Термостабильная Ni-Fe гидрогеназа HydSL из Thiocapsa roseopersicina: некоторые подходы к изучению продукции фермента в гетерологичной системе Escherichia coli

Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2011. Вып. 2. С. 363-376 Биология

УДК 576.31+577.2

Термостабильная Ni-Fe гидрогеназа HydSL из Thiocapsa roseopersicina: некоторые подходы к изучению продукции фермента в гетерологичной системе Escherichia coli

Г. Н. Ширшикова, А. Н. Хуснутдинова, А. А. Цыганков,

А. М. Бутанаев

Аннотация. Термостабильная Ni-Fe гидрогеназа HydSL из Thiocapsa roseopersicina представляет собой димер, состоящий из малой (HydS, 39 кДа) и большой (HydL, 64 кДа) субъединиц, которые кодируются структурными генами hydS (1100 п.н.) и hydL (1700 п.н.) соответственно. В данной работе описана экспрессия структурных генов гидрогеназы в Escherichia coli как отдельно, так и совместно. Во всех случаях субъединицы гидрогеназы выпадали в тельца включения (ТВ) и имели разную электронную плотность, что видно на микрофотографиях штаммов-продуцентов. Показано, что присутствие никеля в ТВ возможно лишь при одновременной экспрессии обеих субъединиц. Полученные результаты позволяют предположить, что для созревания активного центра фермента в гетерологичной системе, как минимум, необходима экспрессия генов обеих субъединиц в одной клетке Escherichia coli.

Ключевые слова: Ni-Fe гидрогеназа, гетерологичная экспрессия, пурпурные бактерии, Escherichia coli.

Введение

Гидрогеназы (EC1.12.xx) — это металлсодержащие ферменты, которые в зависимости от наличия металлов в активном центре можно разделить на Ре-Ре-содержащие, №-Ре-содержащие, и гидрогеназы, у которых активный центр присутствует в виде кофактора, содержащего Ре и легко отделяющегося при выделении [1]. №-Ре-содержащая гидрогеназа ЫуёБЬ из пурпурной серной бактерии ТНіосарза говеорегзісіпа БББ обладает высокой активностью и стабильностью к действию повышенных температур и кислорода, что делает этот фермент привлекательным в практическом отношении как возможный катализатор в топливных элементах [2, 3]. Кроме того, до сих пор не разрешена пространственная структура этого

фермента. И та, и другая задача требуют для своего решения большого количества фермента. К сожалению, T. roseopersicina достаточно сложно культивировать (время удвоения около ЗБ часов, а выход биомассы не превышает 0,4 г сухой биомассы с 1 л [4], и фермент синтезируется на низком уровне. В связи с этим актуальной является экспрессия HydSL гидрогеназы в быстрорастущем организме, например, Escherichia coli.

Попытки гетерологичной экспрессии активной гидрогеназы начались с середины В0-х годов прошлого века, когда удалось показать, что мегаплазмида водородокисляющих бактерий со всеми необходимыми генами для синтеза гидрогеназы может быть перенесена в другие бактерии путем конъюгации [Б]. Однако спектр реципиентов этой мегаплазмиды был очень ограничен. Позднее предпринимались попытки гетерологичной экспресии структурных генов гидрогеназ [б, 7]. Авторам удавалось получить экспрессию генов субъединиц, но фермент был не активен. Это было обусловлено тем, что имеющиеся в организме аксессорные гены не могли обеспечить правильное созревание чужеродного фермента. В то же время было показано, что плазмидный перенос структурных генов вместе со специфической эндопептидазой приводил к синтезу активной Ni-Fe гидрогеназы [В], но активность была на уровне чувствительности методов измерения. Перенос осуществлялся между близкородственными видами сульфатвосстанавливающих бактерий.

