СПОСОБ ПЛАЗМОННО-РЕЗОНАНСНОЙ ФОТОТЕРМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ ОПУХОЛЕЙ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
METHOD FOR PLASMON-RESONANCE PHOTOTHERMAL TUMOUR THERAPY IN EXPERIMENT

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, а именно к терапии опухолей с использованием наночастиц и лазерного излучения и может быть использовано, в том числе, для терапии опухолей труднодоступных локализаций.
В настоящее время актуальной проблемой медицины является создание и разработка новых терапевтических технологий на основе использования наночастиц для лечения онкологических заболеваний.
В онкологии достаточно давно применяется лазерная гипертермия - способ лечения новообразований, основанный на лазерном нагреве и разрушении опухолей. Для повышения эффективности лазерной гипертермии в настоящее время широко используются термосенсибилизаторы - вещества, способные эффективно поглощать лазерное излучения и конвертировать его в тепло. Одним из наиболее действенных и перспективных методов лазерной терапии является плазмонно-резонансная фототермическая терапия, в которой применяется лазерный нагрев металлических, чаще всего золотых наночастиц [Huang X., Jain Р.К., El-Sayed I.H., El-Sayed M.A. Plasmonic photothermal therapy (PPTT) using gold nanoparticles // Lasers Med. Sci., 2008. 23(3), 217-228].
Уникальность золотых наночастиц определяется электрохимическими и оптическими свойствами коллоидного золота, в частности, поверхностным плазмонным резонансом (ППР). Для практического применения предпочтительным является использование термосенсибилизаторов, поглощающих свет в инфракрасной области (700-1000 нм), где поглощение самих биотканей минимально, в так называемом терапевтическом окне прозрачности биотканей [Тучин В.В. Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях. - 2-е изд., испр. и доп. - М.: ФИЗМАТЛИТ, 2010. 478 с.]. Таким образом, плазмонный резонанс наночастиц для применения in vivo должен находиться в инфракрасном (ИК) диапазоне.
В настоящее время различными исследовательскими группами для плазмонно-резонансной гипертермии предложено использование различных золотых наночастиц: нанооболочек, наностержней, наноклеток, нанокубов и других [Kennedy L.C., Bickford L.R., Lewinski N.A., Coughlin A.J., Hu Y., Day E.S., West J.L., Drezek R.A. A new era for cancer treatment: gold-nanoparticle-mediated thermal therapies // Small, 2011. 7. 169-183; Sau Т.К., Rogach A.L., Jackel F., Klar T.A., Feldmann J. Properties and applications of colloidal nonspherical noble metal nanoparticles. Adv Mater. 2010; 22. 1805-1825.; Xia Y., Li W., Cobley C.М., Chen J., Xia X., Zhang Q., Yang M., Cho E.C., Brown P.K. Gold nanocages: from synthesis to theranostic applications // Acc Chem Res. 2011. 44. 914-924.; Zhang J. Biomedical applications of shape-controlled plasmonic nanostructures: a case study of hollow gold nanospheres for photothermal ablation therapy of cancer // J Phys Chem Lett. 2010. 1. 686-695; Huang X., El-Sayed I.H., Qian W., El-Sayed M.A. Cancer cell imaging and photothermal therapy in the near-infrared region by using gold nanorods // J Am Chem Soc. 2006. 128. 2115-2120.].
Использование для фототермической терапии раствора золотых наностержней является предпочтительным из-за коллоидной стабильности и легкой настройки плазмонного резонанса наностержней в соответствии с длиной волны лазерного излучения путем изменением осевого соотношения наночастиц [Maltzahn G., Park J.-H., Agrawal A., Bandaru N.K., Das S.K., Sailor M.J., Bhatia S.N. Computationally guided photothermal tumor therapy using long-circulating gold nanorod antennas // Cancer Res. 2009, 69(9). 3892-3900.]. Для улучшения биосовместимости наночастиц, повышения их стабильности и простоты функционализации в настоящее время используются различные биосовместимые полимеры [Hirn S., Semmler-Behnke М., Schleh C., Wenk A., Lipka J., ., Takenaka S., ., Schmid G., Simon U., Kreyling W.G. Particle size-dependent and surface charge-dependent biodistribution of gold nanoparticles after intravenous administration // European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2011. 77. 407.], более длительное время циркуляции и лучшее накопление в опухолях показывают наночастицы, покрытые нейтрально заряженными полимерами, в том числе полиэтиленгликолем [Wang J., Bai R., Yang R., Liu J., Tang J., Liu Y., Li J., Chaic Z., Chen C. Size- and surface chemistry-dependent pharmacokinetics and tumor accumulation of engineered gold nanoparticles after intravenous administration // Metallomics. 2015. 7. 516-524.].
