СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТОКСИГЕННЫХ ШТАММОВ Clostridium difficile
METHOD OF DIAGNOSING TOXIGENIC STRAINS Clostridium difficile

Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской микробиологии и инфекционным болезням, и может найти применение в клинико-диагностических лабораториях инфекционных стационаров.
Особая актуальность проблемы заболеваний, обусловленных токсигенными штаммами Clostridium difficile (С.difficile), определяется широкой распространенностью как нетоксигенных, так и токсигенных штаммов, трудностями проведения их дифференциальной диагностики. Между тем, токсигенные штаммы С.difficile обуславливают С.difficile - ассоциированные инфекции, характеризуются постоянной тенденцией к росту и разнообразием клинических форм болезни: от стертых бессимптомных форм диарей до тяжелых специфических псевдомембранозных колитов с летальными исходами от 54 до 70% случаев и особенностями биологии возбудителя.
Ведущими факторами в патогенезе развития C.difficile - ассоциированной инфекции в настоящее время считают нарушение микробиоциноза кишечника с последующей колонизацией слизистой толстой кишки токсигенными штаммами С.difficile, которые  продуцируют возбудителем энтеротоксинов А и/или В, повреждение ими слизистой оболочки кишечника и развитие воспалительного процесса. Снижение колонизационной резистентности кишечника, способствующее активной колонизации токсинобразующих штаммов С.difficile, является ключевым фактором в развитии C.difficile - ассоциированной инфекции у детей и взрослых.
Бактериологический (культуральный) метод исследования на искусственных питательных средах является одним из основных и широко используемых методов клинической и эпидемиологической диагностики инфекции С.difficile. Лобзин Ю.В. Современные представления об инфекции Clostridium difficile / Ю.В. Лобзин, С.М. Захаренко, Г.А. Иванов // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2002. - №3, Том 4. - С.200-232.
Впервые С.difficile был выделен в 1935 году Hall O′Toole и соавт. и назван ими клостридии «difficile» в связи с тем, что этот микроорганизм оказался весьма труднокультивируемым.
В последние годы для выделения анаэробов, в том числе и микроорганизмов из рода Clostridium используется среда Вильсона-Блер (железосульфитный агар). Руководство по медицинской микробиологии. Частная медицинская микробиология и диагностика инфекций. - Кн. 2 // Под редакцией А.С. Лабинской, Н.Н. Костюковой, С.М. Ивановой. - М.: Издательство БИНОМ, 2010. - 1152 с. К расплавленному и охлажденному питательному агару ex tempore добавляют 1% раствор глюкозы, хлорида железа и сульфит натрия. Анаэробные бактерии из рода Clostridium, в том числе и С.difficile, образуют на среде колонии черного цвета за счет образования соединений железа с серой. Однако эта среда не относится к эффективным дифференциальным средам для выделения С.difficile, так как в ней отсутствуют селективные добавки, способствующие его росту.
Известен метод выделения С.difficile на среде CDSA (Лобзин Ю.В. Современные представления об инфекции Clostridium difficile / Ю.В. Лобзин, С.М. Захаренко, Г.А. Иванов // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2002. - №3, Том 4. - С.200-232). В способе представлена модифицированная среда, которая обеспечивает выделение токсигенных колоний С.difficile. В то же время появление кратковременной (в течение 1 часа) флуоресценции в длинноволновом УФ-излучении у колоний С.difficile на среде CDSA после извлечения посевов из анаэробной атмосферы является основным недостатком, так как кратковременная флюоресценция не обеспечивает точности проводимого исследования.
Давая оценку вышеописанным методам выделения и идентификации С.difficile, необходимо отметить, что только выделение и идентификация С.difficile без последующего определения продукции токсинов всеми выделенными штаммами приводит к гипердиагностике С.difficile - ассоциированных болезней, что связано с высокой распространенностью бессимптомного носительства нетоксигенных штаммов возбудителя.
Таким образом, вышеуказанные способы не обеспечивают эффективную и точную диагностику токсигенных штаммов С.difficile.
Наиболее близким к предлагаемому способу дифференциальной диагностики токсигенных штаммов С.difficile относится способ дифференциальной диагностики токсигенных штаммов от нетоксигенных на среде Cdifftox plate assay (Darkoh Ch. Novel One-Step Method for Detection of Clostridium difficile Strains Directly from Isolation of Active-Toxin-Producing Stool Samples / Ch. Darkoh, H.L. DuPont, H.B. Kaplan // Journal of Clinical Microbiology. - 2011. - Vol.49(12). - P.4219).
