ПЕГИЛИРОВАННЫЙ ИНТЕРФЕРОН ЛЯМБДА, ОБЛАДАЮЩИЙ ВЫСОКОЙ БИОДОСТУПНОСТЬЮ ПРИ ПЕРОРАЛЬНОМ ПРИМЕНЕНИИ, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
PEGYLATED INTERFERON LAMBDA WITH HIGH BIOACCESSABILITY IN ORAL USE  AND METHOD FOR PRODUCTION THEREOF

Область применения
Группа изобретений относится к медицине, а именно инфекционным болезням и фармакологии, а также фармацевтической промышленности и биотехнологии, и предназначена для получения пегилированного интерферона лямбда, который может быть использован для лечения вирусных гепатитов, поскольку обладает противовирусным действием в отношении гепато-тропных вирусов и высокой биодоступностью при пероральном применении, что обеспечивает его высокую концентрацию в печени минуя системный кровоток, уменьшает системное побочное действие и увеличивает коплаентность терапии.
Уровень техники
Интерфероны лямбда (IFN λ) образуют семейство интерферонов третьего типа, которое состоит из четырех членов - IFN λ1, IFN λ2, IFN λ3 и IFN λ4, обозначаемых также IL-29, IL-28A, IL-28B и IFN λ4 соответственно [1, 2, 3]. IFN λ относятся к семейству цитокинов и выполняют функции, схожие с семейством интерферонов первого типа (IFN α и/или IFN β), однако значительно отличаются от последних: во-первых, IFN λ действуют прежде всего в эпителиальных клетках, которые подвергаются постоянному воздействию синантропных и патогенных микроорганизмов, и во-вторых, благодаря более целенаправленной передаче сигналов, IFN λ обладают существенными терапевтическими преимуществами, т.к. исключаются многие побочные эффекты, ограничивающие клиническое использование IFN α и IFN β. Кроме того, IFN λ обладают иммуномодулирующим действием на врожденную и адаптивную ветви иммунной системы, которые частично совпадают с таковыми IFN α и IFN β [4, 5, 6, 7].
Противовирусная активность IFN λ in vivo впервые была обнаружена в 2006 г. в отношении вируса простого герпеса второго типа [8]. Дальнейшие исследования на животных моделях выявили противовирусное действие экзогенного IFN λ, сравнимое с действием IFN α и IFN β, в отношении таких вирусов как респираторный синцитиальный вирус, ротавирус, вирус ящура, норовирус мышей, вирус лихорадки Западного Нила, вирус простого герпеса 1 типа, вирус гриппа, метапневмовирус человека, коронавирус, вирус оспо-вакцины, вирус гепатита В, вирус пневмонии мышей [1, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16]. Было также установлено, что противовирусная активность IFN λ in vivo более проявлена в отношении вирусов, инфицирующих эпителиальные клетки респираторного, желудочно-кишечного и урогенитального тракта, а также печени [13]. Это обусловило интерес к IFN λ в качестве потенциального терапевтического агента в отношении вирусных гепатитов [17, 18].
Вирусные гепатиты представляют серьезную угрозу общественному здоровью международного масштаба и являются существенным бременем для населения всех регионов мира. В 2016 году Всемирная Организация Здравоохранения приняла «Глобальную стратегию сектора здравоохранения по вирусному гепатиту 2016-2021», в которой отмечается, что вирусный гепатит уносит большое число человеческих жизней, наносит существенный ущерб местным сообществам и системам здравоохранения. На его долю приходится примерно 1,4 миллиона случаев смерти в год в результате острой инфекции, а также рака и цирроза печени, связанных с гепатитом, что сопоставимо с показателями смертности от ВИЧ и туберкулеза. Из этого числа примерно 47% случаев смерти вызвано вирусом гепатита В, 48% - вирусом гепатита С, а остальные - вирусами гепатита А и гепатита Е. Вирусный гепатит все чаще становится причиной смерти людей, живущих с ВИЧ. Примерно 2,9 миллиона человек, живущих с ВИЧ, коинфицированы вирусом гепатита С, а 2,6 миллиона человек - вирусом гепатита В. В мировом масштабе примерно 240 миллионов человек хронически инфицированы вирусом гепатита В, а 130-150 миллионов человек - вирусом гепатита С. Данная стратегия направлена на борьбу со всеми пятью вирусами гепатита (А, В, С, D и Е) и прежде всего с вирусами гепатита В и С, учитывая их высокую значимость для общественного здравоохранения. В отношении лечения хронического вирусного гепатита В и С руководство ВОЗ поддерживает подход с позиций общественного здравоохранения, предусматривающий переход к более простым и безопасным схемам перорального лечения [19].
Несмотря на то, что новые рекомендации в обновленном «Руководстве ВОЗ по скринингу, оказанию медицинской помощи и лечению лиц с хронической инфекцией гепатита С» рекомендуют использовать схемы противовирусных препаратов прямого действия, для особых групп населения в качестве альтернативного варианта лечения по-прежнему рекомендована комбинация софосбувир/пегилированный интерферон и рибавирин [20]. Пегилированные интерфероны обеспечивают стабильный уровень интерферона в сыворотке крови в течение семи дней. Известны пегилированный интерферон-α2b (ПегИнтрон, фирма «Schering-Plough», США) [21], пегилированный интерферон-α2а (Пегасис, «Roche», Швейцария) [22] и цепегилированный интерферон-α2b (Альгерон, «Биокад», Россия) [23]. Основными недостатками этих препаратов являются:
- еженедельные подкожные инъекции при продолжительности лечения от 12 недель, что существенно снижает комплаентность лечению;
- часто возникающие побочные эффекты лечения в виде гриппоподобного синдрома, артралгии, депрессивных состояний, диареи, депрессивных состояний, галлюцинаций, кожных высыпаний, аллергии, заболеваний кроветворной системы, выпадения волос, что также снижает комплаентность лечению [24, 25];
- образование антител, нейтрализующих антивирусную активность препарата, у 30% больных, что сопровождается развитием резистентности к рекомбинантным интерферонам [26].
Таким образом, сохраняется острая потребность в новых терапевтических и профилактических препаратах против вирусных гепатитов, в том числе гепатита С, обладающих высокой эффективностью и минимальными побочными эффектами.