3
2
Нами ранее была апробирована методика фототермической плазмонно-резонансной терапии у крыс с перевитыми опухолями альвеолярного рака печени крыс РС-1 при внутритуморальном введении золотых наностержней [Bucharskaya А.В., Maslyakova G.N., Afanasyeva G.A., Terentyuk G.S., Navolokin N.A., Zlobina O.V., Chumakov D.S., Bashkatov A.N., Genina E.A.,. Khlebtsov N.G, Khlebtsov B.N., Tuchin V.V. The morpho-functional assessment of plasmonic photothermal therapy effects on transplanted liver tumor // Journal of Innovative Optical Health Sciences 05/2015. 8(3). 1541004 (8 pages). DOI:10.1142/S1793545815410047]. Крысам с перевитым раком печени РС-1 при достижении опухолью объема 3,0±0,3 см внутритуморально в количестве 30% от объема опухоли вводилась суспензия золотых наностержней, 41±8 нм длиной и 10±2 нм в диаметре), в концентрации 400 мкг/мл, с максимумом поглощения на длине волны 808 нм, соответствующей плазмонному резонансу золотых наностержней. Облучение проводилось чрескожно над поверхностью опухоли в течение 15 мин. Инфракрасный лазер 808-nm LS-2-N-808-10000 (Санкт-Петербург, Россия) с плотностью мощности 2.3 Вт/см использовался для лазерной гипертермии. Температурный контроль за нагревом опухоли проводили каждые 30 секунд при использовании ИК-термографа IRI4010 (IRYSYS, UK). При проведении лазерной гипертермии был отмечен значительный подъем температуры (55±2°С), наиболее выраженный в первые 2 минуты облучения. Через сутки после лазерной гипертермии животные выводились из эксперимента, при морфологическом исследовании были отмечены выраженные некротические изменения в опухоли, занимающие до 80-90% площади среза. Сохранные опухолевые клетки с дистрофическими изменениями выявлялись только в подкапсулярной зоне опухоли. К сожалению, данный способ также имеет ограничения, связанные с внутритуморальным введением золотых наностержней, что возможно только при поверхностной локализации опухолей. Кроме того, внутриопухолевое введение может приводит к локальному повреждению опухоли, что может спровоцировать ее метастазирование.
При анализе имеющихся способов лазерной гипертермии с внутривенным введением наночастиц было отмечено, что эффективность проведения сеанса лазерной гипертермии зависит от того, насколько правильно выбрано время проведения сеанса после введения наночастиц. Накопление наночастиц в опухолевой ткани резко повышает градиент температуры между опухолью и окружающими здоровыми тканями, что обеспечивает локальность нагрева опухоли. Это делает лазерное воздействие прицельным и снижает негативное влияние лазерного воздействия на нормальные ткани.
На сегодняшний день накопление наночастиц в органах и тканях изучается как методами качественной оценки: трансмиссионной электронной микроскопией, световой микроскопией [Gobin A.M., Lee М.Н., Halas N.J., James W.D., Drezek R.A., West J.L. Near-infrared resonant nanoshells for combined optical imaging and photothermal cancer therapy // Nano Letters. 2007. Vol. 7, No. 7, 1929-1934], конфокальной микроскопией [., Naik A., Kalia Y.N., Guy R.H., Fessi H. Skin penetration and distribution of polymeric nanoparticles // J Control Release. 2004. 14. 99(1). 53-62], оптической когерентной томографией [Sirotkina M.A., Shirmanova M.V., Bugrova M.L., Elagin V.V., Agrba P.D., Kirillin M.Yu., Kamensky V.A., Zagaynova E.V. Continuous optical coherence tomography monitoring of nanoparticles accumulation in biological tissues // Journal of Nanoparticles research. 2011. 13(1). 283-291], так и методами количественной оценки накопления наночастиц в биологических тканях: атомно-абсорбционная спектрометрия [Terentyuk G.S., Maslyakova G.N., Suleymanova L.V., Khlebtsov B.N., Kogan B.Ya., Akchurin G.G., Shantrocha A.V., Maksimova I.L., Khlebtsov N.G., Tuchin V.V. Circulation and distribution of gold nanoparticles and induced alterations of tissue morphology at intravenous particle delivery // Journal of Biophotonics 05/2009. 2(5). 292-302.], метод нейтронно-активационного анализа [James W.D., Hirsch L.R., West J.L., O'Neal P.D., Payne J.D. Application of INAA to the build-up and clearance of gold nanoshells in clinical studies in mice // Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry, 2007, Vol. 271, 2, pp 455-459.].
Большинство из использующихся методов определения накопления наночастиц связаны с выведением животных из эксперимента, либо являются достаточно дорогостоящими.
