СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ КОАГУЛЯЦИИ ПЛАЗМЫ КРОВИ - АКТИВНОСТИ ТРОМБИНА, ВРЕМЕНИ РЕКАЛЬЦИФИКАЦИИ ПЛАЗМЫ И ТОЛЕРАНТНОСТИ ПЛАЗМЫ К ГЕПАРИНУ
METHOD FOR DETERMINING BLOOD PLASMA COAGULATION INDICATORS - THROMBIN ACTIVITY, PLASMA RECALCIFICATION TIME AND PLASMA TOLERANCE TO HEPARIN

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторным способам исследования гемостаза.
Тромбин – IIa фактор свертывания крови, сериновая эндопептидаза, катализирующая ключевую реакцию гемостаза – гидролитическое расщепление фибриногена до фибрин-мономеров, которые самопроизвольно полимеризуются в фибрин — основу тромба. Кроме того, тромбин является одним из сильнейших индукторов агрегации тромбоцитов, активатором ключевого фермента фибринолиза плазминогена и системы протеина С как важнейшего физиологического антикоагулянта. Таким образом, тромбин является связующим звеном между всеми компонентами гемостаза: и сосудисто-тромбоцитарного и коагуляционного и физиологических антикоагулянтов. Определение его активности при различных заболеваниях может использоваться в качестве интегрального показателя гемостаза.
В настоящее время еще одним из показателей коагуляции крови является время рекальцификации плазмы (время коагуляции), определяемое после добавления ионов кальция к цитратной плазме. В клинической лабораторной практике этот показатель сопоставляется с активированным временем рекальцификации цельной крови (АВР).
Кроме того, важным показателем гемостаза является толерантность плазмы к гепарину.
По величинам перечисленных показателей судят о состоянии гемостаза.
Определить ферментативную активность тромбина возможно двумя путями: как скорость расходования его субстрата или как скорость накопления продукта реакции.
Путь определения ферментативной активности тромбина по измерению количества его субстрата за определенный промежуток времени нашел отражение в способе, основанном на добавлении к цитратной бестромбоцитратной плазме или цельной крови флуорогенного субстрата (например, пептида, меченного 7-амино-4-метилкумарином) и рекомбинантного человеческого тканевого тромбопластина для запуска коагуляционного каскада по внешнему механизму с последующим измерением интенсивности флуоресценции образующегося при гидролизе флуорофора (Hemiker H.C., Giesen P., Al Dieri R et al. Calibrated automated trombin generation measurement in clotting plasma.// Pathophysiol. Haemost. Thromb. – 2003 - № 33 – р. 4-15).
Этот метод не пригоден для определения других показателей процесса коагуляции.
Измерение активности тромбина по накоплению продукта реакции (фибрина) затруднительно в связи с тем, что фибрин, по мере своего образования, формирует нерастворимый сгусток, в стабилизации которого принимает участие другой фермент трансглутаминаза (фактор XIII a). (Биохимия: Учебник / Под ред. Е. С. Северина. - 2 изд-е, испр. – М.: Гэотар-мед 2004. - 784 с.: ил.).
Существует способ определения активности тромбина, основанный на скорости образования фибриновых нитей оптико-механическим методом (Спиридонова В.А., Рог Е.В., Дугина Т.Н., Струкова С.М., Копылов А.М. // Биоорган. химия. 2003. T. 29, с.495-498). Сущность этого метода состоит в перемешивании магнитной мешалкой бестромбоцитарной плазмы в присутствии ионов кальция, что приводит к наматыванию на нее фибриновых нитей, которые тормозят вращение мешалки вплоть до полной остановки. Время остановки мешалки фиксируется как время коагуляции плазмы. Если время коагуляции плазмы составляет 1,5 – 3 мин, активность тромбина считают нормальной. Повышение или понижение этого показателя говорит об отклонениях в гемостазе. Стандартизация реагентов и условий реакции делает время коагуляции хорошо воспроизводимым параметром.
Однако с помощью этого метода невозможно разграничить реакции образования полимер-фибрина из фибрин-мономера и полимер-фибрина, стабилизированного с участием трансглутаминазы, а также оценить время активации протромбиназного комплекса, характеризующего толерантность плазмы к гепарину.
