Способ получения высокомолекулярного коллагена
METHOD FOR PRODUCING HIGH-MOLECULAR COLLAGEN

Изобретение относится к перерабатывающей, косметической и пищевой промышленности, а именно к способу получения коллагена.
Способ может быть использован для получения или обогащения медицинских и косметических препаратов, биологически активных добавок, а также функциональных и специализированных продуктов питания.
2
4
Из уровня техники известен способ обработки коллагенсодержащего сырья, при котором сырье (отходы рыбного шкуросырья) замораживают, измельчают на кусочки 20×20 мм и дефростируют водопроводной водой при 2-3-кратной ее смене при температуре 18-20°С в течение 4 часов, обезжиривают щелочно-солевой обработкой, промывают, нейтрализуют, растворяют в органической кислоте, гомогенизируют полученный коллагенсодержащий раствор. В качестве коллагенсодержащего сырья используют отходы шкур рыб, обезжиривание которых осуществляют щелочно-солевым раствором, содержащим 4-5% NaOH и 6-7% NaSO, при жидкостном коэффициенте, равном 3, в течение 18-20 часов, коллаген промывают водой в течение 30 мин, нейтрализуют в один прием раствором сульфата аммония с концентрацией 4,5-5% сульфата аммония от массы исходного сырья в течение 90-120 мин, при этом все технологические процессы проводят при комнатной температуре (патент RU 2139937, заявка 98122080/12, приоритет 07.12.1998, патентообладатель Восточно-Сибирский государственный технологический университет, Байкальский институт природопользования СО РАН).
Недостатком данного способа является неоднородность качества полученного коллагена в смеси и наличие сопутствующих органических и неорганических примесей, полученных в результате химических реакций при обработке, а также микроэлементов, находящихся в составе исходного материала - шкурах.
Из уровня техники известен способ комплексной переработки рыбного сырья для получения гиалуроновой кислоты и коллагена (патент RU 2501812, заявка 2012104315/10, приоритет от 07.02.2012, патентообладатель Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Воронежский государственный университет инженерных технологий), согласно которому шкуры прудовых рыб промывают холодной проточной водой в течение 10-15 мин. Измельчают их до размера 2-3 мм. Проводят водную экстракцию при температуре 40-45°С в течение 40-50 мин при соотношении измельченные шкурьквода равном 1:1 при периодическом перемешивании, фильтруют. Твердую фракцию подвергают отбеливанию в течение 12 ч перекисно-солевым раствором, который готовят путем смешивания 1 л 3%-ной перекиси водорода и 20 г хлорида натрия. Обработку отбеленной твердой фракции 1,0-1,2%-ным проводят раствором гидроксида натрия в течение 24 ч при температуре 20-25°С с последующей нейтрализацией полученной смеси 3%-ным раствором борной кислоты. Обработку набухшей твердой фракции проводят раствором ферментного препарата «Панкреатин», взятым в количестве 0,5-0,6% к массе твердой фракции, в течение 1,5-2,0 ч при температуре 37-40°С. Промывку твердой фракции холодной проточной водой для удаления остатков «Панкреатина» с получением коллагена.
Недостатком способа является снижение качества полученного коллагена за счет частичной гидролизации молекулы белка перед этапом экстракции, отсутствие технологии разволокнения шкуры кислотной обработки, гидролизация белка и получение низкомолекулярного коллагена препаратом панкреатин, а также инициирование процессов денатурации при применении температур более 30°С.
В качестве прототипа выбран способ получения коллагенового продукта (патент RU 2614273, заявка 2014146938, приоритет от 24.11.2014, патентообладатель Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет инженерных технологий"), включающий приемку шкуры пресноводных рыб, очищение их от чешуи, прирезей мышечной ткани, плавников и механических загрязнений, первичную промывку, перекисно-щелочную обработку промытых шкур смесью пероксида водорода и гидроксида натрия с массовой концентрацией 3% и выдержку в течение 1,5-2 часов при температуре 20-25°С и гидромодуле 1:4, последующую промывку шкур в проточной воде при температуре 8-12°С в течение 10-15 мин, выдержку промытых шкур в растворе органической кислоты с последующей их гомогенизацией и фасовкой.
