СПОСОБ ОЦЕНКИ ПОДЛИННОСТИ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
METHOD OF AUTHENTICATING MEDICINAL PLANT RAW MATERIAL AND APPARATUS FOR REALISING SAID METHOD

Изобретение относится к газовой хроматографии и может быть использовано для стандартизации и оценки подлинности различного лекарственного сырья в медицине, фармакологии, здравоохранении, пищевой, парфюмерной и других отраслях промышленности.
Известны способы и устройства для стандартизации лекарственного растительного сырья (ЛРС) и фитопрепаратов (ФП) на их основе, основанные на определении биологически активных соединений (БАС) и стандартных образцов сравнения (СО) с использованием различных видов хроматографии и УФ-спектроскопии. Данные методы позволяют быстро и надежно оценить качество сырья по ведущей группе БАС. При этом, как правило, не используются дополнительные стадии очистки, увеличивающие время анализа и ведущие к неизбежной потере части исследуемых веществ (см.: Отраслевой стандарт Минздрава РФ ОСТ. 91500.05.001-00. Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения. - Введ. 01.01.01. - 2000. - 12 С.).
Известны так же способы стандартизации ЛРС, биологически активных добавок (БАД) и различных ФП (см.: Куркин В.А. Фармакогнозия. Учебник. 2-е изд., перераб; и доп.- Самара: ООО «Офорт». ГОУ ВПО СамГМУ, 2007 - 1239 с.).
Для определения подлинности ЛРС и ФП также используют так называемый метод «отпечатков пальцев», при котором на хроматограмме оценивают не отдельные классы и индивидуальные вещества, а совокупность БАС (см., например, Терешина Н.С., Абрамов А.А., Маркарян А.А. Анализ гомеопатических препаратов барбариса хроматографическими методами. // Вестник МГУ. Сер. 2. Химия, 2006. - Т. 47. №5. - С.346-349.)
Однако известные способы определения подлинности ЛРС не обеспечивают возможности прямого анализа БАС непосредственно в самом ЛРС, а требуют заранее приготовленных препаратов, например, эфирное масло, настойки, экстракты, отвары и т.д.
Наиболее близким к изобретению по совокупности существенных признаков является способ стандартизации полимеров по «отпечаткам пальцев» в виде совокупности пирограмм продуктов их пиролиза, при котором фиксированное количество измельченного исследуемого сырья помещают в герметичный обогреваемый сосуд, выдерживают при заданной температуре, продукты пиролиза дозируют в хроматографическую колонку, измеряют величину их сигнала и времена удерживания для идентификации и стандартизации полимеров (см.: Березкин В.Г., Алишоев В.Р., Немировская И.Б. Газовая хроматография в химии полимеров. - М.: Наука, 1972 - 283 с.)
Недостатками известного способа является низкая достоверность при стандартизации ЛРС и плохая сходимость результата анализа.
Наиболее близким к изобретению по совокупности существенных признаков является газовый хроматограф Цвет-100, содержащий пиролитическую приставку, кран-дозатор, узел ввода пробы с испарителем и делителем потока, капиллярную колонку и пламенно-ионизационный детектор (см.: Алишоев В.Р., Березкин В.Г., Блинов А.С., Колмановский В.Н., Яшин Я.И. и др. Пиролитическое устройство для газовой хроматографии. Авт. свид. СССР №284418 от 14.10.1970. // Бюлл. изобр. №32, 1970, см. также: Техническое описание и инструкция по эксплуатации на хроматограф серии «Цвет-100». Технические условия 1.550.033ТУ).
Недостатком известного устройства для оценки подлинности ЛРС является повышенная погрешность при определении интерполяционных характеристик для качественного и количественного анализа компонентов РПФ, так как внешний стандарт - гомологи н-алканов вводят шприцом в узел ввода пробы с испарителем, а компоненты РПФ в линию газа-носителя краном-дозатором, в результате чего начало двух анализов, фиксируемое по моменту ввода пробы, отличается друг от друга.
Задачей изобретения является повышение достоверности при стандартизации ЛРС и улучшение сходимости результатов анализа в условиях повторяемости.
Эта задача решается за счет того, что в способе оценки подлинности лекарственного растительного сырья, при котором фиксированное количество исследуемой пробы помещают в герметичный сосуд, выдерживают при заданной температуре, компоненты равновесной паровой фазы дозируют в хроматографическую колонку, измеряют величину их сигнала и времена удерживания, отличающийся тем, что исследуемую пробу выдерживают в герметичном сосуде при температуре 100°C в течение 40 минут, компоненты равновесной паровой фазы анализируют на стандартной капиллярной колонке с узлом ввода пробы с делителем потока при линейном программировании температуры, выходные сигналы компонентов равновесной паровой фазы сравнивают с сигналами внешних стандартов гомологов н-алканов для расчета интерполяционных характеристик сорбатов, а синхронизацию момента ввода анализируемых проб осуществляют по сигналу детектора на фиксированную часть потока из линии сброса делителя узла ввода пробы.
