Микроядерный тест в клетках костного мозга и семенников мышей линии СВА при гельминтозах

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2003

МИКРОЯДЕРНЫЙ ТЕСТ В КЛЕТКАХ КОСТНОГО МОЗГА И СЕМЕННИКОВ МЫШЕЙ ЛИНИИ СВА ПРИ ГЕЛЬМИНТОЗАХ

БЕКИШ Вл.Я., КОЛМОГОРОВ В.И., ПОБЯРЖИН В.В.

Витебский государственный медицинский университет, кафедра медицинской биологии и общей генетики

Резюме. Целью работы было изучить с помощью микроядерного теста возможные нарушения в наследственном аппарате клеток костного мозга и семенников мышей линии СВА, вызванные метаболитами гельминтов. Установлено, что метаболиты Hymenolepis nana, Ascaris suum, Toxocara canis и Trichinella spiralis оказывают мутагенное воздействие не только на соматические клетки костного мозга, но и на клетки семенников у инвазированных гельминтами мышей. Этот вывод подтверждается увеличением числа микроядросодержащих полихроматофильных эритроцитов в костном мозге, сперматогониев, сперматоцитов и сперматид в семенниках экспериментальных животных. Отмечается синхронное увеличение числа микроядер в эритроцитах и сперматогониях и в меньшей степени в сперматидах инвазированных мышей. Характер нарушений в геноме хозяина зависит от вида гельминта, использованного для получения инвазии и особенностей его жизненного цикла.

Ключевые слова: гельминты, метаболиты, микроядра, мутагены, клетки сперматогенеза, клетки костного мозга.

Abstract. The aim of this study was to investigate with the use of micronucleus test probable damages in the hereditary apparatus of bone marrow and testicles cells of CBA line mice caused by helminthes metabolites. It was established, that metabolites of Hymenolepis nana, Ascaris suum, Toxocara canis and Trichinella spiralis exerted mutagenous influence not only on somatic cells of bone marrow, but also on cells of testicles in infected mice. This conclusion is supported by the increase in the number of micronucleus containing polychromatophile erythrocytes in bone marrow, spermatogones, spermatocytes and spermatids in testicles of experimental animals. The synchronous increase in the number of micronuclei in erythrocytes, spermatogones and to a lesser degree in spermatids of infected mice is noted. The character of damages in the host genome depends on helminthes species used for invasion and features of its life cycle.

Мутагенное воздействие на наследственный аппарат соматических клеток хозяина оказывают метаболиты описторхисов [8], шисто-сом [16], свиных цепней [15], власоглавов [7], трихинелл [6] и аскарид [3], что выражается в увеличении количества анеуплоидных клеток, а также клеток с хромосомными аберрациями. Изменения в наследственном аппарате генеративных клеток при паразитарных инвазиях остаются малоизученными. Известно только, что некоторые паразитические простейшие

Адрес для корреспонденции: 210023, г.Витебск, пр.Фрунзе, 27, Витебский государственный медицинский университет, кафедра медицинской биологии и общей генетики - Бекиш Вл.Я.

(Entamoeba histolytica, Leishmania donovani) вызывают одновременные поражения в наследственном аппарате как соматических клеток, так и клеток семенников мышей линии Swiss [12, 13]. Мутагенное влияние метаболитов гельминтов на наследственный аппарат клеток семенников хозяина на различных стадиях сперматогенеза ранее никем не изучалось.

Целью данной работы было изучить воздействие метаболитов гельминтов Hymenolepis nana, Ascaris suum, Toxocara canis и Trichinella spiralis на показатели микроядерного теста в клетках костного мозга и семенников мышей линии СВА.

