Изучение взаимодействия с ДНК и определение противоопухолевого препарата онковина с помощью амперометрического биосенсора на основе иммобилизованной ДНК

УДК 543.257.5

С. С. Бабкина, Е. Н. Моисеева, Н. А. Улахович,

Ю. И. Сальников

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ДНК И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ПРЕПАРАТА ОНКОВИНА С ПОМОЩЬЮ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКОГО БИОСЕНСОРА НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ДНК

Проведено изучение взаимодействия иммобилизованной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) с онковином - алкалоидом, обладающим противоопухолевой активностью. Разработан биоаффинный метод его определения на основе использования амперометрического ДНК-сенсора. Данный метод анализа может использоваться для определения данного эффектора ДНК в многокомпонентных системах, в том числе биологических. Предложенный биоаффинный метод определения онковина основан на предварительном концентрировании на модифицированной ДНК нитроцеллюлозной мембране в составе амперометрического биосенсора, реактивации биочувствительной части ДНК-сенсора и дальнейшем восстановлении при потенциале —0,9 В. Нижняя граница определяемых содержаний онковина данным методом составила 2,0х10'9 моль/л. Определена константа аффинного связывания (Ксвяз) комплекса онковина с ренатурированной иммобилизованной ДНК (р-ИДНК) с помощью вольтамперометрических данных. Ксвяз для комплекса онковин-р-ИДНК составила (5,0±0,4)х105 л/моль, что свидетельствует о высокой специфичности взаимодействия. Предложенная методика отличается высокой специфичностью, чувствительностью, хорошей воспроизводимостью, достаточной экспрессностью.

Изучение взаимодействия противоопухолевых препаратов с ДНК и их определение является важным аспектом при разработке новых, более эффективных препаратов и новых методов их определения, а также при выяснении фармакокинетики препаратов [1-3]. Препарат онковин - природный алкалоид индолового ряда - широко применяется в клинической практике для лечения различных видов злокачественных опухолей (острые лейкозы, лимфогранулематоз и др.) [4,5]. Известно, что онковин является интеркалятором т.е., имея планарные ароматические кольца, его молекулы встраиваются и колеблются между парами азотистых оснований двойной цепи ДНК раковых клеток, тем самым, ингибируя синтез нуклеиновых кислот и останавливая рост опухоли [6].

Методы анализа на основе ДНК позволяют предсказать и количественно оценить действие эффектора данного типа на структуру и функции ДНК. Использование электрохимических методов обеспечивает изучение, а также моделирование сложной биологической системы ДНК-онкопрепарат без разделения компонентов с высокой чувствительностью и селективностью, что особенно актуально при анализе биологических объектов. Электрохимические биосенсоры (БС) на основе ДНК позволяют изучать взаимодействие эффекторов с ДНК и определять их достаточно быстро, без дорогостоящего оборудования, без длительной пробоподготовки, достаточно специфично

и селективно, на уровне малых концентраций [7,8]. Методы определения, основанные на биологическом сродстве (биоаффинности) молекул, т.е. биоаффинные методы, нами уже разработаны для определения противоопухолевых препаратов на основе платиновых комплексов [9-11] и противоопухолевого антибиотика антрациклиновой группы адрибластина [12,13].

Цель данного исследования заключалась в разработке биоаффинного метода анализа эффектора ДНК - противоопухолевого алкалоида индолового ряда, на примере онковина - с помощью амперометрического биосенсора на основе выбранной формы иммобилизованной ренатурированной ДНК и стационарного ртутно-пленочного электрода и получения количественных характеристик взаимодействия онковина с данной формой ДНК.

Экспериментальная часть

Вольтамперометрические измерения проводились с помощью вольтамперометрической системы SVA-1BM-01 «Аналитик» (Болгария). Рабочим электродом служил стационарный ртутнопленочный электрод (СРПЭ) с серебряной подложкой (d=0,5 мм), либо разработанный БС, в котором мембрана с иммобилизованной ренатурированной ДНК (р-ИДНК) закрепляется на поверхности СРПЭ с серебряной подложкой [14]. Электрод сравнения - насыщенный каломельный электрод (нас.к.э.). Растворенный кислород удаляли из исследуемых растворов током аргона в течение 20 минут, во время регистрации вольтамперограмм газ пропускали над раствором.

