КУЛЬТУРЫ С ПОВЫШЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ К ФАГАМ

1. Способ генерирования, по меньшей мере, одного устойчивого к бактериофагам вариантного штамма, включающий стадии:
(а) воздействия на материнский бактериальный штамм, содержащий, по меньшей мере, от части локуса CRISPR, по меньшей мере, до одной последовательности нуклеиновой кислоты для получения смеси бактерий, содержащей, по меньшей мере, один устойчивый к бактериофагам вариантный штамм, содержащий модифицированный локус CRISPR;
(b) выбора указанного устойчивого к бактериофагам вариантного штамма из указанной смеси бактерий;
(с) выбора указанных устойчивых к бактериофагам вариантных штаммов, содержащих дополнительный фрагмент нуклеиновой кислоты в указанном модифицированном локусе CRISPR из указанных устойчивых к бактериофагам штаммов, выбранных на стадии (b); и
(d) выделения указанного, по меньшей мере, одного устойчивого к бактериофагам вариантного штамма, где штамм содержит дополнительный фрагмент нуклеиновой кислоты в указанном модифицированном локусе CRISPR.
2. Способ по п.1, где указанный способ дополнительно включает стадию сравнения указанного локуса CRISPR или его части указанного материнского бактериального штамма и указанного модифицированного локуса CRISPR указанного устойчивого к бактериофагам вариантного штамма для идентификации устойчивых к бактериофагам вариантных штаммов, содержащих, по меньшей мере, один дополнительный фрагмент нуклеиновой кислоты в указанном модифицированном локусе CRISPR, который отсутствует в указанном локусе CRISPR материнского бактериального штамма.
3. Способ по п.2, дополнительно включающий стадию выбора указанных устойчивых к бактериофагам вариантных штаммов, содержащих дополнительный фрагмент нуклеиновой кислоты в указанном модифицированном локусе CRISPR.
4. Способ по п.1, где указанный материнский бактериальный штамм подвергается воздействию двух или более последовательностей нуклеиновых кислот.
5. Способ по п.1, где указанный материнский бактериальный штамм подвергается одновременному воздействию двух или более последовательностей нуклеиновых кислот.
6. Способ по п.1, где указанный материнский бактериальный штамм последовательно подвергается воздействию двух или более последовательностей нуклеиновых кислот.
7. Способ по п.1, где указанный материнский бактериальный штамм подвергается воздействию указанной последовательности нуклеиновых кислот посредством инфекции, по меньшей мере, одним бактериофагом, содержащим указанную последовательность нуклеиновой кислоты.
8. Способ по п.7, где указанный, по меньшей мере, один бактериофаг выбран из группы семейств вирусов, состоящей из: Corticoviridae, Cystoviridae, Inoviridae, Leviviridae, Microviridae, Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae и Tectiviridae.
9. Способ по п.7, где указанный, по меньшей мере, один бактериофаг представляет собой естественно встречающийся бактериофаг.
10. Способ по п.7, где указанный, по меньшей мере, один бактериофаг представляет собой мутированный бактериофаг, полученный посредством селективного давления с использованием устойчивой к бактериофагам бактерии.
11. Способ по п.1, где указанный материнский бактериальный штамм подвергается воздействию указанной нуклеиновой кислоты посредством естественного механизма захвата нуклеиновых кислот.
12. Способ по п.11, где указанный естественный механизм захвата нуклеиновых кислот включает естественную компетентность.
13. Способ по п.11, где указанный естественный механизм захвата нуклеиновых кислот материнского бактериального штамма осуществляется конъюгацией или трансформацией.
14. Способ по п.1, где указанный устойчивый к бактериофагам штамм представляет собой нечувствительный к бактериофагам мутант.
15. Способ по п.1, где указанный материнский бактериальный штамм представляет собой нечувствительный к бактериофагам мутант.
16. Способ по п.1, где конец 5' и/или конец 3' указанного локуса CRISPR материнского бактериального штамма сравнивается с указанным модифицированным локусом CRISPR указанного устойчивого к бактериофагам вариантного штамма.
