Флуоресцентные сенсоры, используемые для изучения роли вторичных посредников в клеточной сигнализации

М. М. Злотина, В. В. Емельянов, Т. В. Чиркова

ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ СЕНСОРЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ РОЛИ ВТОРИЧНЫХ ПОСРЕДНИКОВ В КЛЕТОЧНОЙ СИГНАЛИЗАЦИИ

Введение

В процессе своей жизнедеятельности любой растительный организм воспринимает широкий спектр сигналов различной природы. Рецепция клетками внешних сигналов индуцирует на внутриклеточном уровне запуск последовательности событий, приводящих к формированию специфических клеточных ответов. Механизмы преобразования в клетке воспринимаемого сигнала получили название трансдукции сигнала, или «клеточной сигнализации». На многих этапах сигнализации происходит каскадное усиление первичного стимула при участии различных сигнальных систем. Клеточный ответ может выражаться во временном изменении функционального состояния клетки или затрагивать геном клетки, включая изменение экспрессии определенных генов, что, в свою очередь, влияет на направленность морфогенетических и физиолого-биохимических процессов в живом организме.

Механизмы перцепции и последующей трансдукции различных сигналов также определяют развитие адаптационных процессов, направленных на преодоление растением различных неблагоприятных факторов внешней среды, таких как водный дефицит, засоление, несбалансированность питательных элементов, токсичность тяжелых металлов, действие экстремальных температур, ультрафиолетовое излучение, кислородная недостаточность, поражение болезнями и вредителями и т. п. Передача стрессового сигнала через систему внутриклеточных переносчиков может сопровождаться активацией стресс-индуцируемых генов и синтезом стрессовых белков, что способствует повышению устойчивости растений к неблагоприятным факторам внешней среды. В связи с этим расшифровка подобных механизмов представляет интерес не только для фундаментальной науки, но также имеет ярко выраженный прикладной аспект.

В настоящее время широко исследуются пути сигнальной трансдукции при воздействии на растение стрессовых факторов, однако целый ряд вопросов, касающихся этой темы, остается полностью открытым. Основным подходом к изучению сигнальных систем живой клетки является применение специфических флуоресцентных зондов, позволяющих с высокой точностью определять изменения концентраций различных вторичных посредников, участвующих в сигнальной трансдукции, при использовании современных методов флуоресцентной и конфокальной микроскопии. Флуоресцентные сенсоры можно разделить на две основные группы. Использование широко распространенных низкомолекулярных флуоресцентных зондов (первая группа) часто связано с рядом ограничений, к которым относятся токсичность данных зондов для клетки, необходимость загрузки клетки (например, инъекции) извне, трудность в идентификации внутриклеточной компартментации, быстрое выгорание зонда, делающее невозможным длительный мониторинг и т. п. Кроме того, при работе с растительными клетками, содержащими клеточную стенку, возникают дополнительные трудности, связанные

© М. М. Злотина, В. В. Емельянов, Т. В. Чиркова, 2011

с проникновением зонда в клетку. Принципиально новым способом изучения внутриклеточных процессов является применение второй группы флуоресцентных зондов — генетически кодируемых флуоресцентных сенсоров (ГКС) белковой природы, которые ничем не уступают низкомолекулярным флуоресцентным красителям, а во многом и превосходят последние, так как в значительной степени лишены вышеперечисленных отрицательных черт. Использование таких сенсоров в растительных клетках может помочь в изучении путей восприятия и трансдукции сигналов различной природы.

Мы рассмотрим обе группы флуоресцентных сенсоров, чувствительных к важнейшим вторичным посредникам сигнальной трансдукции. В настоящее время механизмы перцепции и трансдукции сигналов различной природы наиболее подробно изучены у животных. Потенциально с использованием генетически кодируемых сенсоров в растительных клетках может быть решен целый ряд важных вопросов, касающихся клеточной сигнализации растений.

Вторичные посредники

Помимо белковых компонентов в трансдукцию сигналов различной природы вовлечены небольшие молекулы, выполняющие роль вторичных сигналов. Такие сигнальные молекулы получили название вторичных посредников, или вторичных мессенджеров. Вторичные посредники отличаются небольшой молекулярной массой, что облегчает их движение в клетке, и способностью к быстрому удалению из цитоплазмы клетки или расщеплению активных форм. Гидрофильные вторичные мессенджеры (Са2+, цАМФ, цГМФ) диффундируют в цитоплазме, гидрофобные переносчики (фосфоинозитиды, диацилглицерол) — в мембранах. Изменения концентраций вторичных посредников являются непременным условием трансдукции сигналов в любой живой клетке.

К важнейшим вторичным посредникам растительной клетки, участвующим в трансдукции различных стрессовых сигналов, относятся ионы кальция Са2+. В результате стрессового воздействия концентрация ионов кальция в цитоплазме может резко возрастать. Например, установлено, что, как в клетках животных и дрожжей, так и в цитоплазме накопление Са2+ является одним из главных механизмов, запускающих при дефиците кислорода экспрессию генов аноксических стрессовых белков (алкогольдеги-дрогеназы, сахарозосинтазы) у растений [1, 2].

Оксид азота N0 также относится к сигнальным молекулам растительного организма. N0 — нейтральная газообразная молекула (свободный радикал), способная легко проникать через клеточные мембраны. Установлено, что содержание оксида азота значительно возрастает при действии на растительный организм ряда стрессовых факторов [3, 4]. Выполняя функцию сигнальной молекулы [5, 6], N0 инициирует защитные механизмы растения в неблагоприятных условиях [7, 8]. Показано, что многофункциональная сигнальная молекула N0 также взаимодействует с другими сигнальными системами и отдельными вторичными посредниками, такими как ионы кальция (Са2+), АФК, цГМФ [8-9].

Недавно получены данные о том, что активные формы кислорода (в частности, пероксид водорода Н202) в субтоксических концентрациях также участвуют в клеточной сигнализации растений, находящихся в стрессовых условиях. Например, снижение уровня кислорода в растительной клетке приводило к активации G-белков [11] и генерации Н202 [12], при этом наблюдалось увеличение уровня транскриптов и активности

стрессового аноксического белка алкогольдегидрогеназы, что указывает на непосредственное участие пероксида водорода в трансдукции анаэробного сигнала.

Кроме того, снижение pH в цитоплазме является первичной важнейшей неспецифической реакцией растительного организма на действие различных стрессовых факторов. Так как активность клеточных ферментов напрямую связана со значениями pH, регуляция pH в клетке имеет важнейшее значение в стрессовых условиях.

Низкомолекулярные химически синтезируемые флуоресцентные красители

Начало использования низкомолекулярных химически синтезируемых флуоресцентных зондов послужило большим толчком для развития молекулярной и клеточной биологии. Вот уже на протяжении нескольких десятилетий применение специфичных флуоресцентных красителей является одним из основных подходов при изучении трансдукции внутриклеточных сигналов у различных организмов. Облучение флуоресцентных красителей возбуждающим светом определенной длины волны сопровождается эмиссией флуоресценции в более длинноволновой области спектра. Детекция изменения их флуоресценции с помощью флуориметров или современных методов флуоресцентной микроскопии отражает изменение уровня вторичных посредников в клетке.

Са2+-чувствительные низкомолекулярные флуоресцентные красители. Известно, что ионы кальция Са2+ играют важнейшую роль в сигнальной трансдукции живой клетки [13, 14]. Универсальность кальция в качестве внутриклеточного посредника определяется огромным разнообразием механизмов кальциевой сигнализации, различающихся по скорости, амплитуде и пространственно-временным соотношениям. Наиболее распространенным подходом в изучении содержания внутриклеточного кальция является использование широкого спектра кальций-чувствительных флуоресцентных красителей [15, 16]. Сегодня с их помощью можно определять уровень внутриклеточного кальция в широком диапазоне концентраций. Выделяют две группы кальций-чувствительных низкомолекулярных флуоресцентных индикаторов: «одноволновые» красители, характеризующиеся одним пиком возбуждения и эмиссии, и «ратиометрические» красители, характеризующиеся аналит-зависимым «перетеканием» максимумов спектра возбуждения или эмиссии флуоресценции. Обе группы красителей имеют свои преимущества и недостатки.

