СПОСОБ МАРКИРОВАНИЯ БИООБЪЕКТОВ В ВОДНОМ РАСТВОРЕ
METHOD OF BIOOBJECT MARKING IN AQUEOUS SOLUTION

Изобретение относится к биосенсорике и может быть использовано для маркирования различных биообъектов (ферментов, белков, ДНК) и последующей оценки их содержания в смесях оптическими методами (такими как абсорбционная спектроскопия, флуоресцентная спектроскопия, флуоресцентная микроскопия, метод поверхностного плазменного резонанса и др.). Маркирование используют при биологическом или медицинском анализе смесей, а также - при экологическом мониторинге окружающей среды [1].
-9
Известен способ маркирования биообъектов в водных растворах, включающий перемешивание смеси маркера и биообъекта в весовом соотношении 100:1 в буфере рН 9,5 в течение 3 часов при температуре 37°С, последующее охлаждение смеси до температуры 4°С, сохранение ее в этих условиях в течение суток и использование колоночной хроматографии. Данное соотношение маркера к биобъекту и временной интервал перемешивания необходимы для образования ковалентной связи между маркером и карбоксильными или аминными группами, расположенными на поверхности биообъекта. Поскольку реакция ковалентного маркирования является реакцией второго порядка, т.е. ее скорость зависит от концентрации маркера и биообъекта, то для снижения порядка реакции со второго на первый необходимо, чтобы концентрация одного из компонентов реакции была существенно больше концентрации другого компонента. Методически в избытке всегда берется маркер, т.к. стоимость его существенно ниже стоимости биобъекта. Скорость реакции экспоненциально затухает с течением времени и через 3 часа в системе наступает равновесие, что и обусловило выбор величины временного интервала. Выбор же температуры проведения реакции, равной 37°С, определен тем фактом, что при такой температуре (температурный интервал нормального функционирования биообъектов - 35-42°С) не происходит термическая денатурация биообъектов. Величина рН 9,5 также не случайна: при этом значении рН белок наиболее ионизован, что улучшает условия маркирования. Охлаждение смеси до 4°С и ее сохранение при этой температуре в течение суток необходимо, поскольку реакция маркирования - эндотермическая и при понижении температуры смеси до 4°С происходит полное прекращение реакции. Выдерживание смеси при такой температуре в течение суток необходимо для полного прекращения реакции во всем объеме смеси, содержащей конъюгат - маркированный биообъект. Колоночную хроматографию используют для выделения конъюгата из смеси. Основными недостатками способа являются: использование низких значений рН (что приводит к частичной денатурации белка), большая продолжительность его реализации, высокий расход реагентов и использование ковалентного маркирования, которое снижает нативность биообъектов и сильно влияет на их аффинные свойства, что обусловливает низкий предел их детектирования, равный 10М (4 нг/мл) [2].
-9
Известен способ маркирования биообъектов, включающий приготовление конъюгата путем перемешивания смеси маркера с биообъектом при температуре 0°С в течение суток, последующее удаление осадка центрифугированием, выполнение гель-хроматографии конъюгата и лиофильной сушки конъюгата в вакууме [3]. Выбор температуры перемешивания, равной 0°С, обусловлен тем, что в этом способе реакция маркирования является экзотермической, т.е. проходит с сильным разогревом, поэтому, чтобы предотвратить термическую денатурацию биообъекта, необходим отвод тепла, чего и достигают проведением реакции при температуре тающего льда. Основными недостатками известного способа являются: большая продолжительность процесса получения конъюгата, использование центрифугирования, гель-фильтрации и лиофильного высушивания, оказывающих негативное воздействие на нативность и афинность биообъектов, что обусловливает низкий предел их детектирования (10 М).
