Lignification process studying in the common pine (Pinus sylvesrtis L. ) cell culture

Заключение. Увеличение урожайности за счет оптимизации системы удобрений на 2т/га у сорта Са-мур позволило повысить коэффициент энергетической эффективности на 20,4 %, биоэнергетический коэффициент (КПД) посева - на 2,1 %, чистый энергетический доход на 71,3 ГДж/га и снизило энергетическую себестоимость на 0,6 ГДж/га.

Варианты опыта, при которых достигнута наибольшая продуктивность посева по сортам культуры, оказались наилучшими и по энергетической эффективности.

Таким образом, энергозатраты на внесение минеральных удобрений окупаются эффективнее при оптимизации системы удобрений.

Литература

1. Доспехов Б.А., Васильев И.П., Туликов А.М. Практикум по земледелию. - М.: Агропромиздат, 1987. -

С. 57-58.

2. Методика государственного сортоиспытания сельскохозяйственных культур. - М.: МСХ СССР, 1961. -

Вып. 1. - 240 с.

3. Базарова Е.И., Глинки Е.В. Методика биоэнергетической оценки технологий производства продукции растениеводства. - М., 1983. - 45 с.

УДК 576.5.57.085.23 Т.В. Железниченко, В.В. Стасова, Г.Ф. Антонова

ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССА ЛИГНИФИКАЦИИ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ

Изучено формирование и лигнификация каллуса сосны обыкновенной при разном содержании в питательной среде сахарозы и поливинилпирролидона. Установлено, что количество низкомолекулярных метаболитов, содержание, состав и структура лигнина, а также соотношение в нем низко- и высокомолекулярных фракций, зависят от условий культивирования и степени развития клеток каллуса. Уровень гистогенеза каллуса и условия его культивирования влияют также на состав структурных единиц и фракций лигнина.

Ключевые слова: Pinus sylvestris L., культура ткани, каллус, вторичное утолщение и лигнификация, лигнин.

T.V. Zheleznichenko, V.V. Stasova, G.F. Antonova LIGNIFICATION PROCESS STUDYING IN THE COMMON PINE (Pinus sylvesrtis L.) CELL CULTURE

Formation and lignification of the common pine tylosis at different sucrose and polyvinyl pyrrolidone availability in nutrient medium is studied. It is determined that the low-molecular metabolite number, availability, composition and structure of lignin, and proportion in it of low - and high-molecular fractions, depend on the cultivation conditions and tylosis cell development degree. Tylosis histogenesis level and the conditions of its cultivation influence the structural unit structure and lignin fractions.

Key words: Pinus sylvestris L., tissue culture, tylosis, secondary thickening and lignification, lignin.

Введение. Процесс лигнификации растений, в том числе хвойных, активно исследуется в последнее время с использованием культуры тканей, которую применяют как модельную систему при изучении путей биосинтеза оксикоричных кислот, как предшественников лигнина, и ферментов, участвующих в этом процессе [13, 4, 7, 6]. Такие сведения важны как для понимания самого процесса лигнификации, так и получения растений либо с низким содержанием лигнина, либо его легкой доступностью химической деградации [10; 5].

Цель исследований. Изучение процесса лигнификации в каллусной культуре ткани сосны обыкновенной.

Объекты и методы исследований. Для получения каллуса использовали стерилизованные отрезки побегов, собранных в конце июня и середине июля и обработанных антисептиком. С отрезков снимали кору и собирали экспланты со стороны либо ксилемы, либо флоэмы, контролируя под микроскопом локализацию камбиальной зоны. Были получены слои клеток развивающейся ксилемы и флоэмы, содержащие камбиальную зону, а также смесь клеток ксилемы и флоэмы с камбием между ними. Последний эксплант позволил получить каллус, который использовался для дальнейших исследований.

Экспланты помещали на питательную среду / МС (среда МС с уменьшенным вдвое содержанием макроэлементов) [8], дополненную активированным углем (0,3 %) и не содержащую ростовых стимуляторов (фитогормонов), и выдерживали в темноте при 2°С в течение 3 дней. Затем их переносили на среду / МС с добавлением аскорбиновой кислоты (0-200 мг/л), фотогормонов (2,4-Д, НУК и БАП) и инкубировали в темноте при 25 ± 2°С в течение месяца до появления первичного каллуса. Эту же среду использовали для поддержания каллусных культур.

