О происхождении и распространении устойчивости к антибиотикам: результаты изучения древних бактерий из многолетнемерзлых отложений

ОБЗОРЫ

© МИНДЛИН С.З., ПЕТРОВА М.А., 2017 УДК 615.33.015.8

Миндлин С.З., Петрова М.А.

о происхождении и распространении устойчивости к антибиотикам: результаты изучения древних бактерий из многолетнемерзлых

отложений

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук,

Москва 123182, Россия

В представленном обзоре обобщены данные, полученные при изучении антибиотикорезистентных бактерий, выделенных из многолетнемерзлых отложений Арктики и Антарктики. При сравнительном анализе молекулярной структуры «древних» природных и современных клинических генов устойчивости к Р-лактамам, стрептомицину, спектиномицину, ванкомици-ну, тетрациклину, сульфаниламидам выявлен высокий уровень их сходства, в ряде случаев достигающий 100%. Рассмотрена молекулярная структура плазмид древних бактерий, несущих детерминанты устойчивости к антибиотикам в сравнении со структурой плазмид современных бактерий. Выявлено широкое распространение среди современных бактерий мелких плазмид, близкородственных древней плазмиде ацинетобактеров, несущей автономный ген устойчивости к стрептомицину/спектино-мицину aadA27.

Описана структура «древнего» интегрона, который удовлетворяет описанию гипотетического предшественника интегронов подгруппы aadA2.

На примерах транспозонов двух подгрупп семейства Тп3 (Тп5393 и Тп21) рассмотрены различные механизмы формирования сложных транспозонов, содержащих одновременно несколько генов устойчивости к антибиотикам. В частности, демонстрируется важная роль интегронов в формировании сложных транс-позонов и приводятся многочисленные случаи независимого встраивания интегронов с разнообразными кассетными генами устойчивости к антибиотикам в различные базовые транспозо-ны семейства Тп3. Отдельно обсуждается история возникновения сложных транспозонов подгруппы Тп21 в свете того, что все простые мобильные элементы, послужившие основой для их формирования были обнаружены в мерзлоте. В совокупности приведенные данные являются убедительным доказательством происхождения как самих клинических генов устойчивости к антибиотикам, так и несущих их мобильных элементов от детерминант устойчивости бактерий, населяющих природные экосистемы.

Ключевые слова: обзор; мерзлота; устойчивость к антибиотикам; плазмиды; транспозоны; интегроны.

Для цитирования: Миндлин С.З., Петрова М.А. О происхождении и распространении устойчивости к антибиотикам: результаты изучения древних бактерий из многолетнемерзлых отложений. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 2017; 35(4): 123-132. DOI 10.18821/0208-0613-2017-35-4-123-132.

Введение

Распространение множественной лекарственной устойчивости у патогенных бактерий представляет серьезную и все возрастающую проблему для медицины и фармацевтической промышленности.

Сегодня процесс возникновения и распространения устойчивых клинических штаммов бактерий происходит

с огромной скоростью, буквально на глазах врачей и исследователей. Уже к концу 80-х годов XX века, в результате продолжающегося интенсивного применения антибактериальных средств, штаммы, характеризующиеся множественной лекарственной устойчивостью, практически полностью вытеснили штаммы, устойчивые только к одному виду антибиотика [1—3]. В последние годы отмечено появление так называемых панрезистентных супербактерий, устойчивых ко всем используемым ныне антибактериальным препаратам [4].

В 2012 г. генеральный директор ВОЗ Маргарет Чен на конференции «Борьба с устойчивостью к противомикроб-ным препаратам — время действовать» заявила о том, что современный мир вступает в новый, неизвестный ранее этап развития, в котором, по её словам, нас может ожидать «конец современной медицины в том виде, как мы ее знаем». Гендиректор ВОЗ предположила, что может наступить пост-антибиотическая эпоха, когда «даже стрептококковое воспаление горла или царапина на коленке ребенка, снова будут приводить к смерти» [5].

Одной из ведущих причин возникновения множественной лекарственной устойчивости является горизонтальный перенос генов (ГПГ). Центральную роль в этом процессе играют различные мобильные генетические элементы — плазмиды, транспозоны, ^-элементы, интегроны. За последние годы сформировано четкое понимание того, что ГПГ является одним из основных механизмов эволюции бактерий.

Гипотеза о том, что актиномицеты-продуценты антибиотиков, живущие в почвах, являются источником генов устойчивости к антибиотикам, была сформулирована еще в 1973 г. американскими учеными Я. Benveniste и J. Davies [6, 7]. Однако впоследствии выяснилось, что гены устойчивости продуцентов антибиотиков имеют очень низкий уровень сходства с таковыми патогенных бактерий. Тогда было сделано предположение о том, что любые природные бактерии, а не только сами продуценты, могут быть источником генов устойчивости к антибиотикам [8].

Самый простой способ проверить эту гипотезу — исследовать устойчивость к антибиотикам природных бактериальных штаммов, выделенных из почвы и воды. И действительно бактерии, устойчивые к наиболее часто назначаемым антибиотикам, были обнаружены среди почвенных бактериальных изолятов, а некоторые из них были устойчивы даже более чем к двум антибиотикам [9—11]. На основе этих исследований был сделан вывод о том, что бактерии, обитающие в окружающей среде, являются естественным резервуаром генов устойчивости к антибиотикам, которые затем могут быть переданы клинически значимым бактериям [11]. Однако сами авторы этих работ не исключали возможности того, что

Для корреспонденции: Миндлин Софья Захаровна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов Институт молекулярной генетики Российской академии наук, Москва 123182, Россия. E-mail: mindlin@img.ras.ru

детерминанты устойчивости к антибиотикам в современных штаммах бактерий, обитающих в окружающей среде, фактически были заимствованы из таких вторичных источников, как комменсальные бактерии или патогены человека [11, 12].

Вечная мерзлота земли из полярных регионов является статической и сбалансированной средой, где микробные сообщества выживают в течение тысяч и миллионов лет [13, 14]. Таким образом, изучение много-летнемерзлых отложений разного возраста предоставляет уникальную возможность для анализа биотопов доан-тибиотической эпохи, позволяя осуществлять сравнение молекулярной структуры антибиотикорезистентных детерминант древних и современных бактерий. Однако несмотря на значительное количество работ, посвященных изучению разнообразия бактерий, обитающих в много-летнемерзлых отложениях и всесторонней их характеристике [см, например, 14—17], лишь в очень немногих из них были проведены исследования резистентности к антибиотикам штаммов бактерий, выделенных из вечной мерзлоты, и только в единичных случаях были сделаны попытки выяснить механизмы этой резистентности.

В представленном обзоре обобщены результаты исследований последних лет, посвященных изучению анти-биотикорезистентных бактерий, выделенных из образцов вечной мерзлоты, а также сформулированы важные выводы, которые проистекают из этих исследований.

Основные направления исследований устойчивых к антибиотикам бактерий, выделенных из многолет-немерзлых отложений

Изучение молекулярно-генетической структуры детерминант устойчивости к различным антибиотикам у бактерий из многолетнемерзлых отложений проводилось двумя коллективами: Лабораторией генетики микроорганизмов (ЛМГМ) в Институте молекулярной генетики РАН (Москва) и в Институте исследований инфекционных заболеваний Майкла Г. ДеГрута (Университет МакМастер, Гамильтон, Онтарио, Канада). Исследования в Москве проводились с использованием преимущественно методов молекулярной генетики [18], а в Канаде — методов целенаправленного анализа древней метагеномной ДНК, выделенной из строго аутенти-фицированных образцов [19].

