Иммобилизация клеток в гель биополимеров как метод защиты микроорганизмов

УДК 637.1

Н.Б. Гаврилова, Н.Л. Чернопольская

ИММОБИЛИЗАЦИЯ КЛЕТОК В ГЕЛЬ БИОПОЛИМЕРОВ КАК МЕТОД ЗАЩИТЫ МИКРООРГАНИЗМОВ

В статье приведены результаты аналитических и экспериментальных исследований процесса микрокап-сулирования пробиотических микрооганизмов в гели биополимеров. Установлен вид и количество наиболее оптимальных биополимеров, параметры процесса микрокапсулирования. Определены способы пролонгирования сроков годности бактериальных препаратов в иммобилизованном и микрокапсулированном виде.

Ключевые слова: иммобилизация, биополимеры, микроорганизмы, мембраны, микрокапсулирование.

Введение

Согласно современным требованиям, предъявляемым к продуктам функционального питания, пробиотические бактерии должны присутствовать в количестве, соответствующем терапевтической дозе (не менее 1 • 10 КОЕ/г продукта), сохранять жизнеспособность на протяжении всего срока хранения продукта и выживать в желудочно-кишечном тракте человека. В связи с этим актуально проведение исследований по выбору метода защиты клеток про-биотических культур в неблагоприятных условиях сложных компонентных систем и желудочно-кишечного тракта.

Объекты и методы исследований

Для исследования выбраны следующие биообъекты: L. acidophilus, штамм La-5, Bifidobacterium lactis штамм BB-12, Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, Lactis subsp. diacetilactis, Bifidobacterium bifidum № 1 и их ассоциации. Экспериментальные исследования проводились в трех-пятикратных повторностях по общепринятым стандартным методам исследований физико-химических, микробиологических и органолептических показателей.

Результаты и их обсуждение

Одним из способов получения высокоактивных и устойчивых в агрессивных условиях клеток микроорганизмов является иммобилизация методом наслаивания, т. е. заключение клеток в гидроколлоидные мембраны, обеспечивающие их защиту, доступ питательных веществ и отвод продуктов жизнедеятельности микроорганизмов во внешнюю среду [1,2].

На основании вышеизложенного, а также существующих медико-биологических требований к составу и свойствам продуктов функционального питания сформулированы основные требования к результату процесса иммобилизации культур пробиотических микроорганизмов:

- носители (подложка) для иммобилизации - биополимеры натурального происхождения;

- пробиотические культуры после иммобилизации наслаиванием должны иметь вид тонких пластинок (мембран);

- мембраны - с периодом распадаемости при растворении от 0,5 до 1,0 ч;

- активность пробиотических культур должна поддерживаться в течение всего срока годности мембран и составлять не менее

1 • 1010 КОЕ/г активизированной закваски.

При реализации сформулированных требований и выборе носителя для иммобилизации учитывались следующие факторы.

Иммобилизацию можно рассматривать как физическое разделение катализатора (клеток) и растворителя, при котором молекулы субстрата и продукта могут легко обмениваться между фазами. Важным фактором процесса иммобилизации является выбор биополимера (носителя). Включение живых клеток в гели биополимеров требует мягких условий иммобилизации. Носитель при этом должен представлять систему открытых пор с хорошими усло-

© Гаврилова Н.Б., Чернопольская Н.Л., 2012

виями для газообмена. Биополимеры обладают уникальными способностями загущения, студнеобразования, влагоудержания и стабилизации структурно-сложных систем. Для исследования выбраны биополимеры натурального животного и растительного происхождения: желатин и пектин. Выбор обусловлен следующим. Молекулы желатина и пектина состоят из групп атомов, резко различающихся по характеру взаимодействия с молекулами воды. В длинной макромолекуле распределены центры взаимодействия с молекулами воды, в результате чего создается гидратная оболочка макромолекулы.

Пектины, независимо от источника происхождения, являются природными ионообмен-никами, способными замещать водороды карбоксильных групп на катионы поливалентных металлов. Для исследований выбран цитрусовый пектин марки SLENDID type 200.

Желатин представляет смесь полипептидов с различной молекулярной массой. Совместное использование пектина и желатина в данный момент изучено недостаточно, это позволяет считать проведение исследований актуальным.

В зависимости от химической природы макромолекул и особенностей пищевой системы биополимеров возможны различные условия гелеобразования, которые приведены в табл. 1.

