КОМПОЗИЦИИ ДОСТАВКИ С ЗАМЕДЛЕННЫМ ВЫСВОБОЖДЕНИЕМ И СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ БЕЛКОВ В ПРОЦЕССЕ ИЗГОТОВЛЕНИЯ
SUSTAINED-RELEASE DELIVERY COMPOSITION AND A METHOD FOR STABILIZING PROTEINS IN THE MANUFACTURING PROCESS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] В настоящей заявке заявляется приоритет согласно 35 U.S.C. § 119(e) заявки U.S. №61/786035, поданной 14 марта 2013 года, описание которой в полном объеме включено в настоящий документ посредством ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0002] Настоящее изобретение, в целом, относится к препаратам для непрерывной доставки активных веществ, например, белков.
ОПИСАНИЕ ПРЕДШЕСТВУЮЩЕГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ
[0003] Доставка лекарств в организм человека, животного, в частности, в глаз человека или животного, в том числе сетчатку, стекловидное тело и увеальный тракт, как правило, достигается высокой системной дозировкой внутриглазных инъекций соединений, содержащих активное вещество, такое как белок.
[0004] Трудности могут заключаться в стабилизации активного вещества, такого как белок, в подходящем носителе, таком как микросферы. Тем не менее, процесс инкапсуляции белка в препарате микросфер часто дестабилизирует белок через множество различных стрессов, таких как концентрационный стресс, напряжение сдвига и межфазное напряжение. Эффект этих вызванных стрессов может привести к денатурации и агрегации белка, что приводит к пониженной биодоступности и потенциально неблагоприятному иммунному ответу.
[0005] Кроме того, чтобы вызвать стресс, белки, заключенные в полимерной матрице, часто подвергаются неблагоприятным физиологическим условиям среды, а также микросреды внутри полимерной матрицы. На физиологическом уровне среды 6елки подвергаются воздействию повышенных температур, таких как 37°С и выше. На микроокружающем уровне белки подвергаются также эффекту концентрации на начальной стадии гидратации, сдвига pH и гидрофобному эффекту полимеров, используемых в матрице. Эти условия окружающей среды могут быть неблагоприятными для долгосрочной стабильности белков и, в конечном счете ограничить их активность и доступность в связи с агрегацией, химической модификацией и фрагментацией.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0006] Описанные в данном документе препараты, способы получения композиций и способы применения композиций включают инкапсулирование белков внутри полимерной матрицы с высокой эффективностью и качеством, чтобы обеспечить непрерывную доставку в течение длительного периода времени.
[0007] В одном варианте реализации изобретения композиция содержит частицы, при этом частицы содержат белок, биоразлагаемый полимер и один или более наполнителей. Частицы могут быть выполнены с возможностью доставлять белок в течение не менее двух месяцев. В некоторых вариантах реализации изобретения биоразлагаемый полимер содержит поли(d,l-лактид-со-гликолид), поли(d,l-лактид) и/или сополимеры полиэтиленгликоля с характеристической вязкостью в диапазоне от 0,1 дл/г до 1,0 дл/г. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, белок имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 кДа до 150 кДа. В одном варианте реализации изобретения один или более наполнителей включают циклодекстрин, трегалозу, аргинин или их комбинацию. Согласно варианту реализации изобретения, циклодекстрин представляет собой сульфобутилэфир-бета-циклодекстрин.
[0008] В другом варианте реализации изобретения водный препарат включает белок, буфер и одно или более вспомогательных веществ, выбранных из группы, состоящей из циклодекстрина, трегалозы и аргинина. Одно или более вспомогательных вещесто могут присутствовать в водной композиции в молярном соотношении в диапазоне от 10/1 до 200/1, по отношению к молярной концентрации белка.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0009] Эти и другие признаки будут далее описаны со ссылкой на графические материалы, кратко описанные ниже. Эти графические материалы и соответствующее описание предназначены для иллюстрации одного или более вариантов реализации изобретения и не ограничивают объем изобретения.
[00010] ФИГ. 1 иллюстрирует гистограмму сравнения выхода растворимого белка в типовых вариантах реализации изобретения.
[00011] ФИГ. 2 иллюстрирует гистограмму сравнения выхода растворимого белка в других типовых вариантах реализации изобретения.
[00012] ФИГ. 3 иллюстрирует гистограмму сравнения выхода растворимого белка в еще других типовых вариантах реализации изобретения.
[00013] ФИГ. 4 представляет собой график, иллюстрирующий профили высвобождения типовых вариантов реализации микросфер.
[00014] ФИГ. 5 представляет собой график, иллюстрирующий профили высвобождения типовых вариантов реализации микросфер.
[00015] ФИГ. 6 представляет собой график, иллюстрирующий профили высвобождения типовых вариантов реализации микросфер.
[00016] ФИГ. 7 представляет собой график, иллюстрирующий профили высвобождения типовых вариантов реализации микросфер.
[00017] ФИГ. 8 представляет собой график, иллюстрирующий функцию связывания типовых вариантов реализации микросфер.
[00018] ФИГ. 9 представляет собой график, иллюстрирующий профили высвобождения типовых вариантов реализации микросфер.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[00019] Как описано в данном документе, контролируемое и непрерывное введение терапевтического агента, такого как белок, путем введения одной или более микрочастиц может улучшить лечение патологий, таких как нежелательные глазные патологии переднего или заднего сегментов. Микрочастицы содержат фармацевтически приемлемый полимерный состав и составлены так, чтобы освободить один или более фармацевтически активных веществ, таких как белок, или другое вещество, нейропротекторное или снижающее внутриглазное давление, в течение длительного периода времени. Микросферы могут быть составлены так, чтобы обеспечить замедленное высвобождение белка, при одновременном снижении количества белковых агрегатов, достижении желаемых профилей высвобождения и повышении стабильности белка в препаратах микросфер.
[00020] Следующие термины могут быть определены следующим образом, если контекст слова не указывает на другое значение.
[00021] В настоящем описании «микросфера» и «микрочастица» используются взаимозаменяемо для обозначения частиц, микросфер, микрочастиц, мелкодисперсных порошков и т.п., содержащих биосовместимую матрицу, инкапсулирующую или включающую терапевтический компонент. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, микросферы не включают наночастицы или наносферы. Микросферы, как правило, биологически совместимыми с физиологическими условиями органа человека, такого как глаз, и не вызывают отрицательных побочных эффектов. Микросферы, вводимые субконъюнктивально, могут быть использованы без нарушения зрения. В некоторых вариантах реализации изобретения микросферы имеют максимальный размер, такой как диаметр или длину менее 1 мм. Например, микрочастицы могут иметь максимальный размер менее чем около 500 мкм. Микрочастицы могут также иметь максимальный размер не более чем около 200 мкм или могут иметь максимальный размер от около 30 мкм до около 50 мкм, среди других размеров.
[00022] В настоящем описании «терапевтический компонент» относится к части микросферы, кроме полимерной матрицы, содержащей один или более терапевтических агентов или веществ, используемых для лечения патологии глаз. Терапевтический компонент может быть дискретной областью микросферы или он может быть равномерно распределен по всей микросфере. Терапевтические агенты терапевтического компонента могут содержать по меньшей мере один белок, они, как правило, офтальмологически приемлемы и предоставлены в такой форме, которая не вызывает значительных побочных реакций при помещении микросферы в глаз.
[00023] В настоящем описании термин «белок» должен иметь общий смысл, как известно в данной области техники, и может относиться к крупным биологическим молекулам, состоящим из одной или более цепей аминокислот. Белки могут выполнять широкий спектр функций в живых организмах, в том числе катализировать метаболические реакции, реплицировать ДНК, отвечать на раздражители и транспортировать молекулы из одного места в другое. Белки могут быть линейными, разветвленными или круглыми и могут быть химически синтезированными или естественными, или полученными рекомбинантным способом. В некоторых вариантах реализации изобретения белки могут также включать белки, которые модифицированы, например, ПЕГилированные белки или пост-трансляционно модифицированные белки.