Основным направлением исследований, проведенных в Москве, было изучение молекулярной структуры детерминант устойчивости к антибиотикам и мобильных элементов, осуществляющих их горизонтальный перенос. Значительное внимание было также уделено сравнительному анализу древних и современных генов устойчивости и содержащих их мобильных элементов. Для выделения устойчивых к антибиотикам бактериальных штаммов в ЛМГМ использовали образцы вечной мерзлоты разных возрастов и генезиса. Пробы вечной мерзлоты в Арктике были собраны в полярных областях Колымской низменности, побережья моря Лаптевых и побережья Восточно-Сибирского моря. В этих регионах слои позднего плейстоцена — так называемый «Ледовый комплекс» (Едомная свита) — представлены сингенетически замороженными осадками с ледяными прожилками, что указывает на то, что они не размораживались с момента замерзания [13]. Образцы вечной мерзлоты Антарктики были извлечены из глубины полярной пустыни «Сухие долины», которая является крупнейшим из незамерзающих районов Антарктики [14].

Исследования, проведенные в Канаде, были преимущественно посвящены идентификации детерминант устойчивости и изучению молекулярных механизмов

устойчивости. В Институте Майкла Г. ДеГрута авторы изучали образцы многолетнемерзлых отложений Берин-гии возрастом 30 000 лет (Клондайк) [20]. Поскольку эти исследования затрагивают гораздо более узкий круг вопросов, это определило ограничение их места в обзоре.

Выделение и первичная характеристика антибиотикорезистентных штаммов из вечной мерзлоты

Большинство антибиотикорезистентных штаммов, использованных в молекулярно-генетических исследованиях детерминант устойчивости, были выделены в ЛМГМ ИМГ РАН. Видовое разнообразие устойчивых изолятов соответствовало разнообразию бактерий, выделенных ранее другими авторами из различных образцов вечной мерзлоты [14—17, 21]. Бактерии устойчивые к антибиотикам были обнаружены как среди арктических, так и антарктических штаммов. При этом около одной трети выделенных мерзлотных штаммов были устойчивы более чем к одному антибиотику. И это был совершенно неожиданный результат, так как клинические бактерии, выделенные в доантибиотическую эпоху, не обладали множественной резистентностью [22, 23]. Для дальнейшей работы были выбраны штаммы, способные хорошо расти на стандартных питательных средах и характеризующиеся высоким уровнем устойчивости к антибиотикам. Среди них были выявлены штаммы, относящиеся к различным группам грамотри-цательных (Acinetobacter, Pseudomonas, Xanthomonas, Flavobacterium, Psychrobacter, Stenotrophomonas, Sphingomonas, Brevundimonas) и грамположитель-ных бактерий (Bacillus, Arthrobacter, Micrococcus, Paenibacillus). Для каждого из этих штаммов был определен спектр устойчивости к различным антибиотикам (Ap, Km, Gm, Sm, Sp, Tc, Su), а также к ртути (Hg).

Создание уникальной коллекции древних штаммов бактерий, устойчивых к различным антибиотикам и ртути, позволило прояснить историю происхождения генов устойчивости современных клинических штаммов бактерий.

Сравнительные исследования генов устойчивости к антибиотикам древних и современных бактерий

Прежде всего, исследователей интересовало, имеются ли у древних бактерий гены устойчивости к антибиотикам и насколько они сходны с генами устойчивости современных клинических штаммов. Было показано, что ряд идентифицированных генов мерзлотных бактерий на 99—100% идентичны генам современных клинических штаммов бактерий (таблица 1). При проверке оказалось, что все они являются функционально активными и обеспечивают устойчивость к соответствующим антибиотикам: blaRTG к ампициллину/карбенициллину, strA-strB — к стрептомицину, tetR-tet(H) — к тетрациклину, aadA2 — к стрептомицину/спектиномицину, sull — к сульфаниламидам [18, 24—27]. Другие исследования по идентификации генов устойчивости к антибиотикам были выполнены с использованием анализа метагеномной ДНК, выделенной из образцов мерзлоты [20]. При анализе ДНК, выделенной из двух образцов мерзлоты, удалось идентифицировать гены, кодирующие устойчивость к бета-лактамам, тетрациклину и гликопептидному антибиотику ванкомицину [20]. Кроме того, авторы с помощью ПЦР синтезировали фрагменты оперона, кодирующего устойчивость к ванкомицину. Им удалось получить амплико-ны, содержащие ген vanA и фрагменты соседних генов vanH and vanX. Дальнейший анализ выявил высокий уровень их сходства с генами устойчивости к ванкомицину современных штаммов Streptomyces coelicolor. При кло-

Таблица 1

характеристика мерзлотных штаммов, подробно изученных в данной работе

Штамм

Место отбора, возраст образцов

Гены устойчивости к антибиотикам

Psychrobacter maritimus MR29-12

Pseudomonas putida Tiki

Brevundimonas vesicularis EK41

Pseudomonas sp. Tik3

Acinetobacter Iwoffii ED23-35

Берег ВосточноСибирского моря, 15-40

Берег моря Лаптевых, 15-40

Сухие долины Мак-Мердо, 50-300

Берег моря Лаптевых, 15-40

Река Хомус-Юрях, 20—40

blaRTG, strA-strB, tetR-tet

strA-strB strA-strB aadA2, sull aad27, tetR-tet

нировании гена vanA в клетках E. coli подтвердили его функциональную активность [20].

Анализ коллекции древних бактерий, устойчивых к различным антибиотикам и соединениям ртути, позволил, в отличие от метагеномных исследований, не только обнаружить гены устойчивости к антибиотикам, но и провести изучение мобильных элементов, участвующих в их горизонтальном переносе.

Сравнительный анализ древних и современных плаз-мид, содержащих гены устойчивости к антибиотикам

Три плазмиды с генами устойчивости к антибиотикам pALWEDl.l (287360 пн), pKLH80 (14835 пн) и pAL-WEDl.8 (4035 пн), обнаруженные в древних бактериях, были секвенированы полностью. Из них две последние, pKLH80 и pALWED1.8, использовали в сравнительных исследованиях древних и современных плазмид.

На плазмиде среднего размера pKLH80 (рис 1) из «древнего» штамма Psychrobacter maritimus MR29-12, были обнаружены сразу три гена устойчивости к различным антибиотикам blaRTG, strA-strB, tetR-tet(H) [26]. Как уже было сказано выше, все эти гены на 99—100% были идентичны соответствующим генам клинических бактерий различных видов. Было показано, что перенос генов устойчивости к стрептомицину и тетрациклину с плазмиды на плазмиду может эффективно осуществлять IS элемент, ISPpyi, непосредственно примыкающий к гену tet(H) (см. рис. 1) [26]. Кроме того, было обнаружено, что короткие нуклеотидные последовательности (4—113 пн), примыкающие к 3' и 5' концам всех пяти ранее описанных генов blaRTG, идентичны соответствующим районам гена плазмиды pKLH80 blaRTG-6 [26]. Полученные результаты подтвердили ранее выдвинутую гипотезу [28] о происхождении генов blaRTG от соответствующего гена психробактеров.

