ОПТИМИЗИРОВАННЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК, КОДИРУЮЩИЕ ЛЕГКУЮ И ТЯЖЕЛУЮ ЦЕПИ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА, СВЯЗЫВАЮЩЕГО ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛИ АЛЬФА, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЕ ДЛЯ БИОСИНТЕЗА АНТИТЕЛА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛА ПОСРЕДСТВОМ РЕКОМБИНАНТНОЙ КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ CHO-S
OPTIMISED DNA SEQUENCES, CODING LIGHT AND HEAVY CHAINS OF MONOCLONAL ANTIBODY, BINDING TUMOUR NECROSIS FACTOR ALPHA, INTENDED FOR ANTIBODY BIOSYNTHESIS, METHOD OF OBTAINING ANTIBODY BY RECOMBINANT CELL LINE CHO-S

Изобретение относится к фармацевтической субстанции терапевтического моноклонального антитела, нейтрализующего активность ФНО-α человека. Представлены оптимизированная последовательность ДНК, способ биосинтеза антитела на основе рекомбинантной клеточной линии CHO-S с описанием важных параметров конечного продукта. Изобретение может быть использовано для создания фармацевтического препарата, применяемого при аутоиммунных заболеваниях, в частности ревматоидного артрита, болезни Крона, язвенного колита, анкилозирующего спондилита, псориатического артрита и др.
Антитела (иммуноглобулины) - класс биологических молекул, синтезируемых В-лимфоцитами иммунной системы. Они обладают свойством высокоспецифично связываться с чужеродными объектами, тем самым нейтрализуя и индуцируя их уничтожение клетками-киллерами. С развитием гибридомных клеточных технологий и молекулярно-биологических методов появилась возможность искусственно создавать и производить антитела, специфичные только к заданной молекулярной мишени (моноклональные антитела). В настоящее время это свойство моноклональных антител активно используется для лечения различных онкологических и аутоимунных заболеваний. Аутоиммунные заболевания, среди которых доминирует ревматоидный артрит, представляет собой тяжелую социальную и экономическую проблему. Золотым стандартом лечения ревматоидного артрита является использование рекомбинантных препаратов на основе моноклональных антител к фактору некроза опухоли (ФНО). Блокирование моноклональными антителами связывания ФНО с иммунокомпетентными клетками обеспечивает противовоспалительный эффект таких лекарств и стойкую ремиссию у больных.
С целью промышленной продукции белков, имеющих фармацевтическое значение, в частности моноклональных антител, широко используются клетки СНО. Важным свойством клеток СНО для использования в клеточной биотехнологии является их широкая приспособляемость к разнообразным условиям культивирования и высокая генетическая пластичность, что позволяет с относительной легкостью проводить с данными клетками различные генетические манипуляции. Кроме того, эти клетки способны к росту при очень высокой клеточной плотности в больших крупногабаритных ферментерах объемом до 10 тыс. литров. Более того, клетки СНО соответствуют принципам биологической безопасности, поскольку подавляющее большинство патогенных вирусов человека, включая вирусы иммунодефицита, полиомиелита, гриппа и герпеса, неспособно в них размножаться.
Вышеупомянутые качества сделали клетки СНО главной клеточной культурой в мировой биотехнологии. В настоящее время около 70% рекомбинантных фармацевтических биопрепаратов производится именно на основе клеток СНО.
Уже существующий на рынке препарат на основе моноклонального антитела к ФНО-α человека моноклональное антитело (Ремикейд) до сих производится в клеточной линии мышиной меланомы SP2/0, разработанной около 20 лет назад, в то время как разработанный штамм-продуцент моноклонального антитела к ФНО-α человека производится в CHO-S клетках, являющихся на сегодня «золотым стандартом» по соотношению эффективности и безопасности в производстве биофармацевтических препаратов, и позволяет минимизировать риски загрязнения продукта эндогенными вирусами и белками клетки-продуцента в процессе производства. Очевидно, переход на принципиально новую клеточную систему экспрессии требует создания и отработки каждой стадии нового технологического процесса - от культивирования до стадий финальной очистки и получения ГЛФ.
