КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ КИШЕЧНИКА
COMPOSITIONS AND METHODS OF PREVENTION OR TREATMENT OF INFLAMMATORY BOWEL DISEASE

Уровень техники
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится главным образом к композициям и способам профилактики или лечения воспалительного заболевания кишечника, в частности к применению докозагексаеновой кислоты для профилактики или лечения воспалительного заболевания кишечника кошек.
Описание предшествующего уровня техники
Термины «воспалительное заболевание кишечника» или «IBD» относятся к группе хронических идиопатических желудочно-кишечных расстройств, характеризующихся воспалительными инфильтратами в собственной пластинке слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта. IBD включают сегментарный гранулематозный энтероколит, лимфоплазмацитарный энтерит, эозинофильный гастроэнтероколит, лимфоцитарный гастроэнтероколит, гнойный энтероколит и гистиоцитарный колит. Лимфоплазмацитарная форма, возможно, является наиболее распространенным типом IBD. Эти специфические типы IBD характеризуются на основе типа воспалительного инфильтрата, обнаруживаемого в собственной пластинке слизистой оболочки. Воспалительные инфильтраты могут сильно варьировать по тяжести и клеточным типам, при этом наиболее часто встречающимися типами клеток являются лимфоциты и плазматические клетки. Воспалительные инфильтраты могут поражать желудок, тонкий и толстый кишечник. У кошек, например, наиболее часто поражаются желудок и тонкий кишечник. Зачастую многочисленные сегменты кишечника вовлечены в патологический процесс, и клинические признаки могут быть комплексными, отражая широкое распространение повреждений слизистой оболочки. Степень тяжести IBD варьирует от легких клинических симптомов до опасных для жизни энтеропатий с белковой дистрофией (целиакия).
Воспалительные инфильтраты слизистых ответственны за клиническое проявление IBD. Воспаление слизистой нарушает нормальные процессы абсорбции. Подобные нарушения приводят к синдрому недостаточности всасывания (малабсорбции) и осмотической диарее. Изменение кишечной проницаемости может приводить к просачиванию жидкости, белка и крови в просвет кишки. Неабсорбированные жиры, углеводы и желчные кислоты приводят к секреторной диарее. Медиаторы воспаления также могут напрямую провоцировать кишечную секрецию и продукцию слизи бокаловидными клетками эпителия. Воспалительные инфильтраты слизистых могут изменять перистальтику тонкого и толстого кишечника по механизму, объясняемому влиянием простагландинов и лейкотриенов на гладкую мускулатуру. Воспаление желудка и тонкого кишечника стимулирует рецепторы, контролирующие рвоту. Для кошек, например, наиболее распространенными клиническими признаками IBD являются хроническая рвота, диарея и потеря веса.
Фундаментальный путь развития IBD включает гиперчувствительность. Две связанные теории пытаются объяснить первопричину реакций гиперчувствительности. Первая теория предполагает, что у кошек с IBD развиваются нарушения в барьере слизистой кишечника. Потеря целостности слизистой ведет к повышенной проницаемости кишок и реакции гиперчувствительности на аллергены, которые в норме переносимы. Вторая теория рассматривает IBD как следствие аберрантного иммунологического ответа на антигены люминального пространства. Оба потенциальных пути завершаются высвобождением медиаторов воспаления. Эти вещества могут в дальнейшем повреждать поверхность слизистой кишечника и вызывать цикл воспаления и потери барьерной функции.
Незаменимые жирные кислоты играют специфическую роль в регуляции клеточной функции. Например, омега-3 эйкозапентаеновая кислота (EPA), омега-6 арахидоновая и гамма-линоленовая кислоты являются предшественниками для синтеза эйкозаноидов - иммунорегуляторных молекул, функционирующих в качестве локальных гормонов и медиаторов воспаления. Эйкозаноиды, синтезируемые из арахидоновой кислоты (ARA), являются провоспалительными по сравнению с эйкозаноидами, продуцируемыми из эйкозапентаеновой и гамма-линоленовой кислот, и в избыточных количествах могут приводить к патологическим состояниям. Макрофаги являются важным источником эйкозаноидов и модулируют интенсивность и продолжительность воспалительного и иммунного ответов. Преобладающей полиненасыщенной жирной кислотой среди мембранных фосфолипидов макрофагов и лимфоцитов является ARA. Введение гамма-линоленовой кислоты или EPA приводит к замещению ARA в мембранах макрофагов на эйкозапентаеновую или гамма-линоленовую кислоту. Результатом такого замещения является меньшая продукция эйкозаноидов - производных ARA, и большая продукция эйкозаноидов - производных EPA и гамма-линоленовой кислоты, посредством чего снижается иммунологический ответ на период воспаления.
Характерный диагноз IBD основан на гистопатологическом обследовании слизистой или полнослойных препаратов кишечной биопсии, полученных эндоскопией или хирургическим методом. Следовательно, необходимы альтернативные методы диагностирования IBD у кошек, менее инвазивные, чем получение биоптатов (препаратов биопсии). Также необходимы новые методы и композиции для профилактики и лечения IBD у кошек.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Таким образом, целью изобретения является предоставление методов профилактики или лечения IBD у кошек.
Следующей целью изобретения является предоставление композиций, пригодных для профилактики или лечения IBD у кошек.
Следующей целью изобретения является предоставление способов определения IBD у кошек.
Следующей целью изобретения является предоставление изделий в форме наборов, содержащих комбинации кормов, соединений, ингредиентов и приспособлений, пригодных для профилактики или лечения IBD у кошек.
Следующей целью изобретения является предоставление средств передачи информации о способах, композициях, изделиях и преимуществах изобретения.
