ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО ВЕЩЕСТВА, ТАКОГО КАК БЕЛОК, С ПЕРИОДИЧЕСКОЙ ПОДПИТКОЙ С ПРИМЕНЕНИЕМ ЧЕРЕДУЮЩИХСЯ БИОРЕАКТОРОВ
TECHNOLOGICAL METHOD FOR PRODUCTION OF BIOLOGICAL SUBSTANCE, SUCH AS PROTEIN, WITH PERIODIC FEEDING BY MEANS OF ALTERNATING BIOREACTORS

Настоящее изобретение относится к способам и системам, которые применяют для крупномасштабного культивирования клеток, особенно суспендированных клеток.
Культивирование клеток может быть выполнено в лабораторных масштабах или в промышленных масштабах. Эти два масштаба вызывают у пользователей различные проблемы. То, что работает в лабораторных масштабах, очень часто не работает в крупных масштабах. Основным различием является эффективность способа культивирования.
Настоящее изобретение в особенности относится к крупномасштабному культивированию с подпиткой или ферментации с подпиткой. Существуют два основных подхода к ферментации с подпиткой: культивирование с подпиткой фиксированного объема и культивирование с подпиткой переменного объема.
При подпитке фиксированного объема лимитирующий субстрат подается без разбавления культуры. Объем культуры также может поддерживаться практически постоянным посредством подачи ограничивающего рост субстрата в чистом виде, например в виде очень концентрированной жидкости или газа (например, кислорода). Определенный тип расширенной подпитки - циклическая подпитка культуры для систем фиксированного объема - относится к периодическому снятию части культуры и применению остаточной культуры в качестве отправной точки для дальнейшего процесса подпитки. В основном когда ферментация достигает определенной стадии (например, когда аэробные условия не могут больше поддерживаться), часть культуры удаляют и оставшуюся биомассу разбавляют до первоначального объема стерильной водой или средой, содержащей питающий субстрат. Разбавление уменьшает концентрацию биомассы и обычно приводит к увеличению удельной скорости роста. Впоследствии, с учетом продолжающейся подпитки скорость роста будет постепенно снижаться по мере того как биомасса увеличивается и снова приближается к максимально поддерживаемой в сосуде, и в этот момент часть культуры может быть снова заменена свежей культуральной средой.
Подпитка переменного объема представляет собой такую подпитку, при которой изменения объема происходят с момента ферментации. Причиной изменений обычно является питающий субстрат. Способ данных изменений объема зависит от требований, ограничений и целей оператора. Данный тип подпитки может быть еще дополнительно классифицирован как процесс с повторяющейся подпиткой или циклическое культивирование с подпиткой, а также единый процесс с подпиткой. Первый из вышеупомянутых обычно подразумевает, что как только ферментация достигает определенного этапа, после которого больше не является эффективной, некоторое количество культуры удаляют из сосуда и заменяют свежей питательной средой. Уменьшение количества клеток приводит в результате к увеличению удельной скорости роста, после чего происходит ее постепенное уменьшение по мере того как устанавливается квазистационарное состояние.
Ферментация с подпиткой имеет характерные признаки получения в периодическом режиме, а также непрерывной ферментации. Подпитка дает несколько преимуществ по сравнению с периодическим и непрерывным культивированием. Подпитка требуемых компонентов для роста и/или других субстратов, необходимых для получения продукта, не исчерпывается, и питательная среда может поддерживаться примерно постоянной в течение всего данного периода. Выработки побочных продуктов, которая, как правило, связана с присутствием высоких концентраций субстрата, также можно избежать посредством ограничения его количества теми количествами, которые необходимы исключительно для получения продукта.
Циклическое культивирование с подпиткой имеет дополнительное преимущество, заключающееся в том, что относящаяся к процессу фаза получения может быть расширена в контролируемых условиях. Контролируемые периодические сдвиги в скоростях роста дают возможность оптимизировать синтез продукта, особенно если интересующий продукт происходит во время замедления роста.