Данные о происхождении генов blaRTG можно рассматривать в качестве одного из убедительных доказательств происхождения генов устойчивости к антибиотикам клинических штаммов от генов бактерий, обитающих в при-

родных экосистемах. Следует подчеркнуть, что к настоящему времени удалось с достоверностью обнаружить всего лишь несколько случаев обмена генами между природными и клиническими бактериями [29].

Плазмиды, родственные pKLH80, были идентифицированы в современных штаммах психробактеров. Ввиду явственно мозаичного строения pKLH80, в качестве ориентира при поиске родственных плазмид избрали ее базовый район (backbone region), содержащий модули репликации и мобилизации (рис. 1). Были обнаружены всего две полностью отсеквенированных плазми-ды, содержащие модуль мобилизации (mobAC, oriT), близкородственный таковому pKLH80. У одной из них, pRWF101 (13956 пн) (CP000714), обнаруженной в штамме Psychrobacter sp., сходство с pKLH80 этим и ограничивалось. У другой (12019 нп), pAST2 (KC734561), найденной в некультивируемой бактерии AST2, высокий уровень идентичности с pKLH80 (95%) распространялся на соседние районы, включая часть гена repB. Кроме того, pAST2 содержала дополнительные гены (рис. 1), на 100% идентичные orf7 и tetR-tet(H) из pKLH80 [26].

При анализе несобранных полных геномов, помимо плазмид, выделенных из природных источников, обнаружили две плазмиды из клинических штаммов Psychrobacter spp., CIP 110854 и 1501 (2011), модули мобилизации которых были на 95% идентичны соответствующим генам базового района pKLH80 [26].

При очевидной ограниченности доступных данных, тем не менее, можно заключить, что плазмиды, родственные pKLH80, довольно широко представлены у современных штаммов психробактеров, включая штаммы, выделенные из клинических образцов.

Вторая отсеквенированная плазмида pALWED1.8 — это мелкая мобилизуемая плазмида (рис. 2). Ее базовый район содержит гены mobA и mobC, отвечающие за мобилизацию плазмиды, а ее дополнительный район — ген aadA27, кодирующий устойчивость к стрептомицину и спектиномицину [27].

Ген aadA27 имеет лишь отдаленное сходство с ранее описанными генами aadA. В отличие от большинства известных вариантов этого гена, aadA27 имеет собственный промотор и не обладает структурными особенностями, свойственным кассетным генам интегронов [30, 31]. В частности, на границах этого гена не были обнаружены последовательности, сходные с сайтом attC, а также ген, кодирующий интегразу.

При исследовании распространения aadA27 среди различных бактерий почти идентичный ген был обнаружен в геноме Acinetobacter sp. PT1 (MAIJ01000419), изолированного в Дюрбане из образца сточных вод (Южная Африка). Кроме того, близкородственные aadA27 нукле-отидные последовательности (идентичность 96%) были идентифицированы в геномах нескольких штаммов различных видов Acinetobacter [27].

Оказалось, что сама плазмида pALWED1.8 также

ISAba14

oriTi oriV ISPsmal ISAba14 ISPpyl

mobC bla rtg-6 tetR

pKLH80

Рис. 1. Кольцевая генетическая карта плазмиды рКЪН80. Местоположение и направление транскрипции генов и К-элементов показано стрелками с различной штриховкой. от(Т — начало конъюгационного переноса плазмиды; от(У—начало репликации плазмиды; герВ — ген, кодирующий белок, инициирующий репликацию плазмиды; strA, strB — гены устойчивости к стрептомицину; tetR, tet(Н) — гены устойчивости к тетрациклину; ЫагЩ-6 — ген устойчивости к бета-лактамам; ISPsma1, \SAba14, \SPpy1 — различные К-элементы; тоЬА, тоЬС — гены, кодирующие белки, осуществляющие мобилизацию плазмиды.

Рис. 2. Сравнительная генетическая структура плазмид pAPWED1.8, рЯАУ* и контига 00021, из генома штамма Асте^Ьа^ег radioresistence SK82. Обозначения генов как на рис. 1 и в тексте.

широко распространена среди различных ацинетобак-терных штаммов. Помимо того, что ее обнаружили в трех мерзлотных штаммах A. lwoffii, она была найдена в двух современных природных штаммах ацинетобак-теров. Кроме того, почти идентичные плазмиды были обнаружены в штамме A. parvus CM11, изолированном из кишечника мыши во Франции (LACJ01000008) и в штамме A. johnsonii Aj2199, выделенном из пе-ритонеальной жидкости человека в Буэнос-Айресе (LVIB01000087).

Дальнейшие исследования показали, что pALWED1.8 является членом обширного семейства родственных плазмид, распространенных среди клинических штаммов ацинетобактеров различных видов. Члены этого семейства характеризуются высоким уровнем гомологии их базовых районов, различаясь в то же время по структуре дополнительных районов. Например, плазмида pRAY* и ее варианты содержат вместо гена устойчивости к стрептомицину/спектиномицину aadA ген устойчивости к канамицину aadB [32].

Очень распространенными оказались плазмиды с геном алкил-сульфатазы, определяющим устойчивость к различным ПАВ, например SDS. Обнаружено 18 вариантов плазмид такого типа (см. рис. 2). Существенно, что почти идентичные плазмиды с геном алкил-сульфатазы были обнаружены в штаммах различных видов ацине-тобактеров, в частности, A. pittii, A. tandoii, A. baumannii and A. gerneri [27].

Транспозоны с генами устойчивости к антибиотикам, обнаруженные в «мерзлотных» бактериях

Транспозоны, содержащие гены устойчивости к различным антибиотикам, широко распространены среди современных как природных, так и клинических штаммов бактерий [33, 35]. Их численность и разнообразие, как и усложнение их молекулярной организации, неизменно увеличиваются с течением времени и в последние десятилетия, что явно связано с применением антибиотиков [36, 37]. На этом фоне имеющиеся данные о транспозонах древних бактерий выглядят более, чем скромно. Фактически в связи с крайней ограниченностью исследований в этом направлении о древних транспозонах известно крайне мало. Исключение составляют транспозоны устойчивости к ртути, целенаправленные исследования которых были выполнены в ходе развития работ, инициированных Р.Б. Хесиным [38]. Было установлено, что многие штаммы устойчивых к ртути бактерий, выделенных из многолетнемерз-лых отложений, содержат транспозоны устойчивости к ртути. Причем оказалось, что основные типы транс-

позонов устойчивости к ртути современных бактерий возникли и были широко распространены задолго до начала активной экономической деятельности человека, а также использования соединений ртути в медицинской практике [39].

Возвращаясь к рассмотрению транспозонов древних бактерий, содержащих гены устойчивости к антибиотикам, приходится ограничиться анализом данных о всего лишь двух транспозонах, исследованных в ИМГ РАН. Это простой транспозон Tn5393 с генами устойчивости к стрептомицину strA-strB и сложный транспозон Тп5045, состоящий из трех различных мобильных элементов. Их описание и анализ их молекулярной структуры представлены ниже.

