Оптимизация кодонного состава гемагглютинина как перспективный способ повышения иммуногенности гриппозных вакцин

ОБЗОР

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 615.371:578.832.1].012

Федорова Е.А.1, Киселева И.В.1, AuewarakulP.2, Suptawiwat O.2, Руденко Л.Г.1

оптимизация кодонного состава гемагглютинина как перспективный способ повышения иммуногенности

гриппозных вакцин

1ФГБУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» СЗО РАМН, Санкт-Петербург, Россия,

2Mahidol University, Bangkok, Thailand

Искусственное изменение кодонного состава последовательностей генов является перспективным методом, позволяющим контролировать экспрессию. В настоящем обзоре рассматриваются теоретические основы данного метода, собраны литературные данные об опыте применения методики изменения кодонного состава генов различных вирусов в разработке противовирусных вакцин. Особое внимание уделено работам, посвященным повышению иммуногенности противогриппозных вакцин с использованием данного подхода. Рассмотрены перспективы использования оптимизации кодонного состава при разработке вакцин для профилактики гриппа. Ключевые слова: вирус гриппа; гриппозная вакцина; им-муногенность; оптимизация кодонного состава.

Введение

Вакцинопрофилактика гриппа, как и многих других вирусных инфекций, остается наиболее эффективным средством предупреждения развития заболевания. Существует 2 направления специфической профилактики гриппа - вакцинопрофилактика с помощью инактиви-рованной (ИГВ) и живой гриппозной (ЖГВ) вакцин. Сравнительные исследования защитного действия ИГВ и ЖГВ, проводившиеся в течение многих лет, показали, что использование ЖГВ позволяет добиться более надежного защитного эффекта за счет воспроизведения у привитых естественной гриппозной инфекцией со стимуляцией всех звеньев иммунитета, в том числе во входных воротах инфекции [1, 2]. Эксперты Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) рекомендуют при угрозе пандемической ситуации применение ЖГВ как одного из профилактических препаратов, поскольку в результате вакцинации ЖГВ возникает перекрестный иммунитет к разным вариантам вируса гриппа [3].

Важнейшей характеристикой любой вакцины, в том числе и гриппозной, является ее способность предотвращать заболевание, что самым непосредственным образом связано с ее иммуногенностью. Требования к вакцинам против гриппа, как к ИГВ, так и ЖГВ, основываются на показателях системного иммунного ответа, определяемого по уровню сывороточных антител [4]. В последние годы в литературе появились сообщения о том, что некоторые живые вакцины вызывали слабый гуморальный иммунный ответ, будучи тем не менее достаточно эффективными [5].

Современные штаммы ЖГВ представляют собой

Для корреспонденции: Федорова Екатерина Алексеевна, e-mail fedorova.iem@gmail.com

For correspondence: Fedorova Ekaterina Alexeevna, e-mail: fedorova. iem@gmail.com

холодоадаптированные реассортантные штаммы вируса гриппа, полученные путем скрещивания эпидемических вирусов с холодоадаптированными донорами аттенуации. Геном вакцинного штамма содержит гемагглютинин и нейраминидазу эпидемического штамма, а остальные 6 генов принадлежат донору аттенуации. В этих генах содержатся аттенуирующие мутации, определяющие стабильность характеристик безопасности вакцинного штамма [6, 7].

Кроме стандартных способов оптимизации имму-ногенности вакцины, таких, как подбор оптимальной вакцинирующей дозы, сочетание с иммуностимулирующими препаратами, использование адъювантов, постоянно разрабатываются и совершенствуются новые подходы к повышению иммуногенной активности вакцинных препаратов. Один из таких подходов - оптимизация кодонного состава генов, кодирующих антигенные детерминанты, успешно применяется в разработке ДНК-вакцин.

Настоящий обзор посвящен методике оптимизации кодонного состава, опыту ее применения для повышения иммуногенности вакцин, а также перспективам использования данного подхода для повышения иммуногенности гриппозных вакцин.

Теоретические основы оптимизации кодонного состава

С момента, когда стал известен феномен вырожденности генетического кода, проводились исследования частоты встречаемости разных кодонов в генах различных организмов. Доказано влияние кодонного состава на регуляцию генов, эффективность трансляции, вторичную структуру ДНК и РНК [8]. Показано, что имеет место предпочтение использования определенных кодонов разными организмами, и кодонный состав генов многоклеточных организмов связан с эволюционным возрастом этих генов. Также была замечена связь между уровнем экспрессии генов и их кодонным составом, наиболее сильно проявляющаяся у примитивных организмов, но существующая также и у высших многоклеточных [9].

Феномен предпочтения определенных кодонов при кодировании генетической информации различными организмами используется при разработке генетических конструкций для изменения их свойств. С созданием методик, позволяющих синтезировать крупные фрагменты ДНК, появилась возможность эффективной модификации генетического материала простейших живых систем, что получило широкое

применение в таких специальных областях, как создание противовирусных вакцин. Метод оптимизации/ деоптимизации кодонного состава заключается в создании генетической конструкции на основе какого-либо гена с измененным составом кодонов, при этом в аминокислотную последовательность кодируемого белка и, соответственно, его структуру, изменения не вносятся, но за счет изменений в РНК меняется эффективность экспрессии гена. При оптимизации кодонного состава триплеты нуклеотидов, кодирующие определенную аминокислоту, заменяют на синонимичные, кодирующие эту же аминокислоту, но более часто использующиеся в генах с высоким уровнем экспрессии в данном виде клеток. За счет этого достигается повышение эффективности этапа трансляции. Это связывают с отсутствием конкуренции за тРНК клетки за счет использования более обильных в данной клетке молекул транспортных РНК [10], а также с изменением последовательности мРНК и соответственно ее вторичной структуры [11], и характеристик стабильности [12], что также может повлиять на скорость и эффективность процесса трансляции.