Используемые в данной работе штаммы T. roseopersicina и E. coli, относятся к одному классу Gammaproteobacteria, но к разным порядкам: Enterobacteriales и Chromatiales соответственно. Эти бактерии занимают разные экологические ниши (анаэробные донные осадки озер и эстуариев, богатые сероводородом и доступные солнечному освещению для T. roseopersicina, и кишечник млекопитающих и человека для E. coli). Кроме того, они имеют принципиально разные типы питания (преимущественно фотогетеротрофный для T. roseopersicina и хемогетеротрофный для кишечной палочки). Вместе с тем, их экологические ниши предполагают прямой контакт с молекулярным водородом. Поэтому эти бактерии содержат много разных гидрогеназ, кодируемых разными генами и синтезирующихся в разных условиях. Обе бактерии способны к поглощению и выделению водорода при брожении. Более того, T. roseopersicina способна к поглощению водорода при дыхании и фотосинтезе, а E. coli также может поглощать Н2 за счет функционирования hya гидрогеназы [9, 10]. Таким образом, несмотря на различные экологические ниши, занимаемые бактериями, можно полагать, что основные биохимические пути созревания активного центра этих ферментов у Thiocapsa и E. coli эволюционно консервативны.

Целью данной работы являлось создание штамма-продуцента E. coli, накапливающего обе субъединицы Ni-Fe гидрогеназы HydSL в одной клетке, и изучение возможности созревания фермента.

Материалы и методы

Штаммы E. coli и условия выращивания. В работе использовали штаммы E. coli DH5a и BL21 (DE3). Клетки E. coli выращивали при +37°С на среде Луриа-Бертани (ЛБ): триптон 1%, дрожжевой экстракт

0.5%, NaCl 1%, pH 7.5); в случае твердой среды — 2% агара. Выращивание жидкой культуры проводили при постоянном перемешивании 240 об/мин на орбитальном шейкере IKA KS 4000i control (IKA, Германия). Содержание антибиотиков в среде выращивания составляло: ампициллин (Am) — 50 мкг/мл в жидкой среде и 100 мкг/мл — в агаризованной, хлорамфеникол (Cm) — 17 мкг/мл в жидкой среде и 34 мкг/мл — в агаризованной.

Плазмиды. В работе использовали плазмиды pET22b (Novagen, США) и p15KS(+) (предоставлена проф. Fischer и Hengstenberg, Германия).

Амплификация генов hydS и hydL из геномной ДНК T. roseopersicina BBS. Последовательности структурных генов Ni-Fe гидрогеназы HydSL известны и доступны в базе данных «Genbank». Мы использовали их для полимеразной цепной реакции (ПЦР), которую ставили на термоциклере фирмы Eppendorf (Германия). Прямой и обратный праймеры: для hydS 5’-AAACATATGGCTGCCCGTAACCCCACT-3’

(NdeI) и 5’-ACCGAATTCTTATAGCTTGGCCTCCAATTCT-3’ (EcoRI) соответственно, для hydL 5’-AAAGAATTCATGAGCGAACGCATCGTC-3’ (EcoRI) и 5’-CCGAAGCTTTTAGGTGATCTTGATCTCCATC-3’ (HindJII) соответственно.

Смесь для ПЦР (50 мкл) содержала 100 нг геномной ДНК, по 200 нМ каждого из праймеров, по 2 мкМ каждого из 4 дНТФ, 2.0 мМ MgCl2, 5 мкл х10 реакционного буфера и 5 ед. P/u-полимеразы (СибЭнзим, Россия). Условия амплификации для обоих генов: 94°С/3 мин; 94°С/30 с, 59°С/30 с, 72°С/2 мин - 30 циклов; 72°С/5 мин. Продукты ПЦР анализировали в 1%-ном агарозном геле.

Создание конструкций для экспрессии структурных генов гидрогеназы. ДНК амплифицированных фрагментов hydS и hydL выделяли из агарозного геля посредством набора QIAquick Gel Extraction Kit (50) (QIAGEN, Германия). Последовательность обоих генов была подтверждена секвенированием. Фрагмент ДНК hydS обрабатывали рестриктазами NdeI и EcoRI, лигировали с ДНК вектора pET22b, обработанной теми же рестриктазами и трансформировали лигазной смесью штамм E coli DH5a. Таким образом, получили плазмиду pET22b-hydS. Фрагмент ДНК hydL обрабатывали рестриктазами EcoRI и HindIII, лигировали с ДНК вектора pET22b-hydS и трансформировали лигазной смесью штамм E coli DH5a. Получена плазмида pET22b-hydS-hydL. Далее ДНК плазмиды pET22b-hydS-hydL обрабатывали рестриктазами NdeI и EcoRI, выделяли из агарозного геля фрагмент pET22b-hydL, заполняли концы с помощью полимеразы Т4, лигировали и трансформировали штамм DH5a. Таким образом, получили плазмиду pET22b-hydL. ДНК плазмиды pET22b-hydL

