Гистоморфометрические характеристики популяций ганглионарных нейронов в отдаленный период после нейротомии и восстановительной операции у собак

© Группа авторов, 2005

Гистоморфометрические характеристики популяций ганглионарных нейронов в отдаленный период после нейротомии и восстановительной операции у собак

В.И. Шевцов, Н.А. Щудло, И.В. Борисова, М.М. Щудло, Р.В. Панфилов,

Т.Н. Варсегова

The histomorphometric characteristics of ganglionary neuron populations in the long-term period after canine neurotomy

and restorative surgery

V.I. Shevtsov, N.A. Chtchoudlo, I.V. Borisova, M.M. Chtchoudlo, R.V. Panfilov,

T.N. Varsegova

Федеральное государственное учреждение науки «Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А. Илизарова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», г. Курган

У двух взрослых беспородных собак выполнено пересечение седалищного нерва на уровне средней трети бедра и первичная микрохирургическая нейрорафия. Через 12 месяцев после операции методами световой микроскопии и компьютерной морфометрии изучены нейроны их ганглиев L5, L6, L7 в сопоставлении с аналогичными данными по четырем неоперированным собакам. В результате исследований отработана методика типирования А и B-нейронов в криостатных срезах, уточнены светооптические качественные характеристики А1 и А2-подтипов, определены размерные диапазоны типов ганглионарных нейронов и получены данные о соотношении A и B-типов в поясничных ганглиях интактных собак. У оперированных животных в популяции А-нейронов средние диаметры ядра и ядрышка меньше интактных на 4 % и на 2 % соответственно, однако на 19 % (статистически достоверно) уменьшена средняя площадь перикарионов. В популяции B достоверно, но незначительно (на 10 %) уменьшена средняя площадь перикарионов, а средние диаметры ядра и ядрышка уменьшены на 8 % (p < 0,05). Сравнение численных долей А и B-нейронов, частоты реактивных изменений и морфометрических характеристик с соответствующими параметрами ганглиев интактных собак свидетельствует, что через 12 месяцев после повреждения и первичной восстановительной операции снижение структурно-функциональной активности более выражено в популяции А-клеток. Наряду с увеличением частоты премортальных изменений нейронов популяции А это приводит к выводу, что в отдалённые сроки после операции гибель B-нейронов замедляется и доминирует потеря А-нейронов. Результаты, полученные на небольшом числе животных, носят предварительный характер, но заставляют коренным образом пересмотреть подходы к нейротропной терапии у пациентов с травмами периферических нервов.

Ключевые слова: чувствительные ганглии, A и B-нейроны, аксотомия, регенерация нерва.

Neurotomy of the sciatic nerve at the level of the femoral middle third and primary microsurgical neurorrhaphy were performed in 2 adult mongrel dogs. The neurons of their ganglia L5, L6, L7 were studied 12 months after surgery in comparison with the similar data of 4 non-operated dogs using the methods of light microscopy and computer morphometry. The study resulted in perfecting the technique of neurons A and B typing in cryostat sections, verifying the light-and-optical qualitative characteristics of A1 and A2 subtypes, determining the size ranges of the types of ganglionary neurons and obtaining the data about the ratio of A and B types in the spinal ganglia of intact dogs. As for the animals operated on, in their population of A-neurons the mean diameters of nucleus and nucleolus were 4% and 2% less (respectively) than those of intact animals, however, the mean area of perikaryons was 19% less (statistically reliably). In B population the mean area of perikaryons was reliably but slightly (10%) less and the mean diameters of nucleus and nucleolus were 8% less (p < 0,05). The comparison of numerical proportions of A and B neurons, frequency of reactive changes and morphometric characteristics with the appropriate parameters of intact dog ganglia demonstrated that 12 months after damage and primary restorative surgery the decrease of structural-and-functional activity was more marked in the population of A-cells. Together with the increase of the frequency of the premortal changes in population A neurons this contributes to come to the conclusion that in the long-term periods after surgery the destruction of B-neurons slows down and A-neuron loss dominates. Though the results obtained in a small number of animals are preliminary, they make to reconsider radically the approaches to neurotropic therapy in patients with injuries of peripheral nerves. Keywords: sensitive ganglia, A and B neurons, axotomy, nerve regeneration.

