СПОСОБ ОЦЕНКИ НАСЫЩЕНИЯ ЭОЗИНОФИЛОВ МОКРОТЫ И НАЗАЛЬНОГО СЕКРЕТА ЭОЗИНОФИЛЬНЫМ КАТИОННЫМ ПРОТЕИНОМ
METHOD FOR ASSESSMENT OF SPUTUM EOSINOPHIL AND NASAL SECRETION SATURATION WITH EOSINOPHILIC CATIONIC PROTEIN

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и может быть использовано в клинической аллергологии и иммунологии, гистологии, патологической физиологии при исследовании содержания катионных протеинов в эозинофилах мокроты и мазка со слизистой оболочки носа у пациентов с аллергическим ринитом и бронхиальной астмой.
В настоящий момент общепринятой методикой изучения цитологии дыхательных путей является микроскопия мазка со слизистой оболочки носа (или микроскопия мокроты), окрашенного по методу Романовского-Гимзе, в котором подсчитываются нейтрофилы и эозинофилы не менее чем в 10 полях зрения, при подсчете не менее 200 клеточных элементов.
Данный метод успешно используется в медицине, однако имеет ряд недостатков. Во-первых, показатели цитологии динамичны и способны изменяться в течение суток, что требует неоднократного повтора исследования. Во-вторых, количественные показатели клеток в ряде случаев не коррелируют с выраженностью (тяжестью) клинических симптомов.
В основу изобретения положена задача нивелировать указанные недостатки, путем оценки функциональной активности клеток, а не их количества.
Эозинофильные катионные протеины являются главным фактором, приводящим к повреждению клеток слизистых оболочек дыхательных путей при аллергическом воспалении [Колобовникова, Ю.В. Эозинофил в норме и при патологии/ Ю.В. Колоборовникова, О.И. Новицкий. - Томск: Изд-во «Печатная мануфактура», 2014. - 124 с.], в связи с чем, количество данных протеинов в клетках может отражать интенсивность воспалительного процесса и коррелировать с тяжестью клинической картины.
В предлагаемом способе цитологического изучения секретов слизистых оболочек дыхательных путей впервые используется окраска водным раствором бромфенолового красителя и оценка количественного содержания бромфенол-положительных гранул в эозинофилах.
Применение данного способа возможно не только для диагностики аллергической природы воспаления, что можно осуществить и при известных методиках исследования, но также для оценки интенсивности воспалительного процесса и ответа на медикаментозную терапию.
Способ оценки насыщения эозинофилов мокроты и назального секрета эозинофильным катионным протеином включает в себя:
1. Биологический материал (мазок со слизистой носа или мокрота) нанести тонким слоем на предметное стекло (фиг. 1).
2. Высушить при комнатной температуре строго в горизонтальном положении.
3. Зафиксировать в 95% этилового спирта (нанести 1-2 капли 95% этилового спирта на мазок) (фиг. 2).
4. Высушить мазок.
5. Окрасить 0,5% водным раствором бромфенолового синего (так, чтобы весь биоматериал был покрыт красителем) в течение 20 минут (фиг. 3).
6. Тщательно промыть в дистиллированной воде и высушить на воздухе (фиг. 4).
7. Осуществить иммерсионную микроскопию при увеличении не менее ×1000. При микроскопии эозинофилы определяются как клетки, содержащие крупные темно-фиолетовые гранулы с неокрашенной цитоплазмой и ядром (фиг. 5).
8. Оценить визуализируемые эозинофилы полуколичественно от 1 до 3 баллов, где «3» балла соответствуют полному заполнению цитоплазмы гранулами без светлых промежутков (фиг. 6, В)., «2» балла - наличию немногочисленных просветов между гранулами (фиг. 6, Б)., «1» балл - единичным гранулам цитоплазмы (фиг. 6, А).
9. Провести расчет насыщения эозинофилов бромфенол-положительными гранулами (среднего коэффициента насыщения эозинофилов) в условных единицах с помощью модифицированной формулы Астальди-Верга (1957). Для этого число клеток с одинаковым содержанием гранул умножить на соответствующее данной группе число баллов, сумма этих произведений делится на общее количество подсчитанных эозинофилов. Пример расчета: в мазке выявлено 10 эозинофилов, оцененных на «1 балл», 20 эозинофилов, оцененных на «2 балла» и 30 эозинофилов, оцененных на «3 балла».
Расчет:
Механизм действия основан на переходе красителя в окрашенную форму при связывании с катионными белками.
Пример конкретного осуществления
Пример 1
Пациент А., 16 лет, впервые поступил на обследование в аллергологическое отделение, диагноз J45.9 - астма неуточненная. При поступлении до начала базисной терапии было выполнено цитологическое исследование индуцированной мокроты, а также определялся средний коэффициент насыщения эозинофилов катионным протеином. Результат:
Через 7 дней от начала лечения ингаляционными кортикостероидами выполнено повторное цитологическое исследование с определением среднего коэффициента насыщения эозинофилов катионным протеином. Результат:
На фоне приема базисной терапии, несмотря на отсутствие существенных количественных изменений цитологического состава, отмечено снижение содержания катионного протеина в эозинофилах мокроты, что говорит о положительной динамике на фоне лечения.