СПОСОБ ФЕРМЕНТАЦИИ ГАЗООБРАЗНОГО СУБСТРАТА, СОДЕРЖАЩЕГО МОНООКСИД УГЛЕРОДА И ВОДОРОД
METHOD FOR FERMENTATION OF GASEOUS SUBSTRATE, CONTAINING CARBON MONOXIDE AND HYDROGEN

Область техники, к которой относится изобретение
2
2
Настоящее описание относится к способу ферментации газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода (СО) и водорода (Н). Настоящее описание предлагает способ ферментации газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода (СО) и  водород (Н), для получения одного или нескольких спиртов.
Уровень техники
Ранее были предложены способы получения химических соединений, таких как уксусная кислота и спирты, например, этанол, путем микробиологической ферментации газообразных субстратов, содержащих монооксид углерода и водород, в среде, содержащей подходящие питательные вещества и следовые количества минералов, с помощью определенных микроорганизмов, таких как род Clostridium. Например, в патенте США №5173429, Gaddy и др., раскрыты Clostridium ljungdahlii АТСС №49587, анаэробные микроорганизмы, производящие этанол и ацетат из синтез-газа. В патенте США №5807722, Gaddy и др., раскрыты способ и аппаратура для превращения отходящих газов в полезные продукты, такие как органические кислоты, с помощью анаэробных бактерий типа Clostridium ljungdahlii АТСС №55380. В патенте США №6136577, Gaddy и др., раскрыты способ и аппаратура для превращения отходящих газов в полезные продукты, такие как органические кислоты и спирты (особенно этанол), с помощью анаэробных бактерий типа Clostridium ljungdahlii АТСС №№55988 и 55989.
В патентной заявке США №20070275447 раскрыты бактерии Clostridium (Clostridium carboxidivorans, АТСС ВАА-624, "Р7"), способные синтезировать из отходящих газов продукты, применяемые в качестве биотоплива. В патенте США №7704723 раскрыты бактерии Clostridium (Clostridium ragsdalei, АТСС ВАА-622, "PI 1"), способные синтезировать из отходящих газов продукты, применяемые в качестве биотоплива.
В патенте WO 2007/117157 описано использование Clostridium autoethanogenum (Accession No. DSM 10061, DSMZ, Germany) для получения этанола путем анаэробной ферментации субстратов, содержащих монооксид углерода. В WO 2009/064200 раскрыты другие бактерии (Clostridium autoethanogenum, Accession No. DSM 19630, DSMZ, Germany) для получения этанола анаэробной ферментацией субстратов, содержащих монооксид углерода.
Как известно, скорость образования химических соединений типа спиртов зависит от плотности микробных клеток («плотность клеток») в ферментационной среде. Соответственно, высокая плотность клеток в биореакторе необходима для достижения и поддержания высокой скорости образования химических веществ.
В патенте США №6136577, Gaddy, раскрыт способ получения этанола ферментацией с использованием рецикла клеток для повышения их плотности.
2
В патенте США №7285402, Gaddy и др., раскрыт способ анаэробной микробиологической ферментации для получения спирта, где предложен способ повышения плотности клеток при запуске процесса с использованием исходной культуры в избытке Н.
Запуск ферментации с использованием порции инокулята из посевной культуры обеспечивает качественный инокулят, не содержащий примесей, но не всегда удачный из-за довольно малой плотности клеток, особенно если параметры процесса, такие как скорость газа и скорость перемешивания, увеличивают слишком быстро сразу после инокуляции.
В настоящее время нужны усовершенствованные способы повышения плотности клеток в микробиологической ферментации газообразного субстрата. Настоящее изобретение предлагает ускоренный способ повышения плотности клеток в способах микробиологической ферментации газообразного субстрата.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2
2
2
2
Настоящее изобретение раскрывает в качестве варианта способ получения одного или нескольких спиртов из газообразного субстрата, включающий: ферментацию газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода (СО) и водород (Н), в водной среде в биореакторе; указанный способ включает определение конверсии СО; определение конверсии Н; увеличение потока газообразного субстрата в предварительно выбранное число раз в интервале 1.0-2.0; причем скорость перемешивания равна или превышает заданную скорость перемешивания; причем указанная заданная скорость перемешивания составляет 10-1000 об/мин; включает увеличение потока газообразного субстрата так, чтобы указанная конверсия СО превышала первую конверсию СО в интервале 5%-95%; включает увеличение потока газообразного субстрата так, чтобы конверсия Н превышала первую конверсию Н в интервале 25-95%; причем указанный биореактор включает один или несколько реакторов; указанный биореактор включает рецикл клеток; включает подачу потока питательной среды в биореактор.
В одном варианте указанная водная среда содержит один или несколько микроорганизмов: биологически чистые анаэробные ацетогенные микроорганизмы; природные анаэробные ацетогенные микроорганизмы; не встречающиеся в природе анаэробные ацетогенные микроорганизмы; не встречающиеся в природе анаэробные ацетогенные генетически модифицированные микроорганизмы, мутанты природных анаэробных ацетогенных микроорганизмов, мутанты не встречающихся в природе анаэробных ацетогенных микроорганизмов.
2
2
2
2
2
В одном варианте настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода (СО) и водород (Н), в водную среду в биореакторе; указанный способ включает определение конверсии СО; определение конверсии Н; увеличение потока газообразного субстрата в предварительно выбранное число раз в интервале 1.0-2.0; причем разница в конверсии СО и конверсии Н превышает или равна заданной разнице в конверсии в интервале 0%-25%; включает увеличение потока газообразного субстрата так, чтобы конверсия СО превышала первую конверсию СО в интервале 25-95%; включает увеличение потока газообразного субстрата, при котором конверсия Н превышает первую конверсию Н в интервале 25-95%.
2
2
2
2
2
В одном варианте настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода (СО) и водород (Н), в водную среду в биореакторе при перемешивании; указанный способ включает определение конверсии СО и Н и усиление перемешивания с предварительно выбранными шагами; причем разница в конверсиях СО и Н менее заданной разницы в конверсиях в интервале 0-25%; причем включает усиление перемешивания таким образом, что конверсия СО превышает вторую конверсию СО в интервале 0-25%; включает усиление перемешивания таким образом, чтобы конверсия Н превышала вторую конверсию Н в интервале 0-25%.
2
2
В одном варианте настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода (СО) и водород (Н), в водную среду в биореакторе при перемешивании; указанный способ включает определение конверсии СО; определение конверсии Н; увеличение потока газообразного субстрата на заданную величину в пределах от 1.0 до 2.0; причем скорость вращения указанной мешалки равна или превышает заданную скорость в интервале от 10 до 1000 об/мин.
2
2
Настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода (СО) и водород (Н), в водную среду в биореакторе; указанную водную среду, включающую один или более микроорганизмов; указанный способ, включающий измерение конверсии СО; измерение конверсии Н; увеличение потока газообразного субстрата на заданную величину в пределах от 1.0 до 2.0; причем скорость перемешивания больше или равна заданной скорости перемешивания; где указанная заданная скорость перемешивания включает скорость вращения мешалки от 10 до 1000 об/мин.
2
2
Настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода (СО) и водород (Н), в водную среду в биореакторе с перемешиванием; указанную водную среду, включающую один или более микроорганизмов; указанный способ включает измерение конверсии СО; измерение конверсии Н; увеличение потока газообразного субстрата на заданную величину в пределах от 1.0 до 2.0; причем скорость перемешивания больше или равна заданной скорости перемешивания; указанная заданная скорость перемешивания включает скорость вращения мешалки от 10 до 1000 об/мин.
В одном варианте способ по настоящему изобретению включает увеличенный поток газообразного субстрата, в котором указанная конверсия СО превышает первую конверсию СО в интервале от 25% до 95%.
2
2
В одном варианте способ по настоящему изобретению включает увеличенный поток газообразного субстрата, в котором указанная конверсия Н превышает первую конверсию Н в интервале от 25% до 95%.
