КОНЪЮГАТЫ ФАКТОРА IX С УВЕЛИЧЕННЫМ ВРЕМЕНЕМ ПОЛУЖИЗНИ
FACTOR IX CONJUGATES WITH EXTENDED HALF-LIFE

1. ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к биосовместимым полимерным конъюгатам фактора IX, композициям, содержащим конъюгаты фактора IX, и способам лечения гемофилии конъюгатами фактора IX.
2. КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Автором изобретения было установлено, что можно улучшить изготовление рекомбинантного фактора IX (далее именуемого FIX) в результате конъюгирования FIX с одним или несколькими биосовместимыми полимерами так, что можно эффективно отделить FIX от фактора IXa (далее именуемого FIXa). Улучшение характеристик изготовления также включает возможность получать конъюгаты FIX высокой степени чистоты.
Конъюгаты FIX могут обладать терапевтическим преимуществом, например, при сравнении с неконъюгированным FIX. Такое терапевтическое преимущество включает, но не ограничено, увеличенное время полужизни в кровотоке, сниженную иммуногенность, более высокую активность, меньшие дозировки и возможность альтернативных путей введения (например, подкожно).
В настоящем описании термины «конъюгат фактора IX» или «конъюгат FIX» относятся к фактору IX, который был модифицирован для включения биосовместимого полимера, что дало улучшенный фармакокинетический профиль по сравнению с немодифицированным фактором IX. Улучшение фармакокинетического профиля можно наблюдать как улучшение одного или нескольких следующих параметров: сила действия, стабильность, площадь под кривой и время полужизни в кровотоке.
В конкретном варианте осуществления изобретения описанные в настоящем документе конъюгаты FIX с высокой степенью чистоты по существу свободны от FIXa. В отношении загрязнения композиций FIX даже следовые количества FIXa могут привести к опасному тромбозу согласно статье Gray et al. Thromb. Haemost. 1995, апрель; 73(4):675-9, включенной в настоящее описание путем ссылки.
Используемый в настоящем описании термин «по существу свободный от FIXa» в контексте очистки FIX и конъюгатов FIX относится к количеству FIXa ниже 1 Ед FIXa на 1000 МЕ FIX. Низкие концентрации FIXa можно измерить с помощью методики, описанной в статье Gray et al. Thromb. Haemost. 1995, апрель; 73(4):675-9. В некоторых вариантах осуществления изобретения количество примеси FIXa может быть меньше 0,5 Ед на 1000 МЕ FIX. В некоторых вариантах осуществления изобретения количество примеси FIXa может быть меньше 0,25 Ед на 1000 МЕ FIX. В некоторых вариантах осуществления изобретения количество FIXa может быть меньше 0,1 Ед на 1000 МЕ FIX.
Конъюгирование FIX с биосовместимым полимером увеличивает возможность разделения конъюгата FIX и FIXa и, поэтому, увеличивает возможность использования FIX в фармацевтических композициях. Более того, биосовместимый фрагмент может защищать FIX от деградации и гуморального иммунного ответа. Конъюгаты FIX могут иметь увеличенное время полужизни в кровотоке, что дает в результате более длительный эффект и менее частое введение. В конкретном варианте осуществления изобретения FIX конъюгирован с одним или несколькими полиэтиленгликолевыми (ПЭГ) фрагментами. В другом конкретном варианте осуществления изобретения FIX конъюгирован с одной или несколькими фрагментами полисиаловой кислоты. В еще одном конкретном варианте осуществления изобретения FIX конъюгирован с альбумином.
Поэтому, в первом аспекте изобретение относится к одному или нескольким биосовместимым полимерам, конъюгированным с FIX через один или несколько остатков цистеина. В варианте осуществления изобретения один или несколько ПЭГ-фрагментов конъюгированы с FIX через один или несколько остатков цистеина.
В одном варианте осуществления изобретения фрагмент биосовместимого полимера конъюгата FIX может быть связан с двумя остатками цистеина, которые образуют дисульфидную связь в FIX. Таким образом, содержащий ПЭГ линкер соединяет мостиком дисульфидную связь. В конкретном варианте осуществления изобретения биосовместимый полимер конъюгирован с FIX в соответствии с общей формулой I:
1-10
в которой обе -S-группы принадлежат остаткам цистеина, которые образуют дисульфидную связь в FIX, в которой Q представляет собой связывающую группу, которая может быть прямой связью, алкиленовой группой (предпочтительно, С-алкиленовой группой) или, необязательно, замещенной арильной или гетероарильной группой;
в которой арильные группы включают фенильную, бензоильную или нафтильную группы;
в которой подходящие гетероарильные группы включают пиридин, пиррол, фуран, пиран, имидазол, пиразол, оксазол, пиридазин, пиримидин и пурин;
в которой соединение с полимером может осуществляться через гидролитически лабильную связь или через стабильную связь.
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
1-6
+
+
+
+
13
CR, -C=CR
Заместители, которые могут присутствовать на необязательно замещенной арильной или гетероарильной группе, включают, например, один или несколько одинаковых или различных заместителей, выбранных из -CN, -NO, -COR, -COH, -CHOH, -COR, -OR, -OCOR, -OCOR, -SR, -SOR, -SOR, -NHCOR, -NRCOR, -NHCOR, -NR'COR, -NO, -NHOH, -NR'OH, -C=N-NHCOR, -C=N-NR'COR, -NR, -NH, -NHR, -NHR, галогена, например фтора или хлора, -C≡ и C=CHR, в которых каждый из R' или R независимо представляет атом водорода или алкильную (предпочтительно С) или арильную (предпочтительно фенильную) группу. Особенно предпочтительно присутствие электроноакцепторных заместителей.
В одном варианте формулы I ПЭГ конъюгирован с FIX в соответствии с общей формулой II:
Конъюгаты FIX можно изготовить таким образом, что они будут по существу свободны от FIXa. При некоторых условиях скорости реакции FIX и FIXa с биосовместимым полимерным субстратом могут отличаться. Без связи с какой-либо конкретной гипотезой различие в скорости реакции может являться следствием различных размеров (молекулярный вес FIX на 11 kDa выше молекулярного веса FIXa) и/или различных конформационных структур FIX и FIXa. На фиг.1 приведена структура FIX, которая включает активирующий домен, расщепляемый при активации FIX до FIXa. В результате, участвующая в реакции конъюгирования боковая цепь аминокислотного остатка в FIX или FIXa может быть более стерически доступна полимерсодержащему реакционно-способному веществу, а более доступный остаток будет быстрее вступать в реакцию с полимерсодержащим реакционно-способным веществом. Эта разница в реакционной способности в конечном итоге позволяет кинетическое разделение FIX и FIXa.
Получаемый рекомбинантно FIX может содержать малые количества FIXa в качестве загрязнения. Иногда эти количества могут быть весьма низкими, порядка 1 Ед FIXa на 1000 Ед FIX (Gray et al. Thromb. Haemost. 1995, апрель; 73(4): 675-9). При некоторых условиях скорость образования конъюгата FIX, такого как FIX-ПЭГ, может быть выше скорости образования FIXa-ПЭГ. В этой ситуации в реакционную смесь можно добавить стехиометрическое или субстехиометрическое количество ПЭГ-реагента относительно FIX. В этом случае весь ПЭГ-реагент будет использован для образования конъюгата FIX-ПЭГ, в то время как FIXa остается непрореагировавшим. Свойства конъюгата FIX-ПЭГ, такие как молекулярный вес и полярность, позволяют легко отделить его от FIXa с использованием известных в данной области методик очистки, включающих, но не ограниченных этим, эксклюзионную и/или ионообменную хроматографию, которые можно использовать на стадии очистки.
