Выделение каротино-протеинового концентрата из панцирных отходов варено-мороженых креветок

УДК 664.38

ВЫДЕЛЕНИЕ КАРОТИНО-ПРОТЕИНОВОГО КОНЦЕНТРАТА ИЗ ПАНЦИРНЫХ ОТХОДОВ ВАРЕНО-МОРОЖЕНЫХ КРЕВЕТОК

М. В. Самсонов

EXTRACTION OF CAROTENE-PROTEIN CONCENTRATE FROM CRUSTACEAN WASTE OF COOKED-FROZEN SHRIMPS

M. V. Samsonov

Разработка рациональной технологии извлечения каротино-протеинового концентрата из панцирных отходов основывается на выборе протеазы, исследовании механизмов и временных интервалов распространения её по слоям кутикулы, а также значении предварительного суспензирования и интенсивности образования микроэмульсии. Все перечисленные факторы влияют не только на количественный выход концентрата, но и на конечное содержание астаксантина. Предложенная в работе модель двухступенчатой переработки панциря вареной северной креветки включает в себя следующие позиции: измельчение, предварительное суспензирование, первую ступень протеолиза, фракционирование, вторую ступень протеолиза, повторное фракционирование, осаждение хитозаном, инактивацию протеазы, вакуумное обезвоживание, хранение и реализацию. На основе экспериментальных данных были установлены оптимальные температурные и временные значения инактивации ферментативного препарата в соотношении с сохранностью астаксантина в неизмененной форме. Режим применяемого процесса соответствует 85 град. С в течение 0,5 мин. Определено, что оптимальный режим вакуумного обезвоживания белкового концентрата составляет 75-80 мин при температуре не выше значения 50 град. С. Проведенный аминокислотный анализ концентрата показал наличие в своем составе девяти незаменимых аминокислот и ещё одиннадцати заменимых, следовательно, белок выделенного комплекса является полноценным с биологической точки зрения. Выполненные исследования по подбору типа хранения показали, что использование непрозрачной полиэтиленовой упаковки без вакуума обеспечивает сохранность неизмененного астаксантина в течение первых 10 сут, а при использовании непрозрачного полиэтиленового пакета под вакуумной упаковкой сохранность начальной формы астаксантина увеличивается до 120-130 сут.

каротино-протеиновый концентрат, протеаза, вакуумное обезвоживание, астаксантин, ферментативный гидролиз

Development of a rational technology for the extraction of carotene-protein concentrate from the crustacean waste is based on a reasonable choice of protease,

studies of the mechanisms and time intervals of its spread through the cuticle layers, as well as the value of pre-suspension and the formation of microemulsions. All of these factors affect not only the quantitative yield of concentrate, but also the final content of astaxanthin. The proposed model of two-stage processing of the carapace of cooked shrimps consists of the following stages: crushing, pre-suspension, the first stage of proteolysis, fractionation, the second step of proteolysis, refractionation, precipitation by chitosan, inactivation of protease, vacuum dehydration, storage and sales. On the basis of the experimental data, the optimal temperature and time values of inactivation of the enzymatic preparation have been found, in the ratio of astaxanthin safety in an unchanged form. The mode of the acceptable inactivation corresponds to 85 deg C, for about 0.5 minutes. It has been determined that the optimal mode of vacuum dehydration of protein concentrate is 75-80 minutes at a temperature not higher than 50 deg C. AFR. The conducted amino acid analysis of the concentrate showed the presence of all nine essential amino acids and eleven other interchangeable, therefore, the protein of the selected complex is complete from a biological point of view. The conducted research on the selection of the storage type has showed that the use of opaque polyethylene packaging without vacuum ensures safety of unchanged astaxanthin during the first 10 days, and when using an opaque plastic bag under vacuum packing, the safety of the initial form of astaxanthin increases to 120-130 days.

carotene-protein concentrate, protease, vacuum dehydration, astaxanthin, enzymatic hydrolysis

ВВЕДЕНИЕ

Развитие рыбоперерабатывающей отрасли в РФ обуславливается внедрением передовых ресурсосберегающих технологий, основанных в том числе на использовании технологических процессов переработки нетрадиционного водного сырья [1]. При этом особый интерес представляет хитинсодержащее сырье, оставшееся после разделки ракообразных (креветок, крабов). Основными продуктами, выделяемыми из панцирьсодержащих отходов (ПСО), являются различные липидо-протеиновые комплексы в связи с каротиноидами (астаксантином), а так же хитин-хитозан [2].

