Набор для выявления вируса SARS-CoV методом ОТ-ПЦР в реальном времени
SET FOR DETECTING SARS-COV VIRUS BY REAL-TIME RT-PCR METHOD

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к диагностике инфекционных заболеваний, в частности к проблеме выявления генетических маркеров коронавируса вида SARS-CoV-2.
Заболевание COVID-19, вызываемое коронавирусом вида SARS-CoV-2, как правило сопровождается повышением температуры тела, утомляемостью и сухим кашлем. В отдельных случаях отмечаются заложенность носа, насморк, фарингит или диарея. Обычно эти симптомы носят слабо выраженный характер. В некоторых случаях заболевание протекает бессимптомно. Примерно в 15% случаев возникает тяжелая симптоматика с развитием дыхательной недостаточности. У пожилых людей, а также лиц с имеющимися соматическими заболеваниями, например, артериальной гипертензией, заболеваниями сердца или диабетом, вероятность тяжелого течения заболевания выше. В 3% случаев заболевание заканчивается летальным исходом.
В виду того, что COVID-19 является высококонтагиозной, а ее распространение вызвало мировую пандемию, ее точная диагностика является актуальной проблемой.
Известны несколько наборов для выявления коронавируса вида SARS-CoV-2: РеалБест РНК вида SARS-CoV-2, Вектор-ПЦРрв-2019-nCoV-RG, АмплиТест SARS-CoV-2, SBT-DX-SARS-CoV-2 и другие (https://roszdravnadzor.ru/).
Целью создания предлагаемого нами набора является расширение арсенала средств, используемых для диагностики COVID-19.
Технической задачей изобретения являлась разработка высокочувствительного набора, основанного на методе ОТ-ПЦР в режиме реального времени, для идентификации генетического материала коронавируса вида SARS-CoV-2 в биологических образцах и других вируссодержащих пробах (культуральная вируссодержащая жидкость, и т.д).
Поставленная задача решалась путем: конструирования диагностических праймеров и флуоресцентно-меченного зонда на консервативный участок гена РНК-зависимой РНК полимеразы SARS-CoV-2; конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК и М82-фага, несущих специфический участок ДНК- и РНК-матрицы; оптимизации концентраций компонентов реакционной смеси и условий проведения ПНР.
Авторами предложен набор, согласно которому выделенную из биологических образцов (кровь и ее производные, мазок из носоглотки, мазок из ротоглотки, мокрота) РНК анализируют в двухстадийной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции для целевых фрагментов РНК генома коронавируса вида SARS-CoV-2 с использованием набора олигонуклеотидных праймеров и соответствующего флуоресцентно меченного зонда, комплементарных участку гена РНК-зависимой РНК полимеразы SARS-CoV-2.
Анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Результаты интерпретируют на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла Ct, причем результат считают положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имеет характерную «сигмовидную» форму и пересекает пороговую линию.
На начальном этапе были подобрана и синтезирована 1 пара специфических олигонуклеотидных праймеров и зонд для гибридизационно-флуоресцентной детекции продуктов ПЦР. Для этого в базе данных NCBI Mega BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/) был выбран наиболее консервативный участок генома SARS-CoV-2. Были проанализированы все имеющиеся в базе данных последовательности. Также были подобраны праймеры и флуоресцентный зонд для ВКО в качестве внутреннего контроля ПЦР. Последовательности олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентного зонда представлены в Таблице 1 и Таблице 2.
Подбор и анализ свойств олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентного зонда проводился с использованием программного обеспечения Oligonucleotide Properties Calculator и MFold.
6
7
6
7
3
Для контроля качества прохождения этапов обратной транскрипции и ПЦР в состав методики были введены рекомбинантные положительные контрольные образцы K+ и ПКО и внутренний контрольный образец (ВКО). Матрицу для создания рекомбинантных положительных контрольных образцов получали синтетическим методом на основе ампликона, включающего в себя диагностическую область-мишень и фланкирующие последовательности нуклеотидов. Ампликон получали методом ПЦР в один шаг.Конечный ПЦР-продукт лигировали в плазмидный вектор pGEM-T («Promega», USA) под контролем промотора Т7 РНК полимеразы и трансформировали им Escherichia coli (штамм XLl-Blue). Рекомбинантные плазмиды из индивидуальных клонов проверяли на правильность ориентации целевой последовательности и отсутствие мутаций в области посадки праймеров и зонда. Проверку осуществляли методом секвенирования по Сэнгеру с помощью прибора для автоматического капиллярного секвенирования ABI PRISM 3500xl («Applied Biosystems», США). Соответствующие заданным критериям рекомбинантные плазмиды использовали для приготовления положительного контрольного образца этапа ПЦР (К+). Для этого определяли концентрацию ДНК в растворе рекомбинантной плазмиды и разводили стерильной водой до рабочей концентрации 1*10 - 1*10 копий/мл. Также данные рекомбинантные плазмиды использовались для получения рекомбинантного РНК-содержащего положительного контрольного образца с защитной белковой оболочкой MS2-фага (ПКО). Для полученного продукта также производили определение концентрации, затем разводили РНК-буфером (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии, Россия) до рабочей концентрации 1*10 - 5*10 копий/мл, которую использовали в качестве препарата ПКО. Оценку аналитической чувствительности способа производили на разведениях РНК-содержащего рекомбинантного положительного контрольного образца (ПКО), из которых экстрагировали РНК с помощью набора для выделения нуклеиновых кислот «Рибо-Преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии, Россия), а затем с помощью специфических праймеров и флуоресцентных зондов определяли минимальное разведение, детектируемое как положительное в 100% случаев. Определенная таким образом аналитическая чувствительность способа составила 5*10 ГЭ/мл.
