ОБЪЕДИНЕННЫЙ ПЦР-ИФА В ПРОБИРКЕ С РАЗВИТОЙ ПОВЕРХНОСТЬЮ
COMBINED PCR-EIA IN TEST TUBE WITH THE EXTENDED SURFACE

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области аналитической биохимии, а точнее анализу ДНК.
Уровень техники
Как правило, методы анализа ДНК основаны на уникальной способности цепей нуклеиновых кислот к гибридизации. Под гибридизацией нуклеиновых кислот понимают процесс повторного образование двухцепочных молекул путем спаривания нуклеотидов комплементарных цепей. Это явление используется как при проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР, polymerase chain reaction - PCR) - основного метода анализа ДНК, так и при многочисленных вариантах анализа ампликонов - продукта данной реакции. Одним из таких методов является гибридизационный иммуноферментный анализ (ИФА, enzyme-linked immunosorbent assay - ELISA), который в англоязычной литературе получил еще одно, более точное название ELOSA (enzyme-linked oligosorbent assay) [Mallet F., Hebrard C., Brand D., Chapuis E., Cros P., Allibert P., Besnier J.M., Barin F. and Mandrand B. Enzyme-linked oligosorbent assay for detection of polymerase chain reaction-amplified human immunodeficiency virus type 1. J.Clin.Microbiol, 31, 1444-1449, 1993.].
В дальнейшем, однако, при использовании сокращений, мы будем придерживаться традиционной терминологии английской транскрипции. Дело в том, что ввиду чрезвычайной популярности и распространенности иммуноферментного анализа, термин ELISA скорее следует воспринимать не как аббревиатуру названий, а как логотип метода, подразумевающий множественность способов его проведения и разнообразие компонентов. Вышесказанное в равной степени относится и к сокращенному названию полимеразной реакции (PCR). Вот почему нередко в научных публикациях, представленных, например, на немецком или французском языках, авторы стараются пользоваться не буквальным переводом названий, а хорошо всем знакомыми сокращениями.
Гибридизационный олигоферментный анализ продуктов полимеразной реакции основан на специфическом взаимодействии ампликонов с т.н. гибридизационым зондом. Последний представляет собой одноцепочный олигонуклеотид, комплементарный доступному участку одной из цепи ампликона и состоящий примерно из 20 оснований. Зонд ковалентно закрепляется на какой-либо твердой матрице (бумажном фильтре или стенке лунки планшета) и после инкубации с образцом специфически связывает комплементарную цепь ампликона. Использование меченых нуклеотидов (например, биотином, дигогксигенином или радиоактивным фосфором), встраиваемых в ампликон в процессе его образования, позволяет не только качественно, но и количественно судить о наличии ампликона в реакционной смеси после завершения полимеразной реакции и, следовательно, о наличии искомой ДНК в исходной анализируемой пробе.
Как правило, иммобилизацию зондов проводят в ячейках 96-луночных планшетов (микроплат), традиционно применяемых в иммуноферментном анализе. Использование соответствующего специального оборудования существенно облегчает и стандартизирует работу с этими планшетами. Вот почему описанный способ обнаружения ампликонов является специфичным, надежным и доступным по цене методом.
http://wxvw.btc-bti.com/pcrelisa.
Совместное использование методов PCR и гибридизационного олигоферментного анализа ампликонов является весьма перспективным направлением развития аналитической химии ДНК для нужд клинической диагностики. В научной и патентной литературе можно найти многочисленные примеры анализа различных ДНК методом PCR-ELISA [PCR-ELISA - A low technology alternative to real time PCR. ]. Этот метод может служить реальной и существенно более дешевой альтернативой анализу ДНК методом PCR в режиме реального времени (real time PCR).
