Способ диагностики ранних проявлений респираторного аллергоза у детей в условиях избыточной контаминации алюминием
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR EARLY MANIFESTATIONS OF RESPIRATORY ALLERGOSIS IN CHILDREN IN CONDITIONS OF EXCESSIVE CONTAMINATION WITH ALUMINUM

Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии, аллергологии, и может быть использовано для ранней диагностики и прогнозирования токсического действия алюминия на проявление респираторного аллергоза у детей. Изобретение предназначено для идентификации неблагоприятного воздействия алюминия, поступающего из окружающей среды, на здоровье ребенка, проживающего на территориях с повышенным содержанием этого токсиканта в атмосферном воздухе и в питьевой воде.
Изобретение может быть использовано для постановки предварительного диагноза как в специализированных клиниках при обследовании пациентов, так и в обычных учреждениях здравоохранения. Результаты указанных обследования необходимы для разработки индивидуальных программ наблюдения и лечения, в зависимости от степени проявлений признаков респираторного аллергоза у ребенка, а, кроме того, могут быть использованы при формировании санитарно-гигиенических мероприятий по предупреждению и устранению воздействия вредных химических веществ, в частности, алюминия, обуславливающего формирование аллергоза у детей.
По международной классификации болезней (МКБ-10) респираторный аллергоз имеет код J10-J47.
Респираторный аллергоз - это специфическое заболевание дыхательной системы, в основе которого лежит какая-либо аллергическая реакция из-за взаимодействия с источником аллергии. При этом заболевании в процесс вовлекаются все органы и отделы дыхательных путей.
В связи с широчайшим использованием химических технологий в различных производственных циклах и сферах человеческой деятельности пристальное внимание ученых и медиков привлекает проблема выявления пороговых критериев, позволяющих на ранних этапах оценить, что воздействие вредного химического вещества превышает компенсаторные возможности организма и наносит вред здоровью человека, особенно детям, в связи с несформировавшимися в полной мере компенсаторными возможностями. Актуальность исследования неблагоприятного воздействия алюминия особенно обусловлена на территориях, вблизи которых размещены предприятия цветной металлургии.
Для задач оценки степени воздействия среды обитания на здоровье, ранней диагностики нарушений здоровья, а также для выбора эффективной профилактики и лечения, актуальным является выделение маркерных показателей конкретных заболеваний или их предвестников у человека под воздействием алюминия, которые могут использовать в качестве индикаторов нарушения гомеостаза и в качестве дополнительных диагностических критериев санитарно-эпидемиологической обстановки.
В настоящее время в атмосферном воздухе промышленных центров присутствует смесь химических загрязнителей от предприятий и автотранспорта, включающая взвешенные вещества, металлы, органические и неорганические вещества.
Алюминий один из самых распространенных металлов в земной коре (около 8% от ее массы), однако он практически не усваивается живыми организмами (в т.ч. растениями, за исключением чая). В организме человека алюминия больше всего в легких (до 43 мг/кг), а его суммарное содержание составляет не более 50 мг. Долгое время считалось, что алюминий не оказывает существенного отрицательного эффекта на организм человека, однако, сейчас эти представления изменились. "Алюминиевое легкое", или алюминоз легких, - профессиональное заболевание, развивающееся в результате вдыхания алюминиевого дыма или алюминиевой пыли с высокой концентрацией частиц металла диаметром менее 5 мкм. Поэтому поиск новых диагностических критериев в виде маркерных показателей конкретных заболеваний от воздействия алюминия, является актуальной задачей.
Из уровня техники известно, что в настоящее время большинство способов диагностики проявления аллергозов основано на использовании в качестве маркеров показателей крови и реже генетические критерии.
Из уровня техники (Патент РФ №2622019) известен способ диагностики бронхиальной астмы у детей младшего возраста, сущность которого заключается в том, что проводят анализ данных анамнеза, оценку клинических симптомов, изучение аллергологического статуса, которое проводят с использованием общего анализа крови, в котором определяют уровень эозинофилов и уровень общего иммуноглобулина Е в сыворотке крови, проведение цитологического исследования индуцированной мокроты, для определения в ней процентного содержания эозинофилов. Дополнительно анализируют Индекс Риска Астмы (API) и при его положительном значении и уровне эозинофилов в мокроте, равном или больше 2,5%, диагностируют бронхиальную астму. Причем при уровне эозинофилов в мокроте меньше 2,5% проводят повторное исследование и при выявлении повышения уровня эозинофилов мокроты не менее чем в 2 раза диагностируют бронхиальную астму, при этом повторное исследование проводят не менее одного раза в 6 месяцев, а при появлении респираторных симптомов - более одного раза в 6 месяцев. Использование известного способа позволяет с высокой точностью диагностировать бронхиальную астму на ранних стадиях у детей в возрасте 5 лет и младше.
