ПОДЛОЖКА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО ОБРАЗЦА МЕТОДОМ СКАНИРУЮЩЕЙ ЗОНДОВОЙ НАНОТОМОГРАФИИ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ
SUBSTRATE FOR EXAMINING A BIOLOGICAL SAMPLE BY SCANNING PROBE NANOTOMOGRAPHY AND A METHOD FOR PRODUCTION THEREOF

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в качестве подложки для исследований биологических образцов методом сканирующей зондовой нанотомографии (СЗНТ).
Известна подложка для исследований биологических образцов, представляющая собой кремниевую пластинку, покрытую пленкой Ленгмюра-Блоджетт из пяти мономолекулярных слоев органического соединения с общей толщиной пленки 6.5 нм [RU 110082, U1]. Такая подложка является гидрофобной и имеет показатель шероховатости до 1 нм, что уменьшает ее адгезионные свойства для биологических объектов. Способ получения данной подложки включает использование материалов, которые не позволяют применять ее для культивирования клеток и их дальнейшего анализа вследствие токсичности и гидрофобности. Данная подложка не является прозрачной, что исключает ее использование для исследований методами световой микроскопии и спектроскопии, которые в некоторых случаях являются необходимыми при получении биологических образцов для анализа.
Техническая проблема заключается в необходимости создания универсальной, механически прочной, прозрачной и биосовместимой подложки для подготовки и анализа биологических образов методом СЗНТ.
Технический результат, достигаемый при осуществлении патентуемой группы изобретений, заключается в обеспечении
- биосовместимости подложки для исследований биологических образцов, что обеспечивает возможность культивирования клеток на подложке, а также иммобилизации на подложке живых организмов и их частей;
- механической прочности подложки для исследований биологических образцов, что позволяет проводить манипуляции с биологическим образцом;
- универсальности подложки для исследований биологических образцов, что позволяет использовать подложку для исследований широкого спектра биологических образцов;
- прозрачности подложки, что делает возможным проведение дополнительных исследований методами световой микроскопии и спектроскопии,
- исключения присутствия остаточных количеств токсичных для клеток веществ в составе подложки, а также ее пригодности для исследований биологических образцов за счет предлагаемого способа получения подложки.
Сущность изобретения заключается в следующем.
Патентуется подложка для исследования биологического образца методом сканирующей зондовой нанотомографии, которая представляет собой пленку толщиной 1-100 мкм, которая содержит 5-100% фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyx mori по массе.
Существует вариант, в котором подложка дополнительно содержит, по меньшей мере, одно вещество, способствующее адгезии и пролиферации клеток млекопитающего.
Предложен также способ получения указанной подложки, в котором для получения пленки водный раствор фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyx mori лиофильно высушивают. После этого растворяют сухой лиофилизированный фиброин шелка в муравьиной кислоте до концентрации 1-100 мг/мл раствора. Полученный раствор наносят на поверхность для высушивания, а после полного высыхания раствора отделяют от поверхности для высушивания пленку из фиброина шелка.
Существует вариант, в котором пленку из фиброина шелка обрабатывают раствором, по меньшей мере, одного вещества, способствующего адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, путем инкубации в растворе этого вещества.
Существует вариант, в котором в состав раствора фиброина шелка перед нанесением на поверхность для высушивания вводят, по меньшей мере, одно вещество, способствующее адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, в количестве до 95% по массе.
Существует вариант, в котором подложку из фиброина шелка перед отделением или после отделения от поверхности для высушивания инкубируют в метаноле или этаноле в течение 10-60 минут.
Существует вариант, в котором подложку из фиброина шелка получают на поверхности посуды для культивирования клеток.
Существует вариант, в котором подложку из фиброина шелка на поверхности посуды для культивирования клеток инкубируют в метаноле или этаноле в течение 10-60 минут.
Изобретения поясняются следующими фигурами.
На Фиг. 1 изображена подложка из фиброина шелка, полученная методом полива водного раствора фиброина шелка на поверхность полированного тефлона.
На Фиг. 2 изображена подложка из фиброина шелка, покрытая раствором коллагена, иммобилизованная на поверхности пластика.
На Фиг. 3 изображена подложка из фиброина шелка, полученная методом полива раствора фиброина шелка в муравьиной кислоте на поверхность полированного тефлона.
Способ получения подложки реализуется следующим образом.
В одном из вариантов подложка для анализа образцов методом сканирующей зондовой нанотомографии представляет собой пленку из фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyx mori толщиной 1-100 мкм, содержащую 5-100% фиброина шелка по массе (фиг. 1).