Однако при переработке ПСО получение пищевого каротино-протеинового концентрата (КПК) с заданными биологическими свойствами связано со значительными экономическими издержками, так как ПСО ракообразных представляет сложносоставное капиллярно-пористое основание, в составе которого заложены плотноупакованные хитино-минеральные пластины с проходящими через неё кристалло-аморфными фибриллами, а так же пигментные клетки липидно-белковой природы [3].

Возможное решение данной проблемы связывается с внедрением научно обоснованных ресурсосберегающих технологий, основанных на применении гидролиза [4]. Гидролиз ПСО подразумевает использование химического или биологического (ферментативного) воздействия на молекулы субстрата [5]. Химический гидролиз основывается на воздействии агрессивных реагентов, что

может представлять определённую технологическую проблему, связанную с дальнейшей очисткой концентрата, а также с целостностью основных выделяемых компонентов [6].

Использование ферментативного гидролиза при выделении КПК из ПСО целесообразнее, что связывается с большей возможностью контролировать и влиять на процесс расщепления, а так же с невысокими технологическими издержками [7]. Основным недостатком применения используемых протеаз (трипсин, химотрипсин) в процессе переработки ПСО являются значительные экономические затраты на препарат. Решением данной проблемы может быть использование недорогой микробиологической протеазы, с низкой степенью очистки - Протосубтилин Г3х-70 нейтральный (ПГ3х) [8, 9].

При создании технологии переработки ПСО необходимо учитывать данные: о воздействии ПГ3х на интенсивность образования микроэмульсий, о степени извлечения азотсодержащих веществ (АСВ) при протеолизе ПСО, о возможном использовании хитозана (в качестве осаждающего агента), о необходимой концентрации протеазы и временных интервалах в аспекте соотношений высокого значения извлечённых высокомолекулярных АСВ при минимальной концентрации микроэмульсии [8, 9, 10, 11]. А также данные о влиянии предварительного суспензирования и воздействии ПГ3х на хитино-минеральный субстрат, с разной степенью однородности, в аспекте превалирования диффузионного или кинетического характера гидролиза, что отображает интенсивность распространения протеазы по слоям кутикулы, в зависимости от временного интервала [11].

Однако существующие режимы температурной инактивации протеазы с последующей сушкой концентрата и его хранение, в меньшей степени направлены на сохранение астаксантина в начальной форме, что в свою очередь не позволяет достичь конечному продукту заданных функционально-биологических свойств. Решение поставленной проблемы заключается в разработке научно обоснованного режима инактивации фермента и применении вакуумного обезвоживания гидролизата.

Цель работы: на основании имеющихся научно обоснованных данных предложить технологическую схему протеолиза ПСО северной креветки (Pandalus borealis) с использованием ПГ3х, с увеличенным количественным выходом неизмененного астаксантина в белковом концентрате.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В рамках научно-исследовательских мероприятий использовались ПСО, полученные в результате разделки варёных северных креветок, с последующим дефростированием на воздухе. Химический состав ПСО: белок - 11,2 %, липиды - 5,5 % (в том числе 0,98 % - каротиноиды), минеральные вещества -5,2 %, влага - 74 %, хитин - 4,2 %. Использовалась протеаза микробиологического происхождения - протосубтилин Г3х нейтральный (Protosubtilin G3H).

Измельчение панцирных отходов производилось в куттере PIMAK объёмом 5 л. Суспензирование проводилось при температурных значениях не более

21 °С продолжительностью не более 5 мин. Процесс инактивации ПГ3х проходил при отсутствии влияния прямого ультрафиолетового излучения в специализированном тепловом шкафу. Центрифугирование осуществлялась в центрифуге со скоростью не менее 5000 об/мин в течение 15 мин.

