СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ, СПЕЦИФИЧНЫЕ В ОТНОШЕНИИ LOX1, И ПУТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

1. Выделенный LOX1-связывающий белок, содержащий набор определяющих комплементарность участков (CDR): вариабельный участок тяжелой цепи (VH)-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3 и вариабельный участок легкой цепи (VL)-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, где набор CDR предусматривает в общей сложности 18 или меньше аминокислотных замен, делеций и/или вставок по сравнению с эталонным набором CDR, в котором:
(i) VH-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1;
(ii) VH-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:5;
(iii) VH-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:14;
(iv) VL-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30;
(v) VL-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:31; и
(vi) VL-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:32.
2. Выделенный LOX1-связывающий белок, содержащий набор определяющих комплементарность участков (CDR): вариабельный участок тяжелой цепи (VH)-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3 и вариабельный участок легкой цепи (VL)-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, где:
(a) (i) VH-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1;
(ii) VH-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:2;
(iii) VH-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:3;
(iv) VL-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30;
(v) VL-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:31; и
(vi) VL-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:32;
(b) (i) VH-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1;
(ii) VH-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:5;
(iii) VH-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:14;
(iv) VL-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:30;
(v) VL-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:31; и
(vi) VL-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:32;
(c) (i) VH-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:38;
(ii) VH-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:39;
(iii) VH-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:44;
(iv) VL-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:55;
(v) VL-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:60; и
(vi) VL-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:61;
или
(d) (i) VH-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:38;
(ii) VH-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:39;
(iii) VH-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:40;
(iv) VL-CDR1 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:55;
(v) VL-CDR2 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:56; и
(vi) VL-CDR3 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:57.
3. Выделенный LOX1-связывающий белок, содержащий вариабельный участок тяжелой цепи (VH), характеризующийся по меньшей мере 90, 95, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:4, 19-29, 41 или 48-54; и вариабельный участок легкой цепи (VL), характеризующийся по меньшей мере 90, 95, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:33, 36, 37, 58 или 65-70.
4. Выделенный LOX1-связывающий белок, содержащий вариабельный участок тяжелой цепи (VH) и вариабельный участок легкой цепи (VL), где последовательность VH предусматривает в общей сложности 15 или меньше аминокислотных замен, делеций и/или вставок по сравнению с эталонной последовательностью VH, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: NO:4, 19-28 и 29, и последовательность VL предусматривает в общей сложности 6 или меньше аминокислотных замен, добавлений и/или делеций по сравнению с эталонной последовательностью VL, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:33, 36 и 37.
5. Выделенный LOX1-связывающий белок, содержащий вариабельный участок тяжелой цепи (VH), выбранный из группы, состоящей из VH, содержащего SEQ ID NO:4, 19-29, 41 или 48-54; и вариабельный участок легкой цепи (VL), выбранный из группы, состоящей из VL, содержащего SEQ ID NO:33, 36, 37, 58 или 65-70.
6. Выделенный LOX1-связывающий белок, содержащий вариабельный участок тяжелой цепи (VH) и вариабельный участок легкой цепи (VL), выбранные из группы, состоящей из:
(a) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:4 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:33;
(b) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:29 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:33;
(c) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:41 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:58 и
(d) VH с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:54 и VL с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:70.
7. Выделенный LOX1-связывающий белок, содержащий вариабельный участок тяжелой цепи (VH), содержащий SEQ ID NO:4, и вариабельный участок легкой цепи (VL), содержащий SEQ ID NO:33.
8. Выделенный LOX1-связывающий белок, содержащий набор определяющих комплементарность участков (CDR): вариабельный участок тяжелой цепи (VH)-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3 и вариабельный участок легкой цепи (VL)-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, как показано в таблице 1, на фигуре 4 или на фигуре 5.
9. Выделенный LOX1-связывающий белок, содержащий вариабельный участок тяжелой цепи (VH) и вариабельный участок легкой цепи (VL), как показано в таблице 1, на фигуре 4 или на фигуре 5.
