ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ NO-СИНТАЗЫ И КОННЕКСИНА-37 КАК ФАКТОР РИСКА РАЗВИТИЯ ИНФАРКТА МИОКАРДА У ЛИЦ БЕЗ КОРОНАРНОГО АНАМНЕЗА

© Коллектив авторов, 2013

Полиморфизм генов эндотелиальной NO-синтазы и коннексина-37 как фактор риска развития инфаркта миокарда у лиц без коронарного анамнеза

А.В. БАЛАЦКИЙ1, Е.Ю. АНДРЕЕНКО2, Л.М. САМОХОДСКАЯ1, С.А. БОЙЦОВ2, В.А. ТКАЧУК1

'Факультет фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова; Государственный научно-исследовательский центр профилактической медицины Минздрава России, Москва

Endothelial NO synthase and connexin 37 gene polymorphisms as a risk factor for myocardial infarction in subjects without a history of coronary artery disease

A.V. BALATSKY1, E.YU. ANDREENKO2, L.M. SAMOKHODSKAYA1, S.A. BOITSOV2, V.A. TKACHUK1

'Faculty of Fundamental Medicine, M.V. Lomonosov State University; 2State Research Center of Preventive Medicine, Ministry of Health of Russia, Moscow

Резюме

Цель исследования. Определение роли полиморфизмов C1019T гена коннексина-37 (Cx37) и G894T гена эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) в развитии инфаркта миокарда (ИМ) у лиц без коронарного анамнеза.

Материалы и методы. В исследование включили 183 мужчин, из них у 56 (18,1%) ИМ развился на фоне клинически и инструментально подтвержденной ишемической болезни сердца (кроме ИМ), а у 127 (81,9%) — без предшествующих клинических признаков ишемической болезни сердца. Полиморфизм генов идентифицировали при помощи полимеразной цепной реакции и анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов.

Результаты. Распространенность аллели G гена eNOS в группе больных ИМ на фоне ИБС составила 59,8%, а у пациентов с ИМ без предшествующего коронарного анамнеза — 75,6% (р<0,01). Генотип GG встречался в 32,1 и 54,3% случаев соответственно (р=0,01; отношение шансов — ОШ 2,5 при 95% доверительном интервале — ДИ от 1,3 до 4,9). Для гена Cx37 распространенность мутантного аллеля Т в группе больных ИМ на фоне ИБС составила 29,5%, а у пациентов с ИМ без предшествующего коронарного анамнеза — 59,8% (р<0,01). Генотип ТТ встречался в 7,1 и 42,5% случаев соответственно (р<0,01; ОШ 9,6 при 95% ДИ от 3,3 до 28,4). Среди пациентов с ИМ на фоне предшествующей ИБС не выявлено ни одного с сочетанием генотипов GG и ТТ, тогда как у пациентов с ИМ без предшествующего коронарного анамнеза такое сочетание обнаружено в 23,6% случаев (р<0,01).

Заключение. Определение полиморфизмов C1019T гена Сх37 и G894T гена eNOS может быть использовано для выявления генетической предрасположенности к развитию ИМ у пациентов с гемодинамически незначимым атеросклерозом и у практически здоровых лиц.

Ключевые слова: инфаркт миокарда, генетика, полиморфизм, коннексин-37, эндотелиальная NO-синтаза.

Aim. To define a role of connexin37 (Cx37) C1019T and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) G894T polymorphisms in the development of myocardial infarction (MI) in subjects without a history of coronary artery disease.

Subjects and results. The investigation enrolled 183 male patients, of whom 56 (18.1%) developed MI in the presence of clinically and instrumentally verified coronary heart disease (CHD) (except MI) and 127 (81.9%) patients did without any previous clinical signs of CHD. The gene polymorphisms were identified using polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis.