обрабатывали рестриктазами BglII и NotI, выделяли фрагмент, содержащий ген hydL вместе с Т7-промотором, лигировали его с ДНК плазмиды p15KS(+), обработанной рестриктазами BamHI и NotI, и лигазной смесью трансформировали штамм DH5<x Так получили плазмиду p15-hydL. Далее плазмиды pET22b-hydS, pET22b-hydL и pET22b-hydS-hydL переносили в штамм BL21 (DE3) для получения продукции субъединиц гидрогеназы в клетках E. coli. Кроме того, BL21 (DE3) последовательно трансформировали ДНК плазмид pET22b-hydS и p15-hydL для получения продуцента E. coli, в котором структурные гены субъединиц расположены на разных плазмидах.

Трансформация. Штаммы E. coli трансформировали плазмидной ДНК на электропораторе MicroPulser (Bio-Rad, США) с контролируемым импульсом в 0.1 см кювете при значении силы поля 1.75 кВ/см, достигаемом за один импульс на образец. Электрокомпетентные клетки E. coli готовили предварительно, как указано в описании к электропоратору MicroPulser, и хранили при -70°С. После электропорации клетки из кюветы переносили в 1 мл среды SOC, выдерживали 1 час при +37°С, затем отбирали аликвоту и высевали на чашку с агаризованной средой ЛБ, содержащей антибиотик.

Индукция экспрессии генов в стандартных условиях, а также при пониженной температуре, в анаэробных условиях и с добавкой никеля. Клетки E. coli выращивали ночь в жидкой культуре на качалке при +37°С. Утром ночной суспензией (0.2 мл) инокулировали 5 мл свежей LB с соответствующим антибиотиком. Далее растили: стандартно — при +37°С, а также при t = +23°C или с добавкой никель (1 мкл 20 мМ NiCl2 на 1 мл суспензии клеток) — до наступления ранней логарифмической фазы (плотность при Аб00 = 0.6). Вариант анаэробного выращивания переносили в пробирку с крышкой, заполняя ее до верха. Затем в опытные варианты добавляли индуктор IPTG в конечной концентрации 1 мМ и продолжали выращивание: t = +37°C — 2.5 ч, = +23°C — 5 ч, анаэробно

— 4 ч и с добавкой Ni — 3 ч. К каждому варианту был контроль без индукции. По окончании выращивания осаждали в эппендорфы по 1 мл суспензии клеток, супернатант удаляли, а осадки использовали для белкового SDS-электрофореза.

Электрофорез белков в ПААГ в денатурирующих условиях. Белки разделяли в вертикальных пластинах 10%-ного полиакриламидного геля в денатурирующих условиях (ДДС-Na) при комнатной температуре с силой тока 40 мА в течение 30-40 мин в камере фирмы BioRad (США). После завершения электрофореза белки окрашивали, выдерживая гель в течение 30 мин в растворе, содержащем 0.25% Кумасси R-250, 45% метанола и 10% ледяной уксусной кислоты. Затем раствор удаляли, а гель кипятили в дистиллированной воде 2-5 мин до проявления четких полос.

Электронная микроскопия. Образцы фиксировали в 1,5%-ом растворе глутарового альдегида на 0,05М какодилатном буфере (рН 7,2) и затем в 1%-м растворе OsO4 в том же буфере. После обезвоживания в серии спиртов материал заключали в эпоксидную смолу Epon 812. Ультратонкие

срезы монтировали на опорные сеточки, контрастировали в течение 30 мин в 3% растворе уранилацетата в 70% спирте и дополнительно контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу [11]. Ультратонкие срезы просматривали в электронном микроскопе JEM-100B (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении В0 кВ.

Выделение телец включения. Клетки E. coli, в которых была индуцирована экспрессия генов, осаждали в течение 1Б минут при Б000 об/мин на центрифуге К-23 (Janetzki, ГДР). Осадок суспендировали в 2 мл буфера для дезинтеграции (Б0 mM Tris-HCl pH=8,0, Б0 mM NaCl и 0,Б% Triton X-100), а затем разрушили ультразвуком на приборе УЗГ-1З-0,1/22 (ВНИИТВЧ, Санкт-Петербург, Россия) режим «2», охлаждая во льду между разрушениями в течение 2 мин. После разрушения гомогенат центрифугировали Б мин при 12000 об/мин на центрифуге с охлаждением Centrifuge 5417R (Eppendorf, Германия). Осадок дважды промывали в 2 мл того же буфера, получая в осадке тельца включения.

