УЛЬТРАЯРКИЕ ДИМЕРНЫЕ ИЛИ ПОЛИМЕРНЫЕ КРАСИТЕЛИ СО СПЕЙСЕРНЫМИ ЛИНКЕРНЫМИ ГРУППАМИ
ULTRA-BRIGHT DIMER OR POLYMER DYES WITH SPACER LINKER GROUPS

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Область техники
Настоящее изобретение в целом относится к димерным и полимерным флуоресцентным или цветным красителям, имеющим жесткие спейсерные группы, и к способам их получения и применения в различных аналитических методах.
Описание предшествующего уровня техники
Известно, что флуоресцентные и/или цветные красители особенно подходят для применений, в которых желателен высокочувствительный детектирующий реагент. Красители, которые способны предпочтительно метить конкретный ингредиент или компонент в образце, дают возможность исследователю определять присутствие, количество и/или расположение этого конкретного ингредиента или компонента. Кроме того, можно осуществлять мониторинг специфических систем в отношении их пространственного и временного распределения в различных средах.
Флуоресцентные и колориметрические методы чрезвычайно распространены в химии и биологии. Эти методы дают полезную информацию о наличии, структуре, расстоянии, ориентации, комплексообразовании и/или расположении для биомолекул. Кроме того, методы с разрешением по времени все чаще используются в измерениях динамики и кинетики. В результате, разработано много стратегий флуоресцентного или цветного мечения биомолекул, таких как нуклеиновые кислоты и белки. Поскольку анализ биомолекул обычно происходит в водной среде, основное внимание уделяется разработке и использованию водорастворимых красителей.
Желательно использовать интенсивно флуоресцентные или цветные красители, поскольку использование таких красителей увеличивает отношение сигнал/шум и дает другие связанные с ними преимущества. В связи с этим, предпринимались попытки увеличить сигнал от известных флуоресцентных и/или цветных фрагментов. Например, димерные и полимерные соединения, содержащие два или более флуоресцентных и/или цветных фрагмента, были получены в ожидании того, что такие соединения будут давать более яркие красители. Однако в результате внутримолекулярного тушения флуоресценции известные димерные и полимерные красители не достигли желаемого увеличения яркости.
Таким образом, в данной области техники существует потребность в водорастворимых красителях, имеющих повышенную молярную яркость. В идеальном варианте, такие красители и биомаркеры должны быть интенсивно окрашенными или флуоресцентными и должны быть доступными в широком диапазоне цветов и при различных длинах волн флуоресценции. Настоящее изобретение удовлетворяет эту потребность и обеспечивает дополнительные связанные с ним преимущества.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Вкратце, варианты осуществления настоящего изобретения в целом относятся к соединениям, подходящим для применения в качестве водорастворимых, флуоресцентных и/или цветных красителей и/или зондов, которые дают возможность визуального обнаружения молекул аналита, таких как биомолекулы, а также к реагентам для их получения. Также описаны способы визуального обнаружения молекул аналита с применением красителей.
4
Описанные здесь варианты осуществления включают два или более флуоресцентных и/или цветных фрагмента, ковалентно связанных линкером («L»). В отличие от ранее опубликованных описаний димерных и/или полимерных красителей, настоящие красители значительно ярче, чем соответствующее соединение мономерного красителя. В то же время, не вдаваясь в теорию, считается, что линкерный фрагмент обеспечивает достаточное пространственное разделение между флуоресцентными и/или цветными фрагментами, благодаря чему внутримолекулярное тушение флуоресценции уменьшается и/или полностью исчезает.
Водорастворимые, флуоресцентные или цветные красители вариантов осуществления изобретения являются интенсивно окрашенными и/или флуоресцентными и могут быть легко обнаружены при визуальном исследовании или другими способами. В некоторых вариантах осуществления соединения могут наблюдаться без предшествующего подсвечивания или химической или ферментативной активации. С помощью соответствующего выбора красителя, как описано в данном документе, могут быть получены визуально обнаруживаемые молекулы аналита различных цветов.
В одном варианте осуществления предложены соединения, имеющие следующую структуру (I):
(I)
1
2
3
4
5
1
2
3
4
или их стереоизомер, таутомер или соль, где R, R, R, R, R, L, L, L, L, M, m и n являются такими, как определено в настоящем описании. Соединения структуры (I) находят применение в ряде областей, включая применение в качестве флуоресцентных и/или цветных красителей в различных аналитических методах.
В другом варианте осуществления предложен способ окрашивания образца, причем способ включает добавление в указанный образец соединения структуры (I) в количестве, достаточном для получения оптического отклика при подсвечивании образца при соответствующей длине волны.
В еще одних вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает способ визуального обнаружения молекулы аналита, включающий:
(a) обеспечение соединения (I); и
(b) обнаружение соединения по его визуальным свойствам.
Другие раскрываемые способы включают способ визуального обнаружения биомолекулы, причем способ включает:
(а) смешивание соединения структуры (I) с одной или несколькими биомолекулами; и
(b) обнаружение соединения по его визуальным свойствам.
Другие варианты осуществления предлагают способ визуального обнаружения аналита, причем способ включает:
2
3
(а) обеспечение соединения, как описано в настоящем документе, где R или R содержит линкер, содержащий ковалентную связь с нацеливающим фрагментом, имеющим специфичность в отношении аналита;
(b) смешивание соединения и аналита, связывающее таким образом нацеливающий фрагмент и аналит; и
(с) обнаружение соединения по его визуальным свойствам.
Другие варианты осуществления относятся к композиции, содержащей соединение структуры (I) и одну или несколько молекул аналита, таких как биомолекула. Также предложено применение таких композиций в аналитических методах для обнаружения одной или нескольких биомолекул.
В некоторых других вариантах осуществления предложено соединение структуры (II):
(II)
1
2
3
4
5
1a
2
3
4
или его стереоизомер, соль или таутомер, где R, R, R, R, R, L, L, L, L, G, m и n являются такими, как определено в данном описании. Соединения структуры (II) находят применение в ряде областей, включая применение в качестве интермедиатов для получения флуоресцентных и/или цветных красителей структуры (I).
В еще одних вариантах осуществления предложен способ мечения молекулы аналита, включающий:
2
3
(а) смешивание соединения структуры (II), где R или R представляет собой Q или линкер, содержащий ковалентную связь с Q, с молекулой аналита;
(b) образование конъюгата соединения и молекулы аналита; и
1b
2
3
1b
(c) взаимодействие конъюгата с соединением формулы M-L-G′, благодаря чему образуется по меньшей мере одна ковалентная связь в результате реакции G и G′, где R, R, Q, G и M-L-G′ являются такими, как определено в данном описании.
В некоторых других вариантах осуществления предложен способ мечения молекулы аналита, включающий:
2
3
1b
(а) смешивание соединения структуры (II), где R или R представляет собой Q или линкер, содержащий ковалентную связь с Q, с соединением формулы M-L-G′, благодаря чему образуется по меньшей мере одна ковалентная связь в результате реакции G и G′; и
2
3
1b
(b) взаимодействие продукта стадии (a) с молекулой аналита, в результате чего образуется конъюгат продукта стадии (a) и молекулы аналита, где R, R, Q, G и M-L-G′ являются такими, как определено в данном описании.
1b
1b
В еще одних вариантах осуществления предложен способ получения соединения структуры (I), включающий: смешивание соединения структуры (II) с соединением формулы M-L-G′, благодаря чему образуется по меньшей мере одна ковалентная связь в результате реакции G и G′, где G и M-L-G′ являются такими, как определено в данном описании.
Еще одни варианты осуществления относятся к флуоресцентному соединению, содержащему Y флуоресцентных фрагментов M, где флуоресцентное соединение имеет пик флуоресцентной эмиссии при возбуждении с заданной длиной волны ультрафиолетового света по меньшей мере на 85% от Y раз больший, чем пик флуоресцентной эмиссии одного М-фрагмента при возбуждении с такой же длиной волны ультрафиолетового света, и где Y является целым числом, равным 2 или более.
Эти и другие аспекты изобретения станут очевидными при обращении к следующему ниже подробному описанию.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фигурах одинаковые ссылочные позиции обозначают аналогичные элементы. Размеры и относительные положения элементов на фигурах необязательно приводятся в масштабе, и некоторые из этих элементов произвольно увеличены и расположены для улучшения читаемости фигуры. Кроме того, конкретные формы элементов в том виде, в котором они изображены, не предназначены для передачи какой-либо информации относительно фактической формы конкретных элементов, и были выбраны исключительно для облегчения распознавания на фигурах.
На фиг. 1 приводятся УФ-спектры поглощения репрезентативных соединений, содержащих триэтиленгликолевый спейсер, и сравнительного соединения при 5 мкм и рН 9.
На фиг. 2 приводятся данные УФ-поглощения репрезентативных соединений, содержащих гексаэтиленгликолевый спейсер, и сравнительного соединения при 5 мкм и рН 9.
На фиг. 3 приводятся эмиссионные спектры флуоресценции репрезентативных соединений, содержащих триэтиленгликолевый спейсер, и сравнительного соединения при 50 нм и рН 9.
На фиг. 4 приводятся эмиссионные спектры флуоресценции репрезентативных соединений, содержащих гексаэтиленгликолевый спейсер, и сравнительного соединения при 50 нм и рН 9.
На фиг. 5 представлены данные УФ-поглощения при 5 мкм для репрезентативных соединений, содержащих четыре гексаэтиленгликолевых спейсера и два или три флуоресцеиновых фрагмента, относительно сравнительного соединения, имеющего один флуоресцеиновый фрагмент.
На фиг. 6 приводится график флуоресцентной эмиссии при 5 мкм для репрезентативных соединений, содержащих четыре гексаэтиленгликолевых спейсера и два или три флуоресцеиновых фрагмента, относительно сравнительного соединения, имеющего один флуоресцеиновый фрагмент.
На фиг. 7 представлен сравнительный эмиссионный отклик флуоресценции для иллюстративных соединений с различными значениями m.
На фиг. 8 представлены данные, позволяющие сравнить флуоресцентную эмиссию для соединения HEG, где m равно 1, 2 или 3, относительно соединения A.
На фиг. 9 представлены данные по УФ-поглощению для соединения I-32, соединения I-46 и соединения В.
На фиг. 10 показаны результаты реакции тримеризации соединения I-42 на основе PAGE анализа.
На фиг. 11 приведены данные, позволяющие сравнить сигнал флуоресценции семи соединений в популяции мертвых и некротических клеток.
На фиг. 12 показана интенсивность флуоресценции конъюгата антитело-I-51 по сравнению с конъюгатом антитело-соединение G.
На фиг. 13 приводятся сравнения конъюгата I-51 и соединения G с эталонным антителом.
На фиг. 14 приводится сравнение UCHT1-I-51, UCHT1-BB515 и UCHT1-FITC.
На фиг. 15 показаны уровни экспрессии CD3 по сравнению со стандартной кривой MEF.
На фиг. 16 показано сравнение фракций UCHT1-I-16 с FITC.
На фиг. 17 показано сравнение фракций UCHT1-I-16 с конъюгатами I-56.
На фиг. 18 показано сравнение UCHT1-I-51-подобного аналога, UCHT1-I-16, с UCHT1-I-56 (10×) и UCHT1-I-53 (6×).
На фиг. 19 представлены данные, позволяющие сравнить UCHT1-I-51-подобный аналог, UCHT1-I-16, с UCHT1-I-56 (10×) и UCHT1-I-53 (6×).
На фиг. 20 показаны результаты регрессионного анализа, выполненного по данным, полученным при тестировании конъюгатов UCHT1-I-16 и UCHT1-I-49, чтобы продемонстрировать эквивалентность между конъюгатами.
На фиг. 21А показаны корреляции между I-16 и I-45, определенные с помощью регрессионного анализа. На фиг. 21В показано наложение кривых титрования и сравнивается с эталонами. На фиг. 21C приведены примеры качественных данных, показывающие фоновую FL и морфологию клеток, позволяющие сравнить Соединение D и I-45.
На фиг. 22 показаны кривые аффинности, в виде гистограмм, с эмиссией соединения, детектированной в канале FL1-A.
На фиг. 23А представлено сравнение интенсивности флуоресценции нецелевого, неспецифического связывания UCHT1-I-21B, UCHT1-I-16 и эталона, UCHT1-FITC, и на фиг. 23B представлены подтверждающие данные.
На фиг. 24 представлены результаты регрессионного анализа, который применялся к данным, для анализа корреляций и относительной аффинности.
На фиг. 25 показаны отношения сигнала к шуму для UCHT1-I-21B, UCHT1-I-51 и UCHT1-FITC.
На фиг. 26А и фиг. 26В представлены данные, сравнивающие UCHT1-Соединение G и UCHT1-I-51 в исследовании с плазменной интерференцией с использованием PBMC. На фиг. 26А показаны данные, полученные в результате добавления 0% глицина, и на фиг. 26В показаны данные, полученные в результате добавления 2,5% глицина.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
В следующем ниже описании некоторые конкретные подробности изложены для обеспечения полного понимания различных вариантов осуществления изобретения. Однако специалисту в данной области будет понятно, что изобретение может быть осуществлено и без этих подробностей.
Если из контекста не следует иное, во всем описании и формуле настоящего изобретения слово «содержать» и его варианты, такие как «содержит» и «содержащий», должны быть истолкованы в широком, охватывающем смысле, т.е. как «включающие без ограничения».
Ссылка во всем данном описании на «один вариант осуществления» или «вариант осуществления» означает, что конкретный признак, структура или характеристика, описанные в связи с вариантом осуществления, включены по меньшей мере в один из вариантов осуществления по настоящему изобретению. Соответственно, фразы «в одном варианте осуществления» или «в варианте осуществления», присутствующие в различных местах данного описания, не обязательно относятся все к одному и тому же варианту осуществления. Кроме того, конкретные признаки, структуры или характеристики могут быть объединены любым подходящим образом в одном или нескольких вариантах осуществления.
2
«Амино» относится к группе -NH.
2
«Карбокси» относится к группе -COH.
«Циано» относится к группе -CN.
«Формил» относится к группе -C(=O)H.
«Гидрокси» или «гидроксил» относится к группе -OH.
«Имино» относится к группе =NH.
2
«Нитро» относится к группе -NO.
«Оксо» относится к группе-заместителю =O.
«Сульфгидрил» относится к группе -SH.
«Тиоксо» относится к группе =S.
1
12
1
8
1
6
«Алкил» относится к группе с прямой или разветвленной углеводородной цепью, состоящей исключительно из атомов углерода и водорода, не содержащей ненасыщенности, имеющей от 1 до 12 атомов углерода (C-C алкил), от 1 до 8 атомов углерода (C-C алкил) или от 1 до 6 атомов углерода (C-C алкил), и которая присоединена к остальной части молекулы одинарной связью, как например, метил, этил, н-пропил, 1-метилэтил (изопропил), н-бутил, н-пентил, 1,1-диметилэтил (т-бутил), 3-метилгексил, 2-метилгексил, и тому подобное. Если в данном описании специально не указано иное, алкильные группы являются необязательно замещенными.
«Алкилен» или «алкиленовая цепь» относится к линейной или разветвленной двухвалентной углеводородной цепи, связывающей остальную часть молекулы с радикальной группой, состоящей исключительно из углерода и водорода, не содержащей ненасыщенности и имеющей от 1 до 12 атомов углерода, как например, метилен, этилен, пропилен, н-бутилен, этенилен, пропенилен, н-бутенилен, пропинилен, н-бутинилен и тому подобное. Алкиленовая цепь присоединена к остальной части молекулы через одинарную связь и к радикальной группе через одинарную связь. Местами присоединения алкиленовой цепи к остальной части молекулы и к радикальной группе могут быть один атом углерода или любые два атома углерода внутри цепи. Если в данном описании специально не указано иное, алкилен является необязательно замещенным.
«Алкенилен» или «алкениленовая цепь» относится к линейной или разветвленной двухвалентной углеводородной цепи, связывающей остальную часть молекулы с радикальной группой, состоящей исключительно из углерода и водорода, содержащей по меньшей мере одну двойную углерод-углеродную связь и имеющей от 2 до 12 атомов углерода, как например, этенилен, пропенилен, н-бутенилен и тому подобное. Алкениленовая цепь присоединена к остальной части молекулы через одинарную связь и к радикальной группе через двойную связь или одинарную связь. Местами присоединения алкениленовой цепи к остальной части молекулы и к радикальной группе могут быть один атом углерода или любые два атома углерода внутри цепи. Если в данном описании специально не указано иное, алкенилен является необязательно замещенным.
«Алкинилен» или «алкиниленовая цепь» относится к линейной или разветвленной двухвалентной углеводородной цепи, связывающей остальную часть молекулы с радикальной группой, состоящей исключительно из углерода и водорода, содержащей по меньшей мере одну тройную углерод-углеродную связь и имеющей от 2 до 12 атомов углерода, как например, этенилен, пропенилен, н-бутенилен и тому подобное. Алкиниленовая цепь присоединена к остальной части молекулы через одинарную связь и к радикальной группе через двойную связь или одинарную связь. Местами присоединения алкиниленовой цепи к остальной части молекулы и к радикальной группе могут быть один атом углерода или любые два атома углерода внутри цепи. Если в данном описании специально не указано иное, алкинилен является необязательно замещенным.
a
b
c
a
b
c
«Простой алкилэфир» относится к любой алкильной группе, определенной выше, в которой по меньшей мере одна углерод-углеродная связь заменена углерод-кислородной связью. Углерод-кислородная связь может находиться на терминальном конце (как в алкоксигруппе) или же углерод-кислородная связь может быть внутренней (т.е. С-О-С). Простые алкилэфиры включают по меньшей мере одну углерод-кислородную связь, но могут включать более одной. Например, полиэтиленгликоль (PEG) входит в значение простого алкилэфира. Если в данном описании специально не указано иное, простая алкилэфирная группа является необязательно замещенной. Например, в некоторых вариантах осуществления простой алкилэфир замещен спиртом или -OP(=R)(R)R, где каждый из R, R и R является таким, как определено для соединений структуры (I).
a
a
«Алкокси» относится к группе формулы -OR, где R представляет собой алкильную группу, как определено выше, содержащую от 1 до 12 атомов углерода. Если в данном описании специально не указано иное, алкоксигруппа является необязательно замещенной.
a
b
a
b
a
b
c
a
b
c
«Простой алкоксиалкилэфир» относится к группе формулы -ORR, где R представляет собой алкиленовую группу, как определено выше, содержащую от 1 до 12 атомов углерода, и R представляет собой простую алкилэфирную группу, как определено в настоящем описании. Если в данном описании специально не указано иное, простая алкоксиалкилэфирная группа является необязательно замещенной, например, замещенной спиртом или -OP(=R)(R)R, где каждый из R, R и R является таким, как определено для соединений структуры (I).
х
«Гетероалкил» относится к алкильной группе, как определено выше, содержащей по меньшей мере один гетероатом (например, N, O, P или S) внутри алкильной группы или на конце алкильной группы. В некоторых вариантах осуществления гетероатом находится внутри алкильной группы (т.е. гетероалкил содержит по меньшей мере одну связь углерод-[гетероатом]-углерод, где x равно 1, 2 или 3). В других вариантах осуществления гетероатом находится на конце алкильной группы и, таким образом, служит для присоединения алкильной группы к остальной части молекулы (например, M1-H-A, где M1 представляет собой часть молекулы, H представляет собой гетероатом, и А представляет собой алкильную группу). Если в данном описании специально не указано иное, гетероалкильная группа является необязательно замещенной. Приводимые в качестве примера гетероалкильные группы включают этиленоксид (например, полиэтиленоксид), необязательно включающий в себя фосфорно-кислородные связи, такие как сложные фосфодиэфирные связи.
a
a
«Гетероалкокси» относится к группе формулы -OR, где R представляет собой гетероалкильную группу, как определено выше, содержащую от 1 до 12 атомов углерода. Если в данном описании специально не указано иное, гетероалкоксигруппа является необязательно замещенной.
х
«Гетероалкилен» относится к алкиленовой группе, как определено выше, содержащей по меньшей мере один гетероатом (например, N, O, P или S) внутри алкиленовой цепи или на конце алкиленовой цепи. В некоторых вариантах осуществления гетероатом находится внутри алкиленовой цепи (т.е. гетероалкилен содержит по меньшей мере одну связь углерод-[гетероатом]-углерод, где x равно 1, 2 или 3). В других вариантах осуществления гетероатом находится на конце алкилена и, таким образом, служит для присоединения алкилена к остальной части молекулы (например, M1-H-A-М2, где M1 и М2 представляют собой части молекулы, H представляет собой гетероатом, и А представляет собой алкилен). Если в данном описании специально не указано иное, гетероалкиленовая группа является необязательно замещенной. Приводимые в качестве примера гетероалкиленовые группы включают этиленоксид (например, полиэтиленоксид) и линкерную группу «С», показанную ниже:
«C-линкер»
Мультимеры указанного выше С-линкера включены в различные варианты осуществления гетероалкиленовых линкеров.
«Гетероалкенилен» представляет собой гетероалкилен, как определено выше, содержащий по меньшей мере одну двойную углерод-углеродную связь. Если в данном описании специально не указано иное, гетероалкениленовая группа является необязательно замещенной.
«Гетероалкинилен» представляет собой гетероалкилен, содержащий по меньшей мере одну тройную углерод-углеродную связь. Если в данном описании специально не указано иное, гетероалкиниленовая группа является необязательно замещенной.
-
-
Выражение «гетероатомный» по отношению к «гетероатомному линкеру» относится к линкерной группе, состоящей из одного или нескольких гетероатомов. Приводимые в качестве примера гетероатомные линкеры включают одиночные атомы, выбранные из группы, состоящей из O, N, P и S, и несколько гетероатомов, например, линкер, имеющий формулу -P(O)(=O)O- или -OP(O)(=O)O-, и мультимеры и их сочетания.
a
b
a
c
b
c
c
-
-
+
«Фосфат» относится к группе -OP(=O)(R)R, где R представляет собой ОН, О или OR; и R представляет собой ОН, О, OR, тиофосфатную группу или дополнительную фосфатную группу, где R представляет собой противоион (например, Na и тому подобное).
a
b
a
c
b
c
a
b
c
a
b
c
-
+
«Фосфоалкил» относится к группе -OP(=O)(R)R, где R представляет собой ОН, О или OR; и R представляет собой -Оалкил, при этом R представляет собой противоион (например, Na и тому подобное). Если в данном описании специально не указано иное, фосфоалкильная группа является необязательно замещенной. Например, в некоторых вариантах осуществления -Оалкильный фрагмент в фосфоалкильной группе необязательно замещен одним или несколькими из гидроксила, амино, сульфгидрила, фосфата, тиофосфата, фосфоалкила, тиофосфоалкила, простого фосфоалкилэфира, простого тиофосфоалкилэфира или -OP(=R)(R)R, где каждый из R, R и R является таким, как определено для соединений структуры (I).
a
b
a
c
b
c
a
b
c
a
b
c
-
+
«Простой фосфоалкилэфир» относится к группе -OP(=O)(R)R, где R представляет собой ОН, О или OR; и R представляет собой простой -Оалкилэфир, при этом R представляет собой противоион (например, Na и тому подобное). Если в данном описании специально не указано иное, простая фосфоалкилэфирная группа является необязательно замещенной. Например, в некоторых вариантах осуществления -Оалкилэфирный фрагмент в простой фосфоалкилэфирной группе необязательно замещен одним или несколькими из гидроксила, амино, сульфгидрила, фосфата, тиофосфата, фосфоалкила, тиофосфоалкила, простого фосфоалкилэфира, простого тиофосфоалкилэфира или -OP(=R)(R)R, где каждый из R, R и R является таким, как определено для соединений структуры (I).
a
b
c
a
b
d
d
c
d
d
d
a
b
d
c
d
-
-
-
-
+
-
-
«Тиофосфат» относится к группе -OP(=R)(R)R, где R представляет собой О или S, R представляет собой OH, O, S, OR или SR; и R представляет собой OH, SH, O, S, OR, SR, фосфатную группу или дополнительную тиофосфатную группу, где R представляет собой противоион (например, Na и тому подобное) и при условии, что: i) R представляет собой S; ii) R представляет собой S или SR; iii) R представляет собой SH, S или SR; или iv) сочетание i), ii) и/или iii).
a
b
c
a
b
d
d
c
d
a
b
d
a
b
d
a
b
c
a
b
c
-
-
+
-
-
«Тиофосфоалкил» относится к группе -OP(=R)(R)R, где R представляет собой О или S, R представляет собой OH, O, S, OR или SR; и R представляет собой -Оалкил, при этом R представляет собой противоион (например, Na и тому подобное), и при условии, что: i) R представляет собой S; ii) R представляет собой S или SR; или iii) R представляет собой S, и R представляет собой S или SR. Если в данном описании специально не указано иное, тиофосфоалкильная группа является необязательно замещенной. Например, в некоторых вариантах осуществления -Оалкильный фрагмент в тиофосфоалкильной группе необязательно замещен одним или несколькими из гидроксила, амино, сульфгидрила, фосфата, тиофосфата, фосфоалкила, тиофосфоалкила, простого фосфоалкилэфира, простого тиофосфоалкилэфира или -OP(=R)(R)R, где каждый из R, R и R является таким, как определено для соединений структуры (I).
a
b
c
a
b
d
d
c
d
a
b
d
a
b
d
a
b
c
a
b
c
-
-
+
-
-
«Простой тиофосфоалкилэфир» относится к группе -OP(=R)(R)R, где R представляет собой О или S, R представляет собой OH, O, S, OR или SR; и R представляет собой простой -Оалкилэфир, при этом R представляет собой противоион (например, Na и тому подобное), и при условии, что: i) R представляет собой S; ii) R представляет собой S или SR; или iii) R представляет собой S, и R представляет собой S или SR. Если в данном описании специально не указано иное, простая тиофосфоалкилэфирная группа является необязательно замещенной. Например, в некоторых вариантах осуществления -Оалкилэфирный фрагмент в тиофосфоалкильной группе необязательно замещен одним или несколькими из гидроксила, амино, сульфгидрила, фосфата, тиофосфата, фосфоалкила, тиофосфоалкила, простого фосфоалкилэфира, простого тиофосфоалкилэфира или -OP(=R)(R)R, где каждый из R, R и R является таким, как определено для соединений структуры (I).
