Аутокринный фактор подвижности клеток в сыворотке крови больных раком молочной железы

А.В. ГИДРАНОВИЧ

АУТОКРИННЫЙ ФАКТОР ПОДВИЖНОСТИ КЛЕТОК В СЫВОРОТКЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

УО «Витебский государственный медицинский университет», Республика Беларусь

В данной статье проведен анализ активности аутокринного фактора подвижности (AMF) в сыворотке крови здоровых доноров и больных раком молочной железы на различных стадиях заболевания. Установлено статистически значимое увеличение активности AMF в сыворотке крови больных раком молочной железы по сравнению с донорами. У больных с метастатическим раком молочной железы активность AMF максимальна. Отмечен стабильный повышенный уровень активности AMF в 1-ой, 2-ой, 3-ей стадиях рака молочной железы, в 4-ой стадии рака молочной железы активность AMF значительно увеличена. Значительное увеличение активности AMF в сыворотке крови больных раком молочной железы может быть скриниговым маркером риска раннего гематогенного метастазирования.

Ключевые слова: рак молочной железы, аутокринный фактор подвижности, AMF.

The analysis of autocrine mobility factor (AMF) activity in the blood serum of healthy donors and breast cancer patients on different stages of the disease was performed. Statistically significant increase of AMF activity in serum of the breast cancer patients was determined. The activity of AMF in the metastasis breast cancer patients' serum was maximal. In the 1st, 2nd, 3rd stages of breast cancer the stable elevated level of AMF activity was observed. Stage 4 was characterized by highly elevated activity of AMF. The high increase of AMF in breast cancer patients' serum may be a screening marker of early hematogenic metastasis risk.

Keywords: breast cancer, autocrine factor of mobility, AMF

Аутокринный фактор подвижности раковых клеток (autocrine motility factor (AMF)) представляет собой белок, синтез которого экспрессирован в раковых клетках. При экскреции он по аутокринному механизму стимулирует подвижность раковых клеток [1].

Аминокислотное секвенирование позволило установить, что аутокринным фактором подвижности раковых клеток является фермент гликолиза глюкозофосфатизо-мераза (ГФИ), (КФ 5.3.1.9), который катализирует обратимую реакцию превращения глюкозо-6-фосфата во фруктозо-6-фосфат, что является вторым этапом гликолитичес-

кого пути Эмбдена-Мейергофа-Парнаса. Реакиця протекает по схеме:

глюкозофосфатизомераза Глюкозо-6-фосфат^Фруктозо-6-фосфат

Прямая реакция обеспечивает функционирование гликолиза и неокислительного пентозофосфатного пути, обратная реакция участвует в глюконеогенезе. Глю-козофосфатизомераза открыта в 1933 году, и представляет собой один из наиболее активных ферментов. Молекулярная масса глюкозофосфатизомеразы составляет

63016 Да (132000). Молекулярная активность этого фермента составляет 3330 оборотов в секунду. Динамическое равновесие реакции, катализируемой глюкозофосфати-зомеразой, устанавливается при содержании в реакционной среде 68% глюкозо-6-фосфата и 32% фруктозо-6-фосфата в мышечной ткани, 60% глюкозо-6-фосфата и 40% фруктозо-6-фосфата в эритроцитах человека и 68-70% глюкозо-6-фосфата и 3032% фруктозо-6-фосфата в сыворотке крови. Выделяют 3 изоформы глюкозофосфати-зомеразы (А, В и С). По некоторым данным, фермент состоит из двух субъединиц с молекулярной массой около 70000 каждая. Ингибиторами глюкозофосфатизомеразы являются 6-фосфоглюконат и протеин, связывающий инсулиноподобный фактор роста [2]. Реакция, катализируемая глюкозофосфатизо-меразой, протекает в 2 этапа. На первом этапе происходит разрушение полуацетальной кольцевой структуры гексозы с образованием глюкозо-6-фосфата с прямой цепью. На втором этапе происходит основная каталитическая функция образования ендиольно-го интермедиата в результате внутримолекулярного переноса водорода между первым и вторым атомами углерода. Поскольку глю-козофсфатизомераза катализирует раскрытие и закрытие кольца через ендиольный интер-медиат, последний должен быть связан с ферментом с образованием фермент-субстратного комплекса.

