СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОДЕГРАДИРУЕМОГО КОМПОЗИТНОГО МАТРИКСА НА ОСНОВЕ РЕГЕНЕРИРОВАННОГО ФИБРОИНА ШЕЛКА Bombyx mori И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
METHOD FOR PREPARING BIODEGRADED COMPOSITE MATRIX OF REGENERATED SILK FIBROIN Bombyx mori AND ITS USE

Группа изобретений относится к области создания биодеградируемых имплантатов на основе регенерированного фиброина шелка Bombyx mori.
Развитие клеточных технологий и использование новых методов биохимии и биоинженерии открывает возможности для восстановления значительных дефектов тканей и органов с использованием созданных in vitro искусственных тканей. Основой искусственных тканей являются носители трехмерного строения (их называют матриксами или матрицами), которые служат субстратом для адгезии аутологичных клеток, способствуя поддержанию их пролиферативной активности, определяют форму и физико-механические свойства имплантата. В настоящее время предпочтение отдается полимерам биологического происхождения или композитным материалам на их основе, так как они, обладая высокой прочностью, не оказывают токсического действия, и, более того, могут служить высокоэффективными биостимуляторами.
Особый интерес исследователей привлекают белки шелка. Биополимеры на основе шелка кокона шелкопряда хорошо изучены, что связано с доступностью материала и многолетним опытом его применения в медицинских целях в качестве шовного материала. Источником полимеров обычно служат коконы шелкопряда Bombyx mori. Основным полимером шелковой нити является фиброин, который может стать основой при создании матриксов для тканевой инженерии. Подготовка материала для синтеза искусственных матриксов на его основе включает этап очистки от других веществ, входящих в состав шелковой нити, таких как серицин, которые способны вызвать иммунный ответ. Фиброины способны к биодеградации в физиологических условиях, не обладают цитотоксичными свойствами и устойчивы к воздействию условий внешней среды. Кроме того, фиброин очень прочный и при этом эластичный, поэтому изделиям из него можно задавать твердую фиксированную форму и использовать для производства прочных и одновременно гибких структур. На основе фиброина можно создавать композитные матриксы, поверхность которых функционализируется различными биологически активными веществами, влияющими на клеточную адгезию, пролиферацию и дифференцировку.
Фиброин - белок, состоящий в основном из серина, глицина, аланина, и в меньшем количестве - тирозина, валина, аспартата и глутаминовой кислоты. Фиброин состоит из легкой, имеющей вес 25 кДа, и тяжелой цепи, имеющей вес 350 кДа, которые связываются между собой дисульфидными связями при внутриклеточном синтезе на мембранах ЭПР и небольшого гликозилированного фрагмента Р25, имеющего вес 25 кДа. Тяжелые, легкие цепи и белок Р25 обычно связываются в общий комплекс в соотношении 6:6:1 с массой 2,3 мДа [Altman G.H. et al. Silk-based biomaterials. Biomaterials 2003, 24(3), 401-416].
Трехмерные матриксы пористой структуры являются основой для поддержания in vitro естественного микроокружения для клеточных популяций. На основе таких матриксов проектируются биоискусственные органы заданных форм и физических характеристик. Возможность модифицировать поверхность материала биологически активными молекулами, такими как компоненты экстрацеллюлярного матрикса, факторы роста и дифференцировки, открывает неограниченные возможности контроля за развитием культуры, позволяет поддерживать желаемый уровень экспрессии определенных генов и функциональную активность клеточной популяции [Gellynck К, Verdonk P.C, Van Nimmen E., Almqvist K.F., Gheysens Т., Schoukens G., Van Langenhove L., Kiekens P., Mertens J., Verbruggen G. Silkworm and spider silk scaffolds for chondrocyte support. J. Mater. 2. Sci. Mater. Med.; 2008, 19(11): 3399-3409, Wang Y., Kirn H.J., Vunjak-Novakovic G., Kaplan D.L. Stem cell-based tissue engineering with silk biomaterials.
