РАЗРАБОТКА ДИАГНОСТИЧЕСКОГО НАБОРА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ОБОЛОЧКИ ВИРУСА КОЛЬЦЕВОЙ ПЯТНИСТОСТИ РАСТЕНИЙ

1. Диагностический набор для определения белка оболочки вируса кольцевой пятнистости (PNRSV), включающий:
а) поликлональные антитела против белка оболочки PNRSV из растений по п.2;
б) конъюгат, меченный щелочной фосфатазой;
в) буфер для сенсибилизации поверхности;
г) буфер для экстракции;
д) буфер ECI;
е) буфер PNP.
2. Способ определения PNRSV в растениях, включающий следующие стадии:
а) получение очищенного белка оболочки PNRSV с применением разработанных праймеров:
последовательность ID 1: прямой 5'-праймер AACTGCAGATGGTTTGCCGAATTTGCAA
последовательность ID 2: обратный 3'-праймер GCTCTAGACTAGATCTCAAGCAGGTC;
б) получение поликлональных антител против белка оболочки PNRSV, полученного на стадии а);
в) проведение твердофазного иммуноферментного анализа с прямыми антителами (DAS-ELISA) для определения PNRSV.
3. Способ по п.2, где полный белок оболочки PNRSV из розы амплифицируется с применением разработанных праймеров с последовательностью ID 1: прямой 5'-праймер AACTGCAGATGGTTTGCCGAATTTGCAA
последовательностью ID 2: обратный 3'-праймер GCTCTAGACTAGATCTCAAGCAGGTC;
4. Способ по п.2, где полный белок оболочки PNRSV с последовательностью ID3: MVCRICNHTHAGGCRSCKKCHPNDALVPLRAQQRVANNPNRMVCRICNHTHAGGCRSCKKCHPNDALVPLRAQQRVANNPNRNRNPNRVSSGMGPAVRPQPVVKTTWTVRGPNVPPRIPKGYYVAHNHREVMTTEAVKYLSIDFTTTLPQLMGQNLTLLTVIVRMNSMSSNGWIGMVEDYKVDQPDGPNALSRKGFLKDQPRGWQFEPPSDLDFDTFARTHRVVIEFKTEVPAGAKVLVRDLYVVVSDLPRVQIPTDVLLVDEDLLEI клонируется в векторе pGEX 2ТК, после чего проводится трансформация штамма BL 21 E.coli.
5. Способ по п.2, где оптимальный синтез белка оболочки PNRSV проверяется раствором IPTG с концентрацией 0,5-0,9 мМ при температуре около 30°С в течение 3-3,5 ч.
6. Способ по п.2, где очистка белка оболочки PNRSV осуществляется известным методом.
7. Способ по п.2, где трижды (с интервалами 1 неделя) проводится иммунизация кроликов очищенным белком оболочки PNRSV, полученным на стадии 1а), и полным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1.
8. Способ по п.2, где иммунизация проводится внутримышечно, подкожно или внутривенно.
9. Способ по п.2, где у кроликов берут кровь на 14-е -15-е сутки для получения поликлональных антител против белка оболочки PNRSV.
10. Способ по п.2, где проводится очистка сывороточных поликлональных антител против белка оболочки PNRSV известными методами.
11. Способ по п.2, где на титрационные микропланшеты наносятся поликлональные антитела в буфере для сенсибилизации поверхности в разведении 1:500-1:1000, после чего планшеты 4-5 раз промывают PBS-T.
12. Способ по п.2, где готовятся образцы на титрационных микропланшетах путем обработки зараженной ткани листьев экстракционным буфером, после чего достигается разведение 1×-1/160× исходного антигена.
13. Способ по п.2, где титрационные микропланшеты инкубируют при примерно 37°С в течение ночи, после чего их промывают, что обеспечивает связывание антигена в лунках.
14. Способ по п.2, где добавляют конъюгат антител, полученных на стадии 1б), в буфере ECI в соотношении 1:500-1:1000 и инкубируют при около 37°С около 4 ч, после чего промывают PBS-T.
15. Способ по п.2, где к смеси по п.14 добавляют примерно 100 мкл раствора пара-нитрофенилфосфата с концентрацией около 1 мг/мл в буфере PNP.
16. Способ по п.2, где реакция останавливается путем добавления около 50 мкл раствора NaOH (концентрация около 3М) через 15-20 мин, в результате чего смесь окрашивается в желтый цвет.
17. Способ по п.2, где окрашенный продукт является конъюгатом антиген-антитело.
18. Способ по п.2, где измеряется поглощение окрашенного продукта при 405 нм для определения Prunus necrotic ringspot virus.