ИЗОЛЯТ БЕЛКА КАНОЛЫ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ
CANOLA PROTEIN ISOLATE, ITS PRODUCTION METHOD AND APPLICATION

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящая заявка является частичным продолжением патентной заявки США №12/213499, поданной 20 июня 2009 г.
Настоящее изобретение относится к производству изолята белка канолы и его применению в водных растворах, включающих безалкогольные напитки и напитки для спортсменов.
Предшествующий уровень техники
Изоляты белка канолы, имеющие содержание белка, по меньшей мере, 100% масс. (N×6,25), могут быть получены из муки из масличных семян способом, описанным в совместно рассматриваемой патентной заявке США №10/137391, поданной 3 мая 2002 г. (публикация патентной заявки США №2003-0125526 и WO 02/089597), и в патентной заявке США №10/476230, поданной 9 июня 2004 г. (публикация патентной заявки США №2004-0254353), правопреемником по которым является автор настоящей заявки и содержание которых включено в настоящую заявку в виде ссылки. Способ представляет собой многостадийный процесс, включающий экстракцию муки из масличных семян канолы водным раствором соли; отделение полученного водного белкового раствора от остаточной муки из масличных семян; повышение концентрации белка в водном растворе, по меньшей мере, примерно до 200 г/л при одновременном поддержании ионной силы раствора, в основном, постоянной с применением селективной мембранной технологии; разбавление полученного концентрированного белкового раствора охлажденной водой с тем, чтобы вызвать образование белковых мицелл; осаждение белковых мицелл отстаиванием с получением аморфной, клейкой, студнеобразной, подобной клейковине белковой мицеллярной массы (РММ) и извлечение белковой мицеллярной массы из супернатанта, имеющего содержание белка, по меньшей мере, около 100% масс. (N×6,25). В контексте описания содержание белка указано в пересчете на сухую массу. Извлеченная РММ может подвергаться сушке.
В одном варианте воплощения способа супернатант от стадии отстаивания РММ подвергается обработке с целью извлечения из него изолята белка канолы. Эта процедура может осуществляться путем начального концентрирования супернатанта с применением ультрафильтрационной мембраны и последующей сушки концентрата. Полученный изолят белка канолы имеет содержание белка, по меньшей мере, около 90% масс., предпочтительно, по меньшей мере, примерно 100% масс. (N×6,25).
Способы, описанные в патентных заявках США №10/137391 и №10/476230, являются, по сути, периодическими способами. В совместно рассматриваемой патентной заявке США №10/298678, поданной 19 ноября 2002 г. (публикация патентной заявки США №2004-0039174 и WO 03/043439), правопреемником по которой является автор настоящей заявки и содержание которой включено в настоящую заявку в виде ссылки, описан непрерывный способ получения изолятов белка канолы. В соответствии с этим способом мука из масличных семян канолы непрерывно смешивается с водным раствором соли; смесь транспортируется по трубопроводу при одновременном экстрагировании белка из муки из масличных семян канолы с образованием водного белкового раствора; водный белковый раствор непрерывно пропускается через селективную мембрану с целью увеличения содержания белка в водном белковом растворе, по меньшей мере, примерно до 50 г/л при одновременном поддержании ионной силы раствора, в основном, постоянной; полученный концентрированный белковый раствор непрерывно смешивается с охлажденной водой с тем, чтобы инициировать образование белковых мицелл, и белковые мицеллы непрерывно осаждаются отстаиванием, в то время как супернатант непрерывно сливается с осадка до тех пор, пока в резервуаре-отстойнике не накопится желательное количество РММ. Эта РММ извлекается из резервуара-отстойника и может подвергаться сушке. РММ имеет содержание белка, по меньшей мере, около 90% масс. (N×6,25), предпочтительно, по меньшей мере, примерно 100% масс. Супернатант, слитый с осадка, может подвергаться обработке с целью извлечения из него изолята белка канолы, как описано выше.
Известно, что семена канолы содержат примерно от 10% до 30% масс. белков, и было идентифицировано несколько различных белковых компонентов. Эти белки включают глобулин 12S, известный как круциферин; белок 7S и запасной белок 2S, известный как напин. Как указывается в совместно рассматриваемой патентной заявке США №10/413371, поданной 15 апреля 2003 г. (публикация патентной заявки США №2004-0034200 и WO 03/088760), и в патентной заявке США №10/510766, поданной 29 апреля 2005 г. (публикация патентной заявки США №2005-0249828), правопреемником по которым является автор настоящей заявки и содержание которых включено в настоящую заявку в виде ссылки, описанные выше способы, включающие разбавление концентрированного водного белкового раствора для образования РММ и обработку супернатанта для извлечения дополнительного белка, приводят к получению изолятов различного белкового профиля.
Так, полученный из РММ изолят белка канолы имеет следующее содержание белковых компонентов: примерно от 60% до 98% масс. белка 7S; примерно от 1% до 15% масс. белка 12S и от 0 до примерно 25% масс. белка 2S. Полученный из супернатанта изолят белка канолы имеет следующее содержание белковых компонентов: примерно от 60% до 95% масс. белка 2S; примерно от 5% до 40% масс. белка 7S и от 0 до примерно 5% масс. белка 12S. Таким образом, в полученном из РММ изоляте белка канолы преобладает белок 7S, а в полученном из супернатанта изоляте белка канолы доминирует белок 2S. Как указывается в вышеупомянутых патентных заявках США №10/413371 и №10/510766, белок 2S имеет молекулярную массу около 14000 дальтон, белок 7S имеет молекулярную массу около 145000 дальтон, а белок 12S имеет молекулярную массу примерно 290000 дальтон.
2
4
4
2
4
4
2
4
4
2
4
max
Krzyzaniak et al. в Nahrung (42) 1998, Nr. 3/4, p.201-204, описал очистку до гомогенности запасного белка 2S (напин) из семян рапса и дал характеристику его вторичной структуры и стабильности конформации. Он выделял напин из семян рапса методом экстракции буфером А (50 мМ NaHPO, pH 7,0, 1 мМ ЭДТУ) с последующим осаждением с помощью (NH)SO, растворением образовавшегося осадка в буфере А, диализом против этого же буфера и обессоливанием гель-хроматографией на колонке с Сефадекс G-50. Фракции, содержащие экстракт напина, собирались и повторно осаждались с помощью (NH)SO. Полученный сырой напин растворялся в буфере В (буфер А при pH 7,4), подвергался диализу против этого же буфера, затем загружался на колонку с СМ-Сефадекс С-50 и элюировался градиентом от 0,15 до 0,35 М NaCl в буфере В. Фракции, содержащие напин, объединялись в одну, осаждались с помощью (NH)SO, повторно растворялись в буфере А и подвергались диализу. Далее напин очищался катионообменной HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография) с использованием в качестве градиента до 1 М NaCl при pH 5,0. Фракции с λ=280 нм собирались, концентрировались и подвергались анализу.
Заявители использовали следующие дополнительные литературные источники в части подготовки в лабораторных условиях образцов белка канолы 2S, очищенного до гомогенности:
Berot, S., Compoint, J.P., Larre, С., Malabat, С. and Gueguen, J. 2005. Large scale purification of rapeseed proteins (Brassica napus L) [Крупномасштабная очистка белков рапса]. J. Chromatography В, 818: 35-42.
Bhatty, R.S., McKenzie, S.L. and Finlayson, A.J. 1968. The proteins of rapeseed (Brassica napus L) soluble in salt solutions [Белки рапса, растворимые в солевых растворах]. Can. J. Biochem., 46: 1191-1197.
Gehrig, P.M., Krzyzaniak, A., Barciszewski, J. and Biemann, K. 1996. Mass spectrometric amino acid sequencing of a mixture of seed storage proteins (napin) from Brassica napus, products of a multigene family [Масс-спектрометрическое определение аминокислотной последовательности в смеси запасных белков (напин) из семян рапса, продуктов мультигенного семейства]. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93: 3647-3652.
Monsalve, R.I. and Rodriguez, R. 1990. Purification and characterization of proteins from the 2S fraction from seeds of the Brassicaceae family [Очистка и характеристика белков из 2S-фракции из семян семейства крестоцветных]. J. Exper. Bot., 41 (222): 89-94.
Muren. E., Ek, В., Bjork, I. and Rask, L. 1996. Structural comparison of the precursor and the mature form of napin, the 2S storage protein in Brassica napus. [Сравнительная оценка структуры предшественника и зрелой формы напина - запасного белка 2S рапса]. Eur. J. Biochem., 242: 214-219.
Изоляты белка канолы настоящего изобретения отличаются от известных в предшествующем уровне техники тем, что обеспечиваемые изобретением изоляты белка канолы, в которых преобладает белок 2S, содержат также и небольшое количество белка 7S.
Канола известна также как рапсовое семя или масличный рапс.
Краткое изложение сущности изобретения
Неожиданно было установлено, что изолят белка канолы, имеющий повышенную долю белка 2S, предпочтительно содержащий, по меньшей мере, около 85% масс. белка 2S и имеющий пониженную долю белка 7S, проявляет отличные свойства в водном растворе по сравнению с изолятом белка канолы, полученным из супернатанта согласно способу, описанному в вышеупомянутых патентных заявках США №10/137391 и 10/476230.
В дополнение к такой же или улучшенной растворимости в широком диапазоне значений pH изолят белка канолы, предлагаемый настоящим изобретением, способен обеспечить повышенную прозрачность в растворе с безалкогольными напитками и напитками для спортсменов, что позволяет получить прозрачные, обогащенные белком напитки. Кроме того, изолят белка канолы показывает более высокую растворимость при pH~3,5 в 0,1 М растворе хлорида натрия, чем полученный из супернатанта изолят белка канолы.
В одном аспекте настоящего изобретения обеспечивается изолят белка канолы, состоящий преимущественно из белка канолы 2S, имеющий содержание белка, по меньшей мере, около 90% масс. (N×6,25), предпочтительно, по меньшей мере, примерно 100% масс. в пересчете на сухую массу (d.b.) и содержащий повышенную долю белка канолы 2S и пониженную долю белка канолы 7S в сравнении с изолятами белка канолы, состоящими преимущественно из белка канолы 2S и полученными из водного супернатанта от образования и осаждения белковых мицелл канолы. Изолят белка канолы получают изоэлектрическим осаждением белка 7S из супернатанта.
Изолят белка канолы и композиция настоящего изобретения обладают рядом уникальных свойств, отличающихся от свойств изолятов белка канолы, полученных из супернатанта, и включающих растворимость, прозрачность, термостойкость, способность к поглощению света при 280 нм, поверхностную гидрофобность и аминокислотный профиль. Эти свойства описаны ниже, а данные, подтверждающие указанные свойства, представлены в нижеприведенных примерах.
Растворимость
Изолят белка канолы показывает такую же или улучшенную растворимость в воде и в газированных и негазированных безалкогольных напитках и напитках для спортсменов по сравнению с изолятом белка канолы, полученным из супернатанта, в широком диапазоне pH и при концентрации белка около 1% масс./об.
В дополнение к этому, изолят белка канолы показывает такую же или улучшенную растворимость в воде в широком диапазоне pH и при концентрации белка примерно 1% масс./об., причем после образования растворов или дисперсий образцы центрифугируются для осаждения нерастворимого материала с получением прозрачного супернатанта.