«Одноволновые» Са2+-чувствительные индикаторы. «Одноволновые» индикаторы характеризуются значительными изменениями интенсивности флуоресценции в присутствии кальция, при этом сдвига в спектрах возбуждения или эмиссии флуоресценции не происходит. Степень изменения интенсивности флуоресцентного сигнала после взаимодействия с кальцием соответствует контрасту индикатора. При работе с «одноволновыми» индикаторами легче избежать или минимизировать перекрывание их спектров со спектрами других флюорофоров [17]. «Одноволновые» флуоресцентные красители, как правило, более яркие по сравнению с «ратиометрическими», поэтому интенсивность излучения, необходимого для возбуждения «одноволновых» флуоресцентных красителей, меньше, что снижает уровень фотоповреждения клетки и «выгорания» (рЬо1оЫеасЫ^) зонда. Кроме того, повышенная яркость позволяет снизить концентрацию используемого красителя и тем самым уровень токсичности для клетки. Однако «одноволновые» красители по сравнению с «ратиометрическими» позволяют менее точно оценивать уровень изучаемого вещества из-за высокого уровня неспецифической фоновой флуоресценции,

что является существенным недостатком данной группы индикаторов. Особенно остро проблема неспецифической фоновой флуоресценции проявляется при изучении растительных клеток, в которых содержится много эндогенных флуорофоров.

К наиболее широко используемым Са2+-чувствительным «одноволновым» индикаторам относится Fluo-3, возбуждаемый в видимой области спектра (рис. 1). а б

О

(“OCCH2)2N

о

N(CH2CO“)2

Индикатор Kd(Ca2+), мкМ R2' R7’ R5 R6

Fluo-3 0,39 Cl Cl CH3 H

Fluo-4 0,35 F F CH, H

Fluo-5F 2,3 F F F H

Fluo-5N 90 F F Z О H

Fluo-4FF 9,7 F F F F

500

550

600 650

Длина волны, нм

Рис. 1. Формулы семейства Са2+-чувствительных флуоресцентных индикаторов Б1ио (а) и Са2+-зависимая флуоресценция индикатора Б1ио-3 (б) [18]

Максимум спектра возбуждения Fluo-3 регистрируется при 506 нм, максимум спектра эмиссии флуоресценции — при 526 нм. Связывание с кальцием вызывает более чем 100-кратное возрастание интенсивности флуоресценции [19]. Calcium green-1 также относится к «одноволновым» индикаторам (А.возб = 490 нм, X = 530 нм). При связывании кальция наблюдается 100-кратное возрастание интенсивности флуоресценции при незначительном уровне автофлуоресценции. Яркость сакшт green-1 в 5 раз превышает яркость Fluo-3 при насыщении Ca2+, что позволяет снизить концентрацию используемого красителя и тем самым уровень токсичности [20].

«Ратиометрические» Са2+-чувствительные флуоресцентные красители. Ратио-метрические индикаторы характеризуются аналит-зависимым сдвигом в спектрах возбуждения или эмиссии флуоресценции. Красители, являющиеся ратиометрическими по спектру возбуждения, возбуждаются на двух различных длинах волн, при этом соотношение интенсивностей флуоресценции, возникающей при возбуждении на двух длинах волн, определяет уровень внутриклеточного кальция (Fura-2). Во втором случае, флуоресцентные зонды возбуждаются светом одной длины волны, при этом спектр возбуждения флуоресценции характеризуется одним максимумом, а спектр эмиссии флуоресценции двумя (Indo-1).

Ратиометрические флуоресцентные зонды обладают рядом положительных черт. Прежде всего, данные красители позволяют с большой специфичностью и точностью определять уровень внутриклеточного кальция (определение соотношения флуоресценции, возбуждаемой на двух длинах волн, позволяет отбросить фоновый (неспецифический) уровень флуоресценции). Кроме того, измерения, проводимые с помощью данных специфических маркеров, не зависят от концентрации загруженного зонда, толщины

клетки и интенсивности возбуждающего облучения. Подобные зонды менее склонны к обесцвечиванию на свету, чем «одноволновые» краски.

К традиционно используемым «ратиометрическим» зондам, чувствительным к ионам кальция, относятся Fura-2 и Indo-1. Широкое применение Fura-2 для определения уровня внутриклеточного Ca2+ связано с его чувствительностью и специфичностью к ионам кальция, кроме того, флуоресцентный зонд загружается в живую клетку, не вызывая при этом значительных повреждений мембран. Данный краситель относительно устойчив к выгоранию. При связывании с Ca2+ спектр возбуждения Fura-2 характеризуется сдвигом, причем измерение соотношения интенсивности флуоресценции, возбуждаемой на двух длинах волн (при 340/380 нм), дает возможность с большой точностью оценить уровень кальция независимо от концентрации красителя в клетке (рис. 2).

Индикатор К/Са2'), мкМ Я4 Я5 Я6

Рига-2 0,14 Н СН3 н

Рига-5Р 0,40 Н Р н

Рига-4Р 0,77 Р Н н

Рига-бР 5,30 Н Н р

Рша-РР 5,50 Н Р р

250

300

350 400 450

Длина волны, нм

Рис. 2. Формулы семейства Ca2+-чувствительных флуоресцентных индикаторов Бита (а) и Са2+-зависимый спектр возбуждения Бшга-2 (б) [21]

Чаще всего Бшга-2 используется в форме ацетоксиметилового эфира из-за способности данного соединения проходить через клеточные мембраны. После попадания в клетку эфирная связь гидролизуется неспецифичными эстеразами цитоплазмы, и индикатор оказывается в свободной форме. Однако применение ацетоксиметилового эфира сопряжено с возникновением ряда трудностей, связанных с внутриклеточной компарт-ментализацией и неполной деэтерификацией. Indo-1 также относится к традиционно используемым «ратиометрическим» Са2+-чувствительным индикаторам и отличается от Бшга-2 наличием сдвига в эмиссионном спектре (405/485 нм). Основным недостатком данного индикатора является фотонестабильность, причем выгорание красителя может происходить достаточно быстро [22].

Таким образом, использование низкомолекулярных флуоресцентных Са2+-чув-ствительных красителей является перспективным направлением в изучении роли кальция в специфических внутриклеточных процессах.

Флуоресцентные красители, чувствительные к активным формам кислорода.

Для изучения роли активных форм кислорода (АФК) в клеточной сигнализации необходимы методы, позволяющие визуализировать локализацию, точно определять количественное содержание и динамику образования активных форм кислорода в живой клетке. Использование флуоресцентных индикаторов, чувствительных к активным формам кислорода, представляется весьма перспективным при изучении биологической роли данных соединений, так как мечение флуоресцентными маркерами дает возможность непосредственно наблюдать за поведением АФК в клетке в реальном времени.

2,7-дихлордигидрофлуоресцеин является широко распространенным флуоресцентным зондом, который традиционно используется для определения АФК (рис. 3). В присутствии АФК 2',7'-дихлордигидрофлуоресцеин окисляется с образованием 2',7'-ди-хлорфлуоресцеина и флуоресцирует. К производным 2',7'-дихлордигидрофлуоресцеина, также используемым при мониторинге активных форм кислорода в клетке, относятся диацетат 2',7'-дихлордигидрофлуоресцеина, дигидрородамин-123, дигидроэтидиум, 10-ацетил-3,7,-дигидроксифеноксазин (коммерческое название AmplexRed) [23, 24, 25].