2
2
Известен способ определения активности тромбина [патент 2429488 RU, МПК G01N 33/86/ Способ определения активности тромбина / Головин Андрей Викторович (RU), Копылов Алексей Михайлович (RU), Завьялова Елена Геннадьевна (RU), Павлова Галина Валериевна (RU), Мудрик Николай Николаевич (RU), Бабий Владимир Евстахиевич (RU); заявитель и патентообладатель Общество с ограниченной ответственностью "АПТО-ФАРМ" (RU). - № 2010119575/15; заявл. 18.05.2010; опубл. 20.09.2011, Бюл. № 26], основанный на методе турбидиметрического наблюдения за образованием фибринового сгустка. Регистрацию светопропускания инкубационной среды в методе проводят с помощью ультрафиолетового диапазона излучения от 230 до 320 нм посредством УФ-спектрофотометра в качестве детектора фибрин-полимера. Для получения фибринового сгустка при температуре 27°С используется 0,1±0,005% человеческий фибриноген; буфер с pH 7,4±0,1, 1,4±0,05 М NaCl, 50±5 мМ KCl, 10±1 мМ MgCl, 10±1 мМ CaCl) и тромбин человеческий (0,2-50 мкМ).
Момент добавления раствора тромбина фиксируют секундомером и проводят измерения оптической плотности образца при рабочей длине волны 200-300 нм (в работе обычно использовалось излучение 230 нм). Измерения прекращают при достижении плато кривой оптической плотности. Этот период времени является временем коагуляции. В описываемом методе активность тромбина рассчитывали как тангенс угла наклона касательной в точке перегиба полученной кривой изменения оптической плотности. Авторы патента считают, что этот параметр можно интерпретировать как максимальную скорость накопления фибрин-полимера.
Однако этот способ используется в области медицинских исследований, фармацевтической промышленности и биотехнологии с целью определения удельной активности тромбина, полученного в процессе его биохимического синтеза. Не фиксируется стадийность процесса и параметры отдельных стадий.
Известен способ определения активности тромбина плазмы крови, представленный в работе (Stief T.W. Specific determination of plasmatic thrombin activity Clinical and Applied Thrombosis/Haemostasis, -2006, -12(3): 324-329). Для наблюдения за процессом коагуляции авторы использовали хромогенный субстрат в концентрации менее 0,4 мМоль/л, аргинин, при концентрации выше 0,8 Моль/л, и фактор II-истощенную плазму. Коагуляцию, инициировали либо тканевым фактором, либо активатором контактной фазы. Авторами были рассчитаны активности циркулирующего тромбина 0,35 мкМ/мин.
Основным недостатком данного метода является то, что он не пригоден для определения других показателей процесса коагуляции.
Флуоресцентная спектроскопия – один из наиболее чувствительных и информативных методов молекулярной сенсорики, которые позволяют раскрыть механизмы биологических реакций. Большое многообразие флуоресцентных сенсоров в совокупности с возможностями их тонкой спектральной настройки и регуляции механизмов оптического отклика позволяет добиться высокой селективности определения содержания молекул, ионов и параметров состояния системы в условиях нативных биологических систем. Поэтому использование различных флуоресцентных сенсоров является актуальной задачей современной медицинской диагностики (Escobedo J.O., Rusin O., Lim S., Strongin R.M. NIR dyes for bioimaging applications//Current opinion in chemical biology. 2010 - №14- р.64-70).
В настоящее время описано множество флуоресцентных сенсоров. Отдельный класс органических флуорофоров представляют соединения бордипирринового ряда, так называемые BODIPY–флуорофоры. Структурные модификации BODIPY позволяют реализовать разные механизмы спектрально-флуоресцентного отклика молекул на присутствие/концентрацию в системе различных соединений, в том числе биогенных молекул. Изменения флуоресцентных характеристик BODIPY в присутствии биомолекул были интерпретированы с использованием теории динамического/статического тушения Штерна-Фольмера и свидетельствуют о возможности использования данных соединений для анализа полярности, гидрофобности/гидрофильности отдельных сайтов белковых молекул для наблюдения за процессом коагуляции плазмы крови.