Проблема, связанная с получением биологических веществ при помощи культуральных систем, заключается в относительно высоких затратах, связанных с получением биологического вещества. В настоящем изобретении предложена более эффективная система культивирования. Настоящее изобретение дает возможность экономически эффективного и контролируемого получения биологического вещества.
В одном варианте реализации настоящего изобретения предложен способ получения биологического вещества путем культивирования клеток, которые продуцируют указанное биологическое вещество в биореакторе, причем указанный способ включает:
- обеспечение биореактора культурой клеток, содержащей указанные клетки, суспендированные в культуральной среде;
- причем указанный способ дополнительно включает осуществление по меньшей мере одного цикла культивирования и сбора клеток, включающего инкубацию указанной культуры клеток в биореакторе до тех пор, пока не будет достигнута ранняя стационарная или стационарная фаза, и сбор культуральной среды с биологическим веществом путем отделения клеток от культуральной среды, содержащей биологическое вещество, и подпитку, по существу, всех клеток обратно в биореактор для продолжения культивирования вместе со свежей культуральной средой. Преимуществом способа согласно настоящему изобретению является высокая выработка биологического вещества. Выработка вещества в дальнейшем увеличивается с каждым дальнейшим циклом инкубации/культивирования и сбора клеток. Таким образом, предпочтительно способ согласно настоящему изобретению включает по меньшей мере 2, более предпочтительно по меньшей мере 5, более предпочтительно по меньшей мере 10 и предпочтительно по меньшей мере 20 циклов инкубации и сбора клеток.
Культуру клеток собирают с помощью системы сбора клеток, которая предпочтительно поддерживает многие из условий этапа инкубации. Таким образом, система сбора клеток предпочтительно содержит средство для поддержания температуры культуры. Когда объем культуры клеток в биореакторе превышает пропускную способность системы сбора клеток, вся культура клеток еще может быть собрана. Предпочтительно это делается путем последовательной подпитки аликвот культуры клеток в систему сбора клеток. Затем цикл сбора клеток завершается, когда по существу вся культура клеток обработана. Культура клеток, которая ждет обработки, не смешивается с клетками, которые уже были обработаны с помощью системы сбора клеток. Это достигается путем подпитки обработанных клеток в другой биореактор. Обработанные клетки, таким образом, снабжаются свежей средой и подпитываются в другой биореактор для последующего цикла инкубации и сбора клеток. Плотность клеток, если это желательно, может быть скорректирована на данном этапе. Клетки могут быть концентрированными или разбавленными в зависимости от пожеланий оператора. Преимуществом настоящего изобретения является то, что возможно реализовать систему сбора клеток, которая имеет меньшую емкость, чем объем культуры клеток.
Увеличение плотности клеток желательно особенно в первых циклах для того чтобы быстро получить заданную плотность клеток, которая является желательной для получения биологического вещества. Разбавление обычно желательно в более поздних циклах, чтобы вместить продолжающееся увеличение количества клеток.
Биологическое вещество предпочтительно представляет собой вещество, которое выделяется из клеток. Биологическое вещество предпочтительно представляет собой белок, предпочтительно выделенный белок. Белок предпочтительно содержит более 50 и предпочтительно более 100 аминокислот. В особенно предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения биологическое вещество представляет собой фактор роста, антитело или растворимую форму мембранносвязанного лиганда. Биологическое вещество также может содержать антигенсвязывающий фрагмент антитела. Неограничивающими примерами таких фрагментов являются одноцепочечные Fv-фрагменты, Fab-фрагменты, моновалентные антитела и антитела, содержащие только тяжелые цепи. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения антитело представляет собой антитело млекопитающего. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения антитело представляет собой моноклональное антитело. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения антитело представляет собой мышиное, человеческое или мышиное/человеческое химерное антитело. Химерное антитело предпочтительно представляет собой гуманизированное мышиное моноклональное антитело или человеческое антитело. Существует различные типы гуманизации. Обычно по меньшей мере постоянные части антитела являются человеческими. Современные гуманизированные антитела также содержат различные участки человека, причем участки, определяющие комплементарность (CDR), заменены мышиными CDR. В качестве альтернативы антитело содержит мутации в мышиных вариабельных участках, чтобы удалить предсказанные человеческие В-клеточные и/или Т-клеточные эпитопы. В наше время стало возможно генерировать так называемые полностью человеческие моноклональные антитела. Они генерируются полностью из человеческих последовательностей. Иммунный ответ на эти полностью человеческие антитела, тем не менее, все еще возможен в зависимости от способа введения и природы CDR.
