Изучение возможности применения метода малоуглового рассеяния лазерного света для определения подлинности активного фармацевтического ингредиента анаферона детского

http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2018-20-5-107-112

УДК 535.4; 615.1; 615.07

ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА МАЛОУГЛОВОГО РАССЕЯНИЯ ЛАЗЕРНОГО СВЕТА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОДЛИННОСТИ АКТИВНОГО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО ИНГРЕДИЕНТА АНАФЕРОНА ДЕТСКОГО

Никифорова М.В., Успенская Е.В., Сыроешкин А.В.

ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов», г. Москва, Российская Федерация

Аннотация. С помощью метода малоуглового рассеяния лазерного света (лазерной дифракции света, ОФС.1.2.1.0008.15, ГФ РФ XIII) были выявлены отличия размерных распределений частиц в исследуемых растворах лекарственного препарата анаферон детский и растворах соответствующих контролей. Проценты отличий коэффициентов экстинкции (е) препарата от е соответствующих контролей варьировали от 4,4% до 10,5% (разные дни, две серии образцов препаратов и контролей). Результаты настоящего исследования могут служить основой для более расширенных исследований оценки пригодности данного метода для определения подлинности активного фармацевтического ингредиента (АФИ) анаферона детского и АФИ других релиз-активных препаратов.

Ключевые слова: лазерная дифракция, релиз-активные препараты, анаферон.

На фармацевтическом рынке широко представлены лекарственные препараты, активным фармацевтическим ингредиентом (АФИ) которых являются релиз-активные (РА) формы антител [1, 2]. Данные препараты хорошо зарекомендовали себя для лечения широкого спектра заболеваний: вирусных инфекций, урогенетальных, метаболических заболеваний, психоэмоциональных расстройств и т.д. [3-7].

Ранее были разработаны методики, позволяющие обнаружить наличие РА форм антител в исследуемых образцах, регистрируя их функциональную активность: это метод иммуноферментного анализа и метод пьезокварцевых иммуносенсоров [8-10]. Однако, до сих пор актуальной задачей является разработка более простых физико-химических методов анализа, позволяющих идентифицировать РА формы антител.

Для настоящего исследования был взят РА препарат анаферон детский, активным фармацевтическим ингредиентом которого является РА форма антител к интерферону (ИФН) гамма. Анаферон детский является препаратом с широким спектром противовирусной активности, зарекомендовавший себя как безопасный и эффективный средство для борьбы с вирусными инфекциями [11-13].

В настоящее время ведется поиск методов, позволяющих на структурном уровне выявить РА формы, а также методов и подходов, позволяющих определить, какие именно физические структуры и явления могут обуславливать релиз-активность в РА препаратах. Так, было показано, что в водных растворах сверхвы-

соких разведений различных биологически-активных веществ присутствуют водные наноструктуры, которые могут обуславливать "особые" свойства и биологическую активность таких растворов [14, 15]. Также в литературе описывают наличие гигантских гетеро-кластеров воды (плотностных неоднородностей размером до миллиметра) в водных растворах низких концентраций (сверхвысоких разведений) веществ [16-18]. Эти данные позволяют высказать предположение о наличии аналогичных структур, самоорганизующихся дисперсных систем, при растворении РА препаратов [15].

Целью исследования являлось изучение возможности применения метода малоуглового рассеяния лазерного света (Low-Angle Laser Light Scattering, LALLS) для идентификации РА форм антител к ИФН гамма. Данный метод описан в общей фармакопейной статье «Определение распределения частиц по размеру методом лазерной дифракции света» (ОФС.1.2.1.0008.15, ГФ РФ XIII) и применяется для контроля качества лекарственных препаратов. С помощью данного метода, позволяющего измерять размеры частиц дисперсной фазы в пределах от 0,1 до 2000 мкм, проводят быстрый и надежный гранулометрический анализ взвесей, суспензий и эмульсий, а также разработана методика исследования растворимости АФИ в жидких средах [19]. Данный метод имеет ряд важных преимуществ: высокая чувствительность, простота исполнения, быстрота и небольшая себестоимость проводимых анализов.

В данной работе были исследованы порошки лактозы моногидрата (SuperTab 30GR, DMV-Fonterra Excipients GmbH & Co. KG, Германия), насыщенные РА формой антител к ИФН гамма (АФИ препарата анаферон детский) в установке псевдоожиженного (кипящего) слоя (Huttlin Pilotlab, Bosch Packaging Technology GmbH, Германия) - образцы двух серии: 1.1 и 2.1, и контроли: 1) образцы 1.2 и 2.2 - порошки лактозы моногидрата, насыщенные 36% водным раствором этилового спирта в тех же условиях, что и образцы препарата, и 2) образцы 1.3 и 2.3 - порошки лактозы моногидрата ненасыщенные (интактные) разных серий, которые были использованы для получения вышеописанных образцов, а именно для приготовления образцов 1.1 и 1.2 использовали интактную лактозу образец 1.3, а для приготовления образцов 2.1 и 2.2 использовали интактную лактозу образец 2.3.

