СПОСОБ ВИДОВОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА
METHOD OF SPECIFIC DIFFERENTIATION OF TUBERCULOSIS MYCOBACTERIA

Изобретение относится к микробиологии, касается бактериологического исследования и может быть использовано для дифференциации и идентификации микобактерий туберкулеза.
Бактериологическое исследование необходимо для подтверждения результатов аллергического, серологического и патоморфологического методов диагностики туберкулеза. Выделение из патологического материала культур несвойственных им видов возбудителя туберкулеза или атипичных микобактерий предполагает их идентификацию и дифференциацию. Видовая дифференциация микобактерий туберкулеза необходима для установления источника инфекции, что имеет значение при выборе противотуберкулезных мероприятий в очаге инфекции. В ветеринарной практике бактериологическое исследование патологического материала проводится при постановке диагноза на туберкулез у крупного рогатого скота при отсутствии у убитых и павших животных изменений, характерных для туберкулеза, или их нечеткой выраженности, а также при необходимости определения вида микобактерий.
Известен способ видовой идентификации микобактерий туберкулеза по культуральным свойствам, включающий обработку диагностического материала, посев на плотную питательную среду, инкубацию и учет результатов. Рост микобактерий туберкулеза бычьего вида чаще обнаруживают на 20-40-й, человеческого - на 20-30-й, птичьего - на 10-20-й день, атипичных микобактерий - в разные сроки. Для изучения культуральных свойств выросшие колонии микобактерий пересевают на различные питательные среды и культивируют их при температуре 20-25, 37-38, 45°С. Микобактерий туберкулеза бычьего вида в первых генерациях на яичных средах при температуре 37-38°С растут скудно, не растут на яичных средах при 22 и 45°С, на яичной среде с салицилатом натрия, на МПА и МПБ и не образуют пигмента. Микобактерии туберкулеза человеческого вида также не растут на яичных средах при 22 и 45°С, на яичной среде с салицилатом натрия, на МПА и МП и не образуют пигмента. Микобактерии туберкулеза птичьего вида растут на яичных средах при 37-38 и 45°С и на яичной среде с салицилатом натрия. Отмечается скудный рост на яичных средах при 22°С и на МПБ.
Культуры атипичных микобактерий растут на яичных средах при различных температурах /1/. Для дифференциации микобактерий туберкулеза человеческого вида от микобактерий туберкулеза бычьего вида применяют ниациновый тест с цианистыми солями с культурой, выращенной на среде Левенштейна-Йенсена без малахитовой зелени, что требует специального оснащения для работы с ядовитыми солями и приготовления дополнительно модифицированной среды Левенштейна-Йенсена. Для дифференциации микобактерий туберкулеза человеческого и бычьего видов пользуются реакцией восстановления нитратов и нитритов. Реакция восстановления нитратов позволяет дифференцировать микобактерии человеческого вида, обладающие нитраредуктазой, от микобактерий бычьего и птичьего видов и от некоторых атипичных микобактерий /2/. Постановка нитраредуктазной реакции включает выращивание исследуемой культуры до массового накопления, причем чтение результатов проводится через 15-16 часов. Микобактерии бычьего типа можно дифференцировать от микобактерий человеческого вида посевом на среду с 2-тиофен-карбоксил-гидразидом (ТСН) /3/. Для дифференциации микобактерий туберкулеза человеческого вида от микобактерий туберкулеза бычьего вида используют также комбинированную среду с ТСН и нитратом калия или натрия. Микобактерии туберкулеза человеческого вида в отличие от микобактерий туберкулеза бычьего вида растут на ТСН, а присутствие в среде нитрата позволяет определять нитратредуктазную активность, свойственную микобактериям туберкулеза человеческого типа, но не микобактериям туберкулеза бычьего и птичьего видов, с помощью реактива Грисса /4/, что обеспечивает одномоментность дифференциации микобактерий туберкулеза человеческого и бычьего видов и атипичных микобактерий.
Цель изобретения - повышение эффективности и упрощение способа дифференциации микобактерий туберкулеза.
