СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ПРОТИВОСУДОРОЖНОГО ДЕЙСТВИЯ ЦИТИКОЛИНА И ВАЛЬПРОАТА НАТРИЯ ПРИ ИХ СОВМЕСТНОМ ПРИМЕНЕНИИ НА МОДЕЛИ ОСТРЫХ ГЕНЕРАЛИЗОВАННЫХ СУДОРОГ, ВЫЗВАННЫХ ПЕНТИЛЕНТЕТРАЗОЛОМ У КРЫС САМЦОВ ЛИНИИ ВИСТАР
METHOD OF DETECTING ANTICONVULSANT ACTION OF SODIUM CITICOLINE AND VALPROATE WHEN APPLYING THEM TOGETHER ON MODEL OF ACUTE GENERALIZED CONVULSIONS CAUSED BY PENTYLENETETRAZOLE IN WISTAR MALE RATS

Изобретение относится к медицине, а именно к нейрохимии, патофизиологии, неврологии и психиатрии. Оно связано с повышением эффективности лечения эпилепсии. Эпилепсия - сложное по этиологии и патогенезу нервно-психическое заболевание - имеет хронически-прогредиентное течение и характеризуется полиморфностью как пароксизмальных проявлений, так и нарушений психической деятельности. С одной стороны, классические и новые противоэпилептические лекарственные средства могут купировать повышенную судорожную активность мозга, но, как правило, не обладают защитными свойствами в отношении нейродегенерации [1]. Таким образом, проблема предотвращения повреждения головного мозга в результате судорог остается нерешенной. С другой стороны, действие большинства противоэпилептических препаратов сопровождается рядом побочных эффектов, к числу которых можно отнести нарушение основных когнитивных функций - внимания, памяти, восприятия и др. [5, 7, 10]. В связи с изложенным представлялось целесообразным исследовать влияние цитиколина (аналога эндогенного цитиколина, который в настоящее время широко применяется в лечении когнитивных, чувствительных, двигательных неврологических нарушений дегенеративной и сосудистой этиологии, и обладает нейрорегенеративными и нейропротективными свойствами) [6, 8, 9, 11, 12] и вальпроата натрия - противосудорожного медикаментозного препарата [2, 3, 4].
Известен способ предупреждения нейродегенерации нейронов у животных с помощью пирацетама в условиях ПТЗ-киндлинга [11]. Известно, что пирацетам - это ноотропное средство, которое повышает устойчивость мозга к гипоксии, интегративной работе, положительно влияет на процессы памяти и обучения, улучшает кровообращение головного мозга и не оказывает седативного действия. В условиях ПТЗ-киндлинга у мышей показано, что применение пирацетама ведет к превенции нейрональных повреждений и снижении дефицита ранее полученных навыков при обучении у животных.
Недостатком данного способа является отсутствие оценки противосудорожного действия пирацетама в условиях острых генерализованных судорог, вызванных пентилентетразолом,
В качестве ближайшего аналога (прототипа) выбран способ усиления препаратом ноопепт противосудорожной активности вальпроата у мышей. Ноопепт - оригинальный дипептидный препарат, обладающего ноотропной, нейропротекторной и анксиолитической активностью. В данном способе на модели судорог, вызванных коразолом у мышей, ноопепт (0,5 мг/кг внутрибрюшинно) ни при однократном, ни при повторном воздействии (10 или 35 дней) не усиливал судорожный эффект коразола, что позволяет предполагать отсутствие у препарата проконвульсивных свойств [3]. Это составляет преимущество ноопепта перед пирацетамом, который усиливает судорожную готовность. При длительном (5-недельном) предварительном воздействии ноопепт усиливал противосудорожный эффект вальпроата. Проведенное исследование может служить экспериментальным обоснованием целесообразности курсового применения ноопепта совместно с вальпроатом с целью усиления противосудорожных свойств последнего, а также благоприятного влияния на когнитивные функции и замедления прогрессирования нейродегенеративных процессов.
Недостатком данного способа является необходимость длительного пятинедельного воздействия ноопепта для усиления противосудорожного эффекта вальпроата, а также то, что применение ноопепта и вальпроата не уменьшает их доз при сочетанном применении для получения противосудорожного эффекта.
Задачей изобретения является разработка способа, который позволяет выявить противосудорожную активность цитиколина и вальпроата натрия натрия в условиях острых генерализованных судорог, вызванных ПЗТ у крыс самцов линии Вистар.
