СИСТЕМА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ EX-VIVO И СПОСОБЫ ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ
EX-VIVO CULTIVATION SYSTEM AND METHODS FOR ITS APPLICATION

Область техники настоящего изобретения
Настоящее изобретение, согласно некоторым его вариантам осуществления, относится к системе культивирования ex vivo и способам ее применения.
Обычный выбор противораковых терапевтических схем лечения в первую очередь основан на происхождения злокачественной ткани, стадии и степени опухоли и общем состоянии здоровья пациента. Такие схемы лечения эффективны у некоторых пациентов, однако они токсичны, вызывая множество побочных эффектов, которые могут быть опасными для жизни.
Наличие целевой лекарственной терапии и возможность идентификации специфических для пациента опухолевых маркеров указали на индивидуальные варианты лечения, но одновременно требуют широкого использования генетического профилирования [смотрите, например, Dancey et al. (2012) Cell 148, 409-420 и Garraway et al. (2013) J. Clin. Oncol. Off. J. Am. Soc. Clin. Oncol. 31, 1806-1814]. Однако экстраполяция генетических данных на конкретные схемы лечения является сложной, и прогнозирование ответа пациента ненадежно. Например, в случае, когда опухоль пациента характеризуется более чем одной подвергаемой нацеливанию мутацией, очень трудно предсказать, какое из потенциальных лекарственных средств будет наиболее эффективным. То же самое верно, когда имеется более одного лекарственного средства для определенной мутации. Таким образом, выбор способа лечения сильно зависит от проб и ошибок.
Доступны различные технологии для непосредственного исследования ответа злокачественных клеток пациента на конкретное лечение, например, происходящие из опухоли клеточные линии, полученные из опухолей пациента, и полученные от пациента модели ксенотрансплантата (PDX) [смотрите, например, Crystal et al. (2014) Science 346, 1480-1486; Clevers et al. (2016) Cell 165, 1586-1597 и Hidalgo et al. (2014) Cancer Discov. 4, 998-1013]. Однако эти модели дороги и требуют много времени, и, что наиболее важно, они не сохраняют первоначальное опухолевое микроокружение, которое может оказывать заметное влияние на чувствительность к лекарственным средствам [Straussman et al. (2012)Nature 487, 500-504].
Системы ex vivo культивирования органов (EVOC), используемые в биологии злокачественных опухолей, представляют собой культуры высокоточных срезов опухоли пациента. EVOC использовали для различных применений, включая в себя исследование токсичности лекарственных средств, захвата вируса, восприимчивости опухолей к радиации или специфических противораковых лекарственных средств [смотрите, например, Vaira et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8352-8356; Vickers et al. (2004) Chem. Biol. Interact. 150, 87-96; de Kanter et al. (2002) Curr. Drug Metab. 3, 39-59; Stoff-Khalili et al. (2005) Breast Cancer Res. BCR 7, R1141-1152; Merz et al. (2013) Neuro-Oncol. 15, 670-681; Gerlach et al. (2014) Br. J. Cancer 110, 479-488; Meijer et al. (2013) Sr. J. Cancer 109, 2685-2695; Grosso et al. (2013) Cell Tissue Res. 352, 671-684; Vaira et al. (2010) PNAS 107, 8352-8356; Roife et al. (2016) Clin. Cancer Res. June 3, 1-10; Maund et al. (2014) Lab. Invest. 94, 208-221; Vickers et al. (2004) Toxicol Sci. 82(2):534-44; Zimmermann et al. (2009) Cytotechnology 61(3): 145-152); Parajuli et al. (2009) In Vitro Cell. Dev. Biol-Animal 45:442-450; Koch et al. (2014) Cell Communication and Signaling 12:73; Graaf et al. Nature Protocols (2010): 5: 1540-1551; Majumder et al. Nat. Commun. 6, 6169 (2015); патентные заявки США №: US 2014/0228246, US 2010/0203575 и US 2014/0302491 и публикацию международной патентной заявки №WO2002/044344.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предложена система культивирования, содержащая культуральную среду и высокоточный срез ткани, помещенный на вставку для тканевых культур, причем высокоточный срез ткани поддерживается в атмосфере с высоким содержанием кислорода, содержащей по меньшей мере 50% кислорода, и причем культуру перемешивают вращением, способствуя периодическому погружению среза ткани в культуральную среду.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения культура находится в планшете для тканевых культур.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения система культивирования содержит лекарственное средство.
Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предложен способ культивирования ткани, предусматривающий культивирование среза ткани высокой точности на вставке для тканевых культур в культуральной среде в атмосфере с высоким содержанием кислорода, содержащей по меньшей мере 50% кислорода; и перемешивание культуры посредством вращения, способствующего периодическому погружению среза ткани в культуральную среду.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения способ дополнительно предусматривает добавление лекарственного средства в культуральную среду.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения предложен способ определения эффективности лекарственного средства или партии лекарственных средств, предусматривающий:
(i) культивирование ткани в соответствии со способом по настоящему изобретению;
(ii) добавление лекарственного средства или партии лекарственных средств в культуральную среду; а также
(iii) определение воздействия лекарственного средства или партии лекарственных средств на ткань, причем чувствительность ткани к лекарственному средству указывает на эффективность лекарственного средства.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения ткань представляет собой патологическую ткань.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения предложен способ выбора лекарственного средства для лечения заболевания у нуждающегося в этом субъекта, причем способ предусматривает:
(i) культивирование патологической ткани, полученной от субъекта в соответствии со способом по настоящему изобретению;
(ii) добавление лекарственного средства в культуральную среду; а также
(iii) определение воздействия лекарственного средства на ткань, причем чувствительность ткани к лекарственному средству указывает на эффективность лекарственного средства для лечения заболевания у субъекта.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения предложен способ лечения заболевания у нуждающегося в этом субъекта, причем способ предусматривает:
(a) выбор лекарственного средства в соответствии со способом по настоящему изобретению; а также
(b) введение субъекту терапевтически эффективного количества лекарственного средства, демонстрирующего эффективность для лечения заболевания у субъекта, тем самым подвергая лечению заболевание у субъекта.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой комбинацию лекарственных средств.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения ткань или высокоточный срез ткани является свежевыделенным.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения ткань или высокоточный срез ткани сохраняется при температуре 4°С.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения ткань или высокоточный срез ткани криоконсервируют.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения на определение влияют оценка морфологии, оценка жизнеспособности, оценка пролиферации и/или оценка гибели клеток.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения определение осуществляется путем оценки морфологии.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения определение проводится в течение 3-5 дней культивирования.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения заболевание представляет собой злокачественную опухоль.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения злокачественную опухоль выбирают из группы, состоящей из злокачественной опухоли яичника, толстой и прямой кишки, легкого, поджелудочной железы, желудка, желудочно-кишечного тракта и молочной железы.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения патологическая ткань представляет собой злокачественную ткань.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения ткань выбирают из группы, состоящей из яичника, толстой и прямой кишки, легкого, поджелудочной железы, желудка, пищевода и молочной железы.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения ткань выбирают из группы, состоящей из яичника, толстой и прямой кишки, легкого, поджелудочной железы, желудка, желудочно-кишечного тракта, молочной железы, печени, хряща и кости.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения добавление осуществляют через 12-24 часа после начала культивирования.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой противовоспалительное лекарственное средство или противораковое лекарственное средство.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения лекарственное средство выбирают из группы, состоящей из 5-фторурацила (5FU), оксалиплатина, иринотекана, цисплатина, 4-гидропероксициклофосфамида, доцетаксела, доксорубицина, навельбина, гемцитабина, гефитиниба, тамоксифена, олапариба, траметиниба, эверолимуса и палбоциклиба.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения концентрация лекарственного средства выше, чем доза лекарственного средства IC50 в клеточной линии.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения концентрацию лекарственного средства получают из эксперимента по дозированию, в котором наблюдается дозозависимый ответ.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения культивирование проводят в течение по меньшей мере 4 дней.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения культивирование проводят в течение по меньшей мере 5 дней.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения культивирование проводят до 7 дней.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения культивирование осуществляют в планшете для тканевых культ.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения высокоточный срез составляет 200-300 мкм.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения срез помещают в середину вставки для клеточных культур.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения срез представляет собой один срез.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения срез находится в непосредственном контакте со вставкой для тканевых культур.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения вставка для тканевых культур представляет собой вставку из титановой сетки.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения ткань представляет собой ткань человека.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения атмосфера с высоким содержанием кислорода содержит по меньшей мере 70% кислорода.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения атмосфера с высоким содержанием кислорода содержит менее чем 95% кислорода.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения способ осуществляется в сочетании с генетическим профилированием.
Если не указано иное, все технические и/или научные термины, используемые в настоящем документе, характеризуются тем же значением, которое обычно понимают специалисты в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, могут использоваться при практическом применении или исследовании вариантов осуществления настоящего изобретения, иллюстративные способы и/или материалы описаны ниже. В случае конфликта, описание патента, включая в себя определения, будет являться главным. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для обязательного ограничения.
Краткое описание нескольких видов графических материалов
Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения описаны в настоящем документе только в качестве примера со ссылкой на прилагаемые графические материалы. С конкретной ссылкой на графические материалы подробно подчеркивается, что показанные подробности приведены в качестве примера и в целях иллюстративного обсуждения вариантов осуществления настоящего изобретения. В связи с этим описание, взятое с графическими материалами, делает очевидным для специалистов в настоящей области техники, как могут быть реализованы варианты осуществления настоящего изобретения.
На графических материалах:
2
2
На фиг. 1 показаны репрезентативные гистологические микрофотографии, демонстрирующие морфологию срезов ксенотрансплантатов, полученных из злокачественной опухоли яичника человека, после 5 дней культивирования ex vivo. Высокоточные срезы собранной ткани инкубировали на титановой вставке (левая колонка) в 6-луночном планшете или непосредственно в 6-луночном планшете (правая колонка); в 21% О (нижний ряд) или в 80% О (верхний ряд) в течение 5 дней; и окрашивали Н&Е. Масштабная линейка представляет 50 мкм. Для каждого состояния ткани исследовали в трех повторах.
2
На фиг. 2 показаны репрезентативные гистологические микрофотографии, демонстрирующие морфологию срезов ксенотрансплантатов, полученных из злокачественной опухоли молочной железы человека, после 5 дней культивирования ех vivo в различных средах. Высокоточные срезы собранной ткани инкубировали на титановой вставке в 80% О в среде DMEM/F12 (левая панель) или M199 (правая панель) в течение 5 дней; и окрашивали Н&Е. Масштабная линейка представляет 50 мкм. Для каждого состояния ткани исследовали в двух повторах.
3
На фиг. 3 показана способность разработанного способа культивирования ex vivo прогнозировать ответы ксенотрансплантатов, полученных из карциномы молочной железы человека, на противораковое лекарственное лечение. Показаны графики, полученные лабораториями Jackson Laboratories, демонстрирующие ответ in vivo двух ксенотрансплантатов, полученных из карциномы молочной железы человека, на лечение 4-гидропероксициклофосфамидом, показывающие, что карцинома молочной железы ТМ00096 устойчива к лечению, в то время как карцинома молочной железы ТМ00098 чувствительна к лечению. Ось Y указывает размер опухоли в мм.
2
Репрезентативные гистологические микрофотографии демонстрируют морфологию срезов карцином молочной железы ТМ00096 (левая колонка) и ТМ00098 (правая колонка) после 5 дней культивирования ex vivo на титановой вставке в 80% О, обработанных в течение 4 дней указанными концентрациями 4-гидропероксициклофосфамида. Масштабная линейка представляет 50 мкм. Для каждого состояния ткани исследовали в двух повторах.
3
На фиг. 4 показана способность разработанного способа культивирования ex vivo прогнозировать ответ ксенотрансплантатов, полученных из колоректальной карциномы человека (CRC), на противораковое лекарственное лечение. Показаны графики, полученные лабораториями Jackson Laboratories, которые демонстрируют ответ in vivo трех ксенотрансплантатов, полученных из CRC, на лечение оксалиплатином, указывая на то, что CRC ТМ00134 устойчива к лечению, в то время как опухоль ТМ00170 является частично чувствительной, a CRC ТМ00164 очень чувствительна к лечению. Ось Y указывает размер опухоли в мм.
2
Репрезентативные гистологические микрофотографии демонстрируют морфологию срезов CRC ТМ00134 (левая панель), ТМ00170 (средняя панель) и ТМ00164 (правая панель) после 5 дней культивирования ex vivo на титановой вставке в 80% О, обработанных в течение 4 дней оксалиплатином в концентрации 0,2 мкМ. Лечение ДМСО служило контролем. Масштабная линейка представляет 50 мкм. Для каждого состояния ткани исследовали в трех повторах.
2
На фиг. 5 показано, что срезы опухолевой ткани, культивируемые в соответствии с разработанным способом культивирования ex vivo, обладают различной чувствительностью к различным противораковым лекарственным средствам. Опухолевую ткань колоректального рака человека (CRC) брали из метастатического очага в брюшине, удаленного во время операции по удалению опухоли и внутрибрюшинной химиотерапии. Показаны репрезентативные гистологические микрофотографии, демонстрирующие морфологию срезов опухоли после 5 дней культивирования ex vivo на титановой вставке в 80% О, обработанных в течение 4 дней указанными противораковыми лекарственными средствами 5-фторурацилом (5-FU), иринотеканом или оксалиплатином. Лечение ДМСО служило контролем. Следует отметить, что ткань была чувствительна к оксалиплатину и иринотекану в зависимости от дозы, но устойчива к 5-фторурацилу. Масштабная линейка представляет 50 мкм. Для каждого состояния ткани исследовали в трех повторах.
2
На фиг. 6 показано, что срезы опухолевой ткани, полученные от разных индивидуумов и культивированные в соответствии с разработанным способом культивирования ex vivo, обладают разной чувствительностью к одному и тому же противораковому лекарственному средству. Опухолевую ткань колоректального рака человека (CRC) брали из метастатического очага в брюшине, удаленного во время операции по удалению опухоли и внутрибрюшинной химиотерапии. Показаны репрезентативные гистологические микрофотографии, демонстрирующие морфологию срезов опухоли после 5 дней культивирования ex vivo на титановой вставке в 80% О, обработанных в течение 4 дней указанными противораковыми лекарственными средствами: 5-фторурацил (5-FU) или оксалиплатин. Лечение ДМСО служило контролем. PR указывает на частичный ответ и NR указывает на отсутствие ответа. Следует отметить, что в то время, как опухоль, полученная у пациента №8, характеризовалась сильным частичным ответом на оксалиплатин и отсутствием ответа на 5-фторурацил, другой пациент, пациент №6, частично ответил на оба лекарственных средства. Масштабная линейка представляет 50 мкм. Для каждого состояния ткани исследовали в двух повторах.