Эта задача решается также за счет того, что в устройстве для оценки подлинности лекарственного растительного сырья, содержащем блок подготовки газов, кран-дозатор, герметичный обогреваемый сосуд для исследуемых образцов, узел ввода пробы с делителем потока, капиллярную колонку, детектор и программатор анализа, отличающееся тем, что вход детектора соединен с помощью тройника как с выходом капиллярной колонки, так и с линией сброса делителя потока узла ввода пробы через постоянное пневмосопротивление, а измерительная схема детектора снабжена дополнительным усилителем, соединенным с программатором анализа.
При решении поставленной задачи создается технический результат, заключающийся в следующем:
i
i
1. Повышается достоверность при стандартизации ЛРС за счет создания справочных банков данных в виде «отпечатков пальцев» для различных ЛРС. Справочные банки содержат совокупность индексов удерживания при линейном программировании температуры колонки  и количественную информацию в виде концентраций компонентов РПФ (C), рассчитанных по относительным выходным сигналам методом двойного внутреннего стандарта. Стандартизация и оценка подлинности исследуемого ЛРС заключается в подтверждении совокупности полученных  и C по справочным данным банка.
2. Улучшается сходимость результатов анализа в условиях повторяемости (прецизионность измерения), что достигается использованием интерполяционных выходных сигналов для качественного и количественного анализа ЛРС.
Это позволяет сделать вывод, что заявляемые изобретения связаны между собой единым изобретательским замыслом.
Изобретение поясняется чертежом. На фигуре 1 схематически изображено устройство для оценки подлинности лекарственного растительного сырья, которое содержит блок подготовки газов 1, кран-дозатор 2, герметичный обогреваемый сосуд для исследуемых образцов 3, узел ввода пробы с делителем потока 4, капиллярную кварцевую колонку 5 фирмы Varian типа VF-1 (длина 30 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 0,5 мкл), детектор 6, дополнительный усилитель 7, программатор анализа 8 и постоянное пневмосопротивление 9.
3
Устройство для оценки подлинности лекарственного растительного сырья работает следующим образом: 5 г измельченного ЛРС помещают в герметичный обогреваемый сосуд 3 и нагревают до 100°C. Кран-дозатор 2 в это время находится в положении «анализ» (сплошные линии), и газ-носитель азот поступает в узел ввода пробы 4, колонку 5 и детектор 6. ЛРС выдерживают в сосуде 340 минут и кран-дозатор переключают в положение «набор» (пунктирные линии), газ-носитель вымывает компоненты РПФ из сосуда 3 в колонку 5. Время операции «набор» 30 секунд, после чего кран-дозатор снова переключают в положение «анализ». Разделение компонентов РПФ проводят в режиме линейного программирования температуры колонки. Начальная температура колонки 40°C, скорость нагрева 5°C/мин. Конечная температура 180°C. Общее время анализа 40 минут. Деление потока на входе в колонку 1:40, расход газа-носителя в колонке 1 см/мин. Начало каждого анализа синхронизируется программатором анализа 8 по сигналу детектора 6 через дополнительный усилитель от фиксированной части потока из линии сброса делителя потока узла ввода пробы 4.
Для определения интерполяционных выходных сигналов в качественном и количественном анализе компонентов РПФ в качестве внешних стандартов используют гомологи н-алканов (от гексана до гексадекана), смесь которых дозируют микрошприцом объемом 0,5 мкл в узел ввода пробы 4, температура испарителя 250°C.
По результатам газохроматографического анализа компонентов РПФ и смеси н-алканов рассчитывают следующие характеристики:
1. Времена удерживания сорбатов РПФ и гомологов н-алканов  и  соответственно, где z - число углеродных атомов в молекуле н-алкана.
2. Индексы удерживания компонентов РПФ при линейном программировании температуры колонки.
3. Нормированные выходные сигналы для компонентов РПФ  и для гомологов н-алканов .
пр
i
z
где y - выходной хроматографический сигнал из линии сброса делителя потока, пропорциональный объему пробы; y и y - выходные сигналы компонентов РПФ и н-алканов соответственно.
4. Концентрации компонентов РПФ методом двойного внутреннего стандарта.
z
z+1
где C и C - концентрация н-алканов в анализируемой смеси.
