Кардиопротективные эффекты ресвератрола при ишемических и реперфузионных повреждениях миокарда

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

© Даниленко Л.М., Покровский М.В., 2015 УДК 615.22-088.331.1

КАРДИОПРОТЕКТИВНЫЕ ЭФФЕКТЫ РЕСВЕРАТРОЛА ПРИ ИШЕМИЧЕСКИХ И РЕПЕРФУЗИОННЫХ ПОВРЕЖДЕНИЯХ МИОКАРДА

Л.М. Даниленко, М.В. Покровский

ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», г. Белгород

В статье изложены результаты исследований влияния дистантного преконди-ционирования путем создания кратковременной ишемии конечностей и фармакологического прекондиционирования ресвератролом на размер зоны некроза миокарда и уровень тропонина I в сыворотке крови после ишемии-реперфузии. Установлено сопоставимое протективное действие как дистантного, так и фармакологического прекондиционирования. Обсуждаются возможные механизмы защитного действия фармакологического прекондиционирования при ишемии/реперфузии. Прекондиционирование сердца ресвератролом обеспечивает кардиопротекцию, о чем свидетельствует снижение размера площади некротизированного миокарда. Кардиопротекция ресвератрола была полностью отменена как N-нитро L-аргинин метиловым эфиром (L-NAME), так и аминогуанидином (AG), что показывает, что ресвератрол обеспечивает кардиопротекцию по типу ишемического прекондицио-нирования, через синтазы оксида азота (NOS).

Ключевые слова: сердце, ишемия/реперфузия, прекондиционирование, ресвератрол.

В настоящее время в современной кардиофармакологии продолжается поиск новых эффективных методов защиты миокарда от ишемического и реперфузионного повреждения. Помимо фармакологических кардио-протекторных средств, важное внимание привлечено к феномену ише-мического прекондиционирования (ИП) миокарда [1, 9, 12]. Реализация кардио-протекции ишемического прекондицио-нирования опосредуется через два окна: во-первых, раннее или классическое прекондиционирование продолжительностью до 3-4 ч и позднее ишемическое прекон-диционирование продолжительностью от 1 до 3-4 дней [8].

В последнее время многочисленные экспериментальные исследования посвящены изучению кардиопротекторных свойств ресвератрола (3, 5, 4'-тригид-рокси-транс-стильбен), который, является природным фенольным соединением со-

держащимся в вине и кожуре винограда [10]. Известны его гиполипидемическая, антиоксидантная, эстрогенная, антиагре-гационная активности, есть результаты по изучению кардиопротективной активности в опытах in vitro. Показана эффективность ресвератрола для защиты почек, сердца и мозга от ишемического-репер-фузионного повреждения [9]. В клетках почек, ресвератрол оказывает свое защитное действие через активацию синтеза оксида азота (NO) [11].

Проверка гипотезы о кардиопротек-тивной активности ресвератрола, реализуемой через механизмы прекондиционирования явилась целью настоящей работы.

Материалы и методы

Изучение выживаемости ишемизиро-ванного миокарда было проведено на 66-и лабораторных кроликах массой 2-2,5 кг. Инфаркт миокарда воспроизводился на наркотизированных животных (хлорал-

гидрат 300 мг/кг), находящихся на управляемом дыхании, путем перевязки нисходящей ветви левой коронарной артерии на уровне нижнего края ушка левого предсердия (60 мин) с последующей реперфу-зией (90 мин). Поперечные срезы миокарда производили через каждые 0,8 см, начиная с уровня 0,8 см ниже места наложенной лигатуры. Срезы миокарда помещали в емкость содержащую фосфатный буфер (рН 7,4) и 1 мг/мл трифенилтетразо-лия хлорида для образования красного формазана [2, 3, 4, 5]. Подсчет площадей интактного и некротизированного миокарда левого желудочка производили на каждом из четырех срезов с помощью попик-сельного анализа в программе Adobe Photoshop 9.0. Уровень Troponin I (TnI) определяли на иммунофлуоресцентном приборе Triage Meter Pro (Biosite, США).

