БИОЧИП ДЛЯ МУЛЬТИПЛЕКСНОГО АНАЛИЗА

Полезная модель относится к области медицины, а именно к диагностике и может быть использована для диагностики онкологических заболеваний. Кроме того, полезная модель может быть использована в ветеринарии, а также в области биологии, иммунологии и цитологии.
Известен биочип (RU №2436843, МПК C12Q 1/00, дата публ. 27.12.2008 г.). Биочип состоит из твердого носителя, рабочих зон с кластерами, содержащими зонды и идентификатор. Твердый носитель, в свою очередь, состоит из двух частей, связанных между собой посредством гибкого многослойного листа, закрепленного на их поверхности с помощью клеевого слоя. Кластеры с зондами расположены симметрично относительно продольной или поперечной оси носителя на многослойном гибком листе и/или на поверхности твердого носителя. При сгибе многослойный лист обеспечивает совмещение кластеров с зондами, расположенных на первой и второй частях носителя, и формирование реакционных объемов либо с помощью сквозных отверстий, выполненных в гибком многослойном листе, расположение которых совпадает с расположением кластеров, или с помощью прокладок, закрепленных по краям многослойного листа и снабженных клеевым слоем.
Недостатком известного биочипа является невозможность визуализации результатов реакции в проходящем свете, данное устройство не применимо для исследования цельных клеток, т.к. содержит праймеры для фрагментов нуклеиновых кислот. Недостатком известного устройства является необходимость совмещения кластеров с зондами расположенных на первой и второй части носителя для создания реакционных объемов.
В качестве прототипа выбран известный биочип для мультиплексного анализа, содержащий прозрачную подложку, выполненную из стекла с нанесенным на его поверхность полилизином, на которой размещены тестовые участки с иммобилизованными антителами, специфичными к антигенам клеток. (А.В. Шишкин, И.И. Шмырев, С.А. Кузнецова, Н.Г. Овчинина, А.А. Бутылин, Ф.И. Атауллаханов, А.И. Воробьев «Иммунологические биочипы для исследования эритроцитов человека». Биологические мембраны, 2008, том 25, 4, с 267-276).
Известный биочип содержит следующие антитела: CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD27, CD29, CD31, CD36, CD38, CD41, CD44, CD45, CD45RA, CD56, CD71, CD72, CD95, CD98, HLA-DR, IgM.
Известный биочип работает следующим образом.
Биочип, содержащий иммобилизированные антитела, помещают в проточную камеру и инкубируют с суспензией клеток. Клетки, имеющие на своей поверхности соответствующие антигены, связываются с антителами, иммобилизированными в строго определенных участках подложки. Затем биочип отмывают от не связавшихся с антителами клеток потоком жидкости с заданной скоростью. Скорость потока жидкости может быть подобрана такой, что происходит отрыв только тех клеток, которые не связались с антителами, а клетки, даже слабо связавшиеся с антителами, остаются на поверхности биочипа. Наличие связавшихся клеток устанавливается путем просмотра пятен биочипа с помощью микроскопа.
Недостатками известного устройства являются невозможность исследования клеток содержащихся в серозных выпотах, по причине наличия большого количества неклеточных элементов, а именно наличие клеток фибробластов, соединительнотканных элементов, что не позволяет проводить исследование в проточной камере, повышает массу исследуемого образца, что влечет за собой недостаточную прочность связывания клеток с антителами. Серозные выпоты на сегодня являются часто встречающимся симптомом заболеваний воспалительного характера, таких как острый панкреатит, цирроз печени, гепатиты и других, а так же онкологии (рак яичника, рак печени, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак ободочной кишки и рак прямой кишки). Например, при раке яичников асцит встречается в 60% случаев. Установление причин асцита несет большие временные и финансовые затраты. Основным способом определения асцита является цитология, однако частота ошибок по данным ряда авторов 25-50%. К тому же с помощью обычного цитологического исследования нельзя определить первичный очаг при асците онкологического генеза. Применяемые антитела не используются для исследования серозных жидкостей по причине отсутствия на клеточных мембранах соответствующих антигенов. Различная локализация антигена в клетке может препятствовать мобилизации клеток на биочипе и делает невозможной полуколичественную оценку. Недостатком данного устройства является использование заданной скорости потока жидкости содержащей клетки необходимой для предотвращения отрыва клеток.