Поставленная цель достигается способом, включающим предпосевную обработку диагностического материала, его посев на плотную питательную среду, инкубацию и регистрацию результатов, причем посев осуществляют на питательную среду, содержащую L-аспарагин, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, малахитовый зеленый, глицерин химически чистый, агар, желток сваренного вкрутую куриного яйца и воду дистиллированную при следующем соотношении компонентов:
L-аспарагин
4,0 г
калий фосфорнокислый двузамещенный
0,5 г
сернокислый магний
0,5 г
лимонная кислота
2,0 г
лимоннокислое аммиачное железо
0,05 г
малахитовый зеленый
20,0 мл
глицерин химический чистый
40,0 г
агар
10,0 г
желток сваренного вкрутую куриного яйца
250,0 г
дистиллированная вода
до 1000,0 мл,
а дифференциацию осуществляют по появлению или отсутствию роста с учетом временного фактора.
Способ осуществляется следующим образом.
Для приготовления среды в химически чистую стерильную колбу емкостью 2,0 л наливают 300,0 мл дистиллированной воды, прогревают на водяной бане до 75-85°С. В воде растворяют последовательно 2,0 г лимонной кислоты, 4,0 г L-аспарагина, 0,5 г сернокислого магния, 0,5 г двузамещенного фосфорнокислого калия, 0,05 г лимоннокислого аммиачного железа, 20,0 мл малахитового зеленого и 40,0 г глицерина химически чистого. Каждый компонент добавляют после полного растворения предыдущего. После внесения всех компонентов общий объем доводят до 750,0 мл стерильной дистиллированной водой. Устанавливают рН=7,1-7,2 добавлением 1н. NaOH или 1н. НСl. Свежие куриные яйца хорошо промывают в проточной воде, отваривают вкрутую, извлекают желтки. Расчетное количество сваренного вкрутую желтка (250 г) растирают в ступке в полученном солевом растворе до получения однородной массы, в которую добавляют 10,0 г агара, перемешивают, доводят объем до 1000 мл и нагревают на водяной бане до расплавления агара. Полученную среду автоклавируют в течение 30 минут при температуре 120°С и 1 атм. Приготовленную питательную среду разливают по пробиркам (30 мл) и скашивают. Диагностический материал обрабатывают по методу Аликаевой 3-6%-ным раствором серной кислоты, высевают на плотную питательную среду и инкубируют при температуре 37°С. Дифференциацию микобактерий туберкулеза бычьего и птичьего видов от атипичных микобактерий осуществляют по появлению роста через 1-2 недели, а микобактерий туберкулеза человеческого вида по отсутствию роста через 10 недель культивирования.
Сущность способа поясняется примерами.
Пример 1. Проводили дифференциацию микобактерий туберкулеза в пробах патологического материала от обследуемых и больных туберкулезом (мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, отделяемое верхних дыхательных путей) предлагаемым способом по сравнению с известными с подтверждением полученных результатов анализом жирнокислотного спектра клеток методом газожидкостной хроматографии. Результаты представлены в таблице 1.
Как видно из таблицы 1, появление роста на среде в соответствии с изобретением через 1 неделю культивирования характеризовало атипичные микобактерии (M.gordonae и M.fortuitum), через 4 недели - микобактерии туберкулеза птичьего вида, а отсутствие роста через 10 недель - микобактерии туберкулеза человеческого вида, что подтвердилось результатами газожидкостной хроматографии.
Таблица 1
Видовая дифференциация микобактерий туберкулеза
Вид микобактерий
Сроки выращивания, недель
Среда выращивания
Тесты
Левенштейна Йенсена
Финн-2
Попелеску
в соответствии с изобретением
ПО
HP
ГЖХ
M.tuberculosis
10
+
+
+
-
б/п
+
M.tuber.
M.tuberculosis
10
+
+
+
-
б/п
+
M.tuber.
M.tuberculosis
10
+
+
+
-
б/п
+
M.tuber.