Для эффективной экспрессии требуется оптимизация последовательности ДНК целевого белка. Показано, что на эффективную экспрессию влияют такие факторы, как процент содержания G-пар, вторичная структура РНК, наличие внутренних сигналов сплайсинга, наличие коротких рамок считывания, длинных гомополимерных последовательностей, использование кодонов и пар кодонов с разной степенью встречаемости. Было показано, что для антител оптимизация последовательности ДНК может значительно повысить уровень экспрессии. Таким образом, последовательности ДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи моноклонального антитела к ФНО, были оптимизированы для получения высокого уровня экспрессии.
Разработка клеточной линии-продуцента моноклонального антитела к ФНО-α человека включала в себя следующие этапы:
- оптимизация последовательностей ДНК, кодирующих легкую и тяжелую цепь антитела (фиг.1);
- создание двух экспрессионных конструкций, кодирующих тяжелую и легкую цепи рекомбинантного моноклонального антитела (фиг.2);
- проведение трансфекции клеток СНО полученными экспрессионными плазмидами;
- отбор клонов и создание клеточного банка штамма-продуцента.
Были сконструированы экспрессионные плазмиды v240 и v241, содержащие кДНК, кодирующие рекомбинантное моноклональное антитело к ФНО-α человека, под контролем цитомегаловирусного промотора. Экспрессионные плазмиды были синтезированы с использованием стандартных молекулярно-биологических методов.
Была проведена трансфекция клеточной линии CHO-S химическим методом. Успешно трансфецированные клетки были отобраны с применением антибиотиков: зеоцин и бластицидин. Для отбора клонов, имеющих максимальную продуктивность по антителу, был использован метод предельных (лимитирующих) разведений с последующей оценкой концентрации моноклонального антитела с помощью ИФА. Отобранные клоны амплифицировали в условиях нормального клеточного роста и создали клеточные банки.
Техническим результатом изобретения является максимизация продуктивности клеток и оптимизация пострансляционных модификаций антитела, в частности гликозилирования тяжелых цепей антитела. В результате проделанной работы были разработаны несколько условий, позволяющие получить моноклональное антитело с высокой продуктивностью и различным гликозилированием тяжелой цепи в зависимости от условий культивирования.
Примеры
2
2
В качестве основной среды для культивирования была выбрана среда ActiCHO P CD (GE Healthcare) с добавлением 6 мМ L-глутамин и 0,1% Pluronic F-68. В качестве добавок использованы UMG (300 мМ уридин, 1500 мМ галактоза, 0,6 mM MnCl), ActiCHO FeedA CD (GE Healthcare) совместно с ActiCHO FeedB CD (GE Healthcare) (в объемном соотношении 10:1, добавляются по отдельности) глюкоза 250 г/л и FunctionMAX Titer Enhancer (Life Technologies). Разработанные схемы культивирования, описывающие порядок внесения различных компонентов, представлены в таблице 1. Клетки культивировали в шейкерных колбах на орбитальном шейкере при ~110 об/мин при 36,5°С, 5% CO в инкубаторе. Для культивирования использовали клетки, депонированные во Всероссийскую Коллекцию Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером Н-145.
Таблица 1
Схема внесения компонентов при культивировании
Компоненты
День
0
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
ActiCHO Feed-A+B
1,76%
1,7 6%
1,7 6%
1,7 6%
1,7 6%
1,7 6%
1,7 6%
1,7 6%
1,7 6%
1,7 6%
1,7 6%
1,7 6%
1,7 6%
FM
3,5%
3,5%
3,5%
3,5%
UMG
4х
4х
4х
4х
4х
4х
Было экспериментально выяснено, что добавление NaCl до концентрации 0,5 М и 1М увеличивает выход целевого антитела после первой стадии аффинной очистки. В качестве аффинного сорбента использовали Mab Select (GE Healthcare). Для оптимизации условий использовали 5 мл сорбента. Перед нанесением образцов колонну уравновешивали 4-5 объемами (относительно объема колонны) буфера Mab 1 (20 mM PhNa, 0,5 М NaCl, pH 7,0). Элюцию с колонны осуществляют 4-5 объемами буфера Mab 2 (100 mM Gly-HCl, pH 3,5). Выход оценивали по количеству белка, измеренным спектрофотометрически, после элюции. Было доказано, что внесение хлорида натрия перед стадией аффинной хроматографии в концентрации 0,5М и 1М увеличивает выход антитела (таблица 2). Было решено добавлять хлорид натрия к культуральной жидкости в концентрации 0,5М непосредственно до стадии фильтрации культуральной жидкости.
