микроРНК, которые описаны в предыдущем разделе. В данном исследовании изучали возможность применения различных комбинаций микроРНК для различения пациентов с воспалительными заболеваниями (астмой, пневмонией, ХОБЛ и болезнью Крона) от пациентов с различными видами рака (пищевода, желудка, ободочной и прямой кишки и немелкоклеточным раком легких). Данные продемонстрировали, что несколько пар микроРНК позволяли эффективно дифференцировать пациентов с воспалительными заболеваниями от пациентов с раком: miR-17-5p/miR-155; mir-192/miR-155; miR-215/miR-155; miR146b-5p/miR155; miR192/miR-30e; miR-146b-5p/miR-30e-3p; miR155/miR-30e-3p.Существует меньшее количество пар микроРНК, дифференцирующих воспалительные заболевания с онкологическим заболеванием, чем пар микроРНК, способных дифференцировать заболевания легочной системы с заболеваниями ЖКТ. Во-первых, изменения экспрессии многих микроРНК характерны для обоих типов патологии. Во-вторых, во многих случаях канцерогенез сопровождается относительно выраженным воспалением. Комбинация из двух пар микроРНК повышает точность теста. Например, комбинация соотношений miR-146b-5p/miR-155 и miR-146b-5p/miR-30e-3p позволяла дифференцировать всех пациентов с воспалительными заболеваниями и пациентов с раком с 80% чувствительностью, 98% специфичностью и 89% точностью.
Таким образом, результаты экспериментов, представленные в настоящем изобретении, подтверждают его основные идеи. Анализ плазменной концентрации микроРНК, характеризующейся повышенным содержанием в конкретной системе органов или органе, позволяет дифференцировать: (i) заболевания системы органов и контроль; (ii) патологии трех органов желудочно-кишечного тракта; (iii) заболевания легких и желудочно-кишечного тракта; (iv) рак и воспалительные заболевания.
Наборы
В связи с вышеописанными способами диагностики и скрининга настоящее изобретение обеспечивает различные наборы, включающие один или более наборов праймеров и/или зондов, специфически обнаруживающих микроРНК-мишень. Такие наборы могут дополнительно включать наборы праймеров и/или зондов, специфически обнаруживающие нормирующую микроРНК. Комбинации праймеров или зондов в наборах могут основываться, например, на различных комбинациях молекул, перечисленных в Таблицах 1-11.
Такие наборы можно использовать для прямого обнаружения микроРНК в образцах биологических жидкостей, полученных от пациентов, или в образцах очищенной РНК.
Набор согласно настоящему изобретению также может включать реагенты для реакций удлинения праймеров и амплификации. Например, в некоторых вариантах реализации, указанный набор может также включать один или несколько из следующих компонентов: фермент обратную транскриптазу, фермент ДНК-полимеразу (например, термостабильную ДНК-полимеразу), буфер для полимеразной цепной реакции, буфер для обратной транскрипции и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дНТФ). В качестве альтернативы (или дополнения) набор может включать реагенты для выполнения анализа гибридизации. Агенты для обнаружения могут включать аналоги нуклеотидов и/или группу-метку, например, непосредственно обнаруживаемую группу, например, флуорофор (флуорохром) или радиоактивный изотоп, или косвенно обнаруживаемую группу, например, член пары связывания, например, биотин, или фермент, способный катализировать нерастворимую колориметрическую или люминометрическую реакцию. Кроме того, набор может также включать, по меньшей мере, один контейнер, содержащий реагенты для электрофоретического обнаружения нуклеиновых кислот. Такие реагенты включают реагенты, непосредственно обнаруживающие нуклеиновые кислоты, например, люминесцентные интеркалирующие агенты или реагенты для окрашивания серебром, или реагенты для обнаружения меченых нуклеиновых кислот, например, ECL реагенты, но не ограничиваются ими.. Набор может дополнительно включать средства выделения или очистки микроРНК, а также положительный и отрицательный контроли. Набор также включает информацию, связанную с ним, в форме, установленной правительственным учреждением, регулирующим производство, использование или сбыт диагностических наборов. Набор также может обеспечивать подробные инструкции по применению, хранению и устранению неполадок. Кроме того, набор необязательно представлен в подходящем корпусе, что предпочтительно для автоматической обработки в условиях высокой производительности.
Компоненты набора могут быть представлены в виде сухого(их) порошка(ов). Если реагенты и/или компоненты представлены в виде сухого порошка, указанный порошок можно восстановить путем добавления подходящего растворителя. Предполагается, что растворитель может также содержаться в еще одном контейнере. Контейнер обычно включает, по меньшей мере, один флакон, пробирку, колбу, бутыль, шприц и/или другие контейнеры, в которые помещен растворитель, необязательно, в разделенном на аликвоты виде. Наборы могут также включать второй контейнер, содержащий стерильный фармацевтически приемлемый буфер и/или другой растворитель.
При наличии более одного компонента в наборе указанный набор также обычно содержит второй, третий или другой дополнительный контейнер, в которые можно по отдельности поместить дополнительные компоненты. Вместе с тем, различные комбинации компонентов можно поместить в контейнер.
Такие наборы также могут включать компоненты, предохраняющие или сохраняющие ДНК или РНК, например, агенты, предохраняющие от разрушения нуклеиновых кислот. Такие компоненты могут, например, являться нуклеазой или свободной РНКазой (RNase-free) или защищать от РНКаз. Любая из композиций или реагентов, описанных в настоящем документе, может входить в состав набора.
Определения
Термин "скрининговый тест" в настоящем документе относится к тесту, применяемому для раннего обнаружения заболевания, предпочтительно до его клинических проявлений. В настоящем документе главным образом описаны два типа скрининг-тестов: (i) скрининг-тесты, обнаруживающие патологию в определенной системе органов/органе/ткани/типе клеток, и (ii) скрининг-тесты, обнаруживающие определенные общие патологические изменения, например, гипоксию, воспаление или канцерогенез, но не локализацию указанной патологии в системе органов/органе/ткани/типе клеток. Термин "универсальный скрининговый тест (УСТ)" относится к одному или обоим из указанных выше скрининг-тестов.
Термин "система органов" относится к группе взаимосвязанных органов, совместно действующих, выполняя определенную задачу. Например, пищевод, желудок, двенадцатиперстная кишка, тонкий и толстый кишечник являются органами пищеварительной системы. Слюнные железы, поджелудочная железа и печень также являются компонентами пищеварительной системы. В то же время Р-островки поджелудочной железы, которые выделяют гормоны, также связаны с эндокринной системой.
