РАЗМНОЖЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ НЕГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ ТКАНЕРЕЗИДЕНТНЫХ γδ T-КЛЕТОК

1. Способ размножения негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток in vitro, включающий культивирование лимфоцитов, полученных из негемопоэтической ткани человека или отличного от человека животного, в присутствии интерлейкина-2 (IL-2) и/или интерлейкина-15 (IL-15), где лимфоциты не находятся в непосредственном контакте со стромальными или эпителиальными клетками в процессе культивирования.
2. Способ по п.1, где лимфоциты не находятся в непосредственном контакте с фибробластами в процессе культивирования.
3. Способ по п.1 или 2, где способ включает культивирование лимфоцитов, полученных из негемопоэтической ткани человека или отличного от человека животного, в присутствии IL-2.
4. Способ по п.1 или 2, где способ включает культивирование лимфоцитов, полученных из негемопоэтической ткани человека или отличного от человека животного, в присутствии интерлейкина-15 (IL-15).
5. Способ по п.1 или 2, где способ включает культивирование лимфоцитов, полученных из негемопоэтической ткани человека или отличного от человека животного, в присутствии IL-2 и IL-15.
6. Способ по любому из предшествующих пунктов, где способ включает культивирование лимфоцитов в отсутствии сигналов активации TCR или костимуляторных сигналов.
7. Способ по любому из предшествующих пунктов, где способ включает в себя культивирование лимфоцитов в отсутствии агониста пути Т-клеточного рецептора.
8. Способ по любому из предшествующих пунктов, где лимфоциты культивируют в отсутствии стромальных или эпителиальных клеток.
9. Способ по п.8, где стромальные или эпителиальные клетки удаляют перед культивированием.
10. Способ по п.8, где лимфоциты культивируют в отсутствии фибробластов.
11. Способ по п.10, где фибробласты удаляют перед культивированием.
12. Способ по любому из предшествующих пунктов, где лимфоциты культивируют в среде для выращивания γδ, содержащей IL-2 и/или IL-15.
13. Способ по п.12, где среде для выращивания γδ не активирует или не стимулирует Т-клеточные рецепторы.
14. Способ по п.12 или 13, где среде для выращивания γδ не содержит факторы роста, отличные от IL-2 и/или IL-15.
15. Способ по любому из пп.12-14, где среде для выращивания γδ состоит из основной среды, дополненной IL-2 и/или IL-15.
16. Способ по любому из предшествующих пунктов, где лимфоциты получают из ткани кожи, желудочно-кишечного тракта (например, толстой кишки), молочной железы, легкого, печени, поджелудочной железы или предстательной железы.
17. Способ по любому из предшествующих пунктов, где γδ Т-клетки представляют собой клетки, отличные от Vδ2.
18. Способ по п.17, где γδ Т-клетки представляют собой клетки Vδ1.
19. Способ по п.17, где γδ Т-клетки представляют собой двойные отрицательные (DN) γδ Т-клетки.
20. Способ по любому из предшествующих пунктов, где способ включает стадию получения лимфоцитов из ткани человека или отличного от человека животного.
21. Способ по п.20, где лимфоциты получают из образца негемопоэтической ткани человека или отличного от человека животного.
22. Способ по п.20 или 21, где ткань содержит негемопоэтические клетки и лимфоциты.
23. Способ по любому из пп.20-22, где способ включает в себя получение образца негемопоэтической ткани человека или отличного от человека животного и отделение лимфоцитов от негемопоэтических клеток указанного образца с получением популяции лимфоцитов, практически не содержащей стромальные клетки.
24. Способ выращивания γδ T-клеток, включающий
(i) получение популяции γδ Т-клеток из негемопоэтической ткани;
(ii) культивирование γδ Т-клеток в условиях, практически исключающих контакт стромальных клеток с γδ Т-клетками, с получением увеличенной популяции γδ Т-клеток.
25. Способ по п.24, где популяция γδ Т-клеток, полученных из негемопоэтической ткани, представляет собой практически чистую популяцию γδ Т-клеток.