2
Известен способ лечения опухолей с помощью лазерной гипертермии. [Gobin А.М., Lee М.Н., Halas N.J., James W.D., Drezek R.A., West J.L. Near-infrared resonant nanoshells for combined optical imaging and photothermal cancer therapy // Nano Letters. 2007. 7. 7. 1929-1934]. Данный способ осуществляют путем внутривенного введения плазмонно-резонансных золотых наночастиц, выполненных в виде нанооболочек диаметром 143 нм, с диаметром ядра 119±11 нм и размером оболочки 12 нм, обладающих максимумом поглощения на длине волны 750-850 нм, мышам с перевитой подкожно мышиной карциномой кишечника, через 20 часов после введения наночастиц проводят исследование опухоли методом оптической когерентной томографии (ОКТ), и затем воздействуют на опухоль лазером с длиной волны 808 нм и плотностью мощности 4 Вт/см, в течение 3 минут. Авторы отмечали уменьшение объема опухоли и увеличение продолжительности жизни мышей после фототермической терапии. Недостатками способа является использование наночастиц больших размеров (более 100 нм) и, вследствие этого, склонность наночастиц к агрегации, что, в первую очередь, не может обеспечить достаточного количества поступления наночастиц в опухоль, и в дальнейшем - нужной эффективности гипертермии.
2
Известен способ лечения опухолей с помощью лазерной гипертермии [Сироткина Марина Александровна. Визуализация и лазерная гипертермия биологических тканей с применением золотых плазмонно-резонансных наночастиц: диссертация кандидата биологических наук: 03.01.02 / Сироткина Марина Александровна; [Место защиты: Институт теоретической и экспериментальной биофизики PAH]. -Пущино, 2014. - 140 с]. Самкам мышей линии СВА прививали рак шейки матки (РШМ-5). Раствор золотых плазмонно-резонансных наностержней (с размерами 50/10 нм с максимумом поглощения 850 нм и 60/15 нм - с максимумом поглощения 775 нм) вводили однократно внутривенно в дозе 250 мкг/кг, контроль накопления наночастиц в опухоли проводили с помощью ОКТ каждые 30 минут в течение 7 часов. При визуализации наибольшего накопления на перевитую опухоль воздействовали локально излучением диодного лазера с плотностью мощности 1.2-1.5 Вт/см, поверхностную температуру перевитой опухоли РШМ-5 поддерживали на постоянном уровне 44-45°С в течение 20 минут, варьируя значение выходной мощности лазера. Лазерную гипертермию проводили под непрерывным контролем поверхностной температуры ИК-термографом. Применение наностержней размером 50/10 нм для лазерной гипертермии привело к торможению роста узла экспериментальной модели на 51% на 7-й день после лазерного воздействия. Лазерная гипертермия перевитой опухоли РШМ-5 с наностержнями размером 60/15 нм оказала выраженное положительное действие, которое заключалось в достоверном замедлении темпа роста узла перевитого рака шейки матки РШМ-5, на 14-й день после воздействия показатель торможения роста опухоли составил 72%.
Однако данный способ лечения недостаточно эффективен, вероятно, за счет невысокой температуры при проведении гипертермии из-за недостаточного накопления золотых наностержней в опухоли. Кроме того, относительно небольшая проникающая способность ОКТ - максимум до 2-3 мм [Fujimoto J.G., Pitris C., Boppart S.A., Brezinski М.Е. Optical Coherence Tomography: An Emerging Technology for Biomedical Imaging and Optical Biopsy // Neoplasia. 2000. 2(1-2). 9-25.] ограничивает возможности адекватного контроля за накоплением наночастиц с помощью ОКТ в глубоко лежащих опухолях.
2
Наиболее близким к предлагаемому способу является способ лечения опухолей с помощью лазерной гипертермии [El-Sayed М.А., Shabaka А.А., El-Shabrawy О.А., Yassin N.A., Mahmoud S.S., El-Shenawy S.M., Al-Ashqar E., Eisa W.H., Farag N.M., El-Shaer M.A., Salah N., Al-Abd A.M. Tissue distribution and efficacy of gold nanorods coupled with laser induced photoplasmonic therapy in Ehrlich carcinoma solid tumor model // PLOS ONE 2013. 8(10). е76207]. Раствор пегилированных золотых плазмонно-резонансных наностержней (с размерами 60±5 и осевым соотношением 4,6 с максимумом поглощения 800 нм) в дозировке 1,5 мг/кг, вводили внутривенно и внутритуморально каждые три недели мышам Balb С с перевитой карциномой Эрлиха. Предварительно проведенная оценка накопления наночастиц в опухоли методом атомно-адсорбционной спектроскопии показала, что максимальное накопление в перевитых опухолях отмечается через 3 суток после внутривенного введения, период полувыведения составлял 11,6 дней. Через 7 дней после каждого внутривенного введения на перевитую карциному Эрлиха воздействовали локально излучением диодного лазера с плотностью мощности 50 Вт/см, в течение 2 минут. Нагрев опухоли составил 79°С.
Однако, данный способ лечения недостаточно эффективен, вероятно, за счет неоптимального выбора времени облучения опухолей. Установленный авторами определенный максимум накопления наночастиц в опухолях составлял 72 часа (3 суток), лазерное воздействие на опухоли проводилось спустя 7 дней после введения наночастиц, контроль за накоплением наночастиц непосредственно перед проведением гипертермии в данном способе отсутствовал. Торможение роста опухолей не происходило с 1-го по 21 день эксперимента и отмечалось лишь начиная с 22 дня - после повторного внутривенного введения раствора наночастиц. Столь длительные интервалы между внутривенным введением наночастиц и лазерной гипертермией неоправданны, так как накопление наночастиц в опухоли снижается, и соответственно, лечение оказывается неэффективным.