17. Способ по п.1, где конец 5' и/или конец 3', по меньшей мере, первого повтора CRISPR или, по меньшей мере, первого спейсера CRISPR локуса CRISPR указанного материнского бактериального штамма сравнивается с указанным модифицированным локусом CRISPR указанного устойчивого к бактериофагам вариантного штамма.
18. Способ по п.1, где указанный устойчивый к бактериофагам вариантный штамм содержит, по меньшей мере, один дополнительный фрагмент нуклеиновой кислоты в модифицированном локусе CRISPR.
19. Способ по п.1, где указанная, по меньшей мере, часть указанного локуса CRISPR указанного материнского бактериального штамма и, по меньшей мере, часть указанного модифицированного локуса CRISPR указанного устойчивого к бактериофагам вариантного штамма сравниваются амплификацией, по меньшей мере, части указанного локуса CRISPR и, по меньшей мере, части указанного модифицированного локуса CRISPR, для получения амплифицированной последовательности локуса CRISPR и амплифицированной последовательности модифицированного локуса CRISPR.
20. Способ по п.19, где указанная амплификация проводится с использованием полимеразной цепной реакции.
21. Способ по п.1, где указанная, по меньшей мере, часть указанного локуса CRISPR указанного материнского бактериального штамма и, по меньшей мере, часть указанного модифицированного локуса CRISPR указанного устойчивого к бактериофагам вариантного штамма сравниваются секвенированием, по меньшей мере, части указанного локуса CRISPR и, по меньшей мере, части указанного модифицированного локуса CRISPR.
22. Способ по п.19, дополнительно включающий стадию секвенирования указанной амплифицированной последовательности локуса CRISPR и указанной амплифицированной последовательности модифицированного локуса CRISPR.
23. Способ по п.1, где указанный дополнительный фрагмент нуклеиновой кислоты в указанном модифицированном локусе CRISPR представляет собой дополнительный элемент повтора-спейсера.
24. Способ по п.1, где указанный дополнительный элемент повтора-спейсера содержит, по меньшей мере, примерно 44 нуклеотида.
25. Способ по п.1, где указанный дополнительный элемент повтора-спейсера содержит от примерно 44 до примерно 119 нуклеотидов.
26. Способ по п.1, где указанный дополнительный элемент повтора-спейсера содержит, по меньшей мере, одну нуклеотидную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 95% идентичность с повтором CRISPR в указанном локусе CRISPR указанного материнского бактериального штамма.
27. Способ по п.1, где указанный дополнительный элемент повтора-спейсера содержит, по меньшей мере, одну нуклеотидную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 95% идентичность с нуклеотидной последовательностью в геноме, по меньшей мере, одного бактериофага.
28. Способ по п.1, где указанный материнский бактериальный штамм представляет собой промышленно применимый штамм.
29. Способ по п.28, где указанный материнский бактериальный штамм восприимчив к инфекции, по меньшей мере, одним бактериофагом.
30. Способ по п.28, где указанный материнский бактериальный штамм содержит штамм, полученный из культуры, выбранной из заквасочных культур, пробиотических культур и культур пищевых добавок.
31. Способ по п.1, где указанный материнский бактериальный штамм выбран из Escherichia, Shigella, Salmonella, Erwinia, Yersinia, Bacillus, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Agrobacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Francisella, Brucella, Campylobacter, Klebsiella, Frankia, Bartonella, Rickettsia, Shewanella, Serratia, Enterobacter, Proteus, Providencia, Brochothrix, Bifidobacterium, Brevibacterium, Propionibacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc и Oenococcus.
32. По меньшей мере, один устойчивый к бактериофагам вариантный штамм, полученный с использованием способа по п.1.
33. Устойчивый к бактериофагам вариантный штамм, полученный способом по п.1, где указанный устойчивый к бактериофагам вариантный штамм представляет собой промышленно применимый штамм.
