Кинетика пероксидазного окисления кверцетина в присутствии Р-циклодекстрина

УДК 577.152.193

КИНЕТИКА ПЕРОКСИДАЗИОГО ОКИСЛЕНИЯ КВЕРЦЕТИНА В ПРИСУТСТВИИ р-ЦИКЛОДЕКСТРИНА

Л.И. Олейник, Т.С. Буслова, И.А. Веселова, Т.Н. Шеховцова

Установлено, что в присутствии макроциклического комплексообразователя Р-циклодекст-рина скорость пероксидазного окисления флавоноида кверцетина возрастает на 20%. Сравнение кинетических параметров указанной реакции в присутствии и в отсутствие Р-цикло-декстрина показало, что его введение не влияет значимо на специфичность фермента по отношению к субстрату-восстановителю (характеризуемую отношением £кат/Км), а повышение скорости реакции не зависит от времени инкубирования кверцетина с Р-циклодекстри-ном. Сделано предположение, что увеличение скорости реакции связано с неспецифическим взаимодействием Р-циклодекстрина с продуктом окисления кверцетина.

Ключевые слова: пероксидаза хрена, кверцетин, в-циклодекстрин.

Цикл о декстрины (рис. 1) являются циклическими олигосахаридами, состоящими из шести, семи или восьми а-Б-глюкопиранозных единиц, связанных а-1,4-гликозидными связями в конусообразную структуру. Эта структура обладает гидрофобной внутренней полостью и гидрофильной внешней поверхностью, поэтому Р-циклодекстрины способны повышать стабильность и растворимость лекарственных препаратов, витаминов и многих других соединений вследствие образования комплексов включения по типу "гость-хозяин" между молекулой-"гостем" и гидрофобной полостью Р-циклодекстрина-"хозяина".

Изучению влияния цикло декстринов на реакции окисления различных веществ (в частности, феноль-ных соединений и 3,3',5,5'-тетраметилбензидина), катализируемые ферментом пероксидазой хрена, посвящен ряд работ [1-4]. Описаны результаты, свидетельствующие как об ингибирующем, так и активирующем

действии циклодекстрина на подобные реакции, причем наблюдаемые эффекты объяснены образованием комплексов либо между циклодекстрином и субстратом фермента, либо между циклодекстрином и интер-медиатами ферментативной реакции.

Известно [5-7], что кверцетин (структурная формула которого представлена на рис. 2), так же, как и ряд других соединений, способен включаться в полость Р-циклодекстрина. При этом включение кверце-тина в такой комплекс позволяет управлять его свойствами, в первую очередь растворимостью в воде, а также, по некоторым данным [2, 5], способностью к окислению. Известно [2], что кверцетин является субстратом пероксидазы, однако подробное описание механизма и кинетики его пероксидазного окисления в литературных источниках отсутствует. В связи с этим представляло интерес изучение как собственного пероксидазного окисления флавоноида, так и воз-

Рис. 1. Структурные формулы циклодекстринов

ОН О

Рис. 2. Структурная формула кверцетина

можности управления указанным процессом путем введения ß-циклодекстрина (ЦД).

Целью данной работы явилось сравнительное изучение кинетики пероксидазного окисления кверцетина в отсутствие и в присутствии ß-циклодекстрина.

Экспериментальная часть Реактивы

В работе использовали следующие реактивы: пе-роксидазу из корней хрена (К.Ф. 1.11.1.7), кверцетин, ß-цикло декстрин ("Sigma", США), гидрофосфат аммония, дигидрофосфат аммония, пероксид водорода ("Merck", Германия), ацетат натрия и уксусную кислоту ("Helicon").

Растворы пероксидазы готовили растворением навески твердого препарата в фосфатном буферном растворе (рН 7,0). Точную концентрацию пероксида-зы устанавливали спектрофотометрически (в403 = 9,4-10 М •см ). Кверцетин растворяли в диметил-сульфоксиде, "х.ч." (ДМСО). Для приготовления 1%-го раствора ß-циклодекстрина и проведения реакции пероксидазного окисления кверцетина использовали 0,05 М ацетатный буферный раствор с рН 4,5. Для приготовления всех водных растворов использовали деионизованную воду с электропроводностью не более 18,2 МОм, очищенную на установке "Milipore" (Франция).

Измерение рН буферных растворов проводили на рН-милливольтметре "Эконикс-жсперт" (Россия). Препараты взвешивали на аналитических весах "OHAUS" (Швейцария). Для регистрации спектров поглощения использовали спектрофотометр "UV-mini 1240" ("Shimadzu", Япония).