Таблица 2
Выход антитела к ФНО-α с MabSelect в зависимости от концентрации хлорида натрия в культуральной жидкости
Концентрация NaCl в культуральной жидкости, М
Емкость сорбента MabSelect, мг/мл
0
17,7
0,5
26,28
1
26,3
3
Перед очисткой антитела культуральную жидкость размораживают, добавляют NaCl до конечной концентрации 0,5М и фильтруют. Первую стадию очистки проводят при температуре 2-8°С. Условия очистки такие же, как и описаны выше с учетом большего объема сорбента. В процессе элюции белковый раствор титруют до значений рН 5,5±0,2 раствором 1 М Трис-HCl рН 8,0. Вторую стадию очистки моноклонального антитела проводят на сорбенте Fractogel SO (Merck) при температуре 2-8°С. Колонну уравновешивают буфером Frac 1 (20 mM NaAc, рН 5,5). Раствор моноклонального антитела разводят уравновешивающим буфером Frac 1 (20 mM NaAc, рН 5,5) до значения проводимости не выше 5 mS/cm (кратность разведения 3-4 раза), доводят рН до значения 5,5±0,2 0,25 М уксусной кислотой, наносят на колонну. Колонну промывают 300 мл буфера Frac 1. Элюцию с колонны осуществляют ступенчатым градиентом 20% буфера Frac 2 (20 mM NaAc, 1 М NaCl, рН 5,5) в буфере Frac 1 (20 mM NaAc, рН 5,5). Начиная с оптической плотности 10 mAU (UV 280 нм), собирают фракции и анализируют методом ГФ-ВЭЖХ. По результатам анализа объединяют фракции с чистотой 98,5% и выше. Полученный раствор белка фильтруют через насадку фильтрующую на флакон Стеритоп 0,22 мкм. Затем раствор антитела концентрируют, используя мембраны для тангенциальной фильтрации с пределом отсечения 50 кДа, уравновешенную буфером ГЛФ (5 mM натрия гидрофосфат, 1,6 mM натрия дигидрофосфат, 142 mM сахарозы, 0,05% полисорбат-80). Далее раствор подвергается последней стадии - гель-фильтрующей хроматографии на сорбенте Sephadex G25 (GE Healthcare). Процесс проводят при температуре 2-8°С. На колонну, предварительно уравновешенную буфером ГЛФ, наносили раствор моноклонального антитела, элюцию с колонны проводили в буфере ГЛФ объемом. Полученный раствор антитела фильтруют через фильтр на 0,2 мкм и при -20°С.
Выявлен состав стабильной фармацевтической композиции в виде лифилизата, куда входят, мг: разработанное антитело против ФНО-α человека - 100; натрия гидрофосфат дигидрат - 6,1; натрия дигидрофосфат моногидрат - 2,2; сахароза - 500 и полисорбат - 80-0,5. Для получения данной композиции были использованы следующие условия сушки:
Замораживание - 2 часа при -30 - -40°С,
Сублимация при -20°С, 6 часа, 70-110 мТорр,
Ступенчатый переход на десорбцию - от -20 до +25°С в течение 2 часов при 70-110 мТорр,
Десорбция при +25°С, 5 часов, 70-110 мТорр.
