Методические аспекты учета численности бактериобентоса в условиях сезонного колебания температур

Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Екологія. - 2012. - Вип. 20, т. 2. - С. 101-107. Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology. Ecology. - 2012. - Vol. 20, N 2. - P. 101-107.

УДК 579:551.352

В. П. Чекалов

Інститут біології південних морів ім. О. О. Ковалевського НАН України, м. Севастополь

МЕТОДИЧНІ АСПЕКТИ ОБЛІКУ ЧИСЕЛЬНОСТІ БАКТЕРІОБЕНТОСУ В УМОВАХ СЕЗОННОГО КОЛИВАННЯ ТЕМПЕРАТУР

Розглянуто доцільність використання коефіцієнта температурної корекції у разі визначення чисельності бактерій в умовах, близьких до природних, ураховуючи також акваторії полярних зон. У теплий період року чисельності потенційно життєздатної та фізіологічно активної мікрофлори зазвичай збігаються. При низьких температурах активною може виявитися одна зі ста клітин. Культивування посівів при нетипових для холодного часу року температурах (+20...+25 °С) спричинює, як правило, викривлення результатів. Запропоновано використовувати як поправний коефіцієнт відсоткове співвідношення колоній, що були вперше виявлені візуально на чашках «холодної» інкубації, до чисельності мезофільних форм за той самий інтервал часу. Для дослідження анаеробної та аеробної складових бактеріального угруповання запропоновано модифіковане середовище Вільсона - Блера.

В. П. Чекалов

Институт биологии южных морей им. А. О. Ковалевского НАН Украины, г. Севастополь

МЕТОДИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ УЧЕТА ЧИСЛЕННОСТИ БАКТЕРИОБЕНТОСА В УСЛОВИЯХ СЕЗОННОГО КОЛЕБАНИЯ ТЕМПЕРАТУР

Рассмотрена целесообразность использования коэффициента температурной коррекции при учете численности бактерий в условиях, приближенных к природным, в том числе в акваториях полярных зон. В теплый период года численности потенциально жизнеспособной и физиологически активной микрофлоры обычно совпадают. При пониженных температурах активной может оказаться лишь одна из ста клеток. Культивирование посевов при нехарактерных (+20...+25 °С) для холодного времени года температурах приводит, как правило, к искаженным результатам. Предложено использовать в качестве поправочного коэффициента процентное соотношение колоний, впервые обнаруженных визуально на чашках «холодной» инкубации, к численности мезофильных форм за тот же интервал времени. Для исследования анаэробной и аэробной составляющих бактериального сообщества предлагается применять модифицированную среду Вильсона - Блера.

V. P. Chekalov

O. Kovalevsky Institute of Biology of the Southern Seas, Sevastopol

METHODICAL ASPECTS OF BACTERIOBENTHOS INVENTORY AT CONDITIONS OF TEMPERATURE SEASONAL FLUCTUATION

The appropriateness of using the coefficient of temperature correction for the censuring of bacteria in natural conditions, including polar zone water areas, is considered. The numbers of potentially viable and physiologically active microflora in the warm period of year usually coincide. Only one cell in a hundred can be active under conditions of the lower temperature. As a rule, the cultivation of bacterial inoculations at

© В. П. Чекалов, 2012

temperatures (+20...+25 °С) which uncharacteristic for a cold season gives the skewed results. A percentage ratio of the number of colonies firstly found out visually under “cold” incubation to the number of colonies of mesophilic forms at the same time lag is proposed to use as a correction coefficient. The modified iron-sulfite agar (Wilson-Blair nutrient medium) is offered for research of anaerobic and aerobic bacterial community.

Вступление

Изменение условий окружающей среды способно вызывать у бактерий как биологических объектов состояние стресса [6; 12]. Температура, являясь мерой интенсивности энергии любой системы, оказывает доминирующее действие на все биологические процессы [11]. Экспериментально доказано, что в каждом случае культивирования разное, иногда довольно значительное, число бактерий будет находиться в экологически обусловленном жизнеспособном, но некультурабельном состоянии (ЖНС) [7; 9]. При изучении скоростей роста бактерий in situ в пресноводном ручье было установлено, что зимой (0...-5 °С) темпы генерации снижались в 8-20 раз [8]. При низкой температуре воды (+4 °С) динамика прироста численности микроорганизмов сильно растянута во времени, но максимум численности при этом через 18 суток оказался на 1/3 больше, чем при высокой [5].

