Способы идентификации антител с пониженной иммуногенностью

1. Способ идентификации варианта исходного антитела с пониженной иммуногенностью, включающий стадии:
(а) приведения в контакт библиотеки клеток-хозяев с антиидиотипическим антителом, которое специфично связывается с исходным антителом, причем указанное исходное антитело представляет собой моноклональное антитело, которое связывается с молекулой-мишенью, указанная библиотека клеток-хозяев содержит клетки-хозяева млекопитающих, каждая из которых экспрессирует на поверхности клетки вариант антитела, отличающийся от исходного антитела одной точечной мутацией аминокислоты;
(б) идентификации популяции клеток в указанной библиотеке клеток-хозяев, которая экспрессирует варианты антитела, демонстрирующие пониженное связывание с антиидиотипическим антителом относительно исходного антитела; и
(в) идентификации варианта антитела, которым обогащена указанная популяция, идентифицируя посредством этого вариант исходного антитела с пониженной иммуногенностью.
2. Способ по п. 1, в котором стадия (б) включает подвергание библиотеки клеток-хозяев проточной цитометрии и сортировку указанной популяции из библиотеки клеток-хозяев.
3. Способ по п. 2, в котором проточная цитометрия представляет собой сортировку клеток, активированную флуоресценцией (FACS).
4. Способ по п. 1, который дополнительно включает (г) определение того, сохраняет ли вариант антитела его способность связываться с молекулой-мишенью.
5. Способ по п. 4, в котором стадия (г) включает осуществление анализа уровня связывания варианта антитела с молекулой-мишенью посредством проточной цитометрии, сортировки с использованием магнитных шариков, BIAcore, FACS, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), AlphaLisa или KinExA (кинетический эксклюзионный анализ).
6. Способ по п. 5, в котором стадия (г) включает осуществление анализа уровня связывания варианта антитела с молекулой-мишенью посредством проточной цитометрии в способе, включающем стадии (1) приведения в контакт клеток библиотеки клеток-хозяев или указанной популяции с флуоресцентно меченной молекулой-мишенью; (2) подвергания указанных клеток проточной цитометрии; (3) сортировки клеток на подпопуляции по количеству связавшейся флуоресцентно меченной молекулы-мишени; и (4) определения того, обогащена ли вариантом антитела подпопуляция клеток, которые экспрессируют варианты антитела, которые связываются с молекулой-мишенью, по существу, одинаково или лучше, чем исходное антитело, определяя посредством этого, сохраняет ли вариант антитела способность связываться с молекулой-мишенью.
7. Способ по п. 6, в котором стадии (г)(1) - (г)(3) осуществляют до, одновременно с или после стадии (б).
8. Способ по п. 6, в котором стадию (г)(4) осуществляют до, одновременно или после стадии (в).
9. Способ по п. 6, который дополнительно включает (д) определение уровня экспрессии варианта по сравнению с уровнем экспрессии исходного антитела.
10. Способ по п. 9, в котором стадия (д) включает осуществление анализа уровня экспрессии варианта антитела посредством проточной цитометрии, сортировки с использованием магнитных шариков, BIAcore, FACS, ELISA, AlphaLisa и KinExA.
11. Способ по п. 10, в котором стадия (д) включает осуществление анализа уровня экспрессии варианта антитела посредством проточной цитометрии в способе, включающем стадии (1) приведения в контакт клеток библиотеки клеток-хозяев или указанной популяции с флуоресцентно меченным антителом, которое связывается с консервативным эпитопом среди вариантов антитела и исходного антитела; (2) подвергания указанных клеток проточной цитометрии; (3) сортировки клеток на подпопуляции по количеству связавшегося флуоресцентно меченного антитела; и (4) определения того, обогащена ли вариантом антитела подпопуляция клеток, которые связываются с флуоресцентно меченным антителом на уровне, по существу равном или лучшем, чем клетки, которые экспрессируют исходное антитело, определяя посредством этого, экспрессируется ли вариант антитела на уровне, по существу равном или лучшем, чем исходное антитело.
12. Способ по п. 11, в котором указанный эпитоп представляет собой константную область вариантов антитела и исходного антитела.
13. Способ по п. 11, в котором стадии (д)(1) - (д)(3) осуществляют до, одновременно с или после стадии (б).
14. Способ по п. 11, в котором стадию (д)(4) осуществляют до, одновременно с или после стадии (в).
