СВИНЬИ, СОДЕРЖАЩИЕ МОДИФИЦИРОВАННЫЙ БЕЛОК CD163, И СВЯЗАННЫЕ С ЭТИМ СПОСОБЫ

1. Генетически отредактированная свинья, где эта свинья содержит отредактированный геном, где это редактирование приводит к удалению домена SRCR5 из белка CD163, продуцируемого свиньей.
2. Генетически отредактированная свинья по п. 1, где эта свинья содержит отредактированный геном, где это редактирование приводит к удалению SRCR5 из белка CD163, продуцируемого животным, и где присутствуют все другие домены белка CD163, и их аминокислотные последовательности не изменены.
3. Генетически отредактированная свинья по п. 1 или 2, где белок CD163, продуцируемый генетически отредактированной свиньей, остается в значительной степени функциональным.
4. Генетически отредактированная свинья по любому из предшествующих пунктов, где белок CD163 не имеет следующей аминокислотной последовательности:
HRKPRLVGGDIPCSGRVEV QHGDTWGTVCDSDFSL EAASVLCRELQCG TVVSLLGGAHFGEG SGQIWAEEFQCEG HESHLSLCPVAPR PDGTCSHSRDVGVVCS (SEQ ID NO: 2).
5. Генетически отредактированная свинья по п. 4, где белок CD163, продуцируемый генетически отредактированной свиньей, не имеет других изменений в аминокислотной последовательности дикого типа.
6. Генетически отредактированная свинья по любому из предшествующих пунктов, которая является гомозиготной или биаллельной для редактирования генома, что приводит к удалению домена SRCR5 из белка CD163, продуцируемого животным.
7. Генетически отредактированная свинья по любому из предшествующих пунктов, где все клетки животного содержат отредактированный геном.
8. Генетически отредактированная свинья по любому из предшествующих пунктов, где геном свиньи отредактирован таким образом, что последовательность, которая кодирует SRCR5, отсутствует в зрелой мРНК, полученной из отредактированного гена CD163.
9. Генетически отредактированная свинья по любому из предшествующих пунктов, где свинья содержит отредактированный геном, в котором был удален экзон 7 гена CD163.
10. Генетически отредактированная свинья по любому из предшествующих пунктов, где акцепторный сайт сплайсинга, расположенный на 5'-конце экзона 7 гена CD163, является инактивированным.
11. Генетически отредактированная свинья по любому из предшествующих пунктов, где экзоны 1-6 и 8-16 гена CD163 не изменены по сравнению с последовательностью дикого типа.
12. Генетически отредактированная свинья по п. 11, где экзон 7 и части интронов 6 и 7, которые фланкируют экзон 7, удалены из гена CD163, но отсутствуют другие изменения в остальных областях гена CD163.
13. Генетически отредактированная свинья по любому из предшествующих пунктов, где отредактированный геном отредактирован так, что последовательность донорного сайта сплайсинга в интроне 6 и акцепторный сайт сплайсинга в интроне 7 не изменяются и остаются функциональными.
14. Генетически отредактированная свинья по любому из предшествующих пунктов, где геном отредактирован таким образом, что, по меньшей мере, часть области гена CD163, расположенной от положения 10466 до 23782 в нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, удаляется.
15. Генетически отредактированная свинья по любому из предшествующих пунктов, где геном отредактирован таким образом, что области от положения 1 до положения 10465 и от положения 23783 или 23754 до положения 32908 в нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, не подвергаются изменениям.
16. Генетически отредактированная свинья по любому из предшествующих пунктов, где геном отредактирован таким образом, что экзон 7 удаляется вместе с участком протяженностью до 5000 оснований, предпочтительно до 2000 оснований, предпочтительно до 1000 оснований, предпочтительно до 500 оснований, предпочтительно до 300 оснований или предпочтительно до 100 оснований, находящимся на 5'-конце экзона 7.
17. Генетически отредактированная свинья по любому из предшествующих пунктов, где геном отредактирован таким образом, что экзон 7 удаляется вместе с участком протяженностью до 75 оснований, находящимся на 3'-конце экзона 7.
