Характеристика штаммов микроорганизмов, участвующих в процессах биоремедиации

© А.Ю. Александров, 2009

УДК 579.66 ББК 28.48

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ, УЧАСТВУЮЩИХ В ПРОЦЕССАХ БИОРЕМЕДИАЦИИ

А.Ю. Александров

На основе тинкториальных, культурально-морфологических и биохимических свойств идентифицированы два штамма углеводородокисляющих микроорганизмов. Определена оптимальная температура для получения максимальной биомассы каждого из штаммов. Изучено влияние органических и минеральных компонентов питательных сред на рост микробных популяций в условиях глубинного культивирования. Рассматривается возможность применения данных штаммов для ликвидации нефтяных загрязнений почв и водоемов.

Ключевые слова: экологическая биотехнология, биоремедиация, нефтяное загрязнение, уг-леводородокисляющие микроорганизмы, биомасса микроорганизмов, глубинное культивирование.

Нефть наносит непоправимый вред экосистемам, зачастую приводя к настоящим экологическим катастрофам. Проблема нефтяного загрязнения затрагивает многие регионы мира, в том числе и Волгоградскую область, в которой находится ряд нефтяных месторождений, а также предприятия нефтепереработки и нефтехимии. При добыче, транспортировке и переработке нефти, а также при авариях происходят разливы нефти, вызывающие загрязнение окружающей среды. Среднегодовая концентрация нефти и нефтепродуктов в поверхностных водах составляет 0,06 мг/дм3, что превышает ПДК в 1,2 раза. В некоторых местах, например в Цимлянском водохранилище, ПДК превышено в 3 раза [3, а 210].

Существуют несколько основных групп методов ликвидации нефтяных загрязнений: механические, физико-химические и биологические. Технологии и устройства, применяемые для биологической очистки почв и водоемов, принято называть термином биоремедиация. Биологические методы подразумевают использование специальных углеводородо-кисляющих микроорганизмов (У ОМ), которые

способны разлагать нефть до безопасных минеральных соединений. В специальной литературе встречается описание УОМ, которые относятся как к бактериям, так и к дрожжам и микроскопическим грибам. Микроорганизмы-деструкторы углеводородов известны среди представителей различных родов: Rhodococcus, Arthrobacter, Azotobacter, Pseudomonas, Candida, Mycobacterium, Bacillus, Nocardia, Acinetobacter и других [6, c. 10]. Влияние на деструктивную активность микроорганизмов оказывают: концентрация нефти, температура, наличие органических и неорганических компонентов питания, кислорода.

Целью данного исследования стала идентификация углеводородокисляющих микроорганизмов, выделенных из нефтезагрязненной почвы, а также определение влияния некоторых физико-химических факторов на рост и развитие микробных популяций в условиях глубинного культивирования.

Из загрязненных отходами нефтепродуктов почв и сточных вод, образующихся в производстве ацетилена и этилена на ОАО «Пла-сткард» (г. Волгоград), были выделены 25 штаммов микроорганизмов. Объектом исследования стали два штамма (№ 10 и № 22) углеводородокисляющих бактерий, выделенных из нефтезагрязненных почв. Выделение микроорганизмов-деструкторов проводилось на селективной питательной среде, содержа-

щей нефть и нефтепродукты в качестве единственного источника углерода. В эту среду вносили содержащую естественную микрофлору почву или почвенную вытяжку и инкубировали при 37 °С в течение 24 ч. Аликвоты проб высевали на плотную питательную среду в чашках Петри и выделяли чистые культуры микроорганизмов, отсевая их на скошенный агар.

Идентификацию микроорганизмов проводили на основе изучения тинкториальных, культурально-морфологических и биохимических свойств.

При изучении тинкториальных свойств был использован метод окраски клеток по Граму. Культурально-морфологичекие свойства изучали на основе характеристики роста на жидких и плотных питательных средах: мясопептонном агаре (МПА) и мясопептон-ном бульоне (МПБ), после выращивания бактерий при 37 °С в течение 48 часов. Окраску мазков на наличие способности к образованию споровых форм проводили по методу Пешкова или Шеффера-Фултона. Перед проведением окраски штаммы помещались в неблагоприятные условия (4 °С) на 48 часов.