Ишемическое прекондиционирова-ние осуществляли путем 5 минутного прекращения кровотока в лигированной коронарной артерии за 30 минут до тотальной ишемии миокарда. Дистантное ишемическое прекондиционирование (ДИП) осуществляли путем наложения жгута на верхнюю треть бедра на 10 минут, с последующей 20 минутной реперфузией и воспроизведением модели инфаркта на 60 минут. Фармакологическое прекондицио-нирование осуществляли с помощью внутривенного введение в маргинальную вену уха кролика ресвератрола в дозе 2 мг/кг. Анализаторы: L-NAME в дозе 25 мг/кг (блокатор индуцибельной (iNOS) и эндотелиальной (eNOS) NO-cинтазы), гли-бенкламид (блокатор КАТФ-каналов) в дозе 0,4 мг/кг, аминогуанидин (блокатор инду-цибельной (iNOS) в дозе 100 мг/кг [6, 7].

Результаты и их обсуждение Наложение лигатуры на нисходящую ветвь левой коронарной артерии в контрольной группе приводило к развитию некроза миокарда левого желудочка, размер которого составил 27,3±1,2%. Применение ДИП, фармакологического прекондиционирования путем внутри-брюшинного введения ресвератрола привело к достоверному уменьшению площади некротизированного миокарда и

составило 9,4±0,5%, 15,2±0,8% соответственно. Блокада еNOS и iNOS на фоне моделирования ишемии/реперфузии, применения ресвератрола, ДИП привела к нивелированию противоишемических эффектов. Величина зоны некроза в группе животных, получавших L-NAME и ресве-ратрол составила 24,1±1,3%, получавших L-NAME и ДИП - 25,3±0,8%, аминогуанидин и ресвератрол - 26,6±1,9%, аминогуанидин и дИп - 22,8±2,0%. При блокаде АТФ-зависимых калиевых каналов величина зоны некроза в группе животных, получавших глибенкламид и ресве-ратрол - 28,5±1,3%, глибенкламид и ДИП - 24,2±1,5%. Уровень тропонина, как и предполагалось, изменяется с размером площади некроза миокарда левого желудочка (табл. 1).

Исходя из результатов экспериментов, дистантное ишемическое преконди-ционирование, фармакологическое пре-кондиционирование ресвератролом обладают в равной степени выраженным кар-диопротекторным действием.

Кратковременная ишемия миокарда инициирует каскад определенных биохимических процессов в кардиомиоцитах. Эти процессы направлены на защиту миокарда от повреждений, связанных с его ишемизацией. Благодаря этому короткому, но эффективному «курсу закаливания» миокард становится подготовленным к последующей ишемии, в связи, с чем он гораздо более успешно защищается от агрессивных факторов, обусловленных ухудшением питания и оксигена-ции сердца. Этот физиологический феномен, названный «ишемическим прекон-диционированием», был открыт не так давно, но уже привлек к себе внимание множества ученых. В случае острой ишемии этот механизм может предотвратить развитие инфаркта миокарда, а если последний все же происходит, ишемическое прекондиционирование обеспечивает меньшие размеры инфаркта, уменьшает вероятность появления аритмии, предохраняет от значительных нарушений функций миокарда левого желудочка, а также уменьшает повреждения миокарда,

Таблица 1

Влияниерезвератрола

Группа % некроза Уровень тропонина I, нг/мл

Контроль (инфаркта миокарда) 27,3±1,2 16,26±1,9

КО/реперфузия + дистантное прекондиционирование 9,4±0,5* 4,9±1,3*

КО/реперфузия + ресвератрол (2 мг/ кг) 15,2±0,8* 5,24±1,1*

КО/реперфузия + дистантное прекондиционирование + ресвератрол (2 мг/ кг) 9,4±0,5* 4,9±1,3*

КО/реперфузия + L-NAME + дистантное прекондиционирование 23,5±1,2 14,15±1,2

КО/реперфузия + L-NAME + ресвератрол (2 мг/ кг) 24,1±1,3 17,11±1,2

КО/реперфузия + аминогуанидин (100 мг/кг) + дистантное прекондиционирование 22,8±2,0 14,11±1,2

КО/реперфузия + аминогуанидин (100 мг/кг) + ресвератрол (2 мг/ кг) 26,6±1,9 15,45±1,2

КО/реперфузия + глибенкламид (0,4 мг/кг) + дистантное прекондиционирование 24,2±1,5 16,34±1,8