При простой замене кодонов по всей последовательности существует высокий риск появления в итоговой молекуле нежелательных регуляторных участков, сайтов рестрикции, повторов и др. С другой стороны, некоторые изменения могут стабилизировать структуру. Таким образом, целью является создание последовательности, в которой будет найдено оптимальное сочетание внесенных изменений, удовлетворяющее целям исследования.

Разработан ряд компьютерных программ, предназначенных для оптимизации последовательностей путем замены кодонов. Алгоритмы, по которым работали программы первого поколения, включали в себя только анализ кодонного состава введенной последовательности и последовательную подмену кодонов на более частые в системе, которую планировалось использовать для экспрессии [13]. Современные алгоритмы включают также анализ итоговой последовательности ДНК и мРНК по ряду показателей. Так, в программе GeneOptimizer [14] происходит последовательная оптимизации небольших участков последовательности, при этом исследователь самостоятельно задает длину участка и параметры, по которым будет проводиться оценка эффективности оптимизации. Среди них рассматриваются индекс использования кодонов (в соответствии с базами данных частоты встречаемости кодонов в различных клетках [15]), анализ последовательности ДНК на наличие сайтов рестрикции, CpG-островков, участков спаривания, гомологии с другими последовательностями, содержания GQ наличия прямых и инвертированных повторов. Доступная для использования в Интернете программа JCat учитывает так называемый кодонный контекст - определенные сочетания кодонов, располагающиеся рядом [16]. Важность этого параметра связана с взаимодействием определенных тРНК в процессе элонгации [17]. Алгоритм Hot RodTM (CODA Genomics, Inc.), разработанный для оптимизации экспрессии белков в E.coli, включает оптимизацию кодонного состава, учет встречаемости пар кодонов и анализ вторичной структуры мРНК, что позволяет проводить компью-

терный дизайн оптимизированных генов с высокой степенью эффективности [18].

В эволюции вирусов адаптация к хозяину включает и использование определенных кодонов и их пар в вирусном геноме, которое соответствует предпочтению кодонов организмом-хозяином [19]. Это дает возможность регулировать взаимодействие вируса с макроорганизмом за счет изменения кодонного состава генома вируса, основываясь на информации о ко-донном составе генов хозяина. На настоящий момент это направление исследований динамично развивается, поскольку представляется крайне перспективным. Ведутся работы с изучением кодонного состава и возможностей его изменения у полиовирусов [20, 21], гепатита А [22-24], парвовирусов [25], вирусов гриппа [26-28], ВИЧ [29, 30], респираторно-синцитиального вируса [31], герпесвирусов [32, 33], ротавирусов [34], папилломавирусов [35] и др.

Использование метода изменения кодонного состава в разработке аттенуированных противовирусных вакцин

Одной из наиболее изученных на настоящий момент моделей, на примере которой исследуются возможности метода изменения кодонного состава в разработке противовирусных вакцин, является по-лиовирус [21, 36, 37]. Разные группы исследователей проводили эксперименты по аттенуации полиовиру-сов путем изменения соотношения кодонов в гене белка капсида полиовируса, заменяя более используемые кодоны на менее используемые [21, 36]. С. Burns и соавт. [36] заменяли кодоны для 9 аминокислот по-лиовируса штамма живой оральной вакцины Сэбина 2-го типа на более редкие синонимичные кодоны. У полученного вируса способность к репликации в клетках HeLa была снижена, причем снижение было пропорционально количеству замененных кодонов [36]. S. Mueller и соавт. [21] получили аналогичные результаты при работе с полиовирусом 1-го типа Mahoney [PV(M)], а также показали, что этапом, обеспечивающим аттенуированный фенотип вируса, является этап трансляции. Полученный штамм протестирован ими на мышах и показано снижение нейровирулентности. Позднее той же группой исследователей предпринято исследование в направлении деоптимизации состава пар кодонов. Как было замечено, пары кодонов, кодирующие определенные пары последовательно расположенных аминокислот, так же, как и кодоны, имеют определенную частоту встречаемости в генах организма, и такие пары достаточно стабильны.

J.R. Coleman и соавт. [20] разработали компьютерную программу, позволяющую моделировать генетическую конструкцию с измененным кодонным составом на основе заданной аминокислотной последовательности, и в первом приближении предсказывать последствия изменения кодонного состава. Программа анализирует состав РНК и на его основе такие характеристики, как взаимодействия между участками цепи, возможную вторичную укладку. Изменения кодонного состава выбирают таким образом, чтобы получившаяся после внесения изменений структура была наиболее энергетически выгодна, и при этом было внесено максимальное количество изменений в заданном направлении. Авторы программы получали

аттенуированные штаммы полиовируса путем разбиения оптимальных кодонных пар: один из компонентов пары заменяли таким образом, чтобы получилась более редкая, не оптимальная пара. Мутации вносили в ген белка капсида Р1, всего в ген была внесена 631 мутация. Также исследовали последствия оптимизации пар кодонов, что потребовало внесения 566 мутаций. Вирус с деоптимизированным составом пар кодонов имел устойчивый аттенуированый фенотип для животных, сохранявшийся в ходе пассирования за счет большого количества мутаций. При этом аттену-ированный таким путем вирус сохранил способность к формированию протективного иммунитета. Вирус с оптимизированным составом пар кодонов имел свойства на уровне вируса «дикого» типа, использованного в качестве контроля, и не обладал повышенной патогенностью или летальностью для мышей [20].