Массовое определение неизмененного астаксантина в концентрате осуществлялось при использовании стандартных методов очистки каротиноидов и подготовке анализов по ГОСТ 54058-2010 с последующим анализом на фото-электроколориметре (ФЕК) модели 2МК.

При определении аминокислотных значений использовался ионообменный хроматографический анализ.

Определение активности протеазы осуществлялось методом изучения скорости превращения субстрата под влиянием фермента в исследуемом сырье при протеолитической реакции катализации.

Схема определения кинетики ферментативных реакций отображается в двухстадийной системе (1):

где Е - ферментный препарат; S - значение субстрата; P - продукты реакции; ккат - const каталитическая.

Начальная скорость катализируемой протеолиза (где расходом субстрата можно пренебречь), выражаетсяя уравнением Михаэлиса-Ментен (2):

где { 'макс = ккат х [/<,] - максимальная скорость реакции; и„ - начальная скорость; [£]0 - начальная концентрация фермента; Kм - const Михаэлиса.

Пробы отбирают через фиксированные временные промежутки, также проводится определённое количество экспериментов для определения динамики активности фермента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОСУЖДЕНИЕ При проведении протеолиза в течение 120 мин извлекается до 65 % КПК [8, 9], однако до 20-25 % КПК остаётся неизвлечённым. Учитывая динамику распространения фермента по слоям кутикулы и соотношение интенсивности гидролиза, предлагается двухступенчатая модель протеолиза с предварительным суспензированием и осаждением образовавшихся микроэмульсий хитозаном [9].

Первая ступень протеолиза проходила при температуре 37о С в течение 2 ч, гидромодуль 1/10, концентрация фермента 0,7 % от массы сырья. Для второго этапа гидролиза берётся 0,2 % протеазы при гидромодуле 2,8, режимы идентичны первой ступени. При использовании полученных данных о специфичности

ПГ3х и его концентрации, а также о процессах и интервале образования микроэмульсий составлена технологическая схема выделения КПК из ПСО вареной креветки (рис. 1).

Рис. 1. Технологическая схема выделения каротино-протеинового концентрата Fig. 1. Process flow diagram of carotene-protein concentrate extraction

Технологическая схема выделения концентрата из ПСО включает в себя следующие основные операции: измельчение, суспензирование, первая ступень протеолиза, фильтрация, вторая ступень протеолиза, фракционирование, инактивация фермента и осаждение хитозаном.

Суспензия, полученная в результате механического отделения биомолекул, несвязанного с хитино-минеральным матриксом, также подвергается фракционированию и концентрированию, что объясняется значительным содержанием астаксантина в составе извлеченных комплексов.

Депротеинизированный хитино-минеральный матрикс используется для производства хитозана по технологии Немцева [12].

При определении параметров инактивации ПГ3х учитывались качественные зависимости температурных показателей от продолжительности

процесса. Начальные режимы инактивации принимаются с учётом литературных и патентных данных по активности протеазы ПГ3х (рис. 2).

Рис. 2. Динамика инактивации ПГ3х Fig. 2. Dynamics of Pg3h inactivation

При минимальных термических значениях (65°С) точка инактивации

достигается в течение 1,1 мин. При максимальном значении в 90°С данный показатель достигается в течение 0.4 мин с момента начала процесса.

При подборе режима инактивации в качестве основополагающего значения использовалось процентное соотношение астаксантина в неизмененной форме (рис. 3).

Рис. 3. Воздействие температурной инактивации на концентрацию неизменённого астаксантина Fig. 3. Effect of temperature inactivation on concentration of unchanged astaxanthin

Полученные результаты (рис. 3) показывают, что в течение первой минуты инактивации происходит потеря от 4 до 12 % астаксантина. Дальнейшее нагревание концентрата ведёт к интенсивному изменению каротиноидов. С учётом данных (рис. 2) оптимальный уровень приемлемой инактивации

соответствует температурному режиму в 85°С в течение 0,5 мин, при этом по достижению установленной точки сохранность астаксантина в начальной форме варьируется в пределах 94-96 %.

Для обезвоживания концентрата использовалась вакуумная сушка.

