КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ GLP-1 И ПУТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
GLP-1-BASED COMPOSITIONS AND THEIR APPLICATION METHODS

Настоящее изобретение относится к области фармацевтических композиций, содержащих семаглутид, представляющий собой пептид на основе GLP-1.
Уровень техники
Как известно, пептиды на основе GLP-1 склонны к потере стабильности в жидких растворах, например к потере физической стабильности. Поэтому необходимы жидкие фармацевтические композиции, содержащие пептиды на основе GLP-1, характеризующиеся еще лучшей стабильностью. Такой улучшенной стабильностью может быть физическая стабильность и/или химическая стабильность.
Краткое описание
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к жидким фармацевтическим композициям, содержащим семаглутид и не более 0,01% (вес./вес.) фенола. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к наборам, содержащим фармацевтическую композицию, определенную в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, определенной в настоящем документе, для применения в медицине.
Описание
Настоящее изобретение относится к жидким фармацевтическим композициям, содержащим семаглутид, представляющий собой пептид на основе GLP-1, и не более 0,01% (вес./вес.) фенола. Неожиданно авторами настоящего изобретения было обнаружено, что такие композиции обладают улучшенной химической и/или физической стабильностью. В некоторых вариантах осуществления композиция не содержит фенола. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 0,01-10 мг/мл семаглутида. В некоторых вариантах осуществления композиция характеризуется рН в диапазоне от 6,0 до 10,0, как например от 7,0 до 7,8.
В некоторых вариантах осуществления композиция по настоящему изобретению представляет собой жидкую фармацевтическую композицию, содержащую семаглутид и не более 0,01% (вес./вес.) фенола, при этом указанная композиция
a. предназначена для парентерального введения;
b. представляет собой водный раствор, содержащий по меньшей мере 60% вес./вес. воды; или
c. дополнительно содержит одно или более фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ, выбранных из группы, состоящей из буфера или средства для обеспечения изотоничности.
В некоторых вариантах осуществления композиция по настоящему изобретению представляет собой жидкую фармацевтическую композицию, содержащую семаглутид, не более 0,01% (вес./вес.) фенола и необязательно одно или более фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ, при этом композиция предназначена для парентерального введения, такого как подкожное введение.
В некоторых вариантах осуществления композиция по настоящему изобретению представляет собой жидкую фармацевтическую композицию, содержащую семаглутид, не более 0,01% (вес./вес.) фенола, по меньшей мере 60% вес./вес. воды и необязательно одно или более фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ.
В некоторых вариантах осуществления термин «стабильность», используемый в настоящем документе, относится к стабильности семаглутида в жидкой фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления стабильностью является химическая стабильность пептида на основе GLP-1 (например, определяемая с помощью HPLC, как например анализ (I), описанный в настоящем документе) и необязательно физическая стабильность пептида на основе GLP-1 (например, определяемая с помощью анализа с тиофлавином Т, как например анализ (II), описанный в настоящем документе).
В некоторых вариантах осуществления термин «химическая стабильность», используемый по отношению к семаглутиду в контексте настоящего документа, относится к сохранению ковалентными связями соединения, представляющего собой семаглутид, своей интактности. В некоторых вариантах осуществления химическую стабильность пептида на основе GLP-1 определяют с помощью HPLC, как например анализ (I), описанный в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления композиция обладает химической стабильностью, если ее ковалентные связи остаются интактными у по меньшей мере 80% (вес/об.) указанных пептидов на основе GLP-1 после хранения в течение 3 месяцев при 25°C. В некоторых вариантах осуществления химическую стабильность семаглутида определяют с помощью анализа (IV), описанного в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления термин «физическая стабильность» по отношению к семаглутиду, используемый в контексте настоящего документа, относится к семаглутиду, практически не образующему агрегатов, например, в виде формирования фибрилл. В некоторых вариантах осуществления физическую стабильность определяют с помощью анализа с тиофлавином Т, как например анализ (II), описанный в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления композиция по настоящему изобретению представляет собой стабильную фармацевтическую композицию. Термин «стабильная фармацевтическая композиция» при применении в настоящем документе относится к фармацевтической композиции, например раствору или суспензии, содержащей пептид на основе GLP-1, и при этом такая композиция после хранения содержит по меньшей мере 80% (вес./об.) указанного пептида на основе GLP-1 (например, после хранения в состоянии покоя в течение 3 месяцев при 25°C). Условия хранения для тестирования стабильности могут предусматривать 2-8°C, как, например, 5°C, или по меньшей мере 2,5 года при 5°C. В качестве альтернативы условия хранения для тестирования стабильности могут предусматривать по меньшей мере 4 недели, как например 6 недель или 3 месяца, необязательно при 30°C. Условия хранения данной стабильной фармацевтической композиции могут предусматривать температуру 5°С в течение 1 года или 2 лет. Условия хранения данной стабильной фармацевтической композиции могут предусматривать температуру 5°С в течение 3 лет. В качестве альтернативы условия такого хранения могут предусматривать температуру 25°С в течение 24 часов или 1 недели. В еще одном альтернативном варианте условия такого хранения могут предусматривать комнатную температуру в течение двух месяцев, как например не более двух месяцев.
