КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ФЕРМЕНТИРУЕМЫЕ ПОЛИСАХАРИДЫ
COMPOSITION CONTAINING FERMENTED POLYSACCHARIDES

Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к пищевой композиции для грудных детей, включающей синергетические смеси пребиотических полисахаридов, и пищевым композициям, включающим смеси полисахаридов.
Уровень техники
Микрофлора на всем протяжении кишечника человека играет ключевую роль в здоровье человека. Микрофлора может быть изменена приемом диетических добавок. Бактерии метаболизируют неусвояемые углеводы и неусвояемые белки до основных конечных продуктов метаболизма - короткоцепочечных жирных кислот (SCFA), таких как ацетат, пропионат, бутират и валерат, которые впоследствии могут быть использованы хозяином. Другими примерами конечных продуктов бактериальной ферментации под действием бактериальных ферментов являются лактат и газ.
Lactobacilli продуцирует как лактат, так лактат плюс ацетат. Bifidobacteria продуцирует лактат и ацетат. Ферментация углеводов Bifidobacteria, Lactobacilli и другими молочнокислыми бактериями, как правило, не ведет к продуцированию пропионата, бутирата, изобутирата, валерата и изовалерата. Эти SCFA указывают на ферментацию углеводов другими видами бактерий, такими как Clostridia Bacteroides или Enterbacteriaea, или указывают на ферментацию белков. Следовательно, (относительному) повышению уровня лактата и ацетата в кишечнике сопутствует (относительное) понижение других специфических показателей стимуляции продуцирования SCFA молочнокислыми бактериями и/или Bifidobacteria.
Материнское молоко обладает бифидогенным свойством, поскольку установленной доминантной бактерией при грудном вскармливании детей является Bifidobacteria. В противоположность при вскармливании грудных детей молочной смесью в бактериальной колонизации нет или в меньшей степени преобладает Bifidobacteria и присутствует много различных видов бактерий (Harmnes et al., 2000, J Pediatr Gastroenterol Nutr 30, 61-67). Существует мнение, что неусвояемые сахариды, присутствующие в грудном молоке, являются ответственными за этот бифидогенный эффект. В толстой кишке и фекалиях грудных детей, находящихся на грудном вскармливании, обнаружено преобладание SCFA в виде ацетата. Кроме того, обнаружены высокие концентрации лактата. Были предприняты несколько попыток создания композиций, имитирующих профиль продуцирования SCFA как у грудных детей, находящихся на грудном вскармливании. Была предложена комбинация короткоцепочечных неусвояемых олигосахаридов или комбинации короткоцепочечных неусвояемых олигосахаридов с неусвояемыми полисахаридами, такими как описанные в WO 0008948. Однако главным недостатком использования короткоцепочечных пребиотических олигосахаридов является то, что это значительно повышает осмотическую нагрузку на кишечник, что в результате может вызвать вредное воздействие, такое как легкий слабительный эффект или, еще хуже, диарею.
Использование неусвояемых полисахаридов с высокой молекулярной массой или высокой степенью полимеризации (DP) имеет недостаток, такой как повышение вязкости продукта. Кроме того, крупные полисахариды с DP выше 300 очень трудно поддаются ферментации молочнокислыми бактериями и Bifidobacteria.
Следовательно, существует потребность в композиции, включающей пребиотики, состоящие из относительно крупных, неусвояемых полисахаридов, которые оказывают желаемое воздействие на продуцирование короткоцепочечной жирной кислоты в кишечнике и не оказывают избыточную осмотическую нагрузку на кишечник и/или не вызывают повышение вязкости продукта.
Краткое описание изобретения
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что введение частично гидролизованной гуаровой камеди (PHGG) в комбинации с инулином или неусвояемыми полидекстринами приводит к некоторому синергетическому положительному эффекту. Этот эффект сходен с эффектом от комбинаций короткоцепочечных неусвояемых олигосахаридов, однако без нежелательного повышения осмотической нагрузки на кишечник и/или вязкости продукта.
Комбинации инулина и частично гидролизованной гуаровой камеди известны из предшествующего уровня техники, например из WО 2004026294. Также Resource support™, который является питательным жидким продуктом для пациентов, больных раком, содержит инулин и Benefiber. Однако до сих пор не подтверждено, что эта комбинация неусвояемых полисахаридов обеспечивает положительные профили короткоцепочечной жирной кислоты, делая их особенно подходящими для использования в питании грудных детей.
