УЛУЧШЕННЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ГОРМОНА РОСТА
IMPROVED METHOD FOR PRODUCING RECOMBINANT HUMAN GROWTH HORMONE

Область изобретения
Изобретение относится к области получения рекомбинантного человеческого гормона роста (hGH).
Предшествующий уровень техники
Человеческий гормон роста (hGH), также известный как соматропин (INN) или соматотропин, представляет собой белковый гормон, продуцируемый и секретируемый соматотропными клетками передней доли гипофиза. Человеческий гормон роста играет ключевую роль в соматическом росте у детей и в метаболизме у взрослых, вследствие его воздействия на метаболизм белков, углеводов и липидов. Человеческий гормон роста представляет собой единичную полипептидную цепь из 191 аминокислоты, имеющей две дисульфидные связи, одну между Cys-53 и Cys-165, образуя большую петлю в молекуле, и другую между Cys-182 и Cys-189, образуя малую петлю около С-конца.
Технология рекомбинантной ДНК позволила получать hGH в неограниченном количестве во множестве различных систем. Одна из таких систем представляет собой бактерии, например, Е. соli. Хотя такой способ является общепризнанным и широко используемым, как и любой технологический способ во все времена, он все же может быть улучшен.
Когда рекомбинантный hGH экспрессируется в клетках E. соli в виде телец включения, тельца включения, как правило, растворяют в присутствии восстановителей и/или хаотропных агентов, таким образом, полностью ренатурируя hGH и облегчая правильную укладку hGH в его биологически активную форму и уменьшая образование агрегатов.
Краткое изложение сущности изобретения
Задача изобретения заключается в том, чтобы обеспечить значительное уменьшение образования агрегатов во время получения hGH без необходимости применения восстановителей и/или хаотропных агентов.
В связи с этим, задача изобретения заключается в том, чтобы предложить способ получения человеческого гормона роста, включающий:
(1) ферментацию клеток Е. соli, продуцирующих человеческий гормон роста (hGH);
(2) выделение телец включения из клеток Е. соli и растворение выделенных телец включения при щелочном pH с получением растворенного hGH;
(3) возможно, лиофилизацию растворенного hGH;
отличающийся тем, что ферментацию осуществляют в культуральной среде, содержащей марганец, цинк, кобальт, молибден, кальций, медь и бор в качестве микроэлементов.
Задача изобретения дополнительно заключается в том, чтобы предложить способ уменьшения количества полимерных форм человеческого гормона роста, образующихся во время способа получения человеческого гормона роста, включающий:
(1) ферментацию клеток Е. соli, продуцирующих человеческий гормон роста (hGH);
(2) выделение телец включения из клеток Е. соli и растворение выделенных телец включения при щелочном pH с получением растворенного hGH;
(3) возможно, лиофилизацию растворенного hGH;
отличающийся тем, что ферментацию осуществляют в культуральной среде, содержащей марганец, цинк, кобальт, молибден, кальций, медь и бор в качестве микроэлементов.
Подробное описание изобретения
Способ получения человеческого гормона роста в соответствии с задачей изобретения, включающий стадии:
(1) ферментации клеток Е. соli, продуцирующих человеческий гормон роста (hGH);
(2) выделения телец включения из клеток Е. соli' и растворения выделенных телец включения при щелочном pH с получением растворенного hGH;
(3) возможно, лиофилизации растворенного hGH;
отличающийся тем, что ферментацию осуществляют в культуральной среде, содержащей марганец, цинк, кобальт, молибден, кальций, медь и бор в качестве микроэлементов.
Способ уменьшения количества полимерных форм человеческого гормона роста, образующихся во время способа получения человеческого гормона роста, в соответствии с задачей изобретения, включающий стадии:
(1) ферментации клеток E. соli, продуцирующих человеческий гормон роста (hGH);
(2) выделения телец включения из клеток Е. соli и растворения выделенных телец включения при щелочном pH с получением растворенного hGH;
(3) возможно, лиофилизации растворенного hGH;
отличающийся тем, что ферментацию осуществляют в культуральной среде, содержащей марганец, цинк, кобальт, молибден, кальций, медь и бор в качестве микроэлементов.
