ПОВЫШЕННАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ DHT-МОДИФИЦИРОВАННЫХ РАСТЕНИЙ К АУКСИНОВЫМ ГЕРБИЦИДАМ, ПОЯВЛЯЮЩАЯСЯ В РЕЗУЛЬТАТЕ РАЗЛИЧИЙ ВО ФРАГМЕНТАХ В МОЛЕКУЛЯРНОЙ СТРУКТУРЕ АУКСИНОВЫХ ГЕРБИЦИДОВ
HIGH RESISTANCE OF DHT-MODIFIED PLANTS TO AUXIN HERBICIDES APPEARING AS THE RESULT OF DIFFERENCES IN FRAGMENTS IN MOLECULAR STRUCTURE OF AUXINIC HERBICIDES

ПРИТЯЗАНИЕ НА ПРИОРИТЕТ
Это заявка испрашивает приоритет предварительной патентной заявки США под номером 61/430693, зарегистрированной 7 января 2011 года на «Повышенная устойчивость DHT-модифицированных растений к ауксиновым гербицидам, появляющаяся в результате различий во фрагментах в молекулярной структуре ауксиновых гербицидов».
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к способу борьбы с нежелательной растительностью на поле, содержащем устойчивую к ауксиновому гербициду сельскохозяйственную культуру хлопчатника, включающий применение к месту, где желательно уничтожение нежелательной растительности, эффективного количества 2,4-ДБ.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Применение ауксиновых гербицидов для борьбы с нежелательной растительностью на поле с устойчивой к ауксиновому гербициду сельскохозяйственной культурой хлопчатника может вызывать временное повреждение у устойчивой к ауксиновому гербициду сельскохозяйственной культуры хлопчатника, которое может приводить к задержке развития. Видимое временное повреждение может включать комбинацию опада листьев, завивание листьев и искривление черешка - вместе называемые эпинастией. Другое временное повреждение, которое может быть видимым спустя 10-14 дней после применения, включает стропировку листьев, уродство и эпинастию на листьях. Такое временное повреждение в начале сезона может приводить к нежелательному увеличению периода созревания сельскохозяйственной культуры хлопчатника, вынуждая фермера к дополнительным расходам и, возможно, снижению общего урожая сельскохозяйственной культуры.
Настоящее изобретение направлено на и решает проблемы, связанные с повреждением сельскохозяйственной культуры, происходящие в результате применения ауксинового гербицида для борьбы с нежелательной растительностью на поле, содержащем устойчивую к ауксиновому гербициду сельскохозяйственную культуру, включая задержку раннего созревания, происходящую в результате повреждения гербицида в начале сезона.
РАСКРЫТИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Целью настоящего изобретения является способ борьбы с нежелательной растительностью на поле, содержащем устойчивую к ауксиновому гербициду сельскохозяйственную культуру хлопчатника, включающий применение к месту, где желательно уничтожение нежелательной растительности, эффективного количества 2,4-ДБ.
Другой целью настоящего изобретения является способ, в котором повреждение устойчивой к гербициду сельскохозяйственной культуры хлопчатника снижается относительно применяемого количества эквивалента кислоты 2,4-Д.
Дополнительные цели и преимущества настоящего изобретения будут с легкостью очевидны специалисту в этой области техники из следующего подробного описания, в котором варианты осуществления настоящего изобретения описаны просто путем иллюстрирования наилучшего варианта осуществления способа, рассмотренного для осуществления настоящего изобретения. Как будет понятно, настоящее изобретение может иметь другие и различные варианты осуществления, и некоторые его детали могут быть модифицированы в различных очевидных отношениях, при этом во всех из них, не отступая от настоящего изобретения. Соответственно, описание должно рассматриваться как иллюстративное по природе и не ограничивающее.
ВАРИАНТ(Ы) ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящие изобретения далее будут описаны более полно. Действительно, эти изобретения могут быть осуществлены во множестве различных форм и не должны быть рассмотрены как ограниченные вариантами осуществления, сформулированными в настоящем описании; скорее эти варианты осуществления приведены так и для того, чтобы это раскрытие удовлетворяло применяемым законным требованиям. Схожие номера относятся к схожим элементам во всем описании.
Многие модификации и другие варианты осуществления настоящих изобретений, сформулированные в настоящем описании, придут на ум специалисту в области техники, к которой принадлежат эти изобретения, с преимуществом указаний, приведенных в предшествующих описаниях. Поэтому необходимо понимать, что настоящие изобретения не должны быть ограничены определенными раскрытыми вариантами осуществления и что модификации и другие варианты осуществления подразумеваются включенными в объем приложенной формулы изобретения. Несмотря на то, что в настоящем описании применены специфические термины, они применены только в общем и описательном смыслах, а не с целью ограничения.
