Получение химерного белка на основе щелочной фосфатазы из бактерии Cobetia marina и силикатеиноподобного катепсина из морской губки Latrunculia oparinae

Вестник ДВО РАН. 2014. № 1

Голотин Василий Александрович

Окончил Дальневосточный федеральный университет в 2011 г. по специальности «биология», специализация «генетика и селекция». С отличием защитил две курсовые и дипломную работу. С 2008 г. работает в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН в лаборатории морской биохимии. Освоил методы генной инженерии и молекулярной биотехнологии, достиг высоких результатов в получении рекомбинант-ных аналогов белков из морских объектов и исследовании способов их применения в медицине и биотехнологии. В 2011 г. поступил в аспирантуру в эту же лабораторию, где учится под руководством заведующего лабораторией к.б.н. В.А. Рассказова и к.б.н. Л.А. Балабановой.

Область научных интересов - экспрессия рекомбинантных генов, выделение и очистка рекомбинантных белков морского происхождения, изучение их физико-химических свойств, биологической роли и применения для различных целей молекулярной биологии и медицины.

Активно участвует в конференциях регионального и международного уровней, в работах по грантам ДВО РАН и РФФИ. Имеет 16 публикаций в сборниках статей и материалах международных научных мероприятий, а также три патента.

УДК 577.2 В.А. ГОЛОТИН

Получение химерного белка на основе щелочной фосфатазы из бактерии Cobetia marina и силикатеиноподобного катепсина из морской губки Latrunculia oparinae

Методами генной инженерии построена оптимальная химерная плазмида, несущая структурные гены легко детектируемой щелочной фосфатазы из морской бактерии Cobetia marina и силикатеиноподобного катепсина из морской губки Latrunculia oparinae, для получения химерного белка CmAP/LoC в клетках Escherichia

ГОЛОТИН Василий Александрович - аспирант (Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Еля-кова ДВО РАН, Владивосток). E-mail: golotin@bk.ru

Работа выполнена при финансовой поддержке Программы «Дальний Восток» (проект № 12-ьП6-10, № 12-Ш24-01).

coli с высоким уровнем экспрессии. Методами белковой хроматографии из химерного белка с высоким выходом выделен силикатеиноподобный катепсин для дальнейшего исследования его свойств.

Ключевые слова: гибридный рекомбинантный белок, генная инженерия, щелочная фосфатаза, силикатеи-ноподобный катепсин.

Production of the chimeric protein on the basis of the alkaline phosphatase from bacteria Cobetia marina and silicatein-like cathepsin from the sea sponge Latrunculia oparinae. V.A. GOLOTIN (G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok).

Using genetic engineering methods, an optimal recombinant plasmid carrying the structural genes of easy-detectable alkaline phosphatase from the marine bacterium Cobetia marina and silikatein-like cathepsin from the sea sponge Latrunculia oparinae has been constructed for the synthesis of chimeric protein CmAP/LoC in the Escherichia coli cells with the high level of expression. Using protein chromatographic methods, the silikatein-like cathepsin has been isolated with high yield for further study of its properties.

Key words: hybrid recombinant protein, genetic engineering, alkaline phosphatase, silicatein-like cathepsin.

Одним из бурно развивающихся направлений молекулярной генетики является белковая инженерия, включающая в себя разработку методов модификации белков для изучения их структурно-функциональных взаимосвязей, а также конструирование новых белков с заданными свойствами. Впечатляющими результатами применения такого подхода являются гибридные белки.

Гибридный, или химерный, белок (англ. fusion protein) - составной белок, полученный объединением полипептидных фрагментов, представляющих собой функциональные домены белков с разными свойствами, с использованием методов белковой или генной инженерии. Химерные белки могут включать в себя белковые последовательности любых организмов и обладать различными свойствами, в частности такими, как углеводная специфичность и ферментативная активность. Создавая, экспрессируя и оптимизируя конструкции, несущие гены, которые кодируют последовательности таких белков, мы получаем принципиально новые белки, представляющие интерес для целей биотехнологии и медицины. Такие белки можно использовать при лечении, профилактике или диагностике различных заболеваний [1, 5, 7, 10]. Ферменты в составе таких гибридных белков могут служить для мониторинга качественных и количественных показателей производства рекомбинантных целевых белков, у которых существует проблема детекции на разных этапах хроматографической очистки.

Цель настоящего исследования - получение силикатеиноподобного катепсина из морской губки Latrunculia oparinae.

