Изменения концентрации восстановленного глутатиона и активности некоторых ферментов его метаболизма в крови больных неспецифическим язвенным колитом

© ЛУКОВНИКОВА Т.Н., КОЛЕСНИЧЕНКО Л.С., НЕСТЕРОВ И.В. -УДК 616.348.002-44

ИЗМЕНЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ВОССТАНОВЛЕННОГО ГЛУТАТИОНА И АКТИВНОСТИ НЕКОТОРЫХ ФЕРМЕНТОВ ЕГО МЕТАБОЛИЗМА В КРОВИ БОЛЬНЫХ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИМ ЯЗВЕННЫМ КОЛИТОМ

Т.Н. Луковникова, Л.С. Колесниченко, И.В. Нестеров.

(Иркутский государственный медицинский университет, ректор - акад. МТА и АН ВШ А.А. Майбо-рода, кафедра биохимии, зав. - проф. В.И. Кулинский, кафедра биоорганической химии, зав. — проф. Л.С. Колесниченко, кафедра госпитальной хирургии ИГМУ и НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН, зав. и директор - член-корр. РАМН, проф. Е.Г. Григорьев).

Резюме. При язвенном колите происходят значительные сдвиги в системе глутатиона в крови. Концентрация глутатиона в эритроцитах уменьшается в ряду: дистальное > левостороннее > тотальное поражение. Уровень глутатиона в плазме больных повышен. Активности глутатион-трансферазы и глутатионредуктазы повышаются, как в эритроцитах, так и в плазме, при дистальной и левосторонней локализации, но не при тотальной. Выявленные изменения могут иметь значение в патогенезе язвенного колита. К выписке нормализуется лишь часть показателей.

Неспецифический язвенный колит (ЯК) - хроническое воспалительное заболевание толстой кишки неизвестной этиологии. В последние годы интерес к ЯК значительно возрос, что связано с увеличением числа больных этим заболеванием, сопровождающимся осложнениями, приводящими к потере трудоспособности[1].

Возможное значение активных форм кислорода и вторичных продуктов оксидативной модификации при ЯК предполагается во многих работах [7,11,12,13], поэтому целесообразно изучение защитной антиоксидантной системы в различных средах этих больных. Выделяют четыре линии защиты от активных форм кислорода и вторичных продуктов оксидативной модификации: 1) супер-оксиддисмутаза; 2) глутатионпероксидаза и ката-лаза; 3) глутатионпероксидаза и глутатионтранс-феразы; 4) глутатионтрансфераза, глиоксалаза, формальдегиддегидрогеназа, хинонредуктаза, аль-дегиддегидрогеназа, эпоксидгидролаза [4,5].

Основную роль в работе антиоксидантной системы играет система глутатиона, т.к. она функционирует на трех линиях ферментативной защиты [2,5]. Кроме того, глутатион поддерживает активности ферментов, других белков и мембран, участвует в биосинтезе ДНК и пролиферации, обмене эйкозаноидов, метаболизме ксенобиотиков, является резервом цистеина, повышает резистентность клеток к вредным воздействиям [6]. Глутатионтрансфераза восстанавливает органические пероксиды, в том числе перекиси ДНК, участвует в биотрансформации ксенобиотиков [2], обезвреживает вторичные метаболиты оксидативной мо-

дификации и главный продукт перекисного окисления липидов - 4-гидроксиалкенали. Глутатион-редуктаза восстанавливает глутатион из его окисленной формы с помощью НАДФН.

Некоторые препараты, применяемые для лечения ЯК, влияют на систему глутатиона. 5-ами-носалицилаты ингибируют глутатионтрансферазу ши [3,8]. Сильными ингибиторами глутатионредуктазы являются нитрофураны [6].