Настоящее изобретение сводится к способу борьбы с нежелательной растительностью на поле, содержащем устойчивую к ауксиновому гербициду сельскохозяйственную культуру хлопчатника, включающему применение к месту, где желательно уничтожение нежелательной растительности, эффективного количества 2,4-ДБ.
Как применено в этой спецификации и если иначе не указано, термин «гербицид» относится к молекуле или комбинации молекул, которые замедляют или иначе уничтожают нежелательные, ненужные растения; такие как, но не ограничивая ими, вредные или мешающие сорняки, широколиственные растения, злаки и осоки; и может быть применен, таким образом, для защиты сельскохозяйственных культур. Фраза «эффективное количество» обозначает количество гербицида, необходимое для оказания видимого желаемого эффекта сокращения нежелательного роста растений, включая эффекты некроза растений, отмирания растений, затормаживания роста, ингибирования размножения, ингибирования пролиферации и удаления, деструкции или иным образом уменьшения появления и активности нежелательных, ненужных растений. Нежелательные, ненужные растения включают устойчивые к гербицидам и резистентные к гербицидам сорные растения, такие как устойчивые к глифосату сорные растения, и резистентные к глифосату сорные растения.
«Ауксиновый гербицид» включает гербициды, содержащие арилоксиалканоатную химическую структуру, такую как феноксиацетатные ауксины (например, 2,4-Д и МЦПА), феноксибутаноатные ауксины (например, 2,4-ДБ и МЦПБ) и пиридилоацетатные ауксины (например, флуроксипир и триклопир).
К растениям по настоящему изобретению могут быть применены многочисленные гены устойчивости к ауксиновым гербицидам. Сельскохозяйственные культуры хлопчатника могут быть модифицированы так, чтобы они содержали любое семейство генов устойчивости (обозначаемые AAD), которые кодируют фермент арилоксиалканоат диоксигеназу (AAD), который затем инактивирует ауксиновый гербицид в растении. Такую устойчивость к гербицидам могут придавать гены AAD-1 (получаемые из Sphingobium herbicidovorans), AAD-12 (получаемые из Delftia acidovorans) и гены AAD-13, как раскрыто в публикации PCT WO 2005/107437, публикации PCT WO 2007/053482 и публикации PCT US 2010/0251432 A1.
Ауксиновый гербицид, такой как 2,4-ДБ, применяют традиционным способом к месту, где желательно уничтожение сорных растений. «Место» предполагает обозначения, включая почву, семена и сеянцы, так же как установившуюся растительность. Гербицидное действие 2,4-ДБ проявляется тогда, когда его применяют непосредственно к растению или к месту расположения растения в любой стадии роста или до высаживания или появления всходов. Наблюдаемый эффект зависит от вида растений, с которыми необходимо бороться, стадии роста растения, параметров разведения при внесении и размера разбрызгиваемых капель, размера частиц твердых компонент, окружающих условий во время применения, конкретного применяемого соединения, конкретных адъювантов и применяемых носителей, типа почвы и т.п., так же как от количества применяемого химиката. Эти и другие факторы могут быть приспособлены, как известно в области техники, для усиления предполагаемого гербицидного действия. В целом, предпочтительно применение 2,4-ДБ на послевсходовой стадии к относительно незрелой нежелательной растительности для достижения максимальной борьбы с сорными растениями.
Хлопок (виды Gossypium) является самой важной в мире текстильной волоконной сельскохозяйственной культурой и одной из самых важных в мире сельскохозяйственных культур для получения масличных семян. Хлопчатники обеспечивают источник пищи для человека, корма для домашнего скота и сырья для промышленности. Семена хлопчатника отжимают для получения пищевого масла, а остаточный материал применяют в качестве корма для животных. Промышленные применения хлопчатника включают получение фитилей, шпагата, бумаги и множества тканевых продуктов.
Род Gossypium является очень большим, в настоящее время содержащим 50 видов. Два тетраплоидных вида Gossypium имеют пригодные для прядения волокна семян, называемые льном. Этими двумя видами являются G. hirsutum (называемый хлопчатник американский) и G. barbadense (называемый хлопком пима).
Хлопчатник является двудольным растением с совершенными цветками, т.е. хлопчатник имеет мужские, пыльцеобразующие органы, и отдельно женские, опыляемые органы на том же самом цветке. Культурный цветок хлопчатника окружен тремя треугольными прицветниками, образующими так называемые квадраты. Цветок имеет открытый венчик с пятью лепестками, тычиночную колонку со сросшимися тычинками, образующую обрамляющую трубку. Синкарпный пестик состоит из трех-пяти плодолистиков с рыльцами, высовывающимися над пыльниками. Завязь развивается в три-пятьгнездовую коробочку или семенную коробочку. От семи до девяти семян находятся внутри каждого отсека или гнезда. За день до цветения из квадрата появляется искривленный венчик. В день цветения венчик открывается и происходит разнос пыльцы. Венчик становится красным на следующий день после цветения и позднее отпадает от растения. Опыление происходит с открытием пыльников и попаданием пыльцы на рыльце или с переносом пыльцы на рыльце насекомыми.
