МУЛЬТИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ С МУТАНТНЫМИ ДОМЕНАМИ FAB

1. Мультиспецифический антигенсвязывающий белок, содержащий по меньшей мере два участка VL, соответственно спаренные с по меньшей мере двумя участками VH с образованием по меньшей мере двух антигенсвязывающих сайтов, и по меньшей мере два участка CH1, соответственно спаренные с двумя участками CL,
где по меньшей мере одна пара CH1/CL содержит мутации в CH1/CL, облегчающие спаривание, выбранные из группы, состоящей из одной или нескольких из
(1) мутации T192E (CH1) и мутаций N137K и S114A (CL), и
(2) мутаций L143Q и S188V (CH1) и мутаций V133T и S176V (CL), и
(3) мутаций T192E, L143Q и S188V (CH1) и мутаций N137K, S114A, V133T и S176V (CL),
(4) мутации K221E (CH1) и мутации E123K (CL),
(5) мутаций T192E и K221E (CH1) и мутаций N137K, S114A и E123K (CL),
(6) мутации L143E, L143D, L143K, L143R или L143H (CH1) и мутации S176E, S176D, S176K, S176R или S176H (CL),
(7) мутации L124E, L124D, L124K, L124R или L124H (CH1) и мутации V133E, V133D, V133K, V133R или V133H (CL),
(8) мутации K228D (CH1) и мутации D122K (CL), и
(9) мутаций K221E и K228D (CH1) и мутаций D122K и E123K (CL),
где если две пары CH1/CL содержат мутации, облегчающие спаривание двух разных пар VH/VL, то две пары CH1/CL не содержат одинаковые мутации, и
где по меньшей мере одна пара VH/VL содержит мутации с заменой на противоположно заряженный аминокислотный остаток, облегчающие спаривание, при этом указанные мутации с заменой на противоположно заряженный аминокислотный остаток предусматривают (1) мутированный остаток в участке VH в положении 39 согласно Кабату, выбранный из E, D, K, R или H, и (2) мутированный остаток в участке VL в положении 38 согласно Кабату, выбранный из E, D, K, R или H, и
где мутированный остаток в участке VH имеет заряд, противоположный заряду мутированного остатка в участке VL.
2. Мультиспецифический антигенсвязывающий белок, содержащий
a) первую пару легкой цепи (LC1)/тяжелой цепи (HC1), содержащую
(1) первый участок VL (VL1), спаренный с первым участком VH (VH1) с образованием первого антигенсвязывающего сайта;
(2) первый константный участок тяжелой цепи 1 (CH1-1), функционально связанный с VH1, и первый константный участок легкой цепи (CL1), функционально связанный с VL1; и
(3) первый домен гетеродимеризации (HD1) и
b) вторую пару легкой цепи (LC2)/тяжелой цепи (HC2), содержащую
(4) второй участок VL (VL2), спаренный со вторым участком VH (VH2) с образованием второго антигенсвязывающего сайта;
(5) второй константный участок тяжелой цепи 1 (CH1-2), функционально связанный с VH2, и второй константный участок легкой цепи (CL2), функционально связанный с VL2; и
(6) второй домен гетеродимеризации (HD2);
где HD1 и HD2 гетеродимеризуются,
где по меньшей мере одна или обе из пары VL1 и VH1 и пары VL2 и VH2 содержат мутации с заменой на противоположно заряженный аминокислотный остаток, облегчающие спаривание, при этом указанные мутации с заменой на противоположно заряженный аминокислотный остаток предусматривают (1) мутированный остаток в участке VH в положении 39 согласно Кабату, выбранный из E, D, K, R или H, и (2) мутированный остаток в участке VL в положении 38 согласно Кабату, выбранный из E, D, K, R или H, и где мутированный остаток в участке VH имеет заряд, противоположный заряду мутированного остатка в участке VL,
где по меньшей мере одна или обе из пары CL1 и CH1-1 и пары CL2 и CH1-2 содержат мутации, облегчающие спаривание, и
где если как пара CL1 и CH1-1, так и пара CL2 и CH1-2 содержат мутации, облегчающие спаривание, то мутации в CH1-1 и CL1, облегчающие спаривание, отличаются от мутаций в CH1-2 и CL2, облегчающих спаривание.