Одним из вариантов высокоэффективной терапии данного заболевания является применение лекарственных препаратов на основе интерферона лямбда, поскольку IFN λ обладают более ограниченными паттернами экспрессии и экспрессируются преимущественно в гепатоцитах. IFN λ обладают противовирусным действием в печени, сравнимыми с IFN α, но с меньшими побочными эффектами, что создает предпосылки для терапевтических преимуществ IFN λ при лечении вирусных инфекций или состояний печени, в том числе вирусного гепатита С и вирусного гепатита В [27].
Наиболее близким к заявляемому средству по технической сущности является препарат пегилированного интерферона лямбда для лечения и профилактики гепатита С, описанный в патенте [28]. Сегодня это единственный в мире препарат пегилированного интерферона лямбда, доведенный до клинических исследований и известный как препарат BMS-914143 компании «Bristol-Myers Squibb». Основным недостатком данного препарата является необходимость еженедельного парентерального введения, что при рекомендованном курсе лечения продолжительностью от 12 недель может вызывать реакции в месте введения в виде болезненности, покраснения, отека, инфильтратов и даже некрозов, что не может удовлетворять требованиям комплаентности терапии. Помимо этого, системное введение сопряжено с характерными для него осложнениями - повышением температуры тела, аллергическими и анафилактическими реакциями.
Наиболее близким к заявляемому способу получения является способ, описанный в патенте [29], включающий растворение биологически активного вещества, например интерферона, в растворе водорастворимого фармакологически приемлемого полимера в концентрации выше 10% до концентрации насыщенного раствора и облучение реакционной смеси ионизирующим излучением. Недостатком данного способа является неконтролируемое образование ковалентной связи между биологически активным веществом и полимером под влиянием ионизирующего излучения, что может снижать специфическую активность интерферона за счет блокирования активных центров, а также за счет необратимого изменения структуры белковой молекулы.
Технический результат, достигаемый данной группой изобретений, заключается в расширении арсенала средств для лечения инфекционных заболеваний, вызываемых гепатотропными вирусами, при применении которых могут использоваться пути введения препарата, отличные от парентерального и повышающие комплаентность пациентов к проводимой терапии, а также способов их получения.
Сущность изобретения
Заявленный технический результат достигается в средстве, представляющем пегилированный интерферон лямбда (далее - ПЭГ-IFN λ), обладающий противовирусным действием в отношении гепатотропных вирусов, отличающийся тем, что его биодоступность при пероральном применении составляет не менее 10%, а получают его путем облучения раствора полиэтиленгликоля с молекулярной массой от примерно 400 до примерно 5000 Да ионизирующим излучением в дозе от 1 до 5 Мрад, смешением полученного раствора с раствором интерферона лямбда, замораживания и охлаждения полученной смеси до температуры -10°С и ниже и облучения замороженной и охлажденной смеси ионизирующим излучением в дозе от 0,1 до 0,5 Мрад.
Противовирусная активность ПЭГ-IFN λ
Противовирусные свойства заявляемого средства выявлены благодаря экспериментальным исследованиям, проведенным в системе «культуральный ВГС (HCVcc) клон JFH1 - клетки гепатомы человека Huh7.5». Эта система является на сегодняшний день наиболее адекватной и принята FDA в США и Европейским сообществом для специфической оценки анти-ВГС активности фармацевтических препаратов на доклинической стадии.
Оценку антивирусной активности ПЭГ-IFN λ проводили с использованием культурального штамма ВГС, выделенного в 1999 году в Японии из сыворотки больного фулминантным гепатитом. На основе этого штамма получен и проклонирован в плазмиде полноразмерный репликон ВГС, который демонстрирует необычно высокую скорость репликации геномной РНК при трансфекции клеток гепатомы человека Huh-7 и продукцию инфекционных вирионов в культуральную среду [30, 31]. Полученный инфекционный культуральный вирус HCVcc был обозначен как клон JFH1 (генотип 2а). Далее был получен дериват Huh-7 клеток, обозначенный Huh-7.5, обладающий более высоким инфекционным потенциалом и способностью к поддержанию длительной инфекции JFH-1 клона HCV [32]. Высокая пермиссивность Huh-7,5 клеток обусловлена наличием в ней мутации гена RIG-1. Продукт этого гена активируется вирусной dsRNA и участвует в индукции интерферон опосредованной противовирусной защиты клетки [33].
Оценку антивирусной активности проводили методами полимеразной цепной реакции (далее - ПЦР) в реальном времени и методом иммуногистохимии. Для индикации ВГС использовали моноклональные антитела мыши 6G7 к вирусному белку Core (FDA, USA). Диапазон тестируемых концентраций ПЭГ-IFN λ составил от 0,0085 до 8500 нг/мл культуральной среды. Схема экспериментов включала 3 последовательных этапа:
1) прединкубация монослоя клеток Huh7.5 ПЭГ-IFN λ;
2) инфицирование клеток Huh7.5 вирусом JFH1 в отсутствии ПЭГ-IFN λ;
3) инкубация с 10-кратными разведениями ПЭГ-IFN λ, соответствующими дозам прединкубации.
Проведенные исследования показали, что 50% ингибирующая доза ПЭГ-IFN λ лежит в диапазоне концентраций 0,0085-0,085 нг/мл, а при концентрации 0,085 нг/мл ПЭГ-IFN λ уже приводит почти к 80%-ному ингибированию репродукции ВГС в клетках гепатомы человека (табл. 1).
При этом анализ цитотоксической активности ПЭГ-IFN λ на культуре клеток гепатомы человека Huh7.5 показал, что даже доза ПЭГ-IFN λ в 8500 нг/мл, что в миллион раз больше эффективной противовирусной дозы, не оказывает никакого цитотоксического действия на клетки Huh7. Использованный для исследования метод определения цитотоксичности основан на способности митохондриальных дегидрогеназ конвертировать водорастворимый 2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфо-фенил)-2Н-тетразолий-5-карбоксанилида (реагент ХТТ, Sigma-Aldrich, США) в формазан, который кристаллизуется внутри клетки. Перевод формазана в раствор с помощью феназинметасульфата (PMS) и последующая фотометрия позволяют точно соотнести изменение оптической плотности раствора с изменением количества жизнеспособных клеток.