Как показали более поздние исследования, проведенные J. Wang и коллегами [Wang J., Bai R., Yang R., Liu J., Tang J., Liu Y., Li J., Chaic Z., Chen C. Size- and surface chemistry-dependent pharmacokinetics and tumor accumulation of engineered gold nanoparticles after intravenous administration // Metallomics. 2015. 7. 516-524.], для различных пегилированных золотых наночастиц, в том числе для золотых наностержней длиной 60 нм и диаметром 15 нм, при однократном внутривенном введении мышам Balb/c с перевитым раком молочной железы 4Т1 200 мкл раствора золотых наночастиц с концентрацией 0,1 мг/мл максимальное накопление золота отмечается в опухоли и внутренних органах через 24 часа, а через 3 суток отмечается снижение содержания золота в опухоли и внутренних органах.
Задачей настоящего изобретения является разработка более эффективного способа лечения опухолей с помощью лазерной гипертермии и плазмонно-резонансных наночастиц с контролем накопления наночастиц в опухоли.
Поставленная задача решается предлагаемым способом фототермической плазмонно-резонансной терапии, включающим внутривенное введение раствора золотых наночастиц, обладающих свойством плазмонного резонанса, максимум поглощения которых совпадает с длиной волны лазерного излучения, контроль накопления наночастиц в опухоли методом термографии в течение 2 минут при воздействии на опухоль диагностическим лазерным излучением небольшой мощности, и при достижении оптимальной температуры - увеличение мощности лазерного излучения и проведение терапевтической лазерной гипертермии опухоли.
Осуществление предлагаемого способа
2
2
Животному внутривенно вводят раствор плазмонно-резонансных золотых наночастиц, покрытых полиэтиленгликолем, далее через 24 часа после введения раствора наночастиц воздействуют на опухоль в течение 2 минут лазерным излучением с длиной волны, соответствующей максимуму поглощения используемых наночастиц с небольшой плотностью мощности - 1-2 Вт/см, при этом исследуют накопление наночастиц в опухоли методом термографии. Плотность мощности лазерного излучения подобрана для выявления накопления наночастиц в опухоли, чтобы избежать выраженного повреждающего действия лазерного излучения в течение 2 минут на опухолевую ткань. Повышение температуры до 45°С и выше свидетельствует о достаточном накоплении наночастиц в опухоли. Далее проводят лазерную гипертермию с увеличением плотности мощности лазерного излучения до 4-5 Вт/см в течение 20 минут. Мощность лазера при этом подбирается таким образом, чтобы нагрев опухоли осуществлялся при температуре 60-70°С. Если температура не достигает в течение 2 минут 45°С, внутривенное введение раствора наночастиц и через 24 часа облучение с контролем накопления наночастиц повторяют до достижения температуры нагрева опухоли 45°С.
Нами была проведена экспериментальная работа по установлению достаточного накопления золота в опухоли для проведения эффективной плазмонно-резонансной фототермической терапии.
В эксперименте, проводимом в соответствии с руководством CIOMS и ICLAS «International Guiding principles for Biomedical Research Involving Animals» [http://iclas.org/wp-content/uploads/2013/03/CIOMS-ICLAS-Principles-Final.pdf], было задействовано 60 самцов белых лабораторных крыс массой 200±20 г, которым имплантировали подкожно, в области лопатки, по 0,5 мл 25% опухолевой взвеси в растворе Хэнкса штамма альвеолярного рака печени РС-1, полученного из банка опухолевых штаммов РОНЦ им. Н.Н. Блохина.
i
i
i
Использовались пегилированные золотые наностержни (ЗНС) со средними размерами длины и диаметра стержней равными 41±8 нм и 10±2 нм, синтезированные в лаборатории нанобиотехнологии ИБФРМ РАН г. Саратова [патент РФ №2474443 «Термосенсибилизатор для лазерной гипертермии и способ его получения» (Хлебцов Б.Н. Хлебцов Н.Г., Терентюк Г.С., дата приоритета 11.09.2008, опубликовано 10.03.2010)]. Геометрические параметры синтезированных наночастиц определялись по трансмиссионным электронно-микроскопическим (ТЭМ) изображениям (Фиг. 1а), полученным на электронном микроскопе Libra-120 (Carl Zeiss, Germany). Вставка на Фиг. 1, а показывает гистограмму численного распределения частиц по осевому соотношению r=L/d со средним значением r=4.03±0.7. Спектр поглощения золотых наностержней измерялся на спектрофотометре Specord 250 BU (Analytik, Jena, Germany), и в соответствии с полученным спектром (Фиг. 1б), были подобраны параметры инфракрасного лазерного излучения. Работа Б.Н Хлебцова и Н.Г. Хлебцова по синтезу и характеристике наночастиц была поддержана грантом РНФ №14-13-01167.
