Способ прогнозирования прогресса папилломавирусной инфекции у пациенток с хроническим рецидивирующим ВПЧ - ассоциированным цервицитом
METHOD FOR PREDICTING THE PROGRESS OF PAPILLOMAVIRUS INFECTION IN PATIENTS WITH CHRONIC RECURRENT INFLUENZA ASSOCIATED CERVICITIS

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано в гинекологических стационарах и амбулаторных условиях женских консультаций и поликлиник для прогнозирования прогресса папилломавирусной инфекции у пациенток с хроническим рецидивирующим ВПЧ-ассоциированным цервицитом.
Цель изобретения - повышение точности прогнозирования прогресса ПВИ у пациенток с ВПЧ-ассоциированным цервицитом, что позволит выбрать правильную тактику ведения.
Актуальность разработанного способа определяется высокой частотой заболеваний шейки матки, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией (ПВИ), поскольку характеризуются выраженной контагиозностью и высоким онкогенным потенциалом вируса [Хронический цервицит и ВПЧ-инфекция в репродуктивном возрасте. Пути снижения диагностической и лечебной агрессии / Т.С. Качалина, Н.М. Шахова, О.В. Качалина и др. // Акушерство, гинекология и репродукция. - 2012. - №4. - С. 6-12]. В настоящее время длительная персистенция вируса папилломы человека (ВПЧ) рассматривается как этиологический фактор дисплазии шейки матки, с высоким риском последующего озлокачествления, что неоднократно подтверждено работами отечественных и зарубежных исследователей [Хронический цервицит и ВПЧ-инфекция в репродуктивном возрасте. Пути снижения диагностической и лечебной агрессии / Т.С. Качалина, Н.М. Шахова, О.В. Качалина и др. // Акушерство, гинекология и репродукция. - 2012. - №4. - С. 6-12; Nagai Y. Persistence of human papillomavirus infection after therapeutic conization for CIN 3: is it an alarm for disease recurrence? / Y. Nagai, T. Maehama, T. Asato, K. Kanazawa // Gynecol Oncol. - 2000. - Vol. 79, N 2. - P. 294-299]. По результатам отечественных исследований среднее время элиминации ВПЧ в возрасте 18-25 лет составляет от 1,5 до 2 лет у каждой второй пациентки. Актуальность проблемы объясняется существенным «омоложением»: каждый пятый рак диагностируется в возрастной группе от 15 до 39 лет, а 42,4% выявленных CIN II-CIN III - до 35 лет [Бычкова, О.С. Современные представления о папилломавирусной инфекции у детей и подростков: эпидемиология, этиология и патогенез (обзор литературы) [Текст] / О.С. Бычкова В.Ф. Коколина // Репродуктивное здоровье детей и подростков. - 2010. - №1. - С. 43-49]. Одним из ключевых звеньев патогенеза хронизации процесса является нарушение соотношения про- и противовоспалительных цитокинов. Нарушение иммунологического равновесия ведет к запуску самоподдерживающегося вялотекущего воспалительного процесса, развитию вторичного иммунодефицитного состояния. В настоящее время в клинических исследованиях изучение цитокинов используют как достоверный диагностический инструмент прогнозирования течения и исхода инфекционного процесса. В то же время активация или угнетение цитокинов зависит от функционирования врожденного иммунитета, за который отвечают TLR. Одним из современных направлений развития диагностики предраковых и онкологических заболеваний стало определение в сыворотке крови онкомаркеров при помощи иммуноферментного анализа. В настоящее время для оценки распространенности опухолевого процесса и динамики его течения активно используется уровень экспрессии онкосупрессора р53, активно участвующего в апоптозе и онкомаркера p16INK4α, выявляемого практически в 100% случаев при раке шейки матки [Кондриков Н.И. Значение иммуногистохимического определения биомаркеров плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки // Акушерство и гинекология. - 2010. - с. 44-47].