2
На фиг. 7 показана способность разработанного способа культивирования ex vivo прогнозировать чувствительность к целевой терапии, как предсказано молекулярным профилированием. Показаны репрезентативные гистологические микрофотографии, демонстрирующие морфологию срезов опухолей трижды негативного рака молочной железы от двух пациентов после 5 дней культивирования ex vivo на титановой вставке в 80% О, обработанных в течение 4 дней AZD4547 (ингибитором FGFR). Лечение ДМСО служило контролем. Следует отметить, что пациент №1, опухоль которого вызывает амплификацию FGFR1, чувствителен к AZD4547 (ингибитор FGFR), в то время как у пациента №2, у которых нет этой мутации, был устойчив к лечению. Масштабная линейка представляет 50 мкм. Для каждого состояния ткани исследовали в двух повторах.
2
3
На фиг. 8 показано, что окрашивание Ki67 на пролиферацию можно использовать для оценки чувствительности ткани к различному лечению. Показаны репрезентативные гистологические микрофотографии, демонстрирующие морфологию (окрашивание Н&Е) и пролиферацию (окрашивание Ki67) у одного пациента после 5 дней культивирования ех vivo на титановой вставке в 80% О, обработанных в течение 4 дней указанными лекарственными средствами. График справа, полученный Jackson Laboratories, демонстрирует ответ in vivo этого ксенотрансплантата, полученного из CRC, на лечение оксалиплатином и 5-фторурацилом. Ось Y указывает размер опухоли в мм. Этот пациент был частично чувствителен к 5-фторурацилу, но очень чувствителен к оксалиплатину как in vivo, так и ex vivo. Лечение ДМСО служило контролем. Масштабная линейка представляет 50 мкм. Для каждого состояния ткани исследовали в двух повторах.
На фиг. 9 показана обработка основных биопсий для EVOC. В этом примере три основных биопсии помещаются одна рядом с другой в жидкую агарозу в металлическом лотке. Добавляют больше агарозы и лоток охлаждают. Биопсии вырезают из агарозы, и блок фиксируют на поршне с помощью контактного клея, внедряют в большее количество агарозы (используя тот же способ, что и с кусочками ткани), а затем разрезают микротомом. Срезы биопсии подвергают воздействию и обрабатывают аналогично срезами тканей. Масштабная линейка представляет 100 мкм.
На фиг. 10 показаны гистологические микрофотографии, демонстрирующие, что ткань можно разрезать и хранить в среде в течение до 48 часов до начала эксперимента без каких-либо неблагоприятных воздействий на ткань или каких-либо изменений в результате. Показана ткань злокачественной опухоли толстой кишки, которую обрабатывали контрольным ДМСО или 5-фторурацилом (5-FU) в течение 4 дней либо сразу после получения среза, либо через 48 часов после охлаждения. BrdU добавляли за 18 часов до окончания эксперимента; и ткань окрашивали антителом к BrdU для идентификации делящихся клеток. Следует отметить, что ткань, обработанная 5-FU, все еще в некоторой степени жизнеспособна, но начинает реагировать на лечение повышенной гибелью клеток и меньшим количеством BrdU в обоих условиях. Масштабная линейка представляет 50 мкм.
2
На фиг. 11 показаны репрезентативные гистологические изображения, демонстрирующие указанные ткани после 5 дней культивирования ex vivo; и таблица, суммирующая исследованные ткани, которые сохраняли структуру и жизнеспособность ткани в течение по меньшей мере 5 дней культивирования. Высокоточные срезы заготовленной ткани инкубировали на титановой вставке в DMEM/F12 в 80% О в течение 5 дней и окрашивали Н&Е. Все эксперименты выполняли в двух повторах на двух разных случаях указанной злокачественной опухоли
Описание конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения
Настоящее изобретение, согласно некоторым его вариантам осуществления, относится к системе культивирования ex vivo и способам ее применения.
Перед подробным объяснением по меньшей мере одного варианта осуществления настоящего изобретения следует понимать, что настоящее изобретение не обязательно ограничено в его применении подробностями, изложенными в последующем описании или приведенными в качестве примеров в разделе примеров. Настоящее изобретение допускает другие варианты осуществления или может быть применено на практике или осуществлено различными способами.
Персонализированные варианты лечения таких заболеваний, как злокачественная опухоль, как правило, используют генетическое профилирование и исследование ответа клеток пациента на конкретное лечение с использованием дорогих и трудоемких моделей, таких как модели клеточных линий, полученных из опухолей пациента, и ксенотрансплантата, полученного от пациента (PDX). В последние годы системы ex vivo для культивирования органов (EVOC) были предложены для применения в различных областях, включая в себя изучение токсичности лекарственных средств, поглощения вируса, восприимчивости опухолей к радиации или специфических противораковых лекарственных средств.
Хотя настоящее изобретение было реализовано на практике, авторы настоящего изобретения разработали систему EVOC, которая может сохранять структуру и жизнеспособность высокоточного среза ткани в течение 7 дней в культуре и, таким образом, может предсказывать ответ патологических тканей на различные лекарственные средства.
Как проиллюстрировано ниже и в разделе примеров, который следует далее, недавно разработанная система EVOC основана на культивировании одного среза ткани, непосредственно помещенного на вставку для культивирования (в данном случае, в середине титановой сетки многократного использования), которая допускает периодическое погружение среза в среду, тем самым облегчая диффузию питательных веществ и газов по срезу, в сильно насыщенной кислородом атмосфере, содержащей кислород (80%), используя стандартную среду с добавлением только фетальной телячьей сыворотки (FCS) и противомикробных средств (пример 1, таблица 1, фиг. 1-2 и 9). Системы EVOC различных злокачественных тканей, включая в себя ткани яичника, толстой и прямой кишок, легкого, поджелудочной железы и молочной железы, культивированные в соответствии с этим способом, демонстрировали высокую жизнеспособность после 4-6 дней культивирования (пример 1, таблица 1, фиг. 11).
Далее авторы настоящего изобретения показывают, что разработанная система EVOC может применяться для прогнозирования ответа опухолей на противораковые лекарственные средства (пример 2). В частности, авторы настоящего изобретения демонстрируют, что чувствительность срезов злокачественной ткани ex vivo, полученных на различных моделях ксенотрансплантатов (PDX), полученных от пациента, к противораковому лечению согласуется с ответом моделей PDX на лечение in vivo (пример 2, таблица 2, фиг. 3-4); и что чувствительность к целевой терапии срезов ткани трижды негативного рака молочной железы ex vivo, полученных от пациентов, согласуется с данными молекулярного профилирования (пример 2, фиг. 7). Кроме того, авторы настоящего изобретения показывают, что системы EVOC опухолей человека от различных пациентов проявляют различную чувствительность к различным противораковым способам лечения (пример 2, таблицы 3-4, фиг. 5-6 и 8). Важно отметить, что ткань может храниться в среде в течение не менее чем 48 часов до начала эксперимента без каких-либо неблагоприятных воздействий на чувствительность ткани или лекарственного средства (пример 2, фиг. 10).
В целом, новая система EVOC сохраняет тканевое микроокружение, архитектуру, жизнеспособность и генетическую гетерогенность. Эта система позволяет быстро, надежно и экономически эффективно изучать ответ тканей человека (например, злокачественных тканей). Следовательно, настоящие идеи дополнительно предполагают применение этой разработанной системы EVOC для доклинических и фундаментальных исследований, а также для оценки эффективности лекарственного средства для лечения заболеваний в целом и для персонализированной терапии в частности.
Таким образом, в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения предложена система культивирования, содержащая культуральную среду и высокоточный срез ткани, помещенный на вставку для тканевых культур, при этом указанный высокоточный срез ткани поддерживается в атмосфере с высоким содержанием кислорода, содержащей по меньшей мере 50% кислорода, и причем указанную культуру перемешивают вращением, способствуя прерывистому погружению указанного среза ткани в указанную культуральную среду.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ культивирования ткани, предусматривающий культивирование высокоточного среза ткани на вставке для тканевых культур в культуральной среде в атмосфере с высоким содержанием кислорода, содержащей по меньшей мере 50% кислорода; и перемешивание культуры вращением, способствуя периодическому погружению указанного среза ткани в указанную культуральную среду
Используемый в настоящем документе термин «система культивирования» относится по меньшей мере к высокоточному срезу ткани, вставке и среде в окружении ех vivo.
Согласно конкретным вариантам осуществления система культивирования сохраняет структуру и жизнеспособность высокоточного среза ткани в течение по меньшей мере 2-10, 2-7, 2-5, 4-7, 5-7 или 4-5 дней в культуре. Согласно конкретному варианту осуществления высокоточный срез ткани сохраняет жизнеспособность в течение по меньшей мере 5 дней, 6 дней, 7 дней или даже 10 дней. Согласно конкретному варианту осуществления высокоточный срез ткани сохраняет жизнеспособность в течение по меньшей мере 5 дней.
Согласно конкретным вариантам осуществления по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% клеток в высокоточном срезе ткани сохраняют жизнеспособность в течение 4-5 дней в культуре, как определено, например, путем морфологического анализа оптимальной площади жизнеспособности.
Используемое в настоящем документе выражение «оптимальная площадь жизнеспособности» относится к микроскопическому полю ткани (например, при 20-кратном увеличении), в котором присутствует наибольшее количество живых клеток на единицу площади, согласно оценке патолога, по сравнению с немедленной пробой до EVOC того же вида.
Таким образом, согласно конкретным вариантам осуществления культивирование проводят в течение 2-10, 2-7, 2-5, 4-7, 5-7 или 4-5 дней.
Согласно конкретному варианту осуществления культивирование проводят в течение по меньшей мере 4 дней.
Согласно конкретному варианту осуществления культивирование проводят в течение по меньшей мере 5 дней.
Согласно конкретному варианту осуществления культивирование проводят в течение до 7 дней.
Используемый в настоящем документе термин «ткань» относится к части твердого органа (т.е. не крови) организма, имеющего некоторую васкуляризацию, которая включает в себя более одного типа клеток и поддерживает по меньшей мере некоторую макроструктуру ткани in vivo, из которой она была удалена
Примеры включают в себя, без ограничения, ткань яичника, ткань толстой и прямой кишок, ткань легкого, ткань поджелудочной железы, ткань молочной железы, ткань головного мозга, сетчатку, ткань кожи, кость, ткань сердца и ткань почек. Согласно конкретным вариантам осуществления ткань выбирают из группы, состоящей из яичника, толстой и прямой кишок, легкого, поджелудочной железы, желудка, желудочно-кишечного тракта и молочной железы. Согласно конкретным вариантам осуществления ткань выбирают из группы, состоящей из яичника, толстой и прямой кишок, легкого, поджелудочной железы, желудка, желудочно-кишечного тракта, молочной железы, печени, хряща и кости. Согласно конкретным вариантам осуществления ткань представляет собой ткань метастатической злокачественной опухоли, полученную из таких участков, как, без ограничения, печень, кость, легкое и брюшина.
Согласно конкретным вариантам осуществления ткань не представляет собой ткань печени.
Согласно конкретным вариантам осуществления ткань не представляет собой ткань предстательной железы.
Согласно конкретным вариантам осуществления ткань представляет собой ткань млекопитающего.
Согласно конкретному варианту осуществления ткань представляет собой ткань человека.
Согласно другому конкретному варианту осуществления ткань представляет собой ткань мыши или крысы.
Согласно конкретным вариантам осуществления ткань представляет собой здоровую ткань.
Согласно другим конкретным вариантам осуществления ткань представляет собой патологическую ткань. Способ может использовать множество подвергнутых скринингу высокоточных срезов ткани (например, каждый на отдельной вставке), каждый из которых может быть из патологической ткани(ей), здоровой(ых) ткани(ей) или их комбинации (например, когда здоровая ткань служит контролем, если взята из той же ткани, что и патологическая ткань).
Согласно конкретным вариантам осуществления ткань представляет собой патологическую ткань.
Используемый в настоящем документе термин «патологическая ткань» относится к ткани, вызывающей заболевание. Следовательно, ожидается, что удаление такой ткани приведет к лечению, как дополнительно определено ниже. Конкретные примеры заболеваний, поддающихся лечению согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, подробно описаны ниже. Согласно конкретным вариантам осуществления патологическая ткань представляет собой воспаленную ткань, фиброзную ткань или злокачественную ткань. Согласно конкретному варианту осуществления патологическая ткань представляет собой злокачественную ткань.
Согласно конкретным вариантам осуществления ткань получают хирургическим путем или с помощью биопсии, лапароскопии, эндоскопии или в виде ксенотрансплантата или любых их комбинаций.
Ткань может быть разрезана и культивирована непосредственно после извлечения ткани (т.е. первичная ткань) или после имплантации в животной модели [т.е. полученный от пациента ксенотрансплантат (PDX)], каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.
Ткань или срез ткани согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения может быть свежевыделенным или храниться, например, при температуре 4°С, или подвергаться криоконсервированию (т.е. замораживанию), например, в жидком азоте.
Согласно конкретным вариантам осуществления ткань или срез ткани является свежевыделенным (т.е. не более чем через 24 часа после извлечения у субъекта и не подвергаться процессам консервирования), как дополнительно раскрыто ниже.
Согласно конкретным вариантам осуществления ткань криоконсервируют после извлечения ткани и перед получением срезов.
Согласно конкретным вариантам осуществления ткань размораживают перед получением срезов.
Согласно конкретным вариантам осуществления срез ткани криоконсервируют после получения срезов.
Согласно конкретным вариантам осуществления срез ткани размораживают перед культивированием.
Согласно конкретным вариантам осуществления ткань сохраняется при температуре 4°С, например, в среде после извлечения ткани и до получения срезов.
Согласно конкретным вариантам осуществления срез ткани сохраняется при температуре 4°С, например, в среде после получения срезов и до культивирования.
Согласно конкретным вариантам осуществления сохранение при температуре 4°С осуществляется в течение до 120 часов, до 96 часов, до 72 часов или до 48 часов.
Согласно конкретным вариантам осуществления консервирование при температуре 4°С осуществляется в течение 24-48 часов.
Таким образом, согласно конкретным вариантам осуществления способ дополнительно предусматривает получение ткани от субъекта или от модели животного, содержащей ткань.
Используемое в настоящем документе выражение «ксенотрансплантат, полученный от пациента» (PDX), относится к ткани, полученной при имплантации первичной ткани животному другого вида относительно донора первичной ткани. Согласно конкретным вариантам осуществления PDX представляет собой ткань, созданную путем имплантации первичной ткани человека (например, злокачественной ткани) мыши с иммунодефицитом.
После извлечения ткани из ткани получают срезы для получения высокоточных срезов.
Используемая в настоящем документе фраза «высокоточный срез ткани» относится к жизнеспособному срезу, полученному из выделенной твердой ткани с воспроизводимой, четко определенной толщиной (например, отклонение толщины ±5% между срезами).
Как правило, срез ткани представляет собой мини-модель ткани, которая содержит клетки ткани в их естественном окружении и сохраняет трехмерную связь, такую как межклеточное и клеточно-матричное взаимодействие интактной ткани без выбора конкретного типа клеток среди различных типов клеток, которые составляют ткань или орган. Высокоточная резка уменьшает источники ошибок из-за различий в толщине среза и повреждении поверхностей среза, которые способствуют неравномерному обмену газов и питательных веществ в срезах ткани; повышает воспроизводимость и позволяет оценивать соседние срезы на гистологию и сравнивать попарно в различных экспериментальных условиях.