Клетки могут быть выращены либо в суспензионной культуре, либо в адгезивной культуре. Некоторые клетки естественным образом живут в суспензии, не привязываясь к поверхности, например к клеткам, которые существуют в кровотоке. Есть также клеточные линии, которые были модифицированы, чтобы иметь возможность выживать в суспензионных культурах таким образом, чтобы они могли быть выращены до более высокой плотности, чем позволяли бы адгезивные условия. Адгезивные клетки требуют поверхности, например пластичной культуры ткани или микроносителя, которые могут быть покрыты компонентами внеклеточного матрикса, чтобы увеличивать адгезионные свойства и давать другие сигналы, необходимые для роста и дифференциации. Адгезивные клетки обычно могут быть адаптированы к росту суспензии, в качестве альтернативы клетки могут быть, как упоминалось выше, прилеплены к микроносителям, которые затем суспендируются и культивируются в биореакторе. Клетки в настоящем изобретении предпочтительно представляют собой клетки, которые растут в суспензии. Предпочтительными являются клетки млекопитающих. Предпочтительные клетки-продуценты представляют собой клетки яичника китайского хомячка или ЯКХ (СНО) клетки, а также клеточную линию NS0. В особенно предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения клетки представляют собой клетки ЯКХ.
Рост клеток в типичном культивировании с периодической подпиткой клеток млекопитающих может быть классифицирован на 7 этапов: (А) лаг-фаза; (В) ранняя фаза логарифмического роста; (С) фаза логарифмического/экспоненциального роста; (D) ранняя стационарная фаза; (Е) стационарная фаза; (G) ранняя фаза гибели; (F) фаза гибели.
A. Во время лаг-фазы клетки адаптируются к условиям роста. Количество клеток в популяции не увеличивается.
B. Во время ранней фазы логарифмического роста все больше и больше клеток адаптируется и вступает в фазу экспоненциального роста.
C. Фаза экспоненциального роста (иногда называемая лог-фазой или фазой логарифмического роста) представляет собой период, характеризующийся клеточным удвоением. Количество новых клеток, появляющихся в единицу времени, пропорционально имеющейся популяции. Если рост не ограничен, удвоение будет продолжаться с постоянной скоростью, так что и количество клеток, и скорость роста популяции будут удваиваться с каждым последующим периодом времени. Для этого типа экспоненциального роста график зависимости натурального логарифма количества клеток от времени представляет собой прямую линию. Наклон этой линии представляет собой удельную скорость роста клеток. Фактический уровень этого роста (т.е. наклон кривой линии на фигуре) зависит от условий роста и типа клеток.
D. Ранняя стационарная фаза (или ранняя фаза плато) представляет собой фазу между фазой логарифмического роста и стационарной фазой и характеризуется прогрессирующим снижением скорости роста популяции. Эта фаза характеризуется тем, что скорость роста популяции составляет треть или менее от максимальной скорости роста в фазе экспоненциального роста. Ранняя стационарная фаза заканчивается, когда рост клеточной популяции равен нулю или менее.
E. Стационарная фаза или фаза плато часто связана с ограничивающим рост фактором; это в основном истощение питательного вещества и/или образование ингибирующих продуктов. В стационарной фазе размер клеточной популяции остается более или менее постоянным. Получение биологического вещества, как правило, самое высокое в этой фазе.
F. В фазе гибели клетки остаются без питательных веществ, или токсичные продукты уже накапливаются до такой степени, что клетки погибают.
