СОСТАВ АГАРОВОГО ПОКРЫТИЯ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ И СОСТАВА ПОПУЛЯЦИИ ВИРУСА МАЧУПО - ВОЗБУДИТЕЛЯ БОЛИВИЙСКОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА НЕГАТИВНЫХ КОЛОНИЙ
COMPOSITION OF AGAR COATINGS FOR DETERMINING MACHUPO - BOLIVIAN HEMORRHAGIC FEVER VIRUS POPULATION CONCENTRATION AND STRUCTURE WITH USING METHOD OF NEGATIVE COLONIES

Изобретение относится к области микробиологии, а именно вирусологии, и представляет собой оптимизированную пропись состава агарового покрытия и условий культивирования инфицированных клеток для определения концентрации и состава популяции биологически активного вируса Мачупо - возбудителя Боливийской геморрагической лихорадки методом негативных колоний.
Изобретение может быть использовано в вирусологических и иммунологических исследованиях для выявления в исследуемых пробах вируса Мачупо, оценки состава популяции по S-признаку и специфического выявления в сыворотках крови реконвалесцентов антител к данному возбудителю.
Метод негативных колоний на монослойной культуре клеток под агаровым покрытием позволяет с высокой точностью проводить определение концентрации биологически активного вируса и одновременно проводить изучение структуры вирусной популяции по размеру негативных колоний (S-признак). Для ряда возбудителей установлена связь данного генетического маркера с вирулентностью природных штаммов внутри вида вируса.
При использовании чувствительной по отношению к данному возбудителю монослойной культуры клеток чувствительность метода во многом определяется возможностью процесса адсорбции и пенетрации клеток, пограничных с инфицированными, оптимальной концентрацией витального красителя для регистрации эффекта выявления неокрашенных участков монослоя клеток и отсутствием неспецифической дегенерации последнего. Эти условия могут быть оптимизированы путем подбора состава первичного и вторичного агаровых покрытий.
В состав агарового покрытия для определения концентрации различных вирусов входят агар-агар, фетальная телячья сыворотка, бикарбонат натрия, аминокислотно-витаминный комплекс, раствор Эрла, l-глутамин, дистиллированная вода и витальный краситель нейтральный красный (входит в состав вторичного агарового покрытия).
Вирус Мачупо является представителем комплекса Такарибе рода Arenavirus семейства Arenaviridae [6, 12]. Природный очаг расположен в северо-восточной части Боливии (провинции Манора и Итенес). В 1959-1962 гг. небольшие вспышки возникали в сельской местности в период полевых работ, в основном среди взрослых мужчин. С 1962 г. заболевания регистрируются в преимущественно в городах и крупных поселках в разных возрастных группах. Резервуаром и источником вируса Мачупо - возбудителя болезни, являются мышевидные грызуны Calomys callosas, которым свойственна персистирующая инфекция. Заражение человека происходит через загрязненные мочой грызунов пишу, воду. Возможно также заражение при тесном контакте с больным в первые дни болезни, когда вирус выделяется из верхних дыхательных путей [5, 11, 14, 15].
Природные штаммы вируса Мачупо выделены от грызунов и больных людей. Проводимые вирусологические исследования тесно связаны с определением концентрации биологически активного вируса [13].
В зависимости от использованных в ходе данного процесса тест-объектов способы определения концентрации можно условно разделить на альтернативные и количественные [3].
При альтернативных методах информация, получаемая при использовании одного тест-объекта, равна 1 бит (объект может либо погибнуть в результате инфицирования, либо нет).
Метод бляшек (негативных колоний) был внедрен в практику вирусологических исследований в 1952 г. [10]. Он внес решающий вклад в развитие методов количественной оценки вирусов в различных материалах. Изучение генетики вирусов человека и животных показало, что значение метода бляшек не ограничивается его использованием для титрования вируссодержащих культур. Анализ закономерностей распределения размеров негативных колоний, выявление в популяциях различных штаммов вирусов, клонов с генотипически обусловленными различиями по данному показателю, использование определенных культур клеток в качестве модельных тест-объектов сделали метод бляшек одним из основных инструментов вирусологических исследований [1, 2, 4].