Глюкозофосфатизомераза, попадая в экстрацеллюлярный матрикс и кровеносное русло, ведет себя как мощный цитокин, вызывающий увеличение подвижности раковых клеток. Кроме того, глюкозофосфатизомераза экстрацеллюлярно обеспечивает рост эмбриональных спинальных сенсорных нейронов [3], является фактором зрелости, участвующим в дифференциров-ке клеток лейкоза [4]. Пониженная экспрессия глюкозофосфатизомеразы определяет наследственную несфероцитарную гемоли-

тическую анемию [5]. Глюкозофосфатизомераза является маркером артрита, определяемым в сыворотке крови и моче [6].

AMF реализует свое действие, как цитокин, посредством специфического рецептора (autocrine motility factor receptor (AMFR)). Ген AMFR кодирует 323-амино-кислотный полипептид, который имеет один трансмембранный домен и несколько гликозилированных участков. В норме AMFR расположен на мембране случайным образом, однако на клетках папилломы AMFR расположен полярно, а на мигрирующей раковой клетке отмечается скопление AMFR преимущественно на переднем и заднем участках по ходу миграции. Повышенная экспрессия AMFR ассоциируется с плохим прогнозом злокачественного заболевания [7].

В ответ на стимуляцию AMF отмечается усиление подвижности всех эпителиальных клеток, в том числе раковых [8]. AMF защищает раковые клетки от развития апоп-тоза и регулирует рост и развитие клеток путем активации Apaf-1 и каспаз [9], а также путем активации системы циклин-за-висимых киназ и супрессии р27 Kip-1 [10]. AMF также регулирует адгезию клеток к матриксу путем активации фокальной ки-назы адгезии [11]. Подвижность клеток, индуцированная AMF, сопровождается потерей E-кадхерина, возможно, через активацию транскрипции супрессора Е-кадхе-рина, белка SNAIL [12]. Отмечено участие липооксигеназы-12 в каскаде ответа на активацию AMF. Активация липооксигеназы-12 приводит к образованию 12-(S)-rnfl-роксиэйкозотетраеновой кислоты (12-(S)-HETE) [13]. 12-^)-Гидроксиэйкозотетрае-новая кислота является мощным эйкозано-идом, который регулирует подвижность раковых клеток [14].

В последнее десятилетие экспрессия AMF и AMFR изучалась при различных видах опухолей: меланоме [15], раке поджелу-

дочной железы, плоскоклеточном раке полости рта и раке печени [16]. Во всех этих исследованиях указывается, что экспрессия ЛМБЯ связана с активной инвазией и про-грессированием злокачественного процесса, отдаленным метастазированием.

В исследованиях ортотопических моделей показано, что при экспрессии ЛМБ злокачественные клетки формировали опухоли большего размера и имели больший метастатический потенциал [17]. Таким образом, ЛМБ имеет большое влияние на поведение раковых клеток, включая регуляцию клеточной подвижности, клеточную адгезию и клеточный рост. Действие ЛМГ, опосредованное ЛМБЯ, включает большое количество внутриклеточных сигнальных путей.

Установлено, что ЛМБ и ЛМБЯ имеют важное прогностическое значение при раке желудка [18], немелкоклеточном раке легкого [19], меланоме [20] и колоректальном раке. Высокий уровень экспрессии ЛМБЯ связан с активным лимфогенным метастазированием и плохим прогнозом [21]. Экспрессия ЛМБ подвергается изменениям под действием различных терапевтических агентов, например герцептина [22].

Показана значительная корреляция между ЛМБ и циклооксигеназой-2 (СОХ-2), которая имеет высокую экспрессию при агрессивном раке молочной железы. Содержание белка СОХ-2 увеличено в опухолях молочной железы и изменяется пропорционально увеличению размера опухоли и развитию отдаленных метастазов [23]. Аналогично, пациенты с высоким уровнем экспрессии ЛМБ имеют худший прогноз.

Экспрессия ЛМБ регулируется множеством факторов, однако основным является гипоксия. Гипоксия характеризуется сниженным содержанием кислорода в тканях. Уровень гипоксии злокачественных опухолей является важным прогностическим фактором. Гипоксия вызывает снижение чувствительности опухоли к химиотерапевти-

ческому и лучевому методам лечения. [24]. Высокий темп роста агрессивных опухолей и отставание неоваскуляризации требует от них эффективной адаптации к гипоксии. Гипоксия активирует два механизма: гликолиз и апоптоз. Регуляция этих процессов происходит через транскрипционный фактор, индуцируемый гипоксией (Н1Г-1а). Н1Г-1а регулирует экспрессию генов в ответ на изменения уровня кислорода в клетках. В условиях нормального содержания кислорода Н1Г-1а крайне нестабилен и быстро разлагается по убиквитин-протео-сомному пути [25]. В условиях гипоксии происходит транслокация Н1Г-1а в ядро, где он связывается с промоторными и эн-хансерными участками генов, содержащими элементы ответа на гипоксию (НКБ), что приводит к их транскрипционной активации. Среди промоторов и энхансеров встречаются гены, кодирующие ферменты гликолиза [26]. Гипоксия стимулирует экспрессию переносчика глюкозы 01Ш>1, гек-сокиназы, фосфофруктокиназы, глицераль-дегид-3-фосфатдегидрогеназы и фосфогли-цераткиназы. Подобная повышенная экспрессия генов, кодирующих гликолитические ферменты, необходима для адаптации раковых клеток к хронической гипоксии.