10. Выделенный LOX1-связывающий белок, содержащий набор определяющих комплементарность участков (CDR): вариабельный участок тяжелой цепи (VH)-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3 и вариабельный участок легкой цепи (VL)-CDR1, VL-CDR2 и VL-CDR3, где:
(a) VH-CDR1 содержит аминокислотную последовательность:
E L S M H (SEQ ID NO: 1);
(b) VH-CDR2 содержит аминокислотную последовательность:
1
2
3
4
5
6
G F D P E D HX HX HX HX HX HX Q K F Q G (SEQ ID NO: 71);
где HX1 выбрана из группы, состоящей из G, W, Y и F,
HX2 выбрана из группы, состоящей из E, T, Q, K, A и S,
HX3 выбрана из группы, состоящей из T, Y, I и N,
HX4 выбрана из группы, состоящей из I, A, R и H,
HX5 выбрана из группы, состоящей из Y, V, T, L и Q, и
HX6 выбрана из группы, состоящей из A, D, G, S и H;
(c) VH-CDR3 содержит аминокислотную последовательность:
7
8
9
10
11
12
HX HX G HX HX HX HX G V R G W D Y Y Y G M D V (SEQ ID NO: 72);
где HX7 выбрана из группы, состоящей из P, S и V,
HX8 выбрана из группы, состоящей из N, W, D и T,
HX9 выбрана из группы, состоящей из Q, R и T,
HX10 выбрана из группы, состоящей из Q и H,
HX11 выбрана из группы, состоящей из G и Q, и
HX12 выбрана из группы, состоящей из K и G;
(d) VL-CDR1 содержит аминокислотную последовательность:
T G S S S N I G A G Y D V H (SEQ ID NO: 30);
(e) VL-CDR2 содержит аминокислотную последовательность:
G N S N R P S (SEQ ID NO: 31); и
(f) VL-CDR3 содержит аминокислотную последовательность:
1
2
3
4
5
6
Q S Y D S LX LX LX LX LX LX (SEQ ID NO: 73);
где LX1 выбрана из группы, состоящей из M и S,
LX2 выбрана из группы, состоящей из L, Y и H,
LX3 выбрана из группы, состоящей из S и R,
LX4 выбрана из группы, состоящей из A и G, или она пропущена (аминокислота отсутствует),
LX5 выбрана из группы, состоящей из W и F, и
LX6 выбрана из группы, состоящей из V, G и A.
11. Выделенный LOX1-связывающий белок, который связывает тот же эпитоп, что и выделенный LOX1-связывающий белок по любому из пп. 1-10.
12. Выделенный LOX1-связывающий белок, который конкурирует за связывание с LOX1 с выделенным LOX1-связывающим белком по любому из пп. 1-10.
13. Выделенный LOX1-связывающий белок по любому из пп. 1-10, где LOX1-связывающий белок снижает, ингибирует или подавляет активность LOX1.
14. Выделенный LOX1-связывающий белок по любому из пп. 1-10, где LOX1-связывающий белок характеризуется по меньшей мере одним свойством, выбранным из группы, состоящей из следующего:
(a) он снижает или ингибирует связывание oxLDL, С-реактивного белка (CRP) и/или конечных продуктов усиленного гликозилирования (AGE) с LOX1;
(b) он подавляет или ингибирует передачу сигнала RhoA/Rac1, монооксида азота (NO), p38MAPK, протеинкиназы B и C, ERK1/2 и/или NFκB в эндотелиальной клетке, экспрессирующей LOX1 клеточной поверхности;
(c) он снижает или ингибирует активность каспазы-8, каспазы-9 и/или BAX в эндотелиальной клетке, экспрессирующей LOX1 клеточной поверхности;
(d) он связывается с LOX1 с однонуклеотидным полиморфизмом K167N;
(e) он снижает или ингибирует интернализацию oxLDL;
(f) он подавляет или ингибирует индуцируемую oxLDL передачу сигнала LOX1;
D
(g) он связывается с LOX1 с константой диссоциации (K) от приблизительно 150 пМ до приблизительно 600 пМ или приблизительно 400 пМ, как определено с помощью BIACORE или KinExA;
on
5
-1
-1
6
-1
-1
5
-1
-1
(h) он связывается с LOX1 со скоростью K от приблизительно 1×10 M сдо приблизительно 6×10 M сили приблизительно 5 x10 M с, как определено с помощью BIACORE; и
off
-4
-1
-4
-1
-4
-1
(i) он связывается с LOX1 со скоростью K от приблизительно 1×10 с до приблизительно 3×10 с или приблизительно 2,3×10 с, как определено с помощью BIACORE.
15. Выделенный LOX1-связывающий белок по любому из пп. 1-14, где LOX1-связывающий белок представляет собой антитело.
16. Выделенный LOX1-связывающий белок по п. 15, где антитело представляет собой моноклональное антитело, рекомбинантное антитело, антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, биспецифическое антитело, мультиспецифическое антитело или фрагмент антитела, связывающий LOX-1.
2
17. Выделенный LOX1-связывающий белок по п. 16, где фрагмент антитела, связывающий LOX-1, выбран из группы, состоящей из Fab-фрагмента, Fab'-фрагмента, F(ab')-фрагмента, Fv-фрагмента, диатела или молекулы одноцепочечного антитела.
18. Выделенный LOX1-связывающий белок по любому из пп. 1-17, где LOX1-связывающий белок или антитело дополнительно содержит константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, выбранный из группы, состоящей из:
(a) константного домена IgA человека;
(b) константного домена IgD человека;
(c) константного домена IgE человека;
(d) константного домена IgG1 человека;
(e) константного домена IgG2 человека;
(f) константного домена IgG3 человека;
(g) константного домена IgG4 человека; и
(h) константного домена IgM человека.
19. Выделенный LOX1-связывающий белок по любому из пп. 1-18, где LOX1-связывающий белок или антитело дополнительно содержит константный домен легкой цепи иммуноглобулина, выбранный из группы, состоящей из:
(a) константного домена каппа-цепи Ig человека; и
(b) константного домена лямбда-цепи Ig человека.