Таблица 1

Физико-химические показатели действия биополимеров

Наименование показателя Пектин Желатин

Оптимальный диапазон рН 3,6-4,4 4,5-10,0

Условия гелеобразования Активная кислотность - При температуре

не менее 4; ниже застывания

сахароза - 55-80%

Продолжительность растворения, мин, не более 10,0 25,0

Массовая доля влаги, %, не более 12,0 16,0

Массовая доля золы, %, не более 1,2 2,0

Пектин и желатин целесообразно применять для иммобилизации пробиотических культур микроорганизмов, так как оба биополимера представляют систему открытых пор с хорошими условиями для газообмена, гели данных биополимеров обладают хорошими диффузными качествами, способны образовывать структуры с оптимальным размером пор. Ге-леобразование протекает при рН = 4,0-4,5, что является определяющим условием жизнеспособности пробиотической микрофлоры. Кроме того, желатин является источником глутами-новой кислоты и аргинина, пектин содержит пищевые волокна, которые стимулируют рост жизнеспособных клеток бифидобактерий, т. е. обладает свойствами пребиотика. Для выбора количественного соотношения выбранных биополимеров выполнены экспериментальные исследования.

Изучение процесса иммобилизации проведено в строго стерильных условиях специального бокса, где смонтирована и установлена пилотная лабораторная установка для проведения экспериментальных исследований.

Этапы проведения эксперимента:

- подготовка (стерилизация или длительная высокотемпературная пастеризация (98 ± 1°С) и выдержка (30 ± 5 с) обезжиренного молока и его охлаждение до температуры (38 ± 1°С);

- чистые монокультуры, полученные из бактериальной лаборатории ОНО «ВНИМИ-Сибирь» Россельсхозакадемии, инокулировали в подготовленное обезжиренное молоко в соотношении 1 : 1 : 1;

- в термостате при температуре (38 ± 1°С) активизировали ассоциацию пробиотических культур;

- одновременно готовилась смесь биополимеров, растворенных в соответствии с технической документацией по использованию изучаемых биополимеров в 0,9%-ном растворе №С1, прошедшем обработку при температуре выше 100°С;

- активизированную ассоциацию пробиотических культур соединяли с раствором биополимеров при температуре (35 ± 1°С) и постоянном перемешивании, в течение 15-20 мин;

- ассоциацию пробиотических культур, иммобилизованную в смесь биополимеров, дозировали слоями в стерильные формы, которые выдерживали в течение 15-20 мин в стерильных условиях специального бокса для полученных пленок (мембран). Герметически закрытые формы с мембранами хранились при температуре (4 ± 2°С) до использования в экспериментальных исследованиях.

Все эксперименты проведены в 3-5-кратной повторности, при этом варьировалось соотношение биополимеров с целью изучения их влияния на качественные характеристики мембран с иммобилизованными пробиотическими культурами. Схема организации эксперимента по определению рационального соотношения биополимеров представлена в табл. 2.

Таблица 2

Схема проведения эксперимента

Номер опыта Концентрация раствора биополимеров, (2 : 1), % Количество пектина, г/на 100 г Количество желатина, г/на 100 г Количество раствора хлористого натрия 0,9%, мл

Опыт 1 5 3,4 1,6 95

Опыт 2 10 6,6 3,4 90

Опыт 3 15 10,0 5,0 85

Опыт 4 20 13,4 6,6 80

Опыт 5 25 16,6 8,4 75

В зависимости от состава используемой композиции биополимеров качественные показатели мембран изменялись.

Качество полученных мембран оценивали по физико-химическим, органолептическим и микробиологическим показателям, представленным в табл. 3 и 4.

Таблица 3

Физико-химические характеристики мембран

Номер опыта Массовая доля сухих веществ, % Динамическая вязкость раствора биополимеров, мПа-с Активность воды Активная кислотность, ед. рН

Опыт 1 5,86 ± 0,12 8,2 0,870 4,37

Опыт 2 10,41 ± 0,10 10,7 0,862 4,40

Опыт 3 13,52 ± 0,15 13,1 0,858 4,38

Опыт 4 19,92 ± 0,13 18,5 0,853 4,40

Опыт 5 23,14 ± 0,15 24,3 0,841 4,38

Таблица 4

Органолептические показатели мембран

Номер опыта Внешний вид Консистенция Вкус и запах Цвет

Опыт 1 Мембраны не образуются

Опыт 2 Мембраны не образуются

Опыт 3 Правильная форма, имеет стан- Мягкие, слабо сохра- Без вкуса и Белый, с кремо-

дартную массу и размеры няющие структуру запаха вым оттенком

Опыт 4 Правильная форма, имеет стан- Упругие, сохраняю- Без вкуса и Белый, с кремо-

дартную массу и размеры щие структуру запаха вым оттенком

Опыт 5 Правильная форма, имеет стан- Излишне упругие, Без вкуса и Белый, с кремо-

дартную массу и размеры ломкие запаха вым оттенком

Анализ полученных данных, представленных в табл. 3, подтверждает: с увеличением концентрации биополимеров активность воды уменьшается, массовая доля сухих веществ увеличивается, активная кислотность не изменяется.

