СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ МИКРОБИОСЕНСОРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ ИЛИ ЛАКТАТА
METHOD OF MAKING MICROBIOSENSOR FOR DETERMINING GLUCOSE OR LACTATE

Изобретение относится к способу приготовления чувствительного элемента микросенсоров для определения глюкозы или лактата, содержащего фермент-оксидазу, иммобилизованную на поверхность электрокатализатора берлинской лазури (БЛ).
Контроль содержания в организме таких ключевых метаболитов, как глюкоза и лактат, есть важная аналитическая задача в связи с ростом заболеваемости диабетом, интересом к изучению стрессовых состояний человека в спортивной медицине, а также для диагностики и лечения широкого спектра заболеваний. Для определения этих двух веществ наиболее распространены методы, использующие ферменты-оксидазы, которые реагируют со своим специфическим субстратом с образованием пероксида водорода.
Среди различных подходов, обеспечивающих работоспособность оксидазных биосенсоров, детектирование пероксида водорода является наиболее эффективным, позволяя определять довольно низкие концентрации данного аналита [3]. На сегодняшний день наиболее эффективным чувствительным электрокатализатором восстановления пероксида водорода является берлинская лазурь [1].
На фиг. 1 приведена конструкция микросенсора на пероксид водорода, описанного в работе [2]. Максимальный диаметр в поперечном сечении не превышает 2 мм, что делает его пригодным для имплантации в живой организм млекопитающего без существенных повреждений. Микросенсор работает по двухэлектродной схеме: рабочий электрод и электрод сравнения расположены коаксиально.
Из патента Риччи и др. известен способ изготовления биосенсора на основе электродов, модифицированных гексацианоферратом железа или берлинской лазурью (Ricci et al., RU 2442130 C2, 10.02.2012; см. пример 5). Однако указанный патент относится к области биосенсоров, а не микробиосенсоров, а следовательно, не обеспечивает возможности имплантации в живые организмы. Техническим результатом заявленного изобретения является повышение чувствительности микробиосенсора по сравнению с указанным аналогом (RU 2442130 С2, 10.02.2012).
Научной группой, включающей в себя авторов данного патента, разработан и опубликован способ иммобилизации ферментов в различные удерживающие матрицы с возможностью дальнейшего сопряжения ферментативной и электродной реакции. Так, в работе [4, 5] описан протокол иммобилизации оксидаз из водно-органических смесей с высоким содержанием органического растворителя. В качестве мембранообразующего агента для глюкозооксидазы выступает полиэлектролит Нафион [4], в случае лактатоксидазы - различные виды силоксанов [5]. Применение указанных методик для изготовления микробиосенсоров оказалось успешным, однако диапазон определяемых датчиками концентраций не покрывал физиологический. Содержание глюкозы в крови составляет от 0.5 до 30 ммоль/л в состоянии тяжелой гипергликемии, лактата - 1 до 10 ммоль/л при интенсивных физических нагрузках. Таким образом, необходима оптимизация состава ферментсодержащих мембран для пролонгирования диапазона определяемых содержаний субстратов.
В связи с этим для глюкозных микробиосенсоров исследовались чувствительность и максимальная определяемая датчиком концентрация в зависимости от концентрации полиэлектролита Нафион растворе фермента перед нанесением на поверхность БЛ (фиг. 2 и 3).
Таким образом, для определения глюкозы физиологических концентраций наиболее всего подходит биосенсор с содержанием полиэлектролита Нафион 0.5%.
2
В случае лактатных микробиосенсоров в качестве параметра оценки при выборе состава исходного раствора для формирования мембраны был взят коэффициент чувствительности. На фиг. 4 изображена его зависимость от концентрации γ-NH-Pr-Sil - гамма-аминопропилсилоксана. На ней присутствует явный максимум для концентрации силоксана, равной 1%.
Таким образом, в диапазоне содержаний силоксана 0.3-2% наилучшей чувствительностью и стабильностью обладают датчики со средним содержанием гамма-аминопропилсилоксана.
Пример 1
Изготовление чувствительного элемента микробиосенсора для определения глюкозы с защитой активного центра фермента полиэлектролитом Нафион
Иммобилизация глюкозооксидазы в мембране Нафиона, представляющего собой сополимер политетрафторэтилена и полисульфонилфторидвинилового эфира (фиг. 5),  проводилось по следующей методике. На первом этапе коммерческий препарат Нафион концентрации 5% разбавляли абсолютированным изопропиловым спиртом до концентрации Нафион 2%. На втором этапе к полученному раствору полиэлектролита добавляли 25%-й водный раствор аммиака для достижения величины pH раствора полиэлектролита 5.5. Нейтрализованный раствор Нафион далее разбавлялся абсолютированным изопропиловым спиртом до необходимой концентрации.
На третьем этапе готовили раствор для создания ферментсодержащей мембраны Нафион. Исходный раствор фермента составлял 10 мг/мл. К полученному раствору фермента добавляли спиртовой раствор Нафион необходимой концентрации и перемешивали. Концентрация фермента в фермент-полиэлектролитном комплексе составляла 1.5 мг/мл, содержание воды в мембране составляло 15%, Нафион 0.5%.
Аналитические характеристики глюкозных микробиосенсоров, состоящих из модифицированных берлинской лазурью микроэлектродов с иммобилизованной на поверхности электрода оксидазой с оптимальным содержанием полимера:
Пример 2
Изготовление чувствительного элемента микробиосенсора для определения лактата с защитой активного центра фермента гамма-аминопропилсилоксана.
Иммобилизацию лактатоксидазы проводили следующим образом: охлажденный при температуре +4°C раствор гамма-аминопропилсилоксана (полимера (3-аминопропил)триэтоксисилана, фиг. 6) в изопропаноле смешивали со свежеприготовленным водным раствором фермента (содержание лактатоксидазы = 1 мг/мл), и эту смесь наносили на рабочую поверхность микроэлектродов, модифицированных берлинской лазурью. Высушивание мембраны и хранение биосенсоров производили при +4°C.
Аналитические характеристики лактатных микробиосенсоров, состоящих из модифицированных берлинской лазурью микроэлектродов с иммобилизованной на ее поверхности оксидазой с содержанием гамма-аминопропилсилоксана 1%:
Литература
1. Karyakin A.A., Prussian Blue and Its Analogues: Electrochemistry and Analytical Applications. Electroanalysis. (2001), 13, 813-19.
2. I.A. Bolshakov, Т.V. Vygodina, R. Gennis, A.A. Karyakin, and A.A. Konstantinov Catalase Activity of Cytochrome с Oxidase Assayed with Hydrogen Peroxide Sensitive Electrode Microsensor. Biochemistry (Moscow) (2010), 75, 1352-1360.
3. G.G. Guilbault, G.J. Lubrano An enzyme electrode for the amperometric determination of glucose. Analitica chimica acta (1973), 64, 433-455.
4. Arkady A. Karyakin, Elena A. Kotel′nikova, Lilia V. Lukachova, and Elena E. Karyakina Optimal Environment for Glucose Oxidase in Perfluorosulfonated Ionomer Membranes: Improvement of First-Generation Biosensors. Analytical Chemistry (2002), 74, 1597-1603.
5. Eugenia I. Yashina, Anastasiya V. Borisova, Elena E. Karyakina, Olga I. Shchegolikhina, Mikhail Yu. Vagin, Dmitry A. Sakharov, Alexandr G. Tonevitsky and Arkady A. Karyakin Sol-Gel Immobilization of Lactate Oxidase from Organic Solvent: Toward the Advanced Lactate Biosensor. Anal. Chem. Letters (2010), 82 (5), 1601-1604.