ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ УКОРЕНЕНИЯ ПОБЕГОВ ВИНОГРАДА В КУЛЬТУРЕ IN VITRO
NUTRIENT MEDIUM FOR ROOTING GRAPE SHOOTS IN CULTURE IN VITRO

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к биотехнологии, и может быть использовано в питомниководстве при получении оздоровленного посадочного материала при помощи методов клонального микроразмножения.
Известны питательные среды различного минерального состава, предназначенные для укоренения ягодных и плодовых растений in vitro (Алексеенко Л.В. Подбор питательных сред для клонального микроразмножения нейтральнодневных и ремонтантных сортов земляники. / Алексеенко Л.В., Высоцкий В.А. / Плодоводство и ягодоводство России: Сб. науч. работ / ВСТИСП. - М., 1997. - Т. IV. - C. 77-82, Шипунова А.А. Подбор минеральной основы питательных сред для клонального микроразмножения жимолости в производственных условиях. / Шипунова А.А., Высоцкий В.А. / Плодоводство и ягодоводство России: Сб. науч. работ / ВСТИСП. - М, 2001. Т. VII. С. 158-163).
Наиболее часто для укоренения побегов, полученных в культуре in vitro, исследователи используют половину макро- и микросолей по прописи, разработанной Мурасиге и Скуга (MS ½), (Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - vol. 5, 95 - P. 473-497).
Для наиболее эффективного ее применения исследователи практически всегда оптимизируют ее состав, изменяя гормональный фон или вводя различные добавки в виде аминокислот, витаминов, препаратов нового поколения (Белошапкина О.О. Использование биопрепаратов при клональном микроразмножении земляники/ Белошапкина О.О., Жаркова И.В. // Докл. ТСХА. - 2001. - №273, ч. 2. - С. 284-289). Значительно реже исследователи изменяют минеральный состав и, как правило, незначительно.
При этом следует отметить, что минеральный состав среды Мурасиге и Скуга (MS) плохо подходит для укоренения побегов, полученных in vitro, так как среда разрабатывалась для культивирования каллусов и каллусных клеток и учитывает, прежде всего, условия для их развития. Соотношение и концентрации макроэлементов в среде неоптимальные относительно потребности в них микрорастений винограда, что в процессе культивирования приводит к дисбалансу минеральных солей, сдвигу pH питательной среды и как следствие ухудшает параметры развития микрорастений винограда.
4
3
3
2
4
4
2
2
4
2
2
2
3
3
2
4
2
2
4
4
2
2
2
Наиболее часто применяемая среда для укоренения (MS ½) содержит следующие компоненты мг/л: NHNO - 825; KNO - 950; KHPO - 85; MgSO*7HO - 185 мг/л, CaCl - 220; FeSO*7HO - 13,4-13,8; Na ЭДТА 2НO - 18,5-18,9; НВO - 3,0-3,2; MnSO4*4HO - 11,0-11,4; ZnSO*7HO - 4,1-4,5; KJ - 0,40-0,44; NaMoO - 0,11-0,15; CuSO*5HO - 0,011-0,015; CoCl⋅6HO - 0,011-0,015; миоинозит - 40-60; тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота по 0,2-0,3; аскорбиновая кислота 0,4-0,6; ИМК - 0,5-1,5; сахароза - 14000-16000; агар - 6000-8000; остальное бидистиллированная вода до 1 л; pH -5,5-5,9.
Наиболее близким к предлагаемому решению является питательная среда - Н2, разработанная для укоренения побегов винограда, полученных на этапе пролиферации (Голодрига П.Я. Методические рекомендации по клональному микроразмножению винограда/ВНИИВиПП «Магарач» (П.Я. Голодрига, В.А. Зленко, Л.А. Чекмарев), ИФР АН СССР (Р.Г. Бутенко), ИФР АН УССР (Б.А. Левенко), и др. - Ялта: Издательская группа ВНИИ ВиПП «Магарач», 1986 - 56 с.).
