АНАЛОГИ ГРЕЛИНА С ЗАМЕЩЕНИЕМ НА N-КОНЦЕ
ANALOGUES OF GHRELIN SUBSTITUTED AT N-END

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к пептидильным аналогам грелина и их терапевтическому применению.
ОПИСАНИЕ ПРЕДШЕСТВУЮЩЕГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ
2
et al., Nature,
Грелин, недавно открытый орексигенный гормон, продуцируется в виде препрогормона, который подвергается протеолитической обработке с образованием пептида со следующей последовательностью: H-Gly-Ser-Ser-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Arg-Val-Gln-Gln-Arg-Lys-Glu-Ser-Lys-Lys-Pro-Pro-Ala-Lys-Leu-Gln-Pro-Arg-NH (Kojima, M.  (1999), 402(6762):656-60; SEQ ID NO:1). Грелин продуцируется эпителиальными клетками, выстилающими внутренние стенки желудка, и его функцией является стимуляция аппетита, его уровни возрастают перед приемом пищи и снижаются после него.
et al., J. Biol. Chem.,
et al., J. Biol. Chem.,
Известны природные структуры грелина из некоторых видов млекопитающих и не млекопитающих (Kaiya, H.  (2001), 276(44):40441-8; и международная патентная заявка PCT/JPOO/04907 [WO 01/07475]). Активный центр, имеющийся в грелине, отвечает за активность, проявляющуюся в отношении рецептора GHS, и включает четыре N-концевых аминокислоты, где серин в третьем положении обычно модифицирован н-октановой кислотой. Помимо ацилирования н-октановой кислотой природный грелин может также быть ацилирован н-декановой кислотой (Kaiya, H.  (2001), 276(44):40441-8).
et al., Proc. Natl. Acad. Sd. USA,
et al., J. Clin. Endocrin. Metab.,
Уровни грелина в плазме тучных людей ниже, чем таковые у более худых людей, и уровни грелина возрастают на протяжении суток с полуночи до рассвета у более худых людей, что свидетельствует о нарушениях в кровеносной системе тучных людей (Yildiz, B. O.  (2004), 101(28):10434-9). Установлено, что люди, страдающие нарушением употребления пищи anorexia nervosa, и пациенты с вызванной раком кахексией имеют более высокие уровни грелина в плазме (Garcia, J. M.  (2005), 90(5):2920-6).
et al., Ann. Med.,
et al., Nature,
et al., Nature,
Как у животных, так и у людей грелин в значительной степени стимулирует секрецию гормона роста (GH) из передней доли гипофиза, главным образом на уровне гипоталамуса, посредством взаимодействия с рецептором (GHS-R) стимулятора секреции GH (GHS) (Ukkola, O.  (2002), 34(2):102-8; и Kojima, M.  (1999), 402(6762):656-60). GH-высвобождающая активность грелина опосредована активацией рецепторов GHS в гипофизе и, главным образом, на уровне гипоталамуса (Kojima, M. (1999), 402(6762):656-60).
et al., Endocr. Rev.,
et al., Pharmacology Review
et al., Eur. J Endocri.,
До того, как было установлено, что грелин является природным лигандом рецептора GHS, было известно, что пульсирующее высвобождение GH из гипофизарных соматотропных клеток регулируется двумя гипоталамическими нейропептидами: GH-высвобождающим гормоном (GHRH) и соматостатином. GHRH стимулирует высвобождение GH, тогда как соматостатин ингибирует секрецию GH (Frohman, L. A.  (1986), 7(3):223-53; и Strobl, J. S.  (1994) 46:1-34). Грелин, вероятно, усиливает активность секретирующих GHRH нейронов, при этом параллельно действуя как функциональный антагонист соматостатина (Ghigo, E.  (1997), 136(5):445-60).
et al., Endocrinology,
et al., Endocrinology,
Molecular and Clinical Advances in Pituitary Disorders,
et al., Life Sci.,
Novel GH-Releasing Peptides,
Высвобождение GH из гипофизарных соматотропных клеток может также контролироваться GH-высвобождающими пептидами (GHRP). Установлено, что гексапептид His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-амид (GHRP-6, SEQ ID NO:27) высвобождает GH из соматотропных клеток дозозависимым образом у некоторых видов, включая человека (Bowers, C. Y.  (1984), 114(5):1537-45). Дальнейшие химические исследования GHRP-6 привели к обнаружению других сильных синтетических стимуляторов секреции GH, таких как GHRP-1, GHRP-2 и гексарелин (Cheng, K.  (1989), 124(6):2791-8; Bowers, C. Y.,  Ed: Melmed, S., Endocrine Research and Education, Inc., Los Angeles, CA, USA, (1993), 153-7; и Deghenghi, R.  (1994), 54(18):1321-8). Структуры этих трех соединений таковы:
2
GHRP-1 Ala-His-D-(2')-Nal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH, SEQ ID NO:2)
2
GHRP-2 D-Ala-D-(2')-Nal-Ala-Trp-D-Nal-Lys-NH, SEQ ID NO:3) и
2
гексарелин His-D-2-MeTrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH. SEQ ID NO:4)
et al., Endocrinology,
et al., Endocrinology,
Molecular and Clinical Advances in Pituitary Disorders,
et al., Life Sci.,
Novel GH-Releasing Peptides
GHS может стимулировать секрецию GH при помощи иного механизма, чем механизм действия GHRH (Bowers, C. Y.  (1984), 114(5):1537-45; Cheng, K.  (1989), 124(6):2791-8; Bowers, C. Y., ,  Ed: Melmed, S., Endocrine Research and Education, Inc., Los Angeles, CA, USA, (1993), 153-7; и Deghenghi, R  (1994), 54(18):1321-8).
et al., Science,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
et al., Bioorg. Med. Chem. Letts.,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
Низкая пероральная биодоступность (<1%) пептидильного GHS явилась причиной поиска непептидильных соединений, имитирующих действие GHRP-6 в гипофизе. Имеются сообщения, что некоторые бензолактамы и спироинданы стимулируют высвобождение GH у различных видов животных, включая человека (Smith, R G  (1993), 260(5114):1640-3, Patchett, A. A.  (1995), 92(15):7001-5; Chen, M.-H.  (1996), 6(18):2163-8). Конкретным примером малого спироиндана является MK-0677 (Patchett, A. A.  (1995), 92(15):7001-5):
et al., Science,
et al., Mol. Endocri.,
et al., Bioorg. Med. Chem. Letts.,
et al., Science,
et al., Mol. Endocri.,
et al., Mol. Brain Res.,
et al., Genomics,
et al., Science,
Действия GHS (как пептидных, так и непептидных), очевидно, опосредованы определенным рецептором GHS (GHSR, Howard, A. D. (1996), 273(5277):974-7; и Pong, S. S.  (1996), 10(1):57-61). Рецептор GHS присутствует в гипофизе и гипоталамусе у различных видов млекопитающих (GHSR1a) и отличается от рецептора GH-высвобождающего гормона. Рецептор GHS также обнаружен в других областях центральной нервной системы и в периферических тканях, например тканях надпочечника, щитовидной железы, сердца, легкого, почки и мышцы (Chen, M.-H.  (1996), 6(18):2163-9, Howard, A. D.  (1996), 273(5277):974-7, Pong, S. S.  (1996), 10(1):57-61, Guan, X.-M.  (1997), 48(1):23-9; и McKee, K. K.  (1997), 46(3):426-34). Имеются сообщения об укороченном варианте GHSR1a (Howard, A. D.  (1996), 273(5277):974-7).
et al., Mol. Endocri.,
et al., Mol. Brain Res.,
et al., Genomics,
Рецептор GHS представляет собой рецептор, связанный с G-белком. Эффекты активации рецептора GHS включают деполяризацию и ингибирование калиевых каналов, возрастание межклеточных концентраций инозитолтрифосфата (IP3) и временное возрастание концентраций внутриклеточного кальция (Pong, S. S.  (1996), 10(1):57-61; Guan, X.-M.  (1997), 48(1):23-9; и McKee, K. K.  (1997), 46(3):426-34).
FASEB J.,
et al., Neurobiol., Aging,
et al., Trends Endocrinol. Metab.,
et al., Drug Discovery Today,
et al., Trends Endocrinol. Metab.,
et al., Drug Discovery Today,
et al., Growth Horm. IGF Res.,
et al., Trends Endocrinol. Metab.,
et al., Trends Endocrinol. Metab.,
et al., Eur. J. Pharmacol.,
et al., Trends Endocrinol. Metab.,
Am. J. Endo. Metab.,
Молекулы GHS, такие как грелин и его аналоги, имеют множество терапевтических (патент США № 6566337; Inui, A.,  (2004), 18(3):439-56; Muller, E. E.  (2002), 23(5):907-19; Casanueva, F. F.  (1999), 10(1):30-8; и Ankerson, M.  (1999), 4:497-506) и диагностических применений. Соединения, проявляющие агонистические эффекты на рецептор GHS, показаны для улучшения GH-дефицитного состояния патенты США №№ 6861409 и 6967237; и Casanueva, F. F.  (1999), 10(1):30-8), увеличения мышечной массы (патенты США №№ 6861409 и 6967237) и/или физической силы (Ankerson, M.  (1999), 4:497-506), повышения плотности костей (патенты США №№ 6861409, 6967237 и 6251902; и Sibilia, V.  (1999), 9(4):219-27), лечения остеопороза (международные патентные заявки №№ PCT/IB96/01353 [WO 97/24369] и PCT/IB98/00873 [WO 98/58947]; и Casanueva, F. F.  (1999), 10(1):30-8), преодоления половой дисфункции (патент США № 6967237; и Casanueva, F. F.  (1999) 10(1):30-8), лечения сердечно-сосудистого заболевания (международные патентные заявки №№ PCT/IB96/01353 [WO 97/24369] и PCT/IB98/00873 [WO 98/58947]; патент США № 6251902; De Gennaro Colonna, V.  (1997), 334(2-3):201-7; и Casanueva, F. F.  (1999), 10(1):30-8), облегчения боли при артрите (Granado, M.,  (2005), 288:486-92), предотвращения или смягчения проявления болезни Альцгеймера (патенты США №№ 6686359 и 6566337) и/или лечения системной красной волчанки или воспалительного заболевания кишечника, например болезни Крона или язвенного колита (патентная публикация США № 2002/0013320).
et al., Nature,
et al., Endocrinology,
Агонистические аналоги грелина могут способствовать прибавлению в весе (патент США № 6967237; Tschop, M.  (2000), 407(6806):908-13; и Tschop, M.  (2002), 143(2):558-68), что, в свою очередь, можно использовать для поддержания желательного веса тела (патенты США №№ 6861409 и 6967237) и/или восстановления физической функции (патенты США №№ 6967237 и 6251902; и международная патентная заявка № PCT/IB96/01353 [WO 97/24369]).
et al., Endocrinology,
et al., Endocrinology,
et al., Endocrinology,
et al., Endocrinology,
et al., Drug Discovery Today,
et al., Trends Endocri. Metab.,
Грелин также повышает аппетит (патент США № 6967237; и Okada, K.  (1996), 137(11):5155-8). В силу этого, грелин часто используют для лечения пациентов, страдающих определенными заболеваниями или нарушениями, либо подвергающихся схемам лечения, обычно сопровождающимися нежелательной потерей веса, например, пациентов, страдающих анорексией (патент США № 6967237; и Tschop, M.  (2002), 143(2):558-68), булимией (патент США № 6967237), кахексией (патенты США №№ 6967237 и 6251902), особенно вызванной раком кахексией (патент США № 6967237; международная патентная заявка № PCT/DK2004/000529 [WO 05/014032]; и Tschop, M.  (2002), 143:558-68), СПИДом (патенты США №№ 6861409 и 6967237; и Tschop, M.  (2002), 143(2):558-68), синдромом атрофии у ослабленных и/или пожилых людей (патенты США №№ 6861409 и 6967237; международная патентная заявка № PCT/IB96/01353 [WO 97/24369]; и Ankerson, M.  (1999) 4:497-506), а также хронической почечной недостаточностью (Casanueva, F. F.  (1999), 10(1):30-8). Медикаментозное лечение, обычно сопровождающееся потерей веса, включает химиотерапию, лучевую терапию, временную или постоянную иммобилизацию и/или диализ (патенты США №№ 6967237 и 6251902).
et al., Lancet,
et al., Am. J. Physiol.,
et al., Horm. Res.,
et al., Drug Discovery Today,
et al., Trends Endocri. Metab.,
Ожирение является основным фактором риска для возникновения диабета, и большая часть пациентов с инсулиннезависимым сахарным диабетом (иначе называемым «NIDDM») имеют избыточный вес. Оба состояния характеризуются повышенными уровнями циркулирующего инсулина и пониженными уровнями GH. Показано, что лечение при помощи GH взрослых людей с дефицитом GH (Jorgensen, J. O.  (1989), 1(8649):1221-5), тучных женщин (Richelsen, B.  (1994), 266(2 Pt 1):E211-6) и пожилых мужчин (Rudman, D.  (1991), 36 (Suppl 1):73-81) вызывает увеличение безжировой массы тела, печеночной и мышечной массы, при этом жировая масса уменьшается. Соответственно, введение агониста грелина представляет собой привлекательную терапию ожирения, если не считать диабетогенных эффектов GH (патент США № 6251902; Ankerson, M.  (1999) 4:497-506; и Casanueva, F. F.  (1999), 10(1):30-8). Осложнения диабета, такие как ретинопатия, и/или для лечения сердечно-сосудистых заболеваний (патент США № 6967237; и публикация патентной заявки США № 2003/0211967) также можно косвенно лечить грелином.
J. Physiol. Pharmacol.,
J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol,
Считается также, что пептиды, влияющие на высвобождение гормона роста (GH), такие как GHRP-1, GHRP-2 и грелин, проявляют гастрокинетические или «прокинетические» эффекты (патент США № 6548501; Peeters, T. L.,  (2003), 54 (supp 4):95-103 и приведенные там ссылки; Trudel, L. et al.,  (2002), 282:G948-52). Вследствие этого аналоги стимуляторов секреции GH также применяют для стимуляции моторики желудочно-кишечного тракта, особенно у пациентов, страдающих пониженной моторикой желудочно-кишечного тракта в результате послеоперационной непроходимости кишечника или в результате гастропареза, связанного с возникновением диабета или хронического диабетического состояния (патент США № 6548501).
Dig. Dis.,
et al., Science,
Моторика желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) (GI) представляет собой согласованный нервно-мышечный процесс, обеспечивающий продвижение питательных веществ по пищеварительной системе (Scarpignato, C.,  (1997), 15:112), нарушение которого может приводить к различным недомоганиям, включая гастроэзофагеальное рефлюксное заболевание (GERD), гастропарез (например, диабетический и послеоперационный), синдром раздраженного кишечника (IBS), запор (например, ассоциированный с гипокинетической фазой IBS), рвоту (например, вызванную средствами противораковой химиотерапии), непроходимость кишечника и псевдозакупорку толстого кишечника (патент США № 6548501; патентная заявка США № 20040266989). Эти различные осложнения, связанные с нарушением моторики ЖКТ, вносят значительный вклад в издержки здравоохранения в промышленно развитых государствах (патент США № 6548501; Feighner, S. D.  (1999), 284:2184-8).
Dorland's Illustrated Medical Dictionary
Dorland's Illustrated Medical Dictionary,
Am. J. of Gastroentero.,
Am. J. of Gastroentero.,
«Непроходимость кишечника» означает закупорку кишечника или кишки, особенно толстой кишки (смотри, например, , p. 816, 27th ed. (W.B. Saunders Company, Philadelphia 1988)). Как правило, любая травма кишечника, в результате которой высвобождаются воспалительные медиаторы, ведущие к активации ингибирующих нервных рефлексов, приводит к возникновению непроходимости кишечника. Непроходимость кишечника можно диагностировать по нарушению нормальных согласованных движений кишечника, что приводит к невозможности проталкивания содержимого кишечника (Resnick, J.,  (1997), 92:751; Resnick, J.,  (1997), 92:934). Непроходимость кишечника следует отличать от запора, который означает редкое или затрудненное опорожнение кишечника (смотри, например,  p. 375, 27th ed. (W.B. Saunders Company, Philadelphia 1988)).