В рамках настоящего изобретения термин "микроРНК, характеризующаяся повышенным содержанием в органе/ткани/типе клеток" (обогащенная) относится к микроРНК, которая присутствует в повышенных количествах (например, по меньшей мере, в 5-кратно более высокой концентрации) в соответствующем органе, ткани или типе клеток по сравнению с другими органами, тканями или типами клеток, и может быть источником обнаруживаемых количеств микроРНК в тестируемой биологической жидкости. Термин "микроРНК, характеризующаяся повышенным содержанием в системе органов" относится к микроРНК, которая присутствует в повышенных количествах (например, по меньшей мере, в 5-кратно более высокой концентрации) во всех или, по меньшей мере, в нескольких органах соответствующей системы органов по сравнению с другими системами органов, органами, тканями или типами клеток, и может быть источником обнаруживаемых количеств микроРНК в тестируемой биологической жидкости. Для возможости использования в настоящем изобретении такая микроРНК, характеризующаяся повышенным содержанием в системе органов/органе/ткани/типе клеток должна обнаруживаться в биологических жидкостях в результате ее высвобождения из клеток и переноса в указанные биологические жидкости.
Термин "патология" используется в настоящем документе для обозначения неуточненной патологии, включающей метаболические и/или структурные изменения в соответствующем органе, ткани или клетках определенного типа, связанные с их дисфункцией и/или частичным разрушением и/или утратой. Термин "связанный с" используется для обозначения любой взаимосвязи, совместной встречаемости и любых причинно-следственных взаимоотношений.
Термин "микроРНК" в настоящем документе относится к классу малых (размером приблизительно 22 нуклеотида) некодирующим зрелым молекулам РНК. Они играют важную роль в регуляции генов-мишеней путем связывания с комплементарными областями матричных транскриптов (мРНК) для репрессии их трансляции или регуляции разрушения (Griffiths-Jones Nucleic Acids Research, 2006, 34, Database issue: D140-D144). Часто мишенью одной микроРНК могут являться несколько мРНК, и одна мРНК может регулироваться несколькими микроРНК, адресно воздействующими на различные участки 3’-нетранслируемой области. При связывании с мРНК, микроРНК может осуществлять регуляцию экспрессии генов и продукции белка за счет воздействия, например, на трансляцию и стабильность мРНК (Back et al.. Nature 455(7209): 64 (2008); Selbach et al.. Nature 455(7209): 58 (2008); Ambros, 2004, Nature, 431, 350-355; Bartel, 2004, Cell, 116, 281-297; Cullen, 2004, Virus Research., 102, 3-9; He et al.,2004, Nat. Rev. Genet., 5, 522-531; и Ying et al., 2004, Gene, 342, 25-28).. Примеры микроРНК, характеризующхеся повышенным содержаниемо в органе/ткани/клетке, пригодных для способов согласно настоящему изобретению, включают, без ограничения, микроРНК, приведенные в Таблице 1. Примеры микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в системе органов, пригодных для способов согласно настоящему изобретению, включают, без ограничения, микроРНК, приведенные в столбце 2 Таблицы 2. Примеры микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в органе/ткани/типе клеток, пригодных для более точной локализации патологии в способах согласно настоящему изобретению, включают, без ограничения, микроРНК, приведенные в столбце 3 Таблицы 2.
Информацию о наиболее известных в настоящее время микроРНК можно найти в базе данных микроРНК miRBase (доступна во всемирной сети на mirbase.org). Кроме того, см. Burside et al., ВМС Genomics 9:185 (2008); Williams et al., BMC Genomics 8: 172 (2007); Landgraf et al., Cell 129: 1401 (2007).
Термин "микроРНК-матрица ", используемый в настоящем описании, относится к многоканальной технологии, применяемой в молекулярной биологии и медицине. Она состоит из упорядоченного набора множественных (например, нескольких тысяч) микроскопических пятен олигонуклеотиды, каждое из которых содержит определенную последовательность (зонд), комплементарную конкретной микроРНК-мишени. После гибридизации зонд-мишень в условиях высокой жесткости полученные гибриды обычно обнаруживают и количественно определяют путем количественной оценки мишени, меченой флуорофором, серебром или хемилюминесцентной меткой, для определения относительной распространенности микроРНК. В способах согласно настоящему изобретению можно использовать как изготовленные на заказ, так и доступные для приобретения матрицы микроРНК. Неограничивающие примеры пригодных доступных для приобретения матриц микроРНК (на основе различных способов мечения мишени, обнаружения гибрида и анализа) включают матрицы производства Agilent, Illumina, Exiqon, Invitrogen, Febit и LC Sciences.
Термин "технологии секвенирования следующего поколения" используется здесь в широком смысле и относится к способам секвенирования, параллельно осуществляющим множественные реакций секвенироивания. Это позволяет значительно повысить пропускную способность и выход данных. Неограничивающие примеры часто применяемых платформ секвенирования следующего поколения включают секвенирование малых РНК Helicos, miRNA BeadArray (Illumina), Roche 454 (FLX-Titanium), и ABI SOLiD.
Термины "лицо" или "субъект" или "животное", используемые в настоящем документе, относятся к людям, домашним животным (например, кошкам, собакам, коровам, лошадям, овцам, свиньям, и т.д.) и экспериментальным животным моделям нейродегенеративных заболеваний или других патологий нейронов (см. Примеры ниже). В предпочтительном варианте реализации субъект является человеком.
Термин "мочевыводящие пути" относится к органам и протокам, которые участвуют в образовании мочи и выведении ее из организма.
Термин "очищенный" в настоящем документе относится к материалу, выделенному в условиях, которые снижают или исключают наличие несвязанных материалов, т.е., загрязнителей, включая природные материалы, из которых получен указанный материал. Например, очистка РНК включает удаление белков, липидов, солей и других соединений, присутствующих в биологических жидкостях.
В настоящем документе термин "практически не содержащий" используется в рабочем порядке в контексте аналитического тестирования материала. Предпочтительно, очищенный материал, практически не содержащий загрязнителей, является по меньшей мере на 50% чистым; более предпочтительно, по меньшей мере на 90% чистым, а еще более предпочтительно, по меньшей мере на 99% чистым. Чистоту можно оценить с помощью хроматографии, гель-электрофореза, анализа состава, биологического анализа и других способов, известных в данной области техники.
В настоящем документе термин "аналогичным образом обработан" относится к образцам (например, образцам биологических жидкостей или очищенной РНК) которые получены с использованием одного и того же протокола.
Термин "контрольный уровень" в настоящем документе охватывает заранее определенные стандарты (например, опубликованные в литературе значения) и уровни, определенные экспериментально в образцах от контрольных субъектов (например, соответствующих по возрасту и полу здоровых субъектов), обработанных аналогичным образом. Поскольку настоящее изобретение описывает скрининг-тесты, которые можно периодически выполнять для одного и того же пациента, в качестве "контрольного уровня" можно использовать ранее полученные данные от этого же субъекта.
Для дифференциальной диагностики (различения) двух патологий, например, рака от воспаления или рака пищевода от рака ободочной и прямой кишки, соотношения уровней микроРНК в плазме сравнивают не с заранее определенными контрольными отношениями, а с заранее определенными диапазонами отношений уровней микроРНК в плазме, характерными для соответствующих патологий. Для определения указанных соотношений используют выборку из нескольких сотен пациентов и измеряют уровни исследуемых микроРНК в образцах их плазмы. Затем рассчитывают соотношения уровней различных пар микроРНК, что обеспечивает диапазон соотношений, характерных для соответствующей патологии, охватывающий, например, 100%, 99% или 95% случаев патологии. Заранее определенный диапазон, используемый в реальных клинических условиях, определяется требованиями к чувствительности и специфичности теста.