В некоторых вариантах осуществления для химической стабильности пептида на основе GLP-1 необходимо, чтобы в конце периода хранения у по меньшей мере 80% (вес./об.), как например у по меньшей мере 90% (вес./об.) или у по меньшей мере 95% (вес./об.), указанного пептида на основе GLP-1 оставались интактными его ковалентные связи. В некоторых вариантах осуществления для химической стабильности пептида на основе GLP-1 необходимо, чтобы в конце периода хранения у по меньшей мере 95% (вес./об.), как например у по меньшей мере 97% (вес./об.) или у по меньшей мере 99% (вес./об.), указанного пептида на основе GLP-1 оставались интактными его ковалентные связи.
Композиция по настоящему изобретению содержит не более 0,01% (вес./вес.) фенола. В некоторых вариантах осуществления композиция по сути не содержит фенола.
Фармацевтические композиции
Термины «фармацевтическая композиция» и «композиция» в настоящем документе применяют взаимозаменяемо, и они относятся к фармацевтическим композициям, подходящим для введения нуждающемуся в этом субъекту.
В некоторых вариантах осуществления композиция содержит от 0,01 до 100 мг/мл семаглутида. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 0,1-50 мг/мл, как например 0,5-25 мг/мл или 1-15 мг/мл, семаглутида. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 0,1-10 мг/мл, как например 0,5-5 мг/мл или 1-2 мг/мл, семаглутида. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 0,01-10 мг/мл, как например 0,01-5 мг/мл, семаглутида. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит не более 9 мг/мл, как например не более 8 мг/мл или не более 7 мг/мл, семаглутида. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит не более 6 мг/мл, как например не более 5 мг/мл или не более 4 мг/мл, семаглутида. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит не более 3 мг/мл, как например не более 2 мг/мл или не более 1 мг/мл, семаглутида. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит по меньшей мере 0,01 мг/мл, как например по меньшей мере 0,02 мг/мл или 0,05 мг/мл, семаглутида. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 1,34 мг/мл семаглутида.
В некоторых вариантах осуществления композиция по настоящему изобретению характеризуется рН в диапазоне от 3 до 10, как например рН от 6 до 10 или от 6 до 9. В некоторых вариантах осуществления композиция по настоящему изобретению характеризуется рН в диапазоне рН от 6,5 до 8,5, как например рН от 7,0 до 7,8.
В некоторых вариантах осуществления композиция по настоящему изобретению содержит одно или более фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ.
В некоторых вариантах осуществления композиция по настоящему изобретению содержит средство для обеспечения изотоничности, такое как пропиленгликоль. В некоторых вариантах осуществления средство для обеспечения изотоничности представляет собой пропиленгликоль или хлорид натрия.
В некоторых вариантах осуществления композиция по настоящему изобретению содержит буфер, такой как фосфатный буфер, TRIS, цитрат, или не содержит буфера. В некоторых вариантах осуществления фосфатный буфер представляет собой натрий-фосфатный буфер, такой как динатрий-гидрофосфатный.
В некоторых вариантах осуществления композиция по настоящему изобретению не содержит консерванта.
Композиция по настоящему изобретению находится в виде жидкой фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления жидкая фармацевтическая композиция представляет собой раствор или суспензию. В некоторых вариантах осуществления композиция по настоящему изобретению находится в виде раствора, такого как водный раствор. В некоторых вариантах осуществления термин «водный раствор», применяемый в настоящем документе, относится к раствору, содержащему по меньшей мере 60% вес./вес. воды. В некоторых вариантах осуществления водный раствор содержит 60-99% вес./вес. воды. В некоторых вариантах осуществления водный раствор содержит по меньшей мере 75% вес./вес. воды, как например по меньшей мере 80% вес./вес. воды или по меньшей мере 85% вес./вес. воды. В некоторых вариантах осуществления водный раствор содержит по меньшей мере 90% вес./вес. воды, как например по меньшей мере 92% вес./вес. воды или по меньшей мере 94% вес./вес. воды.