Анализ физико-химических и органолептических показателей полученных мембран (табл. 4) свидетельствует о том, что образование упругих сохраняющих и восстанавливающих свою структуру мембран происходит при количественном соотношении биополимеров в желирующей системе пектин : желатин как 2 : 1, при общей концентрации сухих веществ -20 мас. %.

В связи с тем, что функциональные свойства полученных мембран зависят не только от наличия в них пищевых веществ, но и от количества жизнеспособных клеток пробиотиче-ских микроорганизмов, необходимо обеспечить в продукте сохранность жизнеспособных клеток пробиотических микроорганизмов в течение всего срока его годности за счет создания благоприятной ростовой и температурной среды обитания микроорганизмов.

Микробиологические исследования проводили в следующих образцах (табл. 5):

- контроль - ассоциация пробиотических микроорганизмов в активизированной форме: L. acidophilus : B. lactis : S. thermophilus в соотношении 1 : 1 : 1,

- опыт - ассоциация пробиотических микроорганизмов в иммобилизованном виде (мембраны).

Таблица 5

Количество жизнеспособных клеток пробиотических микроорганизмов в мембранах

Вариант Общее количество молочнокислых микроорганизмов, КОЕ/см3 Количество бифидо-бактерий, КОЕ/см3 Количество ацидофильной палочки, КОЕ/см3

Контроль 6,5  1010 2,1  109 1,9  1010

Опыт 5,2  1010 2,0  109 1,7  1010

Анализируя данные, представленные в табл. 5, можно сказать, что степень концентрирования жизнеспособных клеток пробиотических микроорганизмов в исследуемых мембранах находится в пределах установленных требований.

Логарифм количества жизнеспособных клеток иммобилизованных микроорганизмов в гели биополимеров представлен на рис. 1.

Рис. 1. Логарифм количества жизнеспособных клеток пробиотических культур, иммобилизованных в гель биополимеров

Таким образом, анализ представленных данных свидетельствует о незначительном снижении степени концентрации жизнеспособных клеток иммобилизованных культур мик-

роорганизмов в мембранах, что положительно характеризует иммобилизацию как метод защиты клеток в неблагоприятных условиях.

Не менее важным критерием пробиотических свойств заквасок является способность микроорганизмов приживаться в желудочно-кишечном тракте человека. В связи с этим были проведены исследования по изучению устойчивости иммобилизованных клеток микроорганизмов к желчи, №С1 и щелочной реакции среды, т. е. к веществам желудочно-кишечного тракта. Результаты исследований представлены в табл. 6.

Таблица 6

Устойчивость иммобилизованных клеток микроорганизмов к веществам желудочно-кишечного тракта

Устойчивость Вариант

Контроль Опыт

К желчи, % 30,0 40,0

К фенолу, % 0,4 0,4

К NaCl, % 6,5 4,0

К щелочной реакции среды, рН 8,3-9,6 8,3-9,2

В результате исследований установлено, что иммобилизованные клетки микроорганизмов проявили устойчивость к исследуемым концентрациям тест-веществ, что может рассматриваться как косвенный показатель лучшей способности иммобилизованных клеток микроорганизмов приживаться в желудочно-кишечном тракте человека. Предположительно такая закономерность прослеживается за счет наибольшего количества ассоциированных компонентов (протеины, полисахариды) клеточных стенок микроорганизмов, содержащих пектины, которые комплементарны соответствующим рецепторам, расположенным на мембранах эпителиальных клеток. Именно пектины, соединения белковой или гликопротеино-вой природы, проявляющие специфическую и обратимую углеводсвязывающую активность, являются медиаторами адгезии, обеспечивая поддержание жизнеспособности пробиотиче-ских клеток микроорганизмов, иммобилизованных в гель биополимеров.

Проверка степени растворимости мембран позволила заключить, что период их распа-даемости составляет от 0,5 до 1,0 ч.

Результаты изучения перевариваемости белков исследуемых мембран пищеварительными ферментами (in vitro) подтверждают: по сравнению с контрольным опытные образцы характеризуются лучшей перевариваемостью.

Для биологических продуктов (пробиотиков), обогащенных функциональными ингредиентами в виде ассоциации культур, приоритетный - показатель уровня клеточной концентрации пробиотических микроорганизмов, достигнутый вследствие использования закваски и технологических параметров производства. Это в полной мере относится и к мембранам клеток ассоциации культур, иммобилизованных в гель биополимеров. Производители заквасок используют различные методы пролонгирования срока их годности: замораживание, высушивание и другие.

Для длительного хранения иммобилизованных клеток микроорганизмов в виде мембран (пластинок) использовали консервирование высушиванием при низких температурах с целью снижения влияния процесса термоинактивации молочнокислых микроорганизмов и бифидобактерий и создания условий, приводящих их в анабиотическое состояние.

