БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНАЯ ДОБАВКА К ПИЩЕ
BIOLOGICALLY ACTIVE FOOD ADDITIVE

Изобретение относится к области медицины, касается биологически активной добавки к пище (БАД), а именно витаминно-минерально-пробиотического комплекса с широким спектром физиологических эффектов, обеспечивающего сбалансированное поступление в организм витаминов и минеральных веществ, а также повышение устойчивости организма к воздействию неблагоприятных факторов за счет стимулирования роста и активности лактобацилл естественной эндогенной микрофлоры кишечника, активации неферментативного звена антиоксидантной системы и уменьшения повреждающего воздействия свободных радикалов, активации факторов общей неспецифической защиты организма и укрепления иммунной системы, проявляющего адаптогенный и цитопротективный эффекты, повышающего физическую и умственную работоспособность, который может быть использован в фармацевтической и пищевой промышленности.
Как известно, особую роль в поддержании высокого уровня жизнедеятельности людей, заботящихся о своем здоровье, выполняют витамины и минеральные вещества, которые способствуют энергетическому метаболизму в организме человека, увеличивают его жизненную энергию и укрепляют иммунную систему. Постоянная поддержка защитных сил организма при помощи витаминов, минеральных солей, макро- и микроэлементов делает организм более выносливым и особенно в условиях интенсивных физических и нервно-эмоциональных нагрузок, когда их расход существенно возрастает. При достаточном их количестве происходит более быстрое и полное восстановление организма, что, как следствие, приводит к хорошему самочувствию. Проблема витаминной и минеральной недостаточности у населения России очень актуальна в настоящее время, так как повсеместно наблюдаемые ухудшения экологической обстановки и социальных условий жизни приводят к обеднению организма указанными ценными, а порой и жизненно необходимыми веществами. В то же время неконтролируемый их прием может стать причиной серьезного нарушения баланса ряда элементов, необходимых для нормальной жизнедеятельности организма.
В связи с ростом числа онкологических, соматических, инфекционных и прочих заболеваний различной этиологии, углублением тяжести их течения и увеличением длительности лечения не меньшую актуальность в настоящее время для обеспечения жизнедеятельности человека имеет и проблема нормализации дисфункциональных нарушений иммунной системы путем повышения общей неспецифической резистентности организма к различным воздействиям, что позволит предупреждать и облегчать как сами заболевания, так и их осложнения, а также ускорять реабилитацию после критических состояний.
Особую значимость проблема поддержания жизнедеятельности людей приобретает в условиях неблагоприятной экологической обстановки и в сочетании с дисбиотическими нарушениями состава симбиотической микрофлоры желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), наблюдаемыми у 90% населения России [1]. Восстановлению и поддержанию здоровой микрофлоры ЖКТ и наиболее сложного и важного ее биотопа - кишечника - в настоящее время уделяется самое пристальное внимание. Естественная физиологическая микрофлора кишечника может быть значительно нарушена вследствие неподходящего или несбалансированного питания, смены климата или воды, при стрессах, развитии хронических заболеваний ЖКТ и других органов, в ходе комплексной терапии с использованием антибиотиков или облучения и ряде других ситуаций. Нормальная микрофлора кишечника имеет чрезвычайно важное значение для макроорганизма, так как составляет основу его микроэкологии и оказывает непосредственное и существенное влияние на его состояние, выполняя ряд жизненно важных функций. К наиболее значимым из них относят обменную и синтетическую функции, функцию детоксикации, участие в процессах пищеварения и формирования естественного иммунитета человека, а также обеспечение колонизационной резистентности. Изменение качественного и/или количественного состава кишечного микробиоценоза приводит к нарушению процессов усвоения нутриентов и минорных компонентов пищи и уменьшению поступления в организм человека целого ряда биологически активных веществ (БАВ), в том числе витаминов и минералов, что проявляется ухудшением процессов его жизнедеятельности. В результате таких нарушений снижается эволюционно созданный барьер колонизационной резистентности макроорганизма, а следовательно, повышается его восприимчивость к возникновению инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы.
При регулировании функций организма с целью обеспечения его нормальной жизнедеятельности обязательно должен учитываться и тот фактор, что одним из «пусковых» механизмов развития в нем различных нарушений является оксидативный стресс - состояние несоответствия уровня продукции свободных радикалов и емкости антиоксидантных систем, вследствие чего формируются предпосылки для избыточного окисления биосубстратов, модификации и необратимого изменения ферментных систем, нарушения структуры и проницаемости биологических мембран, энергетического дефицита и снижения жизнеспособности клеток [2-7]. Оксидативный стресс приводит к значительному увеличению содержания в тканях и в крови водо- и жирорастворимых прооксидантов, прежде всего активных кислородных метаболитов, продуктов перекисного окисления липидов и оксида азота. Указанные вещества чрезвычайно реактогенны, в связи с чем неконтролируемое увеличение их содержания в организме вызывает цитотоксические и генотоксические эффекты. При этом происходит как окисление полиненасыщенных жирных кислот мембран, так и изменение белков, часть из которых выполняет ферментативную функцию, а также ДНК, что проявляется в увеличении мутагенных эффектов.
В интактной клетке оксидативные процессы находятся под строгим контролем различных механизмов антиоксидантной защиты, обеспечивающих протекание свободнорадикальных реакций на стационарном уровне, необходимом для нормальной жизнедеятельности клетки. Важную роль в защите организма от активных кислородных радикалов играет система ферментативных (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионзависимые пероксидаза и трансфераза, церулоплазмин, глутатионредуктаза) [8-12] и неферментативных антиоксидантов (тиоловые соединения - глутатион, цистеин, таурин; витамины - аскорбиновая кислота, токоферол, бета-каротин;
биогенные амины - серотонин, гистамин, катехоламины; олигопептиды - карнитин, карнозин, ансерин, эндорфины, энкефалины; полифенолы; фосфолипиды; убихинон), обладающих способностью в определенных условиях подавлять процессы свободнорадикального окисления [13-17].
Воздействие на организм человека разнообразных экстремальных факторов приводит к изменениям в состоянии антиоксидантной системы и если ресурсы данной защитной системы исчерпываются, возникает дисбаланс между антиокислительными и окислительными процессами, что имеет решающее значение в генезе различных форм патологии [18, 19]. Наступивший дисбаланс приводит к существенным нарушениям как ферментативного, так и неферментативного звеньев антиоксидантной защиты. Снижается активность каталазы, супероксиддисмутазы, содержание бета-каротина, токоферола и убихинона в митохондриях гепатоцитов.
Все более широкое использование для обеспечения нормальной жизнедеятельности людей, заботящихся о своем здоровье, находят специализированные продукты питания - БАД, содержащие разнообразные концентраты натуральных или идентичных натуральным синтетических БАВ [20]. Ежедневное длительное применение подобных БАД как самостоятельно, так и в составе пищевых продуктов и напитков обеспечивает поставку организму комплекса необходимых БАВ. Одни из таких продуктов (БАД-нутрицевтики) позволяют быстро восполнить дефицит необходимых организму веществ - витаминов, минеральных солей, макро- и микроэлементов, отдельных аминокислот, пищевых волокон и других в пределах их физиологической нормы. Другие (БАД-парафармацевтики) проявляют выраженное физиологическое действие и оказывают регулирующее и стимулирующее влияние на определенные функции организма.
Необходимость дополнительного приема специальных продуктов связана прежде всего с применением во все возрастающих масштабах при производстве основных продуктов питания высокотехнологичных процессов, вызывающих «очищение» их от многих незаменимых компонентов пищи, в результате чего человек недополучает ряд важных для его нормальной жизнедеятельности БАВ. Продолжительное несбалансированное питание с использованием таких продуктов, содержащих к тому же зачастую токсины (нитраты, нитриты), приводит к нарушению жизненно важных функций организма и может вызвать целый ряд серьезных заболеваний.
Таким образом, вышеуказанные обстоятельства определили необходимость пристального внимания при обеспечении нормальной жизнедеятельности людей как к восстановлению и поддержанию здоровой микрофлоры ЖКТ, так и к регуляции процессов свободно-радикального окисления и неспецифической защиты, а перспективы изыскания БАД с эффективным регулирующим воздействием на организм человека связали с созданием рецептур, которые наряду со своим основным предназначением в качестве дополнительных источников витаминов и минералов смогут поддерживать нормофлору кишечника, активировать неферментативное звено антиоксидантной системы и укреплять иммунную систему организма путем активации факторов общей неспецифической защиты.
Из числа таких средств большой интерес представляет специальная разработка немецких ученых - БАД БИОН 3, включающая комплекс витаминов, минералов и пробиотиков [21]. По составу, механизмам регулирующего воздействия на организм и достигаемым благоприятным эффектам БАД БИОН 3 наиболее близка к заявляемой БАД и принята в качестве БАД-прототипа.
7
В состав БАД-прототипа, производимого фармацевтической фирмой «Merk Selbstmedikation» (Германия) в твердой дозированной форме (таблетки), включены живые пробиотические молочнокислые бактерии: лактобактерии Lactobacillus gasseri PA 16/8, бифидобактерии Bifidobacterium bifidum MF 20/5 и Bifidobacterium longum SP 07/3 (в 1 таблетке каждой бактерии по 10 КОЕ/г).