Определение металлов. Содержание Fe и Ni в тельцах включения HydS, HydL и HydSL определяли на атомно-эмиссионном спектрометре с индуктивно-связанной плазмой Optima 2100 DV (PerkinElmer, США).

Приготовление сред и буферов, а также стандартные процедуры рестрикции эндонуклеазами, лигирование ДНК, электрофорез в агарозном и полиакриламидном гелях выполняли, как описано в [12].

Результаты и обсуждение

Работы в области получения нативной Ni-Fe гидрогеназы, которые ведутся во многих научных лабораториях, пока позволили получить активный фермент только при гетерологичной экспрессии в близкородственных организмах [13, 14]. В наших экспериментах мы использовали две бактерии, не являющиеся близкими родственниками (рис. 1), но имеющие много общего в метаболизме водорода.

Клонирование и индукция экспрессии структурных генов hydS и hydL гидрогеназы HydSL. Мембрансвязанная Ni-Fe гидрогеназа HydSL из T. roseopersicina представляет собой димер, состоящий из малой (HydS, 39 кДа) и большой (HydL, б4 кДа) субъединиц, которые кодируются структурными генами hydS (1100 п.н.) и hydL (1700 п.н.). Гены были амплифицированы с помощью полимеразной цепной реакции и использованы для создания генетических конструкций.

Кроме структурных генов гидрогеназы, важную роль играют также аксессорные (вспомогательные) гены, кодирующие ответственные за созревание фермента белки. Все содержащие Ni-Fe гидрогеназу протеобактерии, в том числе Thiocapsa и E. coli, имеют сходный набор как минимум семи аксессорных hyp генов [1]. Но у T. roseopersicina они не расположены в отдельном опероне, а распределены по всему геному, что не позволяет клонировать полностью весь оперон, содержащий

Домен

Филум

Класс

Порядок

Род

Вид

Bacteria

Proteobacteria

Gammaproteobacteria

Enterobacteriales

I

Escherichia

I

Escherichia coli

Chroma tiales

I

Phiocapsa

I

Thiocapsa roseopersicina

Рис. 1. Филогенетическое положение Thiocapsa roseopersicina и Escherichia coli [15, 16]

структурные и аксессорные гены, как у ЯаЫопИа впЬгорНа Н16 [14]. Поскольку Е. соИ способна к синтезу не менее 4 собственных гидрогеназ, использующих универсальный набор аксессорных генов Лур-оперона [17, 18], мы предположили, что в определенных условиях экспрессия структурных генов hydSL гидрогеназы Т. говеорегвИсИпа в Е. соИ может привести к появлению функционально активных молекул фермента при участии аксессорных генов Е. соИ

Первые генетические конструкции, созданные нами, имели собранные в один искусственный оперон структурные гены ]т,ус13 и НуйЬ, которые находились под промотором фага Т7. При анализе продуктов экспрессии оказалось, что если два структурных гена присутствуют на одной плазмиде рЕТ22Ь, то продукт второго гена практически отсутствует. При этом происходила экспрессия только того гена, который стоял первым после промотора в конструкции для экспрессии (данные не приведены). Поэтому структурные гены были разнесены в две плазмиды: рЕТ22Ь и р15КБ(+), относящиеся к разным группам совместимости. Это позволило нам получить штаммы-продуценты отдельно малой (HydS), отдельно большой (HydL) и обеих вместе субъединиц №-Ре гидрогеназы HydSL. При индукции генов НуйБ и Нуё,Ь в трех вариантах продуцентов (HydS, HydL и HydS+HydL) происходило накопление продуктов их экспрессии (рис. 2).

При культивировании продуцента двух субъединиц на среде с концентрацией антибиотиков: ампициллин (Ат) — 50 мкг/мл и

хлорамфеникол (Ст) — 25 мкг/мл, мы наблюдали на электрофореграмме ПААГ хорошую продукцию малой субъединицы HydS и гораздо меньшую

— большой субъединицы HydL. Для получения примерно эквимолярного соотношения субъединиц была изменена концентрация антибиотиков в среде культивирования. Плазмида рЕТ22Ь (Ат), которая несет ген малой субъединицы HydS, — многокопийная, а р15^(+) (Ст) с геном ЪуАЬ — малокопийная. Мы понизили селективное давление на плазмиду рЕТ22Ь,

убрав из среды культивирования ампициллин и снизив концентрацию хлорамфеникола до 17 мкг/мл. Так был увеличен выход белкового продукта HydL, что и отражено на рис. 2, дорожка 6.