Однако, указанный известный способ может быть применен только при выраженных проявлениях дыхательной аллергии (бронхиальная астма) и не позволяет идентифицировать развитие респираторного аллергоза на ранней стадии, в период его формирования.
Также из Патента РФ №2346276 известен способ оценки неиммунологических проявлений аллергозов. Для осуществления способа измеряют флуоресценцию эритроцитов периферической крови пациентов. О степени неиммунологических проявлений аллергозов судят по оценочной шкале: при снижении величины флуоресценции относительно нормы менее 10 ед. фл. - определяют слабую степень, при 10-20 ед. фл. - среднюю степень, более 20 ед. фл. - высокую степень неиммунологических проявлений аллергоза. Использование изобретения повышает точность оценки проявлений аллергозов, что позволяет улучшить качество лечебного процесса. Изобретение может быть использовано для ранней диагностики аллергозов.
Недостатком указанного способа является то, что флюоресценция эритроцитов характеризует только неспецифические проявления аллергии, а значит не позволяет установить причину и механизм ее возникновения, что исключает правильный подбор последующего этиотропного лечения.
Известен способ диагностики респираторных аллергозов (Авт. свид-во СССР №1529117). Согласно способу у больного натощак производят забор конденсата выдыхаемого воздуха. Добавляют исследуемый аллерген - раствор томинола, смесь термостатируют 30 мин., добавляют перекись водорода и измеряют светосумму хемилюминесценции, и при увеличении ее значения в 2 раза и более относительно контрольной пробы, не содержащей аллергена, диагностируют респираторный аллергоз.
Недостатком указанного способа является то, что данным способом нельзя установить аллергию, вызванную гаптенами (низкомолекулярными соединениями, в т.ч. и алюминием), так как для реакции аллерген - антиаллерген (антитела класса Е) необходимо конъюгация с белком (альбумином или глобулинами), что данным способом не предусмотрено.
При этом из уровня техники не были выявлены известные способы диагностики ранних проявлений респираторного аллергоза в условиях контаминации алюминием, поэтому сделать выбор ближайшего аналога к заявляемому объекту не представляется возможным.
Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в обеспечении достоверности оценки влияния алюминия на наличие проявлений респираторного аллергоза, с обеспечением возможности в последующем судить о развитии таких состояний у детей уже на ранних стадиях их формирования.
Указанный технический результат достигается предлагаемым Способом диагностики ранних проявлений респираторного аллергоза у детей в условиях избыточной контаминации алюминием, характеризующимся тем, что производят отбор пробы крови у ребенка и определяют в указанной пробе содержание алюминия и уровень иммуноглобулина G (IgG) к алюминию, также у указанного ребенка отбирают пробу буккального эпителия, осуществляют выделение из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), затем на детектирующем амплификаторе с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени проводят генотипирование полиморфизма генов TLR4 и ММР9, используя в качестве праймера участок ДНК путем исследования генотипов гена TLR4 A8595G (rs 1927911) и гена ММР9 Gln279Arg A/G (rs 17576), устанавливая при этом для каждого из указанных генов одно из следующих его состояний: гетерозиготное, или нормальное гомозиготное, или вариантное гомозиготное, и при одновременном выполнении следующих условий: наличие вариантного гомозиготного или гетерозиготного генотипов гена TLR4 A8595G (rs 1927911) и гена ММР9 Gln279Arg A/G (rs 17576), при превышении концентрации алюминия в крови выше референтного уровня более, чем в 2 раза, а также при превышении по сравнению с верхней границей физиологической нормы уровня IgG к алюминию, диагностируют у ребенка наличие ранних проявлений респираторного аллергоза в условиях избыточной контаминации алюминием.
Поставленный технический результат достигается за счет следующего.
В качестве критерия раннего проявления респираторного аллергоза в условиях контаминации алюминием в предлагаемом способе рекомендуется использовать одновременно данные о гетерозиготных или вариантных (патологических) гомозиготных генотипах гена толл-подобного рецептора TLR4 A8595G (rs 1927911), отвечающего за экспрессию рецептора дендритных клеток врожденного иммунитета, ассоциированных с развитием аллергического воспаления, и данные о гетерозиготных или вариантных гомозиготных генотипов гена матриксной металлопротеиназы ММР9 Gln279Arg A/G (rs 17576), отвечающих за образование соединительной ткани, как результат воспалительного повреждения эпителия дыхательных путей.