Семаглутид
6.26
-
+
2
3
Семаглутид, представляющий собой пептид на основе GLP-1, можно получить, как описано в WO2006/097537, пример 4. Семаглутид также известен как N-{18-[N-(17-карбоксигептадеканоил)-L-γ-глутамил]-10-оксо-3,6,12,15-тетраокса-9,18-диазаоктадеканоил}-[8-(2-амино-2-пропановая-кислота),34-L-аргинин]глюкагоноподобный пептид 1(7-37) человека, см. WHO Drug Information Vol. 24, No. 1, 2010. В некоторых вариантах осуществления семаглутид может присутствовать в композиции в своей полностью или частично ионизированной форме; например, одна или более групп карбоновой кислоты (-COOH) могут быть депротонированы в карбоксилатную группу (-COO), и/или одна или более аминогрупп (-NH) могут быть протонированы в группу -NH. В некоторых вариантах осуществления семаглутид добавлен в композицию в форме соли.
Введение и наборы
Композиция по настоящему изобретению предназначена для парентерального введения. В некоторых вариантах осуществления композиция предназначена для подкожного введения.
В некоторых вариантах осуществления композиция по настоящему изобретению предназначена для введения один раз в неделю. В некоторых вариантах осуществления композиция по настоящему изобретению предназначена для введения один раз в день, один раз в два или один раз в три дня.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к набору, содержащему фармацевтическую композицию, определенную в настоящем документе, и инструкции по применению. В некоторых вариантах осуществления инструкции по применению включают вкладыш в упаковку лекарственного средства.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к набору, содержащему фармацевтическую композицию, определенную в настоящем документе, и устройство для осуществления инъекции. В некоторых вариантах осуществления устройство для осуществления инъекции выбрано из группы, состоящей из шприц-ручки с длительным сроком эксплуатации и предварительно заполненной шприц-ручки. Примерами шприц-ручек с длительным сроком эксплуатации являются NovoPen 4 или NovoPen 5 (обе от Novo Nordisk A/S, Дания). Примером предварительно заполненной шприц-ручки является FlexPen (Novo Nordisk A/S, Дания).
Показания
В некоторых вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению предназначены для применения в медицине. В некоторых вариантах осуществления композицию по настоящему изобретению можно применять для следующих видов терапевтического лечения:
(i) предупреждения и/или лечения всех форм диабета, таких как гипергликемия, диабет 2 типа, нарушение толерантности к глюкозе, диабет 1 типа, инсулинонезависимый диабет, MODY (диабет взрослого типа у молодых), гестационный диабет, и/или для снижения уровня HbA1c;
(ii) задержки или предупреждения прогрессирования диабетического заболевания, как например прогрессирования сахарного диабета 2 типа, задержки прогрессирования нарушения толерантности к глюкозе (IGT) до инсулинозависимого сахарного диабета 2 типа и/или задержки прогрессирования инсулинонезависимого сахарного диабета 2 типа до инсулинозависимого сахарного диабета 2 типа;
(iii) предупреждения и/или лечения расстройств приема пищи, таких как ожирение, например, путем уменьшения потребления пищи, снижения массы тела, подавления аппетита, вызывания чувства сытости; лечения или предупреждения расстройства приема пищи, нервной булимии и/или ожирения, вызванного введением антипсихотического средства или стероида; снижения перистальтики желудка и/или задержки опорожнения желудка.
В некоторых вариантах осуществления показание представляет собой (i). В некоторых вариантах осуществления показание представляет собой (ii). В еще одном дополнительном конкретном аспекте показание представляет собой (iii). В некоторых вариантах осуществления показание представляет собой сахарный диабет 2 типа и/или ожирение.
В некоторых вариантах осуществления способ или применение включает предупреждение, лечение, уменьшение интенсивности и/или индуцирование при одном или более из заболеваний или состояний, определенных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления показание представляет собой (i) и (iii). В некоторых вариантах осуществления показание представляет собой (ii) и (iii). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение включает введение эффективного количества пептида на основе GLP-1. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к введению эффективного количества пептида на основе GLP-1.