3. Мультиспецифический антигенсвязывающий белок по п. 1, где по меньшей мере один участок CH1 функционально связан с доменом гетеродимеризации.
4. Мультиспецифический антигенсвязывающий белок, в котором содержатся по меньшей мере две полипептидные цепи и образуются по меньшей мере два антигенсвязывающих сайта, где одна полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:
VL1-L1-VL2-L2-CL [I],
и одна полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:
VH2-L3-VH1-L4-CH1 [II],
где
VL1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;
VL2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;
VH1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;
VH2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;
CL представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;
CH1 представляет собой константный домен CH1 тяжелой цепи иммуноглобулина; и
L1, L2, L3 и L4 представляют собой аминокислотные линкеры,
где VH1 спарен с VL1, VH2 спарен с VL2, и CH1 спарен с CL,
где полипептид формулы I и полипептид формулы II образуют кроссоверную пару легкая цепь-тяжелая цепь,
где один или несколько остатков цистеина сконструированы в одну или обе пары VH1/VL1 и VH2/VL2 с образованием одной или нескольких дисульфидных связей,
где по меньшей мере одна или обе из пары VL1 и VH1 и пары VL2 и VH2 содержат мутации с заменой на противоположно заряженный аминокислотный остаток, которые облегчают спаривание, при этом указанные мутации с заменой на противоположно заряженный аминокислотный остаток предусматривают (1) мутированный остаток в участке VH в положении 39 согласно Кабату, выбранный из E, D, K, R или H, и (2) мутированный остаток в участке VL в положении 38 согласно Кабату, выбранный из E, D, K, R или H,
где мутированный остаток в участке VH имеет заряд, противоположный заряду мутированного остатка в участке VL, и
где пара доменов CH1 и CL содержит мутации, облегчающие спаривание.
5. Мультиспецифический антигенсвязывающий белок, содержащий четыре полипептидные цепи, которые образуют четыре антигенсвязывающих сайта, где каждая из двух полипептидных цепей содержит структуру, представленную формулой:
VL1-L1-VL2-L2-CL [I],
и каждая из двух полипептидных цепей содержит структуру, представленную формулой:
VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc [II],
где
VL1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;
VL2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;
VH1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;
VH2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;
CL представляет собой константный домен легкой цепи иммуноглобулина;
CH1 представляет собой константный домен CH1 тяжелой цепи иммуноглобулина;
Fc содержит шарнирный участок иммуноглобулина и константные домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина; и
L1, L2, L3 и L4 представляют собой аминокислотные линкеры,
где VH1 спарен с VL1 с образованием первого антигенсвязывающего сайта, VH2 спарен с VL2 с образованием второго антигенсвязывающего сайта, и CH1 спарен с CL,
где полипептиды формулы I и полипептиды формулы II образуют кроссоверную пару легкая цепь-тяжелая цепь,
где один или несколько остатков цистеина сконструированы в одну или обе пары VH1/VL1 и VH2/VL2 с образованием одной или нескольких дисульфидных связей,
где одна или обе из пары VL1 и VH1 и пары VL2 и VH2 содержат мутации с заменой на противоположно заряженный аминокислотный остаток, облегчающие спаривание, при этом указанная мутация с заменой на противоположно заряженный аминокислотный остаток предусматривает (1) мутированный остаток в участке VH в положении 39 согласно Кабату, выбранный из E, D, K, R или H, и (2) мутированный остаток в участке VL в положении 38 согласно Кабату, выбранный из E, D, K, R или H, и где мутированный остаток в участке VH имеет заряд, противоположный заряду мутированного остатка в участке VL, и
где один или оба из пары доменов CH1 и CL содержат мутации, облегчающие спаривание, и
где если по меньшей мере две пары CH1/CL содержат мутации, облегчающие спаривание, то совокупность мутаций в одной паре CH1/CL отличается от совокупности мутаций в другой паре CH1/CL.
