СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ К КОМПЛЕКСНЫМ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТАМ
METHOD OF DETERMINING SENSITIVITY OF PATHOGENIC BACTERIA TO COMPLEX ANTI-BACTERIAL PREPARATIONS

Изобретение относится к ветеринарии, в частности, ветеринарной микробиологии, и может найти применение для определения чувствительности выделенных из патологического материала (паренхиматозные органы, носовые, влагалищные смывы, сперма, молоко и т.д.) микроорганизмов, обладающих множественной лекарственной устойчивостью к любым сочетаниям антибактериальных препаратов или готовым комплексным.
Широкое, нерациональное применение антибактериальных препаратов в ветеринарной практике сопровождается увеличением устойчивости микроорганизмов к этим препаратам. Более половины культур возбудителей, выделенных от павших и больных животных, оказываются одновременно устойчивыми к 14-16 препаратам, а также повышается количество культур, усиливающих свой рост в присутствии целого ряда препаратов (Страчунский Л.С. Состояние антибиотикорезистентности в России //. Клиническая фармакология и терапия - 2000, №2. - С.6 - 9. Клиническая микробиология для ветеринарных врачей. - М.: Колосс, 2006).
В ветеринарной практике для антибактериальной терапии часто используют комплексные препараты, эффективность применения которых так же, как и отдельных компонентов препаратов, определяется чувствительностью к ним выделенных возбудителей инфекционных болезней.
Для определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам используют способ диффузии в агар с применением дисков, содержащих определенное количество (5, 10, 15, 30, 150, 300 мкг-ЕД) антибактериального препарата (МУК по определению чувствительности к антибиотикам возбудителей инфекционных болезней животных. Утверждено ГУВМСХ СССР 30.09.1971).
Способ с использованием дисков прост в исполнении, но дает информацию только о бактериостатической активности конкретного антибактериального препарата. Он позволяет по диаметру зоны задержки роста (ЗЗР) определить минимальную подавляющую концентрацию антибактериального препарата в отношении испытуемой культуры возбудителя и классифицировать микроорганизмы на чувствительные с промежуточной чувствительностью и устойчивые (резистентные). Однако нельзя определить этим способом чувствительность резистентных микроорганизмов к действию широко используемых в ветеринарной практике комплексных препаратов из-за отсутствия стандартных бумажных дисков, содержащих одновременно два (или более) препарата.
Прототипом предлагаемого изобретения является способ серийных разведений на жидкой питательной среде (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. - М.: Медицина, 1973 г., с.177-178). Он заключается в том, что выделенная культура микроорганизма засевается в определенный объем среды (7-10 пробирок или чашек Петри на культуру), содержащей убывающие (от 125-500 до 0,03-0,1 мкг/мл) концентрации антибактериального препарата (или нескольких препаратов). Способ серийных разведений в жидкой питательной среде позволяет установить не только минимальную ингибирующую концентрацию (МИК), но и определить бактерицидную концентрацию (БАК) испытуемого препарата в отношении выделенного микроорганизма. Используя этот способ, определяется МИК и БАК вновь создаваемых комплексных препаратов в отношении различных культур микроорганизмов, в том числе с множественной лекарственной устойчивостью. Способ серийных разведений в жидкой питательной среде используется при исследовании чувствительности небольшого количества культур микроорганизмов, при этом устанавливается МИК антибактерального препарата. Для определения БАК необходим дополнительный посев из пробирок с наибольшим разведением препарата, где нет видимого роста культур на минимальную подавляющую концентрацию (МПА). Отсутствие роста на МПА свидетельствует о бактерицидном действии соответствующей концентрации препарата.
В клинической ветеринарной микробиологии способ серийных разведений в жидкой питательной среде имеет ограниченное применение из-за трудоемкости и громоздкости, тем более что чувствительность выделенных возбудителей необходимо определить не к одному, а к нескольким или даже 2-3 десяткам препаратов.