Электронные спектры поглощения были сняты на спектрофотометре U-2000 «Hitachi» (Япония) в кюветах толщиной 1 см. Точность измерения оптической плотности составляла ±1%. Все измерения проводили при термостатировании 298±2 К.

Использовали ДНК эритроцитов цыплят фирмы "Reanal": соотношение N/P 1,6-1,7. Растворы ДНК с концентрацией 0,01 мг/мл в физиологическом растворе (0,9% раствор NaCl) готовили по точной навеске. Концентрацию растворов ДНК определяли спектрофотометрически по поглощению при Л=258 нм.

Применены следующие химические реагенты и растворы: нитрат целлюлозы (НЦ) ФТ-30 типа коллоксилин марки ч. со средним содержанием азота 11,5-12%; органические растворители высокой чистоты марки х.ч. (ацетон, толуол, гексан) и 25% раствор глутарового альдегида фирмы «Reanal»; ацетатный буферный раствор рН=5,2; 1 М раствор NaCl.

Исходный раствор с концентрацией 1,010-4 моль/л готовили по точной навеске препарата «Онковин» фирмы «Lilly France S.A.» (Франция). Исследуемые растворы готовили по точной навеске и методом последовательных разбавлений.

Приготовление биочувствительной части амперометрического р-ИДНК-содержащего биосенсора. Образцы р-ИДНК получали путем растворения навески НЦ в системе органических растворителей при постоянном перемешивании на магнитной мешалке с последующим добавлением водного раствора ренатурированной ДНК (р-ДНК) (денатурацию проводили кипячением раствора ДНК на водяной бане с последующим медленным охлаждением в течение 5 минут) и раствора глутарового альдегида для химического связывания молекул р-ДНК с НЦ матрицей. После этого на поверхности чашки Петри формировали пленку и высушивали ее в течение 5 минут. Полученные образцы р-ИДНК хранят в холодильнике при t = 2 - 50 С.

Биочувствительную часть БС, полученную по данной методике, закрепляли на корпусе электрохимического детектора (СРПЭ) с помощью прижимных колец [14].

Методика определения онковина с помощью амперометрического ДНК-содержащего биосенсора. Для проведения биоаффинного мембранного концентрирования онковина амперометрический БС, содержащий р-ИДНК, погружали в электрохимическую ячейку с модельным раствором онковина различной известной концентрации при pH 5,2 на 20 мин. Затем раствор сливали, ячейку промывали и заливали в нее 5 мл 1 М NaCl, деаэрировали раствор током аргона в течение 20 мин и снимали вольтамперограммы в интервале потенциалов от -0,02 В до -

1,85 В (Ео= - 0,02 В, скорость наложения потенциала 0,5 В/с). Измеряли высоту катодного пика при потенциале - 0,9 В и по полученным данным строили градуировочный график, который использовали для определения неизвестной концентрации онковина.

Методика определения константы аффинного связывания (Ксвяз) комплекса онковин -р-ИДНК. Ксвяз комплекса онковин - р-ИДНК определялась на основании данных метода вольтамперометрии. Для этого готовили серию растворов онковина (рН=5,2) с различной начальной концентрацией, опускали в каждый из них НЦ мембрану с р-ИДНК площадью 1 см2 на 20 мин. После проведения биоаффинного мембранного концентрирования была проведена реактивация р-ИДНК-содержащей мембраны раствором 1 М NaCl. После удаления мембраны проводили измерение высоты тока пика восстановления онковина при потенциале- 0,9 В. После этого строили градуировочный график зависимости высоты тока пика восстановления онковина при потенциале- 0,9 В от его исходной концентрации. Данную градуировочную зависимость использовали для определения концентрации комплекса препарат-р-ИДНК и равновесной концентрации онковина, которые использовали для построения графика Скетчарда в координатах [ОНК-ДНК]/[ОНК] - [ОНК-ДНК] [15].