Основным препятствием для широкого внедрения тандема PCR-ELISA в рутинную практику клинической диагностики является его длительность. Суммарно, без учета времени, затрачиваемого на выделение ДНК из исследуемого образца, продолжительность PCR-ELISA занимает не менее 6-7 часов, из которых минимум три часа приходится на стадию инкубации амплификата на микроплатах. Таким образом, более 50% суммарного времени занимает исключительно стадия анализа продуктов полимеразной реакции. Следовательно, при использовании микроплат главным недостатком ELISA как «индикаторной реакции» процесса образования ампликонов является ее длительность.
Одним из возможных вариантов сокращения продолжительности гибридизационного олигоферментного анализа ампликонов является предварительный нагрев гибридизируемого раствора до температуры плавления ДНК, которая превышает 90°С. Однако осуществить этот процесс на практике приминением традиционных 96-луночных планшетов и стандартных инкубаторов для гибридизации невозможно. Дело в том, что полистирол, используемый в качестве сырья для изготовления планшетов, в диапазоне температур от 90 до 100°С термически неустойчив и подвержен сильным механическим деформациям. Кроме того, инкубаторы для гибридизации, как правило, воздушного типа и конструктивно выполнены таким образом, что не могут обеспечить быстрый и контролируемый резкий перепад температур в камере.
С точки зрения поставленной задачи - найти простой способ сокращения времени анализа ампликонов методом гибридизационного олигоферментного анализа, возможность использования амплификатора ДНК в качестве инкубатора для гибридизации и стандартных пробирок для PCR в качестве гибридизационных сосудов представляется почти идеальным решением. Дело в том, что геометрические формы таких пробирок идеально соответствуют поверхностному рельефу термоблока амплификатора и нужная температура любой стадии гибридизации может быть установлена за секунды и поддерживаться с большой точностью.
Такое конструктивное оформление процесса гибридизации существенно упрощает метод PCR-ELISA в целом и делает его значительно более привлекательным для рутинных исследований по следующим двум причинам. Во-первых, появляется возможность проводить все стадии тандема PCR-ELISA не только в одинаковых, но даже в одних и тех же пробирках. Во-вторых, вместо затрачиваемых при использовании микроплат 3 и более часов процесс специфического взаимодействия амплификата с зондом будет длиться не более 10 минут: за непродолжительным периодом плавления ампликонов при 95°С собственно процесс гибридизации продлится всего нескольких минут, требуемых для постепенного охлаждения пробирки до комнатной температуры.
В научной и патентной литературе описано несколько вариантов анализа ДНК методм PCR-ELISA в одной пробирке [US Patent 6844158]. Одним из наиболее известных является метод, получивший название твердофазный PCR (solid phase PCR) [US Patent 6017738; Adessi С., Matton G., Ayala G., Turcatti G., Mermod J-J, Mayer P. and Kawashima E. Solid phase DNA amplification: characterisation of primer attachment and amplification mechanisms. Nucleic Acids Res., 28, e87, 2000 Carmon A., Vision T.J., Mitchell S.E., Thannhauser T.W., Muller U., Kresovich S. Solid-phase PCR in microwells: Effects of linker length and composition on tethering, hybridization, and extension. BioTechniques 32,410-420, 2002].
В этом методе один из праймеров ковалентно закрепляется на поверхности пробирки. Вследствие этого формирование некоторой части ампликонов будет происходить не только в растворе, но и на стенке сосуда. Ряд последующих операций, традиционных для гетерогенного иммуноферментного анализа, позволяет относительно быстро провести количественный анализ иммобилизованных ампликонов. Основные трудности, препятствующие широкому распространению этого метода, по-видимому, связаны со сложностью подбора условий полимеразной реакции с иммобилизованным праймером.
В другом и существенно менее известном варианте метода PCR-ELISA в одной пробирке отпадает необходимость проводить полимеразную реакцию и гибридизационный анализ последовательно - эти два процесса могут быть совмещены и протекать одновременно.
