ПОЛИЭТИЛЕНИМИН КАК КОМПОНЕНТ СВОБОДНОЙ НЕПОДВИЖНОЙ ФАЗЫ В КАПИЛЛЯРНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ГРАДИЕНТОМ рН

УДК 541.544

ПОЛИЭТИЛЕНИМИН КАК КОМПОНЕНТ СВОБОДНОЙ НЕПОДВИЖНОЙ ФАЗЫ В КАПИЛЛЯРНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ГРАДИЕНТОМ рН А.В. Иванов, С.С. Кубышев, П.Н. Нестеренко, А.Б. Тессман

Предложено использовать водные растворы полиэтиленимина (1:3 - 1:2) как свободную неподвижную фазу для индуцирования нисходящих градиентов рН внутри капилляров. В качестве компонентов элюента применяли уксусную и 6-аминогексано-вую кислоты, а также Трис. Градиенты рН, полученные при скорости расхода элюента 0,4-0,6 мл/мин, характеризуются линейностью в интервале более 5 ед. рН.

Элюирование с градиентом рН давно привлекает внимание исследователей, поскольку позволяет увеличить нагрузочную емкость хроматографических колонок, работать с веществами, разделение которых невозможно при изократическом элюировании, избежать размывания хроматографических зон [1-3]. В зависимости от задачи можно получать ступенчатые или линейные (непрерывные) градиенты в разных диапазонах рН. Однако формирование градиентов рН до колонки за счет смешивания двух или более подвижных фаз требует использования градиентного насоса или смесителя с электронным управлением для задания градиента рН требуемой формы [2-4]. Именно поэтому все больший интерес вызывают внутри-колоночные градиенты рН, создаваемые за счет про-толитических и ионообменных взаимодействий между буферным элюентом и функциональными группами сорбента. Наряду с перечисленными выше внут-риколоночные градиенты рН обладают следующими преимуществами: достигается высокое разрешение пиков благодаря фокусирующему эффекту [2, 4], для их формирования не требуется градиентный насос или смеситель. Иногда возможно сочетать предварительное концентрирование анализируемых компонентов с последующим разделением на той же самой колонке [2, 4]. Внутриколоночные градиенты рН применяют в ионообменной хроматографии белков и ферментов [3-5], в комплексообразовательной хроматографии металлов [6, 7], для разделения лекарственных форм [4, 8] и т.п. Существует два основных способа формирования линейных внутриколоночных градиентов рН: техника хроматофокусирования [4] и техника индуцирования [8, 9]. В технике хроматофо-кусирования через колонку предварительно пропускают буферный стартовый раствор, уравновешивая ее

до определенного значения рН, а затем пропускают буферный элюент при резко отличающейся кислотности, что приводит к линейному изменению рН в слое сорбента. При использовании техники индуцирования через колонку постоянно пропускают разбавленный буферный элюент, в определенные моменты вводя в поток элюента ограниченный объем концентрированного индуцирующего раствора. Это приводит к резкому изменению кислотности эффлюента до значения рН индуцирующего раствора, а затем идет плавное изменение до значения рН элюента. В ряде случаев удается заметно снизить время формирования градиента

Следует отметить новую область применения техники индуцирования линейных градиентов рН -жидкостная хроматография со свободной неподвижной фазой (ЖХСНФ) [10, 11]. В последние годы в ЖХСНФ применяли только элюирование со ступенчатым доколоночным градиентом рН [12, 13], однако при этом на хроматограммах возникал ряд ложных пиков, вызванных сменой подвижных фаз. Использование техники индуцирования позволило бы сочетать преимущества ЖХСНФ и рН-градиентного элюирова-ния. Согласно разработанному подходу [10, 14] индуцирующий раствор, вызывающий формирование градиента рН в капилляре, одновременно служит и свободной неподвижной фазой. Очевидно, что реагент для индуцирования должен обладать достаточной вязкостью. Так, для индуцирования восходящих и нисходящих градиентов рН показано применение вязких гидрофобных кислот [10] и растворов аминов в полиэтиленгликоле [11] соответственно.

В данной статье описано применение растворов полиэтиленимина в качестве свободной неподвижной фазы, индуцирующей нисходящий градиент рН.