Следует понимать, что термины «человеческий гормон роста» и «hGH», используемые здесь взаимозаменяемо, охватывают рекомбинантный человеческий гормон роста, имеющий 191 аминокислоту, или Met-hGH, имеющий 192 аминокислоты (т.е. hGH с дополнительным метионином на N-конце).
Следует понимать, что используемый здесь термин «полимерная форма hGH» охватывает любую форму hGH, которая отличается от hGH, имеющего 191 аминокислоту или 192 аминокислоты (hGH с одним дополнительным метионином на N-конце), такую как димеры и олигомеры hGH, но не ограничивается ими.
Следует понимать, что используемый здесь термин «культуральная среда» охватывает среду ферментера и/или продуцирующую среду.
Микроэлементы в культуральную среду могут быть привнесены обычным образом, например, применением имеющихся в продаже солей микроэлементов, включающих кислоты и основания, и их гидраты. Они могут быть введены в культуральную среду в форме твердых солей или в форме водных растворов, содержащих одну или более чем одну из солей. В одном воплощении их добавляют в форме раствора микроэлементов, содержащих каждый из микроэлементов в предопределенной концентрации. Раствор микроэлементов может дополнительно содержать кислоту или основание для регулирования pH и, например, поддерживания микроэлементов в растворе.
4
2
4
2
2
2
4·
2
2
2
4
2
3
3
Марганец в качестве микроэлемента может быть привнесен с использованием, например, моногидрата сульфата марганца (MnSO·HO). Цинк в качестве микроэлемента может быть привнесен с использованием, например, гептагидрата сульфата цинка (ZnSO·7HO). Кобальт в качестве микроэлемента может быть привнесен с использованием, например, гексагидрата хлорида кобальта (СоСl·HO). Молибден в качестве микроэлемента может быть привнесен с использованием, например, дигидрата молибдата натрия (NaMoO2HO). Кальций в качестве микроэлемента может быть привнесен с использованием, например, дигидрата хлорида кальция (СаСl·2НO). Медь в качестве микроэлемента может быть привнесена с использованием, например, пентагидрата сульфата меди (CoSO·5HO). Бор в качестве микроэлемента может быть привнесен с использованием, например, борной кислоты (НBO). Также в качестве микроэлемента может быть привнесено железо.
Микроэлементы представлены в культуральной среде в следующих диапазонах концентраций (на основе общего объема культуральной среды) («диапазон») и в одном воплощении представлены в указанных конкретных концентрациях («воплощение»):
Микроэлемент
Диапазон (мкМ)
Воплощение (мкМ)
Марганец
4,4-5,4
4,9
Цинк
7,2-8,8
8,0
Кобальт
6,3-7,7
7,0
Молибден
6,2-7,6
6,9
Кальций
15,2-18,6
16,9
Медь
5,5-6,7
6,1
Бор
6,0-7,4
6,7
В одном из воплощений микроэлементы используются в растворе микроэлементов, который добавляют в культуральную среду. В этом воплощении раствор микроэлементов предпочтительно представляет собой концентрированный водный раствор, содержащий микроэлементы в концентрации, которая, при использовании в культуральной среде, позволяет достичь вышеупомянутых диапазонов концентраций.
В одном из воплощений раствор микроэлементов добавляют в культуральную среду в количестве от 0,1 до 10 мл/л на основе общего объема культуральной среды, или от 0,2 до 5 мл/л, или от 0,5 до 1 мл/л, или при приблизительно 0,8 мл/л.
Когда раствор микроэлементов добавляют в культуральную среду в количестве приблизительно 0,8 мл/л, он может содержать 1 г/л моногидрата сульфата марганца. Он может также содержать 2,8 г/л гептагидрата сульфата цинка. Он может также содержать 2 г/л гексагидрата хлорида кобальта. Он может также содержать 2 г/л дигидрата молибдата натрия. Он может также содержать 3 г/л дигидрата хлорида кальция. Он может также содержать 1,85 г/л пентагидрата сульфата меди. Он может также содержать 0,5 г/л борной кислоты. В одном воплощении раствор микроэлементов содержит каждую из вышеупомянутых концентраций микроэлементов.
