Исследование регуляции экспрессии ompF порина - основного белка наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis

Вестник ДВО РАН. 2014. № 1

Быстрицкая Евгения Петровна

Евгения Петровна начала работать в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН в 2005 г., будучи студенткой 2-го курса отделения кафедры биоорганической химии и биотехнологии Дальневосточного государственного университета. За время обучения в ДВГУ выполнила три курсовые и две дипломные работы под руководством к.м.н. М.П. Исаевой.

В 2008 г., с отличием окончив университет, поступила в аспирантуру ТИБОХ ДВО РАН (руководитель М.П. Исаева). Основное направление исследований в рамках диссертационной работы - изучение экспрессии пориновых генов Yersinia pseudotuberculosis с использованием ПЦР в режиме реального времени, а также флуоресцентных репортерных конструкций. Результаты работы Е.П. Быстрицкой представлены на международных и российских конференциях (XIV Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, г. Владивосток, сентябрь 2012 г., 11th International Symposium on Yersinia, Suzhou, China, June, 2013, 2nd Far Eastern International Symposium on Life Sciences, Vladivostok, Russia, September, 2013). Исследования по теме диссертации поддержаны молодежным грантом ДВО РАН (2013 г.) и ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» от Министерства образования и науки РФ (2012-2013 гг.). Кроме того, в 2011 г. и 2012 г. Евгения Петровна выиграла конкурсы на выполнение НИОКР по программе «УМНИК». В январе 2013 г. по результатам конкурса была приглашена на Зимнюю научную школу для молодых ученых «Современная биология и биотехнологии будущего», где представила свой исследовательский проект. Евгения является автором и соавтором 13 научных работ, в том числе 3 статей, 2 из которых опубликованы в зарубежных и 1 - в российском журналах.

За время работы в лаборатории морской биохимии ТИБОХ ДВО РАН Е.П. Быстрицкая освоила методы молекулярной биологии, генной инженерии, биоинформатики, микробиологии, необходимые для успешного решения поставленных перед ней научных задач, а также новые для лаборатории методы, такие как интеграция генно-инженерных конструкций в геном с использованием технологии суицидных плазмид, работа с флуоресцентными репортерными конструкциями.

Евгения Петровна занимается педагогической деятельностью: участвует в проведении Большого практикума по рекомбинантным ДНК у студентов Школы естественных наук ДВФУ, научных мероприятий среди школьников и студентов на базе гимназии ДВФУ и муниципальных общеобразовательных школ.

УДК 577.218

Е.П. БЫСТРИЦКАЯ

Исследование регуляции экспрессии OmpF порина - основного белка наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis

Исследовано влияние температуры культивирования, осмолярности среды, доступности кислорода и воздействие антибиотика на экспрессию гена OmpF Yersinia pseudotuberculosis с помощью метода ПЦР в режиме реального времени. Установлено, что температура является главным фактором, определяющим транскрипцию ompF. Уровень экспрессии ompF возрастает в холодовых условиях и снижается при температуре теплокровного организма (37оС). Ограничение доступа кислорода, изменение концентрации NaCl и воздействие хлор-амфеникола значительного влияния на уровень экспрессии ompF не оказывают.

Ключевые слова: ompF, экспрессия гена, количественная ПЦР.

Study into regulation of expression of OmpF porin, the main outer membrane protein of Yersinia pseudotuberculosis. E.P. BYSTRITSKAYA (G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok).

The impact of cultivation temperature, medium osmolarity, the availability of oxygen and the effect of an antibiotic on Yersinia pseudotuberculosis ompF gene expression were studied using Quantitative real time PCR. We found out the cultivation temperature to be the primary factor determining ompF gene transcription, as ompF expression level was increasing under cold conditions, while decreasing at the temperature of a warm-blooded organism (37 оС). Oxygen limitation, NaCl concentration change and chloramphenicol addition did not have any signifi cant impact on ompF transcription.

Key words: ompF, gene expression, QPCR.

Бактерия Yersinia pseudotuberculosis является возбудителем псевдотуберкулеза - острой кишечной инфекции, характеризующейся полиморфизмом клинических проявлений, затяжным и хроническим течением, развитием вторично-очаговых форм [7]. Возбудитель псевдотуберкулеза способен активно расти и размножаться как во внешней среде, так и в теплокровном организме, сочетая сапрофитный и паразитический образ жизни [1]. Важным свойством микроорганизма являются рост при низких температурах (4-8 оС), устойчивость к замораживанию, длительное существование во внешней среде (воде, почве, на различных пищевых продуктах). Основной резервуар возбудителя и источник заболевания человека - грызуны.

