СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR BREAST CANCER

Изобретение относится к области медицины, в частности к области онкологии, и касается нового онкомаркера.
Рак молочной железы занимает первое место среди всех злокачественных заболеваний у женщин. По современным данным, частота развития рака молочной железы в России за последние 15 лет увеличилась более чем в 2 раза. Известно, что заболеваемость женщин, проживающих в крупных городах и индустриальных районах, выше, чем женщин сельской местности. Рак молочной железы встречается также у мужчин. Многие даже не подозревают о возможности развития у них такого заболевания, что ведет к несвоевременному обращению к врачам, поздней диагностике и началу лечения и, как следствие, к низким терапевтическим результатам.
Терапия заболевания в настоящее время основана на комбинации ранней диагностики и одного или нескольких способов лечения, таких как хирургия, лучевая терапия, химиотерапия и гормональная терапия. Курс лечения в конкретном случае рака молочной железы, как правило, выбирают на основе ряда прогностических параметров, включая анализ специфичных опухолевых маркеров.
Диагностических онкомаркеров известно очень много. Большинство из них успешно применяется в диагностике. Основным применением тестов на определение опухолевых маркеров является мониторинг течения заболевания и эффективности хирургического лечения и/или радио-, химио- и гормонотерапии. Показано, что динамика уровня опухолевого маркера отражает изменение состояния пациента. К тому же иногда удается дифференцировать доброкачественные и злокачественные заболевания по скорости повышения уровня маркера, которая при доброкачественных заболеваниях крайне низка. Ряд тестов может также использоваться в качестве диагностических при скрининговых обследованиях.
Таким образом, определение уровня онкомаркеров представляется целесообразным в следующих случаях:
1. Мониторинг течения заболевания.
2. Мониторинг терапии. Возможность обнаружения рецидива и/или метастазов за 6 мес. и более до начала клинических проявлений, что важно для определения тактики дальнейшего лечения.
3. Идентификация резидуальных опухолей. Отсутствие или незначительное снижение концентрации опухолевого маркера после хирургического вмешательства свидетельствует о неполном удалении опухоли либо о наличии множественных опухолей.
4. Прогнозирование развития некоторых опухолей.
5. Раннее выявление онкозаболеваний у пациентов группы высокого риска. Онкомаркеры могут как продуцироваться самой опухолью, так и вырабатываться организмом в ответ на развитие опухоли. Биомаркеры, используемые для прогнозирования и диагностики опухоли, могут иметь разную природу и происхождение. В современной медицине выделяют следующие категории: генетические, эпигенетические, биомаркеры белковой природы, гликаны (все моно- и полисахариды) и визуальные маркеры.
В настоящее время активно развивается область применения генетических и белковых биомаркеров как наиболее достоверных и простых в измерении.
Наиболее распространенные диагностические тест-системы построены на анализе биомаркеров в физиологических жидкостях, крови и мочи, однако, хорошим материалом для получения красноречивых результатов исследований является также биопсийный материал.
В науке и медицине онкомаркеры в основном используют с тремя основными целями:
1. Диагностической - для диагностики рака на ранних стадиях.
2. Прогностической - для прогноза степени агрессивности опухоли, ее характеристики и оценки рисков и шансов на выздоровление.
3. Предсказательной - для предсказания поведения опухоли в ответ на разные типы лечения. Является необходимой как при выборе вида терапии, так и при подборе конкретных лекарственных препаратов.
Оценка рисков.
Оценка онкомаркеров, ассоциированных с генетическими мутациями и эпигенетическими перестройками, имеет смысл при индивидуальном подходе для определения у пациентов предрасположенности к развитию того или иного вида рака. Известно, что мутации в определенных генах могут способствовать развитию рака и при обнаружении оных у пациентов делается вывод о повышенной предрасположенности к соответствующему типу рака.