Под «растением» понимаются растения целиком, органы растений (например, листья, стебли, корни и т.д.), семена, растительные клетки, пропагулы, эмбрионы и потомство растений. Растительные клетки могут быть дифференцированными или недифференцированными (например, каллюс, суспензия культуры клеток, протопласты, клетки листьев, клетки корней, клетки флоэмы и пыльца).
«Трансгенные растения» или «модифицированные растения» или «устойчиво модифицированные» растения, клетки или ткани относятся к растениям, содержащим введенные или интегрированные в растительную клетку экзогенные последовательности нуклеиновых кислот или фрагменты DNA. Под «устойчивым модифицированием» понимается то, что нуклеотидный конструкт, введенный в растение, интегрируется в геном растения и может передаваться по наследству его потомству.
Гербицидно-активное соединение 4-(2,4-дихлорфенокси)масляная кислота или 2,4-ДБ описано, например, в Tomlin, Clive (редактор) (2009) пятнадцатом издании «Pesticide Manual», British Crop Protection Council (BCPC), страницы 306-308.
Подходящие сельскохозяйственные адъюванты и носители, которые полезны при получении гербицидных смесей по настоящему изобретению, известны специалистам в области техники.
Жидкие носители, которые могут быть применены, включают воду, толуол, ксилол, лигроин, масло сельскохозяйственной культуры, ацетон, метилэтилкетон, циклогексанон, трихлорэтилен, тетрахлорэтилен, этилацетат, амилацетат, бутилацетат, простой монометиловый эфир пропиленгликоля и простой монометиловый эфир диэтиленгликоля, метанол, этанол, изопропанол, амиловый спирт, этиленгликоль, пропиленгликоль, глицерин и т.п. В целом, вода является предпочтительным носителем для разведения концентратов.
Подходящие твердые носители включают тальк, пирофиллитовую глину, кремнезем, аттапульгитовую глину, каолинитовую глину, кизельгур, мел, диатомовую землю, известь, карбонат кальция, бентонитовую глину, фуллерову землю, оболочки семян хлопчатника, пшеничную муку, соевую муку, пемзу, древесную муку, муку из скорлупы грецкого ореха, лигнин и т.п.
18
16
Обычно в композиции по настоящему изобретению желательно включение одного или более поверхностно-активных агентов. Такие поверхностно-активные агенты преимущественно применяют и в твердых и в жидких композициях, особенно такие, которые разработанные для разбавления носителем перед применением. Поверхностно-активные агенты могут быть анионными, катионными или неионными по природе и могут быть применены в качестве эмульгаторов, смачивающих агентов, суспендирующих агентов или в других целях. Типичные поверхностно-активные агенты включают соли алкилсульфатов, такие как лаурилсульфат диэтаноламмония; алкиларилсульфонатные соли, такие как додецилбензолсульфонат кальция; продукты присоединения алкилфенола и алкиленоксида, такие как нонилфенол-C этоксилат; продукты присоединения алкиленоксида и спирта, такие как тридециловый спирт-C этоксилат; мыла, такие как стеарат натрия; алкилнафталинсульфонатные соли, такие как натрия дибутилнафталинсульфонат; диалкиловые сложные эфиры сульфосукцинатных солей, такие как натрия ди(2-этилгексил)-сульфосукцинат; сложные эфиры сорбита, такие как сорбитололеат; четверичные амины, такие как хлорид лаурилтриметиламмония; сложные полиэтиленгликолевые эфиры жирных кислот, такие как стеарат полиэтиленгликоля; блок-сополимеры этиленоксида и пропиленоксида; и соли моно- и диалкилфосфатных сложных эфиров.
Среди адъювантов, традиционно применяемых в сельскохозяйственных композициях, включают агенты улучшающие совместимость, противовспенивающие агенты, пассиваторы, нейтрализующие агенты и буферы, ингибиторы коррозии, краски, одоранты, агенты, улучшающие растекание, агенты, улучшающие подпитывание, клейкие агенты, диспергирующие агенты, загустители, агенты, понижающие температуру замерзания, противомикробные агенты и т.п. Композиции могут также содержать другие совместимые компоненты, например другие гербициды, регуляторы роста растения, фунгициды, инсектициды и т.п., и могут быть составлены в композицию с жидкими или твердыми удобрениями, твердыми носителями для удобрений, такими как нитрат аммония, мочевина и т.п.