Отрезок среза может быть разрезан в разных направлениях (например, передне-заднем, дорсально-вентральном или назально-темпоральном) и толщине. Размер/толщина среза ткани зависит от источника ткани и способа, используемого для получения среза. Согласно конкретному варианту осуществления толщина высокоточного среза позволяет поддерживать структуру ткани в культуре.
Согласно конкретным вариантам осуществления толщина высокоточного среза обеспечивает полный доступ внутренних слоев клеток к кислороду и питательным веществам, так что внутренние слои клеток подвергаются воздействию достаточных концентраций кислорода и питательных веществ.
Согласно конкретным вариантам осуществления толщина высокоточного среза обеспечивает полный доступ внутренних слоев клеток к кислороду и питательным веществам, так что внутренние слои клеток подвергаются воздействию тех же концентраций кислорода и питательных веществ, что и внешние слои клеток.
Согласно конкретным вариантам осуществления высокоточный срез составляет от 50 до 1200 мкм, от 100 до 1000 мкм, от 100 до 500 мкм, от 100 до 300 мкм или от 200 до 300 мкм.
Согласно конкретному варианту осуществления высокоточный срез составляет 200-300 мкм.
Способы получения срезов ткани известны в настоящей области техники и описаны для примеров в разделе «Примеры», который следует далее, и в Roife et al. (2016) Clin. Cancer Res. June 3, 1-10; Vickers et al. (2004) Toxicol Sci. 82(2):534-44; Zimmermann et al. (2009) Cytotechnology 61(3): 145-152); Koch et al. (2014) Cell Communication and Signaling 12:73 и Graaf et al. Nature Protocols (2010) 5: 1540-1551, содержание каждого из которых полностью включено в настоящий документ посредством ссылки. Такие способы предусматривают, без ограничения, получение срезов с использованием вибратома, погружение в агарозу с последующим разрезанием микротомом или получение срезов с использованием матрицы.
В качестве неограничивающего примера ткань выделяют и сразу помещают в физиологическую среду для рассечения (например, ледяной PBS), которая может быть дополнена антибиотиками.
Согласно конкретным вариантам осуществления теплое ишемическое время составляет менее чем 2 часа, менее чем 1,5 часа или менее чем 1 час.
Согласно конкретным вариантам осуществления холодное ишемическое время составляет менее чем 96 часов, менее чем 72 часа, менее чем 48 часов, менее чем 24 часа, менее чем 12 часов, менее чем 5 часов или менее чем 2 часа.
Перед получением срезов ткань прикрепляют к резаку для тканей, например, с помощью контактного клея, с последующим погружением, например, в легкоплавкий агарозный гель. Затем ткань разрезают на высокоточные срезы. Коммерчески доступны многочисленные подходящие устройства для разрезания тканей, такие как, без ограничения, Compresstome™ VF-300 (Precisionary Instruments Inc. NC, США), резак для тканей Brendel-Vitron (Tucson, AZ), высокоточный резак для тканей Krumdieck (модель №MD4000-01; Alabama R&D) и микротом с вибрирующим лезвием Leica VT1200S (Leica, Вецлар, Германия). Согласно конкретным вариантам осуществления устройство для получения срезов заполнено ледяной средой, такой как буфер Williams Medium Е или Krebs-Henseleit (КНВ). Специалист в настоящей области техники должен знать, какая необходима среда и условия для рассечения и для сохранения ткани и среза ткани перед культивированием для каждого типа ткани.
Затем срез ткани помещают на вставку для тканевых культур в сосуд для культивирования ткани, заполненный культуральной средой. Один срез или несколько срезов могут быть помещены в одну вставку для тканевых культур. Согласно конкретным вариантам осуществления один срез помещают на одну вставку для тканевых культур.
Согласно конкретным вариантам осуществления культуральный сосуд заполняют культуральной средой вплоть до дна среза ткани (например, 4 мл среды в 6-луночном планшете, содержащем вставку).
Культура может находиться в стеклянном, пластиковом или металлическом сосуде, который может обеспечить асептическое окружение для культивирования тканей. Согласно конкретным вариантам осуществления культуральный сосуд включает в себя планшеты, колбы, бутылки и флаконы. Культуральные сосуды, такие как COSTAR, NUNC и FALCON, коммерчески доступны от различных производителей.
Согласно конкретным вариантам осуществления культуральный сосуд представляет собой планшет для тканевых культур, такой как 6-луночный планшет, 24-луночный планшет, 48-луночный планшет и 96-луночный планшет.
Согласно конкретному варианту осуществления культуральный сосуд представляет собой 6-луночный планшет для культуры ткани.
Согласно конкретным вариантам осуществления культуральный сосуд предварительно не покрыт белками, экстрагированными из подобранной ткани (например, когда ткань представляет собой злокачественную ткань, тогда культуральный сосуд не покрывают предварительно белками, экстрагированными из опухоли соответствующей стадии и степени). Неограничивающие примеры таких белков включают в себя белки ЕСМ, такие как коллаген, фибронектин, ламинин, вибронектин, кадгерин, филамин А, виментин, остеопонтин, декорин, тенасцин X, белки базальной мембраны, белки цитоскелета и матриксные белки; и факторы роста.
Культуральная среда, используемая в настоящем изобретении, может представлять собой среду на водной основе, которая включает в себя комбинацию веществ, таких как соли, питательные вещества, минералы, витамины, аминокислоты, нуклеиновые кислоты и/или белки, такие как цитокины, факторы роста и гормоны, все из которых необходимы для пролиферации клеток и способны поддерживать структуру и жизнеспособность ткани. Например, культуральная среда может представлять собой синтетическую тканевую культуральную среду, такую как DMEM/F12 (может быть получена, например, от Biological Industries), M199 (может быть получена, например, от Biological Industries), RPMI (может быть получена, например, от Gibco-Invitrogen Corporation products), М199 (может быть получена, например, от Sigma-Aldrich), Ko-DMEM (может быть получена, например, от Gibco-Invitrogen Corporation products), дополненную необходимыми добавками, как дополнительно описано ниже. Предпочтительно, чтобы все ингредиенты, включенные в культуральную среду по настоящему изобретению, были по существу чистыми относительно степени культуры ткани.
Специалисту в настоящей области техники будет известно, как выбрать питательную среду для каждого рассматриваемого типа ткани.
Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения культуральная среда содержит сыворотку, например, фетальную сыворотку теленка (FCS, может быть получена, например, от Gibco-Invitrogen Corporation products).
Согласно конкретным вариантам осуществления культуральная среда содержит менее чем 10% сыворотки.
Согласно конкретным вариантам осуществления культуральная среда содержит менее чем 2% сыворотки, полученной из того же вида, что и культивируемая ткань.
Согласно конкретным вариантам осуществления культуральная среда не содержит сыворотку, полученную из того же вида, что и культивируемая ткань.
Согласно конкретным вариантам осуществления культуральная среда содержит менее чем 2% сыворотки, аутологичной по отношению к культивируемой ткани (т.е. от того же субъекта).
Согласно конкретным вариантам осуществления культуральная среда не содержит сыворотку, аутологичную культивируемой ткани (т.е. от того же субъекта).
Согласно конкретным вариантам осуществления культуральная среда содержит менее чем 2% человеческой сыворотки.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения культуральная среда не содержит человеческую сыворотку.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения культуральная среда не содержит каких-либо примесей животных, т.е. клеток животных, жидкости или патогенов (например, вирусов, инфицирующих клетки животных), т.е. не содержит ксено.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения культуральная среда может дополнительно содержать антибиотики (например, пенициллин, стрептомицин, гентамицин), противогрибковые средства (например, амфотерицин В), L-глутамин или NEAA (заменимые аминокислоты).
Согласно конкретному варианту осуществления среда содержит сыворотку и антибиотики.
Согласно конкретному варианту осуществления среда содержит DMEM/F12, 5% FCS, глутамин, пенициллин, стрептомицин, гентамицин и амфотерицин В
Следует отметить, что культуральная среда может периодически обновляться для поддержания достаточного содержания добавок и для удаления продуктов метаболизма, которые могут повредить ткани. Согласно конкретным вариантам осуществления культуральная среду обновляется каждые 12-72 часа, каждые 24-72 часа, каждые 24-48 часов или каждые 12-48 часов.
Согласно конкретным вариантам осуществления культуральная среда обновляется каждые 12-48 часов.
Согласно конкретному варианту осуществления культуральная среда обновляется один раз через 12-24 часа и затем каждые приблизительно 48 часов.
Используемая в настоящем документе фраза «вставка для тканевых культур» относится к пористой мембране, подвешенной в сосуде для тканевой культуры, и она совместима с последующим культивированием ex vivo среза ткани. Размер пор способен поддерживать срез ткани, в то время как он проницаем для культуральной среды, позволяя проходить питательным веществам и метаболическим отходам к срезу и от него, соответственно. Согласно конкретным вариантам осуществления срез ткани размещают на вставке для тканевых культур, тем самым обеспечивая доступ культуральной среды как к апикальной, так и к базальной поверхности среза ткани.
Согласно конкретным вариантам осуществления размер пор составляет от 0,1 мкм до 20 мкм, от 0,1 мкм до 15 мкм, от 0,1 мкм до 10 мкм, от 0,1 мкм до 5 мкм, от 0,4 мкм до 20 мкм, от 0,4 мкм до 10 мкм или от 0,4 мкм до 5 мкм.
Согласно конкретным вариантам осуществления размер пор составляет от 0,4 мм до 4 мм, от 0,4 мм до 1 мм, от 1 мм до 4 мм, от 1 мм до 3 мм или от 1 мм до 2 мм.
Согласно конкретным вариантам осуществления вставка для тканевых культур является стерильной.
Согласно конкретным вариантам осуществления вставка для тканевых культур является одноразовым.
Согласно конкретным вариантам осуществления вставка для клеточных культур является многоразовой и автоклавируемой.
Вставка для клеточных культур может быть синтетической или натуральной, она может быть неорганической или полимерной, например, сложные эфиры титана, глинозем, политетрафторэтилен (PTFE), тефлон, нержавеющая сталь, поликарбонат, нитроцеллюлоза и целлюлоза. Согласно конкретным вариантам осуществления вставка для клеточных культур представляет собой вставку из титана. Вставки для клеточных культур, которые можно использовать с конкретными вариантами осуществления настоящего изобретения, коммерчески доступны, например, от Alabama R&D, Millipore Corporation, Costar, Corning Incorporated, Nunc, Vitron Inc. и SEFAR и включают в себя, без ограничения, вставки для планшетов МА0036 Well, BIOCOATTM, Transwell, Millicell, Falcon-Cyclopore, Nunc Anapore, титановый экран и тефлоновый экран.
Согласно конкретным вариантам осуществления вставка для тканевых культур представляет собой вставку из титановой сетки, такую как, без ограничения, вставки для планшета Titanium МА0036 Well (Alabama R&D).
Согласно конкретным вариантам осуществления вставка для тканевых культур не покрыта органическим материалом, таким как коллаген, фибронектин или полиэтиленгликоль (PEG).
Согласно конкретным вариантам осуществления вставка для тканевых культур не покрыта белками, выделенными из соответствующей ткани (например, когда ткань представляет собой злокачественную ткань, тогда вставка для тканевых культур предварительно не покрыта белками, выделенными из опухоли соответствующей стадии и степени).
Согласно конкретным вариантам осуществления срез ткани находится в непосредственном контакте со вставкой для тканевых культур.
Согласно конкретным вариантам осуществления срез ткани не отделен от культуральной среды гетерологичным органическим материалом, таким как коллаген, фибронектин или синтетический полимер (который не является частью сосуда для культивирования), например, полиэтиленгликоль (PEG).
Согласно конкретным вариантам осуществления срез ткани находится в непосредственном контакте с культуральной средой.
Согласно конкретным вариантам осуществления срез ткани размещают в середине вставки для клеточных культур. Таким образом, например, когда применяется титановая сетка, такая как вставки для планшетов Titanium МА0036 Well, срез ткани помещается в вогнутость, расположенную в середине вставки.
2
После этого срез ткани культивируют (или поддерживают) при физиологической температуре, например, 37°С, в сильно насыщенной кислородом увлажненной атмосфере, содержащей по меньшей мере 50% кислорода и, например, 5% СО.
Согласно конкретным вариантам осуществления атмосфера с высоким содержанием кислорода содержит по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70% или по меньшей мере 80% кислорода.
Согласно конкретным вариантам осуществления атмосфера с высоким содержанием кислорода содержит по меньшей мере 70% кислорода.
Согласно другим конкретным вариантам осуществления атмосфера с высоким содержанием кислорода содержит менее чем 95% кислорода.
Согласно конкретному варианту осуществления атмосфера с высоким содержанием кислорода содержит приблизительно 80% кислорода.
Согласно конкретному варианту осуществления во время процесса культивирования культуру перемешивают посредством вращения, способствуя периодическому погружению среза ткани в культуральную среду.
Используемые в настоящем документе фразы «вращательное перемешивание, способствующее прерывистому погружению среза ткани в культуральную среду» или «перемешивание посредством вращения, способствуя прерывистому погружению среза ткани в культуральную среду», относится к перемешиванию, которое позволяет периодическое погружение среза ткани в среду, что облегчает диффузию питательных веществ и газа по всей среде и через срез ткани.
Согласно конкретным вариантам осуществления перемешивание представляет собой орбитальное перемешивание.
Согласно конкретным вариантам осуществления перемешивание представляет собой угловое перемешивание, например, под углом 30°-45°.
Согласно конкретным вариантам осуществления перемешивание осуществляется наклонным вращателем (таким как инкубационный блок MD2500, коммерчески доступный от Alabama Research and Development).
Согласно конкретным вариантам осуществления частота перемешивания составляет 50-200 об/мин, 50-150 об/мин или 50-100 об/мин.
Согласно конкретному варианту осуществления частота перемешивания составляет приблизительно 70 об/мин.
Культура ткани и способы по настоящему изобретению могут быть адаптированы для многих применений, включая в себя, без ограничения:
1. Доклинические и фундаментальные исследования, включая в себя:
- изучение механизмов, связанных со здоровьем и заболеванием;
- скрининг патологической ткани (например, опухолевой ткани) на наличие специфических маркеров;
- скрининг и/или разработка новых лекарственных средств, таких как противораковые лекарственные средства или новые комбинации лекарственных средств;
- определение эффективности партии лекарственных средств;
- изучение механизмов чувствительности и резистентности тканей человека. Так, например, лечение одной и той же опухоли несколькими лекарственными средствами и комбинациями лекарственных средств может быть использовано для подробного механистического исследования, которое не может быть легко сформировано у пациентов - людей;
- изучение микробиома опухоли: бактерии, вирусы или грибы, которые могут присутствовать в злокачественных опухолях.
2. Исследование влияния новых лекарственных средств или комбинаций лекарственных средств на срезы опухолей с целью определения приоритетов лекарственных средств или комбинаций лекарственных средств для дальнейшей разработки лекарственных средств, а также механистических исследований, доклинических испытаний in vivo и клинических испытаний.
3. Прогнозирование ответа пациента на лекарственные средства (например, противораковые лекарственные средства) и комбинации лекарственных средств и, следовательно, использование этого прогноза для адаптации конкретной схемы лечения для пациента (т.е. персонализированного лекарственного средства).