По данным последних лет [5], только в Европе несколько сотен тысяч человек в год получают повреждения периферических нервов. Несмотря на высокий уровень хирургической техники восстановительных операций в европейских странах, результативность их нередко раз-

очаровывает врачей и пациентов. Многие авторы считают, что основной причиной неудовлетворительного восстановления чувствительности является посттравматический апоптоз первичных афферентных нейронов. По мнению M.J. Groves et al. [4], после периферической ак-

сотомии количество чувствительных нейронов в спинномозговых узлах уменьшается не более, чем на 20 %; другие авторы [12] приводят существенно отличающиеся данные: через 32 недели после повреждения седалищного нерва крыс погибает около 37 % чувствительных нейронов. Независимо от уровня периферической аксото-мии гибель ганглионарных нейронов B-типа начинается раньше и протекает значительно интенсивнее [12, 13]. Сведения о морфо-функциональных характеристиках выживших нейронов весьма противоречивы. По мнению M.R. Raffe [11], с 10-го по 20-й день после повреждения нерва регенерационная гипертрофия

биосинтетического аппарата приводит к увеличению размеров нейронов. По данным ^ Tan-drup et э1. [12], нейроны обоих типов уменьшаются в размерах, но только на отдельных сроках наблюдения это изменение статистически значимо.

Сказанное определяет актуальность изучения морфофункциональных характеристик выживших нейронов у разных видов животных в отдалённый период регенерации после периферической аксотомии и восстановительной операции. С этой целью нами выполнено пилотное исследование на шести взрослых беспородных собаках в возрасте от 1 до 3 лет.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

У двух собак под внутривенным барбитуровым наркозом выполнено пересечение седалищного нерва на уровне средней трети бедра и первичная микрохирургическая эпиневральная ней-рорафия. Материал для морфологического исследования (спинальные ганглии L5-L7 оперированной и контралатеральной стороны) взят через 12 месяцев после операции. В качестве контроля исследованы ганглии четырёх неоперированных собак. Животных выводили из опыта передозировкой барбитуратов, в процессе ламинэктомии применялась префиксация in situ, а после иссечения материала - погружная фиксация охлажденной смесью 2 % растворов глутарового и пара-формальдегидов на фосфатном буфере (pH 7,4) с добавлением 0,1 % пикриновой кислоты. На следующие сутки после эвтаназии ганглии препарировали микрохирургическими инструментами фирмы Aesculap под бинокулярным стереомикро-скопом и острым лезвием вырезали кусочки для криотомирования. Срезы толщиной 10 мкм окрашивали толуидиновым синим по методикам Рома-новского-Гимза, Живаго и Эйнарсона, небольшую

часть материала от интактных животных им-прегнировали серебром и докрашивали гематоксилином. Препараты изучали и фотографировали, используя большие исследовательские микроскопы фирмы «Opton» (ФРГ). Для оцифровки изображений и количественного исследования использовали аппаратно-программный комплекс "ДиаМорф" (Москва). С каждого ганглия исследовали от 6 до 12 ортотропных срезов. Морфо-метрировали изображения всех ядрышкосодер-жащих профилей нейронов с хорошо выраженным контуром кариолеммы (инструментальное увеличение 500х). Статистические гипотезы проверяли применением точного критерия Фишера в дольном выражении с использованием преобразования Стерлинга для подсчёта искомой вероятности, двухвыборочного t-теста, предоставляемого программой Microsoft Excel 97, непараметрического W-теста Вилкоксона для независимых выборок с помощью NP-модуля программного обеспечения анализа и обработки данных AtteStat.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В процессе микроскопии полученного материала установлено, что наиболее элективное выявление телец Ниссля и структур ядра в криостатных срезах чувствительных нейронов удаётся при окраске толуидиновым синим. Обращая внимание на характер базофильного окрашивания нейроплазмы у интактных и оперированных собак (рис. 1), удаётся уверенно выделить клетки типа А - в соответствии с критериями, известными из литературы [7, 8, 12, 13]; прочие клетки с более интенсивной, пылевидной или гомогенной базофилией мы отнесли к типу B.