2
Как правило, все субъекты, страдающие от ожирения, также считаются страдающими от избыточного веса. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения ожирения. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к применению композиции для лечения или предупреждения ожирения. В некоторых вариантах осуществления субъект, страдающий от ожирения, представляет собой человека, такого как взрослый человек или человек детского возраста (включая младенцев, детей и подростков). Индекс массы тела (BMI) представляет собой показатель телесного жира с учетом роста и веса. Формула для расчета представляет собой BMI=вес в килограммах/рост в метрах. Субъект-человек, страдающий от ожирения, может иметь BMI≥30; при этом данный субъект может также обозначаться как имеющий ожирение. В некоторых вариантах осуществления субъект-человек, страдающий от ожирения, может иметь BMI≥35 или BMI в диапазоне от ≥30 до <40. В некоторых вариантах осуществления ожирение представляет собой тяжелую форму ожирения или морбидное ожирение, при этом субъект-человек может иметь BMI≥40.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения возникновения избыточного веса, необязательно в присутствии по меньшей мере одной сопутствующей патологии, связанной с весом. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к применению композиции для лечения или предупреждения возникновения избыточного веса, необязательно в присутствии по меньшей мере одной сопутствующей патологии, связанной с весом. В некоторых вариантах осуществления субъект, страдающий от избыточного веса, представляет собой человека, такого как взрослый человек или человек детского возраста (включая младенцев, детей и подростков). В некоторых вариантах осуществления субъект-человек, страдающий от избыточного веса, может иметь BMI≥25, например BMI≥27. В некоторых вариантах осуществления субъект, представляющий собой человека, страдающий от избыточного веса, имеет BMI в диапазоне от 25 до <30 или в диапазоне от 27 до <30. В некоторых вариантах осуществления сопутствующая патология, связанная с весом, выбрана из группы, состоящей из гипертензии, диабета (такого как диабет 2 типа), дислипидемии, высокого уровня холестерина и обструктивного апноэ во сне.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу снижения массы тела. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к применению композиции по настоящему изобретению для снижения массы тела. Человек, который будет подвергаться снижению массы тела в соответствии с настоящим изобретением, может иметь BMI≥25, например BMI≥27 или BMI≥30. В некоторых вариантах осуществления человек, который будет подвергаться снижению массы тела в соответствии с настоящим изобретением, может иметь BMI≥35 или BMI≥40. Термин «снижение веса тела» может включать лечение или предупреждение ожирения и/или избыточного веса.
В некоторых вариантах осуществления, как используется в данном документе, конкретные значения, данные в отношении чисел или интервалов, могут пониматься как конкретное значение или как приблизительно конкретное значение (например, плюс или минус 10 процентов от конкретного значения).
Варианты осуществления настоящего изобретения
Ниже приведены неограничивающие варианты осуществления настоящего изобретения.
1. Жидкая фармацевтическая композиция, содержащая семаглутид и не более 0,01% (вес./вес.) фенола.
2. Жидкая фармацевтическая композиция, содержащая семаглутид и практически не содержащая фенола.
3. Композиция по п. 1 или п. 2, где указанная композиция не содержит фенола.
4. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанная композиция представляет собой водный раствор, содержащий по меньшей мере 60% вес./вес. воды, как например по меньшей мере 70% вес./вес. воды или по меньшей мере 80% вес./вес. воды.
5. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где концентрация семаглутида в указанной композиции составляет 0,5-10 мг/мл.
6. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный семаглутид представлен в виде фармацевтически приемлемой соли.
7. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанная композиция содержит одно или более фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ.
8. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанная композиция содержит одно или более средств для корректировки pH, таких как HCl, NaOH или ацетат.
9. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанная композиция содержит буфер и/или средство для обеспечения изотоничности.
10. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный буфер присутствует в указанной композиции в концентрации 0,01-50 мМ.
11. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный буфер представляет собой фосфатный буфер.
12. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанный фосфатный буфер выбран из группы, состоящей из натрий-дигидрофосфатного, динатрий-гидрофосфатного и натрий-фосфатного буферов.
13. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанное средство для обеспечения изотоничности присутствует в указанной композиции в концентрации от 8 мг/мл до 50 мг/мл, как например от 14 мг/мл до 30 мг/мл.
14. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанное средство для обеспечения изотоничности представляет собой пропиленгликоль.
15. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанная композиция не содержит консерванта.
16. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанная композиция характеризуется рН в диапазоне от 6,0 до 10,0.
17. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанная композиция предназначена для парентерального введения.
18. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где указанная композиция предназначена для подкожного введения.
19. Набор, содержащий фармацевтическую композицию по любому из предыдущих пунктов и инструкции по применению.
20. Набор, содержащий фармацевтическую композицию по любому из предыдущих пунктов и устройство для осуществления инъекции для введения указанной композиции субъекту, где указанное устройство для осуществления инъекции выбрано из группы, состоящей из шприц-ручки с длительным сроком эксплуатации и предварительно заполненной шприц-ручки.
21. Фармацевтическая композиция по любому из предыдущих пунктов для применения в медицине.
22. Фармацевтическая композиция для применения по любому из предыдущих пунктов для применения в лечении диабета или ожирения.
23. Способ предупреждения или лечения диабета или ожирения, где фармацевтическую композицию по любому из предыдущих пунктов вводят нуждающемуся в этом субъекту.
Примеры
Общие способы и характеристика
Получение композиций на основе семаглутида
Если не указано иное, композиции на основе семаглутида получали путем растворения буфера (например, дигидрата динатрийгидрофосфата), средства для обеспечения изотоничности (например, пропиленгликоля) и необязательно консерванта (фенола) в воде. В вышеуказанном растворяли семаглутид, рН доводили до 7,4 с использованием гидроксида натрия и/или соляной кислоты, и, наконец, композицию стерилизовали фильтрацией через 0,22 мкм стерильный фильтр.