Наиболее близким к заявляемому способу является способ маркирования иммуноглобулина в водном растворе, включающий приготовление конъюгата в буфере рН 9,5 путем перемешивания смеси маркера и биообъекта, взятых в весовой пропорции 100:1, в течение 3 часов при температуре 37°С, охлаждение смеси до 4°С, сохранение ее при этой температуре (для прекращения реакции маркирования) в течение суток и последующий диализ смеси в буфере рН 7,2 с 3-4-кратной сменой буфера в течение 3 суток при температуре 4°С с целью удаления из нее избытка маркера [4]. Выбор значения рН 7,2 обусловлен тем, что это значение является изоэлектрической точкой ряда белков, в том числе и иммуноглобулина, которая характеризуется минимальным зарядом на поверхности; именно при этом рН большая часть белков функционирует в организме [5-7]. Основные недостатки способа - большой расход реагентов, необходимых для приготовления конъюгата, большая продолжительность его реализации, снижение нативности и аффинных свойств биообъектов, входящих в конъюгат, а также - высокий порог детекции маркируемого объекта.
Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в существенном снижении трудоемкости и материалоемкости процесса, а также в понижении порога детекции биообъекта оптическими методами.
Сущность изобретения заключается в том, что в способе маркирования биообъектов в водном растворе, включающем приготовление в буфере при температуре 37°С конъюгата маркера с биообъектом путем перемешивания их смеси, в качестве маркера используют одностенные углеродные нанотрубки длиной от 0,5 мкм до 0,7 мкм и диаметром от 0,7 нм до 1,1 нм, рН буфера выбирают равным 7,2, а получение конъюгата осуществляют путем сонифицирования смеси ультразвуком, частоту и интенсивность которого, а также продолжительность сонифицирования выбирают обеспечивающими сохранность биообъекта и фиксацию ОУНТ на нем.
Снижение трудоемкости процесса маркирования достигается в результате того, что для получения конъюгата вместо стадий перемешивания, охлаждения и диализа используется метод сонификации (обработка ультразвуком) смеси [8]. Высокочастотные колебания, сообщаемые обрабатываемому материалу ультразвуковыми волнами, способствуют эффективному массообмену в растворе. Кроме оказания физического воздействия на смесь ультразвуковые волны запускают в ней так называемые сонохимические реакции, катализирующие реакцию маркирования, и снижают порог детекции биообъектов [9]. Но время сонифицирования не должно превышать получаса, в противном случае процесс может привести к разрушению белка [10]. Кроме того, с целью сохранения биообъекта в процессе сонификации для каждого объекта необходимо выбрать соответствующие частоту и интенсивность ультразвука [11]. При выполнении этих условий сонифицирование позволяет не только достичь результатов стадий перемешивания, охлаждения и диализа смеси, но и понизить порог оптической детекции биообъекта.
Уменьшение материалоемкости процесса маркирования достигается вследствие того, что в предлагаемом способе отсутствует стадия диализа, требующая больших затрат реагентов.
Понижение порога детекции (маркируемого биообъекта) обеспечивается за счет того, что вместо широко известных маркеров (красителей различных классов) используются одностенные углеродные нанотрубки (ОУНТ) длиной от 0,5 мкм до 0,7 мкм и диаметром от 0,7 нм до 1,1 нм. Такие ОУНТ обладают всеми свойствами, присущими маркеру (оптическим откликом, способностью фиксироваться на биообъекте, продолжительным временем жизни на нем), а также - высоким сродством к биообъектам и каталитическими свойствами, т.е. способностью возбуждать, ускорять и усиливать флуоресценцию [12].