Изменение проницаемости наружной мембраны (НМ) является ответной реакцией клетки на воздействие различных факторов и может рассматриваться в качестве одного из механизмов адаптации бактерии. Контролируемую проницаемость мембраны для низкомолекулярных гидрофильных соединений обеспечивают так называемые неспецифические порины, основные (в количественном отношении) белки НМ грамотрицательных бактерий, которые функционируют как поры [2, 4]. Одним из таких белков является OmpF порин, уровень экспрессии которого колеблется в ответ на изменения условий окружающей среды. Показано, например, что при недостатке питательных веществ, низкой температуре и пониженном осмотическом давлении в клетках ряда бактерий наблюдается преимущественная экспрессия этого белка [3].

Известно, что гидрофильные антибиотики для проникновения в клетку используют неспецифические порины [14]. Для некоторых энтеробактерий показано, что негативная регуляция ompF гена, приводящая к уменьшению числа пор в НМ, является общим

БЫСТРИЦКАЯ Евгения Петровна - аспирант (Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Еляко-ва ДВО РАН, Владивосток). E-mail: belyjane@gmail.com

механизмом развития антибиотикорезистентносш [12, 13]. Что касается Y. pseudotuberculosis, особенности регуляции экспрессии его OmpF порина в условиях антибио-тикового стресса не известны. Механизм регуляции поринов является комплексным, их экспрессия находится под контролем многих транскрипционных и трансляционных факторов, большинство из которых, например micF, ompR, H-NS и др., участвуют в глобальном стрессовом ответе бактерий [5].

Цель данной работы - изучение уровня экспрессии ompF гена, кодирующего основной порин НМ Y. pseudotuberculosis, при различных условиях культивирования и в условиях антибиотикового стресса.

В исследовании использован штамм Y. pseudotuberculosis IP32953. Бактериальную культуру наращивали при различных температурах, с разным уровнем доступности кислорода, при разных концентрациях NaCl, а также в отсутствие или в присутствии антибиотика - хлорамфеникола.

Для определения экспрессии ompF гена и регуляторных факторов использовали метод ПЦР в режиме реального времени с обратной транскрипцией, позволяющий определить уровень транскрипции генов. Количественные эксперименты проводили на одноцепо-чечной кДНК с использованием ген-специфичных праймеров, GoTaq ДНК-полимеразы (Promega, США) и флуоресцентного интеркалирующего красителя Eva Green (Biotium, США) согласно рекомендациям производителей на амплификаторе iCycler iQ5 (Bio-rad, США). Все праймеры, использованные в работе, сконструированы с помощью программы Vector NTI10 на основе нуклеотидных последовательностей 16SrDNA, ompF, micF, ompR генов Y. pseudotuberculosis. Для каждого образца реакцию выполняли в трех повторах.

Полученные результаты стандартизировали относительно уровня транскрипции гена «домашнего хозяйства» 16S rDNA. Уровень экспрессии генов оценивали с помощью метода относительных измерений AACt. Расчет средних значений и стандартного отклонения, а также построение графиков осуществляли в программах STATISTICA 6.0 и Microsoft Excel 2013.

Влияние температуры культивирования. Температура - один из наиболее важных факторов, определяющих устойчивость бактерий рода Yersinia к условиям окружающей среды. Y. pseudotuberculosis является психротолерантным микроорганизмом и способна существовать в широком диапазоне температур (4-42 °С). Поэтому экспрессию ompF исследовали при таких температурах (8; 26; 37 °С), которые свойственны физиологическим условиям существования данной бактерии.

В результате экспериментов обнаружено, что в большинстве случаев при снижении температуры с 26 до 8 °С уровень транскрипции ompF возрастает примерно в 2-4 раза (рис. 1а). Интересно, что при культивировании в среде с нормальной осмолярностью (150 мМ NaCl) снижение температуры не вызывало значительного изменения уровня транскрипции. Повышение температуры до 37 °С сопровождалось снижением экспрессии ompF в 1,7-11,8 раза. В то же время в анаэробных условиях и гипоосмотической среде уровень транскриптов ompF оставался прежним. Подобный тип терморегуляции OmpF порина ранее наблюдался для Escherichia coli и Serratia marcescens [6, 8].

