СПОСОБ ПЕРСОНИФИЦИРОВАННОЙ ИММУНОТЕРАПИИ
METHOD OF PATIENT-SPECIFIC IMMUNOTHERAPY

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии, и предназначено для персонифицированной иммунотерапии.
В настоящее время выбор оптимальных методов терапии раневого процесса является актуальной задачей для врачей различных специальностей.
Особенности современной инфекции заключаются как в наличии устойчивых к антибактериальной терапии штаммов микроорганизмов, так и в возникновении иммуносупрессивного состояния, что приводит к осложнениям воспалительного процесса.
Настоятельная потребность подхода в лечении, ориентированном на конкретного пациента, стала очевидной благодаря последним достижениям науки об индивидуальных особенностях восприимчивости к заболеваниям и к их терапии. Известно, что большинство лекарственных препаратов действует менее чем на половину пациентов, а побочные эффекты могут оказаться тяжелее самих заболеваний.
Одно из направлений персонифицированной иммунотерапии связано с использованием аутологичных цитокинов. Известен способ персонифицированной иммунотерапии при лечении гнойных ран с помощью аутологичных цитокинов, при котором на рану наносят супернатант, полученный путем выделения лимфоцитов из крови больного и культивирования их в присутствии фитогемагглютинина в дозе 8-10 мкг/мл в течение 1,5-3 ч с последующим отмыванием и повторным культивированием в течение 18-24 ч. Ежедневное нанесение на рану полученного средства позволяет в первые сутки лечения значительно уменьшить воспалительную реакцию, экссудацию, размеры раневого дефекта, приводит к раннему появлению грануляций. Это сокращает сроки лечения, в частности, в стационаре (SU 1498498, 19.06.87). Данный способ принят за ближайший аналог. Однако этот способ не лишен недостатков, а именно продуцентами цитокинов в данном способе являются мононуклеарные клетки периферической крови, выделенные с использованием дорогостоящих импортных реактивов. Количество выделяемых клеток мало, и основным действующим началом являются только цитокины.
Предлагаемый персонифицированный способ иммунотерапии основан на локальном применении в зоне патологического очага цитокинов и противомикробных пептидов, полученных при культивировании стимулированных лейкоцитов пациента. Применение в качестве лечебного средства комплекса цитокинов и противомикробных нейтрофильных пептидов, аутологичных для пациента, не вызывает развития аллергических реакций и позволяет сократить сроки применения антибиотиков. Локальное применение пептидов обеспечивает быстрое направленное действие аутологичных цитокинов и противомикробных нейтрофильных пептидов на патологический процесс в зоне повреждения, проявляющееся в противовоспалительном, противомикробном, ранозаживляющем эффекте. Получение из крови пациента большего количества аутологичного препарата, обладающего наряду с противовоспалительным и ранозаживляющим действием, прямой противовирусной и противобактериальной активностью, и локальное применение аутологичного препарата позволяет сократить сроки применения антибиотиков и даже отменить их.
Задачей предлагаемого способа является разработка усовершенствованного персонифицированного способа иммунотерапии.
Техническим результатом предлагаемого способа является предупреждение вторичного иммунодефицита, достаточно быстрое купирование воспалительного процесса с одновременным упрощением и удешевлением способа.
Технический результат достигается за счет снижения или исключения использования антибиотиков посредством одновременного действия комплекса природных цитокинов и противомикробных нейтрофильных пептидов (эндогенных антибиотиков), вырабатываемых аутологичными лейкоцитами с противомикробной активностью в супернатанте не менее 2000 пг/мл.
6
Препарат аутологичных иммунопептидов (противомикробных нейтрофильных пептидов) получают путем выделения лейкоцитов из периферической крови, стимуляции их митогеном (например, фитогемагглютинином), культивированием в течение 20-24-х часов, получением аутологичного супернатанта, его стерилизации и оценки биологической активности. Для этого у пациента забирают 20-40 мл крови из локтевой вены в стерильную пробирку, содержащую антикоагулянт (из расчета 25 ЕД/мл крови). Периферическую кровь смешивают в соотношении 1:5 с 10% раствором желатина и отстаивают в течение 10 мин при комнатной температуре, а затем 30 мин при 37°C. Лейкомассу собирают. Клетки отмывают 0,9% раствором хлорида натрия, центрифугируя их в течение 10 мин при 200g. Определяют общее количество выделенных лейкоцитов, готовят концентрацию 20·10 клеток в 1,0 мл бесцветной среды 199.