G. Ранняя фаза гибели определяет конец стационарной фазы, когда все больше и больше клеток погибает.
В зависимости от того как клетки были обработаны до начала культивирования, лаг-фаза может присутствовать или отсутствовать. Например, крупномасштабные культуры обычно инициируются из посевных культур и прекультур. В таких случаях можно иметь очень короткую или отсутствующую лаг-фазу, так как клетки могут уже быть адаптированы к условиям культивирования при культивировании с подпиткой у посевных культур и/или прекультур.
В циклических системах культивирования, таких как настоящее изобретение, более поздние циклы обычно повторяют этапы С и D. При необходимости один или более циклов дополнительно включают шаги Е, F и G. Фаза экспоненциального роста в более поздних циклах может достичь или не может достичь такой же максимальной скорости роста, как в первом цикле. В каждом цикле начало ранней стационарной фазы характеризуется тем, что скорость роста популяции уменьшается до одной трети или менее максимальной скорости роста в предыдущей экспоненциальной фазе. Скорость роста обычно вычисляется с помощью касательной к кривой роста.
В особенно предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения культуру для каждого цикла собирают в то время, когда культура находится на этапе С, D или Е. Предпочтительно культуру для каждого цикла собирают в то время, когда культура находится на этапе С или D, более предпочтительно на этапе D.
В другом варианте реализации настоящего изобретения культуру в цикле 2 и дальнейших циклах собирают после по меньшей мере одного дня, предпочтительно после по меньшей мере двух дней, более предпочтительно после по меньшей мере трех дней инкубации, клетки независимо от этапа роста находятся внутри в момент инициирования этапа сбора клеток.
В другом варианте реализации настоящего изобретения культуру для каждого цикла собирают, когда достигается заданная плотность клеток. Для культур после первого цикла культивирования и сбора клеток предпочтительно, чтобы их собирали, когда клетки в культуре достигают плотности клеток по меньшей мере 0,7×10е8, предпочтительно по меньшей мере 1×10е8 и более предпочтительно по меньшей мере 2×10е8 на мл.
Примеры систем для получения биологического вещества приведены на фигурах 1-3. В этих системах клетки, которые продуцируют указанное биологическое вещество, культивируют и отделяют от культуральной среды, содержащей биологическое вещество. После отделения предпочтительно по существу все клетки возвращают в биореактор для продолжения культивирования вместе со свежей культуральной средой. На фигуре 1 система сбора клеток 100 содержит множество биореакторов 10, 15. Эти биореакторы выполнены с возможностью инкубации клеточной культуры клеток, суспендированных в культуральной среде в указанном биореакторе. Система состоит из ряда устройств подачи культуральной среды (16), выполненных с возможностью компенсации потерь выходящего потока путем подачи культуральной среды или ее компонента в биореакторы.
В частности, устройство подачи 16 непосредственно соединено с биореактором, при этом другое устройство подачи 16 для подачи среды и буфера могут быть соединены с насосом и коммутационным блоком 40, который соединен с сепаратором 30.
Кроме того, предусмотрены средства (не показаны) для определения количества клеток или плотности в биореакторах 10, 15. Как правило, такими средствами могут быть детектор подсчета клеток, плотномер или проточный цитометр известного в данной области техники типа. Детектор может быть выполнен с возможностью определения плотности клеток. Заданное пороговое значение для введения в детектор может быть определено эвристически или посредством расчета и оно указывает, что инкубация культуры клеток в одном из указанных биореакторов достигла ранней стационарной фазы или стационарной фазы, определенных выше в настоящем описании.
Сепаратор 30 выполнен с возможностью коммуникационной связи между модулем сбора клеток 20 и множеством биореакторов. Сепаратор подпитывается культурой клеток, которую перекачивают с помощью насоса и коммутационного блока из одного из биореакторов 10, 15 и затем подпитывают с помощью среды и буферной подпитки 16. В примере, показанном на фиг. 1 и 2, сепаратор 30 выполнен с возможностью отделения клеток от культуральной среды, содержащей биологическое вещество, посредством центрифуги 35. В центрифуге 35 концентрированный псевдоожиженный слой клеток образуется посредством уравновешивания потоков жидкости свежей среды 16, при этом порция клеток из биореактора и скорость вращения центрифуги 35 являются широко известными через непрерывное сбалансированное действие центробежной силы и силы потока жидкости.