У двух интактных животных типы А и B имели чёткое разграничение по размерным характеристикам (например, в ганглии L7 к типу А можно было отнести абсолютно все нейроны

более 46 мкм, а в ганглии L5 - более 50 мкм в диаметре). У двух других интактных и у обеих оперированных собак от 3 до 5 % нейронов подвергаются перекалибровке. Как правило, в таких нейронах можно отметить признаки реактивных или компенсаторно-приспособительных изменений: например, некоторые нейроны типа B попадают в размерный диапазон А-клеток при увеличении площади перикариона (внутриклеточной гипертрофии) либо отдельные нейроны типа А с ангулярными контурами и признаками конденсации цитоплазмы оказываются в размерном диапазоне B. В интактном материале среди нейронов типа А обнаруживались клетки с относительно равномерным расположением базофильных телец по площади среза клетки (рис. 2, А) либо с преимущественно перинукле-

арным расположением и практически полным отсутствием их по периферии цитона (рис. 2, Б). При импрегнации серебром выявлялись соответствующие им разновидности с равномерным распределением металлофилии (рис. 2, В) и усилением металлофилии по периферии цитона (рис. 2, Г).

У животных опытной группы в ганглиях оперированной стороны практически не встречались нейроны с отсутствием базофилии по периферии клетки.

У интактных собак доли А и В-клеток в ганглии L6 также практически равны, однако в ганглии L7 и особенно L5 выше доля B-клеток (табл. 1). Относительное содержание А и В-клеток в контралатеральных ганглиях оперированных животных мало отличается от интактных. На оперированной стороне в ганглиях L5 и L7 снижена доля B-клеток, а в ганглии L6 - доля A-клеток.

Применение точного критерия Фишера для определения статистической значимости отличий параметров интактных и оперированных

собак даёт p>0,05 для ганглиев L5 и L6 и p ~ 0 для ганглия L7. То есть, только для ганглия L7 статистически высокозначимо отличие относительного содержания A и B-клеток. С большой долей вероятности это можно связать с тем, что у собак именно ганглий L7 содержит нейроны, относящиеся исключительно к пулу седалищного нерва. В L5 и L6 присутствуют нейроны ещё и бедренного нерва, который в данных опытах не был повреждён и оперирован.

Сопоставим морфометрические характеристики А и B-клеток седьмого поясничного ганглия у интактных и оперированных собак (табл. 2). В популяции А средние диаметры ядра и ядрышка меньше интактных всего на 4 % и на 2 % соответственно - статистически незначимо, однако на 19 % (статистически достоверно) уменьшена средняя площадь перикарионов. В популяции B хотя и достоверно, но весьма незначительно (на 10 %) уменьшена средняя площадь перикарионов, а средние диаметры ядра и ядрышка уменьшены на 8 % (p < 0,05).

Рис. 1. Типирование нейронов в ганглии Ь6 оперированной стороны. 12 месяцев после нейротомии и микрохирургической нейрорафии седалищного нерва. Продольный криостатный срез. Окраска толуидиновым синим. А - нейроны типа А; В -нейроны типа В. Инструментальное увеличение 200х

Рис. 2. Варианты распределения базофилии и металлофилии в ганглионарных А-клетках интактных собак. А - нейрон с равномерным распределением базофильных телец в цитоплазме и эксцентрично расположенным ядрышком. Б - базофилия выражена в основном перинуклеарно и отсутствует по периферии клетки (тонкие стрелки); "очаговый периферический хроматолиз" (толстая стрелка). В - нейрон с равномерным распределением металлофилии; Г - нейрон с усилением металлофилии по периферии цитона. Криостатные срезы, окраска толуидиновым синим (А, Б), импрегнация серебром с докра-ской гематоксилином (В, Г). Инструментальное увеличение 500х

Таблица 1

Относительное содержание нейронов А и В-типов в поясничных ганглиях с репрезентацией афферентов седалищного нерва у интактных и оперированных животных

Группа ганглиев Ганглий

Ь5 Ь6 Ь7

А В А В А В

Интактных животных 38,6% 61,4% 51,9% 48,1% 43,1% 56,9%

Оперированной стороны 42,2% 57,8% 46,6% 53,4% 60,2% 39,8%

Контралатеральные 34,5% 65,5% 51,2% 48,8% - -

Результат тетрахорического тестирования параметров интактных и оперированных собак р - 0,100259 р - 0,201897 р - 0