Условия образования негативных колоний в соответствии с механизмом «cell to cell» позволяют считать вирусную популяцию, которую можно выделить из одной отдельно взятой бляшки, как потомство одной вирусной частицы. Это обстоятельство делает метод бляшек незаменимым инструментом при изучении генетики вирусов, в частности при выделении полученных с помощью генетических и генно-инженерных манипуляций генетически измененных вариантов вирусов, обладающих комплексом новых свойств [9].
Оптимизацию метода негативных колоний обычно проводят по следующим направлениям:
- использование более чувствительной по отношению к конкретному возбудителю культуры клеток;
- изменение условий сорбции вируса на клетках (время сорбции, продолжительность сорбции, рН среды);
- оптимизация состава агарового покрытия, поддерживающего рост клеток и обеспечивающего образование негативных колоний на чувствительных клетках в соответствии с механизмом «cell to cell».
Возможность проведения оптимизации по первому направлению обычно ограничена либо небольшим набором чувствительных к возбудителю культур клеток (применительно к аренавирусам - это различные постоянные культуры клеток почки африканской зеленой мартышки), либо отсутствием достоверных преимуществ у одной клеточной культуры по отношению к другой. Оптимизация по второму направлению достаточно быстро проводится в ходе предварительных исследований при определении спектра чувствительных к вирусу культур клеток.
На основе анализа молекулярных механизмов взаимодействия вируса с клеткой и формирования негативных колоний на монослое культуры клеток нами проведена оптимизация состава агарового покрытия применительно к конкретному возбудителю (вирус Мачупо) и чувствительной по отношению к нему культуре клеток (постоянная культура клеток почки африканской зеленой мартышки, линия Vero В).
В практике вирусологических исследований при определении биологической активности аренавирусов используют культуру клеток трех - семисуточного возраста, время адсорбции вируса на клетках составляет 60 минут при температуре от 36,5 до 37,5°С; обычно используют агаровые покрытия, пропись которых представлена в таблице 1 [8].
Вторичное агаровое покрытие наносят через 120 часов после нанесения первичного покрытия, учет результатов проводят после вторичного инкубирования, продолжительность которого составляет 48 часов, таким образом, общая продолжительность анализа составляет 168 часов. Бляшки под агаром имеют нечеткие очертания, трудно различимы. Размер негативных колоний варьирует от 0,5 до 1,5 мм.
Целью настоящего изобретения является оптимизация состава агарового покрытия и условий культивирования инфицированных клеток для определения концентрации и популяции по S-признаку биологически активного вируса Мачупо - возбудителя Боливийской геморрагической лихорадки.
Сущность изобретения заключается в оптимизации состава первичного и вторичного агаровых покрытий путем изменения концентрации в них АВК, фетальной телячьей сыворотки, деминерализованной воды и антибиотиков (по сравнению с аналогом - первичное и вторичное покрытия), раствора Эрла, l-глутамина, бикарбоната натрия, нейтрального красного (вторичное покрытие), замены бакто-агара «Difco» на бактоагар «Bacteriologi Cal» или «Bacto™ Agar» и условий культивирования инфицированных клеток за счет сокращения времени адсорбции вируса на клетках и инкубирования монослоя клеток под вторичным агаровым покрытием (либо окрашивания клеток 0,1% раствором нейтрального красного вместо нанесения вторичного агарового покрытия) при использовании многофакторного анализа.
Техническим результатом настоящего изобретения является:
- увеличение чувствительности метода в  раза;
- достоверное повышение определяемого среднего размера негативных колоний;
- оптимизация процесса клонирования «из бляшки в бляшку» для получения и последующего изучения вариантов исследуемого штамма вируса.
Указанный технический результат достигается за счет оптимизации состава первичного и вторичного агаровых покрытий и условий культивирования инфицированных клеток.
Модифицированная пропись агарового покрытия, рекомендованного для определения концентрации биологически активного вируса Мачупо, представлена в таблице 2.
Оптимизация условий культивирования инфицированных вирусом Мачупо клеток Vero В состоит в следующем. Время адсорбции вируса Мачупо на клетках составляет 45 минут вместо 60; инкубирование монослоя клеток под вторичным агаровым покрытием составляет 24 часа вместо 48 часов. Вместо вторичного агарового покрытия возможно окрашивание монослоя клеток внесением в флакон по 0,5-0,6 мл 0,1% раствора нейтрального красного, что позволяет получить экономический эффект без изменения величины концентрации вируса.