Так, например, мутации в генах KRAS, р53, EGFR, erB2 характерны для рака кишечника, желудка, печени и поджелудочной железы; мутации в генах BRCA1 and BRCA2 - для рака молочной железы и яичников; аномальное метилирование в онкосупрессорных генах р16, CDKN2B и pl4ARF для рака мозга, гиперметилирование MYOD1, CDH1 и CDH13 для рака шейки матки, а р16, р14 и RB1 - для рака ротовой полости.
Диагностика.
Использование онкомаркеров оказывается весьма ценным при непосредственном установлении диагноза, в частности определении принадлежности опухоли к первичной или метастазам за счет сравнения хромосомных нарушений, обнаруженных в первичных и повторных опухолях. Если нарушения совпадают, то вторичная опухоль является метастазом первичной, а если различаются - то независимо возникшим новообразованием.
Прогноз и предсказание терапии. Еще одно применение онкомаркеры находят в прогнозировании болезни после того, как рак был диагностирован. Основываясь на присутствии или повышенной экспрессии некоторых биомаркеров, например, можно определить степень агрессивности рака и его потенциальный ответ на терапию. В качестве примера таких прогностических биомаркеров можно привести ингибитор металлопептидазы 1 (TIMP1) - маркер, ассоциированный с более агрессивными типами миеломы; а повышенный уровень эстрогенового (ER) или прогестеронового (PR) рецепторов характерен для пациентов с лучшей выживаемостью при раке молочной железы; гиперэкспрессия гена HER2 при раке молочной железы говорит о хорошем потенциальном ответе на терапию препаратом трастузумабом; а, например, опухоль с мутацией в 11 экзоне протоонкогена c-KIT с высокой вероятностью будет восприимчива к терапии иматинибом.
Фармадинамика и фармакинетика.
Онкомаркеры также используют для подбора наиболее оптимального режима лечения для каждого конкретного пациента. Из-за различия в эффективности метаболических процессов разные люди по-разному могут реагировать на определенные препараты, которые, накапливаясь в организме, могут представлять для некоторых большую опасность. Все эти показатели обязательно учитываются при расчете дозировок лекарственных препаратов при терапии. Так, например, пациенты с мутацией в гене ТРМТ не способны метаболизировать большие количества препарата меркаптопурина, используемого при терапии лейкемии, поэтому лечение этим препаратом назначается им с учетом особенностей организма.
Мониторинг эффективности терапии. Еще одно применение биомаркеры нашли в мониторинге эффективности примененной противораковой терапии во времени. Например, белок SlOO-beta при положительном ответе на терапию значительно сокращается в количестве в ряде меланом и его регулярная количественная оценка позволяет оценить эффективность примененного лечения.
Рецидивы.
Показатели некоторых онкомаркеров позволяют также сделать предсказание о вероятности рецидивов заболевания. Поиск препаратов для терапии рака.
Онкомаркеры оказываются весьма полезными не только в диагностике заболеваний, но и для поиска новых препаратов для химиотерапии, выступая в качестве мишеней при скрининге библиотек химических соединений.
Из уровня техники известен патент RU 2473555, опубл. 2013-01-27, который раскрывает способ оценки клинического прогноза для индивида, страдающего раком молочной железы, основанный на измерении экспрессии генов в образце рака молочной железы в следующих дескрипторных группах: (1) ERBB2, STAED3, GRB7, THRAP4, PPARBP; (2) ESR1, GATA3, ХВР1, TFF3, ACADSB; (3) KRT5, KRT17, TRIM29, GABRP; (4) KRT18, KRT8, PPP2CA, KRT8L2; (5) PLAU, COL5A2, FAP, THY1; (6) STAT1, UBE2L6, TAP1, LAP3 и (7) SEACAM5, SEACAM6, SEACAM7. При этом сверхэкспрессия большинства генов в дескрипторной группе по сравнению с образцом нормальной ткани молочной железы указывает на то, что образец ткани является положительным для данной группы, а отсутствие сверхэкспрессии большинства генов в дескрипторной группе по сравнению с образцом нормальной ткани молочной железы указывает на то, что образец ткани является отрицательным для данной группы.