Методика эксперимента

Для измерения скорости индикаторной реакции окисления кверцетина, катализируемой пероксидазой из корней хрена, был использован метод тангенсов. Начальную скорость реакции контролировали, регистрируя изменение оптической плотности реакционного раствора при определенной длине волны. Рассчитанный нами молярный коэффициент поглощения продук-

та реакции составил 1,15-104 М-1-см-1 в отсутствие Р-циклодекстрина и 1,33-104 М-1-см-1 в его присутствии. При каждой концентрации кверцетина проводили две серии опытов: в присутствии и в отсутствие Р-циклодекстрина в реакционной системе.

Для регистрации кинетических кривых ферментативного окисления кверцетина поступали следующим образом: в стеклянную пробирку при комнатной температуре вводили последовательно необходимые количества 0,05 М ацетатного буферного раствора, 1%-го раствора Р-циклодекстрина (если необходимо), 10 мкМ раствора фермента, 2 мМ раствора кверцетина в ДМСО и в последнюю очередь 2 М раствора пероксида водорода. В зависимости от эксперимента концентрации компонентов в реакционной смеси варьировали в следующих пределах: 5-100 мкМ кверцетина, 50-500 мкМ пероксида водорода. Общий объем смеси составлял 1 мл. Полученную смесь перемешивали и переносили в кювету для спектрофотометра, в течение 2 мин регистрировали оптическую плотность. Начальную скорость реакции находили по отношению тангенса угла наклона линейного участка кинетической кривой к предварительно определенному молярному коэффициенту поглощения.

Увеличение скорости индикаторной реакции характеризовали отношением разности между скоростями реакции окисления кверцетина в присутствии и в отсутствие Р-циклодекстрина к скорости реакции в отсутствие Р-циклодекстрина.

Результаты и их обсуждение

Судя по литературным данным, до сих пор точно не описаны продукты пероксидазного окисления кверцетина, однако предложена схема окисления кверцетина в присутствии тирозиназы [8] (рис. 3). Поскольку и тирозиназа, и пероксидаза относятся к классу оксидоредуктаз, можно предположить, что пероксидазное окисления будет приводить к образованию тех же продуктов.

Как видно из представленных на рис. 4 спектров поглощения продуктов пероксидазного окисления кверцетина в присутствии и в отсутствие Р-циклодек-стрина, изменение оптической плотности наблюдалось при двух длинах волн - 300 и 540 нм. Однако оптическая плотность при 540 нм быстро убывала (что свидетельствовало о дальнейшем превращении продукта), причем изменение поглощения было не столь значительным, как при 300 нм. По этой причине в дальнейших экспериментах скорость реакции контролировали по накоплению продукта, поглощающего при 300 нм, выбрав концентрацию фермента (0,5 нМ), при

Рис. 3. Схема тирозиназного окисления кверцетина [8]

которой кверцетин в диапазоне концентраций 4100 мкМ окислялся достаточно быстро, а кинетическая кривая была линейна в течение по крайней мере 30 с после начала реакции, т.е. не менее 15 с после начала регистрации оптической плотности.

Концентрация пероксида водорода была выбрана таким образом, чтобы не менее 20 с после начала регистрации оптических плотностей кинетическая кривая имела линейный характер (100 мкМ).

При постоянной концентрации кверцетина (50 мкМ) изучили зависимость скорости реакции от содержания ß-циклодекстрина в диапазоне его концентраций от 0 до 8,35 мМ (соответствует соотношению молярных концентраций ЦЦ-кверцетин от 0 до 167), при этом в диапазоне молярных концентраций ЦЦ-кверцетин 10167 скорость реакции повышалась на 20% по сравнению со скоростью в отсутствие ЦЦ. При этом увеличение скорости реакции в присутствии ß-циклодекст-рина по сравнению со скоростью реакции в его отсутствие не было связано с изменением рН раствора, значение которого в обоих процессах было постоянным и составляло 4,5.

