РЕКОМБИНАНТНЫЕ ШТАММЫ РЕСПИРАТОРНО-СИНЦИТИАЛЬНОГО ВИРУСА С МУТАЦИЯМИ В М2-2 ORF, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИМИ ДИАПАЗОН АТТЕНУИРУЮЩИХ ФЕНОТИПОВ

1. Рекомбинантный респираторно-синцитиальный вирус (РСВ), аттенуированный одной или несколькими модификациями до рекомбинантного генома РСВ, где одна или более модификаций включают:
(a) делецию в открытой рамке считывания (ORF) M2-2, соответствующую делеции из 241 нуклеотида в положениях 8189-8429 SEQ ID NO: 1, в сочетании с нуклеотидными мутациями в положениях, соответствующих T8161, T8167 и T8179 SEQ ID NO: 1 («ΔM2-2»);
Acl
(b) делецию в M2-2 ORF, соответствующую делеции из 234 нуклеотидов в положениях 8203-8436 SEQ ID NO: 1, в сочетании с нуклеотидными мутациями в положениях, соответствующих 8198A и 8200G SEQ ID NO: 1 («ΔM2-2-I»); или
Hind
(c) делецию в M2-2 ORF, соответствующую делеции из 234 нуклеотидов в положениях 8203-8436 SEQ ID NO: 1, в сочетании с нуклеотидными мутациями в положениях, соответствующих 8198A и 8199G SEQ ID NO: 1 («ΔM2-2-III»), где рекомбинантный геном РСВ представляет собой геном D46, аттенуированный одной или несколькими модификациями.
2. Рекомбинантный РСВ по п.1, где одна или более модификаций дополнительно содержат делецию из 112 нуклеотидов, соответствующую положениям 4499-4610 SEQ ID NO: 1, в сочетании с нуклеотидными мутациями в положениях, соответствующих C4489T, C4492T, A4495T, A4497G, и G4498A SEQ ID NO: 1 («6120»).
3. Рекомбинантный респираторно-синцитиальный вирус (РСВ), аттенуированный одной или несколькими модификациями до рекомбинантного генома РСВ, где одна или более модификаций включают
Hind
делецию в M2-2 ORF, соответствующую делеции из 234 нуклеотидов в положениях 8203-8436 SEQ ID NO: 1, в сочетании с нуклеотидными мутациями в положениях, соответствующих 8198A и 8199G SEQ ID NO: 1 («ΔM2-2-III»), и
делецию из 112 нуклеотидов, соответствующую положениям 4499-4610 SEQ ID NO: 1, в сочетании с нуклеотидными мутациями в положениях, соответствующих C4489T, C4492T, A4495T, A4497G, и G4498A SEQ ID NO: 1 («6120»).
4. Рекомбинантный РСВ по любому из пп. 1-3, где одна или более модификаций дополнительно содержат нуклеотидные мутации, кодирующие замены аминокислот V267I в белке N, E218A и T523I в белке F, и C319Y и H1690Y в белке L РСВ («cp»).
5. Рекомбинантный РСВ по любому из пп. 1-4, где одна или более модификаций дополнительно содержат нуклеотидные мутации для введения замены Y1321K в белок L РСВ, и где белок L содержит остаток S1313, где кодоны, кодирующие замену Y1321K и остаток S1313, представляют собой кодоны AAA и TCA, соответственно («1030s»).
6. Рекомбинантный РСВ по любому из пп. 1-5, где одна или более модификаций дополнительно содержат нуклеотидные мутации, кодирующие замену аминокислоты K51R в белке NS2 РСВ («NS2»).
7. Рекомбинантный РСВ по любому из пп. 1-6, где одна или более модификаций дополнительно содержат нуклеотидные мутации, кодирующие замену аминокислоты T24A в белке N РСВ («N»).
8. Рекомбинантный РСВ по любому из пп. 1-7, где одна или более модификаций дополнительно содержат нуклеотидные мутации, кодирующие замену аминокислоты K51R в белке NS2 и T24A в белке N РСВ («NS2/N»).
9. Рекомбинантный РСВ по любому из пп. 1-8, где одна или более модификаций дополнительно содержат делецию в SH ORF, соответствующую делеции из 419 нуклеотидов в положениях 4198-4616 of SEQ ID NO: 1 («ΔSH»).
10. Рекомбинантный РСВ по любому из пп. 1-9, где одна или более модификаций дополнительно содержат замену нуклеотидной последовательности, кодирующей белок G РСВ, соответствующей кодон-оптимизированной нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок G из клинического изолята A/Maryland/001/11.