Центрифуга 35 содержит входное отверстие свежей среды 16, выполненное с возможностью достижения указанной силы потока жидкости и, таким образом, отделения клеток от культуральной среды с биологическим веществом.
В примере насосный и коммутационный блок 40 образован посредством двунаправленного насоса, соединенного с коммутаторами, которые переключают поток жидкости между одним из биореакторов 10 и другим биореактором 15 после очистки культуры клеток в сепараторе 35. В работе при обнаружении указанной ранней стационарной фазы или стационарной фазы в одном из указанного множества биореакторов 10, 15 поток генерируется в сепаратор 30 посредством извлечения культуры клеток из одного из биореакторов 15 и подачи в сепаратор свежей среды и буфера.
Путем направления потока обратно из сепаратора и переключением потока в сторону другого биореактора 15 по существу все клетки подаются обратно из сепаратора 30 через указанный насос и коммутационный блок 40 в другой биореактор 15 для продолжения культивирования вместе со свежей культуральной средой.
Культуральную среду, содержащую биологическое вещество и буфер, периодически подают в модуль сбора 20, который собирает биологическое вещество путем фильтрации, как описано ниже в настоящем описании.
Культуры могут достигать более высоких плотностей клеток в процессе инкубации, когда среда является по меньшей мере частично переработанной. Таким образом, во время инкубации культуры клеток, в отличие от системы, описанной на фигуре 2, предпочтительно, чтобы по меньшей мере часть культуры клеток биореакторов 10 и 15 непрерывно текла в систему сепарации 50, которая содержит отбирающую по размеру полупроницаемую мембрану 55.
Мембрана 55 отделяет клетки и биологическое вещество от веществ, имеющих более низкую молекулярную массу, чем биологическое вещество,
создавая тем самым не содержащий клетки и биологическое вещество выходящий поток, который выводится. Кроме того, поток жидкости, содержащий клетки и биологическое вещество, подается обратно в биореактор, и
потери от вытекания по меньшей мере компенсируются путем подачи культуральной среды или ее компонента в биореактор.
Такие устройства мембранного разделения 50 часто упоминаются как устройства для фильтрации переменного тангенциального потока (ПТП). Этот тип фильтрации отличается от тупиковой фильтрации, при которой поданный материал пропускают через мембрану или фильтрующий слой, при этом твердые вещества оказываются в ловушке в фильтре, а фильтрат высвобождается на другом конце. При ПТП-фильтрации большая часть подаваемого потока движется по касательной через поверхность фильтра, а не в фильтр. Переменный тангенциальный поток создается под действием перегородки, движущейся вверх и вниз внутри головки насоса, соединенной с корпусом фильтра и прикрепленной к биореактору (см. для справки WO 2005/095578 и WO 2008/006494).
Устройство мембранного разделения 50 обычно представляет собой ультрафильтрационное устройство. Фильтр в устройстве разделения, как правило, представляет собой полупроницаемую мембрану, содержащую поры с определенной молекулярной массой отсечки. Фильтр или полупроницаемая мембрана, применяемая в способе согласно настоящему изобретению, способна отделять биологическое вещество от веществ, имеющих более низкую, чем биологическое вещество, молекулярную массу. Другими словами, молекулярная масса отсечки выбрана таким образом, что молекулярная масса отсечки (ММО) меньше, более предпочтительно по меньшей мере фактора 2, наиболее предпочтительно по меньшей мере фактора 3, меньше, чем молекулярная масса биологического вещества. Как правило, но, конечно, в зависимости от молекулярной массы биологического вещества, получаемого в способе согласно настоящему изобретению, ММО разделительной системы предпочтительно составляет по меньшей мере 5, более предпочтительно по меньшей мере 10, наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 кДа и предпочтительно не более 500 кДа, более предпочтительно не более 300 кДа, наиболее предпочтительно не более 100 кДа. Например, для иммуноглобулина класса G (IgG) с молекулярной массой 150 кДа наиболее предпочтительной является разделительная система, имеющая ММО не более 50 кДа.
