Высокоочищенная бутирилхолинэстераза как средство профилактики острого отравления хлорофосом

Б.Н. Филатов, А.Я. Почепцов, Н.И. Мамулайшвили, Ю.И. Великородная

Высокоочищенная бутирилхолинэстераза как средство профилактики острого отравления хлорофосом

ФГУП «Научно-исследовательский институт гигиены, токсикологии и профпатологии»

ФМБА России, г. Волгоград

B.N. Filatov, A.Ya. Pocheptsov, N.I. Mamulaishvili, Yu.I. Velikorodnaya

Purificated butyrylcholinesterase as a tool for prevention of chlorofos acute poisoning

Federal State Unitary Enterprise «Research Institute for Hygiene, Toxicology and Occupational Pathology» at Federal Medical and Biological Agency (FSUE «RIHTOP» FMBA Russia), Volgograd

Ключевые слова: высокоочищенная бутирилхолинэстераза, липосомы, профилактика, хлорофос, острая интоксикация, гистохимия, эстеразы.

Цель. Проведение лабораторных испытаний ли-посомальной полимерно-фосфолипидной формы высокоочищенной бутирилхолинэстеразы в качестве средства профилактики острой интоксикации фосфорорганическими соединениями у экспериментальных животных. Материалы и методы. Материалом исследования служили образцы тканей головного мозга и внутренних органов беспородных белых крыс-самцов. В каждой подопытной группе было по 10 особей весом 150—180 г. В целях профилактики острой интоксикации хлорофосом в дозе, равной ЛД0, вводили полимерно-фосфолипидные липосомы, содержащие высокоочищенную бутирилхолинэстеразу (ВоБХЭ). Гистохимическими методами определяли содержание ацетилхолинэстеразы, бутирилхолинэстеразы и неспецифических эстераз в различных отделах головного мозга, миокарде и печени на высоте развития клинической картины острого отравления — через 20—30мин после введения хлорофоса, а также через 24 ч, через 3, 7 и 10 сут. Результаты. Применение в качестве профилактического средства полимерно-фосфолипидных липосом, содержащих ВоБХЭ, в дозе 25 ед/кгмас-сы тела при острой интоксикации хлорофосом в дозе, равной ЛД0, обеспечивало 100%-ную выживаемость подопытных животных. Препарат обеспечивал частичную защиту эстераз головного мозга и внутренних органов от ингибирова-ния на раннем этапе эксперимента и обеспечивал ускоренное восстановление их активности в более поздние сроки.

Keywords: purificated butyrylcholinesterase, liposomes, prevention, chlorofos, acute poisoning, histochemistry, esterases.

Purpose. Laboratory testing of liposomal polymer-phospholipid form of highly purified butyrylcholinesterase as a tool in prevention of acute intoxication by organophosphorus compounds in experimental animals.

Material and methods. Samples of brain tissue and internal organs of outbred white rats (male) have been used as the material for studying. Each experimental group consisted of 10 animals body weight 150—180g. Polymer-phospholipid liposomes containing highly purified have been injected at the dose equal to LD00 for the prevention of chlorofos acute intoxication. With using of histochemical methods the content of acetylcholinesterase, butyrylcholinesterase and nonspecific esterases has been determined in different parts of the brain, myocardium and liver at maximim of acute poisoning clinical manifestation: in 20—30 minutes, 24 hours, 3,7 and 10 days after chlorofos injection. Results. Using the polymer-phospholipid liposomes containing highly purified butyrylcholinesterase in the dose of25U/kg body weight as the prevention agent in case of chlorofos acute intoxication in the dose equal to LD00 provides 100% survival of exposed animals. The prevention agent provided the partial protection of esterases of brain and internal organs from inhibition on early stage of experiment and quicker recovery of their activity at a later date.

Conclusions. Using the polymer-phospholipid liposomalform of highly purified butyrylcholinesterase in the dose of 25U/kg body weight provides 100% survival of laboratory animals exposed by chlorofos

Выводы. Применение полимерно-фосфолипидной липосомальной формы ВоБХЭ в качестве профилактического средства в дозе 25 ед/кг массы тела способствовало выживанию 100% подопытных животных, получивших хлорофос в дозе ЛД50. Введение ВоБХЭ способствовало защите эстераз от ингибирования и более раннему восстановлению их активности в головном мозге и внутренних органах.

in the dose equal to LD0. Injection of highly purified butyrylcholinesterase provided protection from esterase inhibition and earlier recovery of brain activity and internal organs.