Получение композиций на основе лираглутида
Если не указано иное, композиции на основе лираглутида получали из раствора 1 и раствора 2: раствор 1 получали путем растворения буфера (дигидрата динатрийгидрофосфата), средства для обеспечения изотоничности (маннита) и необязательно консерванта (фенола) в воде. Раствор 2 получали путем растворения лираглутида при медленном перемешивании. Раствор 1 и раствор 2 смешивали, рН доводили до 8,15 с помощью гидроксида натрия и/или соляной кислоты, и, наконец, композицию стерилизовали фильтрацией через 0,22 мкм стерильный фильтр.
Анализ (I): определение содержания высокомолекулярных белков (HMWP) в композициях на основе семаглутида
Определение содержания HMWP проводили с помощью эксклюзионной хроматографии (SE-HPLC) с применением колонки Waters Insulin HMWP с подвижной фазой на основе хлорида натрия, фосфата натрия, фосфорной кислоты и изопропанола с помощью изократического элюирования и детекции при 280 нм. Содержание HMWP приведено в % как объединенная площадь хроматографических пиков, элюирующихся раньше, чем пик мономера семаглутида (т.е. пиков HMWP), относительно общей площади пиков HMWP и мономера семаглутида.
Анализ (II): физическая стабильность композиций на основе семаглутида, оцениваемая с помощью ThT
Целью данного анализа являлась оценка физической стабильности пептида на основе GLP-1 в водном растворе.
Низкая физическая стабильность пептида или белка может привести к образованию амилоидных фибрилл. Фибриллы представляют собой высокоупорядоченные в отношении структуры нитевидные макромолекулярные структуры, образовавшиеся в результате агрегации растворимых белков и характеризующиеся преобладанием структуры бета-листа. Зрелые фибриллы нерастворимы и устойчивы к разрушению. В целях обеспечения качества лекарственного средства и безопасности пациента необходимо минимизировать и контролировать события фибриллообразования в фармацевтических композициях на основе терапевтических пептидов и белков. Агрегацию белков, в том числе фибриллообразование, можно оценить путем визуальной инспекции образца. Фибриллообразование можно оценить с использованием тиофлавина Т (ThT), низкомолекулярного индикаторного зонда с высокой специфичностью к фибриллам. ThT характеризуется отчетливым профилем флуоресценции при связывании с фибриллами по сравнению с ThT в растворе [Naiki et al. (1989) Anal. Biochem. 177, 244-249; LeVine (1999) Methods. Enzymol. 309, 274-284].
В качестве общего механизма инициации фибриллообразования предполагается образование частично свернутого промежуточного соединения пептида. Небольшое количество этих промежуточных соединений подвергается нуклеации с образованием матрицы, на которой могут собираться дополнительные промежуточные соединения, и происходит фибриллообразование. Время задержки соответствует интервалу, за который образуется критическое количество центров фибриллообразования, а константа кажущейся скорости реакции представляет собой скорость, с которой формируется сама фибрилла. Поэтому время задержки, описанное в анализе с ThT, проводимом на планшет-ридере, принимали за показатель склонности к фибриллообразованию композиции на основе пептидов в растворе.
2
Перед проведением анализа ThT добавляли в образцы из исходного раствора в HO до конечной концентрации 20 мкМ в образцах. Аликвоты образцов по 200 мкл композиции, содержащей пептид на основе GLP-1, помещали в 96-луночный микротитровальный планшет (оптический, 0,4 мл, черный Thermo Scientific Nunc), при этом в каждую лунку помещали стеклянную гранулу (2,8-3,2 мм, Whitehouse Scientific). Как правило, на планшете размещали по восемь копий каждого образца. Планшет герметизировали герметизирующей лентой (Thermo Scientific Nunc).
Инкубацию при заданной температуре, встряхивание и измерение флуоресцентного излучения ThT проводили на BMG FLUOStar Omega или BMG FLUOStar Optima. Планшет инкубировали при 40°С со встряхиванием на двойном орбитальном шейкере при 300 об/мин с амплитудой 2 мм. Измерение флуоресценции проводили с помощью возбуждения через 450 нм фильтр, а измерение излучения через 480 нм фильтр. Планшет измеряли каждые 20 минут в течение требуемого периода времени. Между каждым измерением планшет встряхивали и нагревали, как было описано.
Пороговое значение определяли как наивысший уровень флуоресценции ThT (в относительных единицах флуоресценции (RFU)), измеренной на планшете в момент времени 1 ч 13 мин, плюс 100 RFU. Затем пороговое значение использовали для вычисления времени задержки с помощью способа «время до порогового значения» в программном обеспечении BMG FLUOstar.
