ВЕКТОРЫ, СОДЕРЖАЩИЕ СПЕЙСЕРНЫЕ/ФИЛЛЕР ПОЛИНУКЛЕОТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ, И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

1. Рекомбинантная векторная плазмида, содержащая гетерологичную полинуклеотидную последовательность и филлер или спейсерную полинуклеотидную последовательность, отличающаяся тем, что указанная гетерологичная полинуклеотидная последовательность имеет длину меньше чем 4,7 Кб, и отличающаяся тем, что указанная филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность имеет длину, которая, когда объединена с указанной гетерологичной полинуклеотидной последовательностью, то суммарная объединенная длина гетерологичной последовательности и филлер или спейсерной полинуклеотидной последовательности составляет между около 3,0-5,5 Кб, между около 4,0-5,0 Кб или между около 4,3-4,8 Кб.
2. Рекомбинантная векторная плазмида, содержащая гетерологичную полинуклеотидную последовательность и филлер или спейсерную полинуклеотидную последовательность, отличающаяся тем, что указанная гетерологичная полинуклеотидная последовательность имеет длину меньше чем 4,7 Кб и располагается внутри двух ITR последовательностей аденоассоциированного вируса (AAV), отличающаяся тем, что указанная филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность расположена за пределами двух ITR последовательностей аденоассоциированного вируса (AAV), и отличающаяся тем, что указанная филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность имеет длину больше чем 4,7 Кб, между около 5,0-10,0 Кб или между около 6,0-8,0 Кб.
3. Рекомбинантная векторная плазмида по п.2, также содержащая вторую филлер или спейсерную полинуклеотидную последовательность, расположенную внутри двух ITR последовательностей аденоассоциированного вируса (AAV), в которой указанная вторая филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность имеет длину вплоть до около 5,0 Кб.
4. Рекомбинантная векторная плазмида по п.1 или 2, в котором векторная плазмида содержит аденоассоциированный вирусный (AAV) вектор.
5. Рекомбинантная векторная плазмида по п.1, в котором векторный геном, содержащий гетерологичную полинуклеотидную последовательность и филлер или спейсерную полинуклеотидную последовательность, пригоден для упаковки или заключения в капсид в вирусную частицу или в аденоассоциированную вирусную (AAV) частицу.
6. Рекомбинантная векторная плазмида по п.2, в котором векторный геном, содержащий гетерологичную полинуклеотидную последовательность, пригоден для упаковки или заключения в капсид в вирусную частицу или в аденоассоциированную вирусную (AAV) частицу, и полноразмерная филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность не упакована или не заключена в капсид в вирусную частицу или в аденоассоциированную вирусную (AAV) частицу.
7. Рекомбинантная векторная плазмида по п.1, в котором одна или более последовательностей инвертированного концевого повтора (ITR) AAV фланкируют 5’ или 3’ концы гетерологичной полинуклеотидной последовательности.
8. Рекомбинантная векторная плазмида по п.1, в котором гетерологичная полинуклеотидная последовательность и/или филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность находятся/ится внутри двух ITR последовательностей AAV.
9. Рекомбинантная векторная плазмида по п.8, также содержащая вторую филлер или спейсерную полинуклеотидную последовательность, расположенную за пределами двух ITR последовательностей аденоассоциированного вируса (AAV), отличающаяся тем, что указанная филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность имеет длину больше чем 4,0 Кб, между около 5,0-10,0 Кб или около 6,0-8,0 Кб.
10. Рекомбинантная векторная плазмида по п.1, в котором указанная филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность не расположена между 5’ и/или 3’ AAV ITR, которая фланкирует соответствующие 5’ и/или 3’ концы гетерологичной полинуклеотидной последовательности; расположена между 5’ и/или 3’ концами AAV ITR, которая фланкирует соответствующие 5’ и/или 3’ концы гетерологичной полинуклеотидной последовательности; расположена непосредственно примыкающей к 5’ и/или 3’ AAV ITR, которая фланкирует соответствующие 5’ и/или 3’ концы гетерологичной полинуклеотидной последовательности; или расположена внутри гетерологичной полинуклеотидной последовательности.
11. Рекомбинантная векторная плазмида по п.1 или 2, в котором указанная филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность является интроном, относящимся или не относящимся к гетерологичной полинуклеотидной последовательности.
