Способ выделения микроорганизмов для очистки и восстановления нефтезагрязненных почв и грунтов методом фитобиоремедиации
METHOD OF EXTRACTING MICROORGANISMS FOR PURIFICATION AND RECOVERY OF OIL-CONTAMINATED SOIL AND SOIL BY PHYTO-BIOREMEDIATION

Предполагаемое изобретение в целом относится к области удовлетворения потребностей человека, более точно – к способу выделения микроорганизмов для очистки и восстановления нефтезагрязненных почв и грунтов методом фитобиоремедиации. Использование заявленного технического решения обеспечивает возможность повышения эффективности восстановления почвы, загрязненной нефтью или отходами нефтяного производства, и тем самым рекультивировать её для возвращения в хозяйственный оборот за счет селекции природных микроорганизмов, деструктирующих компоненты нефти и эффективно колонизирующих корни растений-сидератов, используемых для фитобиоремедиации. Колонизуя корни растений, микроорганизмы распространяются в слое почвы, одновременно стимулируя и защищая растение, а также деградируя компоненты нефти. Указанный результат достигается за счет синергетического эффекта, а именно - взаимодействия между растениями и микроорганизмами, что позволяет ускорить восстановление почвы и рекультивировать её для возвращения в хозяйственный оборот (сельхозпроизводство, площади под застройку жилья и т.д.) в 2-5 раз быстрее по сравнению с известными способами.
7
Фитобиоремедиация – это способ очистки почв или других схожих субстратов от нефтяных загрязнений с помощью растений и населяющих их микроорганизмов. Корни растений являются нишей для выживания микроорганизмов. За счет питательных веществ, поступающих от растения, в ризосфере может поддерживаться значительная плотность микроорганизмов (до 10 КОЕ на см корня). Если микроорганизмы-деструкторы обладают также и колонизационными способностями, то растения могут распространять их в почве своими корнями, способствуя размножению и распределению этих полезных микроорганизмов. После отмирания растения данные микроорганизмы, оставаясь в почве, могут продолжать утилизировать компоненты нефти, загрязняющие почву. Однако очевидно, что для получения микроорганизмов, которые могли бы эффективно работать, взаимодействуя с растением, нужны дополнительные процедуры, которые позволяют отбирать среди микроорганизмов-деструкторов активные колонизаторы растений, которые могли бы взаимодействовать с растением в ходе фитобиоремедиации [Порхунцова О.А., Бушуева В.И., Федоренчик А.А., Алещенкова З.М. Микробно-растительная ассоциация как эффективный фиторемедиант загрезненных нефтепродуктами почв // ВЕСТНИК БЕЛОРУССКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ АКАДЕМИИ. 2015. №2. С. 87-91].
Общим недостатком исследований, известных из уровня техники, является то, что они не нацелены на выделение микроорганизмов, адаптированных к растениям, которые могли бы ускорить восстановление почв совместно с растениями. Кроме того, полученные результаты не эффективны, так как применяются преимущественно для дальнейших исследований, но не нашли широкого применения по прямому назначению, то есть для ремедиации загрязненных почв.
8
3
5
Является общеизвестным факт, что загрязненная почва имеет ограниченное количество питательных веществ, поэтому микроорганизмы не могут размножаться эффективно в условиях длительной деградации компонентов нефти. Однако при этом следует отметить факт того, что в условиях загрязненной почвы корневая система широкого спектра растений  (в плане питания) – это намного более богатая ниша для микроорганизмов, которая позволяет достигать плотности микроорганизмов до максимально возможного показателя 10 клеток/мг корня, в то время как вне корней (в загрязненной почве) плотность микроорганизмов может достигать только 10-10 клеток на мг почвы [Kamilova F, Validov S, Azarova T, Mulders I, Lugtenberg B. 2005. Enrichment for enhanced competitive plant root tip colonizers selects for a new class of biocontrol bacteria. Environmental Microbiology 7:1809-1817.]. Таким образом, количество микроорганизмов вне корней (в загрязненной почве) в 1000 и более раз меньше по концентрации, чем количество микроорганизмов на корневой системе растений-сидератов.
