Субпопуляции и фагоцитарная активность моноцитов при хронических гастродуоденитах у детей

СУБПОПУЛЯЦИИ И ФАГОЦИТАРНАЯ АКТИВНОСТЬ МОНОЦИТОВ ПРИ ХРОНИЧЕСКИХ ГАСТРОДУОДЕНИТАХ У ДЕТЕЙ

Агафонова Е. В., Маланичева Т. Г., Денисова С. Н.

Казанский государственный медицинский университет

РЕЗЮМЕ

У детей с хроническими гастродуоденитами, ассоциированными с Helicobacter pylori, а также при асссоциации Helicobacter pylori с грибами рода кандида и маркерами вторичной иммунологической недостаточности проводили исследование фагоцитарной активности и иммунофенотипа моноцитов периферической крови методом проточной цитофлюориметрии. Выявлены дифференцированные изменения структуры циркулирующего профиля моноцитов, что свидетельствуют о патогенетической значимости данных нарушений при хронических гастродуоденитах хеликобактерной этиологии, а также при ассоциаци Helicobacter pylori с грибами рода кандида Нарушения фагоцитарной активности моноцитов при хроническх гастродуоденитах у детей связанны с депрессией различных этапов фагоцитоза- функций захвата, мобилизации, киллинга, внутриклеточной биоцидности. Более глубокая депрессия фагоцитарной активности моноцитов имеет место при ХГД ассоциированных с НP и грибами рода кандида.

SUMMARY

There was conducted a study of the phagocytic activity, immunophenotype and peripheral blood monocytes by flow cytometry in children with chronic gastroduodenitis associated with Helicobacter pylori, as well as the association of Helicobacter pylori with fungi of the genus Candida and markers of secondary immune deficiency. The differential changes in the structure of circulating profile of monocytes were revealed, that indicate the pathogenetic significance of these disorders in chronic gastroduodenitis with H. pylori etiology, as well as at association of Helicobacter pylori with fungi of the genus Candida. Violations of the phagocytic activity of monocytes in chronic gastroduodenitis in children are associated with depression of different stages of phagocytosis - capture functions, mobilization, killing, intracellular biocidity. A severe depression in phagocytic activity of monocytes occurs in CGD associated with Hp and fungi of the genus Candida. Keywords: chronic gastroduodenitis in children, Helicobacter pylori, fungi of the genus Candida.

CO CD

Несмотря на успехи достигнутые в лечении и профилактике хронических соматических заболеваний у детей, вызванных бактериальной, вирусной и грибковой флорой возрастает число тяжелых форм, а также форм с торпидным течением воспалительного процесса, частными рецидивами и малой эффективностью от адекватной этио-тропной терапии. Хронические гастродуодениты (ХГД) ассоциированные с Helicobacter pylori (HP) занимают одно из ведущих мест в структуре заболеваний желудочно-кишечного тракта у детей. Персистенция НР, повторные курсы эрадикацион-ной терапии, снижение иммунной защиты, социальные факторы способствуют нарастанию роли грибковой флоры в этиологии ХГД. Воздействие патогенов и их ассоциаций определяет формирование нарушений иммунологической реактивности и развитие вторичной иммунологической

недостаточности. Несмотря на успехи достигнутые в методологии оценки иммунитета имеет место недостаточное внимание к системе моноцитов-макрофагов. Клетки системы мононукле-арных фагоцитов в литературе рассматриваются как универсальные источники иммунного ответа, осуществляющие антигенпредставляющую функцию, опсонизацию и фагоцитоз патогенов, выработку неспефических факторов защиты, биологически активных веществ, регулирующие агре-гационные свойства клеток и микроциркуляцию. В литературе имеются значительное количество исследований [1-6] посвящённых изучению субпо-пуляционной и функциональной гетерогенности мононуклеарных фагоцитов, различающихся по экспрессии мембранных рецепторов и функциональным свойствам [4-6]. Вместе с тем данные о функционировании моноцитов (Мо) при ХГД