26. Способ по п.24 или 25, где популяция γδ Т-клеток, полученных из негемопоэтической ткани, представляет собой клетки, отличные от Vδ2.
27. Способ по п.26, где популяция клеток, отличных от Vδ2, содержит клетки Vδ1.
28. Способ по п.26 или 27, где популяция клеток, отличных от Vδ2, содержит γδ T-клетки DN.
+
+
+
+
29. Способ по любому из пп.24-27, где популяция γδ Т-клеток, полученных из негемопоэтической ткани, содержит γδ T-клетки Vδ1CLACCR8CD103.
30. Способ по любому из пп.24-29, где культивирование на стадии (ii) проводят в отсутствии контакта между γδ Т-клетками и стромальными клетками.
31. Способ по любому из пп.24-30, где γδ Т-клетки на стадии (ii) культивируют в условиях практического отсутствия сигналов активации TCR или костимулирующих сигналов.
32. Способ по любому из пп.24-31, где культивирование на стадии (ii) проводят в отсутствии сигналов активации TCR или костимулирующих сигналов.
33. Способ по любому из пп.24-32, где культивирование на стадии (ii) проводят в среде, кондиционированной стромальными клетками.
34. Способ по любому из пп.23-33, где культивирование γδ T-клеток на стадии (ii) проводят в присутствии IL-2, IL-15 или их сочетания.
35. Способ по любому из пп.24-34, где популяцию γδ T-клеток получают из образца негемопоэтической ткани человека или отличного от человека животного.
36. Способ по любому из пп.24-35, отличающийс тем, что негемопоэтическая ткань содержит негемопоэтические клетки и γδ Т-клетки.
37. Способ по любому из пп.24-36, где способ включает в себя отделение γδ Т-клеток от негемопоэтических клеток с получением выделенной популяции лимфоцитов, содержащей γδ Т-клетки и практически не содержащей стромальные клетки.
38. Способ по любому из пп.24-37, где γδ Т-клетки культивируют в среде для выращивания γδ, содержащей IL-2 и/или IL-15.
39. Способ по любому из пп.24-38, где среда для выращивания γδ не активирует или не стимулирует Т-клеточные рецепторы.
40. Способ по любому из пп.24-39, где среда для выращивания γδ не содержит факторы роста, отличные от IL-2 и/или IL-15.
41. Способ по любому из пп.24-40, где среда для выращивания γδ состоит из основной среды, дополненной IL-2 и/или IL-15.
42. Способ выращивания γδ Т-клеток, включающий
(i) получение негемопоэтической ткани, содержащей негемопоэтические клетки и γδ Т-клетки;
(ii) отделение γδ Т-клеток от негемопоэтических клеток с получением выделенной популяции, содержащей γδ Т-клетки и практически не содержащей стромальные клетки; и
(iii) культивирование популяции, выделенной на стадии (ii), в отсутствии сигналов активации TCR или костимулирующих сигналов с получением увеличенной популяции γδ клеток.
43. Способ по п.42, где выделение на стадии (ii) дополнительно включает в себя отделение γδ Т-клеток от αβ Т-клеток.
44. Способ по п.42 или 43, где популяция, выделенная на стадии (ii), представляет собой практически чистую популяцию γδ Т-клеток.
45. Способ по любому из пп.42-44, где популяция, выделенная на стадии (ii), представляет собой клетки, отличные от клеток Vδ2.
46. Способ по п.45, где популяция клеток, отличных от Vδ2, содержит клетки Vδ1.
47. Способ по п.45 или 46, где популяция клеток, отличных от Vδ2, включает γδ T-клетки DN.
+
+
+
+
48. Способ по любому из пп.42-47, где популяция, выделенная на стадии (ii), включает популяцию, содержащую γδ Т-клетки Vδ1CLACCR8CD103.
49. Способ по любому из пп.44-48, где культивирование на стадии (iii) проводят практически в отсутствии контакта со стромальными клетками.
