Способ флуоресцентной идентификации амилоида
METHOD OF FLUORESCENT IDENTIFICATION OF AMYLOID

Изобретение относится к медицине, а именно к области диагностики амилоидозов при помощи окрашивания гистологических образцов, и может быть использовано в патологической анатомии, цитологии, клинической лабораторной диагностике и биологии.
В настоящее время описано 36 системных и локальных амилоидозов, включая болезнь Альцгеймера и осложнения диабета 2 типа [Sipe J.D. 2016]. Диагностика и дифференциальная диагностика амилоидозов являются весьма актуальными для современного здравоохранения.
Известен способ гистохимического выявления амилоида при помощи Конго красного (золотой стандарт идентификации амилоида) [Bennhold Н., 1922, Гусельникова В.В., 2016, Коржевский Д.Э., 2007, Коржевский Д.Э., 2013]. Несмотря на широкое использование данного способа, он не лишен недостатков, связанных с необходимостью высокой квалификации специалистов-морфологов, частым ложным окрашиванием фона и неамилоидных белковых агрегатов, в частности окрашиванием фиброзных структур.
Предложены также флуоресцентные красители - тиофлавины [Biancalanaa М., 2010] и олиготиофены [ 2015]. Однако эти красители, хотя и обладают достаточно высокой чувствительностью, менее специфичны и чаще, чем Конго красный, приводят к ложноположительным и ложноотрицательным результатам.
Окраска образцов тканей Конго красным, тиофлавинами [Koidec S. 2010] и олиготиофенами [ 2015] включает:
1) Фиксацию биологического материала в растворах формалина или других фиксирующих жидкостях;
2) Обезвоживание фиксированных объектов с помощью этанола;
3) Замещение этанола ксилолом или другим растворителем парафина;
4) Заливку объектов в парафин или комбинированные парафиновые среды;
5) Изготовление срезов и их наклейку на предметные стекла;
6) Удаление парафина (ксилолом или его заменителем) и регидратацию срезов;
7) Окраску препаратов красителем и заключение в водорастворимую или гидрофобную среды.
При этом отложения амилоида в тканях обнаруживаются благодаря его способности сорбировать Конго красный с характерным окрашиванием и двойным лучепреломлением в поляризованном свете, а также по слабо выраженной флуоресценции. Окрашивание тиофлавинами и олиготиофенами сопровождается образованием флуоресцирующих комплексов.
Задачей настоящего изобретения является разработка чувствительного способа, позволяющего с высокой степенью специфичности выявлять амилоид на гистологических препаратах биопсийного и аутопсийного материала, с целью снижения вероятность ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Способ предполагает использование ультрафиолетовой и конфокальной микроскопии (флуоресцентный анализ) для идентификации амилоида, практически полного исключения фоновой окраски тканей и не требует исключительно высокой квалификации персонала.
Поставленная задача была решена путем применения для выявления амилоидных отложений аналога Конго красного на основе флуорена, представляющего собой динатриевую соль 2,7-(1-амино-4-сульфо-2-нафтилазо)флуорена.
В литературе имеется лишь небольшое число публикаций по получению и изучению свойств данного соединения [Novelli А., 1928, Ashburn Т.Т., 1996, Stopa В., 2003]. Для окрашивания амилоида, данное производное флуорена никогда ранее не применялось. Коммерческого препарата не существует. Поэтому были осуществлены синтез и очистка целевого производного флуорена. В качестве исходных соединений использованы 2,7-диаминофлуорен и нафтионовая кислота. Синтез осуществлен путем диазотирования определенного количества диаминофлуорена путем добавления расчетного количества нитрита натрия в разбавленной соляной кислоте при охлаждении и дальнейшего азосочетания бис-диазониевой соли флуорена с расчетным (двойным молярным избытком) количеством натриевой соли нафтионовой кислоты в условиях образования буферной среды за счет добавления уксуснокислого натрия. Реакция сопровождается образованием интенсивно окрашенного продукта. Синтезированный краситель очищен при помощи осаждения в кислых условиях концентрированным раствором хлорида натрия и последующей хроматографии на порошковой целлюлозе и ВЭЖХ. Синтез целевого соединения подтвержден методом масс-спектрометрии.
Полученное вещество характеризуется максимумом поглощения при рН выше 6,0 в видимой области при 500 нм. Это вещество связывается с модельными фибриллами амилоидогенных белков, что сопровождается изменением спектра поглощения и образованием комплексов краситель-фибриллы. Кроме того, в присутствии фибрилл наблюдается выраженное возрастание интенсивности флуоресценции красителя (возбуждение 470-500 нм, эмиссия 590 нм).
Очищенный краситель (производное флуорена) применен для окраски гистологических препаратов больных амилоидозами.
Срезы окрашивают полученным красителем в следующей последовательности:
1) Удаляют парафин и регидратируют срезы.
2) Промывают срезы в дистиллированной воде (5 мин).
3) Удаляют избыток жидкости со срезов, наносят необходимое количество гематоксилина (например, квасцовый гематоксилин Джилла) [Коржевский Д.Э., 2007.] и инкубируют 1 мин при комнатной температуре.
4) Удаляют раствор гематоксилина со срезов и сполоскивают стекла в щелочной воде (70 мкл 10% водного раствора аммиака на 100 мл дистиллированной воды) в течение 1 мин.