Когда стадию ферментации осуществляют в течение более чем одной стадии, например, при приготовлении затравочной культуры в затравочном ферментере и продвижении этой затравочной культуры в продуцирующий ферментер, тогда микроэлементы в соответствии с задачей изобретения используют в течение по меньшей мере одной стадии, или более чем одной стадии, или в течение всех стадий ферментации.
Следует понимать, что используемый здесь термин «щелочной pH» охватывает pH, находящийся в диапазоне от 10 до 12,5. В одном из аспектов щелочной pH составляет приблизительно 12.
Дополнительно предусмотрено, что стадия (2), т.е. выделение телец включения и растворение выделенных телец включения при щелочном pH, не включает применение восстановителей и хаотропных агентов.
Следует понимать, что используемый здесь термин «восстановитель» охватывает агент, способный восстанавливать белковые Cys-Cys связи. Не ограничивающими примерами восстановителей являются дитиотреитол (DTT), бета-меркаптоэтанол, цистеин и глутатион.
Следует понимать, что используемый здесь термин «хаотропный агент» охватывает агент, который нарушает трехмерную структуру в макромолекулах, таких как белки, и денатурирует их. Не ограничивающими примерами хаотропных агентов являются мочевина, гуанидин, тиомочевина и перхлорат лития.
Стадия (3) способа в соответствии с задачей изобретения представляет собой возможную стадию, которая может быть осуществлена в том случае, когда желательно получить hGH в твердой форме. В одном воплощении стадия (3) содержит подстадию очистки растворенного hGH перед лиофилизацией. Подобным образом, подстадия очистки может быть добавлена к стадии (2) в том случае, когда лиофилизацию не осуществляют.
ПРИМЕРЫ
Изобретение дополнительно описано в следующих примерах, которые, как предполагается, никоим образом не ограничивают заявленный объем изобретения.
ПРИМЕР 1 - Способ получения hGH
Производство hGH состоит из способов, хорошо известных в данной области техники, включающих ферментацию и сбор клеток E. соli, продуцирующих hGH, выделение и растворение телец включения, и очистку и лиофилизацию hGH.
Способ ферментации
Способ ферментации hGH состоит из трех стадий, осуществляемых последовательно в колбе шейкера, затравочном ферментере и продуцирующем ферментере. Параметры ферментации, температура, встряхивание, аэрация, давление, pH и кислород полностью контролируются контрольной системой, которая также контролирует потребление глюкозы и аммиака.
Инокулят
Приблизительно 1 мл E. соli, экспрессирующих hGH (АТСС (Американская коллекция типовых культур) No. 39384), инокулировали в колбу, содержащую 200 мл ростовой среды (20 г/л гидролизата казеина, 10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl и 100 мг/л натриевой соли ампициллина). Колбу инкубировали в течение приблизительно 6 часов в ротационном шейкере при приблизительно 30°C при приблизительно 250 об/мин. В конце этого периода времени культура имела оптическую плотность при 660 нм (OD) приблизительно 4. Рассчитанное количество затравочной культуры инокулировали в затравочный ферментер.
Затравочный ферментер
Среда затравочного ферментера содержала:
Гидролизат казеина
20 г/л
Дрожжевой экстракт
10 г/л
К<sub>2</sub>НРO<sub>4</sub>
2,5 г/л
NaCl
5 г/л
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
1 г/л
Антивспениватель (PPG)
0,4 мл/л
Глюкоза
приблизительно 50 г/л
и возможно:
Раствор микроэлементов
0,83 мл/л
1 л раствора микроэлементов состоит из:
MnSO<sub>4</sub>·Н<sub>2</sub>O
1 г/л
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
2,78 г/л
CoCl<sub>2</sub> 6H<sub>2</sub>O
2 г/л
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub> 2H<sub>2</sub>O
2 г/л
CaCl<sub>2</sub> 2H<sub>2</sub>O
3 г/л
CuSO<sub>4</sub> 5H<sub>2</sub>O
1,85 г/л
Н<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>
0,5 г/л
32%НСl
100 мл
Затравочный ферментер (150 л) инокулировали затравочной культурой и ферментацию осуществляли при приблизительно 30°C, pH 7. Уровни растворенного кислорода поддерживали способами, хорошо известными специалистам в данной области техники, и когда OD культуры составляла больше 12, содержимое затравочного ферментера, приблизительно 120 л, переносили в продуцирующий ферментер объемом 1500 л.