В состав среды входит вещество X-gal (5-Бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галактопиранозид), активно расщепляющееся токсигенными штаммами С.difficile, обуславливает образование синих колоний на среде. В то время как, нетоксигенные штаммы С.difficile не способны расщеплять X-gal и поэтому остаются «пепельно» белыми. X-gal (также BCIG от англ. bromo-chloro-indolyl-galaclopyranoside) - органическое соединение, состоящее из галактозы, соединенной с индолом. X-gal используют при клонировании генов для экспрессии в клетке гена фермента β-галактозидазы, закодированного в гене lacZ. X-gal позволяет визуально определить, какие из колоний Е.coli трансформированы нужным вектором. В норме в клетках Е.coli фермент, закодированный геном lacZ, синтезируется под действием индуктора IPTG, а синее окрашивание теряется у клеток, содержащих генно-инженерную конструкцию, в которой ген lacZ нарушен в результате генетической вставки.
Ген lacZ может быть использован в качестве репортерного, при выращивании бактерии или дрожжей на среде, содержащей X-gal. В случае, когда промотор гена-мишени связан с кодирующей частью гена галактозидазы, связывание белка-активатора с промотором приводит к образованию окрашенного продукта расщепления X-gal, активно расщепляющегося только токсигенными штаммами С.difficile.
Таким образом, в связи с быстрым распадом используемых реагентов (X-gal и IPTG) прототипный способ не обеспечивает точную дифференциальную диагностику токсигенных от нетоксигенных штаммов С.difficile. Недостатками этого метода являются: отсутствие стандартизации в связи с быстрым распадом используемых реагентов (X-gal и IPTG), их дороговизной, длительностью и трудоемкостью.
С целью устранения выше указанных недостатков авторами предложен принципиально новый способ дифференциальной диагностики токсигенных штаммов С.difficile.
Технический результат, достигаемый в данном способе, заключается в повышении точности дифференциальной диагностики токсигенных штаммов С.difficile от нетоксигенных за счет использования элективно-селективной среды Cdifftox plate assay, в состав которой входит 1% лактоза и 0,5-1,0 мМ арабинозы. Достигается это тем, что наряду с выявлением возбудителя на среде Cdifftox plate assay, содержащей X-gal (5-Бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галактопиранозид) и IPTG, пробу кала пациента последовательно выдерживают в абсолютным спирте 30-60 мин, обрабатывают 1% раствором дезоксихолата натрия, центрифугируют, осадок высевают на элективно-селективную среду с добавлением 1% лактозы и 0,5-1,0 мМ арабинозы, инкубируют в анаэростате в течение 24-48 ч, выросшие колонии наносят на стандартные диски ONPG и при появлении ярко-желтой окраски диска диагносцируют токсигенные штаммы Clostridium difficile.
В результате многочисленных опытов по испытанию модифицированной нами дифференциально-диагностической среды Cdifftox plate assay, мы обнаружили, что добавление к среде 1% лактозы и 0,5-1,0 мМ арабинозы значительно повышает эффективность выявления токсигенных штаммов С.difficile. В отличие от прототипа авторами установлено, что добавление лактозы, способно разлагать только токсигенные штаммы С.difficile в связи с их биологической особенностью - вырабатывать фермент бета-галактозидазу, гидролизующий лактозу. Бета-галактозидаза представляет собой индуцируемый фермент, присутствующий у микроорганизмов, ферментирующих лактозу.
Авторами показано, что использование хромогенного субстрата орто-нитрофенил-β-D-галактозидазы-ONPG, гидролизуемого бета-галактозидазой, позволяет выполнить экспрессное определение ферментации лактозы на основании цветной реакции за счет образования конечного продукта ярко-желтого цвета - орто-нитрофенола.
Доказано авторами, что повышение точности предлагаемого способа, обеспечивается арабинозой (0,5-1,0 мМ), которая именно в этой концентрации экспрессирует участок локуса Paloc, ответственного за выработку не только экзотоксинов С.difficile, но и фермента бета-галатозидазы, разлагающего лактозу.
Предлагаемый способ позволяет выделять не только культуру С.difficile, но и одновременно с помощью стандартных дисков, пропитанных ONPG - реактивом, выявлять способность выросшей культуры вырабатывать экзотоксины. В отличие от прототипного способа, где для выделения анаэробов, в том числе и микроорганизмов из рода Clostridium, инкубирование на среде предусматривает 48-72 часа, в авторском способе инкубация проходит в течение 24-48 часов, что обеспечивает раннее выявление возбудителя и возможность получения результатов до двух суток после взятия материала. Это позволяет использовать способ как в ранней диагностике клинических форм С.difficile - ассоциированной инфекции, так и при обследовании пациентов при клостридиозном бактерионосительстве и имеет большое практическое значение для здравоохранения.