Наиболее близким по технической сущности и заявляемому эффекту является вариант PCR-ELISA, описанный в заявке на патент CN 1521269. Функционирование предложенной тест-системы осуществлялось следующим образом. Гибридизационный зонд ковалентно «пришивали» к внутренней стенке стандартной PCR-пробирки, в которой впоследствии проводили полимеразную реакцию. Поскольку метод PCR является циклическим процессом, то после каждой стадии плавления ДНК, следующий за этим процесс гибридизации имел место не только в растворе (между вновь синтезированными цепями ампликонов или между цепями ампликона и праймерами), но и на стенках реакционного сосуда (между одной из цепей ампликона и иммобилизованным зондом). Причем количество связавшихся молекул амплификата находилось в прямо пропорциональной зависимости от концентрации апмликонов в ячейке. Таким образом, процессы образования ампликона (реакция PCR) и их связывание со стенкой пробирки (гибридизация амплификата с зондом) проходили параллельно. После окончания PCR необходимо было промыть пробирку и определить количество связавшегося маркированного амплификата каким-либо подходящим стандартным приемом.
Предложенный вариант PCR-ELISA полностью исключает самую продолжительную стадию гибридизации амплификата на планшетах, что существенно сокращает время анализа ДНК в целом: без учета времени на выделение ДНК описанный вариант PCR-ELISA будет занимать не более двух часов. Кроме того, при разработке новых методов анализа ДНК данным способом не требуется внесений каких-либо существенных корректур в уже имеющуюся отлаженную схему или рецептуру реакционной смеси полимеразной реакции, как это имеет место при твердофазном PCR.
Поскольку разные стадии полимеразной реакции протекают при разных температурах в диапазоне от 45 до 98°С - для быстрого создания в растворе нужной температуры, желательно использовать небольшие объемы. Кроме того, высокая стоимость реагентов также диктует условия максимальной минимизации реакционной среды. Поэтому, как правило, эта величина составляет 25-50 мкл. Столь незначительный объем обуславливает, соответственно, и малую площадь соприкосновения раствора с поверхностью пробирки. Это обстоятельство входит в противоречие с условиями, оптимальными для проведения иммуно(олиго)ферментного анализа и выявляет наличие существенных конструктивных недостатков в стандартных гладкостенных PCR-пробирках для целей осуществления PCR-ELISA в одной пробирке. Кроме того, в силу стерических затруднений физически невозможно иммобилизовать на малой поверхности такое количество гибридизационных зондов, которое бы обеспечивало необходимый аналитический сигнал. Последнее обстоятельство оказывает существенное негативное влияние на такой фундаментальный параметр аналитической методики как чувствительность. Следовательно, чтобы совместить проведение «аналитического» (PCR) и «индикаторного» (ELISA) процессов в одной пробирке, необходимо для каждого из них обеспечить максимально благоприятные условия. Для «аналитической» стадии, в сравнении с классическим способом проведения PCR-реакции, никаких существенных изменений в рецептуре или температурных режимах не требуется, в то время как для «индикаторного» процесса, напротив, крайне желательно кардинально улучшить свойства пробирки как реакционного сосуда для олигоферментного анализа. Для этого необходимо, с одной стороны, увеличить поверхностную концентрацию иммобилизованных гибридизационных зондов, а, с другой стороны, без увеличения объема реакционной смеси обеспечить максимально возможную площадь соприкосновения раствора со стенками реакционной пробирки. Другими словами, необходимо, не изменяя геометрических размеров PCR-пробирок и не затрагивая каких-либо иных свойств, увеличить их реакционную поверхность и сорбционную емкость.
Раскрытие изобретения
Поставленная цель достигается заменой гладкой внутренней поверхности PCR-пробирок на рельефную с размерами микрократеров, соизмеримых с толщиной стенок сосуда (см. также чертеж, где дано схематическое изображение структуры внутренней стенки PCR-пробирки с развитой внутренней поверхностью).
При гладкой внутренней поверхности пробирки реакционная среда имеет со стенкой наименьшую площадь соприкосновения. Создание же микрократеров на ее внутренней поверхности существенно увеличит как сорбционную емкость стенки сосуда (можно иммобилизовать на единицу поверхности существенно больше гибридизационных зондов), так и обеспечит соответственно увеличение площади контакта раствора со стенками без необходимости увеличения объема реакционной среды.
