Определение митомицина-С в тканях мочевого пузыря при лечении поверхностного рака

УДК 543.544.6

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИТОМИЦИНА-С В ТКАНЯХ МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ПОВЕРХНОСТНОГО РАКА

А.В. Пирогов, Е.Б. Пашкова, А.А. Бендрышев, Р.В. Ульянов*, О.А. Шпигун

Разработана методика количественного определения митомицина-С в тканях мочевого пузыря методом градиентной высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием в режиме электрораспылительной ионизации. Диапазон линейности градуировочного графика от 20 до 400 мкг/л. Предел обнаружения составил 15 нг/л. Предложена процедура пробоподготовки, представляющая собой простую экстракцию водой. Она позволяет количественно оценить содержание митомицина-C в биологических тканях. Предложенный способ был использован для определения митомицина-C в реальных образцах биологической ткани.

Ключевые слова: микроэмульсионная жидкостная хроматография, митомицин-С.

Рак мочевого пузыря (РМП) в структуре онкологических заболеваний (в 2006 г. в России выявлено 12700 больных) составляет 4%, поражая мужчин и женщин в соотношении 3:1. Наиболее часто (70-80%) встречаются неинвазивные опухоли мочевого пузыря, распространяющиеся в пределах слизистого и под-слизистого слоев. Однако поверхностный РМП склонен к рецидивированию, причем у половины больных рецидивы возникают в течение первого года после проведенного хирургического вмешательства.

Прогноз болезни зависит от стадии и диффе-ренцировки опухоли. Возникновение рецидива или прогрессирования заболевания зависит от ряда прогностических факторов: размер опухоли, ее диффе-ренцировка, количества опухолей (единичные или множественные), частота возникновения рецидивов за год [1].

Основными методами профилактики рецидивов, прогрессирования и при определенных показаниях лечения поверхностного РМП являются внутрипу-зырная химиотерапия (ВХТ), внутрипузырная иммунотерапия и фотодинамическая терапия [2]. Идеальный препарат для химиотерапии рака должен сочетать два основных качества: высокую противоопухолевую активность и низкую системную токсичность. Вну-трипузырное введение химиопрепарата позволяет, с одной стороны, снизить системное токсическое воздействие, а с другой - доставить химиопрепарат к опухоли в максимальной концентрации.

В настоящее время препаратом первой линии при поверхностном раке мочевого пузыря является

Митомицин-С (6-Амино-1,1а,2,8,8а,8б-гексагидро-8-(гидроксиметил)-8а-метокси-5-метил-азирино[2', 3':3,4] пирроло[1,2-а]индол-4,7-дион карбамат) - антибиотик, образуемый некоторыми видами актино-мицетов (рис. 1). Он ингибирует синтез и повреждает ДНК в клетках, а также способствует перекисному окислению липидной мембраны. Препарат не имеет стандартной дозы для внутрипузырного введения, доза может варьировать от 20 до 60 мг на введение с экспозицией до 180 мин. Суммарная курсовая доза препарата варьирует от 150 до 300 мг [3]. Однако, по данным работы [4], в группе больных, получивших однократную инстилляцию химиопрепаратом, частота рецидивов составила 35,8% у больных с одиночными опухолями, а у пациентов с мультифокальным поражением мочевого пузыря частота рецидивов достигала 65,2%. Данный факт свидетельствует о том, что однократная инстилляция является недостаточно эффективной профилактической процедурой у боль-

Н

Рис. 1. Структурная формула митомицина-С

^Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена.

ных с множественными опухолями. Высокий процент рецидивов при внутрипузырной химиотерапии митомицином-C заставляет искать повышения эффективности внутрипузырной химиотерапии в плоскости ее комбинированного использования с другими противоопухолевыми методами, в частности с фотодинамической терапией.