Задачей предлагаемой модели является создание биочипа для проведения диагностических исследований серозных жидкостей (выпотов).
Поставленная задача решается тем, что в известном биочипе для мультиплексного анализа, содержащим прозрачную подложку, выполненную из стекла с нанесенным на его поверхность полилизином, на которой размещены тестовые участки с иммобилизованными антителами, специфичными к антигенам клеток, тестовые участки разделены пластиковыми стенками толщиной 0,2 см, разделяющими биочип на 9 герметичных ячеек и снабжены антителами к рецепторам эстрогена, прогестерона, СА-125, РЭА, СК-7, CK-20, Ber-EP4, TTF1 и WT1, закрытые сверху гидрофобной пленкой из полисилоксана, фиксированной к верхнему краю пластиковых стенок, создающим герметичные ячейки, ограниченные снизу подложкой с полилизиновым покрытием, сверху пленкой из полисилоксана с остальных сторон пластиковыми стенками.
Полезная модель поясняется изображениями (фиг. 1, фиг. 2, фиг. 3).
На фиг. 1 изображено схематическое строение биочипа; на фиг. 2 - внешний вид биочипа для мультиплексного анализа; на фиг. 3 - изображение антител через окуляр флуоресцентного микроскопа.
Предлагаемое устройство (фиг. 1) содержит прозрачную подложку из стекла с полилизиновым покрытием 1 и разделено на 9 равных частей (ячеек) посредством решетки из пластика 2. В каждой ячейке содержатся флуоресцентные антитела (0,01 мкл). Для исследований в рабочей области использовались тестовые участки с антителами к рецепторам Эстрогена (1 ячейка) 3, рецепторам Прогестерона (1 ячейка) 4, рецепторам СА-125 (1 ячейка) 5, рецепторам РЭА (1 ячейка) 6, рецепторам СК 7 (1 ячейка) 7, рецепторам СК 20 (1 ячейка) 8, рецепторам Ber-EP4 (1 ячейка) 9, рецепторам TTF1 10 и рецепторам WT1 11. Для сохранения антител во влажной среде в каждую ячейку добавлен реагент PBS в количестве 0,1 мкл, а сверху на рабочую поверхность нанесена гидрофобная пленка 10, препятствующая транзиту антител из одной ячейки в другую и их высыханию. Биочип хранится в темном месте для исключения выцветания метки.
Настоящая полезная модель представляет собой пластиковую подложку размерами 25,4 мм × 76,2 мм, толщиной 1 мм. Поверхность разделена на две части: одна имеет полилизиновое покрытие и считается рабочей поверхностью, другая не имеет специфического покрытия и предназначена для фиксации биочипа в руках.
Предлагаемая полезная модель отвечает критерию «новизна», так как проведенные патентно-информационные ирследования не выявили источников информации, которые бы породили новизну предлагаемой полезной модели.
Предлагаемое устройство отвечает критерию «промышленная применимость», так как может использоваться в онкологии для диагностики рака молочной железы.
Предлагаемый биочип позволяет получить следующий технический результат.
Предложенная полезная модель позволяет исследовать серозную жидкость, жидкость с менее богатым, чем кровь клеточным составом, содержащего иммобилизованные флуоресцентные антитела, специфичные к антигенам клеток имеет возможность определить характер асцита (реактивный или онкологический), а так же первичный очаг, который имеет опухоль продуцирующая асцит.
Полилизиновое покрытие обладает высокими адгезивными характеристиками и отличает предлагаемый биочип от всех сравниваемых моделей. Строение рабочей поверхности, а именно разграничение на изолированные участки предотвращает транзит антител из одной ячейки в другую и снабжен пластиковыми стенками, разграничивающими ячейки, что исключает необходимость в фоновых участках и их блокирование. Предлагаемый биочип хранится в герметичном непрозрачном контейнере препятствующим прохождению света и тем самым выцветанию флуоресцентной метки. Для предлагаемого биочипа не требуется проточной камеры для проведения исследования на нем. Предлагаемый биочип способен проводить исследование даже при наличии большого количества неклеточных элементов. Покрытие предлагаемого биочипа пленка из полисилоксана, препятствующая высыханию антител и транзиту антител из одной ячейки в другую. Предлагаемый биочип имеет возможность проводить исследования реакционного объема в каждой ячейке в проходящем свете.