Помимо пробиотических бактерий в каждой таблетке БАД-прототипа массой 1050 мг содержатся необходимые организму витамины:
витамин С (аскорбат кальция) - 60 мг
никотинамид - 18 мг
витамин Е (α-токофорола ацетат) - 10 мг
пантотеновая кислота - 6 мг
6
витамин В (пиридоксина гидрохлорид) - 2 мг
2
витамин В - 1,6 мг витамин
1
B (тиамина нитрат) - 1,4 мг
витамин А (ретинола ацетат) - 0,8 мг
3
витамин D - 200 ME
фолиевая кислота - 200 мкг
биотин - 150 мкг
12
витамин В - 1 мкг,
а также минеральные вещества:
кальций (в виде кальция фосфата) - 90 мг
магний (в виде магния оксида) - 45 мг
железо (в виде железа сульфата) - 5 мг
цинк (в виде цинка оксида) - 5 мг
марганец (в виде марганца сульфата) - 1,2 мг
йод (в виде калия йодида) - 100 мкг
селен (в виде селенита натрия) - 30 мкг
хром (в виде хрома хлорида) - 25 мкг
молибден (в виде молибдата натрия) - 25 мкг.
Благодаря комплексному составу БАД-прототип рекомендуют применять не только как дополнительный источник витаминов и минеральных веществ, но и в качестве средства регуляции кишечной флоры и укрепления иммунитета, что должно способствовать хорошему самочувствию. Однако БАД-прототипу характерен ряд существенных недостатков, ограничивающих возможности ее применения в отечественной клинической практике с целью регулирования естественного равновесия кишечной микрофлоры, улучшения за счет этого физиологического состояния кишечника и обеспечения его функционирования как защитного барьера от патогенной микрофлоры. Прежде всего это продукт зарубежной фармацевтической компании, в связи с чем нельзя утверждать, что входящие в состав БАД-прототипа бактерии близки представителям собственной эндогенной микрофлоры различных отделов кишечника и способны в нем размножаться. Одной из основных причин этого является их недостаточная биосовместимость с резидентными бактериями кишечника. Искусственно введенные в составе БАД-прототипа микроорганизмы, как правило, стойко не приживаются в организме россиян и после прекращения их приема быстро элиминируются из кишечника и замещаются случайной микрофлорой. Соответственно низка вероятность выполнения указанными бактериями, внесенными в макроорганизм извне, своей основной функции (заместительной) и тем более за короткий промежуток времени. Назначают БАД-прототип, как правило, в течение достаточно длительного промежутка времени при приеме по 1 таблетке в день (не менее 4 недель на курс при неоднократном повторении курсов в течение года). В наиболее сложных клинических ситуациях ее рекомендуют принимать в течение всего года.
Кроме того, с целью защиты пробиотических микроорганизмов от воздействия соляной кислоты, желчных кислот и ферментов верхних отделов ЖКТ и обеспечения возможности попадания их в большом количестве живыми в кишечник, где и ожидается их благоприятное воздействие, при производстве БАД-прототипа в твердой дозированной форме в виде таблеток используется особая сложная технология и применяется широкий ассортимент вспомогательных веществ. Данное определяет достаточно высокую стоимость БАД-прототипа (700-800 руб. за 30 таблеток), что при необходимости длительного приема также существенно ограничивает ее доступность для широких слоев россиян.
Как видно, отмеченные недостатки существенно ограничивают возможности использования БАД-прототипа в отечественной клинической практике для поддержания на высоком уровне процессов жизнедеятельности людей, заботящихся о своем здоровье.
Целью изобретения явилось расширение ассортимента биологически активных добавок к пище за счет создания комбинированного витаминно-минерально-пробиотического комплекса, который станет дополнительным источником сбалансированного поступления витаминов и минеральных веществ и будет оказывать эффективное регулирующее воздействие на организм здоровых людей, повышая их физическую и умственную работоспособность, а также восстанавливая жизненно важные защитные функции их организма за счет стимуляции роста и активности естественных представителей симбиотической микрофлоры кишечника, регуляции процессов свободнорадикального окисления, укрепления иммунной системы, не содержащего опасные для здоровья вещества, не обладающего сенсибилизирующим действием, способностью к кумуляции, токсическим влиянием на репродуктивную функцию, мутагенным эффектом и отдаленными негативными последствиями, хорошо переносимого и доступного для широких групп населения.
Указанная цель достигается за счет создания БАД, представляющей комбинированный витаминно-минерально-пробиотический комплекс, обеспечивающей при непосредственном употреблении в пищу рациональное сбалансированное поступление биологически активных веществ, необходимых для поддержания оптимального функционирования организма.
Для этого в состав заявляемой БАД включены: витаминно-минеральная и пробиотическая составляющие, а также носитель.
При формировании качественного и количественного состава заявляемой БАД исходили из того, что основные ее компоненты должны оказывать благоприятное регулирующее воздействие на организм:
3
1
1
2
6
12
- восполнять недостаток витаминов (А, Е, С, Д, К, B, В, В, B, никотинамида, фолиевой кислоты, пантотеновой кислоты, биотина, бета-каротина) и минеральных веществ (магния, железа, цинка, марганца, меди, йода, хрома, селена);
- стимулировать рост и активность естественных представителей симбиотической микрофлоры кишечника;
- регулировать процессы свободнорадикального окисления за счет активации неферментативного звена антиоксидантной системы;
- оказывать влияние на факторы неспецифической резистентности и стимулировать функциональную активность иммунокомпетентных клеток для устранения дисфункциональных изменений в иммунной системе.
Существенное отличие от БАД-прототипа заключается в том, что для эффективного нормализующего воздействия на симбиотическую микрофлору кишечника в состав заявляемой БАД включен пробиотический штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335, который представлен своими метаболитами, продуцируемыми в процессе культивирования бацилл. Используют указанный штамм бактерий в виде стерилизованной культуральной жидкости, так как именно в ней сконцентрирован уникальный набор БАВ, продуцируемых бациллами в процессе их выращивания. Наличие в заявляемой БАД указанного лактогенного фактора проявляется в селективной стимуляции роста и активности естественной составляющей симбиотической микрофлоры кишечника - лактобацилл, что и обусловливает один из благоприятных эффектов заявляемой БАД, заключающийся в восстановлении естественной эндогенной микрофлоры кишечника.
Ценность заявляемой БАД состоит и в том, что воздействие БАВ, продуцируемых бациллами Bacillus subtilis, приводит к синтезу в организме и секреции в кровь ферментов лизоцима и миелопероксидазы. Данное свидетельствует о влиянии заявляемой БАД на факторы неспецифической резистентности организма и обусловливает ее способность стимулировать функциональную активность иммунокомпетентных клеток.
Способность бацилл Bacillus subtilis повышать фагоцитарную активность макрофагов и тем самым проявлять иммуномодулирующий эффект связана также с синтезом при их глубинном выращивании азотистых оснований и их производных (аденин, гуанин, тимин, урацил, цитозин), которые представляют отдельную группу иммуномодулирующих веществ и содержатся в СКЖ в значительных количествах (таблица 1). Для заявляемой БАД это имеет большое значение, так как указанные БАВ способствуют восстановлению функциональной активности единой макрофагальной системы организма, угнетенной вследствие воздействия различных неблагоприятных факторов, и существенному повышению эффективности неспецифической защиты. Благодаря стимуляции иммунного ответа заявляемая БАД усиливает защитные функции организма.
Витаминно-минеральная составляющая комплекса, включающая витамины, макро- и микроэлементы в дозах, не превышающих суточную потребность, вводится в организм прежде всего для восполнения их дефицита в организме. В условиях повышенных физических, умственных, а также эмоциональных нагрузок потребность организма во многих витаминах и минералах существенно возрастает. В особенности это касается витаминов группы В, необходимых для нормального функционирования центральной нервной системы, а также веществ, участвующих в неферментативном звене антиоксидантной системы защиты организма. Для этого в состав витаминно-минеральной составляющей комплекса введены комбинации витаминов группы В и антиоксидантов.
1
2
6
12
Витамины группы В (B, В, В, В, пантотеновая кислота, фолиевая кислота) в составе заявляемой БАД содержатся в дозах, не выходящих за пределы допустимых норм, поэтому даже длительное применение заявляемой БАД не повышает риск возникновения неблагоприятных последствий, возможных при их передозировке.
Сбалансированность состава заявляемой БАД для обеспечения антиоксидантного эффекта достигают за счет того, что:
- используют комплекс водо- и жирорастворимых антиоксидантных витаминов (витамин С и витамины Е, А) для подавления свободнорадикальных реакций в водной среде и липидном бислое клеточных мембран. Причем витамин С используют в виде аскорбиновой кислоты;
- дополнительно используют бета-каротин для восполнения его дефицита в митохондриях гепатоцитов и профилактики нарушений в неферментативном звене антиоксидантной защиты;
- используют витамин А и бета-каротин в сочетании с витамином Е для усиления их антиоксидантного воздействия (обеспечения более активного гашения свободных радикалов в липидном бислое биомембран и предотвращения развития свободнорадикальных процессов) и предохранения от разрушения;
- используют синергическую пару (витамин А с цинком) для обеспечения транспорта витамина-антиоксиданта через слизистую оболочку кишечника посредством цинксодержащего белка и более полного усвоения как витамина А, так и цинка. Скорость высвобождения цинка при этом сравнима со скоростью прохождения биохимической реакции его связывания с белком с образованием цинксодержащего белкового комплекса, без которого невозможно усвоение организмом витамина А. В процесс всасывания включается большая площадь кишечника, за счет чего возрастает биодоступность указанных биологически активных компонентов заявляемой БАД;
2
3
- для поддержания и стимуляции активности Se-содержащих антиоксидантных ферментов (глутатионпироксидаз) и ускорения рециклирования их окисленных форм используют соединение 4-валентного селена (NaSеO) в дозе, позволяющей исключить его токсическое действие и максимально проявить антиоксидантный эффект. Для обеспечения оптимального антиоксидантного эффекта используют селенит натрия в сочетании с витамином Е.
12
2
Введение в состав заявляемой БАД меди как дополнительного активного участника кроветворения приводит к тому, что совместно с фолиевой кислотой, витаминами В, В и С обеспечивается способность вызывать синтез аминокислот (метионина и серина), а в совокупности с железом - стимулировать эритропоэз.
