СЕЛЕКТИВНО ЗАМЕЩЕННЫЕ СОЕДИНЕНИЯ ХИНОЛИНА
SELECTIVELY SUBSTITUTED QUINOLINE COMPOUNDS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001]
По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на патент США № 61/890718, поданной 14 октября 2013 г. Данная заявка включена в настоящий документ в качестве ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002]
Область техники
[0003]
Варианты осуществления изобретения относятся к селективно замещенным соединениям хинолона и фармацевтическим средствам, содержащим одно или несколько указанных соединений в качестве активного(ых) ингредиента(ов). Более конкретно, варианты осуществления изобретения относятся к соединениям, которые действуют в качестве антагониста или ингибитора для Toll-подобных рецепторов (TLR) 7 и 8, а также к их применению в составе фармацевтической композиции, эффективной для лечения системной красной волчанки (SLE) и волчаночного нефрита.
[0004]
Описание предшествующего уровня техники
[0005]
.
Системная красная волчанка (SLE) и волчаночный нефрит представляют собой аутоиммунные заболевания, характеризующиеся воспалением и поражением тканей. Например, SLE может привести к поражению кожи, печени, почек, суставов, легких и центральной нервной системы. Больные SLE могут испытывать общие симптомы, такие как крайняя усталость, боль в суставах и отек суставов, необъяснимая лихорадка, кожная сыпь и нарушение функции почек. Поскольку поражение органов среди пациентов различается, симптомы могут различаться. SLE является заболеванием, поражающим, преимущественно, молодых женщин, с пиком начала в промежутке 15-40 лет, и имеющим приблизительно 10-кратную более высокую распространенность у женщин по сравнению с мужчинами
[0006]
Современные методы лечения SLE обычно включают иммуномодулирующие препараты, такие как белимумаб, гидроксихлорохин, преднизон и циклофосфамид. Каждый из этих препаратов может иметь побочные эффекты, ограничивающие дозу, и многие пациенты по-прежнему плохо контролируют заболевание.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0007]
Варианты осуществления по настоящему изобретению касаются соединений и способов их применения для профилактики или лечения заболеваний или состояний, характеризующихся активацией Toll-подобных рецепторов 7 или 8 у пациентов. В одном из вариантов осуществления предложено соединение формулы (I):
1
2
где, по меньшей мере, один из R и R представляет собой -Н, метил или этил, а другой представляет собой
-Н; или другой представляет собой
1
6
C-С-алкил, который необязательно замещен:
3
2
2
2
3
2
2
3
2
3
-OH, метокси, этокси, -OCH(CH), -О(CH)CH, фенилом, фуранилом, -О(CH)OH, фенокси, метилтио, -F, -N(СН), циано, пиридинилокси, фторфенокси, изохроманилом, фенолом, бензиламино, -NHCH, оксо-, амино, карбоксилом, 7-членным спироаминилом, трех-шести-членным циклоалкилом, насыщенным или ненасыщенным и необязательно включающим один или несколько гетероатомов, выбранных из О и N, и необязательно замещенным на одном или нескольких атомах С или N метилом, циано, фтором, метиламино или трифторметилом; или другой представляет собой
3
7
C-C циклоалкан, насыщенный или ненасыщенный, необязательно соединенный мостиковой связью, необязательно включающий один или несколько гетероатомов, выбранных из O, S и N, и необязательно замещенный на одном или нескольких атомах С или N метилом, этилом, пиридинилом, азетидинилом, ацетамидилом, карбоксамидилом, циано, фтором, метиламино или трифторметилом; или
1
2
3
R и R, вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 8-11-членный спиродиамин, 8-членный бициклодиамин, 7-членный спироксамин, пиперидинил, необязательно замещенный этилом, или четырех-шести членный циклоалкил, необязательно замещенный, по крайней мере, одним карбоксамидилом, аминометилом, метилом, (этиламино)метилом, (диметиламино)метилом, диметиламино, (метиламино)метилом и амино; и где R представляет собой -H или метил.
[0008]
В другом варианте осуществления изобретения соединение представляет собой соединение формулы (I), имеющее стереохимию, показанную на одном из соединений формулы (Ia), (Ib), (Ic) или (Id), обладающих такими же наборами заместителей, как указано выше для формулы (Iа):
[0009]
В еще одном варианте осуществления изобретения предложено соединение формулы (Iе) (показана относительная стереохимия):
[0010]
В другом варианте осуществления изобретения соединение представляет собой соединение формулы (II):
где
4
R представляет собой -H или метил;
5
1
5
R представляет собой C-C алкил, который является насыщенным, частично насыщенным или ненасыщенным и который необязательно замещен:
2
2
3
2
-H, -Cl, -F, -OH, -NH, оксо-, -N(CHCH), фенилом, циклогексилом, фенилтриазолилом, циклогексилтриазолилом, пиридинилом, пирролидинилом,
морфолинилом, необязательно замещенным метилом или гидроксиметилом,
-О-, замещенным:
1
6
С-С алкилом, метилфенилом, метилциклогексилом, пиридинилом, диазинилом или фенилом, необязательно замещенным -F или метилом,
-NH-, замещенным:
2-
7
CC алкилом, который является линейным, разветвленным или циклическим, насыщенным или ненасыщенным, и необязательно замещенным оксо-, фенилом, метилом или -OH,
пиридинилом, необязательно замещенным метилом, метокси, фенилом или амино,
диазинилом, необязательно замещенный этилом,
бензоимидазолилом, метилфенилом, фенилпиразолилом, нафтиридилом,
фенилом, необязательно замещенный -F, метилом, этилом или этокси,
имидазолидинилом, необязательно замещенным метилом,
5
или R представляет собой , где n равно 1-3, и где циклический амин необязательно замещен
1
3
C-C алкилом, необязательно замещенным
2
3
2
2
-OH, -F, фенилом, -NH, циклогексилом, -N(CH), -C(O)NH, метилсульфонамидилом, бензолсульфонамидилом, метилбензолсульфонамидилом, или
пирролидинилом, необязательно замещенный метилом или гидроксилом, или
6
6
-NHC(O)R, где R представляет собой
1
5
C-C алкил, фенил, пиридинил, фторфенил, метилсульфонил, фторбензолсульфонил, диметилпиразолсульфонил или
пиразолил, необязательно замещенный метилом;
3
2
3
2
3
пиперидинил, необязательно замещенный -С(O)СН, -С(O)СНСН, метил, оксо-, C(O)Ph, -NH, -NH-C(O)CH или
3
3
3
3
2
3
пиперазинил, необязательно замещенный -C(O)OC(CH), метилом, -C(O)CH, -C(O)Ph, C(O)CH(CH), -C(O)CH или метилсульфонилом; или
5
R представляет собой , где n равно 1 или 2, и где циклический диамин, необязательно, замещен, по меньшей мере, на одном атоме углерода
3
2
2
3
метилом, оксо-, -N(CH), амино, -CHCH, или
3
3
2
3
3
пиперидинилом, необязательно замещенным метилом, -C(O)CH, -C(O)CH(CH), -C(O)Ph или -C(O)OC(CH), и
7
3
1
3
2
8
где R представляет собой -H, фенил, -C(O)CH, С-С алкил, -C(O)NH или -C(O)Ph; и R представляет собой метокси или циано.
[0011]
В еще одном варианте осуществления предложено соединение формулы (III):
где
11
R представляет собой H или метил;
10
14
9
R представляет собой H или, в случае, когда оба, R и R, являются H, представляет собой метил-1,4'-бипиперидинил;
9
2-
3
2
R представляет собой -H или представляет собой -CH, замещенный 1,4'-бипиперидинилом, оксо-, гидроксилом, метилпиридинилом или пиперидинилом, необязательно замещенным гидроксилом, -N(CH) или пиперидинилом.
[0012]
-
2R,6R
N
3R,4S
2R,6R
N
2S,6R
2R,
В другом варианте осуществления изобретения соединение выбрано из rel()-4-(8-цианохинолин-5-ил)--(()-4-фторпирролидин-3-ил)-6-метилморфолин-2-карбоксамида гидрохлорида, ()-4-(8-цианохинолин-5-ил)-6-метил--(1-метилпиперидин-4-ил)морфолин-2-карбоксамида, 5-(()-2-([1,4'-бипиперидин]-1'-илметил)-6-метилморфолинo)хинолин-8-карбонитрила и 5-((7R)-2-(гидроксиметил)-7-метил-1,4-оксазепан-4-ил)хинолин-8-карбонитрила.
[0013]
50
50
50
2
5
В другом варианте осуществления изобретения соединение или его фармацевтически эффективная соль, указанные в абзаце выше, имеют значение IC меньше или равное 20 нМ против рецепторов TLR7 человека, экспрессированных в клеточной линии НЕК-293. В другом варианте осуществления изобретения соединение или его фармацевтически эффективная соль, указанные в абзаце настоящего описания выше, имеют значение IC менее чем или равное 100 нМ против рецепторов TLR7 человека, экспрессированных в клеточной линии НЕК-293. В еще одном варианте осуществления изобретения значение IC против рецепторов TLR7 человека, экспрессированных в клеточной линии НЕК-293, определяют посредством (1) культивирования клеток линии НЕК-293, стабильно экспрессирующих TLR7, в модифицированной Дульбекко среде Игла, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, при плотности 2,22×10 клеток/мл в 384-луночных планшетах, и инкубирования в течение 2-х дней при температуре 37°C, 5% CO; (2) добавления соединения или его фармацевтически приемлемой соли и инкубирования клеток в течение 30 минут; (3) добавления CL097 (InvivoGen) при 3 мкг/мл и инкубирования клеток в течение примерно 20 часов; и (4) количественной оценки NF-каппаB зависимой репортерной активации путем измерения люминесценции.
[0014]
50
50
50
2
5
В других вариантах осуществления настоящего изобретения соединения имеют значение IC против рецепторов TLR7 человека, экспрессированных в клеточной линии НЕК-293, меньше чем или равный 200 нм, меньше чем или равно 180 нм, меньше чем или равно 160 нм, меньше чем или равно 140 нм, меньше чем или равно 120 нм, меньше чем или равно 100 нм, меньше чем или равно 80 нм, меньше чем или равно 60 нм, меньше чем или равно 40 нм или меньше чем или равно 20 нм. В других вариантах осуществления настоящего изобретения, соединения имеют значение IC против рецепторов TLR7 человека, экспрессированных в клеточной линии НЕК-293, составляет от 10 нМ до 30 нМ, от 10 нМ до 50 нМ, от 10 нМ до 100 нМ, от 30 нМ до 50 нМ, от 30 до 100 нМ, или от 50 до 100 нМ. В других вариантах осуществления изобретения IC против рецепторов TLR7 человека, экспрессированных в клеточной линии НЕК-293, определяют посредством (1) культивирования клеток клеточной линии НЕК-293, стабильно экспрессирующих TLR7 в модифицированной Дульбекко среде Игла, содержащей 10% фетальную бычью сыворотку при плотности 2,22×10 клеток/мл в 384-луночном планшете, и инкубирования в течение 2 дней при температуре 37°C, 5% CO; (2) добавления соединения или его фармацевтически приемлемой соли и инкубирования клеток в течение 30 минут; (3) добавления CL097 (InvivoGen) при концентрирования 3 мкг/мл и инкубирования клеток в течение примерно 20 часов; и (4) количественной оценки NF-каппаB зависимой репортерной активации путем измерения люминесценции.
[0015]
Согласно другим вариантам осуществления изобретения предложены способы лечения волчанки, включая, но ими не ограничиваясь, лечение системной красной волчанки, кожной волчанки, психоневрологической волчанки, блокады сердца плода и антифосфолипидного синдрома, заключающиеся во введении фармацевтически эффективного количества соединения или его фармацевтически приемлемой соли по изобретению.
[0016]
Согласно другим вариантам осуществления изобретения предложены способы антагонизма TLR7, включающие введение фармацевтически эффективного количества соединения или его фармацевтически приемлемой соли по изобретению.
[0017]
Согласно другим вариантам осуществления изобретения предложены способы антагонизации TLR8, включающие введение фармацевтически эффективного количества соединения или его фармацевтически приемлемой соли по изобретению.
[0018]
Согласно другим вариантам осуществления изобретения предложены фармацевтические композиции, содержащие, по меньшей мере, одно соединение или его фармацевтически приемлемую соль по изобретению, и, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель.
[0019]
Согласно другим вариантам осуществления изобретения предложены способы лечения системной красной волчанки или волчанки, включающие введение фармацевтически эффективного количества соединения или его фармацевтически приемлемой соли по изобретению.
[0020]
Согласно другим вариантам осуществления изобретения предложены способы антагонизации TLR7, включающие введение фармацевтически эффективного количества соединения или его фармацевтически приемлемой соли по изобретению.
[0021]
Согласно другим вариантам осуществления изобретения предложены способы антагонизации TLR8, включающие введение фармацевтически эффективного количества соединения или его фармацевтически приемлемой соли по изобретению.
[0022]
Согласно другим вариантам осуществления изобретения предложены фармацевтические композиции, содержащие, по меньшей мере, одно соединение или фармацевтически приемлемую соль по изобретению и, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель.
[0023]
2
2-
2
2
2
3
3
2
Термин «необязательно замещенный», как он используется в настоящем документе, означает, что рассматриваемая структура может включать, но не обязательно включает, один или несколько заместителей, независимо выбранных из низшего алкила, метокси-, -ОН, -NH, -СНNH-CH, -OCHCHCH, или -ОСН(СН). Если необязательно замещенный фрагмент является циклическим, то необязательное замещение может быть метиловым мостиком между двумя атомами в кольце.
[0024]
Символ «C(O)», используемый в настоящем документе, относится к карбонильной группе, имеющей формулу С=О.
[0025]
Если не указано иное, указание единственного числа, как использовано в настоящем описании, включая формулу изобретения, означает «один или несколько».
[0026]
Как используется в настоящем документе, «низший алкил» относится к прямым, или в случае трех и четырех-углеродных групп, прямым, разветвленным или циклическим, насыщенным углеводородам, содержащим от одного до четырех атомов углерода.
[0027]
Как используется в настоящем документе, термин «присоединенный через атом азота» в отношении гетероциклической группы, содержащей азот, означает, что точкой присоединения группы к другой структуре является атом азота, который представляет собой часть гетероцикла.
[0028]
Как используется в настоящем документе, термин «TLR7/8» означает «TLR7 и TLR8», или «TLR7 или TLR8», или «TLR7 и/или TLR8.» Конкретное значение может быть понятным специалисту в данной области техники исходя из контекста, в котором встречается «TLR7/8».
[0029]
Гетероциклические группы, приведенные в настоящем документе, включают азетидинил, пирролидинил, пиперидинил, метилазетидинил, пиразолил, пиперазинил, морфолинил, тиазолил, пирролопирролил, имидазолидинил и изотиазолил. В случае, когда упоминается гетероциклическая группа, если не указано иное, будет понятно, что гетероциклический(ие) атом(ы) в группе может(могут) быть в любом положении в группе. Следует также понимать, что имидазолил, пиразолил, тиазолил, пирролил и могут быть ненасыщенными или частично ненасыщенным. Один из вариантов осуществления изобретения может включать фармацевтическую композицию, которая содержит одно или несколько соединений по изобретению вместе с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом. Эти фармацевтические композиции могут быть использованы для лечения или профилактики заболевания или состояния, характеризующегося активацией TLR7/8 у пациента, обычно у пациента-человека, который страдает или предрасположен к такому состоянию или заболеванию. Примеры заболеваний или патологических состояний, характеризующихся активацией TLR7/8, включают системную красную волчанку (SLE) и волчаночный нефрит.
[0030]
Как используется в настоящем документе, «эффективное количество» соединения по варианту осуществления изобретения соответствует эффективному количеству вышеуказанных соединений, то есть, количеству, достаточному для лечения или профилактики системной красной волчанки и волчаночного нефрита.
[0031]
2001
81
схеме 20
Tetrahedron Asymmetry
12,
Варианты осуществления изобретения, представленные в настоящем документе, могут включать соединения, имеющие асимметрические или хиральные центры. Варианты осуществления изобретения включают различные стереоизомеры и их смеси. Отдельные стереоизомеры соединений по вариантам осуществления изобретения могут быть получены путем синтеза исходя из коммерчески доступных исходных веществ, которые имеют асимметрические или хиральные центры, или путем получения смесей энантиомеров соединений с последующим разделением этих соединений. Подходящие способы разделения включают присоединение рацемической смеси энантиомеров, обозначаемых (+/-), к хиральному вспомогательному веществу, разделение полученного диастереомера путем хроматографии или перекристаллизации и выделение оптически чистого продукта из вспомогательного вещества; или прямое разделение смеси оптических энантиомеров на хирального исходного вещества, описанный в работе Tsuzuki, et. al., , 2989 с получением хирального соединения  по .
[0412]
80
(3S,4S
трет-
(3S,6S
трет-
H
К перемешиваемому раствору )-бутил3-(бензиламино)-4-гидроксипирролидин-1-карбоксилата  (3,091 г, 10,57 ммоль) и имидазола (3,60 г, 52,9 ммоль) в DCM (185 мл) добавляли триэтиламин (4,42 мл, 31,7 ммоль). Полученную смесь охлаждали до 1-2°C, и затем по каплям добавляли раствор тионилхлорида (1,16 мл, 15,9 ммоль) в DCM (46 мл) в течение 30 минут. Смесь перемешивали при 1-2°C в течение 6 часов, нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи, после чего реакционную смесь гасили водой (46 мл). Органический слой разделяли, концентрировали с получением сырого продукта в виде белого цвета твердого вещества/пены, который хроматографировали на колонке с силикагелем (н-гептан/EtOAc 2:1) с получением 2-оксида )-бутил3-бензилтетрагидропирроло[3,4-d][1,2,3]оксатиазол-5(3)-карбоксилата (2,10 г, 6,21 ммоль, 58,7%-ный выход) в виде твердого вещества белого цвета.
[0413]
(3S,6S
трет-
3H
(3S,6S
трет-
2
4
К перемешиваемому раствору 2-оксида )-бутил3-бензилтетрагидропирроло[3,4-d][1,2,3]оксатиазол-5()-карбоксилата (2,10 г, 6,21 ммоль) в 1,2-дихлорэтане (10 мл), разбавленному ацетонитрилом (10 мл) и водой (10 мл), охлаждаемому до 2-3°C, добавляли гидрат рутений(III) хлорида (14 мг), затем перйодат натрия (1,39 г, 6,50 ммоль). Полученную смесь перемешивали при 2-3°C в течение 1 часа, нагревали при 17-18°C в течение 1 часа и перемешивали при этой температуре в течение 16 часов. Добавляли 20 масс% раствор NaSO (5 г), потом EtOAc (30 мл), после чего полученную смесь интенсивно перемешивали в течение 10 мин и фильтровали через слой из целита (2 г). Органический слой разделяли, промывали 20 масс% раствором сульфитом натрия (5 г), 20 масс% раствором NaCl (5 г) и концентрировали с получением масла светло-сиреневого/серого цвета. Сырое масло пропускали через слой силикагеля (10 г), элюируя EtOAc (120 мл) и концентрировали досуха с получением 2,2-диоксида )-бутил3-бензилтетрагидропирроло[3,4-натрия, лития, калия, кальция, магния и тому подобное, а также нетоксичные катионы аммония, четвертичного аммония и аминов, включая, но ими не ограничиваясь, аммоний, тетраметиламмоний, тетраэтиламмоний, метиламин, диметиламин, триметиламин, триэтиламин, этиламин и тому подобное.
[0034]
Термин «фармацевтически приемлемые сложные эфиры», используемый в настоящем документе, относится к сложным эфирам, которые гидролизуются in vivo, и включают эфиры, которые легко распадаются в человеческом организме с образованием исходного соединения или его соли. Подходящими сложноэфирными группами являются, например, группы, образованные из фармацевтически приемлемых алифатических карбоновых кислот, в частности алкановых, алкеновых, циклоалкановых и алкандионовых кислот, в которых каждая алкильная или алкенильная группа, как правило, содержит не более 6 атомов углерода. Примерами конкретных эфиров являются формиаты, ацетаты, пропионаты, бутираты, акрилаты и этилсукцинаты.
[0035]
R
В настоящей заявке энантиомеры обозначены символами «» или «S» или изображаются обычным образом жирной линией, указывающей на расположение заместителя над плоскостью страницы в трехмерном пространстве, и прерывистой или пунктирной линией, указывающей на расположение заместителя под плоскости страницы в трехмерном пространстве. Если стереохимическое обозначение не приведено, то определение структуры включает оба стереохимических варианта. Если структурное или химическое название включает «REL» или «rel», подразумевается, что этой структурой показана относительная стереохимия.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
[0036]
ER-899742
ER-899464
Описание фигуры
На фиг.1А и фиг.1В показано непродолжительное in vivo подавление пути TLR7 у мышей с помощью соединений  и . : Самкам мышей линии BALB/с вводили перорально через зонд только носитель (0,5%-ный водный раствор метилцеллюлозы), или соединение, объединенное с носителем, в дозе 33 мг/кг, 100 мг/кг или 300 мг/кг. Через 6, 13 или 24 ч после перорального введения мышам вводили подкожно 15 мкг R848 для стимулирования TLR7. Плазму крови собирали пункцией сердца, и затем через 1,5 часа после стимулирования TLR7 оценивали уровень IL-6 посредством стандартной процедуры ELISA (фиг.1А).
ER-899742
ER-899464
ER-899742,
и  испытывали одновременно в одном эксперименте. (фиг.1В) Повторный эксперимент выполняли с  контролируя все три дозы во всех трех временных точках.
[0037]
ER-899742
Пояснения к фигурам:
На фиг.2A-фиг.2C показаны результаты исследования на модели мышей линии NZBxNZW (сокращенно далее как NZBWF1/J или NZB/W) волчанки.  самок NZBWF1/J мышей получали в возрасте 5 недель, осуществляли начальные отборы крови, и контролировали прогрессирование заболевания у мышей по следующим титрам анти-дцДНК. Мышей 27-недельного возраста разделяли случайным образом на группы с эквивалентными средними титрами анти-дцДНК, и в возрасте 29-ти недель обрабатывали только носителем (Veh, 0,5% метилцеллюлоза) или перорально один раз в день дозой 33, 100 или 300 мг/кг (QD PO). В возрасте 46-ти недель, через 17 недель обработки, у мышей отбирали кровь и исследовали титры анти-дцДНК. Всех мышей 50-недельного возраста умерщвляли (21 неделя обработки соединением). (Фиг.2А) Незадолго до достижения 50-недельного возраста (через 21 недели лечения) у отдельных мышей собирали мочу, и для каждого животного определяли соотношение альбумин/креатинин в моче (UACR, протеинурия) в качестве косвенного показателя функции почек. (Фиг.2B) В этом исследовании наблюдали динамику смертности для групп, обработанных самой высокой и самой низкой дозой. После обработки соединением смертность не наблюдалась. Кроме того, смертность не наблюдалась в группе, обработанной средней дозой (не показано). (Фиг.2С) Влияние обработки на анти-дцДНК титры через 17 недель введения препарата в возрасте 46-ти недель. Не наблюдалось статистически значимого эффекта.
[0038]
ER-899742
Пояснения к фигурам:
ER-899742
ER-899742
На фиг.3А-фиг.3E показаны результаты исследования соединения  на модели заболевания пристан: DBA/1 штамм волчанки.  самкам мышей DBA/1 9-недельного возраста внутрибрюшинно инъецировали 0,5 мл пристана или PBS. На 9 неделе после обработки пристаном у животных отбирали кровь для титров аутоантител. Через 10 недель после инъекции пристаном начинали пероральное один раз в день введение носителя (Veh; 0,5% метилцеллюлоза) или  в дозе 33 мг/кг, 100 мг/кг или 300 мг/кг и продолжали в течение 13 недель лечения. Через 13 недель обработки соединением мышей умерщвляли, и в образцах плазмы крови измеряли титры анти-дцДНК (фиг.3А), анти-Sm/яРНП (фиг.3B), анти-гистон (фиг.3C) и анти-RiboP (фиг.3D) методом ELISA (статистическая значимость обработки по сравнению с носителем, определяемая методом ANOVA с послетестовым критерием Даннетта). (Фиг.3Е) Через 13 недель обработки  в дозе 300 мг/кг измеряли экспрессию IFN-регулируемых генов в цельной крови с помощью набора кПЦР, и вычисляли показатель профиля экспрессии гена IFN (смотри более подробно раздел Фармакологические материалы и способы, относящийся к вычислению показателя IFN). В таблице представлен полный перечень генов, значительно активированных обработкой пристаном по сравнению с контролями PBS. При вычислении показателей интерферона не наблюдали существенных различий между обработанными и обработанными носителем животными. Однако шесть генов были значительно редуцированы при обработке соединением по сравнению с обработкой носителем (t-критерий Стьюдента) и указаны в таблице.
[0039]
ER-899464
Пояснения к фигурам
На фиг.4А-фиг.4C показаны результаты исследования  на модели заболевания NZB/W в аналогичном эксперименте, как показано на фиг.2A. : (Фиг.4A) Незадолго до достижения 50-недельного возраста (через 21 неделю обработки) у отдельных мышей собирали мочу, и для каждого животного определяли соотношение альбумин/креатинин в моче (UACR, протеинурия) в качестве косвенного показателя функции почек. (Фиг.4B) В этом исследовании наблюдали динамику смертности для групп, обработанных самой высокой и самой низкой дозой. В группе, обработанной средней дозой (не показано), смертность не наблюдалась. (Фиг.5С) Влияние обработки на анти-дцДНК титры через 17 недель введения препарата, в возрасте 46-ти недель. Не наблюдался статистически значимый эффект.
[0040]
ER-899464
ER-899742
ER-899464
На фиг.5A-фиг.5D показаны результаты исследования  на модели заболевания, вызываемого пристаном, в аналогичном эксперименте, как показано на фиг.3А-фиг.3E. Пояснения к фигурам: Через 13 недель обработки соединением мышей умерщвляли, и в образцах плазмы крови измеряли титры анти-дцДНК (фиг.5А), анти-Sm/яРНП (фиг.5B), анти-гистон (фиг.5C) и анти-RiboP (фиг.5D) методом ELISA (статистическая значимость обработки по сравнению с носителем, определяемая методом ANOVA с послетестовым критерием Даннетта). Как это было выполнено для , исследовали интерферон-индуцируемую экспрессию гена, но ни один из активирующих заболевание генов, показанных на фиг.3B, не подвергался воздействию обработкой .
[0041]
На фиг.6 показаны структуры и соответствующие химические названия в соответствии с различными вариантами осуществления, представленными в настоящем документе. «ER-номер” является ссылочным номером, присвоенным каждому соединению. Там, где возможно, также включены показатели активности по отношению к клеточной линии НЕК, стабильно экспрессирующей человеческий TLR7, активности по отношению к клеточной линии НЕК, стабильно экспрессирующей человеческий TLR9, данные 1H ЯМР и данные масс-спектрометрии.
[0042]
ER-899742
Пояснения к фигурам:
ER-899742
ER-899742
На фиг.7А-фиг.7G показан эффект от введения доз  у мышей DBA/1J с заболеванием, вызванным пристаном.  Самкам мышей DBA/1 9-недельного возраста внутрибрюшинно инъецировали 0,5 мл пристана или PBS. Через 10 недель после введения пристана у животных отбирали кровь для определения титров аутоантител. Через 11 недель после инъекции пристаном начинали пероральное, один раз в день, введение доз носителя (Veh, 0,5% метил-целлюлоза) или  в дозе 33 мг/кг или 300 мг/кг, и продолжали в течение 14 недель обработки. Через 14 недель обработки соединением мышей умерщвляли, и в образцах плазмы крови измеряли титры анти-дцДНК (фиг.7А), анти-RiboP (фиг.7В), анти-Sm/яРНП (фиг.7С), и анти-гистон (фиг.7D) методом ELISA (статистическая значимость обработки по сравнению с носителем, определяемая методом ANOVA с послетестовым критерием Даннетта). Через 14 недель обработки соединением мышей умерщвляли, и измеряли титры анти-дцДНК (фиг.7А), анти-RiboP (фиг.7В), анти-Sm/яРНП (фиг.7С), и анти-гистон (фиг.7D) в образцах плазмы крови методом ИФА (статистическая значимость обработки по сравнению с носителем, определяемая методом ANOVA с послетестовым критерием Даннетта). Для измерения общих титров IgG методом ELISA в конце дозирования (фиг.7E) использовали аналогичную плазму. Наблюдали контроль аутоантител против дцДНК и RiboP при минимальных изменениях общего уровня IgG. У мышей, обработанных пристаном, в настоящем эксперименте развивался артрит, отек суставов задних лап. Артрит оценивали в зависимости от тяжести, каждую лапку оценивали по шкале от 0 до 4 в зависимости от признаков отека и воспаления. Баллы суммировали для двух задних лапок, оцениваемых для каждого животного, и изображали графически на фиг.7F со статистической оценкой относительно вышеуказанных титров ELISA. Наблюдали дозозависимую статистически значимую супрессию. При подсчете баллов интерферона не наблюдали существенных различий между обработанными и обработанными носителем животными. Однако на фиг.7G показана понижающая регуляция пяти из 28-ти связанных с заболеванием интерферон-модулированных генов при обработке .
[0043]
Пояснения к фигурам
На фиг.8 представлен результат обработки в течение месяца с помощью ER-899742 мышей линии DBA/1J с заболеванием, вызванным пристаном, на поздней стадии после выработки высоких уровней аутоантител. : мышам линии DBA/1J в возрасте 10 недель внутрибрюшинно инъецировали пристан. Через три месяца отбирали титры анти-RiboP и анти-дцДНК, и животных распределяли в случайном порядке на группы с соответствующими средними титрами. Через одну, две или четыре недели перорального введения ER-899742 мышей в группах умерщвляли, и измеряли титры RiboP в сыворотке. На фиг.8 не показано статистически значимое изменение титров анти-RiboP или ДНК через 28 дней введения доз, хотя дозирование было связано с отсутствием увеличения титров.
[0044]
Фиг.9 представляет собой изображение ORTEP кристаллической структуры ER-899742 в виде соли HCl.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0045]
I. TLR и волчанка
[0046]
How dying cells alert the immune system to danger.
Помимо своей роли в качестве рецепторов врожденного иммунитета, способных обнаруживать экзогенные («не свои») патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMP - то есть, обнаружение бактериального LPS с помощью TLR4), Toll-подобные рецепторы (TLR) у млекопитающих также способны распознавать эндогенный стимул (DAMPS), высвобождаемый после повреждения ткани хозяина или стресса, Kono, H. and K.L. Rock, Nat Rev Immunol, 2008. 8(4): p. 279-89. В последние десять лет появилось понимание связи между активацией TLR эндогенными («своими») дистресс-ассоциированными молекулярными паттернами (DAMP) и этиологией аутоиммунных расстройств. В частности, TLR7 могут быть активированы одноцепочечной РНК (оцРНК), полученной как из млекопитающих, так и вирусных источников, в то время как TLR9 могут быть активированы ДНК, полученной из млекопитающих, вирусных и бактериальных источников.
[0047]
Activation of the interferon-alpha pathway identifies a subgroup of systemic lupus erythematosus patients with distinct serologic features and active disease.
.
Волчанка характеризуется аутоантителами, реактивными к самой двухцепочечной ДНК (дцДНК) и связанным белкам (гистонам), а также в отношении широкого спектра РНК-ассоциированных белков, таких как Ro, La, Smith (Sm) и Ul малые ядерный нуклеопротеиды. Kirou, K.A., et al., Arthritis Rheum, 2005. 52(5): p. 1491-503. Вторым общим симптом волчанки, который, как было показано, непосредственно коррелирует с тяжестью заболевания, является неуправляемая экспрессия интерферонов типа 1 (IFN), в частности IFNa, и соответствующее повышение большой панели IFNальфа-регулируемых генов в РВМС пациентов с волчанкой (так называемый «профиль экспрессии гена IFN 1-го типа»). Kirou, K.A., et al., см. выше Основным источником IFN в крови является специализированный иммуноцит, называемый плазмацитоидной дендритной клеткой (pDC), который конститутивно экспрессирует как TLR7, так и TLR9.
[0048]
202
107
25
Human lupus autoantibody-DNA complexes activate DCs through cooperation of CD32 and TLR9.
Immune stimulation mediated by autoantigen binding sites within small nuclear RNAs involves Toll-like receptors 7 and 8.
Ul small nuclear ribonucleoprotein immune complexes induce type I и
interferon in plasmacytoid dendritic cells through TLR7.
Type I interferon in systemic lupus erythematosus and other autoimmune diseases.
Причинно-следственная связь между этими двумя характеристиками заболевания, уровнями аутоантител и IFN, была установлена, когда ряд исследовательских групп коллективно показали, что комплексы антител, полученных от больных с волчанкой, но не от здоровых доноров, способны контролировать продукцию IFN посредством pDC TLR7/9- и РНК/ДНК-зависимого способа. Means, Т.К., et al., J Clin Invest, 2005. 115(2): p. 407-17; Vollmer, J., et al., J Exp Med, 2005. (11): p. 1575-85; Savarese, E., et al., Blood, 2006. (8): p. 3229-34. Кроме того, IFN стимулируют повышение экспрессии TLR7/9 в В-клетках, тем самым повышая активацию TLR/BCR (рецептор В-клеток) аутореактивных В-клеток для дифференцировки в продуцирующие антитела плазматические клетки. Banchereau, J. and V. Pascual, Immunity, 2006. (3): p. 383-92; В этом способе уровни комплексов аутоантител, содержащих лиганды нуклеиновые кислоты TLR7/9, обуславливают прогрессию провоспалительного цикла и волчанки. Авторы настоящего изобретения полагают, как вполне вероятно, что фармакологический антагонизм TLR7/8 будет обеспечивать терапевтические эффекты для пациентов, страдающих волчанкой, нарушая указанный провоспалительный цикл, понижая уровень IFN и сдерживая процесс аутоиммунного заболевания, опосредованный pDC и В-клетками.
[0049]
107
174
Sex-specific association of X-linked Toll-like receptor 7 (TLR7) with male systemic lupus erythematosus.
MicroRNA-3148 modulates allelic expression of Toll-like receptor 7 variant associated with systemic lupus erythematosus.
см. выше;
Synthetic TLR agonists reveal functional differences between human TLR7 and TLR8.
Некоторые другие данные указывают на роль TLR7 в этиологии волчанки человека и подтверждают идею о том, что рецепторы TLR являются важной целью для лечения заболевания. Специфические полиморфизмы в 3'UTR TLR7 были идентифицированы и связаны как с повышенной экспрессией TLR7, так и с усиленным профилем генной экспрессии. Shen, N., et al, Proc Natl Acad Sci USA, 2010. (36): p. 15838-43. Deng, Y. et al, PLOS Genetics, 2013. Е1003336. Кроме того, противомалярийные препараты в качестве стандартного лечения волчанки (SOC), такие как хлорохин, нарушают передачу сигнала через эндосомальный TLR7/9 и ингибируют продукцию IFNальфа PBMC и/или pDC, индуцированную оцРНК-рибонуклеопротеидными комплексами или сывороткой пациента с волчанкой. Кроме того, миелоидные DC и моноциты продуцируют IL-12р40, TNF альфа, и IL-6, поддерживая собственную РНК/TLR8 сигнализацию, предполагая дополнительную роль TLR8-зависимых провоспалительных цитокинов в этиологии волчанки человека в дополнение к TLR7-индуцируемому IFN посредством pDC. Vollmer, Gorden, K.B., et al., J Immunol, 2005. (3): p. 1259-68.
[0050]
184
38
27
58
Экспериментальные данные на мышиной модели подтверждают роль TLR в волчанке. Опубликованные исследования в совокупности показали, что фармакологическое ингибирование делеции как одного TLR7, так и TLR7/9 гена, или двойного TLR7/9 снижает тяжесть заболевания в четырех различных моделях волчанки. Nickerson, K.M., et al., TLR9 regulates TLR7- and MyD88-dependent autoantibody production and disease in a murine model of lupus, J Immunol, 2010.
(4): p. 1840-8; Fairhurst, A.M., et al., Yaa autoimmune phenotypes are conferred by overexpression of TLR7. Eur J Immunol, 2008.
(7): p. 1971-8; Deane, J.A., et al., Control of Toll-like receptor 7 expression is essential to restrict autoimmunity and dendritic cell proliferation. Immunity, 2007.
(5): p. 801-10; Savarese, E., et al., Requirement of Toll-like receptor 7 for pristane-induced production of autoantibodies and development of murine lupus nephritis. Arthritis Rheum, 2008.
(4): p. 1107-15. Отмечая роль TLR7, как одного из важнейших факторов аутоиммунитета, трансгенная сверхэкспрессия TLR7 сама по себе приводит к спонтанной анти-РНК аутореактивности и нефриту в нормально устойчивом к заболеванию штамме C57BL/6. Deane, см. выше.
[0051]
54
54
Antimalarial agents: closing the gate on Toll-like receptor?
Low blood concentration of hydroxychloroquine is a marker for and predictor of disease exacerbations inpatients with systemic lupus erythematosus.
Human TLRs and IL-IRs in Host Defense: Natural Insights from Evolutionary, Epidemiological, and Clinical Genetics.
С точки зрения безопасности, нет никаких сообщений о том, что мыши, лишенные TLR7, 8 или 9-одного или 7/8- и 7/9-двойного гена, обладают ослабленным иммунитетом, в том смысле, что наблюдается инфекция условно-патогенными микроорганизмами. Аналогично, SOC-антивещества, как полагают, в значительной степени безопасны и эффективны при длительном использовании в организме человека для контролирования внезапного обострения волчанки в дозах, предполагаемых для, по крайней мере, частичного ингибирования передачи сигнала TLR7/9. Lafyatis, R., M. York, and A. Marshak-Rothstein, Arthritis Rheum, 2006. (10): p. 3068-70; Costedoat-Chalumeau, N., et al, Arthritis Rheum, 2006. (10): p. 3284-90. Фактически, за исключением случаев повышенной восприимчивости к грамположительным бактериальным инфекциям у детей и, в меньшей степени, в зрелом возрасте, люди со значительным дефектом TLR и сигнальных путей IL-1R (MyD88- и IRAK-4-дефицит) являются, тем не менее, здоровыми и поддерживают иммунологические защитные механизмы на достаточном уровне. Casanova, J.L., L. Abel, and L. Quintana-Murci, Annu Rev Immunol, 2010.
[0052]
На основе этих и других данных авторы настоящего изобретения полагают, что TLR7, в частности, является хорошо проверенной целью в контексте доклинических мышиных моделей SLE заболевания. Как генетические, так и функциональные исследования человека подтверждают гипотезу о том, что антагонизация путей TLR7 и/или TLR8 будет оказывать терапевтический эффект в отношении пациентов, страдающих волчанкой. Кроме того, оба исследования, делеции мышиного гена TLR и долгосрочного использования антивеществ в организме человека, позволяют предположить, что фармакологическое подавление TLR7, 8 и/или 9 может осуществляться без существенного поражения иммунной защиты организма.
[0053]
Поэтому соединение, которое подавляет TLR7, TLR8 или оба, TLR7 и TLR8, как полагают, действует в качестве средства для терапии или профилактики SLE или волчаночного нефрита.
[0054]
Авторы настоящего изобретения обнаружили соединения, которые подавляют TLR7 и/или 8, и, соответственно, как ожидается, обладают профилактическим или терапевтическим эффектом в отношении SLE или волчаночного нефрита. Соединения и способы по изобретению описаны в настоящем документе.
[0055]
II. Терапевтическое применение
[0056]
Уровни доз активных ингредиентов в фармацевтических композициях по изобретению могут быть изменены для того, чтобы получить количество активного(ых) соединения(ий), обеспечивающего(их) достижение желаемого терапевтического эффекта у конкретного пациента для данной композиции и способа введения. Выбранный уровень доз зависит от активности конкретного используемого соединения, способа введения, тяжести состояния, подлежащего лечению, а также состояния и медицинского анамнеза пациента, который проходит лечение. Дозы определяются для каждого конкретного случая с использованием стандартных методов в соответствии с факторами, специфичными для пациента, включая возраст, вес, общее состояние здоровья, а также другие факторы, которые могут оказывать влияние на эффективность соединения(ий) по изобретению. Обычно, в случае перорального введения, соединение в соответствии с настоящим изобретением или его фармацевтически приемлемую соль вводят в дозе приблизительно от 30 мкг до 100 мкг, в дозе от 30 мкг до 500 мкг, в дозе от 30 мкг до 10 г, в дозе от 100 мкг до 5 г или в дозе от 100 мкг до 1 г на взрослого человека в день. В случае введения в виде инъекции, соединение вводят в дозе приблизительно от 30 мкг до 1 г, в дозе от 100 мкг до 500 мг, или в дозе от 100 мкг до 300 мг на взрослого человека в день. В обоих случаях дозу вводят однократно или дозу разделяют на несколько введений. Доза может быть смоделирована, например, с помощью программы Simcyp.
[0057]
Не предполагается, что введение соединения по изобретению млекопитающему, включая человека, будет ограничиваться конкретным способом введения, дозой или частотой введения доз. Настоящее изобретение относится ко всем способам введения, включая пероральное, внутрибрюшинное, внутримышечное, внутривенное, внутрисуставное, внутриочаговое, подкожное введение или любой другой способ, соответствующий обеспечению дозы, адекватной для профилактики или лечения SLE или волчаночного нефрита. Одно или несколько соединений по изобретению можно вводить млекопитающим в виде разовой дозы или нескольких доз. При введении множественных доз, дозы могут быть отделены друг от друга, например, несколькими часами, одним днем, одной неделей, одним месяцем или одним годом. Следует понимать, что для любого конкретного субъекта конкретные режимы дозирования должны быть скорректированы с течением времени в соответствии с индивидуальной потребностью и профессиональным суждением лица, назначающего или наблюдающего за введением фармацевтической композиции, которая содержит соединение по изобретению.
[0058]
Для клинического применения соединение по настоящему изобретению обычно можно вводить внутривенно, подкожно, внутримышечно, в толстую кишку, интраназально, внутрибрюшинно, ректально, буккально или перорально. Композиции, содержащие, по меньшей мере, одно соединение по изобретению, пригодные для использования в медицине или ветеринарии, могут быть представлены в формах, обеспечивающих введение подходящим способом. Эти композиции могут быть получены в соответствии с обычными способами, с использованием одного или нескольких фармацевтически приемлемых адъювантов или вспомогательных веществ. Вспомогательные вещества включают, в частности, разбавители, стерильную воду и различные нетоксичные органические растворители. Приемлемые носители или разбавители для терапевтического применения хорошо известны в области фармацевтики и описаны, например, в обзоре Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000, Philadelphia, и Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. С Boylan, 1988, 1999, Marcel Dekker, New York. Композиции могут быть представлены в виде таблеток, пилюль, гранул, порошков, водных растворов или суспензий, растворов для инъекций, эликсиров или сиропов, и композиции могут необязательно содержать один или несколько агентов, выбранных из группы, включающей подсластители, вкусовые добавки, красители и стабилизаторы для получения фармацевтически приемлемых препаратов.
[0059]
Выбор носителя и содержание активного вещества в носителе обычно определяется в соответствии со свойствами растворимости и химических свойств продукта, конкретного способа введения, а также нормами, которые должны соблюдаться в фармацевтической практике. Например, для изготовления таблеток могут быть использованы вспомогательные вещества, такие как лактоза, цитрат натрия, карбонат кальция и дикальция фосфат и разрыхляющие вещества, такие как крахмал, альгиновые кислоты и некоторые сложные силикаты в сочетании со смазывающими веществами (например, стеарат магния, лаурилсульфат натрия и тальк). Для получения капсулы эффективно использовать лактозу и полиэтиленгликоли с высоким молекулярным весом. При использовании водных суспензий, они могут содержать эмульгирующие вещества, которые способствуют образованию суспензии. Могут быть использованы разбавители, такие как сахароза, этанол, полиэтиленгликоль, пропиленгликоль, глицерин, хлороформ или их смеси.
[0060]
Для парентерального введения используются эмульсии, суспензии или растворы композиций по изобретению в растительном масле (например, кунжутное масло, арахисовое масло или оливковое масло), водно-органические растворы (например, вода и пропиленгликоль), инъецируемые органические сложные эфиры (например, этил олеат) или стерильные водные растворы фармацевтически приемлемых солей. Растворы солей композиций по изобретению, в частности, используются для введения путем внутримышечной или подкожной инъекции. Для внутривенного введения могут быть использованы водные растворы, включающие растворы солей в чистой дистиллированной воде, при условии, что (I) их рН отрегулирован соответствующим образом, (II) они соответствующим образом забуферены и сделаны изотоническими с помощью достаточного количества глюкозы или хлорида натрия, и (III) они стерилизованы нагреванием, облучением или микрофильтрацией. Подходящие композиции, содержащие соединение по изобретению, могут быть растворены или суспендированы в подходящем носителе для использования в распылителе или аэрозоле-суспензии или аэрозоле-растворе, или могут быть поглощены или адсорбированы на подходящем твердом носителе для применения в ингаляторе сухого порошка. Твердые композиции для ректального введения включают суппозитории, полученные в соответствии с известными способами и содержащие, по меньшей мере, одно соединение по изобретению.
[0061]
Дозированные лекарственные формы по изобретению, которые используются для терапевтического введения, должны быть стерильными. Стерильность легко достигается путем фильтрации через стерильные мембраны (например, мембраны c диаметром ячейки 0,2 мкм) или другими известными способами. Лекарственные формы обычно хранятся в лиофилизированной форме или в виде водного раствора. pН композиций по настоящему описанию в некоторых вариантах осуществления, например, может быть в пределах от 3 до 11, может быть в пределах от 5 до 9, или может быть в пределах от 7 до 8, включительно.