Анализ (III): определение степени чистоты лираглутида
Определение степени чистоты проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) с применением колонки Waters XTerra™ MS C18 с градиентным элюированием двух подвижных фаз, при этом одна подвижная фаза представляла собой водную смесь аммонийфосфатного буфера (рН 8)/ацетонитрила, а другая подвижная фаза представляла собой ацетонитрил в воде. Детектирование проводили при 215 нм.
Анализ (IV): определение суммарного количества примесей в семаглутиде
Определение степени чистоты семаглутида проводили с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (RP-HPLC) с применением колонки Kinetex C18 с изократическим элюированием с последующим градиентным элюированием двух подвижных фаз, при этом одна подвижная фаза представляла собой водную смесь фосфатного буфера/ацетонитрила, а другая подвижная фаза представляла собой водную смесь ацетонитрила/изопропанола. Детектирование проводили при 210 нм. Степень чистоты семаглутида приведена в виде суммарного количества примесей в % как объединенная площадь всех хроматографических пиков относительно пиков мономеров семаглутида.
Пример 1: семаглутид
В данном эксперименте тестировали композиции, содержащие семаглутид. Тестируемые композиции содержали семаглутид (как указано в таблице 1), пропиленгликоль (14 мг/мл), дигидрат динатрийгидрофосфата (1,42 мг/мл) и необязательно фенол (5,5 мг/мл) (как указано в таблице 1) при рН 7,4 в водном растворе. Данные композиции получали так, как описано в настоящем документе в разделе «Общие способы получения». Химическую стабильность, выраженную посредством HMWP, определяли с помощью описанного в настоящем документе анализа (I) в начале эксперимента и после хранения при 25°C, 30°C или 37°С. Физическую стабильность, выраженную с помощью анализа с тиофлавином Т (ThT), определяли с помощью описанного в настоящем документе анализа (II).
Результаты приведены в таблицах 2 и 3. К удивлению, эти результаты демонстрируют, что физическая и химическая стабильность семаглутида была улучшена в композициях без фенола по сравнению с композициями с фенолом. Результаты, показанные в таблице 3, представляют собой среднее значение для 8 протестированных образцов.
Таблица 1. Композиции, протестированные в примере 1
№ композиции
Описание
1
Семаглутид, 1 мг/мл, с фенолом
2
Семаглутид, 1 мг/мл, без фенола
3
Семаглутид, 1,34 мг/мл, с фенолом
4
Семаглутид, 1,34 мг/мл, без фенола
5
Семаглутид, 0,5 мг/мл, без фенола
6
Семаглутид, 0,5 мг/мл, с фенолом
7
Семаглутид, 1,0 мг/мл, без фенола
8
Семаглутид, 1,0 мг/мл, с фенолом
9
Семаглутид, 2,0 мг/мл, без фенола
10
Семаглутид, 2,0 мг/мл, с фенолом
Таблица 2. Химическая стабильность композиций на основе семаглутида, выраженная посредством содержания высокомолекулярных белков (HMWP), после хранения при различных температурах. Более низкая концентрация HMWP соответствует лучшей химической стабильности
№ композиции
HMWP (%)
0 месяцев
25°C,6 месяцев
30°C,3 месяца
37°C,3 месяца
1
0,1
2,0
1,9
4,1
2 (без фенола)
0,1
0,3
0,3
0,5
3
0,1
1,9
1,8
3,9
4 (без фенола)
0,1
0,3
0,4
0,6
Таблица 3. Физическая стабильность композиций на основе семаглутида, выраженная с помощью анализа с тиофлавином Т (ThT). Более длительное время задержки соответствует лучшей физической стабильности
№ композиции
Время задержки (часы)
5 (без фенола)
> 117
6
19
7 (без фенола)
> 117
8
35
9 (без фенола)
> 117
10
35
Пример 2 (эталон): лираглутид
Результаты из примера 1 также были неожиданными ввиду того факта, что соединение на основе GLP-1, представляющее собой лираглутид, в отличие от семаглутида, являлось менее химически стабильным в композиции без фенола. Эти результаты показаны в таблице 5.
Результаты из таблицы 5 получали следующим образом: тестировали композиции, содержащие лираглутид. Тестируемые композиции содержали лираглутид (как указано в таблице 4), маннит (36,9 мг/мл), динатрия гидрофосфат (1,42 мг/мл) и необязательно фенол (как указано в таблице 4) при рН 7,4 в водном растворе. Данные композиции получали так, как описано в настоящем документе в разделе «Общие способы получения». Химическую стабильность, выраженную посредством степени чистоты, определяли с помощью описанного в настоящем документе анализа (III) в начале эксперимента и после хранения при 25°C или 37°С.