«Карбоциклический» относится к стабильному 3-18-членному ароматическому или неароматическому кольцу, содержащему от 3 до 18 атомов углерода. Если в данном описании специально не указано иное, карбоциклическое кольцо может быть моноциклической, бициклической, трициклической или тетрациклической кольцевой системой, которая может включать в себя конденсированные или мостиковые кольцевые системы и может быть частично или полностью насыщенной. Неароматические карбоциклильные радикалы включают циклоалкил, тогда как ароматические карбоциклильные радикалы включают арил. Если в данном описании специально не указано иное, карбоциклическая группа является необязательно замещенной.
«Циклоалкил» относится к стабильному неароматическому моноциклическому или полициклическому карбоциклическому кольцу, которое может включать в себя конденсированные или мостиковые кольцевые системы, имеющие от 3 до 15 атомов углерода, предпочтительно имеющие от 3 до 10 атомов углерода, и которое является насыщенным или ненасыщенным и присоединено к остальной части молекулы одинарной связью. Моноциклические циклоалкилы включают, например, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил и циклооктил. Полициклические циклоалкилы включают, например, адамантил, норборнил, декалинил, 7,7-диметилбицикло[2.2.1]гептанил и тому подобное. Если в данном описании специально не указано иное, циклоалкильная группа является необязательно замещенной.
«Арил» относится к кольцевой системе, содержащей по меньшей мере одно карбоциклическое ароматическое кольцо. В некоторых вариантах осуществления арил содержит от 6 до 18 атомов углерода. Арильное кольцо может быть моноциклической, бициклической, трициклической или тетрациклической кольцевой системой, которая может включать в себя конденсированные или мостиковые кольцевые системы. Арилы включают, без ограничения, арилы, полученные из ацеантрилена, аценафтилена, ацефенантрилена, антрацена, азулена, бензола, хризена, флуорантена, флуорена, ассим-индацена, симм-индацена, индана, индена, нафталина, феналена, фенантрена, плейадена, пирена и трифенилена. Если в данном описании специально не указано иное, арильная группа является необязательно замещенной.
«Гетероциклический» относится к стабильному 3-18-членному ароматическому или неароматическому кольцу, содержащему от 1 до 12 атомов углерода и от 1 до 6 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из азота, кислорода и серы. Если в данном описании специально не указано иное, гетероциклическое кольцо может быть моноциклической, бициклической, трициклической или тетрациклической кольцевой системой, которая может включать в себя конденсированные или мостиковые кольцевые системы; и атомы азота, углерода или серы в гетероциклическом кольце могут быть необязательно окислены; атом азота может быть необязательно кватернизирован; и гетероциклическое кольцо может быть частично или полностью насыщенным. Примеры ароматических гетероциклических колец перечислены ниже в определении гетероарилов (т.е. гетероарил является подгруппой гетероциклических колец). Примеры неароматических гетероциклических колец включают, без ограничения, диоксоланил, тиенил[1,3]дитианил, декагидроизохинолил,имидазолинил, имидазолидинил, изотиазолидинил, изоксазолидинил, морфолинил, октагидроиндолил, октагидроизоиндолил, 2-оксопиперазинил, 2-оксопиперидинил, 2-оксопирролидинил, оксазолидинил, пиперидинил, пиперазинил, 4-пиперидонил, пирролидинил, пиразолидинил, пиразолопиримидинил, хинуклидинил, тиазолидинил, тетрагидрофурил, триоксанил, тритианил, триазинанил, тетрагидропиранил, тиоморфолинил, тиаморфолинил, 1-оксотиоморфолинил, и 1,1-диоксотиоморфолинил. Если в данном описании специально не указано иное, гетероциклическая группа является необязательно замещенной.
«Гетероарил» относится к 5-14-членной кольцевой системе, содержащей от 1 до 13 атомов углерода, от 1 до 6 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из азота, кислорода и серы, и по меньшей мере одно ароматическое кольцо. Для целей некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения, гетероарильный радикал может быть моноциклической, бициклической, трициклической или тетрациклической кольцевой системой, которая может включать в себя конденсированные или мостиковые кольцевые системы; и атомы азота, углерода или серы в гетероарильном радикале могут быть необязательно окислены; атом азота может быть необязательно кватернизирован. Примеры включают, без ограничения, азепинил, акридинил, бензимидазолил, бензтиазолил, бензиндолил, бензодиоксолил, бензофуранил, бензоксазолил, бензотиазолил, бензотиадиазолил, бензо[b][1,4]диоксепинил, 1,4-бензодиоксанил, бензонафтофуранил, бензоксазолил, бензодиоксолил, бензодиоксинил, бензопиранил, бензопиранонил, бензофуранил, бензофуранонил, бензотиенил (бензотиофенил), бензотриазолил, бензо[4,6]имидазо[1,2-a]пиридинил, бензоксазолинонил, бензимидазолтионил, карбазолил, циннолинил, дибензофуранил, дибензотиофенил, фуранил, фуранонил, изотиазолил, имидазолил, индазолил, индолил, индазолил, изоиндолил, индолинил, изоиндолинил, изохинолил, индолизинил, изоксазолил, нафтиридинил, оксадиазолил, 2-оксоазепинил, оксазолил, оксиранил, 1-оксидопиридинил, 1-оксидопиримидинил, 1-оксидопиразинил, 1-оксидопиридазинил, 1-фенил-1H-пирролил, феназинил, фенотиазинил, феноксазинил, фталазинил, птеридинил, птеридинонил, пуринил, пирролил, пиразолил, пиридинил, пиридинонил, пиразинил, пиримидинил, пиримидинонил, пиридазинил, пирролил, пиридо[2,3-д]пиримидинонил, хиназолинил, хиназолинонил, хиноксалинил, хиноксалинонил, хинолинил, изохинолинил, тетрагидрохинолинил, тиазолил, тиадиазолил, тиено[3,2-д]пиримидин-4-онил, тиено[2,3-д]пиримидин-4-онил, триазолил, тетразолил, триазинил, и тиофенил (т.е. тиенил). Если в данном описании специально не указано иное, гетероарильная группа является необязательно замещенной.
«Конденсированный» относится к кольцевой системе, содержащей, по меньшей мере, два кольца, при этом два кольца имеют по меньшей мере один общий кольцевой атом, например, два общих кольцевых атома. Когда конденсированное кольцо представляет собой гетероциклильное кольцо или гетероарильное кольцо, общим кольцевым атомом (атомами) может быть углерод или азот. Конденсированные кольца включают бициклические, трициклические, тетрациклические и тому подобное.
,
,
N
N-
N
N
g
h
g
h
g
g
h
g
h
g
2
h
g
h
g
g
g
2
g
2
g
2
g
2
g
2
g
h
g
g
g
h
2
2
g
2
2
g
h
g
h
a
b
c
a
b
c
Термин «замещенный», используемый в настоящем документе, означает любую из вышеуказанных групп (напримералкил, алкилен, алкенилен, алкинилен, гетероалкилен, гетероалкенилен, гетероалкинилен, алкокси, простой алкилэфир, простой алкоксиалкилэфир, гетероалкил, гетероалкокси, фосфоалкил, простой фосфоалкилэфир, тиофосфоалкил, простой тиофосфоалкилэфир, карбоциклик, циклоалкил, арил, гетероциклик и/или гетероарил), в которой по меньшей мере один атом водорода (например 1, 2, 3 или все атомы водорода) заменен связью с неводородными атомами, такими как, без ограничения: атом галогена, такой как F, Cl, Br и I; атом кислорода в группах, таких как гидроксильные группы, алкоксигруппы и сложноэфирные группы; атом серы в группах, таких как тиольные группы, тиоалкильные группы, сульфоновые группы, сульфонильные группы и сульфоксидные группы; атом азота в группах, таких как амины, амиды, алкиламины, диалкиламины, ариламины, алкилариламины, диариламины, N-оксиды, имиды и енамины; атом кремния в группах, таких как триалкилсилильные группы, диалкиларилсилильные группы, алкилдиарилсилильные группы и триарилсилильные группы; и другие гетероатомы в различных других группах. «Замещенный» также означает любую из указанных выше групп, в которых один или более атомов водорода заменены связью более высокого порядка (например, двойной или тройной связью) с гетероатомом, таким как кислород в оксо, карбонильной, карбоксильной и сложноэфирной группах; и азот в таких группах, как имины, оксимы, гидразоны и нитрилы. Например, «замещенный» включает любую из перечисленных выше групп, в которой один или более атомов водорода заменены на -NRR, -NRC(=O)R, -NRC(=O)NRR, -NRC(=O)OR, -NRSOR, -OC(=O)NRR, -OR, -SR, -SOR, -SOR, -OSOR, -SOOR, =NSOR и -SONRR. «Замещенный» также означает любую из указанных выше групп, в которых один или более атомов водорода заменены на -C(=O)R, -C(=O)OR, -C(=O)NRR, -CHSOR, -CHSONRR. В приведенном выше описании R и R являются одинаковыми или различными и независимо друг от друга представляют водород, алкил, алкокси, алкиламино, тиоалкил, арил, аралкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, галогеналкил, гетероциклил, -гетероциклил, гетероциклилалкил, гетероарил, гетероарил и/или гетероарилалкил. «Замещенный» также означает любую из указанных выше групп, в которых один или более атомов водорода заменены связью с амино, циано, гидроксильной, имино, нитро, оксо, тиоксо, галогеновой, алкильной, алкокси, алкиламино, тиоалкильной, арильной, аралкильной, циклоалкильной, циклоалкилалкильной, галогеналкильной, гетероциклильной, -гетероциклильной, гетероциклилалкильной, гетероарильной, -гетероарильной и/или гетероарилалкильной группой. В некоторых вариантах осуществления необязательным заместителем является -OP(=R)(R)R, где каждый из R, R и R является таким, как определено для соединений структуры (I). В дополнение к этому, каждый из перечисленных выше заместителей также может быть необязательно замещен одним или более из указанных выше заместителей.
«Конъюгирование» относится к перекрыванию одной р-орбитали с другой р-орбиталью через промежуточную сигма-связь. Конъюгирование может происходить в циклических или ациклических соединениях. «Степень конъюгирования» относится к перекрыванию по меньшей мере одной р-орбитали с другой р-орбиталью через промежуточную сигма-связь. Например, 1,3-бутадиен имеет одну степень конъюгирования, тогда как бензол и другие ароматические соединения обычно имеют несколько степеней конъюгирования. Флуоресцентные и цветные соединения обычно имеют по меньшей мере одну степень конъюгирования.
«Флуоресцентный» относится к молекуле, которая способна поглощать свет определенной частоты и излучать свет другой частоты. Флуоресценция хорошо известна специалистам в данной области техники.
«Цветной» относится к молекуле, которая поглощает свет в цветном спектре (т.е. красном, желтом, синем и тому подобное).
«Линкер» относится к непрерывной цепи по меньшей мере одного атома, такого как углерод, кислород, азот, сера, фосфор и их сочетания, которая соединяет часть молекулы с другой частью этой же самой молекулы или с другой молекулой, фрагментом или твердым носителем (например, микрочастицей). Линкеры могут соединять молекулу с помощью ковалентной связи или других механизмов взаимодействий, таких как образование ионных или водородных связей.
Термин «биомолекула» относится к любому из множества биологических материалов, включая нуклеиновые кислоты, углеводы, аминокислоты, полипептиды, гликопротеины, гормоны, аптамеры и их смеси. Более конкретно, этот термин включает, без ограничения, РНК, ДНК, олигонуклеотиды, модифицированные или дериватизированные нуклеотиды, ферменты, рецепторы, прионы, лиганды рецепторов (включая гормоны), антитела, антигены и токсины, а также бактерии, вирусы, клетки крови и клетки тканей. Визуально обнаруживаемые биомолекулы по изобретению (например, соединения структуры (I), имеющие связанную с ними биомолекулу) получают, как описано далее, путем контактирования биомолекулы с соединением, имеющим реакционноспособную группу, которая позволяет присоединять биомолекулу к соединению через любой доступный атом или функциональную группу, такую как, амино, гидрокси, карбоксильная или сульфгидрильная группа на биомолекуле.
«Реакционноспособная группа» представляет собой фрагмент, способный реагировать со вторыми реакционноспособными группами (например, «комплементарной реакционноспособной группой») с образованием одной или более ковалентных связей, например, путем реакции замещения, окисления, восстановления, присоединения или циклоприсоединения. Приводимые в качестве примера реакционноспособные группы приводятся в таблице 1, и включают, например, нуклеофилы, электрофилы, диены, диенофилы, альдегид, оксим, гидразон, алкин, амин, азид, ацилазид, ацилгалогенид, нитрил, нитрон, сульфгидрил, дисульфид, сульфонилгалогенид, изотиоцианат, сложный имидоэфир, активированный сложный эфир, кетон, α,β-ненасыщенный карбонил, алкен, малеимид, α-галогенимид, эпоксид, азиридин, тетразин, тетразол, фосфин, биотин, тииран и тому подобное.
-1
-1
Термины «видимый» и «визуально обнаруживаемый» используются в настоящем документе для обозначения веществ, которые можно наблюдать при визуальном исследовании, без предшествующего подсвечивания или химической или ферментативной активации. Такие визуально обнаруживаемые вещества поглощают и излучают свет в области спектра в диапазоне от примерно 300 нм до примерно 900 нм. Предпочтительно такие вещества интенсивно окрашены, предпочтительно имеют молярный коэффициент экстинкции по меньшей мере примерно 40000, более предпочтительно по меньшей мере примерно 50000, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 60000, даже еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 70000, и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 80000 Мсм. Соединения по изобретению могут быть обнаружены путем наблюдения невооруженным глазом или с помощью оптического обнаруживающего устройства, включая, без ограничения, абсорбционные спектрофотометры, просвечивающие микроскопы, цифровые камеры и сканеры. Визуально обнаруживаемые вещества не ограничиваются веществами, которые излучают и/или поглощают свет в видимом спектре. Вещества, которые излучают и/или поглощают свет в ультрафиолетовой (УФ) области (от примерно 10 нм до примерно 400 нм), инфракрасной (ИК) области (от примерно 700 нм до примерно 1 мм), и вещества, излучающие и/или поглощающие в других областях электромагнитного спектра, также входят в объем термина «визуально обнаруживаемые» вещества.
Для целей вариантов осуществления изобретения термин «фотостабильный видимый краситель» относится к химическому фрагменту, который является визуально обнаруживаемым, как определено выше, и не подвергается существенному изменению или разложению под воздействием света. Предпочтительно, фотостабильный видимый краситель не проявляет существенного обесцвечивания или разложения после воздействия света в течение, по меньшей мере, одного часа. Более предпочтительно, видимый краситель стабилен после воздействия света в течение по меньшей мере 12 ч, еще более предпочтительно по меньшей мере 24 ч, еще более предпочтительно по меньшей мере одной недели и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, одного месяца. Неограничивающие примеры фотостабильных видимых красителей, подходящих для применения в соединениях и способах изобретения, включают азокрасители, тиоиндиговые красители, хинакридоновые пигменты, диоксазин, фталоцианин, перинон, дикетопирролопиррол, хинофталон и триарилкарбоний.
Используемый в настоящем документе термин «производное перилена» подразумевает включение любого замещенного перилена, который является визуально обнаруживаемым. Однако этот термин не предполагает включения самого перилена. Термины «производное антрацена», «производное нафталина» и «производное пирена» используются аналогично. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления производное (например, производное перилена, пирена, антрацена или нафталина) представляет собой имидное, бисимидное или гидразаимидное производное перилена, антрацена, нафталина или пирена.
Визуально обнаруживаемые молекулы различных вариантов осуществления изобретения подходят для широкого спектра аналитических применений, таких как биохимические и биомедицинские применения, в которых необходимо определить присутствие, расположение или количество конкретного аналита (например, биомолекулы). В связи с этим, в другом аспекте изобретение предлагает способ визуального обнаружения биомолекулы, включающий: (а) обеспечение биологической системы с визуально обнаруживаемой биомолекулой, содержащей соединение структуры (I), связанное с биомолекулой; и (b) обнаружение биомолекулы по ее видимым свойствам. Для целей изобретения фраза «обнаружение биомолекулы по ее видимым свойствам» означает, что биомолекула, без подсвечивания или химической или ферментативной активации, наблюдается невооруженным глазом, или с помощью оптического детектирующего устройства, включая, без ограничения, абсорбционные спектрофотометры, просвечивающие микроскопы, цифровые камеры и сканеры. Денситометр может использоваться для количественной оценки присутствующей визуально обнаруживаемой биомолекулы. Например, относительное количество биомолекулы в двух образцах можно определить путем измерения относительной оптической плотности. Если известна стехиометрия молекул красителя на одну биомолекулу и известен коэффициент экстинкции молекулы красителя, тогда абсолютная концентрация биомолекулы также может быть определена по измерению оптической плотности. Используемый в настоящем документе термин «биологическая система» используется для обозначения любого раствора или смеси, содержащих одну или несколько биомолекул в дополнение к визуально обнаруживаемой биомолекуле. Неограничивающие примеры таких биологических систем включают клетки, клеточные экстракты, образцы тканей, электрофоретические гели, смеси для анализа и реакционные смеси для гибридизации.
«Твердый носитель» относится к любому твердому субстрату, известному в данной области техники для твердофазного носителя молекул, например, «микрочастица» относится к любому из ряда мелких частиц, пригодных для присоединения к соединениям изобретения, включая, без ограничения, стеклянные гранулы, магнитные гранулы, полимерные гранулы, неполимерные гранулы и тому подобное. В некоторых вариантах осуществления изобретения микрочастицы включают полистирольные гранулы.
Термин «остаток твердого носителя» относится к функциональной группе, остающейся присоединенной к молекуле, когда молекула отщеплена от твердого носителя. Остатки твердого носителя известны в данной области техники и могут быть легко получены на основе структуры твердого носителя и группы, связывающей молекулу с ним.
«Нацеливающий фрагмент» представляет собой фрагмент, который селективно связывается или ассоциирует с определенной мишенью, такой как молекула аналита. «Селективное» связывание или ассоциирование означает, что нацеливающий фрагмент предпочтительно ассоциирует или связывается с желаемой мишенью по сравнению с другими мишенями. В некоторых вариантах осуществления соединения, описанные в настоящем документе, включают связи с нацеливающими фрагментами с целью селективного связывания или ассоциирования соединения с представляющим интерес аналитом (т.е. мишенью нацеливающего фрагмента), что позволяет обнаруживать аналит. Приводимые в качестве примера нацеливающие фрагменты включают, без ограничения, антитела, антигены, последовательности нуклеиновых кислот, ферменты, белки, антагонисты рецепторов клеточной поверхности, и тому подобное. В некоторых вариантах осуществления нацеливающий фрагмент представляет собой фрагмент, такой как антитело, который селективно связывается или ассоциирует со свойством-мишенью на поверхности или внутри клетки, например, свойством-мишенью на клеточной мембране или другой клеточной структуре, тем самым, позволяя обнаруживать представляющие интерес клетки. Небольшие молекулы, которые избирательно связываются или ассоциируют с желаемым аналитом, также рассматриваются как нацеливающие фрагменты в некоторых вариантах осуществления. Специалисту в данной области будут понятны другие аналиты и соответствующие нацеливающие фрагменты, которые будут применяться в различных вариантах осуществления.
«Фрагмент спаривания оснований» относится к гетероциклическому фрагменту, способному к гибридизации с комплементарным гетероциклическим фрагментом посредством водородных связей (например, спаривание оснований по Уотсону-Крику). Фрагменты спаривания оснований включают основания природного и не природного происхождения. Неограничивающие примеры фрагментов спаривания оснований представляют собой основания РНК и ДНК, такие как аденозин, гуанозин, тимидин, цитозин и уридин, и их аналоги.
2
3
11
13
14
13
15
15
17
18
31
32
35
18
36
123
125
Также подразумевается, что варианты осуществления изобретения, описанные в настоящем документе, охватывают все соединения структуры (I) или (II), которые являются изотопно-меченными путем замещения одного или более атомов на атом, имеющий другую атомную массу или массовое число. Примеры изотопов, которые могут быть включены в описанные соединения, включают изотопы водорода, углерода, азота, кислорода, фосфора, фтора, хлора и йода, такие как H, H, C,C, C, N,N, O, O, O, P, P, S, F, Cl, I и I, соответственно.
Изотопно-меченные соединения структуры (I) или (II) обычно могут быть получены традиционными методами, известными специалистам в данной области техники, или способами, аналогичными описанным ниже способам, и в следующих примерах с использованием соответствующего изотопно-меченного реагента вместо немеченного реагента, применявшегося ранее.
«Стабильное соединение» и «стабильная структура» означают соединение, которое является достаточно прочным, чтобы выдерживать выделение из реакционной смеси до пригодной к использованию степени чистоты и для включения в эффективный терапевтический препарат.
«Необязательный» или «необязательно» означает, что описываемое далее событие или обстоятельства могут происходить или могут и не происходить, и что описание включает примеры, где указанное событие или обстоятельство происходит, и примеры, где оно не происходит. Например, «необязательно замещенный алкил» означает, что алкильная группа может быть или может и не быть замещена, и что описание включает в себя как замещенные алкильные группы, так и алкильные группы, не имеющие замещения.
«Соль» включает как кислотно-, так и основно-аддитивные соли.
«Кислотно-аддитивная соль» относится к таким солям, которые образованы с неорганическими кислотами, такими как, без ограничения, соляная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и тому подобное; и органическими кислотами, такими как, без ограничения, уксусная кислота, 2,2-дихлоруксусная кислота, адипиновая кислота, альгиновая кислота, аскорбиновая кислота, аспарагиновая кислота, бензолсульфоновая кислота, бензойная кислота, 4-ацетамидобензойная кислота, камфорная кислота, камфоро-10-сульфоновая кислота, каприновая кислота, капроновая кислота, каприловая кислота, угольная кислота, коричная кислота, лимонная кислота, цикламовая кислота, додецилсерная кислота, этан-1,2-дисульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота, муравьиная кислота, фумаровая кислота, галактаровая кислота, гентизиновая кислота, глюкогептоновая кислота, глюконовая кислота, глюкуроновая кислота, глутаминовая кислота, глутаровая кислота, 2-оксоглутаровая кислота, глицерофосфорная кислота, гликолевая кислота, гиппуровая кислота, изомасляная кислота, молочная кислота, лактобионовая кислота, лауриновая кислота, малеиновая кислота, яблочная кислота, малоновая кислота, миндальная кислота, метансульфоновая кислота, муциновая кислота, нафталин-1,5-дисульфоновая кислота, нафталин-2-сульфоновая кислота, 1-гидрокси-2-нафтойная кислота, никотиновая кислота, олеиновая кислота, оротовая кислота, щавелевая кислота, пальмитиновая кислота, памовая кислота, пропионовая кислота, пироглутаминовая кислота, пировиноградная кислота, салициловая кислота, 4-аминосалициловая кислота, себациновая кислота, стеариновая кислота, янтарная кислота, винная кислота, тиоциановая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, трифторуксусная кислота, ундециленовая кислота, и тому подобное.
N
«Основно-аддитивная соль» относится к солям, которые получены добавлением неорганического основания или органического основания к свободной кислоте. Соли, полученные из неорганических оснований, включают, без ограничения, соли натрия, калия, лития, аммония, кальция, магния, железа, цинка, меди, марганца, алюминия, и тому подобные. Соли, полученные из органических оснований, включают, без ограничения, соли первичных, вторичных и третичных аминов, замещенных аминов, в том числе природных замещенных аминов, циклических аминов и основных ионообменных смол, таких как аммиак, изопропиламин, триметиламин, диэтиламин, триэтиламин, трипропиламин, диэтаноламин, этаноламин, динол, 2-диметиламиноэтанол, 2 диэтиламиноэтанол, дициклогексиламин, лизин, аргинин, гистидин, кофеин, прокаин, гидрабамин, холин, бетаин, бенетамин, бензатин, этилендиамин, глюкозамин, метилглюкамин, теобромин, триэтаноламин, трометамин, пурины, пиперазин, пиперидин,  этилпиперидин, полиаминные смолы, и тому подобное. Особенно предпочтительными органическими основаниями являются изопропиламин, диэтиламин, этаноламин, триметиламин, дициклогексиламин, холин и кофеин.
Кристаллизация может приводить к получению сольватов соединений, описанных в настоящей заявке. Варианты осуществления настоящего изобретения включают все сольваты описанных соединений. Используемый в настоящем документе термин «сольват» относится к комплексу, который содержит одну или несколько молекул соединения по изобретению вместе с одной или несколькими молекулами растворителя. Растворителем может быть вода, и в этом случае сольват может представлять собой гидрат. В качестве альтернативы, растворителем может быть органический растворитель. Таким образом, соединения настоящего изобретения могут существовать в виде гидрата, включая моногидрат, дигидрат, полугидрат, полуторагидрат, тригидрат, тетрагидрат и тому подобное, а также в виде соответствующих сольватированных форм. Соединения по изобретению могут быть истинными сольватами, тогда как в других случаях соединения по изобретению могут просто сохранять дополнительную воду или другой растворитель, или быть смесью воды и некоторого количества дополнительного растворителя.
R
S
R
S
Варианты осуществления соединений по изобретению (например, соединений структуры I или II) или их солей, таутомеров или сольватов могут содержать один или несколько асимметричных центров и могут, таким образом, образовывать энантиомеры, диастереомеры и другие стереоизомерные формы, которые могут быть определены в терминах абсолютной стереохимии как ()- или ()-, или как (D)- или (L)- для аминокислот. Варианты осуществления настоящего изобретения предполагают включение всех таких возможных изомеров, а также их рацемических и оптически чистых форм. Оптически активные (+) и (-), ()- и ()-, или (D)- и (L)-изомеры могут быть получены с использованием хиральных синтонов или хиральных реагентов, или выделены с помощью традиционных методов, например, хроматографии и фракционной кристаллизации. Традиционные методы получения/выделения отдельных энантиомеров включают хиральный синтез из подходящего оптически чистого предшественника или разделение рацемата (или рацемата соли или производного) используя, например, хиральную жидкостную хроматографию высокого давления (HPLC, ВЭЖХ). Когда описанные здесь соединения содержат олефиновые двойные связи или другие центры геометрической асимметрии, и если не указано иное, подразумевается, что соединения включают как Е, так и Z геометрические изомеры. Аналогичным образом, также подразумевается, что должны быть включены все таутомерные формы.