Кроме этого существует вариант, в котором подложка, выполненная в виде пленки, дополнительно содержит, по меньшей мере, одно вещество, способствующее адгезии и пролиферации клеток млекопитающего. Для этого в состав раствора для получения пленки вводят это вещество (например, фибронектин, желатин, эластин), либо покрывают пленку растворами этих веществ (фиг. 2). Для этого отделенную подложку помещают в пробирку с раствором этого вещества (например, фибронектина, желатина, коллагена) и инкубируют в течение указанного времени (например, для раствора фибронектина с концентрацией 10 мкг/мл время инкубации составляет 12 часов, для раствора желатина с концентрацией 10 мг/мл время инкубации составляет 2 часа, для раствора коллагена с концентрацией 20 мг/мл время инкубации составляет 4 часа), либо наносят раствор этого вещества на поверхность подложки и инкубируют в течение указанного времени.
Кроме этого существует вариант, в котором для получения пленки водный раствор фиброина шелка лиофильно высушивают, после чего растворяют сухой лиофилизированный фиброин шелка в муравьиной кислоте до концентрации 1-100 мг/мл и полученный раствор наносят на поверхность для высушивания, и после полного высыхания раствора отделяют от поверхности для высушивания пленку из фиброина шелка (фиг. 3). Для этого используют инструмент, например, шпатель или скальпель.
Кроме этого существует вариант, в котором в состав раствора фиброина шелка перед нанесением на поверхность для высушивания вводят, по меньшей мере, одно вещество, способствующее адгезии и пролиферации клеток млекопитающего, в количестве до 95% по массе. Для этого в раствор фиброина шелка вносят это вещество в сухом виде или в виде раствора и перемешивают, например, с помощью автоматической пипетки или магнитной мешалки.
Кроме этого существует вариант, в котором подложку из фиброина шелка перед отделением или после отделения от поверхности для высушивания инкубируют в метаноле или этаноле в течение 10-60 минут. При этом молекулы фиброина шелка в составе пленки переходят в состояние β-слоев, что приводит к дополнительному увеличению механической прочности подложки и уменьшению ее скорости деградации. Для этого на подложку наносят метанол или этанол так, чтобы он покрывал подложку, или вносят отделенную подложку в пробирку с метанолом или этанолом.
Кроме этого существует вариант, в котором подложку из фиброина шелка получают на поверхности посуды для культивирования клеток. Для этого раствор фиброина шелка наносят на поверхность посуды для культивирования клеток и высушивают при комнатной температуре (фиг. 2).
Кроме этого существует вариант, в котором подложку из фиброина шелка на поверхности посуды для культивирования клеток инкубируют в метаноле или этаноле в течение 10-60 минут. При этом молекулы фиброина шелка в составе пленки переходит в состояние β-слоев, что приводит к дополнительному увеличению механической прочности подложки и уменьшению ее скорости деградации. Для этого в посуду для культивирования клеток вносят метанол или этанол так, чтобы он покрывал подложку.
Предлагаемый способ получения подложки из фиброина шелка для исследования биологического образца осуществляется следующим образом.
Пример 1.
В данном примере фиброин шелка для изготовления подложки выделяли из шелковых нитей 4-0 (Моснитки, Россия). Для этого взвешивали 1 г нитей шелка, разрезали нити на фрагменты по 0,5 см. Кипятили на водяной бане в течение 40 минут в растворе с добавлением двууглекислого натрия для очистки нитей от серицина и других примесей. Затем промывали 3600 мл дистиллированной воды. Кипятили 3 раза по 30 минут в бидистиллированной воде, промывая после каждого кипячения дистиллированной водой. После чего высушивали в сушильном шкафу. Для получения водного раствора фиброина в 9,3 М водный раствор бромида лития вносили навеску фиброина массой 150 мг/мл. Нагревали на кипящей водяной бане в течение 7 часов. После этого проводили диализ полученного раствора против бидистиллированной воды. Полученный диализный раствор замораживали при -80°С, а затем подвергали лиофилизации до полного удаления воды. Полученный лиофилизированный фиброин шелка растворяли в муравьиной кислоте из расчета 1 мг/мл при нагревании до 40°С на водяной бане в течение 10 минут. Полученный раствор центрифугировали 5 минут при 12100 g. Для изготовления подложки полученный раствор вносили в лунки 48-луночного планшета из расчета 400 мкл на лунку и высушивали в течение двух суток при комнатной температуре. Затем в лунки вносили этанол и инкубировали в течение 10 минут. Толщина полученной подложки составляла 1 мкм. В данном примере полученную подложку на планшете использовали для получения образца клеток линии 3Т3 для сканирующей зондовой нанотомографии. Для этого клетки линии 3Т3 культивировали в лунках планшета на подложках в течение 2-х суток в термостате при температуре 37°С и 5% углекислого газа, а затем производили заливку образца в полимерную среду (эпоксидную смолу) следующим образом. Из лунок планшета отбирали среду инкубации и производили две отмывки стерильным натрий-фосфатным буфером (рН=7,4), после чего вносили 2,5% раствор глутарового альдегида в натрий-фосфатном буфере (рН=7,4) и инкубировали в течение 2 часов в темноте при 4°С и двукратно отмывали натрий-фосфатным буфером (рН=7,4). Затем производили дегидратацию образца проводкой по спиртам с увеличивающейся концентрацией по схеме:
а) р-р этанола 30% - 10 мин;
б) р-р этанола 50% - 10 мин;
в) р-р этанола 70% - 10 мин;
г) р-р этанола 80% - 10 мин;
д) р-р этанола 96% - 10 мин.
