Способ лечения аллергического заболевания дыхательных путей (AAD)/астмы
METHOD FOR TREATMENT OF ALLERGIC RESPIRATORY TRACT DISEASE (AAD)/ASTHMA

Область изобретения
Изобретение относится к лечению аллергического заболевания дыхательных путей(AAD)/астмы у субъекта.
Предшествующий уровень техники
Астма представляет собой хроническое респираторное заболевание, поражающее примерно 300 миллионов человек во всем мире, приводящее к 250000 ежегодных смертей. Существует три основных компонента его патогенеза: воспаление дыхательных путей (AI); ремоделирование дыхательных путей (AWR; представляющее собой структурные изменения в дыхательных путях/легких, которые в конечном итоге приводят к фиброзу и обструкции дыхательных путей); и гиперреактивность дыхательных путей (AHR; клиническая характеристика астмы). AWR может возникать из трудноизлечимого или хронического AI, но может также развиваться и вносить вклад в AHR независимо от AI.
Современная терапия астмы, включающая кортикостероиды и β-агонисты, сфокусирована на симптоматическом лечении, а не на регрессии заболевания, и поэтому не является полностью эффективной. Субъекты, получающие терапию на основе β-агонистов, имеют облегчение своих симптомов астмы, но их лежащее в основе AI сохраняется. Таким образом, субъекты, нуждающиеся в хроническом применении β-агонистов, подвергаются большему риску серьезного ухудшения астмы, приводящему к госпитализации и смерти.
"Золотой стандарт" лечения кортикостероидами также неэффективен в лечении субпопуляции субъектов с тяжелой или тяжелой рефракторной формой астмы. Субъекты с тяжелой формой астмы часто нуждаются в лечении высокими дозами кортикостероидов, что может быть связано с системными побочными эффектами и не обязательно улучшает функцию легких или качество жизни. Кроме того, у группы субъектов с тяжелой рефракторной формой астмы наблюдается фиксированная рестрикция дыхательных путей и, следовательно, для этой популяции характерна критическая роль AWR, как части симптомов астмы, что подчеркивает неотложную потребность в стратегиях лечения, которые могут быть нацелены на AWR и уменьшать его.
Мезенхимальные стволовые клетки (MSC) представляют собой мультипотентные стромальные клетки, которые обладают способностью делиться на ряд клеточных линий. Эти клетки экспрессируют главный комплекс гистосовместимости I класса (MHC-I), но лишены МНС-II и ко-стимулирующих молекул CD80, CD86 и CD40, а значит, являются иммунопривилегированными. Таким образом, MSC можно вводить системно посредством внутривенной (IV) инфузии, что обеспечивает широкое распределение. При внутривенном введении MSC накапливаются в легких. MSC также направляются к поврежденным тканям посредством экспрессии хемокинового рецептора 4 типа, экспрессия которого усилена в провоспалительной среде, как в случае астмы, что повышает их способность к хомингу.
Мышиные модели аллергического заболевания дыхательных путей (AAD), которые имитируют некоторые признаки человеческой астмы, использовали, чтобы показать, что MSC проявляют иммуномодулирующие и противовоспалительные свойства, как при непосредственном межклеточном контакте, так и при секреции паракринных факторов. Было показано, что введение экзогенных MSC уменьшает пролиферацию Th2 и уменьшает влияние Th2, которые способствуют AAD. Наблюдалось подавление активации дендритных клеток, миграции и презентации антигена. Снижение ассоциированных с эозинофилами провоспалительных цитокинов наблюдалось в жидкости бронхоальвеолярного лаважа. По сравнению с кортикостероидами, которые подавляют AI, в этих моделях было показано, что MSC активно снижают присутствие и активность клеток, ответственных за воспаление.
Кроме того, было показано, что обработка MSC уменьшают толщину эпителия, гиперплазию гладкой мышцы и метаплазию бокаловидных клеток в дыхательных путях и незначительно снижают субэпителиальное и общее отложение коллагена (фиброз) благодаря их способности повышать уровни желатиназы, разрушающей коллаген, что также свидетельствует об антиремодулирующем действии MSC.
Однако MSC не всегда демонстрируют облегчение неблагоприятных симптомов, связанных с хроническими заболеваниями и результаты лечения с помощью MSC могут варьироваться в зависимости от их тканевого происхождения/источника, степени размножения культуры, донор-зависимой жизнеспособности и эффективности, а также времени их введения.
Кроме того, MSC демонстрируют полезный эффект только при введении в комбинации со вторым терапевтическим агентом.
Кроме того, поскольку только относительно небольшое количество MSC может быть выделено из каждого органа донора, необходим постоянный источник доноров для обеспечения достаточного количества для экспериментального и коммерческого использования.
Следует понимать, что когда здесь упоминается какая-либо публикация из уровня техники, то такая ссылка не является признанием того, что эта публикация является частью общих знаний в данной области в Австралии или любой другой стране.
Краткое изложение сущности изобретения
В первом аспекте предложен способ лечения AAD/астмы у субъекта, включающий введение мезенхимоангиобластных мезенхимальных стволовых клеток (MCA-MSC) субъекту, где MCA-MSC экспрессируют miR-145-5p, miR-181b-5p и miR-214-3р, но не miR-127-3р и miR-299-5p.
В альтернативном или дополнительном воплощении первого аспекта предлагается применение мезенхимоангиобластных мезенхимальных стволовых клеток (MCA-MSC) в изготовлении лекарственного средства для лечения AAD/астмы у субъекта, где MCA-MSC экспрессирует miR-145-5p, miR-181b-5p и miR-214-3р, но не miR-127-3р и miR-299-5p.
В еще одном альтернативном или дополнительном воплощении первого аспекта предлагается мезенхимоангиобластная мезенхимальная стволовая клетка (MCA-MSC) для применения в способе лечения AAD/астмы субъекта, где MCA-MSC экспрессирует miR-145-5р, miR-181b-5p и miR-214-3р, но не miR-127-3р и miR-299-5p.
+
+
+
+
+
+
-
В одном воплощении MCA-MSC имеет фенотип CD73CD105CD90CD146CD44CD10CD31CD45-.
В одном воплощении MCA-MSC получают способом, включающим:
(а) культивирование первичной мезодермальной клетки в среде для формирования мезенхимальных колоний (M-CFM), содержащей LiCl и FGF2 (фактор роста фибробластов 2), но не содержащей PDGF (тромбоцитарный фактор роста), с нормальным содержанием кислорода в течение достаточного времени для образования мезенхимальной колонии; и
(б) культивирование мезенхимальных колоний (а) в прикрепленном состоянии с получением MCA-MSC.
В одном воплощении MCA-MSC вводят внутривенно или интраназально. В одном воплощении MCA-MSC вводят интраназально.
6
9
В одном воплощении лечение включает введение от примерно 1×10 до примерно 1×10 MCA-MSC субъекту.
В одном воплощении субъект представляет собой млекопитающее. В одном воплощении субъект представляет собой человека.
В одном воплощении субъекту предварительно вводят кортикостероид или β-агонист для лечения астмы. В другом воплощении субъекту предварительно не вводят кортикостероид или β-агонист для лечения астмы.
В одном воплощении, субъекту не вводят кортикостероид или β-агонист.
В одном воплощении субъект страдает тяжелой астмой или тяжелой рефрактерной астмой.
В одном воплощении лечение AAD/астмы или их характерного признака включает:
(а) уменьшение AI, AWR, фиброза дыхательных путей, фиброза легких, метаплазии бокаловидых клеток, утолщения эпителия, уровня трансформирующего фактора роста (TGF)-β1 дыхательных путей, плотности субэпителиальных миофибробластов, концентрации субэпителиального коллагена или общей концентрации коллагена легких; или
(б) повышение активности матриксных металлопротеиназ (ММР) в легких; или
(в) любую комбинацию любого одного или более признаков из (а) или любую комбинацию любого одного или более признаков из (а) и (б).
Применение MCA-MSC для лечения AAD/астмы или их характерного признака может обеспечить одно или более из следующих неограничивающих преимуществ:
существенное, если не полное, обратимое устранение аберрантных уровней TGF-β1, фиброза дыхательных путей/легких и AHR;
• повышенные уровни разрушающих коллаген ММР
• отсутствие влияния на базисную экспрессию измеренных параметров, указывающее на безопасное и эффективное лечение AAD/ астмы.
Решение, предложенное в данном изобретении, было неожиданным, поскольку предыдущие исследования показали, что овальбумин(OVA)-индуцированная стимуляция субэпителиального и общего отложения коллагена может быть полностью обратимой только, когда лечение, основанное на стволовых клетках, вводили в комбинации с антифиброзным лекарственным средством. Следовательно, в настоящем изобретении предлагается значительное улучшение лечения AAD/ астмы.
Краткое описание графических материалов
###
На Фиг. 1 показаны эффекты MCA-MSC на показатель перибронхильного воспаления в соответствии с Примером 4. А) Типичные микрофотографии окрашенных гематоксилином и эозином (Н&Е) срезов легких из каждой из исследуемых групп показывают степень инфильтрации воспалительными клетками бронхиальной стенки внутри и вокруг эпителиального слоя дыхательных путей. Масштабная линейка = 50 мкм. В) Также показана среднее значение ± SEM для оценки воспаления для пяти дыхательных путей/мышь, n=8 мышей/группа, где оценивали срезы по количеству и распределению воспалительных агрегатов по шкале от 0 (никакого наблюдаемого воспаления) до 4 (серьезное воспаление). *Р<0,05, ***Р<0.001 против группы физиологического раствора (SAL); Р<0,001 против группы OVA.
##
###
На Фиг. 2 показаны эффекты MCA-MSC на метаплазию бокаловидых клеток в соответствии с Примером 4. А) Типичные микрофотографии окрашенных альцианом синим Шифф-йодной кислотой (ABPAS) срезов легких каждой из исследуемых групп показал распределение бокаловидных клеток (показано стрелками только у OVA-обработанных мышей) в эпителиальном слое дыхательных путей. Масштабная линейка = 25 мкм. В) Также показано среднее значение ± SEM для количества бокаловидных клеток из пяти дыхательных путей/мышь, n=8 мышей/группа. ***Р<0.001 против группы физиологического раствора (SAL); Р<0,01, Р<0,001 против группы OVA.