3
При достижении опухолью объема 3.0±0.3 см животные методом случайной выборки были разделены на 5 групп по 12 крыс в каждой: 1 группа сравнения - без воздействия, 2 группа сравнения - только с лазерным воздействием, 3 группа - с однократным введением золотых наночастиц, 4-я группа - с двукратным введением золотых наночастиц, 5 группа - с трехкратным введением золотых наночастиц. Наночастицы вводились один раз в сутки, в дозировке 2 мг/кг, суточный интервал между последующими введениями был выбран на основании ранее установленных данных о том, что максимальное накопление золота в печени, селезенке и перевитых опухолях наблюдается через 24 часа после однократного внутривенного введения золотых наночастиц [Terentyuk G.S., Maslyakova G.N., Suleymanova L.V., Khlebtsov B.N., Kogan B.Ya., Akchurin G.G., Shantrocha A.V., Maksimova I.L.,. Khlebtsov N.G, Tuchin V.V. Circulation and distribution of gold nanoparticles and induced alterations of tissue morphology at intravenous particle delivery // Journal of Biophotonics 05/2009; 2(5):292-302.; Wang J., Bai R., Yang R., Liu J., Tang J., Liu Y., Li J., Chaic Z., Chen C. Size- and surface chemistry-dependent pharmacokinetics and tumor accumulation of engineered gold nanoparticles after intravenous administration // Metallomics. 2015. 7. 516-524].
Многократное внутривенное введение золотых наностержней было предложено в связи с тем, что согласно рекомендациям руководства по использованию лабораторных животных в экспериментальных исследованиях [Refining procedures for the administration of substances. Report of the BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Lab Anim. 2001. 35(1). 1-41.], максимальный объем вводимого внутривенно вещества зависит от объема циркулирующей крови и у крыс не должен превышать 5 мл/кг. Выбранная дозировка - 2 мг/кг соответствовала концентрации золота - 400 мкг/мл и оптической плотности раствора 20 и была ранее апробирована нами при внутритуморальном введении ЗНС как максимальная терапевтическая доза, оказывающая оптимальный лечебный эффект без токсических проявлений [Bucharskaya А.В., Maslyakova G.N., Afanasyeva G.A., Terentyuk G.S., Navolokin N.A., Zlobina O.V., Chumakov D.S., Bashkatov A.N., Genina E.A., Khlebtsov N.G., Khlebtsov B.N., Tucltin V.V. The morpho-functional assessment of plasmonic photothermal therapy effects on transplanted liver tumor // Journal of Innovative Optical Health Sciences 05/2015; 8(3):1541004 (8pages). DOI:10.1142/S1793545815410047]. Значительно повышать концентрацию золотых наночастиц в растворе также невозможно из-за снижения стабильности коллоидных растворов и увеличения риска возможного токсического действия наночастиц [Mironova Т., Hadjiargyrou М., Simon М., Jurukovski V., Rafailovich M.H. Gold nanoparticles cellular toxicity and recovery: Effect of size, concentration and exposure time // Nanotoxicology. 2010. 4(1). 120-137.].
Исследование накопления золота в опухоли и внутренних органах (печень, почка, селезенка) проводили методом атомно-адсорбционной спектроскопии на спектрофотометре Dual Atomizer Zeeman АА iCE 3500 (Thermo Scientific Inc., USA). Через 24 часа после последнего внутривенного введения золотых наночастиц по 4 животных из каждой группы выводили из эксперимента и проводили определение концентрации золота в 1 г навески ткани. Процесс пробоподготовки тканей осуществлялся в автоматическом режиме с постоянным контролем температуры в микроволновой системе «MARS Xprees» (США).
2
2
Оставшимся в эксперименте животным проводили лазерное облучение с использованием инфракрасного лазера с длиной волны 808 нм. Облучение проводили чрескожно в области опухоли в течение 2 мин. Контроль за температурой нагрева опухоли осуществляли каждые 30 секунд при использовании тепловизора IRI4010 (IRYSYS, UK). Начальную плотность мощности лазерного излучения подбирали в диапазоне 1-2 Вт/см, чтобы избежать выраженного повреждающего воздействия. При наличии быстрого подъема температуры (до 45°С и выше) в первые 2 минуты облучения - крысам далее проводилось лазерное облучение в течение 20 минут, плотность мощности лазерного излучения при этом увеличивали до 4-5 Вт/см, подбирая ее таким образом, чтобы нагрев опухоли происходил при температуре 60-70°С.
Вывод из эксперимента по 4 животных из каждой группы осуществляли через 24 часа после проведения лазерного воздействия. Образцы тканей опухоли и внутренних органов забирали для морфологического исследования. Оставшихся животных оставляли для наблюдения за ростом опухоли в течение 21 дня.