Транспозон Tn5595

Впервые транспозон Tn5393 был обнаружен в штаммах Erwinia amylovora, выделенных в Мичигане в 1990 г. [40]. Этот транспозон содержит пару сцепленных генов, strA-strB, кодирующих фосфотрансферазы, модифицирующие стрептомицин с образованием нетоксичного производного. Позднее Tn5393 и его варианты были обнаружены среди многих бактерий, ассоциированных с растениями, таких как E. amylovora, Xanthomonas campestris и Pseudomonas syringae; они также широко распространились среди многих клинических изолятов грамотрицательных бактерий [34, 41]. В последние годы число и разнообразие транспозонов, родственных Tn5393, неизменно увеличивалось. И если первоначально обнаруженные варианты, в отличие от Tn5393, содержали IS элемент (IS1133 либо IS6100), то более поздние варианты имеют значительно более сложную организацию [36, 42]. В большинстве случаев в результате инсерций различных, чаще всего составных, транспозонов, клинические варианты Tn5393 приобретали дополнительные гены антибиотикоустой-чивости (рис. 3). Именно за счет инсерций составных транспозонов Tn5393d получил гены устойчивости к ß-лактамам (в составе Tn4176), Tn5393g — ген устойчивости к гентамицину, а Tn5393h и Tn5393i — к тетрациклину (в составе Tn10). Один из новых, сложных траспозонов, Tn5393e, утерял устойчивость к стрептомицину, но приобрел устойчивость к канамицину/ неомицину [36]. Следует отметить, что цитируемые данные были опубликованы в 2011 г. С того времени в клинике возникли новые производные транспозона Tn5393, но их подробное описание выходит за рамки настоящего обзора.

Транспозоны, близкородственные Tn5393, были найдены в двух мерзлотных штаммах: Brevundimonas vesic-ularis EK41 и Pseudomonas putida Tik1. Было показано, что транспозон из псевдомонады локализован на конъю-гативной плазмиде и что оба древних транспозона не содержат IS-элементов и близкородственны наиболее просто организованному варианту, Tn5393, первоначально обозначенному Tn5393c [41].

Фрагменты Tn5393 были обнаружены также в составе древней плазмиды pKLH80, в районе, содержащем гены устойчивости к стрептомицину. При этом, гены strA-strB, а также 40-нп фрагмент, прилежащий к 5' концу гена strA и правый инвертированный повтор занимают точно такие же позиции, как и в последовательности Tn5393. В то же время модуль транспозиции Tn5393 вместе с левым инвертированнным повтором полностью отсутствуют [26]. Таким образом, район плазмиды pKLH80, содержащий гены strA-strB, по существу является остатком Tn5393.

Полученные данные свидетельствуют о том, что транс-

позоны, родственные Tn5393, участвовали в распространении генов устойчивости к стрептомицину задолго до начала применения антибиотиков. Существенно, что древние транспозоны сходны с наиболее просто организованным вариантом Tn5393. На основании всех представленных данных можно также заключить, что самый простой вариант Tn5393 не только сформировался раньше, чем варианты с более сложной организацией, но еще 20—40 тысяч лет назад был и самым распространенным.

Сложный транспозон Tn5045

Поиск у «древних» бактерий функционально активных транспозонов, содержащих гены устойчивости к антибиотикам, завершился открытием в древнем штамме Pseudomonas sp. Tik3 транспозона, обозначенного Tn5045 [25].

Транспозон Tn5045 (21,894 нп) является сложным и состоит из трех различных мобильных элементов, встроенных последовательно один в другой (рис. 4): (1) базового транспозона Tn1013* (7791 нп); (2) интегрона

1-го класса (6983-нп), содержащего единственный кассетный ген устойчивости к стрептомицину/спектиноми-цину aadA2 и (3) варианта транспозона TnOtChr (7180-нп), определяющего устойчивость к хрому. При этом хромовый транспозон встроен в интегрон, который в свою очередь встроен в транспозон Tnl0l3* (см.рис. 4).

Базовый транспозон Tn1013* принадлежит к группе Tn21 семейства Tn3, однако в отличие от Tn21 не содержит генов устойчивости к ртути. Почти идентичный ему транспозон Tn1013 был обнаружен в штамме Pseudomonas aeruginosa на плазмиде pBS228 [43]. Хромовый транспозон TnOtChr* оказался практически идентичен транспозону из семейства Tn3, TnOtChr, обнаруженному в хромосоме устойчивого к хрому штамма Ochrobac-trum tritici [44].

Таким образом, все мобильные элементы, входящие в состав Tn5045, оказались высокогомологичными современным генетическим элементам.

Особенно важным для исследований истории возникновения и эволюции клинических транспозонов множе-

Рис. 3. Схематическое изображение генетической структуры транспозонов, родственных Tn5393 (не в масштабе). Обозначения генов как на рис. 1. Серым выделены функционально активные гены устойчивости к антибиотикам: strA и strB — к стрептомицину;

aphAlb — к канамицину/неомицину; bla - к ß-лактамам; aacC3 — к гентамицину; tetR и tetA(B) — к тетрациклину. tnpA, tnpR — гены транспозиции; двуконцевыми стрелками обозначены различные IS-элементы. Места инсерций IS-элементов указаны тонкими

линиями. Схема составлена на основе рисунков из работ [36] и [42].

Тп5045

Рис. 4. Генетическая структура транспозона Тп5045. Обозначения генов как на рис. 1 и 3. Треугольниками обозначены концевые инвертированные повторы (ГТ). ог/А, В, С, Б — структурные гены Тп1013*; ЛгВ, А,С, ^ - гены устойчивости к хрому ТпОгС%г*; Ш11 — ген интегразы; qacEA1, sul1, ог/5 — гены, локализованные на 3'-конце интегрона; aadA2 — кассетный ген устойчивости к

стрептомицину/ спектиномицину интегрона ГпС*.

ственной лекарственной устойчивости представляется обнаружение в «древнем» штамме интегрона, практически идентичного по структуре современным интегронам из семейства Гп2-Гп5, содержащих генные кассеты устойчивости к стрептомицину/ спектиномицину аасА (рис. 5) [45]. Однако, в отличие от многих интегронов этого семейства, «древний» интегрон содержит вместо аллеля аасА1, аллель аасА2. Ранее было показано, что интегрон Гп2, содержащий единственную кассету аасА1, является предшественником всей аасА1 подгруппы [46]. В то же время, предполагаемого предшественника интегронов подгруппы аасА2, обозначенного ГпС и содержащего единственную кассету аасА2, в современных бактериях обнаружить не удалось [46]. Интегрон, входящий в состав Тп5045, по своей структуре сходен с ГпС, и потому был обозначен как 1пС*. Его организация типична для интегронов семейства Гп2-Гп5: 5'-консервативный район (5'-CS) 1пС* содержит ген интеграции 1пШ, сайт интеграции кассетных генов аШ1 и промотор Рс необходимый для экспрессии кассетных генов; 3'-консервативный район (3'-CS) содержит ген устойчивости к сульфонамидам sul1 и две открытые рамки считывания — ог/5 и делеционный вариант гена устойчивости к четвертичным аммониевым соединениям цаеЕА1 [25]. Однако, в отличие от 1п2, ГпС*, вместо К элементов Ш1326 и К1353, содержит в том же участке транспозон устойчивости к хрому ТпОСНг* (см. рис. 5).

Согласно предположению, высказанному Джи-лингс с соавторами [47], возникновение и последующее распространение в клинике интегронов, содержащих гены устойчивости к антибиотикам, произошло спустя несколько десятков лет после начала «антибиотической» эры. Однако, благодаря обнаружению интегрона 1пС* в «древнем» штамме стало очевидным, что интегроны с генами устойчивости к антибиотикам возникли задолго до начала применения антибиотиков в медицине, хотя и встречались редко. Поэтому была высказана гипотеза о том, что сложные транспо-зоны, возникающие за счет инсерций интегронов 1-го класса в транспозоны семейства Тп3, могли возникать еще до начала «антибиотической эры» [25]. Активное использование антибиотиков в медицине и сельском хозяйстве, возможно, привело к увеличению частоты возникновения сложных интегрон-содержащих транс-позонов и уж несомненно к их эффективному отбору и быстрому распространению среди клинических штаммов [25, 33], а также к последующему услож-

нению их молекулярно-генетической организации за счет инсерций новых кассетных генов и других мобильных элементов (рис. 6) [33 и 48].