6. Мультиспецифический антигенсвязывающий белок, содержащий четыре полипептидные цепи, которые образуют три антигенсвязывающих сайта, где
первая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:
VL2-L1-VL1-L2-CL1 [I],
вторая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-1-шарнир-CH2-CH3 [II],
третья полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:
VH3-CH1-2-шарнир-CH2-CH3 [III], и
четвертая полипептидная цепь содержит структуру, представленную формулой:
VL3-CL2 [IV],
где
VL1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;
VL2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;
VL3 представляет собой третий вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;
VH1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;
VH2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;
VH3 представляет собой третий вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;
CL1 представляет собой первый константный домен легкой цепи иммуноглобулина;
CL2 представляет собой второй константный домен легкой цепи иммуноглобулина;
CH1-1 представляет собой первый константный домен CH1 тяжелой цепи иммуноглобулина;
CH1-2 представляет собой второй константный домен CH1 тяжелой цепи иммуноглобулина;
CH2 представляет собой константный домен CH2 тяжелой цепи иммуноглобулина;
CH3 представляет собой константный домен CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина;
шарнир представляет собой шарнирный участок иммуноглобулина, соединяющий домены CH1 и CH2; и
L1, L2, L3 и L4 представляют собой аминокислотные линкеры,
где полипептид формулы I и полипептид формулы II образуют кроссоверную пару легкая цепь-тяжелая цепь, и
где один или несколько остатков цистеина сконструированы в одну или несколько пар VH1/VL1, VH2/VL2 и VH3/VL3 с образованием одной или нескольких дисульфидных связей,
где одна или обе из пары VL1 и VH1 и пары VL2 и VH2 содержат мутации с заменой на противоположно заряженный аминокислотный остаток, облегчающие спаривание, при этом указанные мутации с заменой на противоположно заряженный аминокислотный остаток предусматривают (1) мутированный остаток в участке VH в положении 39 согласно Кабату, выбранный из E, D, K, R или H, и (2) мутированный остаток в участке VL в положении 38 согласно Кабату, выбранный из E, D, K, R или H, и где мутированный остаток в участке VH имеет заряд, противоположный заряду мутированного остатка в участке VL,
где одна или обе из пары CL1 и CH1-1 и пары CL2 и CH1-2 содержат мутации, облегчающие спаривание, и
где если как пара CL1 и CH1-1, так и пара CL2 и CH1-2 содержат мутации, облегчающие спаривание, то мутации в CH1-1 и CL1 отличаются от мутаций в CH1-2 и CL2.
7. Мультиспецифический антигенсвязывающий белок, содержащий
a) первую пару легкой цепи (LC1)/тяжелой цепи (HC1), содержащую
(1) первый участок VL (VL1), спаренный с первым участком VH (VH1) с образованием первого антигенсвязывающего сайта;
(2) первый константный участок тяжелой цепи 1 (CH1-1), функционально связанный с VH1, и первый константный участок легкой цепи (CL1), функционально связанный с VL1, и
b) вторую пару легкой цепи (LC2)/тяжелой цепи (HC2), содержащую
(3) второй участок VL (VL2), спаренный со вторым участком VH (VH2) с образованием второго антигенсвязывающего сайта; и
(4) второй константный участок тяжелой цепи 1 (CH1-2), функционально связанный с VH2, и второй константный участок легкой цепи (CL2), функционально связанный с VL2,
где C-конец CH1-1 функционально связан с N-концом VH2,
где один или несколько остатков цистеина сконструированы в одну или обе пары VH1/VL1 и VH2/VL2 с образованием одной или нескольких дисульфидных связей,
где одна или обе из пары VL1 и VH1 и пары VL2 и VH2 содержат мутации с заменой на противоположно заряженный аминокислотный остаток, облегчающие спаривание, при этом указанные мутации с заменой на противоположно заряженный аминокислотный остаток предусматривают (1) мутированный остаток в участке VH в положении 39 согласно Кабату, выбранный из E, D, K, R или H, и (2) мутированный остаток в участке VL в положении 38 согласно Кабату, выбранный из E, D, K, R или H, и где мутированный остаток в участке VH имеет заряд, противоположный заряду мутированного остатка в участке VL,
где одна или обе из пары CL1 и CH1-1 и пары CL2 и CH1-2 содержат мутации, облегчающие спаривание, и
где если как пара CL1 и CH1-1, так и пара CL2 и CH1-2 содержат мутации, облегчающие спаривание, то мутации в CH1-1 и CL1 отличаются от мутаций в CH1-2 и CL2.
8. Мультиспецифический антигенсвязывающий белок по любому из пп. 2-7, где CH1 содержит мутацию T192E, и CL содержит мутации N137K и S114A.
