Видовой состав и биологические свойства микрофлоры желудка у пациентов с гастритами

В.Е. Ведерников, Ю.А. Захарова, Т. В. Шилкина

ВИДОВОЙ СОСТАВ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МИКРОФЛОРЫ ЖЕЛУДКА У ПАЦИЕНТОВ С ГАСТРИТАМИ

ФГУЗ МСЧ № 140 ФМБА России, г. Пермь

V.E. Vedernikov, J.A. Zakharova, T. V. Shylkina

SPECIFIC STRUCTURE AND BIOLOGICAL PROPERTIES OF MICROFLORA OF THE STOMACH AT PATIENTS WITH GASTRITIS

MSCH FMBA of Russia, Perm

Ключевые слова: острые и хронические гастриты, биотоп желудка, условно-патогенные микроорганизмы, факторы патогенности, антибиотикорезистентностъ, эрадикационная терапия.

Keywords: sharp and chronic gastritis, stomach biotope, conditionally pathogenic microorganisms, pathogenic factors, antibiotic-resistence, antimicrobial therapy.

Цель: Изучение микрофлоры слизистой оболочки желудка у пациентов с острыми и хроническими гастритами.

Материалы и методы: Обследовано 28 образцов биоптатов желудка пациентов с гастритами в возрасте от 17 до 80 лет. Оценка микрофлоры включала видовую идентификацию возбудителей, изучение факторов вирулентности, определение чувствительности к антибактериальным препаратам.

Результаты: Проведенные исследования выявили высокий уровень колонизации слизистой оболочки желудка условно-патогенными штаммами (82,1±7,2%) на фоне низкой высевае- мости Helicobacter pylori (7,1±4,8%). В целом выделено 55 видов представителей бактериальной флоры с преобладанием Streptococcus sp. В структуре микрофлоры 36,3±6,5% штаммов обладали природными или приобретенными факторами патогенности (вирулентности), 45,5±6,7% устойчивостью к препаратам эрадикационной терапии.

Выводы: Ведущие представители бактериальной флоры желудка у пациентов с острыми и хроническими гастритами Streptococcus sp., Stahpylococcus sp., Enterobacteriaceae spp., Candida sp. обладают фенотипической изменчивостью, вирулентными свойствами и устойчивостью к антибактериальным средствам.

The purpose: The characteristic of microflora, which colonize mucous membrane of stomach of patients with sharp and chronic gastritis.

Materials and methods: 28 patients with a sharp gastritis and an aggravation of a chronic gastritis are surveyed. Microflora ofbioptates of stomach mucous membrane studying included studying of specific structure of allocated microbial pathogens, their biological properties, factors of virulence, sensitivity to the antibacterial preparations included in antimicrobial therapy.

Results: Against low presence Helicobacter pylori (7,1+4,8%) high level ofcolonization (82,1±7,2%) of a mucous membrane of a stomach by conditional-pathogenic kinds of bacterial flora Is revealed. The specific structure of allocated isolates has been presented by 55 species of microorganisms with prevalence of Streptococcus sp. At studying of virulent properties 27,3±6,0 % of the allocated microorganisms possessed ureasic activity, 36,3±6,5 % natural or got factors of pathogenicity, 45,5+6,7 % stability to antibacterial preparations.

Conclusion: Leading representatives of bacterialflora of a stomach Streptococcus sp., Stahpylococcus sp., Enterobacteriaceae spp., Candida sp. are characterized by the expressed factors of virulence against high stability to preparations of antimicrobial therapy.

Введение

Предпринятые в последние годы исследования, направленные на изучение микробного состава слизистой оболочки желудка (СОЖ), позволили по-новому оценить микробный пейзаж биоценоза этого органа и пищеварительного тракта в целом, атакже расширить представления ученых об этиологии таких заболеваний, как острые и хронические гастриты, язвенная болезнь, диспепсические расстройства и пр. Вместе с тем, наблюдается противоречивость мнений специалистов по вопросам количественного и качественного состава микрофлоры, формирующей желудочный биотоп [16,18,19], а также о роли Helicobacter pylori (HP) в развитии инфекционного процесса [4,17,21,23]. Таким образом, изучение видового состава микрофлоры, колонизирующей желудок и ведущих биологических свойстве ее представителей при различных

патологических состояниях, безусловно, является актуальной.

Целью настоящего исследования явилось изучение микрофлоры слизистой оболочки желудка у пациентов с острыми и хроническими гастритами и оценка ее биологических свойств.