Одна или несколько из этих либо других целей достигаются при использовании новых способов профилактики и/или лечения IBD у кошек, подверженных или страдающих от IBD, включающих введение кошкам терапевтически эффективного количества докозагексаеновой кислоты (DHA). Способы диагностики IBD и наборы, содержащие комбинации кормов, соединений, ингредиентов и приспособлений, пригодных для профилактики или лечения IBD у кошек, также предоставлены.
Дополнительные цели, признаки и преимущества изобретения будут очевидны для специалистов в данной области.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
+
В одном аспекте, изобретение предоставляет способы лечения IBD у кошек, страдающих IBD. Лечение IBD включает облегчение, подавление и/или устранение IBD. Специалисты в данной области могут диагностировать IBD (и отличить IBD от других желудочно-кишечных заболеваний), используя диагностические тесты (например, определение количества суммарных клеток крови, серологическая биохимия, уровень тироксина в сыворотке, тест на вирус иммунодефицита, тест на вирус кошачьей лейкемии, анализ мочи, анализ фекалий на наличие паразитов и бактерий); исследование рациона; абдоминальные (брюшные) рентгенограмму и/или ультразвук; и/или исследование препаратов биопсии слизистой или полнослойных кишечных биоптатов. В другом аспекте, изобретение предоставляет способы профилактики IBD у кошек, склонных к развитию IBD. Профилактика IBD включает снижение риска IBD, задержку появления IBD, и/или препятствование развитию IBD у кошек. Способы включают введение кошкам терапевтически эффективных количеств докозагексаеновой кислоты (DHA). Терапевтически эффективное количество это количество, которое обеспечит лечение IBD, когда кошка страдает IBD, или профилактику IBD, когда кошка подтверена развитию IBD, либо снижение уровня CD4 лимфоцитов и нейтрофилов у кошек, подверженных IBD или страдающих IBD. Введение подразумевает кошкам DHA или других соединений в подходящей лекарственной форме и подходящим способом введения (например, перорально, местно или парентерально). DHA может быть введена, например, как чистая DHA или ее производное (например, соль, такая как сложный эфир), либо как композиция, содержащая DHA и/или производные DHA. Ссылки в данном тексте на DHA и другие жирные кислоты включают производные этих соединений. DHA-содержащая композиция может также включать одно или несколько традиционных фармацевтически приемлемых вспомогательных средств (например, адъюванты, носители и/или наполнители). В некоторых вариантах осуществления, DHA-содержащие композиции могут содержать кормовую композицию.
Изобретение основано на неожиданном открытии, что DHA, но не EPA или другие подобные жирные кислоты, пригодна для профилактики или лечения IBD у кошек, и что DHA может иметь противоположный эффект у других животных. Хотя EPA и родственные жирные кислоты по отдельности или в комбинации не предотвращают и не лечат IBD, они пригодны для дополнения DHA в профилактике или лечении IBD. Таким образом, неожиданный результат таков, что отдельная DHA или DHA в комбинации с EPA и родственными жирными кислотами эффективны для профилактики или лечения IBD при введении кошкам в терапевтически эффективном количестве.
+
DHA эффективно снижает уровень CD4лимфоцитов и нейтрофилов у кошек, включая кошек, подверженных IBD или страдающих IBD, когда DHA вводят в терапевтически эффективном количестве, как описано в данном описании.
В некоторых вариантах осуществления способы включают введение кошкам DHA в количестве от примерно 6 до примерно 165 мг/кг веса тела в день. В некоторых вариантах осуществления кошкам вводят от примерно 12 до примерно 65 мг/кг веса тела в день DHA. В других кошкам вводят от примерно 12 до примерно 32 мг/кг веса тела DHA в день. Суточное количество DHA может быть введено как однократная доза, либо, в качестве альтернативы, как две и более дозы, составляющие вместе суточную дозу.
В некоторых вариантах осуществления введения DHA включает кормление кошек DHA, то есть кормление DHA или композицией, содержащей DHA (включая производные DHA).
В различных вариантах осуществления, DHA-содержащая композиция, которой кормят кошек, содержит кормовую композицию. В некоторых вариантах осуществления, кормовая композиция соответствует требованиям AAFCO по минимальному содержанию питательных веществ для репродукции и существования. См. официальную публикацию AAFCO, страницы 137-40. В некоторых вариантах осуществления, кормовая композиция содержит сухой корм. В других, кормовая композиция содержит полувлажный корм. Кроме того, в других кормовая композиция содержит влажный корм. Термины «сухой», «влажный», и «полувлажный» используемые в настоящем изобретении хорошо известны специалистам, квалифицированным в данной области. Кормовая композиция может быть кормовой добавкой, угощением, легкой закуской или частично или полностью съедобной игрушкой. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит смесь одного или нескольких кормов или гипоаллергенных кормовых композиций.
В некоторых вариантах осуществления, кошка предстваляет собой кошку-компаньона. Кошка-компаньон может содержаться как домашнее животное. Кошка-компаньон также может быть кошкой широко одомашненных пород, например, домашняя кошка (Felis domesticus), вне зависимости от того, содержится ли она как домашнее животное, или нет. В некоторых вариантах осуществления, кошка представляет собой подрастающую кошку. Подрастающая кошка является той, которая еще не достигла размеров взрослой. Например, подрастающая кошка является той, которой менее одного года. В некоторых вариантах осуществления, кошка представляет собой взрослую кошку. Взрослая кошка является кошкой любого возраста после завершения ювенильного роста и развития, включая пожилых и старых кошек. Например, взрослая кошка является той, которой более одного года на протяжении всего остатка ее жизни. Пожилая кошка представляет собой кошку такого возраста, который сопровождается риском связанных с возрастом заболеваний, вне зависимости от того, демонстрирует ли кошка очевидные физические или поведенческие признаки старения. Например, обычно к пожилым относят кошек возраста от семи до одиннадцати лет. Старая кошка представляет собой кошку, проявляющую признаки преклонного возраста. Например, обычно к старым относят кошек возраста двенадцати и более лет.
