Аптамер, проходящий через гематоэнцефалический барьер головного мозга мыши
APTAMER PASSING THROUGH MOUSE BLOOD-BRAIN BARRIER OF MOUSE BRAIN

Изобретение относится к области биотехнологий, в частности к переносу веществ через гематоэнцефалический барьер головного мозга.
Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) - высокоорганизованная морфофункциональная система, включающая церебральные эндотелиоциты и комплекс поддерживающих структур: базальную мембрану, перициты и астроциты. ГЭБ выполняет барьерную, метаболическую, транспортную, иммунную и нейросекреторную функции, без которых невозможно нормальное функционирование центральной нервной системы (ЦНС). Многие потенциально эффективные лекарственные вещества, предназначенные для лечения заболеваний центральной нервной системы, проявляя высокую активность in vitro, оказываются неэффективными при введении в организм, поскольку ГЭБ препятствует поступлению этих веществ в мозг в терапевтически значимых концентрациях. Одним из подходов к решению этой проблемы является рецептор-опосредованная лекарственная доставка, представляющая собой технологию, при которой нетранспортабельная лекарственная молекула связывается с транспортным вектором, проходящим через ГЭБ.
Небольшие гидрофильные молекулы, такие как аминокислоты, глюкоза и другие, необходимые для нормальной жизнедеятельности клеток головного мозга, для перехода через ГЭБ используют транспортеры, расположенные на поверхности эндотелиоцитов. Такие молекулы как гормоны, трансферрин, инсулин, липопротеины проникают в мозг с помощью специальных транспортеров, находящихся на внешней стороне эндотелиоцитов с помощью механизмов трансцитоза или эндоцитоза. Небольшие липофильные молекулы могут пассивно проходить через ГЭБ. Однако подавляющее большинство малых молекул (98%) и практически все большие молекулы (с молекулярной массой от 1 кДа), в том числе, рекомбинантные белки, не проникают через ГЭБ путем диффузии. Для преодоления гематоэнцефалического барьера им необходимо связаться со специальными транспортерами и/или рецепторами, экспрессирующимися на внешней поверхности эндотелиоцитов.
Известен полипептид, способный преодолевать гематоэнцефалический барьер, и его конъюгат (RU 2408605 С2, C07K 14/81; C07K 19/00; A61K 47/48, 10.01.2011), при этом полипептид имеет аминокислотную последовательность, содержащую последовательность TFFYGGSRGKRNNFKTEEY (SEQ ID NO: 70). Данный полипептид служит в качестве носителя для агента - лекарственного средства или соединения для визуализации, а конъюгация носителя с агентом по своему характеру является химической. Агент выбирают из группы, включающей лекарственное средство, белок, пептид, фермент, противоопухолевое средство, антитело, радиовизуализирующее средство, поддающуюся детекции метку и антиангиогенное соединение.
К недостаткам данного полипептида, как носителя для лекарственных средств через ГЭБ, в том числе и противоопухолевых средств, является, то, что препараты на пептидной основе обладают иммуногенностью, труднее химически синтезируются и более требовательны к условиям хранения.
Известны также полилактидные наночастицы (RU 2423104 С2, A61K 9/08, A61J 1/06, B65D 1/09, 10.07.2011). Изобретение относится к способу получения системы направленной доставки лекарства для введения фармакологически активного вещества в центральную нервную систему млекопитающих через гематоэнцефалический барьер. Система содержит наночастицы на основе поли(DL-лактида) и/или поли(DL-лактид-согликолида), фармакологически активное вещество, абсорбируемое, адсорбируемое и/или включаемое в наночастицы, и содержит TPGS или имеет покрытие из поверхностно-активного вещества плуроник 188, которое осаждают на наполненные лекарством наночастицы.
Полилактидные наночастицы не обладают достаточно точной адресной доставкой лекарственных веществ, вследствие чего последние могут не полностью достигать головного мозга, а накапливаться в других органах и тканях организма, оказывая токсическое воздействие на организм.
Данный недостаток присущ и наночастицам, доставляющим лекарственные вещества через гематоэнцефалический барьер мозга (US 6117454 A61K 47/48; A61K 9/16; A61K 9/51; A61K 9/56; A61K 9/58; A61K 9/64; 2000-09-12). Наночастицы, согласно изобретению, изготовлены из различных биоразралагаемых материалов, таких как акрилаты, альбумин, полиацетаты и др. и не биоразлагаемых материалов, таких как полистерен, поливинилпиридин, полиакролеин и полиглутаральдегид. В качестве поверхностно-активного вещества могут быть использованы сложные эфиры жирных кислот, спирты, полисорбаты, полиоксиэтиленовые эфиры и др.
Одним из наиболее новых и перспективных подходов к решению проблемы поиска веществ, проникающих через гематоэнцефалический барьер, является подбор аптамеров к белкам-мишеням, специфичным для конкретной ткани методом in vivo SELEX.
Известны РНК-аптамеры, проникающие через ГЭБ мыши, которые были подобраны in vivo (Cheng, С. In vivo SELEX for Identification of Brain-penetrating Aptamers / C. Cheng Y.H. Chen, K.A. Lennox, M.A. Behlke, B.L. Davidson // Molecular Therapy-Nucleic Acids. - 2013. - №2. - e67). Для получения аптамеров была использована библиотека РНК длиной 40 нуклеотидов, устойчивая к действию нуклеаз. Библиотека вводилась в хвостовую вену мыши, затем через 1-3 часа проводили перфузию мыши с помощью фосфатного буфера и извлекали мозг. РНК-аптамеры экстрагировали, амплифицировали и вводили в хвостовую вену следующей мыши. После 12 раунда селекции была проведена негативная селекция к сыворотке крови мыши. Всего было проведено 22 раунда селекции аптамеров, после которой было выбрано три последовательности, которые наиболее часто встречались в пуле аптамеров после секвенирования. Было показано, что РНК-аптамеры обладали способностью проникать через ГЭБ мыши, первоначально связываясь с эндотелиальными клетками.