Непроходимость кишечника может быть вызвана множеством причин, таких как роды; ишемия кишечника; забрюшинная гематома; внутрибрюшинный сепсис; внутрибрюшинное воспаление, например, острый аппендицит, холецистит, панкреатит; переломы позвоночника; мочеточниковая колика; грудные повреждения; базальная пневмония; переломы ребер; инфаркт миокарда и нарушения обмена веществ. Послеродовая непроходимость кишечника является обычной проблемой у женщин в период после рождения ребенка и, как считают, возникает вследствие флуктуаций уровней природных опиоидов из-за родового стресса. Пациенты, перенесшие вмешательство, такое как большая полостная операция, включая лапаротомию, по поводу абсцесса в брюшной полости или трансплантации тонкой кишки (SITx), операция в грудной клетке, области таза или ортопедическая хирургия, часто страдают временным нарушением функции кишечника, называемым постхирургической или послеоперационной непроходимостью кишечника (далее в данном документе называемая POI).
et al., Digest. Dis. and Sci.,
POI обычно имеет место в течение 24-72 часов после операции. В некоторых случаях дисфункция кишечника может принимать весьма тяжелую форму, продолжаясь более недели и поражая более чем одну область ЖК тракта (Livingston, E. H.  (1990), 35:121). Нарушение моторики желудочно-кишечного тракта, связанное с POI, принимает наиболее тяжелую форму в толстой кишке. POI характеризуется тошнотой, вздутием живота, рвотой, стойким запором, неспособностью принимать пищу и спазмами. POI не только отсрочивает восстановление нормального приема пищи после хирургического вмешательства и продлевает госпитализацию, но также способствует развитию послеоперационных осложнений, особенно аспирационной пневмонии.
Введение пациенту после хирургического вмешательства опиоидных анальгетиков часто может способствовать и/или усиливать существующую дисфункцию кишечника, тем самым отсрочивая восстановление нормальной функции кишечника. Поскольку практически все пациенты получают опиоидные анальгетики, такие как морфин или другие наркотики, для облегчения боли после хирургической операции, особенно большой хирургической операции, существующее послеоперационное обезболивание может фактически замедлить восстановление нормальной функции кишечника, что приводит к более поздней выписке больного и увеличивает стоимость медицинского обслуживания.
et al., Gastroentero.,
Средства, которые оказывают влияние на моторику желудочно-кишечного тракта, могут также оказывать благоприятное действие на пациентов, страдающих рвотой. Рвота, или извержение рвотных масс, часто предваряется рвотными позывами и может сопровождаться сухой рвотой. Рвоту может вызывать дисбаланс в пищеварительном тракте, такой как непроходимость кишечника, диспепсия или воспаление стенки желудка, либо дисбаланс в сенсорной системе или мозге, такой как укачивание, мигрень или опухоли. Рвота может быть вызвана намеренно, как при анорексии или булимии, и может также возникать в ответ на сильную боль, эмоциональные реакции (например, в ответ на неприятное зрелище или запах), или при беременности. Рвота является обычным осложнением после введения многих лекарственных средств, особенно при противораковом лечении, таком как химиотерапия. Продолжительные приступы или повторная рвота могут приводить к различным травмам организма, включая обезвоживание и электролитный дисбаланс (Quigley, E. M.  (2001), 120:263-86).
et al., Gut,
Средства, которые оказывают влияние на моторику желудочно-кишечного тракта, могут также оказывать благоприятное действие на пациентов, страдающих гастропарезом. Гастропарез, также называемый замедленным опорожнением желудка, является заболеванием, при котором нервы, подходящие к желудку, повреждены или перестают действовать, и опорожнение желудка занимает слишком много времени. Например, после повреждения блуждающего нерва, который контролирует продвижение пищи по пищеварительному тракту, мышцы желудка и кишечника перестают работать нормально и продвижение пищи замедляется или прекращается. Высокое содержание глюкозы в крови вызывает химические изменения в нервах и повреждения кровеносных сосудов, которые переносят кислород и питательные вещества к нервам. Если уровни глюкозы в крови остаются высокими на протяжении долгого периода времени, что часто происходит при диабете, блуждающий нерв может быть поврежден; гастропарез часто возникает у людей с диабетом 1 типа или диабетом 2 типа (Murray, C. D.  (2005), 54:1693-8).
Традиционные виды терапии нарушений моторики ЖКТ, таких как непроходимость кишечника, гастропарез и рвота, считаются неэффективными. Существующие виды терапии для лечения непроходимости кишечника включают функциональную стимуляцию кишечного тракта, разжижители стула, слабительные средства, такие как дульколакс, смазывающие средства, внутривенную гидратацию, назогастральную аспирацию, прокинетические средства, раннее зондовое питание и назогастральную декомпрессию. Назогастральную интубацию для декомпрессии желудка также традиционно применяют для лечения непроходимости кишечника.
Традиционные фармацевтические препараты, применяемые для лечения нарушений моторики ЖКТ, таких как непроходимость кишечника, включают лекарственные средства, которые усиливают перистальтику толстой кишки, такие как Leu13-мотилин и простагландин F2 альфа, а также прокинетические средства, такие как цисаприд. Пропульсид, который содержит цисаприда моногидрат, представляет собой пероральное желудочно-кишечное средство (патент США № 4962115), предназначенное для симптоматического лечения взрослых пациентов с ночной изжогой вследствие гастроэзофагеального рефлюксного заболевания. Другие прокинетические средства включают, например, метоклопрамид, домперидон, ондансетрон, трописетрон, мозаприд и итоприд. Другие виды лечения включают введение антагонистов аденозина - соединений пиразолопиридина (патент США № 6214843); антагониста рецептора гипофизарного пептида, активирующего аденилатциклазу (PACAP), в сочетании с антагонистом рецептора вазоактивного пептида кишечника (VIP) (патент США № 6911430); федотозина (патент США № 5362756); нейропептидов (патент США № 5929035); и антагонистов активируемого протеиназой рецептора-2 (патент США № 5929035). В экстремальных ситуациях непроходимость кишечника лечат при помощи хирургического вмешательства, снимающего закупорку толстой кишки.
Однако данные схемы лечения сопряжены с множеством проблем. Например, пропульсид недавно был изъят из продажи из-за его способности вызывать сердечные аритмии (патент США № 6548501). В настоящее время корпорация Adolor проводит фазу III клинических испытаний способа лечения послеоперационной непроходимости кишечника при помощи алвимопана (энтерег). Однако в терапии корпорации Adolor применяют антагонисты опиоидного рецептора, которые всего лишь блокируют побочные эффекты опиатных анальгетиков, а не облегчают в действительности состояние непроходимости кишечника. Результаты фазы III испытаний свидетельствуют о предельно низкой эффективности и минимальной применимости средства для лечения непроходимости кишечника, особенно послеоперационной непроходимости кишечника.
Более того, данные способы предшествующего уровня техники для лечения нарушений моторики ЖКТ не обладают специфичностью в отношении различных видов нарушений, например, послеоперационной непроходимости кишечника или послеродовой непроходимости кишечника. Кроме того, данные способы предшествующего уровня техники не способны предотвращать нарушения моторики ЖКТ, такие как непроходимость кишечника, гастропарез и рвота. Если бы удалось предотвращать или более эффективно лечить нарушения моторики ЖКТ, такие как непроходимость кишечника, гастропарез и рвота, длительность пребывания в больнице, восстановительный период и медицинские затраты можно было бы значительно сократить и при этом свести к минимуму дискомфорт пациента.
Лекарственные средства, которые избирательно направлены на моторику кишечника с целью исправления желудочно-кишечной дисфункции, вызванной послеоперационной непроходимостью кишечника, являлись бы идеальными средствами-кандидатами для предотвращения и/или лечения послеоперационной и послеродовой непроходимости кишечника. Такие лекарственные средства являлись бы также превосходными средствами-кандидатами для лечения гастропареза и/или рвоты, особенно рвоты, связанной с желудочно-кишечной дисфункцией, вызванной химиотерапией или другими лекарственными средствами. Среди них лекарственные средства, которые не мешают действию опиоидных анальгетиков, принесут наибольшую пользу, поскольку их можно вводить одновременно с лекарственными средствами для обезболивания при минимальных побочных эффектах.
J. Physiol. Pharmacol.,
J. Physiol. Pharmacol.,
et al., J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol.,
et al., Peptides,
et al., Neurogastroenterol. Motil.,
В ряде недавних исследований продемонстрирована потенциальная возможность использования GHS, таких как грелин, GHRP-6 и другие, для стимуляции моторики кишечного тракта и для лечения состояний, таких как непроходимость кишечника и рвота. Например, показано, что грелин и GHRP-6 ускоряют опорожнение желудка у крыс и мышей (Peeters, T. L.,  (2003), 54 (supp 4):95-103). Показано, что у крыс грелин отменяет задержку опорожнения желудка на модели послеоперационной непроходимости кишечника (Peeters, T. L.,  (2003), 54 (supp 4):95-103; Trudel, L.  (2002), 282(6):G948-52), а также показано, что у собак, подвергшихся лапаректомии, грелин облегчает POI у животных, подвергшихся лечению (Trudel, L.  (2003), 24:531-4). У мышей с сепсисом грелин и GHRP-6 ускоряли опорожнение желудка, хотя оказывали незначительный эффект на увеличение проходимости в тонком кишечнике (De Winter, B. Y.  (2004), 16:439-46).
et al., Peptides,
В экспериментах, спланированных так, чтобы имитировать условия госпитализации пациентов-людей, страдающих POI, подвергшихся лапаректомии крысам, вводили опиаты, а также аналог грелина RC-1139 (Poitras, P.  (2005), 26:1598-601). При аналитическом измерении опорожнения желудка установлено, что RC-1139 отменяет POI у контрольных и лапаректомированных крыс в присутствии морфина. Таким образом, сделан вывод, что грелин обладает гастрокинетическими эффектами, не препятствуя проявлению активности опиатов.
et al., Neurosci. Lett.,
У хорьков, подвергшихся воздействию цитотоксического противоракового средства цисплатина, наблюдали значительно меньшее число отрыжек и рвоты после введения грелина в желудочки мозга (Rudd, J. A.  (2006), 392:79-83), что явилось подтверждением способности грелина уменьшать рвоту, в полном согласии с его ролью в модуляции желудочно-кишечных функций. Считается, что роль грелина в модуляции моторики желудка не зависит от активации секреции GH и может быть опосредована вагально-холинергическим мускариновым каскадом реакций (патентная заявка США № 20060025566).
et al., Gut,
Показано также, что грелин стимулирует опорожнение желудка у пациентов с диабетическим гастропарезом (Murray, C. D. (2005), 54:1693-8).
Интересно отметить, что в приведенных выше исследованиях грелин или аналог грелина вводили внутрибрюшинной (в/б) (ip), внутривенной (в/в) (iv) или внутрижелудочковой (в/ж) (icv) инъекцией. В описаниях из других источников (патент США № 6548501; патентная заявка США № 20020042419; патентная заявка США № 20050187237; патентная заявка США № 20060025566) сообщается о пероральном введении GHS в качестве средств для лечения нарушенной моторики желудочно-кишечного тракта.
В данной области известно крайне мало соединений, которые являются полезными для лечения нарушенной моторики ЖКТ, и существует большая потребность в новых соединениях, оказывающих влияние на моторику желудочно-кишечного тракта, например, стимулирующих моторику. Соединения, оказывающие влияние на кинетику желудочно-кишечного тракта, являются полезными для лечения нарушений нормальных функций ЖКТ, таких как непроходимость кишечника и рвота.
Парадоксально, но антагонисты грелина можно также применять для достижения благоприятного эффекта у пациентов (патентные публикации США №№ 2002/187938, 2003/0211967 и 2004/0157227; а также патент США № 6967237). Например, соединения, оказывающие антагонистическое действие на рецептор GHS, способствуя подавлению секреции GH, например, антагонистические аналоги грелина, показаны для отмены избыточной секреции GH (публикация патентной заявки США № 2002/0187938), для содействия потере веса у людей, не страдающих ожирением (патент США № 6967237), для поддержания идеального веса и/или для снижения аппетита (патент США № 6967237). Антагонисты грелина можно также применять для содействия потере веса у тучных людей, если указанная тучность не возникает вследствие развития NIDDM (патент США № 6967237; и публикация патентной заявки США № 2003/0211967).
et al., J. Clin. Endocri. Metab.,
et al., Nat. Med.,
Избыточный вес является фактором, способствующим возникновению многих заболеваний или состояний, таких как гипертензия, дислипидемия и сердечно-сосудистое заболевание (публикация патентной заявки США № 2003/0211967; и патент США № 6967237), а также желчные камни, остеоартрит (патент США № 6967237), определенные виды рака (публикация патентной заявки США №№ 2003/0211967 и 2004/0157227; а также патент США № 6967237) и синдром Прадера-Вилли (патент США № 6950707; международная патентная заявка № PCT/US2004/008385 [WO 04/084943]; Haqq, A. M.  (2003), 88(1):174-8; и Cummings, D. E.  (2002), 8(7):643-4). Антагонисты грелина, которые способствуют снижению веса, вследствие этого будут снижать вероятность подобных заболеваний или состояний и/или являться по меньшей мере частью лечения таких заболеваний или состояний. Также описаны антагонисты молекул GHS, демонстрирующие связывание с онкогенной тканью, что приводило к уменьшению числа онкогенных клеток в тканях-мишенях, например, опухолях легкого, молочных желез, щитовидной железы или поджелудочной железы (международная патентная заявка № PCT/EP99/08662 [WO 00/29011]).
et al., Endocrin.,
et al., Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol.,
Природный грелин, однако, имеет относительно короткое время полужизни, что ограничивает доступные пути введения и дозы, необходимые для достижения заметного эффекта на употребление пищи и/или снижение веса. Имеются сообщения, что кажущееся время полужизни экзогенного грелина в организме крыс составляет 30 минут (Tolle, V.  (2002), 143:1353-61), а в организме человека - только 10 минут (Nagaya, N.  (2001), 280:R1483-R1487). Учитывая широкое разнообразие благоприятных воздействий, которые должны оказывать GHS, в данной области существует потребность в эффективных биологически стабильных молекулах аналогов грелина.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Аналоги грелина, описанные в данном документе, проявляют активность в отношении рецептора GHS. Данные аналоги могут связываться с рецептором и стимулировать или ингибировать активность рецептора GHS. Аналоги грелина имеют множество различных применений, включая, но не ограничиваясь ими, применение в качестве инструмента исследования или в качестве терапевтического средства.
Установлено, что аналоги грелина с замещениями синтетическими аминокислотами изонипекотиновой кислотой (Inp) или  (1-Apc или 4-Apc) на N-конце обладают большей устойчивостью к протеолизу по сравнению с природным грелином, а также повышенной активностью в отношении рецептора GHS.