Термин "примерно" или "приблизительно" обозначает значения в пределах статистически значимого диапазона. Такой диапазон может находиться в пределах порядка величины, предпочтительно в пределах 50%, более предпочтительно - в пределах 20%, еще более предпочтительно - в пределах 10%, и еще более предпочтительно - в пределах 5% от заданного значения или диапазона. Допустимый разброс, охватываемый термином "примерно" или "приблизительно", зависит от конкретной исследуемой системы, и может быть легко учтен специалистом в данной области техники.
В соответствии с настоящим изобретением можно применять стандартные методики молекулярной биологии, микробиологии и технологии рекомбинантных ДНК в пределах данной области техники. Такие методики описаны в литературе в полном объеме. См., например, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (в настоящем документе - "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonueleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; В. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); Ausubel, P.M. et al. (eds.).Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc., 1994. Указанные методики включают сайт-специфический мутагенез, как описано в Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492 (1985), U. S. Patent No. 5,071, 743, Fukuoka et al., Biochem.Biophys. Res. Commun. 263: 357-360 (1999); Kirn and Maas, BioTech. 28: 196-198 (2000); Parikh and Guengerich, BioTech. 24: 4 28-431 (1998); Ray and Nickoloff, BioTech. 13: 342-346 (1992); Wang et al., BioTech. 19: 556-559 (1995); Wang and Malcolm, BioTech. 26: 680-682 (1999); Xu and Gong, BioTech. 26: 639-641 (1999), патенты США №5789166 и 5932419, Hogrefe, Strategies 14. 3: 74-75 (2001), патенты США №5702931, 5780270 и 6242222, Angag and Schutz, Biotech. 30: 486-488 (2001), Wang and Wilkinson, Biotech. 29: 976-978 (2000), Kang et al., Biotech. 20: 44-46 (1996), Ogel and McPherson, Protein Engineer. 5: 467-468 (1992), Kirsch and Joly, Nucl. Acids. Res. 26: 1848-1850 (1998), Rhem and Hancock, J. Bacteriol. 178: 3346-3349 (1996), Boles and Miogsa, Curr. Genet. 28: 197-198(1995), Barrenttino et al., Nucl. Acids. Res. 22: 541-542 (1993), Tessier and Thomas, Meths. Molec. Biol. 57: 229-237 и Pons et al., Meth. Molec. Biol. 67: 209-218.
Термин "меченые данные", используемый для набора данных для обучения, относится к результатам анализа, полученным для клинических образцов от лиц с известным диагнозом. Например, меченые данные для микроРНК, мишенью которых является печень, должны быть собраны от людей с патологией печени (метка "Печень" и, например, "гепатит" или "гепатоцеллюлярная карцинома") и без патологии печени (метка "Контроль").
В настоящем документе термин "D-множество" относится к множеству микроРНК (биомаркеров), предназначенному для обнаружения патологии в конкретной системе органов/органе/ткани/типе клеток. Каждое D-множество включает, по меньшей мере один, но обычно более одного биомаркера, причем некоторые биомаркеры являются членами более чем одного D-множества.
Термин "К-база" относится к базе данных, содержащей информацию обо всех типах скрининг-тестов и их компонентах. Указанная информация сгруппирована в наборе различных таблиц, таких, как:
- список всех скрининг-тестов, разработанных на сегодняшний день;
- список всех патологий, охватываемых указанными тестами;
- список используемых (и предлагаемых для использования) микроРНК;
- список D-множеетв, используемых во всех скрининг-тестах;
- взаимоотношения тип скрининг-теста - D-множества - микроРНК;
- таблицы, содержащие константы для каждой микроРНК, используемой в соответствующих D-множествах.
Указанные таблицы должны быть заполнены на шаге обучения алгоритмов и используются для расчетов в классификационной части алгоритма.
Указанная база данных модифицируется и расширяется по мере поступления новых проверенных научных данных.
Термин "I-база" относится к базе данных, содержащей фактические данные скрининг-тестов для отдельных лиц, включая списки субъектов и соответствующую информацию, историю скрининг-тестов, их исходные данные и обработанные результаты и т.д.
Обе базы данных, а также программы, реализующие алгоритмы для обучения/классификации, являются частью настоящего изобретения.
Термин "итерация" используется в описании алгоритма. Он относится к циклу в составе программы, который выполняется циклически.
ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение также описано и продемонстрировано при помощи следующих Примеров. Вместе с тем, указанные и другие примеры в данном описании используются только в иллюстративных целях и никоим образом не ограничивают объем и значение изобретения или любого приведенного термина. Аналогичным образом, настоящее изобретение не ограничивается конкретными предпочтительными вариантами реализации, описанными в настоящем документе. Фактически, для специалистов в данной области техники при чтении данной заявки могут быть очевидны многие модификации и варианты изобретения, и такие варианты можно реализовать без выхода за рамки настоящего изобретения. Таким образом, настоящее изобретение должно ограничиваться только рамками прилагаемой формулы изобретения, включая все эквиваленты, к которым приписаны пункты указанной формулы изобретения.
Пример 1: Сравнение различных способов, используемых для очистки микроРНК из сыворотки и плазмы.
Существует много коммерческих наборов для выделения микроРНК, включая набор miRNeasy (Qiagen), набор для выделения РНК RNA isolation kit (Ambion/ABI), miRACLE (Agilent), набор для выделения микроРНК высокой чистоты High Pure miRNA isolation kit (Roche) и набор для очистки микроРНК miRNA Purification kit (Norgen Biotek Corp.). Кроме того, широко применяются внутренние методы, основанные на использовании тризола (Invitrogen). После удаления белков с помощью тризола РНК осаждают изопропиловым спиртом или дополнительно очищают на колонках с диоксидом кремния. В некоторых экспериментах очищенную РНК обрабатывают ДНКазой, не содержащей РНКаз (RNAse-free DNAse, Qiagen, ABI, Invitrogen или др.). Полученные различными способами препараты микроРНК сравнивали методом ОТ-ПЦР.
МикроРНК выделяли из образцов плазмы и сыворотки, полученных от одних и тех же 5 здоровых доноров. 107 копий miR-159a Arabidopsis thaliana (ath-miR-159a) добавляли к 1 мл плазмы или сыворотки после добавления гуанидин-содержащего растворв для оценки выхода микроРНК. Сравнивали две методики, одна из которых была основана на использовании набора MirVana Paris kit (Ambion/ABI), а другая - на удалении белков тризолом (Invitrogen) и последующей очистке на колонках с диоксидом кремния. После очистки РНК измеряли концентрации внесенной микроРНК и эндогенных miR-9, miR-16 и miR-134 человека в конечных препаратах методом ОТ-ПЦР. Набор MirVana Paris kit был более эффективным при выделении микроРНК, чем методика на основе тризола, и был выбран для дальнейших экспериментов. Хотя все исследуемые микроРНК обнаруживались в сыворотке и плазме крови, и оба типа образцов подходили для тестирования микроРНК, конечные значения Ct при ПЦР для образцов плазмы были приблизительно на 2 цикла ниже, и их использовали в последующих экспериментах. На основании количественного измерения внесенной ath-miR-159a, средний выход микроРНК, выделенной из плазмы с помощью набора MirVana, составил 71,4%.