Стадию сбора в цикле инкубации и сбора клеток проводят на всей культуре. В настоящем изобретении предпочтительно, чтобы объем культуры был выше, чем емкость устройства для сбора клеток. В данном варианте реализации настоящего изобретения сбор делается путем последовательной подпитки культуры в систему сбора клеток. Система сбора клеток предпочтительно содержит систему фильтрации поперечного потока, в результате чего среда с биологическим веществом заменяется свежей культуральной средой. Такая поперечно-потоковая система сбора клеток обычно содержит фильтры или полупроницаемые мембраны с ММО, которые отделяют клетки от биологического вещества и культуральной среды. В этих устройствах ММО обычно выше 200 кДа. Такие устройства также называют устройствами микрофильтрации поперечного потока, а способы - микрофильтрацией. В этих устройствах микрофильтрации размер пор обычно составляет от 0,1 микрометра до 10 микрометров.
В особенно предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения система сбора клеток содержит систему с псевдоожиженным слоем, основанную на действии центробежной силы. В этом варианте реализации способа согласно настоящему изобретению предпочтительно, чтобы культуральную среду с биологическим веществом собирали путем пропускания культуры клеток в центрифугу, которая поддерживает клетки в виде концентрированного псевдоожиженного слоя посредством постоянного сбалансированного действия центробежной силы и силы потока жидкости, вследствие чего сила потока жидкости действует за счет притока свежей среды, и тем самым клетки отделяются от культуральной среды с биологическим веществом. Предпочтительные примеры систем с псевдоожиженным слоем, основанных на действии центробежной силы, описаны в WO 10/008579, WO 10/008563 и WO 11/044237. Поэтому эти ссылки включены в настоящее описание посредством ссылки.
Для сравнения на фигуре 3 изображен сепаратор 30, отображающий модуль фильтрации тангенциальным потоком. В модуле аналогично устройству мембранного разделения 50, описанному выше в настоящем описании, предусмотрена отбирающая по размеру полупроницаемая мембрана и входное отверстие для свежей среды, выполненное с возможностью обеспечения тангенциальным потоком. Здесь отбирающая по размеру полупроницаемая мембрана предназначена для удержания клеток и позволяют собирать среду вместе с биологическим веществом в выходящем потоке. Таким образом, клетки отделяют от культуральной среды с биологическим веществом, и по существу все клетки могут быть возвращены в другой биореактор 15 для продолжения культивирования вместе со свежей культуральной средой.
Крупномасштабное культивирование в соответствии с настоящим изобретением представляет собой культивирование, которое содержит по меньшей мере 1 литр и предпочтительно по меньшей мере 2 литра культуральной среды и клеток в цикле инкубации и сбора клеток. Предпочтительно оно содержит по меньшей мере 5 литров культуральной среды и клеток.
Способ согласно настоящему изобретению предпочтительно включает систему культивирования с подпиткой как стадию инкубации в циклах инкубации и сбора клеток.
Когда инкубацию культуры клеток в последующие циклы культивирования и сбора клеток проводили в разных или чередующихся биореакторах, неожиданно было обнаружено, что культуры клеток развивались быстрее и вырабатывалось больше биологического продукта. Это было особенно справедливо для тех вариантов реализации настоящего изобретения, в которых объем культуры (т.е. культуральной среды и клеток) превышал объем системы сбора клеток за один проход. Больший выход был замечен, когда собираемые клетки передавали в другой биореактор. Это приводило к предпочтительному способу работы, при котором культура клеток передавалась в другой биореактор для каждого цикла инкубации и сбора клеток. В этом варианте реализации настоящего изобретения предпочтительно, если культура чередуется между двумя биореакторами для каждого цикла инкубации и сбора клеток. Это приводит к тому, что во время сбора клеток культура вводится в систему сбора клеток из одного биореактора, обрабатывается в системе сбора клеток, и впоследствии клетки в свежей культуральной среде выводятся в другой биореактор. Использованный биореактор может оставаться в системе как есть, с получением культуры после завершения следующего цикла, его можно очистить, или он может быть заменен на чистый биореактор, или может иметь место комбинация этих применений.
