АНТИМИКРОБНЫЕ И АГРОХИМИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ
ANTIMICROBIAL AND AGROCHEMICAL COMPOSITIONS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ПАТЕНТНЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно патентной заявке Соединенных Штатов №62/172501, поданной 8 июня 2015 года под названием «Антимикробные и агрохимические композиции» доктора Тони Джон Холла, полное раскрытие которой включено в настоящую заявку посредством ссылки как допустимо национальными или региональными законами.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
3
3-
Настоящее изобретение в целом относится к антимикробным композициям, которые также ингибируют формирование склероциев грибами и, более конкретно, к водным композициям, содержащим ионы меди с ионами цинка или без них, основную соль и фосфористую кислоту в качестве действующих веществ. Композиции дополнительно являются спорицидными и уничтожающими склероции в сочетании с солями азотистой кислоты, такими как нитрит натрия. Композиции являются ингибиторами формирования склероциев грибами благодаря содержанию в них фосфористой кислоты с фосфитной или фосфонатной (РО) группой.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Глобализация сельского хозяйства привела к выращиванию сельскохозяйственных культур в районах, где они могут подвергаться воздействию новых патогенов или новых штаммов существующих патогенов, таких как грибы и бактерии, к которым они чувствительны. По оценкам, 70% всех основных заболеваний сельскохозяйственных культур вызваны фитопатогенными грибами, и в настоящее время признано, что болезни растений угрожают поставкам продовольствия во всем мире.
Развитие коммерческих фунгицидных средств в сельском хозяйстве началось с Бордоской смеси на основе меди в 19 веке. В 20 веке было создано много новых классов синтетических органических фунгицидов с определенными способами действия, но развитие устойчивости грибов ко многим из этих веществ представляет собой возрастающую проблему. Кроме того, многие из этих фунгицидов оказывают токсичное воздействие на окружающую среду или на другие виды, и они могут сохраняться в сельскохозяйственных культурах и проникать в пищевую цепь. Следовательно, существует растущая потребность в новых фунгицидах, которые более безопасны для окружающей среды и для потребителя.
Многие грибы распространяются в виде спор, и фитопатогенные грибы, споры которых распространяются при помощи ветра, являются ответственными за некоторые из наиболее наносящих ущерб заболеваний сельскохозяйственных культур, например, кофейная ржавчина (Hemileia vastairix), пирикуляриоз риса (Magnaporthe oryzae) и черная сигатока (Mycosphaerella fijiensis) на банановых растениях. Споры грибов (и бактерий) обладают высокой устойчивостью к холоду, теплу, ультрафиолетовому свету и большинству фунгицидов. Фактически, большинство спор настолько устойчивы, что химические реагенты, такие как хлорноватистая кислота (отбеливатель) и перекись водорода, которые являются спорицидными при высоких концентрациях (например, 5-10% и >10% соответственно), также наносят большой ущерб растениям, животным и даже антропогенной среде при таких спорицидных концентрациях.
В дополнение к спорам в качестве средства распространения и выживания многие грибы могут образовывать структуры выживания, называемые склероциями, которые представляют собой важный источник фитопатогенных заболеваний, связанных с видами Rhizoctonia, Verticiliium, Sclerotinia и Macrophormina. Склероции представляют собой бесполые, многоклеточные, покоящиеся и высоко химически стойкие структуры. Склероции обычно меланизированы, что придает им устойчивость к воздействию ультрафиолетового излучения и, поэтому, их часто определяют как черные пятна или тела в почве или на растениях, фруктах и овощах. Если только склероции присутствуют в почве, они могут выживать в течение многих лет, заражая недавно посаженные сельскохозяйственные культуры при контакте с корнями растений, что приводит к прорастанию склероциев и росту гиф грибов, которые внедряются в растение через корни. Следовательно, существует потребность в экологически безопасном и экономически приемлемом продукте, который может сдерживать формирование склероциев в сельском хозяйстве.
На сегодняшний день фунгициды на основе меди все еще широко применяют в сельском хозяйстве, включая органическое земледелие, поскольку они являются широко доступными, недорогими и относительно безопасными в применении. Кроме того, устойчивость грибов к продуктам на основе меди является низкой, поскольку медь оказывает сложное токсичное воздействие, включая повреждение клеточной мембраны и инактивацию железосерных кластеров ферментов дегидратаз. Однако в настоящее время доступными продуктами на основе меди являются суспензии соединений меди, такие как гидроксид меди и оксихлорид меди, которые применяют в качестве профилактики за счет удерживания на листьях растений, чтобы предотвратить развитие грибов. Указанные фунгициды на основе меди требуют частого применения и содержат относительно большие количества меди - спреи для листвы Бордоской смеси и продукты оксихлорида меди, как правило, содержат 2,5 грамм/литр элементарной меди - потому что они обеспечивают малое количество ионной меди, которая является фунгицидной/бактерицидной формой меди
Фосфористая кислота в виде солей, таких как фосфит калия, классифицируется Агентством по охране окружающей среды США как биопестицид. Фосфиты имеют как прямые, так и непрямые способы действия против оомицетов и грибов. Прямое воздействие включает ингибирование роста мицелия и подавление образования спор, и прорастания. Косвенное воздействие фосфитов включает активацию ответных защитных реакций растений за счет механизмов, которые еще не полностью объяснены. Фосфиты имеют низкую токсичность и, как и фунгициды на основе меди, имеют преимущество в том, что они недороги, относительно безопасны в применении и действуют через несколько мест приложения действия, избегая развития устойчивости.
Всемирные правила охраны здоровья и окружающей среды становятся все более жесткими в отношении остатков пестицидов. Таким образом, фермеры во всем мире сталкиваются с дилеммой необходимости борьбы с деструктивными патогенами, что требует большего применения фунгицидов/бактерицидов, в то время как органы государственного регулирования требуют меньшего химического остатка на сельскохозяйственных культурах и в почве. Фитопатогенные грибы, распространяющиеся спорами, представляют собой особенно трудную мишень, и в настоящее время нет коммерчески доступных испытанных спорицидных продуктов. Очевидно, что если бы споры могли быть уничтожены/инактивированы на зараженных растениях до высвобождения в воздух, это предотвратило бы их распространение и привело бы к эффективной борьбе с болезнями.
Поэтому существует потребность в эффективных и безопасных спорицидных сельскохозяйственных композициях, которые не являются фитотоксичными. Известно, что реакция между кислотами и нитритом натрия приводит к образованию высокореакционноспособных оксидов азота, которые обладают антимикробной и спорицидной активностью. Эксперименты, проведенные изобретателем с применением композиций, содержащих ионы меди и/или цинка и фосфористую кислоту в сочетании с нитритом натрия, неожиданно выявили синергическую фунгицидную, спорицидную и уничтожающую склероции активность по сравнению с ионами меди и/или цинка, взятыми отдельно, или с фосфористой кислотой, взятой отдельно в сочетании с нитритом натрия. Важно отметить, что указанные композиции в сочетании с нитритом натрия не были фитотоксичными при спорицидных/уничтожающих склероции концентрациях. Кроме того, указанные композиции в сочетании с нитритом натрия преимущественно имеют как кратковременную (приблизительно до 6 часов) спорицидную/уничтожающую склероции активность, так и длительное (от дней до недель) фунгицидное и индуцирующее защиту растений воздействие. Кроме того, указанные композиции могут быть получены и применены безопасным, экономически приемлемым и экологически безопасным образом. В настоящем изобретении описаны такие композиции.
Rhizoctonia solani (R. solani) представляет собой широко распространенный, передающийся через почву растительный патогенный гриб, который вызывает гниль корней и "черную ножку" у многих видов растений, и ризоктониоз на клубнях картофеля. R. solani формирует богатые меланином склероции, которые долгое время могут выживать в почве и действовать в качестве источника первичного заражения в недавно посаженных сельскохозяйственных культурах. При определении воздействия композиций, содержащих медь, цинк и фосфористую кислоту, в анализах ингибирования роста грибов с R. solani, которые обычно исследовали после культивирования от 1 до 2 дней, изобретатель отметил, что в чашках, оставленных более чем на неделю, формирование/или развитие склероциев ингибировалось при концентрациях некоторых композиций, которые лишь частично ингибировали рост R. solani после культивирования от 1 до 2 дней. Такие частично ингибированные культуры обычно сливаются после культивирования от 2 до 4 дней, и в этот момент, когда питательные вещества становятся ограничивающими, гриб начинает формировать склероции, которые сначала появляются как белые пятна или тела, и затем становятся меланизированными, зрелыми черными структурами, которые остаются жизнеспособными в течение многих месяцев, даже в культуральных планшетах, которые высохли.
