ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus subtilis Б 93 ВИЗР ДЛЯ ЗАЩИТЫ КАРТОФЕЛЯ ОТ БОЛЕЗНЕЙ ПРИ ХРАНЕНИИ
Bacillus subtilis B 93 VIZR BACTERIAL STRAIN FOR PROTECTION OF POTATOES FROM ILLNESSES DURING STORAGE

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и представляет собой штамм, продуцирующий комплекс биологически активных веществ, обладающих фунгицидным и бактерицидным действием, может использоваться для получения биопрепарата против грибных и бактериальных болезней картофеля при хранении.
Картофель относится к числу наиболее ценных сельскохозяйственных культур. Однако его сохранение в свежем виде от урожая до урожая связано с определенными трудностями, связанными с поражением клубней фитопатогенными микроорганизмами, вызывающими значительные поражения картофеля даже при холодильном хранении.
В настоящее время ведущее место в защите плодов и овощей от фитопатогенов при выращивании и хранении занимает химический метод. Однако глобальное использование химических средств защиты приводит к ряду отрицательных последствий - нарушениям структуры биоценозов, снижению их способности к саморегуляции, накоплению пестицидов в почве, воде и продуктах питания. Кроме того, возрастает устойчивость к ним в популяциях вредителей и возбудителей болезней, снижающих эффективность их применения.
Анализ отечественной и зарубежной научно-технической литературы показал, что биологический контроль может успешно конкурировать с химическими средствами защиты, не обладая в то же время их недостатками. Микробиометод также обладает значительными преимуществами в плане экономии материалов, энергии и использования возобновляемых ресурсов. Сравнительно новое направление в развитии биоконтроля - применение биопрепаратов на основе активных штаммов антагонистов при хранении продукции растениеводства.
Известны штаммы Bacillus subtilis - продуценты ряда биологических фунгицидов - Алирина-Б, Гамаира, Бактофита, Альбита и т.д. («Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных для применения на территории РФ», 2013). Однако они обладают низкой биологической эффективностью в условиях овощехранилищ и не обеспечивают эффективной защиты растениеводческой продукции от болезней при хранении. В «Государственном каталоге пестицидов и агрохимикатов, разрешенных для применения на территории РФ» отсутствуют биопрепараты, рекомендованные для защиты картофеля от болезней в условиях хранилища.
Научно обосновано применение Bacillus subtilis штамм 413 для снижения потерь моркови от инфекционных заболеваний и улучшения показателей качества продукции при длительном холодильном хранении (Самусенко, 2001).
Наиболее близкий предлагаемому - В. subtilis штамм В-10 ВИЗР - продуцент препарата Алирин-Б для защиты сельскохозяйственных культур от грибных и бактериальных болезней («Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных для применения на территории РФ», 2013). Но этот штамм имеет более узкий спектр действия и недостаточную биологическую эффективность в отношении фитопатогенных грибов и бактерий в условиях низкой температуры при длительном хранении растениеводческой продукции. Алирин-Б рекомендован к применению на картофеле только в период вегетации против «черной ножки», ризоктониоза, фитофтороза и альтернариоза.
Задача изобретения - создание штамма, обладающего широким спектром действия и высокой антагонистической активностью в отношении возбудителей грибных и бактериальных болезней картофеля и перспективного для защиты клубней от болезней при хранении.
Задача была выполнена путем отбора штамма Bacillus subtilis И5-12/23, продуцирующего комплекс биологически активных веществ, обладающего высокой антагонистической активностью в отношении возбудителей грибных и бактериальных болезней картофеля при хранении. Штамм депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов, патогенных для растений и их вредителей ГНУ ВИЗР под № Б-93 ВИЗР. Штамм выделен из почв Индии (Дели) по признакам антагонистической активности в отношении фитопатогенных грибов и бактерий. Идентификация штамма проведена по определителю бактерий Берджи (Хоулт Д., Криг Н. и др. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. 9-е издание. Издательство «Мир». 1997).
