СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО АНТИГЕННОГО ДИАГНОСТИКУМА
METHOD OF PRODUCING ERYTHROCYTIC DIAGNOSTIC ANTIGEN

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к получению диагностических препаратов для диагностирования специфических антител в реакции пассивной гемагглютинации.
Метод реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) основан на иммобилизации антигенов на эритроцитах различных животных. При контакте сенсибилизированных эритроцитов с сывороткой крови, содержащей соответствующие антитела, происходит агглютинация эритроцитов. Получение диагностикумов для РПГА не требует сложного и дорогостоящего оборудования и доступно, при наличии антигенов, любой микробиологической лаборатории. В этой связи метод РПГА сохраняет актуальность и сейчас, особенно при необходимости обследования больших групп населения, в полевых условиях или на слаборазвитых территориях. Использование метода РПГА обязательно при постановке диагноза сифилиса, а также является эффективным способом выявления и контроля результатов лечения бацилоносителей дифтерии (Шмелева Е.А., Макарова С.М., Баталова Т.М., Коржикова М.П., Батурина И.Г. Оценка содержания противодифтерийных антибактериальных антител в сыворотках крови разных групп людей с помощью методов популяционного анализа. // Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. 2002. Т.1. №4. С.121-124).
Известны способы сенсибилизации взвеси эритроцитов путем обработки их связующим агентом с последующей иммобилизацией антигенов. В качестве связующих агентов используют хлорид хрома (Перадзе Т.В. Иммунологическая диагностика вирусных инфекций. - М.: Медицина, 1985. - С.100-106), танин (Pradhan S., Kumar S., Singh D., Sood R.C, Sehgal R. / Development of passive haemagglutination (PHA) and haemagglutination inhibition (HAI) technique for potency estimation of Cobra Antisnake Venom Serum (ASVS). // Biologicals 2007. V.35. P.155-160), глутаровый альдегид (Roy P., Venugopalan A.T. / Passive haemagglutination test in the serology of Newcastle disease Virus. // Tropical Animal Health and Production 2000. V.32. P.19-22). Недостатком данных диагностикумов является низкая чувствительность, плохая воспроизводимость между различными партиями, малый срок хранения (1-3 месяца).
-2
2
Наиболее близким является способ приготовления эритроцитарного антигенного диагностикума путем сенсибилизации антигенами эритроцитов барана в присутствии водных растворов слабых полимерных карбокси- и тетразолсодержащих кислот, концентрация водных растворов 0,2-0,8 мг/мл при объемном соотношении со взвесью эритроцитов 1:1 (Патент РФ №2202801, 2003, МКИ G01N 33/556, G01N 33/531). Недостатком известного способа является высокая концентрация конъюгирующего агента - полимерной кислоты, она составляет 0,4-0,8 мг/мл. Учитывая используемую концентрацию эритроцитов (20% примерный их диаметр (1 мкм) и соотношение раствор полимера: взвесь эритроцитов равное 1:1, можно оценить соотношение количества полимерных звеньев к единице поверхности эритроцита. При концентрации полимера 0,4 мг/мл оно составляет порядка 500. Примерное расстояние между функциональными группами полимера составляет 0,25 нм, что соответствует максимально возможному размещению 10 полимерных групп на нм, таким образом, в известном способе используется чрезмерный избыток связующего агента, существенная часть которого не имеет физической возможности для участия в образовании компонентов диагностикума. Присутствие в системе избытка синтетического полимера неблагоприятно влияет на чувствительность диагностикума из-за блокирования активных участков иммобилизированного антигена, а также повышает риск ложно-положительных реакций за счет неспецифической агглютинации эритроцитов. Необходимость использования повышенного количества конъюгирующего агента связана со слабой способностью полимерных кислот к взаимодействию с молекулами белковой природы в области нейтральных значений pH, поскольку и те, и другие несут частичный отрицательный заряд в этих условиях.
Техническим результатом предлагаемого способа является повышение чувствительности эритроцитарного антигенного диагностикума и снижение содержания конъюгирующего агента.
Новым в достижении поставленного технического результата является то, что в качестве конъюгирующего агента используют поли-1-винилимидазол или сополимер 1-винилимидазола и акриловой кислоты, при содержании 42 мол.% звеньев 1-винилимидазола и концентрации водного раствора полимера 0,01-0,04 мг/мл.
