КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ И/ИЛИ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ АМПЛИФИКАЦИИ ДНК

1. Выделенный праймерный олигонуклеотид, включающий в направлении от 5ʹ- к 3ʹ-концу,
i) первую область, имеющую самокомплементарную последовательность, содержащую в направлении от 5ʹ- к 3ʹ-концу обратный комплемент распознаваемой никирующим ферментом последовательности, палиндромную последовательность и указанную распознаваемую никирующим ферментом последовательность, и
ii) вторую область, состоящую из, по меньшей мере, 16 нуклеотидов, которая специфично связывается с комплементарной областью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты с образованием двухцепочечного гибрида, имеющего ΔG, которая, по меньшей мере, на 15 ккал/моль ниже, чем ΔG любой альтернативной структуры, включающей  вторую областью, где эта вторая область имеет на 3ʹ-конце один или несколько 2ʹ-модифицированных нуклеотидов.
2. Выделенный праймерный олигонуклеотид по п.1, где указанная палиндромная последовательность в первой области имеет длину 2, 4 или 6 нуклеотидов.
3. Выделенный праймерный олигонуклеотид по п.1 или 2, где первая область имеет длину 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов.
4. Выделенный праймерный олигонуклеотид по любому из пп.1-3, где вторая область имеет длину 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.
5. Выделенный праймерный олигонуклеотид по любому из пп.1-4, где первая область является полностью самокомплементарной.
6. Выделенный праймерный олигонуклеотид по любому из пп.1-5, где альтернативная структура представляет собой один или несколько частично двухцепочечных гибридов, которые вторая область может образовывать сама с собой, с частью последовательности первой области, с другими олигонуклеотидами, праймерами или зондами в реакции амплификаци или с частично комплементарными последовательностями нуклеиновых кислот за пределами области целевой последовательности.
7. Выделенный праймерный олигонуклеотид по любому из пп.1-6, в форме гомодимера, образованного путем гибридизации самокомплементарных последовательностей первой области двух молекул праймерных олигонуклеотидов.
8. Выделенный праймерный олигонуклеотид по п.7, где гомодимер имеет ΔG, которая, по меньшей мере, на 15 ккал/моль ниже, чем ΔG любой альтернативной структуры, включающей  праймерный олигонуклеотид.
2
2
2
9. Выделенный праймерный олигонуклеотид по любому из пп.1-8, где один или несколько 2ʹ-модифицированных нуклеотида имеют 2ʹ-модификацию, выбранную из группы, состоящей из 2ʹ-O-метил, 2ʹ-метоксиэтокси, 2ʹ-фтор, 2ʹ-гидроксил, 2ʹ-алкил, 2ʹ-аллил, 2ʹ-O-[2-(метиламино)-2-оксоэтил], 4ʹ-тио, 4ʹ-CH-O-2ʹ-мостик, 4ʹ-(CH)-O-2ʹ-мостик, 2ʹ-LNA и 2ʹ-O-(N-метилкарбамат), или модификаций, содержащих аналоги оснований.
10. Выделенный праймерный олигонуклеотид по любому из пп.1-9, где один или несколько 2ʹ-модифицированных нуклеотида расположены на 3ʹ-конце второй области.
11. Выделенный праймерный олигонуклеотид по п.9 или 10, где два или более 2ʹ-модифицированных нуклеотида являются смежными.
12. Выделенный праймерный олигонуклеотид по п.11, где количество смежных 2ʹ-модифицированных нуклеотидов составляет 4, 5 или 6.
13. Выделенный праймерный олигонуклеотид по любому из пп.1-12, где никирующий фермент представляет собой один или несколько из Nt.BspD6I и Nt.BsfNBI.
14. Выделенный праймерный олигонуклеотид по п.13, где распознаваемая никирующим ферментом последовательность в первой области представляет собой 5ʹ-GAGTC-3ʹ.