4. Поскольку срез ткани сохраняет структуру и обладает высокой жизнеспособностью после 5 дней культивирования, эта система позволяет моделировать исследования как хронической, так и острой токсичности, включая в себя метаболическую активность ткани.
5. Культура, демонстрирующая положительный ответ ex vivo, может использоваться в качестве критерия для включения пациента в клиническое испытание. Таким образом, эта стадия может предварительно отобрать пациентов с высокой вероятностью ответа и, следовательно, может повысить вероятность успешных клинических испытаний. В таких случаях культура тканей ex vivo может позже стать частью критериев приемлемости лекарственного средства.
Таким образом, согласно конкретным вариантам осуществления система культивирования содержит лекарственное средство.
Согласно другим конкретным вариантам осуществления описанный выше способ по настоящему изобретению предусматривает добавление лекарственного средства или комбинации лекарственных средств, как дополнительно описано в настоящем документе ниже.
Используемая в настоящем документе фраза «лекарственное средство» относится к средству, которое оказывает антипатологическое действие, включая в себя небольшие молекулы и биологические лекарственные средства (например, средства нуклеиновых кислот, полипептиды, антитела, аптамеры и т.д.). Как правило, лекарственное средство является экзогенным для высокоточного среза ткани или для тела или ткани человека, из которой получен высокоточный срез ткани. Лекарственное средство может представлять собой лекарственное средство, одобренное регулирующими органами для лечения патологии, или лекарственное средство, находящееся в стадии разработки. Согласно конкретным вариантам осуществления лекарственное средство представляет собой партию лекарственного средства.
Согласно конкретным вариантам осуществления лекарственное средство представляет собой противовоспалительное лекарственное средство.
Неограничивающие примеры противовоспалительных лекарственных средств, которые можно использовать с конкретными вариантами осуществления настоящего изобретения, включают в себя следующие: алклофенак; алкометазона дипропионат; альгестон ацетонид; альфа-амилаза; амцинафал; амцинафид; амфенак натрия; амиприлоза гидрохлорид; анакинра; аниролак; анитразафен; апазон; бальсалазид динатрия; бендазак; беноксапрофен; бензидамина гидрохлорид; бромелаины; броперамол; будесонид; карпрофен; циклопрофен; цинтазон; клирофен; клобетазола пропионат; клобетазона бутират; клопирак; клотиказона пропионат; корметазона ацетат; кортодоксон; дефлазакорт; дозонид; дезоксиметазон; дексаметазона дипропионат; диклофенак калия; диклофенак натрия; дифлоразона диацетат; дифлумидон натрия; дифлунизал; дифлупреднат; дифталон; диметилсульфоксид; дроцинонид; эндризон; энлимомаб; эноликам натрия; эпиризол; этодолак; этофенамат; фелбинак; фенамол; фенбуфен; фенклофенак; фенклорак; фендозал; фенпипалон; фентиазак; флазалон; флуазакорт; флуфенамовая кислота; флумизол; флунизолид ацетат; флуниксин; флуниксин меглумин; флуокортин бутил; фторметолона ацетат; флуквазон; флурбипрофен; флурэтофен; флутиказона пропионат; флурапрофен; фуробуфен; галцинонид; галобетазола пропионат; галопредона ацетат; ибуфенак; ибупрофен; ибупрофен алюминия; ибупрофен пиконол; илонидап; индометацин; индометацин натрия; индопрофен; индоксол; интразол; изофлупредон ацетат; изоксепак; изоксикам; кетопрофен; гидрохлорид лофемизола; ломоксикам; лотепреднол этабонат; меклофенамат натрия; меклофенамовая кислота; меклоризон дибутират; мефенамовая кислота; мезаламин; мезеклазон; метилпреднизолон сулептанат; момифлумат; набуметон; напроксен; напроксен натрий; напроксол; нимазон; олсалазин натрия; орготеин; орпаноксин; оксапрозин; оксифенбутазон; паранилина гидрохлорид; пентосан полисульфат натрия; фенбутазона натрия глицерат; пирфенидон; пироксикам; пироксикам циннамат; пироксикам оламин; пирпрофен; предназанат; прифелон; продолиновая кислота; проквазон; проксазол; цитрат проксазола; римексолон; ромазарит; салколекс; салнацедин; салсалат; сангвинарий хлорид; секлазон; серметацин; судоксикам; сулиндак; супрофен; талметацин; талнифлумат; талозалат; тебуфелон; тенидап; тенидап натрия; теноксикам; тесикам; тесимид; тетридамин; тиопинак; тиксокортол пивалат; толметин; толметин натрия; триклонид; трифлумидат; зидометацин; зомепирак натрий.
Согласно другим конкретным вариантам осуществления лекарственное средство представляет собой противораковое лекарственное средство.
Используемая в настоящем документе фраза «противораковое лекарственное средство» относится к средству, которое обладает противоопухолевым эффектом, включая в себя химиотерапию, небольшие молекулы, биологические препараты, гормональную терапию, антитела и целевую терапию.
Противораковые лекарственные средства, которые можно использовать с конкретными вариантами осуществления настоящего изобретения, включают в себя, без ограничения, следующие: ацивицин; акларубицин; гидрохлорид акодазола; акронин; адриамицин; адозелезин; алдеслейкин; алтретамин; амбомицин; аметантрон ацетат; аминоглутетимид; амсакрин; анастрозол; антрамицин; аспарагиназа; асперлин; азацитидин; азетепа; азотомицин; батимастат; бензодепа; бикалутамид; бисантрен гидрохлорид; биснафид димезилат; бизелезин; блеомицин сульфат; брекинар натрий; бропиримин; бусульфан; кактиномицин; калустерон; карацемид; карбетимер; карбоплатин; кармустин; карубицин гидрохлорид; карзелезин; цедефингол; хлорамбуцил; циролемицин; цисплатин; кладрибин; криснатол мезилат; циклофосфамид; цитарабин; дакарбазин; дактиномицин; даунорубицин гидрохлорид; децитабин; дексормаплатин; дезагуанин; дезагуанин мезилат; диазиквон; доцетаксел; доксорубицин; доксорубицин гидрохлорид; дролоксифен; дролоксифен цитрат; дромостанолон пропионат; дуазомицин; эдатрексат; эфлорнитина гидрохлорид; элсамитруцин; энлоплатин; энпромат; эпипропидин; эпирубицина гидрохлорид; эрбулозол; эзорубицина гидрохлорид; эстрамустин; эстрамутина фосфат натрия; этанидазол; этопозид; этопозида фосфат; этоприн; фадрозола гидрохлорид; фазарабин; фенретинид; флоксуридин; флударабина фосфат; фторурацил; флуроцитабин; фосквидон; фостриецин натрия; гемцитабин; гемцитабина гидрохлорид; гидроксимочевина; идарубицина гидрохлорид; ифосфамид; илмофозин; интерферон альфа-2а; интерферон альфа-2b; интерферон альфа-n1; интерферон альфа-n3; интерферон бета-1a; интерферон бета-1b; ипроплатин; иринотекана гидрохлорид; ланреотида ацетат; летрозол; леупролида ацетат; лиарозола гидрохлорид; лометрексол натрия; ломустин; лозоксантрона гидрохлорид; мазопрокол; майтанзин; мехлорэтамина гидрохлорид; мегестрола ацетат; меленгестрола ацетат; мелфалан; меногарил; меркаптопурин; метотрексат; метотрексат натрия; метоприн; метуредепа; митиндомид; митокарцин; митокромин; митогиллин; митомальцин; митомицин; митоспер; митотан, митоксантрона гидрохлорид; микофеноловая кислота; нокодазол; ногаламицин; ормаплатин; оксисуран; паклитаксел; пэгаспаргаза; пелиомицин; пентамустин; пепломицина сульфат; перфосфамид; пипоброман; пипосульфан; пироксантрона гидрохлорид; пликамицин; пломестан; порфимер натрия; порфиромицин; преднимустин; прокарбазина гидрохлорид; пуромицин; пуромицина гидрохлорид; пиразофурин; рибоприн; сафингол; сафингола гидрохлорид; семустин; симтразен; спарфозат натрия; спарсомицин; спирогермания гидрохлорид; спиромустин; спироплатин; стептонигрин; стрептозоцин; сулофенур; талисомицин; таксол; текогалан натрия; тегафур; телоксантрона гидрохлорид; темопорфин; тенипозид; тероксирон; тестолактон; тиамиприн; тиогуанин; тиотепа; тиазофурин; тирапазамин; тапотекана гидрохлорид; торемифена цитрат; трестолона ацетат; трицирибина фосфат; триметрексат; триметрексата глюкуронат; трипторелин; тубулозола гидрохлорид; урациловый иприт; уредепа; вапреотид; вертепорфин; винбластина сульфат; винкристина сульфат; виндесин; виндесина сульфат; винепидина сульфат; винглицината сульфат; винлеурозина сульфат; винорелбина тартрат; винросидина сульфат; винзолидина сульфат; ворозол; зениплатин; зиностатин; зорубицина гидрохлорид. Дополнительные противоопухолевые средства включают в себя те, которые описаны в главе 52 Antineoplastic Agents (Paul Calabresi and Bruce A. Chabner), и введении к нему, 1202-1263, Goodman and Gilman's "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Eighth Edition, 1990, McGraw-Hill, Inc. (Health Professions Division).
Неограничивающие примеры одобренных противораковых лекарственных средств включают в себя следующие: абареликс, алдеслейкин, алдеслейкин, алемтузумаб, алитретиноин, аллопуринол, альтретамин, амифостин, анастрозол, триоксид мышьяка, аспарагиназа, азацитидин, AZD9291, AZD4547, AZD2281, бевацизумаб, бексаротен, блеомицин, бортезомиб, бусульфан, калустерон, капецитабин, карбоплатин, кармустин, целекоксиб, цетуксимаб, цисплатин, кладрибин, клофарабин, циклофосфамид, цитарабин, дабрафениб, дакарбазин, дактиномицин, актиномицин D, дарбэпоэтин альфа, дарбэпоэтин альфа, даунорубицин липосомальный, даунорубицин, децитабин, денилейкин дифититокс, дексразоксан, дексразоксан, доцетаксел, доксорубицин, дромостанолон пропионат, Эллиотта Б раствор, эпирубицин, эпоэтин альфа, эрлотиниб, эстрамустин, этопозид, экземестан, филграстим, флоксуридин, флударабин, фторурацил 5-FU, фулвестрант, гефитиниб, гемцитабин, гемтузумаб озогамицин, гозерелина ацетат, гистрелина ацетат, гидроксимочевина, ибритумомаб тиуксетан, идарубицин, ифосфамид, иматиниба мезилат, интерферон альфа-2а, интерферон альфа-2b, иринотекан, леналидомид, летрозол, лейковорин, лейпролида ацетат, левамизол, ломустин, CCNU, меклоретамин, азотистый иприт, мегестрола ацетат, мелфалан, L-PAM, меркаптопурин 6-МР, месна, метотрексат, митомицин С, митотан, митоксантрон, нандролон фенпропионат, неларабин, нофетумомаб, опрелвекин, опрелвекин, оксалиплатин, паклитаксел, палбоциклиб палифермин, памидронат, пегадемаз, пегаспаргаза, пегфилграстим, пеметрексед динатрия, пентостатин, пипоброман, пликамицин митрамицин, порфимер натрия, прокарбазин, хинакрин, расбуриказа, ритуксимаб, сарграмостим, сорафениб, стрептозоцин, сунитиниб малеат, тамоксифен, темозоломид, тенипозид VM-26, тестолактон, тиогуанин 6-TG, тиотепа, тиотепа, топотекан, торемифен, тозитумомаб, траметиниб, трастузумаб, третиноин ATRA, урациловый иприт, валрубицин, винбластин, винорелбин, золедронат и золедроновая кислота.
Согласно конкретным вариантам осуществления противораковое лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из следующих: гефитиниб, лапатиниб, афатиниб, BGJ398, СН5183284, линситиниб, РНА665752, кризотиниб, сунитиниб, пазопаниб, иматиниб, руксолитиниб, дасатиниб, BEZ235, пиктилисиб, эверолимус, MK-2206, траметиниб / AZD6244, вемурафиниб / дабрафениб, ССТ196969 / ССТ241161, барасертиб, VX-680, нутлин3, палбоциклиб, BI 2536, бардоксолон, вориностат, навитоклакс (АВТ263), бортезомиб, висмодегиб, олапариб (AZD2281), симвастатин, 5-фторурацил, иринотекан, эпирубицин, цисплатин и оксалиплатин.
Согласно конкретным вариантам осуществления противораковое лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из 4-гидропероксициклофосфамида, 5-фторурацила (5FU), оксалиплатина, иринотекана, доцетаксела, цисплатина, траметиниба, палбоциклиба и AZD4547.
Согласно конкретным вариантам осуществления противораковое лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из 5-фторурацила (5FU), оксалиплатина, иринотекана, цисплатина, 4-гидропероксициклофосфамида, децетаксела, доксорубицина, навельбина, гемцитанима, гефитиниба, тамоксифена, олапариба, траметиниба, эверолимуса и палбоциклиба.
Понятно, что описанные в настоящем документе система культивирования и способы могут применяться для исследования дифференциального эффекта комбинаций лекарственных средств.
Таким образом, согласно конкретным вариантам осуществления лекарственное средство представляет собой комбинацию лекарственных средств.
Конкретные концентрации лекарственного средства в системе культивирования и способах по настоящему изобретению могут быть получены путем культивирования различных концентраций лекарственного средства на нескольких злокачественных тканях (одного типа или различных типов) и оценки диапазона, в котором достигается зависимый от дозы ответ. Как правило, этот зависимый от дозы диапазон отражает спектр, в соответствии с которым культивируемая злокачественная ткань должна отвечать или не давать ответа, что дает прогнозирующий результат.
Согласно конкретным вариантам осуществления концентрация лекарственного средства в системе культивирования и способах по настоящему изобретению по меньшей мере такая же, как доза IC50 лекарственного средства в клеточной линии (например, клеточной линии того же типа ткани и/или вида).
Согласно конкретным вариантам осуществления концентрация лекарственного средства в культуральной системе и способах по настоящему изобретению выше, чем доза IC50 лекарственного средства в клеточной линии (например, клеточной линии того же типа ткани и/или вида).
Согласно конкретным вариантам осуществления концентрация лекарственного средства в культуральной системе и способах по настоящему изобретению по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 25 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 100 раз превышает дозу IC50 лекарственного средства в клеточной линии (например, в клеточной линии того же типа ткани и/или вида).
Согласно конкретным вариантам осуществления концентрация лекарственного средства в системе культивирования и способах по настоящему изобретению по меньшей мере в 10 раз превышает дозу IC50 лекарственного средства в клеточной линии (например, клеточной линии того же типа ткани и/или вида).
Конкретные концентрации противораковых лекарственных средств, которые можно использовать с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения, показаны в таблицах 5-6, приведенных ниже.
Согласно конкретным вариантам осуществления несколько срезов ткани из одной ткани готовят и культивируют в нескольких культуральных сосудах (например, в лунках планшета), что позволяет исследовать ряд лекарственных средств и комбинаций лекарственных средств.
