Влияние способа подготовки образца на морфофункциональные характеристики эритроцитов при исследовании методом атомно-силовой микроскопии

МЕДИЦИНСКАЯ БИОФИЗИКА

Вестн. Ом. ун-та. 2013. № 2. С. 129-132.

УДК 612.111:577.344:57.086

И.А. Лобов, Н.А. Давлеткильдеев

ВЛИЯНИЕ СПОСОБА ПОДГОТОВКИ ОБРАЗЦА НА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ МЕТОДОМ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ

Изучено влияние состава фиксирующего раствора глутарового альдегида на форму, размеры, модуль упругости и шероховатость мембраны эритроцитов при их исследовании методом атомно-силовой микроскопии в жидкости. Установлен оптимальный режим подготовки образца, позволяющий получать изображения эритроцитов с характерными для них формой и размерами. Определено соотношение между величинами модуля упругости и шероховатости мембраны для фиксированных и нативных нефиксированных эритроцитов.

Ключевые слова: эритроциты, глутаровый альдегид, атомно-силовая микроскопия, силовая спектроскопия, модуль упругости, шероховатость мембраны.

Метод атомно-силовой микроскопии (АСМ) все более активно используется для изучения морфофункционального состояния биологических клеток. Исключительным преимуществом этого метода является возможность исследования с высоким разрешением морфологии и функциональных свойств живых клеток в их естественной среде. Однако существующие методики исследования нативных клеток методом АСМ достаточно сложны, их реализация требует строгого соблюдения многих условий, зачастую они малопригодны для проведения длительных экспериментов.

Чаще всего АСМ-исследования проводят на фиксированных клетках, что позволяет стабилизировать структуру клетки, длительно сохранять образцы и получать воспроизводимые результаты. Однако фиксация в той или иной степени искажает морфологические и функциональные характеристики клеток и приводит к получению недостоверных результатов. В связи с этим необходимым является установление соотношения между морфофункциональными параметрами нативных живых клеток и клеток, подвергнутых фиксации в растворах различного состава. Как показывает анализ литературных данных, наименьшее искажение морфологии клеток наблюдается при использовании в качестве фиксатора раствора глутарового альдегида.

Целью данного исследования является установление особенностей морфофункциональных параметров эритроцитов в нативном состоянии и при фиксации в растворах глутарового альдегида различного состава.

На практике зачастую очень сложно получить качественные изображения клеток при сканировании методом контактной АСМ, так как сила адгезии клеток с подложкой настолько мала, что даже при использовании минимальной силы прижатия зонда к образцу в процессе движения зонд может срывать клетки с подложки. Для увеличения силы адгезии обычно модифицируют подложку или используют в качестве буфера кальций содержащие растворы. В настоящей работе в качестве подложки использовалось стекло с покрытием на основе поли-Ь-лизина, которое улучшает адгезию клеток за счёт ионного взаимодействия между отрицательно заряженной мембраной эритроцитов с положительно заряженным слоем поли-Ь-лизина [1]. Однако при этом мембрана клетки может испытывать дополнительное натяжение за счёт увеличения площади контакта, обусловленного дополнительными электростатическими силами.

На всех этапах работы в качестве буферного раствора использовался физиологический раствор (0,9 %-й раствор МаС1). Эритроциты выделялись

© И.А. Лобов, Н.А. Давлеткильдеев, 2013

из цельной периферической крови, забранной у практически здорового донора стандартными клиническими методами. Для отделения эритроцитов от других форменных элементов крови и плазмы несколько капель крови разводились в физиологическом растворе и трёхкратно отмывались центрифугированием при 3000 об/мин. Для предотвращения высыхания эритроцитов осаждение их на стекло производилось во влажной камере, в качестве которой выступала чашка Петри с помещённым в неё бумажным фильтром, смоченным физиологическим раствором. После насыщения камеры парами на стекло наносилась одна капля сильноразве-дённой суспензии эритроцитов. Осаждение клеток продолжалось в течение 20 минут, после этого стёкла трёхкратно аккуратно отмывались круговыми движениями в физиологическом растворе для удаления незакре-пившихся клеток. В результате получался разреженный монослой эритроцитов на стеклянной подложке. Разреженность слоя напрямую зависит от степени разведения суспензии клеток. При недостаточно сильном разведении клетки закрепляются на подложке в основном боковыми поверхностями.

В качестве фиксатора использовали 0,5 и 2,5 %-й растворы глутарового альдегида в физиологическом растворе. Фиксация проводилась в той же влажной камере. На подложку с монослоем осаждённых эритроцитов наносили несколько капель фиксатора и выдерживали в течение 30 минут при комнатной температуре. После этого стёкла трижды отмывались. До начала сканирования стёкла с осаждёнными на них эритроцитами хранились в физиологическом растворе.