15. Выделенный праймерный олигонуклеотид по любому из пп.1-14, где распознаваемая никирующим ферментом последовательность расположена таким образом, чтобы происходило расщепление фосфодиэфирной связи между первой и второй областью.
16. Выделенный праймерный олигонуклеотид по любому из пп.1-15, имеющий первую область, включающую  нуклеотидную последовательность, приведенную ниже:
1
1ʹ
5ʹ-GACTCNNGAGTC-3ʹ;
1
1ʹ
5ʹ-GACTCNNGAGTCN-3ʹ;
2
1
1ʹ
2ʹ
5ʹ-NGACTCNNGAGTCN-3ʹ;
2
1
1ʹ
2ʹ
5ʹ-NGACTCNNGAGTCNN-3ʹ;
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
5ʹ-NNGACTCNNGAGTCNN-3ʹ;
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
5ʹ-NNGACTCNNGAGTCNNN-3ʹ;
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ-NNNGACTCNNGAGTCNNN-3ʹ;
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ-NNNGACTCNNGAGTCNNNN-3ʹ;
5
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ
5ʹ-NNNNGACTCNNGAGTCNNNN-3ʹ;
2
1
1ʹ
2ʹ
5ʹ-GACTCNNNNGAGTC-3ʹ;
2
1
1ʹ
2ʹ
5ʹ-GACTCNNNNGAGTCN-3ʹ;
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
5ʹ-NGACTCNNNNGAGTCN-3ʹ;
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
5ʹ-NGACTCNNNNGAGTCNN-3ʹ;
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ-NNGACTCNNNNGAGTCNN-3ʹ;
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ-NNGACTCNNNNGAGTCNNN-3ʹ;
5
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ
5ʹ-NNNGACTCNNNNGAGTCNNN-3ʹ;
5
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ
5ʹ- NNNGACTCNNNNGAGTCNNNN-3ʹ; и
6
5
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ
6ʹ
5ʹ-NNNNGACTCNNNNGAGTCNNNN-3ʹ,
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
5ʹ-GACTCNNNNNNGAGTC-3ʹ;
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
5ʹ-GACTCNNNNNNGAGTCN-3ʹ;
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
5ʹ-GACTCNNNNNNGAGTCNN-3ʹ;
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
5ʹ-GACTCNNNNNNGAGTCNNN-3ʹ;
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
5ʹ-GACTCNNNNNNGAGTCNNNN-3ʹ;
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ-NGACTCNNNNNNGAGTCN-3ʹ;
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ-NGACTCNNNNNNGAGTCNN-3ʹ;
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ-NGACTCNNNNNNGAGTCNNN-3ʹ;
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ-NGACTCNNNNNNGAGTCNNNN-3ʹ;
5
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ
5ʹ-NNGACTCNNNNNNGAGTCNN-3ʹ;
5
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ
5ʹ-NNGACTCNNNNNNGAGTCNNN-3ʹ;
6
5
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ
6ʹ
5ʹ-NNNGACTCNNNNNNGAGTCNNN-3ʹ;
6
5
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ
6ʹ
5ʹ- NNNGACTCNNNNNNGAGTCNNNN-3ʹ; и
7
6
5
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ
6ʹ
7ʹ
5ʹ-NNNNGACTCNNNNNNGAGTCNNNN-3ʹ,
1
1ʹ
2
2ʹ
3
3ʹ
4
4ʹ
5
5ʹ
6
6ʹ
7
7ʹ
где «N» представляет собой любой нуклеотид (например, имеющий в качестве нуклеотидного основания аденин (A), тимин (T), цитозин (C) или гуанин (G)), и N является комплементарным N, N - N, N - N, N - N, N - N, N - N и N - N.
17. Выделенный праймерный олигонуклеотид по любому из пп.1-16, где первая область содержит последовательность, приведенную в Списке последовательностей, прилагаемом к данному изобретению.