При этом необходим контроль за количеством препарата, собирающегося на стенках мочевого пузыря в здоровых и пораженных раком участках. В литературе, однако, встречаются лишь способы определения митомицина-C в плазме крови. В работе [5] к аликвоте плазмы добавляли раствор внутреннего стандарта (порфиромицина), смесь перемешивали в течение 10 мин, добавляли ацетонитрил для денатурации белка, центрифугировали полученную смесь и в течение 4-5 ч испаряли растворитель под вакуумом. В процессе определения использовали колонку Hypersyl-ODS-C18 (250x8,4 мм, 5 мкм). Предел обнаружения составил 0,5 мкг/л.

В работе [6] для определения митомицина-С в плазме крови использовали колонку LiChroCART C18 (250x4 мм, 5 мкм). В качестве подвижной фазы использовали ацетатный буферный раствор и ацетони-трил в соотношении 85:15, скорость потока подвижной фазы 1 мл/мин, спектрофотометрическое детектирование проводили при 365 нм. Предел обнаружения составил 0,45 мкг/л.

В табл. 1 приведены важнейшие характеристики рассмотренных выше методов определения митомицина-С. По-видимому, хроматографическое определение более предпочтительно, так как обладает большей селективностью по сравнению с электрохимическим. При выборе детектора при хроматогра-фическом определении митомицина-С важно отметить, что спектрофотометрическое детектирование дает более высокие пределы обнаружения, к тому же обладает меньшей селективностью, чем масс-спектроскопическое. Таким образом, для проведения эксперимента было выбрано хроматографическое определение с масс-селективным детектированием.

Данная статья посвящена разработке способа хромато-масс-спектрометрического определения митомицина-С в тканях мочевого пузыря.

Экспериментальная часть

Хроматографические эксперименты выполняли на приборном комплексе «Agilent 1100» фирмы «Agilent» (США), включающем бинарный градиентный насос, автосэмплер, термостат колонки, квадруполь-ный масс-спектрометрический детектор серии SL,

снабженный источником электрораспылительной ионизации и компьютерную систему для сбора и обработки данных. Разделение проводили на хроматогра-фической колонке Zorbax Eclipse XDB-C18 (150x4,6 мм, размер зерна 5 мкм, «Agilent Technologies», США). Пробы взвешивали на аналитических весах «OHAUS Explorer Pro», США с точностью 0,0001 г. Для гомогенизации проб использовали гомогенизатор «Si-lentCrusher», снабженный насадкой типа 3F фирмы «Heidolph», Германия и ультразвуковую баню («Сапфир», Россия). Перед вводом в хроматограф пробы центрифугировали на центрифуге «Elmi СМ-50» (Латвия) при скорости вращения 18000 об./мин. Для отбора точных объемов жидкостей использовали дозаторы переменного объема 10-100 и 100-1000 мкл, фирмы «HTL», Польша. Для приготовления растворов известной концентрации использовали Митомицин-С фирмы «Sigma-Aldrich» (США), а также ацетонитрил (HPLC, gradient grade, «Panreac», Испания). Растворы готовили на деионизованной воде сопротивлением не менее 18,2 Мом.

Для градуировки использовали образец ткани, не содержащей митомицин-С. Образец массой около 50 мг гомогенизировали с 0,5 мл физиологического раствора, в гомогенат вносили необходимое количество стандартного раствора митомицина-С (табл. 1) и добавляли деионизованную воду в таком количестве, чтобы суммарный объем жидкости (физиологического раствора, стандартного раствора митомицина-С и воды) был равен 1 мл. Далее гомогенат помещали на 5 мин на ультразвуковую баню (температура бани не должна превышать 20°С). Смесь центрифугировали в течение 1 мин, отбирали надосадочную жидкость и вводили в хроматограф.

