Успешное применение генной терапии для лечения Х-сцепленной формы адренолейкодистрофии

I I I I I I

I I I

30

Новости клеточных технологий

трансплантации ГСК в 5% растворе альбумина, и не вызывало острых побочных эффектов в виде лихорадки, головной боли, тошноты, рвоты, гипотензии. В двух случаях исследователи были вынуждены вводить НК-лимфоциты пациентам с рецидивом острого лейкоза, остальным — в фазе ремиссии.

Средняя выживаемость после трансплантации ГСК составила 18,7 мес. У одного пациента развилась острая (на седьмой день после введения НК-лимфоцитов), у четырех — хроническая реакция «трансплантат против хозяина» (в среднем между 14 и 68 днем после инфузии НК-лимфоцитов), однако авторы отмечают невозможность установления однозначной причины — введение ГСК или НК-лимфоцитов от ША-несовместимых доноров. Важно, что в двух случаях, когда исследователи были вынуждены трансплантировать НК-лимфоциты в активной стадии лейкоза, антиопухолевого эффекта не наблюдалось, что, возможно, связано со значительным преобладанием трансформированных клеток по отношению к введенным.

Авторы в своей работе не указали причины смерти пациентов, тем самым оставив без оценки эффективность введения НК-лимфоцитов для предупреждения рецидивов лейкозов, что, на первый взгляд, было бы вполне реализуемо в условиях данного клинического исследования. Основной акцент был сделан на доказательстве выполнимости экспансии НК-лимфоцитов in vitro из CD34+ предшественников и возможности их дальнейшего использования в терапии пациентов, перенесших трансплантацию HLA-несовместимых ГСК, без индукции острой реакции «трансплантат против хозяина». Положительные результаты работы позволили авторам сформулировать направления дальнейших исследований, касающихся определения максимально возможной «дозы» НК-лимфоцитов, которую можно трансплантировать в организм реципиентов без серьезных побочных эффектов, а также определения эффективности их применения для предупреждения рецидивов лейкозов.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Carella М.А., Lerma Е., Dejana A. Engraftment of HLA-matched sibling hematopoietic stem cells after immunosuppressive conditioning regimen in patients with hematologic neoplasias. Haematologica 1998; 83: 9D4—9.

2. Ljungman P., Urbano-lspizua A., Cavazzana-Calvo M. et al. Allogeneic and autologous transplantation for haematological diseases, solid tumours and immune disorders: definitions and current practice in Europe. Bone Marrow Transplantation 2006; 37: 439—49.

3. Kumar L. Leukemia: management of relapse after allogeneic bone marrow transplantation. J. Clin. Oncol. 1994; 12C8): 1710—7.

4. Verheyden S., Demanet C. NK cell receptors and their ligands in leukemia. Leukemia 2DD8; 22: 249-57.

5. Ruggeri L., Capanni M., Urbani E. et al. Effectiveness of donor natural killer cell alloreactivity in mismatched hematopoietic transplants. Science 2002; 295: 2097-100.

6. Lundqvist A., Philip McCoy J., Samsel L., Childs R. Reduction of GVHD and enhanced antitumor effects after adoptive infusion of alloreactive Ly49-mismatched NK cells from MHC-matched donors. Blood 2007; 109: 3603-6.

Подготовил И.Я. Базо

По материалам: Yoon S.R., Lee Y.S., Yang S.H, et al. Generation of donor natural killer cells from С034ю progenitor cells and

subsequent infusion after HLA-mismatched allogeneic hematopoietic cell transplantation: a feasibility study. Bone Marrow Transplant, Published online 2 November 2009

Успешное применение генной терапии для лечения Х-сцепленной формы адренолейкодистрофии

Наследственная Х-сцепленная форма адренолейкодистрофии (АЛД) представляет собой фатальное де-миелинизирующее заболевание центральной нервной системы (ЦНС), причиной которого являются мутации в гене АВС01, кодирующем белок-транспортер АШР, локализованный в мембранах пероксисом [1 ]. В пероксисо-мах олигодендроцитов и клеток микроглии этот белок участвует в транспорте эфиров длинноцепочечных жирных кислот (ДЦЖК; более 22 атомов углерода в алифатическом «хвосте»), что необходимо для миелинизации нервных волокон [2]. В результате мутации развивается мультифокальный демиелинизирующий процесс, который приводит к гибели больного, как правило, еще в подростковом возрасте.