3
3
k
0
k
k
0
Динамику роста опухоли оценивали по изменению ее объема по формуле: V=А×В×С/1000 (мм), где А - ширина, В - толщина, С - высота опухоли в мм. Измерения проводили электронным штангенциркулем каждые день от начала эксперимента. Высчитывали индекс торможения роста опухоли (ИТРО) - показатель эффективности противоопухолевой терапии, вычисляли по формуле: ИТРО%=[(V-V)/V]×l00%, где V и V - средний объем (см) опухоли в контрольной и опытной группах в конце эксперимента.
Изменения в органах и тканях после введения наночастиц и воздействия фототермической терапии оценивали морфологическими методами, включающими обзорные методы окраски (гематоксилин и эозин), проводилось морфометрическое исследование гистологических препаратов с использованием системы анализа цифровых изображений Микровизора медицинского μVizo-103 (ЛОМО, Россия).
Для обработки полученных данных использовали пакет прикладных статистических программ «STATISTICA 10.0» (Stat Soft Inc, США).
При проведении лазерной гипертермии без введения золотых наностержней и при однократном введении золотых наностержней у крыс с перевитым раком печени температура локального нагрева опухоли не достигала 40°С в первые 2 минуты, что свидетельствует о том, что накопление золота в опухоли при однократном введении золотых наночастиц было недостаточным. На Фиг. 2, кривая 1 представляет график изменения температуры нагрева опухоли при лазерной гипертермии без введения ЗНС, кривая 2 - график изменения температуры нагрева опухоли при фототермической терапии после однократного внутривенного введения ЗНС.
При исследовании содержания золота в опухоли и внутренних органах методом атомно-абсорбционной спектроскопии (ААС) накопление золота в опухоли при однократном введении было минимальным по сравнению с контрольными показателями в группе сравнения (Табл. 1).
При двукратном введении золотых наностержней у крыс с перевитым раком печени РС-1 при проведении диагностического облучения в первые 2 минуты была достигнута температура - 42,5±2°С, при исследовании методом ААС накопление золота в опухоли при двукратном введении ЗНС повышалось по сравнению с группой сравнения 1 и группой животных с однократным введением ЗНС. На Фиг. 2 кривая 3 представляет график изменения температуры нагрева опухоли при двукратном введении золотых наностержней и проведении лазерной гипертермии.
При трехкратном внутривенном введении в опухоли содержание золота составило в среднем 10,67±0,39 мкг/г сырого веса ткани опухоли, что значительно превышало накопление золота, полученное при одно- и двукратном внутривенном введении. При проведении диагностического лазерного облучения в первые 2 минуты была достигнута температура свыше 45°С - 52±2°С, сопоставимая с температурой, наблюдаемой в первые 2 минуты при проведении лазерной гипертермии при внутритуморальном введении золотых наностержней - 55±2°С. На Фиг. 2 кривая 4 представляет график изменения температуры нагрева опухоли при фототермической терапии после трехкратного внутривенного введения ЗНС, кривая 5 - график изменения нагрева опухоли при лазерной гипертермии после внутритуморального введения ЗНС.
Таким образом, в данной группе животных накопление золота в опухоли при трехкратном внутривенном введении было достаточным для эффективной фототермической терапии, что подтверждалось данными, полученными при морфологическом исследовании.
При морфологическом исследовании в группе сравнения 1 (без воздействия) опухоль имела дольчатое строение, дольки были разделены тонкими прослойками соединительной ткани. Опухолевые клетки имели овально-округлую форму с эксцентрично расположенными ядрами. Значительная часть цитоплазмы клеток была занята крупными вакуолями, содержащими слизь, отмечались скопления слизистых масс в межклеточных пространствах. На Фиг. 3А представлена микрофотография альвеолярного рака печени крысы из группы сравнения 1. Морфологические изменения во внутренних органах были неспецифическими и характерными для токсического действия растущей опухоли: в печени архитектоника строения сохранялась, отмечалось умеренное полнокровие; в селезенке выявили небольшое преобладание белой пульпы над красной, очаги склероза, лимфоидные фолликулы без светлых центров; в почках отмечалось полнокровие в отдельных клубочках, в легких наблюдали умеренное полнокровие, межальвеолярные перегородки местами утолщены, умеренно инфильтрированы лимфоцитами, единичными нейтрофилами.
3
При дальнейшем наблюдении за крысами группы сравнения 1 отмечали стабильный рост опухолей, объем опухоли на 21 день составил в среднем 27,8±2,7 см. На Фиг. 4 представлена динамика роста объема опухоли в группе сравнения 1 (кривая 1).
При морфологическом исследовании опухоли крыс 2 группы сравнения (только лазерное воздействие) через 24 часа после проведенной терапии было установлено, что опухоль сохраняла дольчатое строение. Отмечались небольшие очаги некрозов, составляющие 5-10% от общей площади среза, встречались опухолевые клетки с некробиотическими изменениями. Были выявлены единичные митозы. Сосуды были полнокровными, наблюдалось утолщение соединительнотканных перегородок и инфильтрация их лейкоцитами. На Фиг. 3Б представлена микрофотография альвеолярного рака печени крысы из группы сравнения 2.