Измеряли объемное распределение частиц методом малоуглового рассеяния лазерного света (Low-Angle Laser Light Scattering, LALLS) с помощью Измерителя дисперсности лазерного (ИДЛ-1, модель «Кластер-1», аналог прибора МИД-5, «Институт коллоидной химии и химии воды» Украинской национальной академии наук). Данный метод основан на регистрации интенсивности рассеянного света, угловая зависимость которого определяется размером и оптическими свойствами частиц.

Отбор проб порошков каждого из исследуемых образцов для проведения данного исследования проводился в соответствии с внутренней процедурой отбора проб, соответствующей требованиям ОФС.1.1.0005.15. «Отбор проб лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов», и при соблюдении санитарно-гигиенических правил и условий, исключающих загрязнение проб.

При приготовлении проб для проведения анализа, а именно водных растворов лактозы с концентрацией 2% отбирались навески каждого образца лактозы по 0,2 г с точностью 0,2±0,0007 г. Взвешивание проводилось на аналитических весах Discovery DV215CD (OHAUS, Швейцария). Навески количественно переносили в пробирки Corning номинального объемом 15 мл, добавляли 10 мл воды с пониженным содержанием дейтерия (D/H <5 ppm) комнатной температуры и аккуратно перемешали (переворачивая пробирку) до полного растворения лактозы моногидрата. Лактозы моногидрат легко растворялся.

В качестве фонового раствора применяли н-гексан. Перед измерениями н-гексан отфильтровали через стерильные мембранные фильтры Fluoropore с диаметром пор 0,22 мкм (каталожный номер FGLP02500,

Merck Millipore, Германия). Далее н-гексан отбирали из кюветы и оставляли кювету в приборе с открытой крышкой до ее полного высыхания. Затем, не вынимая кювету из кюветного отделения, дозировали исследуемый раствор. Измерения растворов лактозы проводились после их инкубации при комнатной температуре в течение 1,5 часов в авторежиме (запись в течение 7 мин, интервал между измерениями 30 с). Объем проб для измерений составлял 3 мл. Проводили повторные измерения, анализируя три репрезентативные пробы одной серии образца. Все исследуемые растворы разливали по чистым флуоресцентным кварцевым кюветам 10х10 мм 111-QS (Helma, Германия) и герметично закрывали пробками к этим кюветам в ламинарном боксе в стерильных условиях для исключения загрязнения проб для анализа, после чего передавались на измерения. Таким образом, были предприняты все необходимые меры для исключения риска попадания загрязнений в исследуемые растворы.

С помощью Лазерного малоуглового измерителя дисперсности ИДЛ-1 регистрировали интегральные характеристики дисперсности: объемную концентрацию W в %, оптическую плотность ln(Io/I), где I - интенсивность света, измеренная детектором в присутствии образца в ячейке, I0 - интенсивность света, измеренная детектором при отсутствии образца. Объемная концентрация W представляет собой отношение объема всех частиц к единице объема раствора. Коэффициент экстинкции (е) рассчитывался как отношение оптической плотности к объемной концентрации (ln(I0/I)/W).

Результаты измерений представляли собой спектры распределения доли (в процентах) дисперсных фаз (плотностных неоднородностей), детектируемых в образцах лактозы моногидрата, растворенных в воде с пониженным содержанием дейтерия, от их общего количества по размерам в интервале 0,5-140 мкм. Все результаты для исследуемых растворов были получены с учетом вычитания исходного фонового сигнала (фильтрованного н-гексана). Измерения проводились в трех повторах (n=3).

Было выявлено, что во всех исследуемых растворах преобладали размеры частиц дисперсной фазы от 12 до 50 мкм, но значения коэффициентов экстинкции (е) разных исследуемых образцов отличались. Причем значения коэффициентов экстинкции (е) для каждого исследуемого образца не менялись со временем в течение 7 минут детектирования (рисунок 1), то есть растворы были стабильны.

180 ДЕНЬ 3

175

170

165

155 И Образец 2.2

145

140 0

1 2 3 4 t, мин 5 6 7

Рис. 1. Изменение коэффициентов экстинкции (е) исследуемых образцов во времени (^ мин).