Концентрация активных ингредиентов в гербицидных композициях по этому изобретению, в целом, составляет от приблизительно 0,001 до приблизительно 98 процентов по массе.
Часто применяют концентрации от приблизительно 0,01 до приблизительно 90 процентов по массе. В композициях, разработанных для применения в качестве концентратов, активный ингредиент, в целом, присутствует в концентрации от приблизительно 5 до приблизительно 98 процентов по массе, предпочтительно, от приблизительно 10 до приблизительно 90 процентов по массе. Такие композиции перед применением, как правило, разбавляют инертным носителем, таким как вода. Разбавленные композиции, которые обычно применяют к сорным растениям или месту нахождения сорного растения, в целом, содержат от приблизительно 0,0001 до приблизительно 1 процента по массе активного ингредиента и, предпочтительно, содержат от приблизительно 0,001 до приблизительно 0,05 процентов по массе.
В способах по настоящему изобретению применение гербицида 2,4-ДБ может быть выполнено в равной степени стадии до посева, до появления всходов и после появления всходов сельскохозяйственной культуры. Применение на довсходовой стадии и/или ранней послевсходовой стадии является предпочтительным.
«Довсходовое» определяется как применение гербицида во время периода до появления проростка сельскохозяйственной культуры над поверхностью земли. «Послевсходовое» определяется как применение гербицида во время периода после появления проростка сельскохозяйственной культуры из земли, где в контакт с гербицидом приводят листовую поверхность сельскохозяйственной культуры. Предпочтительно, 2,4-ДБ применяют к сельскохозяйственной культуре хлопчатника на послевсходовой стадии и во время стадии вегетативного роста сельскохозяйственной культуры хлопчатника.
Гербицидные соединения по настоящему изобретению часто применяют вместе с одним или более других гербицидов для борьбы с более широким спектром нежелательной растительности. При применении вместе с другими гербицидами патентуемые в настоящем соединения могут быть составлены в композицию с другим гербицидом или гербицидами, смешаны в резервуаре с другим гербицидом или гербицидами или применены последовательно с другим гербицидом или гербицидами. Некоторые гербициды, которые могут быть применены вместе с соединениями по настоящему изобретению, включают глифосат, глуфосинат, паракват, ALS-ингибиторы (например, сульфонилмочевины, имидазолиноны, триазолопиримидин сульфонанилиды и т.д.), HPPD-ингибиторы (например, мезотрион, изоксафлутол и т.д.), PPO-ингибиторы (например, парафлуфен, фомесафен и т.д.), дикамбу, бромоксинил, арилоксиалканоаты и другие, некоторые из которых могут потребовать генетической модификации для придания устойчивости сельскохозяйственной культуре к этим гербицидам.
Композиции по настоящему изобретению можно применять к сорнякам или месту их обитания при помощи обыкновенных наземных или воздушных распылителей, разбрызгивателей и устройств для внесения гранул, путем добавления в поливную воду и другими традиционными средствами, известными специалистам в области техники.
В одном аспекте настоящего изобретения повреждение устойчивой к гербициду сельскохозяйственной культуры хлопчатника, вызываемое применением эффективного количества 2,4-ДБ, снижается относительно применяемого эффективного количества 2,4-Д. Уменьшение воздействия гербицидов на сельскохозяйственную культуру имеет благоприятный эффект в уменьшении повреждения от гербицидов, таким образом, возможно сокращая время, необходимое для созревания сельскохозяйственной культуры, или даже приводя к экономии производителя путем снижения расходов и увеличения общего урожая сельскохозяйственной культуры.
Не желая быть связанными какой-либо теорией, предполагается, что 2,4-ДБ не является устойчивым гербицидом и подвергается бета-окислению внутри растения. Эта дополнительная метаболическая стадия и/или другие факторы приводят к увеличению способности AAD-модифицированных растений быть устойчивыми к применению 2,4-ДБ по сравнению с 2,4-Д. Это концепция может быть применена ко всем DAA-модифицированным сельскохозяйственным культурам, но особенно полезна при применении к DAA-модифицированным сельскохозяйственным культурам, включающим хлопчатник, которые обладают более низкой устойчивость к 2,4-Д.
Под «повреждением» подразумевается листовая поверхность, выраженная в процентах, которая является эпинастической (имеется опад листьев, закручивание листьев, искривление черешка) при визуальной оценке специалистом в области техники. Сниженное повреждение от 2,4-ДБ относительно 2,4-Д наблюдаемое в течение нескольких минут после применения этих гербицидов и продолжающее после оставаться наблюдаемым в течение длительного интервала времени, такого как от 2 часов после применения до 30 дней после применения, включая от 3 часов после применения до 19 дней после применения и, дополнительно, включая от 6 часов после применения до 24 часов после применения.