4
3
3
2
4
4
2
2
4
2
2
2
3
3
2
4
2
2
4
4
2
2⋅
2
⋅
Прототип питательной среды содержит следующие компоненты мг/л: NHNO - 210; KNO - 717; KHPO - 68; MgSO*7HO - 233 мг/л, CaCl - 356; FeSO*7HO - 7,0; Na ЭДТА2НO - 9,3; НВO - 1,6; MnSO4*4HO - 6,0; ZnSO*7HO - 2,2; KJ - 0,21; NaMoO - 0,06; CuSO*5HO - 0,006; CoCl6HO - 0,006; миоинозит - 50; никотиновая кислота - 0,2; ИУК - 0,1; феруловая кислота - 1,0; сахароза - 1000; агар - 7500; остальное бидистиллированная вода до 1 л; pH -5,6-5,8.
Недостатками данной среды для укоренения являются высокое содержание хлора, несбалансированность элементов по магнию и фосфору, а также низкое содержание хелата железа и микроэлементов (1/4 прописи МС), что при укоренении побегов негативно сказывается на регенерации корней и последующем развитии побегов и листьев. Кроме того, несбалансированное содержание макроэлементов часто провоцирует рост каллусной ткани и преждевременное старение эксплантов.
Задача, на решение которой направлено изобретение, является повышение количества и качества укорененных побегов и преодоление сортовой специфики виноградного растения на этапе укоренения.
4
3
3
2
4
2
4
4
2
3
2
2
2
4
2
2
2
3
3
2
2
2
4
2
2
2
Задача, на решение которой направлено изобретение, решается оптимизацией концентрации и соотношением макросолей, входящих в состав питательной среды: NHNO уменьшается до 150 мг/л; KNO - 750 мг/л; уровень содержания фосфора в среде возрастает в два раза, при этом KHPO заменяется на NaHPO -140 мг/л; MgSO⋅7HO - 220 мг/л, основным источником кальция в среде становиться Ca(NO)⋅4HO - 400 мг/л; CaCl - 25 мг. Остальные компоненты питательной среды добавляются в следующем количестве мг/л: FeSO⋅7HO - 27,8÷30,0; NaЭДТА⋅2НO - 37,3÷40,0; НВO - 6,0÷6,4; MnSO4⋅4HO÷22,0-22,6; ZnSO4⋅7HO - 8,0÷9,2; KJ 0,80÷0,90; NaMoO4 - 0,2÷0,3; CuSO⋅5HO - 0,02÷0,03; CoCl⋅6HO - 0,02÷0,03; миоинозит - 50÷70; тиамин, пиридоксин, по 0,2÷0,5; в качестве ауксина добавляется ИМК или ИУК - 0,1÷0,2; сахароза - 10000; агар - 6000; остальное бидистиллированная вода до 1000; pH - 5,6÷5,8.
4
3
2
Заявленное решение отличается от прототипа и (1/2 МС) не только меньшим содержанием солей NHNO и CaCl, но и заменой фосфорнокислого калия на фосфорнокислый натрий. На Фиг. 1 представлены сравнительные характеристики разработанной питательной среды и прототипа по концентрации макроэлементов по действующему веществу (д.в.).
2
4
2
4
2
3
2
2
Заявленное решение отличается от прототипа и наиболее часто применяемой среды ½ МС тем, что: в 1,5 и 4,0 раза соответственно снижено содержание аммиачной формы азота, в 14,6 и 8,8 раза снижено содержание хлора, источник фосфора KHPO заменен на NaHPO, при этом являясь источником Na, эта соль способствует повышению буферности питательной среды, предотвращая снижение ее pH. Изменен основной источник кальция в среде с CaCl на Ca(NO)*4HO. Кроме того, хелат железа и микроэлементы в предлагаемой среде даны по прописи МС в полном объеме. Все это положительно влияет на укоренение побегов и рост образовавшихся микрорастений в культуре in vitro. Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявленного решения критерию "новизна".