Биохимические свойства штаммов изучались при помощи систем индикаторных бумажных (СИБ). Для определения каталазой активности на поверхность колоний наносили 1-2 капли 3%-го раствора Н202. Декарбокси-лирование аминокислот изучаемыми штаммами определяли по следующей методике. В пробирку, содержащую 4 мл среды состава (г/л дистиллированной воды): пептон - 5 , мясной экстракт - 5, глюкоза - 0,5, придоксаль -0,005, бромкрезол пурпурный - 0,01, крезол красный - 0,005, L-аминокислоты до 1 %, засевают полную петлю суточной агаровой культуры. В качестве контроля использовали ту же среду, но без аминокислот. Наслаивали

0,5-1,0 мл стерильного вазелинового масла, включая контрольную среду. Посевы инкубировали при 32 °С [4, с. 17]. Окисление-ферментацию глюкозы микроорганизмами оценивали на среде Хью-Лейфсона.

Для глубинного аппаратного культивирования УОМ использовался лабораторный ферментер <^КВ-1607 Ро^егт». Эксперименты по изучению влияния различной температуры на рост УОМ проводили в МПБ в условиях

принудительной аэрации, которая достигалась путем подачи воздуха из расчета 0,5 л/мин и скоростью вращения импеллера мешалки 100 об./мин.

Для изучения роста штаммов на отходах пищевых производств использовалась среда с мелассой (отходом производства свекловичного сахара, представляющим собой густую жидкость темно-коричневого цвета с острым запахом), в которую для поддержания осмотического равновесия добавляли 0,9 % NaCl. Эксперименты по определению концентрации мелассы, оптимальной для роста исследуемых микроорганизмов, проводились в средах на основе мелассы с содержанием продукта 0,1, 0,5, 1, 2,5 и 5 %. Культивирование проводилось во флаконах объемом 250 мл, содержащих 100 мл среды. Начальная концентрация клеток исследуемых деструкторов в среде, определяемая по бактериологическому стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича, составляла 108 кл/мл. Флаконы помещали в термостат и инкубировали при 37 °С в течение 48 часов с отбором проб через 24 и 48 часов. Концентрацию живых клеток изучаемых штаммов определяли макрокультуральным методом. Для этого клетки из соответствующего разведения высевали на 3 чашки Петри с агаровой средой, которые помещали в термостат при 37 °С, а через сутки подсчитывали среднее число сформировавшихся колоний. Изучение динамики роста штаммов на среде с мелассой проводилось на ферментере.

Помимо изучения роста нефтедеструкто-ров в средах на основе отходов пищевых производств была исследована способность роста на минеральных средах с добавлением нефти. При подборе среды для глубинного культивирования УОМ применялись минеральные среды с добавлением 1 % нефти от объема в качестве единственного источника углерода и энергии. Были использованы три варианта среды:

- среда 8Е - состав (г/л дистиллированной воды) [1, с. 44]: ^Н4)2НР04 - 1,5; КН2Р04 - 0,7; МgSO4•7H2O - 0,8; ШС1 - 0,5;

- А.Б. Гафарова - состав (г/л) [2, с. 181]: Ш4С1 - 0,5; КН2Р04 - 1,5;

-Э.Р Рахимовой - состав (г/л) [5, с. 650]: (Ш4)^04 - 1,0; MgSO4 - 1,0; ШС1 - 1,0;

дрожжевой экстракт - 0,05. Каждый штамм засевали отдельно во флаконы объемом 400 мл, содержащие 100 мл среды. В контрольные флаконы не добавляли нефть. Начальная концентрация биомассы во флаконах составила 108 кл/мл. Флаконы помещали в термостат и инкубировали при 37 °С в течение 7 суток. Учет численности живых бактерий проводили макрокультуральным методом через 1, 2, 3, 5 и 7 суток.