Для стимуляции лейкоцитов используют митогены (ФГА или конканавалин А) в дозе 10-15 мкг/мл. Через 3 часа стимулятор удаляют, а клетки трижды отмывают от стимулятора и культивируют в бесцветной культуральной среде 199 в течение 20-24-х часов. По окончании культивирования надосадочную жидкость собирают, стерилизуют фильтрацией через фильтры (Millipore-QS, США, диаметр пор 0,22 мкм). Концентрацию нейтрофильных пептидов (HNP-1-3) определяли с помощью иммуноферментного анализа с использованием системы фирмы HBT (Нидерланды). Средние показатели концентрации HNP-1-3 в аутологичном препарате здоровых доноров равны 4800,0±2800 пкг/мл. Было проведено определение прямой противобактериальной и противовирусной активности аутологичного препарата, полученного из культуры лейкоцитов здоровых доноров.
Для изучения прямой противомикробной активности супернатанта лейкоцитов на различные патогенные штаммы микроорганизмов: золотистый стафилококк (S. aureus ATCC6538P), кишечную палочку (E. coli ATCC25922) и гриб рода кандида (C. albicans 865-465) - использовали метод дисков, импрегнированных различными концентрациями аутологичного препарата (50, 5,0, 0,5 мкг). Микробные суспензии высевали на питательные среды и затем раскладывали бумажные диски с разными концентрациями (разведениями) препарата. После 18 часов инкубации в термостате при 37°C измеряли диаметр зон угнетения роста бактерий в мм.
Чувствительность S. piogenes изучали методом разведений в жидкой питательной среде с последующим посевом на кровяной агар и определением через 48 часов инкубации при 37°C роста бактерий.
Все исследуемые концентрации аутологичного препарата угнетали рост S. piogenes и патогенного штамма стафилококка S. aureus.
Клинический эффект от использования способа лечения оценивали по клиническим параметрам: уменьшению воспаления, очищению раны от микроорганизмов, стимуляции репарации, отсутствию аллергических реакций, снижению дозы и сроков применения антибиотиков.
В таблице 1 представлены сравнительные результаты лечения осложненных ран предложенным способом (15 пациентов) по сравнению с ближайшим аналогом (12 пациентов) и базовым методом лечения (с применением антибиотиков у 9 пациентов).
Предложенный способ был включен в комплексное лечение 24-х больных пародонтитом средней степени тяжести. Базисная терапия включала как местное, так и системное лечение. Местное лечение заключалось в удалении зубных отложений, проведении хирургического куретажа, применении антисептиков и противомикробных препаратов. Общая терапия включала витаминотерапию, десенсибилизирующую терапию, антибактериальные препараты при наличии абсцессов и гноетечении.
Применение способа персонализированной иммунотерапии заключалось в использовании аутологичного супернатанта лейкоцитов больного, полученного из 20 мл крови. Препарат наносили в течение 5-7 дней в виде аппликаций (0,5-1 мл) и субмукозного введения. При этом производили обкалывание по 0,1 мл в 4-5 точках вокруг патологического очага пародонта.
Клиническая эффективность предложенного способа представлена в табл.2.
Как показали клинические наблюдения, использование аутологичного препарата иммунопептидов (противомикробных нейтрофильных пептидов) способствует:
быстрому исчезновению признаков воспаления, по сравнению с базовым методом лечения, ограничивает применение антибиотков или полностью отменяет их прием, удлиняет сроки ремиссии до 1 года, нормализует соотношение микроорганизмов в слюне, десневой жидкости. У больных с пародонтитом наблюдается дефицит бифидобактерий и лактобацилл, а преобладают условно-патогенные микроорганизмы (St. aureus St. salivarius, St. epidermidis, Neisseria, Klebsiella Psevdomonas и др.). Аутопрепарат иммунопептидов, содержащий противомикробные нейтрофильные пептиды, оказывает прямое бактерицидное действие на условно-патогенные микроорганизмы и увеличивает содержание лактобактерий и бифидобактерий в слюне и десневой жидкости до показателей нормы.
Хронический тонзиллит и аденоидные вегетации широко распространены, особенно среди детей. Длительная персистенция инфекции в организме таких больных приводит к развитию иммунодефицитного состояния как на локальном, так и на системном уровне. Традиционно применение антибиотиков еще более усугубляет иммунодефицит. В связи с этим применение аутологичного супернатанта лейкоцитов с активностью эндогенных противомикробных пептидов и цитокинов патогенетически обосновано. Применение аутологичного супернатанта у 12 детей с хроническим тонзиллитом и гипертрофией аденоидных вегетаций уменьшало степень обсемененности миндалин стрептококковой и стафилококковой флорой, к 8-10-м суткам полностью исчезал болевой синдром при глотании, улучшалось носовое дыхание. В группе пациентов, леченных базовым способом, получавших курс антибиотиков и промывание миндалин антибактериальным препаратом группы сульфаниламидов в течение 10-ти процедур, обострение хронического воспалительного процесса наблюдалось 4-6 раз в год. Применение аутологичного супернатанта лейкоцитов снижало частоту обострения до 1-2-х раз в год.