Согласно конкретным вариантам осуществления способы по настоящему изобретению предусматривают:
(i) определение эффекта множества (например, по меньшей мере 2) лекарственных средств в соответствии со способом по настоящему изобретению; а также
(ii) определение эффекта комбинаций лекарственных средств, показанных как эффективные, в соответствии со стадией (i), причем повышенная чувствительность ткани к комбинации лекарственных средств указывает на эффективность комбинации лекарственных средств.
Используемый в настоящем документе термин «повышенная чувствительность» относится к увеличению эффекта, индуцированного комбинацией лекарственных средств, по сравнению с эффектом, индуцированным каждым из лекарственных средств в комбинации, который может представлять собой аддитивный или синергетический эффект. Согласно конкретным вариантам осуществления эффект представляет собой синергетический эффект.
Согласно конкретным вариантам осуществления увеличение составляет по меньшей мере 1,5-кратное, по меньшей мере 2-кратное, по меньшей мере 3-кратное, по меньшей мере 5-кратное, по меньшей мере 10-кратное или по меньшей мере 20-кратное, по сравнению с эффектом, вызванным каждым из лекарственных средств в комбинации.
Согласно другим конкретным вариантам осуществления увеличение составляет по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или более чем 100%, по сравнению с эффектом, вызванным каждым из лекарственных средств в комбинации.
Как упомянуто, согласно конкретным вариантам осуществления ткань или срезы ткани могут храниться, т.е. при температуре 4°С, или подвергаться криоконсервированию и размораживанию по желанию, позволяя последовательно исследовать несколько лекарственных средств и комбинаций лекарственных средств.
Таким образом, например, согласно конкретным вариантам осуществления способы по настоящему изобретению предусматривают:
(i) определение эффекта по меньшей мере двух лекарственных средств в соответствии со способом по настоящему изобретению;
(ii) культивирование дополнительного среза ткани, полученного из патологической ткани, полученной от субъекта (например, после криоконсервирования и оттаивания) в соответствии со способом по настоящему изобретению;
(iii) добавление комбинаций лекарственных средств, определенных как эффективные для лечения заболевания у субъекта в соответствии со стадией (i); а также
(iv) определение влияния комбинации лекарственных средств на срез ткани, причем повышенная чувствительность среза ткани к комбинации лекарственных средств указывает на эффективность комбинации лекарственных средств для лечения заболевания у субъекта.
Лекарственное средство или комбинация лекарственных средств могут быть добавлены в культуру в различные моменты времени. Согласно конкретным вариантам осуществления лекарственное средство добавляют в культуру через 2-48 часов, через 2-36, 2-24, 12-48, 12-36 или 12-24 часа после начала культивирования.
Согласно конкретному варианту осуществления лекарственное средство или комбинацию лекарственных средств добавляют в культуру через 12-24 часа после начала культивирования.
Согласно конкретному варианту осуществления лекарственное средство или комбинацию лекарственных средств добавляют в культуру через 12-36 часов после начала культивирования.
Согласно конкретному варианту осуществления лекарственное средство или комбинацию лекарственных средств добавляют в культуру через 12-48 часов после начала культивирования.
Культивирование в присутствии лекарственного средства или комбинации лекарственных средств может осуществляться в течение всего периода культивирования с момента первого добавления лекарственного средства или может быть ограничено во времени. Альтернативно или дополнительно, лекарственное средство или комбинация лекарственных средств может добавляться в культуру несколько раз, например, когда обновляется культуральная среда.
Выбор концентрации лекарственного средства и времени инкубации с лекарственным средством или комбинацией лекарственных средств находятся в пределах возможностей специалистов в настоящей области техники.
Согласно конкретным вариантам осуществления концентрация лекарственного средства и время инкубации с лекарственным средством или комбинацией лекарственных средств приводят к обнаруживаемому воздействию на ткань, как дополнительно описано ниже.
Выбор концентрации лекарственного средства, используемого для исследования ех vivo, которое приведет к обнаруживаемому воздействию на ткань, находится в пределах возможностей специалистов в настоящей области техники. Предпочтительно используемая концентрация должна находиться в линейном диапазоне выбранного параметра.
Количество исследуемого лекарственного средства может составлять не менее чем 1, не менее чем 2, не менее чем 3, не менее чем 5, не менее чем 6, 1-10, 2-10, 3-10, 5-10, 1-5, 2- 5 и 3-5 разных концентраций в одном и том же анализе.
Количество повторов образцов для каждой из исследованных концентраций лекарственного средства может составлять 2, 3, 4, 5 или 6 повторов.
После культивирования можно определить воздействие лекарственного средства или комбинации лекарственных средств на ткани, чтобы таким образом определить эффективность лекарственного средства.
Таким образом, согласно другому аспекту настоящего изобретения существует способ определения эффективности лекарственного средства или партии лекарственных средств, причем способ предусматривает:
(i) культивирование высокоточного среза ткани на вставке для тканевых культур в культуральной среде в атмосфере с высоким содержанием кислорода, содержащей по меньшей мере 50% кислорода; и перемешивание культуры посредством вращения, способствующего периодическому погружению указанного среза ткани в указанную культуральную среду;
(ii) добавление лекарственного средства или партии лекарственных средств к указанной культуральной среде; а также
(iii) определение воздействия указанного лекарственного средства или указанной партии лекарственных средств на указанную ткань, причем чувствительность указанной ткани к указанному лекарственному средству указывает на эффективность указанного лекарственного средства.
Согласно конкретным вариантам осуществления стадия определения осуществляется после предварительно определенного времени культивирования. Время культивирования может варьировать, и определение времени культивирования, которое приведет к обнаруживаемому эффекту, находится в пределах возможностей специалистов в настоящей области техники.
Согласно конкретным вариантам осуществления определение проводится в течение 2-10, 2-7, 2-5, 3-10, 3-7, 3-5 или 4-5 дней культивирования.
Согласно конкретному варианту осуществления определение проводится в течение 3-5 дней культивирования.
Согласно другому конкретному варианту осуществления определение проводится в течение 4-5 дней культивирования.
Способы определения эффектов, вызванных лекарственным средством или комбинацией лекарственных средств, известны в настоящей области техники и включают в себя, например:
- Оценку жизнеспособности с использованием, например, МТТ-теста, основанного на селективной способности живых клеток восстанавливать желтую соль МТТ (3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолия бромид) (Sigma, Aldrich St Louis, МО, США) до пурпурно-синего нерастворимого осадка формазана; анализа WST или анализа поглощения АТФ;
- Оценку пролиферации с использованием, например, анализа BrDu [колориметрический набор BrdU ELISA для пролиферации клеток (Roche, Мангейм, Германия] или окрашивания Ki67;
- Оценку гибели клеток с использованием, например, анализа TUNEL [Roche, Мангейм, Германия], анализа аннексина V [набор апоптоза ApoAlert Annexin V (Clontech Laboratories, Inc., CA, США)], анализа LDH, анализа активированной каспазы 3, анализа активированной каспазы 8 и анализа синтазы оксида азота;
- Оценку старения с использованием, например, анализа связанной со старением р-галактозидазы (Dimri GP, Lee X, et al. 1995. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 92:9363-9367) и анализа укорочения теломеразы;
- Оценку клеточного метаболизма с использованием, например, анализа поглощения глюкозы;
- Различные способы обнаружения РНК и белка (которые определяют уровень экспрессии и/или активности); а также
- Оценку морфологии с использованием, например, окрашивания гематоксилином и эозином (Н&Е).
Согласно конкретным вариантам осуществления на определение влияют оценка морфологии, оценка жизнеспособности, оценка пролиферации и/или оценка гибели клеток.
Согласно конкретным вариантам осуществления определение осуществляется посредством оценки морфологии.
Оценка морфологии с использованием окрашивания Н&Е может предоставить подробную информацию, например, о следующем: содержание клеток, размер и плотность, соотношение жизнеспособных клеток/мертвых клеток, соотношение пораженных (например, опухолевых) клеток/здоровых клеток, инфильтрация иммунных клеток, фиброз, размер и плотность ядер, целостность, апоптотические тела и митотические фигуры. Согласно конкретным вариантам осуществления влияние лекарственного средства на ткань определяют путем оценки морфологии, например, с помощью патоморфолога.
Как правило, результаты каждого из анализов выражаются в числовой форме, причем высокий балл коррелирует с чувствительностью к лекарственному средству, а низкий балл коррелирует с резистентностью к лекарственному средству.
Используемая в настоящем документе фраза «чувствительность к лекарственному средству» или «чувствительность к комбинации лекарственных средств» относится к способности лекарственного средства или комбинации лекарственных средств вызывать клеточные изменения, такие как изменения жизнеспособности клеток, скорости пролиферации, дифференцировки, гибель клеток, некроз, апоптоз, старение, скорость транскрипции и/или трансляции конкретных генов и/или изменения в состояниях белка, например, фосфорилирование, дефосфорилирование, транслокация и любые их комбинации. Согласно конкретным вариантам осуществления клеточные изменения отражаются в снижении жизнеспособности клеток, снижении скорости пролиферации, повышенной гибели клеток и/или аберрантной морфологии по сравнению с таковыми в отсутствие лекарственного средства.
Согласно конкретному варианту осуществления клеточные изменения отражаются в снижении жизнеспособности клеток.
Согласно конкретному варианту осуществления клеточные изменения отражаются посредством аберрантной морфологии.
Согласно конкретным вариантам осуществления изменение составляет по меньшей мере 1,5-кратное, по меньшей мере 2-кратное, по меньшей мере 3-кратное, по меньшей мере 5-кратное, по меньшей мере 10-кратное или по меньшей мере 20-кратное по сравнению с тем же самым в отсутствие лекарственного средства.
Согласно другим конкретным вариантам осуществления изменение составляет по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 99% или по меньшей мере 100% по сравнению с аналогичными показателями в отсутствие лекарственного средства.
Согласно конкретным вариантам осуществления определенная эффективность лекарственного средства указывает на эффективность партии лекарственных средств, то есть чувствительность к лекарственному средству указывает на то, что эта партия является сильнодействующей.
Используемый в настоящем документе термин «активность» относится к показателю биологической активности лекарственного средства, основанному на атрибуте лекарственного средства, который связан с соответствующими биологическими свойствами (т.е. чувствительностью к лекарственному средству).
Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения способ предусматривает сравнение чувствительности ткани к лекарственному средству с чувствительностью ткани к эталонной стандартной партии лекарственных средств, чтобы определить относительную активность партии.
Используемый в настоящем документе термин «относительная активность» относится к качественному измерению эффективности партии лекарственных средств относительно стандартного эталона (RS) лекарственного средства, характеризующегося известной эффективностью.
Согласно конкретным вариантам осуществления эффективность партии лекарственных средств определяется относительно известной эффективности эталонного стандарта (RS).
Используемое в настоящем документе выражение «эталонный стандарт» или «RS» относится к стандартизированному лекарственному средству, которое используется в качестве основы измерения для лекарственного средства. RS обеспечивает откалиброванный уровень биологического эффекта, с которым можно сравнивать новые препараты лекарственного средства.
Согласно конкретному варианту осуществления RS характеризуется оптимальной активностью и качеством активного компонента, который эффективен при лечении заболевания (например, воспалительного заболевания, злокачественной опухоли).
Расчет активности и относительной активности известен в настоящей области техники. Согласно конкретным вариантам осуществления относительная активность вычисляется с использованием программного обеспечения, подходящего для биологических анализов, такого как программное обеспечение для анализа параллельных линий, например, PLA (Stegmann Systems GmbH) и программное обеспечение для анализа данных Gen5 (BioTek).
Реализация способа и/или системы вариантов осуществления настоящего изобретения может предусматривать осуществление или выполнение выбранных задач вручную, автоматически или их комбинацию. Кроме того, в соответствии с фактическим инструментарием и оборудованием вариантов осуществления способа и/или системы по настоящему изобретению несколько выбранных задач могут быть реализованы аппаратными средствами, программным обеспечением или встроенным программным обеспечением или их комбинацией с использованием операционной системы.
Согласно конкретным вариантам осуществления определенная эффективность лекарственного средства или комбинации лекарственных средств указывает на пригодность лекарственного средства для лечения заболевания.
Поскольку авторы настоящего изобретения показывают, что разработанная система EVOC может прогнозировать ответы опухолей на противораковые лекарственные средства и комбинированное лечение (пример 2 в следующем разделе примеров), настоящее изобретение также предусматривает использование систем и способов культивирования, описанных в настоящем документе, для прогнозирование ответа конкретного субъекта на схему лечения, таким образом, выбирая подходящую схему лечения для этого конкретного субъекта и подвергая лечению субъект в соответствии с этим выбором.
Таким образом, согласно аспекту настоящего изобретения предложен способ выбора лекарственного средства для лечения заболевания у нуждающегося в этом субъекта, причем способ предусматривает:
(i) культивирование высокоточного среза патологической ткани, полученного от субъекта, на вставке для тканевых культур в культуральной среде в атмосфере с высоким содержанием кислорода, содержащей по меньшей мере 50% кислорода; и перемешивание культуры посредством вращения, способствующего периодическому погружению указанного среза ткани в указанную культуральную среду;
(ii) добавление лекарственного средства к указанной культуральной среде; а также
(iii) определение воздействия указанного лекарственного средства на указанную ткань, причем чувствительность указанной ткани к указанному лекарственному средству указывает на эффективность указанного лекарственного средства для лечения указанного заболевания у указанного субъекта.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения заболевания у нуждающегося в этом субъекта, причем способ предусматривает:
(a) выбор лекарственного средства или комбинации лекарственных средств в соответствии с описанным в настоящем документе способом; а также
(b) введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества лекарственного средства или комбинации лекарственных средств, демонстрирующих эффективность для лечения указанного заболевания у указанного субъекта, таким образом подвергая лечению заболевание у субъекта.
Используемая в настоящем документе фраза «субъект» относится к субъекту-млекопитающему (например, человеку), у которого диагностировано заболевание или существует риск развития заболевания. Применение у животных также рассматривается. Субъект может быть любого пола и любого возраста, включая в себя новорожденных, младенцев, несовершеннолетних, подростков, взрослых и пожилых людей.
Термин «лечение» относится к ингибированию или прекращению развития патологии (заболевания, нарушения или состояния) и/или к снижению, ремиссии или регрессии патологии. Специалистам в настоящей области техники должно быть понятно, что могут применяться различные методологии и анализы для оценки развития патологии, и аналогичным образом могут применяться различные методологии и анализы для оценки уменьшения, ремиссии или регрессии патологии.
Определение терапевтически эффективного количества лекарственного средства или комбинации лекарственных средств находится в пределах компетенции специалистов в настоящей области техники. Дозировка может варьировать в зависимости от выбранного лекарственного средства, используемой лекарственной формы и используемого пути введения. Точный состав, способ введения и дозировка могут быть выбраны индивидуальным врачом с учетом состояния пациента. (Смотрите, например, Fingl, et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p. 1).
Согласно конкретным вариантам осуществления заболевание представляет собой воспалительное заболевание, которое может представлять собой хроническое воспалительное заболевание или острое воспалительное заболевание.