Для оценки биологической активности были проведены in vitro и in vivo исследования. В частности, был проведен ряд исследований для комплексной оценки связывания антитела с антигеном: методом ИФА было изучено связывание с человеческим ФНО-α в растворимой мономерной и тримерной формах, методом сортировки флуоресцентно-активированных клеток было изучено связывание с трансмембранным нерастворимым ФНО-α на поверхности клеток и, более того, с помощью метода поверхностного плазменного резонанса были определены константы диссоциации (для комплекса антитела с мономерной и тримерной формой ФНО-α). Для оценки биологической активности было проведено исследование нейтрализующей активности по отношению к WEHI-164. Результаты представлены в таблице 3. Данные подтверждают наличие биологической активности полученного антитела in vitro.
Таблица 3
Результаты оценки биологической активности in vitro моноклонального антитела к ФНО-α человека
Исследование
Значение
Стандартное отклонение
Связывание с растворимым ФНО-а человека в мономерной форме, ЕС50 (нМ)
0.1335
0.0262
Связывание с растворимым ФНО-а человека в гомотримерной форме, ЕС50 (нМ)
0.0251
0.0037
Связывание с трансмембранным ФНО-а человека, ЕС50 (нМ)
5.632
0.5928
Нейтрализующая активность по отношению к клеткам WEHI-164, ЕС50 (нМ)
0.4854
0.0888
Эффективность разработанного моноклонального антитела к ФНО-α человека была доказана in vivo на трансгенных мышах Tg197 с гиперэкспрессией ФНО-α человека, приводящей к развитию полиартрита, начиная с 3-4-й недели жизни животного. Была проведена оценка терапевтической эффективности разработанного антитела в предотвращении проявления симптомов артрита у генетически модифицированных мышей Tg197. Для проведения данного исследования мыши (12 мышей в каждой группе, равное количество самцов и самок) получали исследуемое антитело болюсно, однократно (в дозировках 10 мг/кг и 30 мг/кг), внутрибрюшинно на четвертой неделе жизни после появления проявлений артрита, но до развития данных проявлений, а затем проводили оценку состояния данных мышей в возрасте более 5 недель до достижения 9-йнедели жизни. Как показали результаты исследования, лечение исследуемым препаратом при дозировке 10 мг/кг оказывало подавляющее действие на развитие проявления полиартрита, однако не обеспечивало полную защиту от развития данного заболевания. В случае дозировки 30 мг/кг исследуемый препарат оказывал подавляющее действие на развитие проявления полиартрита и сохранял их статистически единообразными по сравнению с мышами в возрасте 3 недель из контрольной группы, не получавших препарат. В таблицах 4-6 приведены данные исследования эффективности разрабатываемого препарата на мышах Tg197.
Таблица 4
Средняя масса тела в группе
Средняя масса тела (г)
Неделя 4
Неделя 5
Неделя 6
Неделя 7
Неделя 8
Неделя 9
Возраст 4 недели, контрольная группа, не получавшая препарат
10,93
-
-
-
-
-
G1-PRM-002 10 мг/кг
12,24
15,28
16,62
17,36
18,02
18,88
G2-PRM-002 30 мг/кг
12,27
15,75
17,51
18,21
19,78
20,86
G3-физиологический
12,26
14,34
15,23
15,58
15,71
16,40
Таблица 5
Средняя оценка артрита, in-vivo
Средняя оценка артрита в условиях in-vivo
Неделя 4
Неделя 5
Неделя 6
Неделя 7
Неделя 8
Неделя 9
Возраст 4 недели, контрольная группа, не получавшая препарат
0,38
-
-
-
-
-
G1-PRM-002 10 мг/кг
0,40
0,43
0,66
0,71
0,82
0,91
G2-PRM-002 30 мг/кг
0,38
0,28
0,36
0,32
0,35
0,45
G3-физиологический раствор
0,29
0,70
0,88
0,99
1,27
1,25
Таблица 6
Средняя гистопатологическая оценка уровня развития артрита, ех-vivo
Средняя гистопатологическая оценка уровня развития артрита
Неделя 4
Неделя 9
Возраст 4 недели, контрольная группа, не получавшая препарат
1,50
-
G1-PRM-002 10 мг/кг
-
2,83
G2-PRM-002 30 мг/кг
-
1,42
G3-физиологический раствор
-
3,27