5) Промывают стекла в дистиллированной воде 3 мин.
6) Далее фильтровальной бумагой максимально убирают воду вокруг срезов и наносят краситель - 0,01% водный раствор динатриевой соли 2,7-(1-амино-4-сульфо-2-нафтилазо)флуорена.
7) После этого перемещают препараты во влажную камеру и инкубируют в термостате при температуре 40°C в течение часа.
8) Промывают препараты в дистиллированной воде (10 мин).
9) Максимально удаляют жидкость со срезов и предметного стекла фильтровальной бумагой и наносят на срезы необходимое количество водорастворимой заключающей среды Fluorescent Mounting Medium (Dako, США) или аналогичной водорастворимой среды, после чего заключают срезы под покровное стекло.
Подготовленные препараты анализируются при помощи микроскопии под УФ и конфокальной микроскопии.
Применимость способа иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Амилоидоз сердца.
На фиг. 1 представлена микрофотография окрашенного заявляемым способом среза препарата миокарда, предоставленного лабораторией кардиомиопатий Института сердечно-сосудистых заболеваний при 1 СПбГМУ им. И.П. Павлова. При исследовании с использованием флуоресцентной микроскопии (микроскоп Leica DM2500) на препарате миокарда определяются интенсивно флуоресцирующие в оранжево-красном диапазоне амилоидные массы (отмечены стрелками), распространяющиеся в межмышечных прослойках соединительной ткани и охватывающих узким ободком отдельные кардиомиоциты. Представленная картина характерна для диффузного отложения амилоида в миокарде. Данный вариант амилоидоза был верифицирован иммуногистохимически как AL-амилоидоз.
Пример 2. Амилоидоз слизистых оболочек (наследственный транстиретиновый амилоидоз).
При использовании флуоресцентной микроскопии (микроскоп Leica DM2500) в препарате слизистой оболочки ротовой полости (фиг. 2) определяются очаговые скопления амилоида (отмечены стрелкой), обладающие интенсивной оранжево-красной флуоресценцией. Указанные скопления обнаружены на границе собственной пластинки слизистой оболочки и мышечной ткани. Представленная картина характерна для проявлений системного амилоидоза. Данный вариант амилоидоза был верифицирован результатами молекулярно-генетического анализа как ATTR-амилоидоз (мутация Ala81Val) с выраженными признаками амилоидозной кардиомиопатии.
В двух представленных примерах краситель продемонстрировал выраженную интенсивность флуоресценции в сочетании с высокой селективностью выявления амилоида при полном отсутствии фоновой флуоресценции. Способ позволяет идентифицировать амилоид по интенсивной красной флуоресценции, в значительной степени упростить процедуру окраски, а также повысить чувствительность за счет практически полного исключения фоновой окраски, сопровождающей окрашивание Конго красным.
Литература
1. Ashburn Т.Т., Han Н., VcGuinness В., Lansbury Р.Т. Amyloid probes based on Congo Red distinguish between fibrils comprising different peptides. Chemistry and Biology. 1996, V. 3, N 5, 351-358.
2. Bennhold H. Eine spezifische  mit Kongorot.  Med. Wschr. 1922, 44, 1537-1538.
3. Biancalanaa M., Koidec S. Molecular mechanism of Thioflavin-T binding to amyloid fibrils // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 2010. Vol. 1804, №7. P. 1405-1412.
4. Novelli A., Ruiz C., New substantive dyes derived from 2,7-diaminofluorene, Ann. Asoc. Quim. Argent., 1928, V. 16, 56-64.
5. Real de  Costa R.,  Filigheddu M.T., Trujillo D.,  Systemic AA amyloidosis: epidemiology, diagnosis, and management // Clinical Epidemiology. 2014. Vol. 6. P. 369-77.
6. Sipe J.D., Benson M.D., Buxbaum J.N., Ikeda S.-i., Merlini G., Saraiva M.J.M., Westermark P. Amyloid fibril proteins and amyloidosis: chemical identification and clinical classification. International Society of Amyloidosis 2016 Nomenclature Guidelines. Amyloid. The Journal of protein folding disorders. 2016, 23 (4), 209-213.
7.  Bijzet J., Hazenberg B.P., Nilsson K.P.,  Sensitive and rapid assessment of amyloid by oligothiophene fluorescence in subcutaneous fat tissue // Amyloid. 2015. Vol. 22, №1, C. 19-25.
8. Stopa В., Piekarska В., Konieczny L., Rybarska J., Spolnik P., Zemanek G., Roterman I., Krol M. The structure and protein binding of amyloid-specific dye reagents. Acta Biochimica Polonica. 2003, V. 50, N 4, 1213-1227.
9. Гусельникова B.B., Кирик O.B., Федорова E.A., Шавловский М.М,, Гудкова А.Я., Коржевский Д.Э. Быстрый способ окраски амилоида Конго красным для световой и флюоресцентной микроскопии // Морфология, 2016, Т. 149, вып. 2. С. 84-88.
10. Коржевский Д.Э. Применение гематоксилина в гистологической технике // Морфология, 2007, Т. 132, вып. 6. С. 77-82.
11. Коржевский Д.Э., Сухорукова Е.Г. Морфологическая диагностика. Гистохимические методы окрашивания гистологических препаратов. СПб.: СпецЛит, 2013.