При этом, РНК-аптамеры не обладают способностью проносить белки, через гематоэнцефалический барьер к головному мозгу мыши, и в частности, к основным отделам головного мозга - латеральным желудочкам, коре больших полушарий и мозжечку. В тоже время многие белки выступают в качестве лекарственных веществ или входят в состав лекарственных препаратов.
Задачей настоящего изобретения является селекция аптамеров in vivo, обладающих способностью проходить через гематоэнцефалический барьер головного мозга мыши к основным отделам головного мозга - латеральным желудочкам, коре больших полушарий и мозжечку и проносить белки через гематоэнцефалический барьер.
Технический результат, достигаемый изобретением заключается в переносе белков через гематоэнцефалический барьер головного мозга мыши к основным отделам головного мозга - латеральным желудочкам, коре больших полушарий и мозжечку, полученными в результате селекции ДНК-аптамерами.
Поставленная задача решается тем, что аптамер, проходящий через гематоэнцефалический барьер головного мозга мыши, полученный в результате селекции in vivo, согласно изобретению получен путем осуществления в первом раунде селекции введения в периферическую кровь мыши одноцепочечной ДНК-библиотеки, а в каждом последующем раунде селекции пула ДНК-аптамеров, полученного в каждом предшествующем раунде селекции, проведения после каждого раунда амплификации экстрагированных из отделов головного мозга мыши ДНК-аптамеров, проверки их специфичности и аффинности связывания с клетками головного мозга мыши, с выявлением пула аптамеров с наибольшей аффинностью, секвенирования и анализа ДНК-аптамеров, выбран из установленной нуклеотидной последовательности, отраженной как SEQ ID NO 1 - SEQ ID NO 23.
Пул ДНК-аптамеров, с наибольшей аффинностью и специфичностью к клеткам коры больших полушарий, мозжечка и латеральных желудочков, выявляют с помощью проточной цитометрии и горизонтального гель-электрофореза.
Аптамер, проходящий через гематоэнцефалический барьер головного мозга мыши может быть выбран из пула ДНК-аптамеров с наибольшей аффинностью, специфичного к латеральным желудочкам, характеризующегося нуклеотидной последовательностью, отраженной как SEQ ID NO 13 - SEQ ID NO 18.
Аптамер, проходящий через гематоэнцефалический барьер головного мозга мыши может быть выбран из пула ДНК-аптамеров с наибольшей аффинностью, специфичного к мозжечку, характеризующегося нуклеотидной последовательностью, отраженной как SEQ ID NO 6 - SEQ ID NO 12.
Аптамер, проходящий через гематоэнцефалический барьер головного мозга мыши может быть выбран из пула ДНК-аптамеров с наибольшей аффинностью, специфичного к коре больших полушарий и мозжечку, характеризующегося нуклеотидной последовательностью, отраженной как SEQ ID NO 1 - SEQ ID NO 5
Аптамер, проходящий через гематоэнцефалический барьер головного мозга мыши может быть выбран из пула ДНК-аптамеров с наибольшей аффинностью, специфичного к коре больших полушарий, мозжечку и латеральным желудочкам одновременно, характеризующегося нуклеотидной последовательностью, отраженной как SEQ ID NO 19 - SEQ ID NO 23.
Изобретение иллюстрируется графическими материалами.
На фиг 1. показаны гистограммы сравнения специфичности аптамеров по отношению к клеткам крови, различным участкам головного мозга, а также к клеткам пренатального мозга и продолговатого мозга мыши.
На фиг. 2 показаны гель-электрофореграммы ПЦР-продуктов полученных:
из мозжечка, латеральных желудочков, коры больших полушарий головного мозга, печени, почки и селезенки интактной мыши (контроль);
после введения одноцепочечной ДНК-библиотеки аптамеров;
после введения ДНК-аптамеров из пула с наибольшей аффинностью к мозжечку;
после введения ДНК-аптамеров из пула с наибольшей аффинностью к латеральным желудочкам;
после введения ДНК-аптамеров из пула с наибольшей аффинностью к коре больших полушарий.
На фиг. 3 представлены фотографии, полученные с помощью конфокальной микроскопии среза головного мозга мыши, в которой вводили ДНК-аптамер, выбранный к коре больших полушарий, мозжечку и желудочкам связанный с белком стрептавидином, меченым флуоресцентной меткой РЕ (фото 1, 2) и мыши, которой вводили стрептавидин, меченый флуоресцентной меткой РЕ, не связанный с ДНК-аптамером (фото 3).
На фиг. 4 представлены фотографии, полученные с помощью конфокальной микроскопии среза мозга мыши, которой вводили ДНК-аптамер, выбранный к коре больших полушарий, связанный с белком стрептавидином, меченым флуоресцентной меткой FITC (фото 1, 2) и мыши, которой вводили стрептавидин, меченый флуоресцентной меткой FITC, не связанный с ДНК-аптамером (фото 3).
На фиг. 5 представлены фотографии, полученные с помощью конфокальной микроскопии среза мозга мыши, которой вводили ДНК-аптамер, выбранный к латеральным желудочкам, связанный с белком стрептавидином, меченым фикоэритрином (фото 1, 2) и мозга мыши, которой вводили стрептавидин, меченый фикоэритрином, не связанный с ДНК-аптамером (фото 3).
На фиг.6 представлены фотографии, полученные с помощью конфокальной микроскопии среза мозга мыши, которой вводили ДНК-аптамер, выбранный к мозжечку, связанный с белком стрептавидином, меченым флуоресцентной меткой FITC (фото 1,2) и мыши, которой вводили стрептавидин, меченый флуоресцентной меткой FITC, не связанный с ДНК-аптамером (фото 3).
