СПОСОБ ПЕРСОНИФИЦИРОВАННОГО ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРАПИИ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА С ПЕГИЛИРОВАННЫМ ИНТЕРФЕРОНОМ-АЛЬФА И РИБАВИРИНОМ
METHOD FOR INDIVIDUAL PREDICTION OF THERAPEUTIC EFFICACY OF CHRONIC HEPATITIS C WITH PEGYLATED INTERFERON ALPHA AND RIBAVIRIN

Изобретение относится к области медицинской диагностики и может быть использовано для индивидуальной прогностической оценки эффективности терапии хронического гепатита C пегилированным интерфероном-альфа и рибавирином, что позволяет более адекватно выбрать пациентов для стандартной двойной противовирусной терапии хронического гепатита C на фоне новых схем лечения.
Вирусом гепатита C (ВГС) инфицировано около 3% населения Российской Федерации [1]. Острый гепатит C в большинстве случаев (в 70-85%) переходит в хроническую инфекцию, которая часто течет бессимптомно первые 10-15 лет. Как установлено, в США продолжительность жизни больных хроническим гепатитом C сокращена на 8-12 лет, если у них не было эффективного курса противовирусной терапии [2]. В нашей стране почти у 40% пациентов с хроническим гепатитом C через 20-25 лет после инфицирования выявляется цирроз печени [3]. Вероятность завершить терапию эффективно, т.е. достичь устойчивого вирусологического ответа (УВО), который включает в себя и нормализацию биохимических показателей печени, значительно выше, если терапия начата в острой фазе инфекции, но и в первые 10 лет течения хронического гепатита она больше, чем в более поздние сроки. Учитывая, что пациенты с впервые диагностированным гепатитом C часто имеют хроническую форму инфекции, то врачу приходится решать сложные задачи: определить степень поражения печени, выбрать схему терапии (традиционную или новую с ингибиторами) и установить вероятность достижения УВО. В настоящее время возможна двойная и тройная терапия больных хроническим гепатитом C, в первом случае используются пегилированный интерферон-альфа и рибавирин, во втором к этим препаратам добавляется телапревир или боцепревир. Двойная терапия дешевле и в ряде случаев легче переносится. Поэтому важно еще до начала терапии выявлять пациентов, которые достигнут УВО на двойной терапии, и тех больных, кому она не поможет и которые нуждаются в новой терапии.
Уровень техники
В конце 90-х годов прошлого века и начале XXI века были созданы основные предпосылки для данного изобретения. Так, международный проект «Геном человека» выявил важную роль однонуклеотидного полиморфизма (ОНП), особенно для генов, кодирующих белки-регуляторы (цитокины) иммунных и воспалительных реакций. В 2009 г. три независимые группы исследователей, выполняя анализ геномных последовательностей по группам пациентов, достигших и не достигших УВО при лечении пегилированным интерфероном-альфа и рибавирином, показали, что ОНП в локусе rs 12979860 у гена IL28B ассоциирован с большой вероятностью достижения успеха при лечении [4, 5, 6].
Еще одной важной научно-технической разработкой, повлиявшей на анализ факторов-предикторов, ассоциированных с вероятностью достижения УВО, являются новые подходы оценки стадии фиброза печени: фиброэластография и биохимическая биопсия (FibroTest). Эти методы неинвазивные, в этом их основное преимущество, а их комбинация позволяет более точно дифференцировать стадии фиброза печени от F0 до F4.
Важным этапом при постановке диагноза «гепатит C» является обнаружение маркеров инфицирования: антител и РНК вируса. Известны отечественные тесты, позволяющие обнаруживать антитела к отдельным белкам ВГС. Это иммуноферментные наборы «Анти-ВГС-спектр» и «Анти-ВГС IgM», сконструированные ЗАО «Вектор-Бест» в конце 1990-х годов прошлого века. В отличие от зарубежных тест-систем они позволяют выявлять иммуноглобулины к отдельным антигенам вируса: core, NS3, NS4ab и NS5a. В зарубежных аналогах используется меньший набор вирусных антигенов или их смесь, предлагается визуальная оценка или дорогостоящий детектор и сложно выполнить титрование антител. В последние годы появились отечественные тесты с высокой чувствительностью в 10-15 МЕ/мл для обнаружения РНК ВГС (тест-система «РеалБест РНК ВГС» производитель «Вектор-Бест» или «Амплисенс HCV-FRT-ЮМЕ/мл» производитель «ИнтерЛабСервис»), что позволяет более корректно выделять пациентов, достигших УВО при терапии.
