СПОСОБ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО ГРАНУЛОЦИТАРНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА
METHOD OF PURIFICATION OF RECOMBINANT GRANULOCYTE COLONY-STIMULATING HUMAN FACTOR

Изобретение относится к биотехнологии и касается усовершенствованной технологии очистки ГКСФ из телец включения E.coli, в частности, очистки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека.
Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ или филграстим) является плейотропным цитокином, стимулирующим пролиферацию, созревание и функцию гранулоцитсодержащих лейкоцитов крови [1, 2, 3]. Г-КСФ является полипептидом с молекулярной массой 18-22 кДа и продуцируется различными типами клеток, включая Т- и В-лимфоциты, макрофаги, тучные клетки, эндотелиальные клетки и фибробласты [4, 5].
Известны способы выделения Г-КСФ человека из культуральной жидкости клеточных линий, полученных из опухолевых клеток человека [6-8]. Недостатками этих способов являются использование опухолевых клеток, низкий выход продукта, вероятность контаминации конечного продукта вирусами человека, невозможность масштабирования процесса выделения и, как следствие, высокая стоимость такого препарата Г-КСФ.
Растущие потребности в Г-КСФ и отсутствие высокопродуктивных природных источников способствовали получению Г-КСФ микробиологическим синтезом на основе технологии рекомбинантных молекул ДНК. Этот метод обеспечивает возможность масштабирования и получения целевого продукта со значительно более высоким выходом из сравнительно недорогого исходного сырья. В процессе роста бактериальных клеток рекомбинантный человеческий (рч) Г-КСФ накапливается в цитоплазме в виде нерастворимых дискретных включений, получивших название тел включения. Методология выделения рч Г-КСФ из тел включения заключается в экстракции белка из тел включения денатурирующими агентами (при этом белок денатурирует и теряет биологическую активность), ренатурации целевого продукта и хроматографии ренатурированного белка.
Известны способы получения Г-КСФ, включающие экспрессию в клетках Escherichia coli, заключающиеся в быстром биосинтезе клетками бактерий рекомбинантного Г-КСФ в виде нерастворимых «телец включения» [патент РФ №2113483 и патент РФ №2260049]. В этих способах проводят конструирование рекомбинантных плазмидных ДНК, кодирующих конститутивный синтез полипептида со свойствами Г-КСФ человека и штаммы Escherichia coli, обеспечивающие синтез этого пептида с уровнем экспрессии 10-30% суммарного клеточного белка.
Однако наряду с особенностями используемых штаммов количество получаемого Г-КСФ во многом зависит от используемой технологии выделения и очистки, так как общие потери белка после второй стадии очистки составляют около 65%. Основная доля этих потерь приходится на стадию хроматографии с фенил-сефарозой. Способы очистки Г-КСФ, которые известны из патентной и научной литературы, содержат различные комбинации ионной хроматографии, хроматофокусирования, гидрофобной хроматографии, гель-хроматографии.
Стандартная технология включает три этапа очистки Г-КСФ после ренатурации, так как обычные способы получения Г-КСФ из телец включения E.coli заключают в себе стадии промывки детергентами или хаотропными веществами, солюбилизацию сильными денатурирующими реагентами (например, хлоргидратом гуанидина, мочевиной) или детергентами с высокой концентрацией (например, N-лауроилсаркозином или додецилсульфатом натрия). Естественно, что после таких манипуляций требуется стадия ренатурации, например, разбавлением денатурирующего реагента или диализом. Итак, после ренатурации проводят очистку белка в три этапа, например, как описано в патенте РФ №2321424:
1. Полученный ренатурированный Г-КСФ на первом этапе подвергают очистке с помощью обращенно-фазной хроматографии на фенил-сефарозе FF High Sub (GE Healthcare). Для этого раствор Г-КСФ наносят на колонну с фенил-сефарозой FF High Sub и связанный материал элюируют буфером 0,025 М ацетата натрия pH 4,5 и 0,001 М ЭДТА.