Результаты и их обсуждение

Определение онковина с помощью амперометрического р-ИДНК-содержащего

БС. В качестве эффектора ДНК был выбран препарат онковин (действующее вещество -винкристина хлорид), широко применяемый в клинической практике для лечения различных видов злокачественных опухолей [4,16]. Как отмечено ранее, онковин является интеркалятором ДНК и ингибирует синтез ДНК опухолевых клеток, останавливая рост опухоли [6,17,18]. Поэтому исследования по уточнению механизма действия данного онкопрепарата, количественной оценке его взаимодействия с ДНК и определения малых его концентраций в биологических объектах, в том числе в сыворотке крови, с целью подбора индивидуальной дозировки данного препарата при лечении являются актуальными.

В данном исследовании была решена задача оптимизации состава биочувствительной части сенсора, что является основным этапом разработки любого биосенсора. При разработке биоаффинного метода определения онковина с помощью амперометрического ДНК-сенсора на основе СРПЭ был учтен механизм его действия, как интеркалятора [6], а также его способность связываться с денатурированной однонитевой ДНК за счет электростатического взаимодействия [19]. Поэтому при приготовлении биочувствительной части биосенсора на основе ИДНК после термической денатурации раствора ДНК проводили медленное охлаждение. В результате при сохранении одинарных цепей образуются и фрагменты вторичной структуры ДНК за счет восстановления водородных связей либо между двумя цепями, либо внутри одной спирали, т.е. происходит процесс частичной ренатурации. В данном случае образуется ренатурированная ДНК, или р-ДНК. Затем проводили ковалентную иммобилизацию данной формы биомолекулы в НЦ матрице.

Таким образом, ренатурацию проводили для того, чтобы взаимодействие онкопрепарата с ДНК протекало наиболее эффективно, что возможно при реализации обоих механизмов комплексообразования онковин-ДНК. Это и делает целесообразным иммобилизовать ДНК одновременно и в одно- и в двунитевой форме. Следует отметить, что ковалентная иммобилизация позволяет фиксировать обе формы молекулы ДНК на матрице, обеспечивая наибольшую доступность центров связывания ДНК для молекул эффектора.

При разработке биоаффинного метода определения онкопрепарата для исключения неспецифического связывания онковина матрицей-носителем ДНК в процессе

концентрирования была приготовлена НЦ мембрана без ДНК. Далее были проведены все операции, описанные выше в Экспериментальной части, при этом появления аналитического сигнала не наблюдалось. Проведенный холостой опыт с НЦ матрицей без иммобилизованных молекул р-ДНК, подтверждает отсутствие неспецифического связывания молекул онковина с матрицей-носителем, поскольку отсутствовал аналитический сигнал онковина после концентрирования на немодифицированной НЦ мембране.

Для сокращения времени анализа было выбрано оптимальное время концентрирования онковина на мембране с р-ИДНК по выходу на предел зависимости тока пика (мкА) от времени концентрирования (мин), которое составило 20 минут. Оптимальное время реактивации мембраны выбиралось по выходу на предел зависимости тока пика (мкА) от времени реактивации (мин), оно также составило 20 минут. Таким образом, было выбрано оптимальное время концентрирования и реактивации для сокращения времени проведения анализа без возможного ухудшения его чувствительности.

Градуировочный график для определения онковина строили по методике, описанной в Экспериментальной части. Уравнение градуировочного графика зависимости логарифма тока пика (мкА) от логарифма концентрации онковина (моль/л) имеет следующий вид:

lglp = (0,427±0,015)lgc + (2,82±0,21), r = 0,9992.

Данный график использовали для определения неизвестной концентрации онкопрепарата. Результаты определения онковина в составе препарата «Онковин» (фирма «Lilly France S.A.» (Франция)) с помощью амперометрического р-ИДНК-содержащего БС представлены в таблице 1. Линейная область определяемых концентраций онковина с

5 9

помощью амперометрического БС на основе р-ИДНК составляет 1,0х10" - 2,0х10"

моль/л. Нижняя граница определяемых содержаний (сн) составляет 2,0х10-9 моль/л (sr = 33%). В случае определения более низких концентраций онковина объем раствора можно увеличить на этапе концентрирования его на мембране БС.

