ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЛАЗНЫХ ИНФЕКЦИЙ P. Aeruginosa, СОДЕРЖАЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ЛИЗОЦИМ
PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING EYE INFECTIONS P. Aeruginosa CONTAINING RECOMBINANT LYSOZYME

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к биотехнологии и медицине и касается разработки новых антимикробных препаратов, основанных на рекомбинантных лизоцимах бактериофагов, эффективных в отношении множественно устойчивых к антибиотикам штаммов микроорганизмов, в частности, изобретение касается фармацевтической композиции на основе рекомбинантного лизоцима бактериофага FMV P. Aeruginosa.
Уровень техники
Многолетнее использование антибиотиков привело к тому, что многие патогенные микроорганизмы приобрели множественную лекарственную устойчивость. Разработка нового антибиотика и его клинические испытания занимают многие годы, а их клиническое использование часто приводит к формированию бактерий, устойчивых к вновь синтезированным антибиотикам.
Проблема лекарственной устойчивости является острой для бактерий Pseudomonas aeruginosa, одним из основных возбудителей гнойно-воспалительных процессов, особенно в условиях стационара. Р. aeruginosa распространена повсеместно, существенное значение в циркуляции возбудителя имеет вода, в которой он может выживать до года (при 37°С), в том числе во многих растворах, применяемых в медицине (например, жидкость для хранения контактных линз). Р. aeruginosa является одним из основных возбудителей нозокомиальных пневмоний, поражений мочеполовой системы у урологических больных, раневых и ожоговых инфекций, вызывает 20-25% гнойных хирургических инфекций и первичных грамотрицательных бактериемий. Для заболеваний, вызываемых Pseudomonas aeruginosa, характерна чрезвычайно высокая устойчивость к действию антибиотиков в связи с множественной резистентностью, передаваемой R-плазмидами, и связанное с этим тяжелое течение заболеваний [Поздеев О.К. Медицинская микробиология / под редакцией В.И.Покровского. Москва: ГЭОТАР-МЕД, 2002, с.230].
Бактерии Pseudomonas aeruginosa способны к формированию биопленки, которая при некоторых инфекциях инкапсулируется в альгинатный матрикс. Известно, что бактерии, способные образовывать бактериальные колонии в форме биопленки, более устойчивы к лечению антибиотиками, чем в жидких культурах [Davies D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nat. Rev. Drug Discov., 2003, v. 2, p.114-122]. Предполагают, что антибиотикоустойчивость бактерий в биопленках связана, в частности, с задержкой или ограниченным проникновением антимикробных агентов через экзополисахаридный матрикс биопленки. Лечение антибиотиками, в особенности в субингибирующих концентрациях, может способствовать образованию биопленок [Rachid S. et.al. Effect of subinhibitory antibiotic concentrations on polysaccharide intercellular adhesin expression in biofilm-forming S. epidermidis. Antimicrob. Agents Chemother., 2000, v. 44, p.3357-63; Otto M. Bacterial evasion of antimicrobial peptides by biofilm formation. Curr. Top Microbiol. Immunol., 2006, v. 306, p.251-258].
Таким образом, актуальной проблемой в успешном лечении заболеваний, вызываемых Pseudomonas aeruginosa, явлется поиск и создание препаратов на основе соединений, способных деградировать альгинатную пленку.
Относительно новый подход к терапии бактериальных инфекций состоит в использовании кодируемых фаговым геномом продуктов, обладающих бактерицидным действием [Fishetti V.A. Bacteriophage lytic enzymes:novel anti-infectives. TRENDS in Microbiology, 2005, v.l3, 491-496]. Повышенный интерес к использованию фаговых лизоцимов, ферментов класса гидролаз, способных расщеплять гликозидные связи в молекулах бактериальных пептидогликанов (представляющих гетерополимеры, состоящие из повторяющихся дисахаридных групп - N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных через р-гликозидные связи) и вызывать тем самым разрушение клеточных стенок и гибель бактерий, связан с увеличившимся распространением штаммов патогенных грамотрицательных бактерий, обладающих множественной устойчивостью к антибиотикам.