Отличием представленного способа является то, что пробу кала последовательно выдерживают в абсолютном спирте 30-60 минут, а затем обрабатывают 1% раствором дезоксихолата натрия. Именно такая последовательность и обработка первичного материала позволяет из спорообразующих микроорганизмов перейти в вегетативную форму. Именно такая совокупность представленных авторами отличительных признаков обеспечивает наиболее раннее выявление возбудителя и возможность получения результатов до двух суток после взятия материала.
Таким образом, предложенный авторами способ отличается новизной и неочевидностью. В доступной нам литературе подобного способа дифференциальной диагностики токсигенных штаммов С.difficile не обнаружено.
Предложенный способ апробирован на материале (пробах кала) от 217 больных ОКИ (Антибиотикоассоциированной диареей). Из них положительный результат был получен у 39 детей (18%), в том числе по клинико-лабораторным данным у 68% больных была диагностирована водянистая диарея, обусловленная Clostridium difficile, у 28,5% был верифицирован антибиотикоассоциированный колит, вызванный Clostridium difficile, a 1 пациент (2,56%) переносил псевдомембранозный колит, средний возраст пациентов составил 3,65±0,55 лет, преобладали мальчики - 67%.
У 52% детей выявление положительного результата, обнаружение токсинов A/В Clostridium difficile сочеталось с наличием в фекалиях других этиологических агентов: диареегенных вирусов (ротавирусы, норовирусы, астровирусы) в ПЦР, патогенных (сальмонелл, диареегенных эшерихий, кампилобактерий) и условно-патогенных бактерий (клебсиелл) - в ПЦР или с помощью классического бактериологического метода. Авторами установлена, бактериологическим методом исследования, частота встречаемости диарей у детей, вызванных токсинопродуцирующими штаммами Clostridium difficile на ряду с клинико-диагностическими характеристиками.
Следовательно, в связи своевременной и точной диагностикой токсигенных штаммов С.difficile, можно начать своевременную этиотропную терапию и предотвратить как осложнение, так и летальные исходы С.difficile - ассоциированной инфекции у детей и взрослых.
Способ осуществляется следующим образом: после сдачи биологического материала (фекалий) пациентом и отбора проб лабораторными работниками проводится исследование проб кала поэтапно в рамках алгоритма. А именно, во-первых, производится обработка проб (1:1) абсолютным спиртом 96%, 30-60 мин и центрифугируются 15-20 мин, далее производится обработка проб (1:1) 1% дезоксихолат натрий (30-60 мин) и удаляется надосадочной жидкости. Затем производится первичный посев проб (осадок) на испытательную среду, в состав которой входит 1% лактоза и 0,5-1,0 мМ арабинозы и ингибирование в анаэробных условиях в течение 24-48 часов. Далее, учитываются первичные подозрительные колонии из первичных посевов. И наконец, необходимо нанести выросшие подозрительные колонии на стандартные диски ONPG и увидеть ярко-желтые диски, что свидетельствует о наличии токсигенных штаммов С.difficile.
Примеры конкретного выполнения способа
1. Поступила в дифференциально-диагностическое отделение ФГБУ НИИДИ ФМБА России, 15.07.13 Пациент Ева Ц., 1 год 8 мес., из г. Санкт-Петербурга, на четвертый день болезни с диагнозом «Антибиотикоассоциированная диарея»,  жалобы: отказ от приема пищи и воды, жидкий стул со слизью зеленого цвета, температура тела до 39°С. Из анамнеза известно, что пациент находился с 05.07.13 по 11.07.13 во ДГБ №2, где получал терапию цефотаксимом и фурагином по основному заболеванию пиелонефриту. Со слов матери ребенок заболел остро с 12.07.13 - температура тела повышалась до 39,5°С, жидкий стул до 7 раз со слизью и прожилками крови и был госпитализирован в ДГБ №5, где ребенок получал цефтриаксоп и инвазионную терапию. В связи с анамнезом заболевания и проведением курса антибактериальной терапии,  пациенту были назначены следующие исследования: кал на патогенную и УПФ микрофлору, на ротавирусную инфекцию, ПЦР на энтеровирусы, кровь ИФА ротавирусы, копрограмму, общий анализ мочи, клинический анализ крови, кал на определение токсинов А/В Clostridiiim difficile, метод фермент-связанного флуоресцентного анализа на автоматическом анализаторе «VIDAS» и проб фекалий на токсигенные штаммы Clostridium difficile. Исследование проб кала проведено в рамках алгоритма: проведена обработка проб кала (1:1) абсолютным спиртом 96%, 30-60 мин, центрифугирование 15-20 мин, далее, проведена обработка проб кала (1:1) 1% дезоксихолат натрий (30-60 мин) и удаление надосадочной жидкости. Затем, произвели первичный посев проб кала (осадок) на испытательную среду, в состав которой входит 1% лактоза и 0,5-1,0 мМ арабинозы, и инкубировали в анаэробных условиях в течение 24-48 часов. Далее, учитываем первичные подозрительные колонии из первичных посевов. И наконец, наносим выросшие подозрительные колонии на стандартные диски ONPG и регистрируем визуально ярко-желтую окраску диска, что свидетельствует о наличие токсигенных штаммов С.difficile.