Известно, что геном человека определяет генетически детерминированные возможности индивидуума, но реализуются они через протеом (совокупность белков), на последний влияют факторы окружающей среды, к числу которых относятся и патогены. Поэтому оценка вероятности пациента завершить противовирусную терапию эффективно должна учитывать не только полиморфизм генов, но и адаптивные функциональные параметры организма. Сделаны попытки оценки адаптивных изменений у больных хроническим гепатитом C для прогностической оценки тяжести течения и эффективности интерферонотерапии. Однако в них не учитываются генетические данные пациентов, и эти технические разработки касаются больных детей [7, 8]. Более детальный анализ, сочетающий молекулярно-генетические и адаптивные функциональные параметры организма, применен в исследовании, в котором изучали влияния генетических факторов вируса гепатита C и полиморфизм генов инфицированных людей на развитие фиброза печени [9]. Аналогом настоящего изобретения может служить разработка «Способ прогнозирования прогрессирующего течения хронического гепатита C (развитие цирроза печени) путем анализа комбинации полиморфных генов цитокинов» (патент RU №2317335) [10]. В указанной разработке учитывается полиморфизм генов трех цитокинов (IL-1b, IL-6, TGF-b1), аллельные формы которых могут влиять на развитие цирроза печени. Недостатками этого технического решения является то, что анализируются ОНП только трех генов, что явно мало; не учитываются адаптивные реакции организма пациента на патоген; выявляются случаи неоднозначного результата анализа, описанные как «сомнительно». Однако эта разработка демонстрирует важность молекулярно-генетических параметров пациента.
Используя перечисленные выше научно-технические достижения, был проведен сравнительный анализ когорты больных, состоящей из трех групп: первая - пациенты, достигшие УВО; вторая - больные, завершившие терапию безрезультатно, и третья - пациенты с последующим, через несколько лет, рецидивом; определены наиболее значимые прогностические показатели, базирующиеся на оценке клинических, иммуногенетических и серологических данных пациента; создан алгоритм их количественной оценки и разработан критерий-предиктор.
Цель предлагаемого изобретения - создание предсказательной модели для оценки индивидуальных возможностей пациента как генетически детерминированных, так и фенотипически сложившихся защитных реакций организма, позволяющей с большей достоверностью подбирать пациентов для стандартной двойной терапии пегилированным интерфероном-альфа и рибавирином хронического гепатита C на фоне новых схем лечения.
Техническая задача настоящего изобретения - создание способа персонифицированного прогнозирования эффективности терапии хронического гепатита C, заключающегося в том, чтобы на основе количественной оценки ведущих прогностических признаков пациента, а именно клинических, иммуногенетических и серологических данных: (1) стадии фиброза печени, (2) количества тромбоцитов, (3) аллельных вариантов полиморфного локуса rs 12979860 гена IL28B, (4) уровня анти-ВГС IgM, (5) наличия анти-NS5a IgG, (6) отношения титров анти-NS4ab IgG к анти-NS3 IgG, разработать критерий-предиктор, позволяющий более адекватно выбрать пациентов для стандартной двойной противовирусной терапии хронического гепатита C на фоне новых схем лечения.
Раскрытие изобретения
Известно, что на эффективность противовирусной терапии влияет много факторов: лекарственные препараты и схема их применения, генотип ВГС и такие факторы пациента, как пол, возраст, этническая принадлежность, сопутствующие заболевания, вредные привычки, генетические особенности обмена железа, углеводов, витаминов и генетически обусловленный уровень ряда цитокинов. Если значимость первых двух факторов (лекарственные препараты и генотип ВГС) общепризнанна, то ранжировать по актуальности факторы пациента непросто, возможно, для каждого этноса они могут менять значимость.