Продуцирующий ферментер
Продуцирующая среда содержала:
Гидролизат казеина
20 г/л
Дрожжевой экстракт
10 г/л
К<sub>2</sub>НРO<sub>4</sub>
2,5 г/л
NaCl
5 г/л
MgSO<sub>4</sub>-7H20
1 г/л
Антивспениватель (PPG)
0,4 мл/л
Глюкоза приблизительно
13 г/л
и возможно:
Раствор микроэлементов
0,83 мл/л
50% раствор глюкозы добавляли во время фазы получения. Температура ферментера составляла приблизительно 30°C, pH поддерживали на уровне приблизительно 7 при помощи аммиака, и уровни растворенного кислорода поддерживали способами, хорошо известными специалистам в данной области техники. При OD 13-16 продукцию hGH индуцировали увеличением температуры ферментации от приблизительно 30°C до приблизительно 42°C, и ферментацию осуществляли в течение следующих приблизительно 2 часов.
Сбор
Бактериальные клетки, содержащие hGH, собирали посредством микрофильтрации через полые волокна. Ферментационный бульон, приблизительно 1200 л, концентрировали и подвергали диализу против очищенной воды (PuW). Суспензию хранили при -10°-30°C.
Выделение и очистка hGH
Собранную клеточную суспензию разрушали и промывали в PuW, получая тельца включения, содержащие hGH. Тельца включения растворяли посредством увеличения pH до 12,0±0,1 добавлением 1 н. NaOH при перемешивании. hGH подвергали рефолдингу посредством уменьшения pH до 10,5±0,1 и добавления 0,5 М бората с pH 9,0 до конечной концентрации бората 10 мМ. При растворении телец включения не применяли ни восстановители, ни хаотропные агенты.
hGH затем очищали способами, известными в данной области техники, включающими серии стадий ультрафильтрации и хроматографии. Аминопептидазу, фермент, удаляющий N-концевой метионин, использовали в процессе удаления N-концевого метионина из Met-hGH. В конце очищенный hGH лиофилизировали.
ПРИМЕР 2 - Сравнительный анализ hGH. полученных с и без микроэлементов
Одиннадцать (11) препаратов hGH получали в соответствии с примером 1, за исключением того, что микроэлементы (ТЕ) не добавляли ни в затравочную среду ферментера, ни в продуцирующую среду.
Двадцать три (23) препарата hGH получали в соответствии с примером 1, где ТЕ добавляли в затравочную среду ферментера и в продуцирующую среду.
м
Таблица 1 демонстрирует, что лиофилизированные препараты, полученные в результате ферментации, содержащей микроэлементы, содержат гораздо меньшее количество полимерных форм hGH. Количество полимерных форм hGH представлено в виде относительного процента от общей площади пика, соответствующей всем пикам в аналитической гельфильтрации (SEC), используемой в анализе. Процедуру SEC осуществляли в соответствии с Somatropin monograph в 6 издании Европейской фармакопеи 2010 года.
Таблица 1
Препарат
Раствор микроэлемента
Полимерные формы
'
-
1,4
II
-
1,9
III
-
1,3
IV
-
1,7
V
-
2,0
VI
-
1,8
VII
-
1,9
VIII
-
3,0
IX
-
1,6
X
-
1,3
XI
-
1,3
XII
+
0,7
XIII
+
0,6
XIV
+
0,8
XV
+
0,7
XVI
+
0,6
XVII
+
0,9
XVIII
+
0,8
XIX
+
0,5
XX
+
1,0
XXI
+
0,7
XXII
+
0,9
XXIII
+
0,8
XXIV
+
0,7
XXV
+
0,8
XXVI
+
0,9
XXVII
+
0,8
XXVIII
+
0,9
XXIX
+
0,9
XXX
+
0,7
XXXI
+
0,7
XXXII
+
0,8
XXXIII
+
0,8
XXXIV
+
0,8