ФРАКЦИИ МОЛОКА, ОБОГАЩЕННЫЕ ФОСФАТИДИЛСЕРИНОМ, ДЛЯ КОМПОЗИЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО ПИТАНИЯ
MILK FRACTIONS ENRICHED WITH PHOSPHATIDYLSERINE FOR FUNCTIONAL ALIMENTATION COMPOSITION

Настоящее изобретение относится к коровьему фосфатидилсерину, его получению и применению.
Фосфолипиды (ФЛ) являются веществами, широко распространенными в биологической среде. Они входят в состав мембран большинства клеток животных и растений. Эти липиды представляют собой двухслойные структуры, выполняющие функции барьеров между различными отделами и обеспечивающие надлежащие условия среды для рецепторов, ферментов и транспортных белков. Кроме того, они выступают в роли трансмиттеров для обеспечения связи между клетками. Значительная часть головного мозга сформирована фосфолипидами. 15% пула фосфолипидов головного мозга человека состоит из фосфатидилсерина (ФС). По мере старения головного мозга материал утрачивается и замещается неактивными веществами, такими как холестерин.
В последнее время к ФС проявляется интерес как к активному компоненту нутрицевтических продуктов (пищи с фармакологическими свойствами) для улучшения когнитивной деятельности, противодействия потере памяти, а также в качестве средства для снятия стресса. В литературе примером может служить статья Benton et al. в журнале Nutritional Neuroscience, Vol.4, pp.169-178, под названием " The influence of Phosphatidylserine Supplementation on Mood and Heart Rate when Faced with an Acute Stressor (Влияние восполнения запасов фосфатидилсерина на настроение и частоту сердечных сокращений при столкновении с острым стрессором)".
В течение ряда лет была проведена серия испытаний со значительными положительными результатами по потреблению ФС во время стресса и когнитивной деятельности, см., например, статью Arjan Blokland et al. "Cognition-Enhancing Properties of Subchronic Phosphatidylserine (PS) Treatment in Middle-Aged Rats: Comparison of Bovine Cortex PS With Egg PS and Soybean PS (Улучшение когнитивной способности в результате субхронического лечения фосфатидилсерином (ФС) у крыс среднего возраста: сравнение ФС коры головного мозга жвачных животных с ФС яйца и ФС соевых бобов)" в журнале Nutrition, Vol.15, No. 10,1999.
ФС может использоваться в качестве нутрицевтика и вводиться в составе различных пищевых композиций, напитков, таблеток и различных батончиков, содержащих концентрат полезных для здоровья ингредиентов.
Исторически в качестве сырья для выделения ФС использовали мозг жвачных животных; однако после вспышки коровьего бешенства (BSE - губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота) этот материал больше не используется по вполне понятным причинам.
В течение ряда последних лет разработан и продается такими компаниями, как Lucas Meyer GmbH/Degussa, Enzymotec, Chemi и Lipogen, полусинтетический вариант, полученный из соевого лецитина. Можно сослаться на патентный документ WO 2005/027822. Основная методика, используемая всеми упоминавшимися производителями ФС, заключается, по имеющимся сведениям, в осуществлении замещения концевой группы фосфолипидов в субстрате, например замещение холиновой группы в фосфатидилхолине на серин с использованием фосфолипазы D в качестве активного фермента для протекания реакции.
Из-за необходимости при таких методиках активировать фермент с помощью кальция, ФС часто получают в виде трудно диспергируемой кальциевой соли. Чистота соединения может варьироваться от 20 до 90%. Другой проблемой, связанной с процессом замещения концевой группы, являются небольшие остатки активности фермента фосфолипазы D, что приводит к нестабильности ФС в жидких водных системах. Еще одной значительной проблемой, связанной с чистыми ФЛ фракциями, полученными как целое, является появление неприятного вкуса в водных системах. Из-за этих недостатков ФС продают, главным образом, в капсулированной форме, растворенными в масле. В силу приведенных выше причин питьевые композиции ФС, диспергированные в воде, до сих пор не пользуются успехом.