Если не указано иное, все процентные соотношения в данном тексте это весовые процентные соотношения на основе сухой массы. Термин "на основе сухой массы" подразумевает, что концентрация ингредиента в композиции измерена после удаления из смеси влаги.
В некоторых вариантах осуществления, композиция, вводимая кошке, содержит от примерно 0,05 до примерно 1% DHA. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит от примерно 0,1 до примерно 0,4% DHA. В других, композиция содержит от примерно 0,1 до примерно 0,2% DHA. В некоторых других вариантах осуществления композиция содержит от примерно 0,05 до примерно 0,2% DHA. В последующих вариантах осуществления композиция содержит от примерно 0,05 до примерно 0,15% DHA. И в прочих подобных вариантах осуществления композиция содержит от примерно 0,05 или примерно 0,1 до примерно 0,15, примерно 0,2 или примерно 0,4% DHA.
В дополнительных вариантах осуществления, композиция, вводимая кошке, дополнительно содержит по меньшей мере одну жирную кислоту, выбранную из группы, состоящей из эйкозапентаеновой кислоты (EPA), арахидоновой (ARA), линоленовой (LA) и альфа-линоленовой (ALA) кислот. В некоторых подобных вариантах осуществления композиция содержит от примерно 0,05 до примерно 1% каждой из жирных кислот, присутствующих в композиции. В других подобных вариантах осуществления композиция содержит от примерно 0,1 до примерно 0,5% или от примерно 0,1 до примерно 0,3% жирных кислот. В одном варианте осуществления, композиция, вводимая кошке, дополнительно содержит от примерно 0,05 до примерно 1% EPA. В некоторых подобных вариантах осуществления композиция содержит от примерно 0,1 до примерно 0,5% EPA. В других подобных вариантах осуществления композиция содержит от примерно 0,1 до примерно 0,3% EPA. В других подобных вариантах осуществления композиция содержит от примерно 0,05 до примерно 0,3% EPA. В прочих подобных вариантах осуществления композиция содержит от примерно 0,15 до примерно 0,3% EPA. В последующих подобных вариантах осуществления композиция содержит от примерно 0,05, примерно 0,1 или примерно 0,15 до примерно 0,2, примерно 0,3, примерно 0,4 или примерно 0,5% EPA.
В некоторых вариантах осуществления композиция, вводимая кошке, содержит от примерно 0,05 до примерно 1% DHA и от примерно 0,05 до примерно 1% EPA; и соотношение количества EPA, присутствующего в композиции, к количеству DHA в композиции составляет примерно от 1 до примерно 2. В некоторых подобных вариантах осуществления соотношение количества EPA, присутствующего в композиции, к количеству DHA присутствующему в композиции составляет от примерно 1,2 до примерно 1,8. В других подобных вариантах осуществления соотношение количества EPA в композиции к количеству DHA в композиции составляет от примерно 1,2 до примерно 1,5. В прочих подобных вариантах осуществления соотношение количества EPA, присутствующего в композиции, к количеству DHA, присутствующему в композиции, составляет от примерно 1,3 до примерно 1,6. И в последующих подобных вариантах осуществления соотношение количества EPA, присутствующего в композиции, к количеству DHA, присутствующему в композиции, составляет от примерно 1, примерно 1,2 или примерно 1,3 до примерно 1,5, примерно 1,6, примерно 1,8 или примерно 2.
В некоторых вариантах осуществления, способы профилактики и лечения дополнительно включают введение кошкам средства против воспалительных заболеваний кишечника (анти-IBD) совместно с введением DHA или комбинации DHA и по меньшей мере одной жирной кислоты выбранной из группы, состоящей из EPA, ARA, LA и ALA. Анти-IBD средство представляет собой соединение, его производное (например, соль, сольват или гидрат соединения) или композицию, содержащую подобные соединения и/или производные, которые используются для профилактики или лечения IBD. Термин «совместно» подразумевает, что анти-IBD средство вводят кошке либо вместе с DHA, либо отдельно от DHA, с той же или иной частотой, тем же или иным способом введения и либо приблизительно в то же время, что и DHA, либо периодически. Термин «приблизительно в то же время» в основном подразумевает, что анти-IBD средство либо вводится, когда кошке вводят DHA, либо в течение примерно 72 часов после введения DHA. «Периодически» в основном подразумевает, что анти-IBD средство вводят кошке следуя схеме режиму введения, подходящему для введения данного средства, в то время как DHA-содержащая композиция скармливается кошке обычным способом, как подходит данной кошке. Таким образом, термин «совместно» в частности включает ситуации, когда анти-IBD средство вводят кошке в течение предписанного промежутка времени, тогда как DHA вводят кошке на протяжении значительно более долгого периода (например, на протяжении жизни). Если кошке вводят более чем одно средство, то лекарственная форма и способ введения для каждого средства могут варьировать. Специалисты, квалифицированные в данной области, согласятся, что одно или несколько анти-IBD средств могут быть введены кошке, в то время как кошка потребляет только DHA-содержащую композицию, либо, альтернативно, когда кошке скармливают различные DHA-содержащие композиции в течение варьируемых временных интервалов.
Подходящие анти-IBD средства включают, например, кортикостероиды (например, преднизон, преднизолон), иммуносупрессанты (например, азатиприн) и антибиотики (например, метронидазол, амоксициллин, тилозин). Анти-IBD средства могут быть введены, например, в форме солей - производных неорганических или органических кислот. В зависимости от конкретного соединения, соль соединения может быть предпочтительнее из-за одного или нескольких физических свойств соли, например, повышенной фармацевтической стабильности при различных температурах и влажности, или требуемой растворимости в воде или масле. Соль предпочтительно является фармацевтически приемлемой солью.