[0062]
В то время как одним из способов введения является пероральное введение лекарственных средств, могут быть использованы другие способы введения. Например, композиции можно вводить подкожно, внутривенно, внутримышечно, в толстую кишку, ректально, интраназально или внутрибрюшинно в виде различных лекарственных форм, таких как суппозитории, имплантированные гранулы или небольшие цилиндры, аэрозоли, пероральные дозированные лекарственные формы, а также композиции для местного применения, такие как мази, капли и кожные пластыри. Соединения по вариантам осуществления по изобретению могут быть включены в формованные изделия, такие как имплантаты, в том числе, но ими не ограничиваясь, клапаны, стенты, трубки и протезы, в которых могут применяться инертные материалы, такие как синтетические полимеры или силиконы (например, композиции Silastic, силиконовый каучук или другие коммерчески доступные полимеры). Такие полимеры могут включать поливинилпирролидон, сополимер пирана, полигидрокси-пропил-метакриламид-фенол, полигидроксиэтил-аспартамид-фенол или полиэтиленоксид-полилизин, замещенный пальмитоильными остатками. Кроме того, соединение по изобретению может быть связано с классом биодеградируемых полимеров, используемых для достижения контролируемого высвобождения лекарственного средства, например, с полимолочной кислотой, полигликолевой кислотой, сополимерами полимолочной и полигликолевой кислоты, полиэпсилонкапролактоном, полигидроксимасляной кислотой, полиортоэфирами, полиацеталями, полидигидропиранами, полицианоакрилатами и поперечно сшитыми или амфипатическими блок-сополимерами гидрогелей.
[0063]
Соединение по изобретению также можно вводить в виде липосомальных систем доставки, таких как небольшие однослойные везикулы, большие моноламеллярные везикулы и многослойные везикулы. Липосомы могут быть образованы из различных липидов, таких как холестерин, стеариламин или фосфатидилхолины. Соединение по изобретению также может быть доставлено с помощью антител, фрагментов антител, факторов роста, гормонов или других целевых фрагментов, с которыми соединены молекулы соединения (например, смотри Remington: The Science and Practice of Pharmacy, vide см. выше), включая in vivo конъюгацию соединения варианта осуществления по изобретения с компонентами крови.
[0064]
III. Синтез
[0065]
Предложены общие и конкретные способы синтеза, которые авторы настоящего изобретения используют для получения примеров осуществления изобретения. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что определенные изменения или модификации этих способов также могут обеспечить синтез соединений в соответствии с изобретением. В некоторых случаях фраза «такие как» используется для перечисления различных альтернатив для более общих соединений или структур. Следует понимать, что фраза «такие как» не должна быть истолкована как ограничивающая, и что ее значение находится в соответствии с «включая, например, но ими не ограничиваясь».
[0066]
Определенные условия были общими для конкретных примеров, представленных ниже.
Микроволновый нагрев осуществляли с использованием микроволнового реактора Biotage Emrys Liberator или Initiator. Колоночную хроматографию осуществляли с использованием системы флэш-хроматографии Biotage SP4. Удаление растворителя осуществляли с использованием либо роторного испарителя Buchi, либо центробежного испарителя Genevac. ЯМР-спектры регистрировали при 400 МГц на спектрометре Varian Unity с использованием дейтерированных растворителей. Химические сдвиги приведены относительно остаточного протонированного растворителя.
[0067]
Тонкослойную хроматографию осуществляли на стеклянных планшетах Whatman, предварительно покрытых 0,25 мм слоем силикагеля, с использованием в различных соотношениях одного или нескольких следующих растворителей: EtOAc, гептан, дихлорметан или метанол.
[0068]
Аналитическую ЖХ/МС проводили для многих примеров с помощью системы Waters ACQUITY™ с использованием колонки XBridge™ CI8 1,7 мкм 2,1×50 мм. Растворители А и В представляют собой смеси вода масс/0,1% муравьиная кислота и ацетонитрил масс/0,1% муравьиная кислота, соответственно. Общее время метода 5 минут с градиентом 5% В-99% В в течение 4 мин при скорости потока 0,3 мл/мин. Масс-спектральные данные получали на системе Waters SQD из 100-2000 а.е.м. в режиме положительной электроспрей-ионизации.
[0069]
Альтернативно, подтверждение чистоты и массы выполняли на системе Waters Autopurification с использованием колонки XBridge™ C8 3,5 мкм 4,6×50 мм. Растворители А и В представляют собой смесь вода масс/0,1% муравьиная кислота и смесь ацетонитрил масс/0,1% муравьиная кислота, соответственно. Общее время метода 6 минут с градиентом 10% В-95% В в течение 5 мин при скорости потока 2,5 мл/мин. Масс-спектральные данные получали на системе Micromass ZQ ™ из 130-1000 а.е.м. в режиме положительной электроспрей-ионизации.
[0070]
Препаративную обращенно-фазовую ЖХ/МС выполняли во многих примерах на системе Waters Autopurification с использованием колонки XBridge™ С8 5 мкм, 19×100 мм. Растворители А и В представляют собой смесь вода масс/0,1% муравьиная кислота и смесь ацетонитрил масс/0,1% муравьиная кислота, соответственно. Общее время метода 12 минут с градиентом 30% В-95% В в течение 10 мин со скоростью потока 20 мл/мин. Масс-спектральные данные получали на системе Micromass ZQ™ из 130-1000 а.е.м. в режиме положительной электроспрей-ионизации.
[0071]
Разделение рацемических соединений посредством препаративной ВЭЖХ выполняли во многих примерах, используя одну из следующих хиральных колонок: Chiralpak IA (5 см×50 см или 2 см×25 см), Chiralpak AD (2 см×25 см) или Chiralcel OD (2 см×25 см). Соотношение энантиомеров очищенных соединений определяли с помощью анализа ВЭЖХ на колонке 0,45 см×25 см с аналогичной неподвижной фазой (IA, AD или OD).
[0072]
Общие методы и эксперименты для получения соединений по настоящему изобретению приведены ниже. В некоторых случаях, конкретное соединение описано в качестве примера. Тем не менее, следует принимать во внимание, что в каждом случае был получен ряд соединений по настоящему изобретению в соответствии со схемами и данными эксперимента, описанными ниже. Для тех соединений, где предоставлены данные ЯМР и/или масс-спектрометрии, данные представлены на фиг.6.
[0073]
В настоящем документе используются следующие сокращения:
Определения: Следующие сокращения имеют указанные значения:
AcOH: уксусная кислота
безвод.: безводный
вод.: водный
Bn: бензил
трет-
Boc: бутоксикарбонил
CSA: камфорсульфоновая кислота
д: день(дни)
DAMP: дистресс-ассоциированный молекулярный паттерн
DBU: 1,8-диазобицикло[5,4,0]ундец-7-ен
DCE: 1,2-дихлорэтан
DCM: дихлорметан
DIPEA: N,N-диизопропилэтиламин
DMA: N,N-диметилацетамид
DMAP: 4-диметиламинопиридин
ДМФ: N,N-диметилформамид
ДМСО: диметилсульфоксид
дцДНК: двухцепочечная ДНК
EDC: 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид
э.и.: энантиомерный избыток
EtOAc: этилацетат
EtOH: этанол
ч: час(часы)
HATU: гексафторфосфат N,N,N',N'-тетраметил-О-(7-азабензотриазол-1-ил)урония
HCl: соляная кислота
HCQ: гидроксихлорохин
hep: н-гептан
HEPES: 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота
ВЭЖХ: высокоэффективная жидкостная хроматография
IFN: интерферон
IPA: изопропиловый спирт или изопропанол
2
3
KCO: карбонат калия
MeOH: метанол
4
MgSO сульфат магния (безводный)
мин: минута (минуты)
трет-
MTBE: метил-бутиловый эфир
2
3
NaСО: карбонат натрия
2
4
NaSO: сульфат натрия (безводный)
4
NaBH: борогидрид натрия
NaCl: хлорид натрия
NaH: 60% гидрид натрия, диспергированный в масле
3
NaHCO: бикарбонат натрия
NaOH: гидроксид натрия
N-
NBS:бромсукцинимид
4
NHCl: хлорид аммония
4
NHOH: гидроксид аммония
N-
NMP:метилпирролидон
o
Ns: нозил или -нитробензолсульфонил
°C: градусы Цельсия
PAMP: патоген-ассоциированный молекулярный паттерн
PBMC: мононуклеарные клетки периферической крови
PBS: фосфатно-солевой буферный раствор
pDC: плазмацитоидные дендритные клетки
2
N-
PhNTf:фенилтрифторметансульфонимид
кПЦР qPCR: количественная полимеразная цепная реакция
R848: резиквимод
к.т.: комнатная температура
насыщ.: насыщенный
SNAP: картридж для флеш-хроматографии с товарным знаком BIOTAGE
SOC: стандарт лечения
оцРНК: одноцепочечная РНК
T3P: ангидрид пропилфосфоновой кислоты
трет-
tBuOK: бутилоксид калия
TEA: триэтиламин
TEMPO: 2,2,6,6-тетраметилпиперидин 1-оксил
Tf: трифторметансульфонат
ТФК: трифторуксусная кислота
ТГФ: тетрагидрофуран
TLDA: Taqman Low Density Array
TLR: Toll-подобный рецептор
TSA: п-толуолсульфоновая кислота
[0074] Общие способы синтеза:
[0075]
схемах 1-31
Соединения получали в соответствии с общими методами синтеза, показанными на :
[0076] Схема 1
[0077]
[0078]
3
схеме 1
1
2006
2
2
3
3
Synthesis,
Для получения соединений по некоторым из примеров используют ключевое промежуточное соединение , которое может быть получено в соответствии со способом, изображенным на . Коммерчески доступный 5-бромхинолин-8-карбальдегид  (Frédérieric de Montigny, Gilles Argouarch, Claude Lapinte, «New Route to Unsymmetrical 9,10-Disubstituted Ethynylanthracene Derivatives», , 293-298) обрабатывают гидроксиламин гидрохлоридом с получением оксима . Затем соединение  превращают в соответствующий нитрил  в присутствии каталитического количества ацетата меди с получением одного из ключевых промежуточных соединений, описанных в настоящем документе. Промежуточное соединение  используют для синтеза соединений, описанных в настоящем документе, путем замены в 5-м положении 5-бромхинолин-8-карбальдегида соответствующими ароматическими, гетероароматическими и насыщенными гетероциклическими соединениями, такими как пиперидины, пиперазины и морфолины, в соответствующих условиях, описанных подробно ниже.
[0079]
3
схеме 2
Альтернативный способ синтеза ключевого промежуточного соединения  показан на , где триэтиламин на первой стадии синтеза заменен на ацетат натрия.
[0080] Схема 2
[0081]
[0082]
схеме 3
3
4
5
Некоторые соединения по примерам получают путем обычного способа конденсации, как показано на , где бромхинолин  конденсируют с соответствующим нуклеофилом  с образованием соединения , которое может представлять собой либо ключевое промежуточное соединение, либо конечное соединение, описанное более подробно ниже.
[0083] Схема 3
[0084]
[0085]
15
14
схеме 4
6
7.
8
9
10
9
11
3
схема 1
2
12
13
14
14
15
Ряд примеров, представленных соединением , получают из дополнительного промежуточного соединения , как показано в общем способе, представленном на . Соответствующим образом защищенный хиральный эпоксид  конденсируются с аллиламином с получением хирального аминоспирта  После защиты вторичного амина мезилатом полученное промежуточное соединение  межмолекулярно циклизуют с образованием ненасыщенного пирана . Восстановление двойной связи энамина для получения соединения , с последующим удалением мезильной группы дает соединение . Конденсация соединения  с бромидом  ( или ) с использованием или без использования катализатора на основе палладия дает соединение , после чего удаление защитной группы у соединения  и последующая активация полученного спирта дает ключевое промежуточное соединение . Активированное соединение  может быть легко преобразовано в ряд соединений по примерам, приведенным ниже, с использованием соответствующим образом замещенных аминов и реагентов конденсации с получением соединений общей структуры .
[0086] Схема 4
[0087]
[0088]
10
схеме 5
8
16
17
10
N-
Альтернативный способ получения общей структуры  показан на . Радикальную циклизацию защищенного спирта  можно осуществить путем обработкибромсукцинимидом с получением соединения . Удаление группы бром с использованием основания дает енол , который затем восстанавливают силаном с получением промежуточного соединения .
[0089] Схема 5
[0090]
[0091]
11
схеме 6
6
18
19
20
21
22
23
22
22
22
11
Альтернативный способ получения соединения общей структуры  изображен на . Начиная с хирального эпокси исходного вещества  после защиты вторичного амина Вос-защитной группой получают спирт . Образование лактона с использованием растворимого в воде DCC (дикальций цитрата) дает соединение , которое затем может быть подвергнуто алкилированию с помощью алкиллития, такого как метиллитий, с образованием смеси кеталей,  и . Затем смесь кеталей восстанавливают с получением диастереомерной смеси соединений морфолина  (являющегося желаемым диастереомеризомером) и соединения , которая может быть легко разделена хроматографией на колонке с силикагелем. Было обнаружено, что соотношение метилморфолиновой смеси составляет от 4:1 до 9:1 в сторону соединения структуры . Для следующих дополнительных соединений проводили рентгеновское исследование кристаллической структуры для подтверждения абсолютной стереохимии соединения . Соединение  легко преобразуется в соединение  путем удаления защиты с помощью кислоты, такой как ТФК, и последующей нейтрализации основанием.
[0092] Схема 6
[0093]
[0094]
11
6
23
24
25
26
11
Третий способ получения ключевого промежуточного соединения  показан на схеме 7. Коммерчески доступный защищенный эпоксид  конденсируют с водным раствором аммиака с получением аминоспирта , который в свою очередь конденсируют с хиральным хлорпропинатом  с образованием энантиомерно чистого амида . Образование эфира с использованием сильного основания, такого как гидрид натрия, дает лактам , который может быть превращен в промежуточное соединение  посредством восстановления амида в циклический амин.
[0095] Схема 7
[0096]
[0097]
5,
схеме 3
12
схеме 4,
схеме 8
28
30
27
29
31
32
33
34
34
35
11
12
схеме 4
11
Альтернативный способ получения соединений по примерам, охватываемых общей структурой  представленных на , и соединения  на проиллюстрирован на . Исходные вещества  и , полученные из коммерчески доступных источников ( и ), могут легко конденсированы в присутствии неорганического основания с образованием соединения . Фенольную защитную группу удаляют путем восстановительного гидролиза с образованием соединения , защитную ацетальную группу гидролизуют кислотой с образованием альдегида , и затем получают бициклический гетероцикл  в условиях конденсации, катализируемой кислотой. Гидроксильная группа фенола соединения  затем активируется с образованием соединения , которое далее может быть конденсировано с соединением  с образованием соединения , как показано на . Соединение  может быть замещено другими нуклеофилами, как показано в приведенных ниже примерах.
[0098] Схема 8
[0099]
[0100]
15
схеме 9
10
13
36
15
схеме 9
В двух альтернативных способах получения соединений с общей структурой  используют процессы, изображенные на  и . Промежуточное соединение  активируется путем образования трифлата  с последующим замещением соответствующим амином в присутствии основания, такого как карбонат калия, с образованием желаемого целевого соединения , как показано на .
[0101] Схема 9
[0102]
[0103]
22
схеме 6
15
37
схеме 10
37
ER-884884
3
ER-884884
15,
Исходя из Вос-защищенного хирального морфолина  на , специалист в данной области может предложить дополнительные примеры получения соединений общей структуры  путем превращения защищенного спирта в промежуточное соединение азида , как показано на .  легко превращается в первичный амин  путем восстановления азида, удаления защитной Вос-группы и конденсации с соединением .  подобным образом может быть преобразован в дополнительные аналоги, изображенные соединением общей структуры  посредством либо процессов алкилирования, либо ацилирования.
[0104] Схема 10
[0105]
[0106]
13
38
39
схеме 11
40
41
38
Осуществление альтернативного ряда примеров соединений проводят путем окисления ключевого промежуточного соединения  с получением соединения  и последующим получением соединений по примерам в условиях амидной конденсации с образованием соединения , как показано на . При получении некоторых соединений по примерам, используя указанный общий способ, потребуется одна или две дополнительные стадии с получением желаемых целевых соединений общей структуры . Аналогичным образом различные сложные эфиры, представленные общей структурой , можно легко получить из соединения  с использованием различных способов специалистами в данной области.
[0107] Схема 11
[0108]
[0109]
11
схеме 4
14
36
42
схеме 12
Аналогичным образом, другие соединения по примерам получают двумя возможными способами: (1) замена активированной группы на алкильную, алкенильную или арильную функциональную группу, используя основание и соединение  по ; или с использованием активированного спирта  или  с фенолами или алкиловыми спиртами в присутствии соответствующего основания. Оба способа получения соединений по примерам с общей химической структурой , показаны на .
[0110] Схема 12
[0111]
[0112]
13
43
44
46
схеме 13
44
45,
46
47
44
47
Ключевое промежуточное соединение  также может быть окислено с образованием альдегида  с последующей конденсацией с различными алкильными и арильными конденсирующими агентами с получением соединений по примерам  или , как показано на . Затем полученные продукты могут быть преобразованы в дополнительные соединения по примерам либо окислением соединения  с получением соединения общей структуры  либо восстановлением соединения с получением соединений общей структуры , где n=2. Аналогичным образом, специалист в данной области может синтезировать дополнительные соединения по примерам из промежуточного соединения  путем активирования гидроксильной группы, например, образованием трифлата с последующим восстановлением с использованием некоторых возможных восстановительных агентов с получением соединений по примерам, которые содержат на одну меньше метиленовых групп или соединения, где n=1.
[0113] Схема 13
[0114]
[0115]
схемы 14
13
68,
62
68
Окончательный набор соединений по примерам получают путем использования . Используя способ синтеза для получения соединения , аналогичный представленному на схеме 4, можно получить желаемое семичленное гетероциклическое соединение  заменяя алкиламин на 1-амино-3-бутен . Затем соединение  может быть активировано и далее конденсировано с различными замещенными аминами для синтеза дополнительных аналогов аналогичным образом, как это показано, в частности, на схемах, представленных выше.
[0116] Схема 14
[0117]
[0118] Получение соединений по примерам
[0119]
3 - Схема 1
Соединение
[0120]
2
К суспензии 5-бромхинолин-8-карбальдегида 1 (1,00 г, 4,24 ммоль) и гидроксиламингидрохлорида (1,177 г, 16,94 ммоль) в ацетонитриле (110 мл) добавляли TEA (2,362 мл, 16,94 ммоль) с последующим нагреванием c обратным холодильником в течение 3 ч и получением суспензии желтого цвета. После полного завершения реакции реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, осадок отфильтровывали, и осадок на фильтре промывали ацетонитрилом (50 мл). Сырой твердый продукт очищали через небольшой слой силикагеля (10 г), элюируя EtOAc (300 мл) с получением альдоксима  в виде твердого вещества желтого цвета.
[0121]
2
3
Смотри
:
2006,
2
Synthesis
Альдоксим  (1,001 г, 4,0 ммоль) и моногидрат ацетата меди (II) (84,6 мг, 0,424 ммоль) в безводном ацетонитриле (180 мл) перемешивали при нагревании с обратным холодильником в течение 12 ч. После завершения реакции охлаждали до комнатной температуры, фильтровали, и слой на фильтре промывали HO, получая твердое вещество коричневого цвета. Сырой твердый продукт очищали через небольшой слой силикагеля (приблизительно 10 г), элюируя (DCM 100 мл) с получением 5-бромхинолин-8-карбонитрила  (0,783 г, 3,4 ммоль, 79,3%-ный выход за 2 стадии) после концентрирования и сушки в вакууме элюированного продукта в виде твердого вещества светло-бежевого цвета.  Frédérieric de Montigny, Gilles Argouarch, Claude Lapinte, ,293.
[0122]
3 - Схема 2
Соединение
[0123]
2
К перемешиваемому раствору тригидрата ацетата натрия (31,6 г, 0232 Моль) в этаноле (0498 л) при 15°C 5-добавляли бромхинолин-8-карбальдегид (49,84 г, 0,211 моль), а затем гидрохлорид гидроксиламина (15, 55 г, 0223 моль). Полученную смесь нагревали при 70°C в течение 3 ч, после чего реакционную смесь охлаждали до 35°C и затем разбавляли водой (250 мл). Смесь частично концентрировали до примерно 250 мл, после чего добавляли воду (250 мл), 2-метокси-2-метилпропан (120 мл) и гептан (120 мл), затем повторно концентрировали смесь до приблизительно 250 мл. Полученную взвесь разбавляли водой (250 мл) и охлаждали до 0°C, после чего добавляли 1М раствор NaOH в воде (211 мл), и конечную смесь интенсивно перемешивали в течение 10 мин. Суспензию фильтровали, промывали водой (498 мл), и осадок на фильтре сушили при 30°C в течение 18 часов с получением альдоксима  (49,75 г, 0198 моль, 93,9%-ный выход) в виде порошка бежевого цвета.
[0124]
2
3
К перемешиваемой суспензии соединения  (48,21 г, 0,192 моль) в ацетонитриле (386 мл) при 15°C добавляли ацетат меди (II) (0,523 г, 2,9 ммоль), затем уксусную кислоту (13,1 мл, 0229 моль). Полученную смесь нагревали с обратным холодильником в течение 21 ч, затем, после полного завершения реакции, реакционную смесь охлаждали до 50°C. Добавляли воду (0,39 л), и смесь частично концентрировали с последующим разбавлением водой (290 мл) и охлаждали до 5°C. Добавляли 1М раствор NaOH в воде (230 мл) и продолжали интенсивное перемешивание в течение 10 мин. Суспензию фильтровали, осадок на фильтре промывали водой (500 мл) и сушили с получением соединения  (42,80 г, 0,183 моль, 95,6%-ный выход) в виде порошка темно-серого цвета.
[0125] Синтез ER-878952 - Схема 3 и 15 (способ 1)
[0126] Схема 15
[0127]
[0128]
3
69
4
3
ER-878952
цис
Соединение  (200,2 мг, 0,86 ммоль) в NMP (1 мл) и коммерчески доступный -2,6 диметилморфолин  (133,4 мг, 1,16 ммоль - в качестве типичного соединения  на схеме ) нагревали в микроволновой печи при 150°C в течение 1 часа. После полного завершения реакции реакционную смесь фильтровали и распределяли в несколько сосудов, разбавляли NMP и очищали с использованием ВЭЖХ (колонка C18, градиент 10/90-95/5 ацетонитрил/вода с 0,1% ТФК, в течение 15 мин, t=8,5-9 мин) с получением после концентрирования и сушки в вакууме желаемых объединенных фракций (180 мг, 0,68 ммоль, 79,1%-ный выход).
[0129] ER-880369
ER-878952,
3
(8,2 мг, 0,031 ммоль, 48,4%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения  с использованием соединения  (15 мг, 0,064 ммоль) и 2-этилморфолина (22,2 мг, 0,191 ммоль). Разделение энантиомеров не выполняли.
[0130]
ER-885618
3
11
схемы 4
(385,2 мг, 1,032 ммоль, 60,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения ER-878952 с использованием соединения  (400 мг, 1,716 ммоль) и (398,1 мг, 1,799 ммоль) из .
[0131]
ER-878952 (способ 2, схема 3 и 15)
Синтез соединения
[0132]
3
69
ER-878952
ER-878952
ER-878952
2
3
2
К перемешиваемой суспензии соединения  (12,00 г, 0,0515 моль) в NMP (30,0 мл) добавляли соединение  (14,8 г, 0,129 моль) с последующим нагреванием при 120°C в течение 4 часов. После полного завершения реакции реакционную смесь охлаждали до 50°C, разбавляли IPA (30 мл), гептаном (60 мл) и затем еще охлаждали до 0°C. Через 30 мин осадок собирали фильтрацией, промывали предварительно охлажденной смесью (до 0°C) IPA (18,0 мл)/гептан (36 мл) и сушили в атмосфере N/вакууме в течение 2 часов с получением  (11,00 г) в виде порошка желтого цвета. Фильтрат концентрировали, распределяли между EtOAc (120 мл) и насыщенным водным раствором NaHCO (60 мл). Органический слой отделяли, промывали водой (60 мл) и пропускали через предварительно обработанный (гептан-этилацетат 1:1) силикагель, элюируют с помощью EtOAc (120 мл), затем концентрировали. Полученное таким образом твердое вещество коричневого цвета суспендировали в смеси EtOAc (10 мл) и гептана (10 мл) и нагревали до 70°C, затем оставляли охлаждаться до 20°C. Выпавший осадок собирали фильтрацией, промывали смесью EtOAc (5,0 мл) и гептана (5,0 мл), затем сушили в атмосфере N/вакуум в течение 1 часа с получением дополнительного количества  (0,649 г) в виде порошка желтого цвета. В итоге по способу получали  (11,64 г, 43,6 ммоль, 89,6%-ный выход).
[0133] ER-879484 (способ 3, схема 3 и 16)
[0134] Схема 16
[0135]
3
70
ER-879484
ER-879484
ER-879569
ER-879570
К перемешиваемому раствору соединения  (15 мг, 64,4 ммоль) и 4-бензил-2-(хлорметил)морфолина  (43,6 мг (0,193 ммоль) в ДМФ (0,5 мл) добавляли TEA (0,27 мкл, 0,194 ммоль). Реакционную смесь нагревали в микроволновой печи при 160°C в течение 1 часа, затем, после полного завершения реакции, реакционную смесь напрямую очищали на колонке для препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой С-18 (колонка Water's X-Bridge C18 19×100 мм; элюируя смесью ацетонитрила в воде с 0,05% ТФК с градиентом 0-40%). Фракции, содержащие целевой продукт, объединяли, концентрировали и сушили в вакууме с получением  (4,2 мг, 0,015 ммоль, 22,7%-ный выход). Энантиомеры  (3,0 мг, 0,010 ммоль) разделяли, используя препаративную колонку ВЭЖХ с получением после концентрирования желаемых фракций и сушки в вакууме (1,0 мг, 0,004 ммоль) и  (1,0 мг, 0,004 ммоль). Абсолютная стереохимия была неизвестной, но устанавливалась произвольным образом.
[0136] ER-879739
3
(12 мг, 0,047 ммоль, 73,6%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения ER-879484, исходя из соединения  (15 мг, 0,064 ммоль) и 2-метилморфолина (19,5 мг, 0,195 ммоль). Разделение энантиомеров не проводили.
[0137] ER-880191
ER-879484
3
ER-878952
2S,6S
цис
(9,5 мг, 0,036 ммоль, 23,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (35 мг, 0,150 ммоль) и ()-2,6-диметилморфолина (741 мг, 6,434 ммоль). Также выделяли-изомер  (15,2 мг, 0,057 ммоль, 37,9%-ный выход). В этом получении TEA не использовали.
[0138] Дополнительные соединения по примерам, полученные из ER-878952
:
[0139] ER-885160
ER-878952
ER-885160
3
:  (85,6 мг, 0,320 ммоль) растворяли в 1,2-этандиоле (1 мл) с последующим добавлением гидроксида калия (60 мг, 1069 ммоль). Реакционную смесь нагревали в микроволновой печи при 120°C в течение 10 часов, после чего фильтровали, потом для очистки напрямую помещали на препаративную ВЭЖХ-колонку C-18 с обращенной фазой (колонка Water's X-Bridge C18 19×100 мм, элюируя 10-100% ацетонитрилом в воде с 0,05% ТФК). Желаемые фракции концентрировали досуха, растворяли в MeOH (3 мл) и элюировали на колонке с силикагелем, пропитанным карбонатом (Biotage Isolute SPE, Si-СО, 1 г), промывали MeOH (3 мл), концентрировали и сушили в вакууме с получением  (56,2 мг, 0,197 ммоль, 61,6%-ный выход).
[0140] Получение соединения ER-890963 в качестве примера соединения 15, схема 4
[0141]
7
7
2R
R
Соединение: В 22-х литровый реактор помещали ()-бензил 2-эпоксипропиловый эфир (0,7692 кг, 4,684 моль) при внутренней температуре 18-19°C. При 18-19°C добавляли аллиламин (3800 мл, 51 моль), и полученную смесь нагревали при 50°C. Через 20 часов смесь концентрировали, отгоняли азеотропно с MTBE (4 л×3) с получением ()-1-(аллиламино)-3-(бензилокси)пропан-2-ола,  (приблизительно 1037 г, 4,684 моль, 100%-ный предполагаемый выход) в виде бесцветного масла.
[0142] Соединение 8
7
8
о
R
N
3
: К перемешиваемой суспензии бикарбоната натрия (1180 г, 14,0 моль) в воде (7,2 л) при 10-11°C добавляли раствор -нитробензолсульфонилхлорида (1038 г, 4684 моль) в DCM (3100 мл) с последующим нагреванием полученной в результате двухфазной смеси до 20°C. Добавляли раствор соединения  (приблизительно 1037 г, предположительно 4684 моль) в DCM (4100 мл) в течение 3 ч при поддержании внутренней температуры в диапазоне 20-23°C и продолжали энергичное перемешивание в течение ночи. Смесь при перемешивании разбавляли водой (4100 мл) и после этого слои разделяли. Водный слой экстрагировали МТВЕ (4100 мл). Объединенные органические слои разбавляли н-гептаном (4100 мл), последовательно промывали 1,0М раствором HCl (4700 мл), насыщенным раствором NaHCO (2,0 кг), водой (4100 мл), концентрировали и досуха отгоняли азеотропно с MTBE (5200 мл×3) с получением после сушки в течение 3-х дней в вакууме ()-N-аллил--(3-(бензилокси)-2-гидроксипропил)-2-нитробензолсульфонамида  (1,855 кг, 4,56 моль, 97%-ный выход) в виде масла коричнево-зеленого цвета.
[0143]
9
8
9
3
R
Соединение: Перемешиваемую суспензию соединения  (1,80 кг, 4429 моль) в DMA (5,40 л) нагревали при 40°C до полного растворения, затем охлаждали до 25°C, после чего смесь помещали в отдельный реактор, содержащий ацетат меди (II) (0,145 кг, 0,797 моль), затем промывали первоначальный сосуд DMA (5,40 л). После заменой внутренней атмосферы на кислород (1 бар) добавляли хлорид палладия(II) (0,063 кг, 0,354 моль) и нагревали при 28-32°C в течение 3-х дней. После полного завершения реакции реакционную смесь разделяли на 2 равные части для облегчения обработки. Каждую часть отдельно выливали в смесь 0,1М раствора HCl (23 л) и МТВЕ (9,0 л), поддерживая при этом внутреннюю температуру <25°C. Слои разделяли, и водный слой экстрагировали MTBE (9,0 л и 5,4 л). Все органические слои объединяли, последовательно промывали 0,1М раствором HCl (5,5 л), 8%-ным раствором NaHCO (5,9 кг), 29%-ным раствором NaCl (6,3 кг). К органическому слою добавляли Целит 545 (270 г), перемешивали в течение 30 мин, фильтровали, и осадок на фильтре промывали МТВЕ (2,7 л). Все фильтраты объединяли и концентрировали. Масло красноватого оттенка повторно растворяли в DCM (3,6 л) и обрабатывали 1,3,5-триазинан-2,4,6-тритионом (79 г, 0,44 моль) при 25°C в течение 1 часа. Смесь разбавляли MTBE (18 л) и фильтровали через Целит 545 (270 г). Реактор и отфильтрованный осадок промывали МТВЕ (3,6 л), и объединенный фильтрат концентрировали с получением ()-2-((бензилокси)метил)-6-метил-4-((2-нитрофенил)сульфонил)-3,4-дигидро-2H-1,4-оксазина  (1748 г, 4322 моль, 97,6%-ный выход) в виде масла желтого цвета.
[0144]
10
9
9
10
8
2
2
2R,6R
Соединение: Перемешиваемую суспензию соединения  (1748 г, 4322 моль) в DCM (3,5 л) нагревали при 33-35°C до тех пор, пока не получали свободно текучую суспензию, после чего смесь охлаждали до 18-20°C. В отдельном реакторе ТФК (1,67 л, 21,6 моль) в DCM (2,62 л) охлаждали до 5°C при перемешивании, после чего добавляли триэтилсилан (1,04 л, 6,48 моль), поддерживая температуру в диапазоне 5-6°C, с последующим охлаждением до -5°C. Суспензию соединения  в DCM медленно добавляли в основной реактор в течение 1,5 ч, поддерживая температуру в интервале -5 и -3°C и затем продолжали перемешивание в течение 4 ч при температуре от -5 до -3°C. После полного завершения реакции реакционную смесь разбавляли предварительно охлажденным н-гептаном (8,74 л при -10°C), затем выливали в предварительно охлажденный раствор NaOH (NaOH: 890 г, 22,3 моль в воде: 8,7 л при 5°C), поддерживая внутреннюю температуру <15°C (более 1 ч), затем в промывочном реакторе промывали МТВЕ (3,5 л). Смесь разбавляли MTBE (5,2 л) и слои разделяли. Органический слой последовательно промывали водой (8,7 л), 30 масс% NaCl (3,5 кг) в воде, водой (5,2 л), обрабатывали Целит 545 (175 г) и фильтровали. Реакционный сосуд и осадок на фильтре промывали MTBE (1,75 л), и объединенные фильтраты концентрировали в вакууме до прибл. 3,5 л, азеотропно отгоняли с н-гептаном (8,7 л) и концентрировали до прибл. 5 л. Осадок рыжевато-коричневого цвета собирали фильтрацией, промывали н-гептаном (3,5 л) и сушили в атмосфере N/вакуум в течение 1 часа. Полученные 1,65 кг твердого вещества объединяли с 353 г твердого вещества, полученного отдельной партией, и суспендировали в смеси н-гептан/EtOAc 1:1 (8,0 л). Смесь нагревали при 61-63°C до полного растворения, охлаждали до 23-25°C в течение 1 ч, разбавляли гептаном (4 л) и дополнительно охлаждали до 10-12°C в течение 30 мин. Перемешивание продолжали при этой температуре в течение 30 мин. Осадок светло-бежевого цвета собирали фильтрованием, промывали смесью н-гептан/EtOAc, 6:1 (2 л) и затем н-гептаном (4 л) с последующей сушкой в атмосфере N/вакуум в течение ночи, а затем сушили в вакуумном печи при 35°C в течение 2 дней с получением ()-2-((бензилокси)метил)-6-метил-4-((2-нитрофенил)сульфонил)морфолина  (1616 г, 3,98 моль, выход 74% за 2 стадии из соединения ) в виде твердого вещества рыжевато-коричневого цвета.
[0145]
[0146]
71
10
2R,6S
Второстепенный продукт: ()-2-((бензилокси)метил)-6-метил-4-((2-нитрофенил)сульфонил)морфолин  (диастереоизомер) выделяли путем очистки исходного раствора .
[0147]
11:
10
11
2R,6R
Соединение К перемешиваемому 1,0M раствору t-BuOK (0,650 л, 0,650 моль) в ТГФ (0,310 л), охлажденному до 5°C, добавляли бензолтиол (63,66 мл, 0,620 моль) при поддержании температуры <10°C. Смесь перемешивали при 10°C в течение 30 мин, затем нагревали до 15°C в течение 1 часа, после чего добавляли раствор соединения (240,00 г, 590,5 ммоль) в ТГФ (0,60 л) при поддержании температуры в диапазоне 15-20°C и затем перемешивали в течение 2 часа. После полного завершения реакции реакционную смесь медленно гасили смесью 1,0M раствора HCl (1,30 л) в н-гептане (3,60 л, предварительно охлажденный до 10°C) при поддержании температуры реакционной смеси <15°C. Полученную смесь интенсивно перемешивали в течение 10 мин, затем слои разделяли. Органический слой экстрагировали водой (0,24 л) с промыванием н-гептаном (0,24 л). Все водные слои объединяли и промывали н-гептаном (3,60 л) с последующим добавлением NaCl (240 г) при перемешивании. Водную смесь подщелачивали 5,0М раствором NaOH (165 мл) с последующей экстракцией, два раза, DCM (по 3,60 л и 2,40). Объединенные органические слои промывали 20 масс% NaCl в воде (1400 г), концентрировали, отгоняли азеотропно с MTBE (1400 мл), повторно разбавляли MTBE (960 мл) и фильтровали через стеклянный фильтр. Фильтрат концентрировали с получением ()-2-((бензилокси)метил)-6-метилморфолина  в виде прозрачного масла коричневатого цвета, которое использовали в последующей реакции без дополнительной очистки.
[0148]
12
3
11
12
4
2R,6R
Соединение: К перемешиваемому раствору соединения  (137,6 г, 0,591 моль) в DMA (260 мл) добавляли DIPEA (308 мл, 1,77 моль), затем раствор соединения (130,67 г, 0,5905 моль) в DMA (260 мл), промывая DMA (130 мл). Реакционную смесь нагревали при 125-130°C в течение 2 часов. После полного завершения реакции реакционную смесь охлаждали до 30°C и разбавляли EtOAc (1,96 л) и водой (0,65 л), после чего выливали в воду (2,61 л) при интенсивном перемешивании. Полученную смесь фильтровали через слой из Целита 545 (260 г) и слои разделяли. Водный слой экстрагировали EtOAc (1,31 л) с последующим объединением органических слоев, которые промывали два раза 5%-ным раствором NaCl (1,0 кг, каждый раз) и концентрировали с получением твердого вещества черного цвета. Твердое вещество растворяли в DCM (1 л), разбавляли н-гептаном (520 мл) с последующим добавлением силикагеля (196 г) и MgSO (130 г). Полученную взвесь перемешивали при 20°C в течение 30 мин, фильтровали и элюировали изопропилацетатом (2,09 л). Объединенный фильтрат концентрировали, и полученное твердое вещество коричневого цвета суспендировали в смеси EtOAc (196 мл) и н-гептана (523 мл). Смесь нагревали до 70°C, затем охлаждали до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. Осадки собирали фильтрованием, промывали смесью EtOAc/н-гептан 3:8 (220 мл) и сушили в вакууме с получением 5-(()-2-((бензилокси)метил)-6-метилморфолино)хинолин-8-карбонитрила  (178,44 г, 0,478 моль, 80%-ный выход) в виде порошка бежевого цвета.
[0149]
13
12
13,
ER-885493,
2R,6R
Соединение : К перемешиваемой суспензии соединения  (167,3 г, 0,45 моль) в ацетонитриле (500 мл) добавляли триметилсилил йодид (82,9 мл, 0,582 моль) при комнатной температуре. Полученную смесь нагревали при 70°C в течение 2 часов, после чего охлаждали до комнатной температуры, медленно гасили водой (167 г) и перемешивали при 25-30°C в течение 1 часа. Реакционную смесь охлаждали до 15°C с последующим добавлением 28% водного раствора гидрохлорида аммония (500 г), после чего реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Смесь частично концентрировали и затем разбавляли водой (0,5 л), MTBE (0,04 л) и н-гептаном (0,3 л) и затем охлаждали до 0-5°C. Осадок собирали фильтрованием и промывали предварительно охлажденной водой (500 мл), затем смесью н-гептан/MTBE 7:1 (400 мл) с последующей сушкой в вакууме (40°C) в течение ночи с получением 5-(()-2-(гидроксиметил)-6-метилморфолино)хинолин-8-карбонитрила  или  (127,2 г, 0,45 моль, 100%-ный выход) в виде порошка бежевого цвета.
[0150]
14
13
14
2
4
rf=
2R,6R
Соединение : К перемешиваемому раствору соединения  (24,8 г, 0,0875 моль) в DCM (200 мл) добавляли частями п-толуолсульфонил хлорид (17,95 г, 94,17 ммоль), затем TEA (24,60 мл, 0,1765 моль) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали в течение 3 часов, затем, после полного завершения реакции, реакционную смесь гасили водой (200 мл). Отделенный органический слой промывали насыщенным солевым раствором (50 мл), сушили над NaSO, фильтровали и концентрировали до смолы коричневого цвета. Сырой продукт очищали на силикагеле (SNAP 340×2 г, элюируя смесью гептан/EtOAc=от 5/1 до 3/1, ТСХ гептан/EtOAc=3/1, 0,6) с получением после концентрирования целевых фракций и сушки в вакууме (()-4-(8-цианохинолин-5-ил)-6-метилморфолин-2-ил)метил 4-метилбензолсульфоната  (34,98 г, 79,95 ммоль, 84,9%-ный выход) в виде порошка желтого цвета.
[0151]
15
Boc-защищенного ER-890963:
14
ER-890963,
S
трет-
2S,6R
S
4
Соединениев виде К раствору соединения  (13,9 г, 31,77 ммоль) и TEA (8,86 мл, 63,541 ммоль) в DMA (89 мл) при комнатной температуре добавляли по каплям коммерчески доступный ()-бутил2-этилпиперазин-1-карбоксилат (7,49 г, 34,95 ммоль) в течение 5 мин. Реакционную смесь перемешивали при 110°C в течение 12 час до полного завершения реакции, после чего реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры. Реакционную смесь концентрировали для удаления DMA с последующим разбавлением DCM (30 мл). Полученный органический раствор промывали два раза водой (по 30 мл), насыщенным солевым раствором (30 мл) и сушили над MgSO. Сырой продукт фильтровали, концентрировали в вакууме и очищали на силикагеле (SNAP 340 г, элюируя смесью 10%-30% EtOAc в гептане, ТСХ гептан/EtOAc=3/1, rt=0,6) с получением после концентрирования объединенных желаемых фракций и сушки в вакууме 5-(()-2-((()-4-(3,3-диметилбутаноил)-3-этилпиперазин-1-ил)метил)-6-метилморфолино)хинолин-8-карбонитрила, или Boc-защищенного  (12,27 г, 24,15 ммоль, 76%-ный выход) в виде порошка желтого цвета.
[0152] ER-890963 или соединение 15:
[0153] Boc-защищенный ER-890963
ER-890963
3
2
4
2
i
(23,55 г, 49,10 ммоль) растворяли при перемешивании в DCM (50 мл), затем в ТФК (50 мл) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали в течение 4 часов при комнатной температуре, затем, после полного завершения реакции, реакционную смесь концентрировали в вакууме. Сырое вещество темно-оранжевого цвета растворяли при перемешивании в DCM (50 мл) и нейтрализовали добавлением насыщ. водного раствора NaHCO при 20°C до тех пор, пока значение рН раствора не становилось равным 5-6. Отделенный водный слой экстрагировали два раза DCM (по 50 мл), после чего объединенные органические слои промывали насыщенным солевым раствором (20 мл), сушили над NaSO, фильтровали, концентрировали досуха. Сырой остаток перекристаллизовывали из смеси DCM/PrOH/гептан/EtO=1/1/1/1 с получением  (17,89 г, 47,14 ммоль, 96%) в виде желтого порошка.
[0154] ER-886604
ER-886604
14
ER-886604
3
(7,8 мг, 0,021 ммоль, 73%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 1-амино-4-метилбензола (0,030 мл, 0,290 ммоль), при нагревании в микроволновой печи при 180°C в течение 15 мин.  очищали с использованием ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка Water's X-Bridge C18 19×100 мм, элюируя 10% ацетонитрилом в воде, содержащей 0,05% ТФК). Фракции, содержащие продукт, объединяли и концентрировали досуха с последующим разбавлением в MeOH (1 мл), пропускали через основной слой из силикагеля (Biotage SiCO, 1 г, элюируя MeOH (1 мл)), концентрировали и сушили в вакууме. Удаление защитной группы Boc не требовалось.
[0155] ER-886608
ER-886604
14
(8,2 мг, 0,019 ммоль, 67%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 5-амино-1,2-диметилбензимидазол дигидрохлорида (30 мг, 0,128 ммоль) вместе с TEA (0,040 мл, 0,290 ммоль).
[0156] ER-886609
ER-886604
14
(7,4 мг, 0,017 ммоль, 59%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 5-амино-1-этил-2-метилбензимидазола (30 мг, 0,171 ммоль).
[0157] ER-886611
ER-886604
14
(9,2 мг, 0,027 ммоль, 88%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 1-аминоциклогексана (30 мг, 0,171 ммоль).
[0158] ER-886787
ER-886604
14
(4,5 мг, 0,012 ммоль, 43,9%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 2-аминопиримидина (24,7 мг, 0,263 ммоль).
[0159] ER-886788
ER-886604
14
(5,2 мг, 0,014 ммоль, 51%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 2-аминопиридина (24,4 мг, 0,263 ммоль).
[0160] ER-886789
ER-886604
14
(4,5 мг, 0,012 ммоль, 42%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 2-амино-6-метилпиридина (28,1 мг, 0,263 ммоль).
[0161] ER-886790
ER-886604
14
(4,6 мг, 0,012 ммоль, 43%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 2-амино-5-метилпиридина (28,1 мг, 0,263 ммоль).
[0162] ER-886814
ER-886604
14
(4,2 мг, 0,012 ммоль, 40,4%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и D-пролинола (26,2 мг, 0,263 ммоль).
[0163] ER-886815
ER-886604
14
(4,0 мг, 0,011 ммоль, 38,2%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 2,2-диметилпирролидина (14,2 мг, 0,145 ммоль).
[0164] ER-886816
ER-886604
14
(6,0 мг, 0,016 ммоль, 60%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 2-изопропилпирролидина (29,4 мг, 0,263 ммоль).
[0165] ER-886817
ER-886604
14
R
(4,2 мг, 0,012 ммоль, 62%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и ()-2-метилпирролидина (22,1 мг, 0,263 ммоль).
[0166] ER-886818
ER-890604
14
S
(4,2 мг, 0,010 ммоль, 35,2%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и ()3-фенилпирролидина (38,2 мг, 0,263 ммоль).
[0167] ER-886819
ER-886604
14
R
(5,2 мг, 0,015 ммоль, 52%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и ()-3-метилпирролидина (22,1 мг, 0,263 ммоль).
[0168] ER-886820
ER-886604
14
S
(6,2 мг, 0,018 ммоль, 62%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и ()-3-гидроксипирролидина (22,6 мг, 0,263 ммоль).
