УСТОЙЧИВЫЕ МУЛЬТИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА

1. Белковая конструкция, содержащая мутированный Fab-фрагмент, который выбирают из
a) Fab-фрагмента, состоящего из
VH и VL доменов представляющего интерес антитела;
CH1 домена, полученного из CH1 домена иммуноглобулина путем замены остатка треонина в положении 192 указанного CH1 домена на аспарагиновую кислоту, и
CL домена, полученного из CL домена иммуноглобулина путем замены аспарагиновой кислоты в положении 137 указанного CL домена на остаток лизина и замены остатка серина в положении 114 указанного CL домена на остаток аланина; и
b) Fab-фрагмента, состоящего из
VH и VL доменов представляющего интерес антитела;
CH1 домена, полученного из CH1 домена иммуноглобулина путем замены остатка лейцина в положении 124 указанного CH1 домена на глутамин и замены остатка серина в положении 188 указанного CH1 домена на остаток валина; и
CL домена, полученного из CL домена иммуноглобулина путем замены остатка валина в положении 133 указанного CL домена на остаток треонина и замены остатка серина в положении 176 указанного CL домена на остаток валина.
2. Белковая конструкция по п. 1, которая содержит или состоит из мультиспецифического антигенсвязывающего фрагмента, содержащего, по меньшей мере, два Fab-фрагмента с разными CH1 и CL доменами, при этом каждый Fab-фрагмент распознает иной представляющий интерес эпитоп, и указанные Fab-фрагменты располагаются последовательно в любом порядке, C-концевая область CH1 домена первого Fab-фрагмента соединяется с N-концевой областью VH домена следующего Fab-фрагмента посредством полипептидного линкера,
причем, по меньшей мере, один Fab-фрагмент состоит из мутированного Fab-фрагмента по п. 1, предпочтительно при этом два Fab-фрагмента являются мутированными Fab-фрагментами по п. 1.
3. Белковая конструкция по п. 2, которая является мультиспецифическим антителом, имеющим два идентичных антигенсвязывающих плеча, каждое из которых состоит из мультиспецифического антигенсвязывающего фрагмента по п. 2.
4. Белковая конструкция по п. 3, которая имеет иммуноглобулин-подобную структуру, содержащая
два идентичных антигенсвязывающих плеча, каждый из которых состоит из мультиспецифического антигенсвязывающего фрагмента по п. 1;
димеризованные CH2 и CH3 домены иммуноглобулина;
шарнирную область IgA, IgG или IgD, связывающую C-концевые области CH1 доменов антигенсвязывающих плеч с N-концевыми областями CH2 доменов.
5. Белковая конструкция по п. 4, которая предпочтительно является биспецифическим антителом и содержит, по меньшей мере, две тяжелые цепи и четыре легкие цепи,
причем каждая тяжелая цепь содержит
a. Fc-область иммуноглобулина, содержащую шарнирный-CH2-CH3 домены,
b. при этом Fc-область соединяется с Fab тяжелой цепи CH1-VH антитела 1 (Ab1) при помощи указанного шарнирного домена,
c. который в свою очередь соединяется с Fab тяжелой цепи CH1-VH антитела 2 (Ab2) при помощи последовательности полипептидного линкера, и последовательность полипептидного линкера соединяет N-конец указанного Fab тяжелой цепи VH домена Ab1 с C-концом указанного CH1 домена Ab2,
и четыре легкие цепи содержат Fab легких цепей CL-VL Ab1 и Fab легких цепей CL-VL Ab2, связанные с их родственными доменами тяжелой цепи;
причем Ab1 и Ab2 распознают разные эпитопы,
и при этом Fab CH1 домен одного из Ab1 или Ab2 является мутированным доменом, полученным из CH1 домена иммуноглобулина путем замены остатка треонина в положении 192 указанного CH1 домена на аспарагиновую кислоту, и родственный CL домен является мутированным доменом, полученным из CL домена иммуноглобулина путем замены остатка аспарагина в положении 137 указанного CL домена на остаток лизина и замены остатка серина в положении 114 указанного CL домена на остаток аланина, и/или
при этом Fab CH1 домен одного или другого из Ab1 или Ab2 является мутированным доменом, полученным из CH1 домена иммуноглобулина путем замены остатка лейцина в положении 124 указанного CH1 домена на глутамин и замены остатка серина в положении 188 указанного CH1 домена на остаток валина, и родственный CL домен является мутированным доменом, полученным из CL домена иммуноглобулина путем замены остатка валина в положении 133 указанного CL домена на остаток треонина и замены остатка серина в положении 176 указанного CL домена на остаток валина.