[00024] В настоящем описании «компонент поддержания высвобождения лекарственного средства» относится к части микросферы, которая является эффективной для обеспечения замедленного высвобождения терапевтических агентов из микросфер. Компонент поддержания высвобождения лекарственного средства может быть биоразлагаемой полимерной матрицей или покрытием, охватывающим область сердцевины микросферы, которая включает терапевтический компонент.
[00025] В настоящем описании «связанный с» означает смешанный с, диспергированный в, в сочетании с, охватывающий или окружающий.
[00026] Термин «биоразлагаемый полимер» относится к полимеру или полимерам, которые разлагаются in vivo, и при этом эрозия полимера или полимеров с течением времени происходит одновременно с или после высвобождения терапевтического агента. Термины «биоразлагаемый» и «биоразрушающийся» эквивалентны и используются в данном документе взаимозаменяемо. Биоразлагаемый полимер может быть гомополимером, сополимером или полимером, содержащим более чем две различных полимерных единицы.
[00027] Термин «терапевтически эффективное количество», используемый в данном документе, относится к уровню или количеству агента, необходимого для лечения патологий, например, глазных патологий или уменьшения, или предотвращения глазной травмы или повреждения, не вызывающего существенных отрицательных или вредных побочных эффектов в глазу или в области глаза. В свете вышеизложенного, терапевтически эффективное количество терапевтического агента, такого как белок, представляет собой количество, которое является эффективным для снижения по меньшей мере одного симптома глазного недуга.
[00028] Специалистам в данной области техники будет понятно значение различных терминов мер, используемых в данном документе. Например, в данном документе в контексте со ссылкой на количество (например, «около 6%»), термин «около» обозначает количество, близкое к и включающее указанное количество, которое все еще выполняет требуемую функцию или достигает желаемого результата, например, «около 6%» может включать 6% и количества, близкие к 6%, которые по-прежнему выполняют нужную функцию или достигают желаемого результата. Например, термин «около» может относиться к количеству, которое находится в пределах менее чем 10%, менее чем 5%, менее чем 0,1% или менее чем 0,01% от указанного количества.
Белки
[00029] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, композиция или препарат микросферы содержит белок, называемый в данном документе белковым компонентом. Белок может быть линейным, разветвленным или круглым. Белок может быть гибридным белком. В некоторых вариантах реализации изобретения этот белок может быть урезан по отношению к его природной форме. Белок может содержать не более чем одну аминокислотную цепь или две или более цепей аминокислот. Если белок содержит более двух аминокислотных цепей, две или более цепей могут быть ковалентно или нековалентно связаны друг с другом. Например, аминокислотные цепи могут быть связаны посредством дисульфидного мостика или двух, или цепи могут быть связаны друг с другом с помощью только нековалентных сил. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, этот белок не содержит синтетически или посттрансляционно модифицированные аминокислоты. Белки могут быть получены рекомбинантно (например, культуры клеток млекопитающего или прокариотической клеточной культуры), синтетически (например, путем твердофазного синтеза) или выделены из природных источников (например, культуры клеток млекопитающего или бактериальной культуры, плазмы, сыворотки, растений, грибов или тому подобного).
[00030] Не ограничивающие примеры белков, которые могут быть включены в композиции и препараты микросфер и, следовательно, доставлены, включают моноклональные и поликлональные антитела, биспецифические антитела, фрагменты антител, антикалины, белки DARP и ферменты. Другие примеры включают гликопротеины и сывороточные альбумины. Если используется, моноклональное или поликлональное антитело может быть использовано в своей естественной форме, как получено, например, посредством клетки, и может или не может содержать посттрансляционных модификаций, или может быть использовано в химически или ферментативно модифицированной форме, полученной после его выделения из культуры клеток или другого биологического образца. Если антитело используется, оно может быть химерным. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело может быть IgA, IgD, IgE, IgG или IgM. Фрагменты антитела включают полученные при помощи папаина (например, фрагмент Fab) или расщепленные пепсином антитела. В более общем смысле, полезные фрагменты антитела включают фрагменты Fab', F(ab)2, Fabc и фрагменты Fv. В некоторых вариантах реализации изобретения могут быть использованы комплементарные фрагменты антитела. Фрагменты антитела могут быть либо получены с помощью модификации целых антител, либо синтезированы de novo с использованием рекомбинантных методик ДНК и дополнительно включают "гуманизированные" антитела, сделанные в настоящее время обычными методами. "Фрагменты антитела" содержат часть полноразмерного антитела, как правило, антиген-связывающий фрагмент или его вариабельный домен.
[00031] В некоторых вариантах реализации изобретения предусматривается, что композиции или препараты микросфер содержат анти-VEGF антитело или белок (т.е. антитело или белок, который специфически связывается с белком сосудистого эндотелиального фактора роста, или VEGF-A). Используемые анти-VEGF антитела включают, но не ограничиваются ими, ранибизумаб (LUCENTIS) и бевацизумаб (AVASTIN). Используемые анти-VEGF белки включают Aflibercept (Eylea) (также известный как VEGF TRAP), VEGF-связывающие белки DARP (DARPin) и VEGF-связывающие антикалины. VEGF Trap (Regeneron Pharmaceuticals, Нью-Йорк) представляет собой химерный белок, который содержит части внеклеточных доменов двух различных рецепторов VEGF, прикрепленных к области Fc (С-конец) человеческого антитела. В некоторых вариантах реализации изобретения композиции или препараты микросфер могут содержать антитело, выбранное из группы, состоящей из анти-VEGF антител, анти-VEGF антител к рецептору, анти-PDGF (тромбоцитарный фактор роста) антител, анти-интегрин антител, терапевтически эффективных фрагментов и их комбинаций.
[00032] В другом варианте реализации изобретения композиции или препараты микросфер могут включать белок, содержащий анти-ФНО (фактор некроза опухоли) антитело или белок. Примеры анти-ФНО антител включают, но не ограничиваются ими, Адалимумаб (HUMIRA), инфликсимаб (REMICADE), цертолизумаб пегол (CIMZIA) и голимумаб (SIMPONI). Используемые анти-ФНО белки включают химерный белок Этанерцепт (ENBREL). Композиции и препараты микросфер, в том числе анти-ФНО белки, могут быть особенно полезны для лечения увеита и болезни Бехчета.
[00033] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, белки могут включать факторы роста, такие как факторы роста нервов, кислотные факторы роста фибробластов и основные факторы роста фибробластов; нейротрофические факторы, такие как мерцательный нейротрофический фактор, нейротрофический фактор головного мозга и нейротрофический фактор линии глиальных клеток; цитокины, такие как интерферон-гамма и интерлейкин-10; антипролиферативные соединения, такие как ритуксимаб; и фибринолизирующий белок, такой как тканевый активатор плазминогена. Терапевтическое применение таких белков может быть широко известно в данной области техники.
[00034] Таким образом, согласно некоторым вариантамв реализации изобретения, композиции или препараты микросфер могут содержать антитело, выбранное из группы, состоящей из анти-VEGF антител (антитела, специфически связывающиеся с VEGF), анти-PDGF антител, анти-VEGF антител к рецептору, анти-интегрин антител, терапевтически эффективных фрагментов и их комбинаций.
121
165
[00035] Фактор А роста эндотелия сосудов (VEGF-A, также упоминаемый как VEGF) представляет собой секретируемый митоген, специфичный для эндотелиальных клеток сосудов, который может стимулировать рост эндотелиальных клеток in vitro и ангиогенез in vivo. VEGF-A может встречаться в различных изоформах. Все изоформы VEGF-A, за исключением VEGF-А, связывают гепарин. У человека наиболее распространенной изоформой VEGF-A является 165-амино кислотный полипептид, VEGF-A. См., например, Houck et al., Mol. Endocrin. 5:1806 (1991) и Leung et al, Science 246:1306 (1989).
