СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА ДЛЯ ТЕРАНОСТИКИ ОПУХОЛЕЙ НА ОСНОВЕ АНТИСТОКСОВЫХ НАНОФОСФОРОВ И БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ
METHOD FOR PRODUCING COMPLEX FOR TUMOR THERAPEUTICS BASED ON ANTI-STOKES NANOPHOSPHORS AND PROTEIN MOLECULES

Предлагаемое изобретение относится к области биомедицины, касается способа получения комплекса для тераностики опухолей на основе антистоксовых нанофосфоров и белковых молекул, которой может найти применение при диагностике и терапии опухолей.
На сегодняшний день разработка новых методов и подходов для диагностики и терапии патологий, в частности, злокачественных новообразований - одна из наиболее актуальных и активно развивающихся областей биомедицины. При этом стратегическими направлениями в этой области признаны: (1) персонализированный подход, основанный на определении индивидуального молекулярного профиля заболевания каждого конкретного пациента и выборе оптимального метода лечения с учетом полученной информации, 2) интегральный подход к терапии с привлечением различных механизмов воздействия на патологические клетки, 3) тщательный мониторинг проводимого лечения. Данные подходы позволяют существенно повысить эффективность лечения при значительном снижении побочных эффектов, при необходимости следить за ходом лечения и корректировать его.
В последнее десятилетие в рамках персонализированного подхода ключевую роль все больше играет «тераностика» - новое направление, подразумевающее создание мультифункциональных агентов, сочетающих в себе диагностические и терапевтические свойства [McCarthy J.R. The future of theranostic nanoagents // Nanomedicine (Lond). 2009. V.4. 1.7. P. 693-5]. Использование таких агентов позволяет одновременно проводить молекулярную диагностику патологии и специфически направленно воздействовать на опухолевые клетки, а также визуализировать распределение терапевтического агента в организме и оценивать терапевтический эффект. Таким образом, разработка подходов к конструированию соединений для тераностики полностью отвечает современным стратегическим подходам к диагностике и терапии опухолей.
4
3+
3+
3+
Наиболее перспективной платформой для создания соединений для тераностики представляются наночастицы различной природы, обладающие уникальным набором свойств, привлекательным для получения мультифункциональных биосовместимых комплексов с определенной избирательностью действия. К таким свойствам наночастиц относятся: (1) программируемость физических и химических характеристик в зависимости от размеров, состава и способов получения; (2) наличие химически-активных функциональных групп на поверхности, позволяющие легко модифицировать частицы, оптимизируя их для конкретной задачи; (3) большая площадь поверхности, позволяющая присоединять значительное количество модулей с различными функциями, в том числе направляющих/нацеливающих, терапевтических, визуализирующих; (4) оптимальный размер, определяющий преимущественное накопление наночастиц в опухолевой ткани за счет ее морфологических особенностей (так называемый EPR-эффект [Maeda Н. Tumor-selective delivery of macromolecular drugs via the EPR effect: background and future prospects // Bioconjug Chem. 2010. V.21. 1.5. P. 797-802]). Использование люминесцентных материалов для получения наночастиц открыло возможность создания комплексов с принципиально новыми оптическими свойствами, что дало толчок к развитию методов молекулярного имиджинга - неинвазивного исследования процессов в живых клетках и тканях, в том числе, на уровне целого организма. Ключевой особенностью этих люминесцентных наночастиц являются их фотофизические свойства, обеспечивающие яркую визуализацию маркированных ими структур на фоне сильного рассеяния и собственной аутофлуоресценции биологической ткани [Nadort A. et al. Quantitative imaging of single upconversion nanoparticles in biological tissue // PLoS ONE. 2013. V.8. 1.5. P. е63292]. Среди люминесцентных наночастиц особенно перспективными представляются ап-конверсионные, или антистоксовые, нанофосфоры - неорганические кристаллы NaYF, легированные ионами иттербия (Yb) и солегированный ионами эрбия (Er) или тулия (Tm). Одной из ключевых особенностей  является способность к ап-конверсии - процессу, при котором поглощение фотона с большей длиной волны ведет к эмиссии фотона с меньшей длиной волны (т.е. большей энергией). Это уникальное фотофизическое свойство обеспечивает перспективность применения антистоксовых  в биомедицинских приложениях. Спектрально выгодное положение света источника накачки (975 нм) и люминесцентного отклика в окне прозрачности биологической ткани обеспечивают глубокое проникновение света с минимальным поглощением и рассеиванием в живой ткани. При этом возбуждение  в инфракрасном спектральном диапазоне сопровождается незначительной автофлуоресценцией биологической ткани. Другой важной отличительной чертой  считается продолжительное время жизни люминесценции, измеряемое в миллисекундах, что позволяет реализовать простые оптические схемы отложенной регистрации, способные нивелировать фон автофлуоресценции.