Известны результаты исследований указанных генов по отдельности. Так, например, были исследованы корреляции между генетическими полиморфизмами трех матриксных металлопротеиназ (ММР) гены и предрасположенность к хронической обструктивной болезни легких (далее - ХОБЛ). Соответствующие исследования были выбраны, используя строгие критерии включения и исключения. Отношение шансов с 95% доверительным интервалом был применен для оценки корреляции между генетическими полиморфизмами ММР и предрасположенность к ХОБЛ. Результаты Мета-анализа показали, что ММР 9 rs3918242 С>Т достоверно коррелирует с повышенной предрасположенностью к ХОБЛ. Основываясь на Мета-анализе, ММР 9 rs3918242 С>Т соотносится с восприимчивостью к ХОБЛ. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27173221
Тяжесть хронической обструктивной болезни легких была модифицирована ММР 9 - 1562С>Т в аддитивной модели (OR = 1,883, Padj = 0,028, Pcor = 0,252). Полиморфизм генов ММР3, ММР9, ADAM33, TIMP3 может быть важным фактором риска развития и прогрессирования хронической обструктивной болезни легких, определены важные генетические и экологические взаимодействия (Association of the ММР3, ММР9, ADAM33 and TIMP3 genes polymorphic markers with development and progression of chronic obstructive pulmonary disease). Korytina GF, Tselousova OS, Akhmadishina LZ, Victorova EV, Zagidullin ShZ, Victorova TV. Mol Biol (Mosk). 2012 May-Jun; 46(3):487-99).
Показано, что ген матриксной металлопротеиназы 9 (ММР9) участвует в патогенезе аллергического ринита (АР) и астмы. Предыдущие исследования показали, что однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) гена ММР9 дают риск развития астмы у детей. Цель этого исследования состояла в том, чтобы исследовать, связаны ли SNP гена ММР9 с риском сезонного АР (поллиноза), многолетней АР и аллергической сенсибилизации. В Японии было завербовано 670 школьников и генотипированы для функционального полиморфизма в промоторе (-1590С / Т: rs3918242) и трех аминокислотных заменах (R297Q: rs17576, P574R: rs2250889, R668Q: rs 17577). Определяли уровни общего и специфического IgE в сыворотке крови. Было установлено, что ген ММР9 вызывает восприимчивость к поллинозу кедра у японских детей. Ген ММР9 может быть связан с поллинозом посредством процессов сенсибилизации (Association of the ММР9 gene with childhood cedar pollen sensitization and pollinosis. Inoue H, Mashimo Y, Funamizu M, Yonekura S, Horiguchi S, Shimojo N, Kohno Y, Okamoto Y, Hata A, Suzuki Y. J Hum Genet. 2012 Mar;57(3): 176-83).
Полиморфизмы TCF2 rs4430796, MMP9 rs2250889 и MMP9 rs 17576 изучались у китайских испытуемых, в том числе 135 пациентов с раком легких и 176 органов управления, используя платформу Sequenom MassARRAY. Ассоциацию генотипов с восприимчивостью к раку легких анализировали с использованием отношения шансов (OR), с 95% доверительным интервалом (95% ДИ) и % (2). Было установлено, что два SNP (rs4430796, rs2250889 и rs17576) значительно связаны с повышенным риском развития рака легких. Геном генотипа АА и генотип AG + АА rs4430796 показали значительно повышенную восприимчивость к раку легких по сравнению с генотипом GG (скорректированный OR = 6,03, 95% ДИ: 1,30-28,09, Р = 0,022, 5,55, 95% ДИ: 1,20-25,58, Р=0,028). По сравнению с генотипом rs 17576 GG генотипы AG и AG + АА также были связаны со значительным риском (скорректированный OR = 2,65, 95% ДИ: 1,60-4,37, Р≤0,001, 2,57, 95% ДИ: 1,59-4,19, Р≤0.001), тогда как генотипы rs2250889 CG и CG + GG имели 2,97 раза (95% ДИ: 1,81-4,85, Р≤0,001) и 2,80-кратное увеличение ассоциаций с раком легких (95% ДИ: 1,73-4,54, Р≤0,001), соответственно, по сравнению с генотипом СС rs2250889. Кроме того, ассоциация rs4430796 с раком легких стала незначительной (Р>0,05) после корректировки по полу и rs2250889. Таким образом три SNP могут играть роль в предрасположенности членов китайского населения Хань к раку легких (Genetic Variants in ММР9 and TCF2 Contribute to Susceptibility to Lung Cancer. Sun JZ, Yang XX, Hu NY, Li X, Li FX, Li M. Chin J Cancer Res. 2011 Sep; 23(3): 183-7).
