СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ОЦЕНКИ ОПОСРЕДОВАННОГО CRISPR/CAS РАЗРУШЕНИЯ ИЛИ ВЫРЕЗАНИЯ И ИНДУЦИРОВАННОЙ CRISPR/CAS РЕКОМБИНАЦИИ С ЭКЗОГЕННОЙ ДОНОРСКОЙ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТОЙ IN VIVO

1. Отличное от человека животное, содержащее репортер CRISPR для оценки индуцированного CRISPR/Cas вырезания нуклеиновой кислоты между первой и второй целевыми последовательностями направляющих РНК, причем репортер CRISPR интегрирован в целевой геномный локус и содержит первый сигнал полиаденилирования, фланкированный первой и второй целевыми последовательностями направляющих РНК, за которыми следует репортерная кассета, содержащая кодирующую последовательность для первого репортерного белка и кодирующую последовательность для второго репортерного белка в любом порядке, причем первый репортерный белок и второй репортерный белок различны.
2. Отличное от человека животное по п. 1, в котором репортер CRISPR также предназначен для оценки индуцированной CRISPR/Cas рекомбинации репортера CRISPR с экзогенной донорской нуклеиновой кислотой.
3. Отличное от человека животное по п. 2, в котором первый репортерный белок содержит третью целевую последовательность направляющей РНК, причем рекомбинация репортера CRISPR с экзогенной донорской нуклеиновой кислотой изменяет кодирующую последовательность для первого репортерного белка на кодирующую последовательность для третьего репортерного белка.
4. Отличное от человека животное по п. 3, в котором кодирующая последовательность для первого репортерного белка изменяется на кодирующую последовательность для третьего репортерного белка путем замены одного кодона.
5. Отличное от человека животное по п. 3 или 4, в котором третья целевая последовательность направляющей РНК перекрывается с частью кодирующей последовательности для первого репортерного белка, модифицированного экзогенной донорской нуклеиновой кислотой.
6. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, в котором один из первого и второго репортерных белков содержит флуоресцентный репортерный белок.
7. Отличное от человека животное по п. 6, в котором флуоресцентный репортерный белок содержит усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP) или усиленный синий флуоресцентный белок (eBFP).
8. Отличное от человека животное по п. 6 или 7, в котором первый и второй репортерные белки содержат флуоресцентный репортерный белок и нефлуоресцентный репортерный белок.
9. Отличное от человека животное по п. 8, в котором флуоресцентный репортерный белок может быть обнаружен в анализе с помощью проточной цитометрии, а нефлуоресцентный белок может быть обнаружен в гистохимическом анализе.
10. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, в котором один из первого и второго репортерных белков содержит белок бета-галактозидазу.
11. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, в котором первый сигнал полиаденилирования также фланкирован сайтами узнавания рекомбиназы для первой рекомбиназы.
12. Отличное от человека животное по п. 11, в котором сайты узнавания рекомбиназы для первой рекомбиназы представляют собой последовательности loxP.
13. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, в котором репортерная кассета содержит мультицистронную нуклеиновую кислоту, содержащую кодирующую последовательность для первого репортерного белка и кодирующую последовательность для второго репортерного белка, разделенных промежуточным участком внутренней посадки рибосомы (IRES) или промежуточной кодирующей последовательностью пептида 2A.
14. Отличное от человека животное по п. 13, в котором мультицистронная нуклеиновая кислота содержит кодирующую последовательность бета-галактозидазы и кодирующую последовательность усиленного синего флуоресцентного белка (eBFP) или кодирующую последовательность усиленного зеленого флуоресцентного белка (eGFP), разделенную промежуточной кодирующей последовательностью пептида P2A.
15. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, в котором репортер CRISPR функционально связан с эндогенным промотором в целевом геномном локусе.
16. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, в котором 5’-конец репортера CRISPR дополнительно содержит 3’-последовательность сплайсинга.
17. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, в котором репортер CRISPR дополнительно содержит кассету селекции.
