СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СТРЕССОВОГО СОСТОЯНИЯ И РЕАКЦИИ ОРГАНИЗМА НА НЕБЛАГОПРИЯТНЫЕ ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR STRESS CONDITIONS AND BODY RESPONSE ON UNFAVOURABLE ECOLOGICAL FACTORS

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической иммунологии, экспериментальной и спортивной медицине, травматологии, и может быть использовано для объективизации оценки стрессовых состояний здоровых и больных людей и животных, воздействия на них неблагоприятных экологических факторов.
Известен способ определения адаптационных реакций организма на основании клинического анализа крови, включающий оценку процентного содержания лимфоцитов и сегментоядерных нейтрофилов и отношения этих показателей, абсолютного количества лейкоцитов, процентного содержания палочкоядерных нейтрофилов, моноцитов и эозинофилов (Абашин В.Г., Долгов Г.В., Пуга Д.П., Петрунин Д.Д. Препарат генферон - новый подход к профилактике инфекционно-воспалительных осложнений после искусственного аборта // Эффективная фармакотерапия в акушерстве и гинекологии, 2007. - №4. - С.2-6).
Однако предложенный способ не позволяет разграничить состояние острого и хронического стресса и не выявляет реакции клеток крови на неблагоприятные экологические факторы.
Известно, что при хроническом стрессе в периферической крови приматов уменьшается концентрация лимфоцитов и увеличивается концентрация моноцитов (Boere V., Paludob G.R., Pianta Т., Canale G., Tomaz C. Effects of novelty, isolation stress, and environmental enrichment on some haematological parameters in marmosets (Callithrix penicillata). In: Laboratory animal husbandry: ethology, welfare, and experimental variables. Michael W. Fox, 2009. priory.com/vet/marmoset.htm). При связанном с хроническим стрессом гиперкортицизме у людей повышается количество реактивных светлых лимфоцитов (Miauchi К., Hirata-Hibi M., Hashimoto M., Hosokawa К. Stress lymphocytes and the dexamethasone suppression test in major depressive disorders // Biological Psychiatry, 1989. - V.2, I.8. - 1021-1028). При остром посттравматическом стрессе у людей количество лимфоцитов увеличивается и существенно меняется их качественный состав: повышается количество малых и средних лимфоцитов со сниженным ядерно-цитоплазматическим отношением и цитоплазматическими гранулами, часть этих клеток имеет эксцентричное, вдавленное ядро, повышенную базофилию цитоплазмы (Karandikar N.J., Hotchkiss E.C., McKenna R.W., Kroft S.H. Transient Stress Lymphocytosis An Immunophenotypic Characterization of the Most Common Cause of Newly Identified Adult Lymphocytosis in a Tertiary Hospital // Am J Clin Pathol 2002; 117:819-825).
Перечисленные аналоги содержат отрывочные данные об особенностях морфологии лимфоцитов и моноцитов крови при стрессовых состояниях, полученные на основе стандартного анализа крови. Их недостаток - сложность идентификации реактивных и атипичных форм клеток крови на основании только визуальных признаков.
Известен метод оценки структурно-функционального состояния лимфоцитов (Свирновский А.И., Шелег С. В., Шиманская Т.И., Медведь И. Н., Радюк И.А., Бакун А.В., Тарас И.Б., Свирновская Э.Л., Ковалева О.В., Авхукова Т.В., Григорович С.А. «Методы оценки структурно-функционального состояния лимфоцитов периферической крови» (методические рекомендации). - Минск, 2000. - 60 С.), который включает просмотр 100 лимфоцитов, выделение малых, средних, больших лимфоцитов и плазматических клеток, регистрацию клеток с пикнотичными, ядрышкосодержащими и вакуолизированными ядрами, клеток с двумя ядрами и микроядрами, отросчатыми и расщепленными ядрами, учет количества клеток с базофильной, вакуолизированной, вытянутой, отросчатой и гранулярной цитоплазмой; при наличии лимфоцитов с двумя ядрами и микроядрами авторы предлагают просмотр 1000 лимфоцитов.
Недостатком предложенного метода является трудоемкость и отсутствие четкого подразделения реактивных лимфоцитов (клеток с признаками антигенной или гормональной стимуляции) и атипичных лимфоцитов (клеток с признаками патологических и дегенеративных изменений), поэтому невозможно разграничить стрессовое состояние и реакцию на неблагоприятные экологические факторы.