Предпочтительная суммарная суточная доза анти-IBD средства (вводимого либо в виде единой дозы, либо в виде разделенных доз) обычно составляет от примерно 0,001 до примерно 100 мг/кг веса тела, более предпочтительно от 0,01 до примерно 30 мг/кг веса тела, и даже еще более предпочтительно от примерно 0,01 до примерно 10 мг/кг веса тела. Композиции лекарственной формы могут включать такие количества и их дольные единицы, чтобы образовывать суточную дозу. Во многих случаях введение анти-IBD средства будет повторено несколько раз. Многократные ежедневные дозы при необходимости могут использоваться для увеличения суммарной суточной дозы. Факторы, определяющие предпочтительный режим введения, включают, например, возраст, вес и состояние кошки; тяжесть заболевания; способ введения; фармакологические соображения по активности, эффективности, фармакокинетическому и токсикологическому профилю конкретного используемого анти-IBD средства; используется ли система доставки лекарства; и вводится ли анти-IBD средство как часть комбинации лекарственных препаратов. Таким образом, режим введения может широко варьировать, и, следовательно, может отличаться от предпочтительной схемы введения, обсужденной выше.
В еще одном аспекте, изобретение предоставляет композиции, подходящие для профилактики и/или лечения IBD у кошек. Эти композиции описаны и проиллюстрированы примерами в контексте способов профилактики и/или лечения IBD у кошек.
В следующем аспекте, изобретение предоставляет способы получения композиций, подходящих для использования в способах профилактики и/или лечения IBD. Подобные композиции могут быть получены, например, путем смешивания двух или более ингредиентов (включая кормовые композиции), которые, будучи скомбинированы, образуют композицию по изобретению; либо путем смешивания одной или нескольких кормовых композиций с дополнительным(и) ингредиентом(ами), такими как, например, DHA, EPA или анти-IBD средство. Подобные композиции могут также быть получены согласно одному или нескольким способам, рассмотренным в Small Animal Nutrition, страницы 127-46 (2000).
В последующем аспекте, изобретение обеспечивает применение DHA и, необязательно по меньшей мере одной жирной кислоты, выбранной из группы, состоящей из EPA, ARA, LA и ALA, для получения композиции по изобретению, подходящей для профилактики или лечения IBD у кошек. В некоторых вариантах осуществления изобретение предусматривает применение DHA для получения композиции, содержащей от примерно 0,05 до примерно 1% DHA. В некоторых подобных вариантах осуществления композиция содержит от примерно 0,1 до примерно 0,4% DHA. В других, композиция содержит от примерно 0,1 до примерно 0,2% DHA. В прочих вариантах осуществления композиция содержит от примерно 0,05 до примерно 0,2% DHA. В последующих подобных вариантах осуществления композиция содержит от примерно 0,05 до примерно 0,15% DHA. И в последующих подобных вариантах осуществления композиция содержит от примерно 0,05 или примерно 0,1 до примерно 0,15, примерно 0,2 или примерно 0,4% DHA. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит кормовую композицию.
В некоторых вариантах осуществления изобретение предусматривает применение DHA и по меньшей мере одной жирной кислоты, выбранной из группы, состоящей из EPA, ARA, LA и ALA, предпочтительно EPA, для получения композиции, содержащей от примерно 0,05 до примерно 1% DHA и от примерно 0,05 до примерно 1% каждой из EPA, ARA, LA и/или ALA, присутствующих в композиции, для профилактики или лечения IBD у кошек. В некоторых подобных вариантах осуществления композиция содержит от примерно 0,1 до примерно 0,4% DHA и от примерно 0,1 до примерно 0,5% одной или нескольких жирных кислот из EPA, ARA, LA и/или ALA. В других подобных вариантах осуществления композиция содержит от примерно 0,1 до примерно 0,2% DHA и от примерно 0,1 до примерно 0,3% одной или нескольких жирных кислот из EPA, ARA, LA и/или ALA. В прочих подобных вариантах осуществления композиция содержит от примерно 0,05 до примерно 0,2% DHA и от примерно 0,05 до примерно 0,3% одной или нескольких из EPA, ARA, LA и/или ALA. В последующих подобных вариантах осуществления композиция содержит от примерно 0,05 до примерно 0,15% DHA и от примерно 0,15 до примерно 0,3% одной или нескольких жирных кислот. В следующих подобных вариантах осуществления композиция содержит от примерно 0,05 или примерно 0,1 до примерно 0,15, примерно 0,2 или примерно 0,4% DHA и от примерно 0,05, примерно 0,1 или примерно 0,15 до примерно 0,2, примерно 0,3, примерно 0,4 или примерно 0,5% одной или нескольких жирных кислот. В некоторых вариантах осуществления, композиция содержит кормовую композицию.
В некоторых вариантах осуществления изобретение обеспечивает применение DHA и EPA для получения композиции, содержащей от примерно 0,05 до примерно 1% DHA и от примерно 0,05 до примерно 1% EPA, где соотношение количества EPA, присутствующего в композиции, к количеству DHA, присутствующему в композиции составляет от примерно 1 до примерно 2, для профилактики и/или лечения IBD у кошек. В некоторых подобных вариантах осуществления соотношение количества EPA в композиции, к количеству DHA, присутствующему в композиции составляет от примерно 1,2 до примерно 1,8. В других подобных вариантах осуществления соотношение количества EPA, присутствующего в композиции к количеству DHA, присутствующему в композиции составляет от примерно 1,2 до примерно 1,5. В других подобных вариантах осуществления соотношение количества EPA, присутствующего в композиции, к количеству DHA, присутствующему в композиции, составляет от примерно 1,3 до примерно 1,6. В последующих подобных вариантах осуществления соотношение количества EPA, присутствующего в композиции, к количеству DHA, присутствующему в композиции составляет от примерно 1, примерно 1,2 или примерно 1,3 до примерно 1,5, примерно 1,6, примерно 1,8 или примерно 2. В некоторых вариантах осуществления, композиция содержит кормовую композицию.