Примечание: Было проведено четыре эксперимента в разные дни. Образец 1.1 и 2.1 - анаферон детский двух производственных серий, образцы 1.2 и 1.3- контроли двух производственных серий

Были рассчитаны проценты отличий коэффициентов экстинкции (е) препарата анаферон детский от е соответствующих контролей (таблица 1), которые варьировали от 4,4% до 10,5%.

Таблица 1

Отличия (в процентах) коэффициентов экстинкции (е) препарата анаферона детского (двух серий) от е контролей, измеренных в разные дни

Серии образцов препарата Отличие (в %) g препарата от е контролей:

интактной лактозы лактозы, насыщенной растворителем, используемом в приготовлении АФИ препарата

1.1 8,7 4,4

10,5 8,1

2.1 6,3 4,4

7,6 4,5

Отличия между группами препаратов двух серий и соответствующих контролей в значениях коэффициентов экстинкции были показаны по результатам статистической обработки данных, а именно после проведения однофакторного дисперсионного анализа с поправкой Тьюки для множественных сравнений.

Анализ проводился с использованием средств языка R version 3.4.2 (2017-09-28). Основной величиной сравнения являлся средний уровень показателя на указанном промежутке, различия считались статистически значимыми при p <0,5 (рисунок 2).

Рис. 2. Статистическая обработка результатов измерений.

Примечание: Использована линейная модель со смешанными эффектами (день эксперимента  ные сравнения проводились между группами с помощью критерия Тьюки.

случайный эффект), попар-

Таким образом, было подтверждено, что образцы лактозы моногидрата, насыщенные раствором РА антител к ИФН гамма (АФИ анаферона детского), отличаются от образцов лактозы моногидрата, насыщенных в тех же условиях растворителем, используемом для приготовления раствора РА антител к ИФН гамма для насыщения, и от ненасыщенной лактозы моногидрата, используемой при их производстве. Причем данная тенденция сохраняется при смене в производственном процессе серии исходной интактной лактозы моногидрата.

В настоящей работе изложены результаты измерений коэффициентов экстинкции препарата анаферон детский двух серий и коэффициентов экстинкции соответствующих контролей (лактозы моногидрата, насыщенной растворителем, и ненасыщенной лактозы, по две серии) методом малоуглового рассеяния лазерного света. Данный метод позволил зафиксировать в релиз-активном препарате анаферон детский, растворенном в воде с пониженным содержанием дейтерия, самоорганизующиеся дисперсные фазы (плотностные неоднородности) определенных размеров и выявить отличия размерных распределений в препарате и контролях. В практическом плане результаты настоящего исследования могут служить основой для более расширенных исследований оценки пригодности данного метода для определения подлинности АФИ анаферона детского и других РА препаратов и возможности его применения для их контроля качества.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

[1] Эпштейн О.И. Феномен релиз-активности и гипотеза "пространственного" гомеостаза // Успехи физиологических наук. 2013. Т. 44. № 3. С. 54-76.

[2] Эпштейн О.И. Сверхмалые дозы (история одного исследования). - М.: РАМН. 2008. 336 с.

[3] Castagne V., Lemaire M., Kheyfets I. et al. Antibodies to S100 proteins have anxiolytic-like activity at ultra-low doses in the adult rat // J Pharm Pharmacol. 2008. V. 60. P. 309-316.

[4] Chu X., Agmo A. Sexual incentive motivation in old male rats: the effects of sildenafil and a compound (Impaza) stimulating endothelial NO synthase // Pharmacol Bio-chem Behav. 2008. V. 89. P. 209-217.

[5] Chu X., Zhavbert E.S., Dugina J.L., Kheyfets I.A. et al. Sildenafil and a compound stimulating endothelial NO synthase modify sexual incentive motivation and copulato-ry behavior in male Wistar and Fisher 344 rats // J Sex Med. 2008. V. 5. P. 2085-2099.

[6] Dugina J.L., Petrov V.I., Babayeva A.R., Martyushev-Poklad A.V. et al. A randomized, open-label, comparative, 6-month trial of oral ultra-low doses of antibodies to tumor necrosis factor-alpha and diclofenac in rheumatoid arthritis // Int J Tissue React. 2005. V. 27. P. 15-21.

[7] Костинов М.П. Новый препарат для лечения гриппа и острых респираторных вирусных инфекций // Инфекционные болезни. 2011. Т. 9. № 4. С. 29-34.

[8] Gavrilova E.S., Bobrovnik S.A., Sherriff G., Myslivets A.A. et al. Novel approach to activity evaluation for release-active forms of anti-interferon-gamma antibodies based on enzyme-linked immunoassay // PLoS One 2014. V. 9. P. e97017.