С использованием того же алгоритма был создан аттенуированный штамм гриппа на основе вируса А/ PR/8/34 (Н1Ш). Генетической модификации подвергали значительные участки последовательности генов НА, КР и РВ1. Модифицированные вирусы получали с использованием стандартной 8-плазмидной системы [47]. Анализировали как одногенные мутанты, так и вариант, содержащий все 3 модифицированных гена. Модифицированные вирусы проявляли такой же, как и вирус «дикого» типа, фенотип по отношению к температурным условиям, уровни репликации мутантов на клетках MDCK были незначительно, в среднем на 1 порядок ниже, чем у «дикого» вируса. Анализ экспрессии генов методом вестерн-блотт показал высокий уровень снижения экспрессии только тех генов, которые были модифицированы у соответствующих вариантов мутантных вирусов. При заражении мышей одногенные мутанты показали сниженную до 500 раз патогенность, вирус, содержащий все 3 модифицированных гена, имел показатели патогенности, сниженные по сравнению с вирусом «дикого» типа в 13 000 раз. При этом доза, необходимая для формирования протективного иммунитета, у аттенуированно-го варианта была выше, чем у вируса «дикого» типа, всего в 10 раз [21].

Повышение иммуногенности противовирусных

вакцин путем оптимизации кодонного состава

Кроме работ по аттенуации вирусов методом де-оптимизации кодонного состава, проводили также работы по оценке возможности увеличения иммуно-генности противовирусных вакцин путем оптимизации кодонного состава. Большая часть исследований в данном направлении посвящена разработке ДНК-вакцин против различных инфекционных агентов (бактерии, вирусы, простейшие) [38, 39]. Предполагаемый механизм увеличения иммуногенности связан с увеличением эффективности трансляции, а следовательно, наработки антигена в клетках. Рядом исследователей показано, что наработка антигена после оптимизации кодонного состава последовательности происходит значительно эффективнее, чем при использовании нативной последовательности [40, 41]. Возможно также использование консенсусной последовательности разных вариантов антигена в качестве основы для оптимизации в целях формирования кросс-протекции. Так, в исследовании [40] при

разработке ДНК-вакцины для профилактики гриппа, вызванного штаммами H5N1, была рассчитана кон-сенсусная последовательность гена гемагглютинина на основе последовательности 467 разных штаммов H5, в том числе относящихся к разным подгруппам птичьего гриппа H5. Однако созданная генетическая конструкция в нативном виде не позволяла добиться эффективной экспрессии гемагглютинина. После оптимизации кодонного состава данной последовательности получена новая генетическая конструкция, которая приводила к значительно более эффективной экспрессии гемагглютинина и вызывала формирование протективного иммунитета у лабораторных животных. В экспериментах на мышах исследователи обнаружили, что использование консенсусной последовательности в качестве исходной действительно позволяет добиться защиты от более широкого круга вирусов [40].

Аналогичное исследование проводилось в рамках разработки вакцины против вируса иммунодефицита человека. Вакцинный материал - ген белка env вируса был оптимизирован в несколько этапов, включая выбор консенсусной последовательности, оптимизацию кодонного состава, оптимизацию структуры мРНК и добавление специфических последовательностей. Иммуногенность этой потенциальной ДНК-вакцины оценивали на трансгенных мышах разных линий, и было показано усиление клеточного иммунного ответа, что особенно важно в случае ВИЧ-инфекции [42]. Годом позже было опубликовано исследование, в котором тем же способом была получена потенциальная ДНК-вакцина против вируса чикунгунья (CHIKV) (р. Alphavirus, сем. Togaviridae), содержащая несколько белков оболочки вируса и формирующая как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ [43]. На примере ВИЧ также проведено исследование увеличения иммуногенности препаратов на основе белков Tat-1 и Tat-2, в норме вызывающих слабый иммунный ответ. Нативная последовательность белков tat по кодонному составу значительно отличается от оптимальной для млекопитающих. С помощью оптимизации кодонного состава препарата авторам удалось значительно увеличить эффективность экспрессии белков в клетках, а также удалось добиться повышенного уровня активации клеточного звена иммунитета при введении препаратов мышам, в том числе повышенную эффективность активации цитотоксических лимфоцитов. Также авторы отметили, что при применении препарата с оптимизированным кодонным составом иммунный ответ развивается преимущественно с активацией Тх1. Изменение кодонного состава позволило увеличить активацию более важного для предотвращения ВИЧ-инфекции клеточного звена иммунитета, однако не позволило добиться значительного увеличения показателей гуморального иммунного ответа [29].

Оптимизация нуклеотидной последовательности также положительно сказывается на развитии местного иммунного ответа. Проводили исследование мукозальной ДНК-вакцины против респираторно-синцитиального вируса на основе аденовирусного вектора [31]. У лабораторных животных были зафиксированы высокие титры специфических IgA после интраназальной иммунизации ДНК-вакциной с оптимизированным соотношением кодонов.

Использование оптимизации кодонного состава для повышения иммуногенности гриппозных ДНК-вакцин

У млекопитающих использование кодонов в одних и тех же тканях практически идентично [27], поэтому для исследования иммуногенности кодон-оптимизированных препаратов, предназначенных для вакцинации человека, могут быть использованы стандартные модельные животные.