15. Способ по п. 1, в котором антиидиотипическое антитело является флуоресцентно меченным.
16. Способ по п. 1, в котором стадия (в) включает массовое параллельное секвенирование нуклеиновых кислот, полученных из популяции.
17. Способ по п. 6, в котором стадия (г)(4) включает массовое параллельное секвенирование нуклеиновых кислот, полученных из подпопуляции клеток, которые экспрессируют варианты антитела, которые связываются с молекулой-мишенью, по существу, одинаково или лучше, чем исходное антитело.
18. Способ по п. 11, в котором стадия (д)(4) включает массовое параллельное секвенирование нуклеиновых кислот, полученных из подпопуляции клеток, которые связываются с флуоресцентно меченным антителом на уровне, по существу равном или лучшем, чем клетки, которые экспрессируют исходное антитело.
19. Способ по п. 1, в котором библиотека клеток-хозяев имеет меньше чем 10000 уникальных членов.
20. Способ по п. 17, в котором библиотека клеток-хозяев имеет от примерно 50 до примерно 10000 уникальных членов.
21. Способ по п. 20, в котором библиотека клеток-хозяев имеет от примерно 1000 до примерно 1300 уникальных членов.
22. Способ по п. 1, в котором клетки-хозяева представляют собой клетки 293с18.
23. Способ по п. 1, в котором варианты антитела экспрессируются из векторов, содержащих точку начала репликации и ядерный антиген вируса Эпштейна-Барр, и в котором вариабельные домены антитела подвергаются дисплею на поверхности клетки в виде части слитого белка полноразмерный IgG-трансмембранный якорь.
24. Способ по любому из пп. 1-23, в котором исходное антитело содержит два вариабельных домена антитела,и в котором варианты антитела содержат вариабельные домены антитела, по меньшей мере один из которых имеет одну точечную мутацию относительно вариабельных доменов в исходном антителе.
25. Способ по п. 24, в котором замены одной аминокислоты находятся в определяющих комплементарность областях (CDR) двух вариабельных доменов антитела.
26. Способ по п. 25, в котором в от примерно 50 до примерно 60 положений аминокислот в CDR двух вариабельных доменов антитела осуществляется замена на каждую из встречающихся в природе аминокислот.
27. Способ по п. 1, в котором библиотека клеток-хозяев сконструирована с использованием NNK мутагенеза.
28. Вариант исходного антитела против TNF-α или исходного связующего фрагмента антитела против TNF-α, где исходное антитело или связующий фрагмент содержит шесть определяющих комплементарность областей («CDR»), имеющих аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 5 (CDR-H1), SEQ ID NO: 6 (CDR-H2), SEQ ID NO: 7 (CDR-H3), SEQ ID NO: 8 (CDR-L1), SEQ ID NO: 9 (CDR-L2) и SEQ ID NO: 10 (CDR-НЗ), где данный вариант содержит по меньшей мере одну замену, выбранную из G5F в CDR-L1, G5I в CDR-L1, G5V в CDR-L1, G5W в CDR-L1, G5Y в CDR-L1, R7I в CDR-L1, R7T в CDR-L1, R7V в CDR-L1, N8A в CDR-L1, N8D в CDR-L1, N8E в CDR-L1, N8G в CDR-L1, N8L в CDR-L1, N8M в CDR-L1, N8Q в