Генотипическое разнообразие штаммов Bacillus anthracis, выделенных в регионе Кавказа

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА, МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ №2, 2012

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 579.852.11:579.253].083.1:577.2.08

Е. И. Еременко, А. Г. Рязанова, О. И. Цыганкова, Е. А. Цыганкова, Н. П. Буравцева,

А. Н. Куличенко

ГЕНОТИпИчЕСКОЕ разнообразие штаммов BACILLUS ANTHRACIS, выделенных В РЕГИОНЕ КАВКАЗА

ФГУЗ Роспотребнадзора Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт

Проведено изучение генотипов штаммов Bacillus anthracis, выделенных в регионе Кавказа, методом мультилокусного анализа областей генома с вариабельным числом тандемных повторов (MLVA). У 149 штаммов идентифицировано 32 отличающихся генотипа MLVA-8, относящихся к группам генотипического разнообразия A1a, A3a, A4 и B1. Из них 9 генотипов ранее не были описаны, а 6 генотипов не встречались в других географических областях, кроме Кавказа, и они могут быть отнесены к эндемичным для этой территории. Большинство идентифицированных генотипов имеет распространение не только на Кавказе, но и в разных странах Евразии, Африки и Америки. Генотипическое разнообразие изолятов в регионе Кавказа сопоставимо с мировым, что отражает исторические связи этого региона, близость к древним торговым путям и интенсивные эпизоотии сибирской язвы на Кавказе. Полученные данные представляют не только теоретический интерес, но и практический, обусловленный их применимостью в эпидемиологических расследованиях вспышек сибирской язвы.

Ключевые слова: Bacillus anthracis, генетическое титрование, MLVA, филогенетический анализ, географическое распределение

Сибирская язва относится к особо опасным зооноз-ным инфекциям, имеющим повсеместное распространение и представляющим проблему для здравоохранения и ветеринарии многих стран, включая Россию.

Регион Кавказа (Северный Кавказ РФ и Закавказье) относится к территориям, на которых сибирская язва часто проявлялась в исторически отдаленные периоды и нередко фиксируется сегодня. Находясь на пересечении торговых путей, соединяющих Европу и Азию, и занимая важное стратегическое положение, эта область на протяжении многих веков неоднократно была объектом нашествий и завоеваний со стороны нескольких империй и ареной военных столкновений. Географическое положение Кавказа способствует его обширным экономическим связям с другими регионами РФ и зарубежья. Принято считать, что на распространение сибирской язвы по Земному шару и эволюцию ее возбудителя в числе других факторов существенно влияла миграция скота, продуктов животноводства и диких животных, что связано с естественными причинами, а также с торговлей и перемещением войск. С появлением метода мультилокус-ного анализа областей генома с вариабельным числом тандемных повторов (MLVA) [10] обнаружилось четкое разделение генотипов MLVA штаммов Bacillus anthracis на основные филогенетические клады A и B с наиболее крупными группами молекулярного разнообразия A1a, A3a, A4 и B1. Также стала явно заметной привязка определенных генотипов штаммов сибиреязвенного микроба к географическим областям, где эти штаммы выделены. Результаты геноти-пирования методом MLVA, полученные в последнее десятилетие в ряде стран, показали принадлежность генотипов штаммов из национальных коллекций как к эндемичным генотипам, так и к общим для разных географических регионов [2-8, 10, 12-18].

В коллекции штаммов микроорганизмов Ставропольского научно-исследовательского противочумного института, который традиционно курирует территории Кавказа и Закавказья, есть изоляты, выделенные в Советском Союзе и странах СНГ с 1957 г. по настоящее время. Генотипы коллекционных штаммов и свежих изолятов методом MLVA определяются с 2000 г., однако анализ результатов генотипирования штаммов из региона Кавказа до сих пор не проводился.

Цель работы - изучение генотипов штаммов сибиреязвенного микроба из коллекции института, выделенных на Кавказе, и их географического распределения.

