Способ профилактики нарушений функций почек ингибитором аргиназы II в эксперименте
METHOD FOR PREVENTING RENAL DYSFUNCTION WITH AN ARGINASE II INHIBITOR IN EXPERIMENT

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии и урологии.
Острое почечное повреждение остается серьезной проблемой здравоохранения, особенно у госпитализированных и критических пациентов, и является основным фактором риска развития хронического заболевания почек [Belayev L.Y., Palevsky P.M. The link between acute kidney injury and chronic kidney disease. // Curr Opin Nephrol Hypertens – 2014. – 23. – 149-154; Coca S.G., Singanamala S., Parikh C.R. Chronic kidney disease after acute kidney injury: a systematic review and meta-analysis. // Kidney Int – 2012. – 81. – 442-448]. Несмотря на поддерживающий уход с использованием заместительной почечной терапии, острая почечная недостаточность по-прежнему связана с увеличением краткосрочной и долгосрочной смертности не только из-за почечной недостаточности, но и из-за сопутствующей дисфункции других органов и систем [Kao C.C., Yang W.S., Fang J.T., et al. Remote organ failure in acute kidney injury. // Journal of the Formosan Medical Association. – 2018]. Ведущей причиной острого почечного повреждения является недостаточная перфузия тканей почек, усугубляющаяся дальнейшей реперфузией [Martin, J.L., Gruszczyk, A.V., Beach, T.E. et al. Mitochondrial mechanisms and therapeutics in ischaemia reperfusion injury // Pediatr Nephrol – 2018. https://doi.org/10.1007/s00467-018-3984-5].
Известен способ профилактики ишемически-реперфузионной травмы почек в эксперименте (Arginase-2 mediates renal ischemia-reperfusion injury / Raup-Konsavage W.M., Gao T., Cooper T.K., et al. // American Journal of Physiology-Renal Physiology. – 2017. – 313:2. – F522-F534), включающий моделирование патологии путем наложения атравматичных зажимов на почечные ножки лабораторных мышей на 28 минут. Для профилактики ишемически-реперфузионной травмы использовали однократное внутрибрюшинное введение неселективного ингибитора аргиназ S-(2-бороноэтил)-L-цистеина за 18 часов до ишемического стимула. Способ обеспечивает уменьшение выраженности гистопатологических изменений, процессов оксидативного стресса и апоптоза, синтез провоспалительных цитокинов; увеличивало образование оксида азота и фосфорилирование eNOS, экспрессию коактиватора 1 альфа γ-рецептора-активатора пролиферации пероксисом и способствовало сохранению митохондриальной ультраструктуры.
Основным недостатком способа является то, что для профилактики в качестве фармакологического агнета используется неселективный ингибитор фермента аргиназы, который снижает активность как аргиназы II, так и аргиназы I. Вследствие подавления активности аргиназы I у животных могут наблюдаться такие побочные эффекты, как гипераммониемия, проявляющаяся в недостаточности цикла ферментов мочевины и приводящая к отравлению организма аммиаком, что может усугублять симптомы накопления других продуктов азотистого обмена при остром почечном повреждении – креатинина и мочевины. С другой стороны, не производилась оценка функционального состояния почек, как основного прогностического критерия, применяемого в клинической практике.
Наиболее близким к заявленному является способ профилактики ишемически-реперфузионной травмы почек в эксперименте (Lempiäinen J, Finckenberg P, Levijoki J, Mervaala E. AMPK activator AICAR ameliorates ischaemia reperfusion injury in the rat kidney. British Journal of Pharmacology. 2012;166(6):1905-1915. doi:10.1111/j.1476-5381.2012.01895.x.), включающий воспроизведение модели патологии и введение лабораторному животному 5-амино-4-имидазолкарбоксамид рибозид-1-β-D-рибофуранозида в дозе 500 мг/кг однократно, причем, 5-амино-4-имидазолкарбоксамид рибозид-1-β-D-рибофуранозида вводят внутривенно за 30 минут до моделирования ишемии и выраженность нефропротективных свойств производят однократно через 24 часа реперфузии без расчета скорости клубочковой фильтрации и фракционной экскреции натрия.