3
2. На второй стадии хроматографической очистки раствор Г-КСФ наносят на катионообменную смолу типа CM Sepharose Fast Flow (GE Healtheare) и связанный материал элюируют градиентом растворов (0,0-0,5 М NaCl) в буфере 50 мМ Na(CHCOO) pH 4,5.
3
3. Очистку мономерной формы Г-КСФ от остатков полимерных форм проводят на третьей стадии очистки Г-КСФ - гель-фильтрации на смоле типа Superdex 75 (GE Healthcare). Хроматографию проводят в буфере 10 мМ Na(CHCOO) pH 5,0, содержащем 5% сорбитола и 0,004% полисорбата 80.
Ближайшим аналогом заявляемого изобретения является способ очистки, приведенный в WO 2007/009950. В известном способе стадию ренатурации осуществляют следующим образом:
Тельца включения (ТВ) растворяют 30 мМ Трис/HCl, 1 мМ ЭДТА, 6М GuHCl, 100 мМ GSH, pH 8,0. Условия ренатурации: 30 мМ Трис/HCl, pH 7,5, 2 мМ GSSG, 2 мМ GSH, 3 М мочевина, буфер охлажден до 4°С. Процесс осуществляют в течение 12 часов при 4°С.
Очистку от грубых загрязнений осуществляют следующим образом:
pH раствора приводят к 3,2 2 М лимонной кислоты. В качестве сорбента используют SP-Sepharose XL-matrix, уравновешенную 20 мМ натрий-ацетатного буфера, pH 5.0. Элюцию проводят тем же буфером с 200 мМ NaCl.
Стадию тонкой очистки осуществляют следующим образом:
Используют фенил-сефарозу. Уравновешивают смесью буферов: 12% буфер В/88% буфер А. Буфер А: 20 мМ цитрат натрия, pH 2,7, 110 мМ NaCl. Буфер В: 20 мМ цитрат натрия, pH 6,7. Образец разводится в 5 раз буфером А и наносится на колонку. Промывка колонки осуществляется указанной смесью буферов. Элюцию проводят линейным градиентом буфера В с 12% до 90%.
Стадия концентрирования очищенного продукта:
SP-Sepharose FF уравновешена 50 мМ фосфат натрия, pH 5,4. Элюцию проводят комбинацией ступенчатого и линейного градиента 50 мМ натрий-фосфатного буфера pH 6,4 (буфер В) с 10% до 15%, с 15% до 35%. Промывку осуществляют буфером В.
Способ, предложенный в WO 2007/009950, позволяет получить выход белка 80% на последней стадии.
Технической задачей данного изобретения является создание более продуктивной технологии получения стабильного препарата очищенного Г-КСФ с улучшенным качеством, пригодного для создания лекарственного препарата медицинского назначения (филграстима).
Эта техническая задача решается способом очистки рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (филграстима) человека, включающим стадию очистки от грубых загрязнений на сорбенте Sepharose (сефароза) с последующей элюцей, стадию тонкой очистки с последующей элюцией и стадию концентрирования очищенного продукта на сефарозе с последующей элюцией, при этом на стадии очистки от грубых загрязнений используют сорбент SP-Sepharose Fast Flow, а элюцию проводят градиентом 0,5 М NaCl в ацетатном буфере pH 5-5,5, стадию тонкой очистки проводят при помощи ионообменной хроматографии на сорбенте YMC BioPro S30, а элюцию проводят градиентом pH, постепенно повышая в растворе объемную долю 40 мМ динатриевой соли фосфорной кислоты, на стадии концентрирования очищенного продукта используют CM-Sepharose Fast Flow, а элюцию проводят градиентом 0,5 М NaCl в ацетатном буфере pH 5-5,5, затем дополнительно проводят стадию гель-фильтрации при помощи Sephadex G25 с последующей элюцией 13,3 мМ натрий-ацетатным буфером, pH 3.
Эффективность данного способа очистки подтверждается следующим примером.
Пример.1.