Воспалительные заболевания, связанные с гиперчувствительностью Неограничивающие примеры гиперчувствительности включают в себя: Гиперчувствительность типа II, включая в себя, без ограничения, ревматоидные заболевания, ревматоидные аутоиммунные заболевания, ревматоидный артрит (Krenn V. et al., Histol Histopathol 2000 Jul; 15 (3):791), спондилит, анкилозирующий спондилит (Krenn V. et al., Histol Histopathol 2000 Jul; 15 (3):791), системные заболевания, системные аутоиммунные заболевания, системную красную волчанку (Erikson J. et al., Immunol Res 1998; 17 (1-2):49), склероз, системный склероз (Renaudineau Y. et al., Clin Diagn Lab Immunol. 1999 Mar; 6 (2): 156); Chan ОТ. et al., Immunol Rev 1999 Jun; 169:107), заболевания желез, железистые аутоиммунные заболевания, аутоиммунные заболевания поджелудочной железы, сахарный диабет I типа (Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract 1996 Oct; 34 Suppl:S125), заболевания щитовидной железы, аутоиммунные заболевания щитовидной железы, болезнь Грейвса (Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am 2000 Jun; 29 (2):339), тиреоидит, спонтанный аутоиммунный тиреоидит (Braley-Mullen Н. and Yu S, J Immunol 2000 Dec 15; 165 (12):7262), тиреоидит Хашимото (Toyoda N. et al., Nippon Rinsho 1999 Aug; 57 (8): 1810), микседему, идиопатическую микседему (Mitsuma Т. Nippon Rinsho. 1999 Aug; 57 (8): 1759); аутоиммунные репродуктивные заболевания, заболевания яичников, аутоиммунные заболевания яичников (Garza KM. et al., J Reprod Immunol 1998 Feb; 37 (2): 87), аутоиммунное антиспермальное бесплодие (Diekman AB. et al., Am J Reprod Immunol. 2000 Mar; 43 (3):134), повторную потерю плода (Tincani A. et al., Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9), нейродегенеративные заболевания, неврологические заболевания, неврологические аутоиммунные заболевания, рассеянный склероз (Cross АН. et al., J Neuroimmunol 2001 Jan 1; 112 (1-2): 1), болезнь Альцгеймера (Oron L. et al., J Neural Transm Suppl. 1997; 49:77), миастению гравис (Infante AJ. And Kraig E, Int Rev Immunol 1999; 18 (1-2):83), двигательные невропатии (Kornberg AJ. J Clin Neurosci. 2000 May; 7 (3): 191), синдром Гийена-Барре, невропатии и аутоиммунные невропатии (Kusunoki S. Am J Med Sci. 2000 Apr; 319 (4):234), миастенические заболевания, миастенический синдром Ламберта-Итона (Takamori М. Am J Med Sci. 2000 Apr; 319 (4):204), паранеопластические неврологические заболевания, атрофию мозжечка, паранеопластическую атрофию мозжечка, синдром непаранеопластической ригидности у мужчин, атрофию мозжечка, прогрессирующую атрофию мозжечка, энцефалит, энцефалит Расмуссена, боковой амиотрофический склероз, синдром Хидэя, синдром Жиля де ла Туретта, полиэндокринопатии, аутоиммунные полиэндокринопатии (Antoine JC. and Honnorat J. Rev Neurol (Paris) 2000 Jan; 156 (1):23); невропатии, дисиммунные невропатии (Nobile-Orazio E. et al., Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 1999; 50:419); нейромиотонию, приобретенную нейромиотонию, врожденный множественный артрогрипоз (Vincent A. et al., Ann N Y Acad Sci. 1998 May 13; 841:482), сердечно-сосудистые заболевания, сердечнососудистые аутоиммунные заболевания, атеросклероз (Matsuura Е. et al., Lupus. 1998; 7 Suppl 2:S135), инфаркт миокарда (Vaarala О. Lupus. 1998; 7 Suppl 2:S132), тромбоз (Tincani A. et al., Lupus 1998; 7 Suppl 2:S107-9), гранулематоз, гранулематоз Вегенера, артериит, артериит Такаясу и синдром Кавасаки (Praprotnik S. et al., Wien Klin Wochenschr 2000 Aug 25; 112 (15-16):660); аутоиммунное заболевание против фактора VIII (Lacroix-Desmazes S. et al., Semin Thromb Hemost.2000; 26 (2): 157); васкулиты, некротизирующие васкулиты мелких сосудов, микроскопический полиангиит, синдром Чурга и Штрауса, гломерулонефрит, пауци-иммунный очаговый некротический гломерулонефрит, серповидный гломерулонефрит (Noel LH. Ann Med Interne (Paris). 2000 May; 151 (3):178); антифосфолипидный синдром (Flamholz R. et al., J Clin Apheresis 1999; 14 (4): 171); сердечную недостаточность, агонистоподобные антитела к β-адренорецептору при сердечной недостаточности (Wallukat G. et al., Am J Cardiol. 1999 Jun 17; 83 (12A):75H), тромбоцитопеническую пурпуру (Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999 Apr-Jun; 14 (2): 114); гемолитическую анемию, аутоиммунную гемолитическую анемию (Efremov DG. et al., Leuk Lymphoma 1998 Jan; 28 (3-4):285), желудочно-кишечные заболевания, аутоиммунные заболевания желудочно-кишечного тракта, кишечные заболевания, хронические воспалительные заболевания кишечника (Garcia Herola A. et al., Gastroenterol Hepatol. 2000 Jan; 23 (1): 16), целиакию (Landau YE. and Shoenfeld Y. Harefuah 2000 Jan 16; 138 (2): 122), аутоиммунные заболевания мускулатуры, миозит, аутоиммунный миозит, синдром Шегрена (Feist Е. et al., Int Arch Allergy Immunol 2000 Sep; 123 (1):92); аутоиммунное заболевание гладких мышц (Zauli D. et al., Biomed Pharmacother 1999 Jun; 53 (5-6):234), заболевания печени, аутоиммунные заболевания печени, аутоиммунный гепатит (Manns MP. J Hepatol 2000 Aug; 33 (2):326) и первичный билиарный цирроз печени (Strassburg СР. et al., Eur J Gastroenterol Hepatol. 1999 Jun; 11 (6): 595);
Гиперчувствительность типа IV или опосредованная Т-клетками, включая в себя, без ограничения, ревматоидные заболевания, ревматоидный артрит (Tisch R, McDevitt НО. Proc Natl Acad Sci USA 1994 Jan 18;91 (2):437), системные заболевания, системные аутоиммунные заболевания, системную красную волчанку (Datta SK., Lupus 1998; 7 (9):591), заболевания желез, аутоиммунные заболевания желез, панкреатические заболевания, аутоиммунные заболевания поджелудочной железы, сахарный диабет 1 типа (Castano L. and Eisenbarth GS. Ann. Rev. Immunol. 8:647); заболевания щитовидной железы, аутоиммунные заболевания щитовидной железы, болезнь Грейвса (Sakata S. et al., Mol Cell Endocrinol 1993 Mar; 92 (1):77); заболевания яичников (Garza KM. et al., J Reprod Immunol 1998 Feb; 37 (2):87), простатит, аутоиммунный простатит (Alexander RB. et al., Urology 1997 Dec; 50 (6):893), полигландулярный синдром, аутоиммунный полигландулярный синдром, аутоиммунный полигландулярный синдром I типа (Hara Т. et al., Blood. 1991 Mar 1; 77 (5): 1127), неврологические заболевания, аутоиммунные неврологические заболевания, рассеянный склероз, неврит, неврит зрительного нерва (Soderstrom М. et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994 May; 57 (5):544), миастению гравис (Oshima M. et al., Eur J Immunol 1990 Dec; 20 (12):2563), синдром мышечной скованности (Hiemstra HS. et al., Proc Natl Acad Sci USA 2001 Mar 27; 98 (7):3988), сердечнососудистые заболевания, сердечный аутоиммунитет при болезни Шагаса (Cunha-Neto Е. et al., J Clin Invest 1996 Oct 15; 98 (8):1709), аутоиммунную тромбоцитопеническую пурпуру (Semple JW. et al., Blood 1996 May 15; 87 (10):4245), аутоиммунитет против хелперных T-лимфоцитов (Caporossi АР. et al., Viral Immunol 1998; 11 (1):9), гемолитическую анемию (Sallah S. et al., Ann Hematol 1997 Mar; 74 (3): 139), заболевания печени, аутоиммунные заболевания печени, гепатит, хронический активный гепатит (Franco A. et al., Clin Immunol Immunopathol 1990 Mar; 54 (3):382), билиарный цирроз, первичный билиарный цирроз печени (Jones DE. Clin Sci (Colch) 1996 Nov; 91 (5):551), заболевания почек, аутоиммунные заболевания почек, нефрит, интерстициальный нефрит (Kelly CJ. J Am Soc Nephrol 1990 Aug; 1 (2): 140), заболевания соединительной ткани, болезни уха, аутоиммунные заболевания соединительной ткани, аутоиммунные заболевания уха (Yoo TJ. et al., Cell Immunol 1994 Aug; 157 (1):249), заболевание внутреннего уха (Gloddek В. et al., Ann N Y Acad Sci 1997 Dec 29; 830:266), заболевания кожи, кожные заболевания, буллезные кожные заболевания, пузырчатку обыкновенную, буллезную пузырчатку и пузырчатку листовую;
Гиперчувствительность замедленного типа, включая в себя, без ограничения, контактный дерматит и лекарственный дерматит.
Аутоиммунные заболевания
Включают в себя, без ограничения, сердечно-сосудистые заболевания, ревматоидные заболевания, заболевания желез, желудочно-кишечные заболевания, кожные заболевания, заболевания печени, неврологические заболевания, заболевания мышц, заболевания почек, связанные с размножением заболевания, заболевания соединительной ткани и системные заболевания.
Примеры аутоиммунных сердечно-сосудистых заболеваний включают в себя, без ограничения, атеросклероз (Matsuura Е. et al., Lupus. 1998; 7 Suppl 2:S135), инфаркт миокарда (Vaarala О. Lupus. 1998; 7 Suppl 2:S132), тромбоз (Tincani A. et al., Lupus 1998; 7 Suppl 2:S 107-9), гранулематоз Вегенера, артериит Такаясу, синдром Кавасаки (Praprotnik S. et al., Wien Klin Wochenschr 2000 Aug 25; 112 (15-16):660), аутоиммунное заболевание против фактора VIII (Lacroix-Desmazes S. et al., Semin Thromb Hemost.2000; 26 (2): 157), некротизирующие васкулиты мелких сосудов, микроскопический полиангиит, синдром Чурга и Штрауса, пауци-иммунный очаговый некротический и серповидный гломерулонефрит (Noel LH. Ann Med Interne (Paris). 2000 May; 151 (3):178), антифосфолипидный синдром (Flamholz R. et al., J Clin Apheresis 1999; 14 (4): 171), индуцированная антителами сердечная недостаточность (Wallukat G. et al., Am J Cardiol. 1999 Jun 17; 83 (12A):75H), тромбоцитопеническая пурпура (Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999 Apr-Jun; 14 (2):114; Semple JW. et al., Blood 1996 May 15; 87 (10):4245), аутоиммунная гемолитическая анемия (Efremov DG. et al., Leuk Lymphoma 1998 Jan; 28 (3-4):285; Sallah S. et al., Ann Hematol 1997 Mar; 74 (3): 139), сердечный аутоиммунитет при болезни Шагаса (Cunha-Neto Е. et al., J Clin Invest 1996 Oct 15; 98 (8): 1709) и аутоиммунитет против хелперных Т-лимфоцитов (Caporossi АР. et al., Viral Immunol 1998; 11 (1):9).
Примеры аутоиммунных ревматоидных заболеваний включают в себя, без ограничения, ревматоидный артрит (Krenn V. et al., Histol Histopathol 2000 Jul; 15 (3):791; Tisch R, McDevitt HO. Proc Natl Acad Sci units S A 1994 Jan 18;91 (2):437) и анкилозирующий спондилит (Jan Voswinkel et al., Arthritis Res 2001; 3 (3): 189).
Примеры аутоиммунных заболеваний желез включают в себя, без ограничения, заболевание поджелудочной железы, сахарный диабет I типа, заболевание щитовидной железы, болезнь Грейвса, тиреоидит, спонтанный аутоиммунный тиреоидит, тиреоидит Хашимото, идиопатическую микседему, аутоиммунность яичников, аутоиммунное антиспермальное бесплодие, аутоиммунный простатит и аутоиммунный полигландулярный синдром I типа. Заболевания включают в себя, без ограничения, аутоиммунные заболевания поджелудочной железы, сахарный диабет I типа (Castano L. and Eisenbarth GS. Ann. Rev. Immunol. 8:647; Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract 1996 Oct; 34 Suppl:S125), аутоиммунные заболевания щитовидной железы, болезнь Грейвса (Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am 2000 Jun; 29 (2):339; Sakata S. et al., Mol Cell Endocrinol 1993 Mar; 92 (1):77), спонтанный аутоиммунный тиреоидит (Braley-Mullen H. and Yu S, J Immunol 2000 Dec 15; 165 (12):7262), тиреоидит Хашимото (Toyoda N. et al., Nippon Rinsho 1999 Aug;57 (8): 1810), идиопатическую микседему (Mitsuma Т. Nippon Rinsho. 1999 Aug; 57 (8): 1759), аутоиммунное заболевание яичников (Garza KM. et al., J Reprod Immunol 1998 Feb; 37 (2):87), аутоиммунное антиспермальное бесплодие (Diekman АВ. et al., Am J Reprod Immunol. 2000 Mar; 43 (3): 134), аутоиммунный простатит (Alexander RB. et al., Urology 1997 Dec; 50 (6):893) и аутоиммунный полигландулярный синдром I типа (Hara Т. et al., Blood. 1991 Mar 1; 77 (5): 1127).
Примеры аутоиммунных желудочно-кишечных заболеваний включают в себя, без ограничения, хронические воспалительные заболевания кишечника (Garcia Herola A. et al., Gastroenterol Hepatol. 2000 Jan; 23 (1):16), целиакию (Landau YE. and Shoenfeld Y. Harefuah 2000 Jan 16; 138 (2): 122), колит, илеит и болезнь Крона.
Примеры аутоиммунных кожных заболеваний включают в себя, без ограничения, аутоиммунные буллезные кожные заболевания, такие как, без ограничения, пузырчатка обыкновенная, буллезная пузырчатка и пузырчатка листовая.
Примеры аутоиммунных заболеваний печени включают в себя, без ограничения, гепатит, аутоиммунный хронический активный гепатит (Franco A. et al., Clin Immunol Immunopathol 1990 Mar; 54 (3):382), первичный билиарный цирроз печени (Jones DE. Clin Sci (Colch) 1996 Nov; 91 (5):551; Strassburg CP. et al., Eur J Gastroenterol Hepatol. 1999 Jun; 11 (6): 595) и аутоиммунный гепатит (Manns MP. J Hepatol 2000 Aug; 33 (2):326).