-9
-11
В качестве первого примера реализации заявляемого способа рассмотрим процесс маркирования в водном растворе иммуноглобулина одностенными углеродными нанотрубками длиной 0,5 мкм и диаметром 0,9 нм, обладающими красной флуоресценцией (670 нм), сильно возгорающейся после проведения иммунной реакции [13, 14]. Детектирование флуоресценции ОУНТ на длине волны 670 нм обладает тем существенным преимуществом, что такая флуоресценция находится в пределах «окна прозрачности», где автофлуоресценция биообъектов минимальна; вследствие этого повышается соотношение сигнал/шум и, как следствие, - понижается на два порядка порог детекции (с 10 М до 10 М). Вначале приготовляют смесь ОУНТ с иммуноглобулином в буфере рН 7,2, затем воздействуют на нее ультразвуковой волной с частотой 42 кГц (например, прибор BRANSON-2510) в течение 30 мин при температуре 37°С. После этого выдерживают смесь в течение двух часов при той же температуре (для завершения выпадения осадка) и отделяют методом декантации образовавшийся осадок от раствора. Раствор, состоящий из комплекса иммуноглобулина с ОУНТ, является искомым конъюгатом. Для выполнения же маркирования иммуноглобулина в водном растворе способом, взятым в качестве прототипа, потребовалось бы 7 дней и 5 литров буфера рН 7,2. Таким образом, выбор ОУНТ в качестве маркера иммуноглобулина и применение процесса сонифицирования смеси иммуноглобулина и ОУНТ в буфере рН 7,2 позволяет существенно снизить трудоемкость и материалоемкость процесса маркирования иммуноглобулина, а также - понизить порог его детекции оптическими методами. Существует ограничение по концентрациям, белок растворим в водной среде, но не до бесконечности - верхний предел - это растворимость белка в водной среде (в среднем 1 г белка на 100 мл воды), нижний предел налагает оптический метод детектирования - для белка 0,5-1,0 мг/мл. Эта концентрация выбиралась нами экспериментально, но она находится в соответствии с данными литературы [15].
Концентрация же нанообъектов из-за отсутствия данных в литературе выбиралась нами экспериментально. Нанотрубки в воде практически нерастворимы и практически не образуют стабильных суспензий. Эксперименты проводили с разными количествами нанотрубок, которые были диспергированы в растворе нейтрального ПАВ - тритон XI 00 (0,001%), основным параметром являлось отсутствие осадка сразу после диспергирования и после суток отстаивания. Интервал концентраций нанотрубок, который после суток отстаивания не давал осадка, использовался для дальнейших исследований с белками в растворе - от 1 до 5 мг нанотрубок в 5 мл водного буферного раствора, в данном примере количество нанотрубок было - 1 мг в 5 мл водного буферного раствора.
-6
Пример 2. Использование ОУНТ в качестве маркера для маркирования ДНК в водном растворе. Рассмотрим процесс маркирования двух различных ДНК, выделенных из листьев табака двух различных сортов (образец 1 и 2), в водном растворе. Вначале растворы, содержащие обе ДНК, следует выдержать в течение 1 часа при температуре 95°С, что необходимо для «расплетания» двойных спиралей, происходящего за счет разрыва водородных связей, образующих спираль. После этого в горячий раствор добавляют ОУНТ в соотношении 2 мг нанотрубок (длина - 0,6 мкм, диаметр - 1,1 нм) на 5 мл раствора ДНК в концентрации 10 М, затем полученную смесь сонифицируют ультразвуком с частотой 42 кГц в течение 90 мин при температуре 37°С. После сонификации смесь 2 часа отстаивают. Затем, после отделения декантацией раствора от осадка, раствор, содержащий комплекс ДНК с ОУНТ, микропипеткой (0.2 мл) наносят на полированные кварцевые подложки. Через 2 часа на поверхности кварца образуются самоорганизованные упорядоченные домены, состоящие из комплексов ДНК с ОУНТ, которые сильно различаются по своей структуре для двух образцов ДНК - шарообразные и нитеподобные. С помощью атомно-силовой микроскопии (или флуоресцентной микроскопии) можно идентифицировать ДНК различного нуклеотидного состава (например, наличие генномодифицированных ДНК в различных продуктах, а также в картофеле, томатах, сое, кукурузе). Для выполнения же маркирования в водном растворе ДНК способом, взятым в качестве прототипа, потребовалось бы 7 дней и 5 литров буфера рН 7,2. Таким образом, использование заявляемого способа позволяет сократить время процесса маркирования с 7 дней до 1 дня и сэкономить 5 литров буфера.