ХАРАКТЕРНЫЕ ПРИЗНАКИ
1. Морфология: Прямые палочки с закругленными концами, часто образуют цепочки.
2. Размер: 0,8-0,9×2,5-3,5 мкм.
3. Клеточная стенка и окраска по Граму: грамположительные, клеточная стенка толстая грамположительного типа (метод анализа - окраска генциановым красителем и йодистым раствором по Граму). Капсулы не образует.
4. Спорообразование: эндоспоры овальные, с центральным положением, термоустойчивые, высокоустойчивые ко многим неблагоприятным условиям окружающей среды. В клетке образуется не более одной споры. Эндоспоры эллипсоидные, расположены центрально и не выходят из размеров спорангия. Околоспоральных включений не обнаружено. Спорообразование не подавляется на воздухе.
5. Тип деления: поперечное бинарное.
6. Простеки: отсутствуют.
7. Подвижность: подвижные.
8. Жгутикование: перитрихиальные жгутики.
9. Пигментация колоний: колонии кремовые, матовые, плоские, с неровным краем, быстро распространяющиеся по поверхности питательной среды, в дальнейшем колонии уплотняются, становятся блестящими и приобретают коричневато-бежевый оттенок.
10. Пигмент в среду не выделяется.
11. Селективных сред нет.
12. Оксидаза: положителен.
13. Каталаза: положителен.
14. Отношение к кислороду: аэроб. В анаэробном агаре не растет.
15. Хемоорганотроф, метаболизм дыхательного типа. Используемые источники углерода при аэробном росте: глюкоза, сахароза, маннит, мальтоза и лактоза. При использовании глюкозы, арабинозы, ксилозы и маннита образует кислоту и ацетоин, газа не образует. Образует гидролазы. Гидролизует крахмал и казеин. Восстанавливает нитрат до нитритов.
16. В аэробных условиях на сорбите и инозите не растет.
17. Неорганические субстраты не окисляет.
18-20. В анаэробных условиях не растет.
21. Отношение к рН: штамм растет в диапазоне рН от 4,5 до 8,5. Оптимальный рН 6,5-7,5.
23. Отношение к NaCl: культура не растет при 10% NaCl.
24. Отношение к температуре: максимальная температура роста - 45-50°С, минимальная - 2-4°С, оптимальная - 22-26°С.
25. Отношение к антибиотикам: образует полипептидные и полиеновые антибиотики.
26. Цитохромы: не определяли.
27. Менахиноны: не определяли.
28. % ГЦ: не определяли.
29. Потребность в факторах роста или специальных добавках: не требуются.
30. Дополнительные сведения: штамм-продуцент биопрепарата для защиты клубней картофеля от фитопатогенных грибов и бактерий - возбудителей болезней при длительном хранении. Способ определения активности продукта: биологический по подавлению роста тест-культур фитопатогенных грибов и бактерий.
31. Способ хранения штамма:
а) косяки со средой СПА или МПА,
б) в лиофилизированном состоянии.
32. Сроки хранения: пересевы через 6 месяцев.
33. Отношение к фагам: фаг не выделяли.
34. Генетические особенности: проведено генотипирование штамма методом ДРИМ (двойное расщепление, избирательное мечение).
Антимикробный спектр: подавляет рост фитопатогенных грибов и бактерий.
Зоны задержки роста тест-культур фитопатогенных грибов и бактерий (радиус в мм):
Alternaria brassicicola - 20.0
Colletotrichum atrawenta - 15.0
Verticillium dahliae - 24.5
Sclerotinia sclerotiorum - 22.0
Phoma exigua -20.5
Fusarium oxysporum - 20.5
Bipolaris sorokiniana - 19.0
Helmintosporium solani - 25.0
Pythium debarianum - 15.0
Ascochyta melonis - 14.0
Septoria nodorum - 20.5
Rhizoctonia solani - 25.0
Phytophthora infestans - 20.5
Clavibacter. michiganensis var. sepedonicum - 22.0
По сравнению с прототипом предложенный штамм обладает не только более широким спектром действия в отношении возбудителей грибных заболеваний, но и высокой антагонистической активностью в отношении фитопатогенных бактерий (табл.1).