Пример 2: Выбор микроРНК для тестирования.
Потенциальные микроРНК-биомаркеры (таблица 1) первоначально отбирали на основании литературных данных об их повышенном содержании в различных органах и тканях (см., например, Hua et al., BMC Genomics 2009, 10: 214; Liang et al., BMC Genomics. 2007, 8: 166; Landgraf et al., Cell. 2007, 129: 1401- 1414; Lee et al., RNA, 2008, 14:35-42; http://ferrolab.dmi.unict.it/miro/; http://inips.helmholtz-muenchen.de/phenomir/). Затем отобрали микроРНК, общие для нескольких органов одной системы органов, в качестве потенциальных биомаркеров соответствующей системы (Таблица 2, столбец 2). Те микроРНК, которые характеризуются повышенным содержанием в одном органе, но не в других органах указанной системы, идентифицировали как потенциальные биомаркеры для более точной локализации патологии (Таблица 2, столбец 3). Для нормировки, помимо добавленной синтетической микроРНК нечеловеческого происхождения, например, ath-mir-159a, и повсеместно распространенной микроРНК, например, miR-16 и miR-30е-3p, выбирают микроРНК, экспрессирующуюся в ряде тканей, но не в ткани-мишени. Например, для нормировки биомаркеров головного мозга можно использовать miR-lOb и miR-141, для биомаркеров дыхательной системы - miR-409-3p, и т.д. Другие перспективные нормирующие микроРНК, характеризующиеся повышенным содержанием в анализируемых тканях, органях и системах, отобрали экспериментально.
Все указанные биомаркеры следует включить в качестве соответствующего D-множества в К-базу для Примера 8 (ниже).
Пример 3: Обнаружение повышения сывороточных/плазменных уровней микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в головном мозге пациентов с диагнозом неврологических заболеваний.
В исследовании использовали образцы плазмы от пациентов с амнестическими УКН и БА, а также АМС (по 20 субъектов в каждой группе). РНК выделяли из двух 200-мкл аликвот образцов плазмы с использованием методики на основе тризола-диоксида кремния в соответствии с процедурой Asuragen. кОТ-ПЦР одиночной мишени проводили с использованием набора для обратной транскрипции TaqMan Reverse Transcription Kit и микроРНК-специфических праймеров типа "петля-стебель" (Applied Biosystems). Этап ОТ проводили в трех повторностях, в окончательном ПЦР использовали 2 мкл эквивалента плазмы.
Данные, представленные на Фигурах 1-6, демонстрируют 2-5-кратное повышение медианной концентрации микроРНК нейритов/синапсов (miR-7, miR-125b, miR-128, miR-132, miR-134, miR-323-3p, miR-382, miR-874) в плазме пациентов с УКН и БА по сравнению с контрольными субъектами соответствующего возраста. Указанный эффект является более заметным при нормировке по микроРНК, характеризующейся повышенным содержанием в головном мозге, например, miR-9, miR-127, miR-181a, miR-370 и miR-491-5p.
Два семейства биомаркеров (miR-132 и miR-134) и несколько нормирующие микроРНК продемонстрировали наибольшую чувствительность и специфичность. Кривые зависимость количества верно классифицированных положительных объектов от количества неверно классифицированных отрицательных объектов (ROC) для этих комбинаций биомаркеров и нормирующей микроРНК представлены на Фиг.7А-С и 8А-С.Биомаркеры miR-128, miR-132 и mir-874 ("семейство miR-132") продемонстрировали 84%-92% чувствительность и 84%-90% специфичность при нормировке по miR-491-5p.Площадь под ROC-кривой (ППК) для miR-128, miR-132 и miR-874 составила 0,95, 0,93 и 0,95, соответственно. Второй перспективный набор биомаркеров состоял из miR-134, miR-323-3p и miR-382 ("семейство miR-134") и демонстрировал 78%-91% чувствительность и 85-87% специфичность при нормировке по miR-370. ППК для miR-134, miR-323-3p и miR-382 составили 0,91, 0,94 и 0,92, соответственно.
Корреляционный анализ, показанный на Фиг.9A-F, демонстрирует, что miR-128, miR-132 и miR-874 образуют одно семейство биомаркеров (значения г-критерия Спирмена при парном сравнении находятся в диапазоне 0,93-0,95), а miR-134, miR-323-p и miR-382 образуют другое семейство биомаркеров (значения г теста Спирмена при попарном сравнении находятся в диапазоне 0,87-0,93). Высокая корреляция между членами семейства miR-134 может легко объясняться тем, что все члены этого семейства, а именно miR-134, miR-323-3p и miR-382, принадлежат к одному кластеру и экспрессируются в клетках одного типа (http://www.diana.pcbi.upenn.edii/cgi-bin/miRGen/v3/Cluster.cgi). Тесные связи между членами семейства miR-132, а именно miR-128, miR-132 и miR-874, не были описаны ранее. Кроме того, представляет интерес, что биомаркеры семейств miR-132 и miR-134 обеспечивают лучшие результаты с разными нормирующими микроРНК. Семейство miR-132 работает лучше, чем семейство miR-134, с нормирующими miR-491-5p, miR-181a, miR-9 и miR-141. С другой стороны, семейство miR-134 демонстрирует лучшие результаты, чем семейство miR-132, с нормирующими miR-370 и miR-127. Корреляция между семействами биомаркеров miR-132 и miR-134 является относительно низкой (значения г-критерия Спирмена при попарном сравнении находятся в диапазоне 0,56-0,79), что указывает на то, что они либо отражают различные патологические процессы, либо локализуются в разных областях головного мозга.
Пример 4: Обнаружение повышения сывороточных/плазменных уровней микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в легких пациентов с заболеваниями легких.
-ΔCt
Образцы плазмы были получены от пациентов, у которых диагностированы различные заболевания легких, например, астма, пневмония, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) и немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), по 10 субъектов в каждой группе. Поскольку включенные в исследование пациенты с астмой и пневмонией были некурящими, а пациенты с ХОБЛ и НМРЛ были курильщиками, образцы плазмы также взяли в двух группах контрольных субъектов - курящих и некурящих, по 10 субъектов в каждой группе. РНК выделяли из двух 200-мкл аликвот образцов плазмы с помощью методики на основе тризола-диоксида кремния в соответствии с процедурой Asuragen. кОТ-ПЦР одиночной мишени проводили с использованием набора для обратной транскрипции TaqMan Reverse Transcription Kit и микроРНК-специфических праймеров типа "петля-стебель" (Applied Biosystems). Этап ОТ проводили в трех повторностях, в конечной ПЦР использовали 2 мкл эквивалента плазмы для измерения концентрации miR-34b, miR-142-5p, miR-146-5p, miR-155, miR-223, miR-486-5p, характеризующиеся повышенным содержанием в легких, а также уровней повсеместно распространенных и характеризующихся повышенным содержанием в в желудочно-кишечном тракте miR-192 и miR-409-3p. Последняя распространена практически повсеместно, но ее экспрессия в легких понижена. Концентрации каждой микроРНК, характеризующейся повышенным содержанием в легких, нормировали по miR-409-3p и miR-192, а также друг по другу, преобразовывали в относительное количество (RQ) микроРНК согласно протоколу ABI (2), и сравнивали с профилями микроРНК контрольных субъектов.