Единственным способом излечить это врожденное заболевание является аллогенная трансплантация ге-мопоэтических клеток. Успех подобной терапии может быть достигнут только на ранних стадиях болезни и при наличии подходящего донора [3]. Поскольку микрогли-альные клетки имеют миелоидное происхождение, полагают, что замещение мутантных гемопоэтических

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, 1У» 1, 2010

стволовых клеток и клеток-предшественников реципиента «здоровыми» клетками донора позволяет в итоге восстановить процесс миелинизации нервных волокон в ЦНС. Действительно, было показано, что костномозговые клетки человека, трансплантированные мышам, мигрируют в головной мозг и дифференцируются в мик-роглиальные клетки, экспрессирующие ALDP [4].

Долгосрочные результаты клинического испытания по применению трансплантации генетически «исправленных» аутологичных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), проведенной двум пациентам с АЛД, были опубликованы в журнале «Science». Несомненно, эта работа стала кульминацией продолжительных исследований д-ра Натали Картье (Nathalie Cartier; INSERM) и проф. педиатрии Патрика Збера (Patrick Aubourg; INSERM и госпиталь Сент-Винсент де Поля) [5]. У обоих пациентов (возраст 7,5 и 7 лет) были обнаружены мутации в гене ABCD1. Несмотря на прогрессирующую демиелинизацию и недостаточность функции надпочечников, отсутствие совместимого донора не давало возможности провести аллогенную трансплантацию.

Новости клеточных технологий

После процедуры В-СБГ-индуцированной мобилизации С034+ клетки были выделены с помощью имму-номагнитной сепарации. Для генетической коррекции клеток пациентов использовали лентивирусный вектор на основе ВИЧ-1, содержащий интактную копию гена АВС01. В результате трансдукции 50% и 33% трансплантированных С034+ клеток экспрессировали функционально активный белок АШР, что привело к более чем двукратному (55% и 68%) снижению в этих клетках уровня ДЦЖК. Инфузию модифицированных С034+ клеток проводили после процедуры полной миелоаб-ляции (циклофосфамид и бисульфан), что важно для успешного приживления трансплантата, поскольку лен-тивирусная коррекция не дает трансплантированным клеткам пролиферативного преимущества по сравнению с остаточными, мутантными ГСК. Восстановление ге-мопоэза у пациентов наступило соответственно на 13-е и 15-е сут.

Посттрансплантационный анализ показал, что со временем экспрессия АШР в мононуклеарных клетках периферической крови постепенно снижается, стабилизируясь на уровне 10% и 15% спустя 30 и 24 мес. после трансплантации (соответственно для 1-го и 2-го пациентов). Разные популяции клеток крови экспрессировали примерно одинаковое количество АШР (9—14%),

уровень экспрессии АШР в С034+ клетках был выше, около 18%.

Поскольку места геномной интеграции вектора представляют собой высоко специфичный маркер для анализа отдельных клеточных клонов, авторы работы провели детальное исследование репертуара инсерци-онных сайтов (ИС) с помощью амплификации уникальных геномных последовательностей, фланкирующих интегрированный вектор (ЬАМ-РСВ^ полимеразная цепная реакция, опосредованная линейной амплификацией) [6], и последующего секвенирования полученного ампликона. Было обнаружено 2217 и 1380 уникальных ИС, большая доля которых располагалась в областях, богатых генами. Этот подход позволил выявить 1,4% и 4,6% ИС, присутствующих как в лимфоидных, так и в миелоидных клетках. Это означает, что вектор был интегрирован в истинные ГСК, способные давать начало клеткам обеих ветвей гемопоэза. Кроме того, количественный анализ ИС показал, что клональный репертуар распределен равномерно: не было обнаружено таких ИС, интеграция вектора в которые приводила бы к активной пролиферации клона и клональному доминированию.

Спустя 14—16 мес. после трансплантации у пациентов прекратилась прогрессирующая демиелинизация

Схема генной терапии Х-сцеппенной формы адренолейкодистрофии

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 1, 2010

т

I I I I I I

I I I

32

Новости клеточных технологий

пирамидального тракта, фронтального белого вещества и других пораженных зон головного мозга. Это сопровождалось стабилизацией нейрологических и когнитивных функций и снижением уровня ДЦЖК в плазме на 38^39%. Важно отметить, что коррекция уровня ДЦЖК оказалась значительно больше ожидаемой, поскольку функционально полноценный АШР экспрессировало лишь 14% моноцитов.