Структурный анализ ныне распространенных сложных транспозонов, содержащих интегроны 1-го класса, свидетельствует о том, что независимые случаи внедрения интегронов в различные транспозоны семейства Тп3 происходили многократно (не менее 10 раз) (табл. 2). При этом в большинстве случаев базовыми элементами для них послужили простые ртутные транспозо-ны. Соответственно на сегодняшний день содержащие тег-оперон транспозоны составляют самую обширную группу сложных транспозонов, а самыми многочисленными среди них являются транспозоны подгруппы Тп21 [33]. Ключевым событием в происхождении транспозо-нов, родственных Тп21, стало встраивание интегрона 1п2 в простой ртутный транспозон названный ТпХ [33] (см. рис. 6). Структуре этого предполагаемого транспозона-предшественника почти идеально соответствует ртутный транспозон Тп5060, обнаруженный в «древнем» штамме псевдомонады [56]. Следует отметить, что сложные транспозоны из подгруппы Тп21, содержащие различные наборы кассетных генов устойчивости и К элементов, широко распространены в настоящее время как среди клинических, так и среди современных природных штаммов бактерий [37, 57].

Рис. 5. Сравнительная генетическая организация интегронов 1п2 и ГпС*. Обозначения генов как на рис. 1 и 4. Короткими вертикальными линиями показаны места инсерций \S1326, Ш353 и ТпОСг*.

Таблица 2

Примеры независимо возникших сложных транспозонов, содержащих интегроны

Сложный транспозон Базовый транспозон Интегрон 1-го класса Кассетные гены Ссыл

Транспозоны, содержащие тег-оперон

Тп21 Тп5060-подобный 1п2 aadA1 33

Тп1696 Тп5036-подобный 1п4 аасС1-огЕ-аасА2-ст1А1 49

б/названия Тп5036-подобный In-t8 oxa30-aadA1 50

Тп6005 Тп5036-подобный 1п(Тп6006) Кассетный ген с неизвестными функциями 51

б/названия Тп5051-подобный б/названия Ыау1т1-аасА4 35

б/названия Тп5051-подобный 1п70.2 Ыау1т1-аасА4-ааСА2-т1А1 52

б/названия Гибрид Тп21 и Тп5036-подобного 1п34-подобный САА12-ог^-ааСА2 53

Другие транспозоны

Тп1412 Тп5563 1п32 blaNPS-1-aphA1a 54

Тп1403 Тп1013-подобный 1п28 Ь1аР1-ст1А1-ааСА1 43

Тп6001 Тп1013-подобный 1п450 Ь1ау1т-3-ог/2-аасА4-аасА4-ааСБ-аасА4 55

Тп5045 Тп1013-подобный 1пС* ааСА2 25

В отличие от этих транспозонов, Тп5045 произошел от транспозона Тп1013, не содержащего генов устойчивости к ртути. Помимо Тп5045, известны и другие независимо возникшие транспозоны без генов устойчивости к ртути (см. табл. 2). Для двух из них, Тп1403 и Тп6001,

как и для Тп5045, базовым элементом послужил Тп1013-подобный транспозон. Однако Тп1403 и Тп6001 содержат интегроны 1п28 и 1п450, соответственно, вместо 1пС*, обнаруженного у Тп5045, а Тп1403 — транспозон типа Тп53Р3с, вместо ТпОС^*.

Тп2607

Тп2424

Рис. 6. Происхождение и эволюция транспозонов из подгруппы Тп21. тег-оперон — оперон устойчивости к ртути; drfA7, оха1, аасА1, с&В2 — кассетные гены устойчивости, соответственно, к триметоприму, к р-лактамам, к аминогликозидам, к хлорамфениколу. Другие обозначения как на рис. 5. Схема составлена на основе данных работы [33].

Преобладание транспозонов, устойчивых к ртути, среди содержащих интегроны сложных транспозонов клинических бактерий, можно объяснить тем, что еще до начала использования антибиотиков препараты ртути применялись в качестве лекарств и дезинфектантов, что и привело к появлению и распространению простых ртутных транспозонов. Они и стали чаще других базовыми в процессе формирования и отбора сложных транспозонов множественной лекарственной устойчивости, происходивших в течение последующего периода активного применения антибиотиков.

Заключение

Изучение антибиотикоустойчивых бактерий, выделенных из многолетнемерзлых отложений, позволило получить неоспоримые свидетельства того, что источником генов устойчивости к антибиотикам клинических патогенных бактерий, как и мобильных элементов (плаз-мид, транспозонов и интегронов), осуществляющих их горизонтальный перенос, являются природные штаммы бактерий, обитающие в окружающей среде.

В частности, у древних бактерий были идентифицированы гены устойчивости к антибиотикам, почти неотличимые от генов устойчивости современных бактерий, распространенных в клинике. В большинстве случаев это были плазмидные гены, что с очевидностью свидетельствует об активном горизонтальном переносе генов устойчивости между различными группами бактерий.

Близкородственные отношения были обнаружены также между древними и современными мобильными генетическими элементами (плазмидами, транспозона-ми и интегронами). Важно отметить, что обнаружение в «древней» бактерии сложного транспозона, содержащего интегрон, однозначно свидетельствует о том, что формирование подобных транспозонов, содержащих детерминанты устойчивости к антибиотикам, могло происходить в популяциях природных бактерий задолго до начала применения антибиотиков в медицинской практике. Интенсивное применение антибиотиков лишь способствовало быстрому отбору сложных транс-позонов, в частности транспозонов, родственных Tn21, несущих одновременно детерминанты множественной лекарственной устойчивости и оперон-устойчивости к ртути (тег-оперон). В пользу такого представления свидетельствует обнаружение в мерзлоте как простого ртутного транспозона Tn5060, практически не отличающегося по нуклеотидной последовательности от гипотетического предшественника Tn21, так и интегрона InC*, с единственным кассетным геном устойчивости aadA2, близкородственного гипотетическому предшественнику группы современных клинических интегронов [46].

В целом исследования древних бактерий позволяют представить убедительную картину происхождения генов антибиотикоустойчивости клинических бактериальных изолятов и их распространения в различных странах и континентах путем горизонтального переноса.

Возникновение множественной устойчивости к антибиотикам клинических бактерий с этих позиций — это суммарный эффект переноса генов устойчивости и мобильных элементов из бактерий окружающей среды и их последующего объединения в сложные мобильные элементы под действием сильного селективного отбора, вызванного активным использованием антибиотиков, прежде всего в медицине и ветеринарии. Можно предположить, что запасы потенциальных генов устойчивости в естественных источниках еще далеко не исчерпаны.