Цалее изучили зависимость ускорения реакции пе-роксидазного окисления кверцетина в присутствии ß-циклодекстрина от времени инкубации смеси кверцетина и ß-циклодекстрина перед введением их в реакционную систему. Предполагали, что если причиной ускорения реакции является образование более реак-ционноспособного по сравнению со свободным квер-цетином комплекса, то скорость реакции должна воз-

растать по мере увеличения времени инкубирования кверцетина с ß-циклодекстрином, вследствие увеличения количества комплекса в системе. Однако нами показано отсутствие значимой зависимости скорости реакции от времени инкубации в диапазоне от 0 до 60 мин. Это свидетельствует либо о том, что в этих условиях комплекс образуется мгновенно (что вызывает сомнения, так как в работах [2, 5] для получения комплекса между кверцетином и ß-циклодекстри-ном его компоненты выдерживали в течение длительного времени (например, 60 мин под действием ультразвука [2] или 24 ч [5])), либо о том, что предположение об образовании более реакционноспособно-го комплекса как причины ускоряющего действия неверно. Для выяснения причины активирующего дей-

Рис. 4. Спектры поглощения реакционного раствора в присутствии и в отсутствие ß-циклодекстрина (фермент 0,5 нМ, кверцетин 50 мкМ, ß-циклодекстрин 2 мМ, пероксид водорода 100 мкМ): 1 - в присутствии ЦД, 2 - в отсутствие ЦД

Кинетические параметры реакций ферментативного окисления кверцетина в присутствии и в отсутствие ß-циклодекстрина

Параметр Кинетические параметры относительно кверцетина

в отсутствие ЦД в присутствии ЦД

VMaKC, мкМ/с 0,32 ± 0,05 0,36 ± 0,05

¿КаТЭф X10-V1 0,64 ± 0,10 0,72 ± 0,09

Км, мкМ 8 ± 3 11 ± 4

£катэф / Км х10-12, с-1мкМ-1 84,9 - - 65,4 - -

параметр кинетические параметры относительно пероксида водорода

в отсутствие ЦД в присутствии ЦД

Кмакс, мкМ/с 0,45 ± 0,03 0,53 ± 0,07

£катэф х10-9,с-1 0,91 ± 0,06 0,11 ± 0,02

Км, мкМ 202 ± 32 186 ± 62

£катэф / Км х10-12, с-1мкМ-1 4,5 - - 5,7 - -

Примечание. Для расчета ккатф было принято, что концентрация пероксидазы хрена может быть определена по поглощению ее раствора при 403 нм.

ствия ß-циклодекстрина сравнили кинетические параметры окисления кверцетина в отсутствие и в присутствии ЦД. Ферментативные реакции окисления кверцетина пероксидом водорода являются двусубст-ратными. В частности, для многих процессов окисления фенольных соединений (к которым можно отнести и кверцетин) наиболее корректным считается использование кинетической схемы "пинг-понг", которая подходит и к данному случаю. Однако попытка рассчитать кинетические параметры этой реакции по указанной схеме с использованием алгоритма расчета, приведенного в [9], привела к абсурдным результатам. По-видимому, причиной является то, что ряд допущений относительно соотношения констант скоростей отдельных стадий и концентраций компонентов реакции, принятых в [9] для получения числовых значений кинетических параметров, неприменим для изучаемой системы. Поэтому для оценки кинетических параметров решили использовать классическую схему Михаэлиса-Ментен для односубст-ратных процессов, поскольку при фиксированной концентрации одного из субстратов (в идеальном случае - при насыщающей концентрации одного из субстратов; однако такие условия зачастую невыполнимы в реальных условиях вследствие ингибирования фермента большими концентрациями субстрата) ско-

рость процесса можно считать зависящей только от концентрации одного из субстратов [10]. При этом рассчитанные по этой схеме величины Кт и ^макс корректнее считать кажущимися величинами, поскольку истинные значения этих показателей рассчитывают для односубстратных реакций.

Для расчета кинетических параметров перокси-дазного окисления кверцетина исследовали зависимость скорости реакции от его концентрации при фиксированной концентрации пероксида водорода, а также зависимость скорости реакции от концентрации пероксида водорода при фиксированной концентрации кверцетина. По полученным данным для реакций, проведенных как в присутствии, так и в отсутствие Р-циклодекстрина, рассчитали кинетические параметры реакции (кажущиеся Км, ^макс, к каэтф, ккгэг>/Км), значения которых представлены в таблице. Выявили, что максимальная скорость и константа Михаэлиса, рассчитанные при варьировании концентрации пероксида водорода при введении Р-циклодек-стрина, не меняется значимо. Это служит подтверждением того, что увеличение скорости процесса не связано с влиянием Р-циклодекстрина на основной субстрат пероксидазы. В присутствии Р-циклодекст-рина возрастает максимальная скорость индикаторной реакции, рассчитанная при варьировании концентрации

кверцетина, и соответственно возрастает константа лодекстрина в изучаемой реакции является неспеци-

