Система редактирования генома CRISPR-Cas9 как средство изучения и способ генной терапии болезни Фабри

УДК 577.21:616-056.7

Макиев Георгий Георгиевич, Хестанова Марина Станиславовна, Кертанов Сослан Русланович, Хестанова Екатерина Артуровна студенты, лечебное дело Северо-Осетинская Государственная Медицинская Академия,

г. Владикавказ, Россия DOI: 10.24411/2520-6990-2020-11301

СИСТЕМА РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНОМА CRISPR-CAS9 КАК СРЕДСТВО ИЗУЧЕНИЯ И СПОСОБ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ БОЛЕЗНИ ФАБРИ

Makiev Georgiy Georgievich, Hestanova Marina Stanislavovna, Kertanov Soslan Ruslanovich, Hestanova Ekaterina Arturovna

students, faculty of general medicine North Ossetian State Medical Academy, Vladikavkaz, Russia

CRISPR-CAS9 GENOME EDITING SYSTEM AS A MEANS OF ANALYSIS AND METHOD OF

GENE THERAPY FOR FABRY DISEASE

Аннотация

В статье анализируются имеющиеся данные и перспективы использования системы редактирования генома CRISPR-Cas9 для изучения болезни Фабри, как классической лизосомальной болезни. Также описываются методики моделирования данной патологии на экспериментальных животных или культуре клеток с помощью CRISPR-Cas9, что открывает новые возможности для разработки и оценки эффективности новых фармакологических средств. Кроме того, в данной работе приводится пример методики генной терапии болезни Фабри на основе CRISPR-Cas9.

Abstract

The article analyzes the available data and prospects for using the crispr-Cas9 genome editing system to study Fabry disease as a classic lysosomal disease. It also describes methods for modeling this pathology in experimental animals or cell culture using CRISPR-Cas9, which opens up new opportunities for developing and evaluating the effectiveness of new pharmacological agents. In addition, this paper provides an example of a gene therapy technique for Fabry disease based on CRISPR-Cas9.

Ключевые словва: болезнь Фабри, CRISPR-Cas9, GLA, глоботриозилцерамид, генная терапия.

Keywords: Fabry disease, CRISPR-Cas9, GLA, globotriosylceramide, gene therapy.

Введение. Болезнь Фабри (БФ)- это редкая, прогрессирующая X-сцепленная патология из группы лизосомальных болезней накопления, вызванное снижением активности или полным отсутствием а-галактозидазы А (а-Gal А) [1,2]. Данные по распространённости очень разнятся, большинство источников приводят частоту встречаемости- от 1:117 000 до 1:476 000 живых новорожденных [3]. Однако приводится и более высокая частота- 1:10000 [4]. Такой разброс данных может говорить о низкой выявляемости, сложности в диагностики и малой информированностью медицинского персонала об этой проблеме, что подтверждает актуальность изучения различных аспектов болезни Фабри.

В основе патологии лежит мутация в гене GLA, картированном на Xq22. Это вызывает недостаточность альфа-галактозидаза А (а-Gal А). Этот фермент содержит приблизительно 429 аминокислот и отвечает за расщепление глоботриозилцерамида (Gb3) на галактозу и лактозилцерамид в лизосомах и, как следствие, накопление сфинголипидов, в частности Gb3. Аккумуляция происходит в широком диапазоне типов клеток, включая клетки эндотелия сосудов, эпителия почечных клубочков и

гладких мышц, а также ганглиоцитах, что объясняет преобладание клинических проявлений, обусловленных поражением этих органов. Наиболее характерным проявлением болезни Фабри является невропатическае боль- акропарестезия и приступообразные боли (кризы Фабри) [2]. Также можно выделить несколько патогномоничных симптомов нарушения зрения и слуха: вортексная кератопатия, радиальная задняя субкапсулярная катаракта (катаракта Фабри), нейросенсорная тугоухость. К позднему постановлению диагноза ведут множество неспецифических симптомов поражения почек, кожи (ангиокератомы), сердечно-сосудистой и пищеварительной систем, цереброваскулярные нарушения

[5].

