Влияние дезоксирибонуклеиновой кислоты из молок лососевых рыб на секрецию цитокинов клетками крови здоровых доноров

Медицинская Иммунология 2005, Т. 7, Ms 5-6, стр 617-619 © 2005, СПб РО РААКИ

Краткие сообщения

ВЛИЯНИЕ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ МОЛОК ЛОСОСЕВЫХ РЫБ НА СЕКРЕЦИЮ ЦИТОКИНОВ КЛЕТКАМИ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ

Федянина Л.Н.

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, г. Владивосток, Россия

Резюме. Изучено влияние ДНК из молок лососевых рыб на секрецию клетками крови здоровых доноров in vitro ранних гемопоэтических факторов (IL-3, GM-CSF, TNFa) и воздействие биологически активных веществ (БАВ) на баланс маркерных цитокинов Th^ Th2 ответа. (IFNy, IL-10).

Установлено, что ДНК оказывает модулирующее действие на секрецию всех исследованных цитокинов -IL-3, GM-CSF, TNFa, IFNy, IL-10 клетками крови здоровых доноров, повышая исходно низкую их концентрацию, снижая исходно высокую и не оказывая существенного влияния на средний уровень их секреции. Под действием ДНК наблюдается более значительное, по сравнению с IL-10 (индекс стимуляции (ИС)=1,9), повышение уровня IFNy (ИС=3,3). Таким образом, показано, что ДНК из молок лососевых рыб обладает иммуномодулирующими свойствами.

Ключевые слова: туберкулез, лекарственная чувствительность, лимфоциты, субпопуляции.

Fedjanina L.N.

SALMON SOFT ROE DNA ON BLOOD CELLS SECRETION OF CYTOKINES IN HEALTHY DONORS

Abstract. Salmon soft roe DNA influence on healthy donors blood cells secretion of early hemopoietic factors (IL-3, GM-CSF, TNFa) as well as biologically active substance influence on cytokine balance of Th1 and Th2 responses (IFNy, IL-10) in vitro was studied.

It is established, that DNA has modulatory effect on secretion of all investigated cytokines - IL-3, GM-CSF, TNFa, INFy and IL-10 by blood cells of healthy donors, increases their initially low concentration, reduces initially high and does not have essential influence at an average level of their secretion. Under action of DNA IFNy level

натриевых солей ДНК и РНК, также получаемая из молок осетровых рыб; ридостин - РНК, выделенная из пекарских дрожжей, ряд синтетических препаратов [4, 9].

Показано, что иммунотропная активность ДНК прокариотов обусловлена, в основном, наличием неметилированных динуклеотидов CpG, в контексте специфических оснований. ДНК позвоночных содержит небольшое количество подобных потенциальных иммуностимуляторных CpG мотивов наряду с присутствием в геноме иммунонейтрализующих последовательностей, но, тем не менее,

Введение

В настоящее время препараты нуклеиновых кислот различного происхождения достаточно широко применяются в качестве иммуномодуляторов. К ним относятся: нуклеинат натрия - РНК, полученный из дрожжей; деринат - натриевая соль нативной ДНК, выделенная из молок осетровых рыб; полидан - смесь

Адрес для переписки:

Федянина Людмила Николаевна,

690087, г. Владивосток, ул. Сельская, д.1.

Тел.: (4232) 44-14-38. E-mail: fedyanina@pochta.ru

617

Федянина Л.Н.

Медицинская Иммунология

также обладает иммуномодулирующими свойствами [5, 6, 12, 13].

Однако, не изучены факторы, определяющие им-мунотропные свойства ДНК позвоночных, типы отвечающих иммунокомпетентных клеток и механизмы их активации.

Установлено, что ДНК из молок лососевых рыб -биологически активное вещество (БАВ), повышает антиинфекционную резистентность мышей в отношении Escherichia coli и Salmonella enteritidis, стимулирует антителогенез, усиливая образование антителообразующих клеток в селезенках мышей, повышает поглотительную и переваривающую активность клеток системы мононуклеарных фагоцитов. Показано ее активирующее действие на факторы гуморального иммунитета, неспецифической резистентности [1, 2, 7, 8]. Однако не исследованы механизмы иммунотропного действия ДНК.

Целью нашей работы явилось изучение влияния ДНК из молок лососевых рыб на секрецию клетками крови здоровых доноров in vitro ранних гемопоэтических факторов (IL-3, GM-CSF, TNFa) и воздействие БАВ на баланс маркерных цитокинов ТЫи Th2 ответа (IFNy, IL-10).

Материалы и методы

БАВ ДНК из молок лососевых рыб получена учеными ФГУП «Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр» (ТИНРО-центр) в г. Владивостоке [3].