«Стереоизомер» относится к соединению, состоящему из тех же атомов, связанных такими же связями, но имеющему другие трехмерные структуры, которые не являются взаимозаменяемыми. Настоящее изобретение предусматривает разные стереоизомеры и их смеси и включает «энантиомеры», что относится к двум стереоизомерам, молекулы которых являются несовместимыми при наложении зеркальными изображениями друг друга.
«Таутомер» относится к протонному сдвигу от одного атома молекулы к другому атому этой же самой молекулы. Настоящее изобретение включает таутомеры любых указанных соединений. Различные таутомерные формы соединений могут быть легко получены специалистами в данной области.
Используемые здесь химические названия и структурные схемы являются модифицированной формой номенклатурной системы IUPAC, полученными при помощи программного обеспечения ACD/Name Version 9.07 и/или программы присваивания названий ChemDraw Ultra Version 11.0 (CambridgeSoft). Также используются общепринятые названия, известные специалистам в данной области техники.
Как отмечалось выше, в одном варианте осуществления настоящего изобретения предложены соединения, подходящие в качестве флуоресцентных и/или цветных красителей в различных аналитических методах. В других вариантах осуществления предложены соединения, подходящие в качестве синтетических интермедиатов для получения соединений, используемых в качестве флуоресцентных и/или цветных красителей. В общих чертах варианты осуществления настоящего изобретения относятся к димерам и более высокомолекулярным полимерам флуоресцентных и/или цветных фрагментов. Флуоресцентные и/или цветные фрагменты связаны линкерным фрагментом. Не желая быть связанными теорией, полагают, что линкер способствует сохранению достаточного пространственного расстояния между флуоресцентными и/или цветными фрагментами, благодаря чему внутримолекулярное тушение уменьшается и/или полностью исчезает, что приводит к образованию соединения красителя, имеющего высокую молярную «яркость» (например, высокую флуоресцентную эмиссию).
Соответственно, в некоторых вариантах осуществления соединения имеют следующую структуру (А):
(A)
1
2
3
1
2
3
где L представляет собой линкер, достаточный для поддержания пространственного разделения между одной или более (например, каждой) М-группой, благодаря чему внутримолекулярное тушение уменьшается или полностью исчезает, и R, R, R, L, L, L и n являются такими, как определено для структуры (I). В некоторых вариантах осуществления структуры (А) L представляет собой линкер, содержащий один или более этиленгликолевых или полиэтиленгликолевых фрагментов.
В других вариантах осуществления предложено соединение, имеющее следующую структуру (I):
(I)
или его стереоизомер, соль или таутомер, где:
M в каждом случае независимо представляет собой фрагмент, имеющий две или более двойные углерод-углеродные связи и по меньшей мере одну степень конъюгирования;
1
L в каждом случае независимо представляет собой или: i) необязательный алкиленовый, алкениленовый, алкиниленовый, гетероалкиленовый, гетероалкениленовый, гетероалкиниленовый или гетероатомный линкер; или ii) линкер, содержащий функциональную группу, способную к образованию путем реакции двух комплементарных реакционноспособных групп;
2
3
L и L в каждом случае независимо представляют собой необязательный алкиленовый, алкениленовый, алкиниленовый, гетероалкиленовый, гетероалкениленовый, гетероалкиниленовый или гетероатомный линкер;
4
L в каждом случае независимо представляет собой гетероалкиленовый, гетероалкениленовый или гетероалкиниленовый линкер более трех атомов в длину, при этом гетероатомы в гетероалкиленовом, гетероалкениленовом и гетероалкиниленовом линкере выбраны из O, N и S;
1
R в каждом случае независимо представляет собой H, алкил или алкокси;
2
3
a
b
c
каждый из R и R независимо представляет собой H, OH, SH, алкил, алкокси, простой алкилэфир, гетероалкил, -OP(=R)(R)R, Q или L';
4
-
-
d
d
R в каждом случае независимо представляет собой OH, SH, O, S, OR или SR;
5
R в каждом случае независимо представляет собой оксо, тиоксо или отсутствует;
a
R представляет собой O или S;
b
d
d
-
-
R представляет собой OH, SH, O, S, OR или SR;
c
d
d
-
-
R представляет собой OH, SH, O, S, OR, OL', SR, алкил, алкокси, гетероалкил, гетероалкокси, простой алкилэфир, простой алкоксиалкилэфир, фосфат, тиофосфат, фосфоалкил, тиофосфоалкил, простой фосфоалкилэфир или простой тиофосфоалкилэфир;
d
R представляет собой противоион;
Q в каждом случае независимо представляет собой фрагмент, содержащий реакционноспособную группу или ее защищенный аналог, способный образовывать ковалентную связь с молекулой аналита, нацеливающим фрагментом, твердым носителем или комплементарной реакционноспособной группой Q′;
L' в каждом случае независимо представляет собой линкер, содержащий ковалентную связь с Q, линкер, содержащий ковалентную связь с нацеливающим фрагментом, линкер, содержащий ковалентную связь с молекулой аналита, линкер, содержащий ковалентную связь с твердым носителем, линкер, содержащий ковалентную связь с остатком твердого носителя, линкер, содержащий ковалентную связь с нуклеозидом, или линкер, содержащий ковалентную связь с другим соединением структуры (I);
m в каждом случае независимо представляет собой целое число, равное нулю или большее, при условии, что, по меньшей мере, в одном случае m представляет собой целое число, равное единице или большее; и
n является целым числом, равным единице или большим.
В других вариантах осуществления соединения структуры (I):
M в каждом случае независимо представляет собой фрагмент, имеющий две или более двойные углерод-углеродные связи и по меньшей мере одну степень конъюгирования;
1
L в каждом случае независимо представляет собой или: i) необязательный алкиленовый, алкениленовый, алкиниленовый, гетероалкиленовый, гетероалкениленовый, гетероалкиниленовый или гетероатомный линкер; или ii) линкер, содержащий функциональную группу, способную к образованию путем реакции двух комплементарных реакционноспособных групп;
2
3
L и L в каждом случае независимо представляют собой необязательный алкиленовый, алкениленовый, алкиниленовый, гетероалкиленовый, гетероалкениленовый, гетероалкиниленовый или гетероатомный линкер;
4
L в каждом случае независимо представляет собой гетероалкиленовый, гетероалкениленовый или гетероалкиниленовый линкер более трех атомов в длину, при этом гетероатомы в гетероалкиленовом, гетероалкениленовом и гетероалкиниленовом линкере выбраны из O, N и S;
1
R в каждом случае независимо представляет собой H, алкил или алкокси;
2
3
-
-
-
-
a
b
c
a
b
d
d
c
d
d
d
каждый из R и R независимо представляет собой H, OH, SH, алкил, алкокси, простой алкилэфир, -OP(=R)(R)R, Q, линкер, содержащий ковалентную связь с Q, линкер, содержащий ковалентную связь с молекулой аналита, линкер, содержащий ковалентную связь с твердым носителем, или линкер, содержащий ковалентную связь с другим соединением структуры (I), где: R представляет собой O или S; R представляет собой OH, SH, O, S, OR или SR; R представляет собой OH, SH, O, S, OR, SR, алкил, алкокси, простой алкилэфир, простой алкоксиалкилэфир, фосфат, тиофосфат, фосфоалкил, тиофосфоалкил, простой фосфоалкилэфир или простой тиофосфоалкилэфир; и R представляет собой противоион;
4
-
-
d
d
R в каждом случае независимо представляет собой OH, SH, O, S, OR или SR;
5
R в каждом случае независимо представляет собой оксо, тиоксо или отсутствует;
Q в каждом случае независимо представляет собой фрагмент, содержащий реакционноспособную группу, способную образовывать ковалентную связь с молекулой аналита, твердым носителем или комплементарной реакционноспособной группой Q′;
m в каждом случае независимо представляет собой целое число, равное нулю или большее, при условии, что, по меньшей мере, в одном случае m представляет собой целое число, равное единице или большее; и
n является целым числом, равным единице или большим.
1
2
3
c
1
2
3
4
a
b
c
a
b
c
Различные линкеры и заместители (например, M, Q, R, R, R, R L, L, L и L) в соединении структуры (I) необязательно замещены еще одним заместителем. Например, в некоторых вариантах осуществления необязательный заместитель выбирают, чтобы оптимизировать растворимость в воде или другое свойство соединения структуры (I). В некоторых вариантах осуществления, каждый алкил, алкокси, простой алкилэфир, простой алкоксиалкилэфир, фосфоалкил, тиофосфоалкил, простой фосфоалкилэфир и простой тиофосфоалкилэфир в соединении структуры (I) необязательно замещен еще одним заместителем, выбранным из группы, состоящей из гидроксила, алкокси, простого алкилэфира, простого алкоксиалкилэфира, сульфгидрила, амино, алкиламино, карбоксила, фосфата, тиофосфата, фосфоалкила, тиофосфоалкила, простого фосфоалкилэфира и простого тиофосфоалкилэфира. В некоторых вариантах осуществления необязательный заместитель представляет собой -OP(=R)(R)R, где R, R и R являются такими, как определено для соединения структуры (I).
1
1
В некоторых вариантах осуществления L в каждом случае независимо представляет собой необязательный алкиленовый, алкениленовый, алкиниленовый, гетероалкиленовый, гетероалкениленовый, гетероалкиниленовый или гетероатомный линкер. В других вариантах осуществления L в каждом случае независимо представляет собой линкер, содержащий функциональную группу, способную к образованию путем реакции двух комплементарных реакционноспособных групп, например, Q группу.
4
4
4
В некоторых вариантах осуществления L в каждом случае независимо представляет собой гетероалкиленовый линкер. В других, более специфичных вариантах осуществления, L в каждом случае независимо представляет собой алкиленоксидный линкер. Например, в некоторых вариантах осуществления L представляет собой полиэтиленоксид, и соединение имеет следующую структуру (IA):
(IA)
где z является целым числом от 2 до 100. В некоторых вариантах осуществления (IA) z является целым числом от 2 до 30, например, от примерно 20 до 25, или примерно 23. В некоторых вариантах осуществления z является целым числом от 2 до 10, например, от 3 до 6. В некоторых вариантах осуществления z равно 3. В некоторых вариантах осуществления z равно 4. В некоторых вариантах осуществления z равно 5. В некоторых вариантах осуществления z равно 6.
1
1
Необязательный линкер L может использоваться в качестве места присоединения фрагмента M к остальной части соединения. Например, в некоторых вариантах осуществления получают синтетический предшественник соединения структуры (I), и фрагмент М присоединяют к синтетическому предшественнику с использованием любого числа простых способов, известных в данной области техники, например, способов, называемых «клик-химия» («click-chemistry»). C этой целью может быть использована любая реакция, которая является быстрой и по существу необратимой, для присоединения М к синтетическому предшественнику с образованием соединения структуры (I). Приводимые в качестве примера реакции включают катализируемую медью реакцию азида и алкина с образованием триазола (реакция Хьюсгена 1,3-диполярного циклоприсоединения), реакцию диена и диенофила (Дильса-Альдера), нитрон-алкиновое циклоприсоединение, облегченное напряжением, реакцию напряженного алкена с азидом, тетразином или тетразолом, [3+2]-циклоприсоединение алкена и азида, реакцию Дильса-Альдера алкена и тетразина с обратными электронными требованиями, фотореакцию алкена и тетразола и различные реакции замещения, такие как замещение удаляемой группы путем нуклеофильной атаки на электрофильный атом. Приводимые в качестве примера реакции замещения включают реакцию амина с: активированным сложным эфиром; сложным эфиром N-гидроксисукцинимида; изоцианатом; изотиоцианатом, или тому подобное. В некоторых вариантах осуществления реакция с образованием L может осуществляться в водной среде.
1
1
Соответственно, в некоторых вариантах осуществления L представляет собой в каждом случае линкер, содержащий функциональную группу, способную к образованию путем реакции двух комплементарных реакционноспособных групп, например, функциональную группу, которая является продуктом одной из предшествующих «клик-реакций». В разных вариантах осуществления, для по меньшей мере одного случая L, функциональная группа может быть образована путем реакции функциональной группы, представляющей собой альдегид, оксим, гидразон, алкин, амин, азид, ацилазид, ацилгалогенид, нитрил, нитрон, сульфгидрил, дисульфид, сульфонилгалогенид, изотиоцианат, сложный имидоэфир, активированный сложный эфир (например, сложный эфир N-гидроксисукцинимида), кетон, α,β-ненасыщенный карбонил, алкен, малеимид, α-галогенимид, эпоксид, азиридин, тетразин, тетразол, фосфин, биотин или тииран, с комплементарной реакционноспособной группой. Например, путем реакции амина со сложным эфиром N-гидроксисукцинимида или изотиоцианатом.
1
1
В других вариантах осуществления, для по меньшей мере одного случая L, функциональная группа может быть образована реакцией алкина и азида. В других вариантах осуществления, для по меньшей мере одного случая L, функциональная группа может быть образована реакцией амина (например, первичного амина) и сложного эфира N-гидроксисукцинимида или изотиоцианата.
1
1
1
1
1
1
В дополнительных вариантах осуществления, для по меньшей мере одного случая L, функциональная группа включает алкеновую, сложноэфирную, амидную, группу сложного тиоэфира, дисульфидную, карбоциклическую, гетероциклическую или гетероарильную группу. В дополнительных вариантах осуществления, для по меньшей мере одного случая L, функциональная группа включает алкеновую, сложноэфирную, амидную, группу сложного тиоэфира, тиомочевинную, дисульфидную, карбоциклическую, гетероциклическую или гетероарильную группу. В других вариантах осуществления функциональная группа включает амид или тиомочевину. В некоторых более специфичных вариантах осуществления, для по меньшей мере одного случая L, L представляет собой линкер, содержащий триазолильную функциональную группу. При этом в других вариантах осуществления, для по меньшей мере одного случая L, L представляет собой линкер, содержащий амидную или тиомочевинную функциональную группу.
1
1
В еще одних вариантах осуществления, для по меньшей мере одного случая L, L-M имеет следующую структуру:
1a
1b
где каждый из L и L независимо представляет собой необязательный линкер.
1
1
В других вариантах осуществления, для по меньшей мере одного случая L, L-M имеет следующую структуру:
1a
1b
где каждый из L и L независимо представляет собой необязательный линкер.
1a
1b
1a
1b
В изложенных выше различных вариантах осуществления, L или L, или оба из них отсутствуют. В других вариантах осуществления, L или L, или оба из них присутствуют.
1a
1b
1a
1b
В некоторых вариантах осуществления каждый из L и L, если присутствуют, независимо представляют собой алкилен или гетероалкилен. Например, в некоторых вариантах осуществления, L и L, если присутствуют, независимо имеют одну из следующих структур:
; или .
1
1
В еще одних, других вариантах осуществления структуры (I), L в каждом случае независимо представляет собой необязательный алкиленовый или гетероалкиленовый линкер. В некоторых вариантах осуществления L имеет одну из следующих структур:
или .
2
3
1
6
2
6
2
6
В дополнительных вариантах осуществления, L и L в каждом случае независимо представляют собой C-C алкилен, C-C алкенилен или C-C алкинилен. Например, в некоторых вариантах осуществления соединение имеет следующую структуру (IB):
(IB)
где:
1
2
3
4
x, x, x и x в каждом случае независимо представляют собой целое число от 0 до 6; и
z является целым числом от 2 до 100, например, от 3 до 6.
1
2
3
4
1
2
3
4
1
3
2
4
1
3
2
4
В некоторых вариантах осуществления соединения структуры (IB), по меньшей мере в одном случае x, x, x или x равно 1. В других вариантах осуществления каждый из x, x, x и xравен 1 в каждом случае. В других вариантах осуществления каждый из x и x равен 0 в каждом случае. В некоторых вариантах осуществления каждый из x и x равен 1 в каждом случае. В еще одних вариантах осуществления каждый из x и x равен 0 в каждом случае, и каждый из x и x равен 1 в каждом случае.
1
1
1
В некоторых более специфичных вариантах осуществления соединения структуры (IB), L в каждом случае независимо содержит триазолильную функциональную группу. В некоторых других специфичных вариантах осуществления соединения структуры (IB), L в каждом случае независимо содержит амидную или тиомочевинную функциональную группу. В других вариантах осуществления соединения структуры (IB), L в каждом случае независимо представляет собой необязательный алкиленовый или гетероалкиленовый линкер.
4
-
-
-
d
d
d
В еще одних вариантах осуществления любого из соединений структуры (I), R в каждом случае независимо представляет собой OH, O или OR. Следует отметить, что «OR» и «SR» используются для обозначения O и S, ассоциированных с катионом. Например, фосфатная группа динатриевой соли может быть представлена как:
,
d
+
где R является натрием (Na).
5
В других вариантах осуществления любого из соединений структуры (I), R в каждом случае представляет собой оксо.
1
В некоторых других вариантах осуществления любого из перечисленных выше соединений, R представляет собой Н.
2
3
2
3
2
3
a
b
c
a
b
c
В других различных вариантах осуществления каждый из R и Rнезависимо представляет собой OH или -OP(=R)(R)R. В некоторых других вариантах осуществления R или R представляет собой OH или -OP(=R)(R)R, и другой из R или R представляет собой Q или линкер, содержащий ковалентную связь с Q.
2
3
a
b
c
c
В еще одних вариантах осуществления любого из приведенных выше соединений структуры (I), каждый из R и Rнезависимо представляет собой -OP(=R)(R)R. В некоторых из этих вариантов осуществления R представляет собой OL'.
2
3
a
b
В других вариантах осуществления каждый из R и Rнезависимо представляет собой -OP(=R)(R)OL', и L' представляет собой алкиленовый или гетероалкиленовый линкер с: Q, нацеливающим фрагментом, аналитом (например, молекулой аналита), твердым носителем, остатком твердого носителя, нуклеозидом или другим соединением структуры (I).
Линкер L' может быть любым линкером, подходящим для присоединения Q, нацеливающего фрагмента, аналита (например, молекулы аналита), твердого носителя, остатка твердого носителя, нуклеозида или другого соединения структуры (I) к соединению структуры (I). Предпочтительно определенные варианты осуществления включают использование L'-фрагментов, выбранных для повышения или оптимизации водорастворимости соединения. В некоторых вариантах осуществления L' представляет собой гетероалкиленовый фрагмент. В некоторых других определенных вариантах осуществления L' содержит алкиленоксидный или сложный фосфодиэфирный фрагмент, или их сочетания.
В некоторых вариантах осуществления L' имеет следующую структуру:
,
где:
m" и n" независимо представляют собой целое число от 1 до 10;
e
R представляет собой Н, электронную пару или противоион;
e
L" представляет собой R или представляет собой непосредственную связь или мостик с: Q, нацеливающим фрагментом, аналитом (например, молекулой аналита), твердым носителем, остатком твердого носителя, нуклеозидом или другим соединением структуры (I).
В некоторых вариантах осуществления m" является целым числом от 4 до 10, например, 4, 6 или 10. В других вариантах осуществления n" является целым числом от 3 до 6, например, 3, 4, 5 или 6.
В некоторых других вариантах осуществления L" представляет собой алкиленовый или гетероалкиленовый фрагмент. В некоторых других определенных вариантах осуществления L" содержит алкиленоксидный, сложный фосфодиэфирный фрагмент, сульфгидрильный, дисульфидный или малеимидный фрагмент, или их сочетания.
В некоторых из приведенных выше вариантов осуществления нацеливающий фрагмент представляет собой антитело или антагонист рецептора клеточной поверхности.
2
3
В других более специфичных вариантах осуществления любого из приведенных выше соединений структуры (I), R или R имеет одну из следующих структур:
;;; ;;  или .
2
3
Некоторые варианты осуществления соединений структуры (I) могут быть получены в соответствии с методами твердофазного синтеза, аналогичными известным в данной области для получения олигонуклеотидов. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления L' представляет собой связь с твердым носителем, остатком твердого носителя или нуклеозидом. Твердые носители, содержащие активированную группу дезокситимидина (dT), легко доступны, и в некоторых вариантах осуществления могут применяться в качестве исходного материала для получения соединений структуры (I). Соответственно, в некоторых вариантах осуществления R или R имеет следующую структуру:
.
Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что описанная выше dT-группа включена только для простоты синтеза и рентабельности, и не является обязательной. Могут использоваться и другие твердые носители, которые приведут к получению другого нуклеозида или остатка твердого носителя, присутствующего на L', или нуклеозид или остаток твердого носителя могут быть удалены или модифицированы после синтеза.
2
3
В еще одних вариантах осуществления Q в каждом случае независимо представляет собой фрагмент, содержащий реакционноспособную группу, способную образовывать ковалентную связь с молекулой аналита или твердым носителем. В других вариантах осуществления Q в каждом случае независимо представляет собой фрагмент, содержащий реакционноспособную группу, способную образовывать ковалентную связь с комплементарной реакционноспособной группой Q′. Например, в некоторых вариантах осуществления Q′ присутствует в другом соединении структуры (I) (например, в положении R или R), и Q и Q′ содержат комплементарные реакционноспособные группы, благодаря чему реакция соединения структуры (I) и другого соединения структуры (I) приводит к ковалентно связанному димеру соединения структуры (I). Мультимерные соединения структуры (I) также могут быть получены аналогичным образом и включены в объем вариантов осуществления изобретения.
Тип Q-группы и возможность присоединения Q-группы к остальной части соединения структуры (I) не имеет ограничений, при условии, что Q содержит фрагмент, имеющий соответствующую реакционную способность для образования желаемой связи.
В некоторых вариантах осуществления Q представляет собой фрагмент, который не подвержен гидролизу в водных условиях, но является достаточно реакционноспособным для образования связи с соответствующей группой на молекуле аналита или твердом носителе (например, амина, азида или алкина).
Некоторые варианты осуществления соединений структуры (I) включают Q-группы, обычно используемые в области биоконъюгирования. Например, в некоторых вариантах осуществления Q содержит нуклеофильную реакционноспособную группу, электрофильную реакционноспособную группу или реакционноспособную группу циклоприсоединения. В некоторых более специфичных вариантах осуществления Q содержит сульфгидрильную, дисульфидную, активированную сложноэфирную, изотиоцианатную, азидную, алкиновую, алкеновую, диеновую, диенофильную, галогенангидридную, сульфонилгалогенидную, фосфиновую, α-галогенамидную, биотиновую, амино или малеимидную функциональную группу. В некоторых вариантах осуществления активированный сложный эфир представляет собой N-сукцинимидный сложный эфир, сложный имидоэфир или сложный полифторфенильный эфир. В других вариантах осуществления алкин представляет собой алкилазид или ацилазид.
Q-группы могут быть удобно представлены в защищенной форме для увеличения устойчивости при хранении или других желательных свойств, и затем защитную группу удаляют в соответствующее время для конъюгирования, например, с нацеливающим фрагментом или аналитом. Соответственно, Q-группы включают «защищенные формы» реакционноспособной группы, включая любую из реакционноспособных групп, описанных выше и в таблице 1 ниже. «Защищенная форма» Q относится к фрагменту, имеющему более низкую реакционную способность при заданных условиях реакции относительно Q, но который может быть превращен в Q в условиях, которые предпочтительно не вызывают деградации или реакции с другими частями соединения структуры (I). Специалист в данной области техники может получить соответствующие защищенные формы Q, исходя из конкретного Q и желаемого конечного применения и условий хранения. Например, когда Q представляет собой SH, защищенная форма Q включает дисульфид, который может быть восстановлен с появлением SH-фрагмента с помощью общеизвестных методов и реагентов.
Приводимые в качестве примера Q-фрагменты представлены в таблице I ниже.
Таблица 1. Примеры Q-фрагментов
Структура
Класс
<img file="00000025.jpg" he="9" wi="12" img-content="undefined" img-format="jpg" />
сульфгидрил
<img file="00000026.jpg" he="9" wi="26" img-content="undefined" img-format="jpg" />
изотиоцианат
<img file="00000027.jpg" he="16" wi="21" img-content="undefined" img-format="jpg" />
сложный имидоэфир
<img file="00000028.jpg" he="23" wi="30" img-content="undefined" img-format="jpg" />
ацилазид
<img file="00000029.jpg" he="34" wi="41" img-content="undefined" img-format="jpg" />
активированный сложный эфир
<img file="00000030.jpg" he="34" wi="41" img-content="undefined" img-format="jpg" />
активированный сложный эфир
<img file="00000031.jpg" he="27" wi="46" img-content="undefined" img-format="jpg" />
активированный сложный эфир
<img file="00000032.jpg" he="28" wi="78" img-content="undefined" img-format="jpg" />
активированный сложный эфир
<img file="00000033.jpg" he="27" wi="33" img-content="undefined" img-format="jpg" />
активированный сложный эфир
<img file="00000034.jpg" he="30" wi="39" img-content="undefined" img-format="jpg" />
активированный сложный эфир
<img file="00000035.jpg" he="24" wi="18" img-content="undefined" img-format="jpg" />
сульфонилгалогенид
<img file="00000036.jpg" he="30" wi="21" img-content="undefined" img-format="jpg" />
малеимид
<img file="00000037.jpg" he="37" wi="57" img-content="undefined" img-format="jpg" />
малеимид
<img file="00000038.jpg" he="32" wi="59" img-content="undefined" img-format="jpg" />
малеимид
<img file="00000039.jpg" he="20" wi="29" img-content="undefined" img-format="jpg" />
α-галогенимид
<img file="00000040.jpg" he="18" wi="35" img-content="undefined" img-format="jpg" />
дисульфид
<img file="00000041.jpg" he="34" wi="47" img-content="undefined" img-format="jpg" />
фосфин
<img file="00000042.jpg" he="9" wi="12" img-content="undefined" img-format="jpg" />
азид
<img file="00000043.jpg" he="9" wi="17" img-content="undefined" img-format="jpg" />
алкин
<img file="00000044.jpg" he="34" wi="23" img-content="undefined" img-format="jpg" />
биотин
<img file="00000045.jpg" he="17" wi="14" img-content="undefined" img-format="jpg" />
диен
<img file="00000046.jpg" he="9" wi="17" img-content="undefined" img-format="jpg" />
алкен/диенофил
<img file="00000047.jpg" he="22" wi="44" img-content="undefined" img-format="jpg" />
алкен/диенофил
-NH<sub>2</sub>
амино
Следует отметить, что в некоторых вариантах осуществления, в которых Q представляет собой SH, SH-фрагмент будет иметь тенденцию образовывать дисульфидные связи с другой сульфгидрильной группой, например, на другом соединении структуры (I). Соответственно, некоторые варианты осуществления включают соединения структуры (I), которые находятся в форме дисульфидных димеров, причем дисульфидная связь получена из SH Q- групп.