2. Поступила в дифференциально-диагностическое отделение ФГБУ НИИДИ ФМБА России, 19.11.12 пациент Екатерина П., возраст 5 лет 1 мес из Санкт-Петербурга, на первый день болезни с диагнозом «Антибиотико-ассоциированная диарея», эксикоз I степени,  жалобы: на рвоту, боли в животе, жидкий стул, лихорадку, состояние средней тяжести. С учетом тяжести заболевания пациента были назначены следующие исследования: кал на патогенную и УПФ микрофлору, на ротавирусную инфекцию, ПЦР на энтеровирусы, кровь ИФА ротавирусы, копрограмму, общ. анализ мочи, клинический анализ крови, кал на определение токсинов А/В Clostridium difficile, метод фермент-связанного флуоресцентного анализа на автоматическом анализаторе «VIDAS» и проб фекалий на токсигенные штаммы Clostridium difficile. Исследование проб кала проведено в рамках алгоритма: проведена обработка проб кала (1:1) абсолютным спиртом 96%, 30-60 мин и дальнейшее центрифугирование 15-20 мин, далее, проведена обработка проб кала (1:1) 1% дезоксихолат натрий (30-60 мин) и удаление надосадочной жидкости. Затем, провели первичный посев проб кала (осадок) на испытательную среду в состав которой входит 1% лактоза и 0,5-1,0 мМ арабинозы, и инкубировали в анаэробных условиях в течение 24-48 часов. Далее, учитываем первичные подозрительные колонии из первичных посевов. И наконец, нанесли выросшие подозрительные колонии на стандартные диски ONPG и увидели диск ярко-желтой окраски, что свидетельствует о наличии  токсигенных штаммов С.difficile.
3. Поступила в отделение кишечной инфекции в ФГБУ НИИДИ ФМБА России 04.05.13, пациент Евгения М., 8 лет 3 мес. из Санкт-Петербурга, на первый день болезни с диагнозом «Антибиотикоассоциированная диарея», с жалобами на трехкратную рвоту, боли в животе. Жидкий стул до 6 раз в сутки.
Из анамнеза известно, что пациент находился в ДГБ №5 от 25.04.13 в течение двух недель с диагнозом ОРВИ и ветряная оспа, получал курс лечения, в том числе и антибактериальные препараты. В связи с анамнезом заболевания и проведением курса антибактериальной терапии, пациенту были назначены следующие исследования: кал на патогенную и УПФ микрофлору, на ротавирусную инфекцию, ПЦР на энтеровирусы, кровь ИФА ротавирусы, копрограмму, общ. анализ мочи, клинический анализ крови, кал на определение токсинов А/В Clostridium difficile, метода фермент-связанного флуоресцентного анализа на автоматическом анализаторе «VIDAS» и проб фекалий на токсигенные штаммы Clostridium difficile. Исследование проб кала проведено в рамках алгоритма: произведена обработка проб кала (1:1) абсолютным спиртом 96%, 30-60 мин, центрифугирование 15-20 мин, далее произведена обработка проб кала (1:1) 1% дезоксихолат натрий (30-60 мин) и удаление надосадочной жидкости. Далее, произвели первичный посев проб кала (осадок) на испытательную среду, в состав которой входит 1% лактозы и 0,5-1,0 мМ арабинозы с последующей инкубацией в анаэробных условиях в течение 24-48 часов. Учитываем первичные подозрительные колонии из первичных посевов путем нанесения выросших подозрительных колоний на стандартные диски ONPG и отмечаем ярко-желтую окраску на диске, что свидетельствует о наличии токсигенных штаммов С.difficile.
Таким образом, способ обладает высокой чувствительностью и специфичностью. простотой и доступностью. Использование способа дифференциальной диагностики токсигенных штаммов Clostridium difficile от нетоксигенных как в ранней диагностике клинических форм С.difficile - ассоциированной инфекции, так и при обследовании пациентов при клостридиозном бактерионосительстве, обуславливает его огромную практическую значимость.
Способ может найти широкое применение в клинико-диагностических лабораториях инфекционных стационаров и быть рекомендован для использования в практическом здравоохранении для диагностики течения от стертых бессимптомных форм диарей до тяжелых специфических псевдомембранозных колитов с летальными исходами, вызванных токсигенными штамами С.difficile у детей и взрослых.