1
3
Дополнительное введение в состав заявляемой БАД витамина К способствует нормализации процессов свертывания крови, а также инициации синтеза в организме специального белка (остеокальцина), который в совокупности с витамином Д обеспечивает оптимальные условия для метаболизма костной ткани.
4
2
4
В заявляемой БАД в отличие от БАД-прототипа железо используют не в виде сульфата железа(II), а в виде фумарата железа (FeCHO), в котором содержание элементарного железа составляет 33%. Фумарат железа в отличие от сульфата железа(II) менее растворим в воде, однако хорошо растворяется в разбавленных растворах кислот, таких как желудочный сок. Данное обусловливает достаточную стабильность заявляемой БАД, так как железо в виде фумарата не связывается с белками в верхних отделах ЖКТ, но в то же время хорошо растворяется непосредственно в желудке и поэтому по биодоступности не уступает водорастворимой соли - сульфату железа(II).
Следует также заметить, что сульфат железа(II) во влажной среде постепенно окисляется до сульфата железа(III), что налагает определенные ограничения на процесс производства, хранение и использование БАД-прототипа.
Хром, как и цинк, считается одним из микроэлементов, способствующих долгой и активной жизни. В составе заявляемой БАД микроэлемент хром используют в виде хрома пиколината - продукта воздействия пиколиновой кислоты, представляющей естественное производное аминокислоты триптофана. В сравнении с другими формами трехвалентного хрома хрома пиколинат обеспечивает более высокое усвоение хрома в ЖКТ. Биологическая роль хрома заключается в том, что данный элемент замедляет синтез гликозированных белков, вызывающих старение, участвует в утилизации глюкозы инсулином, необходим для поддержания стабильного уровня глюкозы в крови и правильного углеводного обмена, профилактирует депрессию, способствует снижению аппетита при атипичной депрессии путем уменьшения потребности в жирной и углеводной пище, для чего требуется в крайне небольшом количестве. Введение в организм данного микроэлемента в составе заявляемой БАД вполне восполняет дефицит его получения из пищи.
Необходимо отметить, что формирование качественного и количественного состава заявляемой БАД, а именно ее витаминно-минеральной составляющей, с целью обеспечения рациональной комбинации входящих в нее компонентов выполнено с учетом норм суточной их потребности, приведенных в методических рекомендациях МР 2.3.1.2432-08 «Нормы физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации».
В качестве носителя в составе заявляемой БАД используют натуральный микропористый силикатный минерал цеолит, основная функция которого связана с иммобилизацией метаболитов, продуцируемых бациллами Bacillus subtilis в процессе их культивирования и сконцентрированных в СКЖ. Целесообразность использования цеолита в качестве компонента заявляемой БАД определена уникальным химическим строением его молекул, когда возникают оптимальные условия для выполнения функций сорбента и носителя метаболитов Bacillus subtilis. Цеолит, не всасываясь в ЖКТ и проходя транзитом, выполняет транспортировку иммобилизованных на нем метаболитов по всему протяжению кишечника. Постепенное высвобождение метаболитов происходит в течение достаточно длительного промежутка времени (до 1 суток).
2
2
Немаловажно и то, что благодаря уникальному химическому строению молекул цеолит обладает выраженным свойством избирательной сорбции и обеспечивает селективное связывание и выведение из организма низкомолекулярных токсинов, супероксидных радикалов (H, OH, HO и т.д.), тяжелых металлов и радионуклидов, проявляя свойства антиоксиданта и внося вклад в защиту тканей и клеток организма от оксидативного стресса. При этом не происходит прямого взаимодействия с полезными нутриентами (витаминами, аминокислотами, белками и др.) и даже улучшается их биодоступность.
Кроме того, цеолит обладает ионообменными свойствами, так как основной скелет его кристаллической решетки состоит прежде всего из тетраэдр и имеет полости, в которых находятся ионы (натрия, калия, кальция), легко обменивающиеся между собой и с окружающим субстратом. Цеолит, проходя транзитом по всему протяжению ЖКТ, участвует в селективном ионообмене и служит дополнительным источником ряда необходимых организму микроэлементов. Частицы используемого цеолита имеют размеры не более 500 мкм и овальную форму кристалла, что исключает образование микротравм в кишечнике и полностью безопасно.
Ингредиенты подобраны таким образом, что заявляемая БАД представляет собой сбалансированный витаминно-минерально-пробиотический комплекс, а количество их в двух капсулах общей массой 1000 мг составляет:
Ретинола ацетат (витамин А), мг - 0,7;
α-токоферола ацетат (витамин Е), мг - 13,6;
Аскорбиновая кислота (витамин С), мг - 94,5;
Бета-каротин, мг - 3,4;
3
Холекалициферол (витамин D), мкг - 14,5;
1
Филлохинон (витамин K), мкг - 174,0;
1
Тиамина гидрохлорид (витамин B), мг - 1,7;
2
Рибофлавин (витамин В), мг - 2,0;
5
Пантотеновая кислота (витамин В), мг - 6,2;
6
Пиридоксина гидрохлорид (витамин В), мг - 2,2;
9
Фолиевая кислота (витамин В), мкг - 500,1;
12
Цианокобаламин (витамин В), мкг - 3,9;
Никотинамид (витамин РР), мг - 21,0;
Биотин (витамин Н), мкг - 54,9;
Магний (в виде магния оксида), мг - 100,0;
Железо (в виде железа фумарата), мг - 10,0;
Цинк (в виде цинка оксида), мг - 7,0;
Марганец (в виде марганца сульфата), мг - 1,4;
Медь (в виде меди сульфата), мг - 0,9;
Йод (в виде йодида калия), мкг - 129,9;
Хром (в виде хрома пиколината), мкг - 24,9;
Селен (в виде селенита натрия), мкг - 35,1;
Цеолит, мг - 195,0.
Стерилизованная высушенная культуральная жидкость, содержащая метаболиты бактерий Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335, мг - 5,0.
Возможность достижения цели изобретения доказывается следующими примерами.
Пример 1. Получение заявляемой БАД в капсулированной твердой дозированной форме для перорального введения.
Заявляемая БАД выполнена в капсулированной твердой дозированной форме, что не только существенно упрощает ее использование при пероральном приеме, но и обеспечивает надежную защиту входящих в ее состав компонентов от воздействия факторов, вызывающих их деградацию. Совместимость компонентов в 1 капсуле обеспечена специальной технологией производства заявляемой БАД.
Получают заявляемую БАД вначале в виде порошка, для чего выполняют следующий алгоритм действий. Выращивают микроорганизмы Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335 методом глубинного культивирования в биологическом реакторе (ферментере). По окончании процесса культивирования КЖ с микроорганизмами подвергают центрифугированию для отделения и последующего удаления живых клеток микроорганизмов, а затем стерилизуют. Перед стерилизацией КЖ смешивают с цеолитом, предварительно измельченным до частиц размером не более 500 мкм. Полученную смесь подвергают лиофилизации, при которой происходит иммобилизация биологически активных метаболитов продуцента на частицах цеолита. Далее в массу добавляют последовательно витаминный и минеральный премиксы и помещают в резервуар установки для гранулирования с целью смешивания и досушивания. После выгрузки массу просеивают на вибросите и передают на стадию капсулирования. Наполнение твердых желатиновых капсул осуществляют на автомате для наполнения капсул, а обеспыливание - на автомате для полировки капсул.
Для введения компонентов витаминно-минеральной составляющей используют витаминный и минеральный премиксы (ООО «КРАФТ», Санкт-Петербург).
В качестве носителя используют цеолит природный - натуральный микропористый силикатный минерал Холинского месторождения (Бурятия) (ООО «КРАФТ», Санкт-Петербург) [22-25].
Как видно, процесс получения заявляемой БАД в капсулированной твердой дозированной форме для перорального введения отличается простотой, а используемые при этом ингредиенты выпускаются отечественной промышленностью, доступны и недороги.
Пример 2. Оценка безопасности заявляемой БАД.
Безопасность заявляемой БАД оценивали по результатам санитарно-химического и радиологического анализа, санитарно-микробиологических исследований, а также путем определения ряда токсикологических и других характеристик: острой токсичности, хронической токсичности и способности к кумуляции, возможного местно-раздражающего действия на слизистую пищевода, раздражающего действия на кожу и глаза, ингаляционного воздействия пылью, сенсибилизирующего действия, возможных отдаленных последствий.
Санитарно-химический и радиологический анализ.
Подготовку проб проводили по ГОСТ 26929-94 «Сырье и продукты пищевые. Подготовка проб. Минерализация для определения токсичных элементов. Межгосударственный стандарт». Свинец и кадмий определяли по ГОСТ 30178-96 «Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод определения токсичных элементов. Межгосударственный стандарт». Мышьяк определяли согласно ГОСТ 26930-86 «Сырье и продукты пищевые. Метод определения мышьяка». Ртуть определяли согласно «Методическим указаниям по обнаружению и определению содержания общей ртути в пищевых продуктах методом беспламенной атомной абсорбции» (№5178-90).
Содержание хлорорганических пестицидов (токсикантов) определяли согласно «Методическим указаниям по определению остаточных количеств хлорорганических пестицидов» (№1766-77) и официальным методам анализа АОАС («Official methods of analysis of the АОАС», 1984, 14th ed., Chapter 29, pp.537-538).
Исследования проводили с использованием весов лабораторных ВЛР-500, газожидкостного хроматографа «Карло Эрба» (модель HRGC 5700), атомно-абсорбционного спектрометра «Перкин-Элмер» (модель 303), гамма-спектрометра «УСК-Гамма-плюс» (Россия), обменных клеток итальянской фирмы «Texnoplast».