Results. The spread of the G allele in the eNOS gene was 59.8% in the patients with MI in the presence of CHD and 75.6% in those with MI without a history of coronary artery disease (p<0.01). The GG genotype was found in 32.1 and 54.3%, respectively (p=0.01; the odds ratio (OR) was 2.5 with 95% confidence interval (CI) 1.3 to 4.9). The spread of the mutant T allele in the Cx37 gene was 29.5% in the patients with MI in the presence of CHD and 59.8% in those with MI without a history of coronary artery disease (p<0.01). The TT genotype was encountered in 7.1 and 42.5% of cases, respectively (p=0.01; OR 9.6 with 95% CI 3.3 to 28.4). There was no case of a combination of GG and TT genotypes among the patients with MI in the presence of CHD whereas this was found in 23.6% of the MI cases without a history of coronary artery disease (p<0.01).

Conclusion. Determination of Cx37 C1019T and eNOS G894T polymorphisms may be used to detect a genetic predisposition to the development of MI in patients with hemodynamically insignificant atherosclerosis and in apparently healthy individuals.

Key words: myocardial infarction, genetics, polymorphism, connexin 37, endothelial nitric oxide synthase.

АГ — артериальная гипертония АСБ — атеросклеротическая бляшка ГМК — гладкие мышечные клетки ГХС — гиперхолестеринемия ДИ — доверительный интервал ИБС — ишемическая болезнь сердца

ИМ — инфаркт миокарда

ОШ — отношение шансов

ПЦР — полимеразная цепная реакция

ССЗ — сердечно-сосудистые заболевания

Cx37 — коннексин-37

eNOS — эндотелиальная NO-синтаза

Инфаркт миокарда (ИМ) представляет важную меди- из ведущих причин инвалидности и вносит значительный цинскую и социальную проблему, поскольку стал одной вклад в структуру смертности во всем мире. Доказано, что

причиной большинства ИМ служит внутрисосудистый тромбоз, возникающий, как правило, на месте атероскле-ротической бляшки (АСБ) с поврежденной поверхностью [1]. При этом бляшки, вызывающие ИМ, чаще всего являются неокклюзирующими и сужают просвет артерии в среднем на 48% [2]. Такие поражения, как правило, гемо-динамически не значимы и не приводят к возникновению типичных симптомов стенокардии. Соответственно лица с подобными АСБ в большинстве случаев считаются практически здоровыми, поэтому возникновение у них ИМ представляется внезапным событием. Ситуация усугубляется тем, что не разработано надежных методов доклинической диагностики ИМ.

В развитии ИМ существенную роль играют генетически обусловленные вариации активности белков, вовлеченных в патогенез атеросклероза и его осложнений [3— 5]. Поскольку для многих генетических факторов не существует биохимических или иных коррелятов, поддающихся измерению у пациентов, наиболее перспективным направлением в доклинической диагностике и прогнозировании развития ИМ у лиц без клинических проявлений ишемической болезни сердца (ИБС) представляется метод прямого генотипирования.

Ранее нами выявлена связь полиморфизма ряда генов с развитием ИБС и ИМ у мужчин моложе 55 лет [6, 7]. Эта связь, в частности, подтверждена для генов эндотелиаль-ной КО-синтазы (eNOS, полиморфизм G894T) и коннексина-37 (Cx37, полиморфизм С1019Т) [7].

Коннексины — политопные интегральные мембранные белки; 6 коннексинов образуют коннексон, а 2 кон-нексона в плазматических мембранах контактирующих клеток, располагаясь друг напротив друга, формируют непрерывный канал, соединяющий внутреннее содержимое двух клеток. Сх37 в организме человека экспрессируется, в частности, в эндотелии и моноцитах. По мере прогрес-сирования атеросклероза Сх37 начинает экспрессиро-ваться также в гладких мышечных клетках (ГМК), находящихся под АСБ [8]. Cx37 участвует в адгезии моноцитов, опосредуя взаимодействие между эндотелием и ГМК сосудов и в настоящее время обсуждается как важный молекулярный фактор, вовлеченный в развитие атеросклероза [9]. В то же время функциональное значение указанного полиморфизма гена Cx37 остается не изученным.