Для придания нанофосфорам специфичности по отношению к конкретной клетке-мишени (направленности действия), а также потенциальной специфической токсичности, необходимо присоединить к наночастице узнающие и токсические молекулы, наиболее перспективными среди которых являются антитела, их фрагменты или альтернативные узнающие белки, и высокоэффективные природные белковые токсины.
Таким образом, разработка методов получения комплексов антистоксовых  с белковыми молекулами, обеспечивающих создание высокоэффективных противоопухолевых тераностических агентов, представляется на сегодняшний день крайне актуальной задачей.
Так, из [Grebenik ЕА et al. Specific visualization of tumor cells using upconversion nanophosphors // Acta Naturae. 2014; 6(4): 48-53] известен способ получения комплексов для флуоресцентного маркирования опухолевых клеток на основе антистоксовых  и молекул противоопухолевого антитела с использованием системы адапторных белков барназа-барстар, известных своим высоким сродством друг к другу. Способ предполагает (1) покрытие наночастиц антистоксовых  сополимером малеинового ангидрида и 1-октадецена (РМАО) для придания частицам гидрофильности, (2) активацию поверхностных карбоксильных групп РМАО с помощью кросслинкеров 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид гидрохлорида (EDC) и N-гидроксисульфосукцинимида (sulfo-NHS), (3) ковалентную конъюгацию антистоксовых  с белком барстаром за счет образования пептидной связи между активированными карбоксильными группами РМАО и аминогруппами в составе барстара, (4) предварительное объединение опухолеспецифичного одноцепочечного антитела 4D5scFv с белком барназой, предполагающее получение генно-инженерной конструкции, кодирующей эти два белка в виде единой полипептидный цепи; (4) сборку комплексов антистоксовых  с опухолеспецифичным антителом за счет взаимодействия барстара, конъюгированного с наночастицей, и барназы, объединенной с антителом 4D5scFv. Данный подход имеет ряд недостатков, среди которых необходимость предварительных трудоемких модификаций как исходных наночастиц, так и антитела и, в связи с этим, многостадийность и сложность протокола получения комплексов. Стоит отметить, что химические манипуляции с белками могут привести к потере их функциональных свойств. Кроме того, в данном способе не контролируется сайт присоединения барстара к наночастице, таким образом, белок присоединяется любой из аминогрупп в его составе и оказывается ориентированным в раствор случайным образом. Поскольку для последующего взаимодействия барстара с барназой необходима строго определенная ориентация этих двух белков относительно друг друга, эффективность итоговой сборки комплекса может быть неоптимальной. Наконец, данный способ не приводит к получению комплекса для тераностики опухолей, поскольку содержит только дигностический компонент (люминесцирующий ), но не содержит терапевтического (токсического) агента в своем составе.
Y
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому изобретению является способ получения комплексов для тераностики опухолей на основе радиоактивных антистоксовых  и молекул противоопухолевого белка таргетного бактериального токсина, известный из [Guryev E.L. et al. Radioactive (90) upconversion nanoparticles conjugated with recombinant targeted toxin for synergistic nanotheranostics of cancer // Proc Natl Acad Sci USA. 2018; 115(39): 9690-9695], принятый за ближайший аналог (прототип).