В последующем аспекте, изобретение обеспечивает способ определения, страдает ли кошка IBD. Способ включает разделение лимфоцитов крови кошки на первый, второй и третий образцы, содержащие равное количество лимфоцитов; воздействие на второй образец митогена в течение периода времени; воздействие на третий образец тем же количеством того же митогена, что и на второй образец, в течение того же промежутка времени, что и на второй образец, в присутствии количества DHA; и сравнение степени пролиферации лимфоцитов во всех образцах. Кошка имеет IBD, если степень пролиферации лимфоцитов во втором образце выше, чем степень пролиферации лимфоцитов в первом образце, и степень пролиферации лимфоцитов в третьем образце меньше, чем степень пролиферации лимфоцитов во втором образце.
Лимфоциты собирают из крови, полученной у кошки, и разделяют на образцы, содержащие равные количества лимфоцитов. Процедуры сбора крови у кошек, выделения лимфоцитов из этой крови и подсчета количества лимфоцитов хорошо известны специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления лимфоциты могут быть собраны, как описано в примере 1. Лимфоциты, выделенные из кошачьей крови, разделяют на три или более образцов, притом, что все образцы содержат равные количества лимфоцитов. В некоторых вариантах осуществления лимфоциты разделяют на три образца (первый, второй и третий образец). Один из образцов (первый) используется в качестве контроля. Один из оставшихся двух образцов (второй) подвергается воздействию количества митогена в течение периода времени; и оставшийся (третий) подвергается действию того же количества митогена, что и второй образец, в течение того же периода времени, что и второй образец, в присутствии DHA. Все образцы инкубируются в течение одинакового периода времени при одной и той же температуре.
Митоген представляет собой средство, стимулирующее митоз. Любой митоген, способный запускать митоз в кошачьих лимфоцитах, подходит для способа по изобретению. В некоторых вариантах осуществления митоген является поликлональным митогеном. Поликлональный митоген представляет собой митоген, индуцирующий митоз в лимфоцитах многих различных специфичностей или клонального происхождения. Митогены, подходящие для способов по изобретению для диагностики IBD включают, например, фитогемагглютинин (PHA), конканавалин А (ConA), митоген лаконоса (PWM), липополисахарид (LPS) и анти-CD3 антитела.
Процедуры измерения степени пролиферации лимфоцитов известны специалистам в данной области. Любая процедура измерения степени пролиферации лимфоцитов in vitro подходят для способа по изобретению. Пролиферация лимфоцитов in vitro может быть оценена непосредственно (например, путем подсчета клеток или определения индекса частоты митозов) или косвенно (например, путем определения суммарной метаболической активности в популяции лимфоцитов либо путем мониторинга синтеза дезоксирибонуклеиновой кислоты (DNA)). В некоторых вариантах осуществления пролиферация лимфоцитов in vitro измеряется, как обсуждено в примере 1.
3
3
В некоторых вариантах осуществления способа по изобретению пролиферацию лимфоцитов измеряют путем мониторинга синтеза DNA. Процедуры для мониторинга и измерения синтеза DNA известны специалистам в данной области. Любая процедура для мониторинга и измерения синтеза DNA подходит для способа по изобретению. Синтез DNA может быть наблюдаем и измерен путем, например, мечения DNA митотически активных клеток H-тимидином или 5-бромо-2'-дезоксиуридином (BrdU) и затем определением количества H-тимидина или BrdU, включившихся в DNA. В некоторых вариантах осуществления синтез DNA измеряется, как показано в примере 1.
Как описано выше, определение того, страдает ли кошка IBD, осуществляется путем сравнения степени пролиферации лимфоцитов in vitro в первом, втором и третьем образцах. Если степень пролиферации лимфоцитов во втором образце (обработанном митогена, но не DHA) выше, чем степень пролиферации лимфоцитов в первом образце (контрольном, не подвергавшемся воздействию митогенов или DHA), то митоген, использованный в анализе, в действительности стимулировал in vitro пролиферацию лимфоцитов во втором и третьем образцах. В этом случае, степень пролиферации лимфоцитов в третьем образце (обработанном как митогеном, так и DHA) сравнивают со степенью пролиферации лимфоцитов во втором образце. Если степень пролиферации лимфоцитов в третьем образце меньше, чем степень пролиферации лимфоцитов во втором образце, то DHA ингибирует провоспалительный эффект митогена, демонстрируя наличие у кошки IBD.
В последующем аспекте, изобретение предоставляет изделия в форме набора, подходящего для профилактики или лечения IBD. Набор содержит DHA или DHA-содержащую композицию по изобретению. В некоторых вариантах осуществления набор, дополнительно, содержит анти-IBD средство (то есть набор содержит одно или несколько анти-IBD средств). В некоторых вариантах осуществления набор, дополнительно, содержит инструкции в отношении одного или нескольких из (а) введения кошке DHA; (b) введения кошке анти-IBD средства совместно с введением DHA; (c) профилактики и/или лечения IBD у кошки путем введения кошке DHA; и (d) профилактики и/или лечения IBD у кошки путем введения анти-IBD средства совместно с введением DHA кошке.
В некоторых вариантах осуществления набор содержит DHA-содержащую кормовую композицию. В некоторых вариантах осуществления набор, дополнительно, содержит анти-IBD средство. В некоторых вариантах осуществления набор, дополнительно, содержит инструкции в отношении одного или некольких из (а) скармливания кошке DHA-содержащей кормовой композиции; (b) введение кошке анти-IBD средства совместно со скармливанием кошке DHA-содержащей кормовой композиции; (c) профилактики и/или лечения IBD у кошки путем скармливания кошке DHA-содержащей кормовой композиции; и (d) профилактики и/или лечения IBD у кошки путем введения анти-IBD средства совместно со скармливанием кошке DHA-содержащей кормовой композиции.