2
2
2
Далее, настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода (СО) и водород (Н), в водную среду в биореакторе; указанную водную среду, включающую один или более микроорганизмов; указанный способ, включающий измерение конверсии СО; измерение конверсии Н; увеличение потока газообразного субстрата на заданную величину в пределах от 1.0 до 2.0; причем разность между конверсией СО и конверсией Н больше или равна разности удельных конверсии на величину в пределах от 0% до 25%.
2
2
2
Далее, настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода (СО) и водород (Н), в водную среду в биореактор с перемешиванием; указанную водную среду, включающую один или более микроорганизмов; указанный способ включает измерение конверсии СО; измерение конверсии Н; увеличение потока газообразного субстрата на заданную величину в пределах от 1.0 до 2.0; причем разность между конверсией СО и конверсией Н больше или равна разности удельных конверсии на величину в пределах от 0% до 25%.
В одном варианте способ по настоящему изобретению включает увеличенный поток газообразного субстрата, в котором указанная конверсия СО превышает первую конверсию СО на величину в интервале от 25% до 95%.
2
2
В одном варианте способ по настоящему изобретению включает увеличенный поток газообразного субстрата, в котором указанная конверсия Н превышает первую конверсию Н на величину в интервале от 25% до 95%.
2
2
2
2
2
Кроме того, настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода (СО) и водород (Н), в водную среду в биореактор с перемешиванием; указанную водную среду, включающую один или более микроорганизмов; указанный способ включает измерение конверсии СО и Н и увеличение перемешивания заданными шагами скорости перемешивания; причем разность конверсии СО и Н меньше разности удельных конверсии на величину в интервале от 0 до 25%; включает увеличенное перемешивание, при котором конверсия СО превышает вторую конверсию СО на величину в интервале от 0 до 25%; включает увеличенное перемешивание, при котором конверсия Н превышает вторую конверсию Н на величину в интервале от 0 до 25%.
2
2
2
Кроме того, настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода (СО) и водород (Н), в водную среду в биореактор с перемешиванием; указанную водную среду, включающую один или более микроорганизмов; указанный способ включает измерение конверсии СО и Н и увеличение перемешивания заданными шагами скорости в интервале от 0 до 200 об/мин; причем разность между конверсией СО и Н меньше разности удельных конверсии на величину в интервале от 0 до 25%.
В одном варианте способ по настоящему изобретению включает увеличенный поток газообразного субстрата, при котором указанная конверсия СО превышает вторую конверсию СО на величину в интервале от 0 до 25%.
2
2
В одном варианте способ по настоящему изобретению включает увеличенный поток газообразного субстрата, при котором указанная конверсия Н превышает вторую конверсию Н на величину в интервале от 0 до 25%.
В одном варианте указанные микроорганизмы по настоящему изобретению включают один или несколько видов микроорганизмов, в том числе: биологически чистые микроорганизмы, природные микроорганизмы, не встречающиеся в природе микроорганизмы, генетически модифицированные не встречающиеся в природе микроорганизмы, мутанты природных микроорганизмов, мутанты не встречающихся в природе микроорганизмов, рекомбинантные микроорганизмы, микроорганизмы, полученные методом генной инженерии, искусственно синтезированные микроорганизмы, причем указанные микроорганизмы выбирают из Acetogenium kivui, Acetobacterium woodii, Acetoanaerobium noterae, Butyribacterium methylotrophicum, Caldanaerobacter subterraneous, Caldanaerobacter subterraneous pacificus, Carboxydothermus hydrogenoformans, Clostridium aceticum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium autoethanogenum (DSM 23693), Clostridium autoethanogenum (DSM 19630 of DSMZ Germany), Clostridium autoethanogenum (DSM 10061 of DSMZ Germany), Clostridium thermoaceticum, Eubacterium limosum, Clostridium ljungdahlii PETC (ATCC 49587), Clostridium ljungdahlii ERI2 (ATCC 55380), Clostridium ljungdahlii C-01 (ATCC 55988), Clostridium ljungdahlii 0-52 (ATCC 55889), Clostridium ultunense, Clostridium ragsdali Pll (ATCC BAA-622), Alkalibaculum bacchi CPU (ATCC BAA-1772), Clostridium coskatii, Clostridium carboxidivorans PI (ATCC PTA-7827), Geobacter sulfurreducens, Morrella thermacetica, Peptostreptococcus productus, Clostridium drakei, рекомбинантного организма (DSM 24138) и их смесей; где указанные микроорганизмы включают один или несколько штаммов Clostridium ljungdahlii, один или более штаммов Clostridium ragsdalei,или один или более штаммов Clostridium carboxidivorans, или один или более штаммов Clostridium autoethanogenum; где указанные микроорганизмы включают один или несколько генетически модифицированных микроорганизмов, полученных внедрением одного или более генов в организм хозяина, выбранного из любого штамма Clostridium ljungdahlii,или любого штамма Clostridium ragsdalei,или любого штамма Clostridium carboxidivorans,или любого штамма Clostridium autoethanogenum; где указанные микроорганизмы включают один или более видов генетически модифицированных микроорганизмов, полученных внедрением в организм хозяина одного или нескольких генов из любых штаммов Clostridium ljungdahlii,или Clostridium ragsdalei,или Clostridium carboxidivorans,или Clostridium autoethanogenum.
В одном варианте настоящее изобретение представляет указанный биореактор, состоящий из одного или более реакторов; причем указанный биореактор включает рецикл клеток и подачу потока питательной среды в биореактор.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На Фигуре 1 приведена схема, иллюстрирующая осуществление способа микробиологической ферментации газообразного субстрата.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Если не указано иное, следующие термины в этом изобретении определены приведенным ниже образом и могут включать либо единственную, либо множественные формы указанных ниже терминов.
Термин «примерно» модифицирует любое количество и относится к вариации этого количества в реальных условиях поддержания культуры микроорганизма, например, в лаборатории, пилотной установке или производственной аппаратуре. Например, количество ингредиента, или мера в смеси,или любое количество, модифицированные словом «примерно», включают вариации и степень точности, обычно применяемые при определении в условиях эксперимента на производстве или в лаборатории. Например, количество компонента продукта, модифицированное словом «примерно», включает вариации порций в разных экспериментах на производстве или в лаборатории и вариации, присущие методу анализа. Независимо от того, модифицированы количества словом «примерно» или нет, количества включают эквиваленты этих количеств. Любое приведенное здесь количество, модифицированное термином «примерно», можно использовать в настоящем изобретении так же, как и количество, не модифицированное термином «примерно».
Термин «ацетоген» или «ацетогенный» относится к бактерии, которая генерирует ацетат в качестве продукта анаэробного дыхания. Этот способ отличается от ацетатной ферментации, хотя оба они протекают в отсутствие кислорода и производят ацетат. Эти организмы также называют ацетогенными бактериями, т.к. все известные ацетогены являются бактериями. Ацетогены находят в различных средах, обычно в анаэробных условиях (отсутствие кислорода). Ацетогены могут использовать в качестве источников энергии и углерода различные соединения; лучшие изученные формы ацетогенного метаболизма включают использование диоксида углерода как источника углерода и водорода как источника энергии.
Термины «биореактор», «реактор» или «биореактор для ферментации» включают устройство для ферментации, состоящее из одного или нескольких сосудов и/или колонн или трубопроводов, которое включает проточный реактор с перемешиванием (CSTR), барботажную колонну, газлифтный ферментер, миксер периодического действия или другие устройства, осуществляющие контакт газ-жидкость. В способе по данному изобретению биореактор для ферментации может включать культивационный реактор, из которого получаемый ферментационный бульон подают во второй ферментационный биореактор, в котором получают основную массу получаемого этанола.
Термин «конверсия» означает часть введенного количества, которая превратилась в продукт(ы); она обозначена в следующем уравнении: (введенное количество - количество на выходе)/(введенное количество).