В исследовании принимали участие 5 пациентов (мужчины) с первичными и рецидивирующими опухолями мочевого пузыря. Средний возраст составил 64 года. У трех пациентов был диагностирован высокодифференцированный переходноклеточный рак (G1), у двух - низкодифференцированный пере-ходноклеточный рак (G3) (табл. 2). После проведения каждого лечебного сеанса проводили биопсию неизмененной слизистой оболочки и опухоли. Био-птаты помещали в пластиковую пробирку, содержащую 1 мл физиологического раствора и определяли концентрацию митомицина-С методом ВЭЖХ. Накопление митомицина-С в слизистой и опухоли исследовали в двух разных режимах: 1) внутрипузырное введение митомицина-С в дозе 40 мг с экспозицией 2 ч; 2) внутрипузырное введение митомицина-С в дозе 40 мг с экспозицией 2 ч и с последующей обработкой

Т а б л и ц а 1

Сравнительная характеристика разных методов определения митомицина-С

Метод определения Условия определения Детектирование Предел обнаружения Диапазон линейности градуировочного графика Литература

Хроматографи-ческий подвижная фаза H2O:MeCN (78:22); скорость потока 0,6 мл/мин; температура 35оС; объем пробы 70 мкл масс-селективное (ESI, напряжение фрагментора 200 В) 20 нг/л 0,1-250 мкг/л [7]

Хроматографи-ческий подвижная фаза H2O:MeCN (70:30); скорость потока 1,3 мл/мин; температура 30оС; объем пробы 50 мкл спектрофотометрическое (длина волны детектирования 365 нм) 1 мкг/л 1-500 мкг/л [5]

Хроматографи-ческий подвижная фаза -фосфатный буферный раствор и метанол (85:15); скорость потока 1 мл/мин; температура колонки 30оС; объем пробы 200 мкл спектрофотометрическое (длина волны детектирования 365 нм) 500 нг/л 0,5-50 мкг/л [8]

Хроматографи-ческий подвижная фаза -ацетатный буферный раствор и MeCN (85:15) ; скорость потока 1 мл/мин; температура колонки 30оС; объем пробы 200 мкл спектрофотометрическое (длина волны детектирования 365 нм) 450 нг/мл 40 до 1000 мкг/л [6]

Электрохимии-ческий первоначальный потенциал 0,0 В; конечный потенциал 0,75 В; скорость развертки 0,2 В/с 30 мкг/л 100-1000 мг/л [9]

Электрохимии-ческий первоначальный потенциал 0,0 В; конечный потенциал 0,75 В; скорость развертки 0,2 В/с 27 мкг/л 83,5 мкг/л - 0,033 г/л [10]

уротелия лазером с длиной волны 630 нм и плотностью энергии 12 Дж/см2.

До проведения исследования с помощью диагностической установки «Спектр» установлено, что раствор митомицина-С не меняет длину волны и плотность энергии лазерного излучения. В исследовании использовали полупроводниковый лазер с длиной волны 630 нм.

результаты и их обсуждение

Выбор условий хроматографического определения

В качестве подвижной фазы выбраны смеси воды и ацетонитрила в разных соотношениях, так как обычно при использовании таких смесей удается добиться наибольшей эффективности и симметричности хроматографического пика. На рис. 2 представлена за-

Т а б л и ц а 2

Содержание митомицина-С в образцах ткани

Возраст (лет), тип опухоли Место отбора пробы Найденная концентрация митомицина- С после обработки, мкг/г ткани

митомицин-С митомицин-С и лазер 12 Дж/см2

58, G1 слизистая 188i 22 11i 2

опухоль 40i 3 123i 17

63, G3 слизистая 345i 37 161i 18

опухоль 147i 21 359i 38

66, G1 слизистая 272i 23 77i 8

опухоль 181i 21 130i 19

67, G1 слизистая 133 i 20 4,1 i 0,6

опухоль 95 i 14 128 i 19

68, G3 слизистая 60i 9 202i 26

опухоль 198i 24 453i 42

висимость времени удерживания митомицина-С от содержания ацетонитрила в подвижной фазе. Увеличение доли ацетонитрила ведет к уменьшению времени удерживания митомицина-С. При определении митомицина-С в реальных образцах использовали режим градиентного элюирования. Состав подвижной фазы в данном случае изменяли следующим образом: в начальный момент времени элюент состоял на 70% из воды и на 30% из ацетонитрила, затем после элюирования митомицина-С из хроматографической колонки (через 5 мин после начала анализа) долю ацетонитрила в подвижной фазе повышали до 90% с целью быстрого вымывания сильноудерживаемых