Сканирование образцов проводилось на атомно-силовом микроскопе SOLVER PRO (NT-MDT) в жидкости в контактном режиме. Использовался зондовый датчик марки CSG01 с силовой константой кантилевера k = 0,03 Н/м и радиусом закругления кончика зонда 10 нм. Для получения АСМ-изо-бражений сила надавливания зонда выбиралась минимально возможной (сигнал DFL не превышал значения 0,3 нА). Скорость сканирования составляла 1-1,5 Гц.

Расчёт модуля упругости эритроцитов проводился по кривым подвода, полученным методом силовой спектроскопии. Сканирование методом силовой спектроскопии проводилось на горизонтальных участках поверхностей клеток, так как наклон поверхности клеток вносит существенное влияние на вид кривых подвода-отвода. Время сканирования одной кривой составляло 2 с, диапазон подвода-отвода - z = -300..+300 нм. Для расчета величины модуля упругости использовалось решение задачи Герца для зонда полусферической формы [2], согласно которому давящая сила зависит от глубины инден-тирования зонда в образец следующим образом:

Wr 2

F =--------Eh 2 ,

3

где F - сила, действующая на образец со стороны зонда; r - радиус закругления зонда; Е - модуль упругости исследуемого объекта; h - глубина индентирования зонда в образец.

Обработка АСМ изображений и расчёт среднеквадратичной шероховатости мембран эритроцитов производились в пакете программ NOVA (NT-MDT). Расчёт среднеквадратичной шероховатости мембран проводился по сканам размером 250х250 нм2.

При сканировании нативных не фиксированных эритроцитов (рис. 1) не удавалось получить изображения с характерной для эритроцитов формой тороидального диско-цита. Эритроциты выглядят сильно сплющенными и слегка вытянутыми вдоль направления сканирования. Высота клеток над подложкой в среднем составила около 100 нм, тогда как типичное её значение находится в диапазоне 0,5-2 мкм. Это связано с тем, что клетка достаточно эластичная, она проминается под давлением зонда при контактном режиме сканирования. Средний диаметр клеток составил 6,46 мкм, что попадает в диапазон значений диаметра нормальных эритроцитов.

4 5 6

pm

а

Plane, мт б

Рис. 1. Типичные а) АСМ-изображение и б) профиль поперечного сечения нативных эритроцитов при сканировании в контактном режиме АСМ

Влияние способа подготовки образца на морфофункциональные характеристики..

131

Модуль упругости эритроцитов, рассчитанный по данным, полученным методом силовой спектроскопии, составил в среднем 350 кПа. Данная величиина в несколько раз превышает величины модуля упругости эритроцитов, которые приводятся в литературных данных [3]. Однако отметим, что даже у одних и тех же авторов в разных работах значения модуля упругости для нативных клеток может изменяться на порядок [4]. Такая вариация модуля упругости клеток определяется следующими факторами:

• адекватностью выбранной модели для расчёта модуля упругости;

• параметрами зонда (жёсткость, радиус закругления и форма кончика, различные модификации зонда);

• параметрами сканирования методом силовой спектроскопии (время сканирования, диапазон подвода-отвода и выбор точки сканирования).

В данной работе в процессе всех измерений вышеперечисленные факторы не изменялись.

Определить значение среднеквадратичной шероховатости для нативных нефиксированных эритроцитов не удалось в связи с их высокой эластичностью. Поэтому данный параметр вычислялся на мембранах эритроцитов, осаждённых на свежерасщепленную слюду. Для этого клетки подвергались лизи-рованию в разбавленном физиологическом растворе. Мембраны отделялись от гемоглобина центрифугированием. Суспензия мембран наносилась в виде капли на подложку и размазывалась кратковременным центрифугированием. При этом на подложке образовывался монослой мембран. Значение среднеквадратичной шероховатости мембран, осаждённых на слюду, составило 0,36 нм.

Для клеток, фиксированных 0,5 %-м раствором глутарового альдегида, наблюдается типичная для эритроцитов форма с чётко выраженным углублением в средней части клетки (рис. 2). Средний диаметр практически не изменился по сравнению с диаметром нефиксированных клеток и составил 6,47 мкм. Высота клеток существенно выросла и достигла в среднем 2 мкм, а для некоторых клеток превысила 2,6 мкм, так что диапазона z-перемещения сканера не хватало для сканирования клетки целиком. Таким образом, при данной концентрации глутаро-вого альдегида в фиксирующем растворе высота клеток несколько превышает типичное для эритроцитов значение. Согласно результатам работы [5], глутаровый альдегид не изменяет структуру липидного бислоя мембраны клеток. Увеличение же высоты клетки может быть связанно с влиянием фиксатора на подмембранный цитоскелет, который отвечает за упругие свойства клеток и сохранение ими своей формы.

Отметим, что качество изображения клеток практически не зависит от силы прижатия

зонда к образцу (величины сигнала DFL) и скорости сканирования, что является существенным преимуществом способа подготовки образца, включающего фиксацию клеток.