На данное явление было обращено внимание заявителя, и в результате предварительных исследований было установлено, что данный эффект возможно применить  для разработки способа выделения микроорганизмов, которые с высокой эффективностью способны  колонизировать  и защищать растения за счет вытеснения фитопатогенов c корней растения-сидерата [Validov S, Kamilova F, Qi S, Stephan D, Wang JJ, Makarova N, Lugtenberg B. 2007. Selection of bacteria able to control Fusarium oxysporum f. sp radicis-lycopersici in stonewool substrate. Journal of Applied Microbiology 102:461-471].
Эти исследования были результатом выполнения проекта по поиску микроорганизмов, которые могут защищать растения в теплицах. При этом заявитель обратил внимание на то, что комбинация способа по выявлению активных колонизаторов с селекцией микроорганизмов, деградирующих нефть, позволяет выделять микроорганизмы, которые сочетают в себе способность к одновременной колонизации растений и деградации углеводородов, что может быть использовано для получения биопрепарата для фитобиоремедиации. Корни растения, проникая в почву, распространяют населяющие их микроорганизмы-деградаторы компонентов нефти в объеме почвы. Деградируя компоненты нефти, микроорганизмы могут защищать растение-сидерата от вредного воздействия токсичных углеводородов, что усиливает рост растений. Кроме того, после отмирания растения микроорганизмы остаются и могут дальше деградировать загрязняющие вещества в почве. Этот способ селекции микроорганизмов позволит разрабатывать биопрепараты, которые значительно увеличивают эффективность очистки почв и почво-грунтов от компонентов нефти с помощью фитобиоремедиации.
Данные предположения нашло подтверждение после проведения лабораторных исследований, где в качестве субстратов были использованы грунты, загрязненные нефтью на территории Азнакаевского района Республики Татарстан.
Заявителем был произведен поиск технических решений из научной и патентной информации в данном направлении, и выявлен существующий уровень техники, представленный далее.
Из исследованного уровня техники выявлены биопрепараты для очистки и восстановления почв, загрязненных нефтью, основаны на получении культур микроорганизмов, которые эффективно разлагают компоненты нефти [Кобзев Е. Н., Шкидченко А.И. Оценка углеводородокисляющей активности микроорганизмов// Прикладная биохимия и микробиология. 2003. Т 39. No.1. С. 25-31].
Для выделения таких культур используются методы накопительных культур, которые позволяют выделить микроорганизмы - деструкторы компонентов нефти из микробных ассоциаций почвы или других субстратов. Как правило, микробный консорциум помещают в минеральную среду, где единственным источником углерода является нефть или ее компоненты, и инкубируют от 7 до 14 суток. Накопительные культуры высевают на агаризованные среды для получения отдельных колоний микроорганизмов и дальнейшего получения чистых культур. Таким образом, могут быть получены микроорганизмы, деградирующие компоненты нефти в почве [Нгуен Тиен, Сопрунова Б.О. Поиски выявление новых бактериальных штаммов с полифункциональными свойствами в техногенных субстратах// Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2011. Т. 13 No5(3).С. 167-170].
Известно изобретение по патенту RU2624667 C1 «Способ выделения микроорганизмов-деструкторов нефти», который осуществляет  селекцию микроорганизмов-деструкторов с последующим их выделением в чистую культуру. Сущностью является способ выделения микроорганизмов-деструкторов нефти, включающий селекцию микроорганизмов-деструкторов с последующим их выделением в чистую культуру, отличающийся тем, что селекцию проводят с помощью мембранного фильтра, предварительно пропитанного нефтью, который погружают в очищаемую почву на глубину не менее 5-10 см от поверхности почвы и выдерживают там от 20 до 90 суток, а выделение микроорганизмов-деструкторов нефти, способных к ее разложению в конкретных почвенно-климатических условиях, осуществляют с мембранного фильтра, который помещают в пробирку с 10 мл стерильной воды, встряхивают не менее 10 мин, после чего полученную суспензию высевают поверхностно на мясо-пептонный агар для изоляции бактерий-деструкторов и на среду Чапека для изоляции грибов-нефтедеструкторов.