18. Отличное от человека животное по п. 17, в котором кассета селекции фланкирована сайтами узнавания рекомбиназы для второй рекомбиназы.
19. Отличное от человека животное по п. 17 или 18, в котором кассета селекции содержит ген лекарственной устойчивости.
20. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, в котором расстояние между первой целевой последовательностью направляющей РНК и второй целевой последовательностью направляющей РНК составляет менее чем приблизительно 500 пар нуклеотидов.
21. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, в котором первая целевая последовательность направляющей РНК и вторая целевая последовательность направляющей РНК идентичны, и каждая из них содержит SEQ ID NO: 41.
22. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, причем отличное от человека животное представляет собой крысу или мышь.
23. Отличное от человека животное по п. 22, причем отличное от человека животное представляет собой мышь.
24. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, в котором целевой геномный локус представляет собой локус «безопасной гавани».
25. Отличное от человека животное по п. 24, в котором локус «безопасной гавани» представляет собой локус Rosa26.
26. Отличное от человека животное по п. 25, в котором репортер CRISPR вставлен в первый интрон локуса Rosa26.
27. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, причем отличное от человека животное представляет собой мышь, и
причем целевой геномный локус представляет собой локус Rosa26, и
причем репортер CRISPR функционально связан с эндогенным промотором Rosa26, вставлен в первый интрон локуса Rosa26 и содержит от 5’ к 3’:
(а) 3’ последовательность сплайсинга;
(b) первый сигнал полиаденилирования, фланкированный:
(i) первым и вторым сайтами loxP и
(ii) первой и второй целевыми последовательностями направляющих РНК, причем первая целевая последовательность направляющей РНК и вторая целевая последовательность направляющей РНК идентичны, и каждая из них содержит SEQ ID NO: 41; и
(c) репортерную кассету, содержащую от 5’ к 3’:
(i) кодирующую последовательность бета-галактозидазы;
(ii) кодирующую последовательность P2A;
(iii) кодирующую последовательность усиленного синего флуоресцентного белка (eBFP), причем кодирующая последовательность eBFP содержит третью целевую последовательность направляющей РНК, содержащую SEQ ID NO: 42; и
(iv) второй сигнал полиаденилирования, причем первый сигнал полиаденилирования и второй сигнал полиаденилирования различны.
28. Отличное от человека животное по п. 27, в котором репортер CRISPR дополнительно содержит:
(d) кассету селекции 3’ репортерной кассеты, причем кассета селекции фланкирована сайтами FRT и содержит от 5’ к 3’:
(i) кодирующую последовательность неомицин-фосфотрансферазы, функционально связанную с промотором убиквитина человека; и
(ii) третий сигнал полиаденилирования.
29. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, причем отличное от человека животное является гетерозиготным по отношению к репортеру CRISPR в целевом геномном локусе.
30. Отличное от человека животное по любому из пп. 1-28, причем отличное от человека животное является гомозиготным по отношению к репортеру CRISPR в целевом геномном локусе.
31. Способ исследования способности нуклеазы CRISPR/Cas вырезать геномную нуклеиновую кислоту in vivo, предусматривающий:
(а) введение отличному от человека животному по любому из пп. 1-30:
(i) первой направляющей РНК, предназначенной для гибридизации с первой целевой последовательностью направляющей РНК в репортере CRISPR;
(ii) второй направляющей РНК, предназначенной для гибридизации со второй целевой последовательностью направляющей РНК в репортере CRISPR; и
(iii) белка Cas; и
(b) измерение активности или экспрессии по меньшей мере одного из первого и второго репортерных белков.
32. Способ по п. 31, при котором белок Cas представляет собой белок Cas9.
33. Способ по п. 31 или 32, при котором белок Cas вводят отличному от человека животному в форме белка.
34. Способ по п. 31 или 32, при котором белок Cas вводят отличному от человека животному в форме информационной РНК, кодирующей белок Cas.
35. Способ по п. 31 или 32, при котором белок Cas вводят отличному от человека животному в форме ДНК, кодирующей белок Cas, причем ДНК функционально связана с промотором, активным в одном или нескольких типах клеток в отличном от человека животном.