Кроме того, изолят белка канолы показывает более высокую растворимость в 0,1 М растворе хлорида натрия при pH 3,5, чем изолят белка канолы, полученный из супернатанта.
Прозрачность
Изолят белка канолы может вводиться в большое число напитков, таких как газированные и негазированные безалкогольные напитки, а также соки, пунши и коктейли, с целью обогащения этих напитков белком. Такие напитки имеют широкий диапазон значений pH - примерно от 2,5 до 5,0 - и зачастую разливаются в упаковки в количестве 12 жидких унций (0,355 л). Изолят белка канолы может добавляться в любом подходящем количестве для обогащения напитка белком, например в количестве, по меньшей мере, около 5 г изолята белка канолы из расчета на 12 жидких унций (0,355 л).
Добавленный изолят белка канолы растворяется в напитке и не ухудшает прозрачности напитка. В прозрачном напитке при концентрации белка 2% масс. прозрачность составляет менее примерно 0,5 при определении ее путем измерения поглощения видимого света при 600 нм. В воде при концентрации белка 1% масс. прозрачность составляет менее примерно 1,0 в диапазоне pH примерно от 2 до 7 при определении ее путем измерения поглощения видимого света при 600 нм.
Термостойкость
В сравнении с изолятом белка канолы, полученным из супернатанта, изолят белка канолы настоящего изобретения показывает улучшенную термостойкость как при pH 6, так и при pH 7. После изоэлектрического осаждения белка 7S из супернатанта, что более подробно описывается ниже, термообработанный супернатант оказался устойчивым к последующему осаждению белка при нагреве.
Способность к поглощению света при 280 нм
Изолят белка канолы настоящего изобретения обладает более низкой способностью к поглощению света при 280 нм, чем полученный из супернатанта изолят белка канолы. Этот результат указывает на то, что изолят белка канолы настоящего изобретения содержит меньше тирозина и триптофана, поглощающих много света при 280 нм, чем белок канолы, полученный из супернатанта.
Поверхностная гидрофобность
Изолят белка канолы настоящего изобретения показывает более низкую поверхностную гидрофобность, чем полученный из супернатанта изолят белка канолы, что, по всей вероятности, можно объяснить пониженным содержанием глобулинов в новом изоляте белка канолы по сравнению с полученным из супернатанта изолятом белка канолы.
Поверхностная гидрофобность изолята белка канолы в большинстве случаев составляет ниже примерно 25, предпочтительно - ниже примерно 20.
Изолят белка канолы настоящего изобретения получают изоэлектрическим осаждением белка 7S из концентрированного супернатанта из способа патентных заявок США №10/137391 и №10/476230 с тем, чтобы снизить долю белка 7S в концентрированном супернатанте и, следовательно, увеличить долю белка 2S. Альтернативно, подобную обработку можно проводить на супернатанте перед его концентрированном или после его частичного концентрирования. Таким образом, в другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается способ получения изолята белка канолы, имеющего повышенную долю белка канолы 2S, который включает (а) обеспечение водного раствора белков 2S и 7S, состоящего преимущественно из белка 2S; (b) изоэлектрическое осаждение белка канолы 7S из водного раствора; (с) удаление осажденного белка 7S из водного раствора и (d) извлечение изолята белка канолы, имеющего содержание белка, по меньшей мере, около 90% масс. (N×6,25) в пересчете на сухую массу (d.b.) и содержащего повышенную долю белка канолы 2S по сравнению с водным раствором белков 2S и 7S.
Краткое описание фигур
На фиг.1 схематически показан способ получения белкового изолята.
На фиг.2 схематически показан способ, который применяется для получения изолята белка канолы настоящего изобретения из супернатанта от процесса образования РРМ, представленного на фиг.1.
Подробное описание изобретения
Изолят белка канолы, обеспечиваемый настоящим изобретением, имеет содержание белка, по меньшей мере, около 90% масс. (N×6,25), предпочтительно, по меньшей мере, примерно 100% масс. и может выделяться из муки из масличных семян канолы периодическим способом или непрерывным способом либо полунепрерывным способом.
Изолят белка канолы, обеспечиваемый настоящим изобретением, состоит преимущественно из белка 2S и содержит повышенную долю белка канолы 2S и пониженную долю белка канолы 7S в сравнении с изолятами белка канолы, состоящими преимущественно из белка 2S и полученными из супернатанта от образования и осаждения белковых мицелл канолы при таких же экспериментальных условиях. Как утверждалось выше, в изолятах белка канолы настоящего изобретения наряду с пониженной долей белка 7S и повышенной долей белка 2S обычно присутствует небольшое остаточное количество белка 7S. Изолят белка канолы получают изоэлектрическим осаждением белка 7S из супернатанта.
Изоляты белка канолы содержат, по меньшей мере, около 85% масс. белка канолы 2S и менее примерно 15% масс. белка канолы 7S; предпочтительно, по меньшей мере, около 90% масс. белка канолы 2S и менее примерно 10% масс. белка канолы 7S; более предпочтительно - максимально возможную долю белка 2S. Как отмечалось выше, такие изоляты белка канолы можно получить обработкой супернатанта, частично концентрированного супернатанта и концентрированного супернатанта, что более подробно описано ниже. Обработка супернатанта, частично концентрированного супернатанта и концентрированного супернатанта приводит к осаждению белка 7S, который может удаляться из обработанного супернатанта любым удобным способом, таким как центрифугирование или фильтрация. На белок 2S указанная обработка не оказывает влияния, и, следовательно, эта обработка повышает долю присутствующего белка 2S за счет снижения доли белка 7S.
Изолят белка канолы растворяется в водном растворе в широком диапазоне значений pH, в большинстве случаев при pH примерно от 2 до 7,5, предпочтительно - примерно от 2 до 4; в большинстве случаев он показывает растворимость, равную или превышающую растворимость изолята белка канолы, состоящего преимущественно из белка 2S и полученного из супернатанта от образования и осаждения белковых мицелл канолы при таких же экспериментальных условиях. К тому же, водные растворы изолята белка канолы в безалкогольных напитках, включая как газированные, так и негазированные безалкогольные напитки, и в напитках для спортсменов, включая как газированные, так и негазированные энергетические напитки для спортсменов, например напитки промышленного производства, показывают более высокую прозрачность, чем такие же водные растворы изолята белка канолы, состоящего преимущественно из белка 2S и полученного из супернатанта от образования и осаждения белковых мицелл канолы при одинаковых условиях получения.
Концентрация изолята белка канолы в водном растворе, включая раствор в безалкогольных напитках и напитках для спортсменов, может варьировать в зависимости от предполагаемого использования раствора. В большинстве случаев концентрация белка может варьировать примерно от 0,1% до 30% масс., предпочтительно - примерно от 1% до 5% масс.
Таким образом, настоящее изобретение включает водные растворы обеспечиваемого им изолята белка канолы, к которым относятся не только вышеупомянутые растворы, но и другие напитки, такие как соки, алкогольные напитки, напитки на кофейной основе и напитки на молочной основе.
Начальная стадия способа получения изолятов белка канолы включает солюбилизацию белкового материала из муки из масличных семян канолы. Белковый материал, выделенный из муки из семян канолы, может быть нативным белком, присутствующим в семенах канолы, или белковый материал может представлять собой белок, модифицированный генетической манипуляцией, но обладающий характерными для нативного белка гидрофобными и полярными свойствами. Мука канолы может быть любой мукой канолы, полученной от удаления масла канолы из масличных семян канолы, с варьирующим уровнем неденатурированного белка, например, полученной от экстракции горячим гексаном или холодной экструзии масла. Удаление масла канолы из масличных семян канолы обычно осуществляется как отдельная операция описываемого здесь способа получения изолята белка.
Солюбилизация белка наиболее эффективно осуществляется при использовании раствора пищевой соли, поскольку присутствие соли облегчает удаление растворимого белка из муки из масличных семян. Если изолят белка канолы предназначается для непищевых целей, то можно использовать химические реагенты непищевого качества. Соль обычно является хлоридом натрия, хотя могут использоваться и другие соли, такие как хлорид калия. Раствор соли имеет ионную силу, по меньшей мере, примерно 0,05, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 0,10, что позволяет достигать солюбилизации значительных количеств белка. С повышением ионной силы солевого раствора степень солюбилизации белка в муке из масличных семян начинает увеличиваться до тех пор, пока не достигнет максимального значения. Любое последующее повышение ионной силы раствора не приводит к увеличению общего количества солюбилизированного белка. Ионная сила раствора пищевой соли, которая инициирует максимальную солюбилизацию белка, варьирует в зависимости от используемой соли и выбранной муки из масличных семян.
С учетом повышенной степени разбавления, требуемой для осаждения белка при увеличении ионной силы, обычно предпочитается использовать значение ионной силы, ниже примерно 0,8, более предпочтительно - примерно от 0,1 до 0,15.
В периодическом способе солюбилизация белка солью осуществляется при температуре примерно от 5°C до 75°C и предпочтительно сопровождается перемешиванием для сокращения времени солюбилизации, которое обычно составляет примерно от 10 до 60 минут. Предпочтительно проводить солюбилизацию таким образом, чтобы экстрагировать максимально достижимое на практике количество белка из муки из масличных семян с тем, чтобы обеспечить высокий общий выход продукта.
В качестве нижнего температурного предела выбрана температура примерно 5°C, поскольку при температуре, ниже указанной, солюбилизация замедляется, что делает ее неэкономичной, в то время как в качестве верхнего предпочтительного температурного предела выбрана температура примерно 75°C, которая учитывает температуру денатурации некоторых из присутствующих белков.
В непрерывном способе экстрагирование белка из муки из масличных семян канолы проводится любым способом, обеспечивающим эффективное непрерывное экстрагирование белка из муки из масличных семян канолы. В одном варианте воплощения способа мука из масличных семян канолы непрерывно смешивается с раствором пищевой соли и смесь транспортируется по трубопроводу, длина которого и скорость потока в котором обеспечивают время нахождения смеси в трубопроводе, достаточное для достижения требуемого экстрагирования в соответствии с указанными здесь параметрами. В таком непрерывном способе стадия солюбилизации солью осуществляется быстро - за время примерно до 10 минут; предпочтительно проводить солюбилизацию таким образом, чтобы экстрагировать максимально достижимое на практике количество белка из муки из масличных семян канолы. Солюбилизация в непрерывном способе проводится при температурах примерно от 5°C до 75°C, предпочтительно - примерно от 15°C до 35°C.
Водный раствор пищевой соли в большинстве случаев имеет pH примерно от 5 до 6,8, предпочтительно - примерно от 5,3 до 6,2; pH раствора соли может устанавливаться на любом желательном для стадии экстракции уровне в диапазоне pH примерно от 5 до 6,8 с использованием подходящей кислоты, обычно соляной кислоты, или щелочи, обычно гидроксида натрия.
Концентрация муки из масличных семян в растворе пищевой соли на стадии солюбилизации может варьировать в широких пределах. Типичные значения концентрации составляют примерно от 5% до 15% масс./об.