2
3
2
3
a
b
c
c
Также в объем определенных вариантов осуществления включены соединения структуры (I), в которых один или оба из R и R содержат связь с другим соединением структуры (I). Например, в которых один или оба из R и R представляют собой -OP(=R)(R)R, и R представляет собой OL', и L' представляет собой линкер, содержащий ковалентную связь с другим соединенем структуры (I). Такие соединения могут быть получены путем получения первого соединения структуры (I), имеющего, например, примерно 10 «M» фрагментов (т.е. n= 9) и имеющего подходящий «Q» для реакции с комплементарной Q'-группой на втором соединении структуры (I). Таким образом, соединения структуры (I), имеющие любое количество «М» фрагментов, например 100 или более, могут быть получены без необходимости последовательного образования связей с каждым мономером. Иллюстративные варианты осуществления таких соединений структуры (I) имеют следующую структуру (I')
(I')
где:
1
2
3
4
5
1
2
3
4
в каждом случае R, R, R, R, R, L, L, L, L, M, m и n независимо являются такими, как определено для соединения структуры (I);
L" представляет собой линкер, содержащий функциональную группу, образующуюся в результате реакции Q-фрагмента с соответствующим Q'-фрагментом; и
α является целым числом, превышающим 1, например, от 1 до 100, или от 1 до 10.
Приводимое в качестве примера соединение структуры (I') представлено в примере 5. Другие соединения структуры (I') могут быть получены специалистом в данной области техники, например, путем димеризации или полимеризации соединений структуры (I), представленных в настоящем описании.
В других вариантах осуществления Q-фрагмент удобно маскируется (например, защищается) как дисульфидный фрагмент, который позже может быть восстановлен для получения активированного Q-фрагмента для связывания с желаемой молекулой аналита или нацеливающим фрагментом. Например, Q-фрагмент может быть маскирован в виде дисульфида, имеющего следующую структуру:
где R представляет собой необязательно замещенную алкильную группу. Например, в некоторых вариантах осуществления Q обеспечивается в виде дисульфидного фрагмента, имеющего следующую структуру:
где n является целым числом от 1 до 10, например, 6.
2
3
2
3
a
b
c
В некоторых других вариантах осуществления один из R или R представляет собой OH или -OP(=R)(R)R, и другой из R или R представляет собой линкер, содержащий ковалентную связь с молекулой аналита, или линкер, содержащий ковалентную связь с твердым носителем. Например, в некоторых вариантах осуществления молекула аналита представляет собой нуклеиновую кислоту, аминокислоту или ее полимер. В других вариантах осуществления молекула аналита представляет собой фермент, рецептор, лиганд рецептора, антитело, гликопротеин, аптамер или прион. В еще одних вариантах осуществления твердый носитель представляет собой полимерную гранулу или неполимерную гранулу.
Значение m представляет собой другую переменную, которая может быть выбрана на основе желаемой интенсивности флуоресценции и/или цвета. В некоторых вариантах осуществления m в каждом случае независимо представляет собой целое число от 1 до 10. В других вариантах осуществления m в каждом случае независимо представляет собой целое число от 1 до 5, например 1, 2, 3, 4 или 5.
В других вариантах осуществления m в каждом случае независимо представляет собой целое число более 2, и z является целым числом от 3 до 10, например, в некотором варианте осуществления m в каждом случае независимо представляет собой целое число более 2, такое как 3, 4, 5 или 6, и z является целым числом от 3 до 6.
Интенсивность флуоресценции также можно регулировать путем выбора различных значений n. В некоторых вариантах осуществления n является целым числом от 1 до 100. В других вариантах осуществления n является целым числом от 1 до 10. В некоторых вариантах осуществления n равно 1. В некоторых вариантах осуществления n равно 2. В некоторых вариантах осуществления n равно 3. В некоторых вариантах осуществления n равно 4. В некоторых вариантах осуществления n равно 5. В некоторых вариантах осуществления n равно 6. В некоторых вариантах осуществления n равно 7. В некоторых вариантах осуществления n равно 8. В некоторых вариантах осуществления n равно 9. В некоторых вариантах осуществления n равно 10.
М выбирают на основе желаемых оптических свойств, например, на основе желаемого цвета и/или длины волны флуоресцентного излучения. В некоторых вариантах осуществления М является одинаковым в каждом случае; однако важно отметить, что в каждом случае M не обязательно должно быть тем же самым M, и некоторые варианты осуществления включают соединения, в которых М не является одинаковым в каждом случае. Например, в некоторых вариантах осуществления каждое M не является одинаковым, и различные М-фрагменты выбирают таким образом, чтобы они имели поглощение и/или эмиссию для использования в методах резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET). Например, в таких вариантах осуществления различные М-фрагменты выбираются таким образом, что поглощение излучения на одной длине волны вызывает эмиссию излучения на другой длине волны по механизму FRET. Приводимые в качестве примера M-фрагменты могут быть подходящим образом выбраны специалистом исходя из желаемого конечного применения. Приводимые в качестве примера М-фрагменты для FRET-методов включают красители флуоресцеин и 5-TAMRA (сложный сукцинимидиловый эфир 5-карбокситетраметилродамина).
M может быть присоединен к остальной части молекулы из любого положения (т.е. атома) на M. Специалисту в данной области будет известен способ присоединения M к остальной части молекулы. Примеры способов включают «клик-реакции», описанные в настоящей заявке.

В некоторых вариантах осуществления М представляет собой флуоресцентный или цветной фрагмент. Может использоваться любой флуоресцентный и/или цветной фрагмент, например, известные в области техники и обычно используемые в колориметрических, УФ- и/или флуоресцентных анализах. Примеры M-фрагментов, которые могут использоваться в разных вариантах осуществления изобретения включают, без ограничения: производные ксантена (например, флуоресцеин, родамин, Oregon Green, эозин или Texas Red); производные цианина (например, цианин, индокарбоцианин, оксакарбоцианин, тиакарбоцианин или мероцианин); производные скварена и замещенные в кольце скварены, включая красители Seta, SeTau и Square; и производные нафталина (например, дансилированные и продановые производные); производные кумарина; производные оксадиазола (например, пиридилоксазол, нитробензоксадиазол или бензоксадиазол); производные антрацена (например, антрахиноны, включая DRAQ5, DRAQ7 и CyTRAK Orange); производные пирена, такие как каскадный синий; производные оксазина (например, Nile red, Nile blue, крезиловый фиолетовый, оксазин 170); производные акридина (например, профлавин, акридиновый оранжевый, акридиновый желтый); производные арилметина: аурамин, кристаллический фиолетовый, малахитовый зеленый; и производные тетрапиррола (например, порфин, фталоцианин или билирубин). Другие примеры М-фрагментов включают: цианиновые красители, ксантатные красители (например, Hex, Vic, Nedd, Joe или Tet); Yakima Yellow; красители Redmond Red; Tamra; Texas Red и Alexa Fluor.
В еще одних вариантах осуществления любого из перечисленного выше, M содержит три или более арильных или гетероарильных кольца или их сочетания, например, четыре или более арильных или гетероарильных кольца, или их сочетания, или даже пять или более арильных или гетероарильных колец, или их сочетания. В некоторых вариантах осуществления М содержит шесть арильных или гетероарильных колец или их сочетания. В других вариантах осуществления кольца конденсированы. Например, в некоторых вариантах осуществления М содержит три или более конденсированных кольца, четыре или более конденсированных кольца, пять или более конденсированных колец или даже шесть или более конденсированных колец.
В некоторых вариантах осуществления М является циклическим. Например, в некоторых вариантах осуществления М является карбоциклическим. В другом варианте осуществления М является гетероциклическим. В еще одних приведенных выше вариантах осуществления М в каждом случае независимо содержит арильный фрагмент. В некоторых из этих вариантов осуществления арильный фрагмент является полициклическим. В других более специфичных примерах арильный фрагмент представляет собой конденсированный полициклический арильный фрагмент, например, который может содержать по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 или даже более 4 арильных колец.
В других вариантах осуществления любого из предшествующих соединений структуры (I), (IA), (IB) или (I'), M в каждом случае независимо содержит, по меньшей мере, один гетероатом. Например, в некоторых вариантах осуществления гетероатом представляет собой азот, кислород или серу.
В еще одних вариантах осуществления любого из указанного выше, М в каждом случае независимо содержит по меньшей мере один заместитель. Например, в некоторых вариантах осуществления заместитель представляет собой фтор-, хлор-, бром-, йод-, амино, алкиламино, ариламино, гидрокси, сульфгидрильную, алкокси, арилокси, фенильную, арильную, метильную, этильную, пропильную, бутильную, изопропильную, трет-бутильную, карбокси, сульфонатную, амидную или формильную группу.
В некоторых даже еще более специфичных вариантах осуществления приведенного выше, M в каждом случае независимо представляет собой диметиламиностильбеновый, хинакридоновый, фторфенилдиметил-BODIPY-, his-фторфенил-BODIPY-, акридиновый, терриленовый, гексафенильный, порфириновый, бензопиреновый, (фторфенил-диметил-дифторбор-диаза-индацен)фенильный, (бис-фторфенил-дифторбор-диаза-индацен)фенильный, кватерфенильный, бибензотиазольный, тербензотиазольный, бинафтильный, биантрацильный, сквареновый, скварилиевый, 9,10-этинилантраценовый или тернафтильный фрагмент. В других вариантах осуществления M в каждом случае независимо представляет собой п-терфенил, перилен, азобензол, феназин, фенантролин, акридин, тиоксантрен, хризен, рубрен, коронен, цианин, периленимид, или периленамид или их производное. В еще одних вариантах осуществления M в каждом случае независимо представляет собой краситель кумарин, краситель резоруфин, краситель на основе дифторида дипиррометенбора, краситель бипиридил рутения, краситель с переносом энергии, краситель тиазоловый оранжевый, полиметиновый или N-арил-1,8-нафталимидный краситель.
В еще одних вариантах осуществления любого из указанного выше, М в каждом случае является одинаковым. В других вариантах осуществления каждое M является различным. В еще одних вариантах осуществления одно или более М являются одинаковыми, и одно или более М являются различными.
В некоторых вариантах осуществления М представляет собой пирен, перилен, периленмоноимид или 6-FAM или их производное. В некоторых других вариантах осуществления М имеет одну из следующих структур:
; ; ; ;
; ;  или .
2
2
-
Хотя М-фрагменты, содержащие группы карбоновой кислоты, представлены в анионной форме (CO) выше, специалисту в данной области будет понятно, что это будет изменяться в зависимости от рН, и протонированная форма (COH) включена в различные варианты осуществления.
В некоторых специфичных вариантах осуществления соединение представляет собой соединение, выбранное из таблицы 2. Соединения в таблице 2 были получены в соответствии с процедурами, изложенными в примерах, и их идентичность была подтверждена масс-спектрометрией.
Таблица 2. Примеры соединений структуры I
№
ММНайденоВычислено
Структура
I-1
1364,61365,2
<img file="00000059.jpg" he="29" wi="115" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-2
1576,21577,3
<img file="00000060.jpg" he="32" wi="117" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-3
1497,41497,3
<img file="00000061.jpg" he="29" wi="115" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-4
1841,41841,6
<img file="00000062.jpg" he="31" wi="114" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-5
2185,82185,9
<img file="00000063.jpg" he="32" wi="117" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-6
2532,22530,2
<img file="00000064.jpg" he="31" wi="113" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-7
1789,61789,5
<img file="00000065.jpg" he="31" wi="114" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-8
2001,62001,6
<img file="00000066.jpg" he="32" wi="115" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-9
2213,52213,8
<img file="00000067.jpg" he="31" wi="115" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-10
4481,64480,9
<img file="00000068.jpg" he="45" wi="99" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-11
8375,98374,3
<img file="00000069.jpg" he="43" wi="95" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-12
TBD<sup>*</sup>
<img file="00000070.jpg" he="35" wi="100" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-13
TBD
<img file="00000071.jpg" he="36" wi="99" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-14
TBD
<img file="00000072.jpg" he="35" wi="99" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-15
TBD
<img file="00000073.jpg" he="31" wi="109" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-16
TBD
<img file="00000074.jpg" he="36" wi="100" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000075.jpg" he="26" wi="97" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000076.jpg" he="17" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-17
15684,615681,5
<img file="00000077.jpg" he="33" wi="93" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000078.jpg" he="18" wi="92" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000076.jpg" he="17" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-18
TBD
<img file="00000079.jpg" he="32" wi="89" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000080.jpg" he="18" wi="77" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000076.jpg" he="17" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-19
TBD
<img file="00000081.jpg" he="34" wi="95" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000082.jpg" he="26" wi="102" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000076.jpg" he="17" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-20
TBD
<img file="00000083.jpg" he="33" wi="93" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000084.jpg" he="32" wi="98" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000076.jpg" he="17" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-21
TBD
<img file="00000085.jpg" he="34" wi="97" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000086.jpg" he="30" wi="103" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000076.jpg" he="17" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-22
TBD
<img file="00000087.jpg" he="38" wi="106" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000088.jpg" he="31" wi="115" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000076.jpg" he="17" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-23
TBD
<img file="00000089.jpg" he="36" wi="100" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000090.jpg" he="26" wi="76" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000076.jpg" he="17" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-24
TBD
<img file="00000091.jpg" he="37" wi="105" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000092.jpg" he="26" wi="93" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000076.jpg" he="17" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-25
TBD
<img file="00000093.jpg" he="37" wi="103" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000094.jpg" he="37" wi="110" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000076.jpg" he="17" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-26
TBD
<img file="00000095.jpg" he="37" wi="103" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000096.jpg" he="30" wi="110" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000076.jpg" he="17" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-27
TBD
<img file="00000097.jpg" he="36" wi="100" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000098.jpg" he="17" wi="73" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000076.jpg" he="17" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-28
TBD
<img file="00000099.jpg" he="37" wi="103" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000100.jpg" he="28" wi="109" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000076.jpg" he="17" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-29
TBD
<img file="00000101.jpg" he="38" wi="105" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000102.jpg" he="20" wi="98" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000076.jpg" he="17" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-30
TBD
<img file="00000103.jpg" he="38" wi="106" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000104.jpg" he="37" wi="112" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000076.jpg" he="17" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-31
TBD
<img file="00000105.jpg" he="39" wi="107" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000106.jpg" he="38" wi="112" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000076.jpg" he="17" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-32
7241,27238,2
<img file="00000107.jpg" he="39" wi="109" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000108.jpg" he="30" wi="111" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000076.jpg" he="17" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-33
TBD
<img file="00000109.jpg" he="39" wi="108" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000110.jpg" he="18" wi="77" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000076.jpg" he="17" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-34
TBD
<img file="00000111.jpg" he="40" wi="111" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000112.jpg" he="29" wi="112" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000076.jpg" he="17" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-35
TBD
<img file="00000113.jpg" he="38" wi="106" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000114.jpg" he="19" wi="92" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000076.jpg" he="17" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-36
TBD
<img file="00000115.jpg" he="39" wi="106" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000116.jpg" he="37" wi="111" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000076.jpg" he="17" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-37
6997,16997,0
<img file="00000117.jpg" he="38" wi="106" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000118.jpg" he="30" wi="111" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000076.jpg" he="17" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-38
TBD
<img file="00000119.jpg" he="38" wi="106" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000120.jpg" he="20" wi="100" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000076.jpg" he="17" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-39
TBD
<img file="00000121.jpg" he="38" wi="105" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000080.jpg" he="18" wi="77" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000076.jpg" he="17" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-40
TBD
<img file="00000122.jpg" he="39" wi="107" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000112.jpg" he="29" wi="112" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000076.jpg" he="17" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-41
TBD
<img file="00000123.jpg" he="37" wi="104" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000124.jpg" he="37" wi="112" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000076.jpg" he="17" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-42
TBD
<img file="00000125.jpg" he="38" wi="106" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000126.jpg" he="20" wi="105" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-43
3103,93103,6
<img file="00000127.jpg" he="47" wi="104" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-44
5619,55619,8
<img file="00000128.jpg" he="48" wi="105" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-45
15684,615681,5
<img file="00000129.jpg" he="48" wi="104" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000130.jpg" he="20" wi="97" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-46
6997,16997,0
<img file="00000131.jpg" he="45" wi="100" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-47
11912,111910,1
<img file="00000132.jpg" he="46" wi="102" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-48
9273,99272,0
<img file="00000133.jpg" he="48" wi="104" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000134.jpg" he="19" wi="94" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-49
16252,916250,0
<img file="00000135.jpg" he="48" wi="99" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000136.jpg" he="17" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000137.jpg" he="18" wi="89" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-50
17260,317260,0
<img file="00000138.jpg" he="49" wi="100" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000139.jpg" he="17" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000140.jpg" he="23" wi="83" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-51
TBD
<img file="00000141.jpg" he="49" wi="107" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000142.jpg" he="30" wi="109" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-52
TBD
<img file="00000143.jpg" he="48" wi="105" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000144.jpg" he="19" wi="80" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-53
TBD
<img file="00000145.jpg" he="50" wi="109" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000146.jpg" he="29" wi="106" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-54
TBD
<img file="00000147.jpg" he="49" wi="106" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000148.jpg" he="26" wi="92" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-55
TBD
<img file="00000149.jpg" he="47" wi="95" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000150.jpg" he="19" wi="70" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000151.jpg" he="25" wi="91" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-56
TBD
<img file="00000152.jpg" he="47" wi="103" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000153.jpg" he="31" wi="112" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-57
TBD
<img file="00000135.jpg" he="48" wi="99" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000150.jpg" he="19" wi="70" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000154.jpg" he="29" wi="108" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-58
TBD
<img file="00000155.jpg" he="51" wi="105" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000150.jpg" he="19" wi="70" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000156.jpg" he="28" wi="110" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-59
TBD
<img file="00000157.jpg" he="50" wi="108" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000158.jpg" he="30" wi="113" img-content="undefined" img-format="jpg" />
I-60
TBD
<img file="00000159.jpg" he="52" wi="109" img-content="undefined" img-format="jpg" />
*
TBD=подлежит определению
2
3
Как используется в таблице 2 и во всей заявке, R, R, m, n и L' имеют определения, приведенные для соединений структуры (I), если не указано иное, и F, F′ и F" относятся к флуоресцеиновому фрагменту, имеющему следующие структуры, соответственно:
F  F′
F"
«dT» относится к следующей структуре:
Некоторые варианты осуществления включают любые из перечисленных выше соединений, включая конкретные соединения, представленные в таблице 2, конъюгированные с нацеливающим фрагментом, таким как антитело.
Настоящее изобретение, в целом, относится к соединениям, имеющим повышенную флуоресцентную эмиссию по сравнению с ранее известными соединениями. Соответственно, некоторые варианты осуществления относятся к флуоресцентному соединению, содержащему Y флуоресцентных фрагментов M, где флуоресцентное соединение имеет пик флуоресцентной эмиссии при возбуждении с заданной длиной волны ультрафиолетового света по меньшей мере на 85% от Y раз больший, чем пик флуоресцентной эмиссии одного М-фрагмента при возбуждении с такой же длиной волны ультрафиолетового света, и где Y является целым числом, равным 2 или более. Флуоресцентные соединения включают соединения, которые излучают флуоресцентный сигнал при возбуждении светом, например, ультрафиолетовым светом.
В некоторых вариантах осуществления флуоресцентное соединение имеет пик флуоресцентной эмиссии по меньшей мере на 90% от Y раз больший, на 95% от Y раз больший, на 97% от Y раз больший или на 99% от Y раз больший, чем пик флуоресцентной эмиссии одного М-фрагмента.
В некоторых вариантах осуществления Y является целым числом от 2 до 100, например, 2-10.
В некоторых вариантах осуществления Y M-фрагментов имеют, независимо, одну из следующих структур:
; ; ; ;
; ;  или ,
где  указывает место присоединения к флуоресцентному соединению.
В других вариантах осуществления один М-фрагмент имеет независимо одну из следующих структур:
; ; ; ; ;  или .
В более специфичных вариантах осуществления флуоресцентное соединение содержит Y М-фрагментов, независимо имеющих одну из следующих структур:
или ,
где  указывает место присоединения к флуоресцентному соединению, и один М-фрагмент имеет следующую структуру:
.
В других вариантах осуществления пик флуоресцентной эмиссии наблюдается при длине волны от примерно 500 нм до примерно 550 нм.
В еще одних вариантах осуществления флуоресцентное соединение содержит по меньшей мере один этиленоксидный фрагмент.
Также предложены композиции, содержащие флуоресцентное соединение по любому из пунктов формулы изобретения и аналит.
4
4
Описанные здесь соединения являются «регулируемыми», это означает, что при правильном выборе переменных в любом из перечисленных выше соединений, специалист в данной области может получить соединение, имеющее желаемую и/или предварительно заданную молярную флуоресценцию (молярную яркость). Регулируемость соединений позволяет пользователю легко получить соединения, имеющие желаемую флуоресценцию и/или цвет, для применения в конкретном анализе или для идентификации конкретного интересующего аналита. Хотя все переменные могут оказывать влияние на молярную флуоресценцию соединений, считается, что правильный выбор M, L, m и n играет важную роль в молярной флуоресценции соединений. Соответственно, в одном варианте осуществления предложен способ получения соединения, имеющего желаемую молярную флуоресценцию, причем способ включает выбор М-фрагмента, имеющего известную флуоресценцию, получение соединения структуры (I), содержащего M-фрагмент, и выбор соответствующих переменных для L, m и n для достижения желаемой молярной флуоресценции.
4
Молярная флуоресценция в некоторых вариантах осуществления может быть выражена через кратное увеличение или уменьшение по сравнению с флуоресцентной эмиссией исходного флуорофора (например, мономера). В некоторых вариантах осуществления молярная флуоресценция настоящих соединений составляет 1,1×, 1,5×, 2×, 3×, 4×, 5×, 6×, 7×, 8×, 9×, 10× или даже выше относительно исходного флуорофора. Различные варианты осуществления включают в себя получение соединений, имеющих желаемое кратное увеличение во флуоресценции относительно исходного флуорофора путем правильного выбора L, m и n.
-
2-
3
Для простоты иллюстрации различные соединения, содержащие фосфорные фрагменты (например, фосфат и тому подобное), изображены в анионном состоянии (например, OPO(OH)O, -OPO). Специалисту в данной области будет понятно, что заряд зависит от рН, и незаряженные (например, протонированные или солевые, например, натриевые или другие катионные) формы также включены в объем вариантов осуществления изобретения.
Композиции, содержащие любое из указанных выше соединений и одну или более молекул аналита (например, биомолекул), предложены в различных других вариантах осуществления. В некоторых вариантах осуществления также предусмотрено применение таких композиций в аналитических методах для обнаружения одной или более молекул аналита.
2
3
2
3
a
b
c
В еще одних вариантах осуществления соединения могут использоваться в различных аналитических методах. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретение предлагает способ окрашивания образца, причем способ включает добавление к указанному образцу соединения структуры (I), например, где один из R или R представляет собой линкер, содержащий ковалентную связь с молекулой аналита (например, биомолекулой) или микрочастицей, и другой из R или R представляет собой H, OH, алкил, алкокси, простой алкилэфир или -OP(=R)(R)R, в количестве, достаточном для получения оптического отклика при подсвечивании образца при соответствующей длине волны.
2
В некоторых вариантах осуществления приведенных выше способов R представляет собой линкер, содержащий ковалентную связь с молекулой аналита, такой как биомолекула. Например, такой как нуклеиновая кислота, аминокислота или ее полимер (например, полинуклеотид или полипептид). В еще одних вариантах осуществления биомолекула представляет собой фермент, рецептор, лиганд рецептора, антитело, гликопротеин, аптамер или прион.
2
В еще одних вариантах осуществления приведенного выше способа R представляет собой линкер, содержащий ковалентную связь с твердым носителем, таким как микрочастица. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения микрочастица представляет собой полимерную гранулу или неполимерную гранулу.
В еще одних вариантах осуществления указанный оптический отклик представляет собой флуоресцентный отклик.
В других вариантах осуществления указанный образец содержит клетки, и некоторые варианты осуществления также включают наблюдение указанных клеток с помощью проточной цитометрии.
В еще одних вариантах осуществления способ дополнительно включает в себя дифференцирование флуоресцентного отклика от отклика второго флуорофора, имеющего детектируемо отличающиеся оптические свойства.
В других вариантах осуществления изобретение предлагает способ визуального обнаружения молекулы аналита, такой как биомолекула, включающий:
2
3
2
3
a
b
c
(a) обеспечение соединения структуры (I), например, в котором один из R или R представляет собой линкер, содержащий ковалентную связь с молекулой аналита, и другой из R или R представляет собой H, OH, алкил, алкокси, простой алкилэфир или -OP(=R)(R)R; и
(b) обнаружение соединения по его визуальным свойствам.
В некоторых вариантах осуществления молекула аналита представляет собой нуклеиновую кислоту, аминокислоту или ее полимер (например, полинуклеотид или полипептид). В еще одних вариантах осуществления молекула аналита представляет собой фермент, рецептор, лиганд рецептора, антитело, гликопротеин, аптамер или прион.
В других вариантах осуществления предложен способ визуального обнаружения молекулы аналита, такой как биомолекула, причем способ включает в себя:
(а) смешивание любого из указанных выше соединений с одной или несколькими молекулами аналита; и
(b) обнаружение соединения по его визуальным свойствам.
В других вариантах осуществления предложен способ визуального обнаружения молекулы аналита, причем способ включает в себя:
2
3
(а) смешивание соединения по п.1 формулы изобретения, где R или R представляет собой Q или линкер, содержащий ковалентную связь с Q, с молекулой аналита;
(b) образование конъюгата соединения и молекулы аналита; и
(с) обнаружение конъюгата по его визуальным свойствам.