Профилактика и лечение острых отравлений фосфорорганическими соединениями (ФОС) по-прежнему остаются одной из приоритетных задач в клинике неотложных состояний. Разработка антидотов, ведущаяся на протяжении нескольких десятилетий, привела к созданию нескольких препаратов, эффективных при определен -ных уровнях острого токсического воздействия. Лимитирующим фактором остается собственная токсичность этих препаратов, ограничивающая их фармакологические возможности. Кроме того, использование этих препаратов в качестве профилактического средства проблематично не только в связи с их высокой токсичностью и быстрой элиминацией, но и в связи с возможностью развития отдаленных последствий, до сих пор мало изученных. Альтернативой традиционным подходам к профилактике и лечению острых отравлений ФОС многие исследователи считают применение нового класса препаратов — ферментов. Они способны вступать в прямое взаимодействие с молекулами ФОС и именуются в литературе «биочистильщиками» (Ыо8С№в^вГ8). К ним относят целый ряд хорошо известных эстераз: ацетилхолинэстеразу, бутирилхолинэстера-зу, карбоксилазу, параоксаназу и фосфори-лазы. Было установлено, что фармакологически эффективны только высокоочищен-ные ферменты.

Лабораторные испытания высоко-очищенных эстераз продемонстрировали их высокую эффективность при использовании в качестве профилактического средства при острых отравлениях высокотоксичными ФОС.

Проведены исследования, показавшие высокую эффективность профилактического использования высокоочищенной генно-

модифицированной бутирилхолинэстеразы, включенной в состав липосом, при отравлении высокотоксичными ФОС [9].

Продолжаются исследования по дальнейшему улучшению фармакологического действия «биочистильщиков», в частности разрабатываются и испытываются различные варианты модификации молекул ферментов в целях увеличения времени их циркуляции в кровеносном русле и защиты их от неспецифического связывания. Основным направлением в этой сфере в настоящее время является так называемое ПЭГилирование, т.е. связывание молекулы фермента с полимером, способным замаскировать присутствие энзима в кровеносном русле без потери его специфической активности. Основным компонентом, используемым в данном методе, является ПЭГ (полиэтиленгликоль). Изучаются различные формы ПЭГ, отличающиеся по молекулярному весу и качественному составу.

Вместе с тем существует еще один метод пролонгации действия и защиты от неспецифического связывания фармакологических препаратов с помощью липосом, когда необходимое лекарственное средство включают во внутреннюю среду или оболочку липо-сом. Для уменьшения неспецифического захвата липосом клетками ретикулоэндотели-альной системы в состав стенки липосом вводят добавки — конъюгаты фосфолипидов с полиэтиленгликолем или другими полимерами. Таким образом получают полимерно-фосфолипидные или ПЭГилированные ли-посомы, способные длительное время циркулировать в биосредах организма без повторного введения. Продолжаются поиски перспективных рекомбинантных форм аце-тилхолинэстеразы, в том числе связанных с полиэтиленгликолем [5; 6].

Помимо высокой специфичности данной терапии отмечаются и практически полное отсутствие собственной токсичности такого антидота, а также отсутствие патологических проявлений при введении избыточно высоких доз фермента, хотя и не отрицается возможность индукции антителообразования при многократном применении [8].

Техника лабораторных работ и фармакологического производства липосомаль-ных препаратов в настоящее время разработана достаточно детально [2; 7], ввиду чего получение и испытание липосомальных препаратов-антидотов вполне осуществимы в лабораторных условиях.

На основании этих данных представляется актуальным изучение профилактического действия включенного в полимерно-фосфолипидные липосомы препарата ВоБХЭ на экспериментальных животных при острой интоксикации ФОС.

Целью данной работы было проведение лабораторных испытаний липосомальной полимерно-фосфолипидной формы ВоБХЭ в качестве средства профилактики острой интоксикации фосфорорганическими соединениями у экспериментальных животных.