Oliver с соавт. [10] исследовали переход в некультурабельное состояние (ЖНС) клеток Vibrio vulnificus, помещенных в естественные эстуариевые (устья рек) воды, в течение зимних и летних месяцев. Клетки, инокулированные в мембранные диффузионные камеры, вступали в ЖНС состояние в январе и феврале, когда температура воды была низкой (в среднем < +15 °С). Напротив, когда клетки в состоянии ЖНС были помещены в те же условия в более теплое время - с августа до ноября (что составляет среднюю водную температуру приблизительно +21 °С), бактерии подвергались быстрой (обычно в пределах 24 ч) реверсии в культурабельное состояние. Это связано с тем, что у прокариотов для поддержания необходимого уровня метаболизма при различных условиях окружающей среды существуют механизмы активации дополнительных форм ферментов, сходных по функции, но отличающихся молекулярной массой и приспособленностью к различным температурам [6]. Ферменты, представленные только одной формой, не смогли бы осуществлять катализ при таких изменениях диапазона температур. Один из важных выводов, которые можно сделать, учитывая вышесказанное - это то, что пробы, взятые из окружающей среды, могут содержать бактерии, пребывающие в своеобразном физиологическом анабиозе.

Однако на практике, при учете численности микроорганизмов, в частности гетеро-трофов, температурный режим культивирования посевов довольно часто не соответствует естественным условиям среды обитания. Поэтому термостатирование их при +20.. .+25 °С дает реальные результаты лишь в летне-осенний период, и только до глубины залегания термоклина, в то время как большая часть и грунтов и водной толщи располагается в более холодных условиях. В хронически холодных полярных водах практически единственными представителями микрофлоры являются психрофильные формы.

Цель данной работы - оценить соотношение между приростом числа колоний в посевах, культивируемых параллельно при оптимальных температурах, и в условиях, близких к естественным. С целью оптимизации набора необходимых питательных сред рассмотрена возможность применения модифицированной среды Вильсона - Блера, предназначенной для выявления анаэробной сульфатредуцирующей микрофлоры, в качестве универсальной при учете как анаэробных, так и аэробных бактерий.

Материал и методы исследований

Для изучения влияния температуры на темпы формирования колоний бактерий на плотных средах в январе (станция 5) и марте (станция 4) 2006 г. отобраны пробы донных отложений в центральной части бухты Круглая в районе г. Севастополь. В границах этих станций выделены зоны сульфурет (4ц и 5ц) с очагами заморов донных макрофитов (зостеры), а также прилегающие к ним фоновые участки с окислительными условиями среды (4ф и 5ф).

Измерение окислительно-восстановительного потенциала производили при помощи универсального иономера ЭВ-74 сразу же после доставки проб в лабораторию.

Содержание органического вещества определяли гравиметрическим методом при прокаливании навесок в муфельной печи при температуре 500 °С.

В качестве материала для исследования ростовых возможностей модифицированной среды Вильсона - Блера использовали донные отложения Балаклавской бухты (пробы 1-6) и глубоководного района восточной части Черного моря (пробы 7-9).

Численность аэробных гетеротрофных микроорганизмов (Аэ) определяли путем глубинного посева разведений донных отложений в среду, предложенную Ю. А. Горбенко [1]. Для выявления анаэробных гетеротрофов (АнАэ) и сульфатреду-цирующих бактерий (СРБ), а также при сравнительных посевах одновременно с мясо-пептонным агаром (МПА) использовали модифицированную стандартную среду Вильсона - Блера. С целью ее адаптации к морским условиям, как и в случае со средой Горбенко, бралась навеска сухой среды в соотношении 1 : 10 от рекомендуемой по прописи. Среды готовили на фильтрованной кипяченой морской воде. Посев осуществляли по методу Л. Д. Штурм [4]. При этом темноокрашенные колонии учитывали как СРБ, а светлые - как анаэробные гетеротрофные бактерии. Ряд посевов термостатиро-вали как при оптимальной температуре (+20.. .+25 °С), так и при температуре, соответствующей зимнему периоду (+5 .+10 °С). Инкубацию при низкой температуре осуществляли в холодильнике. Это имеет смысл, когда температура в месте обитания отличается от оптимума более чем на 10 °С. Часть посевов культивировали при этих режимах поэтапно. Хотя нельзя с полной уверенностью утверждать, что микроорганизмы, выделенные из окружающей среды и растущие при низкой температуре в лабораторных условиях, действительно активны in situ, такая экстраполяция, тем не менее, вполне логична [2]. Считается, что физиологически активные бактериальные клетки на плотных питательных средах формируют видимые колонии в среднем через 10-15 суток [3]. Поэтому подсчет числа выросших колоний проводили посуточно в течение 13 суток.