Биодоступиость ПЭГ-IFN λ
Изучение биодоступности ПЭГ-IFN λ проводили согласно «Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств» [34] на аутбредных лабораторных крысах, весом не менее 180 г в возрасте 12-14 недель, содержание и манипуляции с животными осуществляли в соответствии с СОП «Содержание лабораторных животных» и действующими международными стандартами.
ПЭГ-IFN λ вводили животным однократно в дозе 2,6 мкг/кг в пересчете на IFN λ внутрижелудочно или болюсно внутривенно. Концентрацию IFN λ в сыворотке крови определяли при внутривенном и внутрижелудочном введении в интервале 0-24 часа после введения, а концентрацию IFN λ, в тканях сердца, сальника, печени, почек, поперечно-полосатых мышц и головного мозга крыс - в том же временном интервале при внутрижелудочном введении. Количественное определение IFN λ, в биологических объектах (сыворотка крови, органы и ткани животных) проводили с помощью иммуноферментного метода (ИФА). Проведенные эксперименты показали, что концентрация IFN λ в сыворотке крови при внутривенном введении достигает максимума через 2 мин. после введения и составляет 30947,83±1968,67 пг/мл. При внутрижелудочном введении концентрация IFN λ в сыворотке крови достигает максимума через 4 ч после введения и составляет 1167,61±115,76 пг/мл. Максимальная концентрация IFN λ в тканях крыс при внутрижелудочном введении составляет: в печени - 1239,041125,11 пг/г (через 2 ч после введения), почках - 975,29±109,23 пг/г (через 4 ч после введения), сердце - 488,11±81,53 пг/г (через 2 ч после введения), поперечно-полосатых мышцах - 392,92±37,78 пг/г (через 8 ч после введения). В мозге и сальнике концентрация IFN λ находится ниже порога определения используемого метода (2 пг/мг).
-1
Расчет фармакокинетических параметров, проведенный с использованием внемодельного метода статистических моментов [35] и метода трапеций [36, 37], показал, что при внутрижелудочном введении максимальное время полувыведения, максимальная концентрация и минимальная степень элиминации IFN λ наблюдаются в печени крыс и составляют 10,11 ч, 1,24 нг/г и 0,07 ч соответственно (таблица 2).
Абсолютную биодоступность (F) ПЭГ-IFN λ рассчитывали по формуле:
,
где:
в/с
AUC - площадь под фармакокинетической кривой после внесосудистого введения;
в/в
AUC - площадь под фармакокинетической кривой после внутривенного введения;
в/в
D - величина дозы для внутривенного введения;
в/с
D - величина дозы для внесосудистого введения.
Доза ПЭГ-IFN λ, вводимая крысам внутривенно и внутрижелудочно, одинакова, значение площади под фармакокинетической кривой для внутривенного введения составило 37,96 нг×ч/мл, значение площади под фармакокинетической кривой для внесосудистого пути введения - 7,96 нг×ч/мл, таким образом, абсолютная биодоступность для ПЭГ-IFN λ при пероральном введении составила 20,97%.
Тканевую биодоступность ПЭГ-IFN λ рассчитывали по формуле:
t
p
ƒt=AUC/AUC,
где:
t
AUC - площадь под фармакокинетической кривой вещества в ткани;
p
AUC - площадь под фармакокинетической кривой в сыворотке.
Благодаря тому, что при внутрижелудочном введении происходит прямое всасывание лечебного препарата в портальную вену, максимальная тканевая биодоступность наблюдалась в печени и составила 0,31; тканевая биодоступность в почках составила 0,20; в поперечно-полосатой мускулатуре - 0,13; в сердце - 0,10. При этом ПЭГ-IFN λ практически не проникает в головной мозг и не накапливается в жировой ткани.
Отличия заявляемого средства от прототипа и технические результаты заключаются в следующем:
- заявляемое средство обладает противовирусной активностью в отношении гепатотропных вирусов. Исследования по ингибированию репродукции ВГС в клетках гепатомы человека показали, что 50%-ная ингибирующая доза ПЭГ-IFN λ лежит в диапазоне концентраций 0,0085-0,085 нг/мл, а при концентрации 0,085 нг/мл ПЭГ-IFN λ приводит почти к 80%-ному ингибированию репродукции ВГС;
- заявляемое средство не обладает цитотоксической активностью: даже доза ПЭГ-IFN λ в 8500 нг/мл, что в миллион раз больше эффективной противовирусной дозы, не оказывает цитотоксического действия на культуру клеток гепатомы человека Huh7.5;
- абсолютная биодоступность заявляемого средства при пероральном применении составляет не менее 10%: при однократном внутрижелудочном введении крысам в дозе 2,6 мкг/кг в пересчете на IFN λ абсолютная биодоступность ПЭГ-IFN λ составляет 20,97%. Это делает возможным использование перорального пути введения препарата ПЭГ-IFN λ, исключающим побочные эффекты, характерные для парентерального пути введения и повышающим комплаентность пациентов к проводимой терапии;
- максимальная тканевая биодоступность ПЭГ-IFN λ, максимальная концентрация IFN λ и максимальное время полувыведения IFN λ при однократном внутрижелудочном введении крысам в дозе 2,6 мкг/кг в пересчете на IFN λ наблюдаются в печени и составляют 0,31; 1239,04±125,11 пг/г и 10,11 ч соответственно. Это происходит благодаря прямому всасыванию ПЭГ-IFN λ в портальную вену, и подтверждает «целевое» воздействие заявляемого средства на печень, уменьшая тем самым системное побочное действие, характерное для парентерального пути введения;
- в отличие от прототипа, полученного путем химического пегилирования IFN λ, заявляемое средство получено путем пегилирования IFN λ при облучении исходных компонентов ионизирующим излучением, что значительно упрощает технологическую схему получения и тем самым снижает себестоимость конечного продукта, поскольку исключает многостадийный органический синтез, сопряженный с существенной потерей целевой белковой субстанции на промежуточных технологических стадиях, и последующую очистку активных целевых молекул как от компонентов, не вступивших в реакцию, так и от избыточно модифицированных продуктов реакции.