В эпидемиологических исследованиях установлено неблагоприятное воздействие загрязнения окружающей среды на распространенность астмы. Лабораторные исследования показали, что врожденные иммунные реакции участвуют в возрастании ее частотности. Было проведено исследование для определения того, влияют ли гены Toll-like рецептора 2 и 4 (TLR2 и TLR4) на восприимчивость к неблагоприятным последствиям загрязнения воздуха, связанного с трафиком, в отношении распространенности астмы у детей, проживающих в условиях воздействие твердых частиц, сажи и двуокиси азота. Установлено, что четыре SNP4 TLR4 значительно изменились при влиянии загрязнения воздуха на распространенность диагностированной астмы у детей с рождения до 8 лет. Аналогичные наблюдения были представлены следующими генотипами TLR4: rs2770150 ТС (OR 2.0 (95% ДИ от 1,1 до 3,6)), rs10759931 GG (OR 2,6 (95% ДИ от 1,4 до 4,9)), rs6478317 GG (OR 2,2 (95% ДИ 1.2 До 4.3)), rs10759932 CT или CC (OR 2,9 (95% CT от 1,2 до 6,9)). Таким образом, указанные вариантные аллели TLR2 и TLR4 генов влияют на восприимчивость к неблагоприятным последствиям загрязнения воздуха, связанного с взвешенными частицами, на астму у детей (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20685742).
Благодаря тому, что в заявляемом способе в качестве диагностических критериев предлагается использовать одновременно именно полиморфизм гена TLR4 A8595G (rs 1927911) и гена ММР9 Gln279Arg A/G (rs 17576), обеспечивается точность диагностики, т.к. у ребенка учитывается одновременно и состояние предрасположенности к развитию аллергических реакций, с врожденным характером которых ассоциирован полиморфизм гена толл-подобного рецептора (TLR4), а также состояние эпителия дыхательных путей, врожденный дефект которого связан с полиморфизмом гена матриксной металлопротеиназы (ММР9). Поэтому по данным показателям можно судить о генетически детерминированном характере функциональных нарушений эпителия дыхательных путей с присоединением аллергического компонента и разрабатывать индивидуальные программы диагностики и коррекции. Причем из уровня техники неизвестны методы диагностики ранних проявлений респираторного аллергоза у детей в условиях избыточной контаминации алюминием с использованием одновременно именно полиморфизмов этих генов.
Благодаря использованию в качестве исследуемого материала пробы крови, а также стандартных методик изучения генетических параметров, обеспечивается простота, надежность и доступность исследований, а также получение результатов нужной информативности.
Установление содержания химического контаминанта - алюминия, именно в крови обусловлено тем, что кровь является самой гомеостатичной средой (управляемость и регулируемость концентраций составляющих ее компонентов), имеющей реферируемые (фоновые) уровни в отношении техногенных химических веществ.
Благодаря использованию в качестве исследуемого материала буккального эпителия (пробы биологического материала со слизистой щеки), обеспечивается простота и надежность исследований, а также получение нужной информативности в плане выделения из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) проведения генотипирования полиморфизма указанных генов TLR4 и ММР9. При этом предлагается использовать в качестве праймера участок ДНК гена TLR4 A8595G (rs 1927911) и гена ММР9 Gln279Arg A/G (rs 17576), устанавливая при этом для каждого гена одно из следующих его состояний: гетерозиготное, или нормальное гомозиготное, или вариантное гомозиготное.
У гена TLR4 A8595G (rs 1927911): АА - нормальный гомозиготный генотип; AG - вариантный гомозиготный генотип; GG - гетерозиготный генотип.
У гена ММР9 Gln279Arg A/G(rs 17576): АА - нормальный гомозиготный генотип; AG - гетерозиготный генотип; GG - вариантный гомозиготный генотип.
Измененный генотип гена матриксной металлопротеиназы 9 типа (ММР9) отвечает за ферментные системы, утилизирующие коллагеновые образования. При воздействии алюминием создаются условия для формирования нарушений целостности эпителиальной ткани и ее подверженности воздействию аэрозолей, содержащих алюминий.