Способ предполагает прямое ковалентное соединение наночастиц с белковыми молекулами и включает: (1) покрытие наночастиц антистоксовых  сополимером малеинового ангидрида и 1-октадецена (РМАО) для придания частицам гидрофильности, (2) активацию поверхностных карбоксильных групп РМАО с помощью кросслинкеров 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид гидрохлорида (EDC) и N-гидроксисульфосукцинимида (sulfo-NHS), (3) ковалентную конъюгацию антистоксовых  с белком таргетным бактериальным токсином DARPin-PE40 за счет образования пептидной связи между активированными карбоксильными группами РМАО и аминогруппами в составе DARPin-PE40.
Основным недостатком способа по прототипу является отсутствие контроля сайта присоединения белковой молекулы таргетного токсина DARPin-PE40 к  таким образом, белок присоединяется к  любой из имеющихся в его составе аминогрупп и оказывается ориентированным в раствор случайным образом. Это может нарушить его функциональные свойства, а именно, эффективное связывание с опухолевой клеткой за счет направляющего модуля DARPin и токсический эффект за счет бактериального токсина РЕ40.
В задачу изобретения положена разработка нового способа получения комплекса для тераностики опухолей на основе антистоксовых  и белковых молекул.
Техническим результатом от использования изобретения является повышение контроля сайта присоединения белковой молекулы к поверхности  обеспечивающего сохранение функциональных свойств белка и эффективность итогового комплекса.
4
4
2+
2+
Поставленная задача достигается тем, что способ получения комплекса для тераностики опухолей на основе антистоксовых  и белковых молекул включает покрытие антистоксовых  конфигурации ядро/оболочка состава NaYF:Yb,Er/NaYF полиакриловой кислотой, модифицированной нитрилоуксусной кислотой, загрузку поверхности антистоксовых  ионами никеля Ni за счет комплексообразования Ni с нитрилоуксусной кислотой, получение комплексов модифицированных таким образом антистоксовых  с рекомбинантным белком, имеющим остатки гистидина на С-конце молекулы, за счет нековалентного металл-аффинного взаимодействия между ионами никеля и остатками гистидина.
2+
На фиг. 1 представлена схема процедуры получения комплекса для тераностики опухолей на основе антистоксовых  и белковых молекул с использованием нековалентного металл-аффинного взаимодействия между иммобилизованными на поверхности  ионами никеля и остатками гистидина на С-конце молекулы белка; (а) - этап модификации полиакриловой кислоты (РАА) нитрилоуксусной кислотой (NTA) с использованием кросслинкера 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид гидрохлорида (EDC); (б) - этап загрузки ионов никеля (Ni) на поверхность антистоксовых  (UCNP); (в) - этап получения итоговых комплексов антистоксовых  (UCNP-NTA-Ni) с рекомбинантным белком, имеющим остатки гистидина на С-конце молекулы (His-tag).
На фиг. 2 представлены спектры излучения комплексов для тераностики опухолей на основе антистоксовых  и молекул флуоресцентного белка KillerRed (а) или mCherry (б), полученных с использованием различных способов сборки: нековалентного металл-аффинного взаимодействия между иммобилизованными на поверхности  ионами никеля и остатками гистидина на С-конце молекулы белка, составляющего задачу изобретения; физической адсорбции белка на поверхности ; химической ковалентной конъюгации белка с поверхностью . Легенда на графике (а): черная кривая - нековалентное металл-аффинное взаимодействие; красная кривая - физическая адсорбция на частицы, покрытые PAA-NTA; синяя кривая - химическая конъюгация; розовая кривая - физическая адсорбция на частицы, покрытые РАА.
Легенда на графике (б): черная кривая - нековалентное металл-аффинное взаимодействие; красная кривая - физическая адсорбция на частицы, покрытые PAA-NTA; розовая кривая - химическая конъюгация; зеленая кривая - физическая адсорбция на частицы, покрытые РАА.