Биочип инкубируют с исследуемой жидкостью, после чего осуществляют считывание и анализ результата, используя флуоресцентный микроскоп. В процессе проведения исследования может быть осуществлено окрашивание связавшихся клеток. Использование биочипа позволяет существенно повысить информативность исследования и снизить его стоимость.
Предлагаемый биочип работает следующим образом.
Работу с предлагаемым биочипом начинают с подготовки материала для исследования. Забирают серозную жидкость несколькими рутинными способами (интраоперационно в стерильный шприц в количестве не менее 2 мл, при пункции трансвагинально, трансабдоминально в стерильный шприц). Затем клетки помещают в пробирку и центрифугируют в течение 5 минут при скорости 2000 оборотов в минуту. Затем удаляют надосадочную жидкость, а осадок микропипеткой вносят в ячейки биочипа в количестве 0,2 мл.
Перед внесением осажденных клеток в ячейки биочипа, устройство готовят к работе следующим образом: с рабочей поверхности биочипа удаляют защитную гидрофобную пленку, после чего незамедлительно производят инсталляцию исследуемой жидкости в ячейки. Затем, биочип ставят на нагревательный столик при температуре 37 градусов Цельсия, и закрывают непрозрачной крышкой, для исключения попадания света, на 30 минут. После нагревательного столика предлагаемый биочип помещают на предметное стекло флуоресцентного микроскопа и проводят анализ флуоресценции в каждой из ячеек по следующим параметрам: количество флуоресцентно окрашенных клеток и яркость флуоресценции. После проведения исследования каждой из областей под флуоресцентным микроскопом производят фиксацию клеток. После чего производят краску гематоксилином Майера и проводят морфологическое исследование клеток.
Пример конкретного использования предлагаемого биочипа для мультиплексного анализа дан в виде
Больная С. 55 лет. Диагноз Рак яичников 3с стадии. Асцит. Была выполнена пункция заднего свода влагалища стерильным шприцем. Получено 20 мл светлой асцитической жидкости. Жидкость помещена в стерильную пробирку. Произведено центрифугирование жидкости при скорости 2000 оборотов в минуту в течении 2-х минут. Затем полученный осадок микропипеткой вносили в ячейки биочипа по 0,1 мл в каждую ячейку. Предварительно с рабочей поверхности биочипа была снята изолирующая пленка. После добавления осадка4в ячейки биочип закрывали непрозрачной крышкой и помещали на нагревательный столик, смоченный стерильным физическим раствором, и инкубировали при температуре рабочей поверхности столика 37 градусов Цельсия в течении 40 минут. Затем проводили исследование каждой ячейки под флуорисцентным микроскопом. При исследовании было обнаружено: пять светящихся ядер клеток в ячейке с антителами к CA-125, 3 светящихся ядра клеток в ячейке с антителами к рецепторам эстрогена, конгломерат из светящихся клеток в ячейке с антителами к рецепторам прогестерона, 4 светящихся ядра клетки в ячейке с антителами к СК7, более 10-ти светящихся элементов в ячейке с антителами к Ber-EP4. В ячейках с антителами к WT1 СК20 TTF1 РЭА. После качественно-количественной оценки ячеек под флуорисцентным микроскопом, биочип окрасили по Май-Грюнвальду Гимзе и провели морфологическую оценку картины в ячейках под световым микроскопом. В ячейке с антителами к СА-125 были обнаружены 8 клеток аденокарциномы, в ячейке с антителами к рецепторам прогестерона более 10 клеток аденокарциномы, в ячейке с антителами к рецепторам прогестерона 5 клеток аденокарциономы, в ячейке с антителами к Ber-EP4 более 10 клеток аденокарциномы, в ячейке с антителами к СК7-5 клеток аденокарциномы в остальных ячейках от 3-х до 10 клеток аденокарциномы. Таким образом, был выставлен диагноз серозная аденокарцинома яичника. При морфологическом исследовании операционного материала диагноз подтвердился.