Измененный генотип гена толл-подобного рецептора 4 типа (TLR4) отвечает за функционирование клеточных образований врожденного иммунитета, редкий генотип которого ассоциирован с атопическими, гиперэргическими иммунными реакциями, проявляющимися со стороны дыхательной системы респираторными аллергозами.
Уровень IgG к алюминию характеризует сам феномен специфической сенсибилизации.
Таким образом, при оценке влияния алюминия на проявление респираторного аллергоза у ребенка в предлагаемом способе рекомендуется использовать следующие критерии:
- одновременное наличие вариантного гомозиготного или гетерозиготного генотипов гена TLR4 A8595G (rs 1927911) и наличие вариантного гомозиготного или гетерозиготного генотипов гена ММР9 Gln279Arg A/G(rs17576);
- превышение концентрации алюминия в крови выше референтного уровня более, чем в 2 раза,
- и превышение по сравнению с верхней границей физиологической нормы уровня IgG к алюминию,
Именно благодаря расширению информационных показателей, связанных с полиморфными вариантами указанных генов, ассоциированных с генетическим дефектом эпителия дыхательных путей и врожденной аллергической чувствительностью к внешним факторам (например, алюминий), одновременно с количеством химического токсиканта - алюминия, в крови, и превышением уровня IgG к алюминию по сравнению с физиологической нормой, будет обеспечена точность оценки модифицирующего влияния алюминия на нарушение функции дыхания с аллергокомпонентом.
Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод, что поставленный технический результат обеспечивается за счет совокупности операций предлагаемого способа, их последовательности и режимов его реализации.
Предлагаемый способ реализуется следующим образом.
1. Выбирают территорию экологического риска, характеризующуюся наличием химических токсикантов, обусловленных экологической средой обитания. Исследования были проведены на территории одного из городов Пермского края, характеризующейся наличием в атмосферном воздухе повышенных концентраций алюминия (до 1,2 ПДКм.р.)
3
2. На указанной территории проводят отбор группы детей одной этнической популяции. Затем проводят отбор пробы крови у обследуемого ребенка в специальные пробирки с антикоагулянтом ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) (0,05М раствор ЭДТА в соотношении 500 мкл крови на 50 мкл антикоагулянта) - для определения содержания алюминия. Содержание алюминия в крови определяют по Методике «Методы контроля. Химические факторы. Определение содержания химических элементов в диагностируемых биосубстратах, препаратах и биологически активных добавках методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной аргоновой плазмой», изложенной в МУК 4.1.1483-03, с использованием масс-спектрометра с индуктивно связанной плазмой Agilent 7500сх с октопольной реакционной ячейкой (USA). Устанавливают, имеется ли превышение концентрации этого контаминанта в пробе крови над его референтным уровнем (в примере конкретного осуществления на территории Пермского края фоновым значением по алюминию был показатель равный 0,006±0,004 мг/дм).
3. Затем определяют в пробе крови содержание IgG к алюминию по методике: Зайцева Н.В., Беляев Е.Н., Долгих О.В. Способы диагностики сенсибилизации к низкомолекулярным химическим соединениям/ Методические рекомендации. - М., 2002. - С. 29.
4. Также у указанного ребенка отбирают пробу буккального эпителия (в виде мазка со слизистой оболочки щеки). После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную пробирку типа «Эппендорф» с 500 мкл транспортной среды (стерильный 0,9%-ный раствор NaCl). Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают.
Далее производят выделение ДНК из пробы. Для этого пробы в количестве 100 мкл лизируют 300 мкл лизирующего раствора, представляющего собой 0,5%-ный раствор саркозила и протеиназы К (20 мг/мл) в ацетатном буфере (рН 7,5). Затем добавляют сорбент (каолин) и последовательными процедурами промывки отмывают фосфатно-солевым буфером (рН 7,2) пробы от белков и смесью изопропиловый спирт: ацетон от липидов. Нуклеиновые кислоты остаются при этом на сорбенте. Далее адсорбированные на сорбенте ДНК из пробы экстрагируют ТЕ-буфером, представляющим собой смесь 10 мМ трис-HCl и 1 мМ ЭДТА (рН 8,0). Экстракт подвергают центрифугированию. После центрифугирования пробирки надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК.
Полученный материал готов к постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР проводят на детектирующем амплификаторе с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» с использованием готовых наборов праймеров и зондов производства ЗАО «Синтол», Россия, в котором в качестве праймеров использовались участки ДНК гена TLR4 A8595G (rs 1927911) и гена ММР9 Gln279Arg A/G (rs 17576).