Реализацию предлагаемого изобретения осуществляли следующим образом.
Полиакриловую кислоту (РАА), модифицировал нитрилоуксусной кислотой (NTA) (фиг. 1а), для этого 216 мг РАА (3 ммоль) растворяли в 15 мл 0.1 М фосфатно-солевого буфера, рН доводили до 5.5 с помощью гидроксида натрия. Затем добавляли 95.85 мг кросслинкера EDC (0.5 ммоль) и 131.13 мг NTA-L-lysine (0.5 ммоль), рН доводили до 5.5. Реакцию проводили при перемешивании в течение 12 ч при комнатной температуре. Продукт реакции PAA-NTA очищали диализом (3500 кДа) против раствора хлорида натрия (рН 5.5) в течение двух суток, и далее против дистиллированной воды в течение трех суток.
4
4
4
В качестве наночастиц использовали антистоксовые нанофосфбры конфигурации ядро/оболочка состава NaYF:Yb,Er/NaYF. Поверхность  была модифицирована PAA-NTA (фиг. 1б), для этого остатки олеиновой кислоты, имеющиеся на поверхности  после завершения процедуры синтеза последних, были удалены с помощью тетрафторбората нитрозила (NOBF), который впоследствии был замещен на PAA-NTA. Процедуру проводили следующим образом: 25 мг  ресуспендировали в 5 мл циклогексана; тетрафторборат нитрозила в количестве 5,84 мг растворяли в 5 мл дихлорметана и смешивали с 5 мл суспензии ; смесь инкубировали в течение 10 ч при перемешивании при комнатной температуре, затем  осаждали центрифугированием и ресуспендировали в диметилформамиде; к суспензии добавляли смесь толуена и циклогексана (1:1 о/о), что приводило к слипанию частиц; суспензию центрифугировали, ресуспендировали осадок наночастиц в 5 мл диметилформамида, к суспензии добавляли 150 мг PAA-NTA, растворенной в 5 мл диметилформамида, смесь инкубировали в течение 3 ч при 80°С при интенсивном перемешивании; полученную суспензию , покрытых PAA-NTA, трижды отмывали этанолом и трижды денонсированной водой.
2+
Далее загружали поверхность подготовленных таким образом  ионами Ni (фиг. 1б). Для этого , покрытые PAA-NTA, в количестве 0,5 мг ресуспендировали в 750 мкл деионизированной воды, к суспензии добавляли 300 мкл раствора хлорида никеля в концентрации 200 мМ, обрабатывали реакционную смесь ультразвуком в течение 10 минут, затем перемешивали в течение еще 50 минут; осаждали  центрифугированием и трижды отмывали деионизированной водой.
Затем получали итоговые комплексы антистоксовых  (UCNP-NTA-Ni) с рекомбинантным белком, имеющим остатки гистидина на С-конце молекулы (His-tag) (фиг. 1в), в качестве таких белков использовали флуоресцентный белок-фотосенсибилизатор KillerRed или флуоресцентный белок mCherry. Для этого ресуспендировали 0.5 мг подготовленных описанным выше способом  в 500 мкл раствора белка KillerRed с концентрацией 250 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере или в 500 мкл раствора белка mCherry с концентрацией 250 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере, соответственно.
Предлагаемое изобретение работает следующим образом.
Оценка флуоресцентных свойств комплексов антистоксовых  с флуоресцентным рекомбинантным белком KillerRed или mCherry, полученных различными способами сборки.
Для оценки эффективности сборки комплексов способом, составляющим задачу изобретения, провели его сравнение с другими известными способами - химической ковалентной конъюгацией белка с поверхностью  и физической адсорбцией белка на поверхности .