Известны следующие способы прогнозирования прогрессирования ПВИ:
1. Способ прогнозирования рака шейки матки при доброкачественных и предраковых процессах шейки матки у женщин репродуктивного возраста. Данный способ включает в себя определение клинических факторов риска развития рака шейки матки, метилирования генов MLH1, HIC1, RASSF1A, MGMT, N33, CDH1 в биоптате шейки матки и расчет коэффициента вероятности развития рака шейки матки p, где:
p - коэффициент вероятности риска развития рака шейки матки;
e - основание натурального логарифма, равное 2,71828182845904;
z=2,4274+2,2163*X1+0,3791*X1+0,528*X3+1,1373*X4+1,2187*X5+2,1587*X6+26,5802*X7+1,3323*Х8+1,9323*Х9+1,8596*Х10+1,6689*Х11+1,2123*Х12+1,0690*Х13;
X1 - морфотип (доброкачественные процессы - 1, CIN I - 2, CIN II - 3, CIN III - 4),
Х2 - метилирование MLH1 (значения: есть - 1, нет - 0),
Х3 - метилирование MGMT (значения: есть - 1, нет - 0),
Х4 - метилирование N33 (значения: есть - 1, нет - 0),
Х5 - метилирование RASSF1 (значения: есть - 1, нет - 0),
Х6 - метилирование HIC1 (значения: есть - 1, нет - 0),
Х7 - метилирование CDH1 (значения: есть - 1, нет - 0),
Х8 - ВПЧ высокого риска (значения: есть - 1, нет - 0),
Х9 - дисплазия шейки матки в анамнезе (значения: есть - 1, нет - 0),
X10 - эрозия шейки матки в анамнезе (значения: есть - 1, нет - 0),
X11 - травмы шейки матки после родов/абортов (значения: есть - 1, нет - 0),
X12 - ИППП (значения, есть - 1, нет - 0);
Х13 - отягощенная онкологическая наследственность (значения: есть - 1, нет - 0) и при величине р больше 0,6 прогнозируют высокую вероятность риска развития рака шейки матки, при р, равном 0,3-0,59, - умеренную вероятность, при р меньше 0,29 - низкую вероятность. На основании полученных данных можно определить 3 группы пациенток:
- с низкой вероятностью развития рака - р=0,0-0,29;
- с умеренной вероятностью развития рака - р=0,3-0,59;
- с высокой вероятностью развития рака - р=0,6-1,0.
В предлагаемой формуле должен указываться морфотип (доброкачественные процессы - 1, CIN I - 2, CIN II - 3, CIN III - 4), однако не всегда папилломавирусная инфекция на начальных этапах либо в случае рецидивирования после хирургического лечения имеет клинические проявления на шейке матки до CIN 1-3). Кроме того, данная формула достаточно загромождена переменными и трудна для восприятия практикующему врачу-гинекологу. Это является недостатками данного способа.
2. Способ прогнозирования варианта течения заболевания у больных с плоскоклеточными эпителиальными поражениями низкой степени на фоне папилломавирусной инфекции.
В заявленном способе используют последовательный анализ Вальда. Рассчитывают диагностический коэффициент ДК для каждого из признаков по формуле ДК=101g*(P1/P2), где Р1 - относительная частота признака при первом верифицируемом состоянии, выраженная в долях единицы; Р2 - относительная частота признака при втором верифицируемом состоянии. Учитывают такие признаки, как: вирусная нагрузка вируса папилломы человека (ВПЧ) 16, 18 типов; клинико-кольпоскопический индекс; иммуногистохимический индекс p16ink4α; возраст; начало половой жизни; интервал от менархе до сексуального дебюта. При сумме ДК менее минус 13 битов вероятность благоприятного исхода LSIL составляет 95%, при ДК от плюс 13 до плюс 19 битов вероятность перехода LSIL в плоскоклеточное интраэпителиальное поражение высокой степени (HSIL) составляет 95%, при ДК более плюс 20 битов - вероятность 99%. Способ позволяет прогнозировать вариант течения плоскоклеточного интраэпителиального поражения низкой степени на фоне папилломавирусной инфекции. Недостатком известного способа является ограниченность применения данного способа только для пациенток с диагностированной ЦИН низкой степени.