Наибольший интерес среди существующих BODIPY–флуорофоров представляют соединения с объемными ароматическими заместителями в мезо-положении дипирринового фрагмента. Обладающие достаточной селективностью к белкам плазмы крови при молекулярном комплексообразовании и других межмолекулярных взаимодействий они повышают свои флуоресцентные свойства за счет резонансного переноса энергии (Мarfin Yu S., Aleksakhina E.L., Merkushev D.A., Rumyantsev E.V., Tomilova I.K., Interaction of BODIPY Dyes with the Blood Plasma Proteins// Journal of Fluorescence – 2016 - №1 – p. 255-261).
Эти свойства BODIPY–флуорофоров позволяют использовать их в качестве сенсоров, отражающих изменение концентрации фибриногена, регистрировать ступенчатый процесс его преобразования в фибрин, определять активность тромбина.
Ни один из известных в литературе способов определения показателей коагуляции плазмы крови не предполагает использование флуоресцентных молекул соединений бордипирринового ряда в качестве сенсоров преобразований молекулярного состояния биомолекул плазмы крови.
Техническим результатом заявляемого изобретения является расширение технических возможностей за счет одновременного определения трех показателей коагуляции плазмы крови - активности тромбина, времени рекальцификации плазмы и толерантности плазмы к гепарину, и повышение чувствительности и точности процесса их определения.
Указанный результат достигается тем, что способ одновременного определения показателей коагуляции плазмы крови - активности тромбина (фактор коагуляции IIa), времени рекальцификации плазмы и толерантности плазмы к гепарину, характеризуется, согласно изобретению, тем, что используют флуоресцентный метод в видимом диапазоне излучения 420 – 600 нм с участием соединений бордипиринового ряда (BODIPY), флуоресцентные характеристики которых зависят от присутствия биомолекул (в частности, фибриногена), наблюдают за образованием фибринового сгустка, получают и анализируют кривую коагуляции при регистрации изменения интенсивности флуоресценции на спектрофлуориметре за промежуток времени от стадии формирования полимерного фибрина до стадии стабилизации кровяного сгустка.
Доказательство достижения технического результата: расширение технических возможностей происходит за счет одновременного определения трех показателей коагуляции плазмы крови - активности тромбина, времени рекальцификации плазмы и толерантности плазмы к гепарину по кривой коагуляции, а повышение чувствительности и точности процесса определения показателей коагуляции плазмы в настоящем способе обусловлена высокой чувствительностью бордипириновых флуорофоров к изменению полярности, гидрофобности/гидрофильности отдельных сайтов фибриногена (субстрата тромбина) и продукта его полимеризации – фибрина. Именно высокая чувствительность BODYPI позволяет регистрировать и наблюдать многоступенчатый процесс коагуляции плазмы, разграничить действие двух различных ферментов, рассчитать активность тромбина, используя для этого  кривую коагуляции.
Изобретение поясняется чертежом, на котором приводится кривая коагуляции бестромбоцитарной плазмы»: 1 – в отсутствии гепарина; 2 – в присутствии гепарина.
Пример осуществления способа.
-5
Для исследования использовалась свежая цитратная бестромбоцитарная плазма крови, взятая из локтевой вены. Концентрацию фибриногена в образцах определяли модифицированным методом Клаусса. Плазма, разведенная дистиллированной водой (к 0,4 мл плазмы прибавляли 2,45 мл воды) и 0,15 мл раствора BODIPY–флуорофора в ДМСО (с = 1⋅10 моль/л) смешивались в термостатируемой (37°С) спектрофотометрической кювете.
Запуск коагуляции осуществляли добавлением в кювету 0,04 мл 1% хлорида кальция. С момента добавления через равные промежутки времени автоматически с помощью спектрофлуориметра производили измерение интенсивности флуоресценции образца в интервале длин волн 420–600 нм, при этом были использованы такие соединения бордипирринового ряда, как: 4,4-дифторо-8-фенил-1,3,5,7-тетраметил-2,6-диэтил-4-бор-3a,4a-диаза-s-индацен; 4,4-дифторо-8-(пара-диметиламинофенил)-1,3,5,7-тетраметил-2,6-диэтил-4-бор-3a,4a-диаза-s-индацен; 4,4-дифторо-8-(ди-ортометилфенил)-1,3,5,7-тетраметил-2,6-диэтил-4-бор-3a,4a-диаза-s-индацен, имеющие общую структурную формулу:
Таким образом, регистрировали зависимость интенсивности флуоресценции на максимуме испускания BODIPY–флуорофора от времени – кривую коагуляции образца плазмы. Исследование прекращали при достижении устойчивого плато на кривой изменения флуоресценции. Далее проводили анализ кривой коагуляции (чертеж).