еК08 постоянно экспрессируется в эндотелии сосудов, катализируя образование оксида азота (N0) из L-аргинина. Замена гуанина тимином в 894-й позиции гена КО-синтазы 3-го типа приводит к замене глутамина аспарагином в 298-й позиции самого фермента ^1и298Ар). Молекулярные исследования продемонстрировали отсут-

Сведения об авторах:

Андреенко Елена Юрьевна — к.м.н., н.с. отд. клинической кардиологии и молекулярной генетики ГНИЦ профилактической медицины

Самоходская Лариса Михайловна — к.м.н., доц., с.н.с. лаб. генных и клеточных технологий факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В.Ломоносова

Бойцов Сергей Анатольевич — д.м.н., проф., ген. дир. ГНИЦ профилактической медицины

Ткачук Всеволод Арсеньевич — д.б.н., акад. РАН и РАМН, проф., декан факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В.Ломоносова

ствие различий по ферментативной активности между ал-лельными вариантами eNOS [10], однако при исследовании нативных сосудов показано снижение каталитической активности у носителей аллеля Т eNOS [11].

В последнее время появились сведения об экспериментах in vitro, показывающих возможное взаимодействие Сх37 с eNOS [12]. Согласно полученным данным интенсивность взаимодействия не связана с генетическим полиморфизмом, однако в связи с большой значимостью NO в развитии сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) представляется важным совместное изучение этих двух белков.

Целью работы являлось определение роли полиморфизма генов Cx37 и eNOS в развитии ИМ у лиц без коронарного анамнеза.

Материалы и методы

В исследование включили 183 мужчин в возрасте от 26 до 55 лет с клинически и инструментально подтвержденным диагнозом ИМ; возраст развития ИМ моложе 55 лет. Критериями исключения были нарушение толерантности к глюкозе и сахарный диабет. Перенесенный ИМ подтвержден отклонением от нормы биохимических маркеров (фракция МВ креатинфосфокиназы, кардиоспецифичных тропонинов Т и I) и типичными изменениями на электрокардиограмме. Артериальную гипертонию (АГ) диагностировали на основании следующих критериев: систолическое артериальное давление >140 мм рт.ст. или диастолическое артериальное давление >90 мм рт.ст. в отсутствие антигипертен-зивной терапии и длительностью анамнеза АГ >1 года. Ожирение констатировали на основании индекса массы тела >30 кг/м2. Ги-перхолестеринемию (ГХС) диагностировали на основании повышения уровня общего холестерина >5,3 ммоль/л. Из числа включенных в исследование у 56 (30,6%) ИМ развился на фоне клинически и инструментально подтвержденной ИБС (кроме ИМ), а у 127 (69,4%) — без предшествующих клинических признаков ИБС.

Идентификация полиморфизма генов. ДНК выделяли из венозной крови методом фенолхлороформной экстракции. Полиморфизм генов идентифицировали при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) и анализа полиморфизма длин рестрик-ционных фрагментов. ПЦР проводили на термоциклере Speed-Cycler («Analytik Jena», Германия) с применением соответствующих праймеров и готовой реакционной смеси DreamTaq Green PCR Master Mix («Fermentas», Латвия). Визуализацию результатов осуществляли путем электрофореза в 2% агарозном геле с бромистым этидием при 4 В/см. Условия проведения генотипи-рования для каждого гена представлены в табл. 1.