Экспериментальная часть

Реагенты. В качестве индуцирующих использовали водные растворы полиэтиленимина (ПЭИ) при переменной концентрации, приготовленные из препарата (Aldrich, США). Водные растворы уксусной, 6-аминогексановой кислот и Трис, приготовленные из препаратов фирмы Merck (Германия), использовали в качестве компонентов элюента. Концентрацию компонентов элюента варьировали в диапазоне 0,5-2,0 мМ. Все реагенты имели квалификацию "ч.д.а.".

Аппаратура. Использовали хроматографическую систему высокого давления, состоящую из насоса высокого давления "Beckman-114 M" (США) или "Milton Roy A 802" (Франция), инжектора "Rheo-dyne-7125" (США) с объемом петли 50 мкл или 1 мл для ввода индуцирующего раствора, тефлонового капилляра с внутренним объемом 1 мл (внутренний радиус 0,4 мм, длина ~200 см), цифрового рН-метра НМ-20S (TOA Electronics, Япония) с комбинированным стеклянным электродом GST-5211C и проточной ячейкой для непрерывного контроля рН эффлюента. Сигнал рН-метра регистрировали через АЦП на компьютере Pentium-I с тактовой частотой 100 МГц с помощью DOS-приложения "Экохром" (ИОХ РАН, Россия) или самописца "LKB-2210" (LKB-Bromma, Швеция).

Методика. Через капилляр в течение 10-15 мин пропускали буферный элюент с нижним значением интервала рН, вводили в инжектор 50 мкл (в отдельных экспериментах 0,2-1,0 мл) водного раствора полиэтиленимина с верхним значением интервала рН и непрерывно регистрировали рН эффлюента.

Результаты и их обсуждение

Механизм формирования нисходящего градиента рН в капилляре. Выбор неподвижной фазы. Неподвижные фазы в методе ЖХСНФ называются "свободными", поскольку в отличие от традиционных сорбентов они не постоянно находятся внутри капилляра (колонки), а постепенно вымываются из капилляра. Процесс вымывания фазы идет c гораздо меньшей скоростью, чем прохождение элюента через капилляр, и этого времени обычно достаточно для разделения анализируемых веществ [13]. Таким образом, при необратимой сорбции или необратимом распределении анализируемых веществ капилляр можно легко освободить от отработанных неподвижных фаз

и заполнить новой порцией неподвижной фазы. В качестве свободной неподвижной фазы используют жидкости, не смешивающиеся с водным элюентом и обладающие плотностью, отличной от плотности воды, и достаточно высокой вязкостью [12]. Модель индуцирования восходящего градиента рН при использовании вязкой гидрофобной кислоты (октановой или гептановой) в качестве неподвижной фазы предложена в [10, 14]. Рассмотрим этапы формирования нисходящего градиента рН внутри капилляра при использовании аминов в качестве неподвижной фазы. После ввода порции амина ККН2 внутренние стенки капилляра модифицируются неподвижной фазой, а не сорбировавшаяся на стенках порция амина выходит из капилляра, и тогда рН эффлюента резко повышается до 9-10 (рис. 1). Поскольку изученные нами амины (пропиламин, 2-бутиламин, диизопропилэтила-мин, ундециламин [11]) не обладают достаточной вязкостью и плохо удерживаются на стенках капилляра, то для лучшего удерживания использовали их растворы в вязком полиэтиленгликоле. Толщина слоя амина по длине капилляра может быть неравномерной. Элюент, в состав которого входят слабые органические кислоты НА (уксусная и 6-аминогексано-вая) постепенно титрует амин, и на модифицированных стенках капилляра образуются участки с аммониевым основанием:

ШН2 + Н + А ^ ШН3Л .

Соль аммониевого основания ККН3Л также удерживается некоторое время на внутренних стенках капилляра. Титрование амина продолжается, и из капилляра выходят смесь кислот, первоначально содержащихся в элюенте, и смываемая со стенок соль ККН3А. Таким образом, рН эффлюента плавно снижается до значения рН элюента на входе в капилляр. Внутренние стенки капилляра снова становятся немо-дифицированными, и можно вводить в систему новую порцию индуцирующего реагента ККН2. Профиль градиента зависит от кислотно-основных свойств фаз и от вязкости неподвижной фазы, а рабочий интервал градиента рН определяется соотношением кислотности элюента и основности неподвижной фазы. Добавление полиэтиленгликоля в состав свободной неподвижной фазы способствует более плавному снижению рН эффлюента, но вместе с тем сокращает рабочий интервал градиента рН от 7 до 4,5-5,0.

