СПОСОБ СТИМУЛИРОВАНИЯ ПРОТИВОГРИППОЗНОГО ИММУНИТЕТА

Полезная модель относится к медицине, а именно к способам профилактики и лечения гриппа, и может быть использована для ослабления клинических проявлений гриппа и увеличения выживаемости зараженных гриппом людей и животных независимо от того, какой антигенный вариант вируса гриппа является причиной заболевания.
В качестве прототипа выбран способ стимулирования противогриппозного иммунитета (Патент 2127605 Cl, РФ, МПК А 61 К 39/00, С 07 H 15/256 Способ стимулирования гуморального и клеточного иммунного ответа на целевой антиген/ Криворутченко Ю.Л., Гришковец В.И., Андроновская И.Б., Кривошеий Ю.С.- опубл. 20.03.99 Бюл. №8), который заключается во введении в организм смеси целевого антигена и адъюванта, представляющего собой один из тритерпеновых гликозидов таурозидов, выделенных из различных органов растений рода Hederá L.
Признаками прототипа, совпадающими с существенными признаками заявляемого способа, являются: введение в организм тритерпенового гликозида таурозида Sxl.
Согласно описанию, данному в прототипе, целевой вирусный антиген, представляющий собой очищенный гликопротеид вируса, вводится в иммунизируемый организм вместе с адъювантом на основе сапонинов таурозидов. Адъювант представляет собой отдельный тритерпеновый гликозид, относящийся к таурозидам, или смесь таурозидов. При этом адъювант, приготовленный из одного или нескольких таурозидов, смешивается с конкретным очищенным антигеном в забуференном
изотоническом растворе хлорида натрия (ЗИР) без иного адъюванта и вводится в иммунизируемый организм в составе указанной смеси. Кроме того, адъювант на основе таурозидов может вводиться любым приемлемым путем отдельно от целевого антигена, не содержащего иной адъювант, до введения антигена, во время или после введения антигена.
Причинами, препятствующими достижению ожидаемого технического результата (повышение эффективности стимуляции иммунитета), являются: невозможность введения целевого антигена непосредственно перед или после заражения, а также необходимость приготовления для проведения плановой иммунизации специальной вакцины на основе конкретных вирусных антигенов и таурозидов, причем первое обстоятельство ограничивает сферу применения метода плановой профилактики инфекционного заболевания и исключает его использование для экстренной профилактики и лечения гриппа, а это связано с тем, что введение в организм смесей, включающих антиген инфицирующего агента, непосредственно перед или сразу после заражения гриппом может ослабить иммунный ответ на этот микроорганизм. Вторым ограничением возможности использования представленного в прототипе способа является то, что для использования таурозидов при проведении плановой иммунизации против гриппа необходимо приготовление отдельной вакцины на основе конкретных вирусных антигенов и тритерпеновых гликозидов таурозидов, а это связано с тем, что, исходя из материалов, представленных в прототипе, не ясно, какое влияние на формирование иммунного ответа может оказать использование тех или иных таурозидов в качестве адъювантов при их введении вместе с вакциной другого состава, содержащей смесь целевого антигена с иным адъювантом (фосфатом или гидроокисью алюминия, полиоксидонием).
В основу полезной модели поставлена задача усовершенствования способа-прототипа путем использования таурозида S×l для экстренной профилактики и лечения гриппа, а также путем повышения эффективности плановой профилактики этого заболевания с помощью введения таурозида
S×l одновременно с гриппозной вакциной, содержащей в своем составе другой адъювант.
Поставленная задача решается тем, что в способе стимулирования противогриппозного иммунитета, включающем введение в организм тритерпенового гликозида таурозида ×l, согласно полезной модели, вводят таурозид S×l непосредственно до или после заражения как индивидуальное вещество или таурозид S×l вводят одновременно с гриппозной вакциной, причем тритерпеновый гликозид вводят перорально или в виде инъекций, а вакцину вводят в организм согласно рекомендации производителя.
Между совокупностью существенных признаков заявляемого способа и ожидаемым техническим результатом проявляется следующая причинно-следственная связь: введение таурозида снижает интенсивность репликации вируса гриппа в зараженном организме и усиливает развитие клеточного и гуморального иммунного ответа на антигены вируса, что дает возможность повысить выживаемость зараженных организмов в условиях острой гриппозной инфекции и добиться усиления иммунного ответа на антигены вируса после вакцинации.