Известна заявка ЕА 200971079 А1, касающаяся определенных генетических вариантов на Chr5pl2 и Chrl0q26 в качестве вариантов предрасположенности к раку молочной железы. Описываются способы управления течением заболевания, включающие диагностирование повышенной и/или пониженной предрасположенности к раку молочной железы, способы прогнозирования ответа на лечение и способы определения прогноза с применением таких вариантов.
Заявка US 20110251082 касается использования 2-мерного дифференциального геля (2D-ПГЛП) и масс-спектрального метода для идентификации биомаркеров рака молочной железы в трансформированных клетках молочной железы. Определены многочисленные предполагаемые маркеры для различных стадий рака молочной железы. Оценивалась экспрессия различных белков, в том числе PdLIM1. Однако был сделан вывод о потенциальной важности как маркера парвабумина и противоположном эффекте PdLIM1. Не представлено сведений о PdLIM4.
Заявка WO 2009124251 касается способа диагностики метастатического потенциала опухолей, в том числе клеток рака груди. В данном подходе предлагается измерение в клетках пациентов уровней пяти и более маркеров, выбранных из группы генов типизации TGF [Beta]:
Хотя среди используемых генов ген PDLIM4 упомянут, не раскрыто его использование как единственного маркера рака груди вне комбинаций с другими генами.
На данный момент не существует тестов на онкомаркеры, обладающих 100% чувствительностью и специфичностью. Это обстоятельство серьезно ограничивает их использование в первичной диагностике онкологических заболеваний, поэтому для достижения достоверного результата приходится комбинировать показатели нескольких маркеров. Постепенное накопление знаний относительно механизмов малигнизации ткани и нарушений, потенциально лежащих в основе опухолеобразования, приводит к тому, что в рамках существующих, известных, типов опухолей выделяют подгруппы, обладающие различными типичными профилями генетических нарушений и для которых возможно разработать высокоспецифичные терапевтические подходы. Таким образом, разработка новых биомаркеров опухолей способствует более точной и детальной классификации и, как следствие, дает возможность применять более эффективные терапевтические подходы.
Задача изобретения - разработка способа диагностики рака молочной железы и его применение для выявления отдельного подтипа злокачественных новообразований.
Задача решается за счет способа диагностики рака молочной железы с использованием биомаркера, основанного на эпигенетической супрессии гена PDLIM4/RIL, который может быть использован для диагностики и лечения рака молочной железы, оценки агрессивности заболевания и подбора способа терапии опухоли.
Предложен способ диагностики субтипа рака молочной железы, основанный на определении уровня экспрессии PDLIM4/RIL в опухолевой ткани с помощью технологии секвенирования следующего поколения NGS (next-generation sequencing) или методами Нозерн-гибридизации и ПЦР в реальном времени. Снижение экспрессии PDLIM4/RIL в образце пациента более чем в два раза в сравнении с его уровнем в нормальных тканях свидетельствует о злокачественном процессе (раке молочной железы по RIL-негативному типу) и неблагоприятном прогнозе.
Ген PDLIM4/RIL был впервые картирован на участке длинного плеча хромосомы 5 (5q31), часто делетирующей при ряде злокачественных заболеваний человека. Помимо делеций, ген PDLIM4/RIL часто подвергается эпигенетической супрессии, в результате которой его экспрессия подавляется. В таких случаях отмечается меньшая степень морфологической трансформации и пониженная частота активации тирозиновых киназ.
Технический результат, достигаемый при использовании изобретения - быстрая диагностика подтипа рака молочной железы путем измерения уровня транскриптов гена RIL будет способствовать адекватному выбору терапии. Предлагаемый подход позволит поставить правильный диагноз на ранних доклинических и клинических стадиях развития, в случаях малосимптомного, атипичного течения заболевания, уточнить характер новообразований молочной железы, в более короткие сроки определить тактику лечения. В связи со значительным разнообразием течения заболевания у пациентов медицина будущего будет больше ориентироваться на персонифицированные подходы к терапии. В этом смысле изобретение является актуальным, поскольку направлено на выявление распространенного подтипа рака молочной железы, требующего персонифицированного подхода к лечению. Также, определение детального механизма малигнизации опухолей этого подтипа открывает перспективы к созданию высокоизбирательных эффективных химиотерапевтических препаратов, направленных на ключевые компоненты нарушенных сигнальных путей.