Термин «ферментация» означает ферментацию СО до спиртов и ацетата. Известно множество бактерий, способных проводить ферментацию СО до спиртов, в том числе бутанола и этанола, а также уксусной кислоты, пригодных для использования в способе по настоящему изобретению. Примеры таких бактерий включают род Clostridium, например, штаммы Clostridium ljungdahlii, штаммы Clostridium ljungdahlii, в том числе описанные в WO 2000/68407, ЕР 117309, US Patent Nos. 5173429, 5593886 и 6368819, WO 1998/00558 и WO 2002/08438, штаммы Clostridium autoethanogenum (DSM 10061 и DSM 19630 of DSMZ, Germany), включая описанные в WO 2007/117157 и WO 2009/151342, и Clostridium ragsdalei (PI 1, ATCC BAA622), в том числе описанные соответственно в патенте США №7704723 и "Biofuels and Bioproducts from Biomass-Generated Synthesis Gas," Hasan Atiyeh, изданной в трудах Oklahoma EPSCoR Annual State Conference, April 29, 2010, и Clostridium carboxidivorans (ATCC BAA-624), описанные в патентной заявке США №20070275447. Другие подходящие бактерии включают бактерии рода Moorella, в том числе Moorella sp HUC22-1, и бактерии рода Carboxydothermus. Содержание каждой из этих публикаций полностью введено здесь ссылками. Кроме того, специалисты в данной области могут выбрать другие бактерии для применения в способе по данному изобретению. Важно подчеркнуть, что в способе по настоящему изобретению можно применять смешанную культуру из двух или нескольких бактерий. Одним из видов микроорганизмов, пригодных для применения в настоящем изобретении, является Clostridium autoethanogenum. Ферментацию можно проводить в любом подходящем биореакторе, таком как проточный реактор с перемешиванием (CTSR), барботажная колонна (BCR) или реактор с орошаемым слоем (TBR). Кроме того, в некоторых предпочтительных вариантах данного изобретения биореактор может включать первый культивационный реактор, в котором культивируют микроорганизмы, и второй реактор для ферментации, в который подают ферментационный бульон из культивационного реактора и в котором получают основную часть продукта (этанола и ацетата).
Термин «ферментационный бульон» означает: состав ферментационной среды включает все, что приводит к образованию ферментационного бульона, включая сырые субстраты, продукты ферментации, микроорганизм(ы) и производные компоненты, химические добавки, питательные вещества, газы. В ферментационном бульоне присутствуют все три основные фазы: твердая, жидкая и газообразная, между которыми возможно взаимодействие.
Термин "коэффициент расхода" означает предполагаемое количество газообразного сырья, деленое на реальное текущее значение количества газообразного сырья.
2
2
Термин «микроорганизм» или «микроб» включает бактерии, грибки, дрожжи, археи и протисты; микроскопические растения (называемые зелеными водорослями); и животные, такие как планктон, планарии и амебы. Иногда сюда включают также вирусы, но их часто считают неживыми. Микроорганизмы живут во всех частях биосферы, где есть жидкая вода, включая грунт, горячие источники, дно океана, высокие слои атмосферы и провалы в скалах земной коры. Микроорганизмы критичны для рецикла питательных веществ в экосистемах, т.к. они действуют как деструкторы. Микробы также применяют в биотехнологии, в производстве традиционной пищи и напитков и в современных генно-инженерных технологиях. Важно, что в данном изобретении можно применять микроорганизмы смешанных штаммов, которые могут содержать или не содержать штаммы разных микроорганизмов. Также важно, что для применения в настоящем изобретении можно селективно подбирать микроорганизмы с помощью направленной эволюции. Также очевидно, что технология на основе рекомбинантной ДНК позволяет создавать микроорганизмы путем использования выбранных штаммов существующих микроорганизмов. Можно также создавать микроорганизмы с помощью технологии химического мутагенеза (мутирование бактериальной ДНК в присутствии различных химических соединений) путем подбора штаммов существующих микроорганизмов. Важно, что в настоящем изобретении можно применять бактерии, способные превращать СО и воду или Н и CO в этанол и уксусную кислоту. Некоторые примеры полезных бактерий включают Acetogenium kivui, Acetobacterium woodii, Acetoanaerobium noterae, Butyribactehum methylotrophicum, Caldanaerobacter subterraneous, Caldanaerobacter subterraneous pacijicus, Carboxydothermus hydrogenoformans, Clostridium aceticum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium autoethanogenum (DSM 23693,), Clostridium autoethanogenum (DSM 19630 of DSMZ Germany), Clostridium autoethanogenum (DSM 10061 of DSMZ Germany), Clostridium thermoaceticum, Eubacterium limosum, Clostridium ljungdahlii PETC (ATCC 49587), Clostridium ljungdahlii ERI2 (ATCC 55380), Clostridium ljungdahlii C-01 (ATCC 55988), Clostridium ljungdahlii 0-52 (ATCC 55889), Clostridium ultunense, Clostridium ragsdali Pll (ATCC BAA-622), Alkalibaculum bacchi CPU (ATCC BAA-1772), Clostridium coskatii, Clostridium carboxidivorans P7 (ATCC PTA-7827), Geobacter sulfurreducens, Morrella thermacetica, Peptostreptococcus productus, Clostridium drakei, рекомбинантный микроорганизм (DSM 24138) и их смеси.
Термин "питательная среда" включает среду для культивирования микроорганизмов, которая может содержать один или более витаминов и минеральных веществ, которые способствуют культивированию выбранных микроорганизмов. Компоненты и ассортимент питательных сред, пригодных для применения в настоящем изобретении, известны и содержатся в предыдущих публикациях, таких как International Patent Application No. WO 2008/00558, US Patent No.7,285,402, US Patent No.5,807,722; US Patent No.5593886, и US Patent No.5821111.
Термин «сингаз» или «синтез-газ» означает синтез-газ; так называется газовая смесь, содержащая различные количества монооксида углерода и водорода. Примеры способов получения синтез-газа включают паровой риформинг природного газа или углеводородов для получения водорода, газификацию угля и некоторые виды производств по газификации отходящих газов с получением энергии. Это название происходит от его применения в качестве интермедиата при получении синтетического природного газа (SNG), аммиака или метанола. Сингаз также используют как промежуточный продукт в производстве синтетической нефти, используемой в качестве топлива или смазки, путем синтеза Фишера-Тропша и ранее метода Мобил для превращения метанола в керосин. Сингаз состоит в основном из водорода, монооксида углерода и очень часто некоторого количества диоксида углерода.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2
2
Настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода (СО) и водород (Н), в водную среду в биореактор; причем указанная среда содержит один или несколько микроорганизмов; указанный метод включает измерение конверсии СО; измерение конверсии Н; увеличение расхода газообразного субстрата на заданную величину в интервале от 1.0 до 2.0; причем скорость перемешивания превышает или равна заданной скорости перемешивания; и указанная скорость перемешивания включает заданную скорость вращения мешалки от 10 до 1000 об/мин.
2
2
Настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода (СО) и водород (Н), в водную среду в биореактор с перемешиванием; указанная среда содержит один или несколько микроорганизмов; указанный метод включает измерение конверсии СО; измерение конверсии Н; увеличение расхода газообразного субстрата на заданную величину в интервале от 1.0 до 2.0; и указанная скорость вращения мешалки больше или равна заданной величине от 10 до 1000 об/мин.
В одном варианте в качестве средства перемешивания может служить механическая мешалка, механический смеситель, рециркуляция жидкости, жидкостный циркуляционный насос, жидкостный впрыскиватель, газовый впрыскиватель и т.п.
В одном варианте способ по настоящему изобретению включает увеличение потока газообразного субстрата, при котором указанная конверсия СО превышает первую конверсию СО на величину в интервале от 25% до 95%.
2
2
В одном варианте способ по настоящему изобретению включает увеличение потока газообразного субстрата, при котором конверсия Н превышает первую конверсию Н на величину в интервале от 25% до 95%.
2
2
2
Далее, настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода (СО) и водород (Н), в водную среду в биореакторе; указанная водная среда включает один или несколько микроорганизмов; указанный способ включает измерение конверсии СО; измерение конверсии Н; увеличение потока газообразного субстрата на заданную величину коэффициента расхода в интервале от 1.0 до 2.0; и разность между конверсией СО и конверсией Н больше или равна разности удельных конверсии в интервале от 0% до 25%.