Использование таурозида S×l для экстренной профилактики и лечения гриппа заключается во введении этого сапонина в организм без целевого антигена непосредственно перед, во время или после заражения гриппом. Такое применение таурозида S×l позволяет расширить сферу применения таурозидов и увеличить перечень противогриппозных средств, что создает возможность повышения эффективности экстренной профилактики и лечения гриппа за счет применения веществ (таурозидов), к которым у вирусов гриппа отсутствует устойчивость.
Использование таурозида S×l для плановой профилактики гриппа заключается в раздельном введении этого сапонина и гриппозной вакцины, включающей другой адъювант. Такой способ применения таурозида S×l позволяет усилить иммунный ответ на антигены, входящие в состав различных гриппозных вакцин разных производителей.
Способ заключается в следующем.
Для проведения экстренной профилактики и лечения гриппа таурозид S×l вводят в организм перорально или с помощью инъекций. Сапонин вводят на протяжении 3-х дней до заражения дважды в день - профилактическое введение, на протяжении 3-х дней после заражения дважды в день - терапевтическое введение, или на протяжении 2-х дней до заражения и 3-х дней после заражения дважды в день - лечебно-профилактическое введение. При иероральном введении таурозид S×l растворяют в дистиллированной воде до концентрации 5 миллиграмм/мл и вводят дважды в день из расчета 3-30 миллиграмм/кг тела/сутки. При внутримышечном или внутрибрюшинном инъекционном введении таурозид S×l растворяют в забуференном изотоническом растворе хлорида натрия, рН 7,1 (ЗИР). Раствор сапонина вводят из расчета 0,1-3 мг/кг/сутки.
Для повышения эффективности плановой профилактики гриппа раствор таурозида S×l на дистиллированной воде вводят перорально на протяжении 3-х дней после инъекционного внутримышечного введения вакцины, проводимого в соответствии с рекомендациями производителя. При этом раствор таурозида S×l с концентрацией сапонина 5 милиграмм /мл вводят дважды в день в объеме, обеспечивающем получение суточной дозы тритерпенового гликозида 3-30 мг/кг/сутки.
Сведениями, подтверждающими возможность применения полезной модели, являются ниже перечисленные примеры.
Пример 1.
Мышам линии BALB/c весом 14-16 г перорально путем спаивания через обточенную иглу шприца дважды в день по 20 мкл вводят водный раствор таурозида S×l с концентрацией тритерпенового гликозида 5 миллиграмм /мл из расчета введения 10 миллиграмм сапонина/кг веса животного/сутки. Используют три различные схемы введения таурозида S×l: терапевтическую - животным раствор сапонина вводят после заражения гриппом в течение 72 часов по два раза в день, первое введение
осуществляют через 1 час после заражения; профилактическую - животным раствор сапонина вводят дважды в день в течение 72 часов до заражения; лечебно-профилактическую - животным раствор сапонина вводят дважды в день в течение 48 часов до заражения, затем за час после заражения, а также на протяжении 48 часов после заражения. Мышам из контрольных групп (контроль вируса) по тем же схемам вместо сапонина вводят дистиллированную воду. В экспериментальные и контрольные группы включают по 10-12 животных.
Заражение мышей проводят интраназальным введением 50 мкл аллантоисной жидкости куриного эмбриона, инфицированного вирусом гриппа A/WSN/1/33(H1N1). Используют вирулентный для мышей вариант вируса гриппа A/WSN/1/33(H1N1), адаптированный к этим животным путем многократных пассажей через легкие мышей. Вирусы вводят животным интраназально под легким эфирным наркозом в дозе 10 LD50.
Результаты оценивают по выживаемости животных на протяжении 14 дней после заражения. В течение этого срока при экспериментальном гриппе отмечается смертность животных.
Для сопоставления результатов, полученных в разных опытных и соответствующих контрольных группах, определяют процент смертности (М - отношение числа павших за 14 дней животных к общему числу зараженных животных в группе) и индекс защиты. Индекс защиты (IP) рассчитывают как отношение разницы процентов смертности в контрольной и опытной группах к проценту смертности в контрольной группе по формуле:
где Мс - смертность (%) в контрольной группе, a Me - смертность (%) в опытной группе.
В таблице 1 приведены результаты изучения протективной активности гаурозида S×l при экспериментальной гриппозной инфекции мышей,
вызванной вирусом A/WSN/1/33(H1N1), в случае перорального введения сапонина в дозе 10 мг/кг/сутки.
