МОЛЕКУЛЯРНЫЙ РЕОСТАТ ДЛЯ БАЛАНСА КОФАКТОРОВ

1. Рекомбинантный, искусственный или созданный инженерией метаболический путь, включающий несколько ферментативных стадий, которые превращают субстрат в продукт, причем путь включает не встречающуюся в природе систему молекулярного реостата, выбирающую между или одновременно использующую метаболический путь первого кофактора для получения метаболита и метаболический путь второго кофактора для получения метаболита, в зависимости от доступности кофактора.
2. Рекомбинантный, искусственный или созданный инженерией метаболический путь по п. 1, включающий
(а) первую ферментативную стадию, на которой первый метаболит превращается во второй метаболит с использованием первого кофактора;
(b) вторую ферментативную стадию, на которой первый метаболит превращается во второй метаболит с использованием первого кофактора и второго кофактора или второго кофактора;
причем первая ферментативная стадия активна, когда уровень второго кофактора является низким, и причем вторая ферментативная стадия активна, когда уровень второго кофактора является высоким.
i
3. Рекомбинантный, искусственный или созданный инженерией метаболический путь по п. 1 или 2, причем первый кофактор представляет собой окислительные/восстановительные кофакторы, и второй кофактор представляет собой P.
+
+
+
4. Рекомбинантный, искусственный или созданный инженерией метаболический путь по п. 3, причем окислительные/восстановительные кофакторы представляют собой NAD/NADH, NADP/NADPH или FAD/FADH.
+
5. Рекомбинантный, искусственный или созданный инженерией метаболический путь по любому из пп. 2-4, причем первый кофактор включает NADP/NADPH.
6. Рекомбинантный, искусственный или созданный инженерией метаболический путь по п. 1, причем метаболический путь включает конверсию глицеральдегид-3-фосфата в 3-фосфоглицерат.
7. Рекомбинантный, искусственный или созданный инженерией метаболический путь по п. 6, причем метаболический путь дает метаболит, выбранный из группы, включающей изобутанол, 3-метил-1-бутанол, лейцин и валин.
8. Рекомбинантный, искусственный или созданный инженерией метаболический путь по п. 6, причем путь включает конверсию глицеральдегид-3-фосфата в 1,3-бисфосфоглицерат и 1,3-бисфосфоглицерата в 3-фосфоглицерат.
+
+
9. Рекомбинантный, искусственный или созданный инженерией метаболический путь по любому из пп. 6, 7 или 8, включающий (i) фермент, который превращает глицеральдегид-3-фосфат (G3P) и NADP в 3-фосфоглицерат (3PG) и NADPH; и (ii) фермент, который превращает глицеральдегид-3-фосфат (G3P), NADP и свободный фосфат (Pi) в 1,3-бисфосфоглицерат (1,3BPG), и (iii) фермент, который превращает 1,3-бисфосфоглицерат (1,3BPG) и ADP в 3-фосфоглицерат и ATP.
10. Рекомбинантный, искусственный или созданный инженерией метаболический путь по п. 9, причем фермент из (i) включает NADP-зависимую глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (GapN).
11. Рекомбинантный, искусственный или созданный инженерией метаболический путь по п. 10, причем GapN получают из S. mutans.
12. Рекомбинантный, искусственный или созданный инженерией метаболический путь по п. 9, причем фермент из (ii) включает мутантную глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу (mGap), которая включает мутации D34A/L35R/T36K относительно SEQ ID NO: 6.
13. Рекомбинантный, искусственный или созданный инженерией метаболический путь по п. 9, причем фермент из (ii) включает мутантную глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (mGap), которая имеет последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 6 и включает мутации D34A/L35R/T36K.
14. Рекомбинантный, искусственный или созданный инженерией метаболический путь по п. 9, причем фермент из (iii) включает фермент с числом Комиссии по ферментам (число EC) EC 2.7.2.3.
15. Рекомбинантный, искусственный или созданный инженерией метаболический путь по п. 9, причем фермент из (iii) представляет собой фосфоглицераткиназу.
16. Рекомбинантный, искусственный или созданный инженерией метаболический путь по п. 15, причем фосфоглицераткиназа представляет собой Pgk из G. stearothermophilus.
17. Рекомбинантный, искусственный или созданный инженерией метаболический путь по п. 15, причем фермент из (iii) имеет последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 7 и имеет активность фосфоглицераткиназы.
+
18. Рекомбинантный, искусственный или созданный инженерией метаболический путь по п. 9, причем молекулярный реостат включает ферменты из (i) NADP-зависимую глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (GapN), из (ii) мутантную глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, которая утилизирует NADP, и из (iii) фосфоглицераткиназу.
19. Рекомбинантный, искусственный или созданный инженерией метаболический путь по п. 1, причем путь включает
(i) полипептид, который катализирует образование глюкозо-6-фосфата (G6P) из глюкозы;
(ii) полипептид, который катализирует образование фруктозо-6-фосфата (F6P) из глюкозо-6-фосфата (G6P);
(iii) полипептид, который катализирует конверсию/фосфорилирование фруктозо-6-фосфата (F6P) до фруктозо-1,6-фосфата;
(iv) полипептид, который превращает фруктозо-1,6-фосфат в два глицеральдегид-3-фосфата (G3P);
(v) молекулярный реостат, включающий
+
(a) фермент, который превращает глицеральдегид-3-фосфат (G3P) и NADP в 3-фосфоглицерат (3PG) и NADPH, и
+
(b) фермент, который превращает глицеральдегид-3-фосфат (G3P), NADP и свободный фосфат (Pi) в 1,3-бисфосфоглицерат (1,3BPG), и
(c) фермент, который превращает 1,3-бисфосфоглицерат (1,3BPG) и ADP в 3-фосфоглицерат (3pG) и ATP;
(vi) полипептид, который превращает 3-фосфоглицерат (3PG) в 2-фосфоглицерат (2PG);
(vii) полипептид, который превращает 2-фосфоглицерат (2PG) в фосфоенолпируват (PEP);
(viii) полипептид, который превращает фосфоенолпируват (PEP) в пируват;
(ix) полипептид, который превращает пируват в ацетолактат;
+
(x) полипептид, который превращает ацетолактат и NADPH в 2,3-дигидрокси-3-метилбутаноат и NADP;
(xi) полипептид, который превращает 2,3-дигидрокси-3-метилбутаноат в 3-метил-2-оксобутаноат;
(xii) полипептид, который превращает 3-метил-2-оксобутаноат в изобутаналь, и
+
(xiii) полипептид, который превращает изобутаналь и NADPH в изобутанол и NADP.
20. Рекомбинантный, искусственный или созданный инженерией путь по любому из пп. 1, 2, 4, 6, 7, 8, 18 или 19, причем путь находится в бесклеточной системе.
21. Рекомбинантный полипептид, включающий последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 6 и включает мутации D34A/L35R/T36K, и имеет активность глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.