165
121
[00036] Соответственно, некоторые варианты реализации изобретения предусматривают препараты микросфер, содержащие биоразлагаемую полимерную матрицу и белок, содержащий, состоящий в основном из или состоящий из антитела, DARPin, или антикалина, который связывается с VEGF-A. Такое же антитело, DARPin, или антикалин может распознавать и связывать все изоформы VEGF-A, поскольку антитело, DARPin, или антикалин может распознавать эпитоп, присутствующий во всех изоформах VEGF-A. Например, антитело, DARPin или антикалин может распознавать и специфически связываться с эпитопом в области VEGF-A рецептор-связывающих доменов, присутствующих во всех изоформах VEGF-А, в том числе VEGF.
Соответственно, одно из анти-VEGF-антител (или DARPin, или антикалин), в композиции или препарате микросфер может распознавать и специфически связывать все изоформы VEGF-A. Антитела, в том числе моноклональные антитела и гуманизированные анти-VEGF антитела, которые связываются с VEGF-A или VEGF-рецептором, были описаны См., например, патент U.S. 5955311 и патент U.S. 6884879. Бевацизумаб является одним из примеров моноклонального антитела, которое специфически связывается с человеческим VEGF-A и ингибирует его. Ингибирующие антитела, направленные против PDGF, также были описаны. Смотри, например, WO 2003/025019. Таким образом, микрочастицы, могут содержать белок, который содержит, в основном состоит из или состоит из антикалина.
[00037] Композиции или препараты микросфер, включающие VEGF (сосудистый эндотелиальньш фактор роста) или ингибитор тромбоцитарного фактора роста (PDGF), или оба, такие как антитело или комбинация антител, которые специфически связываются с VEGF и/или PDGF in vivo, могут быть особенно полезны для лечения макулярной дегенерации (в том числе влажной возрастной макулярной дегенерации), ретинопатии, диабетической ретинопатии, пролиферативной диабетической ретинопатии, серповидно-клеточной ретинопатии, ретинопатии недоношенных, ишемической ретинопатии, глазной неоваскуляризации (аномальный рост новых кровеносных сосудов в глазу), хориоидальной неоваскуляризации, неоваскуляризации из-за окклюзии вены сетчатки, неоваскуляризации роговицы, диабетической ишемии сетчатки и макулярного отека у пациента, нуждающегося в этом.
[00038] В одном варианте реализации изобретения композиция или препарат микросфер включает биоразлагаемую полимерную матрицу и первое и второе антитела, или биспецифическое антитело, которые специфически связывают VEGF и PDGF, соответственно, при этом композиция или препарат микросфер обеспечивает непрерывное высвобождение первых и вторых антител или биспецифического антитела в биологически активной форме в течение по меньшей мере 30, 60 или 90 дней после размещения композиции или препарата микросфер в глазу млекопитающего. В одном варианте антитела или биспецифические антитела специфичны для фактора роста А эндотелия сосудов (VEGF-А) и тромбоцитарного фактора роста В (PDGF-B). Эти композиции или препараты микросфер могут быть особенно полезны для лечения глазных опухолей, глазной неоваскуляризации, неоваскуляризации сосудистой оболочки и дегенерации желтого пятна. Под «PDGF-В» подразумевается полипептид В-цепи PDGF.
[00039] Настоящие композиции и препараты микросфер разработаны, чтобы сохранить биологическую активность антитела, так чтобы при высвобождении из системы антитело специфически связывалось с назначенным белком-мишенью. Связывание антитела с белком-мишенью может обеспечить помехи между белком и его лигандом или рецептором, и, таким образом, функция, опосредованная взаимодействием белок/рецептор, может быть подавлена или заторможена антителом. В данной области техники известно несколько способов определения того, что антитело специфически связывается с целевым белком (полипептидом) или является «иммунореактивным» с ним. Примерами этого являются иммунохемилюминесцентньш анализ (ИХЛ (ICMA)), иммуноферментный метод (ELISA) и радиоиммуноанализ (RIA).
[00040] В некоторых вариантах реализации изобретения композиции и препараты микросфер могут включать биоразлагаемые полимерные матрицы и белок, такой как одно или более моноклональных антител, биспецифических антител, белков DARPin, антикалин, фрагментов антител, рекомбинантных полипептидов, полученных из вариабельной области антитела, или их смесей, которые взаимодействуют с (например, связываются с и уменьшают или ингибируют активность) VEGF, или тромбоцитарного фактора роста (PDFG) или их обоих (VEGF и PDFG). Например, согласно варианту реализации изобретения, композиция или препарат микросфер содержит биоразлагаемую полимерную матрицу и биспецифическое антитело, которое специфически связывается с VEGF и PDFG, при этом композиция или препарат микросфер обеспечивает непрерывное высвобождение антитела в биологически активной форме в течение по меньшей мере 90 дней после размещения в глазу млекопитающего. В других вариантах реализации изобретения композиции и препараты микросфер могут включать биоразлагаемую полимерную матрицу и антитело, специфичное для рецептора VEGF.
[00041] Моноклональные антитела, используемые в композициях и препаратах микросфер, могут быть получены с использованием обычных способов, известных специалистам в данной области техники. Вкратце, животным, таким как мыши, вводят желаемый целевой белок или его часть (антиген), такой как VEGF или VEGFR. Целевой белок может быть соединен с белком-носителем. Животных иммунизируют одной или более инъекциями белка-мишени и гипериммунизируют внутривенным (IV) усилителем за 3 дня до слияния. Клетки селезенки мышей выделяют и сливают с помощью стандартных способов с клетками миеломы. Гибридомы могут быть выбраны в стандартной среде гипоксантин/аминоптерин/тимин (HAT), согласно стандартным способам. Гибридом-секретируемые антитела, которые распознают белок-мишень, идентифицируют, культивируют и субклонируют с использованием стандартных иммунологических методов, и антитела очищают, например, с помощью аффинной хроматографии. В некоторых вариантах реализации данного изобретения систему доставки, анти-VEGF или анти-VEGFR моноклонального антитела получают от ImClone Systems, Inc. (Нью-Йорк, Нью-Йорк). Например, данные композиции могут включать антитело от ImClone Systems под названием IMC-18F1 или антитело под названием IMC-1121 Fab. Другой анти-VEGF фрагмент антитела, который может быть использован в данном препарате, - это ранибизумаб, Fab-фрагмент, который связывает VEGF-А. Другим анти-VEGF антителом, используемым в данной системе доставки лекарственных средств, является бевацизумаб, моноклональное антитело, которое связывает VEGF-A.
[00042] Белковый компонент может быть жидкий, дериватизированный в форме частиц или порошкообразной форме и может быть заключен в биоразлагаемой полимерной матрице. Как правило, белковые частицы, высушенные распылением или в виде порошка, будут иметь средний эффективный размер частиц менее чем около 1 микрона. В некоторых вариантах реализации изобретения частицы могут иметь средний эффективный размер частиц примерно на порядок величины меньше чем 1000 нанометров. Например, частицы могут иметь средний эффективный размер частиц менее чем около 500 нм. В некоторых препаратах микросфер частицы могут иметь эффективный средний размер частиц менее чем около 250 нм, а в других вариантах реализации изобретения - размер менее чем около 200 нм.
[00043] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, белковый компонент может иметь подходящую молекулярную массу. Молекулярная масса белка может быть в диапазоне от около 10 килодальтон ("кДа") до около 150 кДа. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, молекулярная масса белкового компонента может быть более чем около 5 кДа, более 10 кДа, более 20 кДа, более 50 кДа или более 100 кДа. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, белковый компонент может иметь молекулярную массу в диапазоне от около 10 кДа до 30 кДа, от 14 кДа до 16 кДа, от 14 кДа до 21 кДа или от 20 кДа до 50 кДа.