Материалы и методы

Материалом исследования служили образцы тканей головного мозга и внутренних органов беспородных белых крыс-самцов. В каждой подопытной группе было по 10 особей весом 150—180 г. Животных содержали в клетках по 8 особей в каждой в помещениях с искусственным освещением (8:00— 20:00 — свет, 20:00-8:00 — темнота) при 20-22 С в условиях свободного доступа к воде и пище.

При постановке экспериментов руководствовались требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных.

В данной работе было проведено две серии экспериментов.

В первой серии моделировали острое отравление хлорофосом внутрижелудочным введением 10% водного раствора хлорофоса в дозе, равной ЛД50 (725 мг/кг).

Во второй серии в качестве профилактического средства подопытным животным

внутримышечно вводили липосомальную взвесь, содержащую ВоБХЭ в дозе 25 ед/кг массы тела и через 1 ч — хлорофос в дозе ЛД50. Животным контрольной группы вводили растворитель в том же объеме.

Всего было использовано 10 групп подопытных животных. Образцы органов и тканей брали для исследования в следующие сроки:

1) на высоте развития клинической картины острого отравления — через 20— 30 мин после введения хлорофоса;

2) через 24 ч;

3) через 3 сут;

4) через 7 сут;

5) через 10 сут.

В качестве профилактического средства была использована ВоБХЭ из сыворотки крови лошади. Активность препарата измерялась в единицах (U). Одна единица способна гидролизовать 1 рмоль бутирилхолина до холина и бутирата за 1 мин при рН=8,0 при температуре 37 С. Кристаллический фермент разводили в физиологическом растворе и использовали для приготовления липосом по описанной методике. Доза действующего вещества составляла 25 ед/кг массы тела животного.

Подопытных и контрольных животных наркотизировали диэтиловым эфиром и забивали методом декапитации. Для исследования брали образцы следующих органов и тканей:

1) головного мозга на уровне лобной доли;

2) головного мозга на уровне 4,5 мм от Bregma (вертикальный разрез через перекрест зрительного нерва);

3) печени;

4) миокарда.

Сразу после извлечения образцы тканей животных из подопытной и контрольной групп, предназначенные для гистохимического исследования, помещали на один блок, замораживали при температуре —18 ...-20С и резали в криостате. Полученные срезы монтировали на одно предметное стекло и инкубировали. Таким образом, получали препараты, которые были одинаковыми по толщине и времени инкубации в одной инкубационной среде, что делало полученный мате-

риал пригодным для количественной оценки. В данной работе с помощью метода гистохимического изучения Карновского исследовали ферменты:

а) ацетилхолинэстеразу (АХЭ) [1];

б) бутирилхолинэстеразу (БХЭ) [1];

Неспецифические эстеразы (НЭ) определяли по методу Пирса [3].

Активность гистохимических реакций на препаратах оценивали полуколичественным методом по Соколовскому [4]. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы Excel-6.

Материалы и методы получения ли-

посом

Исходным материалом для наработки липосом был выбран соевый лецитин (Sigma). В качестве антиокислителя использовали а-токоферол (Fluka). Полимерным компонентом липосом служил L-а-фосфати-дилэтаноламиндистеарат метоксиполиэтилен-гликольконъюгат (Sigma).

Все работы по получению липо-сом проводили на роторном испарителе Heidolph 4000 Laborota. Навеску лецитина, а-токоферола и L-а-фосфатидилэтанол-аминдистеарат метоксиполиэтиленгликоль-конъюгата растворяли в предварительно перегнанном под вакуумом хлороформе. Полученный раствор выпаривали в роторном испарителе до полного удаления хлороформа. На стенках испарительной колбы образовывался тонкий слой лецитина. Для формирования первичных мультиламелляр-ных липосом в колбу помещали некоторое количество стеклянных шариков и вливали 20 мл раствора ВоБХЭ (Sigma) для включения в липосомы. После полного освобождения стенок колбы от пленки лецитина получали взвесь первичных липосом. Униламеллярные ( однослойные) липосомы меньшего размера получали методом экструзии с помощью прибора Liposofast производства фирмы «Avestin». Взвесь липо-сом под давлением многократно пропускали через поликарбонатую мембрану. Были испытаны мембраны с порами 100, 200 и 400 нм. Размерность липосом определяли с помощью измерителя размера микрочастиц

