Способ моделирования обратимой механической желтухи
METHOD FOR MODELING REVERSIBLE MECHANICAL JAUNDICE

Изобретение относится к медицине, экспериментальной хирургии и фармакологии, и может быть использовано для моделирования обратимой механической желтухи у крыс в эксперименте для изучения новых лекарственных средств, обладающих гепатопротекторной активностью.
Формирование обратимой механической желтухи у крыс вызывает некоторые сложности. Это связано анатомическими и физиологическими особенностями животных. В среднем для исследования используются семинедельные крысы массой от 200 до 250 г. Диаметр холедоха этих животных, как правило, не превышает 1 мм, следовательно, он имеет тонкие стенки и очень легко травмируется при манипуляциях. Другой важной особенностью является то, что использование объемных инородных предметов в брюшной полости приводит к выраженному спаечному процессу, рубцовой деформации органов (в том числе желчного протока) и гибели животных.
Существует несколько способов моделирования обратимой механической желтухи. Один из них – наложение нитей на желчные пути, которые проводят через полихлорвиниловые цилиндры и затягивают. Данный способ позволяет произвести реокклюзию желчных путей без повреждения (KZ 7553, МПК G09B 23/28, А61В 17/00, опубл. 17.05.1999).
Однако недостатком данного способа являются невозможность многократного создания регулируемой механической желтухи, так как после лапаротомии у 10 экспериментальных животных образуется выраженный спаечный процесс и повторно идентифицировать холедох не представляется возможным.
Наиболее близким способом моделирования регулируемой механической желтухи в эксперименте является наложение лигатурной перетяжки на общий желчный проток. Удаление лигатуры производится (декомпрессия холедоха) на 3-и сут после моделирования (Беляев А.Н. Эффективность внутрипортальных инфузий мексидола при лечении механической желтухи. Журнал «Хирургия» № 9, 2009, стр. 66-69).
Недостатками данного способа являются вероятность развязывания лигатуры и, как следствие, отсутствие возникновения желтухи, невозможность повторного оперативного вмешательства на экспериментальном животном вследствие выраженного спаечного процесса.
Известно формирование обратимой механической желтухи с использованием быстро рассасывающихся шовных материалов. Суть данной модели заключается в наложении на холедох быстро рассасываемого шовного материала. Удобство данного способа заключается в том, что для его формирования нет потребности в повторной лапаротомии. После окклюзии шовный материал постепенно начинает рассасываться, что в будущем приводит к восстановлению пассажа желчи. Однако срок рассасывания лигатуры будет зависеть от индивидуальных особенностей животных. В связи с этим невозможно применить данный способ в случаях, когда у животных нужно восстановить ток желчи в определенный день (Nurettin Kahramansoy., Fahri Yimaz., Mustafa Sit., A new model of reversible obstructive jaumdice usingrapidly absorbable suture materials. J Clinical and investigative medicine. December 2012; 35(6): Е351-357).
Известно формирование обратимой механической желтухи при помощи титановых клипс. Данный способ достаточно прост в исполнении и выполняется в два этапа. Его суть заключается в наложении титановой клипсы на желчный проток с последующим ее удалением. Однако несмотря на простоту, у данного способа есть ограничения. Во-первых, учитывая, что клипса не обладает эластичностью есть вероятность перфорации желчного протока при ее наложении. Во-вторых, при данном способе развивается выраженный спаечный процесс в области окклюзии, описанный автором данного способа. Это вызывает техническое трудности при удалении конструкции, что может привести к повреждению и перфорации желчного протока. Для того чтобы нивелировать недостатки данной модели автор предлагает использовать биорезорбируемую мембрану из гиалуроновой кислоты/карбоксиметилцеллюлозы, что значительно улучшает результат. Однако высокая стоимость титановых клипс и вышеуказанных мембран значительно ограничивают использование данного способа и не позволяет использовать его рутинно (Ryutaro Mori., Yoji Nagashima., Takafumi Kumamoto., Daisuke Morioka. A simple and easily reproducible model of reversible obstructive jaundice in rats. J in vivo (Athens, Greece) May 2019; 33: Е699-706).