2',7'-дихлордигидрофлуоресцеин 2',7'-дихлордигидрофлуоресцеин диацетат

дигидрородамин 123 АтркхЯес! дигидроэтидиум

Рис. 3. Наиболее распространенные флуоресцентные индикаторы, используемые для определения АФК

Однако применение данных соединений связано с рядом ограничений. Во-первых, красители являются фоточувствительными, что приводит к автоокислению и, как следствие, возникновению высокого уровня фоновой флуоресценции и завышению результатов [26]. Кроме того, производные дихлордигидрофлуоресцеина обладают низкой селективностью и могут взаимодействовать с различными активными формами [27]. И как большинство химически синтезируемых красителей, они не могут быть избирательно направлены в изучаемые компартменты клетки, являющиеся источниками АФК (плазматическая мембрана, митохондрии и т. п.), что особенно важно для изучения сигнальной функции этих соединений. Данные флуоресцентные зонды подходят лишь для изучения общего уровня окислительного статуса живой клетки.

В последнее время получены новые селективные флуоресцентные зонды, чувствительные к Н202. К таким индикаторам относятся пентафторбензенсульфонил-

флуоресцеины [28], которые являются улучшенной версией резоруфинов — ранее описанных АФК-чувствительных флуоресцентных красителей [29]. Сульфонаты характеризуются более высокой устойчивостью к гидролизу по сравнению с эфирами, а наличие пентафторбензенового кольца обусловливает повышение реакционной способности сульфонатов по отношению к Н202. Полученные зонды высокоселективны к молекулам пероксида водорода и не чувствительны к гидроксильному радикалу, пероксинитриту и супероксидному анион-радикалу, однако флуоресцируют в ответ на присутствие в среде N0.

Недавно был синтезирован чувствительный к Н202 флуоресцентный краситель, названный Peroxyfluor-1 [30]. Индикатор обладает высокой селективностью, значительно отличающейся от ранее созданных флуоресцентных индикаторов. Группой ученых разработано и описано целое семейство боронатных красителей, среди них красный Peroxyresorufin-1 (PR1), зеленый PF1 и голубой Peroxyxanthone-1 (PX1) флуоресцентные зонды [31]. Их спектры возбуждения и эмиссии охватывают область ультрафиолета и видимую часть спектра. Данные красители мембранопроницаемы и могут использоваться для определения микромолярных изменений концентрации Н202 в живых клетках с помощью современных методов конфокальной и флуоресцентной микроскопии.

Высокая селективность является необходимым требованием к вновь создаваемым АФК-чувствительным флуоресцентным зондам, так как каждая активная форма обладает своей собственной физиологической активностью.

NО-чувствительные флуоресцентные зонды. Для понимания роли N0 в клеточной сигнализации необходимо использовать методы, дающие возможность визуализировать сайты и динамику продукции N0 т у1уо и т эНи. Для детектирования N0 был разработан ряд методов, к которым относятся: хемилюминесцентные методы; флуори-метрические методы с использованием флуоресцентных N0-индикаторов; спектрофотометрические методы; электрохимические методы с использованием N0-чувствительных микроэлектродов.

Применение N0-чувствительных флуоресцентных зондов с использованием современных методов конфокальной микроскопии позволяет визуализировать изменения уровня внутриклеточного N0 под действием стимулов различной природы в реальном времени. Желательными характеристиками N0-чувствительных флуоресцентных индикаторов являются: 1) высокая специфичность к N0; 2) стабильность, в частности фотостабильность; 3) различие флуоресцентных свойств индикатора в присутствии и отсутствии N0; 4) возбуждение флуоресценции в видимой области спектра (для минимизирования возбуждения автофлуоресценции и повреждения живых систем); 5) высокая проницаемость через мембрану для проникновения в клетку [32].

В присутствии кислорода N0 быстро превращается в N0^. С целью повышения чувствительности определения N0^ был разработан быстрый и чувствительный флуориметрический метод для количественного определения N0^/ N0^ , основанный на реакции N0^ с 2,3-диаминонафталином (ДАН) с образованием флуоресцентного продукта 1Н-нафтотриазола [33] (рис. 4). Однако реакция проходит в кислых

2,3-диаминонафталин 1Н-нафтотриазол

Рис. 4. Реакция взаимодействия Ы02- с 2,3-диамино-нафталином с образованием 1Н-нафтотриазола

условиях, а возбуждение флуоресценции происходит в коротковолновой области спектра (375 нм), что может приводить к серьезным повреждениям живой клетки.

2,7-дихлорфлуоресцин использовался для определения внутриклеточного NO в нейронах [34]. При окислении оксидом азота дихлор-флуоресцин переходит из нефлуоресцентного состояния в флуоресцентное (дихлор-флуоресцеин) (рис. 5).

Однако применение данного индикатора характеризуется очень низкой специфичностью к NO, так как восстановленная форма красителя может также окисляться до дихлорфлуоресцеина различными АФК.

Недавно для изучения физиологической роли оксида азота в живых клетках были получены флуоресцентные NO-чувствительные индикаторы диаминофлуоресцеины (DAFs) [35]. Флуоресцеин широко используется в биологии в качестве флуорофора в виду оптимальной с биологической точки зрения области возбуждения и эмиссии флуоресценции, высокого выхода флуоресценции и коэффициента экстинкции. К преимуществам диаминофлуоресцеинов относится высокая чувствительность к NO. Возбуждение флуоресценции данных индикаторов происходит в видимой области спектра, что минимизирует повреждающее действие излучения на живые системы и снижает автофлуоресценцию биологических объектов. При взаимодействии с NO диами-нофлуоресцеины переходят в соответствующие флуоресцирующие соединения — триазолы (DAF-Ts) (рис. 6).

Однако при работе с биологическими объектами применение данных красителей имеет свои недостатки, к которым, прежде всего, относится сильная зависимость интенсивности флуоресценции хромофора от значений pH. Так, интенсивность флуоресценции DAF-2Т значительно снижается при значениях pH ниже 7. Такая высокая pH-зависимость данных красителей затрудняет определение небольших изменений уровня внутриклеточного NO под действием стимулов, если при этом происходят изменения pH.

Для создания фотостабильных индикаторов, возбуждаемых в более длинноволновой области спектра и работающих в широком диапазоне pH, были получены мембранопроницаемые флуоресцентные NO-индикаторы диаминор од амины (DARs), у которых в качестве хромофора выступает родамин. Данные красители синтезированы из производных соединений фталевого ангидрида и N N -диэтил-3-аминофенола [36]. Как и в случае диаминофлуоресцеинов, взаимодействие NO с диаминородамина-ми сопровождается образованием флуоресцентных форм триазола. Для прохождения

Рис. 6. Реакция взаимодействия NO c DAF-2 с образованием DAF-2T

Рис. 5. Реакция взаимодействия NO c дихлорфлуоресцином с образованием дихлорфлуоресцеина

через клеточные мембраны были получены этиловые эфиры красителей. Кроме того, для ускорения процесса гидролиза эфиров красителей внутриклеточными эстеразами синтезированы ацетоксиметиловые эфиры диаминофлуоресцеинов (DAR-AM). Для повышения pH-стабильности интенсивности флуоресценции получены метилированные формы индикаторов (DAR-M). Недавно синтезированный краситель, содержащий те-траметилродамин в качестве флуорофора (DAR-4M AM), отличается высокой чувствительностью к NO (предел обнаружения оксида азота 7 нМ). При этом использование данного индикатора характеризуется низким уровнем фоновой флуоресценции и возможностью детектировать NO при значениях pH выше 4 [36].

В настоящее время диаминофлуоресцеины и диаминородамины относятся к наиболее широко используемым флуоресцентным NO-чувствительным индикаторам.

