Биотестирование антиоксидантных соединений на одноклеточных организмах

БИОХИМИЯ, БИОТЕХНОЛОГИЯ И ЭКОЛОГИЯ

УДК 57.01

О. В. Карпухина, К. З. Гумаргалиева, А. Н. Иноземцев, Г. Е. Заиков

БИОТЕСТИРОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА ОДНОКЛЕТОЧНЫХ ОРГАНИЗМАХ

Ключевые слова: тяжёлые металлы, антиоксиданты, Paramecium caudatum, пирацетам, полиморфизм.

Исследовано влияние антиоксидантов после воздействия тяжелых металлов на культуру клеток Paramecium caudatum. Данные свидетельствуют о том, что антиоксиданты могут играть важную роль в ослаблении токсического эффекта некоторых опасных тяжелых металлов.

Keywords: heavy metal, antioxidant, Paramecium caudatum, piracetam, polymorphism.

Effect of antioxidants after exposure to heavy metals was investigated. The evidence suggests that antioxidants may play an important role in easing some of the dangerous heavy metals.

Введение

Ионы тяжелых металлов играют существенную роль во многих физиологических процессах. В следовых количествах, некоторые из металлов необходимы для обмена веществ, роста и

развития организма. Однако их избыток приводит к повреждению клеток, в частности, катионы тяжёлых металлов, реагируя с различными

функциональными группами белков, инициируют нарушение их структурной организации [1].

Основным механизмом токсического действия тяжёлых металлов на клетки является процесс образования свободных радикалов и активных форм кислорода (АФК) путем прямого переноса электрона с участием катионов металлов или опосредованного ингибирования

метаболических реакций. Следует подчеркнуть, что реактивные формы кислорода непрерывно производится на определённом уровне при нормальных процессах в организме. Увеличение синтеза АФК является одной из начальных реакций на различные стрессовые факторы в биологических системах, которые являются причиной многих патологий [2].

Антиоксиданты непосредственно или косвенно защищают клетки от токсичных радикальных реакций [2-3]. Одним из фармакологических препаратов, которые способны ограничивать активность процессов

свободнорадикального окисления является пирацетам (2-оксо-1-пирролидинацетамид).

Согласно «мембранной гипотезе» [4], механизм действия пирацетама неспецифичен в отношении клеток или органов и является не столько биохимическим, сколько «механическим». Молекулы препарата связываются с полярными головками фосфолипидов мембраны, в результате чего повышается подвижность липидов

относительно друг друга и, как следствие, эластичность мембраны клетки. При этом препарат воздействует на мембрану лишь в том случае, если

ее эластичность нарушена (например, в результате старения), и не влияет на мембраны с нормальной эластичностью [4].

Целью данной работы стало исследование влияния антиоксидантных соединений на патологические процессы в клетке, инициируемые действием тяжёлых металлов.

Экспериментальная часть

В качестве объекта исследования влияния химических веществ выбрана инфузория Paramecium caudatum, которая обладает морфологическими признаками клетки и реагирует на внешнюю среду подобно многоклеточным организмам. Клетки Paramecium caudatum инкубировали до 30 суток при температуре 21±1 С°. Эффекты антиоксидантных соединений - мексидола и двух структурных форм пирацетама - изучали в конечных концентрациях 1, 10, 25, мкМ, 50 мкМ и 1 мМ. При оценке выживаемости контролем являлись интактные клетки инфузорий. В опытах к 1 мл среды с парамециями добавляли 1 мл антиоксиданта и 1 мл токсиканта. Для регистрации числа инфузорий использовали счётную камеру Горяева. В данной работе исследовалось цитотоксичность хлорида кадмия, ацетата свинца и сульфата меди. Paramecium caudatum обладают высокой чувствительностью к действию токсикантов, т. к. способны реагировать на металлы при их концентрации в диапазоне от 0,1 до 0,0001 мг/мл. Одним из механизмов токсического действия металлов является изменение внутриклеточных условий из-за нарушения проницаемости мембраны. Ионы Cd, Pb и Cu вызвали набухание органелл цитоплазмы, влекущее за собой разрыв мембраны клетки Paramecium caudatum. Гибель клеток отмечалась через 10-20 минут после внесения в среду соли тяжёлого металла. Предварительное внесение в среду антиоксидантного соединения способствовало выживаемости клеток (рис.1-2, 4).