Материалы и методы

Объектом исследования стали генотипы 149 штаммов Б. anthracis, из которых 91 штамм выделен в разное время на территории Северного Кавказа и Закавказья, а также изоляты из других регионов СНГ и вакцинный штамм СТИ-1. Географическое распределение штаммов указано в табл. 1. Генетическое ти-пирование штаммов проводили методом MLVA-8 [10] в нашей модификации [1]. Для сопоставления генотипов штаммов с описанными в литературе полученные размеры ампликонов в парах нуклеотидов перевели в количество тандемных повторов, используя таблицу

Таблица 1

Географическое происхождение штаммов B. anthracis, использованных в работе

№ Географическое происхождение штаммов Количество штаммов

1 Северный Кавказ РФ (Ставропольский край, Республика Дагестан, Северная Осетия-Алания, Ингушская, Чеченская, Карачаево-Черкесская и Кабардино-Балкарская республики) 67

2 Закавказье (Азербайджан, Грузия) 24

3 Юг европейской части РФ (Волгоградская область, Краснодарский край, Республика Калмыкия) 13

4 Центр европейской части РФ (Воронежская, Рязанская области, Мордовская Республика и Республика Татарстан) 7

5 Азиатская часть РФ (Иркутская, Омская области, Республика Бурятия) 28

6 Украина 6

7 Молдавия 1

8 Средняя Азия (Туркменистан и Республика Узбекистан) 3

9 Вакцинный штамм СТИ-1 1

Всего... 150

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

соответствия в работе F. Lista и соавт. [12] и принятые на сайте MLVAnet обозначения [9]. Дендрограмма была построена методом UPGMA с использованием алгоритма Neighbor из пакета программ PHYLIP 3.69 и программы TreeView.

Результаты и обсуждение

Все штаммы были отнесены к 32 отличающимся генотипам (табл. 2).

Из них 8 генотипов (K5, K13, K14, K17, K35, K43, K44 и K45) были идентифицированы в работе P. Keim и соавт. [10], 15 генотипов описаны нами ранее с иными обозначениями [2], 9 генотипов определены впервые.

Среди идентифицированных вариантов было 5 неполных генотипов: 4 моноплазмидных генотипа (U20, R13, R14, G12) штаммов, в которых отсутствовал маркер VNTR pXO2at, и бесплаз-мидный генотип UZ3, лишенный маркеров pXOlaat и pXO2at. Эти генотипы исключены из филогенетического анализа. При этом генотип U20 штамма из Украины совпадал по 7 локусам с генотипами K13 и K14 [10], а генотип R13 иркутских штаммов в такой же мере совпадал с генотипами R9 и R11 штаммов из нашей коллекции, 2 штаммов, выделенных в Чувашии и Новгородской области [3], и 1 штамма из Казахстана [4].

Результаты филогенетического анализа 27 полных генотипов показали, что 22 из них относились к группам генотипического разнообразия A1a и A3a (см. рисунок). Значительно отличались от них генотипы R18, R19 и G17, принадлежащие к группе B1, и генотипы T1 и T8, относящиеся к группе A4. Генотипы R18 и R19 штаммов, выделенных в Омской области и Республике Бурятия азиатской части Российской Федерации, существенно отличались от всех других, идентифицированных в этой работе. Генотип G17, характерный для штамма 228, который был использован как производственный штамм на Табахмельском биокомбинате и выделен из трупа лошади, и для 3 штаммов, выделенных в Республике Дагестан, отличался только по локусу pXO2at от генотипа 89 штамма из США [10] и штамма 1051/35 из РФ [3]. Интересно отметить, что все 4 штамма из нашей коллекции с таким генотипом (9; 19; 7; 53; 17; 2; 6; 8) имели отличающийся фенотип, так как были зависимы от триптофана, не обладали протеолитической и гемолитической активностью, не экскретировали экзотоксин в тесте in vitro (Trp"Hly"Pro"Tox") и были авирулентны для кроликов. Их ревер-танты, отобранные по признакам независимости от триптофана или полученные после пассирования через организм белых мышей, имели обычный фенотип (Trp+Hly+Pro+Tox+), были вирулентны для кроликов, а их генотип (10; 16; 7; 57; 21; 1; 10; 8) соответствовал генотипу R9 штаммов, выделяемых в Республике Северная Осетия-Алания, Ставропольском крае и Республике Калмыкия, и свойственному типовому штамму 81/1.

