Регуляция поведения клеток фосфатами кальция, синтезированными механохимическим методом

Регуляция поведения клеток фосфатами кальция, синтезированными механохимическим методом

И.А. Хлусов, А.В. Карлов, Н.С. Поженько, М.В. Чайкина1

Центр ортопедии и медицинского материаловедения ТНЦ СО РАМН, Томск, 634029, Россия 1 Институт химии твердого тела и механохимии СО РАН, Новосибирск, 630128, Россия

Кальций-фосфатные материалы и покрытия на имплантаты, относящиеся к классу биоактивных изделий, находят широкое распространение в травматологии и ортопедии благодаря высокой способности к интеграции с костной тканью. В данной работе изучена in vitro биологическая активность 8 порошков гидроксилапатита, синтезированных механохимическим методом. Рентгенофазовый анализ и инфракрасная спектроскопия показали возможность синтеза молекул гидроксилапатита с замещением атомов кальция на другие катионы (калий, медь, цинк, барий, магний). Порошки гидроксилапатита, синтезированные механохимическим методом, оказались биоактивными. В зависимости от состава они могут разнонаправлено влиять на прилипание клеток костного мозга посредством растворения в биологических жидкостях. Все протестированные синтетические фосфаты кальция обладали удовлетворительной цитотоксичностью в тесте с трипановым синим. Однако дефицит кальция в молекуле апатита (атомное соотношение Ca/P < 1.67), а также замещение одного иона кальция в элементарной ячейке на барий, подавляет адгезию миелокарио-цитов к пластику. Введение в структуру синтетического гидроксилапатита атомов меди и цинка, напротив, способствовало адгезии клеток. При этом данные элементы обладают противомикробным эффектом, что важно для снижения риска постимплантационной инфекции. Гидроксилапатиты, полученные методом механохимического синтеза, перспективны для изготовления нового класса материалов и покрытий для ортопедии и травматологии, обладающих регулируемой биоактивностью.

Regulation of cells behavior by calcium phosphates obtained by mechanochemical method

I.A. Khlusov, A.V. Karlov, N.S. Pouzhenko, and M.V. Chaikina

Calcium phosphate materials and implant coatings which belongs to the class of bioactive ones, have wide spreading in traumatology and orthopaedy owing to their high capability to integrate with bone tissue. Biological activity of 8 hydroxyapatite powders synthesized by mechanochemical method had been studied in vitro. X-ray phase analysis and infrared spectroscopy demonstrated the possibility to synthesize hydroxyapatite molecules with calcium substitution on other atoms (potassium, copper, zinc, barium, magnesium). Hydro-xyapatites powders obtained by mechanochemical method were bioactive. In dependence on their composition, they may act variously on bone marrow cell adherence by means of dissolution in biological fluids. All tested synthetic calcium phosphate have satisfactory cytotoxicity in trypan blue test. Nevertheless, calcium deficit in hydroxyapatite molecule (atomic Ca/P < 1.67), and also substitution of one calcium ion on barium inhibits myelokaryocytes adhesion on the plastic. Copper and zinc incorporation into synthetic hydroxyapatite structure, vice versa, led to cell adherence. Moreover, these elements have antibacterial effect that is important to diminish a hazard of post implant infection. Hydroxyapatites, obtained by mechanochemical method, are prospective for orthopaedy and traumatology to produce novel class of materials and coatings with regulated bioactivity.

1. Введение

Согласно стандарту ASTM.F1185-89, к практическому применению разрешен синтетический гидроксил-апатит, полный химический аналог минерального вещества кости. Тем не менее, в лабораторных условиях не удается точно воспроизвести структуру природных кристаллов гидроксилапатита [1]. Одним из недостатков стехиометрического гидроксилапатита является его малая растворимость при физиологических рН в области 7.2 [2]. В то же время, считается, что для повышения биологической активности материала необходимо выс-

вобождение в окружающую среду (в результате частичного растворения) биологически активных ионов, прежде всего ионов кальция и фосфора [3]. Они используются организмом для образования на поверхности имплантатов микрокристаллов биологического апатита [4, 5], приводящего к построению новой функциональной системы имплантат/кость.

Среди основных направлений получения апатитов с регулируемой биоактивностью выделяют: 1) получение нестехиометрических гидроксилапатитов; 2) модифицирование гидроксилапатита ионами, не входящими

© Хлусов И.А., Карлов А.В., Поженько Н.С., Чайкина М.В., 2004

Таблица 1

Фазовый состав механохимически синтезированных апатитов, идентифицированных методом рентгенофазового анализа и инфракрасной спектроскопии

№№ Состав реакционной смеси Время Фазовый состав продукта Фазовый состав продукта

п/п и формула синтезированного активации, по данным рентгено- по данным инфракрасной

гидроксилапатита мин фазового анализа спектроскопии*, см-1

3Са(Н2Р04)2.Н20 + 6Са(ОН)2 = Апатит Апатит; 565; 602; 880-шир.;

1 = Са9НРО4(РО4)5(ОН) + 14Н20; 30 (интенсивные рефлексы: 970-сл.; 1045-инт.; 1095-пл.;

(Са/Р)ат = 1.5 3.41; 2.78; 2.70; 2.61) Вода - 1625-сл.; 3400-шир.; 3570-сл.