Статистический анализ. Нормальность распределения количественных признаков оценивали при помощи критерия Шапи-ро—Уилка. В случае нормального распределения значимость различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента, для значений, не распределенных нормально, использовали ¿/-критерий Манна—Уитни. Данные представлены в виде медианы (интер-квартильный размах). Статистическую значимость различий качественных признаков в сравниваемых группах оценивали при помощи критерия х2 с поправкой Йетса на непрерывность для таблиц 2x2. В случае неприменимости данного критерия использовался двусторонний точный критерий Фишера. Уровень значимости был принят как p<0,05. Отношение шансов (ОШ) опре-

Контактная информация:

Балацкий Александр Владимирович — асп. каф. биохимии и молекулярной медицины факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова; 119192 Москва, Ломоносовский пр-т, д. 31, корп. 5; тел./факс: +7(495)939-2430; e-mail: balatsky@fbm. msu.ru

Таблица 1. Условия генотипирования

Параметр

Полиморфизм

G894T гена гЫОЗ

С1019Т гена Сх37

Праймеры

Параметры амплификации

Рестриктаза

Длина рестрикционных

фрагментов

5'-GGCTGGACCCCAG GAAAC-3, 5'-CCACCCAGTCAATCC CTTTG-3,

Денатурация 95 °С — 4' 30 циклов, включающих: денатурацию 95 °С — 10" отжиг 61,3 °С — 10" элонгацию 72 °С — 20" МЬо I GG: 152 п.о. GT: 152 п.о., 92 п.о., 60 п.о. ГГ 92 п.о., 60 п.о.

5'-CTGGACCCACCCCCT CAGAATGGCCAA AGA-3'

5'-AGGAAGCCGTAGTG CCTGGTGG-3, Денатурация 95 °С — 4' 30 циклов, включающих: денатурацию 95 °С — 10"

отжиг 60 °С — 10" элонгацию 72 °С — 20" DгdI

СС: 240 п.о., 35 п.о.

СТ: 275 п.о., 240 п.о., 35 п.о.

TT: 275 п.о.

Примечание. п.о. — пары оснований.

Таблица 2. Характеристика включенных в исследование больных ИМ на фоне ИБС и ИМ без коронарного анамнеза

Показатель Больные с ИМ на фоне ИБС (и=56) Больные ИМ без коронарного анамнеза (и=127) р

Медиана возраста начала заболевания 47,0 (43; 51,3) 47,0 (44,0; 52,0) 0,34

Наличие АГ 42 (75) 76 (59,8) 0,07

Курение 35 (62,5) 68 (53,5) 0,36

ГХС 23 (41,1) 35 (27,6) 0,10

Ожирение 17 (30,4) 29 (22,8) 0,37

Примечание. Данные представлены в виде медианы (25-й процентиль; 75-й процентиль) или абсолютного числа больных (%).

Таблица 3. Результаты генотипирования

Гены

Группа €N08 G894T, генотипы СС Сх37 СЮОТ, генотипы СТ ТТ Всего

Больные ИМ на фоне ИБС (и=56) GG 8 10 0 18

GT 15 12 4 31

'П 4 3 0 7

Всего 27 25 4 56

Больные ИМ без коронарного GG 16 23 30 69

анамнеза (и=127) GT 12 19 23 54

'П 1 2 1 4

Всего 29 44 54 127

деляли как отношение вероятности того, что событие произойдет, к вероятности того, что событие не произойдет, с 95% доверительным интервалом (ДИ). Для статистической обработки использовали пакет программы $1аИ8Иса 6.0.

Результаты

Медиана возраста обследованных составила 47 (44; 52) лет. Курили 103 (56,3%) пациента, 118 (64,5%) страдали АГ, 46 (25,2%) — ожирением, у 58 (31,7%) выявлена ГХС. Сравнительная характеристика пациентов с ИМ на фоне предшествующей ИБС и ИМ без коронарного анамнеза по основным факторам риска развития ССЗ представлена в табл. 2. Из приведенных данных видно, что

группы не различались по распространенности основных факторов риска развития ССЗ. Таким образом, в возможные различия между группами наиболее существенный вклад вносит именно генетический компонент.

