ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ АНАЛИЗ С ДВОЙНЫМИ ФЛУОРОФОРАМИ

1. Репортерная конструкция для измерения ферментативной активности, содержащая:
домен заякоривания в мембране, содержащий первый пептид, который образует комплекс с мембраной клетки;
репортерный домен, содержащий первую копию второго пептида, которая генерирует первый сигнал на первой длине волны, и вторую копию второго пептида, который генерирует второй сигнал на первой длине волны, при этом репортерный домен генерирует совокупный сигнал, который представляет собой сумму первого сигнала и второго сигнала;
сайт расщепления, содержащий третий пептид, причем указанный сайт расщепления вставлен между доменом заякоривания в мембране и по меньшей мере двумя из двух или более копий репортерного домена,
при этом третий пептид выбирают таким образом, чтобы он подвергался расщеплению под воздействием ферментативной активности,
при этом указанный репортерный домен выбирают таким образом, чтобы по меньшей мере часть репортерного домена являлась восприимчивой к протеолизу после расщепления, и при этом совокупный сигнал можно наблюдать в отсутствие любого одного из первого сигнала или второго сигнала.
2. Репортерная конструкция по п. 1, отличающаяся тем, что первая копия второго пептида восприимчива к первому явлению деградации в цитозоле клетки и вторая копия второго пептида восприимчива ко второму явлению деградации в цитозоле клетки после расщепления, при этом первое явление деградации приводит к прекращению генерации первого сигнала и второе явление деградации приводит к прекращению генерации второго сигнала.
3. Репортерная конструкция по п. 1, отличающаяся тем, что второй пептид представляет собой флуоресцентный белок.
4. Репортерная конструкция по п. 1, дополнительно содержащая линкерный пептид, вставленный между первой копией второго пептида и второй копией второго пептида.
5. Репортерная конструкция по п. 1, отличающаяся тем, что второй пептид идентичен по меньшей мере на 80% последовательности SEQ ID NO: 10.
6. Репортерная конструкция по п. 1, отличающаяся тем, что третий пептид представляет собой белок SNARE или его фрагмент.
7. Репортерная конструкция по п. 1, дополнительно содержащая вспомогательный репортерный домен, который генерирует сигнал на второй длине волны, при этом вторая длина волны отличима от первой длины волны.
8. Репортерная конструкция по п. 1, отличающаяся тем, что указанная репортерная конструкция проявляет пониженную склонность к селективности между первой ферментативной активностью и второй ферментативной активностью по сравнению с аналогичной репортерной конструкцией, которая содержит единственную копию второго пептида, при этом третий пептид выбирают таким образом, чтобы он подвергался расщеплению под воздействием либо первой ферментативной активности, либо второй ферментативной активности.
9. Репортерная конструкция по п. 9, отличающаяся тем, что первая ферментативная активность ассоциирована с BoNT/A и вторая ферментативная активность ассоциирована с BoNT/E.
10. Репортерная конструкция по п. 1, отличающаяся тем, что указанная репортерная конструкция не проявляет подходящие уровни FRET.
11. Способ измерения первой ферментативной активности, включающий:
обеспечение клетки, которая экспрессирует репортерную конструкцию, содержащую домен заякоривания в мембране, содержащий первый пептид, который образует комплекс с мембраной клетки, репортерный домен, содержащий первую копию второго пептида, которая генерирует первый сигнал на первой длине волны, и вторую копию второго пептида, которая генерирует второй сигнал на первой длине волны, при этом репортерный домен генерирует совокупный сигнал, который представляет собой сумму первого сигнала и второго сигнала, и сайт расщепления, содержащий третий пептид, причем указанный сайт расщепления вставлен между доменом заякоривания в мембране и по меньшей мере двумя из двух или более копий репортерного домена, и при этом третий пептид выбирают таким образом, чтобы он подвергался расщеплению под воздействием первой ферментативной активности, и по меньшей мере часть указанного репортерного домена выбирают таким образом, чтобы по меньшей мере часть репортерного домена являлась восприимчивой к протеолизу после расщепления;
приведение в контакт указанной клетки с образцом, в котором предполагают наличие первой ферментативной активности; и
наблюдение уменьшения детектируемого сигнала, если в образце содержится первая ферментативная активность,
при этом совокупный сигнал можно наблюдать в отсутствие любого одного из первого сигнала или второго сигнала.
12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что второй пептид представляет собой флуоресцентный белок.
13. Способ по п. 11, отличающийся тем, что у указанного способа понижена селективность между первой ферментативной активностью и второй ферментативной активностью по сравнению с анализом, в котором используют аналогичную репортерную конструкцию, которая содержит единственную копию второго пептида, при этом третий пептид выбирают таким образом, чтобы он подвергался расщеплению под воздействием либо первой ферментативной активности, либо второй ферментативной активности.
14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что первая ферментативная активность ассоциирована с BoNT/A и вторая ферментативная активность ассоциирована с BoNT/E.
15. Способ по п. 11, отличающийся тем, что второй пептид идентичен по меньшей мере на 80% последовательности SEQ ID NO: 10.
16. Способ по п. 11, отличающийся тем, что третий пептид представляет собой белок SNARE или его фрагмент.
17. Способ по п. 11, отличающийся тем, что репортерная конструкция дополнительно содержит эталонный репортер, который генерирует эталонный сигнал, при этом указанный эталонный сигнал отличим от детектируемого сигнала и не зависит от ферментативной активности образца.
18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что указанный эталонный сигнал применяют для нормировки совокупного сигнала.
19. Способ по п. 11, дополнительно включающий этап приведения в контакт клетки с красителем для клеток, отличающийся тем, что указанный краситель для клеток выбирают таким образом, чтобы получить сигнал красителя, который отличим от совокупного сигнала.
20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что указанный сигнал красителя применяют для нормировки совокупного сигнала.
21. Способ по п. 19, отличающийся тем, что указанную клетку приводят в контакт с красителем для клеток перед приведением в контакт клетки с образцом.
22. Способ по п. 19, отличающийся тем, что клетку приводят в контакт с красителем для клеток после того, как клетку приводят в контакт с образцом.
23. Способ по п. 19, отличающийся тем, что клетку приводят в контакт с красителем для клеток и с образцом в течение одного и того же промежутка времени.
24. Способ по п. 11, отличающийся тем, что репортерная конструкция не проявляет подходящих уровней FRET.