В некоторых условиях скорость образования конъюгата FIXa, такого как FIXa-ПЭГ, быстрее скорости образования FIX-ПЭГ. В этих условиях в реакционную смесь можно добавить стехиометрический избыток ПЭГ-реагента. В этом случае важно гарантировать, что весь FIXa использован для образования FIXa-ПЭГ, в то время как большинство FIX, если не весь FIX, остается непрореагировавшим в неконъюгированном состоянии. Свойства конъюгата FIXa-ПЭГ, такие как молекулярный вес и полярность, позволяют легко отделить его от неконъюгированного FIX с использованием известных в данной области методик. В одном варианте осуществления изобретения неконъюгированный FIX очищают эксклюзионной хроматографией или гель-фильтрацией. Полученный в результате чистый FIX затем можно конъюгировать с ПЭГ, что дает в результате чистый конъюгат FIX-ПЭГ.
Конъюгаты FIX имеют один или несколько типов биологической активности немодифицированного FIX (т.е. FIX без присоединенного биосовместимого полимера, такого как, например, ПЭГ). Конъюгат FIX может активироваться in vivo фактором XIa или VIIa и тканевым фактором, давая фактор IXa. Биологическую активность конъюгатов FIX можно определить, используя описанные в настоящем документе аналитические методы.
max
По сравнению с немодифицированным FIX конъюгаты FIX по изобретению могут иметь лучшие показатели по одному или нескольким параметрам фармакокинетического профиля, включая площадь под кривой (AUC), C, клиренс (CL), время полужизни, время удержания в плазме и биодоступность, по сравнению с немодифицированным FIX.
Используемая в настоящем документе «площадь под кривой» или «AUC» в контексте введения пептидного лекарственного препарата пациенту определена как общая площадь под кривой, описывающей концентрацию лекарственного препарата в кровотоке пациента как функцию времени от нуля до бесконечности.
Используемый в настоящем описании термин «клиренс» или «почечный клиренс» определен как объем плазмы, который содержит количество лекарственного препарата, выводимого за минуту.
1/2
Используемый в настоящем описании термин «время полужизни» или «t» в контексте введения пептидного лекарственного препарата пациенту определен как время, которое требуется для снижения концентрации лекарственного препарата в плазме пациента наполовину. С пептидным лекарственным препаратом может быть ассоциировано больше одного значения времени полужизни в зависимости от нескольких механизмов клиренса, распределения и других известных в данной области механизмов. Обычно альфа и бета времена полужизни определены таким образом, что альфа-фаза ассоциирована с распределением, а бета-фаза ассоциирована с клиренсом. Однако для белковых лекарственных препаратов, которые, в основном, ограничены кровотоком, может быть, по меньшей мере, два времени полувыведения. Точное влияние пегилирования на альфа-фазу и бета-фазу времени полужизни будет, как известно в данной области, зависеть от размера получаемого соединения и других параметров. Дальнейшее описание «времени полужизни» находится в Pharmaceutical Biotechnology (1997, DFA Crommelin and RD Sindelar, eds., Harwood Publishers, Amsterdam, pp 101-120).
Используемый в настоящем описании термин «время удержания» в контексте введения пептидного лекарственного препарата пациенту определен как среднее время, в течение которого лекарственный препарат остается в организме пациента после введения препарата.
Композиции, содержащие конъюгаты FIX, по существу свободные от FIXa, обладают повышенной безопасностью. Кроме того, менее вероятно, что композиции, содержащие конъюгаты FIX, будут приводить к тромбозу. В определенном варианте осуществления изобретения менее вероятно, что композиции, содержащие чистые конъюгаты FIX, будут приводить к венозному тромбозу. В еще одном определенном варианте осуществления изобретения менее вероятно, что композиции, содержащие чистые конъюгаты FIX, будут приводить к артериальному тромбозу.
Конъюгаты FIX по настоящему изобретению пригодны для лечения гемофилии В. Используемые в настоящем описании термины «лечить», «лечащий» или «лечение» означают, что тяжесть состояния субъекта уменьшена или состояние, по меньшей мере, частично улучшено или облегчено, и/или что получено некоторое улучшение, уменьшение или снижение, по меньшей мере, одного клинического симптома, и/или что ингибируется или задерживается развитие патологического состояния и/или задерживается начало болезни или заболевания. Термины «лечить», «лечащий» или «лечение» также означают контроль состояния болезни, например гемофилии В.
Конъюгаты FIX по изобретению пригодны для лечения пациентов, страдающих от гемофилии В, обеспечивая этих пациентов фактором IX, что включает в себя введение терапевтически эффективного количества конъюгата FIX и описанных в настоящем документе композиций.
Используемое в настоящем описании «терапевтически эффективное» количество представляет собой количество, которое обеспечивает некоторое улучшение или эффект у пациента. Другими словами, «терапевтически эффективное» количество представляет собой количество, которое обеспечивает некоторое улучшение, уменьшение или снижение, по меньшей мере, одного клинического симптома. Специалистам в данной области хорошо известны ассоциированные с заболеванием клинические симптомы, которые можно лечить способами по изобретению. Кроме того, для специалистов в данной области будет ясно, что терапевтические эффекты не должны быть полными или приводить к выздоровлению при условии обеспечения некоторого положительного эффекта.
В конкретном варианте осуществления изобретения композиции, содержащие конъюгат FIX, свободный от FIXa, обеспечивают способ лечения гемофилии В с пониженным риском тромбоза, подтвержденным снижением среднего показателя тромба.
Используемый в настоящем описании «средний показатель тромба» определен ниже. Тромбы можно оценивать по шкале от 0 до 4. Показатель 0 представляет собой полностью жидкую кровь; присутствие мелких фибриновых точек оценивается как 1, несколько большие кусочки сгустков оцениваются как 2; сгусток, который частично перекрывает просвет, оценивается как 3, а оценка 4 представляет собой полностью затвердевший сегмент. Средний показатель тромба должен быть определен из трех или более независимых экспериментов по протоколу из статьи Wessler et al., J. Appl. Physiol. 14:943-946 (1959).
В другом определенном варианте осуществления изобретения улучшенные свойства конъюгатов FIX обеспечивают способ профилактического лечения гемофилии В. В еще одном определенном варианте осуществления изобретения композиции, содержащие конъюгат FIX, можно вводить пациентам, страдающим от гемофилии В, которые подвергаются хирургическому вмешательству или восстанавливаются после хирургического вмешательства.
Введение конъюгатов FIX пациенту для лечения гемофилии В можно объединить с другими терапевтическими препаратами, такими как транексамовая кислота, аминокапроновая кислота, фактор II (протромбин) и/или фактор Х (фактор Стюарта Прауэра).
Описанные в настоящем документе конъюгаты FIX можно ввести в состав с фармацевтически приемлемым носителем. Используемый в настоящем описании термин «фармацевтически приемлемый» при использовании в отношении составов по настоящему изобретению обозначает, что состав не вызывает неприемлемый уровень раздражения у субъекта, которому вводят состав по любой известной схеме введения. Примеры раздражения включают реакции гиперчувствительности на FIX.