1
28
2
Аспект настоящего изобретения относится к аналогам грелина, где первая аминокислота, перечисленная в определениях от A до A, представляет собой аминокислоту, обнаруженную в соответствующем положении в последовательности природного грелина, то есть H-Gly-Ser-Ser-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Arg-Val-Gln-Gln-Arg-Lys-Glu-Ser-Lys-Lys-Pro-Pro-Ala-Lys-Leu-Gln-Pro-Arg-NH (SEQ ID NO:1), за исключением первой аминокислоты в последовательности, то есть N-концевого остатка, имеющей формулу (I):
2
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
1
(R)-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-R
(I)
в которой:
1
A представляет собой Inp, 1-Apc или 4-Apc;
2
A представляет собой Ser, Abu, Acc, Act, Aib, Ala, Ava, Thr или Val;
3
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
2
2
2
n
A представляет собой Ser, Asp(NH-R), Asp(O-R), Cys(S-R), Dab(S(O)-R), Dap(S(O)-R), Glu(NH-R), Glu(O-R), Ser(C(O)-R), Thr(C(O)-R) или HN-CH((CH)-N(RR))-C(O);
4
1
2
3
4
5
A представляет собой Phe, Acc, Aic, Cha, 2-Fua, 1-Nal, 2-Nal, 2-Pal, 3-Pal, 4-Pal, hPhe, (X,X,X,X,X)Phe, Taz, 2-Thi, 3-Thi, Trp или Tyr;
5
A представляет собой Leu, Abu, Acc, Aib, Ala, Cha, Ile, hLeu, Nle, Nva, Phe, Tle или Val;
6
A представляет собой Ser, Abu, Acc, Act, Aib, Ala, Gly, Thr или Val;
7
A представляет собой Pro, Dhp, Dmt, 3-Hyp, 4-Hyp, Inc, Ktp, Oic, Pip, Thz или Tic;
8
12
13
2
n
A представляет собой Glu, Acc, Aib, Arg, Asn, Asp, Dab, Dap, Gln, Lys, Orn или HN-CH((CH)-N(RR))-C(O);
9
1
2
3
4
5
A представляет собой His, Acc, Apc, Aib, 2-Fua, 2-Pal, 3-Pal, 4-Pal, (X,X,X,X,X)Phe, Taz, 2-Thi или 3-Thi;
10
A представляет собой Gln, Acc, Aib, Asn, Asp или Glu;
11
12
13
2
n
A представляет собой Arg, Apc, hArg, Dab, Dap, Lys, Orn или HN-CH((CH)-N(RR))-C(O);
12
A представляет собой Val, Abu, Acc, Aib, Ala, Cha, Gly, Ile, Leu, Nle, Nva или Tle;
13
A представляет собой Gln, Acc, Aib, Asn, Asp или Glu;
14
A представляет собой Gln, Acc, Aib, Asn, Asp или Glu;
15
A представляет собой Arg, Acc, Aib, Apc, hArg, Dab, Dap, Lys или Orn;
16
A представляет собой Lys, Acc, Aib, Apc, Arg, hArg, Dab, Dap, Orn или делетирована;
17
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
2
2
2
n
A представляет собой Glu, Arg, Asn, Asp, Dab, Dap, Gln, Lys, Orn, Asp(NH-R), Asp(O-R), Cys(S-R), Dab(S(O)-R), Dap(S(O)-R), Glu(NH-R), Glu(O-R), Ser(C(O)-R), Thr(C(O)-R), HN-CH((CH)-N(RR))-C(O) или делетирована;
18
A представляет собой Ser, Abu, Acc, Act, Aib, Ala, Thr, Val или делетирована;
19
A представляет собой Lys, Acc, Aib, Apc, Arg, hArg, Dab, Dap, Orn или делетирована;
20
A представляет собой Lys, Acc, Aib, Apc, Arg, hArg, Dab, Dap, Orn или делетирована;
21
A представляет собой Pro, Dhp, Dmt, 3-Hyp, 4-Hyp, Inc, Ktp, Oic, Pip, Thz, Tic или делетирована;
22
A представляет собой Pro, Dhp, Dmt, 3-Hyp, 4-Hyp, Inc, Ktp, Oic, Pip, Thz, Tic или делетирована;
23
A представляет собой Ala, Abu, Acc, Act, Aib, Apc, Gly, Nva, Val или делетирована;
24
12
13
2
n
A представляет собой Lys, Acc, Aib, Apc, Arg, hArg, Dab, Dap, Orn, HN-CH((CH)-N(RR))-C(O) или делетирована;
25
A представляет собой Leu, Abu, Acc, Aib, Ala, Cha, Ile, hLeu, Nle, Nva, Phe, Tle, Val или делетирована;
26
A представляет собой Gln, Aib, Asn, Asp, Glu или делетирована;
27
A представляет собой Pro, Dhp, Dmt, 3-Hyp, 4-Hyp, Inc, Ktp, Oic, Pip, Thz, Tic или делетирована;
28
12
13
2
n
A представляет собой Arg, Acc, Aib, Apc, hArg, Dab, Dap, Lys, Orn, HN-CH((CH)-N(RR))-C(O) или делетирована;
1
6
0
6
0
2
1
30
2
1
12
2
12
2
2
R представляет собой -OH, -NH, -(C-C)алкокси или NH-X-CH-Z, где X представляет собой (С-C)алкил или (С-C)алкенил и Z представляет собой -H, -OH, -COH или -C(O)-NH;
2
1
30
1
30
1
30
2
30
2
30
1
30
1
30
1
30
1
30
2
30
2
30
1
30
2
30
1
30
R представляет собой H, (C-C)алкил, (C-C)гетероалкил, (C-C)ацил, (C-C)алкенил, (C-C)алкинил, арил(C-C)алкил, арил(C-C)ацил, замещенный (C-C)алкил, замещенный (C-C)гетероалкил, замещенный (C-C)ацил, замещенный (C-C)алкенил, замещенный арил(C-C)алкил, замещенный (C-C)алкинил или замещенный арил(C-C)ацил;
3
4
5
6
7
8
9
10
11
1
40
2
40
1
40
2
40
каждый из R, R, R, R, R, R, R, R и R независимо в каждом случае выбирают из группы, состоящей из (C-C)алкила, (C-C)алкенила, замещенного (C-C)алкила, замещенного (C-C)алкенила, алкиларила, замещенного алкиларила, арила и замещенного арила;
12
13
1
40
1
40
1
40
2
40
2
40
1
40
1
40
1
40
1
40
1
40
2
40
2
40
1
40
1
40
1
40
2
каждый из R и R независимо в каждом случае выбирают из группы, состоящей из H, (C-C)алкила, (C-C)гетероалкила, (C-C)ацила, (C-C)алкенила, (C-C)алкинила, арил(C-C)алкила, арил(C-C)ацила, замещенного (C-C)алкила, замещенного (C-C)гетероалкила, замещенного (C-C)ацила, замещенного (C-C)алкенила, замещенного (C-C)алкинила, замещенного арил(C-C)алкила, замещенного арил(C-C)ацила, (C-C)алкилсульфонила или -C(NH)-NH;
n независимо в каждом случае равен 1, 2, 3, 4 или 5;
1
2
3
4
5
1-10
1-10
2
2
каждый из X, X, X, X и X независимо в каждом случае выбирают из группы, состоящей из H, F, Cl, Br, I, (C)алкила, замещенного (C)алкила, арила, замещенного арила, OH, NH, NO и CN;
при условии, что:
12
13
1
40
1
40
1
40
1
40
1
40
2
1
40
1
40
2
40
2
40
1
40
1
40
1
40
2
40
2
40
1
40
если R представляет собой (C-C)ацил, арил(C-C)ацил, замещенный (C-C)ацил, замещенный арил(C-C)ацил, (C-C)алкилсульфонил или -C(NH)-NH, то R представляет собой H или (C-C)алкил, (C-C)гетероалкил, (C-C)алкенил, (C-C)алкинил, арил(C-C)алкил, замещенный (C-C)алкил, замещенный (C-C)гетероалкил, замещенный (C-C)алкенил, замещенный (C-C)алкинил или замещенный арил(C-C)алкил; или их фармацевтически приемлемую соль.
группой 1
Предпочтительной группой соединений, соответствующих вышеприведенной формуле (I), называемой  соединений, является такая, в которой:
2
A представляет собой Ser или Aib,
3
8
A представляет собой Ser или Glu(NH-R),
4
A представляет собой Phe,
5
A представляет собой Leu,
6
A представляет собой Ser,
7
A представляет собой Pro,
8
A представляет собой Glu или Aib,
9
A представляет собой His,
10
A представляет собой Gln или Aib,
11
A представляет собой Arg,
12
A представляет собой Val,
13
A представляет собой Gln,
14
A представляет собой Gln,
15
A представляет собой Arg,
16
A представляет собой Lys,
17
10
A представляет собой Glu или Ser(C(O)-R),
18
A представляет собой Ser,
19
A представляет собой Lys,
20
A представляет собой Lys,
21
A представляет собой Pro,
22
A представляет собой Pro,
23
A представляет собой Ala,
24
A представляет собой Lys,
25
A представляет собой Leu,
26
A представляет собой Gln;
27
A представляет собой Pro, и
28
A представляет собой Arg,
или их фармацевтически приемлемую соль.
группой 2
Другой предпочтительной группой соединений вышеприведенной формулы, называемой  соединений, является такая, в которой:
1
2
R представляет собой NH,
2
R представляет собой H или ацил,
8
R представляет собой гексил, и
10
R представляет собой октанил,
или их фармацевтически приемлемые соли.
группой 3
Еще более предпочтительной группой соединений из непосредственно предшествующей группы соединений, называемой  соединений, являются соединения, в которых:
2
A представляет собой Aib,
3
A представляет собой Glu(NH-гексил),
8
A представляет собой Aib,
10
A представляет собой Aib, и
17
A представляет собой Ser(н-октаноил),
или их фармацевтически приемлемую соль.
группой 4
Другая предпочтительная группа соединений, соответствующих вышеприведенной формуле (I), называемая повсеместно  соединений, состоит из соединений формулы:
1
2
(Inp)чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:5)
1
2
2
(Inp, Aib)чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:6)
1
2
3
2
(Inp, Aib, Glu(NH-гексил))чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:7)
1
2,10
2
(Inp, Aib)чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:8)
1
2,8
2
(Inp, Aib)чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:9)
1
2
17
2
(Inp, Aib, Ser(н-октаноил))чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:10)
1
17
2
(Inp, Ser(н-октаноил))чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:11) и
1
2,8
17
2
(Inp, Aib, Ser(н-октаноил))чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:12)
1
3
2
[Inp, Ser]чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:13)
1
2
3
2
[Inp, Aib, Ser]чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:14)
1
2
3
17
2
[Inp, Aib, Ser, Ser(н-октаноил))чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:15)
1
2,10
3
2
[Inp, Aib, Ser]чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:16)
или их фармацевтически приемлемые соли.
1
1
2
17
2
2
В одном аспекте предпочтительным соединением из вышеуказанных является (Inp)чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:5) или его фармацевтически приемлемая соль. В другом аспекте предпочтительным соединением из вышеуказанных является (Inp, Aib, Ser(н-октаноил))чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:10) или его фармацевтически приемлемая соль.
1
1
2
17
2
2
В одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество соединения вышеуказанной формулы, более предпочтительно соединения, соответствующего одному или нескольким из группы 1, группы 2, группы 3, группы 4, (Inp)чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:5) и/или (Inp, Aib, Ser(н-октаноил))чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:10), как определено выше в данном описании, или его фармацевтически приемлемой соли, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
Применение в качестве инструмента исследования, как правило, включает использование аналога грелина и наличие рецептора GHS или его фрагмента. Рецептор GHS может присутствовать в различном окружении, таком как субъект-млекопитающее, целая клетка или фрагмент мембраны. Примеры применений в качестве инструмента исследования включают, но не ограничиваются ими, скрининг соединений, активных в отношении рецептора GHS, определение наличия рецептора GHS в образце или препарате и изучение роли или эффекта грелина.
Аналоги грелина можно использовать для скрининга как агонистов грелина, так и антагонистов грелина. Скрининг агонистов грелина можно проводить, например, используя аналог грелина в эксперименте по конкуренции с тестируемыми соединениями. Скрининг антагонистов грелина можно проводить, например, используя аналог грелина, чтобы вызывать активность рецептора GHS, а затем определять способность соединения изменять активность рецептора GHS.
1
1
2
17
2
2
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу скрининга соединения, способного связываться с рецептором GHS. Способ включает стадию определения способности соединения оказывать влияние на связывание аналога грелина с рецептором, фрагментом рецептора, содержащим центр связывания грелина, полипептидом, содержащим фрагмент, или производным полипептида. Соединения, применимые для скрининга, включают соединения вышеприведенной формулы, более предпочтительно соединения, соответствующие одному или нескольким из группы 1, группы 2, группы 3 группы 4, (Inp)чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:5) и/или (Inp, Aib, Ser(н-октаноил))чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:10), как определено выше в данном описании, или их фармацевтически приемлемой соли, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
1
1
2
17
2
2
В другом аспекте изобретение относится к способу вызывания реакции с рецептора грелина у субъекта, нуждающегося в этом, который включает введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения аналога грелина, относящегося к группе 1, группе 2, группе 3, группе 4, (Inp)чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:5) и/или (Inp, Aib, Ser(н-октаноил))чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:10), как определено выше в данном описании, или его фармацевтически приемлемой соли, либо композиции из него, как определено в данном описании.
1
1
2
17
2
2
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу достижения благоприятного эффекта у субъекта, включающему введение указанному субъекту эффективного количества одного или нескольких соединений, соответствующих вышеприведенной формуле, более предпочтительно соединений, соответствующих одному или нескольким из группы 1, группы 2, группы 3 группы 4, (Inp)чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:5) и/или (Inp, Aib, Ser(н-октаноил))чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:10), как определено выше в данном описании, или его фармацевтически приемлемой соли, либо композиции из него, как определено в данном описании, где указанное эффективное количество является эффективным для получения благоприятного эффекта, способствующего лечению (например, излечению или снижению тяжести) или предотвращению (например, снижению вероятности возникновения или тяжести) заболевания или нарушения.
et al., Nature
1
1
2
17
2
2
Грелин индуцирует высвобождение GH из клеток первичной культуры гипофиза дозозависимым образом без стимуляции высвобождения других гипофизарных гормонов. Будучи инъецированным внутривенно анестезированным крысам, грелин стимулировал пульсирующее высвобождение GH (Kojima, M.  (1999), 402(6762):656-60), таким образом, другой аспект настоящего изобретения относится к способу стимуляции секреции GH у субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение эффективного количества одного или нескольких соединений-агонистов, соответствующих формуле (I), более предпочтительно соединения-агониста, соответствующего одному или нескольким из группы 1, группы 2, группы 3, группы 4, (Inp)чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:5) и/или (Inp, Aib, Ser(н-октаноил))чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:10), как определено выше в данном описании, или его фармацевтически приемлемой соли, либо композиции из него, как определено в данном описании, где указанное эффективное количество является по меньшей мере количеством, достаточным для получения детектируемого увеличения секреции GH, и, предпочтительно, является количеством, достаточным для достижения благоприятного эффекта у пациента.
Предпочтительным вариантом непосредственно предшествующего способа является такой, в котором указанная стимуляция секреции GH показана для лечения GH-дефицитного состояния, увеличения мышечной массы и/или плотности костей, преодоления половой дисфункции, прибавления в весе и/или поддержания идеального веса тела, поддержания и/или восстановления физических функций и/или повышения аппетита.
Предпочтительным вариантом непосредственно предшествующего способа является такой, в котором указанное прибавление в весе или его поддержание, либо повышение аппетита показаны пациенту, страдающему заболеванием или нарушением либо подвергающемуся лечению, сопровождающимися потерей веса.
Предпочтительным вариантом непосредственно предшествующего способа является такой, в котором указанное заболевание, сопровождаемое потерей веса, связано с кахексией, которое включает, но не ограничивается ими, анорексию, булимию, рак, СПИД и хроническое обструктивное заболевание легких (COPD). Другим аспектом непосредственно предшествующего способа является такой, в котором указанная потеря веса происходит в результате возникновения синдрома атрофии, особенно у ослабленных или пожилых людей. Дополнительный предпочтительный вариант предшествующего способа заключается в содействии прибавлению в весе после необъяснимой потери веса у здоровых в других отношениях пожилых пациентов, либо в предотвращении, лечении или ослаблении проявлений болезни Альцгеймера. Еще одним предпочтительным вариантом непосредственно предшествующего способа является такой, в котором указанные методы лечения, сопровождающиеся потерей веса, включают химиотерапию, лучевую терапию, временную иммобилизацию, постоянную иммобилизацию и диализ.
Другим предпочтительным вариантом непосредственно предшествующего способа является такой, в котором указанное прибавление в весе или поддержание его и/или повышение аппетита показано здоровым в других отношениях пациентам, не страдающим конкретным заболеванием или нарушением, или не подвергающимся одному из вышеперечисленных методов лечения.
1
1
2
17
2
2
SEQ ID NO:5
SEQ ID NO:10
В другом аспекте изобретение относится к способу лечения хронического обструктивного заболевания легких у субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение эффективного количества одного или нескольких соединений, соответствующих формуле (I), более предпочтительно соединения, соответствующего одному или нескольким из группы 1, группы 2, группы 3, группы 4, (Inp)чГрелин(1-28)-NH () и/или (Inp, Aib, Ser(н-октаноил))чГрелин(1-28)-NH (), как определено выше в данном описании, или его фармацевтически приемлемой соли, либо композиции из него, как определено в данном описании.