Селекцию аптамеров проводили in vivo на белых лабораторных мышах. В 1 раунде селекции использовали одноцепочечную (оц)ДНК-библиотеку (Integrated DNA Technologies, USA), олигонуклеотиды которой содержат случайный набор из 40 нуклеотидов (N40), фланкированный двумя константными участками, 5'-СТС СТС TGA CTG ТАА CCA CG N40 GC ATA GGT AGT CCA GAA GCC-3'. Перед каждым раундом селекции оцДНК-библиотека и пулы аптамеров подвергали денатурации путем нагрева в течение 5 мин до 95°С в фосфатном буфере DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline, Sigma-Aldrich, USA) и ренатурации на льду в течение 10 мин.
Для проведения 1 раунда селекции оцДНК-библиотеку вводили в периферическую кровь мыши. Спустя 2 часа из головного мозга мыши извлекали основные отделы головного мозга мыши - кору больших полушарий, мозжечок и латеральные желудочки. Извлеченные ткани помещали в разные эппендорфы объемом 0,2 мл, ресуспензировали в 95 мкл 10 мМ Tris-HCl буфера, содержащего 10 мМ EDTA, рН 7.4 (ТЕ) (Sigma-Aldrich, USA), и инкубировали при 95°С в течение 30 мин для освобождения аптамеров, связанных с клетками, извлеченными из тканей. После такой денатурации фрагменты ткани удаляли путем центрифугирования при 14000g в течение 15 минут при 4°С, а супернатант (содержащий аптамеры) собирали и хранили при -20°С.
2
2
-1
-1
Впоследствии, экстрагированные из тканей ДНК-аптамеры амплифицировали с помощью симметричной и асимметричной ПЦР. Для проведения симметричной ПЦР 5 мкл пула аптамеров в ТЕ добавляли к 45 мкл смеси для симметричной ПЦР, содержащей следующие компоненты: 1 х ПЦР буфер, 2,5 мМ MgCl, 0,025 U мкл KAPA2G HotStart Robust полимераза (KAPABiosystems, USA), 220 μМ dNTPs, 300 нМ прямого праймера (5'- СТС СТС TGA CTG ТАА CCA CG-3') и 300 нМ обратного праймера (5'- GGC ТТС TGG ACT АСС TAT GC-3') (Syntol, Russia). Для асимметричной ПЦР использовали 5 мкл симметричного ПЦР продукта и 45 мкл смеси для асимметричной ПЦР, содержащей следующие компоненты: 1 х ПЦР буфер, 2,5 мМ MgCl, 0,025 U мкл KAPA2G HotStart Robust полимераза (KAPABiosystems, USA), 220 μМ dNTPs, 1 μМ прямого праймера с флуоресцентной меткой FAM (5'-FAM- СТС СТС TGA CTG ТАА CCA CG-3') и 50 нМ обратного праймера (5'- GGC ТТС TGG ACT АСС TAT GC-3') (Syntol, Russia). Амплификацию проводили по следующей ПЦР программе: предварительный нагрев при 95°С в течение 2 мин; 15 циклов по 30 с при 95°С, 15 с при 56,3°С и 15 с при 72°С. Концентрацию ПЦР-продукта определяли с помощью спектрофотометра Nanovue (NanoVue plus, GE Healthcare, USA).
При проведении последующих раундов в периферическую кровь мыши вводили 0,5 мкМ аптамеров предыдущего раунда. И повторяли описанные выше процедуры. Всего было сделано 8 раундов селекции ДНК-аптамеров Из проведенных раундов выбрали пул с нибольшей аффиностью.
Из представленных на фиг. 1 гистограмм сравнения специфичности ДНК-аптамеров 6 раунда селекции по отношению к клеткам крови, мозжечка, латеральных желудочков, коры больших полушарий, пренатального и продолговатого мозга мыши видно, что каждый пул аптамеров 6 раунда селекции был наиболее специфичен к клеткам того участка головного мозга, из которого он выделялся при селекции, например, ДНК-аптамеры, экстрагированные в ходе селекции из мозжечка, обладали большей специфичностью к клеткам мозжечка по сравнению с другими отделами головного мозга. При этом, ДНК-аптамеры всех пулов показали низкую специфичность к клеткам крови. Специфичность ДНК-аптамеров к клеткам пренатального мозга мыши для всех пулов приблизительно одинакова и в среднем составляет половину от максимального уровня специфичности для каждого пула. Вероятно, это объясняется тем, что в ткани пренатального мозга практически отсутствуют характерные для гематоэнцефалического барьера эндотелиоциты, поэтому ДНК-аптамеры, которые в ходе селекции связывались с клетками эндотелия сосудов, не нашли своих мишеней среди клеток пренатального мозга. Однако, в целом, уровень специфичности ДНК-аптамеров к этим клеткам достаточно высок, что свидетельствует о том, что часть ДНК-аптамеров из каждого пула в ходе селекции in vivo преодолевала гематоэнцефалический барьер. Небольшой процент связывания ДНК-аптамеров наблюдался с клетками продолговатого мозга, что можно объяснить сходством клеток в разных областях головного мозга и наличием одинаковых клеточных рецепторов.
Способность проникать в головной мозг мыши пула ДНК-аптамеров 6 раунда селекции определяли следующим образом. Пул ДНК-аптамеров вводили мыши внутримышечно. Через 1 ч 45 мин животное усыпляли путем введения анестезии и проводили перфузию. Из головного мозга извлекали ткани коры больших полушарий, мозжечка и латеральных желудочков. Также выделяли ткани печени, почек и селезенки. Экстрагированные из тканей ДНК-аптамеры амплифицировали и наличие ПЦР продукта определяли с помощью агарозного гель-электрофореза.
Из представленных на фиг. 2 гель-электрофореграмм видно, что пулы ДНК-аптамеров 6 раунда селекции обладали способностью проникать в головной мозг мыши-позиции 1, 2, 3. Наибольшее количество ПЦР-продуктов было обнаружено в тех отделах головного мозга, к которым выбирались ДНК-аптамеры. В отделах головного мозга мыши, которой вводили оц-ДНК библиотеку наблюдали очень малое количество ПЦР-продуктов, практически незаметное на гель-элекрофореграммах. В тканях интактного животного никаких фрагментов ДНК не было обнаружено. Для оценки характера ПЦР-продуктов на геле также разгоняли оц-ДНК библиотеку, праймер и ПЦР-смесь.
