Роль температуры в реализации анти-лизоцимной активности холерных вибрионов

30

ЗНиСО

май №5

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Абзаева Н.В., Будыка Д.А., Бондаренко А.И., Иванова Г.Ф., Руднев С.М., Гостищева С.Е., Фисун А.А. Электронно-микроскопическая характеристика клеточных элементов вакцинной суспензии в чумной вакцине EV в зависимости от условий культивирования, концентрации микробов и ее объема в ампуле: Сборник материалов I Всероссийского конгресса по инфекционным болезням (2009 г., 30 марта — 1 апреля). Москва. С. 4. Будыка Д.А., Бондаренко А.И., Абзаева Н.В. Морфоме-трические показатели микробных клеток Yersinia pestis EV в зависимости от температуры культивирования и их устойчивость в процессе лиофилизации вакцины чумной живой: Сб. мат. Х Межгос. научно-практ. конф. государств-участников СНГ «Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ» (2010 г., 5—6 октября). Ставрополь, 2010. С. 250. Еременко Ю.Д., Бывалов А.А., Пименов Е.В. Особенности жирно-кислотного состава клеток Yersinia pseudotuberculosis, выращенной на плотной питательной среде при различных температурах //Проблемы особо опасных инфекций. 2005. № 1 (89). С. 41—43. Осадчая А.И., Кудрявцев В.А., Сафронова Л.А. Влияние некоторых факторов на криорезистентность и сохране-

ние жизнеспособности при лиофилизации Bacillus subtilis //Биотехнология. 2002. № 3. С. 45—54.

5. Фармакопейная статья предприятия 42-8654-07 «Вакцина чумная живая, лиофилизат для приготовления суспензии для инъекций, накожного скарификационного нанесения и ингаляций». Ставрополь, 2007. 16 с.

6. Фисун А.А., Будыка Д.А., Бондаренко А.И., Абзаева Н.В., Гостищева С.Е., Иванова Г.Ф., Корнилов Е.В., Когот-кова О.И., Зуенко А.А. Взаимосвязь показателя термостабильности вакцины чумной живой с количеством нежизнеспособных клеточных элементов (балласта) в высушенном препарате в процессе хранения: Сб. мат. Х Межгос. научно-практ. конф. государств-участников СНГ «Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ» (2010 г., 5—6 октября). Ставрополь, 2010. С. 275.

Контактная информация:

Будыка Дмитрий Александрович тел.: 8(652) 26-20-50, e-mail.: chumnpl@yandex.ru

Contact information: Budyka Dmitry, phone.: 8(652) 26-20-50, e-mail.: chumnpl@yandex.ru

-V-

РОЛЬ ТЕМПЕРАТУРЫ В РЕАЛИЗАЦИИ АНТИЛИЗОЦИМНОЙ АКТИВНОСТИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ

Ю.В. Сизова, И.Я. Черепахина, Е.В. Сизова, В.В. Балахнова

THE ROLE OF TEMPERATURE IN THE IMPLEMENTATION ANTILYSOZYMIC ACTIVITY OF VIBRIO CHOLERAE

Г-Ь

U.V. Sizova, I.J. Cherepakhina, E.V. Sizova, V.V. Balahnova

ФКУЗ « Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора

Представлены результаты изучения антилизоцимной активности холерных вибрионов и зависимость ее от температурного фактора. Показано, что среди изученных штаммов преобладают высокие и средние показатели, а среди сальмонелл — низкие показатели, что свидетельствует о родовых различиях, характеризующих АЛА, и роли данной активности в жизнедеятельности холерных вибрионов.

Ключевые слова: холерный вибрион, персистенция, антилизоцимная активность, температура

We presented results of study on antilizotsimnoy activity ofV. cholerae and its dependence on the temperature factor. It is shown that among the studied strains dominate the high and average, and of Salmonella — low rates, indicating that the generic differences, that characterize of the ALA, and the role of this activity in the life of V. cholerae.

Keywords: Vibrio cholerae, persistence, antilizotsimnaya activity, temperature.

Продолжающаяся более пятидесяти лет седьмая пандемия холеры Эль Тор, появление в 1992 г. холерного вибриона О139 серогруппы, выделение в течение последних 20 лет атипичных штаммов с повышенной вирулентностью обусловили проведение масштабных исследований по изучению генотипа и фенотипа данного возбудителя, в том числе с целью анализа его патогенного потенциала. Однако механизмы персистенции холерных вибрионов в организме человека и объектах окружающей среды, ее регуляция, характер фенотипи-ческих проявлений признаков, характеризующих сохранение и переживание V. cholerae в различных экосистемах, изучены мало. Как известно, персистенция — механизм, способствующий длительному переживанию бактерий в организме млекопитающих и объектах окружающей среды, и позволяющий им координированно перестраивать работу клетки для адаптации к меняющим-

ся условиям [4]. У ряда микроорганизмов перси-стенция имеет важное патогенетическое значение в инфекционном процессе, и ее показатели могут быть использованы в медицинской практике в диагностике заболеваний и прогнозировании носительства [3]. Важным является изучение способности холерных вибрионов персистировать в объектах окружающей среды.

