СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ АЛЛЕРГЕНА ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ПАРААЛЛЕРГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА НА ППД ТУБЕРКУЛИН ДЛЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
METHOD OF MANUFACTURING ALLERGEN FOR DIFFERENTIAL DIAGNOSTICS OF PARA-ALLERGIC REACTIONS IN CATTLE TO PPD TUBERCULIN FOR MAMMALS

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, в частности к способу изготовления аллергена для диагностики парааллергических реакций на туберкулез в симультанной пробе с ППД туберкулином для млекопитающих.
Общепринятым способом диагностики туберкулеза крупного рогатого скота является внутрикожная проба с применением ППД туберкулина.
Одна из самых важных проблем при этой диагностике - появление неспецифических реакций на туберкулин.
Массовые выявления неспецифических реакций на туберкулин приводят к убою большого количества здоровых животных, что увеличивает размеры экономического ущерба и вызывает сомнения в правильности диагностики туберкулеза известным способом.
В связи с широким распространением неспецифических (парааллергических) реакций на туберкулин в разные годы многими авторами были предложены различные способы дифференциации этих реакций.
Многочисленными исследованиями отечественных и зарубежных авторов установлено, что основной причиной проявления неспецифических реакций у крупного рогатого скота на туберкулин является сенсибилизация микобактериями: М. avium, М. paratuberculosis и быстрорастущими атипичными микобактериями, широко распространенными в окружающей среде (1, 2, 4).
В нашей стране для дифференциации неспецифических реакций с 1978 года использовалась симультанная проба с применением ППД туберкулина для млекопитающих и комплексного аллергена из атипичных микобактерий (КАМ), а с 2002 года применяется и симультанная проба с ППД туберкулином для млекопитающих и ППД туберкулином для птиц.
Известен способ изготовления комплексного аллергена из атипичных микобактерий (КАМ), включающий выращивание микобактерий М. scrofulaceum №12-C и М. intracellulare №13-H на жидкой питательной среде при 37-38°C, инактивацию культур автоклавированием при температуре 120°C в течение 30 минут, осаждение белка из культурального фильтрата трихлоруксусной кислотой и переосаждение его сернокислым аммонием с последующим диализом через целлофановую оболочку для удаления сульфатов. Содержание единиц действия (ЕД) в 1 мл раствора белка каждого вида этих микобактерий определяли на морских свинках, сенсибилизированных гомологичными микобактериями в сравнении с референтными сериями этих препаратов с известной активностью. Полученные моноаллергены смешивали в равных количествах по содержанию единиц действия (1).
Известен также способ получения аллергена, заключающийся в следующем: выращивание культур атипичных микобактерий М. scrofulaceum, М. intracellulare, М. fortuitum и М. smegmatis проводили раздельно на жидкой питательной среде Сотона при температуре 37-38°C в течение 2-3 недель, далее инактивировали культуры автоклавированием при 120°C в течение 30 минут, осаждали белок из культурального фильтрата каждого штамма в отдельности трихлоруксусной кислотой до конечной 4% концентрации, переосаждали белок сернокислым аммонием при 50%-ном насыщении с последующим диализом раствора белка через целлофановую оболочку против обессоленной воды для удаления сульфатов, затем определяли концентрации белка в растворах каждого штамма и активности по содержанию единиц действия (ЕД) на сенсибилизированных различными видами микобактерий морских свинках и смешивали растворы белка в равных долях по содержанию ЕД, стерильно фильтровали, расфасовывали и лиофилизировали (Прототип).
В задачу наших исследований входило упрощение способа, сокращение времени на его проведение и получение препарата в нативном состоянии.
Этого удается достичь благодаря тому, что при изготовлении комплексного аллергена (КАМ) для раздельного осаждения белков из культурального фильтрата берут трихлоуксусную кислоту до конечной концентрации 6-8%, оставляют раствор белка на 12-20 часов при температуре +4-6°C, центрифугируют при 4-6 тыс.об/мин. в течение 30 минут, растворяют в дистиллированной воде с pH 7,0-8,0 и полученный раствор белка ставят на диализ через целлофановую пленку против обессоленной воды на 12-24 часа, после чего добавляют 0,2-0,3% фенола для стабилизации, фильтруют стерильно и расфасовывают препарат в нативном состоянии.
Предложенный способ получения аллергена заключается в следующем: выращивание культур атипичных микобактерий М. scrofulaceum, М. intracellular, М. fortuitum и М. smegmatis проводят раздельно на жидкой питательной среде Сотона при температуре 37-38°C в течение 4-6 недель, инактивируют культуры автоклавированием при 120°C в течение 40-60 минут, осаждают белок из культурального фильтрата в отдельности трихлоруксусной кислотой до конечной концентрации 6-8%, оставляют на 12-20 часов при температуре +4-6°C, центрифугируют при 4-6 тыс.об/мин в течение 30 мин, полученный белок растворяют в дистиллированной воде с pH 7,0-8,0, разливают в целлофановые трубки и ставят на диализ против обессоленной воды для удаления солей, остатков кислоты на 12-24 часа, проводят стерилизующую фильтрацию, определяют концентрацию белка, содержание единиц действия (ЕД) в 1 мл раствора белка, полученного из каждого штамма микобактерий с последующей подтитровкой концентрации на сенсибилизированных гомологичными видами микобактерий морских свинках в сравнении с референтными сериями этих препаратов с известной активностью, далее смешивают растворы белка в равных долях по содержанию ЕД, добавляют 0,2-0,3% фенола для стабилизации, стерильно фильтруют и расфасовывают в нативном состоянии.