18. Выделенный праймерный димер, имеющий два олигонуклеотидных мономера, где олигонуклеотидный мономер включает  в направлении от 5ʹ- к 3ʹ-концу,
i) первую область, имеющую самокомплементарную последовательность, содержащую в направлении от 5ʹ- к 3ʹ-концу обратный комплемент распознаваемой никирующим ферментом последовательности, палиндромную последовательность и указанную распознаваемую никирующим ферментом последовательность, и
ii) вторую область, состоящую из, по меньшей мере, 16 нуклеотидов, которая специфично связывается с комплементарной областью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты с образованием двухцепочечного гибрида, имеющего ΔG, которая, по меньшей мере, на 15 ккал/моль ниже, чем ΔG любой альтернативной структуры, включающей  вторую областью, где эта вторая область имеет на 3ʹ-конце один или несколько 2ʹ-модифицированных нуклеотидов.
19. Выделенный праймерный димер по п.18, где указанная палиндромная последовательность в первой области имеет длину 2, 4 или 6 нуклеотидов.
20. Выделенный праймерный димер по п.18 или 19, где первая область имеет длину 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов.
21. Выделенный праймерный димер по любому из пп.18-20, где вторая область имеет длину 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.
22. Выделенный праймерный димер по любому из пп.18-21, где первая область является полностью самокомплементарной.
23. Выделенный праймерный димер по любому из пп.18-22, где альтернативная структура представляет собой один или несколько частично двухцепочечных гибридов, которые вторая область может образовывать сама с собой, с частью последовательности первой области, с другими олигонуклеотидами, праймерами или зондами в реакции амплификаци или с частично комплементарными последовательностями нуклеиновых кислот за пределами области целевой последовательности.
24. Выделенный праймерный димер по любому из пп.18-23, в форме гомодимера, образованного путем гибридизации самокомплементарных последовательностей первой области двух молекул праймерных олигонуклеотидов.
25. Выделенный праймерный димер по п.24, где гомодимер имеет ΔG, которая, по меньшей мере, на 15 ккал/моль ниже, чем ΔG любой альтернативной структуры, включающей  олигонуклеотидный мономер.
2
2
2
26. Выделенный праймерный димер по любому из пп.18-25, где один или несколько 2ʹ-модифицированных нуклеотида имеют 2ʹ-модификацию, выбранную из группы, состоящей из 2ʹ-O-метил, 2ʹ-метоксиэтокси, 2ʹ-фтор, 2ʹ-гидроксил, 2ʹ-алкил, 2ʹ-аллил, 2ʹ-O-[2-(метиламино)-2-оксоэтил], 4ʹ-тио, 4ʹ-CH-O-2ʹ-мостик, 4ʹ-(CH)-O-2ʹ-мостик, 2ʹ-LNA и 2ʹ-O-(N-метилкарбамат), или модификаций, содержащих аналоги оснований.
27. Выделенный праймерный димер по любому из пп.18-26, где один или несколько 2ʹ-модифицированных нуклеотида расположены на 3ʹ-конце второй области.
28. Выделенный праймерный димер по п.26 или 27, где два или более 2ʹ-модифицированных нуклеотида являются смежными.
29. Выделенный праймерный димер по п.28, где количество смежных 2ʹ-модифицированных нуклеотидов составляет 4, 5 или 6.
30. Выделенный праймерный димер по любому из пп.18-29, где никирующий фермент представляет собой один или несколько из Nt.BspD6I и Nt.BsfNBI.
31. Выделенный праймерный димер по п.30, где распознаваемая никирующим ферментом последовательность в первой области представляет собой 5ʹ-GAGTC-3ʹ.
32. Выделенный праймерный димер по любому из пп.18-31, где распознаваемая никирующим ферментом последовательность расположена таким образом, чтобы происходило расщепление фосфодиэфирной связи между первой и второй областью.
