ПИЩЕВОЙ ПРОДУКТ И НАПИТОК, МОДУЛИРУЮЩИЙ КИШЕЧНУЮ ФЛОРУ ЧЕЛОВЕКА, ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ, СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ АРАБИНОКСИЛАНА
FOOD PRODUCT AND BEVERAGE MODULATING HUMAN INDESTINAL FLORA, FOOD ADDITIVES, ITS PRODUCTION AND METHODS AND USAGE METHODS OF ARABINOXYLAN PREPARATIONS

Настоящее изобретение относится к применению препаратов арабиноксилана в качестве пребиотических пищевых добавок и к способам улучшения состояния желудочно-кишечного тракта людей посредством дополнения их рациона упомянутыми добавками. В предпочтительном варианте осуществления препараты арабиноксилана получены из натуральных источников, таких как растительный материал, и более предпочтительно из зерновых культур.
О
О
Изобретение касается положительного влияния пищевых продуктов с данными некрахмальными полисахаридами (NSP) на состояние желудочно-кишечного тракта и, конкретнее, на микробиоту кишечника. NSP включают ряд соединений, обладающих различными физико-химическими свойствами. Арабиноксиланы, также называемые пентозанами, являются важной группой NSP зерновых культур и состоят из главной цепи из β-1,4-связанных групп D-ксилопиранозила, с которыми связаны-2 и/или-3 группы α-L-арабино-фуранозила. В типичном арабиноксилане встречаются незамещенные, монозамещенные и двузамещенные остатки ксилозы (см. фиг.1). Арабиноксиланы бывают либо экстрагируемые водой, либо неэкстрагируемые водой. Последние могут быть частично солюбилизированы в условиях щелочной среды или с помощью применения энзимов и связывания больших количеств воды. Экстрагируемые водой арабиноксиланы имеют необычный потенциал формирования вязкости. В целом, в зависимости от источника и способа экстракции, они имеют очень высокую молекулярную массу (до 800000 дальтон). Несмотря на то, что они являются только вспомогательными компонентами, они важны для функциональности зерновых культур в биотехнологических процессах, таких как продукция пшеничного крахмала, пасты и пива, хлебопекарное производство и в других областях пищевой промышленности.
Было показано, что некоторые типы олигосахаридов, полученных из арабиноксилана или ксилана (незамещенный полимер β-1,4-связанных групп D-ксилопиранозила), обладают пребиотическими свойствами. Пребиотиками являются соединения, обычно негликозидные олигосахариды, которые не могут быть переварены ферментами верхнего отдела желудочно-кишечного тракта, но селективно ферментируются некоторыми типами кишечных бактерий в толстой кишке (Gibson and Roberfroid, 1995; Roberfroid, 1988; Van Loo, 2004). Наличие пребиотиков в рационе вызывает сдвиг в составе популяции бактерий кишечника, обычно характеризующийся относительным повышением видов Lactobacillus и Bifidobacterium. Этому сдвигу микробиоты кишечника сопутствует улучшение общего самочувствия, уменьшение кишечных инфекций, повышение уровня короткоцепочечных жирных кислот в кишечнике, лучшая адсорбция минералов и подавление инициирования рака толстой кишки (Van Loo, 2004). Было показано, что препараты ксило-олигосахаридов (XOS, олигосахариды, состоящие из β-1,4-связанных групп D-ксилопиранозила) с преобладанием олигосахаридов со степенью полимеризации (DP) 2-3 (ксилобиоза и ксилотриоза) вызывают значительное повышение уровня бифидобактерий в фекалиях и слепой кишке крыс (EP 0265970B1; Campbell et al., 1997; Hsu et al., 2004) и толстой кишке людей (Okazaki et al., 1990). Подобные богатые ксилобиозой препараты XOS также подавляют ранние симптомы химически индуцированного канцерогенеза в толстой кишке у крыс (Hsu et al., 2004) и повышают всасывание кальция (Toyoda et al., 1993). Также показано, что препарат, состоящий преимущественно из арабиноксило-олигосахаридов (AXOS) с DP 3-5 (арабиносилксилобиоза, арабиносилксилотриоза, арабиносилксилотетраоза и диарабиносилксилотетраоза), повышает уровень бифидобактерий в кишечнике крыс и мышей (Yamada et al., 1993).
Основным недостатком современных коммерческих препаратов XOS, сильно ограничивающим их коммерческий потенциал, является их очень высокая цена по сравнению с другими олигосахаридами, указывающая на то, что современные производственные процессы не эффективны. Описан способ производства пребиотических препаратов с преобладанием XOS с DP 2-3, включающий химическую экстракцию ксилана из продуктов на растительной основе (твердая древесина, сердцевина кукурузного початка, оболочка семени хлопчатника, пшеничные отруби или зерна, используемые для пивоварения), применяя растворы NaClO и высококонцентрированные растворы KOH, с последующим ферментативным гидролизом экстрагированного ксилана с помощью ферментов эндоксиланаз (EP 0265970B1). Подобный способ применялся для изготовления пребиотического препарата AXOS (препарат AXOS с DP 3-5) и включал химическую экстракцию арабиноксилана с применением концентрированного щелочного раствора, с последующим удалением солей ферментативным гидролизом эндоксиланазой и хроматографией на углеродной колонке (Yamada et al., 1993). Главный недостаток этих способов состоит в том, что химическая экстракция ксилана или арабиноксилана неблагоприятна для окружающей среды и требует дорогостоящего удаления химикатов с помощью экстенсивного диализа или ультрафильтрации, прежде чем может быть выполнен ферментативный гидролиз. Другой способ получения XOS или AXOS включает гидротермальный аутогидролиз твердой древесины или зерен, используемых для пивоварения. В этом способе суспензия растительного материала нагревается в специальном реакторе до 150-190°C в течение 20-60 минут (EP 0265970B1; Kabel et al., 2002; Carvalheiro et al., 2004). Недостаток этого способа состоит в том, что из-за высокой температуры реакции образуются побочные продукты, такие как фурфурол, гидроксиметилфурфурол и левулиновая кислота, присутствие которых в продуктах питания нежелательно (Carvalheiro et al., 2004).
Описанные в настоящее время пребиотические препараты XOS и AXOS имеют среднюю степень полимеризации, которая равна либо 2 (EP 0265970B1), либо 4 (Yamada et al., 1993). Для применения, в частности, в пищевой области эти препараты имеют некоторые недостатки. Во-первых, препараты богаты ксилозой, которая имеет сладкий вкус, приблизительно 60% сладости сахарозы (Suntory, xylo-oligosaccharide, brochure and product sheet, 2001). Для некоторых областей применения сладкий вкус может оказаться желательным, но для других областей применения более желателен более нейтральный вкус. Ксило-олигосахариды с низкой средней степенью полимеризации также имеют сладкий вкус, приблизительно 40% от сладкого вкуса сахарозы (Suntory, xylo-oligosaccharide, brochure and product sheet, 2001). Во-вторых, препараты с низкой средней степенью полимеризации имеют уровень энергии, который не желателен для компонентов низкокалорийных пищевых продуктов. Для вычисления величины энергии ксило-олигосахаридов, считается, что величина энергии на грамм метаболизируемой ксилозы составляет 4 калории, на грамм ксилобиозы и ксилотриозы составляет 2 калории и на грамм ксило-арабиноолигосахаридов с DP>4 составляет 0 калорий (Suntory, xylo-oligosaccharide, brochure and product sheet, 2001).
Настоящее изобретение касается пищевых добавок, включающих арабиноксиланы, которые полезным образом модулируют кишечную флору человека. Кроме того, изобретение касается некоторых продуктов питания и напитков, содержащих добавки, наряду со способами получения упомянутых добавок.
На чертежах:
O-
O
O-
O-
О
Фиг.1: Структурные элементы арабиноксиланов. A: незамещенный остаток [β]-D-ксилопиранозила. B: Остаток [β]-D-ксилопиранозила, замещенный в2 молекулой [α]-L-арабинофуранозила. C: Остаток [β]-D-ксилопиранозила, замещенный в -3 молекулой [α]-L-арабинофуранозила. D: Остаток [β]-D-ксилопиранозила, замещенный в2 и3 молекулами [α]-L-арабинофуранозила. Структура C показывает связь феруловой кислоты с -5 молекулы [α]-L-арабинофуранозила.
4
4
4
4
4
4
4
4
Фиг.2: HPSEC профили молекулярных масс различных препаратов AXOS. Применялась колонка Shodex SB-806 HQ (300x8 мм, Showa, Denko K.K., Tokyo, Japan). Элюирующие объемы стандартного пуллулана с молекулярной массой 78,8×10, 40,4×10, 21,2×10, 11,2×10, 4,73×10, 2,28×10, 1,18×10, 0,59×10 Да и глюкозы (180 Да) обозначены слева направо символом "×".
Фиг.3: Распад составляющих моносахаридов AXOS-15-0,27 (A), Xylooligo-95P (B) и фрукто-олигосахаридов (C) в процентах в течение различного времени инкубации при 100°C при pH 2, 3, 7 и 11.
Фиг.4: Гидролиз AXOS-15-0,27 (A), Xylooligo-95P (B) и фрукто-олигосахаридов (C) в процентах в течение различного времени инкубации при 100°C при pH 2, 3 и 7.
Фиг.5: Гидролиз связей ксилозы (A) и связей арабинозы (B) в AXOS-15-0,27 в процентах в течение различного времени инкубации при 100°C при pH 2,3 и 7.
Фиг.6: Сладкий вкус AXOS-15-0,27, Xylooligo-95P и сахарозы. Построенные кривые показывают суммарный процент субъектов (n=20), распознающих сладкий вкус, в зависимости от концентрации соединения в г/л.
4
4
4
4
4
Фиг.7: HPSEC профили молекулярных масс фракций олигосахарида, полученных после ультрафильтрации AXOS, полученного с помощью обработки эндоксиланазой скребкового WU-AX. Применяемые мембраны имели MMCO 5 кДа (панель A), 10 кДа (панель B) и 30 кДа (панель C). Применялась колонка Shodex SB-802,5 HQ (300×8 мм, Showa, Denko K.K., Tokyo, Japan). В качестве маркеров молекулярной массы применялись стандартные P-82 Shodex пуллуланы с молекулярной массой 11,2×10, 4,73×10, 2,28×10, 1,18×10 и 0,59×10 Да, стандартные ксило-олигосахариды с молекулярной массой 810 (DP6), 678 (DP5), 546 (DP4), 414 (DP3) и 282 Да (DP2) и глюкоза с молекулярной массой 180 Да, и их соответствующий элюирующий объем обозначен символом "x" слева направо.
10кДа+30кДа
10кДа+30кДа
10кДа
Фиг.8: HPSEC профили молекулярных масс фракций олигосахарида, полученных после ультрафильтрации с помощью последовательного прохождения через мембраны с MMCO 10 кДа и 30 кДа AXOS, полученного с помощью обработки эндоксиланазой скребкового WU-AX. Анализировались фракции либо ретентата после прохождения через 30 кДа MMCO ретентата с мембраны 10 кДа (RET), пермеата после прохождения через 30 кДа MMCO ретентата с мембраны 10 кДа (PER), либо пермеата после прохождения через 10 кДа мембрану (PER). Применялась колонка Shodex SB-802,5 HQ (300×8 мм, Showa, Denko K.K., Tokyo, Japan). В качестве маркеров молекулярной массы применялись стандартные P-82 Shodex пуллуланы с молекулярной массой 11,2×104, 4,73×104, 2,28×104, 1,18×104 и 0,59×104 Да, стандартные ксило-олигосахариды с молекулярной массой 810 (DP6), 678 (DP5), 546 (DP4), 414 (DP3) и 282 Да (DP2) и глюкоза с молекулярной массой 180 Да и их соответствующий элюирующий объем обозначен символом "×" слева направо.
Фиг.9: Влияние добавления к куриному корму AXOS-7-0,34, AXOS-122-0,66 или Xylooligo-95P на микробиоту слепой кишки цыплят. Композиция микробиоты слепой кишки определялась, соответственно, через 1 и 2 недели после начала эксперимента с помощью подсчета колоний enterobacteriaciae и bifidobacteriaceae на чашках. Столбцы показывают средние значения результатов измерения, а столбец ошибки показывает среднеквадратичное отклонение. Для данного момента времени значения, помеченные различными буквами, значительно различаются друг от друга согласно тесту Tukey с p<0,05.
Фиг.10: Влияние добавления к куриному корму AXOS-15-0,27 в концентрации 0,1% или 0,25%, фрукто-олигосахаридов (FOS) в концентрации 0,25% или 1%, или эндоксиланазы на количество бифидобактерий в слепой кишке цыплят через 14 дней. Бактерии рода Bifidobacterium определялись количественной ПЦР. Значения, помеченные различными буквами, значительно отличаются от друг друга согласно тесту наименьшего значимого различия (p<0,05; n=3). Столбцы показывают средние значения результатов измерения, а столбец ошибки показывает среднеквадратичное отклонение.
Фиг.11: Влияние добавления к рациону крыс 0,25% AXOS-8-0,27, AXOS-15-0,27, AXOS-16-0,78 или AXOS-122-0,66 на уровень ацетата (верхняя панель), пропионата (средняя панель) и бутирата (нижняя панель) в фекалиях крыс через 13 дней кормления. Значения, помеченные различными буквами, значительно отличаются друг от друга согласно тесту наименьшего значимого различия (p<0,05; n=4). Столбцы показывают средние значения результатов измерения, а столбец ошибок показывает среднеквадратичное отклонение.
Фиг.12: Влияние добавления к рациону крыс 4% AXOS-15-0,27 или Xylooligo-95P на уровень ацетата в проксимальном отделе толстой кишки (A), ацетата в дистальном отделе толстой кишки (B), пропионата в дистальном отделе толстой кишки (C) и бутирата в дистальном отделе толстой кишки (D) крыс через 14 дней кормления. Столбцы показывают средние значения результатов измерения, а столбец ошибки показывает среднеквадратичное отклонение.