Одним из достаточно охарактеризованных факторов персистенции микроорганизмов является антилизоцимная активность [1]. Лизоцим является одним из ведущих компонентов неспецифической защиты у беспозвоночных, насекомых и растений, в том числе обитающих в водных эпи-топах [1]. Способность бактерий специфически инактивировать лизоцим была определена как антилизоцимная активность. На примере стафилококков было показано, что динамика экспрессии факторов патогенности коррелировала с

май №

31

динамикой антилизоцимной активности штам-'— ма в ходе инфекционного процесса: при остром процессе происходила селекция клонов с низкой антилизоцимной активностью, а при формирова--чт нии бактерионосительства (персистирующий тип ^ инфекции) имела место селекция высоко активных клонов [3].

Принимая во внимание опубликованные результаты исследований на модели условно-патогенных микроорганизмов, нами была предпринята попытка оценить роль антилизоцимной активности в персистенции холерных вибрионов О1 серогруппы, а также влияние температурного фактора на антилизоцимную активность. Параллельно с холерными вибрионами проводилось исследование антилизоцимной активности энтеробактерий (¿1 1урктипит и еМегШМз), выделенных в лабораториях инфекционных стационаров г. Ростова-на-Дону.

Антилизоцимную активность (АЛА) определяли чашечным методом, предложенным О.В. Бухариным с соавт. [1]. Количественную оценку антилизоцимной активности давали путем определения конечной концентрации лизоци-ма, которую разрушал исследуемый штамм, и где еще наблюдался рост индикаторного штамма микрококка, и выражали в мкг/мл. Для оценки были приняты следующие критерии: низкая — 1—2 мкг/мл; средняя — 3—4 мкг/мл; высокая — свыше 4 мкг/мл. В работе использовали 51 штамм V. ско!егае Е1 Тог, 54 штамма 1урЫтипыт и 30 штаммов еМепШгз.

Результаты исследований показали, что среди холерных вибрионов преобладали культуры с высокой и средней антилизоцимной активностью (49,0 и 37,25 % штаммов соответственно), а низкие значения отмечены только 7 из исследованных штаммов. Штаммов, не обладающих АЛА, среди холерных вибрионов отмечено не было. У взятых для сравнения штаммов сальмонелл преобладали низкие показатели АЛА (74,0 и 76,68 %

штаммов соответственно). У 7—8 % штаммов сальмонелл АЛА не обнаруживалась. Высокой активностью обладал только один штамм 1урЫтигшт. Полученные результаты свидетельствуют о родовых различиях, характеризующих АЛА, и возможной роли данной активности в жизнедеятельности холерных вибрионов. Уровни АЛА в группах штаммов холерных вибрионов, ранжированных по источнику выделения, отличались незначительно (табл.).

Однако при рассмотрении значений АЛА внутри каждой из этих групп оказалось, что показатели АЛА несколько увеличиваются по мере снижения эпидемической значимости штаммов (йх+1ер+< е1хТ;ер+ < е1х—1ер—): у больных эти показатели увеличиваются с 3,1 до 5,5, у носителей — с 3,0 до 4,8, у культур, выделенных из воды открытых водоемов, — с 3,25 до 4,96, из сточной воды — с 5,0 до 6,0.

Данные более демонстративны при рассмотрении средних значений АЛА в группах штаммов, отличающихся между собой по наличию генов йх и 1ер. Было показано, что средние значения в группах несколько увеличиваются по мере снижения эпидемической значимости штаммов (3,59-4,1-5,3). При рассмотрении значений АЛА внутри каждой группы, представленных штаммами с различными генотипами (е1х+1ер+, е1х—1ер+ и йх^ер-), было выявлено, что значения АЛА в группе йх^ер- были наиболее высокими — средний уровень составил 5,3 мкг/мл (5,5 — у больных, 4,8 — у носителей, 4,96 — из воды открытых водоемов и 6,0 — из сточной воды).

У ряда штаммов показатели АЛА были стабильно высокими на всем протяжении исследований. Один из таких штаммов (выделенный из реки Тем ерник), с высоким показателем АЛА (более 10 мкг/мл) был депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора.