Рассматриваемое изобретение также включает трансгенные устойчивые к арилоксиалканоатным гербицидам сельскохозяйственные культуры хлопчатника, включающие один или более дополнительных генов устойчивости к гербициду, включая, но не ограничивая ими, гены устойчивости к глифосату, ALS-(имидазолинон, сульфонилмочевина), арилоксиалканоату, HPPD, PPO и глуфосинату, чтобы, таким образом, обеспечить устойчивые к гербицидам растения, совместимые с борьбой с более широким спектром более устойчивых сорных растений и вариантами регулирования устойчивости к гербицидам.
Нормы внесения составляют от приблизительно 0,1 до приблизительно 2240 грамм эквивалента кислоты/гектар (г-экв. кислоты/га), в целом, применяются на послевсходовой стадии и, предпочтительно, составляют от 1 до приблизительно 1120 г-экв. кислоты/га; для применения на довсходовой стадии, в целом, нормы внесения составляют от приблизительно 1 до приблизительно 2240 г-экв. кислоты/га. Более высокие приведенные нормы внесения, в целом, приводят к неизбирательной борьбе с широким спектром нежелательной растительности. Более низкие нормы внесения, как правило, приводят к избирательной борьбе и могут быть применены к месту нахождения сельскохозяйственных культур хлопчатника. В вариантах осуществления настоящего изобретения, предпочтительная норма внесения 2,4-ДБ для действия на послевсходовой стадии составляет, по меньшей мере, 280 г-экв. кислоты/га, предпочтительно, от приблизительно 280 г-экв. кислоты/га до приблизительно 2240 г-экв. кислоты/га.
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры включены для того, чтобы продемонстрировать конкретные предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения. Эти примеры не должны быть рассмотрены как ограничения к формуле изобретения. Специалистам в области техники будет понятно, что способы, раскрытые в следующих примерах, представляют собой конкретные подходы, применяемые для иллюстрирования предпочтительных вариантов его практического осуществления. Однако специалистам в области техники будет ясно в свете настоящего раскрытия, что в этих конкретных вариантах осуществления может быть сделано множество изменений, при этом все еще получая схожие или подобные результаты, не отступая от сущности и объема настоящего изобретения.
Растения хлопчатника модифицированы геном AAD-1 (AAD-1 хлопчатник), кодирующим белок арилоксиалканоат диоксигеназу (AAD). Эти растения применены в следующих примерах для демонстрации устойчивости к ауксиновым гербицидам, конкретно 2,4-ДБ и 2,4-Д. AAD-1 может также быть применен в качестве селектируемого маркера в селекционных питомниках. Сам ген AAD-1 впервые был раскрыт в смысле придания устойчивости растений к гербицидам в WO 2005/107437 (см. также патент США № 7838733).
Пример 1
2,4-ДБ и 2,4-Д обеспечивают схожую борьбу с сорными растениями на площадках с AAD-1 хлопчатников.
Эксперимент для сравнения действий 2,4-ДБ и 2,4-Д при борьбе с сорными растениями в AAD-1 хлопчатнике проводили на девяти полевых участках, расположенных около Гринвилла, Миссисипи (3 места); Чула, Джорджия; Мейкон, Джорджия; Аттапульгус, Джорджия; Мемфис, Теннесси; Ньюпорт, Арканзас; и Фресно, Калифорния. Экспериментальный план включал по четыре повторных испытания на каждом участке с обработками участков в рандомизированных полных блоках. Каждый участок содержал растения AAD-1 хлопчатника в двух рядах, которые имели длину 6,1 метра. Сорные растения и хлопчатник обрабатывали при росте от 5,1 см до 15,2 см за одно применение обработки. Обработки состояли из Butyrac 200 (2,4-ДБ) и Weedar 64 (2,4-Д), применяемых к участкам в количествах 560, 840 и 1120 г-экв. кислоты/га. Виды сорных растений оценивали визуально один раз в неделю в течение трех недель после применения гербицида в виде доли количества растений в процентах (0-100%, где 0 обозначает отсутствие действия или контроль и 100% обозначает полное отмирание целевого растения), уничтоженных или обнаруживающих тяжелое повреждение, вызванное действием гербицида.
Результаты борьбы с сорными растениями путем применения 2,4-ДБ и 2,4-Д на участках с AAD-1 хлопчатником показаны в таблице 1.