9. Мультиспецифический антигенсвязывающий белок по любому из пп. 2-8, где CH1 содержит мутации L143Q и S188V, и CL содержит мутации V133T и S176V.
10. Мультиспецифический антигенсвязывающий белок по любому из пп. 2-9, где CH1 содержит мутации T192E, L143Q и S188V, и CL содержит мутации N137K, S114A, V133T и S176V.
11. Мультиспецифический антигенсвязывающий белок по любому из пп. 2-10, где CH1 содержит мутацию K221E, и CL содержит мутацию E123K.
12. Мультиспецифический антигенсвязывающий белок по любому из пп. 2-11, где CH1 содержит мутацию K228D, и CL содержит мутацию D122K.
13. Мультиспецифический антигенсвязывающий белок по любому из пп. 2-12, где CH1 содержит мутации K221E и K228D, и CL содержит мутации D122K и E123K.
14. Мультиспецифический антигенсвязывающий белок по любому из пп. 2-13, где CH1 содержит мутацию L143E, L143D, L143K, L143R или L143H, и CL содержит мутацию S176E, S176D, S176K, S176R или S176H.
15. Мультиспецифический антигенсвязывающий белок по любому из пп. 2-14, где CH1 содержит мутацию L124E, L124D, L124K, L124R или L124H, и CL содержит мутацию V133E, V133D, V133K, V133R или V133H.
16. Мультиспецифический антигенсвязывающий белок по любому из пп. 2-15, где VH содержит мутацию Q39E, Q39D, Q39K, Q39R или Q39H, и VL содержит мутацию Q38E, Q38D, Q38K, Q38R или Q38H.
17. Мультиспецифический антигенсвязывающий белок по любому из пп. 2-16, где по меньшей мере одна пара CH1/CL содержит мутации в CH1/CL, облегчающие спаривание, выбранные из группы, состоящей из одной или нескольких из
(1) мутации T192E (CH1) и мутаций N137K и S114A (CL),
(2) мутаций L143Q и S188V (CH1) и мутаций V133T и S176V (CL),
(3) мутаций T192E, L143Q и S188V (CH1) и мутаций N137K, S114A, V133T и S176V (CL),
(4) мутации K221E (CH1) и мутации E123K (CL),
(5) мутаций T192E и K221E (CH1) и мутаций N137K, S114A и E123K (CL),
(6) мутации L143E, L143D, L143K, L143R или L143H (CH1) и мутации S176E, S176D, S176K, S176R или S176H (CL),
(7) мутации L124E, L124D, L124K, L124R или L124H (CH1) и мутации V133E, V133D, V133K, V133R или V133H (CL),
(8) мутации K228D (CH1) и мутации D122K (CL), и
(9) мутаций K221E и K228D (CH1) и мутаций D122K и E123K (CL),
где если по меньшей мере две пары CH1/CL содержат совокупность мутаций, облегчающих спаривание двух разных пар VH/VL, то по меньшей мере две пары CH1/CL не содержат одинаковые мутации, и
где по меньшей мере одна пара VH/VL содержит мутации с заменой на противоположно заряженный аминокислотный остаток, облегчающие спаривание, при этом указанные мутации с заменой на противоположно заряженный аминокислотный остаток предусматривают (1) мутированный остаток в участке VH в положении 39 согласно Кабату, выбранный из E, D, K, R или H, и (2) мутированный остаток в участке VL в положении 38 согласно Кабату, выбранный из E, D, K, R или H, и где мутированный остаток в участке VH имеет заряд, противоположный заряду мутированного остатка в участке VL.
18. Антигенсвязывающий белок, содержащий
антигенсвязывающий домен и
константный участок CH1 тяжелой цепи, спаренный с константным участком CL легкой цепи,
где антигенсвязывающий домен селективно связывается с целевым антигеном, и где участок CH1 и участок CL содержат одну или обе из
a) мутации L143E, L143D, L143K, L143R или L143H в участке CH1 и мутации S176E, S176D, S176K, S176R или S176H в участке CL; и
b) мутации L124E, L124D, L124K, L124R или L124H в участке CH1 и мутации V133E, V133D, V133K, V133R или V133H в участке CL,
где мутированный остаток в участке СH1 имеет заряд, противоположный заряду мутированного остатка в участке СL.