В 2009-2010 гг. во время работы XIV Украинской антарктической экспедиции на станции «Академик Вернадский» отобраны пробы воды на трех станциях в районе

о. Галиндез (Южная Атлантика). Для учета численности мезофильных и гипотермиче-ских форм гетеротрофных бактерий по 1 см3 из каждой пробы засевали на поверхность стандартной среды МПА с последующей параллельной инкубацией при +21 и +4 °С.

Результаты и их обсуждение

Культивирование посевов при +25 °С способствует формированию видимых колоний гетеротрофов уже через 24 часа, тогда как при +5 °С первые колонии появляются на вторые - пятые сутки (табл. 1). Совпадение же, и для Аэ и для АнА, динамики прироста числа колоний в посевах 10 и 25-градусной инкубации, различающихся, правда, масштабом, можно объяснить соответствием температурным условиям среды обитания. Это именно то значение, которое было зафиксировано при отборе проб. Процентное соотношение колоний, впервые обнаруженных визуально на чашках «хо-

103

лодной» инкубации к численности мезофильных форм за тот же интервал времени, отражает долю физиологически активных микробных клеток сообщества, которым не требуется времени на адаптацию. То же соотношение, но через 10-12 суток, будет указывать на потенциально возможную в данных температурных условиях активацию клеток. Она в первую очередь определяется наличием и доступностью питательных веществ.

Таблица 1

Посуточное изменение числа колоний аэробных, анаэробных и сульфатредуцирующих

№ стан ции Группы бакте- рий Темпера- турный режим Время, сутки

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

+25 °С 2 88 178 432 520 578 578 582 608 628 673 706 715

аэробы +10^ +25 °С 0 29 79 90 100 113 120 173* 222 265 298 342 373

5ц +5^ +25 °С 0 0 0 0 3 6 39* 78 187 332 403 451 472

+5 °С 0 0 0 0 3 4 23 43 55 82 94 99 103

анаэро- бы +25 °С 0 1 16 71 104 114 130 140 150 160 162 166 171

+10^ +25 °С 0 0 0 0 3 8 22 26 44* 71 105 129 141

+25 °С 30 227 391 516 614 628 661 694 729 762 767 785 798

+10^ +25 °С 3 15 27 46 93 157 224 365* 465 534 566 586 630

аэробы +10 °С 3 27 66 95 130 161 196 214 236 251 259 263 273

5ф +5^ +25 °С 0 0 6 12 25 33 48 191* 401 505 552 579 623

+5 °С 0 0 4 12 19 28 39 58 108 150 158 187 202

анаэро- бы +25 °С 0 52 102 150 207 211 245 253 266 270 280 292 301

+10^ +25 °С 0 0 0 0 2 6 18 50 * 9 8 124 162 189 207

+25 °С 119 478 685 891 1022 1130 1175 1207 1222 1226 1228 1262 -

аэробы +10^ +25 °С 0 5 114 276 375 634 1157 1326* 1543 1618 1672 1719 -

анаэро- бы +25 °С 0 0 0 2 39 47 53 60 61 63 63 69 -

4ц +10^ +25 °С 0 0 0 0 21 40 58 75* 87 94 96 104 -

+25 °С 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -

СРБ +10^ +25 °С 0 0 0 0 0 3 3 6* 6 6 6 6 -

+25 °С 40 152 251 292 356 393 416 463 478 485 490 499 -

аэробы +10^ +25 °С 0 4 34 91 147 182 204 554* 688 745 808 832 -

анаэро- бы +25 °С 0 0 21 23 24 26 28 34 45 48 49 50 -

4ф +10^ +25 °С 0 0 13 25 81 121 129 177* 200 208 217 220 -

+25 °С 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 -

СРБ +10^ +25 °С 0 0 0 0 0 0 1 3* 3 3 3 3 -

Примечание: * - первое из значений после изменения температурного режима.