12
3
При анализе индивидуальных факторов пациентов в настоящем изобретении учитывали следующие показатели: пол, возраст, этническая принадлежность, длительность инфицирования, клинический анализ крови за последние 12 месяцев, индекс массы тела, генетические особенности обмена железа и витаминов B и D, генотип вируса, вирусная нагрузка, стадия фиброза печени, аллельный вариант гена интерлейкина-28B (IF28B) по локусу rs 12979860 и параметры специфического гуморального ответа на отдельные антигены вируса гепатита C.
В результате логического регрессионного анализа выявлены следующие ведущие прогностические признаки: стадия фиброза печени, количество тромбоцитов крови, аллельный вариант гена IL28B, уровень анти-ВГС IgM, отношение титров анти-NS4ab IgG к анти-NS3 IgG и наличие анти-NS5a IgG. Алгоритм анализа и оценка прогностических признаков приведены ниже.
Один из ведущих факторов, влияющих на достижение УВО, - это степень поражения печени, т.е. стадия фиброза. В нашем исследовании пациенты со стадией фиброза печени F3 не достигали УВО. Трем пациентам удавалось получить вирусологический ответ в конце курса терапии, но он в течение 6 месяцев завершался рецидивом, т.е. появлением РНК ВГС в крови. Поэтому пациенты со стадией фиброза F2 еще могут завершить успешно двойную терапию, а больные со стадией F3 нуждаются в новой терапии, основанной на других препаратах (p<0,01). Однако стадии фиброза F2 и F3 сложно разграничить, поэтому для их подтверждения использовали комбинацию двух методов: фиброэластографию и биохимическую биопсию. Учитывая влияние стадии фиброза на вероятность достижения УВО, была введена следующая количественная оценка стадий: для F0 - два положительных балла, для F1 - один положительный балл, для F2 - ноль баллов, для F3 - один отрицательный балл, для F4 - два отрицательных балла. Примеры анализа прогностических признаков пациента и их количественная оценка представлены ниже в таблицах 1 и 2, где под каждым выявленным показателем (данными исследования) находится оценочный балл, отмеченный знаком «+», если он позитивный, и знаком «-», если он негативный.
Таблица 1
Анализ прогностических признаков пациентов и их количественная оценка
Прогностические признаки
Пациент №1
Пациент №2
Пациент №3
Пациент №4
Пациент №5
Стадия фиброза
F0
F0
F0
F1
F0
+2
+2
+2
+1
+2
Аллельный вариант TT гена IL-28B, локус rs 12979860
нет
нет
нет
нет
да
+1
+1
+1
+1
-1
Содержание анти-ВГС IgM
нет
низкое
умеренное
низкое
умеренное
+1
+1
0
+1
0
Количество тромбоцитов
норма
норма
норма
норма
норма
+1
+1
+1
+1
+1
Аллельный вариант CC гена IL-28B локус rs 12979860
да
да
+1
+1
Аллельный вариант CT гена IL-28B локус rs12979860
да
да
0
0
Отношение титров анти-NS4ab IgG к анти-NSS IgG
1
>1
1
1
<1
+1
+2
+1
+1
-2
Анти-NS5a IgG
есть
есть
нет
нет
нет
+1
+1
-1
-1
-1
Количество баллов
+8
+9
+5
+5
+3
-1
-1
-4
Сумма набранных баллов
+8
+9
+4
+4
-1
Таблица 2
Анализ прогностических признаков пациентов и их количественная оценка
Прогностические признаки
Пациент №6
Пациент №7
Пациент №8
Пациент №9
Пациент №10
Стадия фиброза
F1
F2
F1
F3
F2
+1
0
+1
-1
0
Аллельный вариант ТТ гена IL-28В, локус rs12979860
да
нет
да
нет
да
-1
+1
-1
+1
-1
Содержание анти-ВГС IgM
низкое
умеренное
низкое
высокое
низкое
+1
0
+1
-1
+1
Количество тромбоцитов
норма
низкое
норма
низкое
низкое
+1
-1
+1
-1
-1
Аллельный вариант СС гена IL-28B локус rs12979860
Аллельный вариант СТ гена IL-28B локус rs12979860
да
да
0
0
Отношение титров анти-NS4ab IgG к анти-NS3 IgG
<1
1
<1
<1
1
-2
+1
-2
-2
+1
Анти-NS5a IgG
нет
есть
нет
есть
есть
-1
+1
-1
+1
+1
Количество баллов
+3
+3
+3
+2
+3
-4
-1
-4
-5
-2
Сумма набранных баллов
-1
+2
-1
-3
+1