Таблица №1

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕНОТИПА МОНОЦИТОВ ПРИ ХРОНИЧЕСКИХ ГАСТРОДУОДЕНИТАХ У ДЕТЕЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С WLICOBACTER PYLORI И ГРИБАМИ РОДА КАНДИДА

Показатель Здоровые доноры (N=29) М±m Хронический гастродуоденит, ассоциированный с Helicobacter pylori группа 1 (N=62) M±m Хронический гастродуоденит, ассоциированный с Helicobacter pylori и Candida albicans, группа 2 (N=48) M±m

CD 14+16-% Абс.кол. 94,13±7,21 0,45± 0,04 92,26±6,13 0,31±0,02 74,25± 4,79*/** 0,24±0,01*/**

CD 14+16+ Абс.кол. 4,89±0,50 0,02±0,01 8,06±0,73* 0,03± 0,01 23,07±2,33*/** 0,08±0,03*/**

CD11b% Абс.кол. 65,64 ±3,52 0,31 ± 0,01 82,32±3,71* 0,27±0,01* 37,55±2,71*/** 0,12±0,01*

CD14+HLADR% абс.кол. 88,14±5,04 0,42± 0,04 77,16±5,04* 0,28±0,03* 64,47± 5,04* 0,20± 0,02*

Б >

ст

So

I- E

О iD

h О n

a

ID

e

Б ID

s/

Ü <U J

s

X

s

<

различия достоверны по сравнению с контрольной группой

ограничены сведениями о нарушении какой либо одной эффекторной функции [1].

Цель работы. Оценить значение дефектов функционирования Мо при ХГД НР этиологии, а также при ассоциации HP с грибами рода кандида.

Обследовались дети с ХГД, ассоциированными с HP (гр. 1, N=62), а также дети с ХГД ассоциированные с НР и грибами рода кандида (N=48, гр.2). Преимущественно течение заболевания характеризовалось непрерывным рецидивировани-ем и резистентностью к традиционной терапии. Наряду с основным заболеваниям дети имели другие клинические маркеры ИН, представленные заболеваниями ЛОР органов, кожи, частыми ОРВИ, рецидивирующими бактериальными инфекциями дыхательных путей. Формирование кандидоза подтверждалось культуральными исследованиями -микологическим исследованием биоптатов слизистой желудка и duodenum и наличием повышенного уровня маннано-протеинового антигена Candida albicans (метод иммуносенсоров) в сыворотке крови. Дефекты фукционирования Мо оценивали на основании разработанного нами комплексного подхода, опубликованного в предыдущих исследованиях [7]. На основе экспрессии мембранных рецепторов выделяли субпопуляции Мо- CD 14++16-, CD14+16+, CD14+CD11b+, CD14+HLADR+. Углубленное изучение фагоцитарной активности Мо включало: фагоцитарный индекс (ФИ) — количество «активно» работающих фагоцитов, ФЧ -количество объектов фагоцитоза, которое в среднем приходится на 1 из 100 подсчитанных фагоцитов. ФИ и ФЧ исследовали на этапах 10 и 60 мин инкубации (ФИ 10, ФЧ 10, ФИ 60, ФЧ 60) для оценки ранних и поздних этапов

фагоцитоза. Рассчитывали% переваривания на этапе 10 минутной инкубации (% П 10), % перевариваривания на этапе 60 минутной инкубации (% П 60). Рассчитывали интегральные показатели -коэффициент фагоцитарного индекса (КФИ- ФЧ 10/ ФЧ 60), характеризующий скорость фагоцитоза и коэффициент эффективности фагоцитоза (КЭФ-%П 60/% П10 х 10), отражающий завершённость фагоцитоза.