Материал и методы исследования

Базой клинических исследований по изучению микробного пейзажа желудка у пациентов с острыми и хроническими гастритами явилась ФГУЗ Медсанчасть № 140 ФМБА России. В группу наблюдения вошли 13 мужчин и 15 женщин в возрасте от 17 до 80 лет с острым гастритом или обо

стрением хронического гастрита (ХГ). Диагноз заболевания был установлен в ходе углубленного клинико-лабораторного

обследования, включая морфологическое исследование биоптата. Об остром гастрите свидетельствовала нейтрофильная

воспалительная инфильтрация СОЖ, при хроническом - лимфоплазмоцитарная инфильтрация с примесью нейтрофилов.

Микробиологическим методом обследовано 28 образцов биоптата желудка. Посев биологического материала

осуществляли на геликобактерный агар («ВюМепеих»), кровяной агар, агар Эндо, желточно-солевой агар, агар Сабуро. Для выделения анаэробной микрофлоры применяли обогащенную питательную среду СКС-199. Часть физиологического раствора с кусочком биоптата использовали для уреазного теста (тест-полоски «ВюМепеих»). Таким образом, исследование микрофлоры желудка включало ее количественный (с плотных сред первичного посева) и качественный анализ (со сред обогащения). Идентификацию микроорганизмов проводили в соответствии с действующими нормативными документами [14,20], а так же по собственным модифицированным методикам, защищенным патентами РФ [6,7,8]. Видовое типирова- ние изолятов осуществляли на стандартных питательных средах, тест-системах экспресс-диагностики фирмы «Ьасйета».

В ходе работы были изучены факторы вирулентности наиболее значимых

микроорганизмов. У энтеробактерий и неферментирующих грамотрицательных

бактерий определяли адгезивную активность на культурах клеток НЕр-2 и Hela, в тестах с эритроцитами человека или по образованию пристеночного кольца на мясо- пептонном бульоне [9]. Капсулообразова- ние изучали с помощью окраски по методу Бурри-Гинса [11]; повышенный уровень слизеобразования -визуально на чашках нативного роста микробной культуры; отсутствие подвижности у подвижных в норме форм — на 0,4% полужидком агаре; отсутствие разложения лактозы у лактозопозитивных видов — на агаре Олькеницко- го и среде Эндо [14]. Выявление тиолзави- симого гемолизина осуществляли посевом культуры на питательную среду для его выработки; а-гемолитическую активность

- уколом суточной агаровой культуры в 2% агар Хотгингера с 5% суспензией эритроцитов кролика [13]. Определяли ДНК-азную активность, протеолитические ферменты (среда с молоком и лакмусом, с молоком и метиленовой синью, с желатиной), а интенсивность дыхания с красителем Конго Рот - по методике А.В. Алеушкиной [1]. У стафилококков определяли продукцию плазмокоагулазы, лецитовителлазы, ДНКазы [14], а также персистентные свойства

- антилизоцимную,

антиинтерфероновую активность [5]. Способность коринебакте- рии вырабатывать гемолизины визуализировали на 5% кровяном агаре [22]. К факторам вирулентности стрептококков относили их гемолитическую активность на 5% кровяном агаре с эритроцитами барана, а также разложение гиппурата натрия и др.

При оценке вирулентных свойств бактерий, колонизирующих желудок, особую значимость придавали тесту по определению способности разлагать мочевину. Все выделенные нами штаммы независимо от рекомендуемых методик были тестированы по этому признаку. Хорошо известно, что благодаря этому свойству НР удается значительно снизить кислотность желудочного сока и повысить свои адаптационные

Для подтверждения колонизации слизистой желудка Helicobacter pylori в изучаемой группе пациентов проведены дополнительные методы исследования, включая цитологию биоптата, иммуноферментный анализ (ИФА) крови для выявления суммарных антител IgM, IgA, IgG к антигену CagA. По рекомендации Официального Европейского руководства (Maastricht) в работе был использован неинвазивный иммунохроматографический копротест с моноклональными anti-Н.pylori антителами (ImmunoCard STAT HpSA, Germany). Инфицированными HP считали лиц, у которых присутствовали не менее 2-х из перечисленных признаков.

Изучение антибиотикочувствитель-

ности выделенных штаммов микроорганизмов проводили диско-диффузионным методом на агаре Мюллера-Хинтона («Himedia») с помощью аппарата Densi- La-Meter II «Lachema», диспенсера дисков HiDisc Dispenser Marc III «HiMedia» с антибиотиками производства «HiMedia» и НИЦФ к препаратам из профильных групп, включая антибиотики эрадикаци- онной терапии [12,15].