2
#
###
На Фиг. 3 показано влияние MCA-MSC на толщину эпителия дыхательных путей и субэпиталиальное отложение коллагена (фиброз) в соответствии с Примером 4. А) Типичные микрофотографии окрашенных трихромом по Массону срезов легких из каждой исследуемой группы показывают величину толщины эпителия дыхательных путей и толщины субэпителиального коллагена (синее окрашивание). Масштабная линейка = 50 мкм. Также показано среднее значение ± SEM для В) эпителиальной толщины (мкм) и С) толщины субэпителиального коллагена (мкм) относительно длины базальной мембраны (ВМ) пяти дыхательных путей/мышь, n=8 мышей/группа. *Р<0.05, **Р<0,01, ***Р<0.001 против группы физиологического раствора (SAL); Р<0.05, Р<0,001 против группы OVA; Р<0,05 против OVA MCA-MSC IV группы.
#
###
На Фиг. 4 показаны эффекты MCA-MSC на общую концентрацию коллагена легких (другое измерение фиброза) в соответствии с Примером 4. Показано среднее значение ± SEM для общей концентрации коллагена легких (%-ное содержание коллагена легких/сухая масса ткани) для каждой исследуемой группы; измерено по второй наибольшей доле легких на мышь, из n=8 мышей/группа. **Р<0,01, ***р<0,001 против группы физиологического раствора (SAL); Р<0,05, Р<0,001 против группы OVA; Р<0,05 против OVA MCA-MSC IV группы.
###
На Фиг. 5 показано влияние MCA-MSC на экспрессию TGF-β1 дыхательных путей (профиброзный цитокин) в соответствии с Примером 4. А) Типичные микрофотографии иммуногистохимически (IHC)-окрашенных срезов легких из каждой исследуемой группы показали степень TGF-β1 окрашивания/экспрессии внутри и вокруг эпителиального слоя дыхательных путей. Масштабная линейка = 50 мкм. В) Также показано относительное среднее значение ± SEM для TGF-β1 окрашивания (выраженное как % / область) для пяти дыхательных путей/мышь, n=7-8 мышей/группа. ***р<0,001 против группы физиологического раствора (SAL); Р<0,001 против группы OVA.
#
###
На Фиг. 6 показаны эффекты MCA-MSC на плотность субэпителиальных миофибробластов (ключевых фиброз-продуцирующих клеток) в соответствии с Примером 4. А) Типичные микрофотографии IHC-окрашенных срезов легких из каждой исследуемой группы показывают величину плотности α-SMA-окрашенных миофибробластов (как показано стрелками) в субэпителиальном слое дыхательных путей. Масштабная линейка = 25 мкм. В) Также показано среднее значение ± SEM для количества миофибробластов (на 100 мкм длины ВМ) для пяти дыхательных путей/мышь, n=7-8 мышей/группа. ***Р<0,001 против группы физиологического раствора (SAL); Р<0.05, Р<0,001 против группы OVA; Р<0,05 против группы OVA MCA-MSC IV.
###
На Фиг. 7 показаны эффекты MCA-MSC на уровень ММР-9 (коллаген-разрушающего фермента) в соответствии с Примером 4. А) Типичная желатиновая зимография (инвертированное изображение) показывает относительные уровни экспрессии ММР-9 легких (желатиназа В; 92 кДа) и ММР-13 (коллагеназа-3; ~55 кДа) в каждой из исследуемых групп. В каждом случае 10 мкг общего белка на образец загружали на зимограф для анализа; и отдельные зимографии, анализирующие пять-шесть дополнительных образцов на группу дали аналогичные результаты. В) Также показано относительное среднее значение ± SEM для оптической плотности (OD) ММР-9 (которая представляет собой наиболее сильно экспрессируемую желатиназу в легких самок мышей Balb/c) из n=7-8 мышей/группа. *Р<0,05, **Р<0,01, ***Р<0,001 против группы физиологического раствора (SAL); Р<0,001 против группы OVA; Р<0,05 против группы OVA MCA-MSC IV.
#
###
На Фиг. 8 показаны эффекты MCA-MSC на AHR в соответствии с Примером 4. Сопротивление дыхательных путей (отражающее изменение в AHR) оценивали с помощью инвазивной плетизмографии в ответ на увеличение доз распыленного метахолина (бронхоконстриктора; и выражали как изменение Сопротивления относительно исходного уровня). Показано среднее ± SEM для сопротивления дыхательных путей к каждой испытанной дозе метахолина, из n=7-8 мышей/группа. *Р<0,05, ***р<0,001 против группы физиологического раствора (SAL); Р<0,01, Р<0,001 против группы OVA; Р<0,01 против группы OVA MCA-MSC IV.
На Фиг. 9 представлена схематическая временная шкала для модели хронического аллергического заболевания дыхательных путей из Примеров 5 и 6. Лечение проводят с 64-78 суток (когда патология легких установлена и продолжается).
#
###
На Фиг. 10 показаны эффекты MCA-MSC, дополненных дексаметазоном (DEX), на AHR в соответствии с Примером 5. Сопротивление дыхательных путей (отражающее изменения в AHR) оценивали с помощью инвазивной плетизмографии в ответ на увеличение доз распыленного метахолина (бронхоконстриктора; и выражали, как изменение сопротивления относительно исходного уровня) в соответствии с Примером 4. Показано среднее ± SEM для сопротивления дыхательных путей к каждой испытанной дозе метахолина; из n=6-8 мышей/группа. *Р<0,05, ***Р<0,001 против группы физиологического раствора (SAL); Р<0,05, Р<0,001 против группы OVA; Р<0,01 против группы OVA+DEX.
##
На Фиг. 11 показаны эффекты на AHR MCA-MSC, вводимые интраназально (IN), по сравнению с внутривенным (IV) и внутритрахеальным (ЕТ) введением в соответствии с Примером 6. Сопротивление дыхательных путей (отражающее изменения в AHR) оценивали с помощью инвазивной плетизмографии в ответ на увеличение доз распыленного метахолина (бронхоконстриктора; и выражали как изменение сопротивления относительно исходного уровня) в соответствии с Примером 4. Показано среднее ± SEM для сопротивления дыхательных путей к каждой испытанной дозе метахолина; из n=6-8 мышей/группа. **р<0,01, ***р<0,001 против группы, обработанной физиологическим раствором; р<0,01 против группы OVA.
Подробное описание изобретения
Структурные изменения, известные как ремоделирование дыхательных путей (AWR), характеризуют хроническую/тяжелую астму и вносят вклад в дисфункцию легких. В целом, астму сдерживают кортикостероидами и/или β-агонистами.
Настоящее изобретение относится к лечению астмы у субъекта с использованием MCA-MSC, что является улучшением по сравнению с лечением астмы кортикостероидами и/или β-агонистами и является улучшением по сравнению с предлагаемым лечением MSC в комбинации с другими агентами.
Примеры 1 и 2 демонстрируют дифференцировку человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) в клетки-предшественники, известные как мезенхимоангиобласты (МСА), класс ранних клональных мезоэндодермальных клеток-предшественников, и затем в мезенхимальные стволовые клетки (MCA-MSC). Поскольку iPSC могут пролиферировать бесконечно, и сами МСА могут размножаться в чрезвычайно большое количество MSC, достаточное количество MCA-MSC может быть получено из единичной клетки iPSC главного банка (Master Cell Bank of IPSC) - полученной от одного здорового донора крови, таким образом, ограничивая зависимую от донора и размножения вариабельность и загрязнение нецелевыми клетками, без необходимости чрезмерного размножения культуры после образования MSC.
MCA-MSC по настоящему изобретению обеспечивают преимущества по существу неограниченного источника и дополнительное преимущество улучшенных иммуномодулирующих эффектов по сравнению с MSC из уровня техники.
В данном описании изобретения, в частности в примерах 4 и 5, исследовали терапевтический потенциал этих MCA-MSC при доставке в хорошо известной мышиной модели хронического AAD. Эта мышиная модель AAD представляет три основные признака астмы человека, то есть AI, AWR и AHR, и принята в данной области техники как доклиническая модель астмы. В частности, сравнивали анти-ремодулирующие эффекты внутривенно (IV) введенных MCA-MSC по сравнению с интраназально введенными (IN) MCA-MSC.
Важно отметить, что, хотя некоторые MSC могли продемонстрировать некоторую эффективность в лечении астмы или ее симптомов, такие эффекты были получены только в случае применения этих MSC в комбинации с другими терапевтическими агентами. Настоящее изобретение обеспечивает преимущество в том, оно позволяет избежать необходимости в комбинированной терапии.
Астма
Астма и/или AAD может характеризоваться одним или более из следующих признаков в любой комбинации: AI, AWR, AHR, фиброз дыхательных путей/фиброз легких, метаплазия бокаловидых клеток, утолщение эпителия, повышенные уровни трансформирующего фактора роста (TGF)-β1 дыхательных путей, отсутствие или низкие уровни ММР-9 в легких, повышенная плотность субэпителиальных миофибробластов, накопление субэпителиального коллагена и накопление общего коллагена легких.
Соответственно, лечение астмы и/или AAD с помощью MCA-MSC по настоящему изобретению может характеризоваться лечением любого одного или более из следующих признаков в любой комбинации: уменьшение AI, уменьшение AWR, уменьшение фиброза дыхательных путей/фиброза легких, уменьшение метаплазии бокаловидых клеток, уменьшение утолщения эпителия, уменьшение уровней трансформирующего фактора роста (TGF)-β1 дыхательных путей, уменьшение субэпителиальных миофибробластов и коллагена, а также уменьшение концентрации общего коллагена легких.
Лечение AAD/астмы с помощью MCA-MSC по изобретению может увеличивать экспрессию/активность ММР, например желатиназы и/или коллагеназы. В одном воплощении ММР представляет собой ММР-9. В другом воплощении ММР представляет собой ММР13. В другом воплощении ММР представляет собой ММР1, ММР2, ММР3, ММР7, ММР8 или ММР 12.
Мезенхимоангиобластные мезенхимальные стволовые клетки (MCA-MSC) Соответственно, в изобретении предлагается улучшенная терапия AAD/астмы или одного или более их характерных признаков путем введения MCA-MSC. MCA-MSC оказывают свое воздействие посредством своих иммуномодулирующих свойств и способны действовать непосредственно на месте, продуцирующем характерный признак AAD/астмы.