Заявленное решение обладает изобретательским уровнем, так как не является очевидным для специалистов питомниководов и биотехнологов, а является продуктом творческой деятельности автора изобретения.
Заявленное техническое решение соответствует и другому требуемому критерию изобретения - промышленному применению, что подтверждено экспериментальными данными, полученными при реализации способа.
Пример осуществления способа
4
3
3
2
4
4
2
3
2
2
2
4
2
2
2
3
3
4
2
4
4
2
2
2
В питательную среду вносят следующие компоненты (концентрации в мг), макроэлементы: NHNO - 150; KNO - 750; NaHPO⋅140; MgSO⋅7HO - 220, Ca(NO)⋅4HO - 400; CaCl - 25; Мезоэлементы: FeSO⋅7HO - 27,8-30,0; NaЭДТА⋅2HO - 37,3-40,0; микроэлементы: HBO - 6,0-6,4; MnSO4⋅4H2O - 22,0-22,6; ZnSO⋅7H2O - 8,0-9,2; KJ - 0,80-0,90; NaMoO - 0,2-0,3; CuSO⋅5HO - 0,02-0,03; CoCl⋅6HO - 0,02-0,03; витамины: миоинозит - 50-70; тиамин и пиридоксин, по 0,2-0,5 мг/л; 6-бензиламинопурин 0,2-0,5; сахароза - 10000; агар - 6000; остальное бидистиллированная вода до 1000,0.
В начале объем раствора доводят до 0,5 л, устанавливают pH 5,6-5,8 и добавляют 0,5 л воды с агаром, предварительно нагретой до кипения, для полного расплавления и растворения агара. Питательную среду разливают по сосудам и автоклавируют при давлении 0,7-1,0 атм. (температура 119-121°C) в течение 20-25 мин. После остывания среды осуществляют высадку срезанных с этапа пролиферации побегов.
Испытание разработанной прописи питательной среды показало эффективность ее применения на всех сортах, учувствовавших в испытании. Влияние разработанной питательной среды, для укоренения срезанных с пролиферации побегов, на их рост и развитие через 70 дней, 2016 г. представлено в Табл. 1
Как видно из представленных данных в варианте, где для укоренения побегов примененяли разработанную пропись питательной среды, укореняемость микропобегов была лучше, стабильно улучшалось их развитие, а также снижалось число отбракованных эксплантов из-за некроза или отсутствия развития. При этом положительный эффект получен на всех подопытных сортах. Особенно заметный эффект был на сортах, которые при использовании прототипа регенерировали слабо, проявляя сортовую специфичность.
4
3
2
2
4
2
4
Таким образом, установлено, что заметное снижение концентраций некоторых макросолей (NHNO, CaCl), с одновременной оптимизацией их соотношений в питательной среде с другими макросолями, замена соли KHPO на NaHPO на фоне применения стандартной (не уменьшенной) прописи микроэлементов и хелата железа по Мурасиге и Скуга, заметно повышает процессы регенерации и развития микрорастений на этапе укоренения побегов.
Использование предложенной питательной среды для укоренения микропобегов винограда в условиях in vitro обеспечивает по сравнению с существующей следующие преимущества:
1. Повышает количество укоренных побегов винограда in vitro, срезанных с этапа пролиферации, и соответственно выход укорененных микрорастений в среднем на 20,0-30,0%. Соответственно снижает количество отбракованных эксплантов из-за некроза и отсутствия развития.
2. Заметно улучшает развитие микрорастений винограда, ростовые процессы при этом ускоряются минимум в два раза.
3. В разработанной питательной среде для достижения значительного положительного эффекта предусмотрено использование стандартных и общепринятых (в клональном микроразмножении растений) компонентов и не требуется дополнительно применение редких или малоизученных физиологически активных веществ.