ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЙ БИОПРЕПАРАТ ПРОТИВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ И ГРИБКОВЫХ ИНФЕКЦИЙ, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТЬЮ
ANTIBIOTIC RESISTANT THERAPEUTIC BIOLOGICAL PRODUCT FOR BACTERIAL AND MYCOTIC INFECTIONS

Изобретение относится к микробиологии, ветеринарии и биотехнологии и представляет собой новый препарат - пробиотик из двух штаммов бактерий рода Bacillus, обладающий широким спектром антагонизма по отношению к различным патогенным видам бактерий и грибов, а также устойчивостью к широкому кругу антибиотиков.
В настоящее время препараты - пробиотики из бактерий рода Bacillus - находят широкое применение в ветеринарии для лечения различных заболеваний птиц и сельскохозяйственных животных, поскольку подавляют развитие патогенных бактерий. Однако при тяжелых инфекционных заболеваниях иногда нельзя отказаться от назначения антибиотиков, поскольку они оказывают наиболее быстрый лечебный эффект. Применение антибиотиков приводит к негативным последствиям для организма животного: развитию дисбактериоза и снижению иммунитетета, а также к развитию антибиотикоустойчивости у патогенных штаммов. Для снятия негативных последствий антибиотикотерапии дополнительно применяют пробиотики, чем раньше используется пробиотик, тем меньше осложнений после антибиотикотерапии. Оптимально использование пробиотика одновременно с антибиотиком, но для этого штаммы, входящие в состав пробиотического препарата, должны обладать устойчивостью к антибиотикам.
Известен природный штамм Bacillus subtilis 11В, обладающий широким спектром антагонизма против бактериальных и грибных патогенов, вызывающих заболевания человека, животных и растений, что создает возможность создания на его основе препаратов-пробиотиков, способных лечить широкий круг заболеваний и использоваться в медицинской, ветеринарной и сельскохозяйственной практике (1).
Препарат на основе штамма Bacillus subtilis 11B (2) устойчив к действию антибиотиков пенициллинового ряда (b-лактамным антибиотикам: пенициллину, карбенициллину, ампициллину), полимиксину, а также малочувствителен к стрептомицину, гентамицину, тетрациклину. Поэтому назначать препарат для лечения людей и животных можно совместно с антибиотиками, к которым штамм Bacillus subtilis 11B имеет устойчивость, для предотвращения осложнений антибиотикотерапии (развития дисбиоза кишечника и снижения иммунитета).
Известен также природный Bacillus subtilis 12B (3) и препарат на его основе (4), используемый в качестве ветеринарного пробиотика. Штамм и препарат обладают антагонизмом в отношении патогенных ветеринарных штаммов патогенных бактерий и устойчивостью (или малой чувствительностью) к ряду антибиотиков, в том числе к тобрамицину, эритромицину, линкомицину, неомицину, рифампицину, т.е к тем антибиотикам, к которым чувствителен штамм Bacillus subtilis 11B.
Совмещение двух штаммов Bacillus subtilis 11B и Bacillus subtilis 12 в одном препарате позволяет расширить спектр антибиотикоустойчивости препарата и назначать препарат совместно с антибиотиками, без снижения его эффективности.
Для повышения эффективности действия препаратов - пробиотиков из бацилл - создаются комплексные препараты, включающие несколько штаммов бактерий. Наиболее близкими к изобретению являются штаммы Bacillus subtilis и Bacillus liheniformis, используемые в качестве компонентов препарата против вирусных и бактериальных инфекций, и препарат на основе этих штаммов (5).
10
Штаммы бактерий Bacillus Sabtilis ВКПМ В-7092, ВКПМ В-7048 и штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКПМ В-7038 используются в качестве компонентов препарата Ветом против вирусных и бактериальных инфекций. Препарат содержит смесь биомассы указанных штаммов в споровой форме с титром не менее 3×10 спор/г. В состав препарата входят также крахмал и сахар при определенном количественном соотношении компонентов. Комплексный бактериальный препарат обладает широким спектром антивирусной и антибактериальной активности.