12. Рекомбинантная векторная плазмида по п.1 или 2, в котором указанная филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность содержит полинуклеотидную последовательность, которая не является бактериальной полинуклеотидной последовательностью.
13. Рекомбинантная векторная плазмида по п.1 или 2, в котором указанная филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность содержит последовательность, которая не кодирует белок или пептид.
14. Рекомбинантная векторная плазмида по п.1 или 2, в котором указанная филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность содержит последовательность, которая отличается от любого из: гетерологичной полинуклеотидной последовательности, последовательности AAV инвертированного концевого повтора (ITR), элемента, управляющего экспрессией, ориджина репликации, селективного маркера или полиадениновой последовательности.
15. Рекомбинантная векторная плазмида по п.1 или 2, в котором указанная филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность содержит последовательность между 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-750, 750-1000, 1000-1500, 1500-2000, 2000-2500, 2500-3000, 3000-3500, 3500-4000, 4000-4500, 4500-5000, 5500-6000, 6000-7000, 7000-8000 или 8000-9000 нуклеотидов в длину.
16. Рекомбинантная векторная плазмида по п.1 или 2, в котором указанная гетерологичная полинуклеотидная последовательность кодирует терапевтический белок.
17. Рекомбинантная векторная плазмида по п.16, в котором указанный терапевтический белок содержит фактор свертываемости крови.
18. Рекомбинантная векторная плазмида по п.16, в котором указанный терапевтический белок представляет собой CFTR (белок трансмембранный регулятор муковисцидоза), Фактор XIII, Фактор IX, Фактор X, Фактор VIII, Фактор VIIa или белок С, антитело, белок 65 кДа, специфичный для пигментного эпителия сетчатки (RPE65), эритропоэтин, LDL рецептор, липопротеин липазу, орнитин транскарбамилазу, β-глобин, α-глобин, спектрин, α-антитрипсин, аденозиндезаминазу (ADA), транспортер метала (АТФ7А или АТФ7), сульфамидазу, фермент, вовлеченный в лизосомную болезнь накопления (ARSA), гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазу, β-25 глюкоцереброзидазу, сфингомиелиназу, лизосомную гексозаминидазу, дегидрогеназу разветвленных кетокислот, гормон, ростовой фактор (например, инсулин-подобные ростовые факторы 1 и 2, фактор роста тромбоцитов, эпидермальный фактор роста, фактор роста нервов, нейротрофический фактор 3 и 4, нейротрофический фактор головного мозга, глиальный фактор роста, трансформирующий фактор роста α и β и т.д.), цитокин (например, α-интерферон, β-интерферон, интерферон-γ, интерлейкин-2, интерлейкин-4, интерлейкин 12, фактор, стимулирующий колонии макрофагов-гранулоцитов, лимфотоксин и т.д.), продукт суицидального гена (например, тимидинкиназа вируса простого герпеса, цитозиндезаминаза, токсин дифтерии, цитохром P450, дезоксицитидинкиназа, фактор некроза опухоли и т.д.), белок устойчивости к лекарствам (например, который обеспечивает резистентность к лекарству, используемому при терапии рака), белок супрессирующий опухоль (например, P53, Rb, Wt-1, NF1, Von Hippel-Lindau (VHL), аденоматозный полипоз толстой кишки (APC), пептид с иммуномодуляторными свойствами, толерогенный или иммуногенный пептид или белок Tregitopes или hCDR1, инсулин, глюкокиназу, гуанилат циклазу 2D (LCA-GUCY2D), транспортный Rab белок 1(хороидермия), LCA5 (LCA-леберсилин), орнитин кетокислотную аминотрансферазу (гиратная атрофия), ретиношизин 1 (X-связанный ретиношизис), USHIC (Синдром Ушера 1C), ГТФазу X-связанного пигментного ретинита (XLRP), MERTK (AR формы RP: пигментного ретинита), DFNB1 (коннексин 26 глухота), ACHM 2, 3 и 4 (ахроматопсия), PKD-1 или PKD-2 (поликистозное заболевание почек), TPP1, CLN2, лизосомные болезни накопления, вызванные генными дефицитами (например, сульфатазы, N-ацетилглюкозамин-1-фосфаттрансферазы, катепсина А, GM2-AP, NPC1, VPC2, белков активаторов сфинголипидов и т.д.), одну или более цинк-пальцевые нуклеазы для редактирования генома или донорные последовательности, используемые в качестве восстанавливающей матрицы для редактирования генома.