Недостатком прототипа является недостаточный выход количества полученного негидрализованного коллагена, а также большое количество примесей, солей, образованных в результате кислотно-шелочных реакций и микроэлементов в составе кожи рыбы.
Задачей настоящего изобретения является создание нового способа получения качественного высокоочищенного гидрата рыбного коллагена, (и изолята высокомолекулярного белка коллагена, в случае последующей сушки продукта) а именно гидрата коллагена с сохранением нитевидной структуры молекулы без денатурации и расщепления молекулы до аминокислот, пептидов и пептонов, для широкого использования в пищевой, косметической, медицинской и других отраслях промышленности.
Техническим результатом изобретения является повышение выхода качественной молекулы коллагена в гидратированной форме.
Поставленная задача и указанный технический результат достигаются тем, что в способе получения высокомоллекулярного коллагена, включающем приемку шкуры пресноводных рыб, очищение их от чешуи, прирезей мышечной ткани, плавников и механических загрязнений, первичную промывку, перекисно-щелочную обработку промытых шкур смесью пероксида водорода и гидроксида натрия с массовой концентрацией 3% и выдержку в течение 1,5÷2 часов при температуре 20÷25°С и гидромодуле 1:4, последующую промывку шкур в проточной воде при температуре 8÷12°С в течение 10÷15 мин, выдержку промытых шкур в растворе органической кислоты с последующей их гомогенизацией и фасовкой, согласно изобретению перед первичной промывкой шкуры пресноводных рыб дополнительно обрезают и сортируют по толщине шкуры, первичную промывку осуществляют раствором с пищевым растворителем жира на основе фруктовой кислоты, для перекисно-щелочной обработки промытых шкур используют пероксид водорода с массовой концентрацией 4,0%÷10,0%, выдержку промытых шкур в растворе органической кислоты осуществляют при рН раствора 1,0÷3,0 и во время выдержки осуществляют воздействие ультразвука, после выдержки в растворе органических кислот шкуры измельчают до частиц размером 2,0÷5,0 мм, нейтрализуют щелочным раствором до рН 4,5÷7,0, после гомогенизации смесь фильтруют от крупных частиц, в фильтрат добавляют воду в соотношении 1:5÷1:10 и подвергают холодной стерилизации, далее ультрафильтрации. При этом воздействие ультразвука осуществляют каждые 6÷10 часов по 30÷60 мин при 150÷300 кГц, нейтрализацию измельченных шкур проводят гидроксидом натрия или гидрокарбонатом натрия, в фильтрат добавляют дистиллированную воду, в качестве органической кислоты используют янтарную, лимонную или уксусную кислоты, а холодную стерилизацию осуществляют ультрафиолетом. В качестве пищевого растворителя жира используют вещества на основе фруктовых кислот (яблочной кислоты, молочной кислоты, лимонной кислоты, гликолевой кислоты, винной кислоты). В зависимости от целей дальнейшего использования продукт может быть дополнительно подвергнут лиофильной сушке для получения изолята высокомолекулярного белка коллагена.
Дополнительная сортировка и обрезка шкуры пресноводных рыб перед первичной промывкой необходима для получения однородного сырья, что обеспечит равномерное воздействие на поверхность шкуры и, соответственно, обеспечит выход продукта, исключая возможность гидрализации более тонких частей шкуры, то есть тонкая часть гидролизуется быстрее чем толстая.
Применение для первичной промывки пищевых растворителей жира значительно повышает качество выходящего продукта, так как исключает агрессивное воздействие (в прототипе - хозяйственного мыла) на молекулы белка в том числе и воздействует мягко на сырье, устраняя жировые фракции, которые влияют на качество готового продукта, усложняющие дальнейшую очистку. Также использование пищевых растворителей важно для последующего применения продукта в пищевой промышленности и фармацевтике в качестве медицинских изделий или биологически-активных веществ.