В группах пациентов проанализировано распределение генотипов €N05 и Сх37, а также их сочетание (табл. 3). Распространенность аллеля G гена €N05 в группе больных ИМ на фоне ИБС составила 59,8%, а у пациентов с ИМ без предшествующего коронарного анамнеза — 75,6% (р<0,01). Генотип GG у пациентов с ИМ на фоне ИБС встречался в 32,1% случаев, а у пациентов с ИМ без предшествующего коронарного анамнеза — в 54,3% случаев (р=0,01; ОШ=2,5 при 95% ДИ от 1,3 до 4,9). Генотип GT встречался в 55,4 и 42,5% случаев, а генотип П" — в

Рис. 1. Распределение генотипов eNOS по группам пациентов.

*p=0,01; ОШ 2,5 при 95% ДИ от 1,3 до 4,9.

Рис. 2. Распределение генотипов Сх37 по группам пациентов.

*/»<0,01; ОШ 9,6 при 95% ДИ от 3,3 до 28,4.

12,5 и 3,1% случаев соответственно (рис. 1). Таким образом, генотип GG, соответствующий наиболее высокому уровню каталитической активности eNOS, существенно чаще встречается у лиц, перенесших ИМ без предшествующего коронарного анамнеза.

Для гена Cx37 распространенность мутантного аллеля Т в группе больных ИМ на фоне ИБС составила 29,5%, а у пациентов с ИМ без предшествующего коронарного анамнеза — 59,8% (р<0,01). Генотип СС у пациентов с ИМ на фоне ИБС встречался в 48,2% случаев, а у пациентов с ИМ без предшествующего коронарного анамнеза — в 22,8%. Генотип GT встречался в 44,6 и 34,6% случаев, а генотип TT — в 7,1 и 42,5% случаев (p<0,01; ОШ=9,6 при 95% ДИ от 3,3 до 28,4) соответственно (рис. 2).

Сочетание носительства аллели G (генотипы GG и GT) гена eNOS и аллели Т (генотипы СТ и ТТ) гена Cx37 обнаружено у 26 (46,4%) пациентов с ИМ на фоне ИБС и у 95 (74,8%) с ИМ без предшествующего коронарного анамнеза (р<0,01; ОШ 3,4 при 95% ДИ от 1,8 до 6,6). Учитывая приведенные выше результаты, можно предположить, что прогностически наиболее значимым является сочетание генотипов GG и ТТ. Среди пациентов с ИМ на

фоне предшествующей ИБС не обнаружено ни одного с таким генотипом, тогда как у пациентов с ИМ без предшествующего коронарного анамнеза указанное сочетание выявлено в 30 (23,6%; р<0,01) случаях.

Обсуждение

Данные о связи полиморфизма генов eNOS и Сх37 с развитием ИМ у лиц без коронарного анамнеза или их влиянии на стабильность АСБ в литературе отсутствуют. Тем не менее на основании информации о физиологических эффектах N0 можно сделать предположение о возможном механизме такого влияния. В настоящее время установлены многие антиатерогенные эффекты N0. Помимо влияния на сосудистый тонус, N0 оказывает инги-бирующее действие на адгезию лейкоцитов, активацию, адгезию и агрегацию тромбоцитов, подавляет экспрессию провоспалительных генов и т.д. Однако N0 ингибирует миграцию и пролиферацию ГМК [13, 14], что может приводить к снижению синтеза этими клетками компонентов межклеточного матрикса и дестабилизации АСБ (в том числе гемодинамически незначимой). Это хорошо согласуется с тем фактом, что по результатам настоящей работы генотип GG, соответствующий максимальной каталитической активности eN0S, связан с развитием ИМ в отсутствие стенокардии и других проявлений ИБС. Полученные данные могут свидетельствовать о наличии у N0 не только протективных, но и негативных эффектов, проявляющихся при определенных условиях, что обусловливает необходимость дополнительных исследований, особенно с учетом широкого применения нитратов при ИБС.