3
3-
Такое неожиданное наблюдение было дополнительно исследовано, и представленные здесь результаты показывают, что присутствие фосфористой кислоты в композициях обуславливало ингибирование формирования склероциев. Дальнейшие эксперименты неожиданно показали, что широко используемые агрохимикаты, такие как фосфористая кислота, ее соли, например, фосфит калия и гербицидный глифосат (2-[(фосфонометил)амино] уксусная кислота), все из которых содержат фосфитную или фосфонатную (РО) группу, представляют собой сильные ингибиторы формирования склероциев.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Настоящее изобретение будет описано со ссылкой на следующие чертежи, на которых одинаковые цифры относятся к одинаковым элементам и на которых:
3
3-
На фиг. 1 показаны структуры выбранных химических реагентов: фосфитов и фосфонатов (РО).
2
Фиг. 2 представляет собой график, показывающий уничтожающее склероции воздействие композиции Cu-Zn№31, взятой отдельно, и в сочетании с нитритом натрия (NaNO). CuZn№31 применяли при 1% исходном растворе с от 1 до 100 миллимолярном раствором нитрита натрия. Незрелые (белые) и зрелые (Mack) склероции R. solani обрабатывали в течение 10 минут, и последующий рост грибов на PDA оценивали после 2 дней культивирования. NG = отсутствие роста.
Фиг. 3 представляет собой график, показывающий воздействие фосфористой кислоты (ФК), глифосата (ГФ) и аминометилфосфоновой кислоты (АМФК) на формирование черных склероциев Rhizoctonia solani.
Такие результаты представляют собой среднее значение ± S.D. трех отдельных экспериментов (ФК и ГФ) и двух отдельных экспериментов (АМФК).
Настоящее изобретение будет описано в контексте предпочтительного варианта реализации, однако следует понимать, что намерения ограничить изобретение описанным вариантом реализации не существует. Напротив, существует намерение охватить все альтернативы, модификации и эквиваленты, которые могут быть включены в сущность и объем притязаний согласно настоящему изобретению, как определено в указанном описании и прилагаемых чертежах.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
3
3-
В соответствии с настоящим изобретением предложена антимикробная, спорицидная и уничтожающая склероции композиция, содержащая водный раствор, содержащий ионы меди и/или цинка, при необходимости основную соль и фосфористую кислоту в сочетании с солью азотистой кислоты; причем в предпочтительном варианте реализации изобретения соль азотистой кислоты представляет собой нитрит натрия. Настоящее изобретение включает в некоторых вариантах реализации изобретения химические реагенты, содержащие фосфитную или фосфонатную группу (РО), которая может ингибировать формирование склероциев при концентрациях, которые легко достижимы для сельскохозяйственных применений. Композиции по настоящему изобретению ингибируют формирование склероциев грибами и поэтому могут быть применены в полевой практике для предотвращения возобновления и развития патогенных грибов.
Приведенный выше параграф был предоставлен в качестве введения и не предназначен для ограничения объема притязаний согласно настоящему изобретению, как описано в настоящем описании и прилагаемых чертежах, и пунктах формулы изобретения.
ЛУЧШИЙ ВАРИАНТ РЕАЛИЗАЦИИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение и различные варианты реализации изобретения, описанные и представленные в настоящей заявке, включают композиции, препараты, способы и применения композиций, обладающих ранее неизвестной синергической антимикробной активностью, содержащих ионы меди и/или ионы цинка с фосфористой кислотой в сочетании с солями азотистой кислоты, такой как нитрит натрия. Настоящее изобретение будет описано в качестве примера, а не в качестве ограничения. Модификации, улучшения и дополнения к изобретению, описанные в настоящей заявке, могут быть определены после прочтения настоящего описания и просмотра прилагаемых чертежей; причем такие модификации, улучшения и дополнения считают включенными в сущность и широкий объем притязаний согласно настоящему изобретению, и в его различные варианты реализации, описанные или предусмотренные в настоящей заявке.
Термин антимикробный, используемый в настоящей заявке, включает в себя антибактериальный, фунгицидный, антиоомицетный и антипатогенный, спорицидный и уничтожающий склероции.
Антимикробная, спорицидная и уничтожающая склероции активность описанных композиций является неожиданно более сильной, чем активность ионов меди с ионами цинка или без них, взятых отдельно, или чем активность фосфористой кислоты, взятой отдельно в сочетании с нитритом натрия. Важно отметить, что указанные композиции также не являются фитотоксичными при эффективных антимикробных, спорицидных и уничтожающих склероции концентрациях. Поскольку композиции содержат ионы меди и/или цинка и фосфористую кислоту, они также преимущественно остаются эффективными в качестве антимикробных и стимулирующих защиту растений химических реагентов после того, как спорицидная/уничтожающая склероции реакция с нитритом натрия закончена (через приблизительно 6 часов).
Один вариант реализации настоящего изобретения относится к неожиданно синергическому ингибированию роста растительных патогенных грибов и спорицидной, и уничтожающей склероции активности композиций, содержащих ионы меди с ионами цинка или без них и фосфористую кислоту в сочетании с солью азотистой кислоты по сравнению с фунгицидной и спорицидной активностью растворов ионов меди с ионами цинка или без них, взятых отдельно, или со взятой отдельно фосфористой кислотой в сочетании с солью азотистой кислоты, предпочтительно нитритом натрия.
3
3-
В другом варианте реализации настоящего изобретения показано, что упомянутые выше композиции, содержащие соли меди с солями цинка или без них и фосфористую кислоты, представляют собой неожиданно сильные ингибиторы формирования склероциев грибами. В действительности, дополнительно и неожиданно показано, что различные химические реагенты, содержащие фосфитную или фосфонатную группу (РО), могут ингибировать формирование склероциев при концентрациях, которые легко достижимы для сельскохозяйственных применений. Химические реагенты, в частности, включают фунгициды: фосфит калия, фосфористую кислоту и Aliette, и гербицид глифосат, все из которых являются широко используемыми агрохимикатами.
Композиции, содержащие ионы меди с ионами цинка или без них и фосфористую кислоту, удобно получают в соответствии с общим способом, описанным ниже. Указанные раскрытые варианты реализации настоящего изобретения служат примером некоторых предпочтительных композиций; однако такие примеры не предназначены для ограничения объема притязаний согласно настоящему изобретению. Как будет очевидно специалистам в данной области техники, многочисленные изменения и модификации могут быть сделаны без отступления от сущности и обширного объема притязаний согласно настоящему изобретению.
Антимикробные композиции по настоящему изобретению содержат водные растворы ионов меди, которые получают из оксихлорида меди, двумя формами которого являются: (1) Технический продукт оксихлорида меди (CuOCl-TP, CuOCl-ТП) содержит приблизительно 57% элементарной меди и 1% суспензии в воде, которая имеет рН 6,2 (2) Смачивающийся порошок оксихлорида меди (CuOCI-WP, CuOCl-СП) содержит приблизительно 50% элементарной меди и 1% суспензии в воде, которая имеет рН 8,3. CuOCl-СП (CuOCl-WP) содержит приблизительно 10% бентонита и поверхностно-активного вещества для увеличения «смачиваемости» нерастворимого в воде оксихлорида меди, так что он остается в суспензии дольше, чем CuOCl-ТП (CuOCl-ТР). Ионы меди в композициях могут также быть получены из пентагидрата сульфата меди либо смешанным с CuOCl во время получения композиции, либо полученным отдельно в виде композиции и позже смешанным вместе с композицией на основе CuOCl.
Ионы меди в композициях могут быть с ионами цинка или без них и с фосфористой кислотой с добавлением при необходимости основания для регулирования кислотности композиций. В этом отношении применение гидроксида натрия или гидроксида калия иногда приводило к нестабильности (мутности, кристаллизации) композиций, полученных из CuOCl-ТП (CuOCl-ТР) или сульфата меди, но не композиций, полученных из CuOCl-СП (CuOCl-WP). Неожиданно было установлено, что гидроксид аммония можно применять со всеми тремя соединениями меди для регулирования кислотности композиций без проблем с мутностью или кристаллизацией, и поэтому он представляет собой предпочтительный гидроксид для применения в композициях. Некоторые наблюдения в ряду таких композиций на основе меди и композиций на основе меди и цинка приведены в Таблице 1. Результаты показывают, например, что сульфат меди является более предпочтительным, чем хлорид меди для получения стабильных композиций. Результаты также неожиданно показывают, что CuOCl-СП (CuOCl-WP) является является более предпочтительным, чем медный CuOCl-ТП (CuOCl-ТР) для получения композиций, содержащих только медь, из-за нестабильности (кристаллизации) последнего. Однако было неожиданно обнаружено, что присутствие ионов цинка предотвращает нестабильность (кристаллизацию) в композициях, полученных из CuOCl-ТП (CuOCl-ТР).
3
3
4
Таблица 1. Наблюдения за стабильностью различных медных и медно-цинковых композиций с фосфористой кислотой (НРО) с добавлением гидроксида аммония (NHOH) или без него, полученных и хранимых при комнатной температуре (22°С). В Таблице грамм или граммы сокращают буквой г, миллилитр или миллилитры сокращают буквами мл, и децилитр сокращают буквами дл.