На электрофореграммах белковых экстрактов из клеток-продуцентов Е. соИ мы обнаружили, что малая и большая субъединицы гидрогеназы при их экспрессии как раздельно, так и совместно в одной клетке находились в нерастворимой мембранной фракции в виде телец включения (ТВ).

Рис. 2. Электрофореграмма белков, полученных при экспрессии в Е. свИ структурных генов малой HydS

Для повышения вероятности получения белковых субъединиц в растворимой фазе рекомбинантные клетки выращивают при пониженной температуре, в анаэробных условиях, а также добавляя в среду культивирования металлы для металлсодержащих белков [19, 20]. Проведя индукцию экспрессии структурных генов гидрогеназы в клетках Е. соИ при +23°С, добавив в среду при выращивании продуцентов ионы никеля в конечной концентрации 0.02 мМ, т.к. никель требуется для формирования активного центра, и вырастив штаммы-продуценты в анаэробных условиях, мы не обнаружили появления белковых субъединиц HydS, HydL и HydSL в растворимой фракции. Электрофореграммы белков из последних экспериментов не отличались от изображенных на рис. 3 и поэтому не приведены.

Для подтверждения этого предположения мы провели электронномикроскопическое исследование продуцентов Е. соИ, синтезирующих малую, большую и обе вместе субъединицы гидрогеназы.

Электронно-микроскопические исследования штаммов Е. соїі — продуцентов субъединиц гидрогеназы ИуёБЬ. Мы провели электронно-микроскопическое исследование трех продуцентов Е. соїі, синтезирующих отдельно малую, большую, а также обе субъединицы гидрогеназы вместе. На электронных микрофотографиях видно, что контрольные клетки, в которых не было индукции синтеза субъединиц, имеют сходную морфологию и ультраструктурную организацию (рис. 3).

Рис. 3. Ультратонкий срез клеток Б. свН BL21 (БЕЗ); контрольных вариантов без индукции (а, в, д) и продуцентов (б, г, е) малой HydS (а, б), большой HydL (в, г) и двух субъединиц (д, е) термостабильной гидрогеназы HydSL из Т. гввеврегвгсгпа. Обозначения; Н — нуклеоид, Ц — цитоплазма, ТВ — тельца включения. Длина масштабной линейки — 0,5

мкм

Во всех контрольных вариантах (рис. 3а, в, д) нуклеоид распределен диффузно по центральной части цитоплазмы клеток и выявляется в виде просветленных зон с характерным гранулярно-сетчатым строением. Клетки, в которых индуцировали продукцию HydS, HydL и HydSL, заметно

отличаются друг от друга. Нуклеоид (Н) в клетках продуцентов HydS и HydL (рис. 3б, г) распределен дискретно в виде зон небольшой протяженности и отличается высокой степенью компактизации нитей ДНК, что обычно наблюдается в клетках микроорганизмов при стрессовых условиях [21, 22]. В цитоплазме клеток продуцента HydS (рис. 3б) видны обширные включения (до 0,8 мкм) овоидной формы, которые имеют низкую электронную плотность и явное сродство к мембране, что можно объяснить следующим образом. Нативная гидрогеназа в клетках T. roseopersicina является мембрансвязанной и, как полагают, ассоциируется с мембраной посредством N-концевой последовательности HydS. На N-конце малой субъединицы находится сигнальный пептид, содержащий специфичный RRGFLK мотив, узнаваемый белками двойного аргининового транслокационного пути (ТАТ). При помощи данного пути транслокации созревший фермент доставляется и крепится к внешней стороне цитоплазматической мембраны [23, 24]. Продуцент HydL (рис. 3г) имеет гомогенные включения со значительно более высокой электронной плотностью по сравнению с ТВ, присутствующими в продуценте HydS. Эти образования представлены скоплениями множественных мелких (0,1 мкм и менее) глобул неправильной формы, тесно примыкающих друг к другу и занимающих большую часть цитоплазмы клеток. В клетках третьего штамма, продуцирующего обе структурные субъединицы гидрогеназы HydSL (рис. 3е), нуклеоид менее компактизован по сравнению с первыми двумя вариантами. Он имеет много коротких толстых тяжей ДНК и занимает более обширную область цитоплазмы. Синтезирующиеся субъединицы гидрогеназы также выпадают в ТВ: хорошо видны овоидные ТВ HydS, а темные скопления возле них

— HydL. В продуценте обеих субъединиц ТВ HydL расположены вблизи ТВ HydS в отличие от продуцента одной большой субъединицы, где ТВ распределены по всей цитоплазме.