33. Выделенный праймерный димер по любому из пп.18-32, где олигонуклеотидный мономер имеет первую область, включающую  нуклеотидную последовательность, приведенную ниже:
1
1ʹ
5ʹ-GACTCNNGAGTC-3ʹ;
1
1ʹ
5ʹ-GACTCNNGAGTCN-3ʹ;
2
1
1ʹ
2ʹ
5ʹ-NGACTCNNGAGTCN-3ʹ;
2
1
1ʹ
2ʹ
5ʹ-NGACTCNNGAGTCNN-3ʹ;
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
5ʹ-NNGACTCNNGAGTCNN-3ʹ;
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
5ʹ-NNGACTCNNGAGTCNNN-3ʹ;
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ-NNNGACTCNNGAGTCNNN-3ʹ;
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ-NNNGACTCNNGAGTCNNNN-3ʹ;
5
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ
5ʹ-NNNNGACTCNNGAGTCNNNN-3ʹ;
2
1
1ʹ
2ʹ
5ʹ-GACTCNNNNGAGTC-3ʹ;
2
1
1ʹ
2ʹ
5ʹ-GACTCNNNNGAGTCN-3ʹ;
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
5ʹ-NGACTCNNNNGAGTCN-3ʹ;
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
5ʹ-NGACTCNNNNGAGTCNN-3ʹ;
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ-NNGACTCNNNNGAGTCNN-3ʹ;
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ-NNGACTCNNNNGAGTCNNN-3ʹ;
5
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ
5ʹ-NNNGACTCNNNNGAGTCNNN-3ʹ;
5
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ
5ʹ- NNNGACTCNNNNGAGTCNNNN-3ʹ; и
6
5
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ
6ʹ
5ʹ-NNNNGACTCNNNNGAGTCNNNN-3ʹ,
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
5ʹ-GACTCNNNNNNGAGTC-3ʹ;
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
5ʹ-GACTCNNNNNNGAGTCN-3ʹ;
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
5ʹ-GACTCNNNNNNGAGTCNN-3ʹ;
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
5ʹ-GACTCNNNNNNGAGTCNNN-3ʹ;
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
5ʹ-GACTCNNNNNNGAGTCNNNN-3ʹ;
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ-NGACTCNNNNNNGAGTCN-3ʹ;
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ-NGACTCNNNNNNGAGTCNN-3ʹ;
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ-NGACTCNNNNNNGAGTCNNN-3ʹ;
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ-NGACTCNNNNNNGAGTCNNNN-3ʹ;
5
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ
5ʹ-NNGACTCNNNNNNGAGTCNN-3ʹ;
5
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ
5ʹ-NNGACTCNNNNNNGAGTCNNN-3ʹ;
6
5
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ
6ʹ
5ʹ-NNNGACTCNNNNNNGAGTCNNN-3ʹ;
6
5
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ
6ʹ
5ʹ- NNNGACTCNNNNNNGAGTCNNNN-3ʹ; и
7
6
5
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ
6ʹ
7ʹ
5ʹ-NNNNGACTCNNNNNNGAGTCNNNN-3ʹ,
1
1ʹ
2
2ʹ
3
3ʹ
4
4ʹ
5
5ʹ
6
6ʹ
7
7ʹ
где «N» представляет собой любой нуклеотид (например, имеющий в качестве нуклеотидного основания аденин (A), тимин (T), цитозин (C) или гуанин (G)), и N является комплементарным N, N - N, N - N, N - N, N - N, N - N и N - N.
34. Выделенный праймерный димер по любому из пп.18-33, где олигонуклеотидный мономер содержит первую область, включающую  последовательность, приведенную в Списке последовательностей, прилагаемом к данному изобретению.