При идентификации штамма № 22 были выяснены следующие основные биологические свойства. При микрокопировании мазков наблюдались отдельно расположенные или цепочками мелкие палочки (размеры 0,7— 1,0 х 1,5—3,0 мкм), которые положительно окрашивались по методу Грама. Методом окраски по Пешкову обнаружено образование споровых форм. На МПА микроорганизмы формировали плоские, сухие, мелкоморщинистые, шероховатые, матовые, грязно-белого цвета колонии. Диаметр колоний через 48 часов после посева составлял 20-70 мм. При посеве штамма на МПБ отмечалось образование плотной слизистой пленки грязно-белого цвета, мутность слабая, осадка нет. При нанесении на поверхность колоний 3 % перекиси водорода наблюдалось образование пузырьков, что указывает на каталазную актив-

ность микроорганизма. На основании этих данных штамм был отнесен к роду Bacillus. В дальнейшем штамм получил название Bacillus sp. ТУ22.

При идентификации штамма № 10 были установлены следующие свойства. Палочки размером 1,1-1,5 x 3,7-5,2 мкм отрицательно окрашивались по Граму. При окраске клеток методом Шеффера-Фултона споровых форм не обнаружено. При посеве на МПА формировались колонии выпуклые, гладкие, блестящие, грязно-белого цвета, диаметр 20-50 мм. На росте в МБП пленка не образовывалась, наблюдался плотный осадок белого цвета, мутность среды сильная. Результаты определения биохимических свойств штамма представлены в таблице 1.

Также было выяснено, что штамм № 10 обладает каталазной активностью. На среде Хью-Лейфсона штамм окислял, но не ферментировал глюкозу. Эксперименты по декарбок-силированию аминокислот показали положительную реакцию на аргининдигидролазу и отрицательную реакцию на лизиндекарбоксила-зу и орнитиндекарбоксилазу. В результате исследований вышеперечисленных свойств штамм № 10 был отнесен к роду Pseudomonas и в дальнейшем получил название Pseudomonas sp. ТУ10.

Таблица 1

Биохимические свойства штамма № 10, полученные с использованием СИБ-дисков

Идентификационный тест Результат

1. Наличие оксидазы -

2. Утилизация углеводов:

а) глюкоза +

б) лактоза +

в) арабиноза +

г) манноза +

д) сахароза +

3. Образование индола +

4. Образование сероводорода Н^ +

5. Наличие уреазы +

6. Утилизация натриевых солей:

а) цитрат +

б) малоннат +

7. Окисление спиртов:

а) инозит -

б) маннит +

в) сорбит +

Дальнейшие исследования были направлены на изучение влияния температуры на рост штаммов-деструкторов углеводородов. Динамика роста обоих штаммов была исследована при следующих температурах: 20 °С, 30 °С и 37 °С в течение 48 часов. Концентрации биомассы определяли макрокультуральным методом в пробах бульонной культуры, отобранных через 3, 6, 9, 24 и 48 часов после начала эксперимента. На рисунке 1 представлены сравнительные данные двух штаммов, выращенных при различной температуре. Под приростом понимается отношение максимальной концентрации биомассы к начальной.

Из диаграммы видно, что оптимальной температурой при глубинном аппаратном культивировании для штамма Pseudomonas sp. ТУ10 является 37 °С, а для штамма Bacillus sp. ТУ22 - 30 °С. В дальнейшем именно при этих температурах проводились эксперименты на ферментере.

Для культивирования микроорганизмов в лабораторных и промышленных условиях необ-

ходимо, прежде всего, обеспечить их элементами питания для обеспечения роста биомассы. С экономической точки зрения наиболее выгодно использовать для этих целей различные отходы пищевой промышленности, богатые углеводородами, в том числе мелассу.

Для определения оптимальной для роста двух микроорганизмов концентрации мелассы в питательной среде была проведена серия экспериментов, результаты которых представлены в таблице 2.