[00044] В некоторых вариантах реализации изобретения белок (белки) согласно с композициями или препаратами микросфер может (могут) иметь по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100, по меньшей мере 200 или по меньшей мере 300 аминокислот в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения компонент белка состоит из трех или более аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения этот белок может иметь от 30 до 50 аминокислот в длину или от 100 до 500 аминокислот в длину.
[00045] Композиция или препарат микросфер, согласно некоторым вариантам реализации изобретения, может включать белок в количестве от 1,0% до около 50% по массе композиции, в расчете на общую массу композиции или препарата микросфер. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, этот белок может присутствовать в композиции или препарате микросфер в количестве от около 5% до около 30% по массе, от около 5% до около 40% по массе, от около 10% до около 25% по массе или около 5%, около 10%, около 20% или около 30% по массе белка в пересчете на общую массу композиции или препарата микросфер. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, композиция или препарат микросфер содержит около 5% по массе, около 6% по массе, около 7% по массе белка, около 8% по массе белка, около 10% по массе белка, около 15% по массе белка, около 20% по массе белка, около 25% по массе белка, около 30% по массе белка или около 35% по массе белка в пересчете на общую массу препарата микросфер.
Вспомогательные вещества
[00046] В соответствии с некоторыми вариантами реализации изобретения, композиции или препараты микросфер могут включать один или более общих классов вспомогательных веществ. Общие классы вспомогательных веществ могут включать альбумины, буферные агенты, аминокислоты, углеводы, хелатирующие агенты, циклодекстрины, полиэтиленгликоль, поверхностно-активные вещества и тому подобное. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, композиции, в том числе препараты микросфер, включают не более трех классов вспомогательных веществ. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, композиции включают только два класса вспомогательных веществ.
[00047] Буферные агенты могут включать фосфатные буферы, такие как натрий фосфат гептагидрат двухосновный, натрий фосфат моногидрат одноосновный; и/или боратные буферы, такие как натрий борат, борная кислота, натрий хлорид (в соответствии с Фармакопеей ЕС). Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, буферный агент является единственным вспомогательным веществом, используемым в композиции или препарате микросфер. В некоторых вариантах реализации изобретения буферный агент является одним из двух или одним из трех вспомогательных веществ, присутствующих в композиции или препарате микросфер.
[00048] Некоторые варианты реализации данных композиций включают циклодекстриновый компонент. Например, циклодекстриновый компонент может быть связан с терапевтическим компонентом для повышения растворимости терапевтического компонента в композиции, улучшения или повышения стабильности терапевтического компонента в композиции, по отношению к композициям, которые содержат тот же терапевтический компонент и, в сущности, не содержат циклодекстриновый компонент.
[00049] В некоторых вариантах реализации изобретения вспомогательное вещество композиций по данному изобретению включает циклодекстриновый компонент, такой как один или более типов различных циклодекстринов или производных циклодекстрина. Например, циклодекстриновый компонент может включать циклодекстрин, выбранный из группы, состоящей из альфа-циклодекстрина, бета-циклодекстрина, гамма-циклодекстрина, их производных и их смесей. Термин "производное циклодекстрина" имеет широкое значение, как правило, понимаемое в данной области техники как соединение или смесь соединений, в которых одна или более свободных гидроксильных групп альфа-, бета- или гамма-циклодекстрина заменены любой другой группой. "Водорастворимое" производное циклодекстрина растворяется в концентрации по меньшей мере 300 мг/мл в воде. Производные циклодекстрина, используемые в композициях, раскрытых в данном документе, могут изменяться. Производные альфа-циклодекстрина, бета-циклодекстрина и гамма-циклодекстрина могут быть использованы. В некоторых композициях могут быть использованы производные бета-циклодекстрина, такие как кальций сульфобутиловый-бета-циклодекстрин, натрий сульфобутиловый-бета-циклодекстрин и гидроксипропил-бета-циклодекстрин. Кроме того, производные гамма-циклодекстрина, такие как кальций сульфобутиловый-гамма-циклодекстрин, натрий сульфобутиловый-гамма-циклодекстрин и гидроксипропил-гамма-циклодекстрин могут быть использованы. Некоторые конкретные производные, рассматриваемые в данном документе, являются производными циклодекстринов гидроксипропила, такими как гидроксипропил-бета-циклодекстрин или гидроксипропил-гамма-циклодекстрин.
[00050] Циклодекстрины (CD) являются коммерчески доступными в соединениях, таких как гадроксипропил-гамма-CD ("НР-гамма-CD"), коммерчески доступный как CAVASOL, сульфобутилового эфира 4 бета-CD ("SBE-CD"), коммерчески доступный как CAPTISOL, гидроксипропил-бета-CD ("НР-бета-CD"), коммерчески доступный как KLEPTOSE, гидроксипропил-альфа-циклодекстрин ("НР-альфа-циклодекстрин") и тому подобные.
[00051] При использовании циклодекстрин может содержать определенную массовую долю описанных композиций или препаратов микросфер. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, циклодекстрин присутствует в композиции в количестве в диапазоне от 10% до 75% по массе, в расчете на общую массу композиции. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, циклодекстрин присутствует в композиции в количестве в диапазоне от 30% до 70% по массе, от 1% до 10% по массе, от 3% по массе до 7% по массе, или от 5% по массе до 15% по массе в расчете на общую массу композиции. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, циклодекстрин является единственным вспомогательным веществом, используемым в композиции или препарате микросфер. В некоторых вариантах реализации изобретения циклодекстрин является одним из двух или одним из трех вспомогательных веществ, присутствующих в композиции или препарате микросфер. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, SBE-CD и буферный агент являются единственными наполнителями, присутствующими в композиции или препарате микросфер.
[00052] В некоторых вариантах реализации изобретения одно или более вспомогательных веществ могут включать аминокислоту, отдельно от белкового компонента. Пример аминокислот вспомогательного вещества, которые могут быть использованы в композициях и препаратах микросфер, может включать аргинин, пролин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, лизин, гистидин и/или глицин, а также другие аминокислоты, известные специалистам в данной области техники. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, первая аминокислота присутствует в композиции в количестве в диапазоне от 0,5% по массе до 2% по массе, от 1% по массе до 10% по массе, от 1% по массе до 3% по массе, от 4% по массе до 7% по массе, от 3% по массе до 7% по массе или от 5% по массе до 15% по массе в расчете на общую массу композиции. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, вторая аминокислота присутствует в композиции в количестве в диапазоне от 0,5% по массе до 2% по массе, от 1% по массе до 10% по массе, от 1% по массе до 3% по массе, от 4% по массе до 7% по массе, от 3% по массе до 7% по массе или от 5% по массе до 15% по массе в расчете на общую массу композиции. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, аминокислота и буферный агент являются единственными дополнительными веществами, присутствующие в композиции или препарате микросфер. В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислота представляет собой одно из двух или одно из трех вспомогательных веществ, присутствующих в композиции или препарате микросфер.
[00053] В некоторых вариантах реализации изобретения один или более вспомогательных веществ могут включать углеводы. Пример углеводов вспомогательного вещества может включать трегалозу, инулин или сукралозу, а также другие углеводы, известные специалистам в данной области техники. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, углеводы присутствуют в композиции в количестве в диапазоне от 0,5% по массе до 2% по массе, от 1% по массе до 10% по массе, от 1% по массе до 3% по массе, от 4% по массе до 7% по массе, от 3% по массе до 7% по массе или от 5% по массе до 15% по массе в расчете на общую массу композиции. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, углевод и буферный агент являются единственными вспомогательными веществами, присутствующими в композиции или препарате микросфер. В некоторых вариантах реализации изобретения углевод является одним из двух или одним из трех вспомогательных веществ, присутствующих в композиции или препарате микросфер.