Обязательными компонентами сезонной гриппозной вакцины являются штаммы вируса гриппа типа А, содержащие гемагглютинины сероподтипов H1N1 и H3N2. В 2006 г. было проведено исследование [44], посвященное оптимизации кодонного состава участков гемагглютинина вирусов гриппа се-роподтипов H1N1 (A/New Caledonia/20/99) и H3N2 (A/Panama/2007/99), которые являлись компонентами гриппозной ДНК-вакцины. Было показано, что оптимизация кодонного состава гена гемагглютинина приводила к увеличению иммуногенности вакцины по сравнению с вакциной, подготовленной на основе оригинальной последовательности. Введение конструкции с оптимизированным кодонным составом приводило к более активной экспрессии антигена, а формирование протективного иммунитета у лабораторных животных (кролики, мыши) происходило уже после двух иммунизаций против 3-4, которые требовались в случае использования конструкции с натив-ной последовательностью кодонов [44].

ДНК-вакцина, приготовленная на основе гемаг-глютинина свиного гриппа H1N1 2009 г. (штамм А/ Texas/05/2009), при использовании в конструкции на-тивной последовательности обладала слабой имму-ногенностью из-за крайне низкой экспрессии антигена. После оптимизации кодонного состава последовательности стимуляция CD8+ Т-лимфоцитов и титры антител значительно увеличились. Что интересно, уровень CD4+-ответа, оценивавшийся по уровню продукции цитокинов TNFa, IFNy, IL-2 в спленоцитах как при введении плазмид с нативной последовательностью, так и оптимизированных, оставался постоянным и при этом относительно высоким. Авторы связывают это с тем, что использованный ими путь введения - электропорация - стимулирует иммунный ответ по CD4+-^ra даже при низком уровне экспрессии антигена в клетке [28].

При разработке ДНК-вакцины для профилактики гриппа птиц также был использован подход оптимизации нуклеотидной последовательности гемагглютинина. Соотношение кодонов в созданной генетической конструкции было искусственно смещено в сторону кодонов, более часто встречающихся в организме птиц. В качестве исходного штамма Н5 был использован штамм высокопатогенного гриппа птиц A/goose/Guangdong/1/96. Им-муногенность вакцины оценивали на цыплятах, и по результатам экспериментов авторы сделали вывод о том, что оптимизация последовательности позволяет существенно повысить иммуногенность при одновременном снижении дозы антигена, вводимого в организм [45].

Таким образом, в литературе описано множество вариантов модификаций кодонного состава патогенов в составе различных вакцин. Данные, по-

лученные при работе с разными патогенами, свидетельствуют о перспективности данного подхода. Системы, сконструированные в итоге изменения кодон-ного состава, отвечали требованиям исследователей (аттенуированный фенотип при деоптимизации, повышенная иммуногенность при оптимизации ко-донного состава) и отличались исключительной стабильностью за счет множественности внесенных изменений.

Тем не менее на настоящий момент данный подход можно рассматривать только в качестве теоретической разработки, применение которой на практике требует проведения значительного количества исследований для подтверждения безопасности данного метода и стандартизации методик работы.

По данным экспериментов на модельных животных, негативных последствий, связанных с введением в организм материала, содержащего кодон-оптимизированные последовательности белков, не наблюдалось [20, 29, 40, 42]. Это свидетельствует в пользу безопасности метода оптимизации кодонного состава.

Уже на сегодняшний день созданы компьютерные программы, позволяющие провести изменение ко-донного состава с учетом как частоты встречаемости отдельных кодонов, так и характеристик полученной в итоге ДНК и мРНК [17, 18]. В процессе расчета модифицированной конструкции необходимо контролировать отдельные участки генов и даже отдельные пары кодонов, влияющие на процессы транскрипции и трансляции данного гена. В перспективе сведения о новых описанных регуляторных участках должны вноситься в программу или храниться в единой базе данных об элементах вторичной структуры и факторах, позволяющих контролировать транскрипцию и трансляцию.

«Кодоноптимизированные» вирусы гриппа в опытах на животных

Успех оптимизации кодонного состава на примере ДНК-вакцин позволяет предположить, что этот подход может быть эффективным и при подготовке живых гриппозных пандемических и предпандеми-ческих вакцин. В настоящее время нами в сотрудничестве с Махидолским университетом (Бангкок, Тайланд) начата работа по конструированию штаммов вируса гриппа, содержащих гемагглютинин с оптимизированным кодонным составом, которые в дальнейшем будут использованы в качестве основы для подготовки реассортантных вакцинных штаммов экспериментальной «кодоноптимизированной» ЖГВ. В качестве источников антигенных детерминант для получения вакцинных штаммов ЖГВ планировалось использовать искусственно сконструированные реас-сортанты на основе вируса A/PR/8/34 (РЯ8), содержащие от пандемически актуального вируса нейрамини-дазу и гемагглютинин с оптимизированным составом кодонов. Были сконструированы два реассортанта: (1) НШ1-РЯ8-кодоноптимизированный реассортант (ШШ-РЯ8-опт.) на основе пандемического вируса А/ СаШгша/07/2009 (Н1Ш) и (2) и Н5Ш-РЯ8-кодон-оптимизированный реассортант (Н5Ш-РЯ8-опт.) на основе вируса гриппа птиц А/1игкеу/Тигкеу/1/2005 (Н5Ш).

СП" 300-,

250200150100500-

и

0 14

День р.к

Гуморальный иммунный ответ у морских свинок, зараженных «кодоноптимизированными» вирусами и вакцинными штаммами

ЖГВ и ИГВ на основе тех же вирусов гриппа (по данным РТГА). а - штаммы ШШ: заштрихованные столбцы: ЖГВ; серые столбцы: HШ1-PR8; черные столбцы: HШ1-PR8-кодон-оптимизированный вирус; б - штаммы Н5Ш: заштрихованные столбцы: ЖГВ; серые столбцы: H5N1-PR8; черные столбцы: H5Ш-PR8-кодон-оптимизированный вирус. По оси абсцисс - сроки, на которых производили забор сывороток для оценки иммунного ответа. По оси ординат - значения среднегеометрических титров вирусспецифических антител в сыворотках крови животных. *различия между титрами сывороточных антител в группах «кодоноптимизированных» и не оптимизированных штаммов на 56-й день после заражения статистически значимы при p < 0,05 (критерий Манна-Уитни).