Следующий важный прогностический признак - это аллельный вариант (или генотип) ТТ локуса rs12979860 гена IL28B. Лишь 7,7% пациентов с таким генотипом достигали УВО в нашем исследовании, но у всех в последующие 1-2 года отмечен рецидив. Остальные пациенты (92,3%) не достигали УВО (р<0,001). Вероятно, больные с аллельным вариантом ТТ в позиции rs12979860 гена IL28B - кандидаты на новые схемы лечения. При количественной оценке наличие генотипа ТТ было расценено в один отрицательный балл, его отсутствие - в один положительный балл.
При анализе содержания (титров) иммуноглобулинов М к суммарным антигенам ВГС установлено, что высокие титры этих антител являются одним из показателей безуспешности терапии, особенно, если количество тромбоцитов крови у пациента низкое (р<0,001). При нормальном количестве тромбоцитов возможно достижение УВО, но в последующие 1-2 года у пациентов происходил рецидив. Роль тромбоцитов крови в формировании УВО при терапии гепатита C была обнаружена несколько лет назад, хотя ранговая значимость этого показателя среди всех анализируемых параметров была непонятна [11]. Пациенты с высокими титрами анти-ВГС IgM и низким количеством тромбоцитов (меньше нижней границы нормы), возможно, тоже являются кандидатами на новые схемы лечения. Градация величин титров на высокие, умеренные и низкие приведена в разделе «Материалы и методы». Высокие анти-ВГС IgM оценены в один отрицательный балл, содержание тромбоцитов меньше нижней границы нормы - в один отрицательный балл.
Следующий прогностический признак - наличие генотипа CC гена IL28B. Пациенты, имеющие аллельный вариант СС гена IF28B и низкие титры анти-ВГС IgM или с отсутствием этих антител, при нормальном содержании тромбоцитов и отношении титров анти-NS4ab IgG к анти-NS3 IgG, больше или равным единице, с очень высокой вероятностью достигнут УВО и сохранят его в последующем (p<0,001). В случае, когда отношение титров анти-NS4ab IgG к анти-NSS IgG у таких пациентов меньше единицы, то возможен рецидив, вероятность которого выше при отсутствии иммуноглобулинов G к антигену NS5a. В последнем варианте есть вероятность, что терапия закончится безуспешно. По литературным данным около 25-40% больных с генотипом СС гена IL28B завершают двойную терапию без УВО [4,12]. Низкие титры анти-ВГС IgM или их отсутствие оценены в один положительный балл, нормальное содержание тромбоцитов - в один положительный балл, отношение титров анти-NS4ab IgG к анти-NS3 IgG больше единицы - в два положительных балла, а отношение титров этих антител, равное единице - в один положительный балл, отношение меньше единицы - в два отрицательных балла, наличие анти-NS5a IgG - в один положительный балл, а их отсутствие - в один отрицательный балл.
Еще один важный прогностический признак - аллельный вариант CT гена IL28B. У пациентов с генотипом CT гена IL28B при низком количестве тромбоцитов (меньше нижней границы нормы), сохраняющимся в течение полугода, с большой вероятностью терапия будет безуспешной (p<0,001). Если у пациентов с таким же генотипом количество тромбоцитов нормальное и отношение титров анти-NS4ab IgG к анти-NS3 IgG меньше единицы, то терапия с большой вероятностью завершится безуспешно или будет рецидив через несколько лет (p<0,001). Вероятность достичь УВО высокая у пациентов с генотипом CT гена IL28B, нормальным содержанием тромбоцитов крови и отношением титров анти-NS4ab IgG к анти-NS3 IgG, большим или равным единице (p<0,01). Шанс будет ниже, если нет антител к вирусному антигену NS5a (p<0,05). Персонифицированное прогнозирование вероятности достижения УВО при терапии определяется по сумме набранных пациентом баллов и сопоставлению ее с критерием-предиктором, как представлено в таблице 3.