Генетически кодируемые сенсоры на основе флуоресцентных белков

Создание ГКС на основе флуоресцентных белков (ФБ) является одним из наиболее интенсивно развивающихся направлений современных исследований. Данные сенсорные системы, способные изменять спектральные свойства в ответ на внутриклеточные сигналы, позволяют проследить изменения концентраций исследуемых молекул, а также визуализировать активность клеточных ферментов [37, 38]. За последнее время создан ряд эффективных генетически кодируемых флуоресцентных сенсоров, отличающихся различной специфичностью.

Традиционные методы с использованием низкомолекулярных флуоресцентных красителей часто связаны с рядом ограничений (токсичность этих зондов для клетки, трудности с идентификацией внутриклеточной компартментализации, быстрое выгорание зонда, что делает невозможным длительный мониторинг и т. д.). Большое преимущество ГКС на основе ФБ по сравнению с химически синтезируемыми флуоресцентными метками обусловлено тем, что они не требуют внешней инъекции и со временем «не выходят» из клетки, так как эндогенно экспрессируются самой клеткой. Использование сигналов внутриклеточной локализации позволяет направить ГКС в исследуемые органеллы живой клетки. Кроме того, могут быть получены трансгенные организмы, экспрессирующие такие флуоресцентные сенсорные системы в определенных тканях, с возможностью контролировать экспрессию во времени [37]. Используя специфичные детекторные белковые домены, можно создать ГКС любой ферментативной активности и индикаторы, чувствительные практически к любой сигнальной молекуле.

GFP-подобные белки и их спектральные свойства. Зеленый флуоресцентный белок (green fluorescence protein, GFP) был впервые обнаружен у медузы Aequorea victoria. Ген GFP был клонирован в 1992 г., после чего началось широкое использование флуоресцентных белков в клеточной биологии [39]. Позже были клонированы гены GFP-подобных белков, флуоресцирующих в различных областях спектра (зеленой, желтой, оранжевой, красной), и других хромопротеинов. Белки последней группы эффективно поглощают свет, но не флуоресцируют. Спектр GFP-подобных белков постоянно расширяется. Помимо белков дикого типа, за последнее время были также созданы различные мутантные формы флуоресцентных белков, отличающиеся от белков дикого типа рядом фотохимических свойств (положением спектров поглощения, возбуждения и эмиссии флуоресценции) и характеризующиеся различной стабильностью.

В настоящее время флуоресцентные белки широко используются в качестве марке-

ров в молекулярной и клеточной биологии для мечения отдельных молекул, органелл, клеток, тканей и целых организмов. Например, использование флуоресцентных белков дает возможность изучать поведение внутриклеточного белка: экспрессию его гена, локализацию, подвижность, взаимодействие с молекулами других белков и скорость распада.

Описано множество GFP-подобных белков главным образом у организмов из классов Anthozoa и Hydrozoa типа Cnidaria, значительно различающихся по своим спектральным свойствам. Среди флуоресцентных белков из класса Anthozoa в соответствии с областью флуоресценции выделяют группу зеленых (485-520 нм), желтых (540 нм) и оранжево-красных (более 570 нм) белков. Кроме того, в данном классе найдены нефлуоресцентные хромопротеины и белки с флуоресценцией в двух областях спектра [40].

С помощью методов как случайного, так и сайт-направленного мутагенеза показано, что в формировании спектральных свойств GFP-подобных белков особую роль играют аминокислотные остатки, находящиеся в микроокружении хромофора. В частности, такие работы проводились с красным флуоресцентным белком DsRed1 из коралла Discosoma sp.[41, 42].

Большинство GFP-подобных белков из морских организмов класса Hydrozoa составляют зеленые флуоресцентные белки с максимумами спектров поглощения в области 465-498 нм (исключение составляет Aequorea-GFP, у которого максимум спектра поглощения лежит в ультрафиолетовой области) и максимумами эмиссионных спектров в диапазоне 490-520 нм. К недавно выделенным GFP-подобным белкам из класса Hydrozoa относится хромопротеин anm2CP из Anthomedusae sp., из которого с помощью направленного мутагенеза был получен красный флуоресцентный белок JRed, созданный для мечения белков (Евроген, Россия). Из медузы Phialidium sp. выделен желтый флуоресцентный белок PhiYFP [43].

Помимо классов Anthozoa и Hydrozoa типа Cnidaria, GFP-подобные белки, флуоресцирующие в зеленой области спектра, недавно были выделены из организмов класса Copepoda типа Arthropoda [43]. Данные белки отличаются отсутствием в своем составе остатков триптофана.

Химерные сенсоры на основе FRET между двумя спектральными вариантами флуоресцентных белков. По принципу действия и строения выделяют несколько групп ГКС [37]. Среди них активно используются химерные сенсоры на основе FRET (Forster resonance energy transfer — индуктивно-резонансный перенос энергии) между флуоро-форами двух флуоресцентных белков (донорного и акцепторного). При использовании FRET-индикаторов регистрируется интенсивность флуоресценции донорно-акцептор-ной пары флуоресцентных белков при возбуждении донора светом оптимальной длины волны [37, 38]. Эффективность переноса энергии определяется взаимной ориентацией и расстоянием между флуорофорами, также необходимо, чтобы спектр эмиссии донора перекрывался со спектром возбуждения акцептора. Расстояние между донором и акцептором, при котором эффективность переноса энергии составляет 50%, называют Фёр-стеровским радиусом.

За последнее время создан широкий спектр улучшенных мутантных форм флуоресцентных белков с различными спектральными свойствами (EBFP, ECFP и EYFP). Первыми эффективными донорно-акцепторными парами для FRET, получившими широкое распространение, стали EBFP-EGFP и ECFP-EYFP (донор-акцептор).

«Классическим» вариантом FRET-индикаторов является сенсор, у которого до-норно-акцепторная пара флуоресцентных белков ковалентно связана детекторным

Рис. 7. Схема работы генетически кодируемого FRET-сенсора Донорно-акцепторная пара ФБ ковалентно соединена посредством детекторных доменов. Аналит-зависимое белок-белковое взаимодействие приводит к сближению донорного и акцепторного белков и эмиссии акцепторного флуорофора за счет увеличения FRET [44].

доменом, изменяющим свою структуру при взаимодействии с аналитом или модификации внутриклеточным ферментом (рис. 7).

Также существуют сплит-варианты FRET-сенсоров (split — раздельный), в которых два флуорофора донорного и акцепторного ФБ присоединяются к отдельным чувствительным доменам. Сближение двух

вариантов ФБ сопровождается повышением эффективности FRET между ними с преимущественной эмиссией флуоресценции акцепторного флуорофора, а соотношение яркости флуоресценции донора и акцептора характеризует эффективность резонансного переноса энергии.

Таким образом, при использовании донорно-акцепторной пары ФБ и чувствительных доменов создаются сенсорные системы, отвечающие на определенные внутриклеточные сигналы изменением своих спектральных характеристик.

Наряду с GFP-подобными белками в качестве доноров для FRET, BRET (перенос энергии от биолюминесцентного донора) и LRET (перенос энергии от люминесцентного донора) используются органические красители, люциферазы [45] и лантаниды [46] соответственно.

В настоящее время среди ГКС, созданных на основе FRET, известны различные каль-ций-чувствительные сенсоры [47, 48, 49], сенсоры циклических нуклеотидов (цАМФ,

цГМФ) [50, 51], индикаторы активности С-белков [52,53] и киназной активности [54, 55].

Генетически кодируемые

сенсоры на основе одной молекулы ФБ. Другой разновидностью ГКС являются сенсоры, построенные на одной молекуле, чаще всего пермутированного варианта ФБ ^FP — circularly permuted fluorescent protein), связанного с одним или несколькими детекторными доменами [37, 38, 56]. Так, конформационные изменения

чувствительных доменов в ответ на соответствующие внутриклеточные сигналы сопровождаются структурными изменениями самого флуоресцентного белка в области хромофора, что влияет на его спектральные характеристики (рис. 8). В таких вариантах ФБ N- и C-концы на уровне гена искусственно соединяются пептидным линкером, при этом

Рис. 8. Схема работы кальциевого генетически кодируемого сенсора на основе cpFP [44]

в другой части белка, вблизи хромофора, образуются новые N- и C-концы, что позволяет расположить чувствительные детекторные домены индикатора в непосредственном окружении хромофора. При использовании сенсоров на основе cpFP с одним пиком возбуждения и эмиссии флуоресценции контраст индикатора соответствует степени изменения интенсивности флуоресцентного сигнала после взаимодействия с аналитом.