MCA-MSC секретируют биоактивные молекулы, такие как цитокины, хемокины и факторы роста, и обладают способностью модулировать иммунную систему. Было показано, что MCA-MSC способствуют регенерации и влиянию на иммунную систему, не основываясь на приживлении. Другими словами, сами MCA-MSC необязательно становятся внедренными в субъекта-хозяина - скорее, они оказывают свое действие и затем ликвидируются в течение короткого периода времени. Однако MCA-MSC могут быть приживлены.
При использовании здесь, "мезенхимальная стволовая клетка" или "MSC" относится к определенному типу стволовой клетки, которые могут быть выделены из широкого спектра тканей, включая костный мозг, жировую ткань (жир), плаценту и пуповинную кровь. Альтернативно, MSC могут быть получены из плюрипотентных стволовых клеток (PSC). MSC также известны как "мезенхимальные стромальные клетки".
При использовании здесь, "MCA-MCS" относятся к конкретному типу MSC, полученных из iPSC через мезенхимоангиобластный фенотип. Получение MCA-MSC из PSC описано в международной патентной заявке PCT/AU2017/050228, поданной 14 марта 2017 года, которая включена во всей полноте путем перекрестной ссылки, и описано в Примерах 1 и 2. MCA-MSC отличаются от MSC из уровня техники, например, как показано в Примере 3.
Было показано, что MSC проявляют иммуномодулирующие активности против Т-клеток, В-клеток, дендритных клеток, макрофагов и естественных клеток-киллеров. Не желая быть ограниченным теорией, лежащие в основе механизмы могут включать иммуномодулирующие медиаторы, например оксид азота, индоламин-2,3-диоксигеназу, простагландин Е2, белок гена 6, индуцибельного фактором некроза опухоли, CCL-2, и лиганд 1 программированной смерти. Эти медиаторы экспрессируются на низком уровне до стимуляции, например, воспалительными цитокинами, такими как IFNγ, TNFα и IL-17.
При использовании здесь, термин "плюрипотентные стволовые клетки" или "PSC" относится к клеткам, которые обладают способностью репродуцироваться бесконечно и дифференцироваться в любой другой тип клеток. Имеется два основных типа PSC: эмбриональные стволовые клетки (ESC); и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC).
Используемый здесь термин "эмбриональная стволовая клетка" или "ESC" относится к клетке, выделенной из эмбриона в возрасте от пяти до семи суток, пожертвованного с согласия субъектов, которые завершили терапию in vitro для оплодотворения и имеют избыточные эмбрионы. Применению ESC в некоторой степени препятствуют этические опасения по поводу выделения клеток из человеческих эмбрионов.
Подходящие человеческие PSC включают человеческие эмбриональные стволовые клетки H1 и Н9.
Используемый здесь термин "индуцированная плюрипотентная стволовая клетка" или "iPSC" относится к ESC-подобной клетке, происходящей из взрослых клеток. iPSC имеют очень похожие характеристики с ESC, но лишены этических проблем, связанных с ESC, так как iPSC не происходят из эмбрионов. Напротив, iPSC обычно получают из полностью дифференцированных взрослых клеток, которые "перепрограммированы" назад в плюрипотентное состояние.
Подходящие человеческие iPSC включают, без ограничения ими, iPSC 19-9-7Т, MIRJT6i-mND1-4 и MIRJT7i-mND2-0, происходящие из фибробластов, и iPSC ВМ 119-9, происходящие из мононуклеарных клеток костного мозга. Другие подходящие iPSC могут быть получены из Cellular Dynamics International (CDI) Мадисона, Висконсина, США.
EMH
-
+
+
+
EMH
-
+
+
+
В одном воплощении MCA-MSC, используемые в соответствии с изобретением, образуются из первичных мезодермальных клеток. Первичные мезодермальные клетки могут обладать мезенхимоангиобластным (МСА) потенциалом. Первичные мезодермальные клетки могут иметь фенотип linKDRAPLNRPDGFRalpha. В одном воплощении MCA-MSC по изобретению образуются из первичных мезодермальных клеток linKDRAPLNRPDGFRalpha с МСА потенциалом.
EMH
-
+
+
+
При использовании здесь термин "первичные мезодермальные клетки linKDRAPLNRPDGFRalpha с МСА потенциалом" относятся к клеткам, экспрессирующим типичную первичную полоску и гены боковой платины/внезародышевой мезодермы. Эти клетки могут образовывать колонии МСА и гемангиобластов в бессывороточной среде в ответ на фактор роста фибробластов 2 (FGF2). При культивировании в соответствии с Примером 2 эти клетки становятся MCA-MSC.
EMH
-
Термин lin обозначает отсутствие экспрессии CD31, VE-кадгерин-эндотелиальных маркеров, CD73 и CD 105 мезенхимальных/эндотелиальных маркеров, а также CD43 и CD45 гематопоэтических маркеров.
+
+
+
+
+
+
-
В одном воплощении MCA-MSC, используемые по изобретению, демонстрируют фенотип CD73CD105CD90CD146CD44CD10CD31CD45.
В одном воплощении, MCA-MSC, используемые по изобретению, экспрессируют каждый из микроРНК miR-145-5p, miR-181b-5p и miR-214-3р, но не miR-127-3р и miR-299-5р.
+
В дополнение к их эффектам в лечении ААД/астмы, продемонстрированным здесь, MCA-MSC обладают "иммуномодулирующими активностями", которая можно оценить in vitro как способность MCA-MSC подавлять пролиферацию Т-хелперных (CD4) лимфоцитов. Иммуномодулирующие активности можно количественно определить in vitro относительно эталона, например, как определяют с использованием анализа иммуногенной потенции.
+
+
В подходящем анализе иммунногенной потенции используют облученные тестируемые MCA-MSC, полученные посредством метода, описанного здесь, и облученные клетки MSC контрольного образца, которые помещают в планшет отдельно с различными концентрациями с лейкоцитами, очищенными из периферической крови здорового донора и меченными сукцинимидиловым сложным эфиром карбоксифлуоресцеина. Т-хелперные (CD4) лимфоциты, представляющие собой подмножество эталонного образца, стимулировали добавлением CD3- и CD28-антител. Количество CD4-меченных Т-клеток подсчитывают с использованием проточной цитометрии для оценки пролиферации Т-клеток. Значения IC50 регистрируют как функцию эталонного образца. Более высокое значение IC50 указывает на более высокую величину подавления пролиферации Т-хелперных (CD4) лимфоцитов и, таким образом, указывает на превосходные Т-клеточные иммуномодулирующие свойства. Образцы MSC облучают перед использованием в этом анализе для ликвидации сдерживающего фактора их пролиферативного потенциала.
Лечение AAD/астмы с помощью MCA-MSC
Специалисту в данной области должно быть понятно, что точный способ введения субъекту терапевтически эффективного количества MCA-MSC для лечения AAD/астмы осуществляется по усмотрению практикующего врача. На способ введения, включая дозу, комбинацию с другими агентами, время и частоту введения, и т.п., могут влиять состояние и история болезни пациента.
Хотя преимуществом изобретения является то, что MCA-MSC могут быть использованы сами по себе для лечения AAD/астмы или ее характерного признака, следует понимать, что MCA-MSC можно комбинировать с другой терапией астмы. Например, практикующий врач может лечить страдающего астмой пациента посредством другой терапии астмы, когда астматический пациент применяет существующую схему лечения астмы, включающую терапию кортикостероидом или β-агонистом, а затем применяют лечение с использованием MCA-MSC.
MCA-MSC можно вводить в виде терапевтической композиции. Используемый здесь термин "терапевтическая композиция" относится к композиции, содержащей MCA-MSC или популяцию MCA-MSC, как описано здесь, которые были приготовлены в виде препарата для введения субъекту. Предпочтительно терапевтическая композиция является стерильной. В одном воплощении терапевтическая композиция является апирогенной.
В одном воплощении MCA-MSC или терапевтическая композиция представлена в контейнере, предпочтительно в стерильном контейнере, предпочтительно в апирогенном контейнере. В одном воплощении контейнер представляет собой шприц, например, подходящий для болюсного введения. В другом воплощении контейнер представляет собой инфузионный пакет, пригодный для инфузии. В другом воплощении контейнер приспособлен для интраназального (IN) введения.
MCA-MSC будут приготовлены в виде препарата, дозированы и введены в соответствии с надлежащей медицинской практикой. Факторы, учитываемые в данном контексте, включают конкретный тип заболевания, подлежащего лечению, и ожидаемые побочные эффекты или симптомы, конкретного субъекта, подлежащего лечению, клиническое состояние этого субъекта, место введения, способ введения, схема введения и другие факторы, известные врачам-практикам. Терапевтически эффективное количество вводимых MCA-MSC регулируется этими соображениями.
3
2
11
2
6
2
8
2
3
2
3
2
4
2
4
2
5
2
5
2
6
2
6
2
7
2
7
2
8
2
8
2
9
2
9
2
10
2
10
2
11
2
Дозы MCA-MSC могут варьироваться от примерно 10 клетки/м до примерно 10 клеток/м, например от примерно 10 клеток/м до примерно 2×10 клеток/м, или примерно 10 клеток/м, примерно 5×10 клеток/м, примерно 10 клеток/м, примерно 5×10 клеток/м, примерно 10 клеток/м, примерно 5×10 клеток/м, примерно 10 клеток/м, примерно 5×10 клеток/м, примерно 10 клеток/м, примерно 5×10 клеток/м, примерно 10 клеток/м, примерно 5×10 клеток/м, примерно 10 клеток/м, примерно 5×10 клеток/м, примерно 10 клеток/м, примерно 5×10 клеток/м или примерно 10 клеток/м.
3
11
6
8
3
3
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
10
11
Дозы MCA-MSC могут варьироваться от примерно 10 клеток/кг до примерно 10 клеток/кг, например от примерно 10 клеток/кг до примерно 2×10 клеток/кг, или примерно 10 клеток/кг, примерно 5×10 клеток/кг, примерно 10 клеток/кг, примерно 5×10 клеток/кг, примерно 10 клеток/кг, примерно 5×10 клеток/кг, примерно 10 клеток/кг, примерно 5×10 клеток/кг, примерно 10 клеток/кг, примерно 5×10 клеток/кг, примерно 10 клеток/кг, примерно 5×10 клеток/кг, примерно 10 клеток/кг, примерно 5×10 клеток/кг, примерно 10 клеток/кг, примерно 5×10 клеток/кг или примерно 10клеток/кг.
