ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ПОЛУКОЛИЧЕСТВЕННОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЛЕРГЕНСПЕЦИФИЧЕСКИХ IgE-АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА (IgE-AT-ИФА)

Полезная модель относится к медицине, а именно, к лабораторной диагностике.
К заболеваниям, вызванным недостаточностью иммунной системы, по данным ВОЗ, относятся и аллергические заболевания, число которых с каждым годом асе увеличивается Основными причинами значительного роста таких патологий во всем мире являются индустриализация, химизация, загрязнение окружающей среды. Распространенность таких заболеваний имеет более высокие значения в регионах (районах) с экологически неблагоприятной обстановкой, обусловленной антропогенными воздействиями на окружающую среду, и зависит как от характера аплергениого окружения, так и от климатогеографических особенностей (Пищевая аллергия у детей. Современные аспекты. - Ревякина В.А., Боровик Т.Э., Российский Аллергологический Журнал. N2, 2004.)
Следовательно, проблема аллергических заболеваний является важной медико-социальной проблемой современности, значение которой будет возрастать в последующие годы. Пути решения указанных проблем нашли свое отражение в Приказе Минздравсоцразвития России №342 от 16 мая 2005 г. где в приложении №1 «ПОЛОЖЕНИЕ ОБ ОРГАНИЗАЦИИ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ВРАЧА АЛЛЕРГОЛОГА-ИММУНОЛОГА» в разделе «Диагностика» обязательным пунктом вошло определение специфических IgE-антител к различным видам аллергенов.
Таким образом, определение уровня специфических антител класса IgE в диагностике аллергических заболеваний представляется важным критерием в комплексе диагностическкх мероприятий. А значит, решение практических медицинских вопросов этой проблемы в значительной степени зависит от качества специфической аллергодиагностики in vitro.
Среди лабораторных методов в специфической диагностике аллергий наиболее информативными являются иммунологические: радиоаллергосорбентный тест (PACT) и метод иммуноферментного анализа (ИФА), выявляющие с большой достоверностью специфические IgE и IgG-антитела к различным пищевым аллергенам. Диагностическая ценность данных методов очень высока и составляет 87-85%, информативность же кожного тестирования пищевыми аллергенами - лишь 49%. (Аллергические болезни. Диагностика и лечение. Под ред. Р.Паттерсона. М., Гэотар Мед., 2000, с.733.). Более приемлема для клинического использования, по мнению исследователей, полуколичественная оценка (Комарова М.В. Синельникова Л.В. Фуфыгина Е.Г. К вопросу об исследовании пищевой непереносимости по немедленному и замедленному механизмам. - Сборник научных трудов: "Екатеринбургский консультативно-диагностический центр: итоги 15-летней деятельности в практическом здравоохранении", - Екатеринбург, 2004. - С.229-230).
На Российском рынке определение уровня специфических IgE-антител широко представлено тест-системами зарубежных компаний. Из отечественных производителей тест-системы по определению специфических IgE-антител к различным видам аллергенов выпускают в ФГУП «Аллерген». г.Ставрополь.
Компания "Хитачи Кемикл Диагностике Инк." США) предлагает хемилюминесцентный метод определения специфических IgE и IgG - множественный аллергосорбентный тест с применением хемилюминесцентного анализа (MAST-CLA). Сущность метода MAST-CLA заключается в проведении реакции аллергенспецифический IgE (IgG) с последующей меткой образовавшегося комплекса фотореагентом и определении его свечения, интенсивность которого пропорциональна концентрации специфического IgE (IgG) в сыворотке пациента.
Компания Dade Behring (США) предлагает измерение специфических иммуноглобулинов крови на основе нефелометрического метода. Метод основан на реакции преципитации комплекса «белок - высоко специфичная сыворотка». Для этого производятся измерения бокового рассеяния лазерного излучения на длине волны 480 им. с использованием автоматического анализатора.
Голландская фирма "Medland Systems" предлагает определение специфических IgЕ и IgG в сыворотке крови с использованием алектредиагностического хемилюминисцентного аппарата CLA-1.
Предлагаемые для специфической диагностики аллергены иммобилизованы на твердофазном носителе, в роли которого выступает нитроцелотктозный диск (аллергодиск) диаметра лунки микропланшета (при определении специфических IgE-антител) либо поверхность пластиковых пробирок или лунок микропланшета (при определении специфических IgG-антител).
Milenia-Biotec, Германия, предлагает тест-системы, в которых диагностируемые аллергены представлены в виде тест-кассет.
Наиболее близкой по техническому решению является тест-система для определения специфических IgE-антител к различным аллергенам ФГУП «Аллерген», г. Ставрополь.