Антимикробные композиции по настоящему изобретению и, в частности, спорицидные и уничтожающие склероции композиции по настоящему изобретению содержат (i) водные растворы ионов меди с ионами цинка или без них и фосфористую кислоту с добавлением при необходимости основания, такого как гидроксид натрия, гидроксид калия и предпочтительно гидроксид аммония, и (ii) в сочетании с солью азотистой кислоты, предпочтительно с нитритом натрия.
4
В одном из вариантов реализации настоящего изобретения антимикробная композиция содержит раствор, содержащий оксихлорид меди или пентагидрат сульфата меди с солью цинка (предпочтительно сульфат цинка) или без нее, растворенный в воде с последующим добавлением к раствору фосфористой кислоты, с добавлением при необходимости основания (предпочтительно гидроксида аммония) для регулирования рН образующихся таким образом кислотных медных или медно-цинковых композиций. Такие растворы обозначают, например, Cu-31 или CuZn-43-N и Cu-32-N (N = с добавлением NHOH, см. Таблицу 2).
В одном варианте реализации настоящего изобретения антимикробная композиция содержит суспензию, содержащую оксихлорид меди-СП (WP), смешанный в воде с добавлением гидроксида аммония перед добавлением фосфористой кислоты, которая способствует осаждению бентонита при низких температурах (от 20°С до 50°С (см. ПРИМЕР ниже для получения дополнительной информации)).
Композиции на основе оксихлорида меди удобно получают с применением CuOCl-СП (CuOCl-WP), который содержит оксихлорид меди, бентонит и поверхностно-активное вещество (поверхностно-активные вещества). Было обнаружено, что добавление фосфористой кислоты (i) к солюбилизированному CuOCl-СП (CuOCl-WP) с образованием стабильного раствора и (ii) к суспензии CuOCl-СП (CuOCl-WP) с последующей инкубацией при температуре от 70°С до 90°С в течение от 15 до 30 минут способствовало быстрому осаждению бентонитного компонента, оставляя чистый темно-зеленый раствор с добавлением гидроксида аммония или без него.
В следующем примере описан общий протокол для получения 2Х исходной кислотно-солюбилизированной композиции оксихлорида меди (Cu-32-2Х), которая может быть применена, в свою очередь, для получения композиций, таких как Cu-32 и Cu-Zn-32. Если не указано иное, все химические реагенты были приобретены у Sigma-Aldrich Company Ltd., The old Brickyard, New Road, Гиллингем, Дорсет SP8 4XT, Великобритания. Если не указано иное, Hortiphyte был приобретен у Hortifeeds, Park Farm, Park Farm Road, Кетлторп, Линкольн LN1 2LD, Великобритания. Aliette (Фосэтил-алюминий) и глифосат (2-[(фосфонометил)амино] уксусная кислота) были приобретены у Bayer CropScience, 230 Cambridge Science Park Milton Road, Кембридж CB4 0WB, Великобритания. Аминометилфосфоновая кислота была приобретена у Fisher Scientific UK, Bishop Meadows Road, LE115RG Лафборо, Лестершир, Великобритания. Калия фосфит был приобретен у Wuhan Rison Trading Ltd., 498 Jianshe Ave, Ухань, Китай. Оксихлорида меди 50-Смачивающийся Порошок (CuOCl-СП (CuOCl-WP)) и оксихлорида меди-Технический Продукт (CuOCl-ТП (CuOCl-ТР)) были приобретены у Manica S.P.A.,4 Via , 38068 Роверето, Италия.
10,0 грамм CuOCl-СП (CuOCl-WP) (содержащего 50% элементарной меди) добавляют к 70 миллилитров дистиллированной воды в стеклянном стакане; магнитную мешалку и якорь магнитной мешалки применяют для смешивания и образования зеленовато-голубой суспензии. Если бентонит выпадает в осадок при низкой температуре (от 20°С до 50°С), то добавление 8,0 миллилитров гидроксида аммония (56,6% раствор) в этот момент к суспензии CuOCl-СП (CuOCl-WP) неожиданно ускорит осаждение бентонита. 35,0 грамм фосфористой кислоты добавляют постепенно, что приводит к солюбилизации CuOCl-СП (CuOCl-WP) с образованием темно-зеленого раствора, который перемешивают еще в течение 5 минут, и затем раствор доводят до объема 90 миллилитров дистиллированной водой. Затем раствор нагревают, например, до 37°С в течение 24 часов или в течение того времени, пока выпадает в осадок бентонит состава CuOCl-СП (CuOCl-WP). Бентонит удаляют центрифугированием с последующим декантированием растворимой композиции. Если бентонит необходимо осаждать при высокой температуре (например, от 60°С до 90°С), в этот момент рН кислого раствора может быть изменен добавлением гидроксида аммония (от 1 до 80 миллилитров/литр), и тогда общий объем может быть окончательно доведен до 100 миллилитров дистиллированной водой.
Такой концентрат Cu-32-2Х может быть смешан с другими составами для удобного получения ряда других продуктов. Таким образом, для получения Cu-32, 2Х концентрат смешивают 1:1 с дистиллированной водой. Для получения CuZn-32 равные объемы Cu-32 и Zn-32 (см. Таблицу 2) объединяли при перемешивании.
Следует отметить, что CuOCl-ТП (CuOCl-ТР) не может быть применен для получения стабильных композиций, содержащих только медь, путем добавления фосфористой кислоты и при необходимости нейтрализацией аммониевым основанием, поскольку такие композиции, полученные из CuOCl-ТП (CuOCl-ТР) (с добавлением или без добавления гидроксида аммония), кристаллизуются в течение нескольких дней (см. Таблицу 1). Однако композиции на основе меди и цинка, полученные путем суспендирования CuOCl-ТП (CuOCl-ТР) и соли цинка (предпочтительно сульфата цинка) в воде с последующим добавлением фосфористой кислоты (с добавлением или без добавления гидроксида аммония), представляют собой неожиданно стабильные композиции, которые преимущественно не проявляют признаков кристаллизации даже после нескольких недель и не требуют времени и/или нагревания для осаждения бентонита, как в случае композиций на основе CuOCl-СП (CuOCl-WP), описанных выше (см. Таблицу 1).
Композиции, содержащие сульфат меди, предпочтительно получают с добавлением гидроксида аммония.
Кроме того, композиции на основе меди и композиции на основе меди и цинка, полученные из оксихлорида меди (-СП(WP) или -ТП(-ТР)), могут быть объединены с композициями на основе меди и с композициями на основе меди и цинка, полученными из сульфата меди в соотношениях в диапазоне от 1:1 до 1:100 без какого-либо заметного изменения антимикробной активности, как проиллюстрировано с помощью различных композиций, полученных объединением Cu-31 и Cu-32 в различных отношениях, как показано в Таблице 2.
Для композиций на основе меди и композиций на основе меди и цинка предпочтительно, чтобы общая концентрация элементарной меди и цинка в композициях имела порядок от 1 до 50 грамм/литр.
В композициях на основе меди и цинка отношение концентраций элементарной меди к элементарному цинку может иметь порядок от 100:1 до 1:100, предпочтительно от 10:1 до 1:10 и еще более предпочтительно 1:1.
Если концентрация раствора основания (предпочтительно гидроксида аммония) составляет 14,5 моль/литр, то ее добавляют к композициям в порядке от 1 до 80 миллилитров/литр.
Выбранная кислота для композиций представляет собой фосфористую кислоту. Предпочтительно, чтобы концентрация фосфористой кислоты в композициях имела порядок от 40 до 800 грамм/литр.
Дистиллированная или деионизованная вода представляет собой предпочтительную фазу растворителя для композиций.
Примеры других композиций на основе оксихлорида меди в соответствии с описанными выше протоколами см. в Таблице 2. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения медные и медно-цинковые композиции полученные из оксихлорида меди и сульфата меди могут быть объединены в отношениях от 1:100 до 100:1. Поскольку оксихлорид меди обычно значительно дороже, чем сульфат меди, и протокол для получения соответствующей композиции является более сложным, такие объединения могут быть полезными не только для их практических применений, но и для их затратной эффективности.
Примеры других солюбилизированных фосфористой кислотой композиций Cu№, Cu-Zn№ и Zn№, в соответствии с указанным протоколом см. Таблицу 2. В Таблице грамм или граммы сокращают буквой г, миллилитр или миллилитры сокращают буквами мл.
50)
Таблица 2. Примеры композиций и их компонентов, и их 50% ингибирующая концентрация (IC на рост Rhizoctonia solani при культивировании.
50
4
50
&
S
+
* В композиции, не содержащие основную соль аммония (например, Cu-32), или гидроксид аммония, их добавляли при необходимости после фосфористой кислоты для повышения рН композиции (например, Cu-32-N). **Композиции, обозначенные с помощью №, получены в виде нерастворимых металл-аммонийных комплексов, которые солюбилизированы с помощью фосфористой кислотой. ***Концентрация композиций, необходимых для ингибирования роста R. solani на 50% (IC) на картофельном агаре с декстрозой после 24 часов культивирования при 22°С. Смесь 1:1 содержит в общей сложности 2,5 г/дл элементарной меди, 1,25 г/дл из композиций CuSO⋅5H2O и CuOCl-СП (CuOCl-WP) и имеет ожидаемый IC против R. solani на основе результатов Cu-31 и Cu-32, как и 10:1 и 100:1 Cu-31:Cu-32 смеси. B большинстве экспериментов CuZn№12 использовали в качестве внутреннего стандарта. Эквивалент концентрации в Cu№28, Zn№4 и CuZn№12.
