Новый подход к разработке тканеинженерных конструкций: первый опыт создания «Безматриксного» эквивалента сердечной мышцы

ИМИ!

Новости клеточных технологий

И

Оценку твердости, определяющей жевательную функцию зубов, оценивали с помощью теста твердости Кну-па. Нормальный показатель, характерный для коренных зубов мышей возрастом 9 недель, равен в среднем 88 единицам, чему соответствовала твердость биоинже-нерных зубов. Более того, исследователи оценивали взаимодействие корней с окружающей их костной тканью, т.е. функционирование периодонтальной связки. Известно, что в физиологических условиях в точке компрессии костной ткани запускаются процессы резорбции, опосредованные действием остеокластов, а в области растяжения — остеогенез [3]. В этой связи, при выполнении постоянной механической нагрузки на биоинженерные зубы в щечном направлении (в течение 17 сут.) было показано, что в области компрессии кости локализуются остеокласты (положительная реакция на тартрат-резистентную кислую фосфатазу), а на противоположной, язычной стороне — остеобласты (ос-теокальцин-позитивные), что подтверждает вовлеченность периодонтальной связки в передачу механической нагрузке костной ткани.

В заключении авторы оценивали проводимость но-цицептивной импульсации по нервным окончаниям пульпы зуба. Для этого устанавливали уровень экспрессии нейротрансмиттеров, участвующих в восприятии и проведении болевых раздражений (галанин, galanin) [4], пептид, связанный с геном кальцитонина (calcitonin gene-related peptide, CGRP [5]). Был показан высокий уровень продукции CGRP, а также закономерное увеличение экспрессии галанина при болевой стимуляции.

Таким образом, в серии исследований был отработан метод воспроизведения эмбрионального органогенеза in vitro, обоснована эффективность применения клеточных продуктов, сформированных на его основе, в эксперименте in vivo, а также показаны впечатляющие функциональные результаты трансплантации полученных биоинженерных эквивалентов. Нужно отметить, что данное исследование, базирующееся на использовании эмбрионального клеточного материала, имеет, главным образом, теоретическое и экспериментальное значение, позволяя продвинуться в изучении процессов эмбрионального гисто- и органогенеза, но пока не применимо в клинической практике.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Ohazama A., Modino S.A. Stem-cell-based tissue engineering of murine teeth. J. Dent. Res. 2004; 83C7): 518-22.

2. Pispa J., Thesleff I. Mechanisms of ectodermal organogenesis. Dev. Biol. 2003; 262: 195-205.

3. Wise G.E., King G.J. Mechanisms of tooth eruption and orthodontic tooth movement. J. Dent. Res. 2008; 87: 414-34.

4. Deguchi Т., Takeshita N.. Balam T.A. et al. Galanin-immunoreactive nerve ?bers in the periodontal ligament during experimental tooth

movement. J. Dent. Res. 2003; 82: 677-81.

5. Byers M.R., Narhi M.V. Dental injurymodels: Experimental tools for understanding neuroinflammatory interactions and polymodal nociceptor functions. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 1999; 10: 4-39.

6. Nakao K., Morita R., Saji Y. The development of a bioengineered organ germ method. Nat. Methods 2007; 4[3): 227-30.

7. Ikeda E., Morita R., Nakao K. Fully functional bioengineered tooth replacement as an organ replacement therapy. PNAS 2009; 106(321: 13475-80.

Подготовил ИЯ, Бозо

По материалам: Ikeda Е„ Morita R„ Nakao К. Fully functional bioengineered tooth replacement as an organ replacement therapy. PNAS 2009; 106(32): 13475-80

Новый подход к разработке тканеинженерных конструкций: первый опыт создания «безматриксного» эквивалента сердечной мышцы

Применение тканеинженерных конструкций на основе клеток-предшественниц кардиомиоцитов считается перспективным подходом в лечении пациентов, перенесших инфаркт миокарда, однако исследования в этой области пока ограничиваются доклиническими экспериментами на животных. В течение последних двух лет были опубликованы работы, в которых сообщается о создании жизнеспособных эквивалентов миокарда человека на основе кардиомиоцитов, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ЗСК) человека. Кардиомиоциты вводили в сердечную мышцу экспериментальных животных с индуцированным инфарктом миокарда. Тем не менее, образовавшиеся in vivo фрагменты миокарда состояли из малого количества клеток, большая часть которых со временем гибла [1—3]. Предварительное помещение трансплантируемых клеток на обеспечивающие их адгезию трехмерные матриксы увеличивает

срок жизни и возможные размеры трансплантата [4, 5]. Однако, у подобных тканеинженерных конструкций есть другие недостатки, связанные с недостаточной биосовместимостью, неоптимальными механическими и другими характеристиками различных матриксов.

В 2008 г. научная группа под руководством С. Миггу предложила новый подход к созданию макроскопических тканеинженерных конструкций, предназначенных для восстановления сердечной мышцы после ее повреждения [6]. Фрагменты сердечной ткани были получены из высокоочищенных кардиомиоцитов, индуцированных из ЗСК человека. Клетки центрифугировали и формировали плотный конгломерат, который затем трансплантировали под перикард реципиенту. Со временем, однако, из-за недостатка питания в трансплантате неизбежно развивался некроз, распространявшийся от его центра к периферии. В 2009 г. эта же группа исследователей

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 4, 2009

ИМИ!

Новости клеточных технологий

сообщила об улучшении разработанного подхода и создании васкуляризованных фрагментов сердечной мышцы, благодаря чему удается решить проблему центрального некроза.