Принцип метода: аллергены иммобилизованы на твердофазном носителе (полистироловые 96-луночные планшеты наборные или сплошные). Калибраторы предварительно разводят титрованием. Сыворотку крови и разведенные калибраторы по 100 мкл вносят в лунки планшета. Аллергены связываются со специфическими антителами, присутствующими в сыворотке крови пациента. Избыток антител удаляется на стадии промывки. На следующем этапе ферментмеченые антитела связываются с аллерген-антительным комплексом. После промывки и удаления несвязавшихся компонентов добавляется субстратный раствор, состоящий из ортофенилендиамина и цитратного буферного раствора, взаимодействующий с ферментом, в результате образуется цветной комплекс. Оптическая плотность полученного раствора прямо пропорциональна концентрации специфических IgE-антител в образце сыворотки.
Однако, указанная тест-система для определения специфических иммуноглобулинов класса Е, имеет рад существенных недостатков:
- дополнительные затраты времени и реактивов на предварительное разведение и титрование калибраторов;
- использование большого (100 мкл) сыворотки пациента на 1 аллерген, что затрудняет диагностику широкого спектра аллергенов у одного пациента;
- использование ортофенилендиамина, ядовитого веицества, в качестве хромогена;
- большие затраты субстратной смеси.
Вышеперечисленное затрудняет широкое использование тест-системы в практическом здравоохранении.
Поставлена задача разработки тест-системы для полуколичественного иммунофермеитного определения специфических IgE-антител к широкому спектру отечественных аллергенов в сыворотке крови пациентов (IgE-AT-ИФА).
Поставленная задача осуществляется посредством предлагаемой тест-системы IgE-AT-ИФА, в состав которой входят следующие реагенты, упакованные в одной коробке:
Референс-реагент 1 (Р1) - 96-луночные наборные стрипированнные планшеты размером 125×85, из прозрачного полимерного материала (кат ЛЬ №95029100 Thermo Labsystems, кат. №70507 Greiner) с горизонтальными и вертикальными рядами лунок (8×12). используемые в качестве твердофазного носителя, на которых иммобилизуются моноклональные анти-IgЕ-антитела. Предлагаемые наборные планшеты обладают высоким качеством сорбции, оптическая плотность каждой лунки планшета стандартизирована и не превышает 0,04 единиц оптической плотности (ОП). В лунках вертикального ряда №1 находятся иммобилизованные моноклональные антитела (МКАТ) анти IgE, а в лунках вертикальных рядов с №2 по №12 находятся иммобилизованные аллергены, очищенные, стандартизованные по содержанию азота белка (ОАО "Биомед" им. И.И.Мечникова).
Референс-реагент 2 (Р2) - калибровочные пробы: КПА, КПВ, КПС, КПО, А КПО -содержащие известное количество IgE и соответствующие по ОП - 4, 3, 2, 1, 0 классам (калибрование по стандарту WHO 67/87), жидкие, готовые к применению.
Реагент 3 (Р3) - полистироловые наборные стрипы фирмы "Thermo Lab-systems" (Финляндия) или фирмы "Greiner" (Германия) покрытые различными аллергенами с концентрацией 40 мкг/мл путем физической сорбции - 22 стрила (ряда) по 11 стрипов (рядов) разной специфичности в каждом планшете. Использование наборных стрипов указанных фирм позволяет использовать единичные лунки, что дает возможность избежать периода накопления необходимого для цельных или стриповых 96-луночных планшет сывороток пациентов и сократить время постановки диагноза.
Реагент 4 (Р4) - конъюгат (антитела моноклональные диагностические против легких и тяжелых полипептидных цепей иммуноглобулинов Е человека с
ферментом пероксидазой из хрена. Рабочее разведение конъюгата 1:100 (изготовлен в Санкт-Петербурге ФСП №42-0190-0593-00 от 16.01.2002 г.). Использование указанного конъюгата позволяет улавливать только специфические IgE-антитела.
Реагент 5 (Р5) - промывающий раствор, концентрированный, рН 7,4. Компоненты трио-буфера подобраны с учетом отсутствия перекрестных реакций с другими реагентами тест-системы, что исключает регистрацию неспецифических реакций
Реагент 6 (Р6) -- субстрат-хромогенная смесь [ перекись водорода (ГОСТ 177-88), 3 мМ, в 31 мМ цитратном (кислота лимонная ТУ 6-09-584-75) буфере: тетраметилбензидин - ТМБ (ЗАО "Диаплюс", кат. №0763600)], Система ТМБ-субстрат обеспечивает примерно в 10 раз более высокую чувствительность выявления пероксидазы, чем система ОФД-ЦФР (ортофенилендиамин - цитратно-фосфатный раствор) и, кроме того, менее токсична.