Поставленная задача решается благодаря тому, что способ выявления противосудорожного действия цитиколина и вальпроата натрия при их совместном применении предусматривает следующие отличия: было проведено 3 серии опытов с целью достоверной оценки спектра и степени противосудорожного действия цитиколина и вальпроата натрия. Препараты вводили опытным животным внутрибрюшинно с таким расчетом, чтобы пик их действия совпадал: цитиколин вводили в дозе 300 мг/кг за 1 час до тестирования ПТЗ, а, вальпроат натрия в дозе 70 мг/кг за 10 минут до тестирования ПТЗ. Сущность предложенного способа заключалась в том, что при сочетанном применении цитиколина и вальпроата в минимально действующих дозах на модели острых генерализованных судорог, вызванных ПЗТ, эффект обоих препаратов усиливался. Латентные периоды появления первых судорожных проявлений и латентный период фазы клонических судорог достоверно увеличились на 66,70% и 63,36% соответственно по сравнению с группой контрольных животных, а у 12,5% наблюдали отсутствие клонической и тонической фазы судорог опытных животных. У данных крыс в условиях острых генерализованных судорог, вызванных ПТЗ, противосудорожный эффект цитиколина и вальпроата натрия при их совместном применении был более выражен.
Между совокупностью существенных признаков заявленного объекта и достигнутыми техническими результатами существует причинно-следственная связь: совместное введения цитиколина и вальпроата натрия расширяет их спектр и увеличивает степень их противосудорожного действия у крыс линии Вистар на фоне острых пентилентетразоловых судорог.
Новыми признаками заявленного способа выявления противосудорожного действия цитиколина и вальпроата натрия при их совместном применении на модели острых генерализованных судорог, вызванных ПЗТ, у крыс самцов линии Вистар является:
1. Наличие противосудорожного действия после однократного введения цитиколина в дозе 500 мг/кг за один час до введения ПТЗ, отмечалось повышение судорожных порогов: тяжесть судорог была ниже на 33,18%, продолжительность жизни животных увеличилась в 3,26 раза.
2. Проявление противосудорожного действия вальпроата натрия в дозе 100 мг/кг 10 минут до введения ПТЗ приводило к снижению на 50,7% тяжести судорог и предотвращало гибель животных.
3. При сочетанном применении цитиколина в дозе 300 мг/кг и вальпроата натрия в дозе 70 мг/кг при их совместном применении (цитиколина за час до введения ПТЗ, и вальпроата натрия за 10 минут до введения ПТЗ) достоверно латентные периоды появления первых судорожных проявлений и латентный период фазы клонических судорог увеличились на 66,70% и 63,36% соответственно по сравнению с группой контрольных животных, а у 12,5% наблюдали отсутствие клонической и тонической фазы судорог опытных животных.
Способ разработан на основе следующих экспериментов.
1. Методика экспериментов.
Эксперименты выполнены на крысах самцах линии Вистар (n=116) массой 160-190 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария при свободном доступе к воде и пищи. Все процедуры и эксперименты на животных проводили в соответствии с «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации», утвержденными приказом Министерства здравоохранения РФ №267 от 19.06.2003 г.
Изучение эффективности сочетанного применения вальпроата натрия и цитиколина проводили на модели острых генерализованных судорог, вызванных внутрибрюшинным введением ПТЗ в дозе 70 мг/кг. Определяли латентные периоды первых судорожных проявлений, клонической и тонической фаз (падение животного на бок) генерализованной судорожной реакции, длительность этих фаз, тяжесть судорожной реакции, продолжительность жизни и летальность. Тяжесть судорожной реакции оценивали в баллах: 1 - миоклонические вздрагивания; 2 - клонические судороги передних конечностей (поза «кенгуру»); 3 - повторные клонические судороги; 4 - тонико-клонические судороги с падением животного на бок; 5 - повторные тонико-клонические судороги и/или гибель животного.
Проведено 3 серий опытов. В 1-й и во 2-й сериях определяли минимальное противосудорожное действие цитиколина (Цераксон, «Nicomed Ferrer Internacional, S.A.») и вальпроата натрия (Конвулекс) (Convulex, «Gerot Pharmazeutika GmbH») на острые генерализованные судороги. С этой целью цитиколин вводили внутрибрюшинно в дозах 300, 500 мг/кг за 1 час до введения ПТЗ, а вальпроат натрия - в дозах 70 и 100 мг/кг за 10 мин до введения ПТЗ. В 3-й серии исследовали эффективность сочетанного применения цитиколина и вальпроата натрия в минимально действующих противосудорожных дозах на острые генерализованные судороги у животных. Во всех сериях контролем служили животные, которым вводили физиологический раствор в аналогичных условиях опыта.
2. У контрольных животных во всех сериях опытов введение ПТЗ приводило к развитию генерализованной эпилептической активности: через 43-50 с появлялись первые судорожные проявления в виде вздрагивания головы или отдельных мышц туловища, которые переходили в клонические вздрагивания всего тела. Затем через 52-57 секунд следовали клонические судороги передних конечностей с подъемом животного на задние лапы (поза «кенгуру»). Завершались судороги тонико-клоническим припадком с падением животного на бок и фазой постприступной депрессии. Тяжесть судорог у животных в среднем составила 4,33-4,53 балла, а летальность - 53-87%.