Стадия экстрагирования белка водным раствором соли сопровождается дополнительным эффектом солюбилизации жиров, которые могут присутствовать в муке канолы, что впоследствии приводит к присутствию жиров в водной фазе.
Белковый раствор, полученный на стадии экстракции, в большинстве случаев имеет концентрацию белка примерно от 5 до 40 г/л, предпочтительно - примерно от 10 до 30 г/л.
Водный раствор соли может содержать антиоксидант. Антиоксидант может быть любым пригодным для данной цели антиоксидантом, таким как сульфит натрия или аскорбиновая кислота. Количество используемого антиоксиданта может варьировать примерно от 0,01% до 1% масс. раствора, предпочтительно - примерно 0,05% масс. Антиоксидант служит для ингибирования окисления фенольных соединений в белковом растворе.
Водная фаза от стадии экстракции может затем отделяться от остаточной муки канолы любым удобным способом, например с использованием декантирующей центрифуги с последующей обработкой в тарельчатой центрифуге и/или фильтрацией для удаления остаточной муки. Отделенная остаточная мука может подвергаться сушке для последующего использования.
Цвет готового изолята белка канолы можно улучшить с приданием ему более светлой окраски и менее интенсивного желтого оттенка путем смешивания активированного угля в порошке или другого адсорбента пигментов с отделенным водным белковым раствором и последующего удаления адсорбента (обычно фильтрацией) с получением белкового раствора. Для удаления пигментов может применяться также диафильтрация.
Указанная стадия удаления пигментов может проводиться в любых удобных для этого условиях, в большинстве случаев при комнатной температуре отделенного водного белкового раствора с использованием любого подходящего адсорбента пигментов. В случае использования активированного угля в порошке его количество составляет примерно от 0,025% до 5% масс./об., предпочтительно - примерно от 0,05% до 2% масс./об.
Если мука из семян канолы содержит значительные количества жира, как указывается в патентах США №№5844086 и 6005076, правопреемником по которым является автор настоящей заявки и содержание которых включено в настоящую заявку в виде ссылок, то описанные в этих патентах стадии обезжиривания могут проводиться на отделенном водном белковом растворе и на концентрированном водном белковом растворе, обсуждаемых ниже. Если предусматривается стадия улучшения цвета, то эта стадия может проводиться после первой стадии обезжиривания.
В качестве альтернативы экстракции муки из масличных семян водным раствором соли такая экстракция может проводиться с использованием только одной воды, хотя использование только воды приводит к экстрагированию меньшего количества белка из муки из масличных семян, чем при использовании водного раствора соли. В случае использования такого альтернативного способа соль в концентрациях, указанных выше, может добавляться к белковому раствору после отделения его от остаточной муки из масличных семян с целью удержания белка в растворе в ходе стадии концентрирования, описанной ниже. Если удаление жира проводится в одну стадию, то соль обычно добавляется по завершении этой операции.
Другим альтернативным способом является экстракция муки из масличных семян раствором пищевой соли при относительно высоком значении pH - выше примерно 6,8, в большинстве случаев - примерно до pH 9,9. Значение pH раствора пищевой соли может устанавливаться на требуемом уровне в щелочной области pH с использованием любой пригодной пищевой щелочи, такой как водный раствор гидроксида натрия. Альтернативно, экстракция муки из масличных семян раствором соли может проводиться при относительно низком pH - ниже примерно pH 5, в большинстве случаев - ниже примерно pH 3. При применении этого альтернативного способа водная фаза от стадии экстракции муки из масличных семян отделяется затем от остаточной муки канолы любым пригодным способом, таким как декантирующее центрифугирование с тарельчатым центрифугированием и/или фильтрацией для удаления остаточной муки. Отделенная остаточная мука может подвергаться сушке для последующего использования.
pH водного белкового раствора от стадии экстракции при высоком или низком pH устанавливается затем в диапазоне pH примерно от 5 до 6,8, предпочтительно - примерно от 5,3 до 6,2, как описано выше, перед последующей обработкой, которая обсуждается ниже. Такое регулирование pH может проводиться с использованием любой пригодной для этого кислоты, такой как соляная кислота, или щелочи, такой как гидроксид натрия, в зависимости от потребности.
Водный белковый раствор концентрируется для увеличения концентрации белка в нем при одновременном поддержании ионной силы раствора, в основном постоянной. Такое концентрированно в большинстве случаев проводится для получения концентрированного белкового раствора, имеющего концентрацию белка, по меньшей мере, около 50 г/л, предпочтительно, по меньшей мере, около 200 г/л, более предпочтительно, по меньшей мере, около 250 г/л.
Стадия концентрирования может проводиться любым удобным путем, совместимым с периодическим или непрерывным способом, например с применением любой удобной селективной мембранной технологии, такой как ультрафильтрация или диафильтрация, с использованием мембран, таких как мембраны из полых волокон или мембраны, свернутые в спирали, с соответствующей проницаемостью по молекулярной массе, например, примерно от 3000 до 100000 дальтон, предпочтительно - примерно от 5000 до 10000 дальтон, в зависимости от различных материалов, из которых изготовлены мембраны, и конфигурации мембран, а в случае непрерывного способа - в зависимости от размеров мембран, обеспечивающих требуемую степень концентрирования водного белкового раствора, пропускаемого через мембраны.
Как хорошо известно, ультрафильтрация и аналогичные селективные мембранные технологии обеспечивают прохождение низкомолекулярных веществ через мембрану с одновременным удерживанием веществ с более высокой молекулярной массой на мембране. Низкомолекулярные соединения включают не только ионные виды пищевой соли, но и низкомолекулярные материалы, экстрагированные из исходного материала, такие как углеводы, пигменты и антипитательные факторы, а также любые низкомолекулярные формы белка. Обычно выбирается мембрана с такой проницаемостью по молекулярной массе, которая обеспечивает удерживание значительной доли белка в растворе при одновременном прохождении загрязняющих веществ через мембрану, что зависит от различных материалов, из которых изготовлены мембраны, и конфигурации мембран.
Концентрированный белковый раствор может затем подвергаться стадии диафильтрации с использованием водного раствора соли такой же молярности и с таким же pH, какие имеет экстракционный раствор. Указанная диафильтрация может осуществляться с использованием примерно от 2 до 20 объемов диафильтрационного раствора, предпочтительно - примерно от 5 до 10 объемов диафильтрационного раствора. В ходе диафильтрации из водного белкового раствора удаляются дополнительные количества загрязняющих веществ, которые проходят через мембрану в пермеат. Операция диафильтрации может проводиться до тех пор, пока в пермеат не перейдут значительные дополнительные количества загрязняющих веществ и красящих веществ с заметной окраской. Указанная диафильтрация может осуществляться с применением той же мембраны, какая использовалась на стадии концентрирования. Однако при необходимости стадия диафильтрации может проводиться с применением отдельной мембраны с разной молекулярной проницаемостью, например мембраны с проницаемостью по молекулярной массе примерно от 3000 до 100000 дальтон, предпочтительно - примерно от 5000 до 10000 дальтон, в зависимости от материала, из которого изготовлена мембрана, и конфигурации мембраны.
В диафильтрационной среде может присутствовать антиоксидант, по меньшей мере, на каком-то этапе стадии диафильтрации. Антиоксидант может представлять собой любой пригодный для данной цели антиоксидант, такой как сульфит натрия или аскорбиновая кислота. Количество антиоксиданта, используемое в диафильтрационной среде, зависит от применяемых материалов и может варьировать примерно от 0,01% до 1% масс., предпочтительно составляя около 0,05% масс. Антиоксидант служит для ингибирования окисления фенольных соединений, присутствующих в концентрированном растворе изолята белка канолы.
Стадия концентрирования и стадия диафильтрации могут проводиться при любой удобной температуре, в большинстве случаев при температуре примерно от 20°C до 60°C, предпочтительно - примерно от 20°C до 30°C, в течение периода времени, достаточного для достижения требуемой степени концентрирования. Применяемые температурные и другие режимы зависят до некоторой степени от мембранного оборудования, используемого для проведения концентрирования, и от требуемой концентрации белка в растворе.
Концентрированный и необязательно диафильтрованный белковый раствор может подвергаться, при необходимости, последующей операции обезжиривания, как описано в патентах США №5844086 и 6005076.
Концентрированный и необязательно диафильтрованный белковый раствор может подвергаться операции удаления красящих веществ, альтернативной описанной выше операции удаления красящих веществ. Для этой цели может использоваться активированный уголь в порошке, а также гранулированный активированный уголь (GAC). Другим материалом, который может применяться в качестве адсорбента красящих веществ, является поливинилпирролидон.
Стадия обработки адсорбентом красящих веществ может проводиться при любых удобных условиях, в большинстве случаев при комнатной температуре раствора белка канолы. В случае применения активированного угля в порошке его количество может составлять примерно от 0,025% до 5% масс./об., предпочтительно - примерно от 0,05% до 2% масс./об. Если в качестве адсорбента красящих веществ используется поливинилпирролидон, то его количество может составлять примерно от 0,5% до 5% масс./об., предпочтительно - примерно от 2% до 3% масс./об. Адсорбент красящих веществ может удаляться из раствора белка канолы любым пригодным для этого способом, например фильтрацией.
Концентрированный и необязательно диафильтрованный раствор от необязательной стадии удаления красящих веществ может подвергаться пастеризации с целью уничтожения любых бактерий, которые могут присутствовать в муке-сырье как следствие ее хранения или других факторов и экстрагироваться из муки в раствор изолята белка канолы на стадии экстракции. Такая пастеризация может осуществляться при любых требуемых режимах пастеризации. В большинстве случаев концентрированный и необязательно диафильтрованный белковый раствор пастеризуется при температуре примерно от 55°C до 70°C, предпочтительно - примерно от 60°C до 65°C, в течение примерно от 10 до 15 минут, предпочтительно - в течение примерно 10 минут. Затем пастеризованный концентрированный белковый раствор может охлаждаться для последующей обработки, как описывается ниже, предпочтительно до температуры примерно от 25°C до 40°C.
В зависимости от температуры, применяемой на стадии концентрирования и необязательной стадии диафильтрации, и от того, проводится стадия пастеризации или нет, концентрированный белковый раствор может подогреваться до температуры, по меньшей мере, примерно от 20°C до 60°C, предпочтительно - примерно от 25°C до 40°C, для снижения вязкости концентрированного белкового раствора и облегчения, тем самым, выполнения последующей стадии разбавления и образования мицелл. Концентрированный белковый раствор не должен нагреваться до температуры, выше которой не происходит образования мицелл при разбавлении охлажденной водой.
Затем концентрированный белковый раствор от стадии концентрирования и необязательной стадии диафильтрации, необязательной стадии удаления красящих веществ, необязательной стадии пастеризации и необязательной стадии обезжиривания разбавляется с тем, чтобы инициировать образование мицелл при смешивании концентрированного белкового раствора с охлажденной водой, берущейся в объеме, требуемом для достижения желательной степени разбавления. Степень разбавления концентрированного белкового раствора может варьировать в зависимости от той доли белка канолы, которую желательно получить мицеллярным путем, и от той доли белка канолы, которая извлекается из супернатанта. В большинстве случаев при пониженных уровнях разбавления значительно больше белка канолы остается в водной фазе.