Недостатком известного способа является длительный срок инкубации фильтров в почве и выделение микроорганизмов, колонизационные свойства которых на растениях не показаны, что не гарантирует их эффективность для фитобиоремедиации почв, загрязненных компонентами нефти. Кроме того, высев микроорганизмов на неселективные среды очевидно повышает возможность выделения сопутствующей микрофлоры, которая не разлагает компоненты нефти, что препятствует эффективному использованию получаемого биопрепарата по назначению.
13
10
12
Известно изобретение по патенту RU2529735C1 «Способ получения биопрепарата для очистки и восстановления плодородия почвогрунтов, загрязненных нефтепродуктами». Сущностью является способ получения биопрепарата для очистки и восстановления плодородия почво-грунтов, загрязненных нефтепродуктами, на основе наполнителя и бактериальных культур, отличающийся тем, что готовят смесь из жидких бактериальных культур, вкачестве которых берут штаммы Pseudomonas fluorescens ВКГRCAM00538 с титром10, КОА-4 Pseudomonas fluorescens ND-610 ВНИИСХМ с титром10, Azotobacter chroococcum АИН RCAM00539 с титром10 в соотношении соответственно 3:1,5:0,5-3:2:1, и осуществляют обработку отходов обогащения бурого угля путем добавления к ним полученной жидкой смеси штаммов с последующим перемешиванием и высушиванием приготовленной смеси в течение не менее 2,5 суток при комнатной температуре, при этом отходы обогащения бурого угля и предварительно подготовленную смесь штаммов берут соответственно в соотношении, мас.%: 40-50:50-60.
Недостатком известного способа является нацеленность на активацию микроорганизмов, а не на адаптацию их к колонизации растения, поэтому он не может быть использован для получения штаммов для фитобиоремедиации.
Известно изобретение по патенту RU 2352630C1 «Способ выделения и активации консорциума аборигенных микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов» с последующей активацией консорциума аборигенных нефтеокисляющих микроорганизмов с использованием смеси биотрина с отходом спиртового производства. Сущностью является способ выделения и активации консорциума аборигенных нефтеокисляющих микроорганизмов, включающий отбор проб с нефтезагрязненных почв и грунтов, выделение консорциума аборигенных нефтеокисляющих микроорганизмов, отличающийся тем, что после выделения проводят активацию консорциума аборигенных нефтеокисляющих микроорганизмов с использованием смеси биотрина с отходом спиртового производства-барды при соотношении компонентов 1:1 в количестве не менее 0,01 мас.%.
Недостатком известного способа является то, что отсутствует селекция микроорганизмов, активно колонизирующих растение, что необходимо для эффективной фитобиоремедиации. Кроме того, методика не предполагает выделение чистых культур микроорганизмов, которые нужны для создания биопрепаратов.
3
3
Известно изобретение по патенту RU2426781C2 «Способ отбора штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов». Сущностью является способ выбора штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов, отличающийся тем, что проводят отбор проб с нефтезагрязненной поверхности, выделяют чистые культуры углеводородокисляющих бактерий, культивируют их на плотной питательной среде, у выросших штаммов микроорганизмов определяют каталазную активность, затем из них готовят одно миллиардную микробную взвесь, смешивают ее с жидкой средой Раймонда в соотношении 1:150, в качестве единственного источника углерода добавляют нефть или нефтепродукты с места загрязнения из расчета 1 см на 1 дм среды Раймонда, инкубируют в течение 12 суток, затем высевают на плотную питательную среду, культивируют, по окончании культивирования у исследуемых штаммов микроорганизмов определяют каталазную активность и при ее снижении по сравнению с исходной на 30% и более исследуемый штамм микроорганизма выбирают как активный деструктор нефти и нефтепродуктов.
Недостатком известного способа является отсутствие селективных условий для отбора штаммов активных колонизаторов корней растений, что делает его непригодным к использованию в качестве способа селекции микроорганизмов для фитобиоремедиации.