1
1
2
17
2
2
Настоящее изобретение относится к способу стимулирования моторики желудочно-кишечного тракта у пациента (например, млекопитающего, такого как человек). Способ включает стадию введения терапевтически эффективного количества одного или нескольких соединений, соответствующих вышеуказанной формуле, более предпочтительно соединений, соответствующих одному или нескольким из группы 1, группы 2, группы 3, группы 4, (Inp)чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:5) и/или (Inp, Aib, Ser(н-октаноил))чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:10), как определено выше в данном описании, или их фармацевтически приемлемых солей, либо композиции из них, как определено в данном описании, указанному пациенту, страдающему нарушением, или находящемуся под угрозой нарушения моторики желудочно-кишечного тракта.
1
1
2
17
2
2
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения состояний нарушения моторики желудочно-кишечного тракта путем введения терапевтически эффективного количества пептидильного аналога грелина или пролекарства на его основе, способного облегчать такие состояния желудочно-кишечного тракта, где аналог или пролекарство включает одно или несколько соединений, соответствующих вышеуказанной формуле, более предпочтительно соединений, соответствующих одному или нескольким из группы 1, группы 2, группы 3, группы 4, (Inp)чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:5) и/или (Inp, Aib, Ser(н-октаноил))чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:10), как определено выше в данном описании, или их фармацевтически приемлемых солей, либо композиции из них, как определено в данном описании. Способ по изобретению является полезным для стимуляции моторики желудка и желудочно-кишечного тракта у пациента (например, млекопитающего, такого как человек), и ввиду этого является полезным для лечения состояний, облегчение которых наступает в результате повышения моторики желудка и желудочно-кишечного тракта, таких как гастроэзофагеальное рефлюксное заболевание (GERD), синдром раздраженного кишечника (IBS), запор, непроходимость кишечника, рвота, гастропарез, псевдозакупорка толстого кишечника, и тому подобное.
1
1
2
17
2
2
В другом аспекте изобретение относится к способу, применимому для стимуляции моторики желудка и желудочно-кишечного тракта у пациента (например, млекопитающего, такого как человек) путем введения терапевтически эффективного количества одного или нескольких соединений, соответствующих вышеуказанной формуле, более предпочтительно соединений, соответствующих одному или нескольким из группы 1, группы 2, группы 3, группы 4, (Inp)чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:5) и/или (Inp, Aib, Ser(н-октаноил))чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:10), как определено выше в данном описании, или их фармацевтически приемлемых солей, либо композиции из них, как определено в данном описании, где нарушение моторики желудка или непроходимость кишечника связана с введением опиата, такого как морфин, но не ограничиваясь им.
1
1
2
17
2
2
В другом аспекте изобретение относится к способу лечения непроходимости кишечника, гастропареза или рвоты путем введения терапевтически эффективного количества одного или нескольких соединений, соответствующих вышеуказанной формуле, более предпочтительно соединений, соответствующих одному или нескольким из группы 1, группы 2, группы 3, группы 4, (Inp)чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:5) и/или (Inp, Aib, Ser(н-октаноил))чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:10), как определено выше в данном описании, или их фармацевтически приемлемых солей, либо композиции из них, как определено в данном описании, способных облегчать непроходимость кишечника, рвоту или гастропарез. В еще одном аспекте состояние, излечиваемое способом по изобретению, представляет собой непроходимость кишечника, такую как послеоперационная непроходимость кишечника, а операция может являться операцией на желудочно-кишечном тракте, такой как хирургия брюшной полости. Послеоперационная непроходимость кишечника может возникать на любом участке пищеварительного тракта, например в желудке, тонком кишечнике или толстом кишечнике. Послеоперационная непроходимость кишечника может сопровождаться присутствием морфина. В другом аспекте непроходимость кишечника бывает вызвана иным фактором, чем желудочно-кишечная хирургия, и может возникать на любом участке пищеварительного тракта, например в желудке, тонком кишечнике или толстом кишечнике. В еще одном аспекте изобретения состояние, излечиваемое способом по изобретению, представляет собой рвоту, такую как рвоту, связанную с, или вызванную введением противоракового химиотерапевтического средства, беременностью, булимией или анорексией. В еще одном аспекте изобретения состояние, излечиваемое способом по изобретению, представляет собой гастропарез, такой как диабетический гастропарез. Диабет может являться диабетом I типа или II типа.
1
1
2
17
2
2
В другом аспекте изобретение относится к способу осуществления хирургического вмешательства на пациенте, который включает введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества одного или нескольких соединений, соответствующих вышеуказанной формуле, более предпочтительно соединений, соответствующих одному или нескольким из группы 1, группы 2, группы 3, группы 4, (Inp)чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:5) и/или (Inp, Aib, Ser(н-октаноил))чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:10), как определено выше в данном описании, или их фармацевтически приемлемых солей, либо композиции из них, как определено в данном описании. В одном варианте осуществления непосредственно предшествующего способа осуществления хирургического вмешательства включает выявление пациента, нуждающегося в указанном хирургическом вмешательстве.
1
1
2
17
2
2
В одном варианте осуществления способа проведения хирургического вмешательства хирургическое вмешательство может прямо или косвенно затрагивать желудочно-кишечный тракт. Виды хирургического вмешательства, при которых может быть полезным применение способа по данному изобретению, включают, но не ограничиваются ими, лапаротомию, трансплантационную хирургию, хирургию мочеполовой системы, хирургию лимфатической системы, хирургию дыхательной системы и хирургическое удаление раковой опухоли из любого органа или ткани в брюшной полости. Соединения, применимые для осуществления способа проведения хирургического вмешательства, соответствующие одному или нескольким из группы 1, группы 2, группы 3, группы 4, (Inp)чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:5) и/или (Inp, Aib, Ser(н-октаноил))чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:10), как определено выше в данном описании, или их фармацевтически приемлемым солям, либо их композициям, как определено в данном описании, можно вводить до, во время или после хирургического вмешательства, либо в любом их сочетании.
1
1
2
17
2
2
В другом аспекте изобретение относится к способу предотвращения послеоперационной непроходимости кишечника у пациента, нуждающегося в этом, который включает введение указанному пациенту до, во время или после хирургического вмешательства, либо в любом их сочетании, терапевтически эффективного количества одного или нескольких соединений, соответствующих вышеуказанной формуле, более предпочтительно соединений, соответствующих одному или нескольким из группы 1, группы 2, группы 3, группы 4, (Inp)чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:5) и/или (Inp, Aib, Ser(н-октаноил))чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:10), как определено выше в данном описании, или их фармацевтически приемлемых солей, либо композиции из них, как определено в данном описании.
1
1
2
17
2
2
В другом аспекте изобретение относится к способу предотвращения рефлюксного заболевания, рвоты, гастропареза, синдрома раздраженного кишечника, запора или псевдозакупорки толстого кишечника у пациента, нуждающегося в этом, который включает введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества одного или нескольких соединений, соответствующих вышеуказанной формуле, более предпочтительно соединений, соответствующих одному или нескольким из группы 1, группы 2, группы 3, группы 4, (Inp)чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:5) и/или (Inp, Aib, Ser(н-октаноил))чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:10), как определено выше в данном описании, или их фармацевтически приемлемых солей, либо композиции из них, как определено в данном описании. Рвота может быть связана с лечением противораковым химиотерапевтическим средством, беременностью, булимией или анорексией. Гастропарез может быть связан с диабетом; диабет может быть диабетом I типа или диабетом II типа.
группой 5
Вторая наиболее предпочтительная группа соединений, соответствующих вышеуказанной формуле (I), называемая в тексте данного документа соединений, состоит из соединений, соответствующих формуле:
1
2,10
3
2
(Inp, Aib, Glu(NH-гексил))чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:17)
1
2,10
3
2
(1-Apc, Aib, Glu(NH-гексил))чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:18)
1
2,10
3
2
(Ac-Inp, Aib, Glu(NH-гексил))чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:19) и
1
2,10
3
2
(Ac-1-Apc, Aib, Glu(NH-гексил))чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:20),
или их фармацевтически приемлемых солей.
1
2,10
3
1
2,10
3
1
2,10
3
1
2,10
3
2
2
2
2
В одном аспекте предпочтительным соединением является (Inp, Aib, Glu(NH-гексил))чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:17) или его фармацевтически приемлемая соль. В другом аспекте предпочтительным соединением является (1-Apc, Aib, Glu(NH-гексил))чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:18) или его фармацевтически приемлемая соль. В другом аспекте предпочтительным соединением является (Ac-Inp, Aib, Glu(NH-гексил))чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:19) или его фармацевтически приемлемая соль. В другом аспекте предпочтительным соединением является (Ac-1-Apc, Aib, Glu(NH-гексил))чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:20) или его фармацевтически приемлемая соль.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество соединения вышеуказанной формулы, более предпочтительно соединения, относящегося к группе 5, как определено выше в данном описании, или его фармацевтически приемлемой соли, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
В одном аспекте изобретение относится к способу скрининга соединения, способного связываться с рецептором GHS, включающему определение способности соединения влиять на связывание соединения, относящегося к группе 5, как определено выше в данном описании, или его фармацевтически приемлемой соли, с рецептором, с фрагментом рецептора, с полипептидом, содержащим фрагмент рецептора, или с производным полипептида.
В другом аспекте изобретение относится к способу вызывания реакции с рецептора грелина у субъекта, нуждающегося в этом, который включает введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения аналога антагониста грелина, относящегося к группе 5, как определено выше в данном описании, или его фармацевтически приемлемой соли, либо композиции из него, как определено в данном описании.
В другом аспекте изобретение относится к способу достижения благоприятного эффекта у субъекта, включающему введение субъекту эффективного количества соединения аналога грелина, относящегося к группе 5, как определено выше в данном описании, или его фармацевтически приемлемой соли, либо композиции из него, как определено в данном описании, где эффективное количество является эффективным для получения благоприятного эффекта, способствующего излечению или снижению тяжести, или уменьшению вероятности возникновения или степени тяжести заболевания или нарушения. В одном аспекте благоприятный эффект способствует излечению или снижению тяжести, или уменьшению вероятности возникновения или степени тяжести заболевания или нарушения.
В клиническом плане избыточную секрецию GH считают неотъемлемым свойством многих заболеваний или состояний. Другой аспект настоящего изобретения относится к способу подавления секреции GH у субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение эффективного количества одного или нескольких соединений, относящихся к группе 5, как определено выше в данном описании, или их фармацевтически приемлемых солей, либо композиции из них, как определено в данном описании, где указанное эффективное количество является по меньшей мере количеством, достаточным для получения детектируемого снижения секреции GH, и, предпочтительно, является количеством, достаточным для достижения благоприятного эффекта у пациента.
Соединения антагонистов грелина, относящиеся к группе 5, как определено выше в данном описании, или их фармацевтически приемлемые соли, или композиции из них, как определено в данном описании, можно также использовать для достижения благоприятного эффекта у пациента. Предпочтительным вариантом непосредственно предшествующего способа является такой, где указанное подавление секреции GH показано для содействия снижению веса и/или уменьшению аппетита, поддержанию идеального веса тела, избавлению от ожирения, лечению диабета и его осложнений, таких как ретинопатия, и/или облегчению сердечно-сосудистых заболеваний. Избыточный вес является фактором, способствующим возникновению различных заболеваний, включая, но не ограничиваясь ими, гипертензию, диабет, дислипидемию, сердечно-сосудистое заболевание, образование желчных камней, остеоартрит, синдром Прадера-Вилли и/или определенные формы рака. Доказано, что снижение веса уменьшает вероятность таких заболеваний, если является частью показанного лечения таких заболеваний.
В другом аспекте изобретение относится к способу подавления секреции гормона роста у субъекта, нуждающегося в таком подавлении, включающему стадию введения субъекту эффективного количества соединения аналога грелина, относящегося к группе 5, как определено выше в данном описании, или его фармацевтически приемлемых солей, либо композиции из него, как определено в данном описании, где эффективное количество является по меньшей мере количеством, достаточным для получения детектируемого снижения секреции гормона роста.
В одном варианте непосредственно предшествующего аспекта подавление секреции гормона роста показано для лечения заболевания или состояния, характеризующегося избыточной секрецией гормона роста, для содействия потере избыточного веса тела, для содействия снижению аппетита, для содействия поддержанию веса тела, для лечения ожирения, для лечения диабета, для лечения осложнений диабета, включая ретинопатию, или для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. В другом аспекте избыточный вес является фактором, способствующим возникновению заболевания или состояния, включая гипертензию, диабет, дислипидемию, сердечно-сосудистое заболевание, желчные камни, остеоартрит и рак. Ожидается, что содействие потере веса тела снизит вероятность таких заболеваний или состояний. В другом аспекте содействие потере веса тела является по меньшей мере частью лечения таких заболеваний или состояний. В другом аспекте избыточный вес вызван синдромом Прадера-Вилли. В еще одном аспекте лечению подвергается ожирение.
Эффективное количество одного или нескольких соединений аналогов грелина и композиций на их основе, соответствующих и подходящих для применения на практике любого аспекта настоящего изобретения, можно вводить субъекту, нуждающемуся в этом, любыми приемлемыми медицинскими способами, включая, но не ограничиваясь ими, внутривенные, подкожные или пероральные способы, либо имплантацию состава с замедленным высвобождением.
Другие характерные особенности и преимущества настоящего изобретения становятся понятны из дополнительных описаний, приведенных в данном документе, включая различные примеры. Предлагаемые примеры иллюстрируют различные компоненты и методологию, применимую для практического осуществления настоящего изобретения. Примеры не ограничивают формулу изобретения. Основываясь на настоящем раскрытии, специалист в данной области может выявлять и использовать другие компоненты и методологии, применимые для практического осуществления настоящего изобретения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к аналогам грелина, которые устойчивы к протеолизу и при этом либо стимулируют, то есть действуют как агонисты, либо подавляют, то есть действуют как антагонисты, активность рецептора GHS. Как подробно описано выше, аналоги по данному изобретению являются полезными для лечения широкого спектра недомоганий у субъекта.
«Субъект», как используют в данном описании, означает млекопитающее или не млекопитающее животное, включая, например, и без ограничений, человека, крысу, мышь или сельскохозяйственное животное. Применение термина «субъект» необязательно означает наличие заболевания или нарушения. Термин «субъект» включает, например, млекопитающее или не млекопитающее животное, которому вводят дозу аналога грелина в процессе эксперимента, млекопитающее или не млекопитающее животное, которое подвергают лечению, чтобы способствовать облегчению заболевания или нарушения, и млекопитающее или не млекопитающее животное, которое подвергают профилактическому воздействию, чтобы затормозить развитие или предотвратить возникновение заболевания или нарушения.
in vitro
in vitro
«Терапевтически приемлемое количество» соединения или композиции по изобретению, без учета препарата или пути введения, представляет собой такое количество, которое вызывает желаемую биологическую ответную реакцию у субъекта. Биологический эффект терапевтического количества может иметь место и быть измерен на многих уровнях в организме. Например, биологический эффект терапевтического количества может иметь место и быть измерен на клеточном уровне путем измерения реакции рецептора, который связывает грелин и/или аналог грелина, либо биологический эффект терапевтического количества может иметь место и быть измерен на системном уровне, например, вызывая повышение/понижение уровней циркулирующего гормона роста. Биологический эффект терапевтического количества может иметь место и быть измерен на уровне организма, например, вызывая ослабление симптома(ов) или прогрессирования заболевания или состояния у субъекта. Терапевтически приемлемое количество соединения или композиции по изобретению, без учета препарата или пути введения, может вызывать один или несколько биологических эффектов у субъекта. В случае если соединение или композицию по изобретению тестируют в  системе, терапевтически приемлемое количество соединения или композиции можно рассматривать как количество, которое вызывает поддающуюся измерению ответную реакцию в выбранной  системе.
Агонисты и антагонисты грелина, описанные в данном документе, такие как соединения из групп 1, 2, 3, 4 и/или 5, являются полезными для увеличения, снижения и/или поддержания веса тела у субъекта, нуждающегося в этом. Вес тела часто измеряют и используют для определения индекса массы тела («ИМТ») («BMI»). Значение ИМТ для субъекта рассчитывают как величину веса в килограммах, деленную на квадрат величины роста в метрах. «Нормальный» диапазон ИМТ, как хорошо известно в данной области, составляет 19-22. Индивидуумы, у которых индекс массы тела опускается ниже «нормального» диапазона, более подвержены заболеваниям, и определенные методы лечебного воздействия, такие как химиотерапия, менее эффективны для индивидуумов с ИМТ, сниженным по сравнению с нормой.