Пулы ДНК-аптамеров 6 раунда селекции специфичных к латеральным желудочкам, коре больших полушарий и мозжечку были секвенированы и проанализированы с помощью методов математического анализа. В результате чего были выбраны последовательности ДНК-аптамеров к коре больших полушарий, представленные как SEQ ID NO 1 - SEQ ID NO 5, мозжечку, представленные как SEQ ID NO 6 - SEQ ID NO 12, латеральным желудочкам, представленные как SEQ ID NO 13 - SEQ ID NO 18 и ДНК-аптамеры специфичные к коре больших полушарий, мозжечку и латеральным желудочкам одновременно, представленные как SEQ ID NO 19 - SEQ ID NO 23.
В приведенных примерах показана возможность транспортировки белка с помощью ДНК-аптамеров, специфичных к основным отделам головного мозга мыши.
Пример 1.
Для того чтобы показать, что ДНК-аптамеры, выбранные к коре больших полушарий, мозжечку и латеральным желудочкам, могут проносить белки через ГЭБ головного мозга мыши использовали метод конфокальной микроскопии.
Были использованы следующие реактивы:
1. ДНК-аптамеры, проходящие через ГЭБ мозга мыши, связанные с белком стрептавидином, меченым красным флуоресцентным белком фикоэритрином.
2+
2+
2. Фосфатный буфер с Са и Mg
2+
2+
3. 4% параформальдегид, разведенный в фосфатном буфере с Са и Mg
4. 15% Хлоралгидрат
2+
2+
2+
2+
Для того чтобы связать ДНК-аптамеры с белком стрептавидином меченым красным флуоресцентным белком фикоэритрином, ДНК-аптамеры, представленные как SEQ ID NO 19 - SEQ ID NO 23, меченые биотином, предварительно разогревали до 95°С и, остудив на льду, инкубировали в течение 30 минут со стрептавидином, меченым фикоэритрином при 6°С. Далее 100 мкл ДНК-аптамера в конечной концентрации 1 мкМ вводили мыши внутримышечно. В качестве контроля того, что ДНК-аптамер может проносить стрептавидин и фикоэритрин через ГЭБ вводили другой мыши стрептавидин, меченый фикоэритрином, не связанный с ДНК-аптамером. Через 30 минут мышей усыпляли и перфузировали с помощью фосфатного буфера Са и Mg и 4% параформальдегида в фосфатном буфере с Са и Mg для удаления из головного мозга всех клеток крови и его фиксации. Далее мозг извлекали, замораживали с помощью жидкого азота и с помощью криостата Microm НМ525 готовили гистологические срезы. Срезы помещали на предметные стекла, фиксировали полистиролом и накрывали покровными стеклами. Полученные срезы анализировали с помощью конфокального микроскопа Carl Zeiss LSM 780.
Результаты анализа срезов представлены на фиг. 3. На фото 1 фиг. 3 представлен срез целого головного мозга мыши, которой был введен ДНК-аптамер SEQ ID NO 23, связанный со стрептавидином, меченым красным флуоресцентным фикоэритрином. На фото 2 фиг. 3 представлен выделенный и обозначенный стрелочкой участок на фото 1 фиг. 3. 3, 1 (позиция 4). На фото 3 фиг. 3 представлена фотография среза головного мозга мыши, которой был введен стрептавидин, меченый фикоэритрином, не связанный с ДНК-аптамером. Как видно из фотографий, на срезе головного мозга мыши, которой вводили аптамер связанный со стрептавидином, меченым фикоэритрином, наблюдается флуоресценция. Это подтверждает, что ДНК-аптамер прошел через ГЭБ и связался со структурами в мозге. Детально представлено на фото 2 фиг. 3. В срезе головного мозга мыши, которой был введен стрептавидин, фикоэритрином, не связанный с ДНК-аптамером, флуоресценции не наблюдалось, что говорит о том, что сам по себе белок не прошел через ГЭБ. Таким образом, показано, что ДНК-аптамеры SEQ ID NO 19 - SEQ ID NO 23 обладают способностью проходить и проносить белки через ГЭБ.
Пример 2.
Для того чтобы показать, что ДНК-аптамеры, выбранные к коре больших полушарий могут проносить белки через ГЭБ мозга мыши использовали метод конфокальной микроскопии.
Были использованы следующие реактивы:
5. ДНК-аптамеры, проходящие через ГЭБ мозга мыши, связанные с белком стрептавидином, меченым флуоресцентной меткой FITC
2+
2+
6. Фосфатный буфер с Са и Mg
2+
2+
7. 4% параформальдегид, разведенный в фосфатном буфере с Са и Mg
8. 15% Хлоралгидрат
2+
2+
2+
2+
Для связывания ДНК-аптамеров с белком стрептавидином, меченым флуоресцентной меткой FITC, ДНК-аптамеры, представленные как SEQ ID NO 1 - SEQ ID NO 5, меченые биотином, предварительно разогревали до 95°С и, остудив на льду, инкубировали в течение 30 минут со стрептавидином, меченым флуоресцентной меткой FITC при 6°С. Далее 100 мкл ДНК-аптамера в конечной концентрации 1 мкМ вводили мыши внутримышечно. Через 30 минут мышь усыпляли и осуществляли перфузию головного мозга с помощью фосфатного буфера Са и Mg и 4% параформальдегида в фосфатном буфере с Са и Mg для удаления из головного мозга всех клеток крови и его фиксации. Далее мозг извлекали, замораживали с помощью жидкого азота и с помощью криостата Microm НМ525 готовили гистологические срезы. Срезы помещали на предметные стекла, фиксировали полистиролом и накрывали покровными стеклами. Полученные срезы анализировали с помощью конфокального микроскопа Carl Zeiss LSM 780.