Имеются работы по определению уровня глутатиона и активности ферментов его метаболизма в слизистой оболочке толстой кишки при ЯК. Однако есть лишь единичные публикации об изменении этих показателей в крови: сообщалось об увеличении концентрации восстановленного глутатиона в плазме [10] и отсутствии изменения его уровня в эритроцитах [13]. Частота экспрессии глутатионтрансферазы ши при ЯК не изменялась по группе в целом, но была ниже при более раннем начале и более тяжелом течении [9]. Данных об изменении активности глутатионредуктазы при ЯК в эритроцитах и плазме в доступной литературе не обнаружено.

Целью настоящей работы являлось изучение концентрации восстановленного глутатиона и активности глутатионтрансферазы и глутатионредуктазы в эритроцитах и плазме больных ЯК с различным уровнем поражения толстой кишки во время обострения и к моменту окончания стационарного лечения.

Материалы и методы

Обследовано 43 больных ЯК (муж. - 19 и жен. - 24) в возрасте от 14 до 60 лет с длительно-

стью заболевания от 1 месяца до 20 лет. С дистальной локализацией было 18 больных, с левосторонней - 14 и с тотальной — 11. Диагноз ЯК верифицировали эндоскопически, рентгенологически и гистологически. Больные получали стандартное лечение. Контрольную группу составили 12 практически здоровых людей сопоставимого возраста и пола. Кровь брали утром натощак в пробирку с гепарином. Пробы центрифугировали при 8000 об/мин для разделения плазмы и эритроцитов. Эритроциты промывали изотоническим раствором, затем гемолизировали дистиллированной водой в соотношении 1:3 и центрифугировали при 8000 об/мин в течение 15 минут. Полученную надосадочную жидкость использовали как ферментный препарат. Активности ферментов определяли стандартными спектрофотометрическими методами. Все этапы проводили с охлаждением. Часть плазмы и гемолизата осаждали 5% сульфо-салициловой кислотой в соотношении 1:1 и 1:2, соответственно, для определения восстановленного глутатиона. Результаты обработаны статистически с использованием критериев Б, 1 и с! для несвязанных выборок. Различия считали значимыми при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Концентрация глутатиона в эритроцитах по сравнению с контролем не изменялась при дистальном поражении, но снижалась при левостороннем (в среднем на 26%) и, особенно, при тотальном поражении (на 49%). К выписке из стационара у больных с дистальной локализацией концентрация глутатиона в эритроцитах даже

уменьшалась (на 46%), у остальных не изменялась (табл.1).

В плазме больных ЯК уровень глутатиона был повышен в 2 раза при дистальном процессе, при левостороннем — на 154%, при тотальном — на 55% (различия приближаются к значимым - р<0,1). К окончанию лечения в стационаре концентрация глутатиона в плазме при дистальном процессе нормализовалась, а при левостороннем и тотальном поражении значимо не изменялась, оставаясь повышенной по сравнению с контролем (на 118 и 152%, соответственно).

В эритроцитах больных с дистальным и левосторонним процессом активность глутатионре-дуктазы при поступлении повышена (на 68 и 107%, соответственно). К моменту выписки из стационара уровень глутатионредуктазы не отличался от контроля. В то время как при тотальном поражении глутатионредуктаза в эритроцитах значимо не изменялась по сравнению с контролем, а к выписке увеличивалась, превышая норму на 50%.

В плазме активность глутатионредуктазы была повышена при дистальном и левостороннем процессах в одинаковой степени (в среднем на 70%). Однако у больных с тотальным поражением активность глутатионредуктазы в плазме оставалась на уровне контроля. К окончанию лечения в стационаре у больных с дистальной локализацией процесса показатель снижался и не отличался от нормы. При левостороннем поражении активность глутатионредуктазы в плазме оставалась повышенной (на 78%). К выписке у больных с тоталь-

Таблица 1

Концентрация глутатиона и активность глутатионтрансферазы и глутатионредуктазы в эритроцитах и плазме больных неспецифическим язвенным колитом с разным уровнем поражения толстой кишки (х ± Бх).