Предполагают, что для практического применения в сельском хозяйстве в виде спрея для листвы, например, исходный раствор композиции должен быть добавлен в воду со смешиванием или перемешиванием до разбавления, например, в 100-1000 раз. Соответствующее количество исходного раствора нитрита натрия, например, 690 грамм/литр(10 М), затем добавляли бы с непрерывным перемешиванием или смешиванием до разбавления, например, в 200 раз, с получением конечной концентрации 50 мМ в объединенном продукте. Соответствующий вспомогательное средство, адгезивный агент, адъювант, носитель, поверхностно-активное вещество или наполнитель может затем быть добавлен при соответствующей концентрации к эффективному количеству объединенного продукта.
Для того чтобы настоящее изобретение могло быть проиллюстрировано, более легко оценено и легко приведено в исполнение специалистами в данной области техники, варианты реализации изобретения теперь будут представлены с помощью только неограничивающих примеров и описаны со ссылкой на прилагаемые чертежи.
ПРИМЕР 1. Анализ ингибирования роста грибов с помощью композиций.
50
Анализ ингибирования роста грибов. Штамм Rhizoctonia solani (R. solani) выделяли из склероциев на кожуре картофеля и поддерживали при культивировании на картофельном агаре с декстрозой (PDA) при комнатной температуре (22°С). Чтобы определить воздействие композиций на рост грибов, 10 микролитров исследуемых композиций, разведенных в стерильной дистиллированной воде, помещали в лунки 12-луночного планшета для тканевых культур и 1 миллилитр PDA добавляли пипеткой в каждую лунку. Планшет встряхивали для равномерного распределения исследуемой композиции по всему агару (только дистиллированную воду использовали в качестве контроля), и затем агару давали застыть. Вставки агара, содержащие гифы грибов (3×3 миллиметра) из сформированной грибной культуры, вырезали с помощью скальпеля и вставляли в отверстия, вырезанные в центре агара в каждой лунке 12-луночного планшета, которые затем культивировали при комнатной температуре. Чтобы определить воздействие композиций на радиальный рост грибов, диаметр гиф грибов измеряли дважды под углом 90° с использованием линейки, и был рассчитан средний диаметр в миллиметрах. Концентрации композиций, необходимые для ингибирования радиального роста R. solani на 50% (IC), определяли графически.
Результаты:
50
50
50
50
50
Как показано в Таблице 2, различные Cu, CuZn, Cu№ и Cu-Zn№композиции, все имели значения IC в диапазоне от 0,14% до 0,28% исходного раствора (приблизительно от 700 до 350 раз разбавления исходных растворов соответственно), показывая, что способ, с помощью которого получены композиции, и источник меди не оказывали существенного влияния на способность композиций ингибировать рост растительного патогенного гриба R. solani при культивировании. Кроме того, медные (и CuZn) композиции полученные из оксихлорида меди и сульфата меди могут быть смешаны вместе в широком диапазоне концентраций и по-прежнему поддерживать полную фунгицидную активность. Следует отметить, что композиции были более активны, чем компоненты, из которых они были получены. CuOCl-СП (CuOCl-WP), CuOCl-ТП (CuOCl-TP), сульфат меди, сульфат цинка и фосфористая кислота имели значения IC 2,0%, 1,8%, 0,39%, 0,33% и 0,64% соответственно против R. solani, поэтому это факт, что все композиции имели значительно более низкие значения IC (приблизительно 0,15%), чем можно было бы ожидать при объединении медной композиции и фосфористой кислоты; это указывает на синергизм компонентов при их объединении в описанных композициях. Такой синергизм особенно заметен с композициями, полученными из оксихлорида меди, поскольку CuOCl-СП (CuOCl-WP) и -ТП(-ТР) имели особенно низкие значения IC50 2,0 и 1,8% соответственно, и фосфористая кислота имела IC 0,64%, и все же Cu-32 и Cu-32-T имели значения IC 0,19% и 0,17% соответственно. В совокупности указанные результаты, показывающие синергическую активность составных частей, когда они объединены в композициях, показывали неожиданно усиленную антимикробную активность таких композиций, полученных с применением протоколов, описанных выше в разделе «Лучший способ реализации изобретения».
Также следует отметить, что существуют особые преимущества медно-цинковых (CuZn) композиций: (i) Коммерчески доступные фунгициды на основе меди (например, Бордоская смесь, оксихлорид меди, гидроксид меди и оксид меди) обычно содержат около 2,5 грамм/литр элементарной меди при разбавлении, например, для опрыскивания листвы. Соль меди в таких продуктах в значительной степени нерастворима и находится в виде суспензии, поэтому продукты прилипают к листьям растений; когда идет дождь, и продукт на листьях становится влажным, выделяется небольшое количество активной ионной меди, и это имеет антимикробную активность. Негативным побочным эффектом дождя является то, что он смывает медную суспензию с листьев на землю, поэтому требуется частое применение указанных продуктов.
Большинство композиций, содержащих только медь, описанных в Таблице 2, содержали 25 грамм/литр элементарной меди (4,4, 5 и 10 грамм/децилитр CuOCl-ТП (CuOCl-ТР), CuOCl-СП (CuOCl-WP) и сульфата меди соответственно) в 100Х исходных растворах, поэтому 1:100 разведенный спрей для листвы, содержащий композицию, содержал бы 0,25 грамм/литр элементарной меди, что в 10 раз меньше, чем в типичных коммерческих продуктах. Присутствие ионной меди (и цинка) в композициях (в дополнение к синергическому антимикробному воздействию с фосфористой кислотой) отчасти объясняет, почему они были настолько более активны (от 10 до 15 раз) при ингибировании роста R. solani по сравнению с продуктами в виде суспензий CuOCl-СП (CuOCl-WP) и -ТП(ТР) даже в PDA питательных средах в присутствии воды (см. Таблицу 2). Кроме того, суспензии существующих продуктов на основе меди имеют тенденцию к осаждению и могут блокировать оборудование для опрыскивания, тогда как описанные композиции представляют собой ионные растворы, которые больше подходят для применения с оборудованием для опрыскивания.
Сельскохозяйственных культуры, такие как виноградные лозы и картофель, обычно опрыскивают от 10 до 15 раз за сезон, тогда как Си или CuZn композиция, описанная в настоящей заявке, применяемая для обработки опрыскиванием, содержала бы примерно столько же меди в обработке за весь сезон, как одно применение коммерчески доступного продукта на основе меди. Композиции CuZn обычно получают только с 50% количества меди, содержащейся в сопоставимых композициях, содержащих только медь, (например, см. Cu№28 и CuZn№12 в Таблице 2), и все же они являются сравнимыми по активности в качестве фунгицидных композиций; это означает, что концентрация меди понижена до 1/20, чем в коммерческих продуктах на основе меди. Хорошо известно, что большое количество коммерческих фунгицидов на основе меди (нерастворимая, не ионная медь) необходимо часто применять, чтобы быть эффективными, и это приводит к тому, что дождь или полив смывает в почву большое количество потенциально токсичной меди.
Культивируемые сельскохозяйственные земли (где фунгициды на основе меди не применяют) часто испытывают недостаток в питательных микроэлементах, таких как медь и особенно цинк (Sillinpaa. М. (1982) Micronutrients and the nutrient status of soils: A global study. FAO Soils Bulletin, No. 48. FAO, Рим, Италия), и поэтому композиции CuZn, описанные в настоящей заявке, могли бы обеспечить эффективное питательное количество таких микроэлементов при применении к растениям.
ПРИМЕР 2. Фунгицидные анализы с композициями и нитритом натрия.
Фунгицидный анализ. Вставки агара, содержащие гифы грибов (3×3 миллиметра), вырезали из культивированного Magnaporthe oryzae (М oryzae) на картофельном агаре с декстрозой (FDA) и помещали в лунки 96-луночного планшета, содержащие 75 микролитров различных концентраций нитрита натрия или стерильной дистиллированной воды, ДВ (DW). Для начала реакции в лунки добавляли 75 микролитров композиций (разведенных в ДВ (DW)). Планшет осторожно встряхивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут, и тогда жидкость удаляли, и 150 микролитров среды СМ-1 добавляли в течение 5 минут, чтобы остановить реакцию. Среду СМ-1 удаляли и вставки агара вставляли в отверстия, вырезанные в PDA в чашках Петри диаметром 9 сантиметров (от 6 до 7 вставок агара на чашку Петри), которые затем культивировали при комнатной температуре в течение 4 дней, и тогда измеряли рост грибов (дважды под углом 90° с использованием линейки), и был рассчитан средний диаметр в миллиметрах. Если рост грибов не мог быть обнаружен глазом, то культуры были изучены с помощью фазовой микроскопии (40Х), чтобы подтвердить отсутствие роста (NG), о чем свидетельствовал визуальный осмотр.