Известно изобретение по патенту RU2241745С2 «Способ выделения деструкторов нефти и нефтепродуктов». Сущностью является способ выделения деструкторов нефти и нефтепродуктов, включающий отбор проб с нефтезагрязненной поверхности, селекцию углеводородокисляющих бактерий с последующим пересевом полученных культур и дальнейшую наработку в отдельности всех отселектированных микроорганизмов в ферментерах при параметрах культивирования, оптимальных для выделенных микроорганизмов, отличающийся тем, что селекцию начинают на жидкой минеральной среде с добавлением нефти с места загрязнения, инкубирование ведут при различных температурах +5°С, +15°С, +25°С и +35°С, а отбор культур для пересева осуществляют через 5, 10 и 15 дней.
Недостатками известного способа являются получение смеси культур микроорганизмов, а также отсутствие селекции микроорганизмов на предмет активной колонизации растений, поэтому известный способ не может быть использован для выделения микроорганизмов, способствующих фитобиоремедиации.
При этом заявителем из исследованного уровня техники не выявлены технические решения, совпадающие с заявленным техническим решением по существенным признакам, а именно – в известных технических решениях отсутствует селекция микроорганизмов на предмет активной колонизации растений. Исходя из  изложенного, формула изобретения составлена без ограничительной части.
Целью и техническим результатом заявленного технического решения
является разработка способа выделения природных микроорганизмов, который позволит выделить чистые культуры микроорганизмов, деструктирующие компоненты нефти (полиароматические соединения) и эффективно колонизирующие корни растений-сидератов, используемых для фитобиоремедиации.
При этом микроорганизмы распространяются в слое почвы, колонизуя корни растений, одновременно стимулируя и защищая растение, а также деградируя компоненты нефти. Синергизм растений и микроорганизмов позволяет ускорить восстановление почвы и рекультивировать её для возвращения в хозяйственный оборот (сельхозпроизводство, площади под застройку жилья и т.д.) в 2-5 раз быстрее, согласно данным лабораторных испытаний на почвах, взятых с мест загрязнений нефтью около нефтедобывающих скважин в Азнакаевском районе Республики Татарстан.
Сущностью заявленного технического решения
заключающийся в том, что
является способ выделения микроорганизмов для очистки и восстановления нефтезагрязненых почв и грунтов методом фитобиоремедиации,   суспензию загрязненной почвы с микроорганизмами высевают на минеральную агаризованную среду, помещают в среду с парами нафталина, инкубируют посеянные  микроорганизмы, выросшие колонии микроорганизмов смывают и используют для инокуляции стерильных проростков растений-сидератов,  проростки с инокулированными микроорганизмами высаживают в песок и инкубируют, растения, полученные из проростков, извлекают из песка, отделяют апикальную часть корня с микроорганизмами, помещают в стерильный физраствор для смывания микроорганизмов, наносят полученный смыв на поверхность минеральной агаризованной среды, затем стадии, начиная с помещения в среду с парами нафталина и заканчивая нанесением полученного смыва на поверхность минеральной агаризованной среды, повторяют дважды, далее отбирают  выросшие колонии микроорганизмов для дальнейшего использования в качестве биоагентов фитобиоремедиации.
Заявленное техническое решение иллюстрируется Фиг.
На Фиг.
приведена Таблица, в которой представлены результаты проведенных экспериментальных исследований:
- в столбце 2 приведены видовые названия микроорганизмов,
- в столбцах 3 и 4 приведена эффективность колонизации микроорганизмами корней ржи и рапса,
- в столбцах 5, 6 и 7 приведены результаты потребления (деградации) микроорганизмами основных ароматических компонентов нефти - нафталина, аценафтена и фенантрена.
Поставленные цели и заявленный технический результат достигается тем, что в процедуре выделения микроорганизмов используется накопительная культура на живом растении-сидерате, которая позволяет отобрать эффективные микроорганизмы-колонизаторы корней растений-сидератов. Дополнительная селекция на минеральной среде с нафталином, как модельном полиароматическом углеводороде, позволяет выделять данные микроорганизмы-колонизаторы растений с дополнительным свойством – деградацией ароматических компонентов нефти.