Благодаря увеличению времени полужизни конъюгатов FIX фармацевтические композиции могут содержать более низкую дозу FIX, чем обычно вводимые для эффективного лечения гемофилии. Фармацевтические составы по изобретению могут быть составлены для парентерального введения, включающего, но не ограниченного этим, интрадермальные, подкожные и внутримышечные инъекции, и внутривенные или внутрикостные инфузии. Фармацевтические составы по настоящему изобретению могут принимать форму растворов, суспензий, эмульсий, которые включают конъюгат FIX, такой как FIX-ПЭГ, и фармацевтически приемлемый разбавитель, адъювант или носитель в зависимости от пути введения.
Фармацевтические композиции по изобретению составлены для доставки терапевтической дозы конъюгата FIX. Дозировку конъюгата FIX можно выразить в международных единицах (МЕ). Используемый в настоящем описании термин «международная единица» или «МЕ» относится к оценке эффективности по международному стандарту Всемирной Организации Здравоохранения. По этой оценке одна МЕ активности фактора IX на кг веса тела приблизительно равна активности фактора IX в 1 мл пулированной нормальной плазмы человека и увеличивает концентрацию фактора IX в плазме на 1%.
Доза конъюгатов FIX, содержащихся в фармацевтическом составе, может находиться в диапазоне от 1 МЕ до 10000 МЕ. В некоторых вариантах осуществления изобретения доза конъюгата FIX может находиться в диапазоне от 100 МЕ до 5000 МЕ, или от 200 МЕ до 2500 МЕ. В некоторых вариантах осуществления изобретения доза конъюгата FIX может составлять примерно 250 МЕ, примерно 500 МЕ, примерно 1000 МЕ или примерно 2000 МЕ.
Конъюгат FIX вводят в количестве, достаточном для лечения гемофилии В. Используемое в настоящем описании «достаточное количество» или «количество, достаточное для» достижения определенного результата, относится к количеству конъюгата FIX, которое эффективно для получения желаемого эффекта, который, необязательно, представляет собой терапевтический эффект (т.е. в результате введения терапевтически эффективного количества). Например, «достаточное количество» или «количество, достаточное для» может представлять собой количество, которое эффективно для снижения риска гемартроза, геморрагии, желудочно-кишечного кровотечения и меноррагии.
В некоторых вариантах осуществления дозировка конъюгата FIX является достаточной для того, чтобы активность фактора IX в кровотоке составляла от 1 МЕ/кг до 150 МЕ/кг. В другом варианте осуществления изобретения композицию вводят в такой дозировке, чтобы активность фактора IX в кровотоке составляла от 10 МЕ/кг до 120 МЕ/кг. В другом варианте осуществления изобретения композицию вводят в такой дозировке, чтобы активность фактора IX в кровотоке составляла от 20 МЕ/кг до 100 МЕ/кг.
Конъюгаты по изобретению можно использовать таким же образом, как и немодифицированный FIX. Однако благодаря улучшенным свойствам конъюгатов FIX фармацевтические составы по изобретению можно вводить реже неконъюгированного FIX. Например, конъюгаты FIX можно вводить один раз в неделю вместо одного раза в день для немодифицированного рекомбинантного FIX. Настоящее изобретение также охватывает схемы дозирования, в которых для эффективного лечения гемофилии В производные FIX можно вводить дважды в день, один раз в день, один раз каждые два, три или четыре дня, или один раз в неделю. Ожидается, что снижение частоты введения в результате обеспечит лучшее соблюдение пациентами схем лечения, что приведет к лучшим результатам лечения, а также к улучшению качества жизни пациента.
3. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг.1 представлено схематическое изображение фактора IX, на котором приведена аминокислотная последовательность, структура и различные домены.
На фиг.2 показано время полужизни в кровотоке неконъюгированного FIX-ПЭГ в сыворотке мыши.
На фиг.3 показано время полужизни FIX-ПЭГ 10 kDa в сыворотке мыши.
На фиг.4 показано время полужизни FIX-ПЭГ 20 kDa в сыворотке мыши.
4. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении описан FIX, конъюгированный с одним или несколькими биосовместимыми полимерами с целью получения конъюгата FIX, который по существу свободен от FIXa. Описанные в настоящем документе конъюгаты FIX также имеют улучшенные биологические и фармакокинетические свойства, включающие, но не ограниченные этим, увеличенное время полужизни в кровотоке или время удержания в плазме, по сравнению с немодифицированным FIX. Кроме того, описанные в настоящем документе конъюгаты менее восприимчивы к гуморальному ответу. Настоящее изобретение также относится к способам получения таких конъюгатов. В определенном варианте осуществления изобретения конъюгатом FIX является конъюгат FIX-ПЭГ. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам применения конъюгатов FIX для лечения гемофилии В.
Изобретение, в частности, относится к конъюгатам FIX, в которые биосовместимый полимер конъюгирован с одним или несколькими остатками цистеина. В одном варианте осуществления изобретения конъюгатом является конъюгат FIX-ПЭГ, в котором одна или несколько ПЭГ-групп конъюгированы с FIX через один или несколько цистеиновых остатков. В определенном варианте осуществления изобретения конъюгат FIX-ПЭГ содержит одну или несколько ПЭГ-групп, одновременно связанных с двумя цистеиновыми остатками, которые образуют дисульфидную связь в ПЭГ. Эти конъюгаты можно получить восстановительным расщеплением дисульфидной связи с последующей реакцией, в которой фрагмент ПЭГ связывается с обеими тио-группами. Полученный конъюгат FIX содержит фрагмент ПЭГ, который соединяет мостиком две серы, которые раньше образовывали дисульфидную связь.
Композиции по изобретению содержат конъюгаты FIX-ПЭГ, которые по существу свободны от FIXa. Композиции по изобретению имеют меньший показатель тромба по сравнению с композициями, которые содержат следовые загрязнения FIXa, тем самым снижая риск тромболитических проявлений, включая, но не ограниченных этим, венозный и/или артериальный тромбоз.
Настоящее изобретение также относится к способу очистки FIX от FIXa, в котором используется преимущество различных скоростей образования конъюгатов FIX относительно конъюгатов FIXa в реакции конъюгирования с фрагментами биосовместимого полимера. Это приводит к кинетическому разделению FIX и FIXa. В одном варианте осуществления изобретения биосовместимым полимером является ПЭГ.
Конъюгаты FIX по настоящему изобретению имеют улучшенный фармакокинетический профиль по сравнению с немодифицированным FIX.
Другим аспектом изобретения является способ лечения гемофилии В, включающий в себя введение нуждающемуся в этом пациенту фармацевтической композиции, содержащей конъюгат FIX-ПЭГ и фармацевтически приемлемый разбавитель, адъювант или носитель. Используемый в настоящем описании в отношении введения конъюгатов FIX термин «нуждающийся в этом пациент» относится к пациенту, у которого был поставлен диагноз гемофилии В и/или дефицита фактора IX.
4.1 Рекомбинантный фактор IX
Для получения производных и конъюгирования по настоящему изобретению предусмотрен рекомбинантный фактор IX, полученный любыми способами, известными в данной области. Предпочтительно получать FIX, используя способы, изложенные в одном или нескольких из следующих патентов и публикаций, каждый из которых полностью включен путем ссылки: патенты США №№ 5268275, 5171569, 5888809, 6531298; международные патентные публикации №№ WO 2005/030039, WO 2006/101474, WO 2006/089613; публикации заявок США №№ 2003/0220247, 2005/0271644, 2006/0121574 и 2006/0194284.