Таким образом, встраивание рецепторного домена (внешнего белка) во флуоресцентный белок и конструирование сенсоров на основе cpFP являются весьма перспективными для изучения важнейших биохимических и физиологических сигналов в клетке. На основе данного метода созданы циркулярно модифицированные формы Aequorea-GFP и его мутантов — cpEGFP, cpECFP и cpEYFP [56]. Среди химерных сенсоров на основе срFPs созданы различные кальций-чувствительные индикаторы [56, 57, 58], сенсоры киназной активности [59] и ГКС HyPer, чувствительный к пероксиду водорода H2O2 [60].

Генетически кодируемые сенсоры, чувствительные к ионам кальция

Кальций-чувствительные сенсоры на основе люминесцентного белка акворина.

Одним из первых был получен люминесцентный сенсор ионов кальция, созданный на основе люминесцентного белка акворина, полученного из медузы Aequorea victoria и ряда других морских организмов [61]. Показано, что акворин люминесцирует голубым светом, и, наряду с GFP, является компонентом биолюминесцентных систем морских организмов. Акворин состоит из двух компонентов: апопротеина апоакворина, содержащего кальций-связывающие сайты, и люминофора коэлентеразина. Связывание апоаквори-ном ионов кальция, характеризующееся низким сродством, но высокой специфичностью, сопровождается окислением коэлентеразина и, как следствие, люминесценцией в голубой области спектра. На основе акворина были получены кальций-чувствительные сенсорные системы у различных организмов, в том числе растений. Однако необходимость введения кофактора коэлентеразина и трудность визуализации (люминесценция слабее флуоресценции) являются ограничениями при использовании акворина в качестве кальциевого зонда. Кроме того, подобные системы достаточно сложны в калибровке и с их использованием затруднено изучение внутриклеточной компартментализации сигнала.

Генетически кодируемые флуоресцентные кальций-чувствительные сенсоры. Кальций-чувствительные FRET-сенсоры. К первым Ca2+-чувствительным индикаторам на основе FRET между двумя спектральными формами флуоресцентных белков относится FIP-CBsm [49]. В состав данного химерного сенсора входят синий флуоресцентный белок EBFP и оптимизированный зеленый белок RSGFP с максимумами эмиссии на длинах волн 440 и 505 нм соответственно, связанные между собой с помощью кальмо-дулинсвязывающего фрагмента киназы легкой цепи миозина MLCK. Так, в отсутствии в среде ионов кальция между донорным и акцепторным флуоресцентными белками FRET сопровождается яркой флуоресценцией RSGFP. При взаимодействии связанного с кальцием кальмодулина c чувствительным доменом индикатора (фрагментом киназы легкой цепи миозина) происходит разделение флуоресцентных белков и, как следствие, уменьшение FRET-взаимодействия между ними.

Также к FRET-сенсорам, чувствительным к ионам кальция, относятся «Cameleons», содержащие две мутантные формы GFP, соединенные между собой кальмодулином (CaM) и пептидом M13 (кальмодулинсвязывающим фрагментом киназы легкой цепи

миозина) [62, 48]. Связывание сенсора с кальцием сопровождается пространственным сближением флуорофоров и увеличением FRET между флуоресцентными белками. За последнее время было создано несколько вариантов Cameleons, CaM-домен которых различается сродством к кальцию. Создаваемые версии индикатора также характеризуются различной яркостью, контрастностью и pH-чувствительностью. Так, разработан ряд сенсоров YCs (Yellow Cameleons), у которых донорно-акцепторная пара состоит из EСFP и EYFP. К новым вариантам YCs относятся индикаторы, содержащие в качестве акцепторов более яркие и pH-стабильные желтые флуоресцентные белки Venus [63] и Citrine [64], а также их пермутированные формы [65]. Недавно в работе, посвященной изучению изменения уровня концентрации цитоплазматического кальция [Ca2+]cyt и кальция эндоплазматического ретикулума [Ca2+]ER при прорастании пыльцевой трубки Arabidopsis thaliana и Nicotiana tabacum, был использован индикатор YC3.6, содержащий донорно-акцепторную пару ECFP/cp173Venus [66].

Помимо кальмодулина, роль Ca2+-чувствительного линкерного домена может также выполнять тропонин С (TnC) (регулятор сокращения сердечной и скелетной мускулатуры), меняющий конформацию в присутствии кальция. Такие конформационные изменения сопровождаются увеличением FRET между ФБ. Данные кальцийчувствительные FRET-сенсоры названы S-Troponeon (со скелетным TnC) и C-Troponeon (c сердечным TnC) [67]. Полученный в настоящее время FRET-сенсор TN-XL с модифицированными акцепторным белком cpCitrine и чувствительным доменом mutcsTnC отличается pH-стабильностью в физиологическом диапазоне, высоким контрастом и линейной зависимостью индуктивно-резонансной передачи энергии от концентрации ионов кальция в среде [47].

Кальций-чувствительные индикаторы на основе одного ФБ. Ca2 -чувствительные сенсоры, созданные на основе инсерции кальмодулина (CaM) в оптимизированный желтый флуоресцентный белок EYFP, получили название Camgaroo [56, 64]. Конформацион-ные изменения чувствительного домена (кальмодулина) в присутствии кальция сопровождаются депротонированием, т. е. переходом хромофора индикатора из нейтральной формы в заряженную. Такие структурные изменения в окружении хромофора приводят к увеличению яркости флуоресценции с максимальным семикратным контрастом in vitro. Тем не менее индикаторы Camgaroo не могут улавливать колебания концентрации кальция в физиологическом диапазоне (в пределах нескольких сотен наномолей) ввиду низкой аффинности.

Среди высоко чувствительных кальциевых ГКС можно выделить сенсор G-CaMP, сконструированный на основе кальмодулина CaM и его пептида-мишени M13, присоединенных соответственно к С- и N-концам пермутированного по 145-му положению оптимизированного зеленого флуоресцентного белка EGFP [57]. За счет CaM-M13 взаимодействия, сопровождающегося изменениями в микроокружении хромофора, флуоресценция индикатора G-CaMP обратимо меняется в зависимости от наличия (отсутствия) ионов кальция. При добавлении к G-CaMP кальция максимальное увеличение эмиссии in vitro составило 4,5 раза. Однако в экспериментах с нейронами Drosophila данный химерный белок демонстрировал высокую зависимость от pH и низкую яркость флуоресценции [68].

Позже был создан ГКС G-CaMP1.6, являющийся улучшенным вариантом G-CaMP. Индикатор характеризуется более яркой флуоресценцией, большей pH-стабильностью, более высоким сродством к кальцию и максимальным контрастом in vitro, составляю-

щим 4,9 раза. К недостаткам данного индикатора относят медленное созревание при 37°С [69].

К сенсорам на основе cpFP, чувствительным к ионам кальция, также принадлежат так называемые перикамы (Pericams) — химерные молекулы, которые содержат кальмо-дулин, M13 и cpEYFP [70]. Старые N- и C-концы cpEYFP соединены пептидным линкером GlyGlySerGlyGly, новые N- и C-концы образованы в положениях 145 и 144 соответственно. К C-концу cpEYFP данного индикатора пришит кальмодулин (E140Q), к N-концу — M13. При возрастании концентрации ионов Ca2+ перикамы изменяют свои спектральные свойства, вероятно, из-за изменения микроокружения хромофора, возникающего в результате взаимодействия M13 с кальцийсвязанным кальмодулином. Среди перикамов выделяют Flash-Pericams («вспыхивающие перикамы», cpEYFP145-144(Y203H)), у которых связывание ионов кальция in vitro сопровождается восьмикратным увеличением интенсивности флуоресценции. Сенсоры характеризуются высокой контрастностью, однако отличаются медленным созреванием при 37°С и низкой pH-стабильностью.

