ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ЖИВОТНЫЕ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ

1. Способ получения генетически модифицированного животного, причем указанный способ включает
воздействие на эмбрионы или клетки мРНК, кодирующей TALEN, при этом TALEN специфически связывается с целевым хромосомным сайтом в эмбрионах или клетках,
клонирование клеток в суррогатную мать или имплантацию эмбрионов в суррогатную мать,
при этом суррогатная мать, таким образом, вынашивает животное, которое является генетически модифицированным только в целевом хромосомном сайте для TALEN и не содержит репортерный ген.
2. Способ по п. 1, включающий воздействие на эмбрионы TALEN без репортерного гена, при этом больше чем приблизительно 1% эмбрионов включают модификацию в целевом хромосомном сайте.
3. Способ по п.1 или 2, включающий получение эмбрионов, имеющих генетическую структуру, о которой известно, что она способна экспрессировать набор признаков, и воздействие на эмбрионы TALEN без репортерного гена, и скрининг вынашиваемого животного в отношении модификации и в отношении экспрессии набора признаков.
4. Способ по п. 1, включающий воздействие на клетки TALEN без репортерного гена и клонирование клеток, при этом более 1% клонированных клеток дают животных, включающих модификацию в целевом хромосомном сайте.
5. Способ по п. 1, включающий воздействие на клетки TALEN без репортерного гена, получение колоний клональных клеток и тестирование субпопуляции членов колоний для идентификации колоний, включающих модификацию в целевом хромосомном сайте.
6. Способ по п. 5, где тестирование субпопуляции членов колоний представляет собой деструктивный процесс.
7. Способ по п. 6, где способ тестирования выбирают из группы, включающей нуклеолитический анализ, секвенирование, PAGE, ПЦР, удлинение праймера или гибридизацию.
8. Способ по п. 1, где генетическую модификацию выбирают из группы, включающей вставку, делецию, инверсию или транслокацию.
9. Способ по п. 1, где TALEN представляет собой первый TALEN, и целевой хромосомный сайт представляет собой первый сайт, при этом способ дополнительно предусматривает второй TALEN, направленный на второй целевой хромосомный сайт.
10. Способ по п. 1, дополнительно включающий воздействие на эмбрионы или клетки одноцепочечной ДНК (оцДНК), которая содержит экзогенную последовательность, при этом генетическая модификация включает экзогенную последовательность.
11. Способ по п. 10, где экзогенная последовательность включает альтернативный аллель для целевого хромосомного сайта для TALEN.
12. Способ по п. 11, где альтернативный аллель связан с количественным признаком или качественным признаком.
13. Способ по п. 11, где альтернативный аллель включает аллель миостатина, присутствующий у крупного рогатого скота породы бельгийская голубая.
14. Способ по любому из пп. 11-13, где клетка или эмбрион принадлежит первой породе, а аллель принадлежит второй породе животного.
15. Способ по п. 14, где первая порода представляет собой крупный рогатый скот породы Вагю или Нелоре, а вторая порода представляет собой крупный рогатый скот породы бельгийская голубая, при этом потомок представляет собой теленка породы Вагю или Нелоре.
16. Способ по п. 11, где аллель выбирают из группы, включающей вставку, делецию, полиморфизм и однонуклеотидный полиморфизм.
17. Способ по п. 11, где альтернативный аллель
предусматривает улучшенный признак сельскохозяйственного животного, и его выбирают из группы, включающей локус комолости, рецессивный ген, ответственный за нарушения фертильности, ген для улучшения мясной продуктивности, ген для улучшения молочной продуктивности, ген устойчивости к африканской чуме свиней и их комбинации; или
предусматривает животную модель, и его выбирают из группы, включающей ген для уменьшения размера животного, ген, который стимулирует рост опухоли, онкоген, гены гиперхолестеринемии, ген воспалительного заболевания кишечника, ген расщепленного позвоночника, ген легочной гипертензии, ген, вызывающий пороки сердца, и ген глютеновой болезни.
18. Способ по п. 1, где целевой хромосомный сайт выбирают для повреждения гена, где повреждение гена включает
вставку, делецию или замещение одного или нескольких оснований в последовательности, кодирующей ген и/или его цис-регуляторный элемент.
19. Способ по п. 1, где генетическую модификацию выбирают из группы, включающей вставку, делецию, замену на экзогенную последовательность нуклеиновой кислоты, инверсию, транслокацию, конверсию гена в природный аллель, конверсию гена в синтетический аллель, межвидовую аллельную миграцию, внутривидовую аллельную миграцию и конверсию гена в новый аллель.
