СПОСОБ ОЧИСТКИ ГОЗЕРЕЛИНА
METHOD OF PURIFYING GOSERELIN

Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности и медицины.
Гозерелин Goserelin-6-[0-(1,1-Диметилэтил)-D-серин]-10-деглицинамидорилизинг фактора лютеинизирующего гормона (свиного) 2-(аминокарбонил)гидразид.
Гозерелин является синтетическим аналогом природного ЛГРГ (гонадотропин-рилизинг гормона). При постоянном применении препарат ингибирует (подавляет) выделение гипофизом лютеинизирующего (вызывающего образование желтого тела в яичнике) гормона, что ведет к снижению концентраций тестостерона (мужского полового гормона) в сыворотке крови у мужчин и концентраций эстрадиола (женского полового гормона) в сыворотке крови у женщин. В начальной стадии курса лечения гозерелин, подобно другим агонистам лютеинизирующего гормона, может вызвать временное увеличение концентрации тестостерона в сыворотке крови у мужчин и эстрадиола - у женщин. У мужчин примерно к 21 дню после первой инъекции концентрации тестостерона снижаются до кастрационных уровней (уровень гормона, который наблюдается у пациентов с удаленными половыми железами) и продолжаются оставаться сниженными при постоянном лечении, проводимом каждые 28 дней. У большинства больных при этом наблюдается регресс (обратное развитие) опухоли предстательной железы и симптоматическое улучшение (улучшение состояния). У женщин концентрации эстрадиола в сыворотке крови снижаются также примерно к 21 дню после первой инъекции и при постоянном лечении, проводимом каждые 28 дней, остаются сниженными до уровней, сопоставимых с теми, которые наблюдаются у женщин в постклимактерическом периоде. Этот эффект связан с положительной ответной реакцией гормонально зависимых форм рака, молочной железы, эндометриоза (появившихся в различных органах участков ткани, сходных по строению с внутренней оболочкой матки, и подвергающихся циклическим изменениям соответственно менструальному циклу) и фибром (доброкачественных опухолей, развивающихся из соединительной ткани) матки. При лечении эндометриоза гозерелин уменьшает выраженность симптомов, включая боль, и уменьшает размеры и количество эндометриальных поражений. При лечении фибром гозерелин, используемый в качестве вспомогательного средства при оперативных вмешательствах, сокращает области поражения, уменьшает кровопотери при операции, улучшает гематологический статус (показатели состояния крови) больных. Гозерелин обладает почти полной биологической доступностью. Введение препарата депо каждые 4 недели обеспечивает поддержание эффективных концентраций. Кумуляции (накопления) в тканях при этом не происходит. Период полувыведения из сыворотки крови составляет 2-4 ч.
Показания к применению:
Лечение рака предстательной железы, чувствительного к гормональному воздействию; лечение чувствительного к гормональному воздействию рака молочной железы у женщин в предклимактерическом и климактерическом периодах; эндометриоз; фибромы матки (в качестве вспомогательного средства в комплексе с хирургическим лечением).
Для применения в медицине и для медико-биологических исследований необходимы гомогенные высокоочищенные препараты. Поэтому исследователи в данной области большое внимание уделяют разработке новых эффективных способов очистки гормональных препаратов.
Патент на получение субстанции US 5510460 (А) описывает способ твердофазного синтеза пептидов, содержащих аза-аминокислоты, например декапептида гозерелина, который включает: (I) сборку всех аминокислот пептида, кроме С-концевой аза-аминокислоты синтеза традиционной твердой фазы; (II) расщепление пептида с подложки с гидразином или замещенным гидразином; и (III) взаимодействие гидразида. Гозерелин очищают методом хроматографии на колонке Dynamax 60 с градиентным элюированием раствором ацетонитрила в воде.
CN 102690329 А, опубл. 2012.09.26, касается способа очистки гозерелина, который включает следующие этапы: выполнение градиентного элюирования на хроматографической колонке, затем преобразование гозерелин трифторацетата в ацетат с помощью анионообменных смол. Процесс подходит для крупномасштабных методов очистки гозерелина в промышленности.
В решении согласно ЕР 2119724 А1 сырой продукт очищают хроматографией на колонке с Сефадексом G-25 (выпускаемого фирмой Pharmacia Упсала, Швеция), окончательный пептид очищали ионообменной хроматографией.
В качестве ближайшего аналога может быть указан CN 102863517А, опубл. 2013.01.09, который раскрывает метод очистки гозерелина в том числе по этапам: 1) растворение неочищенного пептида в водном растворе уксусной кислоты в объемном соотношении 5%-20% и метанола в объемном соотношении 15%-40% в зависимости от концентрации 50 г/л -100 г/л; 2) использование октадецилсилан химически связанного силикагеля в качестве неподвижной фазы; 3) преобразование не-ацетатного гозерелина в ацетат обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией.