Результаты анализа срезов представлены на фиг. 4. На фото 1 фиг. 4, представлен срез целого головного мозга мыши, которой был введен аптамер SEQ ID NO 2, связанный со стрептавидином, меченым флуоресцентной меткой FITC. На фото 2 фиг. 4 представлен в трехмерном изображении выделенный и обозначенный стрелочкой участок на фото 1 фиг. 4 (позиция 5). На фото 3 фиг. 4 представлена фотография среза головного мыши, которой был введен стрептавидин, меченый флуоресцентной меткой FITC, не связанный с ДНК-аптамером. Как видно из фотографий, в срезе мозга мыши, которой вводили ДНК-аптамер, связанный со стрептавидином, меченым флуоресцентной меткой FITC, наблюдается флуоресценция. Это подтверждает, что ДНК-аптамер прошел через ГЭБ и связался со структурами в головном мозге, детально представленными на фото 2 фиг. 4. В срезе головного мозга мыши, которой был введен стрептавидин, меченый флуоресцентной меткой FITC, не связанный с ДНК-аптамером, флуоресценции не наблюдалось, что говорит о том, что сам по себе белок не прошел через ГЭБ. Таким образом, показано, что ДНК-аптамеры SEQ ID NO 1 - SEQ ID NO 5 обладают способностью проходить через ГЭБ и проносить через него белки.
Пример 3.
Для того чтобы показать, что ДНК-аптамеры, выбранные к желудочку, могут проносить белки через ГЭБ мозга мыши использовали метод конфокальной микроскопии.
Были использованы следующие реактивы:
1. ДНК-аптамеры, проходящие через ГЭБ мозга мыши, связанные с белком стрептавидином, меченым красным флуоресцентным белком фикоэритрином;
2+
2+
2. Фосфатный буфер с Са и Mg;
2+
2+
3. 4% параформальдегид, разведенный в фосфатном буфере с Са и Mg;
4. 15% Хлоралгидрат.
2+
2+
2+
2+
Для того чтобы связать ДНК-аптамеры с белком стрептавидином, меченым красным флуоресцентным белком фикоэритрином, ДНК-аптамеры, представленные как SEQ ID NO 13- SEQ ID NO 18, меченые биотином, предварительно разогревали до 95°С и, остудив на льду, инкубировали в течение 30 минут со стрептавидином, меченым фикоэритрином при 6°С. Далее 100 мкл ДНК-аптамера в конечной концентрации 1 мкМ вводили мыши внутримышечно. В качестве контроля того, что ДНК-аптамер может проносить стрептавидин и фикоэритрин через ГЭБ вводили другой мыши стрептавидин, меченый фикоэритрином, не связанный с ДНК-аптамером. Через 30 минут мышей усыпляли и перфузировали с помощью фосфатного буфера Са и Mg и 4% параформальдегида в фосфатном буфере с Са и Mg для удаления из мозга всех клеток крови и его фиксации. Далее головной мозг извлекали, замораживали с помощью жидкого азота и с помощью криостата Microm НМ525 готовили гистологические срезы. Срезы помещали на предметные стекла, фиксировали полистиролом и накрывали покровными стеклами. Полученные срезы анализировали с помощью конфокального микроскопа Carl Zeiss LSM 780.
Результаты анализа срезов представлены на фиг. 5. На фото 1 фиг. 5 представлен срез целого головного мозга мыши, которой был введен ДНК-аптамер SEQ ID NO 13, связанный со стрептавидином, меченым фикоэритрином. На фото 2 фиг. 5 представлен выделенный и обозначенный стрелочкой участок на фото 1 фиг. 5 (позиция 6). На фото 3 фиг. 5 представлена фотография среза головного мозга мыши, которой был введен стрептавидин, меченый фикоэритрином, не связанный с ДНК-аптамером. Как видно из фотографий, на срезе головного мозга мыши, которой вводили ДНК-аптамер, связанный со стрептавидином, меченым фикоэритрином, наблюдается флуоресценция. Это подтверждает, что ДНК-аптамер прошел через ГЭБ и связался со структурами в головном мозге. Детально представлено на фото 2 фиг. 5 В срезе головного мозга мыши, которой был введен стрептавидин, меченый фикоэритрином, не связанный с ДНК-аптамером, флуоресценции не наблюдалось, что говорит о том, что сам по себе белок не прошел через ГЭБ. Таким образом, показано, что ДНК-аптамеры SEQ ID NO 13 - SEQ ID NO 18 обладают способностью проходить и проносить белки через ГЭБ.
Пример 4.
Для того чтобы показать, что ДНК-аптамеры, выбранные к мозжечку, могут проносить белки через ГЭБ мозга мыши использовали метод конфокальной микроскопии.
Были использованы следующие реактивы:
1. ДНК-аптамеры, проходящие через ГЭБ мозга мыши, связанные с белком стрептавидином, меченым флуоресцентной меткой FITC
2+
2+
2. Фосфатный буфер с Са и Mg;
2+
2+
3. 4% параформальдегид, разведенный в фосфатном буфере с Са и Mg;
4. 15% Хлоралгидрат.
+
2+
2+
2+
Для того чтобы связать ДНК-аптамеры с белком стрептавидином, меченым флуоресцентной меткой FITC, ДНК-аптамеры, представленные как SEQ ID NO 6 - SEQ ID NO 12, меченые биотином, предварительно разогревали до 95°С и, остудив на льду, инкубировали в течение 30 минут со стрептавидином, меченым флуоресцентной меткой FITC при 6°С. Далее 100 мкл ДНК-аптамера в конечной концентрации 1 мкМ вводили мыши внутримышечно. В качестве контроля того, что ДНК-аптамер может проносить стрептавидин через ГЭБ вводили другой мыши стрептавидин, меченый флуоресцентной меткой FITC, не связанный с ДНК-аптамером. Через 30 минут мышей усыпляли и перфузировали с помощью фосфатного буфера Са2 и Mg и 4% параформальдегида в фосфатном буфере с Са и Mg для удаления из мозга всех клеток крови и его фиксации. Далее мозг извлекали, замораживали с помощью жидкого азота и с помощью криостата Microm HM525 готовили гистологические срезы. Срезы помещали на предметные стекла, фиксировали полистиролом и накрывали покровными стеклами. Полученные срезы анализировали с помощью конфокального микроскопа Carl Zeiss LSM 780.