2
Проводят реакцию амплификации, это достигается тем, что для исследования аллельного состояния каждого гена у отдельного человека готовят свою реакционную смесь. В каждую пробирку вносят 0,1 мкл готовой смеси праймеров (принятый в генетике термин, обозначающий конечные нуклеотиды с меткой, ограничивающие (отрезающие) амплифицируемую цепочку нуклеотидов гена) и зондов для выбранных генов TLR4 A8595G (rs 1927911) и ММР9 Gln279Arg A/G (rs 17576) (использованы Наборы реагентов для определения полиморфизма TLR4 A8595G (rs 1927911) и ММР9 Gln279Arg A/G (rs17576) ЗАО «Синтол», Россия). В каждую пробирку добавляют остальные компоненты необходимые для осуществления ПЦР: нуклеотиды (дезоксинуклеозидтрифосфаты: по 10 мМ дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), буфера (100 мМ трис-HCl-буфера, 500 мМ KCl, 40 мМ MgCl) и Tag F-полимеразы. Вносят пробу в количестве 10 мкл. Таким образом, общий объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Каждая пробирка плотно закрывается пробкой и устанавливается в амплификатор.
При проведении ПЦР амплификацию и детекцию проводят на детектирующем амплификаторе CFX96 фирмы Bio-Rad.
Используется универсальная программа амплификации, подобранная производителем реактивов. Она включает в себя несколько этапов: 1 этап - активация TaqF-полимеразы (режим «горячего старта») продолжается 15 мин при 95°С; 2 этап - установочные циклы амплификации без измерения флуоресценции (5 циклов); 3 этап - рабочие циклы амплификации с измерением флюоресценции (40 циклов).
Каждый цикл амплификации включает в себя денатурацию ДНК (5 с при 95°С), отжиг праймеров (20 с при 60°С) и саму реакцию полимеризации ДНК (15 с при 72°С).
Регистрация сигнала флюоресценции, возникающего при накоплении продуктов амплификации участков ДНК проводится в режиме «реального времени» после стадии отжига праймеров для выбранных генов по каналу VIC - для детекции одного из аллельных вариантов генов, и по каналу FAM - для альтернативного варианта.
Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флюоресценции с установленной на заданном уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла (N) в соответствующей графе в таблице результатов, отображаемой в программном обеспечении для амплификатора CFX96.
По соотношению пороговых циклов, полученных по двум каналам детекции, определяют состояние гена TLR4 в исследуемом участке ДНК A8595G (rs 1927911), а также гена ММР9 в исследуемом участке ДНК Gln279Arg A/G (rs 17576) (метод аллельной дискриминации). Возможных вариантов состояния гена было два: гомозиготное - в случае, когда одно из значений порогового цикла не определяется (ниже пороговой линии) и гетерозиготное - в случае, когда получено два значения пороговых циклов и по этим каналам получены параболические кривые флюоресценции. В зависимости от того, накопление какого продукта амплификации происходит в реакции, устанавливается гетерозиготное, или нормальное гомозиготное, или вариантное гомозиготное состояние гена TLR4 A8595G (rs 1927911) и генаММР9 Gln279Arg A/G (rs17576).
5. И при выполнении следующих условий: наличие вариантного гомозиготного или гетерозиготного генотипов гена TLR4 A8595G (rs 1927911) и гена ММР9 Gln279Arg A/G (rs 17576), превышение концентрации алюминия в крови выше референтного уровня более, чем в 2 раза, а также превышение по сравнению с верхней границей физиологической нормы уровня IgG к алюминию, диагностируют у ребенка наличие ранних проявлений респираторного аллергоза в условиях избыточной контаминации алюминием.
При проведении испытаний по реализации предлагаемого способа выполнено исследование детского населения, проживающего в различных по содержанию алюминия условиях среды обитания.
Были сформированы две группы: группа наблюдения, дети которой проживали на неблагополучной в отношении алюминия территории, и группа сравнения, проживающая в условиях санитарно-гигиенического благополучия. В группу наблюдения вошли 12 детей (средний возраст 6,0±0,4 года); 50% мальчиков и 50% девочек). В группу сравнения вошли 14 детей (средний возраст 6,2±0,2 года); 43% мальчиков и 57% девочек). Группы были сопоставимы по тендерному, возрастному и социальным критериям.
На территориях проживания детей группы наблюдения отмечено превышение содержания алюминия до 2,1 ПДК м.р.
Оценка риска здоровью детей показала, что при хронической экспозиции контаминантов коэффициенты опасности для алюминия составили - до 1,12. Установлено, что хроническое воздействие алюминия формирует опасность развития нарушений со стороны органов дыхания (индекс опасности HI - до 3,73).