Примеры аутоиммунных неврологических заболеваний включают в себя, без ограничения, рассеянный склероз (Cross АН. et al., J Neuroimmunol 2001 Jan 1; 112 (1-2): 1), болезнь Альцгеймера (Oron L. et al., J Neural Transm Suppl. 1997; 49:77), миастению гравис (Infante AJ. And Kraig E, Int Rev Immunol 1999; 18 (1-2):83; Oshima M. et al., Eur J Immunol 1990 Dec; 20 (12):2563), невропатии, двигательные невропатии (Kornberg AJ. J Clin Neurosci. 2000 May; 7 (3): 191); синдром Гийена-Барре и аутоиммунные невропатии (Kusunoki S. Am J Med Sci. 2000 Apr; 319 (4):234), миастению, миастенический синдром Ламберта-Итона (Takamori М. Am J Med Sci. 2000 Apr; 319 (4):204); паранеопластические неврологические заболевания, атрофию мозжечка, паранеопластическую атрофию мозжечка и синдром мышечной скованности (Hiemstra HS. et al., Proc Natl Acad Sci units S A 2001 Mar 27; 98 (7):3988); непаранеопластический синдром мышечной скованности, прогрессирующую атрофию мозжечка, энцефалит, энцефалит Расмуссена, боковой амиотрофический склероз, хорею Сидегема, синдром Жиля де ла Туретта и аутоиммунные полиэндокринопатии (Antoine JC. and Honnorat J. Rev Neurol (Paris) 2000 Jan; 156 (1):23); дисиммунные невропатии (Nobile-Orazio E. et al., Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 1999; 50:419); приобретенную нейромиотонию, врожденный множественный артрогрипоз (Vincent A. et al., Ann N Y Acad Sci. 1998 May 13; 841:482), неврит, неврит зрительного нерва (Soderstrom М. et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994 May; 57 (5):544) и нейродегенеративные заболевания.
Примеры аутоиммунных мышечных заболеваний включают в себя, без ограничения, миозит, аутоиммунный миозит и первичный синдром Шегрена (Feist Е. et al., Int Arch Allergy Immunol 2000 Sep; 123 (1):92) и аутоиммунное заболевание гладких мышц (Zauli D. et al., Biomed Pharmacother 1999 Jun; 53 (5-6):234).
Примеры аутоиммунных заболеваний почек включают в себя, без ограничения, нефрит и аутоиммунный интерстициальный нефрит (Kelly CJ. J Am Soc Nephrol 1990 Aug; 1(2): 140).
Примеры аутоиммунных связанных с размножением заболеваний включают в себя, без ограничения, повторную потерю плода (Tincani A. et al., Lupus 1998; 7 Suppl 2:S 107-9).
Примеры аутоиммунных заболеваний соединительной ткани включают в себя, без ограничения, заболевания уха, аутоиммунные заболевания уха (Yoo TJ. et al., Cell Immunol 1994 Aug; 157 (1):249) и аутоиммунные заболевания внутреннего уха (Gloddek В. et al., Ann N Y Acad Sci 1997 Dec 29; 830:266).
Примеры аутоиммунных системных заболеваний включают в себя, без ограничения, системную красную волчанку (Erikson J. et al., Immunol Res 1998; 17 (l-2):49) и системный склероз (Renaudineau Y. et al., Clin Diagn Lab Immunol. 1999 Mar; 6 (2): 156); Chan ОТ. et al., Immunol Rev 1999 Jun; 169:107).
Инфекционные заболевания
Примеры инфекционных заболеваний включают в себя, без ограничения, хронические инфекционные заболевания, подострые инфекционные заболевания, острые инфекционные заболевания, вирусные заболевания, бактериальные заболевания, вызываемые простейшими заболевания, паразитарные заболевания, грибковые заболевания, микоплазменные заболевания и прионные заболевания.
Согласно конкретным вариантам осуществления заболевание представляет собой злокачественную опухоль.
Термины «злокачественная опухоль» и «злокачественный» описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое, как правило, характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Используемые в настоящем документе термины «злокачественная опухоль» и «злокачественный» относятся к любой солидной опухоли, метастазированию злокачественной опухоли и/или солидному предраку.
Примеры злокачественной опухоли включают в себя, без ограничения, карциному, бластому, саркому и лимфому. Более конкретные примеры таких злокачественных опухолей включают в себя плоскоклеточный рак, злокачественную опухоль легкого (включая в себя мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого и плоскоклеточную карциному легкого), глиому, меланому, злокачественную опухоль брюшины, гепатоцеллюлярную злокачественную опухоль, желудочную злокачественную опухоль, желудка и пищевода или желудка (включая в себя злокачественную опухоль желудочно-кишечного тракта), злокачественную опухоль поджелудочной железы, глиобластому, злокачественную опухоль шейки матки, злокачественную опухоль яичников, злокачественную опухоль печени, злокачественную опухоль мочевого пузыря, гепатому, злокачественную опухоль молочной железы, злокачественную опухоль толстой кишки, злокачественную опухоль толстой и прямой кишок, карциному эндометрия или матки, карциному слюнных желез, саркому мягких тканей, злокачественную опухоль почек, злокачественную опухоль предстательной железы, злокачественную опухоль влагалища, злокачественную опухоль щитовидной железы, печеночную карциному, саркому Капоши, карциноидную карциному и различные типы злокачественной опухоли головы и шеи.
Предраковые заболевания хорошо охарактеризованы и известны в настоящей области техники (смотрите, например, Berman JJ. and Henson DE., 2003. Classifying the precancers: a metadata approach. BMC Med Inform Decis Mak. 3:8). Примеры предраковых заболеваний включают в себя, без ограничения, приобретенные небольшие предраковые состояния, приобретенные крупные поражения с ядерной атипией, предраковые поражения, возникающие при наследственных гиперпластических синдромах, которые прогрессируют до злокачественной опухоли, и приобретенные диффузные гиперплазии и диффузные метаплазии. Неограничивающие примеры небольших предраковых заболеваний включают в себя HGSIL (плоскоклеточное интраэпителиальное поражение шейки матки высокой степени), AIN (анальная интраэпителиальная неоплазия), дисплазия голосовых связок, аберрантные крипты (толстой кишки), PIN (интраэпителиальная неоплазия предстательной железы).
Неограничивающими примерами приобретенных крупных поражений с ядерной атипией являются тубулярная аденома, AILD (ангиоиммунобластическая лимфаденопатия с диспротеинемией), атипичная менингиома, полип желудка, парапсориаз крупных бляшек, миелодисплазия, папиллярная переходная клеточная карцинома in-situ, рефрактерная анемия с избытком бластов и Шнейдерова папиллома. Неограничивающие примеры поражений-предшественников, происходящих с наследственными гиперпластическими синдромами, которые прогрессируют до злокачественной опухоли, включают в себя синдром атипичной родинки, аденоматоз С-клеток и МЕА. Неограничивающие примеры приобретенной диффузной гиперплазии и диффузной метаплазии включают в себя болезнь Педжета кости и язвенный колит.
Согласно конкретным вариантам осуществления злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из злокачественной опухоли яичников, злокачественной опухоли толстой и прямой кишок, злокачественной опухоли легких, злокачественной опухоли поджелудочной железы, злокачественной опухоли желудка, злокачественной опухоли желудочно-пищеводного канала и злокачественной опухоли молочной железы.
Согласно конкретным вариантам осуществления злокачественная опухоль представляет собой метастатическую злокачественную опухоль.
Поскольку доступны различные дополнительные технологии для прогнозирования ответа пациента на схему лечения, способы по настоящему изобретению можно комбинировать с другими способами, известными в настоящей области техники, такими как, без ограничения, генетическое профилирование, модели полученных из опухолей пациентов происходящих из опухолей клеточных линий и полученных от пациента ксенотрансплантатов (PDX), как также описано в разделе примеров ниже.
Согласно конкретным вариантам осуществления способ осуществляют в комбинации с генетическим профилированием.
Используемый в настоящем документе термин «генетическое профилирование» относится к молекулярной сигнатуре набора генов в биологических образцах с использованием любой подходящей технологии профилирования, такой как, без ограничения, ДНК-секвенирование, РНК-секвенирование и техники микрочипирования.
Используемый в настоящем документе термин «приблизительно» относится к±10%.
Термины «содержит», «содержащий», «включает в себя», «включающий в себя», «имеющий» и их родственные слова по корню и значению означают «включающий в себя, без ограничения».
Термин «состоящий из» означает «включающий в себя и ограниченный».
Термин «состоящий по существу из» означает, что композиция, способ или структура могут включать в себя дополнительные ингредиенты, стадии и/или части, но только если дополнительные ингредиенты, стадии и/или части не изменяют существенно основные и новые характеристики заявленной композиции, способа или структуры.
Используемые в настоящем документе формы единственного числа включают в себя множественные упоминания, если контекст явно не предписывает иное. Например, термин «соединение» или «по меньшей мере одно соединение» может включать в себя множество соединений, включая в себя их смеси.
На протяжении настоящей заявки различные варианты осуществления настоящего изобретения могут быть представлены в формате диапазона. Следует понимать, что описание в формате диапазона предназначено только для удобства и краткости и не должно рассматриваться как негибкое ограничение объема настоящего изобретения. Соответственно, следует считать, что описание диапазона конкретно раскрывает все возможные поддиапазоны, а также отдельные числовые значения в этом диапазоне. Например, описание диапазона, такого как от 1 до 6, должно рассматриваться как специально раскрытые поддиапазоны, такие как от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3 6 и т.д., а также отдельные числа в этом диапазоне, например, 1, 2, 3, 4, 5 и 6. Это применимо независимо от ширины диапазона.
Всякий раз, когда числовой диапазон указан в настоящем документе, он подразумевает включение в себя любого цитируемого числа (дробного или целого) в указанный диапазон. Фразы «диапазон/диапазоны между» первым указанным числом и вторым указанным числом и «диапазон/диапазоны от» первого указанного числа «до» второго указанного числа используются в настоящем документе взаимозаменяемо и предназначены для включения первого и второго указанных чисел и всех дробных и целых чисел между ними.
Используемый в настоящем документе термин «способ» относится к способам, средствам, техникам и процедурам для выполнения данной задачи, включая в себя, без ограничения, те способы, средства, техники и процедуры, которые известны или легко разработаны из известных способов, средств, техник и процедур специалистами-практиками области химии, фармакологии, биологии, биохимии и медицины.
Когда делается ссылка на конкретные перечни последовательностей, следует понимать, что такая ссылка также охватывает последовательности, которые, по существу, соответствуют ее комплементарной последовательности, включая в себя незначительные вариации последовательности, возникающие, например, в результате ошибок последовательности, ошибок клонирования или других изменений, приводящих к замене основания, делеции основания или добавлению основания при условии, что частота таких вариаций составляет менее чем 1 на 50 нуклеотидов, альтернативно, менее чем 1 на 100 нуклеотидов, альтернативно, менее чем 1 на 200 нуклеотидов, альтернативно, менее чем 1 на 500 нуклеотидов, альтернативно менее чем 1 на 1000 нуклеотидов, альтернативно, менее чем 1 на 5000 нуклеотидов, альтернативно, менее чем 1 на 10000 нуклеотидов.
Понятно, что определенные признаки настоящего изобретения, которые для ясности описаны в контексте отдельных вариантов осуществления, также могут быть предоставлены в комбинации в одном варианте осуществления. И наоборот, различные признаки настоящего изобретения, которые для краткости описаны в контексте одного варианта осуществления, также могут быть предусмотрены отдельно или в любой подходящей подкомбинации или как подходящие в любом другом описанном варианте осуществления настоящего изобретения. Определенные признаки, описанные в контексте различных вариантов осуществления, не должны рассматриваться как существенные признаки этих вариантов осуществления, если только вариант осуществления не работает без этих элементов.
Различные варианты осуществления и аспекты настоящего изобретения, описанные выше и заявленные в разделе формулы изобретения ниже, находят экспериментальную поддержку в следующих примерах.
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры вместе с приведенными выше описаниями иллюстрируют некоторые варианты осуществления настоящего изобретения неограничивающим образом.
Как правило, используемая в настоящем документе номенклатура и используемые в настоящем изобретении лабораторные процедуры включают в себя способы молекулярной, биохимической, микробиологической и рекомбинантной ДНК. Такие приемы подробно описаны в литературе. Смотрите, например, "Molecular Cloning: А laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R.M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal., "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); методологии, изложенные в патенте США №4666828; 4683202; 4801531; 5192659 и 5272057; "Cell Biology: А Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); доступные иммуноанализы подробно описаны в патентной и научной литературе, смотрите, например, патент США №3791932; 3839153; 3850752; 3850578; 3853987; 3867517; 3879262; 3901654; 3935074; 3984533; 3996345; 4034074; 4098876; 4879219; 5011771 и 5281521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, М.J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B.D., and Higgins S.J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B.D., and Higgins S.J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R.I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal., В., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol.1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); все из которых включены посредством ссылки, как если бы они были полностью изложены в настоящем документе. Другие общие ссылки приведены в настоящем документе. Считается, что процедуры в настоящем документе хорошо известны в настоящей области техники и предоставлены для удобства читателя. Вся информация, содержащаяся в них, включена в настоящий документ посредством ссылки.
МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ
Срезы ткани - Здоровые и злокачественные ткани (печень, легкое, толстая кишка, молочная железа, поджелудочная железа или метастатические ткани злокачественной опухоли, происходящие из легкого, толстой кишки, молочной железы или поджелудочной железы) получали от моделей PDX мышей (Nod Scid Gamma Mice Jackson Laboratories USA и/или Harlan Laboratories); биопсии человека и хирургически удаленные ткани; и ксенотрансплантаты, полученные от человека (злокачественная опухоль яичников, PDX поджелудочной железы). После сбора свежую ткань немедленно помещали в ледяной забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS, Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Израиль) или ледяную культуральную среду (RPMI Biological Industries). Высокоточный резальный станок для тканей (CompresstomeTM VF-300: Precisionary Instruments Inc. NC, США) очищали 70% этанолом, дважды промывали стерильной водой, и новое лезвие (Double Edge Blades 32017759 Belgar, Иерусалим, Израиль) прикрепляли и располагали в нужном месте.
3
Ткань оставляли на льду, пока ее не переносили в предварительно очищенный резальный станок для тканей; затем ткань удаляли из PBS и аккуратно прикрепляли к поршню с помощью контактного клея и стабилизировали в 3% агарозе с низким содержанием геля, нагревали до температуры 50°С и затем охлаждали до отверждения перед использованием (агароза, низкое гелеобразование А0701 Sigma-Aldrich, 3% в 0,9 г NaCl). Поршень с тканью вставляли в назначенное место в резальном станке для ткани, и ванну заполняли охлажденной льдом средой Е Уильяма с добавлением пенициллина и стрептомицина. Для поддержания среды в ванне при низких температурах конструировали полый охлаждающий змеевик, который находится в ванне. Затем ледяную воду прокачивали через змеевик с помощью стандартного погружного насоса. Ткань нарезали на срезы толщиной до ~ 250 мкМ. Приблизительно 30-40 срезов готовили из 1 см куска ткани. Два или три среза немедленно помещали в одноразовые пластиковые гистологические кассеты и фиксировали в 4% PFA.