Другие примеры способов включают способ обнаружения аналита, причем способ включает в себя:
2
3
(a) обеспечение соединения структуры (I), где R или R содержит линкер, содержащий ковалентную связь с нацеливающим фрагментом, имеющим специфичность в отношении аналита;
(b) смешивание соединения и аналита, связывающее таким образом нацеливающий фрагмент и аналит; и
(с) обнаружение соединения, например, по его визуальным или флуоресцентным свойствам.
В некоторых вариантах осуществления указанного выше способа аналит представляет собой частицу, такую как клетка, и способ включает использование проточной цитометрии. Например, соединение может быть снабжено нацеливающим фрагментом, таким как антитело, для селективного связывания с нужной клеткой, тем самым делая клетку обнаруживаемой любым числом методов, таких как визуальная или флуоресцентная детекция. Подходящие антитела могут быть выбраны специалистом в данной области в зависимости от желаемого конечного применения. Приводимые в качестве примера антитела для использования в некоторых вариантах осуществления включают UCHT1 и MOPC-21.
Таким образом, варианты осуществления настоящих соединений находят применение в любом числе способов, включая, без ограничения: подсчет клеток; сортировку клеток; обнаружение биомаркера; количественное определение апоптоза; определение жизнеспособности клеток; определение антигенов клеточной поверхности; определение общего содержания ДНК и/или РНК; идентификацию специфических последовательностей нуклеиновой кислоты (например, в качестве зонда нуклеиновой кислоты); и диагностику заболеваний, таких как рак крови.
В дополнение к указанным выше способам, варианты осуществления соединений структуры (I) находят применение в различных дисциплинах и способах, включая, без ограничения: визуализацию в эндоскопических процедурах для идентификации раковых и других тканей; одноклеточные и/или одномолекулярные аналитические методы, например, обнаружение полинуклеотидов с малой амплификацией или без нее; визуализацию рака, например, путем включения нацеливающего фрагмента, такого как антитело или сахар, или другой фрагмент, который предпочтительно связывает раковые клетки, в соединение структуры (I); визуализацию в хирургических процедурах; связывание гистонов для идентификации различных заболеваний; доставку лекарственного средства, например, путем замены М-фрагмента в соединении структуры (I) активным лекарственным фрагментом; и/или в контрастных веществах при лечении зубов и других процедурах, например, при предпочтительном связывании соединения структуры (I) с различной флорой и/или организмами.
1
2
3
4
5
1
2
3
4
1
2
3
4
5
1
2
3
4
Подразумевается, что любой вариант осуществления соединений структуры (I), как описано выше, и любой конкретный выбор, описанный здесь для переменных R, R, R, R, R, L', L, L, L, L, M, m и/или n в соединениях структуры (I), как описано выше, может быть независимо объединен с другими вариантами осуществления и/или переменными соединений структуры (I) для получения вариантов осуществления изобретения, не описанных специально выше. Кроме того, в случае, если список вариантов выбора указывается для какой-либо конкретной переменной R, R, R, R, R, L', L, L, L, L, M, m и/или n в конкретном варианте осуществления и/или пункте формулы изобретения, подразумевается, что каждый индивидуальный выбор может быть исключен из конкретного варианта осуществления и/или пункта формулы изобретения, и что оставшийся список вариантов выбора будет считаться находящимся в пределах объема изобретения.
Подразумевается, что в настоящем описании комбинации заместителей и/или переменных отображенной формулы допустимы только в том случае, если такие комбинации приводят к образованию стабильных соединений.
Protective Groups in Organic Synthesis
Специалистам в данной области также будет понятно, что в описанном здесь способе функциональные группы соединений-интермедиатов могут нуждаться в защите подходящими защитными группами. Такие функциональные группы включают гидрокси, амино, меркапто и карбоновую кислоту. Подходящие защитные группы для гидрокси включают триалкилсилил или диарилалкилсилил (например, трет-бутилдиметилсилил, трет-бутилдифенилсилил или триметилсилил), тетрагидропиранил, бензил и тому подобное. Подходящие защитные группы для амино, амидино и гуанидино включают трет-бутоксикарбонил, бензилоксикарбонил и тому подобное. Подходящие защитные группы для меркапто включают C(O)-Rʺ (где Rʺ представляет собой алкил, арил или арилалкил), п-метоксибензил, тритил и тому подобное. Подходящие защитные группы для карбоновой кислоты включают алкиловые, ариловые или аралкиловые сложные эфиры. Защитные группы могут быть добавлены или удалены в соответствии со стандартными методами, которые известны специалистам в данной области техники и описаны в данном документе. Использование защитных групп подробно описано в публикации Green, T.W. и P.G.M. Wutz,  (1999), 3rd Ed., Wiley. Как понятно специалисту в данной области, защитная группа может также представлять собой полимерную смолу, такую как смола Ванга, смола Ринка или 2-хлортритилхлоридная смола.
Кроме того, все соединения по изобретению, которые существуют в форме свободного основания или кислоты, могут быть превращены в их соли путем обработки подходящим неорганическим или органическим основанием или кислотой способами, известными специалисту. Соли соединений по изобретению могут быть превращены в форму их свободного основания или кислоты с помощью стандартных методов.
Следующие ниже схемы реакций иллюстрируют примеры способов получения соединений данного изобретения. Понятно, что специалист в данной области может получить эти соединения аналогичными способами или путем комбинирования других способов, известных специалисту. Предполагается также, что специалист в данной области сможет получить способом, аналогичным описанному ниже, другие соединения структуры (I), конкретно не проиллюстрированные ниже, используя соответствующие исходные компоненты и изменяя по мере необходимости параметры синтеза. Как правило, исходные компоненты могут быть получены из таких источников, как Sigma Aldrich, Lancaster Synthesis, Inc., Maybridge, Matrix Scientific, TCI и Fluorochem USA, и т.д., или синтезированы согласно источникам, известным специалистам в данной области техники (см., например, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 5th edition (Wiley, December 2000)), или получены, как описано в данном изобретении.
Схема реакции I
1
2
3
2
3
а
а
b
b
Схема реакции I иллюстрирует пример способа получения интермедиата, подходящего для получения соединений структуры (I), где R, L, L и M являются такими, как определено выше, R и R являются такими, как определено выше, или являются их защищенными вариантами, и L является необязательным линкером. Как показано на схеме реакции I, соединения структуры  можно приобрести или получить способами, хорошо известными специалистам в данной области техники. Реакция  с М-Х, где Х представляет собой галоген, такой как бром, в условиях реакции сочетания Сузуки, известных в данной области, приводят к образованию соединений структуры . Соединения структуры  могут использоваться для получения соединений структуры (I), как описано ниже.
Схема реакции II
1
1
2
3
2
3
с
d
Схема реакции II иллюстрирует альтернативный способ получения интермедиатов, подходящих для получения соединений структуры (I). Как показано на схеме реакции II, где R, L, L, L, G и M являются такими, как определено выше, и R и R являются такими, как определено выше, или являются их защищенными вариантами, соединение структуры , которое может быть приобретено или получено хорошо известными методами, вступает в реакцию с M-G' с образованием соединений структуры . Здесь G и G' представляют собой функциональные группы, имеющие дополнительную реакционную способность (т.е. функциональные группы, которые реагируют с образованием ковалентной связи). G' может быть присоединена к М как боковая группа или может быть частью основной цепи M. G и G' могут представлять собой любое число функциональных групп, описанных в данном документе, таких как алкин и азид, соответственно, амин и активированный сложный эфир, соответственно, или амин и изотиоцианат, соответственно, и тому подобное.
b
d
e
Соединение структуры (I) может быть получено из одной из структур  или  по реакции в хорошо известных условиях автоматизированного синтеза ДНК с фосфорамидитным соединением, имеющим следующую структуру ():
,
e
()
где А является таким, как определено в данном описании, и каждый L независимо представляет собой необязательный линкер.
2
3
b
d
Способы синтеза ДНК хорошо известны в данной области техники. Вкратце, две спиртовые группы, например R и R в интермедиатах  или  выше, функционализированы с помощью диметокситритильной (DMT) группы и 2-цианоэтил-N,N-диизопропиламинофосфорамидитной группы, соответственно. Фосфорамидитная группа связывается со спиртовой группой, как правило, в присутствии активатора, такого как тетразол, с последующим окислением атома фосфора йодом. Диметокситритильная группа может быть удалена с помощью кислоты (например, хлоруксусной кислоты), оставляя открытым свободный спирт, который может взаимодействовать с фосфорамидитной группой. 2-цианоэтильная группа может быть удалена после олигомеризации путем обработки водным раствором аммиака.
3
2
Получение фосфорамидитов, используемых в способах олигомеризации, также хорошо известно в данной области. Например, первичный спирт (например, R) может быть защищен как DMT-группа по реакции с DMT-Cl. Вторичный спирт (например, R) затем функционализируют в качестве фосфорамидита реакцией с соответствующим реагентом, таким как 2-цианоэтил-N,N-диизопропилхлорофосфорамидит. Способы получения фосфорамидитов и их олигомеризации хорошо известны в данной области и описаны более подробно в примерах.
b
d
е
Соединения структуры (I) получают олигомеризацией интермедиатов  или  и , в соответствии с хорошо известным фосфорамидитным методом химического синтеза, описанным выше. Желаемое число m и n повторяющихся звеньев включается в молекулу путем повторения фосфорамидитного сочетания желаемое число раз. Следует отметить, что соединения структуры (II), описанные ниже, могут быть получены аналогичными способами.
В различных других вариантах осуществления предложены соединения, подходящие для получения соединений структуры (I). Соединения могут быть получены, как описано выше, в форме мономера, димера и/или олигомера, и после этого М-фрагмент ковалентно присоединяется к соединению путем любого числа методик синтеза (например, описанных выше «клик-реакций»), с образованием соединения структуры (I). Соответственно, в различных вариантах осуществления предложено соединение, имеющее следующую структуру (II):
(II)
или его стереоизомер, соль или таутомер, где:
G в каждом случае независимо представляет собой фрагмент, содержащий реакционноспособную группу или ее защищенный аналог, способные образовывать ковалентную связь с комплементарной реакционноспособной группой;
1a
2
3
L, L и L в каждом случае независимо представляют собой необязательный алкиленовый, алкениленовый, алкиниленовый, гетероалкиленовый, гетероалкениленовый, гетероалкиниленовый или гетероатомный линкер;
4
L в каждом случае независимо представляет собой гетероалкиленовый, гетероалкениленовый или гетероалкиниленовый линкер более трех атомов в длину, при этом гетероатомы в гетероалкиленовом, гетероалкениленовом и гетероалкиниленовом линкере выбраны из O, N и S;
1
R в каждом случае независимо представляет собой H, алкил или алкокси;
2
3
a
b
c
каждый из R и R независимо представляет собой H, OH, SH, алкил, алкокси, простой алкилэфир, гетероалкил, -OP(=R)(R)R, Q или L';
4
-
-
d
d
R в каждом случае независимо представляет собой OH, SH, O, S, OR или SR;
5
R в каждом случае независимо представляет собой оксо, тиоксо или отсутствует;
a
R представляет собой O или S;
b
d
d
-
-
R представляет собой OH, SH, O, S, OR или SR;
c
d
d
-
-
R представляет собой OH, SH, O, S, OR, OL', SR, алкил, алкокси, простой алкилэфир, простой алкоксиалкилэфир, фосфат, тиофосфат, фосфоалкил, тиофосфоалкил, простой фосфоалкилэфир или простой тиофосфоалкилэфир;
d
R представляет собой противоион;
Q в каждом случае независимо представляет собой фрагмент, содержащий реакционноспособную группу или ее защищенный аналог, способную образовывать ковалентную связь с молекулой аналита, нацеливающим фрагментом, твердым носителем или комплементарной реакционноспособной группой Q′;
L' в каждом случае независимо представляет собой линкер, содержащий ковалентную связь с Q, линкер, содержащий ковалентную связь с нацеливающим фрагментом, линкер, содержащий ковалентную связь с молекулой аналита, линкер, содержащий ковалентную связь с твердым носителем, линкер, содержащий ковалентную связь с остатком твердого носителя, линкер, содержащий ковалентную связь с нуклеозидом, или линкер, содержащий ковалентную связь с другим соединением структуры (II);
m в каждом случае независимо представляет собой целое число, равное нулю или большее, при условии, что, по меньшей мере, в одном случае m представляет собой целое число, равное единице или большее; и
n является целым числом, равным единице или большим.
В других вариантах осуществления структуры (II):
G в каждом случае независимо представляет собой фрагмент, содержащий реакционноспособную группу, способную образовывать ковалентную связь с комплементарной реакционноспособной группой;
1a
2
3
L, L и L в каждом случае независимо представляют собой необязательный алкиленовый, алкениленовый, алкиниленовый, гетероалкиленовый, гетероалкениленовый, гетероалкиниленовый или гетероатомный линкер;
4
L в каждом случае независимо представляет собой гетероалкиленовый, гетероалкениленовый или гетероалкиниленовый линкер более трех атомов в длину, при этом гетероатомы в гетероалкиленовом, гетероалкениленовом и гетероалкиниленовом линкере выбраны из O, N и S;
1
R в каждом случае независимо представляет собой H, алкил или алкокси;
2
3
-
-
-
-
a
b
c
a
b
d
d
c
d
d
d
каждый из R и R независимо представляет собой H, OH, SH, алкил, алкокси, простой алкилэфир, -OP(=R)(R)R, Q, линкер, содержащий ковалентную связь с Q, линкер, содержащий ковалентную связь с молекулой аналита, линкер, содержащий ковалентную связь с твердым носителем, или линкер, содержащий ковалентную связь с другим соединением структуры (II), где: R представляет собой O или S; R представляет собой OH, SH, O, S, OR или SR; R представляет собой OH, SH, O, S, OR, SR, алкил, алкокси, простой алкилэфир, простой алкоксиалкилэфир, фосфат, тиофосфат, фосфоалкил, тиофосфоалкил, простой фосфоалкилэфир или простой тиофосфоалкилэфир; и R представляет собой противоион;
4
-
-
d
d
R в каждом случае независимо представляет собой OH, SH, O, S, OR или SR;
5
R в каждом случае независимо представляет собой оксо, тиоксо или отсутствует;
Q в каждом случае независимо представляет собой фрагмент, содержащий реакционноспособную группу, способную образовывать ковалентную связь с молекулой аналита, твердым носителем или комплементарной реакционноспособной группой Q′;
m в каждом случае независимо представляет собой целое число, равное нулю или большее, при условии, что, по меньшей мере, в одном случае m представляет собой целое число, равное единице или большее; и
n является целым числом, равным единице или большим.
G-фрагмент в соединении структуры (II) может быть выбран из любого фрагмента, содержащего группу, имеющую группу с подходящей реакционной способностью для образования ковалентной связи с комплементарной группой на М-фрагменте. В иллюстративных вариантах осуществления G фрагмент может быть выбран из любого из описанных в данном документе Q-фрагментов, включая конкретные примеры, приведенные в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления G в каждом случае независимо содержит фрагмент, подходящий для реакций, включающих: катализируемую медью реакцию азида и алкина с образованием триазола (реакция Хьюсгена 1,3-диполярного циклоприсоединения), реакцию диена и диенофила (Дильса-Альдера), нитрон-алкиновое циклоприсоединение, облегченное напряжением, реакцию напряженного алкена с азидом, тетразином или тетразолом, [3+2]-циклоприсоединение алкена и азида, реакцию Дильса-Альдера алкена и тетразина с обратными электронными требованиями, фотореакцию алкена и тетразола и различные реакции замещения, такие как замещение удаляемой группы путем нуклеофильной атаки на электрофильный атом.
В некоторых вариантах осуществления G в каждом случае независимо представляет собой фрагмент, содержащий функциональную группу, представляющую собой альдегид, оксим, гидразон, алкин, амин, азид, ацилазид, ацилгалогенид, нитрил, нитрон, сульфгидрил, дисульфид, сульфонилгалогенид, изотиоцианат, сложный имидоэфир, активированный сложный эфир, кетон, α,β-ненасыщенный карбонил, алкен, малеимид, α-галогенимид, эпоксид, азиридин, тетразин, тетразол, фосфин, биотин или тииран.
В других вариантах осуществления G включает в каждом случае независимо алкиновую или азидную группу. В других вариантах осуществления G включает в каждом случае независимо амино, изотиоцианатную или активированную сложноэфирную группу. В разных вариантах осуществления G в каждом случае независимо включает реакционноспособную группу, способную образовывать функциональную группу, содержащую алкен, сложный эфир, амид, сложный тиоэфир, дисульфид, карбоциклическую, гетероциклическую или гетероарильную группу после реакции с комплементарной реакционноспособной группой. Например, в некоторых вариантах осуществления гетероарил представляет собой триазолил.
2
3
1
6
2
6
2
6
В разных других вариантах осуществления соединения структуры (II), L и L в каждом случае независимо представляют собой C-C алкилен, C-C алкенилен или C-C алкинилен.
В других вариантах осуществления соединение имеет следующую структуру (IIA):
(IIA)
где:
1
2
3
4
x, x, x и x в каждом случае независимо представляют собой целое число от 0 до 6.
1a
1a
1a
1a
В других вариантах осуществления структуры (II) каждый L отсутствует. В других вариантах осуществления каждый L присутствует, например, L в каждом случае независимо представляет собой гетероалкилен. В некоторых вариантах осуществления L имеет следующую структуру:
.
В любом другом из приведенных выше вариантов осуществления соединения (II) G в каждом случае независимо представляет собой  или .
1
2
3
4
1
2
3
4
1
3
2
4
1
3
2
4
В разных вариантах осуществления соединения структуры (IIA), по меньшей мере в одном случае x, x, x или x равно 1. В других вариантах осуществления каждый из x, x, x и xравен 1 в каждом случае. В других вариантах осуществления каждый из x и x равен 0 в каждом случае. В некоторых вариантах осуществления каждый из x и x равен 1 в каждом случае. В еще одних вариантах осуществления каждый из x и x равен 0 в каждом случае, и каждый из x и x равен 1 в каждом случае.
4
4
4
В некоторых других вариантах осуществления соединения структуры (II) или (IIA), L в каждом случае независимо представляет собой гетероалкиленовый линкер. В других, более специфичных вариантах осуществления, L в каждом случае независимо представляет собой алкиленоксидный линкер. Например, в некоторых вариантах осуществления L представляет собой полиэтиленоксид, и соединение имеет следующую структуру (IIB):
(IIB)
где z является целым числом от 2 до 100, например, от 3 до 6.
4
-
5
d
В других вариантах осуществления R в каждом случае независимо представляет собой OH, O или OR, и в других вариантах осуществления R представляет собой в каждом случае оксо.
1
В некоторых других вариантах осуществления любого из перечисленных выше соединений структуры (II) или (IIa), R представляет собой H.
2
3
2
3
2
3
a
b
c
a
b
c
В других различных вариантах осуществления соединений структуры (II), каждый из R и Rнезависимо представляет собой OH или -OP(=R)(R)R. В некоторых других вариантах осуществления R или R представляет собой OH или -OP(=R)(R)R, и другой из R или R представляет собой Q или линкер, содержащий ковалентную связь с Q.
2
3
a
b
c
c
В еще одних вариантах осуществления любого из приведенных выше соединений структуры (II), каждый из R и Rнезависимо представляет собой -OP(=R)(R)R. В некоторых из этих вариантов осуществления R представляет собой OL'.
2
3
a
b
В других вариантах осуществления структуры (II) каждый из R и Rнезависимо представляет собой -OP(=R)(R)OL', и L' представляет собой гетероалкиленовый линкер с: Q, нацеливающим фрагментом, аналитом (например, молекулой аналита), твердым носителем, остатком твердого носителя, нуклеозидом или другим соединением структуры (II).
Линкер L' может быть любым линкером, подходящим для присоединения Q, нацеливающего фрагмента, аналита (например, молекулы аналита), твердого носителя, остатка твердого носителя, нуклеозида или другого соединения структуры (II) к соединению структуры (II). Предпочтительно определенные варианты осуществления включают использование L'-фрагментов, выбранных для повышения или оптимизации водорастворимости соединения. В некоторых определенных вариантах осуществления L' содержит алкиленоксидный или сложный фосфодиэфирный фрагмент, или их сочетания.
В некоторых вариантах осуществления L' имеет следующую структуру:
,
где:
m" и n" независимо представляют собой целое число от 1 до 10;
e
R представляет собой Н, электронную пару или противоион;
e
L" представляет собой R или представляет собой непосредственную связь или мостик с: Q, нацеливающим фрагментом, аналитом (например, молекулой аналита), твердым носителем, остатком твердого носителя, нуклеозидом или другим соединением структуры (II).
В некоторых из приведенных выше вариантов осуществления нацеливающий фрагмент представляет собой антитело или антагонист рецептора клеточной поверхности.
2
3
В других более специфичных вариантах осуществления любого из приведенных выше соединений структуры (II), R или R имеет одну из следующих структур:
;
;
;
;  или .
2
3
Некоторые варианты осуществления соединений структуры (II) могут быть получены в соответствии с методами твердофазного синтеза, аналогичными известным в данной области для получения олигонуклеотидов. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления L' представляет собой связь с твердым носителем, остатком твердого носителя или нуклеозидом. Твердые носители, содержащие активированную группу дезокситимидина (dT), легко доступны, и в некоторых вариантах осуществления могут применяться в качестве исходного материала для получения соединений структуры (II). Соответственно, в некоторых вариантах осуществления R или R имеет следующую структуру:
.
2
3
В еще одних вариантах осуществления соединений структуры (II) Q в каждом случае независимо представляет собой фрагмент, содержащий реакционноспособную группу, способную образовывать ковалентную связь с молекулой аналита или твердым носителем. В других вариантах осуществления Q в каждом случае независимо представляет собой фрагмент, содержащий реакционноспособную группу, способную образовывать ковалентную связь с комплементарной реакционноспособной группой Q′. Например, в некоторых вариантах осуществления Q′ присутствует в другом соединении структуры (II) (например, в положении R или R), и Q и Q′ содержат комплементарные реакционноспособные группы, благодаря чему реакция соединения структуры (II) и другого соединения структуры (II) приводит к ковалентно связанному димеру соединения структуры (II). Мультимерные соединения структуры (II) также могут быть получены аналогичным образом и включены в объем вариантов осуществления изобретения.
Тип Q-группы и возможность присоединения Q-группы к остальной части соединения структуры (II) не имеет ограничений, при условии, что Q содержит фрагмент, имеющий соответствующую реакционную способность для образования желаемой связи.
В некоторых вариантах осуществления соединений структуры (II), Q представляет собой фрагмент, который не подвержен гидролизу в водных условиях, но является достаточно реакционноспособным для образования связи с соответствующей группой на молекуле аналита или твердом носителе (например, амина, азида или алкина).
Некоторые варианты осуществления соединений структуры (II) включают Q-группы, обычно используемые в области биоконъюгирования. Например, в некоторых вариантах осуществления Q содержит нуклеофильную реакционноспособную группу, электрофильную реакционноспособную группу или реакционноспособную группу циклоприсоединения. В некоторых более специфичных вариантах осуществления Q содержит сульфгидрильную, дисульфидную, активированную сложноэфирную, изотиоцианатную, азидную, алкиновую, алкеновую, диеновую, диенофильную, галогенангидридную, сульфонилгалогенидную, фосфиновую, α-галогенамидную, биотиновую, амино или малеимидную функциональную группу. В некоторых вариантах осуществления, активированный сложный эфир представляет собой N-сукцинимидный сложный эфир, сложный имидоэфир или сложный полифторфенильный эфир. В других вариантах осуществления алкин представляет собой алкилазид или ацилазид.
Приводимые в качестве примера Q-фрагменты для соединений структуры (II) приведены в таблице I выше.
Как и в случае соединений структуры (I), в некоторых вариантах осуществления соединений структуры (II), где Q представляет собой SH, SH-фрагмент будет иметь тенденцию образовывать дисульфидные связи с другой сульфгидрильной группой на другом соединении структуры (II). Соответственно, некоторые варианты осуществления включают соединения структуры (II), которые находятся в форме дисульфидных димеров, причем дисульфидная связь получена из SH Q- групп.
2
3
2
3
a
b
c
В некоторых других вариантах осуществления соединений структуры (II) один из R или R представляет собой OH или -OP(=R)(R)R, и другой из R или R представляет собой линкер, содержащий ковалентную связь с молекулой аналита, линкер, содержащий ковалентную связь с нацеливающим фрагментом, или линкер, содержащий ковалентную связь с твердым носителем. Например, в некоторых вариантах осуществления молекула аналита представляет собой нуклеиновую кислоту, аминокислоту или ее полимер. В других вариантах осуществления молекула аналита представляет собой фермент, рецептор, лиганд рецептора, антитело, гликопротеин, аптамер или прион. В некоторых вариантах осуществления нацеливающий фрагмент представляет собой антитело или антагонист рецептора клеточной поверхности. В еще одних вариантах осуществления твердый носитель представляет собой полимерную гранулу или неполимерную гранулу.
В других вариантах осуществления соединений структуры (II) m в каждом случае независимо представляет собой целое число от 1 до 10. Например, в некоторых вариантах осуществления m в каждом случае независимо представляет собой целое число от 1 до 5, такое как 1, 2, 3, 4 или 5. В некоторых вариантах осуществления m равно 1. В некоторых вариантах осуществления m равно 2. В некоторых вариантах осуществления m равно 3. В некоторых вариантах осуществления m равно 4. В некоторых вариантах осуществления m равно 5.
В еще одних вариантах осуществления соединений структуры (II) n является целым числом от 1 до 100. Например, в некоторых вариантах осуществления n является целым числом от 1 до 10. В некоторых вариантах осуществления n равно 1. В некоторых вариантах осуществления n равно 2. В некоторых вариантах осуществления n равно 3. В некоторых вариантах осуществления n равно 4. В некоторых вариантах осуществления n равно 5. В некоторых вариантах осуществления n равно 6. В некоторых вариантах осуществления n равно 7. В некоторых вариантах осуществления n равно 8. В некоторых вариантах осуществления n равно 9. В некоторых вариантах осуществления n равно 10.
В других вариантах осуществления соединение структуры (II) выбирают из таблицы 3.