Известно формирование обратимой механической желтухи с использованием холедохохоледохоанастомоза.  Данный способ состоит из двух этапов. На первом этапе крысе выполняется лапаротомия, производится выделение холедоха и перевязка его двумя тонкими лигатурами, между которыми желчный проток пересекается. На втором этапе выполняется релапаротомия, выделяется проксимальная и дистальная культя желчного протока и при помощи пластиковой трубки от внутрисосудистого катетера производится  наложение холедохохоледохоанастомоза с восстановлением пассажа желчи по желчевыводящим путям. Данный способ технически сложный и требует дополнительного дорогостоящего оборудования, микрохирургического навыка у исследователя, а так же длительного времени операции, что значительно ограничивает рутинное использование данного метода. В другой модификации данного способа описывается возможность наложения холедоходуоденоанастомоза, однако данный способ имеет все те же ограничения, плюс данный анастомоз достаточно часто забивается кишечным содержимым что приводит к нарушению тока желчи и как следствие рецидива механической желтухи (Xin Huang, Chong-Hui Li, Ai-Qun Zhang, Zhe Kong, Wan-Qing Gu, Jia-Hong Dong. J Annals of Surgical Treatment and Research 2017;92(6):389-395).
Представленный нами способ формирования обратимой желтухи у крыс имеет явное преимущество перед всеми вышеуказанными моделями. Во-первых, ток желчи в любой можно восстановить в любой день после окклюзии в зависимости от потребностей исследователя, что не позволяет первый способ. Во-вторых, для создания заявленного способа все используемые материалы имеют небольшую стоимость. Третьим преимуществом является простота и быстрота операции. Четвертым преимуществом является отсутствие потребности в повторной лапаротомии, что значительно уменьшает количество осложнений со стороны органов брюшной полости и послеоперационной раны.
Технический результат, при использовании заявленного изобретения, заключается в разработке способа моделировании обратимой механической желтухи у белых лабораторных крыс для последующего изучения гепатопротекторной активности новых лекарственных веществ.
Сущность изобретения заключается в том, что способ моделирования обратимой механической желтухи включает фиксацию дистального отдела общего желчного протока к внутренней поверхности передней брюшной стенке. В брыжейке позади общего желчного протока делают окно, через которое проводят латексный жгут, затем производят дополнительный разрез кожи на 1 см правее лапаротомной раны, оба конца латексного жгута через отдельные проколы мышц передней брюшной стенки в области контрапертурного разреза выводят под кожу, после чего жгут натягивают и формируют 3 узла, сдавливая общий желчный проток между жгутом и передней брюшной стенкой, лапаротомную и контрапертурную раны ушивают. На 5-е сутки осуществляют доступ к латексному узлу путем рассечения кожи над ним, узел пересекают, выполняют декомпрессию общего желчного протока.
На фиг. 1 показана схема заявленной модели обратимой механической желтухи у крыс; на фиг. 2 показан общий желчный проток, проходящий в брыжейке двенадцатиперстной кишки; на фиг. 3 представлены микрофотографии печени животных без лечения 5-ые; 14-ые сут Гемотоксилин и эозин, Х200 (пример 1), на фиг. 4 представлены микрофотографии печени животных на фоне введения Гептрала 5-ые, 14-ые сут Гемотоксилин и эозин, Х200 (пример 2).
Способ моделирования обратимой механической желтухи осуществляет следующим образом.
У белых беспородных крыс обоего пола под уретановым наркозом  (800 мг/кг внутрибрюшинно) производят верхнюю срединную лапоротомию для доступа к брюшной полости. Для визуализации общего желчного протока 1 доли печени 2 отводят кверху, начальную часть двенадцатиперстной кишки 3 захватывают анатомическим пинцетом на расстоянии 1 см от пилорического отдела желудка и смещают книзу. Особенность строения общего желчного протока у крыс заключается в том, что его дистальная часть на достаточно большом протяжении проходит в брыжейке двенадцатиперстной кишки 4 и в данной области холедох достаточно подвижный (фиг. 2). В данной части брыжейки позади холедоха делается окно, через которое проводится латексный жгут 5 диаметром 1 мм и длиной 7 см. После этого производится дополнительный разрез кожи на 1 см правее лапоротомной раны. Оба конца латексного жгута через отдельные проколы мышц передней брюшной стенки 6 в области контрапертурного разреза выводятся на переднюю поверхность под кожу, после чего жгут натягивается и формируются три узла. Таким образом, общий желчный проток сдавливается между жгутом и передней брюшной стенкой, что приводит к застою желчи, о чем свидетельствует расширение диаметра  проксимального отдела холедоха. Лапоротомная рана послойно ушивается. Кожа контрапертурной раны 7 зашивается наглухо 8, закрывая сформированный латексный узел на передней поверхности мышц, что предотвращает инфицирование брюшной полости
Декомпрессия общего желчного протока выполняется на 5-ые сут под общим обезболиванием. Осуществляется доступ к латексному узлу путем рассечения кожи над ним. Узел пересекается и извлекается. Оставшиеся дефекты от латексного жгута в мышцах передней брюшной стенки ушиваются отдельными узловыми швами. Кожа данной области зашивается непрерывным швом.