90
137
Результаты проведенных измерений представлены в таблицах 2 и 3 и свидетельствуют, что в заявляемой БАД содержание токсикантов (хлорорганические пестициды ГХЦТ и ДЦТ), опасных для здоровья веществ (свинец, кадмий, ртуть, мышьяк), радионуклидов (Sr, Cs) не превышает допустимые уровни, установленные «Едиными санитарно-эпидемиологическими и гигиеническими требованиями к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю)» Таможенного союза ЕврАзЭС (глава II, раздел I, индекс 10.6) (норматив ЕТ (глава II, раздел I, индекс 10.6)) [26]. Такие же пестициды как алдрин и гептахлор в заявляемой композиции не обнаружены.
Санитарно-микробиологические исследования.
Микробиологические исследования проводили в соответствии с требованиями методических указаний МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов» и МУК 2.3.2.721-98 «Определение безопасности и эффективности биологически активных добавок к пище», ГОСТ Р 52814-2007 «Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella», ГОСТ Р 52815-2007 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества коагулазоположительных стафилококков и Staphylococcus aureus», ГОСТ Р 52816-2007 «Продукты пищевые. Метод выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)», ГОСТ 10444.8-88 «Продукты пищевые. Метод определения Bacillus cereus», ГОСТ 10444.12-88 «Продукты пищевые. Метод определения дрожжей и плесневых грибов», ГОСТ 30726-2001 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli».
Результаты оценки санитарно-микробиологических показателей безопасности представлены в таблице 4 и свидетельствуют, что по санитарно-микробиологическим показателям безопасности заявляемая БАД соответствует «Единым санитарно-эпидемиологическим и гигиеническим требованиям к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю)» Таможенного союза ЕврАзЭС (глава II, раздел I, индекс 10.6, 10.10) (норматив ЕТ (глава II, раздел I, индекс 10.6, 10.10)).
Исследование острой токсичности.
Заявляемую БАД вводили здоровым беспородным белым крысам обоих полов массой 130-150 г и 180-200 г перорально через металлический атравматический зонд в виде внутрижелудочных водно-крахмальных взвесей, которые готовили ex tempore. Исследования проводили с использованием пробит-анализа по Литчфилду-Уилкоксону в модификации З. Рота [27]. В ходе эксперимента были сформированы 2 группы по 10 животных в каждой: опытная (вводили заявляемую БАД два раза в день в максимально переносимой дозе - 15 г/кг) и контрольная (вводили эквивалентные объемы 1% крахмальной взвеси).
Наблюдение за подопытными животными осуществляли в течение 14 сут с регистрацией показателей: летальность, время гибели животных, симптоматика отравления, результаты ежедневного наблюдения общего состояния и поведения, взвешивания, результаты контроля потребления корма и воды, результаты вскрытия и макроскопического описания погибших и выживших животных в конце исследования (эвтаназия осуществлялась передозировкой эфира), результаты определения массовых коэффициентов внутренних органов.
Введение заявляемой БАД в максимально переносимых дозах не вызывало гибели подопытных животных. Не отмечали и какие-либо другие признаки негативного воздействия заявляемой БАД. В частности, не отмечали какие-либо диспепсические явления. Во все дни наблюдения по общему состоянию и поведению животные опытной и контрольной групп не отличались.
Результаты изучения динамики массы тела подопытных животных, получавших заявляемую БАД, в течение 14 сут наблюдения за ними позволили установить, что динамика массы тела животных опытной и контрольной групп практически не различалась (таблица 5).
Вскрытие животных опытных групп, проведенное через день после острого введения заявляемой БАД, позволило установить, что листки плевры и органы грудной клетки не изменены. Легкие бледно-розовые, воздушные, без уплотнений на ощупь. Размеры сердца в пределах нормы. В полостях сердца содержится небольшое количество жидкой крови. Мышца сердца плотная, коричневой окраски. Желудок заполнен небольшим количеством плотной пищи. Слизистая оболочка блестящая, складчатая, слегка розоватой окраски.
Слизистая тонкого кишечника блестящая, гладкая, розоватой окраски. Размеры и форма печени не различаются у животных опытной и контрольной групп. Поверхность печени гладкая. Капсула тонкая, прозрачная. Рисунок печени на разрезе не изменен. Ткань печени умеренно полнокровна. Почки обычной величины и формы, коричневатого цвета, плотные, с отчетливым корковым и мозговым веществом на разрезе. Щитовидная железа, надпочечники и поджелудочная железа по внешнему виду не различаются. При осмотре гистологических препаратов желудка и паренхиматозных органов различий в структуре между опытной и контрольной группами животных также не обнаружено.
Сосуды легких были умеренно полнокровны. Эпителий альвеол и внутрилегочных бронхов изменений не представлял. Альвеолы были заполнены воздухом. Отека либо воспаления легочной ткани не наблюдалось. Миобифриллы левого желудочка сердца и межжелудочковой перегородки имели отчетливую поперечную исчерченность, ядра кардиомиоцитов были светлыми. Сосуды миокарда умеренно полнокровные. Дольчатое строение печени сохранялось. Границы гепатоцитов были четкими, цитоплазма гепатоцитов - слабобазофильной, зернистой, ядра с достаточным содержанием хроматина и тонкой ядерной мембраной.
Эпителий извитых канальцев почек изменений не представлял. Цитоплазма его была зернистой, оксифильной, ядра светлыми. Сосуды клубочков умеренно полнокровные.
Строение слизистой оболочки фундальной части желудка животных опытной и контрольной групп не различалось. Ядра эпителия слизистой и желез были светлыми. В базальных отделах желез сохранилась зернистость в цитоплазме. Эпителий ворсинок и крипт слизистой тонкой кишки был сохранен, в криптах присутствовали митозы.
При окраске замороженных срезов печени суданом IV признаков жировой дистрофии не наблюдалось.
Анализ величин массовых коэффициентов (МК) органов белых крыс позволил установить, что острое введение им заявляемой БАД в максимально переносимой дозе не вызывает какие-либо достоверные отличия по сравнению с контрольной группой, получавшей 1% крахмальную взвесь (таблица 6).
Таким образом, результаты токсикометрии, данные наблюдений за подопытными животными на протяжении 14 дней после острого введения, а также данные некропсии позволяют отнести заявляемую БАД к нетоксичным (относительно безвредным по С.Д. Заугольникову) и малоопасным (IV класс опасности по ГОСТ 12.1.007) веществам.
Исследование хронической токсичности и способности к кумуляции.
Исследования хронической токсичности проводили на белых нелинейных крысах-самцах массой 180-200 г.при введении заявляемой БАД внутрижелудочно через атравматичный металлический зонд в течение 30 дней при суточной дозе 1,5 г/кг. Животные контрольной группы получали 1% крахмальную взвесь в аналогичных объемах.
Измерение основных физиологических показателей осуществляли через 30 дней хронического ежедневного введения заявляемой БАД.
В течение всего периода наблюдения летальных эффектов не наблюдали. Общее состояние и поведение подопытных животных оставалось нормальным и не отличалось от контрольной группы в течение всего эксперимента.
Результаты изучения интегральных показателей общей токсичности, представленные в таблицах 7 и 8, свидетельствуют, что ни по одному из анализируемых показателей не было выявлено статистически значимых различий с контрольной группой животных, получавших 1% крахмальную взвесь (p>0,05 при 95% уровне вероятности), или патологических отклонений за пределы варьирования физиологической нормы.
Вскрытие крыс, умерщвленных на следующий день после последнего введения заявляемой БАД, показало, что размеры, форма и окраска внутренних органов не имели макроскопических изменений по сравнению с контрольной группой. Слизистая оболочка желудка и тонкого кишечника были блестящими, бледно-розовыми, без признаков раздражения или воспаления.
Гистологическое исследование препаратов легких, миокарда, печени, почек и слизистой желудка подопытных животных, получавших заявляемую БАД, не выявило дистрофических, воспалительных или некробиотических изменений органов.
Эпителий альвеол и внутрилегочных бронхов изменений не имел, альвеолы были воздушными. Ателектазов либо отека легочной ткани не наблюдалось. Поперечная исчерченность миофибрилл миокарда была отчетливой. Строение печени нарушений не имело. Границы гепатоцитов были отчетливые, цитоплазма зернистая, слабобазофильная, ядра светлые с тонкой мембраной и отчетливыми ядрышками. Нефроэпителий с оксифильной зернистой цитоплазмой и светлыми четкими ядрами. Эпителий слизистой желудка сохранен, главные и обкладочные клетки желез желудка не изменены.
Следовательно, хроническое внутрижелудочное поступление заявляемой БАД в организм подопытных животных не вызывает дистрофических или деструктивных изменений паренхиматозных органов и не сопровождается раздражением слизистых оболочек ЖКТ. Таким образом, по интегральному показателю кумуляции и показателям общей нелетальной токсичности заявляемая БАД не обладает способностью к кумуляции и нетоксична.
Исследование возможного местно-раздражающего действия.
Местно-раздражающее действие заявляемой БАД оценивали на модели мерцательного эпителия пищевода лягушки. Цитотоксический эффект изучали на болотных лягушках Rana temporaria массой 25 г. После обездвиживания путем разрушения спинного мозга и фиксации животных на пробковом столе вскрывали грудную клетку, выделяли пищевод и рассекали в каудальнем направлении. Над глоточной частью пищевода устанавливали две штанги. В ходе эксперимента регистрировали время прохождения пробковой крошкой участка пищевода длиной 10 мм, ограниченного штангами, до и после нанесения на слизистую оболочку пищевода дистиллированной воды или заявляемой БАД в виде порошка в количестве 50 мг. Продолжительность воздействия составляла 1 мин.
Экспериментально установлено, что нанесение на слизистую оболочку пищевода заявляемой БАД в виде порошка не влияет на двигательную функцию мерцательного эпителия пищевода лягушки (таблица 9). Таким образом, заявляемая БАД не оказывает местно-раздражающего действия.
