СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХИРАЛЬНОЙ ПЛАНАРНОЙ ПЛАСТИНЫ ДЛЯ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ОПТИЧЕСКИХ ИЗОМЕРОВ
METHOD OF OBTAINING CHIRAL PLANAR PLATE FOR THIN LAYER CHROMATOGRAPHY OF OPTICAL ISOMERS

Предложение относится к области аналитической химии, а именно к способу изготовления пластинок для тонкослойной (планарной) хроматографии (ТСХ, ПТСХ), и может быть использовано для хирального распознавания стереоизомеров органических соединений в аналитической химии, фармакологии, медицине, биохимии и других областях.
В настоящее время известны способы получения сорбентов для колоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) высокого давления и капиллярного электрофореза (КЭ), несущие различные хиральные селекторы [US 4919803, 1990; RU 2348455, 2006]. Однако методы ВЭЖХ и КЭ имеют ряд недостатков по сравнению с высокоэффективной ТСХ (ВЭТСХ) - требуется сложное оборудование, значительные усилия (давление) для проведения и оптимизации процесса разделения. В дополнение к вышесказанному только один образец можно исследовать за один процесс ВЭЖХ (КЭ)-анализа. Для рутинных исследований и, в особенности, в промышленных (например, фармацевтических) процессах необходим массовый скрининг аналитов, который реализуется методами ТСХ.
Известно, что перенос хиральных фаз из колоночной ВЭЖХ в планарную хроматографию не является простым процессом, т.к. химическая структура связующего для сорбента и подложки, необходимого для получения планарных пластин для ТСХ, оказывает существенное влияние ни разделение [US 54399792, 1995]. Любые взаимодействия между органическим (крахмал, полиакриламид, полиакрилат, поливиниловый спирт) [US 5439979, 1975; J. Chromatography, 448, 1988; Germany 1598382, 1965; Germany 1517929, 1966] или неорганическим (силиказоль, гипс) [US 3594217, 1971; RU 2037826, 1992; RU 2139533, 2004; RU 2175767, 2001] связующим и хроматографически активными группами аналита приводят к взаимодействиям между разделяемыми энантиомерами и хиральная сепарация может быть нарушена [Klaus К Unger 'Takings and Stationary Phases in Chromatographic Techniques" N 13: "Theory in Chromatographic Separation of Enantiomers" by William H. Pirkle and Thomas C. Pochapsky, 1990].
Кроме того, особенностью тонкослойной хроматографии является открытый слой сорбента. Поэтому влияние кислорода воздуха и изменение состава подвижной фазы за счет испарения вносит свои коррективы при переносе техники хроматографирования от ВЭЖХ к высокоэффективной ТСХ (ВЭТСХ).
Известны сорбенты для разделения оптически активных соединений на основе кремнеземов, модифицированных низкомолекулярными хиральными селекторами: производными хинина [SU 1429016, 1988]; производными фенилаланининола и тиооксамида [Mendeleev Commun. 2005, v. 15, №4, p.143]; производными нафталеинуксусной кислоты (напроксена) [US 4191803, 1990]; хитозаном и его производными [Вестник МГУ, стр.2, Химия, 2004, Т.45, №3, с.180]; высокомолекулярными хиральными селекторами: полианилином [US 62656115, 2001]; полиметилакриламидом [US 5439979, 1995].
Известно применение макроциклических антибиотиков как сепарационных агентов (например, ванкомицин, стрептомицин, рифамицин, 3,5-диметилфенил производные ванкомицина для энантиомерных разделений [US 5964999, 1999].
Известны хроматографические носители на основе силикагеля с химически привитыми гликопептидными антибиотиками, такими как ванкомицин, тейкопланин, тейкопланин агликон и ристомицин [US 6669842, 2003].
Известны промышленно выпускаемые хиральные тонкослойные пластины Macherey-Nagel (DUREN, Germany), состоящие из гидрофобного силикагеля (RP-18) с поливиниловым спиртом в качестве связующего, импрегнированного (2S,4R,2'RS)-N-(2'-гидрокси-додецил)-4-гидроксипролином и ионами меди (II) (пластины Chiralplate) [J. Chrom., V. 448, pp.11-30, 1988].
Недостатком указанных аналогов является то обстоятельство, что известные хроматографические сорбенты для ВЭЖХ, КХ и ТСХ, полученные разными способами физической и химической модификации поверхности слоев кремнеземных матриц известными хиральными агентами, обладают энантиоселективностью лишь к определенным классам веществ или обладают недостаточной энантиоселективностью, кроме того, процесс получения многостадиен и сложен. Существенным недостатком указанных аналогов является то обстоятельство, что в процессе модификации силикагелевых слоев пластин не учитывается влияние связующего в силикагелевом слое ТСХ-пластин.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения сорбента для разделения оптических изомеров с химически привитым гликопептидным антибиотиком эремомицином [RU 2255802, 2005]. Хроматографическая хиральная фаза проявляет хорошую селективность в разделении широкого круга энантиомеров. Способ получения известного сорбента заключается в обработке силикагелевой матрицы 3-глицидооксипропилтриалкоксисиланом с последующим ковалентным связыванием эремомицина в водном или водно-органическом щелочном растворе при температуре не выше 40°С и высушиванием после отмывки при температуре 50°С. Эремомицин имеет следующую структурную формулу:
Существенным недостатком известного способа получения хроматографического кремнеземного слоя является сложный многостадийный процесс химической иммобилизации хирального селектора при повышенной температуре до 50°С, что может привести к частичному или полному разрушению молекулы антибиотика. Неконтролируемое изменение структуры молекулы хирального селектора при иммобилизации может привести к неконтролируемому изменению селективности или полной потере энантиоселективности сорбента. Данный способ модификации кремнеземов не учитывает влияние связующего в тонкослойной пластине.