В том случае, если желательно получить максимальную долю белка мицеллярным путем, концентрированный белковый раствор разбавляется примерно в 5-25 раз, предпочтительно - примерно в 10-20 раз.
Охлажденная вода, с которой смешивается концентрированный белковый раствор, имеет температуру ниже примерно 15°C, в большинстве случаев - примерно от 1°C до 15°C, предпочтительно - ниже примерно 10°C, поскольку повышенный выход белкового изолята в форме белковой мицеллярной массы обеспечивается именно этими более низкими температурами при используемых коэффициентах разбавления.
В периодическом способе партия концентрированного белкового раствора добавляется в статическую толщу охлажденной воды, взятой в требуемом объеме, как обсуждалось выше. Разбавление концентрированного белкового раствора и, как следствие этого, понижение ионной силы раствора инициирует образование, в виде помутнения, массы из высокоассоциированных белковых молекул в виде дискретных белковых капель в мицеллярной форме. В периодическом способе белковые мицеллы оставляются в покое для оседания их в толще охлажденной воды с образованием агрегатированной коалесцирующей, плотной аморфной, клейкой наподобие клейковины, белковой мицеллярной массы (РММ). Оседание можно ускорить, например, центрифугированием. Индуцированное таким путем оседание уменьшает содержание жидкости в белковой мицеллярной массе, снижая, тем самым, ее влагосодержание в большинстве случаев примерно с 70% масс. - 95% масс. до значения, составляющего в большинстве случаев примерно от 50% масс. до 80% масс. от общей мицеллярной массы. Снижение влагосодержания мицеллярной массы таким путем приводит и к уменьшению содержания соли, поглощенной мицеллярной массой, и, следовательно, содержания соли в сухом изоляте.
Альтернативно, операция разбавления может выполняться в непрерывном режиме путем непрерывной подачи концентрированного белкового раствора в одно входное отверстие Т-образного трубопровода, в то время как вода для разбавления поступает в другое входное отверстие Т-образного трубопровода, в результате чего смешивание происходит в самом трубопроводе. Вода для разбавления подается в Т-образный трубопровод со скоростью, достаточной для достижения требуемой степени разбавления концентрированного белкового раствора.
Смешивание концентрированного белкового раствора и воды для разбавления в трубопроводе инициирует образование белковых мицелл, и смесь непрерывно отводится через выходное отверстие Т-образного трубопровода в резервуар-отстойник, из которого после его наполнении супернатант сливается с осадка. Смесь предпочтительно подается в толщу жидкости в резервуаре-отстойнике таким образом, чтобы минимизировать турбулентность в толще жидкости.
В непрерывном способе белковые мицеллы оставляются в покое для оседания их в резервуаре-отстойнике с образованием агрегатированной коалесцирующей, плотной аморфной, клейкой наподобие клейковины, белковой мицеллярной массы (РММ), и этот процесс продолжается до тех пор, пока на дне резервуара-отстойника не накопится желательное количество РММ, после чего накопившаяся РММ выгружается из резервуара-отстойника. Вместо осаждения седиментацией РММ может непрерывно отделяться центрифугированием.
Комбинация параметров процесса концентрирования белкового раствора до предпочтительного содержания белка, составляющего, по меньшей мере, примерно 200 г/л, и использование коэффициента разбавления примерно от 10 до 20 приводят к повышению выхода продукта, зачастую - к значительному повышению выхода продукта в пределах количества белка, извлекаемого в форме белковой мицеллярной массы из исходного экстракта муки, и к получению намного более "чистых" изолятов в плане количественного содержания белка по сравнению с выходами и чистотой изолятов, достигаемыми при использовании любого из известных способов получения белковых изолятов предшествующего уровня техники, описанных в вышеупомянутых патентных заявках США.
По сравнению с периодическим способом применение непрерывного способа для получения изолята белка канолы позволяет значительно сократить по времени начальную стадию экстрагирования белка при том же уровне его экстрагирования и применять значительно повышенные температуры на указанной стадии. В дополнение к этому в непрерывном способе риск загрязнения меньше, чем в периодическом способе, что приводит к получению продукта более высокого качества и к возможности осуществления способа на более компактном оборудовании.
Осажденный изолят отделяется от остаточной водной фазы или супернатанта, например, декантацией остаточной водной фазы от осевшей массы или центрифугированием. РММ может использоваться во влажном виде или может подвергаться сушке любым пригодным способом, таким как распылительная сушка или сублимационная сушка, для получения ее в сухом виде. Сухая РММ имеет высокое содержание белка - выше примерно 90% масс., предпочтительно, по меньшей мере, около 100% масс. (при расчете по Кьельдалю N×6,25) белка, в основном неденатурированного (что показали измерения дифференциальной сканирующей калориметрией). Сухая РММ, выделенная из жиросодержащей муки из масличных семян, имеет также низкое остаточное содержание жира, что неизбежно в случае применения способов патентов США №5844086 и 6005076, которое может составлять менее примерно 1% масс.
Как указывается в вышеупомянутых патентных заявках США №10/413371 и 10/510766, РММ состоит преимущественно из белка канолы 7S и имеет следующее содержание белковых компонентов: примерно от 60% до 98% масс. белка 7S, примерно от 1% до 15% масс. белка 12S и от 0 до примерно 25% масс. белка 2S.
Супернатант от стадии образования и осаждения РММ содержит значительные количества белка канолы, не осажденного на стадии разбавления, и подвергается дальнейшей обработке с целью извлечения из нее изолята белка канолы. Как описывается в вышеупомянутых патентных заявках США №10/413371 и 10/510766, изолят белка канолы, полученный из супернатанта, состоит преимущественно из белка канолы 2S и имеет следующее содержание белковых компонентов: примерно от 60% до 95% масс. белка 2S, примерно от 5% до 40% масс. белка 7S и от 0 до примерно 5% масс. белка 12S.
Супернатант от стадии разбавления, проводимой после удаления РММ, концентрируется с целью повышения концентрации белка в нем. Такое концентрирование осуществляется с применением любой подходящей селективной мембранной технологии, например ультрафильтрации, с использованием мембран с соответствующей проницаемостью по молекулярной массе, обеспечивающей прохождение низкомолекулярных веществ, включающих соль и другие небелковые низкомолекулярные материалы, экстрагированные из белоксодержащего исходного материала, через мембрану при одновременном удержании белка канолы в растворе. Можно использовать ультрафильтрационные мембраны с проницаемостью по молекулярной массе примерно от 3000 до 100000 дальтон, предпочтительно - примерно от 5000 до 10000 дальтон в зависимости от различных материалов, из которых изготовлены эти мембраны, и конфигурации мембран. Концентрирование супернатанта таким путем сокращает также объем жидкости, подлежащей удалению в процессе сушки для получения белка. В большинстве случаев супернатант концентрируется перед сушкой до концентрации белка, по меньшей мере, около 50 г/л, предпочтительно - примерно от 100 до 300 г/л, более предпочтительно - примерно от 200 до 300 г/л. Указанная операция концентрирования может проводиться в периодическом режиме или в виде непрерывной операции, как описано выше для стадии концентрирования белкового раствора.
Концентрированный супернатант может подвергаться затем стадии диафильтрации с использованием воды, содержащей соль или подкисленной воды. Стадия диафильтрации может проводиться с использованием примерно от 2 до 20 объемов диафильтрационного раствора, предпочтительно - примерно от 5 до 10 объемов диафильтрационного раствора. При операции диафильтрации из водного супернатанта удаляются дополнительные количества загрязняющих веществ, которые проходят через мембрану с пермеатом. Операция диафильтрации может проводиться до тех пор, пока в пермеат не перейдут значительные дополнительные количества загрязняющих веществ и красящих веществ с видимой окраской. Такая диафильтрация может осуществляться с использованием той же мембраны, какая использовалась на стадии концентрирования. Однако при необходимости диафильтрация может проводиться с использованием отдельной мембраны, например мембраны с проницаемостью по молекулярной массе примерно от 3000 до 100000 дальтон, предпочтительно - примерно от 5000 до 10000 дальтон, в зависимости от различных материалов, из которых изготовлена мембрана, и конфигурации мембраны.
В диафильтрационной среде может присутствовать антиоксидант, по меньшей мере, на каком-то этапе стадии диафильтрации. Антиоксидант может представлять собой любой пригодный антиоксидант, такой как сульфит натрия или аскорбиновая кислота. Количество антиоксиданта в диафильтрационной среде зависит от используемых материалов и может варьировать примерно от 0,01% до 1% масс., предпочтительно - примерно 0,05% масс. Антиоксидант служит для ингибирования окисления фенольных соединений, присутствующих в концентрированном растворе изолята белка канолы.
Концентрированный и необязательно диафильтрованный белковый раствор может подвергаться операции удаления красящих веществ, альтернативной описанной выше операции удаления красящих веществ. Для этой цели могут применяться активированный уголь в порошке, а также гранулированный активированный уголь (GAC). Другим материалом, который может использоваться в качестве адсорбента красящих веществ, является поливинилпирролидон.
Стадия обработки адсорбентом красящих веществ может проводиться в любых пригодных для этого условиях, в большинстве случаев при комнатной температуре раствора белка канолы. В случае применения активированного угля в порошке его количество может составлять примерно от 0,025% до 5% масс./об., предпочтительно - примерно от 0,05% до 2% масс./об. Если в качестве адсорбента красящих веществ используется поливинилпирролидон, то его количество может составлять примерно от 0,5% до 5% масс./об., предпочтительно - примерно от 2% до 3% масс./об. Адсорбент красящих веществ может удаляться из раствора белка канолы любым подходящим способом, например фильтрацией.
В соответствии с настоящим изобретением концентрированный и необязательно диафильтрованный супернатант после необязательной операции удаления красящих веществ обрабатывается методом изоэлектрического осаждения с целью снижения количества белка 7S, присутствующего в растворе, удаления белка 7S и повышения за счет этого доли белка 2S в белке канолы, присутствующем в концентрированном супернатанте.
Указанный способ обработки может осуществляться при pH и степени солености, достаточных для снижения доли белка 7S, присутствующего в концентрированном супернатанте, предпочтительно - для значительного уменьшения доли белка 7S. В большинстве случаев содержание белка 7S в супернатанте снижается такой обработкой, по меньшей мере, примерно на 50% масс., предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 75% масс. Осажденный белок 7S может удаляться любым пригодным способом, таким как центрифугирование или фильтрация либо их комбинация.
В процессе изоэлектрической обработки в супернатант, частично концентрированный супернатант или концентрированный супернатант сначала добавляется соль, обычно хлорид натрия, хотя могут использоваться и другие соли, такие как хлорид калия, для получения подсоленного раствора с электропроводимостью, по меньшей мере, около 0,3 миллисименс (мСм), предпочтительно - примерно от 10 до 20 мСм.
pH подсоленного супернатанта доводится до значения, которое инициирует изоэлектрическое осаждение белка 7S, в большинстве случаев - до pH примерно от 2,0 до 4,0, предпочтительно - примерно от 3,0 до 3,5. Изоэлектрическое осаждение белка 7S может проводиться в широком диапазоне температур, в большинстве случаев при температуре примерно от 5°C до 70°C, предпочтительно - примерно от 10°C до 40°C. Осажденный белок 7S удаляется из изоэлектрически осажденного супернатанта любым пригодным способом, таким как центрифугирование или фильтрация либо их комбинация.