Исследование действия на кожу и глаза
Действие на кожу и кожно-резорбтивное действие изучалось на белых крысах-самках массой 130-150 г. После помещения животных в специальные домики их хвосты на 2/3 помещали на 4 ч в кашицу, которую получали, смешивая заявляемую БАД в виде порошка с холодной водой в количествах соответственно 90% и 10%. Через 1 ч и 16 ч после окончания однократной аппликации не отмечалось эритемы или отека кожи хвостов (величина отека оценивалась путем измерения толщины хвоста в средней части при помощи толщинометра типа ТР-1-10). Установлено, что 20-кратная аппликация не вызывала гибели подопытных животных и не выявляла раздражающего действия на кожу в течение последующего 5-дневного срока наблюдения.
Морфологически кожа хвостов в месте нанесения порошка изменений не имела. Эпидермис и придатки кожи также были без изменений. Слои эпидермиса были отчетливо выражены, базальная мембрана сохранена. Эпителиальные клетки наружных и внутренних корневых влагалищ волосяных фолликулов и соединительно-тканная сумка хорошо выражены.
Макроскопические и микроскопические изменения внутренних органов у подопытных животных отсутствовали.
Изучение морфологических, биохимических, гематологических и физиологических показателей белых крыс не выявило достоверных отличий от контрольной группы животных, хвосты которых помещали в воду.
Следовательно, заявляемая БАД не обладает раздражающим действием на кожу и кожно-резорбтивным действием, то есть нетоксична при попадании на кожу или при контакте с ней.
Исследовали также раздражающее действие заявляемой БАД на слизистую оболочку глаза кролика. В ходе эксперимента установлено, что через 1 мин после однократного внесения заявляемой БАД в виде порошка в количестве 50 мг в конъюнктивальный мешок глаза кролика появились умеренная гиперемия и слезотечение, сопровождавшиеся непродолжительным блефароспазмом, что можно расценить как реакцию на индифферентное механическое инородное тело. Полнокровие сосудов сохранялось не более 20 мин, а через 40-45 мин все возникшие явления раздражения полностью прошли. Следовательно, заявляемая БАД обладает слабым раздражающим действием на слизистую оболочку глаза кролика, как любая механическая пыль.
Исследование ингаляционного воздействия пылью.
3
Однократное динамическое ингаляционное воздействие заявляемой БАД в виде порошка на белых крыс-самках массой 130-150 г производили в течение 2 ч в стандартных камерах Б.А. Курляндского объемом 200 литров. Скорость подачи воздуха составляла 60 л/мин при температуре 20°C. Максимально возможные концентрации пыли, которые в ходе эксперимента определяли гравиметрическим методом, достигали с помощью пылевых распылителей. Пробы воздуха отбирали через каждые 30 мин. В ходе эксперимента средняя концентрация пыли составила 55,5±3,5 г/м.
Как в ходе воздействий, так и после них у подопытных животных не наблюдалось летальных исходов, а лишь признаки пылевого (механического) раздражения верхних дыхательных путей (чихание, груминг) и глаз (лакримация), а также беспокойство.
Вскрытие умерщвленных животных не выявило изменений, кроме умеренного полнокровия внутренних органов. В дыхательных путях определялись частички порошка заявляемой БАД.
Следовательно, острое ингаляционное воздействие пылью заявляемой БАД не представляет опасности, так как не вызывает признаков отравления, а лишь способно незначительно раздражать верхние дыхательные пути и глаза, как любая механическая пыль.
Исследование сенсибилизирующего действия.
2
Изучение сенсибилизирующего действия заявляемой БАД проводили на морских свинках. Для этого в кожу наружной поверхности уха животных туберкулиновым шприцем вводили однократно 0,02 мл водного разведения заявляемой БАД в дозе 10 мг/кг, а через 10 дней на предварительно выстриженные участки кожи боковой поверхности спины размером 2×2 см наносили и фиксировали заявляемую БАД в виде порошка из расчета 20 мг/см. Забор крови у животных осуществляли через 3 ч после постановки кожных проб.
Результаты оценки влияния заявляемой БАД на показатели сенсибилизирующего действия представлены в таблице 10 и свидетельствуют об отсутствии признаков сенсибилизации в периферической крови - эозинофилии или увеличения уровня лизиса в реакции специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) по сравнению с контролем. При осмотре кожи спины подопытных животных признаков раздражения не отмечалось. Следовательно, заявляемая БАД при эпикутанном контакте не обладает сенсибилизирующим действием, то есть не провоцирует развитие аллергии.
Исследование возможных отдаленных последствий.
Изучение возможного гонадотоксического эффекта проводили в соответствии с методическими рекомендациями по показателям, обязательным при первичной оценке химических веществ [28, 29]. Изучение мутагенной активности проводили по частоте образования микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга (из бедренной кости) белых мышей в соответствии с методическими рекомендациями [30, 31].
Результаты изучения возможных гонадотоксического и мутагенного эффектов заявляемой БАД при введении ее в течение 10 дней в дозе 1 г/кг, проведенного через 15 дней после окончания ее введения, свидетельствуют об отсутствии достоверно значимых сдвигов показателей гонадотоксичности и мутагенности (таблица 11). Угнетения сперматогенеза или увеличения частоты мутаций также не наблюдалось.
Следовательно, заявляемая БАД не обладает токсическим влиянием на репродуктивную функцию и не оказывает мутагенного эффекта. Это свидетельствует о ее безопасности в плане развития отдаленных негативных последствий у человека.
Пример 3. Оценка стабильности заявляемой БАД в процессе хранения. Исследовали возможность сохранения активности и безопасности заявляемой БАД в виде порошка и устанавливали гарантированный срок годности в случае хранения при различных температурах и без использования специального оборудования.
1
2
В ходе эксперимента порошок закладывали в 100 потребительских упаковок в виде двойных полиэтиленовых пакетов и хранили их в течение 2,5 лет при температурах 5±2°C, 10±3°C, 25±5°C, 35±6°C, закладывая 25 упаковок на каждый температурный режим. Через каждые 6 месяцев хранения отбирали по 5 упаковок от соответствующего температурного режима и определяли характеристики порошка: влажность, амилолитическую и протеолитическую активности, микробиологическую чистоту и содержание витаминов (С, B, В, Е) и минералов (цинк, хром, селен, магний). Для оценки возможных изменений указанных характеристик при хранении определяли их значения в начале исследований.
Данные, представленные в таблице 12, свидетельствуют о том, что при выбранных для испытаний температурных режимах хранения (от 5 до 40°C) оцениваемые показатели практически не изменились при хранении в течение 2,5 лет. Средние значения показателей составили:
массовая доля влаги - 5,9%, амилолитическая активность - 2,8±0,4 ед. АА/г, протеолитическая активность - 0,4±0,1 ед. ПА/г. Микробиологическая чистота заявляемой БАД, оцениваемая отсутствием в ней патогенных микроорганизмов (Pseudomonas aeruginosa, Enterobacteriaceae, Staphylococcus aureus и Bacillus cereus), сохранялась в течение 2,5 лет, то есть весь период исследований. Содержание витаминов и минералов также сохранялось в течение всего периода хранения.
Таким образом, гарантированный срок хранения заявляемой БАД, выполненной в твердой форме в виде порошка, составляет не менее 2,5 лет при температуре не выше 40°C при условии соблюдения сохранности упаковки. Особые температурные условия хранения или использование специального оборудования при этом не требуются.
Пример 4. Исследование влияния метаболитов Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335 на рост и активность пробиотических лактобацилл.
В ходе эксперимента in vitro исследовали антагонистическую активность метаболитов Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335 в отношении живых лактобацилл Lactobacillus plantarum 8R-A3, а также их влияние на рост и активность указанных лактобацилл, близких естественной составляющей эндогенной микрофлоры кишечника. При этом активность лактобацилл Lactobacillus plantarum 8R-A3 оценивалась по уровню их специфической антибактериальной активности в отношении ряда условно-патогенных микроорганизмов (стафилококков, эшерихий, псевдомонад),
Исследования проводили с использованием:
- метода прямого антагонизма путем прямого нанесения стерильных метаболитов бактерий Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335 или живых лактобацилл Lactobacillus plantarum 8R-A3 в лунки или на поверхность твердой питательной среды (агар МРС-4) сразу же после посева в нее лактобацилл Lactobacillus plantarum 8R-A3 или индикаторных тест-культур с последующей инкубацией в течение 24 ч при температуре 37°C;
- метода двухслойного агара [32], при котором в нижний слой твердой питательной среды (агар МРС-4) вносили суспензию метаболитов Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335 или живые лактобациллы Lactobacillus plantarum 8R-A3, а в верхний слой засевали лактобациллы Lactobacillus plantarum 8R-A3 или индикаторные тест-культуры.
Метаболиты Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335 вводили в концентрациях 1 г или 0,1 г в 10 мл агара.
Лактобациллы засевали в различных количествах, составляющих 7 lg КОЕ/мл - 2 lg KOE/мл.
В качестве тест-культур условно-патогенных микроорганизмов использовали Staphylococcus aureus 209, Escherichia coli M15 и Pseudomonas aeruginosa.
С использованием методов прямого антагонизма и двухслойного агара установлено, что метаболиты Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335 не оказывают ингибирующий эффект на рост лактобацилл Lactobacillus plantarum 8R-A3.
Также установлено, что метаболиты Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335 как лактогенный фактор стимулируют рост пробиотических лактобацилл. В присутствии метаболитов Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335 вырастало большее количество (в четыре и более раз) лактобацилл Lactobacillus plantarum 8R-A3 (таблица 13). Колонии лактобацилл при посеве 50 колоний на чашку Петри и росте в присутствии метаболитов Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335 в 2 раза крупнее, их диаметр увеличивался с 1 мм до 2 мм по сравнению с контролем (без добавления метаболитов Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335).
В присутствии метаболитов Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335 антибактериальные эффекты лактобацилл Lactobacillus plantarum 8R-A3, то есть их специфическая антагонистическая активность, в отношении стафилококков, эшерихий и псевдомонад существенно возрастала (таблицы 14-16).