Технической задачей и положительным результатом заявляемого технического решения является разработка низкотемпературного способа получения планарных хиральных пластинок на основе кремнеземов с различными органическими или неорганическими связующими для разделения и анализа оптических изомеров методами ТСХ.
Указанная задача и технический результат достигается в описываемом способе получения хиральных кремнеземных пластинок для тонкослойной хроматографии оптических изомеров за счет введения методом низкотемпературной иммобилизации в водной среде при комнатной температуре (не выше 25°С) в кремнеземный слой со связующим гликопептидного антибиотика эремомицина.
Способ получения хиральной планарной пластины для тонкослойной хроматографии оптических изомеров заключается в химической иммобилизации гликопептидного антибиотика эремомицина с помощью кремнийорганического модификатора на поверхность силикагеля, где вначале силикагель со связующим обрабатывают γ-глицидоксипропилтриалкоксисиланом, затем в щелочном водном растворе иммобилизуют в качестве селектора антибиотик эремомицин при температуре не выше 25°С, при этом в качестве связующего используют золь кремневой кислоты, а спейсер прививают к слою силикагеля и к связующему ковалентными связями.
В заявленном способе наилучшие результаты показал эремомицин, полученный с использованием штамма-продуцента Amicolatopsis orientalis subsp [RU 2110578, 1988].
Поставленная задача решается также описываемым способом получения хроматографического слоя хиральных планарных пластин, который включает химическую иммобилизацию гликопептидного антибиотика методом поверхностной сборки, сущность которой состоит в том, что на первой стадии иммобилизуют спейсер - кремнеорганический модификатор) γ-глицидоксипропилтриалкоксисилан на поверхность кремнезема со связующим, а затем, на второй стадии, прививается эремомицин в щелочном водном растворе при комнатной (20°С) температуре.
Предпочтительно в качестве связующего используют поливиниловый спирт с молекулярной массой 15 KDa или неорганический вариант связующего в виде устойчивого золя кремневой кислоты.
Излагаемая сущность данного способа раскрывается ниже на примерах его экспериментального осуществления.
Пример 1 описывает методику получения хиральных кремнеземных планарных пластин с неорганическим связующим (силиказоль) и иммобилизованным эремомицином, который получен биотехнологическими методами с использованием штамма-продуцента Amicolatopsis orientalis subsp [RU 2110578, 1998].
Прививку спейсера к кремнеземной матрице со связующим осуществляли следующим образом.
Тонкослойная пластина с силиказолевым связующим получена на основании патентов [SU 1736541, 1992; RU 2037826, 1995].
ТСХ-пластину с кремнеземным слоем и силиказолевым связующим переводили в Н-форму путем промывки в течение 12 часов водным раствором 2М азотной кислоты с последующей отмывкой дистиллированной водой до рН 6-7 с целью достижения максимальной плотности протоноакцепторных активных силанольных групп (до 68 мкмоль/мг) на поверхности силикагеля.
Тонкослойные пластины (10 шт.) размером 10×10 см помещали в 1700 мл раствора ацетатного буфера (0,1М водный раствор ацетата натрия, доведенного до рН 5,5 ледяной уксусной кислотой) с добавлением 50 мл γ-глицидоксипропилтриалкоксисилана. Реакционную смесь с ТСХ-пластинами выдерживали при комнатной температуре (20°С) в течение 5 суток. После прививки спейсера к кремнезему со связующим ТСХ-пластины отмывали дистиллированной водой, этанолом и снова водой. По данным элементного анализа содержание углерода составляет 5,11%.
Затем полученные ТСХ-пластины, модифицированные эпоксидными группами, помещали в 1700 мл раствора эремомицина (концентрация 1 мг/мл) в воде, доведенного 1М раствором гидроксида натрия до рН 8,5. Полученную реакционную смесь оставляли в течение 7 суток для иммобилизации низкомолекулярного гликопептидного антибиотика на поверхность кремнеземного слоя ТСХ-пластин с неорганическим связующим. После окончания процесса иммобилизации пластины отмывали дистиллированной водой и сушили на воздухе при комнатной температуре. По данным элементного анализа содержание углерода составляет 12,51%.
Таким образом, получены ТСХ-пластины с привитым хиральным селектором.
Пример 2. Тонкослойные кремнеземные пластины с полимерным связующим (поливиниловый спирт с молекулярной массой 15 KDa) получены согласно [FRG 1598382, 16.06.65; SU 1736541, 1992).