Патофизиологическая роль Сх37 и полиморфизма его гена в развития атеросклероза и дестабилизации АСБ также нуждается в дальнейшем изучении. Учитывая данные литературы о взаимодействии Сх37 и eNOS, а также выявленный в настоящей работе синергизм их влияния на развитие ИМ, можно предположить, что eNOS может модулировать работу коннексонов, влияя через них на процесс атерогенеза.

Заключение

В настоящее время диагностика нестабильной АСБ и выявление пациентов с нестабильной гемодинамикой базируется в основном на инвазивных методиках, не подходящих для скрининга, так как существующие неинвазив-ные методы не обладают достаточной разрешающей способностью. Для создания методов массового обследования важную роль могут играть генетические маркеры, позволяющие выявлять пациентов из группы высокого риска. Определение полиморфизмов С1019Т гена Сх37 и G894T гена eNOS может быть использовано для выявления генетической предрасположенности к развитию ИМ у пациентов с гемодинамически незначимым атеросклерозом и у практически здоровых лиц.

Работа выполнена в рамках государственного контракта №16.512.11.2262 по федеральной целевой программе «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007—2013 гг.».

ЛИТЕРАТУРА

1. Zaman A.G., Heft G, Worthley S.G., Badimon J.J. The role of plaque rupture and thrombosis in coronary artery disease. Atherosclerosis 2000; 149 (2): 251—266.

2. Ambrose J.A., Tannenbaum M.A., Alexopoulos D. et al. Angiographic progression of coronary artery disease and the development of myocardial infarction. J Am Coll Cardiol 1988; 12 (1): 56—62.

3. Lane D.A., Grant P.J. Role of hemostatic gene polymorphisms in venous and arterial thrombotic disease. Blood 2000; 95 (5): 1517—1532.

4. Damani S.B., Topol E.J. Future use of genomics in coronary artery disease. J Am Coll Cardiol 2007; 50 (20): 1933—1940.

5. PackardR.R., Libby P. Inflammation in atherosclerosis: from vascular biology to biomarker discovery and risk prediction. Clin Chem 2008; 54 (1): 24—38.

6. Андреенко Е.Ю., Самоходская Л.М., Балацкий А.В. и др. Прогностическая значимость носительства аллелей вариантов генов, контролирующих систему гемостаза и их сочетания с традиционными факторами риска в раннем развитии ише-мической болезни сердца. Кардиоваск тер и проф 2011; 8: 32—39.

7. Андреенко Е.Ю. Изучение роли полиморфизма генов, контролирующих систему гемостаза и функцию эндотелия со-

судов в раннем развитии ишемической болезни сердца: Дис. ... канд. мед. наук. М 2010; 111.

8. Burnier L., Fontana P., Angelillo-Scherrer A., Kwak B.R. Intercellular communication in atherosclerosis. Physiology (Bethesda) 2009; 24: 36—44.

9. Derouette J.P., Desplantez T, Wong C.W. et al. Functional differences between human Cx37 polymorphic hemichannels. J Mol Cell Cardiol 2009; 46: 499—507.

10. Hingorani A.D. Endothelial nitric oxide synthase polymorphisms and hypertension. Curr Hypertens Rep 2003; 5: 19—25.

11. Persu A., Vinck W.J., El Khattabi O. et al. Influence ofthe endothelial nitric oxide synthase gene on conventional and ambulatory blood pressure: sib-pair analysis and haplotype study. J Hypertens 2005; 23: 759—765.

12. Pfenniger A., Derouette J.P., Verma V. et al. Gap Junction Protein Cx37 Interacts With Endothelial Nitric Oxide Synthase in Endothelial Cells Arterioscler Thromb Vasc Biol 2010; 30 (4): 827—834.

13. Sase K., Michel Т. Expression and regulation of endothelial nitric oxide synthase. Trends Cardiovasc Med 1997; 7: 28—37.

14. Von Der Leyen H.E., Gibbons G.H., Morishia R. et al. Gene therapy inhibiting neointimal vascular lesion: in vivo transfer of endothelial cell nitric oxide synthase gene. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92: 1137—1141.

Поступила 27.12.2012