Фиг.13: Влияние добавления к рациону крыс 4% AXOS-15-0,27 или Xylooligo-95P на уровень бифидобактерий в слепой кишке через 14 дней кормления. Бактерии рода Bifidobacterium определялись с помощью количественной ПЦР. Значения, обозначенные различными буквами, значительно отличаются от друг друга согласно тесту наименьшего значимого различия (p<0,05; n=4). Столбцы показывают средние значения результатов измерения, а столбец ошибки показывает среднеквадратичное отклонение.
Фиг.14: Влияние приема внутрь 4,88 г/день AXOS-15-0,27 или 4,81 г/день WPC в течение 14 дней на количество бифидобактерий в фекалиях здоровых людей-добровольцев. Бактерии рода Bifidobacterium определялись с помощью количественной ПЦР. Столбцы показывают средние значения результатов измерения, а столбец ошибки показывает среднеквадратичное отклонение. Столбец со звездочкой показывает значительное отличие от базального уровня согласно тесту Wilcoxon Signed Ranks (p<0,05; n=5).
15
3
Фиг.15: Влияние приема внутрь однократной дозы AXOS-15-0,27 (0,24, 0,73, 2,21 или 4,88 г) на экскрецию азота с мочой (A) и фекалиями (B) и на время ороцекального транзита (C). Экскреция азота выражена в процентах от принятого N-меченого азота, выведенного с образцами либо мочи, либо фекалий, забранных в течение 0-48 и 0-72 часов после приема внутрь пробного завтрака, соответственно. Время ороцекального транзита выражено в процентах от принятого H-меченого PEG, в образцах фекалий, собранных в течение 0-72 часов. Столбцы показывают средние значения результатов измерения, а столбцы ошибки показывают среднеквадратичное отклонение. Столбец с одной звездочкой или двумя звездочками показывает значительное отличие от контрольной терапии согласно тесту Wilcoxon Signed Ranks при p<0,05 (n=9) и p<0,01 (n=9), соответственно.
Фиг.16: Влияние приема внутрь однократной дозы AXOS-15-0,27 (0,24, 0,73, 2,21 или 4,88 г) на экскрецию с мочой p-крезола (A) и фенола (B). Экскреция p-крезола и фенола выражена в виде суммарного количества p-крезола и фенола (мг), выделенного с образцами мочи, забранными через 0-24 часа после приема внутрь пробного завтрака. Столбцы показывают средние значения результатов измерения, а столбцы ошибки показывают среднеквадратичное отклонение. Столбец с одной звездочкой или двумя звездочками показывает значительное отличие от контрольной терапии согласно тесту Wilcoxon Signed Ranks при p<0,05 (n=9) и p<0,01 (n=9), соответственно.
Ранее был описан пребиотический эффект подкрепления корма или пищевых продуктов специфическими препаратами арабиноксилана. Конкретнее, уровень техники предоставляет примеры бифидогенных эффектов с одной стороны ксило-арабино-олигосахаридов, имеющих среднюю степень полимеризации (DP) ниже 4, и с другой стороны препаратов арабиноксилана, включающих длинноцепочечные природные арабиноксиланы. Доступные препараты ксило-арабино-олигосахаридов производятся в условиях сильнодействующей и неконтролируемой деполимеризации, приводящей к наличию относительно высоких уровней ксилозы и коротких ксило-олигосахаридов, которые имеют сладкий вкус. Сладость этих препаратов ограничивает их применение в некоторых пищевых продуктах. Кроме того, молекулы ксило-арабино-олигосахарида с DP ниже 4 имеют содержание метаболической энергии, которое является нежелательным в низкокалорийных пищевых продуктах. Физико-химические характеристики природных арабиноксиланов, такие как высокая вязкость и высокое влагоудержание, делают их не пригодными для широкого спектра пищевых продуктов. Частичная деполимеризация природных арабиноксиланов улучшает их физико-химические характеристики, и были описаны препараты, включающие молекулы арабиноксилана, имеющие среднюю DP приблизительно 58. Однако пребиотическая активность этих частично деполимеризованных арабиноксиланов у людей демонстрировалось только в относительно больших дозах (>6 г в сутки; Grasten et al. 2003).
Настоящее изобретение основано на обнаружении того, что препараты арабиноксилана, включающие арабиноксиланы, имеющие среднюю степень полимеризации (DP) от 5 до 50, являются мощными пребиотическими агентами при назначении людям и подопытным животным, служащим моделью для людей. Кроме того, подобные препараты не имеют ни одного из физико-химических или органолептических недостатков препаратов, включающих либо природные арабиноксиланы, либо короткоцепочечные ксило-арабино-олигосахариды. Также было обнаружено, что как у людей, так и у крыс и цыплят препараты арабиноксилана по изобретению оказывали более сильный бифидогенный эффект, чем препараты, включающие частично деполимеризованные арабиноксиланы, имеющие среднюю DP 58 или более. Кроме того, отмечено, что препараты арабиноксилана по изобретению главным образом проявляют свою пребиотическую активность в дистальной части толстой кишки, тогда как короткоцепочечные ксило-олигосахариды более активны в проксимальной части толстой кишки. Это открытие особенно важно, поскольку, по-видимому, существует зависимость между композицией флоры в дистальном отделе толстой кишки и развитием заболеваний толстой кишки и в частности рака толстой кишки. Кроме пребиотического эффекта в чистом виде, также были отмечены другие благоприятные эффекты применения препаратов арабиноксилана настоящего изобретения, такие как сокращение экскреции азота с мочой и сопутствующее повышение экскреции азота с фекалиями, а также сокращение экскреции крезола и фенола с мочой.
Таким образом, первой задачей настоящего изобретения является создание препаратов арабиноксилана для применения в качестве пищевой добавки или в качестве основы для продукта с питательной добавкой. Препараты арабиноксилана характеризуются тем, что молекулы арабиноксилана, содержащиеся в указанных препаратах, имеют среднюю DP, варьирующую от 5 до 50. В предпочтительном варианте осуществления препарат арабиноксилана включает по меньшей мере 15% указанных молекул арабиноксилана. В более предпочтительном варианте осуществления препараты включают более 30% указанных арабиноксиланов, например, более 60%. В еще более предпочтительном варианте осуществления арабиноксиланы, содержащиеся в препаратах по изобретению, имеют среднюю DP от 7 до 40 DP, еще более предпочтительно от 7 до 20 DP. Предпочтительно, 90% арабиноксиланов, содержащихся в препаратах по изобретению, имеют DP от 2 до 650, определяемую с помощью высокоэффективной эксклюзионной хроматографии (HPSEC), более предпочтительно от 2 до 130.
В предпочтительном варианте осуществления препараты арабиноксилана по изобретению доступны из природных источников, таких как растительный материал, и более предпочтительно из зерновых культур. Они могут быть представлены выбранными фракциями указанных природных арабиноксиланов или могут быть получены с помощью деполимеризации или фрагментации указанных природных арабиноксиланов, или они могут быть структурными аналогами, произведенными с помощью химических, ферментативных и/или физических процессов. В предпочтительном варианте осуществления препараты арабиноксилана получены из боковой фракции процесса разделения глютена и крахмала, такой как WPC (Pfeifer & Langen). В другом предпочтительном варианте осуществления препараты арабиноксилана получены из отрубей зерновых культур.
Пребиотические эффекты препаратов арабиноксилана по изобретению при назначении с пищей наблюдались в дозе 0,25 г на порцию. Таким образом, следующей задачей настоящего изобретения является создание пищевого продукта или напитка, включающего препарат арабиноксилана по изобретению. В предпочтительном варианте осуществления пищевой продукт или напиток содержит от 0,1 до 5 г препарата арабиноксилана по изобретению на порцию. В более предпочтительном варианте осуществления пищевой продукт или напиток содержит от 0,25 до 5 г препарата арабиноксилана по изобретению на порцию. В еще более предпочтительном варианте осуществления пищевой продукт или напиток содержит от 1 до 3 г препарата арабиноксилана по изобретению на порцию. В другом предпочтительном варианте осуществления пищевой продукт или напиток содержит от 0,1 до 5 г арабиноксиланов, имеющих среднюю DP от 5 до 50, на порцию. В более предпочтительном варианте осуществления пищевой продукт или напиток содержит от 0,25 до 5 г арабиноксиланов, имеющих среднюю DP от 5 до 50, на порцию. В еще более предпочтительном варианте осуществления пищевой продукт или напиток содержит от 1 до 3 г арабиноксиланов, имеющих среднюю DP от 5 до 50, на порцию. Как указано выше, препараты арабиноксилана по изобретению особенно подходят в качестве полезной добавки к низкокалорийным пищевым продуктам.
В частном варианте осуществления пищевой продукт является молочным продуктом, таким как йогурт или свежий сыр. Предпочтительно, указанный молочный продукт содержит от 0,25 до 5 г, более предпочтительно от 1 до 3 г арабиноксиланов, имеющих среднюю DP от 5 до 50, в 100 г на порцию 125 г. Опционально указанный молочный продукт содержит живые бактерии рода Bifidobacterium или Lactobacillus, которые способны ферментировать арабиноксиланы. В другом частном варианте осуществления напитки по изобретению являются так называемыми функциональными безалкогольными напитками. Предпочтительно, подобные функциональные безалкогольные напитки содержат от 0,25 до 5 г, более предпочтительно от 1 до 3 г арабиноксиланов, имеющих среднюю DP от 5 до 50, в 100 мл. В альтернативном варианте указанный функциональный безалкогольный напиток содержит желательное количество таких арабиноксиланов в 250 мл. В частном варианте осуществления указанные функциональные безалкогольные напитки содержат живые бактерии рода Bifidobacterium или Lactobacillus, которые способны ферментировать арабиноксиланы.
Обычно, пищевые продукты, содержащие в качестве компонента зерновые культуры или материал, полученный из зерновых культур, содержат арабиноксиланы. Однако арабиноксиланы, содержащиеся в этих пищевых продуктах, являются либо длинноцепочечными природными арабиноксиланами с DP более 6000, либо частично деполимеризованными арабиноксиланами, имеющими DP по крайней мере от 200 до 300. В связи с этим, обогащение указанных пищевых продуктов арабиноксиланами по изобретению также повышает их пищевую ценность. Предпочтительно, подобное обогащение осуществляют посредством добавления указанного количества препарата арабиноксилана по изобретению в качестве компонента во время изготовления пищевых продуктов, содержащих зерновые культуры. Ясно, что подобное обогащение приводит к тому, что содержащий зерновые культуры пищевой продукт, включающий арабиноксиланы, имеющие DP 200 и выше, будет содержать популяцию арабиноксиланов, имеющих DP ниже 200, указанная популяция будет характеризоваться средней DP от 5 до 50. Специалисту ясно, что обогащение содержащих зерновые культуры пищевых продуктов упомянутой популяцией арабиноксиланов, имеющих DP ниже 200, может по меньшей мере частично быть осуществлено при использовании ксиланолитических ферментов в подходящих условиях, во время изготовления этих пищевых продуктов. В частном варианте осуществления указанный пищевой продукт является хлебобулочным изделием, таким как хлеб. Предпочтительно, указанный хлеб обогащен арабиноксиланами, имеющими среднюю DP от 5 до 50, в количестве от 0,25 до 5 г, более предпочтительно от 1 до 3 г на 100 г. В другом варианте осуществления пищевой продукт является кондитерским продуктом, таким как пирог. Предпочтительно, указанный кондитерский продукт обогащен арабиноксиланами, имеющими среднюю DP от 5 до 50, в количестве от 0,25 до 5 г, более предпочтительно от 1 до 3 г на 100 г. В еще одном варианте осуществления пищевой продукт является макаронным продуктом. Предпочтительно, указанный макаронный продукт обогащен арабиноксиланами, имеющими среднюю DP от 5 до 50, в количестве от 0,25 до 5 г, более предпочтительно от 1 до 3 г на 80 г. В еще одном варианте осуществления пищевой продукт является зерновым завтраком. Предпочтительно, указанный зерновой завтрак обогащен арабиноксиланами, имеющими среднюю DP от 5 до 50, в количестве от 0,25 до 5 г, более предпочтительно от 1 до 3 г на 30 г. В еще одном варианте осуществления пищевой продукт является печеньем, например, сухим печеньем для завтрака. Предпочтительно, указанное печенье обогащено арабиноксиланами, имеющими среднюю DP от 5 до 50, в количестве от 0,25 до 5 г, более предпочтительно от 1 до 3 г на 125 г.
К другим пищевым продуктам, которые могут быть полезным образом обогащены препаратами арабиноксилана по изобретению, относятся например, без ограничения, продукты из мясного фарша, шоколадные конфеты, печенья, батончики и десерты, такие как десертные пудинги.
Третьей задачей настоящего изобретения является создание продукта с пищевой добавкой, включающего препарат арабиноксилана по изобретению. В предпочтительном варианте осуществления продукт с пищевой добавкой является капсулой, таблеткой, порошком или т.п. В более предпочтительном варианте осуществления продукт с пищевой добавкой разработан таким образом, что он позволяет ежедневно принимать 0,1 и 5 г арабиноксиланов, имеющих среднюю DP от 5 до 50, более предпочтительно от 0,25 до 5 г, например от 1 до 3 г.
Пятой задачей настоящего изобретения является создание способа изготовления препарата арабиноксилана по изобретению. В первом варианте осуществления способ включает следующие стадии:
i. выделения неэкстрагируемой водой фракции арабиноксилана из богатых арабиноксиланом материалов, таких как отруби, пшеничная мука или пшеничные остатки, путем удаления крахмала и белков из указанного богатого арабиноксиланом материала, предпочтительно, с использованием амилолитических и протеолитических ферментов, соответственно;
ii. деполимеризации неэкстрагируемой водой фракции арабиноксилана с использованием одного или более ксиланолитических ферментов.
Во втором варианте осуществления способ включает следующие стадии:
i. получения частично деполимеризованного экстрагируемого водой содержащего арабиноксилан препарата, такого как препарат, полученный из побочной фракции процесса разделения глютена и крахмала;
ii. если требуется, удаления крахмала и белков из указанного содержащего арабиноксилан препарата, предпочтительно с использованием амилолитических и протеолитических ферментов, соответственно;
iii. деполимеризации арабиноксиланов, содержащихся в указанном препарате, с использованием одного или более ксиланолитических ферментов.