Исследуемые ферменты Показатели концентрации глутатиона и активности его ферментов

Контроль Дистальное поражение Левостороннее поражение Тотальное поражение

Поступление п-18 Выписка /¡=15 Поступление /2=18 Выписка я=15 Поступление /1=18 Выписка /¡=15

GSH, эритроциты, мкмоль/мл 2,72±0,0717 2,44+0,216 г,м 1,33+0,106 в 2,00±0,181 г 1,63+0,117 г 1,40±0,210 в 1,95±0,252

GSH, плазма, нмоль/мл 21,1 ±2,66 в 45,2±6,52 л 22,8±3,45 Г 53,5±5,32 в 46,0±7,81 а 32,7±6,08 в 53,1±12,7

GR, эритроциты, нмоль/мин на мг белка 9,13+0,520 г 15,3+1,13 л 9,93± 1,33 Г 18,9±0,952 м 9,28+0,508 7,38± 1,42 б,к 14,1±2,50

GR, плазма, нмоль/мин на мг белка 0,639±0,0533 в 1,11 ±0,1 20 л 0,738±0,0728 в 1,12±0,124 в 1,14±0,153 0,726±0,123 а 0,926±0,184

GST, эритроциты, нмоль/мин на мг белка 9,55±0,960 г 17,0± 1,09 м 11,5+0,730 11,0± 1,07 11,9±2,28 9,83±0,853 11,4±1,26

GST, плазма, нмоль/мин на мг белка 0,927+0,109 г 2,27±0,153 а,м 1,22±0,0948 в 1,73±0,188 м 0,735±0,0818 0,952±0,151 1,10±0,154

Примечания: значимость сдвигов по сравнению с контролем: а - р<0,1; б - р<0,05; в - р<0,01; г - р<0,001. Значимость сдвигов по сравнению с поступлением: к — р<0,05; л - р<0,01; м - р<0,001.

ной локализацией уровень фермента в плазме имел тенденцию к повышению по сравнению с контролем (р<0,1), хотя от показателя при поступлении значимо не отличался.

В эритроцитах активность глутатионтрансфе-разы при дистальном поражении увеличена (на 78%), к выписке она возвращалась к норме. Уровень глутатионтрансферазы в эритроцитах больных с левосторонним и тотальным поражением не отличался от контроля и к окончанию стационарного лечения не изменялся.

В плазме больных с дистальной и левосторонней локализацией процесса активность глутатионтрансферазы была повышена (на 145 и 87%, соответственно). К выписке данный показатель уменьшался по сравнению с поступлением и у больных с левосторонним поражением не отличался от контроля. При тотальной локализации активность глутатионтрансферазы в плазме от контроля не отличалась и к выписке не изменялась.

Значительное снижение концентрации глута-тиона в эритроцитах при тотальном поражении, скорее всего, обусловлено более выраженным синдромом мальабсорбции [1]. Мальабсорбция приводит к снижению уровня аминокислот, необходимых для синтеза глутатиона, в первую очередь цистеина, а снижение последнего сочетается с уменьшением концентрации глутатиона в слизистой оболочке толстой кишки [13]. Другой возможный механизм - более выраженное снижение активности ферментов синтеза глутатиона [13]. Поддержанию нормального или незначительно отличающегося от контроля глутатиона в эритроцитах при дистальном и левостороннем процессах может способствовать индукция глутатионредук-тазы, отсутствующая при тотальном поражении. К выписке глутатионредуктаза в эритроцитах больных с менее распространенным процессом нормализуется, а у больных с тотальной локализацией увеличивается.