19. Рекомбинантная векторная плазмида по п.1 или 2, в котором указанная гетерологичная полинуклеотидная последовательность представляет собой полинуклеотид, который, когда транскрибирован, транскрибирован в РНК.
20. Рекомбинантная векторная плазмида по п.1 или 2, в котором указанная гетерологичная полинуклеотидная последовательность представляет собой полинуклеотид, который, когда транскрибирован, транскрибирован в ингибиторную нуклеиновую кислоту (например, в ингибиторную РНК).
21. Рекомбинантная векторная плазмида по п.20, в котором указанная ингибиторная нуклеиновая кислота представляет собой одноцепочечную последовательность или образует двух- или трехцепочечную последовательность.
22. Рекомбинантная векторная плазмида по п.20, в котором указанная ингибиторная нуклеиновая кислота представляет собой микро-РНК (мкРНК), миРНК, кРНК, транс-сплайсинговую РНК, антисмысловую РНК или образующую триплекс РНК.
v
FMRI
FMR1
FMR1
23. Рекомбинантная векторная плазмида по п.20, в котором указанная ингибиторная нуклеиновая кислота ингибирует экспрессию: гена хантингтина (HTT), гена, ассоциированного с денаторубропаллидолусиазной атрофией (например, атрофин 1, ATN-1), андрогенного рецептора в X хромосоме при спинобульбарной мышечной атрофии, человеческого атаксина-1, -2, -3 и 7, Ca2.1 P/Q зависимого от напряжения кальциевого канала кодируется (CACNA1A), TATA-связывающего белка, противоположной цепи Атаксина 8, также известного как ATXN8OS, В бета изоформы 55 кДа регуляторной единицы белковой серин/треонин фосфатазы 2А при спинально-церебеллярной атаксии (тип 1, 2, 3, 6, 7, 8, 12, 17),  (умственная отсталость 1 ломкой X хромосомы) при синдроме ломкой X хромосомы,  (умственная отсталость 1 ломкой X хромосомы) при тремер/атаксии ассоциированной с ломкой X хромосомой,  (умственная отсталость 2 ломкой X хромосомы) или членов семьи 2 2AF4/FMR2 при умственной отсталости ломкой XE хромосомы; миотонинпротеинкиназы (MT-PK) при миотонической дистрофии; фратаксина при наследственной атаксии Фридрейха; мутантного гена супероксиддисмутазы 1 (SOD1) при амиотрофическом латеральном склерозе; гена, вовлеченного в патогенез болезни Паркинсона и/или болезни Альцгеймера; аполипопротеина B (APOB) и пропротеина конвертазы субтилизин/кексин типа 9 (PCSK9); гиперхолестеролемии; HIV Tat, транс-активатора транскрипционного гена вируса иммунодефицита человека при ВИЧ инфекции; HIV TAR, HIV TAR, элемента гена транс-активатора ответа вируса иммунного дефицита человека при ВИЧ инфекции; С-С хемокинового рецептора (CCR5) при ВИЧ инфекции; нуклеокапсидного белка вируса саркомы Рауса (RSV)при RSV инфекции, специфической микро РНК печени (miR-122) при вирусной инфекции гепатита С; p53 острое почечное нарушение или отсроченная функция трансплантанта или острая почечная недостаточность поврежденной почки; протеинкиназы N3 (PKN3) при развивающихся рецидивах или метастазирующих солидных раках; LMP2, LMP2, также известного как протеасомная субъединица бета-типа 9 (PSMB 9), метастазирующая меланома; LMP7 также известного как протеасомная субъединица бета-типа 8 (PSMB 8), метастазирующая меланома; MECL1 также известного как протеасомная субъединица бета-типа 10 (PSMB 10), метастазирующая меланома; сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) в солидных опухолях; белка кинезинового веретена при солидных опухолях; супрессора апоптоза B-клеток CLL/лимфомы (BCL-2) при хронической миелоидной лейкемии; рибонуклеотидной редуктазы M2 (RRM2) при солидных опухолях; фурина при солидных опухолях; Polo-подобной киназы 1 (PLK1) при опухолях печени; диацилглицеролацилтрансферазы 1 (DGAT1) при инфекции гепатита С, бета катенина при семейном аденомазном полипозе; бета 2 адренорецептора, глаукома; RTP801/Redd1, также известного как белок транскрипта 4 индуцируемого повреждением DAN при диабетическом отеке желтого пятна (DME) или возрастной макулярной дистрофии; рецептора 1 сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGFR1) при возрастной макулярной дистрофии или хороидальной неоваскуляризации, капсазы 2 при не артериитной ишемической оптической нейропатии; кератина 6А N17K мутантного белка при врожденной панионихии; последовательностей генома/гена вируса гриппа А при инфекции гриппа; коронавирусных последовательностей генома/гена синдрома атипичной пневмонии (SARS) при SARS инфекции; последовательностей генома/гена синцитиального респираторного вируса при синцитиальной респираторной инфекции; последовательностей генома/гена филовируса Эбола при инфекции Эбола; последовательностей генома/гена вируса гепатита В и С при инфекции гепатита В и С; последовательностей генома/гена вируса простого герпеса (HSV) при HSV инфекции; последовательностей генома/гена вируса Коксаки В3 при инфекции вируса Коксаки В3; «молчания» патогенных аллелей гена (аллель специфичное «молчание»), как, например, Торсин А (TOR1A) при первичной дистонии, пан-класс I и HLA-аллель специфичные при трансплантанте; мутантного гена родопсина (RHO) при аутосомно-доминантной наследственной пигментной дистрофии сетчатки (adRP); или в котором указанные ингибиторные нуклеиновые кислоты связываются с транскриптом любого из вышеизложенных генов или последовательностей.