Фаги, развивающиеся по литическому пути, синтезируют литические ферменты (эндолизины или лизоцимы), разрушающие клеточную стенку. Расщепление бактериальной клеточной стенки необходимо для освобождения фагового потомства. Литические ферменты бактериофагов объединяют под общим термином пептидогликановые гидролазы, хотя химический механизм их действия может быть различен в зависимости от того, какой именно тип связи в мукополимере клеточной стенки они разрывают (в частности, лизоцим гидролизует пептидогликан, расщепляя гликозидные связи между N-ацетилглюкозамином и N-ацетилмурамовой кислотой). Более того, даже сходные по механизму действия литические ферменты разных видов фагов могут обладать разными физико-химическими свойствами, что может иметь критическое значение при изготовлении конечного продукта - лекарственного препарата (например, повышенную температурную устойчивость при хранении). Главное преимущество фаговых эндолизинов по сравнению с антибиотиками состоит в специфичности их действия в отношении патогенных бактерий и сохранении нормальной микрофлоры. Накопленные к настоящему времени немногочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что среди бактерий-мишеней не возникает устойчивость к лизинам фагов.
Эндолизины могут быть изолированы и частично очищены из культуральной жидкости лизатов бактерий, инфицированных соответствующими бактериофагами. Однако метод прямого получения белков из лизатов бактерий неудобен, прежде всего, из-за низкого титра фага и, как следствие, низкой концентрация эндолизинов в лизате. Низкое удельное содержание целевого белка делает трудновыполнимым, если не невозможным его очистку от продуктов фагового лизиса. По этой причине, единственным способом наработки очищенных эндолизинов бактериофагов является их микробиологический синтез.
Для очищенных фаговых лизоцимов была продемонстрирована литическая активность в отношении рада патогенных бактерий, таких как стрептококки группы A, Streptococcus pneumonia, Bacillus anthracis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aurens и др. [Courchesne N. M. D., Parisien A., Lan C. Q. Production and Application ofBacteriophage and Bacteriophage-Encoded Lysins. Recent Patents on Biotechnology, 2009, v. 3,37-45]. В экспериментах по колонизации in vivo, выполненных на модельных животных, была продемонстрирована способность фаговых лизоцимов элиминировать S. pyogenes, пневмококки и стрептококки группы В, а в экспериментах с инфицированными внутривенно S. pneumoniae мышами было показано, что фаговый лизоцим препятствует развитию бактеримии и сепсиса [Fishetti V.A., Bacteriophage lytic enzymes:novel anti-infectives. TRENDS in Microbiology, 2005, v.l3, 491-496].
Также была продемострирована способность рекомбинантного лизоцима бактериофага К лизировать как инактивированные, так и живые культуры S.aureus, S. epidermidis, S. saprophytics, S. chromogenes, S.captis, S. hominis, S. haemolyticus, S. caprea and S. hyicus, включая метициллин-резистентные штаммы S. aureus (MRSA), которые вызывают серьезные госпитальные инфекции по всему миру [WO/2008/001342].
На основе клонирования гена лизоцима KMV- подобного бактериофага FMV Pseudomonas aueruginosa в клетках дрожжей получен очищенный рекомбинантный лизоцим, который обладает антибактериальной активностью в отношении синегнойной палочки [Козлов Д.Г. и др. Клонирование и экспрессия гена лизоцима бактериофага FMV в клетках дрожжей S. cerevisiae и Р. pastoris., 2010, Генетика, т.46, стр.340-348]. Лизоцимную активность оценивали по образованию зон лизиса на газоне тест-культуры клеток бактерий. При тестировании лизоцимной активности тест-культуры предварительно обрабатывали парами хлороформа для обеспечения проникновения лизоцима через альгинатный матрикс.Таким образом, хотя и была продемонстрирована литическая активность рекомбинантного лизоцима фага FMV, возможная терапевтическая активность рекомбинантного лизоцима фага FMV в отношении инфекций, вызываемых Pseudomonas aueruginosa, не была описана.