Методы

Исследования проведены на 440 мышах-самцах линии СВА массой 1 б-1В г, разделенных на В групп. Животным первых четырех групп (интактные контроли на каждую инвазию) вводили 0,2 мл 2%-го крахмального геля. Животных 5-й, б-й, 7-й и В-й групп заражали в дозе 20 инвазионных яиц H. nana, A. suum, T. canis и личинок T. spiralis соответственно на 1 грамм массы тела по методикам, разработанным нами [9, 1, 4] и О.-Я. Л. Бекишем и соавт. [5]. Забой животных, контрольных на гимено-лепидоз и аскаридоз, а также зараженных H. nana и A. suum, проводили на 3, 7, 14 и 2В-й дни, а контрольных на токсокароз и трихинеллез, и зараженных T. canis и T. spiralis - на 3, 7, 14, 21, 2В, б0, и 90-й дни от начала инвазии, что связано с особенностями биологии данных паразитов. На каждый срок наблюдения во всех группах брали по 10 животных. Готовили препараты из клеток костного мозга по методике W. Schmid et al. [14] в группах животных, зараженных H. nana, A. suum, T. canis и контрольных на эти инвазии, а также из клеток семенников по методике Jeong Byeong-Seon et al. [11] во всех группах. Препараты окрашивали красителем Гимза фирмы Sigma. При проведении микро-ядерного теста в клетках костного мозга у каждого животного исследовалось по 1000 поли-

% 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0

и 1000 нормохроматофильных эритроцитов, а в клетках семенников - по 200 сперматогони-ев, 200 сперматоцитов и 200 сперматид. Учитывалось количество этих видов клеток с микроядрами. Исследования выполнены на микроскопе БМЯВ фирмы Ье1еа при увеличении 1200х.

Результаты

При заражении мышей линии СВА инвазионными яйцами Н. папа на 3 день наблюдения количество микроядросодержащих поли-хроматофильных эритроцитов в костном мозге было больше достоверно в 3,4 раза, сперма-тогониев в семенниках - в 1,4 раза, чем в контрольной группе (рис. 1). К 7 дню наблюдения количество микроядросодержащих полихрома-тофильных эритроцитов было в 4 раза, а спер-матогониев - в 2,2 раза выше у зараженных мышей по сравнению с контролем (Р<0,05). На 14 день эксперимента у зараженных мышей число полихроматофильных эритроцитов с микроядрами было повышено в 2,6 раза, спер-матогониев с микроядрами - в 1,3 раза по сравнению с контролем. На 28 день наблюдения число микроядросодержащих полихромато-фильных эритроцитов достоверно не отличалось от интактного контроля. Число сперма-тоцитов с микроядрами достоверно не отли-

3 7 14 2В

Дни инвазии

♦ полихроматофильные эритроциты ЧИН сперматогонии —Д— сперматиды

Рис. 1. Уровень микроядросодержащих клеток в костном мозге и семенниках мышей линии СВА при экспериментальном гименолепидозе в процентах к контролю.

чалось от показателей интактного контроля на всех сроках наблюдения, а количество микроядросодержащих сперматид только на 28-й день превышало контрольные показатели в 1,9 раза (Р<0,05).

В костном мозге мышей линии СВА, зараженных яйцами А. Бииш, к 3-му дню инвазии число полихроматофильных эритроцитов с микроядрами достоверно превышало контрольный показатель в 5,6 раза и количество микроядросодержащих сперматогониев в семенниках - в 3,2 раза (рис. 2). На 7 день инвазии число полихроматофильных эритроцитов с микроядрами было в 5,1 раза, сперматогониев - в 2,6 раза выше, по отношению к контролю (Р<0,05). Число микроядросодержащих сперматоцитов у инвазированных мышей достоверно не отличалось от интактного контроля на 3-й и 7-й дни, а сперматид - на 3-й, 7-й и 14-й дни эксперимента. К 14 дню у инвазиро-ванных животных количество полихромато-фильных эритроцитов с микроядрами было в 6,1 раза, микроядросодержащих сперматогониев - в 5,6 раза выше, чем в контроле (Р<0,05). На этот срок наблюдения у мышей с экспериментальным аскаридозом отмечалось также достоверное увеличение в 3,7 раза числа микроядросодержащих сперматоцитов. На 28-й день инвазии у мышей в костном мозге было в 2,5 раза больше полихроматофильных эритро-

цитов с микроядрами, чем у контрольных животных (Р<0,05). В семенниках животных наблюдалось достоверное увеличение числа микроядросодержащих сперматогониев - в 1,2 раза, сперматоцитов - в 4,3 раза, сперматид - в 3,6 раза по сравнению с интактным контролем.