Таблица 3. Примеры соединений структуры (II)
№
Структура
II-1
<img file="00000185.jpg" he="24" wi="128" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-2
<img file="00000186.jpg" he="28" wi="131" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-3
<img file="00000187.jpg" he="24" wi="128" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-4
<img file="00000188.jpg" he="28" wi="131" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-5
<img file="00000189.jpg" he="28" wi="131" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-6
<img file="00000190.jpg" he="28" wi="131" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-7
<img file="00000191.jpg" he="28" wi="131" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-8
<img file="00000192.jpg" he="28" wi="131" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-9
<img file="00000193.jpg" he="28" wi="131" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-10
<img file="00000194.jpg" he="35" wi="121" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-11
<img file="00000195.jpg" he="35" wi="121" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-12
<img file="00000196.jpg" he="41" wi="116" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-13
<img file="00000197.jpg" he="41" wi="115" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-14
<img file="00000198.jpg" he="40" wi="113" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-15
<img file="00000199.jpg" he="35" wi="124" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-16
<img file="00000200.jpg" he="39" wi="110" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000201.jpg" he="32" wi="117" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000202.jpg" he="19" wi="70" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-17
<img file="00000203.jpg" he="38" wi="107" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000204.jpg" he="20" wi="99" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000205.jpg" he="19" wi="70" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-18
<img file="00000206.jpg" he="38" wi="106" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000207.jpg" he="18" wi="77" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000208.jpg" he="19" wi="70" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-19
<img file="00000209.jpg" he="39" wi="108" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000082.jpg" he="26" wi="102" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000210.jpg" he="19" wi="70" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-20
<img file="00000211.jpg" he="39" wi="108" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000212.jpg" he="39" wi="118" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000205.jpg" he="19" wi="70" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-21
<img file="00000213.jpg" he="39" wi="108" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000214.jpg" he="34" wi="119" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000205.jpg" he="19" wi="70" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-22
<img file="00000215.jpg" he="38" wi="105" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000088.jpg" he="31" wi="115" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000205.jpg" he="19" wi="70" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-23
<img file="00000216.jpg" he="38" wi="105" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000090.jpg" he="26" wi="76" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000205.jpg" he="19" wi="70" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-24
<img file="00000217.jpg" he="38" wi="105" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000092.jpg" he="26" wi="93" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000205.jpg" he="19" wi="70" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-25
<img file="00000218.jpg" he="37" wi="104" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000094.jpg" he="37" wi="110" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000205.jpg" he="19" wi="70" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-26
<img file="00000219.jpg" he="36" wi="100" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000220.jpg" he="31" wi="114" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000205.jpg" he="19" wi="70" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-27
<img file="00000221.jpg" he="35" wi="98" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000222.jpg" he="18" wi="74" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000205.jpg" he="19" wi="70" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-28
<img file="00000223.jpg" he="37" wi="103" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000224.jpg" he="22" wi="86" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000205.jpg" he="19" wi="70" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-29
<img file="00000225.jpg" he="36" wi="101" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000226.jpg" he="19" wi="94" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000205.jpg" he="19" wi="70" img-content="undefined" img-format="jpg" />
II-30
<img file="00000227.jpg" he="37" wi="102" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000228.jpg" he="37" wi="113" img-content="undefined" img-format="jpg" /><img file="00000205.jpg" he="19" wi="70" img-content="undefined" img-format="jpg" />
2
В разных вариантах осуществления G в соединениях таблицы 3 представляет собой алкинил, такой как этинил. В других вариантах осуществления G в соединениях таблицы 3 представляет собой азид. В других вариантах осуществления G в соединениях таблицы 3 представляет собой амино (NH). В других вариантах осуществления G в соединениях таблицы 3 представляет собой изотиоцианат. В других вариантах осуществления G в соединениях таблицы 3 представляет собой активированный сложный эфир, такой как N-гидроксисукцинимидный сложный эфир.
Соединения структуры (II) могут использоваться в различных способах, например, в вариантах осуществления предложен способ мечения аналита, такого как молекула аналита или нацеливающий фрагмент, причем способ включает:
2
3
(а) смешивание любого из описанных соединений структуры (II), где R или R представляет собой Q или линкер, содержащий ковалентную связь с Q, с молекулой аналита;
(b) получение конъюгата соединения и аналита или нацеливающего фрагмента; и
1b
(c) взаимодействие конъюгата с соединением формулы M-L-G′, благодаря чему образуется по меньшей мере одна ковалентная связь по реакции по меньшей мере одного G и по меньшей мере одного G′,
где:
M представляет собой фрагмент, имеющий две или более двойные углерод-углеродные связи и по меньшей мере одну степень конъюгирования;
1b
L представляет собой необязательный алкиленовый, гетероалкиленовый или гетероатомный линкер; и
G' представляет собой реакционноспособную группу, комплементарную G.
Другой вариант осуществления представляет собой способ мечения аналита, такого как молекула аналита или нацеливающий фрагмент, причем способ включает:
2
3
1b
(а) смешивание любого из соединений структуры (II), описанных здесь, где R или R представляет собой Q или линкер, содержащий ковалентную связь с Q, с соединением формулы M-L-G′, благодаря чему образуется по меньшей мере одна ковалентная связь путем реакции G и G′; и
(b) взаимодействие продукта стадии (a) с аналитом или нацеливающим фрагментом, в результате чего образуется конъюгат продукта стадии (a) и молекулы аналита,
где:
M представляет собой фрагмент, имеющий две или более двойные углерод-углеродные связи и по меньшей мере одну степень конъюгирования;
1b
L представляет собой необязательный алкиленовый, гетероалкиленовый или гетероатомный линкер; и
G' представляет собой реакционноспособную группу, комплементарную G.
1b
Кроме того, как отмечалось выше, соединения структуры (II) можно использовать для получения соединений структуры (I). Соответственно, в одном варианте осуществления предложен способ получения соединения структуры (I), включающий смешивание соединения структуры (II) с соединением формулы M-L-G′, благодаря чему образуется по меньшей мере одна ковалентная связь путем реакции G и G′; где:
M представляет собой фрагмент, имеющий две или более двойные углерод-углеродные связи и по меньшей мере одну степень конъюгирования;
1b
L представляет собой необязательный алкиленовый, гетероалкиленовый или гетероатомный линкер; и
G' представляет собой реакционноспособную группу, комплементарную G.
Следующие примеры приведены с целью иллюстрации, а не ограничения.
ПРИМЕРЫ
Общие методы
Масс-спектральный анализ проводили в системе Waters/Micromass Quattro Micro MS/MS (в режиме «MS only») с использованием программного обеспечения для сбора данных MassLynx 4.1. Подвижная фаза, используемая для LC/MS на красителях, представляла собой 100 мМ 1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропанол (HFIP) в 8,6 мМ триэтиламине (TEA), pH 8. Фосфорамидиты и молекулы предшественников также анализировали с использованием системы Waters Acquity UHPLC с колонкой Acquity BEH-C18 2,1 мм × 50 мм, поддерживаемой при 45°С, применяя градиент подвижной фазы ацетонитрил/вода. Молекулярные массы для мономерных интермедиатов были получены с использованием ионизации, усиленной инфузионным введением катиона тропилия, на системе Waters/Micromass Quattro Micro MS/MS (в режиме «MS only»). Профили возбуждения и эмиссии регистрировали на спектрофотометре Cary Eclipse.
Все реакции проводили в высушенной в сушильном шкафу стеклянной посуде в атмосфере азота, если не указано иное. Коммерчески доступные реагенты для синтеза ДНК приобретали у Glen Research (Sterling, VA). Безводный пиридин, толуол, дихлорметан, диизопропилэтиламин, триэтиламин, уксусную кислоту, пиридин и ТГФ приобретали у Aldrich. Все другие химические реагенты приобретали у Aldrich или TCI и использовали в исходном виде, без дополнительной очистки.
ПРИМЕР 1
Синтез красителей с этиленгликолевым спейсером
Соединения с этиленоксидными линкерами получали следующим образом:
2
2
6
Олигофторозидные конструкции (т.е. соединения структуры (I)) синтезировались на синтезаторе Applied Biosystems 394 DNA/RNA Synthesizer в масштабе 1 мкмоль и имели 3'-фосфатную группу или 3'-S-(CH)-OH группу или любую из других групп, описанных в данном документе. Синтез осуществляли непосредственно на CPG-гранулах или на твердом носителе из полистирола с использованием стандартного фосфорамидитного метода химического синтеза. Олигофторозиды синтезировали в 3'-5' направлении с использованием стандартных методов твердофазного синтеза ДНК, и сочетания с использованием стандартного синтеза с β-цианоэтилфосфорамидитом. Фторозидный фосфорамидит и спейсеры (например, гексаэтилоксигликольфосфорамидит, триэтилоксигликольфосфорамидит, полиэтиленгликольфосфорамидит) и линкер (например, 5'-аминомодификатор фосфорамидита и тиольные модификаторы S2 фосфорамидита) растворяли в ацетонитриле с получением 0,1 М растворов и добавляли друг за другом, используя следующий цикл синтеза: 1) удаление 5'-диметокситритильной защитной группы дихлоруксусной кислотой в дихлорметане, 2) сочетание следующего фосфорамидита с активатором в ацетонитриле, 3) окисление P(III) с образованием стабильного P(V) с использованием смеси йод/пиридин/вода, и 4) блокирование любых непрореагировавших 5'-гидроксильных групп уксусным ангидридом/1-метилимидазолом/ацетонитрилом. Цикл синтеза повторяли до тех пор, пока ни была собрана полноразмерная олигофторозидная конструкция. По окончании сборки цепи монометокситритильную (ММТ) группу или диметокситритильную (DMT) группу удаляли с помощью дихлоруксусной кислоты в дихлорметане.
4
Соединения получали на носителе из стекла с контролируемым размером пор (CPG) в масштабе 0,2 мкмоль в меченой пробирке Эппендорфа. Добавляли 400 мкл 20-30% NHOH и осторожно перемешивали. Открытые пробирки помещали в термостат при 55°С на ~5 мин или до тех пор, пока не высвобождался избыток газов, и затем герметично закрывали и инкубировали в течение 2 ч (±15 мин). Пробирки извлекали из термостата и давали возможность достичь комнатной температуры, после чего следовало центрифугирование при 13400 об/мин в течение 30 с для получения супернатанта и твердой фазы. Супернатант осторожно удаляли и помещали в меченую пробирку, и затем добавляли 150 мкл ацетонитрила для промывки носителя. После добавления промывки в пробирки их помещали в устройство CentriVap при 40°C до высыхания.
Продукты характеризовали с помощью ESI-MS (см. таблицу 2), УФ-поглощения и флуоресцентной спектроскопии.
ПРИМЕР 2
Спектральный анализ соединений
2
3
-1
-1
Высушенные соединения ресуспендировали в 150 мкл 0,1 М NaCO буфера с получением ~1 мМ исходного раствора. Концентрированный исходный раствор разводили 50× в 0,1× PBS и анализировали на УФ-спектрометре NanoDrop с получением показаний оптической плотности. Показания оптической плотности использовались вместе с коэффициентом экстинкции (75000 M смдля каждого звена FAM) и законом Бера для определения фактической концентрации исходного раствора.
2
3
2
3
На основе вычисленных концентраций исходного раствора ~4 мл 5 мкМ раствора готовили в 0,1М NaCO (pH 9) и анализировали в кварцевой кювете 1 × 1 см на УФ-спектрометре Cary 60, с использованием спектрального диапазона 300-700 нм для измерения суммарной оптической плотности относительно группы. Из этих 5 мкМ растворов второе разведение проводили при 50 нм или 25 нМ (также в 0,1 М NaCO, рН 9) для спектрального анализа на флуориметре Cary Eclipse. Длину волны возбуждения устанавливали на 494 нм, и эмиссионные спектры получали от 499 нм до 700 нм.
На фиг. 1 и фиг. 2 приводится УФ-поглощение репрезентативных соединений структуры (I) и сравнительного соединения («Соединение А»). Как видно на фиг. 1 и фиг. 2, коэффициент экстинкции в УФ-области репрезентативных соединений структуры (I), содержащих два флуоресцеиновых фрагмента, приблизительно в два раза больше, чем у соединения А.
Соединение А
4
Также определяли эмиссионные спектры флуоресценции репрезентативных соединений структуры (I) и сравнивали с эмиссионным спектром соединения A. Как показывают данные на фиг. 3 и фиг. 4, флуоресцентная эмиссия репрезентативных соединений структуры (I) оказывается выше, чем для соединения А, и эмиссия увеличивается по мере увеличения количества триэтиленгликолевых или гексаэтиленгликолевых звеньев. Не желая быть связанными теорией, полагают, что это неожиданное увеличение флуоресцентной эмиссии связано с уменьшением внутримолекулярного тушения, связанного с пространственным расстоянием, обеспечиваемым L.
Соединения I-10 и I-11 тестировали для определения влияния количества М-фрагментов на УФ-поглощение и флуоресцентную эмиссию соединений. На фиг. 5 представлены данные, позволяющие сравнить УФ-поглощение соединений I-10 и I-11 со сравнительным соединением, имеющим один М-фрагмент («соединение В») при 5 мкм. При 5 мкМ соединение B, которое содержит одно FAM-звено, поглощало при 0,43 е.о.п. (AU), тогда как соединение I-10 (3 FAM-звена) поглощало при 1,17 е.о.п. и соединение I-11 (5 FAM-звеньев) поглощало при 2,00 е.о.п.
Соединение B
Эмиссионные спектры флуоресценции для соединений I-10, I-11 и В при 25 нМ представлены на фиг. 6. В отличие от тушения (как в случае более близко расположенных FAM-звеньев) соединения I-10 и I-11 показали эмиссионные отклики, которые были выше в 2,5 и 4,3 раза, соответственно, по сравнению со значением для соединения B.
ПРИМЕР 3
Сравнительный эмиссионный отклик флуоресценции
2
3
Соединения «HEG», «TEG», «C2», «C3», «C4» и «C6», где R и R являются такими, как определено для соединения I-3, и m изменяется от 1 до 9, получали и определяли их эмиссионные спектры флуоресценции. Результаты представлены на фиг. 7. Данные показывают, что соединения в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения (т.е. HEG и TEG) имеют повышенную флуоресцентную эмиссию при меньшем числе повторяющихся спейсерных фрагментов (т.е. более низких значениях m) по сравнению с другими соединениями красителей.
На фиг. 8 представлены данные, позволяющие сравнить флуоресцентную эмиссию для соединения HEG, где m равно 1, 2 или 3, относительно соединения A (50 нМ, pH=9). Данные показывают увеличение флуоресцентной эмиссии для HEG относительно соединения A, когда m больше 2.
ПРИМЕР 4
Получение репрезентативных соединений
4
4
4
Соединения I-29, I-32 и репрезентативные аналоги были получены и протестированы для определения того, имеют ли соединения, в которых L представляет собой длинный линкер (~1000 дальтон PEG), сходные свойства с соединениями с более короткими линкерами L, но с несколькими повторами (т.е. m более 1). На фиг. 9 представлены данные по УФ-поглощению для соединения I-60, соединения I-46 и соединения В. Данные показывают, что соединения с длинными линкерами L имеют УФ-поглощение, аналогичное соединениям с несколькими повторами более коротких линкеров, при этом и те и другие соединения имеют повышенное поглощение по сравнению с контрольным соединением B.
ПРИМЕР 5
Получение 99-мерного красителя
Соединение I-42, содержащее 33 флуоресцеиновых фрагмента, получали с помощью стандартных методов твердофазного синтеза олигонуклеотидов, как описано в данном документе. I-42 (представленный как «А» в приведенной ниже схеме) тримеризовали, как проиллюстрировано и описано ниже, с образованием 99-мерного красителя.
TM
В полипропиленовую пробирку емкостью 200 мкл помещали натрий-фосфатный буфер (3,5 мкл, 100 мМ, рН=6,5) и раствор бис-дисульфида I-42 (5,5 мкл, 0,18 мМ в воде). К этому добавляли раствор трис-(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP, 1,0 мкл, 10 мМ в воде). Пробирку закрывали, перемешивали на вортексе и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Смесь обессоливали через колонки для обессоливания Zeba Micro Spin (Pierce, кат. № 89877). Обессоленный раствор обрабатывали натрий-фосфатным буфером (2,0 мкл, 500 мМ, pH=7,2) и DMSO-раствором бисмалеимидоэтана (BMOE, 1,0 мкл, 0,25 мМ) и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь разводили водой (100 мкл) и анализировали с помощью PAGE (фиг. 10, Invitrogen EC6875, 10% гель с TBE-мочевиной, постоянное напряжение 180 В, электрофорез останавливали, когда разрешение наиболее высокомолекулярных соединений было достигнуто, визуализировали с помощью УФ-излучения (365 нм)).
Другие олигомерные красители, имеющие любое желаемое число фрагментов красителей, получали аналогичным образом.
ПРИМЕР 6
Общие методы проточной цитометрии
Если не указано иное, в следующих ниже примерах использовались следующие общие методики.
Лизис цельной крови:
Метод с использованием забуференного хлорида аммония.
f
Для окрашивания живых клеток антикоагулированную этилендиаминтетраацетатом (ЭДТА) кровь здорового человека лизировали с помощью раствора хлорида аммония (АСК), 15 мл крови к 35 мл лизирующего раствора в течение 15 мин при комнатной температуре (КТ). Клетки дважды промывали 50% сбалансированного солевого раствора Хенкса (HBSS) и 50% 1% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1× физиологического раствора, забуференного фосфатом Дульбекко (DPBS), с 0,02% азидом натрия. Затем клетки повторно суспендировали до 100 мкл/образец/0,1-1×10е6 в донорской плазме. Клетки в плазме добавляли к предварительно разведенным антителам к V в 100 мкл 1% альбумина бычьей сыворотки (BSA) и 1× DPBS с 0,02% азидом натрия в 96-луночных полипропиленовых планшетах HTS. После инкубирования в течение 45 мин при КТ клетки дважды промывали 50% HBSS и 50% - 1% FBS и 1× DPBS с 0,02% азидом натрия.
Метод лизирования/фиксации
. Кровь лизировали 1,0 мл RBC-лизирующего раствора (хлорида аммония), 100-15 мл крови к 35 мл лизирующего раствора в течение 15 мин при комнатной температуре (КТ). Клетки затем дважды промывали 50% HBSS и 50% - 1% FBS и 1× DPBS с 0,02% азидом натрия. Затем клетки повторно суспендировали до 100 мкл/образец/1×10е6 в донорской плазме. Предварительно разведенные антитела добавляли в 100 мкл 1% BSA и 1× DPBS с 0,02% азидом натрия. 100 мкл клеток добавляли в 96-луночные полипропиленовые планшеты HTS (общий объем образца 200 мкл). После инкубирования в течение 45 мин при КТ клетки дважды промывали 50% HBSS и 50% - 1% FBS и 1× DPBS с 0,02% азидом натрия.
Получение конъюгатов антител:
Конъюгаты антител получали путем реакции соединения структуры (I), содержащего Q-фрагмент, имеющий следующую структуру:
с желаемым антителом. Таким образом, соединение и антитело конъюгируют путем реакции S на антителе с Q-фрагментом с образованием следующей связывающей структуры:
Конъюгаты антител обозначаются названием антитела, за которым следует номер соединения. Например, UCHT1-I-45 указывает на конъюгат, образованный между соединением I-45 и антителом UCHT1. Если указанный номер соединения не включает указанный выше Q-фрагмент в таблице 2, имеется ввиду, что Q-фрагмент был введен, и конъюгат получен из образующегося в результате соединения, имеющего Q-фрагмент.
Разведение конъюгатов:
Антитела доводили до КТ. Конъюгаты антител разводили до концентраций в диапазоне 0,1-540 нМ (8,0 мкг или менее на образец) в буфере для окрашивания клеток (1× DPBS, 1% BSA, 0,02% азид натрия). В некоторых примерах серийные разведения для каждого образца начинались с 269 нМ антитела в буфере для окрашивания клеток, и разведения антител хранили защищенными от света до использования. В других экспериментах разведения начинали при 4,0 мкг антитела/объем образца, при этом объем образца находился в диапазоне 100-200 мкл. Титры осуществляли в двух- или четырехкратных разведениях для получения кривых связывания. В некоторых случаях 8,0 или 2,0 мкг/объем образца использовали в первой лунке в серийном разведении.
Проточная цитометрия с конъюгатом:
аффинность
яркость
разрешения
яркости
не были включены
После определения физических характеристик, конъюгаты тестировали на активность и функциональность ( связывания антител и  красителя) и сравнивали с эталонным окрашиванием антителом. Затем качество  определяли путем анализа  по сравнению с автофлуоресцентными отрицательными контролями и другим неспецифическим связыванием с использованием проточного цитометра. Обширные исследования конъюгатов MOPC-21 контрольного изотипа мышиного IgG1,k  при тестировании I-45, поскольку неспецифическое связывание MOPC-21 было охарактеризовано во время тестирования UCHT1-Соединение C и UCHT1-I-45 в более ранних испытаниях. Конъюгаты I-45 тестировали на Т-клетках Jurkat, В-клетках Ramos и гетерогенной популяции лейкоцитов в крови человека или мононуклеарных клетках периферической крови (PBMC) и с использованием полистирольных гранул, покрытых козьими антимышиными Ig. Скрининг цельной крови был самым обычным для тестирования UCHT1-I-45 и его аналогов. Осуществлялись вспомогательные исследования по мере формирования новых конструкций. При тестировании конъюгатов (UCHT1-I-56, I-48, I-49, I-16 и I-21B) использовали дополнительные методы проточной цитометрии и сравнивали с эталонами конъюгатов антител от Sony Biotechnology (UCHT1-FITC) и ранее охарактеризованными в большинстве исследований ключевыми вспомогательными эталонами (например, UCHT1-I-45, UCHT1-I-49).
Соединение C
Проведение проточной цитометрии свободного красителя:
аффинность
яркости
линейности
После определения молекулярных и физических характеристик красители также тестировали на потенциальную  к клеткам по сравнению с эталонным красителем. Поскольку красители могут также функционировать как клеточные зонды и связываться с клеточным материалом, - красители могут в целом подвергаться скринингу относительно крови при высоких концентрациях (от >100 нМ до 10000 нМ) для определения специфических характеристик. Ожидаемое или непредусмотренное нецелевое связывание затем квалифицировали путем оценки  и  после разведения по сравнению с автофлуоресцентными отрицательными контролями и другими контрольными красителями с использованием проточного цитометра. Исследования соединения D (свободного красителя соединения С, но не функционализированного) были положительным контролем для яркого нецелевого связывания красителей и прежде были охарактеризованы в форме конъюгата. I-45 красители тестировали на гетерогенной популяции лейкоцитов в крови человека, когда клетки обрабатывали лизирующим и фиксирующим раствором, а также когда проводили состаривание крови или при применении к РВМС популяциям моноцитов. Вспомогательные исследования, ранжирующие афинность (соединение D, I-45, I-49 и I-16) были выполнены для сравнений партий красителей, включая красители из очень ранних исследований, при характеризации соединения D.
Соединение D
Последовательность операций проточной цитометрии:
Клетки культивировали и наблюдали за визуальными признаками метаболического стресса для скрининга красителя или нецелевого связывания (данные не показаны), или свежие здоровые клетки использовали для скрининга конъюгата. Клетки подсчитывали периодически для проверки плотности клеток (1×10е5 и 1×10е6 жизнеспособных клеток/мл). Конъюгаты антител разводили (предпочтительно в планшете или пробирках) до сбора клеток в буфере для окрашивания (DPBS, 0,1% BSA, 0,02% азида натрия). Использовали клетки с диапазоном жизнеспособности 80-85%. Клетки промывали дважды центрифугированием и промыванием клеток буфером для удаления индикатора рН и блокирования клеток с Ig и другими белками, содержащимися в FBS. Плотность клеток доводили до объема образца в буфере для окрашивания. Клетки наносили на планшеты, по одному образцу в лунку, или красители (предварительно разведенные) наносили на клетки в планшете. Затем клетки инкубировали в течение 45 мин при 23°С. Клетки промывали дважды центрифугированием и промывкой клеток промывочным буфером, затем аспирировали планшет. Клетки повторно суспендировали в буфере для сбора. 5000 интактных клеток было получено с помощью проточной цитометрии.
Флуоресценцию красителей определяли с помощью 488 нМ линии голубого лазера путем проточной цитометрии с пиком эмиссии (521 нМ), детектированным с использованием полосового фильтра 525/50. По меньшей мере 1500 интактных клеток, при целевом получении 3000-5000 интактных клеток, было получено с помощью проточной цитометрии и проанализировано для идентификации жизнеспособных клеток, присутствующих в клеточном препарате.
Методы анализа данных:
Описательная статистика.
Программное обеспечение EC-800 позволяет пользователю собирать многочисленные статистические данные для каждого полученного образца. Средняя или медианная интенсивность флуоресценции (MFI) в канале FL1-A использовалась для измерения яркости соединения антитело-краситель, при применении проточной цитометрии и при оценке шума. Другие статистические данные оценивали для определения характеристик красителя и общего качества реагентов, включая медианное отношение «сигнал/шум» и абсолютную флуоресценцию (медиану или геометрическое среднее).
Гистограммы.
События проточной цитометрии гейтировали по размеру по параметрам прямого светорассеяния относительно бокового светорассеяния (объем клетки относительно гранулярности клетки). Затем эти клетки гейтировали по флуоресцентной эмиссии при 515 нм для средней интенсивности флуоресценции (MFI). Собранные данные представлены в виде двухпараметрических гистограмм, построенных как количество событий по оси y против интенсивности флуоресценции, которая представлена в логарифмической шкале по оси х. Данные могут быть обобщены кривыми аффинности или гистограммами относительной интенсивности флуоресценции.
Кривые связывания.
Величина MFI была выбрана, поскольку она является параметром, который наилучшим образом измеряет яркость соединения антитело-краситель в процессе FCM, она может быть выражена как среднее геометрическое, медианное или среднее значение и представлять абсолютные показатели флуоресценции. Для сравнения, там где шум может быть в высокой степени характерен, отношение «сигнал/шум» определяется как MFI, S/N. В примерах 7, 8 и 14 MFI конъюгатов UCHT1-Соединение C в зависимости от концентрации показано, чтобы продемонстрировать кривые связывания реагента.
Двумерные двухпараметрические гистограммы.
В некоторых случаях события FCM не гейтировали для оценки качественных результатов, и данные выражали гранулярностью клеток (SSC) в зависимости от флуоресценции красителя. Этот метод позволяет провести общую оценку всех популяций, полученных в цельной крови.
