СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ ЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИОФАГОВ
METHOD OF QUANTITATIVE ASSESSMENT OF LYTIC ACTIVITY OF BACTERIOPHAGES

Изобретение относится к медицине, к разделам: эпидемиологии и микробиологии. Может быть использовано для определения чувствительности микроорганизмов к бактериофагам.
Известен способ оценки специфической активности бактериофагов (патент РФ №2296163, опубл. 27.03.2007 г.), сущность которого сводится к тому, что в стандартных условиях монослоя культуры клеток эмбриона человека проводят совместное культивирование в течение 2 часов тест-штамма микроорганизма с соответствующим лечебным бактериофагом. Специфическую активность бактериофага оценивают по степени снижения адгезии тест-штамма микроорганизма к клеткам монослоя по сравнению с контролем (монослой клеток и тест-штамм без бактериофага).
Недостатки этого метода состоят в том, что методика очень трудоемка, имеет высокую себестоимость, большой расход дорогостоящих расходных материалов - пробирки Лейтона, кожно-мышечные или легочные фибробласты эмбриона человека, бактериофага (1,8 мл), многокомпонентная среда Игла (многократная отмывка), окраска по Романовскому-Гимза, этиловый спирт 96°. Оценка интенсивности адгезии также трудоемка и при этом субъективна, проводится по трем показателям, один из которых определяется микроскопически.
Известен способ нанесения капли бактериофаговой культуры (0,01 мл) на бактериальный газон на чашке Петри - Spot-test. Учет степени лизиса микроорганизмов регистрируется по четырехкрестовой схеме: 4 и 3 креста - высокая чувствительность - полный лизис или незначительный вторичный рост; 1 и 2 креста - низкая чувствительность - полусливной рост, от 50 до 10 колоний; отрицательный - отсутствие лизиса (Н.В. Алексанина. Изучение чувствительности к бактериофагам условно-патогенных энтеробактерий, выделенных от детей раннего возраста. / Журнал «Инфекция и иммунитет». - 2014 г. - специальный выпуск. - С. 62-63).
Следует отметить, что данная методика на твердой питательной среде не позволяет достигнуть максимально возможного взаимодействия в комплексе микроорганизм - бактериофаг, как это происходит в жидкой среде. Соответственно полученные результаты чувствительности микроорганизмов к бактериофагу интерпретировать на процессы, проходящие в человеческом организме, не совсем корректно.
Ближайшим аналогом (прототипом) предлагаемого способа для определения чувствительности микроорганизмов к бактериофагам является методика, основанная на специфичности литического действия бактериофагов. Суточную агаровую культуру микроорганизмов засевают в пробирки с жидкой питательной средой. В одну из них добавляют специфический бактериофаг от 1 до 10 капель в зависимости от литической силы фага. Пробирки ставят в термостат на 18-20 часов, после чего по густоте роста (мутности) учитывают полное или частичное воздействие фага на бактерии по сравнению с ростом в контрольной пробирке. (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Под редакцией М.О. Биргера, Москва, «Медицина», 1982. - С. 118-119).
Недостатками способа является субъективная оценка результатов постановки теста - определение мутности раствора «на глаз», отсутствие возможности оценить умеренную чувствительность исследуемых микроорганизмов к бактериофагу, а также большой расход дорогостоящего бактериофага, увеличивающего стоимость исследования.
Общее для всех методов определения чувствительности микроорганизмов к специфическим бактериофагам то, что необходимо совместное культивирование микроорганизма с бактериофагом в питательной среде - микроорганизмы + бактериофаг + питательная среда (плотная или жидкая), инкубирование при температуре 37°С.
Сравнение двух методик определения чувствительности бактерий к специфическим бактериофагам (на плотной и в жидкой питательных средах) показало значительное расхождение результатов. Этот факт свидетельствует о несовершенстве существующих методик определения чувствительности микроорганизмов к бактериофагам. Указанные методы определения устойчивости к бактериофагам, применяемые в настоящее время бактериологическими лабораториями в практическом здравоохранении, не позволяют объективно оценить литические свойства бактериофагов, так как результаты оцениваются очень субъективно - в «крестах». Кроме того, широкое применение фаготерапии в лечении и профилактике бактериальных инфекций требует определения чувствительности к специфическим бактериофагам. Это выдвигает приоритетную задачу разработки способа, позволяющего количественно определять и оценивать чувствительность микроорганизмов к бактериофагам.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение надежности способа, достижение достоверности полученного результата за счет количественной оценки чувствительности микроорганизмов к фаговым препаратам, разработка четких цифровых значений для определения литической способности бактериофагов.