При экспериментальном токсокарозе к 3му дню наблюдения в костном мозге количество полихроматофильных эритроцитов с микроядрами было выше достоверно в 4,6 раза, а в семенниках число микроядросодержащих спер-матогониев - в 7,5 раза, сперматоцитов - в 4 раза, чем в контроле (рис. 3). Увеличение этих показателей наблюдалось также на 7-й день, когда количество микроядросодержащих поли-хроматофильных эритроцитов было в 4,3 раза, сперматогониев - в 6,3 раза, сперматоцитов -в 5,6 раза больше, чем в интактном контроле. К 14-му дню инвазии количество микроядросодержащих полихроматофильных эритроцитов уменьшилось и достоверно не отличалось от их количества в контрольной группе. Однако число сперматогониев и сперматоцитов с микроядрами достоверно превышало контрольные показатели соответственно в 6,7 и 6 раз. На 21-й день у инвазированных мышей микроядросодержащих полихроматофильных эритроцитов было в 2,3 раза, сперматогониев

- в 11 раз, сперматоцитов - в 8 раз, сперматид

- в 3 раза больше, чем в контроле (Р<0,05). На

полихроматофильные эритроциты сперматоциты

сперматогонии дни инвазии сперматиды

Рис. 2. Уровень микроядро содержащих клеток в костном мозге и семенниках мышей линии СВА при экспериментальном аскаридозе в процентах к контролю.

полихроматофильные эритроциты сперматогонии

сперматоциты —Д— сперматиды

Дни инвазии

Рис. 3. Уровень микроядросодержащих клеток в костном мозге и семенниках мышей линии СВА при экспериментальном токсокарозе в процентах к контролю.

28-й день количество полихроматофильных эритроцитов, сперматогониев, сперматоцитов и сперматид с микроядрами было соответственно в 4,6; 5,З; 10,5 и 8 раз больше, чем в контрольной группе (Р<0,05). На 60-й и 90-й дни инвазии все исследованные показатели также достоверно отличались от контрольных.

При экспериментальном трихинеллезе достоверное увеличение числа микроядросодержащих клеток сперматогенеза наблюдалось, начиная с 14-го дня эксперимента, когда у ин-вазированных мышей количество сперматого-ниев с микроядрами было в 22 раза, спермато-цитов - в 9,3 раза и сперматид - в 10,5 раза

сперматогонии

сперматоциты

сперматиды

Дни инвазии

Рис. 4. Уровень микроядросодержащих клеток в семенниках мышей линии СВА при экспериментальном трихинеллезе в процентах к контролю.

больше, чем у интактных (рис. 4). К 21-му дню у зараженных животных число микроядросодержащих сперматогониев превышало контрольные показатели в 12 раз, сперматоцитов и сперматид - в 17 раз. На 28-й и 60-й дни все исследованные показатели также достоверно отличались от контрольных. Так, количество сперматогониев, сперматоцитов и сперматид с микроядрами на 28-й день было соответственно в 3,3; 6,5 и 40 раз, а на 60-й день - в 3,5; 3,5 и 3,6 раза больше, чем в группе интактных животных (Р<0,05). На 90-й день достоверно в 7 раз было выше только число микроядросодержащих сперматоцитов.

Обсуждение

Микроядерный тест является наиболее хорошо изученным, надежным методом оценки генотоксичности факторов окружающей среды. Он высокочувствителен в исследовании большинства мутагенов, канцерогенов как соматических, так и генеративных клеток человека и экспериментальных животных [10].

Нами установлено, что заражение мышей линии СВА H. nana, A.suum, T. canis и T. spiralis приводит к увеличению числа микроядросодержащих полихроматофильных эритроцитов, сперматогониев, сперматоцитов и сперматид у экспериментальных животных. То есть результаты исследований подтверждают гипотезу о том, что метаболиты гельминтов оказывают мутагенное воздействие не только на соматические клетки костного мозга, но и на клетки семенников у инвазированных гельминтами мышей [2]. Нарушения в генетическом аппарате как соматических, так и генеративных клеток хозяина сходны при различных гельминтозах, но степень их выраженности на различных сроках наблюдения зависит от вида гельминта, использованного для получения инвазии и особенностей его жизненного цикла.

