БИОПРЕПАРАТ В ВИДЕ ВОДНОЙ СУСПЕНЗИИ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ПОЧВЕННОГО ПЛОДОРОДИЯ
BIOLOGICAL PREPARATION IN FORM OF AQUEOUS SUSPENSION FOR INCREASING SOIL FERTILITY

Изобретение относится к биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии и, в частности, к производству бактериальных препаратов на основе азотфиксирующих бактерий, используемых в агротехнике для повышения плодородия почвы и урожайности.
Известно использование в сельском хозяйстве различных, в первую очередь минеральных, удобрений, которые вводят в почву в виде растворов, порошка или гранул. Недостатком известных удобрений следует признать их медленно оказываемое действие на растения, поскольку процесс освобождения питательных веществ из удобрений длителен и происходит в основном за счет сообщества микроорганизмов, присущего почве, в которую внесли указанное удобрение. Поэтому вносят вместе с удобрениями различные биодобавки, ускоряющие процесс высвобождения питательных веществ из различных удобрений, а также процесс усвоения высвобожденных веществ растениями. Кроме того, указанные биодобавки способствуют дополнительному накоплению питательных веществ в почве в легкоусвояемой растениями форме.
Известно, что основным источником азота для почвы является молекулярный азот атмосферы. Процесс его усвоения, перевод в доступную для растений форму осуществляется с помощью микроорганизмов азотфиксаторов. Почвенные микроорганизмы-азотфиксаторы при успешном развитии способны накапливать в почве значительные количества до 100 кг/га минерального азота, усвояемого растениями. При внесении в почву азотфиксирующих микроорганизмов значительно сокращается применение минеральных азотных удобрений. Микроорганизмы-азотфиксаторы, переводя молекулярный азот атмосферы в доступную для растений форму, улучшают азотное питание сельскохозяйственных растений.
В настоящее время применение бактериальных препаратов для повышения плодородия почвы является перспективным приемом агротехнологии, альтернативой возрастающему использованию минеральных удобрений. Это особенно актуально в условиях необходимости экологической безопасности.
Известно применение бактериальных удобрений на основе различных штаммов микроорганизмов или их метаболитов (авт. св. СССР №1473345, пат. РФ. №1806123, пат. РФ №2041867).
Для повышения эффективности удобрения в них дополнительно вводят водные суспензии бактериальных культур (авт. свид. СССР №589238), суспензии дрожжей и одноклеточных водорослей (авт. свид. СССР №935501), предварительно ферментированный птичий помет и торф, консорциум бактерий Streptococcus thermophilus, Streptococcus bovis, Dactobacillus salivaries var salicinicus, Lactobacillus salivaries var salicinicus, Lactobacillus acidophilus (RU, патент 2055823, С05F 11/08, 1996).
Известно использование различных микроорганизмов: азотфиксирующие (Azotobacter chroococcum), фосфаторастворяющие (Bacillus mucilaginosus), молочнокислые в виде консорциума, содержащего Streptococcus thermophilus. Streptococcus bovis, Lactobacillus salivaries var salicinicus, Lactobacillus salivaries var salivarus, Lactobacillus acidophilus. Дополнительно могут быть внесены Trichoderma viride, Beauveria bassiana (патент РФ №2081866).
Общими недостатками использования микроорганизмов являются сложность производства, а также наличие проблем при хранении и транспортировании и связанная с этим низкая стабильность препарата.
Известно большое количество микроорганизмов-азотфиксаторов, используемых для получения на их основе бактериальных препаратов: симбиотические и ассоциативные азотфиксаторы, свободноживущие азотфиксаторы. Давно известны и применяются препараты на основе свободноживущих азотфиксирующих бактерий рода Azotobacter: препарат «Азотобактерин» (сб. «Бактериальные удобрения», ред. Березовая Е.Ф., Доросинский Л.М., 1961 г., Ленинград). В основном для данных препаратов использовали бактерии Azotobacter chrorococum. Известны штаммы Azotobacter chrorococum для бактериального препарата (авт.св. СССР №1316189). Данный штамм является несимбиотическим азотфиксатором для ячменя. Препарат на основе этого штамма имеет незначительный срок годности и слабую эффективность в полевых условиях, длительное время культивирования - около 130 часов. Также следует признать низкую продуктивность культуры при выращивании в предлагаемых условиях, использование дорогостоящего и дефицитного стимулятора роста - арахидоновой кислоты, а также низкую жизнеспособность культуры на кислых почвах (рН меньше 5,0) и в условиях низкой влажности (меньше 20%).
Использование Azotobacter позволяет повысить урожай в основном лишь овощных культур и кормовых трав (Мишустин Е.Н. и др. Клубеньковые бактерии и инокуляционный процесс. М., 1973. Barber J.E. et al. Plant fnd Sil. 1979. 52. №1).
Штамм Azotobacter mysorens-7 №164 применяется для изготовления бактериального удобрения, повышающего урожайность злаковых кормовых трав (авт. свид. СССР №1083531).