Таблица. Характеристика холерных вибрионов по АЛА, ранжированных по источнику выделения

Источник выделения штамма Количество штаммов Наличие генов Средний уровень АЛА, мкг/мл Средний уровень АЛА в группе, мкг/мл

йх 1ер

Больные 10 + + 3,1 4,12

2 — + 3,75

1 — - 5,5

Носители 2 + + 3,0 3,9

6 — + 3,91

3 — — 4,8

Вода открытых водоемов 4 + + 3,25 4,07

2 — + 4,0

12 — — 4,96

Сточная вода 1 + + 5,0 5,25

2 — + 4,75

1 — — 6,0

32

ЗНиСО

май №5

M Ю h M

н M M M

^ 00 ^

OS M h M

С учетом полученных данных о более высокой АЛА у эпидемически неопасных холерных вибрионов, можно предположить, что она является тем фактором, который способствует персистенции нетоксигенных холерных вибрионов в течение определенного времени в организме человека и в объектах окружающей среды. У штаммов, выделенных из сточной воды, эти показатели оказались наиболее высокими, что косвенно может свидетельствовать об участии АЛА в выживании холерных вибрионов в агрессивной среде.

Однако дальнейшие исследования этого фактора внесли некоторые коррективы в трактовку роли АЛА в персистенции холерных вибрионов.

Изучение антилизоцимной активности традиционно проводится, согласно методике, при 37 °С (температура организма человека). Однако, как известно, для холерных вибрионов более естественна водная среда обитания, температура которой даже в теплое время года значительно ниже. В связи с этим представляло интерес изучение пер-систентного потенциала холерных вибрионов по АЛА при более низкой температуре, характерной для воды открытых водоемов в летнее время. Для этих целей несколько штаммов холерных вибрионов культивировали на щелочном агаре рН 7,7 при температуре 22 и 37 °С, и сравнивали уровень активности по приведенной ранее методике, но при двух температурах (22 и 37 °С).

Результаты опыта показали, что у штаммов холерных вибрионов, культивируемых как при 22, так и при 37 °С при стандартном методе определения АЛА (37 °С) достоверных различий в уровнях активности не наблюдалось.

Но при определении антилизоцимной активности при 22 °С, которая примерно соответствует температуре воды открытых водоемов, было отмечено ее снижение у всех изученных штаммов (рис.).

При этом у эпидемически значимых штаммов, которые, как известно, длительное время не выживают в воде открытых водоемов, антилизоцимная активность снизилась всего на 1—2 мкг/мл. Это может свидетельствовать о том, что для токсиген-ных V. cholerae смена температурной среды обитания в плане повышения или снижения АЛА, существенной роли не играет, поскольку она а priori у токсигенных штаммов ниже, чем у неток-сигенных штаммов.

Другое значение этот фактор имеет у холерных вибрионов, лишенных генов токсинопродукции (ctx-tcp+ и ctx-tcp-), у которых наблюдалось резкое снижение показателей АЛА: на 4—12 мкг/мл

г an  г г  г  г  г г  г

I I МЫ "

-£—f—

^t- 0\

MosooMMMMh»

штаммы

122 С 137 С

Рис. Оценка АЛА холерных вибрионов при различных температурах

у ctx-tcp+ штаммов и на 6—13 мкг/мл — у ctx-tcp-. При последующих определениях по стандартной методике при 37 °С показатели восстанавливались до исходного уровня, что свидетельствует о наследственно закрепленном уровне АЛА у V. cholerae и фенотипи-ческой его вариабельности в зависимости от температурных условий обитания холерных вибрионов.

Вероятно, данный фактор, инактивирующий (или связывающий) лизоцим и обозначенный в литературе как «антилизоцимная активность», при низких температурах не связывается с белком. В свете полученных данных можно предположить, что высокая антилизоцимная активность у нетоксигенных вибрионов играет важную роль в короткой или продолжительной (при вибрионо-носительстве) персистенции таких вибрионов в организме человека, в котором при оптимальной температуре происходит инактивация лизоцима, и создаются условия для их выживания.

Нам представляется, что при миграции в объекты окружающей среды антилизоцимная активность резко снижается, поскольку даже при встрече холерных вибрионов с гидробионтами, содержащими лизоцим, неактивный или слабо активный при низких температурах, им нет необходимости индуцировать продукцию так называемого антилизоцимного фактора.

Таким образом, показано, что холерные вибрионы обладают выраженной антилизоцим-ной активностью, уровень которой зависит от температуры окружающей среды, тем самым демонстрируя роль АЛА в персистенции возбудителя холеры.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. Екатеринбург, 1999. 336 с.

2. Бухарин О.В., Валышев А.В. Микробные ингибиторы лизоцима //Журн. микробиол. 2006. № 4. С. 8—13.

3. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я. Бактерионосительство (медико-экологический аспект). Екатеринбург, 1996. 203 с.

4. Честнова Т.В., Серегина Н.В. Особенности существования бактерий в составе биопленок на примере уропато-генных кишечных палочек //Вестник новых медицинских технологий. 2010. Т. XVII. № 4. С. 28—30.

Контактная информация:

Сизова Юлия Владимировна, тел. 8 (918) 509-74-62, е-mail: yuisa@mail.ru

Contact Information: Sizova Yulia,

рИоие 8 (3472) 55-19-48, е-mail: yuisa@mail.ru

r-Ь