2
2
2
Далее, настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода (СО) и водород (Н), в водную среду в биореакторе с перемешиванием; указанная водная среда включает один или несколько микроорганизмов; указанный способ включает измерение конверсии СО; измерение конверсии Н; увеличение потока газообразного субстрата на заданную величину коэффициента расхода в интервале от 1.0 до 2.0; и разность между конверсией СО и конверсией Н больше или равна разности удельных конверсии в интервале от 0% до 25%.
В одном варианте способ по настоящему изобретению включает увеличение потока газообразного субстрата, когда конверсия СО превышает первую конверсию СО на величину в интервале от 25 до 95%.
2
2
В одном варианте способ по настоящему изобретению включает увеличение потока газообразного субстрата, когда конверсия Н превышает первую конверсию Н на величину в интервале от 25 до 95%.
2
2
2
2
2
Кроме того, настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода (СО) и водород (Н), в водную среду в биореакторе с перемешиванием; указанная водная среда включает один или несколько микроорганизмов; указанный способ включает измерение конверсии СО; измерение конверсии Н и усиление перемешивания заданными шагами скорости перемешивания; разность между конверсией СО и Н меньше разности удельных конверсии в интервале от 0 до 25%; включает усиление перемешивания, когда конверсия СО превышает вторую конверсию СО на величину в интервале от 0 до 25%; усиление перемешивания, когда конверсия Н превышает вторую конверсию Н на величину в интервале от 0 до 25%.
2
2
2
Кроме того, настоящее изобретение предлагает способ ферментации газообразного субстрата, включающий: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода (СО) и водород (Н), в водную среду в биореакторе с перемешиванием; указанная водная среда включает один или несколько микроорганизмов; указанный способ включает измерение конверсии СО и Н и увеличение скорости перемешивания заданными шагами в интервале от 0 до 200 об/мин; причем разность конверсии СО и Н меньше заданной разности удельных конверсии на величину в интервале от 0 до 25%.
В одном варианте способ по настоящему изобретению включает увеличение скорости вращения указанной мешалки, причем конверсия СО превышает вторую конверсию СО на величину в интервале от 0 до 25%.
2
2
В одном варианте способ по настоящему изобретению включает увеличение скорости вращения указанной мешалки, когда конверсия Н превышает вторую конверсию Н на величину в интервале от 0 до 25%.
В одном варианте указанные микроорганизмы настоящего изобретения включают один или несколько видов биологически чистых природных анаэробных ацетогенных бактерий; причем указанные микроорганизмы включают один или несколько видов не встречающихся в природе анаэробных ацетогенных бактерий; указанные микроорганизмы включают один или несколько видов не встречающихся в природе анаэробных ацетогенных бактерий, полученных генетической модификацией с использованием анаэробных ацетогенных бактерий в качестве организма хозяина; указанные микроорганизмы включают один или несколько видов не встречающихся в природе анаэробных ацетогенных бактерий, полученных внедрением генов анаэробных ацетогенных бактерий в организм хозяина; указанные микроорганизмы выбирают из нескольких примеров полезных бактерий, включая Acetogenium kivui, Acetobacterium woodii, Acetoanaerobium noterae, Butyribacterium methylotrophicum, Caldanaerobacter subterraneous, Caldanaerobacter subterraneous pacificus, Carboxydothermus hydrogenoformans, Clostridium aceticum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium autoethanogenum (DSM 23693), Clostridium autoethanogenum (DSM 19630 в DSMZ Germany), Clostridium autoethanogenum (DSM 10061 в DSMZ Germany), Clostridium thermoaceticum, Eubacterium limosum, Clostridium ljungdahlii PETC (ATCC 49587), Clostridium ljungdahlii ERI2 (ATCC 55380), Clostridium ljungdahlii C-01 (ATCC 55988), Clostridium ljungdahlii 0-52 (ATCC 55889), Clostridium ultunense, Clostridium ragsdali Pll (ATCC BAA-622), Alkalibaculum bacchi CPU (ATCC BAA-1772), Clostridium coskatii, Clostridium carboxidivorans P7 (ATCC PTA-7827), Geobacter sulfurreducens, Morrella thermacetica, Peptostreptococcus productus, Clostridium drakei, рекомбинантные микроорганизмы (DSM 24138) и их смеси; причем указанные микроорганизмы включают один или более штаммов Clostridium ljungdahlii, включают один или более штаммов Clostridium ragsdalei, включают один или более штаммов Clostridium carboxidivorans, включают один или более штаммов Clostridium autoethanogenum; причем указанные микроорганизмы включают один или несколько видов генетически модифицированных микроорганизмов, полученных внедрением одного или более выбранных генов в организм хозяина, выбранного из любого штамма Clostridium ljungdahlii strains или любого штамма Clostridium ragsdalei strains или любого штамма Clostridium carboxidivorans или любого штамма Clostridium autoethanogenum; причем указанные микроорганизмы включают один или несколько видов генетически модифицированных микроорганизмов, полученных внедрением в организм хозяина одного или нескольких видов генов из любого штамма Clostridium ljungdahlii strain или из любого штамма Clostridium ragsdalei strain или из любого штамма Clostridium carboxidivorans strain или из любого штамма Clostridium autoethanogenum.
В одном варианте настоящее изобретение предлагает указанный биореактор, включающий один или более реакторов; причем указанный биореактор включает рецикл клеток и подачу потока питательной среды в биореактор.
На Фигуре 1 представлен способ получения химического продукта, такого как смесь спиртов, из газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода (СО), такого как сингаз, путем ферментации с бактериями; этот способ включает биореактор (100), содержащий ферментационный бульон, в котором находятся указанные бактериальные клетки и ферментационная среда. Газовый поток, включающий газовый субстрат, содержащий СО (101), может подаваться в биореактор вместе с потоком ферментационной среды (102). Поток ферментационного бульона (110), содержащего бактериальные клетки и указанный(е) химический(е) продукт(ы), можно удалять из указанного биореактора. Поток отходящего из ферментера газа (120), содержащий неиспользованную часть указанного газообразного субстрата, отдувают из биореактора. В одном варианте поток ферментационного бульона (110) перетекает в аппарат рецикла клеток (200), где клетки концентрируют и возвращают (220) в биореактор. Прошедший поток (210) из указанного аппарата рецикла клеток направляют для выделения указанн(ого)ых химическ(ого)их продукт(а)ов (не показан на схеме). В одном варианте поток ферментационного бульона (110) направляют на выделение смеси указанного спиртового продукта (не показано на схеме).
В одном варианте биореактор (100) снабжен мешалкой (105), обеспечивающей перемешивание для облегчения контакта газообразного потока, содержащего газовый субстрат, и интенсификации массопереноса между газовым субстратом и ферментационной средой. Желательно обеспечить хорошую скорость массопереноса и, таким образом, адекватное перемешивание в биореакторе в ходе всего ферментационного процесса.
Имеются устройства для отбора образцов газообразного потока, содержащего газовый субстрат, подаваемый в биореактор (101), и газа, отходящего из биореактора (120) (не показано). Имеется устройство для отбора образцов ферментационного бульона из биореактора (не показано). Указанные образцы газа и жидкости отбирают через определенные интервалы времени и проводят анализ на поглощение или образование различных газообразных компонентов, образование различных продуктов и определяют оптическую плотность ферментационного бульона.
Измеренные значения можно использовать для расчета удельного поглощения (SCU) монооксида углерода (СО) и плотности клеток в ферментационном бульоне в биореакторе, с помощью следующих уравнений:
Плотность клеток равна массе клеток в единице объема ферментационного бульона. Объем биореактора представляет собой объем жидкости в биореакторе при отключенном перемешивании. Константа массы клеток представляет собой массу (г) сухих бактериальных клеток в литре ферментационного бульона с оптической плотностью, равной единице (1). Оптическая плотность в уравнении два (2) представляет собой измеренное значение оптической плотности образца, полученного после разбавления ферментационного бульона в подходящем растворителе, таком как солевой раствор.