Заявляемый способ осуществляется следующим образом.
На первом этапе в одноразовую пластиковую пробирку с 200 мкл раствора антикоагулянта (0,05М раствор ЭДТА) собиралось 2000 мкл венозной крови пациенток с ВПЧ-ассоциированным цервицитом. Затем в пробирку типа «Эппендорф» с замком вносилась цельная кровь в количестве 1000 мкл и центрифугировалась со скоростью 3000 об/мин на высокоскоростной центрифуге «MiniSpin» («Eppendorf», Германия) при комнатной температуре в течение 5 мин, плазма удалялась пипеткой и пробирка выдерживалась при -20°C в течение 1 часа. Содержимое полностью размораживалось при комнатной температуре, и в пробирку вносился реактив «ДНК-экспресс-кровь» в соотношении 500 мкл цельной крови к 500 мкл реактива. Полученная смесь тщательно перемешивалась на микроцетрифуге-вортексе «MicroSpin FV-2400» (Biosan, Латвия). Затем пробирка со смесью прогревалась при 99°C в течение 15 минут в твердотельном термостате «Гном» (НПФ «ДНК-технология», Россия). Полученный супернатант использовался в качестве исследуемого образца ДНК.
На втором этапе готовились рабочие смеси реагентов для амплификации с реакционной смесью НОРМА и ПАТОЛОГИЯ из расчета на 1 пробу: 17,5 мкл разбавителя, 2,5 мкл реакционной смеси, 0,2 мкл Taq-полимеразы. Пробирки центрифугировались в течение 3-5 секунд при 1500-3000 об/мин на микроцентрифуге-вортексе, затем переносились в прогретый до температуры +94°C программируемый термостат (амплификатор) «Терцик» (НПФ «ДНК-технология», Россия) с точным типом регулирования, и проводилась амплификация.
На конечном этапе проводилось разделение продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза по следующей схеме:
1. В аппарат для электрофореза заливался ТАЕ буфер, приготовленный на дистиллированной воде разбавлением 50×ТАЕ в 50 раз (pH=8,3).
2. Готовилась 3% агароза из расчета на 1 гель: к 1,5 г агарозы добавить 1 мл 50×ТАЕ буфера и 55 мл дистиллированной воды (включен запас на испарение).
3. Приготовленная смесь расплавлялась на электрической плите на небольшой мощности. К 50 мл расплавленной агарозы добавлялось 5 мкл 1% раствора бромистого этидия.
4. Расплавленная агароза сразу же заливалась в планшет для заливки геля. Для получения в агарозном геле карманов для нанесения образцов устанавливалась на планшет гребенка, используя зажим типа «бульдог», после застывания геля зажим убирался.
5. В карманы геля наносилось по 10 мкл амплификата в последовательности, соответствующей нумерации проб.
6. Подключалась электрофоретическая камера к источнику питания и задавалось напряжение, соответствующее напряженности электрического поля 10-15 В/См геля. Проводилось электрофоретическое разделение продуктов амплификации в направлении от катода (-) к аноду (+) в течение 15 мин. Контроль за электрофоретическим разделением осуществлялся визуально по движению полосы красителя.
7. Гель из формы переносился на стекло УФ-трансиллюминатора и результаты анализировались визуально с защитным экраном и при помощи программы. Фрагменты анализируемой ДНК проявлялись в виде светящихся оранжево-красных полос под УФ-излучением с длиной волны 310 нм. Результаты интерпретировались в следующих вариантах: нормальная гомозигота, гетерозигота, мутантная гомозигота.