6. Белковая конструкция по п. 5, в которой Fab CH1 домен Ab1 является мутированным доменом, полученным из CH1 домена иммуноглобулина путем замены остатка треонина в положении 192 указанного CH1 домена на аспарагиновую кислоту, и родственный CL домен является мутированным доменом, полученным из CL домена иммуноглобулина путем замены остатка аспарагина в положении 137 указанного CL домена на остаток лизина и замены остатка серина в положении 114 указанного CL домена на остаток аланина, и в которой Fab CH1 домен Ab2 является мутированным доменом, полученным из CH1 домена иммуноглобулина путем замены остатка лейцина в положении 124 указанного CH1 домена на глутамин и замены остатка серина в положении 188 указанного CH1 домена на остаток валина, и родственный CL домен является мутированным доменом, полученным из CL домена иммуноглобулина путем замены остатка валина в положении 133 указанного CL домена на остаток треонина и замены остатка серина в положении 176 указанного CL домена на остаток валина.
7. Белковая конструкция по п. 5, в которой Fab CH1 домен Ab2 является мутированным доменом, полученным из CH1 домена иммуноглобулина путем замены остатка треонина в положении 192 указанного CH1 домена на аспарагиновую кислоту, и родственный CL домен является мутированным доменом, полученным из CL домена иммуноглобулина путем замены остатка аспарагина в положении 137 указанного CL домена на остаток лизина и замены остатка серина в положении 114 указанного CL домена на остаток аланина, и в которой Fab CH1 домен Ab1 является мутированным доменом, полученным из CH1 домена иммуноглобулина путем замены остатка лейцина в положении 124 указанного CH1 домена на глутамин и замены остатка серина в положении 188 указанного CH1 домена на остаток валина, и родственный CL домен является мутированным доменом, полученным из CL домена иммуноглобулина путем замены остатка валина в положении 133 указанного CL домена на остаток треонина и замены остатка серина в положении 176 указанного CL домена на остаток валина.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3,
4
5,
6
7
8,
9
10
8. Белковая конструкция по любому из пп. 2-7, в которой последовательность полипептидного линкера содержит или состоит из аминокислотной последовательности EPKXCDKXHXXPPXPAPELLGGPXXPPXPXPXGG (SEQ ID NO:1), где X, X, X X, XX, X,XX, X, одинаковые или разные, представляют собой любую аминокислоту.
9. Белковая конструкция по п. 8, в которой последовательность полипептидного линкера содержит или состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из
EPKSCDKTHTSPPAPAPE LLGGPGGPPGPGPGGG (SEQ ID NO: 2);
EPKSCDKTHTSPPAPAPE LLGGPAAPPAPAPAGG (SEQ ID NO: 3);
EPKSCDKTHTSPPAPAPE LLGGPAAPPGPAPGGG (SEQ ID NO: 4);
EPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSTPPTPSPSGG (SEQ ID NO:5) и EPKSCDKTHTSPPSPAPE LLGGPSTPPTPSPSGG (SEQ ID NO:6).
10. Белковая конструкция по любому из пп. 1-9, распознающая и EGFR и HER2/neu.
11. Белковая конструкция по п. 10, которая представляет собой мультиспецифическое антитело, предпочтительно биспецифическое антитело, при этом Ab1 и Ab2, являющиеся разными, независимо выбирают из группы, состоящей из цетуксимаба или его мутированного производного, с одной стороны, и трастузумаба или его мутированного производного, с другой стороны.
12. Белковая конструкция по любому из пп. 1-9, распознающая и CD38 и PD-L1.
13. Белковая конструкция по п. 12, которая представляет собой мультиспецифическое антитело, предпочтительно биспецифическое антитело, при этом Ab1 и Ab2, являющиеся разными, независимо выбирают из группы, состоящей из даратумумаба или его мутированного производного, с одной стороны, и атезолизумаба или его мутированного производного, с другой стороны.
14. Белковая конструкция по п. 12, которая представляет собой биспецифическое антитело, содержащее, предпочтительно, состоящее из a) двух тяжелых цепей, каждая из которых содержит, предпочтительно состоит из SEQ ID NO:7 и b) четырех легких цепей, две из них содержат, предпочтительно состоят из SEQ ID NO:15, а две другие содержат, предпочтительно состоят из SEQ ID NO: 18.
15. Полипептид, содержащий, предпочтительно состоящий из тяжелой цепи антигенсвязывающего фрагмента или тяжелой цепи мультиспецифического антитела по любому из пп. 2-14.
16. Полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую полипептид по п. 15.
17. Клетка-хозяин, трансфицированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид по п. 16.
18. Клетка-хозяин по п. 17, дополнительно трансформированная, по меньшей мере, двумя полинуклеотидами, кодирующими две разные легкие цепи: первая легкая цепь специфически спаривается с первой VH/CH1 областью указанной тяжелой цепи; вторая легкая цепь специфически спаривается со второй VH/CH1 областью указанной тяжелой цепи.
19. Способ получения антигенсвязывающего фрагмента или мультиспецифического антитела по любому из пп. 2-14, указанный способ включает следующие стадии: a) культивирование в подходящей среде и условиях культивирования клетки-хозяина, экспрессирующей тяжелую цепь антитела по любому из пп. 2-14 и легкую цепь антитела по любому из пп. 2-14; и b) восстановление указанных полученных антител из культуральной среды или из указанных культивируемых клеток.
20. Мультиспецифический антигенсвязывающий фрагмент или мультиспецифическое антитело по любому из пп. 2-14, предназначенное для использования в качестве медикамента.