Микроорганизмы, применяемые в данном изобретении, могут быть одним или несколькими видами анаэробных ацетогенных бактерий.
Микроорганизмы, применяемые в данном изобретении, могут включать один или несколько видов природных анаэробных ацетогенных бактерий; могут включать один или несколько видов не встречающихся в природе анаэробных ацетогенных бактерий; могут включать один или несколько видов не встречающихся в природе анаэробных ацетогенных бактерий, полученных генетическим модифицированием анаэробных ацетогенных бактерий в качестве организма хозяина; могут включать один или несколько видов не встречающихся в природе анаэробных ацетогенных бактерий, полученных внедрением генов анаэробных ацетогенных бактерий в организм хозяина.
Микроорганизмы, применяемые в данном изобретении, могут включать один или несколько видов бактерий, выбранных из Acetogenium kivui, Acetobacterium woodii, Acetoanaerobium noterae, Butyribacterium methylotrophicum, Caldanaerobacter subterraneous, Caldanaerobacter subterraneous pacificus, Carboxydothermus hydrogenoformans, Clostridium aceticum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium autoethanogenum (T)SM 23693J, Clostridium autoethanogenum (DSM 19630 of DSMZ Germany), Clostridium autoethanogenum (DSM 10061 of DSMZ Germany), Clostridium thermoaceticum, Eubacterium limosum, Clostridium ljungdahlii PETC (ATCC 49587), Clostridium ljungdahlii ERI2 (ATCC 55380), Clostridium ljungdahlii C-01 (ATCC 55988), Clostridium ljungdahlii 0-52 (ATCC 55889), Clostridium ultunense, Clostridium ragsdali Pll (ATCC BAA-622), Alkalibaculum bacchi CPU (ATCC BAA-1772), Clostridium coskatii, Clostridium carboxidivorans P7 (ATCC PTA-7827), Geobacter sulfurreducens, Morrella thermacetica, Peptostreptococcus productus, Clostridium drakei, рекомбинантного микроорганизма (DSM 24138) и их смеси.
В одном варианте микроорганизмы, применяемые в способе по настоящему изобретению, включают один или несколько видов штаммов Clostridium ljungdahlii или один или несколько видов штаммов Clostridium ragsdalei или один или несколько видов штаммов Clostridium carboxidivorans или один или несколько видов штаммов Clostridium autoethanogenum.
В одном варианте микроорганизмы, применяемые в способе по настоящему изобретению, включают один или несколько видов генетически модифицированных микроорганизмов, полученных внедрением одного или нескольких видов выбранных генов в организм хозяина, выбранный из любого штамма Clostridium ljungdahlii или из любого штамма Clostridium ragsdalei или из любого штамма Clostridium carboxidivorans или из любого штамма Clostridium autoethanogenum.
В одном варианте микроорганизмы, применяемые в способе по настоящему изобретению, включают один или несколько видов генетически модифицированных микроорганизмов, полученных внедрением в любой организм хозяина одного или нескольких видов генов любого штамма Clostridium ljungdahlii, или любого штамма Clostridium ragsdalei, или любого штамма Clostridium carboxidivorans, или любого штамма Clostridium autoethanogenum.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Один вариант способа по настоящему изобретению включает: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода (СО) и водород (Н), в водную среду в биореакторе с перемешиванием; указанная водная среда включает один или несколько видов микроорганизмов; указанный способ включает измерение конверсии СО и Н и увеличение скорости вращения указанной мешалки заданными шагами в интервале значений от 0 до 200 об/мин; причем разность между конверсией СО и Н меньше разности удельных конверсии в интервале значений от 0 до 25%. В одном варианте конверсия СО превышает первую конверсию СО на величину в интервале от 0 до 25%. В одном варианте конверсия Н превышает первую конверсию Н на величину в интервале от 0 до 25%. Измерения конверсии СО и Н и увеличение скорости вращения указанной мешалки можно проводить повторно. В одном варианте конверсия СО превышает конверсию Н. В другом варианте конверсия СО меньше конверсии Н. В одном варианте скорость перемешивания увеличивают на меньшую величину, если текущая скорость перемешивания мала, и увеличивают на большую величину, если текущая скорость перемешивания велика. В одном варианте скорость перемешивания повышают на меньшую величину, если текущие значения конверсии СО и Н малы, и повышают на большую величину, если текущие значения конверсии СО и Н велики. Например, в одном варианте, когда мешалка вращается со скоростью от 200 до 400 об/мин, повышают скорость вращения мешалки примерно на 50 об/мин, если значения конверсии СО и Н находятся в интервале от примерно 20 до примерно 30% и от примерно 10 до примерно 15% соответственно и различаются между собой не более чем на 15%. В случае, когда мешалка вращается со скоростью от 400 до 600 об/мин, скорость перемешивания повышают на 100 об/мин, если конверсии СО и Н находятся в интервале от 30 до 50% и 15 до 35% соответственно и их численные значения различаются между собой не более чем на 15%.
2
2
2
2
2
Один вариант способа по настоящему изобретению включает: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода (СО) и водород (Н), в водную среду в биореакторе с перемешиванием; указанная водная среда включает один или несколько видов микроорганизмов; указанный способ включает измерение конверсии СО и Н и увеличение потока газообразного субстрата заданными шагами на величину в интервале от 1.0 до 2.0 от текущего значения; причем разность между конверсией СО и Н меньше или равна разности удельных конверсии в интервале значений от 0 до 25%. В одном варианте конверсия СО превышает первую конверсию СО на величину в интервале от 0 до 25%. В одном варианте конверсия Н превышает первую конверсию Н на величину в интервале от 0 до 25%.
В одном варианте скорость потока газообразного субстрата увеличивают между двумя последовательными увеличениями скорости перемешивания. В одном варианте скорость потока газообразного субстрата увеличивают между каждыми двумя последовательными увеличениями скорости перемешивания. В одном варианте скорость потока газообразного субстрата увеличивают между двумя попеременными увеличениями скорости перемешивания.
2
2
2
2
2
Один вариант способа по настоящему изобретению включает: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода (СО) и водород (Н), в водную среду в биореакторе с перемешиванием; указанная водная среда включает один или более микроорганизмов; указанный способ включает измерение конверсии СО и Н и увеличение потока газообразного субстрата заданными шагами на величину в интервале от 1.0 до 2.0 от текущего значения; разность между значениями конверсии СО и Н больше или равна разности удельных конверсии в интервале значений от 0 до 25%. В одном варианте конверсия СО превышает вторую конверсию СО на величину в интервале от 25 до 95%. В одном варианте конверсия Н превышает вторую конверсию Н на величину в интервале от 25 до 95%.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Один вариант способа по настоящему изобретению включает: подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода (СО) и водород (Н), в водную среду в биореакторе с перемешиванием; указанная водная среда включает один или более микроорганизмов; указанный способ включает измерение конверсии СО и Н и увеличение потока газообразного субстрата заданными шагами на величину в интервале от 1.0 до 2.0 от текущего значения; скорость вращения мешалки больше или равна заданному значению в интервале от 10 до 1000 об/мин. В одном варианте конверсия СО превышает вторую конверсию СО на величину в интервале от 25 до 95%. В одном варианте конверсия Н превышает вторую конверсию Н на величину в интервале от 25 до 95%. Измерения конверсии СО и Н и увеличение потока газообразного субстрата на заданную величину можно повторять. Заданная величина коэффициента потока может быть разной при разных повторениях. В одном варианте при низкой конверсии Н используют малое значение коэффициента потока и большое значение коэффициента потока при высокой конверсии Н. Например, в одном варианте можно использовать коэффициент потока в интервале от 1.00 до 1.05, когда конверсия Н превышает 45%; коэффициент потока в интервале от 1.05 до 1.10 можно использовать при конверсии Н, более 50%; коэффициент потока в интервале от 1.10 до 1.15 можно использовать при конверсии Н более 65%; коэффициент потока в интервале от 1.15 до 1.20 можно использовать при конверсии Н более 75%.