При выявлении у пациентки аллеля Ser в гене TLR6 и гомозиготного генотипа Pro/Pro или Arg/Arg в гене ТР53 прогнозируют низкий риск прогрессирования ПВИ; при выявлении у пациентки мутации Pro/Pro в гене TLR6 либо гетерозиготного генотипа Pro/Arg в гене ТР53 прогнозируют средний риск прогрессирования ПВИ; при определении у пациентки мутации Pro/Pro в гене TLR6 и гетерозиготного генотипа Pro/Arg в гене ТР53 прогнозируют высокий риск прогрессирования ПВИ.
Предлагаемый способ основан на следующем исследовании.
На первом этапе были обследованы 48 пациенток с ВПЧ-ассоциированным хроническим цервицитом и 24 женщины без патологии шейки матки. Пациентки с ВПЧ-ассоциированным цервицитом вошли в основную группу. Контрольную группу составили женщины без патологии шейки матки. Группы были идентичны по возрастному, соматическому и психологическому исходному состоянию.
Критерии включения: пациентки с ВПЧ-ассоциированным хроническим рецидивирующим цервицитом.
Критерии исключения: отсутствие ПВИ у пациентки, экстрагенитальная патология инфекционного генеза, РШМ, нежелание самой женщины.
В ходе исследования были изучены взаимосвязи точечных нуклеотидных мутаций промоторных участков генов большинства цитокинов и TLR. Определялись генетические полиморфизмы TLR: Мутация 1 толл-подобного рецептора 9, полиморфизма A2848G в гене TLR9, Мутация толл-подобного рецептора 2, полиморфизма Arg753Gln в гене TLR2, Мутация толл-подобного рецептора 3, полиморфизма Phe412Leu в гене TLR3, Мутация толл-подобного рецептора 4, полиморфизма Asp299Gly в гене TLR4, Мутация 2 толл-подобного рецептора 4 TLR4 Thr399lle (rs4986791), Мутация толл-подобного рецептора 6, полиморфизма Ser249Pro в гене TLR6, Мутация толл-подобного рецептора 9, полиморфизма Т-1237С в гене TLR9.
Определялась мутация белка р53 ТР53 (Pro47Ser) и мутация 2 белка р53 ТР53 (Pro72Arg).
Также изучались генетические полиморфизмы интерлейкинов: Мутация интерлейкина 2, полиморфизма T-330G в гене IL2, Мутация интерлейкина 6, полиморфизма C-174G в гене IL6, Мутация - 3 интерлейкина 10, полиморфизма С-819Т в гене IL10, Мутация интерлейкина 12В, полиморфизма А1188С в гене IL12B, Мутация интерлейкина 1b полиморфизма Т-31С в гене IL1b, Мутация 2 интерлейкина 1b IL1b Т-511С, Мутация интерлейкина 4 IL4 С-589Т, Мутация - 1 интерлейкина 10 IL10 G-1082А, Мутация интерлейкина 17А IL17A G-197A.
В ходе молекулярно-генетического исследования при сравнении частот встречаемости аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов цитокинов у обследованных женщин групп не было выявлено статистически значимых отличий.
При сравнении частот встречаемости аллелей и генотипов полиморфных маркеров в гене ТР53 выявлена значительная вариабельность в генотипах гена Pro72Arg, при анализе полиморфизма Arg72Pro в гене ТР53 значимых различий не выявлено.
Частоты встречаемости аллелей и генотипов полиморфного маркера гена Pro72Arg в гене ТР53 выявило вариабельность в генотипах в группах сравнения, за счет гетерозиготного генотипа Pro/Arg, который встречался у пациенток с ВПЧ-ассоциированным цервицитом чаще в 2 раза (58,3% против 29,2% соответственно в контрольной группе) (p<0,01) (табл. 1).
При сравнении частот встречаемости аллелей и генотипов полиморфных маркеров TLR выявлена значительная вариабельность в генотипах гена TLR6. При сравнении частот встречаемости аллелей и генотипов полиморфных маркеров TLR выявлена значительная вариабельность в генотипах гена TLR6.