Как и ожидалось, miR-34b и miR-486-5p, характеризующиеся существенно повышенным содержанием в легких, оказались эффективными биомаркерами, а miR-409-3p являлась эффективной нормирующей микроРНК (Фигура 10A-D). Другими эффективными нормирующими микроРНК являлись miR-142-5p, miR-146b-5p, miR-155 и miR-223, характеризующиеся повышенным содержанием в легких (Фигуры 11А-Н и 12А-Н), что, по меньшей мере, в некоторых случаях, можно объяснить их ингибированием при патологиях легких (Liu X. et al. Clin. Cancer Res. 2009, 15: 1177-1183; Miko E. et al., Exp.Lung Res. 2009, 35: 646-664; Halappanavar S. et al. Toxicology 2011, 285: 133-141; Heegaard NH et al. Int. J. Cancer, 2012, 130: 1378-1386). Как ни странно, miR-192 также вела себя как эффективный биомаркер (Фигура 13A-J). Поскольку показано, что эта микроРНК также являлась биомаркером заболеваний ЖКТ, разумно предположить, что экспрессия или/и секреция этой микроРНК увеличивается вследствие развития воспаления или опухоли (Benjamin H. et al., J. Mol. Diagn. 2010, 12: 771-779; Lan HY. Clin. Exp.Pharmacol. Physiol. 2011 Dec. 28 [в печати]; Luzna P. et al. Diagn. Pathol. 2011, 6: 114; Wu Q. et al. J. Biomed. Biotechnol. 2011, Epub May 26; Zhou J. et al., J. Clin. Oncol. 2011, 29: 4781-4788).
Соотношения микроРНК-биомаркер/нормирующая микроРНК не отличались для курящих и некурящих контрольных субъектов. Таким образом, различные патологии можно было сравнивать с объединенной группой контрольных субъектов (курящих и некурящих субъектов). На Фигуре 14А-С продемонстрировано, что все четыре анализируемые патологии эффективно дифференцировались с помощью такого объединенного контроля с использованием различных наборов микроРНК-биомаркеров и нормирующих микроРНК, например miR-34b, нормированной по miR-409-3p, miR-486-5p, нормированной по miR-223, или miR-192, нормированной по miR-155. Кроме того, существовали другие эффективные наборы микроРНК-биомаркеров и нормирующих микроРНК.
Кроме того, исследовали способность различных комбинаций микроРНК-биомаркеров и нормирующих микроРНК обеспечивать дифференцированную диагностику НМРЛ от таких воспалительных заболеваний, как астма, пневмония и ХОБЛ. На Фигуре 15А-С показано, что пациенты с НМРЛ дифференцировались от пациентов с воспалительными заболеваниями, с использованием соотношений miR-34b к miR-155, miR-486-5p к miR-146b-5p, или miR-192 к miR-146b-5p.Кроме того, существовали другие эффективные комбинации микроРНК-биомаркеров и нормирующих микроРНК.
Пример 5: Обнаружение повышения сывороточных/плазменных уровней микроРНК, характеризующихся повышенным содержанием в желудочно-кишечном тракте пациентов с заболеваниями желудочно-кишечного тракта.
-ΔCt
Образцы плазмы были получены от пациентов различными заболеванями ЖКТ, например, раком пищевода, желудка и толстой кишки, и воспалительным состоянием - болезнью Крона, по 10 субъектов в каждой группе. РНК выделяли из двух 200-мкл аликвот образцов плазмы с помощью методики на основе тризола-диоксида кремния в соответствии с процедурой, Asuragen. кОТ-ПЦР одиночной мишени проводили с использованием набора для обратной транскрипции TaqMan Reverse Transcription Kit и микроРНК-специфических праймеров типа "петля-стебель" (Applied Biosystems). Этап ОТ проводили в трех повторностях, в окончательном ПЦР использовали 2 мкл эквивалента плазмы для измерения концентрации miR-145, miR-148a, miR-192, miR-194, miR-203, miR-215, характеризующиеся повышенным содержанием в органах ЖКТ, а также уровней повсеместно распространенной miR-30е-3p. Концентрации каждой микроРНК, характеризующейся повышенным содержанием в ЖКТ, нормировали по miR-30е-3p, а также друг по другу, преобразовывали в относительное количество (RQ) микроРНК согласно протоколу ABI (2), и сравнивали с профилями микроРНК контрольных субъектов. На Фигуре 16A-L ясно показано, что miR-192, miR-194, miR-203 и miR-215 являлись эффективными биомаркерами, а miR-145, miR-148a и miR-30е-3p являлись эффективными нормирующими микроРНК. Соотношения биомаркеров/нормирующих микроРНК эффективно дифференцировали пациентов со всеми изученными заболеваниями с контрольными субъектами. МикроРНК-203, в характеризующаяся существенно повышенным содержанием в пищеводе и желудке, особенно эффективна при обнаружении рака этих органов, а микроРНК-215, характеризующаяся существенно повышенным содержанием в толстой кишке, наиболее эффективна при дифференциальной диагностике пациентов с раком толстой кишки и болезнью Крона с контрольными субъектами. Комбинации miR-192 и miR-203, нормированные по miR-30е-3p, позволяли эффективно дифференцировать пациентов со всеми патологиями ЖКТ и контрольных субъектов (Фигура 16М) с 94% чувствительностью и 100% специфичностью, рассчитанными, как описано в Примере 8. Важно, что все опухоли соответствовали 1 или 2 стадиям рака, что означает, что предлагаемый способ можно эффективно использовать для скрининга и ранней диагностики.
Кроме того, различные виды рака сравнивали друг с другом, а болезнь Крона сравнивали с всеми видами рака ЖКТ. В результате были найдены следующие соотношения биомаркеров/нормирующих микроРНК, позволяющие различать конкретные патологии:
1. Болезнь Крона от рака пищевода, желудка и ободочной и прямой кишки: miR-194/miR-148а; miR-215/miR-30e-3p; miR-215/miR-194; miR-203/miR-148a; miR-192/miR-203; miR-215/miR-203 и miR-194/miR-192 (Фигура 17A-G).
2. Рак пищевода от рака желудка: miR-194/miR-145; miR194/miR-148a; miR194/miR-30e-3p (Фигура 18А-С).
3. Рак желудка от рака ободочной и прямой кишки: miR-203/30е-3p; miR-203/miR-148a; miR-215/miR-203 (Фигура 18D-F).
4. Рак пищевода от рака ободочной и прямой кишки: miR-192/miR-145; miR192/miR-148a; miR192/miR-30e-3p (Фигура 18G-I).