К увеличению концентрации уровня глутатиона в плазме больных, очевидно, приводит воспаление и некроз слизистой оболочки с выходом глутатиона из клеток, где его концентрация намного выше [6]. Этому может способствовать снижение активности у-глутамилтрансферазы в

слизистой оболочке толстой кишки [13], а также повышение активности глутатиоредуктазы. Нормализация данного показателя выявлена только у больных с дистальным процессом, у остальных же он оставался повышенным, что, вероятно, связано с сохраняющимся воспалением толстой кишки. Изменения активности глутатионредуктазы в плазме параллельны изменениям концентрации глутатиона. Увеличение уровня глутатионтрансферазы в эритроцитах больных ЯК с дистальной локализацией и глутатионтрансферазы в плазме больных с дистальным и левосторонним поражением может способствовать уменьшению уровня активных форм кислорода и вторичных продуктов оксидативной модификации и в результате — ограничению процесса в толстой кишке. Почти полное отсутствие сдвигов в плазме при тотальном поражении может отражать недостаточность системы глутатиона - меньший синтез как самого трипептида, так и ферментов его метаболизма.

Таким образом, в эритроцитах больных с тотальным поражением выявлено уменьшение концентрации глутатиона и отсутствие повышения активности глутатионтрансферазы и глутатионредуктазы при обострении ЯК. В плазме изменения уровня глутатиона параллельны изменениям активности глутатионредуктазы. К окончанию лечения в стационаре концентрация глутатиона и активность глутатионредуктазы в плазме повышены при левосторонней и тотальной локализации, но не при дистальной. Активность глутатионтрансферазы в эритроцитах и плазме увеличена у больных с дистальным и левосторонним процессом. К выписке нормализуются лишь немногие показатели.

Полученные результаты свидетельствуют, что воспалительный процесс влияет на систему глутатиона, которая изменяется в зависимости от распространенности процесса и фазы течения заболевания. Планируется изучить влияние препаратов, применяемых в лечении ЯК, на активности ферментов метаболизма глутатиона in vitro, а также продолжить набор материала, чтобы с учетом степени активности процесса и длительности заболевания разобраться в выявленных изменениях. Дальнейшие исследования представляют интерес для понимания патогенеза ЯК.

CHANGE OF CONCENTRATION OF REDUCED GLUTATHIONE AND ACTIVITY OF SOME ITS METABOLISM ENZYMES IN BLOOD OF ULCERATIVE COLITIS PATIENTS

T.N. Lukovnikova, L.S. Kolesnichenko, I.V. Nesterov

There are significant shifts of glutathione system in blood in patients suffered from ulcerative colitis. The concentration of glutathione in RBCs decreases in a line: distal> left-side> total affection. The level of glutathione in plasma in patients i§ increased. Activity of glutathione S-transferase and glutathione reductase increase both in RBCs and in plasma in distal and left-side localization, but not in total. The revealed changes would take part in pathogenesis of ulcerative colitis. To the end of hospital stay, just part of parameters is normalized.

Литература

[.Златкина А.Р., Белоусова Е.А., Мисаутова А.А. Современные аспекты патогенеза диареи при язвенном колите// Тер. Архив. - 1994. - Т.66, №12. -С.67.

2. Колесниченко Л.С., Кулинский В.И. Глутатионтрансферазы // Успехи современной биологии. -1989. - Т. 107, №2. - С. 184-185.

3. Колесниченко Л.С., Кулинский В.И., Манторо-ва Н.С. Регуляция различных изоферментов глута-

тионтрансферазы протеинкиназой А и сАМР // Укр. биохим. журн. - 1991. -Т.63, №2. - С.81.

4. Кулинский В.И. Активные формы кислорода и ок-сидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита . // Соросовский образовательный журнал. - 1999. - №1. - С.2-12.

5. Кулинский В.И., Колесниченко J1.C. Биологическая роль глутатиона // Успехи современной биологии. - 1990. - Т. 110. №1(4). - С.20-22.

6. Кулинский В.И., Колесниченко JI.C. Обмен глутатиона // Успехи биологической химии. - 1990. -Т.31. - С.162.

7. Blau S., Rubinstein A., Bass P. et al. Differences in the reducing power along the rat GI tract: lower antioxidant capacity of the colon // Mol. Cell biochem. -1999. - Vol.194, N.l-2. - P.185-191.