В типичном лабораторном биореакторе, таком как New Brunswick Bioflow I, перемешивание со скоростью вращения мешалки в интервале 300-900 оборотов в минуту (об/мин) оказывается достаточным для обеспечения необходимого массопереноса. В одном варианте скорость вращения мешалки находится в интервале 500-700 об/мин. В другом варианте скорость вращения мешалки находится в интервале 550-650 об/мин. В одном варианте скорость вращения мешалки составляет 600 об/мин.
В одном варианте с использованием более крупного биореактора, таком как биореактор объемом от 100 до 500 литров, перемешивание осуществляют при скорости вращения мешалки от 50 до 500 об/мин. В одном варианте с промышленным биореактором объемом от примерно 100000 до примерно 1000000 литров скорость вращения мешалки была в интервале от примерно 1 до примерно 50 об/мин. В различных вариантах для более крупного биореактора требуется меньшая скорость перемешивания, чем для биореактора меньшего размера.
В одном варианте настоящее изобретение предлагает контроль температуры в биореакторе в интервале от 25 до 50°C.
В одном варианте способа по настоящему изобретению указанный биореактор состоит из одного реактора. В одном варианте способа по настоящему изобретению указанный биореактор включает два или более реакторов.
В одном варианте способа по настоящему изобретению указанный биореактор представляет собой аппарат с рециклом клеток.
В одном варианте способа по настоящему изобретению указанный газовый поток включает газовый субстрат, содержащий СО и также водород. В одном варианте указанный газовый поток, содержащий СО, представляет собой сингаз. В одном варианте указанный газовый поток, содержащий СО, представляет собой отходящий газ металлургического производства. В одном варианте указанный газовый поток, содержащий СО, представляет собой сингаз, полученный газификацией углеродного материала, включающего биомассу.
В одном варианте один или более культивационных или посевных ферментеров обеспечивает подачу первоначальной порции культуры бактериальных клеток. В одном варианте один или более культивационных или посевных ферментеров продолжает подачу бактериальных клеток в биореактор в соответствии со способом по настоящему изобретению. В одном варианте настоящего изобретения способ включает рецикл клеток.
Питательная среда включает среду для культивирования микроорганизмов, которая может содержать один или более витаминов и минеральных веществ, обеспечивающих культивирование выбранных микроорганизмов. В Таблице 1  показан вариант питательной среды, предназначенной для настоящего изобретения. Специалистам в данной области известны и другие питательные среды, пригодные для применения в настоящем изобретении. Кроме того, в настоящем изобретении можно использовать питательную среду, которая не известна специалистам в данной области, но приготовлена из различных компонентов, указанных в Таблице 1. Настоящее изобретение предлагает усовершенствованные составы питательной среды.
Таблица 1
Компоненты среды и их концентрации
Компонент/Ион
Добавлен в виде
Концентрация
<img file="00000005.tif" he="7" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
NH<sub>4</sub>Cl/(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
≤838
Fe
FeCl<sub>2</sub>·4H<sub>2</sub>O
≤17
Ni
NiCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O
≤0.2
Со
CoCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O
≤1.0
Se
Na<sub>2</sub>SeO<sub>3</sub>
≤0.1
Zn
ZnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O
≤0.5
Mo
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O
≤0.3
Mn
MnCl<sub>2</sub>·4H<sub>2</sub>O
≤0.2
В
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>
≤1.1
Cu
CuCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O
≤0.15
W
Na<sub>2</sub>WO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O
≤1.2.
K
KCl
≤79
Mg
MgCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O
≤60
Na
NaCl
≤80*
Ca
CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O
≤55
Цистеин HCl
Цистеин HCl
≤250
<img file="00000006.tif" he="7" wi="11" img-content="undefined" img-format="tif" />
Н<sub>3</sub>РО<sub>4</sub>/(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
≤820
Пантотеновая кислота
Пантотеновая кислота
≤0.04
Биотин
Биотин
≤0.02
Тиамин
Тиамин
≤0.05
* Концентрация Na только из NaCl. Эта величина не включает Na из других компонентов, таких как Na<sub>2</sub>WO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O.
** Концентрация Са<sup>+2</sup> не включает кальций из кальциевой соли пантотеновой кислоты (т.е. d-Пантотената кальция).
ПРИМЕРЫ
Сравнительный Пример (См. Пример 11 в US 7285402)
2
2
Для приготовления запаса посевных культур для культивирования в реакторе выращивали культуры Clostridium ljungdahlii, штамм С-01 (АТСС Accession NO.55988) в 150 мл бутылках на СО, CO и Н в обогащенной среде, содержащей 1 г/л дрожжевого экстракта и 1 г/л триптиказы с солями и витаминами. Концентрация витамина составляла 0.4 мл/л среды - водного раствора, содержащего 50.5 мг/л пантотената кальция, 20.6 мг/л d-биотина и 50.6 мг/л тиамина·HCl. Бутылки инкубировали при 37°C во встряхиваемом инкубаторе. Культуры выращивали до фазы экспоненциального роста по визуальному наблюдению. При каждой инокуляции переносили примерно 90 мл запасной культуры из бутылки в 1 л среды, что составляло 9% от объема инокуляции. Удачная инокуляция описана ниже. Для получения удачного инокулята вся процедура может быть повторена несколько раз.
2
2
6
По получении удачного инокулята, инокулят в количестве 90 мл/л добавили в 1 л порцию основной среды, содержащей 0.4 мл/л витаминов и солей (момент времени t=0). Скорость перемешивания составила 240 об/мин и pH 5.3, температура 38.5°C и время пребывания газа (непрерывный поток газа) 110 минут. Газовое сырье содержало 62% Н, 31% СО и 7% СН. Через 13 час (t=13 час) отметили некоторую конверсию СО и при t=23 час скорость перемешивания увеличили от 240 об/мин до 300 об/мин. Время пребывания газа уменьшили до 100 мин в момент времени t=27 час, и в момент времени t=46 час время пребывания газа уменьшили еще раз. Скорость перемешивания также увеличивали до 100 об/мин в моменты времени t=28 час, 59 час, 72 час и 85 час.
2
При t=110 час система работала со временем пребывания газа 80 минут и скоростью перемешивания 600 об/мин. Концентрация клеток составила 0.5 г/л, и конверсия СО была равна 35%. Конверсия Н не наблюдалась, но некоторые количества этанола и ацетата (примерно 1 г/л каждого) накопились в бульоне данной порции. Вплоть до этого момента времени наблюдали повышение числа клеток в реакторе.
2
2
Поток среды с такой же концентрацией, как в основной среде, был подан при скорости 0.4 мл/мин в момент времени t=120 час. Затем была начата программа номинального повышения скорости газа, скорости перемешивания и скорости среды при тщательном сохранении избытка Н в системе. В момент времени t=210 час концентрация этанола составила 17 г/л, концентрация ацетата 1 г/л, концентрация клеток 1.6 г/л, конверсия СО почти 100% и конверсия Н 90%. Производительность по этанолу достигла 11.4 г/л-сутки.
2
Снова запустили программу постепенного повышения скорости газа. Одновременно увеличили количество витамина и достигли скорости подачи витамина 0.7 мл/л среды. В момент времени t=610 час реактор производил 20 г/л этанола и примерно 2 г/л ацетата. Конверсия СО составила почти 100%, а конверсия Н 85%. Производительность по этанолу достигла 14 г/л-сутки. Ферментационная среда в примерах 1-4 содержала один или несколько компонентов из приведенных в Таблице 1.
Пример 1: Clostridium ljungdahalii РЕТС:
2
Повышение плотности бактериальных клеток в реакторе при поддержании разности конверсии СО и Н на заданном уровне.