Известна способность поли-1-винилимидазола активно взаимодействовать с белками в области нейтральных значений pH (Анненков В.В., Мазяр Н.Л. и др. Взаимодействие бычьего сывороточного альбумина с поли-N-винилазолами. // Высокомолек. соед. А. 2000. Т.42. №11, с.1804-1809). Введение в имидазольную цепь кислотных групп приводит к полимерным амфолитам, также активным в реакции комплексообразования, что позволяет снизить концентрацию конъюгирующего агента в 40 раз и повысить чувствительность тест-системы в 2,6 раза.
Сопоставительный анализ с прототипом показывает, что предлагаемый способ отличается от известного тем, что в качестве конъюгирующего агента используют поли-1винилимидазол или сополимер 1-винилимидазола с акриловой кислотой при содержании 42 мол.% звеньев 1-винилимидазола и концентрации водного раствора полимера 0,01-0,04 мг/мл, что соответствует критерию "новизна".
Новая совокупность признаков обеспечивает повышение чувствительности эритроцитарного антигенного диагностикума и снижение содержания конъюгирующего агента при высоком сроке хранения диагностикума, что соответствует критерию "промышленная применимость".
Способ получения эритроцитарного антигенного диагностикума осуществляют следующим образом.
Для приготовления диагностикума используют эритроциты барана. Взятие крови у барана проводят из яремной вены по 300 мл в антикоагулянт (5%-ный раствор цитрата натрия). Эритроциты сразу отмывают охлажденным физиологическим раствором 3 раза на центрифуге при 15000-20000 g. Формалинизацию эритроцитов проводят по методу Weinbach. Из отмытых эритроцитов готовят 8%-ную взвесь клеток на физиологическом растворе. К одному объему взвеси добавляют равный объем фиксирующего раствора (3%-ный раствор формальдегида на физиологическом растворе с pH 7,0-7,2, профильтрованный через бумажный фильтр). Смесь помещают в термостат при +37°С на 20 часов, периодически перемешивая, после чего эритроциты отмывают физиологическим раствором 3 раза при 15000-20000 g и хранят в консерванте (0,03%-ный формальдегид) в виде 20%-ной взвеси клеток. Перед сенсибилизацией эритроциты отмывают один раз при 15000-20000 g охлажденным физиологическим раствором и определяют агглютинацию клеток. Для этого в лунки пластины микротитратора "Такачи" вносят по 0,1 мл 0,2%-ной взвеси отмытых эритроцитов в 0,9%-ном растворе хлорида натрия. В случае отсутствия спонтанной агглютинации клетки оседают через 1,0-1,5 часа в виде точки с резко очерченными краями. Такие эритроциты используют для приготовления диагностикума.
К одному объему 20%-ной взвеси отмытых от формалина эритроцитов добавляют равный объем раствора конъюгирующего агента, перемешивают 2 часа при комнатной температуре и добавляют 0,5 объема раствора антигена (Bifidobacterium bifidum 791). Смесь выдерживают 30 минут на водяной бане при 56°С и 30 минут при комнатной температуре при постоянном перемешивании. Далее отмывают эритроциты от несвязанного белка три раза физиологическим раствором при 15000-20000 g в течение 5 минут. Готовят 0,8% взвесь сенсибилизированных эритроцитов на физиологическом растворе с добавлением 0,1 мг/мл консерванта (азида натрия), взмучивают и подвергают контролю. Для специфического контроля используют иммунную кроличью сыворотку, содержащую соответствующие антитела. Для этого проводят трехкратную иммунизацию кроликов В. bifidum 791. Для контроля используют иммунную сыворотку с титром антител не ниже 1:64. Методика проведения анализа, учета ложноположительных реакций и обработки результатов соответствует общепринятой в методе пассивной гемагглютинации (Каральник Б.В. Варианты реакции агглютинации настоящее и будущее. // ЖМЭИ. 1989. №8, С.84-89).