Изоэлектрически осажденный супернатант, если он еще не сконцентрирован, подвергается затем концентрированию, как описано выше, и диафильтрации для удаления соли перед последующей сушкой концентрированного и диафильтрованного супернатанта для получения изолята белка канолы изобретения. Концентрированный, диафильтрованный и изоэлектрически осажденный супернатант может быть подвергнут фильтрации для удаления остаточных макрочастиц и необязательной стадии удаления красящих веществ, как обсуждалось выше, перед сушкой любым пригодным способом, таким как распылительная сушка или сублимационная сушка, для получения изолята белка канолы согласно изобретению в сухом виде. Сухой изолят белка канолы имеет высокое содержание белка - свыше примерно 90% масс., предпочтительно, по меньшей мере, примерно 100% масс. белка (N×6,25).
Перед сушкой pH концентрированного, диафильтрованного и изоэлектрически осажденного супернатанта может доводиться до значения pH, соответствующего предполагаемому использованию сухого изолята; в большинстве случаев это значение pH составляет примерно от 2 до 5, предпочтительно - примерно от 2,5 до 4.
Этот изолят белка канолы содержит высокую долю белка 2S - предпочтительно, по меньшей мере, 90% масс., наиболее предпочтительно, по меньшей мере, около 95% масс. белка канолы в изоляте. Изолят содержит также некоторую долю белка 7S.
Альтернативно, изоэлектрическая обработка супернатанта для осаждения белка 7S может проводиться на супернатанте перед вышеупомянутыми стадиями концентрирования и диафильтрации. После удаления осажденного белка 7S супернатант концентрируется, необязательно подвергается диафильтрации, необязательно подвергается операции удаления красящих веществ и сушке с получением изолята белка канолы согласно изобретению.
В качестве еще одной альтернативы, супернатант можно подвергнуть сначала частичному концентрированию до любого подходящего уровня, а уже частично сконцентрированный супернатант можно подвергнуть изоэлектрической обработке для осаждения белка 7S. Затем, после удаления осажденного белка 7S, супернатант концентрируют в большинстве случаев до концентрации примерно от 50 до 300 г/л, предпочтительно - примерно от 200 до 300 г/л, необязательно подвергают диафильтрации, необязательно подвергают операции удаления красящих веществ и сушке до получения изолята белка канолы согласно изобретению.
Осажденный белок 7S удаляется из супернатанта, частично концентрированного супернатанта или концентрированного супернатанта любым пригодным способом, таким как центрифугирование или фильтрация либо их комбинация.
После удаления осажденного белка 7S значение pH изоэлектрически обработанного супернатанта или частично сконцентрированного изоэлектрически обработанного супернатанта может доводиться до любого значения в процессе или после концентрирования или диафильтрации, как обсуждалось выше.
Описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения
На фиг.1 показан способ двухстадийной мембранной обработки в сравнении с получением изолятов белка канолы (CPI) мицеллярным путем.
Как можно видеть, ретентат от первой стадии ультрафильтрации (Ультрафильтрация #1), которая может включать стадии ультрафильтрации и диафильтрации, обрабатывается одним из двух путей. В способе двухстадийной мембранной обработки ретентат подвергается распылительной сушке с получением изолята белка канолы, который состоит преимущественно из белка канолы 7S.
В способе вышеупомянутых патентных заявок США №10/137321 и 10/476230 ретентат подвергается стадии разбавления, на которой изолят белка канолы осаждается в виде белковой мицеллярной массы. Белковая мицеллярная масса подвергается распылительной сушке с получением изолята белка канолы, состоящего преимущественно из белка канолы 7S.
В способе с двухстадийной мембранной обработкой пермеат от первой стадии ультрафильтрации подвергается второй стадии ультрафильтрации (Ультрафильтрация #2-А), которая может включать ультрафильтрацию и диафильтрацию. Ретентат от второй стадии ультрафильтрации подвергается распылительной сушке с получением изолята белка канолы, состоящего преимущественно из белка 2S.
В способе US 10/137321 и 10/476230 супернатант от осаждения белковой мицеллярной массы подвергается стадии ультрафильтрации (Ультрафильтрация #2-В), которая может включать ультрафильтрацию и диафильтрацию. Ретентат от стадии ультрафильтрации сначала подвергается изоэлектрическому осаждению белка 7S, а затем распылительной сушке с получением изолята белка канолы, состоящего преимущественно из белка 2S.
На фиг.2 показаны способы обработки супернатанта от процесса мицеллообразования для получения изолята белка канолы согласно изобретению, в которых изоэлектрическое осаждение супернатанта проводится либо после его концентрирования (Ультрафильтрация #2) (схема справа на фиг.2), либо перед его концентрированием (схема слева на фиг.2).
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Пример 1
Настоящий пример описывает один из способов получения изолята белка канолы
К 'а' кг муки из семян канолы добавляли 'b' л 0,1 М раствора NaCl при температуре окружающей среды и перемешивали в течение 30 минут до получения водного белкового раствора. Остаточную муку канолы удаляли, а полученный белковый раствор осветляли путем центрифугирования и фильтрации с получением 'с' л фильтрованного белкового раствора, имеющего содержание белка 'd' % масс.
Аликвоту 'е' л раствора белкового экстракта уменьшали в объеме до 'f' л путем концентрирования на поливинилидендифторидной (PVDF) мембране с проницаемостью по молекулярной массе 5000 дальтон, а затем подвергали диафильтрации на той же мембране с 'g' л 0,1 М раствора NaCl. Диафильтрованный ретентат пастеризовали при 60°C в течение 10 минут. Полученный пастеризованный концентрированный белковый раствор имел содержание белка 'h' % масс.
Концентрированный раствор при 'i' °C разбавляли в соотношении 'j' холодной RO-водой, имеющей температуру 'k' °C. Мгновенно образовавшееся белое помутнение оставляли в покое для его оседания. Верхний слой взятой для разбавления воды удаляли, а осевшую вязкую, клейкую массу (РММ) извлекали со дна емкости. Выход составил 'l' % масс. фильтрованного белкового раствора. Установлено, что сухой белок, полученный из РММ, имел содержание белка 'm' % (N×6,25) в пересчете на сухую массу (d.b.). Продукт был обозначен 'n' C300.
Параметры с 'а' по 'n' для двух процессов приводятся в нижеследующей табл.I.
Таблица I
n
BW-SA034-J12-04A
BW-SA035-J14-04A
а
15
15
b
150
150
с
75
68
d
1,93
1,95
е
75
68
f
4
4
g
20
20
h
19,08
14,20
i
33
33
j
1:10
1:10
k
3
3
l
37,45
28,32
m
103,08
99,73
Удаленный супернатант сокращали в объеме до 'о' л путем ультрафильтрации с использованием полиэфирсульфоновой (PES) мембраны с проницаемостью по молекулярной массе 10000 дальтон, а полученный концентрат подвергали затем диафильтрации на той же мембране с использованием 'р' л воды. Диафильтрованный концентрат пастеризовали при 60°C в течение 10 минут. Пастеризованный концентрат содержал 'q' % масс. белка. Вместе с дополнительным белком, извлеченным из супернатанта, общий выход белка из фильтрованного белкового раствора составил 'r' % масс. Пастеризованный концентрат разделяли на две одинаковые порции. Одну порцию подвергали распылительной сушке с получением готового продукта, обозначенного 'n' С200 и имевшего содержание белка 's' % (N×6,25) d.b.
Параметры с 'n' по 's' для двух процессов приводятся в нижеследующей табл.II.
Таблица II
n
BW-SA034-J12-04A
BW-SA035-J14-04A
o
3,5
3
p
7
6
q
4,83
4,30
r
49,35
38,05
s
91,73
93,69
Вторую порцию пастеризованного концентрированного супернатанта нагревали до 85°C в течение 10 минут, а затем центрифугировали для удаления осажденного белка. Полученный концентрат подвергали распылительной сушке до получения готового продукта, обозначенного 'n' C200H и имевшего содержание белка 't' % (N×6,25). Параметры с 'n' по 't' для двух процессов приводятся в нижеследующей табл.III.
Таблица III
n
BW-SA034-J12-04A
BW-SA035-J14-04A
t
91,32
92,11
Пример 2
Настоящий пример описывает альтернативный способ получения изолята белка канолы.
К муке канолы добавляли раствор хлорида натрия при температуре окружающей среды и перемешивали в течение 30 минут до получения водного белкового раствора. Остаточную муку канолы удаляли, а полученный белковый раствор осветляли путем центрифугирования и фильтрации.
Аликвоту раствора белкового экстракта сокращали в объеме путем концентрирования на поливинилидендифторидной (PVDF) мембране, после чего необязательно подвергали диафильтрации на той же мембране с раствором хлорида натрия. Ретентат пастеризовали затем при 60°C в течение 10 минут.
Концентрированный раствор разбавляли холодной RO-водой. Мгновенно образовавшееся белое помутнение оставляли в покое для его оседания. Верхний слой взятой для разбавления воды удаляли, а осевшую вязкую, клейкую массу (РММ) извлекали либо декантацией либо центрифугированием. РММ подвергали распылительной сушке для получения готового продукта.
Затем тепловая обработка проводилась на удаленной воде, использовавшейся для разбавления (супернатант), частично концентрированном супернатанте или концентрированном супернатанте.
В случае проведения тепловой обработки на концентрированном супернатанте 'а' л супернатанта уменьшали в объеме до 'b' л путем ультрафильтрации с использованием полиэфирсульфоновой (PES) мембраны с проницаемостью по молекулярной массе 'с' дальтон, а полученный концентрат подвергали затем диафильтрации на той же мембране с 'd' л воды. Диафильтрованный концентрат пастеризовали при 60°C в течение 10 минут. Пастеризованный концентрат содержал 'е' % масс. белка. Вместе с дополнительным белком, извлеченным из супернатанта, общий выход белка из фильтрованного белкового раствора составил 'f' % масс. Пастеризованный концентрат разделяли на две одинаковые порции. Одну порцию 'g' л подвергали распылительной сушке с получением готового продукта, обозначенного 'h' C200 и имевшего содержание белка 'i' % (N×6,25) d.b.
Параметры с 'а' по 'i' для шести процессов приводятся в нижеследующей табл.IV.
Таблица IV
h
BW-SA033-Е10-04А
BW-MS034-Е04-05А
BW-SD061-К07-05А
BW-SD062-L18-05A
BW-SD061-I26-06A
BW-SD062-К20-06А
а
755
36
33
451
n/а
n/а
b
38
2,9
4,5
45
n/а
n/а
с
100000
10000
10000
10000
n/а
n/а
d
0
7
23,5
225
n/а
n/а
е
15,2
5,7
6,18
8,73
n/а
n/а
f
53,7
51,8
66,7
58,4
n/а
n/а
g
38
1,45
0
0
n/а
n/а
i
97,12
95,23
n/а
n/а
n/а
n/а
n/a = данных нет
Другую порцию 'j' л пастеризованного концентрированного супернатанта нагревали до 85°C в течение 10 минут, а затем центрифугировали для удаления осажденного белка. Полученный остаточный центрифугат подвергали затем распылительной сушке для получения готового продукта, обозначенного 'h' C200H и имевшего содержание белка 'k' % (N×6,25) d.b. Параметры 'h', 'j' и 'k' для шести процессов приводятся в нижеследующей табл.V.