01234567

цт

а

Plane, |im б

Рис. 2. Типичные а) АСМ-изображение и б) профиль поперечного сечения фиксированных 0,5 %-м раствором глутарового альдегида эритроцитов при сканировании в контактном режиме аСм

Модуль упругости клеток при таком способе подготовки возрастает по сравнению с нативными клетками на порядок и равен в среднем 5,93 МПа, что можно связать с влиянием глутарового альдегида на цитоскелет эритроцитов.

Шероховатость мембран эритроцитов также значительно возросла. Её среднее значение составило 1,52 нм, что в несколько раз превышает аналогичный параметр для нативных клеток. В величину среднеквадратичной шероховатости мембраны основной вклад вносят выступающие из липидного бислоя интегральные и полуинтегральные белки. Считается, что интегральные белки клеток являются центрами крепления цитоскелета. Таким образом, связывание цитоскелета глутаровым альдегидом непосредственно повлияет и на интегральные белки. Рост шероховатости мембраны обусловлен более сильным выпячиванием интегральных белков из липидного бислоя.

При фиксации клеток 2,5 %-м раствором глутарового альдегида их средний диаметр уменьшился до значения 5,14 мкм

(рис. 3). Как можно видеть из профиля поперечного сечения эритроцита, его форма стала полусферической, т. е. при данном способе подготовки образца форма клеток из тороидального дискоцита трансформировалась в сфероцит. Высота клеток над подложкой еще более возросла по сравнению с высотой клеток, фиксированных в 0,5 %-м растворе глутарового альдегида, и для большинства клеток превысила величину диапазона z-перемещения сканера (2,6 мкм).

1 2 3 4 5 6 7

)jm

а

Plane, |лл б

Рис. З. Типичные а) АСМ-изображение и б) профиль поперечного сечения (внизу) фиксированных 2,5 %-м раствором глутарового альдегида эритроцитов при сканировании в контактном режиме АСМ

Величина модуля упругости также выросла и составила в среднем 8,76 МПа. Величина шероховатости мембраны эритроцитов почти не изменилась по сравнению с шероховатостью клеток, фиксированных в 0,5 °/о-м растворе глутарового альдегида, и составила в среднем 1,6 нм.

Таким образом, из полученых результатов видно, что с ростом концентрации глу-тарового альдегида в фиксирующем растворе увеличиваются параметры морфофункционального состояния эритроцитов. Существенно увеличивается высота клетки над подложкой, на порядок возрастает модуль

упругости, пятикратно увеличивается шероховатость мембраны эритроцита.

В настоящей работе были рассмотрены три способа подготовки эритроцитов для исследования методами АСМ: без фиксации клеток и с фиксацией в растворах глутаро-вого альдегида с концентрациями 0,5 и 2,5 %. При использовании фиксатора существенно упрощается процесс получения качественных АСМ-изображений клеток. Однако при этом существенно возрастают параметры морфофункционального состояния клеток, такие как высота клетки над подложкой, модуль упругости клетки и шероховатость ее мембраны, по сравнению с аналогичными параметрами для нативных клеток. Все полученные параметры возрастают с увеличением концентрации глутарового альдегида в фиксирующем растворе. Способ подготовки, при котором удается получить изображения эритроцитов с характерной для них тороидальной формой, является фиксация клеток 0,5 %-м раствором глутарового альдегида в течение 30 мин. При этом относительно нативных клеток величина модуля упругости возрастает на порядок, а величина среднеквадратичной шероховатости мембраны увеличивается почти в пять раз.

Предполагаемой причиной увеличения морфофункциональных параметров эритроцитов при фиксации в растворе глутарового альдегида является влияние фиксатора на подмембранный цитоскелет клеток, который отвечает за их упругие свойства и сохранение ими своей формы.

ЛИТЕРАТУРА

[1] Ebner A., Schillers H., Hinterdofren P. Normal and pathological erythrocytes studied by atomic force microscopy // Atomic force microscopy in biomedical research: method and protocols, methods in molecular biology. 2011. V. 736. P. 223-241.

[2] Cappella B., Dietler G. Force-distance curves by atomic force microscopy // Surface Science Reports. 1999. V. 34. P. 1-104.

[3] Kuznetsova T. G., Starodubtseva M. N., Yegoren-kov N. I., Chizhik S. A, Zhdanov R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity // Micron. 2007. № 38. P. 824-833.

[4] Dulinska I., Targosz M., Stroyny W., Lekka M., Czuba P., Balwierz W, Szymonski M. Stiffness of normal and pathological erythrocytes studies by means of atomic force microscopy // Journal of biochemical biophysical methods. 2006. V. 66. P. 1-11.

[5] Кузнецова Т. Г., Стародубцева М. Н., Егорен-ков Н. И. Определение механических свойств клеточных поверхностей // Методологические аспекты сканирующей зондовой микроскопии : мат-лы VII Международного семинара. Минск, 2006. С. 153-157.