В некоторых вариантах осуществления изобретения FIX лиофилизирован или высушен при замораживании. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения FIX не лиофилизирован или не высушен при замораживании. В некоторых вариантах осуществления изобретения к FIX добавляют криопротекторы, например, сахарозу или трегалозу. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения к FIX не добавляют криопротекторы, например, сахарозу или трегалозу.
4.2 Конъюгаты фактора IX
max
По сравнению с немодифицированным FIX конъюгаты FIX по изобретению могут иметь лучшие показатели по одному или нескольким параметрам фармакокинетического профиля, включая площадь под кривой (AUC), C, клиренс (CL), время полужизни, время удержания в плазме и биодоступность. Конъюгаты FIX могут иметь большую клиническую активность in vivo по сравнению с немодифицированным FIX. Конъюгаты по изобретению могут обладать увеличенными силой действия и стабильностью.
Очистку и выделение описанных в настоящем документе конъюгатов FIX от FIXa можно проводить известными в данной области хроматографическими способами. Способы включают, но не ограничены, ионообменную хроматографию и эксклюзионную хроматографию. Конъюгаты FIX по изобретению могут иметь один или несколько типов биологической активности немодифицированного FIX. Конъюгаты FIX могут активироваться in vivo фактором XIa или VIIa и тканевым фактором, давая фактор IXa. Биологическую активность конъюгатов FIX можно определить, используя описанные в настоящем документе методы анализа.
FIX для модифицирования по изобретению можно получить и выделить из природных источников, таких как плазма человека. FIX для модифицирования по изобретению можно получить рекомбинантной экспрессией.
В одном варианте осуществления изобретения FIX-компонент конъюгата имеет последовательность FIX человека, показанную на фиг.1. В качестве альтернативы последовательность FIX можно модифицировать или получить ее производные для включения одного или нескольких изменений в аминокислотную последовательность, включая вставки, делеции или замены.
Конъюгат FIX-ПЭГ может привести к увеличению времени полужизни в кровотоке и времени удержания в плазме, снижению клиренса и увеличению клинической активности in vivo. FIX можно модифицировать ковалентным присоединением полиэтиленгликолевого полимера через один или несколько его аминокислотных остатков, включая, но не ограниченных этим, лизин, гистидин, аргинин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, серин, цистеин, а также N-концевые α-амино и С-концевые карбоксильные группы белка. Полиэтиленгликолевые полимерные единицы могут быть линейными или разветвленными.
Конъюгат FIX-ПЭГ можно вводить внутривенно или подкожно с помощью инъекции. Конъюгат FIX-ПЭГ также можно ввести в состав таблетки, капсулы, раствора или суспензии для перорального введения.
Одним аспектом изобретения является конъюгат FIX-ПЭГ, в котором ПЭГ связан с одной или несколькими аминогруппами FIX. Другим аспектом изобретения является конъюгат FIX-ПЭГ, в котором полиэтиленгликолевый полимер связан с одной или несколькими карбоксильными группами FIX. Другим аспектом изобретения является конъюгат FIX-ПЭГ, в котором полиэтиленгликолевый полимер связан с одной или несколькими спиртовыми группами FIX. В определенном варианте осуществления изобретения ПЭГ-содержащий фрагмент может быть связан с тиольной боковой цепью цистеина. В другом определенном варианте осуществления изобретения ПЭГ-содержащий фрагмент может соединять мостиком две тиольные группы цистеинов, которые образуют дисульфидную связь в природном FIX.
Другим аспектом изобретения является конъюгат FIX-ПЭГ, в котором полиэтиленгликолевый полимер связан с остатком лизина. ε-аминогруппу лизина можно легко пегилировать с помощью ряда методик, включающих, но не ограниченных этим, алкилирование и ацилирование.
Другим аспектом изобретения является конъюгат FIX-ПЭГ, в котором полиэтиленгликолевый полимер связан с N-концевой α-аминогруппой. Конъюгат N-концевого α-аминоостатка FIX и ПЭГ можно получить с помощью ряда методик, включающих, но не ограниченных этим, алкилирование или ацилирование N-концевой α-аминогруппы.
Другим аспектом изобретения является конъюгат FIX, который содержит один или несколько конъюгированных с ПЭГ остатков цистеина. Присоединение молекулы ПЭГ к остатку цистеина может потребовать расщепления дисульфидной (-S-S-) связи.
В одном варианте осуществления изобретения один или несколько биосовместимых полимеров присоединены к FIX через один или несколько цистеиновых остатков. В определенном варианте осуществления изобретения биосовместимый полимерный фрагмент конъюгата FIX связан с двумя остатками цистеина, которые образуют дисульфидную связь в FIX. В другом определенном варианте осуществления изобретения ПЭГ-полимер конъюгирован с FIX в соответствии с общей формулой:
1-10
в которой Q представляет собой связывающую группу, которая может быть прямой связью, алкиленовой группой (предпочтительно, С-алкиленовой группой) или, необязательно, замещенной арильной или гетероарильной группой;
в которой арильные группы включают фенильную и нафтильную группы;
в которой подходящие гетероарильные группы включают пиридин, пиррол, фуран, пиран, имидазол, пиразол, оксазол, пиридазин, пиримидин и пурин;
в которой соединение с полимером может осуществляться через гидролитически лабильную связь или через нелабильную связь.
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
1-6
+
+
+
+
13
CR, -C=CR
Заместители, которые могут присутствовать на необязательно замещенной арильной или гетероарильной группе, включают, например, один или несколько одинаковых или различных заместителей, выбранных из -CN, -NO, -COR, -COH, -CHOH, -COR, -OR, -OCOR, -OCOR, -SR, -SOR, -SOR, -NHCOR, -NRCOR, -NHCOR, -NR'COR, -NO, -NHOH, -NR'OH, -C=N-NHCOR, -C=N-NR'COR, -NR, -NH, -NHR, -NHR, галогена, например фтора или хлора, -C≡ и C=CHR, в которых каждый из R' или R независимо представляет атом водорода или алкильную (предпочтительно С) или арильную (предпочтительно фенильную) группу. Особенно предпочтительно присутствие электроноакцепторных заместителей.
В еще одном определенном варианте осуществления изобретения ПЭГ конъюгирован с FIX в соответствии с общей формулой:
Существует несколько различных типов полиэтиленгликолевых полимеров, которые будут образовывать конъюгаты с FIX. Существуют линейные ПЭГ-полимеры, которые содержат единственную полиэтиленгликолевую цепь, и существуют разветвленные или с боковыми ответвлениями ПЭГ-полимеры. Разветвленные полиэтиленгликоли содержат 2 или несколько отдельных линейных цепей ПЭГ, связанных вместе через соединительную группу. Например, два ПЭГ-полимера могут быть связаны друг с другом остатком лизина. Одна линейная цепь ПЭГ связана с α-аминогруппой, в то время как другая цепь ПЭГ связана с ε-аминогруппой. Оставшаяся карбоксильная группа лизина остается доступной для ковалентного присоединения белка. В продаже доступны как линейные, так и разветвленные полиэтиленгликолевые полимеры с различным молекулярным весом.