11. Рекомбинантный РСВ по п.10, где кодон-оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок G из клинического изолята A/Maryland/001/11, содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 8 (G001BB).
12. Рекомбинантный РСВ по любому из пп. 1-11, где одна или более модификаций дополнительно содержат замену нуклеотидной последовательности, кодирующей белок F РСВ, соответствующей кодон-оптимизированной нуклеотидной последовательностью, изложенной как SEQ ID NO: 9 (FBB).
13. Рекомбинантный РСВ по любому из пп. 1-11, где одна или более модификаций дополнительно содержат замену нуклеотидной последовательности, кодирующей белок F РСВ, соответствующей нуклеотидной последовательностью, изложенной как SEQ ID NO: 10 (F001), которая кодирует белок F из клинического изолята A/Maryland/001/11.
14. Рекомбинантный РСВ по любому из пп. 1-11, где одна или более модификаций дополнительно содержат замену нуклеотидной последовательности, кодирующей белок F РСВ, соответствующей кодон-оптимизированной нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок F из клинического изолята A/Maryland/001/11.
15. Рекомбинантный РСВ по п.14, где кодон-оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок F из клинического изолята A/Maryland/001/11, содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 11 (F001BB).
16. Рекомбинантный РСВ по любому из пп. 1-15, где одна или более модификаций дополнительно содержат нуклеотидные мутации, кодирующие замены аминокислот K66E и Q101P в белке F РСВ («HEK»).
17. Рекомбинантный РСВ по любому из пп. 1-16, где одна или более модификаций дополнительно содержат нуклеотидные мутации, кодирующие замены аминокислот E218A и T523I в белке F РСВ (замены cp в F).
18. Рекомбинантный РСВ по любому из пп. 1-17, где одна или более модификаций дополнительно содержат обратный порядок генов, кодирующих белки G и F в геноме РСВ.
19. Рекомбинантный РСВ по п.1, где одна или более модификаций включают или состоят из комбинации мутаций, выбранных из любой из:
ΔM2-2, cp/ΔM2-2, cp/ΔM2-2/HEK, ΔM2-2/1030s, NS2/N/ΔM2-2, NS2/ΔM2-2, N/ΔM2-2, ΔSH/ΔM2-2, cp/ΔSH/ΔM2-2, 6120/ΔM2-2, 6120/cp/ΔM2-2, 6120/ΔM2-2/1030s, 6120/NS2/N/ΔM2-2, 6120/G001BB/FBB/ΔM2-2, 6120/FBB/G001BB/ΔM2-2, 6120/G001BB/F/ΔM2-2, 6120/G/FBB/ΔM2-2, 6120/G/FBBHEK/ΔM2-2, 6120/G/FBBcpHEK/ΔM2-2, 6120/FBB/G/ΔM2-2, 6120/G001BB/F001BB/ΔM2-2, 6120/NS2/ΔM2-2, или 6120/N/ΔM2-2; или
Acl
Acl
Acl
Acl
Acl
Acl
Acl
Acl
Acl
Acl
Acl
Acl
Acl
Acl
Acl
Acl
Acl
Acl
Acl
Acl
Acl
Acl
ΔM2-2-I, cp/ΔM2-2-I, cp/ΔM2-2-I/HEK, ΔM2-2-I/1030s, NS2/N/ΔM2-2-I, NS2/ΔM2-2-I, N/ΔM2-2-I, ΔSH/ΔM2-2-I, cp/ΔSH/ΔM2-2-I, 6120/ΔM2-2-I, 6120/cp/ΔM2-2-I, 6120/ΔM2-2-I/1030s, 6120/NS2/N/ΔM2-2-I, 6120/G001BB/FBB/ΔM2-2-I, 6120/FBB/G001BB/ΔM2-2-I, 6120/G001BB/F/ΔM2-2-I, 6120/G/FBB/ΔM2-2-I, 6120/G/FBBHEK/ΔM2-2-I, 6120/G/FBBcpHEK/ΔM2-2-I, 6120/FBB/G/ΔM2-2-I, 6120/G001BB/F001BB/ΔM2-2-I, 6120/NS2/ΔM2-2-I; или
Acl
Hind
Hind
Hind
Hind
Hind
Hind
Hind
Hind
Hind
Hind
Hind
Hind
Hind
Hind
Hind
Hind
Hind
Hind
Hind
Hind
Hind
Hind
Hind
6120/N/ΔM2-2-I; или ΔM2-2-III; cp/ΔM2-2-III, cp/ΔM2-2-III/HEK, ΔM2-2-III/1030s, NS2/N/ΔM2-2-III, NS2/ΔM2-2-III, N/ΔM2-2-III, ΔSH/ΔM2-2-III, cp/ΔSH/ΔM2-2-III, 6120/ΔM2-2-III, 6120/cp/ΔM2-2-III, 6120/ΔM2-2-III/1030s, 6120/NS2/N/ΔM2-2-III, 6120/G001BB/FBB/ΔM2-2-III, 6120/FBB/G001BB/ΔM2-2-III, 6120/G001BB/F/ΔM2-2-III, 6120/G/FBB/ΔM2-2-III, 6120/G/FBBHEK/ΔM2-2-III, 6120/G/FBBcpHEK/ΔM2-2-III, 6120/FBB/G/ΔM2-2-III, 6120/G001BB/F001BB/ΔM2-2-III, 6120/NS2/ΔM2-2-III, или 6120/N/ΔM2-2-III.