Общая схема
Стадия
Используемый сорбент
1
SP-Sepharose Fast Flow
2
YMC BioPro S30
3
CM-Sepharose Fast Flow
4
Sephadex G25
Ренатурацию проводят, например, следующим образом: растворенные в 8М мочевине тельца включения, содержащие филграстим, вносятся в ренатурационный буфер, содержащий 20 мМ раствора Трис/НСl pH 8,0; 1М раствора мочевины; 1 мМ раствора ЕДТА; 1 мМ раствора GSH; 1 мМ раствора GSSG. После 14-17 часов ренатурации при 12°С раствор фильтруется и передается для очистки. Или ТВ растворяют в 20 мМ Трис/HCl, pH 8,0, 0,1% CHAPS, 20 мМ DTT, 6M GuHCl. В следующих условиях: 20 мМ Трис/HCl, pH 8,0, 1М мочевина, 1 мМ ЭДТ, 1 мМ GSH; 1 мМ GSSG в течение 14-20 часов при 8-12°С. Ренатурацию останавливают добавлением ацетата натрия, pH 4,5 до 12,5 мМ.
На стадии очистки от грубых загрязнений (первая стадия) было взято 570 мл раствора филграстима после ренатурации телец включения серии «Exp 2», что составляло 115 мг белка (относительная чистота 71,43%), и нанесено на колонку объемом 7,5 мл с сорбентом SP-Sepharose Fast Flow. Для уравновешивания и промывки колонны использовали 50 мМ ацетатного буфера. Элюцию белка проводили градиентом соли хлорида натрия от 0 до 0,5М в ацетатного буфере pH 5,0. По результатам анализа были объединены пробы с относительной чистотой белка более 70%. Количество белка в суммарной пробе после первой стадии составило 101 мг, то есть 88,6% от общего количества нанесенного белка, относительная чистота филграстима составила 89,04%.
Стадию тонкой очистки (вторая стадия) проводили порционно в 2 стадии (суммарный раствор после стадии 1 был разделен пополам и последовательно была проведена очистка каждой порции). На данном этапе использовали колонну объемом 8,24 мл с сорбентом YMC BioPro S30. Для уравновешивания и промывки колонны использовали раствор, составленный из 90% v/v 20 мМ лимонной кислоты и 10% v/v 40 мМ динатриевой соли фосфорной кислоты. Элюцию проводили градиентом pH, постепенно повышая в растворе объемную долю 40 мМ динатриевой соли фосфорной кислоты. По результатам анализа были объединены пробы с относительной чистотой белка - более 91%. Количество белка в суммарной пробе составило 65 мг, т.е. 68% от общего количества нанесенного белка, относительная чистота филграстима составила 97,33%. Таким образом, выход филграстима после данного этапа очистки составил 57% от исходного количества белка, полученного после стадии ренатурации.
На третьей стадии проводили концентрирование раствора очищенного продукта (белка) с помощью метода хроматографии на колонне объемом 5 мл с использованием сорбента CM-Sepharose Fast Flow. Для уравновешивания и промывки колонны использовали 50 мМ ацетатного буфера. Элюцию белка проводили градиентом соли хлорида натрия от 0 до 0,5 М в ацетатном буфере pH 5,0. По результатам анализа были объединены пробы с относительной чистотой белка - более 96%. Количество белка в суммарной пробе составило 63,8 мг, т.е. 98% от общего количества нанесенного белка, относительная чистота филграстима составила 98,10%. Таким образом, выход филграстима после данного этапа очистки составил 56% от исходного количества белка, полученного после стадии ренатурации.
Дополнительную стадию гель-фильтрации (четвертый этап) проводили на колонне объемом 51 мг при помощи сорбента Sephadex G25. Элюцию проводили 13,3 мМ натрий-ацетатным буфером, pH 3,9. По результатам анализа были объединены все пробы, их относительная чистота по белку составила более 97%. Количество белка в суммарной пробе составило 60,2 мг, то есть 95% от общего количества нанесенного белка, относительная чистота филграстима составила 98,1%.
Таким образом, выход филграстима после очистки составил 52% от исходного количества белка, полученного после стадии ренатурации.