КО/реперфузия + глибенкламид (0,4 мг/кг) + резвератрол (2 мг/ кг) 28,5±1,3 16,95±1,8

Примечание: КО/реперфузия - коронарооклюзия нисходящей ветви левой коронарной артерии на уровне ушка (60 мин) с последущей реперфузией (90 мин); ИП-ишемическое прокондиционирование (5 мин); ДИП-дистантное ишемическое преконди-ционирование (10 мин) верхней трети бедра; *р < 0,05 - в сравнении с контролем; # р < 0,05 - в сравнении с серией без фармакологического анализатора

связанные с реперфузией. К механизмам реализации кардиопротективного действия ресвератрола [6] можно отнести: ан-тиоксидантный, противовоспалительный, повышающий активность ферментов NOS, стимулирующих ангиогенез. Но один из самых обсуждаемых механизмов - это эффект, опосредованный через пре-кондиционирование. Каким образом ишемия может сыграть прекондициони-рующее, то есть «подготавливающее», действие? Во время кратковременного ишемического эпизода кардиомиоциты начинают выделять аденозин и брадики-нин, что, в свою очередь, вызывает активацию универсального внутриклеточного мессенджера - протеинкиназы С. Под ее действием АТФ-зависимые калиевые каналы гладкомышечных клеток сосудов и кардиомиоцитов, закрытые в норме, открываются. За счет этого происходит защитное укорочение сердечных потенциалов действия. Такой эффект имеет энергосберегающее значение, и при возникновении в ближайшее время повторной

ишемии миокарда отмечается снижение его метаболической активности, уменьшение скорости распада АТФ, замедление гликогенолиза и снижение скорости нарастания внутриклеточного ацидоза. Благодаря всему этому миокард лучше переносит ишемию, в том числе более длительную и выраженную.

Как видно из нашего исследования, АТФ-зависимые калиевые каналы являются важным эффекторным звеном в реализации цитопротекторного действия как дистантного прекондиционирования, так и ресвератрола. Оксид азота играет важную роль в реализации кардиопротектор-ных эффектов ресвератрола. И в том и другом случае синтез его осуществляется за счет активации индуцибельной N0-синтазы, однако в механизме цитопро-текции большое значение имеет эндоте-лиальная Ш-синтаза, выполняющая, по всей вероятности, триггерную роль. Доказанная способность ресвератрола активировать протеинкиназы [2] позволяет предположить их триггерную роль в про-

цессе реализации эффектов фармакологического прекондиционирования. Вышеизложенное подтверждает наше предположение о том, что ресвератрол является триггером ишемического прекондицио-нирования и может вызывать фармакологическое прекондиционирование, а реализация естественных механизмов защиты от ишемии осуществляется за счет активации АТФ-зависимых калиевых каналов и биосинтеза оксида азота, фармакологических миметиков прекондицио-нирования, индуцирующих воспроизводимый и стабильный кардиопротектив-ный ответ и в то же время лишенных серьезных побочных эффектов.

Выводы

1. Проведение дистантного ишеми-ческого прекондиционирования, введение ресвератрола достоверно, относительно контрольной группы животных, уменьшает распространенность зоны некроза миокарда левого желудочка.

2. АТФ-зависимые калиевые каналы являются эффекторным звеном в механизме цитопротекторного действия как дистантного ишемического прекондиционирования так и ресвератрола на модели коро-нарооклюзионного инфаркта миокарда.

3. Блокада эндотелиальной и инду-цибельной NO-синтазы нивелирует цито-протекторный эффект рекомбинантного ресвератрола на модели коронарооклюзи-онного инфаркта миокарда, доказывает роль оксида азота в реализации эффектов прекондиционирования.

Литература

1. Даниленко Л.М. Противовоспалительные эффекты дистантного ишемиче-ского прекондиционирования в сочетании с рекомбинантным эритропо-этином / Л.М. Даниленко, М.В. Покровский, О.О. Новиков // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. - 2011. - № 4, вып. 13/2. -С. 49-53.

2. Даниленко Л.М. Тригерный механизм противоишемического действия эри-тропоэтина и ресвератрола / Л.М. Даниленко, М.В. Покровский, О.О. Новиков // Научные ведомости БелГУ.