Процесс сушки осуществлялся при температуре не выше 50°С (используемая температура рекомендована при обезвоживании белковых паст и концентрированных гидролизатов) в вакуумной установке. Использование больших температур нежелательно, так как приводит к изменению начальной формы астаксантина, снижая его биологические свойства (рис. 4).

Рис. 4. Кривая вакуумной сушки Fig. 4. Vacuum drying curve

Данные по кривой обезвоживания позволили разделить процесс на несколько этапов. Первый этап соответствовал временному интервалу от 0 до 20 мин и характеризовался начальным прогреванием сырья. Потеря влаги при этом минимальна. Второй этап соответствовал отрезку времени от 20 до 50 мин, который обуславливается периодом постоянной сушки. Происходило интенсивное удаление влаги по линейному закону. Снижение влаги наблюдается до первой критической точки влажности (точка в 50 мин). Третий этап состоял из двух участков кривизны - первый на интервале от 50 до 70 мин, где достигалась вторая критическая точка влажности. И второй отрезок - от 70 до 80 мин, здесь достигалась точка равновесия влажности, при этом дальнейшее удаление влаги не происходит.

Из анализа полученных данных видно, что оптимальное время вакуумного обезвоживания соответствует временному интервалу в 75-80 мин.

Технология двухступенчатого протеолиза ПСО позволяет получать белковый концентрат со значительным содержанием неизмененного астаксантина (табл. 1) и аминокислот (табл. 2).

Таблица 1. Химический состав обезвоженного белкового концентрата Table 1. Chemical composition of dehydrated protein concentrate_

Наименование показателей Содержание в КПК, %

Белок, не менее 82.6

Липиды, не более 2.4

Минеральные в-ва, не более 3,5

Влага, не более 10

Астаксантин в неизменённой форме, не менее 0.05

Хитин/хитозан, не более 1

Данные по химическому составу позволяют отнести выделенный КПК к белковому концентрату с невысоким содержанием липидов (в 2,0-2,4 % от общей массы). Щадящие режимы обработки позволяют сохранить значительную концентрацию неизмененного астаксантина как в свободном виде, так и в комплексе с протеинами и липидами.

Таблица 2. Аминокислотный состав КПК Table 2. Amino acid composition of the CPC

Наименование аминокислоты Результаты испытаний г/100г Погрешность / Неопределённость

Фенилаланин 2.41 0.69

Тирозин 1.65 0.47

Лейцин 2.7 0.99

Изолейцин 1.3 0.99

Гистидин 1.61 0.77

Цистин 1.7 0.55

Аланин 3.04 0.75

Метионин 1.53 0.49

Ванин 3.32 1.26

Глутаминовая кислота - Глутамин 7.23 2.75

Треонин 2.81 1.07

Серин 2.73 0.67

Пролин 2.36 0.9

Глицин 2.81 0.91

Аспарагиновая кислота - Аспарагин 8.22 3.12

Лизин 4.62 1.49

Аргинин 3.77 1.43

Триптофан 0.62 0.18

Показатели аминокислотного состава КПК демонстрируют наличие всех девяти незаменимых аминокислот и ещё одиннадцати заменимых. Биологические значения аминокислотного состава позволяют характеризовать белковый концентрат как полноценный с биологической точки зрения.

Для определения хранимоспособности КПК (с учётом комнатных

температур в 21°С) по таким показателям, как концентрация неизменённого астаксантина, проведены исследования по определению сохранности в непрозрачной вакуумной и обычной упаковке. В качестве обычной упаковки использовался непрозрачный полиэтиленовый пакет (рис. 5).

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100110120130140150160170ISO Продолжительность хранения , сут

Рис. 5. Влияние переменных временных интервалов и типов упаковки на хранимоспособность астаксантина Fig. 5. Dependence of the variable time intervals and packaging types on the storage capacity of astaxanthin

Исходя из полученных данных по сохранности астаксантина, можно сделать вывод, что при использовании непрозрачной полиэтиленовой вакуумной упаковки потери каротиноидов не происходят в течение 120 сут хранения при комнатной температуре (21о С). Небольшие изменения в 1 % наблюдаются после 130-140 сут хранения.