Таблица 1
Процентное выражение борьбы с целевыми сорными растениями при помощи 2,4-ДБ и 2,4-Д при 1120 г-экв. кислоты/га в AAD-1 хлопчатнике
Виды<sup>a</sup>
2,4-ДБ
2,4-Д
WAA<sup>b</sup>
≤80%
>80%
>90%
≤80%
>80%
>90%
ACCOS
88
90
3
ACNHI
99
99
2
AMAPA
81
89
3
AMAPA GLY-res
19
26
3
AMARE
89
93
3
AMASS<sup>c</sup>
77
92
3
CASOB
100
98
3
DEDTO
48
53
3
IAQTA
99
99
2
IPOHG
100
100
2
IPOSS
99
99
3
MOLVE
41
54
3
RCHSC
99
97
3
SEBEX
89
88
3
SIDSP
84
89
3
SOLNI
89
93
3
Аббревиатуры: AAD, арилоксиалканоат диоксигеназа; г-экв. кислоты/га, грамм-эквивалент кислоты на гектар.глифосат GLY-res, -устойчивый; WAA, недель после применения.Код разновидностей поддержан европейской Организацией
<sup>a </sup>Код вида, поддерживаемый Европейской организацией защиты растений (http://eppt.eppo.org/index.php.).
<sup>b </sup>Неделя после применения для измерения максимальной борьбы; n=36 участков.
Почти для всех целевых видов и в каждую неделю измерений с увеличением нормы внесения 2,4-ДБ или 2,4-Д получали больший уровень борьбы, с самым высоким результатом при 1120 г-экв. кислоты/га. Поэтому на этом наибольшее действие наблюдали при 1120 г-экв. кислоты/га. Таким образом, основываясь на эффективности действия, 1120 г-экв. кислоты/га является предпочтительной нормой внесения для борьбы с сорными растениями в AAD-1 хлопчатнике из этих трех протестированных норм. При 1120 г-экв. кислоты/га результат борьбы классифицировали либо как ≤80%, >80% или >90% уничтожения или тяжелого повреждения сорных растений.
По норме внесения 1120 г-экв. кислоты/га 2,4-ДБ и 2,4-Д обеспечивали эквивалентную борьбу с каждым видом сорного растения, за исключением видов Amaranthus (AMASS), в отношении которого действие 2,4-Д было заметно выше, чем у 2,4-ДБ, на 92-77% уничтожения. Большинство видов уничтожалось на >80% обоими гербицидами. Виды, уничтожение которых составляло менее 80% обоими гербицидами, представляли собой устойчивые к глифосату Amaranthus palmeri (AMAPA GLY-res), Desmodium tortuosum (DEDTO) и Mollugo verticillata (MOLVE).
Пример 2
Растения хлопчатника, модифицированные AAD-1, обладают повышенной устойчивостью к 2,4-ДБ по сравнению с 2,4-Д.
Для оценки устойчивости AAD-1-хлопчатника к действиям 2,4-ДБ и 2,4-Д гербицидных соединений гербициды Butyrac 200 (2,4-ДБ) и Weedar 64 (2,4-Д) применяли индивидуально путем разбрызгивания над AAD-1-растениями хлопчатника в двух полевых опытах.
Один эксперимент проводили в четырех полевых местах около Гринвилль, Миссисипи; Бринсон, Джорджия; Мемфис, Теннесси; и Фресно, Калифорния. Экспериментальный план включал по четыре повторных испытания на каждом месте с участками обработки в рандомизированных полных блоках. Каждый участок содержал AAD-1-растения хлопчатника в двух рядах, которые имели длину 6,1 метра. Растения хлопчатника обрабатывали при росте от 5,1 см до 10,2 см в высоту за одну обработку. Обработки состояли из Butyrac 200 (2,4-ДБ), примененного в количествах 560, 840, 1120, 1680 и 2240 г-экв. кислоты/га; и Weedar 64 (2,4-Д), примененного в количествах 840 и 1120 г-экв. кислоты/га. Спустя один день после применения AAD-1-растения хлопчатника визуально оценивали на процент листового покрытия, обнаруживающего повреждения, вызванные гербицидом.
Результаты повреждения у AAD-1-растений хлопчатника от 2,4-ДБ или 2,4-Д показаны в таблице 2. При нормах внесения 840 г-экв. кислоты/га 2,4-ДБ приводил к меньшему (но не статистически значимо) уровню повреждения у AAD-1-хлопчатника, чем наблюдаемое с 2,4-Д. Однако, при предпочтительной норме внесения 1120 г-экв. кислоты/га в течение первого дня после применения 2,4-ДБ приводил к значимо меньшему количеству повреждений у AAD-1-хлопчатника, чем наблюдаемое с 2,4-Д. Даже при двойной норме внесения 2,4-ДБ (2240 г-экв. кислоты/га) по сравнению с 2,4-Д (1120 г-экв. кислоты/га) AAD-1-хлопчатник имел значимо меньшее количество повреждений от 2,4-ДБ, чем от 2,4-Д.