18. Генетически отредактированная свинья по любому из предшествующих пунктов, где геном отредактирован таким образом, что отредактированный геном содержит делецию области, расположенной от:
а) приблизительно положения 23060 до приблизительно положения 23760, например, от положения 23065 до положения 23753, в нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1;
b) приблизительно положения 23260 до приблизительно положения 23760, например, от положения 23268 до положения 23753, в нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1; или
c) приблизительно положения 23370 до приблизительно положения 23760, например, от положения 23374 до положения 23753, в нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1.
19. Генетически отредактированная свинья по любому из предшествующих пунктов, где отредактированный геном содержит вставленную последовательность.
20. Генетически отредактированная свинья по любому из предшествующих пунктов, где геном отредактирован таким образом, что область, расположенная от положения 23378 до положения 23416 в нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, отредактирована так, что акцепторный сплайсинга сайт в интроне 6 инактивируется.
21. Генетически отредактированная свинья по любому из предшествующих пунктов, где акцепторный сайт сплайсинга в интроне 6 частично или полностью удален или его последовательность изменена любым другим подходящим способом, так что он больше не функционирует.
CgG CCatgg
22. Генетически отредактированная свинья по п. 20 или п. 21, где акцепторный сайт сплайсинга редактируют для изменения последовательности от AATGCTATTTTTCAG CCCACAGGAAACCCAGG (SEQ ID NO: 3) до AATGCTATTTTTGGAAACCCAGG (SEQ ID NO: 4), где изменения последовательности показаны строчными буквами.
23. Генетически отредактированная свинья по любому из предшествующих пунктов, где генетически отредактированная свинья имеет повышенную толерантность или устойчивость к инфекции PRRSV по сравнению со свиньями дикого типа, предпочтительно, где животное устойчиво к инфекции РРСС.
24. Генетически отредактированная клетка или эмбрион свиньи, где редактирование приводит к удалению домена SRCR5 из белка CD163, продуцируемого клеткой или эмбрионом свиньи.
25. Способ получения генетически отредактированной свиньи, включающий в себя этапы:
a) получения свиной клетки;
b) редактирования генома клетки для создания модификации генома, которая приводит к удалению домена SRCR5 из белка CD163; иc) создания животного из указанной клетки.
26. Способ по п. 25, где модификацией генома, которая приводит к удалению домена SRCR5 из белка CD163, является делеция экзона 7 из гена CD163 или инактивация акцепторного сайта сплайсинга в интроне 6 гена CD163.
27. Способ по п. 25 или 26, где на этапе a) клетка свиньи является соматической клеткой, гаметой, зародышевой клеткой, гаметоцитом, стволовой клеткой (например, тотипотентной стволовой клеткой или плюрипотентной стволовой клеткой) или зиготой.
28. Способ по любому из пп. 25-27, где на этапе a) клетка свиньи представляет собой одноклеточную зиготу, и этап b) способа, по меньшей мере, инициируют и предпочтительно завершают в зиготе на стадии одной клетки.
29. Способ по любому из пп. 25-28, где этап b) включает в себя:
введение сайт-специфичной нуклеазы в клетку, сайт-специфичная нуклеаза, нацелена на подходящую последовательность-мишень в гене CD163;
инкубацию указанной клетки в подходящих условиях для того, чтобы указанная сайт-специфичная нуклеаза воздействовала на ДНК в указанной последовательности-мишени или рядом с ней; и
тем самым индуцирование события редактирования в гене CD163, которое приводит к удалению домена SRCR5 из белка CD163.
30. Способ по п. 29, где событие редактирования, которое приводит к удалению домена SRCR5 из белка CD163, может представлять собой делецию экзона 7 из гена CD163 или инактивацию акцепторного сайта сплайсинга в интроне 6 гена CD163.
31. Способ по п. 29 или 30, где этап b) включает в себя введение в клетку сайт-специфичных нуклеаз, которые нацелены на сайты-мишени, фланкирующие экзон 7 гена CD163, чтобы индуцировать двухцепочечные разрезы ДНК на каждой стороне экзона 7 и тем самым вызывать его делецию.