В предпочтительном варианте реализации настоящее изобретение включает культивирование клеток с периодической подпиткой клеток млекопитающих (более конкретно клеток ЯКХ) с применением чередующихся биореакторов в сочетании с периодическим отделением биомассы от биологического вещества (более конкретно моноклональных антител) и компонентов отходов.
Высокая плотность клеток, высокая жизнеспособность клеток и высокая продуктивность могут периодически поддерживаться во времени путем отделения биомассы в ранней стационарной фазе роста от биологического вещества и компонентов отходов и повторной подачи этих жизнеспособных клеток во второй биореактор, который работает в режиме загрузки с подпиткой. Клетки затем продолжают расти в фазе экспоненциального роста и достигают ранней стационарной фазы (часто в течение 0,5-2 дней). Далее процесс периодического отделения повторяется, и биомасса передается обратно в первый реактор, который работает в режиме с подпиткой, и снова клетки растут в течение 0,5-2 дней от фазы экспоненциального роста к ранней стационарной фазе. Этот способ периодической подпитки в чередующиеся биореакторы после отделения биологических веществ и отходов компонентов повторяется до тех пор, пока не будет получено достаточно биологического вещества или жизнеспособность клеток не упадет ниже 90%. При необходимости биомасса может быть концентрированной или разбавленной после отделения перед переносом в следующий биореактор.
Предпочтительный вариант реализации настоящего изобретения, в котором в ходе инкубации культуры клеток в биореакторе по меньшей мере часть культуры клеток непрерывно перетекает в разделительную систему, которая содержит отбирающую по размеру мембрану, предпочтительно объединяют с предпочтительным вариантом реализации настоящего изобретения, в котором культуральную среду с биологическим веществом собирают в результате подачи потока культуры клеток в центрифугу, которая поддерживает клетки в виде концентрированного псевдоожиженного слоя посредством постоянного сбалансированного действия центробежной силы и силы потока жидкости, вследствие чего сила потока жидкости действует за счет притока свежей среды, и тем самым клетки отделяются от культуральной среды с биологическим веществом. Клетки могут быть впоследствии переданы обратно в биореактор для дальнейшего цикла культивирования и сбора клеток или могут быть переданы в другой биореактор. В последнем режиме, как упомянуто выше в настоящем описании, можно реализовать систему сбора клеток, которая имеет меньшую емкость для жидкости, чем объем культуры клеток. При дальнейшей инкубации предпочтительно, чтобы по меньшей мере часть культуры клеток непрерывно перетекала в разделительную систему, которая содержит отбирающую по размеру мембрану. В разделительном устройстве потребляемая среда и вещества (отходы) с более низкой молекулярной массой, чем у биологического вещества, удаляются из культуры. В системе сбора клеток потребляемая среда, биологическое вещество и вещества (отходы), имеющие более высокую молекулярную массу, чем у биологического вещества, такие как клеточный дебрис, нуклеиновые кислоты и белки, удаляются из культуры. Этот предпочтительный вариант реализации настоящего изобретения является особенно эффективным способом обеспечения условий для многократного цикла культивирования и сбора клеток при очень высокой плотности клеток, при сохранении относительно недорогой системы, связанной с непрерывным культивированием в биореакторе, причем по меньшей мере часть культуры клеток непрерывно протекает в разделительную систему, которая содержит отбирающую по размеру мембрану.