В последующем аспекте, изобретение предоставляет изделия в форме набора, содержащего два или более ингредиентов, которые, будучи скомбинированы друг с другом, и, необязательно, с дополнительными ингредиентами, являющимися или нет частью набора, дают DHA-содержащую композицию по изобретению, подходящую для профилактики или лечения IBD у кошек. Одним из двух или более ингредиентов, которые должны быть скомбинированы, могут быть, например, чистая DHA или ее производное, либо композиция, содержащая DHA. Другим из двух или более ингредиентов, которые должны быть скомбинированы, может быть, например, кормовая композиция. Если для получения композиции необходимы дополнительные ингредиенты, являющиеся или нет частью набора, набор предоставляет инструкции касательно этих ингредиентов. В некоторых вариантах осуществления набор, дополнительно, содержит анти-IBD средство. В некоторых вариантах осуществления набор, дополнительно, содержит инструкции в отношении одного или нескольких из (а) получения композиции путем комбинирования двух или более ингредиентов, и, необязательно, дополнительных ингредиентов, являющихся или нет частью набора; (b) скармливания кошке данной композиции для, например, профилактики и/или лечения IBD; (c) введения кошке анти-IBD средства совместно со скармливанием кошке композиции; (d) профилактики и/или лечения IBD у кошек путем скармливания кошке композиции; и (е) профилактики и/или лечения IBD у кошки путем введения кошке анти-IBD средства совместно со скармливанием кошке композиции.
В некоторых вариантах осуществления набор содержит отдельные контейнеры в одной упаковке или отдельные контейнеры в виртуальной упаковке, в зависимости от компонента набора, либо (A) DHA; (B) DHA-содержащая композиция; или (C) два или более ингредиентов, которые, будучи скомбинированы друг с другом, либо, и, необязательно, с дополнительными ингредиентами, являющимися или нет частью набора, дают DHA-содержащую композицию; и одно или несколько из (1) по меньшей мере одной жирной кислоты, выбранной из группы, состоящей из EPA, ARA, LA и ALA; (2) кормовой композиции, подходящей для потребления кошкой, склонной к IBD или страдающей от воспалительного заболевания кишечника; (3) анти-IBD средства; и (4) инструкций в отношении одного или нескольких из (а) получения композиции, содержащей только DHA или в комбинации с по меньшей мере одной жирной кислотой, выбранной из группы, состоящей из EPA, ARA, LA и ALA; (b) получения кормовой композиции, подходящей для потребления кошкой, склонной к IBD или страдающей от воспалительного заболевания кишечника, и содержащей терапевтически эффективное количество только DHA или в комбинации с по меньшей мере одной жирной кислотой, выбранной из группы, состоящей из EPA, ARA, LA и ALA; (c) кошке только DHA или в комбинации с по меньшей мере одной жирной кислотой, выбранной из группы, состоящей из EPA, ARA, LA и ALA для профилактики и/или лечения IBD у кошек; (d) профилактики и/или лечения IBD у кошек путем скармливания кошкам композиции, содержащей только DHA или в комбинации с по меньшей мере одной жирной кислотой, выбранной из группы, состоящей из EPA, ARA, LA и ALA; (е) введения кошке анти-IBD средства совместно со скармливанием кошке композиции, содержащей только DHA или в комбинации с по меньшей мере одной жирной кислотой, выбранной из группы, состоящей из EPA, ARA, LA и ALA; и (f) профилактики и/или лечения IBD у кошек путем введения кошке анти-IBD средства совместно со скармливанием кошке композиции, содержащей только DHA или в комбинации с по меньшей мере одной жирной кислотой, выбранной из группы, состоящей из EPA, ARA, LA и ALA.
Термин «в одной упаковке» в целом означает, что компоненты набора физически ассоциированы внутри или с одним или несколькими контейнерами и рассматриваются как единица промышленного производства, распространения, продажи или использования. Контейнеры включают, например, пакеты, коробки, бутылки, целлофановые упаковки, соединенные скобами или иначе зафиксированные компоненты, и их комбинации. Одной упаковкой могут быть, например, контейнеры или индивидуальные пищевые композиции, физически ассоциированные таким образом, что они рассматриваются как единица промышленного производства, распространения, продажи или использования. Термин «виртуальная упаковка» в целом означает, что компоненты набора ассоциированы путем указаний на один или несколько физических или виртуальных компонентов набора, инструктируя пользователя как получить дополнительные компоненты, например, в пакете, содержащем один компонент и указания, инструктирующие пользователя посетить веб-сайт, получить записанное сообщение, просмотреть визуальное сообщение, либо связаться с персоналом, ухаживающим за животными, для получения инструкций по использованию набора. Когда набор содержит виртуальную упаковку, набор ограничен инструкциями в виртуальном пространстве и одним или несколькими физическими компонентами.
В последующем аспекте, изобретение предоставляет средства передачи информации или инструкции для одного или нескольких из (1) использования DHA или DHA-содержащей композиции для профилактики и/или лечения IBDy кошек; (2) профилактики и/или лечения IBD у кошек путем введения кошке анти-IBD средства совместно со скармливанием кошке DHA или DHA-содержащей композиции; и (3) использования набора по изобретению для профилактики и/или лечения IBD у кошек, включая документы, цифровые запоминающие устройства, оптические запоминающие устройства, аудиопрезентации или видеоизображения, содержащие информацию или инструкции. В некоторых вариантах осуществления средства сообщения содержат документ, цифровое запоминающее устройство, оптическое запоминающее устройство, аудиопрезентацию, или видеоизображение, содержащее информацию или инструкции. Предпочтительно, средства сообщения представляют демонстрируемый веб-сайт или брошюру, этикетку продукта, вкладыш в упаковку, рекламу или визуальное изображение, содержащие подобную информацию или инструкции. Полезная информация или инструкции включают, например, (1) информацию или инструкции, как использовать композицию, способ или набор по изобретению и (2) контактную информацию для персонала, ухаживающего за животными, на случай вопросов об изобретении и его использовании.