Нами впервые была замечена корреляция супрессии гена PDLIM4/RIL с морфологией и биохимическими свойствами опухолевых клеток и установлена роль опухолевого супрессора в злокачественной трансформации клеток молочной железы. Результаты наших исследований указывают на то, что в рамках группы аденокарцином молочной железы, характеризующихся тройным негативным фенотипом, можно выделить крупную подгруппу опухолей, в которых в основе опухолевой трансформации лежит эпигенетическая супрессия PDLIM4/RIL. Подавление PDLIM4/RIL ведет к увеличению функциональной активности фосфатазы PTP-BL, которая, в свою очередь, дефосфорилирует и переводит в функционально-активную форму рецептор-неассоциированную тирозиновую киназу c-Src, ответственную за активизацию пролиферации, подавление про-апоптотических сигналов, увеличение клеточной подвижности. Возможность осуществления изобретения может быть продемонстрирована следующими примерами.
Пример 1. Определение роли PDLIM4/RIL в злокачественной трансформации.
Проведен анализ экспрессии его мРНК в образцах злокачественных новообразований из разных органов по сравнению с окружающей нормальной тканью методом Нозерн-гибридизации с Cancer Profiling Array I (BD Clontech) (241 пара образцов «опухоль/норма» из 8 тканей человека). Было обнаружено, что уровень экспрессии PDLIM4/RIL был подавлен в 2 и более раз в 43% (23 из 53) образцов злокачественных опухолей молочной железы (рис. 1). Для независимого подтверждения этих данных был проанализирован уровень PDLIM4/RIL в панели из 8 линий клеток карцином молочной железы человека. В четырех случаях из 8 экспрессия PDLIM4/RIL оказалась ниже уровня детекции, в остальных 4 клеточных линиях уровень PDLIM4/RIL был сравним с контролем (рис. 2а, б).
Сопоставление статуса PDLIM4/RIL с морфологией клеток позволило показать, что высокий уровень экспрессии PDLIM4/RIL коррелирует с повышенной агрессивностью культур рака молочной железы MDA-MB-231, -435S, -436 и ВТ-474 (рис. 2в). Клетки этих линий характеризуются звездчатой или веретенообразной формой, слабой степенью адгезии и распластанности, высокой скоростью роста и видимым отсутствием межклеточных контактов. Малоагрессивные клеточные линии MCF-7, ВТ-20, T-47D и MDA-MB-468 с недетектируемым уровнем PDLIM4/RIL, наоборот, сохраняют эпителиальную морфологию и межклеточные контакты. Анализ экспрессии эпителиального маркера Е-кадгерина подтвердил эффекты, наблюдаемые на уровне клеточной морфологии. Клетки линий MDA-MB-231, -435S, -436 и ВТ-474 не экспрессируют Е-кадгерин (методами иммуноблоттинга и ОТ-ПЦР) и не имеют межклеточных контактов, т.е. подверглись эпителиально-мезенхимной трансформации, которая является необходимым условием высокой степени агрессивности эпителиальных опухолей. Линии MCF-7, ВТ-20, T-47D и MDA-MB-468, наоборот, сохраняли высокие уровни Е-кадгерина, межклеточные контакты и эпителиальный фенотип (рис. 2).
Тем не менее, ни эктопическая экспрессия PDLIM4/RIL в малоагрессивных культурах клеток рака молочной железы, ни подавление его экспрессии в высокоагрессивных линиях с помощью коротких интерферирующих РНК не привела к реверсии фенотипов или изменению статуса Е-кадгерина. Из этого следует, что обратная корреляция между экспрессией этих двух белков - следствие их корегуляции одним сигнальным каскадом.