Генотип Т1 штамма из Туркменистана совпадал с генотипом штамма 11 (1940) и отличался по одному из локусов от генотипов штамма 15 (1345) из Таджикистана [3], генотипов 71 и 74 у штаммов из Ирландии, Пакистана и Германии [10]. Генотип R16 отличался по одному из локусов от генотипов 43 и 47 [10].

Из описанных ранее в работе [10] генотипов 8 были свойственны штаммам разного географического происхождения. Так, генотип К5 был присущ штаммам из Канады и Республики Северная Осетия-Алания (РФ), генотип К13 - штаммам из Турции, Китая, Республики Северная Осетия-Алания, Республики Дагестан, Волгоградской и Воронежской областей (РФ), генотип К14 -штаммам из Китая и Республики Дагестан, генотип К17 - штамму из Норвегии, Республики Северная Осетия-

Таблица 2

Генотипы MLVA-8 штаммов B. anthracis

№ Генотип Количество тандемных повторов локусов VNTR

vrrA vrrBl vrrB2 vrrCl vrrC2 CG3 pXOlaat pXO2at

1 G12 10 16 7 57 21 1 7 -1

2 U20 10 16 7 57 21 1 9 -1

3 R13 10 16 7 57 21 1 10 -1

4 R14 10 16 7 57 21 1 8 -1

5 R11 10 16 7 57 21 1 10 7

6 R24 10 16 7 57 21 1 8 7

7 K5 10 16 7 57 21 1 7 7

8 R16 10 16 7 57 17 1 10 12

9 R21 10 16 7 57 17 1 9 8

10 K44 10 16 7 57 17 2 7 10

11 K35 10 16 7 57 17 2 9 10

12 K43 10 16 7 57 17 2 10 10

13 K45 10 16 7 57 17 2 8 10

14 K14 10 16 7 57 21 1 9 10

15 R5 10 16 7 57 17 2 11 16

16 UZ3 8 16 7 48 17 2 -1 -1

17 UZ4 10 16 7 57 17 1 11 8

18 R32 10 16 7 57 21 1 8 8

19 R22 10 16 7 57 17 1 8 8

20 R9 10 16 7 57 21 1 10 8

21 K13 10 16 7 57 21 1 9 8

22 R2 11 16 7 57 21 1 8 8

23 R6 11 16 7 57 21 1 10 8

24 K17 11 16 7 57 21 1 9 8

25 AZ3 11 16 6 57 21 1 8 8

26 R23 10 16 6 57 17 2 9 10

27 E10 11 16 8 57 21 2 6 7

28 R18 9 19 9 53 17 2 8 8

29 R19 9 19 9 53 17 2 8 9

30 G17 9 19 7 53 17 2 6 8

31 T1 10 16 7 48 21 2 9 8

32 T8 10 16 7 48 21 2 7 8

Примечание.

-1 - отсутствие маркера.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА, МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ №2, 2012