В следующем аспекте, данное изобретение обеспечивает использование DHA и, необязательно, по меньшей мере одной жирной кислоты, выбранной из группы, состоящей из EPA, ARA, LA и ALA, для получения лекарственного средства. В другом, изобретение обеспечивает использование терапевтически эффективного количества данных жирных кислот для получения лекарственного средства для профилактики или лечения IBD у кошек. В целом, лекарственные средства получают путем смешивания соединения или композиции с инертными наполнителями, буферами, связующими компонентами, пластификаторами, красителями, растворителями, уплотнителями, лубрикантами, вкусоароматическими добавками, увлажняющими средствами и другими ингредиентами, известными квалифицированным специалистам как полезные для получения лекарственных средств и разработки лекарственных средств, подходящих для введения животным.
Изобретение не ограничено конкретными методологией, протоколами и реагентами, здесь описанными, так как они могут варьировать. Далее, используемая терминология имеет целью описать только частные варианты осуществления, и не предназначена для ограничения возможностей данного изобретения. Как использованные в описании, так и в приложенной формуле изобретения, формы единственного числа включают множественное число, если контекст в явном виде не утверждает обратное. Подобным образом, слова «включать», «включает», «образует» следует интерпретировать скорее включительно, чем исключительно только.
Если не обозначено иное, все технические и научные термины и аббревиатуры в данном тексте подразумевают то же значение, которое обычно имеют для специалистов в области изобретения. Хотя некоторые методы и материалы, схожие или эквивалентные тем, что описаны в описании, могут использоваться в практике, предпочтительные методики, устройства и материалы описаны в данном тексте.
Все упомянутые в данном описании патенты, патентные заявки и публикации включены как ссылки в пределах, допустимых законом, с целью описания и раскрытия соединений, процессов, техник, процедур, технологий, изделий и других композиций и методов, в них раскрытых, которые могут быть использованы с данным изобретением. Однако ничто в данном тексте не подлежит истолкованию как допущение, что изобретение не правомочно датировать подобные раскрытия более ранним числом в силу предшествующего изобретения.
ПРИМЕРЫ
Изобретение далее может быть проиллюстрировано следующими примерами, хотя станет понятно, что примеры включены только лишь с целью иллюстрации и не предполагают ограничения пределов изобретения, если специально не оговорено другое.
Пример 1
Этот пример иллюстрирует влияние DHA и EPA на in vitro пролиферацию лимфоцитов, полученных из крови здоровых кошек и кошек с IBD.
В исследовании использованы одиннадцать здоровых кошек и одиннадцать кошек с IBD. Кошки с IBD диагностированы путем кишечной биопсии и имеют историю болезни с хронической диареей. В течение шести недель всех кошек кормили диетологически адекватным сухим кормом, рекомендуемым при желудочно-кишечных расстройствах. Кровь собирали у кошек на четвертой, пятой и шестой неделях. Образцы с равным количеством лимфоцитов использовали в тесте по in vitro пролиферации лимфоцитов.
Конкретнее, 4,5 мл крови смешивали с 4,5 мл HBSS (сбалансированный солевой раствор Хенкса) +25 mM HEPES. 4 мл фиколл-пака (Amersham) медленно вносили под разбавленную кровь. Смесь центрифугировали двадцать минут при 500g и 25°C. Верхний слой убирали. Лимфоциты переносили в чистую пробирку, ресуспендировали в 6 мл HBSS +25 mM HEPES, и затем центрифугировали десять минут при 200g и 25°C. Супернатант убирали, и лимфоциты промывали 6 мл HBSS. Эти этапы промывки и центрифугирования повторяли еще два раза. Промытые лимфоциты затем ресуспендировали в 5 мл среды AIM (Invitrogen). Образцы по 200000 лимфоцитов в 100 мкл среды AIM использовали для теста по in vitro пролиферации лимфоцитов.
2
Тест по in vitro пролиферации лимфоцитов проводили с использованием системы ИФА (Amersham Biotrak, version 2). Образцы лимфоцитов инкубировали в 96-луночных планшетах с 7 мкг/мл PHA (фитогемагглютинин) в отсутствие или присутствии 12,5 или 25 μM DHA или EPA в инкубаторе на 37°C с 5% СО и 90% влажностью в течение сорока часов. После этого добавляли 20 мкл 100 μM BrdU, и образцы инкубировали два часа при 37°C. Затем планшеты убирали из инкубатора и центрифугировали десять минут при 300g и 25°C. Среду удаляли постукиванием и промоканием, и клетки высушивали в химическом вытяжном шкафу в течение по меньшей мере пятидесяти минут. 200 мкл фиксирующего раствора добавляли в каждую лунку, и планшет инкубировали тридцать минут при комнатной температуре. Фиксирующий раствор удаляли постукиванием и промоканием, и 200 мкл блокирующего буфера добавляли в каждую лунку, и планшет инкубировали тридцать минут при комнатной температуре. Блокирующий буфер удаляли постукиванием и промоканием, и 100 мкл анти-BrdU рабочего раствора добавляли в каждую лунку, и планшет инкубировали девяносто минут при комнатной температуре. Анти-BrdU рабочий раствор удаляли постукиванием и промоканием, и каждую лунку ополаскивали три раза по 300 мкл промывочного раствора. 100 мкл 3,3',5,5'-тетраметилбензидина добавляли в каждую лунку и инкубировали десять минут, или пока не была достигнута интенсивность окраски. 25 мкл 1 М серной кислоты добавляли, чтобы остановить реакцию; и планшет считывали на интеграционном спектрофотометре для прочтения планшетов (PerkinElmer) в течение пяти минут. Результаты теста по in vitro пролиферации лимфоцитов представлены в таблицах 1 и 2.