Параметры сонификации для различных белков. Поскольку прибор, который мы используем для сонификации, имеет постоянную мощность, и чтобы увеличить энергию облучения, у нас есть один параметр - это время облучения, который для различных белков различен. Естественно, как любой параметр - время имеет верхний предел - это 90 мин, выше которого мы не поднимались из опасения необратимой денатурации белка, и нижний предел - 30 мин, ниже которого вообще ничего не происходит. В этих временных интервалах мы и работали.
-6
Пример 3. Использование ОУНТ в качестве флуоресцентного маркера для маркирования фиброНектина - белка, входящего в состав хрящевой ткани, а также в систему, ответственную за свертываемость крови. К 3-5 мл водного раствора фибронектина с концентрацией 10 М добавляют 5 мг нанотрубок (длина - 0,7 мкм, диаметр - 1,1 нм), затем полученную смесь сонифицируют ультразвуком с частотой 42 кГц в течение 30 мин при температуре 37°С. После завершения сонификации смеси смесь отстаивают 2 часа. После отделения декантацией раствора от осадка раствор используют для получения ленгмюровских пленок. В данном примере использование ОУНТ позволяет не только позиционировать с помощью флуоресцентного микроскопа места иммобилизации стволовых клеток, но и в несколько раз ускорить их рост. Для выполнения же маркирования иммуноглобулина в водном растворе способом, взятым в качестве прототипа, потребовалось бы 7 дней и 5 литров буфера рН 7,2. Таким образом, использование заявляемого способа и в этом примере позволяет сократить время процесса маркирования с 7 дней до 1 дня и сэкономить 5 литров буфера.
Источники информации
1. Ajayan P., Zhou J. Application of carbon nanotubes // Carbon nanotubes. Topics Appl. Physics, 2001, v.80, p.391-425.
2. Minari L., Charchat S., Bonorino C. An ELISA serum assay for autoantibodies to HSP 70 in immunomediated hearing loss // J. Immunol. Methods, 2003, v.283, p.155-161.
3. Чудинова Г., Лобанов А., Румянцева В., Чудинов А., Стомахин А., Миронов А. Синтез конъюгатов бычьего сывороточного альбумина с водорастворимым иттербиевым порфирином // Биоорг. Химия, 2004, т.30(1), с.99-104.
4. U.Schobel, H.Egelhaaf, D.Fronlich, A.Brecht, D.Gelkrug, G.Gauglits "Mechanism of fluorescence quenching in donor-acceptor labeled antibody-antigen conjugates" J. Of Fluorescence, 2000, v.10(2), p.147-154.
5. Кнорре Д., Мызина С. Биологическая химия // М.: Высш. школа, 1998, с.71-72.
6. Литмен Г., Гуд Р. Иммуноглобулины //М.: Мир, 1981, с.58-163.
7. Досон Р., Элиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика // М.: Мир, 1991 г., с.316.
8. Вольпинер И.Е. Биофизика ультразвука//М.: Наука, 1973 г., с.180-192.
9. Suslick К. Sonochemistry // Kirk - Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, John Willey & Sons Inc., New York, 1998, v.26, p.516-541.
10. См. [8], гл.1 "Мощный ультразвук и его химическое действие", с.9-74.
11. См. [8], гл.4 "Действие УЗ-волн на биомакромолекулы", "Иммуноглобулины", с.180-193.
12. Endo М., Strano М., Ajayan P. Potential applications of carbon nanotubes // Carbon nanotubes. Topics Appl. Physics, 2008, V.111, p.13-62.
13. Mu С., Mangum В., Xie С., Gerton J. Nanoscale fluorescence microscopy using carbon nanotubes // J. Select. Topics.in Quant. Electronics, 2008, v.14, p.206-216.
14. Kam N., Jessor Т., Wender P., Dai H. Nanotube molecular transporters: Internalization of carbon nanotube - protein conjugates into mammalian cells // JACS, 2004, v.126, p.6850-6851.
15. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия. - М.: Мир, 1984, т.2, с.38.