Таблица 2

Планиметрические характеристики нейронов ганглия Ь7 у оперированных и интактных животных

Средний диаметр Средний диаметр Средний диаметр Средняя площадь

Группа неи| зона ядра ядрышка перикариона

А В А В А В А В

Опер 61,6±1,3 30,9±1,1 23,6±0,5 15,1±0,4 6,2±0,1 4,4±0,1 2634±120 608±52

Интакт 67,7±2,2 33,3±0,07 24,6±0,6 16,5±0,3 6,3±0,1 4,8±0,1 3253±232 677±31

Опер/интакт х 100% 91 % 93 % 96 % 92 % 98 % 92 % 81 % 90 %

Интервал р-значения <0,05 <0,05 >0,05 <0,05 >0,05 <0,05 <0,05 <0,05

Данные таблицы 3 позволяют видеть, что популяция B-клеток по частоте качественных изменений мало отличается от интактной: наиболее значительно отличие по признаку "частота ангулярных контуров цитона", но даже оно оказывается статистически недостоверным (по результатам точного теста Фишера p ~ 0,135335). Однако повышение, хотя и статистически недостоверное, частоты эктопии ядер и статистически значимое увеличение частоты эксцентричных ядрышек в А-нейронах оперированных животных вероятно следует трактовать как реактивное изменение.

При микроскопии А-нейронов с эктопиро-ванными ядрами создаётся впечатление увеличения размеров цитона, декомпозиции базо-фильных телец в его центре. Эктопированные ядра, как правило, менее конденсированы по сравнению с центрально расположенными, а

ядрышко в них часто увеличено. Совокупность перечисленных признаков укладывается в хорошо известную картину центрального хроматолиза.

Локальная декомпозиция базофильных телец ("очаговый периферический хроматолиз"), встречалась чаще в нейронах ганглия L7 ин-тактных собак, чем оперированных, причём чаще в А-, нежели в B-клетках. Следует обратить внимание на то, что в популяции А-нейронов оперированных животных по сравнению с ин-тактными на 5 % (p ~ 0,033373) увеличена доля клеток с ангулярными контурами. В срезе такие клетки имеют форму треугольников, ромбов, реже шестиугольников; создаётся впечатление конденсации их цитоплазмы, некоторые из них имеют резко базофильное конденсированное ядро. Других характерных морфологических признаков апоптоза [10] встретить не удалось.

Таблица 3

Частота структурных особенностей и реактивных изменений в разных типах нейронов спинального ганглиия L7

у интактных и оперированных собак

Признак Неоперированные собаки Опыт

А B A B

Эктопия ядра 0,9 % 2,7 % 1,7 % 1,7 %

Эктопия ядрышка 5,4 % 14,4 % 16,1 % 16,9 %

Центральный хроматолиз 0 0 1,7 % 0

"Очаговый периферический хроматолиз" 10,8 % 0,9 % 3,4 % 0

Ангулярные контуры цитона 0,9 % 5,4 % 5,9 % 8,5 %

Вакуолизация ядра 0 0 2,0 % 0,8 %

Вакуолизация цитоплазмы 1,8 % 0,9% 0,8 % 1,7 %

Цитоплазматические включения (липофусцин) 2,7 % 0 2,5 % 0

Изменения формы ядра 0 0,9 % 0 0,8 %

ОБСУЖДЕНИЕ

Функционально нейроны спинальных ганглиев гетерогенны, поскольку трансформируют афферентные сигналы разных рецепторных модальностей: тактильной, температурной, ноцицептивной и проприоцептивной [8]. В начале прошлого века делались попытки морфологической типизации нейронов по тинкториальным свойствам. По мнению A.R. Lieberman [7], большинство этих классификаций являются "эзотерическими", а М.В. Войно-Ясенецкий и Ю.М. Жаботинский [1] подчёркивали, что способность нейронов к окрашиванию в значительной мере определяется факторами артефициального характера и посмертными изменениями. Однако приведённое у А.А. За-варзина и С.И. Щелкунова [2] подразделение ганглионарных нейронов на светлые и тёмные было подтверждено в исследованиях J.-H. Scharf (1958) и K.H. Andres (1961), назвавших их типами A и B [цит. по 7, стр. 219]. Эта классификация получила широкое признание [8, 12, 13], поскольку было установлено, что нейроны A и B различаются не только тинкториальными свойствами и размерными характеристиками, но также деталями ультраструктуры, строением отростков, биохими-

ческими свойствами.