Очевидно, что назрела насущная необходимость разработки способов увеличения эффективности ис-

пользования антибиотиков при лечении инфекционных заболеваний, а также мер по противодействию их необоснованного применения не только в медицине, но и в животноводстве и растениеводстве. Уместно вспомнить слова, произнесенные упомянутой выше Маргарет Чен, генеральным директором ВОЗ: «Многое можно сделать, чтобы ограничить развитие резистентности в процессе селективного давления на бактерии. А именно: назначать антибиотики должным образом и только при необходимости. Правильно выполнять лечение. Ограничить использование антибиотиков в производстве продуктов питания. И решать проблему некачественных и поддельных лекарств» [5]. Следует добавить: необходимо активно разрабатывать принципиально новые способы борьбы с инфекционными заболеваниями.

Благодарность. Авторы благодарят А.В. Кульбачин-ского и Т.С. Ильину за полезные замечания и советы при работе над рукописью.

Финансирование. Работа частично финансировалась Российским фондом фундаментальных исследований (гранты 05-04-49372, 08-04-00263, 11-04-01217 и 14-0401917) и Программой Президиума РАН по молекулярной и клеточной биологии (грант А.В. Кульбачинского).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

1. Price K.E., Kresel P.A., Farchione L.A., Siskin S.B., Karpow S.A. Epidemiological studies of aminoglycoside resistance in the U.S.A. J. Antimicrob. Chemother. 1981; 8(Suppl. A): 89—105.

2. Shimizu K., Kumada T., Hsieh W.-C., Chung H.Y., Chong Y., Hare R.S. et al. Comparison of aminoglycoside resistance patterns in Japan, Formosa, and Korea, Chile, and the United States. Antimicrob. Agents Chemother. 1985; 28: 282—8.

3. Shaw K.J., Hare R.S., Sabatelli F.J., Rizzo M., Cramer C.A., Naples L. et al. Correlation between aminoglycoside resistance profiles and DNA hybridization of clinical isolates. Antimicrob. Agents Chemother. 1991; 35(11): 2253—61.

4. Yu H., Qu F., Shan B., Huang B., Jia W., Chen C. et al. Detection of the mcr-1 Colistin Resistance Gene in Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae from Different Hospitals in China. Antimicrob. Agents Chemother. 2016; 60(8): 5033—5. doi: 10.1128/AAC.00440-16.

5. Chan M. Antimicrobial resistance in the European Union and the World: Keynote address at the conference on Combating antimicrobial resistance: time for action. Copenhagen, Denmark 14 March 2012. Available at: www.who.int

6. Benveniste R., Davies J. Aminoglycoside antibiotic-inactivating enzymes in actinomycetes similar to those present in clinical isolates of antibiotic-resistant bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1973; 70: 2276—80.

7. Davies J. Inactivation of antibiotics and the dissemination of resistance genes. Science. 1994; 264: 375—82.

8. Davies J., Smith D.I. Plasmid-determined resistance to antimicrobial agents. Annu. Rev. Microbiol. 1978; 32: 469—518.

9. Esiobu N., Armenta L., Ike J. Antibiotic resistance in soil and water environments. Int. J. Environ. Health Res. 2002; 12: 133—44.

10. Riesenfeld S.C., Goodman R.M., Handelsman J. Uncultured soil bacteria are a reservoir of new antibiotic resistance genes. Environ. Microbiol. 2004; 6: 981—9.

11. D'Costa V.M., McGrann K.M., Hughes D.W., Wright G.D. Sampling the antibiotic resistome. Science. 2006; 311: 374—7.

12. Linton A.H. J. Flow of resistance genes in the environment and from animals to man. Antimicrob. Chemother. 1986; 18(Suppl. C): 189—97.

13. Vorobyova E., Soina V., Gorlenko M., Minkovskaya N., Zalinova N., Mamukelashvili A. et al. The deep cold biosphere: facts and hypothesis. FEMSMicrobiol. Rev. 1997; 20: 277—90.

14. Gilichinsky D.A., Wilson G.S., Friedmann E.I., McKay C.P., Sletten C.P., Rivkina E. et al. Microbial populations in Antarctic permafrost: biodiversity, state, age, and implication for astrobiology. Astrobiology. 2007; 7: 275—311.

15. Vishnivetskaya T.A., Petrova M.A., Urbance J., Ponder M., Moyer C.L. Gilichinsky D.A., Tiedje J.M. Bacterial community in ancient Siberian permafrost as characterized by culture and culture-independent methods. Astrobiology. 2006; 6(3): 400—14.

16. Steven B., Briggs G., McKay C.P., Pollard W.H., Greer C.W., Whyte L.G. Characterization of the microbial diversity in a permafrost sample from the Canadian high Arctic using culture-dependent and culture-independent methods. FEMS Microbiol. Ecol. 2007; 59(2): 513—23.

17. Bakermans C., Skidmore M.L., Douglas S., McKay C.P. Molecular characterization of bacteria from permafrost of the Taylor Valley, Antarctica. FEMS Microbiol. Ecol. 2014; 89(2): 331—46. doi: 10.1111/1574-6941.12310.

18. Petrova M., Gorlenko Z., Mindlin S. Molecular structure and translocation of a multiple antibiotic resistance region of a Psychrobacter psychro-philus permafrost strain. FEMS Microbiol. Lett. 2009; 296(2): 190—7. doi: 10.1111/j.1574-6968.2009.01635.x.

19. Willerslev E., Hansen A.J., Poinar H.N. Isolation of nucleic acids and cultures from fossil ice and permafrost. Trends Ecol. Evol. 2004; 19: 141—7.

20. D'Costa V.M., King C.E., Kalan L., Morar M., Sung W.W., Schwartz C. et al. Antibiotic resistance is ancient. Nature. 2011; 477(7365): 457—61. doi: 10.1038/nature10388.

21. Wilhelm R.C., Niederberger T.D., Greer C., Whyte L.G. Microbial diversity of active layer and permafrost in an acidic wetland from the Canadian High Arctic. Can. J. Microbiol. 2011; 57(4): 303—15. doi: 10.1139/ w11-004.

22. Datta N., Hughes V.M. Plasmids of the same Inc groups in Enterobacteria before and after the medical use of antibiotics. Nature. 1983; 306(5943): 616—7.

23. Hughes V.M., Datta N. Conjugative plasmids in bacteria of the 'pre-anti-biotic' era. Nature. 1983; 302(5910): 725—6.

24. Петрова М.А., Горленко Ж.М., Соина В.С., Миндлин С.З. Изучение ассоциации генов strA-strB с плазмидами и транспозонами у современных и древних штаммов бактерий. Генетика. 2008; 44(9): 112—6. [Petrova M.A., Gorlenko Zh.M., Soina V.S., Mindlin S.Z. Association of the strA-strB genes with plasmids and transposons in the present-day bacteria and in bacterial strains from permafrost. Rus. J. Genet. 2008; 44(9): 112—6. (in Russian)].

25. Petrova M., Gorlenko Zh., Mindlin S. Tn5045, a novel integron-contain-ing antibiotic and chromate resistance transposon isolated from a permafrost bacterium. Res. Microbiol. 2011; 162(3): 337—45. doi: 10.1016/j. resmic.2011.01.003.

26. Petrova M., Kurakov A., Shcherbatova N., Mindlin S. Genetic structure and biological properties of the first ancient multiresistance plasmid pKLH80 isolated from a permafrost bacterium. Microbiology. 2014; 160(Pt 10): 2253—63. doi: 10.1099/mic.0.079335-0.