Пример 1. Исследование влияния концентрации конъюгирующего агента на чувствительность эритроцитарных диагностикумов
Для исследования влияния концентрации конъюгирующего агента на чувствительность эритроцитарного диагностикума его получают, применяя в качестве конъюгирующих агентов водные растворы поли-1-винилимидазола (ПВИ) от 0,01 до 0,04 мг/мл и водные растворы сополимера 1-винилимидазола и акриловой кислоты (ВИ-АК-125) 0,005-0,8 мг/мл. Сополимеры ВИ-АК получены в соответствие с (Даниловцева Е.Н., Анненков В.В., Михалева А.И., Трофимов Б.А. / Сополимеры 1-винилимидазола и акриловой кислоты для биосепарации. // Высокомолек. соед. А. 2004. Т. 46. №2, с.241-246). Растворы получают с использованием дистиллированной воды, выдерживают при комнатной температуре 24-48 часов перед началом работ, хранят растворы при 4°С не более 14 дней. Результаты определения активности полученных тест-систем представлены в таблице 1. Полученные данные показывают, что наибольшая активность диагностикума на основе поли-1-винилимидазола и сополимера 1-винилимидазола и акриловой кислоты ВИ-АК-125 наблюдается при концентрации 0,01 мг/мл, слегка понижаясь при 0,04 мг/мл.
Пример 2. Сравнение активности эритроцитарного диагностикума на основе различных конъюгирующих агентов
Для приготовления эритроцитарного диагностикума используют поли-1-винилимидазол (ПВИ) и сополимеры 1-винилимидазола и акриловой кислоты (ВИ-АК-125, ВИ-АК-126, ВИ-АК-127), отличающиеся различным содержанием звеньев 1-винилимидазола в сополимере. Для сопоставления используют также полиакриловую кислоту (ПАК 75 кД) и полиметакриловую кислоту (ПМАК). Растворы получают с использованием дистиллированной воды, выдерживают при комнатной температуре 24-48 часов перед началом работы, хранят растворы при 4°С не более 14 дней. Концентрация ПВИ и сополимеров ВИ-АК составляет 0,01 мг/мл, а ПАК и ПМАК - 0,4 мг/мл, что соответствует оптимальной величине для последних в соответствие с прототипом (см. Патент РФ №2202801, 2003). Результаты определения активности полученных диагностикумов представлены в таблице 2. Наибольшую чувствительность показывают эритроцитарные диагностикумы на основе поли-1-винилимидазола и сополимера 1-винилимидазола и акриловой кислоты, содержащего 42 мол.% звеньев 1-винилимидазола. Активность тест-системы ВИ-АК-125 превосходит лучший показатель прототипа (ПМАК) в 2.6 раза при концентрации конъюгирующего агента в 40 раз меньше.
Пример 3. Проверка сохранности эритроцитарного диагностикума
Для проверки активности эритроцитарного диагностикума при хранении определяют титры антител ряда сывороток с использованием свежеприготовленного диагностикума и хранившегося 3 года. Диагностикум приготовлен на основе сополимера 1-винилимидазола и акриловой кислоты ВИ-АК-125 при концентрации 0,01 мг/мл (таблица 3). Полученные результаты указывают на хорошую сохранность диагностикума в течение трех лет.
Таблица 2
№сыворотки
Конъюгирующий агент
ПАК
ПМАК
ПВИ
ВИ-АК-125
ВИ-АК-126
ВИ-АК-127
Титры антител
1
1:2
1:8
1:4
1:4
1:2
1:4
2
1:8
1:4
1:32
1:64
отр
1:4
3
отр
отр
1:2
1:2
отр
отр
4
1:16
1:8
1:8
1:32
отр
1:8
5
1:2
1:4
1:8
1:8
отр
1:4
6
отр
1:4
1:8
1:2
отр
1:2
7
1:16
1:8
1:32
1:64
1:2
1:4
8
1:2
1:4
1:8
1:8
отр
1:2
9
отр
1:4
168
1:2
отр
1:2
10
1:8
1:8
1:64
1:256
1:2
1:8
Примечания: Сополимеры ВИ-АК-125, ВИ-АК-126, ВИ-АК-127 содержат 42, 19 и 72 мол.% звеньев 1-винилимидазола соответственно.
Таблица 3
№сыворотки
Диагностикум
3 года хранения
Свежеприготовленный
Титры антител
1
1:4
1:4
2
1:64
1:128
3
1:2
1:4
4
1:32
1:32
5
1:8
1:8
6
1:2
1:2
7
1:64
1:64
8
1:8
1:8
9
1:2
1:2
10
1:256
1:256
log<sub>2</sub>
3,6
3,8
Примечание: log<sub>2</sub> - средний логарифм обратных титров (для отрицатльных проб принят равным 0).