Результаты анализа срезов представлены на фиг. 6. На фото 1 фиг. 6 представлен срез целого мозга мыши, которой был введен ДНК-аптамер SEQ ID NO 10, связанный со стрептавидином, меченым флуоресцентной меткой FITC. На фото 2 фиг. 6 представлен выделенный и обозначенный стрелочкой участок на фото 1 фиг. 6, 1 (позиция 7). На фото 3 фиг. 6 представлена фотография среза головного мозга мыши, которой был введен стрептавидин, меченый флуоресцентной меткой FITC, не связанный с ДНК-аптамером. Как видно из фотографий, на срезе головного мозга мыши, которой вводили ДНК-аптамер связанный со стрептавидином, меченым флуоресцентной меткой FITC, наблюдается флуоресценция. Это подтверждает, что ДНК-аптамер прошел через ГЭБ и связался со структурами в мозге. Детально представлено на фото 2 фиг. 6. В срезе мозга мыши, которой был введен стрептавидин, меченый флуоресцентной меткой РЕ, не связанный с ДНК-аптамером, флуоресценции не наблюдалось, что говорит о том, что сам по себе белок не прошел через ГЭБ. Таким образом, показано, что ДНК-аптамеры SEQ ID NO 6 - SEQ ID NO 12 обладают способностью проходить и проносить белки через ГЭБ.
Таким образом, показано, что ДНК-аптамеры могут проходить через гематоэнцефалический барьер мозга мыши и выступать в качестве векторов для доставки белков и лекарственных препаратов через ГЭБ. Некоторые ДНК-аптамеры, обладающие определенной функциональной активностью могут сами выступать в качестве лекарственных препаратов для лечения заболеваний ЦНС.
--->
Перечень последовательностей аптамеров, проходящих через ГЭБ мозга мыши
SEQ ID NO 1
<110> Красноярский научный центр СО РАН, ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
<120> Аптамер, проходящий через ГЭБ
<130> ссылка на досье (дело заявки)
<160> число последовательностей
<210> 1
<211> 100
<212> single stranded DNA
<213> искусственная последовательность
<220> Нуклеотидная последовательность, проходящая через гематоэнцефалический барьер мозга мыши Co-302
<223> Аптамер, полученный с помощью технологии SELEX
<400> 1
ctcctctgac tgtaaccacg atacgggtaa acgcgagcgt gcatgaagtg attgacggcg 60
caggcctgtg gagtgggcag gcataggtag tccagaagcc 100
SEQ ID NO 2
<110> Красноярский научный центр СО РАН, ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
<120> Аптамер, проходящий через ГЭБ
<130> ссылка на досье (дело заявки)
<160> число последовательностей
<210> 2
<211> 100
<212> single stranded DNA
<213> искусственная последовательность
<220> Нуклеотидная последовательность, проходящая через гематоэнцефалический барьер мозга мыши Co-451
<223> Аптамер, полученный с помощью технологии SELEX
<400> 2
ctcctctgac tgtaaccacg gcgcgtgtgg aggcgtacac gtagcgcatc agtgtcagag 60
catgtatacg gtgcatgtga gcataggtag tccagaagcc 100
SEQ ID NO 3
<110> Красноярский научный центр СО РАН, ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
<120> Аптамер, проходящий через ГЭБ
<130> ссылка на досье (дело заявки)
<160> число последовательностей
<210> 3
<211> 100
<212> single stranded DNA
<213> искусственная последовательность
<220> Нуклеотидная последовательность, проходящая через гематоэнцефалический барьер мозга мыши Co-587
<223> Аптамер, полученный с помощью технологии SELEX
<400> 3
ctcctctgac tgtaaccacg gcgtgcacct ccgcgtatgg cttgcatatg agtgctgttc 60
tccgtatttc ggacatacgg gcataggtag tccagaagcc 100
SEQ ID NO 4
<110> Красноярский научный центр СО РАН, ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
<120> Аптамер, проходящий через ГЭБ
<130> ссылка на досье (дело заявки)
<160> число последовательностей
<210> 4
<211> 100
<212> single stranded DNA
<213> искусственная последовательность
<220> Нуклеотидная последовательность, проходящая через гематоэнцефалический барьер мозга мыши Co-434
<223> Аптамер, полученный с помощью технологии SELEX
<400> 4
ctcctctgac tgtaaccacg acgcgcgatg cggcaagcat gttacgccca tgtatcttcg 60
tgcacatgcc ctccgtgtgt gcataggtag tccagaagcc 100
SEQ ID NO 5
<110> Красноярский научный центр СО РАН, ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
<120> Аптамер, проходящий через ГЭБ
<130> ссылка на досье (дело заявки)
<160> число последовательностей
<210> 5
<211> 100
<212> single stranded DNA
<213> искусственная последовательность
<220> Нуклеотидная последовательность, проходящая через гематоэнцефалический барьер мозга мыши Co-1455
<223> Аптамер, полученный с помощью технологии SELEX
<400> 5
ctcctctgac tgtaaccacg gtacggtcgt cactgtgcgt acgctgtgca aagatgcaag 60
tgcgcatact gggtgtcggt gcataggtag tccagaagcc 100
SEQ ID NO 6
<110> Красноярский научный центр СО РАН, ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
<120> Аптамер, проходящий через ГЭБ
<130> ссылка на досье (дело заявки)
<160> число последовательностей
<210> 6
<211> 100
<212> single stranded DNA
<213> искусственная последовательность
<220> Нуклеотидная последовательность, проходящая через гематоэнцефалический барьер мозга мыши Ce-21827
<223> Аптамер, полученный с помощью технологии SELEX
<400> 6
ctcctctgac tgtaaccacg ttgtggactc ccgcgctcac tgcggatcta cttattctca 60