3
11
6
8
3
3
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
10
11
Дозы MCA-MSC могут варьироваться от примерно 10 клеток до примерно 10 клеток, например от примерно 10 клеток до примерно 2×10 клеток, или примерно 10 клеток, примерно 5×10 клеток, примерно 10 клеток, примерно 5×10 клеток, примерно 10 клеток, примерно 5×10 клеток, примерно 10 клеток, примерно 5×10 клеток, примерно 10 клеток, примерно 5×10 клеток, примерно 10 клеток, примерно 5×10 клеток, примерно 10 клеток, примерно 5×10 клеток, примерно 10 клеток, примерно 5×10 клеток или примерно 10 клеток.
Термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству MCA-MSC, эффективному для лечения субъекта.
MCA-MSC можно вводить в виде единичной дозы, дробной дозы или нескольких доз. Например, дробную дозу может вводить в обе ноздри субъекта, например приблизительно половина дозы на ноздрю.
Субъекту можно вводить 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 доз MCA-MSC.
Субъекту можно вводить две или более дозы MCA-MSC через 1 неделю, 2 недели, 1 месяц или 2 месяца. Субъекту можно вводить две или более доз ежеквартально, два раза в год, ежегодно, раз в два года или с большим интервалом, например, если AAD/астма или их характерный признак повторяется у субъекта, уже обработанного MCA-MSC в момент повторения или после него.
MCA-MSC можно вводить системно или периферически любым подходящим путем, например путями, включающими внутривенное (IV), интраназальное (IN), интратрахеальное, внутрилегочное и внутриартериальное введение. В одном воплощении MCA-MSC вводят посредством IV, IN, интратрахеального или внутрибрюшинного пути. В одном воплощении MCA-MSC вводят IN.
В одном воплощении MCA-MSC предварительно обрабатывают перед введением. Предварительная обработка может быть проведена с использованием фактора роста или путем редактирования гена, например, когда фактор роста может примировать MCA-MSC, а редактирование гена может придать новое терапевтическое свойство MCA-MSC.
MCA-MSC могут быть введены субъекту до, во время или после развития AAD/астмы или их характерного признака у субъекта.
Как таковые, термины "лечить", "лечащий" или "лечение" относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактике или предупредительным мерам, где целью является предупреждение, уменьшение или облегчение AAD/астмы или их характерного признака у субъекта, или замедление (уменьшение) развития AAD/астмы или их характерного признака у субъекта. Субъекты, нуждающиеся в лечении, включают тех, которые уже имеют AAD/астму или их характерный признак, а также тех, у кого AAD/астма или их характерный признак следует предупредить или облегчить.
Термины "предупреждение", "предотвращение", "превентивный" или "профилактический" относятся к предотвращению возникновения AAD/астмы или их характерного признака, или к задерживанию или защите от возникновения AAD/астмы или их характерного признака. Субъект, нуждающийся в предупреждении ААД/астмы или их характерного признака, может быть склонен к развитию ААД/астмы или их характерного признака, например, из-за семейного анамнеза.
Термин "устранять" или "устранение" относится к уменьшению, снижению или ликвидации AAD/ астмы или их характерного признака.
Лечение AAD/астмы или их характерного признака путем введения MCA-MSC может привести к примерно 1% уменьшению, примерно 2% уменьшению, примерно 3% уменьшению, примерно 4% уменьшению, примерно 5% уменьшению, примерно 6% уменьшению, примерно 7% уменьшению, примерно 8% уменьшению, примерно 9% уменьшению, примерно 10% уменьшению, примерно 15% уменьшению, примерно 20% уменьшению, примерно 25% уменьшению, примерно 30% уменьшению, примерно 35% уменьшению, примерно 40% уменьшению, примерно 45% уменьшению, примерно 50% уменьшению, примерно 55% уменьшению, примерно 60% уменьшению, примерно 65% уменьшению, примерно 70% уменьшению, примерно 75% уменьшению, примерно 80% уменьшению, примерно 85% уменьшению, примерно 90% уменьшению, примерно 95% уменьшению, примерно 99% уменьшению или примерно 100%-ному уменьшению AAD/астмы или их характерного признака.
В одном воплощении лечение AAD/астмы или их характерного признака посредством введения MCA-MSC может уменьшить AAD/астму или их характерный признак до величины, эквивалентной этой величине у субъекта, не имеющего AAD/астмы или их характерного признака.
Специалист в данной области легко поймет, как оценить и количественно определить AAD/астму или их характерный признак, и сможет сделать это без трудностей или излишней нагрузки, например, используя способы, изложенные в настоящих примерах. Например, можно количественно определить следующее: 1) показатель воспаления, как меру AI; 2) метаплазию бокаловидых клеток, как меру AI-индуцированной AWR; 3) толщину эпителия, как меру AWR; 4) субэпителиальную толщину коллагена, как меру AWR/фиброза; 5) концентрацию общего коллагена легких, как меру AWR/фиброза; 6) эпителиальное окрашивание TGF-β1, как меру AWR; 7) плотность субэпителиальных миофибробластов, как меру AWR; 8) желатиназу (например ММР-2 и/или ММР-9) и/или экспрессию/активность коллагеназы (например ММР-1 и/или ММР-13), как меру AWR; и/или 9) гиперреактивность дыхательных путей/реактивность, как меру функции легких и AHR.
Любое количественное определение AAD/астмы или их характерного признака можно сравнить с контролем, например здоровым контрольным субъектом или здоровой популяцией контрольных субъектов, которые не имеют AAD/астмы или их характерного признака. Альтернативно, контролем может быть контрольный субъект или популяция контрольных субъектов, которые имели AAD/астму или их характерный признак и подвергались лечению с помощью MCA-MSC и реагировали на них.
При использовании здесь термин "субъект" может относиться к млекопитающему. Млекопитающее может быть приматом, в частности человеком, или может быть домашним животным, животным из зоопарка или животным-компаньоном. Хотя, в частности, предполагается, что способ, описанный здесь, пригоден для медицинского лечения людей, он также применим для ветеринарного лечения, включая лечение домашних животных, таких как лошади, крупный рогатый скот и овцы, животных-компаньонов, таких как собаки и кошки, или животных, содержащихся в зоопарке, таких как кошачьи, волчьи, бовидные и копытные.
Если не определено иное в данном описании, используемые здесь технические и научные термины имеют то же значение, которое обычно подразумевается специалистам в области техники, к которой относится настоящее изобретение, и в ссылках на опубликованные тексты.
Следует отметить, что "а" или "an" относится к одному или более, например следует понимать, что "MCA-MSC" представляет одну или более MCA-MSC. Таким образом, "а" или "an", "один или более" и "по меньшей мере один" могут быть использованы взаимозаменяемо в данном описании изобретения.
В следующей ниже формуле изобретения и в описании изобретения, за исключением случаев, когда контекст требует иного из-за языка выражения или необходимо подразумеваемого смысла, слово "содержать" или его варианты, такие как "содержит" или "содержащий" используются в широком смысле, то есть для указания на присутствие указанных признаков, но не исключения наличия или добавления дополнительных признаков в различных воплощениях изобретения.
Используемый здесь термин "примерно" означает диапазон значений для заданного числа, составляющий ±25% величины этого числа. В других воплощениях термин "примерно" означает диапазон значений для данного числа, составляющий ±20%, ±15%, ±10% или ±5% величины этого числа. Например, в одном воплощении, "примерно 3 грамма" означает значение от 2,7 граммов до 3,3 граммов (то есть 3 грамма ±10%) и тому подобное.
Аналогично, время или продолжительность событий может варьироваться по меньшей мере на 25%. Например, в то время как конкретное событие может быть раскрыто в одном воплощении, как длящееся одни сутки, это событие может длиться более или менее одних суток. Например, "одни сутки" могут включать период от примерно 18 часов до примерно 30 часов. В других воплощениях периоды времени могут отличаться на ±20%, ±15%, ±10% или ±5% от этого периода времени.
Следующие примеры помогают описать данное изобретения, которое не следует ограничивать такими примерами.
Примеры
Пример 1. Реагенты для получения MCA-MSC

Реагенты, перечисленные в таблице 1, известны специалисту в данной области и имеют обычные составы, например IMDM и F12 Хэма. GLUTAMAX содержит дипептид L-аланил-L-глутамин, обычно поставляемый в концентрации 200 мМ в 0,85% NaCl. GLUTAMAX высвобождает L-глутамин при расщеплении дипептидной связи культивируемыми клетками. Липидный концентрат определенного химического состава содержит 2 мг/л арахидоновой кислоты, 220 мг/л холестерина, 70 мг/л DL-альфа-токоферола ацетата, 10 мг/л линолевой кислоты, 10 мг/л линоленовой кислоты, 10 мг/л миристиновой кислоты, 10 мг/л олеиновой кислоты, 10 мг/л пальмитиновой кислоты, 10 мг/л пальмитолеиновой кислоты, 90 г/л плюроника F-68, 10 мг/л стеариновой кислоты, 2,2 г/л TWEEN 80 и этиловый спирт. Н-1152 и Y27632 представляют собой высокоактивные, проникающие в клетки, селективные ингибиторы ROCK (Rho-ассоциированная образующая спиральные спирали серин/треонин-протеинкиназа).
Пример 2. Дифференцировка человеческих iPSC в MCA-MSC
2
2
2
1. Размораживали iPSC в полной среде Е8 (основная среда DMEM/F12 + добавка Е8) + 1 мкМ H1152 на покрытом витронектином (0.5 μg/cm) пластмассовой посуде. Посеянные клетки iPSC инкубировали при 37°С, 5% CO, 20% O (нормальное содержание кислорода).
2
2
2
2. Размножали три пассажа iPSC в полной среде Е8 (без ингибитора ROCK) на покрытой витронектином (0.5 μg/cm) пластмассовой посуде и инкубировали при 37°С, 5% СО, 20% O (нормальное содержание кислорода) перед инициированием процесса дифференцировки.