Таким образом, анализ концентрации в плазме микроРНК, характеризующихся существенно повышенным содержанием о в органах ЖКТ, эффективен при: (i) обнаружении болезни Крона и опухолей в пищеводе, желудке и толстой кишке; (ii) дифференциальной диагностике воспалительного заболевания и рака; (iii) дифференциальной диагностике раковых заболеваний, расположенных в различных органах ЖКТ.
Пример 6: Дифференциальная диагностика в различных системах органов
-ΔCt
В исследовании использовали препараты микроРНК, выделенные из образцов плазмы от пациентов, как описано в Примерах 4 и 5. Исследовали возможность использовать комбинации различных микроРНК для отличения пациентов с заболеваниями ЖКТ (болезнью Крона и раком пищевода, желудка и ободочной и прямой кишки) от пациентов с заболеваниями дыхательной системы (астмой, пневмонией, ХОБЛ и НМРЛ). В исследование включили miR-126, miR-146b-5p, miR-155 и miR-486-5p, характеризующиеся повышенным содержанием в легких, и miR-145, miR-192, miR-203 и miR-215, характеризующиеся повышенным содержанием в ЖКТ. Известно, что регуляция экспрессии некоторых из этих микроРНК (Таблица 3) нарушается при патологиях различных органов. Кроме того, анализировали miR-17-5p и mir-31, указанные в патологические процессы различных органов, а также miR-30е-3p and miR-409-3p, использованные в качестве нормирующих микроРНК в Экспериментах 4 и 5. РНК выделяли из двух 200-мкл аликвот образцов плазмы с помощью методики на основе тризола-диоксида кремния в соответствии с процедурой, Asuragen. Анализ TaqMan кОТ-ПЦР микроРНК с одиночной мишенью (Applied Biosystems) проводили с использованием 2 мкл эквивалентов плазмы в трех повторностях в реакционном объеме 10 мкл при окончательной ПЦР. Концентрации каждой микроРНК нормировали по miR-30е-3p и miR-409-3p, а также друг по другу, преобразовывали в относительное количество (RQ) микроРНК согласно протоколу ABI (2), и сравнивали профили микроРНК, характерные для пациентов с заболеваниями легких и ЖКТ. На Фигуре 19A-U продемонстрировано, что многие пары микроРНК эффективно различали пациентов с заболеваниями дыхательной системы и ЖКТ: miR-192/miR-126; miR-155/miR-126; miR-145/miR-126; miR-155/miR-30e-3p; miR-192/miR-30e-3p; miR-155/miR-409-3p; miR-486-5p/miR-17-5p; miR-155/miR-17-5p; miR-192/miR-17-5p; miR-146b-5p/miR-31; miR-155/miR-31; miR-192/miR-31; miR-486-5p/miR-155; miR-192/miR-155; miR-145/miR-155; miR-146b-5p/miR-155; 486-5p/miR-203; miR-192/miR-203; miR-145/miR-203; miR-192/miR-215; miR-155/miR-215.
Комбинация из двух пар микроРНК повышала точность теста. На Фигурах 19V и 19W представлен пример комбинации соотношений miR-145/miR-155 и miR-486-5p/miR-155, позволявшей дифференцировать пациентов со всеми патологиями ЖКТ и пациентов с заболеваниями дыхательной системы с 95% чувствительностью, 90% специфичностью и 93% точностью.
Пример 7: Дифференциальная диагностика рака с воспалительными заболеваниями
Для очистки РНК использовали те же образцы плазмы и исследовали те же микроРНК, которые исследовались в Примере 6. В данном исследовании изучали возможность применения различных комбинаций микроРНК для различения пациентов с воспалительными заболеваниями (астмой, пневмонией, ХОБЛ и болезнью Крона) от пациентов с различными видами рака (пищевода, желудка, ободочной и прямой кишки и немелкоклеточным раком легких). На Фигуре 20A-F продемонстрировано, что несколько пар микроРНК позволяли эффективно отличать пациентов с воспалительными заболеваниями от пациентов с различными видами рака: miR-17-5p/miR-155; mir-192/miR-155; miR-215/miR-155; miR192/miR-30e; miR-146b-5p/miR-30e-3p; miR155/miR-30e-3p. Выявлено меньшее количество пар микроРНК, обеспечивающих дифференциальную диагностику воспалительных заболеваний и онкологических заболевание, чем пар микроРНК, позволяющих отличать заболевания легочной системы от заболеваний ЖКТ. Во-первых, изменения экспрессии многих микроРНК характерны для обоих типов патологии. Во-вторых, во многих случаях канцерогенез сопровождается относительно выраженным воспалением.
Комбинация из двух пар микроРНК повышала точность теста. На Фигурах 20G и 20Н представлен пример комбинации соотношений miR-146b-5p/miR-155 и miR-146b-5p/miR-30e-3p, позволявшей отличать всех пациентов с воспалительными заболеваниями и от пациентов с раком с 80% чувствительностью, 98% специфичностью и 89% точностью.
Таким образом, результаты вышепредставленных экспериментов подтверждают основные идеи настоящего изобретения. Анализ плазменной концентрации микроРНК, характеризующийся повышенным содержанием в конкретной системе органов или органе, позволяет дифференцировать: (i) заболевания системы органов с контролем; (ii) патологии трех органов ЖКТ; (iii) заболевания легких и ЖКТ; (iv) рак и воспалительные заболевания.
Пример 8: Способ анализа множественных микроРНК и его применение для отбора биомаркеров и обнаружения системы органов или конкретного органа с патологическими изменениями.
Для разработки УСТ (этап исследований) и его клинического применения (обработка данных скрининга) использовали два различных приложения. Алгоритмы обоих приложений содержали компоненты обучения и классификации, однако значительно отличались друг от друга.
Алгоритм, используемый для разработки скрининг-теста
В нижеследующем описании алгоритма и связанных с ним фигурах термин "биомаркер" определяет пару микроРНК (маркер и нормирующую микроРНК), используемую для диагностики патологии, и в более общем плане, для различения различных групп субъектов. Термин "ROC" означает соотношение правильного и ложного обнаружения сигналов, статистику, используемую для классификации.
Предлагаемый алгоритм основан на следующих упрощенных предположениях:
- Для любого биомаркера или комбинации биомаркеров доступно ограниченное количество экспериментов, например ≤20;
- Ответ любого биомаркера на конкретную патологию можно исследовать независимо; он не обязательно должен быть связан с "окончательной" комбинацией биомаркеров, приписанной к конкретному D-множеству;
- Алгоритмы должны являться вероятностными, что обеспечивает более точную оценку результатов.
Первая часть алгоритма связана с обучением при использовании меченых данных для патологии соответствующей системы органов, органа, ткани или типа клеток. На Фигуре 21А описаны операции этой части алгоритма.