Изнуряющие боли и остальные тяжелые проявления данной патологии ведут нарушению качества жизни пациентов с болезнью Фабри. Нередко на этом фоне развивается депрессивный синдром. Также характерным для данной категории больных является ранняя потеря трудоспособности. Приведённые факты указывают на необходимость разработки специфических способов лечения.

<<ш1кшетим~^©и©ма1>#щ51)),2©2© а medical sciences

Генетические основы. На сегодняшний день полученные экспериментальные данные позволяют охарактеризовать тип наследования болезни Фабри X-сцепленным доминантным с неполной пене-трантностью у женщин [6].

Ген, который кодирует a-GAL, охватывает приблизительно 12 kb. и семь экзонов. БФ может быть вызван несколькими типами молекулярных мутаций в этом гене [7]. В основном они относятся к несинонимическим однонуклеотидным полиморфизмам (SNPs): missense (57%), nonsense (11%). Также частичные делеции (6%), вставки (6%) и дефекты в процессинге РНК, которые приводят к ошибочным сплайсингам (6%) [8,9]. Взаимосвязь между генотипом и фенотипом является сложной, поскольку одна и та же мутация может определять различные клинические проявления. Это можно объяснить, как факторами окружающей среды, так и корреляцией с группой крови. Пациенты групп крови AB или B могут иметь более тяжелые проявления заболевания, поскольку они имеют дополнительное накопление гликосфинголипидов в мембране эритроцитов группы крови [10].

Применение CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 в настоящее время является наиболее широко используемым методом для редактирования генома. Эта техника универсальна. Она может быть использован для изменения регуляции генов, участвующих в процессах деградации и синтеза сфинголипи-дов, анализа функций генов, генерации нокаута или целенаправленных мутаций. Редактирование генома с помощью CRISPR-Cas9 используется в качестве подхода к лечению заболеваний и для создания моделей заболеваний. Оно осуществляется с помощью средств проектирования (инструментов) CRISPR-Cas9. Это компьютерные программные платформы и инструменты биоинформатики, целью которых является облегчение разработки направляющих (гидовых) РНК (gRNAs) и их дальнейшее использования системой редактирования генов CRISPR / Cas9.

Лечение. Суть применения CRISPR-Cas9 для лечения болезни Фабри заключается в редактировании генов для восстановления активности фермента. Так, в 2017 году Sheng-Kai Chang и его коллеги с использованием CRISPR-Cas9 восстановили активность фермента GLA в фибробластах пациентов с БФ после удаления мутации GLA IVS4 + 919 G> A. Эта специфическая мутация, по-видимому, связана с проявлением сердечно-сосудистых осложнений, в том числе и изменений миокарда по типу кардиомиопатии, с большей частотой встречаемости в тайваньской популяции (примерно 1:1500 мужчин). Мутация мешает нормальному сплайсингу РНК, производя усеченный белок GLA без активного центра фермента. Терапию проводили с CRISPR-Cas9, используя две единичные гидовые РНК (sgRNAs), выполняющих функцию делецион-ного инструмента (по механизму "молекулярных ножниц") для устранения мутаций в фибробластах пациентов с БФ. Продуктивность данной методики была доказана значительным увеличением активности GLA до значений, сопоставимых с таковыми

57_

показателями в нормальных фибробластах, и клиренсом внутриклеточного Gb3, оцененного с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания. Эта работа показала явные доказательства того, что CRISPR-Cas9 обладает потенциалом для генной терапии, направленной на генетические заболевания [11].

Моделирование. Использование CRISPR-Cas9 для моделирования болезни Фабри может быть использовано как для анализа действия различных лекарственных средств, так и для создания новых методик генной терапии.

Несколько исследователей применили CRISPR-Cas9 к БФ. В 2016 году исследователи использовали CRISPR-Cas9 для нокаута гена GLA (в экзоне 1) в клетках почечной ткани эмбрионов человека (HEK 293T), чтобы создать экспериментальные модели для изучение in vitro лекарственных средств для лечение болезни Фабри. В частности, они стремились разработать модель БФ для изучения фермент-заместительной терапии с рекомбинантным человеческим a-Gal-A (rha-GLA) [12].