M.tuberculosis
10
+
+
+
-
б/п
+
M.tuber.
M.tuberculosis
10
+
+
+
-
б/п
+
M.tuber.
M.tuberculosis
10
+
+
+
-
б/п
+
M.tuber.
M.tuberculosis
10
+
+
+
-
б/п
+
M.tuber.
M.tuberculosis
10
+
+
+
-
б/п
+
M.tuber.
M.tuberculosis
10
+
+
+
-
б/п
+
M.tuber.
M.tuberculosis
10
+
+
+
-
б/п
+
M.tuber.
M.tuberculosis
10
+
+
+
-
б/п
+
M.tuber.
M.tuberculosis
10
+
+
+
-
б/п
+
M.tuber.
M.tuberculosis
10
+
+
+
-
б/п
+
M.tuber.
M.tuberculosis
10
+
+
+
-
б/п
+
M.tuber.
M.tuberculosis
10
+
+
+
-
б/п
+
M.tuber.
M.tuberculosis
10
+
+
+
-
б/п
+
M.tuber.
M.tuberculosis
10
+
+
+
-
б/п
+
M.tuber.
M.tuberculosis
10
+
+
+
-
б/п
+
M.tuber.
M.tuberculosis
10
+
+
+
-
б/п
+
M.tuber.
M.tuberculosis
10
+
+
+
-
б/п
+
M.tuber.
M.tuberculosis
10
+
+
+
-
б/п
+
M.tuber.
M.tuberculosis
10
+
+
+
-
б/п
+
M.tuber.
M.tuberculosis
10
+
+
+
-
б/п
4-
M.tuber.
M.gordonae
1
+
+
+
+
оранж.
-
M.gord.
M.gordonae
1
+
+
+
+
оранж.
-
M.gord.
M.gordonae
1
+
+
+
+
оранж.
-
M.gord.
M.gordonae
1
+
+
+
+
оранж.
-
M.gord.
M.fortuitum
1
+
+
+
+
б/п
+
M.fort.
M.fortuitum
1
+
+
+
+
б/п
+
M.fort.
M.fortuitum
1
+
+
+
+
б/п
+
M.fort.
M.fortuitum
1
+
+
+
+
б/п
+
M.fort.
M.avium
4
+
+
+
+
б/п
-
M.avium
Примечание: ПО - пигментообразование, НР - нитратредуктазная реакция, ГЖХ - газожидкостная хроматография
Пример 2. Проводили дифференциацию микобактерий туберкулеза в пробах патологического материала (подчелюстные, заглоточные, брыжеечные лимфатические узлы, участки тощей и подвздошной кишок, печень и селезенка) от павших и убитых животных с изменениями, характерными для туберкулеза, и референс-штаммов микобактерий туберкулеза предлагаемым способом по сравнению с известными с подтверждением полученных результатов анализом жирноклслотного спектра клеток методом газожидкостной хроматографии. Результаты представлены в таблицах 2 и 3.
Таблица 2
Видовая дифференциация микобактерий туберкулеза в пробах патологического материала от павших и убитых животных
Вид микобактерий
Происхождение штамма
Сроки выращивания, недель
Среда
Тесты
Левенштейна Йенсена
Финн-2
в соответствии с изобретением
ГЖХ
M.avium
ГИСК
3
+
+
+
M.avium
M.avium
ГИСК
3
+
+
+
M.avium
M.avium
ГИСК
3
+
+
+
M.avium
M.tuberculosis (Academia)
ГИСК
10
+
+
-
M.tuber.
M.tuberculosis (Н<sub>37</sub>R<sub>Y</sub>)
ГИСК
10
+
+
±
M.tuber.
M.tuberculosis (Н<sub>37</sub>R<sub>а</sub>)
ГИСК
10
+
+
±
M.tuber.
M.bovis (Vallee)
ГИСК
3
+
+
+
M.bovis
M.bovis (Ravenall)
ГИСК
3
+
+
+
M.bovis
M.bovis (BCG)
ГИСК
3
+
+
+
M.bovis
M.bovis (N2)
лимфатический узел коровы, Московская обл.