Разработка и синтез кодоноптимизированных генов были выполнены компанией GenScript (США). Для выполнения проектов по оптимизации последовательностей эта компания использует запатентованный алгоритм Optimum GeneTM, направленный на комплексное воздействие на процессы транскрипции и трансляции [46]. При внесении изменений в последовательность гена контролируется ряд параметров, влияющих на эффективность экспрессии, в том числе содержание GC, сайты сплайсинга, регуляторные участки последовательностей и элементы вторичной структуры мРНК.

В качестве основы использовали последовательности генов НА вирусов A/California/07/09 (№ последовательности в Genbank: GQ906804.1) и A/turkey/ Turkey/1/2005 (№ DQ407519.1). Полиосновный сайт расщепления в гемагглютинине H5 был заменен на

Титры «кодоноптимизированных» штаммов в сравнении с их неоптимизированными аналогами при разных температурах инкубации в развивающихся куриных эмбрионах и культуре клеток MDCK

Вирусы* Титр вируса при разных температурах инкубации

ig ЦПД5с ig Эвд50

33°С 25°С 32°С 38°С 40°С

HlNl-PRB-опт. 5,1 0 4,5 5,1 0

H1N1-PR8 7,6 0 8,2 8,2 0

Н5Ш^8-опт. 4,6 0 4,5 3,7 0

H5N1-PR8 5,7 0 5,7 7,0 0

Примечание. *Н1Ш-РК8 - реассортант, содержащий гемаг-глютинин и нейраминидазу от вируса А/СаН£эгша/07/2009(Н1Ш), и 6 генов, кодирующих внутренние белки - от вируса А/РЯ/8/34 (НШ1). Н5Ш-РЙ8 - реассортант, содержащий гемагглютинин и нейраминидазу от вируса АЛигкеу/Тигкеу/01/2005 (Н5Ш), и 6 генов, кодирующих внутренние белки - от вируса А/РЯ/8/34 (Н1Ш). Все «кодоноптимизированные» варианты содержат «кодонопти-мизированный» гемагглютинин, остальные гены идентичны соответствующим генам у не оптимизированных штаммов.

моноосновный. Гены были клонированы в плазмиды pHW2000. Далее по методике [47] сконструированы два реассортантных штамма, каждый из которых содержал нативную нейраминидазу соответствующего «дикого» вируса, гемагглютинин с оптимизированным составом кодонов, а остальные 6 генов принадлежали донору высокой урожайности РЯ8. Для предварительной оценки влияния кодонной оптимизации в составе живого вируса нами определены лабораторные характеристики этих штаммов и изучена их безвредность для лабораторных животных (морских свинок).

Титры «кодоноптимизированных» вирусов в развивающихся куриных эмбрионах и культуре клеток MDCK были в среднем ниже, чем у аналогичных не-оптимизированных штаммов, но по фенотипическим свойствам (способности / не способности к репродукции за пределами температурного оптимума) вирусы не отличались (см. таблицу).

Штаммы с оптимизированным гемагглютинином не были токсичными для морских свинок при интра-назальном введении, также, как и не оптимизированные варианты.

Что же касается иммуногенности вариантов с оптимизированным гемагглютинином для морских свинок, то по показателям РТГА она была в среднем в 2 раза выше иммуногенности не оптимизированных вариантов (рис. 1). Различия в среднегеометрических титрах (СГТ) антител через 8 нед после вакцинации в группах кодоноптимизированных и не оптимизированных вирусов отличались статистически достоверно при уровне значимости p<0,05 и оценке с использованием критерия Манна-Уитни. Вирусы вводили в титре 4,5 ^ ЭИД50/0,2 мл в каждую ноздрю животного и определяли титр вирусспецифических антител в сыворотках через 14, 28 и 56 дней после заражения. Как видно на рисунке, на 56-й день после заражения СГТ сывороточных антител после введения кодон-оптимизированных вариантов составляли 1:254, в то время как не оптимизированные варианты вызывали

гуморальный ответ в титре 1:100 (для вируса H1N1) и 1:127 (для вируса H5N1).

Заключение

В настоящее время для подготовки инактивирован-ных вакцин против пандемически опасных высокопатогенных вирусов гриппа птиц используют PR8-реассортантные вирусы с модифицированным сайтом расщепления в гемагглютинине [48, 49], что является гарантией безопасности их применения - вирусы полностью сохраняют антигенный профиль «дикого» птичьего вируса, но утрачивают его вирулентные потенции за счет удаления полиосновной последовательности в сайте расщепления. При подготовке кодон-оптимизированного H5N1-PR8-реассортанта нами также был использован гемагглютинин вируса гриппа птиц с модифицированным сайтом расщепления, поэтому его последующее применение в качестве донора антигенных детерминант штамма ЖГВ против пандемически опасного высокопатогенного вируса сможет обеспечить дополнительную безопасность вакцинных штаммов.