В одном аспекте изобретения конъюгат FIX-ПЭГ содержит один или несколько линейных полиэтиленгликолевых полимеров, связанных с FIX, причем каждый ПЭГ имеет молекулярный вес от примерно 2 kDa до примерно 100 kDa. В другом аспекте изобретения конъюгат FIX-ПЭГ содержит один или несколько линейных полиэтиленгликолевых полимеров, связанных с FIX, причем каждый ПЭГ имеет молекулярный вес от примерно 5 kDa до примерно 40 kDa. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый линейный ПЭГ имеет молекулярный вес от примерно 5 kDa до примерно 20 kDa. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый линейный ПЭГ имеет молекулярный вес, составляющий примерно 10 kDa. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый линейный ПЭГ имеет молекулярный вес, составляющий меньше примерно 10 kDa. В частных вариантах осуществления изобретения конъюгат FIX-ПЭГ содержит больше одного линейных ПЭГ-полимеров, связанных с FIX, например, два, три или четыре линейных ПЭГ-полимеров, связанных с FIX. В некоторых вариантах осуществления изобретения конъюгаты FIX-ПЭГ содержат два линейных ПЭГ-полимера, причем каждый линейный ПЭГ имеет молекулярный вес примерно 10 kDa.
Конъюгат FIX-ПЭГ по этому изобретению может содержать один или несколько разветвленных ПЭГ-полимеров, связанных с FIX, причем каждый разветвленный ПЭГ имеет молекулярный вес от примерно 2 kDa до примерно 100 kDa. В другом аспекте изобретения конъюгат FIX-ПЭГ содержит один или несколько разветвленных полиэтиленгликолевых полимеров, связанных с FIX, причем каждый разветвленный FIX имеет молекулярный вес от примерно 5 kDa до примерно 40 kDa. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый разветвленный ПЭГ имеет молекулярный вес от примерно 5 kDa до примерно 20 kDa. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый разветвленный ПЭГ имеет молекулярный вес, составляющий примерно 10 kDa. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждый разветвленный ПЭГ имеет молекулярный вес, составляющий меньше примерно 10 kDa. В частных вариантах осуществления изобретения конъюгат FIX-ПЭГ содержит больше одного разветвленного ПЭГ-полимера, связанного с FIX, например, два, три или четыре разветвленных ПЭГ-полимеров, связанных с FIX. В некоторых вариантах осуществления изобретения конъюгаты FIX-ПЭГ содержат два разветвленных ПЭГ-полимера, причем каждый линейный ПЭГ имеет молекулярный вес примерно 10 kDa.
Очистку конъюгатов FIX-ПЭГ можно проводить известными в данной области хроматографическими способами, включающими, но не ограниченными, ионообменную хроматографию и эксклюзионную хроматографию.
4.3 Способы получения производных фактора IX
4.3.1 Методики пегилирования цистеиновых остатков
В данной области существует ряд способов для образования конъюгатов остатков цистеина с полиэтиленгликолем или пегилированных остатков цистеина. Преимущество этих методик состоит в том, что они избирательны в отношении цистеина, что означает, что эти способы не затрагивают другие боковые цепи. На схеме 1a активированный дисульфид, ПЭГ-орто-пиридил-дисульфид, вступает в реакцию с тиолами, образуя более стабильный симметричный дисульфид. На схеме 1b остаток цистеина вступает в реакцию с ПЭГ-малеамидом через присоединение тиола к активированной двойной связи в реакции присоединения по Михаэлю. На схеме 1с тиол атакует конъюгат по активированной концевой винильной группе ПЭГ-винилсульфона, давая пегилированный остаток цистеина. На схеме 1d тиол цистеина замещает молекулу йода в результате нуклеофильной атаки, давая конъюгированный с ПЭГ остаток цистеина.
Две цистеиновых группы, которые совместно образуют дисульфидную связь, также можно избирательно пегилировать, используя методику, показанную на схеме 2. Сначала восстанавливается нативная дисульфидная связь. Один из полученных тиолов из этой связи может нуклеофильно атаковать электрофильную группу, как, например, 1,4-присоединение к енону. После этого происходит отрыв уходящей группы, такой как, например, сульфон. Последующее удаление второго енона, за которым следует 1,4-присоединение оставшегося тиола, приводит к соединенному мостиком дисульфиду с присоединенной ПЭГ-группой.
Приведенную на схеме 2 методику также можно использовать для получения конъюгата FIX с одним или несколькими независимыми фрагментами ПЭГ, конъюгированными с ним. Например, восстановление первой нативной дисульфидной связи проходит в контролируемых условиях, хорошо известных в данной области. Потом, в соответствии со схемой 2, к фактору присоединяется первый фрагмент ПЭГ. Далее происходит восстановление второй дисульфидной связи, например, при более полных восстановительных условиях, хорошо известных в данной области. Затем к фактору присоединяется второй фрагмент ПЭГ, опять в соответствии со схемой 2. Эту многостадийную процедуру можно повторять по мере необходимости.
4.3.2 Способы получения высокочистого FIX
Конъюгирование FIX с биосовместимыми полимерами предоставляет способ получения высокочистых конъюгатов FIX. В частности, особенно предпочтительны способы образования конъюгатов FIX в присутствии FIXa без образования конъюгатов FIXa. Конъюгаты FIX можно легко отделить от FIXa хроматографическими способами, такими как ионообменная или эксклюзионная хроматография.
В одном варианте осуществления изобретения скорость образования FIX-ПЭГ превышает скорость образования FIXa-ПЭГ. На схеме 3 ниже показана реакция избирательного конъюгирования FIX.
К реакционной смеси FIX в присутствии следовых количеств FIXa добавляют стехиометрическое количество ПЭГ-реагента. В одном варианте осуществления изобретения соотношение ПЭГ-реагента к FIX в реакционной смеси составляет от примерно 0,1 до примерно 1,5. В другом варианте осуществления изобретения соотношение ПЭГ-реагента к FIX составляет от примерно 0,1 до примерно 1,0. В другом варианте осуществления изобретения соотношение ПЭГ-реагента к FIX составляет от примерно 1,0 до примерно 1,5. В другом варианте осуществления изобретения соотношение ПЭГ-реагента к FIX составляет от примерно 0,1 до примерно 0,5. В другом варианте осуществления изобретения соотношение ПЭГ-реагента к FIX составляет от примерно 0,5 до примерно 0,7. В другом варианте осуществления изобретения соотношение ПЭГ-реагента к FIX составляет от примерно 0,7 до примерно 1,0.
В одном варианте осуществления изобретения ПЭГ-реагент можно добавить в реакционную смесь сразу. В другом варианте осуществления изобретения ПЭГ-реагент добавляют медленно и постепенно. ПЭГ-реагент можно добавлять в течение периода времени до примерно 1, 2, 6, 12, 18 или 24 часов. Прохождение реакции можно контролировать способами, включающими, но не ограниченными этим, масс-спектроскопию, быструю жидкостную хроматографию белка (FPLC) или электрофорез в додецилсульфат-полиакриламидном геле (SDS-PAGE). Важно гарантировать, что FIXa не превращается в конъюгат FIXa-ПЭГ. В одном варианте осуществления изобретения FIX практически количественно превращается в FIX-ПЭГ. В другом варианте осуществления изобретения FIX превращается в FIX-ПЭГ с эффективностью приблизительно от 80% до 90%, от 70% до 80%, от 60% до 70%, от 50% до 60%, от 40% до 50%, от 30% до 40%, от 20% до 30% или от 10% до 20%. Непрореагировавший FIX можно использовать повторно в дополнительных реакциях конъюгирования.