24. Рекомбинантная векторная плазмида по п.1 или 2, также содержащая последовательность управления экспрессией, которая управляет транскрипцией гетерологичной нуклеотидной последовательности.
25. Рекомбинантная векторная плазмида по п.24, в котором последовательность управления экспрессией включает промотор или энхансер, который обеспечивает транскрипцию гетерологичной полинуклеотидной последовательности.
26. Рекомбинантная векторная плазмида по п.24, в котором элемент управления экспрессией включает конститутивный или регулируемый элемент управления.
27. Рекомбинантная векторная плазмида по п.24, в котором элемент управления экспрессией включает тканеспецифичный элемент управления экспрессией или промотор.
28. Рекомбинантная векторная плазмида по п.1 или 2, также содержащая полиадениновую последовательность, расположенную с 3’ конца гетерологичной полинуклеотидной последовательности.
29. Рекомбинантная векторная плазмида по п.1 или 2, также включающая селективный маркер и/или ориджин репликации.
30. Рекомбинантная векторная плазмида по п.29, в котором указанный селективный маркер включает ген, кодирующий белок, который обеспечивает устойчивость к антибиотику.
31. Клетка, содержащая рекомбинантную векторную плазмиду по любому из пп.1-30.
32. Вирусная частица, содержащая векторный геном рекомбинантной векторной плазмиды по любому из пп.1-30.
33. AAV частица, содержащая векторный геном рекомбинантной векторной плазмиды по любому из пп.1-30.
34. Множество вирусных частиц или AAV частиц, содержащих векторный геном рекомбинантной векторной плазмиды по любому из пп.1-30.
35. Вирусные частицы или AAV частицы по любому из пп.32-34, в котором вирусная частица или AAV частицы является(ются) выделенной или очищенной.
36. Фармацевтическая композиция, включающая вирусные частицы или AAV частицы по любому из пп.32-34.
37. Способ доставки или трансфекции гетерологичной полинуклеотидной последовательности в млекопитающее или клетку млекопитающего, включающий введение вирусной частицы по п.32, AAV частицы по п.33, множества вирусных частиц или AAV частиц по п.34 или 35, или фармацевтической композиции по п.36 указанному млекопитающему или в клетку указанного млекопитающего, таким образом доставляя или трансфицируя гетерологичную полинуклеотидную последовательность в млекопитающего или клетку млекопитающего.
38. Способ лечения дефицита у млекопитающего или нуждающегося в экспрессии или функции белка, или нуждающегося в снижении экспрессии или функции эндогенного белка, включающий:
а. предоставление вирусной частицы по п.32, AAV частицы по п.33, множества вирусных частиц или AAV частиц по п.34 или 35, или фармацевтической композиции по п.36; и
b. введение вирусной частицы вирусной частицы по п.32, AAV частицы по п.33, множества вирусных частиц или AAV частиц по п.34 или 35, или фармацевтической композиции по п.36 млекопитающему, в котором указанная гетерологичная полинуклеотидная последовательность кодирует ингибиторную последовательность или белок, который снижает экспрессию или функцию эндогенного белка в млекопитающем.