В 1-й серии опытов введение цитиколина в дозе 500 мг/кг оказывало противосудорожное действие, которое выражалось в увеличении на 42,09% латентного периода первых судорожных проявлений и на 47,43% клонических судорог по сравнению с группой контрольных животных. Тяжесть судорог была ниже на 33,18%. Продолжительность жизни животных увеличивалась в 3,26 раза. Число погибших животных было на 80,61% ниже, чем в контрольной группе. Введение цитиколина в дозе 300 мг/кг вызывало у животных только увеличение латентного периода наступления тонических судорог и не влияло на другие показатели судорожной активности по сравнению с группой контрольных животных.
Во 2-й серии опытов противосудорожное действие вальпроата натрия в дозе 100 мг/кг выражалось в снижении на 50,77% тяжести судорог и предотвращении гибели животных. Доза вальпроата натрия 70 мг/кг оказалась менее эффективной: тяжесть судорог была ниже на 24,25%, а летальность - на 46,42% по сравнению с группой контрольных животных.
Таким образом, цитиколин и вальпроат натрия в дозах 300 и 70 мг/кг по-отдельности оказывали менее выраженное противосудорожное действие и были выбраны для проведения дальнейшего исследования.
В 3-й серии опытов сочетанное применение вальпроата натрия в дозе 70 мг/кг и цитиколина в дозе 300 мг/кг привело к усилению противосудорожных свойств обоих препаратов. Так, латентные периоды появления первых судорожных проявлений и латентный период фазы клонических судорог увеличились на 66,70 и 63,36%, соответственно, по сравнению с группой контрольных животных. У 12,5% опытных животных наблюдали отсутствие клонической и тонической фазы судорог.
Таким образом, изобретение позволяет выявить как спектр противосудорожного действия сочетанного применения цитиколина и вальпроата натрия так и степень их выраженного противосудорожного действия у животных на модели острых генерализованных судорог, вызванных ПЗТ, что связано с усилением противосудорожного действия цитиколина и вальпроата натрия при их совестном применении.
Литература
1. Киссин М.Я. Клиническая эпилептология - М.: ГЭОТАР-Медия, 2009. - 256 с.
2. Карпова М.Н., Зиньковский К.А., Кузнецова Л.В., Клишина Н.В. Повышение порогов судорожной реакции после введения цитиколина мышам линии С57В1/6 // Бюл. экспер. биол. и мед. 2014. Т. 158, №9. С. 296-298.
3. Кравченко Е.В., Понтелеева И.В., Трофимов С.С. и др. Оригинальный ноотропный и нейропротекторный препарат ноопепт усиливает противосудорожную активность вальпроат натрия (конвулекс) а у мышей // Экспер. и клин. фармакол. 2009. Т. 72, №6. С. 15-17.
4. Кузнецова Л.В., Карпова М.Н., Зиньковский К.А., Клишина Н.Ю. Влияние цитиколина на развитие хронической эпилептизации мозга (пентилентетразолового киндлинга) и острую судорожную реакцию мышей С57В1/6, подвергшихся киндлингу // Патол. физиол. и эксперим. терапия. 2014. №.3. С.3-9.
5. Малинин Д.И. Побочное действие психотропных средств. М., 2000.
6.  J.,  G.С. The Role of Citicoline in Neuroprotection and Neurorepair in Ischemic Stroke // Brain Sci. 2013. Vol. 3, N 3. P. 1395-1414.
7. Fritz N., Glogau S., Hoffmann J. et al. Efficacy and cognitive side effects of tiagabine and topiramate in patients with epilepsy // Epilepsy Behav. 2005. Vol. 6, N3. P. 373-381.
8. Hurtado O., Lizasoain I., Moro  Neuroprotection and recovery: recent data at the bench on citicoline // Stroke. 2011. Vol. 42, N 1. Suppl. P.
9. Hurtado О., Moro M.A., Cardenas A. et al. Neuroprotection afforded by prior citicoline administration in experimental brain ischemia: effects on glutamate transport // Neurobiol. Dis. 2005. Vol. 18. N 2. P. 336-345.
10. Meador K.J., Loring D.W., Moore E.E. et al. Comparative cognitive effects of phenobarbital, phenytoin, and valproate in healthy adults // Neurology. 1995. Vol. 45, N8. P. 1494-1499.
11. Pohle W., Becker A., Grecksch G. et al. «Piracetam prevents pentylenetetrazol kindling-unduced neuronal loss and learning defcits // Seizure. 1997. V. 6 P. 467-474.
11. Saver J.L. Citicoline: update on a promising and widely available agent for neuroprotection and neurorepair // Rev. Neurol. Dis. 2008. Vol. 5, P. 167-177.
12. Secades J.J. Probably role of citicoline instroke rehabilitation: review of literature // Rev. Neurol. 2012. Vol. 54, P. 173-179;