50. Способ по любому из пп.42-48, где культивирование на стадии (iii) проводят в отсутствии контакта γδ Т-клеток со стромальными клетками.
51. Способ по любому из пп.42-50, где культивирование на стадии (iii) проводят практически в отсутствии сигналов активации TCR или костимулирующих сигналов.
52. Способ по любому из пп.42-51, где культивирование на стадии (iii) проводят в отсутствии сигналов активации TCR и костимулирующих сигналов.
53. Способ по любому из пп.42-52, где культивирование на стадии (iii) проводят в среде, кондиционированной стромальными клетками.
54. Способ по любому из пп.42-53, где культивирование на стадии (iii) проводят в присутствии IL-2, IL-15, или их сочетания.
55. Способ по п.54, где выделенную популяцию культивируют в среде для выращивания γδ, содержащей IL-2 и/или IL-15.
56. Способ по п.55, где среда для выращивания γδ не активирует или не стимулирует Т-клеточные рецепторы.
57. Способ по п.55 или 56, где среде для выращивания γδ не содержит факторы роста, отличные от IL-2 и/или IL-15.
58. Способ по любому из пп.55-57, где среде для выращивания γδ состоит из основной среды, дополненной IL-2 и/или IL-15.
59. Способ по любому из пп.24-58, где число γδ Т-клеток в увеличенной популяции γδ Т-клеток по меньшей мере в 20 раз превышает число γδ Т-клеток, полученных из негемопоэтической ткани после культивирования в течение 14 дней.
60. Способ по п.59, где число γδ Т-клеток в увеличенной популяции γδ Т-клеток по меньшей мере в 2 раза превышает число γδ Т-клеток, полученных из негемопоэтической ткани после культивирования в течение 7 дней.
+
61. Способ по любому из пп. 24-60, где увеличенная популяция γδ T-клеток состоит по меньшей мере на 50% из клеток Vδ1.
+
62. Способ по п.61, где увеличенная популяция γδ T-клеток состоит по меньшей мере на 70% из клеток Vδ1.
+
63. Способ по п.62, где увеличенная популяция γδ T-клеток состоит по меньшей мере на 90% из клеток Vδ1.
64. Способ по любому из пп.24-63, где увеличенная популяция γδ T-клеток по меньшей мере на 10% является положительной по CCR4, CCR8 и CD103.
65. Способ по п.63, где увеличенная популяция γδ T-клеток по меньшей мере на 30% является положительной по CCR4 и CCR8.
66. Способ по п.65, где увеличенная популяция γδ T-клеток по меньшей мере на 60% является положительной по CCR8.
-
67. Способ по любому из пп.24-66, где γδ T-клетки представляют собой клетки Vδ2.
68. Негемопоэтическая тканерезидентная γδ Т-клетка, полученная по способу, описанному в одном из предшествующих пунктов.
69. Негемопоэтическая тканерезидентная γδ Т-клетка, характеризующаяся одним или несколькими из следующих признаков:
высокий
высокий
высокий
низкий/отсутствует
(i) имеет фенотип CD69, ICOS, TIM3 и CD28
(ii) осуществляет повышающую регуляцию одного или нескольких из CCR3, CD39, CD11b и CD9,
(iii) продуцирует IFN-γ в ответ на лиганд NKG2D в отсутствии агонистов TCR,
(iv) продуцирует IL-13 в отсутствии агонистов TCR,
(v) продуцирует один или несколько из IFN-γ, TNF-α и GM-CSF в ответ на активацию TCR,
(vi) не продуцирует или практически не продуцирует IL-17 в ответ на активацию TCR,
(vii) растет в культуральной среде, содержащей IL-2 в отсутствии дополнительных факторов роста,
(viii) обеспечивает цитотоксический Т-клеточный ответ в отсутствии агонистов TCR и/или
(ix) обладает селективной цитотоксичностью в отношении опухолевых клеток по сравнению с нормальными клетками.