27. Kurakov A., Mindlin S., Beletsky A., Shcherbatova N., Rakitin A., Erma-kova A., Mardanov A., Petrova M. The ancient small mobilizable plasmid pALWED1.8 harboring a new variant of the non-cassette streptomycin/ spectinomycin resistance gene aadA27. Plasmid. 2016; 84-85: 36—43. doi: 10.1016/j.plasmid.2016.02.005.

28. Bonnin R.A., Poirel L., Nordmann P. A novel and hybrid composite transposon at the origin of acquisition of bla(RTG-5) in Acinetobacter baumannii. Int. J. Antimicrob. Agents. 2012; 40: 257—9. doi: 10.1016/j. ijantimicag.2012.04.002.

29. Perry J.A., Wright G.D. The antibiotic resistance «mobilome»: searching for the link between environment and clinic. Front. Microbiol. 2013; 4:138. doi: 10.3389/fmicb.2013.00138.

30. Stokes H.W., Hall R.M. A novel family of potentially mobile DNA elements encoding site-specific gene-integration functions: integrons. Mol. Microbiol. 1989; 3: 1669—83.

31. Hall R.M., Collis C.M. Antibiotic resistance in gram-negative bacteria: the role of gene cassettes and integrons. Drug Resist. Update. 1998, 1: 109—19.

32. Hamidian M., Nigro S.J., Hall R.M. Variants of the gentamicin and tobramycin resistance plasmid pRAY are widely distributed in Acinetobacter. J. Antimicrob. Chemother. 2012; 67(12): 2833—6. doi: 10.1093/ jac/dks318.

33. Liebert C.A., Hall R.M., Summers A.O. Transposon Tn21, flagship of the floating genome. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999; 63: 507—22.

34. Sundin G.W., Bender C.L. Dissemination of the strA-strB streptomycin-resistance Mol. Ecol. 1996; 5: 133—43.

35. Toleman M.A., Biedenbach D., Bennett D., Jones R.N., Walsh T.R. Genetic characterization of a novel metallo-beta-lactamase gene, blaIMP-13, harboured by a novel Tn5051-type transposon disseminating carbapenemase genes in Europe: report from the SENTRY worldwide antimicrobial surveillance programme. J. Antimicrob. Chemother. 2003; 52(4): 583—90.

36. Cain A.K., Hall R.M. Transposon Tn5393e carrying the aphAl-containing transposon Tn6023 upstream of strAB does not confer resistance to streptomycin. Microb. Drug Resist. 2011; 17(3): 389—94. doi: 10.1089/ mdr.2011.0037.

37. Chowdhury R.P., Ingold A., Vanegas N., Martinez E., Merlino J., Merkier A.K. et al. Dissemination of multiple drug resistance genes by class 1 integrons in Klebsiella pneumoniae isolates from four countries: a comparative study. Antimicrob. Agents Chemother. 2011; 55(7): 3140—9. doi: 10.1128/AAC.01529-10.

38. Khesin R.B., Karasyova E.V. Mercury-resistant plasmids in bacteria from a mercury and antimony deposit area. Mol. Gen. Genet. 1984; 197: 280—5.

39. Mindlin S., Minakhin L., Petrova M., Kholodii G., Minakhina S., Gor-lenko Zh., Nikiforov V. Present-day mercury resistance transposons are common in bacteria preserved in permafrost grounds since the Upper Pleistocene. Res. Microbiol. 2005; 156: 994—1004.

40. Chiou C.S., Jones A.L. Nucleotide sequence analysis of a transposon (Tn5393) carrying streptomycin resistance genes in Erwinia amylovora and other gram-negative bacteria. J. Bacteriol. 1993; 175: 732—40.

41. Sundin G.W. Distinct recent lineages of the strA- strB streptomycin-resistance genes in clinical and environmental bacteria. Curr. Microbiol. 2002; 45(1): 63—9.

42. Mantengoli E., Rossolini G.M. Tn5393d, a complex Tn5393 derivative carrying the PER-1 extended-spectrum beta-lactamase gene and other resistance determinants. Antimicrob. Agents Chemother. 2005; 49(8): 3289—96.

43. Stokes H.W., Elbourne L.D., Hall R.M. Tn1403, a multiple-antibiotic resistance transposon made up of three distinct transposons. Antimicrob. Agents Chemother. 2007; 51: 1827—9.

44. Branco R., Chung A.P., Johnston T., Gurel V., Morais P., Zhitkovich A.J. The chromate-inducible chrBACF operon from the transposable. element TnOtChr confers resistance to chromium (VI) and superoxide. J. Bacteriol. 2008; 190(21): 6996—7003. doi: 10.1128/JB.00289-08.

45. Brown H.J., Stokes H.W., Hall R.M. The integrons InO, In2, and In5 are defective transposon derivatives. J. Bacteriol. 1996; 178: 4429—37.

46. Bissonnette L., Roy P.H. Characterization of InO of Pseudomonas aeruginosa plasmid pVS1, an ancestor of integrons of multiresistance plasmids and transposons of gram-negative bacteria. J. Bacteriol. 1992; 174: 1248—57.

47. Gillings M., Boucher Y., Labbate M., Holmes A., Krishnan S., Holley M., Stokes H.W. The evolution of class 1 integrons and the rise of antibiotic resistance. J. Bacteriol. 2008; 190(14): 5095—100. doi: 10.1128/ JB.00152-08.

48. Zeighami H., Haghi F., Hajiahmadi F. Molecular characterization of integrons in clinical isolates of beta-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in Iran. J. Chemother. 2015; 27(3): 145— 51. doi: 10.1179/1973947814Y.0000000180.

49. Partridge S.R., Brown H.J., Stokes H.W., Hall R.M. Transposons Tn1<59<5 and Tn21 and their integrons In4 and In2 have independent origins. Antimicrob. Agents Chemother. 2001; 45: 1263—70.

50. Villa L., Caratolli A. Integrons and transposons on the Salmonella enterica serovar Typhimurium virulence plasmid. Antimicrob. Agents Chemother. 2005; 49: 1194—7.

51. Labbate M., Chowdhury P.R., Stokes H.W. A class 1 integron present in a human commensal has a hybrid transposition module compared to Tn402: evidence of interaction with mobile DNA from natural environments. J. Bacteriol. 2008; 190: 5318—27. doi: 10.1128/JB.00199-08.

52. Riccio M.L., Pallecchi L., Docquier J.D., Cresti S., Catania M.R., Pagani L. et al. Clonal relatedness and conserved integron structures in epidemiologically unrelated Pseudomonas aeruginosa strains producing the VIM-1 metallo-{beta}-lactamase from different Italian hospitals. Antimicrob. Agents Chemother. 2005; 49: 104—10.

53. Márquez C., Labbate M., Raymondo C., Fernández J., Gestal A.M., Holley M.J. Urinary tract infections in a South American population: dynamic spread of class 1 integrons and multidrug resistance by homologous and site-specific recombination. J. Clin. Microbiol. 2008; 46(10): 3417—25. doi: 10.1128/JCM.00835-08.

54. Minakhina S., Kholodii G., Mindlin S., Yurieva O., Nikiforov V. Tn5053 family transposons are res site hunters sensing plasmidal res sites occupied by cognate resolvases. Mol. Microbiol. 1999; 33(5): 1059—68.

55. Tseng S.P., Hsueh P.R., Tsai J.C., Teng L.J. Tn6001, a transposon-like element containing the blaVIM-3-harboring integron In450. Antimicrob. Agents Chemother. 2007; 51(11): 4187—90.