Успешные результаты этого клинического испытания во многом обусловлены верным выбором вектора для генетической коррекции С034+ клеток. Сокращенный протокол для трансдукции и стабильная экспрессия трансгена несмотря на отсутствие клонального доминирования у трансдуцированных клеток — несомненно, важные преимущества использованного лентивирусного вектора на основе ВИЧ-1. Кроме того, данный вектор содержит инактивирующийся промотер/энхансер длинных терминальных повторов НТВ), что предотвращает генотоксические эффекты, обусловленные транскрип-ционно активными ШЗ [7], а, значит, снижает вероятность онкотрансформации модифицированных клеток.

Главным и неожиданным выводом из этой работы явилось то, что стабильная экспрессия АШР лишь в примерно 15% С014+ моноцитов достаточна для купирования демиелинизирующего процесса и нейрологи-

ческих нарушений у пациентов. Это кардинально отличается от результатов аллогенной трансплантации ГСК у больных АЛД, где блокада прогрессирующей демие-линизации в головном мозге наблюдалась только при более чем 80% приживлении донорских кроветворных клеток [3]. Авторы полагают, что такая разница может быть обусловлена выраженной экспрессией белка ALDP в генетически модифицированных микроглиальных клетках, что позволяет купировать демиелинизацию нервной ткани.

После длительного периода неудач и скептицизма прошедший год можно, несомненно, обозначить как год возвращения генной терапии в ряды перспективных подходов для лечения наследственных заболеваний [8]. Этот факт был однозначно подчеркнут журналом Science при традиционном ежегодном отборе наиболее значимых событий в сфере науки [9]. Так, успешные долгосрочные результаты также были получены при лечении аутосомно-рецессивной формы тяжелого комбинированного иммунодефицита (дефицит аденозиндезаминазы) [10] и амавроза Лебера (врожденная дистрофия сетчатки глаза) [11]. Клинические испытания с привлечением большего числа пациентов должны в дальнейшем определить судьбу генной терапии этих наследственных заболеваний.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Aubourg P., Mandel J.L. X-linked adrenoleukodystrophy. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1996; 804: 461-76.

2. Aubourg P., Dubois-Dalcq M. X-linked adrenoleukodystrophy enigma: how does the ALD peroxisomal transporter mutation affect CNS glia? Glia 2000; 29C2]: 186-90.

3. Shapiro E., Krivit W., Lockman L. et al. Long-term effect of bone-marrow transplantation for childhood-onset cerebral X-linked adrenoleukodystrophy. Lancet 2000; 356C9231): 713—8.

4. Asheuer М., Pflumio F., Benhamida S. et al. Human CD34 1 cells differentiate into microglia and express recombinant therapeutic protein. PNAS 2004; 101 [101: 3557-62.

5. Successful treatment of adrenoleukodystrophy by transplantation of stem cells carrying a new gene therapy vector. INSERM, press information, Friday 06 November 2009. www.inserm.fr/content/ download/5367/43422/file/cp_adrenoleucodystrophie_ 06nov09 [version anglaisel.pdf

6. Schmidt M., SchwarzwaelderK., Bartholomae C. et al. Fligh-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR [LAM-PCR], Nat. Methods. 2007; 4C121: 1051-7.

7. Montini E., Cesana D., Schmidt M. et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of FISC gene therapy. J. Clin. Invest. 2009; 119C4]: 964-75.

8. Naldini L. Medicine. A comeback for gene therapy. Science 2009; 326C5954): 805-6.

9. Breakthrough of the year. The runners-up. Science 2009; 326C5960): 1600-7.

10. Auti A., Cattaneo F., Galimberti S. et al. Gene therapy for immunodeficiency due to adenosine deaminase deficiency. N. Engl. J. Med. 2009; 360C5): 447-58.

11. Maguire A., Fligh K., Auricchio A. et al. Age-dependent effects of RPE65 gene therapy for Leber’s congenital amaurosis: a phase 1 dose-escalation trial. Lancet 2009; 374(97011: 1597—605.

Подготовил А.В. Лелявский

По материалам: Cartier N„ Hacein-Bey-Abina S., Bartholomae C.C. et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-Hnked adrenoleukodystrophy. Science 2009: 326 (5954): 818-23

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, ІУ» 1, 2010