На стандартной кривой коагуляции (чертеж - кривые 1 и 2) можно наблюдать три участка: верхнее плато, ниспадающий участок и нижнее плато.
lag
lag
Длина верхнего плато (t) соответствует периоду времени активации протромбиназного комплекса и очень чувствительна к наличию или отсутствию антикоагулянтов в плазме. Присутствие гепарина в крови человека (Яковлев А.Н. Медицинский совет, 2010, №5-6, 64 – 67), из которой получена плазма, значительно удлиняет этот период (кривая 2 на чертеже). Промежуток времени t является лимитирующим показателем, определяющим толерантность плазмы к гепарину, т.к. является характеристикой, отражающей время начала формирования сгустка фибрина после добавления в исследуемый материал гепарина (табл.1). Ранее доказано, что толерантность плазмы к гепарину в норме составляет 7-15 минут. Если же этот показатель составляет менее 7 мин, то диагностируется заболевание сердечно-сосудистой системы (Кишкун А.А. Руководство по лабораторным методам диагностики. Учебно-практическое издание. ГЭОТАР-Медиа, 2009 - 800 с. Общая врачебная практика: диагностическое значение лабораторных исследований: учебн.пособ./под ред. Вялова С.С., Чорбинской С.А., 4-е изд. , М.: МЕДпресс-информ, 2010).
Ниспадающий участок кривой коагуляции соответствует ключевой реакции плазменного гемостаза – гидролитическому расщеплению фибриногена при каталитическом действии имеющегося в плазме тромбина до фибрин-мономеров, которые самопроизвольно полимеризуются в фибрин — основу тромба. Касательная, проведенная к ниспадающему участку кривой коагуляции, образует угол наклона φ к оси ординат: tg φ пропорционален скорости образования полимерного фибрина из фибриногена, т.е. активности тромбина. Активность тромбина прямо пропорциональна произведению tg φ и концентрации фибриногена в плазме (мкМоль/л) с учетом разведения в спектрофотометрической кювете (табл.2). Как показывают данные этой таблицы, усредненная активность тромбина крови у группы пожилых людей (45-65 лет), определенная по предлагаемому методу, соответствует литературным данным (Stief T.W. Specific determination of plasmatic thrombin activity Clinical and Applied Thrombosis/Haemostasis, -2006. -12(3): 324-329).
При выходе на нижнее плато кривой коагуляции над процессом латеральной полимеризации фибрин-полимеров в фибриновом сгустке начинают преобладать процессы их стабилизации под действием другого фермента – трансглютаминазы. Это наглядно видно на участке ав кривой коагуляции 1: тангенс угла наклона касательной к этому участку кривой коагуляции изменяется. Время выхода на нижнее плато, полученное экстраполяцией касательной, тангенс угла наклона которой характеризует активность тромбина, следует считать временем окончания коагуляции (в клинической практике - время рекальцификации плазмы, референсные значения 100-180 мин) (табл.3).
lag
Время задержки (t) формирования фибринового сгустка (время активации протромбиназного комплекса) показаны в таблице 1.
Таблица 1.
№ примеров
Время активации протромбиназного комплекса, мин
Цитратная плазма без гепарина(добровольцы в возрасте 45-65 лет без установленного диагноза сердечно-сосудистого заболевания)
Цитратная плазма с гепарином(пациенты в возрасте 45-65 лет с диагнозом острый коронарный синдром)
1
1.67
4,33
2
1,33
4,33
3
2
4,67
4
1,67
4,67
5
1,67
5,00
6
1,33
4,67
7
2
4,67
8
1,67
5,67
9
1,67
4,33
10
1,33
5,00
11
2
4,67
12
2
5,00
13
1,67
4,67
14
1,67
4,67
15
1,33
5,00
16
1,67
5,67
17
2
5,00
18
2
4,33
19
1,67
5,00
20
1,67
5,33
1,70±0,30
4,60±0,37
lag
lag
Данные таблицы 1 иллюстрируют, что анализ кривой коагуляции, полученной по предлагаемому способу, позволяет оценить время активации (t) протромбиназного комплекса, являющееся лимитирующим фактором процесса коагуляции и обуславливающим толерантность плазмы к гепарину, тем самым оценить вклад t в величину показателя толерантности и во временя рекальцификации плазмы, повышая чувствительность и точность процесса определения показателей коагуляции плазмы крови.
