Способ получения липополисахарида V. cholerae 01 и 0139 серогрупп

Способ получения липополисахарида V. cholerae 01 и 0139 серогрупп включает следующие этапы:
а) взвесь влажных микробных клеток возбудителя холеры штаммов V. cholerae 01 и 0139 серогрупп выращивают при 37°С в течение суток и обеззараживают кипячением на водяной бане в течение 15 мин;
10
б) готовят бактериальную суспензию густотой 15×10 м.кл./мл, которую суспендируют в 20 мл 10 мМ Hepes-буфера, содержащего 20% сахарозы при pH 7,0;
в) проводят ультразвуковую обработку 5-ю импульсами по 12 с с минутным интервалом на холоду, удаляют неразрушенные клетки низкоскоростным центрифугированием, а супернатант ультрацентрифутируют при 100 тыс. g в течение часа, получая осадок, представляющий собой клеточные оболочки;
4
г) клеточные оболочки суспендируют в 3 мл трисхлоридного лизис-буфера pH 8,0, содержащем 0,1М ЭДТА-Na, 2% SDS и перемешивают до полного растворения;
д) добавляют к 3 мл лизированных клеточных оболочек 1 мг проназы, 400 мкг ДНКазы, 100 мкг РНКазы и инкубируют в течение 10 ч при 37°С;
е) добавляют к полученному раствору 6 мл холодного этанола, содержащего 0,375М хлорида натрия, охлаждают до 0°С и центрифугируют при 12000 об/мин в течение 15 мин при 0-4°С;
ж) осадок суспендируют в 5 мл лизис-буфера, содержащего 0,1М ЭДТА тетранатриевой соли, 2% SDS в трисхлоридном буфере (pH 8,0) и добавляют проназу в количестве 100 мкг и инкубируют при 37°С 10 ч;
з) к полученной субстанции добавляют 10 мл холодного этанола с 0,375М хлорида магния, охлаждают до 0°С и центрифугируют при 12000 об/мин в течение 15 мин при 0-4°С;
и) осадок суспендируют в 10 мл трисхлоридного буфера (pH 8,0) и ультрацентрифугируют при 200 тыс. g в течение 2 ч при 20°С;
к) полученный осадок ЛПС суспендируют в дистиллированной воде и лиофилизируют.