УЛУЧШЕННЫЕ ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ

1. Модифицированная клетка, содержащая
геном указанной клетки, при этом указанный геном содержит одно или более изменений, включающих
делеции,
добавления и/или
замены,
по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты в одном или более, в целом, более, чем в 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 90 или 100 эндогенных ретровирусных (ERV) элементах, которые являются частью указанного генома.
2. Модифицированная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанная клетка представляет собой клетку млекопитающего, предпочтительно клетку линии клеток млекопитающего, такую как модифицированная клетка СНО, включая модифицированную СНО-K1.
3. Модифицированная клетка по п. 1 или 3, отличающаяся тем, что ERV-элементы происходят из гаммаретровирусных ERV, включая ERV вируса эпидемии коал (KoRV), ERV вируса опухоли молочной железы у мышей (MMTV), ERV вируса лейкоза мышей (MLV), и при этом указанные одно или более изменений адаптированы для подавления или исключения высвобождения одного или более, предпочтительно более, чем 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 100% указанных ERV.
4. Модифицированная клетка по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что указанные один или более (ERV) элементов представляют собой или происходят из гена gag, pol и/или env, предпочтительно из указанного гена gag, кодирующего белок МА (ядерного матрикса), СА (белок капсида), NC (белок нуклеокапсида), белки, кодирующие дополнительный домен, такие как рр12 или р6, и/или представляют собой длинные концевые повторы (LTR) ERV.
5. Модифицированная клетка по п. 4, отличающаяся тем, что указанный один или более ERV-элементов кодируют белок Gag (групповой антиген), белок Pol (обратная транскриптаза) и/или белок Env (оболочки).
6. Модифицированная клетка по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что указанные делеции, добавления или замены содержат более, чем 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150 или 200 нуклеиновых кислот.
7. Модифицированная клетка по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что указанные изменения представляют собой добавления в форме направленных интеграций, и указанные один или более (ERV) элементов представляют собой или происходят по меньшей мере из одного гена gag, pol и/или env, предпочтительно генов gag, и последовательности указанного гена подвергнуты указанным направленным интеграциям трансгена, предпочтительно кодирующего маркерный белок, такой как GFP (зеленый флуоресцентный белок), и/или указанное изменение(-я) приводят к доминантно-негативному фенотипу.
8. Модифицированная клетка по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что указанные ERV-элементы получены из гена gag, и по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% или все указанные элементы содержат указанные изменения.
9. Модифицированная клетка по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что указанные изменения содержатся в консенсусных последовательностях указанных EVR-элементов, при этом длина такой консенсусной последовательности может составлять по меньшей мере 5, 10, 15 или 20 пар оснований, предпочтительно длина составляет 15-25 или 30-50 пар оснований.
10. Модифицированная клетка по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что указанная модифицированная клетка не высвобождает или по существу не высвобождает ERV.
11. Модифицированная клетка по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что указанная модифицированная клетка содержит гетерологичные последовательности нуклеотидных кислот, которые кодируют, ингибируют или активируют по меньшей мере один белок пути рекомбинации, и/или гетерологичные последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют по меньшей мере одну последовательность или белок, подавляющий экспрессию по меньшей мере одного белка пути рекомбинации, предпочтительно HR, еще более предпочтительно Nbs1, Mre11, Rad51, лигазы 1 и/или лигазы 3.
12. Модифицированная клетка по п. 11, отличающаяся тем, что указанные гетерологичные последовательности нуклеотидных кислот присутствуют в виде вектора, который не интегрирован в геном указанной клетки.
13. Модифицированная клетка по любому из предшествующих пунктов, дополнительно содержащая гетерологичную донорную ДНК, предпочтительно в векторе, кодирующую по меньшей мере один маркерный белок, такой как GFP (зеленый флуоресцентный белок).
14. Модифицированная клетка по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что указанная клетка дополнительно содержит трансген.