Как используют в данном описании, субъектом или млекопитающим с ожирением называют таких, у которых вес тела больше примерно на 20%, примерно на 25%, примерно на 30%, или более, по сравнению с нормальным весом тела для указанного субъекта. Нормальный вес тела можно определять путем сравнения с весом субъекта в предшествующий момент времени, такой, когда уровни грелина были в норме, либо путем сравнения уровней грелина у субъекта со средними значениями у других субъектов сходного возраста и/или состояния.
Как используют в данном описании, субъектом или млекопитающим с избыточным весом называют таких, у которых вес тела примерно на 5%-20% больше, чем нормальный вес тела для указанного субъекта. Нормальный вес тела можно определять путем сравнения с весом субъекта в предшествующий момент времени, такой, когда уровни грелина были в норме, либо путем сравнения уровней грелина у субъекта со средними значениями у других субъектов сходного возраста и/или состояния.
Как используют в данном описании, субъектом или млекопитающим с нормальным весом называют таких, у которых вес тела находится в пределах от примерно 5% избытка до примерно 5% недостатка по сравнению с нормальным весом тела для указанного субъекта. Нормальный вес тела можно определять путем сравнения с весом субъекта в предшествующий момент времени, такой, когда уровни грелина были в норме, либо путем сравнения уровней грелина у субъекта со средними значениями у других субъектов сходного возраста и/или состояния. У субъекта с нормальным весом ИМТ находится в диапазоне примерно 19-22.
Как используют в данном описании, субъектом или млекопитающим с истощением называют таких, у которых вес тела примерно на 5%-30%, или даже на 50% меньше, чем нормальный вес тела для указанного субъекта. Нормальный вес тела можно определять путем сравнения с весом субъекта в предшествующий момент времени, такой, когда уровни грелина были в норме, либо путем сравнения уровней грелина у субъекта со средними значениями у других субъектов сходного возраста и/или состояния.
Как используют в данном описании, термины «лечить», «лечение» и «воздействие» включают паллиативное, лечебное и профилактическое воздействие.
Как используют в данном описании, «поддающийся измерению» означает, что биологический эффект является как воспроизводимым, так и статистически достоверно отличающимся от допустимой погрешности аналитического метода.
«Протеолиз», как используют в данном описании, означает направленную деградацию, то есть расщепление пептида путем гидролиза пептидной связи протеолитическим клеточным ферментом, называемым протеазой.
Если не указано иное, все технические или научные термины, используемые в данном описании, имеют то значение, которое принято среди специалистов в той области, к которой принадлежит изобретение. Кроме того, все публикации, патентные заявки, патенты и другие литературные источники, упомянутые в данном документе, включены в него посредством ссылок.
Конкретные аминокислоты, присутствующие в соединениях по изобретению, могут быть и представлены в данном документе следующим образом:
<b><i>Номенклатура и сокращения</i></b>
<b>Символ</b>
<b>Значение</b>
Abu
α-аминомасляная кислота
Acc
1-амино-1-цикло(C<sub>3</sub>-C<sub>9</sub>)алкилкарбоновая кислота
A3c
1-амино-1-циклопропанкарбоновая кислота
A4c
1-амино-1-циклобутанкарбоновая кислота
A5c
1-амино-1-циклопентанкарбоновая кислота
A6c
1-амино-1-циклогексанкарбоновая кислота
Act
обозначает структуру: <img file="00000003.tif" he="28" wi="35" img-content="undefined" img-format="tif" />
Aib
α-аминоизомасляная кислота
Aic
2-аминоиндан-2-карбоновая кислота
Ala или A
аланин
β-Ala
бета-аланин
Apc
обозначает структуру: <img file="00000004.tif" he="19" wi="22" img-content="undefined" img-format="tif" />
Arg или R
аргинин
hArg
гомоаргинин
Asn или N
аспарагин
Asp или D
аспарагиновая кислота
Ava
5-амино-н-валериановая кислота
Cha
β-циклогексилаланин
Cys или C
цистеин
hCys
L-гомоцистеин
Dab
2,4-диаминомасляная кислота
Dap
2,3-диаминопропионовая кислота
Dhp
3,4-дегидропролин
Dmt
5,5-диметилтиазолидин-4-карбоновая кислота
2-Fua
β-(2-фурил)аланин
Gln или Q
глютамин
Glu или E
глютаминовая кислота
Gly или G
глицин
His или H
гистидин
3-Hyp
транс-3-гидрокси-L-пролин, то есть, (2S,3S)-3-гидроксипирролидин-2-карбоновая кислота
4-Hyp
4-гидроксипролин, то есть, (2S,4R)-4-гидроксипирролидин-2-карбоновая кислота
Ile или I
изолейцин
Inc
индолин-2-карбоновая кислота
Inp
изонипекотиновая кислота
Ktp
4-кетопролин
Leu или L
лейцин
hLeu
гомолейцин
Lys или K
лизин
Met или M
метионин
1-Nal
β-(1-нафтил)-L-аланин
2-Nal
β-(2-нафтил)-L-аланин
Nle
норлейцин
Nva
норвалин
Oic
октагидроиндол-2-карбоновая кислота
Orn
орнитин
2-Pal
β-(2-пиридинил)аланин
3-Pal
β-(3-пиридинил)аланин
4-Pal
β-(4-пиридинил)аланин
Phe или F
фенилаланин
hPhe
гомофенилаланин
Pip
пипеколиновая кислота
Pro или P
пролин
Ser или S
серин
Taz
β-(4-тиазолил)аланин, то есть: <img file="00000005.tif" he="24" wi="30" img-content="undefined" img-format="tif" />
2-Thi
β-(2-тиенил)аланин
3-Thi
β-(3-тиенил)аланин
Thp
4-амино-4-карбокситетрагидропиран
Thr или T
треонин
Thz
тиазолидин-4-карбоновая кислота
Tic
1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновая кислота
Tle
трет-лейцин
Trp или W
триптофан
Tyr или Y
тирозин
Val или V
валин
Если аминокислота имеет изомерные формы, то представлена L-форма аминокислоты, если прямо не указано иное.
3
Номенклатура, используемая для обозначения пептидов, является той, которую обычно используют в данной области, где аминогруппа на N-конце представлена слева, а карбоксильная группа на C-конце представлена справа, то есть структура имеет вид -NH-CI(R')-CO-, где R и R' каждый независимо представляет собой атом водорода или боковую цепь аминокислоты (например, R = CH и R' = H для Ala), или R и R' могут быть соединены с образованием кольцевой системы. Для N-концевой аминокислоты сокращение обозначает структуру:
или, если N-концевая аминокислота представляет собой изонипекотиновую кислоту (Inp), сокращение обозначает структуру:
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Пептид по данному изобретению также представлен в данном описании в другом формате, например, (Aib)чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:21), с замещенной аминокислотой(ами) из природной последовательности, находящейся внутри первых скобок (например, Aib вместо Ser в чГрелине). Числа внутри вторых скобок означают число аминокислот, имеющихся в пептиде (например, чГрелин(1-18) (SEQ ID NO:22) означает аминокислоты с 1 по 18 пептидной последовательности человеческого грелина). Обозначение «NH», например, в (Aib)чГрелин(1-28)-NH (SEQ ID NO:21), указывает на то, что C-конец пептида амидирован. (Aib)чГрелин(1-28) (SEQ ID NO:23) или, альтернативно, (Aib)чГрелин(1-28)-OH (SEQ ID NO:24) указывает на то, что C-конец представляет собой свободную кислоту. Строчную букву ставят перед словом «Грелин», чтобы указать источник или происхождение, то есть «ч» указывает на то, что грелин является гомологом формы грелина, обнаруженного у человека.
Если не указано иное, аминокислоты с хиральным центром представлены в форме L-энантиомера. Ссылка на «ее производное» означает модифицированную аминокислоту, такую как соответствующая D-аминокислота, N-алкиламинокислота, β-аминокислота или меченая аминокислота.
Как используют в данном описании, Acc охватывает аминокислоты, выбранные из группы 1-амино-1-циклопропанкарбоновой кислоты (A3c); 1-амино-1-циклобутанкарбоновой кислоты (A4c); 1-амино-1-циклопентанкарбоновой кислоты (A5c); 1-амино-1- циклогексанкарбоновой кислоты (A6c); 1-амино-1-циклогептанкарбоновой кислоты (A7c); 1-амино-1-циклооктанкарбоновой кислоты (A8c) и 1-амино-1-циклононанкарбоновой кислоты (A9c).
«Ацил» означает R"-C(O)-, где R" представляет собой H, алкил, замещенный алкил, гетероалкил, замещенный гетероалкил, алкенил, замещенный алкенил, арил, алкиларил или замещенный алкиларил.
«Алкил» означает углеводородную группу, содержащую один или несколько атомов углерода, где множественные атомы углерода, при их наличии, соединены одинарными связями. Алкильная углеводородная группа может представлять собой прямую цепь или содержать одно или несколько разветвлений или циклических групп.
2
3
2
1-20
3
3
3
2
0-20
2
0-20
2
0-20
«Замещенный алкил» означает алкил, где один или несколько атомов водорода углеводородной группы заменены одним или большим количеством заместителей, выбранных из группы, состоящей из галогена (то есть фтора, хлора, брома и йода), -OH, -CN, -SH, -NH, -NHCH, -NO, -C алкила, замещенного 1-6 атомами галогена, -CF, -OCH, -OCF и -(CH)-COOH. В других вариантах осуществления присутствуют 1, 2, 3 или 4 заместителя. Наличие -(CH)-COOH приводит к получению алкилкислоты. Примеры алкилкислот, содержащих или состоящих из -(CH)-COOH, включают, но не ограничиваются ими, 2-норборнануксусную кислоту, трет-масляную кислоту и 3-циклопентилпропионовую кислоту.
«Гетероалкил» означает алкил, где один или несколько атомов углерода углеводородной группы заменены одной или большим количеством следующих групп: амино, амидо, -O-, -S- или карбонил. В других вариантах осуществления присутствуют 1 или 2 гетероатома.
2
3
2
1-20
3
3
3
2
0-20
«Замещенный гетероалкил» означает гетероалкил, где один или несколько атомов водорода углеводородной группы заменены одним или большим количеством заместителей, выбранных из группы, состоящей из галогена (то есть фтора, хлора, брома и йода), -OH, -CN, -SH, -NH, -NHCH, -NO, -C алкила, замещенного 1-6 атомами галогена, -CF, -OCH, -OCF и -(CH)-COOH. В других вариантах осуществления присутствуют 1, 2, 3 или 4 заместителя.
«Алкенил» означает углеводородную группу, образованную двумя или несколькими атомами углерода, где имеется одна или несколько двойных углерод-углеродных связей. Алкенильная углеводородная группа может представлять собой прямую цепь или содержать одно или несколько разветвлений или циклических групп.
2
3
2
1-20
3
3
3
2
0-20
«Замещенный алкенил» означает алкенил, где один или несколько атомов водорода заменены одним или большим количеством заместителей, выбранных из группы, состоящей из галогена (то есть фтора, хлора, брома и йода), -OH, -CN, -SH, -NH, -NHCH, -NO, -C алкила, замещенного 1-6 атомами галогена, -CF, -OCH, -OCF и -(CH)-COOH. В других вариантах осуществления присутствуют 1, 2, 3 или 4 заместителя.
π
1-20
1-20
2
2
1-20
3
3
2
0-20
«Арил» означает необязательно замещенную ароматическую группу по меньшей мере с одним кольцом, имеющим конъюгированную -электронную систему, содержащую вплоть до двух систем конъюгированных или конденсированных колец. Арил включает, но не ограничивается ими, карбоновый арил, гетероциклический арил и биарильные группы. Предпочтительно, арил представляет собой 5- или 6-членное кольцо. Предпочтительными атомами для гетероциклического арила являются один или несколько атомов серы, кислорода и/или азота. Примеры арила включают, но не ограничиваются ими, фенил, 1-нафтил, 2-нафтил, индол, хинолин, 2-имидазол и 9-антрацен. Арильные заместители выбирают из группы, состоящей из -C алкила, -C алкокси, галогена (то есть фтора, хлора, брома и йода), -OH, -CN, -SH, -NH, -NO, -C алкила, замещенного 1-5 атомами галогена, -CF, -OCF и -(CH)-COOH. В других вариантах осуществления арил содержит 0, 1, 2, 3 или 4 заместителя.
Термин «галогено-» охватывает фторо-, хлоро-, бромо- и йодо-.
1
12
2
12
Термин «(C-C)углеводородный фрагмент» охватывает алкил, алкенил и алкинил, и в случае алкенила или алкинила имеет место C-C.
«Алкиларил» означает «алкил», присоединенный к «арилу».
Под Glu(NH-гексил) имеют в виду:
Под Ser(н-октаноил) или Ser(C(O)-гептил) имеют в виду:
N-концевые аминокислоты Inp и Apc имеют структуры:
Настоящее изобретение включает диастереомеры, а также их рацемические и разделенные энантиомерно чистые формы. Аналоги грелина могут содержать D-аминокислоты, L-аминокислоты или их любые сочетания. Предпочтительно, аминокислоты, присутствующие в аналоге грелина, являются L-энантиомерами.
Предпочтительные производные аналогов по изобретению включают D-аминокислоты, N-алкиламинокислоты, β-аминокислоты и/или одну или несколько меченых аминокислот (включая меченый вариант D-аминокислоты, N-алкиламинокислот или β-аминокислоты). Меченое производное указывает на изменение аминокислоты или производного аминокислоты при помощи детектируемой метки. Примеры детектируемых меток включают люминесцентные, ферментативные и радиоактивные метки. Как тип метки, так и положение метки могут влиять на активность аналога. Метки следует выбирать и располагать таким образом, чтобы не оказывать существенного влияния на активность аналога грелина в отношении рецептора GHS. Влияние конкретной метки и ее положения на активность грелина можно определять при помощи анализов, определяющих активность и/или связывание грелина.
in vivo
Защитная группа, ковалентно присоединенная к C-концевой карбоксильной группе, снижает реакционную способность карбоксильного конца в условиях . Защитную группу на карбоксильном конце предпочтительно присоединяют к α-карбонильной группе последней аминокислоты. Предпочтительные защитные группы на карбоксильном конце включают амид, метиламид и этиламид.
Другие конкретные сокращения, используемые в данном описании, расшифровываются следующим образом:
<b><i>Номенклатура и сокращения</i></b>
<b>Символ</b>
<b>Значение</b>
Boc:
<i>трет</i>-бутилоксикарбонил
BSA:
бычий сывороточный альбумин
Bzl:
бензил
DCM:
дихлорметан
DIC:
N,N-диизопропилкарбодиимид
DIEA:
диизопропилэтиламин
Dmab:
4-{N-(1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогексилиден)-3-метилбутил)амино}бензил
DMAP:
4-(диметиламино)пиридин
DMF:
диметилформамид
DNP:
2,4-динитрофенил
EDTA
этилендиаминтетрауксусная кислота
Fmoc:
фторенилметилоксикарбонил
HBTU:
2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат
cHex
циклогексил
HOAT:
О-(7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3- тетраметилурония гексафторфосфат
HOBt:
1-гидроксибензотриазол
HPLC
высокоэффективная жидкостная хроматография
(ВЭЖХ):
MBHA
4-метилбензгидриламин
Mmt:
4-метокситритил
NMP:
N-метилпирролидон
Pbf:
2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонил
PhiPr
γ-2-фенилизопропиловый сложный эфир
PyAOP:
7-азабензотриазол-1-илокситрис(пирролидино)фосфония гексафторфосфат
tBu:
<i>трет</i>-бутил
TIS:
триизопропилсилан
TOS:
тозил
trt
тритил
TFA:
трифторуксусная кислота
TFFH:
тетраметилфторформамидиния гексафторфосфат
Z:
бензилоксикарбонил
Способы синтеза
Current Protocols in Molecular Biology
et al.,
Molecular Cloning, A Laboratory Manual,
Peptide and Protein Drug Delivery
et al., Solid Phase Synthesis,
Соединения по изобретению можно получать, используя методы, раскрытые в примерах данного описания, а также методы, хорошо известные в данной области. Например, полипептидную часть аналога грелина можно синтезировать и модифицировать химическими или биохимическими методами. Примеры методов биохимического синтеза, включающие введение нуклеиновой кислоты в клетку и экспрессию нуклеиновых кислот, приведены в Ausubel, , John Wiley, 1987-1998 и Sambrook  в  2-е издание, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Методы химического синтеза полипептидов также хорошо известны в данной области (Vincent в , New York, N.Y., Dekker, 1990). Например, пептиды по данному изобретению можно получать стандартным твердофазным пептидным синтезом (Stewart, J.M.  Pierce Chemical Co., 2-е издание 1984).