Оценка риска развития заболеваний осуществляется по стандартизованной методике в соответствии с «Руководством по оценке риска для здоровья населения при воздействии химических веществ, загрязняющих окружающую среду» (Р 2.1.10.1920-04).
У всех обследуемых детей была взята венозная кровь, исследование которой проводилось по вышеуказанной схеме. Также была взята проба буккального эпителия для установления по реакции ПЦР полиморфизма исследуемых генов.
Для доказательства достоверности заявляемых критериев диагностики проявления респираторного аллергоза был установлен в пробе крови уровень иммуноглобулина Е (IgE). Этот показатель IgE является подтверждающим фактором иммунной гиперэргии, проявляющимся нарастанием атопии. Кроме того, именно IgE характеризует респираторную сенситивность, так как гиперчувствительность немедленного типа по Джеллу и Кумбсу, ассоциирована как раз с повышением реагинов, к которым относится IgE.
Данные, полученные в результате исследований, приведены в таблице 1.
Результаты приведены в таблице 1 в виде пяти блоков, в каждом из которых показано различное сочетание полиморфизмов указанных генов, содержание алюминия, уровень IgG и IgE.
3
Данные, приведенные в указанной таблице, показывают, что при одновременном сочетании вариантного (гетерозиготное или патологическое гомозиготное состояние генотипа) аллеля гена TLR4 A8595G (rs 1927911) и гена ММР9 Gln279Arg A/G (rs 17576), концентрации виновного фактора (алюминия) выше референтной концентрации (0,006±0,004 мг/дм) более, чем в 2 раза, и превышении выше физиологической нормы уровня IgG к алюминию (пациенты 1-3), наблюдается повышение по сравнению с физиологической нормой уровня IgE. А это значит, что при этом фиксируется реализация алюминием негативной генетической программы у ребенка, выражающейся в нарушении функции дыхания через проявление респираторного аллергоза.
Тогда как при допустимом (на уровне референтной концентрации) содержании алюминия в крови, даже в условиях наследования вариантного генотипа указанных генов (пациенты 8-10), уровень IgE и IgG находится в пределах физиологической нормы.
И, наоборот, в случае превышения содержания алюминия в крови более, чем 2 раза по сравнению с референтным уровнем, но при отсутствии полиморфных изменений указанных генов (пациенты 11-12), уровень IgE и IgG находится в пределах физиологической нормы.
У пациентов 4-7, которые характеризуются превышением содержания алюминия в крови более, чем 2 раза по сравнению с референтным уровнем, превышением по сравнению с нормой уровня IgG к алюминию, но при этом имеют наследование вариантного генотипа только одного из указанных генов, а не одновременно вместе, проявлений респираторного аллергоза не диагностировано, при этом уровень общего IgE находится в пределах нормы, что указывает на отсутствие необходимых генетических условий (наследственной предрасположенности) для реализации имеющегося воздействия в виде гиперчувствительности респираторного характера.
Таким образом, это доказывает то, что только одновременное превышение содержания алюминия в крови более, чем в 2 раза, по отношению к референтному уровню, превышение IgG к алюминию выше нормы и только одновременное наличие полиморфных генотипов гена TLR4 A8595G (rs1927911) и гена ММР9 Gln279Arg A/G (rs17576), характеризуется появлением негативных эффектов в виде отклонения от нормы уровня IgE, характеризующего появления респираторного аллергоза, и таким образом подтверждается точность и достоверность предлагаемого способа.
Для иллюстрации реализации предлагаемого способа приведены два примера по конкретным пациентам одного возраста и этнической принадлежности из группы детей с повышенным содержанием алюминия в крови и детей с содержанием алюминия в пределах референтной концентрации.
3
Пример 1. Пациент, 6 лет, русский. Установлен уровень алюминия в крови более чем в 2 раза выше референтного уровня - 0,05 мг/дм. Установлено наличие гетерозиготного генотипа гена TLR4 A8595G (rs1927911) - AG и гетерозиготного генотипа гена ММР9 Gln279Arg A/G (rs 17576), - AG. Значение содержания IgG к алюминию: 0,201 у.е., т.е. в 2,0 раза выше верхней границы нормы. Содержание общего IgE- маркера респираторной аллергии - 81,5 МЕ/мл, т.е. выше диапазона нормы (0-49 МЕ/мл). Таким образом, установлены высокие значения уровня IgG к алюминию и содержания общего IgE на фоне повышенного по отношению к референтному уровню, более чем в 2 раза содержания алюминия в крови, а также наличие гетерозиготного полиморфизма гена TLR4 A8595G (rs1927911) и гетерозиготного полиморфизма гена ММР9 Gln279Arg A/G (rs 17576), кодирующих белки ответственные за толерантность к врожденной аллергизации и функциональное состояние эпителия дыхательных путей, что указывает на реализацию нарушений иммунологической реактивности и формирование повышенной чувствительности и респираторной (дыхательной) аллергии у данного пациента, инициированной действием алюминия.