Для химической ковалентной конъюгации белка KillerRed или mCherry использовали систему кросслинкеров EDC и sulfo-NHS для активации поверхностных карбоксильных групп РАА . Процедуру проводили следующим образом: 0,4 мг EDC растворяли в 500 мкл деионизированной воды, рН доводили соляной кислотой до 5-6; 1,1 мг sulfo-NHS растворяли в 500 мкл деионизированной воды; 0,5 мг , покрытых РАА как описано выше, ресуспендировали в 250 мкл EDC и 250 мкл NHS и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего обрабатывали реакционную смесь ультразвуком при охлаждении;  затем осаждали центрифугированием и отмывали дважды деионизированной водой; ресуспендировали  в 500 мкл раствора белка KillerRed с концентрацией 250 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере или в 500 мкл раствора белка mCherry с концентрацией 250 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере; инкубировали при +4°С в течение ночи.
Для физической адсорбции белка KillerRed или mCherry ресуспендировали 0,5 мг , покрытых РАА или PAA-NTA как описано выше, в 500 мкл раствора белка KillerRed с концентрацией 250 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере или в 500 мкл раствора белка mCherry с концентрацией 250 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере; инкубировали при +4°С в течение ночи.
Анализировали полученные тремя способами комплексы антистоксовых  с флуоресцентным рекомбинантным белком KillerRed или mCherry путем регистрации спектров излучения флуоресцентных белков KillerRed или mCherry (фиг. 2а и 2б, соответственно). Флуоресценцию данных белков возбуждали при длине волны 585 нм или 587 нм, соответственно; регистрацию сигнала флуоресценции проводили в диапазоне длин волн 590-750 нм или 600-750 нм, соответственно. На приведенных графиках (фиг. 2) видно, что комплексы, полученным способом нековалентного металл-аффинного взаимодействия между иммобилизованными на поверхности  ионами никеля и остатками гистидина на С-конце молекулы белка, составляющего задачу изобретения, демонстрируют значительно большую интенсивность флуоресценции белка KillerRed (фиг. 2а) или mCherry (фиг. 2б), по сравнению с комплексами, полученными способами физической адсорбции белка на поверхности  и химической ковалентной конъюгации белка с поверхностью  с использованием кросслинкеров, что свидетельствует о сохранении функциональным свойств присоединяемого к наночастице белка, в данном случае - флуоресценции.
Таким образом, способ получения комплексов антистоксовых  с белком на основе нековалентного металл-аффинного взаимодействия между иммобилизованными на поверхности  ионами никеля и остатками гистидина на С-конце молекулы белка, составляющий задачу изобретения, приводит к сохранению функциональной активности белка. Этот способ позволяет получать комплексы антистоксовых  с рекомбинантными белками различной функциональности, имеющими олигогистидиновую последовательность в заданном месте молекулы - направляющими (специфически связывающимися с определенными молекулами на поверхности опухолевой клетки и обеспечивающими адресование комплекса к целевым клеткам), флуоресцирующими (обеспечивающими визуализацию комплекса в клетках и органах) и токсическими (рекомбинантными токсинами различного происхождения и механизма действия, белковыми фотосенсибилизаторами, уничтожающими опухолевую клетку). Как известно, в состав многих рекомбинантных белков введена последовательность из шести остатков гистидина на С-конце молекулы (так называемый «гистидиновый хвост»), необходимая для процедуры выделения и очистки (получения) рекомбинантного белка. Таким образом, дополнительные модификации белковой молекулы для ее последующего присоединения к  с целью получения многофункционального комплекса для тераностики не требуются. Поскольку расположение «гистидинового хвоста» на С-конце молекулы белка строго задано, то его использование как места присоединения белка к поверхности антистокового  обеспечивает контроль сайта присоединения и строго определенную ориентацию присоединенного к частице белка в пространстве. Это, в свою очередь, обеспечивает сохранение функциональной активности присоединенного белка. Эффективность итогового комплекса определяется, в частности, функциональной активностью присоединенных к  белков, что лежит в основе создания многофункциональных агентов для тераностики опухолей.