Предпочтительно, чтобы во время культивирования в разделительной системе и центрифуге поддерживали условия культивирования. Таким способом клетки, которые культивируются, испытывают условия культивирования в различных циклах культивирования и сбора клеток согласно настоящему изобретению. С точки зрения клеток культивирование представляет собой непрерывное культивирование, тогда как с точки зрения оператора процесса, ответственного за обработку утилизации отходов и сбор биологической субстанции, культивирование является полунепрерывным. С точки зрения клеток систему, содержащую систему разделения, центрифугу и один или несколько биореакторов можно рассматривать как один биореактор для культуры клеток. Клетки испытывают условия культивирования в течение всей процедуры. Не все условия культивирования должны поддерживаться. Предпочтительным условием культивирования, которое должно поддерживаться, является температура, другим условием культивирования, которое предпочтительно должно поддерживаться, является оксигенация. Еще одним дополнительным условием культивирования, которое предпочтительно должно поддерживаться, является рН. Поддержание условий культивирования предпочтительно означает, что условие в течение всей процедуры не отклоняется более чем на 15% от значения условия в начале процедуры. Температуру предпочтительно поддерживают на уровне 35,5-37,5°С, предпочтительно на уровне 37°С, оксигенацию предпочтительно поддерживают на уровне 40-60% в пересчете на концентрацию растворенного кислорода, предпочтительно на уровне 50% концентрации растворенного кислорода, рН предпочтительно поддерживают на уровне значения рН 6,7-7,5, предпочтительно на уровне рН 7 или 7,1.
В одном варианте реализации настоящего изобретения предпочтительно, чтобы в первом из циклов культивирования и сбора клеток клетки собирали при более низкой плотности клеток, чем в более позднем цикле культивирования и сбора клеток. В этом варианте реализации настоящего изобретения клетки собирают предпочтительно при плотности клеток менее чем 50×10е6, предпочтительно менее чем 25×10е6 клеток/мл.
Плотность клеток, относящаяся к клеткам в культуральной среде, которая выводится на стадии центрифугирования, на стадии сбора клеток может изменяться по отношению к плотности клеток, относящейся к клеткам в культуральной среде, которая вводится в центрифугу. Этот вариант реализации настоящего изобретения позволяет устанавливать плотность клеток, относящуюся к клеткам в культуральной среде в начале культивирования, в следующем цикле культивирования и сбора клеток. В зависимости от желаемой или требуемой плотности клеток использование ПТП-аппарата может быть применено к обоим биореакторам со скорректированной стратегией подачи. Разделение биологического вещества и компонентов отходов (межклеточной жидкости) реализуется путем применения центрифугирования или поперечно-потоковой фильтрации в фильтрующем модуле сбора 20. С этой целью на фигурах 1-3 фильтрующий модуль сбора 20 содержит отверстие для выпуска отходов 21 и фильтрующий элемент глубинного типа 22, который выполнен с возможностью отделения биологического вещества от веществ, имеющих более высокую молекулярную массу, чем биологическое вещество.
Процесс разделения всего содержимого биореактора должен быть завершен в течение нескольких часов из-за жизнеспособности клеток.
Элементом настоящего изобретения является повторяемое культивирование клеток с периодической подпиткой между экспоненциальной фазой роста и ранней стационарной фазой роста в чередующихся биореакторах. Этот способ дает высокую выработку биологического вещества в относительно короткий период времени по сравнению с перфузионной обработкой благодаря низкому уровню компонентов отходов. Кроме того, повторение этой короткой, но дающей высокую выработку фазы способа подпитки дает гораздо более высокие общие выработки, которые можно сравнить с регулярной периодической обработкой и обработкой с подпиткой. Общая выработка биологического вещества может в 25 раз превышать выработку при регулярной периодической обработке в течение 10 дней после того как первое культивирование с подпиткой достигнет ранней стационарной фазы.
Дополнительным преимуществом данного повторяемого культивирования клеток с периодической подпиткой является возможность сделать возможной непрерывную последующую обработку благодаря коротким промежуткам между последовательными сборами клеток (0,5-2 суток). Биологическое вещество может непрерывно выпускаться из промежуточной емкости для хранения для подачи дополнительной очистки. В этом случае посредством обработки может быть реализована высокая выработка продукта в малообъемном непрерывном эксплуатационном режиме.