В моделировании способа было использовано 16 белых беспородных лабораторных крыс весом 250 г (8 особей – женского пола, 8 – мужского).
Для подтверждения  развития механической желтухи  у всех  животных из хвостовой вены забирали кровь на 3-и, 5-ые сут после окклюзии общего желчного протока, а также на 7-ые, 14-ые и 21-е сут после его реперфузии, для определения биохимических маркеров (аланинаминатрасфераза АЛТ, аспарагинаминотрансфераза АСТ, общий билирубин ОБ, билирубин прямой ПБ, билирубин непрямой НБ, гаммаглутамилтранспептидаза ГГТП). Часть животных выводили из эксперимента на 3-и, 5-ые, 7-ые, 14-ые и 21-е сут и изучали макро- и микроморфологию печени.
Способ моделирования обратимой механической желтухи для изучения гепатопротекторной активности новых лекарственных веществ подтверждается примерами.
Пример 1.
У 8 белых лабораторных крыс (4 – женские особи, 4 – мужские особи) под уретановым наркозом произвели верхнюю срединную лапоротомию. После отведения печени кверху и двенадцатиперстную кишку книзу сделали окно в брыжейке двенадцатиперстной кишки позади холедоха через которое провели латексный жгут диаметром 1 мм и длиной 7 см. После этого выполнили  дополнительный разрез кожи на 1 см правее лапоротомной раны. В данной области трансмускулярно через отдельные проколы вывели оба конца латексного жгута на переднюю поверхность мышц передней брюшной стенки и сформировали три узла, фиксируя холедох к задней поверхности передней брюшной стенки. Операционную рану послойно ушили. На 3-и,     5-ые, 7-ые, 14-ые, 21-ые сут у всех животных их хвостовой вены забирали кровь на биохимическое исследование. 4 крысы, выбранные случайным образом на 5-ые, 14-ые сут были выведены из эксперимента под эфирным наркозом для изучения микроморфологии печени. После компрессии общего желчного протока у всех животных наблюдалось повышение АЛТ, АСТ крови начиная с 3-и сут, достигших максимального значения к 5-ым сут (табл. 1). Так, показатели АЛТ – 151,6 Е/л, при норме 76 Е/л, АСТ – 324,2 Е/л при норме 99 Е/л, что свидетельствует о развитие цитолитического синдрома, подтвержденного морфологически при окраске срезов печени гематоксилином и эозином. На гистологических препаратах на 5-ые сут развивалось полнокровие центральных вен и синусоид, очаги некроза, зернистая и гидропическая дистрофия части гепатоцитов, лимфо – и гистиоцитарная инфильтрация, выраженная пролиферация желчных протоков. Уровень ОБ достигал 152,8 мкмоль/л, ПБ 150,138 мкмоль/л, НБ 2,662 мкмоль/л, при норме ОБ 6,9 мкмоль/л, ПБ 1,7 мкмоль/л, НБ 5,2 мкмоль/л.
После декомпрессии у всех животных восстанавливался пассаж желчи по желчевыводящим путям. Клинически это проявлялось в виде нормализации цвета мочи до светло-желтого. Кал становился темно-коричневого цвета, ушные раковины приобретали бледно-розовую окраску, глазное яблоко становилось насыщенно красным. Динамику цитолитического и холестатического синдрома изучали путем взятия крови из хвостовой вены с последующим изучением вышеуказанных биохимических показателей на 7-ые, 14-ые, 21-ые сут. Уже на 7-ые сут отмечалось значительное снижение изучаемых показателей: ОБ 36 мкмоль/л, ПБ 17,955 мкмоль/л, НБ 18,045 мкмоль/л, ГГПД 38 Е/л. Представленная положительная динамика сохранялась на протяжении всего эксперимента и к 21-ым сут все исследуемые показатели пришли в норму: ОБ 7,33 мкмоль/л, ПБ 1,71 мкмоль/л, НБ 5,62 мкмоль/л, ГГПД 11 Е/л (табл. 1).
Морфологическая картина печени на 14-ые сут характеризовалась сохранением полнокровия центральных вен, мелковакуольной дистрофией отдельных гепатоцитов, пролиферацией фибробластов, снижением уровня лимфогистиоцитарной инфильтрации. Однако стоит отметить, что к               21-ым сут эксперимента все исследуемые значения, за исключением прямого билирубина, оставались выше исходного уровня.
Пример 2.