Использование невакуумной упаковки позволяет сохранять начальную концентрацию астаксантина в течение 10 сут хранения. Последующее хранение ведёт к снижению концентрации неизмененного астаксантина, что объясняется в первую очередь окислительными процессами при контакте с кислородом.

При использовании краткосрочного хранения КПК рационально использовать обычную, не вакуумную упаковку. Однако для более продолжительного хранения необходимо применять упаковку под вакуумом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработана технологическая схема выделения белкового концентрата со значительным содержанием полноценного (с биологической точки зрения) белка и неизменённого астаксантина, при концентрации липидов в 2,0-2,4 % (на сухое вещество).

Предложенная модель двухступенчатого протеолиза ПСО северной креветки включала в себя предварительное суспензирование, первую ступень

гидролиза (2 ч при 37°С, гидромодуль 1/10, концентрация фермента 0,7 % от

массы сырья), вторую ступень гидролиза (2 ч при 37°С, гидромодуль 2/8, концентрация фермента 0,2 %), центрифугирование (не менее 5000 об/мин, 15 мин), осаждение хитозаном образовавшейся микроэмульсии, инактивацию

фермента (85°С, 0,5 мин), вакуумное обезвоживание (75-80 мин при температуре

не более 50 °С).

Продолжительность хранения КПК при температуре не выше 21°С при вакуумной упаковке составляет 120-130 сут без потери астаксантина, при упаковке без вакуума - 10 сут.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Артюxова, C. А. Tеxнoлогия продуктов из гидробионтов: учеб. / С. А. Артюxова, В. Д. Богданов, В. М. Дацyн. - Москва: Колос, 2001. - 496 с.

2. Строкова, Н. Г. Биотехнологические аспекты комплексной переработки ракообразных / Н. Г. Строкова, А. В. Подкорытова // Биотехнология: состояние и перспективы: IV Московский междунар. конгресс: материалы. - 2011. - Ч. 2. -С. 241-242.

3. Noël, P. Comparative study of tegumentary carotenoids in Processa edulis, and Lysmata seticaudata (Crustacea, Caridae) / P. Noël, Y. Couturier-Bhaud // Comp. Biochem. and Phisiol. B. - 1981. - 70, N 3. - P. 571-578.

4. Строкова, Н. Г. Универсальная комплексная технология переработки культивируемых и промысловых ракообразных / Н. Г. Строкова, Н. В. Семикова, О. В. Ефремов // Морские прибрежные экосистемы. Водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки: IV Междунар. науч.-практ. конф.: тез. докл. - Южно-Сахалинск, 2011. - С. 242.

5. Неклюдов, А. Д. Получение и очистка белковых гидролизатов / А. Д. Неклюдов, А. Н. Иванкин, А. В. Бердутина // Прикладная биохимия и микробиология. - 2000. - Т. 36, № 4. - С. 379-370.

6. Севодина, К. В. Кинетическое моделирование и его роль в изучении процессов неферментативного потемнения пищевых продуктов / К. В. Севодина, Г. И. Севодина // Ползуновский вестник. - 2011. - № 4-1. - С. 56-58.

7. Максимюк, Н. Н. О преимуществах ферментативного способа получения белковых гидролизатов / Н. Н. Максимюк, Ю. В. Марьяновская // Фундаментальные исследования. - 2009. - № 1. - С. 34-35.

8. Самсонов, М. В. Сравнительный анализ выделения астаксантина из панцирных отходов ракообразных с использованием ферментных препаратов трипсин, химотрипсин, протосубтилин / М. В. Самсонов, М. Л. Винокур, М. П. Андреев // Известия КГТУ. - 2017. - № 44. - С. 143-150.

9. Самсонов, М. В. Использование протосубтилина г3х для предотвращения образований микроэмульсий при гидролизе панцирных отходов северной креветки / М. В. Самсонов // Известия КГТУ. - 2017. - № 47. - С. 123-134.

10. Неклюдов, А. Д. Получение и очистка белковых гидролизатов / А. Д. Неклюдов, А. Н. Иванкин, А. В. Бердутина // Прикладная биохимия и микробиология. - 2000. - Т. 36, № 4. - С. 371-379.