Таблица V
h
BW-SA033-Е10-04А
BW-MS034-Е04-05А
BW-SD061-К07-05А
BW-SD062-L18-05A
BW-SD061-I26-06A
BW-SD062-К20-06А
j
0
1,45
4,5
45
n/а
n/а
k
n/а
92,9
95,49
96,86
n/а
n/а
В случае проведения тепловой обработки на супернатанте или частично концентрированном супернатанте 'l' л супернатанта уменьшали в объеме до 'm' л путем ультрафильтрации с использованием полиэфирсульфоновой (PES) мембраны с проницаемостью по молекулярной массе 'n' дальтон. Затем супернатант или частично концентрированный супернатант нагревали до 85°C в течение 10 минут, после чего центрифугировали для удаления осажденного белка. При необходимости остаточный осажденный белок удаляли фильтрацией. Осветленный образец уменьшали затем в объеме до 'о' л путем ультрафильтрации с использованием полиэфирсульфоновой (PES) мембраны с проницаемостью по молекулярной массе 'р' дальтон. Концентрат содержал 'q' % масс. белка. Вместе с дополнительным белком, извлеченным из супернатанта, общий выход белка из фильтрованного белкового раствора составил 'r' % масс. Концентрат подвергали распылительной сушке для получения готового продукта, обозначенного 'h' C200HS и имевшего содержание белка 's' % (N×6,25) d.b. Параметры 'h' и с 'l' по 's' для шести процессов приводятся в нижеследующей табл.VI.
Таблица VI
h
BW-SA033-E10-04A
BW-MS034-E04-05A
BW-SD061-K07-05A
BW-SD062-L18-05A
BW-SD061-I26-06A
BW-SD062-K20-06A
l
n/a
n/a
n/a
n/a
670
908
m
n/a
n/a
n/a
n/a
670
228
n
n/a
n/a
n/a
n/a
n/a
10000
o
n/a
n/a
n/a
n/a
26,4
25,6
p
n/a
n/a
n/a
n/a
10000
10000
q
n/a
n/a
n/a
n/a
11,6
12,57
r
n/a
n/a
n/a
n/a
59,3
57,5
s
n/a
n/a
n/a
n/a
92,38
92,42
Пример 3
Настоящий пример описывает получение изолята белка канолы в соответствии с одним вариантом воплощения изобретения.
К муке канолы добавляли раствор хлорида натрия при температуре окружающей среды и перемешивали в течение 30 минут до получения водного белкового раствора. Остаточную муку канолы удаляли, а полученный белковый раствор осветляли путем центрифугирования и фильтрации.
Аликвоту раствора белкового экстракта сокращали в объеме путем концентрирования на полиэфирсульфоновой (PES) мембране. Затем ретентат пастеризовали при 60°C в течение 1 минуты.
Концентрированный раствор разбавляли холодной RO-водой. Мгновенно образовалось белое помутнение. Осевшую вязкую, клейкую массу (РММ) отделяли от супернатанта центрифугированием. РММ подвергали распылительной сушке для получения готового продукта.
'а' л супернатанта смешивали с 'b' кг хлорида натрия для доведения концентрации соли примерно до 0,1 М. После добавления соли pH доводили до 3,5 добавлением разбавленной соляной кислоты. Электропроводимость образца составила 14,03 мСм. Образец оставляли в покое в течение 10 минут, как только белок начал осаждаться.
Осажденный белок удаляли центрифугированием из подкисленного супернатанта. Осажденный белок подвергали распылительной сушке для получения готового продукта.
pH подкисленного супернатанта снижали до 3 добавлением разбавленной соляной кислоты. Затем 'с' л подкисленного супернатанта уменьшали в объеме примерно до 'd' л путем ультрафильтрации с использованием полиэфирсульфоновой (PES) мембраны с проницаемостью по молекулярной массе 'е' дальтон, после чего концентрат подвергали диафильтрации на той же мембране с 'f' л подкисленной воды. Диафильтрованный концентрат фильтровали для удаления остаточного осажденного белка. Аликвоту 'g' кг подвергали распылительной сушке для получения готового продукта, обозначенного 'h' C200IS, который имел содержание белка 'i' % масс. (N×6,25) d.b.
Параметры с 'а' по 'i' приводятся в нижеследующей табл.VIII.
Таблица VIII
h
BW-SA077-K07-07A
а
111,2
b
0,65
с
95
d
7
е
10000
f
30
g
4
i
92,86
Пример 4
Настоящий пример содержит оценку растворимости сухих изолятов белка канолы распылительной сушки, полученных в примерах 2 и 3.
Растворимость высушенного распылительной сушкой концентрированного супернатанта (С200) и модифицированных продуктов (С200Н и C200HS), полученных способами примера 2, и изоэлектрически осажденного супернатанта (C200IS), полученного способами примера 3, определяли с помощью модифицированной версии методики Morr et al., J. Food Sci. 50: 1715-1718.
Количество порошка сухого белка, достаточное для обеспечения 0,5 г белка, взвешивали в лабораторном стакане, затем добавляли небольшое количество очищенной методом обратного осмоса (RO) воды, и смесь перемешивали до получения однородной пасты. Затем добавляли дополнительную воду для доведения объема до примерно 45 мл. Содержимое лабораторного стакана медленно вымешивали в течение 60 минут с помощью магнитной мешалки. pH определяли сразу после диспергирования белка и устанавливали на соответствующем уровне (pH 2, 3, 4, 5, 6 или 7) добавлением NaOH или HCl. Был приготовлен также образец с нативным pH. В образцах с установленным pH величину pH измеряли и корректировали дважды за время перемешивания 60 минут. Спустя 60 минут перемешивания общий объем образца доводили RO водой до 50 мл, что обеспечило получение 1% масс./об. белковой дисперсии. Аликвоту белковой дисперсии резервировали для определения содержания белка Leco-анализом с помощью прибора для определения азота Leco FA28 Nitrogen Determinator. Вторую порцию образца центрифугировали при 8000 g в течение 10 минут с получением осадка нерастворившегося материала и прозрачного супернатанта. Содержание белка в супернатанте определяли Leco-анализом.
Растворимость (%) = (концентрация белка в супернатанте/концентрация белка в первоначальной дисперсии) × 100.
Полученные результаты приводятся в нижеследующей табл.IX.
Таблица IX
Партия
Продукт
Растворимость (%)
pH 2
pH 3
pH 4
pH 5
pH 6
pH 7
Нативный pH
SA033-Е10-04А
Концентрированный супернатант (С200)
86,5
86,7
91,7
97,2
81,2
75,6
89,8
MS043-Е04-05А
Концентрированный супернатант (С200)
87,4
81,5
92,4
95,3
93,8
94,2
89,8
MS043-Е04-05А
Модифицированный концентрированный супернатант (С200Н)
100
100
100
91,7
92,5
90,7
94,3
SD061-К07-05А
Модифицированный концентрированный супернатант (С200Н)
96,7
95,7
100
97,2
81,2
75,6
89,8
SD062-L18-05A
Модифицированный концентрированный супернатант (С200Н)
98,8
89,0
97,9
100
94,1
100
100
SD061-I26-06A
Супернатант сначала термообработанный, затем сконцентрированный (C200HS)
97,7
92,4
100
95,9
100
98,4
94,3
SD062-К20-06А
Супернатант частично сконцентрированный, затем термообработанный, затем сконцентрированный (C200HS)
100
94,1
100
91,8
100
100
90,6
SA077-К07-07А
Изоэлектрически осажденный супернатант (C200IS)
100
98,0
100
95,7
100
100
100
Как можно видеть из результатов табл.IX, сухие изоляты из модифицированного концентрированного супернатанта (С200Н); термообработанного, а затем сконцентрированного супернатанта (C200HS) и изоэлектрически осажденного супернатанта заметно лучше растворялись в воде при различных значениях pH, чем сухой изолят из концентрированного супернатанта (С200), полученный согласно примеру 1.
Пример 5
Настоящий пример содержит оценку растворимости изолятов белка канолы распылительной сушки, полученных в примерах 2 и 3, в безалкогольном напитке и в напитке для спортсменов.
Растворимость в безалкогольном напитке (Спрайт) или в напитке для спортсменов высушенного распылительной сушкой концентрированного супернатанта (С200) и модифицированных продуктов (С200Н и C200HS), полученных способами примера 2, и изоэлектрически осажденного супернатанта (C200IS), полученного способами примера 3, определяли по модифицированной методике Morr et al., J. Food Sci. 50: 1715-1718, как описано выше в примере 4, но вместо воды использовали безалкогольный напиток или напиток для спортсменов, концентрация белка составляла 2% масс./об., регулирование pH не проводилось.
Полученные результаты приводятся в нижеследующей табл.X.
Таблица Х
Партия
Продукт
Растворимость (%) в газированном безалкогольном напитке
Растворимость (%) в негазированном напитке для спортсменов
SA033-E10-04А
Концентрированный супернатант (С200)
91,5
85,2
MS043-E04-05А
Концентрированный супернатант (С200)
94,2
84,8
MS043-E04-05А
Модифицированный концентрированный супернатант (С200Н)
92,0
96,3
SD061-K07-05А
Модифицированный концентрированный супернатант (С200Н)
99,3
97,0
SD062-L18-05А
Модифицированный концентрированный супернатант (С200Н)
100
98,2
SD061-I26-06А
Супернатант сначала термообработанный, затем сконцентрированный (C200HS)
100
98,7
SD062-K20-06А
Супернатант частично сконцентрированный, затем термообработанный, затем сконцентрированный (C200HS)
97,3
95,6
SA077-K07-07А
Изоэлектрически осажденный супернатанть (C200IS)
95,2
95,7
Как можно видеть из результатов табл.X, сухой изолят из модифицированного концентрированного супернатанта (С200Н); термообработанного, а затем сконцентрированного супернатанта (C200HS) и изоэлектрически осажденного супернатанта (C200IS) были заметно лучше растворимы в безалкогольном напитке и напитке для спортсменов, чем сухой изолят из концентрированного супернатанта (С200).
Пример 6
Настоящий пример содержит оценку прозрачности растворов изолятов белка канолы распылительной сушки, полученных в примерах 2 и 3, которые были приготовлены растворением указанных изолятов в воде при различных значениях pH.
Количество порошка сухого белка, достаточное для обеспечения 0,5 г белка, взвешивали в лабораторном стакане, затем добавляли небольшое количество очищенной методом обратного осмоса (RO) воды и смесь перемешивали до получения однородной пасты. Затем добавляли дополнительную воду для доведения объема до примерно 45 мл. Содержимое лабораторного стакана медленно вымешивали в течение 60 минут с помощью магнитной мешалки. pH определяли сразу после диспергирования белка и устанавливали на соответствующем уровне (pH 2, 3, 4, 5, 6 или 7) добавлением NaOH или HCl. Был приготовлен также образец с нативным pH. В образцах с установленным pH величину pH измеряли и корректировали дважды за время перемешивания 60 минут. Спустя 60 минут перемешивания общий объем образца доводили RO-водой до 50 мл, что обеспечило получение 1% масс./об. белковой дисперсии. Прозрачность растворов определяли путем измерения спектрофотометром спектральной поглощательной способности (СПС) при 600 нм с использованием чистой воды в качестве контроля. Чем ниже показатель СПС, тем выше прозрачность.