Таблица 1 - Результаты определения онковина в составе препарата «Онковин»

Введено, с х105, моль/л Найдено, (c ± 5) х105, моль/л Sr

0,0005 0,00053 ± 0,00008 0,12

0,005 0,0052 ± 0,0003 0,05

0,01 0,013 ± 0,001 0,06

0,50 0,51 ± 0,03 0,05

1,00 5 ,0 0, +1 ,0 0,04

Нами было изучено комплексообразование онковина с молекулами р-ИДНК для оценки сродства эффектора именно к данной форме ДНК, а также для оптимизации разработанного аналитического метода.

Для количественной характеристки специфичности комплексообразования провели определение константы аффинного связывания онковина с иммобилизованной формой р-ДНК на основании полученных вольтамперометрических данных методом Скетчарда [15] в координатах: [Сцнк -онк]/[Сонк] — [Сонк], где [Сднк-онк] - равновесная концентрация комплекса р-ИДНК-онковин, [Сонк] - равновесная, т.е. оставшаяся несвязанной после образования комплекса, концентрация онковина. Значение Ксвяз составило (5,0±0,4)х105 л/моль. Полученное высокое значение еще раз подтверждает большую способность к комплексообразованию с выбранной формой р-ИДНК и свидетельствует о перспективности определения противоопухолевых препаратов этого класса с помощью р-ИДНК-содержащего БС.

Чувствительность разработанного биоаффинного метода отражает высокое сродство онковина к р-ИДНК, подтвержденное высоким значением константы аффинного связывания образующегося комплекса. Следует отметить, что проведенное исследование позволило смоделировать реальную систему цитостатик-ДНК опухолевых клеток организма и еще раз количественно подтвердить высокую эффективность данного противоопухолевого препарата.

Было также показано, что ДНК после иммобилизации является биологически активной и сохраняет свою активность не менее 30 дней. В течение всего этого времени отсутствует вымываемость р-ДНК из НЦ мембраны. Равенство аналитических сигналов, полученных при использовании различных участков мембраны с данной формой иммобилизованной ДНК равной площади, свидетельствует об однородности биочувствительной части сенсора по составу. Следует сказать, что при необходимости можно легко заменить мембрану после проведения анализа на новую.

Для оценки возможности использования разработанного амперометрического ДНК-сенсора как нового инструмента биохимического анализа при определении фармпрепаратов была разработана методика определения онковина в реальных объектах -в сыворотке крови человека.

Возможность проведения таких анализов имеет большое значение, т.к., как отмечалось выше, препарат онковин широко используется в клинической практике для лечения различных видов злокачественных опухолей [2-4], но обладает рядом побочных действий. Поэтому необходимость его определения в многокомпонентных системах, в том числе биологических, для уточнения индивидуальной дозировки препарата с целью уменьшения токсичности и увеличения эффективности лечения являются актуальными.

При анализе сыворотки крови на содержание онковина в электрохимическую ячейку вводили 3 мкл сыворотки крови, опускали р-ИДНК-содержащий БС и все дальнейшие операции проводили как описано выше; для нахождения неизвестной концентрации фармпрепарата использовали градуировочный график. Результаты определения онковина в сыворотке крови с помощью амперометрического ДНК-сенсора представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Результаты определения онковина в сыворотке крови с помощью амперометрического р-ИДНК-содержащего БС

Анализируемый объект Вольтамперометрия с ДНК-сенсором

Найдено, (с±5)х10'8, моль/л Яг

Сыворотка крови 1 2,4±0,3 0,10

Сыворотка крови 2 0,23 ± 0,02 0,07

Сыворотка крови 3 2,1 ± 0,4 0,15

Сыворотка крови 4 0,45±0,03 0,05

Сыворотка крови 5 1,3±0,2 0,12

Таким образом, результаты изучения процесса комплексообразования фармпрепарата с р-ИДНК, найденные оптимальные условия проведения анализа, широкий диапазон определяемых содержаний, возможность селективного определения онковина в присутствии электрохимически неактивных компонентов матрицы, либо восстанавливающихся в иной области потенциалов, позволяют использовать разработанный амперометрический ДНК-сенсор как новое средство биохимического контроля за содержанием фармпрепаратов-цитостатиков, на примере онковина, в многокомпонентных биологических системах, в том числе в сыворотке крови человека.

Литература

1. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. М.: Мир, 1987. 584 с.