Предлагаемый способ решает задачу упрощения и снижения трудоемкости определения чувствительности микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью к комплексным антибактериальным препаратам. Достигаемый технический результат - сокращение времени определения чувствительности к любому количеству эффективных препаратов, которые могут быть использованы для лечения больного животного.
Для этого в способе определения чувствительности патогенных бактерий к комплексным антибактериальным препаратам, включающем разведение растворов антибактериальных препаратов стандартной питательной средой, внесение патогенных бактерий в приготовленные разведения, инкубирование их в термостате, визуальную оценку чувствительности патогенных бактерий к антибактериальным препаратам, согласно изобретению внесение патогенных бактерий осуществляют в разведение антибактериального препарата, приготовленного в терапевтической концентрации, заявленной производителем, раскапанного в лунки планшета, инкубирование проводят в течение 3÷4 часов, затем в питательную среду с антибактериальным препаратом и патогенными бактериями вводят бромкрезоловый пурпурный, проводят визуальную оценку окраски содержимого лунки и по изменению окраски с красной на желтую делают вывод о чувствительности патогенных бактерий к комплексному антибактериальному препарату, причем чувствительными к комплексным антибактериальным препаратам считают микроорганизмы, у которых отсутствует рост в питательной среде с антибиотиками и при добавлении индикатора цвет среды в лунке становится красным, как и в положительном контроле, а устойчивыми считают микроорганизмы, при культивировании которых в питательной среде с антибиотиками наблюдается рост и при добавлении индикатора цвет среды в лунке становится желтым, как и в отрицательном контроле. Бромкрезоловый пурпурный вводят в питательную среду с антибактериальным препаратом и патогенными бактериями в количестве 10 мкл 0,5% раствора.
Бромкрезоловый пурпурный - это аммонийная соль 5′,5′′-дибром-о-крезолсульфофталеина, химический реактив, индикатор, переход окраски раствора от желтой к пурпуровой в интервале рН 5,2-6,8.
Способ осуществляют следующим образом. Для испытания берут 12-18-часовые культуры возбудителей (микроорганизмов), выделенных из патологического материала и обладающих множественной лекарственной устойчивостью. Из 12-18-часовой агаровой культуры возбудителя готовят микробную взвесь на стерильном изотоническом растворе натрия хлорида, по стандарту мутности доводят ее концентрацию до 10 млн.м.т. в мл. В качестве питательной среды при определении чувствительности выделенного возбудителя к сочетаниям антибактериальных препаратов используют МПБ (рН 7,2-7,4) либо бульон Хоттингера (рН 7,4-7,6). В качестве индикатора, который добавляют в питательную среду с антибиотиком и культурой, используют 0,05÷1% бромкрезолового пурпурного, который при изменении среды в кислую сторону рН 5,2-6,8 меняет свой цвет с красного на желтый. В разборные (стрипованные) стерильные 96-луночные планшеты раскапывают раствор с терапевтическими концентрациями антибактериального препарата в 0,2 мл питательной среды +0,01 мл 10 миллиардной взвеси тестируемой культуры +0,01 мл 0,05÷0,1% раствора индикатора бромкрезоловый пурпурный. Количество лунок на каждую культуру испытуемого возбудителя соответствует числу сочетаний или комплексных антибактериальных препаратов, к которым определяется чувствительность, плюс одна пробирка для контроля, т.е. для каждого препарата или сочетания занимается одна лунка. В контрольную пробирку препарат не вносят.
Планшеты с заполненными лунками мясопептонным бульоном, антибиотиком, культурой и индикатором инкубируют в течение 3-4 часов в термостате при температуре 36±1°C. Проводят последующую визуальную оценку окраски содержимого лунки и по ее изменению делают вывод о чувствительности микроорганизма к антибактериальному препарату (при наличии изменения цвета контрольной лунки).
Изменение окраски с красной на желтую в контрольной лунке оценивается визуально, отсутствие изменения цвета в лунке с антибиотиками свидетельствует о чувствительности микроорганизмов к комплексным антибактериальным препаратам, изменение окраски бульона при росте испытуемой культуры в лунках с антибиотиками говорит об устойчивости микроорганизмов.