Задачей настоящего изобретения является разработка нового эффективного способа очистки гозерелина.
Задача решается способом очистки гозерелина, который включает растворение гозерелина-сырца в водном растворе уксусной кислоты, фильтрование полученного раствора и последующую трехстадийную хроматографическую очистку.
На первой стадии раствор сырца пропускают через гидрофобный сорбент. Наносят раствор трипторелина-сырца на колонну из расчета 20-70 г гозерелина-сырца на 1 л упакованного сорбента. Элюируют водным раствором изопропилового спирта с уксусной кислотой. Проводят градиентное элюирование. Линейный градиент от 1-5% ИПС+0,3-2% УК до 8-15% ИПС+0,5-2% УК за 2,5 объема колонки, затем изократическое элюирование раствором, содержащим 8-15% ИПС+0,6% УК.
На второй стадии полученный раствор элюата подвергают очистке с помощью ионообменной хроматографии. Наносят раствор после первой стадии очистки на колонну из расчета 20-30 г гозерелина на 1 л упакованного сорбента. Элюируют водным раствором ацетата аммония. Концентрация ацетата аммония до 0,4М. Концентрация уксусной кислоты - 0,6%. Предпочтительно элюирование включает изократическое элюирование 0,1-0,3 М раствором ацетата аммония за 8 объемов колонны, затем линейный градиент от 0,2М до 0,3 М ацетатом аммония за 8 объемов колонки, затем изократическое элюирование 0,3 М ацетатом аммония.
На третьей стадии полученные фракции подвергают высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенно-фазовом сорбенте. Наносят раствор трипторелина на колонну из расчета 4-12 г гозерелина на 1 л упакованного сорбента. Элюируют водным раствором ацетонитрила с уксусной кислотой. Концентрация ацетонитрила 2-25%. Концентрация уксусной кислоты - 0,2-2%.. Фракции с содержанием гозерелина более 97,5% объединяют. Полученный раствор концентрируют в вакууме в 2 раза и проводят процедуру концентрирования на обращенно-фазовом сорбенте, элюируют водным раствором изопропилового спирта с уксусной кислотой. Полученный раствор упаривают на ротационном испарителе и лиофилизуют.
Блок-схема хроматографической очистки гозерелина
1. Взвешивание и ВЭЖХ-анализ гозерелина-сырца.
2. Растворение сырца.
3. Фильтрование.
4. Жидкостная хроматография низкого давления (ЖХ НД) на колонне с полистиролдивинилбензольным сорбентом марки LPS-500 (75-150 мкм).
5. Ионообменная хроматография низкого давления (ИОХ НД) на колонне с ионообменным сорбентом СПС-био-SP сульфопропил.
6. ВЭЖХ на колонке со сферическим силикагелем С18 Grace Vydac Denali.
7. Упаривание и лиофильная сушка.
Объектом настоящего изобретения является способ очистки гозерелина, включающий растворение гозерелина в водном растворе уксусной кислоты, фильтрование полученного раствора и последующую хроматографическую очистку, отличающийся тем, что для растворения используют 0,6% раствор уксусной кислоты (УК), добавляют к фильтрату изопропиловый спирт (ИПС) до концентрации 2%, затем перемешивают полученный раствор, хроматографическая очистка включает три стадии, где на первой стадии проводят жидкостную хроматографию низкого давления на колонне с полистиролдивинилбензольным сорбентом марки LPS-500 с размером 75-150 мкм, используя градиентное элюирование водным раствором, содержащим изопропиловый спирт и уксусную кислоту с линейным градиентом концентрации от 5% ИПС+0,6% УК до 10% ИПС+0,6% УК, затем изократическое элюирование водным раствором, содержащим 10% ИПС и 0,6% УК, на второй стадии полученный раствор элюата подвергают очистке методом ионообменной хроматографии на колонне, упакованной катионообменным сорбентом СПС-био-SP сульфопропил с размером частиц 70 мкм, с использованием в качестве элюирующего раствора водного раствора ацетата аммония с концентрацией ацетата аммония до 0,4М, на третьей стадии полученные фракции подвергают высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонне с обращенно-фазовом сорбентом - сферическим силикагелем Grace Vydac Denali с размером 10 мкм, с использованием в качестве элюирующего раствора водного раствора ацетонитрила с уксусной кислотой с концентрацией ацетонитрила 3,0-13% и уксусной кислоты - 0,25%, полученный раствор концентрируют в вакууме в 2 раза и проводят процедуру концентрирования на обращенно-фазовом сорбенте, элюируют водным раствором изопропилового спирта с уксусной кислотой, упаривают и лиофилизуют.
Сырец гозерелина представляет собой сухой порошка желтого цвета. Содержание гозерелина в сырце до 60% в сухом веществе.
Полученный сырец гозерелина анализируют с помощью ВЭЖХ (фиг. 1).