Наиболее частыми причинами, способствующими развитию нарушений иммунитета в тканях глаза, являются вирусные, бактериальные инфекции, травмы. В связи с этим в лечении кератитов различной этиологии в последние годы применяются иммуномодуляторы с целью купирования клинических проявлений иммунной недостаточности и повышения тем самым терапии основного заболевания. Предложена схема применения аутологичного супернатанта лейкоцитов в комплексном лечении вирусного кератита у детей (n=16). В качестве контроля использовался базовый способ лечения у 10 больных и способ по ближайшему аналогу (n=8), включающий применение аутологичного супернатанта мононуклеарных клеток в комплексе с базовой терапией. Результаты клинической эффективности представлены в таблице 3. Применение аутологичного супернатанта лейкоцитов в лечении герпетического кератита сокращало продолжительность воспалительного процесса. Купирование отека роговицы происходило на сутки раньше, чем при лечении по ближайшему аналогу, и на 3-е суток раньше, чем в контрольной группе. Купирование роговичного синдрома также происходило раньше в основной группе. Полная эпителизация роговицы в основной группе произошла на 6-е сутки, тогда как в контрольной группе на 11-12-е, а у больных, леченных по способу прототипа, - на 8-е сутки. Восстановление остроты зрения до 0,9-1,0 наблюдали у 56% пациентов основной группы, у 12% пациентов контрольной группы и 40% - пациентов, леченных по ближайшему аналогу. Пребывание в стационаре пациентов основной группы сокращалось на 5 дней.
Таким образом, в ходе клинических наблюдений за результатами лечения пациентов подтвержден высокий эффект аутологичного супернатанта лейкоцитов в комплексном лечении герпетического кератита, проявляющийся в стимуляции репарации, более быстром купировании воспалительного процесса, быстрой эпителизации роговицы, увеличении остроты зрения и сокращении сроков пребывания пациентов в стационаре практически в 2 раза.
Способ осуществляется следующим образом. Получают супернатант стимулированных аутологичных лейкоцитов с концентрацией противомикробных пептидов в супернатанте не менее 2000 пг/мл, вводят супернатант подкожно, или субмукозно, или в виде аппликаций, или в виде инстилляций в течение 5-10 дней. При подкожном или субмукозном введении супернатант вводят в объеме по 0.4-0.5 мл 1 раз в день путем обкалывания по 0,1 мл в 4-5-ти точках вокруг патологического очага. Для аппликаций используют супернатант в объеме по 0.2-2.0 мл 1 раз в день. Для инстилляций в носовую полость используют супернатант по 2 капли в каждый носовой ход 3 раза в день. Для инстилляций в конъюнктивальную используют супернатант по 2 капли в каждый глаз 4-5 раз в день.
Пример 1. Больная Т.П. К-ова, 32 г., госпитализирована в роддом по поводу тазового предлежания плода.
Произведено кесарево сечение в нижнем маточном сегменте по поводу беременности 40 недель, тазового предлежания, дородового излития вод. На 7-е сутки после операции выявлена подапоневротическая нагноившаяся гематома, расхождение швов до апоневроза.
Через 2 дня из 40 мл венозной крови выделены лейкоциты и получен аутологичный супернатант лейкоцитов (18 мл).
В течение 7-ми дней ежедневно после очищения раны перекисью водорода, проводили обработку раны в виде аппликаций 2 мл раствора аутологичного супернатанта (концентрация противомикробных нейтрофильных пептидов равнялась 3580 пг/мл). Уже на 2-е сутки применения препарата края раны очистились, появились яркие грануляции, на 3-и сутки в раневом отделяемом преобладала сапрофитная и условно-патогенная микрофлора, на 7-е сутки произошло заживление раны.
2
Пример 2. Больной С-ев поступил на кафедру общей хирургии педиатрического факультета РГМУ с диагнозом трофическая язва голени (площадью 4,8 см) на фоне хронической венозной недостаточности, диабет. До поступления больной в течение полутора месяцев лечился амбулаторно без положительного результата.
Из 40 мл крови было получено 20 мл супернатанта лейкоцитов с активностью нейтрофильных пептидов 2340 пк/мл. После стандартной обработки на раневую поверхность апплицировали 1 мл аутологичного супернатанта и по 0,1 мл вводили подкожно в 5 точках по краям язвы. После чего накладывали стерильную повязку. Курс лечения продолжался в течение 10 дней. На 5-е сутки лечения происходило очищение язвенной поверхности, одновременно появлялась краевая эпителизация. На 7-е сутки появились активные грануляции. Через 14 дней 50% поверхности язвы было эпителизировано. На 20-е сутки больной был выписан из стационара в удовлетворительном состоянии.
