Использование ДНК-маркеров для генотипирования инбредных линий лабораторных мышей

&_________________

КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ

БИОМЕДИЦИНА • № 6 2007, с. 149-152

Использование ДНК-маркеров для генотипирования инбредных линий лабораторных мышей

В.В. Мартынов, |А.М. Малашенко, В.Н. Каркищенко, Т.Б. Бескова

Научный центр биомедицинских технологий РАМН, Москва

Применение ISSR-ПЦР и RAPD-ПЦР ДНК маркеров для изучения генетического полиморфизма мышей пяти инбредных линий позволило выявить уникальный генетический профиль каждой исследованной линии. Полученные данные могут быть использованы в дальнейшем для создания «ДНК-паспортов» инбредных линий лабораторных мышей, а также для контроля генетической однородности этих линий.

Ключевые слова: Мыши, полиморфизм, генетический профиль, ДНК-маркеры.

Введение

Лабораторные мыши Mus musculus являются наиболее востребованным видом лабораторных животных. Их используют для проведения исследований в области онкологии, токсикологии, вирусологии, иммунологии, трансплантологии, физиологии, сравнительной генетики и многих других областях биологии и экспериментальной медицины [1]. Очевидно, что для решения таких разнохарактерных по сути своей задач, необходимо иметь животных с определенными биологическими особенностями — для каждой задачи своими. Выведение инбредных линий позволило получить таких животных. Основным достоинством инбредной линии является то, что все животные внутри этой линии гомозиготны и однородны по генотипу. Использование инбредных животных в эксперименте позволяет получать воспроизводимые результаты и повышает эффективность и надежность биологических исследований.

Генетическая однородность животных в пределах одной инбредной линии поддерживается путем применения специальной методики разведения таких линий [1]. Но даже при тщательном соблюдении всех правил, при разведении инбредных

животных существует опасность нарушения гомозиготности. Причиной этого могут быть спонтанные мутации или случайные скрещивания (генетическая контаминация) [1, 3]. И если мутации приводят к образованию новых линий или сублинейной дивергенции, то случайное скрещивание ведет к необратимой потере гомозиготности, то есть к потере инбредно-го статуса и соответствующих фенотипических качеств каждого отдельно взятого животного. Опасность генетической контаминации особенно велика, когда в одном помещении содержатся несколько линий с одинаковой окраской шерсти.

Эффективным инструментом контроля генетической однородности мышей ин-бредных линий являются ДНК-маркеры, основанные на методе полимеразной цепной реакции (ПЦР) [2, 4-8]. Основными преимуществами таких маркеров является их высокая степень диспергированности по геному, независимость от возраста и физиологического состояния животного, а также простота, надежность и воспроизводимость лабораторных манипуляций, необходимых для выявления таких маркеров. В своем исследовании, направленном на создание генетических стандартов инбредных линий, мы использовали ДНК- маркеры двух типов: Inter-simple sequence repeat (ISSR) —

ПЦР и Randomly amplified polymorphic DNA

Рис. Электрофоретический спектр продуктов амплификации геномной ДНК мышей пяти инбредных линий с праймером 3.

1 - ВД_В/с; 2 - РВД/2; 3 - ОВД; 4 - С57В1_/6; 6 -С57В_/10-6РР. Стрелками 1, 7 обозначены мономорфные зоны, стрелками 2-6 -полиморфные зоны.

Материалы и методы

Выделение ДНК. Геномную ДНК выделяли из печени трехнедельных самок мышей линий BALB/cLacY (BALB/c), DBA/2 JY (DBA/2), CBA/LacY (CBA), C57BL/6 JY (C57BL/6) и C57BL/10-GFP (C57BL/10) из коллекционного фонда лабораторных мышей НЦБМТ РАМН при помощи набора Diatom DNA Prep 100 (ООО «Компания Биоком», Россия) по инструкции фирмы-производителя.