Заявленный технический результат достигается также в способе получения пегилированного интерферона лямбда, обладающего противовирусным действием в отношении гепатотропных вирусов и биодоступностью при пероральном применении не менее 10%, который включает приготовление раствора полиэтиленгликоля с молекулярной массой от примерно 400 до примерно 5000 Да и интерферона лямбда, заморозку и охлаждение приготовленного раствора до температуры -10°C и ниже и последующее облучение замороженного и охлажденного раствора ионизирующим излучением в дозе от 0,1 до 0,5 Мрад, отличающийся тем, что приготовление раствора полиэтиленгликоля и интерферона лямбда осуществляют путем смешения раствора интерферона лямбда и раствора полиэтиленгликоля, причем раствор полиэтиленгликоля перед смешением подвергают облучению ионизирующим излучением в дозе от 1 до 5 Мрад.
2
4
В качестве полиэтиленгликоля с молекулярной массой от примерно 400 до примерно 5000 Да используют полиэтиленгликоль, полученный любым известным способом, например полиэтиленгликоль производства ООО «Завод синтанолов», Россия. В качестве растворителя для приготовления раствора полиэтиленгликоля используют очищенную воду или водный солевой буфер, обеспечивающий поддержание рН раствора в пределах, необходимых в дальнейшем для сохранности белка, предпочтительно от 6,0 до 7,9, например фосфатно-солевой буфер (NaHPO 10 ммоль/л, NaCl 150 ммоль/л, рН=7,4), а концентрация ПЭГ в полученном растворе составляет от 0,20 до 0,50 г/мл. Раствор ПЭГ переносят в полиэтиленовые пакеты или пробирки таким образом, чтобы толщина слоя жидкости не превышала 5-8 мм, и герметично запаивают. В качестве тары возможно использование любой другой упаковки, проницаемой для ионизирующего излучения и в то же время устойчивой к его воздействию. В качестве ионизирующего излучения используют поток ускоренных электронов в дозе от 1 до 5 Мрад.
6
7
Молекулярная масса ПЭГ и доза ионизирующего излучения определены в предварительных экспериментах по обработке водных растворов ПЭГ с молекулярной массой от примерно 400 до примерно 20000 Да ионизирующим излучением в дозе от 0,25 до 10 Мрад с дальнейшим анализом образцов облученных ПЭГ методом гель-проникающей высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием испарительного детектора светорассеяния и методом хроматомасс-спектрометрии. В настоящее время известно, что облучение водного раствора ПЭГ высокими дозами ионизирующего излучения приводит к межмолекулярному кросслинкингу и формированию гидрогелей вне зависимости от его молекулярной массы. В частности, для 4% водного раствора ПЭГ с молекулярной массой 1 500 Да выявлена способность образовывать гидрогель при достижении поглощенной дозы излучения в 12-14 Мрад. В то же время ПЭГ с низкой молекулярной массой при облучении в водных растворах при низких дозах и малых концентрациях полимера обладает способностью к внутримолекулярным сшивкам, приводящим к синтезу полимерных клубков, так называемых наногелей [38]. В ходе проведенных экспериментов установлено, что при воздействии ионизирующего излучения молекулы ПЭГ претерпевают структурные изменения, характеризующиеся различной степенью сшивки в зависимости как от их молекулярной массы, так и от дозы облучения. При облучении раствора ПЭГ с молекулярной массой 10000 Да и выше даже при минимальной поглощенной дозе 0,25 Мрад наблюдается значительная агрегация молекул ПЭГ с образованием надмолекулярных структур сверхбольших масс 10-10 Да. При облучении растворов ПЭГ с молекулярной массой от примерно 400 до примерно 5000 Да в дозе от 1 до 5 Мрад имеют место характерные внутримолекулярные взаимодействия, не приводящие к явно выраженному предгелированию и образованию надмолекулярных ассоциатов, что определяет выбор данного типа полимеров, поскольку в этих условиях ПЭГ демонстрирует выраженную способность к внутримолекулярному кросслинкингу при низких энергетических затратах и в то же время формирует полимерную матрицу, необходимую в дальнейшем для встраивания белка.
2
4
В качестве IFN λ. используют природный или рекомбинантный интерферон лямбда, полученный любым известным способом. Для приготовления раствора IFN λ, в качестве растворителя используют очищенную воду или водный солевой буфер, обеспечивающий поддержание рН раствора в пределах, необходимых для сохранности белка, предпочтительно от 6,0 до 7,9, например, фосфатно-солевой буфер (NaHPO 10 ммоль/л, NaCl 150 ммоль/л, рН=7,4). Концентрация интерферона лямбда в полученном растворе составляет 0,25 мг/мл и выше, предпочтительно 0,9 мг/мл, но она должна быть достаточной для того, чтобы при смешении с раствором ПЭГ концентрация IFN λ в итоговой смеси составила от 0,2 до 0,8 мг/мл. Возможно также использование растворов IFN λ, выпускаемых производителями, например раствора интерферона лямбда 1 производства ЗАО «СЦФБ», Россия.
Далее готовят смесь облученного раствора ПЭГ и раствора IFN λ. Использование IFN λ в виде раствора необходимо для обеспечения равномерности перемешивания, поскольку при растворении сухого IFN λ необходимо интенсивное перемешивание, которое изменяет вязкость и структуру раствора ПЭГ. Для приготовления смеси растворов IFN λ и ПЭГ количества раствора IFN λ и предварительно облученного раствора ПЭГ подбирают таким образом, что после смешения растворов концентрация IFN λ в полученной смеси составляет от 0,2 до 0,8 мг/мл, а концентрация полиэтиленгликоля - от 8 до 12 мг/мл, при этом в качестве растворителя используют воду или водный солевой буфер, обеспечивающий поддержание рН раствора в пределах, необходимых для сохранности белка, предпочтительно от 6,0 до 7,9. Оптимальные концентрации IFN λ и ПЭГ были выявлены экспериментально для достижения наибольшей сохранности и стабильности белка и сохранения необходимого избытка по массе полимера относительно содержания белковой субстанции, поскольку в процессе радиационного воздействия именно избыток молекул ПЭГ в первую очередь принимает на себя основную атаку свободных радикалов, способствуя тем самым повышению сохранности белковой молекулы. Полученную смесь переносят в полиэтиленовые пакеты или пробирки таким образом, чтобы толщина слоя жидкости не превышала 5-8 мм, и герметично запаивают. В качестве тары возможно использование любой другой упаковки, проницаемой для ионизирующего излучения и в то же время устойчивой к его воздействию.