Известно, что экспрессия Е-кадгерина регулируется на уровне транскрипции тремя белками-репрессорами Snail, Slug и Twist, которые в свою очередь являются компонентами TGFβ/R-, NFkB-, ERK- или β-катенин- зависимых сигнальных путей. Была выявлена корреляция экспрессии PDLIM4/RIL и транскрипционного репрессора Slug, обратно коррелировавшие с уровнем мРНК Е-кадгерина (рис. 2а), причем эти события не зависели ни от NFkB, ни от ERK, ни от β-катенинового каскадов. При иммуноблот-анализе в тотальных белковых экстрактах малоагрессивных клеточных линий рака молочной железы была детектирована процессированная форма TGFβ1, выполняющего в нормальных условиях функцию сигнала к дифференцировке. Связывание трансформирующего фактора β со своим рецептором приводит к фосфорилированию, гетеродимеризации и транспорту в ядро белка Smad2, транскрипционного фактора, ответственного за активацию генов-мишеней сигнального каскада TGFβ. Выявление фосфорилированной формы Smad2 подтвердило факт активации TGFβ в этих клетках (рис. 2б). При этом тотальные количества Smad2 во всех исследованных клетках были сравнимыми.
Экспрессия PDLIM4/RIL подавляется в злокачественных новообразованиях молочной железы и опухолевых клеточных линиях того же происхождения, что сопровождается активацией сигнального каскада, инициируемого TGFβ1, и сохраненной экспрессией эпителиального маркера Е-кадгерина. Известно, что сверхэкспрессия близкородственного белка Mystique увеличивает зависимость клеток от субстрата. PDLIM4/RIL показывает аналогичный эффект, а его выключение способствует независимости клеток от прикрепления и более эффективному метастазированию. При снятии проблемы зависимости от адгезии с помощью какого-либо другого механизма может происходить отбор клеток с повышенной экспрессией PDLIM4/RIL, что будет способствовать усилению их миграции и пролиферации, повышая агрессивность опухоли.
Таким образом, нами показано, что низкий уровень экспрессии гена PDLIM4/RIL может служить эффективным диагностическим маркером для выявления отдельного подтипа злокачественных новообразований молочной железы - опухолей, характеризующихся неполной эпителиально-мезенхимальной транзицией и относительно малоинвазивных.
Рис.1. Экспрессия мРНК PDLIM4/RIL в человеческих опухолях различного происхождения по сравнению с нормальными тканями. Нозерн-анализ образцов тотальной РНК, представленных на микропанели Cancer Profiling Array I (BD Clontech), с помощью PDLIM4/RIL-специфического зонда. Все значения нормализованы по мРНК GAPDH. а - вид ауторадиограммы микропанели (О - образец тотальной РНК из опухоли; Н - из окружающей морфологически нормальной ткани от того же пациента); б - доля пар «норма : опухоль», в которых экспрессия мРНК PDLIM4/RIL в опухоли подавлена в 2 и более раз (Н/О>2), не изменена (0.5<Н/О<2) или повышена в 2 и более раз (Н/О<0.5). Пунктиром выделена область ауторадиограммы блота (а) и столбчатой диаграммы (б), соответствующие парам «норма : опухоль» из молочной железы.
Рис.2. Экспрессия PDLIM4/PIL и особенности морфологии и сигнальных каскадов линий клеток рака молочной железы человека. а - экспрессия мРНК PDLIM4/RIL, Е-кадгерина и Slug по данным ОТ-ПЦР; б - вестерн-блот анализ экспрессии белков PDLIM4/RIL, Е-кадгерина, трансформирующего фактора роста бета (TGFβ) и активированного Smad2; в - морфология клеток использованных культур опухолей молочной железы и первичного эпителия. Световая микроскопия. Черной рамкой обозначены культуры клеток с высокой экспрессией PDLIM4/RIL, серым пунктиром - линии, где экспрессия PDLIM4/RIL недетектируема.