[00054] В некоторых вариантах реализации изобретения одно или более вспомогательных веществ могут включать хелатирующий агент. Пример хелатирующего агента вспомогательного вещества, который может быть использовано в композициях и препаратах микросфер, может включать ЭДТА. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, хелатирующий агент и буферный агент являются единственными вспомогательными веществами, присутствующими в композиции или препарате микросфер. В некоторых вариантах реализации изобретения хелатирующий агент является одним из двух или одним из трех вспомогательных веществ, присутствующих в композиции или препарате микросфер.
[00055] В некоторых вариантах реализации изобретения одно или более вспомогательных веществ могут включать полиэтиленгликоль. Пример полиэтиленгликоля вспомогательного вещества, который может быть использован в композициях и препаратах микросфер, может включать ПЭГ400. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, полиэтиленгликоль и буферный агент являются единственными вспомогательными веществами, присутствующими в композиции или препарате микросфер. В некоторых вариантах реализации изобретения полиэтиленгликоль является одним из двух или одним из трех вспомогательных веществ, присутствующих в композиции или препарате микросфер.
[00056] В некоторых вариантах реализации изобретения один или более наполнителей могут включать поверхностно-активное вещество. Пример поверхностно-активного вещества вспомогательного вещества, которое может быть использовано в композициях и препаратах микросфер, может включать полисорбат 80. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, поверхностно-активное вещество и буферный агент являются единственными вспомогательными веществами, присутствующими в композиции или препарате микросфер. В некоторых вариантах реализации изобретения поверхностно-активное вещество является одним из двух или одним из трех вспомогательных веществ, присутствующих в композиции или препарате микросфер.
[00057] В соответствии с некоторыми вариантами реализации данного изобретения, дополнительное вещество в композиции может быть в жидкой форме с подходящей молярной концентрацией. В некоторых вариантах реализации изобретения одно или более дополнительных веществ, присутствующих в композиции, имеют молярную концентрацию в диапазоне от около 6 мМ до около 120 мМ. В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительное вещество имеет концентрацию в диапазоне от около 5 мМ до около 75 мМ. Согласно другим вариантам реализации изобретения, дополнительное вещество имеет концентрацию в диапазоне от около от 6 мМ до около 60 мМ. В соответствии с другими вариантами реализации изобретения, дополнительное вещество имеет концентрацию около 6 мМ, около 20 мМ, около 40 мМ, около 60 мМ, около 100 мМ, около 120 мМ и тому подобное. В соответствии с вариантом реализации изобретения, дополнительное вещество, такое как циклодекстрин, такой как сульфобутиловый-бета-циклодекстрин, может быть использован в концентрации 60 мМ.
[00058] Дополнительное вещество или дополнительные вещества могут присутствовать в композициях или препаратах микросфер в количестве от 0,01% по массе до около 50% по массе, от 0,01% до около 20% по массе, от около 0,01% по массе до около 15% по массе композиции или от около 15% по массе до около 30% по массе композиции в расчете на общую массу композиции.
Биоразлагаемая полимерная матрица
[00059] В одном варианте реализации изобретения микросферы включают биоразлагаемую полимерную матрицу. Биоразлагаемая полимерная матрица представляет собой один из компонентов поддержания высвобождения лекарственного средства. Биоразлагаемые полимерные матрицы могут быть изготовлены из одного полимера или смеси двух или более полимеров. Биоразлагаемые полимерные матрицы могут быть эффективными при формировании биоразлагаемой микросферы. Биоразлагаемая микросфера включает белковый компонент, связанный с биоразлагаемой полимерной матрицей.
[00060] Подходящие полимерные материалы или композиции для применения в микросферах включают те материалы, которые совместимы, то есть биосовместимы, с глазом так, чтобы не вызвать никакого существенного вмешательства в функционирование или физиологию глаза. Такие материалы могут быть по меньшей мере частично или существенно полностью биоразлагаемыми или биоразрушаемыми.
[00061] Примеры пригодных полимерных материалов включают, но не ограничиваются ими, материалы, полученные из и/или включающие органические сложные эфиры и органические эфиры, которые при деградации разлагаются до физиологически приемлемых продуктов разложения, в том числе мономеров. Кроме того, полимерные материалы, полученные из и/или включающие ангидриды, амиды, ортоэфиры и т.п., сами по себе или в сочетании с другими мономерами, также могут найти применение. Полимерные материалы могут быть добавленными или конденсационными полимерами, преимущественно конденсационными полимерами. Полимерные материалы могут быть сшитые или не сшитые, при этом, например, не более чем слегка сшитые, например, менее чем около 5% или менее чем около 1% полимерного материала является сшитым. По большей части, помимо углерода и водорода, полимеры будут содержать по меньшей мере кислород и азот, преимущественно кислород. Кислород может присутствовать в виде оксида, например, гидрокси или простого эфира, карбонила, например, не-оксо-карбонила, такого как сложный эфир карбоновой кислоты и тому подобное. Азот может присутствовать в виде амида, циано и амино. Полимеры, изложенные в Heller, Biodegradable Polymers in Controlled Drug Delivery, In: CRC Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, Vol. 1, CRC Press, Boca Raton, Fla. 1987, pp 39-90, который описывает инкапсуляцию для регулируемой доставки лекарственного средства, могут найти применение в текущих микросферах.
[00062] Кроме того, представляют интерес полимеры гидроксиалифатических карбоксильных кислот, либо гомо-, либо сополимеры и полисахариды. Интересующие полиэфиры включают полимеры D-молочной кислоты, L-молочной кислоты, рацемат молочной кислоты, гликолевой кислоты, поликапролактон и их комбинации. Как правило, с использованием L-лактата или D-лактата, получают медленно разрушаемый полимер или полимерный материал, в то время как рацемат лактата существенно повышает эрозию.
[00063] Используемые полисахариды, например, включают, но не ограничиваются ими, альгинат кальция и функционализированные целлюлозы, в частности, эфиры карбоксиметилцеллюлоз, отличающиеся нерастворимостью в воде, молекулярной массой от около 5 кД до 500 кД.
[00064] Другие полимеры, представляющие интерес, включают, но не ограничиваются ими, поливиниловый спирт, сложные полиэфиры, простые полиэфиры и их комбинации, которые являются биосовместимыми и могут быть биоразлагаемыми и/или биоразрушаемыми.
[00065] Некоторые характеристики полимеров или полимерных материалов для использования могут включать биосовместимость, совместимость с белком, простоту использования полимера в создании микросфер, период полураспада в физиологической среде по меньшей мере около двух недель, в некоторых вариантах реализации изобретения более чем около месяца, и растворимость (или отсутствие растворимости) в воде.
[00066] Биоразлагаемые полимерные материалы, включенные для формирования микросфер, могут быть предметом ферментативной или гидролитической нестабильности. Водорастворимые полимеры могут быть сшиты гидролитическими или биоразлагаемыми нестабильными сшивками, чтобы обеспечить полезные нерастворимые в воде полимеры. Степень устойчивости может изменяться в широких пределах, в зависимости от выбора мономера, использования гомополимера или сополимера, использования смеси полимеров и включения в полимер концевых групп кислот.
[00067] В некоторых вариантах реализации изобретения одинаково важно контролировать биодеградацию полимера, и, следовательно, расширенным профилем высвобождения препарата микросфер является относительная средняя молекулярная масса полимерной композиции, используемой в микросферах. Различные молекулярные массы одинаковых или различных полимерных композиций могут быть включены в микросферы, чтобы модулировать профиль высвобождения. В некоторых композициях и препаратах микросфер относительная средняя молекулярная масса полимера может колебаться от около 9 кДа до около 64 кДа, от около 10 кДа до около 54 кДа или от около 12 кДа до около 45 кДа.