Реагент 7 (Р7) - стоп-реагент (кислота серная (ГОСТ 4204-79). 1N].
Чувствительность полуколичественного метода анализа оценивается минимальным уровнем IgE-антител (1 класс), при котором cuie можно обнаружить в иммуноферментной реакции различие в оптической плотности между КПО и КПО, не содержащей IgE-антитела.
Точность определяется способностью тест-системы давать одинаковые результаты при тестировании одной и той же сыворотки на одном стрипе. Выражается коэффициентом вариации различных специфичностей в 8 репликантах каждого образца сыворотки.
Перед началом работы набор извлекают из холодильника и выдерживают в течение 30 мин. при комнатной температуре. Реагенты перед использованием тщательно перемешивают и готовят рабочие растворы:
Промывающий раствор, 10-кратный концентрат, разводят в 10 раз дистиллированной водой. К одному объему Р5 добавляют 9 объемов дистиллированной воды, рН 7,4.
Рабочий раствор конъюгата МКАТ анти IgE готовят путем разведения в 100 раз промывающим раствором.
Рабочий раствор субстрат хромогенной смеси готовится смешиванием равных частей Р6 и Р7. Раствор стабилен в течение 1 часа после приготовления.
Во все лунки стрипов вносят по 90 мкл промывающего раствора. В лунки А-Н первого ряда вносят по 10 мкл калибраторов в дублях. 8 остальные лунки вносят по 10 мкл исследуемых сывороток. Планшет накрывают крышкой, перемешивают на шейкере или вручную в течение 1 мин, татем помещают в термостат на 1 час при t° +37°С.
Содержимое лунок удаляют путем стряхивания из перевернутого планшета. Во все лунки планшета вносят по 150 мкл промывающего раствора, удаляют путем стряхивания. Процедуру повторяют 3 раза. Во все лунки вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата. Планшеты инкубируют в течение 1 часа при температуре +37°С. Повторяют процедуру промывания 3 раза промывающим раствором и 2 раза -дистиллированной водой.
Во все лунки планшета вносят по 100 мкл субстрат хромогенной смеси. Выдерживают в защищенном от света месте при комнатной температуре в течение 5-30 мин.
Вносят стоп-реагент по 50 мкл в каждую лунку планшета. Учет проводят на спектрофотометре вертикального тасанирования при длине волны 450 нм. Анализ считается действительным, если:
- ОП КПО не превышает 0,2;
- ОП КПА превышает 1,5;
- ОП КПО превышает показатели ОП КПО.
Рассчитывают среднюю арифметическую между показателями ОП дублей каждого из тестируемых образцов сывороток. Если ОЛ тестируемой сыворотки выше ОП раствора КПА, то уровень содержания аллергенспецифических IgE-антител соответствует 3 классу и т.д. В учете результатов реакции, с целью контроля за специфической и неспецифической терапией, предлагается определение количественного содержания специфических IgE-антител по калибровочному графику. На линейной миллиметровой бумаге на оси У откладываются показатели оптической плотности, на оси Х - значения концентрации калибраторов.
Сравнительный анализ исследований сыворотки пациентов в предлагаемой полезной модели проводили с исследованиями этих же образцов сывороток с использованием диагностического набора по определению специфических IgE - антител к пищевым аллергенам фирмы ФГУП «Аллеррен», г. Ставрополь.
Исследовалась сыворотка 100 пациентов, мужчин и женщин в возрасте от 18 до 60 лет (средний возраст 35±3,1). Обследуемые пациенты были разделены на 2 группы в соответствии с диагнозами:
- 1 группу составили 70 человек (средний возраст 31±3,1) с диагнозом: аллергический ринит;
- 2 группу - 30 человек (средний возраст 34±2,1) составили практически здоровые сотрудники лаборатории Центра Специализированных видов медицинской помощи.
Результаты определения специфических IgE-антител между тест- системой IgE-AT-ИФА и тест-системой фирмы ФГУП «Аллерген» в контрольной и опытной группах представлены в Таблицах 1 и 2 соответственно, Существенные отличия, отмечаемые в результатах оценок аллергенов домашней и библиотечной пыли. подсолнечника, райграса, полыни, березы, ольхи могут быть обусловлены более высокой чувствительностью субстрат-хромогенной смеси. В остальном значимых отличий в показателях не отмечено.
Таким образом, полученные результаты сравнения позволяют сделать вывод о том, что предлагаемая полезная модель в виде тест-системы для полуколичественного иммуноферментного определения специфических IgE-антител в сыворотке крови человека (IgE-AT-ИФА) может конкурировать как с зарубежными, так и с отечественными аналогами. Минимальное количество сыворотки, расходуемой на 1 аллерген (10 мкл) позволяет рекомендовать использование тест-системы как в практическом здравоохранении вообще, так и в педиатрии, в частности.