Генотип Группа Количество Места

молекулярного штаммов вьщеления

разнообразия штаммов

R11 А1а 2 МОР

R24 А1а 11 СТА, ЧИР, ВОЛ

К5 А1а 1 РСО-А

R5 АЗа 5 СТА

R16 АЗа 4 КБР

К44 АЗа 6 АЗР

К43 АЗа 11 КБР, АЗР

К35 АЗа 4 ЧИР, КБР, АЗР

К14 А1а 1 РД

К45 АЗа 7 РД, РСО-А, АЗР, ГРУ

UZ4 А1а 1 УЗБ

R32 А1а 2 РД, РТ

R22 А1а 2 ИРК

R9 А1а 3 РСО-А, СТА, PK

К13 А1а 4 РСО-А, РД, ВОЛ, ВОР

R21 А1а 3 КБР, ВОЛ

R2 А1а 9 СТА, ЧИР, АЗР

R6 А1а 19 СТА, КЧР, РСО-А, PK

К17 А1а 9 КБР, АЗР, PK, ВОЛ, РЯЗ, ВОР, УКР

Т1 А4 1 ТРК

Т8 А4 1 ТРК

AZ3 А1а 1 АЗР

R23 АЗа 1 КБР

ЕЮ АЗа 1 УКР

R18 В1 10 РБ, ОМС

R19 В1 1 ОМС

G17 В1 4 РД, ГРУ

Дендрограмма ОТ^МА генотипов штаммов В. апЛга^. ВОЛ - Волгоградская область; ВОР - Воронежская область; ИРК - Иркутская область; КБР - Кабардино-Балкарская Республика; КЧР - Карачаево-Черкесская Республика; РБ - Республика Бурятия; РД - Республика Дагестан; РК - Республика Калмыкия; МОР - Республика Мордовия; РСО-А -Республика Северная Осетия - Алания; СТА - Ставропольский край; РТ - Республика Татарстан; РЯЗ - Рязанская область; ОМС - Омская область; ЧИР - Чеченская Республика и Республика Ингушетия; АЗР - Азербайджан; ГРУ - Грузия; ТРК - Туркменистан; УЗБ - Узбекистан; УКР - Украина;

ЭФ - Эфиопия.

Алания, Кабардино-Балкарской Республики, Республики Калмыкия, Волгоградской, Рязанской и Воронежской областей РФ, Азербайджана и Украины. Генотип К35 был характерен как для штаммов из Турции, Намибии, Великобритании, США, так и для штаммов из Азербайджана, Грузии и Чеченской Республики РФ, генотип К43 - для штаммов из Турции и Кабардино-Балкарской Республики, генотип К44 - для турецких, намибийских, грузинских и азербайджанских штаммов, а генотип К45 - для штаммов из Республики Дагестан, Республики Северная Осетия-Алания, Азербайджана, Грузии, Турции, ЮАР, Аргентины и США.

Генотип R9 совпадал с генотипом штамма из Казахстана [4], генотип R11 - с генотипом штаммов из Чувашии и Новгородской области и Казахстана [3]. Генотипы Т8 и Т1 штаммов из Туркменистана совпадали с генотипами штаммов из Казахстана [4] и Таджикистана [3] соответственно.

Генотип G12 2 бескапсульных грузинских штаммов, выделенных из почвы, полностью совпадал с генотипом VII ветеринарного вакцинного штамма 55, описанным в работе [13], а генотип R14, к которому принадлежали штаммы из Чеченской Республики, Республики Татарстан, Украины и Молдовы, соответствовали вакцинному штамму СТИ-1.

Генотипы Я2, R5, R16, G17, Я23 и А23 не встречались в других географических областях, кроме Кавказа, и могут быть отнесены к эндемичным для этой территории.

Больше всего отличающихся генотипов имели штаммы, выделенные в Азербайджане, - 7 генотипов у 17 штаммов, из которых 14 были выделены во время одной крупной вспышки сибирской язвы, а также штаммы из

Кабардино-Балкарской Республики - 6 генотипов у 13 штаммов, из которых по 4 штамма было выделено в ходе 2 вспышек и 3 - еще в 1. По 5 генотипов идентифицировано у штаммов из Ставропольского края, Республики Северная Осетия-Алания и Республики Дагестан, по 3 - у штаммов из Чеченской Республики и Грузии.

Результаты сравнения количества генотипов MLVA у изолятов сибиреязвенного микроба, выделенных на Кавказе (19 генотипов для 91 штамма) и в мире (89 генотипов для 426 штаммов и 221 генотип для 1033 штаммов) [10, 18], показывают, что степень геноти-пического разнообразия у кавказских штаммов сопоставима с наблюдаемой в мировой коллекции.