[0169] ER-886853
ER-886604
14
(6,2 мг, 0,017 ммоль, 58%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 2-амино-4-метилпиридина (28,1 мг, 0,263 ммоль).
[0170] ER-886854
ER-886604
14
(2,9 мг, 0,007 ммоль, 25%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 3-фенилпирролидина гидрохлорида (47,7 мг, 0,263 ммоль).
[0171] ER-886855
ER-886604
14
(4,9 мг, 0,013 ммоль, 44%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 2-амино-5-метоксипиридина (32,2 мг, 0,263 ммоль).
[0172] ER-886856
ER-886604
14
S
(7,8 мг, 0,022 ммоль, 78%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и ()-2-метилпирролидина (22,1 мг, 0,263 ммоль).
[0173] ER-886857
ER-886604
14
(5,6 мг, 0,015 ммоль, 54%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 2,5-диметилпирролидина (25,7 мг, 0,263 ммоль).
[0174] ER-886858
ER-886604
14
(3,6 мг, 0,009 ммоль, 32%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 2-амино-4-метоксипиридина (32,2 мг, 0,263 ммоль).
[0175] ER-886859
ER-886604
14
(2 мг, 0,005 ммоль, 20%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 2-амино-6-метоксипиридина (32,2 мг, 0,263 ммоль).
[0176] ER-886860
ER-886604
14
(2,5 мг, 0,006 ммоль, 21%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 5-амино-1-фенилпиразола (41,3 мг, 0,263 ммоль).
[0177] ER-886866
ER-886604
14
(8,2 мг, 0,022 ммоль, 78%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и L-пролинола (22,1 мг, 0,263 ммоль).
[0178] ER-886867
ER-886604
R
(4,5 мг, 0,013 ммоль, 45%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения  исходя из соединения 14 (12,5 мг, 0,029 ммоль) и ()-3-гидроксипирролидина (22,6 мг, 0,263 ммоль).
[0179] ER-886868
ER-886604
14
S
(6,5 мг, 0,019 ммоль, 65%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и ()-3-метилпирролидина (22,1 мг, 0,263 ммоль).
[0180] ER-886869
ER-886604
14
(5,3 мг, 0,015 ммоль, 51%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 3,3-диметилпирролидина (25,7 мг, 0,263 ммоль).
[0181] ER-886948
ER-886604
14
(6,2 мг, 0,016 ммоль, 56%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 2-амино-3-метоксипиридина (32,2 мг, 0,263 ммоль).
[0182] ER-886949
ER-886604
14
R
(4,8 мг, 0,013 ммоль, 46%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и ()-3-гидроксипиперидина (26,2 мг, 0,263 ммоль).
[0183] ER-886950
ER-886604
14
R,S
(5,0 мг, 0,013 ммоль, 46%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и ()-2,6-диметилпиперидина (29,4 мг, 0,263 ммоль).
[0184] ER-8869
ER-886604
14
S
3-
51 (3,2 мг, 0,009 ммоль, 31%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и ()-гидроксипиперидина (26,2 мг, 0,263 ммоль).
[0185] ER-886953
ER-886604
14
(5,8 мг, 0,016 ммоль, 55%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 4-гидроксипиперидин (26,2 мг, 0,263 ммоль).
[0186] ER-886955
ER-886604
14
(7,5 мг, 0,020 ммоль, 69%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 2-гидроксиметилпиперидина (29,9 мг, 0,263 ммоль).
[0187] ER-887137
ER-886604
14
(4,5 мг, 0,012 ммоль, 42%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 2,3-диметилпиперазина (29,6 мг, 0,263 ммоль).
[0188] ER-887138
ER-886604
14
(5,9 мг, 0,016 ммоль, 57%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 3-аминопиридина (24,4 мг, 0,263 ммоль).
[0189] ER-887139
ER-886604
14
(6,5 мг, 0,018 ммоль, 63%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 3-аминопиридина (24,4 мг, 0,263 ммоль).
[0190] ER-887141
ER-886604
14
(5,2 мг, 0,014 ммоль, 50%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 4-метилпиперидина (25,7 мг, 0,263 ммоль).
[0191] ER-887142
ER-886604
14
(4,5 мг, 0,012 ммоль, 41%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 4,4-дифторпиперидина (31,4 мг, 0,263 ммоль).
[0192] ER-887143
ER-886604
14
(4,7 мг, 0,011 ммоль, 38%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 4-фенилпиперидина (41,8 мг, 0,263 ммоль).
[0193] ER-887144
ER-886604
14
(6,2 мг, 0,017 ммоль, 59%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 4-фторпиперидина (26,8 мг, 0,263 ммоль).
[0194] ER-887145
ER-886604
14
(6,5 мг, 0,019 ммоль, 65%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 1-аминоциклопентана (22,1 мг, 0,263 ммоль).
[0195] ER-887146
ER-886604
14
(7 мг, 0,018 ммоль, 60%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 1-амино-3-метилциклогексана (29,4 мг, 0,263 ммоль).
[0196] ER-887177
ER-886604
14
(5,3 мг, 0,014 ммоль, 49%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 2-амино-3-метилпиридина (20 мг, 0,145 ммоль).
[0197] ER-887253
ER-886604
14
(10,2 мг, 0,029 ммоль, 60%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (20 мг, 0,046 ммоль) и пиперазина (40 мг, 0,460 ммоль).
[0198] ER-887442
ER-886604
14
(6,2 мг, 0,016 ммоль, 59%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,2 мг, 0,028 ммоль) и 1-амино-4-метилциклогексана (30 мг, 0,265 ммоль).
[0199] ER-887443
ER-886604
14
(4,5 мг, 0,013 ммоль, 47%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 1-амино-циклобутана (10 мг, 0,141 ммоль).
[0200] ER-887444
ER-886604
14
(7,7 мг, 0,020 ммоль, 70,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 1-амино-циклогептана (20 мг, 0,177 ммоль).
[0201] ER-887526
ER-886604
14
(6,2 мг, 0,016 ммоль, 57%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 1-амино-4-гидроксициклогексана (30 мг, 0,260 ммоль).
[0202] ER-887528
ER-886604
14
(5,4 мг, 0,015 ммоль, 51,2%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 1-амино-2-гидроксициклопентана (30 мг, 0,297 ммоль).
[0203] ER-887539
ER-886604
14
(5,3 мг, 0,014 ммоль, 49%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 1-амино-2-метилциклогексана (30 мг, 0,265 ммоль).
[0204] ER-887538
ER-886604
14
(6,5 мг, 0,014 ммоль, 51,8%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 2-амино-5-фенилпиридина (50 мг, 0,294 ммоль).
[0205] ER-887540
ER-886604
14
(6,1 мг, 0,014 ммоль, 49%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 2-амино-3-фенилпиридина (50 мг, 0,294 ммоль).
[0206] ER-887586
ER-886604
14
S,R
(6,2 мг, 0,017 ммоль, 59%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и ()-1-амино-2-гидроксипирролидина (10 мг, 0,099 ммоль).
[0207] ER-887587
ER-886604
14
(7,5 мг, 0,019 ммоль, 65%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 2-амино-3-этоксилпиридина (40 мг, 0,290 ммоль).
[0208] ER-887588
ER-886604
14
(5,6 мг, 0,013 ммоль, 45%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 4-амино-2-фенилпиридина (20 мг, 0,118 ммоль).
[0209] ER-887589
ER-886604
14
(2,4 мг, 0,006 ммоль, 19%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 2-амино-6-фенилпиридина (20 мг, 0,118 ммоль).
[0210] ER-887722
ER-886604
14
(3,5 мг, 0,009 ммоль, 32%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 5-метилпиперазин-2-она (20 мг, 0,175 ммоль).
[0211] ER-887723
ER-886604
14
N
(6,2 мг, 0,017 ммоль, 59%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 1--метилпиперазина (10 мг, 0,100 ммоль).
[0212] ER-887724
ER-886604
14
N
(6,2 мг, 0,016 ммоль, 55%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 1--пропилпиперазина (40 мг, 0,138 ммоль).
[0213] ER-887725
ER-886604
14
(7,2 мг, 0,018 ммоль, 64%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 4-(диметиламино)-пиперидина (20 мг, 0,156 ммоль).
[0214] ER-887927
ER-886604
14
(10,2 мг, 0,024 ммоль, 82,3%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 1,4'-бипиперидина (20 мг, 0,119 ммоль).
[0215] ER-8879
ER-886604
14
R
трет-
28 (3,2 мг, 0,009 ммоль, 31%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и ()-бутилпиперидин-3-илкарбамата (30 мг, 0,150 ммоль).
[0216] ER-888070
ER-886604
14
трет-
(4,5 мг, 0,012 ммоль, 43%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и бутилпиперидин-4-илкарбамата (30 мг, 0,150 ммоль).
[0217] ER-888202
ER-886604
14
(6,2 мг, 0,018 ммоль, 62%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и пиперидина (0,034 мл, 0,348 ммоль).
[0218] ER-888203
ER-886604
14
(7,2 мг, 0,020 ммоль, 58%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (15,5 мг, 0,035 ммоль) и морфолина (0,030 мл, 0,350 ммоль).
[0219] ER-888204
ER-886604
14
2S,6R
(6,2 мг, 0,016 ммоль, 57%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и ()-2,6-диметилморфолина (0,070 мл, 0,580 ммоль).
[0220] ER-888205
ER-886604
14
ER-885491
2R,6R
(4,6 мг, 0,012 ммоль, 41%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и (()-6-метилморфолин-2-ил)метанола или  (40 мг, 0,305 ммоль).
[0221] ER-885491
11
ER-885491
2
2
2
2
2
: К перемешиваемой суспензии соединения  (890,2 мг, 4,023 ммоль) в MeOH (8 мл) добавляли 5%-ный палладий на угле (270 мг), после чего смесь продували газообразным H три раза с вакуумированием между загрузками. Реакционную смесь перемешивали в атмосфере H при 40°C в течение 8 час. Неполностью прореагировавшую смесь дегазировали в вакууме с продувкой газообразным N, а затем добавляли 5%-ный палладий на угле (100 мг) и 2 капли конц. HCl, после чего реакционную смесь помещали в атмосферу H, как описано выше, в течение 4 ч при 40°C. После полного завершения реакции реакционную смесь продували газообразным N с последующим фильтрованием через Целит 545, элюированием MeOH (5 мл), концентрированием и сушкой в вакууме. Сырой продукт  (378,2 мг, 2,883 ммоль, 71,7%-ный выход) использовали на последующей стадии без дополнительной очистки.
[0222] ER-888285
ER-886604
14
N-
(8,6 мг, 0,020 ммоль, 59%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (15 мг, 0,034 ммоль) и(2-пиридил)пиперазина (30 мг, 0,184 ммоль).
[0223] ER-888286
ER-886604
14
N-
(10,2 мг, 0,020 ммоль, 71,3%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (14,6 мг, 0,033 ммоль) и(4-пиридил)пиперазина (30 мг, 0,184 ммоль).
[0224] ER-888288
ER-886604
14
N-
(7,2 мг, 0,016 ммоль, 52%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (15 мг, 0,034 ммоль) и(пиперидин-4-ил)ацетамид (20 мг, 0,141 ммоль). HCl соль получали способами, описанными выше.
[0225] ER-888289
ER-886604
14
(16,2 мг, 0,039 ммоль, 21,6%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (80 мг, 0,183 ммоль) и 1,8-нафтиридин-2-амина (100 мг, 0,689 ммоль).
[0226] ER-888320
ER-886604
14
(5,8 мг, 0,015 ммоль, 42%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (15,5 мг, 0,035 ммоль) и пиперидин-4-карбоксамида (20 мг, 0,156 ммоль).
[0227] ER-888321
ER-886604
14
N-
(6,2 мг, 0,013 ммоль, 37%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (15,5 мг, 0,035 ммоль) и(пиперидин-4-ил)бензамида (40 мг, 0,196 ммоль).
[0228] ER-888322
ER-886604
14
(10,5 мг, 0,027 ммоль, 75,3%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (15,5 мг, 0,035 ммоль) и 1-изопропилпиперазина (20 мг, 0,156 ммоль).
[0229] ER-888330
ER-886604
14
(4,2 мг, 0,011 ммоль, 30%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (15,5 мг, 0,035 ммоль) и пиперазин-1-карбоксамида (20 мг, 0,155 ммоль).
[0230] ER-888479
ER-886604
14
(7,6 мг, 0,018 ммоль, 51%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (15 мг, 0,034 ммоль) и 4-циклогексилпиперидина (30 мг, 0,179 ммоль).
[0231] ER-888480
ER-886604
14
(8,3 мг, 0,020 ммоль, 58%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (15 мг, 0,034 ммоль) и 4-(пирролидин-1-ил)пиперидина (30 мг, 0,194 ммоль).
[0232] ER-888838
ER-886604
14
(6,2 мг, 0,015 ммоль, 45%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (15 мг, 0,034 ммоль) и 3,5-диметилпиридин-2,6-диамина (20 мг, 0,146 ммоль).
[0233] ER-888977
ER-886604
14
1H
(1,2 мг, 0,003 ммоль, 11%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 1,3-диметил--пиразол-5-амина (28,8 мг, 0,259 ммоль).
[0234] ER-889448
ER-886604
14
(8,2 мг, 0,022 ммоль, 63%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (15 мг, 0,034 ммоль) и 1-этилпиперазина (0,020 мл, 0,136 ммоль).
[0235] ER-889469
ER-886604
14
(6,5 мг, 0,018 ммоль, 52%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (15 мг, 0,034 ммоль) и 1-(азетидин-3-ил)пирролидина (20 мг, 0,158 ммоль).
[0236] ER-889470
ER-886604
14
(7,2 мг, 0,017 ммоль, 48%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (15 мг, 0,034 ммоль) и 1-(азетидин-3-ил)пиперидина (20 мг, 0,158 ммоль).
[0237] ER-889557
ER-886604
14
(7,7 мг, 0,020 ммоль, 58,6%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (15 мг, 0,034 ммоль) и пиперидин-4-илметанола (20 мг, 0,174 ммоль).
[0238] ER-889571
ER-886604
14
R
-
(3,2 мг, 0,008 ммоль, 23%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (15 мг, 0,034 ммоль) и ()-1,3'бипирролидина (20 мг, 0,143 ммоль).
[0239] ER-889572
ER-886604
14
R
(1,1 мг, 0,003 ммоль, 7,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (15 мг, 0,034 ммоль) и ()-1-(пирролидин-3-ил)пиперидина (20 мг, 0,130 ммоль).
[0240] ER-889601
ER-886604
14
(6,7 мг, 0,018 ммоль, 51%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (15 мг, 0,034 ммоль) и 1-метил-1,4-диазепана (20 мг, 0,175 ммоль).
[0241] ER-889602
ER-886604
14
(10,2 мг, 0,022 ммоль, 65,3%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (15 мг, 0,034 ммоль) и фенил(пиперазин-1-ил)метанона (30 мг, 0,158 ммоль).
[0242] ER-891084
14
(7,2 мг, 0,016 ммоль, 47%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения ER-886608, исходя из соединения  (15 мг, 0,034 ммоль) и 1-(пиперидин-4-ил)азепана (30 мг, 0,165 ммоль).
[0243] ER-890108
ER-886604
14
(15,2 мг, 0,036 ммоль, 58,6%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (27 мг, 0,062 ммоль) и 1-(азетидин-3-ил)-4-метилпиперазина (90,2 мг, 0,581 ммоль). К реакционной смеси также добавляли триэтиламин (0,008 мл, 0,062 ммоль).
[0244] ER-890112
ER-886604
14
(296,5 мг, 0,683 ммоль, 74,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (400,6 мг, 0,916 ммоль) и 4,4'-бипиперидина (290 мг, 1,723 ммоль).
[0245] ER-894472
ER-894473
ER-886604
14
(53,9 мг, 0,143 ммоль, 25%-ный выход) и  (51,2 мг, 0,135 ммоль, 23,6%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (250 мг, 0,571 ммоль) и 5-метилпиперазин-2-она (78,3 мг, 0,686 ммоль). Стереохимию каждой диастереомерной метильной группы устанавливали произвольно.
[0246] ER-886507
ER-886604
14
(4,2 мг, 0,013 ммоль, 51,9%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (10,6 мг, 0,024 ммоль) и пирролидина (0,022 мл, 0,257 ммоль), используя в качестве растворителя вместо DMA толуол (1 мл). Удаление защитной группы Boc не требовалось.
[0247] ER-886508
ER-890507
14
N,N-
(3,3 мг, 0,010 ммоль, 38,9%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (10,8 мг, 0,025 ммоль) и диэтиламина (0,027 мл, 0,262 ммоль).
[0248] ER-886509
ER-890507
14
(4,8 мг, 0,013 ммоль, 44,9%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и бензиламина (0,028 мл, 0,263 ммоль).
[0249] ER-886601
ER-890507
14
(6,6 мг, 0,018 ммоль, 64,2%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и фениламина (0,008 мл, 0,087 ммоль).
[0250] ER-886602
ER-890507
14
(6,4 мг, 0,017 ммоль, 60,1%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 1-амино-3-метилбензола (0,028 мл, 0,263 ммоль).
[0251] ER-88710
ER-890507
14
S
4 (2,1 мг, 0,005 ммоль, 17,9%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и ()-2-(трифторметил)пирролидина (36,1 мг, 0,260 ммоль).
[0252] ER-886603
ER-890507
14
(7,6 мг, 0,020 ммоль, 71%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 1-амино-2-метилбензола (0,030 мл, 0,290 ммоль), используя в качестве растворителя вместо толуола NMP (1 мл).
[0253] ER-886957
ER-886507
14
(4,7 мг, 0,013 ммоль, 45%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 2-метилпиперидина (25,7 мг, 0,263 ммоль).
[0254] ER-886958
ER-886507
14
(6,2 мг, 0,016 ммоль, 57%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 2-этилпиперидина (29,3 мг, 0,263 ммоль).
[0255] ER-887139
ER-886507,
14
S
(2,1 мг, 0,005 ммоль, 18%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения  исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и ()-2-трифторметилпирролидина (36,1 мг, 0,263 ммоль).
[0256] ER-887252
ER-886507
14
(2,6 мг, 0,006 ммоль, 21%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 2-амино-4-фенилпиридина (20 мг, 0,145 ммоль).
[0257] ER-887258
ER-886507
14
N-
(4,2 мг, 0,010 ммоль, 34%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) ифенил пиперазина (0,040 мл, 0,290 ммоль) в толуоле (0,5 мл).
[0258] ER-887259
ER-886507
14
(3,2 мг, 0,009 ммоль, 30%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 2,6-диметилпиридина (30 мг, 0,290 ммоль).
[0259] ER-887260
ER-886507
14
S,S
(3,3 мг, 0,009 ммоль, 30,1%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и ()-2,5-диметилпиперазина (29,6 мг, 0,263 ммоль).
[0260] ER-887261
ER-886507
14
N-
(4,2 мг, 0,011 ммоль, 39%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12 мг, 0,027 ммоль) иацетил пиперазина (40 мг, 0,274 ммоль).
[0261] ER-887262
ER-886507
14
4-
R
S
(2,4 мг, 0,006 ммоль, 22%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и ()-гидрокси-2-()-гидроксиметилпирролидина (30,4 мг, 0,263 ммоль).
[0262] ER-887268
ER-886608
14
ER-890963
ER-887268
ER-886608
R
трет-
(9,3 мг, 0,017 ммоль, 10%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (50 мг, 0,114 ммоль) и ()-бутил3-метилпиперазин-1-карбоксилата (100 мг, 0,570 ммоль), используя толуол (1 мл). Для Вос-защищенного , указанного выше, требовалось удаление защитной группы Вос.  очищали с использованием ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка Water's X-Bridge C18 19×100 мм, элюируя смесью 10-40% ацетонитрила в воде с 0,05% ТФК) с последующей нейтрализацией, как описано для .
[0263] ER-88726
ER-887268
14
R
трет-
9 (6,2 мг, 0,025 ммоль, 21,4%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (51,8 мг, 0,118 ммоль) и ()-бутил2-метилпиперазин-1-карбоксилата (100 мг, 0,570 ммоль).
[0264] ER-887270
ER-887268
14
S
трет-
(12,2 мг, 0,033 ммоль, 30%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (50 мг, 0,114 ммоль) и ()-бутил2-метилпиперазин-1-карбоксилата (200 мг, 1,14 ммоль).
[0265] ER-887271
ER-887268
14
R,R
трет-
(2,3 мг, 0,006 ммоль, 5,5%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (48,2 мг, 0,110 ммоль) и ()-бутил 2,5-диметилпиперазин-1-карбоксилат гидрохлорида (100 мг, 0,399 ммоль) и DIPEA (0,10 мл, 0,55 ммоль).
[0266] ER-887272
ER-887268
14
S,R
трет-
(3,2 мг, 0,008 ммоль, 7,1%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (52,7 мг, 0,120 ммоль) и ()-бутил 2,5-диметилпиперазин-1-карбоксилата (100 мг, 0,467 ммоль).
[0267] ER-890119
ER-890963
14
трет-
(256,2 мг, 0,630 ммоль, 58,6%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (450 мг, 1,029 ммоль) и бутил4-(азетидин-3-ил)пиперазин-1-карбоксилата (314,2 мг, 1,302 ммоль). К реакционной смеси также добавляли триэтиламин (0,172 мл, 1,23 ммоль). Вместо DMA использовали диоксан (2 мл). Требовалось удаление защитной группы Вoc с помощью ТФК с последующей нейтрализацией конечного продукта, как описано выше.
[0268] ER-892253
ER-890119
14
трет-
(152,3 мг, 0,362 ммоль, 4,0% полный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (4,0 г, 9,1 ммоль) и бутил(1-(азетидин-3-ил)пиперидин-4-ил)карбамата (2,52 г, 9,9 ммоль).
[0269] ER-888605
ER-890119
14
(7,6 мг, 0,017 ммоль, 5,0%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (150 мг, 0,343 ммоль) и [1,4'-бипиперидин]-2-он гидрохлорида (82,5 мг, 0,377 ммоль). Удаление группы Boc не требовалось.
[0270] ER-888605
ER-890119
14
(7,6 мг, 0,017 ммоль, 5,0%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (150 мг, 0,343 ммоль) и [1,4'-бипиперидин]-2-он гидрохлорида (82,5 мг, 0,377 ммоль). Удаление группы Boc не требовалось.
[0271] ER-890093
ER-890119
14
(15,2 мг, 0,035 ммоль, 45,4%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (33,6 мг, 0,077 ммоль) и 4-(пиперидин-4-ил)морфолина (52 мг, 0,305 ммоль). Удаление группы Boc не требовалось.
[0272] ER-890104
ER-890119
14
ER-890104
ER-890106
трет-
(569 мг, 1,06 ммоль, 42,6%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (1,08 г, 2,5 ммоль) и бутил4-(пиперидин-4-ил)пиперазин-1-карбоксилата (1,00 г, 3,7 ммоль). Удаление защитной группы Вос в  (21 мг, 0,039 ммоль) выполняли способом, описанным выше, с получением  (12,4 мг, 0,029 ммоль, 73,2%-ный выход).
[0273] ER-890105
ER-890119
14
ER-890105
ER-890107
трет-
(65 мг, 0,122 ммоль, 11,3%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (1,08 г, 2,5 ммоль) и бутил4-(пиперидин-4-ил)пиперазин-1-карбоксилата (1,00 г, 3,7 ммоль). К реакционной смеси также добавляли DIPEA (0,65 мл, 3,7 ммоль). Выполняли удаление защитной группы Вос в  (60 мг, 0,112 ммоль), как описано выше, с получением  (11,3 мг, 0,026 ммоль, 23,2%-ный выход).
[0274] ER-890311
ER-886608
14
S
(4,5 мг, 0,011 ммоль, 31%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (15 мг, 0,034 ммоль) и ()-1-(пирролидин-3-ил)пиперидин дигидрохлорида (30 мг, 0,108 ммоль), заменяя DMA на ацетонитрил (1 мл). К реакционной смеси также добавляли триэтиламин (0,014 мл, 0,102 ммоль). Дигидрохлоридную соль продукта получали способами, описанными выше.
[0275] ER-890342
ER-890311
14
(41,3 мг, 0,101 ммоль, 11%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (150,2 мг, 0,916 ммоль) и 4-(азетидин-3-ил)морфолина (221,6 мг, 1,030 ммоль).
[0276] ER-890343
ER-890311
14
(25,2 мг, 0,062 ммоль, 77,2%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (35,2 мг, 0,080 ммоль) и 1-(азетидин-3-ил)-4-метилпиперазина (40,3 мг, 0,0201 ммоль).
[0277] ER-890344
ER-890311
14
S
трет-
(21,4 мг, 0,059 ммоль, 73,8%) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (35,2 мг, 0,080 ммоль) и ()-бутил3-метилпиперазин-1-карбоксилата (28,2 мг, 0,201 ммоль). Выполняли удаление защитной группы Boc с помощью ТФК с последующей нейтрализацией.
[0278] ER-890963
ER-890344
14
S
трет-
(685,2 мг, 1,806 ммоль, 86%) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (919 мг, 2,101 ммоль) и ()-бутил2-этилпиперазин-1-карбоксилата (500 мг, 2,333 ммоль). Дигидрохлоридную соль продукта получали способами, описанными выше.
[0279] ER-891090
ER-890311
14
S
(54,2 мг, 0,133 ммоль, 46,8%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (137,5 мг, 0,314 ммоль) и ()-1,3'-бипирролидина дигидрохлорида (30 мг, 0,165 ммоль). Удаление группы Boc не требовалось.
[0280] ER-895204
ER-890311
14
N-
(35,2 мг, 0,084 ммоль, 73,1%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (50 мг, 0,114 ммоль) иэтилпиперидин-4-карбоксамида (21,4 мг, 0,137 ммоль). Гидрохлоридную соль продукта получали способами, описанными выше.
[0281] Получение ER-887612 в качестве модифицированного примера получения соединения 15 по схеме 4:
[0282]
3
ER-886849,
R
R
3
Смесь соединения  (201 мг, 0,862 ммоль) и ()-2-гидроксиметил морфолина гидрохлорида (132, 0,856 ммоль) в NMP (3 мл) нагревали при 170°C в течение 16 часов. После полного завершения реакции реакционную смесь охлаждали, фильтровали, элюировали MeOH (2 мл), затем очищали непосредственно методом ВЭЖХ с использованием колонки C-18, элюируя смесью 10-100% ацетонитрила в воде с 0,1% ТФК. Желаемый продукт собирали и концентрировали досуха. Полученный продукт растворяли в MeOH (2 мл) и пропускали через основной слой силикагеля (Biotage, 1 г, SiCO), элюируя MeOH (5 мл) с получением ()-5-(2-(гидроксиметил)морфолино)хинолин-8-карбонитрила, или  (108 мг, 0,401 ммоль, 46,9%-ный выход).
[0283]
ER-886849
4
R
К перемешиваемому раствору  (101 мг, 0,375 ммоль) в DCM (2 мл) добавляли п-толуолсульфонил хлорид (78,5 мг, 0,412 ммоль), затем DIPEA (0,13 мл, 0,746 ммоль) и DMAP (2,3 мг, 0,019 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 час, после чего добавляли дополнительное количество п-толуолсульфонил хлорида (78,7 мг, 0,413 ммоль) с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 4 часов. К реакционной смеси после полного завершения реакции при перемешивании добавляли воду (1,2 мл) и DCM (5,9 мл) и затем разделяли слои. Органический слой промывали насыщенным солевым раствором (1,2 мл), сушили над MgSO, фильтровали и концентрировали досуха. Сырой продукт очищали на силикагеле (Biotage SP4, Interchim 25 г, элюируя смесью EtOAc в гептане с градиентом 20-100%), желаемые фракции собирали, концентрировали и сушили в вакууме с получением ()-(4-(8-цианохинолин-5-ил)морфолин-2-ил)метил 4-метилбензолсульфоната (85 мг, 0,201 ммоль, 53,6%-ный выход).
[0284]
ER-887612
R
3
Раствор ()-(4-(8-цианохинолин-5-ил)морфолин-2-ил)метил 4-метилбензол-сульфоната (27 мг, 0,064 ммоль) и 2-аминопиридина (90 мг, 0,956 ммоль) в NMP (1 мл) нагревали в микроволновой печи при 150°C в течение 15 мин. Охлажденную реакционную смесь разбавляли NMP (3 мл) и очищали напрямую методом ВЭЖХ на колонке С-18, элюируя смесью 10-100% ацетонитрила в воде с 0,1% ТФК. Желаемый продукт собирали и концентрировали досуха. Полученный продукт растворяли в MeOH (2 мл) и пропускали через основной слой силикагеля (Biotage, 1 г, SiCO), элюируя MeOH (5 мл) с получением  (16 мг, 0,046 ммоль, 71,9%-ный выход).
[0285] ER-885211
ER-886849
3
R
(4 мг, 0,016 ммоль, 24,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (15 мг, 0,064 ммоль) и ()-2-метилморфолина (22 мг, 0,160 ммоль). К реакционной смеси добавляли TEA (0,05 мл, 0,359 ммоль).
[0286] Альтернативный синтез соединения 10 - Схема 5
[0287]
16
8
16
3
2
3
2R
Соединение: К перемешиваемому раствору соединения  (2,869 г, 7,06 ммоль) в ацетонитриле (14,4 мл), охлажденному до 5-6°C, добавляли ТФК (0,163 мл, 2,12 ммоль), затем NBS (1,385 г, 7,78 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа, после чего добавляли 9% NaHCO (6,6 г, 7,1 ммоль), затем сульфит натрия (NaSО; 0,27 г, 2,1 ммоль) и далее перемешивали в течение 5 мин. Смесь разбавляли водой (5,7 мл) и толуолом (29 мл), перемешивали в течение еще 5 мин с последующим разделением слоев. Водный слой экстрагировали толуолом (14,4 мл), после чего объединенные органические слои промывали 20%-ным NaCl (7,20 мл), концентрировали до приблизительно 5 мл, и далее разбавляли MTBE (29 мл). Добавляли 2M раствор NaOH (7,1 мл), и полученную двухфазную смесь интенсивно перемешивали в течение 10 мин. Органический слой разделяли и последовательно промывали два раза 20%-ным NaCl (по 14 мл), водой (5,7 мл), концентрировали до приблизительно 5 мл и разбавляли толуолом (14,4 мл). Полученный раствор, содержащий ()-2-((бензилокси)метил)-6-(бромметил)-4-((2-нитрофенил)сульфонил)морфолин , использовали непосредственно в следующей реакции.
[0288]
17
16
17
3
R
Соединение: К перемешиваемому раствору в толуоле соединения  (приблизительно 3,43 г, 7,06 ммоль, полученного выше) добавляли DBU (2,66 мл, 17,648 ммоль) и затем нагревали при 100°C в течение 4 часов. После полного завершения реакции реакционную смесь охлаждали до 15°C и затем при перемешивании добавляли MTBE (60 мл) и 1M раствор HCl (21,2 мл). Слои разделяли, после чего водный слой экстрагировали MTBE (20 мл). Объединенные органические слои промывали водой (10 мл), 9 масс% раствором NaHCO в воде (10 г, 10,713 ммоль), 20 масс% раствором NaCl (10 мл), концентрировали досуха. Данное неочищенное масло желтого цвета с примесями солей разбавляли DCM (10 мл), фильтровали и концентрировали с получением сырого ()-2-((бензилокси)метил)-6-метилен-4-((2-нитрофенил)сульфонил)-морфолина  (3,2 г) в виде масла оранжевого цвета.
[0289]
10:
17
10
8
2R,6R
СоединениеК перемешиваемому раствору триэтилсилана (1,69 мл, 10,6 ммоль) в DCM (4 мл) при 0°C добавляли ТФК (2,72 мл, 35,3 ммоль) и затем охлаждали до -15°C. Добавляли сырой продукт  (приблизительно 2,86 г, 7,06 ммоль) в DCM (4 мл), поддерживая при этом температуру -5°C, и затем добавляли смытые с помощью DCM остатки (4 мл). Полученную смесь перемешивали при температуре в диапазоне от -10 до -5°C в течение 1 часа, затем нагревали при 2-3°C в течение еще 1 часа. После полного завершения реакции реакционную смесь охлаждали до -10°C, выливали в предварительно охлажденный (2°C) 2M раствор NaOH (21,2 мл, 42,4 ммоль), промыв реактор с помощью DCM (2 мл). Конечную смесь экстрагировали MTBE (50 мл), и органический слой промывали водой (10 мл), 20 масс% раствором NaCl (10 мл) и концентрировали с получением масла оранжевого цвета. После объединения и концентрирования нужных фракций с последующей сушкой в вакууме сырой продукт очищали на силикагеле (н-гептан/MTBE 1:2) с получением ()-2-((бензилокси)метил)-6-метил-4-((2-нитрофенил)сульфонил)морфолина (1,437 г, 3,54 ммоль, 50%-ный выход за 3 стадии, исходя из соединения ) в виде твердого вещества светло-желтого цвета.
[0290] Альтернативный синтез соединения 11 - схема 6
[0291]
18
19:
6
18
2R
трет-
R
трет-
Соединенияи К перемешиваемой суспензии глицина (85,86 г, 1,144 моль) в 1,4-диоксане (660 мл) добавляли 1,0M водный раствор NaOH (1144 мл, 1,114 моль) и затем нагревали до 80°C после чего раствор медленно в течение 2 часов добавляли ()-бензил 2-эпоксипропиловый эфир  (93,90 г, 0,5718 моль) в 1,4-диоксане (94 мл), поддерживая внутреннюю температуру в интервале 77-82°C. После полного завершения реакции реакционную смесь охлаждали до 18°C и затем добавляли ди-бутилдикарбонат (262,1 г, 1,201 моль), поддерживая температуру в диапазоне 18-21°C. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, после чего полученную смесь промывали два раза гептаном (2000 мл). Водный слой подкисляли с помощью 20 масс% лимонной кислоты (270 г) и экстрагировали три раза EtOAc (2000 мл & 2×1000 мл). Объединенные органические слои промывали дважды 20 масс% раствором NaCl (460 г каждый), концентрировали, растворяли в EtOAc (560 мл), фильтровали, концентрировали и разбавляли DCM (280 мл) с получением ()-2-((3-(бензилокси)-2-гидроксипропил)(бутоксикарбонил)амино)уксусной кислоты  в растворе.
[0292]
18
19
3
R
трет-
К перемешиваемому раствору EDC (120,6 г, 0,6290 моль) и DMAP (2,10 г, 0,0172 моль), суспендированному в DCM (380 мл), при 15°C добавляли вышеуказанный раствор соединения  в течение 30 минут при поддержании температуры ниже 20°C. Реакционную смесь перемешивали при 18-20°C в течение 3 час, после чего охлаждали до 10°C и затем при перемешивании гасили 20 масс% раствором лимонной кислоты (820 г). Слои разделяли, и водный слой экстрагировали MTBE (1,4 л). Объединенные органические слои промывали насыщенным водным раствором NaHCO (480 г), 30%-ным раствором NaCl (470 г) и концентрировали. Полученный таким образом сырой продукт очищали на силикагеле (элюируя смесью н-гептан/EtOAc 4:1-3:1) с получением после объединения желаемых фракций, концентрирования и сушки в вакууме ()-бутил2-((бензилокси)метил)-6-оксоморфолин-4-карбоксилата  (96 г, 0,298 моль, 26,1%-ный выход за две стадии) в виде прозрачного масла желтого цвета.
[0293]
22
23
19
22
19
23
4
3
3
трет-
2R,6R
трет-
(2R,6S
трет-
Соединения и : К перемешиваемому раствору соединения  (134,29 г, 0,418 моль) в ТГФ (1100 мл), охлажденному до -75°C, в течение 1 часа добавляли по каплям 1,5M раствор комплекса MeLi-LiBr в диэтиловом эфире (334 мл, 0,501 моль)), поддерживая при этом температуру <-65°C. Смесь охлаждали до -75°C и перемешивали в течение 1,5 час, после чего реакционную смесь медленно гасили в течение 10 мин 20 масс% водным раствором NHCl (270 г), поддерживая при этом температуру <-55°C. Смесь нагревали при 0°C в течение 1 часа, распределяли между водой (270 г) и MTBE (1340 мл). Водный слой экстрагировали MTBE (1100 мл) с последующим объединением органических слоев и их промывкой 20 масс% раствором NaCl (270 г) и концентрировали досуха. Остаток растворяли в толуоле (1100 мл), фильтровали, концентрировали, азеотропно отгоняли досуха с толуолом (1100 мл) и затем растворяли в DCM (1200 мл). Смесь охлаждали до -72°C и добавляли триэтилсилан (0,200 л, 1,25 моль), затем триметилсилил трифторметансульфонат (151 мл, 0,836 моль) в течение 45 мин, поддерживая при этом температуру <-68°C. К реакционной смеси после полного завершения реакции в течение 20 мин добавляли ТФК (129 мл, 1,67 моль) в DCM (336 мл, 5,24 моль), поддерживая при этом температуру <-65°C. Смесь нагревали до -10°C и затем при перемешивании добавляли насыщенный водный раствор NaHCO (0,70 кг). Слои разделяли, и водный слой экстрагировали два раза DCM (по 940 мл). Объединенные органические слои промывали насыщенным водным раствором NaHCO (0,70 кг), концентрировали, растворяли в ацетонитриле (400 мл), обрабатывали ди-бутилдикарбонатом (91,2 г, 0,418 моль) при 20-25°C и перемешивали в течение 1 часа. Реакционную смесь после полного завершения реакции азеотропно отгоняли досуха с толуолом (800 мл) и после объединения желаемых фракций, концентрирования и сушки в вакууме очищали на силикагеле (элюируя смесью н-гептан/EtOAc 9:1-4:1) с получением ()-бутил 2-((бензилокси)метил)-6-метилморфолин-4-карбоксилата  (61,90 г, 0,193 моль, 46%-ный выход, исходя из соединения ) в виде твердого вещества белого цвета. Примесный стереоизомер )-бутил2-((бензилокси)метил)-6-метилморфолин-4-карбоксилат  может быть отделен путем колоночной хроматографии на силикагеле.
[0294]
11
22
11
3
2R,6R
Соединение: К перемешиваемому раствору соединения  (27 мг, 0,084 моль) в DCM (0,60 мл) при комнатной температуре добавляли ТФК (0,30 мл, 0,0039 моль) и затем перемешивали в течение 30 мин. После полного завершения реакции реакционную смесь концентрировали, азеотропно отгоняли досуха с толуолом (1,8 мл×2) и растворяли в DCM (3,0 мл). Органический раствор промывали насыщенным водным раствором NaHCO (0,50 г), концентрировали и сушили в вакууме с получением ()-2-((бензилокси)метил)-6-метилморфолина  (19 мг, 100%-ный выход) в виде бесцветной пленки.
[0295] 2
альтернативный синтез соединения 11 - схема 7
ой
[0296]
23
6
23
2R
R
Соединение: Раствор ()-бензил-2-эпоксипропилового эфира  (21,0 г, 0,128 моль) в EtOH (100 мл) медленно добавляли к 7,0M раствору аммиака в MeOH (100 мл) и 28%-ного водн. гидрохлорида аммония (210 мл) при комнатной температуре. Реакционный сосуд плотно закрывали и перемешивали при комнатной температуре в течение 23 часов. После полного завершения реакции реакционную смесь концентрировали в вакууме, и сырой продукт азеотропно отгоняли досуха дважды с толуолом (100 мл) с получением ()-1-амино-3-(бензилокси)пропан-2-ола  (23 г) в виде воскообразного твердого вещества, содержащего около 15% димера. Сырой продукт использовали на следующей реакции без дополнительной очистки.
25
23
25
S
rf=
S
N
R
2
4
Соединение : К раствору  (12,0 г, 49,7 ммоль) в EtOH (15 мл) добавляли коммерчески доступный метил ()-(-)-2-хлорпропионат, 24 (6,69 г, 54,6 моль). Смесь нагревали до 70°C и перемешивали в течение 14 час, затем, после полного завершения реакции, реакционную смесь концентрировали в вакууме. Сырой продукт разбавляли EtOAc (50 мл), промывали 1н раствором HCl (20 мл), насыщенным солевым раствором (20 мл), и затем органическую фазу сушили над безводным NaSO, фильтровали и концентрировали досуха. После концентрирования и сушки в вакууме желаемых объединенных фракций, очистка на силикагеле (SNAP 10 г, гептан/EtOAc=5/1-1/5, затем только EtOAc, ТСХ гептан/EtOAc=1/3, 0,45) давала ()--(()-3-(бензилокси)-2-гидроксипропил)-2-хлорпропанамид (9,86 г, 36,2 ммоль, 73%-ный выход) виде бесцветного сиропа.
[0297]
26
25
26
+
rf=
2R,6R
Соединение: К перемешиваемой суспензии 60% гидрида натрия (5,82 г, 0,0728 моль) в ТГФ (440 мл), охлажденной до 0°C, добавляли по каплям в течение 15 мин соединение  (9,89 г, 36,4 ммоль) в ТГФ (100 мл). Реакционную смесь перемешивали при 0°C еще 30 мин, после чего оставляли нагреваться до комнатной температуры в течение 1 часа. После полного завершения реакции реакционную смесь охлаждали до 0°C, в процессе чего медленно добавляли изопропиловый спирт (100 мл). Сырой раствор нейтрализовали с помощью Dowex Н с последующим отделением смолы фильтрованием, промывкой изопропанолом два раза (по 20 мл) и концентрированием фильтрата досуха. После сбора желаемых объединенных фракций, концентрирования и сушки в вакууме сырой продукт очищали на силикагеле (SNAP 100 г, гептан/EtOAc=1/1 - только EtOAc, ТСХ гептан/EtOAc=1/3, 0,4)) с получением ()-6-((бензилокси)метил)-2-метилморфолин-3-она  (6,42 г, 27,3 ммоль, 75%-ный выход).
[0298]
11:
Соединение
[0299]
26
11
11
2
3
транс
цис
цис/транс
В перемешиваемый раствор соединения  (6,67 г, 28,3 ммоль) в ТГФ (20 мл) добавляли по каплям при комнатной температуре 1M раствор тетрагидроалюмината лития в ТГФ (40,0 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2,5 часов, затем, после полного завершения реакции, реакционную смесь охлаждали до 0°C и затем медленно добавляли по каплям воду (13 мл), затем 1M раствор NaOH в воде (0,8 мл). Гашеную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре до тех пор, пока не образовался сыпучий осадок белого цвета. Осадок отфильтровывали через слой Целита 545 и промывали EtOAc, DCM и EtO (по 10 мл каждого). Фильтрат концентрировали и очищали на силикагеле (SNAP 100 г, только DCM - DCM/MeOH=97/3, ТСХ CHCl/MeOH=9/l, rf=0,5, rf=0,4). Получали диастереоизомерную смесь соединения (4,42 г, 20,0 ммоль, 70,6%-ный выход), из которой выделяли чистое соединение (0,93 г, 4,2 ммоль, 15%-ный выход).
[0300] Альтернативное получение соединения 12 - схема 8
[0301]
28:
28
3
N-
СоединениеК суспензии карбоната натрия (31 г, 0,37 моль) в воде (50 мл) добавляли раствор 1-амино-3,3-диэтоксипропана (10,00 мл, 61,81 ммоль) в DCM (50 мл) и затем охлаждали до 0°C. При интенсивном перемешивании при 0°C добавляли бензолсульфонил хлорид (7,65 мл, 60,0 ммоль) и затем нагревали до 20°C и продолжали перемешивание в течение 2 часов, после чего добавляли MTBE (150 мл). Органический слой отделяли, промывали 1,0M раствором HCl (50 мл), насыщенным NaHCO (50 г), водой (50 г), концентрировали и азеотропно отгоняли досуха два раза с MTBE (150 мл × 2) с получением(3,3-диэтоксипропил)бензолсульфонамида (17,34 г, 60,34 ммоль, 97%-ный выход) в виде прозрачного масла светло-желтого цвета.
[0302]
30:
29
30
СоединениеК перемешиваемому раствору 2-фтор-4-гидроксибензонитрила (15,00 г, 0,1094 моль) в ДМФ (45,0 мл), охлажденному до 0°C, добавляли карбонат калия (37,8 г, 0,274 моль), затем перемешивали при 0-5°C в течение 30 мин. К реакционной смеси при температуре <5°C добавляли бензилбромид (13,7 мл, 0,115 моль), перемешивали при 5°C в течение 1 часа с последующим нагреванием до 20°C и перемешивали еще в течение 2,5 часов. После полного завершения реакции реакционную смесь распределяли между водой (180 мл) и MTBE (220 мл), и слои разделяли, и органический слой промывали водой (90 мл), концентрировали и азеотропно отгоняли досуха два раза с помощью EtOAc (по 150 мл) с получением 4-(бензилокси)-2-фторбензонитрила, соединение (24,64 г, 0,1084 моль, 99%-ный выход) в виде твердого вещества белого цвета.
[0303]
32
28
30
31
32
2
3
N-
N
N-
N
Соединение: К перемешиваемому раствору соединения  (13,28 г, 46,21 ммоль) в NMP (30,0 мл) при комнатной температуре добавляли соединение (10,00 г, 44,01 ммоль), затем CsCO (21,5 г, 66,0 ммоль). Полученную смесь нагревали при 110°C в течение 16 часов и затем охлаждали до комнатной температуры. Смесь распределяли между водой (120 г) и MTBE (120 мл), и водный слой экстрагировали MTBE (120 мл). Объединенные органические слои промывали водой (60 г), концентрировали и азеотропно отгоняли досуха два раза с EtOAc (по 100 мл каждый раз) с получением(5-(бензилокси)-2-цианофенил)--(3,3-диэтоксипропил)бензолсульфонамида  в виде масла коричневатого цвета. Сырой продукт в течение 3 час подвергали гидрированию с помощью 10 масс% Pd-C (1,40 г) в EtOAc (100 мл) в атмосфере газообразного водорода (баллон, находящийся под давлением), после чего очищенную реакционную смесь фильтровали через слой из Целита, промывали EtOAc (100 мл) и концентрировали. Полученный таким образом сырой продукт очищали на силикагеле (элюируя смесью н-гептан/MTBE 2:3) с получением(2-циано-5-гидроксифенил)--(3,3-диэтоксипропил)бензол-сульфонамида  (16,38 г, 40,50 ммоль, 92%-ный выход) в виде вязкого масла желтого цвета.