Внутриклеточная роль глюкозофосфа-тизомеразы достаточно хорошо изучена в классических энзимологических исследо -ваниях, однако ее внеклеточная «неглико-литическая» роль в качестве цитокина (ЛМГ) открыта недавно и изучена недостаточно, в частности, при раке молочной железы. В связи с вышеизложенным изучение активности ЛМБ в сыворотке крови больных раком молочной железы является актуальным.

Целью нашего исследования явилось изучение активности ЛМБ в сыворотке крови больных раком молочной железы с различной распространенностью злокачественного процесса.

Материалы и методы

В проспективном исследовании обследованы 90 больных раком молочной железы, проходивших лечение в Витебском областном онкологическом диспансере в 2006-2007 году и 16 здоровых доноров. Критерием включения в исследование явилось наличие цитологически или гистологически верифицированного рака молочной железы, отсутствие поражения печени метастатическим либо неспецифическим процессом по данным УЗИ, нормальные показатели билирубина, АлАТ, АсАТ при биохимическом исследовании сыворотки крови. В плане исследования выделяли следующие группы больных:

1. Больные с 1 стадией рака молочной железы

2. Больные со 2 стадией рака молочной железы

3. Больные с 3 стадией рака молочной железы

4. Больные с 4 стадией рака молочной железы

5. Критерий N

6. Критерий N1

7. Критерий N2

8. Критерий N3

Венозную кровь получали при венепункции натощак и переносили в сухую пробирку. После ретракции сгустка проводили центрифугирование при 1500 об/мин в течение 15 мин. Полученную сыворотку, не имеющую признаков гемолиза, делили на аликвоты и замораживали в низкотемпературной холодильной установке при -16-18°С, где хранили до исследования. Активность в сыворотке крови глюкозофосфати-зомеразы (AMF) определяли по методу Bruns и Hinsberg [27]. Полученные данные обрабатывали статистически. Рассчитывали медиану (М), среднее квадратическое отклонение (а), верхний и нижний квартили. При оценке достоверности изменений исходили из гипотезы о негауссовом распределении учетного признака в изучаемых группах. Для оценки значимости изменений между группами использовали критерий Манна-Уитни, Краскелла-Уоллеса.

Таблица 1

Зависимость активности аутокринного фактора подвижности от стадии рака молочной железы

Медиана Минимум Максимум Нижний квартиль Верхний квартиль Стандартное отклонение

Стадия 1 202,5832*f 58,5555 347,5554 169,9999 237,0554 61,3126

Стадия 2 221,9443*f 49,1111 417,4442 174,7221 270,1110 80,3064

Стадия 3 224,3054*f 0,0000 399,4998 180,8610 297,4999 93,4639

Стадия 4 467,4998* 462,7776 472,2220 462,7776 472,2220 6,6782

Доноры 123,7220f 105,7780 162,4440 110,0280 145,9165 18,6630

* - р<0,05 по сравнению с донорами f - р<0,05 по сравнению с 4-ой стадией

500 450 400 350

, 300 "Ь

• 250

^ 200

Э 150

100

50 0

Доноры Стадия 2 Стадия 4

Стадия 1 Стадия 3

Меап

I I

±1,96*8Б

Рис. 1. Активность аутокриииого фактора подвижности в сыворотке крови больных раком молочной

железы.

Изменения считали достоверными при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Медиана активности АМБ в сыворотке крови доноров (п=16) составила 123,72 нмоль-с-1-л-1 (а=18,66). У больных с 1-ой стадией рака молочной железы (п=34) активность АМБ была повышена в 1,64 раза по сравнению с аналогичным показателем у доноров и составила 202,58 нмоль-с-1-л-1 (а=61,31), изменения достоверны, Тест Манна-Уитни р=0,000015 (таблица 1).