35. Выделенный олигонуклеотидный зонд для обнаружения целевой молекулы нуклеиновой кислоты, содержащий:
i) олигонуклеотид;
ii) флуоресцентный репортер; и
iii) молекулу-гаситель, способную поглощать энергию возбуждения от флуоресцентного репортера;
где флуоресцентный репортер и молекула-гаситель ковалентно связаны с противоположными 5ʹ- и 3ʹ-концами олигонуклеотида,
где олигонуклеотид включает  первую область, имеющую нуклеотидную последовательность, которая в значительной степени комплементарна последовательности целевой нуклеиновой кислоты, и
a) вторую область перед 5ʹ-концом первой области, и
b) третью область после 3ʹ-конца первой области, которая имеет нуклеотидную последовательность, комплементарную второй области,
где этот олигонуклеотид способен образовывать шпилечную структуру «петля-на-стебле» путем гибридизации второй и третьей областей, когда олигонуклеотид не связан с целевой молекулой нуклеиновой кислоты, и
где ΔG двухцепочечного гибрида между целевой последовательностью и первой последовательностью олигонуклеотидного зонда, по меньшей мере, на 15 ккал/моль ниже, чем ΔG любой альтернативной структуры, включающей  олигонуклеотидный зонд.
36. Выделенный олигонуклеотидный зонд по п.35, где альтернативная структура представляет собой один или несколько частично двухцепочечных гибридов, которые первая область может образовывать сама с собой, с частью последовательности первой области, с другими олигонуклеотидами, праймерами или зондами в реакции амплификаци или с частично комплементарными последовательностями нуклеиновых кислот за пределами области целевой последовательности.
37. Выделенный олигонуклеотидный зонд по п.35 или 36, где вторя и третья области имеют длину 4-8 нуклеотидов.
38. Способ амплификации специфичного продукта в реакции амплификации с внесением одноцепочечного разрыва и достройкой, данный способ включает:
(a) приведение в практически изотермических условиях целевой молекулы нуклеиновой кислоты в контакт с полимеразой, двумя или несколькими праймерами, каждый из которых специфично связывается с комплементарной последовательностью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты, никирующим ферментом и обнаруживаемым полинуклеотидным зондом, где, по меньшей мере, один праймер включает  в направлении от 5ʹ- к 3ʹ-концу,
i) первую область, имеющую самокомплементарную последовательность, содержащую в направлении от 5ʹ- к 3ʹ-концу обратный комплемент распознаваемой никирующим ферментом последовательности, палиндромную последовательность и указанную распознаваемую никирующим ферментом последовательность, и
ii) вторую область, состоящую из, по меньшей мере, 16 нуклеотидов, которая специфично связывается с комплементарной областью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты с образованием двухцепочечного гибрида, имеющего ΔG, которая, по меньшей мере, на 15 ккал/моль ниже, чем ΔG любой альтернативной структуры, включающей  вторую область, где эта вторая область имеет на 3ʹ-конце один или несколько 2ʹ-модифицированных нуклеотидов; и
(b) получение ампликонов, содержащих, по меньшей мере, часть целевой молекулы нуклеиновой кислоты.
39. Способ обнаружения специфичного продукта в реакции амплификации с внесением одноцепочечного разрыва и достройкой, данный способ включает:
(a) приведение в практически изотермических условиях целевой молекулы нуклеиновой кислоты в контакт с полимеразой, двумя или несколькими праймерами, каждый из которых специфично связывается с комплементарной последовательностью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты, никирующим ферментом и обнаруживаемым полинуклеотидным зондом, где, по меньшей мере, один праймер включает  в направлении от 5ʹ- к 3ʹ-концу,
i) первую область, имеющую самокомплементарную последовательность, содержащую в направлении от 5ʹ- к 3ʹ-концу обратный комплемент распознаваемой никирующим ферментом последовательности, палиндромную последовательность и указанную распознаваемую никирующим ферментом последовательность, и
ii) вторую область, состоящую из, по меньшей мере, 16 нуклеотидов, которая специфично связывается с комплементарной областью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты с образованием двухцепочечного гибрида, имеющего ΔG, которая, по меньшей мере, на 15 ккал/моль ниже, чем ΔG любой альтернативной структуры, включающей  вторую область, где эта вторая область имеет на 3ʹ-конце один или несколько 2ʹ-модифицированных нуклеотидов;
(b) получение ампликонов, содержащих, по меньшей мере, часть целевой молекулы нуклеиновой кислоты; и
(c) обнаружение сигнала, специфичного для гибридизации олигонуклеотидного зонда с целевой молекулой нуклеиновой кислоты или ее ампликоном, где этот сигнал указывает на наличие целевой молекулы нуклеиновой кислоты, присутствующей в образце, или ее ампликона.