Таким образом, экспериментально установлено, что метаболиты Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335 в составе заявляемой БАД представляют лактогенный фактор и стимулируют рост лактобацилл и их специфическую антагонистическую активность в отношении условно-патогенных микроорганизмов, чем и обусловлено благоприятное воздействие заявляемой БАД на естественную эндогенную микрофлору кишечника.
Пример 5. Исследование иммунотропных эффектов заявляемой БАД.
Исследования, предусматривающие оценку способности заявляемой БАД оказывать влияние на факторы неспецифической резистентности организма, выполнены на белых беспородных лабораторных мышах массой 18-23 г. Использовали 80 животных, которые были распределены на две группы по 40 особей в каждой: контрольную (получали изотонический раствор хлорида натрия) и опытную (получали заявляемую БАД).
Заявляемую БАД вводили в течение 7 сут перорально 1 раз в сутки в дозе 150 мкг/мышь. Оценку эффекта воздействия осуществляли через 1, 3 и 7 сут. Для этого у животных контрольной и опытной групп проводили забор крови для исследования, причем забор крови проводили до начала исследований и затем спустя 1, 3 и 7 сут. На каждом этапе исследования забор материала проводили от 10 животных из группы, индивидуально от каждой мыши после ее декапитации.
Динамику изменений факторов неспецифической резистентности оценивали путем определения функционального состояния клеток фагоцитарной системы (переваривающей активности гранулярных лейкоцитов), а также концентрации в сыворотке крови ферментов лизоцима и миелопероксидазы, являющихся медиаторами межклеточного взаимодействия при развитии иммунного ответа на любое антигенное воздействие.
Переваривающую активность гранулярных лейкоцитов периферической крови подопытных животных оценивали по методу Зеленовой Е.Г. и Никифорова В.А. (1972). Сыворотку получали по стандартной методике, отделяя сгусток крови от жидкой фазы. Для оценки функционального состояния фагоцитирующих клеток кровь забирали в пробирки, предварительно обработанные силиконом (Serva, Германия) и содержащие раствор гепарина из расчета 20 ЕД на 1 мл крови.
Фагоцитарный индекс (Фи), представляющий отношение выраженности поглотительной и переваривающей функций фагоцитирующих клеток, определяли через 15 мин и 30 мин инкубации с тест-объектом фагоцитоза, в качестве которого использовали тест-микроб (М. lysodeicticus), выращенный на мясопептонном агаре в термостате при температуре 37°C в течение 24 ч. В качестве оцениваемого показателя служил индекс переваривающей активности гранулярных лейкоцитов (ИП), представляющий отношение количества фагоцитирующих клеток в мазке через 30 мин инкубации крови с тест-объектом фагоцитоза к количеству фагоцитирующих клеток в мазке через 15 мин инкубации крови с тест-объектом фагоцитоза.
Значения ИП определяли по формуле:
где А - количество фагоцитирующих клеток на 100, просчитанных в мазке гранулярных лейкоцитов, поглотивших тест-микроб в течение 15 мин инкубации;
В - количество фагоцитирующих клеток на 100, просчитанных в мазке гранулярных лейкоцитов, поглотивших тест-микроб в течение 30 мин инкубации.
Величину ИП выражали в условных единицах. Экспериментальные данные по оценке функционального состояния гранулярных лейкоцитов периферической крови мышей, получавших заявляемую БАД (фиг.1), свидетельствуют, что применение заявляемой БАД способствует существенному повышению функциональной активности гранулярных лейкоцитов периферической крови, так как значения ИП значительно превышают уровень показателя контрольной группы (различия с группой «контроль» достоверны при p<0,05).
Концентрацию лизоцима в сыворотке крови определяли по методу Бухарина О.В. с соавт. (1974). Для этого кровь подопытного животного собирали в центрифужную пробирку и получали сыворотку. Затем 0,1 мл сыворотки крови переносили в бактериологическую пробирку и добавляли 0,9 мл физиологического раствора. Полученную смесь перемешивали и добавляли к ней 1,5 мл суспензии тест-микроба, которую предварительно стандартизовали на фотоэлектроколориметре ФЭК-56М до экстинкции 0,66.
Готовую суспензию, содержащую тест-микроб и исследуемую сыворотку, перемешивали и помещали в термостат на 30 мин при температуре 37°C. По истечении времени инкубации пробирки вынимали из термостата и определяли экстинкцию материала. Полученные величины экстинкции с помощью специальных таблиц переводили в значения, характеризующие концентрацию лизоцима в сыворотке крови, и выражали в мкг/мл.
Уровень миелопероксидазы (МПО) в сыворотке крови определяли по методу, разработанному на основании общепринятых подходов к выявлению этого субстрата в сыворотке крови и иммунокомпетентных клетках (Gell P.G.H. и др. (1968); Page R.C. и др. (1978)). Для определения концентрации МПО в сыворотке крови в 96-луночные планшеты для иммунологических реакций с плоским дном, начиная со второй лунки ряда А, разливали по 0,1 мл сывороток, взятых от подопытных животных. Затем в них добавляли по 0,1 мл реактива, представляющего собой смесь бензидина и 3% перекиси водорода. В первую лунку ряда А панели (контроль) вместо сыворотки наливали 0,1 мл физиологического раствора. После добавления реактива панели встряхивали, помещали в термостат и выдерживали при температуре 37°C в течение 60 мин. По прошествии времени инкубации панели вынимали из термостата и просматривали на вертикальном спектрофотометре «Dynatech» (Германия) при длине волны 495 нм. Концентрацию фермента в сыворотке крови получали в единицах экстинкции и выражали в условных единицах.
Как свидетельствуют представленные на фиг.2-3 данные по оценке концентраций лизоцима и миелопероксидазы в сыворотке крови мышей, получавших заявляемую БАД, иммунотропные эффекты заявляемой БАД проявляются на уровне клеток фагоцитарной системы крови и процессов, связанных с синтезом и секрецией в кровь указанных ферментов. Эффекты достоверного повышения функциональной активности факторов неспецифического иммунитета (различия с группой «контроль» достоверны при p<0,05) регистрировали уже через 1 сут после введения заявляемой БАД и длились они как минимум 7 сут от момента введения. Стимулирующее действие заявляемой БАД на механизмы неспецифической резистентности имело место уже после однократного ее введения. Уровни концентраций лизоцима и миелопероксидазы в сыворотке крови животных, получавших заявляемую БАД, через 1 сут выросли соответственно в 2,2 и 1,5 раза в сравнении с контрольной группой животных, которым вводили изотонический раствор хлорида натрия.
Пример 6. Оценка биологической активности заявляемой БАД. Биологическую активность заявляемой БАД оценивали на основании изучения ее адаптогенной активности, нейротрофического и цитопротективного эффектов, антиоксидантных свойств.
Опыты по оценке указанных характеристик выполняли на беспородных белых крысах-самцах массой 180-200 г. и белых беспородных лабораторных мышах массой 18-23 г после внутрижелудочного (через зонд) введения заявляемой БАД. Необходимая доза введения заявляемой БАД составила 100 мг/кг (адаптированная для крыс профилактическая доза с учетом коэффициента межвидового переноса, равного 6, исходя из необходимости введения содержимого 2 капсул, составляющего 1000 мг в сутки для человека средней массой 60-70 кг) или 150 мг/кг (адаптированная для мышей профилактическая доза с учетом коэффициента межвидового переноса, равного 10, исходя из необходимости введения содержимого 2 капсул, составляющего 1000 мг в сутки для человека средней массой 60-70 кг).
Влияние заявляемой БАД на устойчивость крыс к воздействию высоких температур.
Адаптогенные свойства заявляемой БАД оценивали по воздействию на подопытных животных температурного фактора, что позволяет провести комплексную оценку влияния заявляемой БАД на метаболические системы, устойчивость функционирования которых в условиях гипертермии определяет выживаемость особей.
Для оценки устойчивости крыс в условиях гипертермии подопытную и контрольную группы по 6 животных в клетке помещали в вентилируемый термостат и выдерживали при температуре 60°C. Устройство термокамеры позволяло обеспечить адекватный газообмен, достаточный для предупреждения кислородной недостаточности, и позволяло наблюдать за животными через смотровое застекленное отверстие. В ходе наблюдения регистрировали развитие симптоматики поражения и отмечали время манифестации судорожного синдрома и гибели особей.
Экспериментальные данные свидетельствуют, что заявляемая БАД при четырехнедельном введении оказывает положительное влияние на устойчивость крыс к гипертермии (таблица 17). Скорость развития судорожного синдрома у крыс, получавших заявляемую БАД, имеет отчетливую тенденцию к снижению, а продолжительность их жизни в условиях гипертермии достоверно выше. Таким образом, заявляемая БАД обладает адаптогенным действием и при курсовом применении способна увеличить устойчивость к воздействию экстремальных факторов.
Влияние заявляемой БАД на процессы краткосрочной памяти и умственную работоспособность крыс.
Нейротрофические эффекты заявляемой БАД оценивали по влиянию на краткосрочную память крыс и в сравнении с БАД-прототипом [33]. Базисной моделью для оценки влияния на формирование и воспроизведение памятного следа в норме и в условиях его экспериментального нарушения является методика условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) [34]. Основными преимуществами этого метода являются быстрота выработки рефлекса (обучение с одной пробы) и возможность дифференцированного воздействия на различные фазы памяти.

Подопытные животные были разделены на 4 группы: контрольную и три опытные по 10 особей в каждой. Перед выработкой УРПИ подопытным животным первой и второй опытной групп на протяжении 10 дней внутрижелудочно вводили соответственно заявляемую БАД и БАД-прототип в дозе 100 мг/кг каждой. Животным третьей опытной группы также на протяжении 10 дней вводили внутрижелудочно препарат сравнения «Ноопепт таблетки 10 мг» (ЗАО «Мастер-клон», Москва) в виде водной взвеси в дозе 5 мг/кг (адаптированная для грызунов максимальная терапевтическая доза для человека в расчете на активный компонент). Животным контрольной группы вводили 1% крахмальную взвесь в объеме 0,2 мл.