Результаты:
2
3
3
2
Результаты в Таблице 3 показывают, что в отсутствие нитрита натрия (NaNO), CuZn№12 и ее компоненты, сульфат меди-сульфат цинка (CuZn) и фосфористая кислота (НРО) при максимальной испытанной концентрации (1% исходного раствора) не были фунгицидными для М. oryzae. Однако в присутствии 10 миллимолярного нитрита натрия все три композиции показали зависящее от концентрации увеличение фунгицидной активности при всего лишь 30 минут воздействия. Ясно, что CuZn был немного менее фунгицидной, чем фосфористая кислота, и что оба они были значительно менее активны, чем CuZn№12. Результат с фосфористой кислотой был неожиданным, поскольку образование оксидов азота из NaNO зависит от рН, а фосфористая кислота имеет более низкий рН, чем CuZn№12 (Таблица 3). Однако такой неожиданный результат был объяснен, когда был рассчитан синергизм между CuZn и фосфористой кислотой.
Чтобы определить, была ли объединенная активность CuZn и фосфористой кислоты в форме CuZn№12 в присутствии или в отсутствие нитрита натрия синергической, использовали следующую формулу:
Sf=М/[А+0.01×В(100-А)]
Где: Sf - коэффициент синергизма, А - процент влияния CuZn; В - процент влияния фосфористой кислоты; М - процент влияния смеси, CuZn№12. Если Sf>1, то существовал синергизм. (Ссылка: Samoucha Y and Cohen Y (1984). Synergy between Metalaxyl and Mancozeb in controlling downy mildew in cucumbers. Phytopathology 74:1434-1437).
Когда были рассчитаны значения коэффициента синергизма (Таблица 3), наблюдали отчетливый синергизм при концентрациях композиции 0,3% (Sf=1,37) и 1% (Sf=1,57) в сочетании с 10 мМ нитритом натрия.
Поэтому такие результаты показывают, что объединение CuZn и фосфористой кислоты в виде композиции CuZn№12 действует синергически в сочетании с нитритом натрия с получением неожиданно большего, чем ожидали, антимикробного/фунгицидного воздействия.
3
3
Таблица 3. Фунгицидные эффекты композиции CuZn№12 и ее компонентов: медно-цинкового(CuZn) компонента и фосфористой кислоты (НРО) при эквивалентных концентрациях против М. oryzae в присутствии и в отсутствие 10 миллимолярного нитрита натрия. NG указывает на отсутствие роста. Контрольный рост грибов с дистиллированной водой (ДВ) составлял 20 мм. Процент контрольных значений в круглых скобках использовали для расчета коэффициента синергизма (Sf; значение >1,0 означает синергизм), как описано в тексте.
ПРИМЕР 3. Спорицидные анализы с композициями и нитритом натрия.
6
6
2
Спорицидные анализы: (1) Споры Bolrylis cinerea (В. cinerea, также известный как серая гниль) и Fusarium oxysporum f. sp.cubense (F. oxysporum, вызывает "панамскую болезнь" банана) были выделены из зрелых культур, выращенных на картофельном агаре с декстрозой (PDA) в чашках Петри 9 сантиметров, путем осторожной промывки стерильной дистиллированной водой, ДВ (DW). Содержащий споры раствор пропускали через 40-микронный фильтр для удаления дебриса, и фильтрат доводили до 2×10 (В. cinerea) или 5×10 (F. oxysporum) спор/миллилитр в ДВ (DW). Десять микролитров образцов нитрита натрия (растворенного в стерильной ДВ (DW)) или ДВ (DW) добавляли в лунки 48-луночного планшета для тканевых культур, содержащих 10 микролитров растворов спор. Для начала реакции были добавлены композиции (время = 0), и реагенты тщательно перемешивали, осторожно встряхивая планшет. После 30 минут инкубации при комнатной температуре реакцию останавливали добавлением 1 миллилитра PDA при 60°С. Затем планшеты культивировали при комнатной температуре в течение от 3 до 4 дней, и тогда рост грибов оценивали визуально. Рост грибов оценивали следующим образом: рост грибов, эквивалентный контрольным культурам (с ДВ (DW)), оценивали как 2. Если рост грибов был явно меньше, чем контроль, он был оценен как 1. Отсутствие роста грибов было оценено как 0. При немедленном добавлении PDA после композиции (в течение 2 секунд) рост грибов не наблюдали независимо от концентраций нитрита натрия (до 100 миллимоль/литр) или композиции (до 1% разбавления исходного раствора), что показывает, что PDA эффективно ингибирует реакцию даже при максимальных концентрациях NaNO (100 мМ) и CuZn№12 (1%), примененных в экспериментах.
4
(2) Для определения спорицидного воздействия композиций, взятых отдельно, споры В. cinerea (1×10) подвергали воздействию различных концентраций композиций или ДВ(DW) при 22°С в микроцентрифужных пробирках. Через 1 час воздействия споры дважды промывали при помощи 1 мл, ДB(DW), затем суспендировали в PDA и инкубировали в течение 6 дней, и тогда оценивали рост грибов, как описано в Таблице 4.
Результаты:
Результаты в Таблице 4 показывают, что композиции CuZn№12, Cu№28, Zn№4 были немного спорицидными при 10% исходном растворе, но не при более низких концентрациях, тогда как композиция Cu-32 проявила небольшую спорицидную активность при 10% и 5% исходном растворе, но не при более низких концентрациях.
Большая спорицидная активность Cu№32 может быть объяснена более высокой концентрацией фосфористой кислоты (17,5 грамм/децилитр) по сравнению с другими 3 композициями (4 грамм/децилитр, см. Таблицу 2).
Таблица 4. Спорицидное воздействие композиций против спор В. cinerea после 1 часа инкубации при 22°С в отсутствие нитрита натрия. Споры, подвергнутые воздействию дистиллированной воды в течение 1 часа, были использованы в качестве контрольных*. Рост грибов оценивали через 6 дней после того, как обработанные споры суспендировали в картофельном агаре с декстрозой.
2. Спорицидное воздействие 4 композиций, испытанных в эксперименте, показанное в Таблице 4, было относительно слабым, учитывая высокие примененные концентрации (композиции предназначены для применения при <1% исходного раствора). Однако, поскольку композиции являются кислотными из-за присутствия фосфористой кислоты, ожидали, что они могли бы проявить повышенную спорицидную активность в сочетании с нитритом натрия, поскольку последующая реакция образовывала бы азотистую кислоту, которая высвобождает высокореакционноспособные оксиды азота, которые, как известно, являются спорицидными.
2
2
Результаты в Таблице 5, показывают, что нитрит натрия, взятый отдельно (NaNO+ДВ (DW)), и все композиции, взятые отдельно (NaNO=0), не имели спорицидной активности против спор В. cinerea при любой испытанной концентрации (все получили 2 = контрольный рост). Сульфат меди (Cu), сульфат цинка (Zn), сульфат меди с сульфатом цинка (CuZn),взятые отдельно, показали спорицидную активность в присутствии 100 мМ нитрита натрия, тогда как фосфористая кислота была активна при 1% (что эквивалентно ее концентрации в 3 композициях при 1%), но показала небольшую активность при более низких концентрациях. Все 3 композиции показали зависящее от концентрации увеличение спорицидной активности с нитритом натрия. Наиболее активной композицией была Cu№28, затем CuZn№12 и Zn№4. Спорицидная активность CuZn№12 была больше, чем ожидали из ее компонентов Cu-Zn и фосфористой кислоты (как рассмотрено в фунгицидном эксперименте - см. Таблицу 3), несмотря на то, что последняя имеет более низкий рН, чем CuZn№12, как в присутствии, так и в отсутствие 100 миллимолярного нитрита натрия. Поскольку Cu№28 была значительно более спорицидной, чем CuZn№12 и Zn№4, несмотря на то, что значения рН указанных 3 композиций были одинаковыми, оказалось, что присутствие меди в композициях Cu№28 и CuZn№12 (последняя была менее активна, чем Cu№28, по-видимому, из-за присутствия только половины концентрации ионов меди - см. Таблицу 2) вместе с фосфористой кислотой приводило к неожиданному усилению спорицидной активности в присутствии нитрита натрия, который не имеет отношения к простым аспектам с рН.
Эксперименты зависимости от времени показали (i), что эффективная спорицидная активность была получена в течение 1 минуты после смешивания 100 миллимолярного нитрита натрия и CuZn№12 (1% исходного раствора) и (ii) что спорицидная активность была исчерпана через приблизительно 6 часов после смешивания реагентов (данные не показаны).
