КИНЕТИЧЕСКИЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ БИОМАТЕРИАЛА
KINETIC METHOD OF DETERMINING BIOMATERIAL ANTIOXIDANT ACTIVITY

Изобретение относится к медицине, биологии, фармации и пищевой технологии, а именно к тем их разделам, где исследуются гомолитические свойства липидов и их участие в свободнорадикальных реакциях окисления, осуществляется подбор антиоксидантов.
10
В настоящее время развитие многих патологий связывают с активацией перекисного окисления липидов биомембран /Бурлакова Е.Б., Алесенко А.В., Молочкина A.M. Биоантиоксиданты в лучевом поражении и злокачественном росте. - М.: Наука, 1975. - 214 с.; Коган А.Х., Сыркин А.Л., Дриницина С.В. Кислородные свободнорадикальные процессы в патогенезе ишемической болезни сердца и перспективы применения антиоксиданта Q (убихинона) для их коррекции // Кардиология. - 1997. - №12. - С.62-70; Козлов Ю.П. Свободные радикалы и их роль в нормальных и патологических процессах. - М.: Изд-во МГУ, 1973. - 174 с./. При этом в организме нарушается баланс процессов образования и распада пероксидов, свойственный нормальным тканям. Увеличение концентрации пероксидов меняет физические и биологические свойства мембран. Поэтому терапию многих патологий связывают с применением антиоксидантов. Актуальной остается проблема предварительного тестирования их антиоксидантной активности, контролирование и диагностика антиоксидантной активности липидов биомембран в норме и при патологии.
В последние годы ведется целенаправленный поиск эффективных ингибиторов окисления среди объектов растительного и биологического материала: морепродукты, лекарственные растения, сапропели. Исследования подобного рода позволили открыть новые классы антиоксидантов, отыскать альтернативные природные источники ингибиторов окисления. При этом необходимо проводить тестирование суммарной антиоксидантной активности растительного и животного биоматериала.
Разработан экспресс-способ тестирования антиоксидантной активности соединений в водно-липидной среде в условиях эмульсий, приближенных к биологическим средам, позволяющий тестировать водорастворимые антиоксиданты /Ушкалова В.Н., Перевозкина М.Г., Барышников Э.В. Разработка способа тестирования средств антиоксидантотерапии // В сб.: Свободно-радикальное окисление липидов в эксперименте и клинике. - Тюмень, Из-во Тюм. ГУ, 1997. - С.77-82/.
3
3
3
В качестве прототипа был выбран кинетический способ определения антиоксидантной активности липидов /А.с. 1051428 (СССР), МКИ G01N 33/48. Способ определения антиокислительной активности липидов. Ушкалова В.Н., Кадочникова Г.Д., Соловьев В.Е., заявка №3357314/28-13, 16.10.1981, опубл. 30.10.1983. Бюл. №40, с.154/. Сущность способа состоит в том, что в качестве субстрата окисления используют метилолеат (0,5-2,5 мл) в присутствии азо-бис-изобутиронитрила (АИБН) в количестве 0,5-4 мг/мл в растворе хлорбензола и добавки липидов (1-3 мл), пробу насыщают кислородом при температуре 60,0±0,2°C, волюмометрическим методом определяют τi2 время поглощения 25 мм кислорода на 1 мл пробы. В аналогичных условиях определяют τi1 время поглощения 25 мм кислорода на 1 мл контрольной пробы без добавок липидов. Рассчитывают антиоксидантную активность липидов по формуле:
<mrow><mi>A</mi><mi>O</mi><mi>A</mi><mo>=</mo><mfrac><mrow><mi>τ</mi><mi>i</mi><mn>2</mn><mo>−</mo><mi>τ</mi><mi>i</mi><mn>1</mn></mrow><mrow><mi>τ</mi><mi>i</mi><mn>1</mn></mrow></mfrac><mo>×</mo><mi>K</mi><mo>,</mo></mrow>
где τi1 - время поглощения кислорода на 1 мл субстрата при окислении контрольной пробы, мин;
τi2 - время поглощения кислорода на 1 мл субстрата при окислении пробы, мин;
<mrow><mi>K</mi><mo>=</mo><mfrac><mn>1</mn><mn>2</mn></mfrac><mo>,</mo></mrow>
P - навеска липидов, мг.
