ПРОЦЕСС КРУПНОМАСШТАБНОГО ПРОИЗВОДСТВА КЭПИРОВАННЫХ И НЕКЭПИРОВАННЫХ ЦИСТЕИНОВ АНТИТЕЛ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ КОНЪЮГАЦИИ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ БЕЛКОВ

1. Способ получения цистеин-содержащих белков, которые могут быть конъюгированы с химической полезной нагрузкой, включающий этапы:
(а) засева ростовой среды для клеток, содержащей один или более ростовых компонентов, выбранных из цистеина, цистина и глутатиона, клетками, способными экспрессировать цистеин-содержащие белки;
(b) инкубации указанных клеток до достижения плотности клеток, достаточной для истощения большинства указанных ростовых компонентов, присутствующих в указанной ростовой среде; и
(с) дальнейшей инкубации указанных клеток для экспрессии цистеин-содержащих белков, имеющих один или более некэпированных остатков цистеина, содержащих свободный тиол; и
где указанные клетки, способные экспрессировать цистеин-содержащие белки, являются клетками млекопитающих.
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий этап:
(d) введения заданного кэпирующего фрагмента или его предшественника в указанные экспрессированные цистеин-содержащие белки;
в результате чего происходит кэпирование одного или более цистеинов в указанных белках указанным заданным кэпирующим фрагментом, и где указанный заданный кэпирующий фрагмент выбран из группы, состоящей из 5-тио-2-нитробензойной кислоты (TNB), 2-меркаптопиридина, дитиодипиридина (DTDP), 4-тиобензойной кислоты, 2-тиобензойной кислоты, 4-тиобензолсульфокислоты, 2-тиобензолсульфокислоты, метилсульфоната (Ms), п-толуолсульфоната (Ts) и трифторметансульфоната (Tf), или выбран из реакционноспособной группы, состоящей из малеимид-триокса-4-формилбензамид (MTFB) подобных молекул с альдегидной ручкой или малеимид-азидо-лизин подобных молекул с азидной ручкой или дибензоциклооктил-полиэтилен-малеимид (DBCO-ПЭГ4-малеимид) подобных молекул с алкиновой ручкой.
3. Способ получения цистеин-содержащих белков, которые могут быть конъюгированы с химической полезной нагрузкой, включающий этапы:
(а) засева ростовой среды для клеток, содержащей один или более ростовых компонентов, выбранных из цистеина, цистина и глутатиона, клетками, способными экспрессировать цистеин-содержащие белки;
(b) инкубации указанных клеток для экспрессии цистеин-содержащих белков, имеющих один или более некэпированных остатков цистеина, содержащих свободный тиол; и
(с) на этапе (а), этапе (b) или на обоих этапах (а) и (b) поддержание концентрации указанных одного или более ростовых компонентов на уровне менее 0,4 мМ, менее 0,3 мМ, менее 0,2 мМ, менее 0,1 мМ или менее 0,05 мМ; и
где указанные клетки, способные экспрессировать цистеин-содержащие белки, являются клетками млекопитающих.
4. Способ по п. 3, дополнительно включающий этап:
(d) введения заданного кэпирующего фрагмента или его предшественника в указанные экспрессированные цистеин-содержащие белки;
в результате чего происходит кэпирование одного или более цистеинов в указанных белках указанным заданным кэпирующим фрагментом, и где указанный заданный кэпирующий фрагмент выбран из группы, состоящей из 5-тио-2-нитробензойной кислоты (TNB), 2-меркаптопиридина, дитиодипиридина (DTDP), 4-тиобензойной кислоты, 2-тиобензойной кислоты, 4-тиобензолсульфокислоты, 2-тиобензолсульфокислоты, метилсульфоната (Ms), п-толуолсульфоната (Ts) и трифторметансульфоната (Tf), или выбран из реакционноспособной группы, состоящей из малеимид-триокса-4-формилбензамид (MTFB) подобных молекул с альдегидной ручкой или малеимид-азидо-лизин подобных молекул с азидной ручкой или дибензоциклооктил-полиэтилен-малеимид (DBCO-ПЭГ4-малеимид) подобных молекул с алкиновой ручкой.