8
Для достижения указанного результата в заявляемом способе количественной оценки литической активности бактериофагов, включающем приготовление бактериальной суспензии суточной культуры микроорганизма в концентрации 1,5*10 КОЕ/мл, выращенной в течение 18-24 часов при температуре 37°С, соединенной с мясо-пептонным бульоном и специфическим бактериофагом, согласно изобретению, для постановки реакции применяют плоскодонные планшеты для иммуноферментного анализа и оценку литической активности бактериофага осуществляют по среднему значению многократных измерений оптической плотности с вычетом оптической плотности фона реакции взаимодействия компонентов, а именно при значении показателя не более 0,045±0,025 испытуемый микроорганизм оценивают как чувствительный к бактериофагу, при этом значения оптической плотности контроля роста микроорганизма должны превышать средний показатель оптической плотности более чем в 2 раза, при значении показателя литической активности выше указанного, микроорганизм считают устойчивым к исследуемому бактериофагу.
Решение указанной задачи в предлагаемом способе заключается в совместном культивировании испытуемых микроорганизмов и специфических бактериофагов в мясо-пептонном бульоне в лунках микропланшета в пятикратной повторности. Ставят контроли: в одну лунку вносят мясо-пептонный бульон + бактериофаг - контроль стерильности и определение оптической плотности фона; в две лунки - мясо-пептонный бульон + микроорганизмы - контроль роста исследуемого микроорганизма. Культивирование проводят при температуре 37°С в течение 10-12 часов. Далее измеряют оптическую плотность на микропроцессоре Multiscan, вычисляют показатель по формуле и сравнивают с контролем роста культуры.
8
Для приготовления рабочей суспензии исследуемого микроорганизма используют чистую суточную агаровую культуру. Микробную массу берут бактериологической петлей с плотного питательного агара и помещают в стеклянную пробирку, содержащую 4,5 мл стерильного физиологического раствора, и тщательно гомогенизируют. Плотность инокулята, измеряя на денсиляметре, точно доводят 0,5 ЕД по МакФарланду, что соответствует 1,5*10 КОЕ/мл. Исследование литической активности бактериофагов проводят в стерильных пластиковых плоскодонных планшетах для иммуноферментного анализа. На исследование одной культуры микроорганизма (включая контроли) отводится 8 лунок одного ряда (по вертикали). В лунки A, B, C D, E, вносят 150 мкл мясо-пептонного бульона, 50 мкл испытуемого специфического бактериофага и 20 мкл приготовленной суспензии микроорганизмов. Таким образом, испытуемый микроорганизм и специфический бактериофаг исследуют пятикратно. В лунку F вносят 150 мкл мясо-пептонного бульона и 50 мкл бактериофага - фон реакции взаимодействия этих компонентов и контроль стерильности, и в лунки G и H - 150 мкл мясо-пептонного бульона и 20 мкл приготовленной суспензии микроорганизмов - контроль роста испытуемого микроорганизма. Планшет заклеивают пленкой и инкубируют в термостате при 37°C в течение 10-12 часов. Измеряют оптическую плотность на фотометре микропланшетного формата Multiscan FC при длине волны 450/620 нм после удаления пленки. Показатель литической активности (ЛА) рассчитывают по формуле: вычисляют среднее значение пяти показателей оптической плотности (ОП средняя) - в лунках A, B, C, D, E и вычитают оптическую плотность фона среды (ОП фона) - лунки F.
ЛА = ОП средняя - ОП фона
Испытуемый микроорганизм оценивают как чувствительный к бактериофагу при значении показателя ЛА не более 0,045±0,025, и значения ОП контроля роста микроорганизма (лунки G, H) должны превышать показатель ОП средняя более чем в 2 раза, при этом бактериофаг оценивается как обладающий высокой литической активностью. При значении показателя ЛА выше указанного - микроорганизм считают устойчивым к исследуемому бактериофагу, а его литическую активность - низкой.
Примеры конкретного выполнения
Пример 1. Определение литической активности стафилококкового бактериофага к микроорганизмам Staphylococcus aureus: 2891, 2879, 2887, 2917, 2904, 2902, 2898, 2838, 2841, 2929, 2880, 2897.
Расходные материалы: мясо-пептонный бульон, испытуемый бактериофаг, стерильный 96-луночный микропланшет для иммунологических реакций, автоматический пипеточный дозатор со стерильными наконечниками, физиологический раствор.