Недостатком способа (прототипа) является исключение определения антиоксидантной активности суммы водорастворимых ингибиторов окисления в гомогенатах растительного и животного биоматериала, использование большого количества липидов и эфиров высших ненасыщенных жирных кислот, что делает сложным применение способа к дорогостоящим биологическим объектам, а также трудоемкость и длительность анализа.
Задачей, решаемой заявляемым изобретением, является увеличение эффективности способа и сокращение времени тестирования пробы биоматериала.
Технический результат - простой способ, не требующий больших материальных затрат, основанный на определении суммарной антиоксидантной активности жирорастворимых и водорастворимых компонентов биоматериала, ведущий к увеличению точности результатов и сокращению времени тестирования пробы биоматериала.
-3
-3
-3
3
i
Указанный технический результат достигается тем, что наряду с определением антиоксидантной активности жирорастворимых компонентов биоматериала в составе модельного субстрата, включающего в себя: биоматериал, эфиры высших ненасыщенных жирных кислот (этилолеата, метилолеата, метиллинолеата и др.) в присутствии азо-бис-изобутиронитрила (АИБН) в концентрации в пробе (2-60)×10М в хлорбензоле, особенностью является то, что параллельно проводят определение антиоксидантной активности водорастворимых компонентов биоматериала в составе модельного субстрата, включающего в себя: биоматериал, эфиры высших ненасыщенных жирных кислот (этилолеата, метилолеата, метиллинолеата и др.), водный раствор хлорида меди (II) в концентрации в пробе (1-3)×10 М, водный раствор цетилтриметиламмония бромида (ЦТМАБ) в концентрации в пробе (1-5)×10 М, поглощение кислорода оценивают волюмометрическим методом в термостатированной установке типа Варбурга при температуре t=(60±0,2)°C при перемешивании на магнитной мешалке. Измеряют объем (мм) поглощенного кислорода во времени, строят график в координатах ∆V/t. Графическим методом из кинетических кривых определяют величину периода индукции (τ) и рассчитывают суммарную антиоксидантную активность жирорастворимых и водорастворимых компонентов биоматериала с учетом контрольных проб.
Сущность предлагаемого способа состоит в том, что гомогенат биоматериала 0,001-0,05 г экстрагируют 10-100-кратным избытком смеси (1:1 по объему) н-гептан:изопропиловый спирт в течение 5 минут, центрифугируют 2-3 минуты при 1500-3000 об/мин, разделяют на 2 фазы.
-3
3
i
Гептановый экстракт (жирорастворимые антиоксиданты) сушат 20 мин безводным сульфатом натрия, 0,5-1 мл гептанового экстракта помещают в манометрическую ячейку, добавляют 0,5-1 мл эфира высшей ненасыщенной жирной кислоты (этилолеата, метилолеата, метиллинолеата и др.) и раствор азо-бис-изобутиронитрила (АИБН) в концентрации в пробе (2-60)×10 М в хлорбензоле, доводят хлорбензолом до общего объема пробы 2 мл. Поглощение кислорода оценивают волюмометрическим методом в термостатированной установке типа Варбурга при температуре t=(60±0,2)°C при перемешивании на магнитной мешалке. Измеряют объем (мм) поглощенного кислорода во времени, строят график в координатах ∆V/t. Графическим методом из кинетических кривых определяют величину периода индукции (τ). В аналогичных условиях определяют поглощение кислорода в контрольной пробе (без добавок гептанового экстракта).