Силикатеины, гомологи катепсина L, - белки спикул губок, обладающие способностью гидролизовать эфиры кремниевой кислоты с образованием аморфного кремнезема и конденсировать молекулы предшественника - тетраэтоксиэтилана (TEOS) с образованием кремниевых наноструктур определенной формы в обычных условиях окружающей среды [4]. Широкие возможности применения силикатеинов в биотехнологии для получения новых нанокомпозитных материалов на основе кремния [8, 11, 12] делают перспективным исследование свойств новых силикатеинов из разных видов губок и получение их реком-бинантных аналогов методами генной и белковой инженерии.

Ранее в лаборатории морской биохимии ТИБОХ ДВО РАН получен рекомбинантный аналог силикатеиноподобного катепсина морской губки L. oparinae [3]. Метод определения количества осажденного им кремнезема из кремнесодержащих веществ часто приводит к недостоверным результатам, так как примесные белки способны к неспецифическому агрегированию друг с другом и осаждению компонентом самого субстрата (THEOS), что сильно затрудняет определение специфической активности содержащих рекомби-нантный белок фракций при хроматографической очистке. Другая проблема заключается в том, что при низкой концентрации рекомбинантный белок не способен к осаждению кремнезема, и это затрудняет его детекцию. Кроме того, при концентрациях свыше 2 мг/мл

рекомбинантный катепсин в течение 2 сут полностью выпадает в осадок вместе с примесными белками.

В данной работе предложено объединить силикатеиноподобный катепсин морской губки L. oparinae и щелочную фосфатазу (ЩФ) для получения бифункционального белка с легко детектируемой фосфатазной активностью, что позволило бы более точно и быстро определять наличие и количество силикатеина во фракциях при проведении хроматогра-фий. Кроме того, есть основание полагать, что слияние структурного гена щелочной фос-фатазы с генами таких белков, как силикатеины, повышает их растворимость и, соответственно, функциональность при гетерологической экспрессии.

Для получения химерного белка с фосфатазной активностью мы использовали ЩФ из штамма морской бактерии Cobetia marina (КММ 296), ранее выделенную и охарактеризованную в ТИБОХ ДВО РАН [9]. Она оказалась очень перспективным ферментом в области биотехнологии и генной инженерии, проявляя необычные физико-химические свойства и являясь на сегодняшний день самой высокоактивной ЩФ (11000-14000 ед/мг) из существующих в мире коммерческих препаратов [2]. Высокая ферментативная активность и скорость расщепления хромогенного субстрата позволяют быстро и эффективно обнаруживать фракции, содержащие ЩФ, даже с низкой концентрацией белка.

Для подготовки к построению генетической конструкции амплифицировали кодирующий участок гена ЩФ с использованием геномной ДНК C. marina КММ 296 и двух геноспецифических праймеров, содержащих на концах сайты рестрикции NcoI и SacI: 5' -TATTCCATGGCAGAGATCAAGAATGTCATTCTGAT-3' (прямой праймер на начало гена ЩФ). Обратный геноспецифический праймер ЩФ содержал последовательность линкерного участка:

5-TTAAGAGCTCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCAC CACCCTTCGCTACCACTGTCTTCAGATACTGTCCT-3'.

Фрагмент гена, кодирующий силикатеиноподобный катепсин (GenBank EU909159), получен с помощью кДНК L. oparinae с использованием генспецифичных праймеров: 5'- AGCTGAGCTCGATGACGACGACAAGAGCGTCTGCCCAGAGGAAGTGGACTGGA GGACTAAGGGA-3' (прямой праймер, содержащий последовательность сайта для энте-рокиназы) и 5'-AGCTAAGCTTTTATATGGTAGTGTACATAGCCTTGGTTG-3' (обратный праймер со стоп-кодоном на конце).

Полученные фрагменты последовательно лигированы в плазмиду pET40-b(+) (Novagen) по сайтам рестрикции NcoI и SacI (для ЩФ), SacI и HindIII (для силикатеино-подобного катепсина). Лигирование проводили Т4 ДНК лигазой (Fermentas, Литва) согласно рекомендациям производителя. Трансформацию Escherichia coli плазмидной ДНК

ATGCGTCCWCGTAEAGGATCGAGATCGATCTCGATCCCGCEAAAITAATACGACTCACTATAGGGGAATTCTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAflCTTTAAGAAGGAGATATA^AT _OSPC____»_