34. Устойчивый к бактериофагам вариантный штамм, полученный способом по п.1, где указанный устойчивый к бактериофагам вариантный штамм выбран из заквасочных культур, пробиотических культур и культур пищевой добавки.
35. Композиция, содержащая устойчивый к бактериофагам вариантный штамм, полученный с использованием способа по п.1.
36. Композиция, содержащая, по меньшей мере, два устойчивых к бактериофагам вариантных штамма, полученных способом по п.1.
37. Пищевой продукт или корм, содержащий композицию по п.35 или 36.
38. Способ получения пищевого продукта или корма, включающий добавление указанной композиции по п.35 или 36 к указанной пище или корму.
39. Заквасочная культура, пробиотическая культура или культура пищевой добавки, содержащая композицию по п.35 или 36.
40. Способ ферментации, включающий добавление композиции по п.35 или 36 к заквасочной культуре.
41. Способ ферментации, включающий добавление композиции по п.35 или 36 к среде ферментации в условиях, при которых происходит брожение компонентов указанной среды ферментации.
42. Способ по п.41, где на указанное брожение не воздействует присутствие бактериофагов.
43. Способ по п.41, где указанная среда ферментации представляет собой пищевой продукт.
44. Способ по п.43, где указанный пищевой продукт представляет собой диетический продукт.
45. Способ по п.44, где указанный диетический продукт представляет собой молоко.
46. Способ по п.41, где, по меньшей мере, две различные композиции, содержащие два или более устойчивых к бактериофагам вариантных штамма, последовательно подвергаются воздействию указанной среды ферментации.
47. Способ уменьшения вредной популяции бактериофагов в среде ферментации, включающий воздействие на среду ферментации, по меньшей мере, одного устойчивого к бактериофагам вариантного штамма, полученного с использованием способа по п.1, в условиях, при которых уменьшается популяция бактериофагов.
48. Способ генерирования, по меньшей мере, одного устойчивого к бактериофагам вариантного штамма, включающий стадии:
(а) воздействие на материнский бактериальный штамм, содержащий, по меньшей мере, от части локуса CRISPR, по меньшей мере, до одной последовательности нуклеиновой кислоты для получения смеси бактерий, содержащей, по меньшей мере, один устойчивый к бактериофагам вариантный штамм, содержащий модифицированный локус CRISPR;
(b) выбора устойчивого к бактериофагам вариантного штамма из указанной смеси бактерий;
(с) сравнения указанного локуса CRISPR или его части указанного материнского бактериального штамма и указанного модифицированного локуса CRISPR указанного устойчивого к бактериофагам вариантного штамма, для идентификации устойчивых к бактериофагам вариантных штаммов, содержащих, по меньшей мере, один дополнительный фрагмент нуклеиновой кислоты в указанном модифицированном локусе CRISPR, который отсутствует в указанном локусе CRISPR указанного материнского бактериального штамма;
(d) выбора указанных устойчивых к бактериофагам вариантных штаммов, содержащих дополнительный фрагмент нуклеиновой кислоты в указанном модифицированном локусе CRISPR;
(е) анализа указанного, по меньшей мере, одного дополнительного фрагмента нуклеиновой кислоты в указанном модифицированном локусе CRISPR для идентификации указанного, по меньшей мере, одного устойчивого к бактериофагам вариантного штамма; и
(f) выделения указанного, по меньшей мере, одного устойчивого к бактериофагам вариантного штамма.
49. Способ генерирования мутантов фагов, избегающих CRISPR, включающий:
(а) получение, по меньшей мере, одного материнского фага и устойчивого к фагам бактериального штамма, содержащего, по меньшей мере, один локус CRISPR, где указанный локус CRISPR содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая, по меньшей мере, примерно на 95% идентична, по меньшей мере, одной протоспейсерной последовательности в геноме указанного, по меньшей мере, одного материнского фага;
(b) воздействие на указанный, по меньшей мере, один материнский фаг устойчивого к фагам бактериального штамма в таких условиях, чтобы был получен, по меньшей мере, один вариант фага; и
(с) отбор, по меньшей мере, одного варианта фага, где указанный, по меньшей мере, один вариант фага проявляет способность инфицировать указанный устойчивый к фагам бактериальный штамм и представляет собой мутант фага, избегающий CRISPR.