40. Способ по п.39, где олигонуклеотидный зонд содержит:
i) олигонуклеотид;
ii) флуоресцентный репортер; и
iii) молекулу-гаситель, способную поглощать энергию возбуждения от флуоресцентного репортера;
где флуоресцентный репортер и молекула-гаситель ковалентно связаны с противоположными 5ʹ- и 3ʹ-концами олигонуклеотида,
где олигонуклеотид включает  первую область, имеющую нуклеотидную последовательность, которая в значительной степени комплементарна последовательности целевой нуклеиновой кислоты, и
a) вторую область перед 5ʹ-концом первой области, и
b) третью область после 3ʹ-конца первой области, которая имеет нуклеотидную последовательность, комплементарную второй области,
где этот олигонуклеотид способен образовывать шпилечную структуру «петля-на-стебле» путем гибридизации второй и третьей областей, когда олигонуклеотид не связан с целевой молекулой нуклеиновой кислоты.
Geobacillus
Bacillus stearothermophilus
41. Способ по любому из пп.38-40, где полимераза представляет собой ДНК-полимеразу I из  spp. или  или ее активные фрагменты и производные.
42. Способ по п.41, где полимераза представляет собой один или несколько из следующих ферментов: Bst ДНК-полимераза I, Gst ДНК-полимераза I или Gka ДНК-полимераза I.
43. Способ по п.42, где указанная палиндромная последовательность в первой области имеет длину 2, 4 или 6 нуклеотидов.
44. Способ по любому из пп.38-43, где первая область имеет длину 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов.
45. Способ по любому из пп.38-44, где вторая область имеет длину 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.
46. Способ по любому из пп.38-45, где первая область является полностью самокомплементарной.
47. Способ по любому из пп.38-46, где альтернативная структура представляет собой один или несколько частично двухцепочечных гибридов, которые вторая область может образовывать сама с собой, с частью последовательности первой области, с другими олигонуклеотидами, праймерами или зондами в реакции амплификаци или с частично комплементарными последовательностями нуклеиновых кислот за пределами области целевой последовательности.
48. Способ по любому из пп.38-47, в форме гомодимера, образованного путем гибридизации самокомплементарных последовательностей первой области двух молекул праймерных олигонуклеотидов.
49. Способ по п.48, где гомодимер имеет ΔG, которая, по меньшей мере, на 15 ккал/моль ниже, чем ΔG любой альтернативной структуры, включающей  праймерный олигонуклеотид.
2
2
2
50. Способ по любому из пп.38-49, где один или несколько 2ʹ-модифицированных нуклеотида имеют 2ʹ-модификацию, выбранную из группы, состоящей из 2ʹ-O-метил, 2ʹ-метоксиэтокси, 2ʹ-фтор, 2ʹ-гидроксил, 2ʹ-алкил, 2ʹ-аллил, 2ʹ-O-[2-(метиламино)-2-оксоэтил], 4ʹ-тио, 4ʹ-CH-O-2ʹ-мостик, 4ʹ-(CH)-O-2ʹ-мостик, 2ʹ-LNA и 2ʹ-O-(N-метилкарбамат), или модификаций, содержащих аналоги оснований.
51. Способ по любому из пп.38-50, где один или несколько 2ʹ-модифицированных нуклеотида расположены на 3ʹ-конце второй области.