Предлагаемая полезная модель:
1. Позволяет определять специфические IaE-антитела к широкому спектру отечественных аллергенов, определяемых как «региональные»;
2. Дешева, с достаточно коротким временем постановки, что позволяет ее использование в скрининговых исследованиях;
3. Безопасна в диагностике;
4. Высокочувствительна и воспроизводима;
5. Использование предлагаемой полезной модели возможно в любой клинической лаборатории, имеющей планшетный или стриповый спектрофотометр.
Таблица 1
Уровень общего IgE у больных аллергическим ринитом (n=70)
Уровень общего IgE (M±m, ME/мл)
Количество больных пищевой аллергией
146,9±14,3
34
356,3±15,2
23
604,7±28,8
13
Таблица 2
Уровень общего IgE в контрольной группе (n=30)
Уровень общего IgE (M±m, ME/мл)
t Количество обследуемых
42,7±14,2
16
136,5±9,3
13
>200
1
Таблица 3
Сравнение диагностической эффективности тест-системы IgE-AT-ИФА и набора по определению специфических IgE-антител к пищевым аллергенам фирмы ФГУП «Аллерген» г. Ставрополь
Наименование аллергена
IgG-AT-ИФА - классы (частота выявления, %)
ФГУП «Аллерген» классы (частота выявления, %)
0
1
2
3
4
0
1
2
3
4
n
%
n
%
n
%
n
%
n
%
n
%
n
%
n
%
n
%
n
%
Апельсин
12
17,1
21
30
27
38,6
9
12,9
7
1,4
10
14,3
25
35,7
28
40
7
10
0
0
Мандарин
14
20
25
35,7
29
41,4
2
2,9
0
0
16
22,8
23
32,8
30
42,8
3
4,3
0
0
Лимон
9
12,9
18
25,7
29
41,4
12
17,1
2
2,9
11
15,7
19
27,1
26
37,1
12
17,2
2
2,9
Белок куриных яиц
10
14,3
23
32,8
21
30
11
15,7
4
5,7
13
18,6
21
30
22
31,4
9
12,9
5
7,1
Желток куриных яиц
25
35,7
14
20
29
41,4
2
2,9
0
0
24
34,3
16
22,8
27
38,6
2
2,9
1
1,4
Домашняя пыль
19
27,1
20
28,6
23
32,9
6
8,6
2
2,9
28
40
20
29
20
29
2
2,9
0
0
Библиотечная пыль
21
30
21
30
24
34,3
3
4,3
1
1,4
23
32,8
23
32,8
22
31,4
2
2,9
0
0
Райграс
17
24,3
21
30
23
32,8
7
10
2
2,9
20
29
24
34,3
20
29
5
7,1
1
1,4
Полынь
28
40
14
20
17
24,3
10
14,3
1
1,4
36
51,4
15
21,4
14
20
5
7,1
0
0
Береза
24
34,3
17
24,3
20
29
8
11,4
1
1,4
21
30
21
30
24
34,3
4
5,7
0
0
Ольха
24
34,3
12
17,2
33
48,1
1
1,4
1
1,4
21
30
14
20
35
50
0
0
0
0
Хек
19
27,1
23
32,8
23
32,8
4
5,7
1
1,4
22
31,4
21
30
24
34,3
2
2,9
1
1,4
Подсолнечник
21
30
21
30
19
27,1
7
10
2
2,9
26
37,1
22
31,4
18
25,7
4
5,7
0
0
Гречневая крупа
26
37,1
23
32,8
12
17,1
9
12,9
0
0
27
38,6
25
35,7
14
20
4
5,7
0
0
Овсяная крупа
27
38,6
22
31,4
15
21,4
6
8,6
0
0
27
38,6
26
37,1
11
15,7
5
7,1
1
1,4
Пшеничная мука
22
31,4
18
25,7
24
34,3
5
7,2
1
1,4
25
35,7
20
29
21
30
4
5,7
0
0
Ржаная мука
16
22,8
19
27,1
27
38,6
6
8,6
2
2,9
19
27,1
27
38,6
16
22,8
7
10
1
1,4
Рисовая крупа
23
32,8
12
17,2
23
32,8
9
12,9
3
4,3
21
30
13
18,6
24
34,3
11
15,7
1
1,4
Ячменная крупа
24
34,3
23
32,8
19
27,1
3
4,3
1
1,4
25
35,7
25
35,7
17
24,3
3
4,3
0
0
Примечание: жирным шрифтом выделены аллергены, показатели которых значительно отличаются от показателей тест-системы фирмы ФГУП «Аллерген