Определение продукции (3-лактамаз у энтеробактерий и неферментирующих грамотрицательных бактерий осуществляли методами «двойных дисков», Е-теста и теста Oxoid [12]. При определении продукции р-лактамаз грампо- ложительных бактерий использовали нитроцефиновые диски и йодометрический метод на бумажных полосках; резистентность к оксациллину у стафилококков изучали скрининговым методом (на чашке с 4,0%-ным солевым агаром, содержащим 6 мкг/мл оксациллина) диско-диффузионным методом и с помощью латекс-агглютинации по выявлению пенициллинсвязывающего белка - ПСБ2а [2]. При обработке цифровых данных использовали статистический пакет «Biostat» для Windows, версия 4.03 и таблицы «Exel».

Результаты исследований

Микробиологическийскрининг28па-циентов с острым гастритом или обострением ХГ, выявил в 82,1+7,2% образцах желудочных биоптатов условно-патогенные штаммы микроорганизмов. Микрофлора была представлена в монокультуре у 21,4+7,8% пациентов, в виде микробных ассоциаций — у 60,7+9,2%. Большинство ассоциаций (52,9+13,0%) состояло из 2 микроорганизмов. У 28,6+8,6% пациентов в колонизации СОЖ принимали участие анаэробные виды.

Уровень колонизации пациентов изучаемой группы HP составил 7,1±4,8%.При этом уреазный тест, оказался положительным у 23,3+7,7% пациентов. Особо отметим, что у 32,1±8,8% обследованных лиц в структуре микрофлоры желудка присутствовали штаммы, активно продуцирующие уреазу, что могло сыграть решающую роль при оценке вышеуказанного теста.

Дополнительные методы иссле

дования, направленные на поиск НР-инфекции у пациентов с острыми и хроническими гастритами, выявили возбудителя цитологически у 6 пациентов

определил суммарные антитела к антигену CagA в сыворотке крови у 5 человек (17,9+7,2%), неинвазивный копрологиче- ский метод дал положительный результат только у 4 (14,3+6,6%). Таким образом, по наличию 2х и более признаков диагноз HP-инфицирования был подтвержден у 5 пациентов (17,9+7,2%), и был достоверно сопоставим с результатами бактериологии ф>0,05). Это позволило подтвердить невысокий уровень колонизации пациентов изучаемой группы Helicobacter pylori.

Состав прочей условно-патогенной бактериальной флоры, колонизирующей СОЖ, был представлен 55 видами микрофлоры , включая аэробные, факультативно-анаэробные, анаэробные бактерии и грибы рода Candida (Табл. I).

Первое ранговое место в составе микрофлоры антрального отдела желудка заняли стрептококки (30,9+6,2%). На втором месте с достоверно-сопоставимой частотой (/?>(),05) встречались стафилококки (16,4±5,0%), анаэробные микроорганизмы (14,6+4,7%), энтеробактерии (10,9+4,2%) и грибы рода Candida (10,9+4,2%). Удельный вес коринебактерий, нейссерий, псевдомонад, лактофлоры был невелик и не превысил в целом 12,7+4,5%. Ведущими представителями бактериальной флоры желудка были S. pyogenes, S. milleri, E. coli, C. albicans, Peptostreptococcus sp.

При изучении вирулентных свойств 27,3 ±6,0% выделенных микроорганизмов обладали уреазной активностью, 36,3+6,5% — природными или приобретенными факторами патогенности, 45,53=6,7% — устойчивостью к антибиотикам, включая резистентность к ведущим препаратам эрадикационной терапии (ма- кролидам, ампициллинам, тетрацикли-нам, метронидазолу). В целом 56,4±6,7% выделенных из СОЖ бактериальных изо- лята имели выраженные факторы вирулентности, включая высокий уровень

антибиотикочувствительности, что дает право высказать гипотезу об их участии в развитии инфекционно-воспалительного процесса в СОЖ. В том числе в 4-х случаях удалось выделить высокорезистентных

представителей микрофлоры, устойчивых к пяти и более антибиотикам из профильных групп. В их числе два гемолитических, продуцирующих гиппурат натрия и мочевину S. milleri, коагулирующий плазму и обладающий антилизоцимной и интерфе-роновой активностью S. aureus', лактозо-негативная капсулообразующая высокослизистая и неподвижная E. coli.