Методы использования штамма описаны в примерах, а результаты представлены в таблицах.
Пример 1. Культивирование штамма В. subtilis Б 93 ВИЗР  проводили в глубинных условиях в колбах Эрленмейера в течение 72 часов на круговой качалке при 28°С до завершения фазы споруляции.
Состав жидкой питательной среды (г/л) (практикум по микробиологии под ред. Егорова Н.С., 1976):
Панкреатический гидролизат кильки - 10,05
Натрия хлорид - 4,95
Глюкоза - 10,0
Вода - до 1 литра
рН 7,1±0,2
0,5/30 мин
Определение антагонистической активности 3-суточной культуральной жидкости, полученной при глубинном выращивании штамма, проводили стандартным микробиологическим методом лунок (Практикум по микробиологии под ред. Н.С. Егорова, 1976; Руководство к практическим занятиям по микробиологии под ред. Н.С. Егорова, 1995). Диаметр зоны задержки роста измеряли через 3-5 суток в зависимости от скорости роста тест-культуры. Эффективность в отношении фитопатогенных грибов и спектр действия по сравнению с прототипом представлены в табл.1.
Таблица 1
Сравнительная характеристика спектра антагонистической активности штаммов В. subtilis В-10 ВИЗР и В. subtilis Б 93 ВИЗР (культуральная жидкость)
№
Виды фитопатогенных микроорганизмов
Диаметр зоны лизиса тест-культуры, мм
В. subtilis Б 93 ВИЗР
В. subtilis В-10 (прототип)
1
Clavibacter michiganense subsp. michiganense
24
0
2
Clavibacter.michiganensis var. sepedonicum
22
0
3
Xanthomonas campestris pv. vesicatoria
18
0
4
Pseudomonas corrugata
24
0
5
P. syringae pv. tomato
30
0
6
Erwinia carotovora subsp. carotovora
24
0
7
Alternaria solani
20
18
8
Alternaria brassicicola
22
10-15
9
Fusarium graminearum
34
25-30
10
Fusarium oxysporum
20
20-30
11
Ascochyta fabae
18
18
12
Colletotrichum lagenarium
24
20
13
Rhizoctonia solani
24
18
14
Bipolaris sorokiniana
24
5-7
15
Sclerotinia libertiana
24
5-7
16
Septoria nodorum
15-20
18-20
17
Phytophthora infestans
10-20
20-21
18
Phoma exigua
14-21
20-22
19
Helmintosporium solani
15-20
25-28
Как видно из таблицы 1, штамм В. subtilis Б 39 ВИЗР, в отличие от прототипа, обладает не только антигрибной, но и высокой антибактериальной активностью. Существенно выше у предлагаемого штамма антагонистическая активность в отношении фитопатогенных грибов Colletotrichum lagenarium, Rhizoctonia solani, Bipolaris sorokiniana и Sclerotinia libertiana.
Пример 2. Культуральную жидкость штамма В. subtilis Б 93 ВИЗР получали так же, как в примере 1. Изучение биологической эффективности в модельных опытах и в картофелехранилище осуществляли в соответствии со стандартными методиками, изложенными в следующих пособиях: «Методика исследований по культуре картофеля», М., 1967; «Методика полевого опыта», М., 1985; «Методические указания по государственным испытаниям фунгицидов, антибиотиков и протравителей семян сельскохозяйственных культур», М., 1965; «Методика исследований по защите картофеля от болезней, вредителей, сорняков и иммунитету», М., 1995; «Методические указания по регистрационным испытаниям фунгицидов в сельском хозяйстве», Санкт-Петербург, 2009.
Лабораторные опыты были заложены с учетом динамики развития заболеваний в насыпи клубней в картофелехранилище в основной период хранения. Для проведения опытов были отобраны по 10 клубней на повторность с признаками болезней. Клубни были обработаны соответственно схеме опыта и заложены во влажные камеры.