Таблица 4. Композиции, протестированные в примере 2
№ композиции
Описание
11
Лираглутид (3 мг/мл), без фенола (pH 7,4)
12
Лираглутид (3 мг/мл), фенол (0,04 мг/мл) (pH 7,4)
13
Лираглутид (3 мг/мл), фенол (0,16 мг/мл) (pH 7,4)
14
Лираглутид (3 мг/мл), фенол (0,8 мг/мл) (pH 7,4)
15
Лираглутид (3 мг/мл), фенол (2,5 мг/мл) (pH 7,4)
Таблица 5. Химическая стабильность, выраженная посредством степени чистоты, композиций, содержащих лираглутид, после хранения при различных температурах. Более высокая степень чистоты соответствует лучшей химической стабильности
№ композиции
Степень чистоты (%)
0 месяцев
3 месяца при 25°C
3 месяца при 37°C
11 (без фенола)
98
88
72
12
98
93
80
13
98
94
81
14
97
95
83
15
98
95
84
Пример 3: семаглутид - дополнительные эксперименты
В данном эксперименте тестировали композиции, содержащие семаглутид. Тестируемые композиции содержали семаглутид, средство для обеспечения изотоничности (пропиленгликоль (14 мг/мл) или хлорид натрия (6,3 мг/мл)) необязательно буфер (дигидрат динатрийгидрофосфата (1,42 мг/мл) или дигидрат тринатрийцитрата (2,35 мг/мл)) и необязательно фенол (5,5 мг/мл или 0,1 мг/мл) при рН 7,0, 7,4 или 7,8 в водном растворе; при этом подробности в отношении каждой протестированной композиции показаны в таблице 6. Композиции получали так, как описано в настоящем документе в разделе «Общие способы получения». Химическую стабильность, выраженную посредством HMWP, определяли с помощью анализа (I), а выраженную в виде суммарного количества примесей определяли с помощью описанного в настоящем документе анализа (IV) в начале эксперимента и после хранения при 30ºC. Физическую стабильность, выраженную с помощью анализа с тиофлавином Т (ThT), определяли с помощью описанного в настоящем документе анализа (II).
Результаты приведены в таблицах 7 и 8. В соответствии с результатами из примера 1 эти результаты демонстрируют, что физическая стабильность и химическая стабильность семаглутида была улучшена в композициях без фенола или с низкой концентрацией фенола по сравнению с композициями с фенолом в концентрации 5,5 мг/мл. Результаты демонстрируют, что физическая стабильность и химическая стабильность семаглутида также были улучшены в композициях без фенола, содержащих либо буфер на основе дигидрата тринатрийцитрата, либо не содержащих буфера или средства для обеспечения изотоничности, представляющего собой хлорид натрия, по сравнению с композициями с фенолом. Химическая и физическая стабильность являлись улучшенными у композиций с 0,1 мг/мл фенола относительно композиций с 5,5 мг/мл фенола и схожими с композициями без фенола. Это было продемонстрировано для композиций с рН 7,0-7,8 и концентрацией семаглутида 0,1-10 мг/мл.
Таблица 6. Композиции, протестированные в примере 3
№ соед.
Состав композиции
Семаглутид (мг/мл)
Фенол (мг/мл)
Буфер
Средство для обеспечения изотоничности
pH
1
0,5
0
Phos*
PG**
7,0
2
0,5
0,1
Phos
PG
7,0
3
0,5
5,5
Phos
PG
7,0
4
0,5
0
Phos
PG
7,4
5
0,5
0,1
Phos
PG
7,4
6
0,5
5,5
Phos
PG
7,4
7
0,5
0
Phos
PG
7,8
8
0,5
0,1
Phos
PG
7,8
9
0,5
5,5
Phos
PG
7,8
10
10
0
Phos
PG
7,0
11
10
0,1
Phos
PG
7,0
12
10
5,5
Phos
PG
7,0
13
10
0
Phos
PG
7,4
14
10
0,1
Phos
PG
7,4
15
10
5,5
Phos
PG
7,4
16
10
0
Phos
PG
7,8
17
10
0,1
Phos
PG
7,8
18
10
5,5
Phos
PG
7,8
19
0,1
0
Phos
PG
7,4
20
0,1
5,5
Phos
PG
7,4
21
0,5
0
Phos
Цитрат***
7,4
22
0,5
5,5
Phos
Цитрат
7,4
23
0,5
0
Phos
Отсутствует<sup>#</sup>
7,4
24
0,5
5,5
Phos
Отсутствует
7,4
25
0,5
0
NaCl<sup>##</sup>
PG
7,4
26
0,5
5,5
NaCl
PG
7,4
#
##
*) Phos: дигидрат динатрийгидрофосфата, 1,42 мг/мл. **) PG: пропиленгликоль, 14 мг/мл. ***) Цитрат: дигидрат тринатрийцитрата, 2,35 мг/мл. ) Отсутствует: фармацевтических вспомогательных веществ в виде буфера добавлено не было. ) NaCl: хлорид натрия, 6,3 мг/мл.