Оценка состава желудочной микрофлоры у пациентов с острым гастритом и обострением ХГ позволили выделить из слизистой отдела желудка представителей условно-патогенной микрофлоры, отличающейся выраженными факторами виру

Таблица 1

Микробный пейзаж антрального отдела желудка у пациентов с острым гастритом и обострением хронического гастрита

Представители микрофлоры Количество выделенных штаммов Концентрация в материале

Абс. %с±т IgKOE/rp

Стрептококки 17 30,9±6,2 3,5

S. pyogenes 5 9Д±3,9 4,0

S. milis 3 5,5±ЗД 3,0

S. salivarius 2 3,6±2,5 3,5

S. milleri 6 10,9±4,2 2,3

S. sangius 1 1,8±1,8 4,0

Стафилококки 9 16,4±5,0 1,9

S. aureus 2 3,6±2,5 1,5

S. epidermidis 2 3,6±2,5 1,0

S. chromogenes 3 5,5±ЗД 22

S. warnerii 2 3,6±2,5 2,5

Энтеробактерии 6 10,9±4,2 3,0

E. coli 4 7,3±3,5 3,3

E. cloacae 1 1,8±1,8 3,0

C.freundii 1 1,8±1,8 2,0

Коринебактерии 4 7,3±3,5 3,0

C. parametabolium 1 1,8+1,8 2,0

C. xerosis 1 1,8±1,8 3,0

C. striatum 1 1,8± 1,8 4,0

C. matruchotti 1 1,8±1,8 3,0

Нейееерии 3,6±2,5 2,0

N. sicca 1 1,8±1,8 2,0

N. subßava 1 1,8+1,8 2,0

Лактобактерии 1 1,8±1,8 3,0

Lactobacillus sp. 1 1,8±1,8 3,0

Анаэробы 14,6±4,7 2,8

Bifidobacterium sp. 1 1,8± 1,8 1,0

Peptostreptococcus sp. 4 7,3±3,5 3,0

Fusobacterium sp. 5,5±3,1 3,0

Грибковая флора 10,9±4,2 1,5

C. albicans 4 7,3±3,5 1,5

C. tropicalis 1 1,8±1,8 1,0

C. krusei 1 1,8±1,8 2,0

Геликобактер 2 3,6±2,5 3,0

H. pylori 2 3,6±2,5 3,0

ВСЕГО: 55 100,0 2,7

лентности, включая уреазную активность и пациентов с наличием лактофлоры в желудке высокую устойчивость к антибактериальным (1,8+1,8%) было минимальным, что диктует препаратам. Вместе с тем число необходимость включения в ком

плексную терапию больных с острыми и хроническими гастритами альтернативной терапии с использованием пробиотических препаратов, содержащих лактобактерии. Высокий уровень колонизации желудка представителями микрофлоры с выраженными факторами патогенности на фоне их низкой концентрации в биологическом материале (2,7Lg КОЕ/гр), на наш взгляд, можно объяснить развитием заболевания на фоне выраженного иммунодефицита, а так же высокой степенью агрессии микрофлоры, колонизирующей СОЖ.

Необходимо отметить низкий уровень (7,1±4,8%) высеваемости ведущего, по мнению ряда авторов [4,12], представителя микрофлоры желудка — Helicobacter pylori (HP) при одновременно небольшом числе пациентов с положительными результатами цитологического исследования биоптата, ИФА крови на наличие CagA и копрологического теста. Существенное расхождение результатов, полученных этими методами, с результатами теста на уреазу, можно объяснить низкой специфичностью уреазного метода. У 32,1±8,8% пациентов из желудочного биоптата были идентифицированы условно- патогенные штаммы микроорганизмов, активно продуцирующие мочевину. Следовательно, при оценке роли HP в развитии гастрита, необходимо использовать комплекс различных методов (гистологических, цитологических, иммунологических, молекулярно-

биологических, хроматографических),

подтвердающих НР- инфицирование.

Выводы

Микрофлора желудка у 82,1±7,2% пациентов с гастритами в 30,9±6,2% случаев представлена Streptococcus sp,. в 16,4±5,0% —

Stahpylococcussp., в 10,9±4,2% -Enterobacteriaceae spp., в 10,9±4,2% — Candida sp., в 14,6±4,7% — анаэробными видами. Среди микроорганизмов, колонизирующих

слизистую оболочку желуд

ка, наибольший удельный вес принадлежит S.pyogenes, S.milleri, E.coli, C. albicans, Peptostreptococcus sp. Структуру микрофлоры желудочного биотопа составляют представители условно-патогенной микрофлоры, в 56,4±6,7% случаев обладающие

фенотипической изменчивостью, вирулентными свойствами и устойчивостью к антибактериальным средствам, включая препараты эрадикационной терапии.

Литература

1. Алеушкина A.B. Медицинская микробиология: Учебное пособие / А.В. Алеушкина. — Ростов н/Д: Феникс, 2003. -480с.