Амплификация ДНК. Для амплификации геномной ДНК использовали следующие праймеры: (1)-САСАСАСАСАСА-САСА(О/А)О, (2)-САСАСАСАСАСАСАСА (О/А)(С/Т), (3)-АОСАОСАОСАОС(С/Т) и (4)-ОАСТСааТАТСО. Полимеразную цепную реакцию проводили в термоциклере Терцик («ДНК-технология», Россия). Реакционная смесь объемом 25мкл содержала: 50 нг геномной ДНК, 0.2 мкл Taq ДНК-по-лимеразы (5 ед/мкл) («БегтеПаБ», Литва), 2.5 мкл 10х буфера («БегтейаБ»), 2 мкл 25 мМ MgCL2, 2.5 мкл 2.5 мМ раствора каждого из четырех дезоксинуклеотидфосфатов и 20 пМ каждого праймера. Протокол амплификации включал: 1 цикл продолжительностью 7 мин денатурации при 95°С; 35 циклов по 45 сек при 94°С для денатурации цепей ДНК, 45 сек при 64°С для отжига праймеров (1) и (2) и при 62°С для отжига праймера (3) и 1 мин при 36°С для отжига праймера (4), 1 мин 20 сек при 72°С для синтеза комплементарных цепей ДНК для праймеров (1)-(3) и 1 мин 30 сек для праймера (4); и завершающего синтеза в течение 7 мин при 72°С.

Для разделения продуктов амплификации использовали электрофорез в 1,5%-ном агарозном геле («АтгеБсо», США). Для визуализации ДНК использовали краситель Е1Вг («АтгеБсо») в соответствии с инструкцией фирмы-производителя, гели сканировали в ультрафиолетовом свете с длиной волны 312 нм, при помощи трансиллюминатора ^Иэег Lourmat ЕСХ-

Таблица 1

Количество локусов, выявляемых в геноме мыши при помощи праймеров 1-4

Название праймера Число выявленных локусов Из них полиморфных

Праймер 1 22 15

Праймер 2 13 2

Праймер 3 20 9

Праймер 4 12 4

Итого: 67 30

15M (Франция), оборудованного видто-системой «Gel Imager-2» для регистрации гелей (Россия). В качестве маркера молекулярной массы при определении длины фрагментов ДНК использовали Gene Ruler 100bp Plus («Fermentas»).

Результаты

Применение вышеуказанных ДНК-мар-керов позволило получить четыре электрофоретических спектра продуктов амплификации, характерных для каждого из четырех использованных праймеров, и тем самым выявить в геноме мышей ряд локусов. Под термином «локусы» здесь мы понимаем фрагменты геномной ДНК, амплифицированные в ходе ПЦР и различающиеся по своей электрофоретической подвижности. Среди выявленных локусов были как мономорфные, так и полиморфные (диморфные) локусы.

В качестве примера того, какие локусы можно считать полиморфными, а какие мо-номорфными, приводится фрагмент электрофоретического спектра продуктов амплификации геномной ДНК мышей с праймером (3), как наиболее наглядный

(рис.). Ампликоны (зоны) с одинаковой электрофоретической подвижностью, которые присутствуют у всех исследованных линий, являются мономорфными локуса-ми, в то время как ампликоны, которые есть у одних линий, но отсутствуют у других можно считать полиморфными локу-сами. Так, например, на рисунке зоны, обозначенные стрелками 1 и 7, присутствуют у всех пяти линий, и поэтому представляют собой мономорфнымй локус. Зона 2 есть только у линий BALB/c, С57ВЦ/6 и С57ВЦ/10, но отсутствует у линий БВА/2 и СВА, то есть этот локус находится в полиморфном состоянии — у одних линий в этом локусе один аллель (видимая зона), а у других линий другой аллель (отсутствие видимой зоны). Точно также полиморфными являются локусы, обозначенные стрелками 3-6.