8
Готовят бактериальную суспензию испытуемых штаммов микроорганизмов, физиологическим раствором доводят ее концентрацию до 0,5 ЕД по МакФарланду, что соответствует 1,5*10 КОЕ/мл. С учетом количества исследуемых микроорганизмов во все лунки вносят 150 мкл мясо-пептонного бульона (можно использовать автоматический дозатор для разлива жидкостей), затем в лунки A, B, C, D, E, F, вносят 50 мкл испытуемого специфического бактериофага. Далее закапывают 20 мкл приготовленной суспензии микроорганизмов штамма 2891 в лунки A, B, C, D, E и G, H - первого столбца; 20 мкл приготовленной суспензии микроорганизмов штамма 2879 в лунки A, B, C, D, E и G, H - второго столбца и т.д. Лунки ряда F - контроль фона мясо-пептонного агара с бактериофагом, лунки G, H каждого столбца служат контролем роста испытуемого микроорганизма. Планшет заклеивают пленкой и инкубируют в термостате при температуре 37°C в течение 10-12 часов. Измеряют оптическую плотность на фотометре микропланшетного формата Multiscan FC при длине волны 450/620 нм после снятия пленки. Результаты исследования литической активности стафилококкового бактериофага в отношении испытуемых микроорганизмов Staphylococcus aureus представлены в таблице 1.
Показатель литической активности (ЛА) рассчитывают по формуле: вычисляют среднее значение пяти показателей оптической плотности (ОП средняя) - в лунках A, B, C, D, E и вычитают оптическую плотность фона среды (ОП фона) - лунки F.
ЛА = ОП средняя - ОП фона
Испытуемый микроорганизм оценивают как чувствительный к бактериофагу при значении показателя ЛА не более 0,045±0,025, и значения ОП контроля роста микроорганизма (лунки G, H) должны превышать показатель ОП средняя более чем в 2 раза, при этом бактериофаг оценивают как обладающий высокой литической активностью. При значении показателя ЛА выше указанного (>0,07) - микроорганизм считают устойчивым к исследуемому бактериофагу, а его литическую активность - низкой.
Таким образом, микроорганизмы Staphylococcus aureus: 2891, 2879, 2887, 2902, 2898, 2838, 2841, 2929, 2880 - чувствительные к стафилококковому бактериофагу, а микроорганизмы 2917, 2904, 2897 - устойчивые к данному фагу и не могут быть рекомендованы для фаготерапии.
Для подтверждения значимости оценки литической активности бактериофага по оптической плотности проведено экспериментальное исследование - из каждой опытной лунки микропланшета сделан высев на мясо-пептонный агар в чашки Петри. После инкубации при температуре 37°C в течение 10-12 часов подсчитано количество выросших колоний. Результаты, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что штаммы, указанные как чувствительные к бактериофагу, высевались в единичных количествах, в то время как штаммы, устойчивые к действию бактериофага, давали массивный рост.
Пример 2. Определение литической активности коли-протейного бактериофага к микроорганизмам Escherichia coli: 2841, 2056, 2907, 2910, 2785, 2902, 2785, 2784, 2923, 2908, 2920, 2098.
Расходные материалы и порядок постановки реакции, аналогичный примеру 1.
Результаты исследования литической активности коли-протейного бактериофага в отношении испытуемых микроорганизмов Escherichia coli представлены в таблице 2.
Показатель литической активности бактериофага (ЛА) рассчитывают по формуле: вычисляют среднее значение пяти показателей оптической плотности (ОП средняя) - значения оптической плотности лунках A, B, C, D, E, и вычитают оптическую плотность фона среды (ОП фона) (значение оптической плотности лунки F).
ЛА = ОП средняя - ОП фона
Испытуемый микроорганизм оценивают как чувствительный к бактериофагу при значении показателя ЛА не более 0,045±0,025, и значения ОП контроля роста микроорганизма (лунки G, H) должны превышать показатель ОП средняя более чем в 2 раза, при этом бактериофаг оценивают как обладающий высокой литической активностью. При значении показателя ЛА выше указанного (>0,07) - микроорганизм считают устойчивым к исследуемому бактериофагу, а его литическую активность - низкой.
Таким образом, микроорганизмы Escherichia coli 2841, 2056, 2907, 2785, 2902, 2785, 2784, 2923, 2908 - чувствительные к коли-протейному бактериофагу, а микроорганизмы Escherichia coli 2910, 2920, 2098 - устойчивые к данному фагу и не могут быть рекомендованы для фаготерапии.
Для подтверждения значимости оценки литической активности бактериофага по оптической плотности также проведено экспериментальное исследование - из каждой опытной лунки микропланшета сделан высев на мясо-пептонный агар в чашки Петри. После инкубации при температуре 37°C в течение 10-12 часов подсчитано количество выросших колоний. Результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют о том, что микроорганизмы, указанные как чувствительные к бактериофагу, высевались в единичных количествах, в то время как устойчивые к действию бактериофага давали массивный рост.
Преимущества способа
1. Способность в жидкой питательной среде (мясо-пептонный бульон) максимально достигать условий взаимодействия комплекса «микроорганизм - бактериофаг».
2. Объективность оценки результата исследования за счет измерения оптической плотности.
3. Минимальный расход питательной среды (мясо-пептонного бульона) и бактериофага.