Активность тромбина крови у группы добровольцев  в возрасте 45-65 лет без установленного диагноза сердечно-сосудистого заболевания показана в таблице 2.
Таблица 2
№ примеров
tg φ
A<sub>tr</sub>, mkM/ мин
1
0,26
0,33
2
0,18
0,23
3
0,38
0,48
4
0,23
0,29
5
0,20
0,25
6
0,22
0,28
7
0,24
0,30
8
0,27
0,34
9
0,26
0,33
10
0,49
0,61
11
0,41
0,51
12
0,33
0,42
13
0,23
0,29
14
0,29
0,37
15
0,21
0,26
16
0,17
0,22
17
0,35
0,45
18
0,29
0,37
19
0,18
0,23
20
0,41
0,51
0,35±0,11
Данные таблицы 2 показывают, что усредненная активность тромбина крови у группы пожилых людей (45-65 лет) соответствует литературным данным (Stief T.W. Specific determination of plasmatic thrombin activity Clinical and Applied Thrombosis/Haemostasis, -2006. -12(3): 324-329) и получена при одновременном определении других заявленных показателей, которые также соответствуют референсным значениям.
Время рекальцификации плазмы у группы добровольцев в возрасте 45-65 лет без установленного диагноза сердечно-сосудистого заболевания показано в таблице 3.
Таблица 3.
№ примеров
Время рекальцификации плазмы, мин
1
3,33
2
4,00
3
2,67
4
2,67
5
3,33
6
2,33
7
3,00
8
2,67
9
2,33
10
2,33
11
1,67
12
3,00
13
2,67
14
2,33
15
3,00
16
2,67
17
2,67
18
2,33
19
2,33
20
1,67
2,65 ±0,98
Данные таблицы 3, отражающие время рекальцификации плазмы, получены путем экстраполяции касательной к ниспадающему участку кривой коагуляции на ось абсцисс (время), отсекая стадию стабилизации фибринового сгустка. Такой подход позволяет повысить точность и чувствительность анализа, т.к. учитывает действие только тромбина и не учитывает стабилизирующее действие другого фермента - трансглютаминазы (фактор коагуляции XIII).
Основные контролируемые показатели коагуляции плазмы крови, полученные на разных соединениях бордипирринового ряда, представлены в таблице №4.
Таблица 4
Название BODIPY
Время рекальцификации плазмы, мин
Актив-ность тромбинаA<sub>tr</sub>, mkM/ мин
Время активации протромбиназного комплекса, мин
Длина волны макси-мума флуорес-ценции образца BODIPY, нм
Цитратная плазма без гепарина(добровольцы в возрасте 45-65 лет без установленного диагноза сердечно-сосудистого заболевания)
Цитратная плазма с гепарином(пациенты в возрасте 45-65 лет с диагнозом острый коронарный синдром)
4,4-дифтор-8-фенил-1,3,5,7-тетраметил-2,6-диэтил-4-бор-3а,4а-диаза-s-индацен
2,65 ±0,98
0,35±0,11
1,70±0,30
4,60±0,37
580
4,4-дифторо-8-(пара-диметиламинофенил)-1,3,5,7-тетраметил-2,6-диэтил-4-бор-3a,4a-диаза-s-индацен
2,65 ±0,97
0,35±0,14
1,70±0,31
4,60±0,36
537
4,4-дифторо-8-(ди-ортометилфенил)-1,3,5,7-тетраметил-2,6-диэтил-4-бор-3a,4a-диаза-s-индацен
2,65 ±0,97
0,35±0,10
1,70±0,29
4,60±0,37
537
Таким образом, данный способ позволяет, используя сенсорные возможности BODIPY–флуорофоров, регистрировать, выделять и одновременно численно характеризовать стадии процесса коагуляции плазмы, т.е. повысить точность и чувствительность определения показателей коагуляции, таких, как активность тромбина, время рекальцификации плазмы и толерантность плазмы к гепарину.