Использование для перекисно-щелочной обработки промытых шкур в смеси пероксида водорода с массовой концентрацией 4,0%÷10,0% обусловлено необходимостью очищения от красящего кожного пигмента рыбы и получения «чистого» продукта бело-молочного цвета. На практике отмечено, что использование перекиси водорода с концентрацией от 4,0 до 10,0% дает больший положительный эффект на очистку шкуры от пигмента, использование повышенной концентрации перекиси водорода обуславливает более темный цвет исходного сырья.
Использование органической кислоты, например янтарной, лимонной или уксусной, для выдержки промытых шкур при рН раствора 1,0÷3,0, необходимо для кислотного разволокнения нативного, природного коллагена до тропоколлагеновых субъединиц.
Применение во время выдержки ультразвукового воздействия позволяет ускорить кислотное разволокнение нативного коллагена. Параметры подбираются эмпирическим путем в зависимости от частоты, продолжительности воздействия и используемой волны. Так для периодического шести-десяти часового воздействия оптимальной продолжительностью являются 30÷60 мин и 150÷300 кГц.
Измельчение шкур после выдержки в растворе органических кислот до частиц размером 2,0÷5,0 мм с последующей нейтрализацией щелочным раствором, например раствором гидроксида натрия или гидрокарбоната натрия, до рН 4,5÷7,0 позволит повысить рН массы и с последующей гомогенизацией получить однородную массу с нейтральным рН, что положительно сказывается на качестве продукта.
Механическая фильтрация после гомогенизации позволит отделить неразволокненные фракции обработанного сырья для дальнейшей ультрафильтрации, ультрафильтрация позволяет убрать примеси и получить концентрированную массу чистого коллагена, химически связанного с водой - чистого высокомоллекулярного гидратированного коллагена.
Добавление в фильтрат с коллагеном воды, преимущественно дистиллированной, в соотношении 1:5÷1:10 необходимо для эффективного проведения холодной стерилизации, например ультрафиолетом, и последующей ультрафильтрации, для получения чистого гидратированного коллагена.
Способ получения высокомоллекулярного коллагена осуществляется следующим образом. Способ включает приемку шкуры пресноводных рыб, таких как толстолобик, карп, белый амур, сазан, щука, очищение их от чешуи, прирезей мышечной ткани, плавников и механических загрязнений, обрезку и сортировку по толщине шкуры, первичную промывку пищевым растворителем жира, перекисно-щелочную обработку промытых шкур смесью пероксида водорода с массовой концентрацией 4,0%÷10,0% и гидроксида натрия с массовой концентрацией 3% и выдержку в течение 1,5÷2 часов при температуре 20÷25°С и гидромодуле 1:4, последующую промывку шкур в проточной воде при температуре 8÷12°С в течение 10÷15 мин, выдержку промытых шкур в растворе органической кислоты при рН раствора 1,0÷3,0, во время выдержки осуществляют воздействие ультразвука, после выдержки в растворе органических кислот шкуры измельчают до частиц размером 2,0÷5,0 мм и нейтрализуют щелочным раствором до рН 4,5÷7,0, после чего их гомогенизируют и фильтруют, в фильтрат добавляют воду в соотношении 1:5÷1:10, осуществляют холодную стерилизацию, ультрафильтрацию и фасовку. В зависимости от целей дальнейшего использования продукт может быть подвергнут лиофильной сушке.
Пример 1 реализации способа.