Михаэлиса относительно кверцетина, что представляется естественным, поскольку она отражает концентрацию субстрата, необходимую для достижения скорости, в два раза меньшей максимальной. Специфичность связывания субстратов, которую характеризуют отношением ^кат/Км, мало изменялась при введении ß-циклодекстрина. Это свидетельствует, по-видимому, о том, что ß-циклодекстрин не связывается ни с субстратами реакции, ни с самим ферментом. В связи с этим расчет константы активации в данном случае представляется нецелесообразным. Учитывая, что скорость реакции не меняется значимо при варьировании времени выдерживания кверцетина и ß-циклодек-стрина перед введением их в реакцию, можно предположить, что причиной ускоряющего действия ß-цик-

фическое связывание молекулы-рецептора с продуктом окисления кверцетина. Ранее на подобный эффект указывали в работе [11] для ряда процессов с участием ферментов. В отличие от авторов [2], наблюдавших ингибирование ß-циклодекстрином перокси-дазного окисления кверцетина при длительном совместном выдерживании (60 мин) флавоноида с олигоса-харидом под действием ультразвука, мы показали, что при непосредственном введении в реакцию окисления ß-циклодекстрина последний ускоряет процесс. Это, очевидно, связано с тем, что во время протекания ферментативной реакции кверцетин не внедряется в полость ß-циклодекстрина, а, по-видимому, лишь неспецифически взаимодействует с продуктом окис-

ления флавоноида.

Исследования выполнены при поддержке РФФИ (проект № 09-03-00823-а).

CÜHCOK ^HTEPATYPM

1. Trotta F., Ferrari R.P., Laurenti E., Moraglio G., Trossi A. // J. Incl. Ph. Mol. Recognition Chem. 1996. 25. P. 225.

2. Lucas-Abellan C., Fortea I., Gabaldyn J.A., Nbcez-Delicado E. // J. Agric. Food Chem. 2007. 56. P. 255.

3. Chen JB., Xia C.G., Li S.B. // Chinese Chem. Lett. 2000. 11. P. 721.

4. ReihmannM.H., Ritter H. // Macromol. Chem. Phys. 2000. 201. P. 798.

5. Koontz J.L., Marcy J.E., O 'Keefe S.F., Duncan S.E. // J. Agric. Food Chem. 2009. 57. P. 1162.

6. Borghetti G.S., Lula I.S., Sinisterra R.D., Bassani V.L. // Am. Ass. Pharm. Sci. 2009. 10. P. 235.

7. Zheng Y, Haworth I.S., Zuo Z., ChowM. S.S., Chow A.H.L. // J. Pharm. Sci. 2005. 94. P. 1079.

8. Kubo K., Nihei K., Shimizu K. // Bio. Med. Chem. 2004. 12. P. 5343.

9. Garsia-MorenoM., Moreno-ConesaM., Rodriges-Lypez J.N., Garsia-CanovasF., Varyn R. // Biol. Chem. 1999. 380. P. 689.

10. Copeland R.A. Enzymes: A practical introduction to structure, mechanism, and data analysis. Wiley, 2000.

11. Villalonga R, Cao R, Fragoso A. // Chem. Rev. 2007. 107. P. 3088.

Поступила в редакцию 01.04.2010.

KINETICS OF QUERCETIN OXIDATION CATALYZED BY HORSERADISH PEROXIDASE IN THE PRESENCE OF P-CYCLODEXTRIN

L.I. Oleynik, T.S. Buslova, I.A. Veselova, T.N. Shekhovtsova

The rate of quercetin oxidation catalyzed by horseradish peroxidase was found to increase by 20% in the presence of macrocyclic complexing agent P-cyclodextrin. The comparison of the kinetic parameters of this reaction in the presence and in the absence of b-cyclodextrin showed that the introduction of P-cyclodextrin did not influence significantly the specificity of the enzyme towards the reducing substrate (estimated as kcat/Km ratio). At the same time, the reaction rate did not depend on the time of incubation of quercetin and P-cyclodextrin. The increase of the reaction rate was supposed to be associated with non-specific interaction between p-cyclodextrin and the product of quercetin oxidation.

Key words: horseradish peroxidase; cyclodextrin; quercetin.

Сведения об авторах: Олейник Любовь Игоревна - аспирант химического факультета MrY(lioleynk@mail.ru); Буслова Татьяна Сергеевна - студентка химического факультета MTY (tanyabuslova@gmail.com); Веселова Ирина Анатольевна — доцент кафедры аналитичской химии химического факультета MTY, канд. хим. наук (irina.veselova@mail.ru); Шеховцова Татьяна Николаевна — профессор кафедры аналитичской химии химического факультета MTY, докт. хим. наук(tnshekh@yandex.ru).