Обращает внимание совпадение генотипов штаммов сибиреязвенного микроба из региона Кавказа и штаммов из Турции и Казахстана. Также идентичными оказались генотипы штаммов из Туркменистана, Казахстана и Таджикистана, тогда как генотипы штаммов из Сибири (Омская область, Республика Бурятия) были максимально близки к генотипу G17 штаммов из Грузии и Республики Дагестан. Все эти регионы связывал древний Великий шелковый путь.

Частое обнаружение в европейской части РФ штаммов с генотипом K17, который впервые был описан P. Keim и соавт. [10] у единственного штамма из Норвегии, связано, вероятно, с распространением возбудителя вдоль исторического торгового пути "из варяг в греки", проходившего вблизи Кавказа.

Более сложными, по всей видимости, были пути распространения возбудителя сибирской язвы, отражающие близость или идентичность генотипов кавказских штаммов с генотипами изолятов из отдаленных регионов планеты, среди которых нередки генотипы

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

штаммов из Южной Африки (Намибия, ЮАР). Так, генотип E10 штамма, выделенного в Украине из карбункула больного, который заразился при контакте с импортированным из Эфиопии сырьем животного происхождения, уникален среди всех изученных и относится к той же группе генотипического разнообразия A3a, что и генотипы южноафриканских штаммов.

Наиболее удаленными от Кавказа регионами являются США и Канада, однако штаммы и из этих стран имели такие же или близкие генотипы, относящиеся к основной ветви A, что и "кавказские" изоляты. Этот факт свидетельствует в пользу описанной L. Kenefic и соавт. радикальной клональной экспансии ветви A, связанной с ее распространением на североамериканском субконтиненте после отделения от трансев-разийской линии TEA западной североамериканской линии WNA и внедрения в Северную Америку в до-колумбовские времена [11].

Результаты сопоставления генотипов штаммов подтверждают уникальность географического положения и истории Северного Кавказа и Закавказья, области многочисленных нашествий армий завоевателей и прохождения торговых путей, движения народов из Азии в Европу и в обратном направлении. Эти события неизбежно сопровождались перемещением домашнего скота и продуктов животноводства, что провоцировало распространение возбудителей зоонозов.

Таким образом, при изучении генотипов у штаммов, выделенных в регионе Северного Кавказа и Закавказья, установлено достаточно близкое родство большинства из них как между собой, так и с генотипами штаммов из стран Евразии, Африки и Америки. С другой стороны, показано значительное генотипическое разнообразие штаммов возбудителя сибирской язвы в этом регионе и наличие обмена штаммами в его пределах и сопредельных территориях.

Полученные данные представляют не только теоретический, но и практический интерес, обусловленный их применимостью в эпидемиологическом расследовании вспышек сибирской язвы. Использование для генотипирования разных сочетаний маркеров MLVA, их комбинаций с маркерами SNP и SNR, представительных баз данных генотипов и методов биоинформатики открывают перспективу внедрения гибкой многоцелевой системы молекулярного анализа штаммов возбудителя сибирской язвы.

Сведения об авторах:

фГУз Роспотребнадзора Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт

Еременко Евгений Иванович - д-р мед. наук, проф., гл. науч. сотр. лаб. сибирской язвы, e-mail: anthraxlab@ mail.ru;

Рязанова Алла Геннадьевна - канд. мед. наук, зав. лаб. сибирской язвы;

Цыганкова Ольга Ивановна - д-р мед. наук., вед. науч. сотр. лаб. сибирской язвы;

Цыганкова Елена Анатольевна - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. сибирской язвы;

Буравцева Нина Павловна - д-р мед. наук, проф., гл. науч. сотр. лаб. сибирской язвы;

Куличенко Александр Николаевич - д-р мед. наук, проф., директор ФГУЗ Роспотребнадзора «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт».

ЛИТЕРАТУРА

1. Еременко Е. И., Кейм П., Прайс Л. Б. и др. // Генная диагностика особо опасных инфекций: Материалы науч.-практ. конф. (21-22 ноября 2000 г., Саратов). - Саратов, 2006. - С. 33-36.