Наличие Ni в тельцах включения гидрогеназы HydSL как показатель возможного частичного формирования активного центра при гетерологичной экспрессии в E. coli. Образование ТВ при экспрессии многих чужеродных генов в гетерологичной системе E. coli происходит в результате неправильного свертывания и агрегации продуктов экспрессии [25, 26]. Однако ТВ могут содержать достаточно протяженные структуры, напоминающие природные альфа-спирали и бета-складки. Показано, что состав телец включения негомогенен, и, наряду с неправильно свернутыми доменами, могут находиться правильно свернутые последовательности или даже полноценно свернутые белки. Процент правильно свернутых белков в ТВ варьируется и зависит от специфики белка и условий формирования ТВ. Иногда достаточно простые белковые молекулы сохраняют активность даже в ТВ [27]. Поскольку многие вспомогательные гены T. roseopersicina имеют соответствующие гомологи у E. coli, существует вероятность того, что экспрессия структурных генов малой и большой субъединиц в клетке E. coli может привести к

появлению в ТВ полипептидных структур, подобных природным, а также к включению в активный центр никеля и (или) железа и (или) формированию электронпроводящей цепочки, напоминающей природную, и состоящей из железо-серных кластеров.

У Ni-Fe гидрогеназы HydSL белковая оболочка окружает металлсодержащий активный центр, обеспечивая особые условия для работы атомов Ni и Fe. Фермент состоит из малой электронпереносящей субъединицы HydS, содержащей железо-серные (Fe-S) кластеры, и большой — каталитической

— HydL, которая содержит Ni-Fe активный центр. В большой субъединице Ni координирован четырьмя цистеиновыми лигандами, два из которых присоединяют атом железа [28]. Атом железа также координирован

диатомными небелковыми лигандами — двумя СО и одним CN, что стабилизирует его в низкопотенциальном состоянии. Железосерные

кластеры малой субъединицы формируют электронпроводящий канал внутри белковой молекулы, осуществляя перенос электронов от активного центра к поверхности молекулы. Хотя пространственная структура гидрогеназы HydSL из T. roseopersicina не изучена, известно [29], что

малая субъединица фермента включает от 10 до 12 атомов железа,

составляющих несколько железо-серных кластеров. Большая субъединица в активном центре содержит атом железа и атом никеля. Используя метод атомно-эмиссионной спектрометрии, мы определили содержание железа и никеля в тельцах включения, выделенных из продуцентов малой и большой субъединиц, продуцента обеих субъединиц Ni-Fe гидрогеназы HydSL, а также из контрольного штамма, продуцирующего белок PsbO, который не содержит железа и никеля, но образует ТВ. Результаты измерений показали хорошее совпадение расчетных и фактических данных (молярное соотношение металл/белок) только по никелю у продуцента обеих субъединиц (1.0 и 1.2 mol/mol, соответственно). Присутствие никеля в тельцах включения HydSL позволяет предположить, что для сборки активного центра необходимо участие обеих субъединиц, и возможно, только в этом случае происходит включение металлов в структуры, подобные природному активному центру. Наши предположения подтверждают исследования, проведенные на HoxBC Ni-Fe гидрогеназе из Ralstonia eutropha, где экспрессия только большой субъединицы приводит лишь к частичной сборке активного центра [З0].

Заключение

Нам удалось, клонируя (порознь и совместно) структурные гены Ni-Fe гидрогеназы HydSL из Thiocapsa roseopersicina, подобрав оптимальные концентрации антибиотика для выравнивания продукции малой (HydS) и большой (HydL) субъединиц и используя такие методы в исследовании гидрогеназы как электронная микроскопия штаммов-продуцентов и определение металлов в тельцах включения, получить в Escherichia coli

гетерологичную экспрессию структурных генов гидрогеназы HydSL из Thiocapsa roseopersicina и показать возможность включения никеля в активный центр фермента даже в ТВ, но лишь при совместной продукции обеих субъединиц. В литературе отсутствуют данные о посубъединичном клонировании структурных генов Ni-Fe гидрогеназы HydSL из Thiocapsa roseopersicina,, их экспрессии в гетерологичной системе E. coli и определении металлов в ТВ, поэтому наши результаты могут служить отправными для дальнейших более детальных исследований.