2
1
1
1
30
1
30
Заместитель R вышеприведенной типичной формулы можно присоединять к свободному амину N-концевой аминокислоты стандартными методами, известными в данной области. Например, алкильные группы, например, (C-C)алкил, можно присоединять путем восстановительного алкилирования. Гидроксиалкильные группы, например, (C-C)гидроксиалкил, также можно присоединять путем восстановительного алкилирования, где свободная гидроксильная группа защищена т-бутиловым сложным эфиром. Ацильные группы, например, COE, можно присоединять путем связывания свободной кислоты, например, ECOOH со свободным амином N-концевой аминокислоты, смешивая подготовленную смолу с 3 молярными эквивалентами как свободной кислоты, так и диизопропилкарбодиимида в метиленхлориде в течение 1 часа. Если свободная кислота содержит свободную гидроксильную группу, например, п-гидроксифенилпропионовая кислота, тогда связывание можно проводить с дополнительными 3 молярными эквивалентами HOBT.
1
2
0
2
1
2
0
2
2
2
2
2
2
2
Если R представляет собой NH-X-CH-CONH (то есть Z=CONH), синтез пептида начинается с Fmoc-HN-X-CH-COOH, связанного со смолой Rink Amide-MBHA (амид-4-метилбензилгидриламин, поставщик Novabiochem, San Diego, CA). Если R представляет собой NH-X-CH-COOH (то есть Z-COOH), синтез пептида начинается с Fmoc-HN-X-CH-COOH, связанного со смолой Wang.
При синтезе аналога грелина по данному изобретению, содержащего A5c, A6c и/или Aib, время связывания составляет два часа для данных остатков и остатка, следующего сразу за ними.
Ниже приведены примеры для дальнейшей иллюстрации различных отличительных особенностей настоящего изобретения. Примеры также иллюстрируют полезные методики для осуществления на практике данного изобретения. Данные примеры не ограничивают заявленное изобретение.
Пример 2: (Ac-1-Apc
, Aib
, Glu(NH-гексил)
)чГрелин(1-28)-NH
(SEQ ID NO:20)
1
2,10
3
2
2-10
3
3
Комплекс Fmoc-(Aib,Glu)чГрелин(2-28) с защитой боковой цепи-смола Rink amid-MBHA синтезировали на пептидном синтезаторе 433A (поставщик Applied Biosystems, Foster City, CA, U.S.A.), используя фторенилметилоксикарбонильную (Fmoc) химию. Использовали Rink амид-4-метилбензилгидриламиновую (MBHA) смолу (поставщик Novabiochem, San Diego, CA, U.S.A.) с замещением 0,64 ммоль/г. Используемые аминокислоты Fmoc (поставщик AnaSpec, San Jose, CA, U.S.A.) представляли собой Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Aib-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH и Fmoc-Val-OH. Кроме того, Fmoc-Glu(О-2-PhiPr)-OH (поставщик Novabiochem, San Diego, CA, U.S.A.) использовали на A. Синтез проводили в масштабе 0,1 ммоль. Группы Fmoc удаляли обработкой 20% пиперидином в N-метилпирролидоне (NMP) в течение 30 минут. На каждой стадии связывания аминокислоту Fmoc (3 экв, 0,3 ммоль) сначала предварительно активировали в 2 мл раствора 0,45 М смеси 2-(1-H-бензотриазол-1-ил)-1,1,2,3-тетраметилурония гексафторфосфат/1-гидроксибензотриазол (HBTU/HOBT) в NMP. К активированному сложному эфиру аминокислоты добавляли 1 мл диизопропилэтиламина (DIEA) и 1 мл NMP. Пептидный синтезатор ABI 433 A был запрограммирован на следующие действия:
(1) промывание NMP,
(2) удаление защитной группы Fmoc при помощи 20% пиперидина в NMP в течение 30 минут,
(3) промывание NMP, и
(4) связывание с предварительно активированной аминокислотой Fmoc в течение одного-трех часов.
N,N
Смолу связывали последовательно в соответствии с последовательностью указанного в заголовке пептида. После сборки пептидной цепи смолу полностью промывали при помощи -диметилформамида (DMF) и дихлорметана (DCM).
После окончания сборки пептидной цепи на 433A комплекс пептид-смола переносили в реакционный сосуд на шейкере и Fmoc удаляли при помощи 25% Pip/DMF в течение 30 мин. Смолу промывали DMF. Fmoc-Apc-OH (0,4 ммоль) связывали при помощи TFFH (тетраметилфторформамидиния гексафторфосфат) (поставщик Perceptive Biosystems, Warrington, U.K) (0,4 ммоль), HOAt (0,4 ммоль), DMAP (диметиламинопиридин) (0,1 г) и DIEA (1,2 ммоль) однократно в течение четырехчасового цикла, а затем вновь в течение ночи.
3
2
Группу Fmoc удаляли, как указано выше, и пептид блокировали при помощи Ac2O (уксусный ангидрид) (5 ммоль) и DIEA (5 ммоль) в DMF в течение 30 минут. Группы PhiPr удаляли с Glu при помощи 2×3% TFA в DCM в течение 10-минутного цикла. Boc, частично удаленный с боковой цепи Lys, заменяли, используя Boc2O (0,8 ммоль) и DIEA (0,8 ммоль) в DCM в течение ночи. Затем смолу обрабатывали PyAOP (7-азабензотриазол-1-илокситрис(пирролидино)фосфония гексафторфосфат) (поставщик Applied Biosystems, Foster City, CA, U.S.A.) (0,6 ммоль), HOAt (0,6 ммоль), DMAP (0,1 г) и DIEA (1,8 ммоль) в течение 10-минутного цикла, после чего добавляли гексил-NH, то есть гексиламин (поставщик Sigma-Aldrich Chemicals, St. Louis, MO, U.S.A.) (2,0 ммоль), и полученную смолу непрерывно встряхивали в течение ночи.
2
18
0
Для отщепления указанного в заголовке пептида смолу обрабатывали смесью TFA, HO и триизопропилсилана (TIS) (9,5 мл/0,85 мл/0,8 мл) в течение четырех часов. Смолу отфильтровывали, и фильтрат вливали в 200 мл эфира. Преципитат собирали центрифугированием. Этот неочищенный продукт растворяли в смеси ацетонитрила и воды и очищали при помощи системы препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой на колонке (4×43 см) с C DYNAMAX-100 A (поставщик Varian, Walnut Creek, CA, U.S.A.). Колонку элюировали на протяжении примерно 1 часа, используя линейный градиент от 92% A:8% B до 72% A:28% B, где A представляло собой 0,1% TFA в воде и B представляло собой 0,1% TFA в ацетонитриле. Фракции проверяли аналитической ВЭЖХ и те из них, которые содержали чистый продукт, объединяли и лиофилизировали до сухости, получив в итоге 1,5 мг (0,5%) белого твердого вещества. Чистоту оценивали методом ВЭЖХ, она составляла примерно 97,5%. Молекулярный вес, определенный масс-спектрометрическим анализом с ионизацией электрораспылением (ESI-MS), составил 3435,1 (в соответствии с рассчитанным молекулярным весом, равным 3434,5).
Пимер 4: (1-Apc
, Aib
, Glu(NH-гексил)
)чГрелин(1-28)-NH
(SEQ ID NO:18)
1
2,10
3
2
2,10
3
3
Комплекс Fmoc-(Aib,Glu)чГрелин(2-28) с защитой боковой цепи-смола Rink amid-MBHA синтезировали на пептидном синтезаторе 433A (поставщик Applied Biosystems, Foster City, CA, U.S.A.), используя фторенилметилоксикарбонильную (Fmoc) химию. Использовали Rink амид-4-метилбензилгидриламиновую (MBHA) смолу (поставщик Novabiochem, San Diego, CA, U.S.A.) с замещением 0,64 ммоль/г. Используемые аминокислоты Fmoc (поставщик AnaSpec, San Jose, CA, U.S.A.) представляли собой Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Aib-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH и Fmoc-Val-OH. Кроме того, Fmoc-Glu(О-2-PhiPr)-OH (поставщик Novabiochem, San Diego, CA, U.S.A.) использовали на A. Синтез проводили в масштабе 0,1 ммоль. Группы Fmoc удаляли обработкой 20% пиперидином в N-метилпирролидоне (NMP) в течение 30-минутного цикла. На каждой стадии связывания аминокислоту Fmoc (3 экв, 0,3 ммоль) сначала предварительно активировали в 2 мл раствора 0,45 М смеси 2-(1-H-бензотриазол-1-ил)-1,1,2,3-тетраметилурония гексафторфосфат/1-гидроксибензотриазол (HBTU/HOBT) в NMP. К активированному сложному эфиру аминокислоты добавляли 1 мл диизопропилэтиламина (DIEA) и 1 мл NMP. Пептидный синтезатор ABI 433 A был запрограммирован на проведение следующих реакций:
(1) промывание NMP,
(2) удаление защитной группы Fmoc при помощи 20% пиперидина в NMP в течение 30 минут,
(3) промывание NMP, и
N,N
(4) связывание с предварительно активированной аминокислотой Fmoc в течение одного-четырех часов. Смолу связывали последовательно в соответствии с последовательностью указанного в заголовке пептида. После сборки пептидной цепи смолу полностью промывали при помощи -диметилформамида (DMF) и дихлорметана (DCM).
После окончания сборки пептидной цепи на 433A комплекс пептид-смола переносили в реакционный сосуд на шейкере и Fmoc удаляли, погружая в раствор 25% Pip/DMF примерно на 30 минут. Вслед за этим смолу промывали DMF. Fmoc-Apc-OH (0,4 ммоль) связывали при помощи TFFH (тетраметилфторформамидиния гексафторфосфат) (поставщик Perceptive Biosystems, Warrington, U.K) (0,4 ммоль), HOAt (0,4 ммоль), DMAP (диметиламинопиридин) (0,1 г) и DIEA (1,2 ммоль) в течение одного четырехчасового цикла, а затем вновь в течение ночи.
3
2
Группу Fmoc удаляли, как указано выше. Группы PhiPr удаляли с Glu, используя два цикла обработки 3% TFA в DCM, затрачивая по 10 минут на цикл. Boc, который был частично удален с боковой цепи Lys во время процесса, заменяли, используя Boc2O (0,8 ммоль) и DIEA (0,8 ммоль) в DCM в течение ночи. Смолу обрабатывали PyAOP (7-азабензотриазол-1-илокситрис(пирролидино)фосфония гексафторфосфат) (поставщик Applied Biosystems, Foster City, CA, U.S.A.) (0,6 ммоль), HOAt (0,6 ммоль), DMAP (0,1 г) и DIEA (1,8 ммоль) в течение 10 минут, после чего добавляли гексил-NH, то есть гексиламин (поставщик Sigma-Aldrich Chemicals, St. Louis, MO, U.S.A.) (2,0 ммоль), и полученный раствор со смолой непрерывно встряхивали в течение ночи.
2
18
0
Указанный в заголовке пептид отделяли от смолы расщеплением, обрабатывая смесью TFA, HO и триизопропилсилана (TIS) (9,5 мл/0,85 мл /0,8 мл) в течение примерно четырех часов. Смолу отфильтровывали, и фильтрат вливали в 200 мл эфира. Преципитат собирали центрифугированием. Неочищенный продукт растворяли в смеси ацетонитрила и воды и очищали при помощи системы препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой на колонке (4×43 см) с C DYNAMAX-100 A (поставщик Varian, Walnut Creek, CA, U.S.A.). Колонку элюировали на протяжении примерно 1 часа, используя линейный градиент от 92% A:8% B до 72% A:28% B, где A представляло собой 0,1% TFA в воде и B представляло собой 0,1% TFA в ацетонитриле. Фракции проверяли аналитической ВЭЖХ и те из них, которые содержали чистый продукт, объединяли и лиофилизировали до сухости, получив в итоге 4,6 мг (1,4%) белого твердого вещества. Чистоту оценивали методом ВЭЖХ, она составляла примерно 99,8%. Молекулярный вес, определенный масс-спектрометрическим анализом с ионизацией электрораспылением (ESI-MS), составил 3393,5 (в соответствии с рассчитанным молекулярным весом, равным 3393,1).
Пример 11: (Inp
, Ser(н-октаноил)
)чГрелин(1-28)-NH
(SEQ ID NO:11)
1
17
2
17
3
17
Комплекс Fmoc-(Ser)чГрелин(2-28) с защитой боковой цепи-смола Rink amid-MBHA синтезировали на пептидном синтезаторе модели 433A (поставщик Applied Biosystems, Foster City, CA, U.S.A.), используя фторенилметилоксикарбонильную (Fmoc) химию. Использовали Rink амид-4-метилбензилгидриламиновую (MBHA) смолу (поставщик Novabiochem, San Diego, CA, U.S.A.) с замещением 0,64 ммоль/г. Используемые аминокислоты Fmoc (поставщик AnaSpec, San Jose, CA, U.S.A.) представляли собой Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Aib-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH и Fmoc-Val-OH. Кроме того, Fmoc-Ser(Trt)-OH (поставщик также AnaSpec, San Jose, CA, U.S.A.) использовали на A и A. Синтез проводили в масштабе 0,2 ммоль. Группы Fmoc удаляли обработкой 20% пиперидином в N-метилпирролидоне (NMP) в течение 30 минут. На каждой стадии связывания аминокислоту Fmoc (3 экв, 0,3 ммоль) сначала предварительно активировали в 2 мл раствора 0,45 М смеси 2-(1-H-бензотриазол-1-ил)-1,1,2,3-тетраметилурония гексафторфосфат/1-гидроксибензотриазол (HBTU/HOBT) в NMP. К активированному сложному эфиру аминокислоты добавляли 1 мл диизопропилэтиламина (DIEA) и 1 мл NMP. Пептидный синтезатор ABI 433 A был запрограммирован на выполнение следующих действий:
(1) промывание NMP,
(2) удаление защитной группы Fmoc при помощи 20% пиперидина в NMP в течение 30 минут,
(3) промывание NMP, и
(4) связывание с предварительно активированной аминокислотой Fmoc в течение 1 или 2 часов.
N,N
Смолу связывали последовательно в соответствии с последовательностью указанного в заголовке пептида. После сборки пептидной цепи смолу полностью промывали при помощи -диметилформамида (DMF) и дихлорметана (DCM).
После окончания сборки пептидной цепи на 433A комплекс пептид-смола переносили в реакционный сосуд на шейкере и Fmoc удаляли, используя смесь 25% Pip/DMF в течение 30-минутного цикла. Смолу промывали DMF. Fmoc-Inp-OH (1,0 ммоль) связывали при помощи TFFH (тетраметилфторформамидиния гексафторфосфат) (поставщик Perceptive Biosystems, Warrington, U.K) (1,0 ммоль), HOAt (1,0 ммоль), DMAP (диметиламинопиридин) (0,1 г) и DIEA (3,0 ммоль) один раз в течение ночи.
3
17
3
17
Группы Trt удаляли с Ser и Ser, используя два цикла обработки 3% TFA в DCM, каждый цикл продолжался в течение примерно 10 минут. Boc, который был частично удален с боковой цепи Lys, как указано выше, заменяли, используя Boc2O (0,8 ммоль) и DIEA (0,8 ммоль) в DCM в течение ночи. Октановую кислоту (10 ммоль) связывали с боковыми цепями Ser и Ser при помощи DIC (5 ммоль), DMAP (0,2 мг) и DIEA (5 ммоль) в DCM в течение ночи.