15. Модифицированная клетка по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что указанный трансген представляет собой маркерный ген, кодирующий маркерный белок, такой как GFP, и/или обладающий терапевтической активностью белок, который предпочтительно интегрирован в геном.
16. Модифицированная клетка по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что указанная клетка представляет собой клетку СНО, и при этом по меньшей мере одно изменение представляет собой замену по меньшей мере одной миристоилированной аминокислоты в мотиве миристоилирования в одном или более ERV-элементов таком, как, например, ген gag или ERV-элементе, полученном из гена gag, на немиристоилированную аминокислоту, при этом указанная модифицированная клетка содержит по меньшей мере тразниентно
последовательности, как, например, в форме транзиентно экспрессированного вектора, кодирующего белки HR и/или MMEJ, такие как Pad51, Lig3, Ercc1, Pold3; и/или
- последовательности, как, например, последовательности миРНК, такие как миРНК11, или векторы, кодирующие указанные последовательности.
17. Модифицированная клетка по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что указанная клетка представляет собой клетку СНО, содержащую один или более указанных ERV-элементов, таких как ген gag или ERV-элемент, полученный из гена gag, который содержит мотив PPYP, и при этом (i) последовательности, кодирующие указанный мотив PPYP, и/или последовательности, содержащие вплоть до 20 нуклеиновых кислот, фланкирующие последовательности в (i), содержат указанное изменение.
18. Модифицированная клетка по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что указанная модифицированная клетка представляет собой клетку СНО и содержит делеции, добавления и/или замены по меньшей мере в одной последовательности, соответствующей SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, или в последовательностях с более, чем 90% или 95% идентичностью последовательности к таким последовательностям, предпочтительно в границах ERV-элементов указанных последовательностей.
19. Модифицированная клетка по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что указанная модифицированная клетка представляет собой клетку СНО и содержит делеции, добавления и/или замену в консенсусной последовательности ERV группы 1, такой как SEQ ID NO: 30, или в последовательностях с более, чем 90% идентичностью последовательности к такой последовательности, и при этом указанная последовательность, содержащие такие делеции, добавления и/или замены, не кодирует функциональный белок Gag.
20. Способ улучшенного редактирования генома, включающий
(i) введение гетерологичной системы для введения одно- или двухцепочечных разрывов в последовательность целевой нуклеиновой кислоты, такой как консенсусная последовательность ERV-элемента, предпочтительно ERV-элемента, который представляет собой или который получен из гена gag, в клетку, предпочтительно в представляющую интерес клетку, и дополнительно
(ii) введение в указанную клетку
(a) гетерологичных последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих или активирующих по меньшей мере один белок по меньшей мере одного указанного пути рекомбинации, и/или
(b) гетерологичных последовательностей, кодирующих одну или более последовательностей таких, как, например, миРНК, или белки, подавляющие/снижающие экспрессию по меньшей мере одного белка по меньшей мере одного указанного пути рекомбинации, при этом указанная гетерологичная система (i) и/или последовательности (ii) (а) и/или (ii) (b) предпочтительно по меньшей мере транзиентно экспрессируются в представляющей интерес клетке.
21. Способ по п. 20, согласно которому указанные гетерологичные последовательности кодируют или активируют по меньшей мере один белок пути рекомбинации, в частности по меньшей мере один белок гомологичной рекомбинации (HR), в частности Rad51.
22. Способ по п. 20, согласно которому маркерный ген, такой как GFP, вставлен в указанную целевую нуклеотидную последовательность посредством гомологичной рекомбинации, и при этом клетки, содержащие указанный маркерный ген, предпочтительно являются отобранными.
23. Способ по любому из пп. 20-22, согласно которому указанные гетерологичные последовательности нуклеиновых кислот (а) кодируют или активируют белки MNR-комплекса, такие как Nbs1 и/или Mre11, и/или при этом указанные гетерологичные последовательности (b) кодируют последовательности или белки, подавляющие экспрессию по меньшей мере одного белка пути HR, такого как Rad51.