Достоверное увеличение числа полихрома-тофильных эритроцитов с микроядрами при экспериментальных гименолепидозе, аскаридозе и токсокарозе отмечено с 3-го дня наблюдения. В это время цистицеркоиды карликового цепня находятся внутри ворсинок тонкого кишечника хозяина, растут, проходят стадию метамеры, личинки A. suum и T. canis проникают через стенку

кишечника и начинают миграцию по кровяному руслу. Эти процессы сопровождаются выделением большого количества экскреторно-секреторных метаболитов в ткани хозяина. Повышение количества микроядросодержащих полихроматофиль-ных эритроцитов на 7-й и 14-й дни от момента заражения можно связать с высокой биологической активностью гименолеписов, находящихся в кишечнике хозяина. Личинки A. suum в этот период мигрируют по кровяному и лимфатическому руслам и трехкратно линяют, выделяя максимальное количество секреторно-экскреторных метаболитов, и к 14 дню заканчивают миграцию в легких, где часть из них погибает, выделяя дополнительно эндогенные антигены. К 28-му дню количество микроядросодержащих полихромато-фильных эритроцитов при экспериментальном гименолепидозе и аскаридозе снижается, что можно объяснить уменьшением выделения экскреторно-секреторных метаболитов карликовыми цепнями вследствие понижения биологической активности паразитов и элиминацией их из кишечника, а также окончанием миграции и гибелью личинок аскарид. При экспериментальном токсокарозе данный показатель сохраняется на достаточно высоком уровне и в последующие сроки наблюдения. Это можно связать с тем, что личинки T. canis непрерывно находятся в активном состоянии и выделяют свои метаболиты при миграции по кровяному руслу и внутренним органам, а также с выделением эндогенных антигенов при гибели части личинок.

Более позднее увеличение числа микроядросодержащих клеток семенников и длительное сохранение его на достоверно повышенном уровне связано с тем, что жизненный цикл клеток сперматогенеза более длительный, чем у клеток костного мозга. Практически одновременно с полихроматофильными эритроцитами при всех инвазиях увеличивалось только количество микроядросодержащих сперматогониев. Достоверное увеличение числа микроядросодержащих спер-матид при экспериментальном гименолепидозе и аскаридозе (в 1,9 и 3,6 раза соответственно) наблюдалось только на 28-й день. При токсока-розе этот показатель достоверно повышался с 21го, достигал максимума (в 8 раз) на 28-й день и сохранялся на достоверно увеличенном уровне до конца эксперимента, так как личинки токсо-кар могут длительное время мигрировать и вы-

делять свои метаболиты. При заражении мышей инвазионными личинками T. spiralis рост числа сперматогониев, сперматоцитов и сперматид с микроядрами наблюдался с 14-го дня наблюдения. Максимально количество микроядросодержащих сперматоцитов и сперматид достоверно увеличивалось на 14-й, 21-й и 28-й дни инвазии в 20 - 40 раз. Однако к 90-му дню число микроядросодержащих сперматид достоверно не отличалось от контроля, что связано с образованием вокруг личинок трихинелл известковых капсул, препятствующих выделению экскреторно-секреторных метаболитов.

Таким образом, при экспериментальных гельминтозах отмечается синхронное увеличение числа микроядер в эритроцитах и сперматогони-ях и в меньшей степени в сперматидах инвазиро-ванных мышей. Наиболее подвержены мутагенному воздействию полихроматофильные эритроциты, наименее - сперматиды, что можно объяснить наличием гематотестикулярного барьера в семенниках, а также тем, что поврежденные спер-матогонии и сперматоциты подвергаются элиминации и количество сперматид снижается.

Выводы

На основании вышеизложенного можно констатировать, что инвазии H. nana, A. suum, T. canis и T. spiralis обуславливают синхронные повреждения генома как соматических, так и генеративных клеток хозяина, выраженность которых зависит от вида паразита и особенностей его биологии.