Для инициации дифференциации каллуса с последующей лигнификацией после 12 пассажа изменяли состав питательной среды и условия освещенности. Каллус выращивали на свету при 16-часовом фотопериоде и 25 ± 2°С. В питательной среде изменяли концентрацию сахарозы с 3 (обр. 14) до 5 % (обр. 15-16). Показано, что сахароза является источником углерода в процессе лигнификации [9]. Кроме того, в среду добавляли поливинилпироллидон (обр. 16), который снижает отрицательное влияние фенолов, накапливающихся в среде, на прирост каллусной массы [7]. Все среды доводили до рН 5.8 и автоклавировали.

Для анализа использовали каллус с одинаковым временем выращивания на питательной среде (три недели). Так как после этого периода дифференциация клеток в каллусе была неравномерной, т.е. каллус имел гетерогенную структуру, его биомассу разделяли на «светлую» (активно делящиеся клетки) (обр. 14с-16с) и «темную» (с лигнифицированными клеточными стенками) (обр. 14т-16т) части, которые анализировали раздельно.

Цитологические исследования проводили методом давленых препаратов и мацерации. Присутствие лигнина оценивали по реакции Визнера (флороглюцин - соляная кислота).

Лигнин выделяли тиогликолевой кислотой [11], после экстракции клеток каллуса 80 % этанолом. В процессе выделения были получены низко- и высокомолекулярные фракции лигнина. Структуру лигнина исследовали методом щелочного окисления с оксидом меди [2].

В спиртовых экстрактах определяли содержание таких низкомолекулярных метаболитов, как углеводы [1], фенолы [3], аскорбиновая и дегидроаскорбиновая кислоты [14], определяющие уровень окислительных процессов в ткани.

Результаты исследований и их обсуждение. Гистохимический анализ показал, что в «светлых» (т.е. растущих) частях каллуса преобладали округлые клетки с тонкими стенками и крупным ядром. Очень редко наблюдалось слабое окрашивание на лигнин (обр. 14с-16с).

В «темных» (т.е. дифференцированных) частях каллуса форма клеток была более разнообразной. Встречались округлые, овальные и другие по форме клетки, многие с вторичным утолщением (трахеидопо-добные). Утолщение клеточных стенок было различным, но реакцию на лигнин давали преимущественно стенки со сплошным утолщением (обр. 14т-16т).

Химический анализ. Состав спирторастворимых метаболитов меняется в зависимости от условий культивирования каллуса и степени дифференциации клеток (рис. 1).

X

О

X

го

*

ф

О

О

20

15

го

5510

со

14с 14т 15с 15т 16с 16т

Образцы каллуса

£

о

X

го

*

ф

О

О

Образцы каллуса

а

5

0

Рис. 1. Содержание углеводов

Количество низкомолекулярных углеводов при содержании сахарозы в питательной среде 3 % ниже (обр. 14с, 14т), чем при 5 % (обр. 15с, 15т), тогда как спирторастворимых ФС, наоборот, выше. Применение поливинилпирролидона (обр. 16) усиливает накопление углеводов в растущих клетках каллуса.

Данные по влиянию сахарозы на спирторастворимые углеводы и фенольные соединения указывают на то, что этот субстрат оказывает значительное воздействие на метаболизацию низкомолекулярных соединений.

Отношение АК/ДАК, определенное по содержанию аскорбиновой (АК) и дегидроаскорбиновой (ДАК) кислот, в активно делящейся части каллуса (обр. 14с), культивированного при 3 %-й сахарозе, было низким (0,055), т.е. преобладали процессы окисления. В лигнифицированной части (обр. 14т) АК не было обнаружено, что, вероятно, связано с её окислением до ДАК и, возможно, с подавлением синтеза АК. Отношение АК/ДАК в 15с (0,164) ниже, чем в 15т (0,264). Низкое содержание АК в 15т (10,6 мг % от сух. веса) по сравнению с 15 с (23,1 мг % от сух. веса) может оказывать воздействие на лигнификацию каллуса в 15т, поскольку окисление АК до ДАК способствует накоплению продуктов окисления предшественников лигнина - монолиг-нолов, производных оксикоричных кислот. Увеличение концентрации АК в обр. 15 по сравнению с обр. 14 обусловлено повышенным содержанием сахарозы, что приводит к образованию уроновых кислот в каллусе, являющихся субстратами для синтеза АК.