Другой проблемой, связанной с продажами, является природа ФС. ФС с замещенной концевой группой не является природным. Фактически, это полусинтетическое вещество со всеми ограничениями, налагаемыми органами здравоохранения на использование в пищевых продуктах человека.
Для решения описанных выше проблем был проведен поиск нового природного источника ФС.
Молоко содержит фосфолипиды в мембранах жировых глобул молока (МЖГМ). Эти мембраны оформлены в упорядоченные двухслойные структуры вместе с особыми белками, так называемыми МЖГМ-белками.
В обезжиренном молоке присутствуют особые фрагменты МЖГМ, происходящие из комплекса Гольджи в вымени и из материала МЖГМ, выделенного из жировых глобул.
31
После проведения экстракции растворителем можно определить состав фосфолипидов, предпочтительно, с помощью ЯМРP (Spectral Service GmbH, Германия).
31
Типичный состав фосфолипидов молока следующий (согласно методу ЯМРP):
мол. %
Фосфатидилхолин (ФХ)
27
Фосфатидилинозитол (ФИ)
7
Фосфатидилсерин (ФС)
13
Сфингомиелин (СФ)
25
Фосфатидилэтаноламин (ФЭ)
27
Другие
1
Состав ФЛ молока является уникальным в природе благодаря высокому содержанию ФС и сфингомиелина (СФ).
СФ также является биологически активной полярной жидкостью молока. Он снижает усвоение холестерина и, кроме того, рассматривается как обладающий противоопухолевым действием в толстом кишечнике. Установлено, что активным антиканцерогенным действием обладает продукт разложения СФ в кишечнике, а именно церамид. Можно сослаться на работу Vesper et. al. (1999) Spingolipids in food and the emerging importance of Spingolipids to nutrition (Сфинголипиды в пище и новое значение сфинголипидов для питания), J. Nutr. 129: р. 1239-1250.
Цельное молоко является неудовлетворительным источником ФС. Оно содержит только около 27 мг ФС на литр. В обезжиренном молоке содержится около 10 мг/л. В пахте от сбивания сливок содержится около 130 мг ФС/л. Пахта от молочного жира является еще лучшим источником ФС, в ней содержится около 250 мг ФС/л.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Следующие термины, использованные в описании, имеют приведенное ниже значение:
- нутрицевтик означает любое вещество, являющееся пищей или частью пищи и обеспечивающее медицинскую пользу или пользу для здоровья, включая предупреждение и лечение заболевания;
- пахта означает сывороточную фазу после производства масла или молочного жира;
ФЛ - аббревиатура для фосфолипидов;
ФС - аббревиатура для фосфатидилсерина;
СФ - аббревиатура для сфингомиелина;
МЖГМ - аббревиатура, относящаяся к мембране жировых глобул молока;
- ФЛ концентрат при использовании в контексте данного изобретения означает фосфолипидный концентрат, полученный из коровьего молока;
31
- высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с ЯМРP детектором представляет собой усовершенствованный метод определения фосфолипидного состава, включая ФС, после экстракции высушенных образцов растворителями;
- модель Трирского Общественного Стресс-Теста (TSST), как описано Kirschbaum, С, Pirke, KM, Hellbhammer, DH, "The "Trier Social Stress Test" A tool for investigating Psychobiological stress responses in laboratory settings («Трирский Общественный Стресс-Тест» - способ исследования психобиологической реакции на стресс в лабораторных условиях), Neurophysiobiology, 1993, 28, р.76-81;
- Esprion 300 от DMV Internacional представляет собой сывороточный белковый концентрат с содержанием белка около 30%.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к источнику фосфатидилсерина природного состава, происходящего из коровьего молока, обладающему превосходной диспергируемостью и органолептическими свойствами, а также физической стабильностью.
Такой источник может быть получен из пахты или сывороточной фазы производства молочного жира. Он может содержать более 0,2% ФС от массы общего количества сухих веществ, например, от 0,2 до 10% ФС или от 1,5 до 3% ФС от массы общего количества сухих веществ.