В ее состав входит 79,02% ДНК, 7,8% белка, 2,1% липидов и 10,68% воды. Молекулярная масса препарата составляет 270-500 кДа, гиперхромный эффект - не менее 37%. ДНК представляет собой аморфный порошок светло-кремового цвета, растворимый в воде при нагревании и не растворимый в органических растворителях [1, 2, 7, 8].

Уровни цитокинов IL-3, GM-CSF, TNFa, IFNy , IL-10 - определяли в цельной крови здоровых доно-

ров после специфической стимуляции клеток ДНК методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью наборов Duoset (Genzyme diagnostics, Cambridge, USA) [11]. Дозу ДНК (50 мкг/мл) подбирали экспериментально.

Готовую кровь от доноров (28 человек), разбавляли стерильной средой RPMI 1640 с 3% глютамина и 100 мкг/мл гентамицина. К 1,35 мл разбавленной крови добавляли 0,15 мл среды RPMI 1640 и 0,15 мл исследуемого вещества (конечная концентрация 50 мкг/мл). Пробирки помещали в термостат на 18-72 часа, затем кровь центрифугировали в течение 5 минут, супернатант отбирали и хранили при -20°С.

Математическую обработку полученных результатов проводили с использованием методов вариационной статистики с применением непараметрического Т-критерия Уилкоксона для попарно связанных пар [10].

Результаты и обсуждение

Интенсивность продукции цитокинов, вырабатываемых в контрольных культурах (спонтанная секреция) отличалась выраженной гетерогенностью у различных доноров. Уровень IL-3 колебался от 0,01 пг/мл до 34,03 пг/мл; GM-CSF от 0,21 пг/мл до 34,52 пг/мл; TNF-a от 3,1 пг/мл до 2223,44 пг/мл; IFN-y от 3,42 пг/мл до 115,41 пг/мл; IL-10 от 0,1 пг/мл до 199,96 пг/мл. Для анализа результатов полученные показатели условно делили на 3 группы: в 1-ю группу были включены показатели доноров с исходно низкими уровнями цитокинов; во 2-ю группу - со средними, в 3-ю - с исходно высокими (табл.1).

В группе доноров с исходно низкими показателями секреции всех цитокинов при добавлении ДНК наблюдалась стимуляция синтеза всех цитокинов (табл.1). Индекс стимуляции изучаемых цитокинов составил: IL-3 - 4,4; TNFa - 2,5; IL-10 -1,9; IFNy - 3,3; GM-CSF - 5,7. В наибольшей сте-

Табл.1. ВЛИЯНИЕ ДНК НА ПРОДУКЦИЮ ЦИТОКИНОВ КЛЕТКАМИ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ, ПГ/МЛ

Цитокины Группа с исходно низкими показателями Г руппа с исходно средними показателями Группа с исходно высокими показателями

Контроль ДНК Контроль ДНК Контроль ДНК

IL-3 0,5±0,1 2,2±0,6* 2,9±0,3 2,1±0,6 21,0±0,8 11, 1 ±8,9*

GM-CSF 0,4±0,1 2,3±1,0* 3,5±0,6 2,9±0,9 13,1 ±2,1 5,0±1,9*

TNFa 37,9±8,9 95,9±17,6** 200,8±35,5 283,9±56,7 1045,2±265,6 504,6±110,5*

IFN-y 8,8±1,1 29,4±6,4** 18,5±1,1 19,3±3,3 69,4±16,7 40,2±11,3*

IL-10 4,7±0,7 8,7±1,3* 24,2±4,6 27,8±13,4 146,2±13,2 58,8±15,7*

Примечание: * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001

618

2005, Т. 7, № 5-6

Влияние дезоксирибонуклеиновой кислоты из молок лососевых рыб...