В образцах 16с и 16т уровень АК и ДАК не измерялся, поскольку применение поливинилпирролидона затрудняет их определение.

Условия культивирования и степень гистогенеза каллуса существенно влияют также на содержание и состав лигнина (рис. 2). Увеличение содержания сахарозы способствует усилению лигнификации ткани, что согласуется с содержанием АК. В зависимости от факторов меняется также соотношение низкомолекулярных и высокомолекулярных фракций в синтезированном лигнине. Минимальное содержание фракций лигнина отмечалось в растущей («светлой») части каллуса, культивированного при низком (3 %) содержании сахарозы (обр.14с), а максимальное в дифференцированной («темной») части каллуса, культивированного на среде с повышенной (5 %) концентрацией сахарозы (обр. 15т).

го

*

ф

ч

о

О

25

20

15

10

5

0

Образцы каллуса

14с 14т 15с 15т 16с 16т

Образцы каллуса

б

Рис. 2. Содержание низкомолекулярных (ТГЛ-1) (а) и высокомолекулярных (ТГЛ-11) (б) фракций лигнина при разных условиях культивирования каллуса и разной степени развития клеток (% от сухого веса

клеточных стенок)

Применение поливинилпирролидона при 5 %-м содержании сахарозы в среде способствует приросту каллусной биомассы, но отрицательно влияет на накопление лигнина в тканях (обр. 16с, 16т).

Лигнины, выделенные из клеток разного онтогенетического развития, а также при разных условиях культивирования каллуса, отличались содержанием и составом фенилпропановых единиц (рис. 3).

3 i & g Q) О S S I * л О

5 О

CL I-(D О

° 1 о °

(D

*=Z

О

1= ^ =

* X

^ =T

a g <s I

6

5

4

¿3

i_

I—

2

1

0

Æ феруловая  п-кумаровая

Образцы каллуса

14с 14т 15с 15т 16с

Образцы каллуса

16т

б

Рис. 3. Содержание продуктов щелочного окисления лигнина

Во всех образцах, за исключением 16т, преобладали гваяцильные структуры, характерные для лигнина хвойных (рис. 3, а). Отмечено довольно высокое содержание п-оксифенилпропановых структур, являющихся производными п-кумаровой кислоты, тогда как в лигнине зрелой ксилемы хвойных и, в частности, сосны [12], они обнаруживались в следовых количествах. Характеристику лигнина хвойных часто дают по соотношению сирингильных и гваяцильных структур как S/V (или наоборот V/S).

По нашим неопубликованным данным in vivo, в лигнине ранней ксилемы сосны обыкновенной отношение S/V составляет 0,31, лигнине поздней - 0,12. В лигнинах in vitro отношение S/V оказалось равным

0.42.для 15т и 0,95 - для 16т. Сравнение отношений показывает, что лигнин каллуса отличается по структуре от лигнина ранней и поздней ксилемы, однако ближе к лигнину зрелой ранней древесины. При использовании поливинилпирролидона в лигнине в основном преобладают сирингильные структуры.

В лигнине каллуса, кроме того, наблюдалось высокое содержание оксикоричных кислот - феруловой и п-кумаровой (рис. 3, б). При этом «светлая» часть каллуса, культивирующегося с повышенной концентрацией сахарозы, содержала кислот больше, чем «темная». Это может свидетельствовать о различном уровне конденсированности лигнина из-за разной степени связи с гемицеллюлозами клеточных стенок каллуса. Если рассматривать сформированный лигнин с этой точки зрения, то лигнин из образца 15т, по-видимому, имеет более конденсированную структуру (более «плотный»).

Повышенное содержание феруловой и п-кумаровой кислот в лигнине из 16с (культивирование с поли-винилпирролидоном), вероятно, означает, что макромолекулы лигнина в начале их формирования в этих условиях имеют множественные связи с компонентами клеточной стенки. В 16т этих связей меньше. По степени конденсированности лигнин этой части каллуса, по-видимому, аналогичен лигнину из 15т.

Результаты показывают, что состав и соотношение фенилпропановых единиц лигнина, продуцируемого каллусными культурами, а значит и биогенез предшественников лигнина, зависят от условий культивирования и состояния развития каллуса.

Заключение. Содержание и структурные характеристики лигнина, полученного в культуре ткани сосны обыкновенной, зависят от условий культивирования и степени развития клеток каллуса. В зависимости от этих факторов меняется количество образованного лигнина, состав и соотношение фенилпропановых единиц в структуре лигнина. Данные указывают на возможность регулирования биосинтеза и структуры полимера.

Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований, грант № 09-04-00155. Авторы выражают благодарность Т.Н. Вараксиной и И.Н. Третьяковой за помощь в проведении экспериментов.

Литература

1. Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances / M. Doubois, R.A. Gilles,

JK Hamilton [at el.] // Anal. Chem. - 1956. - Vol. 28. - P. 350-356.

2. Hartley R.D. Improved methods for the estimation by gas-liquid chromatography of lignin degradation products from plants // J. Chromatog. - 1971. - Vol. 54. - P. 335-344.

3. Jannings A.C. The determination of dihydroxy phenolic compounds in extracts of plant tissues // Analyt. Bio-chem. - 1981. - Vol. 118. - N 2. - P. 396-398.

4. Lignification related enzymes in Picea abies suspension cultures / A. Kärkönen, S. Koutaniemi, M. Mustonen [at el] // Physiol Plant. - 2002. - Vol. 114. - P. 343-353.

5. Mansfield S.D. Solutions for dissolution - engineering cell walls for deconstruction // Curr Opin Biotechnol. -2009. - Vol. 20. - P. 286-294.

6. Effect of light and activated charcoal on tracheary element differentiation in callus cultures Pinus radiata

D. Don / R. Möller, R.D. Ball, A.R. Henderson [at el] // Plant Cell Tissue and Organ Culture. - 2006. - Vol. 85. - P. 161-171.

7. Möller R., McDonald A.G., Walter C. Cell differentiation, secondary sell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don. // Planta. - 2003. - Vol. 217. - P. 736-747.

8. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - Vol. 15. - P. 473-497.

9. Rogers L.A., Dubos S., Surman C. Campbell M.M. Light, the circdian clock, and sugar perception in the control of lignin biosynthesis // J Exp Bot. - 2005. - Vol. 56. - P. 1651-1663.

10. Sticken M.B. Plant genetic engineering for biofuel production: towards affordable cellulosic ethanol // Nat Rev Genet. - 2008. - Vol. 9. - P. 433-443.

11. Venverloo C.J. The lignin of Populus nigra L. A comparative study of the lignified structures in tissue cultures and the tissue of the trees // Acta Bot. Neerl. - 1969. - Vol. 18. - P. 241-314.

12. Грушников О.П., Елкин В.В. Достижения и проблемы химии лигнина. - М.: Наука, 1973. - 296 с.

13. Запрометов М.Н. Фенольные соединения: распространение, метаболизм и функции в растениях. -

М.: Наука, 1993. - 272 с.

14. Чаплыгина И.А., Антонова Г.Ф. Опыт определения аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислот в

формирующейся древесине лиственницы сибирской // Ботанические исследования в Сибири /

под ред. В.Л. Черепнина [и др.]. - Красноярск, 2002. - С. 254-257.

----------♦------------

УДК 582.6/9.006(571.56) П.А. Павлова

ЦВЕТЕНИЕ ТРАВЯНИСТЫХ МНОГОЛЕТНИКОВ ПРИРОДНОЙ ФЛОРЫ В ЯКУТСКОМ БОТАНИЧЕСКОМ САДУ

В статье представлены результаты исследований по изучению сроков и длительности цветения декоративных многолетников природной флоры в Якутском ботаническом саду. Интродуценты, по данным автора, по срокам цветения можно разделить на весенние, летние и позднелетние растения. Наибольшая длительность цветения отмечена у позднелетних, наименьшая - у весенних растений.

Ключевые слова: флора, фенология, вегетационный период, интродукция.

P.A. Pavlova

NATURAL FLORA HERBACEOUS PERENNIALS FLOWERING IN YAKUTSK BOTANICAL GARDEN

The research results on studying the terms and duration of the natural flora decorative perennials flowering in Yakutsk botanical garden are given in the article. According to the author’s data the introduced plants can be divided into spring, summer and late- summer ones on the basis of the flowering terms. The greatest flowering duration is registered in late-summer plants, the least - in spring plants.

Key words: flora, phenology, vegetative period, introduction.

Введение. Ритм развития растений - один из показателей взаимоотношения организма и среды, складывающийся в результате длительного процесса приспособления организма к условиям существования. Изучение характера цветения как части сезонного ритма развития растений в культуре представляет теоре-