50. Способ по п.49, где указанный устойчивый к фагам бактериальный штамм представляет собой устойчивый к бактериофагам вариантный штамм, полученный с использованием способа по п.48.
51. Способ по п.49, дополнительно включающий стадию сравнения, по меньшей мере, части указанной, по меньшей мере, одной протоспейсерной последовательности и мотива CRISPR, расположенного около указанной, по меньшей мере, одной протоспейсерной последовательности в указанном варианте фага, по меньшей мере, с одной протоспейсерной последовательностью и мотивом CRISPR указанного материнского фага.
52. Способ по п.51, дополнительно включающий стадию выбора указанных вариантных фагов, которые инфицируют указанный устойчивый к фагам бактериальный штамм, где указанные вариантные фаги содержат указанные мутанты фагов, избегающих CRISPR, и где указанные фаги, избегающие CRISPR, содержат, по меньшей мере, одну мутацию в указанной, по меньшей мере, одной протоспейсерной последовательности и/или в мотиве CRISPR указанных мутантов фагов, избегающих CRISPR.
53. Способ по п.49, где указанный способ повторяется один или несколько раз с использованием указанных мутантов фагов, избегающих CRISPR, и другого устойчивого к фагам CRISPR бактериального штамма, содержащего, по меньшей мере, один локус CRISPR, где указанный локус CRISPR содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая, по меньшей мере, на 95% идентична, по меньшей мере, одной протоспейсерной последовательности в геноме указанных мутантов фагов, избегающих CRISPR.
54. Способ по п.49, где указанный, по меньшей мере, один бактериофаг выбран из группы семейств вирусов, состоящей из Corticoviridae, Cystoviridae, Inoviridae, Leviviridae, Microviridae, Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae и Tectiviridae.
55. Способ по п.49, где указанный устойчивый к фагам бактериальный штамм выбран из Escherichia, Shigella, Salmonella, Erwinia, Yersinia, Bacillus, Vibrio, Legionella, Pseudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Agrobacterium, Staphylococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Francisella, Brucella, Campylobacter, Klebsiella, Frankia, Bartonella, Rickettsia, Shewanella, Serratia, Enterobacter, Proteus, Providencia, Brochothrix, Bifidobacterium, Brevibacterium, Propionibacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Streptococcus и Oenococcus.
56. Мутант фага, избегающий CRISPR, полученный с использованием способа по п.49.
57. Мутант фага, избегающий CRISPR, по п.56, где две или более мутации присутствуют, по меньшей мере, в двух протоспейсерных последовательностях и/или в указанном мотиве CRISPR.
58. Мутант фага, избегающий CRISPR, где геном мутанта фага, избегающий CRISPR, создан методом генной инженерии для включения мутаций, по меньшей мере, в одном протоспейсере и/или указанном мотиве CRISPR.
59. Мутант фага, избегающий CRISPR, где, по меньшей мере, один указанный мотив CRISPR мутирован.
60. Мутант фага, избегающий CRISPR, где, по меньшей мере, один указанный мотив CRISPR подвергнут делеции.
61. Композиция, содержащая, по меньшей мере, один мутант фага, избегающий CRISPR, по п.56.
62. Способ регулирования бактериальных популяций в продукте, включающий воздействие на композиции по п.61, среды ферментации, где указанная среда ферментации содержит, по меньшей мере, одну популяцию нежелательных бактерий, в таких условиях, что популяция указанных нежелательных бактерий уменьшается, и среда ферментации используется для генерирования указанного продукта.
63. Способ по п.62, где указанный продукт выбран из пищевых продуктов, кормов, косметических изделий, продуктов для личного ухода, гигиенических продуктов, ветеринарных продуктов и пищевых добавок.
64. Способ по п.62, где указанный способ повторяется, по меньшей мере, однократно, и указанные другие композиции по п.61 используются при ротации.