Формирование микрорельефа внутренней поверхности PCR-пробирок может быть достигнуто литьем, а также механическим и/или физическим воздействиями на внутреннюю поверхность уже готовых пробирок. Гетерогенность неровностей, образованных микро- и макрократерами, может соответствовать 1 по 6 классам шероховатости и колебаться в широком диапазоне от нескольких до сотен микрон. Создание микродефектов внутренней поверхности PCR-иробирок позволяет увеличить их реакционную поверхность и сорбционную емкость в десятки раз. Помимо чисто математических расчетов, взаимовлияние величины реакционной поверхности и сорбционной емкости может быть наиболее наглядно продемонстрировано в опытах по олигоферментному анализу растворов ампликонов разной концентрации.
Таким образом, первым аспектом настоящего изобретения является тест-система для анализа ДНК, которая включает:
а) реакционный сосуд для проведения PCR-ELISA, представляющий собой PCR-пробирку стандартных размеров с развитой внутренней поверхностью;
б) стандартный набор реактивов для PCR-анализа, который включает буферную смесь, олигонуклеотиды и фермент Taq-полимеразу;
в) стандартный набор реактивов для ELISA, включающий подлежащий иммобилизации гибридизационный зонд, конъюгат и соответствующий субстрат;
г) инструкцию к применению.
Увеличение площади внутренней поверхности пробирки достигается за счет микродефектов ее стенок, представляющих собой микро- и макрократоры. Гетерогенность неровностей внутренней поверхности пробирки, образованных этими микро- и макрократерами, находится в диапазоне от нескольких микрон до сотен микрон.
Вторым аспектом настоящего изобретения является способ анализа ДНК, включающий применение описанной выше тест-системы. Этот способ предусматривает первоначальную стандартную процедуру иммобилизации зонда на внутренней поверхности PCR-пробирки с последующим последовательным проведением в этой пробирке аналитической (PCR) и индикаторной (ELISA) реакций.
Осуществление изобретения
Для экспериментального подтверждения достижения поставленных целей были проведены эксперименты в пробирках двух видов: с гладкой и развитой поверхностями. При изготовлении реакционных сосудов первого типа (с гладкой поверхностью) все операции по химической модификации внутренних стенок с целью иммобилизации гибридизационных зондов проводились в необработанных PCR-пробирках. При изготовлении реакционных сосудов второго типа перед проведением аналогичных операций внутренняя поверхность пробирок была предварительно разрыхлена использованием алмазной фрезы, рабочий профиль которой был комплементарен геометрической форме PCR-пробирки. Другими словами, сосуды второго типа изготовлялись на базе PCR-пробирок с развитой внутренней поверхностью.
В изготовленных таким образом реакционных сосудах был проведен олигоферментный анализ растворов амплификата, полученных последовательным разбавлением.
В качестве тест-объекта использовали ДНК микроорганизмов Chlamydia trachomatis, являющихся причиной одного из самых распространенных инфекционных заболеваний. Поэтому PCR-диагностика хламидиоза проводится практически в каждой клинико-диагностической лаборатории, а композионный состав реакционной смеси, схема реакции, структуры праймеров или гибирдизационых зондов, как правило, хорошо известны. В нашем случае для получения амплификата стандартным способом использовался один из первых PCR-методов, предложенных для рутинной диагности [Claas H.C., Melchers W.J., de Bruijn I.H., de Graaf M., van Dijk W.C., Lindeman J., Quint W.G. Detection of Chlamydia trachomatis in clinical specimens by the polymerase chain reaction. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis., 9, 864-868,1990].