20. Рекомбинантный РСВ по любому из пп. 1-19, где рекомбинантный геном РСВ содержит одну или более модификаций, и нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности плюс-цепи, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 1.
21. Рекомбинантный РСВ по любому из пп. 1-20, где рекомбинантный геном РСВ содержит одну или более модификаций, и нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности плюс-цепи, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 1.
22. Рекомбинантный РСВ по любому из пп. 1-21, где рекомбинантный геном РСВ содержит одну или более модификаций, и остальные нуклеотиды генома РСВ содержат нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности плюс-цепи, по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 1.
23. Рекомбинантный РСВ по любому из пп. 1-22, где рекомбинантный геном РСВ представляет собой геном D46, содержащий одну или более модификаций.
24. Рекомбинантный РСВ по п.1, где рекомбинантный геном РСВ содержит одну из:
(a) мутации 6120 и ΔМ2-2, и нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности плюс-цепи, по меньшей мере на 90% идентичной, по меньшей мере на 95% идентичной, и/или по меньшей мере на 99% идентичной SEQ ID NO: 5 (последовательность LID/ΔM2-2);
(b) мутации cp и ΔМ2-2, и нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности плюс-цепи, по меньшей мере на 90% идентичной, по меньшей мере на 95% идентичной, и/или по меньшей мере на 99% идентичной SEQ ID NO: 1 (последовательность D46);
(c) мутации cp и ΔМ2-2, и нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности плюс-цепи, по меньшей мере на 90% идентичной, по меньшей мере на 95% идентичной, и/или по меньшей мере на 99% идентичной SEQ ID NO: 15 (последовательность D46/cp/ΔM2-2);
(d) мутации 6120, ΔM2-2 и 1030s, и нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности плюс-цепи, по меньшей мере на 90% идентичной, по меньшей мере на 95% идентичной, и/или по меньшей мере на 99% идентичной SEQ ID NO: 16 (последовательность LID/ΔM2-2/1030s);
(e) мутации 6120, ΔM2-2 и 1030s, и нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности плюс-цепи, по меньшей мере на 90% идентичной, по меньшей мере на 95% идентичной, и/или по меньшей мере на 99% идентичной SEQ ID NO: 17 (последовательность LID/cp/ΔM2-2);
Hind
Hind
(f) мутации NS2, N, ΔM2-2-III, и нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности плюс-цепи, по меньшей мере на 90% идентичной, по меньшей мере на 95% идентичной, и/или по меньшей мере на 99% идентичной SEQ ID NO: 4 (последовательность D46/ΔM2-2-III);
Hind
Hind
(g) мутации NS2, N, ΔM2-2-III, и нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности плюс-цепи, по меньшей мере на 90% идентичной, по меньшей мере на 95% идентичной, и/или по меньшей мере на 99% идентичной SEQ ID NO: 18 (последовательность D46/NS2/N/ΔM2-2-III);
Acl
AclI
(h) мутации NS2, N, ΔM2-2-I, и нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности плюс-цепи, по меньшей мере на 90% идентичной, по меньшей мере на 95% идентичной, и/или по меньшей мере на 99% идентичной SEQ ID NO: 3 (последовательность D46/ΔM2-2-I); или
Acl
(i) мутации NS2, N, ΔM2-2-I, следующие нуклеотидные мутации с положениями относительно SEQ ID NO: 1: 404C, 779G, делеция C1099, 1139A, 1140G, 1182G, 1210G, 5612A, 5616A, 5640G, 6216C, 6222C, 6387T, 7215C, 7482T, 7560A, 7702G, 10515T, и 13634A; и нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности плюс-цепи, по меньшей мере на 90% идентичной, по меньшей мере на 95% идентичной, и/или по меньшей мере на 99% идентичной SEQ ID NO: 19 (последовательность 276).