Сублимационная сушка (лиофилизация) - наиболее современный и перспективный метод консервирования пищевых продуктов, обеспечивающий совершенное высушивание с максимальным сохранением природных, пищевых, органолептических и биологических свойств продукта и наиболее генетическую стабильность основных свойств пробиотических культур в неблагоприятных условиях [3, 4].

Сублимационная сушка мембран осуществлена на производственной сушильной установке марки TG 50. Использованы стандартные условия для высушивания заквасок, приведенные на блок-схеме (рис. 2).

Рис. 2. Блок-схема высушивания мембран на сублимационной сушилке марки Тв 50

Свежие и сухие мембраны измельчали и расфасовывали в сухие стерильные флаконы и помещали на хранение. Установлен режим холодильного хранения при температуре (4 ± 2°С). Для определения срока годности разработана программа, составленная в соответствии с рекомендациями МУК 4.2.1847-04 и определена периодичность исследований.

Сравнительная гистограмма жизнеспособных клеток пробиотических культур микроорганизмов в процессе хранения мембран представлена на рис. 3.

сП"

£ I 1 18 36 54 72 90 108

Продолжительность хранения, сут

Общее количество микроорганизмов

Количество бифидобактерий

Количествоацидофильной палочки

Общее количество микроорганизмов

Количество бифидобактерий

Количествоацидофильной палочки (сухиемембраны)_

Рис. 3. Сравнительная гистограмма жизнеспособных клеток пробиотических культур микроорганизмов в процессе хранения мембран

Определен гарантированный срок хранения мембран, не подвергнутых сублимационной сушке - 18 сут, сухих мембран - 90 сут при температуре (4 ± 2°С) [5, 6].

По результатам исследований разработана технология бактериального концентрата пробиотических культур, иммобилизованных в гель биополимеров, и нормативная докумен-

тация. Апробация бактериального концентрата проведена на молочном предприятии г. Омска ОНО «ВНИМИ-Сибирь» Россельхозакадемии.

Список литературы

1. Suo, Z. Efficient Immobilization and Patterning of Live Bacterial Cells / Z. Suo, R. Avci, X. Yang, David W. Pascual // Langmuir. - 2008, April 15. - 24 (8). - Р. 4161-4167.

2. Tsen, Jen-Horng. Enhancement of freezing-resistance of Lactobacillus rhamnosus by the application of cell immobilization / Jen-Horng Tsen, Hui-Ying Huang, V. An-Erl King // J. Gen. Appl. Microbiol. - 2007. - Vol. 53. -Р. 215-219.

3. Сублимационная сушка в пищевой промышленности / Э.И. Гуйго [и др.]. - М. : Пищевая пром-сть. 1972. - 246 с.

4. Буянова, И.В. Физико-химические особенности технологии низкотемпературного хранения сыров : монография / И.В. Буянова. - Кемерово, 2005. - 196 с.

5. Гаврилова, Н.Б. Научные и практические основы биотехнологии молочных и молокосодержащих продуктов с использованием иммобилизации клеток микроорганизмов : монография / Н.Б. Гаврилова, О.А. Глади-лова, Н.Л. Чернопольская. - Омск : Вариант-Омск, 2011. - 184 с.

6. Гаврилова, Н.Б. Экспериментальное исследование иммобилизации клеток микроорганизмов в гель биополимеров / Н.Б. Гаврилова // Техника и технология пищевых производств. - № 3 (26), 2012. - С. 21-28.

SUMMARY

N.B. Gavrilova, N.L. Chernopolskaya

Immobilization of cages in gel of biopolymers, as the method of protection of microorganisms

In article results of analytical and pilot studies of process of microencapsulation of pro-biotic mikrooganizm are given to gels of biopolymers. The look and amount of the most optimum biopolymers, parameters of process of microencapsulation is established. Ways of prolongation of expiration dates of bacterial preparations in the immobilized and microencapsulated look are defined.

Key words: immobilization, biopolymers, microorganisms, membranes, microencapsulation.

УДК 637.444 И.А. Ивкова

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ВТОРИЧНОГО МОЛОЧНОГО СЫРЬЯ С ЦЕЛЬЮ ПОВЫШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ

Работа посвящена изысканию новых источников нетрадиционного сырья и полному использованию вторичных ресурсов при производстве пищевых продуктов, в частности, кондитерских (печенье сахарных, сдобных и песочных сортов).

Ключевые слова: сухая молочная деминерализованная сыворотка, безотходные ресурсосберегающие технологии, конкурентоспособность продукции, экономический эффект, снижение себестоимости, удешевление рецептуры.

Введение

Вопрос изыскания нетрадиционных источников сырья и более полного использования вторичных ресурсов приобретает все большую остроту при производстве пищевых продуктов, в том числе и мучных кондитерских изделий.

© Ивкова И.А., 2012