В частном варианте осуществления, после обработки ксиланолитическими ферментами препарат подвергают ультрафильтрации для уменьшения в препарате количества моносахаридов и олигосахаридов, имеющих DP 4 или менее.
Последней задачей настоящего изобретения является создание способа анализа концентрации и средней DP популяции арабиноксиланов с DP менее 200 в пищевом продукте, содержащем зерновые. Указанный способ включает следующие стадии:
i. размалывания образца продукта, содержащего зерновые культуры, предпочтительно после сушки или сублимационной сушки указанного образца;
ii. экстракции размолотого образца в дистиллированной воде;
iii. обработки экстракта амилолитическими ферментами в подходящих условиях для преобразования всего крахмала в глюкозу, например, используя обработку амилазой с последующей обработкой амилоглюкозидазой;
iv. удаления глюкозы из образца, полученного на стадии (iii), например, путем метаболизации глюкозы, используя дрожжи;
v. определения профиля молекулярных масс арабиноксиланов, содержащихся в образце, полученном на стадии (iv), предпочтительно используя высокоэффективную жидкостную хроматографию (HPLC);
vi. вычисления относительного количества и средней DP фракции арабиноксилана, меньше DP 200, например, с помощью анализа поверхности под кривой HPLC.
Изобретение далее поясняется посредством иллюстративных вариантов осуществления, описанных ниже.
Иллюстративный вариант осуществления
Примеры
Пример 1: Препарат XOS/AXOS со средней DP>4
Материалы и методы
Xylooligo-95P. Коммерческий препарат ксило-олигосахарида Xylooligo-95P, состоящий в основном из ксилобиозы, ксилотриозы и ксилотетраозы, был получен от Suntory Ltd (Tokyo, Japan).
Изготовление неэкстрагируемого водой арабиноксилана из пшеничных отрубей. Для изготовления неэкстрагируемого водой арабиноксилана (WU-AX) из отрубей, в качестве исходного материала применялись коммерческие пшеничные отруби (Meneba Meel BV, Rotterdam, The Netherlands). Материал, не содержащий арабиноксилан, был частично удален из отрубей с помощью ферментативной обработки согласно способу, описанному Maes et al. (2004). Сначала, для гидролиза крахмала, суспензия пшеничных отрубей в воде (1:7 вес/объем) обрабатывалась термостабильной α-амилазой (Termamyl 120LS, Novozymes, Bagsvaerd, Denmark; 1 мкл/г пшеничных отрубей) в течение 90 минут при 90°C. После охлаждения до 50°C pH суспензии был установлен на уровне 6,0, используя концентрированную HCI, и суспензия инкубировалась с протеазой (Neutrase 0,8L, Novozymes, Bagsvaerd, Denmark; 150 мкл/г пшеничных отрубей) в течение 24 часов при 50°C для гидролиза остаточных белков. После этого суспензия была прокипячена и отфильтрована, и фильтрат был удален. Остаток, называемый "WU-AX из отрубей", был промыт водой и высушен на воздухе.
Изготовление неэкстрагируемого водой арабиноксилана из крахмала пшеничной муки или скребковой пшеницы. Применяя стандартные методы, пшеничная мука может быть фракционирована на 4 различные фракции (McRitchie, 1985): A-крахмал (крахмал высшего сорта), B-крахмал (скребковый крахмал или остатки), глютен и растворимую в воде фракцию. WU-AX сконцентрирован во фракции скребкового крахмала. Материал, не содержащий арабиноксилан, был частично удален из скребковой фракции с помощью ферментативной обработки. Суспензия скребкового крахмала в воде (1:6 вес/объем) сначала обрабатывалась термостабильной α-амилазой (Termamyl 120LS, Novozymes, Bagsvaerd, Denmark, 30 мкл/г скребкового крахмала) в течение 60 минут при 90°C и амилоглюкозидазой (Megazyme, Bray, Ireland, 20 мкл/г скребкового крахмала) в течение 16 часов при 60°C для гидролиза крахмала. После кипячения в течение 30 минут и центрифугирования, остаток инкубировался с протеазой (Neutrase 0.8L, Novozymes, Bagsvaerd, Denmark, 20 мкл/г скребкового крахмала) в течение 20 часов при 50°C, для гидролиза остаточных белков. После этого суспензия снова кипятилась (30 минут), фильтровалась и фильтрат был удален. Остаток, называемый "WU-AX из муки", был промыт водой, этанолом (95 об.%) и высушен на воздухе. Вместо экстракции WU-AX из пшеничного крахмала, WU-AX может также быть выделен непосредственно из скребкового крахмала пшеницы. В этом случае в качестве исходного материала применялась коммерчески доступная боковая фракция промышленного процесса разделения клейковины и крахмала Meritena 233 (Tate и LyIe, Aalst, Belgium). Суспензия Meritena 233 в воде (1:5 вес/объем) затем обрабатывалась термостабильной α-амилазой (Termamyl 120LS, Novozymes, Bagsvaerd, Denmark; 30 мкл/г Meritena 233) в течение 60 минут при 90°C и амилоглюкозидазой (Megazyme, Bray, Ireland; 20 мкл/г Meritena 233) в течение 16 часов при 60°C для гидролиза крахмала. После кипячения в течение 30 минут и центрифугирования остаток инкубировался с протеазой (Neutrase 0,8 л, Novozymes, Bagsvaerd, Denmark; 20 мкл/г Meritena 233) в течение 20 часов при 50°C для гидролиза остаточных белков. После этого суспензия снова кипятилась (30 минут), фильтровалась и фильтрат был удален. Остаток, называемый "скребковый WU-AX", был промыт водой, этанолом (95 об.%) и высушен на воздухе.
Концентрат пентозана пшеницы (WPC). Концентрат пентозана пшеницы (WPC, Pfeifer & Langen, Dormagen, Germany) получен из пшеничной муки, и его химический состав был подробно описан Courtin и Delcour (1998). WPC богат экстрагируемым водой арабиноксиланом (приблизительно 43%) и белковым материалом (приблизительно 30%). Оставшаяся часть главным образом состоит из арабиногалактанового пептида (приблизительно 14%) и в меньшей степени полимерной глюкозы (6%).
Изготовление AXOS с avDP 122 и коэффициентом A/X 0,66 (AXOS-122-0,66). Исходный материал для изготовления AXOS-122-0,66 был коммерческим продуктом «Концентрат пентозана пшеницы» (WPC, Pfeifer & Langen, Dormagen, Germany). WPC был солюбилизирован в деионизированной воде (1:10 вес/обьем) и в качестве водной суспензии был добавлен кремний (20% вес/объем) до соотношения кремний/белок 7:1. Для получения максимальной адсорбции белков к кремнию pH смеси был установлен на уровне 4,8, применяя 0,1М HCl. После перемешивания в течение 30 минут суспензия была отфильтрована по Büchner. Остаток, включающий кремний/белок, был удален, тогда как фильтрат был подвергнут преципитации этанолом. Этанол (95 об.%) добавлялся при непрерывном перемешивании до конечной концентрации 65% (по объему) и после перемешивания в течение дополнительных 30 минут, осаждения (24 часа, 4°C) и фильтрации полученный остаток был высушен от растворителя (этанол, ацетон и диэтиловый эфир) и высушен на воздухе. Полученный материал был гомогенизирован и просеян через сито 250 мкм.
Изготовление AXOS с avDP 16 и коэффициентом AJX 0,78 (AXOS-16-0,78). AXOS-16-0,78 был изготовлен из исходного коммерческого продукта «Концентрат пентозана пшеницы» (WPC, Pfeifer & Langen, Dormagen, Germany). WPC был обработан кремнием для удаления белков, как описано для препарата AXOS-122-0,66. Полученный фильтрат далее инкубировался при 30°C в течение 24 часов с XAA, эндоксиланазой из Aspergillus aculeatus (Shearzyme 500L, Novozymes, Bagsvaerd, Denmark) в количестве 29 единиц на грамм концентрата пентозана пшеницы. После инактивации фермента с помощью кипячения (30 минут) полученный раствор был охлажден и подвергнут преципитации этанолом. Этанол (95 об.%) добавлялся при непрерывном перемешивании до конечной концентрации 80% (по объему) и после перемешивания в течение дополнительных 30 минут, осаждения (24 часа, 4°C) и фильтрации полученный остаток был растворен в деионизированной воде и снова подвергнут преципитации этанолом. Этанол (95 об.%) добавлялся при непрерывном перемешивании до конечной концентрации 65% (по объему) и после перемешивания в течение дополнительных 30 минут, осаждения (24 часа, 4°C) и фильтрации осажденный материал был удален. Оставшуюся надосадочную жидкость подвергли ротационному испарению для удаления этанола, растворили в деионизированной воде и лиофилизировали. Полученный материал был гомогенизирован и просеян через сито 250 мкм.
Изготовление AXOS с avDP 7 и коэффициентом AJX 0,34 (AXOS-7-0,34). В качестве исходного материала для изготовления AXOS-7-0,34, применялся WU-AX из отрубей, который был выделен, как описано выше. WU-AX из отрубей затем инкубировался при 30°C в течение 24 часов с эндоксиланазой XBS (Grindamyl H640, Danisco, Denmark) в количестве 80 единиц на грамм сухого изолированного WU-AX из отрубей. После фильтрации и инактивации фермента с помощью кипячения (30 минут) фильтрат был лиофилизирован и полученный материал был гомогенизирован и просеян через сито 250 мкм.
Изготовление AXOS с avDP 15 и коэффициентом AJX 0,27 (AXOS-15-0,27). В качестве исходного материала для изготовления AXOS-15-0,27 применялись коммерческие пшеничные отруби (Dossche Mills & Bakery, Deinze, Belgium). Суспензия пшеничных отрубей в воде (1:7 вес/объем) сначала обрабатывалась термостабильной α-амилазой (Termamyl 120LS, Novozymes, Bagsvaerd, Denmark; 1 мкл/г отрубей пшеницы) в течение 90 минут при 90°C для гидролиза крахмала. После охлаждения до 50°C pH суспензии был установлен на уровне 6,0, применяя концентрированную HCl, и суспензия инкубировалась с протеазой (Neutrase 0,8 л, Novozymes, Bagsvaerd, Denmark; 40 мкл/г отрубей пшеницы) в течение 4 часов при 50°C, для гидролиза остаточных белков. После этого суспензия подвергалась кипячению в течение 20 минут, фильтровалась и фильтрат удалялся. Остаток промывался водой и ресуспендировался в деионизированной воде (1:14 вес/объем). Суспензия инкубировалась при непрерывном перемешивании в течение 10 часов при 50°C с эндоксиланазой XBS (Grindamyl H640, Danisco, Дания) в количестве 1,4 единицы на грамм обескрахмаленных и освобожденных от белков пшеничных отрубей, и в течение следующих 10 часов при 50°C после добавления второй дозы эндоксиланазы XBS в количестве 1,1 единиц на грамм обескрахмаленных и освобожденных от белков пшеничных отрубей. После инактивации фермента с помощью кипячения (30 минут) раствор концентрировался в выпарном аппарате с падающей пленкой до концентрации сухого вещества 20% и в конце высушивался в распылительной сушилке.
Изготовление AXOS с avDP 8 и коэффициентом A/X 0,27 (AXOS-8-0,27). AXOS-8-0,27 был изготовлен с помощью инкубирования раствора (1:10 вес/объем) AXOS-15-0,27 при 30°C в течение 1 часа с XAA, эндоксиланазой из Aspergillus aculeatus (Shearzyme 500L, Novozymes, Bagsvaerd, Denmark) в количестве 125 единиц на грамм AXOS-15-0,27. После инактивации фермента с помощью кипячения (30 минут) раствор был лиофилизирован и полученный материал был гомогенизирован и просеян через сито 250 мкм.
Изготовление AXOS с avDP 39 и коэффициентом A/X 0,22 (AXOS-39-0,22). AXOS-39-0,22 был изготовлен из скребковой пшеницы WU-AX, которая была изолирована из Meritena 233 B-крахмала, как описано выше. Скребковый WU-AX, имеющий средний коэффициент A/X 0,63, был взвешен в концентрации 3 г/л в 25 мМ буфере натрия ацетата (pH 4,7) и инкубировался при непрерывном перемешивании в течение 2 часов при 30°C с эндоксиланазой XBS (Grindamyl H640, Danisco, Denmark) в количестве 3,3 единиц на грамм скребкового WU-AX. После центрифугирования (10000 г, 15 минут, 18°C) супернатант подвергался кипячению в течение 30 минут для инактивации фермента, тогда как остаток был промыт ранее упомянутым буфером натрия ацетата (1/4 начального объема). Промывная вода была инактивирована (30 минут, 100°C) и смешана с супернатантом. После фильтрации полученный раствор был лиофилизирован для получения AXOS с avDPGc 262 и коэффициентом A/X 0,50. Ферментированный и солюбилизированный материал был далее растворен в деионизированной воде (1:20 вес/объем) и pH раствора был установлен на уровне 2,8 с помощью добавления HCl (1M). Раствор инкубировался в течение 24 часов при 90°C для удаления крупной фракции α-1,2- и α-1,3-связанных заместителей арабинозы, которые, по всей видимости, более подвержены кислотному гидролизу, чем β-1,4-связанные подгруппы ксилозы AXOS. После охлаждения до комнатной температуры раствор был нейтрализован с помощью добавления 1М NaOH и центрифугирован (10000 г, 20 минут, 18°C). К полученному супернатанту при непрерывном перемешивании был добавлен этанол (95 об.%) до результирующей концентрации этанола 80% (по объему). Смесь перемешивалась в течение дополнительных 30 минут и выдерживалась в течение ночи при 4°C. Осажденные соединения AXOS были выделены с помощью центрифугирования (10000 г, 20 минут, 4°C), растворены в деионизированной воде, лиофилизированы и полученный материал был гомогенизирован и просеян через сито 250 мкм.