CDR-L1, N8R в CDR-L1, N8T в CDR-L1, A1I в CDR-L2, А1Т в CDR-L2, A1V в CDR-L2, T4D в CDR-L2, R2G в CDR-L3, N4F в CDR-L3, N4M в CDR-L3, N4W в CDR-L3, N4Y в CDR-L3, R5L в CDR-L3, R5N в CDR-L3, R5W в CDR-L3, R5Y в CDR-L3, T9Y в CDR-L3, D1S в CDR-H1, Y2A в CDR-H1, Y2C в CDR-H1, Y2K в CDR-H1, Y2M в CDR-H1, Y2R в CDR-H1, Y2S в CDR-H1, Y2V в CDR-H1, Н5С в CDR-H1, H5D в CDR-H1, Н5Е в CDR-H1, H5S в CDR-H1, Н5Т в CDR-H1, Т3А в CDR-H2, T3G в CDR-H2, T3N в CDR-H2, W4A в CDR-H2, W4F в CDR-H2, W4H в CDR-H2, W4L в CDR-H2, W4M в CDR-H2, W4V в CDR-H2, N5G в CDR-H2, S6D в CDR-H2, S6L в CDR-H2, I9K в CDR-H2, D10L в CDR-H2, Y11A в CDR-H2, Y11C в CDR-H2, Y11E в CDR-Н2, Y11F в CDR-H2, Y11G в CDR-H2, Y11H в CDR-H2, Y11I в CDR-H2, Y11K в CDR-H2, Y11L в CDR-H2, Y11M в CDR-H2, Y11N в CDR-H2, Y11Q в CDR-H2, Y11R в CDR-H2, Y11S в CDR-H2, Y11V в CDR-H2, Y11W в CDR-H2, A12Y в CDR-H2, D13N в CDR-H2, V15D в CDR-H2, V15L в CDR-H2, V15M в CDR-H2, V15Q в CDR-H2, V15T в CDR-H2, E16F в CDR-H2, Е16Н в CDR-H2, Е16K в CDR-
Н2, E16R в CDR-H2, Е16Т в CDR-H2, E16W в CDR-H2, G17A в CDR-H2, G17C в CDR-H2, G17E в CDR-H2, G17H в CDR-H2, G17I в CDR-H2, G17K в CDR-H2, G17L в CDR-H2, G17M в CDR-H2, G17N в CDR-H2, G17P в CDR-H2, G17Q в CDR-H2, G17R в CDR-H2, G17S в CDR-H2, G17T в CDR-H2, G17Y в CDR-H2, V1G в CDR-H3, V1R в CDR-H3, V1W в CDR-H3, L4T в CDR-H3, L4V в CDR-H3, T6V в CDR-H3, S9K в CDR-H3, S9W в CDR-H3, S9Y в CDR-H3 и D11V в CDR-H3,
где шесть CDR в совокупности имеют вплоть до 8 аминокислотных замен по сравнению с последовательностями CDR исходного антитела или связующего фрагмента.
29. Антитело против TNF-α или связующий фрагмент против TNF-α по п. 28, в котором CDR включают по меньшей мере одну замену, выбранную из G5F в CDR-L1, G5I в CDR-L1, G5Y в CDR-L1, R7I в CDR-L1, R7T в CDR-L1, R7V в CDR-L1, N8A в CDR-L1, N8D в CDR-L1, N8E в CDR-L1, N8G в CDR-L1, N8L в CDR-L1, N8M в CDR-L1, N8Q в CDR-L1, N8R в CDR-L1, N8T в CDR-L1, A1V в CDR-L2, R2G в CDR-L3, N4F в CDR-L3, N4M в CDR-L3, N4W в CDR-L3, R5L в CDR-L3, R5N в CDR-L3, R5W в CDR-L3 и R5Y в CDR-L3.
30. Антитело против TNF-α или связующий фрагмент против TNF-α по п. 28, в котором CDR включают по меньшей мере одну замену, выбранную из R2G в CDR-L3, R5L в CDR-L3, R5N в CDR-L3 и R5Y в CDR-L3.
31. Антитело против TNF-α или связующий фрагмент против TNF-α по п. 28, в котором CDR включают по меньшей мере одну замену, выбранную из G5F в CDR-L1, G5I в CDR-L1, G5Y в CDR-L1, R7I в CDR-L1, N4M в CDR-L3 и R5W в CDR-L3.
32. Антитело против TNF-α или связующий фрагмент против TNF-α по п. 28, в котором CDR включают по меньшей мере одну замену, выбранную из N8D в CDR-L1 и N8E в CDR-L1.
33. Антитело против TNF-α или связующий фрагмент против TNF-α по п. 28, в котором CDR включают по меньшей мере одну замену, выбранную из R7T в CDR-L1, R7V в CDR-L1, N8A в CDR-L1, N8G в CDR-L1, N8L в CDR-L1, N8M в CDR-L1, N8Q в CDR-L1, N8R в CDR-L1, N8T в CDR-L1, A1V в CDR-L2, N4F в CDR-L3 и N4W в CDR-L3.