В таблице № 1 представлены данные по изучению субпопуляционного состава Мо периферической крови при ХГД у детей в зависимости от этиологии заболевания. В группе 1, по сравнению с контрольной, имело место повышение относительного содержания СD14+CD11b+ клеток, по сравнению с контрольной группой (р<0,05). Повышение Мо экспрессирующих рецепторы адгезии при различных патологиях определяется нарастанием «метаболического взрыва», повышением синтеза и секреции биологически активных продуктов [1,5]. Вместе с тем Мо, коэкспрессиру-ющие СD14+и CD11b+ антигены относят к субпопуляции, преимущественно продуцирующей ИЛ-1 и №N-7 [3]. Повышение экспресии молекул адгезии коррелирует с повышением спонтанной биоцидности клетки и отражают нарастание «респираторного взрыва» [4]. В группе 2 отмечено снижение относительного (р<0,05) и абсолютного (р<0,05) содержания С014+С011Ь+ Мо. Снижение субпопуляции Мо, экспрессирующих интегрино-вые рецепторы связано со снижением их функциональной активности, что характеризует группу детей с ХГД ассоциированных с НР и ГРС. Снижение содержание С014+С011Ь+ Мо,. экспрессирующих

о

CD

*

Таблица № 2

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ МОНОЦИТОВ ПРИ ХРОНИЧЕСКИХ ГАСТРОДУОДЕНИТАХ У ДЕТЕЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С WLICOBACTER PYLORI И ГРИБАМИ РОДА КАНДИДА

Показатель Здоровые доноры (N 29) M±m Хронический гастродуоденит, ассоциированный с Helicobacter pylori группа 1 (N=62) М±m Хронический гастродуоденит, ассоциированный с Helicobacter pylori и Candida albicans группа 2 (N=48) M±m

НСТ сп.мон. 15,25±1,22 31,88+3,95* 30,25±3,95*

НСТ инд.мон 55,53±3,13 48,24±4,16 38,21±3,11*

ФР 40,28±3,11 15,40±1,39* 7,96±0,59*/**

КМ 3,64±0,19 1,53±0,19* 1,26±0,14*

ФИ 10 25,41±3,45 35,92±2,94 * 20,98±2,79 **

ФЧ10 3,73±0,35 3,45±0,44 3,01±0,21

ФИ 60 62,72±5,35 44,83±4,01 * 30,16±2,98*/**

ФЧ60 . 6,82±0,65 5,06±0,58 3,27±0,49*/**

%П10 25,75±2,43 25,61±2,45 16,32±1,99*

%П 60 74,74±4,43 55,77±4,01* 20,37±3,86*/**

КФИ 1,83±0,18 1,48±0,32* 1,08±0,09*/**

КЭФ 2,90±0,24 2,18±0,19* 1,24±0,11*/**

* различия достоверны по сравнению с контрольной группой ^<0,05;p<0,001) ** различия достоверны по сравнению с группой 1 ^<0,05; p<0,001)

интегриновые рецепторы также ассоциируется с угнетением ^ 1 профиля иммунного ответа. что приводит к снижению антигрибковой защиты и способствует персистенции грибов [2]. Повышение содержания CD14+CD16+ Мо имело место в группах 1 и 2, как по относительному (р<0,05), так и по абсолютному количеству (р<0,001). Согласно официальной номенклатуре [4,5] использование метода проточной цитофлюориметрии позволяет дифференцировать Мо периферической крови на 2 субпопуляции- «классические» (CD14++CD16-) и «неклассические», провоспалительные (CD14+CD16+). Мо 0014+0016+ представляют собой минорную субпопуляцию- активированные и/или более дифференцированные клетки с высоким уровнем провоспалительной активности [1,2,3]. Однако при ряде иммунопатологических состояний Мо С014+С016+ проявляют регуляторную/супрес-сорную активность, обусловленную продукцией ]Х-10 [2,3]. Более выраженное повышение субпопуляции 14+16+ (> чем в 5 раз) имело место в группе 2. Возможно, дихтомия регуляторной активности Мо обусловлена особенностями их активации, в этом случае Мо характеризуются снижением экспресии HLADR [3]. В нашем исследовании высокие прямые