Сер. Медицина. Фармация. - 2012. -№ 10, вып. 18/2. - С. 138-142.

3. Колесник И.М. Дистантное и фармако-

логическое прекондиционирование -новые возможности стимуляции не-оваскулогенеза / И.М. Колесник, М.В. Покровский, О.С. Гудырев // Кубанский научный медицинский вестник. -2010. - № 6. - С. 56-58.

4. Коркушко О.В. Эндотелиальная дисфункция / О.В. Коркушко В.Ю. Лиш-невская // Кровооб^ та гемостаз. -2003. - № 2. - С. 4-15.

5. Покровский М.В Методические подхо-

ды для количественной оценки развития эндотелиальной дисфункции при L-NAME-индуцированной модели дефицита оксида азота в эксперименте / М.В. Покровский, В.И. Кочкаров, Т.Г. Покровская // Кубанский научный медицинский вестник. - 2006. - № 10. -С. 72-77.

6. Agnes А. A common mechanism in the protective effects of preconditioning, cardiac pacing and physical exercise against ischemia and reperfusion-induced arrhythmias / А. Agnes, А. Parratt J.R. // Exp. Clin. Cardiol. - 2005. - Vol. 10, № 3. - P. 200-205.

7. Donnely, R. Cardiac troponins: IT upgrade for the heart / R. Donnely, M.W Millar-Craig // Lancet. - 1998. - Vol. 351, № 9102. - P. 537-539.

8. Dipak, K.D. Resveratrol in Cardioprotection: A Therapeutic Promise of Alternative Medicine / K.D. Dipak., М. Nilanja-na // Molecular Interventions. - 2006. -Vol. 6. - P. 36-47.

9. Ignatowicz E.W. Resveratrol, a natural chemopreventive agent against degenerative diseases / E.W. Ignatowicz, Baer-Dubowska // Pol. J. Pharmacol. - 2001. -Vol. 53. - P. 557-569.

8. Constans J. Conri С. Circulating markers of endothelial function in cardiovascular disease / J. Constans, С. Conri // Clin. Chim. Acta. - 2006. - Vol. 368, № 1-2. -P. 33-47.

10. Kuriyama H. Pharmacological and physiological significance of ion channels and factors that modulate them in vascu-

lar tissues / H. Kuriyama, K. Kitamura, H. Nabata // Pharmacol. Rev. - 1995. -Vol. 47. - P. 387-573.

11. Preconditioning and postconditioning: the essential role of the mitochondrial permeability transition pore / S.Y. Lim

[et al.] // Cardiovasc Res. - 2007. - Vol. 75, № 3. - P. 530-535. 12. Sato M. Myocardial protection by proty-kin, a novel extract of trans-resveratrol and emodin / M. Sato, G. Maulik, D.K. Bagchi // Free Radic. Res. - 2000. - Vol. 32. - P. 135-144.

CARDIOPROTECTIVE EFFECTS OF RESVERATROL IN ISCHEMIC AND REPERFUSION MYOCARDIAL INJURY

L.M. Danilenko, M. V. Pokrovsky

The article presents the results of studies of the effect of distant preconditioning by creating short-term limb ischemia and pharmacologic preconditioning of resveratrol on the size of myocar-dial necrosis and the level of troponin I in serum after ischemia-reperfusion. Established a comparable protective effect as distant and pharmacological preconditioning. Possible mechanisms of the protective effect of pharmacological preconditioning during ischemia/reperfusion. Preconditioning of the heart by resveratrol provides cardioprotection, as evidenced by the reduction in the size of the area of myocardial necrosis. Cardioprotection resveratrol was completely abolished as N-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), and aminoguanidine (AG), which show that resveratrol provides cardioprotection type of ischemic preconditioning by nitric oxide synthase (NOS).

Keywords: hearts, ischemia/reperfusion, preconditioning, resveratrol.

Даниленко Л.М. - к.ф.н., доц. кафедры фармакологии Белгородского государственного национально исследовательского университета.

E-mail: Danilenko_L@bsu.edu.ru

Покровский М.В. - д.м.н., проф., зав. кафедрой фармакологии Белгородского государственного национально исследовательского университета.

E-mail: mpokrovsky@yandex.ru