Пример 3.
Больная К-ва О., 11 лет, госпитализирована в ЛОР-отделение детской клинической больницы Росздрава г.Москвы с диагнозом обострение хронического тонзиллита в сочетании с гипертрофией аденоидных вегетаций. При эндоскопическом осмотре отмечена гипертрофия миндалин III степени, лакуны миндалин расширены, деформированы с грубыми спайками. Лакуны выполнены слизистыми пробками. Ткань аденоидов гиперплазирована и расположена по всей поверхности носоглотки.
В составе микрофлоры миндалин преобладали золотистый стафилококк, a-гемолитический стрептококк, нейссериальная флора. Отмечено увеличение подчелюстных, заушных лимфатических узлов. Больная не получала антибактериальной и противовирусной терапии.
На 2-е сутки получено 10 мл аутологичного супернатанта лейкоцитов. В полученном супернатанте была определена концентрация противомикробных нейтрофильных пептидов. Она составила 6600 пг/мл. К 10 мл супернатанта лейкоцитов добавляли 20 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Этот раствор использовали для промывания миндалин и инстилляции в полость носа.
Схема применения аутологичного супернатанта лейкоцитов была следующей. Ежедневно однократно осуществляли последовательное промывание лакун миндалин 0,9% раствором натрия хлорида с целью очистки лакун от патологического содержимого. После этого закапывали по 10 капель 0,9% раствора натрия хлорида в каждую ноздрю, через 5 мин осуществляли инстилляции аутологичного супернатанта по 2 капли в каждую ноздрю. Процедуры последовательных инстилляций проводили 3 раза в день. Курс инстилляций составил 7 дней.
На 3-и сутки после проводимого лечения отмечалось значительное уменьшение выраженности болевого синдрома, прошло чувство першения и сухости в горле при глотании, уменьшилась гиперемия слизистой оболочки миндалин, отечность и воспалительная инфильтрация ткани миндалин, к 5-м - сбугристость и деформированность ткани миндалин, сократились размер и глубина лакун, к 10-м суткам наблюдалось полное купирование болевого синдрома при глотании, дальнейшее сокращение размеров лакун и отсутствие в них содержимого, значительно улучшилось носовое дыхание. Значительно снизилась степень обсеменения в основном за счет снижения стрептококковой и стафилококковой флоры. Больная выписана в удовлетворительном состоянии. Состояние ремиссии продолжалось 14 мес. У пациентов, леченных базовым способом, обострения наблюдались каждые 3-4 мес.
Пример 4. Больная С-ая, 15 лет, поступила в Морозовскую детскую городскую клиническую больницу с диагнозом древовидный кератит.
При поступлении: проявления роговичного синдрома (слезотечение, светобоязнь, блефароспазм, невралгическая боль), снижение остроты зрения OS=0,5, OD=0,7, снижение чувствительности роговой оболочки. При биомикроскопии определялось слизистое отделяемое, выраженная перикорнеальная инъекция, наличие на роговице инфильтрата в виде веточки.
У больной из 15 мл крови по известному методу было получено 7 мл аутологичного супернатанта лейкоцитов с концентрацией противомикробных нейтрофильных пептидов 4680 пг/мл. Супернатант инстиллировали в конъюнктивальную полость по 2 капли в каждый глаз 4-5 раз в день в течение 7 дней параллельно с проводимой противовирусной терапией, включающей препарат зовиракс, сосудистой терапией (аскорутин), десенсибилизирующей терапией (тавегил). На 4-е сутки лечения исчезла перикорнеальная инъекция, произошло купирование отека роговицы, роговичного синдрома. Полная эпителизация роговицы наблюдалась на 7-е сутки. Восстановление прозрачности роговицы привело к восстановлению остроты зрения OS=0,9, OD=0,9. Больная провела в стационаре 8 дней и выписана.
Таким образом, применение аутологичных препаратов, полученных из лейкоцитов больного, значительно сокращает сроки заживления ран, стимулирует появление грануляций, снижает болевые ощущения, изменяет состав микроорганизмов, определяемых в раневом отделяемом, и, что особенно важно, позволяет избежать приема антибиотиков, усугубляющих течение вторичного иммунодефицита, развивающегося при длительно текущих раневых процессах.
Данный способ может быть использован при лечении широкого спектра заболеваний, при которых имеют место нарушения в иммунной системе.