Иммобилизацию гибридизационного зонда (аминированный 5'- или 3'-олигонулеотид) на стенках пробирок проводили использованием методик, заимствованных из работ по созданию ДНК-биочипов (microarray technology) [Beier M., Hoheisel J.D. Versatile derivation of solid support media for covalent bonding on DNA-microchips. Nucleic Acids Res., 27, 1970-1977, 1999; Pirrung M.C. How to make a DNA Chip.Angewandte Chemie 41, 1276-1289, 2002]. Последовательность процессов может быть отражена простой двухстадийной схемой: силанизация поверхности+хемосорбция [Beaucage S.L. Strategies in the preparation of DNA Oligonucleotide Arrays for Diagnostic Application. Curr.Med.Chem., 8, 1213-1244, 2001].
На первой стадии пробирки обрабатывали спиртовым раствором гамма-пропилтриэтоксисилана. В результате этой обработки на поверхности полипропилена происходило формирование силиконовой пленки, содержащей первичные аминогруппы. Эти группы в дальнейшем были задействованы в процессах ковалентной иммобилизации олигонуклеотида. Для этого непосредственно перед «пришивкой» гибридизационных зондов аминогруппы стенок сосудов модифицировались янтарным ангидридом, а сам процесс иммобилизации проводили с использованием водорастворимого карбодиимида [Jiang X-S., Chai С., Zhang Y., Zhuo R-X., Мао H-Q., Leong K.W. Surface-immobilization of adhesion peptides on substrate for ex vivo expansion of cryopreserved umbilical cord blood CD34+cells. Biomaterials 27, 2723-2732, 2006].
Измерение параметров флюоресценции после проведения иммуноферментного анализа проводили на спектрофлуориметре FL-800 (компании Biotech), предназначенном в том числе для регистрации сигнала непосредственно из ПЦР-пробирки.
Результаты анализа ампликонов методом гибридизации в PCR-пробирках с разной внутренней поверхностью представлены в таблице. Как следует из представленных данных, в сравнении с гладкостенными, в пробирках с развитой внутренней поверхностью, значение минимально определяемой концентрации ампликона уменьшилось почти на два порядка.
Таблица
Значения флюоресценции в зависимости от концентрации ампликона, гибридизируемого в PCR-пробирках с различной реакционной поверхностью. [Условия: 50 мкл 20 мМ Трис-НСl буферного раствора, 10 минут гибридизации: 95°С - 3 мин, 45°С - 5 мин; 15 минут взаимодействия с конъюгатом стрептавидин-щелочная фосфатаза; 10 минут инкубации с субстратом (4-метилумбелиферилфосфат) при 45°С]
Количество анализируемого амплификата (мкл)
Значения флюоресценции
Стандартная PCR-пробирка
PCR-пробирка с развитой поверхностью
5
5213
9696
1
2896
8896
0,5
2060
8719
0,2
960
6974
0,1
821
6743
0,05
-
5293
0,01
-
3740
Орицательный контроль (1 мкл)
986
1147
Фон
657
689
Кроме того, как видно в таблице, уже при небольших концентрациях анализируемого вещества в PCR-пробирке с развитой поверхностью регистрируется достаточно высокий уровень сигнала. Это позволило предположить, что при проведении PCR-ELISA в одной пробирке, после определенного числа циклов амплификации, не имело никакого смысла продолжать далее накапливать амплификат. Проведенные эксперименты подтвердили сделанное предположение. Действительно, для достижения одной и той же величины сигнала при раздельном использовании PCR и ELISA, при проведении PCR-ELISA в гладкостенных пробирках или пробирках с развитой поверхностью, число циклов амплификации одной и той же исходной концентрации ДНК составило 40, 33 и 28 соответственно.
Представленные результаты однозначно указывают на органичное взаимодействие и взаимовлияние трех основных составляющих заявляемой тест-системы: PCR, ELISA и реактора. Использование PCR-пробирок с развитой поверхностью позволяет улучшить одновременное протекание названных процессов, что проявляется в значительном сокращении числа циклов амплификации и существенном улучшении аналитических характеристик ELISA как способа количественного анализа ампликонов.