СПОСОБ ОЦЕНКИ УСТОЙЧИВОСТИ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ ПУТЕМ ИЗМЕРЕНИЯ ГИСТОХИМИЧЕСКИМ МЕТОДОМ СОДЕРЖАНИЯ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ В ЭРИТРОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БЕРЕМЕННЫХ
METHOD FOR ASSESSING ERYTHROCYTE MEMBRANE STABILITY IN AGGRAVATED CYTOMEGALOVIRAL INFECTION BY HISTOCHEMICAL MEASUREMENT OF CALCIUM ION CONTENT IN PREGNANT WOMEN'S PERIPHERAL BLOOD ERYTHROCYTES

1. Цель изобретения - выявить, что при обострении цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации при снижении в мембранах эритроцитов ионов кальция создается угроза разрушения эритроцитов и появляются признаки гипоксии в периферической крови беременной.
2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке способа диагностики устойчивости мембран эритроцитов и появлению в периферической крови беременной признаков гипоксии.
3. Раскрытие изобретения. Экранирование фиксированных зарядов клеточной поверхности снижает электрофоретическую подвижность клеток. Этот эффект может быть объяснен как экранирование фиксированных зарядов клеточной поверхности, и связывания ионов кальция с соответствующими заряженными группировками мембраны [1, 4]. На поверхности эритроцитов могут реагировать с ионами кальция остатки нейраминовой (сиаловой) кислоты и карбоксильные группы белков [8]. В различных мембранах поверхностный заряд может в значительной степени варьировать [7].
Ионы кальция, связывающиеся на поверхности клеточной мембраны, существенны для поддержания их структурной целостности. Стабильность мембраны может снижаться, о чем свидетельствует прогрессирующее снижение сопротивления и утечка через каналы содержимого клетки. При снижении ионизированного кальция на поверхности мембраны уменьшается поверхностный потенциал мембраны [2]
4. Новая техническая задача
Найти новый способ оценки устойчивости мембран эритроцитов методом определения количества связанных ионов кальция с мембраной в зависимости от обострения в организме цитомегаловирусной инфекции.
5. Уровень техники раскрытия изобретения
Устойчивость мембран эритроцитов зависит от количества связанного с ее рецепторами ионов кальция. В случае снижения содержания ионов кальция заряд мембраны снижается, нарушается проходимость мембранных каналов и наблюдается утечка содержимого клеток [4].
Эти вопросы успешно решались в течение многих лет микроэлектрофоретическим методом на интактных клетках [4]. Однако в организме человека эти вопросы обстоят намного сложнее. В целом ряде случаев клеточная мембрана эритроцитов попадает под воздействие чужеродных белков, которыми являются и антигены вирусных инфекций. Поэтому мы применили в наших исследованиях гистохимический метод с целью показать, как ионы кальция связываются с рецепторами мембран эритроцитов как в норме, так и при вирусных заболеваниях.
Антиген цитомегаловируса находит рецептор на мембране эритроцита в качестве гликофорина, количество которого при вирусных заболеваниях резко возрастает, что нами и отмечено [5]. Это позволило провести исследования связи ионов кальция с мембраной эритроцитов гистохимическим методом с последующим цитофотометрическим подсчетом содержания связанного с мембраной эритроцита ионов кальция. Метод специфичен и прост в своем исполнении.
Отсутствие достаточного количества ионов кальция на мембране эритроцитов приводит к нарушению ее устойчивости и как следствие к гибели клетки, что фиксировалось автоматической установкой "Mekos" по количеству дегенеративных форм эритроцитов. Наконец, биохимическим методом подтверждается, что количество оксигемоглобина в этой ситуации значительно снижается, что составляет угрозу формирования в третьем триместре гестации для беременной гипоскии. Подобных исследований у беременных при обострении цитомегаловирусной инфекции мы не встречали.
6. Осуществление изобретения
6.1. Исследования проводились на базе акушерского отделения ФГБУ Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания СО РАМН. Обследовано 25 рожениц в возрасте 18-25 лет с хронической цитомегаловирусной инфекцией в стадии обострения (основная группа) и 10 беременных без патологии (контрольная группа). Диагноз устанавливался при комплексном исследовании периферической крови на наличие JgM или четырехкратного и более нарастания титра антител JgG в парных сыворотках в динамике через 10 дней, индекса авидности (65%), а также наличия ДНК к цитомегаловирусу (ЦМВ). Исследования проводились с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с учетом человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными приказом Министерства здравоохранении РФ №266 от 19.06.2003 г.