[9] Don E., Farafonova O., Pokhil S., Barykina D.V. et al. Use of Piezoelectric Immunosensors for Detection of In-terferon-Gamma Interaction with Specific Antibodies in the Presence of Released-Active Forms of Antibodies to Interferon-Gamma // Sensors. 2016. V. 16. P. 96.

[10] Pschenitza M., Gavrilova E.S., Tarasov S.A. Application of a heterogeneous immunoassay for the quality control testing of release-active forms of diclofenac // Int Im-munopharmacol. 2014. V. 21. P. 225-230.

[11] Tarasov S.A., Zarubaev V.V., Gorbunov E.A., Sergeeva S.A. et al. Activity of ultra-low doses of antibodies to gamma-interferon against lethal influenza A(H1N1)2009 virus infection in mice // Antiviral Res. 2012. V. 93. № 2. P. 219-224.

[12] Petrova N.V., Emelyanova A.G., Gorbunov E.A., Edwards M.R. et al. Efficacy of novel antibody-based drugs against rhinovirus infection: In vitro and in vivo results // Antiviral Res. 2017. V. 142. P. 185-192.

[13] Tarasov S.A., Kachanova M.V., Gorbunov E.A., Zabolot-neva J.A. et al. Anaferon, released-active from of antibodies to IFNy, as an effective medicine for treatment and prophylaxis of a wide spectrum of infections // Clinical Research and Trials. 2016. V. 2. № 5. P. 229-232.

[14] Коновалов А.И., Рыжкина И.С. Образование нано-ассоциатов - ключ к пониманию физико-химических и биологических свойств высокоразбавленных водных растворов // Известия Академии наук. Серия химическая. 2014. № 1. С. 1-14.

[15] Рыжкина И.С., Муртазина Л.И., Киселева Ю.В., Коновалов А.И. Самоорганизация и физико-химические свойства водных растворов антител к интерферону-гамма в сверхвысоком разведении // Доклады академии наук. 2015. Т. 462. № 2. С. 185-189.

[16] Лаптев Б.И., Сидоренко Г.Н., Горленко Н.П., Кульчен-ко А.К. и др. Оценка структуры воды и водных растворов хлорида натрия с использованием диэлектро-метрии и резонансного метода // Вестник ТГАСУ. 2013. № 2. С. 235-244.

[17] Сыроешкин А.В., Смирнов А.Н., Гончарук В.В., Успенская Е.В. и др. Вода как гетерогенная структура // Электронный научный журнал «Исследовано в России». 2006. С. 843-854.

[18] Бурлакова Е.Б., Конрадов А.А., Мальцева Е.Л. Действие сверхмалых доз биологически активных веществ и низкоинтенсивных физических факторов // Химическая физика. 2003. Т. 22. № 2. С. 21-40.

[19] Анфимова Е.В., Успенская Е.В., Плетнева Т.В., Сыроешкин А.В. Исследование кинетики растворимости лекарственных субстанций методом лазерной дифракции в водных растворах с различным изотопным составом по водороду. // Разработка и регистрация лекарственных средств. 2017. №1 (18). С. 152-155.

STUDY OF THE POSSIBILITY TO APPLY THE METHOD OF LOW-ANGLE LASER LIGHT SCATTERING FOR THE DETERMINATION OF IDENTITY OF ACTIVE PHARMACEUTICAL INGREDIENT OF ANAFERON FOR CHILDREN

Nikiforova M. V., Uspenskaya E.V., Syroeshkin A.V.

RUDN University, Moscow, Russian Federation

Annotation. Low-angle laser light scattering (laser light diffraction, GPM. 1.2.1.0008.15, SP RFXIII Ed.) revealed the differences in particle size distribution in the study solutions of Anaferon for children, a drug product, and solutions of the respective controls. Percentage of the differences between extinction coefficients (e) of the drug and e of the respective controls varied form 4.4% to 10.5% (different days, two series of samples and controls). The study results may serve as a basis for assessing the suitability of this method for identification of active pharmaceutical ingredient (API) of Anaferon for children and APIs of other released-active drugs. Key words: laser diffraction, released-active drugs, anaferon.

REFERENCES

[1] Epstein O.I. The phenomenon of release activity and the hypothesis of "spatial" homeostasis // Usp Fiziol Nauk. 2013. V.44, №3. P. 54-76.

[2] Epstein OI. Ultra-Low Doses (History of one study). Moscow: Publishing House of RAMN; 2009. 336 p.