Таблица 3
Определение вероятности достижения УВО при терапии по критерию-предиктору
Критерий-предиктор
Прогноз
От +9 до +6
Очень высокая вероятность достичь УВО
От +5 до +2
Хорошая вероятность достичь УВО, но впоследствии возможен рецидив
+1
Умеренная вероятность достичь УВО, впоследствии очень возможен рецидив
От 0 до -9
УВО не будет достигнут
Анализ описанных выше параметров прогностических признаков пациента как генетически детерминированных, так и фенотипически сложившихся защитных реакций его организма и их количественная оценка позволяет выявлять пациентов, для которых двойная терапия будет безуспешной или успешной с последующим длительным отсутствием РНК ВГС, и пациентов, достигших УВО, но с последующим, через нескольких лет, рецидивом.
Осуществление изобретения
Материалы и методы
Критерии формирования когорты пациентов. Анализируемая когорта была сформирована из 105 пациентов, завершивших двойную терапию пегилированным интерфероном-альфа и рибавирином 1-5 лет назад. Пациенты с хроническим гепатитом B, ВИЧ-инфекцией, токсическим гепатитом и онкологическими заболеваниями не включались в исследование.
Для определения стадии фиброза печени использовали метод кратковременной эластографии, выполненный с помощью аппарата «Фиброскан» («Echosense», Франция). Этот метод основан на регистрации отраженного ультразвукового колебания средней амплитуды и низкой частоты. Ультразвуковой сигнал, проходя через ткань печени, приобретает сдвиг и изменяет скорость в зависимости от эластичности ткани. В процессе анализа исследуется эластичность 2-3 фрагментов правой доли печени размером 1×4 см на глубину до 6,5 см от поверхности кожи. В результате анализа определяется средний показатель эластичности печени, выраженный в килопаскалях, который соответствует определенной величине шкалы METAVIR. Информативность метода наиболее высокая при установлении стадии F4, хорошая при разграничении стадий F0, F1, F2 и F3.
Для определения стадии фиброза печени использовали еще один метод - биохимическую биопсию, называемую также «фибротест» (разработчик «BioPredictive», Франция). Анализируется венозная кровь на определенные биохимические показатели по протоколу производителя, стадии фиброза выражаются в единицах шкалы METAVIR. Достоинство метода - получение информации не только о стадии фиброза печени, но и степени воспалительной активности. Информативность метода наиболее высокая при разграничении F0, F1, F2 и F3.
Обнаружение РНК ВГС выполняли методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с применением тест-наборов «РеалБест РНК ВГС, качественный» и «РеалБест РНК ВГС, количественный» (ЗАО «Вектор-Бест», Россия). Чувствительность этих тест-систем 15 МЕ/мл. Амплификацию проводили в приборе Rotor-Gene 3000/6000 («Corbett Research», Австралия), используя программную версию производителя.
Анализ полиморфного локуса (rs 12979860) гена IL28B осуществляли методом ПЦР в реальном времени, используя комплект реагентов для определения генетических полиморфизмов «Иммуногенетика IL28B» (НПО «ДНК-технология», Россия). В положении rsl2979860 выявляли аллельные варианты CC, CT или TT. Амплификацию проводили в приборе ДТ-332 (НПО «ДНК-технология», Россия), используя программную версию производителя.
Иммуноглобулины M и G, специфичные к вирусным антигенам core, NS3, NS4ab, NS5a, выявляли с помощью иммуноферментных коммерческих тест-систем «Бест анти-ВГС-IgM» и «Бест анти-ВГС - спектр» (ЗАО «Вектор-Бест», Россия). Отношение анти-NS4ab IgG к анти-NS3 IgG определяли как отношение титров. Содержание анти-ВГС IgM считалось высоким при оптической плотности выше порога чувствительности в пятом разведении, умеренным - в третьем и четвертом разведении, в остальных - низким.