Наиболее близким техническим решением к предлагаемому относится биопрепарат, который содержит ассоциацию азотфиксирующих бактерий Azotobacter chrorococum и Beijerinckia fluminensis, консервант, а также микро- и макроэлементы, например ионы магния, железа, марганца, цинка, молибдена, бора и кобальта (пат. РФ №2148571).
Общим недостатком известных биопрепаратов является низкая жизнеспособность культуры на кислых почвах, низкая продуктивность культуры.
Техническая задача, решаемая посредством настоящего изобретения, состоит в разработке биопрепарата на основе штамма бактерий Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933 для повышения почвенного плодородия, способствующего повышению урожайности культурных растений, увеличению срока хранения препарата и более простой и дешевой технологии получения препарата.
9
Поставленная цель достигается путем использования биопрепарата для повышения почвенного плодородия, содержащего азотфиксирующие бактерии, консервант и микроэлементы медь, цинк, магний, марганец, кобальт, молибден, бор, при этом в качестве азотфиксирующих бактерий используется штамм бактерий Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933 с содержанием живых бактерий не менее 1×10 кл/мл в культуральной жидкости, а в качестве консерванта используют поваренную соль, при следующем соотношении компонентов, мас.%
штамм бактерий в культуральной жидкости
50-60
микроэлементы
0,2 - 0,3
поваренная соль
1,0-1,5
вода
остальное до 100
Штамм бактерий Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933 является продуцентом экзополисахарида (патент РФ 2073712). Препарат получают простой и дешевой технологией получения препарата, а именно используют один штамм, что упрощает технологию и позволяет повысить технологическую стерильность.
Штамм Azotobacter vinelanlii (Lipman) выделен из почвы методом почвенных пластинок из нейтральной пахотной почвы АБС МГУ "Чашково". Штамм депонирован в ВКПМ института "ВНИИгенетики", наименование штамма ФЧ-1, присвоенный номер при депонировании ВКПМ В-5933. Штамм растет на многих натуральных и синтетических средах: МПА, агаризованном сусле, средах Эшби, Виноградского, Федорова. Культивирование на указанных средах осуществляется при 28-30°С в течение 2-2,5 суток при рН 6,8-7,2.
Для улучшения роста культуры и синтеза втор-метаболитов в состав сред вносится азот в виде аммонийных солей и органический азот в виде белково-витаминного концентрата (БВК). На вязкость раствора постферментационной жидкости рН в интервале 2-11 не влияет, система биологически стабильна.
2
4
4
2
4
2
2
4
2
Пример 1. Бактерия Azotobacter vinelandii (Lipman) ВКПМ В-5933 при росте на богатой органической среде (жидком сусле) в условиях аэрации при 20-30°С в течение 48 ч продуцирует экзополисахарид, превращая постферментационную жидкость в гель. Культивирование штамма осуществляли на жидкой минеральной среде, содержащей в 100 г воды КНРO - 1,0 г; MgSO·7НO - 0,5 г; FeSO·7НO - 0,0005 г; NaМоO ·2HО - 0,005 г.
3
В качестве источника углеродного питания использовали глюкозу в концентрации 1,5%. При культивировании на жидкой минеральной среде заявляемый штамм требует дополнительный фактор роста - ферментализат БВК в количестве 0,2 г на 100 г воды. Выращивание осуществляли при 28-30°С в условиях аэрации и перемешивании в колбах объемом 750 см со 100 мл среды указанного состава в течение 48 ч на качалках (n 220 об/мин). При этом происходит подкисление среды до рН 4,7 за счет выделения органических кислот и СО в культуральную жидкость. Было установлено оптимальное значение рН для роста культуры Azotobacter vinelandii (Lipman) 6,8-7,0 и для синтеза экзополисахаридов 6,8-7,2.
9
Пример 2. Периодическое культивирование штамма Azotobacter vinelandii (Lipman) осуществляют в аппаратах типа АНКум объемом 10 л, рабочий объем 4 л. Использовали среду из примера 1. В качестве источника углеродного питания применяли этанол в количество 1 об. В качестве инокулята использовали штамм, полученный по примеру 1, в колбе на качалке. Количество инокулята 10-20%. Условия проведения процесса: температура 28-30°С, рН 6,8-7,2, подача воздуха 0,5 л/л среды в 1 мин, скорость перемешивания 300 об/мин, время культивирования 18-20 ч. Содержание живых бактерий в культуральной жидкости 1,3×10 кл/мл. Процесс идет стабильно, ассоциация устойчиво сохраняет свои свойства в пяти последовательных ферментациях.
Авторами были установлены новые свойства штамма бактерий Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933. Указанная культура обладает рядом ценных характеристик: возможность развития на кислых почвах (рН меньше 5,5), в условиях пониженной влажности (12-14%), на почвах, бедных органикой. Культура накапливает значительные количества витаминов (табл.1). При определенных условиях культура синтезирует значительное количество полисахаридов-альгинатов, которые играют важную роль в выживаемости и адаптационных процессах при внесении препарата в почву. Температурный режим +12+40°С.