3
2
2
2
2
3. Собирали и сеяли iPSC в виде одиночных клеток/небольших колоний в количестве 5×10 клеток/см на покрытую коллагеном IV (0,5 мкг/см) пластмассовую посуду в полной среде Е8 + 10 мкМ Y27632 и инкубировали при 37°С, 5% СО, 20% О (нормальное содержание кислорода) в течение 24 ч.
2
2
4. Заменяли полную среду Е8 + 10 мкМ Y27632 на среду для дифференцировки и инкубировали при 37°С, 5% СО, 5% О (гипоксические условия) в течение 48 ч с получением первичных мезодермальных клеток.
2
2
5. Собирали колониеобразующие первичные мезодермальные клетки из адгезивной культуры в среде для дифференцировки в виде суспензии одиночных клеток, переносили к суспензионной культуре M-CFM и инкубировали при 37°С, 5% СО, 20% О (нормальное содержание кислорода) в течение 12 суток, до образования мезенхимальных колоний.
2
2
2
2
6. Собирали и сеяли мезенхимальные колонии на покрытую фибронектином/коллагеном I (0,67 мкг/см фибронектина, 1,2 мкг/см коллагена I) пластмассовую посуду в M-SFEM и инкубировали при 37°С, 5% СО, 20% О (нормальное содержание кислорода) в течение 3 суток с получением MSC (Пассаж 0).
4
2
2
2
7. Собирали колонии и сеяли в виде одиночных клеток (Пассаж 1) в количестве 1,3×10 клеток/см на покрытую фибронектином/коллагеном 1 пластмассовую посуду в M-SFEM и инкубировали при 37°С, 5% CO, 20% O (нормальное содержание кислорода) в течение 3 суток.
4
2
2
2
8. Собирали и сеяли в виде одиночных клеток (Пассаж 2) в количестве 1,3×10 клеток/см на покрытую фибронектином/коллагеном 1 пластмассовую посуду в M-SFEM и инкубировали при 37°С, 5% СО, 20% О (нормальное содержание кислорода) в течение 3 суток.
4
2
2
2
9. Собирали и сеяли в виде одиночных клеток (Пассаж 3) в количестве 1,3×10 клеток/см на покрытую фибронектином/коллагеном 1 пластмассовую посуду в M-SFEM и инкубировали при 37°С, 5% СО, 20% О (нормальное содержание кислорода) в течение 3 суток.
4
2
2
2
10. Собирали и сеяли в виде одиночных клеток (Пассаж 4) в количестве 1,3×10клеток/см на покрытую фибронектином/коллагеном 1 пластмассовую посуду в M-SFEM и инкубировали при 37°С, 5% СО, 20% О (нормальное содержание кислорода) в течение 3 суток.
4
2
2
2
11. Собирали и сеяли в виде одиночных клеток (Пассаж 5) в количестве 1,3×10клеток/см на покрытую фибронектином/коллагеном 1 пластмассовую посуду в M-SFEM и инкубировали при 37°С, 5% СО, 20% О (нормальное содержание кислорода) в течение 3 суток.
12. Собирали в виде одиночных клеток и замораживали конечный продукт.
Было проведено два эксперимента (ТС-А-96 и DAD-V-90) для исследования влияния добавления PDGF-BB (10 нг/мл) и/или LiCl (1 мМ) к M-CFM на Т-клеточную супрессию MCA-MSC, происходящих из iPSC. Т-клеточную супрессию оценивали с использованием анализа иммуногенной потенции Waisman Biomanufacturing's ImmunoPotency Assay (IPA).
3
2
4
2
3
2
Как указано в Таблице 7, оценивали следующие комбинации тромбоцитарного фактора роста (PDGF) и LiCl: PDGF+/LiCl+, PDGF-/LiCl-, PDGF+/LiCl- и PDGF-/LiCl+. Следует отметить, что в эксперименте ТС-А-96 сравнивали две разные плотности посева Dnegl (5×10 клеток/см и 1×10 клеток/см) и две разные концентрации активина А (АА) в среде для дифференцировки (1X АА = 15 нг/мл и 0,1Х АА = 1,5 нг/мл). Одну плотность посева Dnegl (5×10е клеток/см) и концентрацию активина А (1,5 нг/мл) использовали в эксперименте DAD-V-90. Также следует обратить внимание, что один leukopak (LPK7) использовали в первом IP A (IPA 1) и два leukopaks (LPK7 и LPK8) использовали во втором IP A (IPA 2).
Этот анализ предназначен для оценки степени, до которой каждая линия MSC может подавлять пролиферацию Т-хелперных (CD4+) лимфоцитов. Криоконсервированные MSC тестировали с использованием криоконсервированных лейкоцитов, очищенных из периферической крови здоровых лиц (клетки мононуклеоцитов периферической крови (РВМС), полученные из Leucopaks (LPK)). Таким образом, ожидается вариация клеточной популяции LPK от донора к донору. Каждый исследуемый образец MCA-MSC тестировали против РМВС от двух разных субъектов для оценки материала клинической категории с возможностью ограничить тестирование одним образцом РМВС для материала исследовательской категории. Анализ для каждого тестируемого образца MCA-MSC проводили совместно с эталонной стандартной линией MSC, чтобы обеспечить целостность/воспроизводимость анализа и нормализовать тестируемые образцы. Анализ описан в Bloom et al. Cytotherapy, 2015, 17(2): 140-51.
5
5
4
4
5
В кратком изложении, тестируемые MCA-MSC подвергали воздействию 21 Гр гамма-облучения. В 48-луночный планшет для культивирования тканей в отдельные лунки высевали 4×10е, 2×10е, 4×10е и 2×10е облученных MCA-MSC. РМВС отдельно метили карбоксифлуоресцеин-сукцинимидиловым эфиром. Меченые клетки РМВС помещали в планшет по 4×10 клеток на лунку, содержащую указанные выше MCA-MSC. Это приводило к титруемым соотношениям PBMC:MCA-MSC 1:1, 1:0,5, 1:0,1 и 1:0,05. В дополнительную лунку помещали только стимулированные РВМС, в другую - только MCA-MSC и еще в одну - клетки в соотношении 1:0,05 без стимуляции; все эти лунки служили в качестве контролей. Затем в каждую лунку добавляли моноклональные антитела, стимулирующие Т-клетки, анти-человеческий CD3-эпсилон и античеловеческий CD28 (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN).
На четвертый день культивирования клетки собирали из отдельных лунок. Клетки из каждой лунки инкубировали с аллофикоцианин-меченными анти-человеческий CD4. Затем в клетках CD4+ определяли пролиферацию по интенсивности карбоксифлуоресцеина с использованием проточного цитометра. Контрольные лунки только с MCA-MSC служили для выделения MCA-MSC из лунок для совместного культивирования. Контрольные лунки только с РВМС служили в качестве положительного контроля для максимальной пролиферации Т-клеток, относительно которой определяли степень супрессии, опосредованной клетками MCA-MSC. Лунку с нестимулированными клетками в соотношении 1:0,05 использовали для создания отрицательного контрольного окна против которого измеряли пролиферацию.
Из соотношений тестируемых образцов использовали кривую наилучшего соответствия для получения значений IC50. Значения IC50 нормализовали по эталонному стандарту (IC50 эталонного стандарта/IC50 тестируемого образца). Это нормализованное значение IC50 имело большие значения для более активных (более супрессивных) образцов и меньшие значения для менее активных образцов.
Результаты
Данные по IC50, представленные в Таблице 7, показывают, что M-CFM с добавлением LiCl, но не содержащая PDGF (то есть PDGF-/LiCl+), была оптимальной для дифференцировки iPSC с получением iPSC-MSC, которые являются иммуномодулирующими. Кроме того, низкая концентрация активина А также улучшает иммуносупрессию MCA-MSC, происходящих из iPSC.
+
+
+
+
+
+
-
-
MCA-MSC, продуцируемые в соответствии с этим Примером, демонстрируют фенотип CD73CD105CD90CD146CD44CD10CD31CD45.
Пример 3. Анализ микро-РНК MCA-MSC
MCA-MSC, полученные в соответствии с Примером 2, подвергали анализу против микроматрицы микроРНК (miRNA), содержащей 1194 miRNA и панель miRNA собственной разработки, состоящую из miR-127-3р, miR-145-5p, miR-181b-5p, miR-214-3р, miR-299-5p, проверенную против 71 образцов MSC и 94 образцов не-MSC.
MCA-MSC, полученные в соответствии с Примером 2, экспрессировали каждый из miR-145-5p, miR-181b-5p и miR-214-3р, но не miR-127-3р и miR-299-5p.
Анализ главных компонент 233 miRNA микроматрицы, достоверно обнаруживаемых в нормализованных данных (присутствует по меньшей мере в одном проанализированном образце), полученных для всех протестированных образцов, показал, что MCA-MSC, полученные в соответствии с Примером 2, отличаются от каждого из остальных 71 образцов MSC.
Пример 4. Лечение AAD/астмы in vivo
Методы и материалы
Животные
Мышей Balb/c в возрасте шести-восьми недель получали от Monash Animal Services (Monash University, Clayton, Victoria, Австралия) и размещали в контролируемой среде, с циклом освещения 12 часов свет/12 часов темнота, со свободным доступом к воде и лабораторному корму (Barastock Stockfeeds, Pakenham, Victoria, Австралия). Всем мышам был обеспечен период акклиматизации 4-5 суток до проведения каких-либо экспериментов, и все выполненные процедуры были одобрены Комитетом по этике в отношении животных университета Монаша (Номер этических норм: MARP/2016/078), которые соответствуют Австралийскому руководству по уходу за лабораторными животными и их использования в научных целях. Индукция хронического AAD
Для оценки эффектов MSC на хроническое AAD, у мышей (n=24) была создана модель хронического AAD, индуцированного овальбумином (OVA). Мышей сенсибилизировали двумя внутрибрюшинными (IP) инъекциями 10 мкг OVA куриного яйца класса V (Sigma-Aldrich, МО, USA) и 400 мкг алюминиевокалиевых квасцов в качестве адъюванта (alum; AJAX Chemicals, NSW, Австралия) в сутки 0 и 14. Затем их подвергали ингаляционному воздействию на все тело (распыление) аэрозольного OVA (2,5% масс/об. в 0,9% физиологическом растворе) в течение тридцати минут, три раза в неделю, в промежутке между 21 и 63 сутками, используя ультразвуковой распылитель (Omron NE-U07; Omron, Kyoto, Япония). Однако контрольным мышам (n=24) вместо OVA делали IP инъекции 500 мкл 0,9% физиологического раствора и распыляли 0,9% физиологический раствор.