6.2. Верификация ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекса авидности осуществлялись методами ИФА на спектрофотометре "Stat-Fax-2100" (USA) с использованием тест-систем ЗАО "Вектор-Бест" (Новосибирск), методами ПНР на аппарате ДТ-96 (Россия) с использованием наборов НПО "ДНК-технология " (Москва).
7. Монослойные мазки периферической крови приготовляли на центрифуге Stat-Sprin Μ 700-22 (USA).
8. Выявление ионов кальция проводили с использованием рекомендаций Косса [3].
8.1. Фиксация выполнялась в течение 30 мин в закрытом эксикаторе в парах параформальдегида.
8.2. После фиксации мазки заливали 5% раствором нитрата серебра на 15 мин при ярком дневном свете.
8.3. После окраски нитратом серебра мазки промывались 5% раствором тиосульфата натрия и дистиллированной водой
8.4. Далее на мазок наносится на 30 мин 1% раствор сафранина на 96% этиловом спирте.
8.5. Обезводить в спиртах возрастающей крепости, просветлить в ксилоле и заключить в бальзам. В местах размещения кальция появляются черные зерна реакции, фон - желто-розовый.
9. Полученные мазки изучались под цифровым микроскопом MEIJI (Япония), связанным с компьютером через цитофотометрическую программу "Scion " (USA), позволяющую определять автоматически количество продуктов реакции (в данном случае кальция) в каждом эритроците.
10. Число дегенеративных форм эритроцитов определяли с помощью цитофотометрической установки "Mekos "(МЗ РФ, 29/100110198/1282-01).
11. Уровень оксигемоглобина определяли по методу Эвелина и Мэллой [6].
12. Статистическая обработка проводилась непарным параметрическим критерием Стъюдента и методом Фишера.
В процессе исследования установлено, что обострение хронической цитомегаловирусной инфекции до титра 1:1600 на третьем триместре гестации связано со снижением количества ионов кальция в мембранах эритроцитов до 12,80±0,40 усл.ед., контроль - 34,00±0,07 усл.ед. (фигура 1, 2). Это связано с тем, что рецепторы мембран эритроцитов связаны в большинстве с антигеном цитомегаловируса, что экранирует контакты кальция с мембраной эритроцита. Это приводит к нарушению устойчивости мембраны эритроцитов и появлению в периферической крови беременной до 12,0±0,95% дегенеративных форм, а также к снижению оксигемоглобина до 92,3±1,5%, что и создает угрозу формирования в организме беременной гипоксии.
На фигуре 1 изображена гистохимическая реакция на активность ионов кальция в мембранах эритроцитов периферической крови беременной, перенесшей на третьем триместре гестации обострение цитомегаловирусной инфекции с титром антител к цитомегаловирусу 1:1600. Реакция на кальций снижается до 12,80±0,40 усл.ед., при контроле - 34,00±0,07 усл.ед.
Гистохимическая реакция на кальций по Коссу. Увеличение - 10±100.
На фигуре 2 изображена гистохимическая реакция на активность ионов кальция в мембранах эритроцитов периферической крови беременной, не болевшей в течение гестации. Интенсивность реакции на кальций - 34,00±0,07 усл.ед. Гистохимическая реакция на кальций по Коссу. Увеличение-10±100.
ЛИТЕРАТУРА
1. Дорошенко П.А., Костюк П.Г., Мартынюк А.Е. Инактивация кальциевых токов в соматической мембране нейронов моллюсков// Нейрофизиология. 1982. Т. 14, №5. С. 525-531.
2. Дорошенко П.А., Мартынюк А.Е. Блокирование кальцийзависимого выходящего тока в соматической мембране нейронов моллюсков повышением рН внутриклеточной среды// Нейрофизиология. 1982. Т.14, №5. - С. 426-430.
3. Кононский А.И. Гистохимия. Киев.: Вища Школа. 1976. - 277 с.
4. Костюк П.Г. Кальций и клеточная возбудимость. М.: Наука, 1986, 254 с.
5. Луценко М.Т., Андриевская И.Α., Кутепова О.Л. Морфофункциональная характеристика глутатионового цикла эритроцитов периферической крови беременных, перенесших в период гестации обострение цитомегаловирусной инфекции // Бюлл. экспер. биологии и медицины. 2014. Т.157, №2. С. 246-250.
6. Покровский А.А. Справочник биохимических исследований. М.Медицина. 1969. 337 с.
7. Bolognani L., Masserini Μ., Bodimi P. Lipid composition in ganglia of molluses// J. Neurochem.,1981. V.36. P. 821-825.
8. Seaman G.V., Vasser P., Kenall M.J. Electrophoretic studies of human polynuclear leucocytes and erythrocytes// Arch. Biochem. And Biophys.1969. V.135. P 356-363.