Эффективными считаются антибиотики или два антибактериальных препарата, или комплексные препараты (включают два и более антибактериальных препаратов), которые в растворе, содержащем их в терапевтической концентрации (заявленной производителем), задерживают рост испытуемых культур микроорганизмов. При отсутствии роста микроорганизма в питательной среде с добавленным антибактериальным средством отмечается стабильное состоянием рН, поэтому при добавлении индикатора цвет среды не изменяется.
В случае если антибактериальное средство неэффективно или недостаточно эффективно, его терапевтической концентрации недостаточно для задержки роста испытуемой культуры микроорганизма. Соответственно, при росте микроорганизма в питательной среде с добавлением антибактериального средства отмечается накопление кислых продуктов его жизнедеятельности и рН среды сменяется в кислую сторону, т.е. понижается, поэтому при добавлении индикатора цвет среды изменяется.
Проведенные микроскопические исследования мазков из лунок, где в присутствии антибактериальных препаратов не было изменения окраски бульона, показали отсутствие в мазках микробных клеток. При высеве из таких лунок 0,01 мл на МПА рост возбудителя отсутствовал либо на поверхности агара обнаруживали единичные колонии (до 10, редко больше).
Пример. Исследован патологический материал с крупного свинокомплекса от 60 павших и больных поросят разного возраста 26 групп. В 15 группах диагностирована смешанная кишечная инфекция, была вызвана в разных ассоциациях 46 микроорганизмами (энтеропатогенная Е. Coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella choleraesuis, реже другие), в разной степени устойчивыми одновременно к 14-16 антибактериальным препаратам (ампициллин, амоксициллин, гентамицин, тилозин, тетрациклин, рифампицин, полимиксин, норфлоксацин, энрофлоксацин, фуразолидон, фурагин, эритромицин, левомицетин, доксициклин, стрептомицин, неомицин и др.). С учетом наличия зоны задержки роста (ЗЗР) вокруг диска с антибактериальным препаратом (меньше, чем для чувствительного микроорганизма, либо наличие в ЗЗР отдельных колоний, «пленки»), совместимости (сенергидный либо аддитивный эффект) антибактериальных препаратов были подобраны и испытаны по предлагаемому способу следующие комплексные препараты (таблица 1).
В таблице 2 приведен пример чувствительности изолированных из 13 проб патматериала культур стрептококка группы Д Enterococcus faecalis на твердых питательных средах с использованием коммерческих дисков. Подобные таблицы составляются на каждую выделенную культуру микроорганизмов. Сочетания препаратов выбираются с учетом наличия ЗЗР (зоны задержки роста) на АГВ вокруг диска с антибактериальным препаратом (промежуточная чувствительность, наличие в ЗЗР отдельных колоний, «пленки»), либо берутся заранее известные компоненты, входящие в состав комплексного препарата (например, рифампицин и полимиксин, используемые в составе рифапола).
Полученную изолированную культуру микроорганизма испытывают на чувствительность к сочетанием антибактериальных препаратов, подобранных в лаборатории (таблица 3), взятых в заявленных для них стандартной бактерицидной концентрации, или к комплексным готовым коммерческим официнальным формам, в заявленной терапевтической концентрации (таблица 1).
В последнем варианте определение чувствительности выделенного возбудителя к комплексному препарату можно проводить параллельно с исследованием способа диффузии в агар (а не после него, как в первом случае).
Чувствительность возбудителей с множественной лекарственной устойчивостью к комплексным препаратам оказалась различной. Наиболее эффективными были в конкретной ситуации диоксиген - 95,6%, диоксинор - 94,4% культур, кинокол 93,4%, микобаксан - 91,3, наименьшей была чувствительность к пульмокиту (41,3%), который проверялся не по результатам чувствительности выделенных культур к дискам антибиотиков (дисков с китасамицином, входящим в препарат, на момент исследований в наличии не было), а по просьбе из хозяйства, т.к. в нем этот препарат применяется. В целом, во всех группах быстро были подобраны от 4 до 12 препаратов используемых в хозяйстве, которые можно использовать для эффективной антибактериальной терапии.