У 8 белых лабораторных крыс (4 – женские особи, 4 – мужские особи) под уретановым наркозом произвели верхнюю срединную лапоротомию. После отведения печени кверху и двенадцатиперстную кишку книзу сделали окно в брыжейке двенадцатиперстной кишки позади холедоха через которое провели латексный жгут диаметром 1 мм и длиной 7 см. После этого выполнили  дополнительный разрез кожи на 1 см правее лапоротомной раны. В данной области трансмускулярно через отдельные проколы вывели оба конца латексного жгута на переднюю поверхность мышц передней брюшной стенки и сформировали три узла, фиксируя холедох к задней поверхности передней брюшной стенки. Операционную рану послойно ушили. На 3-и,     5-ые, 7-ые, 14-ые и 21-ые у всех животных их хвостовой вены забирали кровь на биохимическое исследование. 4 крысы, выбранные случайным образом на 5-ые, 14-ые сут были выведены из эксперимента под эфирным наркозом для изучения и микроморфологии печени. После компрессии общего желчного протока у всех животных наблюдалось повышение АЛТ, АСТ крови начиная с 3-х сут, достигших максимального значения к 5-ым сут (табл. 2). Так, показатели АЛТ – 155,1 Е/л, при норме 76 Е/л, АСТ – 320,4 Е/л при норме     99 Е/л, что свидетельствует о развитие цитолитического синдрома, подтвержденного морфологически при окраске срезов печени гематоксилином и эозином.
Уровень ОБ достигал 158,3 мкмоль/л, ПБ 146,205 мкмоль/л, НБ 12,095 мкмоль/л, при норме ОБ 6,9 мкмоль/л, ПБ 1,7 мкмоль/л, НБ 5,2 мкмоль/л.
После декомпрессии с лечебной целью всем крысам данной группы ежедневно вводился Гептрал в хвостовую вену в суточной дозировке            60 мг/кг. Динамику цитолитического и холестатического синдрома изучали путем взятия крови из хвостовой вены с последующим изучением вышеуказанных биохимических показателей на 7-ые, 14-ые, 21-ые сут. Результат исследования отражен в табл. 2. Из результатов исследования видно, что уже с 7-х сут отмечена значительная положительная динамика в виде снижения всех изучаемых показателей: ОБ 27 мкмоль/л, ПБ 3,42 мкмоль/л, НБ 23,58 мкмоль/л, ГГПД 14,5 Е/л. Представленная положительная динамика сохранялась на протяжении всего эксперимента и к 21-ым сут все исследуемые показатели пришли в норму: ОБ 6 мкмоль/л, ПБ 1,71 мкмоль/л, НБ 4,29 мкмоль/л, ГГПД 3 Е/л (табл. 2). В данной группе нормализация биохимических показателей происходила более стремительно в сравнении с группой крыс без лечения. Так же стоит отметить, что к 21-му дню эксперимента уровень АЛТ, АСТ, ОБ, НБ был сопоставим с показателями интактных животных, что обусловлено гепатопротекторной активностью препарата Гептрал. На микропрепаратах печени, окрашенных гемотоксилином и эозином на 14-ые сут наблюдения на фоне введения препарата Гептрал наблюдалось незначительное полнокровие центральных вен, участки размножения печеночных клеток с наличием двухядерных гепатоцитов.
Таким образом, заявленный способ может использоваться для изучения гепатопротекторной активности лекарственных средств.
Таблица 1
Биохимические показатели крови животных (пример 1)
Уровень АЛТ (Е/Л)
Уровень АСТ (Е/Л)
Уровень ОБ (мкмоль/л)
Уровень ПБ(мкмоль/л)
Уровень НБ(мкмоль/л)
ГГПД (Е/Л)
3 сутки
129,4
247,6
113,9
100,89
13,01
87,2
5 сутки
151,6
324,2
152,8
150,138
2,662
103,8
7 сутки
103,5
341,9
36
17,955
18,045
38
14 сутки
92,5
190,3
21,5
3,42
18,08
22,5
21 сутки
90,1
148,7
7,33
1,71
5,62
11
Таблица 2
Биохимические показатели крови животных (пример 2)
Уровень АЛТ (Е/Л)
Уровень АСТ (Е/Л)
Уровень ОБ(мкмоль/л)
Уровень ПБ(мкмоль/л)
Уровень НБ (мкмоль/л)
ГГПД(Е/Л)
3сутки
131,6
249,1
115,7
97,47
18,23
76
5 сутки
155,1
320,4
158,3
146,205
12,095
101,9
7 сутки
84,2
197
27
3,42
23,58
14,5
14 сутки
64,9
103
9,5
1,71
7,79
10
21 сутки
62,5
93
6
1,71
4,29
3