32. Способ по п. 31, где один сайт-мишень находится интроне 6, и сайт рестрикции находится на 3'-конце донорного сайта сплайсинга на 3'-конце экзона 6, и где другой сайт-мишень находится в интроне 7, и сайт рестрикции находится на 5'-конце акцепторного сайта сплайсинга на 5'-конце экзона 8.
33. Способ по любому из пп. 25-31, где этап b) включает в себя введение в клетку апстрим сайт-специфичной нуклеазы, где эта апстрим сайт-специфичная нуклеаза нацелена на сайт-мишень перед экзоном 7 CD163, и введение в клетку даунстрим сайт-специфичной нуклеазы, где эта даунстрим сайт-специфичная нуклеаза нацелена на сайт-мишень после экзона 7 CD163.
34. Способ по любому из пп. 29 или 30, где этап b) включает в себя введение сайт-специфичной нуклеазы, которая нацелена на акцепторный сайт сплайсинга в интроне 6.
35. Способ по п. 34, где сайт-специфичная нуклеаза, которая нацелена на акцепторный сайт сплайсинга в интроне 6, создает один двухцепочечный разрез в желаемом сайте рестрикции, чтобы инактивировать акцепторный сайт сплайсинга, связанный с экзоном 7, негомологичным соединением концов (NHEJ) или гомологичной репарацией (HDR).
36. Способ по п. 35, включающий в себя предоставление матрицы HDR, предпочтительно матрицы HDR, имеющей следующую последовательность: GAAGGAAAATAT GGAATCATATTCT CCCTCACCGAAATGC TATTTTTCgGC CatggGGAAACCCAGG CTGGTTGGAGGGG ACATTCCCTGCTCTGGTC (SEQ ID NO: 16), где строчные буквы показывают изменения, сделанные по сравнению с неизмененной последовательностью.
37. Способ по любому из пп. 25-36, где сайт-специфичная нуклеаза включает в себя, по меньшей мере, одну из следующих нуклеаз: нуклеаза цинкового пальца (ZFN), эффекторная нуклеаза, подобная активаторам транскрипции (TALEN), направляемая РНК нуклеаза CRISPR, (CRISPR/Cas9) или мегануклеаза.
38. Способ по п. 25, включающий в себя этапы:
получения зиготы свиней;
введения сайт-специфичной нуклеазы в зиготу, где эта сайт-специфичная нуклеаза, нацелена на подходящую последовательность-мишень в гене CD163;
инкубации указанной зиготы в подходящих условиях для того, чтобы указанная сайт-специфичная нуклеаза воздействовала на ДНК в указанной последовательности-мишени или рядом с ней и тем самым индуцировала событие редактирования в гене CD163, которое приводит к удалению домена SRCR5 из белка CD163; и получения животного из указанной генетически отредактированной зиготы.
39. Способ по любому из пп. 25-38, включающий в себя характеристику произошедшего события генетического редактирования.
40. Способ получения генетически отредактированной клетки или эмбриона свиньи, этот способ включает в себя этапы:
получения клетки или эмбриона свиньи;
редактирования генома клетки или клеток внутри эмбриона для получения геномного редактирования, которое приводит к удалению домена SRCR5 белка CD163.
41. Способ модификации свиньи для повышения ее устойчивости или толерантности к PRRSV, включающий в себя редактирование генома клеток свиньи для создания модификации, которая приводит к удалению домена SRCR5 из белка CD163.
42. Животное, клетка или эмбрион, полученные способом по любому из пп. 25-41, или животное, которое является потомком животного, полученного по любому из пп. 25-39 или 41.
43. Свинья или клетка свиньи, которая несет или экспрессирует белок CD163, в котором удален домен SRCR5.
44. Клетка по п. 43, которая представляет собой макрофаг, происходящий из моноцитов периферической крови (ММПК) или легочный альвеолярный макрофаг (ЛАМ).