Контроль полученных результатов - определение чувствительности выделенных культур (МПК) к антибактериальным препаратам проводили с помощью общепринятого метода определения чувствительности к антибиотикам серийных разведений в жидкой питательной среде. Полученные результаты исследования были сопоставимы с результатами, полученными при определении антибактериальной чувствительности стандартным общепринятым методом и подтверждены эффективной антибактериальной терапией в хозяйстве.
Результаты проведенных исследований показывают, что чувствительность микроорганизма с установленной множественной лекарственной устойчивостью можно дополнительно определить к имеющимся в наличии препаратам, например, к 14 антибактериальным препаратам, включая и их комплексные сочетания, за 3-4 часа.
Предложенный способ определения чувствительности патогенных бактерий с множественной лекарственной устойчивостью к комплексным антибактериальным препаратам позволяет в лаборатории значительно сократить время и количество расходных материалов, снизить трудоемкость определения чувствительности микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью, а в хозяйстве более точно и в более ранние сроки назначать адекватную антибактериальную терапию.
Таблица 1
Результаты определения чувствительности культур с множественной лекарственной устойчивостью, выделенных из патологического материала, к комплексным антибактериальным препаратов.
№ п/п
Комплексный препарат (сочетание антибактериальных веществ/препаратов)
Концентрация в 1 мл среды, мкг (ЕД)
Кол-во исследованных культур
Чувствительные к препарату (кол-во/%)*
Устойчивые к комплексному препарату
МПК чувствительных культур мкг/мл (определена в прототипе)
МПК устойчивых культур мкг/мл (определена в прототипе)
1
Микобаксан ампициллина натриевая соль + окситетрациклина гидрохлорид + тетрациклина гидрохлорид + сульфадимезин + нистатин
10 мкг/мл
46
42/91,3
4
0,04-6,25
12,5-50
2
Колифлок колистина сульфат + энрофлоксацин
10 мкг/мл
46
39/84,8
7
3,7-6,25
12,5-50
3
Нифулин метронидазол + фуразолидон + хлортетрациклина гидрохлорид
10 мкг/мл
26
21/80,8
5
1,85-6,25
12,5-100
4
Квинокол Энрофлоксацин + гентамицин
10 мкг/мл
36
26/72,2
10
3,7-6,25
12,5-50
5
Диоксинор норфлоксацина гидрохлорид + диоксидин
10 мкг/мл
36
34/94,4
2
0,04-6,25
12,5-50
6
Амоксиклав амоксициллин + клавулановая кислота
10 мкг/мл
32
21/65,6
11
1,85- 6,25
12,5-100
7
Пульмокит китасамицин + триметоприм + сульфадиазина
10 мкг/мл
46
19/41,3
27
3,7-6,25
12,5-400
№ п/п
Комплексный препарат (сочетание антибактериальных веществ/препаратов)
Концентрация в 1 мл среды, мкг (ЕД)
Кол-во исследованных культур
Чувствительные к препарату (кол-во/%)*
Устойчивые к комплексному препарату
МПК чувствительных культур мкг/мл (определена в прототипе)
МПК устойчивых культур мкг/мл (определена в прототипе)
8
Фурамикс полимиксина сульфат + фуразолидон
10 мкг/мл
36
27/75
9
3,7-6,25
12,5-200
9
Тилоколин тилозин + колистина сульфат
10 мкг/мл
36
24/66,7
12
3,7-6,25
12,5-200
10
Рифапол полимиксин + рифампицин
10 мкг/мл
26
16/61,5
10
3,7-6,25
12,5-200
11
Диоксиген диоксидин + гентамицин
10 мкг/мл
46
44/95,6
2
1,85-6,25
12,5-50
12
Рифалекс левомицетин + рифампицин
10 мкг/мл
26
18/69,2
8
3,7-6,25
12,5-200
13
Гентаприм гентамицина сульфат + сульфадиметоксин + триметоприм
10 мкг/мл
46
34/73,9
12
1,85-6,25
12,5-100
14
Дизпаркол левомицетин + метронидазол + тилозин
10 мкг/мл
26
16/61,5
10
3,7-6,25
12,5-200
15
Кинокол (энрофлоксацин - колистина сульфат)
10 мкг/мл
46
43/93,4
3
3,7-6,25
12,5-100
16
Анзациклин рифампицин и тетрациклин
10 мкг/мл
46
38/82,6
8
1,85-6,25
12,5-200
Примечание - *расчет % чувствительных культур - 42 (чувствительные) : 46 (всего исследованных культур)*100=91,3%
Таблица 2
Результаты исследования чувствительности к антибактериальным препаратам на примере выделенных бактериальных культур Enterococcus faecalis. Исследование с помощью дисков с антибиотиками
Наименование
Зона задержки роста микроорганизмов, в мм
Воспроизводство сосуны
Воспроизводство свиноматки
уч. доращивания
уч. Откорма №1
уч. Откорма №2
0-1 дн
1-5 дн.