Отмечалась тенденция к увеличению активности АМБ в сыворотке крови больных раком молочной железы параллельно с увеличением стадии заболевания. В группе больных со 2-ой стадией РМЖ (п=30) активность ГФИ была выше и составила 221,94 нмоль-с"1-л"1 (а=80,30) тест Манна-Уитни по сравнению с группой больных с

1-ой стадией РМЖ р=0,32. Активность АМБ у больных с 3-ей стадией РМЖ (п=24) наблюдались близкие значения с таковы -ми в группе больных с 1-ой стадией и 2-ой стадией РМЖ. Медиана составила 224,31 нмоль'с^'л"1 (а=93,46) тест Манна-Уинтни по сравнению с группой со 2-ой стадией РМЖ р=0,71. У больных с 4-ой стадией РМЖ наблюдалось более значительное повышение активности АМБ до 467,50 нмоль'С"1,л"1 (а=6,68), тест Манна-Уитни по сравнению с больными с 3-ей стадией РМЖ р=0,02, изменения достоверны. Следует отметить, что наличие злокачественной опухоли определяло значительное повышение активности АМБ, которое оставалось достаточно стабильным в группах больных с 1-,

2-, 3-ей стадиями (рис. 1). У больных с 4-ой стадией РМЖ наблюдалась максимальная активность АМБ.

Исследования зависимости активности АМБ от степени распространенности

регионарного лимфогенного метастатического процесса показали, что медиана активности ЛМБ у больных РМЖ с показателем N составляла 212,48 нмоль-с"1-л"1 (а=88,77) (таблица 2).

В группе больных со значением N аналогичный показатель активности был несколько выше и составил 225,72 нмоль-с^-л-1 (о=62,24), при К2 - 289,00 нмоль-с"1-л"1 (о= 125,13), при N - 209,67 нмоль-с"1-л"1 (о=90,25). Тест Краскела-Уоллиса не выявил значимых различий между исследуемыми группами N К1, К2, К3, из чего следует сделать вывод, что повышенная активность ЛМБ у больных раком молочной железы в малой мере определяет активность лимфогенного метастазирования опухоли или требует для этого включения дополнительных процессов.

Выводы

1. Новые сведения о роли ЛМБ позволяют применить хорошо отработанные методики определения активности ЛМБ в сыворотке крови при раке молочной железы.

2. Определение ЛМБ в сыворотке крови больных раком молочной железы может быть ценным диагностическим методом для выявления групп пациентов с по-

вышенным риском развития гематогенного метастатического процесса, а также критерием, определяющим необходимость более тщательного диагностического поиска у больных с отсутствием клинически выявляемых метастазов на момент исследования.

3. Возникает необходимость изменения клинического подхода к больным раком молочной железы с повышенной активностью AMF в сыворотке крови в сторону более тщательной диагностики гематогенного метастазирования первичной опухоли с применением для этого инвазивных и неинва-зивных методов с высокой специфичностью

ЛИТЕРАТУРА

1. Purification of B16-F1 melanoma autocrine motility factor and its receptor / S. Silletti [et al.] // Cancer Res. - 1991. - Vol. 51. -P. 3507-3511.

2. Tsuboi, K. K. Phosphoglucose isomerase from human erythrocyte. Preparation and properties / K. K. Tsuboi, K. Fukunaga, C. H. Chervenka // J. Biol. Chem.- 1971.- Vol. 246, N 24.-P. 7586-7594.

3. Neuroleukin: a lymphokine product of lectin-stimulated T cells / M. E. Gurney [et al.] // Science. - 1986. - Vol. 234. - P. 574-581.

4. The differentiation and maturation mediator for human myeloid leukemia cells shares homology

Таблица 2

Зависимость активности аутокринного фактора подвижности от степени лимфогенной диссеминацни рака молочной железы

n Медиана Минимум Максимум Нижний квартиль Верхний квартиль а

N1 23 225,7221* 109,5555 384,3887 187,9444 270,1110 62,2422

N2 5 288,9999* 167,1666 472,2220 170,9444 311,6665 125,1333

N3 11 209,6666* 0,0000 370,2220 177,5555 235,1666 90,2486

No 49 212,4999* 49,1111 462,7776 169,9999 255,9443 88,7670

Доноры 16 123,7220 105,7780 162,4440 110,0280 145,9165 18,6630

* -р<0,05 по сравнению с донорами

with neuroleukin or phosphoglucose isomerase / W. Xu [et al.] // Blood. - 1996. - Vol. 87. -P. 4502-4506.

5. Glucosephosphate isomerase (GPI) deficiency mutations associated with hereditary nonspherocytic hemolytic anemia (HNSHA) / E. Beutler [et al.] // Blood Cells Mol. Dis. -1997. - Vol. 23. - P. 402-409.