8. Gupta V., Jani J.P., Jacobs S. et al. Activity of mel-phalan in combination with GST inhibitor sulfasalazine //Cancer Chemother. Pharmacol. - 1995. -Vol.36, N.I. -P.13-19.

9. Hertervig E., Nillson A., Seidegard J. The expression GST mu in patients with inflammatory bowel disease // Scand. J. Gastroenterol. - 1994. - Vol.29, N.8. - P.729-735.

10. Hoffenberg E.J., Deutsch J., Smith S. et al. Circulating antioxidant concentrations in children with IBD // Am. J. Clin. Nutr. - 1997. - Vol.65, N.5. - P.482-488.

11. Moghadasian M.N., Freemen H.J., Godin D.V. Endogenous antioxidant status in neoplastic and adjacent tissues in 1,2-dimethylhydrazine-induced colon cancer in rats: effects of olsalazine // Carcinogenesis. -1996. - Vol.17, N.5. - P.983-987.

12. Nosal’ova V., Bauer V. Protective effect of stobadine in experimental colitis // Life sci. - 1999. - Vol.65, N.18-19. - P. 1919-1921.

13. Sido B., Hack V., Hochlehnert A. et al. Impairment of intestinal glutathione synthesis in patients with IBD // Gut. - 1998. - Vol.42, - N.4. - P.485-492.

© РЕМНЕВ А.Г. -УДК 616.832-07

НОВЫЙ МЕТОД НЕИНВАЗИВНОЙ ДИАГНОСТИКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ АФФЕРЕНТНЫХ ПУТЕЙ СПИННОГО МОЗГА

А.Г. Ремнёв.

Резюме. Разработан метод оценки функционального состояния афферентных путей спинного мозга (АПСМ). Способ осуществляли путем магнитной.стимуляции шейного и поясничного отделов спинного мозга. Вызванные ответы регистрировали от круговых мышц глаза. Разность величин латентных периодов моторных ответов круговых мышц глаза, зарегистрированных при магнитной стимуляции шейного и поясничного отделов спинного мозга, позволяла определить скорость распространения возбуждения по АПСМ. Было обследовано 60 здоровых лиц в возрасте от 15 до 48 лет. В результате проведенных исследований было определено, что в среднем скорость распространения возбуждения по АПСМ у здоровых людей составляет 90,3±16,3±1,7 м/с. Таким образом, метод магнитной стимуляции позволяет оценить функциональное состояние не только двигательных (эфферентных) проводящих путей нервной системы, но и чувствительных (афферентных), в частности АПСМ.

В современной диагностике заболеваний нервной системы в настоящее время применяется значительное количество различных инструментальных диагностических методов исследования. Несомненное предпочтение отдаётся неинвазивным и безболезненным методам функциональной диагностики.

Известно, что проводящие пути нервной системы могут быть представлены восходящими (афферентными, чувствительными) и нисходящими (эфферентными, двигательными) путями. В настоящее время исследование афферентных проводящих систем спинного мозга и ствола головного мозга ограничивается изучением неврологического статуса и применением различных методик изучения соматосенсорных вызванных потенциалов (ССВП) [2,4,5]. Однако широкое применение исследования ССВП для оценки функционального

состояния афферентных проводящих систем осложняется рядом недостатков, которые состоят в невозможности регистрации вызванных ответов в ряде случаев и большим количеством артефактов, что значительно затрудняет обработку получаемых результатов.

За последние десятилетия в неврологическую практику введены новые диагностические методы и среди этих методов - магнитная стимуляция (МС). Метод МС применяется в диагностике заболеваний нервной системы с 1985 г., когда учёными Шеффилдского университета (Великобритания) впервые был создан магнитный стимулятор, способный вызвать возбуждение моторной коры головного мозга человека [13,14]. Метод МС нашел широкое применение в клинической практике при исследовании проведения возбуждения по кортикоспинальному тракту при различных