Данная серия была нормирована до концентрации белка 0,66 мг/мл буфером для ГЛФ (10 мМ AcNa; 5% Сорбитол; 0,006% Полисорбат-80; pH 3,9). Далее была проведена фасовка субстанции по 1 мл во флаконы объемом 2 мл. Серии присвоено название «GCSF Ехр2 010310».
Пример 2.
Процесс проводили, как в примере 1, только на стадии очистки от грубых загрязнений и на стадии концентрирования очищенного продукта элюцию проводили в ацетатном буфере pH 5,5. Результаты аналогичны примеру 1.
В таблице 1 представлены существенные отличия заявленного способа от ближайшего аналога.
Таблица 1.
Стадии процесса
Ближайший аналог (WO 2007/009950)
Заявляемый способ
Очистка от грубых загрязнений
pH раствора приводят к 3,2 2 М лимонной кислоты. В качестве сорбента используют SP-Sepharose XL-matrix, уравновешанную 20 мМ натрий-ацетатного буфера, pH 5.0. Элюцию проводят тем же буфером с 200 мМ NaCl.
SP-Sepharose Fast Flow. Элюцию проводят градиентом 0,5 М NaCl в ацетатном буфере pH 5-5,5.
Тонкая очистка
Используют фенил-сефарозу. Уравновешивают
Ионообменная хроматография на сорбенте
смесью буферов: 12% буфер В/88% буфер А. Буфер А: 20 мМ цитрат натрия, pH 2,7, 110 мМ NaCl. Буфер В: 20 мМ цитрат натрия, pH 6,7. Образец разводится в 5 раз буфером А и наносится на колонку. Промывка колонки осуществляется указанной смесью буферов. Элюцию проводят линейным градиентом буфера В с 12% до 90%.
YMC BioPro S30, элюцию проводят градиентом pH, постепенно повышая в растворе объемную долю 40 мМ динатриевой соли фосфорной кислоты.
Концентрированно очищенного продукта
SP-Sepharose FF уравновешена 50 мМ фосфат натрия, pH 5,4. Элюцию проводят комбинацией ступенчатого и линейного градиента 50 мМ натрий-фосфатного буфера pH 6.4 (буфер В) с 10% до 15%, с 15% до 35%. Промывку осуществляют буфером В.
CM-Sepharose Fast Flow. Элюцию проводят градиентом 0,5 М NaCl в ацетатном буфере pH 5-5,5
Гель-фильтрация
Не проводится
Sephadex G25. Элюцию проводят 13,3 мМ натрий-ацетатным буфером, pH 3,9
Таким образом, из уровня техники ранее не было известно сочетание заявляемых параметров очистки, что свидетельствует о соответствии заявляемого способа условию патентоспособности «новизна». Из уровня техники также не предполагалось такое сочетание параметров для повышения выхода продукта на последней стадии - до 95%, с относительной чистотой 98,1%, что свидетельствует о соответствии условию патентоспособности «изобретательский уровень».
Таким образом, данное техническое решение позволяет повысить общий выхода Г-КСФ (филграстима) до 95% на последней стадии с относительной чистотой - 98,1%.
Источники информации
1. Metcalf D. // Blood, 1986, v.67, No.2, p.257-267.
2. Basu S., Dunn A., Ward A. // International Journal of Molecular Medicine, 2002, v.10, p.3-10.
3. Platzer E. //. Eur. J. Hematol., 1989, V.42, p.1-15.
4. Morstyn G., Burgess A.W. // Cancer Res., 1988, V.45, p.5624-5637.
5. Cairo M.S. // Amer. J. Pediatr. Hematol. Oncol., 1989. V.11, p.238-244.
6. Welte, K., Platzer, E., Lu, L. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, v.82, №5, p.1526-1530.
7. Nomura H., Imazeki I., Oheda M., Kubota M., Tamura M., Ono M., Ueyama Y., Asano S. // EMBO J., 1986, v.5, No.5, p.891-896.
8. Morioka, E., Taniguchi, S., Okamura, S., Shibuya, Т., Niho, Y. // Res. Exp. Med. (Beri), 1990, v.190, №4, 229-238.