Изготовление AXOS с avDP 13 и коэффициентом A/X 0,21 (AXOS-13-0,21). AXOS-13-0,21 был изготовлен с помощью инкубирования раствора AXOS-39-0,22 (3 г/л) при 30°C в течение 2 часов с XAA, эндоксиланазой от Aspergillus aculeatus (Shearzyme 500L, Novozymes, Bagsvaerd, Denmark), в количестве 27,7 единиц на грамм AXOS-39-0,22. После инактивации фермента с помощью кипячения (30 минут), раствор был лиофилизирован и полученный материал был гомогенизирован и просеян через сито 250 мкм.
Определение характеристик изолированных препаратов.
Для определения характеристик препаратов олигосахаридов применялись различные технологии.
Общее и конечное содержание редуцирующих сахаров определялось с помощью газожидкостного хроматографического анализа, как описано Courtin и др. (2000). Содержание образцов арабиноксилана (AX) вычислялось по формуле 0,88×(% арабинозы + % ксилозы). Средняя степень полимеризации AXOS, определяемая с помощью газожидкостной хроматографии (avDPGc), вычислялась как сумма общего содержания ксилозы и арабинозы, разделенная на конечное содержание редуцирующей ксилозы. Содержание белка (N×5,7) в образцах определялось с помощью метода анализа сжиганием Dumas, адаптированного официального метода AOAC (1995).
1
1
2
2
3
3
1
2
3
6
Определение профиля олигосахаридов, содержащихся в препаратах, было выполнено с помощью высокоэффективной анионообменной хроматографии с импульсной амперометрической детекцией (HPAEC-PAD), применяя хроматографическую систему Dionex DX-500 (Sunnyvale, CA, USA) оборудованную электрохимическим детектором ED-40, градиентным насосом GP-50 и автоматическим пробозаборником AS-3500. Образцы (10 мг) были растворены в очищенной деионизированной воде (2 мл, удельное сопротивление 18 мОм/см), отфильтрованы и введены (25 мкл) в защитную колонку Carbopac PA-100 (4×25 мм), закрепленную на анионообменной колонке Carbopac PA-100 (4×250 мм). Элюцию (1,0 мл/мин) проводили линейным градиентом ацетата натрия от 0 до 250 мМ в 100 мМ NaOH в течение 30 минут, затем линейным градиентом ацетата натрия от 250 до 400 мМ в 100 мМ NaOH в течение 15 минут. После градиента колонка элюировалась в течение 5 минут 100 мМ NaOH. Мониторинг элюции проводился с применением детектора ED-40 в режиме импульсной амперометрической детекции со следующими параметрами настройки потенциалов и интервалов времени: E,+0,05 V (t=400 мс); E,+0,75 V (t=200 мс); E,-0,15 V (t=400 мс). В качестве ссылок применялись арабиноза (A), ксилоза (X), ксилобиоза (X) и XOS с DP от 3 до 6 (от X до X).
2
6
4
4
4
4
4
4
4
4
HPSEC
HPSEC
Высокоэффективная эксклюзионная хроматография размера (HPSEC) была выполнена на системе HPLC (Kontron Instruments, 325 pump systems, Kontron, Milan, Italy), оборудованной автоинжектором. Все препараты были растворены в 0,3% хлориде натрия (1,5 мл), отфильтрованы и введены (20 мкл) в защитную колонку Shodex SB-800P (Showa, Denko K.K., Tokyo, Japan, 50×6 мм), закрепленную на колонке Shodex SB-806 HQ HPSEC (300×8 мм, диапазон разделения: 1×10-20×10 Да). Элюция проводилась 0,3% натрия хлоридом (0,5 мл/мин; 30°C) и мониторировалась с помощью детектора показателя преломления (VDS Optilab, Berlin, Germany). В качестве маркеров молекулярной массы применялись стандартные пуллуланы Shodex P-82 (2,0 мг/мл) с молекулярной массой 78,8×10, 40,4×10, 21,2×10, 11,2×10, 4,73×10, 2,28×10, 1,18×10 и 0,59×10 Да, и глюкоза с молекулярной массой 180 Да. Средняя степень полимеризации (avDP) олигосахаридов, определяемая с помощью высокоэффективной эксклюзионной хроматографии размера (avDP), вычислялась как MM/132.
Определение активности ксиланолитических ферментов. Активность ксиланолитических ферментов определялась колориметрически, используя в качестве нерастворимого субстрата ксилазим (фирмы Megazyme, Bray, Ireland), согласно инструкциям изготовителя. Под одной единицей понималось количество фермента, необходимого для изменения экстинкции 1,0 при 590 нм в условиях анализа.
Результаты и обсуждение
Различные типы AXOS были изготовлены или из пшеничных отрубей, пшеничной муки или из пшеничного скребкового крахмала, как описано в материалах и методах. Свойства различных препаратов в отношении содержания арабиноксилана, средней степени замещения (отношение арабинозы к ксилозе) и средней степени полимеризации показаны в Таблице 1, где они сравниваются с такими же показателями для Xylooligo-95P, коммерческого препарата XOS с известными пребиотическими свойствами (Campbell et al., 1997; Hsu et al., 2004). Согласно номенклатуре, примененной в Таблице 1, а также в дальнейшем препараты AXOS именуются AXOS-x-y, где x - средняя степень полимеризации, определенная с помощью газожидкостной хроматографии, а y - отношение арабинозы к ксилозе. Различные препараты имели среднюю степень полимеризации в диапазоне от 7 до 122 (по сравнению с 2 для Xylooligo-95P), и степень замещения в диапазоне от 0,21 до 0,78 (по сравнению с 0,09 для Xylooligo-95P). Препараты, полученные из пшеничных отрубей (AXOS-7-0,34, AXOS-15-0,27, AXOS-8-0,27), имели более низкую степень замещения, чем препараты, полученные из пшеничной муки (AXOS-122-0,66, AXOS-16-0,78). Мы также показали, что степень замещения соединений AXOS может быть уменьшена с помощью обработки кислотой. Действительно, AXOS-39-0,22 изготовлен из скребкового WU-AX с помощью различных шагов, включающих обработку кислотой (см. Материалы и методы), и это уменьшает среднюю степень замещения от 0,63 в скребковом WU-AX до 0,22 в AXOS-39-0,22.
На фиг.2 показано распределение молекулярных масс различных препаратов AXOS, определенное с помощью HPSEC. Все препараты AXOS были полидисперсными и состояли из молекулярных единиц с пиком, расположенным близко к avDP, определенным с помощью газожидкостной хроматографии. Диапазон степеней полимеризации, в пределы которого попадают 90% олигосахаридов, определенный по профилям элюции HPSEC, предоставлен для различных препаратов AXOS в Таблице 1.
ПРИМЕР 2: Физико-химические и сенсорные свойства препаратов XOS/AXOS
Материалы и методы
Препараты олигосахаридов. Xylooligo-95P, AXOS-15-0,27, AXOS-39-0,22, и AXOS-13-0,21 были получены как описано в Материалах и методах примера 1. Препарат фрукто-олигосахарида (FOS) был представлен коммерческим продуктом Raftilose (Orafti, Tienen, Belgium). Использованный для органолептического анализа AXOS-15-0,27 был сначала растворен в воде (1:25 вес/объем) и обработан активированным углем для удаления возможного привкуса от процесса производства. Суспензия AXOS-15-0,27 и активированного угля (0,75 г/г AXOS-15-0,27) перемешивалась в течение 1 часа при 18°C, и после декантации активированный уголь был удален с помощью центрифугирования (10000 г, 30 минут, 18°C).
Определение стабильности. Определение стабильности осуществлялось на экстрагируемой водой части препаратов олигосахаридов, которая была получена с помощью суспендирования препаратов в деионизированной воде (1:10 вес/объем) с последующим встряхиванием (2 часа, 18°C), центрифугированием (10000 г, 20 минут, 18°C) и фильтрацией. После лиофилизации фильтрата экстрагируемые водой образцы были растворены в универсальном буфере со значениями рН 2, 3, 7 и 11, для получения растворов, имеющих концентрацию олигосахарида 0,15% (вес/объем). Универсальный буфер был изготовлен из основного раствора, состоящего из 6,0 г лимонной кислоты, 3,9 г дигидрофосфата калия, 1,8 г борной кислоты и 5,8 г диэтилбарбитуровой кислоты, растворенных в воде (1,0 л) (Britton and Welford, 1937). Определенные количества (20 мл) этого основного раствора были отрегулированы с помощью либо 2,0 М HCl, либо 2,0 М NaOH для достижения желательного pH. Каждый из растворов олигосахарида сохранялся в кипящей воде в течение разных интервалов времени (0, 5, 10, 15, 20, 30 и 60 минут). После этого раствор был охлажден и с помощью газожидкостной хроматографии было определено общее содержание моносахарида и конечное содержание редуцирующего сахара, как описано в Материалах и методах примера 1. Процент деградации FOS вычислялся по формуле (1), тогда как процент деградации Xylooligo-95P и AXOS-15-0,27 вычислялся по формуле (2). Процент гидролиза FOS, и Xylooligo-95P и AXOS-15-0,27 вычислялся по формулам (3) и (4), соответственно.
(1) % деградации = ((суммарная концентрация глюкозы + маннозы, в момент времени 0 и при pH 7) - (суммарная концентрация глюкозы + маннозы))/(суммарная концентрация глюкозы + маннозы в момент времени 0 и при pH 7)
(2) % деградации = ((суммарная концентрация ксилозы + арабинозы, в момент времени 0 и при pH 7)-(суммарная концентрация ксилозы + арабинозы))/(суммарная концентрация ксилозы + суммарная концентрация арабинозы в момент времени 0 и при pH 7)
(3) % гидролиза = ((концентрация редуцирующей глюкозы + маннозы)-(концентрация редуцирующей глюкозы + маннозы, в момент времени 0 и при pH 7))/(максимальное количество редуцирующей глюкозы + маннозы, которое может войти в раствор)
(4) % гидролиза = ((концентрация редуцирующей ксилозы + арабинозы)-(концентрация редуцирующей ксилозы + арабинозы, в момент времени 0 и при pH 7))/(максимальное количество редуцирующей ксилозы + арабинозы, которое может войти в раствор)
Процент гидролиза связей ксилозы и арабинозы в AXOS-15-0,27 вычислялся по формулам (5) и (6), соответственно.
(5) % гидролиза ксилозы = ((концентрация редуцирующей ксилозы)-(концентрация редуцирующей ксилозы в момент времени 0 и при pH 7))/(максимальное количество редуцирующей ксилозы, которое может войти в раствор),
(6) % гидролиза арабинозы = ((концентрация редуцирующей арабинозы)-(концентрация редуцирующей арабинозы, в момент времени 0 и при pH 7))/(максимальное количество редуцирующей арабинозы, которое может войти в раствор)
Органолептические анализы. Органолептические анализы проводились в тихой комнате в присутствии одновременно не более 10 добровольцев. Субъектов просили воздержаться от приема пищи и питья по меньшей мере в течение 1 часа до сеанса. Сначала субъекты были ознакомлены с процедурами, а затем их попросили попробовать на вкус закодированные образцы с разными концентрациями Xylooligo-95P, AXOS-15-0,27, сахарозы (ссылочная сладость), натрия хлорида (ссылочная соленость) и аскорбиновой кислоты (ссылочный кислый вкус), растворенных в очищенной деионизированной воде (удельное сопротивление 18 мОм/см). Раствор с самой высокой концентрацией каждого соединения был пронумерован цифрой 8, а с самой низкой концентрацией был пронумерован цифрой 1 (Таблица 2). Субъектов попросили попробовать на вкус последовательно всю серию концентраций одного соединения в порядке повышения концентрации, несмотря на то, что порядок предоставления каждому человеку различных соединений был случайным. Перед дегустацией ряда концентраций соединения, сначала очищенной деионизированной водой (удельное сопротивление 18 мОм/см) дважды прополаскивался рот, а затем 5 мл каждого испытуемого раствора с помощью одноразового шприца помещались в рот субъекта, в течение 5 секунд полоскались во рту, а затем проглатывались. Участников просили указать самую низкую концентрацию, при которой вкус соединения мог быть определен как сладкий, соленый или кислый (индивидуальный порог распознавания). Средний порог распознавания вкуса, определенный как концентрация, при которой половина субъектов правильно определила вкусовой признак специфического соединения, был вычислен по данным индивидуальных порогов распознавания, полученных в сумме от 20 человек.
rel
sp
rel
app
Измерение вязкости. Измерение вязкости осуществлялось у экстрагируемой водой части препаратов олигосахаридов, которая была получена с помощью суспендирования препаратов в воде (1:10 вес/объем) с последующим встряхиванием (2 часа, 18°C), центрифугированием (10000 г, 20 минут, 18°C) и фильтрацией. После лиофилизации фильтрата определялась вязкость 5,0% (вес/объем) раствора с помощью вискозиметра типа Ostwald (Капиллярный вискозиметр, Schott Geräte, Type 50904) при 30°C согласно Vinkx и др. (1991). Измерение вязкости раствора было выполнено в 3 экземплярах и результаты были выражены по отношению (η) к вязкости деионизированной воды посредством деления времени истечения каждого из растворов олигосахарида на время истечения деионизированной воды в тех же экспериментальных условиях. После вычисления удельной вязкости (η=η-1) определялась кажущаяся характеристическая вязкость ([η], дл/г), применяя уравнение Morris (Morris, 1984), как обозначено в формуле (7), где c (выраженное в мг/мл) обозначает концентрацию олигосахарида, предполагая, что только олигосахариды вносят свой вклад в вязкие свойства растворов. После каждого анализа вискозиметр дважды промывался деионизированной водой, дважды 95% этанолом, однократно ацетоном и однократно диэтиловым эфиром и затем высушивался со сжатым воздухом.