Разработка новых препаратов на основе фаговых лизоцимов, эффективных в отношении множественно устойчивых к антибиотикам штаммов Pseudomonas aueruginosa, способных вызывать тяжелые формы заболеваний человека, является одной из важнейших проблем инфекционной патологии.
Раскрытие изобретения
Авторами настоящего изобретения впервые предложена фармацевтическая композиция на основе рекомбинантного эндолизина (лизоцима) бактериофага FMV Pseudomonas aueruginosa, являющаяся эффективным антибактериальным средством в отношении инфекций, вызываемых Pseudomonas aueruginosa.
Осуществление изобретения
Предложенное изобретение впервые обеспечивает фармацевтическую композицию для профилактики и лечения инфекций, вызываемых Pseudomonas aueruginosa.
Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии, что рекомбинантный лизоцим бактериофага FMV Pseudomonas aueruginosa в комбинации с ЭДТА обладает антибактериальной активностью в отношении патогенных штаммов Pseudomonas aueruginosa, в частности, его применение в офтальмологии при инфекциях, вызываемых Р. aueruginosa, приводит к значительному улучшению симптомов или полному исчезновению воспалительного процесса глаз.
Фармацевтическая композиция согласно изобретению содержит рекомбинантный фаговый лизоцим, очищенный из культуральной жидкости S. cerevisiae, включающих структурный ген фага FMV, клонированный в составе вектора pPDX2-GALl-F12 под контролем сильного галактозо-индуцируемого промотора GAL1 в клетках дрожжей S. cerevisiae [Козлов Д.Г. и др. Клонирование и экспрессия гена лизоцима бактериофага FMV в клетках дрожжей S. cerevisiae и Р. pastoris., 2010, Генетика, т.46, стр.340-348], в комбинации с ЭДТА.
Предпочтительно, фармацевтическая композиция содержит рекомбинантный фаговый лизоцим в эффективном количестве и от 5 до 50 мкг/мл растворимого рекомбинантного лизоцима и от 0,029 до 0,049% ЭДТА. Наиболее предпочтительно фармацевтическая композиция содержит 10 мкг/мл растворимого рекомбинантного лизоцима и 0,049% ЭДТА.
Фармацевтическая композиция на основе рекомбинантного лизоцима бактериофага FMVv. ЭДТА согласно изобретению может быть использована для лечения различных заболеваний, вызываемых Р. aeruginosa, таких как гнойно-воспалительные процессы слизистых поверхностей ушей, носа и глотки, мочеполовой системы, гнойные хирургические инфекции. Предложенная фармацевтическая композиция может использоваться в виде спреев для орошения слизистых мембран при инфекционных заболеваниях носа и глотки, мочеполовой системы, в виде растворов, гелей, паст для обработки поверхностей инфицированных ран и ожогов, для профилактики и лечения инфекционных заболеваний глаз, а также в виде кремов в косметологии для обработки кожных покровов и слизистых оболочек.
Фармакологическая активность фармацевтической композиции в отношении офтальмологических заболеваний, вызываемых Р. aeruginosa, была изучена на модели глазных инфекций у кроликов (пример 2).
Для испытаний на кроликах фармацевтическую композицию получают, как описано в Примере 1.
9
Животные были прооперированы для получения проникающего ранения роговицы в верхнем сегменте. Затем каждый глаз через переднюю камеру был инфицирован Р. aeruginosa в количестве примерно 5,5×10, достаточном для развития воспалительного процесса.
Спустя 8 часов и в течение последующих 6-ти дней 3-м кроликам проведена инстилляция в инфицированный левый глаз фармацевтической композиции и другим 3-м кроликам проведена инстилляция офтаквикса (Офтаквикс , производство компании Alcon, Бельгия) в инфицированный левый глаз, правый глаз у всех кроликов был оставлен в качестве контроля.