Влияние осмолярности среды. Осмолярность среды является важным абиотическим фактором, влияющим на проницаемость НМ многих грамотрицательных бактерий. Известно, что ompF относится к осморегулируемым генам и находится под контролем двух-компонентной регуляторной системы EnvZ-OmpR. Для E. coli показано, что OmpF порин является преобладающим белком в условиях низкой осмолярности [9].

Для исследования влияния осмолярности на транскрипцию ompF гена Y. pseudotuber-culosis бактериальную культуру наращивали в средах с различным содержанием NaCl: 0 мМ (гипо-), 150 мМ (нормо-), 300 мМ (гиперосмотические среды).

Как можно видеть (рис. 1б), осмолярность среды не оказывала значительного влияния на уровень экспрессии ompF Y. pseudotuberculosis. Лишь в холодовых аэробных условиях

Рис. 1. Относительный уровень экспрессии ompF гена в штамме Y. pseudotuberculosis IP32953 при разных условиях культивирования. а - влияние температуры на уровень экспрессии ompF. Референсное условие - экспрессия ompF при 26°С; б - влияние осмолярности среды на уровень экспрессии ompF. Референсное условие - экспрессия ompF при концентрации NaCl 150 мМ; в - влияние доступности кислорода на уровень экспрессии ompF. Референсное условие - экспрессия ompF в аэробных условиях. О2- - анаэробные условия, О2+ - аэробные условия. Столбцы отражают результаты измерений трех повторов с учетом стандартного отклонения

гипоосмотическая среда приводила к увеличению транскрипции данного гена, что объясняется оптимальным сочетанием факторов окружающей среды, предпочтительных для синтеза OmpF порина. В гиперосмотической среде экспрессия ompF Y. pseudotuberculosis, в отличие от экспрессии этого белка у E. coli [9], оставалась на прежнем уровне (по сравнению с 150 мМ NaCl).

Влияние доступности кислорода. Y. pseudotuberculosis как факультативный анаэроб способна размножаться в кислородной и бескислородной средах. Доступность кислорода является важным фактором окружающей среды, который также оказывает влияние на экспрессию белков НМ. Например, для E. coli показано, что OmpF экспрессируется преимущественно в аэробных условиях [11].

Для исследования влияния дефицита кислорода на уровень экспрессии ompF Y. pseudo-tuberculosis бактериальную культуру наращивали в аэробных и анаэробных условиях. Аэробные условия достигались с помощью интенсивного перемешивания на качалке (200 об/мин). Для создания анаэробных условий поверхность среды покрывали тонким слоем минерального масла и оставляли без перемешивания.

Согласно полученным результатам (рис. 1в), ограничение доступа кислорода в большинстве исследуемых условий не вызывало существенных изменений в уровне экспрессии ompF. Исключение составляла гипоосмотическая среда, наращивание в которой при температурах 8 и 26 °С приводило к уменьшению транскрипции ompF в 3-3,5 раза, что согласуется с данными, полученными ранее для E. coli [11], при температуре 37 °С транскрипция возрастала в 3,9 раза.

Влияние антибиотикового стресса. Для изучения влияния антимикробных препаратов на экспрессию основного порина нами использован антибиотик хлорамфеникол (Cm), проникающий в бактериальную клетку через пориновые каналы [10]. Методом серийных разведений выявлена его минимальная ингибирующая концентрация для штамма IP32953 Y. pseudotuberculosis - 20 мкг/мл. Уровень транскрипции ompF гена определяли после инкубирования бактериальной культуры с антибиотиком в различных концентрациях (5, 20, 50 и 100 мкг/мл) в течение часа. Установлено, что в исследуемых условиях антибиотик не оказывает существенного влияния на транскрипцию ompF (рис. 2).

Рис. 2. Относительный уровень экспрессии генов ompF, ompR, micF в штамме Y. pseudotuberculosis IP32953 при воздействии хлорамфеникола (Cm) в различных концентрациях. Референсное условие - экспрессия генов в штамме, культивируемом без антибиотика. Столбцы отражают результаты измерений трех повторов с учетом стандартного отклонения

Для E. coli известно, что такие факторы регуляции экспрессии поринов, как micF и ompR, являются факторами глобального стрессового ответа, в том числе антибиотиково-го стресса; micF, некодируемая малая РНК, контролирует экспрессию ompF на посттранскрипционном уровне. OmpR является транскрипционным фактором, который способен связываться с низкоаффинными сайтами в промоторной области ompF гена, приводя к репрессии его транскрипции [5].