Задачей изобретения является разработка способа гематологической диагностики стрессового состояния и реакции организма на неблагоприятные экологические факторы, предусматривающего количественную оценку представительства типичных, реактивных и атипичных лимфоцитов, а также моноцитов на основе рационального сочетания компьютерных технологий и опыта гематолога, повышение документированности и достоверности анализа крови и расширение его диагностических возможностей.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе диагностики стрессового состояния и реакции организма на неблагоприятные экологические факторы, включающем оценку структурно-функционального состояния лимфоцитов в мазке периферической крови, анализируют выборку агранулоцитов с применением метода компьютерного анализа их цифровых изображений, идентифицируют типичные, реактивные и атипичные формы лимфоцитов, преобладание среди типичных лимфоцитов малых темных узкоплазменных форм, доля малых и средних реактивных темных лимфоцитов больше 5% - свидетельствует о состоянии острого стресса, низкий лимфоцитарно-моноцитарный индекс (меньше 6,0), доля реактивных светлых лимфоцитов больше 10%, содержание больших гранулярных лимфоцитов меньше 5% - свидетельствуют о состоянии хронического стресса, значительная доля атипичных лимфоцитов (более 5%), в том числе двуядерных, многоядерных и с микроядрами - свидетельствует о реакции организма на неблагоприятные экологические факторы.
Настоящее изобретение поясняют подробным описанием, исследовательскими данными, таблицей и иллюстрациями, на которых изображено:
Фиг.1 - изображение поля зрения с агранулоцитом и вырезанной зоной интереса; а - цифровое изображение поля зрения мазка крови, полученное на аппаратно-программном комплексе «Диаморф» (инструментальное увеличение 1250×); 6 - зона интереса;
Фиг.2 - типичные малые и средние лимфоциты в электронном слайде;
Фиг.3 - реактивные темные малые и средние лимфоциты в электронном слайде;
Фиг.4 - реактивные светлые большие лимфоциты в электронном слайде.
Способ осуществляют следующим образом.
Изготавливают по стандартной методике мазок периферической крови, окрашенный по Романовскому-Гимза. На аппаратно-программном комплексе (световой исследовательский микроскоп, соединенный с видеокамерой, платой захвата и персональным компьютером) получают цифровые изображения от 100-150 полей зрения, содержащих агранулоциты (лимфоциты и/или моноциты). С помощью цифрового изображения шкалы объект-микрометра проводят геометрическую калибровку изображений. В графическом редакторе изображений из полей зрения вырезают зоны интереса-изображения отдельных клеток (фиг.1).
th
Затем анализируют выборку агранулоцитов с применением метода компьютерного анализа их цифровых изображений, идентифицируют типичные, реактивные и атипичные формы лимфоцитов. Для этого изображения лимфоцитов и моноцитов сортируют в программе Power Point. Для определения количественных характеристик пользуются либо специальными компьютерными программами-анализаторами изображений, либо стандартными графическими редакторами. Типичные лимфоциты (фиг.2), иммунобласты и плазмоциты идентифицируют по известным из гематологии критериям (Абрамов М.Г. Гематологический атлас, 1985, - 238 с.). К реактивным малым и средним темным лимфоцитам (фиг.3) относят клетки до 10 мкм диаметром с ободком цитоплазмы >2 мкм, цитоплазма темно-базофильная с мелкими азурофильными гранулами или вакуолями, ядро с глубокими вдавлениями или дольчатое. К реактивным светлым большим лимфоцитам (фиг.4) относят клетки более 12 мкм диаметром с обильной светлой цитоплазмой и базофилией по контуру клетки; многие из этих клеток имеют полигонально-отросчатую форму, обтекающую эритроциты. К атипичным лимфоцитам относят клетки с удлиненной формой ядра и цитоплазмы, тонко-отросчатые лимфоциты, клетки с выбухающим ядром, расщепленным ядром, отросчатым ядром, двухъядерные или многоядерные, а также клетки с микроядрами. Для идентификации моноцитов пользуются также известными из гематологии критериями (Wintrobe's Clinical Hematology - 12 ed. Lippincot Williams & Wilkins, 2004. - P. 252 - 253). Для разграничения типичных малых (<7 мкм), средних (7-10 мкм) и больших лимфоцитов (>10 мкм) определяют диаметры отдельных клеток методом расчета среднего ортогонального диаметра. Для уточнения деталей строения ядра лимфоцитов или моноцитов (наличие или отсутствие ядрышка, двуядерные и многоядерные формы, наличие микроядер, рисунок хроматина) пользуются редактированием яркости и контраста, а также цветового баланса цифровых изображений либо приемами цветовой сегментации, поскольку при световой микроскопии мазка и просмотре цифровых изображений перечисленные детали видны не всегда.
Для каждого класса клеток (лимфоциты типичные малые, лимфоциты типичные средние, лимфоциты типичные большие, лимфоциты реактивные, лимфоциты атипичные, промоноциты и моноциты) формируют отдельные группы слайдов в программе Power Point.
Подсчитывают количество лимфоцитов каждого типа и его процентную долю в общей выборке, рассчитывают лимфоцитарно-моноцитарный индекс - отношение количества лимфоцитов к количеству моноцитов. Для анализа агранулоцитограмм полученные количественные параметры заносят в таблицу. Наряду с этим в таблицу вносят информацию о преобладающем фенотипе типичных лимфоцитов.