Результаты и обсуждение
Стабильность AXOS-15-0,27 сравнивалась со стабильностью установленных пребиотических соединений, фрукто-олигосахаридов (FOS, коммерческий продукт Raftilose) и ксило-олигосахаридов (XOS, коммерческий продукт Xylooligo-95P). Различные олигосахариды содержали при различных рН (2, 3, 7 и 11) при 100°C в течение различных интервалов времени. Процент разложения определялся с помощью определения уменьшения содержания составляющих моносахаридов, а процент гидролиза определялся с помощью определения повышения количества составляющих редуцирующих моносахаридов. Как показано на Фиг.3, ни один из олигосахаридов не претерпел существенной деградации при низком или нейтральном pH (2, 3 или 7). С другой стороны, при щелочном pH (11) наблюдалась деградация всех трех тестируемых олигосахаридов. Этот эффект был наиболее выражен для Xylooligo-95P, 73% которого деградировало через 60 минут. Самым устойчивым к щелочи олигосахаридом оказался AXOS-15-0,27 (фиг.3). Деградация, наблюдаемая при щелочном pH, известна как щелочное "отщепление", реакция, которая наблюдается при повышенных температурах (60-100°C) и развивается с редуцирующего конца олигосахарида (Whistler and BeMiller, 1958; Santori et al., 2003). Из трех тестируемых олигосахаридов, FOS явно оказался самым чувствительным к гидролизу при низком pH (фиг.4). При pH 2 и 3, 58% и 53% FOS были гидролизованы через 60 минут. Xylooligo-95P и AXOS-15-0,27 показали равный уровень гидролиза при pH 2. Однако при pH, равном 3, AXOS-15-0,27 был более стабилен, чем Xylooligo-95P, процент гидролиза для AXOS-15-0,27 был только 2%, в отличие от 6% для Xylooligo-95P (фиг.4). Дальнейшее исследование гидролиза AXOS-15-0,27 при низком pH показало, что связи арабинозы более склонны к кислотному гидролизу, чем связи ксилозы. Действительно, инкубирование AXOS-15-0,27 при pH 2, 100°C в течение 60 минут вызвало гидролиз 54% всех связей арабинозы, тогда как в этих условиях были гидролизованы только 4% связей ксилозы (фиг.5).
По описаниям, ксилоолигосахариды с низкой DP, такой как Xylooligo-95P, были сладкими на вкус, со сладостью около 40% сладости сахарозы (Suntory, xylo-oligosaccharide, brochure and product sheet, 2001). В настоящее время ничего не известно о вкусовых свойствах арабиноксилоолигосахаридов с большей степенью полимеризации. Дегустационная комиссия из 20 человек определила порог распознавания вкуса AXOS-15-0,27 и Xylooligo-95P. Тестируемые образцы также включали сахарозу, натрия хлорид и аскорбиновую кислоту в качестве представителей сладкого, соленого и кислого вкуса, соответственно. Субъектов просили указать концентрацию, при которой они распознали вкус, являющийся сладким, соленым или кислым, для ряда концентрации каждого из тестируемых соединений. Только 15% субъектов дегустационной комиссии отметили сладкий вкус AXOS-15-0,27 при самой высокой тестируемой концентрации (71,5 г/л) и ни один из субъектов не указал соленый или кислый вкус. Средний порог распознавания вкуса для сладости сахарозы и Xylooligo-95P был 7 и 24 г/л, соответственно, тогда как для AXOS-15-0,27 порог был выше 71,5 г/л. Таким образом, AXOS-15-0,27 более чем в 10 раз менее сладкий, чем сахароза и более чем в 3 раза менее сладкий, чем Xylooligo-95P, который сам приблизительно в три раза менее сладкий, чем сахароза.
Была определена вязкость AXOS-15-27, AXOS-39-0,22 и AXOS-13-0,21 и произведено сравнение с вязкостью фрукто-олигосахаридов (FOS, коммерческий продукт Raftilose) и ксилоолигосахаридов (XOS, коммерческий продукт Xylooligo-95P). Как показано в Таблице 3, различные препараты AXOS имеют более высокую кажущуюся характеристическую вязкость, которая в 3-10 раз выше вязкости FOS и Xylooligo-95P.
ПРИМЕР 3: Фракционирование препаратов AXOS с помощью ультрафильтрации
Материалы и методы
Изготовление AXOS. Был изготовлен скребковый WU-AX, как описано в Материалах и методах примера 1. Скребковый WU-AX был суспендирован в буфере уксуснокислого натрия (25 мМ, pH 4,7) в количестве 3 г/л и инкубировался с XAA, эндоксиланазой из Aspergillus aculeatus (Shearzyme 500L, Novozymes, Bagsvaerd, Denmark), в количестве 18,4 ед. на грамм скребкового WU-AX в течение 4 часов при 30°C. После инактивации ферментов с помощью кипячения в течение 30 минут и последующей фильтрации суспензии AXOS был получен в фильтрате.
Разделение AXOS с помощью ультрафильтрации. AXOS были фракционированы в устройстве для ультрафильтрации “камера для перемешивания HP4750” с глухим концом (Sterlitech Corporation, Kent, USA). Использованные мембраны для ультрафильтрации имели порог отсечения молекулярной массы (MMCO) либо 5 кДа (P005F, Celgard, Wiesbaden, Germany), 10 кДа (PES-10, Synder Filtration, Vacaville, CA, USA), либо 30 кДа (PES-030H, Celgard). Концентрационная поляризация на поверхности мембран была сведена к минимуму покрытой тефлоном магнитной мешалкой, расположенной в центре камеры, со скоростью перемешивания 700 об/мин. Источником давления был баллон с газообразным азотом под давлением. Давление контролировалось с помощью регулятора давления, и все эксперименты по фильтрации осуществлялись при постоянном давлении в 4 бар при комнатной температуре. Камера для ультрафильтрации с глухим концом была заполнена 300 мл фракционируемого раствора и фильтрация была остановлена, когда был собран пермеат общим объемом приблизительно 200 мл.
2
4
4
4
4
4
3
Определение характеристик выделенных препаратов. См. Материалы и методы в примере 1. Высокоэффективная эксклюзионная хроматография размера (HPSEC) была выполнена как описано в Материалах и методах в примере 1, за исключением того, что применялась HPSEC колонка Shodex SB-802,5 HQ (Showa, Denko K.K., Tokyo, Japan, 300×8 мм, диапазон разделения: 1×10-1×10 Да). Маркерами молекулярных масс были стандартные пуллуланы Shodex P-82 (2,0 мг/мл) с молекулярной массой 11,2×10, 4,73×10, 2,28×10, 1,18×10 и 0,59×10 Да, стандартные ксило-олигосахариды с молекулярными массами 810 (DP6), 678 (DP5), 546 (DP4), 414 (DP3) и 282 Да (DP2) и глюкоза с молекулярной массой 180 Да.
Результаты и обсуждение
Наличие в препаратах AXOS сладких на вкус и метаболизируемых олигосахаридов низкой молекулярной массы может быть нежелательным для отдельных областей применения в качестве компонента пищи, тогда как для других областей применения использование сладких на вкус препаратов AXOS, состоящих главным образом из олигосахаридов низкой молекулярной массы, является желательным. По этой причине целесообразно разработать способ, который позволит фракционировать препараты AXOS таким образом, что AXOS/XOS с DP2-3 будут отделены от AXOS с более высокой DP. Фракционирование арабиноксиланов ранее всегда осуществлялось с помощью преципитации спиртовыми растворами различных концентраций (Courtin and Delcour, 1998). Однако применение спиртовой преципитации в промышленном масштабе технически и экономически непривлекательно. В связи с этим, была исследована возможность дальнейшего фракционирования ферментативно полученного AXOS с помощью ультрафильтрации.
Например, AXOS, изготовленный с помощью инкубирования скребкового WU-AX с XAA (18,4 ед./г) в течение 4 часов при 30°C, был подвергнут ультрафильтрации, используя мембраны с порогом отсечения молекулярной массы (MMCO) либо 5 кДа, 10 кДа, либо 30 кДа.
5кДа
5кДа
5кДа
При применении мембран 5 кДа, HPSEC профиль фракции пермеата (PER) (Фиг.7a) главным образом показывает олигосахариды, соответствующие по размеру ксилобиозе (DP2) и ксилотриозе (DP3). Фракция ретентата (RET), которая содержит 86% растворимого арабиноксилана в основном растворе AXOS (Таблица 4), в основном показывает тот же профиль молекулярных масс, что и препарат AXOS до ультрафильтрации, за исключением того, что количество олигосахаридов с DP2 и DP3 уменьшилось примерно наполовину (Фиг.7a). Неполное удаление олигосахаридов с низкой DP из фракции RET может быть следствием их удержания, в результате уменьшения потоков пермеата, вызванного наличием компонентов с высокой молекулярной массой.
10кДа
10кДа
10кДа
30кДа
30кДа
10кДа
30кДа
10кДа
С помощью ультрафильтрации с применением мембраны 10 кДа из фракции пермеата было выделено 34% содержащегося арабиноксилана, тогда как 65% остались в фракции пермеата (Таблица 4). Фракция пермеата (PER) содержала главным образом олигосахариды с DP2 к DP6. Фракция ретентата (RET) имела низкое содержание олигосахаридов малого размера с DP 2-4 и состояла главным образом из олигосахаридов с молекулярной массой в пределах от 700 до >110000 Да (от DP5 до DP>850) (Фиг.7B). По сравнению с фракцией PER пермеат, полученный с применением мембран 30 кДа (PER), имел более высокое содержание олигосахаридов с молекулярной массой от 1000 до 10000 Да. Соответственно, фракция ретентата 30 кДа мембран (RET) имела более низкое содержание олигосахаридов с молекулярной массой в пределах от 1000 до 10000 Да по сравнению с RET, но, неожиданно, содержание DP2 и DP3 олигосахаридов было более высоким в RET, чем в RET.
5кДа
10кДа
30кДа
5кДа
10кДа
30кДа
10кДа
10кДа+30кДа
10кДа+30кДа
10кДа
10кДа
Из Таблицы 4 ясно, что ультрафильтрация влияет на соотношение A/X в полученных фракциях AXOS. Фракции пермеата (PER, PER и PER) были обогащены олигосахаридами с относительно низким соотношением A/X, тогда как фракции ретентата (RET, RET и RET) содержали компоненты с более высоким соотношением A/X. Для оценки возможности дальнейшего фракционирования AXOS с помощью ультрафильтрации фракция RET была подвергнута процессу повторной ультрафильтрации, в котором применялась мембрана с MMCO 30 кДа. Профили HPSEC фракции пермеата (PER) и фракции ретентата (RET), полученных после ультрафильтрации фракции RET через мембрану с MMCO 30кДа, вместе с фракцией PER показаны на Фиг.8.
10кДа+30кДа
10кДа+30кДа
Фракция RET содержит главным образом компоненты с высокой молекулярной массой (>20000 Да), которые появляются в свободном объеме колонки Shodex SB-802,5 HQ. Фракция PER, которая представляет приблизительно 25% арабиноксиланов в основном растворе AXOS (Таблица 5), состоит главным образом из олигосахаридов среднего размера с молекулярной массой в пределах от 700 до 10000 Да (DP от 5 до 75) (Фиг.8).
Эти результаты указывают на то, что ультрафильтрация с предпочтительным применением мембраны с MMCO 10 кДа может применяться в качестве способа изготовления препаратов AXOS как с высоким содержанием олигосахаридов с DP от 2 до 6 с помощью забора пермеата после ультрафильтрации, так и с высоким содержанием олигосахаридов с DP>4 и низким содержанием с DP от 2 до 4, с помощью забора ретентата после ультрафильтрации. Последующая ультрафильтрация, предпочтительно используя ретентат с мембран 10 кДа и пропуская его через мембраны 30 кДа, может использоваться для получения фракции AXOS, которая богата AXOS с DP в пределах от 5 до 75.
ПРИМЕР 4: Влияние препаратов AXOS на кишечник цыпленка
Материалы и методы
Препараты олигосахарида. См. Материалы и методы в примере 1.
Микробиологические анализы путем подсчета колоний на чашках. Содержимое слепой кишки цыплят было взвешено, растворено в пропорции 1:10 в стерильном физиологическом пептонно-солевом растворе (PPSS; 0,1% бактопептон, 0,85% NaCl), гомогенизировано в гомогенизаторе stomacher и затем разведено в PPSS согласно схеме десятикратного разведения. Подходящие разведения затем были высеяны на чашки, применяя технологию посева на чашки, с фиолетово-красным желчным агаром с глюкозой (VRBG; Oxoid CM0485B, Basingstoke, U. K) для подсчета энтеробактерий и с анаэробным агаром Wilkins-Chalgren (Oxoid CM619), модифицированным добавлением кристаллической уксусной кислоты (1 мл/л) и мупироцина (100 мг/л), для бифидобактерий. Указанные модификации повышают селективность агара Wilkins-Chalgren для бифидобактерий и показано, что модифицированный агар Wilkins-Chalgren особенно подходит для одностадийного определения числа бифидобактерий в слепой кишке цыплят (Rada et al., 1999; Rada and Petr, 2000). Подсчет колоний производился после 1 дня аэробной инкубации при 37°C для энтеробактерий и после 4 дней анаэробной инкубации (в анаэростатах с системой Oxoid anaerogen AN0025A) при 37°C для бифидобактерий. Числа были представлены в пересчете на грамм содержимого слепой кишки. Для сведения к минимуму воздействия кислорода на бифидобактерии во время подготовки образца были приняты некоторые профилактические меры: (i) содержимое слепой кишки извлекалось из слепой кишки непосредственно перед началом подготовки пробы; (ii) непосредственно перед применением растворители и агары были обработаны в автоклаве или прокипячены, для устранения растворенного кислорода; (iii) чашки для подсчета бифидобактерий были помещены в анаэробную атмосферу на 2 часа от начала подготовки образца.