Обнаруженный благоприятный эффект был значительно более явным при совместном введении полисахарида с PHGG, чем каждого компонента в отдельности или в комбинации, например, инулина и неусвояемых полисахаридов. Это показывает, что частично гидролизованный полигалактоманнан с фруктополисахаридом или частично гидролизованный полигалактоманнан с неусвояемым полидекстрином действуют синергетически. Кроме того, предполагают, что этот результат указывает на синергетическое действие питания для грудных детей, включающего частично гидролизованную гуаровую камедь и второй ферментируемый, неусвояемый полисахарид с DP между 10 и 300, иной, чем гидролизованная гуаровая камедь.
В частности, неожиданно было обнаружено, что ферментирование настоящей смеси в результате ведет к: а) к синергетическому повышению общего количества образованных SCFA; b) к синергетическому повышению общего количества образованного лактата; c) к относительному повышению количества ацетата и лактата; d) к относительному понижению количества бутирата, валерата и разветвленных короткоцепочечных жирных кислот; и/или е) понижению газообразования на Мм SCFA.
Введение настоящей комбинации неусвояемых полисахаридов в питание для грудных детей, таким образом, приводит в результате к тому, что воздействие композиции становится в значительной степени сходным с воздействием грудного молока. Однако в одном варианте воплощения изобретение предусматривает использование комбинации частично гидролизованного галактоманнана и полисахарида, выбранного из фруктополисахарида или неусвояемого полидекстрина, для получения композиций, которые способствуют созданию среды в толстой кишке по сути подобной той, что у детей, находящихся на грудном вскармливании.
Введение настоящей композиции, кроме того, может быть использовано для достижения одного или более из следующих физиологических эффектов: значительного повышения уровня Bifidobacteria и/или молочнокислых бактерий; значительного повышения уровня молочной кислоты и/или значительного повышения общего уровня SCFA; значительного относительного повышения количества ацетата; значительного относительного понижения количества бутирата; значительного суммарного понижения изобутирата, валерата и изовалерата; понижения газообразования; более длительной и равномерной ферментации, включая, главным образом, ферментация в дистальных отделах толстой кишки, и более высокой степени ферментации в проксимальном отделе толстой кишки.
В результате изменений в уровнях молочнокислых бактерий, Bifidobacteria, уровнях лактата, уровнях и профилях SCFA композиция обеспечивает один или более из следующих эффектов:
- сокращение проницаемости кишечника в месте продуцирования SCFA. Это важно для предотвращения заболеваний и поддержания здоровья, особенно для предотвращения развития аллергий;
- снижение числа случаев спонтанной контрактуры и напряжения мышц толстой кишки в результате отсутствия спазмов, отсутствия колик и отсутствия абдоминальной боли;
- повышение абсорбции ионов Са, что важно для минерализации костей и развития костей;
- повышение продуцирования слизи слизистой оболочкой кишечника, что обеспечивает защиту от иммобилизации и колонизации патогенами;
- понижение рН в результате ингибирования патогенных бактерий.
Это новое синергетическое взаимодействие частично гидролизованного галактоманнана и других неусвояемых полисахаридов в образовании SCFA и лактата ведет к новому применению при лечении и предотвращении диареи, колик и/или абдоминальных спазмов и аллергии.
Настоящие пищевые композиции, включающие эти пребиотические смеси, также могут быть применены для взрослых, страдающих от проблем в кишечнике, таких как воспалительное заболевание кишечника (IBD) или синдром раздраженного кишечника (IBS).
Детальное описание предпочтительного варианта
осуществления изобретения
Настоящее изобретение относится к способу вскармливания грудных детей, указанный способ включает введение пищевой композиции грудному ребенку, отличающийся тем, что композиция включает:
неусвояемую, ферментируемую, частично гидролизованную камедь со степенью полимеризации DP между 10 и 300 в количестве от 0,1 до 15 г на 100 г сухой массы указанной пищевой композиции; и
неусвояемый, ферментируемый растворимый полисахарид со степенью полимеризации DP между 10 и 300, иной, чем частично гидролизованная камедь, в количестве от 0,1 до 15 г на 100 г сухой массы указанной пищевой композиции.
Также настоящее изобретение относится к композиции, в которой белок составляет от 5 до 16 эн%; жир от 35 до 60 эн%; и углеводы от 25 до 75 эн%, включающей от 0,1 до 15 г на 100 г сухой массы композиции неусвояемой ферментируемой, частично гидролизованной камеди со степенью полимеризации DP между 10 и 300 и
от 0,1 до 15 г на 100 г сухой массы композиции неусвояемого, ферментируемого, растворимого полисахарида со степенью полимеризации DP между 10 и 300, иного, чем частично гидролизованная камедь.
Использованный здесь термин «степень полимеризации» (DP) означает количество мономерных единиц, соединенных вместе в поли- или олигомер.