Заявленное техническое решение реализуется в лабораторных условиях следующим образом.
Для выделения микроорганизмов проводят следующие шаги:
1. Навеску почвы, например, 1 г с мест загрязнения нефтью (с находящимися в ней микроорганизмами) ресуспендируют, например, в 10 мл стерильного физраствора (0,9% NaCl) и шпателем высевают в чашку Петри на поверхность минеральной агаризованной среды BM следующего состава:
- фосфат калия двузамещенного 5,8 г/л,
- фосфат калия однозамещенного 3 г/л,
- сульфат аммония 1 г/л,
- сульфат магния 0,2 г/л,
- агар в концентрации 18 г/л.
2. На крышку чашки Петри насыпают, например, 0,5 г нафталина, который служит источником углерода и энергии, затем нижнюю часть чашки Петри с посеянной почвой с микроорганизмами переворачивают на крышку, при этом пары нафталина используются микроорганизмами в качестве углерода и источника энергии.
Инкубируют посеянные микроорганизмы, например, при 20 ºС в течение, например, 7 суток.
3. Выросшие колонии микроорганизмов стерильно смывают и используют полученную суспензию микроорганизмов для инокуляции стерильных проростков растений-сидератов.
4. Проростки с инокулированными микроорганизмами стерильно высаживают в заранее стерилизованную пробирку с песком, затем инкубируют, например, при 20-23 ºС при длине светового дня 16 часов в течение, например, 7 -10 суток.
5. Растения, полученные из проростков, стерильно извлекают из пробирки, отделяют апикальную корня с микроорганизмами и помещают корень в стерильный физраствор для смывания микроорганизмов. Смывают микроорганизмы качанием в течение, например, 15 минут.
6. Наносят полученный по п.4 смыв шпателем на поверхность минеральной агаризованной среды BM с нафталином (см. п.1).
Затем шаги по пунктам 2, 3, 4, 5, 6 повторяют дважды.
7. Выросшие колонии микроорганизмов отбирают для дальнейшего использования в качестве биоагентов фитобиоремедиации.
6
7
Данные микроорганизмы способны деградировать (потреблять) основные ароматические компоненты нефти, например - нафталин, аценафтен и фенантрен, а также способны колонизировать корни растений-сидератов, например, рапса и ржи с плотностью 10-10 клеток на 1 см корня этих культур.
Заявленный способ был осуществлен заявителем на примере штаммов Rhodococcus erythropolis (ВКПМ AC-1668), Pseudomonas aureofaciens (ВКМ В-2501), Pseudomonas putida (ВКМ В-2380Д), Stenotrophomonas maltophylia (ВКПМ В-12247) (ВКПМ - Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов,  ВКМ - Всероссийская коллекция микроорганизмов). Колонизацию проводили на корнях растений ржи и рапса. При этом была проведена деградация на примере следующих полиароматических соединений – компонентов нефти: нафталине, аценафтене, фенантрене.
При этом заявитель поясняет, что исследованные микроорганизмы являются лишь иллюстрацией осуществления заявленного способа, что не ограничивает объем патентных притязаний по отношению к другим микроорганизмам, поскольку набор микроорганизмов определялся конкретным используемым консорциумом микроорганизмов в используемой почве. При использовании других видов почв по заявленному способу могут быть выделены  микроорганизмы других видов, также являющиеся хорошими колонизаторами корней растений-сидератов, при этом обладающие деградирующими свойствами по отношению к компонентам нефти.
При этом заявитель также поясняет, что приведенные полиароматические соединения – компоненты нефти: нафталин, аценафтен, фенантрен являются лишь иллюстрацией осуществления заявленного способа, что не ограничивает объем патентных притязаний по отношению к другим компонентам нефти, поскольку ферменты деградации полиароматических соединений имеют низкую специфичность, поэтому могут разрушать сходные по структуре соединения.
Результаты конкретной апробации заявленного технического решения приведены в Таблице на Фиг.
