СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ГЕМОКУЛЬТУР К АНТИБИОТИКАМ
METHOD FOR DETERMINING SENSITIVITY OF BACTERIAL HEMOCULTURES TO ANTIBIOTICS

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике. Разработанный способ может быть использован в бактериологических лабораториях клиник для определения чувствительности бактериальных гемокультур к антибиотикам.
Известны стандартные способы определения чувствительности гемокультур к антибиотикам, которые включают световую микроскопию с окраской по Граму, высев первичной бульонной гемокультуры на дифференциально-диагностические плотные питательные среды с последующим субкультивированием, получение чистых культур микроорганизмов, приготовление бактериальной суспензии из чистых культур микроорганизмов, инокуляцию полученной суспензией питательного агара Мюллера-Хинтона, помещение на поверхность инокулированной питательной среды бумажных дисков с тестируемыми антибиотиками, инкубацию образцов при 35°С с последующим считыванием зон задержки роста культуры микроорганизмов вокруг дисков с антибиотиками. Вместо бумажных дисков с антибиотиками могут быть использованы специальные тест-полоски, импрегнированные антибиотиком в различных концентрациях. Известен способ определения чувствительности гемокультур к антибиотикам с помощью автоматических микробиологических анализаторов, включающий световую микроскопию с окраской по Граму, высев первичной бульонной гемокультуры на дифференциально-диагностические плотные питательные среды с последующим субкультивированием, получение чистых культур микроорганизмов, приготовление бактериальной суспензии из чистых культур микроорганизмов, инокуляцию полученной суспензией специальных карт, содержащих различные антибиотики в различных концентрациях с последующим учетом результатов [Методические указания МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам», МУК 4.2.2886-11 «Идентификация микроорганизмов и определение чувствительности их к антибиотикам с применением автоматизированной системы для биохимического анализа», клинические рекомендации МАКМАХ «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам», версия 2015-02. http://www.antibiotic.ru/minzdrav/files/ docs/clrec-dsma2015.pdf].
Основным недостатком данных способов является длительное время, необходимое для получения результата (обычно не менее 2 сут), что обусловлено физиологией микроорганизмов, требующих времени для накопления биомассы. Это является критичным для своевременного назначения адекватной антимикробной терапии, так как известно, что каждый час задержки с назначением антибиотика у больных с септическим шоком сопровождается приростом летальности на 6,7% [Kumar A., Roberts D., Wood К.Е. et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Crit. Care Med. 2006; 34 (6): 1589-1596].
Известен ряд альтернативных способов оценки чувствительности гемокультур к антибиотикам:
1. Способы косвенного определения устойчивости к антибиотикам по выявлению соответствующих генетических детерминант методом полимеразной цепной реакции [Dark P., Wilson С, Blackwood В. et al. Accuracy of LightCycler SeptiFast for the detection and identification of pathogens in the blood of patients with suspected sepsis: a systematic review protocol. BMJ Open. 2012; 2 (1): е000392]. Данные способы позволяют оценить устойчивость лишь к некоторым препаратам и не охватывают всего необходимого их перечня.
2. Определение устойчивости к антибиотикам на основе физико-химического анализа методом MALDI-ToF масс-спектрометрии продуктов, образующихся при инкубации исследуемого микроорганизма в растворе антимикробного препарата [Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-ToF) Mass Spectrometry for Detection of Antibiotic Resistance Mechanisms: from Research to Routine Diagnosis. Clin Microbiol Rev. 2013; 26 (1): 103-114]. Данная технология является в настоящее время экспериментальной и также предполагает использование в качестве субстрата чистых культур микроорганизмов.
3. Способ определения чувствительности гемокультур к антибиотикам путем анализа в режиме реального времени микроскопических изображений, отражающих гибель микробных клеток в присутствии антибиотиков. Результат антибиотикограммы доступен в среднем через 6-6,5 ч. [Price С, Douglas I., Turtle Е. et al. Rapid identification and antimicrobial susceptibility testing of bacteria in bloodstream infections using the Accelerate ID/AST technology. ECCMID 2015; EV0493].
4. Способ экспресс-анализа in vitro чувствительности грамотрицательных бактерий к антибиотикам в биологических жидкостях по повышению уровня эндотоксина в тестируемых образцах после добавления того или иного антибиотика (заявка WO2014RU00074 20140131). Заявленная применимость данного способа ограничена только грамотрицательными бактериями.
Также известен способ определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным веществам (RU №2505813 Сl, 27.01.2014), включающий забор биологического материала, инкубацию содержащихся в нем микроорганизмов на питательной среде, введение в питательную среду исследуемого антимикробного вещества с последующей оценкой результата. Исследуемое антимикробное вещество вводят в питательную среду до начала культивирования микроорганизмов в концентрации, близкой к максимально достижимой в месте забора биологического материала. Оценку чувствительности микроорганизмов к антимикробному веществу осуществляют после появления видимого роста микроорганизмов в контрольном посеве. Недостатком данного способа является недостаточная точность получаемого результата, так как ряд антибиотиков, вводимых в плотную питательную среду в процессе ее приготовления, подвергается неизбежной деградации, что делает непредсказуемой концентрацию препарата в готовой среде и не позволяет оценить получаемый результат. Данный метод использован нами в качестве наиболее близкого аналога разработанного способа.