[0304]
33
32
33
N-
N
Соединение: К перемешиваемому раствору соединения  (5,45 г, 13,5 ммоль) в ТГФ (40 мл), охлажденному до 0°C, добавляли воду (5,4 мл), затем ТФК (11 мл, 0,14 моль). Полученную смесь оставляли нагреваться до 20°C и перемешивали в течение ночи. После полного завершения реакции реакционную смесь азеотропно отгоняли досуха два раза с толуолом (по 54 мл) с получением(2-циано-5-гидроксифенил)--(3-оксопропил)бензолсульфонамида (4,55 г, 13,8 ммоль, 100%-ный выход) в виде вязкого масла.
[0305]
34
33
34
Соединение : К перемешиваемой суспензии (1,64 г, 4,96 ммоль) в смеси толуола (29,5 мл) и NMP (1,2 мл), нагреваемой при 70°C, добавляли D-(+)-10-камфорсульфоновую кислоту (1,15 г, 4,96 ммоль) и затем нагревали при 100°C в течение 14 час. После полного завершения реакции реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, разбавляли EtOAc (60 мл), промывали водой (6,3 мл) и концентрировали с получением масла темно-коричневого цвета. Сырой продукт очищали на силикагеле (элюируя смесью н-гептан/EtOAc 1:1) с получением 5-гидрокси-1-(фенилсульфонил)-1,2-дигидрохинолин-8-карбонитрила  (685 мг, 2,19 ммоль, 44%-ный выход) в виде твердого вещества желтого цвета.
[0306]
35
12
34
35
35
11
12
3
2
4
2R,6R
Соединенияи : К перемешиваемой суспензии соединения  (0,393 г, 1,26 ммоль) в DCM (3,0 мл) добавляли 2,6-лутидин (0,437 мл, 3,78 ммоль) и затем охлаждали до 1-2°C. При поддержании температуры ниже 4°C добавляли раствор трифторметансульфонового ангидрида (0,275 мл, 1,64 ммоль) в DCM (1,0 мл). Реакционную смесь перемешивали при 2-3°C в течение 1 часа, выливали в предварительно охлажденную (5°C) смесь MTBE (20 мл) и 1M раствор HCl (6,3 мл). Полученный отделенный органический слой промывали 9 масс% раствором NaHCO (3 г), 20 масс% раствором NaCl (5 г), сушили над NaSO (2 г) в течение 1 часа, фильтровали и концентрировали с получением сырого 8-циано-1-(фенилсульфонил)-1,2-дигидрохинолин-5-ил трифторметан-сульфоната  в виде масла желтого цвета. Соединение  растворяли в NMP (2,5 мл) и DIPEA (1,75 мл, 10,1 ммоль), затем добавляли (0,446 г, 2,02 ммоль), и полученную смесь нагревали при 125°C в течение ночи. После полного завершения реакции реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и распределяли между EtOAc (30 мл) и водой (10 мл). Органический слой промывали водой (10 мл), концентрировали и очищали на колонке с силикагелем (элюируя смесью н-гептан/EtOAc 1:1) с получением 5-(()-2-((бензилокси)метил)-6-метилморфолино)хинолин-8-карбонитрила  (80,2 мг, 0,215 ммоль, 17%-ный выход) в виде твердого вещества коричневого цвета.
[0307] Синтез соединения 36 - Схема 9:
13
36
2
2R,6R
К перемешиваемой суспензии соединения (10,97 г, 38,72 ммоль) в DCM (44 мл) добавляли 2,6-лутидин (5,38 мл, 46,5 ммоль) и затем охлаждали до 0°C. Добавляли раствор ангидрида трифторметансульфоновой кислоты (TfO; 6,84 мл, 40,7 ммоль) в DCM (22 мл), поддерживая при этом температуру <5°C и перемешивая в течение 1 часа. После полного завершения реакции реакционную смесь гасили насыщенным раствором бикарбоната натрия (65 г), и смесь нагревали до 15°C. Слои разделяли, и водный слой экстрагировали DCM (55 мл). Объединенные органические слои промывали 20 масс% NaCl (33 г) и перемешивали над флоризилом (11 г) в течение 1,5 час, после чего смесь фильтровали, элюировали MTBE (55 мл) и концентрировали. Твердое вещество коричневого цвета суспендировали в DCM (11 мл), разбавляли н-гептаном (110 мл), фильтровали, промывали смесью н-гептан/DCM 10:1 (121 мл) и сушили в вакууме с получением (()-4-(8-цианохинолин-5-ил)-6-метилморфолин-2-ил)метил трифторметансульфоната  (15,20 г, 36,6 ммоль, 94%-ный выход) в виде твердого вещества светло-коричневого цвета.
[0308] Синтез ER-887927 в соответствии со схемами 9 и 17:
[0309] Схема 17
[0310]
[0311]
36
72
ER-887927
N-
2
К перемешиваемой суспензии соединения  (1,002 г, 2,412 ммоль) в ацетонитриле (6,0 мл) добавляли карбонат калия (1,33 г, 9,65 ммоль), затем коммерчески доступный 1,4'-бипиперидин  (609 мг, 3,62 ммоль). Реакционную смесь нагревали с обратным холодильником в течение 5 часов, затем, после полного завершения реакции, реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, разбавляли водой (12 мл) и частично концентрировали. Добавлялигептан (10 мл) и MTBE (10 мл), и смесь частично концентрировали, в процессе чего полученное таким образом твердое вещество коричневого цвета собирали фильтрованием, промывали: (1) водой (15 мл) и (2) н-гептаном (15 мл) и сушили в вакууме в течение ночи. Высушенное твердое вещество растворяли в н-гептане (10 мл, 0,2 моль), разбавляли ацетонитрилом (5,0 мл, 0,096 моль), затем при комнатной температуре в течение 10 мин обрабатывали флоризилом (0,50 г). Смесь фильтровали, элюировали ацетонитрилом (10 мл) и концентрировали с получением твердого вещества коричневого цвета, которое растирали в смеси MTBE/н-гептан 1:2 (15 мл), фильтровали, промывали смесью MTBE/н-гептан 1:3 (10 мл) и сушили в атмосфере N/вакуума с получением  в виде порошка светло-коричневого цвета (1,001 г, 2,31 ммоль, 95%-ный выход).
[0312] ER-893881
ER-887927
36
S
2
3
(15,2 мг, 0,037 ммоль, 51,6%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (30 мг, 0,072 ммоль) и ()-1,3'-бипирролидин дигидрохлорида (20,5 мг, 0,144 ммоль), используя вместо KCO TEA (0,020 мл, 0,141 ммоль).
[0313] ER-894483
ER-893881
36
R
3-
(30 мг, 0,079 ммоль, 32,8%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (100 мг, 0,241 ммоль) и ()-метилпиперазин-2-она (54,9 мг, 0,481 ммоль).
[0314] ER-894484 (30 мг, 0,079 ммоль, 32,8%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения ER-893881, исходя из соединения 36 (100 мг, 0,241 ммоль) и (
S
)-3-метилпиперазин-2-она (54,9 мг, 0,481 ммоль).
[0315] ER-894504
ER-893881
36
2S,5R
(30 мг, 0,076 ммоль, 31,5%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (100 мг, 0,241 ммоль) и ()-2,5-диметилпиперазина (54,9 мг, 0,481 ммоль).
[0316] ER-894505
ER-893881
36
(30 мг, 0,076 ммоль, 31,5%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (100 мг, 0,241 ммоль) и 2,3-диметилпиперазина (54,9 мг, 0,481 ммоль).
[0317] ER-894655
ER-893881
36
трет-
(140 мг, 0,309 ммоль, 64,2%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (200 мг, 0,482 ммоль) и бутил 2,2-диметилпиперазин-1-карбоксилата (206 мг, 0,961 ммоль). Защитную группу Вос гидролизовали, используя 4н HCl диоксан с последующим выделением желаемого продукта путем азеотропной отгонки досуха с толуолом и сушки в вакууме.
[0318] ER-894151
ER-893881
36
трет-
3
4
(1,066 г, 3,16 ммоль, 65,4%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (2,0 г, 4,81 ммоль) и бутилазетидин-3-илкарбамата (0,995 г, 5,78 ммоль). В Boc-защищенном промежуточном соединении удаляли защитную группу с использованием ТФК (3 мл) в DCM (3 мл). Реакционную смесь оставляли перемешиваться в течение 30 мин, после чего реакционную смесь концентрировали досуха путем азеотропной отгонки три раза с толуолом (по 5 мл). Остаток разбавляли DCM (10 мл), промывали два раза насыщ. раствором NaНСО (5 мл), водой (5 мл), насыщенным солевым раствором (5 мл), сушили над MgSO, фильтровали, концентрировали и сушили в вакууме с получением желаемого продукта.
[0319] ER-890250
ER-887927
: К охлажденному перемешиваемому раствору соединения  (50 мг, 0,115 ммоль) в ТГФ (1 мл) при -78°C добавляли 1,6M комплекса метил литий-литий бромид в этиловом эфире (0,15 мл, 0,24 ммоль), после чего цвет раствора изменялся от светло-желтого до ярко-красного/оранжевого. Реакционную смесь перемешивали в течение 1,5 час при температуре -78°C, после чего гасили водным раствором гидрохлорида аммония (2 мл) с последующим медленным нагреванием до комнатной температуры. Реакционную смесь экстрагировали три раза с помощью DCM (5 мл), и объединенные органические слои сушили, фильтровали и концентрировали досуха.
3
ER-890250
Сырое промежуточное соединение растворяли в ацетоне (1 мл), затем добавляли раствор нитрата аммония-церия (300 мг, 0,547 ммоль) в воде (1,5 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин, после чего реакционную смесь концентрировали до сырого твердого вещества. Твердое вещество суспендировали в 5 мл ацетона, перемешивали в течение 5 мин, фильтровали, и твердый слой на фильтре элюировали три раза ацетоном (по 5 мл). Объединенные фильтраты концентрировали, затем очищали методом ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка X-Bridge C18 19×100 мм с использованием градиента смеси ацетонитрил/вода с 0,1% муравьиной кислотой). Желаемые фракции объединяли, концентрировали, растворяли в MeOH (2 мл), пропускали через колонку с SiCO, элюировали два раза MeOH, концентрировали и сушили в вакууме с получением  (4,4 мг, 0,010 ммоль, 8,5%-ный выход).
[0320] Синтез ER-884884 в соответствии со схемой 10:
[0321] Соединение 37:
22
схемой 6
(3R,5S
трет-
К перемешиваемому раствору соединения  в соответствии со  (1,003 г, 3,121 ммоль) в EtOH (5 мл) добавляли 5% Pd на угле (100 мг) и затем несколько раз заполняли колбу газообразным водородом. Реакционную смесь нагревали до 40°C в атмосфере водорода (баллон, находящийся под давлением) и перемешивали в течение ночи, после чего реакционную смесь продували газообразным азотом несколько раз при вакуумировании системы с помощью вакуумного насоса между очистками. После полного завершения реакции реакционную смесь фильтровали через Целит 545, слой на фильтре промывали два раза EtOH (по 5 мл каждый раз), затем объединенные фильтраты концентрировали и сушили в вакууме. Сырой продукт, )-бутил3-(гидроксиметил)-5-метилпиперидин-1-карбоксилат (0,720 г, 3,114 ммоль, 99,8%-ный выход) использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
[0322]
(3R,5S
трет-
(3S,5R
трет-
4
К перемешиваемому раствору )-бутил 3-(гидроксиметил)-5-метилпиперидин-1-карбоксилата (0,783 г, 3,385 ммоль) в DCM (5 мл) добавляли п-толуолсульфонил хлорид (0,968 г, 5,078 ммоль), затем DMAP (40 мг, 0,33 ммоль) и DIPEA (1,18 мл, 6,77 ммоль) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов, затем добавляли воду (5 мл) с последующим перемешиванием в течение еще 15 мин. Полученный органический слой промывали 0,1н раствором HCl (5 мл), насыщенным солевым раствором (3 мл), сушили над MgSO, фильтровали и концентрировали досуха. Сырой продукт очищали на силикагеле (Biotage, элюируя смесью 3:1 гептан:EtOAc) с получением )-бутил3-метил-5-((тозилокси)метил)пиперидин-1-карбоксилата (0,8602 г, 2,232 ммоль, 65,9%-ный выход).
[0323]
37
3S,5R
трет-
2R,6R
трет-
2
4
К перемешиваемому раствору ()-бутил3-метил-5-((тозилокси)метил)пиперидин-1-карбоксилата (0,860 г, 2,232 ммоль) в ДМФ (7 мл) при комнатной температуре добавляли азид натрия (0,218 г, 3,347 ммоль), после чего реакционную смесь нагревали до 80°C и перемешивали еще 3 часа. После полного завершения реакции реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, разбавляли EtOAc (25 мл) и промывали три раза водой (по 5 мл). После концентрирования желаемых объединенных фракций и сушки в вакууме полученный органический слой сушили над безводным NaSO, фильтровали, концентрировали, после чего сырой продукт очищали на силикагеле (Biotage, элюируя смесью EtOAc в гептане с градиентом 0-15%) с получением ()-бутил2-(азидометил)-6-метилморфолин-4-карбоксилата  (0,545 г, 2,126 ммоль, 95,3%-ный выход) в виде бесцветного кристаллического твердого вещества.
[0324] ER-884884:
37
(2S,6R
трет-
К перемешиваемому раствору соединения  (0,545 г, 2,126 ммоль) в MeOH (5 мл) добавляли 5% палладий на активированном угле (250 мг), затем несколько раз сосуд заполняли газообразным водородом. Реакционную смесь выдерживали в атмосфере водорода (баллон, находящийся под давлением) при комнатной температуре и перемешивали в течение 12 часов, после чего реакционную смесь продували газообразным азотом несколько раз при вакуумировании системы с помощью вакуумного насоса между очистками. После полного завершения реакции реакционную смесь фильтровали через Целит 545, слой на фильтре промывали два раза EtOH (по 2 мл), затем объединенные фильтраты концентрировали и сушили в вакууме. Сырой продукт, )-бутил2-(аминометил)-6-метилморфолин-4-карбоксилат (0,489 г, 2,10 ммоль, 99,9%-ный выход) использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
[0325]
3
ER-884884
(2S,6R
трет-
К перемешиваемому раствору )-бутил2-(аминометил)-6-метилморфолин-4-карбоксилата (50,2 мг, 0,218 ммоль) в DCM (0,5 мл) при комнатной температуре добавляли ТФК (0,25 мл, 3,4 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа, после чего концентрировали и азеотропно отгоняли досуха два раза с толуолом (по 2 мл) и сушили в вакууме. Сырой морфолин с удаленной защитной группой растворяли при перемешивании в DMA (1 мл), затем добавляли TEA (2 мл) и соединение  (50 мг, 0,214 ммоль). Реакционную смесь нагревали до 140°C и перемешивали в течение 1 часа, затем, после полного завершения реакции, реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и после концентрирования желаемых объединенных фракций и сушки в вакууме напрямую помещали на колонку для препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой (после фильтрования) с получением  (12,1 мг, 0,043 ммоль, 19,7%-ный выход).
[0326] Замещенное соединение 15, схема 10
ER-879713
ER-884884
ER-879713
или : К перемешиваемому раствору  (30,2 мг, 0,107 ммоль) в DCM (0,5 мл) добавляли TEA (30 мкл, 0,20 ммоль), затем 2,2-диметилпропаноил хлорид (20 мкл, 0,162 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов, затем, после полного завершения реакции, реакционную смесь концентрировали, фильтровали и после концентрирования желаемых объединенных фракций и сушки в вакууме напрямую очищали посредством препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка Water's X-Bridge C18 19×100 мм; элюировали градиентом ацетонитрила в воде с 0,05% ТФК) с получением  (20,5 мг, 0,056 ммоль, 52,3%-ный выход).
[0327] ER-886432
ER-879713
ER-884884
(10,2 мг, 0,023 ммоль, 52,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (50 мг, 0,177 ммоль) и 1-фенилциклобутанкарбонил хлорида (8,5 мг, 0,044 ммоль).
[0328] ER-886563
ER-879713
ER-884884
(3,6 мг, 0,023 ммоль, 20,3%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (12,4 мг, 0,044 ммоль) и бензолацетил хлорида (0,007 мл, 0,053 ммоль).
[0329] ER-888137:
ER-884884
ER-888137
К перемешиваемому раствору  (30,2 мг, 0,107 ммоль) в NMP (0,5 мл) добавляли 2-хлор-5-фторпиримидин (140 мг, 1,056 ммоль). Реакционную смесь нагревали в микроволновой печи при 150°C в течение 5 мин, после чего охлажденную реакционную смесь очищали на колонке для препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой C-18, элюируя ацетонитрилом в воде с градиентом 10-40%. Желаемые фракции концентрировали и сушили в вакууме с получением  (6,5 мг, 0,017 ммоль, 9,7%-ный выход).
[0330] ER-888701
ER-888137
ER-884884
(12,2 мг, 0,031 ммоль, 17,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (50 мг, 0,177 ммоль) и 2-хлор-5-этилпиримидина (150 мг, 1,052 ммоль).
[0331] ER-888896
ER-888137
ER-884884
(3,0 мг, 0,008 ммоль, 23,1%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (10,1 мг, 0,036 ммоль) и 2-хлорпиразина (30 мг, 0,261 ммоль).
[0332] Схема 18: Альтернативный способ получения замещенного соединения 15:
[0333]
[0334] ER-879713 или соединение 76 с использованием схемы 18:
[0335]
73:
37
73
(2S,6R
трет-
Соединение К перемешиваемому раствору соединения  (0,545 г, 2,126 ммоль) в MeOH (5 мл) добавляли 5%-ный палладий на активированном угле (250 мг), затем несколько раз сосуд заполняли газообразным водородом. Реакционную смесь выдерживали в атмосфере водорода (баллон, находящийся под давлением) при комнатной температуре и перемешивали в течение 12 часов, после чего реакционную смесь продували газообразным азотом несколько раз при вакуумировании системы с помощью вакуумного насоса между очистками. После полного завершения реакции реакционную смесь фильтровали через Целит 545, слой на фильтре промывали два раза EtOH (по 2 мл), затем объединенные фильтраты концентрировали и сушили в вакууме. Сырой продукт, )-бутил2-(аминометил)-6-метилморфолин-4-карбоксилат  (0,489 г, 2,10 ммоль, 99,9%-ный выход) использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
[0336]
74
73
74
4
(2R,6S
трет-
Соединение: К перемешиваемому раствору соединения  (50,2 мг, 0,218 ммоль) в DCM (0,5 мл)) добавляли TEA (36,5 мкл, 0,268 ммоль), затем 2,2-диметилпропаноил хлорид (29,5 мкл, 0,235 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа, затем, после полного завершения реакции, реакционную смесь промывали водой, экстрагировали три раза DCM (по 3 мл), и объединенные органические слои сушили над MgSO, фильтровали, концентрировали и сушили в вакууме с получением сырого )-бутил2-метил-6-(пиваламидометил)морфолин-4-карбоксилата  (R=tBu).
[0337] ER-879713:
74
75
3
76
ER-879713
К перемешиваемому раствору сырого соединения  в DCM (5 мл) добавляли ТФК (0,25 мл, 3,4 ммоль) с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 1 часа. После полного завершения реакции реакционную смесь концентрировали и азеотропно отгоняли два раза с толуолом и затем сушили в вакууме в течение 30 мин, после чего сырое желаемое промежуточное соединение  растворяли в DMA (1 мл), затем добавляли TEA (2 мл) и соединение  (50 мг, 0,214 ммоль). Реакционную смесь нагревали до 140°C и перемешивали в течение 1 часа, затем, после полного завершения реакции, реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и после концентрирования желаемых объединенных фракций и сушки в вакууме напрямую помещали на колонку для препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой (после фильтрования) с получением соединения  по примеру или  (9,3 мг, 0,025 ммоль, 11,6%-ный выход, R=tBu).
[0338] ER-879689
ER-879713
73
3
(4,3 мг, 0,013 ммоль, 6,0%-ный выход, R=Me) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (50,2 мг, 0,218 ммоль, R=Me) и соединения  (50 мг, 0,215 ммоль).
[0339] ER-886360
ER-879713
73
3
(14,3 мг, 0,035 ммоль, 15,8%-ный выход, R=CH(Me)Ph) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (50,2 мг, 0,218 ммоль, R=CH(Me)Ph) и соединения  (50 мг, 0,215 ммоль).
[0340] Дополнительные примеры замещенного соединения 15:
[0341] ER-888603:
37
трет-
2R,6R
1H
4
К перемешиваемому раствору соединения  (58,1 мг, 0,227 ммоль) и циклогексилацетилена (0,026 мл, 0,200 ммоль) в бутиловом спирте (0,08 мл) и воде (0,07 мл) добавляли бикарбонат натрия (2,5 мг, 0,030 ммоль), затем пентагидрат сульфата меди (II) (2,5 мг, 0,010 ммоль) и аскорбат натрия (7,8 мг, 0,039 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 14 часов, после чего добавляли DCM (5 мл) и насыщенный бикарбонат натрия (5 мл) и перемешивали еще 10 мин. Слои разделяли, и водный слой экстрагировали два раза DCM (по 3 мл). Объединенные органические слои сушили над безводным MgSO, фильтровали и концентрировали досуха. Сырое Boc-защищенное промежуточное соединение растворяли при перемешивании в DCM (3 мл), затем добавляли ТФК (0,8 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа, затем, после полного завершения реакции, реакционную смесь концентрировали и азеотропно отгоняли досуха с помощью толуола (2 раза по 5 мл). Сырой продукт очищали посредством ВЭЖХ (колонка Water's X-Bridge C18 19×100 мм; элюировали градиентом ацетонитрила в воде с 0,05% ТФК) с получением ()-2-((4-циклогексил--1,2,3-триазол-1-ил)метил)-6-метилморфолина (8,9 мг, 0,034 ммоль, 16,8%-ный выход).
[0342]
3
ER-888603
2R,6R
К перемешиваемому раствору ()-2-((4-циклогексил-1Н-1,2,3-триазол-1-ил)метил)-6-метилморфолина (8,9 мг, 0,034 ммоль) в DMA (0,3 мл) и TEA (0,005 мл, 0,036 ммоль) добавляли соединение  (7,85 мг, 0,034 ммоль). Смесь нагревали в микроволновой печи при 150°C в течение 30 мин, после чего охлажденную реакционную смесь напрямую помещали на колонку для препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой С-18 (колонка Water's X-Bridge C18 19×100 мм; элюируя градиентом 10-40% ацетонитрила в воде с 0,05% ТФК). Желаемые объединенные фракции концентрировали и сушили в вакууме с получением  (3,3 мг, 0,008 ммоль, 23,3%-ный выход или 3,9% общий выход).
[0343] ER-888604
ER-888603
37
3
(5,2 мг, 0,013 ммоль, 6,5% общий выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (58,1 мг, 0,227 ммоль), фенилацетилена (0,022 мл, 0,200 ммоль) и соединения  (7,85 мг, 0,034 ммоль).
[0344] ER-889556:
ER-887268
ER-889556
3
К перемешиваемой суспензии  (140,3 мг, 0,384 ммоль) в воде (1,5 мл) добавляли формальдегид (1 мл) и муравьиную кислоту (0,55 мл), после чего реакционную смесь нагревали в микроволновой печи при 110°C в течение 1,5 часов. После полного завершения реакции реакционную смесь охлаждали и напрямую помещали на колонку для препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой С-18, элюируя градиентом 10-40% ацетонитрила в воде с 0,1% ТФК. Желаемые объединенные фракции концентрировали, растворяли в MeOH (5 мл), пропускали через слой из SiCO, элюируя MeOH (10 мл), концентрировали и сушили в вакууме с получением  (75 мг, 0,197 ммоль, 51,5%-ный выход).
[0345] ER-890114
ER-889556
ER-890112
(75,9 мг, 0,170 ммоль, 40,5%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (182 мг, 0,420 ммоль).
[0346] ER-890108
ER-889556
ER-890119
(72,1 мг, 0,171 ммоль, 40,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (170,6 мг, 0,420 ммоль).
[0347] ER-890345
ER-889556
ER-890344
(43,5 мг, 0,115 ммоль, 38%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (110,2 мг, 0,302 ммоль).
[0348] ER-890346
ER-889556
ER-887269
(52,6 мг, 0,139 ммоль, 73,3%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (69 мг, 0,189 ммоль).
[0349] ER-890831
ER-889556
ER-887270
(85,2 мг, 0,225 ммоль, 74,5%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (110,2 мг, 0,302 ммоль).
[0350] ER-890964
ER-889556
ER-890963
(506,2 мг, 1,286 ммоль, 71,2%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (685,2 мг, 1,806 ммоль).
[0351] ER-890186
ER-889556
ER-890107
(10,2 мг, 0,023 ммоль, 20,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (48 мг, 0,111 ммоль).
[0352] ER-890223
ER-889556
ER-890106
(35 мг, 0,078 ммоль, 42,9%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (100 мг, 0,182 ммоль) в виде ТФК соли.
[0353] ER-894656
ER-889556
ER-894655
(31,7 мг, 0,068 ммоль, 61,5%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (50 мг, 0,111 ммоль) в виде дигидрохлоридной соли.
[0354] ER-889728
ER-888070
ER-889728
4
3
: К перемешиваемому раствору  (12,5 мг, 0,034 ммоль) в DCM (0,5 мл) добавляли TEA (0,01 мл, 0,072 ммоль), затем никотиноил хлорид (10 мг, 0,071 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа после чего реакционную смесь разбавляли DCM (5 мл), промывали водой (2 мл), насыщенным солевым раствором (2 мл), сушили над MgSО, фильтровали и концентрировали досуха. Сырой продукт очищали на препаративной колонке с обращенной фазой C-18 ВЭЖХ, элюируя градиентом 10-25% ацетонитрила в воде с 0,1% ТФК. Желаемые объединенные фракции концентрировали, растворяли в MeOH (5 мл), пропускали через слой из SiCО, элюируя MeOH (10 мл), концентрировали и сушили в вакууме с получением  (7,2 мг, 0,015 ммоль, 45%-ный выход).
[0355] ER-889729
ER-889728
ER-888070
(8,2 мг, 0,017 ммоль, 51,3%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (12,5 мг, 0,034 ммоль) и изоникотиноил хлорида (10 мг, 0,071 ммоль).
[0356] ER-889734
ER-889728
ER-888070
(8,6 мг, 0,018 ммоль, 52,9%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (12,5 мг, 0,034 ммоль) и пиколиноил хлорида (10 мг, 0,071 ммоль).
[0357] ER-889744
ER-889728
ER-888070
(12 мг, 0,028 ммоль, 80,8%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (12,5 мг, 0,034 ммоль) и гесаноил хлорида (9 мг, 0,067 ммоль).
[0358] ER-889745
ER-889728
ER-888070
(8 мг, 0,018 ммоль, 54%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (12,5 мг, 0,034 ммоль) и изобутирил хлорида (7 мг, 0,066 ммоль).
[0359] ER-889746
ER-889728
ER-888070
(7,6 мг, 0,017 ммоль, 50%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (12,5 мг, 0,034 ммоль) и 2,2-диметилпропаноил хлорид (8 мг, 0,066 ммоль).
[0360] ER-890113
ER-889728
ER-890112
(25,6 мг, 0,054 ммоль, 66,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (35,2 мг, 0,081 ммоль) и уксусного ангидрида (0,093 мл, 0,984 ммоль).
[0361] ER-890120
ER-889728
ER-890119
(20,3 мг, 0,045 ммоль, 54,2%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (33,7 мг, 0,083 ммоль) и уксусного ангидрида (0,012 мл, 0,127 ммоль).
[0362] ER-890122
ER-889728
ER-890119
(35,2 мг, 0,069 ммоль, 43,1%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (65,2 мг, 0,160 ммоль) и бензоилхлорида (0,037 мл, 0,318 ммоль).
[0363] ER-890142
ER-889728
ER-890112
(45,2 мг, 0,084 ммоль, 53,1%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (68,5 мг, 0,158 ммоль) и бензоилхлорида (0,037 мл, 0,318 ммоль).
[0364] ER-890187
ER-889728
ER-890107
(9,4 мг, 0,020 ммоль, 18,0%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (48 мг, 0,111 ммоль) и уксусного ангидрида (0,125 мл, 1,3 ммоль).
[0365] ER-890188
ER-889728
ER-890107
(8,9 мг, 0,018 ммоль, 16,0%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (48 мг, 0,111 ммоль) и изобутирилхлорида (0,051 мл, 0,487 ммоль).
[0366] ER-890189
ER-889728
(10 мг, 0,019 ммоль, 16,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из ER-890107 (48 мг, 0,111 ммоль) и бензоилхлорида (0,056 мл, 0,482 ммоль).
[0367] ER-890190
ER-889728
ER-890119
(6,5 мг, 0,014 ммоль, 36,8%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (15,6 мг, 0,038 ммоль) и изобутирилхлорида (0,006 мл, 0,058 ммоль).
[0368] ER-890219
ER-889728
ER-890106
(32,0 мг, 0,067 ммоль, 91,8%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (40,2 мг, 0,073 ммоль) в виде ТФК соли, TEA (0,20 мл, 1,43 ммоль) и уксусного ангидрида (0,10 мл, 1,06 ммоль).
[0369] ER-890221
ER-890219
ER-890106
(28,2 мг, 0,056 ммоль, 76,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (40,2 мг, 0,073 ммоль) в виде ТФК соли и изобутирилхлорида (0,080 мл, 0,764 ммоль).
[0370] АER-890222
ER-890219
ER-890106
(30,1 мг, 0,056 ммоль, 76,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (40,5 мг, 0,074 ммоль) в виде ТФК соли и бензоилхлорида (0,20 мл, 1,723 ммоль).
[0371] ER-892254
ER-889728
ER-892253
(24,2 мг, 0,0,52 ммоль, 67,5%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (32,2 мг, 0,077 ммоль) и уксусного ангидрида (0,015 мл, 0,151 ммоль). К реакционной смеси добавляли ацетонитрил (0,5 мл)
[0372] ER-892256
ER-889728
ER-890119
(25,2 мг, 0,052 ммоль, 41,9%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (50,2 мг, 0,124 ммоль) и метансульфонил хлорида (0,011 мл, 0,142 ммоль).
[0373] ER-893926
ER-889728
ER-888070
1H
(124,2 мг, 0,255 ммоль, 51,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (180,2 мг, 0,493 ммоль) и 1,3-диметил--пиразол-4-карбонил хлорида (93,8 мг, 0,592 ммоль).
[0374] ER-893927
ER-889728
ER-892253
1H
(45,2 мг, 0,0,83 ммоль, 57,8%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (60,5 мг, 0,144 ммоль) и 1,3-диметил--пиразол-4-карбонил хлорида (27,4 мг, 0,173 ммоль).
[0375] ER-893948
ER-889728
ER-888070
(65,3 мг, 0,147 ммоль, 29,9%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (180,2 мг, 0,493 ммоль) и метансульфонил хлорида (68 мг, 0,593 ммоль).
[0376] ER-894149
ER-889728
ER-888070
(67,2 мг, 0,133 ммоль, 80,6%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (60,2 мг, 0,165 ммоль) и бензолсульфонил хлорида (0,023 мл, 0,180 ммоль).
[0377] ER-894150
ER-889728
ER-888070
(58,2 мг, 0,111 ммоль, 69,9%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (58,2 мг, 0,159 ммоль) и 4-фторбензолсульфонил хлорида (0,025 мл, 0,188 ммоль).
[0378] ER-894152
ER-889728
ER-894151
(36,2 мг, 0,095 ммоль, 63,6%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (50,6 мг, 0,150 ммоль) и уксусного ангидрида (0,014 мл, 0,135 ммоль).
[0379] ER-894153
ER-889728
ER-894151
(5,4 мг, 0,012 ммоль, 7,4%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (52,2 мг, 0,155 ммоль) и 4-фторбензоил хлорида (25 мг, 0,158 ммоль).
[0380] ER-894154
ER-889728
ER-894151
(38,5 мг, 0,093 ммоль, 62,4%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (50,4 мг, 0,149 ммоль) и метансульфонил хлорида (0,012 мл, 0,146 ммоль).
[0381] ER-894155
ER-889728
ER-894151
(42,1 мг, 0,085 ммоль, 57,1%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (50,3 мг, 0,149 ммоль) и 4-фторбензолсульфонил хлорида (29 мг, 0,149 ммоль).
[0382] ER-894159
ER-889728
ER-894151
1H
(20,4 мг, 0,041 ммоль, 27,4%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (50,5 мг, 0,150 ммоль) и 1,3-диметил--пиразол-4-сульфонил хлорида (29 мг, 0,149 ммоль).
[0383] ER-894160
ER-889728
ER-888070
1H
(47,2 мг, 0,0,90 ммоль, 65,8%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (50,1 мг, 0,137 ммоль) и 1,3-диметил--пиразол-4-сульфонил хлорида (27 мг, 0,139 ммоль).
[0384] ER-894206
ER-889728
ER-894151
(11,3 мг, 0,029 ммоль, 19%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (50,6 мг, 0,150 ммоль) и изобутирилхлорида (16 мг, 0,150 ммоль).
[0385] ER-894594
ER-889728
ER-894151
(215 мг, 0,487 ммоль, 46,4%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (354 мг, 1,049 ммоль) и бензойного ангидрида (407 мг, 1,81 ммоль). Вместо DCM использовали ацетонитрил (2 мл).
[0386] Получение ER-890252:
36
схемой 9
R
трет-
трет-
R
2S,6R
К перемешиваемому раствору соединения  (2,0 г, 4,8 ммоль) в соответствии со  в ацетонитриле (15 мл) добавляли ()-бутилпирролидин-2-илкарбамат (1,10 г, 5,9 ммоль), затем TEA (1,6 мл, 11,5 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 70°C в течение 3 часов, затем, после полного завершения реакции, реакционную смесь концентрировали до сырого сиропа, разбавляли DCM (20 мл), промывали водой (5 мл), сушили, фильтровали и концентрировали досуха. Сырой продукт очищали на силикагеле (Biotage SP4, 40+M, элюируя градиентом 5% MeOH в 1:1 EtOAc:DCM - 10% MeOH в 1:1 EtOAc:DCM 10 объемов колонки за цикл. Продукт, содержащий фракции, объединяли, концентрировали и сушили в вакууме с получением бутил(()-1-((()-4-(8-цианохинолин-5-ил)-6-метилморфолин-2-ил)метил)пирролидин-3-ил)карбамата (1,35 г, 3,0 ммоль, 62%-ный выход).
[0387]
трет-
R
2S
6R
2S,6R
R
К перемешиваемому раствору бутил(()-1-(((,)-4-(8-цианохинолин-5-ил)-6-метилморфолин-2-ил)метил)-пирролидин-3-ил)карбамата (1,35 г, 3,0 ммоль) в DCM (10 мл) добавляли ТФК (8,1 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре, после чего концентрировали и азеотропно отгоняли досуха три раза с толуолом (по 10 мл) и затем сушили в вакууме с получением сырого 5-(()-2-((()-3-аминопирролидин-1-ил)метил)-6-метилморфолинo)хинолин-8-карбонитрила (1,39 г, 3,0 ммоль, 100%-ный выход) в виде ТФК соли.
[0388] ER-890252
ER-890222
2S,6R
R
(120,3 мг, 0,306 ммоль, 71,2%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из 5-(()-2-((()-3-аминопирролидин-1-ил)метил)-6-метилморфолино)хинолин-8-карбонитрила (200 мг, 0,430 ммоль) в виде ТФК соли и уксусного ангидрида (0,80 мл, 8,46 ммоль).
[0389] ER-890253
ER-890122
2S,6R
R
(146,5 мг, 0,348 ммоль, 80,8%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из 5-(()-2-((()-3-аминопирролидин-1-ил)метил)-6-метилморфолино)хинолин-8-карбонитрила (200 мг, 0,430 ммоль) в виде ТФК соли и изобутирил хлорида (0,50 мл, 4,77 ммоль).
[0390] ER-894544
ER-890122
2S,6R
R
(103,6 мг, 0,227 ммоль, 52,9%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из 5-(()-2-((()-3-аминопирролидин-1-ил)метил)-6-метилморфолинo)хинолин-8-карбонитрила (200 мг, 0,430 ммоль) в виде ТФК соли и бензоилхлорида (0,50 мл, 4,31 ммоль).
[0391] ER-894546
ER-890222
ER-890252
2S,6R
S
2S,6R
S
2S,6R
R
S
трет-
(96,7 мг, 0,214 ммоль, 49,8%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из 5-(()-2-((()-3-аминопирролидин-1-ил)метил)-6-метилморфолино)хинолин-8-карбонитрила (200 мг, 0,430 ммоль) в виде ТФК соли и уксусного ангидрида (0,80 мл, 8,46 ммоль). 5-(()-2-(((()-3-Аминопирролидин-1-ил)метил)-6-метилморфолино)хинолин-8-карбонитрил получали способом, аналогичным способу получения 5-(()-2-((()-3-аминопирролидин-1-ил)метил)-6-метилморфолино)хинолин-8-карбонитрила, используя ()-бутилпирролидин-2-илкарбамата в качестве исходного вещества на первой стадии, описанной выше, для получения .
[0392] ER-894547
ER-894546
2S,6R
S
(120,8 мг, 0,287ммоль, 66,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из 5-(()-2-((()-3-аминопирролидин-1-ил)метил)-6-метилморфолино)хинолин-8-карбонитрила (200 мг, 0,430 ммоль) в виде ТФК соли и изомасляного ангидрида (0,70 мл, 4,22 ммоль).
[0393] ER-894548
ER-894546
2S,6R
S
(110,4 мг, 0,242 ммоль, 56,4%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из 5-(()-2-((()-3-аминопирролидин-1-ил)метил)-6-метилморфолино)хинолин-8-карбонитрила (200 мг, 0,430 ммоль) в виде ТФК соли и бензойного ангидрида (0,50 г, 2,21 ммоль).
[0394] ER-894545
ER-889556
2S,6R
R
(32 мг, 0,084 ммоль, 19,6%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из 5-(()-2-((()-3-аминопирролидин-1-ил)метил)-6-метилморфолинo)хинолин-8-карбонитрила (200 мг, 0,430 ммоль) в виде ТФК соли.
[0395] ER-894549
ER-889556
2S,6R
S
(103,8 мг, 0,274 ммоль, 63,6%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из 5-(()-2-((()-3-аминопирролидин-1-ил)метил)-6-метилморфолинo)хинолин-8-карбонитрила (200 мг, 0,430 ммоль) в виде ТФК соли.
[0396] Получение 886355, используя модификации для схемы 7 и схемы 4:
22
схеме 7
R
S
S
N
R
К перемешиваемому раствору ()-1-амино-3-(бензилокси)пропан-2-ола, соединение по  (8,0 г, 44,1 ммоль), в ДМФ (60 мл) добавляли ()-2-хлорбутановую кислоту (5,0 г, 40,8 ммоль), затем TEA (10,5 г, 103,8 ммоль), DMAP (0,4 г, 3,3 ммоль) и, наконец, EDC (9,52 г, 49,7 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 дней, затем, после полного завершения реакции, реакционную смесь концентрировали до сырого сиропа. Очистка на силикагеле (Biotage, элюируя градиентом 20-100% EtOAc в гептане) с последующем сбором желаемых фракций, концентрированием и сушкой в вакууме приводили к получению ()--(()-3-(бензилокси)-2-гидроксипропил)-2-хлорбутанамида (683,5 мг, 2,392 ммоль, 5,9%-ный выход).
[0397]
S
N
R
2R,6R
К перемешиваемой суспензии гидрида натрия (203,1 мг, 5,1 ммоль в виде 60% масляной дисперсии) в ТГФ (18 мл), охлаждаемой до 0°C, добавляли по каплям ()--(()-3-(бензилокси)-2-гидроксипропил)-2-хлорбутанамид (362,8 мг, 1,270 ммоль) в ТГФ (3,8 мл) в течение 5 мин, после чего реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 30 мин с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 5 часов. После полного завершения реакции реакционную смесь гасили медленным добавлением IPA (1 мл) с последующим добавлением Dowex 50, H+ форма, до тех пор, пока не достигалось значение рН от нейтрального до кислотного. Конечную суспензию фильтровали, и твердое вещество промывали два раза EtOAc. Объединенный фильтрат концентрировали, и полученный сырой продукт очищали на силикагеле (Biotage, элюируя смесью 1:1 EtOAc:гептан). Желаемые фракции объединяли, концентрировали и сушили в вакууме с получением ()-6-((бензилокси)метил)-2-этилморфолин-3-она (314 мг, 1,260 ммоль, 99,2%-ный выход).
[0398]
2R,6R
2R,6R
К перемешиваемому раствору ()-6-((бензилокси)метил)-2-этилморфолин-3-она (362,2 мг, 1,453 ммоль) в ТГФ (2 мл) в течение 2 минут добавляли по каплям при комнатной температуре 1M раствор тетрагидроалюмината лития в ТГФ (2 мл, 2 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2,5 часов, после чего охлаждали до 0°C, затем по каплям добавляли воду (0,6 мл) и потом 1M раствор гидроксида натрия в воде (,04 мл). Гашеную реакционную смесь нагревали до комнатной температуры, перемешивали до образования гранулированного твердого вещества и фильтровали через слой Целита 545, промывая EtOAc (5 мл), DCM (5 мл) и этиловым эфиром (5 мл). Фильтрат концентрировали, и полученный сырой продукт очищали на силикагеле (Biotage, элюируя градиентом 5-10% MeOH в DCM), затем объединяли желаемые фракции, концентрировали и сушили в вакууме с получением ()-2-((бензилокси)метил)-6-этилморфолина (50,2 мг, 0,213 ммоль, 14,6%-ный выход).
[0399]
3
ER-886355
2R,6R
К перемешиваемому раствору ()-2-((бензилокси)метил)-6-этилморфолина (12,4 мг, 0,053 ммоль) и соединения  (10,2 мг, 0,044 ммоль) в DMA (2 мл) добавляли DIPEA (0,015 мл, 0,086 ммоль), и затем нагревали в микроволновой печи при 150°C в течение 7 часов. Охлажденную после полного завершения реакционную смесь напрямую помещали на колонку C-18 для ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка Water's X-Bridge C18, 19×100 мм, элюируя линейным градиентом 10%-90% ацетонитрила в воде с 0,1% муравьиной кислотой) и концентрировали продукт желаемого пика, затем упаривали досуха в высоком вакууме с получением  (6,2 мг, 0,016 ммоль, 36,4%-ный выход).
[0400] Получение ER-887199:
2R,6R
2R,6R
2
2
Перемешиваемый раствор ()-2-((бензилокси)метил)-6-этилморфолина (552,2 мг, 2,347 ммоль) в MeOH (10 мл) прогоняли на колонке 10% Pd(OH) в атмосфере H при давлении 1 атм в течение 16 часов, используя прибор для гидрирования H-Qube. После полного завершения реакции реакционный раствор концентрировали и сушили в вакууме с получением сырого (()-6-этилморфолин-2-ил)метанола (320 мг, 2,204 ммоль, 93,9%-ный выход), который использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
[0401]
3
ER-887199
2R,6R
((-6-Этилморфолин-2-ил)метанол (145,2 мг, 1,00 ммоль) и соединение  (266,4 мг, 1,143 ммоль) в 1-метилпирролидин-2-оне (2 мл) нагревали в микроволновой печи при 180°C в течение 15 минут, после чего охлаждали до комнатной температуры и напрямую помещали на колонку C-18 для ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка Water's X-Bridge C18, 19×100 мм, элюируя линейным градиентом 10%-90% ацетонитрила в воде с 0,1% муравьиной кислотой) и концентрировали продукт желаемого пика, затем упаривали досуха в высоком вакууме с получением  (92,3 мг, 0,313 ммоль, 31,3%-ный выход).
[0402] Получение соединения ER-899742 по примеру, используя схему 11 и 19
[0403] Схема 19
[0404]
[0405] ER-895194
38
13
38
ER-895194
или соединение : К перемешиваемому раствору соединения  (231,0 г, 815,3 ммоль) в DCM (3,93 л) при 0-5°C добавляли йодбензол диацетат (525 г, 1630,6 ммоль), поддерживая при этом температуру <5°C. Добавляли TEMPO (25,4 г, 162,8 ммоль), затем воду (151 мл), потом полученную реакционную смесь нагревали до 10°C, перемешивали в течение 30 минут и далее оставляли нагреваться до комнатной температуры и перемешивали в течение 15 часов. После полного завершения реакции реакционную смесь охлаждали до <15°C и гасили медленным добавлением 1,34 л 10% (масс/об) раствора тиосульфата натрия в воде при поддержании температуры реакции ≤15°C с последующим дополнительным перемешиванием при комнатной температуре в течение 45 мин. Значение pH гашеной реакционной смеси доводили до 9 медленным добавлением 1M раствора гидроксида натрия в воде при поддержании температуры ≤25°C. Перемешиваемые слои разделяли, и органический слой промывали водой (560 мл). К объединенным водным слоям добавляли 1-бутанол (2,31 л), после чего смесь охлаждали до 10-15°C, затем медленно добавляли 5M раствор серной кислоты (231 мл), поддерживая температуру ≤25°C для доведения значения pH приблизительно до 5. Полученные слои разделяли, и водный слой экстрагировали 3 раза 1-бутанолом (2,31 л) при поддержании значения pH водного слоя равным около 5 между экстракциями. Объединенные водные слои концентрировали при нагревании до 50-55°C, после чего полученную взвесь твердого вещества желтого цвета концентрировали путем азеотропной отгонки три раза с н-гептаном (по 693 мл) до объема, равного 1,5 л, с последующим добавлением DCM (2,31 л). Суспензию твердого вещества желтого цвета перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа, затем фильтровали, промывали слой на фильтре два раза DCM (462 мл). Полученный осадок на фильтре желтого цвета сушили в вакууме в течение ночи при 40°C, затем суспендировали в толуоле (1,16 л) и концентрировали до полного высушивания при 45°C в вакууме с получением соединения  или  (187 г, 629 ммоль, 77%-ный выход) в виде желтого твердого вещества.