В нашем материале на светооптическом уровне наряду с типами A и B у интактных собак различимы разновидности А-нейронов: с равномерным распределением базо- и металло-фильных структур; с ослаблением базофилии и усилением металлофилии по периферии цитона, что, по-видимому, обусловлено сосредоточением в этой зоне главным образом элементов ци-тоскелета. Данное предположение согласуется с выводами специального исследования О.С. Сотникова и др. [3]. Экстримы распределения базофилии в А-нейронах выявляются у других видов животных в окрашенных толуидино-вым синим полутонких срезах [7]. Они соответствуют ультраструктурным подтипам А1 и А2, которые, по данным J.M. Jacobs [цит. по 7], различаются ультраструктурно по представительству и распределению аппарата Гольджи, гранулярного эндоплазматического ретикулума (ГЭР), свободных рибосом, нейрофиламентов. По данным литературы, у мышевидных грызунов [7] численные доли A и B-типов ганглио-нарных нейронов приблизительно равны. В на-

шем материале у всех четырех интактных собак выявлены незначительные различия ганглиев L5, L6, L7 по этому параметру. Его отличия от интактного материала у двух оперированных собак однонаправленны, невелики и статистически значимы только для ганглия L7. В комплексе с данными планиметрических исследований и результатами полуколичественной оценки качественных изменений нейронов типа A и B они заставляют предположить, что, несмотря на некоторое преобладание утраты нейронов типа B, к 12 месяцам после операции этот тип нейронов обладает меньшими отличиями от интактной нормы, чем популяция А. Анализ причин изменений размерных характеристик ядер и ядрышек в B-нейронах требует дополнительных исследований на большем количестве животных. Следует также отметить, что через 12 месяцев после повреждения нерва и восстановительной операции представительство клеток, которые находятся в состоянии денервационной атрофии и необратимых реактивных изменений, более значительно в популяции А по сравнению с популяцией B. Отсутствие сопоставления с ин-тактным материалом считается одним из главных источников неправильной интерпретации морфологических изменений нейронов [1], поэтому мы анализировали структурные особенности и реактивные изменения нейронов путём сопоставления частоты качественных признаков у оперированных и интактных собак. Это позволило дифференцированно оценить структурные особенности и реактивные изменения. О том, что тёмные нейроны с ангулярными контурами довольно-таки часто встречаются в нормальных интактных ганглиях разных видов животных, писали многие авторы [цит. по 7]. Высокая частота эктопии ядрышек в B-клетках

1. Изменения относительного содержания нейронов A и B типов в спинальных ганглиях L5-L7 у собак через 12 месяцев после нейротомии и восстановительной операции по сравнению с неопе-рированными животными указывают на то, что преобладание потери нейронов B-типа характерно лишь для определённого этапа регенерации.

2. Сопоставление частоты реактивных изменений и морфометрических характеристик нейронов A и B-типов с интактным материалом свидетельствует, что через 12 месяцев после повреждения и первичной восстановительной операции снижение структурно-функциональной активности более выражено в популяции А-клеток. Наряду с увеличением частоты премортальных изменений нейронов популяции А это заставляет предположить, что в отдалённые сроки после операции гибель B-нейронов замедляется и до-

седьмого поясничного ганглия у неоперирован-ных и оперированных собак, по-видимому, также должна интерпретироваться как их структурная особенность, а не патологическое изменение, поскольку, по данным литературы [7], в ганглиях грудного отдела мышевидных грызунов, кошек и зайцеобразных частота этого признака во всех нейронах варьирует от 50 до 100 %. В единичных работах в качестве реактивного изменения нейронов спинальных ганглиев рассматривается периферический хроматолиз. Так, частота "глобулярных и сфероидальных" хроматолитических образований, которые ультраструктурно соответствуют расширениям цистерн ГЭР, аккумуляциям нейрофиламентов и липидным каплям, выше у животных, перенесших субпериневральную инъекцию алюминий-содержащего раствора, по сравнению с интакт-ными животными [6]. В нашем материале этот признак преобладал в популяции А у интактных собак и практически не встречался у оперированных. Вероятно, он отражает структурно-функциональную активность нормальных нейронов, их участие в самовосстановлении мембранных структур, цитоскелетных протеинов, органелл, синтезе и секреции нейротрансмитте-ров. Это предположение хорошо подтверждается тем, что у нейронов с "периферическим хроматолизом", как правило, отмечается звёздооб-разная конфигурация хроматина в ядре, что считается [1] признаком высокой функциональной активности ядры-шка. Следовательно, снижение частоты рассматриваемого признака у оперированных животных можно трактовать как показатель сниженной структурно-функциональной активности нейронов, о чём также свидетельствует уже рассмотренное достоверное уменьшение средней площади перикариона.