Кроме того, источник согласно изобретению может быть источником сфингомиелина в количестве, почти в два раза превышающем количество фосфатидилсерина.
Такой источник является полезным в составе нутрицевтической композиции.
Он может представлять собой нутрицевтический ингредиент в форме порошка или жидкого концентрата в дисперсии или в растворе.
Примерами нутрицевтических композиций являются шоколад, мороженое, напитки, йогурт, питательные батончики или любая нутрицевтическая форма.
В частности, можно получать нутрицевтическую композицию в форме напитка без проблем, связанных с осаждением активного ингредиента, содержащую количество источника согласно изобретению, дающее в результате напиток, содержащий более 20 мг ФС и более 40 мг СФ на порцию, например от 20 мг до 500 мг ФС и от 40 до 1500 мг СФ на порцию.
Дневная порция обычно составляет от 20 до 1000 мл или от 100 до 250 мл.
Нутрицевтическая композиция также может быть приготовлена для потребления в составе твердой пищи, единичная форма или доза которой содержит от 20 мг до 500 мг ФС и от 40 мг до 1500 мг СФ.
Могут использоваться все значения между 20 мг и 500 мг ФС и между 40 мг и 1500 мг СФ. Нет каких-либо конкретных ограничений. Однако воздействие менее 20 мг ФС и 40 мг СФ в день будет трудно измерить. Более 500 мг ФС и более 1500 мг СФ в день не причинят вреда здоровью.
Основой нутрицевтической композиции может быть молоко или молочные напитки, такие как питьевой йогурт или обычный йогурт, любой другой тип напитков, включая воду, кислый фруктовый сок или аналогичные напитки с фруктовым вкусом, имеющие величину рН в интервале от 2 до 8.
Изобретение также относится к способу получения источника фосфатидилсерина, происходящего из коровьего молока, из сыворотки от производства молочного жира, включающему концентрирование обычных сливок путем центрифугирования с последующим разрушением полученной эмульсии в гомогенизаторе, сбором сывороточной фазы, отделением жира и обработкой методом ультрафильтрации, включая диафильтрование, и, наконец, осуществлением распылительной сушки.
Такой способ может давать концентрат молочных ФЛ, в котором фосфолипидная фракция будет составлять более 75% от общего содержания липидов в концентрате.
При таком способе обычное содержание жиров в сливках концентрируют приблизительно от 40 до 80%. Чем выше концентрация жира в сливках перед инверсией фаз, тем выше содержание ФЛ, включая фосфатидилсерин, в сывороточной фазе.
Источник фосфатидилсерина, происходящего из коровьего молока, кроме того, может быть получен из ретентата (ультраконцентрата) от микрофильтрации молочной сыворотки после обезжиривания.
Таким образом, для того чтобы получить порошок с высоким содержанием, в первую очередь, ФС, сливки для производства молочного жира концентрируют с помощью центрифугирования до получения сливок, содержащих около 80% жира. После разрушения эмульсии с использованием высоких усилий сдвига получают концентрированную сыворотку масла или пахту вместе с молочным жиром. Пахту, полученную таким образом, непрерывно обезжиривают в ходе процесса, дающего сыворотку, содержащую около 70-80% ФЛ от общего количества липидов в сыворотке. После этого сыворотку охлаждают и подвергают ультрафильтрации для снижения содержания лактозы и зольных веществ и, возможно, подвергают диафильтрованию с получением ультраконцентрата, содержащего 17% ФЛ от общего количества липидов, и, в частности, около 2,0-2,5% ФС от общего количества сухих веществ. И, наконец, этот концентрат подвергают распылительной сушке.
По такой методике получают хороший источник природного ФС со следующим типичным составом ингредиентов:
(%)
Общее содержание липидов
21-25
Фосфолипиды
16-19 (в частности, около 2% ФС и 5% сфингомиелина)
Белки
55-60
Лактоза
6-9
Зольные вещества
6
Неожиданно было обнаружено, что при добавлении описанного выше материала в основу для напитка, такую как вода или обезжиренное молоко, с получением 100 мг ФС на порцию объемом 200 мл получается эффективный источник ФС без осаждения ФС и без изменения вкуса в процессе длительного хранения при температуре холодильника.
ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Пример 1
Эффект источника согласно изобретению сравнивали с имеющимися на рынке соевыми продуктами, содержащими ФС, модифицированными путем замещения концевой группы.
В три партии по 40 литров обезжиренного молока, помещенные в резервуары с двойными стенками, добавляли три разных порошка, содержащих ФС из различных источников, а именно:
- концентрат молочных ФЛ согласно изобретению, полученный из пахты, содержащий 2,0% ФС;
- «ФС 20» от Enzymotec (Израиль), содержащий 21% ФС, представляющий собой ФС-продукт из соевого лецитина, модифицированного замещением концевых групп;
- аналогичный продукт «ФС 60» от Enzymotec, полученный по тому же принципу, что и «ФС 20», содержащий 62% ФС.
Добавку ФС рассчитывали таким образом, чтобы получать дозу в 100 мг ФС на порцию объемом 200 мл напитка на основе снятого молока.
Молоко с добавленным ФС-материалом нагревали до температуры 75°С в резервуаре с двойными стенками и выдерживали при конечной температуре в течение 10 минут.
Дисперсию гомогенизировали в два этапа, под давлением 40 и 160 бар соответственно, и подвергали УВТ (ультравысокотемпературной) обработке при температуре 142°С в течение 6 секунд. После охлаждения продукт помещали в стерильные флаконы емкостью 500 мл и хранили при температуре 8°С в течение 8 месяцев.
31
Молоко проверяли на вкус и содержание ФС (ЯМРP) через неделю; 1 месяц; два и три месяца.
В результате теста было определено, что молоко с добавленной фракцией из пахты было физически и органолептически стабильным.
Молоко, в которое были добавлены ФС 20 и ФС 60, оказалось физически нестабильным. Уже спустя 1 неделю 70% ФС выпадало в виде осадка и оседало на дне флаконов. Напиток, приготовленный с помощью ФС из источника согласно изобретению, оказался стабильным в течение всего периода испытаний и не показал осаждения.
Что касается органолептических свойств, образец с ФС 20 приобретал неприятный посторонний привкус, свойственный сое, что делало молоко практически непригодным для питья. Вкус образца с ФС 60 был более устойчивым в течение испытательного периода.
В заключение следует отметить, что в соответствии с использованной технологией производства только полученный из пахты ФС согласно изобретению показал длительную физическую стабильность без осаждения активного соединения.
Пример 2
3
240 метрических тонн сливок, содержащих 40% жира, концентрировали со скоростью 11,5 м/ч при температуре 70°С в центробежном сепараторе с получением сливок с содержанием жира приблизительно 80%. На следующей стадии концентрированные сливки подвергали инверсии фаз в гомогенизаторе, после чего сывороточную фазу, обогащенную фосфолипидами, извлекали со скоростью 1300 л/ч в ходе двухстадийной сепарации и охлаждали до температуры приблизительно 4°С. После ультрафильтрации и сушки сывороточной фазы (пахты) получали около 1,2 метрических тонн концентрата молочных ФЛ с высокой долей ФЛ по отношению к общему содержанию липидов, то есть содержащего 19% ФЛ при общем содержании липидов 23,3%. Состав концентрата молочных ФЛ более подробно описан в приведенной ниже таблице.
(%)
Белки (Nx6.38, Кьельдаль)
58,5
Лактоза
6,6
Зольные вещества
5,3
Влага
3,5
Общее содержание липидов
23,3
Общее содержание фосфолипидов
19,1
- сфингомиелин
5,1
- фосфатидилхолин
5,4
- фосфатидилэтаноламин
4,3
- фосфатидилсерин
2,3
- фосфатидилинозитол
1,5
Общее содержание церамидов
1,3
Ганглиозиды
0,59
Холестерин
0,27
Триглицериды
≈3
Пример 3
Рецептура, сравнение и клиническое испытание
Готовили тестируемый напиток, содержащий приблизительно 300 мг фосфатидилсерина на дозу или порцию объемом 250 мл, используя концентрат молочных ФЛ, полученный в Примере 2. Для получения требуемой дозы фосфатидилсерина на порцию объемом 250 мл брали около 13,5 г порошка молочных ФЛ. Напиток использовали для клинических испытаний по эндокринным, автономным и психологическим параметрам в соответствии с моделью Трирского Общественного Стресс-Теста (TSST). Исследования проводили в институте DAACRO (Diagnostic assessment and clinical research organization - Организации диагностической оценки и клинического обследования) в Трире, Германия, под руководством Dr. Juliane Hellhammer.