-3
-3
3
i
0,5-1 мл изопропилового экстракта помещают в манометрическую ячейку, добавляют 0,5-1 мл эфира высшей ненасыщенной жирной кислоты (этилолеата, метилолеата, метиллинолеата и др.), добавляют водный раствор хлорида меди (II) в концентрации в пробе (1-3)×10 М, водный раствор цетилтриметиламмония бромида (ЦТМАБ) в концентрации в пробе (1-5)×10 М, доводят водой до общего объема пробы 4 мл. Поглощение кислорода оценивают волюмометрическим методом в термостатированной установке типа Варбурга при температуре t=(60±0,2)°C при перемешивании на магнитной мешалке. Измеряют объем (мм) поглощенного кислорода во времени, строят график в координатах ∆V/t. Графическим методом из кинетических кривых определяют величину периода индукции (τ). В аналогичных условиях определяют поглощение кислорода в контрольной пробе (без добавок изопропилового экстракта). Разработанный экспресс-способ тестирования антиоксидантной активности водорастворимых соединений в водно-эмульсионной среде позволяет сократить время тестирования биоматериала в 2-3 раза по сравнению с прототипом.
Полученные в процессе окисления липидных субстратов экспериментальные кинетические кривые описываются функциональными зависимостями методом наименьших квадратов.
Определение суммарной антиоксидантной активности жирорастворимых и водорастворимых компонентов биоматериала осуществляется по формуле:
<mrow><mstyle displaystyle="true"><mo>∑</mo><mrow><mi>A</mi><mi>O</mi><mi>A</mi><mo>=</mo><mfrac><mrow><mi>τ</mi><mi>i</mi><mn>1</mn><mo>×</mo><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>τ</mi><mi>i</mi><mn>2</mn><mo>−</mo><mi>τ</mi><mi>i</mi><mn>3</mn></mrow><mo>)</mo></mrow><mo>+</mo><mi>τ</mi><mi>i</mi><mn>3</mn><mo>×</mo><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>τ</mi><mi>i</mi><mn>4</mn><mo>−</mo><mi>τ</mi><mi>i</mi><mn>1</mn></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mrow><mi>τ</mi><mi>i</mi><mn>3</mn><mo>×</mo><mi>τ</mi><mi>i</mi><mn>1</mn></mrow></mfrac><mo>×</mo><mi>K</mi></mrow></mstyle><mo>,</mo></mrow>
где ΣАОА - суммарная антиоксидантная активность;
τi1 - период индукции без изопропиловой пробы (контроль), мин;
τi2 - период индукции гептановой пробы (жирорастворимые антиоксиданты), мин.;
τi3 - период индукции без гептановой пробы (контроль), мин;
τi4 - период индукции изопропиловой пробы (водорастворимые антиоксиданты), мин;
<mrow><mi>K</mi><mo>=</mo><mfrac><mn>1</mn><mi>P</mi></mfrac><mo>,</mo></mrow>
Р - навеска биоматериала, мг.
При навеске менее 5 мг биоматериала на 1 мл метилолеата поправочным коэффициентом К можно пренебречь.
Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
Берут 0,005 г (точная навеска) лярда пеляди, экстрагируют 5 мл смеси (1:1 по объему) н-гептан:изопропиловый спирт в течение 5 минут, центрифугируют 2-3 минуты при 1500-3000 об/мин, разделяют на 2 фазы.
-3
3
i
Гептановый экстракт сушат 20 мин. 0,5 г безводного сульфата натрия, 0,5 мл гептанового экстракта помещают в манометрическую ячейку, добавляют 0,5 мл метилолеата, добавляют раствор азо-бис-изобутиронитрила (АИБН) в концентрации в пробе 3×10 М в хлорбензоле, доводят хлорбензолом до общего объема пробы 2 мл. Поглощение кислорода оценивают волюмометрическим методом в термостатированной установке типа Варбурга при температуре t=(60±0,2)°C при перемешивании на магнитной мешалке. Измеряют объем (мм) поглощенного кислорода во времени, строят график в координатах ∆V/t. Графическим методом из кинетических кривых определяют величину периода индукции (τ). В аналогичных условиях определяют поглощение кислорода в контрольной пробе (без добавок гептанового экстракта).