[0406]
38
77
78
79
3S,4R
трет-
(3R,4S
трет-
3
4
К перемешиваемому раствору соединения  (300 мг, 1,01 ммоль) в DCM (2 мл) добавляли смесь ()-бутил3-амино-4-фторпирролидин-1-карбоксилата и )-бутил 3-амино-4-фторпирролидин-1-карбоксилата  (205,3 мг, 1,005 ммоль ммоль), HBTU (247 мг, 1,211 ммоль) и DIEA (0,70 мл, 4,04 ммоль), затем перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Когда было обнаружено, что реакция полностью завершилась, и смесь концентрировали досуха с последующим растворением в EtOAc (20 мл), промывали 1 раз водой (10 мл), 2н раствором лимонной кислоты в воде (10 мл), насыщенным раствором NaHCO (10 мл) и насыщенным солевым раствором (10 мл). Объединенные водные слои экстрагировали 3 раза EtOAc (по 10 мл), затем объединенные органические фракции сушили над MgSO, фильтровали и концентрировали досуха. Сырой продукт очищали на колонке Biotage с силикагелем (25 г), элюируя 0-10% MeOH в DCM (200 мл всего) с получением диастереомерной смеси соединения  и .
[0407]
78
79
72
73
Соединения  и  разделяли на колонке Chiral Technologies' 5 мкМ Chiralpak IA соответствующего размера, элюируя системой растворителей гептан:EtOH:MeOH:DEA (70:15:15:0,1). После концентрирования и сушки до твердого вещества с помощью вакуумного насоса получали: соединение  (95 мг, 0,196 ммоль, 19,5%-ный выход) в виде первой элюированной фракции; и соединение  (75 мг, 0,155 ммоль, 15,4%-ный выход) в виде второй элюированной фракции.
[0408]
78
ER-899742
Соединение  (95 мг, 0,196 ммоль) растворяли при перемешивании в диоксане (17 мкл), затем добавляли по каплям 4н раствор HCl в диоксане (0,49 мл 1,97 ммоль, 10 эквивалентов) в течение 3 минут при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали в течение еще 4 часов, потом, после полного завершения реакции, реакционную смесь концентрировали и азеотропно отгоняли 3 раза с использованием толуола (по 10 мл) досуха и далее сушили в высоком вакууме с получением -HCl (69 мг, 0,164 ммоль, 84%) выход) в виде HCl соли, которая не требовала дополнительной очистки.
[0409] Непрямое определение абсолютной стереохимии ER-899742
[0410] Схема 20
[0411]
ER-899742
2001
81
схеме 20
Tetrahedron Asymmetry
12,
Для определения абсолютной стереохимии  использовали косвенный способ с использованием подтвержденного хирального исходного вещества, описанный в работе Tsuzuki, et. al., , 29891 с получением хирального соединения  по .
[0412]
80
(3S,4S
трет-
(3S,6S
трет-
H
К перемешиваемому раствору )-бутил3-(бензиламино)-4-гидроксипирролидин-1-карбоксилата  (3,091 г, 10,57 ммоль) и имидазола (3,60 г, 52,9 ммоль) в DCM (185 мл) добавляли триэтиламин (4,42 мл, 31,7 ммоль). Полученную смесь охлаждали до 1-2°C, и затем по каплям добавляли раствор тионилхлорида (1,16 мл, 15,9 ммоль) в DCM (46 мл) в течение 30 минут. Смесь перемешивали при 1-2°C в течение 6 часов, нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи, после чего реакционную смесь гасили водой (46 мл). Органический слой разделяли, концентрировали с получением сырого продукта в виде белого цвета твердого вещества/пены, который хроматографировали на колонке с силикагелем (н-гептан/EtOAc 2:1) с получением 2-оксида )-бутил3-бензилтетрагидропирроло[3,4-d][1,2,3]оксатиазол-5(3)-карбоксилата (2,10 г, 6,21 ммоль, 58,7%-ный выход) в виде твердого вещества белого цвета.
[0413]
(3S,6S
трет-
3H
(3S,6S
трет-
2
4
К перемешиваемому раствору 2-оксида )-бутил3-бензилтетрагидропирроло[3,4-d][1,2,3]оксатиазол-5()-карбоксилата (2,10 г, 6,21 ммоль) в 1,2-дихлорэтане (10 мл), разбавленному ацетонитрилом (10 мл) и водой (10 мл), охлаждаемому до 2-3°C, добавляли гидрат рутений(III) хлорида (14 мг), затем перйодат натрия (1,39 г, 6,50 ммоль). Полученную смесь перемешивали при 2-3°C в течение 1 часа, нагревали при 17-18°C в течение 1 часа и перемешивали при этой температуре в течение 16 часов. Добавляли 20 масс% раствор NaSO (5 г), потом EtOAc (30 мл), после чего полученную смесь интенсивно перемешивали в течение 10 мин и фильтровали через слой из целита (2 г). Органический слой разделяли, промывали 20 масс% раствором сульфитом натрия (5 г), 20 масс% раствором NaCl (5 г) и концентрировали с получением масла светло-сиреневого/серого цвета. Сырое масло пропускали через слой силикагеля (10 г), элюируя EtOAc (120 мл) и концентрировали досуха с получением 2,2-диоксида )-бутил3-бензилтетрагидропирроло[3,4-d][1,2,3]оксатиазол-5(3H)-карбоксилата (1,54 г, 4,35 ммоль, 70,0%-ный выход) в виде твердого вещества белого цвета.
[0414]
82
81
(3S,6S
трет-
(3S,4S
трет-
(3S,4R
трет-
3
2,2-Диоксид )-бутил3-бензилтетрагидропирроло[3,4-d][1,2,3]оксатиазол-5(3H)-карбоксилата (20 мг, 0,056 ммоль) растворяли в TBAF (1M раствор в ТГФ, 1,0 мл) и нагревали с обратным холодильником в течение ночи, после чего реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и подкисляли HCl (1M раствор, 2 мл). Через 2 часа смесь нейтрализовали с помощью NaHCO (9% водный раствор, 2,5 г) и экстрагировали EtOAc (10 мл). Органический слой разделяли, концентрировали и объединяли с двумя дополнительными партиями, используя по 100 мг (по 0,282 ммоль) исходного оксатиазола для каждой партии. Объединенные сырые продукты очищали хроматографией на колонке с силикагелем (н-гептан/EtOAc 1:1) с получением )-бутил3-(бензиламино)-4-фторпирролидин-1-карбоксилата  (29 мг, 0,099 ммоль, 15,9%-ный выход), в виде масла светло-коричневого цвета и менее полярного на ТСХ (силикагель), и )-бутил3-(бензиламино)-4-фторпирролидин-1-карбоксилата  (20 мг, 0,068 ммоль, 11,0%-ный выход) в виде масла светло-коричневого цвета и более полярного на ТСХ (силикагель).
[0415]
81
83
(3S,4R
трет-
(3S,4R
трет-
3
)-Бутил3-(бензиламино)-4-фторпирролидин-1-карбоксилат  (16 мг, 0,054 ммоль) подвергали гидрированию с помощью 10 масс% Pd-C (10 мг) в этаноле (3 мл). После полного завершения реакции реакционную смесь фильтровали, концентрировали и азеотропно отгоняли с CDCl с получением )-бутил3-амино-4-фторпирролидин-1-карбоксилатаа  (8,3 мг, 0,041 ммоль, 75,9%-ный выход).
[0416]
38
ER-895194
78
78
ER-899742
(3S,4R
трет-
К перемешиваемому раствору )-бутил3-амино-4-фторпирролидин-1-карбоксилата и соединения  или  (15 мг, 0,050 ммоль) в ДМФ (0,2 мл) добавляли пропилфосфоновый ангидрид (0,2 г 50% раствора в EtOAc) при 40°C в течение 2 часов. Реакционную смесь пропускали через слой из силикагеля (3 г, элюируя смесью гептан-EtOAc 1:3), и затем дополнительно очищали с помощью препаративной ТСХ (н-гептан/EtOAc 1:4) с получением соответствующего амида  в виде масла желто-зеленого цвета (11,2 мг, 0,023 ммоль, 56%-ный выход за 2 стадии). Данные 1H-ЯМР и ВЭЖХ соответствовали соединению , как описано выше, таким образом, абсолютная стереохимия  ненапрямую подтверждалась.
[0417]
HER-899742
ER-899742-01
ER-899742-01
ER-899742-01
Способ кристаллизации
Рентгеноструктурный анализ
2R,6R
3S,4R
2
Абсолютную стереохимию  также подтверждали с помощью рентгеновской дифракции. : 5,3 мг  (партия MC2-1130-120-1) растворяли в 0,5 мл IPA и 0,3 мл HO. Сосуд, содержащий раствор, закрывали крышкой и хранили при комнатной температуре в течение дня. На следующий день крышку снимали, и IPA медленно выпаривали в течение дня при комнатной температуре. На следующий день сосуд закрывали крышкой и флакон хранили при комнатной температуре в течение 2-х недель, после чего появлялись бесцветные игольчатые кристаллы , из которых отбирали монокристалл для рентгеноструктурного анализа. : Оборудование: R-AXIS RAPID II (RIGAKU); Источник рентгеновских лучей: CuKa (1=1,54187A); Температура: 297 K (23,85°C); Измерение: Метод колебаний вдоль оси ω. Размер кристаллов: 0,1×0,1×0,4 мм. Кристаллическую структуру растворяли при конечном R-факторе и параметре Flack -0,01.Структуру  определяли как гидрохлорид ()-4-(8-цианохинолин-5-ил)-N-[()-4-фторпирролидин-3-ил]-6-метилморфолин-2-карбоксамид. См. фиг.8 для рисунка ORTEP.
[0418]
82
3S
4S
трет-
(3S,4S
трет-
3
(,)-Бутил3-(бензиламино)-4-фторпирролидин-1-карбоксилат  (24 мг, 0,082 ммоль) подвергали гидрированию на 10 масс% Pd-C (10 мг) в этаноле (3 мл). Реакционную смесь фильтровали, концентрировали и азеотропно сушили с CHCl с получением )-бутил3-амино-4-фторпирролидин-1-карбоксилата (16,6 мг, 0,081 ммоль, 99,2%-ный выход), который использовали на следующей стадии без очистки.
[0419]
38
ER-895194
85
(3S,4S
трет-
(3S,4S
трет-
3-
2R,6R
К перемешиваемому раствору )-бутил3-амино-4-фторпирролидин-1-карбоксилата (12,5 мг, 0,061 ммоль) и соединения  или  (18 мг, 0,061 ммоль) в ДМФ (0,2 мл) обрабатывали ангидридом пропилфосфоновой кислоты (50% раствор в EtOAc; 0,2 г,) при 40°C в течение 2 часов. Реакционную смесь пропускали через слой силикагеля (3 г, элюируя смесью гептан-EtOAc 1:3), и затем дополнительно очищали с помощью препаративной ТСХ (н-гептан/EtOAc 1:4) с получением )-бутил(()-4-(8-цианохинолин-5-ил)-6-метилморфолин-2-карбоксамидо)-4-фторпирролидин-1-карбоксилата  (14,2 мг, 0,029 ммоль, 47%-ный выход за 2 стадии) в виде масла желто-зеленого цвета.
[0420] ER-899745
ER-899742
79
-HCl (62,3 мг, 0,148 ммоль, 96%-ный выход) был получен с использованием тех же эквивалентов реагентов, что и для -HCl, исходя из соединения  (75 мг, 0,155 ммоль).
ER-894550
ER-899742
38
ER-894550
3
(5,3 мг, 0,016 ммоль, 18,4%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25,9 мг, 0,087 ммоль) и гидрохлорида этиламина (206 мг, 0,962 ммоль). Вместо DCM использовали ДМФ (0,5 мл).  очищали методом ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка X-Bridge C18 19×100 мм; элюируя градиентом с повышающимся содержанием ацетонитрила c 0,1% муравьиной кислотой), затем объединяли желаемые фракции, концентрировали и сушили в вакууме. Фракции, содержащие продукт, объединяли и концентрировали досуха с последующим разбавлением в MeOH (1 мл), пропускали через основной слой из силикагеля (Biotage SiCO, 1 г, элюируя MeOH (1 мл)), концентрировали и сушили в вакууме.
[0421] ER-895473
ER-899742
38
ER-895473
S
трет-
3
(103 мг, 0,261 ммоль, 27,1%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (286 мг, 0,962 ммоль) и ()-бутил2-этилпиперазин-1-карбоксилата (206 мг, 0,962 ммоль). Вместо DCM в реакции образования амида использовали ДМФ (3 мл), и в способе удаления Boc-группы использовали 2,0M раствор HCl в этиловом эфире (1,3 мл, 2,6 ммоль) с использованием ацетонитрила (1 мл) в качестве растворителя.  очищали с использованием ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка X-Bridge C18 19×100 мм; элюируя градиентом с повышающимся содержанием ацетонитрила в воде с 0,1% муравьиной кислотой). Фракции, содержащие продукт, объединяли и концентрировали досуха с последующим разбавлением в MeOH (1 мл), пропускали через основной слой из силикагеля (Biotage SiCO, 1 г, элюируя MeOH (1 мл)), концентрировали и сушили в вакууме.
[0422] ER-895474
ER-899742
38
(6,3 мг, 0,015 ммоль, 19,6%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (22,5 мг, 0,076 ммоль) и (3,4-дифторфенил)метанамина (10,83 мг, 0,076 ммоль). Удаление защитной группы Boc не требовалось.
[0423] ER-895475
ER-895473
38
R
трет-
(16,2 мг, 0,044 ммоль, 71,5%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (18,3 мг, 0,062 ммоль) и ()-бутилпирролидин-3-илкарбамата (11,46 мг, 0,062 ммоль).
[0424] ER-895476
ER-895474
38
(14,0 мг, 0,042 ммоль, 28,8%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (43,0 мг, 0,145 ммоль) и гидрохлорида азетидина (13,53 мг, 0,145 ммоль).
[0425] ER-895477
ER-895474
38
(26,1 мг, 0,058 ммоль, 32,1%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (54,0 мг, 0,182 ммоль) и 1,4'-бипиперидина (30,6 мг, 0,182 ммоль).
[0426] ER-895478
ER-895474
38
(15,9 мг, 0,047 ммоль, 29,0%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (48,4 мг, 0,163 ммоль) и циклопропанамина (11,42 мкл, 0,163 ммоль).
[0427] ER-895479
ER-895473
38
трет-
(14,9 мг, 0,042 ммоль, 23,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (53,2 мг, 0,179 ммоль) и бутилазетидин-3-илкарбамата (30,8 мг, 0,179 ммоль).
[0428] ER-897922
ER-895474
38
(15,1 мг, 0,041 ммоль, 48,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и 1-аминобутан-2-ола (13,0 мг, 0,146 ммоль).
[0429] ER-897923
ER-895474
38
(13,9 мг, 0,038 ммоль, 44,9%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и 2-этоксиэтанамина (13,0 мг, 0,146 ммоль).
[0430] ER-897924
ER-895474
38
R
(17,0 мг, 0,046 ммоль, 54,9%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и ()-2-аминобутан-1-ола (14,0 мг, 0,157 ммоль).
[0431] ER-897925
ER-895474
38
(4,5 мг, 0,012 ммоль, 14,5%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и 2-аминопропан-1,3-диола (14,0 мг, 0,154 ммоль).
[0432] ER-897926
ER-895474
38
(7,6 мг, 0,021 ммоль, 24,4%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и 3-аминопропан-1,2-диола (15,0 мг, 0,165 ммоль).
[0433] ER-897927
ER-895474
38
R
(15,0 мг, 0,039 ммоль, 46,9%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и ()-(тетрагидрофуран-2-ил)метанамина (15,0 мг, 0,148 ммоль).
[0434] ER-897928
ER-895474
38
(14,9 мг, 0,039 ммоль, 46,6%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и (тетрагидрофуран-2-ил)метанамина (16,0 мг, 0,158 ммоль).
[0435] ER-897929
ER-895474
38
(10,3 мг, 0,027 ммоль, 32,0%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и 2-пропоксиэтанамина (16,0 мг, 0,155 ммоль).
[0436] ER-897930
ER-895474
38
R
(12,8 мг, 0,033 ммоль, 39,8%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и ()-2-аминопентан-1-ола (16,0 мг, 0,155 ммоль).
[0437] ER-897931
ER-895474
38
(11,1 мг, 0,029 ммоль, 34,5%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и 2-изопропоксиэтанамина (15,0 мг, 0,145 ммоль).
[0438] ER-897932
ER-895474
38
(10,0 мг, 0,026 ммоль, 31,1%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и 1-метоксибутан-2-амина (0,0160 г, 0,155 ммоль).
[0439] ER-897933
ER-895474
38
(9,0 мг, 0,021 ммоль, 24,6%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и 2-амино-1-(2-фторфенил)этанола (23,0 мг, 0,148 ммоль).
[0440] ER-897934
ER-895474
38
S
(13,3 мг, 0,035 ммоль, 41,1%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и ()-2-амино-3-метилбутан-1-ола (15,0 мг, 0,145 ммоль).
[0441] ER-897935
ER-895474
38
(15,7 мг, 0,041 ммоль, 48,6%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и 2,2-диметоксиэтанамина (15,0 мг, 0,143 ммоль).
[0442] ER-897936
ER-895474
38
(10,4 мг, 0,027 ммоль, 32,2%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и 2-(2-аминоэтокси)этанола (16,0 мг, 0,152 ммоль).
[0443] ER-897937
ER-895474
38
1S,2S
(12,1 мг, 0,031 ммоль, 36,5%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и ()-2-аминоциклогексанола (23,0 мг, 0,200 ммоль).
[0444] ER-897938
ER-895474
38
(8,5 мг, 0,022 ммоль, 25,6%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и 2-аминоциклогексанола (17,0 мг, 0,148 ммоль).
[0445] ER-897939
ER-895474
38
(10,1 мг, 0,025 ммоль, 30,3%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и 2-аминогексан-1-ола (18,3 мг, 0,156 ммоль).
[0446] ER-897940
ER-895474
38
S
(10,3 мг, 0,026 ммоль, 30,9%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и ()-2-амино-3,3-диметилбутан-1-ола (19,0 мг, 0,162 ммоль).
[0447] ER-897941
ER-895474
38
S
(14,0 мг, 0,035 ммоль, 42,0%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и ()-2-аминогексан-1-ола (19,0 мг, 0,162 ммоль).
[0448] ER-897942
ER-895474
38
2S
3S
(9,9 мг, 0,025 ммоль, 29,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и (,)-2-амино-3-метилпентан-1-ола (18,0 мг, 0,154 ммоль).
[0449] ER-897943
ER-895474
38
S
(11,1 мг, 0,028 ммоль, 33,3%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и ()-2-амино-4-метилпентан-1-ола (18,0 мг, 0,154 ммоль).
[0450] ER-897944
ER-895474
38
R
(10,9 мг, 0,027 ммоль, 32,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и ()-2-амино-4-метилпентан-1-ола (18,0 мг, 0,154 ммоль).
[0451] ER-897945
ER-895474
38
(13,2 мг, 0,032 ммоль, 38,3%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и (4-метилморфолин-2-ил)метанамина (20,0 мг, 0,154 ммоль).
[0452] ER-897946
ER-895474
38
S
(16,1 мг, 0,035 ммоль, 42,0%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и ()-2-амино-4-(метилтио)бутан-1-ола (20,0 мг, 0,148 ммоль).
[0453] ER-897947
ER-895474
38
(12,0 мг, 0,029 ммоль, 34,3%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и 2-феноксиэтанамина (21,0 мг, 0,153 ммоль).
[0454] ER-897948
ER-895474
38
S
(12,0 мг, 0,028 ммоль, 33,1%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и ()-2-амино-3-фенилпропан-1-ола (24,0 мг, 0,159 ммоль).
[0455] ER-897949
ER-895474
38
(11,7 мг, 0,027 ммоль, 32,3%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и 2-феноксипропан-1-амина (29,0 мг, 0,192 ммоль).
[0456] ER-897950
ER-895474
38
(11,7 мг, 0,027 ммоль, 32,3%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и 1-амино-3-фенилпропан-2-ола (23,0 мг, 0,152 ммоль).
[0457] ER-897952
ER-895474
38
(14,0 мг, 0,032 ммоль, 38,6%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и 2-(пиридин-3-илокси)пропан-1-амина (24,0 мг, 0,158 ммоль).
[0458] ER-897955
ER-895474
38
(8,2 мг, 0,019 ммоль, 22,5%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и 2-(4-фторфенокси)этанамина (23,0 мг, 0,148 ммоль).
[0459] ER-897956
ER-895474
38
(11,2 мг, 0,026 ммоль, 26%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и 2-амино-1-(3-фторфенил)этанола (24,0 мг, 0,155 ммоль).
[0460] ER-897957
ER-895474
38
S
(9,8 мг, 0,022 ммоль, 26,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и ()-2-амино-3-циклогексилпропан-1-ола (30,0 мг, 0,191 ммоль).
[0461] ER-897958
ER-895474
38
(13,6 мг, 0,031 ммоль, 36,5%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и изохроман-1-илметанамина (24,0 мг, 0,147 ммоль).
[0462] ER-897960
ER-895474
38
(13,0 мг, 0,029 ммоль, 34,6%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и 1-амино-3-феноксипропан-2-ола (25,0 мг, 0,150 ммоль).
[0463] ER-897961
ER-895474
38
1S
2R
(9,7 мг, 0,022 ммоль, 25,8%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и 4-((,)-2-амино-1-гидроксипропил)фенола (32,0 мг, 0,191 ммоль).
[0464] ER-897962
ER-895474
38
1S,2S
(17,8 мг, 0,040 ммоль, 47,4%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и ()-2-амино-1-фенилпропан-1,3-диола (26,0 мг, 0,155 ммоль).
[0465] ER-897963
ER-895473
38
трет-
(3,1 мг, 0,007 ммоль, 8,4%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и бутил 4-(3-амино-2-гидроксипропил)пиперазин-1-карбоксилата (40,0 мг, 0,154 ммоль).
[0466] ER-897964
ER-895473
38
трет-
(12,7 мг, 0,036 ммоль, 21,5%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и бутил 3-аминоазетидин-1-карбоксилата (27,0 мг, 0,157 ммоль).
[0467] ER-897965
ER-895473
38
S
трет-
(0,4 мг, 0,001 ммоль, 1,3%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и ()-бутил3-аминопирролидин-1-карбоксилата (29,0 мг, 0,156 ммоль).
[0468] ER-897966
ER-895473
38
R
трет-
(0,4 мг, 0,001 ммоль, 1,3%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и ()-бутил 3-аминопирролидин-1-карбоксилата (29,0 мг, 0,156 ммоль).
[0469] ER-897967
ER-895473
38
S
трет-
(0,3 мг, 0,001 ммоль, 0,9%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и ()-бутил 3-аминопиперидин-1-карбоксилата (30,0 мг, 0,150 ммоль).
[0470] ER-897968
ER-895473
38
R
трет-
(0,4 мг, 0,001 ммоль, 1,3%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и ()-бутил3-аминопиперидин-1-карбоксилата (30,0 мг, 0,150 ммоль).
[0471] ER-897969
ER-895473
38
S
трет-
(0,2 мг, 0,001 ммоль, 0,6%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и ()-бутил2-(аминометил)пирролидин-1-карбоксилата (30,0 мг, 0,150 ммоль).
[0472] ER-897970
ER-895473
38
трет-
(3,4 мг, 0,008 ммоль, 9,4%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,084 ммоль) и бутил (2-аминоэтил)(бензил)карбамата (38,0 мг, 0,152 ммоль).
[0473] ER-898560
ER-895473
38
(11,2 мг, 0,030 ммоль, 30,9%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (28,8 мг, 0,097 ммоль) и пиридин-2-амина (9,12 мг, 0,097 ммоль).
[0474] ER-898561
ER-895474
38
(12,8 мг, 0,033 ммоль, 44,6%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (22,1 мг, 0,074 ммоль) и 6-метилпиридин-2-амина (8,04 мг, 0,074 ммоль).
[0475] ER-898562
ER-895474
38
(7,4 мг, 0,020 ммоль, 18,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (31,2 мг, 0,105 ммоль) и 5-метилизоксазол-3-амина (10,30 мг, 0,105 ммоль).
[0476] ER-898563
ER-895474
38
(6,5 мг, 0,017 ммоль, 16,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (30,7 мг, 0,103 ммоль) и гидрохлорида 2,2,2-трифторэтанамина (13,99 мг, 0,103 ммоль).
[0477] ER-898564
ER-895474
38
(1,4 мг, 0,004 ммоль, 3,8%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и 2,2-дифторэтанамина (8,18 мг, 0,101 ммоль).
[0478] ER-898565
ER-895474
38
(3,0 мг, 0,008 ммоль, 7,5%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (30,2 мг, 0,102 ммоль) и 3,3,3-трифторпропан-1-амина (11,49 мг, 0,102 ммоль).
[0479] ER-898566
ER-895474
38
N2,N2,
(14,6 мг, 0,037 ммоль, 20,4%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (53,7 мг, 0,181 ммоль) и 2-триметилпропан-1,2-диамина (20,99 мг, 0,181 ммоль).
[0480] ER-898914
ER-895474
38
(31,6 мг, 0,092 ммоль, 28,8%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (95,2 мг, 0,320 ммоль) и гидрохлорида 2-фторэтанамина (31,9 мг, 0,32 ммоль).
[0481] ER-898915
ER-895474
38
(19,1 мг, 0,054 ммоль, 19,3%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (82,3 мг, 0,277 ммоль) и гидрохлорида 3-фторпропан-1-амина (31,4 мг, 0,277 ммоль).
[0482] ER-898916
ER-895474
38
R
(14,6 мг, 0,037 ммоль, 21,5%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (51,4 мг, 0,173 ммоль) и ()-1,1,1-трифторпропан-2-амина (20 мг, 0,177 ммоль).
[0483] ER-898917
ER-895474
38
R
(27,6 мг, 0,066 ммоль, 20,4%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (95,7 мг, 0,322 ммоль) и ()-1,1,1-трифтор-3-метилбутан-2-амина (45,4 мг, 0,322 ммоль).
[0484] ER-898918
ER-895474
38
1H
(15,0 мг, 0,038 ммоль, 19,3%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (59,2 мг, 0,199 ммоль) и 1,3-диметил--пиразол-5-амина (22,13 мг, 0,199 ммоль).
[0485] ER-898919
ER-895474
38
1H
(13,1 мг, 0,035 ммоль, 10,5%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (98,1 мг, 0,33 ммоль) и 1-метил--пиразол-5-амина (32,0 мг, 0,33 ммоль).
[0486] ER-898920
ER-895474
38
(20,1 мг, 0,060 ммоль, 21,4%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (83,3 мг, 0,280 ммоль) и гидрохлорида 2-аминоацетонитрила (25,9 мг, 0,28 ммоль).
[0487] ER-898921
ER-895474
38
(11,4 мг, 0,032 ммоль, 12,8%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (73,1 мг, 0,246 ммоль) и гидрохлорида циклопропанкарбонитрила (25,5 мг, 0,246 ммоль).
[0488] ER-898922
ER-895474
38
(25,4 мг, 0,067 ммоль, 33,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (59,0 мг, 0,198 ммоль) и 1,2,4-тиадиазол-5-амина (20,07 мг, 0,198 ммоль).
[0489] ER-898923
ER-895474
38
(12,6 мг, 0,032 ммоль, 16,5%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (57,6 мг, 0,194 ммоль) и 3-метил-1,2,4-тиадиазол-5-амина (22,31 мг, 0,194 ммоль).
[0490] ER-899017
ER-899742
38
трет-
-HCl (328 мг, 0,769 ммоль, 65,3%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (350 мг, 1,177 ммоль) и бутил 2,6-диазаспиро[3,4]октан-6-карбоксилата (250 мг, 1,177 ммоль).
[0491] ER-899019
ER-899742
38
трет-
-HCl (26 мг, 0,059 ммоль, 58,2%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и бутил4-(аминометил)-4-фторпиперидин-1-карбоксилата (23,4 мг, 0,101 ммоль).
[0492] ER-899020
ER-899742
38
трет-
-HCl (25 мг, 0,062 ммоль, 61,4%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и бутил 3-(аминометил)азетидин-1-карбоксилата (18,8 мг, 0,101 ммоль).
[0493] ER-899023
ER-899742
38
трет-
-HCl (25,5 мг, 0,060 ммоль, 59,4%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и бутил 1,6-диазаспиро[3,4]октан-6-карбоксилата (21,4 мг, 0,101 ммоль).
[0494] ER-899024
ER-899742
38
трет-
-HCl (30,1 мг, 0,068 ммоль, 67,5%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и бутил1,7-диазаспиро[4,4]нонан-1-карбоксилата (22,8 мг, 0,101 ммоль).
[0495] ER-899025
ER-899742
38
1H
-HCl (32,1 мг, 0,077 ммоль, 76%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и 4-амино-1-метил--пиразол-3-карбоксамида (14,1 мг, 0,101 ммоль). Удаление защитной группы Boc не требовалось.
[0496] ER-899031
ER-899742
38
-HCl (30,1 мг, 0,079 ммоль, 78%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и (3-метилоксетан-3-ил)метанамина (10,2 мг, 0,101 ммоль). Удаление защитной группы Boc не требовалось.
[0497] ER-899032
ER-899742
38
-HCl (28,7 мг, 0,079 ммоль, 78%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и 2-оксо-6-азаспиро[3,3]гептана (10,0 мг, 0,101 ммоль). Удаление защитной группы Boc не требовалось.
[0498] ER-899033
ER-899742
38
-HCl (32,8 мг, 0,093 ммоль, 92%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и оксетан-3-амина (7,4 мг, 0,101 ммоль). Удаление защитной группы Boc не требовалось.
[0499] ER-899034
ER-899742
38
-HCl (26,4 мг, 0,067 ммоль, 66,2%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и дигидрохлорида оксетан-3,3-диилдиметанамина (19,1 мг, 0,101 ммоль). Удаление защитной группы Boc не требовалось.
[0500] ER-899035
ER-899742
38
-HCl (25,9 мг, 0,071 ммоль, 70,1%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и оксетан-2-илметанамина (8,8 мг, 0,101 ммоль). Удаление защитной группы Boc не требовалось.
[0501] ER-899036
ER-899742
38
трет-
-HCl (33,1 мг, 0,082 ммоль, 82%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и бутилпиперазин-1-карбоксилата (18,8 мг, 0,101 ммоль).
[0502] ER-899191
ER-899742
38
-HCl (30,7 мг, 0,081 ммоль, 80%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и азетидин-3-карбоксамида (10,1 мг, 0,101 ммоль). Удаление защитной группы Boc не требовалось.
[0503] ER-89919
ER-899742
38
трет-
2-HCl (34,4 мг, 0,078 ммоль, 77%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и бутил2,7-диазаспиро[4,4]нонан-2-карбоксилата (22,8 мг, 0,101 ммоль).
[0504] ER-899193
ER-899742
38
трет-
-HCl (38,1 мг, 0,081 ммоль, 80%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и бутил3,9-диазаспиро[5,5]ундекан-3-карбоксилата (25,7 мг, 0,101 ммоль).
[0505] ER-899196
ER-899742
38
-HCl (23,7 мг, 0,057 ммоль, 56,4%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и 4-аминоникотинамида (13,84 мг, 0,101 ммоль). Удаление защитной группы Boc не требовалось.
[0506] ER-89928
ER-899742
38
2-HCl (29,6 мг, 0,079 ммоль, 79%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и пиридин-4-амина (9,5 мг, 0,101 ммоль). Удаление защитной группы Boc не требовалось.
[0507] ER-899283
ER-899742
38
-HCl (31,1 мг, 0,083 ммоль, 83%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и пиридин-3-амина (9,5 мг, 0,101 ммоль). Удаление защитной группы Boc не требовалось.
[0508] ER-899285
ER-899742
38
трет-
1H
-HCl (28,5 мг, 0,059 ммоль, 58,6%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и бутил4-(4-амино--пиразол-1-ил)пиперидин-1-карбоксилата (26,9 мг, 0,101 ммоль).
[0509] ER-899286
ER-899742
38
трет-
1H
-HCl (31,7 мг, 0,070 ммоль, 69,2%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и бутил3-(4-амино--пиразол-1-ил)азетидин-1-карбоксилата (24,0 мг, 0,101 ммоль).
[0510] ER-899287
ER-895474
38
(29,7 мг, 0,079 ммоль, 78%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и (1H-пиразол-5-ил)метанамина (9,80 мг, 0,101 ммоль).
[0511] ER-899288
ER-895474
38
(20,7 мг, 0,057 ммоль, 56,6%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и 1H-пиразол-4-амина (8,38 мг, 0,101 ммоль).
[0512] ER-899289
ER-895474
38
(35,5 мг, 0,078 ммоль, 77%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и (3-(трифторметил)пиридин-2-ил)метанамина (17,77 мг, 0,101 ммоль).
[0513] ER-899290
ER-895474
38
(15,0 мг, 0,034 ммоль, 33,9%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и 1-(пиридин-2-ил)этанамина (12,33 мг, 0,101 ммоль).
[0514] ER-899291
ER-895474
38
(26,1 мг, 0,067 ммоль, 66,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и пиридин-2-илметанамина (10,91 мг, 0,101 ммоль).
[0515] ER-899292
ER-895474
38
(31,0 мг, 0,077,2 ммоль, 76,4%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и (6-метилпиридин-2-ил)метанамина (12,3 мг, 0,101 ммоль).
[0516] ER-899293
ER-895474
38
(32,0 мг, 0,079 ммоль, 77,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и (1-метилпиперидин-2-ил)метанамина (12,9 мг, 0,101 ммоль).
[0517] ER-899294
ER-895474
38
(32,2 мг, 0,080 ммоль, 79%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и (3-метилпиридин-2-ил)метанамина (12,3 мг, 0,101 ммоль).
[0518] ER-899334
ER-895473
38
R
трет-
(51,3 мг, 0,140 ммоль, 11,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (357,2 мг, 1,201 ммоль) и ()-бутил2-(аминометил)пирролидин-1-карбоксилата (224 мг, 1,201 ммоль).
[0519] ER-899414
ER-899742
38
R
трет-
-HCl (31,1 мг, 0,075 ммоль, 74,1%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и ()-бутил2-(аминометил)пирролидин-1-карбоксилата (20,2 мг, 0,101 ммоль).
[0520] ER-899415
ER-899742
38
S
трет-
-HCl (30,5 мг, 0,071 ммоль, 70,3%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и ()-бутил2-(аминометил)пиперидин-1-карбоксилата (21,6 мг, 0,101 ммоль).
[0521] ER-899416
ER-899742
38
трет-
-HCl (24,2 мг, 0,055 ммоль, 54,3%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и бутил3-амино-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-карбоксилата (22,84 мг, 0,101 ммоль).
[0522] ER-899417
ER-899742
38
трет-
-HCl (32,8 мг, 0,076 ммоль, 76%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и бутил4-аминоазепан-1-карбоксилата (21,62 мг, 0,101 ммоль).
[0523] ER-899418
ER-899742
38
1R,5S,6S
трет-
-HCl (29,6 мг, 0,072 ммоль, 70,9%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и ()-бутил 6-амино-3-азабицикло[3,1,0]гексан-3-карбоксилата (20,0 мг, 0,101 ммоль).
[0524] ER-899476
ER-899742
ER-899745
ER-899742
38
(3R,4S
трет-
(3S,4R
трет-
-HCl (31,0 мг, 0,068 ммоль, 67,4%-ный выход) или диастереомерную смесь  и  получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и 1:1 смеси )-бутил3-амино-4-фторпирролидин-1-карбоксилата и )-бутил3-амино-4-фторпирролидин-1-карбоксилата (20,6 мг, 0,101 ммоль).
[0525] ER-899477
ER-899742
38
(3R,4S
трет-
(3S,4R
трет-
-HCl (25,5 мг, 0,059 ммоль, 58,2%-ный выход) в виде диастереомерной смеси получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и смеси 1:1 )-бутил3-амино-4-фторпиперидин-1-карбоксилата и )-бутил3-амино-4-фторпиперидин-1-карбоксилата (22,02 мг, 0,101 ммоль).
[0526] ER-899479
ER-899742
38
трет-
-HCl (30,5 мг, 0,071 ммоль, 70,6%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и бутил6-амино-2-азаспиро[3,3]гептан-2-карбоксилата (21,42 мг, 0,101 ммоль).
[0527] ER-897383
ER-895474
38
(14,2 мг, 0,017 ммоль, 14,1%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (35,2 мг, 0,118 ммоль) и 2-аминоэтанола (10,9 мг, 0,178 ммоль). Вместо DMAC использовали ДМФ (1 мл).
[0528] ER-897385
ER-897383
38
(14,2 мг, 0,017 ммоль, 14,1%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (35 мг, 0,118 ммоль) и 2-метоксиэтанамина (13,7 мг, 0,178 ммоль).
[0529] ER-897445
ER-897383
38
R
трет-
трет-
(87 мг, 0,245 ммоль, 72,9% общий выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (100 мг, 0,336 ммоль) и ()-2-((бутилдифенилсилил)окси)пропан-1-амина (158 мг, 0,505 ммоль) с последующим удалением бутилдифенилсилил-защитной группы с использованием 1M раствора TBAF в ТГФ (0,43 мл, 0,43 ммоль) в DCM (1,1 мл), перемешиванием в течение 1 часа при комнатной температуре. Желаемый продукт очищали на силикагеле (элюировали 80-100% EtOAc в гептане).
[0530] ER-897446
ER-897445
38
S
трет-
(67 мг, 0,189 ммоль, 75% общий выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (75 мг, 0,252 ммоль) и ()-1-((бутилдифенилсилил)окси)пропан-2-амина (103 мг, 0,329 ммоль).
[0531] ER-897447
ER-897445
38
R
трет-
(78 мг, 0,220 ммоль, 65,5% общий выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (100 мг, 0,336 ммоль) и ()-1-((бутилдифенилсилил)окси)пропан-2-амина (158 мг, 0,505 ммоль).
[0532] ER-897827
ER-897445
38
S
трет-
(48,2 мг, 0,131 ммоль, 64,9% общий выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (60 мг, 0,202 ммоль) и ()-1-((бутилдифенилсилил)окси)бутан-2-амина (90 мг, 0,303 ммоль).
[0533] ER-897828
ER-897445
38
S
трет-
(49,4 мг, 0,129 ммоль, 64% общий выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (60 мг, 0,202 ммоль) и ()-1-((бутилдифенилсилил)окси)-3-метилбутан-2-амина (103 мг, 0,303 ммоль).
[0534] ER-897829
ER-897445
38
S
трет-
(65,2 мг, 0,157 ммоль, 77,7% общий выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (60 мг, 0,202 ммоль) и ()-2-((бутилдифенилсилил)окси)-1-фенилэтанамина (114 мг, 0,303 ммоль).
[0535] ER-897830
ER-897445
38
R
трет-
(60,2 мг, 0,145 ммоль, 71,8% общий выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (60 мг, 0,202 ммоль) и ()-2-((бутилдифенилсилил)окси)-1-фенилэтанамина (114 мг, 0,303 ммоль).
[0536] ER-899722
ER-895474
38
(79 мг, 0,215 ммоль, 25,6%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (250 мг, 0,841 ммоль) и 2-метилпропан-1,2-диамина (0,09 мл, 0,841 ммоль). Вместо DMAC использовали DCM (2 мл).
[0537] ER-899295
ER-899722
38
1H
(27,5 мг, 0,0,71 ммоль, 70,4%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (30 мг, 0,101 ммоль) и 3-амино--пиразол-4-карбонитрила (10,9 мг, 0,101 ммоль).
[0538] ER-898946
38
ER-898946
трет-
трет-
: Соединение  (50 мг, 0,168 ммоль), HATU (128 мг, 0,336 ммоль) и DIEA (0,176 мл, 1,009 ммоль) растворяли в смеси DCM:ДМФ (5 мл:2 мл), затем добавляли бутил 4-аминопиперидин-1-карбоксилат (67,4 мг, 0,336 ммоль). Полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов, после чего добавляли дополнительное количество HATU (128 мг, 0,336 ммоль) и бутил4-аминопиперидин-1-карбоксилат (67,4 мг, 0,336 ммоль) с последующим перемешиванием в течение еще 3 часов. После полного завершения реакции реакционную смесь концентрировали досуха, и сырой продукт очищали хроматографией (25 г силикагеля), элюируя 10% ацетонитрилом в DCM с получением чистого Boc-защищенного продукта. Boc-защищенный продукт растворяли в смеси DCM (4 мл)/ТФК (0,5 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов, после чего растворитель удаляли при пониженном давлении, остаток растворяли в MeOH (10 мл) и добавляли 0,3 г MP-карбоната (pH>7). Полученную суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин, после чего полимерные гранулы фильтровали, промывали MeOH (10 мл), и растворитель концентрировали и сушили в высоком вакууме с получением  (12 мг, 0,027 ммоль, 16,0%-ный выход).
[0539] ER-898694
ER-898946
38
S
трет-
-2 HCl (67 мг, 0,155 ммоль, 46,1%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (100 мг, 0,336 ммоль) и ()-бутил2-(аминометил)морфолин-4-карбоксилата (95 мг, 0,437 ммоль) с последующим добавлением 3н раствора HCl в диоксане (31 мкл) с получением после концентрирования и сушки в высоком вакууме дигидрохлоридной соли.
[0540] Альтернативный способ получения ER-899742
ER-899745
38
77
78
79
3
2
4
и : К перемешиваемому раствору соединения  (2,91 г, 9,79 ммоль) и TEA (1,706 мл, 12,24 ммоль) в DCM (50,0 мл) добавляли соединение  (2,000 г, 9,792 ммоль) и HOBT (2,65 г, 19,59 ммоль). Реакционную смесь охлаждали до 0°C и затем добавляли порциями EDC (3,75 г, 19,59 ммоль), после чего смесь нагревали до 40°C и перемешивали в течение 3 часов. Добавляли DCM (50 мл), и слои разделяли, после чего органический слой промывали насыщенным раствором хлорида аммония (20 мл), насыщенным раствором NaHCO (20 мл), насыщенным солевым раствором (20 мл), сушили над NaSO, фильтровали и концентрировали досуха. Сырой продукт очищали на силикагеле (Biotage SP4, элюируя смесью 10% MeOH:DCM). Диастереомеры разделяли, как описано выше, с получением соединения  (1,65 г, 3,41 ммоль, 34,8%-ный выход) и соединения  (1,49 г, 3,08 ммоль, 31,5%-ный выход).
[0541]
78
ER-899742
ER-899742
Соединения  (470 мг, 0,97 ммоль) растворяли в перемешиваемом растворе DCM (5,0 мл) и затем добавляли ТФК (2,5 мл, 32,45 ммоль), после чего реакционную смесь нагревали до 49°C и перемешивали в течение 2 часов. После полного завершения реакции реакционную смесь азеотропно отгоняли досуха три раза с толуолом (по 2 мл) и затем сушили в вакууме с получением -ТФК (543 мг, 0,97 ммоль, 100%-ный выход продукта, который содержал 1,5 молекулы ТФК на одну молекулу  согласно данным масс-спектра) в виде твердого вещества оранжевого цвета.
[0542]
ER-899742
ER-899742
Свободное основание  может быть получено путем растворения соли ТФК в MeOH и добавления гидроксидной формы Amberlite IRA 400, и либо перемешивая в течение 10 мин, либо сразу достигая нейтрального значения рН. Полученную суспензию фильтровали, промывали МеОН два раза равными объемами, и объединенные фильтраты концентрировали до пастообразного состояния. Пасту азеотропно отгоняли два раза с толуолом с получением  в форме свободного основания с количественным выходом. Затем HCl солевая форма может быть синтезирована способом, описанным выше.
[0543] ER-899742
78
ER-899742
-HCl соль может быть получена непосредственно из соединения  обработкой 5,5н HCl в изопропаноле с получением желаемого продукта с количественным выходом после перемешивания в течение 2 час при комнатной температуре с последующей азеотропной отгонкой досуха 3 раза с толуолом и сушкой в высоком вакууме в виде 1,5 молекул HCl на одну молекулу  согласно данным масс-спектрального анализа.