В аналогичном исследовании также использовался CRISPR-Cas9 для создания клеточной модели болезни Фабри для оценки пригодности терапии фармакологическими шаперонами, целью которых является специфически связывать белковые структуры и стабилизировать их. В этом случае мишенью был экзон 3 гена GLA в HEK 293T. Хотя сайт-мишень был специфическим, одноклеточный анализ выявил различные мутации GLA, запускаемые CRISPR-Cas9, которые частично приводят к полной потере ферментативной функции. Следовательно, эта модель была успешной в получении разрушенного гена GLA, но метод не был очень обнадеживающим, так как было обнаружено множество мутаций для предположительно специфического "режущего" инструмента [13].

Кроме клеток HEK 293T для создания моделей болезни Фабри также используются эмбриональные стволовые клетки человека (hESCs). Был произведен нокаут GLA для дальнейшей направленной дифференциации в кардиомиоциты и исследования протеома. Модель была разработана для изучения аутофагической дисфункции и секреции экзосом при гипертрофической кардиомиопатии, связанной с БФ [14].

Другие случаи моделей БФ были сгенерированы из других клеточных линий, а именно из подоци-тов, полученных от человека с БФ, иммортализо-ванных путём активации гена теломеразы, [15] и из эндотелиальной клеточной линией человека. В обеих линиях производилось разрушение GLA, путём использования инструментов CRISPR-Cas9 [16, 18].

Технология CRISPR-Cas9 также использовалась для создания моделей in vivo, включая крыс с нокаутом GLA . Экспериментальные крысы были полностью лишены - a-Gal-A, что сопровождалось накоплением соответствующих биомаркеров: Gb3 и лизо^ЬЗ, в частности в сенсорных нейронах; и развитием болевого поведения у крыс. Также в ганглиях дорсального корешка крыс обнаруживали

значительные изменения N-гликана. Эта модель была использована для изучения потенциала переходного рецептора катионного канала анкирина 1 (TRPA1), локализованного в сенсорных нейронах крыс, в качестве потенциальной мишени для лечения боли у пациентов с БФ. При использовании антагониста TRPA1- HC-030031 болевое поведение у крыс с экспериментальной болезнью Фабри с успехом было полностью нивелировано [17, 19, 20].

Выводы. CRISPR-Cas9 успешно используется для анализа гена GLA и создания моделей болезни Фабри как in vitro, так и in vivo для поиска новых способов лечения. Кроме того, уже разработаны достоверные способы генной терапии болезни Фабри. Хотя CRISPR-Cas9 в большинстве случаев использовался для генерации модели заболевания, а не для непосредственно лечения, эти работы дают важную информацию для точного нацеливания гена GLA, в контексте таргетной терапии. Эта информация может быть использована в будущей генной терапии и интеграции немутантного гена GLA.

Список литературы:

1. Barbara Namer, Kirstin Orstavik, Roland Schmidt et al. Changes in Ionic Conductance Signature of Nociceptive Neurons Underlying Fabry Disease Phenotype. Front Neurol. 2017; 8: 335.

2. Juan M. Politei, Didier Bouhassira, Dominique P. Germain et al. Pain in Fabry Disease: Practical Recommendations for Diagnosis and Treatment. CNS Neurosci Ther. 2016 Jul; 22(7): 568-576.

3. Кузенкова Л. М., Намазова-Баранова Л. С., Подклетнова Т. В., Геворкян А. К., Вашакмадзе Н. Д., Савостьянов К. В., Студеникин В. М., Пушков С. А. Болезнь Фабри: особенности заболевания у детей и подростков. Вопросы современной педиатрии. 2015; 14 (3): 341-348.

4. Е.А. Каровайкина, С.В. Моисеев, Н.М. Буланов, А.С. Моисеев, Н.Р. Носова, В.В. Фомин. Распространенность и основные проявления поражения почек у пациентов с болезнью Фабри. Клиническая фармакология и терапия, 2018, 27

5. Sestito S., Ceravolo F., Concolino D. Anderson-Fabry disease in children // Curr. Pharm. Des. 2013. Vol. 19. № 33. P. 6037-6045.