Расфасованную смесь замораживают и охлаждают до температуры -10°С, при этом перед замораживанием смесь может быть подвергнута дегазации любым доступным способом. После этого проводят облучение замороженной и охлажденной смеси ионизирующим излучением в замороженном виде, при этом в качестве ионизирующего излучения используют поток ускоренных электронов в дозе от 0,1 до 0,5 Мрад. Облучение смеси в замороженном виде необходимо для снижения негативного эффекта от действия свободных радикалов: при таком облучении смеси сохранность IFN λ по данным обратно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и SDS-электрофореза в полиакриламидном геле достигает 69%, в то время как при облучении той же смеси без заморозки даже при минимальной дозе 0,25 Мрад используемые методы выявляют лишь остаточные количества IFN λ. Проведение дегазации смеси растворов перед расфасовкой и замораживанием также позволяет увеличить сохранность IFN λ до 73-76%. Это объясняется тем, что процессы образования свободных радикалов в растворе полимера под действием ионизирующих излучений протекают с участием растворенного кислорода воздуха, а при дегазации содержание кислорода в растворе уменьшается. При этом значения степени связывания белка в полимер-белковые коньюгаты в дегазированной смеси и смеси без обработки различаются между собой незначительно (N=1,14 и N=1,22, соответственно), что означает, что доля ПЭГ, химически связанного с интерфероном лямбда, составляет около 0,4% от его общего количества. Преобладающая часть ПЭГ в исследуемом образце вступает в нековалентные обратимые взаимодействия с молекулами белка, формируя надмолекулярные комплексы.
После облучения целевой продукт хранят в замороженном виде или подвергают разморозке и при необходимости - дополнительной очистке методом стерилизационной фильтрации, после чего для удобства хранения подвергают стерильному розливу в стерильную упаковку, например стеклянные флаконы.
Отличие заявляемого способа от прототипа и технические результаты заключаются в том, что в заявляемом способе:
- используют раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой от примерно 400 до примерно 5000 Да, который перед смешением с раствором интерферона лямбда подвергают облучению ионизирующим излучением. При этом происходят структурные изменения молекул полиэтиленгликоля, которые не связаны с увеличением молекулярной массы, но приводят к формированию полимерной матрицы, необходимой для встраивания белка;
- приготовление раствора полиэтиленгликоля и интерферона лямбда осуществляют путем смешения раствора интерферона лямбда и раствора полиэтиленгликоля. Это позволяет избежать интенсивного перемешивания раствора ПЭГ, необходимого при растворении сухого интерферона лямбда, и в то же время сохранив вязкость и структуру раствора ПЭГ, необходимую для эффективного пегилирования интерферона лямбда;
- происходит модификация свойств интерферона лямбда таким образом, что его биодоступность при пероральном применении составляет не менее 10%. При этом не происходит образования ковалентных связей между интерфероном лямбда и полиэтиленгликолем, что позволяет избежать неконтролируемого изменения свойств интерферона лямбда и использовать в качестве интерферона лямбда любой доступный интерферон.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения:
Пример 1. Получение ПЭГ-IFN λ.
2
4
К 20,00 г ПЭГ-1500 (производство ООО «Завод синтанолов», Россия) добавляют 15,00 мл очищенной воды. Смесь перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения полиэтиленгликоля, после чего доводят объем смеси до 50,00 мл. Полученный раствор с концентрацией ПЭГ-1500 0,40 г/мл переносится в полиэтиленовый пакет таким образом, чтобы толщина слоя жидкости не превышала 5-8 мм, и герметично запаивается. Упакованный раствор ПЭГ-1500 подвергается воздействию ионизирующим облучением в дозе 2,0 Мрад на ускорителе электронов ИЛУ-10 (ЭУ-75). 80,00 мл раствора интерферона лямбда 1 (ЗАО «СЦФБ», Россия) с концентрацией интерферона лямбда 1 0,86 мг/мл смешивают с 3,45 мл облученного раствора ПЭГ-1500, доводят объем полученной смеси до 138,00 мл с помощью фосфатно-солевого буфера (NaHPO 10 ммоль/л, NaCl 150 ммоль/л, рН=7,4), и тщательно перемешивают. Далее проводят дегазацию полученного раствора с помощью вакуумного насоса и колбы Бунзена. Откачка воздуха из колбы производится до давления 10-50 мм.рт.ст. в течение 30-40 минут. Затем дегазированный раствор помещается в полиэтиленовый пакет таким образом, чтобы толщина раствора в горизонтальном положении не превышала 5-8 мм, пакет герметично запаивается, замораживается и охлаждается до -20°С в морозильной камере в течение 12 часов, после чего проводится облучение ионизирующим излучением на ускорителе электронов ИЛУ-10 (ЭУ-75) в дозе 0,25 Мрад. После облучения пакет с ПЭГ-IFN λ1 размораживают, проводят стерилизующую фильтрацию посредством вакуумной стерилизационной системы «Stericup» (Merck Millipore), розлив и укупорку в стерильные стеклянные флаконы.
Пример 2. Изучение цитотоксической активности ПЭГ-IFN λ
Цитотоксическую активность ПЭГ-IFN λ1 полученного в Примере 1, определяли на культуре клеток гепатомы человека Huh7.5 в диапазоне концентраций ПЭГ-IFN λ1 от 0,85 до 8500 нг/мл (в пересчете на IFN λ1) микрометодом на 96-луночных планшетах ("Greiner") с использованием 2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфо-фенил)-2Н-тетразолий-5-карбоксанилида (реагент ХТТ, Sigma-Aldrich, США). Метод основан на способности митохондриальных дегидрогеназ конвертировать водорастворимый ХТТ в формазан, который кристаллизуется внутри клетки. Перевод формазана в раствор с помощью феназинметасульфата (PMS) и последующая фотометрия позволяют точно соотнести изменение оптической плотности раствора с изменением количества жизнеспособных клеток. Специфическая гибель клеток Huh7.5, обработанных разными концентрациями белков клеток по отношению к необработанным (контроль, 100% жизнеспособности), оценивалась в двух повторах. Результаты представлены на фиг. 1.
Пример 3. Изучение антивирусной активности ПЭГ-IFN λ.