Недостатком данного препарата является отсутствие у данного препарата антагонизма в отношении плесневых грибов родов Fusarium, Alternaria, Penicillium - источников опасных микотоксинов, споры которых попадают в корма для животных и могут являться причиной микотоксикозов. Нет указаний на возможность использования препарата совместно с антибиотиками, без которых нельзя обходиться при тяжелых формах инфекции.
Задачей предлагаемого изобретения является создание нового комплексного бактериального препарата - пробиотика на основе штаммов бактерий Bacillus subtilis 11B и Bacillus subtilis 12B, обладающего более широким спектром антагонистической активности, в том числе к штаммам родов Pseudomonas, Streptococcus, Escherihia coli, грибам родов Fusarium, Alternaria, Penicillium, и устойчивого к широкому кругу антибиотиков, что позволяет использовать его для лечения тяжелых форм инфекции при одновременной терапии с антибиотиком.
Для решения указанной задачи предлагаются:
- штамм бактерий Bacillus subtilis 11B, депонированый под номером ВКМ В-2218Д во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН 19.08.1999 г. Штамм выделен из здорового растения пшеницы в Уфимском районе. Идентификацию штамма проводили по «Определителю бактерий Берджи». - М.: Мир, 1997;
- штамм В. subtilis 12В, депонированный в коллекции микроорганизмов ВГНКИ под номером 12В-ДЕП. Штамм выделен из зоокомпоста в Уфимском районе республики Башкортостан. Идентификацию штамма проводили по «Определителю бактерий Берджи». - М.: Мир, 1997.
Технический результат заключается в том, что препарат содержит биомассы штаммов бактерий Bacillus subtilis 11B и бактерий Bacillus subtilis 12В в равных соотношениях.
Сухая форма препарата дополнительно содержит крахмал и сахар.
Препарат содержит в качестве основы живые клетки штамма Bacillus subtilis 12В и штамма Bacillus subtilis 11B в равных количествах и стабилизатор (или носитель) при следующем соотношении компонентов, мас %:
Биомасса штаммов Bacillus subtilis, 1×10<sup>8</sup>-10×10<sup>9</sup> живых микробных клеток в 1 мл препарата
90-99
Стабилизатор, наполнитель (носитель)
1-10
В качестве стабилизатора для жидкой формы препарата можно использовать натрия хлорид в концентрации 0,9%. При получении сухих форм препарата (гранулирование, таблетирование или лиофильное высушивание) в биомассу вносят наполнитель (или носитель), что обусловлено его защитным действием для бактериальных клеток при высушивании.
При получении сухой биомассы штаммов (для получения порошка или гранул) в биомассу дополнительно вносят глюконат или стеарат кальция, крахмал, желатин и сахарозу и др. стабилизаторы в количестве от 1,0-10,0 мас.% с целью придания биомассе необходимых физических свойств. При необходимости можно смешивать готовую биомассу с сорбентом (например, активированным углем, карболонгом, лактулозой, ацетилфталилцеллюлозой, гелем фосфата алюминия) в соотношении 1:1 по сухому остатку, после чего жидкость отделяют фильтрацией и высушивают микрогранулы иммобилизованной биомассы вакуумной сушкой до остаточной влажности 5-10%.
После получения биомассы в сухом виде (порошок, гранулы) биомассу смешивают со вспомогательными веществами в соотношении 2:1 - 3:1 и таблетируют. В качестве вспомогательных веществ используют (мас.%.): стеарат кальция (0,5-1,0), тальк (2,5-3,0) и(или) крахмал (0,5-1,0) и(или) аэросил (0,5-0,8), глюкозу (5,0-20,0), сухое молоко (10,0-30,0) и(или) метилцеллюлозу (или поливинилпирролидон) (0,1-0,5). Получают таблетированную форму препарата, удобную в употреблении.
Пример 1. На основе штамма B.subtilis 11В с типичными морфологическими, культуральными, биохимическими свойствами приготовлены 5 вариантов жидкого препарата с различным содержанием микробных клеток в составе 1 дозы препарата.