Литература

1. Бекиш В л.Я. Методика получения культуры инвазионных яиц аскарид// В кн.: Пятый Республ. съезд специалистов клин. лаб. диагностики Беларуси. Мат. съезда. - Минск. - 1997. - с. 140 - 141.

2. Бекиш Вл.Я. Метаболиты гельминтов как возможные мутагены половых клеток хозяина// Вопросы экспериментальной биологии и медицины (сб. науч. трудов). -Витебск. - 1999. - с. 70-73.

3. Бекиш Вл.Я. Мигрирующие личинки аскарид и их метаболиты как мутагены// Сб. науч. трудов IV съезда врачей-инфекционистов Республики Беларусь. -Витебск. - 1997. - с. 21 - 22.

4. Бекиш Вл.Я., Бекиш Л.Э., Колмогоров В.И. Экспериментальная модель висцерального токсокароза// Теоретические и практические вопросы медицины и фармации (матер. конф.

студентов и молодых ученых). -Витебск. - 2000. -с. 26-29.

5. Бекиш О.-Я.Л., Бурак И.И., Острейко Н.Н.

Экспериментальный трихинеллез: методы

воспроизведения и модели// Метод. рекоменд. -Витебск. - 1982. - 24 с.

6. Бекиш О.-Я.Л., Калинин Л.В., Любаковская Л.А. Цитогенетические изменения в клетках костного мозга белых крыс при трихинеллезе различной степени тяжести// Сб. Роль наследственных факторов в патогенезе заболеваний человека. -Витебск. - 1992. - с. 73-78.

7. Бекиш О. -Я. Л., Степанов А. В. Цитогенетическое исследование клеток красного костного мозга белых мышей, инвазированных Trichocephalus muris //Сб. Роль наследственных факторов в патогенезе заболеваний человека. - Витебск. - 1992. - с. 93-95.

8. Ильинских Н.Н. Популяционные исследования цитогенетической патологии в очагах описторхоза в условиях Обь-Иртышского бассейна// В кн.: Комплексные гигиенические исследования - в практику здравоохранения. -Новокузнецк. - 1981.

- с. 481- 484.

9. Побяржин В.В., Бекиш О.-Я.Л. Экспериментальная

модель воспроизведения гименолепидоза// Современная паразитология: проблемы и

перспективы (Труды конф., посвященной 65-летию каф. мед. биол. и общей генетики). - Витебск. -1999. - с. 34-36.

10. Ashby J., Tinwell H. The rodent bone marrow micronucleus assay: contrast between its sensitivity to human carcinogens and its insensitivity to NTP rodent carcinogens// Mutation Research (Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis) - 1996 - vol. 352 - p. 181-184.

11. Jeong Byeong-Seon, Zhang Hongen, Won Chang-Deok, Ma Te-Hsiu. A simplified protocol of the mouse spermatid micronucleus assаy// Environ. and Mol. Mutagenes. - 1994. - 23, Suppl. №23. - p. 28.

12. Manna G. K., Sarkar A.K. Mutagenic potential of human kala-azar haemoflagellate in mouse// Curr. Sci. (India).

- 1989. - Vol. 58, № 22. - p. 1268 - 1271.

13. Manna G. K., Sadhukhan A., Datta S. Mutagenic potential of the human intestinal amoeba, Entamoeba histolytica assayed in mice as model // Cytology. -1991. -Vol. 56, №4. - p. 613-619.

14. Schmid W. The micronucleus test // Mutat. Res. - 1975.

- Vol. 31, №1. - p. 9-16.

15. Serrano-Garcia L, Montero-Montoya R. Micronuclei and chromatid buds are the result of related genotoxic events// Environ. Mol. Mutagen. - 2001. - Vol. 38. -№1. - p. 38-45.

16. Shubber E. K., Salin H. Cytogenic studies on blood lymphocytes from patients with Shistosoma mansoni / / Jap. J. Med. Sci. and Biol. -1987. -Vol. 40, №4. - p. 137-145.

Поступила 11.01.2003 г. Принята в печать 10.04.2003 г.