[00068] В некоторых микросферах применяют сополимеры гликолевой кислоты и молочной кислоты, при этом скорость биодеградации контролируют соотношением гликолевой кислоты к молочной кислоте. Наиболее быстро разлагающийся сополимер имеющий примерно равные количества гликолевой кислоты и молочной кислоты. Гомополимеры или сополимеры, имеющие отличные от равных соотношения, более устойчивы к разложению. Отношение гликолевой кислоты к молочной кислоте также влияет на хрупкость микросфер. Мольный процент (моль %) полимолочной кислоты в сополимере полигликолевой кислоты полимолочной кислоты (PLGA) может быть в пределах от 15 мол % до около 85 моль %. В некоторых вариантах реализации изобретения мольный процент полимолочной кислоты в сополимере (PLGA) находится в пределах от около 35 моль % до около 65 моль %. В некоторых вариантах реализации изобретения сополимер PLGA с 50 моль % полимолочной кислоты и 50 моль % полигликолевой кислоты можно использовать в полимерной матрице. В некоторых вариантах реализации изобретения сополимер PLGA с 75 моль % полимолочной кислоты и 25 моль % полигликолевой кислоты можно использовать в полимерной матрице.
[00069] Биоразлагаемая полимерная матрица субконъюнктивальных микросфер может содержать смесь двух или более биоразлагаемых полимеров. Например, микросферы могут содержать смесь первого биоразлагаемого полимера и иной второй биоразлагаемый полимер. Один или более биоразлагаемых полимеров могут иметь концевые кислотные группы.
[00070] В соответствии с некоторыми вариантами реализации изобретения, используемый биоразлагаемый полимер может иметь характеристическую вязкость в диапазоне от около 0,1 дл/г до около 1,0 дл/г. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, используемый биоразлагаемый полимер может иметь характеристическую вязкость в диапазоне от около 0,5 дл/г до около 1,0 дл /г.
[00071] Некоторые примеры полимеров, которые могут быть использованы отдельно или в комбинации с образованием микросфер, включают те,, которые перечислены в ТАБЛИЦЕ А ниже, при этом характеристики, спецификации и данные тестирования коммерчески доступных полимеров включены в качестве ссылки в полном объеме:
[00072] Биоразлагаемые полимерные микросферы могут содержать смесь двух или более биоразлагаемых полимеров. Например, микросферы могут содержать смесь первого биоразлагаемого полимера и иного второго биоразлагаемого полимера. Один или более из биоразлагаемых полимеров могут иметь концевые кислотные группы. В некоторых вариантах реализации изобретения микросферы включают не более чем один тип биоразлагаемого полимера.
[00073] В соответствии с некоторыми вариантами реализации изобретения, биоразлагаемый полимер включает от 75% по массе до 94% по массе препарата микросфер в пересчете на общую массу композиции. Согласно другим вариантам реализации изобретения, биоразлагаемый полимер включает от 75% по массе до 85% по массе препарата микросфер в пересчете на общую массу препарата микросфер. Согласно другим вариантам реализации изобретения, биоразлагаемый полимер включает от 85% по массе до 95% по массе препарата микросфер в пересчете на общую массу препарата микросфер.
Микросферы
[00074] Белок-содержащие микросферы могут быть изготовлены с использованием подходящих процессов. В одном варианте реализации изобретения белок-содержащие микросферы могут быть изготовлены по типу «вода в масле» в водной эмульсии, как описано в публикации РСТ №2011/041642, чьи способы получения микросфер по типу «вода в масле» в водной эмульсии включены в данное описание в качестве ссылки во всей их полноте.
[00075] Высвобождение белкового компонента из микросфер может включать начальный импульс высвобождения с последующим постепенным увеличением количества высвобождаемого белкового компонента или высвобождение может включать начальную задержку в высвобождении белкового компонента с последующим увеличением высвобождения.
[00076] Может быть желательным обеспечить относительно постоянную скорость высвобождения белкового компонента из микросфер. Например, может быть желательно, чтобы белковый компонент был высвобожден в количествах от около 2 мкг до около 10 мкг в сутки в течение всего срока существования микросфер. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, может быть желательно, чтобы белковый компонент был высвобожден в количестве около 4 мкг в сутки, 5 мкг в сутки, 6 мкг в сутки, 7 мкг в сутки и тому подобное. Тем не менее, скорость высвобождения может либо увеличиваться, либо уменьшаться в зависимости от состава матрицы биоразлагаемого полимера. Кроме того, профиль высвобождения белкового компонента может включать один или более линейных участков и/или один или более нелинейных участков. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость высвобождения больше нуля, как только микросферы начинают ухудшаться или разрушаться.
[00077] Микросферы могут быть монолитными, т.е. имеющими активный агент или агенты, однородно распределенные в полимерной матрице или инкапсулированные, при этом резервуар активного агента инкапсулирован посредством полимерной матрицы. Благодаря легкости производства микросферы могут демонстрировать преимущества по сравнению с инкапсулированными формами. Однако больший контроль, предоставляемый инкапсулированными микросферами, может быть полезным в некоторых обстоятельствах, когда терапевтический уровень лекарственного средства попадает в узкий диапазон. Кроме того, терапевтический компонент, в том числе белковый компонент, может быть неоднородно распределен в структуре матрицы. Например, микросферы могут включать участок, который имеет большую концентрацию белкового компонента относительно второй части микросфер.
[00078] В соответствии с некоторыми вариантами реализации изобретения, микросферы, описанные в данном документе, могут иметь размер от около 5 мкм до около 1 мм или от около 10 мкм до около 0,2 мм для введения с помощью иглы. В соответствии с вариантом реализации изобретения, микросферы могут иметь размер около 0,15 мм. Микросферы, вводимые с помощью игольчатой инъекции, могут иметь любые соответствующие размеры в пределах, позволяющих перемещать их через устройство доставки, такое как игла, такие как игла 22, игла 25, игла 27 и тому подобные.
[00079] Общая масса микросферы в виде однократной дозы в оптимальном объеме зависит от объема субконъюнктивального пространства и активности или растворимости белка. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, доза составляет от около 1 мг до около 40 мг микросфер на дозу. В некоторых вариантах реализации изобретения доза составляет от 0,1 мг до 1 мг, от 10 мг до 30 мг, от 10 мг до 20 мг и тому подобное. В одном варианте реализации изобретения однократное введение может содержать около 1 мг, или около 5 мг, или около 10 мг, или около 15 мг, или около 17 мг, или около 20 мг, или около 30 мг, или около 35 мг микросфер, в том числе включенный терапевтический компонент. Для нечеловеческих индивидуумов размеры и общая масса микросфер(ы) могут быть больше или меньше, в зависимости от вида индивидуума.
[00080] Преимуществом белкового препарата микросфер на основе поли(D, L-лактида-ко-гликолида) ("PLGA") по сравнению с обычными препаратами в форме растворов, является те, что препарат микросфер может доставлять активный белок в течение более длительного периода времени, в некоторых случаях более нескольких недель или месяцев.
ПРИМЕРЫ
[00081] Без намерения ограничивать объем изобретения, примеры реализации изобретения изложены в следующих примерах.
ПРИМЕР 1
[00082] Стабилизация белкового раствора высокой концентрации путем включения вспомогательных веществ.
[00083] В соответствии с примером, растворимый выход белка из раствора антикалина в концентрации 100 мг/мл на натрий-фосфатном буфере («PBS») был измерен в типовом варианте реализации изобретения со вспомогательными веществами и без них через один месяц при температуре 37°С. Согласно первой композиции, 100 мг/мл раствор антикалина готовили на PBS с добавлением SBE-CD в молярной концентрации 6 мМ. 6 мМ SBE-CD присутствует в композиции в количестве 10,6 масс %, в расчете на общую массу композиции. В соответствии со вторым вариантом композиции, 100 мг/мл антикалина готовили на PBS с 60 мМ SBE-CD. 60 мМ SBE-CD присутствует в композиции в количестве 54,1 масс %, в расчете на общую массу композиции. В соответствии с третьим вариантом композиции, 100 мг/мл раствор антикалина готовили на PBS с 120 мМ SBD-CD. 120 мМ SBE-CD присутствует в композиции в количестве 70,2 масс % в расчете на общую массу композиции. В соответствии с первым контрольным препаратом, 100 мг/мл раствор антикалина готовили на PBS, без SBE-CD. Раствор хранили при 37°С в течение одного месяца, а затем анализировали для определения процента выхода растворимого белка в растворе. Полученные результаты проиллюстрированы на фигуре 1.