70. Способ скрининга ингибитора контрольной точки, включающий
(i) культивированиие негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток in vitro в непосредственном контакте со стромальными или эпителиальными клетками (например, фибробластами) в присутствии и отсутствии тестируемого соединения, или культивирование негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток in vitro в непосредственном контакте со стромальными или эпителиальными клетками (например, фибробластами) в условиях изменения экспрессии тестируемого гена в γδ Т-клетках, и/или в стромальных или эпителиальных клетках (например, фибробластах);
(ii) определение скорости пролиферации или активации негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток в присутствии и отсутствии тестируемого соединения, или в присутствии и отсутствии изменения экспрессии тестируемого гена в фибробластах или γδ Т-клетках, или определение скорости уничтожения стромальных или эпителиальных клеток (например, фибробластов) в присутствии и отсутствии тестируемого соединения, или в присутствии и отсутствии изменения экспрессии тестируемого гена в стромальных или эпителиальных клетках (например, в фибробластах) и/или γδ Т-клетках, причем, если скорость пролиферации или активации Т-клеток в присутствии тестируемого соединения выше, чем в отсутствии тестируемого соединения, или в присутствии изменения экспрессии тестируемого гена в стромальных или эпителиальных клетках (например, фибробластах) и/или γδ Т-клетках, выше, чем в отсутствии изменения экспрессии тестируемого гена в стромальных или эпителиальных клетках (например, фибробластах) и/или γδ Т-клетках, и/или если скорость уничтожения стромальных или эпителиальных клеток (например, фибробластов) в присутствии тестируемого соединения выше, чем в отсутствии тестируемого соединения, или в присутствии изменения экспрессии тестируемого гена в стромальных или эпителиальных клетках (например, фибробластах) и/или γδ Т-клетках, выше, чем в отсутствии изменения экспрессии тестируемого гена в фибробластах и/или γδ Т-клетках, то тестируемое соединение, скорее всего, является модулятором контрольной точки, или тестируемый ген, по всей вероятности, является геном-кандидатом контрольной точки.
71. Негемопоэтические тканерезидентные γδ Т-клетки, полученные по способу, описанному в одном из пп.1-67, для применения в способе лечения человека или отличного от человека животного с помощью адоптивной Т-клеточной терапии.
72. Негемопоэтические тканерезидентные γδ Т-клетки для применения по п.71, где человек представляет собой пациента-человека, страдающего от рака или инфицированного вирусом, таким как CMV или HIV.
73. Способ лечения индивидуума с помощью адоптивной Т-клеточной терапии, где способ включает в себя введение индивидууму, нуждающемуся в этом, негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток, полученных по способу, описанному в одном из пп.1-67.
74. Способ по п.73, где индивидуум представляет собой пациента-человека, страдающего от рака или инфицированного вирусом, таким как CMV35 или HIV.
75. Негемопоэтические тканерезидентные γδ Т-клетки, полученные по способу, описанному в одном из пп.1-67, для применения в способе лечения человека или отличного от человека животного с помощью терапии химерным антигенным рецептором.
76. Негемопоэтические тканерезидентные γδ Т-клетки для применения по п. 75, где человек представляет собой человека-пациента, страдающего от рака.
77. Способ лечения индивидуума с помощью терапии химерным антигенным рецептором, включающий введение индивидууму, нуждающемуся в этом, негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток, полученных по способу, описанному в одном из пп.1-67.
78. Способ по п.77, в котором индивидуум представляет собой человека-пациента, страдающего от рака.
79. Способ лечения индивидуума с помощью адоптивной Т-клеточной терапии, где способ включает введение негемопоэтических тканерезидентных γδ Т-клеток по п. 69.
80. Способ по п.79, где индивидуум представляет собой пациента-человека, страдающего от рака или инфицированного вирусом, таким как CMV35 или HIV.
81. Способ лечения индивидуума с помощью терапии химерным антигенным рецептором, включающий введение негемопоэтической тканерезидентной γδ Т-клеткипо п.69, где клетка экспрессирует химерный антигенный рецептор.
82. Способ по п.81, где индивидуум представляет собой человека-пациента, страдающего от рака.