Оценку антивирусной активности ПЭГ-IFN λ1, полученного в Примере 1, проводили с использованием модели JFH1 клон/Huh-7.5 клетки, которая в настоящее время является общепризнанной системой для оценки антивирусной активности препаратов, включая интерфероны.
Линеаризованная ДНК плазмиды pJFH1 pUC была использована в качестве матрицы для транскрипции полноразмерной инфекционной РНК ВГС с помощью набора реагентов TranscriptAid™ для высокоэффективной транскрипции с Т7 РНК-полимеразой (Fermentas, Латвия).
6
4
Культуральный вирус гепатита С (JFH1) был получен в результате трансфекции синтезированной РНК в клетки гепатомы человека Huh7.5 с использованием набора для трансфекции РНК Mirus Bio MIR 2250 (Mirus, США). Максимальный выход вируса в культуральную среду через 8 пассажей трансфецированных клеток достиг 1,37×10 копий РНК/мл по результатам ПЦР в реальном времени (тест-система «АмплиСенс HCV-Монитор-FL», ИЛС, Москва). Далее вируссодержащую культуральную жидкость концентрировали центрифугированием в ячейке с отсекающим фильтром Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit (100 кДа) (Millipore, США) и проводили еще 4 субпассажа на клетках Huh7.5 для получения вирусного стока JFH1. Сток титровали на монослое клеток Huh7.5 методом иммуногистохимического определения фокусов инфекционности (далее - фи). Для этого монослой клеток Huh7.5, выращенный в 96-луночных планшетах, инфицировали 10-кратными разведениями стока JFH1, инкубировали 72 часа, отмывали 1ХФСБ, фиксировали изопропанолом, обрабатывали моноклональными антителами 6G7 к белку Core 6G7 и вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена. Фокусы инфицированных клеток окрашивали хромогеном АЕС (3-Amino-9-ethylcarbazole, Sigma), который окисляется пероксидазой с образованием нерастворимого осадка красного цвета. Сканирование фокусов проводили с помощью микроскопа "Axiovert" 40 CFL ZEISS. Титр ВГС составил ~ 2×10 фи/мл. Полученный сток фасовали по аликвотам 1,5 мкл и хранили при -80°C до использования при определении антивирусной активности ПЭГ-IFN λ1.
6
2
Для оценки антивирусной активности ПЭГ-IFN λ1 методом ПЦР в реальном времени монослой клеток Huh7.5, выращенный на 24-х луночных планшетах, инкубировали с 10-кратными разведениями ПЭГ-IFN λ1 в диапазоне 0,085-8500 нг/мл в культуральной среде в течение 12 часов при 37°C. Затем среду с ПЭГ-IFN λ1 удаляли и клетки инфицировали одинаковой дозой вируса JFH1 (из расфасованного замороженного стока) 4,37×10 копий РНК/лунку (кроме контроля клеток) по 3 лунки на одну дозу ПЭГ-IFN λ1. Адсорбцию вируса проводили 2 часа при 37°С без ПЭГ-IFN λ1, затем вирус удаляли и в лунки вновь добавляли среду с соответствующими разведениями ПЭГ-IFN λ1. Планшеты инкубировали 2 суток при 37°С в СО инкубаторе, затем готовили лизаты инфицированных и контрольных клеток следующим образом:
- монослой клеток трижды промывали TBS-буфером (150 мМ NaCl, 50 mМ Трис, рН 7.6);
- обрабатывали смесью лизирующего буфера 100 мкл/лунка (150 мМ NaCl, 50 mM Трис, р 7.6, 1% Тритон Х-100) и коктейля из ингибиторов протеаз (AEBSF, aprotinin, bestatin, Е-64, EDTA, leupeptin) (Sigma, США), переносили в центрифужные микропробирки, выдерживали во льду 10 минут, замораживали;
- лизаты трижды подвергали заморозке-разморозке;
- полученную смесь центрифугировали 30 минут при скорости центрифугирования 14000 об./мин, при температуре 4°С;
- супернатант расфасовывали по 100 мкл и проводили ПЦР в реальном времени с использованием тест-системы «АмплиСенс HCV-Монитор-FL».
Результаты ПЦР представлены в таблице 3.
* - лизат не инфицированных клеток Huh7.5, отрицательный контроль (бланк);
** - лизат клеток Huh7.5, инфицированных вирусом, но не обработанных IFN λ1, положительный контроль, 100% инфекции.
Оценку антивирусного действия ПЭГ-IFN λ1 проводили также иммуно-гистохимическим методом подсчета фокусов инфекционности, описанным ранее, на монослое клеток Huh 7.5 в диапазоне концентраций ПЭГ-IFN λ1 от 0,0085 до 8,5000 нг/мл. Результаты этого анализа представлены на фиг. 2, где видно, что доза ПЭГ-IFN λ1 0,0085 нг/мл ингибирует репродукцию вируса на 25%, а следующая 10-кратная доза 0,085 нг/мл - уже на 75%, таким образом, 50%-ная ингибирующая доза лежит в диапазоне концентраций ПЭГ-IFN λ1 0,0085-0,085 нг/мл.
Пример 4. Изучение биодоступности ПЭГ-IFN А.
Исследование биодоступности ПЭГ-IFN λ1, полученного в Примере 1, проводили согласно «Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств», [34]. В качестве тест-систем были использованы аутбредные лабораторные крысы весом не менее 180 г в возрасте 12-14 недель, полученные из отдела экспериментальных биологических моделей НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук» (Ветеринарные удостоверения имеются), содержание и манипуляции с животными проводили в соответствии с СОП «Содержание лабораторных животных» и международными стандартами, действующими в настоящий момент (Animal Welfare Act, Guide for Care and Use of Laboratory Animals).
ПЭГ-IFN λ1 вводили животным однократно в дозе 2,6 мкг/кг в пересчете на IFN λ1 внутрижелудочно или внутривенно. Концентрацию IFN λ1 при однократном внутрижелудочном введении ПЭГ-IFN λ1 определяли в сыворотке крови, а также тканях сердца, сальника, печени, почек, поперечно-полосатых мышц и головного мозга крыс до введения препарата и через 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 16 и 24 часа после введения, при однократном внутривенном введеним - в сыворотке крови до введения препарата и через 0,03, 0,17, 0,33, 0,5, 0,75, 1 и 2 часа после введения. На каждую точку использовали 6 животных.