Таким образом, введение таурозида Sxl повышает способность к выживанию мышей, зараженных вирусом гриппа, при использовании любой из изученных схем применения вещества. Сапонин обладает умеренным протективным эффектом при введении до или непосредственно после заражения. При введении этого гликозида по лечебно-профилактической схеме протективный эффект таурозида Sxl возрастает вдвое. Представленные данные свидетельствуют о способности таурозида Sxl стимулировать механизмы врожденного противогриппозного иммунитета и указывают на возможность использования указанного тритерпенового гликозида для проведения экстренной профилактики и лечения гриппа.
Пример 2.
Мышей линии BALB/c весом 25-28 г иммунизируют путем внутримышечного введения в бедро 0,1 мл гриппозной вакцины, разведенной 1:10 на ЗИР. Используют тривалентную субъединичную вакцину "ГРИПОЛ" содержащую высоко-очищенные гемагглютинин и нейраминидаза вирусов гриппа А и В в комплексе с адъювантом полиоксидонием. Производитель вакцины ФДУП НВО "Микроген" МОЗ РФ, Россия, Москва. В состав вакцины входят гемагглютинины вирусов штаммов AIVR-116(111N1), подобный A/New Caledonia/20/99; NYMC Х-157 (A/New York/55/2004) подобный A/California/7/2004(H3N2); В/Jiangsu/10/2003, подобный B/Shanghai/361/2002. Сразу после вакцинации животным перорально вводят водный раствор таурозида Sxl с концентрацией 5 милиграмм/мл по 20 мкл на введение дважды в день в течение 3 дней. Суточная доза сапонина составляет 7-8 мг/кг/день. В контрольной группе животным по той же схеме перорально вводят дистиллированную воду. Через 4, 14, 21 день после вакцинации у животных берут кровь для определения титров антигемагглютининовых антител (антигемагглютининов). Для этого используют реакцию торможения
гемагглютинации (РТГА) со стандартными гриппозными диагностикумами и формалинизированными куриными эритроцитами.
Через 4 месяца после начала эксперимента проводят забор крови для обнаружения остаточных титров антител. Затем проводят ревакцинацию. Через 5 дней после ревакцинации у животных берут кровь из хвостовой вены и с помощью РТГА в сыворотках выявляют титры антигемагглютининов. Оценку результатов проводят путем сравнения титров антигемагглютининов в сыворотках животных, принадлежащих к разным группам. Статистическую достоверность различий показателей титров антител проводят с помощью определения критерия Стьюдента (t), используя программно-математический комплекс для персонального компьютера MS Excel 97 и пакет программ для статистического анализа данных Statistica. Рассчитывают среднее арифметическое (М), стандартную ошибку (m) и достоверность отличий между показателями в группах (р).
В таблице 2 приведены результаты влияния пероралыюго введения таурозида S×l на продукцию антигемагглютининов при первичном иммунном ответе на внутримышечное введение вакцины "Грипол"
В таблице 3 приведены результаты влияния пероралыюго введения таурозида S×l на продукцию антигемагглютининов при вторичном иммунном ответе после реиммунизации вакциной "Грипол".
Как показано в таблице 2, пероральное введение таурозида S×l обеспечивает к 21 дню после иммунизации достоверно более выраженную продукцию антител, специфичных ко всем типам гемагглютининов, входящих в состав вакцины.
Как показано в таблице 3, пероральное введение таурозида S×l после внутримышечного введения вакцины обеспечивает более интенсивное формирование иммунологической памяти в отношении гемагглютининов H1 и H3 вирусов гриппа типа А, входящих в состав вакцины. Это проявляется в достоверно более высоком (чем в контрольных группах) росте титров антигемагглютининов, которое регистрируется на 5 день после ревакцинации
без дополнительного введения сапонина. При этом усиления иммунологической памяти в отношении антигенов вируса гриппа типа В не происходит.
Таким образом, введение таурозида S×l интенсифицирует процессы формирования приобретенного иммунитета против гриппа. Это проявляется в повышении уровней как первичного, так и вторичного гуморального иммунного ответа, индуцируемого введением субъединичной вакцины, включающей другой адъювант, и касается, главным образом, стимуляции выработки антител к гемагглютининам вирусов гриппа типа А.
Данный способ позволяет за счет усиления врожденного и приобретенного иммунного ответа к гриппу повысить устойчивость организма к гриппу как при экстренной профилактике и лечении этого заболевания, так и при проведении вакцинации.
Основными преимуществами предлагаемого способа являются доступность сырья и средств для получения используемог о вещества, а также высокие вакциноусиливающие и протективные свойства, позволяющие использовать способ как для профилактики, так и для лечения гриппа.