СПОСОБ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ КАРТОФЕЛЯ IN VITRO СОРТА КАРТОФЕЛЯ "ЕРМАК"
METHOD OF POTATO MICROCLONING IN VITRO OF "ERMAK" POTATO VARIETY

Изобретение относится к биотехнологии растений, в частности к получению безвирусного и продуктивного исходного материала для дальнейшего семеноводства картофеля.
Картофель - вегетативно-размножаемая культура, относительно слабая по устойчивости к вирусам, важнейший продукт питания населения. Россия занимает одно из последних мест по урожайности культуры картофеля. Низкая урожайность связана с резкими температурными колебаниями и инфицированностью почвы возбудителями болезней и низким качеством семенного материала. Зараженность патогенами семенного материала является одной из основных причин снижения урожайности картофеля.
В последнее десятилетие в Западной Сибири оказался полностью утрачен знаменитый омский сорт «Ермак», получивший призвание во всем мире. Картофель, считавшийся гордостью Прииртышья, загубили вирусы. По данным ЗАО «Тепличный» г. Омска (2014) картофель, используемый в промышленном картофелеводстве Омского региона, а особенно сорт «Ермак» практически на 100% поражен мозаичными вирусами (X, Y, S, L, M) и вироидами (ВВКК), приводящим к большим потерям урожая (от 50 до 90%), плохому хранению и снижению качества картофеля. В промышленном картофелеводстве сорт «Ермак» отсутствует за счет вырождения вирусами. Сибирский сорт картофеля Ермак - высокоурожайный, ранний, устойчив к температурным стрессам и фитофторозам, имеет отличные вкусовые и качественные характеристики, способен давать стабильный урожай в разных почвенно-климатических зонах, однако в последнее время находится на грани полного вырождения фитопатогенами. Если санкции распространятся на семенной картофель из Европы, то Сибирский регион может вообще остаться без второго хлеба (картофеля).
Для защиты картофеля от вирусной инфекции и вырождения требуются регулярное оздоровление исходного посадочного материала.
Известен способ микроклонального размножения картофеля, включающий культивирование оздоровленных растений картофеля in vitro путем черенкования на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, сахарозу, Fe-хелат, глицерин, ИУК, агар-агар, витамины по Уайту, получение меристемных растений-регенерантов и высадку растений в грунт, при этом перед высадкой в грунт меристемные растения-регенеранты подвергаются ежесуточному воздействию температурой +4-+5°C в течение 2 ч продолжительностью 6-7 дней [Патент RU №2487532 (13) C1, МПК A01H 4/00, А01G 7/00, 20.07.2013 (аналог).
Наиболее близким по технической сущности к заявленному изобретению является способ микроклонального размножения картофеля, включающий культивирование оздоровленных растений картофеля in vitro путем микрочеренкования на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту, сахарозу, глицерин, активированный уголь, аскорбиновую кислоту, получение растений-регенерантов и высадку растений-регенерантов в грунт, причем микрочеренкование исходных растений проводят на апикальную, среднюю и базальную части, выращивание апикальной и средней частей осуществляется на питательной среде с содержанием сахарозы в количестве 20000 мг/л при температуре 23-25°C днем и 17-18°C ночью с последующим высаживанием растений-регенерантов картофеля в грунт, а выращивание базальной части (для микроклубнеобразования) проводят на питательной среде с содержанием сахарозы 80000 мг/л в темноте при температуре 8-10°C с последующим получением микроклубней картофеля in vitro [Патент RU №2329639 (13) C2, МПК A01G 4/00, 27.07.2008 (прототип)].
Недостатками данных способов размножения картофеля являются низкая скорость роста растений in vitro, небольшой выход растений-регенерантов и микроклубней из одного исходного растения, маленькие размеры микроклубней и трудоемкость работы с пробирками.
Техническим результатом заявленного изобретения является повышение коэффициента размножения растений-регенерантов, размеров и количества микроклубней, ускорение роста эксплантов, техническая простота культивирования и снижение трудоемкости работы, возрождение и получение в короткие сроки оздоровленного Сибирского сорта картофеля «Ермак», импортозамещение используемых голландских и немецких сортов картофеля.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе микроклонального размножения картофеля, включающем культивирование оздоровленных растений картофеля in vitro путем микрочеренкования на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту, аскорбиновую кислоту, сахарозу, для получения микроклубней в питательную среду дополнительно вводят кинетин, феруловую кислоту, тиамин, повышенную концентрацию сахарозы и изменяют условия культивирования.