Mehta A., Widmer U. Chapter 19 Natural history of Fabry disease. In: Mehta A., Beck M., Sunder-Plass-mann G., editors. Fabry Dis Ease: Perspectives from 5 Years of FOS. Oxford PharmaGenesis; Oxford, UK: 2006.

7. Keating GM, Simpson D. Agalsidase Beta: a review of its use in the management of Fabry disease. Drugs. 2007; 673):435-55.

9. Maier EM, Osterrieder S, Whybra C, Ries M, Gal A, Beck M, et al. Disease manifestations and X inacti-vation in heterozygous females with Fabry disease. Acta Paediatr. 2006; 95451):30-8.

10. Duro G., Zizzo C., Cammarata G., Burlina A., Burlina A., Polo G., Scalia S., Oliveri R., Sciarrino S.,

Francofonte D., et al. Mutations in the GLA Gene and LysoGb3: Is It Really Anderson-Fabry Disease? Int. J. Mol. Sci. 2018; 19:3726

11. Chang S.K., Lu Y.H., Chen Y.R., Hsieh Y.P., Lin W.J., Hsu T., Niu D.M. AB043. Correction of the GLA IVS4 + 919 G > A mutation with CRISPR/Cas9 deletion strategy in fibroblasts of Fabry disease. Ann. Transl. Med. 2017; 5.

12. Song H.-Y., Chiang H.-C., Tseng W.-L., Wu P., Chien C.-S., Leu H.-B., Yang Y.-P., Wang M.-L., Jong Y.-J., Chen C.-H., et al. Using CRISPR/Cas9-Mediated GLA Gene Knockout as an In Vitro Drug Screening Model for Fabry Disease. Int. J. Mol. Sci. 2016; 17:2089.

13. Lenders M., Stappers F., Niemietz C., Schmitz B., Boutin M., Ballmaier P.J., Zibert A., Schmidt H., Brand S.-M., Auray-Blais C., et al. Mutation-specific Fabry disease patient-derived cell model to evaluate the amenability to chaperone therapy. J. Med. Genet. 2019; 56:548-556.

14. Song H.Y., Chien C.S., Yarmishyn AA., Chou S.J., Yang Y.P., Wang M.L., Wang C.Y., Leu H.B., Yu W.C., Chang Y.L., et al. Generation of GLA-Knockout Human Embryonic Stem Cell Lines to Model Autophagic Dysfunction and Exosome Secretion in Fabry Disease-Associated Hypertrophic Cardiomyopathy. Cells. 2019; 8:327.

15. Pereira E.M., Labilloy A., Eshbach M.L., Roy A., Subramanya A.R., Monte S., Labilloy G., Weisz O.A. Characterization and phosphoproteomic analysis of a human immortalized podocyte model of Fabry disease generated using CRISPR/Cas9 technology. Am. J. Physiol. Physiol. 2016; 311:F1015-F1024.

16. Kang J.J., Kaissarian N.M., Desch K.C., Kelly R.J., Shu L., Bodary P.F., Shayman J.A. a-galactosidase a deficiency promotes von Willebrand factor secretion in models of Fabry disease. Kidney Int. 2019; 95:149-159.

17. Miller J.J., Aoki K., Moehring F., Murphy C.A., O'Hara C.L., Tiemeyer M., Stucky C.L., Dahms N.M. Neuropathic pain in a Fabry disease rat model. JCI Insight. 2018; 3.

18. Duro G., Zizzo C., Cammarata G., Burlina A., Burlina A., Polo G., Scalia S., Oliveri R., Sciarrino S., Francofonte D., et al. Mutations in the GLA Gene and LysoGb3: Is It Really Anderson-Fabry Disease? Int. J. Mol. Sci. 2018; 19:3726.

19. Germain D.P., Elliott P.M., Falissard B., Fomin V.V., Hilz M.J., Jovanovic A., Kantola I., Linhart A., Mignani R., Namdar M., et al. The effect of enzyme replacement therapy on clinical outcomes in male patients with Fabry disease: A systematic literature review by a European panel of experts. Mol. Genet. Metab. Rep. 2019; 19:100454.

20. Waldek S., Feriozzi S. Fabry nephropathy: A review—how can we optimize the management of Fabry nephropathy. BMC Nephrol. 2014; 15:72.