2
Статистический анализ и выявление достоверных различий. Для установления различий в сравниваемых признаках в группах пациентов определяли среднее арифметическое количественных показателей со стандартным отклонением или среднее геометрическое со стандартным отклонением. Статистическую достоверность различий признаков при их нормальном распределении оценивали с помощью t-критерия, при ненормальном распределении - по критерию χ. Уровень значимости имел общепризнанное для медико-биологических исследований значение p<0,05.
В связи с тем, что в последние годы появляются новые препараты и новые схемы лечения хронического гепатита C, важно еще до начала терапии выявлять пациентов, которые достигнут УВО на двойной терапии пегилированным интерфероном-альфа и рибавирином, и тех больных, кому она не поможет и которые нуждаются в новой схеме лечения. Предлагаемый способ позволяет решать эту задачу. Способ базируется на определении персональной количественной оценки прогностических признаков пациента и сопоставлении их с разработанным критерием-предиктором. Предлагаемая предсказательная модель персонифицированной прогностической оценки позволяет более адекватно выбрать пациентов для стандартной двойной противовирусной терапии хронического гепатита C на фоне новых схем лечения.
Список литературы
1. Alter M.J. Epidemiology of hepatitis С virus infection. // World J. Gastroenterol. 2007, v. 13, 2436-2441.
2. Center for Disease Control and Prevention. HCV. // http://www.cdc.gov/hepatitis/HCV. Accessed 8 Oct 2010.
3. Самохвалов Е.И., Николаева Л.И., Альховский С.В. и др. Частота встречаемости отдельных субтипов вируса гепатита C в Московском регионе. // Вопросы вирусологии. 2013, №1, с.36-40.
4. Ge D.I., Fellay J., Thompson A.J. et al. Genetic variation in IL-28B predicts hepatitis С treatment-induced viral clearance. // Nature. 2009, v.461, 399-401.
5. Suppiah V., Moldovan M., Ahlensiel G. et al. IL-28B is associated with response to chronic С interferon-alpha and ribavirin therapy. // Nat. Genet. 2009, v. 41, 1100-1104.
6. Tanaka Y., Nishida N., Sugiyama M. et al. Genome-wide association with response to pegylated interferon-alpha and ribavirin therapy for chronic hepatitis C. // Nat. Genet. 2009, v.41, 1105-1109.
7. Жукова E.А., Шабунина E.И., Каплина H.А. и др. Способ прогнозирования эффективности интерферонотерапии вирусных гепатитов у детей // Патент RU №2379689.
8. Чурбакова О.В., Кельцев В.А., Минаев Ю.Л. Способ прогнозирования тяжести течения хронических вирусных гепатитов B и C у детей и подростков. Патент RU №2477072.
9. Николаева Л.И., Колотвин А.В., Самоходская Л.М. и др. Анализ влияния генетических факторов вируса гепатита С и полиморфизма генов инфицированных людей на развитие фиброза печени. // Эпидемиология и инфекционные болезни, 2012, №5, стр.7-13.
10. Самоходская Л.М., Абдуллаев С.М., Целищева Ю.Н. и др. Способ прогнозирования прогрессирующего течения хронического гепатита C (развитие цирроза печени) путем анализа комбинации полиморфных генов цитокинов. Патент RU №2317335.
11. Mauss S., Zehnter Е., Manns М. et al. Baseline platelet count predicts sustained viral response (SVR) in the treatment of chronic hepatitis С with PEG-IFNα-2b and ribavirin: results from the German PEG-IFNα-2b observational study. // Hepatology. 2009, v.50, 1032A.
12. Montes-Cano M.A., Garcia-Lozano J.R., Abad-Molina С et al. Interleikin-28B genetic variants and hepatitis С virus infection by different genotypes. // Hepatology. 2010, v.52, 33-37.