Основным недостатком способа является то, что профилактика нарушений функций почек оценивается только с помощью измерения сывороточных концентраций креатинина и мочевины без расчета скорости клубочковой фильтрации и фракционной экскреции натрия, а также отсутствия данных о динамике на третьи сутки эксперимента, когда патологические изменения достигают своего максимума, что не позволяет полностью говорить об эффективной профилактике нарушений функций почек в эксперименте.
С другой стороны, 5-амино-4-имидазолкарбоксамид рибозид-1-β-D-рибофуранозид в клинических исследованиях III фазы не подвердил свою эффективность при ишемических и реперфузионных повреждениях сердца, имеющих сходный патогенез с изучаемой моделью [Pokrywka A, Cholbinski P, Kaliszewski P, Kowalczyk K, Konczak D, Zembron-Lacny A. Metabolic modulators of the exercise response: Doping control analysis of an agonist of the peroxisome proliferator-activated receptor δ (GW16) and 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide (AICAR). J Physiol Pharmacol. 2014;65(4):469–76.]. Кроме того, в качестве средства для наркоза использовался изофлуран, который по данным литературы обладает нефропротективной активностью, что могло исказить полученные результаты исследования [Carraretto, A.R. et al. Does propofol and isoflurane protect the kidney against ischemia/reperfusion injury during transient hyperglycemia?. Acta Cir. Bras. [online]. 2013, vol.28, n.3 [cited  2018-05-27], pp.161-166.].
Задачей предлагаемого изобретения является создание более эффективного способа профилактики нарушений функций почек с использованием ингибитора аргиназы II KUD975.
Поставленная задача достигается тем, что предложен способ профилактики нарушений функций почек с использованием ингибитора аргиназы II KUD975, включающий профилактику лекарственным средством путем однократного введения его раствора лабораторным животным с последующим моделирование патологии путем наложения атравматичных зажимов на почечные ножки на 40 минут с последующей реперфузией кровотока в почках, причем в качестве лабораторных животных используют белых крыс линии Wistar, в качестве лекарственного средства используют ингибитор аргиназы II KUD975, вводимый в дозе 3 мг/кг внутрижелудочно через зонд за 120 минут до моделирования ишемии, а оценку выраженности изменения функциональных показателей производят через 24 и 72 часа реперфузии.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является эффективный способ профилактики нарушений функций почек с использованием ингибитора аргиназы II KUD975 в эксперименте, подтверждаемого результатами биохимических исследований и расчета скорости клубочковой фильтрации и фракционной экскреции натрия. Исследуемое нами вещество KUD975 представляет собой синтезированное соединение фенольной природы - метиловый эфир (2-((1-гидроксинафталин-2-ил)тио)ацетил)-D-пролина.
В патогенезе ишемически-реперфузионных повреждений почек важную роль играет фермент, регулирующий обмен L-аргинина и оксида азота – аргиназа, существующая в двух изоформах: аргиназа I и аргиназа II [Arginase-2 mediates renal ischemia-reperfusion injury / Raup-Konsavage W.M., Gao T., Cooper T.K., et al. // American Journal of Physiology-Renal Physiology. – 2017. – 313:2. – F522-F534].
Основным преимуществом предлагаемого способа является то, что введение ингибитора аргиназы II KUD975 в дозе 3 мг/кг однократно за 120 минут до индукции ишемии приводит к выраженной профилактике нарушений функций почек в эксперименте, что подтверждается результатами биохимических исследований и расчета скорости клубочковой фильтрации и фракционной экскреции натрия.
СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ
Эксперименты проведены на 80 крысах-самцах линии Wistar массой 180-220 г. Для исследования взяты крысы без внешних признаков заболевания, прошедшие карантинный режим.
