СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ В КОСТНОЙ И ХРЯЩЕВОЙ ТКАНЯХ
METHOD FOR ALKALINE PHOSPHATASE TEST BONE AND CARTILAGE TISSUES

Изобретение относится к медицине, а именно к определению ферментов в костной и хрящевой тканях при изучении регенераторных процессов.
Известны способы определения ферментов в костной ткани, показывающие результат в виде биохимических данных [1]. Однако способы трудоемки, требуют многоэтапной подготовки исследуемого материала. Полученные результаты являются только количественными и невозможна визуализация ферментов в образцах костной и хрящевой тканях, чего требует практика: присутствие или отсутствие фермента, место его локализации.
В применяемых гистохимических методиках по определению ферментов [1-4] для подготовки образцов тканей для исследования требуется специальная аппаратура и реактивы. Кроме того, для того чтобы костную ткань сделать годной для резки, необходимо удалить отложенные в ее основном веществе соли извести. Эта процедура называется - декальцинацией [2]. Однако методы кислотной декальцинации совершенно не подходят для ГХ исследования. Ферменты сохранившиеся при фиксации, в значительной степени, если не полностью, разрушаются даже при кратковременной декальцинации.
Как известно сохранность структур исследуемой костной ткани, а так же сохранность выявляемых ферментов достигается путем замораживания -высушивания или замещения в замороженном состоянии криостатных срезов [4]. Однако способ технически сложен, необходима заморозка при температуре минус 50°С и минус 70°С, требует специального оборудования и реактивов.
°
Известен способ гистохимического исследования ферментов в мягких тканях [3], образцы которых сначала фиксируют в 10% нейтральном формалине в течение 10 часов при температуре +4°С или в этанол-ацетоне по Гесснеру, затем обезвоживают и заливают в парафин согласно схеме: 3 смены ацетона - (каждая по 3 часа); эфир-этанол (1:1) - 3 часа при +4°С; 2% целлоидин в эфире - 12 часов; 2 смены бензола - (каждая по 30 минут при комнатной температуре); пропитка парафином в вакууме при температуре 56С 30 мин и заливка. После чего готовят парафиновые срезы для исследования.
Недостатком способа является невозможность определения щелочной фосфатазы в срезах костной и хрящевой тканей.
Техническая задача - упрощение способа и возможность визуализации определения щелочной фосфатазы в костной и хрящевой тканях за счет повышения качества срезов исследуемого материала, решается следующим образом.
В способе определения щелочной фосфатазы в костной и хрящевой тканях включающий подготовку образцов исследуемых тканей и гистохимическое исследование полученного материала, согласно изобретения образцы исследуемых костной и хрящевой тканей обрабатывают в забуференном растворе нейтрального 10% формалина, в течение 1 суток, при температуре +4°С, затем обрабатывают в 0,1 М растворе фосфатного буфера сначала в 4 смены по 2 часа каждая, затем в 9 смен по часу каждая с добавлением сахарозы постепенно возрастающей концентрации, после чего исследуемый материал погружают в реагент О.С.Т., замораживают при -35°С, готовят срезы и визуально определяют наличие щелочной фосфатазы.
Подготовка недекальцинированных образцов костной и хрящевой ткани в 0,1 М фосфатном буфере с добавлением сахарозы, позволяет получать срезы большего размера, в сравнении со срезами только после заморозки в -35°С и -196°С без предварительной подготовки. Кроме того срезы практически не подвергаются деформации, что улучшает качество морфологического исследования.
Использование реагента О.С.Т. - «Tissue-Тек О.С.Т. Compound)), являющегося стабилизатором температуры, позволяет защитить образцы тканей в процессе заморозки от кристаллизации и растрескивания, т.е. исключить образование в тканях кристаллов льда, разрывающих клетки и их ядра.
Авторами проведена работа по исследованию фрагментов костной ткани бедра, полученных от 30 взрослых кроликов. Приготовление срезов производилось на микротоме снабженном термоохлаждающим столиком. Температурный режим устройства позволяет замораживать ткань до -18°С. Для работы производили охлаждение ножа до температуры -30°С. Были использованы наборы реактивов для гистоэнзиматических реакций в тканях человека, фирмы BioOptica, Италия. Полученные срезы фиксировали на стекле, наносили реактив и инкубировали в термостате при +37°С - 1 час. Фото-протоколирование полученных препаратов проводили с помощью видео-насадки VidiCam и микроскопа Olympus.
Фрагменты костной ткани для исследования были разделены на 2 группы. Первая группа - при подготовке образцов ткани для исследования применяли глубокое замораживание тканей при -196°С.