Использованный здесь термин «растворимый» в случае полисахарида, волокна или олигосахарида означает, что вещество является, по меньшей мере, на 50% растворимым согласно способу, описанному L. Prosky et al., J Assoc. Off. Anal. Chem. 71, 1017-1023 (1988).
Использованный здесь термин «ферментируемый» относится к способности претерпевать (анаэробно) разложение микроорганизмами в толстой кишке на более мелкие молекулы, в частности, короткоцепочечные жирные кислоты и лактат. Ферментируемость может быть определена, например, методом, описанным в Am. J. Clin. Nutr. 53, 1418-1424 (1991).
Камедь
Настоящая композиция включает от 0,1 до 15 г на 100 г сухой массы композиции неусвояемой, ферментируемой, частично гидролизованной камеди со степенью полимеризации DP между 10 и 300. Гидролизованная камедь является предпочтительно водорастворимой. Использованный здесь термин «частично гидролизованная» относится к композиции, которая была подвергнута гидролизу (например, температурному, механическому, кислотному или ферментативному), но не была гидролизована до моносахаридных единиц.
Использованный здесь термин «камедь» относится к общедоступным смолам, в частности к смоле конджак, ксантановой камеди, гуаровой камеди (гуарановой камеди), камеди из плодов белой акации (рожкового дерева), камеди плодов тары, камеди трагаканта, аравийской камеди или гуммиарабику, камеди карайи, камеди гхатти, альгиновой камеди, камеди акации Сейял, камеди геллановии и другим камедям.
В одном варианте воплощения настоящего изобретения предпочтительно использован неусвояемый, ферментируемый, частично гидролизованный галактоманнан. Галактоманнан в основном состоит из единиц с линейной цепью β-(1,4)-D-маннанопиразила, связанных через α-(1,4)-D связь с ответвлениями галактозы. В наиболее предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения использованы гуаровая камедь, камедь из плодов белой акации и/или камедь тары.
Частично гидролизованный галактоманнан может быть получен частичным или ограниченным гидролизом. Молекулы галактоманнана,входящие в состав камеди, редуцированны в размере ферментом, таким как β-манназа и/или химической/физической обработкой. Эта обработка снижает вязкость до показателя ниже 20 сП 10% раствора в воде при температуре 25°С, определенную вискозиметром Брукфилда.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения использована частично гидролизованная гуаровая камедь (PHGG). Гуаровая камедь является полисахаридом, получаемым из эндосперма Cyamopsis Tetragonolobus, и содержит в основном гидроколлоидные частицы полисахаридов с высокой молекулярной массой, состоящие из единиц галактозы и маннозы, связанных гликозидными связями. Наиболее предпочтительно гуаровая камедь состоит из единиц с линейной цепью (1→4)бета-D-маннанопиранозила, связанных через (1→6) связи с альфа- D-галактопиранозилом. PHGG является коммерчески доступной под торговой маркой Benefiber от Novartis Nutrition Corporation или под торговой маркой «Sunfiber AG» от Taiyo Kagaku, Japan. Предпочтительна гидролизованная камедь в форме агломератов, которые имеют лучшую растворимость.
Настоящая композиция предпочтительно включает между 0,5 и 8 г на 100 г сухой массы и более предпочтительно между 1 и 5 г на 100 г сухой массы неусвояемой, ферментируемой, частично гидролизованной камеди со степенью полимеризации (DP) между 10 и 300, в частности PHGG. Предпочтительно эти количества неусвояемой, ферментируемой, частично гидролизованной камеди обеспечены использованием неусвояемой ферментируемой частично гидролизованной камеди со степенью полимеризации (DP) между 20 и 150, более предпочтительно между 25 и 100.
Полисахариды
Настоящее изобретение включает неусвояемый ферментируемый растворимый полисахарид с DP между 10 и 300, иной, чем частично гидролизованная неусвояемая, ферментируемая камедь, в количестве между 0,1 и 15 г на 100 г сухой массы композиции. Указанный неусвояемый, ферментируемый, растворимый полисахарид предпочтительно выбран из группы, состоящей из фруктополисахарида и неусвояемого полидекстрина.