Клиническая оценка степени воспалительного процесса представлена в табл.2-4 (Пример 2).
Отмечается значительное снижение воспалительного процесса при использовании фармацевтической композиции в соответствии с изобретением.
Таким образом, результаты исследования фармакологической активности композиции согласно изобретению в отношении офтальмологических заболеваний на модели глазных инфекций у кроликов демонстрируют ее высокую специфичность по отношению к Pseudomonas aeruginosa, быстроту действия и отсутствие побочных эффектов.
Фармацевтическая композиция согласно изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель, растворитель или наполнитель. Фармацевтически приемлемый носители включают, но не ограничиваются, фосфатным буфером, дистиллированной водой, эмульсиями масло в воде и т.п.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами, представленными для подтверждения, но не ограничения объема притязаний.
Примеры
Пример 1. Получение фармацевтической композиции.
Смешивают 50 мкл 13,6% р-ра Tris HCl (pH доводят до 7,5 с помощью 10% р-ра НСl), 3,9 мкл 12,7% р-ра ЭДТА и 7,7 мкл 0,13% р-ра рекомбинантного лизоцима с водой до 1 мл общего объема.
Пример 2. Фармакологическая активность рекомбинантного лизоцима в отношении офтальмологических заболеваний на модели глазных инфекций у кроликов.
Эксперимент по изучению эффективности лизоцима проводился на базе МНИИ ГБ им. Гельмгольца в отделе травматологии, реконструктивной и пластической хирургии. При оценке полученных результатов использовались данные микробиологического исследования, проводимого в микробиологической лаборатории Института. В качестве источника инфекции использовали штамм Р. aeruginosa, полученный из коллекции ГИСК (Государственная коллекция патогенных микроорганизмов) им. Тарасовича. В качестве модели использовали 6 кроликов породы шиншилла, массой 3,5-4 кг.
9
Кроликам было нанесено проникающее ранение роговицы с последующим инфицированием Р. aeruginosa. Операция по нанесению проникающего ранения роговицы кроликам была проведена после предварительной анестезии раствором алкаина (по 2 капли в каждый глаз). Проникающее ранение роговицы контролировалось под операционным микроскопом и сопровождалось выходом влаги из передней камеры (ПК) глаза. После этого всем кроликам в оба глаза (OU) вводилась жидкая суспензия бактерий Р. aeruginosa в концентрации 5,5×10.
Через 8 часов после операции кроликам №1, 2, 3 в левый глаз проведена инстилляция 5 капель лизоцима 3 раза с интервалом в 2 часа, правый глаз оставлен контрольным. Кроликам №4, 5, 6 в левый глаз проведена инстилляция 5 капель офтаквикса 3 раза с интервалом в 2 часа, правый глаз оставлен в качестве контроля.
Оценку клинических проявлений при проникающей ране роговицы проводили в условных баллах по следующим признакам:
Таблица 1
Отделяемое из
Отделяемого нет
0
конъюнктивальной
Незначительное отделяемое
1
полости (ОКП)
Умеренное отделяемое
2
Выраженное отделяемое
3
Гиперемия
Сосуды не видны
0
Конъюнктивы (ГК)
Умеренная инъекция конъюнктивы
1
Выраженная инъекция конъюнктивы
2
Отек роговицы(ОР)
Отека нет
0
Локальный отек в области краев раны
1
До <sup>1</sup>/<sub>4</sub> площади роговицы
2
От <sup>1</sup>/<sub>4</sub> до <sup>1</sup>/<sub>2</sub> площади роговицы
3
Экссудативная
П/к равномерная, радужка спокойна
0
реакция передней
П/к равномерная, небольшое количество
1
камеры (ЭРПК)
экссудата
П/к неравномерная, умеренное количество
2
экссудата, сосуды радужки расширены.
П/к мелкая, значительное количество экссудата,
3
радужка отечна
На следующий день после операции при осмотре кроликов наблюдались следующие клинические проявления.