Эксперименты с различными композициями и нитратом натрия или мочевиной не показали признаков спорицидной активности против спор В. cinerea (данные не показаны), поэтому предпочтительным соединением для получения спорицидной активности в сочетании с композициями является нитрит натрия.
3
3
2
Таблица 5. Спорицидная активность трех композиций и их компонентов: сульфата меди (Сu), сульфата цинка (Zn), сульфата меди и сульфата цинка (CuZn) и фосфористой кислоты (НРО) с нитритом натрия (NaNO) и без него против спор В. cinerea. Значения рН выбранных 1% растворов с 100 миллимолярным нитритом натрия и без него также показаны.
Результаты в Таблице 6, показывают, что сульфат меди и оксихлорид меди-СП-WP) не имели спорицидной активности в сочетании с нитритом натрия при концентрациях до 30 миллимоль/литр (только 100 миллимолярный нитрит натрия был спорицидным против спор F. oxysporum, данные не показаны). Испытанные 2 композиции, Cu-31 и Cu-32 содержат сульфат меди и CuOCl-СП (CuOCl-WP) соответственно в качестве их медной соли с 17,5 грамм/децилитр фосфористой кислоты (Таблица 2), и обе композиции показали синергическую спорицидную активность в сочетании с нитритом натрия по сравнению с их компонентами, взятыми отдельно в сочетании с нитритом натрия при эквивалентных концентрациях.
Такие результаты подтверждают и расширяют результаты, приведенные в Таблице 5, показывая, что две различные медные соли даже в простых композициях с фосфористой кислотой показывают синергически усиленную спорицидную активность по сравнению с их компонентами, взятыми отдельно в сочетании нитритом натрия.
3
3
2
Таблица 6. Спорицидная активность двух композиций и их компонентов против спор F. oxysporum: сульфата меди, (CM (CS), в Cu-31), оксихлорида меди-СП (-WP) (CuOCl, в Cu-32) и фосфористой кислоты (НРО) с нитритом натрия (NaNO) и без него против спор В. cinerea.
В совокупности такие результаты имеют важные следствия для потенциального применения указанных спорицидных композиций в полевой практике. Хорошо известно, что подкисленный нитрит натрия образует азотистую кислоту, которая, в свою очередь, разлагается на спорицидные оксиды азота. Однако представленные в настоящей заявке результаты показывают, что композиции на основе меди (и композиции на основе меди и цинка), содержащие фосфористую кислоту, неожиданно имеют большую спорицидную активность, чем эквивалентные концентрации фосфористой кислоты, взятой отдельно в сочетании с нитритом натрия.
Кроме того, применение настоящих композиций с нитритом натрия, например, в качестве спрея для листвы, оказывало бы не только спорицидное действие, которое могло бы уничтожать споры перед их высвобождением в воздух и тем самым уменьшать распространение связанной грибной инфекции, но после того, как спорицидное воздействие было бы исчерпано (через приблизительно 6 часов), существовала бы непрекращающаяся, стойкая антимикробная и стимулирующая защиту растений активность, обеспечиваемая композицией на основе меди или меди и цинка, и фосфористой кислоты, остававшейся на обработанных растениях.
Когда смесью спрея для листвы, содержащей 1% композиции CuZn№12 и 50 миллимолярного нитрита натрия, опрыскивали два раза в день в течение 5 дней посаженные 10 дней назад саженцы риса, не было значительного влияния на рост саженцев, и не наблюдали хлороз по сравнению с контрольными саженцами риса, которых опрыскивали только водой. Интересно, что когда тот же спрей для листвы применяли к розовым кустам, у которых розовые бутоны были заражены тлей (зеленой и черной), насекомые были обнаружены мертвыми в течение 5 минут после опрыскивания; наблюдение за розовыми кустами, которые были обработаны опрыскиванием, в течение следующих нескольких дней показало, что ни растения, ни бутоны роз не были повреждены спреем.
В совокупности такие результаты показывают, что композиция в сочетании с нитритом натрия не была фитотоксичной для саженцев риса или розовых кустов, в то время как спрей был эффективным инсектицидом против тлей. Таким образом, различные варианты реализации настоящего изобретения включают композиции, описанные в настоящей заявке, применяемые в качестве инсектицида.
ПРИМЕР 4. Анализы уничтожающей склероции активности с композициями и нитритом натрия.
Анализы уничтожающей склероции активности Вставки агара, содержащие белые незрелые склероции (3×3 миллиметра), вырезали из культивированного в течение от 6 до 8 дней R. solani, в то время как зрелые меланизированные (черные) склероции (приблизительно 10×3 миллиметров) вырезали из культивированного в течение 13 дней R. Solani, и вставки разрезали на части 2×3 миллиметра с помощью скальпеля. Образцы склероциев затем помещали в лунки 96-луночного планшета, содержащие 75 микролитров нитрита натрия с различными концентрациями или стерильной дистиллированной воды, ДВ (DW) в качестве контроля. Для начала реакции в лунки добавляли 75 микролитров CuZn№31 (разведенной в ДВ (DW)). Планшет осторожно встряхивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут, и тогда жидкость осторожно удаляли, и 150 микролитров среды СМ-1 добавляли в течение 5 минут, чтобы остановить реакцию. Среду СМ-1 удаляли, и вставки агара осторожно вставляли в отверстия, вырезанные в PDA в чашках Петри 9 см (4 вставки на чашку Петри), которые затем культивировали при комнатной температуре до тех пор, пока рост грибов не был дважды измерен под углом 90° с использованием линейки, и был рассчитан средний диаметр в миллиметрах. Если рост грибов не мог быть обнаружен глазом, то культуры были изучены с помощью фазовой микроскопии (40Х), чтобы подтвердить отсутствие роста (NG), о чем свидетельствовал визуальный осмотр
Результаты:
Результаты на Фиг. 2 показывают, что сочетание CuZn№31(1%) с нитритом натрия (от 1 до 100 миллимоль/литр) обладало уничтожающей склероции активностью, которая была зависимой от концентрации, как против незрелых (белых), так и против зрелых (черных, пигментированных) склероциев R. solani при всего лишь 10 минутах воздействия. Белые склероции были более чувствительны к сочетанию реагентов, чем черные склероции. CuZn№31 (1%+0) и нитрит натрия (0+100), взятые отдельно, имели небольшое или вообще не имели значимого уничтожающего склероции воздействия, как на белые, так и на черные склероции, поскольку рост грибов был аналогичен наблюдаемому в контролях (0), что свидетельствует о том, что образование оксидов азота было необходимым для замеченной уничтожающей склероции активности.
Следует отметить, что встречающиеся в природе микросклероции Verticillium dahliae (V. dahliae) на картофельных полях в основном (~90%) имеют диаметр менее 125 микрометров (Smith VL и Rowe RC. Phytopathology 74: 553-556, 1984), и вероятно, что микросклероции будут более восприимчивыми к уничтожающему склероции воздействию Cu-Zn№31 в сочетании с нитритом натрия, чем применяемые в патентной заявке 2×3 миллиметровые части зрелых склероциев.
Результаты в Таблице 7 показывают уничтожающую склероции активность четырех аналогичных композиций (компоненты которых показаны в Таблице 7) против меланизированных (черных) склероциев R. solani в присутствии увеличивающихся концентраций нитрита натрия и в его отсутствие. Ни одна из композиций не имела уничтожающую склероции активность без нитрита натрия (0+1%), и в равной степени самая высокая испытанная концентрация нитрита натрия (30+0) не имела уничтожающую склероции активность. Однако все четыре композиции показали дозозависимое увеличение уничтожающей склероции активности с увеличением концентраций нитрита натрия, что указывает на то, что образование оксидов азота было необходимым для замеченной уничтожающей склероции активности. В целом, четыре композиции имели сходную уничтожающую склероции активность (измеренную за счет способности склероциев образовывать гифы при культивировании на PDA после обработки), причем две композиции, содержащие сульфат меди, были несколько более активными, чем те, которые содержали оксихлорид меди. Все четыре композиции имели полноценную уничтожающую склероции активность с 30 миллимолярным нитритом натрия, как было замечено с композицией CuZn№31 (Фиг. 2).
2
Таблица 7. Уничтожающая склероции активность четырех композиций с нитритом натрия и без него (NaN0) против черных (меланизированных) склероциев R. solani. Обработанные склероции культивировали на PDA в течение 2 дней, и тогда измеряли радиальный рост гиф (в миллиметрах). Компоненты композиций показаны в нижней части Таблицы.
**Оба соединения обеспечивают 2,5 г/дл элементарной меди при указанных концентрациях
ПРИМЕР 5. Ингибирование формирования склероциев грибами.