Для обозначения коэффициента температурной адаптации предлагается использовать символ Аё , где ‘ - фактическая температура в точке отбора пробы; ё - время регистрации результата в сутках (начального или «-го). То есть:

10 А = N10 х 100

5 N25 ’

где N10 и N25 - количество колоний гетеротрофов, выросших за 5 суток при культивировании посевов соответственно при +10 и +25 °С.

На станции 5, в отличие от четвертой, среда имела ярко выраженный окислительный характер (табл. 2). Культивирование посевов аэробов при +5 °С выявило достаточно низкий уровень активно растущих бактерий. Через 4-5 суток лишь одной из ста клеток удалось сформировать колонии. В то же время при +10 °С, что соответствует температуре в точке взятия пробы, рост отмечался уже на первые - вторые сутки, а их доля составляла 10-30 %. В дальнейшем, к двенадцатым суткам, во всех посевах низкотемпературного культивирования коэффициент температурной коррекции достиг этого уровня. Такие же тенденции наблюдались и для анаэробных бактерий.

Таблица 2

Изменение доли физиологически активных бактериальных клеток в зависимости от температуры и продолжительности инкубирования посевов

№ станции Температура среды, °С Ек, мВ Органическое вещество, мг/г Время учета, сутки тАп , %

аэробные анаэробные

5° 10° 10°

5ц 10,3 +95 429 начальное 7 12 0,6 (5)* 4.0 14.0 32,0 (2)* 21,0 2,9(5)* 17,0

5ф +111 243 начальное 7 12 1,0 (4)* 5,9 24,0 10,0 (1)* 30.0 34.0 1,0(5)* 7,0

4ц 7,5 -200 412 начальное 7 - 1,0 (2)* 99,0 54,0 (5)* 109,0

4ф +180 317 начальное 7 - 2,6 (2)* 49,0 62,0 (3)* 461,0

Примечание: * - в скобках указано время появления колоний при низкотемпературной инкубации посевов.

На станции 4 при четком разделении по окислительно-восстановительным условиям в восстановленных грунтах сульфуреты доля аэробных микроорганизмов, дающих рост при +10 °С, уже через семь суток достигла 99 %, тогда как в достаточно аэрированных фоновых грунтах степень активации составляла лишь 49 %. В то же время потенциальные ростовые возможности анаэробов оказались выше в фоновой точке. Изначально высокая их доля к седьмым суткам культивирования достигла рекордных 461 %. Среди анаэробных и, особенно, сульфатредуцирующих бактерий преобладали психрофильные формы (см. табл. 1). Возможно, это связано с тем, что пробы были отобраны в начале марта, когда бактериальное сообщество полностью адаптировалось к условиям пониженных температур, достигших в придонном слое +7,5 °С.

В хронически холодных антарктических водах мезофильные формы, не являясь типичными для таких условий, обычно привнесены извне либо человеком, либо животными (табл. 3). Это видно, в том числе, и по коэффициенту температурной адаптации. Если для точек с эпизодическим и постоянным хозяйственно-бытовым сбросом он оказался весьма низким (4А6 = 1,0 и 4А4 = 0,3 соответственно), то на фоновой точке достиг 4А9 = 4,0. К концу же эксперимента, на 13-е сутки, коэффициент в чистой зоне

105

возрос до 30,7, то есть активной оказалась каждая третья бактериальная клетка, в то время как в двух других точках его значения составили лишь 6,1 и 3,0.

Таблица 3

Посуточное изменение числа колоний

Уровень загрязнения Темпе- ратур- ный режим Время, сутки

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 13

Чистая зона +21 °С 0 10 40 65 68 73 73 73 75 75 75 75

+4 °С 0 0 0 0 0 0 0 0 3 5 15 23

Эпизодическое (органика) загрязнение +21 °С 13 43 143 578 1565 1740 2098 2228 2293 2313 2313 2313

+4 °С 0 0 0 0 0 18 38 63 78 100 120 140

Постоянный хоз-бытовой сброс +21 °С 0 63 273 1650 2833 3123 3295 3348 3353 3368 3368 3368

+4 °С 0 0 0 5 9 25 35 40 50 64 84 101

Параллельными посевами на питательный агар (МПА) и среду Вильсона - Блера проверена возможность применения последней не только для выявления анаэробов и сульфатредукторов, но и для учета аэробных гетеротрофов. Число выросших на среде Вильсона - Блера колоний зачастую в 1,5-2,0 (и более) раза превышало их количество на МПА (табл. 4).