[0544] ER-899464
38
ER-899464
ER-899464
ER-899464
-HCl: К перемешиваемому раствору соединения  (50 г, 168,2 ммоль) в ДМФ (250 мл) добавляли TEA (29,3 мл, 210,2 ммоль), затем 4-амино-1-метилпиперидин (28,8 г, 252,3 ммоль) и HOBT (45,4 г, 336,4 ммоль). Реакционную смесь охлаждали до 0°C, затем частями добавляли EDC (64,5 г, 336,4 ммоль). Реакционную смесь нагревали до 40°C и перемешивали в течение еще 6 часов. После полного завершения реакции реакционную смесь медленно выливали в сосуд, содержащий воду (1,5 л), при перемешивании, после чего добавляли DCM (1,5 л), перемешивали еще 10 мин. Два слоя разделяли, и водный слой экстрагировали три раза DCM (600 мл каждый). Объединенные органические слои концентрировали до раствора в ДМФ, затем концентрировали при 50°C в вакууме. Полученную взвесь желтого цвета разбавляли этиловым эфиром (1 л) и перемешивали в течение 15 мин, после чего твердое вещество собирали фильтрованием, затем слой на фильтре промывали этиловым эфиром (0,5 л) и сушили в вакууме с получением  (44,9 г, 114 ммоль, 67,9%-ный выход). HCl соль получали растворением  (22,8 г, 57,9 ммоль) в 10 объемах изопропанола и 1 объеме воды с последующим добавлением 1 эквивалента 5,5н раствора HCl в изопропаноле с получением осадка белого цвета. Твердое вещество фильтровали и промывали изопропанолом (2 об.), потом сушили в вакууме с получением -HCl (20,3 г, 47,2 ммоль, 81,5%).
[0545] ER-899477
ER-899464
38
3S,4R
трет-
(78 мг, 0,196 ммоль, 58,3%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (100 мг, 0,336 ммоль) и ()-бутил3-амино-4-фторпиперидин-1-карбоксилата (220 мг, 1,009 ммоль).
[0546] ER-897968
ER-899464
38
R
трет-
(475 мг, 1,252 ммоль, 37,2%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (1,00 г, 3,364 ммоль) и ()-бутил 3-аминопиперидин-1-карбоксилата (2,021 г, 10,091 ммоль).
[0547] ER-899018
ER-899464
38
трет-
(370 мг, 0,975 ммоль, 58,0%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (500 мг, 1,682 ммоль) и бутил (азетидин-3-илметил)(метил)карбамата (500 мг, 2,497 ммоль).
[0548] ER-899819
ER-899464
38
трет-
(62 мг, 0,158 ммоль, 31,3%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (150 мг, 0,505 ммоль) и бутил3-аминоазепан-1-карбоксилата (324 мг, 1,514 ммоль).
[0549] ER-899416
ER-899464
38
1R,3S,5S
трет-
-HCl (53 мг, 0,120 ммоль, 35,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (100 мг, 0,336 ммоль) и ()-бутил 3-амино-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-карбоксилата (76 мг, 0,336 ммоль).
[0550] ER-899417
ER-899464
38
трет-
-HCl (56 мг, 0,130 ммоль, 38,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (100 мг, 0,336 ммоль) и бутил 4-аминоазепан-1-карбоксилата (144 мг, 0,673 ммоль).
[0551] ER-899285
ER-899464
38
трет-
1H
-HCl (52 мг, 0,108 ммоль, 32,1%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (100 мг, 0,336 ммоль) и бутил 4-(4-амино--пиразол-1-ил)пиперидин-1-карбоксилата (179 мг, 0,673 ммоль)
[0552] ER-899021
ER-899464
38
трет-
-HCl (62 мг, 0,140 ммоль, 41,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (100 мг, 0,336 ммоль) и бутил 2,6-диазаспиро[3,5]нонан-6-карбоксилата (152 мг, 0,673 ммоль).
[0553] ER-899619
ER-899464
38
S
трет-
-HCl (36 мг, 0,084 ммоль, %-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (100 мг, 0,336 ммоль) и ()-бутил 3-(метиламино)пиперидин-1-карбоксилата (216 мг, 1,009 ммоль).
[0554] ER-899616
ER-899464
38
R
трет-
-HCl (21 мг, 0,049 ммоль, %-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (100 мг, 0,336 ммоль) и ()-бутил 3-(метиламино)пиперидин-1-карбоксилата (216 мг, 1,009 ммоль).
[0555] ER-898566
ER-899464
38
N2,N2,
-HCl (272 мг, 0,630 ммоль, 37,5%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (500 мг, 1,682 ммоль) и 2-триметилпропан-1,2-диамина (586 мг, 5,045 ммоль).
[0556] ER-899618
ER-899464
38
-HCl (4,8 мг, 0,011 ммоль, 3,2%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из соединения  (500 мг, 1,682 ммоль) и 4-аминопиколинамида (138 мг, 1,009 ммоль).
[0557] ER-899477
ER-899464
38
(3S,4R
трет-
(3R,4S
трет-
(78 мг, 0,196 ммоль, 58,3%-ный выход в виде диастереомерной смеси) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (100 мг, 0,336 ммоль) и рацемической смеси )-бутил3-амино-4-фторпиперидин-1-карбоксилата и )-бутил3-амино-4-фторпиперидин-1-карбоксилата (220 мг, 1,009 ммоль).
[0558] ER-895415
соединения 41
схеме 11
38
ER-895415
2
4
в качестве примера  по : К перемешиваемому раствору соединения  (1,10 г, 3,70 ммоль) в DCM (5 мл) при 0°C в течение 2 мин по каплям добавляли оксалил хлорид (1,0 мл, 11,42 ммоль). Реакционную смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа, после чего реакционную смесь концентрировали и сушили в вакууме. Высушенный сироп охлаждали до 0°C, затем медленно добавляли MeOH (5 мл) при перемешивании. После полного завершения реакции реакционную смесь концентрировали досуха, разбавляли DCM (10 мл), промывали насыщенным сульфитом натрия (3 мл), насыщенным солевым раствором (3 мл) и затем сушили над NaSO, фильтровали и концентрировали досуха. После объединения желаемых фракций, концентрирования и сушки в вакууме сырой продукт очищали на силикагеле (элюирование градиентом 0-50% EtOAc в гептане) с получением  (894 мг, 2,81 ммоль, 76%-ный выход).
[0559] Получение примера соединения ER-899332 в соответствии со схемой 21:
[0560] Схема 21
[0561]
[0562]
ER-89947
ER-899332
Раствор 2-HCl (49,8 мг, 0,119 ммоль) и параформальдегида (8,90 мг, 0,297 ммоль) в DCM (0,5 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Добавляли триацетоксиборгидрид натрия (62,8 мг, 0,297 ммоль), и полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 дней. После удаления растворителей, неочищенный продукт хроматографировали на силикагеле (15% MeOH в DCM) с получением  (8,16 мг, 0,021 ммоль, 18,3%-ный выход).
[0563] ER-899457
ER-899332
ER-899336
(50 мг, 0,117 ммоль, 97%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (50 мг, 0,122 ммоль).
[0564] ER-899836
ER-899477
ER-899836
: Перемешиваемый раствор  (76 мг, 0,191 ммоль) в 37%-ном растворе формальдегида в воде (0,5 г, 16,652 ммоль) и муравьиной кислоте (0,5 мл, 13,036 ммоль) нагревали при 80°C в течение 3 часов, затем, после полного завершения реакции, реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры. Смесь азеотропно отгоняли досуха четыре раза с толуолом (по 2 мл каждый раз), и полученный остаток растворяли в MeOH (5 мл) и затем добавляли гидроксидную форму Amberlite IRA400 (2 г) и перемешивали в течение 10 мин. Добавляли дополнительное количество Amberlite IRA400 при перемешивании до тех пор, пока значение pH не становилось нейтральным, после чего суспензию фильтровали, концентрировали и азеотропно отгоняли два раза с толуолом (по 2 мл). Затем сырое вещество очищали на силикагеле (Biotage SNAP Ultra, 25 г, элюируя смесью 1-40% MeOH в DCM) с получением после объединения желаемых фракций, концентрирования и сушки в вакууме (55 мг, 0,134 ммоль, 69,9%-ный выход).
[0565] ER-899836
ER-899836
(50 мг, 0,124 ммоль) растворяли в ацетонитриле (1 мл) с последующим добавлением 2M раствора HCl в диэтиловом эфире (0,062 мл, 0,124 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Полученный раствор оранжевого цвета концентрировали досуха и помещали в высокий вакуум на ночь с получением -HCl с количественным выходом.
[0566] ER-899688
ER-899836
ER-897968
-HCl (381 мг, 0,886 ммоль, 88,4%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из  (600 мг, 1,58 ммоль).
[0567] ER-899820
ER-899836
ER-899819
-HCl (45 мг, 0,110 ммоль, 69,9%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения -HCl, исходя из  (62 мг, 0,158 ммоль).
[0568] ER-899337
ER-899836
ER-897968
(35,6 мг, 0,087 ммоль, 24%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (142 мг, 0,361 ммоль) в виде свободного основания.
[0569] ER-899835
ER-899836
ER-899718
(29 мг, 0,071 ммоль, 81%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (34 мг, 0,086 ммоль) в виде свободного основания.
[0570] ER-899837
ER-899836
ER-899417
(35,6 мг, 0,087 ммоль, 24,2%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (142 мг, 0,361 ммоль) в виде свободного основания.
[0571] ER-898707
ER-899836
ER-898694
-формиат (17 мг, 0,0,36 ммоль, 78%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (20 мг, 0,046 ммоль), сохраняя в виде формиатной соли вместо преобразования в НСl соль, как описано выше.
[0572] Другие примеры получения соединений, изображенные общей структурой 39 или 40 на схеме 11
ER-895472
38
ER-895472
3
2
4
: К охлажденному раствору соединения  (22,7 мг, 0,076 ммоль) и TEA (12,8 мкл, 0,092 ммоль) в ТГФ при -15°C добавляли этилхлорформиат (8,1 мкл, 0,084 ммоль). После перемешивания в течение 1,5 часа добавляли гидроксид аммония (6,0 мкл, 0,153 ммоль), затем продолжали перемешивание в течение еще 2 часа при -10°C. Реакционную смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры и перемешивали еще 2 час. После полного завершения реакции реакционную смесь гасили добавлением насыщенного раствора NaHCO (5 мл) с последующим экстрагированием водной фазы 3 раза EtOAc (по 5 мл). Объединенные органические слои сушили над безводным NaSO, фильтровали и концентрировали с получением масла светло-желтого цвета. Сырой продукт очищали методом ВЭЖХ с обращенной фазой на колонке C-18 (колонка Water's X-Bridge C18 19×100 мм; использовали градиент смеси ацетонитрил/вода с 0,1% муравьиной кислотой) с получением  (6,2 мг, 0,021 ммоль, 27,5%-ный выход).
[0573] ER-899122
38
ER-899122
3
2
4
: К охлажденному раствору соединения (80 мг, 0,24 ммоль) и 4-метилморфолина (32 мкл, 0,288 ммоль) в ТГФ (4 мл) при 0°C добавляли изопропил хлорформиат (38 мкл, 0,084 ммоль). После перемешивания в течение 30 мин добавляли тетрагидропиран-4-иламин (29,1 мг, 0,288 ммоль), после чего продолжали перемешивание в течение еще 2 часа при -10°C. Реакционную смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры и перемешивали еще 16 часов. После полного завершения реакции реакционную смесь гасили добавлением насыщенного раствора NaHCO (5 мл), затем водную фазу экстрагировали 3 раза EtOAc (по 5 мл каждый раз). Объединенные органические слои сушили над безводным NaSO, фильтровали и концентрировали с получением масла светло-желтого цвета. После концентрирования желаемых фракций досуха и помещения продукта в высокий вакуум, сырой продукт очищали на силикагеле (25 г), элюируя линейным градиентом 80-100% EtOAc в гептане с получением  (40 мг, 0,100 ммоль, 41,7%-ный выход)
[0574] ER-899121
ER-899122
38
(40 мг, 0,104 ммоль, 43,3%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (80 мг, 0,24 ммоль) и 3-аминометил-оксетана (25,06 мг, 0,288 ммоль).
[0575] ER-899123
ER-899122
38
(40 мг, 0,109 ммоль, 45,5%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (80 мг, 0,24 ммоль) и 3-аминотетрагидрофурана (25,06 мг, 0,288 ммоль).
[0576] ER-899140
ER-899122
38
трет-
(20 мг, 0,051 ммоль, 21,3%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (80 мг, 0,24 ммоль) и бутил(2-аминоэтил)(метил)карбамата (50,1 мг, 0,288 ммоль), после удаления Вос-группы с использованием ТФК и нейтрализации MP-карбонатом, как описано.
[0577] ER-899151
ER-899152
ER-899122
38
ER-899122
(15 мг, 0,035 ммоль, 14,6%-ный выход) и  (15 мг, 0,035 ммоль, 14,6%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (80 мг, 0,24 ммоль) и 3-амино-1,1,1-трифтор-2-пропанола (37,1 мг, 0,288 ммоль) в виде смеси стереоизомеров. Два продукта разделяли методом хроматографии, описанным для . Стереоизомерные центры определяли произвольным образом и не были определены однозначно.
[0578] ER-899153
ER-899122
38
(32 мг, 0,083 ммоль, 34,4%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (80 мг, 0,24 ммоль) и гидрохлорида метилового эфира глицина (36,1 мг, 0,288 ммоль).
[0579] ER-899154
ER-899122
38
(16 мг, 0,041 ммоль, 17,3%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (80 мг, 0,24 ммоль) и диметилэтилендиамина (31,6 мкл, 0,288 ммоль).
[0580] ER-899159
ER-899160
ER-899122
38
ER-899122
(14 мг, 0,033 ммоль, 13,8%-ный выход) и  (13 мг, 0,031 ммоль, 12,8%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (80 мг, 0,24 ммоль) и гидрохлорида 4-амино-1,1,1-трифторбутан-2-ола (51,6 мг, 0,288 ммоль) в виде смеси стереизомеров. Два продукта разделяли методом хроматографии, описанным для . Стереоизомерные центры определяли произвольным образом и не были определены однозначно.
[0581] ER-899161
ER-899122
38
(13 мг, 0,031 ммоль, 12,9%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (80 мг, 0,24 ммоль) и дигидрохлорида 4,4,4-трифторбутан-1,3-диамина (61,9 мг, 0,288 ммоль) в виде диастереомерной смеси.
[0582] ER-899152
ER-899153
2
4
(9 мг, 0,024 ммоль, 37,0%-ный выход) получали путем растворения  (24 мг, 0,65 ммоль) в MeOH (2 мл) и воде (0,5 мл) с последующим добавлением гидроксида лития (3,12 мг, 13,0 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 16 часов при комнатной температуре, затем, после полного завершения реакции, реакционную смесь подкисляли 3н раствором HCl до pH 3, потом экстрагировали 3 раза EtOAc (по 10 мл), органические слои объединяли, сушили над безводным NaSO, фильтровали и концентрировали досуха. Сырой продукт очищали на колонке C-18 для ВЭЖХ с обращенной фазой, элюируя линейным градиентом 10%-90% ацетонитрила в воде с 0,1% муравьиной кислотой, и концентрируя продукт желаемого пика с последующей сушкой в высоком вакууме.
[0583] ER-899278
ER-899140
38
R
трет-
(20 мг, 0,051 ммоль, 33,8%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (50 мг, 0,15 ммоль) и ()-бутил2-(аминометил)морфолин-4-карбоксилата (48,6 мг, 0,225 ммоль).
[0584] ER-899366
ER-899140
38
2S,6R
трет-
(70 мг, 0,171 ммоль, 42,4%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (120 мг, 0,404 ммоль) и ()-бутил2-(аминометил)-6-метилморфолин-4-карбоксилата (112 мг, 0,484 ммоль).
[0585] ER-899367
ER-899140
38
трет-
(40 мг, 0,102 ммоль, 38%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (80 мг, 0,269 ммоль) и бутилгексагидропирроло[3,4-c]пиррол-2(1H)-карбоксилата (68,5 мг, 0,373 ммоль).
[0586] ER-899459
ER-899122
38
N
N
(30 мг, 0,074 ммоль, 31,3%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (70 мг, 0,235 ммоль) и ,-диметилпиперидин-4-амина (36,2 мг, 0,283 ммоль).
[0587] ER-899464
ER-899122
38
(20 мг, 0,051 ммоль, 18,9%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (80 мг, 0,269 ммоль) и 1-метилпиперидин-4-амина (36,9 мг, 0,323 ммоль).
[0588] ER-899588
ER-899140
38
трет-
(40 мг, 0,105 ммоль, 44,8%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (70 мг, 0,235 ммоль) и бутилпиперидин-4-илкарбамата (56,6 мг, 0,283 ммоль).
[0589] ER-899608
ER-899140
38
трет-
(40 мг, 0,102 ммоль, 37,8%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (70 мг, 0,235 ммоль) и бутил(4-метилпиперидин-4-ил)карбамата (63,4 мг, 0,296 ммоль).
[0590] ER-899680
ER-899122
38
(40 мг, 0,098 ммоль, 19,2%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (100 мг, 0,336 ммоль) и 1-этилпиперидин-3-амина (43,1 мг, 0,336 ммоль).
[0591] ER-899431
ER-899122
38
(53 мг, 0,103 ммоль, 51,3%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (99 мг, 0,333 ммоль) и метиламина (2M раствор в ТГФ) (1,50 мл, 3,00 ммоль).
[0592] ER-899626
ER-899122
38
(29 мг, 0,071 ммоль, 35,3%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (60 мг, 0,202 ммоль) и 4-амино-1-этил пиперидина (25,9 мг, 0,202 ммоль).
[0593] ER-899718
ER-899140
38
трет-
(32 мг, 0,081 ммоль, 40,1%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (60 мг, 0,202 ммоль) и бутил4-амино-4-метилпиперидин-1-карбоксилата (47,6 мг, 0,222 ммоль).
[0594] Дополнительные соединения по примерам: Модификация общей структуры 39 по схеме 11:
[0595] Схема 22
[0596]
[0597] ER-899333
:
38
86
(3R,4S
трет-
3
2
4
-HClК перемешиваемому раствору соединения  (58,2 мг, 0,196 ммоль) и HBTU (89 мг, 0,235 ммоль) в DCM (1,94 мл) добавляли DIEA (137 мкл, 0,783 ммоль), затем )-бутил3-амино-4-фторпиперидин-1-карбоксилат (42,7 мг, 0,196 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи, потом? после полного завершения реакции? реакционную смесь концентрировали и разбавляли EtOAc (10 мл). Органический раствор промывали 2н водным раствором лимонной кислоты, насыщенным раствором NaHCO, сушили над безводным NaSO, фильтровали и концентрировали досуха. Сырой продукт очищали на силикагеле (50 г, элюируя смесью 40-100% EtOAc в гептане, 20 объемов колонки) с получением соединения  (58,5 мг, 0,118 ммоль, 56,2%-ный выход) в виде твердого вещества светло-желтого цвета.
[0598]
86
87
2
4
К перемешиваемому раствору соединения  (58,8 мг, 0,118 ммоль) и метилйодида (7,39 мкл, 0,118 ммоль) в ДМФ (1 мл), охлажденному до 0°C, добавляли NaH (5,20 мг, 0,13 ммоль, дисперсия в масле). Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 3,5 часов. После полного завершения реакции реакционную смесь охлаждали на бане с ледяной водой и гасили медленным добавлением насыщенного раствора хлорида аммония (5 мл), затем воды (5 мл) и экстрагировали два раза EtOAc (по 10 мл). Объединенные органические фазы сушили над безводным NaSO, фильтровали и концентрировали досуха. Сырой продукт очищали на силикагеле (25 г, элюируя 40-100% градиентом EtOAc в гептане, 20 объемов колонки) с получением соединения  (42,9 мг, 0,084 ммоль, 71,0%) в виде твердого вещества светло-желтого цвета.
[0599]
87
ER-89933
К перемешиваемому раствору соединения  (42,9 мг, 0,084 ммоль) в EtOAc (1 мл) добавляли 4,0 н HCl в 1,4-диоксане (0,419 мл, 1,677 ммоль) и затем перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа, затем, после полного завершения реакции, реакционную смесь концентрировали и сушили в вакууме с получением -HCl (23,4 мг, 0,054 ммоль, 62,3%).
[0600] Схема 23
[0601]
[0602] ER-8999335
38
88
трет-
3
2
4
: К перемешиваемому раствору соединения  (357,2 мг, 1,201 ммоль) и HBTU (547 мг, 1,442 ммоль) в DCM (10 мл) добавляли DIEA (0,84 мл, 4,806 ммоль) и бутил(азетидин-3-илметил)карбамат (224 мг, 1,201 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 3 часов, затем, после полного завершения реакции, реакционную смесь концентрировали, растворяли в EtOAc (25 мл) и промывали 2н водным раствором лимонной кислоты (20 мл), насыщенным раствором NaНСО (20 мл) и сушили над безводным NaSO, фильтровали и концентрировали досуха. Сырой продукт очищали на силикагеле (40 г, элюируя смесью 50-100% EtOAc/гептан, 20 объемов колонки) с получением соединения  (181,6 мг, 0,390 ммоль, 32,5%-ный выход) в виде твердого вещества светло-желтого цвета.
[0603]
88
ER-899335
4
2
4
3
2
4
К перемешиваемому раствору соединения  (52,6 мг, 0,113 ммоль) и этилйодида (10,50 мкл, 0,13 ммоль) в ДМФ (1,0 мл, 12,915 ммоль) при 0°C добавляли 60%-ный гидрид натрия (5,87 мг, 0,147 ммоль), после чего реакционную смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры и перемешивали в течение 6 часов. После полного завершения реакции реакционную смесь охлаждали до 0°C и гасили медленным добавлением насыщенного раствора NHCl (5 мл), и затем разбавляли водой (5 мл) и экстрагировали два раза EtOAc (по 10 мл). Объединенные органические фазы сушили над безводным NaSO, фильтровали и концентрировали досуха. Сырой продукт очищали на силикагеле (25 г, элюируя смесью 70-100% EtOAc в гептане, 20 объемов колонки) с получением Boc-защищенного промежуточного соединения, которое использовали на следующей стадии. Группу Boc удаляли растворением промежуточного соединения в EtOAc (1 мл) и добавлением ТФК (0,5 мл), и затем перемешивали в течение 1 часа. После полного завершения реакции реакционную смесь концентрировали досуха, растворяли в DCM (10 мл), промывали 2 раза насыщенным NaHCO, сушили над безводным NaSO, фильтровали, концентрировали и сушили в высоком вакууме с получением  (4,1 мг, 0,010, ммоль, 9,3%) в виде твердого вещества светло-желтого цвета.
[0604] Схема 24
[0605]
[0606] ER-899336:
ER-899334
ER-899336
4
2
4
К перемешиваемому раствору  (35,4 мг, 0,097 ммоль) и йодметана (0,013 мл, 0,213 ммоль) в ДМФ (1 мл) при 0°C добавляли 60%-ный гидрид натрия (9,69 мг, 0,242 ммоль), после чего реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. После полного завершения реакции реакционную смесь охлаждали до 0°C и гасили медленным добавлением насыщенного раствора NHCl (5 мл) и затем разбавляли водой (5 мл) и экстрагировали два раза с помощью EtOAc (по 10 мл). Объединенные органические фазы сушили над безводным NaSO, фильтровали и концентрировали досуха. После сбора желаемого вещества, концентрирования и сушки в высоком вакууме, сырой продукт очищали на силикагеле (25 г, элюируя смесью 70-100% EtOAc в гептане, 20 объемов колонки) с получением  (5,2 мг, 0,013 ммоль, 13,6%-ный выход).
[0607]
Схема 25
[0608]
[0609] ER-899481:
ER-898946
ER-899481
2
3
К перемешиваемому раствору  (60 мг, 0,158 ммоль) в ацетонитриле (10 мл) добавляли KCO (87 мг, 0,632 ммоль) и 2-бромацетамид (43,6 мг, 0,316 ммоль). Реакционную смесь нагревали до 60°C и перемешивали в течение 16 часов, затем, после полного завершения реакции, реакционную смесь фильтровали. После сбора желаемого вещества, концентрирования и сушки в высоком вакууме, полученный раствор концентрировали, и сырой продукт очищали на ВЭЖХ-колонке C-18 (элюируя 10%-50% ацетонитрилом в воде с 0,1% муравьиной кислотой) с получением  (43 мг, 0,099 ммоль, 62,3%-ный выход).
[0610] ER-885612 в качестве примера соединения 42 по схеме 12
13
ER-885612
4
: К охлажденному перемешиваемому раствору соединения  (25 мг, 0,088 ммоль) в ДМФ (0,5 мл) при 0°C добавляли NaH (3,5 мг, 0,088 ммоль, 60%-ная масляная дисперсия), затем метилйодид (16,5 мкл, 0,265 ммоль). Реакционную смесь перемешивали еще 20 мин, после чего медленно добавляли воду (1 мл). Гашеную реакционную смесь экстрагировали два раза DCM (по 2 мл), сушили над MgSO, фильтровали и концентрировали досуха. После объединения желаемых объединенных фракций, концентрирования и сушки в вакууме, очистка на колонке для препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка X-Bridge C18 19×100 мм; элюируя 0-50% ацетонитрилом в воде с 0,05% ТФК) давала  (16,9 мг, 0,057 ммоль, 64,6%-ный выход).
[0611] ER-885807
ER-885612
13
(15,2 мг, 0,049 ммоль, 55,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,088 ммоль) и йодэтана (20,6 мг, 0,132 ммоль).
[0612] ER-885808
ER-885612
13
(8,2 мг, 0,025 ммоль, 28,6%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,088 ммоль) и изопропилйодида (22,5 мг, 0,132 ммоль).
[0613] ER-885892
ER-885612
13
(3,1 мг, 0,009 ммоль, 10,4%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,088 ммоль) и 1-йод-2-метилпропана (15,2 мкл, 0,132 ммоль).
[0614] ER-885929
ER-885612
13
(17,5 мг, 0,048 ммоль, 54,6%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,088 ммоль) и 1-йодгексана (37,4 мг, 0,176 ммоль).
[0615] ER-885930
ER-885612
13
(7,9 мг, 0,021 ммоль, 23,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (25 мг, 0,088 ммоль) и циклогексилметил бромида (31,3 мг, 0,177 ммоль).
[0616] ER-895324
ER-885612
13
(35,2 мг, 0,098 ммоль, 54,7%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (50,6 мг, 0,179 ммоль) и 2-бромпиридина (20,4 мкл, 0,214 ммоль). Вместо ДМФ использовали ТГФ (1 мл).
[0617] ER-895325
ER-893324
13
(54,2 мг, 0,150 ммоль, 83,8%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (50,6 мг, 0,179 ммоль) и 2-бромпиримидина (57 мг, 0,359 ммоль).
[0618] ER-894552
ER-893324
13
(5 мг, 0,014 ммоль, 19,2%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (20,4 мг, 0,072 ммоль) и 2-хлорпиразина (8,3 мг, 0,0,072 ммоль).
[0619] ER-886137
13
ER-886137
: В сухой сосуд для проведения микроволновых реакций добавляли карбонат цезия (172,5 мг, 0,529 ммоль), йодид меди (I) (33,6 мг, 0,176 ммоль), 1,1'-бинафтил-2,2'-диамин (50,2 мг, 0,177 ммоль), 2-йод-1,3-диметилбензол (123 мг, 0,53 ммоль) в ДМСО (0,3 мл), затем соединение  (50 мг, 0,177 ммоль). Реакционную смесь нагревали в микроволновой печи при 110°C в течение 12 часов, после чего смесь напрямую помещали на колонку для препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка Water's X-Bridge C18 19×100 мм; используя градиент 0-50% ацетонитрила в воде с 0,05% ТФК) для очистки элюированием с получением сырого продукта. После объединения желаемых объединенных фракций, концентрирования и сушки в вакууме сырой продукт очищали на силикагеле (Biotage элюируя градиентом 25% EtOAc в гептане - 100% EtOAc) с получением  (12,1 мг, 0,031 ммоль, 17,6%-ный выход).
[0620] ER-886514
14
ER-886514
: К перемешиваемой суспензии соединения  (10,5 мг, 0,024 ммоль) и карбоната калия (30 мг, 0,217 ммоль) в толуоле (1 мл) добавляли фенол (24,4 мг, 0,259 ммоль). Реакционную смесь нагревали в микроволновой печи при 150°C в течение 5 часов, после чего сырую смесь фильтровали и напрямую помещали на колонку для препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка Water's X-Bridge C18 19×100 мм; используя градиент 0-50% ацетонитрила в воде с 0,05% ТФК) с получением после объединения желаемых объединенных фракций, концентрирования и сушки в вакууме (4,5 мг, 0,013 ммоль, 54,1%-ный выход).
[0621] ER-886515
ER-886514
14
(3,2 мг, 0,009 ммоль, 37,6%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (10,6 мг, 0,024 ммоль) и 3-метилфенола (28,1 мг, 0,260 ммоль).
[0622] ER-886516
ER-886514
14
(4,7 мг, 0,013 ммоль, 52,4%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (10,6 мг, 0,024 ммоль) и 4-метилфенола (28,1 мг, 0,260 ммоль).
[0623] ER-886605
ER-886514
14
(7,9 мг, 0,020 ммоль, 85,1%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (10,3 мг, 0,024 ммоль) и 3,4-дифторфенола (20 мг, 0,154 ммоль). В этом способе получения вместо толуола использовали 1-метилпирролидинон (1 мл).
[0624] ER-886606
ER-886605
14
(7,2 мг, 0,019 ммоль, 81,2%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (10,3 мг, 0,024 ммоль) и 3-фторфенола (13,2 мг, 0,118 ммоль).
[0625] ER-886624
ER-886605
14
(5,1 мг, 0,014 ммоль, 59%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (10 мг, 0,023 ммоль) и 2-фторфенола (10 мг, 0,089 ммоль).
[0626] ER-886786
ER-886605
14
(8,2 мг, 0,022 ммоль, 76,9%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из соединения  (12,5 мг, 0,029 ммоль) и 2-метилфенола (28,1 мг, 0,260 ммоль).
[0627] Другие примеры
13
ER-885493
использования соединенияили  в качестве исходного вещества:
[0628] ER-885621
13
ER-885621
2
3
4
: К перемешиваемому раствору бис(2-метоксиэтил)аминосеры трифторида (24,4 мкл, 0,132 ммоль) в DCM (0,1 мл), охлаждаемому до -78°C в атмосфере N, добавляли соединение  (25 мг, 0,088 ммоль) в DCM (0,1 мл). Реакционную смесь оставляли нагреваться до -50°C и перемешивали в течение 0,5 часов, нагревали до 0°C и перемешивали в течение 1,5 час. Реакционную смесь нагревали до 5°C и перемешивали в течение 2 часов, после чего по каплям добавляли насыщенный раствор NaHCO в воде до тех пор, пока значение pH не достигало 10. Слои разделяли, и органический слой промывали два раза водой (1 мл), сушили над MgSO, фильтровали и концентрировали досуха. После объединения желаемых объединенных фракций, концентрирования и сушки в вакууме очистка на колонке для препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой, элюируя 0-50% ацетонитрилом в воде, обеспечивала  (12,5 мг, 0,044 ммоль, 49,8%-ный выход).
[0629] ER-885906
13
ER-885906
: Перемешиваемый раствор соединения  (85,5 мг, 0,302 ммоль) в тионилхлориде (2 мл) нагревали при 85°C в течение 24 часов, после чего удаляли избыточное количество тионилхлорида и сырой продукт очищали на колонке для препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой, элюируя 0-50% ацетонитрилом в воде, с получением после объединения желаемых объединенных фракций, концентрирования и сушки в вакууме(4,3 мг, 0,014 ммоль, 4,7%-ный выход).
[0630] Получение ER-886431 и ER-886480
44, схема 13
в качестве примеровсоединения
[0631]
43
ER-886250
13
43
ER-886250
3
2
4
2R,6R
Соединение или : К перемешиваемому раствору соединения  (200 мг, 0,706 ммоль) в DCM (5 мл) и пиридина (0,114 мл, 1,4 ммоль) при 0°C в атмосфере азота добавляли перйодинан Десса-Мартина (359 мг, 0,846 ммоль), после чего реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа. Было обнаружено, что реакция полностью не завершилась, поэтому добавляли дополнительное количество перйодинана Десса-Мартина (359 мг, 0,846 ммоль) и пиридина (0,114 мл, 1,4 ммоль), затем перемешивали в течение еще 30 мин. После полного завершения реакции реакционную смесь промывали насыщенным водным раствором NaHCO (4 мл) с 10% водным раствором тиосульфата натрия (2 мл). Смесь перемешивали в течение 30 мин, после чего смесь экстрагировали три раза DCM (по 4 мл каждый раз). Объединенные органические слои промывали насыщенным солевым раствором (4 мл), сушили над NaSO, фильтровали и концентрировали. После объединения желаемых фракций, концентрирования и сушки в вакууме сырой продукт очищали на силикагеле (Biotage SP4, 25 г, элюируя смесью 10-100% EtOAc в гептане) с получением 5-(()-2-формил-6-метилморфолинo)хинолин-8-карбонитрила  или  (110 мг, 0,391 ммоль, 55,4%-ный выход) в виде сиропа желтого цвета.
[0632]
43
ER-886431
ER-886480
2
4
Rf=
К перемешиваемому раствору  (25 мг, 0,089 ммоль) в ТГФ (0,5 мл) при 0°C в атмосфере азота добавляли по каплям в течение 2 минут 1M раствор винил магний бромида (0,098 мл, 0,098 ммоль) в ТГФ. Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 2 часов, после чего медленно добавляли насыщенный раствор хлорида аммония (0,5 мл), затем воду (0,25 мл). Гашеную реакционную смесь нагревали до комнатной температуры, перемешивали в течение еще 10 мин и экстрагировали два раза EtOAc (по 2 мл). Объединенные органические слои промывали насыщенным солевым раствором (1 мл), сушили над NaSO, фильтровали и концентрировали. Сырой продукт очищали на пластинах для препаративной ТСХ (пластины Merck Silica Gel 60 F254, 2 20×20 см, элюируя EtOAc) с получением после раздельного элюирования желаемых фракций на силикагеле, концентрирования и сушки в вакууме (3 мг, 0,010 ммоль, 11,2%-ный выход, Rf=0,75, EtOAc) и  (3 мг, 0,0,10 ммоль, 11,2%-ный выход, 0,80. EtOAc) в виде сиропа желтого цвета. Для обоих примеров стереохимию свободной спиртовой группы определяли произвольным образом.
[0633] ER-886530
ER-886531
ER-886431
ER-886480
43
Rf=
(11 мг, 0,032 ммоль, 36,4%-ный выход, 0,80, EtOAc) и  (3 мг, 0,0,10 ммоль, 11,2%-ный выход, Rf=0,75, EtOAc) получали способом, аналогичным способу получения  и , исходя из соединения  (25 мг, 0,089 ммоль) и 2M раствора хлорида бутилмагния в ТГФ (0,131 мл, 0,262 ммоль). Сырой продукт очищали на силикагеле (Biotage SP4, 25 г, элюируя смесью 20-100% EtOAc в гептане. Для обоих примеров стереохимию свободной спиртовой группы определяли произвольным образом.
[0634] ER-886532
ER-886533
ER-886530
ER-886531
43
Rf=
(4 мг, 0,011 ммоль, 6,3%-ный выход, 0,80, EtOAc) и  (4 мг, 0,011 ммоль, 6,3%-ный выход, Rf=0,75, EtOAc) получали способом, аналогичным способу получения  и , исходя из соединения  (49 мг, 0,174 ммоль) и 1,3M раствора хлорида циклогексилмагния в ТГФ (0,20 мл, 0,260 ммоль). Для обоих примеров стереохимию свободной спиртовой группы определяли произвольным образом.
[0635] ER-886567
ER-886568
ER-886530
ER-886531
43
Rf=
(3,6 мг, 0,009 ммоль, 5,3%-ный выход, 0,80, EtOAc) и  (8,6 мг, 0,022 ммоль, 12,8%-ный выход, Rf=0,75, EtOAc) получали способом, аналогичным способу получения  и , исходя из соединения  (49 мг, 0,174 ммоль) и 1M раствора хлорида фенетилмагния в ТГФ (0,26 мл, 0,260 ммоль). Для обоих примеров стереохимию свободной спиртовой группы определяли произвольным образом.
[0636] ER-886520
ER-886530
ER-886531
43
Rf=
(26 мг, 0,084 ммоль, 49,1%-ный выход, 0,80, EtOAc) получали способом, аналогичным способу получения  и , исходя из соединения  (48 мг, 0,171 ммоль) и 2M раствора хлорида этилмагния в ТГФ (0,128 мл, 0,256 ммоль). Для дополнительных исследований использовали диастереомерную смесь.
[0637] ER-886564 и ER-886565 по схеме 26
[0638] Схема 26
[0639]
[0640]
22
89
2R,6R
трет-
К перемешиваемому раствору соединения  (2,51 г, 7,8 ммоль) в EtOH (40 мл) добавляли 10% палладий на активированном угле в 50% воде (1,66 г), затем несколько раз сосуд заполняли газообразным водородом. Реакционную смесь выдерживали в атмосфере водорода (баллон, находящийся под давлением) при 40°C и перемешивали в течение 16 часов, после чего реакционную смесь продували газообразным азотом несколько раз при вакуумировании системы между очистками с помощью вакуумного насоса. После полного завершения реакции реакционную смесь фильтровали через Целит 545, слой на фильтре промывали два раза EtOH (85 мл каждый), затем объединенные фильтраты концентрировали и сушили в вакууме. Сырой продукт, ()-бутил2-(гидроксиметил)-6-метилморфолин-4-карбоксилат  (1,56 г, 6,7 ммоль, 86,5%-ный выход), использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
[0641]
89
90
3
2
4
2R,6R
трет-
К перемешиваемому раствору соединения  (1,501 г, 6,5 ммоль) в DCM (30 мл) и пиридине (1,05 мл, 13,0 ммоль) при 0°C в атмосфере азота добавляли перйодинан Десса-Мартина (3,3 г, 7,8 ммоль), после чего реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа. Было обнаружено, что реакция полностью не завершилась, поэтому добавляли дополнительное количество перйодинана Десса-Мартина (1,4 г, 3,3 ммоль) и пиридина (0,52 мл, 6,4 ммоль), и затем перемешивали в течение дополнительных 2 часов. После полного завершения реакции реакционную смесь промывали насыщенным водным раствором NaHCO (37 мл) с 10% водным раствором тиосульфата натрия (18 мл). Смесь перемешивали в течение 30 мин, после чего смесь экстрагировали три раза DCM (по 40 мл). Объединенные органические слои промывали насыщенным солевым раствором (37 мл), сушили над NaSO, фильтровали и концентрировали. После объединения желаемых фракций, концентрирования и сушки в вакууме сырой продукт очищали на силикагеле (Biotage 40+S, 40 г, элюируя смесью 10-100% EtOAc в гептане) с получением ()-бутил2-формил-6-метилморфолин-4-карбоксилата  (1,285 г, 5,6 ммоль, 86,2%-ный выход) в виде бесцветного сиропа.
[0642]
90
91
2
4
2
6
5
2R,6R
трет-
К перемешиваемому раствору соединения  (208 мг, 0,907 ммоль) в ТГФ (5 мл) при 0°C в атмосфере азота добавляли по каплям в течение 2 мин 1M раствор бромида бензилмагния (2,3 мл, 2,3 ммоль) в ТГФ. Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 2,5 часов, после чего медленно добавляли насыщенный раствор хлорида аммония (4,8 мл), затем воду (2,5 мл). Гашеную реакционную смесь нагревали до комнатной температуры, перемешивали в течение еще 10 мин и экстрагировали два раза EtOAc (по 20 мл). Объединенные органические слои промывали насыщенным солевым раствором (9,5 мл), сушили над NaSO, фильтровали и концентрировали. После объединения желаемых фракций, концентрирования и сушки в вакууме сырой продукт очищали на силикагеле (Biotage SP4, 25 г, элюируя смесью 25-100% EtOAc в гептане) с получением ()-бутил2-((R,S)-1-гидрокси-2-фенилэтил)-6-метилморфолин-4-карбоксилата  (172 мг, 0,539 ммоль, 59,4%-ный выход, R=-CHCH) в виде бесцветного масла.
[0643]
91
92
2R,6R
2
6
5
К перемешиваемому раствору соединения  (172 мг, 0,539 ммоль) в DCM (1,2 мл) добавляли ТФК (1,2 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре, затем, после полного завершения реакции, реакционную смесь, разбавляли толуолом (4,6 мл), концентрировали и азеотропно отгоняли досуха два раза с толуолом (по 4,6 мл каждый раз) с получением 1-(()-6-метилморфолин-2-ил)-2-фенилэтанола  (179 мг, 0,534 ммоль, 99,0%-ный выход, R=-CHCH), в виде соли ТФК без дополнительной очистки.
[0644]
92
3
93
ER-886564
94
ER-886565
N-
2
2
6
5
2
6
5
Сырое соединение  (179 мг, 0,534 ммоль) растворяли вметилпирролидоне (3 мл), затем добавляли соединение  (187 мг, 0,802 ммоль) и DIPEA (0,2 мл, 1,1 ммоль). Смесь нагревали в микроволновой печи при 170°C в течение 5 часов, после чего охлажденную смесь напрямую помещали на колонку для препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой С18, элюируя 10-60% ацетонитрилом в воде с 0,1% ТФК. Две элюированные фракции отдельно концентрировали досуха, азеотропно отгоняли два раза с MeOH (по 5 мл каждый раз). Каждый изомер растворяли в MeOH (2 мл) и пропускали через основной слой силикагеля (силикагель-CO), элюируя два раза MeOH (по 2 мл) с последующим концентрированием и сушкой в вакууме с получением отдельно соединения  или  (19 мг, 0,051 ммоль, 9,5%-ный выход, первая фракция, R=-CHCH) и соединения  или  (23 мг, 0,062 ммоль, 11,5%-ный выход, вторая фракция, R=-CHCH). Стереохимию положения спиртовой группы устанавливали произвольно.
[0645] ER-895200
ER-895310
ER-886564
ER-886564
3
(22,2 мг, 0,075 ммоль, 32,1%-ный выход, первая фракция) и  (15,2 мг, 0,051 ммоль, 21,8%-ный выход, вторая фракция) получали способом, аналогичным способу получения  и , исходя из соединения  (54,6 мг, 0,234 ммоль) и 1-((2R,(5R)-6-метилморфолин-2-ил)этанола (68,2 мг, 0,470 ммоль). Стереохимию положения спиртовой группы устанавливали произвольно.
[0646] ER-895326
ER-895200
ER-895326
2
4
: К перемешиваемому раствору  (17,9 мг, 0,060 ммоль) в ТГФ (0,3 мл) добавляли гидрид натрия (4,8 мг, 0,120 ммоль, 60% дисперсия в масле), затем 2-бромпиримидин (19 мг, 0,120 ммоль). Реакционную смесь нагревали до 60°C и перемешивали в течение 30 мин, после чего охлаждали до комнатной температуры и медленно гасили добавлением по каплям воды (0,5 мл). Смесь экстрагировали три раза DCM (по 3 мл), и объединенные органические слои промывали насыщенным солевым раствором (3 мл), сушили над NaSO, фильтровали и концентрировали досуха. Сырой продукт очищали на силикагеле (Biotage, элюируя градиентом 0-10% EtOAc в гептане) с получением после объединения желаемых фракций, концентрирования и сушки в вакууме (20,3 мг, 0,054 ммоль, 90,1%-ный выход).
[0647] ER-895327
ER-895326
ER-895310
(6,4 мг, 0,017 ммоль, 63%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (7,9 мг, 0,027 ммоль) и 2-бромпиримидина (8 мг, 0,0,50 ммоль).
[0648] ER-895412
90
N-
2R,6R
трет-
S
2
4
: К перемешиваемому 1,6Mраствору бутил лития в ТГФ (1,36 мл, 2,18 ммоль) при -40°C добавляли по каплям 2-бромпиридин (0,21 мл, 2,20 ммоль) в диэтиловом эфире (2 мл) с последующим перемешиванием в течение 30 мин при -40°C. Добавляли по каплям соединение  (500 мг, 2,18 ммоль) в ТГФ (2 мл) в течение 3 минут, после чего реакционную смесь перемешивали при -40°C в течение 2 часов и потом при 0°C в течение 1 часа. После полного завершения реакции реакционную смесь медленно гасили насыщенным раствором хлорида аммония в воде (2 мл), потом нагревали до комнатной температуры, разделяли слои и экстрагировали водный слой два раза EtOAc (по 2 мл). Объединенные органические слои промывали насыщенным солевым раствором (2 мл), сушили над NaSO, фильтровали и концентрировали досуха. Сырой продукт очищали сначала пропусканием на силикагеле (Biotage, элюируя смесью 30% EtOAc в гептане с последующей кристаллизацией из 3:1 DCM:MeOH с получением, после фильтрования и сушки в вакууме, ()-бутил2-(()-гидрокси(пиридин-2-ил)метил)-6-метилморфолин-4-карбоксилата (150 мг, 0,486 ммоль, 22,3%-ный выход)
[0649]
2R,6R
трет-
S
S
2R,6R
3
4
К перемешиваемому раствору ()-бутил2-(()-гидрокси(пиридин-2-ил)метил)-6-метилморфолин-4-карбоксилата (150 мг, 0,486 ммоль) в DCM (5 мл) добавляли ТФК (1 мл), затем перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. После полного завершения реакции реакционную смесь концентрировали и азеотропно отгоняли досуха три раза с толуолом (по 5 мл каждый раз), затем разбавляли DCM (10 мл), промывали два раза насыщенным NaHCO в воде (2 мл), насыщенным солевым раствором (2 мл), сушили над MgSO, фильтровали и концентрировали и сушили в вакууме с получением сырого ()-(()-6-метилморфолин-2-ил)(пиридин-2-ил)метанола (97,8 мг, 0,469, 96,4%-ный выход).
[0650]
3
ER-895296
S
2R,6R
К перемешиваемому раствору ()-(()-6-метилморфолин-2-ил)(пиридин-2-ил)метанола (97,8 мг, 0,469 ммоль) и соединения  (54,6 мг, 0,234 ммоль) в DMAC (1 мл) добавляли TEA (0,132 мл, 0,947 ммоль). Реакционную смесь нагревали в микроволновой печи при 105°C в течение 3 часов, после чего охлажденную реакционную смесь напрямую очищали на колонке для препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка Water's X-Bridge C18 19×100 мм; используя градиент 0-50% ацетонитрила в воде с 0,1% муравьиная кислота) с получением после объединения желаемых объединенных фракций, концентрирования и сушки в вакууме (15,2 мг, 0,042 ммоль, 18,0%-ный выход, R=2-пиридил).