2
18
0
Fmoc с конца удаляли погружением в 25% Pip/DMF на 30 минут. Затем смолу промывали DMF. Указанный в заголовке пептид отделяли от смолы расщеплением, используя смесь TFA, HO и триизопропилсилана (TIS) (9,5 мл/0,85 мл /0,8 мл) в течение примерно 4 часов. Смолу отфильтровывали, и фильтрат вливали в 200 мл эфира. Преципитат собирали центрифугированием. Неочищенный продукт растворяли в смеси ацетонитрила и воды и очищали при помощи системы препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой на колонке (4×43 см) с C DYNAMAX-100 A (поставщик Varian, Walnut Creek, CA, U.S.A.). Колонку элюировали на протяжении примерно 1 часа, используя линейный градиент от 85% A:15% B до 55% A:45% B, где A представляло собой 0,1% TFA в воде и B представляло собой 0,1% TFA в ацетонитриле. Фракции проверяли аналитической ВЭЖХ и те из них, которые содержали чистый продукт, объединяли и лиофилизировали до сухости, получив в итоге 41,7 мг (5,9%) белого твердого вещества. Чистоту оценивали методом ВЭЖХ, она составляла примерно 96,6%. Молекулярный вес, определенный масс-спектрометрическим анализом с ионизацией электрораспылением (ESI-MS), составил 3507,4 (в соответствии с рассчитанным молекулярным весом, равным 3508,16).
Следующие пептиды по изобретению могут быть получены рядовым специалистом в данной области при использовании методов синтеза, аналогичных тем, которые в основном описаны выше в данном документе:
1
2,10
3
2
Пример 1: (Ac-Inp, Aib, Glu(NH-гексил))чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:19)
1
2,10
3
2
Пример 2: (Ac-1-Apc, Aib, Glu(NH-гексил))чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:20)
1
2,10
3
2
Пример 3: (Inp, Aib, Glu(NH-гексил))чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:17)
1
2,10
3
2
Пример 4: (1-Apc, Aib, Glu(NH-гексил))чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:18)
1
2
Пример 5: (Inp)чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:5)
1
2
2
Пример 6: (Inp, Aib)чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:6)
1
2
3
2
Пример 7: (Inp, Aib, Glu(NH-гексил))чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:7)
1
2,10
2
Пример 8: (Inp, Aib)чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:8)
1
2,8
2
Пример 9: (Inp, Aib)чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:9)
1
2
17
2
Пример 10: (Inp, Aib, Ser(н-октаноил))чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:10)
1
17
2
Пример 11: (Inp, Ser(н-октаноил))чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:11)
и
1
2,8
17
2
Пример 12: (Inp, Aib, Ser(н-октаноил))чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:12)
1
3
2
Пример 13: [Inp, Ser]чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:13)
1
2
3
2
Пример 14: [Inp, Aib, Ser]чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:14)
1
2
3
17
2
Пример 15: [Inp, Aib, Ser, Ser(н-октаноил))чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:15)
1
2,10
3
2
Пример 16: [Inp, Aib, Ser]чГрелин(1-28)-NH, (SEQ ID NO:16).
Набор предпочтительных вариантов осуществления, перечисленных выше, анализировали при помощи масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ESI-MS) для определения молекулярного веса. В таблице 1, приведенной ниже, представлены сгруппированные данные такого тестирования. Также указана чистота каждого из выбранных соединений, определенная методом ВЭЖХ.
<b>ТАБЛИЦА 1 </b><b>Молекулярный вес и чистота выбранных соединений</b>
Пример №
СОЕДИНЕНИЕ
Молекулярный вес (рассчитанный)
Молекулярный вес (MS-ES)
Чистота (%)
№1
(Ac-Inp<sup>1</sup>, Aib<sup>2,10</sup>, Glu(NH-гексил)<sup>3</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:19)
3420,0
3419,5
97,0%
№2
(Ac-1-Apc<sup>1</sup>, Aib<sup>2,10</sup>, Glu(NH-гексил)<sup>3</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:20)
3435,5
3434,5
97,5%
№3
(Inp<sup>1</sup>, Aib<sup>2,10</sup>, Glu(NH-гексил)<sup>3</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:17)
3378,0
3377,6
97,8%
№4
(1-Apc<sup>1</sup>, Aib<sup>2,10</sup>, Glu(NH-гексил)<sup>3</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:18)
3393,1
3393,5
99,8%
№5
(Inp<sup>1</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:5)
3434,0
3423,8
96,2%
№6
(Inp<sup>1</sup>, Aib<sup>2</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:6)
3422,3
3422,1
99,0%
№7
(Inp<sup>1</sup>, Aib<sup>2</sup>, Glu(NH-гексил)<sup>3</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:7)
3421,4
3421,3
99,0%
№8
(Inp<sup>1</sup>, Aib<sup>2,10</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:8)
3379,0
3379,3
99,0%
№9
(Inp<sup>1</sup>, Aib<sup>2,8</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:9)
3378,2
3377,4
98,0%
№10
(Inp<sup>1</sup>, Aib<sup>2</sup>, Ser(н-октаноил)<sup>17</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:10)
3506,2
3505,8
98,0%
№11
(Inp<sup>1</sup>, Ser(н-октаноил)<sup>17</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:11)
3508,2
3507,4
96,6%
№12
(Inp<sup>1</sup>, Aib<sup>2,8</sup>, Ser(н-октаноил)<sup>17</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:12)
3462,2
3462,3
99,0%
№13
[Inp<sup>1</sup>, Ser<sup>3</sup>]чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:13)
3297,8
3298,2
99,5%
№14
[Inp<sup>1</sup>, Aib<sup>2</sup>, Ser<sup>3</sup>]чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:14)
3295,8
3296,3
99,9%
№15
<u>[</u>Inp<sup>1</sup>, Aib<sup>2</sup>, Ser<sup>3</sup>, Ser(н-октаноил)<sup>17</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:15)
3380,0
3380,9
99,0%
№16
[Inp<sup>1</sup>, Aib<sup>2,10</sup>, Ser<sup>3</sup>]чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:16)
3252,8
3253,3
99,9%
Набор предпочтительных вариантов осуществления, перечисленных выше, анализировали для определения стабильности, то есть времени ½ жизни в плазме модельной крысы, при помощи методики, известной специалисту в данной области. В таблице 2, приведенной ниже, представлены сгруппированные данные такого тестирования.
<b>ТАБЛИЦА 2</b><b>Время ½ жизни выбранных соединений в плазме крысы</b>
Пример №
СОЕДИНЕНИЕ
Время ½ жизни в плазме крысы (часы)
№1
(Ac-Inp<sup>1</sup>, Aib<sup>2,10</sup>, Glu(NH-гексил)<sup>3</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:19)
9,4
№3
(Inp<sup>1</sup>, Aib<sup>2,10</sup>, Glu(NH-гексил)<sup>3</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:17)
10,6
№4
(1-Apc<sup>1</sup>, Aib<sup>2,10</sup>, Glu(NH-гексил)<sup>3</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:18)
10,0
№5
(Inp<sup>1</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:5)
6,2
№6
(Inp<sup>1</sup>, Aib<sup>2</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:6)
1,4
№7
(Inp<sup>1</sup>, Aib<sup>2</sup>, Glu(NH-гексил)<sup>3</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:7)
6,7
№8
(Inp<sup>1</sup>, Aib<sup>2,10</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:8)
1,2
№9
(Inp<sup>1</sup>, Aib<sup>2,8</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:9)
1,2
№10
(Inp<sup>1</sup>, Aib<sup>2</sup>, Ser(н-октаноил)<sup>17</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:10)
0,6
№11
(Inp<sup>1</sup>, Ser(н-октаноил)<sup>17</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:11)
0,7
№12
(Inp<sup>1</sup>, Aib<sup>2,8</sup>, Ser(н-октаноил)<sup>17</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:12)
0,7
Определение биологической активности
В данном документе описаны способы, которые могут быть и были использованы для характеристики соединений по изобретению. Квалифицированные специалисты должны знать и принимать во внимание варианты данных анализов, которые могут приводить к получению сопоставимых результатов. Квалифицированные специалисты также должны знать и принимать во внимание, что можно использовать другие анализы для получения результатов и определения характеристик, приведенных в данном документе.
Анализ для определения связывания с рецептором GHS
50
Активность соединений по изобретению в отношении рецептора GHS могла быть и была определена с помощью методов, таких как те, что описаны в приведенных ниже примерах. Что касается IC, большее значение означает эффективность и, тем самым, указывает, что для достижения ингибирования связывания требуется меньшее количество.
Анализ связывания можно проводить, используя полученные рекомбинантными способами полипептиды рецептора GHS, находящиеся в различном окружении. Такое окружение включает, например, клеточные экстракты и очищенные клеточные экстракты, содержащие полипептид рецептора GHS, экспрессированный с рекомбинантной нуклеиновой кислоты или природной нуклеиновой кислоты; сюда же относится, например, использование очищенного рецептора GHS, полученного рекомбинантными способами, либо при помощи природной нуклеиновой кислоты, который помещен в иное окружение.
Скрининг соединений, активных в отношении рецептора GHS
Скрининг соединений, активных в отношении рецептора GHS, легче проводить, используя экспрессированный рекомбинантными методами рецептор. Экспрессированный рекомбинантными методами рецептор GHS обладает определенными преимуществами, такими как возможность экспрессировать рецептор в определенной клеточной системе таким образом, что ответную реакцию на соединение в рецепторе GHS можно легко отличить от ответной реакций в других рецепторах. Например, рецептор GHS можно экспрессировать в клеточной линии, такой как HEK 293, COS 7 и CHO, которая обычно не экспрессирует данный рецептор, при помощи экспрессионного вектора, при этом та же самая клеточная линия без экспрессионного вектора может служить контролем.
Скрининг соединений, снижающих активность рецептора GHS, облегчается при использовании аналога грелина в анализе, который обеспечивает активность рецептора GHS. Можно измерять эффект тестируемых соединений на такую активность для выявления, например, аллостерических модуляторов и антагонистов.
2+
2+
2+
et al., Cell Calcium,
et al., Science,
Активность рецептора GHS можно измерять, используя различные методы, такие как определение изменения во внутриклеточной конформации рецептора GHS, в активностях, сопряженных с G-белком, и/или во внутриклеточных мессенджерах. Предпочтительно, активность рецептора GHS измеряют, используя метод, такой как те, с помощью которых измеряют внутриклеточную концентрацию Ca. Примеры методов, хорошо известных в данной области, которые можно применять для измерения концентрации Ca, включают использование красителей, таких как Fura-2, и использование Ca-чувствительных биолюминесцентных репортерных белков, таких как экворин. Примером клеточной линии, в которой используют экворин для измерения активности G-белка, является HEK293/aeql7 (Button, D.  (1993), 14(9):663-71; и Feighner, S. D.  (1999), 284(5423):2184-8).
Химерные рецепторы, содержащие связывающую область грелина, функционально связанную с другим G-белком, также можно использовать для измерения активности рецептора GHS. Химерный рецептор GHS содержит N-концевой внеклеточный домен, трансмембранный домен, составленный из трансмембранных областей, областей внеклеточных петель и областей внутриклеточных петель, а также внутриклеточный карбоксильный конец. Методы получения химерных рецепторов и измерения сопряженных с G-белком ответных реакций приведены, например, в международной патентной заявке № PCT/US96/12336 [WO 97/05252] и патенте США № 5264565, включенных в данное описание посредством ссылок.
Стимуляция активности рецептора GHS
Можно использовать аналоги грелина для стимуляции активности рецептора GHS, которую можно использовать, например, для изучения эффектов модуляции рецептора GHS и/или секреции GH, для выявления антагонистов грелина и/или для улучшения состояния субъекта, страдающего заболеванием или состоянием, таким как GH-дефицитное состояние, пониженная мышечная масса и/или плотность костей, половая дисфункция, патологический вес тела, утрата двигательных навыков и/или физических функций и/или отсутствие нормального аппетита.
Увеличение веса или аппетита имеет решающее значение для поддержания идеального, здорового веса тела у индивидуумов, склонных к потере веса, таких как больные или пожилые люди. Потеря веса или аппетита у субъекта с недостаточным весом тела может приводить к серьезным проблемам со здоровьем. Для пациента, страдающего заболеванием или подвергающегося медицинскому лечению, которое вызывает потерю веса и/или снижение нормального аппетита, эффективность лечения указанного заболевания или состояния зависит от способности пациента поддерживать постоянный вес.
Напротив, антагонисты грелина являются полезными для лечения, способствующего потере веса у тех субъектов, для которых потеря веса является необходимой.
Биологические анализы - Примеры
1. Анализ связывания с рецептором
1A. Получение клеток CHO-K1, экспрессирующих человеческий рекомбинантный рецептор GHS
et al., Cell,
кДНК рецептора стимулятора секреции GH человека (hGHS-R или рецептор грелина) клонировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), хорошо известным специалистам в данной области, при этом использовали РНК из мозга человека в качестве матрицы (поставщик Clontech, Palo Alto, CA, U.S.A.), специфические для гена праймеры, фланкирующие полноразмерную кодирующую последовательность hGHS-R (С: 5' - A T G T G G A A C G C G A C G C C C A G C G A A G A G - 3' (SEQ ID NO:25) и АС: 5' - T C A T G T A T T A A T A C T A G A T T C T G T C C A - 3' (SEQ ID NO:26)) и набор Advantage 2 PCR Kit (поставщик Clontech, Palo Alto, CA, U.S.A.). Продукт ПЦР клонировали в вектор pCR2.1, используя набор Original TA Cloning Kit (поставщик Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.A.). Полноразмерный человеческий GHS-R субклонировали в экспрессионный вектор млекопитающих pcDNA 3.1 (поставщик Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.A.). Плазмиду трансфецировали в клетки линии CHO-K1 яичника китайского хомячка (поставщик Американская коллекция типовых культур, Rockville, MD, U.S.A.), используя известные методы с фосфатом кальция, как описано в Wigler, M.  (1977), 11(1):223-32. Клоны одиночных клеток, стабильно экспрессирующие hGHS-R, получали, отбирая трансфецированные клетки, растущие в клонзапирающих кольцах в среде RPMI 1640, обогащенной 10% фетальной бычьей сывороткой и 1 мМ пируватом натрия, содержащей 0,8 мг/мл G418 (поставщик Gibco, Grand Island, NY, U.S.A.).
1B. Анализ связывания с GHS-R:
2
125
125
125
125
Мембраны для исследований связывания радиоактивного лиганда могут быть и были получены гомогенизацией вышеуказанных клеток CHO-K1, экспрессирующих человеческий рекомбинантный рецептор GHS, примерно в 20 мл ледяного 50 мМ Tris-HCl с помощью устройства Brinkman Polytron (Brinkman, Westbury, NY, U.S.A.) при установке на 6 в течение 15 секунд. Гомогенаты промывали дважды центрифугированием (39000 g/10 минут) и полученные осадки ресуспендировали примерно в 50 мМ Tris-HCl, содержащем 2,5 мМ MgCl и 0,1% бычий сывороточный альбумин (BSA). Для выбранного анализа аликвоты примерно по 0,4 мл инкубировали с 0,05 нМ (I)грелином (~2000 Ки/ммоль; Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, U.S.A.) в присутствии или в отсутствие 0,05 мл немеченого конкурирующего тестируемого пептида. Спустя примерно 60 минут при 4°C связавшийся (I)грелин отделяли от свободного грелина быстрой фильтрацией через фильтры GF/C (поставщик Brandel, Gaithersburg, MD, U.S.A.), которые были предварительно вымочены в смеси 0,5% полиэтиленимин/0,1% BSA. Затем фильтры промывали 3 раза 5-мл аликвотами ледяного 50 мМ Tris-HCl и 0,1% BSA. Связавшуюся радиоактивность, задержанную фильтрами, просчитывали при помощи гамма-спектрометрии (используя спектрометр производства Wallace LKB, Gaithersburg, MD, U.S.A.). Специфическое связывание определяли, вычитая (I)грелин, связанный в присутствии 1000 нМ грелина (поставщик Bachem, Torrence, CA, U.S.A.), из общего количества связанного (I)грелина.
Набор предпочтительных вариантов осуществления тестировали при помощи анализа связывания с рецептором, обсуждавшегося выше, и результаты, полученные для данных соединений, представлены в таблице 3, приведенной ниже.