Вакцинные штаммы ЖГВ представляют реассор-танты, полученные при скрещивании актуального «дикого» вируса с холодоадаптированным, безвредным для человека вирусом устаревшей антигенной структуры - донором аттенуации. Из 8 генов «дикого» вируса реассортантный вакцинный штамм наследует гены, кодирующие гемагглютинин и нейраминидазу, а от донора аттенуации - 6 внутренних генов, вместе с которыми реассортанту передается ряд важных свойств донора, и самый главный из них аттенуация для человека [50].

В литературе описаны первые успехи использования PR8-реассортантов, предназначенных для инак-тивированных вакцин против гриппа птиц H5N1, в качестве источника гемагглютинина для штаммов живой гриппозной вакцины [51-53]. Авторы скрещивали донор аттенуации отечественной ЖГВ - холодоадап-тированный вирус А/Ленинград/134/17/57 (H2N2)- и PR8-реассортанты с модифицированным сайтом расщепления, получая в свою очередь реассортанты, несущие гемагглютинин птичьего вируса, а остальные гены - от донора аттенуации и обладающие всеми характеристиками, присущими вакцинным штаммам ЖГВ (температурочувствительностью репродукции, холодоадаптированностью, аттенуацией для лабораторных животных).

PR8-реассортантные вирусы гриппа, содержащие гемагглютинин с оптимизированным кодонным составом, продемонстрировали жизнестойкость, способность к репликации в различных системах (развивающиеся куриные эмбрионы, культура клеток MDCK), были не токсичны для животных и обладали более высокой иммуногенностью, чем не оптимизированные варианты. Это подтверждает, что метод оптимизации кодонного состава является многообещающим способом повышения иммуногенности «диких» вирусов гриппа. Можно полагать, что этот метод окажется перспективным и в плане повышения имму-ногенности гриппозных вакцин, в частности живой гриппозной вакцины, что особенно актуально в связи с появлением в циркуляции штаммов, гуморальный иммунный ответ на которые снижен [5].

Сведения об авторах:

Федорова Екатерина Алексеевна - (Fedorova Ekaterina Alexeevna), мл. научн. сотрудник отдела вирусологии, e-mail: fedorova.iem@gmail.com

Киселева Ирина Васильевна - (Kiseleva Irina Vasil'ev-na), д-р биол. наук, рук. лаб. вакцинных штаммов отдела вирусологии, e-mail: irina.v.kiseleva@gmail.com

Auewarakul Prasert - Prof., Faculty of Medicine, Siriraj Hospital, Mahidol University, Bangkok, Thailand. e-mail: sipaw@mahidol.ac.th

Suptawiwat Ornpreya - PhD, Faculty of Medicine, Siriraj Hospital, Mahidol University, Bangkok, Thailand. e-mail: ornpreya@yahoo.com

Руденко Лариса Георгиевна (Rudenko Larisa Georgievna) д-р мед.наук, проф., зав. отд. вирусологии, e-mail: vaccine@mail.ru

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

1. Баранцева И.Б., Найхин А.Н., Донина С.А., Степанова Л.А., Рекстин А.Р., Григорьева Е.П. и др. Гуморальный и местный иммунный ответ на гриппозные вакцины у лиц пожилого и молодого возраста. Вопросы вирусологии. 200; 2: 32-36. [Baranttsva I.B., Naykhin A.N., Donina S.A., Stepanova S.A., Reks-tin A.R., Grigorieva E.P. et al. Humoral and local immune responses to influenza vaccines in elderly and young patients. Voprosy viruso-logii. 2003; 2: p. 32-6. (in Russian)]

2. Tamura S., Tanimoto T., Kurata T. Mechanisms of broad cross-protection provided by influenza virus infection and their application to vaccines. Jpn. J. Infect. Dis. 2005; 8(4): 195-07.

3. WH0/IVB/09.05. Global pandemic influenza action plan to increase vaccine supply: progress report 2006-2008. Available at: http:// whqlibdoc.who.int/hq/2009/WH0_IVB_09.05_eng.pdf. (Accessed 1 October 2013).

4. Фармакопейная статья предприятия № 420417409703. Вакцина гриппозная аллантоисная интраназальная живая сухая. [Pharmacopeial article of manufacturer. Intranasal allantoic live influenza vaccine. (in Russian)]

5. Mallory R.M., Malkin E., Ambrose C.S., Bellamy T., Shi L., Yi T. et al. Safety and immunogenicity following administration of a live, attenuated monovalent 2009 H1N1 influenza vaccine to children and adults in two randomized controlled trials. PLoS One. 2010; 5(10): e13755.

6. Hoffmann E., Mahmood K., Chen Z., Yang C.F., Spaete J., Green-berg H.B. et al. Multiple gene segments control the temperature sensitivity and attenuation phenotypes of ca B/Ann Arbor/1/66. J. Virol. 2005. 79(17): 11014-21.

7. Kiseleva I., Klimov A., Su Q., Szymkowiak C., Toner T.J., Kwan W.-S. et al. Role of individual genes of the A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) cold-adapted donor strain in manifestation of the temperature-sensitive phenotype of reassortant influenza A viruses. 2004. In: Proceedings of options for the control of influenza V. Okinawa, Japan, 6-9 October, 2003: 547-50.

8. Tats A., Tenson T., Remm M. Preferred and avoided codon pairs in three domains of life. BMC Genomics. 2008; 9: 463.

9. Prat Y., Fromer M., Linial N., Linial M. Codon usage is associated with the evolutionary age of genes in metazoan genomes. BMC Evol Biol. 2009; 9: 285.

10. Holm L. Codon usage and gene expression. Nucleic Acids Res. 1986; 14(7): 3075-87.

11. Besse F., Ephrussi A. Translational control of localized mRNAs: restricting protein synthesis in space and time. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2008. 9(12): 971-80.