Микробиологические анализы с помощью количественной ПЦР. Экстракция ДНК была выполнена, как описано Van de Wiele et al (2004) из образцов слепой кишки, растворенных 1:5 в PPSS. Амплификация была выполнена в реакционных смесях объемом 25 мкл с применением буферов, снабженных реактивами SYBR Green PCR Core, как описано поставщиками (PE Applied Biosystems, Nieuwerkerk a/d Ijssel, The Netherlands) в оптических 96-луночных реакционных чашках с оптическими колпаками (PE Applied Biosystems). Прямой и обратный праймеры, BIF164f и BIF163r соответственно (Satokari et al., 2001), применялись в концентрации 1 мкM для детекции копий генов 16s рибосомальной РНК от бактерий рода Bifidobacterium. Температурный режим ПЦР был следующий: 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, с последующими 40 циклами при 94°C в течение 1 минуты, 62°C в течение 1 минуты и 60°C в течение 1 мин. Матричная ДНК была амплифицирована в трех экземплярах реакционных смесей и мониторировалась с применением прибора ABI Prism SDS7000 (PE Applied Biosystems). На основе амплификации ПЦР в реальном времени в четырех экземплярах реакции на четырех различных разведениях ДНК, извлеченной из культуры Bifidobacterium breve (штамм LMG 11042), были построены стандартные кривые. Данные ПЦР в реальном времени от экспериментальных образцов были изображены в зависимости от стандартной кривой и корректированы для эффективности экстракции ДНК, применяя фактор, состоящий из концентрации ДНК в экспериментальном образце с наибольшей концентрацией ДНК, разделенной на концентрацию ДНК каждого отдельного экспериментального образца.
Статистические анализы. Влияние различных рационов на массу тела, потребление корма или микробную композицию кишечника животных было проанализировано с помощью однофакторного вариационного анализа с уровнем достоверности 95%, применяя программное обеспечение Analyse-it версии 1.71. В случае, если для диетического фактора наблюдался статистически значимый эффект, различия между рационами анализировались либо с помощью теста наименьшего значимого различия (LSD), либо с помощью теста Tukey с уровнем достоверности 95%.
Результаты и обсуждение
Влияние добавления препаратов производных различных (арабино)ксиланов было протестировано на микробной композиции нижнего отдела кишечного тракта цыплят.
Для первого эксперимента, 64 цыпленка (петухи Ross) однодневного возраста мужского пола были приобретены в промышленном инкубаторе (Avibel, Tielt, Belgium) и распределены на 4 загона (16 цыплят на загон). В каждом загоне находился резервуар для питья и контейнер для корма 1 м. Температура в манеже на момент помещения птиц была 35°C и впоследствии каждые 2 дня уменьшалась на 1°C. Животные содержались в условиях освещения в течение 23 часов и в темноте в течение 1 часа.
Корма (1 корм на загон) и питьевую воду давали вволю. Продолжительность эксперимента составляла 14 дней.
Тестировались следующие экспериментальные корма:
- Контрольный корм
- Контрольный корм + препарат 0,25% AXOS-7-0,34 (0,17% чистого AX)
- Контрольный корм + препарат 0,25% AXOS-122-0,66 (0,18% чистого AX)
- Контрольный корм + 0,25% Xylooligo-95P (0,22% чистого AX).
Концентрации, приведенные в скобках, были корректированы на их чистоту, вычисленную по содержанию в них AX. Контрольный корм состоял из коммерческого начального корма (Krix 0, Hendrix UTD, Boxmeer, The Netherlands), который содержал в качестве добавки ферментную смесь из ксиланазы и глюканазы (Roxazyme).
В возрасте семи дней все животные были взвешены, и из группы случайным образом были выбраны и забиты декапитацией 8 животных. После этого животные препарировались для забора слепых кишок. Слепые кишки были опорожнены и содержимое было объединено в две группы на каждый вид терапии (четыре слепых кишки в каждой группе). Этот протокол был повторен, когда оставшиеся животные достигли возраста четырнадцати дней, за исключением того, что слепые кишки были объединены в три группы на каждый вид терапии (от трех, трех и двух животных в каждой группе). У животных из группы AXOS-7-0,34, по сравнению с контрольной группой значимых различий по средней массе тела обнаружено не было. Животные из групп AXOS-122-0,66 и Xylooligo-95P через семь дней имели массу тела, значительно более низкую, чем в контрольной группе, но животные, пойманные через 14 дней, отличались от контроля незначительно. В случае группы AXOS-122-0,66, относительно более низкая масса тела через 7 дней возможно была обусловлена значительно более низкой массой цыплят в этой группе при выведении.
8
9
2
3
5
Анализ микробиоты слепой кишки цыплят выявил высокое содержание энтеробактерий (приблизительно 10-10/г содержимого слепой кишки) как через 7 дней, так и через 14 дней кормления, и для любого вида терапии ни одного значимого различия обнаружено не было. Уровни бифидобактерий через 7 дней были низкими во всех группах терапии (приблизительно 10-10/г содержимого слепой кишки) (фиг.9) за исключением животных в группе Xylooligo-95P, у которых уровень бифидобактерий был намного более высоким (приблизительно 108/г содержимого слепой кишки). Через 14 дней число бифидобактерий в слепой кишке у контрольной группы оставалось низким. Напротив, явное повышение числа бифидобактерий (на множитель приблизительно 10) наблюдалось в содержимом слепой кишки группы AXOS-7-0,34. В группе Xylooligo-95P уровень бифидобактерий был несколько ниже относительно 7-дневного уровня, но, несмотря на это, через 14 дней он был все еще значительно выше, чем у контрольной группы. В группе AXOS-122-0,66 через 14 дней наблюдалось умеренное повышение числа бифидобактерий в содержимом слепой кишки, однако, это повышение не было значительным в сравнении с контрольной группой.
Для второго эксперимента, 54 цыпленка (петухи Ross) однодневного возраста мужского пола были приобретены в промышленном инкубатории (Avibel, Tielt, Belgium) и распределены на 6 загонов (9 цыплят на загон). Условия в загонах были такими же, как описано для первого эксперимента (см. выше). Продолжительность эксперимента составляла 14 дней. Тестировались следующие экспериментальные корма:
- Контрольный корм
- Контрольный корм + 0,141% препарат AXOS-15-0,27 (0,1% чистого AX)
- Контрольный корм + 0,352% препарат AXOS-15-0,27 (0,25% чистого AX)
- Контрольный корм + 0,263% препарат FOS (0,25% чистого FOS)
- Контрольный корм + 1,053% препарат FOS (1% чистого FOS)
- Контрольный корм + препарат 0,01% Xylanase.
Концентрации, указанные в скобках, были скорректированы по их чистоте, вычисленной по содержанию в них AX или FOS. Препарат FOS являлся коммерческим продуктом Raftilose (Orafti, Tienen, Belgium). Препарат xylanase являлся коммерческим продуктом Belfeed (Beldem, Groot-Bijgaarden, Belgium). Композиция контрольного корма приведена в Таблице 6.
В возрасте 14 дней все животные были взвешены и забиты декапитацией. После этого животные были препарированы для забора слепых кишок и содержимое слепых кишок было объединено по 3 животных, относящихся к одинаковой группе терапии. Число бифидобактерий в объединенных образцах слепой кишки определялось с помощью количественной ПЦР.
Через две недели кормления соответствующими рационами значимых различий по массе тела у животных из групп с разной терапией обнаружить не удалось. Относительно числа бифидобактерий в слепой кишке цыплят через 2 недели, только цыплята, получавшие кормление рационом, содержащим 0,25% AXOS-15-0,27, значительно отличались от группы с контрольной терапией (фиг.10). Число бифидобактерий у цыплят, получавших 0,25% AXOS-15-0,27, было в 22 раза выше, чем у цыплят, получавших контрольный рацион. Необходимо отметить, что фрукто-олигосахариды (FOS), документально доказанное пребиотическое соединение, которое было включено в целях сравнения, не вызывало повышения числа бифидобактерий в слепых кишках цыплят, даже в дозе в 4 раза большей, чем та, при которой эффективен AXOS-15-0,27. Это указывает на то, что AXOS-15-0,27 является удивительно мощным бифидогенным соединением.
Бифидобактерии позитивно ассоциируются с здоровьем животных и человека и являются компонентами многих пробиотических соединений. Повышается интерес к селективному обогащению этих популяций бактерий в желудочно-кишечном тракте в дополнение к прямому приему микробных препаратов, для повышения или поддержания положительного статуса здоровья у животных и людей, включая супрессивное влияние на колоректальный рак (Van Loo et al., 2004). Результаты экспериментов по кормлению цыплят показывают, что все корма, содержащие арабиноксилан, стимулировали присутствие бифидобактерий в слепой кишке цыплят. Препарат AXOS с высокой степенью полимеризации, AXOS-122-0,66, вызывал только умеренное незначительное увеличение популяции бифидобактерий в слепой кишке цыплят. С другой стороны, препараты от низкой до средней степени полимеризации, Xylooligo-95P, AXOS-7-0,34 и AXOS-15-0,27, вызывали сильное и значительное повышение уровня бифидобактерий, не вызывая снижения массы тела животных. Реакцию на Xylooligo-95P можно было наблюдать уже через 7 дней, тогда как AXOS-7-0,34 и AXOS-15-0,27 вызывали бифидогенную реакцию только через 14 дней. Это указывает на то, что Xylooligo-95P быстрее ферментируется бифидобактериями, чем AXOS-7-0,34 и препараты AXOS-15-0,27, которые имеют более высокую среднюю степень полимеризации и более высокую степень средней степени замещения. Медленная ферментация выбранными полезными бактериями является желательным свойством пребиотического соединения для применения у людей и животных с длинным кишечником. Медленная ферментация кишечными бактериями увеличивает фракцию пребиотического соединения, которое полностью не расходуется после прохождения через проксимальные части толстой кишки и таким образом может быть использовано в качестве субстрата для ферментации соответствующими бактериями в дистальных частях толстой кишки. У людей частота развития рака в дистальной и ректальной частях толстой кишки, взятая вместе, более высока, чем для проксимальной части толстой кишки (http://www.state.ni.us/health/cancer/cr/subsites.htm), и поэтому важно, что пребиотические соединения могут стимулировать полезную микробиоту дистального отдела толстой кишки и прямой кишки.
ПРИМЕР 5: Влияние препаратов AXOS на кишечник крыс
Материалы и методы
Изготовление XOS/AXOS. См. Материалы и методы в примере 1.
Микробиологические анализы с помощью количественной ПЦР. См. Материалы и методы в примере 4.
Анализ на определение короткоцепочечных жирных кислот. Образцы кишечника были экстрагированы 5 объемами воды/фосфорной кислоты/муравьиной кислоты (98/1,8/0,2, в объемных единицах) и отделены от примесей с помощью центрифугирования (22000 г, 10 минут). Короткоцепочечные жирные кислоты (SCFAs) были проанализированы с помощью газожидкостной хроматографии (Shimadzu, GC 14A) на колонке, заполненной Chromosorb W (размер ячейки сита 60/30; Supelco, Bellefonte, USA), и детекции с помощью ионизации в пламени. Концентрации SCFAs были вычислены на основании стандартов с известными концентрациями различных кислот. В качестве внутреннего стандарта применялась капроновая кислота.
Статистические анализы. Влияние различных рационов на массу тела, потребление корма, SCFA или микробную композицию кишечника животных было проанализировано с помощью однофакторного вариационного анализа с уровнем достоверности 95%, применяя программное обеспечение Analyse-it версии 1.71. В случае, если для диетического фактора наблюдался статистически значимый эффект, различия между рационами анализировались с помощью теста наименьшего значимого различия (LSD) с уровнем достоверности 95%.
Результаты и обсуждение
Для первого эксперимента на крысах 40 крыс самцов 6-недельного возраста (Wistar) были приобретены у Elevage Janvier (Le Genest-St-lsle, France) и помещены в клетки с основанием из проволоки из нержавеющей стали (2 крысы на клетку) в комнате с управляемой окружающей средой (22°C) с 14-10 часовым циклом света-темноты.
В течение 7 дней крысам был предоставлен свободный доступ к воде и к гранулам (10 мм) 'основного гуманизированного рациона'. Композиция 'основного гуманизированного рациона' приведена в Таблице 7. После 7 дней адаптации к основному гуманизированному рациону крысы были случайным образом разделены на 5 групп с разной терапией (8 крыс/группу) и в течение 13 дней каждой группе был предоставлен свободный доступ к гранулам (10 мм) одного из следующих рационов:
- Основной гуманизированный рацион
- Основной гуманизированный рацион + 0,70% препарата AXOS-122-0,66 (0,5% чистого AX)
- Основной гуманизированный рацион + 0,69% препарата AXOS-16-0,78 (0,5% чистого AX)
- Основной гуманизированный рацион + 0,73% препарата AXOS-15-0,27 (0,5% чистого AX)
- Основной гуманизированный рацион + 0,72% препарата AXOS-8-0,27 (0,5% чистого AX)
Концентрации, указанные в скобках, были скорректированы по их чистоте, вычисленной по содержанию в них AX. Для рационов, содержащих AXOS, крахмал в основном гуманизированном рационе был замещен соответствующим количеством AXOS.
3 раза в неделю животные взвешивались и измерялось потребление корма. Через 13 дней терапии все животные были взвешены и усыплены повышенной дозой нембутала. После этого животные были препарированы для забора фекалий. Фекалии были собраны в виде частиц из дистальных отделов толстой кишки до заднего прохода. Фекалии от 2 животных, относящихся к одинаковой группе терапии, были объединены и проанализированы на содержание SCFA.
Потребление корма во время периода лечения колебалось от 18,9 до 27,7 г/день со средним показателем 22,7 г/д. Исходная масса тела крыс в начале терапии составляла в среднем 262,0 г, а конечная масса тела через 13 дней терапии составляла в среднем 375,3 г. Никаких значительных различий по массе тела или потреблении корма в группах с различной терапией обнаружить не удалось.