36. Способ по любому из пп. 31-35, при котором первая направляющая РНК и вторая направляющая РНК идентичны и каждая содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.
37. Способ по любому из пп. 31-36, при котором репортерный белок, измеренный на стадии (b), представляет собой флуоресцентный репортерный белок, а стадия (b) предусматривает анализ с помощью проточной цитометрии.
38. Способ по любому из пп. 31-36, при котором репортерный белок, измеренный на стадии (b), представляет собой белок бета-галактозидазу, а стадия (b) предусматривает анализ гистохимическим окрашиванием.
39. Способ по любому из пп. 31-38, при котором направляющие РНК на стадии (а) вводят в форме РНК.
40. Способ по любому из пп. 31-38, при котором каждая из направляющих РНК на стадии (а) вводится отличному от человека животному в форме ДНК, кодирующей направляющую РНК, причем ДНК функционально связана с промотором, активным в одном или нескольких типах клеток у отличного от человека животного.
41. Способ по любому из пп. 31-40, при котором введение предусматривает опосредованную аденоассоциированным вирусом (AAV) доставку, опосредованную липидными наночастицами доставку или гидродинамическую доставку.
42. Способ по п. 41, при котором введение предусматривает опосредованную AAV доставку.
43. Способ по п. 42, при котором введение предусматривает опосредованную AAV8 доставку, и стадия (b) предусматривает измерение активности репортерного белка в печени отличного от человека животного.
44. Способ оптимизации способности нуклеазы CRISPR/Cas вырезать геномную нуклеиновую кислоту in vivo, предусматривающий:
(I) выполнение способа по любому из пп. 31-43 в первый раз у первого отличного от человека животного;
(II) изменение переменной и выполнение способа стадии (I) во второй раз с измененной переменной у второго отличного от человека животного; и
(III) сравнение активности или экспрессии репортерного белка на стадии (I) с активностью или экспрессией по меньшей мере одного репортерного белка на стадии (II) и выбор способа, приводящего к более высокой активности или экспрессии репортерного белка.
45. Способ по п. 44, при котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой способ доставки вводимых направляющих РНК и/или белка Cas отличному от человека животному.
46. Способ по п. 44, при котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой путь введения направляющих РНК и/или белка Cas, вводимых отличному от человека животному.
47. Способ по п. 44, при котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой концентрацию или количество направляющих РНК и/или белка Cas, введенных отличному от человека животному.
48. Способ по п. 44, при котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой концентрацию или количество направляющих РНК, введенных отличному от человека животному, относительно концентрации или количества белка Cas, введенного отличному от человека животному.
49. Способ по п. 44, при котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой направляющие РНК, введенные отличному от человека животному.
50. Способ по п. 44, при котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой белок Cas, введенный отличному от человека животному.
51. Способ исследования индуцированной CRISPR/Cas рекомбинации геномной нуклеиновой кислоты с экзогенной донорской нуклеиновой кислотой in vivo, предусматривающий:
(а) предоставление отличного от человека животного по любому из пп. 1-30, в котором репортер CRISPR также предназначен для оценки индуцированной CRISPR/Cas рекомбинации репортера CRISPR с экзогенной донорской нуклеиновой кислотой, причем первый сигнал полиаденилирования был удален из репортера CRISPR и причем кодирующая последовательность для первого репортерного белка содержит третью целевую последовательность направляющей РНК, и введение отличному от человека животному:
(i) направляющей РНК, предназначенной для гибридизации с третьей целевой последовательностью направляющей РНК в репортере CRISPR;
(ii) белка Cas и
(iii) экзогенной донорской нуклеиновой кислоты, способной рекомбинировать с репортером CRISPR и изменять кодирующую последовательность для первого репортерного белка на кодирующую последовательность для третьего репортерного белка; и
(b) измерение активности или экспрессии третьего репортерного белка.