-3
-3
3
i
1 мл изопропилового экстракта помещают в манометрическую ячейку, добавляют 1 мл метилолеата, добавляют водный раствор хлорида меди (II) в концентрации в пробе 3×10 М, водный раствор цетилтриметиламмония бромида (ЦТМАБ) в концентрации в пробе 1×10 М доводят водой до общего объема пробы 4 мл. Поглощение кислорода оценивают волюмометрическим методом в термостатированной установке типа Варбурга при температуре t=(60±0,2)°C при перемешивании на магнитной мешалке. Измеряют объем (мм) поглощенного кислорода во времени, строят график в координатах ∆V/t. Графическим методом из кинетических кривых определяют величину периода индукции (τ). В аналогичных условиях определяют поглощение кислорода в контрольной пробе (без добавок изопропилового экстракта).
Определение суммарной антиоксидантной активности жирорастворимых и водорастворимых компонентов биоматериала осуществляется по формуле:
<mrow><mstyle displaystyle="true"><mo>∑</mo><mrow><mi>A</mi><mi>O</mi><mi>A</mi><mo>=</mo><mfrac><mrow><mn>5</mn><mo>×</mo><mrow><mo>(</mo><mrow><mn>50</mn><mo>−</mo><mn>15</mn></mrow><mo>)</mo></mrow><mo>+</mo><mn>15</mn><mo>×</mo><mrow><mo>(</mo><mrow><mn>25</mn><mo>−</mo><mn>5</mn></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mrow><mn>15</mn><mo>×</mo><mn>5</mn></mrow></mfrac><mo>×</mo><mn>1</mn><mo>=</mo><mn>6,3</mn></mrow></mstyle></mrow>
Пример 2.
Берут 0,005 г (точная навеска) липидов эритроцитов крови, экстрагируют 5 мл смеси (1:1 по объему) н-гептан:изопропиловый спирт в течение 5 минут, центрифугируют 2-3 минуты при 1500-3000 об/мин, разделяют на 2 фазы.
-3
3
i
Гептановый экстракт сушат 20 мин. 0,5 г безводного сульфата натрия, 0,5 мл гептанового экстракта помещают в манометрическую ячейку, добавляют 0,5 мл метилолеата, добавляют раствор азо-бис-изобутиронитрил (АИБН) в концентрации в пробе 3×10 М в хлорбензоле, доводят хлорбензолом до общего объема пробы 2 мл. Поглощение кислорода оценивают волюмометрическим методом в термостатированной установке типа Варбурга при температуре t=(60±0,2)°C при перемешивании на магнитной мешалке. Измеряют объем (мм) поглощенного кислорода во времени, строят график в координатах ∆V/t. Графическим методом из кинетических кривых определяют величину периода индукции (τ). В аналогичных условиях определяют поглощение кислорода в контрольной пробе (без добавок гептанового экстракта).
-3
-3
i
1 мл изопропилового экстракта помещают в манометрическую ячейку, добавляют 1 мл метилолеата, добавляют водный раствор хлорида меди (II) в концентрации в пробе 3×10 М, водный раствор цетилтриметиламмония бромида (ЦТМАБ) в концентрации в пробе 1×10 М, доводят водой до общего объема пробы 4 мл. Поглощение кислорода оценивают волюмометрическим методом в термостатированной установке типа Варбурга при температуре t=(60±0,2)°C при перемешивании на магнитной мешалке. Измеряют объем (мм) поглощенного кислорода во времени, строят график в координатах ∆V/t. Графическим методом из кинетических кривых определяют величину периода индукции (τ). В аналогичных условиях определяют поглощение кислорода в контрольной пробе (без добавок изопропилового экстракта).