С этих позиций представляется перспективным использовать полиамины (например, полиэтилен-

имин) в качестве компонентов свободной неподвижной фазы, индуцирующей градиент рН. С другой стороны, по кислотно-основным свойствам в сочетании с высокой (до нескольких сотен пуаз) вязкостью [15] несомненный интерес представляют ионные жидкости.

Свободная неподвижная фаза на основе поли-этиленимина. Различают полиэтиленимин (ПЭИ) низкой и высокой молекулярной массы [16]. ПЭИ низкой молекулярной массы (600-10000) представляет собой вязкую жидкость (вязкость 1103-2104 пуаз), плотность которой сравнима с плотностью воды (1,05 г/см ); температура стеклования -45°С. ПЭИ высокой молекулярной массы (30000-100000) является эластомером с очень высокой вязкостью - от 410 до 10 пуаз (4000-10000 Пас) и температурой стеклования -(20-30) °С [16]. Полиэтиленимин хорошо смешивается с водой, давая истинные растворы в широком интервале концентраций. Значения ^ К для аминогрупп в составе ПЭИ равномерно распределены в широком интервале от 4,2 до 10,5, что делает перспективным использование ПЭИ в качестве индуцирующего реагента. Если неподвижные фазы на основе пропиламина или бутиламина в ЖХСНФ можно сравнить с монофункциональными анионообменника-ми, то ПЭИ в этом случае - аналог анионообменни-ков РВЕ-94, РВЕ-118 или Те1хеп-8Ю2 - полифункциональных полиэлектролитных сорбентов для хромато-фокусирования [2, 4, 7]. Дополнительным преимуществом является хорошее удерживание полиэтиленими-на на стенках капилляра, обусловливаемое гидрофобными контактами макромолекул тефлона и полиэти-ленимина. Однако чрезвычайно высокая вязкость, характерная даже для ПЭИ низкой молекулярной массы, не позволяет использовать чистый полимер как свободную неподвижную фазу. Решением проблемы является применение водных растворов ПЭИ, поскольку в этом случае вязкость заметно снижается. Так, для 33%-го раствора она составляет 150-250 пуаз (15-25 Пас). Такие растворы пригодны в качестве неподвижной фазы для ЖХСНФ.

Варьирование содержания ПЭИ в растворе позволяет добиться такой вязкости раствора, при которой профиль градиента будет линейным при сохранении широкого рабочего интервала рН (не менее 5 ед. рН), а время выхода не превысит 50-60 мин. Хроматогра-фические условия, выбранные оптимальными на основе предыдущего исследования [12] (элюент - 1 мМ уксусная кислота, по 0,5 мМ аминогексановой кислоты и Трис при скорости 0,4 мл/мин), сохранили на

первом этапе эксперимента. С увеличением доли по-лиэтиленимина в водном растворе от 1:5 до 1:2 (по объему) профиль градиента становится более линейным, рабочий интервал градиента увеличивается. Так, время выхода градиента рН для растворов ПЭИ 1:5, 1:3 и 1:2 составляет 44-45, 70-75 и более 160 мин соответственно (рис.1, таблица). Начальная точка градиента при этом смещается в область более высоких значений рН. Хотя в последнем случае профиль градиента наиболее плавный и практически линейный во всем рабочем интервале рН (от 10,2 до 5,0), слишком длительное время формирования не позволяет выбрать такие условия в качестве оптимальных. Таким образом, градиент, индуцированный при использовании раствора ПЭИ (1:3), благодаря меньшему времени формирования более интересен для практических задач. Однако данную серию экспериментов проводили при низкой скорости расхода элюента.

Скорость расхода элюента в ЖХСНФ также существенно влияет на профиль градиента рН. Для проверки влияния скорости элюента выбрали растворы ПЭИ 1:2 и 1:3, состав элюента оставили прежним. При скорости 0,8 мл/мин время выхода градиента рН заметно сокращается (35-37 мин) в отличие от скорости 0,4 мл/мин (таблица, рис. 2); расширяется рабочий интервал рН, но на профиле градиента отчетливо проявляются 2 линейных участка с перегибом или даже небольшим повышением рН (в области 7,2-7,5), причем первый участок более пологий

рН

0 40 80 120 160

и мин

Рис. 1. Влияние содержания ПЭИ в составе свободной неподвижной фазы на профиль градиента рН. Элюент: 1 мМ уксусная кислота, 0,5 мМ аминогексановая кислота, 0,5 мМ Трис (0,4 мл/мин); неподвижная фаза - водный раствор ПЭИ: 1 - 1:3, 2 - 1:2