Анализ ингибирования роста грибов и ингибирования формирования склероциев: штамм Rhizoctonia solani (R. solani), примененный в указанных экспериментах, выделяли из склероциев на картофеле и его поддерживали при культивировании на картофельном агаре с декстрозой (PDA) при комнатной температуре (22°С) Чтобы определить воздействие композиций на рост грибов, 10 микролитров исследуемых композиций, разбавленных стерильной дистиллированной водой, помещали в лунки 12-луночного планшета для тканевых культур, и добавляли пипеткой в каждую лунку 1 миллилитр PDA. Планшет встряхивали для равномерного распределения исследуемой композиции по всему агару (только дистиллированную воду использовали в качестве контроля), и затем агару давали застыть. Вставки агара, содержащие гифы грибов (3×3 миллиметра) из сформированной грибной культуры, вырезали с помощью скальпеля и вставляли в отверстия, вырезанные в центре агара в каждой лунке 12-луночного планшета, который затем культивировали при комнатной температуре (22°С).Чтобы определить воздействие композиций на радиальный рост грибов, диаметр гиф грибов измеряли дважды под углом 90° с использованием линейки, и был рассчитан средний диаметр в миллиметрах. Если рост грибов не мог быть обнаружен глазом, то культуры были изучены с помощью фазовой микроскопии (40Х), чтобы подтвердить отсутствие роста (NG), о чем свидетельствовал визуальный осмотр
Чтобы определить воздействие соединений и композиций на формирование склероциев, культуры R. solani исследовали ежедневно, и радиальный рост грибов измеряли до тех пор, пока культуры не слились, после чего развитие белых (незрелых) склероциев и зрелых (черных пигментированных) склероциев фиксировали, и количество зрелых склероциев было подсчитано на 10 день культивирования.
Результаты:
Результаты в Таблице 8 показывают, что композиция Cu-32 (содержащая фосфористую кислоту) полностью ингибировала образование незрелых и зрелых склероциев в культурах R. solani. Хотя Cu-32 частично ингибировала радиальный рост R. solani на 1 день (и 2 день) культивирования, рост был сплошным к 3 дню культивирования, но формирование склероциев полностью отсутствовало при всех трех концентрациях. Композиция Cu-32-Р04 (содержащая фосфористую кислоту) также частично ингибировала рост R. solani., но однажды было достигнуто слияние белых склероциев и затем черных склероциев, образовавшихся при двух более низких испытанных концентрациях, как это было замечено в контрольных культурах (с дистиллированной водой). При максимальной испытанной концентрации Cu-32-Р04 была аналогична Cu-32 при ингибировании роста и предотвращении формирования белых и черных склероциев. Композиция Cu-36 (содержащая серную кислоту) была наименее сильным ингибитором роста R. solani, и формирование склероциев было очень схожим по зависимости от времени и количествам с контрольными культурами во всех трех испытанных концентрациях.
Такие результаты ясно показывают, что Cu-32 была наиболее сильным ингибитором формирования склероциев, причем Cu-32-PO4 имела то же воздействие при самой высокой испытанной концентрации, и Cu-36 имела небольшое воздействие на формирование склероциев. Поскольку три композиции были идентичными, кроме примененной кислоты и имели сходные значения рН (Таблица 8 подпись), результаты неожиданно показали, что присутствие фосфористой кислоты в композициях было необходимым для оптимального ингибирования формирования склероциев R. solani.
Таблица 8. Воздействие трех композиций, различающихся только в кислоте, которую они содержат, на радиальный рост и формирование склероциев Rhizoctonia solani.
рН композиции (разбавлена 1:1000 дистиллированной водой, эквивалентна 0,1% об./об. исходного раствора): Cu-32=2,69; Cu-32-P04=2,63; Cu-36=2,46.
* Композиции были идентичны, за исключением примененной кислоты - см. Таблицу 1; (%) = процент исходного раствора. **Белые/черные SCL = незрелые/зрелые (пигментированные) склероции.
Результаты в Таблице 9 показывают, что фосфористая кислота и ее соль щелочного металла, фосфит калия, оба полностью ингибировали образование зрелых (черных, пигментированных) склероциев R. solani при концентрациях 40 миллиграмм/литр и выше.
При указанных концентрациях оба продукта были лишь умеренными ингибиторами роста грибов, поэтому ингибирующее действие фосфита на формирование склероциев возникало, несмотря на рост грибов.
Коммерческие продукты фосфита калия обычно применяют при концентрациях приблизительно 4 грамм/литр в виде спрея для листвы для стимуляции защиты растений от воздействия патогенов; указанная концентрация в 100 раз превышает концентрацию, необходимую для полного предотвращения формирования склероциев (40 миллиграмм/литр) R. Solani при культивировании.
Таблице 9 Воздействие фосфористой кислоты и фосфита калия на радиальный рост и формирование склероциев R. solani.
* Белые/черные SCL = незрелые/зрелые (пигментированные) склероции.
Результаты в Таблице 10 показывают, что Hortiphyte и Aliette, коммерческие продукты, которые содержат фосфит калия и Фосэтил-алюминий (фосфонат), соответственно, имеют почти одинаковое воздействие на рост и образование склероциев R. solani, при доведении до эквивалентных концентраций фосфита в виде фосфористой кислоты.
3
3-
Hortiphyte продают в виде жидкого удобрения, которое служит источником азота и калия, а также фосфора в виде фосфита калия. Aliette продают как фунгицид, и он содержит РО группу в виде трис(О-этилфосфонат) алюминия.
3
3
3-
3-
Такие результаты показывают, что именно концентрация фосфитной/фосфонатной группы (РО), а не та форма, в которой она присутствует, важна для того, чтобы ингибировать формирование склероциев R. solani при культивировании. Таблица 10. Воздействие трех разных форм фосфита (РО) на радиальный рост и формирование склероциев Rhizoctonia solani при культивировании.
3
3-
*Все композиции были доведены до присутствия одинаковых количеств фосфитной/фосфонатной группы (РО). Hortiphyte содержит фосфит калия (25%). Aliette представляет собой трис(О-этилфосфонат) алюминия или Фосэтил-алюминий (80% масс). **Белые/черные SCL = незрелые/зрелые (пигментированные) склероции.
Результаты в Таблице 11, показывают, что фосфористая кислота была более сильным ингибитором роста грибов (на 1 день культивирования) и формирования склероциев (на 10 день культивирования), чем глифосат или аминометилфосфоновая кислота (АМФК), которая представляет собой продукт микробиологического разложения почвой глифосата. Из-за проблем с растворимостью АМФК можно было испытывать только при максимальной концентрации 1 грамм/литр, когда она была подобна по активности на рост R. solani и формирование склероциев на глифосат, но была значительно менее активна, чем фосфористая кислота.
На фиг. 3 показано количество черных склероциев, образованных с фосфористой кислотой, глифосатом и АМФК от 2 до 3 повторных экспериментов. Очевидно, что фосфористая кислота была приблизительно в 20 раз активнее глифосата и приблизительно в 30 раз активнее АМФК при ингибировании формирования черных склероциев R. solani.
Фосфористая кислота и соли фосфита обычно применяют при концентрации 4 г/л в виде спрея для листвы, но, как показано в Таблицах 9 и 11, оба продукта полностью ингибировали образование склероциев при 1/100 указанной концентрации (40 миллиграмм/литр). Продукт глифосата, испытанный в указанных экспериментах, рекомендуют для применения в виде спрея для листвы при 8 грамм/литр (содержащего 6,8 грамм/литр действующего вещества), но формирование склероциев происходило (хотя и при более низком уровне по сравнению с контрольными) при всего лишь от 1/3 до 1/10 указанной концентрации.
Однако, хотя глифосат (гербицид) и фосфит (фунгицид/стимулятор защиты растений) имеют совершенно разное применение в сельском хозяйстве, в практическом плане потенциально важно, что любой из указанных продуктов, применяемый отдельно, может значительно ингибировать образование склероциев в концентрациях от 10 до 100 раз ниже соответственно, чем те концентрации, при которых их применяют в виде спрея для листвы для основного сельскохозяйственного применения продукта.
В других экспериментах, в которых были объединены фосфористая кислота и глифосат, не было синергического или ингибирующего действия какого-либо соединения на другое (данные не показаны); воздействие объединенных продуктов было аддитивным и преобладало над действием фосфористой кислотой, что можно было бы ожидать по результатам, показанным в Таблице 11 и на фиг. 3. Так как было обнаружено, что глифосат и фосфористая кислота и ее калиевая соль были совместимы в растворе, объединение, например, глифосата и фосфита калия также могло быть применено в качестве продукта -эффективного гербицида/ингибитора формирования склероциев в полевой практике, особенно потому, что оба продукта являются высокоэффективными при нанесении на растения в виде спрея для листвы.
Таблица 11. Воздействие фосфористой кислоты, глифосата и аминометилфосфоновой кислоты (АМФК) на радиальный рост и формирование склероциев Rhizoctonia solani при культивировании.
$
* Глифосат рекомендуют для применения в виде спрея для листвы при 8 г/л, что означает 6,8 г/л действующего вещества. АМФК представляет собой аминометилфосфоновую кислоту. **Белые/черные SCL = незрелые/зрелые (пигментированные) склероции.