2
2
Процедура культивирования. Срезы ткани помещали по отдельности в 6-луночные планшеты (Corning СС-3516 Getter, Petach-Tikva, Израиль) напрямую, поверх титановых вставок (МА0036 Well Inserts, Alabama R&D, Alabama, США) или на PEG или PEG, размещенный на титановой вставке. Каждая лунка содержала 4,5 мл среды DMEM/F12 или M199 с добавлением пенициллина (100 МЕ/мл), стрептомицина (100 мкг/мл), гентамицина (G1397 50 мкг/мл Sigma-Aldrich), 5% фетальной сыворотки теленка (FCS, 10270106 Gibco Sigma-Aldrich, Rehovot, Израиль), амфотерицин В (А-4888 2,5 мкг/мл Sigma-Aldrich) и глутамин (L-глутамин 03-020-1 В 100 мкл/мл Biological Industries). Планшеты инкубировали во влажном инкубаторе при температуре 37°С с 5% CO и 21% или 80% О (с использованием кислородной камеры: BioSpherix С274, NY, США; контроллера кислорода: Biospherix ProOx С21, NY, США, и кислорода 98% Maxima Air Innovations, Ашдод, Израиль).
Весь инкубатор помещали в орбитальный шейкер с перемешиванием (TOU-120N MRC, Холон, Израиль) при 70 об/мин. После инкубации в течение ночи среду заменяли свежей средой. В указанных лунках свежая среда содержала противораковое лекарственное средство [4-гидропероксициклофосфамид (sc-206885 ENCO, Петах-Тиква, Израиль), 5-фторурацил (5FU, А10042 Adooq Biotag, Kfar Yona, Израиль), оксалиплатин (09512 Sigma-Aldrich), иринотекан (A10479-200 Adooq Biotag, Кфар-Йона, Израиль), доцетаксел (01885 Sigma-Aldrich), цисплатин (Sigma-Aldrich,), траметиниб (A11029 Adooq Biotag, Kfar Yona, Израиль), ингибитор CDK4/6 палбоциклиб (PZ0199 Sigma-Aldrich) или ингибитор FGFR AZD4547 (A11075-5 Adooq Biotag) в указанных концентрациях. Среду заменяли один раз каждые 48 часов свежим лекарственным средством/ДМСО в течение 4-6 дней.
Функциональные анализы. За восемнадцать-двадцать четыре часа до окончания культивирования в среду добавляли BrdU (конечная концентрация: 10 мкМ/мл) для последующего окрашивания антителом к BrdU (BRDU+anti-BRDU В5002 Sigma-Aldrich и 94-MS-1058-P Eldan, Петах-Тиква, Израиль) и/или к Ki67 (94-RM-9106-S Eldan, Петах-Тиква, Израиль). В конце культивирования ткани помещали между двумя стеклянными покровными стеклами, помещали в одноразовую пластиковую гистологическую кассету и фиксировали в течение ночи в 4% параформальдегиде (PFA). Затем срезы парафинизировали, блокировали и нарезали на срезы толщиной 5 мкМ для окрашивания гематоксилином и эозином (Н&Е) и другого окрашивания IHC, такого как окрашивание Ki67.
Пример 1
Условия органной культуры ex vivo для поддержания структуры и функций срезов здоровых и опухолевых тканей
Чтобы получить структуру и функцию ткани в течение не менее чем 5 дней в органной культуре ex vivo (EVOC), исследовали несколько условий. Условия включали в себя:
1. Культивирование срезов ткани на разных поверхностях, таких как титановые вставки, по сравнению с непосредственным погружением срезов в культуральную среду;
2
2
2
2. Инкубирование ткани в стандартных условиях культивирования ткани с 21% О и 5% СО по сравнению с атмосферой с высоким содержанием кислорода, содержащей 80% O;
3. Культивирование 1 среза в каждой лунке по сравнению с несколькими срезами в каждой лунке;
4. Использование разных сред, таких как DMEM/F12 и M199;
5. Культивирование на PEG с титановыми вставками или без них. Результаты суммированы в таблице 1 ниже.
2
2
С этой целью инкубация ткани в атмосфере с высоким содержанием кислорода, содержащей 80% О, значительно увеличивала жизнеспособность ткани по сравнению со стандартными условиями культивирования ткани с 21% О (репрезентативная культура ксенотрансплантатов, полученных из злокачественной опухоли яичников человека, показана на фиг. 1). Кроме того, ткань выживает лучше, когда поддерживается на титановых вставках, которые обеспечивают взаимодействие между средой и воздухом, по сравнению с непосредственным введением ткани в лунку для культивирования ткани, так что срез полностью погружается в среду (репрезентативная культура ксенотрансплантатов, полученных из злокачественной опухоли яичников человека, показана на фиг. 1). Кроме того, DMEM/F12 представляла собой среду лучше, чем M199 (репрезентативная культура ксенотрансплантатов, полученных из злокачественной опухоли яичников человека, показана на фиг. 2).
Все ткани для EVOC, представленные в таблице 1 выше, получали в результате хирургического вмешательства. Тем не менее, разработанный анализ может быть адаптирован для небольших тканей биопсии, взятых с помощью кор-биопсии из опухолевой ткани (фиг. 9). В частности, ткань погружают в агарозу в две стадии: сначала жидкую агарозу помещают в небольшой металлический лоток, кор-биопсии помещают на агарозу, а агарозу добавляют поверх биопсий. Лоток охлаждают и агарозу с биопсиями вырезают в блоке. На второй стадии блок агарозы прикрепляется к поршню с помощью контактного ключа и окружают агарозой способом, подобным тому, который используется для кусочков ткани.
В целом, получали EVOC из разных источников, представляющих многочисленные ткани, которые сохраняли структуру и жизнеспособность ткани в течение по меньшей мере 5 дней культивирования (фиг. 1, 2 и 11). Важно отметить, что все ткани исследовал патоморфолог, и они считались полностью жизнеспособными с той же морфологией, что и обычная патология ткани от пациента.
2
В целом культивирование одного среза ткани непосредственно в середине титановой вставки в среде DMEM/F12 в атмосфере с высоким содержанием кислорода, содержащей 80% О, и перемешивание культуры при орбитальном встряхивании, которое способствует прерывистому погружению среза ткани в культуральную среду, поддерживало структуру и жизнеспособность ткани в течение не менее чем 5 дней культивирования. Эту недавно разработанную систему EVOC использовали в следующих ниже примерах.
Пример 2
Разработанное EVOC может использоваться для прогнозирования ответа опухолей на противораковые средства
Разработанное EVOC может предсказать ответ in vivo полученных от пациента ксенотрансплантатов на лечение: Несколько моделей полученных от мышей ксенотрансплантатов (PDX) с известными ответами in vivo на противораковые лекарственные средства приобретали в Jackson Laboratories. Опухоли вырезали у мышей, культивировали, как описано выше в материалах и способах и примере 1, и исследовали чувствительность срезов ткани к противораковым лекарственным средствам. Всего исследовали семь моделей PDX, происходящих из 3 типов опухолей (злокачественная опухоль молочной железы, злокачественная опухоль легкого и злокачественная опухоль толстой и прямой кишок), и во всех исследованных моделях разработанная система EVOC смогла правильно предсказать чувствительность опухолей к лечению лекарственными средствами (таблица 2 ниже и фиг. 3-4). Кроме того, наблюдался четкий дозозависимый ответ в системе EVOC.
Таким образом, как можно видеть на фиг. 3-4 и в таблице 2 ниже, опухоли, которые были устойчивы к лечению in vivo, также были устойчивы к лечению ex vivo, даже когда применялись очень высокие дозы. Напротив, при применении лечения, к которому опухоли были чувствительны in vivo, гибель клеток обнаруживалась ex vivo при низких концентрациях лекарственного средства, а чувствительность к лекарственному средству увеличивалась с повышением концентрации лекарственного средства.
Разработанное EVOC демонстрирует, что опухоли человека обладают дифференциальной чувствительностью к различным противораковым способам лечения. Опухолевые ткани пациента, вырезанные из опухолей пациента во время хирургического иссечения, непосредственно культивировали, как описано выше в материалах и способах и в примере 1, и исследовали чувствительность срезов ткани к противораковым лекарственным средствам. Наиболее распространенные противораковые схемы лечения применяли для каждого типа опухоли, т.е., например, для злокачественной опухоли толстой и прямой кишок человека, стандартным лечением является 5-фторурацил, оксалиплатин и/или иринотекан. На фиг. 5 показан пример опухоли, которая оказалась устойчивой к высоким дозам 5-фторурацила, но относительно чувствительной к иринотекану и оксалиплатину. Определение пролиферации клеток, например, окрашивание Ki67 также можно использовать для оценки жизнеспособности среза ткани и чувствительности к противораковым лекарственным средствам. Таким образом, на фиг. 8 показан пример злокачественной опухоли толстой и прямой кишок, которая оказалась частично чувствительной к 5-фторурацилу, но очень чувствительной к лечению оксалиплатином по окрашиванию Ki67.
В целом, разработанная система EVOC ясно показала, что опухоли пациента могут быть чувствительными к одному противораковому лекарственному средству, но устойчивыми к другому. Более того, EVOC, полученные от разных пациентов, по-разному отвечали на одно и то же противораковое лечение (фиг. 6 и таблицы 3-4 ниже). Кроме того, для каждого противоракового лечения наблюдался дозозависимый ответ (например, таблицы 3-4).
Разработанное EVOC может предсказать чувствительность к целевой терапии, как предсказано молекулярным профилированием: В качестве средства для персонализированной медицины опухолевая ткань пациента может быть исследована на возможные действенные генетические мутации, например, путем секвенирование экзома. Одну из опухолей получали от пациента с тройным негативным раком молочной железы, который, как было установлено, несет соматические генетические изменения, которые потенциально могут быть нацелены, включая в себя амплификацию FGFR1 и амплификацию CDK6. Как можно видеть на фиг. 7, хотя опухоль, полученная от этого пациента (пациент 1), была устойчивой ex vivo к ингибитору CDK4/6 палбоциклибу, она продемонстрировала высокую чувствительность к ингибитору AZD4547 FGFR. Наиболее важно, что злокачественная опухоль молочной железы, полученная от другого пациента, который не имел амплификации FGFR1 (пациент 2), была устойчива к ингибированию FGFR в разработанной системе EVOC.
Ткань может храниться в течение 48 часов до культивирования: Ткани опухоли пациента, иссеченные из опухолей пациента во время хирургического иссечения, непосредственно культивировали, как описано выше в разделе «Материалы и способы» и в примере 1, или культивировали после 48 часов хранения в среде при температуре 4°С; и исследовали чувствительность срезов ткани к противораковым средствам. На фиг. 10 показан пример ткани злокачественной опухоли толстой кишки, которая, как было обнаружено, частично чувствительна к 5-фторурацилу аналогичным образом в обоих условиях (т.е. непосредственного культивирования или через 48 часов хранения при температуре 4°С).
В целом, ткань может храниться в среде не менее чем 48 часов до начала эксперимента без каких-либо неблагоприятных воздействий на чувствительность ткани или лекарственного средства.
В целом, недавно разработанная EVOC делает процесс изучения ответа злокачественной ткани человека быстрым, экономичным и универсальным для многих злокачественных тканей. Все исследованные злокачественные ткани, включая в себя ткани яичника, толстой и прямой кишок, легкого, поджелудочной железы и молочной железы, показали высокую жизнеспособность после 4-7 дней в культуре.
Хотя настоящее изобретение было описано в связи с его конкретными вариантами осуществления, очевидно, что многие альтернативы, модификации и варианты будут очевидны для специалистов в настоящей области техники. Соответственно, оно предназначено для охвата всех таких альтернатив, модификаций и вариантов, которые соответствуют сущности и широкому объему прилагаемой формулы изобретения.
Все публикации, патенты и заявки на патенты, упомянутые в настоящем описании, включены в настоящий документ полностью посредством ссылки в описании в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент были конкретно и индивидуально указаны для включения в настоящий документ посредством ссылки. Кроме того, цитирование или идентификация любой ссылки в настоящей заявке не должны рассматриваться как признание того, что такая ссылка доступна в качестве предшествующего уровня техники для настоящего изобретения. В той степени, в которой используются заголовки разделов, они не должны рассматриваться как обязательные ограничения.
ССЫЛКИ
1. Dancey, J.E., Bedard, P. L., Onetto, N. & Hudson, T. J. The genetic basis for cancer treatment decisions. Cell 148, 409-420 (2012).
2. Garraway, L.A. Genomics-driven oncology: framework for an emerging paradigm. J. Clin. Oncol. Off. J. Am. Soc. Clin. Oncol. 31, 1806-1814 (2013).
3. Crystal., A.S. et al. Patient-derived models of acquired resistance can identify effective drug combinations for cancer. Science 346, 1480-1486 (2014).
4. Liu, X. et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am. J. Pathol. 180, 599-607 (2012).
5. Daniel, V.C. et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69, 3364-3373 (2009).
6. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell 165, 1586-1597 (2016).
7. Hidalgo, M. et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4, 998-1013 (2014).
8. Straussman, R. et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature 487, 500-504 (2012).
9. Olson, О.C. & Joyce, J.A. Microenvironment-mediated resistance to anticancer therapies. Cell Res. 23, 179-181 (2013).
10. Vaira, V. et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8352-8356 (2010).
11. Vickers, A.E.M. & Fisher, R.L. Organ slices for the evaluation of human drug toxicity. Chem. Biol. Interact. 150, 87-96 (2004).
12. de Kanter, R., Monshouwer, M., Meijer, D.K.F. & Groothuis, G.M.M. Precision-cut organ slices as a tool to study toxicity and metabolism of xenobiotics with special reference to non-hepatic tissues. Curr. Drug Metab. 3, 39-59 (2002).
13. Stoff-Khalili, M.A. et al. Preclinical evaluation of transcriptional targeting strategies for carcinoma of the breast in a tissue slice model system. Breast Cancer Res. BCR 7, R1141-1152 (2005).
14. Merz, F. et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neuro-Oncol. 15, 670-681 (2013).
15. Gerlach, M. M. et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. Br. J. Cancer 110, 479-488 (2014).
16. Meijer, A. et al. Nutlin-3 preferentially sensitises wild-type p53-expressing cancer cells to DR5-selective TRAIL over rhTRAIL. Br. J. Cancer 109, 2685-2695 (2013).
17. Grosso, S. H. G. et al. Breast cancer tissue slices as a model for evaluation of response to rapamycin. Cell Tissue Res. 352, 671-684 (2013).
18. Majumder, B. et al. Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity. Nat. Commun. 6, 6169 (2015).
19. Roife, D. et al. Ex Vivo Testing of Patient-Derived Xenografts Mirrors the Clinical Outcome of Patients with Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Clin. Cancer Res. June 3, 2016; DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-15-2936.
20. Maund, SL. et al. Optimization and comprehensive characterization of a faithful tissue culture model of the benign and malignant human prostate. Lab. Invest. 94, 208-221 (2014).
21. Siolas, D., Hannon, G. Patient Dervided Tumor Xengrafts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73: 5315-5319 (2013).
22. Vaira, V. et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. PNAS 107, 8352-8356 (2010).
23. van der Kuip, H., et al. Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer 6, 86-90.
24. Salmon, E., et al. Matrix architecture defines the preferential localization and migration of T-cells into the stroma of human lung tumors. J. Clin. Invest. 122, 899-910 (2012).