В результате экспериментов нами установлено, что воздействие Cm приводит к увеличению экспрессии генов ompR и micF, причем уровень их транскрипции возрастает прямо пропорционально концентрации антибиотика. Однако, как видно из рис. 2, видимых изменений в транскрипции ompF гена не наблюдалось. По-видимому, это обусловлено недостаточной продолжительностью эксперимента, что не позволило обнаружить снижение экспрессии данного порина.

Таким образом, нами установлено, что температура оказывает существенное влияние на уровень экспрессии ompF гена Y. pseudotuberculosis. Более того, она является главным, среди исследованных, фактором, определяющим его транскрипцию. В холодовых условиях уровень экспрессии ompF возрастает, тогда как при температуре 37 °С наблюдается снижение его транскрипции. В то же время осмолярность, ограниченный доступ кислорода и воздействие хлорамфеникола не оказывают значительного влияния на уровень экспрессии ompF.

ЛИТЕРАТУРА

1. Новикова О.Д., Хоменко В.А., Емельяненко В.И., Лихацкая Г.Н., Зелепуга Е.А., Ким Н.Ю., Исаева М.П., Портнягина О.Ю., Вострикова О.П., Сидорова О.В., Соловьёва Т.Ф. OmpC-подобный порин из Yersinia pseudotuberculosis: молекулярная характеристика, физико-химические и функциональные свойства // Биол. мембраны. 2011. Т. 28, № 2. С. 95-110.

2. Buchanan S.K., Smith B.S., Venkatramani L., Xia D., Esser L., Palnitkar M., Chakraborty R., van der Helm D., Deisenhofer J. Crystal structure of the outer membrane active transporter FepA from Escherichia coli // Nature Struct. Biol. 1999. Vol. 6. P. 56-63.

3. Castillo-Keller M., Vuong P., Misra R. Novel mechanism of Escherichia coli porin regulation // J. Bacteriol. 2006. Vol. 188. P. 576-586.

4. Cowan S.W., Schirmer T., Rummel G., Steiert M., Ghosh R., Pauptit A., Jansonius J.N., Rosenbusch J.P. Crystal structures explain functional properties of two Escherichia coli porins // Nature. 1992. Vol. 358. P. 727-733.

5. De la Cruz M.A., Calva E. Complexities of porin genetic regulation // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2010. Vol. 18. P. 24-36.

6. Hutsul J.A., Worodec E. Molecular characterization of the Serratia marcescens OmpF porin, and analysis of S. marcescens OmpF and OmpC osmoregulation // Microbiol. 1997. Vol. 143. P. 2797-2806.

7. Ljungberg P., Valtonen M., Harjola V.P., Kaukoranta-Tolvanen S.S., Vaara M. Report of four cases of Yersinia pseudotuberculosis septicemia and a literature review // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1995. Vol. 14. P. 804-810.

8. Lundrigan M.D., Earhart C.F. Gene envY of Escherichia coli K-12 affects thermoregulation of major porin expression // J. Bacteriol. 1984. Vol. 157. P. 262-268.

9. Matsubara M., Mizuno T. EnvZ-independent phosphotransfer signaling pathway of the OmpR-mediated osmoregulatory expression of OmpC and OmpF in Escherichia coli // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1999. Vol. 63. P. 408-414.

10. Mortimer P.G., Piddock L.J. The accumulation of five antibacterial agents in porin-deficient mutants of Escherichia coli // J. Antimicrob. Chemother. 1993. Vol. 32. P. 195-213.

11. Ni B.N., Dorman C.J., Higgins C.F. An overlap between osmotic and anaerobic stress responses: a potential role for DNA supercoiling in the coordinate regulation of gene expression // Mol. Microbiol. 1989. Vol. 3. P. 933-942.

12. Nikaido H. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. Vol. 67. P. 593-656.

13. Nikaido H. Porins and specific diffusion channels in bacterial outer membranes // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269. P. 3905-3908.

14. Pages J.M., James C.E., Winterhalter M. The porin and the permeating antibiotic: a selective diffusion barrier in Gram-negative bacteria // Nat. Rev. Microbiol. 2008. Vol. 6. P. 893-903.