20. Выделенный LOX1-связывающий белок по любому из пп. 1-19, где LOX1-связывающий белок или антитело дополнительно содержит константный домен тяжелой цепи IgG1 человека и константный домен легкой лямбда-цепи человека.
21. Выделенный LOX1-связывающий белок по любому из пп. 18-20, где константный домен Fc-участка IgG1 предусматривает мутацию в положениях 234, 235 и 331, где нумерация положений приведена согласно EU-индексу по Kabat.
22. Выделенный LOX1-связывающий белок по п. 21, где Fc-домен IgG1 предусматривает мутации L234F, L235E и P331S, где нумерация положений приведена согласно EU-индексу по Kabat.
23. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты или набор молекул нуклеиновой кислоты, которые кодируют LOX1-связывающий белок по любому из пп. 1-22.
24. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты или набор молекул нуклеиновой кислоты по п. 23, которые представляют собой кДНК.
25. Выделенный полинуклеотид или молекула кДНК, достаточные для применения в качестве гибридизационного зонда, ПЦР-праймера или праймера для секвенирования, которые представляют собой фрагмент молекулы нуклеиновой кислоты или набор молекул нуклеиновой кислоты по п. 23 или 24 или их комплементарную последовательность.
26. Молекула нуклеиновой кислоты или молекула кДНК по п. 23 или 24, где молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с регуляторной последовательностью.
27. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп. 23, 24 или 26.
28. Клетка-хозяин, трансформированная молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп. 23, 24 или 26 или вектором по п. 27.
29. Клетка-хозяин по п. 28, где клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяина млекопитающего.
30. Клетка-хозяин млекопитающего по п. 29, где клетка-хозяин представляет собой клетку миеломы мыши NS0, клетку человека PER.C6 или клетку яичника китайского хомячка (CHO).
31. Способ получения LOX1-связывающего белка по любому из пп. 1-22, включающий культивирование клетки-хозяина по любому из пп. 28, 29 или 30 в подходящих условиях для получения LOX1-связывающего белка.
32. Способ по п. 31, дополнительно включающий выделение LOX1-связывающего белка, секретируемого из клетки-хозяина.
33. LOX1-связывающий белок, полученный с применением способа по п. 32.
34. Фармацевтическая композиция, содержащая LOX1-связывающий белок по любому из пп. 1-22 или 33 и фармацевтически приемлемый носитель.
35. Фармацевтическая композиция по п. 34, дополнительно содержащая группу для введения метки или эффекторную группу.
36. Фармацевтическая композиция по п. 35, где группа для введения метки выбрана из группы, состоящей из изотопных меток, магнитных меток, редокс-активных фрагментов, оптических красителей, биотинилированных групп, флуоресцентных молекул, как, например, биотинилированные сигнальные пептиды, зеленые флуоресцентные белки (GFP), синие флуоресцентные белки (BFP), голубые флуоресцентные белки (CFP) и желтые флуоресцентные белки (YFP), а также эпитопов полипептидов, распознаваемых вторичным репортером, как, например, гистидиновый пептид (his), гемагглютинин (HA), пептид, связывающийся с частицами золота, и Flag.
37. Фармацевтическая композиция по п. 35, где эффекторная группа выбрана из группы, состоящей из радиоактивного изотопа, радионуклида, токсина, терапевтического и химиотерапевтического средства.
38. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 34-37 для применения в качестве лекарственного препарата.
39. Применение фармацевтической композиции по любому из пп. 34-37 для лечения заболевания или состояния, связанного с LOX1.
40. Применение по п. 39, где заболевание или состояние выбрано из группы, состоящей из атеросклероза, тромбоза, коронарной недостаточности (CAD), ишемии (например, ишемии миокарда), инфаркта (например, инфаркта миокарда), острого коронарного синдрома (ACS), инсульта, реперфузионного повреждения, рестеноза, заболевания периферических сосудов, гипертензии, сердечной недостаточности, воспаления (например, хронического воспаления), ангиогенеза, преэклампсии и рака.
41. Способ лечения, предупреждения и/или облегчения заболевания или состояния, связанного с LOX1, у субъекта, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества композиции, содержащей LOX1-связывающий белок по любому из пп. 1-22 или 33, или фармацевтической композиции по любому из пп. 34-37.
42. Способ по п. 41, где заболевание или состояние выбрано из группы, состоящей из атеросклероза, тромбоза, коронарной недостаточности (CAD), ишемии (например, ишемии миокарда), инфаркта (например, инфаркта миокарда), острого коронарного синдрома (ACS), инсульта, реперфузионного повреждения, рестеноза, заболевания периферических сосудов, гипертензии, сердечной недостаточности, воспаления (например, хронического воспаления), ангиогенеза, преэклампсии и рака.
43. Способ по п. 41, где LOX1-связывающий белок или фармацевтическую композицию вводят отдельно или в комбинированной терапии.
44. Способ снижения или ингибирования активности LOX1 у субъекта, включающий введение эффективного количества LOX1-связывающего белка по любому из пп. 1-22 или 33 или фармацевтической композиции по любому из пп. 34-37.