Силикагель с полимерным связующим в адсорбционном слое ТСХ-пластины, модифицированный силанольными группами путем гидроксилирования, получен, как в примере 1.
Силикагелевый слой с полимерным связующим, модифицированный эпоксигруппами с последующей иммобилизацией эремомицина, получен, как в примере 1.
По данным элементного анализа содержание углерода составляет 9,5%.
Пример 3. В таблице 1 представлены данные по содержанию углерода, определенного в кремнеземном слое ТСХ-пластин с силикагелевым связующим в зависимости от времени иммобилизации гликопептидного антибиотика эремомицина, определенного методом элементного анализа.
Таблица 1
Данные по элементному анализу иммобилизованных пластин (n=3)
Шифр эксперимента
Время иммобилизации (ч)
Содержание углерода, %
1
24
10,10±0,02
2
48
10,49±0,02
3
72
10,89±0,03
6
144
12,32±0,05
7
168
12,51±0,06
Пример 4. Хроматографический анализ осуществляли методом восходящей планарной хроматографии; в качестве стереоизомеров использовались основные D,L-аминокислоты: фениаланин, триптофан, лейцин, метионин, аланин, валин, аспариновая кислота, треонин, лизин, серин.
f
s
Хроматографические пики детектировали в видимом диапазоне путем постхроматографической дереватизации разделенных оптических изомеров аминокислот. Хроматографические зоны регистрировали при помощи видеоденситометра «ДенСкан». Запись хроматограмм и расчет факторов удерживания (R), разделения (R) и селективности проводили с помощью программно-аппаратного комплекса «Dens-Мультихром» (Ленхром-Амперсенд, Россия).
В качестве подвижной фазы использовали водно-метанольные и водно-метанольные смеси с добавками солей. В таблице 2 представлен состав подвижных фаз и результаты хроматографического разделения аминокислот на ТСХ-пластинах, полученных с силикагелевым связующим, как в примере 1, где:
Rf(L) - коэффициент удерживания L-стереоизомеров аминокислот
Rf(D) - коэффициент удерживания D-стереоизомеров аминокислот
Rs - фактор разрешения, указывающий на селективность разделения
Таблица 2
Результаты, полученные при разделении энантиомеров аминокислот
Элюент
Аминокислоты
Rf(L)
Rf(D)
Rs
Метанол - 0,1 М раствор NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> (2:8, объемн.)1=8 см
фениаланин
0,81
0,67
3,14
триптофан
0,67
0,62
1,83
лейцин
0,85
0,74
2,68
метионин
0,85
0,77
2,43
аланин
0,88
0,79
1,67
валин
0,86
0,75
1,95
треонин
0,90
0,88
0.57
Метанол-вода (1:1, объемн.)1=8 см
фениаланин
0,71
0,52
4,56
триптофан
0,52
0,39
4,68
лейцин
0,69
0,56
3,40
метионин
0,67
0,56
3,96
аланин
0,69
0,54
3,09
валин
0,71
0,50
5,04
серин
0,71
0,66
0,80
Хроматограммы разделения некоторых оптических изомеров аминокислот приведены на прилагаемой фигуре, где представлено разделение D- и L- изомеров аминокислот: 1-D,L-фенилаланин, 2-D,L-триптофан, 3-D,L-лейцин, 4-D,L-метионин, 5-D,L-аланин, 6-D,L-валин, 7-D,L-аспарагиновая кислота, 8-D,L-треонин, 9-D,L-лизин, 10-D,L-серин на хиральной фазе - силикагель с силиказолевым связующим, иммобилизованный эремомицином; элюент: метанол - вода (1:1, объемн.); детектирование - 0,2% раствор нингидрина в ацетоне.
Пример 5. В таблице 3 представлены хроматографические данные разделения D- и L-аминокислот, полученные на коммерческих пластинах Chiralplate с органическим связующим поливиниловым спиртом фирмы Macherey-Nagel (Германия).
Таблица 3
Результаты, полученные при разделении энантиомеров аминокислот на пластинах Chiralplate фирмы (MN, Германия)
Элюент
Аминокислоты
Rf(D)
Rs
Метанол-вода-ацетонитрил (5:5-12, объемн.)L=13cm
фениаланин
0.59
0.49
2.60
триптофан
0.61
0.51
2.60
изолейцин
0.58
0.47
2.86
метионин
0.59
0.54
1.30
валин
0.62
0.54
2.08
тирозин
0.66
0.58
2.08
пролин
0.47
0.41
1,56
Из полученных данных видно, что энантиоселективность хиральных планарных пластин с силиказолевым связующим и иммобилизованным эремомицином значительно выше, чем энантиоселективность планарных пластин, полученных другими методами.
Таким образом, разработанный способ получения хиральной планарной пластины для тонкослойной хроматографии стереоизомеров позволяет получить пластины, обладающие хорошими физико-химическими свойствами, позволяющими проводить высокоэффективное разделение и аналитический контроль изомеров оптически активных соединений, что свидетельствует о соответствии данного технического решения всем требуемым критериям, защищаемым патентом.