ATGAAGAAAGGTTTTATGTTGTTTACTTTGTTAGCGGCGTTTTCAGGCTTTGCTCAGGCTGAT ..ЮбЬр...GAATTTCTCGACGAACACCAAAAAATGACCAGCGGTAAAGGATCAACTAGTGGTTCTGGT net l.ya Lys Glv Rie Met Leu Ptie Thr Leu Leu Ala Ala № Ser Gly - t Ala Gin Ala Asp . . . 202aa... Glu Fhe Leu Asp la j Hie Gin Lys Met Thr Зег Gly Lya Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gty

signal peptidase —-

HlB-Tug _ _ _S-Tas

CATCACCATCACCATCACTCCGCGCGTCTGCTGCCAGGCCGTAGTACTGCAATTGGTAT GAAAGAAACCGC TGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACACCC CAGATC TGGGT ACC HI5 His His Hie HI5 H15 5er Ala Gly L-ЭМ Vol Pre. Arq Gly Fhr Ala II'- Gly lf.1 ..yi. GFU Thr Alo Ala AEq l.yi. R15 GKl Ary Gill H15 Met Asp 5er Pro Asp '-Л-1 Gly Гг-thmmo n 1

_ _ Nco I Sag I Hind III___Mis-Tag_

-СшЛР-LoC-

GA7 gaccacgac aagagccc gggcttctc z TGAAC^

Asp Asp Asp Asp- LyS 5er "Yr. Gly ~~ie Ser Ser T

entemklnase 1 EntemkiS^ SiSp

TTGATTAAT ACCTAGGCTGCT AAACAAAGCCCGAAAGGAAGC TGAGTTGGCTGC TGCL * I._.4'L' ВЛССАА I •!.' I .vuсATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTT TG

cloning/expression regions

Рис.1. Схематическое изображение области экспрессии химерного белка CmAP/LoC в плазмиде pET40-b(+) (Novagen). CmAP - ген щелочной фосфатазы бактерии C. marina; LoC - ген силикатеиноподобного катепсина губки L. oparinae; Enterokinase - сайт для энтерокиназы; Stop - стоп-кодон

проводили методом с использованием хлористого марганца [6]. Поиск трансгенных колоний E. coli, содержащих плазмиды со вставкой гена силикатеина, осуществляли методом ПЦР колоний с использованием набора реактивов Encyclo PCR kit и специфических праймеров для плазмиды системы pET (Евроген, Россия). Выделение плазмидной ДНК из E. coli осуществляли методом щелочного лизиса. Полученные генетические конструкции (CmAP/LoC, рис. 1) проверены на отсутствие мутаций секвенированием с использованием ABI Prism Big Dye Terminator 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США).

Экспрессию трансформированной в компетентные клетки E. coli Rosetta(DE3) реком-бинантной плазмиды проводили после добавления 0,2 мМ изопропил^-0-1-тиогалакто-пиранозида (ИПТГ) в культуру трансгенных клеток. Далее клетки культивировали в течение 12 ч при 16 °С.

Осажденные центрифугированием бактериальные клетки озвучивали в буфере А, содержащем 20 мМ Трис-HCl (pH 8,0). Полученный клеточный лизат наносили на ДЕАЕ-целлюлозу-52 (Whatman). Элюцию проводили линейным градиентом против буфера Б: 20 мМ Трис-HCl (pH = 8,0), 0,4М NaCl. Фракции, содержащие целевой белок, наносили на Ni-NTA агарозу (Qiagen) в буфере В: 20 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 0,15М NaCl. Элюцию проводили с помощью буфера Г, содержащего 20 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 50 мМ ЭДТА. Активные фракции определяли спектрофотометрически при 400 нм с помощью расщепления фосфатазой 4-нитрофенилфосфата до 4-нитрофенола. Далее сконцентрированный с помощью ,3EAE-Toyopearl-650M (Toyo soda) белок собирали и обрабатывали энтерокиназой (Invitrogen), в результате чего химерный белок расщеплялся на щелочную фосфатазу и силикатеиноподобный катепсин. Эти белки были разделены с помощью гель-фильтрации (Sephacryl S-100HR, Sigma) (рис. 2).

В результате экспрессии химерного белка CmAP/LoC выявлено существенное повышение количественного содержания целевого белка силикатеиноподобного катепсина в клеточном экстракте по сравнению с полученным ранее разработанным методом [2]. Это,

вероятно, связано с особенностями процес-синга рекомбинантного химерного белка внутри трансгенной E. coli. ЩФ морской бактерии в составе CmAP/LoC, расположенная с N-конца химерного белка, может выполнять роль шаперона для силикатеи-на эукариотического организма, механизм взаимодействия которых требует дополнительного изучения.