[00084] Как проиллюстрировано на фигуре 1, первый контрольный препарат показал снижение на 39% выхода растворимого белка после одного месяца инкубации при 37°С. Уменьшение выхода растворимого белка может быть вызвано агрегацией белка, ведущей к образованию нерастворимых частиц. Однако, как проиллюстрировано на фигуре 1, добавление SBE-CD в концентрации 6 мМ и 60 мм в 100 мг/мл растворе антикалина на PBS увеличивало выход растворимого белка на 19% и 23%, соответственно, после одного месяца инкубации при 37°С. При самой высокой испытанной концентрации SBE-CD - 120 мМ увеличение выхода растворимого белка по сравнению с первой сравнительной композицией, без добавления SBE-CD, составляет только 10%. Удивительно, что самый высокий процент выхода растворимого белка происходит при молярной концентрации SBE-CD, равной 60 мМ, притом препарат с наиболее высокой концентрацией SBE-CD не тестировался. Первый, второй, третий и четвертый составы показали увеличенный выход растворимого белка по сравнению с композициями, не содержащими дополнительные вещества в PBS.
ПРИМЕР 2
[00085] Стабилизация раствора антикалина при повышенных температурах путем включения вспомогательных веществ.
[00086] В соответствии с другим вариантом реализации изобретения, стабильность белка антикалина оценивали при повышенной температуре 50°С. Согласно этому примеру, был исследован выход растворимого белка антикалина в концентрации 10 мг/мл на натрий-фосфатном буфере в типовом варианте реализации изобретения со вспомогательными веществами и без них после двух дней при 50°С. В соответствии с четвертой композицией, раствор антикалина в концентрации 10 мг/мл готовили на PBS с SBE-CD. SBE-CD присутствует в композиции в количестве 46,0 масс % в расчете на общую массу композиции. В соответствии с пятой композицией, раствор антикалина в концентрации 10 мг/мл готовили на PBS с гидроксипропил-бета-циклодекстрином ("НР-бета-CD"). НР-бета-CD присутствует в композиции в количестве 35,2 масс % в расчете на общую массу композиции. В соответствии с шестой композицией, раствор антикалина в концентрации 10 мг/мл готовили на PBS с гидроксипропил-гамма-циклодекстрином ("НР-гамма-CD"). НР-гамма-CD присутствует в композиции в количестве 38,4 масс % в расчете на общую массу композиции. В соответствии с седьмой композицией, раствор антикалина в концентрации 10 мг/мл готовили на PBS с трегалозой. Трегалоза присутствует в композиции в количестве 35,2 масс % в расчете на общую массу композиции. Согласно второму контрольному варианту, раствор антикалина в концентрации 10 мг/мл готовили на PBS без дополнительных вспомогательных веществ. Растворы хранили в термостате при 50°С в течение двух дней, а затем анализировали, чтобы определить процент выхода растворимого белка в растворе. Полученные результаты проиллюстрированы на фигуре 2.
[00087] Фигура 2 иллюстрирует выход растворимого белка растворов антикалина в концентрации 10 мг/мл, созданных со вспомогательными веществами в PBS и без них, после инкубации в термостате при температуре 50°С в течение двух дней. Как проиллюстрировано на фигуре 2, выход растворимого белка в контрольном препарате два составлял около 66%. Как проиллюстрировано, добавление либо SBE-CD (в четвертой композиции), либо трегалозы (в седьмой композиции) увеличивает выход растворимого белка на около 18%, в то время как добавление НР-бета-CD (в пятой композиции) или НР-гамма-CD (в шестой композиции) увеличивает выход растворимого белка на 12%. Удивительно, что композиция, включающая углевод трегалозы, проявляет такой же высокий выход растворимого белка, как и композиция, включающая SBE-CD. Четвертая, пятая, шестая и седьмая композиции показали повышенный выход растворимого белка по сравнению с композицией, которая не содержит никаких дополнительных вспомогательных веществ в PBS.
[00088] В соответствии с еще одним вариантом реализации изобретения, стабильность белка антикалина оценивали при повышении температуры до 50°С. Согласно этому примеру, был определен выход растворимого белка антикалина в концентрации 10 мг/мл после пяти дней при температуре 50°С в вариантах реализации изобретения со вспомогательными веществами и без вспомогательных веществ на фосфатно-солевом буфере ("PBS"). В соответствии с восьмым вариантом композиции, раствор антикалина в концентрации 10 мг/мл был подготовлен на PBS с ПЭГ400. ПЭГ400 присутствовал в композиции в количестве 54,6 масс % в расчете на общую массу композиции. В соответствии с девятым вариантом композиции, раствор антикалина в концентрации 10 мг/мл был подготовлен на PBS с декстраном. Декстран присутствовал в композиции в количестве 63,7 масс % в расчете на общую массу композиции. В соответствии с десятым вариантом композиции, раствор антикалина в концентрации 10 мг/мл был подготовлен на PBS с глицином. Глицин присутствует в композиции в количестве 4,8 масс % в расчете на общую массу композиции. В соответствии с одиннадцатым вариантом композиции, раствор антикалина в концентрации 10 мг/мл был подготовлен на PBS с пролином. Пролин присутствует в композиции в количестве 7,1 масс % в расчете на общую массу композиции. В соответствии с третьим контрольным препаратом, раствор антикалина в концентрации 10 мг/мл был подготовлен на PBS без каких-либо вспомогательных веществ. Растворы хранили в термостате при температуре 50°С в течение пяти дней, а затем анализировали, чтобы определить процент выхода растворимого белка в растворе. Полученные результаты проиллюстрированы на фигуре 3.
[00089] На фигуре 3 проиллюстрирован выход растворимого белка антикалина в концентрации 10 мг/мл на PBS после инкубации в термостате при температуре 50°С в течение 5 дней в вариантах реализации изобретения со вспомогательными веществами и без них. Данные результаты показывают, что не все вспомогательные вещества повышают выход растворимого белка, по сравнению с раствором белка без вспомогательных веществ. Например, десятый и одиннадцатый варианты композиции, которые включали добавление аминокислот глицина и пролина, соответственно, повышали выход растворимого антикалина. Добавление ПЭГ400 и декстрана в восьмой и девятой варианты композиции, соответственно, снижало выход растворимого белка антикалина на 7%-11%.
ПРИМЕР 3
[00090] Производство и тестирование основанных на PLGA антикалиновых микросфер.
[00091] В соответствии с примерным вариантом реализации изобретения, основанные на PLGA антикалиновые микросферы были получены с использованием способа испарения растворителя двойной эмульсии. Способ изготовления данных микросфер известен как процесс «вода в масле в воде» (W/O/W) и описан, например, в публикации РСТ No. 2011/041642, при этом способы изготовления микросфер, описанные в указанном документе, таким образом, специально включены в качестве ссылки. Согласно этому примеру, процесс был выполнен при температуре от около 4°С до 10°С, чтобы улучшить воспроизводимость от партии к партии и увеличить стабильность антикалина.
[00092] Для определения экспериментальной дозировки белка в полимерной сети PLGA и качества белка инкапсулированный белок и его растворимые продукты распада были извлечены из высушенных микросфер с использованием двухэтапного способа экстракции с последующим анализом SEC. Продукты распада антикалина были разделены на две категории: продукты с высокой молекулярной массой ("ВММ") и продукты с низкой молекулярной массой ("НММ"). Продукты ВММ являются агрегатами антикалина с молекулярной массой выше, чем у мономера антикалина, тогда как продукты НММ - это фрагменты антикалина с молекулярной массой ниже, чем у мономера антикалина.