Спектры возбуждения флуоресценции Ratiometric-Pericams («ратиометрические перикамы», cpEYFP145-144(H148D/Y203F)) в отличие от Flash-Pericams содержат два максимума (на 415 и 494 нм) за счет введения в 203-е положение флуоресцентного белка остатка фенилаланина. В присутствии ионов Ca2+ происходит перераспределение максимумов возбуждения флуоресценции в сторону максимума на 494 нм с десятикратным изменением отношения интенсивностей флуоресценции, возникающей при возбуждении на двух длинах волн in vitro [70].

Inverse-Pericams, как и Flash-Pericams, являются «одноволновыми» кальций-чув-ствительными индикаторами. Однако в присутствии ионов Ca2+ «инверсные перикамы», напротив, характеризуются шестикратным уменьшением интенсивности зеленой флуоресценции in vitro, что связано со снижением квантового выхода флуоресценции в результате связывания кальция. По сравнению с Flash-Pericams данные индикаторы характеризуются более высоким сродством к кальцию и наименьшей среди перикамов чувствительностью к pH. С помощью данных индикаторов изменение концентрации Ca2+ измеряли в ядре, цитоплазме и митохондриях [70].

Недавно в Институте биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН были разработаны высококонтрастные кальцийчувствитель-ные сенсоры Case 12 и Case 16 (от Calcium sensor) c максимальным контрастом среди всех созданных сегодня ГКС. Данные индикаторы содержат пермутированный флуоресцентный белок cpEYFP, имеющий остаток фенилаланина в 203-м положении, кальций-связывающий белок CaM и его пептид-мишень M13, присоединенные к С- и N-концам пермутанта соответственно [58]. Связывание ионов кальция с кальмодулином сопровождается значительными конформационными изменениями последнего, что обусловливает его взаимодействие с пептидом-мишенью в составе химерного конструкта. Конформационные изменения аминокислотных остатков в окружении хромофора, возникающие в результате такого взаимодействия, влияют на соотношение его нейтральной (протонированной) и заряженной (депротонированной) форм (перераспределение в сторону последней), квантовый выход флуоресценции, коэффициент молярной экс-тинкции, что, в результате, приводит к изменению спектральных свойств сенсора.

По сравнению с ранее созданными cpFP-содержащими Са2+-чувствительными индикаторами Сase 12 и Case 16 отличаются повышенной pH-стабильностью и при физиологических значениях рН (7,2-7,5) показывают достаточно высокую яркость

флуоресценции и высокий контраст. Важно, что действие данных сенсоров в ответ на Са2+ полностью обратимо, что является значительной характеристикой генетически кодируемых сенсоров [58]. Путем присоединения на уровне гена к N-концу Case12 сигнала мембранной локализации нейромодулина (MLS) был получен мембрано-ло-кализованный вариант Case12 (Сase12mem). Огромную роль в поддержании кальциевого гомеостаза клетки играют митохондрии. В результате присоединения на уровне гена к Case12 с N-конца удвоенного сигнала митохондриальной локализации (dMito) из VIII субъединицы предшественника цитохромоксидазы С была получена версия Case12mito, позволяющая наблюдать за изменением митохондриальной концентрации кальция ([Ca2+]m) [58].

Генетически кодируемый сенсор на основе cpFP, чувствительный к H2O2 Недавно в лаборатории Института биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН был создан первый генетически кодируемый флуоресцентный сенсор HyPer, чувствительный к пероксиду водорода (H2O2), дающий возможность прямо определять внутриклеточное содержание одной из основных генерируемых клеткой активных форм кислорода [60]. Индикатор содержит пермутированный флуоресцентный белок cpEYFP, вставленный в регуляторный домен прокариотического белка OxyR E. coli между 205 и 206 а. о., чувствительный к H2O2. В основе работы HyPer лежит процесс окисления двух остатков цистеина (Cys 199 и Cys 208), входящих в состав прокариотического белка, протекающий при взаимодействии данного индикатора с H2O2. Окисление сопровождается конформационными изменениями регуляторного домена OxyR и, как следствие, изменениями флуоресцентных свойств пермутированного белка-индикатора. HyPer относится к «ратиометрическим» индикаторам, характеризуется двумя пиками возбуждения с максимумами на длинах волн 420 и 500 нм и пиком эмиссии флуоресценции с максимумом на длине волны 516 нм.

В отличие от традиционно используемых красителей (производных дихлордиги-дрофлуоресцеина) HyPer характеризуется повышенной селективностью и чувствительностью к пероксиду водорода, показывает высокое сродство к H2O2 (субмикромолярная область). Максимальный контраст HyPer in vitro составил 2,5 раза [60]. Использование HyPer не сопровождается дополнительной генерацией активных форм на свету.

pH-чувствительные сенсоры. Известно, что флуоресцентные свойства как Aequorea GFP дикого типа, так и его мутантных форм зависят от уровня pH. Так, при высоких значениях pH (10,0-12,2) у нативного GFP наблюдается резкое увеличение интенсивности флуоресценции, а также сильный сдвиг спектров поглощения и возбуждения флуоресценции [71], что может быть связано с ионизацией (депротонированием) хромофора. В диапазоне pH 4-6 происходит тушение флуоресценции GFP. Чувствительность флуоресцентных белков к значениям внутриклеточного pH может быть описано величиной pKa (pH, при котором происходит снижение интенсивности флуоресценции на 50% от начальной величины). Ввиду быстрого и обратимого изменения интенсивности флуоресценции в ответ на изменение кислотности среды было предложено использовать GFP в качестве индикатора внутриклеточного pH [72, 73]. Оптимизированные версии Aequoreа-GFP, такие как EGFP (pKa 5,5) и EYFP (pKa 7,1), являются более чувствительными к изменениям pH по сравнению с GFP дикого типа (pKa 4,5).

За последнее время был получен ряд генетически кодируемых сенсоров внутриклеточного pH на основе одного ФБ [74, 75, 76], использование которых является новым подходом в изучении многих внутриклеточных процессов. Например, pH-чувствительные

сенсоры pH-лоурины использовали при изучении пресинаптической активности, и в этом случае изменение значений pH с 5,6 до 7,4 при действии потенциала сопровождалось переходом pH-индикатора из нефлуоресцентного состояния в флуоресцентное [77].

Заключение

Известно, что быстрые изменения концентраций различных вторичных посредников являются непременным условием трансдукции сигналов в любой живой клетке. Сегодня вопросы, возникающие при изучении путей трансдукции сигналов различной природы и участия в них вторичных посредников (Ca2+, H2O2, NO), не могут быть однозначно решены с помощью традиционных низкомолекулярных флуоресцентных сенсоров и требуют принципиально новых подходов. Принципиально новым подходом в изучении клеточной сигнализации является применение генетически кодируемых флуоресцентных зондов белковой природы, которые в значительной степени лишены недостатков традиционных низкомолекулярных красителей. Использование в генетических конструкциях зондов сигнальных последовательностей локализации позволяет обеспечить четкую идентификацию компартментализации сигнальных каскадов или их этапов. В настоящий момент механизмы перцепции и трансдукции сигналов различной природы наиболее подробно изучены у животных. В области клеточной сигнализации растений целый ряд вопросов остается открытым. Модификация генетически кодируемых сенсоров для растений может позволить решить целый ряд принципиально важных вопросов современной биологии растений.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки в рамках реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (ГК 2010-1.3.2-203-002-008).