пени возросли уровни секреции ранних гемопоэтических цитокинов GM- CSF (ИС=5,7) и IL-3 (ИС=4,4). При этом процент доноров с высокими цифрами уровня секреции GM-CSF был наименьшим среди этой группы и составил-66,7%. В большем проценте случаев на введение ДНК реагировал TNFa (86,75%), однако уровень повышения его секреции оказался наименьшим (ИС=2,5). Самый низкий уровень продукции и процент вовлечения в него доноров был у IL-10 (ИС=2,9 и 76,9%, соответственно). Показатели роста продукции IFN-y занимали промежуточное положение. В группе со средними показателями при введении ДНК концентрация всех цитокинов в супернатантах статистически не отличалась от таковой в контроле (табл.1). Однако наблюдалась тенденция к повышению уровня IFN-y, TNFa и IL-10 и снижению показателей GM-CSF и IL-3. В группе с исходно высокими уровнями цитокинов ДНК проявляла ингибирующее, но также не равнозначное по интенсивности действие на секрецию всех исследуемых цитокинов. В большей степени и примерно одинаково ДНК ингибировала продукцию GM-CSF и IL-10; в 85,7% случаев инициировала снижение концентрации GM-CSF в 2,6 раза, с 13,1±2,1 пг/мл до 5,0±1,9 пг/мл, и IL-10 в 2,5 раза, с 146,2±13,2 пг/мл - до 58,8±15,7 пг/мл. Уровни TNFa и IL-3 также снижались в 83,3 % и 85,7% случаев, в 2 и 1,9 раза, соответственно. Наименее чувствительным к действию ДНК в группе доноров с исходно высокими уровнями цитокинов, оказался IFN-y, уровень, которого уменьшился в 1,7 раза. Таким образом, ДНК оказывает модулирующее действие на секрецию всех исследованных цитокинов - IL-3, GM-CSF, TNFa, IFN-y и IL-10 клетками крови здоровых доноров, повышая исходно низкую их концентрацию, снижая исходно высокую и не оказывая существенного влияния при среднем уровне их секреции.

Введение ДНК обуславливает повышение уровня цитокинов, вырабатываемых преимущественно ТЫ-клетками (IFNy), т.е. способствует развитию клеточного иммунного ответа in vitro. Сопоставление иммуностимулирующего действия БАВ и бактериальной ДНК, позволяет определить некоторое сходство. Однако, как мы уже упоминали, иммуностимулирующее действие бактериальной ДНК обусловлено наличием в ее структуре неметилированных CpG-динуклеотидов в составе определенных последовательностей [4, 5, 11, 12], которых очень немного в ДНК позвоночных, при наличии иммунонейтрализующих/иммуносуп-рессивных мотивов [5, 6, 12, 13]. Исходя из этого,

можно сделать предположение, что либо иммуностимулирующий эффект бактериальной ДНК обусловлен не только CpG-динуклеотидами, либо в молекуле ДНК позвоночных существуют свои собственные структуры, ответственные за ее активирующее влияние на иммунную систему. Это делает перспективным дальнейшее изучение ДНК природного происхождения, ее структуры и механизмов иммунотропного действия.

Список литературы

1. Беседнова Н.Н., Касьяненко Ю.И., Эпштейн Л.М., Гажа А.К. Иммунотропные свойства дезоксирибонуклеиновой кислоты из молок лососевых рыб//Ан-тибиотики и химиотерапия.-1999.- т.44. - №10.-С.13-16.

2. Беседнова Н.Н., Эпштейн Л.М. Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) из молок рыб-перспективы клинического применения (в помощь практическому врачу). -2002., Владивосток: ТИНРО-центр -38с.

3. Патент СССР № 915446 .Способ получения ДНК из молок рыб / Гаймула М.А., Кална В.Х., Мик-стайс У.Я., Эпштейн Л.М.-Заяв.10.10.80; Опубл. 01.07. 91.

4. Пашук Л.К., Апрышко Г.Н., Трещалина Е.М. Препараты ДНК как потенциальные терапевтические средства // Хим-фарм. журн.- 1995. -№ 6.-С.61-64.

5. Рыкова Е.Ю., Лактионов П.П., Власов В.В. Активирующее влияние ДНК на иммунную систему // Усп. совр. биол.-2001.-№121.- С.160-171.

6. Серебряная Н.Б., Новик А.А. ДНК как иммуностимулятор // Медицинская иммунология.-

2001.-т.3. - №1.-С.27-34.

7. Федянина Л.Н., Потапова В.В., Эпштейн Л.М. Влияние ДНК из молок лососевых рыб на некоторые показатели гуморального иммунного ответа // Тез. докл. X1 Российской национальный конгресс «Человек и лекарство». - Москва. 2004. - С. 845.

8. Федянина Л.Н., Каленик Т.К., Потапова В.В. Иммуномодулирующее действие ДНК из молок лососевых рыб // Здоровье и образование. Материалы Международной научно-практической конференции. Пермь. - 2004.- С. 277-297.

9. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы: механизм действия и клиническое применение //Иммунология.-2003.-т.24.-№ 4.-С.196-203.

10. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990. - 352 с.

11. De Groote D., Zangerle P.F., Gevaert Y. et al. Direct stimulation of cytokines (IL-1a, TNF-a, IL-6, IL-2, IFN-y and GM-CSF) in whole blood. Comparison with isolated PBMC stimulation // Cytokine. -1992. - №4.- P. 239 - 248.

поступила в редакцию 10.07.2005 принята к печати 15.09.2005

619