3
В данной группе животных темп роста опухоли не отличался от темпа роста опухоли в группе сравнения 1. На 21 день после проведения фототермической терапии объем опухоли в группе с однократным внутривенным введением ЗНС незначительно отличался от объема опухоли в группе сравнения и составлял 24,3±2,4 см, ИТРО по объему опухоли составил 12,6%. Динамика роста объема опухоли в группе сравнения 2 представлена на Фиг. 4 (кривая 2). Незначительное торможение роста опухолей может быть обусловлено недостаточной эффективностью воздействия лазерной гипертермии без введения золотых наночастиц.
При однократном внутривенном введении ЗНС и воздействии лазерного излучения через 24 часа после проведенной терапии опухоль сохраняла дольчатое строение. Отмечались небольшие очаги некрозов, занимающие до 20-30% от общей площади среза, встречались опухолевые клетки с некробиотическими изменениями. Выявлялись единичные митозы в ткани опухоли. На Фиг. 3В представлена микрофотография альвеолярного рака печени крысы после однократного внутривенного введения ЗНС и воздействия лазерного излучения.
3
В данной группе животных отмечали небольшое замедление темпов роста перевиваемой опухоли по сравнению с группой сравнения 1, начиная с 7 дня эксперимента. На 21 день после проведения фототермической терапии объем опухоли в группе с однократным внутривенным введением ЗНС составлял в среднем 17,8±2,9 см, ИТРО по объему в среднем составил 36%. Динамика роста объема опухоли в данной группе животных представлена на Фиг. 4 (кривая 3). Таким образом, при однократном внутривенном введении золотых наностержней и проведении лазерной гипертермии отмечалась небольшая регрессия перевитой опухоли.
При двукратном внутривенном введении ЗНС и воздействии лазерного излучения через 24 часа после проведенной терапии в ткани опухоли развивались очаги некрозов, составляющие до 30-50% от площади среза, встречались опухолевые клетки с некробиотическими изменениями. На Фиг. 3Г представлена микрофотография альвеолярного рака печени крысы после двукратного внутривенного введения ЗНС и воздействия лазерного излучения. Были выявлены единичные митозы. Сосуды были полнокровными, наблюдалось утолщение соединительнотканных перегородок и инфильтрация их лейкоцитами.
3
Отмечали значительное замедление темпов роста опухоли в данной группе животных по сравнению с группой сравнения 1, начиная с 4 дня. На 21 день после проведения фототермической терапии объем опухоли в исследуемой группе составлял 14,9±2,6 см, т.е. почти был в 2 раза меньше объема опухоли в группе сравнения 1, ИТРО по объему опухоли составил 46,4%. Динамика роста объема опухоли в данной группе животных представлена на Фиг. 4 (кривая 4). Таким образом, при двукратном внутривенном введении золотых наностержней и проведении лазерной гипертермии отмечалась более выраженная регрессия перевитой опухоли.
3
При трехкратном внутривенном введении ЗНС и воздействии лазерного излучения в ткани опухоли отмечались более выраженные некротические изменения - очаги некрозов составляли до 70-80% от общей площади опухоли, сохранные опухолевые клетки с дистрофическими изменениями отмечались только под капсулой опухоли. На Фиг. 3Д представлена микрофотография альвеолярного рака печени крысы после трехкратного внутривенного введения ЗНС и воздействия лазерного излучения. Изменения в опухоли были аналогичны некробиотическим изменениям в опухоли при внутритуморальном введении золотых наночастиц и воздействии лазерного излучения. На Фиг. 3Е представлена микрофотография альвеолярного рака печени крысы после внутритуморального введения ЗНС и воздействия лазерного излучения. Наблюдали значительное замедление темпов роста опухоли по сравнению с группой сравнения 1, начиная со 2 дня. На 21 день после проведения фототермической терапии объем опухоли в исследуемой группе был значительно меньше объема опухоли в группе сравнения 1 и составлял в среднем 8,8±1,4 см, ИТРО по объему опухоли составил 68,3%. Динамика роста объема опухоли в данной группе животных представлена на Фиг. 4 (кривая 5). Таким образом, при трехкратном внутривенном введении золотых наностержней и проведении лазерной гипертермии отмечалась выраженная регрессия опухоли. По сравнению с прототипом торможение роста опухоли начиналось уже со 2-го дня, в то время как в прототипе торможение роста опухоли отмечается только начиная с 21 дня, после повторного введения наночастиц.
Во всех опытных группах значительных морфологических изменений во внутренних органах после проведения фототермической терапии не было выявлено.
Примеры конкретного использования предлагаемого способа
Пример 1.