Выбор крыс-самцов в эксперименте связан с наличием циклических гормональных изменений у самок и ренопротективных эффектов у эстрогенов, что может повлиять на чистоту эксперимента.
Каждая группа включала 10 крыс. Первая группа – группа ложнооперированных животных (24 часа), вторая группа – группа ложнооперированных животных (72 часа), третья группа – с моделированием ишемически-реперфузионных повреждений почек (контроль, 24 часа), четвертая группа – с моделированием ишемически-реперфузионных повреждений почек (контроль, 72 часа), пятая группа – с коррекцией патологии ингибитором аргиназы II KUD975 (24 часа реперфузии), шестая группа – с коррекцией патологии ингибитором аргиназы II KUD975 (72 часа реперфузии), седьмая группа – с коррекцией патологии L-норвалином (препарат сравнения, 24 часа реперфузии), восьмая группа – с коррекцией патологии L-норвалином (препарат сравнения, 72 часа реперфузии).
Моделирование ишемически-реперфузионного повреждения почек производили следующим образом: под общей анестезией (хлоралгидрат, 300 мг/кг внутрибрюшинно) производили срединную лапаротомию, выделяли почечные ножки и последовательно накладывали атравматичные сосудистые зажимы на обе ножки с ишемическим периодом 40 минут под контролем микроциркуляции. Далее производили снятие зажимов, промывали брюшную полость 0,9% раствором натрия хлорида и послойно ушивали рану. Для получения образцов мочи, животных помещали в метаболические клетки со свободным доступом к воде на 12 или 24 часа. Далее измерялся диурез и отбирались образцы для дальнейшего исследования. Через 24 или 72 часа реперфузии лабораторное животное наркотизировали путем внутрибрюшинной инъекции хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг массы тела животного, производили релапаротомию и отбирали кровь из правого желудочка для биохимических исследований.
В пятой и шестой экспериментальных группах животным за 120 мин до наложения сосудистых зажимов вводили ингибитор аргиназы II KUD975в дозе 3 мг/кг однократно внутрижелудочно через зонд. В седьмой и восьмой экспериментальных группах животным за 30 мин до наложения сосудистых зажимов вводили L-норвалин в дозе 100 мг/кг однократно внутрибрюшинно.
О выраженности ренопротективных свойств судили по результатам биохимических исследований и расчета скорости клубочковой фильтрации и фракционной экскреции натрия через 24 и 72 часа реперфузионного периода.
Уровень сывороточного креатинина и мочевины определяли фотоколориметрическим методом с помощью стандартных наборов реактивов. Концентрация ионов калия и натрия в сыворотке крови определялась по стандартной методике, прилагаемой к наборам на автоматическом анализаторе.
Клиренс эндогенного креатинина (скорость клубочковой фильтрации (СКФ) рассчитывался следующим образом:
Фракционная экскреция натрия (FEna) рассчитывалась по следующей формуле:
Достоверность изменений абсолютных параметров определяли разностным методом вариационной статистики с нахождением средних значений сдвигов, средней арифметической и вероятности возможной ошибки (р) по таблицам Стьюдента. Различия оценивали как достоверные при p<0,05. Для расчётов использовали программу статистического анализа Microsoft Excel.
ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ
Через 24 часа реперфузии в группе с моделированием патологии уровень креатинина сыворотки крови не отличался достоверно от группы ложнооперированных животных и составлял 55,7±0,8 мкмоль/л и 57,9±2,38 мкмоль/л соответвенно. Однако за счет снижения диуреза отмечалось падение скорости клубочковой фильтрации с 0,51±0,03 мл/мин в группе ложнооперированных животных до 0,17±0,02 мл/мин в группе ишемии-реперфузии. Через 72 часа отмечалось прогрессирующее снижение фильтрационной способности почек, выражающееся в нарастании уровня сывороточного креатинина с 56±1,52 мкмоль/л до 120±3,45 мкмоль/л и снижении скорости клубочковой фильтрации в 8,2 раза с 0,49±0,03 мл/мин в группе ложнооперированных животных до 0,06±0,01 мл/мин в группе с моделированием патологии.