11. Самсонов, М. В. Исследование процесса гидролиза панцирных отходов вареной креветки с использованием протосубтилина / М. В. Самсонов, М. Л. Винокур, М. П. Андреев // Известия КГТУ. - 2017. - № 46. - С. 90-101.

12. Немцев, С. В. Получение низкомолекулярного водорастворимого хитозана / С. В. Немцев // Биотехнология. - 2001. - № 6. - С. 37-42.

Haynubiu ^ypnan «H3eecmuH KfTY», №50, 2018 г.

REFERENCES

1. Artyuhova S. A. Tekhnologiya produktov iz gidrobiontov [Technology of products from hydrobionts ]. Moscow, 2001, 496 p.

2. Strokova N. G Biotekhnologicheskie aspekty kompleksnoj pererabotki rakoobraznyh [Biotechnological aspects of complex processing of crustaceans]. Biotechnology: status and prospects, 2011, no. 2, pp. 241-242.

3. Noël P. Comparative study of tegumentary carotenoids in Processa edulis, and Lysmata seticaudata

4. Strokova N. G. Universal'naya kompleksnaya tekhnologiya pererabotki kul'tiviruemyh i promyslovyh rakoobraznyh [Universal complex technology of processing of cultivated and commercial crustaceans]. Moscow, Marine coastal ecosystem, 2011, 242 p.

5. Neklyudov A. D. Poluchenie i ochistka belkovyh gidrolizatov [Preparation and purification of protein hydrolysates]. Applied biochemistry and Microbiology, vol. 36, no. 4, pp. 379-370.

6. Sevodina K. V. Kineticheskoe modelirovanie i ego rol' v izuchenii processov nefermentativnogo potemneniya pishchevyh produktov [Kinetic modeling and its role in the study of non-enzymatic darkening of food products]. Polzunovskii Herald, 2011, no. 4-1, pp. 56-58.

7. Maksimyuk N. N. O preimushchestvah fermentativnogo sposoba polucheniya belkovyh gidrolizatov [On the advantages of enzymatic method for producing protein hydrolysates]. Fundamental study, 2009, no. 1, pp. 34-35.

8. Samsonov M. V., Vinokur M. L, Andreev M. P. Sravnitelnii analiz videleniya astaksantina iz pancirnih othodov rakoobraznih s ispolzovaniem fermentnih preparatov tripsin himotripsin protosubtilin [Comparative analysis of extraction of astaxanthin from crustacean shellfish waste with the use of enzyme preparations of trypsin, chymotrypsin, protosubtilin]. IzvestiyaKGTU, 2017, no. 44, pp. 143-150.

9. Samsonov M. V. Ispol'zovanie protosubtilina g3h dlya predotvrashcheniya obrazovanij mikroehmul'sij pri gidrolize pancirnyh othodov severnoj krevetki [Use protosubtilin G3h for the prevention of micro-emulsions formation during hydrolysis of crustacean waste for Northern shrimp]. Izvestiya KGTU , 2017, no. 47, pp. 123-134.

10. Neklyudov A. D. Poluchenie i ochistka belkovyh gidrolizatov [Preparation and purification of protein hydrolysates]. Applied biochemistry and Microbiology, 2000, vol. 36, no.4, pp. 371-379.

11. Samsonov M. V., Vinokur M. L., Andreev M. P. Issledovanie processa gidroliza pancirnyh othodov varenoj krevetki s ispolzovaniem protosubtilina [Study of the hydrolysis process of crustacean waste of boiled shrimps using protosubtilin]. Izvestiya KGTU,, 2017, no. 46, pp. 90-101.

12. Nemtsev S. V. Poluchenie nizkomolekuljarnogo vodorastvorimogo hitozana [Preparation of low molecular weight water-soluble chitosan]. Biotechnology, 2001, no. 6, pp. 37-42.

ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ

Самсонов Максим Вячеславович - Калининградский государственный технический университет; аспирант кафедры «Технология продуктов питания»;

E-mail: Samsonov-Sk@ya.ru

SamsonovMaximVyacheslavovich - Kaliningrad State Technical University; Postgraduate student of the Department of food technology; E-mail: Samsonov-Sk@ya.ru