1 сутки 5 сутки 10 сутки 15 сутки 20 сутки 25 сутки 30 сутки  Рв  контроль  Рв+ ПИР эт  Рв+ аПИР I

Рис. 1 - Динамика роста культуры Paramecium caudatum при внесении в среду ацетата свинца и пирацетама

1 сутки 5 сутки 10 сутки 15 сутки 20 сутки 25 сутки 30 сутки  Си  контроль  Cu+ ПИР  Cu+ аПИР

Рис. 2 - Динамика роста культуры Paramecium caudatum при внесении в среду сульфата меди и пирацетама

Ранее нами установлено, что диацетат свинца и хлорид кадмия в водном растворе выступают в роли катализаторов структурных перестроек нейротропного препарата - пирацетама [5]. При растворении в присутствии солей тяжелых металлов структура препарата подвергается изменениям с образованием промежуточных продуктов, которые значительно влияют на функциональные свойства лекарственного соединения. В исследованиях адаптивных реакций крыс в ответ на воздействие тяжёлых металлов стресс-протекторный эффект пирацетама был неоднозначным из-за различия в

фармакологическом действии полиморфных форм пирацетама кристаллического и

аморфизированного. Структурно-модифицированная форма препарата аналогичная структурной форме пирацетама, обнаруженной в растворе в результате каталитического действия солей кадмия и свинца, оказала негативное влияние на выработку адаптивных реакций [5-7].

В данной работе растворы лекарственной формы пирацетама (АКРИХИН, Россия) и аморфизированного пирацетама способствовали нормальному функционированию клеток культуры Paramecium caudatum (рис.3).

Аморфизированный пирацетам по сравнению с кристаллической фармацевтической формой препарата оказал больший положительный эффект на рост численности инфузорий. Это объясняется тем, что эта структурно - модифицированная форма пирацетама обладает хорошей растворимостью и

высокой биодоступностью. Обе формы пирацетама защитили клетки от токсического действия ацетата свинца и сульфата меди (рис. 1-2). Выживаемость клеток Paramecium caudatum к 20-ым суткам составила более 50%. При воздействии хлорида кадмия на инфузории протекторный эффект пирацетама не установлен.

1 сутки 5 сутки 10 сутки 15 сутки 20 сутки 25 сутки 30 сутки Р  контроль  ПИР эт  аПИР

Рис. 3 - Влияние пирацетама на динамику роста культуры Paramecium caudatum ПИР эт -раствор лекарственной формы пирацетама; ПИР ам - раствор структурно-модифицированного пирацетама; контроль физ. раствор

Для сравнения в опыте использовался мексидол (2-этил-6-метил-3-оксипиридина

сукцината) - широко применяемый в медицинской практике синтетический антиоксидант. Мексидол помогает сохранению структурно-функциональной организации биомембран. Механизм действия мексидола определяется прежде всего, его антиоксидантным действием: способностью ингибировать перекисное окисление липидов биомембран и усиливать активность антиоксидантных ферментов [8-9] и мембранопротекторными эффектами: уменьшение вязкости мембраны и увеличение ее текучести, повышение соотношения липид-белок [10].

Добавление мексидола (рис. 4) в среду с Paramecium caudatum на протяжении 30 суток положительно влияло на численность клеток.

Значительный рост культуры клеток относительно контроля (р<0,05) был зарегистрирован на 15-20 сутки.