tcctcgttcg tccagaagct gcataggtag tccagaagcc 100
SEQ ID NO 7
<110> Красноярский научный центр СО РАН, ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
<120> Аптамер, проходящий через ГЭБ
<130> ссылка на досье (дело заявки)
<160> число последовательностей
<210> 7
<211> 100
<212> single stranded DNA
<213> искусственная последовательность
<220> Нуклеотидная последовательность, проходящая через гематоэнцефалический барьер мозга мыши Ce-1521
<223> Аптамер, полученный с помощью технологии SELEX
<400> 7
ctcctctgac tgtaaccacg gatgagtcct ctgactgtaa ccacgttggc gaatctagcg 60
ctaaatgcgg atcgacttag gacta gcataggtag tccagaagcc 100
SEQ ID NO 8
<110> Красноярский научный центр СО РАН, ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
<120> Аптамер, проходящий через ГЭБ
<130> ссылка на досье (дело заявки)
<160> число последовательностей
<210> 8
<211> 100
<212> single stranded DNA
<213> искусственная последовательность
<220> Нуклеотидная последовательность, проходящая через гематоэнцефалический барьер мозга мыши Ce-21393
<223> Аптамер, полученный с помощью технологии SELEX
<400> 8
ctcctctgac tgtaaccacg ttgctgactc tcgcgctcac ttcggaccta cttatcagaa 60
ccttcgttcg ttaagaggca gcataggtag tccagaagcc 100
SEQ ID NO 9
<110> Красноярский научный центр СО РАН, ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
<120> Аптамер, проходящий через ГЭБ
<130> ссылка на досье (дело заявки)
<160> число последовательностей
<210> 9
<211> 100
<212> single stranded DNA
<213> искусственная последовательность
<220> Нуклеотидная последовательность, проходящая через гематоэнцефалический барьер мозга мыши Ce-574
<223> Аптамер, полученный с помощью технологии SELEX
<400> 9
ctcctctgac tgtaaccacg atacgggtaa acgcgagcgt gcatgaagtg attgacggcg 60
caggcctgtg gagtgggcag gcataggtag tccagaagcc 100
SEQ ID NO 10
<110> Красноярский научный центр СО РАН, ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
<120> Аптамер, проходящий через ГЭБ
<130> ссылка на досье (дело заявки)
<160> число последовательностей
<210> 10
<211> 101
<212> single stranded DNA
<213> искусственная последовательность
<220> Нуклеотидная последовательность, проходящая через гематоэнцефалический барьер мозга мыши Ce-4814
<223> Аптамер, полученный с помощью технологии SELEX
<400> 10
ctcctctgac tgtaaccacg cttgtagact cccgcgctca tttcggatct acttatgcaa 60
atcctcgttc gttaagaagc tgcataggta gtccagaagc c 101
SEQ ID NO 11
<110> Красноярский научный центр СО РАН, ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
<120> Аптамер, проходящий через ГЭБ
<130> ссылка на досье (дело заявки)
<160> число последовательностей
<210> 11
<211> 101
<212> single stranded DNA
<213> искусственная последовательность
<220> Нуклеотидная последовательность, проходящая через гематоэнцефалический барьер мозга мыши Ce-21827
<223> Аптамер, полученный с помощью технологии SELEX
<400> 11
ctcctctgac tgtaaccacg cttgtggact cccgcgctca ctgcggatct acttattctc 60
atcctcgttc gtccagaagc tgcataggta gtccagaagc c 101
SEQ ID NO 12
<110> Красноярский научный центр СО РАН, ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
<120> Аптамер, проходящий через ГЭБ
<130> ссылка на досье (дело заявки)
<160> число последовательностей
<210> 12
<211> 101
<212> single stranded DNA
<213> искусственная последовательность
<220> Нуклеотидная последовательность, проходящая через гематоэнцефалический барьер мозга мыши Ce-21827
<223> Аптамер, полученный с помощью технологии SELEX
<400> 12
ctcctctgac tgtaaccacg cttgtggact cccgcgctca ctgcggatct acttattctc 60
atcctcgttc gtccagaagc tgcataggta gtccagaagc c 101
SEQ ID NO 13
<110> Красноярский научный центр СО РАН, ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
<120> Аптамер, проходящий через ГЭБ
<130> ссылка на досье (дело заявки)
<160> число последовательностей
<210> 13
<211> 108
<212> single stranded DNA
<213> искусственная последовательность
<220> Нуклеотидная последовательность, проходящая через гематоэнцефалический барьер мозга мыши Ve-296
<223> Аптамер, полученный с помощью технологии SELEX
<400> 13
ctcctctgac tgtaaccacg cgtatctagc tcctcttact gtcaccccga aggtgtcggc 60
cttagtaagg ctacagccaa gggaacgtag cataggtagtc cagaagcc 108
SEQ ID NO 14
<110> Красноярский научный центр СО РАН, ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
<120> Аптамер, проходящий через ГЭБ
<130> ссылка на досье (дело заявки)
<160> число последовательностей
<210> 14
<211> 100
<212> single stranded DNA
<213> искусственная последовательность
<220> Нуклеотидная последовательность, проходящая через гематоэнцефалический барьер мозга мыши Ve-539
<223> Аптамер, полученный с помощью технологии SELEX
<400> 14
ctcctctgac tgtaaccacg atacgggtaa acgcgagcgt gcatgaagtg attgacggcg 60
caggcctgtg gagtgggcag gcataggtag tccagaagcc 100
SEQ ID NO 15
<110> Красноярский научный центр СО РАН, ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
<120> Аптамер, проходящий через ГЭБ
<130> ссылка на досье (дело заявки)
<160> число последовательностей
<210> 15
<211> 105
<212> single stranded DNA