2. Бадиков, В.Д Микробиологические основы антимикробной терапии инфекционных заболеваний / В.Д. Бадиков. -Руководство для врачей. — СПб, 2005. -184с.

3. Воробьев П.А. Клинические и экономические вопросы применения препарата нексиум (эзомепразол) в лечении гастроэзофагальной рефлюксной болезни, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки / П.А. Воробьев, A.B. Власов // Клиническая фармакология и фармакоэкономика. -2009. - №3. - С.49-55.

4. Григорьев A.B. Желудочно-кишечный тракт, как среда обитания бактерий. Раздел 1. / А.В. Григорьев. - Морфология жел5Щочно-кишечного бактериального биотопа. — Москва-Киев, 2004. - 600с.

5. Диагностика и санация стафилококковых бактерионосителей. Методические рекомендации (Утв. гл. гос. санит. врачом РФ 6.04.01). — М., 2001. — 15с.

6. Захарова Ю.А. Способ видовой микробиологической диагностики условно-патогенных энтеробактерий / Ю.А. Захарова // Патент РФ на изобретение №2327160.

7. Захарова Ю.А. Способ видовой дифференциальной диагностики стрептококков группы В и группы D / Ю.А. Захарова // Патент РФ на изобретение №2327161.

8. Захарова Ю.А. Способ видовой дифференциальной диагностики стафилококков / Ю.А. Захарова, И.В. Фельдблюм, А.М. Николаева // Патент РФ на изобретение № 2331073.

9. Королюк А.М. Медицинская микробиология (с техникой бактериологических и иммунологических исследований): учебное пособие / А.М. Королюк, В.Б. Сбойчикова. -СПб: ВМА, 1999. - 267с.

10. Крюков H.H. Helicobacter pylori. Заболевания, ассоциированные с ним. Эпидемиология. клиника, диагностика, лечение / H.H. Кроюков, С.Г. Кочетков, С.Г. Шахов. - Самара,СамГМУ, 1999. -84с.

11. Лабинская A.C. Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований / А.С. Лабинская, Л.П. Блинкова. — М: Медицина, 2004. -576с.

12. Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4-21890-04, 2004.

13. Павлович С.А. Медицинская микробиология / С.А. Павлович. — Мн.: Высш. шк., 2000. — 133с.

14. Приказ М3 СССР от 22.04.85г. «Об унификации микробиологи-ческих (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностическихлабораториях лечебно-проф]

15. Сидоренко С.В. Антибиотикограмма: дискодиффузионный метод (интерпретация результатов) / С.В. Сидоренко, В.Е. Колупаев. - М.: Арина, 1999.

-29с.

16. Урсова Н.И. Современные представления о сисбиозах кишечника у детей / Н.И. Усова, Г.В. Ри- марчук // — AocTyn:http//www.old. consilium-medicum. com/media/ consilium/01 _08c/25.shtml

17. Циммерман Я.С. Клиническая гастроэнтерология / Я.С. Циммерман. — М: ГЭОТАР - Медиа, 2009. - 416с.

18. Чернин В.В. Язвенная болезнь, хронический гастрит и эзофагит в аспекте дисбактериоза гастродуоденальной зоны / В.В. Чернин, В.М. Червинец, В.М. Бондаренко и др. — Тверь: ООО Издательство «Триада», 2004. — 200с.

19. BicE.M. Molecular analisis of the bacterial microbiota in the human stomach / E.M. Bic, P.B. Eckburg, S.R. Gill et al // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2006. - Vol. 103. — P.732-737.

20. Holt, J. Bergey,s Manual of determinative bacterioloji Ninth Edition/ J. Holt, N. Krieg, P. Sneath et al — Baltimor- Philadelphia-Hon Kong-London et al — 1997. — V.2. - 799p.

21. Tan M.P. Chronicaln Helicobacter pylori infection does not significantly alter the microbiota of the murine of the stomach / M.P. Tan, M. Kaparacis, M. Galic et al // Appl. Environ. Microbiol. — 2007. — Vol.73.-P.1010-1013.

22. Koneman E.W. Color atlas and textbook of diagnostic microbiology / E.W. Koneman, S.D. Allen, W.M. Janda et al // Jr. 5th ed. New York: Lippincott-Raven Publishers, 1997. — P.83-84.

23. Weston A.P. Prospective evaluation of the prevalence of gastric Helicobacter pylori infection in patients with GERD, Barrett's esophagus, Barrett's dysplasia and Barrett's adenocarcinoma / A.P. Weston, A.S. Badr, M. Topolovski et al // Am. I. Gastroenterol.. -2000,- Vol. 95. - P.387-394.