Настоящая композиция предпочтительно включает между 0,5 и 8 г и более предпочтительно между 1 и 5 г неусвояемого, ферментируемого, растворимого полисахарида.
n
Термин «фруктополисахарид» относится к полисахаридному углеводу, включащему цепь из, по меньшей мере, 10 β-связанных фруктозных единиц с DP между 10 и 300, предпочтительно между 20 и 300. Предпочтительно используют инулин. Инулин коммерчески доступен под торговой маркой «Raftilin HP», (Orafti). Использованный здесь термин «инулин» относится к глюкозе, присоединенной к фруктозе в виде цепочек с, по меньшей мере, 90% единиц фруктозы с DP между 10 и 300. Инулин может быть описан, как GF, в которой G представляет собой единицу глюкозила, F представляет собой единицу фруктозила и n является количеством единиц фруктозила, соединенных друг с другом, n составляет 9 или более. Однако небольшая часть молекул инулина может не оканчиваться единицей глюкозы, по причине гидролиза. Среднее значение DP фруктополисахарида составляет предпочтительно, по меньшей мере, 15, более предпочтительно, по меньшей мере, 20 или более, вплоть до 300. В инулине единицы фруктозы связаны через β(2→1)связь.
Настоящая композиция предпочтительно включает между 0,5 и 8 г и более предпочтительно между 1 и 5 г фруктополисахарида.
Неусвояемые полидекстрины относятся к устойчивым к расщеплению (мальто)декстринам или устойчивой к расщеплению полидекстрозе с DP от 10 до 50, предпочтительно между 10 и 20. Неусвояемые полидекстрины являются, по меньшей мере, на 75% неусвояемыми, предпочтительно, по меньшей мере, на 90% неусвояемыми. Эти неусвояемые полидекстрины предпочтительно получены комбинацией реакций гидролиза и трансглюкозидации. В предпочтительном варианте воплощения изобретения неусвояемые полидекстрины включают α(1→4), α(1→6) глюкозидные связи и 1→2 и 1→3 связи. Неусвояемые полидекстрины коммерчески доступны под торговой маркой «Fibersol 2» от Matsutami Inductries или Litesse от Danisco.
Настоящая композиция предпочтительно включает между 0,5 и 8 г и более предпочтительно между 1 и 5 г неусвояемого полидекстрина.
Соотношения
Настоящая композиция имеет массовое соотношение неусвояемого, ферментируемого полисахарида:к неусвояемой, ферментируемой, частично гидролизованной камеди в пределах от 1:19 до 19:1, предпочтительно от 1:4 до 4:1, более предпочтительно от 0,5:1 до 2:1. Синергетический эффект от двух неусвояемых полисахаридов проявляется больше и более очевиден, когда соотношение двух неусвояемых полисахаридов приближается к 1:1.
Жидкая композиция
Настоящую композицию предпочтительно вводят в жидкой форме. Для того чтобы соответствовать энергетическим требованиям, композиция предпочтительно содержит от 50 до 200 ккал/100 мл, более предпочтительно от 60 до 90 ккал/100 мл. Осмолярность композиции обычно составляет между 150 и 420 мОсм/л, предпочтительно от 260 до 320 мОсм/л. Снижение осмолярности ставит целью снижение гастроинтестинального стресса, например снижение случаев диареи, в частности, у грудных детей.
Предпочтительно композиция в жидкой форме имеет вязкость ниже 35 сП. Для композиции подходит порошкообразная форма, из которой она может быть восстановлена водой до жидкой формы.
Дневная доза
Если композиция находится в жидкой форме, то предпочтительный объем введения, исходя из потребностей, находится в пределах приблизительно от 80 до 2500 мл, более предпочтительно приблизительно от 450 до 1000 мл в день, что является подходящим количеством для грудного ребенка. Ребенок считается грудным в возрасте от 0 до 36 месяцев.
Дневная эффективная доза настоящей композиции предпочтительно включает от 1 до 40 г ферментируемого, неусвояемого полисахарида/день, включая гидролизованную камедь и растворимый ферментируемый, неусвояемый полисахарид, предпочтительно от 2 до 10 г/день. Суммарная концентрация а) частично гидролизованной камеди (предпочтительно PHGG) и b) растворимого неусвояемого полисахарида, предпочтительно выбранного из группы, состоящей из фруктополисахарида или неусвояемого полидекстрина, составляет предпочтительно от 0,2 до 5 г/100 мл, более предпочтительно от 0,2 до 3,5 г/100 мл, еще более предпочтительно от 0,3 до 2,4 г/100 мл и наиболее предпочтительно от 0,35 до 1 г/100 мл.
Лечение
Настоящая композиция может быть успешно использована как способ лечения и/или предупреждения диареи, (желудочно-кишечных) инфекций, колик, абдоминальных спазмов, абдоминальных болей, синдрома раздраженного кишечника (IBS), воспалительных заболеваний кишечника (IBD), аллергии, экземы, астмы и/или атопических заболеваний. В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения использован способ лечения или предупреждения аллергии или аллергических реакций.