34. Антитело против TNF-α или связующий фрагмент против TNF-α по п. 28, в котором CDR включают по меньшей мере одну замену, выбранную из
G5F в CDR-L1, G5I в CDR-L1, G5V в CDR-L1, G5W в CDR-L1, G5Y в CDR-L1, R7I в CDR-L1, R7T в CDR-L1, R7V в CDR-L1, N8A в CDR-L1, N8G в CDR-L1, N8L в CDR-L1, N8M в CDR-L1, N8Q в CDR-L1, N8R в CDR-L1, N8T в CDR-L1, A1I в CDR-L2, А1Т в CDR-L2, A1V в CDR-L2, T4D в CDR-L2, N4F в CDR-L3, N4M в CDR-L3, N4W в CDR-L3 и R5W в CDR-L3.
35. Антитело против TNF-α или связующий фрагмент против TNF-α по п. 28, в котором CDR включают замену G5V в CDR-L1.
36. Антитело против TNF-α или связующий фрагмент против TNF-α по п. 28, в котором CDR включают по меньшей мере одну замену, выбранную из G5W в CDR-L1, A1I в CDR-L2, А1Т в CDR-L2 и T4D в CDR-L2.
37. Антитело против TNF-α или связующий фрагмент против TNF-α по п. 28, в котором CDR включают по меньшей мере одну замену, выбранную из G5W в CDR-L1, R7T в CDR-L1, R7V в CDR-L1, N8A в CDR-L1, N8D в CDR-L1, N8E в CDR-L1, N8L в CDR-L1, N8M в CDR-L1, N8Q в CDR-L1, N8R в CDR-L1, A1I в CDR-L2, А1Т в CDR-L2, A1V в CDR-L2, T4D в CDR-L2, N4F в CDR-L3, N4W в CDR-L3, N4Y в CDR-L3 и T9Y в CDR-L3.
38. Антитело против TNF-α или связующий фрагмент против TNF-α по п. 28, в котором CDR включают по меньшей мере одну замену, выбранную из N4Y в CDR-L3 и T9Y в CDR-L3.
39. Антитело против TNF-α или связующий фрагмент против TNF-α по п. 28, в котором CDR включают по меньшей мере одну замену, выбранную из D1S в CDR-H1, Y2A в CDR-H1, Y2C в CDR-H1, Y2K в CDR-H1, Y2M в CDR-H1, Y2R в CDR-H1, Y2S в CDR-H1, Y2V в CDR-H1, Н5С в CDR-H1, H5D в CDR-H1, Н5Е в CDR-H1, H5S в CDR-H1, Н5Т в CDR-H1, Т3А в CDR-H2, T3G в CDR-H2, T3N в CDR-H2, W4A в CDR-H2, W4F в CDR-H2, W4H в CDR-H2, W4L в CDR-H2, W4M в CDR-H2, W4V в CDR-H2, D10L в CDR-H2, V1G в CDR-H3, V1R в CDR-H3, V1W в CDR-H3, L4T в CDR-H3, L4V в CDR-H3, T6V в CDR-H3, S9K в CDR-H3 и D11V в CDR-H3.
40. Антитело против TNF-α или связующий фрагмент против TNF-α по п. 28, в котором CDR включают по меньшей мере одну замену, выбранную из N5G в CDR-H2, S6D в CDR-H2, S6L в CDR-H2, I9K в CDR-H2, Y11A в CDR-H2, Y11C в CDR-H2, Y11E в CDR-H2, Y11F в CDR-H2, Y11G в CDR-H2, Y11H в CDR-Н2, Y11I в CDR-H2, Y11K в CDR-H2, Y11L в CDR-H2, Y11M в CDR-H2, Y11N в
CDR-H2, Y11Q в CDR-H2, Y11R в CDR-H2, Y11S в CDR-H2, Y11V в CDR-H2, Y11W в CDR-H2, A12Y в CDR-H2, V15D в CDR-H2, V15L в CDR-H2, V15M в CDR-H2, V15Q в CDR-H2, V15T в CDR-H2, E16F в CDR-H2, Е16Н в CDR-H2, Е16K в CDR-H2, E16R в CDR-H2, Е16Т в CDR-H2, E16W в CDR-H2, G17A в CDR-H2, G17C в CDR-H2, G17E в CDR-H2, G17H в CDR-H2, G17I в CDR-H2, G17K в CDR-H2, G17L в CDR-H2, G17M в CDR-H2, G17N в CDR-H2, G17P в CDR-H2, G17Q в CDR-H2, G17R в CDR-H2, G17S в CDR-H2, G17T в CDR-H2, G17Y в CDR-H2, S9W в CDR-H3 и S9Y в CDR-H3.