8
9
В лабораторных опытах для определения влияния штамма на развитие спороношения серебристой парши клубни обрабатывали разведениями культуральной жидкости с титром жизнеспособных клеток 10 и 10 КОЕ/мл. В стандарте клубни обрабатывали фунгицидом Максим, КС (0,2 л/т), в контроле - водой. После обработки клубни были заложены во влажные камеры. По истечении 2-7 дней были проведены учеты интенсивности спороношения гриба, вызывающего серебристую паршу картофеля (Helmintosporium solani Dur.ex.Mont).
Экспериментальные данные статистически обработаны посредством дисперсионного анализа.
Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования отобранного штамма для снижения пораженности картофеля болезнями при хранении (таблица 2).
В борьбе с паршой серебристой (табл.2) штамм показал более высокую биологическую активность в сравнении с прототипом и стандартом. При проведении 1-го учета ни в одном из вариантов опыта спороношения Helmintosporium solani Dur.ex.Mont отмечено не было. Результаты второго учета показали, что развитие болезни при использовании штамма В. subtilis Б 93 ВИЗР  при обеих концентрациях рабочего раствора было в 2 раза ниже по сравнению со штаммом В. subtilis В-10 (прототип) и в 4,5 раз - по сравнению с контролем. Биологическая эффективность в этих вариантах опыта достигла 77.8%, показатель биологической эффективности превышал эффективность химического стандарта.
Таблица 2
Биологическая эффективность штамма B. subtilis Б 93 ВИЗР  в отношении спороношения серебристой парши на клубнях картофеля
Варианты опыта, титр клеток в разведениях культуральной жидкости штамма, КОЕ/мл
Второй учет (28.12.2012)
Биологическая эффективность, %
количество клубней со спороношением, Р,%
развитие болезни, R,%
Р, %
R, %
Контроль, вода
90.0
36.0
0
0
В. subtilis В-10, 10<sup>9</sup> (прототип)
70.0
16.0
22.2
55.6
В. subtilis Б 93 ВИЗР 10<sup>9</sup>
40.0
8.0
55.6
77.8
B. subtilis Б 93 ВИЗР, 10<sup>8</sup>
40.0
8.0
55.6
77.8
Максим, КС, стандарт, 0,2 л/т
60.0
12.0
33.3
67.7
НСР<sub>0,5</sub>
8.0
2.2
Пример 3. Культуральную жидкость штамма В. subtilis Б 93 ВИЗР получали так же, как в примере 1 и 2. Закладка образцов клубней картофеля на длительное хранение с целью оценки биологической эффективности штамма в отношении комплекса болезней была проведена в картофелехранилище ГНУ ВНИИКХ (Московская область, Люберецкий район, п. Красково, микрорайон Коренево).
8
9
В опыте использовали клубни сорта Сантэ (среднеранний, универсального использования). Урожайность высокая. Сорт устойчив к раку картофеля (возбудитель Synchytrium endobioticum), золотистой картофельной цистообразующей нематоде (Globodera rostochiensis), вирусным болезням, восприимчив по ботве к фитофторозу. Среднеустойчив к обыкновенной парше, восприимчив к ризоктониозу и фомозу. Набор материала для проведения опытов был произведен через 3 дня после уборки урожая. Перед обработкой и закладкой на хранение проводили клубневой анализ с целью определения фитопатологического состояния картофеля. Перед закладкой на хранение клубни обрабатывали разведениями культуральной жидкости штамма с титром жизнеспособных клеток 10 и 10 КОЕ/мл. В стандарте клубни обрабатывали фунгицидом Максим, КС (0,2 л/т), в контроле - водой. Расход рабочей жидкости - 3 л/т. Масса образца клубней картофеля составляла 5 кг. Повторность опыта - 10-кратная. Общая масса клубней каждого варианта - 50 кг. Место размещения образцов: в насыпи картофеля на глубине 20-30 от поверхности.