Эта часть предполагает интенсивный диалог, практически на каждом этапе, с человеком, который выполняет эксперименты. Самый первый этап всегда включает некоторые ручные операции - печать значений образцов или выполнение операций импорта данных (частично или полностью) из некоторых стандартных документов. Тип документа может являться листом Excel или текстовым файлом с разделителями, но не ограничивается ими. Все остальные этапы могут выполняться автоматически, причем единственной ручной операцией является подтверждение типа "Далее", или включать некоторую возможность ручных исправлений. Например, на этапе нормировки следует обеспечить наилучший тип нормировки, или выполнить всю обработку для ее нескольких типов. Некоторые образцы могут иметь значения за пределами определенного статистически обоснованного диапазона. Как правило, указанный диапазон является кратным стандартному отклонению, например, в два или три раза превышал стандартное отклонение, но не ограничивался этим; в зависимости от распределения значений (насколько оно близко к нормальному и т.д.), могло приниматься решение относительно необходимости исключения этих образцов из статистических расчетов, и т.д. Статистический анализ включает расчет уровня Р разделения мишень-контроль и параметров кривой ROC (зависимость количества верно классифицированных положительных объектов от количества неверно классифицированных отрицательных объектов). Последний этап алгоритма - принятие решения о добавлении маркера - может включать компоненты (внутренний цикл) алгоритма классификации, описанного ниже. На этом этапе рассчитанные параметры применяли к набору для обучения. Решение об использовании указанного маркера основано на уровне успеха классификации. Это решение может быть пересмотрено на этапе классификации.
Компонент классификации указанного алгоритма показан на Фигуре 21B.
Вторую часть алгоритма, классификацию, применяют в основном для валидации обработки данных. Кроме того, его компонент, внутренний цикл, может использоваться на последнем этапе алгоритма обучения. В целом на стадии исследования эти компоненты - процедуру обучения и процедуру классификации - используют интерационно, т.е. повторяют несколько раз с целью достижения клинически приемлемой точности тестирования.
Процедура классификации содержит два вложенных цикла итерации, по D-множествам (внешний цикл) и биомаркерам в каждом D-множестве (внутренний цикл).
Этапы итераций по внутреннему циклу биомаркеров включают:
Этап 1. Нормировка D-множества биомаркеров
Нормировка может включать одну общую нормировку скрининг-теста (одну на тест), на основе внесенной микроРНК, и специфическую нормировку для конкретного D-множества - типа b), с) или d) (см. раздел Подробное описание изобретения, выше), или более одной из них. Вариант специфической нормировки для каждого биомаркера включен в К-базу в виде описания D-множества. Таким образом, если биомаркер является членом более чем одного D-множества, его следует нормировать соответственно в каждом множестве.
Этап 2. Расчет вероятности для биомаркера
Концентрацию биомаркера у конкретного субъекта следует преобразовать в две возможности:
наличия патологии или ее отсутствия. Операция преобразования использует две вероятностные функции, основанные на обработке данных о биомаркере в двух популяциях: с патологией и без нее (контрольная популяция). Каждая функция вероятности является линейно аппроксимированной кривой, идущей от 1 к 0 для контрольной популяции, и от 0 к 1 для популяции с патологией-мишенью. Описание каждой кривой хранят, извлекают и обновляют в К-базе.
Этап 3. Использование истории (точки, разнесенные по времени)
Кривые мишеней и контрольные кривые в значительной перекрываются. Если фактическое значение находится в пределах указанной перекрывающейся области, необходимо принять решение о том, как интерпретировать данный результат. Данная операция основана на сравнении вероятностей наличия и отсутствия патологии; анализе существующих данных о биомаркере для этого же субъекта, если такие данные были получены и сохранены в 1-базе, но не ограничивается этим.
Данная операция является окончанием итераций биомаркера.
Этапы итераций по циклу D-множества (внешние D-этапы)
Этап 1. Расчет вероятности для мишени
В большинстве случаев биомаркеры, включенные в определенное D-множество, статистически независимы, то есть вероятность принадлежности конкретного значения концентрации к контрольной группе или группе мишеней по существу не зависит от величин(ы) других биомаркеров D-множества. В этом случае рассчитывали взвешенную сумму вероятностей биомаркеров, составляющих указанное D-множество. По умолчанию все веса равны, например, вес каждого из трех биомаркеров составлял 1/3. Вместе с тем отдельные веса для каждого биомаркера в пределах этого D-множества могли храниться в К-базе. Веса могут быть основаны на некоторых ROC-параметрах биомаркеров, например, чувствительности, специфичности или ППК (площади под кривой). Сумма весов для всех биомаркеров в любом D-множестве должна быть равна 1.
В случае значительной взаимозависимости некоторых биомаркеров в конкретном D-множестве, К-база содержит описание многомерной поверхности вероятностей для указанной группы, где размерность равна количеству зависимых биомаркеров в группе. При использовании указанного описания каждую комбинацию значений биомаркеров преобразовывают в две возможности. Если D-множество содержит также независимые биомаркеры, вероятности D-множества рассчитывают с использованием взвешенной суммы вероятностей для группы (групп) зависимых биомаркеров и отдельных независимых биомаркеров.
D-этап 2. Принятие решения.
Как правило, результат должен быть представлен в виде оценки "ПОЛОЖИТЕЛЬНО" или "ОТРИЦАТЕЛЬНО" по отношению к патологии-мишени. В особых случаях также можно использовать результат "НЕ ОПРЕДЕЛЕНО" с прилагаемым процентным значением. Параметры принятия решения должны быть определены заранее и хранятся в К-базе. Они могут являться параметрами в масштабах всего скрининга или специфичными по отношению к мишени (системе органов/органу/ткани); указанные параметры применяли в вероятностям, рассчитанным на предыдущем этапе (D-этап 1). Указанные параметры можно было применять к каждой из двух вероятностей (РР - вероятность патологии, PC - вероятность принадлежности к контрольной группе), или, чаще, к их разности. Примеры: (i) параметр дифференцирования был равен 0, т.е. РР>PC означало "ПОЛОЖИТЕЛЬНО", РР<PC означало "ОТРИЦАТЕЛЬНО"; (ii) РР - PC≤0,25 означало "ОТРИЦАТЕЛЬНО", РР - PC≥0,35 - "ПОЛОЖИТЕЛЬНО", а значения между ними - "НЕ ОПРЕДЕЛЕНО"; (iii) РР>0,6 означало "ПОЛОЖИТЕЛЬНО", PC>0,7 означало "ОТРИЦАТЕЛЬНО", другие значения означали "НЕ ОПРЕДЕЛЕНО".
D-этап 3. Регистрация
Результаты отображают и хранят в 1-базе вместе с идентификационными данными, например, № теста, отметкой даты/времени, идентификационными данными пациента и т.д.
Алгоритм для клинических испытаний и применения
После завершения стадии исследования К-база содержит все компоненты УСТ и его вариантов: биомаркеры, D-множества и константы для классификации. На следующей стадии с использованием этих инструментов проводят клинические исследования в более крупных масштабах.