Установка для выработки рефлекса пассивного избегания представляла собой фанерный ящик - отсек, который состоял из освещенной части с вмонтированной лампой накаливания мощностью 40 Вт и затемненной с медными стержнями диаметром 2 мм на полу. К стержням через латер и замыкающий ключ подавали ток от сети. Между собой части были разделены перегородкой с отверстием, которое перекрывалось заслонкой.
На 11 день исследования проводили выработку УРПИ у крыс в установке, запускающим стимулом которой было нахождение животного в ярко освещенном пространстве.
Крысу помещали в светлую часть отсека. После перехода крысы в темную часть сразу же наносили неустранимое болевое воздействие 5 последовательными стимулами переменного тока (1 мА, длительностью 1 с каждый с интервалом 2 с).
При тестировании (повторном помещении в освещенную часть отсека через 24 ч с целью определения сохранения УРПИ) за каждым животным наблюдали в течение 180 с. При этом регистрировали время латентного периода перехода крысы в темную часть отсека, время пребывания в светлой и темной частях отсека и число животных, не зашедших в темную часть отсека (число обученных животных).
Результаты оценки показателей УРПИ свидетельствуют о достижении максимального эффекта в случае использования заявляемой БАД (таблица 18). Применение заявляемой БАД позволяет активировать когнитивные процессы и в большей степени закрепить сформированный оборонительный рефлекс. По сравнению с контрольной группой латентный период реакции перехода животных и время их пребывания в светлой части отсека увеличились соответственно на 89,3% и 71,4%, а время пребывания в темной части отсека уменьшилось в 4,4 раз. При этом навыки были выработаны у всех 10 животных первой опытной группы, что в 2,0 раза превышает показатель контрольной группы.
При использовании БАД-прототипа по сравнению с контрольной группой латентный период реакции перехода животных и время их пребывания в светлой части отсека увеличились соответственно на 73,3% и 54,2%, а время пребывания в темной части отсека уменьшилось в 2,8 раз. При этом навыки были выработаны у 8 животных, что в 1,6 раз превысило показатель контрольной группы.
В аналогичных условиях при использовании широко известного препарата ноопепт в сравнении с контрольной группой латентный период реакции перехода животных и время пребывания их в светлой части отсека увеличились соответственно на 53,3% и 35,7%, а время пребывания в темной части отсека уменьшилось в 2,9 раз. При этом навыки были выработаны только у 7 животных из 10, что в 1,4 раз превысило показатель контрольной группы.
Таким образом, установлено, что заявляемая БАД в случае ее применения с профилактической целью улучшает мнестические функции ЦНС, оказывает позитивное влияние на когнитивные процессы и способствует улучшению памяти и способности к обучению. При этом она эффективнее БАД-прототипа и не уступает препарату ноопепт.
Влияние заявляемой БАД на устойчивость крыс к воздействию гиперкапнической гипоксии.
Оценку адаптогенного и цитопротективного эффектов заявляемой БАД проводили при гипоксических нагрузках в силу универсальности данного состояния при различных экстремальных воздействиях и патологических состояниях. Гипоксию моделировали с помощью эксикатора с водяным замком, что позволяло обеспечить гипоксическую нагрузку при разряжении воздуха, эквивалентном атмосфере на высоте 11,5 км, и при постоянном увеличении количества углекислого газа за счет поступления выдыхаемого животными воздуха. Крыс помещали в камеру попарно (по одной из опытной и контрольной групп) и выдерживали в ней до момента их гибели, регистрируя частоту и скорость развития судорожного синдрома, а также продолжительность жизни животных. Перед экспериментом животным опытной группы на протяжении четырех недель внутрижелудочно вводили заявляемую БАД в дозе 100 мг/кг. Животным контрольной группы вводили 1% крахмальную взвесь в объеме 0,2 мл.
Установлено, что заявляемая БАД способствует значимому повышению устойчивости животных к воздействию неблагоприятных факторов, моделирующих условия закрытых помещений, задымленной среды и подземного транспорта, то есть проявляет цитопротективное действие (таблица 19).
Влияние заявляемой БАД на степень ишемических повреждений головного мозга при стенозе двух сонных артерий.
Исследовали эффективность заявляемой БАД на моделях ишемии головного мозга (ишемического инсульта) по показателям развития оксидативного стресса с регистрацией как его выраженности, так и исходов в виде накопления продуктов пероксидации. Из четырех сосудов, принимающих участие в кровоснабжении головного мозга крысы, одномоментно перевязывали 2 сонные артерии. Операцию выполняли под кетаминовым наркозом. Наблюдение за наркотизированными животными осуществляли в течение 2,5 ч после стенозирования, после чего их декапитировали и извлекали головной мозг для биохимического исследования. Активность каталазы эритроцитов оценивали по скорости распада перекиси водорода, введенной в среду в известном количестве. Антирадикальную емкость плазмы крови и гомогенатов головного мозга оценивали по восстановлению свободного радикала (дифенилпикрилгидразила). При этом более низкие показатели оптической плотности этого окрашенного продукта свидетельствовали о восстановлении радикала и об эффекте антиоксидантного воздействия заявляемой БАД. Диеновые конъюгаты гидроперекисей жирных кислот экстрагировали из крови и гомогенатов головного мозга изопропанолом и гептанолом для раздельного определения в фосфолипидной фракции мембран. Известно, что продукты пероксидации способны поглощать проходящий свет с длиной волны 232 нм, тогда как неокисленные двойные связи - при длине волны в 220 нм. Отношение показателей экстинции свидетельствует о доли продуктов пероксидации в общей липидной фракции. Определяли показатели оптической плотности с использованием спектрофотометра марки СФ-26.
Перед экспериментом животным опытной группы на протяжении четырех недель внутрижелудочно вводили заявляемую БАД в дозе 100 мг/кг, а животным контрольной группы - 1% крахмальную взвесь в объеме 0,2 мл. Выявлены существенные различия между показателями крови животных контрольной и опытной групп (таблица 20). Активность каталазы в крови у животных, получавших заявляемую БАД, остается на низком уровне, что отражает отсутствие субстрата для данного фермента, который образуется в ходе реакций оксидативного стресса. В сравнении с животными контрольной группы в гораздо меньшем количестве выявляли в крови крыс диеновые конъюгаты гидроперекисей жирных кислот.
Наряду с исследованием характеристик содержания продуктов перекисного окисления липидов в крови проводили изучение процессов перекисного окисления непосредственно в очаге повреждения. Результаты спектрофотометрии проб гомогенатов головного мозга (таблица 21) показали, что в случае применения заявляемой БАД снижается содержание диеновых конъюгатов в экстрагируемой изопропанолом фосфолипидной мембранной фракции, чем обеспечивается защитный эффект на уровне клеток и тканей. Заявляемая БАД активирует неферментативное звено антиоксидантной защиты.
Таким образом, введение заявляемой БАД в течение четырех недель позволяет достичь адекватного цитопротективного эффекта, сопряженного с ограничением пероксидации липидов и активацией неферментативного звена антиоксидантной системы.
Влияние заявляемой БАД на длительность плавания мышей.
Плавание является тяжелой физической динамической нагрузкой и позволяет оценить эффективность адаптогенов и активность окислительно-восстановительных процессов в мышцах мышей. В ходе эксперимента плавание осуществлялось при температуре воды 38-39°C и выполнялось с грузом, представляющим собой свинцовую трубку на резиновом кольце, прикрепленную к корню хвоста мыши и составляющую 5% от массы тела. Одновременно в большой ванне плавали по 5 животных из контрольной и двух опытных групп. Животным первой и второй опытных групп ежедневно внутрижелудочно вводили соответственно заявляемую БАД и БАД-прототип в дозе 150 мг/кг каждой. Мыши контрольной группы получали ежедневно внутрижелудочно 1% крахмальную взвесь в объеме 0,2 мл.
Критерием утомления и прекращения плавания считали первое «ныряние» мыши с погружением носовых ходов в воду. Регистрировали продолжительность плавания мышей от момента помещения их в ванну до момента первого «ныряния». Результаты тестирования, проведенного через 14 дней после ежедневного введения заявляемой БАД, позволили установить, что заявляемая БАД увеличивает продолжительность плавания мышей на 33,9%, то есть оказывает протективное действие и снижает утомляемость (таблица 22).
В аналогичных условиях БАД-прототип увеличивает продолжительность плавания мышей только на 14,4%, то есть по эффективности уступает заявляемой БАД в 2,4 раза
Влияние заявляемой БАД на статико-силовую выносливость мышей.
Влияние заявляемой БАД на статико-силовую выносливость изучали путем регистрации времени висения мышей опытной и контрольной групп на вертикальной сетке. Заявляемую БАД, как и в тесте плавания с грузом, вводили мышам опытной группы в дозе 150 мг/кг. Животные контрольной группы получали при этом ежедневно внутрижелудочно 1% крахмальную взвесь в объеме 0,2 мл.
Животных тестировали после 14-дневного введения заявляемой БАД. Критерием истощения статической силы считали время, когда мышь уже не могла удерживать вес своего тела и падала с сетки вниз (собственный вес мышей составлял в среднем 25 г). Результаты эксперимента демонстрируют увеличение статической физической выносливости опытных животных под воздействием заявляемой БАД (таблица 23).
Влияние заявляемой БАД на мышечную силу крыс.