Настоящая композиция предпочтительно вводится орально. Композиция особенно эффективна для использования в способе вскармливания грудных детей и/или стимуляции роста грудных детей. Поскольку композиция особенно эффективна для стимуляции развития кишечной флоры, композиция может успешно вводиться младенцам от 0 до 6 лет, предпочтительно грудным детям от 0-48 месяцев, более предпочтительно грудным детям от 0-18 месяцев и наиболее предпочтительно грудным детям от 0-12 месяцев. Чем меньше возраст младенца, тем более важно преобладание молочнокислых бактерий в молочнокислой флоре.
Макронутриенты
В настоящей композиции белок составляет от 5 до 16 эн%; жир от 35 до 60 эн%; и углеводы от 25 до 75 эн%, предпочтительно, белок составляет от 5 до 12,0 эн%; жир от 39 до 50 эн%; и углеводы от 40 до 55 эн% (эн% - сокращение от термина показатель энергетического вклада и представляет собой относительное количество каждого компонента, участвующего в общей калорийной ценности препарата).
Предпочтительно композиция содержит от 1,4 до 6 г источника белка на 100 мл. Композиция соответственно содержит от 8,5 до 19 г на 100 г сухой массы. Источник белка может включать крупные неповрежденные белки, гидролизованные белки, пептиды или свободные аминокислоты или их смеси. Подходящим источником белка являются белки коровьего молока, казеин, сывороточные белки и соевый белок. Процентное содержание белка рассчитывается по Къельдалю, N·6,38. Кроме того, композиция предпочтительно содержит от 2,1 до 6,5 г жира на 100 мл, от 0,3 до 1,5 г линолевой кислоты (LА) на 100 мл, по меньшей мере 50 мг α-линоленовой кислоты (ALA) на 100 мл, в которой соотношение LA/ALA составляет приблизительно от 5 до 15. Предпочтительно жир составляет от 12,5 до 30 г на 100 г сухой массы композиции, LA от 1,8 до 12,0 г на 100 г сухой массы композиции и ALA, по меньшей мере, 0,30 г на 100 г сухой массы композиции, в которой соотношение LA/ALA составляет приблизительно от 5 до 15. Количество насыщенных жирных кислот предпочтительно составляет от 10 до 58% от общей массы жирных кислот, концентрация мононенасыщенных жирных кислот оставляет от 17 до 60% от общей массы жирных кислот и концентрация полиненасыщенных жирных кислот оставляет от 11 до 36% от общей массы жирных кислот. Преимущество этих количеств и соотношений ALA и LA заключается в том, что достигается сбалансированный биосинтез n-3 и n-6 полиненасыщенных жирных кислот. Предпочтительно настоящая композиция состоит из длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот (LC PUFA), таких как эйкозапентаеновая кислота (ЕРА), докозагексаеновая кислота (DHA) и арахидоновая кислота (АА). Подходящими источниками липидов являются молочный жир, масло канолы, сафлоровое масло, подсолнечное масло, оливковое масло, кокосовое масло, жир обитателей моря и т.п. или фракции, или их смеси, включающие подходящие жирные кислоты.
Настоящая композиция предпочтительно содержит от 6 до 19 г усвояемых углеводов на 100 мл, предпочтительно 6-19 г лактозы. Другими подходящими источниками усвояемых углеводов являются мальтодекстрин, крахмал, сахароза, глюкоза и мальтоза.
Пробиотики
7
10
8
9
7
11
8
10
Согласно одному из предпочтительных вариантов воплощения изобретения композиция содержит пробиотические бактерии. Пробиотические бактерии являются живыми микробными пищевыми ингредиентами, оказывающими положительное воздействие на здоровье человека. Общепринято относить к пробиотическим бактериям «молочнокислые бактерии», называемые так, потому что молочная кислота является основным продуктом, полученным при ферментации углеводов. Настоящая композиция предпочтительно содержит представителей рода Lactobacillus и/или Bifidobacterium. Bifidobacteriа и Lactobacilli являются бактериями, которые в основном присутствуют в толстой кишке грудных детей, находящихся на грудном вскармливании. Кроме того, присутствие пробиотиков усиливает ферментацию смеси полисахаридов до SCFA (особенно ацетата) и лактата в толстой кишке, поскольку, кроме того, усиливает формирование здоровой среды в толстой кишке, особенно у грудных детей. Концентрация пробиотиков предпочтительно составляет от 1·10 колониеобразующих единиц (КОЕ) до 2·10 КОЕ на 100 мл, предпочтительно от 1·10 КОЕ до 2·10 КОЕ на 100 мл. Предпочтительно концентрация составляет между 6·10 и 1·10 КОЕ/100 г массы, предпочтительно между 6·10 и 3·10 КОЕ/100 г массы.