6. Arthritis provoked by linked T and B cell recognition ofa glycolytic enzyme / I. Matsumoto [et al.] // Science. - 1999. - Vol. 286. -P. 1732-1735.

7. Expression of autocrine motility factor receptor correlates with disease progression in human gastric cancer / Y. Hirono [et al.] // Br. J. Cancer. - 1996. - Vol. 74. - P. 20032007.

8. Autocrine motility factor receptor in human bladder carcinoma: gene expression, loss of cell-contact regulation and chromosomal mapping / S. Silletti [et al.] // Int. J. Oncol. - 1993. - № 3. -P. 801-807.

9. Autocrine motility factor signaling induces tumour apoptotic resistance by regulations Apaf-1 and Caspase-9 apoptosome expression / A. Haga [et al.] // Int. J. Cancer. - 2003. -Vol. 107. - P. 707-714.

10. Activation of small GTPase Rho is required for autocrine motility factor signaling / S. Tsutsumi [et al.] // Cancer Res. - 2002. - Vol. 62. -P. 4484-4490.

11. Tumour autocrine motility factor responses are mediated through cell contact and focal adhesion rearrangement in the absence of new tyrosine phosphorylation in metastatic cells / S. Silletti [et al.] // Am. J. Pathol. - 1996. - Vol. 148. -P. 1649-1660.

12. Autocrine motility factor signaling enhances pancreatic cancer metastasis / S. Tsutsumi [et al.] / / Clin. Cancer. Res.- 2004.- N 10.-P. 7775-7784.

13. Autocrine motility factor induces differential 12-lipoxygenase expression and activity in high-and low-metastatic K1735 melanoma cell variants / S. Silletti [et al.] // Cancer Res. - 1994. - Vol. 54. - P. 5752-5756.

14. Regulation oftumor cell motility by 12(S)-HETE / S. Silletti [et al.] // Adv. Exp. Med. Biol. - 1997. - Vol. 400B.-P. 683-692.

15. Expression and function ofthe AMF receptor by human melanoma in experimental and clinical systems / J. Timar [et al.] // Clin. Exp. Metastasis. - 2002. - Vol. 19. - P. 225-232.

16. Autocrine motility factor enhances hepatoma cell invasion across the basement membrane through activation ofbeta1 integrins / T. Torimura [et al.] // Hepatology. - 2001. - Vol. 34. - P. 62-71.

17. Autocrine motility factor signaling enhances pancreatic cancer metastasis / S. Tsutsumi [et al.] // Clin. Cancer Res. - 2004. - N 10. -P. 7775-7784.

18. Expression of autocrine motility factor receptor correlates with disease progression in human gastric cancer / Y. Hirono [et al.] // Br. J. Cancer. - 1996. - Vol. 74. - P. 2003-2007.

19. Significance of autocrine motility factor receptor gene expression as a prognostic factor in non-small-cell lung cancer / I. Takanami [et al.] // Int. J.Cancer. - 2001. - Vol. 95. - P. 384387.

20. Expression and function of the AMF receptor by human melanoma in experimental and clinical systems / J. Timar [et al.] // Clin. Exp. Metastasis. - 2002. - Vol. 19. - P. 225-232

21. Significance of autocrine motility factor receptor gene expression as a prognostic factor in non-small-cell lung cancer / I. Takanami [et al.] // Int. J. Cancer. - 2001. - Vol. 95. -P. 384-387.

22. Antihuman epidermal growth factor receptor 2 antibody herceptin inhibits autocrine motility factor (AMF) expression and potentiates antitumour effects of AMF inhibitors / A. H. Talukder [et al.] // Clin. Cancer Res. -

2002. - N 8. - P. 3285-3289.

23. Prognostic significance of elevated cyclooxygenase-2 expression in breast cancer / A. Ristimaki [et al.] // Cancer Res. - 2002. -Vol. 62. - P. 632-635.

24. Semenza, G. L. Targeting HIF-1 for cancer therapy / G. L. Semenza // Nat. Rev. Cancer. -

2003. - N 3. - P. 721-732.

25. Regulation of the hypoxia-inducible transcription factor 16 by the ubiquitine-proteosome pathway / P. J. Kallio // J. Biol. Chem. - 1999. - Vol. 247. - P. 6519-6525.

26. Semenza, G. L. Regulation of mammalian homeostasis by hypoxia-inducible factor / G. L. Semenza // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. -1999. - Vol. 15. - P. 551-578.

27. Клиническая ферментология / под ред. Э. Щеклика // Польское государственное медицинское издательство. - Варшава, 1966. - 491 с.

Поступила 12.08.2007г.