52. Способ по п. 51, при котором белок Cas представляет собой белок Cas9.
53. Способ по п. 51, при котором белок Cas вводят отличному от человека животному в форме белка.
54. Способ по п. 51, при котором белок Cas вводят отличному от человека животному в форме информационной РНК, кодирующей белок Cas.
55. Способ по п. 51, при котором белок Cas вводят отличному от человека животному в форме ДНК, кодирующей белок Cas, причем ДНК функционально связана с промотором, активным в одном или нескольких типах клеток отличного от человека животного.
56. Способ по любому из пп. 51-55, при котором третий репортерный белок, измеренный на стадии (b), представляет собой флуоресцентный репортерный белок, а стадия (b) предусматривает анализ с помощью проточной цитометрии.
57. Способ по любому из пп. 51-56, при котором первый репортерный белок представляет собой усиленный синий флуоресцентный белок (eBFP), а третья направляющая РНК содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14.
58. Способ по любому из пп. 51-57, при котором первый репортерный белок представляет собой усиленный синий флуоресцентный белок (eBFP), а третий репортерный белок представляет собой усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP).
59. Способ по п. 58, при котором экзогенная донорская нуклеиновая кислота содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 16.
60. Способ по любому из пп. 51-59, при котором экзогенная донорская нуклеиновая кислота представляет собой одноцепочечный дезоксинуклеотид.
61. Способ по любому из пп. 51-60, при котором направляющую РНК на стадии (а) вводят в форме РНК.
62. Способ по любому из пп. 51-60, при котором направляющую РНК на стадии (а) вводят отличному от человека животному в форме ДНК, кодирующей направляющую РНК, причем ДНК функционально связана с промотором, активным в одном или нескольких типах клеток отличного от человека животного.
63. Способ по любому из пп. 51-62, при котором введение предусматривает опосредованную аденоассоциированным вирусом (AAV) доставку, опосредованную липидными наночастицами доставку или гидродинамическую доставку.
64. Способ по п. 63, при котором введение предусматривает опосредованную доставку AAV.
65. Способ по п. 64, при котором введение предусматривает опосредованную доставку AAV8, а стадия (b) предусматривает измерение активности репортерного белка в печени отличного от человека животного.
66. Способ оптимизации способности CRISPR/Cas индуцировать рекомбинацию геномной нуклеиновой кислоты с экзогенной донорской нуклеиновой кислотой in vivo, предусматривающий:
(I) выполнение способа по любому из пп. 51-65 в первый раз у первого отличного от человека животного;
(II) изменение переменной и выполнение способа стадии (I) во второй раз с измененной переменной у второго отличного от человека животного и
(III) сравнение активности или экспрессии третьего репортерного белка на стадии (I) с активностью или экспрессией третьего репортерного белка на стадии (II) и выбор способа, приводящего к более высокой активности или экспрессии третьего репортерного белка.
67. Способ по п. 66, при котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой способ доставки путем введения одного или нескольких из направляющей РНК, белка Cas и экзогенной донорской нуклеиновой кислоты отличному от человека животному.
68. Способ по п. 66, при котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой путь введения одного или нескольких из направляющей РНК, белка Cas и экзогенной донорской нуклеиновой кислоты, вводимых отличному от человека животному.
69. Способ по п.66, при котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой концентрацию или количество одного или нескольких из направляющей РНК, белка Cas и экзогенной донорской нуклеиновой кислоты, введенной отличному от человека животному.
70. Способ по п. 66, при котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой экзогенную донорскую нуклеиновую кислоту, введенную отличному от человека животному.
71. Способ по п. 66, при котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой концентрацию или количество направляющей РНК, введенной отличному от человека животному, относительно концентрации или количества белка Cas, введенного отличному от человека животному.
72. Способ по п. 66, при котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой направляющую РНК, введенную отличному от человека животному.
73. Способ по п. 66, при котором измененная переменная на стадии (II) представляет собой белок Cas, введенный отличному от человека животному.