50
Хорошо известно, что подкисление нитрита натрия приводит к образованию реакционноспособных, биоцидных оксидов азота, но представленные в настоящей заявке результаты ясно показывают, что новые ионные композиции на основе меди и на основе меди и цинка с фосфористой кислотой неожиданно имеют синергически большую антимикробную (Таблица 3), спорицидную (Таблица 6) и уничтожающую склероции (Таблица 7) активность, чем эквивалентные концентрации фосфористой кислоты, взятой отдельно в сочетании с нитритом натрия, даже при том, что растворы солей меди или растворы солей меди и цинка, взятые отдельно в сочетании с нитритом натрия являются лишь слабо антимикробными (Таблица 3) или спорицидными (Таблица 5). Различные описанные ионные композиции на основе меди и ионные композиции на основе меди и цинка являются эффективными антимикробными продуктами, что показано с помощью их способности ингибировать рост гриба R. solani со значениями IC в диапазоне от 0,14 до 0,28% от исходных растворов (Таблица 2), что указывает на то, что способ, с помощью которого получены композиции, не оказывает существенного влияния на их сильную антимикробную активность композиций. Кроме того, медные (и медно-цинковые) композиции на основе оксихлорида меди и сульфата меди могут быть получены или смешаны вместе в широком диапазоне концентраций при сохранении полной антимикробной активности. Неожиданно композиции, содержащие ионы меди или ионы меди и цинка вместе с фосфористой кислотой, являются в большей степени антимикробными, чем компоненты, из которых они получены (см. Таблицу 2). В совокупности, такие результаты показывают синергическую активность композиций по сравнению с их компонентами и указывают на неожиданно усиленную антимикробную активность композиций, полученных как описано в разделе «Лучший способ реализации изобретения».
Важно отметить, что при сочетании композиций с нитритом натрия, их антимикробная и спорицидная активности усиливаются синергически (Таблица 3 и Таблица 5 соответственно). Такое объединение, применяемое, например, в виде спрея для листвы, оказывало бы не только спорицидное действие, которое могло бы уничтожить споры грибов до их высвобождения в воздух и тем самым уменьшать распространение связанной грибной инфекции, но после того, как спорицидное воздействие было бы исчерпано (через приблизительно 6 часов), существовала бы непрекращающаяся, стойкая антимикробная и стимулирующая защиту растений активность, обеспечиваемая медными или медно-цинковыми компонентами композиции и компонентом фосфористой кислотой композиции, остававшейся на обработанных растениях. Также должно быть возможным продлить спорицидное воздействие объединения, включив в нее форму нитрита натрия с замедленным высвобождением. Это было бы полезно, если время, необходимое для получения и применения спорицидного объединения, составляет более 6 часов.
Кроме того, объединение композиций с нитритом натрия (ни одна из которых, взятая отдельно, не имела уничтожающей склероции активности) также неожиданно проявляет уничтожающую склероции активность (Таблица 7). В действительности, полноценная уничтожающая склероции активность была достигнута с помощью объединения композиций, разбавленных 1:100 (1%) их исходных растворов, и 30 миллимолярного нитрита натрия при всего лишь 10 минутах воздействия. Такие результаты свидетельствуют о том, что такие объединения могут быть эффективно применены в полевой практике не только для предотвращения формирования склероциев, в первую очередь путем ингибирования роста грибов, но также путем уничтожения склероциев в сухом растительном материале до обработки, что в противном случае могло бы привести к убыточному, долгосрочному заражению почвы склероциями.
Формирующие склероции грибы, такие как R. solani, V. Dahliae и М. Phaseolina, представляют собой серьезную проблему в почве полей, используемых для производства салатных, картофеля, шпината и клубники. Уничтожение склероциев в почве путем фумигации теперь запрещено или ее постепенно прекращают, но в настоящее время нет доступных эффективных альтернативных стратегий. Объединение композиций с нитритом натрия уничтожает склероции и сильно ингибирует рост грибов, поэтому склероции не могли бы формироваться в первую очередь; кроме того, было показано, что фосфористая кислота в композициях ингибирует формирование склероциев при концентрациях (≥40 миллиграмм/литр), которые значительно ниже, чем тех присутствующих в фунгицидных концентрациях композиций (при 1% исходного раствора, концентрация фосфористой кислоты обычно находится в диапазоне от 400 до 1750 миллиграмм/литр - см. Таблицу 2).
3
3-
В дополнение к фосфористой кислоте было также показано, что фосфит калия, глифосат и Aliette, которые представляют собой широко применяемые агрохимикаты, которые содержат фосфитную или фосфонатную (РО) группу, все являются ингибиторами формирования склероциев. Однако фосфористая кислота, фосфит калия и Aliette были наиболее сильными ингибиторами формирования склероциев, и поскольку они являются недорогими и широко применяемыми продуктами, можно было бы разумно ожидать, что ежедневное применение указанных продуктов к сельскохозяйственным культурам при низких концентрациях в подводе воды, таком как спреи, поливной трубопровод системы капельного орошения или системы кругового полива, могли бы обеспечить удобный и экономически приемлемый способ предотвращения формирования склероциев грибами в полевой практике.
3
3-
Было неожиданно показано, что уничтожающая склероции композиция, содержащая соединение, содержащее фосфит или фосфонат (РО), предотвращает формирование склероциев грибами. Соединение может быть, например фосфористой кислотой или ее солью, например, фосфиты калия, натрия, кальция, меди, алюминия, цинка или аммония или их объединения. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения соединение может также представлять собой глифосат N-(фосфонометил)-глицин).
Композиция также может представлять собой в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения объединение глифосата с фосфористой кислотой или ее солью.
В другом варианте реализации настоящего изобретения медная или медно-цинковая композиция с фосфористой кислотой в сочетании с нитритом натрия для получения азотистой кислоты и оксидов азота приводит к антимикробным (бактерицидным, фунгицидным) и спорицидным, и уничтожающим склероции композициям для применений в сельском хозяйстве.
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения соль азотистой кислоты представляет собой соль натрия или калия. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения соль меди может быть оксихлоридом меди или сульфатом меди. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения соль меди может быть оксихлоридом меди в виде смачивающегося продукта. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения соль цинка может представлять собой сульфат цинка, ацетат цинка или нитрат цинка. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения основание может представлять собой гидроксид аммония, гидроксид натрия или гидроксид калия, предпочтительным является гидроксид аммония. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения вода может представлять собой дистиллированную воду, деионизованную воду, очищенную воду, фильтрованную воду, воду фармацевтической степени чистоты, воду для использования в медицине и обратно-осмотическую воду, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения соль меди и/или цинка, которую применяли для получения раствора является гидратированной. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения отношение меди к цинку в композиции находится в диапазоне от 100:1 до 1:100, более предпочтительно от 10:1 до 1:10, и еще более предпочтительно 1:1. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения композиция дополнительно содержит вспомогательные средства, адъюванты, носители, поверхностно-активные вещества или наполнители.
Неожиданно существует более сильная антимикробная/фунгицидная и спорицидная активность композиций Cu/CuZn с фосфористой кислоты, ФК (РА), чем композиции только с фосфористой кислотой, ФК (РА), независимо от того, применяли ли их отдельно или при смешивании с солью нитрита. Фосфористая кислота также стимулирует защитные механизмы растений.
2
Неожиданное усиление спорицидного воздействия за счет присутствия ионов меди при применении фосфористой кислоты в качестве активатора NaNO для сельскохозяйственных применений не было предсказуемым. Кроме того, фунгицидные эксперименты в настоящей заявке показывают, что усиленное антимикробное воздействие, обеспечиваемое присутствием меди с фосфористой кислотой, представляло собой непредсказуемое синергическое воздействие.
50
Однако, хотя фосфористая кислота и фосфит калия, взятые отдельно, представляют собой очень эффективные ингибиторы формирования склероциев R. solani (при концентрациях 40 мг/л и выше), они представляют собой относительно слабые ингибиторы роста грибов (значения IC с R. solani составляют приблизительно 250 и 400 мг/л соответственно), и ни один из продуктов, взятый отдельно, не является спорицидным или уничтожающим склероции при концентрациях, меньших, чем 4 грамм/литр, которые обычно применяли в виде спрея для листвы. Поэтому, так существуют значительные преимущества для применения одной из описанных в настоящей заявке композиций с нитритом натрия или без него в полевой практике.
Интересно, что при применении в виде спрея для листвы на саженцах риса и розовых кустах композиции в сочетании с нитритом натрия, не были фитотоксичными, и на розовых кустах, зараженных тлей, было обнаружено, что объединение имело быстрое инсектицидное действие.
В идеальном случае, агрохимикаты должны быть легкими и безопасными в применении, экологически безопасными, также как недорогими и эффективными. Настоящие композиции в сочетании с нитритом натрия являются предпочтительными в этом отношении, поскольку композиции являются недорогими и относительно безопасными в применении, и экологически безопасными, поскольку они содержат значительно более низкие уровни содержания меди (примерно в 10 раз меньше при 1% разбавлении исходного раствора), чем наиболее доступные в настоящее время агрохимикаты на основе меди.