Лечение с помощью MCA-MSC
Через 24 часа после установления хронического AAD (на 64 сутки) подгруппы мышей, подвергшихся воздействию/сенсибилизированных OVA или физиологическим раствором (n=8 мышей/группа), подвергали IV или IN введению MCA-MSC. Во всех случаях был выбран четырнадцатидневный период лечения (с суток 64-77), чтобы скопировать временной интервал, используемый для оценки эффектов других FN-доставляемых стволовых клеток, таких как полученные из костного мозга человека (стромальные) MSC и эпителиальные клетки амниона человека в OVA-индуцированной хронической модели AAD.
7
6
7
6
MCA-MSC получали в соответствии с Примерами 1 и 2. Определяющей характеристикой MSC является экспрессия CD73, CD90 и CD105, и клетки MCA-MSC были >99% положительными в отношении всех трех этих маркеров, но отрицательными в отношении CD43/45 и CD31, что подтверждает отсутствие клеток гематопоэтических и эндотелиальных линий. Все виды лечения проводили один раз в неделю в течение периода лечения (в сутки 64 и 71). Утром каждой плановой обработки замороженные MCA-MSC оттаивали на водяной бане 37°С, затем ресуспендировали следующим образом: для IV введения MCA-MSC l×10 клеток ресуспендировали в 2 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). Мышей фиксировали в фиксаторе Perspex и 1×10 клеток/200 мкл PBS инъецировали в хвостовую вену мышеи, подвергнутых воздействию/сенсибилизированных физиологическим раствором или OVA. Для IN-введения MCA-MSC, 1×10 клеток ресуспендировали в 0,5 мл PBS. Мышей слегка анестезировали изофлураном (Baxter Health Care, NSW, Австралия) и держали в положении полулежа, пока происходило интраназальное вливание. Затем мышам интраназально вводили 1×10 клеток/50 мкл PBS; 25 мкл в каждую ноздрю с помощью автоматической пипетки.
Инвазивная плетизмография
На 78-е сутки (7 суток после последней обработки MCA-MSC) мышей анестезировали кетамином (10 мг/кг массы тела) и ксилазином (2 мг/кг массы тела) в 0,9% физиологическом растворе. Затем всем мышам делали трахеостомия с помощью трахеостомической трубки 18 размера. Затем мышей помещали в камеру плетизмографа Buxco FinePointe (Вихсо, Research Systems, Wilmington, NC, USA) и вентилировали. Затем измеряли сопротивление дыхательных путей каждой мыши в ответ на увеличение доз распыленного метахолина (метахолин; Sigma-Aldrich, МО, USA), растворенного в PBS и доставляемого интратрахеально от 6,25 до 50 мг/мл в 4 дозах, чтобы вызвать бронхоконстрикцию и оценить AHR. Изменение сопротивления дыхательных путей (максимального сопротивления дыхательных путей после каждой дозы за вычетом базового сопротивления только к PBS) наносили на график в зависимости от соответствующей дозы метахолина.
Коллекция тканей
После инвазивной плетизмографии ткани легких от каждого животного выделяли и промывали в холодном PBS перед разделением на четыре отдельные доли. Самую большую долю фиксировали в 10% нейтральном забуференном формальдегиде в течение ночи и обрабатывали, чтобы разрезать и погрузить в парафиновый воск (для гистологического и иммуногистохимического анализа различных конечных точек). Оставшиеся три доли были мгновенно заморожены в жидком азоте для различных других анализов.
Гистопатология легких
После того, как самая большая доля от каждой мыши была погружена в парафин, каждый тканевый блок был последовательно рассечен (толщина 3 мкм) и помещен на заряженные стекла Mikro Glass (Grale Scientific, Ringwood, Victoria, Австралия) и подвергнут различным гистологическим окрашиваниям или иммуногистохимии. Для оценки показателя воспаления, толщины эпителия и отложения субэпителиального внеклеточного матрикса (ЕСМ), один срез (на стекло) от каждой мыши подвергали трихромному окрашиванию по Массону. Для оценки метаплазии бокаловидых клеток, второй набор слайдов подвергали окрашиванию альцианом синим Шифф-йодной кислотой (ABPAS). Срезы, окрашенные трихромом по Массону и ABPAS, морфометрически анализировали, как подробно описано ниже.
Иммуногистохимия (IHC)
IHC использовали для обнаружения TGF-β1 (с использованием поликлонального антитела; sc-146; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA; разведение 1:1000) или a-гладкомышечного актина (α-SMA; маркер миофибробластной дифференцировки; с использованием моноклонального антитела; М0851; DAKO, Glostrup, Denmark; разведение 1:200). Окрашивание первичными антителом определяли с использованием DAKO EnVision антикроличьих или антимышиных наборов и хромогена 3,3'-диаминобензидина (DAB), в то время как отрицательные контроли, которые подвергали воздействию наборов EnVision в отсутствие какого-либо первичного антитела, также были включены. Затем все стекла были контрастно окрашены гематоксилином и отсканированы гистологической службой Monash с помощью ScanScope AT Turbo (Aperio, CA, USA) для морфометрического анализа.
Морфометрический анализ
2
2
Стекла, окрашенные трихромом по Массой, ABPAS и IHC, подвергали морфометрическому анализу следующим образом. Пять дыхательных путей (диаметром 150-300 мкм) на участок были выбраны случайным образом и проанализированы с помощью программного обеспечения Aperio LnageScope (Aperio, CA, USA). Стекла, подвергнутые окрашиванию трихромом по Массону, подвергли полуколичественному определению показателя перибронхиального воспаления, где экспериментатор проводил эксперимент вслепую и оценивал отдельные дыхательные пути от 0 (отсутствие обнаруживаемого воспаления вокруг дыхательных путей) до 4 (широко распространенные и массивные воспалительные агрегаты клеток, обобщенный размер ~0,6 мм). Стекла, подвергнутые окрашиванию трихромом по Массону, также подвергали анализу толщины эпителия и субэпителиального отложения ЕСМ посредством измерения толщины эпителия и субэпителиального слоя ЕСМ (окрашенного голубым) и выражали как мкм/мкМ длины базальной мембраны (ВМ).
2
На стеклах, окрашенных ABPAS-, a-SMA анализировали метаплазию бокаловидых клеток и количество субэпителиальных миофибробластов, соответственно, путем подсчета количества положительно окрашенных бокаловидных клеток или α-SMA-положительных клеток на 100 мкм длины ВМ. На TGF-β1-окрашенных стеклах определяли экспрессию белка TGF-β1 посредством выполнения алгоритма для оценки сильно положительно-окрашенных пикселей в дыхательных путях. Результаты выражали в виде числа сильно положительных пикселей на общую площадь (мм) дыхательных путей; а затем относительно контрольной группы, обработанной физиологическим раствором, которое выражали как 1. Анализ гидроксипролина
Вторую по величине долю легкого от каждой мыши обрабатывали, как описано выше, для измерения содержания гидроксипролина (Royce, S. G. et al., (2013) Clin. Sci. 124, 41-51), который определяли из стандартной кривой очищенного транс-4-гидрокси-L-пролина (Sigma-Aldrich). Значения гидроксипролина умножали на коэффициент 6,94 (на основе гидроксипролина, представляющего ~14,4% аминокислотного состава коллагена в большинстве тканей млекопитающих) для экстраполяции общего содержания коллагена, которое в свою очередь делили на сухую массу каждой соответствующей ткани, чтобы получить процент концентрации коллагена.
Желатиновая зимография
Третья по величине доля легкого от каждой мыши была обработана, как подробно описано ранее, для извлечения белков, содержащих матриксные металлопротеиназы (ММР) (Woessner, J. F., (1995) Methods Enzymol. 248, 510-528), затем равные аликвоты общего белка (10 мкг на образец) оценивали на 7,5% акриламидных гелях, содержащих 1 мг/мл желатина. Желатинолитическую активность визуализировали в виде четких полос. Денситометрию ММР-9 (преобладающей желатиназы в легких самок мышей balb/c) проводили с использованием денситометра Gs710 Densitometer (Bio-Rad Laboratories, Gladesville, NSW, Австралия) и программы Quantity-one (Bio-Rad). Затем наносили на график относительное среднее значение ± SEM для оптической плотности (OD) ММР-9.
Статистический анализ
Весь статистический анализ проводили с использованием программы GraphPad Prism v6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) и выражали в виде среднего ± SEM. Результаты AHR проанализировали с помощью двустороннего дисперсионного анализа ANOVA с апостериорным тестом Бонферрони. Остальные данные были проанализированы методом одностороннего анализа ANOVA с апостериорным тестом Ньюмена-Кейлса для множественных сравнений между группами. В каждом случае данные считались значимыми при Р<0,05.
Результаты
Влияние MCA-MSC на AI
AI полуколичественно определяли из окрашенных Н&Е срезов легких с использованием системы оценки воспаления (от 0 до 4). Показатель перибронхиального воспаления для OVA-обработанных мышей (2,75±0,09) был значительно выше, чем установленный для контролей, сенсибилизированных/спровоцированных физиологическим раствором (SAL) (0,25±0,09; Р<0,001 против SAL-группы) (Фиг. 1). Повышенный уровень воспаления в группе OVA подтвердил, что эти мыши были успешно сенсибилизированы и спровоцированы OVA.
Введение MCA-MSC значительно уменьшало OVA-индуцированную перибронхиальную воспалительную клеточную инфильтрацию. (1,25±0,23; Р<0,001 по сравнению с группой OVA), не влияя на показатель базисного воспаления при введении SAL-контрольным мышам (Фиг. 1А, Фиг. 1В). Однако обработка с помощью MCA-MSC не может полностью снизить AI до уровня, измеренного у SAL-контрольных мышей (Р<0,05 против SAL-группы для лечения введением MCA-MSC мышам, обработанным OVA).