Исследователи провели несколько параллельных экспериментов, в которых трансплантировали иммуноде-фицитным мышам конгломераты клеток, содержавшие:

— кардиомиоциты, полученные из ЭСК человека (в количестве 3-108);

— кардиомиоциты, полученные из ЭСК человека (в количестве 3-108), и эндотелиальные клетки, выделенные из пуповинной вены человека, в соотношении 1:1;

— кардиомиоциты, полученные из ЗСК человека (в количестве 3-108), эндотелиальные клетки, выделенные из пуповинной вены человека, и эмбриональные дермальные фибробласты мыши, в соотношении 1:1:0,5;

— кардиомиоциты, полученные из ЗСК человека

-

ные из пуповинной вены человека, и фетальные дермальные фибробласты человека, в соотношении 1:1:0,5.

Клеточные конгломераты трансплантировали под перикард, и через 1 нед. после операции оценивали их приживаемость, а также проводили гистологический и им-муногистохимический анализ образовавшейся ткани.

Было вновь подтверждено, что трансплантаты, состоящие только из кардиомиоцитов, быстро резорбируются in vivo и не формируют жизнеспособных структур в сердце реципиента. Добавление в исходные клеточные конгломераты эндотелиальных клеток пуповинной вены также не влияло на полученный результат, не приводя к развитию в трансплантате капиллярной сети. Добавление же к двухкомпонентным клеточным конгломератам эмбриональных фибробластов мыши либо человека приводило к тому, что в обоих случаях в трансплантате формировалась капиллярная сеть. Все фрагменты сердечной ткани, полученные в экспериментах, были способны к ритмичным сокращениям под действием электрической стимуляции in vitro, однако трехкомпонентные трансплантаты обладали в 3^4 раза более высокой механической прочностью в сравнении с одно- и двухкомпонентными, тем не менее, не обладая механическими характеристиками нормальной сердечной ткани. По-видимому, увеличение механической прочности было связано с синтезом коллагена фибробластами — в трансплантате между кардиомиоцитами обнаруживались тонкие волокна соединительной ткани.

In vivo трехкомпонентные клеточные конгломераты формировали фрагменты сердечной мышцы, в 10 раз

превосходившие по размерам фрагменты ткани, образовавшиеся из одно- и двухкомпонентных конгломератов. Более того, образовавшиеся в них капилляры анасто-мозировали с капиллярами сердца животного-реципиен-та, что было подтверждено обнаружением в капиллярах, имевших выстилку из эндотелиоцитов человека, форменных элементов крови мыши.

Эмбриональные фибробласты, содержавшиеся в трехкомпонентных трансплантатах, обеспечивали выживание и пролиферацию кардиомиоцитов и эндоте-лиоцитов не только благодаря синтезу паракринных факторов, но и прямым межклеточным контактам. Добавление в исходный клеточный конгломерат кондиционированной культуральной среды, в которой выращивали эмбриональные фибробласты, не оказывал значимых эффектов на свойства одно- и двухкомпонентных трансплантатов. Авторы работы указывают на то, что эмбриональные фибробласты по своим характеристикам очень близки к мультипотентным мезенхимальным стромальным клеткам (ММСК), содержащимся в костном мозге взрослых млекопитающих и, по-видимому, следующим шагом в разработке «безматриксных» тканеинженерных конструкций должно стать использование именно этого типа клеток вместо эмбриональных фибробластов.

Несмотря на то, что в описанной работе проведен исчерпывающий анализ полученных тканеинженерных структур, остается решить ряд фундаментальных и практических вопросов, прежде чем можно будет говорить о потенциальной применимости данной методики в клинике. Все полученные фрагменты ткани были способны сокращаться в ритме здорового сердца человека (около 70 сокращений в мин). Однако этого факта, приведенного авторами работы в качестве доказательства принципиальной возможности использования трансплантатов в терапии пациентов с перенесенным инфарктом, недостаточно для подобного вывода. На данный момент не ясно, какого эффекта следует ожидать от трансплантации тканеинженерных фрагментов сердечной мышцы в поврежденный миокард, поскольку трансплантация проводилась только в интактную ткань. Микроокружение в зоне повреждения значительно отличается от такового в здоровой ткани, и до проведения соответствующих доклинических испытаний нельзя спрогнозировать приживаемость трансплантатов и их успешную интеграцию в сердечную мышцу реципиента, а, значит, нельзя и сделать уверенного заключения о перспективности описанного интересного подхода.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Laflamme М.А., Chen K.Y., Naumova A.V. et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat. Biotechnol. 2007; 25: 1015—24.

2. Caspi 0., Huber I., Kehat I. et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes improves myocardial performance in infarcted rat hearts. J. Am. Coll. Cardiol. 2DD7; 50: 1884—93.

3. Van Laake L.W., Passier R., Monshouver-Kloots J. et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes survive and mature in the mouse heart and transiently improve function after myocardial infarction.

Stem Cell Res. 2DD7; 1: 9-24.

4. Simpson D., Liu H., Fan T.H. et al. A tissue engineering approach to progenitor cell delivery results in significant cell engraftment and improved myocardial remodeling. Stem Cells 2DD7; 25: 2350—7.

5. Carrier R.L., Papadaki M., Rupnick M. et al. Cardiac tissue engineering: Cell seeding, cultivation parameters, and tissue construct characterization. Biotechnol. Bioeng. 1999; 64: 580—9.

6. Stevens K.R., Pabon L., Muskheli V., Murry C.E. Scaffold-free human cardiac tissue patch created from embryonic stem cells. Tissue Eng. Part A 2008; 15: 1211-22.

Подготовила А.С. Григорян

По материалам: Stevens K.R., Kreutziger K.L., Dupras S.K. et al. Physiological function and transplantation of scaffold-free and vascularized human cardiac muscle tissue. PNAS 2009; 106: 16568-73

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, hl< 4, 2009