52. Способ по п.38 или 51, где два или более 2ʹ-модифицированных нуклеотида являются смежными.
53. Способ по п.52, где количество смежных 2ʹ-модифицированных нуклеотидов составляет 4, 5 или 6.
54. Способ по любому из пп.38-53, где никирующий фермент представляет собой один или несколько из Nt.BspD6I и Nt.BsfNBI.
55. Способ по п.54, где распознаваемая никирующим ферментом последовательность в первой области представляет собой 5ʹ-GAGTC-3ʹ.
56. Способ по любому из пп.38-55, где распознаваемая никирующим ферментом последовательность расположена таким образом, чтобы происходило расщепление фосфодиэфирной связи между первой и второй областью.
57. Способ по любому из пп.38-56, где праймер имеет первую область, включающую нуклеотидную последовательность, приведенную ниже:
1
1ʹ
5ʹ-GACTCNNGAGTC-3ʹ;
1
1ʹ
5ʹ-GACTCNNGAGTCN-3ʹ;
2
1
1ʹ
2ʹ
5ʹ-NGACTCNNGAGTCN-3ʹ;
2
1
1ʹ
2ʹ
5ʹ-NGACTCNNGAGTCNN-3ʹ;
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
5ʹ-NNGACTCNNGAGTCNN-3ʹ;
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
5ʹ-NNGACTCNNGAGTCNNN-3ʹ;
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ-NNNGACTCNNGAGTCNNN-3ʹ;
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ-NNNGACTCNNGAGTCNNNN-3ʹ;
5
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ
5ʹ-NNNNGACTCNNGAGTCNNNN-3ʹ;
2
1
1ʹ
2ʹ
5ʹ-GACTCNNNNGAGTC-3ʹ;
2
1
1ʹ
2ʹ
5ʹ-GACTCNNNNGAGTCN-3ʹ;
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
5ʹ-NGACTCNNNNGAGTCN-3ʹ;
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
5ʹ-NGACTCNNNNGAGTCNN-3ʹ;
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ-NNGACTCNNNNGAGTCNN-3ʹ;
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ-NNGACTCNNNNGAGTCNNN-3ʹ;
5
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ
5ʹ-NNNGACTCNNNNGAGTCNNN-3ʹ;
5
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ
5ʹ- NNNGACTCNNNNGAGTCNNNN-3ʹ; и
6
5
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ
6ʹ
5ʹ-NNNNGACTCNNNNGAGTCNNNN-3ʹ,
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
5ʹ-GACTCNNNNNNGAGTC-3ʹ;
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
5ʹ-GACTCNNNNNNGAGTCN-3ʹ;
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
5ʹ-GACTCNNNNNNGAGTCNN-3ʹ;
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
5ʹ-GACTCNNNNNNGAGTCNNN-3ʹ;
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
5ʹ-GACTCNNNNNNGAGTCNNNN-3ʹ;
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ-NGACTCNNNNNNGAGTCN-3ʹ;
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ-NGACTCNNNNNNGAGTCNN-3ʹ;
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ-NGACTCNNNNNNGAGTCNNN-3ʹ;
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ-NGACTCNNNNNNGAGTCNNNN-3ʹ;
5
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ
5ʹ-NNGACTCNNNNNNGAGTCNN-3ʹ;
5
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ
5ʹ-NNGACTCNNNNNNGAGTCNNN-3ʹ;
6
5
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ
6ʹ
5ʹ-NNNGACTCNNNNNNGAGTCNNN-3ʹ;
6
5
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ
6ʹ
5ʹ- NNNGACTCNNNNNNGAGTCNNNN-3ʹ; и
7
6
5
4
3
2
1
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ
6ʹ
7ʹ
5ʹ-NNNNGACTCNNNNNNGAGTCNNNN-3ʹ,
1
1ʹ
2
2ʹ
3
3ʹ
4
4ʹ
5
5ʹ
6
6ʹ
7
7ʹ
где «N» представляет собой любой нуклеотид (например, имеющий в качестве нуклеотидного основания аденин (A), тимин (T), цитозин (C) или гуанин (G)), и N является комплементарным N, N - N, N - N, N - N, N - N, N - N и N - N.