ПРИМЕР 7
Оценка красителей для неспецифического и нецелевого связывания с использованием некротических и апоптотических популяций Т-клеток Jurkat, подвергнутых тепловому стрессу
Клетки Jurkat культивировали в соответствии с инструкциями, предложенными американской коллекцией типовых культур (АТСС), собирали живыми, подвергали тепловому стрессу, промывали 2-3 раза и окрашивали конъюгированными антителами. Окрашивание проводили путем нанесения на клетки предварительно разведенных красителей и предварительно разведенных конъюгированных антител, инкубации, промывки, и в дальнейшем получения с помощью проточной цитометрии. Популяцию мертвых и некротических клеток (~10% полученных клеток) оценивали по сигналу флуоресценции. Результаты показаны на фиг. 11. Как показано на фиг. 11, отмечается, что флуоресценция выше у 10× соединения D свободного красителя по сравнению с 10× I-47, 5× соединением Е, 5× I-44, 3× соединением F и 3× I-43.
Соединение E
Соединение F
ПРИМЕР 8
Оценка конъюгатов по интенсивности флуоресценции: UCHT1-Соединение G относительно UCHT1-I-51
5
Жизнеспособные клетки Jurkat культивировали в соответствии с инструкциями, предложенными АТСС, и собирали, затем выделяли при ~225 RCF в течение 6 мин в центрифуге с контролируемой температурой, установленной на 23°С. Супернатант удаляли. Затем клетки дважды промывали в буфере клеточной суспензии (не содержащий кальция и магния 1× DPBS, 1,0% FBS, 0,02% азида натрия, pH 7,2). После второй промывки клетки центрифугировали, супернатант удаляли и клетки (~5 × 10 жизнеспособных клеток на образец) повторно суспендировали до объема образца (конечного объема 100 мкл). Клетки инкубировали с растворами конъюгатов антитело-краситель в течение 45 мин при КТ. После инкубации образцы дважды промывали и затем суспендировали в буфере для сбора.
Данные получали и оценивали на SONY EC-800 FCM, и наносили на график количество белка антитела в нМ в зависимости от геометрического среднего значения относительной флуоресценции, как показано на фиг. 12. Как можно видеть, MOPC-21-Соединение G имеет неспецифическое связывание, но оба конъюгата в 4-5 раз ярче, чем эталон FITC. Этот пример также показывает, что MOPC21-I-51 демонстрирует снижение неспецифического связывания по сравнению с конъюгатом UCHT1-Соединение G (при этих уровнях красителя на метку (DOL)).
Соединение G
ПРИМЕР 9
Оценка экспрессии CD3 (специфичность и разрешение) в образце гетерогенных клеток и клетках периферической цельной крови
Цельную кровь отбирали от здорового донора в стабилизированную ЭДТА пробирку для транспортировки и кратковременного хранения. Кровь лизировали АСК, 15 мл крови к 35 мл лизирующего раствора в течение 15 мин при КТ. Клетки дважды промывали 50% сбалансированного солевого раствора Хенкса (HBSS) и 50% - 1% FBS и 1× DPBS с 0,02% азидом натрия. Клетки повторно суспендировали до 100 мкл/образец/1×10е6 в донорской плазме. Антитела предварительно разводили в 100 мкл 1% BSA и 1× DPBS с 0,02% азидом натрия и добавляли к 100 мкл клеток в 96-луночных полипропиленовых планшетах HTS (общий объем образца 200 мкл). Клетки инкубировали в течение 45 мин при КТ, дважды промывали 50% HBSS и 50% - 1% FBS и 1× DPBS с 0,02% азидом натрия, и повторно суспендировали в 1% FBS и 1× DPBS с 0,02% азидом натрия.
На фиг. 13 представлены сравнения конъюгата I-51 и соединения G с эталонным антителом. На фиг. 13 морфология клеток (SSC-Lin) показана на двухпараметрической гистограмме с эмиссией красителя, детектированной в канале FL1-A. Отмечается неспецифическое связывание (NSB) конъюгата соединения G на гетерогенной популяции клеток, главным образом нейтрофилов и моноцитов, тогда как конъюгаты I-51 не показывают NSB. NSB UCHT1-Соединение G в лизированной цельной крови эффективно снижает доступность антител для связывания с CD3.
На фиг. 14 приводится сравнение UCHT1-I-51, UCHT1-BB515 и UCHT1-FITC. UCHT1-I-51 в 6 раз ярче, чем UCHT1-FITC.
ПРИМЕР 10
Уровни экспрессии CD3 по сравнению со стандартной кривой молекулярного эквивалента флуорохрома (MEF).
Используя лизированную цельную кровь, экспрессию CD3 высокой антигенной плотности визуализировали по результатам интенсивности флуоресценции и сравнивали с 6-пиковыми (или 8-пиковыми) выходными сигналами флуоресценции гранул (Sony Biotech, каталожный № AE700520) для оценки значений MEF. UCHT1-FITC, используемые в качестве эталона, UCHT1-Соединение G и UCHT1-I-51, а также UCHT1-BB515, используемые в качестве дополнительного эталонного конъюгата, сравнивались в том же эксперименте с использованием стандартов. 6-пиковые гранулы состояли из смеси 3,8 мкм гранул с 6 различными интенсивностями флуоресценции и были использованы для проверки линейности и чувствительности прибора и оценки MEF при параллельном выполнении в данной методике.
На фиг. 15 показаны уровни экспрессии CD3 по сравнению со стандартной кривой MEF. Как можно видеть, I-51 примерно в 6 раз ярче эталона, и соединение G примерно в 2 раза ярче. Показанные диапазоны концентрации составляют 133 нМ и ниже. Следует отметить, что, в сравнении, на фиг. 13 показано, что неспецифическое связывание UCHT1-Соединение G в лизированной цельной крови эффективно снижает доступность антител для связывания с CD3.
ПРИМЕР 11
Сравнение фракций UCHT1-I-16 с FITC и I-56 конъюгатами
Гранулы предварительно обрабатывали (перемешивали на вортексе и обрабатывали ультразвуком) и промывали, и количество гранул калибровали к разведению 2× C, как определено в предварительных экспериментах для оптимизации получений и достижения линейной кривой насыщения. Гранулы инкубировали с конъюгатами антител, промывали и далее получали с помощью проточной цитометрии. 0,1% раствор BSA в 1× DPBS использовали для разведений гранул, промывки и получения. Антитела предварительно разводили в 1% буфере для окрашивания BSA в 96-луночных полипропиленовых планшетах, начиная с 4,0 мкг в объеме 200 мкл в первой лунке, и затем серийно разводили по 100 мкл в каждой последующей лунке для по меньшей мере 8 разведений (двукратно). Затем добавляли тщательно перемешанные на вортексе гранулы (при 2× C), и 100 мкл гранул добавляли к 100 мкл антитела в каждой лунке. Гранулы инкубировали в течение 20 мин при КТ, промывали и получали с помощью проточной цитометрии.
Результаты показаны на фиг. 16. UCHT1-I-16 при DOL ~3,0 приближались к теоретическому максимуму. Как показано на фиг. 17, был проведен аналогичный эксперимент для выделения различий кривых аффинности, отмечаемых между UCTH1-I-16 и вспомогательным эталоном с более длинной связью, UCHT1-I-56.
ПРИМЕР 12
UCHT1-I-51-подобный аналог, UCHT1-I-16, в сравнении с UCHT1-I-56 (10×) и UCHT1-I-53 (6×)
Периферические WBC обрабатывали лизирующим буфером, забуференным ACK, в течение 20 мин при 25°C при медленном качании, затем центрифугировали и удаляли лизирующий буфер. Клетки промывали один раз HBSS, pH 7,2, затем 1× HBSS, содержащим 0,5% FBS и 0,02% азида натрия, pH 7,2, и повторно суспендировали в буфере для окрашивания (1× DPBS, 1% BSA, 0,02% азид натрия, pH 7,2). Клетки затем наносили на предварительно разведенные конъюгированные антитела и инкубировали в течение 40 мин при 23-25°C, защищая от света.
На фиг. 18 показано сравнение UCHT1-I-51-подобного аналога, UCHT1-I-16, с UCHT1-I-56 (10×) и UCHT1-I-53 (6×).
ПРИМЕР 13
UCHT1-I-51-подобный аналог, UCHT1-I-16, в сравнении с UCHT1-I-56 (10×) и UCHT1-I-53 (6×)
Антитела оценивали на специфическое связывание и разрешение флуоресценции с помощью проточной цитометрии. Клетки Jurkat культивировали в соответствии с инструкциями, предложенными АТСС, и собирали живыми. Окрашивание проводили, когда клетки наносили на предварительно разведенные конъюгированные антитела, инкубировали в течение 20-40 мин, промывали и затем получали с помощью проточной цитометрии. UCHT1-I-51-подобный аналог, UCHT1-I-16, сравнивали с UCHT1-I-56 (10×) и UCHT1-I-53 (6×). Результаты показаны на фиг. 19.
ПРИМЕР 14
Сравнение разрешения конъюгата UCHT1 с помощью регрессионного анализа
Клетки выделяли из периферической цельной крови и замораживали в замораживающем буфере. Клетки размораживали, оставляли в покое, обрабатывали аутологичной плазмой для блокирования FcR и для имитации среды цельной крови, промывали 2-3 раза и затем окрашивали конъюгатом так же, как при использовании цельной крови. Гранулы предварительно калибровали, чтобы оптимизировать получение и достичь насыщения при окрашивании антителами. Гранулы инкубировали с конъюгатами антител, промывали и далее получали с помощью проточной цитометрии.
Регрессионный анализ осуществляли по данным, полученным при тестировании конъюгатов UCHT1-I-16 и UCHT1-I-49, чтобы продемонстрировать эквивалентность между конъюгатами. Результаты показаны на фиг. 20.
ПРИМЕР 15
Испытание на аффинность неочищенного красителя I-49 и I-16 в цельной крови
Краситель подвергали скринингу с использованием метода окрашивания, лизирования, фиксации и промывки цельной крови для оценки фона в трех популяциях, - моноцитах, гранулоцитах и лимфоцитах, в испытании на эквивалентность в присутствии избытка красителя. Гранулоциты, присутствующие в цельной крови, были выбраны в качестве основной цели для анализа. Хотя также исследовались лимфоциты и моноциты, эти данные не показаны на кривых регрессии.
Неочищенный краситель использовали в избытке (первое титрование, начинающееся при 10000 нМ) без присутствия конъюгата антитела, чтобы выделить, а также оценить различия неспецифического связывания между двумя почти идентичными конструкциями. Периферические WBC обрабатывали лизирующим буфером, забуференным ACK, в течение 20 мин при 25°C при медленном качании, центрифугировали и удаляли лизирующий буфер. Раствор для лизиса и фиксации эритроцитов наносили на краситель и клетки, и клетки затем промывали один раз HBSS, pH 7,2, затем 1× HBSS, содержащим 0,5% FBS и 0,02% азида натрия, pH 7,2, и затем повторно суспендировали в буфере для окрашивания (1× DPBS, 1% BSA, 0,02% азид натрия, pH 7,2).
Относительные данные MFI сопоставлялись по концентрации и сравнивались с помощью регрессионного анализа, чтобы продемонстрировать уровень согласованности и подобия между неочищенными I-45 и I-16. В этом испытании установлено, что I-45 и I-16 имеют почти эквивалентные уровни фона. При использовании тех же данных скрининга красителей аналоги I-45 (I-49 и I-16) накладываются друг на друга при рассмотрении всей кривой титрования и контролей. Аналоги I-45, находящиеся в диапазоне между MFI контролями, включенными для сравнения, представляют собой соединение D (10×), и два аналога соединения D (аналоги i и ii), имеющие более длинные алкиленовые спейсерные группы. I-49 имеет немного более высокий фон, чем I-16, и фон I-16 очень похож на I-45. 10× флуорофорные конструкции представляют собой димер в неспецифическом связывании, отличный от 6×, демонстрируя эффективность модуляции основной цепи для размещения дополнительных флуорофоров при одновременном снижении свойств неспецифического связывания 10× молекулы. Результаты показаны на фиг. 21A - фиг. 21C. На фиг. 21А показаны корреляции между I-16 и I-45; на фиг. 21В показаны наложения кривых титрования и сравнения с эталонами; и на фиг. 21C приведены примеры качественных данных, показывающие фоновую FL и морфологию клеток, позволяющие сравнить Соединение D и I-45.
ПРИМЕР 16
Сравнение UCHT1-I-21B и UCHT1-I-16 в клетках крови, которые были зафиксированы и хранились в течение 72 ч
Цельную кровь отбирали от здорового донора в стабилизированную ЭДТА пробирку для транспортировки и кратковременного хранения. Кровь обрабатывали лизирующими агентами либо до, либо после окрашивания антителами. Клетки лизировали с помощью ACK, 15 мл крови к 35 мл лизирующего раствора в течение 15 мин при КТ, и затем дважды промывали 50% HBSS и 50% - 1% FBS и 1× DPBS с 0,02% азидом натрия. Клетки повторно суспендировали до 100 мкл/образец/1×10е6 в донорской плазме. Предварительно разведенные антитела в 100 мкл 1% BSA и 1× DPBS с 0,02% азидом натрия добавляли к 100 мкл клеток, которые затем добавляли в 96-луночные полипропиленовые планшеты HTS (общий объем образца 200 мкл). После инкубации клеток в течение 45 мин при КТ клетки дважды промывали 50% HBSS+50% - 1% FBS и 1× DPBS с 0,02% азидом натрия. Затем клетки повторно суспендировали в 1% FBS и 1× DPBS с 0,02% азидом натрия. Клетки еще раз промывали, фиксировали в 2% параформальдегиде при 200 мкл/лунку, однократно промывали 1× DPBS, хранили в течение 72 ч при 2-8 °C, еще раз промывали, используя 1× DPBS, и затем получали с использованием 0,1% BSA в 1× DPBS.
Разрешение конъюгатов сравнивали с эталоном, UCHT11-FITC, и с теоретической яркостью для DOL 3,0. Новая конструкция UCHT1-I-21B лучше всего соответствует теоретической, когда DOL равен 3,0 в этом методе, и оказывается в семь раз ярче, чем UCHT1-FITC. На фиг. 22 кривые аффинности, в виде гистограмм, показаны с эмиссией соединения, детектированной в канале FL1-A.
Оценку неспецифического связывания проводили путем измерения флуоресценции гранулоцитов. На фиг. 23 представлено сравнение интенсивности флуоресценции нецелевого, неспецифического связывания UCHT1-I-21B, UCHT1-I-16 и эталона, UCHT1-FITC. Все фракции и повторы UCHT1-I-21B показывают меньший фон, чем другие конструкции и эталон FITC, включенные в испытание. Регрессионный анализ применяли к данным для анализа корреляций и относительных аффинностей, как показано на фиг. 24, и было определено, что UCHT1-I-21B не имеет линейной зависимости с UCHT1-I-16.
ПРИМЕР 17
UCHT1-I-21B с использованием клеточной модели Jurkat и простого двухточечного титра
Как и в примере 16, тестирование UCHT1-I-21B проводили в простом двухточечном титре с 2,0 и 0,125 мкг на образец антитела. Клетки Jurkat культивировали в соответствии с инструкциями, предложенными АТСС, собирали живыми или подвергали тепловому стрессу, промывали 2-3 раза и затем окрашивали конъюгированными антителами. Окрашивание проводили, когда клетки наносили на предварительно разведенные конъюгированные антитела, инкубировали, промывали и затем получали с помощью проточной цитометрии.
Как показано на фиг. 25, UCHT1-I-21B демонстрирует более высокую аффинность при низкой концентрации по сравнению с UCHT1-I-51, как и ожидалось. Фактическое отношение «сигнал/шум» превышает теоретическое на уровне концентрации субнасыщения 0,125 мкг на образец и превосходит UCHT1-I-51.
ПРИМЕР 18
Сравнение UCHT1-Соединение G и UCHT1-I-51 в исследовании с плазменной интерференцией с использованием PBMC
РВМС и аутологичную плазму предварительно выделяли из периферической цельной крови и затем замораживали в замораживающих средах. Клетки размораживали, ненадолго оставляли в покое, промывали два или три раза, и затем окрашивали конъюгированными антителами, как если бы они были свежевыделенными из цельной крови, с аутологичной плазмой или HBSS, присутствующими во время окрашивания антителами.
UCHT1-Соединение G взаимодействовало с моноцитами с образованием флуоресцентных событий в присутствии активированной и инактивированной донорской плазмы и добавлений 2,5% глицина. На фиг. 26А показаны данные, полученные в результате добавления 0% глицина, и на фиг. 26В показаны данные, полученные в результате добавления 2,5% глицина. Цвиттерионная форма аминокислоты глицин играет роль в иммунологических анализах в качестве суррогатной аффинности для амидного связывания или блокирования природными полиаминами, тем самым усиливая или блокируя эффекты других реагентов в системе окрашивания живых клеток. Плазма, повторно вводимая в РВМС, является либо (1) активированной, с комплементом, тромбоцитами, присутствующими при нормальных уровнях, либо (2) инактивированной (как комплемент плазмы, так и другие факторы) путем нагревания, фильтрации и центрифугирования, с удалением большинства тромбоцитов. Инактивированная плазма функционирует в большей степени в качестве блокирующего агента, в то время как ожидается, что активированная плазма будет иметь высокую интерференцию.
Исследование имитирует ряд эффектов, возможных в цельной крови, когда кровь мобилизована, плазма присутствует, является остаточной, разбавлена или вымыта. Соединения С и I-45 демонстрируют явные различия в поведении, как и ожидалось, поддерживающие снижение фонового связывания и отчетливое улучшение в активности за счет структурной модификации до I-45. В целом, следует отметить, что фон UCHT1-I-51 ограничен по сравнению с Соединением G, в то время как глицин, когда он присутствует, немного усиливает фоновое окрашивание I-51 и подавляет фон UCHT1-соединения G, в частности, в инактивированной плазме и чистом контроле. В целом, UCHT1-Соединение G имеет более высокий фон моноцитов.
ПРИМЕР 19
Получение фосфорамидитов и соединений
Приводимые в качестве примера соединения были получены с использованием стандартных методик твердофазного синтеза олигонуклеотидов и флуоресцеинсодержащего фосфорамидита, имеющего следующую структуру:
,
который был приобретен у ChemGenes (каталожный номер CLP-9780).
4
Приводимые в качестве примера линкеры (L) включали в соединения путем сочетания с фосфорамидитом, имеющим следующую структуру:
который также является коммерчески доступным.
Другие примеры соединений получали с использованием фосфорамидита, полученного по следующей схеме:
Окончательное снятие защиты дает желаемый фрагмент F". Другие коммерчески доступные фосфорамидитные реагенты использовались соответствующим образом для введения различных частей соединений. Q-фрагменты, имеющие следующую структуру:
были введены путем реакции
со свободным сульфгидрилом. Другие Q-фрагменты вводятся аналогичным образом в соответствии со знаниями специалиста в данной области.
Репрезентативные варианты осуществления включают, без ограничения, следующие:
Вариант осуществления 1. Соединение, имеющее следующую структуру (I):
(I)
или его стереоизомер, соль или таутомер, где:
M в каждом случае независимо представляет собой фрагмент, имеющий две или более двойные углерод-углеродные связи и по меньшей мере одну степень конъюгирования;
1
L в каждом случае независимо представляет собой или: i) необязательный алкиленовый, алкениленовый, алкиниленовый, гетероалкиленовый, гетероалкениленовый, гетероалкиниленовый или гетероатомный линкер; или ii) линкер, содержащий функциональную группу, способную к образованию путем реакции двух комплементарных реакционноспособных групп;
2
3
L и L в каждом случае независимо представляют собой необязательный алкиленовый, алкениленовый, алкиниленовый, гетероалкиленовый, гетероалкениленовый, гетероалкиниленовый или гетероатомный линкер;
4
L в каждом случае независимо представляет собой гетероалкиленовый, гетероалкениленовый или гетероалкиниленовый линкер более трех атомов в длину, при этом гетероатомы в гетероалкиленовом, гетероалкениленовом и гетероалкиниленовом линкере выбраны из O, N и S;
1
R в каждом случае независимо представляет собой H, алкил или алкокси;
2
3
a
b
c
каждый из R и R независимо представляет собой H, OH, SH, алкил, алкокси, простой алкилэфир, гетероалкил, -OP(=R)(R)R, Q, или его защищенную форму, или L';
4
-
-
d
d
R в каждом случае независимо представляет собой OH, SH, O, S, OR или SR;
5
R в каждом случае независимо представляет собой оксо, тиоксо или отсутствует;
a
R представляет собой O или S;
b
d
d
-
-
R представляет собой OH, SH, O, S, OR или SR;
c
d
d
-
-
R представляет собой OH, SH, O, S, OR, OL', SR, алкил, алкокси, гетероалкил, гетероалкокси, простой алкилэфир, простой алкоксиалкилэфир, фосфат, тиофосфат, фосфоалкил, тиофосфоалкил, простой фосфоалкилэфир или простой тиофосфоалкилэфир;
d
R представляет собой противоион;
Q в каждом случае независимо представляет собой фрагмент, содержащий реакционноспособную группу или ее защищенную форму, способную образовывать ковалентную связь с молекулой аналита, нацеливающим фрагментом, твердым носителем или комплементарной реакционноспособной группой Q′;
L' в каждом случае независимо представляет собой линкер, содержащий ковалентную связь с Q, линкер, содержащий ковалентную связь с нацеливающим фрагментом, линкер, содержащий ковалентную связь с молекулой аналита, линкер, содержащий ковалентную связь с твердым носителем, линкер, содержащий ковалентную связь с остатком твердого носителя, линкер, содержащий ковалентную связь с нуклеозидом, или линкер, содержащий ковалентную связь с другим соединением структуры (I);
m в каждом случае независимо представляет собой целое число, равное нулю или большее, при условии, что, по меньшей мере, в одном случае m представляет собой целое число, равное единице или большее; и
n является целым числом, равным единице или большим.
4
Вариант осуществления 2. Соединение варианта осуществления 1, в котором L в каждом случае независимо представляет собой гетероалкиленовый линкер.
4
Вариант осуществления 3. Соединение варианта осуществления 2, в котором L в каждом случае независимо представляет собой алкиленоксидный линкер.
4
Вариант осуществления 4. Соединение варианта осуществления 1, в котором L представляет собой полиэтиленоксид, и соединение имеет следующую структуру (IA):
(IA)
где z является целым числом от 2 до 100.
Вариант осуществления 5. Соединение варианта осуществления 4, в котором z является целым числом от 3 до 6.
1
Вариант осуществления 6. Соединение по любому из вариантов осуществления 1-5, в котором L в каждом случае представляет собой линкер, содержащий функциональную группу, способную к образованию путем реакции двух комплементарных реакционноспособных групп.
1
Вариант осуществления 7. Соединение варианта осуществления 6, в котором, для по меньшей мере одного случая L, функциональная группа может быть образована путем реакции функциональной группы, представляющей собой альдегид, оксим, гидразон, алкин, амин, азид, ацилазид, ацилгалогенид, нитрил, нитрон, сульфгидрил, дисульфид, сульфонилгалогенид, изотиоцианат, сложный имидоэфир, активированный сложный эфир, кетон, α,β-ненасыщенный карбонил, алкен, малеимид, α-галогенимид, эпоксид, азиридин, тетразин, тетразол, фосфин, биотин или тииран, с комплементарной реакционноспособной группой.
1
Вариант осуществления 8. Соединение варианта осуществления 6, в котором, для по меньшей мере одного случая L, функциональная группа может быть образована реакцией алкина и азида.
1
Вариант осуществления 9. Соединение варианта осуществления 6, в котором, для по меньшей мере одного случая L, функциональная группа включает алкеновую, сложноэфирную, амидную, группу сложного тиоэфира, тиомочевинную, дисульфидную, карбоциклическую, гетероциклическую или гетероарильную группу.
1
1
Вариант осуществления 10. Соединение варианта осуществления 6, в котором, для по меньшей мере одного случая L, L представляет собой линкер, содержащий триазолильную функциональную группу.
1
1
Вариант осуществления 11. Соединение варианта осуществления 6, в котором, для по меньшей мере одного случая L, L-M имеет следующую структуру:
1a
1b
где каждый из L и L независимо представляет собой необязательный линкер.
1
1
Вариант осуществления 12. Соединение варианта осуществления 6, в котором, для по меньшей мере одного случая L, L-M имеет следующую структуру:
1a
1b
где каждый из L и L независимо представляет собой необязательный линкер.
1a
1b
Вариант осуществления 13. Соединение по любому из вариантов осуществления 11-12, в котором L или L, или и то и другое отсутствует.
1a
1b
Вариант осуществления 14. Соединение по любому из вариантов осуществления 11-12, в котором L или L, или и то и другое присутствует.
1a
1b
Вариант осуществления 15. Соединение варианта осуществления 14, в котором, каждый из L и L, если присутствуют, независимо представляют собой алкилен или гетероалкилен.
1a
1b
Вариант осуществления 16. Соединение варианта осуществления 14, в котором, L и L, если присутствуют, независимо имеют одну из следующих структур:
;  или .
1
Вариант осуществления 17. Соединение по любому из вариантов осуществления 1-5, в котором L в каждом случае независимо представляет собой необязательный алкиленовый или гетероалкиленовый линкер.
2
3
1
6
2
6
2
6
Вариант осуществления 18. Соединение по любому из вариантов осуществления 1-17, в котором L и L в каждом случае независимо представляют собой C-C алкилен, C-C алкенилен или C-C алкинилен.
Вариант осуществления 19. Соединение по любому из вариантов осуществления 1-18, в котором соединение имеет следующую структуру (IB):
(IB)
где:
1
2
3
4
x, x, x и x в каждом случае независимо представляют собой целое число от 0 до 6; и
z является целым числом от 2 до 100.
1
2
3
4
Вариант осуществления 20. Соединение варианта осуществления 19, в котором, по меньшей мере, в одном случае x, x, x или x равно 1.
1
2
3
4
Вариант осуществления 21. Соединение варианта осуществления 19 или 20, в котором каждый из x, x, x и xравен 1 в каждом случае.
1
Вариант осуществления 22. Соединение по любому из вариантов осуществления 19-21, в котором L в каждом случае независимо содержит триазолильную функциональную группу.