Список литературы

1. Vignais P.M., Billoud B. Classification, and biological function of hydrogenases: an overview // Chem. Rev. 2007. V.107. P.4206-4272.

2. Morozov S.V., Voronin O.G., Karyakina E.E. Tolerance to oxygen of hydrogen enzyme electrodes // Electrochem. Comm. 2006. V.8. P.851-854.

3. Karyakin A.A., Morozov S.V., Voronin O.G. The limiting performance characteristics in ioelectrocatalysis of hydrogen enzymes // Angew. Chem. 2007. V.119. P.7382-7384.

4. Цыганков А.А., Гоготов И.Н. Непрерывное культивирование фототрофных бактерий // Прикл. Биохим. Микробиол. 1979. Т.15. С.665-670.

5. Umeda F, Min H., Urushihara M. Conjugal transfer of hydrogen-oxidizing ability of Alcaligenes hydrogenophilus to Pseudomonas oxalaticus // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1986. V.137. P.108-113.

6. Mura G.M., Pedroni P., Pratesi C. The [Ni-Fe] hydrogenase from the thermophilic bacterium Acetomicrobium flavidum // Microbiology. 1996. V.142. P.829-836.

7. Asada Y, Koike Y, Schnackenberg J. Heterologous expression of clostridial hydro-genase in the Cyanobacterium synechococcus PCC7942 // Biochim Biophys Acta. 2000. V.1490. №3. Р.269-278.

8. Rousset M, Magro V., Forget N. Heterologous expression of the Desulfovibrio gigas [NiFe] hydrogenase in Desulfovibrio fructosovorans MR400 // J. Bacteriol. 1998. V.180. P.4982-4986.

9. Laurinavichene T.V., Rakhely G, Kovacs K.L. The effect of sulfur compounds on H2 evolution/consumption reactions, mediated by various hydrogenases, in the purple sulfur bacterium, Thiocapsa roseopersicina // Arch. Microbiol. 2007. V.188, №4. Р.403-410.

10. Laurinavichene T.V., Tsygankov A.A. H2 consumption by Escherichia coli coupled via hydrogenase 1 or hydrogenase 2 to different terminal electron acceptors // FEMS microbiology letters. 2001. V.202, №1. Р.121-124.

11. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy // J. Cell. Biol. 1963. V.17. P.208-213.

12. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 479 с.

13. Rousset M, Magro V., Forget N. Heterologous expression of the Desulfovibrio gigas [NiFe] hydrogenase in Desulfovibrio fructosovorans MR400 // J. Bacteriol. 1998. V.180. P.4982-4986.

14. Lenz O., Gleiche A., Strack A. Requirements for Heterologous Production of a Complex Metalloenzyme: the Membrane-Bound [NiFe] Hydrogenase // J. Bacteriol. 2005. V.187, №18. P.6590-6595.

15. Определитель бактерий Берджи. Под ред. Хоулта Дж., Крига Н., Снита П. и др. в 2-х томах. М.: Мир, 1997. Т.1. 432 с.

16. Нетрусов А.И., Котова И.Б. Микробиология. М.: Академия, 2007. 352 с.

17. Bock A., King P.W., Blokesch M. Maturation of hydrogenases jj Advances in Microbial Physiology. 2006. V.51. P.1-71.

18. Maroti G, Fodor B.D., Rakhely G. Accessory proteins functioning selectively and pleiotropically in the biosynthesis of [NiFe] hydrogenases in Thiocapsa roseopersicina jj Eur. J. Biochem. 2003. V.270. P.2218-2227.

19. Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Т.1. Генная и белковая инженерия. М.: Наука, 2004. 526 с.

20. Lee S.Y., Lee H.J., Park J.-M. Bacterial hydrogen production in recombinant Escherichia coli harboring a HupSL hydrogenase isolated from Rhodobacter sphaeroides under anaerobic dark culture jj Intern. J. Hydrogen Energy. 2010. V.35. P.1112-1116.