25. Рекомбинантный РСВ по п.1, где рекомбинантный геном РСВ представляет собой один из:
генома D46/cp/ΔM2-2;
генома LID/ΔM2-2/1030s;
генома LID/cp/ΔM2-2;
Hind
генома D46/NS2/N/ΔM2-2-III;
генома LID/ΔM2-2; или
генома 276.
26. Рекомбинантный РСВ по п.1, где нуклеотидная последовательность рекомбинантного генома РСВ содержит или включает нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности плюс-цепи, изложенной в виде любой из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 19.
27. Рекомбинантный РСВ по п.1, где рекомбинантный геном РСВ содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности плюс-цепи, изложенной в виде SEQ ID NO: 3, дополнительно модифицированную введением следующих нуклеотидных мутаций относительно SEQ ID NO: 1: 404C, 779G, 1099T, 1139A, 1140G, 1182G, 1210G, 5612A, 5616A, 5640G, 6216C, 6222C, 6387T, 7215C, 7482T, 7560A, 7702G, 10515T и 13634A.
28. Рекомбинантный РСВ по п.1, где рекомбинантный геном РСВ содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности плюс-цепи, изложенной в виде SEQ ID NO: 3, дополнительно модифицированную введением следующих нуклеотидных мутаций относительно SEQ ID NO: 1: 404C, 779G, делеция C1099, 1139A, 1140G, 1182G, 1210G, 5612A, 5616A, 5640G, 6216C, 6222C, 6387T, 7215C, 7482T, 7560A, 7702G, 10515T и 13634A.
29. Рекомбинантный РСВ по п.1, где рекомбинантный геном или антигеном РСВ содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, дополнительно модифицированную введением одного или нескольких следующих нуклеотидных замен в положениях относительно SEQ ID NO: 1: 404C, 779G, 1099T, 1139A, 1140G, 1182G, 1210G, 1938A, 5612A, 5616A, 5640G, 6216C, 6222C, 6387T, 7215C, 7482T, 7560A, 7702G, 10515T, 13634A, 13901T.
30.Рекомбинантный РСВ по любому из пп. 1-29, где РСВ представляет собой подтип A РСВ.
31. Рекомбинантный РСВ по любому из по пп. 1-19, где РСВ представляет собой подтип B РСВ.
32. Рекомбинантный РСВ по любому из пп. 1-31, где РСВ является инфекционным, аттенуированным и самореплицирующимся.
33. Выделенная полинуклеотидная молекула, содержащая нуклеотидную последовательность рекомбинантного генома РСВ по любому из пп. 1-32 или антигеномную кДНК, или последовательность РНК генома РСВ.
34. Вектор, содержащий полинуклеотидную молекулу по п.33.
35. Клетка, содержащая полинуклеотидную молекулу или вектор по п.33 или 34.
36. Способ получения рекомбинантного РСВ, включающий
трансфекцию пермиссивной клеточной культуры вектором по п.34;
инкубирование клеточной культуры в течение достаточного периода времени для репликации вируса; и
очистку реплицированного рекомбинантного РСВ.
37. Рекомбинантный РСВ, полученный способом по п.36.
38. Фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный РСВ по любому из пп. 1-32 или 37.
39. Способ индукции иммунного ответа на РСВ у индивидуума, включающий введение иммуногенно эффективного количества фармацевтической композиции по п.38 индивидууму.
40. Способ по п.39, где иммунный ответ представляет собой защитный иммунный ответ.
41. Способ по п.39 или 40, где фармацевтическую композицию вводят интраназально.
42. Способ по п.39 или 40, где РСВ вводят путем инъекции, аэрозоля, назального спрея или капель в нос.
43. Способ по любому из пп. 39-42, где индивидуум является человеком.
44. Способ по любому из пп. 39-43, где индивидуум имеет возраст от 1 до 6 месяцев.
45. Способ по любому из пп. 39-44, где индивидуум является серонегативным по РСВ.
46. Применение рекомбинантного РСВ по любому из пп. 1-32 или 37 для индукции иммунного ответа на РСВ у индивидуума.