Описание чертежа
Чертеж - образование короткоцепочечных жирных кислот в мМ/г неусвояемого полисахарида (IP) через 48 часов ферментирования in vitro частично гидролизованной гуаровой камеди (PHGG), инулина, неусвояемого полидекстрина (ID), смеси частично гидролизованной гуаровой камеди и инулина (соотношение по массе 1:1), смеси частично гидролизованной гуаровой камеди и неусвояемого полидекстрина (соотношение по массе 1/1) и смеси инулина и неусвояемого полидекстрина, полученных из свежих детских фекалий. Суммарный показатель IC составляет 4,5 и включает валерат, изобутират и изовалерат. Данные были уточнены в сравнении с контрольной ферментацией. Чертеж показывает, что комбинация PHGG и инулина или неусвояемого полидекстрина синергетически улучшает образование SCFA. Результаты показали преимущество использования этих комбинаций в питании детей.
Примеры
Пример 1. Синергетические эффекты при ферментировании образцов
Материалы.
Микрофлора была получена из свежих детских фекалий от детей, которых кормили молочными смесями. Свежий фекальный материал от детей, находящихся на искусственном вскармливании, в возрасте от 6 до 12 месяцев были объединены и помещены в консервирующую среду на 2 часа.
Консервирующая среда:
забуфференный пептон 20,0 г/л, L-Cysteine-HCl 0,5 г/л, меркаптоуксусный натрий 0,5 г/л, 1 таблетка резазурина на литр. Уровень pH приведен к 6,7±0,1 с 1М NaОН или HCl. Доведена до кипения в микроволновой печи. Емкости для сыворотки с 25 мл среды были наполнены 30 мл сыворотки и стерилизованы в течение 15 минут при 121˚С.
Среда McBain & MacFarlane:
2
4
2
3
4
2
2
4
2
забуфференная пептоном вода 3,0 г/л, дрожжевой экстракт 2,5 г/л, муцин (щеточная кайма) 0,8 г/л, триптон 3,0 г/л, L-Cysteine-HCl 0,4 г/л, соли желчных кислот 0,05 г/л, KHPO·3HO 2,6 г/л, NaHCO 0,2 г/л, NaCl 4,5 г/л, MgSO·7HO 0,5 г/л, CaCl 0,228 г/л, FeSO·7HO 0,005 г/л. 500 мл сосуды Скотта были наполнены средой и стерилизованы в течение 15 минут при 121˚С.
Буферная среда:
2
4
2
3
4
2
2
4
2
2
4
3
KHPO·3HO 2,6 г/л, NaHCO 0,2 г/л, NaCl 4,5 г/л, MgSO·7HO 0,5 г/л, CaCl 0,228 г/л, FeSO·7HO 0,005 г/л. Уровень pH приведен к 6,3±0,1 с помощью KHPO или NaHCO. 500 мл сосуды Скотта были наполнены средой и стерилизованы в течение 15 минут при 121˚С.
Фекальная суспензия:
консервированный раствор фекалий был центрифугирован при 13000 об/мин в течение 15 минут. Супернатант был удален, и фекалии смешали со средой McBain & MacFarlane в массовом соотношении 1:5.
Была использована частично гидролизованная гуаровая камедь SunFiber от Taiyo. Был использован неусваяемый полисахарид Fibersol-2 от Matsutani. Был использован фруктополисахарид RaftilineHP от Orafti.
Методы.
Свежий фекальный материал от детей был смешан с консервирующей средой за 2 часа и хранился при температуре 4°С в течение от 0-3 часов. Эксперименты по ферментации были начаты через 3 часа хранения.
Ферментирование:
15,0 мл фекальной суспензии были смешаны с: а) 500 мг SunFiber, b) 500 мг Fibersol-2, с) 500 мг RaftilineHP, d) 250 мг SunFiber + 250 мг RaftilineHP, е) 250 мг SunFiber +250 мг Fibersol-2, f) 250 мг RaftilineHP + 250 мг Fibersol-2 или g) без введения (контроль) и смешанны в емкости. При t=0 был изъят образец (0,5 мл). 14,5 мл полученной в результате суспензии были помещены в диализную камеру в 250 мл емкости, наполненной 250 мл буферной среды. Емкость была плотно закупорена и инкубирована при температуре 37˚С. Образцы были извлечены из диализной камеры (0,5 мл) или диализного буфера (1 мл) с помощью шприца для подкожного введения после 3, 24 и 48 часов и немедленно помещены на лед для остановки ферментации. Затем образцы хранили при температуре минус 20°С.