Условия формирования и характеристики индуцированных градиентов рН

Свободная неподвижная фаза: соотношение ПЭИ : вода; объем Состав элюента Скорость расхода элюента, мл/мин Интервал градиента рН Время выхода градиента, мин *

1:5; 50 мкл 1 мМ уксусная кислота, 0,5 мМ аминогексановая кислота, 0,5 мМ Трис 0,4 9,77-4,70 43-45

1:4, 50 мкл тот же 0,4 9,83-4,70 55-58

1:3; 50 мкл тот же 0,4 9,87-4,68 70-75

1:2; 50 мкл тот же 0,4 10,20-4,68 более 160

Та же тот же 0,6 10,30-4,68 92-95

-//- тот же 0,8 11,20-4,65 40-43

1:3, 50 мкл 1 мМ уксусная кислота, 1 мМ аминогексановая кислота, 0,5 мМ Трис 0,4 9,88-4,60 27-28

Та же тот же 0,6 9,82-4,60 23-25

1:2, 0,2 мл тот же 0,6 10,90-4,70 115-120

1:2; 0,8 мл тот же 0,6 11,55-4,70 более 180

Та же 10 мМ уксусная кислота, 5 мМ аминогексановая кислота, 1 мМ Трис 0,6 10,08-4,50 42-45

1:2; 1,0 мл тот же 0,6 11,03-4,55 49-53

* Время снижения рН от максимального до значения рН элюента.

(рис. 2, кривая 1). Такая форма градиента хорошо воспроизводится при многократном повторении эксперимента. Вероятно, при более высокой скорости элюента вымывание свободной неподвижной фазы или аммониевого основания из капилляра происходит не совсем равномерно, и на этом участке градиента частично выходит порция еще неоттитрованного амина. Более высокая скорость подвижной фазы может

препятствовать равномерному распределению ПЭИ по стенкам капилляра. В пользу такого предположения говорит и заметный сдвиг начальной точки градиента в щелочную область (до рН 11,2-11,3).

При скорости расхода элюента 0,6 и 0,4 мл/мин начальные точки градиента лежат практически в одной области рН (10,2-10,3). Время выхода градиента сокращается до 90-95 мин (таблица), снижение рН

рН

0 40 80 120

С, мин

Рис. 2. Влияние скорости элюента на профиль градиента рН при использовании 1:2 раствора ПЭИ в качестве неподвижной фазы. Скорость расхода элюента: 1 - 0,8 мл/мин, 2 - 0,6 мл/мин, 3 - 0,4 мл/мин

рН

л_1.

0 10 20 30

и мин

Рис. 3. Градиенты рН, полученные при использовании 1:3 раствора ПЭИ. Элюент: 1 мМ уксусная кислота, 1 мМ аминогексановая кислота, 0,5 мМ Трис; скорость расхода элюента: 1 - 0,6 мл/мин, 2 - 0,4 мл/мин

идет достаточно плавно. Для сравнения приведен градиент рН, полученный ранее при скорости 0,4 мл/мин (кривая 2 на рис.1 и кривая 3 на рис. 2). Таким образом, скорость расхода элюента 0,6 мл/мин можно считать оптимальной при использовании 1:2 раствора ПЭИ. На рис. 3 представлены градиенты, индуцированные при использовании 1:3 раствора ПЭИ в качестве неподвижной фазы. Помимо скорости варьировали состав элюента - увеличили концентрацию 6-аминогексановой кислоты до 1 мМ. Время выхода градиента в этом случае не превышало 3035 мин, оба градиента имеют достаточно плавную, линейную форму в широком диапазоне рН от 9,7-

9,8 до 4,7 (таблица). Таким образом, предложенные условия можно использовать в практических целях.

Объем свободной неподвижной фазы. При индуцировании восходящих градиентов рН мы показали на примере октановой кислоты, что вводимый объем неподвижной фазы существенно влияет на линейность градиента. Аналогичным образом варьировали объем свободной неподвижной фазы для растворов ПЭИ 1:2 и 1:3. Можно было сразу предположить, что время выхода градиента при увеличении вводимого объема многократно возрастет. Для того чтобы время не превышало 50-60 мин, увеличили концентрации кислот в элюенте в 5-10 раз (таблица). На основании предыдущих экспериментов выбрали скорость подвижной фазы 0,6 мл/мин. Градиенты, индуцированные при введении 0,8-1,0 мл раствора ПЭИ (1:2), линейны в диапазоне более 5 ед. рН, а их продолжительность в таких условиях не превышает 40 мин (рис.4). Оба градиента представляют практический интерес, но, на наш взгляд, градиент, полученный при введении 1 мл раствора ПЭИ (рис.4, кривая 2), предпочтительнее из-за более плавного снижения рН.