21. Сузина Н.Е., Ставская С.С., Фихте Б.А. Изменения в ультраструктурной организации клеток Pseudomonas aeruginosa под действием додецилсульфата натрия jj Микробиология. 1988. Т.57. С.255-257.

22. Suzina N.E., Moulyukin A.L., Dmitriev V.V. The structural bases of long-term anabiosis in non-spore-forming bacteria jj Advances in Space Research. 2006. V.38. Р.1209-1219.

23. Vignais P.M., Billoud B., Meyer J. Classification and phylogeny of hydrogenases jj FEMS Microbiol. Rev. 2001. V.25. P.455-501.

24. Wu L.F., Chanal A., Rodrigue A. Membrane targeting and translocation of bacterial hydrogenases jj Arch. Microbiol. 2000. V.173. P.319-324.

25. Kopito R.R. Aggresomes, inclusion bodies and protein aggregation jj Trends Cell Biol. 2000. V.10. P.524-530.

26. Villaverde A., Carrio M.M. Protein aggregation in recombinant bacteria: biological role of inclusion bodies jj Biotechnol. Lett. 2003. V.25. P.1385-1395.

27. Garcia-Fruitos E., Martmez-Alonso M., Gonzalez-Montalbdn N. Divergent genetic control of protein solubility and conformational quality in Escherichia coli jj J. Mol. Biol. 2007. V.374. P.195-205.

28. Kovdcs K.L., Kovacs A.T., Maroti G. Hydrogenases of Thiocapsa roseopersicina jj Biochem. Soc. Trans. 2005. V.33. P.61-63.

29. Szilagyi A., Kovdcs K.L., Rdkhely G. Homology modeling reveals the structural background of the striking difference in thermal stability between two related NiFe hydrogenases jj J. Molecular Modeling. 2002. V.8. P.58-64.

30. Winter G, Buhrke T., Lenz O. A model system for [NiFe] hydrogenase maturation studies: Purification of an active site-containing hydrogenase large subunit without small subunit jj FEBS Lett. 2005. V.579. P.4292-4296.

Ширшикова Галина Николаевна (gsh99@rambler.ru), к.б.н., старший научный сотрудник, Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино.

Хуснутдинова Анна Наилевна (hvosta@gmail.com), младший научный сотрудник, Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино.

Цыганков Анатолий Анатольевич (ttt-00@mail.ru), д.б.н., заведующий лабораторией, Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино.

Бутанаев Александр Михайлович (boutanaev@mail.ru), к.б.н., и.о. зав. сектором, Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино.

Thermostable [NiFe]-containing HydSL hydrogenase from Thiocapsa roseopersicina: to study the enzyme production in Escherichia coli heterologous system

G.N. Shirshikova, A.N. Khusnutdinova, A.A. Tsygankov, A.M. Butanaev

Abstract. Thermostable Ni-Fe containing HydSL hydrogenase from Thiocapsa roseopersicina is a dimer, consisting of the small (HydS, 39 kDa) and the large (HydL, 64 kDa) subunits, which are encoded by hydS (1100 b.p.) and hydL (1700 b.p.) structural genes, respectively. This work describes an expression of the hydrogenase structural genes in Escherichia coli both separately and jointly. In all cases, hydrogenase subunits precipitated into inclusion bodies (IB) that have different electronic densities, as shown by electron microscopy of producers. We showed that the presence of Ni in IBs is only possible at simultaneous expression of both subunits. The obtained results allowed us to suggest that the expression of at least two structural genes in the same cell is required for the successful maturation of the active enzyme center in Escherichia coli heterologous system.

Keywords: Ni-Fe hydrogenase, heterologous expression, purple sulfur bacteria, Escherichia coli.

Shirshikova Galina (gsh99@rambler.ru), candidate of biological sciences, senior researcher, Institute of Basic Biological Problems of RAS, Pushchino.

Khusnutdinova Anna (hvosta@gmail.com), junior researcher, Institute of Basic Biological Problems of RAS, Pushchino.

Tsygankov Anatoly (ttt-00@mail.ru), doctor of biological sciences, head of laboratory, Institute of Basic Biological Problems of RAS, Pushchino.

Boutanaev Alexander (boutanaev@mail.ru), candidate of biological sciences, section head, Institute of Basic Biological Problems of RAS, Pushchino.

Поступила 07.06.2011