20. Способ по п. 1, дополнительно включающий доставку рекомбиназы в клетку или эмбрион.
21. Способ по п. 1, где мРНК TALEN напрямую вводят в клетку в виде мРНК.
22. Способ по п. 21, где прямое введение в клетку включает способ, выбранный из группы, включающей электропорацию, трансфекцию, липофекцию, липосомную трансфекцию, нуклеофекцию, трансфекцию биолистическими частицами, трансфекцию наночастицами, липидную трансфекцию, электрослияние и прямую инъекцию.
23. Способ по п. 1, где мРНК TALEN вводят в клетку в виде плазмиды, которая кодирует мРНК.
24. Способ по п. 10, где оцДНК вводят в клетку после введения в клетку вектора, кодирующего TALEN.
25. Способ по п. 24, где оцДНК вводят в клетку в интервале от приблизительно 8 часов до приблизительно 3 дней после введения в клетку вектора, экспрессирующего TALEN.
26. Способ по п. 10, где мРНК TALEN напрямую вводят в клетку приблизительно в то же самое время, что и оцДНК.
27. Способ по п. 1, где клетка представляет собой первичную клетку или стволовую клетку, и способ осуществляют без стадии отбора, которая требует либо положительного, либо отрицательного критерия отбора по выживанию.
28. Способ по п. 1, где вынашиваемое животное выбирают из группы, включающей свинью, коров, овец, коз, курицу, кролика, рыбу, данио-рерио, собаку, мышь, кошку, мышь, крысу и лабораторное животное.
29. Способ по п. 1, где клетку выбирают из группы, включающей клетку сельскохозяйственного животного, клетку парнокопытного, культивируемую клетку, первичную клетку, первичную соматическую клетку, зиготу, первичную половую клетку, стволовую клетку и зиготу, или где эмбрион представляет собой бластоцисту.
30. Способ по п. 1, где TALEN представляет собой правый TALEN и дополнительно включает левый TALEN, который вводят вместе с правым TALEN.
31. Способ по п. 1, при этом клетки представляют собой первичные соматические клетки или стволовые клетки.
32. Способ по п. 1, при этом клетки клонируют посредством переноса ядра или переноса хроматина соматической клетки.
33. Способ по п. 1, где вынашиваемое животное является гомозиготным по модификации.
34. Способ по п. 1, где вынашиваемое животное представляет собой животное-основателя.
35     Генетически модифицированное животное, полученное согласно способу по любому из пп. 1-34.
36. Животное-основатель, полученное согласно способу по любому из пп. 1-34.
37. Способ получения генетически модифицированной клетки или эмбриона животного, не являющегося человеком, включающий
воздействие на эмбрионы или клетки животного in vitro мРНК, кодирующей TALEN, при этом TALEN специфически связывается с целевым хромосомным сайтом в эмбрионах или клетках, при этом клетки или эмбрионы генетически модифицируют только в целевом хромосомном сайте, и при этом способ осуществляют без репортерного гена.
38. Способ по п. 37, включающий клетки и дополнительно включающий культивирование клеток и выделение колоний клеток.
39. Способ по п. 37 или 38, при этом способ осуществляют без добавок, которые создают положительное или отрицательное давление отбора для отбора генетически модифицированных клеток.
40. Способ по п. 37, дополнительно включающий воздействие на эмбрионы или клетки животного in vitro одноцепочечной ДНК, которая содержит экзогенную последовательность.
41. Способ по п. 37 или 40, включающий клетки и дополнительно включающий культивирование клеток и выделение колоний клеток, где тестируемую клетку отбирают из выделенной колонии, и тестирование тестируемой клетки для определения того, как была модифицирована клетка.
42. Способ по п. 41, где тестирование представляет собой деструктивный процесс, который разрушает тестируемую клетку.
43. Способ по п. 37, где клетка представляет собой первичную клетку.
44. Способ по п. 43, где первичная клетка представляет собой клетку, выбранную из группы, включающей свинью, корову, овцу, козу, кур, кролика, рыбу, данио-рерио, собаку, мышь, кошку, мышь, крысу и лабораторное животное.
45. Способ по п. 37, включающий воздействие на первичную клетку, не являющуюся человеческой, в in vitro культуре или на эмбрион, не являющийся человеческим, нуклеиновой кислотой, кодирующей TALEN, где нуклеиновая кислота кодирует N-концевую лидерную часть, имеющую по меньшей мере 80% гомологию с SEQ ID NO:132.