Таким образом, водные растворы ПЭИ перспективны для индуцирования линейных нисходящих градиентов в широком интервале рН внутри капилляров. Наиболее интересными из изученных представляются следующие системы:

а) неподвижная фаза - 1:3 раствор ПЭИ (50 мкл), элюент - 1 мМ уксусная кислота, 0,5-1 мМ аминогексановая кислота, 0,5 мМ Трис при скорости 0,40,6 мл/мин;

рН

0 10 20 30 40

С, мин

Рис. 4. Индуцирование градиентов рН при варьировании объема свободной неподвижной фазы. Неподвижная фаза: 1:2 раствор ПЭИ. Элюент: 10 мМ уксусная кислота, 5 мМ аминогексановая кислота, 1 мМ Трис (0,6 мл/мин). Объем раствора ПЭИ, мл: 1 - 0,8, 2 - 1,0

б) неподвижная фаза - 1:2 раствор ПЭИ (50 мкл), элюент - 1 мМ уксусная кислота и по 0,5 мМ амино-гексановой кислоты и Трис при скорости 0,6 мл/мин;

в) неподвижная фаза - 1:2 раствор ПЭИ (0,8-1,0 мл), элюент - 10 мМ уксусная кислота и по 5 мМ

аминогексановой кислоты и Трис при скорости 0,6 мл/мин.

В дальнейшем было бы интересно изучить формирование нисходящих градиентов при использовании ионных жидкостей в качестве неподвижной фазы.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Jandera P., Churacek J. Gradient elution in column liquid

chromatography: theory and practice. Amsterdam; Oxford; N.Y.; Tokio, 1985.

2. Иванов А.В., Нестеренко П.Н. // ЖАХ. 1999. 54. № 6. С. 566.

3. Liu Y.S., Anderson D.J. // J. Chromatogr. A. 1997. 762. P. 207.

4. Amersham Biosciences BioDirectory (Catalogue). Uppsala, 2003.

5. KangX., Frey D.D. // Anal.Chem. 2002. 74. P. 1038.

6. Nesterenko P.N., Ivanov A.V. // Mendeleev Comm. 1994. N 5. Р.

174.

7. Иванов А.В., Нестеренко П.Н. // Изв. вузов. Химия и химтехно-

логия. 1999. 42. С. 122.

8. Slais K. // J. Microcol. Sep. 1991. 3. P. 191.

9. JanecekM, Slais K. // Chromatographia. 1993. 36. P. 246.

10. Иванов А.В., Тессман А.Б., Пирогов А.В. // ЖФХ. 2003. 77.

C. 934.

11. Иванов А.В., Кубышев С.С., Нестеренко П.Н. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2004. 45. № 4. С. 240.

12. Counter-Current Chromatography. Editors: J.M.Menet,

D.Thiebaut. N.Y.; Basel, 1999.

13. Kitazume E., Higashiyama T., Sato N. et al. // Anal.Chem. 1999. 71. P. 5515.

14. Тессман А.Б., Иванов А.В. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2004. 45. № 6. С. 386.

15. Плетнев И.В., Формановский А.А., Смирнова С.В. и др. // ЖАХ. 2003. 58. №7. С. 710.

16. Гембицкий П.А., Жук Д.С., Каргин В.А. Полиэтиленимин. М., 1971.

Поступила в редакцию 28.06.04

POLYETHYLENEIMINE AS COMPONENT OF FLOWING RETENTIVE PHASE IN PH GRADIENT CAPILLAR LIQUID CHROMATOGRAPHY

A.V. Ivanov, S.S. Kubyshev, P.N.Nesterenko, A.B.Tessman

The application of polyethyleneimine solutions (1:3 - 1:2) in water as flowing retentive phase to induce the decreasing pH gradients within capillars was suggested. The acetic and 6-amino hexanoic acids and Tris were used as components of eluents. The pH gradients, formed at flow rate 0,4-0,6 ml/min, are linear and smooth within 5 pH-units interval.