3
+
+
+
M.bovis
M.bovis(N3)
лимфатический узел коровы, Московская обл.
3
+
+
+
M.bovis
M.vaccae (N296)
лимфатический узел коровы, Якутск
1
+
+
+
M.vaccae
M.vaccae (N1896)
лимфатический узел коровы, Якутск
1
+
+
+
M.vaccae
M.phlei
ГИСК
1
+
+
+
M.phlei
M.flavescens
ГИСК
1
+
+
+
M.flavesc.
M.smegmatis
ГИСК
1
+
+
+
M.smegm.
M.peregrinum
ГИСК
2
+
+
+
M.peregr.
M.gordonae
ГИСК
2
+
+
+
M.tuber.
M.scrofulaccum
ГИСК
2
+
+
+
M.scroful.
Примечание: ГЖХ - газожидкостная хроматография
Как видно из таблицы 2, появление роста на среде в соответствии с изобретением через 1-2 неделю культивирования характеризовало атипичные микобактерии (M.vaccae, M.phlei, M.flavescens, M.smegmatis, M.peregrinum, M.gordonae и M.scrofulaccum), через 3 недели - микобактери туберкулеза птичьего и бычьего видов, отсутствие роста или слабый рост через 10 недель - микобактерии туберкулеза человеческого вида, что подтвердилось результатами газожидкостной хроматографии. Возможность дифференциации микобактерий туберкулеза бычьего вида от микобактерий туберкулеза человеческого вида заявленным способом была подтверждена результатами культивирования микобактерий туберкулеза на среде с салицилатом натрия (росли микобактерии туберкулеза бычьего вида и не росли микобактерии туберкулеза человеческого вида) и ТСН (росли микобактерии туберкулеза человеческого вида и не росли микобактерии туберкулеза бычьего вида) и результатами газожидкостной хроматографии (таблица 3).
Таблица 3
Дифференциация микобактерий туберкулеза человеческого и бычьего видов
Вид микобактерий
Происхождение штамма
Способ дифференциации
Тесты
выращивание на среде с салицилатом натрия
выращивание на среде с ТСН
Выращивание на среде в соответствии с изобретением
ГЖХ
М.tuberculo-sis(Academia)
ГИСК
-
+
-
M.tuberculosis
М.tuberculosisH<sub>37</sub>R<sub>v</sub>
ГИСК
-
+
±
M.tuberculosis
M.tuberculosis Н<sub>37</sub>R<sub>а</sub>
ГИСК
-
+
±
M.tuberculosis
M.bovis (Vallee)
ГИСК
+
-
+
M.bovis
M.bovis (Ravenall)
ГИСК
+
-
+
M.bovis
M.bovis (BCG)
ГИСК
+
-
+
M.bovis
M.bovis (N2)
лимфатический узел коровы, Московская обл.
+
-
+
M.bovis
M.bovis (N3)
лимфатический узел коровы, Московская обл.
+
-
+
M.bovis
Примечание: ГЖХ - газожидкостная хроматография
Результаты проведенных исследований показали полное совпадение результатов биохимических и газохроматографических исследований, что указывает на специфичность способа в соответствии с изобретением. Заявляемый способ дифференциации микобактерий туберкулеза по появлению или отсутствию роста на среде, содержащей L-аспарагин, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, малахитовый зеленый, глицерин химически чистый, агар, желток сваренного вкрутую куриного яйца и воду дистиллированную, с учетом временного фактора обладает значительной разрешающей способностью при простоте осуществления.
Источники информации
1. Туберкулез сельскохозяйственных животных / Под ред. Шишкова В.П., Урбана В.П. - Агропромиздат, 1991. - С.122-123.
2. Virtanen S.A. Study of nitrate reduction by mycobacteria. Acta Tuberc. Sc. 1960, v.48, P.1-119.
3. The biology of the Mycobacteria / Vol.1, Academic press, 1982, 544 р.
4. Патент РФ №2102483 С1, 20.01.1998.