1
Вариант осуществления 23. Соединение по любому из вариантов осуществления 19-21, в котором L в каждом случае независимо представляет собой необязательный алкиленовый или гетероалкиленовый линкер.
4
-
d
Вариант осуществления 24. Соединение по любому из вариантов осуществления 1-23, в котором R в каждом случае независимо представляет собой OH, O или OR.
5
Вариант осуществления 25. Соединение по любому из вариантов осуществления 1-24, в котором R в каждом случае представляет собой оксо.
1
Вариант осуществления 26. Соединение по любому из вариантов осуществления 1-25, в котором R в каждом случае представляет собой H.
2
3
a
b
c
Вариант осуществления 27. Соединение по любому из вариантов осуществления 1-26, в котором каждый из R и Rнезависимо представляет собой OH или -OP(=R)(R)R.
2
3
2
3
a
b
c
Вариант осуществления 28. Соединение по любому из вариантов осуществления 1-26, в котором один из R или R представляет собой OH или -OP(=R)(R)R, и другой из R или R представляет собой Q или линкер, содержащий ковалентную связь с Q.
2
3
a
b
c
Вариант осуществления 29. Соединение по любому из вариантов осуществления 1-26, в котором каждый из R и Rнезависимо представляет собой -OP(=R)(R)R.
c
Вариант осуществления 30. Соединение варианта осуществления 29, в котором, R представляет собой OL'.
Вариант осуществления 31. Соединение варианта осуществления 30, в котором L' представляет собой гетероалкиленовый линкер с: Q, нацеливающим фрагментом, молекулой аналита, твердым носителем, остатком твердого носителя, нуклеозидом или другим соединением структуры (I).
Вариант осуществления 32. Соединение варианта осуществления 31, в котором L' содержит алкиленоксидный или сложный фосфодиэфирный фрагмент, или их сочетания.
Вариант осуществления 33. Соединение варианта осуществления 32, в котором L' имеет следующую структуру:
,
где:
m" и n" независимо представляют собой целое число от 1 до 10;
e
R представляет собой Н, электронную пару или противоион;
e
L" представляет собой R или представляет собой непосредственную связь или мостик с: Q, нацеливающим фрагментом, молекулой аналита, твердым носителем, остатком твердого носителя, нуклеозидом или другим соединением структуры (I).
Вариант осуществления 34. Соединение по любому из вариантов осуществления 29-33, в котором нацеливающий фрагмент представляет собой антитело или антагонист рецептора клеточной поверхности.
2
3
Вариант осуществления 35. Соединение по любому из вариантов осуществления 29-34, в котором R или R имеет одну из следующих структур:
;;
;
;
;
;  или
.
2
3
Вариант осуществления 36. Соединение по любому из вариантов осуществления 29-35, в котором R или R имеет следующую структуру:
.
Вариант осуществления 37. Соединение по любому из вариантов осуществления 1-26 или 28-33, в котором Q содержит нуклеофильную реакционноспособную группу, электрофильную реакционноспособную группу или реакционноспособную группу циклоприсоединения.
Вариант осуществления 38. Соединение варианта осуществления 37, в котором Q содержит сульфгидрильную, дисульфидную, активированную сложноэфирную, изотиоцианатную, азидную, алкиновую, алкеновую, диеновую, диенофильную, галогенангидридную, сульфонилгалогенидную, фосфиновую, α-галогенамидную, биотиновую, амино или малеимидную функциональную группу.
Вариант осуществления 39. Соединение варианта осуществления 38, в котором активированный сложный эфир представляет собой N-сукцинимидный сложный эфир, сложный имидоэфир или сложный полифторфенильный эфир.
Вариант осуществления 40. Соединение варианта осуществления 38, в котором азид представляет собой алкилазид или ацилазид.
Вариант осуществления 41. Соединение по любому из вариантов осуществления 1-33, в котором Q представляет собой фрагмент, выбранный из таблицы 1.
2
3
2
3
a
b
c
Вариант осуществления 42. Соединение по любому из вариантов осуществления 1-26, в котором один из R или R представляет собой OH или -OP(=R)(R)R, и другой из R или R представляет собой линкер, содержащий ковалентную связь с молекулой аналита, линкер, содержащий ковалентную связь с нацеливающим фрагментом, или линкер, содержащий ковалентную связь с твердым носителем.
Вариант осуществления 43. Соединение варианта осуществления 42, в котором молекула аналита представляет собой нуклеиновую кислоту, аминокислоту или ее полимер.
Вариант осуществления 44. Соединение варианта осуществления 42, в котором молекула аналита представляет собой фермент, рецептор, лиганд рецептора, антитело, гликопротеин, аптамер или прион.
Вариант осуществления 45. Соединение варианта осуществления 42, в котором нацеливающий фрагмент представляет собой антитело или антагонист рецептора клеточной поверхности.
Вариант осуществления 46. Соединение варианта осуществления 42, в котором твердый носитель представляет собой полимерную гранулу или неполимерную гранулу.
Вариант осуществления 47. Соединение по любому из вариантов осуществления 1-46, в котором m в каждом случае независимо представляет собой целое число от 1 до 10.
Вариант осуществления 48. Соединение по любому из вариантов осуществления 1-46, в котором m в каждом случае независимо представляет собой целое число от 1 до 5.
Вариант осуществления 49. Соединение по любому из вариантов осуществления 1-48, в котором n является целым числом от 1 до 100.
Вариант осуществления 50. Соединение по любому из вариантов осуществления 1-48, в котором n является целым числом от 1 до 10.
Вариант осуществления 51. Соединение по любому из вариантов осуществления 1-50, в котором M в каждом случае независимо представляет собой фрагмент, содержащий четыре или более арильных или гетероарильных колец, или их сочетания.
Вариант осуществления 52. Соединение по любому из вариантов осуществления 1-51, в котором M в каждом случае независимо является флуоресцентным или цветным.
Вариант осуществления 53. Соединение варианта осуществления 52, в котором M является флуоресцентным.
Вариант осуществления 54. Соединение по любому из вариантов осуществления 1-53, в котором M в каждом случае независимо содержит конденсированный полициклический арильный фрагмент, содержащий по меньшей мере 4 конденсированных кольца.
Вариант осуществления 55. Соединение по любому из вариантов осуществления 1-54, в котором М в каждом случае независимо представляет собой диметиламиностильбеновый, хинакридоновый, фторфенилдиметил-BODIPY-, his-фторфенил-BODIPY-, акридиновый, терриленовый, гексафенильный, порфириновый, бензопиреновый, (фторфенил-диметил-дифторбор-диаза-индацен)фенильный, (бис-фторфенил-дифторбор-диаза-индацен)фенильный, кватерфенильный, бибензотиазольный, тербензотиазольный, бинафтильный, биантрацильный, сквареновый, скварилиевый, 9,10-этинилантраценовый или тернафтильный фрагмент.
Вариант осуществления 56. Соединение по любому из вариантов осуществления 1-54, в котором М в каждом случае независимо представляет собой п-терфенил, перилен, азобензол, феназин, фенантролин, акридин, тиоксантрен, хризен, рубрен, коронен, цианин, периленимид, или периленамид или их производное.
Вариант осуществления 57. Соединение по любому из вариантов осуществления 1-54, в котором М в каждом случае независимо представляет собой краситель кумарин, краситель резоруфин, краситель на основе дифторида дипиррометенбора, краситель бипиридил рутения, краситель с переносом энергии, краситель тиазоловый оранжевый, полиметиновый или N-арил-1,8-нафталимидный краситель.
Вариант осуществления 58. Соединение по любому из вариантов осуществления 1-54, в котором М в каждом случае независимо представляет собой пирен, перилен, периленмоноимид или 6-FAM или их производное.
Вариант осуществления 59. Соединение по любому из вариантов осуществления 1-54, в котором M в каждом случае независимо имеет одну из следующих структур:
; ; ; ;
; ;  или .
Вариант осуществления 60. Соединение, выбранное из таблицы 2.
Вариант осуществления 61. Способ окрашивания образца, включающий добавление к указанному образцу соединения по любому из вариантов осуществления 1-60 в количестве, достаточном для получения оптического отклика при подсвечивании образца при соответствующей длине волны.
Вариант осуществления 62. Способ варианта осуществления 61, в котором указанный оптический отклик представляет собой флуоресцентный отклик.
Вариант осуществления 63. Способ по любому из вариантов осуществления 61-62, в котором указанный образец содержит клетки.
Вариант осуществления 64. Способ варианта осуществления 63, также включающий наблюдение указанных клеток с помощью проточной цитометрии.
Вариант осуществления 65. Способ варианта осуществления 62, дополнительно включающий дифференцирование флуоресцентного отклика от отклика второго флуорофора, имеющего детектируемо отличающиеся оптические свойства.
Вариант осуществления 66. Способ визуального обнаружения молекулы аналита, причем способ включает в себя:
2
3
(а) обеспечение соединения варианта осуществления 1, в котором R или R представляет собой линкер, содержащий ковалентную связь с молекулой аналита; и
(b) обнаружение соединения по его визуальным свойствам.
Вариант осуществления 67. Способ визуального обнаружения молекулы аналита, причем способ включает в себя:
2
3
(а) смешивание соединения варианта осуществления 1, в котором R или R представляет собой Q или линкер, содержащий ковалентную связь с Q, с молекулой аналита;
(b) образование конъюгата соединения и молекулы аналита; и
(с) обнаружение конъюгата по его визуальным свойствам.
Вариант осуществления 68. Способ визуального обнаружения аналита, причем способ включает в себя:
2
3
(а) обеспечение соединения по любому из вариантов осуществления 1-36, в котором R или R содержит линкер, содержащий ковалентную связь с нацеливающим фрагментом, имеющим специфичность в отношении аналита;
(b) смешивание соединения и аналита, связывающее таким образом нацеливающий фрагмент и аналит; и
(с) обнаружение соединения по его визуальным свойствам.
Вариант осуществления 69. Композиция, содержащая соединение по любому из вариантов осуществления 1-60 и одну или более молекул аналита.
Вариант осуществления 70. Применение композиции варианта осуществления 69 в аналитическом методе для обнаружения одной или более молекул аналита.
Вариант осуществления 71. Соединение, имеющее следующую структуру (II):
(II)
или его стереоизомер, соль или таутомер, где:
G в каждом случае независимо представляет собой фрагмент, содержащий реакционноспособную группу или ее защищенный аналог, способные образовывать ковалентную связь с комплементарной реакционноспособной группой;
1a
2
3
L, L и L в каждом случае независимо представляют собой необязательный алкиленовый, алкениленовый, алкиниленовый, гетероалкиленовый, гетероалкениленовый, гетероалкиниленовый или гетероатомный линкер;
4
L в каждом случае независимо представляет собой гетероалкиленовый, гетероалкениленовый или гетероалкиниленовый линкер более трех атомов в длину, при этом гетероатомы в гетероалкиленовом, гетероалкениленовом и гетероалкиниленовом линкере выбраны из O, N и S;
1
R в каждом случае независимо представляет собой H, алкил или алкокси;
2
3
a
b
c
каждый из R и R независимо представляет собой H, OH, SH, алкил, алкокси, простой алкилэфир, гетероалкил, -OP(=R)(R)R, Q или L';
4
-
-
d
d
R в каждом случае независимо представляет собой OH, SH, O, S, OR или SR;
5
R в каждом случае независимо представляет собой оксо, тиоксо или отсутствует;
a
R представляет собой O или S;
b
d
d
-
-
R представляет собой OH, SH, O, S, OR или SR;
c
d
d
-
-
R представляет собой OH, SH, O, S, OR, OL', SR, алкил, алкокси, простой алкилэфир, простой алкоксиалкилэфир, фосфат, тиофосфат, фосфоалкил, тиофосфоалкил, простой фосфоалкилэфир или простой тиофосфоалкилэфир;
d
R представляет собой противоион;
Q в каждом случае независимо представляет собой фрагмент, содержащий реакционноспособную группу или ее защищенный аналог, способную образовывать ковалентную связь с молекулой аналита, нацеливающим фрагментом, твердым носителем или комплементарной реакционноспособной группой Q′;
L' в каждом случае независимо представляет собой линкер, содержащий ковалентную связь с Q, линкер, содержащий ковалентную связь с нацеливающим фрагментом, линкер, содержащий ковалентную связь с молекулой аналита, линкер, содержащий ковалентную связь с твердым носителем, линкер, содержащий ковалентную связь с остатком твердого носителя, линкер, содержащий ковалентную связь с нуклеозидом, или линкер, содержащий ковалентную связь с другим соединением структуры (II);
m в каждом случае независимо представляет собой целое число, равное нулю или большее, при условии, что, по меньшей мере, в одном случае m представляет собой целое число, равное единице или большее; и
n является целым числом, равным единице или большим.
Вариант осуществления 72. Соединение варианта осуществления 71, в котором G в каждом случае независимо содержит функциональную группу, представляющую собой альдегид, оксим, гидразон, алкин, амин, азид, ацилазид, ацилгалогенид, нитрил, нитрон, сульфгидрил, дисульфид, сульфонилгалогенид, изотиоцианат, сложный имидоэфир, активированный сложный эфир, кетон, α,β-ненасыщенный карбонил, алкен, малеимид, α-галогенимид, эпоксид, азиридин, тетразин, тетразол, фосфин, биотин или тииран.
Вариант осуществления 73. Соединение варианта осуществления 71, в котором G в каждом случае независимо содержит алкиновую или азидную группу.
Вариант осуществления 74. Соединение варианта осуществления 71, в котором G в каждом случае независимо содержит реакционноспособную группу, способную образовывать функциональную группу, содержащую алкен, сложный эфир, амид, сложный тиоэфир, дисульфид, карбоциклическую, гетероциклическую или гетероарильную группу после реакции с комплементарной реакционноспособной группой.
Вариант осуществления 75. Соединение варианта осуществления 74, в котором гетероарил представляет собой триазолил.
2
3
1
6
2
6
2
6
Вариант осуществления 76. Соединение по любому из вариантов осуществления 71-75, в котором L и L в каждом случае независимо представляют собой C-C алкилен, C-C алкенилен или C-C алкинилен.
Вариант осуществления 77. Соединение варианта осуществления 71, в котором соединение имеет следующую структуру (IIA):
(IIA)
где:
1
2
3
4
x, x, x и x в каждом случае независимо представляют собой целое число от 0 до 6.
1a
Вариант осуществления 78. Соединение по любому из вариантов осуществления 71-77, в котором каждый L отсутствует.
1a
Вариант осуществления 79. Соединение по любому из вариантов осуществления 71-77, в котором каждый L присутствует.
1a
Вариант осуществления 80. Соединение варианта осуществления 79, в котором L в каждом случае независимо представляет собой гетероалкилен.
1a
Вариант осуществления 81. Соединение варианта осуществления 80, в котором L имеет следующую структуру:
.
Вариант осуществления 82. Соединение варианта осуществления 81, в котором G в каждом случае независимо представляет собой  или .
1
2
3
4
Вариант осуществления 83. Соединение по любому из вариантов осуществления 77-82, в котором по меньшей мере, в одном случае x, x, x или x равно 1.
1
2
3
4
Вариант осуществления 84. Соединение по любому из вариантов осуществления 77-83, в котором каждый из x, x, x и xравен 1 в каждом случае.
4
Вариант осуществления 85. Соединение по любому из вариантов осуществления 71-84, в котором L является таким, как определено в любом из вариантов осуществления 2-5.
4
-
d
Вариант осуществления 86. Соединение по любому из вариантов осуществления 71-85, в котором R в каждом случае независимо представляет собой OH, O или OR.
5
Вариант осуществления 87. Соединение по любому из вариантов осуществления 71-86, в котором R в каждом случае представляет собой оксо.
1
Вариант осуществления 88. Соединение по любому из вариантов осуществления 71-87, в котором R представляет собой Н.
2
3
a
b
c
Вариант осуществления 89. Соединение по любому из вариантов осуществления 71-88, в котором каждый из R и Rнезависимо представляет собой OH или -OP(=R)(R)R.
2
3
2
3
a
b
c
Вариант осуществления 90. Соединение по любому из вариантов осуществления 71-88, в котором один из R или R представляет собой OH или -OP(=R)(R)R, и другой из R или R представляет собой Q или линкер, содержащий ковалентную связь с Q.
2
3
a
b
c
Вариант осуществления 91. Соединение по любому из вариантов осуществления 71-88, в котором каждый из R и Rнезависимо представляет собой -OP(=R)(R)R.
c
Вариант осуществления 92. Соединение варианта осуществления 91, в котором R представляет собой OL'.
Вариант осуществления 93. Соединение варианта осуществления 92, в котором L' представляет собой гетероалкиленовый линкер с: Q, нацеливающим фрагментом, молекулой аналита, твердым носителем, остатком твердого носителя, нуклеозидом или другим соединением структуры (I).
Вариант осуществления 94. Соединение варианта осуществления 93, в котором L' содержит алкиленоксидный или сложный фосфодиэфирный фрагмент, или их сочетания.
Вариант осуществления 95. Соединение варианта осуществления 94, в котором L' имеет следующую структуру:
,
где:
m" и n" независимо представляют собой целое число от 1 до 10;
e
R представляет собой Н, электронную пару или противоион;
e
L" представляет собой R или представляет собой непосредственную связь или мостик с: Q, нацеливающим фрагментом, молекулой аналита, твердым носителем, остатком твердого носителя, нуклеозидом или другим соединением структуры (I).
Вариант осуществления 96. Соединение по любому из вариантов осуществления 91-95, в котором нацеливающий фрагмент представляет собой антитело или антагонист рецептора клеточной поверхности.
2
3
Вариант осуществления 97. Соединение по любому из вариантов осуществления 91-96, в котором R или R имеет одну из следующих структур:
;
;
;
;
или .
2
3
Вариант осуществления 98. Соединение по любому из вариантов осуществления 91-97, в котором R или R имеет следующую структуру:
.
Вариант осуществления 99. Соединение по любому из вариантов осуществления 71-98, в котором Q содержит нуклеофильную реакционноспособную группу, электрофильную реакционноспособную группу или реакционноспособную группу циклоприсоединения.
Вариант осуществления 100. Соединение варианта осуществления 99, в котором Q содержит сульфгидрильную, дисульфидную, активированную сложноэфирную, изотиоцианатную, азидную, алкиновую, алкеновую, диеновую, диенофильную, галогенангидридную, сульфонилгалогенидную, фосфиновую, α-галогенамидную, биотиновую, амино или малеимидную функциональную группу.
Вариант осуществления 101. Соединение варианта осуществления 100, в котором активированный сложный эфир представляет собой N-сукцинимидный сложный эфир, сложный имидоэфир или сложный полифторфенильный эфир.
Вариант осуществления 102. Соединение варианта осуществления 100, в котором алкин представляет собой алкилазид или ацилазид.
Вариант осуществления 103. Соединение по любому из вариантов осуществления 71-98, в котором Q представляет собой фрагмент, выбранный из таблицы 1.
2
3
2
3
a
b
c
Вариант осуществления 104. Соединение по любому из вариантов осуществления 61-88, в котором один из R или R представляет собой OH или -OP(=R)(R)R, и другой из R или R представляет собой линкер, содержащий ковалентную связь с молекулой аналита, линкер, содержащий ковалентную связь с нацеливающим фрагментом, или линкер, содержащий ковалентную связь с твердым носителем.
Вариант осуществления 105. Соединение варианта осуществления 104, в котором молекула аналита представляет собой нуклеиновую кислоту, аминокислоту или ее полимер.
Вариант осуществления 106. Соединение варианта осуществления 104, в котором молекула аналита представляет собой фермент, рецептор, лиганд рецептора, антитело, гликопротеин, аптамер или прион.
Вариант осуществления 107. Соединение варианта осуществления 104, в котором нацеливающий фрагмент представляет собой антитело или антагонист рецептора клеточной поверхности.
Вариант осуществления 108. Соединение варианта осуществления 104, в котором твердый носитель представляет собой полимерную гранулу или неполимерную гранулу.
Вариант осуществления 109. Соединение по любому из вариантов осуществления 71-108, в котором m в каждом случае независимо представляет собой целое число от 1 до 10.
Вариант осуществления 110. Соединение по любому из вариантов осуществления 71-108, в котором m в каждом случае независимо представляет собой целое число от 1 до 5.
Вариант осуществления 111. Соединение по любому из вариантов осуществления 71-110, в котором n является целым числом от 1 до 100.
Вариант осуществления 112. Соединение по любому из вариантов осуществления 71-110, в котором n является целым числом от 1 до 10.
Вариант осуществления 113. Соединение, выбранное из таблицы 3.
Вариант осуществления 114. Способ мечения молекулы аналита или нацеливающего фрагмента, причем способ включает в себя:
2
3
(а) смешивание соединения варианта осуществления 71, в котором R или R представляет собой Q или линкер, содержащий ковалентную связь с Q, с молекулой аналита или нацеливающим фрагментом;
(b) получение конъюгата соединения и молекулы аналита или нацеливающего фрагмента; и
1b
(c) взаимодействие конъюгата с соединением формулы M-L-G′, благодаря чему образуется по меньшей мере одна ковалентная связь по реакции по меньшей мере одного G и по меньшей мере одного G′,
где:
M представляет собой фрагмент, имеющий две или более двойные углерод-углеродные связи и по меньшей мере одну степень конъюгирования;
1b
L представляет собой необязательный алкиленовый, гетероалкиленовый или гетероатомный линкер; и
G' представляет собой реакционноспособную группу, комплементарную G.
Вариант осуществления 115. Способ мечения молекулы аналита или нацеливающего фрагмента, причем способ включает в себя:
2
3
1b
(а) смешивание соединения варианта осуществления 71, в котором R или R представляет собой Q или линкер, содержащий ковалентную связь с Q, с соединением формулы M-L-G′, благодаря чему образуется по меньшей мере одна ковалентная связь путем реакции G и G′; и
(b) взаимодействие продукта стадии (a) с молекулой аналита или нацеливающим фрагментом, в результате чего образуется конъюгат продукта стадии (a) и молекулы аналита или нацеливающего фрагмента,
где:
M представляет собой фрагмент, имеющий две или более двойные углерод-углеродные связи и по меньшей мере одну степень конъюгирования;
1b
L представляет собой необязательный алкиленовый, гетероалкиленовый или гетероатомный линкер; и
G' представляет собой реакционноспособную группу, комплементарную G.
1b
Вариант осуществления 116. Способ получения соединения варианта осуществления 1, причем способ включает смешивание соединения варианта осуществления 71 с соединением формулы M-L-G′, благодаря чему образуется по меньшей мере одна ковалентная связь путем реакции G и G′; где:
M представляет собой фрагмент, имеющий две или более двойные углерод-углеродные связи и по меньшей мере одну степень конъюгирования;
1b
L представляет собой необязательный алкиленовый, гетероалкиленовый или гетероатомный линкер; и
G' представляет собой реакционноспособную группу, комплементарную G.
Вариант осуществления 117. Флуоресцентное соединение, содержащее Y флуоресцентных фрагментов M, где флуоресцентное соединение имеет пик флуоресцентной эмиссии при возбуждении с заданной длиной волны ультрафиолетового света по меньшей мере на 85% от Y раз больший, чем пик флуоресцентной эмиссии одного М-фрагмента при возбуждении с такой же длиной волны ультрафиолетового света, и где Y является целым числом, равным 2 или более.
Вариант осуществления 118. Флуоресцентное соединение варианта осуществления 117, имеющее пик флуоресцентной эмиссии по меньшей мере на 90% от Y раз больший, чем пик флуоресцентной эмиссии одного М-фрагмента.
Вариант осуществления 119. Флуоресцентное соединение варианта осуществления 117, имеющее пик флуоресцентной эмиссии по меньшей мере на 95% от Y раз больший, чем пик флуоресцентной эмиссии одного М-фрагмента.
Вариант осуществления 120. Флуоресцентное соединение варианта осуществления 117, имеющее пик флуоресцентной эмиссии по меньшей мере на 97% от Y раз больший, чем пик флуоресцентной эмиссии одного М-фрагмента.
Вариант осуществления 121. Флуоресцентное соединение варианта осуществления 117, имеющее пик флуоресцентной эмиссии по меньшей мере на 99% от Y раз больший, чем пик флуоресцентной эмиссии одного М-фрагмента.
Вариант осуществления 122. Флуоресцентное соединение по любому из вариантов осуществления 117-121, в котором Y является целым числом от 2 до 100.
Вариант осуществления 123. Флуоресцентное соединение по любому из вариантов осуществления 117-121, в котором Y является целым числом от 2 до 10.
Вариант осуществления 124. Флуоресцентное соединение по любому из вариантов осуществления 117-123, в котором Y M-фрагментов имеют, независимо, одну из следующих структур:
; ; ; ;
; ;  или ,
где  указывает место присоединения к флуоресцентному соединению.
Вариант осуществления 125. Флуоресцентное соединение по любому из вариантов осуществления 117-124, в котором один М-фрагмент имеет независимо одну из следующих структур:
; ; ; ; ;  или .
Вариант осуществления 126. Флуоресцентное соединение по любому из вариантов осуществления 117-123, в котором флуоресцентное соединение содержит Y М-фрагментов, независимо имеющих одну из следующих структур:
или ,
где  указывает место присоединения к флуоресцентному соединению, и один М-фрагмент имеет следующую структуру:
.
Вариант осуществления 127. Флуоресцентное соединение по любому из вариантов осуществления 117-126, в котором пик флуоресцентной эмиссии наблюдается при длине волны от примерно 500 нм до примерно 550 нм.
Вариант осуществления 128. Флуоресцентное соединение по любому из вариантов осуществления 117-127, в котором флуоресцентное соединение содержит по меньшей мере один этиленоксидный фрагмент.
Вариант осуществления 129. Композиция, содержащая флуоресцентное соединение по любому из вариантов осуществления 117-128 и аналит.
Все патенты США, публикации патентных заявок США, патентные заявки США, иностранные патенты, заявки на иностранные патенты и непатентные публикации, упомянутые в данном описании, включены в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме, в той степени, в которой это не противоречит настоящему описанию.
Исходя из вышеизложенного, понятно, что хотя конкретные варианты осуществления изобретения были описаны в данном документе для целей иллюстрации, возможно внесение различных модификаций, без отклонения от сущности и объема изобретения. Соответственно, изобретение ничем не ограничено, кроме прилагаемой формулы изобретения.