Вариант 1. Препарат, содержащий, мас.%:
8
биомасса B.subtilis 11В, 0,5×10 живых микробных клеток или колониеобразующих единиц (КОЕ);
биомасса B.subtilis 12В, 0,5×10<sup>8</sup> живых микробных клеток или колониеобразующих единиц (КОЕ)
в 1 мл препарата
91;
стабилизатор (натрия хлорид)
9.
Вариант 2.
Препарат, содержащий, мас.%:
8
биомасса B.subtilis 11В, 2×10 живых микробных клеток (КОЕ);
биомасса B.subtilis 12В, 2×10<sup>8</sup> живых микробных клеток (КОЕ)
в 1 мл препарата
91,
стабилизатор (натрия хлорид)
9.
Вариант 3. Препарат, содержащий, мас.%:
8
биомасса B.subtilis 11В, 5×10 живых микробных клеток (КОЕ);
биомасса B.subtilis 12В, 5×10<sup>8</sup> живых микробных клеток (КОЕ)
в 1 мл препарата
91;
стабилизатор (натрия жлорид)
9.
Вариант 4.
Препарат, содержащий, мас.%:
9
биомасса B.subtilis 11В, 1,0×10 живых микробных клеток (КОЕ);
биомасса B.subtilis 12B, 1,0×10<sup>9</sup> живых микробных клеток (КОЕ)
в 1 мл препарата
91;
стабилизатор (натрия хлорид)
9.
Изготовленные варианты препарата разливали в стерильные флаконы, укупоривали резиновыми пробками и обкатывали алюминиевыми колпачками.
Пример 2. Штамм В. subtilis 11В культивируют в жидкой питательной среде, обеспечивающей спорообразование в течение 16 часов.
Штамм В. subtilis 12В культивируют в жидкой питательной среде, обеспечивающей спорообразование в течение 16 часов.
9
Полученные биомассы смешивают в равных соотношениях (при необходимости концентрируют с помощью микрофильтрации до содержания микробных клеток 100×10 кл/мл по ОСО на 10 ЕД). К биомассе добавляют стабилизатор на основе крахмала и лактозы или сахарозо-желатиновой среды, смешивают, гранулируют и подсушивают до остаточной влажности не более 5%. Далее порошок измельчают до получения однородной массы и дозировано расфасовывают во флаконы (или пакеты).
Вариант 5. Препарат, содержащий, мас.%.:
биомасса
25,0
крахмал
31,1
лактоза
42,6
метилцеллюлоза (или поливинилпирроллидон)
1,3
8
Готовый порошок белого или бежевого цвета, сладковатый на вкус. Остаточная влажность не более 5%. Порошок растворяется в воде, 0,1 н. HCl и нейтральных растворах в течение 15 мин с образованием рыхлого комковатого осадка. Готовый порошок содержат биомассу В. subtilis в количестве не менее (1,5±0,5)×10 КОЕ/г.
Пример 3. Штамм В. subtilis 11В культивируют в жидкой питательной среде, обеспечивающей спорообразование в течение 16 часов.
Штамм В. subtilis 12В культивируют в жидкой питательной среде, обеспечивающей спорообразование в течение 16 часов.
9
Полученные биомассы смешивают в равных соотношениях (при необходимости концентрируют с помощью микрофильтрации до содержания микробных клеток 100×10 кл/мл по ОСО на 10 ЕД). К биомассе добавляют стабилизатор на основе крахмала и лактозы или сахарозо-желатиновой среды и вносят глюконат кальция в количестве 2,0 мас.%, перемешивают и досушивают открытым способом (или лиофильно в кассетах). По окончании сушки порошок измельчают до получения однородной массы, добавляют вспомогательные вещества и таблетируют.