Исследование сывороточной концентрации мочевины продемонстрировало, что моделирование 40-минутной билатеральной модели ишемии-реперфузии почек приводило к росту данного показателя через 24 часа реперфузии с 5,35±0,21 ммоль/л до 9,7±0,68 ммоль/л, которое несколько нивелировалось через 72 часа, достигая уровня 8,33±0,23 ммоль/л.
В группе ложнооперированных животных уровень фракционной экскреции натрия через 24 и 72 часа составлял 0,38±0,02% и 0,5±0,02%. Моделирование острого почечного повреждения ишемически-реперфузионного генеза приводило к росту FeNa до 2,24±0,12% до 7,4±0,78% через 24 и 72 часа реперфузии соответственно.
Профилактика нарушений функций почек ингибитором аргиназы II KUD975 приводила к снижению сывороточной концентрации креатинина через 72 часа реперфузии до 73,7±2,22 мкмоль/л и росту скорости клубочковой фильтрации до 0,31±0,02 мл/мин и 0,26±0,02 мл/мин на первые и третьи сутки эксперимента соответственно, отличаясь достоверно от показателей группы контроля и группы препарата сравнения (p<0,05) Уровень сывороточной концентрации мочевины также снижался до 6,47±0,37 ммоль/л и 6,9±0,23 ммоль/л через 24 и 72 часа реперфузии соответственно. Фракционная экскреции натрия на фоне профилактического применения KUD975 в дозе 3 мг/кг, отражающая канальцевую дисфункцию также снижалась, составляя 1,14±0,11% и 1,8±0,09% в различные временные точки эксперимента, превосходя по эффективности препарат сравнения.
Профилактика нарушений функций почек L-норвалином приводила к снижению сывороточной концентрации креатинина через 72 часа реперфузии до 93,4±3,39 мкмоль/л и росту скорости клубочковой фильтрации до 0,21±0,02 мл/мин и 0,15±0,01 мл/мин на первые и третьи сутки эксперимента соответственно, отличаясь достоверно от показателей группы контроля лишь на третьи сутки эксперимента (p<0,05) Уровень сывороточной концентрации мочевины снижался до 7,8±0,29 ммоль/л и 7,8±0,48 ммоль/л через 24 и 72 часа реперфузии соответственно. Фракционная экскреции натрия на фоне профилактического применения L-норвалина составила 1,42±0,13% и 2,76±0,21% в различные временные точки эксперимента. Динамика биохимических маркеров острого почечного повреждения, скорости клубочковой фильтрации и фракционной экскреции натрия представлены в таблицах 1 и 2.
Таблица 1
Динамика биохимических маркеров острого почечного повреждения в экспериментальных группах (М±m; n=10)
x
y
Примечание:  – р<0,05 в сравнении с группой ложнооперированных животных;  – р<0,05 в сравнении с группой ишемии-реперфузии.
Таблица 2
Динамика скорости клубочковой фильтрации и фракционной экскреции натрия в экспериментальных группах (М±m; n=10)
x
y
Примечание:  – р<0,05 в сравнении с группой ложнооперированных животных;  – р<0,05 в сравнении с группой ишемии-реперфузии.
Таким образом, в предлагаемом способе внутрижелудочное введение ингибитора аргиназы II KUD975 в дозе 3 мг/кг однократно за 120 минут до индукции ишемии приводит к более выраженной профилактике нарушений функций почек, чем введение L-норвалина в дозе 100 мг/кг, что подтверждается результатами биохимических исследований и расчета скорости клубочковой фильтрации и фракционной экскреции натрия через 24 и 72 часа реперфузионного периода.