12. Tokuoka M., Tanaka M., Ono K., Takagi S., Shintani T., Gomi K. Codon optimization increases steady-state mRNA levels in Aspergillus oryzae heterologous gene expression. Appl. Environ. Microbiol. 2008; 74(21): 6538-46.

13 Fuglsang A. Codon optimizer: a freeware tool for codon optimization. ProteinExpr. Purif. 2003; 31(2): 247-9.

14. Raab D., Graf M., Notka F., Schodl T., Wagner R. The GeneOptimizer Algorithm: using a sliding window approach to cope with the vast sequence space in multiparameter DNA sequence optimization. Syst. Synth. Biol. 2010. 4(3): 215-25.

15. Nakamura Y., Gojobori T., Ikemura T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Res. 2000; 28(1): 292.

16. Grote A., Hiller K., Scheer M., Munch R., Nortemann B. et al. JCat: a

novel tool to adapt codon usage of a target gene to its potential expression host. Nucleic Acids Res. 2005; 33(Web Server issue): W526-31.

17. Chung B.K., Lee D.Y. Computational codon optimization of synthetic gene for protein expression. BMC SystBiol. 2012; 6: 134.

18. Hatfield G.W., Roth D.A. Optimizing scaleup yield for protein production: Computationally Optimized DNA Assembly (CODA) and Translation Engineering. BiotechnolAnnuRev. 2007; 13: 27-42.

19. Bahir I., Fromer M., Prat Y., Linial M. Viral adaptation to host: a proteome-based analysis of codon usage and amino acid preferences. Mol. Syst. Biol. 2009; 5: 311.

20. Coleman J.R., Papamichail D., Skiena S., Futcher B., Wimmer E., Mueller S. Virus attenuation by genome-scale changes in codon pair bias. Science. 2008; 320(5884): 1784-7.

21. Mueller S., Papamichail D., Coleman J.R., Skiena S., Wimmer E. Reduction of the rate of poliovirus protein synthesis through large-scale codon deoptimization causes attenuation of viral virulence by lowering specific infectivity. J. Virol. 2006; 80(19): 9687-96.

22. Aragones L., Guix S., Ribes E., Bosch A., Pinto R.M. Fine-tuning translation kinetics selection as the driving force of codon usage bias in the hepatitis A virus capsid. PLoSPathog. 2010. 6(3): e1000797.

23. D'Andrea L., Pinto R.M., Bosch A., Musto H., Cristina J. A detailed comparative analysis on the overall codon usage patterns in hepatitis A virus. Virus Res. 2011; 157(1): 19-24.

24. Pinto R.M., Aragones L., Costafreda M.I., Ribes E., Bosch A. Codon usage and replicative strategies of hepatitis A virus. Virus Res. 2007; 127(2): 158-63.

25. Zhi N., Wan Z., Liu X., Wong S., Kim D.J., Young N.S. et al. Codon optimization of human parvovirus B19 capsid genes greatly increases their expression in nonpermissive cells. J. Virol. 2010. 84(24): 13059-62.

26. Mani I., Singh V., Chaudhary D.K., Somvanshi P., Negi M.P. Codon optimization of the major antigen encoding genes of diverse strains of influenza a virus. Interdiscip Sci. 2011; 3(1): 36-42.

27. Mueller S., Coleman J.R., Papamichail D., Ward C.B., Nimnual A., Futcher B. et al. Live attenuated influenza virus vaccines by computer-aided rational design. Nat Biotechnol. 2010. 28(7): p. 723-6.

28. Tenbusch M., Grunwald T., Niezold T., Storcksdieck Genannt Bonsmann M., Hannaman D., Norley S. et al. Codon-optimization of the hemagglutinin gene from the novel swine origin H1N1 influenza virus has differential effects on CD4(+) T-cell responses and immune effector mechanisms following DNA electroporation in mice. Vaccine. 2010; 28(19): 3273-7.

29. Ramakrishna L., Anand K.K., Mohankumar K.M., Ranga U. Codon optimization of the tat antigen of human immunodeficiency virus type 1 generates strong immune responses in mice following genetic immunization. J. Virol. 2004; 78(17): 9174-89.

30. Yan J., Corbitt N., Pankhong P., Shin T., Khan A., Sardesai N.Y. et al. Immunogenicity of a novel engineered HIV-1 clade C synthetic consensus-based envelope DNA vaccine. Vaccine. 2011; 29(41): 7173-81.

31. Kim S., Jang J.E., Yu J.R., Chang J. Single mucosal immunization of recombinant adenovirus-based vaccine expressing F1 protein fragment induces protective mucosal immunity against respiratory syncytial virus infection. Vaccine. 2010; 28(22): 3801-8.

32. Fu M. Codon usage bias in herpesvirus. Arch Virol. 2010; 155(3): 391-6.

33. Roychoudhury S. Mukherjee D. A detailed comparative analysis on the overall codon usage pattern in herpesviruses. Virus Res. 2010; 148(1-2): 31-43.

34. Gomez M.M., Tort L.F., Volotao Ede M., Recarey R., Moratorio G., Musto H. et al. Analysis of human P[4]G2 rotavirus strains isolated in Brazil reveals codon usage bias and strong compositional constraints. Infect. GenetEvol. 2011; 11(3): 580-6.

35. Kim M.S., Sin J.I. Both antigen optimization and lysosomal targeting are required for enhanced anti-tumour protective immunity in a human papillomavirus E7-expressing animal tumour model. Immunology. 2005; 116(2): 255-66.