Biomaterials; 2006, 24(36): 6064-6082.]. При разработке трехмерных матриц отдается предпочтение полимерам природного происхождения (биополимерам) и различным композитным материалам на их основе: альгинаты, коллаген, желатин, хитозан, гиалуроновая кислота, полиэфиры бактериального происхождения [Волова Т.Г., Севастьянов В.И., Шишацкая Е.И. Полиоксиалканоаты, 2е издание. Красноярск: Платина, 2006: с.288]. Такие биополимеры обладают высокой биосовместимостью, способностью к биодеградации (продукты распада нетоксичны для организма) и, зачастую, свойствами биостимуляторов. Способностью к биодеградации обладают не только полимеры естественного происхождения, но и синтетические алифатические полиэфиры, но, в отличие от последних, биополимеры при распаде не образуют соединений с токсичным действием. Продукты распада или выводятся из животного организма или принимают активное участие в физиологических процессах [Dawson Е, Mapili G, Erickson К, Taqvi S, Roy K. Biomaterials for stem cell differentiation. Advanced drug delivery reviews; 2008, 60(2): 215-228, Ma Р.Х. Biomimetic materials for tissue engineering. Advanced drug delivery reviews; 2008, 60(2): 184-198, Sachlos Е., Czemuszka J.T. Making tissue engineering scaffolds work. Review: the application of solid freeform fabrication technology to the production of tissue engineering scaffolds. European cells and materials; 2003, 30(5): 29-39]. Способность к биодеградации полимеров нашла применение в рамках еще одного активно развивающегося направления биоинженерии, занимающегося разработкой систем доставки лекарств. Использование биодеградируемых полимеров для доставки лекарственных веществ в место назначения позволяет временно отсрочить активное действие вещества до разрушения полимера-носителя в целевом органе [Torchilin V. Multifunctional and stimuli-sensitive pharmaceutical nanocarriers. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics; 2009, 71; 431-444].
Поиск материалов, обладающих широким спектром свойств, необходимых для решения различных задач, привел к возрождению интереса к полимерам, созданным на основе шелка. Источниками таких полимеров являются нити кокона шелкопряда. С целью использования в биологии шелк отмывается от сопутствующих примесей, растворяется в химических растворителях и осаждается в виде регенерированного фиброина шелка. Конструкции из этого биополимера могут быть использованы для создания имплантатов на основе собственных клеток. Такие имплантаты обладают биологической инертностью, достаточной механической прочностью, способностью к биорезорбции и биодеградации, поддерживают адгезию и пролиферацию клеток. Иммуногенность фиброина шелка крайне низкая [Panilaitis В., Altman G.H., Chen J., Jin HJ, Karageorgiou V., Kaplan D.L. Macrophage responses to silk. Biomaterials; 2003, 24(18): 3079-3085.] и имплантаты на основе регенерированного фиброина шелка разрушаются с образованием нетоксичных продуктов.
Для улучшения свойств матрикса к фиброину добавляют различные полимеры [А.С.Коньков, О.Л.Пустовалова, И.И.Агапов. Биосовместимые материалы из регенерированного шелка для тканевой инженерии и лекарственной терапии. Биотехнология, 2010 №1, с.9-16], в частности добавка хитозана улучшает механические свойства материала, но снижает его адгезионные свойства, ухудшая биосовместимость.
Создание таких материалов, как правило, включает последовательную многостадийную обработку коконов Bombyx mori [RU 2270209, 2006-02-20].
Из уровня техники известен [Tamada Ya. New process to form a silk fibroin porous 3-D structure, Biomacromolecules. 2005 Nov-Dec; 6(6):3100-6] простой и удобный способ получения материала на основе регенерируемого фиброина для создания биодеградируемого матрикса, включающий стадии замораживания-оттаивания. Также в данном источнике описано применение получаемого комплекса в качестве основы для имплантата. Данный источник информации выбран в качестве прототипа.
2
2
5
H
2
Предлагаемый нами способ получения отличается от прототипа тем, что мы растворяем регенерированный фиброина в буфере, содержащем CaCl, CHO, НО в молярном соотношении 1:2:8, диализируем полученный раствор до концентрации фиброина не ниже 20 мг/мл и смешиванием его с ДМСО, затем осуществляем включение в состав полученного матрикса дополнительного полимера (желатина или полилизина).
В заявленных композитных конструкциях в качестве основного материала матрицы используется регенерированный фиброин шелка, а в качестве дополнительного - желатин (продукт гидролиза коллагена - основного белка межклеточного матрикса), сохраняющий биологические свойства, сходные со свойствами нативного коллагена или полилизин. В структуре желатина существует адгезионный пептид RGD, повышающий адгезию и пролиферацию эукариотических клеток. Полилизин при нейтральном рН положительно заряжен, что также позволяет повысить адгезию эукариотических клеток.
Таким образом, техническим результатом заявленной группы изобретений является улучшение биосовместимости, существенно повышенные адгезионные свойства матрикса и пролиферация клеток в организме млекопитающего.
2
2
5
2
Кроме того, использование буфера, содержащего СаСl, CHOH, НО, позволяет значительно снизить стоимость получения материала на основе фиброина по сравнению с прототипом.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ
Рис.1. Мышиные фибробласты ЗТЗ на поверхности матрикса из регенерированного фиброина шелка. Сканирующая конфокальная микроскопия, ядра клеток окрашены Sytox Green.