74. Клетка отличного животного, содержащая репортер CRISPR для оценки индуцированного CRISPR/Cas вырезания нуклеиновой кислоты между первой и второй целевыми последовательностями направляющих РНК, причем репортер CRISPR интегрирован в целевой геномный локус и содержит первый сигнал полиаденилирования, фланкированный первой и второй целевыми последовательностями направляющих РНК, за которыми следует репортерная кассета, содержащая кодирующую последовательность для первого репортерного белка и кодирующую последовательность для второго репортерного белка в любом порядке, причем первый репортерный белок и второй репортерный белок различны.
75. Геном отличного от человека животного, содержащий репортер CRISPR для оценки индуцированного CRISPR/Cas вырезания нуклеиновой кислоты между первой и второй целевыми последовательностями направляющих РНК, причем репортер CRISPR интегрирован в целевой геномный локус и содержит первый сигнал полиаденилирования, фланкированный первой и второй целевыми последовательностями направляющих РНК, за которыми следует репортерная кассета, содержащая кодирующую последовательность для первого репортерного белка и кодирующую последовательность для второго репортерного белка в любом порядке, причем первый репортерный белок и второй репортерный белок различны.
76. Нацеливающий вектор, содержащий репортер CRISPR, фланкированный плечами гомологии, причем репортер CRISPR предназначен для оценки индуцированного CRISPR/Cas вырезания нуклеиновой кислоты между первой и второй целевыми последовательностями направляющих РНК, причем репортер CRISPR содержит первый сигнал полиаденилирования, фланкированный первой и второй целевыми последовательностями направляющих РНК, за которыми следует репортерная кассета, содержащая кодирующую последовательность для первого репортерного белка и кодирующую последовательность для второго репортерного белка в любом порядке, причем первый репортерный белок и второй репортерный белок различны, и причем плечи гомологии подходят для направления рекомбинации с желаемым целевым геномным локусом для облегчения геномной интеграции.
77. Способ получения отличного от человека животного по любому из пп. 1-30, предусматривающий:
(а) модификацию генома плюрипотентной клетки отличного от человека животного для включения репортера CRISPR, интегрированного в целевой геномный локус, причем репортер CRISPR предназначен для оценки индуцированного CRISPR/Cas вырезания нуклеиновой кислоты между первой и второй целевыми последовательностями направляющих РНК, причем репортер CRISPR содержит первый сигнал полиаденилирования, фланкированный первой и второй целевыми последовательностями направляющих РНК, за которыми следует репортерная кассета, содержащая кодирующую последовательность для первого репортерного белка и кодирующую последовательность для второго репортерного белка в любом порядке, причем первый репортерный белок и второй репортерный белок различны;
(b) идентификацию или отбор генетически модифицированной плюрипотентной клетки отличного от человека животного, содержащей репортер CRISPR;
(c) введение генетически модифицированной плюрипотентной клетки отличного от человека животного в эмбрион-хозяина отличного от человека животного и
(d) имплантация и гестация эмбриона-хозяина отличного от человека животного в суррогатной матери.
78. Способ получения отличного от человека животного по любому из пп. 1-30, предусматривающий:
(а) изменение генома эмбриона одноклеточной стадии отличного от человека животного для включения репортера CRISPR, интегрированного в целевой геномный локус, причем репортер CRISPR предназначен для оценки индуцированного CRISPR/Cas вырезания нуклеиновой кислоты между первой и второй целевыми последовательностями направляющих РНК, причем репортер CRISPR содержит первый сигнал полиаденилирования, фланкированный первой и второй целевыми последовательностями направляющих РНК, за которыми следует репортерная кассета, содержащая кодирующую последовательность для первого репортерного белка и кодирующую последовательность для второго репортерного белка в любом порядке, причем первый репортерный белок и второй репортерный белок различны;
(b) отбор генетически модифицированного эмбриона одноклеточной стадии отличного от человека животного и
(с) имплантацию и гестацию генетически модифицированного эмбриона одноклеточной стадии отличного от человека животного в суррогатной матери.