36. Burns C.C., Shaw J., Campagnoli R., Jorba J., Vincent A., Quay J., et al. Modulation of poliovirus replicative fitness in HeLa cells by deoptimization of synonymous codon usage in the capsid region. J. Virol. 2006; 80(7): 3259-72.

37. Lauring A.S., Jones J.O., Andino R. Rationalizing the development of live attenuated virus vaccines. Nat. Biotechnol. 2010; 28(6): 573-9.

38. Ingolotti M., Kawalekar O., Shedlock D.J., Muthumani K., Weiner D.B. DNA vaccines for targeting bacterial infections. Expert. Rev. Vaccines. 2010; 9(7): 747-63.

39. Zhu Y., Lu F., Dai Y., Wang X., Tang J., Zhao S., et al. Synergis-tic enhancement of immunogenicity and protection in mice against Schistosoma japonicum with codon optimization and electroporation

delivery of SjTPI DNA vaccines. Vaccine. 2010; 28(32): 5347-55.

40. Chen M.W., Cheng T.J., Huang Y., Jan J.T., Ma S.H., Yu A.L., et al. A consensus-hemagglutinin-based DNA vaccine that protects mice against divergent H5N1 influenza viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008; 105(36): 13538-43.

41. Li K.B., Zhang X.G., Ma J., Jia X.J., Wang M., Dong J., et al. Codon optimization of the H5N1 influenza virus HA gene gets high expression in mammalian cells. BingDuXueBao. 2008; 24(2): 101-5.

42. Yan J., Yoon H., Kumar S., Ramanathan M.P., Corbitt N., Kutzler M., et al. Enhanced cellular immune responses elicited by an engineered HIV-1 subtype B consensus-based envelope DNA vaccine. Mol. Ther. 2007; 15(2): 411-21.

43. Muthumani K., Lankaraman K.M., Laddy D.J., Sundaram S.G., Chung C.W., Sako E., et al. Immunogenicity of novel consensus-based DNA vaccines against Chikungunya virus. Vaccine. 2008; 26(40): 5128-34.

44. Wang S., Taaffe J., Parker C., Solorzano A., Cao H., Garcia-Sastre A., et al. Hemagglutinin (HA) proteins from H1 and H3 serotypes of influenza A viruses require different antigen designs for the induction of optimal protective antibody responses as studied by codon-optimized HA DNA vaccines. J. Virol. 2006; 80(23): 11628-37.

45. Jiang Y., Yu K., Zhang H., Zhang P., Li C., Tian G., et al. Enhanced protective efficacy of H5 subtype avian influenza DNA vaccine with codon optimized HA gene in a pCAGGS plasmid vector. Antiviral Res. 2007; 75(3): 234-1.

46. OptimumGene™ - Codon Optimization. Available at: http://www. genscript.com/codon_opt.html (Accessed 22 November 2013).

47. Hoffmann E., Krauss S., Perez D., Webby R., Webster R.G. Eight-plasmid system for rapid generation of influenza virus vaccines. Vaccine. 2002; 20(25-26): 3165-70.

48. Webby R.J., Perez D.R., Coleman J.S., Guan Y., Knight J.H., Gov-orkova E.A., et al. Responsiveness to a pandemic alert: use of reverse genetics for rapid development of influenza vaccines. Lancet. 2004; 363(9415): 1099-103.

49. Dong J., Matsuoka Y., Maines T.R., Swayne D.E., O'Neill E., Davis C.T., et al. Development of a new candidate H5N1 avian influenza virus for pre-pandemic vaccine production. Influenza Other Respi. Viruses. 2009; 3(6): 287-95.

50. Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. 1994; СПб.: Наука; 1994.

[Alexandrova G.I., Klimov A.I. Live influenza vaccine. 1994. St. Petersburg: Nauka; 1994. (in Russian)]

51. Gambaryan A.S., Lomakina N.F., Boravleva E.Y., Kropotkina E.A., Mashin V.V., Krasilnikov I.V. et al. Comparative safety, immuno-genicity, and efficacy of several anti-H5N1 influenza experimental vaccines in a mouse and chicken models (Testing of killed and live H5 vaccine). Influenza Other Respi Viruses. 2012; 6(3): 188-95.

52. Larionova N., Kiseleva I., Dubrovina I., Bazhenova E., Rudenko L. Peculiarities of reassortment of cold-adapted influenza A master donor virus with viruses possessed avian origin HA and NA H5N1. Influenza Other Respi Viruses. 2011; 5(Suppl.1): 346-9.

53. Kiseleva I., Larionova N., Fedorova E., Dubrovina I., Bazhenova E., Ross T.M., et al. Live cold-adapted attenuated vaccine against H5N1 influenza viruses. J. Med. Safety. 2013: 36-41.

Поступила 06.12.13 Received 06.12.13

CODON OPTIMIZATION OF HEMAGGLUTININ AS A PROMISING TOOL FOR IMPROVING OF THE INFLUENZA VACCINES IMMUNOGENICITY

Fedorova E. A.1, Kiseleva I. V.1, Auewarakul P.2, Suptawiwat O.2, Rudenko L. G.1

institute of Experimental Medicine, North-West Branch, Russian Academy of Medical Sciences, St. Petersburg, Russia; 2Mahidol University, Bangkok, Thailand

Modification of the codon bias of sequences is a promising tool of the gene expression control. The theoretical basis of the codon optimization is reviewed, data on experiments in changing the viral gene codon bias for purposes of vaccine development are discussed. Research into the field of the influenza vaccine immunogenicity improvement with codon optimization method is reviewed. Prospects of the use of the codon optimization technique for influenza vaccine development are considered.

Key words: influenza virus, influenza vaccine, immunogenicity, codon optimization