Рис.2. Пористая структура матрикса из регенерированного фиброина шелка, полученного методом замораживания-оттаивания. Сканирующая электронная микроскопия, 400-кратное увеличение.
Рис.3. Гистологическое исследование имплантированных матриксов. Окраска гематоксилин-эозином. Через 2 месяца после имплантации происходит замещение материала матрикса соединительной тканью. Показан новообразованный кровеносный сосуд.
ПРИМЕРЫ, ИЛЛЮСТРИРУЮЩИЕ ПРЕДЛАЕАЕМЫЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Материалы и методы: приборы и реактивы
Материалы
Сухая культуральная среда DMEM (Gibco Laboratories, Германия); культуральная пластиковая посуда (Nunc, Дания и Costar, США); остальные реактивы производства Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Германия).
Методы
Эксперименты проводились в соответствии с ГОСТ Р ИСО 10993-19-2009 "Исследование физико-химических, морфологических и топографических свойств материалов".
Сканирующая электронная микроскопия
Для изучения структуры матриксов использовали методы сканирующей электронной микроскопии. Подготовку образцов для электронной микроскопии осуществляли стандартным методом, включающим фиксацию глутаровым альдегидом, постфиксацию 1% тетроксидом осмия, обезвоживание возрастающими концентрациями этанола и погружением в ацетон. Далее препараты высушивали методом перехода критической точки в приборе. Перед просмотром в микроскопе образцы напыляли слоем золота толщиной 20 нм в атмосфере аргона при ионном токе 6 мА и давлении 0,1 мм рт.ст. на приборе Ion Coater IB-3 (Eiko Engineering, Мито, Япония). Для сканирующей электронной микроскопии использовали Camscan S2 (Cambridge Instruments, Кембридж, Великобритания) в режиме SEI. Разрешение микроскопа 10 им, рабочее напряжение 20 кВ. Изображения были получены с использованием программного обеспечения MicroCapture (SMA, РФ).
Лазерная конфокальная микроскопия
Для сканирующей лазерной конфокальной микроскопии использовали микроскоп Axiovert 200M LSM510 МЕТА (Carl Zeiss, Jena, Germany) с объективами Plan-Neofluar 10×/0,3, Plan-Neofluar 20×/0,5 и Plan-Neofluar 40×/1,3 Серии оптических срезов для получения изображений с высоким разрешением получали с одного или синхронно с двух каналов с установленным согласно рекомендациям производителей размером пинхола (pinhole). Диаметр пинхола был 1 диск Эйри (Airy unit), дающий оптимальное соотношение сигнала к шуму. Настраивали установки лазера и анализирующих фильтров согласно рекомендациям производителей.
Культивирование клеток
2
Трехмерные полимерные матрицы использовали для культивирования мышиных фибробластов 3Т3. Образцы помещали в плашку для культивирования клеток и добавляли 300 мкл суспензии мышиных фибробластов 3Т3 в концентрации 24000 клеток в 1 мл культуральной среды DMEM (Sigma), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки. Отмывали не прикрепившиеся к субстрату клетки, и инкубировали матрицы при 37°С в присутствии 6.1% СO. Культуральную среду меняли каждые 2 дня. Для количественного анализа адгезии клеток использовали функциональные возможности приложений 3D for LSM Version 1.4.2 (Carl Zeiss, Йена, Германия) и Imaris 6.1.5 (Bitplane AG, Цюрих, Швейцария). С их помощью получали высококонтрастные изображения, позволяющие в заданном цветовом канале четко отделить от фона воксели, соответствующие ядрам, выявленным флуоресцентным красителем. Подсчет количества ядер, окрашенных Sytox Green, на трехмерных изображениях с помощью 3D for LSM осуществлялся автоматически: определялось количество структур, однородных по цвету, соответствующих по объему ядрам изучаемых клеток. Такой подсчет требует использования изображений с высоким разрешением, с минимальной аутофлуоресценцией фона и максимальным соотношением сигнала к шуму.
Имплантация полимерных матриксов под кожу мышам.
Исследования проводились в соответствии с ГОСТ Р ИСО 10993-6-2009 "Исследование местного действия после имплантации".