5. Среднее квадратическое отклонение (СКО) среднего арифметического результата измерений.
где  - для предлагаемого способа;
i
x=y - для известного способа;
n - число измерений.
6. Относительное СКО среднего арифметического результата измерения в %.
7. Граница доверительного интервала измерения в %.
8. Правильность измерения концентрации модельной смеси в %.
i
i
ист
где C - измеренная по уравнению (3) концентрация с использованием выходных сигналов, y (для известного способа) и  (для предлагаемого способа); С - истинная концентрация в модельной смеси, рассчитанная по процедуре приготовления путем взвешивания компонентов смеси на аналитических весах.
i
В известном способе навеску измельченного ЛРС помещают в пиролитическую приставку, выдерживают при температуре 800°С, а продукты пиролиза хроматографируют и получают совокупность выходных сигналов ( - время удерживания и Q - площадь хроматографического пика) в виде «отпечатков пальцев».
Эксперименты проводили с использованием следующего ЛРС: листья мяты перечной, трава тархуна, трава зверобоя и плоды расторопши пятнистой.
Правильность и прецизионность измерения оценивали по результатам анализа модельной двухкомпонентной смеси н-алканов (декан - 35 мас.%, и ундекан - 65 мас.%). Число измерений n=5. Смесь готовили гравиметрическим методом путем взвешивания компонентов на аналитических весах ВЛА-200.
Результаты экспериментов сведены в таблицу «Сравнительные данные экспериментальной проверки известного и предлагаемого способов».
Таблица 1
Сравнительные данные экспериментальной проверки известного и предлагаемого способов
№ п/п
Наименование
Известный способ
Предлагаемый способ
н-декан
н-ундекан
н-декан
н-ундекан
1.
Среднее значение выходного сигнала, (2)
- абсолютного, y<sub>i</sub>, мВ·с
720
1275
-
-
- нормированного, <img file="00000015.tif" he="6" wi="5" img-content="undefined" img-format="tif" />
-
-
0,343
0,607
2.
Относительное СКО, S<sub>r</sub>, %, (5)
3,9
4,1
1,6
1,7
3.
Граница доверительного интервала измерения, ±Δ, %, (6)
10,8
11,4
4,4
4,7
4.
Правильность измерения концентрации модельной смеси, δ, %, (7)
6,1
5,8
2,5
2,4
5.
Анализ ЛРС для стандартизации и оценки подлинности
Совокупность выходных сигналов «отпечатки пальцев»
Время удерживания <img file="00000016.tif" he="6" wi="6" img-content="undefined" img-format="tif" />, мин
Индекс удерживания, (1)
5.1.
Листья мяты перечной
20,251±3,1
935, 968,1015,1026, 1059,1083, 1142, 1167 Δ=±2 ед. индекса
5.2.
Трава тархуна
593, 655, 665, 709, 804, 1145, 1504, 1512 Δ=±2 ед. индекса
5.3.
Трава зверобоя
11,972±1,8
601,633,660, 686, 793,923Δ=±2 ед. индекса
5.4.
Плоды расторопши пятнистой
9,055±1,414,755±2,2
540, 568, 580, 711, 869, 907, 998Δ=±2 ед. индекса
Как видно из приведенных в таблице 1 данных, предложенный способ обеспечивает значительное повышение достоверности при стандартизации ЛРС по сравнению с известным способом. Так, совокупность выходных сигналов для всех образцов ЛРС (п.5 таблицы 1) составляет не менее шести сигналов с различными индексами удерживания, а граница доверительного интервала измерения не превышает ±2-х единиц индекса или 2%, в то время как для известного способа трава тархуна вообще не идентифицируется, а для листьев мяты перечной и травы зверобоя имеет место только по одному реперному веществу, причем граница доверительного интервала измерения абсолютного времени удерживания в режиме пиролиза достигает ±15%.
Прецизионность или сходимость измерения выходных сигналов в условиях повторяемости и правильность измерения концентрации модельной смеси для предлагаемого способа более чем в два раза выше, чем для известного (см. п.п.2, 3, 4 таблицы 1).
Использование предлагаемого способа оценки подлинности лекарственного растительного сырья и устройства для его осуществления позволяет:
1. Создать справочно-информационный банк данных по совокупности выходных сигналов компонентов РПФ (индексы удерживания при линейном программировании температуры колонки и количественное содержание отдельных компонентов РПФ по нормированным выходным сигналам методом двойного внутреннего стандарта).
2. Проверить стандартизацию и оценку подлинности ЛРС с использованием справочного банка.
3. Проводить экспресс-анализ качества и принадлежности различных БАД и ФП данному ЛРС.