46. Способ по п. 37, включающий воздействие на клетки TALEN без репортерного гена, при этом более 1% клеток включают модификацию в целевом хромосомном сайте.
47. Способ по п. 37, включающий воздействие на клетки TALEN без репортерного гена, получение колоний клональных клеток и тестирование субпопуляции членов колоний для идентификации колоний, включающих модификацию в целевом хромосомном сайте.
48. Способ по п. 37, где генетическую модификацию выбирают из группы, включающей вставку, делецию, инверсию или транслокацию.
49. Способ по п. 37, где TALEN представляет собой первый TALEN, и целевой хромосомный сайт представляет собой первый сайт, при этом способ дополнительно предусматривает второй TALEN, направленный на второй целевой хромосомный сайт.
50. Способ по п. 37, дополнительно включающий воздействие на эмбрионы или клетки одноцепочечной ДНК (оцДНК), которая содержит экзогенную последовательность, при этом генетическая модификация включает экзогенную последовательность.
51. Способ по п. 37, где экзогенная последовательность включает альтернативный аллель для целевого хромосомного сайта для TALEN.
52. Способ по п. 51, где альтернативный аллель включает аллель миостатина, присутствующий у крупного рогатого скота породы бельгийская голубая.
53. Способ по п. 37 или п. 52, где аллель выбирают из группы, включающей вставку, делецию, полиморфизм и однонуклеотидный полиморфизм.
54. Способ по п. 37, где целевой хромосомный сайт выбирают для повреждения гена, где повреждение гена включает
вставку, делецию или замещение одного или нескольких оснований в последовательности, кодирующей ген и/или его цис-регуляторный элемент.
55. Способ по п. 37, дополнительно включающий доставку рекомбиназы в клетку или эмбрион.
56. Способ по п. 37, где мРНК TALEN напрямую вводят в клетку в виде мРНК.
57. Способ по п. 37, где мРНК TALEN вводят в клетку в виде плазмиды, которая кодирует мРНК.
58. Способ по п. 50, где оцДНК вводят в клетку после введения в клетку вектора, кодирующего TALEN.
59. Способ по п. 50 или 58, где оцДНК вводят в клетку в интервале от приблизительно 8 часов до приблизительно 3 дней после введения в клетку вектора, экспрессирующего TALEN.
60. Способ по п. 50 или 58, где мРНК TALEN напрямую вводят в клетку приблизительно в то же самое время, что и оцДНК.
61. Способ по п. 37, при этом клетки представляют собой первичные соматические клетки или стволовые клетки.
62. Генетически модифицированное животное, причем животное представляет собой основателя, содержащего экзогенную последовательность нуклеиновой кислоты в заданном сайте и не имеющего других генетических модификаций.
63. Животное по п. 62, где экзогенная последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой аллель, и заданный сайт является гомологом аллеля.
64. Животное по п. 62 или 63, где животное является гомозиготным по аллелю.
65. Способ создания генетической модификации, включающий
воздействие на первичную клетку, не являющуюся человеческой, в in vitro культуре или на эмбрион, не являющийся человеческим, нуклеиновой кислотой, кодирующей TALEN, где нуклеиновая кислота кодирует N-концевую лидерную часть, имеющую по меньшей мере 80% гомологию с SEQ ID NO:132.
66. Способ по п. 65, где N-концевая лидерная часть имеет 80% гомологию с частью последовательности длиной 22 остатка в SEQ ID NO:132 и имеет общую длину не больше чем приблизительно 30 остатков.
67. Способ по п. 65 или 66, при этом нуклеиновая кислота имеет по меньшей мере 90% гомологию с SEQ ID NO: 132.
68. Животное, полученное согласно способу по любому из пп. 1-34, 37-61 или 65-67.
69. Животное по п. 68, полученное при обработке животного с получением потомства с необходимыми признаками, потомства с устойчивостью к заболеваниям, потомства, которое приобретает заболевание, или потомства, не имеющего генетического нарушения.
70. Животное по п. 68 или 69 для обработки животного с получением потомства с необходимыми признаками, где необходимый признак выбран из группы, включающей продуктивный признак, признак, характеризующий тип, признак работоспособности, признак фертильности, материнский признак, улучшенную мясную продуктивность, отсутствие рогов, улучшенную молочную продуктивность, размер животного и уменьшенный размер животного.