10-15 дн
№1
№2
№3
35 дн.
60 дн.
70 дн.
88 дн.
128 дн.
150 дн.
180 дн.
Ампициллин
ус
ус
17
ус
ус
ус
23р
22
30р
20р
23
-
-
Амоксициллин
ус
-
17
ус
12р
ус
24
15
25р
17
15
-
-
Линкомицин
ус
-
25
ус
12р
-
16пл
-
30р
27пл
ус
-
ус
Эритромицин
ус
-
ус
ус
-
ус
13
-
11пл
ус
ус
ус
-
Тетрациклин
-
8р
20р
ус
-
-
-
-
ус
20р
12р
12р
ус
Левомицетин
10
-
20р
18пл
ус
ус
10пл
10
12
13
-
-
8р
Рифампицин
ус
12р
18
11
12
13
12р
13
30пл
30р
30р
8р
10р
Гентамицин
10р
ус
ус
10
10р
ус
-
-
30пл
16
8р
11пл
15р
Полимиксин
-
18р
ус
ус
18р
10
13
-
10
10р
ус
14р
10
Фуразолидон
10р
18
-
20р
-
20
ус
10р
19
26
12р
14р
21р
Фурадонин
13р
17р
12пл
13пл
14р
21
-
15
24р
30р
15р
19р
17
Норфлоксацин
-
ус
10
14
10р
13
10
-
25р
20
12
15р
18р
Энрофлоксацин
12р
-
-
-
10пл
11
-
-
28
23р
17
10р
10р
Тилозин
-
ус
13р
ус
ус
ус
ус
-
15
15
ус
-
-
Стрептомицин
-
ус
-
-
-
11
-
-
23р
22р
ус
8р
10
Доксициклин
12
8р
15
10
10
10
13
10
12
20
13
12р
10р
«-» - отсутствие задержки роста культуры вокруг диска;
Р - в зоне задержки роста рост устойчивых рас микроорганизмов к антибактериальному препарату в виде отдельных колоний;
Пл - в зоне задержки роста «газона» сплошной рост устойчивых рас микроорганизмов к антибактериальному препарату в виде пленки;
Ус - усиление роста культур вокруг диска с антибактериальным препаратом.
Таблица 3
Результаты определения чувствительности культур с множественной лекарственной устойчивостью, выделенных из патологического материала, к сочетаниям антибактериальных препаратов в жидкой питательной среде.
№ п/п
Сочетание антибактериальных препаратов
Концентрация в 1 мл среды, мкг (ЕД)
Кол-во исследованных культур
Чувствительные к сочетанию
Устойчивые к сочетанию
1
Ампициллин + полимиксин
7,5+75
5
4
1
2
рифампицин + доксициклин
1,25+2,5
11
11
0
3
Гентамицин + энрофлоксацин
2,5+1,25
8
6
2
4
Полимиксин + рифампицин
75+1,25
8
7
1
5
Энрофлоксацин + Фуразолидон
1,25+75
12
10
2