Анализ результатов опыта, проведенного в условиях картофелехранилища ГНУ ВНИИКХ, подтвердили данные лабораторных опытов об эффективности отобранного штамма для защиты клубней картофеля. По окончании периода хранения в марте 2013 года был проведен клубневой анализ и определены пораженность болезнями и потери массы картофеля при хранении (таблицы 3-5).
Таблица 3
Влияние штаммов бацилл на поражение клубней картофеля болезнями в период хранения (06.09.2012-26.03.2013)
Варианты опыта, титр клеток в разведениях культуральной жидкости штамма, КОЕ/мл
Количество клубней, %
здоровых
пораженных возбудителями
всего
в том числе
парши обыкновенной (S. scabies)
кольцевой гнили (C. michiganensis var. sepedonicum)
фитофтороза (P. infestans)
сухой гнили (Phomaexigua)
Контроль, вода
13.3
86.7
52.3
7.4
11.8
15.2
В. subtilis В-10 ВИЗР, 10<sup>9</sup> (прототип)
30.4
69.6
47.3
4.8
8.5
9.0
В. subtilis Б 93 ВИЗР, 10<sup>9</sup>
32.4
67.6
53.8
2.6
8.2
3.0
B.subtilis Б 93 ВИЗР, 10<sup>8</sup>
35.5
64.5
55.7
2.9
4.4
1.5
Максим, КС, стандарт, 0,2 л/т
30.0
70.0
54.1
3.5
8.3
4.1
НСР<sub>0,5</sub>
2.3
5.4
6.6
0.4
1.4
0.2
Отмечено существенное снижение развития болезней на клубнях семенного картофеля после обработки штаммом В. subtilis Б 93 ВИЗР и стандартом Максим, КС по сравнению с контролем. Количество здоровых клубней после применения штамма достигало 32.4-35.5%, в то время как в прототипе этот показатель составлял 30.4%, в контроле не превышал 13.3%. Таким образом, по сравнению с контролем выход здоровой продукции увеличился в 2.7 раза. Обработка штаммом эффективно снижала пораженность клубней всеми проявившимися заболеваниями, за исключением парши обыкновенной. Наибольший эффект штамм проявил в отношении возбудителей кольцевой и сухой гнилей картофеля. В варианте с применением штамма В. subtilis Б 93 ВИЗР распространенность кольцевой гнили составила 2.6-2.9%, сухой гнили - 1.5-3.0%, что значительно ниже этих показателей у штамма В. subtilis В-10 (прототип) и стандарта фунгицида Максим, КС (4.8 и 3.5%; 9.0 и 4.1% соответственно).
Таким образом, анализ результатов опыта показал, что обработка клубней штаммом В. subtilis  Б 93 ВИЗР перед закладкой на хранение в картофелехранилище уменьшало количество больных грибными и бактериальными болезнями клубней и повышало выход здорового картофеля в 2.6-2.7 раза. Биологическая эффективность штамма В. subtilis Б 93 ВИЗР в отношении кольцевой гнили, сухой гнили и фитофтороза достигала 80-90% и была существенно выше эффективности прототипа (28.0-40.8%) и стандартного фунгицида Максим, КС (29.7-73.0%) (табл.4).