[3] Castagne V., Lemaire M., Kheyfets I. et al. Antibodies to S100 proteins have anxiolytic-like activity at ultra-low doses in the adult rat // J Pharm Pharmacol. 2008. V. 60. P. 309-316.

[4] Chu X., Agmo A. Sexual incentive motivation in old male rats: the effects of sildenafil and a compound (Impaza) stimulating endothelial NO synthase // Pharmacol Bio-chem Behav. 2008. V. 89. P. 209-217.

[5] Chu X., Zhavbert E.S., Dugina J.L., Kheyfets I.A. et al. Sildenafil and a compound stimulating endothelial NO synthase modify sexual incentive motivation and copulato-ry behavior in male Wistar and Fisher 344 rats // J Sex Med. 2008. V. 5. P. 2085-2099.

[6] Dugina J.L., Petrov V.I., Babayeva A.R., Martyushev-Poklad A.V. et al. A randomized, open-label, comparative, 6-month trial of oral ultra-low doses of antibodies to tumor necrosis factor-alpha and diclofenac in rheumatoid arthritis // Int J Tissue React. 2005. V. 27. P. 15-21.

[7] Kostinov M.P. A new drug for treatment of influenza and acute respiratory viral infections. // Infections diseases. 2011. V. 9. № 4. P. 29-34.

[8] Gavrilova E.S., Bobrovnik S.A., Sherriff G., Myslivets A.A. et al. Novel approach to activity evaluation for release-active forms of anti-interferon-gamma antibodies based on enzyme-linked immunoassay // PLoS One 2014. V. 9. P. e97017.

[9] Don E., Farafonova O., Pokhil S., Barykina D.V. et al. Use of Piezoelectric Immunosensors for Detection of In-terferon-Gamma Interaction with Specific Antibodies in the Presence of Released-Active Forms of Antibodies to Interferon-Gamma // Sensors. 2016. V. 16. P. 96.

[10] Pschenitza M., Gavrilova E.S., Tarasov S.A. Application of a heterogeneous immunoassay for the quality control testing of release-active forms of diclofenac // Int Im-munopharmacol. 2014. V. 21. P. 225-230.

[11] Tarasov S.A., Zarubaev V.V., Gorbunov E.A., Sergeeva S.A. et al. Activity of ultra-low doses of antibodies to gamma-interferon against lethal influenza A(H1N1)2009 virus infection in mice // Antiviral Res. 2012. V. 93. № 2. P. 219-224.

[12] Petrova N.V., Emelyanova A.G., Gorbunov E.A., Edwards M.R. et al. Efficacy of novel antibody-based drugs against

rhinovirus infection: In vitro and in vivo results // Antiviral Res. 2017. V. 142. P. 185-192.

[13] Tarasov S.A., Kachanova M.V., Gorbunov E.A., Zabolot-neva J.A. et al. Anaferon, released-active from of antibodies to IFNy, as an effective medicine for treatment and prophylaxis of a wide spectrum of infections // Clinical Research and Trials. 2016. V. 2. № 5. P. 229-232.

[14] Konovalov A.I., Ryzhkina I.S. Formation of nanoassoci-ates as a key to understanding of physicochemical and biological properties of highly dilute aqueous solutions // Russian Chemical Bulletin. 2014. V. 63. № 1. P. 1-14.

[15] Ryzhkina I.S., Murtazina L.I., Kiseleva Y.V., Konovalov A.I. Self-organization and physicochemical properties of aqueous solutions of the antibodies to interferon gamma at ultrahigh dilution // Doklady Physical Chemistry. 2015. V. 462. № 1. P. 185-189.

[16] Laptev B.I., Sidorenko G.N., Gorlenko N.P., Kylchenko A.K. et al. Evalution of water structure and aqueous solution of sodium chloride using dielectrometry and resonance method // Vestnik TGASU. 2013. № 2. P. 235-244.

[17] Syroeshkin A.V., Smirnov A.N., Goncharuk V.V., Uspen-skaya E.V. et al. Water as a heterogeneous structure // Is-sledovano v Rossii (electronic publication in Russian). 2006. P. 843-854.

[18] Burlakova E.B., Konradov A.A., Maltseva E.L. The effects of ultra-low doses of biologically active substances and low-intensity physical factors // Himicheskaya fizika. 2003. V. 22. № 2. P. 21-40.

[19] Anfimova E.V., Uspenskaya E.V., Pleteneva T.V., Syroeshkin A.V. Solubility kinetics of drugs studied by LALLS method in water solutions with various hydrogen isotope content // Development and registration of drugs. 2017. №1 (18). P. 152-155.