Вариант 6. Препарат, содержащий, мас.%:
биомасса
50,0
стеарат кальция
0,8
сахарозо-желатиновая среда
29,6
глюконат кальция
2,0
тальк
2,5
глюкоза
5,0
сухое молоко
10,0
метилцеллюлоза
0,1
8
Готовые таблетки имеют круглую форму диаметром 0,8-12 мм с гладкой твердой поверхностью беловато-серого или желтоватого цвета, сладковатые на вкус, со специфическим запахом. Средняя масса таблетки составляет от 0,75±0,05 г с остаточной влажностью не более 5%. Таблетки растворяются в 0,1 н. HCl и нейтральных растворах в течение 30-45 мин с образованием рыхлого комковатого осадка. Готовые таблетки содержат биомассу штамма В. subtilis в количестве (2,5±0,5)×10 KOE.
Проверяли безвредность полученных вариантов препарата на лабораторных животных, специфическую антагонистическую активность в отношении тест-культур - представителей различных групп патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и устойчивость к антибиотикам.
Препарат характеризуется безвредностью (см. таблицу 1).
Для определения безвредности содержимое флакона с жидким препаратом использовали без разведения, порошок или таблетку разводили в 10 мл физиологического раствора и вводили 0,5 мл препарата перорально мышам. Для каждого варианта опыта использовали не менее 10 мышей массой 15-16 г. Препарат считали безвредным, если все мыши оставались живыми в течение пяти суток наблюдения и ни у одной из них не выявлено заболевания.
Таблица 1
Изучение безвредности препарата
№
Варианты препарата (кол-во клеток в 1 дозе)
Количество животных (штук)
Средняя масса животных, г
Было
Выжило
До введения
Через 1 сутки
Через 5 суток
1
0,5×10<sup>8</sup>
10
10
15,4±0,3
15,6±0,3
16,9±0,3
2
2,0×10<sup>8</sup>
10
10
15,7±0,2
15,9±0,3
17,0±0,2
3
5,0×10<sup>8</sup>
10
10
15,82±0,2
16,0±0,2
17,08±0,2
4
1,0×10<sup>9</sup>
10
10
15,65±0,2
15,7±0,2
17,1±0,2
5
1,5×10<sup>8</sup>
10
10
16,0±0,2
16,1±0,2
17,2±0,2
6
2,5×10<sup>8</sup>
10
10
15,6±0,2
15,8±0,2
17,1±0,2
Испытание показало, что все животные остались живыми, их первоначальная масса увеличилась, отсутствовали какие-либо признаки заболевания.
Препарат характеризуется широким спектром антагонистической активности в отношении тест-штаммов культур патогенных микроорганизмов (таблица 2).
Для определения специфической активности исследовали антагонистическую активность вариантов препарата в отношении тест-культур. Исследование осуществляли методом отсроченного антагонизма. Для этого содержимое флакона с порошком (или таблетку) растворяли в 2-5 мл физиологического раствора. Полученную взвесь высевали штрихом по диаметру чашки Петри с агаризованной средой Гаузе N 2. Посевы инкубировали в термостате при 37°С в течение 72 ч. Затем к выросшей культуре подсевали штрихом тест-микроорганизмы (500-миллионные суспензии суточных культур в физиологическом растворе). Учет результатов проводили через 18 часов инкубирования при 37°С по величине зон отсутствия роста тест-культур.
Контролем роста тест-культур служило параллельное выращивание их на чашках с агаризованной средой Гаузе N 2 без исследуемой культуры.