2
2
2
2
2
Реактор New Brunswick Bioflow I, содержащий ферментационную среду, запустили при скорости активного роста Clostridium ljungdahalii 0.45 г/л. До начала опыта установили скорость перемешивания в реакторе 100 об/мин и скорость газообразного потока 25 мл/мин. В пробах газа и жидкости, отбираемых из реактора через каждые 2-4 часа, определяли поглощение или образование разных газообразных компонентов, концентрацию уксусной кислоты в бульоне, концентрацию этанола в бульоне и оптическую плотность культуры. Поток сингаза в реактор измеряли в реальном времени. Перемешивание реактора повышали ступенчато, в зависимости от конверсии СО и Н. Критерии для усиления перемешивания были следующие: в интервале от 100 до 500 об/мин, когда конверсии СО и Н были выше 10% и отличались друг от друга не более чем на 15%, т.е. конверсия Н была 12% и конверсия СО была 25%, скорость мешалки повышали на 50 об/мин. В интервале от 500 до 600 об/мин: когда конверсии СО и Н отличались друг от друга не более чем на 15%, т.е. конверсия Н была 30% и конверсия СО была 43%, скорость перемешивания повысили на 100 об/мин. Аналогично повышали ступенчато скорость потока газа в реактор. Критерии для повышения газообразного потока были следующие:
2
Когда конверсия Н была >45%, поток газа увеличивали на 5%
2
Когда конверсия Н была >50% поток газа увеличивали на 10%
2
Когда конверсия Н была >65% поток газа увеличивали на 15%
2
Когда конверсия Н была >75% поток газа увеличивали на 20%.
Во всех указанных случаях поток газа увеличивали только тогда, когда конверсия СО была выше 65%.
После начала активного роста бактерий в реакторе (когда плотность клеток в реакторе превышала примерно на 50% начальную плотность клеток) к культуре добавляли композицию витаминов (помимо витаминов, уже присутствовавших в среде), если концентрация уксусной кислоты в культуральном бульоне была ниже заданного значения. Критерии для добавления к культуре витаминного коктейля были следующие: если содержание уксусной кислоты в бульоне было меньше чем примерно 2.5 г/л, то добавляли примерно 0.34 мл витаминов на литр культуры; если содержание уксусной кислоты в бульоне было меньше чем примерно 2 г/л, то добавляли примерно 0.67 мл витаминов на литр культуры; если содержание уксусной кислоты в бульоне было меньше чем примерно 1.5 г/л, то добавляли примерно 1 мл витаминов на литр культуры. Витаминная композиция в этих опытах была следующей:
Биотин
0.08-0.8 мкМ
Тиамин HCl
0.12-1.2 мкМ
Кальций d-пантотенат
0.15-2 мкМ
Кроме биотина, тиамина и пантотената кальция в пример РЕТС внесли витаминную добавку АТСС (каталог No.MD-VS) до конечной концентрации 1% (от ферментационной среды).
Через 12.33 часа после начала инокуляции поток культивационной среды в реактор составил примерно 0.09 мл/мин (примерное время удерживания клеток 277 час). Через 16.08 час после начала инокуляции поток культивационной среды в реактор увеличили до примерно 0.5 мл/мин (примерное время удерживания клеток 50 час). Через 17.8 час к реактору присоединили систему рецикла клеток для контроля высокого содержания уксусной кислоты (8.027 г/л) в культуральном бульоне. В этот момент одну седьмую часть (по объему) подали в систему рецикла клеток (в результате одна система культуры (по объему) была потеряна). Как только присоединение системы рецикла клеток было завершено, через 18.02 час после инокуляции начали разбавлять уксусную кислоту в бульоне путем увеличения потока культивационной среды до 1.5 мл/мин и удаления 1 мл/мин пермеата через систему рецикла клеток.
Плотность клеток в реакторе повышалась во времени и достигла величины 2 г/л через 93.13 часа инокуляции в реакторе. К этому моменту времени концентрация этанола в бульоне составила 3.8 г/л, а общая концентрация уксусной кислоты в бульоне составила 6.93 г/л. Во время этого запуска значение pH культуры поддерживали на уровне между 4.4 и 5.1. Температуру культуры в реакторе поддерживали на уровне от 38.5 до 39.2°C.
Пример 2: Clostridium ljungdahlii С-01:
2
Повышение плотности бактериальных клеток в реакторе при поддержании разности конверсии СО и Н на заданном уровне
2
2
2
2
2
2
Биореактор New Brunswick Bioflow I, содержащий примерно 1.5 литра (например, от примерно 1.32 до примерно 1.6 литров) ферментационной среды запустили с примерно 0.28 г/л активно растущего штамма Clostridium ljungdahlii С-01. Перед началом опыта скорость перемешивания в биореакторе составляла примерно 100 об/мин и скорость газообразного потока была примерно 30 мл/мин. В ходе опыта температуру в биореакторе поддерживали на уровне от примерно 36 до примерно 38°C. Через некоторые интервалы времени (примерно через 2 часа) отбирали пробы для анализа: сингаз на входе в биореактор; газ на выходе из биореактора; ферментационный бульон в биореакторе. Данные анализа позволили определить: поглощение различных компонентов газа, образование различных компонентов газа, концентрацию уксусной кислоты, концентрацию этанола и оптическую плотность ферментационного бульона. Начальную скорость перемешивания в реакторе (100 об/мин) повышали ступенчато, в зависимости от конверсии СО и Н. Критерии для усиления перемешивания были следующие: скорость перемешивания в интервале от примерно 100 до примерно 500 об/мин, когда конверсии СО и Н были равны или превышали начальные значения примерно на 10% и отличались друг от друга не более чем примерно на 15%; например, когда конверсия Н была примерно 12% и конверсия СО была примерно 25%, интенсивность перемешивания повышали примерно на 50 об/мин. В интервале от примерно 500 до примерно 600 об/мин: когда конверсии СО и Н различались менее чем примерно на 15%, например, когда конверсия Н была примерно 30%, а конверсия СО была примерно 43%, интенсивность перемешивания повышали примерно на 100 об/мин. Когда конверсии СО и Н были равны или превышали примерно 60% и примерно 45% соответственно, скорость газообразного потока в реактор повышали ступенчато и при этом повышали интенсивность перемешивания. Критерии для увеличения подачи газа были следующими:
2
Если конверсия Н была больше или равна примерно 45%, подачу сингаза повышали примерно на 5%;
2
Если конверсия Н была больше или равна примерно 50%, подачу сингаза повышали примерно на 10%;
2
Если конверсия Н была больше или равна примерно 65%, подачу сингаза повышали примерно на 15%;
2
Если конверсия Н была больше или равна примерно 75%, подачу сингаза повышали примерно на 20%.
После начала активного роста бактерий в биореакторе (когда плотность клеток в реакторе превышала более чем на 50% начальную величину) в культуру добавляли витаминную композицию (помимо витаминов, уже присутствующих в среде), если концентрация уксусной кислоты в культуральном бульоне была ниже заданного значения. Критерии для добавления в культуру витаминного коктейля были следующие: если содержание уксусной кислоты в культуральном бульоне было ниже примерно 2.5 г/л, то добавляли примерно 0.34 мл витаминов на литр культуры; если содержание уксусной кислоты в культуральном бульоне было ниже примерно 2 г/л, то добавляли примерно 0.67 мл витаминов на литр культуры; если содержание уксусной кислоты в культуральном бульоне было ниже примерно 1.5 г/л, то добавляли примерно 1 мл витаминов на литр культуры. Состав витаминной добавки в этих опытах был следующим:
Биотин
0.08-0.8 мкМ
Тиамин HCl
0.12-1.2 мкМ
Кальций d-пантотенат
0.15-1.5 мкМ
Через примерно 28 часов после начала инокуляции поток культивационной среды в реактор составил примерно 0.5 мл/мин (примерное время удерживания клеток 125 час). В ходе опыта величину pH поддерживали на уровне примерно 4.5.
Масса клеток увеличивалась во времени и достигла значения примерно 2.8 г/л через примерно 128 час инокуляции в реакторе. В этот момент культура производила примерно 25 г/л этанола.