<b>ТАБЛИЦА 3</b><b>Значения Ki связывания с рецептором для выбранных соединений</b>
Пример №
СОЕДИНЕНИЕ
Ki (нМ)
SEM
№1
(Ac-Inp<sup>1</sup>, Aib<sup>2,10</sup>, Glu(NH-гексил)<sup>3</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:19)
370,00
18,18
№2
(Ac-1-Apc<sup>1</sup>, Aib<sup>2,10</sup>, Glu(NH-гексил)<sup>3</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:20)
39,99
10,92
№3
(Inp<sup>1</sup>, Aib<sup>2,10</sup>, Glu(NH-гексил)<sup>3</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:17)
0,10
0,04
№4
(1-Apc<sup>1</sup>, Aib<sup>2,10</sup>, Glu(NH-гексил)<sup>3</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:18)
0,12
0,01
№5
(Inp<sup>1</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:5)
0,36
0,08
№6
(Inp<sup>1</sup>, Aib<sup>2</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:6)
0,41
0,20
№7
(Inp<sup>1</sup>, Aib<sup>2</sup>, Glu(NH-гексил)<sup>3</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:7)
0,33
0,04
№8
(Inp<sup>1</sup>, Aib<sup>2,10</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:8)
0,40
0,02
№9
(Inp<sup>1</sup>, Aib<sup>2,8</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:9)
0,37
0,00
№10
(Inp<sup>1</sup>, Aib<sup>2</sup>, Ser(н-октаноил)<sup>17</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:10)
0,44
0,05
№11
(Inp<sup>1</sup>, Ser(н-октаноил)<sup>17</sup>)чГрелин(1-28)-NH<sub>2</sub>, (SEQ ID NO:11)
0,49
0,02
2. Анализы функциональной активности GHS-R
2A. Опосредованная рецептором GSH активация внутриклеточного iCa
in vitro
2+
2+
6
2+
2+
2+
Вышеуказанные клетки CHO-K1, экспрессирующие человеческий рецептор GSH, собирали инкубацией в 0,3% EDTA/фосфатно-солевом буферном растворе при 25°C; затем клетки 2 раза промывали центрифугированием. Промытые клетки ресуспендировали в забуференном солевом растворе Хенкса (HBSS) для введения флуоресцентного индикатора Ca Fura-2AM. Клеточные суспензии в примерной концентрации 10 клеток/мл инкубировали с 2 мкМ Fura-2AM в течение примерно 30 минут примерно при 25°C. Несвязавшийся Fura-2AM удаляли двукратным центрифугированием в HBSS, и полученные суспензии переносили в спектрофлюориметр (модель Hitachi F-2000, Tokyo, Japan), снабженный магнитным перемешивающим устройством и термостатируемым держателем кювет. После установления температуры 37°C добавляли аналоги грелина для измерения мобилизации внутриклеточного Ca. Длины волн возбуждения и излучения составляли 340 и 510 нм, соответственно. Возрастание количества измеренного Ca указывало на агонистическую активность тестируемого пептида, тогда как уменьшение количества (или дефицит) измеренного Ca указывало на антагонистическую активность тестируемого пептида.
Применяя данный метод анализа, установили, что соединения примеров 1, 2, 3 и 4 обладают антагонистической активностью в отношении рецептора грелина.
in vivo
2B. Высвобождение/супрессия GH
in vivo
et al., Life Sciences,
in vivo
Как хорошо известно в данной области, соединения можно тестировать на их способность стимулировать или подавлять высвобождение GH  (Deghenghi, R.  (1994), 54(18):1321-8; и международная патентная заявка № PCT/EP01/07929 [WO 02/08250]). Чтобы определить способность соединения стимулировать высвобождение GH , выбранное соединение в дозе примерно 300 мг/кг вводили подкожной инъекцией крысам в возрасте 10 дней. Циркулирующий GH измеряли спустя примерно 15 минут после инъекции и сравнивали с уровнями GH у крыс, которым инъецировали контрольный растворитель.
in vivo
Аналогично, выбранные соединения можно тестировать на их способность противодействовать индуцированной грелином секреции GH . Соединение по рассматриваемой в настоящий момент заявке в дозе 300 мг/кг вводили подкожной инъекцией вместе с грелином крысам в возрасте 10 дней.
Затем циркулирующий GH измеряли спустя примерно 15 минут после инъекции и сравнивали с уровнями GH у крыс, которым инъецировали только грелин.
2C. Влияние на моторику желудочно-кишечного тракта
Показано, что грелин повышает моторику желудка и ускоряет опорожнение желудка у субъектов, страдающих гастропарезом. Соединения по изобретению можно тестировать для определения эффекта соединений на опорожнение желудка и прохождение содержимого через кишечник, используя анализы, описанные ниже.
in vivo
2C(i). Изучение  влияния грелина на прохождение содержимого через кишечник
Можно проводить исследование влияния природного грелина и пептидильного аналога грелина по настоящему изобретению на прохождение содержимого через кишечник. В таком исследовании группы по восемь крыс оставляли голодать в течение примерно 24 часов со свободным доступом к воде. Природный грелин, выбранный аналог или контроль, такой как атропин, вводили анестезированным тестируемым субъектам. Примерно через пять минут после первого введения грелина, выбранного аналога или контроля, 2 мл тонкоизмельченного активированного угля вводили тестируемым субъектам через желудочный зонд. Спустя еще примерно 25 минут тестируемых субъектов умерщвляли цервикальным переломом и извлекали тонкий кишечник. Расстояние, пройденное активированным углем, измеряли от привратника желудка.
in vivo
2C(ii). Исследование влияние грелина на опорожнение желудка
Соединения по изобретению можно тестировать для определения влияния соединений на опорожнение желудка. В таком исследовании группы по восемь самцов крыс Sprague Dawley (вес 200-250 грамм) оставляли голодать в течение примерно 24 часов со свободным доступом к воде. Природный грелин, выбранный аналог грелина или контрольное соединение, такое как метоклопрамид, вводили внутривенно анестезированным тестируемым субъектам. Примерно через пять минут после первого введения природного грелина, выбранного аналога грелина или контрольного соединения каждому тестируемому субъекту вводили по 1,5 мл пищи, меченной феноловым красным (0,5 мг/мл фенолового красного и 1,5% метилцеллюлоза в цельном молоке), через желудочный зонд. Спустя еще примерно 20 минут тестируемых субъектов умерщвляли цервикальным переломом, желудки извлекали и индивидуально измельчали. Оставшийся в желудке тестируемых субъектов феноловый красный экстрагировали и измеряли спектрофотометрически при длине волны 560 нм.
В других экспериментах группы по восемь самцов крыс Sprague Dawley (вес 200-250 грамм) оставляли голодать в течение примерно 24 часов со свободным доступом к воде. Животным вводили подкожной инъекцией либо среду для лекарственного средства, либо природный грелин или выбранные аналоги грелина в различных дозах. Примерно через 15 минут крысам перорально вводили 1,5 мл пищи, меченной феноловым красным (0,5 мг/мл фенолового красного и 1,5% метилцеллюлоза в цельном молоке). Спустя еще примерно 15 минут субъектов умерщвляли цервикальным переломом и, после пережатия привратника желудка и кардиального отверстия, желудок удаляли. Оставшийся в желудке тестируемых субъектов феноловый красный экстрагировали и измеряли спектрофотометрически при длине волны 560 нм.
2C(iii). Влияние на POI у крыс
Под изофлурановой анестезией проводили 3-сантиметровую лапаротомию у самцов крыс Sprague Dawley (вес 200-250 грамм), чтобы вызвать желудочно-кишечную непроходимость. Абдоминальные мышцы и кожу сшивали и животных оставляли для восстановления в течение примерно двух часов и сорока пяти минут. В это время лапарэктомированным животным подкожно вводили среду для лекарственного средства или выбранные аналоги грелина. Спустя примерно 15 минут после введения соединений или среды животным вводили меченную феноловым красным пищу (смотри выше). Спустя еще примерно 15 минут субъектов умерщвляли цервикальным переломом и опорожнение желудка определяли, как описано выше.
2C(iv). Влияние на POI у крыс в присутствии морфина
Под изофлурановой анестезией проводили 3-сантиметровую лапаротомию у самцов крыс Sprague Dawley (вес 200-250 грамм), чтобы вызвать желудочно-кишечную непроходимость. Абдоминальные мышцы и кожу сшивали и животных оставляли для восстановления в течение примерно 2,5 часов, в это время лапарэктомированным животным подкожно вводили 4 мг/кг морфина. Спустя примерно 15 минут после введения морфина лапарэктомированным животным подкожно вводили среду для лекарственного средства или выбранные аналоги грелина. Спустя примерно 15 минут после введения соединений или среды животным вводили меченную феноловым красным пищу (смотри выше). Спустя еще примерно 15 минут субъектов умерщвляли цервикальным переломом и опорожнение желудка определяли, как описано выше.
2C(v). Влияние на моторику желудка у крыс в присутствии морфина
Самцам крыс Sprague Dawley (вес 200-250 грамм) подкожно вводили 4 мг/кг морфина. Спустя примерно 15 минут после введения морфина животным подкожно вводили среду для лекарственного средства или выбранные аналоги грелина. Спустя примерно 15 минут после введения соединений или среды животным вводили меченную феноловым красным пищу (смотри выше). Спустя еще примерно 15 минут субъектов умерщвляли цервикальным переломом и опорожнение желудка определяли, как описано выше.
2D. Влияние на вес тела
Лиганды для рецепторов меланокортина по настоящему изобретению можно тестировать для определения влияния на употребление пищи и/или вес тела, используя следующий метод. Специалисту в данной области должно быть понятно, что методы, аналогичные тем, которые описаны в данном документе, можно использовать для анализа влияния соединений по изобретению на употребление пищи и/или вес тела.
2D(i). Эксперименты по острому кормлению (голодание)
ad libitum
Самцов крыс Sprague Dawley (250 г) размещали в индивидуальных клетках и содержали в условиях чередования света-темноты 12:12 часов. Крыс лишали пищи за 18 часов до начала эксперимента, оставляя доступ к воде . В момент времени 0 крысам вводили подкожной (sc) инъекцией выбранные соединения в выбранных дозах, например 500 или 100 нмоль/кг, или среду для лекарственного средства и давали корм. Индивидуальное потребление корма измеряли примерно через 1, 2, 3, 4, 5 и 6 часов после инъекции.
2D(ii). Эксперименты по острому кормлению (не голодание)
ad libitum
Самцов крыс Sprague Dawley (250 г) размещали в индивидуальных клетках и содержали в условиях чередования света-темноты 12:12 часов. На протяжении всего эксперимента корм и вода были доступны . В момент времени 0 крысам вводили подкожной инъекцией либо соединение в дозе 8 мкмоль/кг, либо среду для лекарственного средства. Индивидуальное потребление корма измеряли примерно через 0,5, 1, 1,5, 2, 3 и 4 часа после инъекции.
2D(iii) Хронические эксперименты по кормлению
ad libitum
Самцов крыс Sprague Dawley (250 г) размещали в индивидуальных клетках и содержали в условиях чередования света-темноты 12:12 часов, при этом корм и вода были доступны . Крысам вводили подкожной инъекцией 3×/сутки (08.00, 12.00 и 16.00 ч) соединение в различных дозах или среду для лекарственного средства в течение 7 дней. Индивидуальный вес тела и потребление корма измеряли ежедневно.
Введение
Remington's Pharmaceutical Sciences 18е издание,
Modem Pharmaceutics 2е издание
Аналоги грелина можно составлять в препарат и вводить субъекту, используя руководство, приведенное в данном документе, наряду с методами, хорошо известными в данной области. Предпочтительный способ введения обеспечивает доставку эффективного количества соединения к цели. В общих чертах руководство по фармацевтическому введению приведено, например, в  Ed. Gennaro, Mack Publishing, 1990, и , Eds. Banker and Rhodes, Marcel Dekker, Inc., 1990, оба источника включены в данное описание посредством ссылок.
Аналоги грелина можно получать в виде кислотных или основных солей. Фармацевтически приемлемые соли (в форме водо- или жирорастворимых, либо дисперсных продуктов) включают общепринятые нетоксичные соли или четвертичные аммониевые соли, образованные из неорганических или органических кислот или оснований. Примеры таких солей включают, но не ограничиваются ими, кислотно-аддитивные соли, такие как ацетат, адипат, альгинат, аспартат, бензоат, бензолсульфонат, бисульфат, бутират, цитрат, камфорат, камфорсульфонат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, фумарат, глюкогептаноат, глицерофосфат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, 2-гидроксиэтансульфонат, лактат, малеат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, оксалат, памоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, пикрат, пивалат, пропионат, сукцинат, тартрат, тиоцианат, тозилат и ундеканоат; а также соли оснований, такие как соли аммония, соли щелочных металлов, такие как соли натрия и соли калия, соли щелочно-земельных метадллов, такие как соли кальция и магния, соли с органическими основаниями, такие как соли дициклогексиламина, N-метил-D-глюкамина, и соли с аминокислотами, такими как аргинин и лизин.
Аналоги грелина можно водить различными путями, включая пероральный и назальный прием, либо трансдермальную и трансмукозальную инъекцию. Активные ингредиенты, вводимые перорально в виде суспензии, можно получать при помощи методов, хорошо известных в области фармацевтического составления препаратов, и они могут содержать микрокристаллическую целлюлозу для придания объема, альгиновую кислоту или альгинат натрия в качестве суспендирующего средства, метилцеллюлозу для повышения вязкости и подсластители/отдушки. В виде таблеток с немедленным высвобождением фармацевтические препараты могут содержать микрокристаллическую целлюлозу, дикальцийфосфат, крахмал, стеарат магния и лактозу и/или другие эксципиенты, связующие вещества, наполнители, разрыхлители, разбавители и смазывающие вещества.
Препараты, вводимые назально аэрозольным распылением или ингаляцией, можно получать, например, в виде растворов в физиологическом растворе, используя бензиловый спирт или другие подходящие консерванты, стимуляторы всасывания для усиления биодоступности, используя фтороуглеводороды и/или используя другие солюбилизирующие или диспергирующие средства.
Аналоги грелина можно также вводить внутривенно (как болюсным вливанием, так и инфузией), внутрибрюшинно, подкожно, местно, с окклюзией или без нее, либо внутримышечно. При введении инъекцией инъецируемый раствор или суспензию можно составлять с использованием подходящих нетоксических парентерально-приемлемых разбавителей или растворителей, таких как раствор Рингера или изотонический раствор хлорида натрия, либо подходящих диспергирующих или смачивающих и суспендирующих средств, таких как стерильные легкие нелетучие масла, включая синтетические моно- или диглицериды и жирные кислоты, включая олеиновую кислоту.
Подходящие режимы дозирования предпочтительно определяют, принимая во внимание факторы, хорошо известные в данной области, включая тип субъекта, к которому применяют дозирование, возраст, вес, половую принадлежность и медицинское состояние субъекта, путь введения, почечную или печеночную функцию субъекта, желаемый эффект и конкретное применяемое соединение.
Оптимальная точность при достижении концентраций лекарственного средства в диапазоне, в котором достигается эффективность без токсичности, требует режима, основанного на кинетике доступности лекарственного средства для зон-мишеней. Сюда относится рассмотрение распределения, состояния равновесия и удаления из организма лекарственного средства. Суточная доза для субъекта, как ожидается, составит от 0,01 до 1000 мг для субъекта в сутки.
Аналоги грелина можно поставлять в наборе. Такой набор обычно содержит активное соединение в лекарственных формах для введения. Лекарственная форма содержит достаточное количество активного соединения, такое, чтобы можно было достичь желаемого эффекта при введении субъекту через равные интервалы, например, 1-6 раз в сутки, на протяжении курса в 1 или более дней. Предпочтительно, набор содержит инструкции, описывающие применение лекарственной формы для достижения желаемого эффекта и количество лекарственной формы, которое следует принимать в течение определенного периода времени.
Данное изобретение описано в иллюстративной манере и следует понимать, что использованная терминология по своему характеру предназначена для описания, а не для ограничения объема изобретения. Очевидно, что многие модификации и варианты настоящего изобретения являются возможными в свете вышеуказанных идей. Таким образом, следует понимать, что в рамках прилагаемой формулы изобретения данное изобретение можно осуществлять на практике иным образом, чем конкретно описано.
Патент и научная литература, приведенная в данном документе, представляют информацию, которая доступна для специалистов в данной области. Полное содержание всех патентов, патентных публикаций и других публикаций, цитированных в данном документе, включено в данный документ посредством ссылок.