56. Kholodii G., Mindlin S., Petrova M., Minakhina S. Tn5060 from the Siberian permafrost is most closely related to the ancestor of Tn21 prior to integron acquisition. FEMS Microbiol. Lett. 2003; 226(2): 251—5.

57. Djordjevic S.P., Stokes H.W., Chowdhury R.P. Mobile elements, zoonotic pathogens and commensal bacteria: conduits for the delivery of resistance genes into humans, production animals and soil microbiota. Front. Microbiol. 2013; 4: 86. doi: 10.3389/fmicb.2013.00086.

Поступила 10.05.17 Принята к печати 10.07.17

Mindlin S.Z., Petrova MA.

ON THE ORIGIN AND DISTRIBUTION OF ANTIBIOTIC RESISTANCE: THE PERMAFROST BACTERIA STUDIES

Institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow 123182, Russia

The presented mini-review summarizes the results of studies of antibiotic-resistant bacteria isolated from Arctic and Antarctic permafrost deposits. Comparative analysis of the molecular structure of the «ancient» environmental and modern clinical genes of resistance to beta-lactams, streptomycin, spectinomycin, vancomycin, tetracycline, sulfanilamides revealed a high level of their similarity, in

some cases reaching 100%. The molecular structure of the antibiotic resistance plasmids of ancient bacteria was investigated and its comparative analysis with the plasmids of modern bacterial strains was carried out. A wide distribution among the modern bacteria of small plasmids, closely related to the ancient Acinetobacter plasmid, carrying an autonomous streptomycin/ spectinomycin resistance gene aadA27, has been revealed. The structure of the «ancient» integron satisfying the description of the hypothetical precursor of the subgroup aadA2 integrons is described. On the examples of the Tn3 family transposons (Tn5393 and Tn2i subgroups) various mechanisms of the formation of antibiotic resistance complex transposons are considered. In particular, the important role of integrons in the formation of complex transposons is demonstrated by a presentation of the numerous cases of independent insertion of integrons containing various cassette resistance genes into various Tn3 family base transposons. Separately, the origin of complex Tn2i related transposons is considered in connection with the detection in the permafrost of simple mobile elements, their possible precursors. Together, these data are considered as convincing evidence of the origin of both the antibiotic resistance genes of clinical bacteria and the mobile elements carrying them from the resistance determinants of bacteria inhabiting natural ecosystems.

Keywords: review; permafrost, antibiotic resistance; plasmids, transposons, integrons

For citation: Mindlin S.Z., Petrova M.A. On the origin and distribution of antibiotic resistance: the permafrost bacteria studies. Moleku-lyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology) 2017; 35(4): 123-132 (Russian). DOI 10.18821/0208-0613-2017-35-4-123-132.

For correspondence: Sofia Z.Mindlin, Dr. Sci. Biol., lead researcher of the department of molecular genetics; Institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow 123182, Russia. E-mail: mindlin@img.ras.ru

Acknowledgments. The authors are grateful to A.V. Kulbachinskiy and T.S. Ilyina for helpful comments and suggestions and for critical reading of the manuscript.

This work was partially supported by the Russian Foundation for Basic Research (grants 05-04-49372, 08-04-00263, 11-04-01217 and 14-0401917) and by the Russian Academy of Sciences Presidium Program «Molecular and Cellular Biology» (grant to A.V. Kulbachinskiy). Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Received 10.05.17 Accepted 10.07.17

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 616.831-006.484:577.21.00

Кит О.И., Водолажский Д.И., Росторгуев Э.Е., Франциянц Е.М., Панина С.Б.

молекулярно-генетические маркеры глиом

ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России,

344037 Ростов-на-Дону, 14-я Линия, 63

Резюме. Глиомы — инвазивные опухоли мозга, характеризующиеся высокими уровнями рецидивирования и смертности. Морфологически глиомы подразделяют на астроцитомы, оли-годендроглиомы и смешанные олиго-астроцитомы. Согласно классификации ВОЗ, по степени злокачественности (I—IV) глиомы дифференцируют на следующие группы: I (пилоцитарные астроцитомы), II (глиомы низкой степени злокачественности), III (глиомы высокой степени), IV (глиобластомы). Мутации в генах IDH1/2, TP53, метилирование гена MGMT наиболее часто обсуждаются как прогностические маркеры глиом. Цель настоящего обзора — анализ исследований и экспериментальных результатов (базы данных Scopus, Web of Science, Pubmed), касающихся характерных для различных морфологических групп и стадий глиом соматических мутаций, аберрантной регуляции экспрессии генов сигнальных путей, а также диагностических и прогностических маркеров прогрессирования глиом. Отдельно рассмотрены молекулярно-генетические особенности медулло-бластом и эпендимом.

Ключевые слова: гяиомы, молекулярные маркеры, онко-генные мутации, эпигенетические изменения, обзор.

Для цитирования: Кит О.И., Водолажский Д.И., Росторгуев Э.Е., Франциянц Е.М., Панина С.Б. Молекулярно-генетические маркеры глиом. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 2017; 35(4): 132-140. DOI 10.18821/0208-0613-2017-354-132-140.

Глиомы — наиболее распространенные инвазивные первичные опухоли мозга у взрослых, характеризующиеся высокими уровнями смертности и рецидивирования после хирургического удаления, с частотой встречаемости около 5 пациентов в год на 100,000 человек в мире. Глиомы поражают головной и спинной мозг и возникают в результате онко-трансформации глиальных клеток [1]. Приблизительно 70% всех глиом относятся к злокачественным; 5-летний рубеж выживаемости

Для корреспонденции: Панина Светлана Борисовна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной онкологии РНИОИ, e-mail: tailana703@gmail.com

преодолевают лишь 20% пациентов с данным заболеванием [2]. Морфологически все глиомы подразделяют на астроцитомы, олигодендроглиомы и смешанные олиго-астроцитомы. Наиболее распространенным и опасным типом глиом является мультиформная глиобластома ^ВМ, IV степень злокачественности по классификации ВОЗ), медиана выживаемости пациентов с GBM составляет приблизительно 14 мес с момента постановки диагноза, что на 4 мес больше относительно выживаемости 5 лет назад [3—5].

В настоящее время стандарты лечения глиом включают хирургическую резекцию с последующей адъювант-ной лучевой и химиотерапией, при этом объем резекции является независимым фактором риска при выживании пациента [6]. В течение десятилетий ключевым подходом в лечении глиом являлась лучевая терапия; при этом применение такого цитостатистического алкилирующе-го агента как темозоломид (Тemozolomidum) одновременно или после лучевой терапии значительно увеличило среднюю выживаемость пациентов. Уже на пути обширного внедрения в клиническую практику таргетная терапия агрессивных глиобластом, например, бевацизу-маб, рекомбинантные гиперхимерные моноклональные антитела к фактору роста эндотелия сосудов VEGF [5].

Кроме величины резекции глиомы, к прогностическим факторам относятся возраст на момент постановки диагноза, общее состояние больного по шкале Карновского, а также определенные генетические факторы риска [7]. Низкая эффективность при лечении глиом объясняется, прежде всего, высокой гетерогенностью клеток опухоли и инвазивностью, а также часто встречающейся на практике поздней постановкой диагноза, когда появляются явно выраженные симптомы заболевания. В подавляющем большинстве случаев данные опухоли неизлечимы: глиомы низкой степени злокачественности прогрессируют в глиомы высокой степени злокачественности; даже глиомы низкой степени злокачественности часто диагно-