Анализ SCFA.
Образцы был изъяты из ледяной воды, разбавлены 10х MilliQ. 350 мкл образца было смешано с 200 мкл 5% (об./об.) муравьиной кислоты, 100 мкл 1,25 г/л 2-этилмасляной кислоты (Sigma-Aldrich, Zwijndreht, The Netherlands) и 350 мкл MilliQ. Уксусная, пропионовая, n-масляная, изомасляная и n-валериановая кислоты были подвергнуты количественному анализу с использованием газового хроматографа (GC) Varian 3800 (Varian Inc., Walnut Greek, USA), оснащенного плазменным ионизатором. Образец 0,5 мкл был введен при 80˚С в колонку (Stabilwax, 15х0,53 мм, толщина слоя 1,00 мкм, Restek Co., USA) с использованием гелия в качестве газа-носителя (3,0 фунт/кв. дюйм). Новые колонки были выдержаны в течение ночи при температуре 200˚С. После введения образца термостат был нагрет до температуры 160˚С со скоростью 16˚С/мин с последующим нагреванием до температуры 220˚С со скоростью 20˚С/мин и затем выдержан при температуре 220˚С в течение 1,5 минут. Температура инжектора и детектора составила 200˚С. Затем каждый из десяти образцов колонки был очищен введением 0,5 мкл 1% (об./об.) муравьиной кислоты во избежании эффекта запоминания колонки, с последующим введением 0,5 мкл стандартной смеси SCFA (1,77 мМ уксусной кислоты, 1,15 мМ пропионовой кислоты, 0,72 мМ n-масляной кислоты, 0,72 мМ изомасляной кислоты, 0,62 мМ n-валериановой кислоты, полученных от (Sigma-Aldrich, Zwijndreht, The Netherlands)) для мониторинга эффекта запоминания. Уровни SCFA были определены с использованием 2-этилмасляной кислоты, в качестве международного стандарта.
Анализ молочной кислоты.
Образцы были изъяты изо льда и центрифугированы при 14000 об/мин в течение 5 минут. 100 мкл супернатанта были нагреты в течение 10 минут до 100°С для инактивации ферментов. Концентрации L-молочной кислоты и D-молочной кислоты были определены ферментативно с использованием набора для определения L-молочной кислоты и D-лактат-дегидрогеназы (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany).
Результаты.
Результаты показаны на чертеже. Из чертежа видно, что использование смеси PHGG и инулина в результате неожиданно приводит к более высокому количеству SCFA, особенно ацетата, образованного на г неусвояемого полисахарида в сравнении с отдельными компонентами или в пересчете на эффект, полученный при введении отдельных компонентов. Эффект, полученный при введении, является средним результатом ферментирования, расчитанным по результатам ферментирования только RaftilineHP и только SunFiber. Эти результаты показывают синергетический эффект от PHGG и инулина и являются показателями синергетического эффекта настоящей композиции для вскармливания (грудных детей).
Ферментирование смеси PHGG и инулина показывает значительное снижение количества и процентного соотношения изобутирата плюс изовалерата плюс валерата, чем при отдельной ферментации компонентов (PHGG 0,029, инулин 0,021, PHGG + инулина: 0,010 мМ/г неусвояемого полисахарида).
Ферментирование смеси PHGG и неусвояемого полисахарида неожиданно приводит к более высокому количеству SCFA, особенно ацетата, который превосходит теоретический эффект от введения двух неусвояемых полисахаридов. Ферментирование смеси PHGG и неусвояемого полидекстрина в результате приводит к синергетическому повышению количества ацетата, в то время как количество бутирата понижено и (относительное) количество изобутирата плюс изовалерата плюс валерата было понижено(PHGG 0,029, ID 0,028, PHGG+ID 0,017 мМ/г неусвояемого полисахарида).
Неожиданно было обнаружено, что ферментирование комбинации неусвояемого полидекстрина и инулина не ведет к синергетическому повышению продуцирования SCFA, но показывает снижение продуцирования SCFA. Результатом этого явилось более высокое относительное количество изобутирата плюс изовалерата плюс валерата.
После 3 часов ферментации in vitro детского фекального материала было определено образование лактата. Таблица 1 показывает конечные продукты метаболизма, образованные по временным точкам. Синергетическое повышение образования лактата наблюдалось в смеси PHGG с инулином или PHGG с неусвояемым полидекстрином. Комбинация инулина и неусвояемого полидекстрина не показала такого эффекта.