6
7
3
4
Из данных, приведенных в Таблице, можно сделать вывод, что эффективность колонизации микроорганизмами корней ржи и рапса свидетельствуют о высокой плотности микроорганизмов на корнях растений - по заявленному техническому решению значение плотности микроорганизмов составляет 10-10КОЕ/см против 10-10КОЕ/см у обычных почвенных микроорганизмов [1], то есть выше на 3-4 порядка.
В Таблице также приведены результаты потребления микроорганизмами основных ароматических компонентов нефти - нафталина, аценафтена и фенантрена, являющихся наиболее стойкими поллютантами и канцерогенами среди компонентов нефти – результаты показали, что по всем компонентам нефти получен положительный результат по их деградации (потреблению).
Заявленный способ не требует значительных материальных затрат и позволяет в течение достаточно короткого времени, например, месяца получить чистые культуры микроорганизмов-деструкторов нефти с удовлетворительными колонизационными способностями.
Использование микроорганизмов для фитобиоремедиации способствует развитию растений-сидератов в условиях зараженной почвы, а также распространению микроорганизмов в слое почвы без механического перемешивания за счет разрастания корней растений-сидератов.
достигнуты поставленные цели и заявленный технический результат
Таким образом, из вышеизложенного можно сделать вывод, что заявителем , а именно - создан способ выделения природных микроорганизмов, который позволяет выделить чистые культуры микроорганизмов, деструктирующие компоненты нефти (полиароматические соединения) и эффективно колонизирующие корни растений-сидератов, используемых для фитобиоремедиации. Эти свойства микроорганизмов позволяют использовать их в качестве микробных агентов для фитобиоремедиации при очистке почв, загрязненных нефтью.
Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как из исследованного заявителем уровня техники не выявлена совокупность признаков, приведенная в независимом пункте формулы изобретения. Показано, что по заявленному способу производится селекция микроорганизмов, способных деградировать ароматические компоненты нефти и эффективно колонизировать корни растений-сидератов.
Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, так как из исследованного заявителем уровня техники не выявлена совокупность приведенных в независимом пункте формулы изобретения  признаков и совокупность полученных технических результатов.
Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость»,  предъявляемому к изобретениям, так как заявленное техническое решение возможно реализовать в промышленности посредством применения известных из уровня техники материалов, оборудование и технологий.
ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Kamilova F, Validov S, Azarova T, Mulders I, Lugtenberg B. 2005. Enrichment for enhanced competitive plant root tip colonizers selects for a new class of biocontrol bacteria. Environmental Microbiology 7:1809-1817.
2. Validov S, Kamilova F, Qi S, Stephan D, Wang JJ, Makarova N, Lugtenberg B. 2007. Selection of bacteria able to control Fusarium oxysporum f. sp radicis-lycopersici in stonewool substrate. Journal of Applied Microbiology 102:461-471.
3. Кобзев Е. Н., Шкидченко А.И. Оценка углеводородокисляющей активности микроорганизмов// Прикладная биохимия и микробиология. 2003. Т 39. No1. С. 25-31
4. Нгуен Тиен, Сопрунова Б.О. Поиски выявление новых бактериальных штаммов с полифункциональными свойствами в техногенных субстратах// Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2011. Т. 13 No5(3).С. 167-170
5. Порхунцова О.А., Бушуева В.И., Федоренчик А.А., Алещенкова З.М. Микробно-растительная ассоциация как эффективный фиторемедиант загрезненных нефтепродуктами почв // ВЕСТНИК БЕЛОРУССКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ АКАДЕМИИ. 2015. №2. С. 87-91
6. Патент RU2529735C1, опубликовано 27.09.2014. «Способ получения биопрепарата для очистки и восстановления плодородия почвогрунтов, загрязненных нефтепродуктами»
7. Патент RU2624667C1, опубликовано 05.07.2017. «Способ выделения штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти»
8. Патент RU2352630C1, опубликовано 20.04.2009. «Способ выделения и активации консорциума аборигенных микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов» (прототип)
9. Патент RU2426781C2, опубликовано 20.08.2011. «Способ выбора штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов».
10. Патент RU2241745, опубликовано 10.12.2004. «Способ выделения деструкторов нефти и нефтепродуктов».