Из обезжиренного молочного порошка и молочного масла готовили напиток-плацебо. Напитки гомогенизировали под давлением 50 бар и термообрабатывали при температуре 143°С в течение 4 с. Композиции ароматизировали ванильным экстрактом и подслащивали добавлением сукралозы. Содержание лактозы в испытываемом напитке доводили до такого же количества, как в плацебо. Напиток-плацебо практически не содержал фосфолипидов, которые бы выявлялись при анализе. Таким образом, тестируемый напиток и плацебо были эквивалентными в отношении липидов (1,3%), белков (3,2%) и лактозы (4,4%).
Как тестируемый напиток, так и плацебо были вполне стабильными при хранении в течение, по меньшей мере, 4 месяцев и не приобретали посторонних привкусов.
Клиническое испытание охватывало в общей сложности 46 пациентов при двойном слепом распределении. Тестируемый напиток и напиток-плацебо употребляли контролированным способом в течение 3 недель, после чего пациентов подвергали стресс-тесту TSST. Измеряли физиологические, эндокринные и когнитивные параметры, такие как память, настроение/подверженность стрессам, и сравнивали их между группами.
Результаты клинического испытания
На основании оценки результатов эксперимента сделано следующее заключение:
в своей совокупности результаты настоящего исследования подтверждают, что введение 13,5 г молочных ФЛ порошка, такого как определен выше (то есть добавки в соответствии с изобретением), в питьевую композицию приводит к явным свидетельствам улучшения состояния рабочей памяти, в то же время ослабляя физиологическую и эндокринную реакцию на стресс. Например, содержание сыворотки и уровни кортизола в слюне в тестируемой группе были существенно снижены.
Кроме того, было отмечено, что в сыворотке крови пациентов тестируемой группы холестерин ЛПНП (липопротеид низкой плотности) был значительно снижен, приблизительно на 10%, по сравнению с группой плацебо. На величину ЛПВП (липопротеид высокой плотности) влияния не оказывалось.
Пример 4
Композиция молочного шоколада
Молочный шоколад с добавкой концентрата молочных ФЛ производили по следующему рецепту, получая партию в 100,03 кг конечного продукта.
Количество (кг)
Сахар
39,00
Какао-масса
16,50
Масло какао
18,50
Лактоза
4,00
Молочный порошок
17,50
Порошок молочных ФЛ
4,50
Ванилин
0,03
Продукт был физически и органолептически полностью сопоставим с контрольным образцом, не содержащим молочных ФЛ. Дневная порция в 100 г шоколада обеспечит 100 мг ФС (плюс 160 мг СФ).
Пример 5
Композиция мороженого
Мороженое готовили по следующему рецепту, получая партию в 100 кг.
Количество (кг)
Сливки (40% жирности)
25,00
СОМ (сухое обезжиренное молоко)
3,62
Esprion 300 (концентрат сывороточного белка)
0,67
Сахар
9,00
Сироп фруктозы
9,00
Эмульгатор (LBG)
0,12
Гуаровая камедь
0,08
Порошок молочных ФЛ
4,33
Вода
до 100
Нормальная дневная порция мороженого составляет 75 г. При использовании 4,33% порошка молочных ФЛ с 2,2% ФС дневное количество ФС составляет 70 мг (160 мг СФ). Продукт был сопоставимым с контрольным образцом по вкусу и стабильности. Количество эмульгатора в тестируемом продукте может быть значительно уменьшено.