[0651] Получение ER-886625 в качестве примера соединения 45, схема 13
[0652]
ER-886520
45
ER-886625
3
2
4
К перемешиваемому раствору  (19 мг, 0,061 ммоль) в DCM (0,5 мл) и пиридина (0,010 мл, 0124 ммоль) при 0°C в атмосфере азота добавляли перйодинан Десса-Мартина (31,1 мг, 0,073 ммоль), после чего реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа. Было обнаружено, что реакция полностью не завершилась, поэтому добавляли дополнительное количество перйодинана Десса-Мартина (31,1 мг, 0,073 ммоль) и добавляли пиридин (0,010 мл, 0124 ммоль) с последующим перемешиванием в течение дополнительных 30 мин. После полного завершения реакции реакционную смесь промывали насыщенным водным раствором NаНСО (0,4 мл) c 10% водным раствором тиосульфата натрия (0,2 мл). Смесь перемешивали в течение 30 мин, после чего смесь экстрагировали три раза DCM (0,3 мл каждый). Объединенные органические слои промывали насыщенным солевым раствором (0,35 мл), сушили над NaSO, фильтровали и концентрировали. После объединения желаемых фракций, концентрирования и сушки в вакууме сырой продукт очищали на силикагеле (Biotage SP4, 25 г, элюируя смесью 10-80% EtOAc в гептане) с получением соединения  или  (7 мг, 0,023 ммоль, 37,1%-ный выход) в виде твердого вещества желтого цвета.
[0653] ER-886626
ER-886625
ER-886532
ER-886533
(10,8 мг, 0,030 ммоль, 90,9%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из смеси  и  (12 мг, 0,033 ммоль).
[0654] ER-886629
ER-886625
ER-886567
ER-886568
(6,6 мг, 0,017 ммоль, 81%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из смеси  и  (8 мг, 0,021 ммоль).
[0655] Получение ER-886912 и ER-886913:
[0656]
ER-886568
2
4
R
2R,6R
4-
К перемешиваемому раствору  (124 мг, 0,32 ммоль) в DCM (1,3 мл) при комнатной температуре добавляли метансульфонил хлорид (37 мкл, 0,478 ммоль), затем DMAP (7,8 мг, 0,064 ммоль) и DIPEA (0,17 мл, 0,959 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, затем добавляли воду (1 мл) и DCM (5 мл) с последующим перемешиванием в течение еще 5 мин и разделением слоев. Органический слой промывали насыщенным солевым раствором (1 мл), сушили над NaSO, фильтровали и концентрировали. После объединения желаемых фракций, концентрирования и сушки в вакууме сырой продукт очищали на силикагеле (Biotage SP4, 25 г, элюируя смесью 20-100% EtOAc в гептане) с получением ()-1-(()-(8-цианохинолин-5-ил)-6-метилморфолин-2-ил)-3-фенилпропилметан-сульфоната (136 мг, 0,292 ммоль, 93,5%-ный выход) в виде твердого вещества желтого цвета.
[0657]
ER-886912
ER-886913
ER-886912
ER-886913
R
2R,6R
3
Раствор ()-1-(()-4-(8-цианохинолин-5-ил)-6-метилморфолин-2-ил)-3-фенилпропил метансульфоната (38 мг, 0,082 ммоль) в NMP (2 мл) и пирролидине (0,10 мл, 1,21 ммоль) нагревали в микроволновой печи при 150°C в течение 15 мин, затем охлаждали, фильтровали и напрямую помещали на колонку ВЭЖХ C-18 (колонка Water's X-Bridge C18 19×100 мм; используя градиент 0-50% ацетонитрила в воде с 0,05% ТФК). Фракции  и  раздельно концентрировали досуха, растворяли в MeOH (3 мл) и элюировали на колонке с силикагелем, пропитанным карбонатом (Biotage Isolute SPE, Si-СО, 1 г), промывали MeOH (3 мл), концентрировали и сушили в вакууме с получением  (1,4 мг, 0,003 ммоль, 3,9%-ный выход) в виде первого элюированного пика и  (0,6 мг, 0,001 ммоль, 1,5%-ный выход) в виде второго элюированного пика. Для обоих примеров стереохимию функциональной группы амина определяли произвольным образом.
[0658] Получение ER-886131: Модификация схемы 7 по схеме 27:
0659] Схема 27
[
[0660]
[0661]
95
96
S
S
Перемешиваемый раствор коммерчески доступного ()-2-пропилоксирана  (3,0 г, 34,8 ммоль, R=этил) в гидроксиде аммония (100 мл) герметически закрывали и перемешивали в течение 24 час с последующей азеотропной отгонкой досуха три раза с толуолом (100 мл каждый). Сырой бесцветный продукт ()-1-аминопентан-2-ол  (R=этил) использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.
[0662]
96
97
98
S
S
N
S
4
К перемешиваемому раствору сырого соединения  (0,987 мг, 9,57 ммоль) в EtOH (20 мл) добавляли ()-метил 2-хлорпропаноат  (1,568 г, 11,5 ммоль, R'=метил) с последующим нагреванием до 70°C и перемешиванием в течение 24 часов. Реакционную смесь после полного завершения реакции охлаждали до комнатной температуры, концентрировали досуха и остаток растворяли в EtOAc (20 мл). Органический раствор промывали три раза 1н водным раствором HCl (по 5 мл каждый раз), насыщенным солевым раствором (5 мл), сушили над MgSO, фильтровали и концентрировали досуха. Сырой продукт очищали на силикагеле (Biotage, элюировали градиентом 20-100% EtOAc в гептане) с получением ()-2-хлор--(()-2-гидроксипентил)пропанамида  (0,356 г, 1,839 ммоль, 19,2%-ный выход, R=этил; R'=метил).
[0663]
98
99
2S,6S
(2R,6S
цис
транс
К перемешиваемому раствору соединения  (0,356 г, 1,839 ммоль) в ТГФ (22 мл) при 0°C добавляли гидрид натрия (294,2 мг, 7,277 ммоль, 60% дисперсия в масле). Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 30 мин, зетем нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение еще 5 часов. После полного завершения реакции реакционную смесь медленно гасили IPA (1 мл) с последующим добавлением Dowex 50, H+ форма, до тех пор, пока не было установлено нейтральное значение рН. Суспензию фильтровали и промывали два раза IPA (по 5 мл каждый раз). Фильтрат концентрировали, затем очищали на силикагеле (Biotage 25 г, элюируя EtOAc). После объединения желаемых фракций, концентрирования и сушки в вакууме получали смесь ()-2-метил-6-пропилморфолин-3-она и )-2-метил-6-пропилморфолин-3-она  (168,2 мг, 1,07 ммоль, 58,2%-ный выход, R=этил; R'=метил) при соотношении  к  как 2:1.
[0664]
99
100
(2R,S;6S
К перемешиваемому раствору соединения  (168,2 мг, 1,07 ммоль) в ТГФ (0,8 мл) при комнатной температуре добавляли 1M раствор тетрагидроалюминат лития (1 мл, 1 ммоль) по каплям в течение 2 минут. Реакционную смесь перемешивали в течение еще 2,5 часов, затем, после полного завершения реакции, реакционную смесь охлаждали до 0°C с последующим добавлением воды (0,43 мл) и 1M гидроксида натрия в воде (0,03 мл) и потом перемешивали в течение 30 мин. Полученный осадок фильтровали через целит 454 и элюировали EtOAc (2 мл), DCM (2 мл) и диэтиловым эфиром (2 мл). Объединенные фильтраты концентрировали и сушили в вакууме с получением сырого )-2-метил-6-пропилморфолина, соединение  (R=этил; R'=метил), который используется непосредственно в следующей реакции.
[0665]
100
3
ER-886131
101
ER-886132,
102
2
цис
Сырое соединение  растворяли в NMP (5 мл), затем добавляли  (150 мг, 0,636 ммоль) и DIPEA (0,2 мл, 1,1 ммоль). Смесь нагревали в микроволновой печи при 145°C в течение 7 часов, после чего охлажденную смесь напрямую помещали на колонку для препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой С18, элюируя 10-60% ацетонитрилом в воде с 0,1% ТФК. Две элюированные фракции раздельно концентрировали досуха, азеотропно отгоняли два раза MeOH (по 5 мл каждый раз). Каждый изомер растворяли в MeOH (2 мл) и пропускали через основной слой силикагеля (силикагель-СО), элюируя два раза MeOH (по 2 мл) с последующим концентрированием и сушкой в вакууме с получением отдельно , соединение  (64,2 мг, 0,217 ммоль, 34,2%-ный выход, -изомер, R=этил; R'=метил), и соединение  (25,2 мг, 0,85 ммоль, 13,4%-ный выход, транс-изомер, R=этил; R'=метил).
[0666] ER-886212
ER-886131
90
97
S
S
(315,2 мг, 0,975 ммоль, 8,5% общий выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из коммерчески доступного ()-1-аминогептан-2-ола, соединение  (3,08 г, 23,5 ммоль, R=н-бутил) и ()-метил 2-хлорпропаноата, соединение  (1,568 г, 11,5 ммоль, R'=метил).
[0667] Альтернативные примеры получения соединения 101 по схеме 28:
[0668] Схема 28
[0669]
[0670] Получение ER-886211:
[0671]
103
104
3
4
К перемешиваемому раствору 2-этилоксиранае  (621 мг, 8,61 ммоль, R=этил) в DCM (60 мл) в атмосфере азота добавляли бензиламин (996 мг, 9,30 ммоль), затем трифлат скандия (341 мг, 0,693 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 часов, затем, после полного завершения реакции, реакционную смесь гасили насыщенным NaHCO (20 мл), экстрагировали три раза DCM (по 10 мл), и объединенные органические слои сушили над MgSO, фильтровали и концентрировали досуха. После концентрирования объединенных желаемых фракций и сушки в вакууме сырой продукт очищали на силикагеле (Biotage 25 г, элюируя смесью гептан:EtOAc:TEA при соотношении 10:10:0,1) с получением 1,1-(бензилaзанeдиил)бис(бутан-2-ол)  (658 мг, 2,628 ммоль, 30,4%-ный выход, R=этил).
[0672]
104
105
106
3
4
3S
5R
3R,5R
К перемешиваемому раствору соединения  (584 мг, 2,323 ммоль) в воде (0,3 мл) в течение 5 минут медленно добавляли концентрированную серную кислоту (2 мл), после чего реакционную смесь нагревали при 150°C в течение 2 часов. После полного завершения реакции реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и медленно выливали в насыщенный раствор NaHCO (20 мл) при перемешивании. Смесь экстрагировали два раза DCM (по 10 мл), и объединенные органические слои промывали водой (5 мл), насыщенным солевым раствором (5 мл), сушили над MgSO, фильтровали и концентрировали досуха. После концентрации раздельно объединенных желаемых фракций и сушки в вакууме сырой продукт очищали на силикагеле (Biotage 25 г, элюируя смесью гептан:EtOAc при соотношении 2:1) с получением (,)-1-бензил-3,5-диэтилпиперидина  (234,2 мг, 1,003 ммоль, 43,2%-ный выход, R=этил), и ()-1-бензил-3,5-диэтилпиперидина  (190,2 мг, 0,815 ммоль, 35,1%-ный выход, R=этил).
[0673]
105
107
К перемешиваемому раствору соединения  (107,1 мг, 0,462 ммоль) в MeOH (5 мл) добавляли 5%-ный палладий на активированном угле (250 мг), затем несколько раз сосуд заполняли газообразным водородом. Реакционную смесь выдерживали в атмосфере водорода (баллон, находящийся под давлением) при комнатной температуре и перемешивали в течение 12 часов, после чего реакционную смесь продували газообразным азотом несколько раз при вакуумировании системы с помощью вакуумного насоса между очистками. После полного завершения реакции реакционную смесь фильтровали через Целит 545 слой на фильтре промывали два раза MeOH (по 2 мл), затем объединенные фильтраты концентрировали и сушили в вакууме. Сырой продукт, (3S,5R)-3,5-диэтилпиперидин  (0,066 г, 0,462 ммоль, 99,9%-ный выход, R=этил), использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
[0674]
107
3
101
ER-886211
К перемешиваемому раствору соединения  (0,066 г, 0,462 ммоль, R=этил) в NMP (2 мл) добавляли DIPEA (0,13 мл, 0,728 ммоль) и соединение  (86,3 мг, 0,370 ммоль). Реакционную смесь нагревали в микроволновой печи при 150°C в течение 1 часа, после чего напрямую очищали на колонке для препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка Water's X-Bridge C18 19×100 мм; элюируя градиентом 0-50% ацетонитрила в воде с 0,05% ТФК) с получением после объединения желаемых объединенных фракций, концентрирования и сушки в вакууме аналога соединения  или  (45,2 мг, 0,153 ммоль, 41,4%-ный выход, R=этил).
[0675]
Другие примеры:
[0676] ER-885113
ER-885113
трет-
трет-
цис-
2
4
: К перемешиваемому раствору 2-(ди-бутилфосфино)бифенила (20 мг, 0,067 ммоль) и трис(дибензилиденацетон)дипалладия(0) (20 мг, 0,022 ммоль) в толуоле (0,8 мл) в атмосфере азота при комнатной температуре добавляли коммерчески доступный 5-бром-8-метоксихинолин (201 мг, 0,844 ммоль), бутоксид натрия (122 мг, 1,27 ммоль) и 2,6-диметилморфолин (125 мг, 1,085 ммоль), затем толуол (0,8 мл). Реакционную смесь нагревали с обратным холодильником и перемешивали в течение 3 часов, затем, после полного завершения реакции, реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, потом добавляли воду (5 мл). Полученную смесь экстрагировали два раза EtOAc (по 5 мл каждый раз), и объединенные органические слои промывали насыщенным солевым раствором (2 мл), сушили над NaSO, фильтровали и концентрировали досуха. Сырой продукт очищали на силикагеле дважды (Biotage SP4, 25+S, элюируя смесью 12-100% EtOAc в гептане) с получением после объединения желаемых фракций, концентрирования и сушки в вакууме (49 мг, 0,180 ммоль, 21,3%-ный выход).
[0677] ER-887960
ER-885113
цис
(13,7 мг, 0,049 ммоль, 23,5%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из 5-бром-8-хлор-1,7-нафтиридина (51 мг, 0,210 ммоль) и -2,6-диметилморфолина (31,4 мг, 0,273 ммоль)
[0678] ER-886133
ER-886134
S
S
4
и : Раствор ()-2-((бензилокси)метил)оксирана (65 г, 0,396 моль) и 28%-ный NHOH в воде перемешивали при комнатной температуре в течение 14 часов, затем, после полного завершения реакции, реакционную смесь концентрировали и азеотропно отгоняли два раза с толуолом (150 мл каждый) с получением ()-1-амино-3-(бензилокси)пропан-2-ола (70,6 г, 0,390 моль, 98%-ный выход) в виде сырого твердого вещества белого цвета.
[0679]
S
R
R
N
R
2
4
К перемешиваемому раствору сырого ()-1-амино-3-(бензилокси)пропан-2-ола (54,4 г, 0,300 моль) в этаноле (400 мл) добавляли метил ()-(+)-2-хлорпропионат (40,44 г, 0,330 моль) по каплям в течение 30 минут. Реакционную смесь нагревали до 75°C и перемешивали в течение 16 часов, затем, после полного завершения реакции, реакционную смесь концентрировали досуха. Сырую смесь разбавляли EtOAc (200 мл), промывали 1н водным раствором HCl (100 мл), насыщенным солевым раствором (100 мл), сушили над NaSO, фильтровали и концентрировали досуха. После объединения желаемых фракций, концентрирования и сушки в вакууме сырой продукт очищали на силикагеле (Biotage, элюируя линейным градиентом 30-80% EtOAc в гептане) с получением ()--(()-1-(бензилокси)пропан-2-ил)-2-хлорпропанамида (65,7 г, 0,239 моль, 79,7%-ный выход).
[0680]
R
N
R
2S,6S
К перемешиваемому раствору ()--(()-1-(бензилокси)пропан-2-ил)-2-хлорпропанамида (8,8 г, 0,032 моль) в ТГФ (440 мл) при 0°C добавляли частями NaH (5,181 г, 0,130 моль, в виде 60% масляной дисперсии) в течение 10 минут. Реакционную смесь перемешивали при 0°C, затем оставляли медленно нагреваться до комнатной температуры и перемешивали еще 6 часов. После полного завершения реакции реакционную смесь медленно гасили IPA (20 мл), затем Dowex 50, H+ смола (30 г) с последующим перемешиванием до тех пор, пока не определялось кислотное значение рН. Гашеную суспензию фильтровали, промывали EtOAc (50 мл) и концентрировали досуха. После объединения желаемых фракций, концентрирования и сушки в вакууме сырой продукт очищали на силикагеле (200 г, элюируя 30-50%градиентом EtOAc в гептане) с получением ()-6-((бензилокси)метил)-2-метилморфолин-3-она (6,12 г, 0,026 моль, 81,3%-ный выход).
[0681]
2S,6S
2S,6S
К перемешиваемому раствору ()-6-((бензилокси)метил)-2-метилморфолин-3-она (6,12 г, 0,026 моль) в ТГФ (20 мл) в атмосфере азота при комнатной температуре добавляли по каплям в течение 15 минут 1M раствор тетрагидроалюмината в ТГФ (30 мл, 0,030 моль). Реакционную смесь перемешивали в течение 2,5 часов, после чего охлаждали до 0°C и затем медленно добавляли воду (13 мл) и затем 1н водный раствор NaOH (0,9 мл). Гашеную реакционную смесь перемешивали до тех пор, пока осадок не стал гранулированным, после чего добавляли Целит 545 (10 г), потом фильтровали через слой из целита и промывали три раза DCM (30 мл) и этиловым эфиром (30 мл). Объединенные фильтраты концентрировали и очищали на силикагеле (Biotage, элюируя градиентом 0-5% MeOH в DCM) с получением после объединения желаемых фракций, концентрирования и сушки в вакууме ()-2-((бензилокси)метил)-6-метилморфолина (2,7 г, 0,012 моль, 46,2%-ный выход).
[0682]
2S,6S
трет-
2S,6S
трет-
К перемешиваемому раствору ()-2-((бензилокси)метил)-6-метилморфолина (2,7 г, 0,012 моль) в DCM (50 мл) добавляли ди-бутилдикарбонат (6,807 г, 0,031 моль), затем TEA (4,35 мл, 0,031 моль) и DMAP (100 мг, 0,82 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов, затем, после полного завершения реакции, реакционную смесь промывали 0,1н раствором HCl (50 мл) и насыщенным солевым раствором (50 мл). Органическую фазу концентрировали с последующей очисткой на силикагеле (Biotage, элюируя 10-20% градиентом EtOAc в гептане) с получением после объединения желаемых фракций, концентрирования и сушки в вакууме ()-бутил2-((бензилокси)метил)-6-метилморфолин-4-карбоксилата (3,68 г, 11,4 ммоль, 95,4%-ный выход).
[0683]
2S,6S
трет-
2S,6S
трет-
К перемешиваемому раствору ()-бутил2-((бензилокси)метил)-6-метилморфолин-4-карбоксилата (3,102 г, 9,7 ммоль) в этаноле (15 мл) добавляли 5%-ный Pd на угле (300 мг), затем вакуумировали и заполняли реакционный сосуд три раза газообразным водородом. Реакционную смесь нагревали при 40°C, выдерживая в атмосфере водорода (баллон, находящийся под давлением) и перемешивали в течение ночи, после чего реакционную смесь продували газообразным азотом несколько раз при вакуумировании системы с помощью вакуумного насоса между очистками. После полного завершения реакции реакционную смесь фильтровали через Целит 545, слой на фильтре промывали два раза этанолом (по 10 мл), затем объединенные фильтраты концентрировали и сушили в вакууме. Сырой продукт, ()-бутил2-(гидроксиметил)-6-метилморфолин-4-карбоксилат (2,15 г, 9,3 ммоль, 95,8%-ный выход), использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
[0684]
3
ER-885477
2S,6S
трет-
2S,6S
К перемешиваемому раствору ()-бутил2-(гидроксиметил)-6-метилморфолин-4-карбоксилата (200 мг, 0,865 ммоль) в DCM (5 мл) при комнатной температуре добавляли ТФК (0,5 мл, 6,7 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа, после чего концентрировали и азеотропно отгоняли досуха два раза с толуолом (по 5 мл каждый раз) и сушили в вакууме. Сырой морфолин с удаленной защитной группы растворяли при перемешивании в DMAC (1 мл), затем добавляли DIPEA (0,23 мл, 1,3 ммоль) и соединение  (152,4 мг, 0,654 ммоль). Реакционную смесь нагревали в микроволновой печи при 140°C и перемешивали в течение 3 часов, затем, после полного завершения реакции, реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, концентрировали и очищали на силикагеле (Biotage, элюируя смесью 30-80% EtOAc в гептане) с получением после концентрирования желаемых объединенных фракций и сушки в вакууме 5-(()-2-(гидроксиметил)-6-метилморфолино)хинолин-8-карбонитрила или  (165,2 мг, 0,583 ммоль, 89,2%-ный выход).
[0685]
ER-885477
ER-886133
3
4
К охлажденному перемешиваемому раствору бис(2-метоксиэтил)аминосеры трифторида (Deoxo-Fluor) (0,044 мл, 0,239 ммоль) в DCM (2 мл) в атмосфере азота при -78°C в течение 3 минут добавляли по каплям  (50,4 мг, 0,178 ммоль) в DCM (2 мл). Реакционную смесь нагревали до -50°C и перемешивали в течение 30 мин, после чего нагревали до 0°C и перемешивали в течение 1,5 час. После полного завершения реакции реакционную смесь медленно гасили добавлением по каплям насыщенного раствора NaHCO до тех пор, пока значение pH не становилось основным (~5 мл). Смесь разбавляли DCM (10 мл), и слои разделяли, после чего органический слой промывали два раза водой (по 5 мл каждый раз), сушили над MgSO, фильтровали и концентрировали. Сырой продукт очищали на колонке ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка X-Bridge C18 19×100 мм; элюируя линейным градиентом 10%-90% ацетонитрила в воде с 0,1% муравьиной кислотой) и концентрировали продукт желаемого пика, затем упаривали досуха в высоком вакууме с получением  (35,2 мг, 0,123 ммоль, 69,3%-ный выход).
[0686]
ER-885477
ER-886134
К  (25,2 мг, 0,089 ммоль) добавляли тионилхлорид (2 мл) с последующим нагреванием до 85°C и перемешиванием в течение 24 часов. После полного завершения реакции реакционную смесь концентрировали досуха путем азеотропной отгонки два раза с толуолом (по 5 мл каждый раз). Сырой продукт очищали на колонке ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка X-Bridge C18 19×100 мм; элюируя линейным градиентом 10%-90% ацетонитрила в воде с 0,1% муравьиной кислотой) и концентрировали продукт желаемого пика, затем упаривали досуха в высоком вакууме с получением  (2,1 мг 0,007 ммоль, 7,8%-ный выход).
[0687] Получение ER-889363 в соответствии со схемой 14
62
6
64
3
o
R
: К перемешиваемой суспензии гидрохлорида 3-бутениламина  (5,45 г, 50,6 ммоль) в DCM (33 мл) добавляли NaHCO (110 г), затем -нитробензолсульфонил хлорид (13,5 г, 60,8 ммоль). Полученную смесь интенсивно перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, после чего добавляли фенилгидразин гидрохлорид (2,9 г, 20 ммоль), и перемешивание продолжали в течение еще 1 часа. После полного завершения реакции реакционную смесь экстрагировали MTBE (70 мл) и затем последовательно промывали 20% водным раствором лимонной кислоты (35 мл), водой (35 мл) и концентрировали. Полученное твердое вещество сиреневого цвета (13,32 г) растворяли в NMP (70 мл) и добавляли карбонат калия (21 г, 0,15 моль), затем ()-глицидол-бензиловый эфир  (9,98 г, 60,8 ммоль). Смесь нагревали до 50°C и перемешивали в течение 22 часов, после чего разбавляли водой (300 мл) и экстрагировали два раза MTBE (200 мл каждый). Все органические слои объединяли и концентрировали с получением масла оранжевого цвета, которое хроматографировали на колонке с силикагелем (н-гептан/MTBE 1:1) с получением соединения , (7,90 г, 18,8 ммоль, 37%-ный выход за 2 стадии) в виде масла оранжевого цвета.
[0688]
64
65
2
2
К перемешиваемому раствору соединения  (7,90 г, 18,8 ммоль) в DMAC (94,8 мл) при комнатной температуре добавляли ацетат меди (II) (0,853 г, 4,70 ммоль), затем PdCl (0,416 г, 2,35 ммоль). Полученную смесь перемешивали в атмосфере O (баллон) при комнатной температуре в течение 16 часов, после чего добавляли дополнительное количество PdCb (0,200 г, 1,13 ммоль), и смесь нагревали до 40°C и перемешивали в течение 6 часов. После полного завершения реакции реакционную смесь гасили пиридином (4,5 мл, 56 ммоль), перемешивали в течение 5 мин, затем разбавляли MTBE (400 мл). Смесь промывали водой (250 мл), и органический слой отделяли, концентрировали. Сырое масло желтого цвета очищали хроматографией на колонке с силикагелем (н-гептан/MTBE 1:1) с получением соединения  (0,740 г, 1,77 ммоль, 9,4%-ный выход, 31%-ный выход из расчета на выделенный субстрат).
[0689]
65
66
К охлажденному перемешиваемому раствору соединения  (1,480 г, 3,54 ммоль) в DCM (14,8 мл) при 0°C добавляли триэтилсилан (2,96 мл, 18,6 ммоль), затем ТФК (4,44 мл, 57,6 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 1 часа, после чего смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение еще 1 часа. После полного завершения реакции реакционную смесь азеотропно отгоняли два раза с толуолом (60 мл каждый) и затем очищали хроматографией на колонке с силикагелем (н-гептан/MTBE 1:1) с получением соединения (1,382 г, 3,29 ммоль, 92%-ный выход) в виде масла желтого цвета.
[0690]
66
67
трет-
К перемешиваемому раствору соединения (1,382 г, 3,29 ммоль) в ДМФ (8,3 мл, 0,11 моль) добавляли карбонат калия (1,45 г, 10,5 ммоль), затем бензолтиол (0,360 мл, 3,50 ммоль). Полученную смесь нагревали при 40°C в течение 2 часов, потом после полного завершения реакции реакционную смесь разбавляли водой (12 мл). Добавляли ди-бутил дикарбонат (0,897 г, 4,11 ммоль) с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 1 часа. После полного завершения реакции реакционную смесь разбавляли водой (29 мл) и экстрагировали два раза MTBE (по 40 мл), и объединенные органические слои концентрировали с получением масла желтого цвета. Сырой продукт очищали хроматографией на колонке с силикагелем (н-гептан/MTBE 4:1) с получением соединения  (847 мг, 2,52 ммоль, 77%-ный выход) в виде бесцветного масла и его стереоизомера (8,3 мг, 0,25 ммоль, 7,5%-ный выход) в виде бесцветного масла.
[0691]
67
3
3
3
4
К перемешиваемому раствору соединения  (0,847 г, 2,52 ммоль) в DCM (4,2 мл) добавляли ТФК (4,2 мл, 0,055 моль) при комнатной температуре и перемешивали в течение 30 мин. После полного завершения реакции реакционную смесь концентрировали, азеотропно отгоняли с толуолом (20 мл) и распределяли между насыщенным NaНСО (8,5 мл) и DCM (20 мл). Органический слой разделяли, сушили над MgSO (2,0 г), фильтровали и концентрировали досуха. Сырое промежуточное соединение растворяли в NMP (2,12 мл), затем добавляли DIPEA (0,66 мл, 3,8 ммоль) и далее соединение  (0,706 г, 3,03 ммоль). Полученную смесь нагревали до 140°C и перемешивали в течение 2 часов, затем, после полного завершения реакции, реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и распределяли между EtOAc (40 мл) и водой (20 мл). Водный слой экстрагировали EtOAc (20 мл), и объединенные органические слои промывали водой (10 мл) и концентрировали с получением сырого продукта в виде твердого вещества/масла коричневого цвета. Сырой продукт очищали на силикагеле (элюируя смесью н-гептан/EtOAc 1:1) с получением смеси 4:1 желаемого промежуточного соединения:соединения  (0,684 мг).
68
ER-889363
Сырую промежуточную смесь (0,684 мг) суспендировали в ацетонитриле (6,0 мл), затем добавляли йодтриметилсилан (0,377 мл, 2,65 ммоль) и затем нагревали до 60°C и перемешиванием в течение 2 часов. После полного завершения реакции реакционную смесь охлаждали до 40°C с последующим добавлением воды (3,0 мл), и реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры при перемешивании в течение еще 1 часа. Добавляли 28%-ный водн. раствор гидроксид аммония (1,0 мл), и полученную смесь экстрагировали два раза EtOAc (по 20 мл), после чего объединенные органические слои концентрировали, затем очищали на силикагеле (элюируя 100% EtOAc) с получением соединения  или  (404 мг, 1,36 ммоль, 53%-ный выход) в виде твердого вещества желтого цвета.
[0692]
ER-889363
2
4
2R,7R
К перемешиваемому раствору  (355 мг, 1,194 ммоль) в DCM (4 мл) добавляли п-толуолсульфонил хлорид (350 мг, 1,836 ммоль), затем DIPEA (0,32 мл, 1,837 ммоль) и DMAP (10 мг, 0,082 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов, потом, после полного завершения реакции, реакционную смесь промывали водой (2 мл) и насыщенным солевым раствором (2 мл) с последующей сушкой над NaSO, фильтрованием и концентрированием досуха. Сырой продукт очищали на силикагеле (Biotage, SP4, 25+M, элюируя смесью 10-60% EtOAc в гептане при 20 объемам колонки. Желаемые фракции объединяли, концентрировали и сушили в вакууме с получением (()-4-(8-цианохинолин-5-ил)-7-метил-1,4-оксазепан-2-ил)метил 4-метилбензолсульфоната (476,6 мг, 1,056 ммоль, 88,4%-ный выход)
[0693]
ER-889822
3
((2R,7R)-4-(8-Цианохинолин-5-ил)-7-метил-1,4-оксазепан-2-ил)метил-4-метил-бензолсульфонат (19,4 мг, 0,043 ммоль) и 1,4'-бипиперидин (30 мг, 0,178 ммоль) растворяли в DMAC (0,5 мл) и потом нагревали в микроволновой печи при 150°C в течение 10 мин. Охлажденную реакционную смесь разбавляли ацетонитрилом (0,5 мл), фильтровали и очищали методом ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка Xbridge C18, элюируя градиентом 10-40% ацетонитрила в воде с 0,1% муравьиной кислотой). Объединенные желаемые фракции концентрировали, разбавляли MeOH (1 мл) и пропускали через колонку с основным SiCO, элюируя MeOH (2 мл), затем концентрировали и сушили в вакууме с получением  (11 мг, 0,025 ммоль, 57,2%-ный выход).
[0694]
Другие примеры:
[0695] ER-890094
: Раствор (3-(бромметил)фенил)борной кислоты (129,5 мг, 0,603 ммоль) и 1,4'-бипиперидина (190 мг, 1,129 ммоль) в DMAC (1 мл) нагревали в микроволновой печи при 150°C в течение 10 мин, после чего реакционную смесь охлаждали и концентрировали досуха для использования на следующей стадии в виде неочищенной (3-([1,4'-бипиперидин]-1'-илметил)фенил)борной кислоты.
[0696]
3
ER-890094
2
4
3
Перемешиваемый раствор, содержащий соединение  (44,5 мг, 0,191 ммоль), сырую (3-([1,4'-бипиперидин]-1'-илметил)фенил)борную кислоту (86,5 мг, 0,286 ммоль), ацетат палладия(II) (6 мг, 0,027 ммоль), 2-дициклогексилфосфино-2',6'-диметоксибифенил (12 мг, 0,029 ммоль) и 1M раствор карбоната натрия в воде (0,029 мл, 0,029 ммоль) в EtOH (0,6 мл) и толуоле (0,6 мл) нагревали при 70°C в течение 16 часов. После полного завершения реакции реакционную смесь охлаждали, разбавляли DCM (10 мл), промывали водой (3 мл), сушили над NaSO, фильтровали и концентрировали досуха. Сырой продукт разбавляли смесью 1:1 ДМСО:ацетонитрил (2 мл) и напрямую очищали методом ВЭЖХ (XBridge C18, элюируя смесью 10-40% ацетонитрила в воде с 0,1% муравьиной кислотой). Желаемый продукт собирали и концентрировали досуха. Полученный продукт растворяли в MeOH (2 мл) и пропускали через слой основного силикагеля (Biotage, 1 г, SiCO), элюируя MeOH (5 мл) с получением, после концентрирования и сушки в вакууме,  (5 мг, 0,012 ммоль, 6,3%-ный выход).
[0697] ER-890244
ER-890094
(63,2 мг, 0,153 ммоль, 27,3% общий выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из (4-(бромметил)фенил)борной кислоты (134,2 мг, 0,625 ммоль) и 1,4'-бипиперидина (125 мг, 0,564 ммоль).
[0698] ER-888200
3
ER-888200
2
4
: Перемешиваемый раствор, содержащий соединение  (251 мг, 1,077 ммоль), (3-формил-5-метилфенил)борную кислоту (350 мг, 2,135 ммоль), бис(трифенилфосфин)хлорид палладия(II) (150 мг, 0,214 ммоль), хлорид лития (91 мг, 2,147 ммоль), карбонат натрия (230 мг, 2,17 ммоль) и 10%-ный карбонат натрия в воде (2,3 мл) в ДМФ (11 мл) нагревали до 90°C в течение 3 часов. Охлажденную реакционную смесь разбавляли EtOAc (48 мл) и водой (12 мл) при перемешивании с последующим фильтрованием через Целит 545 (1,2 г), элюируя EtOAc (10 мл). Отделенный водный слой экстрагировали два раза с помощью EtOAc (12 мл каждый), и объединенные органические слои промывали водой (24 мл) и насыщенным солевым раствором (24 мл), затем сушили над NaSO, фильтровали и концентрировали досуха. Сырой продукт очищали на силикагеле (Biotage SP4, Interchim 25 г, элюируя смесью 20-100% EtOAc в гептане), после чего фракции желаемого продукта объединяли, концентрировали и сушили в вакууме с получением  (163 мг, 0,599 ммоль, 55,6%-ный выход).
[0699] ER-888201:
ER-888200
ER-888201
2
4
К перемешиваемому раствору  (21 мг, 0,077 ммоль) в MeOH (2,1 мл), охлажденному до 0°C, добавляли тетрагидроборат натрия (3,2 мг, 0,085 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа, после чего добавляли воду (2,1 мл), смесь концентрировали до половины объема, затем экстрагировали EtOAc (19 мл). Органический слой промывали насыщенным солевым раствором (3,9 мл), сушили над NaSO, фильтровали и концентрировали досуха с получением  (17,4 мг, 0,63 ммоль, 82,4%-ный выход).
[0700] ER-888644
ER-888201
ER-888644
п
п
2
4
: К перемешиваемому раствору  (91 мг, 0,332 ммоль) в DCM (1,8 мл) добавляли -толуолсульфонилхлорид (101 мг, 0,530 ммоль), затем добавляли DMAP (2 мг, 0,016 ммоль) и DIPEA (1,8 мл, 1,03 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов, после чего добавляли дополнительное количество -толуолсульфонилхлорида (101 мг, 0,530 ммоль) с последующим перемешиванием в течение 2 часов. После полного завершения реакции реакционную смесь разбавляли при перемешивании водой (1 мл) и DCM (5,2 мл). Слои разделяли, и органический слой промывали насыщенным солевым раствором (1 мл), сушили над NaSO, фильтровали и концентрировали досуха. Сырой продукт очищали на силикагеле (Biotage SP4, Interchim 25 г, элюируя смесью 20-100% EtOAc в гептане), после чего фракции желаемого продукта объединяли, концентрировали и сушили в вакууме с получением  (63 мг, 0,212 ммоль, 65%-ный выход).
[0701] ER-888645
ER-888644
ER-888645
N-
3
: Раствор  (20 мг, 0,068 ммоль) и 4-гидроксипиперидина (70 мг, 0,692 ммоль) вметилпирролидоне (2 мл) нагревали в микроволновой печи при 150°C в течение 15 мин. Охлажденную реакционную смесь разбавляли NMP (4 мл) и напрямую очищали методом ВЭЖХ на колонке C-18 (Xbridge С18, элюируя 10-40% ацетонитрилом в воде с 0,1% ТФК). Желаемый продукт собирали и концентрировали досуха. Полученный продукт растворяли в MeOH (2 мл) и пропускали через основной слой силикагеля (Biotage, 1 г, SiCO), элюируя MeOH (5 мл) с получением, после концентрирования и сушки в вакууме,  (19,9 мг, 0,056 ммоль, 81,5%-ный выход).
[0702] ER-888646
ER-888645
ER-888644
(17,9 мг, 0,047 ммоль, 68,1%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (20 мг, 0,068 ммоль) и 4-диметиламинопиперидина (87,6 мг, 0,683 ммоль).
[0703] ER-888647
ER-888645
ER-888644
(15,3 мг, 0,043 ммоль, 62,8%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (20 мг, 0,068 ммоль) и 1-метилпиперазина (68,4 мг, 0,683 ммоль).
[0704] ER-889504
ER-888645
ER-888644
(46 мг, 0,108 ммоль, 62%-ный выход) получали способом, аналогичным способу получения , исходя из  (51 мг, 0,174 ммоль) и 1,4'-бипиперидина (102 мг, 0,606 ммоль).
[0705] Общее способ скринингового исследования и фармакологическая стратегия.
[0706]
Для определения эффективных и селективных TLR7/8 соединений, первоначально аналоги исследовали аналоги по клеточной панели репортерных линий TLR4, TLR7 и TLR9 человека (более подробно см. Фармакологические материалы и способы). Подгруппа соединений, которые были эффективными и селективными в отношении TLR7, также исследовали на предмет активности TLR8 (см. таблицу 3 ниже) и эффективности TLR7/8 в первичном анализе РВМС человека (более подробно см. Фармакологические материалы и способы). Для определения дозазависимой активности и продолжительности действия против TLR7 мыши, некоторые соединения подвергали in vivo (STIV) анализу, (более подробно см. Фармакологические материалы и способы). Затем селективные соединения оценивали по воздействию на одну или несколько следующих мышиных моделей волчанки: BXSB-Yaa, NZB NZW и Пристан DBA/1.
[0707]
Многие соединения, описанные в качестве вариантов осуществления по настоящему изобретению, демонстрируют наномолярную активность как против TLR7 человека и мыши, так и TLR8 человека, когда эти рецепторы, экспрессированные либо на клеточных линиях или первичных клетках, стимулируются синтетическими низкомолекулярными (CL097, R848) лигандами или лигандами нуклеиновой кислоты (РНК). С другой стороны, большинство соединений, описанных в настоящем документе в качестве вариантов осуществления, являются неактивными в отношении пути TLR9.
[0708]
50
50
Современные SOC препараты для лечения волчанки включают противомалярийные средства, такие как хлорохин и гидроксихлорохин (HCQ), которые, как было показано, ингибируют активацию TLR7/9 in vitro. Это может, по крайней мере, частично, объяснить их эффективность в борьбе с развитием волчанки. Варианты осуществления по настоящему изобретению, однако, как было показано, предполагают значительно более эффективное ингибирование. Например, было установлено, что соединение ER-899742 (показано и описано выше) приблизительно в 1000 раз более эффективно против РНК-Ig TLR7/8 стимула, чем HCQ (IC=0,0009 мкМ, HCQ IC ~1,5 мкМ). Это показывает, что ER-899742 будет предлагать гораздо более эффективное ингибирование пути TLR7/8 в сравнении с существующими в настоящее время средствами лечения волчанки. Об этом свидетельствуют результаты, приведенные в таблице 1 ниже.
[0709]
ТАБЛИЦА 1.Эффективность и селективность соединения <b>ER-899742</b> в сравнении с гидроксихлорохином (Плаквенил).
Вид клеток:
<b>Лиганд:</b>
<b>Рецептор(ы):</b>
<b>Аналит:</b>
<b>ER-899742</b> IC<sub>50</sub> (мкМ)
HCQ<sup>2</sup>IC<sub>50</sub> (мкМ)
HEK-293
LPS
Человеческий TLR4
NFkB -люцифераза
>10
N.D.
HEK-293
CL097
Человеческий TLR7
NFkB -люцифераза
0,006
N.D.
HEK-293
CpG-ODN
Человеческий TLR9
NFkB -люцифераза
>10
N.D.
Hu PBMC
<sup>1</sup>RNA-Ig
Человеческий TLR7/8
IL-6
0,0009
1-2
Hu PBMC
LPS
Человеческий TLR4
IL-6
>10
Hu PBMC
CpG-ODN
Человеческий TLR9
IL-6
0,15-0,30
ПОЯСНЕНИЯ К ТАБЛИЦЕ:
<sup>1</sup>RNA-Ig=оцРНК, полученная из последовательности IV стволовой петли UlsnRNA в комплексе с антителом (см. «Материалы и способы» для более подробной информации)
<sup>2</sup>HCQ=Гидроксихлорохин
[0710]
Фармакологические исследования in vitro
70-80
50
50
50
Сравнительную эффективность ER-899742 по сравнению с гидроксихлорохином дополнительно исследовали с использованием клонированного TLR7 и соединения 8 в клеточной линии НЕК 293, как описано ниже в разделе . Также сравнивали воздействие на TLR7 мышей. Перед считыванием интенсивности люминесценции клетки стимулировали в течение ночи агонистом TLR7/8 против CL097 при заранее определенной ED: 3 мкг/мл для НЕК-hTLR7, 1,5 мкг/мл для НЕК-mTLR7 и 12 мкг/мл для НЕК-hTLR8. Осуществляли три исследования и определяли значение IC с использованием программы GraphPad Prism 6 для построения графика нелинейной регрессии. Отдельные результаты исследования и их средние значения приведены в таблице 2. Данные показывают, что в этом анализе ER-899742 имел среднее значение IC, равное 0,024 мкМ, в клеточной линии НЕК TLR7, и среднее значение IC, равное 0,0024 мкМ, в клеточной линии НЕК/TLR8.
[0711]
ТАБЛИЦА 2.Эффекты <b>ER-899742</b> в отношении реакции TLR7 и TLR8 по сравнению с гидроксихлорохином.
<b>IC</b><sub><b>50</b></sub><b> (мкМ)</b>
<b>Вид клеток:</b>
<b>Тест</b>
<b>ER-899742</b>
<b>HCQ</b>
HEK-mTLR7<sup>1</sup>
1
0,066
13,85
2
0,071
13,53
3
0,076
15
среднее
<b>0,071</b>
<b>14,13</b>
HEK-hTLR7
1
0,024
6,8
2
0,023
14,55
3
0,026
5,95
среднее
<b>0,024</b>
<b>9,10</b>
HEK-hTLR8
1
0,002
>>10
2
0,0025
>>10
3
0,0026
>>10
среднее
<b>0,0024</b>
<b>>>10</b>
[0712]
1
mTLR7, мышиный TLR7; hTLR7, человеческий TLR7; hTLR8, человеческий TLR8
[0713]
ТАБЛИЦА 3.Эффективность селективных соединений против человеческого TLR8 в формате исследования HEK-293 (более подробно см. в разделе Фармакологические материалы и способы).
<b>Номер соединения</b>
<b>HEK/hTLR8</b>IC<sub>50</sub> (мкМ)
<b>Номер соединения</b>
<b>HEK/hTLR8</b><b>IC</b><sub><b>50</b></sub><b> (мкМ)</b>
ER-878952
0,0060
ER-886858
0,0020
ER-878952
0,0195
ER-886869
0,1610
ER-879484
0,0180
ER-886949
0,0780
ER-879713
0,0800
ER-886953
0,0660
ER-880191
0,0100
ER-886955
0,0830
ER-880639
0,0500
ER-887138
0,0130
ER-885047
0,0940
ER-887139
0,0080
ER-885113
0,0110
ER-887142
0,1150
ER-885493
0,1007
ER-887143
0,1480
ER-885612
0,0550
ER-887144
0,0480
ER-885618
0,0050
ER-887145
0,1050
ER-885621
0,0250
ER-887199
0,0770
ER-885892
0,0370
ER-887253
0,0020
ER-885906
0,0200
ER-887258
0,1750
ER-885930
0,1470
ER-887259
0,0005
ER-886355
0,0660
ER-887261
0,0770
ER-886431
0,0310
ER-887269
0,0032
ER-886507
0,1820
ER-887271
0,0016
ER-886508
0,1860
ER-887272
0,0029
ER-886509
0,1190
ER-887443
0,1380
ER-886514
0,0050
ER-887444
0,1930
ER-886530
0,0050
ER-887526
0,1220
ER-886532
0,0300
ER-887528
0,1350
ER-886533
0,0140
ER-887538
0,0850
ER-886565
0,0290
ER-887539
0,0005
ER-886567
0,0050
ER-887540
0,0030
ER-886568
0,0050
ER-887586
0,1265
ER-886624
0,0860
ER-887587
0,0018
ER-886625
0,0100
ER-887588
0,0005
ER-886626
0,0050
ER-887722
0,0210
ER-886629
0,0050
ER-887723
0,0090
ER-886814
0,0600
ER-887724
0,0060
ER-886816
0,1070
ER-887725
0,0010
ER-886818
0,0810
ER-887927
0,0005
ER-886820
0,0780
ER-887928
0,0110
ER-886854
0,0460
ER-890963
0,0028
ER-886857
0,0720
ER-894594
0,1160
[0714] Экспресс анализ in vivo (STIV):
Для оценки эффективности соединений in vivo против мышиного TLR7 использовали in vivo (STIV). Вкратце, мышам перорально вводили соединения и затем в различные моменты времени для стимулирования TLR7 подкожно вводили агонист R848. Потом для оценки эффективности соединения и продолжительности действия соединения после стимуляции R848 измеряли уровень IL-6 в плазме посредством анализа ELISA. Важно отметить, что продукция цитокинов после in vitro или in vivo стимуляции с помощью R848, как показано, была полностью TLR7-зависимой при использовании мышей с дефицитом TLR7. Таким образом, активность соединений в исследовании STIV можно с уверенностью отнести к их модуляции пути TLR7. Однократная пероральная доза ER-899742, составляющая 300 мг/кг, полностью супрессирует путь R848/TLR7/IL-6 in vivo в течение, по крайней мере, 24 часов (см фиг.1А и фиг.1В). Сводные данные активности анализа STIV для группы соединений представлены в таблице 4 ниже.