Конъюгат FIX-ПЭГ можно легко отделить от реакционной смеси с помощью ион-аффинной или эксклюзионной хроматографии. После стадии разделения важно гарантировать, что получаемый в результате конъюгат FIX-ПЭГ по существу свободен от FIXa. Это можно подтвердить способами, описанными в Gray et al. Thromb. Haemost. 1995, апрель; 73(4):675-9, или способами из раздела 5.3 ниже.
В другом варианте осуществления изобретения скорость образования конъюгата FIXa-ПЭГ выше скорости образования FIX-ПЭГ. Непрореагировавший FIX затем отделяют от конъюгата FIXa-ПЭГ хроматографическими способами, описанными в настоящем документе. Для получения чистого FIX-ПЭГ с оставшимся очищенным FIX можно провести дополнительную реакцию пегилирования. На схеме 4 показано, как в этих обстоятельствах можно синтезировать очищенный FIX-ПЭГ.
В этих условиях в реакционную смесь можно добавить стехиометрический избыток ПЭГ-реагента относительно FIXa. В одном варианте осуществления изобретения соотношение ПЭГ-реагента к FIXa в реакционной смеси составляет от примерно 100 до примерно 1000. В другом варианте осуществления изобретения соотношение ПЭГ-реагента к FIXa составляет от примерно 10 до примерно 100. В другом варианте осуществления изобретения соотношение ПЭГ-реагента к FIXa составляет от примерно 1,1 до примерно 10.
Важно гарантировать, что все количество FIXa было использовано в образовании FIXa-ПЭГ. Свойства конъюгата FIXa-ПЭГ, такие как молекулярный вес и полярность, позволяют легко отделить его от неконъюгированного FIX, используя известные в данной области методики. В одном варианте осуществления изобретения неконъюгированный FIX очищают эксклюзионной хроматографией или гель-фильтрацией.
4.4 Способы анализа биологической активности
Конъюгаты FIX по изобретению имеют один или несколько типов биологической активности немодифицированного FIX. Способы определения активности конъюгата FIX, полученного по способам настоящего изобретения, можно провести, используя хорошо известные в данной области способы, такие как одностадийный метод активированного частичного тромбопластинового времени, описанный, например, в Biggs (1972, Human Blood Coagulation Haemostasis and Thrombosis (Ed. 1), Oxford, Blackwell, Scientific, pg. 614). Кратко, для анализа биологической активности конъюгата FIX, созданного по способам настоящего изобретения, анализ можно провести с равными объемами активированного частичного тромбопластинового реагента, лишенной FIX плазмой, выделенной из крови пациента с гемофилией В с использованием хорошо известных в данной области методик стерильной флеботомии, и нормальной пулированной плазмой в качестве стандарта или образцом. В этом анализе одну единицу активности определяют как количество активности, присутствующей в одном миллилитре нормальной пулированной плазмы. Дополнительно можно провести анализ биологической активности, основанный на способности FIX уменьшать время свертывания плазмы у пациентов с дефицитом FIX до нормы, как описано, например, в Proctor and Rapaport (1961, Amer. J. Clin. Path. 36: 212). Биологическую активность конъюгатов FIX для гарантии отсутствия загрязнения FIXa можно определить, используя методы анализа, описанные также в секции 5.3.
4.4.1 Фармацевтические композиции
Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим конъюгат FIX в качестве активного ингредиента. Конъюгат FIX можно ввести в состав вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Благодаря увеличению времени полужизни конъюгата FIX фармакокинетические композиции могут содержать меньшие дозы FIX, чем обычно вводимые для эффективного лечения гемофилии В. Фармацевтические составы по изобретению можно составить для парентерального введения, включая, но не ограниченные этим, интрадермальные, подкожные и внутримышечные инъекции, и внутривенные или внутрикостные инфузии. Фармацевтические составы по настоящему изобретению могут представлять собой растворы, суспензии или эмульсии, которые включают конъюгат FIX, такой как химически модифицированный полиэтиленгликолем FIX, и фармацевтически приемлемый разбавитель, адъювант или носитель, в зависимости от пути введения.
Фармацевтические композиции по изобретению составлены для доставки терапевтической дозы конъюгата FIX. Дозировку конъюгата FIX можно выразить в международных единицах (МЕ). Доза конъюгатов FIX, содержащаяся в фармацевтическом составе, может находиться в диапазоне от 1 МЕ до 10000 МЕ. В некоторых вариантах осуществления изобретения доза конъюгата FIX может находиться в диапазоне от 100 МЕ до 5000 МЕ, или от 200 МЕ до 2500 МЕ. В некоторых вариантах осуществления изобретения доза конъюгата FIX может составлять примерно 250 МЕ, примерно 500 МЕ, примерно 1000 МЕ или примерно 2000 МЕ.
В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтические композиции по изобретению имеют предпочтительный профиль иммуногенности, например, по сравнению с аналогичной фармацевтической композицией неконъюгированного FIX. В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтические композиции по изобретению по существу менее иммуногенны, чем аналогичная фармацевтическая композиция неконъюгированного FIX, или по существу не иммуногенны. В родственных вариантах осуществления изобретения такие фармацевтические композиции с предпочтительными профилями иммуногенности подходят для подкожного введения пациенту, например, в способе лечения гемофилии В.
4.5 Способы лечения гемофилии В
Описанные в настоящем документе конъюгаты FIX предоставляют способ лечения гемофилии В. Фармацевтические композиции по изобретению составлены для доставки терапевтической дозы конъюгата FIX. В некоторых вариантах осуществления дозировка конъюгата FIX является достаточной для того, чтобы активность FIX в кровотоке субъекта составляла от 1 МЕ/дл до 150 МЕ/дл. В другом варианте осуществления изобретения композицию вводят в такой дозировке, чтобы концентрация активности FIX в кровотоке субъекта составляла от 10 МЕ/дл до 120 МЕ/дл. В другом варианте осуществления изобретения композицию вводят в такой дозировке, чтобы активность FIX в кровотоке субъекта составляла от 20 МЕ/дл до 100 МЕ/дл.
В некоторых вариантах осуществления изобретения активность конъюгата FIX составляет примерно 100% от активности аналогичного неконъюгированного FIX. В некоторых вариантах осуществления изобретения активность конъюгата FIX выше примерно 80%, 60% или 40% от активности аналогичного неконъюгированного FIX. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения активность конъюгата FIX выше примерно 20% от активности аналогичного неконъюгированного FIX. Хотя это не является предпочтительным, активность может быть ниже 20%, как, например, 10%, 5% или даже 1%, и все еще предпочтительно может использоваться по сравнению с неконъюгированным FIX.
Для получающих конъюгат FIX пациентов может быть необходимо, чтобы активность FIX контролировалась медицинским работником. Описанные в настоящем изобретении конъюгаты FIX можно также вводить пациентам, страдающим от гемофилии В, которые подвергаются хирургической процедуре или восстанавливаются после нее.