Полученные результаты приводятся в нижеследующей табл.XI.
Как можно видеть из результатов табл.XI, сухой изолят из модифицированного концентрированного супернатанта (С200Н); термообработанного, а затем сконцентрированного супернатанта (C200HS) и изоэлектрически осажденного супернатанта (C200IS) дали заметно более прозрачные растворы в воде при различных значениях pH, чем сухой изолят из концентрированного супернатанта (С200). Это различие было наиболее выраженным при низких значениях pH.
Пример 7
Настоящий пример содержит оценку прозрачности растворов сухих изолятов распылительной сушки, полученных в примерах 2 и 3, которые были приготовлены растворением указанных изолятов в безалкогольном напитке или в напитке для спортсменов.
Прозрачность оценивали путем измерения поглощения видимого света при 600 нм раствором 2% масс./об. белка в бесцветном прозрачном газированном безалкогольном напитке промышленного производства (Спрайт) или в окрашенном негазированном напитке для спортсменов промышленного производства (Апельсиновый пунш марки Gatorade). Перед измерением прозрачности образца, содержащего белок, проводилась поверка спектрофотометра чистым образцом (т.е. без белка) соответствующего напитка. Чем ниже показатель способности к поглощению света, тем лучше светопропускание и тем выше прозрачность раствора.
Полученные результаты приводятся в нижеследующей табл.XII.
Таблица XII
Партия
Продукт
А600 в газированном безалкогольном напитке
А600 в негазированном напитке для спортсменов
SA033-E10-04A
Концентрированный супернатант (С200)
2,716
2,808
MS043-E04-05A
Концентрированный супернатант (С200)
2,248
2,514
MS043-E04-05A
Модифицированный концентрированный супернатант (С200Н)
0,397
0,954
SD061-K07-05A
Модифицированный концентрированный супернатант (С200Н)
0,099
0,363
SD062-L18-05A
Модифицированный концентрированный супернатант (С200Н)
0,079
0,344
SD061-I26-06A
Супернатант сначала термообработанный, затем сконцентрированный (C200HS)
0,081
0,326
SD062-K20-06A
Супернатант частично сконцентрированный, затем термообработанный, затем сконцентрированный (C200HS)
0,092
0,311
SA077-K07-07A
Изоэлектрически осажденный супернатант (C200IS)
0,040
0,168
Как можно видеть из результатов табл.XII, прозрачность растворов, приготовленных из полученного распылительной сушкой изолята из модифицированного концентрированного супернатанта (С200Н); термообработанного, а затем сконцентрированного супернатанта (C200HS) и из изоэлектрически осажденного супернатанта (C200IS) была намного выше прозрачности растворов, приготовленных из высушенного распылительной сушкой концентрированного супернатанта (С200).
Пример 8
Настоящий пример содержит значения pH традиционных напитков.
Значение pH традиционных напитков определяли pH-метром и полученные результаты представили в нижеследующей табл.XIII.
Таблица XIII
Значения pH традиционных напитков
Напиток
pH
Кока-кола классик
2,68
Диетическая кока-кола
3,41
Севен-ап
3,60
Спрайт
3,24
Маунтин дью (с фруктовыми вкусовыми добавками)
3,10
Имбирный эль фирмы Canada Dry
2,85
Чай со льдом (напиток с чайным ароматом)
3,19
Персиковый чай со льдом фирмы Snapple Beverage Corp.
2,96
Содовая (вода)
4,61
Gatorade - товарный знак фруктовых пуншей:
Апельсиновый пунш
2,98
Фруктовый пунш
3,05
Лимон-лайм пунш
2,97
Фруктовый напиток SoBe на основе зеленого чая
2,72
Яблочный сок (не из концентрата)
3,62
Апельсиновый сок (из концентрата)
3,91
Виноградный сок (из концентрата)
3,20
Купажированный сок из тропических плодов (яблоко, апельсин, ананас, пассифлора, манго) (из концентрата)
3,77
Купажированный сок (яблоко, апельсин, пассифлора) (из концентрата)
3,69
Фруктовый пунш
2,93
Клюквенный коктейль (глинтвейн)
2,77
Пример 9
Настоящий пример содержит дополнительную оценку растворимости высушенного распылительной сушкой концентрированного супернатанта (С200), модифицированных продуктов (С200Н и C200HS) и изоэлектрически осажденного супернатанта (C200IS), полученных способами примеров 1, 2 и 3.
Количество порошка сухого белка, достаточное для обеспечения 0,5 г белка, взвешивали в лабораторном стакане, затем добавляли небольшое количество очищенной методом обратного осмоса (RO) воды и смесь перемешивали до получения однородной пасты. Затем добавляли дополнительную воду для доведения объема до примерно 45 мл. Содержимое лабораторного стакана медленно перемешивали в течение 60 минут с помощью магнитной мешалки. pH определяли сразу после диспергирования белка и устанавливали на соответствующем уровне (pH 2, 3, 4, 5, 6 или 7) добавлением NaOH или HCl. Был приготовлен также образец с нативным pH. В образцах с установленным pH величину pH измеряли и корректировали дважды за время перемешивания 60 минут. Спустя 60 минут перемешивания общий объем образца доводили RO-водой до 50 мл, что позволило получить 1% масс./об. белковую дисперсию. Образцы (20 мл) дисперсий переносили затем в предварительно взвешенные центрифужные пробирки, высушенные в печи при 105°C в течение 30 минут, а затем охлажденные в сушильном шкафу, которые закрывали колпачками. Образцы центрифугировали при 7800 g в течение 10 минут с получением осадка не растворившегося материала и прозрачного супернатанта. Супернатант и колпачки пробирок удаляли, а полученный осадок высушивали в течение ночи в печи, установленной на 55°C. На следующее утро пробирки переносили в сушильный шкаф для охлаждения. Регистрировали массу сухого материала осадка. Сухую массу исходного порошка белка рассчитывали путем умножения массы порошка на коэффициент [(100 - влагосодержание порошка (%))/100]. Затем рассчитывали растворимость продукта:
растворимость (%) = [(1 - (масса сухого осадка нерастворимого материала/(2/5 × масса исходного порошка сухого белка))) × 100].
Полученные результаты приводятся в нижеследующей табл.XIV.
Таблица XIV
Партия
Продукт
Растворимость (%)
pH 2
pH 3
pH 4
pH 5
pH 6
pH 7
Нативный pH
SA034-J12-04A
Модифицированный концентрированный супернатант (С200Н)
99,0
97,7
96,0
97,2
87,5
89,5
89,9
SA035-J14-04A
Концентрированный супернатант (С200)
96,2
95,7
96,0
93,3
86,2
87,5
86,7
SA035-J14-04A
Модифицированный концентрированный супернатант (С200Н)
97,1
97,3
96,6
97,2
87,9
87,4
90,8
SA033-Е10-04А
Концентрированный супернатант (С200)
91,4
90,0
91,8
91,9
81,1
84,9
89,3
MS043-Е04-05А
Концентрированный супернатант (С200)
93,9
92,9
93,5
91,9
86,1
82,7
87,5
SD061-К07-05А
Модифицированный концентрированный супернатант (С200Н)
98,8
97,6
97,4
95,3
91,0
93,3
94,8
SD061-I26-06A
Супернатант сначала термообработанный, затем сконцентрированный (C200HS)
97,5
97,6
98,4
95,8
88,2
92,7
88,1
SD062-К20-06А
Супернатант частично сконцентрированный, затем термообработанный, затем сконцентрированный (C200HS)
98,3
98,2
97,9
97,6
91,9
92,2
93,4
SA07-К07-07А
Изоэлектрически осажденный супернатант (C200IS)
99,4
100
99,3
97,8
96,3
98,5
99,9
Как можно видеть из результатов табл.XIV, сухие изоляты из модифицированного концентрированного супернатанта (С200Н); термически обработанного, а затем сконцентрированного супернатанта (C200HS) и изоэлектрически осажденного супернатанта (C200IS) заметно более растворимы в воде при различных значениях pH, чем сухой изолят из концентрированного супернатанта (С200).
Пример 10
Настоящий пример содержит оценку термостойкости при pH 7 высушенного распылительной сушкой концентрированного супернатанта (С200), модифицированного продукта (С200Н) и изоэлектрически осажденного супернатанта (C200IS), полученных способами примеров 1, 2 и 3.
Количество порошка сухого белка, достаточное для обеспечения 1,6 г белка, взвешивали в лабораторном стакане, затем добавляли примерно 15 г очищенной методом обратного осмоса (RO) воды и смесь перемешивали в течение, в общей сложности, 60 минут с помощью магнитной мешалки. При необходимости продукт также вручную диспергировали в условиях перемешивания перемешивающим стержнем, как и в случае с магнитной мешалкой. Спустя 30 минут перемешивания определяли pH образца и доводили его до pH 7 добавлением, в случае необходимости, NaOH или HCl. Затем образец перемешивали в продолжение еще 30 минут. Спустя 60 минут перемешивания, контролировали pH и при необходимости повторно доводили его до pH 7; затем общую массу образца доводили до 20 г добавлением RO-воды, что позволило получить 8% масс./масс. белковую дисперсию. Дисперсии переносили в предварительно взвешенные центрифужные пробирки, предварительно высушенные в печи при 105°C в течение 30 минут, а затем охлажденные в сушильном шкафу. Фиксировали массу дисперсии в пробирках, затем пробирки с образцами закрывали колпачками и подвергали тепловой обработке, поместив их на 30 минут в водяную баню температурой 90°C. В ходе тепловой обработки уровень воды поддерживали более высоким, чем уровень жидкости в образце. После тепловой обработки образцы сразу же охлаждали, поместив их в баню с ледяной водой. После этого образцы помещали на всю ночь в холодильник. На следующее утро образцы трижды центрифугировали каждый раз при 7800 g в течение 10 минут. Супернатант декантировали из пробирок (при этом наблюдались некоторые незначительные потери осадка нерастворимого материала в ряде образцов, в которых указанный осадок не был полностью компактным) и снимали колпачки с пробирок. Осадок высушивали, поместив незакрытые пробирки на всю ночь в печь с температурой 55°C. На следующее утро образцы переносили в сушильный шкаф для охлаждения. Измеряли массу сухого осадка нерастворимого материала. Сухую массу исходного порошка белка рассчитывали путем умножения массы порошка на коэффициент [(100 - влагосодержание порошка (%))/100]. Затем рассчитывали влияние тепловой обработки на растворимость продукта следующим образом:
% нерастворимого порошка после тепловой обработки = [(масса сухого осадка нерастворимого материала/масса дисперсии в центрифужной пробирке/20) × начальная масса порошка сухого белка] × 100.
Полученные результаты приводятся в нижеследующей табл.XV.