Таблица 1
Тестируемый компонент
Лактат (мМ/г неусвояемого полисахарида)
SunFiber
5
RaftilineHP
0
Fibersol-2
68
SunFiber+Fibersol-2
89
SunFiber+RaftilineHP
24
Fibersol-2+RaftilineHP
44
Кинетика образования SCFA
Таблица 2 показывает кинетику образования SCFA в мМ/г неусвояемого полисахарида (уточнены в сравнении с контролем) (% общего SCFA, образованного за 48 часов). Комбинация PHGG с инулином показывает высокий уровень образования SCFA между 24 и 48 часами, указывает, что в дистальном отделе толстой кишки все еще образуется SCFA. Однако также в первые 3 часа было образовано большое количество SCFA.
Смесь SCFA + неусвояемый полидекстрин также в результате привела к увеличению образования SCFA в течение последних 24 часов и в течение первых 3 часов. Этот эффект был синергетическим; этот эффект был выше, чем при введении отдельных компонентов.
Таблица 2
Временной интервал (часы)
0-3
3-24
24-48
SunFiber
0,41 (8%)
3,92 (78%)
0,68 (14%)
RaftilineHP
0,21 (4%)
4,04 (82%)
0,70 (14%)
Fibersol-2
0,42 (18%)
1,42 (61%)
0,50 (21%)
SunFiber + Fibersol-2
0,57 (14%)
2,67 (67%)
0,76 (19%)
SunFiber + RaftilineHP
0,34 (5%)
4,15 (66%)
1,84 (29%)
Следующие примеры не ограничиваются композициями, содержащими синергетические смеси ферментируемых полисахаридов.
Пример 2
Жидкая композиция, которая получена после восстановления 13,5 г смеси водой до конечного объема 100 мл, содержащая на конечные 100 мл:
Энергетическая ценность: 67 ккал
Белок:
8 эн%
1,4 г
0,6 казеина
0,8 сывороточный
Усвояемые углеводы:
45 эн%
7,5 г
7,3 г лактозы
0,2 г других углеводов
Жир:
47 эн%
3,5 г
1,5 г насыщенных
1,5 г мононенасыщенных
0,5 г полиненасыщенных
0,4 г линолевой кислоты
0,07 г α-линоленовой кислоты
Неусвояемый полисахарид:
0,4 г
0,1 г фруктополисахарида
0,3 г частично гидролизованной гуаровой камеди
Осмолярность:
300 мОсм/л
Кроме того, композиция содержит минералы, микроэлементы, витамины и холин, и таурин в количествах в соответствии с международными рекомендациями для молочных смесей для грудного вскармливания.
Пример 3
Жидкая композиция, которая получена после восстановления 15,8 г смеси водой до конечного объема 100 мл, содержащая на конечные 100 мл:
Энергетическая ценность: 72 ккал
Белок:
11 эн%
1,9 г (частично гидролизованный сывороточный белок)
Усвояемые углеводы:
40 эн%
8,7 г
3,9 г сахарозы
3,0 г лактозы
0,9 г других
4,8 г полисахаридов
2,0 г крахмала
2,8 г других
Жир:
40 эн%
3,3 г
1,4 г насыщенных (включая 1,4 β-пальмитат)
1,4 г мононенасыщенных
0,5 г полиненасыщенных
0,43 г линолевой кислоты
0,08 г α-линоленовой кислоты
Неусвояемый полисахарид:
0,8 г
0,4 г неусвояемого полидекстрина
0,4 г частично гидролизованной гуаровой камеди
Пробиотики:
1,5·10<sup>8</sup> КОЕ Bifidobacteria
Осмолярность:
270 мОсм/л
Кроме того, композиция содержит минералы, микроэлементы, витамины и холин, и таурин в количествах в соответствии с международными рекомендациями для молочных смесей для грудного вскармливания.
Пример 4
Жидкая композиция, состоящая из:
На 100 мл:
Энергетическая ценность: 150 ккал
Белок:
9 эн%
3,4 г(казеин)
Усвояемые углеводы:
50 эн%
18,8 г
3,0 г сахарозы
0,9 г мальтозы
14,3 г полисахаридов
0,6 г другие
Жир:
41 эн%
6,8 г
0,7 г насыщенных
4,1 г мононенасыщенных
2,0 г полиненасыщенных
1,62 г линолевой кислоты
0,34 г α-линоленовой кислоты
Неусвояемый полисахарид:
1,5 г
0,8 г фруктополисахарида
0,7 г частично гидролизованной гуаровой камеди
Осмолярность:
390 мОсм/л
Кроме того, композиция содержит минералы, микроэлементы, витамины и холин, и таурин в количествах в соответствии с международными рекомендациями для молочных смесей для грудного вскармливания.