Таблица 4

Сопоставление ростовых возможностей питательного агара и среды Вильсона - Блера при учете численности гетеротрофных бактерий

Среда Станции

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Мясопептонный агар 207 1125 11 3,3 19 579 1289 377 156

Среда Вильсона - Блера 482 394 29 3,8 39 839 1222 757 796

Учет отмеченных выше трех групп бактерий можно с успехом осуществлять на среде Вильсона - Блера. Ее отличие от питательного агара заключается в двух компонентах. Во-первых, это железосульфитный комплекс для выявления продуцирования И2Б, во-вторых, наличие глюкозы. С учетом степени разведения (1 : 10) сухого концентрата и типичности этих соединений для морских экосистем можно говорить скорее о стимуляции, а не об ингибировании роста аэробных бактерий.

Выводы

Введение коррекции численности микроорганизмов в зависимости от температурных условий места обитания позволяет более точно оценивать темпы самоочищения природных водоемов. Культивирование посевов при нехарактерных для холодного времени года температурах (+20...+25 °С) приводит, как правило, к ее завышению. Если в теплый период численность потенциально жизнеспособной и физиологически активной микрофлоры совпадает, то в условиях пониженных температур активной может оказаться лишь каждая сотая клетка.

Применение модифицированной среды Вильсона - Блера для выявления, наряду с анаэробными бактериями, также и аэробных, позволяет без снижения качества исследований сократить трудозатраты на их проведение.

Библиографические ссылки

1. Горбенко Ю. А. О наиболее благоприятном количестве «сухого питательного агара» в средах для культивирования морских гетеротрофных микроорганизмов II Микробиология. - 19б1. -Т. ЗО, вып. 1. - С. 168-172.

2. Жизнь микробов в экстремальных условиях I Под ред. Д. Кашнера. - М. : Мир, 1981. - 5І9 с.

3. Никифорова Е. П. Численность сапрофитных бактерий в воде Рыбинского и Шекснинского водохранилищ при посевах на питательной среде различного состава I Е. П. Никифорова, В. И. Романенко II Биология внутренних вод. - 1972. - № І5. - С. 5-9.

4. Родина А. Г. Методы водной микробиологии. - Л. : Наука, 1965. - З6З с.

5. Романенко В. И. Микробиологические процессы продукции и деструкции органического вещества во внутренних водоемах. - Л. : Наука, 1985. - 295 с.

6. Сомов Г. П. Психрофильность патогенных бактерий I Г. П. Сомов, Т. Н. Варвашевич, Н. Ф. Тимченко. - Новосибирск : Наука, 1991. - 204 с.

7. Юдин И. П. Современные подходы к оценке жизнеспособности бактерий с акцентом на феномене некультурабельности II Annals of Mechnikov Institute. - 2007. - № 3. - С. 8-іб.

8. Bott T. L. Bacterial growth rates and temperature optima in a stream with a fluctuating thermal regime II Limnol. Oceanogr. - 1975. - Vol. 20. - P. І9І-І97.

9. Colwell R. R. Bacterial death revisited II Nonculturable microorganisms in the environment I Ed. D. J. Grimes. - Washington, D. C. : ASM Press, 2000. - P. 325-342.

10. Entry into, and resuscitation from, the viable but nonculturable state by Vibrio vulnificus in an estuarine environment I J. Oliver, F. Hite, D. McDougald et al. II Appl. Environ. Microbiol. - І995. -Vol. бі. - P. 2б24-2б30.

11. Isaksen M. F. Adaptation of psychrophilic and psychrotrophic sulfate-reducing bacteria to permanently cold marine environments I M. F. Isaksen, B. B. Jшrgensen II Appl. Environ. Microbiol. -199б. - Vol. б2. - P. 408-414.

12. Rollins D. Viable but nonculturable stage of Campylobacter jejuni and its role in survival in the natural aquatic environment I D. Rollins, R. Colwell II Appl. Environ. Microbiol. - 198б. - Vol. 52. -P. 53І-538.

Надійшла до редколегії 26.04.2012