Кроме того, описанные в настоящем документе конъюгаты FIX свободны от загрязнения FIXa, которое может привести к нежелательным тромболитическим осложнениям. Таким образом, описанные в настоящем документе конъюгаты FIX и способы их изготовления дают чистые конъюгаты FIX, которые менее вероятно вызовут нежелательный тромбоз, определяемый по среднему показателю тромба. В одном варианте осуществления изобретения средний показатель тромба композиции конъюгата FIX составляет меньше 1 после трех или нескольких независимых измерений. В другом варианте осуществления изобретения средний показатель тромба составляет менее 0,5 после трех или более независимых измерений. В другом варианте осуществления изобретения средний показатель тромба после трех или нескольких независимых измерений составляет менее 0,3. В другом варианте осуществления изобретения средний показатель тромба после трех или нескольких независимых измерений составляет менее 0,1. В еще одном варианте осуществления изобретения средний показатель тромба составляет 0 после трех или нескольких независимых измерений.
В некоторых вариантах осуществления изобретения вводимая доза конъюгата FIX приблизительно равна дозе, необходимой для аналогичного неконъюгированного FIX. В некоторых вариантах осуществления изобретения вводимая доза конъюгата FIX примерно в два раза, примерно в три раза, примерно в четыре раза или примерно в пять раз, чем необходимая доза для аналогичного неконъюгированного FIX.
Настоящее изобретение также направлено на способы лечения гемофилии В путем введения нуждающемуся в этом пациенту конъюгата FIX и дополнительного терапевтического агента. Дополнительным терапевтическим агентом может быть одно соединение или несколько из транексамовой кислоты, аминокапроновой кислоты, фактора II (протромбина) и/или фактора X (фактор Стюарта Прауэра).
Конъюгат FIX и дополнительный терапевтический агент можно вводить последовательно или одновременно. При последовательном введении порядок введения не принципиален. Например, конъюгат FIX можно вводить перед введением дополнительного терапевтического агента. В качестве альтернативы, введение дополнительного терапевтического агента может предшествовать введению конъюгата FIX.
Вне зависимости от того, будут ли они вводиться в отдельных композициях или в одной композиции, предпочтительно, чтобы каждая композиция фармацевтически подходила для введения. Более того, при раздельном введении конъюгат FIX и терапевтический агент можно вводить с помощью одного или различных способов введения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения конъюгаты FIX по изобретению проявляют по существу такие же фармацевтические эффекты, как аналогичный неконъюгированный FIX. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения введение конъюгатов FIX по изобретению приводит к нормальному индуцируемому фибрином свертыванию крови, указывающему на коагуляцию.
4.5.1 Схемы дозирования
Схемы дозирования включают введение страдающему от гемофилии В пациенту конъюгатов по изобретению дважды в день, один раз в день, через день, два раза в неделю, один раз в неделю, один раз в две недели или один раз в месяц.
Медицинский работник может контролировать активность FIX у субъекта, получающего конъюгат FIX, и соответственно изменять схему дозирования. В одном варианте осуществления изобретения активность FIX у пациента определяют немедленно после введения конъюгата FIX. В другом варианте осуществления изобретения активность FIX у субъекта определяют через 0,5 ч, 1 ч, 6 ч, 12 ч или 24 ч после введения конъюгата FIX. В другом варианте осуществления изобретения активность FIX у субъекта определяют через 2 дня, 4 дня, 1 неделю, 2 недели или 3 недели после введения конъюгата FIX.
5. ПРИМЕРЫ
5.1 Синтез конъюгатов FIX
Конъюгаты FIX по изобретению можно легко синтезировать с использованием известных в данной области способов синтеза. В следующих примерах продемонстрирован синтез конъюгата FIX-ПЭГ.
5.1.1 Пример 1: Пегилирование FIX через образование мостика по дисульфидной связи
К фактору IX добавляли водный раствор мочевины и 2-меркаптоэтанола. рН полученного раствора доводили до 8,5, используя 10%-й водный раствор метиламина. Затем через реакционный раствор барботируют азот в течение приблизительно 30 минут. Продолжая пропускать азот, нагревают пробирку до 37°С. Затем охлаждают реакционную смесь в ледяной бане с солью, а затем в реакционный раствор добавляют 10 мл продуваемого аргоном охлажденного раствора 1N HCl в абсолютном этаноле. После выпадения осадка его выделяют центрифугированием и затем промывают три раза дополнительными порциями смеси HCl с абсолютным этанолом и дважды охлажденным диэтиловым эфиром, продуваемым азотом. После каждого промывания осадок выделяют центрифугированием. Промытый осадок затем растворяют в продуваемой азотом деионизированной воде и высушивают при замораживании, получая сухое твердое вещество. Частичное восстановление FIX можно подтвердить и количественно оценить, используя тест Элмана, который дает число свободных тиолов на молекулу белка.
В микропробирке («эппендорфе») частично восстановленный FIX растворяют в продуваемом агроном растворе аммония, рН 8. В отдельном эппендорфе полимерный конъюгирующий реагент, α-метокси-ω-4-[2,2-бис[(п-толилсульфонил)-метил]ацетил]бензамид, полученный из полиэтиленгликоля, также растворяют в растворе аммония и этот раствор добавляют к раствору фактора IX. Эппендорф с ПЭГ промывают свежим раствором аммония и его также добавляют в основной эппендорф, где проводится реакция. Затем эппендорф закрывают под аргоном и греют при 37°С в течение приблизительно 24 ч, а затем позволяют остыть до комнатной температуры. Остывший реакционный раствор затем анализируют с помощью электрофореза в натрийдодецилсульфат-полиакриламидном геле (SDS-PAGE).
5.1.2. Пример 2: Избирательное образование и очистка FIX-ПЭГ в присутствии загрязнения FIXa
К реакционной смеси, содержащей FIX, который загрязнен FIXa, добавляли водный раствор мочевины и 2-меркаптоэтанола. рН полученного раствора доводили до 8,5, используя 10%-й водный раствор метиламина. Затем через реакционный раствор барботируют азот в течение приблизительно 30 минут. Продолжая пропускать азот, нагревают пробирку до 37°С. Затем охлаждают реакционную смесь в ледяной бане с солью, после чего в реакционный раствор добавляют 10 мл продуваемого аргоном охлажденного раствора 1N HCl в абсолютном этаноле. После выпадения осадка его выделяют центрифугированием и затем промывают три раза дополнительными порциями смеси HCl с абсолютным этанолом и дважды охлажденным диэтиловым эфиром, продуваемым азотом. После каждого промывания осадок отделяют центрифугированием. Промытый осадок затем растворяют в продуваемой азотом деионизованной воде и высушивают при замораживании, получая сухое твердое вещество. Частичное восстановление FIX можно подтвердить и количественно оценить, используя тест Элмана, который дает число свободных тиолов на молекулу белка.
В эппендорфе частично восстановленный FIX растворяют в продуваемом агроном растворе аммония, рН 8. В отдельном эппендорфе меньше одного эквивалента полимерного конъюгирующего реагента, α-метокси-ω-4-[2,2-бис[(п-толилсульфонил)-метил]ацетил]бензамида, полученного из полиэтиленгликоля, также растворяют в растворе аммония и полученный раствор добавляют к раствору фактора IX. Эппендорф с ПЭГ промывают свежим раствором аммония и его также добавляют в основной эппендорф, где проводится реакция. Затем эппендорф закрывают под аргоном и греют при 37°С в течение приблизительно 24 ч, а затем позволяют остыть до комнатной температуры. Остывший реакционный раствор затем анализируют с помощью электрофореза в натрийдодецилсульфат-полиакриламидном геле (SDS-PAGE). Очистку FIX-ПЭГ из реакционной смеси затем проводят с помощью эксклюзионной хроматографии.