Предложенный способ получения аллергена позволяет сократить длительность изготовления препарата за счет исключения переосаждения белков сернокислым аммонием (2 суток), сократить длительность диализа до одних суток, исключить процесс лиофилизации препарата, так как препарат расфасовывается в нативном состоянии.
Аллерген, полученный предложенным способом, апробирован нами с положительными результатами в лабораторных условиях на сенсибилизированных различными атипичными микобактериями, М. avium и БЦЖ морских свинках (65 гол.) и на крупном рогатом скоте благополучных по туберкулезу хозяйств Волгоградской, Ярославской, Рязанской областей (675 гол.).
Ниже приводятся конкретные примеры осуществления заявляемого способа.
Таблица 1
Результаты испытаний различных моноаллергенов на сенсибилизированных атипичными микобактериями морских свинках
Аллерген, кол-во белка в 0,1 мл испыт. раст-ра
Интенсивность реакций животных на гомолог. моноаллергены (мм)
СенсибилизацияM. intracellulare
Сенсибилизац.М. scrofulaceum
СенсибилизацияM. fortuitum
СенсибилизацияМ. smegmatis
Аллерген Intracellulare
14,3±1,22
4,8±0,42
8,5±0,95
8,1±0,94
Аллерген Scrofulaceum
7,1±0,65
19,3±1,45
6,3±0,34
7,4±0,96
Аллерген Fortuitum
7,6±1,23
5,2±0,96
15,7±1,53
9,5±1,65
Аллерген Smegmatis
6,3±0,67
5,8±0,96
12,4±2,3
21,2±2,14
КАМ производств.
3,4±0,95
3,2±0,66
5,8±0,96
6,2±0,97
Прототип
6,8±0,97
13±0,88
7,5±0,96
14,3±1,05
Таблица 2
Результаты испытаний различных аллергенов (контроля, прототипа и заявляемого) на сенсибилизированных атипичными микобактериями морских свинках
Аллерген
Интенсивность реакций животных на гомолог. моноаллергены (мм)
СенсибилизацияM. intracellulare
Сенсибилизац.M. scrofulaceum
СенсибилизацияM. fortuitum
СенсибилизацияM. smegmatis
ППД туберкулин для млекопит.
4,1±0,76
3,8±0,33
2,5±0,46
4,1±0,43
Производственный КАМ
15,3±1,34
14,4±0,88
8,4±1,03
9,6±1,97
Прототип
17,0±2,05
15,1±1,74
16,4±2,05
16,2±1,86
Испытуемый аллерген
16,7±1,22
15,8±2,05
17,2±1,55
16,8±2,35
Примеры испытания в производственных условиях на КРС.
Пример 1. Исследовали 256 коров благополучного хозяйства по туберкулезу (СПК им. Кирова, Старополтавский р-н, Волгоградская обл.) внутрикожной пробой симультанно ППД туберкулина для млекопитающих, КАМ, прототип и заявляемый аллерген. Препараты вводили в дозе 0,2 мл каждого в область шеи (с правой стороны ППД и КАМ, а с левой - 2 последние). Учет и оценку реакций делали через 72 часа после введения препаратов. У 16 голов реакции были выражены сильнее на ППД туберкулин, на КАМ - 29, и с левой стороны шеи на оба препарата реакции были ярко выражены у 33 голов. Общее число реагирующих животных (16+33) равно 49 (показатель А). По таблице определения достоверности различий находили цифру 49, которая равна 34 (показатель Б), что указывает на достоверность различий в реакциях (94,5%), т.е. животные данных групп сенсибилизированы атипичными микобактериями, что в дальнейшем было подтверждено бактериологическими исследованиями.
Аналогичные испытания препаратов в той же последовательности были проведены на 250 головах КРС (ОАО ПЗ им. Дзержинского, Ярославского р-на, Ярославской обл.) и на 169 коровах (колхоз «Заветы Ильича», Касимовский р-н, Рязанская обл.) и везде подтверждена сенсибилизация животных атипичными микобактериями. Результаты симультанной пробы были подтверждены бактериологическими исследованиями, т.е. наличие туберкулеза у животных вышеперечисленных хозяйств исключено.
Анализ данных, полученных при сравнительном испытании заявляемого аллергена, прототипа и производственного КАМ показал, что заявляемый аллерген обладает большей чувствительностью, чем производственный КАМ, и одинаковой чувствительностью с прототипом как при испытании на сенсибилизированных морских свинках, так и в производственных условиях на крупном рогатом скоте.
Предложенный способ получения аллергена найдет применение в биологической промышленности и животноводческих хозяйствах, позволяя сократить сроки изготовления комплексного аллергена из атипичных микобактерий (КАМ), повысить качество дифференциальной диагностики на ППД туберкулин для млекопитающих и уменьшить экономический ущерб от вынужденного убоя реагирующих на ППД туберкулин животных.
Источники информации
1. Дис … док. вет. наук. Аллергическая диагностика туберкулеза у животных: повышение их эффективности / Шаров А.Н, Москва. - 1989. - С.75. (Аналог).
2. Патент на изобретение №2443428, Российской Федерации, A61K 39/04 (2012) и A61K 39/35 (2012). Способ изготовления аллергена для дифференциальной диагностики парааллергических реакций у крупного рогатого скота на ППД туберкулин для млекопитающих (Гулюкин М.И. и др.)
3. Ж. Ветеринария.- 1978 - №4. - С.35-38.
4. Сбор. науч. трудов ВГНКИ. - М., 1985, С.3-9