При выращивании культуры Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933 на плотных средах культура образует так называемую полисахаридную капсулу, что способствует устойчивости биопрепарата при хранении и в почве.
При разработке состава препарата с использованием культуры Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933 было проверено влияние микроэлементов: кобальта, молибдена, бора, магния, марганца, цинка. Результаты испытаний отражены в табл.3. При использовании заявленного препарата с микроэлементами установлено экспериментально положительное влияние микроэлементов на азотфиксацию и выживаемость штамма Azotobacter vinelandii при хранении и внесении в почву.
Биопрепарат эффективен по азотфиксации, обладает способностью к синтезу биологически активных веществ в защищенном и открытом грунте в широком диапазоне рН и влажности, удобен в применении, проявляет свойства, усиливающие сопротивляемость пшеницы к различным заболеваниям, улучшает показатели фитосанитарного состояния посевов.
Пример 3.
Биопрепарат готовили в аппарате с мешалкой. Для приготовления препарата использовали культуру Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933, выращенную в условиях примера 2.
Взяли 50 г культуральной жидкости, содержащей Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933. Дополнительно внесли в культуральную жидкость смесь микроэлементов: цинк, магний, марганец, кобальт, молибден, бор в равных долях из расчета 0,22 г смеси микроэлементов, в качестве консерванта внесли соль поваренную (ГОСТ Р 51574 - 2000) 1 г. Добавили воду до 100 г, перемешали. Товарная форма препарата - водная суспензии.
Таким образом, предлагаемый препарат имеет следующий состав, из расчета на 100 г препарата:
культуральная жидкость Azotobacter vinelandii
ВКПМ В-5933
50 г
микроэлементы
0,22 г
поваренная соль
1 г
вода
48,78
Срок хранения препарата 12 месяцев.
Используемые составы биопрепарата в последующих опытах приведены в табл.1.
Экспериментально была установлена способность культуры Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933 синтезировать и выделять витамины, играющие важную роль в нормальном обмене веществ и жизнедеятельности растений (табл.2).
Полученный препарат использовали для обработки овощей защищенного грунта (помидоры, огурцы) и открытого грунта (картофель). Результаты применения приведены в табл.3.
Было определено влияние биопрепарата на урожайность ячменя и пшеницы при применении в фазе кущения. Опытно-производственные обработки полей ячменя и пшеницы проведены с помощью аэрозольного генератора регулируемой дисперсности. Результаты приведены в табл.4.
В условиях 2006 года на яровой пшенице биопрепарат проявил высокую эффективность, увеличивал урожайность культуры в пределах 13-18% и проявлял свойства, усиливающие сопротивляемость пшеницы к различным заболеваниям. Показатели фитосанитарного состояния посевов были более благополучными на вариантах с используемым препаратом. Снижалось развитие корневых гнилей на 15-20% и бурая ржавчина развивалась менее интенсивно на 5-10% по сравнению с контролем.
Предложенный препарат, кроме накопления фиксированного азота, проявляет свойства, усиливающие сопротивляемость пшеницы к различным заболеваниям, улучшает показатели фитосанитарного состояния посевов, снижает интенсивность развития корневых гнилей и бурой ржавчины, что позволяет сохранить урожай при существенном сокращении использования для данных целей различных ядохимикатов.
Таким образом, применение предложенного препарата позволяет сократить внесение азотных минеральных удобрений, повысить урожайность и получить более качественную, содержащую большое количество белка, углеводов, витаминов продукцию при существенном сокращении содержания в продукции нитратов, нитритов, вредных ядохимикатов.
Таблица 1
Культуральная жидкость Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933, мас.%
Микроэлементы, мас.%
Консервант, мас.%
Срокхранения, месяц
Прибавка урожая огурцов, кг/м<sup>2</sup>
50
0,2
1,0
12
4,4
60
0,3
1,5
12
4,7
55
0,25
1,2
4,5
Штамм по прототипу (пат.2148571) 50%
0,22
1
4,5
3,8
Таблица 2
Наименование витаминов
Содержание витаминов в мкг на 1 г сухого вещества в клетках Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933
Тиамин
90
Рибофлавин
356
Никотиновая кислота
395
Биотин
5,1
Таблица 3
Культура
Урожайность различных культур, кг/м<sup>2</sup>
Контроль (без добавления препарата)
С добавлением биопрепарата
С добавлением биодобавки по прототипу
Томаты
17,2
23,1
21,7
Огурцы
13,5
17,8
16,5
Картофель
11,4
17,3
17,3
Таблица 4
Культура
Площадь, га
Урожай, ц/га
Прибавка
опыт
контроль
опыт
контроль
ц/га
%
Ячмень «Ача»
120
34
28,8
22,6
6,2
27
Пшеница
Новосибирская 20
4,9
56,1
31,6
27,4
4.4
15
Пшеница Новосибирская 15
34,5
7,5
24,4
19,9
4,5
18