Полученные результаты анализируют и формулируют диагностическое заключение. Преобладание среди типичных лимфоцитов малых темных узкоплазменных форм, доля малых и средних реактивных темных лимфоцитов больше 5% - свидетельствует о состоянии острого стресса, низкий лимфоцитарно-моноцитарный индекс (меньше 6,0), доля реактивных светлых лимфоцитов больше 10%, содержание больших гранулярных лимфоцитов меньше 5% - свидетельствуют о состоянии хронического стресса, значительная доля атипичных лимфоцитов (более 5%), в том числе двуядерных, многоядерных и с микроядрами - свидетельствует о реакции организма на неблагоприятные экологические факторы.
В качестве примера использования способа приводим результаты исследований мазков крови 5 экспериментальных животных - собак (таблица 1), которые в течение 1 месяца содержались в стандартных условиях - карантинном отделении вивария - в соответствии с требованиями Министерства здравоохранения РФ к работе экспериментально-биологических клиник, а также «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей». У 2 собак из 5 (коды мазков крови - 4862ро1 и 4864ро1) взятие крови для анализа проведено через сутки после стандартной экспериментальной операции - перерезки и шва седалищного нерва.
9
По результатам стандартного общего анализа крови у 4 собак из 5 (в таблице 1 отмечены звездочками - 4862ро1, 4864ро1, 5073, 4705) выявлен абсолютный лимфоцитоз (>2,9×10/л), что заставляет заподозрить наличие стрессового состояния.
При изучении агранулоцитограммы (таблица 1), построенной по предложенному способу, установлено, что типичные лимфоциты трех неоперированных животных представлены малыми и средними лимфоцитами, темными и светлыми, узко- и широкоплазменными, у одной собаки из трех неоперированных имеются единичные большие лимфоциты. У оперированных животных практически все типичные лимфоциты представлены малыми темными узкоплазменными формами.
Абсолютный лимфоцитоз в сочетании с присутствием реактивных темных малых лимфоцитов свидетельствует о наличии острого стресса. У оперированных животных доля реактивных темных малых лимфоцитов достоверно выше (у оперированных 15,3% и 21%, у неоперированных 3,8% и 4,9%) - то есть указанный показатель отражает степень выраженности острого стресса.
Кроме того, у всех исследованных собак доля реактивных светлых лимфоцитов значительна, что свидетельствует о хроническом стрессе разной степени выраженности. Высокие значения данного показателя (>30%) и низкий лимфоцитарно-моноцитарный индекс (<6,0) позволяют выявить животных с высоким уровнем хронического стресса. Отсутствие у животных плазмоцитов и наличие только единичных плазмобластов позволяют исключить острые и хронические инфекционные заболевания. Вместе с тем низкое содержание больших гранулярных лимфоцитов (<5%) свидетельствует о снижении клеточного иммунитета, что также характерно для хронического стресса и позволяет подтвердить указанное состояние.
У собак с признаками острого стресса выражен «сдвиг вправо» показателей моноцитограммы (в выборке агранулоцитов отсутствуют промоноциты)
У 3 собак из 5 значительная доля атипичных лимфоцитов заставляет предположить действие неблагоприятных экологических факторов, причем у 2 собак из 3 наличие лимфоцитов с микроядрами указывает на признаки нестабильности генома.
Таблица 1
Данные количественного анализа агранулоцитов экспериментальных животных
Код мазка крови
4862ро1*
4864pol*
4891
5073*
4705*
ЛИМФОЦИТОГРАММА
Преобладающий фенотип типичных лимфоцитов
Малые темные узкоплазменные
Малые темные узкоплазменные
Малые, средние, большие, узко- и широкоплазменные
Малые и средние узко- и широкоплазменные, темные и светлые
Малые и средние светлые широкоплазменные
Доля типичных лимфоцитов
65,3%
45,7%
55,1%
72,8%
45,1%
В том числе большие гранулярные лимфоциты
2%
0%
1%
0%
0%
Реактивные формы: темные малые и средние
15,3%
21%
0%
3,8%
4,9%
Светлые большие
10,2%
32,1%
30,3%
11,6%
47,1%
Иммунобласты
0%
1,2%
0%
0%
2,9%
Плазмоциты
0%
0%
0%
0%
0%
Атипичные лимфоциты
9,2%
0%
14,6%
11,7%
0%
В том числе с микроядрами
3,1%
0%
3,3%
0%
0%
МОНОЦИТОГРАММА
Промоноциты
0
0
9,1%
0
0
Собственно моноциты
100%
100%
90,9%
100%
100%
ЛИМФОЦИТАРНО-МОНОЦИТАРНЫИ ИНДЕКС
Отношение числа лимфоцитов к числу моноцитов в выборке из 150 агранулоцитов
6,1
3,0
3,1
6,9
3,1
Предложенный способ не требует дорогостоящего оборудования и реактивов, но позволяет надежно и объективно выявить особенности дивергентной морфологии этих клеток. В частности, он может применяться в клинических и экспериментальных исследованиях влияния стрессовых состояний и действия неблагоприятных экологических факторов на течение послеоперационного периода и репаративно-восстановительных процессов, а также в индивидуальном прогнозировании функциональных исходов оперативного или консервативного лечения.