Из таблицы 2 видно, что рост обоих микроорганизмов наблюдался при концентрации мелассы в среде в пределах от 0,1 до 1 %. Повышение концентрации мелассы до 2,5 % приводило к снижению числа клеток представителей Pseudomonas sp., тогда как рост Bacillus sp. в этом случае вовсе прекращался. Дальнейшее увеличение содержания мелассы (до 5 %) пагубно влияло на развитие обоих изучаемых штаммов. Наиболее эффективной урожайность микробной биомассы оказалась при концентрации мелассы 0,5 %.

Bacillus sp. ТУ22  Pseudomonas sp. ТУЇ 0

37 ЗО

градусов, °С

20

Рис. 1. Прирост биомассы УОМ при различных температурах культивирования

Таблица 2

Результаты определения концентрации биомассы углеводородокисляющих микроорганизмов в средах на основе мелассы

Конц ентр ация мелассы, % Концентрация живых клеток, кл/мл

Pseudomonas sp. ТУ10 Bacillus sp. ТУ22

24 часа 48 часов 24 часа 48 часов

0,1 1,4  108 2,3  109 6,3  107 5,5  109

0,5 8,5  108 1,3  1010 2,0  108 1,1  1010

1,0 1,2  108 8,2  109 5,3  107 3,3  109

2,5 3,3  107 2,0  107 0 0

5,0 0 0 0 0

Впоследствии эти данные были использованы при изучении динамики роста штаммов УОМ при глубинном аппаратном культивировании в средах на основе мелассы. Результаты опытов представлены на рисунках 2 и 3.

Для штамма Pseudomonas sp. ТУ10 после непродолжительной лаг-фазы началась экспоненциальная фаза, которая продолжалась с 9 до 24 часов после начала эксперимента. Максимальная концентрация составила 5,8- 101G. У штамма Bacillus sp. ТУ22 лаг-фаза

Время культивирования, ч

Рис. 2. Динамика роста Pseudomonas sp. ТУ10 на среде с 0,5 % мелассы

Время культивирования, ч

Рис. 3. Динамика роста Bacillus sp. ТУ22 на среде с 0,5 % мелассы ISSN 1998-992X. Вестн. Волгогр. гос. ун-та. Сер. 3, Экон. Экол. 2009. № 1 (14) 235

продолжалась 12 часов. Экспоненциальная фаза штамма продолжалась с 12 до 24 часов после начала эксперимента. Максимальная концентрация биомассы равна 1,67Т010.

Последующие исследования были посвящены определению роста УОМ на синтетических питательных средах. Известно более 20 различных минеральных питательных сред для культивирования УОМ. Для выбора оптимальной среды был исследован рост Bacillus sp. ТУ22 (рис. 4) и Pseudomonas sp. ТУ10 (рис. 5) на трех различных вариантах среды.

Наибольшую концентрацию биомассы штамма Bacillus spTy22 удалось получить культивированием в среде А.Б. Гафарова (1,2Т08 на 2-е сутки культивирования). Для штамма Pseudomonas spTy10 наивысший показатель концентрации биомассы был получен при выращивании на среде Э.Р. Рахимовой (1,6Т08 через сутки после начала культивирования). Эти среды можно использовать при глубинном аппаратном культивировании в ферментере для получения максимальной биомассы изучаемых штаммов.

О)

Н

Ы

at

«о

№

S

ЕГ

OS

а.

н

X

а>

Я

X

£

100

80

60

40

20

V///A а 1 сутки

IIIIIIIIIIIIII 2 сутки

ІВЙ8ЙЙ8І 3 сутки

1 1 5 сутки

' і 11 11 і rm і 11 11 і 11 и J_LLLLE3] 7 сутки

8Е

Гафарова Рахимовой Варианты питательных сред

ч Я "ч 5Й 140.