Для определения уровня загрязнения фактором IXa дополнительный анализ выделенного продукта можно провести способами, изложенными в Gray et al. Thromb. Haemost. 1995, апрель; 73(4):675-9 или разделе 5.3 ниже.
5.2. Получение рекомбинантного фактора IX
5.2.1 Пример 3: Первичная трансфекция клеток СНО геном фактора IX
Ген фактора IX дикого типа трансфецировали в клетки СНО предельным разведением в 96-луночных планшетах. Ген фактора IX находится под контролем промотора CHEF-I. Клеткам позволяли расти в 5% сыворотке в течение 14 дней. Культуральную среду собирали, и общее количество антигена фактора IX в мкг на мл определяли с помощью твердофазного ИФА (ELISA) к фактору IX. Было проанализировано более 150 клонов и определено общее количество фактора IX, продуцируемое каждым клоном.
Трансфецированные геном фактора IX клетки СНО продуцируют антиген фактора IX, который детектировали с помощью ELISA к фактору IX.
5.2.2 Пример 4: Супертрансфекция продуцирующих фактор IX клеток СНО генами VKGC и VKOR
Для повышения процентного содержания активного фактора IX, продуцируемого в трансфецированных фактором IX клетках СНО, первичные трансфектанты пулировали (объединяли клетки, полученные после первой трансфекции), размножали в культуре и супертрансфецировали (повторно трансфецировали) векторами, содержащими кДНК ферментов, которые считаются важными для эффективного гамма-карбоксилирования фактора IX, зависимого от витамина К. Продуцирующие фактор IX клоны пулировали в колбе для качания и супертрансфецировали как кДНК витамин К-зависимой гамма-карбоксилазы (VKGC), так и кДНК витамин К-зависимой эпоксидредуктазы (VKOR). Индивидуально супертрансфецированные клетки растили, используя предельное разведение в 96-луночных планшетах в 5%-й сыворотке в течение 14 дней. Общее количество антигена фактора IX, продуцируемого на мл, определяли с помощью ELISA к фактору IX. Количество активного фактора IX измеряли с помощью анализа свертывания крови АРТТ (активированного частичного тромбопластинового времени) с использованием лишенной фактора IX плазмы в качестве субстрата и полученного из плазмы фактора IX в качестве стандарта.
5.3 Методы биологического анализа конъюгатов FIX
5.3.1 Пример 5: анализ FIX-ПЭГ и FIXa
Проводили анализ очищенной композиции FIX-ПЭГ для определения активности FIX-ПЭГ, а также любой загрязняющей активности FIXa или FIXa-ПЭГ. Анализ проводили по протоколам, описанным в Smith, K. J. et al., Blood, 72, 1269-1277 (1988), для FIX, и Varadi, K. et al., Thromb. Haemos., 35, 576-585 (1976), для загрязнения фактором IXa.
5.3.2 Пример 6: композиция FIX-ПЭГ в in vivo анализе тромбогенности
Этот пример использовали для определения, может ли конъюгат FIX, очищенный по способу из примера 2, вызывать нежелательную коагуляцию вследствие загрязнения фактором IXa, которую измеряют с помощью in vivo анализа на тромбогенность методом измерения стаза у кроликов по Весслеру.
Препараты FIX вводят in vivo с помощью инъекции в выделенные, лигированные фрагменты яремных вен кролика в соответствии с процедурой, описанной в Wessler et al., J. Appl. Physiol. 14:943-946 (1959), для анализа образования застойных тромбов.
Оценку осуществляют по системе Wessler, et al. в соответствии с размером кровяного сгустка, причем оценка +4 для сгустка представляет наибольший размер сгустка, который может в норме генерироваться с тромбогенными материалами в выбранном сосуде определенного размера и типа, а +1 представляет собой наименьший такой сгусток, который можно визуально детектировать. Эксперимент повторяют три раза и определяют арифметическое среднее.
5.3.3 Пример 7: определение следов FIXa и FIXa-ПЭГ в очищенных композициях FIX-ПЭГ
2
Референсный FIXa (25 мкл), разведенный в буфере TBS c 1% альбумином человека, или 25 мкл разведений тестируемого концентрата FIX в TBS с 1% альбумином человека помещали в 96-луночные микротитровочные планшеты при 37°С. Аналитический реагент, содержащий равные объемы фактора Х человека, фосфолипида из бычьего мозга и рекомбинантного десульфатогирудина, прогревали в течение 5 мин при 37°С. Затем к реагенту добавляли равные объемы прогретых рекомбинантного фактора VIII и CaCl. Сразу после смешивания 125 мкл этого реагента добавляли к лункам, содержащим образцы FIX или FIXa. После 20 минут образования фактора Xa при 37°С, 50 мкл переносили в 100 мкл S-2765 (Quadratech Epsom UK). После 2-минутной инкубации реакцию останавливали добавлением 50 мкл 50%-й уксусной кислоты и регистрировали длину волны поглощения. Затем для определения количества FIXa в тестируемой смеси измеряли уровень поглощения для тестируемого субстрата при этой длине волны.
5.3.4 Пример 8: Сравнение времени полужизни в кровотоке FIX-ПЭГ 10 kDa и FIX-ПЭГ 20 kDa с неконъюгированным FIX
Получали FIX-ПЭГ 10 kDa и FIX-ПЭГ 20 kDa (в каждом из которых молекула ПЭГ является линейной), используя процедуры, изложенные в примерах 1 и 2.
Неконъюгированный FIX, FIX-ПЭГ 10 kDa и FIX-ПЭГ 20 kDa вводили мышам, лишенным FIX, и у каждой мыши измеряли плазматическую концентрацию FIX как с помощью ELISA, так и хромогенным методом, начиная от 15 мин до 48 часов после введения. Средние плазматические концентрации FIX показаны на фиг.2, 3 и 4, соответственно. При измерении за период времени, начиная от примерно 15 минут до примерно 4 часов после введения, время полужизни FIX-ПЭГ 10 kDa и 20 kDa было примерно в 2-2,5 раза выше времени полужизни неконъюгированного FIX. При измерении за период времени, начиная от примерно 15 минут до примерно 48 часов после введения, время полужизни FIX-ПЭГ 20 kDa было приблизительно в 11 раз выше времени полужизни неконъюгированного FIX, а время полужизни FIX-ПЭГ 10 kDa было приблизительно в 8 раз выше времени полужизни неконъюгированного FIX.
5.3.5 Пример 9: Активность FIX-ПЭГ 10 kDa и FIX-ПЭГ 20 kDa у мышей, лишенных FIX
Активность FIX-ПЭГ 10 kDa и FIX-ПЭГ 20 kDa определяли, проводя исследование наружного кровотечения на мышах, лишенных FIX. Мышам вводили эквивалент дозы 45 мкг/мл неконъюгированного FIX. Мышам обрезали хвосты, и FIX-ПЭГ 10 kDa и FIX-ПЭГ 20 kDa вводили 12 и 16 мышам, соответственно. Смерть была предотвращена у 11 из 12 мышей в группе FIX-ПЭГ 10 kDa, а в группе FIX-ПЭГ 20 kDa смерть была предотвращена у 12 из 16 мышей. Визуально определяли, является ли остановка кровотечения результатом образования фибринового сгустка в отличие от тромбоцитарной остановки кровотечения. Эти результаты указывают на то, что оба FIX-ПЭГ 10 kDa и FIX-ПЭГ 20 kDa являются активными.