Влияние MCA-MSC на AWR
Метаплазия бокаловидных клеток
Метаплазию бокаловидных клеток морфометрически оценивали на ABPAS-окрашенных срезах легких и выражали как число бокаловидных клеток/100 мкм длины ВМ (Фиг. 2). Мыши, обработанные OVA, имели существенно увеличенные количества бокаловидных клеток (6,08±0,52) по сравнению с их аналогами SAL-контроля (0,001±0,00; Р<0,001 по сравнению с SAL-группой; Фиг. 2А, Фиг. 2Б). Введение MCA-MSC было способно значительно, хотя и не полностью, уменьшить OVA-индуцированное повышение числа бокаловидных клеток (от 3,97±0,64 до 2,89±0,48, Р<0,01 против группы OVA; Фиг. 2А, Фиг. 2Б). Однако доставка MCA-MSC не восстановила OVA-индуцированную метаплазию бокаловидных клеток до значения, измеренного у SAL-контролей (обе Р<0,001 по сравнению с SAL-группой), но не влияла на количество бокаловидных клеток у SAL-обработанных мышей.
Толщина эпителия дыхательных путей
2
Толщина эпителия дыхательных путей была морфометрически оценена по срезам легких, окрашенных трихромом по Массону, и выражена в мкм/мкм длины ВМ (Фиг. 3). Толщина эпителия OVA-обработанных мышей (19,16±0,63) была значительно выше измеренной у SAL-контролей (14,28±0,45; .Р<0,001 по сравнению с SAL-группой; Фиг. 3А, Фиг. 3Б). Доставка MCA-MSC значительно, хотя и не полностью, уменьшила толщину эпителия (от 18,59±0,77 до 16,67±0,87) по сравнению со значением, измеренным у группы OVA (Р<0,05 против группы OVA; Р<0,05 против SAL-группы; Фиг. 3А, Фиг. 3Б). Важно отметить, что лечение MCA-MSC не влияло на толщину базального эпителия у мышей SAL-контроля.
Отложение субэпителиального коллагена
2
Отложение субэпителиального коллагена морфометрически оценивали по срезам легких, окрашенных трихромом по Массону, и выражали в мкм/мкм длины ВМ (Фиг. 3); и оно было существенно повышено у OVA-обработанных мышей (27,63±0,66) по сравнению с SAL-контролем (14,31±1,87; Р<0,001 против SAL-группы; Фиг. 3А, Фиг. 3С). Доставка MCA-MSC уменьшает аберрантное OVA-индуцированное увеличение отложения субэпителиального коллагена (от 22,39±1,78 до 16,98±0,98; Р<0,05 против группы OVA; Фиг. 3А, Фиг. 3В).
Концентрация общего коллагена легких (фиброз)
Концентрацию общего коллагена легких (% концентрация коллагена/сухая масса легочной ткани) экстраполировали из уровней гидроксипролина, присутствующих во второй по величине доле легкого каждой мыши, и использовали как меру фиброза (Фиг. 4); и она была существенно увеличена у OVA-обработанных мышей (3,94±0,09%) по сравнению со значением, измеренным у SAL-контроля (2,89±0,18%; Р<0,001 против SAL-группы). Введение MCA-MSC OVA-обработанным мышам снижает фиброз в легких (от 3,26±0,17% до 3,62±0,07%; Р<0,05 против группы OVA; Фиг. 4).
Экспрессия TGF-β1 в дыхательных путях
Для того чтобы определить механизмы, посредством которых MCA-MSC были способны реверсировать OVA-индуцированное субэпителиальное и общее отложение коллагена (фиброз), относительные изменения уровней экспрессии TGF-β1 в дыхательных путях (профиброзный цитокин) морфометрически оценивали в IHC-окрашенных срезах легких и выражали, как % окрашивания на анализируемые дыхательные пути (Фиг. 5). Экспрессия TGF-β1 в дыхательных путях была значительно повышена у OVA-обработанных мышей (1,85±0,13) по сравнению с измеренной у SAL-контролей (1,00±0,08; Р<0,001 против SAL-группы; Фиг. 5А, Фиг. 5Б). Доставка MCA-MSC OVA-обработанным мышам возвращает аберрантные уровни экспрессии TGF-β1 дыхательных путей к измеренным у SAL-контроля (от 1,06±0,05 до 1,22±0,05; Р<0,001 против группы OVA; не отличается от группы SAL) без влияния на базисные уровни экспрессии TGF-β1 в дыхательных путях при введении мышам SAL-контроля (Фиг. 5А, Фиг. 5Б).
Плотность субэпителиальных миофибробластов
Изменения плотности α-SMA-окрашенных субэпителиальных миофибробластов также морфометрически оценивали в IHC-окрашенных срезах легких и выражали как количество миофибробластов/100 мкм длины ВМ (Фиг. 6). Следовые количества субэпителиальных a-SMA-позитивных миофибробластов были обнаружены у мышей SAL-контроля (0,14±0,05), в то же время OVA-обработанные мыши имели ~30-кратное увеличение плотности миофибробластов (4,37±0,37; Р<0001 против SAL-группы; Фиг. 6А, Фиг. 6Б). Введение MCA-MSC уменьшало OVA-индуцированное увеличение плотности субэпителиальных миофибробластов (от 2,86±0,27 до 3,42±0,09; Р<0,05 против группы OVA) при отсутствии какого-либо влияния на базисные количества миофибробластов при введении мышам SAL-контроля (Фиг. 6А, Фиг. 6Б). Однако введение MCA-MSC не полностью реверсировало аберрантную нагрузку субэпителиальных миофибробластов обратно к значению, измеренному в SAL-контрольных мышах (оба Р<0,001 против SAL-группы; Фиг. 6А, Фиг. 6Б).
Экспрессия желатиназы в легких
Авторы также определяли, было ли связано MCA-MSC-опосредованное реверсирование OVA-индуцированного фиброза дыхательных путей/легких с их способностью влиять на уровни коллаген-деградирующих ММР. Желатиновая зимография продемонстрировала, что легкие самок мышей Balb/с преимущественно экспрессировали ММР-9 (желатиназу В) и в меньшей степени ММР-13 (коллагеназу-3) (Фиг. 7). Относительные уровни экспрессии ММР-9 у OVA-обработанных мышей (1,62±0,22) значительно не отличались от измеренного у SAL-контрольных животных (1,00±0,09) (Фиг. 7А; Фиг. 7Б). По сравнению с этим, введение MCA-MSC OVA-обработанным мышам значительно повышало уровни ММР-9 (от 3,77±0,18 до 4,56±0,20; Р<0,05 против OVA MCA-MSC группы), в ~1,3 и ~1,8 раза выше, чем было измерено у мышей, обработанных только OVA (Р<0,001 против группы OVA; Р<0,001 против SAL-группы; Фиг. 7А; Фиг. 7Б). Интересно, что доставка MCA-MSC SAL-обработанным мышам также существенно повышала уровни ММР-9 (от 1,95±0,38 до 2,65±0,30; Р<0,05 против SAL-группы).
Влияния MCA-MSC на AHR
AHR оценивали с помощью инвазивной плетизмографии в ответ на увеличение концентраций распыленного метахолина - бронхоконстриктора. (Фиг. 8). Как и ожидалось, мыши, обработанные OVA, имели существенно повышенное AHR по сравнению с измеренным у SAL-контроля (Р<0,001 против SAL-группы; Фиг. 8). Доставка MCA-MSC реверсировала OVA-индуцированное увеличение AHR (Р<0,05 против группы OVA; Фиг. 8). Как и в случае большинства других измеренных конечных точек, доставка MCA-MSC не влияла на базисные измерения AHR при введении SAL-контрольным мышам (Фиг. 8).
Обсуждение
Целью данного исследования была оценка терапевтического потенциала новых MCA-MSC, происходящих из iPSC, против трех центральных компонентов патогенеза хронического AAD/астмы: AI, AWR и AHR, при терапевтическом введении при установленной патологии заболевания.
Введение MCA-MSC защищает против установленных AI, AWR (метаплазия бокаловидных клеток, аберрантные уровни TGF-β1 дыхательных путей, накопление субэпителиальных миофибробластов и коллагена, концентрация общего коллагена легких) и AHR, которые были индуцированы повторной сенсибилизацией OVA и провокацией у мышей (Таблица 8). Это приводит к реверсии аберрантных уровней TGF-β1 в дыхательных путях, фиброза дыхательных путей/легких и AHR в течение двухнедельного (один раз в неделю) периода лечения и к значительному увеличению уровней коллаген-разрушающего ММР-9 путем доставки MCA-MSC (Таблица 8). Столь же важно, как было показано, что введение MCA-MSC не влияет на базисную экспрессию измеренных параметров, что позволяет предположить, что введение MCA-MSC является безопасным и наиболее эффективным средством лечения главных компонентов AAD/ астмы.
На Фиг. 8 стрелки в колонках OVA, SAL MCA-MSC IV и SAL MCA-MSC IN отражают изменения по сравнению со значениями, измеренными у мышей, обработанных физиологическим раствором (SAL), тогда как стрелки в группах OVA MCA-MSC IV и OVA MCA-MSC отражают изменения только в группе OVA. (-) означает отсутствие изменений по сравнению с SAL- или OVA-обработанными мышами соответственно. *Р<0,05, **Р<0,01 против группы OVA MCA-MSC IV.
Воспалительный компонент астмы способствует обструкции дыхательных путей. Th2-асимметричное воспаление приводит к увеличению определенного подмножества цитокинов, включающих интерлейкин (EL)-13, и индукции метаплазии бокаловидных клеток.
В соответствии с этими наблюдениями, предыдущие исследования показали, что внутривенное введение происходящих из iPSC MSC (не MCA-MSC, как раскрыто в данном описании изобретения) может частично уменьшать воспалительный показатель дыхательных путей в острой модели OVA путем подавления уровней цитокинов Th2, IL-4, IL-5 и IL-13. Системные эффекты MCA-MSC могут быть даже связаны с их способностью активировать регуляторные Т-клетки через прямой контакт клетка-клетка. Однако имеющиеся в настоящий момент данные о том, что MCA-MSC заметно подавляют AI на ~75% и метаплазию бокаловидных клеток на ~50% указывают на то, что MCA-MSC больше опосредуют иммуномодулирующие свойства по сравнению с MSC, происходящими из костного мозга или жировой ткани человека.
Непосредственное введение MCA-MSC в дыхательные пути/легкие позволяет защитным факторам, которые они выделяют, оставаться в легочной среде. Кроме того, непосредственно введенные MCA-MSC скорее всего остаются в воспаленных легких и обладают более сильными защитными эффектами против воздействия аллергенов, опосредованных супрессией антигенпредставляющих леток, включающих альвеолярные макрофаги и дендритные клетки.