24. Способ по любому из пп. 20-23, согласно которому делеция или вставка введены в указанные один или более ERV-элементов посредством негомологичного соединения концов (NHEJ) или опосредованного микрогомологией соединения концов (MMEJ).
25. Способ по любому из пп. 20-24, согласно которому указанные гетерологичные последовательности представляют собой часть интегрирующих или неинтегрирующих векторов.
26. Способ по любому из пп. 20-25, согласно которому указанная не встречающаяся в природе система для введения одно- или двухцепочечных разрывов в целевую нуклеотидную последовательность представляет собой CRISPR/Cas9-систему или основанную на ней систему.
27. Способ по любому из пп. 20-26, согласно которому указанная клетка представляет собой клетку СНО, и при этом по меньшей мере одна миристоилированная аминокислота в мотиве миристоилирования в одном или более ERV-элементах заменена на немиристоилированную аминокислоту, причем указанный способ предпочтительно осуществляют во время транзиентной экспрессии последовательностей, кодирующих белки HR и/или MMEJ, такие как Pad51, Lig3, Ercc1, Pold3, и/или последовательностей, как, например, последовательностей миРНК, таких как siMRe11, или кодирующих их векторов.
28. Способ по любому из пп. 20-27, согласно которому указанная клетка представляет собой клетку СНО, содержащую в одном или более указанных ERV-элементах мотив PPYP, и при этом (i) последовательности, кодирующие указанный мотив PPYP, и/или последовательности, содержащие вплоть до 20 нуклеиновых кислот, фланкирующие указанные последовательности (i), содержат изменение, причем указанный способ предпочтительно осуществляют во время транзиентной экспрессии последовательностей РНК, подавляющих экспрессию белков HR, таких как Rad51.
29. Модифицированная клетка, при этом геном указанной клетки содержит одно или более изменений, включающих:
(a) делеции,
(b) добавления и/или
(c) замены,
по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты в одном или более, в целом в более, чем 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 90 или 100 эндогенных ретровирусных (ERV) элементах, и которая получена при помощи способов по любому из пп. 19-27.
30. Модифицированная клетка по п. 28, отличающаяся тем, что указанная клетка представляет собой клетку млекопитающего, предпочтительно клетку линии клеток млекопитающего, такую как модифицированная клетка СНО, включая модифицированную СНО-K1.
31. Набор, содержащий:
(i) в одной емкости по меньшей мере один неинтегрирующий вектор, кодирующий по меньшей мере нуклеазу, такую как CRISPR,
(ii) в той же или в дополнительной емкости по меньшей мере одну гидовую РНК или последовательность, кодирующую по меньшей мере одну гидовую РНК, нацеливающую на мотив в ERV-элементе,
(iii) в той же или в дополнительной емкости по меньшей мере одну миРНК или последовательность, кодирующую по меньшей мере одну миРНК, и
в дополнительной емкости инструкцию о том, как обеспечить попадание (i), (ii) и (iii) внутрь клетки.
32. Набор по п. 31, отличающийся тем, что указанные последовательности, кодирующие по меньшей мере одну гидовую РНК, нацеливающую на указанный мотив в ERV-элементе, и/или указанные последовательности, кодирующие по меньшей мере одну миРНК, являются частью вектора.
33. Набор по п. 32, отличающийся тем, что указанный вектор представляет собой неинтегрирующий вектор (i).
34. Набор по любому из пп. 31-33, отличающийся тем, что указанный ERV-элемент кодирует белок Gag.
35. Набор по п. 32, отличающийся тем, что указанный мотив представляет собой мотив миристоилирования или мотив PPXY, в частности мотив PPYP.
36. Набор по любому из пп. 31-35, отличающийся тем, что указанные миРНК направлены против гена пути HR.