Литература

1. Subbaiah C. C., Bush D. S., Sachs M. M. Elevation of cytosolic calcium precedes anoxic gene expression in maize suspension-cultured cells // Plant Cell. 1994a. Vol. 6. P. 1747-1762.

2. Subbaiah C. C., Zhang J., Sachs M. M. lnvolvement of lntracellular calcium in anaerobic gene expression and survival of maize seedlings // Plant Physiol. 1994b. Vol. 105. P. 369-376.

3. Mur L. A. J., Carver T. L. W., Prats E. No way to live: the varios roles of nitric oxide in plant-pathogen interactions // J. Exp. Bot. 2006. Vol. 75. P. 489-505.

4. Rockel P., Strube F., Rockel A.et al. Regulation of nitric oxide (NO) production by plant nitrate reductase in vivo and in vitro // J. Exp. Bot. 2002. Vol. 53. P. 103-110.

5. Lamattina L., Garcia-Mata C., Graziano M., Pagnussat G. Nitric oxide: the versatility of an extensive signal molecule // Annu. Rev. Plant Biol. 2003. Vol. 54. P. 109-136.

6. Neill S. J., Desikan R., Hancock J. T. Nitric oxide signaling in plants // New Phytol. 2003. Vol. 159. P. 11-35.

7. Delledonne M., Xia Y., Dixon R. A., Lamb C. Nitric oxide functions as a signal in plant disease resistance // Nature. 1998. Vol. 394. P. 585-588.

8. Durner J., Wendehemme D., Klessig D. F. Defense gene induction in tobacco by nitric oxide, cyclic GMP and cyclic ADP-ribose // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.1998. Vol. 95. P. 10328-10333.

9. Asai S., Yoshioka H. Nitric oxide as a partner of reactive oxygen species participates in disease resistance to necrotrophic pathogen Botrytis cinerea in Nicotiana benthamiana // Mol. Plant-Microbe Interac. 2009. Vol. 22. P. 619-629.

10. Courtois C., Besson A., Dahan J., Bourque S. et al. Nitric oxide signaling in plants: interplays with Ca2+ and protein kinases // J. Exp. Bot. 2008. Vol. 59. P. 155-163.

11. Baxter-Burrell A.,Yang Z., Springer P. S., Bailey-Serres J. RopGAP4-dependent Rop GTPase rheostat control of Arabidopsis oxygen deprivation tolerance // Science. 2002. Vol. 296. P. 2026-2028.

12. Blokhina O. B., Chirkova T. V., Fagerstedt K. V. Anoxic stress leads to hydrogen peroxide formation in plant cells // J. Exp. Bot. 2001. Vol. 52, N 359. P. 1179-1190.

13. Медведев C. С. Кальциевая сигнальная система растений // Физиол. раст. 2005. Т. 52. С. 282305.

14. Dodd A. N., Kudla J., Sanders D. The Language of Calcium Signaling // Annu. Rev. Plant Biol. 2010. Vol. 61. P. 593-620.

15. Grynkiewicz G., Poenie M, Tsien R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties // J. Biol. Chem. 1985. Vol. 260. P. 3440-3450.

16. Tsien R.Y. Fluorescent indicators of ion concentrations // Methods Cell Biol. 1989. Vol. 30. P. 127156.

17. Schild D., Jung A., Schultens H. A. Localization of calcium entry through calcium channels in olfactory receptor neurones using a laser scanning microscope and the calcium indicator dyes Fluo-3 and Fura-Red // Cell Calcium. 1994. Vol. 15. P. 341-348.

18. Hanson G. T., Hanson B. J. Fluorescent probes for cellular assays // Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 2008. Vol. 11. P. 505-513.

19. Kao J. P., Harootunian A. T., Tsien R. Y. Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by Fluo-3 // J. Biol. Chem. 1989. Vol. 264. P. 8179-8184.

20. Eberhard M., Erne P. Calcium binding to fluorescent calcium indicators: calcium green, calcium orange and calcium crimson // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1991. Vol. 180. P. 209-215.

21. Tsien R. Y., Poenie M. Fluorescence ratio imaging: A new window into intracellular ionic signaling // Trends Biochem. Sci. 1986. Vol. 11. P. 450-455.

22. Wahl M., Lucherini M. J., Gruenstein E. Intracellular Ca2+ measurement with Indo-1 in substrate-attached cells: advantages and special considerations // Cell Calcium. 1990. Vol. 11. P. 487-500.

23. Henderson L. M., Chappell J. B. Dihydrorhodamine 123: a fluorescent probe for superoxide generation // Eur. J. Biochem. 1993. Vol. 217. P. 973-980.

24. Rothe G., Valet G. Flow cytometric analysis of respiratory burst activity in phagocytes with hydro-ethidine and 2, 7-dichlorofluorescin // J. Leukoc. Biol. 1990. Vol. 47. P. 440-448.

25. Zhou M., Diwu Z., Panchuk-Voloshina N., Haugland R.P. A stable nonfluorescent derivative of resorufin for the fluorometric determination of trace hydrogen peroxide: applications in detecting the activity of phagocyte NADPH oxidase and other oxidases // Anal. Biochem. 1997. Vol. 253. P. 162-168.

26. Marchesi E., Rota C., Fann Y. C. et al. Photoreduction of the fluorescent dye 2’-7’-dichlorofluo-rescein: a spin trapping and direct electron spin resonance study with implications for oxidative stress measurements // Free Radical Biol. Med. 1999. Vol. 26. P. 148-161.

27. Yoshida Y., Shimakawa S., Itoh N., Niki E. Action of DCFH and BODIPY as a probe for radical oxidation in hydrophilic and lipophilic domain // Free Radical Res. 2003. Vol. 37. P. 861-872.

28. Maeda H., Fukuyasu Y., Yoshida S., Fukuda M. et al. Fluorescent probes for hydrogen peroxide based on a non-oxidative mechanism // Angew. Chem. Int. Ed. 2004. Vol. 43. P. 2389-2391.

29. Maeda H., Matsuura S., Nishida M., Senba T. et al. Hydrogen peroxide-induced deacetylation of acetyl resorufin as a novel indicator reaction for fluorometric detection of glucose using only glucose oxidase // Chem. Pharm. Bull. 2001. Vol. 49. P. 294-298.

30. Chang M. C. Y., Pralle A., Isacoff E. Y., Chang C. J. A selective, cell-permeable optical probe for hydrogen peroxide in living cells // J. Am. Chem. Soc. 2004. Vol. 126. P. 15392-15393.

31. Miller E. W., Albers A. E., Pralle A. et al. Boronate-based fluorescent probes for imaging cellular hydrogen peroxide // J. Am. Chem. Soc. 2005. Vol. 127. P. 16652-16659.

32. Nagano T., Yoshimura T. Bioimaging of Nitric Oxide // Chem. Rev. 2002. Vol. 102. P. 1235-1269.

33. Misco T. P., Schilling J., Salvemini D. et al. A fluorometric assay for the measurement of nitrite in biological samples // Anal. Biochem. 1993. Vol. 214. P. 11-16.

34. Gunasekar P. G., Kanthasamy A. G., Borowitz J. L., Isom, G. E. Monitoring intracellular nitric oxide formation by dichlorofluorescin in neuronal cells // J. Neurosci. Methods. 1995. Vol. 61. P. 15-21.

35. Kojima H., Nakatsubo N., Kikuchi K., Kawahara S. et al. Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins // Anal. Chem. 1998. Vol. 70. P. 2446-2453.

36. Kojima H., Hirotani M., Nakatsubo N., Kikuchi K. et al. Bioimaging of nitric oxide with fluorescent indicators based on the rhodamine chromophore // Anal. Chem. 2001. Vol. 73. P. 1967-1973.

37. Суслова Е. А. Чудаков Д. М. Генетически кодируемые внутриклеточные сенсоры на основе флуоресцентных белков // Биохимия. 2007. Т. 72. С. 837-855.