Предварительную пробоподготовку проводили следующим образом:
Сыворотка крови. Кровь забирали после умерщвления животного из полости сердца. Для отделения сыворотки от сгустка клеточных элементов обводили собранную кровь по стенкам пробирки стеклянной палочкой. Далее инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Выдерживали в холодильнике 1 час, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. Выделенную сыворотку собирали в пластиковые пробирки и замораживали при температуре от -18 до -20°С. В качестве нулевой точки (до введения) использовали пробы сыворотки крови 6 интактных животных, которые получали аналогичным способом.
Ткань печени, мозга, сердца, скелетной (поперечено-полосатой) мышцы, почек, сальника и тонкого кишечника. Для определения IFN λ1 в органах и тканях навеску ткани (около 1 г) дважды замораживали и размораживали, тщательно растирали в ступке и готовили 20%-ные гомогенаты на дистиллированной воде. Полученную суспензию встряхивали на шейкере в течение 10 мин. После этого пробирки центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант переносили в чистые пробирки и использовали для анализа. В качестве нулевой точки (до введения) использовали пробы ткани печени, мозга, сердца, скелетной мышцы, почек и сальника 6 интактных животных, которые получали аналогичным способом.
Количественное определение IFN λ1 в биологических объектах (сыворотка крови, органы и ткани животных) проводили с помощью иммуноферментного метода (ИФА) с использованием наборов Human IL-29 Platinum ELISA («Bender MedSystems GmbH», Австрия, кат. номер BMS2049), предназначенных для определения концентрации IFN λ1 человека в культуральных супернатантах, сыворотке, плазме и других биологических образцах в интервале концентраций от 2 до 1000 пг/мл, в соответствии с инструкцией производителя. Учет результатов проводили на анализаторе иммуноферментных реакций АИФР-01 «УНИПЛАН» (ЗАО «Пикон», Россия) при длине волны 450 нм.
Результаты определения концентраций IFN λ1 в сыворотке крови и органах и тканях крыс после однократного внутрижелудочного введения ПЭГ-IFN λ1 представлены в таблице 4. Данные по количественному определению концентрации IFN λ1 в мозге и сальнике не представлены, так как концентрация была ниже 2 пг/мл и не выявлялась ИФА с использованием наборов Human IL-29 Platinum ELISA.
Результаты определения концентраций IFN λ1 в сыворотке крови крыс после однократного внутривенного введения ПЭГ-IFN λ1 в дозе 2,6 мкг/кг представлены в таблице 5.
Расчет фармакокинетических параметров на основе полученных данных проводился с использованием внемодельного метода статистических моментов [39] и метода трапеций [40, 41]. Результаты расчета представлены в таблице 2.
Источники
1. Perez-Martin Е, Weiss М, Diaz-San Segundo F, Pacheco JM, Arzt J, Grubman MJ, de los Santos T. Bovine type III interferon significantly delays and reduces the severity of foot-and-mouth disease in cattle. // J Virol. - 2012 - Vol. 86, №8. - P. 4477-4487.
2. Prokunina-Olsson L, Muchmore B, Tang W, Pfeiffer RM, ParkH, Dickensheets H, Hergott D, Porter-Gill P, Mumy A, Kohaar I, Chen S, Brand N, Tarway M, Liu L, Sheikh F, Astemborski J, Bonkovsky HL, Edlin BR, Howell CD, Morgan TR, Thomas DL, Rehermann B, Donnelly RP, O'Brien TR. A variant upstream of IFNL3 (IL28B) creating a new interferon gene IFNL4 is associated with impaired clearance of hepatitis С virus. // Nat Genet. - 2013. - Vol. 45(2). - P. 164-71.
3. O'Brien TR, Prokunina-Olsson L, Donnelly RP. IFN-λ4: The Paradoxical New Member of the Interferon Lambda Family. // J Interferon Cytokine Res. - 2014. - Vol. 34(11). - P. 829-838.
4. Григорян С.С. Интерфероны лямбда (3-й тип интерферонов) и вирусные инфекции. // Интерферон-2011 / Сборник научных статей. - Москва. - 2012. - 512 с. С. 63-72
5. Durbin, R.K., Kotenko, S.V., and Durbin, J.E. Interferon induction and function at the mucosal surface. // Immunol. Rev. - 2013. - Vol. 255. - P. 25-39.
6. Hermant, P., and Michiels, T. Interferon-λ in the context of viral infections: production, response and therapeutic implications. // J. Innate Immun. - 2014. - Vol. 6. - P. 563-574.
7. Mahlakoiv, Т., Hernandez, P., Gronke, K., Diefenbach, A., and Staeheli, P. Leukocyte-derived IFN-a/b and epithelial IFN-1 constitute a compartmentalized mucosal defense system that restricts enteric virus infections. // PLoS Pathog. - 2015. - Vol. 11. - art. no. e1004782.
8. AnkN, WestH, Bartholdy C, Eriksson K, Thomsen AR, Paludan SR. Lambda interferon (IFN-lambda), a type III IFN, is induced by viruses and IFNs and displays potent antiviral activity against select virus infections in vivo. // J Virol. - 2006. - Vol. 80(9). - P. 4501-4509.
9. Mordstein, M., Neugebauer, E., Ditt, V., Jessen, В., Rieger, Т., Falcone, V., Sorgeloos, F., Ehl, S., Mayer, D., Kochs, G., et al. Lambda interferon renders epithelial cells of the respiratory and gastrointestinal tracts resistant to viral infections. // J. Virol. - 2010. - Vol. 84. - P. 5670-5677.
10. Pott J,  T, Mordstein M, Duerr CU, Michiels T, Stockinger S, Staeheli P, HornefMW. IFN-lambda determines the intestinal epithelial antiviral host defense. // Proc Natl Acad Sci USA. - 2011. - Vol. 108(19). - P. 7944-7949.
11. Heinze B, Frey S, Mordstein M,  A, Ehl S, Buchholz UJ, Collins PL, Staeheli P, Krempl CD. Both nonstructural proteins NS1 and NS2 of pneumonia virus of mice are inhibitors of the interferon type I and type III responses in vivo. // J Virol. 2011 May; 85(9): 4071-84. doi: 10.1128 / JVI.01365-10. Epub 2011 Feb 9.