В соответствии с этим принципом нами были проанализированы все полученные спектры. В результате у мышей исследуемых линий всего было выявлено 67 геномных локусов, из которых 30 оказались полиморфными (см. табл.1). Для всех полиморфных локусов мы составили сводную таблицу распределения аллелей в этих ло-кусах для того, чтобы получить генетиче-

Таблица 2

Распределение аллелей в 30 полиморфных локусах, выявленных при помощи ДНК маркирования

Линия Порядковые номера локусов

Праймер 1 Праймер 2 Праймер 3 Праймер 4

1 2 3 4 5 6 7 в 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

BALB/c - - + + - + - - + - + + - - + + + + - - + - + - + - + - + -

DBA/2 + + + - - + - + - - + - - + + - - - + - + - - + - + + - + +

CBA - + + - - + - + - + - - + + - + + - + - + - + + + - + - + +

C57BL/6 + + - + - + - - + - + + - + + + - + - + - + + + + + - + - -

C57BL/10 + + - + + - + - + - + + - + + + - + - + - + + + + + - - + -

ский профиль каждой исследованной линии (см. табл. 2), при этом наличие видимой зоны в локусе обозначали знаком «+», а отсутствия видимой зоны знаком «-». Как видно из таблицы 2, каждая линия обладает уникальным генетическим профилем, что позволяет использовать полученные данные для генотипирования и, в перспективе, мониторинга генетической стандартности инбредных линий.

Мыши трансгенной линии C57BL/10-GFP получены из Jackson Laboratory с любезного разрешения А.В.Червонского.

Литература

1. Бландова З.К., Душкин В.А., Малашенко А.М., Шмидт Е.Ф. Линии лабораторных животных для медико-биологических исследований. — М.: Наука, 191, 1983.

2. Cheah Y.C., Nadeau J.H., Pugh S., Paigen B. New murine polymorphisms detected by random amplified polymorphic DNA (RAPD) PCR and mapped by use of recombinant inbred strains. // Mamm. Genome., v. 5, No 12, 762-767, 1994.

3. Fitch W.M., Atchley W.R. Evolution in Inbred Strains of Mice Appears Rapid. // Science, v. 228, No. 7, 1169-1175, 1985.

4. Iakoubova, O.A., Olsson C. L., Dains K.M., et al. Microsatellite marker panels for use in high-throughput genotyping of mouse crosses. // Physiol Genomics, v. 3, 145-148, 2000.

5. Ideraabdullah F.Y., de la Casa-Esperon E., Bell T.A., Detwiler D.A. et al. Genetic and Haplotype Diversity Among Wild-Derived Mouse Inbred Strains. // Genome Res, v.14, 1880-1887, 2004.

6. Mishra M., Dubey N., Totey S.M. et al. Phylogenetic relationships and genetic polymorphisms in wild Indian mice. // Biomol. Eng., v. 18, 281-288, 2002.

7. Venugopal G, Trivedi H.N., Mohapatra S.S. Arbitrary single short primers identify polymorphic DNA markers that distinguish inbred strains of mice. // Biochem.Biophys. Res. Commun., v. 203, 659-665, 1994.

8. Wiltshire T., Pletcher M.T., Batalov S. et al. Genome-wide single-nucleotide polymorphism analysis defines haplotype patterns in mouse. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 100, No 6, 3380-3385, 2003.

USING OF DNA MARKERS IN THE GENOTYPING OF INBRED STRAINS OF LABORATORY MICE V.V.Martynov, A.M.Malashenkol V.N.Karkischenko, T.B.Beskova

The Research Center for Biomedical Technology of RAMS, Moscow

Key words: Mice, polymorphism, genetic standardization, DNA markers.

The ISSR-PCR and RAPD-PCR markers have been applied for study of the genetic diversity among five inbred strains of mice. Overall thirty polymorphic loci have been found. The distribution of alleles at these loci is specific for each strain. These results indicate that DNA markers may be successfully used for genotyping inbred strains of mice and monitoring of their genetic purity.