Для получения высокомоллекулярного коллагена использовали шкуру толстолобика весом до 1 кг. Чешуя мелкая и имеет различную толщину шкуры, поэтому требуется обрезка и сортировка по толщине. Самая толстая хвостовая часть, поэтому было удалено около 5 см. Менее толстая часть - по краям, поэтому удаляют 1÷1,5 см. После сортировки получили три разных фракции: центральную часть, хвостовую, края шкуры. Разные части шкуры затем имеют различные временные периоды обработки. Очистку проводят ручным или машинным способом от чешуи, прирезей мышечной ткани, плавников и механических загрязнений. Для примера выбрана центральная часть шкуры. Проводят первичную промывку шкуры в машинах барабанного типа в растворе с пищевыми растворителями жира на основе фруктовой яблочной кислоты, которые разрешены для мытья фруктов и овощей для ликвидации жира в течение 30 мин. Затем для удаления из воды следов пищевого растворителя жира промытые таким образом шкуры тщательно промывают проточной водой. Далее необходимо провести обесцвечивания шкуросырья. Для этого центральную часть шкуры заливают смесью пероксида водорода с массовой концентрацией 8,0% и гидроксида натрия с массовой концентрацией 3%. Перекисно-щелочную обработку проводят в течение 2х часов при температуре 20-25°С и гидромодуле 1:4. Далее обработанные таким образом шкуры промывают в проточной воде при температуре 11°С в течение 15 мин. Шкуры заливают раствором лимонной кислоты до рН 2,0 с массовой концентрацией 4% и выдерживают 5 суток. Во время продолжительной выдержки воздействуют на массу каждые 8 часов ультразвуком в течение 50 мин при 150 кГц, это ускоряет разволокнение ткани. После шкуру толстолобика измельчают шинковальным станком до частиц размером 2÷5 мм. Полученную массу нейтрализуют гидрокарбонатом натрия до рН 7,0 и гомогенизируют плунжерным гомогенизатором. Далее механически фильтруют для удаления крупных частиц, остатков неразволокненной шкуры. Полученный фильтрат разводят стерилизованной дистиллированной водой 1:5, размешивают и полученную массу подвергают холодной стерилизации ультрафиолетом. При ультрафильтрации через керамическую мембрану с диаметром отверстий 5 нм через каналы проходит раствор солей и ионов (в примере ионы натрия, цитрат-ионы, механически связанная вода, с растворенными в ней солями и микроэлементами), на поверхности мембраны остается чистый белок - коллаген в гидратной форме (коллаген и химически связанная вода), а также происходит процесс концентрирования. Полученную массу упаковывают в вакууме в вакуумную тару, используя в дальнейшем как сырье для косметических средств и пищевых продуктов, или используют как сырье в фармацевтической промышленности в качестве биологически-активных добавок. Часть массы высушивают низкотемпературным лиофильным способом, упаковывают в вакуумную тару для дальнейшего использования в производстве сухих форм.
Полученный в примере продукт имеет молочно-белый цвет и содержит 80% коллагена, 20% воды, жиры, соли, микроэлементы отсутствуют. После низкотемпературной лиофильной сушки продукт удается сконцентрировать до 99,9% содержания коллагена.
Пример 2 реализации способа.
Способ аналогичен примеру 1. За исключением следующего. Для получения высокомолекулярного коллагена использовали шкуру толстолобика, ее хвостовую часть, которая является самой толстой частью шкуры. После перекисно-щелочной шкуры заливают раствором лимонной кислоты до рН 2,0 с массовой концентрацией 6% и выдерживают 7 суток. Во время продолжительной выдержки воздействуют на массу каждые 8 часов ультразвуком в течение 50 мин при 250 кГц, это ускоряет разволокнение ткани. Полученный в примере продукт имеет молочно-белый цвет и содержит 80% коллагена, 20% воды, жиры, соли, микроэлементы отсутствуют. После низкотемпературной лиофильной сушки продукт удается сконцентрировать до 99,9% содержания коллагена.
Заявленное изобретение на практике показало свою эффективность в достижении технического результата. Предложенный способ может быть реализован в условиях промышленного производства с использованием стандартного оборудования, общеизвестных технологий и материалов. Специалисту в данной области техники очевидно множество других вариантов осуществления изобретения, представленного в приведенном выше описании. Поэтому, следует понимать, что изобретение не ограничивается конкретным раскрытием воплощения и другие варианты выполнения могут быть включенными в объем предлагаемой формулы.