Пример хроматографической очистки гозерелина.
260 г сырца гозерелина растворяют в 4 л 0,6% водного раствора уксусной кислоты (УК), перемешивают 2 часа. При необходимости добавляют уксусную кислоту до рН=4-5.
Полученный раствор фильтруют через стеклянный фильтр пор. 3 с целлюлозным фильтром.
Если отфильтровать через стеклянный фильтр не удается, то проводят осветление раствора на установке проточной ультрафильтрации «Pellicon» с мембранами 100 кДа.
Уравновешивают колонну с сорбентом LPS-500 (сополимер стирола с дивинилбензолом марки LPS-500, диаметр колонны 150 мм, высота слоя сорбента 480 мм, диаметр частиц 75-150 мкм), прокачивая 20 л водного раствора, содержащего 1-5% изопропилового спирта (ИПС)+0,5-2% уксусной кислоты.
Добавляют к раствору гозерелина-сырца изопропиловый спирт до концентрации 2%, затем перемешивают полученный раствор.
Раствор 260 г сырца гозерелина в 4 л раствора, содержащего 0,6% УК + 2% ИПС, содержащий 150 г гозерелина, наносят на колонну. Расход при нанесении 300 мл/мин.
Проводят градиентное элюирование. Линейный градиент от 5% ИПС+0,6% УК до 10% ИПС+0,6% УК за 2,5 объема колонки, затем изократическое элюирование раствором, содержащим 10% ИПС+0,6% УК. Расход подвижной фазы - 400 мл/мин. УФ-детектирование при 254 нм.
Собранные фракции анализируют с помощью ВЭЖХ. Фракции с чистотой по хроматограмме выше 70% объединяют. Выход по целевому продукту на стадии предварительной очистки составляет 94%.
Объединенные фракции после предварительной очистки на LPS-500 подвергают очистке с помощью ионообменной хроматографии на колонне, упакованной катионообменным сорбентом СПС-био-SP сульфопропил (размер частиц 70 мкм, диаметр колонны 150 мм, высота слоя сорбента 300 мм).
Уравновешивают колонну с СПС-био-SP сульфопропил (SPS-bio), прокачивая 20 л до стабилизации базовой линии «0,6% УК».
Раствор, полученный после предварительной очистки на LPS-500, содержащий 140 г гозерелина в 32 л, наносят на колонну с SPS-bio. Расход при нанесении 250 мл/мин.
Проводят элюирование следующим образом: изократическое элюирование 0,2 М раствором ацетата аммония за 8 объемов колонны, затем линейный градиент от 0,2 М до 0,3 М ацетатом аммония за 8 объемов колонки, затем изократическое элюирование 0,3 М ацетатом аммония. Расход подвижной фазы 300 мл/мин. УФ-детектирование при 254 нм.
Собранные фракции анализируют с помощью ВЭЖХ. Фракции с чистотой по хроматограмме выше 80% объединяют. Выход по целевому продукту на стадии ионообменной хроматографии составляет 85%.
Фракции после очистки на SPS-bio подвергают ВЭЖХ на колонне аксиального сжатия диаметром 101 мм и высотой слоя сорбента 300 мм, заполненную обращено-фазовым сорбентом Grace Vydac Denali 10 мкм 100А.
К объединенному раствору после SPS-bio добавляют ацетонитрил (ACN) до концентрации 3% об./об (v/v) и УК в таком количестве, чтобы pH раствора был ниже 5, перемешивают с одновременным барботированием гелием в течение 15 мин.
Уравновешивают колонну водным раствором, содержащим 3% ACN и 0,25%) УК до стабилизации базовой линии.
Вводят в колонку 5 л раствора после SPS-bio, содержащего 10 г гозерелина.
Проводят изократическое элюирование водным раствором, содержащим 13% ACN + 0,25% УК, регенерируют колонну, промывая ее водным раствором, содержащим 50% ACN + 0,25% УК, и уравновешивают водным раствором, содержащим 3% ACN и 0,25% УК перед последующим нанесением. Расход подвижной фазы - 300 мл/мин. УФ-детектирование при 254 нм. Собранные фракции анализируют с помощью ВЭЖХ. Фракции с чистотой по хроматограмме выше 97,5% объединяют. Выход по целевому продукту на стадии ВЭЖХ составляет 90%.
Полученный раствор концентрируют в вакууме в 2 раза и проводят процедуру концентрирования на обращенно-фазовом сорбенте, элюируют водным раствором, содержащим 25% ACN + 0,25% УК.
Целевые фракции после ВЭЖХ упаривают на вакуумном испарителе Buchi Rotavapor R220 при температуре бани не выше 40°С до концентрации примерно 100-200 г/л и лиофилизуют.
Получают 105,4 г высушенного гозерелина.
Степень очистки более 99,5%.