Пример 1: Определение концентрации вируса Мачупо в исследуемых пробах
2

-1
Пластиковые флаконы с площадью рабочей поверхности 25 см фирма «Cellstar», с трехсуточным монослоем клеток Vero В, отобранные для титрования, извлекают из термостата и удаляют из них ростовую среду. Десятикратным шагом готовят разведения исследуемой пробы на солевом растворе Хенкса, содержащем антибиотики в концентрации 100 Ед.мл. На каждом флаконе обозначают номер пробы и разведение; на каждое разведение берут не менее четырех флаконов. В каждый из флаконов вносят по 0,5 мл соответствующего разведения и, покачивая флакон, равномерно распределяют инокулят по всему монослою клеток. Затем флаконы укладывают горизонтально, при этом поверхность с монослоем клеток должна находиться внизу, и оставляют при температуре (37,5±0,5)°С. Через 45 минут инокулят из флаконов удаляют пипеткой и в каждый флакон вносят 8,0 мл первичного агарового покрытия (таблица 2). Флаконы укладывают горизонтально, поверхность с инфицированным монослоем клеток должна находиться внизу. Когда агар застывает, флаконы переворачивают монослоем клеток вверх и помещают в термостат при температуре (37,5±0,5)°С. Через 120 часов во флакон вносят 4,0 мл вторичного агарового покрытия (таблица 2) и продолжают инкубирование при тех же условиях. Вместо вторичного агарового покрытия возможно внесение 0,1% раствора нейтрального красного по 0,5-0,6 мл в флакон. Учет негативных колоний проводят через 24 часа после нанесения вторичного агарового покрытия или 0,1% раствора нейтрального красного. Негативные колонии (бляшки) белого цвета, имеют четко очерченные края на розовом фоне живых клеток Vero В. Диаметр бляшек, измеренный с помощью масштабного клина, составляет от 0,8 до 2,6 мм.
-1
Концентрацию вируса Мачупо в исследуемой пробе, выраженную в БОЕ⋅мл, рассчитывают по формуле:
где
-1
А - количество бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл пробы, БОЕ⋅мл;
а - средневзвешенное количество бляшек во флаконе, шт;
n
b - кратность наивысшего разведения;
1
n
b b - кратность разведения исследуемого материала;
с - объем инокулята, мл.
Пример 2 : Определение среднего размера негативных колоний вируса Мачупо на монослойной культуре клеток Vero В
Определение проводят, как описано в предыдущем примере. Размеры негативных колоний измеряют с помощью масштабного клина с точностью ±0,1 мм. Средний размер негативных колоний определяют по формуле:
где
ср
Д - средний размер негативных колоний;
i
i
n - количество негативных колоний с диаметром d;
N - общее число измеренных негативных колоний.
Пример 3 : Получение клонированного варианта вируса Мачупо
-1
Исследование проводят для определения корреляции размера негативных колоний с биологическими характеристиками. Определение проводят как описано в примере 1, затем отдельные негативные колонии отбирают с помощью пастеровской пипетки, содержимое суспендируют в 2,0 мл солевого раствора Хенкса, содержащего антибиотики в концентрации 100 Ед.мл. Полученным материалом (и одновременно исходной культурой вируса) инфицируют монослойную культуру клеток Vero В. Далее определение проводят, как описано в примере 2. Значимым результатом является достоверное различие среднего размера негативных колоний у исходной и клонированной культуры вируса.
Пример 4 : Определение наличия специфических антител к вирусу Мачупо в антителсодержащих субстратах
В работе используют исследуемые иммунные сыворотки, положительный контрольный образец (сыворотку животного того же вида, заведомо содержащую специфические антитела к вирусу Мачупо), отрицательный контрольный образец (сыворотку животного того же вида, заведомо не содержащую специфические антитела к вирусу Мачупо) и культуру штамма Карвалло вируса Мачупо.
Исследование проводят, как описано в примере 1 (до внесения первичного агарового покрытия). Исследуемые иммунные сыворотки добавляют в объеме 0,3 мл на 100 мл покрытия. Далее определение проводят, как описано в примерах 1 и 2. При наличии достоверного снижения размера негативных колоний в вариантах с исследуемой сывороткой и положительном контрольным образцом (по сравнению с отрицательным контрольным образцом) делается заключение о наличии в анализируемой пробе специфических вируснейтрализующих антител к вирусу Мачупо.