Опыты проводились в условиях научно-производственной лаборатории «Прикладная биотехнология» ФГБОУ ВПО «Омский государственный технический университет» с оздоровленным безвирусным сортом картофеля «Ермак».
Питательная среда в контрольном варианте (табл. 1) готовилась по прототипу, в опытном варианте в питательную среду для клубнеобразования in vitro добавляли 1-2 мг/л феруловой кислоты, 1-2 мг/л кинетина, 1,0-1,2 мг/л тиамина и сахарозы 81000-85000 мг/л.
Способ осуществляют следующим образом.
2
Оздоровление картофеля от фитопатогенов осуществлялось вычленением этиолированных проростков, разделением их на кусочки (1-1,5 см с одной почкой), стерилизацией в 0,1%-ном растворе диацида в течение 3-5 мин с последующей трехкратной промывкой стерильной дистиллированной HO, вычленением и внесением апикальных меристем на питательную среду для культивирования апикальных меристем, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту, аскорбиновую кислоту, сахарозу 20000 мг/л, кинетина 1-2 мг/л, ИУК 1-2 мг/л для морфогенеза и образования меристемных оздоровленных растений-регенерантов. Размножение оздоровленных растений-регенерантов проводилось микрочеренкованием in vitro на питательной среде, содержащей макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту, аскорбиновую кислоту, сахарозу 20000 мг/л, кинетин 1-2 мг/л, феруловую кислоту 1-2 мг/л, тиамин 1 мг/л. Выращивание и размножение растений-регенерантов производили при 16-ти часовом освещении (5000 Лк), 8 ч полной темноты, при температуре 22-25°C, влажности воздуха 70%.
Для получения микроклубней картофеля использовалась питательная среда, содержащая макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту, аскорбиновую кислоту, сахарозу 81000 -85000 мг/л, кинетин 1-2 мг/л, феруловую кислоту 1-2 мг/л, тиамина 1,0-1,2 мг/л и следующие условия культивирования: 8 ч освещения (5000-7000 Лк), 16 ч полной темноты, при пониженной температуре 19-20°C и относительной влажности воздуха 70-80%, культивируют в течение 30 дней до образования микроклубней.
1
Для культивирования растений-регенерантов используют стеклянные банки с резьбой и металлической герметичной завинчивающейся крышкой объемом 900 мл (82×160 мм) с вырезанным отверстием в крышке для внесения питательной среды и эксплантов. Отверстие закрывают ватно-марлевыми пробками и обворачивают фольгой, составляют в медицинские бюксы, автоклавируют 20 мин при давлении 1 атм и температуре 120°C. Используют различные варианты питательных сред, которые различаются по содержанию сахарозы, фитогормона - кинетина, ароматической непредельной карбоновой кислоты - феруловой кислоты и витамина B - тиамина.
Введенная в состав феруловая кислота обладает активным действием на ростовые процессы, выступая в качестве активатора ИУК-оксидазы или участвуя в ее биосинтезе. Феруловая кислота более дешевле, чем гетерауксины, что снижает себестоимость получения оздоровленных растений. Совместное использование в питательной среде феруловой кислоты и кинетина способствует более интенсивному стимулированию ростовых процессов, морфогенезу и приживаемости растений.
Экспериментально было установлено, что введение в питательную среду сахарозы в количестве 81000-85000 мг/л, феруловой кислоты в количестве 1-2 мг/л, кинетина в количестве 1-2 мг/л стимулирует процесс индукции микроклубнеобразования. Повышение содержания тиамина до 1,2 мг/л способствует более быстрому росту и здоровому развитию растению, более мощному развитию корневой системы, стимулирует ростовые процессы, влияет на обмен веществ в растении.