корреляции CD14+HLADR+%-CD14+16+% (г=0,78, p<0,05); С014+НЬЛОЯ+х109/л-С014+16+х109/л (r=0,88, p<0,001), а также снижение субпопуляции CD14+HLADR+ в группе 2 позволяют предполагать появление клеток с супрессорными функциями в структуре циркулирующего пула Мо в группе в группе детей с ХГД ассоциированными с HP и ГРС. Также, частота встречаемости пациентов с повышенным содержанием 14+16+ Мо и средний уровень этих клеток выше у больных с угнетением стимулированной пролиферации и продукции INFg, что указывает и на возможную роль данной популяции клеток в нарушении Th1 антигенспецефического ответа [1]. Изучение субпопуляции CD14++CD16- в нашем исследовании выявило снижение их относительного (p<0,05) и абсолютного (p<0,05) количества в группе 2. Клетки CD14+CD16- составляют большинство циркулирующих Мо в организме человека. Показано что обе субпопуляции Мо сопоставимо осуществляют фагоцитоз и киллинг Candida аlbicans [2]. Индукция выработки ИЛ-ф и простагландина Е 2 (PGE2) — индукторов ^17-хелперов выше в субпопуляции CD14++CD16- по сравнению с CD14+CD16+ [2]. Также в субпопуляци CD14++CD16- выше% клеток,

экспрессирующих маннановые MRR рецепторы для Candida albicans [2]. Обе субпопуляции Мо обладают противогрибковыми иммунитетом, но только «классические» Мо способны индуцировют Th17 ответ на Candida albicans, что является важным компонентом противогрибковой защиты организма [1,2]. Таким образом, снижение субпопуляции СБ14+С016-является важным патогенетическим фактором персистенции грибов при ХГД у детей. В группе 2, по сравнению с контрольной, выявлено достоверное снижение субпопуляции Мо, экспрес-сирующей антигены гистосовместимости II класса, как по относительным (p<0,05), так и по абсолютным значениям (p<0,05). Уменьшение субпопуляции HLADR+Мо свидетельствует о нарушении экспрессии ко-стимуляторных молекул и может быть причиной дефекта антигенпрезентирующей функции [3,4], отражая формирование вторичной иммунологической недостаточности. Таким образом, при рецидивирующем течении ХГД у детей, ассоциированных с НР и Candida albicans, выявлены дифференцированные особенности субпопу-ляционного профиля Мо периферической крови.

Данные по изучению показателей фагоцитарной активности моноцитов у детей с ХГД представлены в таблице № 2. В группах 1 и 2 выявлено повышение спонтанной биоцидности Мо (НСТ сп. 31,88% в группе 1, p<0,05; 30,25% в группе 2; p<0,05). При ХГД ассоциированных с НР отмечена активация ранних этапов фагоцитарной активности (ФИ10 35,92, p<0,05 по сравнению с группой контроля) на фоне депрессии поздних этапов поглощения патогена (снижение ФИ 60, p<0,05;% П 60, p<0,05, по сравнению с группой контроля). В группе 1, на фоне высокой активности оксидантных микробицидных систем, имело место угнетение мобилизационного потенциала и резерва клеток, что проявлялось снижением КМ (p<0,05, по сравнению с группой контроля) и ФР (p<0,05, по сравнению с группой контроля). Поздние этапы фагоцитарной активности клетки были депрессированы в группах 1 и 2, при этом в группе 2 отмечено снижение ФИ 60 и% П 60, как по сравнению с группой контроля (p<0,05, p<0,05 соответственно), так и по сравнению с группой 1 (p<0,05, p<0,05 соответственно). По сравнению с группой 1, в группе 2 отмечено снижение