Таблица 2
Среднее повреждение 1 DAA от 2,4-ДБ или 2,4-Д, примененных на послевсходовой стадии к AAD-1 хлопчатнику
Доверительный интервал<sup>b</sup>
Гербицид
Норма внесения(г-экв. кислоты/га)
Повреждение (%)<sup>a</sup>
нижнее среднее (%)
верхнее среднее (%)
Значимые группы<sup>с</sup>
2,4-ДБ
560
2,3
0,2
4,1
a
2,4-ДБ
840
4,1
2,1
7,9
ab
2,4-ДБ
1120
2,8
1,5
5,3
ab
2,4-ДБ
1680
4,5
2,4
8,2
ab
2,4-ДБ
2240
6,3
4,6
8,6
b
2,4-Д
840
7,4
4,5
12,0
bc
2,4-Д
1120
13,0
9,5
17,7
c
Аббревиатуры: AAD, арилоксиалканоат диоксигеназа; DAA, дней после применения.Г-экв. кислоты/га, грамм-эквивалент кислоты на гектар.
<sup>a</sup>Повреждение оценивали визуально в виде процента эпинастической листовой поверхности хлопчатника на участке; n=16 участков.
<sup>b</sup>Доверительные интервалы, которые не накладываются, указывают на значимые различия (P =0,05).
<sup>с</sup>Интервалы, отмеченные одинаковыми буквами,                                                                                                                                                                                                                                                                                                                         значимо не отличаются.
Другой эксперимент проводили в одном месте в поле при Университете Джорджии, на ферме Ponder Farm, около Тифтон, Джорджия. Экспериментальный план включал по три повторных испытания на участках в рандомизированных полных блоках. Каждый участок содержал AAD-1-растения хлопчатника в одном ряду, который имел длину 7,6 метра. Хлопчатники обрабатывали при росте 48,3 см в высоту (стадия 6-го листа) за одну обработку. Обработки состояли из Butyrac 200 (2,4-ДБ), примененного в количествах 280, 560, 1120 и 2240 г-экв. кислоты/га; и Weedar 64 (2,4-Д), примененного в количествах 560 и 1120 г-экв. кислоты/га. На 0, 1, 2, 19 и 45 дни после применения AAD-1-растения хлопчатника оценивали визуально на предмет процента листового покрытия, обнаруживших повреждение, вызванное гербицидом.
Результаты повреждения у AAD-1-растений хлопчатника с течением времени после применения 2,4-ДБ или 2,4-Д показаны в таблице 3. Самые высокие уровни повреждения у AAD-1-растений хлопчатника при всех нормах внесения визуально наблюдали в день (день 0) применения гербицида, как для 2,4-ДБ, так и для 2,4-Д. В дни 0, 1, 2 и 19 после применения в предпочтительной норме внесения 1120 г-экв.кислоты/га 2,4-ДБ приводил к значительно меньшему количеству повреждения, чем наблюдали для 2,4-Д. На 45 день после применения повреждения у AAD-1-растений хлопчатника не были достоверно различными для 2,4-ДБ и 2,4-Д, примененными в количестве 1120 г-экв. кислоты/га. Даже в двойной норме внесения 2,4-ДБ (2240 г-экв. кислоты/га) по сравнению с 2,4-Д (1120 г-экв. кислоты/га) AAD-1-растения хлопчатника имели значимо меньше повреждения от 2,4-ДБ, чем от 2,4-Д, в дни 0, 1 и 19 после применения.
Таблица 3
Среднее повреждение с течением времени от 2,4-ДБ и 2,4-Д, примененных на послевсходовой стадии к AAD-1-растениям хлопчатника
Гербицид
Норма внесения(г-экв. кислоты/га)
Среднее повреждение (%)<sup>ab</sup>
0 DAA
1 DAA
2 DAA
19 DAA
45 DAA
2,4-ДБ
280
1,7 a
0,7 a
1,3 ab
0,0 a
0,0 a
2,4-ДБ
560
2,7 a
0,0 a
0,7 a
0,7 a
0,0 a
2,4-ДБ
1120
5,0 ab
0,7 a
1,3 ab
0,0 a
1,7 a
2,4-ДБ
2240
9,3 b
2,0 a
3,3 abc
0,7 a
0,0 a
2,4-Д
560
6,7 ab
6,7 b
4,0 bc
1,7 a
3,3 a
2,4-Д
1120
23,3 c
14,0 c
4,7 c
5,0 b
2,3 a
Минимальное значимое различие (P=0,05)
6,2
4,2
3,3
2,4
4,5
Аббревиатуры: AAD, арилоксиалканоат диоксигеназа; DAA, дней после применения.Г-экв. кислоты/га, грамм-эквивалент кислоты на гектар.