Таблица 2
Антагонистическая активность вариантов препарата
№
Тест-культуры
Варианты препарата (кол-во клеток в 1 дозе)
1
2
3
4
5
6
0,5×10<sup>8</sup>
2,0×10<sup>9</sup>
5,0×10<sup>9</sup>
1,0×10<sup>9</sup>
1,5×10<sup>9</sup>
2,5×10<sup>8</sup>
1
2
3
4
5
6
7
8
2
Staphylococcus
10-15
15-20
15-20
15-20
18-20
18-20
aureus (Филиппов)
3
Staphylococcus
10-15
15-20
15-20
15-20
18-20
18-20
aureus (Никифоров)
4
St. aureus 66
10-12
15-16
15-16
15-16
15-16
15-16
5
St. aureus 67
8-10
10-12
10-12
10-12
10-12
10-12
7
St. aureus 80
10-12
12-15
12-15
12-15
12-15
12-15
8
Proteus vulgaris 177
10-15
15-20
15-20
15-20
15-20
15-20
9
Pr. vulgaris 12
8-10
10-12
12-15
12-15
12-15
12-15
10
P. vulgaris 48
8-10
12-15
12-15
12-15
12-15
12-15
11
Pr. vulgaris 41
8-10
10-12
12-15
12-15
12-15
12-15
12
Proteus mirabilis 237
15-18
18-20
18-20
18-20
18-20
18-20
13
Pr. mirabilis 40
12-15
15-20
15-20
15-20
15-20
15-20
14
Pr. mirabilis 36
12-15
15-18
15-18
15-18
15-18
15-18
15
Pr. mirabilis 35
15-18
18-20
18-20
18-20
18-20
18-20
16
Candida albicans
25-30
25-30
25-30
25-30
25-30
25-30
17
Escherihia coli 177
20-22
22-25
22-25
22-25
22-25
22-25
18
E.coli 154
10-12
12-15
12-15
12-15
12-15
12-15
19
E.coli 140
10-12
12-15
12-15
12-15
12-15
12-15
20
Shigella sonne 2586
10-12
12-15
12-15
12-15
12-15
12-15
21
Shigella HK
20-22
22-25
22-25
22-25
22-25
22-25
22
Pseudomonas
12-15
15-20
15-20
15-20
15-20
15-20
aeruginosa 8
23
P. aeruginosa 126
10-12
12-15
12-15
12-15
12-15
12-15
24
Streptococcus 321
10-12
12-15
12-15
12-15
12-15
12-15
25
Streptococcus 325
10-12
12-15
12-15
12-15
12-15
12-15
26
Streptococcus 191
10-12
12-15
12-15
12-15
12-15
12-15
27
Paratyhv 269
10-12
12-15
12-15
12-15
12-15
12-15
28
Paratyhv 15
12-15
15-20
15-20
15-20
15-20
15-20
29
Hexaere II 1230
12-15
15-20
15-20
15-20
15-20
15-20
8
8
8
Из данных таблицы 1 следует, что оптимальным количеством живых микробных клеток в одной дозе препарата является 2-5×10. Снижение количества микробных клеток до 0,5×10 снижает уровень антагонистической активности, а увеличение количества микробных клеток до 10×10 и выше не изменяет существенным образом антагонистическую активность препарата в отношении тест-культур микроорганизмов. Использование препарата в таблетках (вариант 6) не снижает уровень антагонистической активности.
Препарат обладает устойчивостью к целому ряду антибиотиков (таблица 3).
Чувствительность препарата к антибиотикам определяли с помощью стандартных дисков, пропитанных антибиотиками. В чашку Петри с МПА наливали 1 мл клеточной суспензии препарата в 0,9%-ном растворе натрия хлорида и равномерно распределяли по поверхности агара. Избыток удаляли пастеровской пипеткой. На поверхности засеянного агара пинцетом раскладывали диски с антибиотиками, по 5 дисков на каждую чашку. Чашки выдерживали в термостате при температуре (37±1)°С в течение (18±2) ч, после чего измеряли зоны задержки роста вокруг дисков, включая диаметр самого диска.