71. Животное по п. 68 или 69 для обработки животного с получением потомства с устойчивостью к заболеваниям, где заболевание выбрано из группы, включающей ген устойчивости к африканской чуме свиней, раку, гиперхолистеринемии, воспалительному заболеванию кишечника и заболеванию сердца.
72. Животное по п. 68 или 69 для обработки животного с получением потомства, которое приобретает устойчивость к заболеванию, где заболевание выбрано из группы, включающей рак, гиперхолестеринемию, воспалительное заболевание кишечника, расщепленный позвоночник, легочную гипертензию, нарушение сердечной деятельности и глютеновую болезнь.
73. Животное по п. 68 или 69 для обработки животного с получением потомства, не имеющего генетического нарушения, где генетическое нарушение представляет собой снижение фертильности.
74. Клетка, полученная согласно способу по любому из пп. 1-34, 37-61 или 65-67.
75. Клетка по п. 74, полученная при обработке животного с получением потомства с необходимыми признаками, потомства с устойчивостью к заболеваниям, потомства, которое приобретает заболевание, или потомства, не имеющего генетического нарушения.
76. Клетка по п. 74 или 75 для обработки животного с получением потомства с необходимыми признаками, где необходимый признак выбран из группы, включающей продуктивный признак, признак, характеризующий тип, признак работоспособности, признак фертильности, материнский признак, улучшенную мясную продуктивность, отсутствие рогов, улучшенную молочную продуктивность, размер животного и уменьшенный размер животного.
77. Клетка по п. 74 или 75 для обработки животного с получением потомства с устойчивостью к заболеваниям, где заболевание выбрано из группы, включающей ген устойчивости к африканской чуме свиней, раку, гиперхолистеринемии, воспалительному заболеванию кишечника и заболеванию сердца.
78. Клетка по п. 74 или 75 для обработки животного с получением потомства, которое приобретает устойчивость к заболеванию, где заболевание выбрано из группы, включающей рак, гиперхолестеринемию, воспалительное заболевание кишечника, расщепленный позвоночник, легочную гипертензию, нарушение сердечной деятельности и глютеновую болезнь.
79. Клетка по п. 74 или 75 для обработки животного с получением потомства, не имеющего генетического нарушения, где генетическое нарушение представляет собой снижение фертильности.
80. Эмбрион, полученный согласно способу по любому из пп. 1-34, 37-61 или 65-67.
81. Эмбрион по п. 80, полученный при обработке животного с получением потомства с необходимыми признаками, потомства с устойчивостью к заболеваниям, потомства, которое приобретает заболевание, или потомства, не имеющего генетического нарушения.
82. Эмбрион по п. 80 или 81 для обработки животного с получением потомства с необходимыми признаками, где необходимый признак выбран из группы, включающей продуктивный признак, признак, характеризующий тип, признак работоспособности, признак фертильности, материнский признак, улучшенную мясную продуктивность, отсутствие рогов, улучшенную молочную продуктивность, размер животного и уменьшенный размер животного.
83. Эмбрион по п. 80 или 81 для обработки животного с получением потомства с устойчивостью к заболеваниям, где заболевание выбрано из группы, включающей ген устойчивости к африканской чуме свиней, раку, гиперхолистеринемии, воспалительному заболеванию кишечника и заболеванию сердца.
84. Эмбрион по п. 80 или 81 для обработки животного с получением потомства, которое приобретает устойчивость к заболеванию, где заболевание выбрано из группы, включающей рак, гиперхолестеринемию, воспалительное заболевание кишечника, расщепленный позвоночник, легочную гипертензию, нарушение сердечной деятельности и глютеновую болезнь.
85. Эмбрион по п. 80 или 81 для обработки животного с получением потомства, не имеющего генетического нарушения, где генетическое нарушение представляет собой снижение фертильности.
86. Применение клетки, полученной согласно способу по любому из пп. 37-61 или 65-67, для получения генетически модифицированного животного.
87. Применение клетки по п. 86 для получения потомства с необходимым признаком, потомства с устойчивостью к заболеваниям, потомства, которое приобретает заболевание, или потомства, не имеющего генетического нарушения.
88. Применение эмбриона, полученного согласно способу по любому из пп. 37-61 или 65-67, для получения генетически модифицированного животного.
89. Применение эмбриона по п. 88 для получения потомства с необходимым признаком, потомства с устойчивостью к заболеваниям, потомства, которое приобретает заболевание, или потомства, не имеющего генетического нарушения.