1 сутки 5 сутки 10 сутки 15 сутки 20 сутки 25 сутки 30 сутки  контроль  МЕК  Рв+МЕК  Cu+МЕК  Cd+МЕК

Рис. 4 - Динамика роста культуры Paramecium caudatum при внесении в среду солей тяжёлых металлов и мексидола

Кроме того, мексидол способствовал защите клеток инфузорий от токсического воздействия ацетата свинца до 10 суток, хлорида кадмия до 15 суток и сульфата меди до 30 суток. Таким образом, в хроническом эксперименте установлено, что два антиоксидантных соединения - пирацетам и мексидол защищали клетки инфузорий от развития окислительного стресса, вызываемого солями тяжёлых металлов. В пробах с антиоксидантом и солью тяжёлого металла отсутствовали особи с патологически изменённой формой клетки -характерной для токсического воздействия металла «вакуолизацией» клеточных мембран. Внесение в среду с парамециями антиоксидантов со специфическим мембрано - протекторным действием оказалось достаточным для предотвращения окисления мембранных липидов, вызывающего гибель клетки.

Заключение

Высокая чувствительность к химическим соединениям инфузории Paramecium caudatum позволяет дать предварительную оценку токсичности ксенобиотиков, вызывающих оксидантный стресс, и эффективности антиоксидантных соединений.

Антиоксиданты с мембранопротекторыми эффектами значительно уменьшают токсическое действие ионов Cd, Pb и Cu, тем самым способствуя

адаптации одноклеточного организма к окислительному повреждению мембран и органелл, инициируемого воздействием тяжёлых металлов.

Литература

1. Gaetke L., Chow C., Toxicol., 189, 147-163

2. Halliwell B., Gutteridge J.M.C. Free Radicals in Biology and Medicine, Ed 4. Clarendon Press, Oxford. 2006.704 р.

3. Бурлакова Е.Б.. Мисин В.М, Храпова Н.Г., Завьялов А.Ю. Антиоксиданты. Термины и определения. Изд-во РУДН. Москва. 2010. 63 с.

4. Winblad B., CNS Drug Rev, 11, .2, 169-182

5. Карпухина О.В., Соловьев А.Г., Гумаргалиева К.З., Иноземцев А.Н., ж. Хим. физика, 25, 5, 77-80

6. Карпухина О.В., Гумаргалиева К.З., Бокиева С.Б. Иноземцев А.Н., Кузнецова О.Н., Заиков Г.Е.., Вестн. Казанск.Техн.Унив. 15,15,165-167

7. Карпухина О.В., Гумаргалиева К.З., Костикова Н.П. , Иноземцев А.Н., Бокиева С.Б. Динамика химических и биологических процессов, XXI век. Москва, 2012, С..303-312.

8. Воронина Т.А., ж. Психофарм. биол. наркол., 1, 2-12

9. Bashkatova V, Narkevich V, Vitskova G, Vanin A., Prog. Neuropsychopharmacol Biol Psychi., 27, 3, 487-492

10. Дюмаев K.M., Воронина Т.А., Смирнов Л.Д. Антиоксиданты в профилактике и терапии патологий ЦНС. Изд. Ин-та биомед. химии РАМН, Москва, 1995. 272 с.

© О. В. Карпухина - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. стабильности и устойчивости органических веществ и материалов Института химической физики им. Н.Н.Семёнова РАН, olgakarp@newmail.ru; К. З. Гумаргалиева - д-р хим. наук, проф., зав. лаб. стабильности и устойчивости органических веществ и материалов Института химической физики им. Н.Н.Семёнова РАН, stusl@chph.ras.ru; А. Н. Иноземцев - д-р биол. наук, рук-ль лаб. эволюции механизмов памяти каф. ВНД МГУ им. М.В. Ломоносова, A_Inozemtsev@nerobiology.ru; Г. Е. Заиков - д-р хим. наук, проф. каф. технологии пластических масс КНИТУ.