На основании полученного результата проводят проверку и оценку биомаркеров и D-миожеств, а также некоторых модификаций алгоритма и/или констант.Например, можно применять другой алгоритм классификации, например, полиномиальную логистическую регрессию (Hosmer DW, Lemeshow S. Applied logistic regression. Wiley, 2000; Allison PD. Logistic regression using the SAS system: theory and application. Wiley, 2008) или методику опорных векторов (Cristianini N, Shawe-Taylor J. An Introduction to Support Vector Machines and Other Kernel-based Learning Methods. Cambridge Press, 2000; Abe S. Support Vector Machines for Pattern Classification. Springer, 2010). Соответственно, вносят некоторые изменения в К-базу. После таких изменений проводили клинические испытания.
При клиническом применении алгоритм классификации испольует константы и параметры из К-базы, а фактические данные тестов хранятся в 1-базе. К-базу оставляют без изменений до следующей модернизации, т.е. поступления новых проверенных научных данных.
В целом, любой из алгоритмов, функциональных операций, или объектов изобретения, описанных в данном описании, можно реализовать в цифровой электронной схеме или в компьютерном программном обеспечении, программно-аппаратном средстве или аппаратном средстве, включая структуры, описанные в данном описании, и их структурные эквиваленты, или в комбинации одного или более из них. Например, в некоторых вариантах реализации одно или более устройств обработки данных может являться частью модуля, который можно установить в компьютере и настроить на выполнение алгоритмов для выбора и/или обнаружения биомаркеров патологий, а также выполнение алгоритмов классификации одной или более патологий. В некоторых вариантах реализации указанное одно или более устройств обработки данных может являться частью модуля, который можно установить в компьютере и настроить на выполнение алгоритма классификации, описанного в Примере 8, включая вложенные циклы итераций (например, цикла биомаркера и цикла D-множества). Например, указанное одно или более устройств обработки данных можно настроить для выполнения одной или более операций, показанных на Фигурах 21А и 21B. В некоторых вариантах реализации указанные алгоритмы можно реализовать в виде одного или более компьютерных программных продуктов, т.е. одного или более модулей компьютерной программы, закодированных на машиночитаемом носителе для исполнения, или для управления работой устройства обработки данных.
Машиночитаемый носитель может являться машиночитаемым устройством хранения информации, машиночитаемой подложкой для устройств хранения, запоминающим устройством, или комбинацией одного или более из них. Термин "устройство обработки данных" охватывает все инструменты, устройства и машины для обработки данных, включая, в качестве примера, программируемый процессор, компьютер, или несколько процессоров или компьютеров. Указанное устройство может включать, в дополнение к аппаратному обеспечению, код, создающий среду выполнения для рассматриваемой компьютерной программы, например, код, составляющий прошивку процессора, стек протокола, систему управления базами данных, операционную систему, среду выполнения или комбинацию одного или более из них. Указанное устройство включает код для создания, проверки и/или модификации таблиц К-базы или 1-базы. В некоторых вариантах реализации К-база и 1-база могут поддерживаться в системе управления базами данных, например, в числе прочего, SQL-сервере, Oracle, MySQL.
Компьютерная программа (также называемая программой, программным обеспечением, программным приложением, скриптом или кодом) может быть написана на любом языке программирования, в том числе компилируемом или интерпретируемом языке, и может быть развернута в любой обычно используемой форме, представляя собой компонент, подходящий для использования в вычислительной среде. Компьютерная программа не обязательно соответствует файлу в файловой системе. Программа может храниться в фрагменте файла, который содержит другие программы или данные (например, один или несколько скриптов, хранящихся в документе с языком разметки), в одиночном файле, посвященном рассматриваемой программе, или в нескольких согласованных файлах (например, файлах, в которых хранятся один или несколько модулей, подпрограмм или фрагментов кода). Компьютерную программу можно открыть для выполнения на одном компьютере или на нескольких компьютерах, расположенных в одном месте или распределенных по нескольким сайгам и соединенных сетью связи.
Способы, описанные в настоящей заявке, можно осуществить с помощью одного или более программируемых процессоров, выполняющих одну или более компьютерных программ для осуществления функций по обработке входных данных и получения выходных данных. Процессоры, пригодные для выполнения компьютерной программы, включают, в качестве примера, микропроцессоры общего и специального назначения, и любые один или несколько процессоров цифрового компьютера любого типа.
В некоторых вариантах реализации пользователь вручную вводит данные, полученные при скрининг-тестах на стадии исследований или клинической стадии, с помощью одного или нескольких устройств. В некоторых вариантах реализации пользователь может наблюдать или принимать выходные данные, например, но не ограничиваясь этим, данные о классификации биомаркеров и данные, относящиеся к обнаружению изменений концентрации биомаркеров, с помощью одного или более устройств вывода. Для обеспечения взаимодействия с пользователем можно использовать другие виды устройств; например, обратная связь, предоставляемая пользователю, может являться любой формой сенсорной обратной связи, например, визуальной обратной связью или слуховой обратной связью; и ввод от пользователя может осуществляться в любой форме, включая акустический, речевой или тактильный ввод.
Варианты реализации объекта изобретения, описанного в данной заявке, могут быть реализованы в компьютерной системе, включающей конечный компонент, например, в виде сервера данных, или включающей промежуточный компонент, например, сервер приложений, или включающей фронтальный компонент, например, клиентский компьютер, имеющий графический пользовательский интерфейс или веб-браузер, через который пользователь может взаимодействовать с объектом изобретения, описанным в данной заявке, или любую комбинацию одного или более из таких оконечных, промежуточных или фронтальных компонентов. Например, в некоторых вариантах реализации указанная система может включать графический пользовательский интерфейс/веб-интерфейс, который позволяет пользователю вводить и/или проверять данные в К-базе и I-базе. В качестве альтернативы или дополнения, указанный интерфейс может позволить пользователю управлять, изменять или манипулировать выполнением алгоритма. В некоторых вариантах реализации указанная система может извлекать или выводить данные из других систем и/или компонентов, соединенных в сеть.
Настоящее изобретение не ограничивается конкретными вариантами реализации, описанными в настоящем документе. Фактически, из предшествующего описания для специалистов в данной области техники очевидны различные модификации изобретения в дополнение к описанным здесь. Подразумевается, что такие модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения.
Все патенты, патентные заявки, публикации, средства анализа, литературные данные и другие материалы, упоминаемые в настоящем документе, полностью включены в настоящий документ посредством ссылок, как если бы они физически присутствовали в настоящем описании.
* Библиография
1. Osada H., Takahashi Т., Carcinogenesis 2007, 28, 2-12.
2. Scholer N. et al., Exptl. Hematology 2010, 38, 1126-1130.
3. Ma L., Weinberg RA., Trends in Genetics, 2008, 24, 448-456.
4. Esquela-Kerscher A, Slack FJ, Nature Rev. Cancer, 2006, 6, 259-269.
5. Krutovskikh VA, Herceg Z., Bioessays, 2010, 32, 894-904.
6. Wang Q. et al., Exptl. Biol. Med., 2012, [Epub Feb 16].
7. Oglesby ПС et al., Respiratory Res., 2010, 11, 148.
8. Leidinger P. et al., Frontiers in Genetics, 2012, 2, 104.
9. Lujambio A, Lowe SW., Nature, 2012, 482, 347-355.
10. Yu D.-C., et al., Int. J. Mol. Sci, 2012, 12, 2055-2063.