Таблица 3
Антибиотикоустойчивость вариантов препарата
№
Антибиотики
Зоны торможения роста, мм
Варианты препарата
1
2
3
4
5
6
1
Ампициллин
0-6
0-6
0-6
0-6
0-6
0-6
2
Бензилпенициллин
0
0
6
8
6
6-8
3
Карбенициллин
0
0
0
0
0
0
4
Полимиксин
0
0
0
0
0
0
5
Стрептомицин
0-8
0-8
0-8
0-8
0-8
0-8
6
Рифампицин
0-6
0-6
6
6
6-8
6-8
7
Гентамицин
0-7
0-7
0-6
0-6
0-6
0-6
8
Клотримазол
8-10
8-10
8-10
10
10
10
9
Левомицитин
18-20
18-20
18-20
18-20
18-20
18-20
10
Тетрациклин
6-8
6-8
6-8
6-8
6-8
6-8
11
Мономицин
6-8
6
6
6-8
6-8
8
12
Гептомицин
10-15
10-15
10-15
10-15
10-15
10-15
13
Клотримазол
10-12
10-12
10-12
10-12
10-12
10-12
14
Неомицин
6
6
0
6-8
6-8
6-8
15
Цепарин
15-20
15-20
15-20
15-20
15-20
15-20
16
Канамицин
10-15
10-15
10-15
10-15
10-15
10-15
17
Новограмон
20-25
20-25
20-25
20-25
20-25
20-25
18
Бисенгиол
10-15
10-15
10-15
10-15
10-15
10-15
19
Тобрамицин
6-8
0-8
0
6
6-9
6
20
Эритромицин
6-8
0
6
6
6-9
6-8
Из полученных данных следует, что препарат устойчив к действию антибиотиков пенициллинового ряда (b-лактамным антибиотикам: пенициллину, карбенициллину, ампициллину), полимиксину, а также малочувствителен к стрептомицину, гентамицину, тетрациклину, тобрамицину, эритромицину, мономицину, рифампицину.
8
Эффективность заявляемого препарата в оптимальных концентрациях микробных клеток (2-10)×10 для нормализации микробиоценоза кишечника оценена при лечении 10 больных телят с выраженной диспепсией. Препарат назначали по 1 дозе два раза в день в течение 10 суток. Результаты исследования микрофлоры кишечника у больных телят до начала лечения и через 7-10 дней после окончания лечения представлены в таблице 4.
После назначения препарата симптомы диспепсии и диареи были купированы в течение 3-7 дней, препарат давали в течение 10 дней.
Показатели состояния микробиоценоза кишечника показывают, что терапевтическое действие препарата заключается в эффективном устранении УПМ (98,0%) и восстановлении нормофлоры (90%). Показана его абсолютная безвредность и хорошая переносимость.
Таблица 4
Состояние микрофлоры кишечника у больных телят на фоне лечения комплексным препаратом
Представители микрофлоры кишечника
Количество больных(n-30)
До лечения
После лечения
Абс.
%
Абс.
%
Снижение бифидобактерий (10<sup>4</sup>-10<sup>5</sup>)
30
100
4
13,3
Снижение лактобактерий (10<sup>4</sup>-10<sup>5</sup>)
22
73,3
2
6,6
Снижение споровых анаэробов (10<sup>3</sup>-10<sup>4</sup>)
18
60
4
13,3
Повышение УПФ (10<sup>6</sup>), в том числе:
Протей
14
46,7
0
0
Клибсиелла
9
30,0
0
0
Гемолитические эшерихии
14
46,7
0
0
Стафилококки
18
60
3
1,0
Псевдомонады
6
20,0
0
0
Стрептококки
12
40,0
0
0
Лактозонегативные энтеробактерии
9
30,0
3
1,0
Грибки кандида
6
20,0
0
0
Сальмонеллы
4
13,3
0
0
Эффективность элиминации УПМ
98,0%
Эффективность восстановления нормофлоры
90%
Источники информации
1. Патент №2182172 «Штамм бактерий Bacillus subtilis, обладающий широким спектром антагонистической активности», опубл. 13.10.2002, бюл. №13.
2. Патент №2181596 «Лекарственный препарат из бактерий рода Bacillus», опубл. 27.04.2002, бюл. №12.
3. Патент №2169767 «Штамм бактерий Bacillus subtilis, обладающий широким спектром антагонистической активности и устойчивостью к антибиотикам», опубл. 27.06.2001, бюл. №18.
4. Патент №2172175 «Лечебно-профилактический биопрепарат», опубл. 20.08.2001, бюл. №23.
5. Патент №2142287 «Штаммы бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis, используемые в качестве компонентов препарата против вирусных и бактериальных инфекций, и препарат на основе этих штаммов», опубл. 10.12.1999.