Аналитическую специфичность набора оценивали с помощью панели нуклеиновых кислот 4 респираторных вирусов (таблица 3). В результате исследования перекрестных реакций не зафиксировано.
Таким образом, в результате проведенных исследований был разработан и апробирован набор выявления РНК коронавируса вида SARS-CoV-2 в различных видах биологического материала.
Технический результат достигается путем определения РНК коронавируса вида SARS-CoV-2, включающим выделение РНК исследуемой пробы, проведение обратной транскрипции и ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени, согласно изобретению.
Диагностика проводится следующим образом: Подготовку проб проводят согласно МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Материалом для исследования могут служить: клинические и биологические образцы. Экстракция производится из 100 мкл полученной суспензии образца с лизирующим буфером на основе 6 моль гуанидинизотиоцианата в объеме, указанном в инструкции к набору для выделения РНК, и последующим инкубированием 5 минут при температуре (65±1)°C. Выделение РНК осуществляют с помощью наборов «Рибо-преп» и «Рибо-Сорб» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии, Россия) в соответствии с инструкциями к наборам. Во все пробирки, включая контроль выделения, на этапе прогревания в лизирующем буфере добавляют 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО).
После выделения РНК приступают к постановке ОТ-ПЦР. Для упрощения и стандартизации подготовки реактивов в тест-систему входят 8 смесей. Реактив Amp 1RT представляет из себя буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl, рН 8.0 (при 25°C), 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитол, 50% (v/v) глицерин и 0.1% (v/v) NP-40, ингибитор РНКаз, M-MuLV - RH ревертаза и HS-Taq ДНК-полимераза. Реактив Amp 1B представляет из себя буферный раствор, содержащий 100 мМ Трис-HCl, рН 8.3 (при 25°C), 150 мМ KCl, 0,6 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 10 мМ MgCl2, 8 мМ ДТТ, стабилизаторы и усилители ферментов. Реактив Amp 2 содержит олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды к коронавирусу вида SARS-CoV-2 и к ВКО. К+ представляет собой смесь двух типов кДНК: кДНК SARS-Cov-2 и кДНК ВКО, содержащих специфическую последовательность нуклеотидов ДНК, амплифицируемую с участием Реактива Amp 2. К- представляет собой дистиллированную стерильную воду. ПКО представляет собой псевдовирусные частицы на основе MS2 фага, содержащие фрагмент РНК SARS-CoV-2, амплифицируемый с участием Реактива Amp 2. ОКО - дистиллированная стерильная вода. ВКО представляет собой псевдовирусные частицы на основе MS2 фага, содержащие генетическую последовательность артифициальной РНК, амплифицируемую с участием праймеров к ВКО и детектируемую с участием зондов к ВКО в составе Реактива Amp 2. Все реактивы, кроме ПКО и ВКО, хранятся при температуре -20°C. ПКО и ВКО хранятся при температуре +4°C.
Для постановки реакции ОТ-ПЦР в реальном времени отбирают необходимое количество микропробирок объемом 0,2 мл, соответствующее числу исследуемых проб, а также четыре пробирки для положительных и отрицательных контролей. Далее по числу исследуемых проб смешивают реакционные смеси: 1 мкл реактив Amp1RT, 12,5 мкл реактив Amp1B, 1,5 мкл реактив Amp2. По 15 мкл полученной смеси вносят в подготовленные пробирки, затем добавляют 10 мкл РНК-пробы, экстрагированной из исследуемого материала. Готовят 4 контрольные реакции. Для этого в пробирку для положительного контроля ПЦР вносят 10 мкл К+, в пробирку для положительного контроля обратной транскрипции вносят 10 мкл образца, экстрагированного из ПКО. В пробирку для отрицательного контроля ПЦР вносят 10 мкл К-, в пробирку для отрицательного контроля экстракции вносят 10 мкл пробы, экстрагированной из ОКО. Конечный объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Микропробирки переносят в программируемый амплификатор с функцией амплификации в режиме «реального времени» с наличием 2 каналов детекции флуоресценции (FAM/SybrGreen/Green и JOE/HEX). Режим амплификации представлен в таблице 4.
Детекцию флуоресцентного сигнала производят при 57°C по каналам Green (FAM) и Yellow (JOE/HEX).
Учет и анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения прибора на основании отсутствия или наличия сигнала флуоресценции в исследуемых пробах по детектируемым каналам. Результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов. Результат считают положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имеет характерную «сигмовидную» форму и пересекает пороговую линию. Накопление флуоресцентного сигнала по каналу JOE свидетельствует о наличии в исследуемом материале РНК коронавируса вида SARS-CoV-2. При этом результат считается валидным, если параллельно в пробе по каналу FAM регистрируется накопление флуоресцентного сигнала ВКО, а в образцах К+ и ПКО - по каналу JOE. Сигнал по каналу JOE в образцах К- и ОКО должен отсутствовать.
Сущность изобретения поясняется чертежом, где на ФИГ. 1 представлены кривые флуоресценции, отражающие динамику образования продукта реакции при анализе образцов РНК коронавируса вида SARS-CoV-2. Каждая кривая выше пороговой линии отображает положительный результат на выявление в образце РНК коронавируса вида SARS-CoV-2, каждая кривая ниже пороговой линии отображает отрицательные контроли, не содержащие РНК коронавируса вида SARS-CoV-2.
Таким образом, заявляемый набор позволяет достоверно выявлять РНК коронавируса вида SARS-CoV-2в клинических пробах.
Ниже приведен перечень последовательностей синтетических олигонуклеотидов и флуоресцентно меченого зонда.