<213> искусственная последовательность
<220> Нуклеотидная последовательность, проходящая через гематоэнцефалический барьер мозга мыши Ve-1906
<223> Аптамер, полученный с помощью технологии SELEX
<400> 15
ctcctctgac tgtaaccacg gtatctagct ctgactgtaa ccacgttggc gaatctagcg 60
ctaaatgcgg atcgacttag gactagcata ggtagtccag aagcc 105
SEQ ID NO 16
<110> Красноярский научный центр СО РАН, ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
<120> Аптамер, проходящий через ГЭБ
<130> ссылка на досье (дело заявки)
<160> число последовательностей
<210> 16
<211> 100
<212> single stranded DNA
<213> искусственная последовательность
<220> Нуклеотидная последовательность, проходящая через гематоэнцефалический барьер мозга мыши Ve-669
<223> Аптамер, полученный с помощью технологии SELEX
<400> 16
ctcctctgac tgtaaccacg acgcgcgatg cggcaagcat gttacgccca tgtatcttcg 60
tgcacatgcc ctccgtgtgt gcataggtag tccagaagcc 100
SEQ ID NO 17
<110> Красноярский научный центр СО РАН, ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
<120> Аптамер, проходящий через ГЭБ
<130> ссылка на досье (дело заявки)
<160> число последовательностей
<210> 17
<211> 100
<212> single stranded DNA
<213> искусственная последовательность
<220> Нуклеотидная последовательность, проходящая через гематоэнцефалический барьер мозга мыши Ve-639
<223> Аптамер, полученный с помощью технологии SELEX
<400> 17
ctcctctgac tgtaaccacg gcgcgtgtgg aggcgtacac gtagcgcatc agtgtcagag 60
catgtatacg gtgcatgtga gcataggtag tccagaagcc 100
SEQ ID NO 18
<110> Красноярский научный центр СО РАН, ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
<120> Аптамер, проходящий через ГЭБ
<130> ссылка на досье (дело заявки)
<160> число последовательностей
<210> 18
<211> 100
<212> single stranded DNA
<213> искусственная последовательность
<220> Нуклеотидная последовательность, проходящая через гематоэнцефалический барьер мозга мыши Ve-9231
<223> Аптамер, полученный с помощью технологии SELEX
<400> 18
ctcctctgac tgtaaccacg gtatctagct cctcttactg tcaccccgtc catggatata 60
tgcaggttac gctggctagt tgaaa gcataggtag tccagaagcc 100
SEQ ID NO 19
<110> Красноярский научный центр СО РАН, ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
<120> Аптамер, проходящий через ГЭБ
<130> ссылка на досье (дело заявки)
<160> число последовательностей
<210> 19
<211> 100
<212> single stranded DNA
<213> искусственная последовательность
<220> Нуклеотидная последовательность, проходящая через гематоэнцефалический барьер мозга мыши BBB-2698
<223> Аптамер, полученный с помощью технологии SELEX
<400> 19
ctcctctgac tgtaaccacg atgcgtgttg tcatgcgcgt acagggtgca cgtgtactca 60
tgcgtgtgta tatcgtgtgt gcataggtag tccagaagcc 100
SEQ ID NO 20
<110> Красноярский научный центр СО РАН, ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
<120> Аптамер, проходящий через ГЭБ
<130> ссылка на досье (дело заявки)
<160> число последовательностей
<210> 20
<211> 100
<212> single stranded DNA
<213> искусственная последовательность
<220> Нуклеотидная последовательность, проходящая через гематоэнцефалический барьер мозга мыши BBB-2722
<223> Аптамер, полученный с помощью технологии SELEX
<400> 20
ctcctctgac tgtaaccacg acgcactttt ggggttgtat gcggggtgcg cacacgtccg 60
gacatgtgtc cttcgttcgt gcataggtag tccagaagcc 100
SEQ ID NO 21
<110> Красноярский научный центр СО РАН, ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
<120> Аптамер, проходящий через ГЭБ
<130> ссылка на досье (дело заявки)
<160> число последовательностей
<210> 21
<211> 100
<212> single stranded DNA
<213> искусственная последовательность
<220> Нуклеотидная последовательность, проходящая через гематоэнцефалический барьер мозга мыши BBB-3265
<223> Аптамер, полученный с помощью технологии SELEX
<400> 21
ctcctctgac tgtaaccacg tgcctctcct ctgactgtaa ccacgaccgg gtcttacggt 60
gtcgcggaca ctctggcgta gcataggtag tccagaagcc 100
SEQ ID NO 22
<110> Красноярский научный центр СО РАН, ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
<120> Аптамер, проходящий через ГЭБ
<130> ссылка на досье (дело заявки)
<160> число последовательностей
<210> 22
<211> 100
<212> single stranded DNA
<213> искусственная последовательность
<220> Нуклеотидная последовательность, проходящая через гематоэнцефалический барьер мозга мыши BBB-3963
<223> Аптамер, полученный с помощью технологии SELEX
<400> 22
ctcctctgac tgtaaccacg acgtgtgccc gggtgaaccg gcgcagcgcg tgtatggtta 60
tgcatgtgtc aggtccgtgc gcataggtag tccagaagcc 100
SEQ ID NO 23
<110> Красноярский научный центр СО РАН, ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития России
<120> Аптамер, проходящий через ГЭБ
<130> ссылка на досье (дело заявки)
<160> число последовательностей
<210> 23
<211> 100
<212> single stranded DNA
<213> искусственная последовательность
<220> Нуклеотидная последовательность, проходящая через гематоэнцефалический барьер мозга мыши Br-1
<223> Аптамер, полученный с помощью технологии SELEX
<400> 23
ctcctctgac tgtaaccacg ttggcgaatc tagcgctaaa tgcggatcga cttaggacta 60
gcataggtag tccagaagcc gcataggtag tccagaagcc 100
<---