41. Антитело против TNF-α или связующий фрагмент против TNF-α по п. 28, в котором CDR включают по меньшей мере одну замену, выбранную из N5G в CDR-H2, S6D в CDR-H2, S6L в CDR-H2, Y11M в CDR-H2, Y11Q в CDR-H2, A12Y в CDR-H2, Е16Н в CDR-H2, G17H в CDR-H2, S9W в CDR-H3 и S9Y в CDR-Н3.
42. Антитело против TNF-α или связующий фрагмент против TNF-α по п. 28, в котором CDR включают по меньшей мере одну замену, выбранную из I9K в CDR-H2, Y11A в CDR-H2, Y11C в CDR-H2, Y11E в CDR-H2, Y11F в CDR-Н2, Y11G в CDR-H2, Y11H в CDR-H2, Y11I в CDR-H2, Y11K в CDR-H2, Y11L в CDR-H2, Y11N в CDR-H2, Y11R в CDR-H2, Y11S в CDR-H2, Y11V в CDR-H2, Y11W в CDR-H2, V15D в CDR-H2, V15L в CDR-H2, V15M в CDR-H2, V15Q в CDR-H2, V15T в CDR-H2, E16F в CDR-H2, Е16K в CDR-H2, E16R в CDR-H2, Е16Т в CDR-H2, E16W в CDR-H2, G17A в CDR-H2, G17C в CDR-H2, G17E в CDR-H2, G17I в CDR-H2, G17K в CDR-H2, G17L в CDR-H2, G17M в CDR-H2, G17N в CDR-H2, G17P в CDR-H2, G17Q в CDR-H2, G17R в CDR-H2, G17S в CDR-H2, G17T в CDR-H2 и G17Y в CDR-H2.
43. Антитело против TNF-α или связующий фрагмент против TNF-α по п. 28, в котором CDR включают по меньшей мере одну замену, выбранную из I9K в CDR-H2, Y11A в CDR-H2, Y11C в CDR-H2, Y11E в CDR-H2, Y11F в CDR-Н2, Y11G в CDR-H2, Y11H в CDR-H2, Y11I в CDR-H2, Y11K в CDR-H2, Y11L в CDR-H2, Y11N в CDR-H2, Y11R в CDR-H2, Y11S в CDR-H2, Y11V в CDR-H2, Y11W в CDR-H2, D13N в CDR-H2, V15D в CDR-H2, V15L в CDR-H2, V15M в CDR-H2, V15Q в CDR-H2, V15T в CDR-H2, E16F в CDR-H2, Е16K в CDR-H2, E16R в CDR-H2, Е16Т в CDR-H2, E16W в CDR-H2, G17A в CDR-H2, G17C в CDR-H2, G17E в CDR-H2, G17I в CDR-H2, G17K в CDR-H2, G17L в CDR-H2,
G17M в CDR-H2, G17N в CDR-H2, G17P в CDR-H2, G17Q в CDR-H2, G17R в CDR-H2, G17S в CDR-H2, G17T в CDR-H2 и G17Y в CDR-H2.
44. Антитело против TNF-α или связующий фрагмент против TNF-α по п. 28, в котором CDR включают замену D13N в CDR-H2.
45. Антитело против TNF-α или связующий фрагмент против TNF-α по п. 28, в котором исходное антитело против TNF-α или исходный связующий фрагмент против TNF-α содержит фрагмент вариабельной области тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 2, и фрагмент вариабельной области легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 4.
46. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело против TNF-α или связующий фрагмент против TNF-α по п. 28.
47. Клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело против TNF-α или связующий фрагмент против TNF-α по п. 28.
48. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело против TNF-α или связующий фрагмент против TNF-α по п. 28 и фармацевтически приемлемый носитель.
49. Способ лечения пациента-человека, страдающего от иммунного расстройства, включающий введение пациенту-человеку терапевтически эффективного количества антитела против TNF-α или связующего фрагмента против TNF-α по любому из пп. 28-45.
50. Способ по п. 49, где иммунное расстройство выбрано из ревматоидного артрита, юношеского идиопатического артрита, псориатического артрита, анкилозирующего спондилита, болезни Крона, бляшечного псориаза и аксиального спондилоартрита.