Частоты встречаемости аллелей и генотипов полиморфного маркера гена TLR6 распределились следующим образом: аллель Pro встречалась чаще у пациенток основной группы, чем в контрольной - 58,4% против 30,2%, а аллель Ser встречалась реже - в 41,6% и 69,8% случаях соответственно. Также отмечено значимое увеличение частоты мутантных гомозигот Pro/Pro у больных основной группы, что в 12,5 раза чаще, чем в контрольной - 50% против 4,1% (p<0,01). У каждой второй обследованной пациентки была определена гомозигота Pro/Pro. Количество гетерозигот Ser/Pro значимо различалось, за счет повышения генотипа Pro/Pro у пациенток основной группы. Частота встречаемости нормальной гомозиготы Ser/Ser не отличались - 33,3% против 50,0%. (табл. 2).
При дальнейшем анализе выявлена зависимость между наличием мутантной гомозиготы Pro/Pro TLR6 у больных основной группы и длительностью заболевания. Так, средняя продолжительность заболевания на момент обследования у женщин без мутации в гене TLR6 в основной группе составила - 2,5±1,2 года, а у пациенток, носительниц мутантной гомозиготы Pro/Pro гена TLR 6, - 3,9±1,01 год (p<0,01) (табл. 3).
После выявления значимых различий на основе молекулярно-генетического анализа группа с ВПЧ-ассоциированным хроническим рецидивирующим цервицитом была разделена на две клинические подгруппы: 1 и 2, в которых были проанализированы иммуногенетические особенности обследуемых. В подгруппу №1 вошло 30 пациенток с ВПЧ-ассоциированным хроническим рецидивирующим цервицитом с нарастанием количественной вирусной нагрузки ПВИ в динамике, в подгруппу №2 - 18 пациенток с ВПЧ-ассоциированным хроническим цервицитом с уменьшением вирусной количественной нагрузки в динамике. Для определения значимости различий исходов в зависимости от воздействия фактора риска и оценки силы связи между фактором риска и исходом использовались таблицы сопряженности (табл. 4, 5)
Таким образом, сила связи между наличием у пациенток с ВПЧ-ассоциированным хроническим рецидивирующим цервицитом гетерозиготного генотипа Pro/Arg в гене ТР53, мутантной гомозиготы Pro/Pro TLR6 и прогрессированием ПВИ определена как сильная (p<0,01).
Предлагаемый способ реализован в следующих клинических наблюдениях.
ПРИМЕР №1
6
6
3
Больная М.А., 29 лет, обратилась с жалобами на скудные выделения бело-желтого цвета из влагалища в течение 16 месяцев. Не замужем, незащищенные половые контакты в течение года отрицает. До обращения дважды с периодичностью 6 месяцев обнаружен ВПЧ 33 тип в количестве 3,8*10 и 2,4*10 копий/100 тыс. клеток. Прошла 2 курса противовирусной терапии по поводу вагинита и цервицита бактериально-вирусной этиологии. При осмотре шейки матки в зеркалах обнаружена гиперемия вокруг цервикального канала, выделения - бели умеренные. При бимануальном осмотре патологических изменений не выявлено. Кольпоскопически диагностирован хронический цервицит с признаками вирусного поражения (при проведении пробы Шиллера обнаружена йоднегативная зона с четкими контурами по передней губе). Бактериоскопически-промежуточный тип мазка на флору. В соскобе из цервикального канала методом ПЦР ДНК обнаружен ВПЧ 33 тип в количестве 2,5*10 копий/100 тыс. клеток. Пациентке выставлен диагноз. Хронический рецидивирующий ВПЧ-ассоциированный цервицит.
Проведено генотипирование полиморфизмов Ser249Pro в гене TLR6 и Pro72Arg в гене ТР53. Обнаружено, что пациентка имеет гомозиготный генотип Ser/Ser в гене TLR6 и гомозиготу Pro/Arg в гене ТР53.
Таким образом, прогнозируется низкий риск прогрессирования ПВИ, что подтверждается динамикой снижения количественной нагрузки ВПЧ 33 типа.