<sup>a</sup>Повреждение, оцененное визуально в виде процента эпинастического листового покрытия у хлопчатника на участок; n=3 участка.
<sup>b</sup>Средние, отмеченные одинаковыми буквами, значимо не различаются.
Пример 3
Растения хлопчатника, модифицированные AAD-12, обладают умеренно повышенной устойчивостью к 2,4-ДБ по сравнению с 2,4-Д.
Чтобы оценить устойчивость AAD-12-растений хлопчатника к действиям 2,4-ДБ и 2,4-Д гербицидных соединений, гербициды DB Straight (2,4-ДБ) и Weedar 64 (2,4-Д) применяли индивидуально путем разбрызгивания над AAD-12-растениями хлопчатника в одном оранжерейном эксперименте. Четыре обработки состояли из двух норм внесения 1120 и 2240 г-экв. кислоты/га для каждого из этих двух гербицидов. Экспериментальный план включал четыре повторных испытания отдельных AAD-12-растений хлопчатника при каждой обработке. Растения выращивали в горшках. Обработки не были рандомизированы. Во время обрызгивания растения находились в стадии 3-4 листа. Обрызгиваемые AAD-12-растения хлопчатника визуально оценивали на предмет процента листового покрытия, обнаруживавшего вызванное гербицидом повреждение, в дни 0, 1, 2, 4 и 12 после применения.
Результаты средних величин повреждений, наблюдавшихся у AAD-12-растений хлопчатника от 2,4-ДБ или 2,4-Д, показаны в таблице 4. Со дня 0 до дня 4 после применения (DAA) растения, обработанные 2,4-ДБ, обнаруживали более низкий процент видимого повреждения листового покрова, чем растения, обработанные 2,4-Д; однако наблюдаемые процентные величины были статистически значимо различными только при более высокой норме внесения, 2240 г-экв. кислоты/га, в день 2 и день 4 после применения в этом эксперименте.
Таблица 4
Среднее повреждение с течением времени от 2,4-ДБ и 2,4-Д, примененных на послевсходовой стадии к AAD-12-растениям хлопчатника
Гербицид
Норма внесения(г-экв. кислоты/га)
Среднее повреждение (%)<sup>ab</sup>
0 DAA
1 DAA
2 DAA
4 DAA
12 DAA
2,4-ДБ
1120
0,0 a
1,8 ab
0,0 a
1,0 b
1,0 a
2,4-ДБ
2240
0,0 a
0,0 b
0,0 a
0,5 b
3,3 a
2,4-Д
1120
0,5 a
2,3 ab
3,0 a
3,0 b
3,0 a
2,4-Д
2240
1,3 a
4,3 a
3,8 a
6,8 a
3,0 a
Достоверно значимое различие по критерию Тьюки (P=0,05)
2,8
3,0
4,5
3,4
3,9
Аббревиатуры: AAD, арилоксиалканоат диоксигеназа; DAA, дней после применения. Г-экв. кислоты/га, грамм-эквивалент кислоты на гектар; HSD, достоверно значимое различие.
<sup>a</sup>Повреждение, оцененное визуально в виде процента эпинастического листового покрытия у хлопчатника на участок; n=4 участка.
<sup>b</sup>Средние, отмеченные одинаковыми буквами, значимо не различаются.
Пример 4
Растения хлопчатника, модифицированные AAD-13.
Клетка хлопчатника может быть модифицирована AAD-13 для получения хлопчатника с устойчивостью к 2,4-ДБ и 2,4-Д, которая схожа с устойчивостью, придаваемой генами AAD-1 или AAD-12.
Хлопчатник, модифицированный AAD-13, может быть применен при помощи тех же способов, описанных ранее в примере № 7 США 2010/0251432 [PCT/US08/63212 (Lira et al.)].
В предыдущих описаниях приведено множество конкретных деталей, таких как: конкретные материалы, структуры, химикаты, способы и т.д., для обеспечения лучшего понимания настоящего изобретения. Однако настоящее изобретение может быть применено на практике, не обращаясь к конкретно указанным деталям. В остальных случаях известные структуры обработки не были подробно описаны для того, чтобы без необходимости не вносить неясность в настоящее изобретение.
В настоящем изобретении показаны и описаны только предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения и всего несколько примеров его многосторонности. Необходимо понимать, что настоящее изобретение пригодно к применению в различных других комбинациях и средах и позволяет вносить изменения или модификации в пределах объема изобретательной сущности, как выражено в настоящем описании.