Определение суммарной антиоксидантной активности жирорастворимых и водорастворимых компонентов биоматериала осуществляется по формуле:
<mrow><mstyle displaystyle="true"><mo>∑</mo><mrow><mi>A</mi><mi>O</mi><mi>A</mi><mo>=</mo><mfrac><mrow><mn>5</mn><mo>×</mo><mrow><mo>(</mo><mrow><mn>140</mn><mo>−</mo><mn>15</mn></mrow><mo>)</mo></mrow><mo>+</mo><mn>15</mn><mo>×</mo><mrow><mo>(</mo><mrow><mn>40</mn><mo>−</mo><mn>5</mn></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mrow><mn>15</mn><mo>×</mo><mn>5</mn></mrow></mfrac></mrow></mstyle><mo>×</mo><mn>1</mn><mo>=</mo><mn>15,3</mn></mrow>
Пример 3.
Берут 0,005 г (точная навеска) облепихового масла, экстрагируют 5 мл смеси (1:1 по объему) н-гептан:изопропиловый спирт в течение 5 минут, центрифугируют 2-3 минуты при 1500-3000 об/мин, разделяют на 2 фазы.
-3
3
i
Гептановый экстракт сушат 20 мин. 0,5 г безводного сульфата натрия, 0,5 мл гептанового экстракта помещают в манометрическую ячейку, добавляют 0,5 мл метилолеата, добавляют раствор азо-бис-изобутиронитрил (АИБН) в концентрации в пробе 3×10 М в хлорбензоле, доводят хлорбензолом до общего объема пробы 2 мл. Поглощение кислорода оценивают волюмометрическим методом в термостатированной установке типа Варбурга при температуре t=(60±0,2)°C при перемешивании на магнитной мешалке. Измеряют объем (мм) поглощенного кислорода во времени, строят график в координатах ∆V/t. Графическим методом из кинетических кривых определяют величину периода индукции (τ). В аналогичных условиях определяют поглощение кислорода в контрольной пробе (без добавок гептанового экстракта).
-3
-3
3
i
1 мл изопропилового экстракта помещают в манометрическую ячейку, добавляют 1 мл метилолеата, добавляют водный раствор хлорида меди (II) в концентрации в пробе 3×10 М, водный раствор цетилтриметиламмония бромида (ЦТМАБ) в концентрации в пробе 1×10 М, доводят водой до общего объема пробы 4 мл. Поглощение кислорода оценивают волюмометрическим методом в термостатированной установке типа Варбурга при температуре t=(60±0,2)°C при перемешивании на магнитной мешалке. Измеряют объем (мм) поглощенного кислорода во времени, строят график в координатах ΔV/t. Графическим методом из кинетических кривых определяют величину периода индукции (τ). В аналогичных условиях определяют поглощение кислорода в контрольной пробе (без добавок изопропилового экстракта).
Определение суммарной антиоксидантной активности жирорастворимых и водорастворимых компонентов биоматериала осуществляется по формуле:
<mrow><mstyle displaystyle="true"><mo>∑</mo><mrow><mi>A</mi><mi>O</mi><mi>A</mi><mo>=</mo><mfrac><mrow><mn>5</mn><mo>×</mo><mrow><mo>(</mo><mrow><mn>70</mn><mo>−</mo><mn>15</mn></mrow><mo>)</mo></mrow><mo>+</mo><mn>15</mn><mo>×</mo><mrow><mo>(</mo><mrow><mn>30</mn><mo>−</mo><mn>5</mn></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mrow><mn>15</mn><mo>×</mo><mn>5</mn></mrow></mfrac><mo>×</mo><mn>1</mn><mo>=</mo><mn>8,7</mn></mrow></mstyle></mrow>
Пример 4.