Таблица 7. Химическая стабильность композиций на основе семаглутида, выраженная посредством содержания высокомолекулярных белков (HMWP) и суммарного количества примесей, после хранения при температуре 30°C. Более низкая концентрация HMWP и концентрация суммарного количества примесей соответствует лучшей химической стабильности
№ композиции
DS (мг/мл)
Фенол (мг/мл)
Химическая стабильность
HMWP (%)
Суммарное количество примесей (%)
0 месяцев
30°C3 месяца
0 месяцев
30°C3 месяца
1 (pH 7,0)
0,5
0
0,1
0,3
3,1
7,0
2 (pH 7,0)
0,5
0,1
0,1
0,3
3,2
7,2
3 (pH 7,0)
0,5
5,5
0,1
1,4
3,2
7,8
4 (pH 7,4)
0,5
0
0,1
0,3
3,1
6,7
5 (pH 7,4)
0,5
0,1
0,1
0,3
3,2
6,6
6 (pH 7,4)
0,5
5,5
0,1
2,4
3,2
8,4
7 (pH 7,8)
0,5
0
0,1
0,2
3,1
6,5
8 (pH 7,8)
0,5
0,1
0,1
0,3
3,2
6,6
9 (pH 7,8)
0,5
5,5
0,1
4,8
3,1
10,6
10 (pH 7,0)
10
0
0,1
1,4
3,1
8,4
11 (pH 7,0)
10
0,1
0,1
0,7
3,1
7,7
12 (pH 7,0)
10
5,5
0,1
N/A<sup>1</sup>
3,0
N/A<sup>1</sup>
13 (pH 7,4)
10
0
0,1
0,9
3,1
7,8
14 (pH 7,4)
10
0,1
0,1
0,7
3,1
6,9
15 (pH 7,4)
10
5,5
0,1
0,8
3,0
6,9
16 (pH 7,8)
10
0
0,1
0,9
3,0
6,6
17 (pH 7,8)
10
0,1
0,1
0,6
3,1
6,8
18 (pH 7,8)
10
5,5
0,1
1,0
3,1
6,9
19 (низкое содержание DS)
0,1
0
0,1
0,2
3,5
7,7
20 (низкое содержание DS)
0,1
5,5
0,1
4,7
3,7
11,4
21 (цитрат)
0,5
0
0,1
0,2
3,1
6,2
22 (цитрат)
0,5
5,5
0,1
2,2
3,2
7,7
23 (без буфера)
0,5
0
0,1
0,2
3,2
6,9
24 (без буфера)
0,5
5,5
0,1
2,3
3,2
9,3
25 (NaCl)
0,5
0
0,1
0,3
3,1
6,4
26 (NaCl)
0,5
5,5
0,1
3,4
3,2
8,9
1
DS: семаглутид. Физически не стабилен >1 месяца при 30ºC.
Таблица 8. Физическая стабильность композиций на основе семаглутида, выраженная с помощью анализа с тиофлавином Т (ThT). Более длительное время задержки соответствует лучшей физической стабильности
№ композиции
Семаглутид (мг/мл)
Фенол (мг/мл)
Время задержки (часы)
1 (pH 7,0)
0,5
0
42
2 (pH 7,0)
0,5
0,1
63
3 (pH 7,0)
0,5
5,5
5
4 (pH 7,4)
0,5
0
>117
5 (pH 7,4)
0,5
0,1
>117
6 (pH 7,4)
0,5
5,5
87
7 (pH 7,8)
0,5
0
>117
8 (pH 7,8)
0,5
0,1
>117
9 (pH 7,8)
0,5
5,5
>117
10 (pH 7,0)
10
0
117
11 (pH 7,0)
10
0,1
>117
12 (pH 7,0)
10
5,5
25
13 (pH 7,4)
10
0
>117
14 (pH 7,4)
10
0,1
>117
15 (pH 7,4)
10
5,5
>117
16 (pH 7,8)
10
0
>117
17 (pH 7,8)
10
0,1
>117
18 (pH 7,8)
10
5,5
>117
19 (низкое содержание DS)
0,1
0
>117
20 (низкое содержание DS)
0,1
5,5
>117
21 (цитрат)
0,5
0
>117
22 (цитрат)
0,5
5,5
>117
23 (без буфера)
0,5
0
>117
24 (без буфера)
0,5
5,5
4
25 (NaCl)
0,5
0
>117
26 (NaCl)
0,5
5,5
8
Результаты представляют собой среднее значение для 8 протестированных образцов. DS: семаглутид.
Хотя определенные признаки настоящего изобретения были проиллюстрированы и описаны в данном документе, специалистам в данной области теперь станут очевидны многие модификации, замены, изменения и эквиваленты. Следовательно, следует понимать, что прилагаемая формула изобретения предназначена для охвата всех таких модификаций и изменений, которые находятся в пределах истинной сущности настоящего изобретения.