12. Nice, T.J., Baldridge, M.T., McCune, B.T., Norman, J.M., Lazear, H.M., Artyomov, M., Diamond, M.S., Virgin, H.W. Interferon-λ cures persistent murine norovirus infection in the absence of adaptive immunity. // Science. - 2015. - Vol. 347(6219). - P. 269-273.
13. Lazear, H.M., Daniels, B.P., Pinto, A.K., Huang, A.C., Vick, S.C., Doyle, S.E., Gale, M., Jr., Klein, R.S., and Diamond, M.S. Interferon-1 restricts West Nile virus neuroinvasion by tightening the blood-brain barrier. // Sci. Transl. Med. - 2015. - Vol. 7. - P. 284ra59.
14. ThatteA, DeWitte-Orr SJ, Lichty B, Mossman KL, Ashkar AA. A critical role for IL-15 in TLR-mediated innate antiviral immunity against genital HSV-2 infection. // Immunol Cell Biol. - 2011. - Vol. 89(6). - P. 663-669.
15. Bartlett NW, Buttigieg K, Kotenko SV, Smith GL. Murine interferon lambdas (type III interferons) exhibit potent antiviral activity in vivo in a poxvirus infection model. // J Gen Virol. - 2005. - Vol.86(Pt 6). - P. 1589-1596.
16. Pagliaccetti N.E., Chu E.N., Bolen Ch.R., Kleinstein S.H., RobekM.D. Lambda and alpha interferons inhibit hepatitis В virus replication through a common molecular mechanism but with different in vivo activities. // Virology. - 2010. - Vol. 401(2). - P. 197-206.
17. Donnelly, R.P., Dickensheets, H., and O'Brien, T.R. Interferon-lambda and therapy for chronic hepatitis С virus infection. // Trends Immunol. - 2011. - Vol. 32. - P. 443-450.
18. Hayes, C.N., Imamura, M., Aikata, H., and Chayama, K. Genetics of IL28B and HCV-response to infection and treatment. // Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. - 2012. - Vol. 9. - P. 406-417.
19. Глобальная стратегия сектора здравоохранения по вирусному гепатиту 2016-2021. На пути к ликвидации вирусного гепатита. - ВОЗ, Женева, Швейцария, 2016. - 56 с.
20. Новые рекомендации в обновленном Руководстве ВОЗ по скринингу, оказанию медицинской помощи и лечению лиц с хронической инфекцией гепатита С.Аналитическая справка. - ВОЗ, Женева, Швейцария, 2016.-12 с.
21. Патент US 5951974, МПК A61P 43/00, A61P 35/02, A61K 47/34, A61P 1/16, C07K 1/08, C07K 14/56, A61P 35/00, A61K 38/21, C07K 1/113, A61P 31/12, A61K 47/48, A61K 38/00, опубл. 14.09.1999.
22. Патент ЕР 0809996, МПК C07K 1/10, C07K 14/56, A61P 35/00, A61P 37/02, A61K 31/00, A61P 31/00, A61P 31/12, A61K 31/745, C07K 14/52, C07K 14/555, C07K 1/113, A61K 47/48, A61K 38/21, A61P 37/00, C07K 17/08, A61P 31/04, опубл. 03.12.1997.
23. Патент RU 2447083, МПК C07K 14/56, A61K 38/21, A61K 47/48, A61P 37/00, A61P 35/00, A61P 31/12, опубл. 10.04.2012.
24. Patten S.B. What is the best approach to treating interferon-induced depression in people with multiple sclerosis? // J. Neurosci. - 2001 - V. 26. - P. 66.
25. Wills R.J. Clinical pharmacokinetics of interferons // Clin. Pharmacokinet. - 1990. - Vol.19. - №5. - P. 390-399.
26. Prummer О., Streichan U., Porzsolt F. Treatment-induced interferon (IFN)-α antibodies: Differential neutralisation of the antiviral and antiproliferative IFN-α activity in vitro // J. Interferon Res. - 1991. - №11. - P. 265.
27. Muir, A.J., Arora, S., Everson, G., Flisiak, R., George, J., Ghalib, R., Gordon, S.C., Gray, Т., Greenbloom, S., Hassanein, Т., et al.; EMERGE study group A randomized phase 2b study of peginterferon lambda-la for the treatment of chronic HCV infection. 1/3. Hepatol. - 2014. - Vol. 61. - P. 1238-1246.
28. Патент RU 2496514, МПК A61K 38/21, A61K 38/20, A61P 31/20, опубл. 27.10.2013.
29. Патент RU 2409669, МПК C12N 11/08, C12N 11/10, A61K 38/00, A61K 38/43, опубл. 27.05.2012.
30. Kato Т., Date Т., Murayama A. et al. Cell culture and infection system for hepatitis С virus. // Nature protocols - 2006. - Vol. 1(5). - P.2334-2339.
31. Kato N., Mori K., Abe K. et al. Efficient replication systems for hepatitis С virus using a new human hepatoma cell line. // Virus Research. - 2009. - Vol. 146. - P.41-50.
32. Blight K.J., McKeating J.A., Rice CM. Highly permissive cell lines for subgenomic and genomic hepatitis С virus RNA replication. // J. Virol. - 2002. -Vol. 76(24). - P.13001-13014.
33. Bartenschlager R. and Pietschmann T. Efficient hepatitis С virus cell culture system: What a difference the host cell makes. // PNAS. - 2005. - Vol. 102(28). - P.9739-9740.
34. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2013. - 944 с.
35. Пиотровский В.К. Метод статистических моментов и интегральные модельно-независимые параметры фармакокинетики // Фармакология и токсикология. - 1986. - №5. - С. 118-125.
36. Каркищенко Н.Н., Хоронько В.В., Сергеева С.А., Каркищенко В.Н. Фармакокинетика. - Ростов-на- Дону, 2001. - 383 с.
37. Мирошниченко И.И. Основы фармакокинетики. - М.: Издательский дом «ГЭОТАР-МЕД», 2002. - 188 с.
38. Rosiak J. М., Janik I., Kadlubowski S., Kozicki M., Kujawa P., Stasica P., Ulanski P. Radiation formation of hydrogels for biomedical application // Radiation synthesis and modification of polymers for biomedical applications Final results of a coordinated research project 1996-2000. - 2002. - P. 5-48.