Технической проблемой является создание способа определения чувствительности бактериальных гемокультур к антибиотикам.
Техническим результатом, достигаемым при реализации настоящего изобретения, является повышение точности определения чувствительности бактериальных гемокультур к антибиотикам в условиях сокращения времени исследования за счет:
- использования при тестировании бульонной культуры непосредственно из флакона для посева крови;
- инокуляции первичной бульонной гемокультурой агара Мюллера-Хинтона;
- использования стандартных бумажных дисков с антибиотиками, помещаемых на поверхность инокулированного агара Мюллера-Хинтона;
- осуществления инкубации при температурном режиме 37°С до появления визуально заметного роста.
При этом сокращение времени исследования (время получения результата антибиотикограммы сокращается до 3-5 ч) обусловлено исключением стадии получения чистой культуры, а также сокращением времени инкубации чашек с дисками.
Кроме того, проведенные нами клинико-лабораторные исследования (исследовались различные питательные среды, варианты приготовления суспензии, режимы инкубации) продемонстрировали высокую точность определения чувствительности гемокультур к антибиотикам лишь в случае сочетания следующих компонентов тестирования: первичная бульонная гемокультура (используемая для приготовления бактериальной суспензии с плотностью 0,5 стандарта мутности по McFarland), питательный агар Мюллера-Хинтона (используемый для инокуляции приготовленной суспензией), инкубация при 37°С в суховоздушном термостате. Нами было выявлено, что именно данное сочетание компонентов создает условия для ускоренного роста микроорганизмов, отмечаемого визуально, что сокращает время проведения тестирования.
Таким образом, применение данного способа определения чувствительности гемокультур к антибиотикам позволяет повысить точность и сократить время исследования.
Сущность разработанного способа.
Осуществляют световую микроскопию с окраской по Граму. Готовят бактериальную суспензию плотностью 0,5 стандарта мутности по McFarland, используя непосредственно первичную бульонную гемокультуру. Приготовленной суспензией инокулируют питательный агар Мюллера-Хинтона. Через 10 мин после инокуляции на поверхность агара Мюллера-Хинтона помещают бумажные диски с тестируемыми антибиотиками и инкубируют при 37°С в суховоздушном термостате до появления визуально заметного роста. Оценивают диаметр зон задержки роста микроорганизмов вокруг дисков с антибиотиками, определяя устойчивость возбудителя бактериемии к тестируемому антибиотику при выявлении зоны задержки роста, диаметр которой пропорционален уровню активности тестируемого антибиотика.
Способ осуществляется следующим образом.
Содержимое флаконов с положительной гемокультурой окрашивают по Граму и подвергают микроскопии, после чего в случае наличия монокультуры осуществляют приготовление разведения для инокуляции питательного агара Мюллера-Хинтона в стандартных чашках Петри.
Плотность инокулята - 0,5 стандарта мутности по McFarland. Через 10 мин после инокуляции агара Мюллера-Хинтона на его поверхность помещают бумажные диски с тестируемыми антибиотиками.
Перечень тестируемых антибиотиков выбирается произвольно в зависимости от конкретных диагностических потребностей.
Инокулированный агар с дисками помещают в суховоздушный термостат, где осуществляют инкубацию при 37°С, периодически (1 раз в час, начиная с третьего часа инкубации) просматривая чашки на предмет появления визуально заметного роста.
При появлении роста оценивают диаметр зон задержки роста микроорганизмов вокруг дисков с антибиотиками. Наличие зоны задержки роста указывает на активность тестируемого препарата, причем диаметр данной зоны пропорционален уровню активности тестируемого антибиотика. Отсутствие зоны задержки роста свидетельствует об устойчивости возбудителя бактериемии к данному антибиотику.
Пример.
Больной К., 29 лет, на фоне клинической картины системного воспаления выявлена положительная гемокультура. При микроскопическом исследовании положительной гемокультуры с окраской по Граму визуализированы грамотрицательные палочки, начата антибиотикотерапия меропенемом.
Непосредственно из первичной бульонной гемокультуры была приготовлена бактериальная суспензия плотностью 0,5 стандарта мутности по McFarland, которой был инокулирован питательный агар Мюллера-Хинтона, после чего на его поверхность были помещены бумажные диски с тестируемыми антибиотиками (цефуроксим, цефтриаксон, цефтазидим, цефоперазон/сульбактам, цефепим, эртапенем, имипенем, меропенем, дорипенем, полимиксин, ципрофлоксацин, левофлоксацин, амикацин). Через 3 ч инкубации образца в суховоздушном термостате при 37°С визуально отмечено появление зон задержки роста бактериальной культуры вокруг дисков с полимиксином и амикацином. Зоны задержки роста бактериальной культуры вокруг дисков с цефуроксимом, цефтриаксоном, цефтазидимом, цефоперазоном/сульбактамом, цефепимом, эртапенемом, имипенемом, меропенемом, дорипенемом, ципрофлоксацином и левофлоксацином отсутствовали. Антибиотикотерапия меропенемом признана неэффективной, произведена замена антибиотика на полимиксин с последующей положительной динамикой состояния пациента.
Описанный пример подтверждает точность определения чувствительности бактериальных гемокультур к антибиотикам в условиях сокращения времени исследования.