Это говорит о том, что, согласно предлагаемому способу, у данного ребенка состояние от воздействия алюминия оценивается, как формирование ранних проявлений респираторного аллергоза.
-
3
3
Для доказательства данного вывода, были установлены следующие иммунологические показатели у данного ребенка, которые имели следующие значения: CD127 - лимфоциты (Т-регуляторные клетки) - 6,1% (физиологическая норма 3-5%); IgG - 14,5 г/дм (норма 10,0-13,0 г/дм).
-
Анализируя представленные данные, можно сделать вывод, что у пациента имеются изменения в иммунной системе, в частности, наличие избыточной активности иммунной системы, которое может характеризоваться наличием либо переходом в нозологические формы гиперэргии иммунитета (аллергия, аутоиммунитет). Такой вывод подкрепляется тем, что наблюдается повышенная экспрессия иммуноцитов с фенотипом регуляторных клеток (CD127 - лимфоциты), а также гиперпродукция иммуноглобулинов класса G.
Пример 2. Пациент, 5 лет, русский. Определяется уровень алюминия в крови более, чем в 2 раза выше референтного уровня - 0,05 мг/дм. Отсутствуют полиморфные (вариантные) генотипы гена TLR4 A8595G (rs1927911) - АА и гена ММР9 Gln279Arg A/G (rs17576) - АА. Значение содержания IgG к алюминию: 0,092 у.е. - в диапазоне нормы. Содержание общего IgE - маркера респираторной аллергии - 9,88 МЕ/мл - не превышает диапазон нормы (0-49 МЕ/мл). Таким образом, отсутствие полиморфизма генов TLR4 A8595G (rs1927911) и ММР9 Gln279Arg A/G (rs 17576) на фоне даже повышенного по отношению к референтному уровню, более чем в 2 раза, содержания алюминия в крови, не приводит к развитию негативных эффектов в виде отклонения от нормы уровня IgG к алюминию и IgE общего, то есть в отсутствии негативной генетической программы превышение референтной концентрации алюминия в крови не формирует развитие аллергических процессов, в том числе респираторных, и не меняет состояние иммунологической реактивности у данного пациента.
-
3
3
Для доказательства данного вывода - отсутствия повышенной иммунной реактивности, были установлены следующие иммунологические показатели у данного ребенка, которые имели следующие значения: CD127 - лимфоциты (Т-регуляторные клетки) - 3,1% (норма 3-5%); IgG - 10,75 г/дм (норма 10,0-13,0 г/дм).
-
Анализируя представленные данные, можно сделать вывод, что у обследуемого пациента отсутствуют изменения в иммунной системе. Такой вывод подкрепляется тем, что отсутствует повышенный уровень иммуноцитов с фенотипом регуляторных клеток (CD127 лимфоциты), а также не наблюдается превышения нормы содержания иммуноглобулинов класса G. Таким образом, при анализе мембранных и внутриклеточных маркеров иммунного статуса изменений показателей, обусловленных действием алюминия, выявлено не было.
Таким образом, приведенные данные показывают, что при реализации предлагаемого способа с использованием предлагаемых критериев обеспечивается его назначение.
Заявляемый способ позволяет с достаточной достоверностью установить ранние проявления респираторного аллергоза, ассоциированные с влиянием алюминия, по заявляемым генетическим критериям, содержанию алюминия в крови и по уровню IgG к алюминию.
Примечание: 1. Ген TLR4 (A8595G) (rs1927911): АА - нормальный гомозиготный генотип; AG - гетерозиготный генотип; GG - вариантный гомозиготный генотип;
2. Ген ММР9 Gln279Arg A/G(rs17576): АА - нормальный гомозиготный генотип; AG - гетерозиготный генотип; GG - вариантный гомозиготный
3
2
2
3. Зависимость уровня IgG к алюминию и содержания IgE общего от концентрации алюминия в крови (мг/дм) достоверна (R = 0,65-0.81; р<0,05), где R - коэффициент детерминации; p - вероятность.