58. Способ по любому из пп.38-57, где праймер включает  первую область, содержащую последовательность, приведенную в Списке последовательностей, прилагаемом к данному изобретению.
59. Набор реагентов для амплификации целевой последовательности в реакции амплификации с внесением одноцепочечного разрыва и достройкой, данный набор реагентов содержит один или несколько праймерных олигонуклеотида, включающих  в направлении от 5ʹ- к 3ʹ-концу,
i) первую область, имеющую самокомплементарную последовательность, содержащую в направлении от 5ʹ- к 3ʹ-концу обратный комплемент распознаваемой никирующим ферментом последовательности, палиндромную последовательность и указанную распознаваемую никирующим ферментом последовательность, и
ii) вторую область, состоящую из, по меньшей мере, 16 нуклеотидов, которая специфично связывается с комплементарной областью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты с образованием двухцепочечного гибрида, имеющего ΔG, которая, по меньшей мере, на 15 ккал/моль ниже, чем ΔG любой альтернативной структуры, включающей  вторую область, где эта вторая область имеет на 3ʹ-конце один или несколько 2ʹ-модифицированных нуклеотидов; и
указания по использованию этих праймерных олигонуклеотидов в способах по любому из пп.38-58.
60. Набор реагентов по п.59, дополнительно включающий  олигонуклеотидный зонд, содержащий:
i) олигонуклеотид;
ii) флуоресцентный репортер; и
iii) молекулу-гаситель, способную поглощать энергию возбуждения от флуоресцентного репортера;
где флуоресцентный репортер и молекула-гаситель ковалентно связаны с противоположными 5ʹ- и 3ʹ-концами олигонуклеотида,
где олигонуклеотид включает  первую область, имеющую нуклеотидную последовательность, которая в значительной степени комплементарна последовательности целевой нуклеиновой кислоты, и
a) вторую область перед 5ʹ-концом первой области, и
b) третью область после 3ʹ-конца первой области, которая имеет нуклеотидную последовательность, комплементарную второй области,
где этот олигонуклеотид способен образовывать шпилечную структуру «петля-на-стебле» путем гибридизации второй и третьей областей, когда олигонуклеотид не связан с целевой молекулой нуклеиновой кислоты;
и указания по использованию этих праймерных олигонуклеотидов в способах по любому из пп.38-58.
61. Материальный, энергонезависимый, машиночитаемый носитель, содержащий: инструкций для компьютерной программы для реализации способа выбора праймерного олигонуклеотида, праймерный олигонуклеотид включает:
i) первую область, имеющую самокомплементарную последовательность, содержащую в направлении от 5ʹ- к 3ʹ-концу обратный комплемент распознаваемой никирующим ферментом последовательности, палиндромную последовательность и указанную распознаваемую никирующим ферментом последовательность, и
ii) вторую область, состоящую из, по меньшей мере, 16 нуклеотидов, которая специфично связывается с комплементарной областью в целевой молекуле нуклеиновой кислоты;
способ включает:
a) выбор второй области указанного праймерного олигонуклеотида, где ΔG двухцепочечного гибрида, образованного путем гибридизации второй области и целевой молекулы нуклеиновой кислоты, по меньшей мере, на 15 ккал/моль ниже, чем ΔG любой альтернативной структуры, включающей  вторую область;
b) выбор первой области указанного праймерного олигонуклеотида, где ΔG гомодимера, образованного путем гибридизации самокомплементарных последовательностей первой области двух молекул праймерного олигонуклеотида, по меньшей мере, на 15 ккал/моль ниже, чем ΔG любой альтернативной структуры, включающей  праймерный олигонуклеотид.