Образец отмывали трехкратно пропиленоксидом по 10 минут, а затем инкубировали в смеси пропиленоксида и эпоксидной смолы в соотношении 1:1 в течение 30 минут, после чего образец переносили в смесь пропиленоксида и эпоксидной смолы в соотношении 1:2 и инкубировали в течение 30 минут. Для заливки образца использовалась эпоксидная среда (Ероху Embedding Medium kit, Sigma-Aldrich, Cat. №45359-1EA-F). Образец заключали в эпоксидную среду, инкубировали в термостате при 45°С в течение 24 часов, после чего продолжали инкубацию в течение 72 часов при температуре 60°С. Затем образец отделяли от лунки планшета с помощью скальпеля.
Пример 2.
2
В данном примере фиброин шелка для изготовления подложки выделяли из шелковых нитей 4-0 (Моснитки, Россия). Для этого взвешивали 1 г нитей шелка, разрезали нити на фрагменты по 0,5 см. Кипятили на водяной бане в течение 40 минут в растворе с добавлением двууглекислого натрия для очистки нитей от серицина и других примесей. Затем промывали 3600 мл дистиллированной воды. Кипятили 3 раза по 30 минут в бидистиллированной воде, промывая после каждого кипячения дистиллированной водой. После чего высушивали в сушильном шкафу. Для получения водного раствора фиброина в 9,3 М водный раствор бромида лития вносили навеску фиброина массой 150 мг/мл. Нагревали на кипящей водяной бане в течение 7 часов. После этого проводили диализ полученного раствора против бидистиллированной воды. Полученный диализный раствор замораживали при -80°С, а затем подвергали лиофилизации до полного удаления воды. Полученный лиофилизированный фиброин шелка растворяли в муравьиной кислоте из расчета 100 мг/мл при нагревании до 40°С на водяной бане в течение 60 минут. Полученный раствор центрифугировали 5 минут при 12100 g. Для изготовления подложки полученный раствор наносили на поверхность полированного тефлона (в данном примере для получения подложки площадью 1 см наносили 600 мкл раствора) и высушивали в течение двух суток при комнатной температуре. Полученную подложку из фиброина шелка отделяли от поверхности тефлона с помощью скальпеля, предварительно инкубировав в этаноле в течение 60 минут. Толщина полученной подложки составляла 100 мкм (фиг. 3). В данном примере полученную подложку помещали в чашку Петри и использовали для получения образца клеток линии 3Т3 для сканирующей зондовой нанотомографии. Для этого клетки линии 3Т3 культивировали в чашке Петри с подложкой из фиброина шелка в течение 2-х суток в термостате при температуре 37°С и 5% углекислого газа, а затем производили заливку подложки с клетками линии 3Т3 в полимерную среду (эпоксидную смолу) следующим образом. Подложку переносили в пробирку со стерильным натрий-фосфатным буфером (рН=7,4) и производили две отмывки стерильным натрий-фосфатным буфером (рН=7,4), после чего вносили 2,5% раствор глутарового альдегида в натрий-фосфатном буфере (рН=7,4) и инкубировали в течение 2 часов в темноте при 4°С и двукратно отмывали натрий-фосфатным буфером (рН=7,4). Затем производили дегидратацию образца проводкой по спиртам с увеличивающейся концентрацией по схеме:
а) р-р этанола 30% - 10 мин;
б) р-р этанола 50% - 10 мин;
в) р-р этанола 70% - 10 мин;
г) р-р этанола 80% - 10 мин;
д) р-р этанола 96% - 10 мин.
Образец отмывали трехкратно пропиленоксидом по 10 минут, а затем инкубировали в смеси пропиленоксида и эпоксидной смолы в соотношении 1:1 в течение 30 минут, после чего образец переносили в смесь пропиленоксида и эпоксидной смолы в соотношении 1:2 и инкубировали в течение 30 минут. Для заливки образца использовалась эпоксидная среда (Epoxy Embedding Medium kit, Sigma-Aldrich, Cat. №45359-1EA-F). Образец заключали в эпоксидную среду в пластиковой ячейке для заливки, инкубировали в термостате при 45°С в течение 24 часов, после чего продолжали инкубацию в течение 72 часов при температуре 60°С.
Таким образом, предложенный способ позволяет получить универсальную, прозрачную, механически прочную, биосовместимую подложку для исследования биологического образца методом СЗНТ.