Nanotrac. С помощью спектрофотометра UNICO 2800 определяли устойчивость липосом по степени седиментации во времени. Наиболее устойчивыми оказались липосомы, полученные при использовании мембраны с размерами пор 200 нм. Для освобождения жидкой фазы взвеси от не включенного в липосомы ВоБХЭ использовали метод гель-фильтрации, пропуская взвесь через хроматографическую колонку, заполненную Sephadex-G50 superfine. При хранении в холодильнике в плотно закупоренном состоянии в заполненном азотом флаконе липосомальная взвесь оставалась биологически активной не менее 7 сут.

Результаты

В первой серии экспериментов клиническая картина острого отравления хлорофосом начинала развиваться через 20—30 мин после внутрижелудочного введения хлорофоса. На высоте клинических проявлений наблюдали адинамию, затруднение дыхания (вдоха) как следствие паралича дыхательной мускулатуры, гиперсаливацию, тонические судороги, симптом кровавых слез. Гибель животных наступала через 40—60 мин после введения хлорофоса. У выживших животных в течение 24—72 ч происходило постепенное восстановление двигательных функций.

Острое отравление хлорофосом в дозе ЛД50, сопровождалось снижением активности АХЭ, БХЭ и НЭ в головном мозге, печени и миокарде. Максимальное ингибирова-ние АХЭ и НЭ в головном мозге и внутренних органах происходило в первые часы интоксикации (рис. 1, 3). Максимум падения активности БХЭ в этих органах отмечался через 24 ч (рис. 2). В ряду изученных эсте-раз БХЭ головного мозга и миокарда оказалась наиболее чувствительной к действию хлорофоса.

В более поздние сроки эксперимента изменения ферментативной активности носили волнообразный характер. Минимальные значения активности в течение первых 24 ч сменялись подъемом через 3 сут, затем вновь следовало понижение уровня активности, но уже в меньшей степени. К исходу 10-х суток эксперимента большинство гистохимических показателей активности эстераз дости-

Соотношение контроль/опыт 1,4

1,2

1

0,8 0,6 0,4 0,2 0

Лобная доля Большие полушария Печень Миокард

3 сут 7 сут

Время контроля 10 сут

Рис. 1. Динамика активности АХЭ при остром отравлении хлорофосом в дозе ЛД50

Соотношение контроль/опыт 1,2

1

0,8 -0,6 0,4 0,2 0

Лобная доля Большие полушария Печень Миокард

Время контроля

3 сут 7 сут

10 сут

Рис. 2. Динамика активности БХЭ при остром отравлении хлорофосом в дозе ЛД50

Соотношение контроль/опыт 1,2

1

0,8 0,6 0,4 0,2 0

--1-1-1-1- Лобная доля ^^"Большие полушария Печень Миокард

Время контроля

3 сут 7 сут

10 сут

Рис. 3. Динамика активности НЭ при остром отравлении хлорофосом в дозе ЛД5д

гали контрольных показателей или приближались к ним.

Во второй серии экспериментов после введения липосомального препарата ВоБХЭ и хлорофоса клиническая картина острого отравления начинала развиваться через 20-30 мин. На высоте клинических проявлений — через 1 ч — наблюдали адинамию, слабо выраженные признаки затруднения дыхания, мелкие тонические судороги, гиперсаливацию, симптом кровавых слез. Несмотря на наличие клинических признаков тяжелого отравления хлорофосом, выживали 100% животных; че-

Соотношение контроль/опыт 1,2

1

0,8 0,6 0,4 0,2 0

30 мин

Лобная доля Большие полушария Печень Миокард

Время контроля

24 ч

3 сут 7 сут 10 сут

Рис. 4. Динамика активности АХЭ при остром отравлении хлорофлсом в дозе ЛД5д. Профилактическое применение полимерно-фосфолипидной липосомальной формы ВоБХЭ в дозе 25ед/кг массы тела