19. Антигенсвязывающий белок по п. 18, дополнительно содержащий мутации в CH1/CL, облегчающие спаривание, выбранные из группы, состоящей из одной или нескольких из
(1) мутации T192E (CH1) и мутаций N137K и S114A (CL),
(2) мутаций L143Q и S188V (CH1) и мутаций V133T и S176V (CL),
(3) мутаций T192E, L143Q и S188V (CH1) и мутаций N137K, S114A, V133T и S176V (CL),
(4) мутации K221E (CH1) и мутации E123K (CL),
(5) мутации K228D (CH1) и мутации D122K (CL), и
(6) мутаций K221E и K228D (CH1) и мутаций D122K и E123K (CL),
где если две пары CH1/CL содержат мутации, облегчающие спаривание двух разных пар VH/VL, то две пары CH1/CL не содержат одинаковые мутации.
20. Антигенсвязывающий белок по п. 18 или 19, дополнительно содержащий по меньшей мере одну пару VH/VL, содержащую мутации с заменой на противоположно заряженный аминокислотный остаток, облегчающие спаривание, при этом указанные мутации с заменой на противоположно заряженный аминокислотный остаток предусматривают (1) мутированный остаток в участке VH в положении 39 согласно Кабату, выбранный из E, D, K, R или H, и (2) мутированный остаток в участке VL в положении 38 согласно Кабату, выбранный из E, D, K, R или H, и где мутированный остаток в участке VH имеет заряд, противоположный заряду мутированного остатка в участке VL.
21. Антигенсвязывающий белок, содержащий
антигенсвязывающий домен и
константный участок CH1 тяжелой цепи, спаренный с константным участком CL легкой цепи,
где антигенсвязывающий домен селективно связывается с целевым антигеном, и где участок CH1 и участок CL содержат одну или обе из
a) мутации L143E, L143D, L143K, L143R или L143H в участке CH1 и мутации S176E, S176D, S176K, S176R или S176H в участке CL; и
b) мутации K221E и K228D в участке CH1 и мутации D122K и E123K в участке CL,
где мутированный остаток в участке СH1 имеет заряд, противоположный заряду мутированного остатка в участке СL.
22. Антигенсвязывающий белок по п. 21, дополнительно содержащий по меньшей мере одну пару VH/VL, содержащую мутации с заменой на противоположно заряженный аминокислотный остаток, облегчающие спаривание, при этом указанные мутации с заменой на противоположно заряженный аминокислотный остаток предусматривают (1) мутированный остаток в участке VH в положении 39 согласно Кабату, выбранный из E, D, K, R или H, и (2) мутированный остаток в участке VL в положении 38 согласно Кабату, выбранный из E, D, K, R или H, и где мутированный остаток в участке VH имеет заряд, противоположный заряду мутированного остатка в участке VL.
23. Мультиспецифический антигенсвязывающий белок по любому из пп. 1-22, дополнительно содержащий один или несколько остатков цистеина, сконструированных в одну или несколько пар VH/VL с образованием одной или нескольких дисульфидных связей.
24. Мультиспецифический антигенсвязывающий белок по п. 23, где один или оба участка VH содержат одну или обе из мутаций 44°C и 105°C, и один или оба участка VL содержат одну или обе из мутаций 100°C и 43°C.
25. Набор, содержащий одну или несколько выделенных молекул нуклеиновой кислоты, содержащих одну или несколько нуклеотидных последовательностей, кодирующих мультиспецифический антигенсвязывающий белок по любому из пп. 1-24.
26. Набор, содержащий один или несколько векторов экспрессии, содержащих одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты по п. 25.
27. Выделенная клетка-хозяин, содержащая одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты по п. 25 или один или несколько векторов экспрессии по п. 26.
28. Фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и мультиспецифический антигенсвязывающий белок по любому из пп. 1-24.
29. Способ лечения нарушения, при котором активность антигена оказывает отрицательное воздействие, при этом способ предусматривает введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества мультиспецифического антигенсвязывающего белка по любому из пп. 1-24.
30. Мультиспецифический антигенсвязывающий белок или антигенсвязывающий белок по любому из пп. 1-24, содержащий три HCDR для каждого участка VH и три LCDR для каждого участка VL и дополнительно характеризующийся специфичностью связывания с одним или несколькими целевыми антигенами или одним или несколькими целевыми эпитопами.