2. Rauf S. Electrochemical approach of anticancer drugs-DNA interaction/ S. Rauf, J.J. Gooding, K. Ahtar// J. of Pharm. and Biomed. Analysis. 2005. V. 37, №. 2. P. 205-217.

3. Благой Ю.П. Взаимодействие ДНК с биологически активными веществами (ионами металлов, красителями, лекарствами) // Соросовский образовательный журнал. 1998. Т. 10, №35. С. 18-25.

4. Wong L.C. Primary treatment with vincristine, dactinomycin and cyclophosphamide in cell tumor of the ovary / L.C. Wong, H. Nhgan, H. Ma // Gynecologic Oncology. 1989. V. 34, №. 2. P. 155-158.

5. Souquet P.J. Carboplatin, vinblastin and mytomycin (CMV) in advanced and disseminated non small cell lung cancer / P.J. Souquet, P. Fournel // Lung cancer. - 1991. - V. 7, N. 1. - P. 102.

6. Graves D. Intercalative binding of small molecules to nucleic acids / D. Graves, L. Velea // Cur. Org. Chem. 2000. V. 4, №. 9. P. 915-929.

7. Wang J. Electrochemical biosensors: towards point-of-care cancer diagnostics / J. Wang // Biosens.Bioelectron. 2006. V. 21, №. 10. P. 1887-1892.

8. Bagni G. Deoxyribonucleic acid (DNA) biosensors for environmental risk assessment and drug studies / G. Bagni, D. Ozella, R. Sturchio, M. Mascini // Anal. Chim. Acta. 2006. V. 1016. P. 345-353.

9. Бабкина С. С. Вольтамперометрическое определение компонентов биоспецифического взаимодействия дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и антител к ней с образованием комплексов Pt(II) /С.С.Бабкина, Н.А.Улахович, Э.П.Медянцева, О.В Климович //Журн.аналит.хим. - 1998. - Т.53, №6. - С.604-607.

10. Бабкина С. С. Определение аутоантител к ДНК с помощью биосенсора на основе комплекса Pt(II) с ДНК / С.С.Бабкина, Н.А.Улахович, Э.П.Медянцева, О.В Климович // Прикл.биохимия и микробиология. 1998. Т.34, №5. С.572-575.

11. Babkina S.S. Amperometric DNA biosensor for the determination of autoantibodies using DNA interaction with Pt(II) complex / S.S.Babkina, N.A.Ulakhovich, Yu.I.Zyavkina // Analytica Chimica Acta. 2004. V.502, №.1. P.23-30.

12. Бабкина С.С. Взаимодействие иммобилизованной ДНК с адрибластином и ионами кобальта (II) и их определение биоаффинными методами, основанными на использовании амперометрического ДНК-сенсора / С.С. Бабкина, Е.Н. Моисеева, Ю.И. Сальников // Вестник Казанского технологического университета. 2006. №2. С. 211-218.

13. Бабкина С.С. Определение противоопухолевого антибиотика доксорубицина с помощью амперометрического биосенсора на основе иммобилизованной ДНК / С.С. Бабкина, Е.Н. Моисеева, Н.А. Улахович // Фармация. 2006. №. 5. С. 9-11.

14. Budnikov H.C., Medyantseva E.P., Babkina S.S. An enzyme amperometric sensor for toxicant determination// J. Electroanal. Chem. 1991. V.310. P.49-55.

15. Варфоломеев C.Д. Биокинетика. М.: ФАИР-Пресс, 1999.720 с.

16. Реестр лекарственных средств России. Энциклопедия лекарственных средств. М., ООО «РЛС». 2004.С. 317-318.

17. Bijnen P. Drug interactions in oncology / P. Bijnen, J. Schellens // Oncology. 2004. V. 5, №. 8. P. 489-496.

18. Руководство по медицине. Диагностика и терапия/ Под ред. Р. Беркоу, Э. Флетчера. М.: Мир, 1997.С. 771-878.

© С. С. Бабкина - д-р хим. наук, проф. каф. неорганической химии КГУ; Е. Н. Моисеева - асп. той же кафедры; Н. А. Улахович - д-р хим. наук, проф., зав. каф. неорганической химии КГУ; Ю. И. Сальников - д-р хим. наук, проф. той же кафедры.