Соотношение контроль/опыт 1,4

1,2

1

0,8 0,6 0,4 0,2 0

Лобная доля Большие полушария Печень Миокард

Время контроля

3 сут 7 сут

10 сут

Рис. 5. Динамика активности БХЭ при остром отравлении хлорофосом в дозе ЛД5д. Профилактическое применение полимерно-фосфолипидной липосомальной формы ВоБХЭ в дозе 25ед/кг массы тела

Соотношение контроль/опыт 1,2

1

0,8 -0,6 0,4 0,2 0

"Лобная доля Большие полушария Печень Миокард

Время контроля

3 сут 7 сут

10 сут

Рис. 6. Динамика активности НЭ при остром отравлении хлорофосом в дозе ЛД5д. Профилактическое применение полимерно-фосфолипидной липосомальной формы ВоБХЭ в дозе 25ед/кг массы тела

рез 24 ч они ничем не отличались от ин-тактных особей по внешнему виду и поведению.

Максимум снижения активности всех эстераз происходил на высоте развития клинической картины острого отравления — через 30 мин (рис. 4, 5, 6), при этом степень ингибирования ферментов была меньше, чем в предыдущем эксперименте. Обращало на себя внимание раннее снижение активности БХЭ во всех изученных органах и тканях. Через 24 ч после начала интоксикации происходило восстановление активности эстераз, которое продолжалось и в бо-

30 мин

24 ч

30 мин

24 ч

30 мин

24 ч

30 мин

24 ч

30 мин

24 ч

лее поздний срок — через 3 сут. В заключительной стадии эксперимента было отмечено практически полное восстановление активности АХЭ, БХЭ и НЭ в головном мозге, печени и миокарде.

Заключение

Применение полимерно-фосфолипид-ной липосомальной формы ВоБХЭ в качестве профилактического средства в дозе 25 ед/кг массы тела способствовало выживанию 100% подопытных животных, получивших хлорофос в дозе ЛД50.

Введение ВоБХЭ способствовало частичной защите эстераз от ингибирования в начальной стадии интоксикации и более быстрому восстановлению их активности в головном мозге и внутренних органах.

Литература

1. Гайер Г. Электронная гистохимия. М.: Мир, 1974.

2. Дудниченко А.С., Краснопольский Ю.М., Швец В.И. Липосомальные препараты в эксперименте и клинике. Харьков: РА-Каравелла, 2001.

3. Кононский А. И. Гистохимия. К.: Вища школа, 1976.

4. Соколовский В. В. Гистохимические исследования в токсикологии. Л.: Медицина, 1971.

5. Cohen O., Kronman C., Raveh L. et al. Comparison of polyethylene glycol-conjugated recombinant human acetylcholinesterase and serum human butyrylcholinesterase

as bioscavengers of organophosphate compounds // Molecular Pharmacology. 2006. Vol. 70. Nr. 3. P. 1121-1131.

6. Kronman C., Cohen O., Raveh L. et al. Polyethylene-glycol conjugated recombinant human acetylcholinesterase serves as an efficacious bioscavenger against soman intoxication // Toxicology. 2007. Vol. 233. Nr. 1-3. P.40-46.

7. Liposomes: A practical approach / Ed. by V. Torchilin, V. Weissig. New Oxford Press, 2003.

8. Poyott T., Nachon F., Froment M.T. et al. Mutant of Bungarus fasciatus acetyl -cholinesterase with low affinity and low hydrolase activity toward organophosphorus esters // Biochimica et Biophysica Acta. Proteins and Proteomics. 2006. Vol. 1764. Nr. 9. P. 1470-1478.

9. Way J.L., Petricovics I., Hong K. et al. A new approach to the antagonism of lethality of OP with recombinant — enzymes within liposomes and dendrimeric polymers / / Sevens international symposium on protection against CB warfare agents.: Stockholm, Sweden, 15-19 June, 2001. P. 51.

Контакты:

Почепцов Александр Яковлевич,

зав. лабораторией патоморфологии

ФГУП «НИИ ГТП» ФМБА России.

Тел. раб.: 8-442-78-62-57;

тел. моб.: 8-919-986-39-85.

E-mail: niigtp@rihtop.ru; pochepcov@rihtop.ru