Капотен является производным пролина с отдаленной боковой тиольной группой. Препарат применяют при лечении легкой и умеренной гипертонии, а также при тяжелых формах сердечно-сосудистых заболеваний. Была изучена антиоксидантная активность капотена в процессе окисления метиллинолеата в условиях инициирования в среде хлорбензола и катализа в водно-липидной среде в сравнении с дибунолом и α-токоферолом. Была установлена высокая антиоксидантная активность капотена в водно-липидных катализируемых субстратах, превышающая ингибирующие свойства а-токоферола и уступающая активности дибунола. В безводной среде капотен проявлял низкие антиоксидантные свойства /Перевозкина М.Г., Тихонова В.В., Кадочникова Г.Д. и др. / Физико-химические закономерности окисления липидных субстратов под действием гипотензивных препаратов // Свободно-радикальное окисление липидов в эксперименте и клинике. - Тюмень, Из-во Тюм. ГУ, 1997. - С. 104-113/.
2
Кинетические параметры окисления метиллинолеата в растворе хлорбензола в присутствии 6×10-3 М АИБН и в водно-липидной среде в присутствии 2×10-3 М CuCl в зависимости от концентрации капотена, [InH] - ингибитор, t=600C (Таблица 1).
С учетом этих выводов проанализируем биоматериал больных, проходивших лечение капотеном, при этом важно учитывать жирорастворимые и водорастворимые фракции препарата.
Берут 1,0 г (точная навеска) цельной крови больных, принимавших препарат капотен в среднесуточной дозе 150 мг в течение двух недель, экстрагируют 5 мл смеси (1:1 по объему) н-гептан:изопропиловый спирт в течение 5 минут, центрифугируют 2-3 минуты при 1500-3000 об/мин, разделяют на 2 фазы.
-3
i
Гептановый экстракт сушат 20 мин. 0,5 г безводного сульфата натрия, 0,5 мл гептанового экстракта помещают в манометрическую ячейку, добавляют 0,5 мл метилолеата, добавляют раствор азо-бис-изобутиронитрил (АИБН) в концентрации в пробе 3×10 М в хлорбензоле, доводят хлорбензолом до общего объема пробы 2 мл. Поглощение кислорода оценивают волюмометрическим методом в термостатированной установке типа Варбурга при температуре t=(60±0,2)°C при перемешивании на магнитной мешалке. Измеряют объем (мм) поглощенного кислорода во времени, строят график в координатах ∆V/t. Графическим методом из кинетических кривых определяют величину периода индукции (τ). В аналогичных условиях определяют поглощение кислорода в контрольной пробе (без добавок гептанового экстракта).
-3
-3
i
1 мл изопропилового экстракта помещают в манометрическую ячейку, добавляют 1 мл метилолеата, добавляют водный раствор хлорида меди (II) в концентрации в пробе 3×10 М, водный раствор цетилтриметиламмония бромида (ЦТМАБ) в концентрации в пробе 1×10М, доводят водой до общего объема пробы 4 мл. Поглощение кислорода оценивают волюмометрическим методом в термостатированной установке типа Варбурга при температуре t=(60±0,2)°C при перемешивании на магнитной мешалке. Измеряют объем (мм) поглощенного кислорода во времени, строят график в координатах ∆V/t. Графическим методом из кинетических кривых определяют величину периода индукции (τ). В аналогичных условиях определяют поглощение кислорода в контрольной пробе (без добавок изопропилового экстракта).
Определение суммарной антиоксидантной активности жирорастворимых и водорастворимых компонентов биоматериала осуществляется по формуле:
Преимущества предлагаемого способа состоят в том, что он позволяет определять суммарную антиоксидантную активность водорастворимых и жирорастворимых компонентов биоматериала, увеличить точность расчетов, снизить расходование метилового или этилового эфира высших ненасыщенных жирных кислот, а также сократить время тестирования пробы биоматериала.