Поскольку повышенные уровни SCFA в кишечнике являются критерием сдвигов в кишечной микрофлоре, вызванной приемом пребиотических соединений (Van Loo, 2004), мы определили содержание SCFA в фекалиях групп с различной терапией. Как показано на Фиг.11, уровень пропионата в фекалиях крыс, получавших AXOS-8-0,27, AXOS-15-0,27 и AXOS-16-0,78, был значительно выше, чем в контрольной группе или группе AXOS-122-0,66. Также наблюдалась тенденция на повышение уровней ацетата и бутирата в фекалиях групп AXOS-8-0,27, AXOS-15-0,27 и AXOS-16-0,78. SCFAs, такие как ацетат, пропионат и бутират вырабатываются бактериями в анаэробной среде кишечника в качестве акцепторов электронов дыхания. Как известно, пребиотические соединения повышают уровни SFCA в нижних отделах желудочно-кишечного тракта. Высокие уровни SCFAs являются желательными, так как они снижают pH содержимого кишечника и таким образом ограничивают рост потенциально патогенных гнилостных бактерий. Снижение pH кишечника также влечет за собой повышение растворимости и биодоступности таких минералов, как кальций и магний (Teitelbaum and Walker, 2002). Кроме того, короткоцепочечные жирные кислоты, особенно бутират, стимулируют эпителиальные клетки толстой кишки, таким образом увеличивая адсорбционную способность эпителия (Topping and Clifton, 2001).
Тот факт, что среди крыс, получавших терапию AXOS-15-0,27 или AXOS-16-0,78, двумя препаратами с приблизительно одинаковой средней степенью полимеризации, но с разным отношением A/X, не наблюдалось никаких значимых различий, указывает на то, что степень замещения не оказывает большого влияния на способность AXOS стимулировать бактериальную ферментацию в толстой кишке. С другой стороны, при сравнении эффектов AXOS-16-0,78 и AXOS-122-0,66, двух препаратов с приблизительно одинаковой степенью замещения, но с разной степенью полимеризации, становится ясно, что препараты AXOS с высокой степенью полимеризации, такие как AXOS-122-0,66, являются менее мощными пребиотическими соединениями, чем препараты с более низкой средней степенью полимеризации. Вследствие этого, предпочтительными пребиотическими соединениями являются препараты AXOS со средней степенью полимеризации менее 120. В случае, если предпочтительной является медленная ферментация, с целью увеличения доступности AXOS в дистальных отделах толстой кишки и прямой кишке, предпочтительными являются препараты AXOS со средней степенью полимеризации, в пределах от 4.
Для второго эксперимента на крысах, 24 крысы самца 6-недельного возраста (Wistar) были приобретены у Elevage Janvier (Le Genest-St-lsle, France) и помещены в клетки с основанием из проволоки из нержавеющей стали (2 крысы на клетку) в комнате с управляемой окружающей средой (22°C) с 14-10 часовым циклом света-темноты. В течение 6 дней крысам был предоставлен свободный доступ к воде и гранулам (10 мм) 'основного гуманизированного рациона'. Композиция 'основного гуманизированного рациона' приведена в Таблице 7. После 6 дней на основном гуманизированном рационе крысы были случайным образом разделены на 3 группы с различной терапией (8 крыс/группа) и каждой группе был предоставлен свободный доступ к гранулам (10 мм) одного из следующих рационов:
- Основной гуманизированный рацион
- Основной гуманизированный рацион + препарат 5,87% AXOS-15-0,27 (4% чистого AX)
- Основной гуманизированный рацион + 5,26% Xylooligo-95P (4% чистого AX).
Концентрации, указанные в скобках, были скорректированы по их чистоте, вычисленной по содержанию в них AX. В рационах, содержащих AXOS-15-0,27 или Xylooligo-95P, крахмал в основном гуманизированном рационе был замещен адекватным количеством AXOS. 3 раза в неделю животные взвешивались и измерялось потребление корма. Через 14 дней терапии все животные были взвешены, усыплены повышенной дозой нембутала и препарированы для забора проксимальных отделов толстой кишки, слепой кишки и дистальных отделов толстой кишки. Содержимое слепой кишки от 2 животных, относящихся к одинаковой группе терапии, было объединено и проанализировано на содержание SCFA.
В проксимальном отделе толстой кишки уровни SCFA были намного ниже, чем в дистальном отделе толстой кишки, и только ацетат был выше порога детекции в образцах проксимального отдела толстой кишки. Следовательно, можно было получить данные только для ацетата в проксимальном отделе толстой кишки и для ацетата, пропионата и бутирата в дистальном отделе толстой кишки. Ни один из видов терапии значительно на повлиял на уровни SCFA при 95% уровне вероятности. Однако, судя по данным, может наблюдаться четкая динамика. Как показано на Фиг.12, группы AXOS-15-0,27 и Xylooligo-95P имели более высокие уровни ацетата и бутирата, но не пропионата, по сравнению с контрольной группой. Наиболее яркий эффект наблюдался для бутирата в дистальном отделе толстой кишки, повышение которого в сравнении с контрольной группой составляло 58% в группе AXOS-15-0,27 и 34% в группе Xylooligo-95P. В сравнении с Xylooligo-95P, наблюдался более сильный эффект AXOS-15-0,27 на все SCFAs в дистальном отделе толстой кишки. Интересно, что Xylooligo-95P вызывал самое сильное повышение ацетата в проксимальном отделе толстой кишки, тогда как AXOS-15-0,27 приводил к самому сильному повышению ацетата в дистальном отделе толстой кишки. Количество бифидобактерий было значительно повышено в слепых кишках крыс, получавших или AXOS-15-0,27, или Xylooligo-95P, по сравнению с крысами, которые получали контрольный рацион. Самое высокое увеличение количества бифидобактерий в слепой кишке наблюдалось в группе AXOS-15-0,27 (1,08 log единиц, или в 12 раз выше, чем в контрольной группе, фиг.13).
Эти результаты указывают на то, что AXOS-15-0,27 является более мощным пребиотическим соединением, чем Xylooligo-95P. Данные также указывают на то, что AXOS-15-0,27 ферментируется более медленно, чем Xylooligo-95P, так как Xylooligo-95P оказывал на SCFA более сильный эффект в проксимальном отделе толстой кишки, тогда как AXOS-15-0,27 оказывал более сильный эффект в дистальном отделе толстой кишки. Более медленная ферментация AXOS-15-0,27 в отличие от Xylooligo-95P также наблюдалась в экспериментах на цыплятах, представленных в примере 5. Свойство медленной ферментации AXOS-15-0,27 является желательным, так как это приводит к достижению большего количества пребиотического соединения в дистальной толстой кишке, где оно может проявить свое полезное действие предположительно подавляющее онкогенез.
ПРИМЕР 6: Влияние препаратов AXOS на кишечник человека
Материалы и методы
Изготовление AXOS-15-0,27 и WPC. См. Материалы и методы примера 1.
Микробиологические анализы с помощью количественной ПЦР. См. Материалы и методы в примере 4.
Субъекты. Ни один из добровольцев, участвующих в экспериментах, не имел в анамнезе желудочно-кишечных или метаболических заболеваний, или операций. Субъекты не получали антибиотики или любое другое лечение, влияющее на кишечный транзит или кишечную флору, в течение по меньшей мере 3 месяцев до начала исследования. Во время экспериментов ни одна из женщин не была беременна. Добровольцы не соблюдали никаких стандартных рационов. Однако их просили поддерживать правильный характер питания до конца периода исследования и избегать чрезмерного приема кисломолочных продуктов и пищевых компонентов, содержащих высокие количества ферментируемых углеводов. Эксперименты были одобрены Этическим Комитетом Университета Leuven, и все субъекты дали информированное согласие.
Меченые субстраты.
15
15
15
15
3
Лактоза-[N,N]-уреид был синтезирован по способу Schoorl, модифицированному Hofmann (1931) с [N,N]мочевиной, полученной от Euriso-top (Saint-Aubin, France). H-меченый полиэтиленгликоль (3H-ШТИФТ) был получен от New England Nuclear Life Science Products (Boston, MA, USA).
tot
2
15
15
15
15
14
15
Определение N и N в моче и кале. Общее содержание N и накопление N в моче и кале определялось с помощью применения элементного анализатора (ANCA-SL; PDZ, Cheshire, UK) в сочетании с детектором по теплопроводности (TCD; PDZ) и масс-спектрометра для анализа отношений стабильных изотопов (IRMS; PDZ). Известный объем мочи (15 мкл) или известная масса кала (приблизительно 5-7 мг лиофилизированного кала) окислялась в присутствии кислорода при 1000°C. После этого продукты горения проходили через вторую печь, содержащую медь при 600°C, где происходила адсорбция лишнего кислорода и редукция оксидов азота до элементарного азота. Суммарное содержание азота определялось с помощью TCD детектора, тогда как накопление N определялось с помощью IRMS детектора, связанного с камерой сгорания элементного анализатора. Соотношение изотопов NN к N определялось в сравнении с калиброванным лабораторным стандартом (то есть стандартным раствором сульфата аммония). Процент выделенного N от принятой дозы вычислялся следующим образом (Evenepoel et al., 1999):
15
15
15
t
% дозы N = 100 x мг избытка  N / мг принятого N,
15
t
t
bas
tot
где избыток мг  N = AP-APx N / 100
t
15
и AP: определенное накопление N в указанном образце мочи, выраженное в атомных процентах (AP)
bas
15
AP: накопление N в основном образце мочи (выраженное в AP)
tot
N: суммарное содержание азота в указанном образце мочи.
15
15
15
3
3
3
2
Для образцов мочи процент принимаемой дозы N был обобщен за период 0-48 ч после пробного завтрака, тогда как для образцов кала процент принятой дозы N был обобщен за период 0-72 ч после пробного завтрака. Для образцов кала была выполнена коррекция различий орофекального транзита по времени у разных индивидуумов. Это было выполнено с помощью разделения общего процента, выделенного более чем за 72 часаN от принятой дозы, на общий процент выделенного более чем за 72 часа H-PEG от принятой дозы. Содержание H-PEG в кале определялось с помощью жидкостно-сцинтилляционного измерения (жидкостный сцинтилляционный спектрометр Tricarb, модель 3375; Packard Instruments, Downers Grove, IL, USA) после окисления до H-HO (окислитель образцов Packard, модель 307).
2
4
2
4
Определение производных фенола в моче. Суммарное содержание p-крезола и фенола определялось с помощью технологии газожидкостной хроматографии - масс-спектрометрии (GC-MS). С помощью концентрированной HSO pH 950 мл мочи было отрегулировано до pH 1. Этот раствор находился в нагретом до 90°C состоянии в течение 30 минут для освобождения от белков и гидролиза конъюгированных фенолов. После охлаждения до комнатной температуры, в качестве внутреннего стандарта был добавлен 2,6-диметилфенол в объеме 50 мл (20 мг/100 мл). Фенолы были экстрагированы с помощью 1 мл этилацетата. Слой этилацетата был высушен с помощью NaSO и 0,5 мл этого раствора были проанализированы на GC-MS (Trace GC-MS, Thermo Finnigan, San Jose, CA, USA). Применялась аналитическая колонка 1 мкм AT5-MS с внутренним диаметром 30 м×0,32 мм (Alltech Associates, Deerfield, IL, USA). Газообразный гелий, категория CG, применялся в качестве носителя при постоянной скорости потока 1,3 мл/мин. Температура печи была запрограммирована изначально на 75°C (изотермическая в течение 5 минут) и повышалась на 10°C/мин до 160°C и на 20°C/мин до 280°C. Масс-спектрометрическая детекция была выполнена электронным ударом в режиме полного сканирования от m/z 59 до m/z 590 со скоростью два сканирования в секунду. Результаты для p-крезола и фенола были выражены в виде суммарного содержания (мг), полученного за 0-24 часа сбора.
Статистический анализ. Статистический анализ был выполнен с помощью программного обеспечения SPSS версии 12.0. Статистическая оценка данных была выполнена с помощью применения теста Wilcoxon Signed Ranks с уровнем достоверности 95%.
Результаты и обсуждение
Первый эксперимент на людях был выполнен на 10 здоровых добровольцах (5 мужчин и 5 женщин, возрастной диапазон 23-37 лет). 10 добровольцев были случайным образом разделены на две группы по 5 человек в каждой. Первая группа в течение 2 недель получала по 7 г в сутки (4,88 г) AXOS-15-0,27, суспендированного в воде, тогда как вторая группа получала ежедневно по 11,6 г (4,82 г) WPC, суспендированного в воде. Значения веса, приведенные в скобках, являются корректированными значениями веса для AXOS, исходя из содержания AX и содержания влаги в препарате.
Образцы кала каждого из добровольцев собирались в течение дня до начала эксперимента и в течение 15 дня. Каждый раз, кал после первого за день опорожнения кишечника собирался, взвешивался и сохранялся при -20°C до бактериологического анализа с помощью количественной ПЦР.
Как показано на фиг.14, субъекты, получавшие 4,88 г/день AXOS-15-0,27 в течение 14 дней, имели уровень фекальных бифидобактерий, который был на 1,55 log единиц (= в 35 раз) выше базального уровня (p=0,043). Напротив, уровень бифидобактерий был немного снижен после назначения субъектам WPC в дозе 4,82 г/день в течение 2 недель, несмотря на то, что различие с базальным уровнем не было значимым (p=0,715).
Эти данные указывают на то, что соединения AXOS с промежуточной средней степенью полимеризации, такие как AXOS-15-0,27 (avDP=15, Таблица 1), оказывают более сильный пребиотический эффект, чем соединения с высокой средней степенью полимеризации, такие как WPC (avDP=58, Таблица 1). Тот же вывод может быть сделан, исходя из тестов на бифидогенные эффекты у цыплят (см. пример 4) и на повышение SCFAs у крыс (см. пример 5).