Наряду с метаплазией бокаловидных клеток, пролиферация эпителия вносит основной вклад в ремоделирование эпителия при астме. Снижение барьерной функции эпителия и десквамация приводят к пролиферации эпителия. Эта пролиферация является особенно широкомасштабной при тяжелой астме, когда увеличение эпителия приводит к обструкции дыхательных путей. Учитывая, что это перепрограммирование происходит на ранних стадиях патогенеза астмы, терапия астмы должна быть нацелена на эпителий. Введение MCA-MCS приводит к уменьшению толщины эпителия, помимо аналогичное снижения AI. Это противоречит предыдущим результатам, относящимся к MCS, происходящим из костного мозга, когда внутриназальная доставка MCS из костного мозга сама по себе не оказывала влияния на толщину эпителия. В этом исследовании на толщину эпителия не влияло уменьшение AI. Следовательно, различие, наблюдаемое между MCA-MSC и MSC из костного мозга, по-видимому обусловлено активными свойствами самих MCA-MSC, а не пассивным эффектом, производимым их способностью уменьшать AI
Кроме того, в другом исследовании, введение пептида эпителиального фактора репарации (фактор"трилистника"-2) уменьшает толщину эпителия в той же степени, что и комбинированное лечение антифиброзным агентом и кортикостероидом, помимо значительного снижение AI, обеспечиваемого комбинированным лечением. Как таковое, уменьшение пролиферации эпителия не было опосредовано уменьшением воспаления.
С этим дополнительным фактом настоящие результаты показывают, что доставка MCA-MSC обеспечивает 1) достаточное накопление паракринных факторов, уменьшающих толщину эпителия и/или 2) эти клетки вступают в непосредственный контакт с поврежденным эпителием и опосредуют реверсирование его пролиферации. Такое уменьшение толщины эпителия и метаплазии бокаловидных клеток, продуцируемое MCA-MSC, является первым свидетельством реверсированного AWR.
Кульминация ряда факторов, включающих механические повреждения и аллергены, может способствовать деструкции легочной структуры и функции дыхательных путей, приводя к AWR в дополнении к AI. Повреждение, вызванное аллергенами или наследственной восприимчивостью, заставляет легкие подвергаться эндогенным процессам ремоделирования в попытке самовосстановления структуры и функции дыхательных путей, и эти репаративные процессы приводят к аберрантному заживлению ран, со временем приводя к фиброзу. Фиброз был очевиден в OVA-сенсибилизированных дыхательных путях, о чем свидетельствовали аберрантные повышения уровня субэпителиального и общего коллагена. Доставка MCA-MSC значительно уменьшает как аберрантное субэпителиальное, так и общее отложение коллагена и в некоторых случаях полностью реверсирует это аберрантное отложение коллагена к уровням, наблюдаемым в неповрежденной, обработанной физиологическим раствором группе. Эти результаты были неожиданными, так как предыдущие исследования показали, что OVA-индуцированное повышение субэпителиального и общего отложения коллагена может быть полностью реверсировано только при совместном применении лечения на основе стволовых клеток с антифиброзным лекарственным средством. В этих исследованиях комбинированного лечения было высказано предположение, что антифиброзное лекарственное средство создает более благоприятную среду, в которой можно вводить терапевтические средства на основе стволовых клеток, таким образом способствуя выживанию стволовых клеток и увеличивая их пролиферативную и миграционную способность для индукции их защитных/терапевтических эффектов. Следовательно, доставка MCA-MSC обеспечивает эффекты, аналогичные эффектам антифиброзного лекарственного средства и может обладать антифиброзными свойствами, аналогичными фетальным фибробластам, что может способствовать заживлению ран в отсутствие фиброза.
Эти результаты также соответствуют наблюдаемому MCA-MSC-индуцированному уменьшению толщины эпителия. Фиброгенные факторы роста обычно высвобождаются эпителиальными клетками в ответ на нарушения эпителия. При астме этот ответ усилен, свидетельствуя о том, что субэпителиальный фиброз является результатом передачи сигналов от дефектного эпителия к более глубокой стенке дыхательных путей. Таким образом, MCA-MSC могут оказывать свое антифибротическое действие через иммуномодулирующие свойства и возможную секрецию антифиброзных медиаторов, учитывая уменьшение субэпителиального и общего коллаген при внутривенном введении.
Основным выводом этого исследования было то, что MCA-MSC реверсируют фиброз и возвращают AHR к уровням, измеренным у непораженных мышей. AHR обусловлена обструкцией дыхательных путей, которая может быть вызвана закупоркой слизью из-за метаплазии бокаловидных клеток и утолщения эпителия. Кроме того, взаимодействие между AI и фиброзом стенки дыхательных путей приводят к среде, которая повышает AHR. Фиброз не только снижает податливость дыхательных путей у субъектов с астмой, но и это размножение в ЕСМ приводит к задержке растворимых медиаторов воспаления и хроническому сохранению установленного AHR. Как таковое, AHR может быть реверсировано к нормальным уровням без повреждения главным образом путем уменьшения субэпителиального фиброза и уменьшения AI, и/или путем уменьшения обструкции дыхательных путей, опосредованного снижением количества бокаловидных клеток и более низкими уровнями утолщения эпителия, обеспечиваемых MCA-MSC. Как показано в данном описании изобретения, MCA-MSC корректировали AHR путем нацеливания на AWR на нескольких уровнях, в дополнение к их противовоспалительным эффектам.
В заключение следует отметить, что в настоящем исследовании, впервые использующем MCA-MSC для лечения хронического AAD/астмы, было обнаружено, что MCA-MSC эффективно уменьшают AI и реверсируют маркеры AWR, а также AHR. Следовательно, MCA-MSC обеспечивают независимую терапию AAD/астмы. MCA-MSC также можно использовать в качестве вспомогательной терапии для AAD/астмы. MCA-MSC могут обеспечить особые терапевтические преимущества для субпопуляции субъектов с AAD/астмой, которые не отвечают на текущую терапию, то есть терапию кортикостероидами или β-агонистами.
Поразительный вывод, который выделяет MCA-MSC из других стволовых клеток, изученных ранее, заключается в том, что другие MSC/стволовые клетки обеспечивают терапевтический эффект только при введении в комбинации с другими терапевтическими агентами.
Пример 5
6
AAD/астму индуцировали в группах из 6-8 мышей таким же образом, как в Примере 4, за исключением того, что мышей провоцировали распыленным аэрозольным раствором овальбумина в течение 30 минут, три раза в неделю в течение 8 недель (от суток 21 до 77, Фиг. 9), вместо 6 недель, как в Примере 4. Мышей случайным образом распределяли в одну из пяти групп: 1 - необработанные контроли (нет астмы); 2 -необработанные сенсибилизированные животные (астма); 3 - сенсибилизированные животные (астма), обработанные с помощью IN инфузии MCA-MSC; 4 сенсибилизированные животные (астма), обработанные с помощью IN инфузии дексаметазона (DEX); 5 - сенсибилизированные животные (астма), обработанные с помощью IN инфузии MCA-MSC + DEX. Все мыши, обработанные MCA-MSC, получали дозу 10 клеток интраназально в двух случаях (один раз в неделю в недели 9 и 10). DEX (1 мг/кг/сутки) вводили один раз в сутки с недель 9-11. DEX улучшает AHR, но MCA-MSC оказывает значительно более выраженные эффекты, при этом DEX не оказывал никакого дополнительного эффекта по сравнению с одними MCA-MSC (Фиг. 10).
Пример 6
Модель, используемая в данном примере, была такой же, как Примере 5, 9-недельная аллерген-индуцированная модель хронического заболевания дыхательных путей с использованием самок мышей Balb/c, которые наиболее восприимчивы в этой модели.
Сравнивали следующие группы 7-8-недельных самок мышей Balb/c (n~8 мышей на группу), которым MCA-MSC вводили один раз в неделю в течение 9-11 недель интраназально (IN), внутривенно (IV) или эндотрахеально (ЕТ):
1) сенсибилизированные физиологическим раствором/спровоцированные контроли;
2) OVA-сенсибилизированные/спровоцированные (AAD);
6
3) OVA-сенсибилизированные/спровоцированные + 1×10 MCA-MSC/мышь посредством IN введения;
6
4) OVA-сенсибилизированные/спровоцированные + 1×10 MCA-MSC/мышь посредством IV введения; и
6
5) OVA-сенсибилизированные/спровоцированные + 1×10 MCA-MSC/мышь посредством ЕТ введения.
Эта схема с 20% SD, обеспечивает 90% эффективность для выявления 25% эффекта с n=8 мышей/группа.
Гиперреактивность дыхательных путей (мера функции легких) была проанализирована и представлена на Фиг. 11.
У мышей с OVA-индуцированным хроническим AAD было значительно ухудшенное AHR в ответ на увеличенные дозы бронхоконстриктора по сравнению с их обработанными физиологическим раствором аналогами. Это OVA-индуцированное AHR было существенно снижено, на 79-80%, посредством IN или IV введения MCA-MSC (введение один раз в неделю с недель 9-11 в присутствии продолжающегося OVA-индуцированного повреждения). Не было существенной разницы в AHR у мышей IN- или IV-обработанных MCA-MSC против контрольных животных, обработанных физиологическим раствором.
ЕТ введение MCA-MSC уменьшало AHR на 61%, что все еще было значительно ниже, чем значение, измеренное для группы, обработанной только OVA, но значительно выше, чем значение, измеренное ля группы, обработанной физиологическим раствором.
Не было значительной разницы в AHR у IN-, IV-, ЕТ-обработанных групп, что указывало на то, что все три способа доставки MCA-MSC обеспечивают эффективный подход к лечению хронического AAD/астмы.
Дополнительные анализируемые конечные точки включают:
1) показатель воспаления;
2) метаплазию бокаловидных клеток;
3) толщину эпителия;
4) повреждение эпителия;
5) толщину субэпителиального коллагена;
6) концентрацию общего коллагена легких;
7) окрашивание эпителиального TGF-бета1;
8) плотность субэпителиальных миофибробластов; и
9) экспрессию/активность желатиназы (ММР-2 и ММР-9).