Оценка мышечной силы проводилась на белых крысах с использованием динамометра для крыс. Результаты, представленные в таблице 24, свидетельствуют, что ежедневный прием заявляемой БАД в течение 14 дней способствовал увеличению показателя мышечной силы подопытных животных на 15,3% по сравнению с фоновым показателем в первой опытной группе и на 17,1% по сравнению с контрольной группой, получавшей 1% крахмальную взвесь также в течение 14 дней. Использование в течение 14 дней БАД-прототипа способствовало увеличению показателя мышечной силы крыс на 5,4% по сравнению с фоновым показателем во второй опытной группе и на 5,8% по сравнению с контрольной группой. Таким образом, по показателю влияния на мышечную силу заявляемая БАД превосходит БАД-прототип в 2,8 раз.
Таким образом, проведенные исследования показали, что заявляемая БАД, представляющая собой комбинированный витаминно-минерально-пробиотический комплекс, обеспечивает рациональное сбалансированное поступление биологически активных веществ в организм, проявляет широкий спектр физиологических эффектов и восстанавливает жизненно важные защитные функции организма, повышая его устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов:
- стимулирует рост и активность пробиотических лактобацилл и нормализует за счет этого естественную эндогенную микрофлору кишечника;
- обладает цитопротективным эффектом, сопряженным с ограничением пероксидации липидов и активацией неферментативного звена антиоксидантной системы организма, что выражается в снижении утомляемости и увеличении статической физической выносливости;
- проявляет иммунотропные эффекты и повышает функциональную активность факторов неспецифического иммунитета;
- обладает адаптогенным действием и увеличивает устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов;
- оказывает позитивное влияние на когнитивные процессы, улучшает мнестические функции ЦНС, способствует улучшению памяти и способности к обучению, повышает умственную работоспособность;
- не обладает сенсибилизирующим действием и не провоцирует развитие аллергии;
- не обладает токсическим влиянием на репродуктивную функцию, не оказывает мутагенного эффекта и безопасна в плане развития отдаленных негативных последствий.
Кроме того, заявляемая БАД не содержит токсичные и опасные для здоровья компоненты в количествах, превышающих допустимые уровни, относится к малоопасным веществам, нетоксична, не обладает способностью к кумуляции и хорошо переносится, так как не проявляет нежелательные побочные эффекты в виде кожно-резорбтивного и местно-раздражающего действия.
Заявляемое изобретение удовлетворяет критерию «новизна», так как впервые предложен состав биологически активной добавки к пище, представляющей собой комбинированный витаминно-минерально-пробиотический комплекс, компоненты которого подобраны таким образом, что обеспечивается сбалансированное поступление в организм витаминов и минеральных веществ, а также повышение устойчивости организма к воздействию неблагоприятных факторов за счет стимулирования роста и активности лактобацилл естественной эндогенной микрофлоры кишечника, активации неферментативного звена антиоксидантной системы и уменьшения повреждающего воздействия свободных радикалов, активации факторов общей неспецифической защиты организма и укрепления иммунной системы, проявляющего адаптогенный и цитопротективный эффекты и повышающего физическую и умственную работоспособность.
Заявляемое изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень», так как из доступной информации целесообразность использования в качестве пробиотической составляющей метаболитов Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335 и возможность обеспечения при этом лактогенного эффекта и благоприятного воздействия на рост и активность лактобацилл естественной эндогенной микрофлоры кишечника, адекватно обоснованное сочетание водо- и жирорастворимых антиоксидантных витаминов, а также оптимальное количество селена при введении его в виде селенита натрия не представляются очевидными.
Соответствие заявляемого изобретения критерию «пригодность для применения» подтверждается приведенными примерами, показавшими несложную технологию производства заявляемой биологически активной добавки в капсулированной твердой дозированной форме, ингредиенты которой выпускаются отечественной промышленностью, доступны и недороги, а также результатами многочисленных исследований, подтвердивших стойкость заявляемой БАД при хранении в течение 2,5 лет, безопасность и высокую биологическую активность.
Список литературы
1. Дисбиоз кишечника. Руководство по диагностике и лечению / Под редакцией проф. Е.И. Ткаченко, проф. А.Н. Суворова. - СПб.: СпецЛит, 2007. - 238 с.
2. Абрамова Ж.И., Оксенгендлер Г.Н. Человек и противоокислительные вещества. - Л.: Наука. Ленингр. отд-ие. 1985. - 232 с.
3. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов. - М., 1989. - 368 с.
4. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И., Козлов А.В., Осипов А.А., Рощупкин Д.И. Свободные радикалы в живых системах // Итоги науки и техники. Сер. Биофизика. / ВНИИТИ. - М. 1991. - Т. 29. - 250 с.
5. Жуков А.А., Жирнов Г.Ф. Механизм оксигеназных реакций: основные, промежуточные и побочные продукты оксигеназного цикла // Вестник АМН СССР. 1988. - №1. - С.33-43.
6. Журавлев А.И. Спонтанная биохемилюминесценция животных тканей // Биохемилюминесценция. - М.: Наука. 1983. - С.3-29.
7. Зенков Н.К., Меньшикова Е.Б. Активированные кислородные метаболиты в биологических системах // Успехи соврем. биологии. 1993. - Т.113, №3. - С.286-296.
8. Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов // Успехи соврем. биологии. 1993. - Т.113, №4. - С.442-455.
9. Плужников Н.Н., Софронов Г.А. Фармакологическая коррекция состояния актиоксидантной системы организма // Патофизиология экстремальных состояний: Избранные лекции и доклады. / Под ред. В.Ю. Шанина и В.И. Захарова. - СПб., 1993. - С.108-113.
10. Bryan C.L., Campbell G.D., Lawrence R.A., Jenkinson S.G. Diphosphoryl lipid-A protects rats from lethal hyperoxid // J. Lab. Clin. Med. 1992. - Vol.161, №2. - P.559-566.
11. Cadenas E., Boveris A., Chanse B. Jow-level chemiluminescence of biological systems // Free Radicals in Biology. 1984. - Vol.6, - P.211-242.
12. Оксидативный стресс и воспаление: патогенетическое партнерство: Монография / Под ред. О.Г. Хурцилавы, Н.Н. Плужникова, Я.А. Накатиса. - СПб.: Издательство СЗГМУ им. И.И. Мечникова, 2012. - С.97-111.
13. Fridovich I. Superoxide dismutases - anadaptation to a paramagnetic gas // J. Biol. Chem. 1989. - Vol.264, №14. - P.7761-7764.
14. Воскресенский О.Н., Бобырев В.Н. Биоантиоксиданты - облигатные факторы питания // Вопр. мед. химии. 1992. - №4. - С.21.
15. Метелица Д.Н. Активация кислорода ферментными системами. - М.: Наука, 1982. - 256 с.
16. Маеда X., Акаике Т. Оксид азота и кислородные радикалы при инфекции, воспалении и раке // Биохимия. 1998, Т.63, вып.7. - С.1007-1019.
17. Воскресенский О.Н., Бобырев В.Н. Биоантиоксиданты - облигатные факторы питания // Вопр. мед. химии. 1992. №4. - С.21-26.
18. Соколовский В.В. Тиоловые антиоксиданты в молекулярных механизмах неспецифической реакции организма на экстремальные воздействия // Вопр. мед. химии. 1988. Т.34, №6. - С.2-11.
19. Fliss H., Menard M. Oxidant-induced mobilization of zinc from metallothionein. Note // Arch. Biochem. Biophys. 1992. - Vol.293, №1. - P.195-199.
20. Федорова B.C., Буданцева Е.П., Павлюченко И.В. БАД к пище как предмет изобретения // Патенты и лицензии. 2003. - №6. - С.18-21.
21. Свидетельство о государственной регистрации биологически активной добавки к пище БИОН 3. RU.77.9.11.003.Е.043698.10.11 от 14.10.2011.
22. Авраменко В.А., Василевский В.А. Новые сорбенты на основе модифицированных цеолитов и их применение в экологии, сельском хозяйстве и медицине // Цеолиты Приморья. Тезисы докладов научно-практической конференции. Владивосток, 1994, - С.16-19.
23. Паничев A.M., Гульков А.Н. Природные минералы и причинная медицина будущего. Владивосток: Издательство ДВГТУ, 2001, - 216 с.
24. Пылев Л.Н., Васильева Л.А., Валамина И.Е. Анализ биологической агрессивности цеолитов различных месторождений РФ // Природные минералы на службе человека. Материалы научно-практической конференции. Новосибирск, 1999, - С.68-70.
25. ТУ 9197-033-16925875-03 «Цеолит природный - сырье для производства биологически активных добавок к пище».
26. Единые санитарно-эпидемиологические и гигиенические требования к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю). Глава II. Раздел 1. - M., 2010, - С.6-451.
27. Гланц Э. Медико-биологическая статистика. M., 1999.
28. Методы экспериментальных исследований по установлению порогов действия промышленных ядов на генеративную функцию. Методические рекомендации. - M., 1969, - 25 с.
29. Методы экспериментальных исследований по установлению порогов действия промышленных ядов на генеративную функцию с целью гигиенического нормирования. Методические рекомендации 1744-77. - M., 1978, - 35 с.
30. Оценка мутагенной активности химических веществ микроядерным методом. Методические рекомендации 28/10. - M., 1984, - 21 с.
31. Критерии оценки и методы прогнозирования отдаленных последствий действия на организм вредных веществ в воздухе рабочей зоны. Информационное письмо. НИИ гиг. тр. и проф. забол. - M., 1985, - 15 с.
32. Ермоленко Е.И., Исаков В.А., Ждан-Пушкина С.Х., Тец В.В. Количественная оценка антагонистической активности лактобацилл. // Журн. микробиол. эпидем., иммунобиол. - 2004. - №5. - С.94-98.
33. «Методические рекомендации по доклиническому изучению лекарственных средств с ноотропным типом действия» (в книге «Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств». Под ред. А.Н. Миронова. Часть первая. M.: Гриф и К, 2012, - С.276-297).
34. Буреш Я. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. M.: Высш. шк., 1991. - 399 с.