Таблица 4
Биологическая эффективность штамма В. subtilis Б 93 ВИЗР в отношении возбудителей болезней клубней картофеля в период хранения (06.09.2012-26.03.2013)
Варианты опыта, титр клеток в разведениях культуральной жидкости штамма, КОЕ/мл
Биологическая эффективность (%) в отношении возбудителей
кольцевой гнили (Clavibacter michiganensis var. sepedonicum)
фитофтороза (Phytophthora infestans)
сухой гнили (Phoma exigua)
Контроль, вода
-
-
-
В. subtilis В-10 ВИЗР, 10<sup>9</sup> (прототип)
35.1
28.0
40.8
В. subtilis Б 93 ВИЗР, 10<sup>9</sup>
64.9
30.5
80.3
В. subtilis Б 93 ВИЗР, 10<sup>8</sup>
60.8
62.7
90.1
Максим, КС, стандарт, 0,2 л/т
52.7
29.7
73.0
Таблица 5
Влияние штаммов бацилл на сохранность клубней картофеля в период хранения (06.09.2012-26.03.2013)
Варианты опыта, титр клеток в разведениях культуральной жидкости, КОЕ/мл
Масса клубней
Хозяйственная эффективность %
здоровых
потери массы, %
кг
%
всего
в том числе
технические отходы
абсолютная гниль
естественная убыль
Контроль, вода
3.66
73.2
26.8
8.0
8.4
10.4
100
В. subtilis В-10, 10<sup>9</sup> (прототип)
3.04
60.7
39.3
6.2
18.3
14.8
83.1
В. subtilis Б 93 ВИЗР, 10<sup>9</sup>
3.92
78.5
21.5
7,3
4.2
10.0
107.1
B. subtilis Б 93 ВИЗР, 108
4.06
81.3
18.7
4.6
7.7
6.4
110.9
Максим, КС, стандарт, 0,2 л/т
3.69
73.9
26.1
5.3
7.2
13.6
100
НСР<sub>0,5</sub>
0.02
1.3
1.1
2.1
0.9
Сохранность клубней после их обработки штаммом В. subtilis Б 93 ВИЗР была существенно выше по сравнению с прототипом и стандартом - фунгицидом Максим, КС (78.5-81.3%, 60.7% и 73.9% соответственно). Хозяйственная эффективность в вариантах с применением штамма В. subtilis Б 93 ВИЗР в обеих концентрациях культуральной жидкости достигала 107.1-110.9%, что существенно превышало этот показатель у прототипа. Эти варианты опыта характеризовались самыми низкими потерями массы клубней в период хранения (18.7-21.5%). В варианте с прототипом потери массы клубней достигли 39.3%. Естественная убыль массы клубней была в 1.5-2.3 раза ниже, чем у прототипа, в 1.4-2 раза ниже, чем в стандарте, и 1.5 раза ниже, чем в контроле (табл.5).
Таким образом, проведенные исследования показали высокую эффективность отобранного штамма В. subtilis Б 93 ВИЗР и перспективность его использования в качестве продуцента биопрепарата для защиты клубней картофеля от комплекса болезней при хранении.
Литература
1. Н.В. Самусенко. Научное обоснование применения бактерий-антагонистов при длительном холодильном хранении корнеплодов моркови. Дис. к.т.н., Санкт-Петербург, 2001.
2. Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных для применения на территории РФ, 2013. http://www.mcx.ru.
3. Методика исследований по культуре картофеля. М., ВАСХНИП, НИИКХ, 1967, 189 с.
4. Б.А. Доспехов. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). - 5-е изд., доп. и перераб.: Агропромиздат, 1985. - 351 с.
5. Методические указания по государственным испытаниям фунгицидов, антибиотиков и протравителей семян сельскохозяйственных культур. М, 1985. 130 с.
6. Методика исследований по защите картофеля от болезней, вредителей, сорняков и иммунитету. М., ВНИИКХ, 1995. - 105 с.
7. Методические указания по регистрационным испытаниям фунгицидов в сельском хозяйстве. - Санкт-Петербург. - 2009. - 377 с.
8. Практикум по микробиологии / Под ред. Егорова Н.С. - М.: МГУ, 1976. - 308 с.
9. М.Н. Пименова, Н.Н. Гречушкина, Л.Г. Азова, А.И. Нетрусов, Е.В. Семенова, Н.Н. Колотилова, Л.М. Захарчук, В.В. Зинченко, С.И. Мыльникова, М.В. Нефедова, И.В. Ботвинко. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Учеб. пособие / Под ред. Н.С. Егорова. - 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Изд-во МГУ, 1995. - 224 с.
10. Хоулт Д., Криг Н. и др. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. 9-е издание. Издательство «Мир». 1997.