Результаты определения концентрации биологически активного вируса Мачупо (штамм Карвалло, депонированного в Государственной коллекции возбудителей геморрагических лихорадок I группы патогенности ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России (№01/17)) при использовании аналогового и разработанного нами состава агарового покрытия (полученные с соблюдением принципа «единственного различия»), представлены в таблице 3.
Таким образом, представленные данные показывают достижение технического результата: использование оптимизированного состава агарового покрытия и условий культивирования инфицированных клеток для определения концентрации и состава популяции по S-признаку вируса Мачупо - возбудителя Боливийской геморрагической лихорадки, приводит к:
- увеличению чувствительности метода в  раза;
- достоверному повышению определяемого среднего размера негативных колоний;
- оптимизации процесса клонирования «из бляшки в бляшку» для получения и последующего изучения вариантов исследуемого штамма вируса.
Источники информации
1. Гендон Ю.З. Молекулярная генетика вирусов человека и теплокровных животных. - М., Медицина, 1975.
2. Жданов В.М., Ершов Ф.И. Молекулярные основы биологии арбовирусов. - М., Медицина, 1973.
3. Костюкова Н.И. Основы математического моделирования. Оценка биологически активных веществ на основании альтернативных кривых "доза-эффект" Сайт в интернете intuit.ru>department/se/mathmodel/13/3.html.
4. Левкович Е.Н., Карпович Е.Л., Засухина Г.Д. Генетика и эволюция вирусов животных. - М., Медицина, 1971.
5. Маркин В.А., Пантюхов В.Б., Марков В.И., Бондарев В.П. Боливийская геморрагическая лихорадка. - Журн. микробиол., 2013., №3. - С. 118-126.
6. Руководство по вирусологии. Вирусы и вирусные инфекции человека и животных / Под ред. академика Д.К. Львова. - М., ООО Изд-во «Мед. информ. агентство». - 2013. - 1200 с.; ил.
7. Сыромятникова С.И., Писцов М.Н., Борисевич С.В., Хамитов Р.А., Марков В.И., Максимов В.П. Состав агарового покрытия для титрования методом негативных колоний коронавируса - возбудителя тяжелого острого респираторного синдрома / Патент на изобретение №2325436. Зарегистрирован 27.05.2008 г.
8. Сыромятникова С.И., Пантюхов В.Б., Шатохина И.В., Маркин В.А., Пирожков А.П., Тимофеев М.А., Сизикова Т.Е., Румянцева И.Г., Борисевич С.В. Оптимизация условий количественной оценки возбудителя Аргентинской геморрагической лихорадки. - Журн. микробиол., 2013, №2. - С. 51-55.
9. Пшеничнов В.А., Донченко В.В., Мошков А.Е. О некоторых закономерностях изменения структуры вирусных популяций // В кн.: Экология и популяционная генетика микроорганизмов. Свердловск, Изд. АН СССР, 1975. - С. 89-91.
10. Dulbecco R. Production of plaques in monolayer tissue cultures caused by single particles of animal viruses // PNAS USA 1952. - V. 38. - P. 747-752.
11. Peters C.J. Arenaviruses diseases / In: Porterfield J.S., ed. Exotic viral infections. London, N Y 1995. P. 227-246.
12. Peters C.J., Buchmeier M., Rollin P.E., et al. Arenaviruses // Field's Virology Third Edition Vol. 1 / Ed. B.N. Fields, D.M. Knipe, P.M. Powley - Philadelphia, 1996, P. 1521-1551.
13. Peters C.J., Jahrling P.B., Liu C.T. et al. Experimental studies of arenaviral hemorrhagic fevers // Arenaviruses: Biol. and Immunother. Berlin, 1987. - P. 5-61.
14. Peters C.J., Kuehne R.W., Mercado R.R., et al. Hemorrhagic fever in Cochabamba, Bolivia, 1971 // Am. J. Epidemiol. - 1974. - Vol. 99, N 3. - P. 425-433.
15. Webenga N.H. Immunologic Studies of Tacaribe, Junin and Machupo viruses // Amer. J. Trop. Med. Hyg. - 1965. - Vol. 14, №5. - P. 802-808.