[0715]
ТАБЛИЦА 4.Суммарные данные экспресс анализа in vivo (STIV) для некоторых соединений.
<b>% супрессии в сравнении со средой</b>
<b>ER-878410</b>
<b>ER-878629</b>
<b>ER-878952</b>
<b>ER-885493</b>
<b>ER-886611</b>
<b>ER-886788</b>
<b>ER-886814</b>
<b>ER-886820</b>
<b>ER-886948</b>
<b>ER-886953</b>
<b>ER-887137</b>
<b>ER-887145</b>
<b>ER-887259</b>
<b>ER-887268</b>
<b>ER-887269</b>
<b>ER-887270</b>
Время
Доза(мг/кг)
<b>3 часа</b>
<b>11</b>
<b>53</b>
<b>6</b>
<b>22</b>
<b>3</b>
<b>33</b>
<b>90</b>
<b>0</b>
<b>93</b>
<b>93</b>
<b>46</b>
<b>9</b>
<b>10</b>
<b>9</b>
<b>67</b>
<b>8</b>
<b>100</b>
<b>10</b>
<b>0</b>
<b>10</b>
<b>10</b>
<b>89</b>
<b>9</b>
<b>10</b>
<b>9</b>
<b>200</b>
<b>8</b>
<b>300</b>
<b>9</b>
<b>6</b>
<b>X</b>
<b>2</b>
<b>10</b>
<b>10</b>
<b>10</b>
<b>9</b>
<b>10</b>
<b>X</b>
<b>5 час</b>
<b>22</b>
2
<b>67</b>
<b>9</b>
<b>200</b>
<b>9</b>
<b>6 час</b>
<b>11</b>
<b>0</b>
<b>3</b>
<b>8</b>
<b>33</b>
<b>90</b>
<b>0</b>
<b>57</b>
<b>68</b>
<b>35</b>
<b>9</b>
<b>99</b>
<b>9</b>
<b>84</b>
<b>9</b>
<b>95</b>
<b>98</b>
<b>100</b>
<b>10</b>
<b>2</b>
<b>10</b>
<b>96</b>
<b>44</b>
<b>9</b>
<b>10</b>
<b>9</b>
<b>99</b>
<b>9</b>
<b>10</b>
<b>300</b>
<b>6</b>
<b>5</b>
<b>X</b>
<b>2</b>
<b>10</b>
<b>10</b>
<b>81</b>
<b>9</b>
<b>10</b>
<b>X</b>
<b>99</b>
<b>98</b>
<b>12 час</b>
<b>200</b>
<b>9</b>
<b>400</b>
<b>7</b>
<b>600</b>
<b>9</b>
<b>13 час</b>
<b>33</b>
<b>37</b>
<b>100</b>
<b>81</b>
<b>300</b>
<b>99</b>
<b>18 час</b>
<b>22</b>
<b>0</b>
<b>67</b>
<b>5</b>
<b>200</b>
<b>9</b>
<b>2</b>
<b>600</b>
<b>9</b>
<b>19 час</b>
<b>11</b>
<b>19</b>
<b>0</b>
<b>2</b>
<b>33</b>
<b>0</b>
<b>0</b>
<b>14</b>
<b>43</b>
<b>0</b>
<b>2</b>
<b>38</b>
<b>0</b>
<b>15</b>
<b>6</b>
<b>9</b>
<b>100</b>
<b>10</b>
<b>1</b>
<b>19</b>
<b>35</b>
<b>5</b>
<b>4</b>
<b>63</b>
<b>9</b>
<b>62</b>
<b>9</b>
<b>58</b>
<b>300</b>
<b>3</b>
<b>1</b>
<b>X</b>
<b>2</b>
<b>10</b>
<b>39</b>
<b>49</b>
<b>9</b>
<b>10</b>
<b>X</b>
<b>99</b>
<b>95</b>
<b>24 час</b>
<b>33</b>
<b>25</b>
<b>100</b>
<b>26</b>
<b>300</b>
<b>10</b>
X = мыши не переносили указанную дозу.
<b>ER-887586</b>
<b>ER-887723</b>
<b>ER-887724</b>
<b>ER-887725</b>
<b>ER-887927</b>
<b>ER-888070</b>
<b>ER-888201</b>
<b>ER-888281</b>
<b>ER-888288</b>
<b>ER-888320</b>
<b>ER-888321</b>
<b>ER-888322</b>
<b>ER-888480</b>
<b>ER-889469</b>
Время
Доза(мг/кг)
<b>3 часа</b>
<b>33</b>
<b>99</b>
<b>9</b>
<b>7</b>
<b>10</b>
<b>98</b>
<b>100</b>
<b>100</b>
<b>99</b>
<b>9</b>
<b>9</b>
<b>98</b>
<b>10</b>
<b>10</b>
<b>100</b>
<b>200</b>
<b>300</b>
<b>99</b>
<b>9</b>
<b>6 час</b>
<b>11</b>
<b>85</b>
<b>33</b>
<b>62</b>
<b>10</b>
<b>99</b>
<b>9</b>
<b>100</b>
<b>88</b>
<b>3</b>
<b>4</b>
<b>78</b>
<b>78</b>
<b>86</b>
<b>99</b>
<b>10</b>
<b>100</b>
<b>100</b>
<b>99</b>
<b>10</b>
<b>99</b>
<b>9</b>
<b>100</b>
<b>10</b>
<b>5</b>
<b>7</b>
<b>99</b>
<b>94</b>
<b>10</b>
<b>10</b>
<b>10</b>
<b>100</b>
<b>300</b>
<b>10</b>
<b>10</b>
<b>99</b>
<b>9</b>
<b>100</b>
<b>10</b>
<b>4</b>
<b>97</b>
<b>10</b>
<b>13 час</b>
<b>11</b>
<b>33</b>
<b>9</b>
<b>87</b>
<b>100</b>
<b>31</b>
<b>10</b>
<b>300</b>
<b>19 час</b>
<b>1,22</b>
<b>56</b>
<b>3,67</b>
<b>70</b>
<b>11</b>
<b>94</b>
<b>63</b>
<b>33</b>
<b>15</b>
<b>77</b>
<b>83</b>
<b>9</b>
<b>98</b>
<b>70</b>
<b>4</b>
<b>0</b>
<b>50</b>
<b>59</b>
<b>24</b>
<b>89</b>
<b>100</b>
<b>45</b>
<b>97</b>
<b>91</b>
<b>9</b>
<b>100</b>
<b>90</b>
<b>7</b>
<b>6</b>
<b>53</b>
<b>59</b>
<b>82</b>
<b>98</b>
<b>73</b>
<b>300</b>
<b>95</b>
<b>10</b>
<b>99</b>
<b>9</b>
<b>100</b>
<b>99</b>
<b>7</b>
<b>10</b>
<b>24 час</b>
<b>11</b>
<b>33</b>
<b>14</b>
<b>100</b>
<b>0</b>
<b>300</b>
<b>55</b>
<b>ER-889470</b>
<b>ER-889556</b>
<b>ER-889601</b>
<b>ER-889745</b>
<b>ER-890093</b>
<b>ER-890223</b>
<b>ER-890311</b>
<b>ER-890345</b>
<b>ER-890346</b>
<b>ER-890931</b>
<b>ER-890963</b>
<b>ER-890964</b>
<b>ER-893881</b>
<b>ER-894206</b>
<b>ER-894550</b>
Время
Доза(мг/кг)
<b>3 часа</b>
<b>33</b>
<b>10</b>
<b>10</b>
<b>93</b>
<b>8</b>
<b>10</b>
<b>9</b>
<b>10</b>
<b>90</b>
<b>96</b>
<b>95</b>
<b>9</b>
<b>67</b>
<b>100</b>
<b>98</b>
<b>10</b>
<b>96</b>
<b>93</b>
<b>92</b>
<b>99</b>
<b>6 час</b>
<b>11</b>
<b>33</b>
<b>96</b>
<b>10</b>
<b>95</b>
<b>94</b>
<b>92</b>
<b>82</b>
<b>98</b>
<b>82</b>
<b>8</b>
<b>98</b>
<b>100</b>
<b>10</b>
<b>10</b>
<b>90</b>
<b>84</b>
<b>95</b>
<b>99</b>
<b>99</b>
<b>99</b>
<b>9</b>
<b>300</b>
<b>10</b>
<b>13 час</b>
<b>33</b>
<b>0</b>
<b>98</b>
<b>31</b>
<b>0</b>
<b>4</b>
<b>72</b>
<b>100</b>
<b>99</b>
<b>10</b>
<b>80</b>
<b>19</b>
<b>7</b>
<b>97</b>
<b>300</b>
<b>95</b>
<b>10</b>
<b>99</b>
<b>19 час</b>
<b>1,22</b>
<b>44</b>
<b>3,67</b>
<b>89</b>
<b>0</b>
<b>11</b>
<b>29</b>
<b>0</b>
<b>48</b>
<b>0</b>
<b>0</b>
<b>33</b>
<b>47</b>
<b>0</b>
<b>0</b>
<b>52</b>
<b>2</b>
<b>53</b>
<b>45</b>
<b>0</b>
<b>100</b>
<b>78</b>
<b>98</b>
<b>96</b>
<b>52</b>
<b>88</b>
<b>24 час</b>
<b>33</b>
<b>0</b>
<b>48</b>
<b>100</b>
<b>64</b>
<b>50</b>
<b>71</b>
<b>300</b>
<b>10</b>
<b>10</b>
<b>99</b>
<b>ER-894551</b>
<b>ER-895204</b>
<b>ER-897968</b>
<b>ER-897969</b>
<b>ER-898566</b>
<b>ER-898694</b>
<b>ER-898946</b>
<b>ER-899017</b>
<b>ER-899018</b>
<b>ER-899122</b>
<b>ER-899193</b>
<b>ER-899285</b>
Время
Доза(мг/кг)
<b>6 час</b>
<b>11</b>
<b>98</b>
<b>98</b>
<b>33</b>
<b>98</b>
<b>81</b>
<b>0</b>
<b>10</b>
<b>9</b>
<b>61</b>
<b>3</b>
<b>100</b>
<b>99</b>
<b>73</b>
<b>4</b>
<b>75</b>
<b>300</b>
<b>13 час</b>
<b>11</b>
<b>52</b>
<b>37</b>
<b>33</b>
<b>56</b>
<b>22</b>
<b>3</b>
<b>29</b>
<b>73</b>
<b>2</b>
<b>2</b>
<b>0</b>
<b>90</b>
<b>100</b>
<b>98</b>
<b>43</b>
<b>35</b>
<b>54</b>
<b>86</b>
<b>3</b>
<b>16</b>
<b>0</b>
<b>12</b>
<b>10</b>
<b>5</b>
<b>0</b>
<b>300</b>
<b>X</b>
<b>99</b>
<b>85</b>
<b>71</b>
<b>98</b>
<b>5</b>
<b>55</b>
<b>1</b>
<b>X</b>
<b>24 час</b>
<b>11</b>
<b>0</b>
<b>33</b>
<b>53</b>
<b>39</b>
<b>0</b>
<b>0</b>
<b>0</b>
<b>0</b>
<b>28</b>
<b>15</b>
<b>100</b>
<b>91</b>
<b>39</b>
<b>8</b>
<b>4</b>
<b>30</b>
<b>0</b>
<b>0</b>
<b>0</b>
<b>89</b>
<b>300</b>
<b>X</b>
<b>78</b>
<b>80</b>
<b>29</b>
<b>10</b>
<b>3</b>
<b>34</b>
<b>0</b>
<b>X</b>
<b>X = мыши не переносили указанную дозу.</b>
<b>ER-899322</b>
<b>ER-899337</b>
<b>ER-899369</b>
<b>ER-899417</b>
<b>ER-899418</b>
<b>ER-899457</b>
<b>ER-899464</b>
<b>ER-899476</b>
<b>ER-899477</b>
<b>ER-899481</b>
<b>ER-899616</b>
Время
Доза(мг/кг)
<b>6 час</b>
<b>100</b>
<b>95</b>
<b>99</b>
<b>98</b>
<b>71</b>
<b>19</b>
<b>10</b>
<b>9</b>
<b>99</b>
<b>96</b>
<b>5</b>
<b>79</b>
<b>13 час</b>
<b>100</b>
<b>70</b>
<b>30</b>
<b>62</b>
<b>0</b>
<b>10</b>
<b>74</b>
<b>9</b>
<b>65</b>
<b>68</b>
<b>5</b>
<b>27</b>
<b>ER-899619</b>
<b>ER-899688</b>
<b>ER-899718</b>
<b>ER-899722</b>
<b>ER-899742</b>
<b>ER-899745</b>
<b>ER-899477</b>
<b>ER-899835</b>
<b>ER-899836</b>
Время
Доза(мг/кг)
<b>6 час</b>
<b>100</b>
<b>79</b>
<b>10</b>
<b>74</b>
<b>89</b>
<b>10</b>
<b>10</b>
<b>9</b>
<b>99</b>
<b>9</b>
<b>13 час</b>
<b>100</b>
<b>35</b>
<b>96</b>
<b>51</b>
<b>33</b>
<b>61</b>
<b>5</b>
<b>2</b>
<b>79</b>
<b>87</b>
[0716] Мышиные модели волчанки.
Для РОС оценки соединений были выбраны две различные модели заболеваний волчанки (NZB/W и пристан), поскольку (1) штамм NZB/W развивает спонтанное заболевание с полигенной этиологией, демонстрируя многие признаки волчанки человека, например, ДНК-ассоциированную аутореактивность, протеинурию и нефрит, опосредованный иммунным комплексом, и (2) положительные результаты целевой оценки TLR7 и/или TLR9 отмечали для обеих моделей заболеваний.
[0717]
Основные выводы для ER-899742 в моделях SLE являются следующими (см. фиг.2A-фиг.2C, фиг.3A-3E и фиг.7A-7G, и таблицу 7):
ER-899742
1)в нескольких дозах в диапазоне 33-300 мг/кг обеспечивает выраженное увеличение выживаемости в модели NZB/W, соответствующее существенному снижению протеинурии и гистологических признаков гломерулонефрита.
IR-899742
ER-899742
ER-899742
2) супрессирует различные специфичности аутоантител в модели с пристаном, в частности, сильным воздействием на РНК-связанную реактивность, например, анти-RiboP титры. Снижение экспрессии некоторых IFN-модулированных генов в цельной крови является результатом обработки  в этой модели. Также в этой модели наблюдали подавление артрита посредством .
[0718]
ER-899464
Основные выводы для в моделяхSLE являются следующими (см. фигуры 4-5):
ER-899464
1) в нескольких дозах, в диапазоне от 33 до 300 мг/кг, обеспечивает значительное увеличение выживаемости в модели NZB/W, сопровождаемое значительным снижением протеинурии.
ER-899464
2)  супрессирует различные специфичности аутоантител в модели с пристаном, в частности, сильным воздействием на РНК-связанную реактивность, например, анти-RiboP титры.
[0719] ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ
:
[0720] Фармакологические данные in vitro
:
[0721]
5
2
Клетки HEK-293 (ATCC) создавали для стабильной экспрессии фактора транскрипции NF-каппаB, индуцируемого Е-селектин (ELAM-1) люциферазным репортером, полученного из плазмиды pGL3 (Promega), содержащей пары оснований, от -224lbp до -254bp, из промотора человеческого гена E-селектина (инвентарный номер NM_000450). Затем эти клетки создавали для стабильной и индивидуальной экспрессии TLR4, TLR7 или TLR9 полноразмерной ORF кДНК человека. Человеческую кДНК TLR4 (инвентарный номер NM_138554) клонировали в вектор экспрессии pcDNA 3.0, (Invitrogen). TLR4 трансфицированные клетки также создавали для экспрессии человеческого MD-2 корецептора [MD-2 кДНК (инвентарный номер NM_015364) клонировали в вектор pEF-BOS] и добавляли 10 нМ растворимого CD14 (R&D Systems) в среде для оптимизации реактивностей LPS. Человеческую TLR9 кДНК (инвентарный номер NM_017442) клонировали в вектор pBluescript II KS (Agilent). Человеческую TLR7 кДНК (инвентарный номер NM_016562) получали из OriGene. Клетки НЕК-293, стабильно экспрессирующие человеческий TLR8 (инвентарный номер NM_138636) или мышиный TLR7 (инвентарный номер NM_133211), приобретали у компании InyivoGen и затем стабильно трансфицировали pNiFty2 (NF-каппаB)-люцифераза репортерной плазмидой (InvivoGen). Каждый тип клеток высевали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), содержащей 10% фетальную бычью сыворотку (FBS), при плотности 2,22×10 клеток/мл в 384-луночный планшет и инкубировали в течение 2-х дней при 37°C, 5% CO. Затем добавляли различные концентрации соединений антагониста. Потом клетки инкубировали в течение еще 30 минут, перед добавлением соответствующего агониста TLR, в следующем порядке (указаны конечные концентрации): липополисахарид (LPS; Sigma) при 10 мкг/мл для TLR4, CL097 (InvivoGen) при 3 мкг/мл для человеческого TLR7 и TLR8 и мышиного TLR7, и CpG-2006-2A [последовательность: TCGTCGTTAAGTCGTTAAGTCGTT (SEQ ID NO: 1) с фосфоротиоатным остовом, синтезируемый Sigma-Aldrich] в 0,6 мкM для TLR9. Затем клетки инкубировали в течение ночи и количественно определяли активацию NF-каппаB зависимого люциферазного репортера путем измерения люминесценции с помощью реагента SteadyGlo (Promega) или Steadylite™ (Perkin Elmer) в соответствии с протоколом, предложенным производителем.
[0722] Исследование на основе РВМС человека
2+
2+
6
5
. Мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС) выделяли из свежевзятой гепаринизированной (10 USP единиц/мл, Hospira, Lakeforest, IL) цельной крови здорового донора по градиенту плотности (Histopaque 1077, Sigma, Inc., St. Louis, MO). Вкратце, 25 мл крови с 15 мл PBS (без Ca, Mg) разбавляли в 50 мл конической пробирке, и добавляли 12 мл Histopaque с помощью спинальной иглы. Пробирки центрифугировали в течение 45 минут при 1200 оборотов в минуту (350×g), и РВМС собирали из лейкоцитарной пленки. Затем клетки дважды промывали в PBS, и красные кровяные клетки лизировали суспензией в 5 мл раствора хлорида аммония (IX Red Blood Cell Lysis Buffer, eBioscience) в течение 5 минут при комнатной температуре. После окончательной промывки в PBS, РВМС повторно суспендировали при конечной концентрации 2×10/мл в среде RPMI-1640 с L-глутамином (Invitrogen) и с добавлением 25 мМ HEPES (Mediatech, Inc, Manassas VA), 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone, Logan, UT) и пенициллин-стрептомицин-глутамина (Mediatech), и высевали при 100 мкл/лунка (2×10 клетки/лунка) в 96-луночные планшеты, обработанные культурой ткани (Falcon).
2
2
5
Соединения антагониста, солюбилизированные и последовательно разведенные в 100% ДМСО, добавляли в трех повторах к клеткам с выходом конечной концентрации 0,1% (ДМСО об/об). Гидроксихлорохин (Acros Organics), растворенный и серийно разведенный в PBS, добавляли в трех повторах к клеткам. РВМС инкубировали с соединениями антагониста или HCQ в течение 30 минут при 37°C, 5% CO, затем добавляли различные реагенты агонистов TLR в 100 мкл полной среды на лунку в следующей последовательности (указаны конечные концентрации): R848 (Resiquimod; GLSynthesis, Worcester, MA) при 1 мкМ для TLR7 и TLR8, LPS (Sigma) при 10 нг/мл для TLR4, и CpG-2216 (InvivoGen) при 5 мкг/мл для TLR9. Для получения агониста TLR7/8, который имитирует РНК-содержащие иммунные комплексы аутоантител у пациентов с волчанкой, синтезировали 26-мерную РНК с последовательностью, полученной из Ul-мяРНК структуры типа «стебель-петля» IV человека [(последовательность: GGGGGACUGCGU-UCGCGCUUUCCC (SEQ ID NO:2) с фосфоротиоатным остовом] (Dharmacon, Inc., Lafayette, CO), которая, как было показано ранее, является эффективным агонистом TLR7 и TLR8. Эту молекулу РНК разбавляли до 2,5 мкм в бессывороточной среде RPMI и добавляли мышиное моноклонального антитело к человеческой одноцепочечной ДНК (MAB3034, Millipore, Inc., Billerica, MA), которое также дает перекрестную реакцию с РНК при разбавлении 1:25 или при 1 мкг/мл. Перед добавлением к клеткам полученный стимул «РНК-Ig» инкубировали при комнатной температуре в течение 15-30 минут. PBMC инкубировали с различными агонистами TLR в течение 20 часов при 37°C, 5% СО. Собирали супернатанты клеточных культур, и уровни различных цитокинов человека оценивали, как указано стандартной процедурой ELISA в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем (BD Biosciences, Inc., San Diego, CA). Результаты приведены в таблице 5. В последующем исследовании (таблица 6) анализировали способность ER-899742 блокировать стимуляцию нормальных РВМС различными лигандами TLR7/8, но не ДНК-опосредованную активацию TLR9. В этом анализе клетки высевали в 96-луночные планшеты при 1×10 клетки/лунка в 100 мкл.
[0723]
Таблица 5
<b>Данные анализа PBMC для некоторых соединений</b>
<b>Номер соединения</b>
<b>PBMC человека</b>IC<sub>50</sub> (мкМ)
<b>Номер соединения</b>
<b>PBMC человека</b><b>IC</b><sub><b>50</b></sub><b> (мкМ)</b>
ER-878952
0,151
ER-886858
0,015
ER-878952
0,151
ER-886859
0,107
ER-879570
0,113
ER-886860
0,240
ER-879689
1,240
ER-886866
0,050
ER-880639
0,169
ER-886867
0,034
ER-884884
0,204
ER-886868
0,050
ER-885493
0,180
ER-886869
0,112
ER-885612
0,614
ER-886912
0,383
ER-885618
0,023
ER-886913
0,520
ER-885807
0,331
ER-886949
0,032
ER-885906
0,033
ER-886950
0,114
ER-886131
0,098
ER-886951
0,079
ER-886133
0,127
ER-886953
0,026
ER-886134
0,277
ER-886955
0,129
ER-886211
0,175
ER-886957
0,017
ER-886355
0,177
ER-886958
0,034
ER-886360
0,486
ER-887137
0,002
ER-886516
0,056
ER-887138
0,004
ER-886564
0,108
ER-887139
0,005
ER-886565
0,095
ER-887140
0,110
ER-886567
0,022
ER-887141
0,049
ER-886568
0,079
ER-887142
0,147
ER-886605
0,021
ER-887143
0,013
ER-886606
0,015
ER-887144
0,063
ER-886608
0,001
ER-887145
0,015
ER-886609
0,004
ER-887146
0,038
ER-886624
0,023
ER-887177
0,000
ER-886625
0,091
ER-887199
0,117
ER-886626
0,080
ER-887252
0,002
ER-886787
0,076
ER-887253
0,001
ER-886820
0,062
ER-887258
0,055
ER-886853
0,004
ER-887259
0,001
ER-886854
0,020
ER-887260
0,004
ER-886855
0,034
ER-887261
0,120
ER-886856
0,111
ER-887262
0,103
ER-886857
0,098
ER-887268
0,005
ER-887270
0,001
ER-887269
0,001
ER-887271
0,002
ER-888603
0,007
ER-887272
0,002
ER-888604
0,006
ER-887442
0,047
ER-888644
0,019
ER-887443
0,032
ER-888645
0,047
ER-887526
0,050
ER-888646
0,003
ER-887528
0,056
ER-888647
0,012
ER-887538
0,048
ER-888701
0,018
ER-887539
0,000
ER-888896
0,050
ER-887540
0,001
ER-888977
0,217
ER-887586
0,098
ER-889469
0,013
ER-887587
0,001
ER-889470
0,012
ER-887588
0,001
ER-889504
0,002
ER-887589
0,036
ER-889556
0,010
ER-887612
0,053
ER-889557
0,085
ER-887722
0,065
ER-889571
1,000
ER-887723
0,007
ER-889728
0,021
ER-887724
0,006
ER-889744
0,008
ER-887725
0,002
ER-889745
0,046
ER-887927
0,000
ER-889745
0,046
ER-887960
0,041
ER-889746
0,073
ER-888070
0,003
ER-889822
0,025
ER-888200
0,016
ER-890093
0,022
ER-888201
0,004
ER-890108
0,009
ER-888202
0,008
ER-890113
0,022
ER-888203
0,105
ER-890119
0,008
ER-888204
0,022
ER-890120
0,005
ER-888205
0,040
ER-890121
0,011
ER-888285
0,014
ER-890186
0,001
ER-888286
0,223
ER-890187
0,079
ER-888288
0,015
ER-890188
0,087
ER-888288
0,015
ER-890189
0,114
ER-888289
0,011
ER-890250
0,116
ER-888321
0,022
ER-890252
0,042
ER-888322
0,018
ER-890253
0,064
ER-888330
0,154
ER-890342
0,121
ER-888479
0,091
ER-890344
0,002
ER-888480
0,001
ER-895472
0,161
ER-890345
0,001
ER-895477
0,013
ER-890346
0,006
ER-897385
0,142
ER-890831
0,001
ER-897445
0,104
ER-890963
0,002
ER-897446
0,053
ER-890964
0,001
ER-897447
0,100
ER-892253
0,066
ER-897827
0,039
ER-893881
0,009
ER-897828
0,021
ER-893926
0,008
ER-897922
0,064
ER-893948
0,150
ER-897938
0,016
ER-894149
0,031
ER-897940
0,021
ER-894150
0,004
ER-897945
0,002
ER-894152
0,175
ER-897964
0,020
ER-894154
0,143
ER-897965
0,010
ER-894155
0,042
ER-897967
0,013
ER-894159
0,042
ER-897968
0,001
ER-894160
0,011
ER-897969
0,007
ER-894483
0,209
ER-7982
0,009
ER-894484
0,174
ER-899285
0,007
ER-894504
0,005
ER-899287
0,120
ER-894545
0,005
ER-899293
0,013
ER-894546
0,069
ER-899295
0,032
ER-894547
0,012
ER-899332
0,014
ER-894548
0,028
ER-899337
0,002
ER-894549
0,014
ER-899366
0,001
ER-894550
0,097
ER-899367
0,012
ER-894551
0,003
ER-899414
0,025
ER-894552
0,017
ER-899415
0,013
ER-894594
0,087
ER-899416
0,431
ER-894655
0,005
ER-899417
0,001
ER-894656
0,007
ER-899418
0,005
ER-895200
0,026
ER-899431
0,347
ER-895204
0,023
ER-899457
0,003
ER-895310
0,034
ER-899459
0,016
ER-895324
0,001
ER-899464
0,001
ER-895325
0,026
ER-899476
0,003
ER-895326
0,002
ER-899477
0,006
ER-895327
0,026
ER-899479
0,002
ER-898563
0,122
ER-899481
0,008
ER-898565
0,198
ER-899588
0,007
ER-898566
0,011
ER-899688
0,011
ER-898694
0,002
ER-899742
0,001
ER-898707
0,002
ER-899745
0,004
ER-898914
0,168
ER-899134
0,010
ER-898919
0,055
ER-899140
0,011
ER-898921
0,302
ER-899152
0,036
ER-898922
>1,00
ER-899154
0,014
ER-898923
0,631
ER-899160
0,252
ER-898946
0,002
ER-899161
0,125
ER-899017
0,004
ER-899193
0,009
ER-899018
0,009
ER-899278
0,001
ER-899019
0,014
ER-899282
0,034
ER-899020
0,035
ER-899616
0,054
ER-899021
0,005
ER-899619
0,033
ER-899121
0,142
ER-899626
0,001
ER-899122
0,080
[0724]
[0725] Клеточное исследование селезенки мыши
2
2
2
6
5
. У самок мышей BALB/с (Jackson Labs, Bar Harbor, ME), умерщвленных с помощью СО, изымали селезенки. Моноклеточную суспензию получали путем пропускания селезенок через нейлоновый клеточный фильтр с диаметром ячейки 40 мкм. Клетки дважды промывали по 50 мл PBS (Mediatech, Inc., Manassas, VA), и эритроциты лизировали в 5 мл буфера для лизиса RBC (eBioscience, Inc., San Diego, CA) в течение 5 минут при комнатной температуре. Клетки промывали два раза дополнительно PBS и, наконец, снова суспендировали в дополненном RPMI-1640 при плотности 2,5×10 клеток/мл. Клетки высевали при 100 мкл/лунка (2,5×10 клеток/лунка) в 96-луночных планшетах, обработанных тканевой культурой (Falcon). Серийные разведения соединений, растворенные в 100% ДМСО, добавляли в трех повторах к клеткам с получением конечной концентрации 0,1% ДМСО. Клетки инкубировали с соединением в течение 30 минут при 37°C, 5% CO, затем добавляли 100 мкл/лунка 740 мкМ R848 (Resiquimod; GLSynthesis, Worcester, MA) в полной среде для конечной концентрации 370 нм R848. Клетки инкубировали в течение 20 часов при 37°C, 5% СО. Супернатанты культур собирали, и уровни IL-6 оценивали с использованием стандартной процедуры ELISA в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем (BD Biosciences, Inc., San Diego, CA). Полученные данные приведены ниже в таблице 7.
Таблица 7
<b>Данные по мышиным спленоцитам</b>
<b>Номер соединения</b>
<b>Мышиные спленоциты</b><b>IC</b><sub><b>50</b></sub><b> (мкМ)</b>
<b>Номер соединения</b>
<b>Мышиные спленоциты</b><b>IC</b><sub><b>50</b></sub><b> (мкМ)</b>
ER-878952
1,611
ER-889601
0,179
ER-885493
0,517
ER-889745
0,090
ER-887253
0,049
ER-890093
0,088
ER-887268
2,124
ER-890311
0,428
ER-887722
0,463
ER-890831
0,170
ER-887723
0,047
ER-890963
0,250
ER-887724
0,070
ER-893881
0,270
ER-887927
0,026
ER-893948
0,420
ER-888070
0,076
ER-894152
0,660
ER-888288
0,135
ER-894655
0,084
ER-888480
0,087
ER-894656
0,023
ER-889469
0,097
ER-895204
0,051
ER-889470
0,152
ER-895325
0,120
ER-889556
0,432
ER-895326
0,090
[0726] Фармакологические исследования in vivo:
[0727] Экспресс анализ in vivo (STIV)
. Шести-восьми недельным самкам мышей линии BALB/с (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) перорально вводили через зонд, в объеме 200 мкл, соединения антагониста, объединенные с 0,5% водным раствором метил-целлюлозы (Sigma, St. Louis, MO). После этого в разные моменты времени для стимулирования TLR7 мышам вводили подкожно, в объеме 100 мкл, 15 мкг R848 (Resiquimod; GLSynthesis, Worcester, MA). Плазму крови собирали пункцией сердца, и определяли уровни IL-6 через 1,5 часа после стимуляции LR7 с использованием стандартной процедуры ELISA в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем (R&D Systems).
[0728] Формы мышиной модели волчанки
. Мышей самок линии NZB WF1/J приобретали у компании Jackson Labs (Bar Harbor, ME), обе из которых демонстрировали спонтанную волчанку. Самок мышей линии DBA/1 приобретали у компании Harlan Laboratories (Indianapolis, IN) и, в указанном возрасте, внутрибрюшинно инъецировали 0,5 мл пристана (2,6,10,14-тетраметилпентадекан; Sigma, St. Louis, MO) для индуцирования химическим способом волчанки, или 0,5 мл PBS для получения аналогичных по возрасту небольных контрольных мышей.
[0729]
Дальнейшее исследование варианта осуществления показано на фиг.2A-фиг.2C, демонстрирующих исследование ER-899742 на модели волчанки у мышей линии NZBxNZW (далее сокращенно NZBWF1/J или NZB/W). Самок мышей линии NZBWF1/J получали в возрасте 5 недель, выполняли начальный отбор крови и контролировали прогрессирование заболевания у мышей по следующим титрам анти-дцДНК. Мышей в возрасте 27 недель распределяли в случайном порядке на группы с эквивалентными средними анти-дцДНК титрами, и в возрасте 29 недель обрабатывали только носителем (Veh; 0,5% метил-целлюлозы) или перорально один раз в день (QD РО) в дозе 33, 100 или 300 мг/кг. Через 17 недель обработки у мышей в возрасте 46 недель отбирали кровь и исследовали титры анти-дцДНК. Всех мышей в возрасте 50 недель умерщвляли (21 неделя обработки соединением). На фиг.2(а) показано, что незадолго до достижения 50-недельного возраста (через 21 неделю обработки) у отдельных мышей собирали мочу, и для каждого животного определяли соотношение альбумин/креатинин в моче (UACR, протеинурия) в качестве косвенного показателя функции почек. На фиг.2(B) показана динамика смертности, наблюдаемая в этом исследовании для групп, обработанной самой высокой и самой низкой дозой. После обработки соединением смертность не наблюдалась. Кроме того, в группе, обработанной средней дозой (не показано), смертность не наблюдалась. На фиг.2(С) показано влияние обработки на анти-дцДНК титры через 17 недель введения препарата, в возрасте 46-ти недель. Не наблюдался статистически значимый эффект.
[0730]
В конце эксперимента у подопытных животных отбирали почки, как показано на фиг.2А-2С, фиксировали в 10% формалине в течение 24 часов, заливали в парафин, и Н&Е окрашенные срезы получали для гистопатологической оценки слепым методом (степень 0/1+: от «в пределах нормы» до минимальной; степень 2: умеренная; степень 3: от умеренно выраженной до выраженной; степень 4: тяжелая). Результаты представлены в таблице 8.
[0731]
Таблица 8.
Среда
ER-899742, 33 mpk
ER-899742, 100 mpk
ER-899742, 300 mpk
Общее число исследованных мышей
19
18
17
18
GN Score
0
0
11
15
9
2+
1
5
1
7
3+
4
1
1
0
4+
14
1
0
2
% объединенного заболевания степени 3 и 4
74%
11%
6%
11%
[0732] Оценка титров аутоантител методом ELISA
. Титры анти-дсДНК, -Sm/яРНА, -RiboP и -гистона оценивали с использованием стандартного метода ELISA. Вкратце, 96-луночные EIA/RIA ELISA планшеты (Corning) покрывали 100 мкл разбавленного антигена в PBS в течение 90 минут при комнатной температуре в следующей последовательности (указаны конечные концентрации): 10 ед/мл комплекс Sm/яРНП (Immunovision), 10 мкг/мл дцДНК тимуса теленка (Sigma), 5 ед/мл RiboP (Immunovision) и 5 мкг/мл гистон (Immunovision). Планшеты промывали PBS/0,05% Tween 20 (промывочный буфер) и блокировали в течение ночи PBS/1% BSA (блокирующий буфер) при 4°C. Планшеты промывали, образцы плазмы мыши, разведенные в блокирующем буфере (в пределах 1:25-1:10000 в зависимости от модели и антигена), добавляли в лунки в объеме 100 мкл на лунку, и планшеты инкубировали в течение 90 минут при комнатной температуре. Затем планшеты промывали, в каждую лунку добавляли 100 мкл анти-мышиного-IgG-HRPO (Southern Biotech), разбавленного 1:50000 в PBS/1%BSA/0,05%>Tween, и планшеты инкубировали в течение 90 минут при комнатной температуре. Планшеты промывали и в лунки добавляли 100 мкл 1:1 смеси компонентов субстрата из набора субстрата OptEIA ТМВ (BD Biosciences). Планшеты инкубировали при комнатной температуре и, после достаточного формирования цвета, реакцию останавливали добавлением 100 мкл раствора 0,18M серной кислоты. Планшеты считывали спектрофотометрическим методом при длине волны 450 нм.
[0733] Оценка протеинурии
. У отдельных мышей отбирали мочу либо вручную, либо путем помещения 1-2 мышей на метаболическую клетку на 18 часов, и для каждого животного определяли соотношение альбумин/креатинин в моче (UACR) в качестве косвенного показателя функции почек. (UACR вычисляли как соотношение альбумина (мг) и креатинина (г) на децилитр мочи). Определяли уровни альбумина в образцах мочи, используя специальный протокол «сэндвич»-метода ELISA с использованием набора мышиных антител к альбумину (Bethyl Labs), который включал покрывающее антитело и вторичное антитело, меченное конъюгатом HRP для обнаружения. Уровни креатинина определяли с использованием коммерческого набора для анализа креатинина (Cayman).
[0734] Гистологическая оценка нефрита
. У отдельных мышей изымали почки, фиксировали в 10% формалине в течение 24 часов, заливали в парафин и получали Н&Е окрашенные срезы для патоморфологической оценки слепым способом. Симптомы для оценки нефрита являются следующими: Степень 0 - нормальные пределы; Степень 1 - лентовидное утолщение капиллярных стенок; Степень 2 - повышенное содержание паренхиматозных клеток, сегментирование, образование серповидных тел; Степень 3 - смотри Степень 2, увеличение тяжести и степени (% поражения клубочков) поражения клубочков; Степень 4 - склероз; тяжелая гломерулярная болезнь (нефункциональный орган).
[0735] Оценка экспрессии генов интерферона в цельной крови
. Экспрессию IFN-регулируемых генов в цельной крови измеряли с помощью кПЦР. Вкратце, мышей умерщвляли, кровь отбирали через полую вену, и 100 мкл хранили в пробирках, содержащих RNAlater (Ambion, Austin TX). Суммарную РНК выделяли с использованием набора Mouse RiboPure Blood RNA Isolation Kit (Ambion). Концентрации РНК определяли с использованием спектрофотометра NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific, Waltham MA). Синтезировали первую цепь кДНК из 100 нг суммарной РНК с использованием смеси Superscript Vilo™ Master Mix (Life Technologies, Grand Island, NY). После обратной транскрипции кДНК разбавляли водой без нуклеаз и перемешивали со смесью TaqMan Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems). Затем смесь наносили на специальный TaqMan Low Density Array (TLDA), произведенный фирмой Applied Biosystems, и кПЦР выполняли на ABI 7900HT Fast Real-time PCR System (Applied Biosystems). Исходные данные объединяли с помощью RQ-Manager 1.2.1 (Applied Biosystems) и анализировали с использованием программного обеспечения Genedata Analyst 2.2 (Genedata).
[0736]
A simple sequentially rejective multiple test procedure.
Панель TLDA содержит до 45 генов-мишеней, выбранных из таблицы 9, представленной ниже, и 3 конститутивных гена для нормализации. Конститутивные гены Hprtl выбирали для нормализации на основе коэффициента вариации. Относительные величины определяли для генов-мишеней и использовали для вычисления кратности изменения для каждой пораженной заболеванием мыши относительно контрольной группы, непораженной заболеванием, которой вводили внутрибрюшинно только инъекции PBS. Стандартный t-критерий Стьюдента осуществляли с целью определения того, какие гены-мишени значительно увеличены между группой непораженной заболеванием (обработанной PBS) и группой, пораженной заболеванием и обработанной наполнителем (обработанной пристаном), представляя, таким образом, набор заболевание-регулированных генов. На фиг.7G показана коррекция ложных результатов при множественном сравнении (FDR) с помощью команды p.adjust в пакете «базовый» с опцией по умолчанию. Holm, S. Scandinavian Journal of Statistics, 1979. 6(2): p. 65-70. Впоследствии для каждой мыши вычисляли «показатель IFN» как медианное кратное изменение всех заболевание-регулированных генов, идентифицированных в t-критерии.
Таблица 9
<b>Символ гена</b>
<b>Taqman ID</b>
<b>Название гена</b>
18S
Hs99999901_sl
эукариотическая 18S рРНК
Bst2
Mm01609165_gl
антиген стромальных клеток костного мозга 2
C1qa
Mm00432142_ml
компонент комплемента 1, субкомпонент q, альфа-полипептид
C3
Mm00437858_ml
компонент комплемента 3
C3ar1
Mm02620006_sl
рецептор 1 компонента комплемента 3a
Ccl2
Mm00441243_gl
хемокиновый лиганд 2 (C-C мотива)
Ccl5
Mm01302427_ml
хемокиновый лиганд 5 (C-C мотива)
Ccr2
Mm00438270_ml
хемокиновый рецептор 2 (C-C мотива)
Cd274
Mm00452054_ml
антиген CD274
Cd300e
Mm00468131_ml
антиген CD300e
Cd38
Mm01220906_ml
антиген CD38
Cd40
Mm00441891_ml
антиген CD40
Cdkn2c
Mm00483243_ml
ингибитор циклин-зависимой киназы 2С (p18, ингибирует CDK4)
Cmpk2
Mm00469582_ml
цитидинмонофосфат (UMP-CMP) киназа 2
Cxcl10
Mm00445235_ml
хемокиновый лиганд 10 (C-X-C мотива)
Cxcl11
Mm00444662_ml
хемокиновый лиганд 11 (C-X-C мотива)
Ddx60
Mm00460708_ml
DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box полипептид 60
Elane
Mm00469310_ml
эластаза, экспессированная нейтрофилами
Epsti1
Mm00712734_ml
взаимодействие эпителиальных клеток стромы 1 (молочная железа)
Fcgr1
Mm00438874_ml
Fc рецептор, IgG, высокая аффинность I
Fpr1
Mm00442803_sl
формилпептидный рецептор 1
Gapdh
Mm99999915_gl
глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа
Herc6
Mm01341950_ml
hect-домен и RLD 6
Hprt
Mm00446968_ml
гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза
Ifi202b
Mm00839397_ml
интерферон-активированный ген 202B
Ifi204
Mm00492602_ml
интерферон-активированный ген 204
Ifi27l2a
Mm01329883_gH
интерферон, индуцибeльный альфой белок 27 типа 2A
Ifi35
Mm00510329_ml
интерферон-индуцированный белок35
Ifi44
Mm00505670_ml
интерферон-индуцированный белок 44
Ifih1
Mm00459183_ml
интерферон, индуцированный с доменом 1 геликазы C
Ifit1
Mm00515153_ml
интерферон-индуцированный белок с тетратрикопептидными повторами 1
Ifit2
Mm00492606_ml
интерферон-индуцированный белок с тетратрикопептидными повторами 2
Ifit3
Mm01704846_sl
интерферон-индуцированный белок с тетратрикопептидными повторами 3
Il3ra
Mm00434273_ml
интерлейкин 3 рецептора, альфа цепь
1l6
Mm00446190_ml
интерлейкин 6
Il6ra
Mm00439653_ml
интерлейкин 6 рецептора, альфа
Irf5
Mm00496477_ml
регуляторный фактор интерферона 5
Irf7
Mm00516788_ml
регуляторный фактор интерферона 7
Isg15
Mm01705338_sl
ISG15 убиквитин-подобный модификатор
Isg20
Mm00469585_ml
интерферон-стимулированный белок
Lta
Mm00440228_gH
лимфотоксин A
Ly6e
Mm01200460_gl
комплекс лимфоцит антиген 6, локус E
Mmp8
Mm00439509_ml
матриксная металлопротеиназа 8
Mmp9
Mm00442991_ml
матриксная металлопротеиназа 9
Mpo
Mm00447886_ml
миелопероксидаза
Ms4a6c
Mm00459296_ml
трансмембранные 4-домены, подсемейство A, член 6C
Mx1
Mm00487796_ml
myxovirus (вирус гриппа) резистентность 1
Oas3
Mm00460944_ml
2-5 олигоаденилатсинтетаза 3
Oasl2
Mm00496187_ml
2-5 олигоаденилатсинтетаза-подобная 2
Ppia
Mm02342430_gl
пептидилпролил изомераза A (циклофилин A)
Prf1
Mm00812512_ml
перфорин 1 (формирующий поры белок)
Rsad2
Mm00491265_ml
содержащий домен радикал S-аденозилметионин 2
Siglec1
Mm00488332_ml
Ig-подобный лектин 1, связывающий сиаловую кислоту 1, сиалоадгезин
Stat1
Mm00439531_ml
сигнал датчика и активатор транскрипции 1
Tlr7
Mm00446590_ml
Toll-подобный рецептор 7
Tlr9
Mm00446193_ml
Toll-подобный рецептор 9
Tnf
Mm00443258_ml
фактор некроза опухоли
Tnfsf10
Mm01283606_ml
фактор некроза опухоли (лиганд) надсемейство, член 10
Tnfsf13b
Mm00446347_ml
фактор некроза опухоли (лиганд) надсемейство, член 13b
Trem14
Mm00553947_ml
запускающий рецептор, экспрессированный на клетках подобным миелоидным 4
Trex1
Mm00810120_sl
экзонуклеаза три прим репарации 1
Usp18
Mm00449455_ml
убиквитин специфичная пептидаза 18
Xaf1
Mm01248390_ml
XIAP-связанный фактор 1