<=> iH 120

в S 100

Си <и н 80

м ев «о 60

к S 40

а 03 а. 70

н X <и Я X & 0

.ттИдЯ.!—ВИ

8Е

Гафарова Рахимовой

Варианты питательных сред

Рис. 4. Динамика роста штамма Bacillus sp. ТУ22 на различных вариантах синтетических питательных сред:

а - среды без добавления нефти; б - среды с добавлением нефти

Рис. 5. Динамика роста штамма Pseudomonas sp. ТУ10 на различных вариантах синтетических питательных сред:

а - среды без добавления нефти; б - среды с добавлением нефти

Проанализировав данные, полученные при культивировании на синтетических средах с добавлением нефти, автор сделал следующие предположения: а) наличие в питательной среде калия стимулирует рост штамма Bacillus sp. ТУ22; б) на рост Pseudomonas sp. ТУ22 благоприятное влияние оказывает добавление в среду магния и серы.

Таким образом, на основе изученных тинкториальных, культурально-морфологических и биохимических свойств были идентифицированы два штамма-деструктора углеводородов, которые были отнесены к представителям родов Bacillus и Pseudomonas. Исследование влияния температуры на рост УОМ позволило установить, что для штамма Bacillus ТУ22 оптимальной температурой роста является 30 °С, а для штамма Pseudomonas sp. ТУ22 - 37 °С. При глубинном культивировании штаммов в среде с добавлением мелассы оптимальной является 0,5%-я концентрация. Изучен рост штаммов-нефтедеструкторов на минеральной среде с добавлением нефти и выяснено, какие из вариантов питательных сред позволяют получить максимальную концентрацию УОМ.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Андреева, И. С. Психротолерантные штам-мы-нефтедеструкторы для биоремедиации почв и водной среды / И. С. Андреева, Е. К. Емельянова, С. Н. Загребальный, С. Е. Олькин, И. К. Резников // Биотехнология. - 2006. - N° 1. - С. 43-52.

2. Гафаров, А. Б. Изменение состава сообщества бактерий-деструкторов ароматических соединений в нефтешламах в процессе их обезвреживания в проточном биореакторе / А. Б. Гафаров, А. В. Панов, А. Е. Филонов, А. М. Боронин // Прикладная биохимия и микробиология. - 2006. - Т 42, № 2. - С. 180-186.

3. Доклад о состоянии окружающей среды Волгоградской области в 2007 году. - М. : Глобус, 2008. - 384 с.

4. Илюхин, Н. Г. Микробиология, таксономия и бактериологическая диагностика Pseudomonas pseudomallei / В. И. Илюхин, В. С. Замараев, В. И. Кап-лиев // Мелиоидоз : сб. науч. тр. / под ред. Н. Г. Тихонова. - Волгоград : Ниж.-Волж. кн. изд-во, 1995. - С. 8-26.

5. Рахимова, Э. Р. Очистка почвы от нефтяного загрязнения с использованием денитрифицирующих углеводородокисляющих микроорганизмов / Э. Р. Рахимова, А. Л. Осипова, С. К. Зарипова // Прикладная биохимия и микробиология. - 2004. -Т. 40, №6. - С. 649-653.

6. Халимов, Э. М. Эколого-микробиологи-ческие основы рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами : дис. ... канд. биол. наук : 03.00.07 / Э. М. Халимов. - М., 1996. - 132 с.

PROPERTIES OF MICROORANISMS’ STRAINS PARTICIPATING IN BIOREMEDIATION PROCESSES

А. Yu. Alexandrov

On the analysis of tinctorial, morphological and biochemical properties two strains of hydrocarbon-oxidizing microorganisms were identified. The optimal temperature for maximal biomass production of each strain was defined. The impact of organic and mineral components of nutrient medium on microbial population growth was studied in submerged cultivation. Potential use of the strains for elimination of the soil and fresh water oil pollution is considered.

Key words: ecological biotechnology, bioremediation, oil pollution, hydrocarbon-oxidizing microorganisms, microorganism, biomass, submerged cultivation.