Кролики №1, 2, 3 - на правом глазу выраженные признаки гнойной инфекции, левый глаз практически спокойный.
Кролики №4, 5, 6 - на правом глазу выраженные признаки гнойной инфекции, левый глаз - выраженные признаки инфекции, отделяемое на конъюнктиве и веках, экссудат в передней камере.
Таблица 2
Кролик
Глаз
Клинические признаки
ОКП
ГК
ОР
ЭРПК
1
OD
3
2
2
2
OS
0
1
0
1
2
OD
2
2
1
2
OS
0
1
0
1
3
OD
3
2
2
3
OS
0
0
0
0
4
OD
3
2
2
3
OS
2
1
1
2
5
OD
3
2
2
2
OS
2
2
1
2
6
OD
3
2
2
3
OS
2
1
1
2
Практическое отсутствие инфекции на левом глазу у кроликов №1, 2, 3 свидетельствует о высокой эффективности фармацевтической композиции согласно изобретению при инстилляции после травмы/операции.
Кроликам №1, 2, 3 в левый глаз проведена инстилляция 5 капель лизоцима 3 раза с интервалом в 2 часа, правый оставлен контрольным.
Кроликам №4, 5, 6 в левый глаз проведена инстилляция 5 капель офтаквикса 3 раза с интервалом в 2 часа, правый оставлен контрольным.
На 3-й день после операции при осмотре кроликов наблюдались следующие клинические проявления.
№1, 2, 3 кролики - на правом глазу выраженные признаки гнойной инфекции, левый глаз практически спокойный.
№4, 5, 6 кролики - на правом глазу выраженные признаки гнойной инфекции, левый глаз - умеренные признаки инфекции, небольшое отделяемое, экссудат в передней камере.
Таблица 3
Кролик
Глаз
Клинические признаки
ОКП
ГК
ОР
ЭРПК
1
OD
3
2
2
2
OS
0
1
0
1
2
OD
2
2
1
2
OS
0
1
0
1
3
OD
3
2
2
3
OS
0
0
0
0
4
OD
3
2
2
3
OS
2
1
1
2
5
OD
3
2
2
2
OS
2
1
1
2
6
OD
3
2
2
3
OS
1
1
1
2
Кроликам №1, 2, 3 в левый глаз проведена инстилляция 5 капель лизоцима 3 раза с интервалом в 2 часа, правый оставлен контрольным.
Кроликам №4, 5, 6 в левый глаз проведена инсталляция 5 капель офтаквикса 3 раза с интервалом в 2 часа, правый оставлен контрольным.
На 4-й день после операции при лечении кроликов офтаквиксом также отмечается положительный эффект.
Таблица 4
Кролик
Глаз
Клинические признаки
ОКП
ГК
ОР
ЭРПК
1
OD
3
2
2
2
OS
0
1
0
0
2
OD
2
2
1
2
OS
0
1
0
1
3
OD
3
2
2
3
OS
0
0
0
0
4
OD
3
2
2
3
OS
2
1
1
2
5
OD
3
2
2
2
OS
1
1
1
2
6
OD
3
2
2
3
OS
1
1
1
1
Кроликам №1, 2, 3 в левый глаз проведена инсталляция 5 капель лизоцима 3 раза с интервалом в 2 часа, правый оставлен контрольным.
Кроликам №4, 5, 6 в левый глаз проведена инсталляция 5 капель офтаквикса 3 раза с интервалом в 2 часа, правый оставлен контрольным.
На 7-й день после операции положительная симптоматика сохраняется на OS у всех 6 кроликах, расплавление роговицы на OD (контроль) началось у кроликов 1-3.
Таким образом, результаты исследования фармакологической активности композиции согласно изобретению в отношении офтальмологических заболеваний на модели глазных инфекций Р. aeruginosa у кроликов демонстрируют высокую специфичность фармацевтической композиции по отношению к Р. aeruginosa, быстроту действия и отсутствие побочных эффектов.