ПРИМЕР №2
3
3
Больная П.Ю., 37 лет, обратилась с жалобами на незначительные выделения молочного цвета из влагалища в течение 18 месяцев. Замужем, незащищенные половые контакты в течение года отрицает. До обращения 8 месяцев назад обнаружен ВПЧ 16 тип в количестве 2,9*10 копий/100 тыс. клеток. Прошла курс противовирусной терапии по поводу хронического цервицита бактериально-вирусной этиологии. При осмотре шейки матки в зеркалах выявлены гиперемия вокруг цервикального канала, выделения - бели умеренные. При бимануальном осмотре патологических изменений не выявлено. Кольпоскопически диагностирована эктопия шейки матки, осложненная хроническим цервицитом вирусной этиологии (при проведении пробы Шиллера обнаружена йоднегативная зона с четкими контурами в зоне трансформации). Бактериоскопически-промежуточный тип мазка на флору. В соскобе из цервикального канала методом ПЦР ДНК обнаружен ВПЧ 16 типа в количестве 4,3*10 копий/100 тыс. клеток. Пациентке выставлен диагноз: Хронический рецидивирующий ВПЧ-ассоциированный цервицит.
Проведено генотипирование полиморфизмов Ser249Pro в гене TLR6 и Pro72Arg в гене ТР53. У пациентки обнаружена мутантная гомозигота Pro/Pro в гене TLR6 и гомозигота Arg/Arg в гене ТР53. Следовательно, прогнозируется средний риск прогрессирования ПВИ, что доказывается отсутствием как регресса, так и прогресса после комплексной противовирусной терапии.
ПРИМЕР №3
3
6
8
Больная Е.В., 23 года, обратилась с целью профилактического осмотра. Периодически имеет жалобами на выделения желтого цвета из влагалища в течение длительного времени, усиливающиеся после менструации. Замужем, беременность - 1, роды - 1. В течение 30 месяцев трижды лечилась по поводу ПВИ. Обнаружен ВПЧ 39 и 51 типов в количестве 2,1*10 и 4,7*10 копий/100 тыс. клеток. Наблюдается с диагнозом: эктропион, осложненный ВПЧ-ассоциированным цервицитом. После отсутствия положительной динамики в консервативной терапии после родов была произведена химическая деструкция шейки матки на фоне противовирусной терапии. При объективном исследовании в зеркалах, на шейке матки деформирована, слегка гипертрофирована, выделения бели. При бимануальном осмотре патологических изменений не выявлено. При кольпоскопии выявлена рубцовая деформация шейки матки после химической деструкции. Хронический цервицит. LSIL (нежный ацетобелый эпителий, йоднегативная зона, уходящая в цервикальный канал). Бактериоскопически констатирован вагинит неспецифической этиологии. В соскобе из цервикального канала методом ПЦР ДНК 51 типа ВПЧ в количестве 5,9*10 копий/100 тыс. клеток. У пациентки при иммуногенетическом обследовании обнаружена мутация Pro/Pro в гене TLR6 и гетерозиготный генотип Pro/Arg в гене ТР53. Таким образом, прогнозируется высокий риск прогрессирования ПВИ, что подтверждается клиническими данными и нарастанием количества ВПЧ, несмотря на проведенные три курса противовирусной терапии и деструкцию шейки матки.
Таким образом, заявленный способ позволяет с высокой степенью достоверности прогнозировать прогресс ПВИ у пациенток хроническим, рецидивирующим, ВПЧ-ассоциированным цервицитом, что в дальнейшем поможет выбрать правильную тактику ведения таких пациенток.
Преимуществами заявляемого способа является:
1. Способ позволяет достоверно спрогнозировать прогресс ПВИ у пациенток хроническим, рецидивирующим, ВПЧ-ассоциированным цервицитом.
2. Способ является простым и доступным для практических врачей и может использоваться в амбулаторных условиях.
3. Способ не требует применения многочисленных дорогостоящих реактивов, оборудования и позволяет снизить материальные затраты при диагностике данной патологии, в связи с чем является более рациональным и экономически оправданным.