10 20 30 40

Доля ацетонитрила, мас.%

Рис. 2. Зависимость времени удерживания митомицина-С от концентрации ацетонитрила в подвижной фазе. Условия определения: колонка Zorbax Eclipse XDB-C18 (150*4,6 мм, размер зерна 5 мкм). Градиентное элюирование при соотношении воды и ацетонитрила: 0-5 мин вода (70:30); 5,0-7,5 мин (10:90); 7,5-12,0 мин (70:30). Термостатирование при 30 оС. Объем вводимой пробы 50 мкл, скорость потока подвижной фазы 0,5 мл/мин. Спектрофото-метрическое детектирование при 365 нм

компонентов пробы, после чего (через 7,5 мин после начала анализа) состав элюента приводили к первоначальному состоянию (вода 70%, ацетонитрил 30%). Таким образом, удавалось сократить время анализа до 12 мин без ущерба для селективности разделения. Хроматографическую колонку термостатировали при 30°С. Объем вводимой пробы составлял 50 мкл, а скорость потока подвижной фазы - 0,5 мл/мин.

Выбор режима детектирования

В качестве источника ионизации выбран вариант электрораспылительной ионизации в режиме регистрации положительных ионов. Для подбора оптимальных условий масс-спектроскопического детектирования в режиме прямого ввода использовали раствор митомицина (50 мкг/л) в режиме сканирования ионов (от m/z = 100 до m/z = 1000). Найдено, что наиболее интенсивными ионами в масс-спектре являлись ионы с m/z = 335 и m/z = 357 (рис. 3). Для снижения пределов обнаружения количественное определение проводили по сумме аналитических сигналов, полученных от этих ионов.

Для поиска наилучшего соотношения сигнал/шум исследовали зависимость сигналов от напряжения фрагментора. Напряжение варьировали в диапазоне от 0 до 200 В с шагом 10 В (рис. 4). Установлено, что оптимальное значение напряжения фрагментора составляет 40 В.

Пробоподготовка

Объектами исследования являлись образцы ткани мочевого пузыря, взятые на опухоли и вблизи опу-

Рис. 3. Масс-спектр митомицина-С

Рис. 4. Зависимость интенсивности сигнала детектора при разных напряжениях фрагментора

холи. Определение митомицина-С проводили в два этапа. На первом этапе отбирали физиологический

раствор, в котором находился образец ткани. Измеряли объем отобранной жидкости и вводили в хроматограф. Второй этап - определение содержания митомицина-С непосредственно в ткани. Для этого пробирку с тканью взвешивали на аналитических весах, затем добавляли 0,5 мл экстрагента и помещали на 2 мин на ультразвуковую баню. Обнаружено, что наилучшим экстрагентом является вода, так как при ее использовании удается добиться наиболее полной экстракции из-за наибольшего разбухания образца ткани. Ультразвуковую баню использовали для интенсификации процесса экстракции, т.е. для сокращения времени пробоподготовки и увеличения степени извлечения митомицина-С из ткани. Температуру воды в бане поддерживали на уровне 40°С во избежание разложения митомицина-С. Далее полученный раствор с осадком центрифугировали (16 000 об/мин) в течение 2 мин и отобранную надосадочную жидкость вводили в хроматограф. После этого содержимое пробирки удаляли, выдерживали пустую пробирку в течение 2 ч в сушильном шкафу при температуре 150°С и взвешивали пустую пробирку на аналитических весах. Массу ткани находили по разности полученных величин. Затем суммировали значения концентрации митомицина-С, полученные на первом и втором этапах, и пересчитывали содержание данного вещества на 1 г ткани.