минирует потеря А-нейронов.

3. Полученные данные об изменениях выживших нейронов в отдалённые сроки после повреждения нерва и восстановительной операции формируют представление о необходимости разработки и применения более специфической и длительной, чем это принято в настоящее время, нейротропной терапии у пациентов с травмами периферических нервов.

4. Разработанный в данном исследовании алгоритм оценки гистоморфометрических характеристик популяций нейронов, сочетающий количественные и полуколичественные параметры, может быть эффективно использован для сравнительных исследований результативности различных экспериментально моделируемых хирургических и терапевтических стратегий в лечении травм нервных стволов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Войно-Ясенецкий, М. В. Источники ошибок при морфологических исследованиях / М. В. Войно-Ясенецкий, Ю. М. Жаботин-ский. - Л. : Медицина, 1970. - 319 с.

2. Заварзин, А. А. Руководство по гистологии / А. А. Заварзин, С. И. Щелкунов. - М. : Медгиз, 1954.- 700 с.

3. Морфометрия переживающих и импрегнированных солями тяжёлых металлов нервных волокон / О. С. Сотников [и др.] // Арх. анат. - 1978.- Т. 94, № 5.- С. 57-62.

4. Axotomy-induced apoptosis in adult rat primary sensory neurons / M. J. Groves [et al.] // J. Neurocytol. - 1997. - Vol. 26, No 9. - P. 615624.

5. Systemic acetyl-L-carnitine eliminates sensory neuronal loss after peripheral axotomy : a new clinical approach in the management of peripheral nerve trauma / A. Hart [et al.] // Experimental Brain Research. - 2002. - Vol. 145, No 2. - P. 182-189.

6. Aluminum-induced model of motor neuron degeneration: subperineurial injection of aluminum in rabbits / T. Kihira [et al.] // Neurotox-icology, 1995.- V. 16, № 3.- P. 413-424.

7. Lieberman, A. R. Sensory ganglia / A. R. Lieberman // Peripheral Nerve / ed. D. N. S. Landon. - Halsted Press, 1976. - P. 189-277.

8. Lawson, S. N. Morphological and biochemical cell types of sensory neurons / S. N. Lawson // Sensory neurons : diversity, development and plasticity / ed. S. A. Scott. - New York : Oxford Univ. Press, 1992. - P. 27-59.

9. Neurogenesis in postnatal mouse dorsal root ganglia / M. P. Namaka [et al.] // Experimental Neurology. - 2001. -Vol. 172. - P. 60-69.

10. Oliveira, A. L. R. Apoptosis of sensory neurons and satellite cells after sciatic nerve transsection in C57BL/6J mice / A. L. R. Oliveira // Braz. J. Med. Biol. Res. - 2001. - Vol. 34, No 3. - P. 375-380.

11. Raffe, M. R. Peripheral nerve injuries in the dog. Part II. / M. R. Raffe // &>mpendium on Continuing Education for the Small Animal Practitioneer. - 1979. - Vol. 1. - P. 269-276.

12. Tandrup, T. Delayed loss of small dorsal root ganglion cells after transection of the rat sciatic nerve / T. Tandrup, C. J. Woolf, R. E. Coggeshall // J. Comp. Neurol. - 2000. - Vol. 422, No 2. - P. 172-180.

13. Vestergaard, S. Effect of permanent axotomy on number and volume of dorsal root ganglion cell bodies / S. Vestergaard, T. Tandrup, J. Jakobsen // J. Comp. Neurol. - 1997. - Vol. 388, No 2. - P. 307-312.

Рукопись поступила 20.08.04.