НСТ инд (р<0,05), снижение КМ (р<0,05) и ФР (р<0,05), что отражает более глубокое снижение функциональных резервов клетки при более выраженном угнетении киллинга и мобилизации при ХГД ассоциированных с НР и ГРС. В группе 2, по сравнению с группой 1, отмечено снижение ФИ 10 (р<0,05), что отражает угнетение фагоцитоза на ранних этапах поглощения патогенов. Таким образом, снижение скорости и эффективности фагоцитоза в группе 1 преимущественно было связано с угнетением поздних этапов захвата и переваривания патогенов. Более выраженное снижение скорости и эффективности фагоцитоза в группе 2 определялось депрессией поглощения, переваривания и киллинга на ранних и поздних этапах фагоцитоза.

ВЫВОДЫ

1. Разнонаправленные изменения в структуре циркулирующего профиля Мо свидетельствуют о патогенетической значимости данных нарушений при ХГД хелико-бактерной этиологии, а также при ассоциаци НР с грибами рода кандида

2. При ХГД ассоциированных с НР преимущественно выявлено повышение субпопуляции «провоспалительных» Мо и Мо экспрессирующих рецепторы адгезии. При ХГД ассоциированных с ИР и ГРС отмечено повышение субпопуляции Мо с супрессорной/регуляторной активностью на фоне снижения антигенпредставляющих Мо и клеток, ассоциированных с профилем иммунного ответа, что, возможно, способствует «уклонению» грибов от действия иммунной системы и вызывает прогрессирование заболевания.

3. Нарушения фагоцитарной активности Мо при ХГД у детей связанны с депрессией различных этапов фагоцитоза- функций захвата, мобилизации, киллинга и внутриклеточной биоцидности. Более глубокая депрессия фагоцитарной активности Мо связанная с угнетением ранних и поздних этапов фагоцитоза имеет место при ХГД ассоциированных с ИР и грибами рода кандида.

Б >

ст

So

I- Е

О ru

h О г

S/ о.

а

ID

е

Б ID

s/

û

<u j

s

X

s

<

ЛИТЕРАТУРА

1. Nockher W.A., Scherberich J. E. Expanded CD14+16+ monocyte subpopulation in patients with acute and chronic infectionis //Infect. Immun. — 1998. — Vol.66. — P.2782-2790.

2. Smeekens S.P., van de Veerdonk F.L., Joosten L.A., JacobsL., Jansen T., Williams D.L., van der Meer J.W., Kullberg B.J., Netea M.G. The classical CD14 (++) CD16 (-) monocytes, but not the patrolling CD14 (+) CD16 (+) monocytes, promote Th17 responses to Candida albicans.//Eur J Immunol. — 2011. — Oct;41 (10): Р. 2915-24.

3. Skrzeczynnnska J., Kobylarz K., Hartwich Z., Zembala M., Pryjma J. CD14+16+ monocytes in the course of sepsiss in neonates and small children: monitoring and functional studies// Scand.J.Immunol/-2002. — Vol.55. — P.629-638.

4. WongK.L., Tai J.J., Wong W.C., Han H., SemX., Yeap W.H., Kourilsky P., Wong S.C. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets // Blood. — 2011. — Aug 4;118 (5): P. 16-31.

5. Wang S.Y., Mak K. L., Chen L. Y., Chou M. P., Ho C. K. Heterogeneity of human blood monocytes: two subpopulations with differents sizes, phenotypes and function// Immunol. —2009. — Vol.77. — P.298-303.

6. Ziegler-Heitbrock H.W.L. Heterogeneity of human blood monocytes: CD14+16+ subpopulation//Immunol/Today. —2006. — Vol.17. — P.424-428.

7. Тамбова Н. А., Софронов В. В., Агафонова Е. В., Велижин-ская Т. А. Роль системы мононуклеарных фагоцитов при различных вариантах бронхитов у детей раннего возраста //Российский педиатрический журнал. — 2007. — N. 5. — C. 16-18.