Количественное определение митомицина-С

В оптимальных условиях была построена градуи-ровочная зависимость площади пика от концентрации митомицина-С. Для построения зависимости исполь-

Рис. 5. Хроматограмма экстракта ткани здорового участка ткани мочевого пузыря, обработанного митомицином-С. Условия определения см. на рис. 2

зовали экстракты из контрольного (т.е. не содержащего митомицин-С) образца ткани, добавляя известные количества митомицина-С. Градуировочный график линеен при концентрациях от 20 до 400 мкг/л. Предел обнаружения составил 15 нг/л. На рис. 5 представлена хроматограмма экстракта здорового участка ткани мочевого пузыря, обработанного митомицином-С.

В табл. 2 приведено содержание митомицина-С в образцах, взятых на разных участках ткани больных раком мочевого пузыря. Хотя для достоверных выводов число пациентов недостаточно, вероятно, можно говорить о тенденции накопления митомицина-С в тканях опухоли после ее обработки лазером.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Botteman M.F., Pashos C.L., Hauser R.S. // Qual. Life. Res. 2003. 12. P. 675.

2. Чиссов В.И., Старинский В.В., Петрова Г.В. Злокачественные новообразования в России в 2001 году (заболеваемость и смертность). М., 2010.

3. Русаков И.Г., Быстрое А.А. // Практ. онкология. 2003. 4. С. 214.

4. Hamdy F.C., Hastie K.J., Kerry R., Williams J.L. // Braz. J. Urol. 1993. 71. P. 183.

5. Rump A., Woschee M., Theisohn R., Fischbach W., Lackner W., Klaus W. // Eur J. Clin. Pharmacol. 2002. 58. P. 459.

6. Yi D, Yi J., Xue D, Xue B. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2005. 25. P. 413.

7. Nozal M.J., Bernal J.L., Marin M.T., Bernal J., Torres R.M., Merayob J. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2006. 40. P. 100.

8. Paroni R., Arcelloni C, Veccchi D. // Clin-Chem.1997. 43. P. 615.

9. Marin D., Pérez P., Teijeiro C., PalecekE. // Biological Procedures Online. 1998. 1. P. 100.

10. Qu W, Wang H, Wu K. // Collect. Czech. Chem. Commun. 2005. 70. P. 178.

Поступила в редакцию 06.04.12

THE DETERMINATION OF MITOMYCIN-C IN URINARY BLADDER AT SURFACE CANCER THERAPY

A.V. Pirogov, E.B. Pashkova, A.A. Bendryshev, R.V. Ulyanov, O.A. Shpigun

A technique of the quantitative determination of mitomicin-C in bladder core by a method of gradient high performance liquid chromatography with a mass-spectrometric detection in an electrospray mode of ionization was developed. A range of linearity of the calibration plot is 20 to 400 ppb. The limit of the detection is 15 ppb. A sampling procedure, including a single extraction by water allow the quantitatively determination of mitomicin-C. The proposed technique was used for the determination of mitomicin-C in the real samples of human bladder.

Key words: microemulsion liqiud chromatography, mitomicin-C.

Сведения об авторах: Пирогов Андрей Владимирович - вед. науч. сотр. кафедры аналитической химии химического факультета МГУ, докт. хим. наук (Pirogov@analyt.chem.msu.ru); Пашкова Елена Борисовна - аспирант кафедры аналитической химии химического факультета МГУ; Бендрышев Александр Александрович - мл. науч. сотр. кафедры аналитической химии химического факультета МГУ; Ульянов Роман Васильевич - науч. сотр. Московского научно-исследовательского онкологического института им. П.А. Герцена, канд. мед. наук; Шпигун Олег Алексеевич -профессор кафедры аналитической химии химического факультета МГУ, докт. хим. наук, чл.-корр. РАН (Shpigun@ analyt.chem.msu.ru).