38. Chudakov D. M., Lukyanov S., Lukyanov K. A. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging // Trends Biotechnol. 2005. Vol. 23. P. 605-613.

39. Prasher D. C., Eckenrode V. K., Ward W. W., Prendergast F. G. et al. Primary structure of the Aequo-rea victoria green-fluorescent protein // Gene. 1992. Vol. 111. P. 229-233.

40. Labas Y. A., Gurskaya N. G., Yanushevich Y. G., Fradkov A. F. et al. Diversity and evolution of the green fluorescent protein family // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2002. Vol. 99. P. 4256-4261.

41. Baird G. S., Zacharias D. A., Tsien R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2000. Vol. 97. P. 11984-11989.

42. Lukyanov K. A., Fradkov A. F., Gurskaya N. G., Matz M. V. et al. Natural animal coloration can be determined by a nonfluorescent green fluorescent protein homolog // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 25879-25882.

43. Shagin D. A., Barsova E. V., Yanushevich Y. G., Fradkov A. F. et al. GFP-like proteins as ubiquitous metazoan superfamily: evolution of functional features and structural complexity // Mol. Biol. Evol. 2004. Vol. 5. P. 841-850.

44. Frommer W. B., Davidson M. W., Campbell R. E. Genetically encoded biosensors based on engineered fluorescent proteins // Chem. Soc. Rev. 2009. Vol. 38. P. 2833-2841.

45. Xu Y., Piston D. W., Johnson C. H. A. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) system: application to interacting circadian clock proteins // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1999. Vol. 96. P. 151156.

46. Weiss S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules // Science. 1999. Vol. 283. P. 1676-1683.

47. Mank M., ReiffD. F., Heim N. FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change // Biophys. J. 2006. Vol. 90. P. 1790-1796.

48. Miyawaki A., Llopis J., Heim R., McCaffery J. M. et al. Fluorescent indicators for Ca2+- based on green fluorescent proteins and calmodulin // Nature. 1997. Vol. 388. P. 882-887.

49. Romoser V. A., Hinkle P. M., Persechini A. Detection in living cells of Ca2+-dependent changes in the fluorescence emission of an indicator composed of two green fluorescent protein // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 13270-13274.

50. Nikolaev V. O., Gambaryan S., Lohse M. J. Fluorescent sensors for rapid monitoring of intracellular cGMP // Nat. Methods. 2006. Vol. 3. P. 23-25.

51. Zaccolo M., De Giorgi F., Cho C. Y., Feng L. et al. A genetically encoded, fluorescent indicator for cyclic AMP in living cells // Nat. Cell. Biol. 2000. Vol. 2. P. 25-29.

52. Mochizuki N., Yamashita S., Kurokawa K., Ohba Y. et al. Spatio-temporal images of growth-factor-induced activation of Ras and Rap1 // Nature. 2001. Vol. 411. P. 1065-1068.

53. Seth A., Otomo T., Yin H. L., Rosen M. K. Rational design of genetically encoded fluorescence resonance energy transfer-based sensors of cellular Cdc42 signaling // Biochem. 2003. Vol. 42. P. 3997-4008.

54. Nagai T., Miyazaki M., Aoki R., Zama T. et al. A fluorescent indicator for visualizing cAMPinduced phosphorylation in vivo // Nat. Biotechnol. 2000. Vol. 18. P. 313-316.

55. TingA.Y., Kain K. H., Klemke R.L., Tsein R. Y. Genetically encoded fluorescent reporters of protein tyrosine kinase activities in living cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. Vol. 98. P. 15003-15008.

56. Baird G. S., Zacharias D. A., Tsien R. Y. Circular permutation and receptor insertion within green fluorescent proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.1999. Vol. 96. P. 11241-11246.

57. Nakai J., Ohkura M., Imoto K. A high signal-to-noise Ca2+- probe composed of a single green fluorescent protein // Nat. Biotechnol. 2001. Vol. 19. P. 137-141.

58. Souslova E. A., Belousov V. V., Lock J. G., Stromblad S. et al. Single fluorescent protein-based Ca2+-sensors with increased dynamic range // BMC Biotechnol. 2007. Vol. 7. P. 37.

59. Kawai Y., Sato M., Umezawa Y. Single color fluorescent indicators of protein phosphorylation for multicolor imaging of intracellular signal flow dynamics // Anal. Chem. 2004. Vol. 76. P. 6144-6149.

60. Belousov V. V., Fradkov A. F., Lukyanov K. A., Staroverov D. B. et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide // Nat. Methods. 2006. Vol. 3. P. 281-286.

61. Shimomura O., Johnson F. H., Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bio-luminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea // J. Cell. Comp. Physiol. 1962. Vol. 59. P. 223-239.

62. Miyawaki A., Griesbeck O., Heim R., Tsien R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.1998. Vol. 96. P. 2135-2140.

63. Nagai T., Ibata K., Park E. S., Kubota M. et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications // Nat. Biotechnol. 2002. Vol. 20. P. 87-90.

64. Griesbeck O., Baird G. S., Campbell R. E. et al. Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. P. 29188-29194.

65. Nagai T., Yamada S., Tominaga T. et al. A high-throughput method for development of FRET-based indicators for proteolysis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. Vol. 101. P. 10554-10559.

66. Iwano M., Entani T., Shiba H., Kakita M. et al. Fine-tuning of the cytoplasmic Ca2+ concentration is essential for pollen tube growth // Plant Physiol. 2009. Vol. 150. P. 1322-1334.

67. Heim N., Griesbeck O. Genetically encoded indicators of cellular calcium dynamics based on troponin C and green fluorescent protein // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279. P. 14280-14286.

68. Wang L., Jackson W. C., Steinbach P. A., Tsein R. Y. Evolution of new nonantibody proteins via iterative somatic hypermutation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. Vol. 101. P. 16745-16749.

69. Ohkura M., Matsuzaki M., Kasai H. et al. Genetically encoded bright Ca2+-probe applicable for dynamic Ca2+-imaging of dendritic spines // Anal. Chem. 2005. Vol. 77. P. 5861-5869.

70. Nagai T., Sawano A., Park E. S., Miyawaki A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+ // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. Vol. 98. P. 3197-3202.

71. Ward W. W., Bokman S. H. Reversible denaturation of Aequorea green-fluorescent protein: physical separation and characterization of the renatured protein // Biochemistry. 1982. Vol. 21. P. 4535-4540.

72. Robey R. B., Ruiz O., Santos A. V. P., Ma J. et al. pH-dependent fluorescence of a heterologously expressed Aequorea green fluorescent protein mutant: in situ spectral characteristics and applicability to intracellular pH estimation // Biochem. 1998. Vol. 37. P. 9894-9901.

73. Yuste R., Miller R. B., Holthoff K., Zhang S., Miesenbock G. Synapto-pHluorins: chimeras between pH-sensitive mutants of green fluorescent protein and synaptic vesicle membrane proteins as reporters of neurotransmitter release // Methods Enzymol. 2000. Vol. 327. P. 522-546.

74. Hanson G. T., Mc Ananey T. B., Park E. S., Rendell M. E. et al. Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 1. Structural characterization and preliminary application // Biochemistry. 2002. Vol. 41. P. 15477-15488.

75. Johnson D. E., Ai H. W., Wong P., Young J. D. et al. Red fluorescent protein pH biosensor to detect concentrative nucleoside transport // J. Biol. Chem. 2009. Vol. 284. P. 20499-20511.

76. Miesenbock G., De Angelis D. A., Rothman J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescentproteins // Nature. 1998. Vol. 394. P. 192-195.

77. Sankaranarayanan S., De Angelis D., Rothman J. E., Ryan T. A. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity // Biophys J. 2000. Vol. 79. P. 2199-2208.

Статья поступила в редакцию 20 декабря 2010 г.