При использовании стеклянных банок с металлической крышкой с отверстием для внесения эксплантов, снижается себестоимость оздоровленных растений и микроклубней, увеличивается выход и размер микроклубней, упрощается способ размножения. Использование пробирок - дорогой, громоздкий, трудоемкий процесс, в результате микроклубни имеют меньшие размеры. Применение стеклянных банок с резьбой и металлической крышкой для культивирования растений-регенерантов и микроклубнеобразования экономически выгоднее контейнерной технологии, т.к. позволяет использовать банки многократно, подвергать их автоклавированию, в отличие от пластиковых контейнеров и громоздких пробирок. Себестоимость банок гораздо дешевле пробирок и пластиковых контейнеров.
2
Использование 0,1% раствора диацида с целью стерилизации выделенных этиолированных проростков в течение 3-5 мин с последующей трехкратной промывкой стерильной HO позволяет ингибировать развитие бактериальной и вирусной инфекции.
Отечественный сибирский сорт картофеля «Ермак» высокоурожайный, устойчивый к фитофторозу, находится на грани полного исчезновения за счет вырождения вирусами. Исследованиями по оздоровлению Сибирского сорта картофеля «Ермак», выведенного для резко континентального климата Сибири, в настоящее время не известны.
2
Пример 1. Оздоровление картофеля от фитопатогенов осуществлялось вычленением этиолированных проростков, разделением их на кусочки (1-1,5 см с одной почкой), стерилизацией в 0,1%-ном растворе диацида в течение 3-5 мин с последующей трехкратной промывкой стерильной дистиллированной HO, вычленением и внесением апикальных меристем в пробирки с питательной средой, содержащей макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту, сахарозы 20000 мг/л, кинетин 1-2 м г/л, ИУК 1-2 мг/л для морфогенеза, выращивание и размножение растений-регенерантов производили при 16-ти часовом освещении (5000 Лк), 8 ч полной темноты, при температуре 20°C, влажности воздуха 70%. Пробирочные растения, имеющие 12-15 листьев, извлекают из пробирок и черенкуют в условиях ламинар-бокса на стерильных чашках Петри. В автоклавированные (стерильные) стеклянные банки (900 мл) с металлической крышкой и отверстием для внесения растительных эксплантов наливают 100 мл агаризованной питательной среды для клубнеобразования, содержащей макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту, аскорбиновую кислоту, 82000 мг/л сахарозы, 1 мг/л кинетина, 1 мг/л феруловой кислоты, 1,2 мг/л тиамина. Индукцию микроклубней проводят при 8-ми часовом освещении (5000-7000 Лк), 16 ч полной темноты, при пониженной температуре 19-20°C и относительной влажности воздуха 70-80%. По окончании культивирования микроклубни отделяются и направляются на реализацию потребителям для высадки семенного картофеля в грунт или переносятся на хранение в холодильные камеры при температуре (4±2)°C сроком на 2-3 месяца до момента реализации.
Пример 2. Осуществляется аналогично примеру 1, однако для питательной среды для клубнеобразования вносят 81000 мг/л сахарозы, 1 мг/л кинетина, 2 мг/л феруловой кислоты, 1,1 мг/л тиамина.
Пример 3. Осуществляется аналогично примеру 1, однако для питательной среды для клубнеобразования вносят 83000 мг/л сахарозы, 2 мг/л кинетина, 1,5 мг/л феруловой кислоты, 1,2 мг/л тиамина.
Предлагаемый способ позволяет получить безвирусные растения-регенеранты отечественного сорта картофеля «Ермак» с повышенной жизнеспособностью, приживаемостью, высокими морфометрическими показателями и увеличить выход и размер микроклубней.
Совместное использование в питательной среде феруловой кислоты, кинетина и тиамина способствует более интенсивному стимулированию ростовых процессов, морфогенезу и приживаемости растений картофеля. Феруловая кислота более дешевле, чем гетерауксины, что снижает себестоимость получения оздоровленных растений. Использование стеклянных банок с резьбой и закручивающейся крышкой с отверстием для внесения питательной среды и черенков значительно снижает себестоимость оздоровленных растений и микроклубней, позволяет повысить производительность размножения оздоровленных высокопродуктивных растений картофеля, упрощает способ размножения, уменьшает затраты.
Полученные предлагаемым способом оздоровленные микроклубни картофеля были физиологически зрелыми, хорошо хранились и при последующем выращивании in vivo формировали здоровые растения.
Предлагаемый способ прост в использовании, экологически безопасен и может быть использован на картофелевыращивающих предприятиях.