Предлагаемый нами метод выделения и очистки рекомбинантного силикатеино-подобного катепсина по сравнению с ранее предложенным [3] почти в 2 раза сокращает потерю белка и время его выделения, а также повышает конечный выход целевого белка с 1 до 1,5 мг в пересчете на 1 л бактериальной культуры.

Таким образом, показано, что ЩФ из морской бактерии C. marina является эффективным белковым маркером для выделения трудно детектируемых белков, таких как силикатеиноподобный катепсин, что делает этот фермент перспективным для применения в генной инженерии.

Рис. 2. Электрофорез белковых фракций в 12,5 %-ном полиакриламидном геле. 1 - клеточный экстракт трангенных клеток E. coli; 2 - активные белковые фракции после ДЕАЕ-целлюлозы; 3 - активные белковые фракции после Ni-NTA агарозы и энтероки-назы (химерный белок расщепляется на щелочную фосфатазу и силикатеиноподобный катепсин); 4 -белковая фракция силикатеиноподобного катепсина (26 кДа) после рехроматографии на Ni-NTA агарозе и гель-фильтрации

ЛИТЕРАТУРА

1. Арсланбаева Л.Р. Получение генетических кодируемых FRET-сенсоров каспазы-3 на основе тербий-связывающего пептида и красных фуоресцентных белков DsRed2 и TagRFP: автореф. дис. ... канд. биол. наук. М., 2011. 15 с.

2. Голотин В.А., Балабанова Л. А., Лихацкая Г.Н., Рассказов В.А. Структурно-функциональные особенности щелочной фосфатазы морской бактерии Cobetia marina // Всерос. молодеж. конф. «Взгляд в будущее» (Владивосток, 4-9 сент. 2013 г.). Владивосток, 2013. С. 30-40.

3. Ковальчук С.Н., Голотин В.А., Шкрыль Ю.Н., Авраменко Т.В., Каменев Д.Г., Нарышкина Н.Н., Вере-мейчик Г.Н., Рассказов В.А., Булгаков В.П., Кожемяко В.Б. Разработка способов получения функционально активных рекомбинантных силикатеинов морских губок // Перспективные направления развития нанотехнологий в ДВО РАН. 2013. Т. 6. С. 165-178.

4. Cha J., Shimizu K., Zhou Y., Christiansen S., Chmelka B., Stucky G., Morse D. Silicatein filaments and subunits from a marine sponge direct the polymerization of silica and silicones in vitro // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. Vol. 96. P. 361-365.

5. Deyev S.M., Waibel R., Lebedenko E.N., Schubiger A.P., Pluckthun A. Design of multivalent complexes using the barnase-barstar module // Nat. Biotechnol. 2003. Vol. 21. P. 1486-1492.

6. Hanahan D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids // J. Mol. Biol. 1983. Vol. 166. P. 557-580.

7. Lin X., Xie J., Niu G., Zhang F., Gao H., Yang M., Quan Q., Aronova M.A., Zhang G., Lee S., Leapman R., Chen X. Chimeric ferritin nanocages for multiple function loading and multimodal imaging // Nano Lett. 2011. Vol. 128. P. 1293-1303.

8. Müller W.E., Wang X., Cui F.Z., Jochum K.P., Tremel W., Bill J., Schröder H.C., Natalio F., Schlossmacher U., Wiens M. Sponge spicules as blueprints for the biofabrication of inorganic-organic composites and biomaterials // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009. Vol. 83. P. 397-413.

9. Plisova E.Y., Balabanova L.A., Ivanova E.P., Kozhemyako V.B., Mikhailov V.V., Agafonova E.V., Rasska-zov V.A. A highly active alkaline phosphatase from the marine bacterium Cobetia // Mar. Biotechnol. 2005. Vol. 7, N 3. P. 173-178.

10. Porteus M.H., Baltimor D. Chimerik nucleases stimulate gene targeting in human cells // Science. 2003. Vol. 300. P. 736.

11. Schröder H.C., Schlossmacher U., Boreiko A., Natalio F., Baranowska M., Brandt D., Wang X., Tremel W., Wiens M., Müller W.E. Silicatein: nanobiotechnological and biomedical applications // Prog. Mol. Subcell. Biol. 2009. Vol. 47. P. 251-273.

12. Wang X., Schröder H.C., Wiens M., Schloßmacher U., Müller W.E. Biosilica: molecular biology, biochemistry and function in demosponges as well as its applied aspects for tissue // Engineer. Adv. Mar. Biol. 2012. Vol. 62. P. 231-271.