Таблица XV
Образец
% исходного порошка, не растворившегося после тепловой обработки
SA034-J12-04A С200
22,8
SA034-J12-04A С200Н
12,3
SA035-J14-04A С200
18,6
SA035-J14-04A С200Н
12,7
SA033-E10-04A С200
42,2
SD061-K07-05A С200Н
14,6
SA077-K07-07A C200IS
5,8
Как можно видеть из результатов табл.XV, термостойкость растворов, приготовленных из полученных распылительной сушкой изолятов из модифицированного концентрированного супернатанта (С200Н) и изоэлектрически осажденного супернатанта (C200IS), превышает термостойкость растворов, приготовленных из полученного распылительной сушкой изолята из концентрированного супернатанта (С200).
Пример 11
Настоящий пример содержит оценку термостойкости при pH 6 высушенного распылительной сушкой концентрированного супернатанта (С200), модифицированных продуктов (С200Н и C200HS) и изоэлектрически осажденного супернатанта (C200IS), полученных способами примеров 1, 2 и 3.
Количество порошка сухого белка, достаточное для обеспечения 0,3 г белка, взвешивали в лабораторном стакане, затем добавляли около 25 г очищенной методом обратного осмоса (RO) воды и смесь перемешивали в течение, в общей сложности, 60 минут с помощью магнитной мешалки. Спустя 30 минут перемешивания определяли pH образца и в зависимости от его значения доводили до pH 6 добавлением либо NaOH, либо HCl. После этого образец перемешивали еще в течение дополнительных 30 минут. Спустя 60 минут перемешивания контролировали значение pH и при необходимости повторно устанавливали его на pH 6, после чего общую массу образца доводили до 30 г добавлением RO-воды, что позволило получить 1% масс./масс. белковую дисперсию. Дисперсии переносили в предварительно взвешенные центрифужные пробирки, предварительно высушенные в печи при 105°C в течение 30 минут, а затем охлажденные в сушильном шкафу. Фиксировали массу дисперсии в пробирках, затем пробирки с образцами закрывали колпачками и подвергали тепловой обработке, поместив их на 10 минут в водяную баню температурой 85°C. В ходе тепловой обработки уровень воды поддерживали более высоким, чем уровень жидкости в образце. После тепловой обработки образцы сразу же охлаждали, поместив их в баню с ледяной водой. Затем образцы центрифугировали при 7800 g в течение 10 минут. Супернатант декантировали из пробирок и снимали колпачки с пробирок. Полученный осадок высушивали, поместив незакрытые пробирки на всю ночь в печь температурой 55°C. На следующее утро пробирки переносили в сушильный шкаф для охлаждения. Измеряли массу сухого осадка. Сухую массу исходного порошка белка рассчитывали путем умножения массы порошка на коэффициент [(100 - влагосодержание порошка (%))/100]. Затем рассчитывали влияние тепловой обработки на растворимость продукта следующим образом:
% не растворившегося порошка после тепловой обработки = [(масса сухого нерастворимого осадка/масса дисперсии в центрифужной пробирке/30) × начальная масса сухого порошка белка] × 100.
Полученные результаты приведены в нижеследующей табл.XVI.
Таблица XVI
Образец
% исходного порошка, не растворившегося после тепловой обработки
SA034-J12-04A С200
19,6
SA034-J12-04A С200Н
9,0
SA035-J14-04A С200
27,5
SA035-J14-04A С200Н
13,7
SA033-E10-04A С200
30,4
SD061-K07-05A С200Н
8,9
SA077-K07-07A C200IS
4,5
Как можно видеть из результатов табл.XVI, термостойкость растворов, приготовленных из высушенного распылительной сушкой изолята из модифицированного концентрированного супернатанта (С200Н), термообработанного, а затем сконцентрированного супернатанта (C200HS) и изоэлектрически осажденного супернатанта (C200IS), превышает термостойкость растворов, приготовленных из высушенного распылительной сушкой изолята из концентрированного супернатанта (С200).
Пример 12
Настоящий пример содержит оценку растворимости при pH 3,5 и в условиях солености (0,10 М NaCl) высушенного распылительной сушкой концентрированного супернатанта (С200), модифицированного продукта (С200Н) и изоэлектрически осажденного супернатанта (C200IS), полученных способами примеров 1, 2 и 3.
Количество сухого белка в порошке, достаточное для обеспечения 0,5 г белка, взвешивали в лабораторном стакане, а затем добавляли около 45 г 0,1 М NaCl. Содержимое стакана перемешивали в течение 30 минут с помощью магнитной мешалки. Затем доводили pH до 3,5 добавлением HCl, после чего образец перемешивали в течение еще 30 минут. Одновременно контролировали pH и при необходимости вновь устанавливали pH 3,5. Затем массу образца доводили до 50 г добавлением дополнительного количества 0,1 М NaCl, что позволило получить 1% масс./масс. белковую дисперсию. Образцы (примерно по 30 г) дисперсий переносили затем в предварительно взвешенные центрифужные пробирки, предварительно высушенные в течение 30 минут в печи при температуре 105°C, а затем охлажденные в сушильном шкафу. Фиксировали массу дисперсии в пробирках и закрывали пробирки колпачками. Образцы центрифугировали при 7800 g в течение 10 минут с получением нерастворимого осадка. Супернатант декантировали из пробирок (примечание: наблюдались некоторые очень незначительные потери осадка нерастворимого материала в ряде образцов, в которых указанный осадок не был полностью компактным) и снимали колпачки с пробирок. Полученный осадок сушили в течение ночи в печи с установленной температурой 55°C. На следующее утро пробирки переносили в сушильный шкаф для охлаждения. Фиксировали массу сухого осадка материала. Сухую массу исходного порошка белка рассчитывали путем умножения массы используемого порошка на коэффициент [(100 - влагосодержание порошка (%))/100]. Затем рассчитывали влияние pH и концентрации соли на растворимость продукта следующим образом:
% не растворившегося порошка в условиях эксперимента = [(масса сухого нерастворимого осадка)/((масса исходного образца в центрифужной пробирке/50) × начальная масса сухого порошка белка)] × 100.
Полученные результаты приведены в нижеследующей табл.XVII.
Таблица XVII
Образец
% исходного порошка, не растворившегося в 0,1 М NaCl при pH 3,5
SA034-J12-04A С200
4,1
SA034-J12-04A С200Н
1,4
SA035-J14-04A С200
9,4
SA035-J14-04A С200Н
2,6
SA033-E10-04A С200
19,1
SD061-K07-05A С200Н
1,6
SA077-K07-07A C200IS
0,8
Как можно видеть из результатов табл.XVII, сухие изоляты из модифицированного концентрированного супернатанта (С200Н) и изоэлектрически осажденного супернатанта (C200IS) были заметно лучше растворимы в солевом растворе при pH 3,5, чем сухой изолят из концентрированного супернатанта (С200).
Пример 13
Настоящий пример содержит оценку поверхностной гидрофобности высушенного распылительной сушкой супернатанта (С200), модифицированных продуктов (С200Н и C200HS) и изоэлектрически осажденного супернатанта (C200IS), полученных способами примеров 1, 2 и 3.
0
0
0
Поверхностную гидрофобность различных изолятов определяли при комнатной температуре с помощью теста на поверхностную гидрофобность (S), предусматривающего применение гидрофобного красителя 1-анилин-8-нафталенсульфоната (ANS). Относительную интенсивность флуоресценции измеряли спектрофлуориметром (S), при этом гидрофобность белков определяли путем расчета общего наклона кривых интенсивности относительной флуоресценции (RFI). Чем выше (S), тем более гидрофобным является белок, поскольку краситель притягивается гидрофобными участками белковой молекулы.
Поскольку полученный из концентрированного супернатанта белок (С200) содержит более высокий процент глобулина (7S), этот изолят обладает, как было установлено, повышенной гидрофобностью согласно ANS-тесту. Глобулины канолы считаются достаточно гидрофобными, и это было доказано настоящим примером. Модифицированные продукты показали, как и ожидалось, более низкие значения вследствие пониженных уровней белков глобулинов. Основным компонентом обоих изолятов является альбумин напин. Этот белок является высокополярным, чем и объясняется его очень низкая поверхностная гидрофобность.
Результаты приводятся в нижеследующей табл.XVIII. Данные таблицы скорректированы к содержанию белка 100% (N×6,25) в каждом изоляте.
Таблица XVIII
Образец
% 7S
S<sub>0</sub> 100% N×6,25
SA033-E10-04A С200
32,18
78,1
SA034-J12-04A С200
13,13
32,6
SA035-J14-04A С200
24,52
58,1
SA034-J12-04A С200Н
3,55
12
SA035-J14-04A С200Н
7,55
14,9
SD061-I26-06A C200HS
4,05
12,1
SA077-K07-07A C200IS
3,12
17,6
Как можно видеть из результатов табл.XVIII, сухие изоляты, полученные из модифицированного концентрированного супернатанта (С200Н); термообработанного, а затем сконцентрированного супернатанта (C200HS) и изоэлектрически осажденного супернатанта (C200IS), были заметно менее гидрофобными, чем сухой изолят из концентрированного супернатанта (С200). Кроме того, результаты показывают, что поверхностная гидрофобность связана линейной зависимостью с содержанием глобулинов.
Пример 14
Настоящий пример содержит оценку способности к поглощению света при 280 нм 1 мг/мл белковых растворов высушенного распылительной сушкой концентрированного супернатанта (С200), модифицированных продуктов (С200Н и C200HS) и изоэлектрически осажденного супернатанта (C200IS), полученных способами примеров 1, 2 и 3.
Количество сухого белка в порошке, достаточное для обеспечения 50 мг белка, отвешивали в лабораторном стакане, затем добавляли около 45 мл 10 мМ фосфатного буфера, pH 6,66, и смесь перемешивали в общей сложности в течение 60 минут с помощью магнитной мешалки. Спустя 60 минут перемешивания общий объем образца доводили до 50 мл добавлением буфера, что обеспечило концентрацию белка 1 мг/мл. Образцы осветляли центрифугированием при 7800 g в течение 10 минут; затем супернатанты переносили в кварцевую кювету и считывали поглощение света при 280 нм с использованием фосфатного буфера в качестве контроля.
Полученные результаты приводятся в нижеследующей табл.XIX.
Таблица XIX
Образец
Способность к поглощению света при 280 нм
SA034-J12-04A С200
0,694
SA034-J12-04A С200Н
0,656
SA035-J14-04A С200
0,710
SA035-J14-04A С200Н
0,654
SA033-E10-04A С200
0,700
SD061-I26-06A C200HS
0,668
SA077-K07-07A C200IS
0,611
Как можно видеть из результатов табл.XIX, растворы, приготовленные из высушенного распылительной сушкой супернатанта (С200), поглощали больше света при 280 нм, чем растворы, приготовленные из модифицированного (С200Н); термообработанного, а затем сконцентрированного супернатанта (C200HS) и изоэлектрически осажденного супернатанта (C200IS).
Промышленная применимость
Говоря кратко, настоящее изобретение обеспечивает изолят белка канолы, содержащий повышенную долю белка 2S и пониженную долю белка 7S, который может найти применение в приготовлении прозрачных водных растворов, в частности в напитках. Возможны модификации в масштабе изобретения.