Таблица 1
Влияние DHA на пролиферацию лимфоцитов
без PHA
PHA
PHA+12,5 μM DHA
PHA+25 μM DHA
Здоровые кошки
0,05±0,05
0,32±0,21
0,28±0,19
0,25±0,17
Кошки с IBD
0,09±0,11
0,58±0,26
0,49±0,15
0,45±0,18
Таблица 2
Влияние EPA на пролиферацию лимфоцитов
без PHA
PHA
PHA+12,5 μM EPA
PHA+25 μM EPA
Здоровые кошки
0,05±0,05
0,32±0,21
0,38±0,23
0,37±0,23
Кошки с IBD
0,09±0,11
0,58±0,26
0,62±0,27
0,63±0,29
Как видно из таблиц 1 и 2, пролиферационная активность лимфоцитов, полученных из крови кошек с IBD, выше пролиферационной активности лимфоцитов, полученных из крови здоровых кошек. Инкубация лимфоцитов кошек с IBD как с 12,5 μM, так и с 25 μM DHA, снижает пролиферацию лимфоцитов. Инкубация лимфоцитов кошек с IBD как с 12,5 μM, так и с 25 μM EPA, не снижает пролиферацию лимфоцитов.
Пример 2
Этот пример иллюстрирует влияние DHA и EPA на цитокиновый профиль лимфоцитов, полученных из крови здоровых кошек и кошек с IBD.
Лимфоциты получали из крови здоровых кошек и кошек с IBD, как описано в примере 1, и затем подвергали воздействию DHA и EPA также, как описано в примере 1. Рибонуклеиновые кислоты (RNA) выделяли из всех образцов, и полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени (RT-PCR) проводили для оценки изменений уровня экспрессии следующих цитокинов: интерлейкины 1α, 1β, 2, 6 и 10 (IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-6 и IL-10); фактор ингибирования миграции макрофагов (MIF); интерферон гамма (IFN-γ); и трансформирующий фактор роста бета (TGF-β). Результаты PCR анализа цитокинов представлены в таблице 3.
Таблица 3
Влияние DHA и EPA на экспрессию цитокинов
IL-1α
IL-6
MIF
IL-2
IFN-γ
IL-1β
IL-10
TGF-β
Здоровые кошки без PHA
1
1
1
1
1
1
1
1
Здоровые кошки (PHA)
0,82
3,55
12,25
1,03
5,95
1,03
0,65
1,1
Здоровые кошки (PHA+DHA)
0,86
5,75
16,9
21,05
37,6
0,87
0,95
3,55
Здоровые кошки (PHA+EPA)
1,05
10,6
14,05
59,4
130,9
1,17
1,2
4,7
Кошки с IBD без PHA
0,355
*
0,56
39,25
106
0,53
1,4
6,9
Кошки с IBD (PHA)
0,57
5,1
10,45
7,9
23,75
0,63
0,37
6,95
Кошки с IBD (PHA+DHA)
0,57
13,9
6,55
3
4,9
1,85
0,45
1,45
Кошки с IBD (PHA+EPA)
0,46
6,45
4,45
1,89
4,45
1,34
0,34
2,4
*=не обнаружено DHA=12,5 μM DHA
EPA=12,5 μM EPA
Согласно таблице 3, уровень экспрессии провоспалительных интерлейкинов IL-2 и IFN-γ намного выше у кошек с IBD по сравнению со здоровыми кошками, что демонстрирует наличие воспаления. Уровень экспрессии анти-воспалительного цитокина TGF-β слегка повышен у кошек с IBD по сравнению со здоровыми кошками, возможно, чтобы противодействовать воспалению. DHA снижает уровень экспрессии IL-2 и IFN-γ у кошек с IBD до уровня, близкого к уровню экспрессии IL-2 и IFN-γ у здоровых кошек, стимулированных PHA в отсутствие DHA. Уровни экспрессии цитокинов в лимфоцитах кошек с IBD, обработанных PHA и DHA, схожи с уровнями экспрессии цитокинов в лимфоцитах здоровых кошек, обработанных PHA в отсутствие DHA, предполагая, что DHA нормализует ответ лимфоцитов кошек с IBD на стимуляцию митогеном.
EPA также снижает уровень экспрессии IL-2 и IFN-γ у кошек с IBD до уровня, близкого к уровню экспрессии IL-2 и IFN-γ у здоровых кошек, стимулированных PHA в отсутствие EPA. Уровни экспрессии цитокинов в лимфоцитах кошек с IBD, обработанных PHA и EPA, схожи с уровнями экспрессии цитокинов в лимфоцитах здоровых кошек, обработанных PHA в отсутствие EPA, предполагая, что EPA, как и DHA, нормализует ответ лимфоцитов кошек с IBD на стимуляцию митогенами (хотя, как показано в примере 1, EPA не снижает пролиферацию лимфоцитов in vitro).
В описании изобретения раскрыты типичные предпочтительные варианты осуществления изобретения, и, хотя использованы конкретные термины, они применены только в общем и описательном смысле, а не с целью ограничения пределов изобретения, которые установлены далее в формуле изобретения. Очевидно, многие модификации и варианты изобретения возможны в свете вышеуказанной идеи; следовательно, должно быть понятно, что, в пределах приложенной формулы изобретения, изобретение может быть применено на практике иначе, чем конкретно описано.