3
2
2
2
2
Для эксперимента был взята белая лабораторная крыса-самец, которой имплантировали подкожно в области лопатки 0.5 мл 25% опухолевой взвеси в растворе Хенкса штамма альвеолярного рака печени РС-1. При достижении опухолью диаметра 3.0 см животному внутривенно вводили раствор пегилированных золотых наностержней, в дозировке 2 мг/кг, и через 24 часа после введения наночастиц опухоль чрескожно, в течение 2 минут, облучали инфракрасным лазером с длиной волны 808 нм, плотность мощности 2 Вт/см. При проведении лазерной гипертермии была достигнута температура 40°С, что свидетельствовало о недостаточном накоплении золота в опухоли. Животному была проведена повторная внутривенная инъекция раствора золотых наностержней, и через 24 часа опухоль чрескожно в течение 2 минут облучали инфракрасным лазером с длиной волны 808 нм, плотность мощности 2 Вт/см. При проведении лазерной гипертермии была достигнута температура 43°С, что также свидетельствовало о недостаточном накоплении золота в опухоли. Животному была проведена третья внутривенная инъекция раствора золотых наностержней, и через 24 часа опухоль чрескожно в течение 2 минут облучали инфракрасным лазером с длиной волны 808 нм, плотность мощности 2 Вт/см. При проведении лазерной гипертермии была достигнута температура 50°С, что свидетельствовало о достаточном накоплении золота в опухоли. Животному было проведено дальнейшее лазерное облучение с увеличением плотности мощности до 4 Вт/см в течение 20 минут. Через 24 часа животное было выведено из эксперимента, и при проведении морфологического исследования повреждающее воздействие фототермической плазмонно-резонансной терапии было подтверждено наличием обширных полей некроза, занимающих около 80% от площади среза и появлением дистрофических изменений в сохранных клетках опухоли.
Пример 2.
3
2
2
2
2
Для эксперимента были взяты 2 белых лабораторных крысы-самца, которым имплантировали подкожно в области лопатки 0,5 мл 25% опухолевой взвеси в растворе Хэнкса штамма альвеолярного рака печени РС-1. При достижении опухолью диаметра 3.0 см одному животному внутривенно вводили раствор пегилированных золотых наностержней, в дозировке 2 мг/кг, и через 24 часа после введения опухоль чрескожно в течение 2 минут облучали инфракрасным лазером с длиной волны 808 нм, плотность мощности 2 Вт/см. При проведении лазерного облучения была достигнута температура 41°С, что свидетельствовало о недостаточном накоплении золота в опухоли. Животному была проведена повторная внутривенная инъекция раствора золотых наностержней, и через 24 часа опухоль чрескожно в течение 2 минут облучали инфракрасным лазером с длиной волны 808 нм, плотность мощности 2 Вт/см. При проведении лазерного облучения была достигнута температура 44°С, что также свидетельствовало о недостаточном накоплении золота в опухоли. Животному была проведена третья внутривенная инъекция золотых наночастиц, и через 24 часа опухоль чрескожно в течение 2 минут облучали инфракрасным лазером с длиной волны 808 нм, плотность мощности 2 Вт/см. При проведении лазерной гипертермии была достигнута температура 51°С, что свидетельствовало о достаточном накоплении золота в опухоли. Животному было проведено дальнейшее лазерное облучение с увеличением плотности мощности до 4 Вт/см в течение 20 минут. В дальнейшем проводилось наблюдение за ростом опухоли в течение 21 дней. Вторая крыса после имплантации опухоли не подвергалась никакому воздействию.
3
3
После проведения фототермической плазмонно-резонансной терапии отмечалось снижение темпов роста опухоли по сравнению с перевитой опухолью у крысы без воздействия, объем опухоли через 21 день после проведения фототермической терапии составил 11 см (у крысы без воздействия объем опухоли составил 28 см).
Таким образом, как видно из описания и примеров, нами впервые предложен неинвазивный способ контроля за достаточным накоплением наночастиц в опухоли с помощью измерения локальной температуры нагрева опухоли при диагностическом лазерном облучении с небольшой плотностью мощности.
Нами впервые предложен способ плазмонно-резонансной фототермической терапии опухолей, отличительными признаками которого являются многократное внутривенное введение золотых наночастиц и проведение диагностического лазерного облучения опухоли с небольшой плотностью мощности под контролем термографии, при этом каждое повторное введение проводят через 24 часа в период максимального накопления после предыдущей инъекции золотых наночастиц. Подъем температуры ниже 45°С в течение 2 минут диагностического лазерного облучения опухоли свидетельствует о недостаточном накоплении наночастиц и требует повторного их введения. При достижении температуры 45°С и выше в течение 2 минут диагностического лазерного облучения, плотность мощности лазерного излучения увеличивают для проведения терапевтической лазерной гипертермии в течение 20 минут. Количество внутривенных введений золотых наночастиц в каждом конкретном случае может варьироваться и определяется достижением нужной температуры нагрева опухоли.
Результат применения данного способа заключается в повышении эффективности лазерной гипертермии опухолей, обуславливающем выраженную регрессию перевитых опухолей, проявляющуюся в некробиотических изменениях клеток опухоли и торможении роста опухоли.