5. Способ получения цистеин-содержащих белков, которые могут быть конъюгированы с химической полезной нагрузкой, включающей этапы:
(а) засева ростовой среды для клеток, содержащей один или более ростовых компонентов, выбранных из цистеина, цистина и глутатиона, клетками, способными экспрессировать цистеин-содержащие белки; и
(b) инкубации указанных клеток для экспрессии цистеин-содержащих белков, имеющих один или более остатков некэпированных цистеинов, содержащих свободный тиол, при этом концентрация указанных ростовых компонентов после указанной инкубации составляет менее 0,4 мМ, менее 0,3 мМ, менее 0,2 мМ, менее 0,1 мМ или менее 0,05 мМ; и
где указанные клетки, способные экспрессировать цистеин-содержащие белки, являются клетками млекопитающих.
6. Способ по п. 5, дополнительно включающий после указанного этапа инкубации этап:
(с) введения заранее заданного кэпирующего фрагмента или его предшественника в указанные экспрессированные цистеин-содержащие белки;
в результате чего происходит кэпирование одного или более цистеинов в указанных белках указанным заданным кэпирующим фрагментом, и где указанный заданный кэпирующий фрагмент выбран из группы, состоящей из 5-тио-2-нитробензойной кислоты (TNB), 2-меркаптопиридина, дитиодипиридина (DTDP), 4-тиобензойной кислоты, 2-тиобензойной кислоты, 4-тиобензолсульфокислоты, 2-тиобензолсульфокислоты, метилсульфоната (Ms), п-толуолсульфоната (Ts) и трифторметансульфоната (Tf), или выбран из реакционноспособной группы, состоящей из малеимид-триокса-4-формилбензамид (MTFB) подобных молекул с альдегидной ручкой или малеимид-азидо-лизин подобных молекул с азидной ручкой или дибензоциклооктил-полиэтилен-малеимид (DBCO-ПЭГ4-малеимид) подобных молекул с алкиновой ручкой.
7. Способ по любому из пп. 1 и 2, в котором указанные ростовые компоненты истощают путем ограничения относительного показателя предельного количества цистеина в указанной ростовой среде для клеток до менее чем 1,0x.
8. Способ по п. 7, в котором указанный показатель составляет примерно 0,95х, 0,90х, 0,85х, 0,80х, 0,75х, 0,70х, 0,65х, 0,60х, 0,55х, 0,50х, 0,45х, 0,40х, 0,35x, 0,30x, 0,25x, 0,20x, 0,15x, 0,10x или 0,05x.
9. Способ по любому из пп. 1-6, в котором указанные цистеин-содержащие белки выбирают из группы, состоящей из антител и слитых белков.
10. Способ по любому из пп. 1 и 2, в котором указанная достигнутая плотность клеток составляет, по меньшей мере, примерно 1E6 кл./мл.
11. Способ по п. 10, в котором указанная плотность клеток составляет, по меньшей мере, примерно 5E6 кл./мл, 10E6 кл./мл, 50E6 кл./мл, 100E6 кл./мл или 500E6 кл./мл.
12. Способ по любому из пп. 2, 4 и 6, в котором указанный заданный кэпирующий фрагмент представляет собой 5-тио-2-нитробензойную кислоту (TNB).
13. Способ по любому из пп. 2, 4 и 6, в котором указанный предшественник заданного кэпирующего фрагмента представляет собой 5,5'-дитиобис(2-нитробензоат) (DTNB).
14. Способ по любому из пп. 2, 4 и 6, в котором указанные кэпированные белки подвергают дальнейшей обработке, состоящей из одного или более из: выделения, очистки и концентрации.
15. Способ по любому из пп. 2, 4 и 6, в котором по меньшей мере 50% указанных клеток отделяют от указанных экспрессированных цистеин-содержащих белков перед введением указанного заданного кэпирующего фрагмента или его предшественника.
16. Способ по п. 15, в котором указанное отделение осуществляют центрифугированием или фильтрацией.
17. Способ по любому из пп. 1-16, в котором указанный цистеин-содержащий белок представляет собой антитело.
18. Способ по любому из пп. 1-16, в котором указанный цистеин-содержащий белок представляет собой антитело, выбранное из анти-EDB антитела и анти-HER2 антитела.
19. Способ по п. 18, в котором указанное анти-HER2 антитело представляет собой трастузумаб.
20. Способ по любому из пп. 1-19, в котором указанные клетки, способные экспрессировать цистеин-содержащие белки, представляют собой клетки яичника китайского хомячка (СНО).