39. Способ по п.37 или 38, в котором вирусная частица или AAV частица доставляется внутривенно, внутриартериально, внутримышечно, подкожно, орально, путем интубации, через катетер, через кожу, внутричерепно, путем ингаляции, внутриполостно или через слизистую.
40. Способ по п.37 или 38, в котором млекопитающее является человеком.
41. Способ производства рекомбинантных вирусных или AAV частиц, включающий:
а. введение в упаковывающую клетку-хелпер рекомбинантной векторной плазмиды по любому из пп.1-30 для производства продуктивной вирусной или AAV инфекции; и
b. культивирование указанных клеток-хелперов в условиях для производства вирусных или AAV частиц, имеющих векторный геном.
42. Способ получения рекомбинантных вирусных или AAV частиц со сниженным количеством рекомбинантных вирусных или AAV частиц, в которых рекомбинантные векторные геномы содержат контаминирующую нуклеиновую кислоту, включающий:
а. введение в упаковывающую клетку-хелпер рекомбинантной векторной плазмиды по любому из пп.1-30; и
b. культивирование указанных клеток-хелперов в условиях для производства рекомбинантных вирусных или AAV частиц, имеющих векторный геном, в которых произведенные рекомбинантные вирусные или AAV частицы имеют сниженное количество вирусных или AAV частиц с рекомбинантными векторными геномами, которые содержат контаминирующую нуклеиновую кислоту, по сравнению с количеством вирусных или AAV частиц, которые содержат контаминирующую нуклеиновую кислоту, произведенных в условиях, при которых филлер или спейсерная полинуклеотидная последовательность из рекомбинантной векторной плазмиды отсутствует.
43. Способ по п.42, в котором указанная контаминирующая нуклеиновая кислота состоит из нуклеиновой кислоты, происходящей из основы или плазмидной части рекомбинантной векторной плазмиды по любому из пп.1-30.
44. Способ по п.42, в котором указанная контаминирующая нуклеиновая кислота состоит из бактериальных последовательностей или последовательностей, отличных от гетерологичной полинуклеотидной последовательности, или ITR, промотора, энхансера, ориджина репликации, полиадениновой последовательности или селективного маркера.
45. Способ по любому из пп. 41-44, в котором клетка представляет собой клетки млекопитающих.
46. Способ по любому из пп. 41-44, в котором клетка предоставляет хелперные функции, такие как упаковка указанного вектора в вирусную частицу.
47. Способ по любому из пп. 41-44, в котором клетка предоставляет AAV хелперные функции.
48. Способ по любому из пп. 41-44, в котором клетка предоставляет AAV Rep и/или Cap белки.
49. Способ по любому из пп. 41-44, в котором клетка является постоянно или временно трансфицированой полинуклеотидом(ами), кодирующим Rep и/или Cap белковую последовательность(и).
50. Способ по любому из пп. 41-44, в котором клетка предоставляет Rep78 или Rep68 белки.
51. Способ по любому из пп. 41-44, в котором клетка является постоянно или временно трансфицирована полинуклеотидной(ыми) последовательностью(ями), кодирующей(ими) Rep78 или Rep68 белки.
52. Рекомбинантная векторная плазмида по любому из пп.1-30, клетка по п.31, AAV частица по любому из пп.32-36 или способ по любому из пп.37-44, в котором указанная AAV представляет собой AVV1, AVV2, AVV3, AVV4, AVV5, AVV6, AVV7, AVV8, AVV9, AVV10, AVV11, Rh74 и Rh10 серотип или гибрид, или химеру любого из указанных выше серотипов.
53. Рекомбинантная векторная плазмида по любому из пп.1-30, клетка по п.31, AAV частица по любому из пп.32-36 или способ по любому из пп.37-44, в котором указанная AAV частица содержит VP1, VP2 или VP3 капсидный белок AVV1, AVV2, AVV3, AVV4, AVV5, AVV6, AVV7, AVV8, AVV9, AVV10, AVV11, Rh74, Rh10 серотипа или гибрида, или химеры любого из указанных AAV серотипов.
54. Рекомбинантная векторная плазмида по любому из пп.2, 3, 7-10, 14 или 44 или клетка по пп.48-51, в котором указанные последовательности Cap, Rep или ITR происходят из AVV1, AVV2, AVV3, AVV4, AVV5, AVV6, AVV7, AVV8, AVV9, AVV10, AVV11, Rh74, Rh10 серотипов или гибрида, или химеры любого из указанных AAV серотипов.