2. Цыганкова О. И., Еременко Е. И., Брюханов А. Ф. и др. // Журн. микробиол. - 2003. - № 6, прил. - С. 51-56.

3. ШишковаН. А., Мокриевич А. Н., ПлатоновМ. Е. и др. // Пробл. особо опасных инфекций. - 2010. - Вып. 104. - С. 60-65.

4. Aikembayev A., Lukhnova L. et al. // Emerg. Infect. Dis. - 2010. -Vol. 16, N 5. - P. 789-796.

5. Fasanella A., Van Ert M., Altamura S. et al. // J. Clin. Microbiol. -2005. - Vol. 43. - P. 3398-4301.

6. FouetA., Smith K, Keys C. et al. // J. Clin. Microbiol. - 2002. - Vol. 40, N 12. - P. 4732-4734.

7. Gierczynski R., Kaluzewski S., Rakin A. et al. // FEMS Microbiol. Lett. - 2004. - Vol. 239. - P. 235-240.

8. Gierczynski R., Jackubczak A., Lagielski M // Pol. J. Microbiol. -

2009. - Vol. 58, N 1. - P. 3-7.

9. http://minisatellites.u-psud.fr/MLVAnet/

10. Keim P., Price L. B., Klevytska A. M. et al. // J. Bacteriol. - 2000. -Vol. 182, N 10. - P. 2928-2936.

11. Kenefic L., Pearson T., OkinakaR. et al. // PLoS one. - 2009. - Vol. 4, N 3. - e4813.doi:10.1371/journal.pone.0004813.

12. ListaF., Faggioni G., Valjevac S. et al. // BMC Microbiol. - 2006. -Vol. 6. - P. 33. doi:10.1186/1471-2180-6-33.

13. Merabishvili M., Natidze M., Rigvava S. et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 2006. - Vol. 72, N 8. - P. 5631-5636.

14. Okutani A., Sekizuka T., Boldbaatar B. et al. // J. Vet. Med. Sci. -

2010. - Vol. 72, N 1. - P. 93-97.

15. Ryu C., Lee K., Hawng H.-J. et al. // Appl. Environ. Microbiol. -2005. - Vol. 71, N 8. - P. 4664-4671.

16. Simonson T., OkinakaR., WangB. et al. // BMC Microbiol. - 2009.

- Vol. 9. - P. 71. doi:10.1186/1471-2180-9-71.

17. Sue D., Marston C., Hoffmaster A. et al. // J. Clin. Microbiol. - 2007.

- Vol. 45, N 6. - P. 1777-1782.

18. VanErtM., Easterday W., HuynhL. et al. // PLoS one. - 2007. - Vol. 2, N 5. - e461. doi:10.1371/journal.pone.0000461.

Поступила 10.08.2011

GENOTYPE DIVERSITY OF THE BACILLUS ANTHRACIS STRAINS ISOLАTED FROM THE CAUCASUS REGION

E. I. Eremenko, A. G. Ryazanova, O. I. Tsygankova, E. A. Tsygankova, N. P. Buravtseva, and A. N. Kulitchenko

Stavropol Plague Control Research Institute, Federal Service for Customers' Rights Protection and Human Well-Being Surveillance, Stavropol, Russia

The study of the genotypes of Bacillus anthracis strains isolated from the Caucasus region was performed using MLVA. Among 149 strains, 32 distinctive MLVA-8 genotypes belonging to A1a, A3a, A4 and B1 molecular diversity groups were identified. 9 genotypes were not described previously; 6 genotypes were not found in other geographic regions and could be considered as endemic for Caucasus. The majority of the identified genotypes are widespread not only in Caucasus, but also throughout Eurasia, Africa, and America. Molecular diversity of Caucasian isolates is comparable to the worldwide diversity. This represents historical relations of this region, proximity to ancient trade routes and intensity of the anthrax epizootic in Caucasus.

The obtained results are of interest from the theoretical point of view, as well as for the application in epidemiological research of the anthrax outbreaks.

Key words: Bacillus anthracis, genetic typing, MLVA, phyloge-netic analysis, geographical distribution