Вторая группа - подготовку образцов ткани осуществляли по предлагаемому методу: после обработки образцов ткани в забуференном растворе нейтрального 10% формалина, в течение 1 суток, при температуре +4°С, обрабатывали исследуемый материал в фосфатном буфере с добавлением сахарозы возрастающей концентрации, затем погружали в реагент, стабилизирующий температуру «Tissue-Тек О.С.Т. Compound)) (О.С.Т.) и замораживали при -35°С.
При микроскопичеком исследовании срезов подготовленных образцов, авторами выявлено, что ткани второй группы, имеют более четкие структуры, остеоциты располагающиеся в толще костных балок и остеонов определяются отчетливо. На срезах отмечались незначительные микротрещины. Срезы фрагментов суставных поверхностей и кортикальной пластинки в группе с проводкой с добавлением сахарозы(Фиг.1), получались более тонкими, имели больший размер и менее других подвергались деформации. На Фиг.1 представлено сравнение срезов бедренной кости. Щелочная фосфатаза: А - без добавления сахарозы. Б - с добавлением сахарозы. (Ув. 100).
Проведенная гистоэнзиматическая реакция на выявление щелочной фосфатазы показала активность фермента в остеоцитах, с локализацией на поверхности гаверсовых каналов и по краю костных балок (Фиг.2. Бедренная кость. Щелочная фосфатаза в остеоцитах. ГК - гаверсов канал. Ув. 400). Остеоциты имеют вид веретенообразных клеток с длинными канальцами отходящими к предыдущему и последующему рядам клеток. Щелочная фосфатаза локализуется в районе ядра, а также по всей длине канальцев (Фиг.3. Бедренная кость. Локализация щелочной фосфатазы в ядре и канальцах остеоцитов. Ув. 400.). Щелочная фосфатаза была обнаружена и в суставном хряще (Фиг.4. Щелочная фосфатаза в суставном хряще. X-суставной хрящ. К - кость. Ув. 400). На границе хряща и субхондральной зоны обнаружены изогенные группы гипертрофированных хондроцитов активно синтезирующие щелочную фосфатазу. Фермент в виде глыбок локализуется в ядрах хондроцитов. Эти группы находятся ниже базальной линии, относясь к слою оссифицирующегося хряща (Фиг.5. Щелочная фосфатаза в изогенных группах (ИГ) хрящевых клеток. Ув. 200).
Таким образом, предлагаемый способ прост в исполнении, позволяет получать срезы недекальцинированной костной ткани высокого качества, визуально определять наличие и локализацию щелочной фосфатазы в экспериментальном и диагностическом операционном материале (костная и хрящевая ткань) без применения специальной техники (криостата), что расширяет возможности гистологического исследования костной ткани.
Способ осуществляют следующим образом. Исследуемый экспериментальный или диагностический операционный материал (костные или хрящевые фрагменты) на начальном этапе обрабатывают в забуференном растворе нейтрального 10% формалина и выдерживают в течение 1 суток при температуре +4°С, затем обрабатывают материал в 0,1 М растворе фосфатного буфера с рН 7,4: первые сутки в 4 смены по 2 часа, меняя раствор, оставляя в последнем материал на ночь; на следующие сутки исследуемый материал обрабатывают в ОДМ растворе фосфатного буфера (рН 7,4) с добавлением сахарозы постепенно возрастающей концентрации (5, 5, 5, 10, 10, 10, 20, 20, 20%) в 9 смен по часу, оставляя материал на ночь в растворе с наибольшей концентрацией сахарозы. После чего погружают исследуемый материал в реагент О.С.Т. (производитель «Tissue-Тек О.С.Т. Compound))) и замораживают при минус 35°С. Из предварительно подготовленного материала готовят срезы, используя термоохлаждающий столик и исследуют на наличие и локализацию щелочной фосфатазы визуально, а так же используя гистохимические методы.
Предлагаемый способ прост в исполнении, его возможно использовать для определении щелочной фосфатазы в образцах ткани в каждом учреждении медицинского профиля и научной лаборатории без использования специального оборудования (криостата, микротома для приготовления недекальцинированных срезов).
Используемая литература
1. Саркисов Д.С., Перов Ю.Л. Микроскопическая техника / под ред. Д.С. Саркисова, Ю.Л. Перова. - М.: Медицина. 1996. - 544 с.
2. Ромейс Б. Микроскопическая техника / Б. Ромейс. - М.: Издательство иностранной литературы, 1953. - 718 с.
3. Луппа X. Основы гистохимии. Изд. «Мир». - 1980. - 344 с.
4. Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. Изд.» Мир» М.: - 1982. - 272 с.
5. An Y.Н. Handbook of histology methods for bone and cartilage / Y.H. An, K.L. Martin. - NY: Humana Press, 2003. - 587p.