Пример 3: Clostridium autoethanogenum (DSM 10061):
2
Повышение плотности бактериальных клеток в реакторе при поддержании разности конверсии СО и Н на заданном уровне
2
2
2
2
2
2
Биореактор New Brunswick Bio flow I, содержащий примерно 1.5 литра (например, от примерно1.38 до примерно 1.6 литров) ферментационной среды, запустили с примерно 0.33 г/л штамма активно растущих Clostridium autoethanogenum. В начале опыта скорость перемешивания в биореакторе была 100 об/мин и газ подавали со скоростью примерно 30 мл/мин. В ходе опыта температуру в биореакторе поддерживали на уровне от примерно 36 до примерно 37.5°C. Через некоторые интервалы времени (например, через 2 часа) отбирали пробы для анализа: сингаз на входе в биореактор; отходящий газ из биореактора; ферментационный бульон в биореакторе. По данным анализа определяли: поглощение различных компонентов газа, образование различных компонентов газа, концентрацию уксусной кислоты, концентрацию этанола и оптическую плотность ферментативного бульона. Начальную скорость перемешивания в биореакторе повышали ступенчато, в зависимости от конверсии СО и Н. Критерии для увеличения интенсивности перемешивания были следующими; в интервале от примерно 100 до примерно 500 об/мин, когда конверсии СО и Н превышали примерно 10% и различались между собой не более чем на 15%, например, когда конверсия Нбыла примерно 12%, конверсия СО была примерно 25%, скорость перемешивания увеличивали на примерно 50 об/мин. В интервале от примерно 500 до примерно 600 об/мин: когда конверсии СО и Н отличались между собой не более чем на примерно 15%, например, когда конверсия Н была примерно 30% и конверсия СО была примерно 43%, скорость перемешивания повышали примерно на 100 об/мин. Когда конверсии СО и Н становились равными или превышали примерно 65% и примерно 45% соответственно, скорость газообразного потока в реактор повышали ступенчато наряду с интенсификацией перемешивания. Критерии для увеличения подачи газа были следующими:
2
Если конверсия Н была больше или равна примерно 45%, подачу сингаза повышали примерно на 5%;
2
Если конверсия Н была больше или равна примерно 50%, подачу сингаза повышали примерно на 10%;
2
Если конверсия Н была больше или равна примерно 65%, подачу сингаза повышали примерно на 15%;
2
Если конверсия Н была больше или равна примерно 75%, подачу сингаза повышали примерно на 20%.
После начала активного роста бактерий в реакторе (когда плотность клеток в реакторе становилась выше примерно 50% начальной величины) в культуру добавляли витаминную композицию (помимо витаминов, присутствующих в среде), если концентрация уксусной кислоты в культуральном бульоне была ниже заданного значения. Критерии для добавления витаминного коктейля были следующими: если содержание уксусной кислоты в культуральном бульоне было ниже примерно 2.5 г/л, то добавляли примерно 0.34 мл витаминов на литр культуры; если содержание уксусной кислоты в культуральном бульоне было ниже примерно 2 г/л, то добавляли примерно 0.67 мл витаминов на литр культуры, если содержание уксусной кислоты в культуральном бульоне было ниже примерно 1.5 г/л, то добавляли примерно 1 мл витаминов на литр культуры. Состав витаминной добавки в этих опытах был следующим:
Биотин
0.08-0.8 мкМ
Тиамин HCl
0.12-1.2 мкМ
Кальций d-пантотенат
0.15-1.5 мкМ
Через примерно 12.5 часов после начала инокуляции поток культивационной среды в реактор составлял примерно 0.1 мл/мин (примерное время удерживания клеток 233 час). Через примерно 27.8 часов после начала инокуляции поток культивационной среды в реактор составлял примерно 0.2 мл/мин (примерное время удерживания клеток 116 час). Через примерно 66.2 после начала инокуляции поток культивационной среды в реактор был примерно 0.42 мл/мин (примерное время удерживания клеток 61 час). В ходе опыта значение pH поддерживали на уровне примерно 4.5.
Масса клеток увеличивалась во времени и достигла значения примерно 2.59 г/л примерно через 120 час после инокуляции в реакторе. В этот момент производительность культуры по этанолу составила примерно 19 г/л.
Пример 4: Butyribacterium Methylotrophicum (АТСС 33266).
2
Повышение плотности бактериальных клеток в реакторе при поддержании разности конверсии СО и Н на заданном уровне
В этом опыте протестировали способ запуска процедуры поглощения монооксида углерода неклостридиальным ацетогеном.
2
2
2
2
2
Этот опыт был запущен в биореакторе New Brunswick Bioflow I, содержащим 0.79 г/л активно растущего Butyribacterium Methylotrophicum в ферментационой среде, как описано выше. Перед началом опыта установили скорость перемешивания в реакторе 100 об/мин и скорость газообразного потока 40 мл/мин. Каждые 2-4 часа отбирали на анализ пробы газа и жидкости и определяли поглощение и образование различных компонентов газа, концентрацию уксусной кислоты в бульоне, концентрацию этанола в бульоне и оптическую плотность культуры. Кроме того, с помощью регулятора массового расхода ежедневно измеряли состав сингаза и поток сингаза в реактор в реальном времени. Интенсивность перемешивания в реакторе повышали ступенчато в зависимости от конверсии СО и Н. Критерии для усиления перемешивания были следующими. В интервале от 100 до 500 об/мин, если конверсии СО и Н были ниже 10% и различались между собой менее чем на 15%, например, когда конверсия Н была 12% и конверсия СО была 25%, скорость перемешивания увеличивали на 50 об/мин. В интервале от 500 до 600 об/мин: когда конверсии СО и Н различались между собой менее чем на 15%, например, когда конверсия Н была 30% и конверсия СО была 43%, скорость перемешивания увеличивали на 100 об/мин. Аналогично, повышали ступенчато скорость подачи газа в реактор. Критерии для повышения подачи газа были следующими:′
2
Если конверсия Н была >45%, подачу газа повышали на 5%
2
Если конверсия Н была >50%, подачу газа повышали на 10%
2
Если конверсия Н была >65%, подачу газа повышали на 15%
2
Если конверсия Н была >75%, подачу газа повышали на 20%.
Во всех этих случаях подачу газа увеличивали только тогда, когда конверсия СО была выше примерно 65%.
После начала активного роста бактерий в реакторе (когда плотность клеток в реакторе становилась выше примерно 50% начальной величины) в культуру добавляли витаминную композицию (помимо витаминов, присутствующих в среде), если концентрация уксусной кислоты в культуральном бульоне была ниже заданного значения. Критерии для добавления витаминного коктейля были следующими: если содержание уксусной кислоты в культуральном бульоне было ниже примерно 2.5 г/л, добавляли примерно 0.34 мл витаминов на литр культуры; если содержание уксусной кислоты в культуральном бульоне было ниже примерно 2 г/л, то добавляли примерно 0.67 мл витаминов на литр культуры, если содержание уксусной кислоты в культуральном бульоне было ниже примерно 1.5 г/л, то добавляли примерно 1 мл витаминов на литр культуры. Состав витаминной добавки в этих опытах был следующим:
Биотин
0.08-0.8 мкМ
Тиамин HCl
0.12-1.2 мкМ
Кальций d-пантотенат
0.15-1.5 мкМ.
В этом опыте к реактору перед началом опыта присоединяли систему рецикла клеток (CRS). Через 09.58 час после начала опыта в реактор начали подавать поток ферментационной среды (питательные вещества) со скоростью 1 мл/мин и отводили пермеаты из реактора через CRS со скоростью 1 мл/мин.
Масса клеток увеличивалась во времени и достигла значения примерно 4.56 г/л через 43 часа после инокуляции в реакторе. В этот момент производительность культуры по этанолу составила 10.53 г/л и общая концентрация уксусной кислоты составила 4.24 г/л. Во время этого запуска значение pH культуры поддерживали на уровне между 4.69 и 4.71. Температуру культуры в реакторе поддерживали на уровне от 38.5 до 38.6°C.
Специалисты в данной области могут осуществить многие модификации и вариации настоящего изобретения, не отклоняясь от его объема, включая конкретные варианты, примеры, формулу, заявку и т.д. Все опубликованные документы включены здесь ссылками.