Для исследования местного действия после имплантации и способности к деградации, матриксы из регенерированного фиброина шелка имплантировали подкожно лабораторным мышам линии Balb/c четырехмесячного возраста. Перед операцией животные в течение 7 дней содержались в виварии для акклиматизации. Содержание животных и условия проведения экспериментов in vivo соответствовали ГОСТ Р ИСО 10993-2-2009 "Требования к обращению с животными" и ГОСТ Р ИСО 10993-6-2009 "Исследование местного действия после имплантации". Перед процедурой имплантации удаляли шерсть с поверхности кожи мышей депиляционным кремом. Проводили премедикацию карпрофеном (carprofen): препарат Римадил (Pfizer Animal Health, США) (с действующим веществом карпрофен) вводили из расчета 5 мг на 1 кг, согласно рекомендациям производителя.
Операцию проводили в стерильных условиях под общей анестезией препаратом Золетил 100 (Virbac Sante Animale, Kappoc, Франция) в дозе 5 мг на 100 г. Перед имплантацией участок кожи в месте разреза обеззараживали 0,05% раствором хлоргексидина (Биоген, РФ), а излишки антисептика удаляли стерильными салфетками. Для имплантации делали разрез длиной 5 мм на спине животного, подкожный карман формировали с помощью заостренного шпателя, отделяя подкожные ткани от мышечного слоя. Образец в виде диска диаметром 10 мм и толщиной 2 мм помещали в образовавшуюся полость с помощью стерильного пинцета. Разрез закрывали нерассасывающейся полипропиленовой нитью, накладывая простые узелковые хирургические швы. Рану обрабатывали антисептиком и закрывали клеем медицинским БФ-6 (Вертекс ЗАО, РФ). После пробуждения животные были активны и не проявляли признаков дискомфорта. Через 2 месяца имплантированные образцы извлекали для гистологических исследований. Образцы с прилежащей тканью извлекали, промывали фосфатно-солевым буфером и фиксировали в смеси Буэна согласно стандартной методике. Образцы дегидратировали в растворах этанола возрастающей концентрации (растворы этанола 50%, 60%, 70%, 80%, 96%, 100%) по 2 часа в каждом, удаляли спирт инкубацией в смеси изопропанола и O-ксилола (1:1) в течение 2 часов и в двух сменах чистого O-ксилола по 30 минут. Обезвоженные образцы подготавливали к заливке в парафин последовательной инкубацией в расплавленной смеси Histomix (BioVitrum, РФ) и O-ксилола (1:1) в течение 1 часа и, далее, в трех сменах расплавленного Histomix при 52°С по 30 минут в каждой. Подготовленные образцы помещали в формы для заливки блоков и заливали расплавленным Histomix.
Подготовка срезов для гистологических исследований
Для приготовления срезов толщиной 5 мкм из заключенных в парафин образцов использовали микротом Ротмик-1 (Орион Медик, РФ). Срезы наклеивали на поверхность предметных стекол. Срезы перед гистологическими исследованиями депарафинировали последовательной инкубацией в двух сменах O-ксилола и в 100% этаноле, ополаскивали в 100% этаноле, двух сменах 96% спирта и двух сменах дистиллированной воды.
Депарафинированные срезы окрашивали смесью гематоксилина и эозина по стандартной методике. Перед окрашиванием срезы промывали дистиллированной водой. Далее срез инкубировали в растворе квасцового гематоксилина по Эрлиху, промывали в водопроводной воде, инкубировали в 1%-ном водном растворе эозина и промывали в водопроводной воде. После удаления излишков воды срезы последовательно инкубировали в 96% этаноле и ксилоле, а затем заключали в бальзам.
Микроскопические исследования имплантата
Микроскопические исследования для изучения местного действия после имплантации проводились согласно ГОСТ Р ИСО 10993-6-2009. Гистологические срезы изучали с использованием микроскопа Zeiss Imager Al (Zeiss) с объективами Zeiss ЕС Plan-Neofluar 40×/0,75 Ph2 и A-plan 20×70,45 Ph2. Изображения получали с помощью камеры AxioCam MRc 5 (Zeiss), изображения обрабатывали с помощью программного обеспечения AxioVision 4.7.2 (Zeiss). Также срезы изучали на микроскопе Leica DM 1000 (Leica Microsystems, Inc., Банокберн, США) с объективами Leica Hi-Plan 40×/0,65 и 10×/0,25 и камерой Leica DFC 295 и полученные изображения обрабатывали при помощи программного обеспечения Leica Application Suite Version 3.4.0.