[00093] Профили высвобождения полученных микросфер были оценены in vitro с помощью среды высвобождения, содержащей 100 мМ фосфата, pH 7,4 при температуре 37°С без перемешивания. Все образцы были приготовлены в двух повторностях. В каждой предварительно заданной временной точке 90% раствора отбирали для аналитического анализа, и объем пробы заменяли тем же объемом свежей среды высвобождения.
ПРИМЕР 4
[00094] Инкапсуляция антикалина в основанных на PLGA микросферах.
[00095] Таблица В ниже иллюстрирует несколько примеров технологий изготовления основанных на PLGA антикалиновых микросфер. Как показано в таблице В, основанные на PLGA препараты микросфер без каких-либо вспомогательных веществ имеют эффективность инкапсуляции около 78,6%, что включает 11,4% растворимых агрегатов. Как показано в таблице, преимущественно, добавление некоторых вспомогательных веществ снижает количество растворимых агрегатов с 11,4% вплоть до 3,9%.
[00096] Как показано в таблице В, препараты, включающие SBE-CD, имели наименьшее количество растворимых агрегатов в диапазоне от 3,9% до 4,7% [снижение агрегатов в три раза]. Без связывания с какой-либо теорией, этот результат может продемонстрировать способность SBE-CD защитить белок от условий создания и высвобождения микросфер. Интересно, что, в то время как добавление аргинина вызывало небольшой эффект снижения растворимых агрегатов, оно повышало эффективность инкапсуляции белка при использовании отдельно или в сочетании с SBE-CD. Трегалоза также продемонстрировала снижение агрегатов микросфер в препаратах. Удивительно, что комбинация SBE-CD и аргинина обладала синергическим эффектом в снижении количества агрегатов и повышении эффективности инкапсуляции в процессе подготовки PLGA микросфер.
[00097] Таблица С показывает более широкое применение этой комбинации, в минимизации агрегатов, при этом включение этих вспомогательных веществ в других комбинациях PLGA полимерных микросфер приводит к совокупной концентрации микросфер с агрегатами около 5%.
ПРИМЕР 5
[00098] Замедленное высвобождение антикалина из микросфер на основе PLGA.
[00099] Микросферы на основе PLGA были изготовлены и испытаны, как описано в примере 3. На фигурах 4 и 5 представлены различные профили высвобождения антикалина и продемонстрирована способность модулировать высвобождение антикалина, предусматривая различные высвобождения, скорость высвобождения и продолжительность высвобождения путем модификации состава микросфер и процесса их изготовления.
[000100] Фигуры 4 и 5 иллюстрируеют некоторые из полезных свойств в результате включения определенных вспомогательных веществ в микросферы на основе PLGA, например, способность препаратов достигать замедленного высвобождения на протяжении 2-3 месяцев. Препараты микросфер со вспомогательными веществами продемонстрировали устойчивое непрерывное высвобождение, в то время как скорость высвобождения препарата микросфер без вспомогательных веществ быстро снижалась после семи дней, как проиллюстрировано на фигуре 4. Микросферы на основе PLGA со вспомогательными веществами продемонстрировали практически полный выход препарата с суммарным выходом около 77%, в то время как микросферы на основе PLGA без вспомогательных веществ показали суммарный выход около 47%. Фиг. 5 иллюстрирует способность модулировать выброс и скорость высвобождения с использованием различных вспомогательных веществ при одинаковых параметрах процесса.
ПРИМЕР 6
[000101] Влияние полимеров на выход антикалина из микросфер на основе PLGA.
[000102] Полимерные свойства, такие как характеристическая вязкость ("ХВ"), температура стеклования и молекулярная масса, могут облегчить степень инкапсуляции и высвобождения белка. Три полимера с различной ХВ (Resomer  RG 755S, RG 753S и RG 752S) были оценены в технологии изготовления микросфер. Таблица D иллюстрирует влияние характеристической вязкости полимера на инкапсуляцию и выброс. Из таблицы видно, что, хотя были использованы тот же процесс и тот же состав вспомогательных веществ, препарат микросферы с RG755S имеет самую высокую эффективность инкапсуляции, самое высокое качество белка (например, самый низкий процент растворимых агрегатов) и самый низкий выброс.
[000104] Фиг. 6 иллюстрирует высвобождение антикалина из микросфер, изготовленных из полимеров с различной ХВ. Микросферы, изготовленные из RG755S, который имеет самую высокую ХВ, продемонстрировали непрерывное высвобождение, в то время как микросферы, полученные из RG753S и RG752S, показали усеченные кривые высвобождения после семи дней.
[000105] Смешивание полимеров может повлиять на выброс и скорость высвобождения антикалина из микросфер на основе PLGA. Как проиллюстрировано на фигуре 7, RG755S может быть смешан с более гидрофильным полимером, чтобы снизить выброс и повысить скорость высвобождения антикалина из микросфер. Смешивание полимеров RG755S и RG502H в соотношении 13:1 привело к образованию препарата микросфер с более низким выбросом и большей скоростью высвобождения, по сравнению с препаратом микросфер на основе RG755S. Тем не менее, продолжительность высвобождения сократилась до одного месяца.
ПРИМЕР 7
[000106] Связывающая активность антикалина, высвобожденного из микросфер на основе PLGA.
[000107] Связывающую активность антикалина, освобожденного из отдельных микросфер на основе PLGA, измеряли с помощью иммуноферментного анализа ("ELISA"). Активность определяется как процент концентрации, определенный отношением концентрации ELISA к концентрации SEC. Фигура 8 иллюстрирует активность связывания высвобожденного антикалина из микросфер на основе PLGA за двухмесячный период. Высвобожденный белок активен на протяжении всего периода высвобождения и имеет связьшающую активность выше 70% для препаратов микросфер со вспомогательными веществами и выше 50% для препаратов микросфер без вспомогательных веществ.
ПРИМЕР 8
[000108] Производство, испытание и выпуск содержащих антитела микросфер на основе PLGA.
[000109] В соответствии с еще одним примером, микросферы на основе PLGA были изготовлены и испытаны, как описано в примере 3, с использованием антитела бевацизумаб вместо анти-VEGF белка, антикалина. Фигура 9 сравнивает профили высвобождения препаратов микросфер на основе PLGA с антикалином и препаратов микросфер на основе PLGA с бевацизумабом. Данные показывают, что способ и композиция, которые были использованы для разработки препарата доставки антикалина с замедленным высвобождением, могут быть использованы с моноклональными антителами полной длины с молекулярной массой 149 кДа для доставки активных белков в течение длительного периода времени.
[000110] Хотя настоящее изобретение было описано в контексте некоторых предпочтительных вариантов реализации изобретения и примеров, специалистам в данной области техники будет понятно, что настоящее изобретение распространяется за пределы конкретно раскрытых вариантов реализации на другие альтернативные варианты реализации изобретения и/или применения изобретения и очевидные модификации и их эквиваленты. Кроме того, хотя определенное количество вариаций настоящего изобретения были показаны и описаны подробно, другие модификации, которые находятся в пределах объема настоящего изобретения, будут очевидны специалистам в данной области техники на основании данного изобретения. Также предполагается, что различные комбинации или второстепенные особенности и аспекты вариантов реализации данного изобретения могут быть осуществлены и все еще подпадать под объем настоящего изобретения. Соответственно, следует понимать, что различные особенности и аспекты раскрытых вариантов реализации изобретения могут быть объединены друг с другом или заменять друг друга для того, чтобы выполнять различные варианты данного изобретения. Таким образом, предполагается, что объем настоящего изобретения в данном документе не должен быть ограничен конкретными раскрытыми вариантами реализации, описанными выше, но должен быть определен только добросовестным ознакомлением с формулой изобретения.