3
3
3
3
3
3
3
15
15
15
15
15
15
15
15
Во втором эксперименте оценивалось влияние различных однократных доз AXOS-15-0,27 на метаболизм NH, p-крезола и фенола в толстой кишке человека. NH, фенол и p-крезол являются токсичными и потенциально канцерогенными метаболитами, которые продуцируются бактериями в толстой кишке при ферментации белков. Метаболизм NH оценивался, применяя лактозил-[N,N]-уреид в качестве биомаркера. При пероральном приеме лактозил-уреид достигает толстой кишки в неизмененном виде, так как молекулярная связь между молекулой углевода и мочевиной в лактозил-уреиде устойчива к ферментативному расщеплению в желудочно-кишечном тракте человека. Когда лактозил-[N,N]-уреид достигает толстой кишки, он разлагается с помощью выбранных бактерий до [N,N]-меченой мочевины. Меченая мочевина подвергается быстрому гидролизу с продукцией  NH (Wutzke et al. 1997). Меченый NH смешивается с аммиаком, присутствующим в толстой кишке, и, как следствие, изменения, наблюдаемые при определении меченого N, отражают метаболический путь NH в толстой кишке. В дополнение к мониторингу метаболизма NH в толстой кишке определялось наличие фенола и p-крезола в моче как признака бактериальной ферментации белков в толстой кишке. На основании литературных данных (Evenepoel et al. 1999) можно предположить, что в физиологических условиях приблизительно от 3 до 6% принимаемых с пищей белков остаются непереваренными. Когда непереваренные белки достигают толстой кишки, они ферментируются бактериальной флорой ободочной и толстой кишок. Бактериальная ферментация аминокислоты тирозина приводит к продукции фенола и p-крезола. Эти соединения в значительной степени адсорбируются в толстой кишке, детоксифицируются в слизистой оболочке и в печени (с помощью конъюгации с глюкуронидами и сульфатами) и, наконец, выделяются с мочой. Так как фенол и p-крезол образуются исключительно в результате бактериального метаболизма, а не вследствие человеческого метаболизма, выведение фенола и p-крезола с мочой отражает бактериальную продукцию этих соединений в толстой кишке (Smith and Macfarlane, 1996). Как следствие, любое влияние пребиотических соединений на ферментацию белка в толстой кишке должно отразиться на концентрации фенола и p-крезола в моче.
15
15
3
3
Второй эксперимент на людях был выполнен на 9 здоровых добровольцах (3 мужчины и 6 женщин, возрастной диапазон 19-26 лет). Каждый доброволец получал 5 различных пробных завтраков, содержащих разные дозы AXOS-15-0,27, с интервалом в 1 неделю между каждым пробным завтраком. Разные суточные дозы AXOS-15-0,27 составляли 0, 0,35 г (0,24 г), 1,05 г (0,73 г), 3,17 г (2,21 г) и 7 г (4,88 г), со значениями веса в скобках, обозначающими корректированный вес AXOS, исходя из содержания AX и содержания влаги в препарате. Последовательность, с которой добровольцы принимали различные пробные завтраки, была случайной. Пробный завтрак состоял из блина (15,8 г белков, 11,6 г жиров и 21,1 г углеводов; 255 килокалорий), содержащего 75 мг субстрата лактозил-[N,N]-уреида, меченого стабильным изотопом, полиэтиленгликоля (H-PEG), меченого тритием 185 кБк, и AXOS-15-0,27 в соответствующей дозе. H-PEG применялся в качестве биомаркера времени оро-фекального транзита (Geboes et al 2005).
Моча собиралась у реципиентов, которым для профилактики бактериального роста был добавлен 1 грамм неомицина. Основной образец мочи собирался перед потреблением пробного завтрака. После приема каждого пробного завтрака, в течение 48 ч производился сбор мочи в 3 различных фракциях: 0-6 ч, 6-24 ч и 24-48 ч. После определения объема мочи образцы забирались и сохранялись при -20°C до проведения анализа. Забор кала производился через 72 часа после приема пробного завтрака. После опорожнения кишечника кал немедленно замораживался, взвешивался и затем сохранялся при -20°C. Все образцы кала, забранные в один день, были объединены и гомогенизированы перед дальнейшим анализом. Были отобраны и высушены сублимацией образцы известного веса. Высушенный материал был взвешен снова и определенные количества были взяты для анализа на азот и радиоактивность.
15
15
15
Как показано на Фиг.15A, в сравнении с контрольным завтраком, в котором отсутствовал AXOS-15-0,27, после приема пробного завтрака, содержащего AXOS-15-0,27, отмечалось последовательное снижение уровня экскреции N-меченого азота с мочой. После приема контрольного завтрака, 44,5% принятой дозы N были возвращены в образцах мочи. Эта фракция была снижена до 40,4% (-9% в сравнении с контролем), 43,7% (-2% в сравнении с контролем), 33,1% (-26% в сравнении с контролем) и 33,6% (-25% в сравнении с контролем) после приема внутрь 0,24, 0,73, 2,21 и 4,88 г AXOS-15-0,27, соответственно. Снижение выделения N мочой было значимым с p<0,05 для доз AXOS-15-0,27 2,21 и 4,88 г.
15
15
15
3
С другой стороны, добавление в пробный завтрак AXOS-15-0,27 вызывало последовательное повышение экскреции N с калом (фиг.15B). В группе, получавшей контрольный пробный завтрак, 15,1% принятой дозы N были выведены с калом. Эта фракция была увеличена до 16,4% (+8 % в сравнении с контролем), 18,8% (+24% в сравнении с контролем), 25,3% (+67% в сравнении с контролем) и 26,1% (+72% в сравнении с контролем) после приема внутрь 0,24, 0,73, 2,21 и 4,88 г AXOS-15-0,27, соответственно. Повышение экскреции N с калом было значимым с p<0,05 для доз AXOS-15-0,27 2,21 и 4,88 г. AXOS-15-0,27 в любой из тестируемых доз не оказывал никакого эффекта на время желудочно-кишечного транзита, что было определено с помощью биомаркера H-PEG, (фиг.15C).
Последовательное снижение уровня выделения p-крезола и фенола с мочой отмечалось после приема пробного завтрака, содержащего AXOS-15-0,27, в сравнении с контрольным завтраком, не содержащим AXOS-15-0,27 (фиг.16). Фракция p-крезола, экскретируемого с мочой, была снижена на -9%, -21%, -35% и -41% в сравнении с контролем, после приема внутрь 0,24, 0,73, 2,21 и 4,88 г AXOS-15-0,27, соответственно (фиг.16A). Фракция фенола, экскретируемого с мочой, была снижена на -45%, -39%, -33% и -45% в сравнении с контролем, после приема внутрь 0,24, 0,73, 2,21 и 4,88 г AXOS-15-0,27, соответственно (фиг.16B). Снижение выделения фенола с мочой было значимым с p<0,05 для всех тестируемых доз AXOS-15-0,27, в пределах от 0,24 г до 4,88 г. Таким образом, было продемонстрировано, что AXOS-15-0,27 является пребиотическим соединением у людей, которое активно в поразительно низких дозах, ниже 0,24 г на порцию.
Снижение выделения азота с мочой и сопутствующее повышение выделения азота с калом ранее наблюдалось у людей, которым назначались известные пребиотические соединения, такие как инулин и лактулоза (De Preter et al. 2004; Geboes et al. 2005). Стимуляция выделения аммиака с калом является желательной, так как показано, что аммиак уменьшает продолжительность жизни эпителиальных клеток толстой кишки, усиливает их метаболизм и делает их более склонными к химическому канцерогенезу (Visek 1978). Аммиак в толстой кишке главным образом продуцируется в результате бактериальной ферментации непереваренных белков (Smith & Macfarlane, 1996; Fooks et al., 1999). Медленно ферментируемые пребиотические углеводы, такие как AXOS, с промежуточной степенью полимеризации стимулируют сахаролитические бактерии и сахаролитические пути метаболизма у бактерий, находящихся в толстой кишке. Таким образом, подобные соединения подавляют протеолитическую ферментацию в толстой кишке и стимулируют повторную утилизацию аммиака как источника азота бактериями, которые используют углеводы в качестве главного источника углерода и энергии. По той же самой причине желательным является сокращение выделения с мочой метаболитов ферментации белка крезола и фенола, так как эти производные фенола вовлечены в развитие рака кишечника (Bone et al. 1976). Снижение выделения производных фенола с мочой ранее наблюдалось для пребиотического соединения лактулозы (De Preter et al. 2004). Предполагается, что пониженное выделение крезола и фенола вызывается повышенной утилизацией аминокислоты тирозина или метаболических продуктов гниения белка, посредством увеличенной сахаролитической активности бактерий в толстой кишке, которая стимулируется пребиотическими соединениями.
Ссылочные материалы
Таблицы
Таблица 1Свойства различных препаратов (арабино)ксилана. AX: содержание арабиноксилана, выраженное в % сухого вещества; AIX: отношение арабинозы к ксилозе; avDPGC: средняя степень полимеризации, определенная с помощью газожидкостной хроматографии; avDP<sub>HPSEC</sub>: средняя степень полимеризации, определенная с помощью высокоэффективной эксклюзионной хроматографии размера. 90% диапазон DP: диапазон степеней полимеризации, в который попадают 90% олигосахаридов.
AX<sup>a</sup>
A/X
avDP<sub>GC</sub>
avDP<sub>HPSEC</sub> <sup>b</sup>
90% диапазонDP
WPC
42,8<sup>d</sup>
0,58<sup>e</sup>
N.D.
58
1-480
AXOS-122-0,66
73,7<sup>d</sup>
0,66<sup>e</sup>
122
150
12-1200
AXOS-7-0,34
67,8
0,34
7
9
2-190
AXOS-16-0,78
77,6
0,78
16
19
2-130
AXOS-15-0,27
72,3
0,27
15
12
2-650
AXOS-8-0,27
80,4
0,27
8
N.D.
N.D.
AXOS-39-0,22
77,3
0,22
39
46
5-240
AXOS-13-0,21
86,2
0,21
13
9
2-80
Xylooligo-95P
79,2
0,09
2
3
1-5
<sup>a</sup>AX=0,88 × (% арабиноза + % ксилоза)
<sup>b</sup>avDP<sub>HPSEC</sub> = MM<sub>HPSEC</sub>/132
<sup>c</sup> N.D. = не определялся
<sup>d</sup>AX<sub>cor </sub>= 0,88×(% арабиноза - 0,7 × % галактоза + % ксилоза)
<sup>e</sup>A/X<sub>cor</sub> = (% арабиноза - 0,7 Ч % галактоза)/% ксилоза
Таблица 2Концентрации различных препаратов, применяемых в тестах органолептических анализов
Концентрацияномер
AXOS-15-0,27 (г/л)
Xylooligo-95P (г/л)
Сахароза (г/л)
Натрия хлорид (мкг/л)
Аскорбиновая кислота (мкг/л)
8
71,5
64
32,4
800
96
7
35,7
32
16,2
400
48
6
17,9
16
8,1
200
24
5
8,9
8
4,0
100
12
4
4,5
4
2,0
50
6
3
2,2
2
1,0
25
3
2
1,1
1
0,5
12,5
1,5
1
0,5
0,5
0,25
6,25
0,75
Таблица 3Кажущаяся характеристическая вязкость (дл/г) 5% (вес/объем) растворов разных олигосахаридов
Таблица 4Ультрафильтрация препарата AXOS, при прохождении через отдельную мембрану с MMCO 5 кДа, 10 кДа или 30 кДа. Выход препарата выражен в % содержания арабиноксилана в исходном материале. Анализы включают отношение арабинозы к ксилозе (AIX) и среднюю степень полимеризации, определяемую с помощью газожидкостной хроматографии (avDPGG).
Фракция
Выход препарата
А/Х
avDP<sub>GS</sub>
AXOS до ультрафильтрации
100%
0,50
8
AXOS в пермеате с мембраны 5 кДа
11,2%
0,24
3
AXOS в ретентате с мембраны 5 кДа
86,1%
0,55
11
AXOS в пермеате с мембраны 10 кДа
34,2%
0,33
5
AXOS в ретентате с мембраны 10 кДа
64,8%
0,58
12
AXOS в пермеате с мембраны 30 кДа
52,4%
0,40
6
AXOS в ретентате с мембраны 30 кДа
45,7%
0,61
15
Таблица 5Ультрафильтрация препарата AXOS с помощью последовательного пропускания через мембраны 10 кДа и 30 кДа. Выход продукта выражен в % содержании арабиноксилана в исходном материале. Анализы включают отношение арабинозы к ксилозе (A/X) и среднюю степень полимеризации, определенную с помощью газожидкостной хроматографии (avDP<sub>GC</sub>).
Фракция
Выход продукта
А/Х
avDP<sub>GS</sub>
AXOS до ультрафильтрации
100%
0,50
8
AXOS после прохождения через 10 кДа мембрану (пермеат)
34,2%
0,33
5
AXOS после прохождения последовательно через 10 кДа мембрану (ретентат) и 30 кДа мембрану (пермеат)
25,2%
0,50
7
AXOS после прохождения последовательно через 10 кДа мембрану и 30 кДа мембрану (ретентат)
36,6%
0,65
18
Таблица 6Компоненты корма и композиционный анализ рациона цыплят, примененного во втором эксперименте на цыплятах.
Компоненты корма
%
Пшеница
40,72
Желтая кукуруза
17,00
Соевая мука-48
21,81
HF соевые бобы
10,00
RA жир
6,54
CaCO<sub>3</sub>
0,85
D-Ca-фосфат
1,08
NaCl
0,32
R фитаза
0,035
L лизин HCl
0,29
DL метионин
0,26
L треонин
0,10
Заранее приготовленная смесь витаминов и Tr. el.
1,00
Сумма
100,005
Композиция
Метаболизируемая энергия МДж/кг
12,30
Сырой протеин, %
21,00
d-лизин, %
1,15
d-SAA, %
0,80
d-треонин, %
0,75
Ca, %
0,95
Pav., %
0,45
Na+K-Cl, мэкв/кг
214
C 18:2, %
2,29
Таблица 7Композиционный анализ «основного гуманизированного рациона», применяемого в экспериментах на крысах.
Композиция
Метаболизируемая энергия (МДж/кг)
18,7
Сухое вещество, %
94,4
Сырой протеин, %
20,4
Сырой жир, %
19,2
Сырые волокна, %
1,4
Сырая зола, %
6,2
Чистые экстракты N, %
47,3
Крахмал, %
28,2
Сахароза, %
16,7
Кальций, %
0,94
Фосфор, %
0,70
Натрий, %
0,35
Магний, %
0,18
Калий, %
0,31
Хлор, %
0,5