Осуществление изобретения показано на примерах
Примеры
Пример 1. Способ получения биодеградируемого композитного матрикса на основе регенерированного фиброина
2
2
2
5
2
2
5
2
Растворяют 150 мг регенерированного фиброина в предварительно приготовленном с помощью перемешивания и нагревания растворе, состоящем из 513 мг СаСl, 388 мкл HO, 420 мкл 96% СНOН (молярное соотношение компонентов: СаСl: СНOН: PLO 1:2:8). Vp-pa=1000-1050 мкл. Сфиброина=145 мг/мл. Полученную смесь инкубируют на водяной бане в течение 1 часа при 80°С до полного растворения фиброина. Раствор вносят в диализный мешок. Диализ проводят против 500 мл HO в течение 80 минут. Диализованный раствор фиброина с концентрацией не ниже 20 мг/мл смешивают с ДМСО (необходимая концентрация ДМСО=1%), добавляют желатин или полилизин. Количество желатина или полилизина составляет от 10 до 90% от общего количества полимера. Далее раствор перемешивают и заливают в форму. Затем ставят в холодильник при - 18°С на срок не менее 48 часов. Полученный матрикс достают из холодильника, заливают органическим растворителем, например 96% этанолом и инкубируют не менее 60 мин. В итоге получают матрикс с размерами пор от 10 до 200 мкм (рис.1).
Пример 2. Сравнение адгезионных свойств матриксов
Осуществляли приготовление биодеградируемого композитного матрикса на основе регенерированного фиброина вышеуказанным способом.
Проводили сравнение матриксов полученных способом, описанном в прототипе, и приготовленного согласно заявляемому способу.
Для определения количества прикрепленных к матриксам клеток изучали образцы методом конфокальной микроскопии через 24 часа после инокуляции мышиных фибробластов 3Т3 (рис.2). Фибробласты и секретируемые ими компоненты экстрацеллюлярного матрикса являются основой соединительной ткани, что определяет ключевую роль этих клеток при регенерации тканей разных органов. Образцы фиксировали 4% формалином в течение 30 минут и выявляли клетки SYTOX Green nucleic acid stain (Invitrogen, Карлсбадам, США), ядерным красителем с высокой афинностью к нуклеиновым кислотам. Матрицы инкубировали в растворе в течение 20 минут при постоянном перемешивании среды для улучшения циркуляция и повышения доступности красителя для клеток. После связывания SYTOX Green с ДНК наблюдается увеличение его флюоресценции в 500 раз. Методом конфокальной микроскопии получали изображения, представляющие собой серии горизонтальных оптических срезов матрицы, позволяющие наблюдать клетки и структуры матрицы на глубине до 600 мкм. Изображения использовали для подсчета клеток. Как видно из таблицы, добавление в состав матрикса желатина или полилизина значительно повышало адгезию и пролиферацию мышиных фибробластов 3Т3 на поверхности матриксов.
Нами также были проведены испытания на адгезию и пролиферацию мышиных фибробластов 3Т3 на поверхности матриксов и при других концентрациях желатина или полилизина (в частности 50%, 90%), они также показали значительное повышение адгезии и пролиферации.
Пример 3. Гистологические исследования имплантированных матриксов
Полученные нами трехмерные матриксы были имплантированы под кожу мышам линии BALB/c. Гистологическое исследование образцов, полученных после их извлечения через два месяца, показали, что внутрь матрикса внедряется соединительная ткань в виде тяжей, состоящих из фибробластоподобных клеток и сопровождающих их коллагеновых волокон. При этом наблюдается деградация материала матрикса и его замещение молодыми фибробластами, выявляемыми по морфологическим признакам, одним из которых является рыхлый хроматин ядра (эухроматин и наличие 1-2 ядрышек). Гистологическое изучение имплантатов не показало никаких фенотипических изменений прорастающих в имплантат тканей, которые могли бы свидетельствовать о нарушениях физиологии контактирующих с матриксом клеток. Нами также был отмечен высокий уровень васкуляризации тканей, замещающих матрикс после имплантации. Были выявлены кровеносные сосуды, выстланные плоским эндотелием, и вновь образовавшиеся сосуды с "высоким эндотелием" (рис.3). Большое количество новообразованных сосудов свидетельствует об активных процессах ангиогенеза и тканеобразования, происходящих в матриксе через 2 месяца после его имплантации лабораторным животным. Замещение материала матрикса васкуляризированной тканью подтверждает возможность применения созданных нами матриксов в качестве основы, в том числе и при конструировании биоискусственных органов.
Сравнение адгезии и пролиферации мышиных фибробластов 3Т3 на поверхности матриксов на основе регенерированного фиброина шелка через 24 часа после инокуляции.
Образцы матриксов
Прототип
90% регенерированный фиброин шелка 10% желатин
90%регенерированный фиброин шелка 10% полилизин
Количество клеток в 1 мм<sup>3</sup>
45±6
54±7
55±8