3Са(Н2Р04)2.Н20 + 6.6Са(ОН)2 = Апатит Апатит; 565; 602; 880-сл.;

2 = Са96(Р04)б(0Н)і2+ 15Н20; 30 (интенсивные рефлексы: 1420-1460-сл. - С03 в апатите;

(Са/Р)ат = 1.6 3.44; 2.80; 2.72; 2.63) 970-сл.; 1045-инт.; 1095-пл. Вода -1625-сл.; 3400-шир.; 3570-сл.

3Са(Н2Р04)2.Н20 + 7Са(ОН)2 = Апатит Апатит; 570; 605; 630-пл.; 880-сл.; 970-сл.;

3 = Са^РО^ОН^ + 15Н2О; 30 (интенсивные рефлексы: 1040 инт.; 1090-сл.; 1420-1460-сл. - С03

(Са/Р)ат = 1.67 3.417; 2.788; 2.706; 2.643) в апатите. Вода - 3400-3500-шир.; 3570-сл.

3Са(Н2Р04)2 .Н20 + 7.8Са(ОН)2 = Апатит Апатит; 570; 605; 630-сл. пл.; 880-сл.;

4 = Саю8(Р04)6(0Н)з6 + 15Н2О; 30 (интенсивные рефлексы: 970-сл.; 1040 инт.; 1090-сл; 1420-1460-сл.

(Са/Р)ат = 1.8 3.443; 2.806; 2.719; 2.629) - С03 в апатите; 3400-3500-шир.; 3570-сл.

3Са(Н2Р04)2 .Н20 + 7Са(ОН)2 + Апатит Апатит; 570; 605; 630-пл.; 880-сл.;

5 + КН2Р04 (0.04 ат. %) = 30 (интенсивные рефлексы: 970-сл.; 1040 инт.; 1090-сл; 1420-1460-сл.

= Са1оКо.о4(Р04),о4(ОН)2 + 15Н2О 3.417; 2.788; 2.703; 2.614) - С03 в апатите; 3400-3500-шир.; 3570-сл.

3Са(Н2Р04)2.Н20 + 7Са(ОН)2 + Апатит Апатит; 570; 605; 630-пл.; 880-сл.; 970-сл.;

6 + СиО (0.04 ат. %) + 30 (интенсивные рефлексы: 1040 инт.; 1090-сл.; 1640 ср.-3420 сильн.,

+ Zn0(0.04 ат. %) = 3.443; 2.8059; 2.7197; шир. 1420-1460-сл. - С03 в апатите;

= Са10(Си, ^0.08 (РО4)6(ОН)2.16 2.6292) 3400-3500-шир.; 3570-сл.

3Са(Н2РО4)2.Н2О + 6Са(ОН)2 + 10 Апатит (10 мин) Са- Апатит; 10 и 30 мин, одинаковые;

7 + Ва(ОН)2 .8Н2О = Хуже окристаллизован Апатит: 570; 605; 880-сл.; 970-сл.; 1040-инт.;

= Са9Ва(РО4)6(ОН)2 + 23Н2О 30 3.469; 2.823; 2.7388; 1090-плечо; Н20: 1640 сл. 1420-1460-сл.

Апатит (30 мин) 3.44; 2.805; 2.706; 2.629 С03 в апатите; Вода - 3400-3500-шир.

2Са(Н2РО4)2 .Н2О + 7Са(ОН)2 + 10 Апатит (близкий Са- Апатит; 10 и 30 мин, одинаковые;

8 + Mg(H2PO4)2 = Са^(РО4)6(ОН)2 + рентгенофазовый анализ Апатит; 570; 605; 880-сл.; 970-сл.; 1040 инт.;

+ 14Н2О 30 для 10 и 30 мин: 3.44; 2.79; 2.72; 2.629) 1090-пл.-сл.; вода - 1640 сл. 1420-1460-сл. -С03 в апатите) Вода - 3400-3500-шир.

Примечание: сл. — слабый; инт. — интенсивный; пл. — плечо; шир. — широкий

в его структуру [2]. В этом плане метод механохимии твердых тел позволяет решать обе задачи [6].

В связи с этим, функциональный ответ клеток костного мозга на экстракты стехиометрического гидрокси-лапатита, апатитов, дефицитных по кальцию (Са/Р)ат. <

< 1.67) и с различными замещениями в катионной под-решетке, синтезированных механохимическим методом, представлял несомненный интерес.

2. Материалы и методы

Механохимический синтез апатитов [6] проводили в планетарной мельнице ЭИ-2х150 в керамических барабанах с керамическими шарами в течение 10 либо 30 мин. Фазовый состав полученных порошков определяли по данным рентгенофазового анализа и инфракрасной спектроскопии (табл. 1). Биологические эксперименты проводились с использованием биологического материала 2 крыс-самцов линии Wistar массой 200300 грамм. Выделяли костный мозг бедренных костей и культивировали миелокариоциты в 24-луночном пластиковом планшете в концентрации 8.5 • 106 /лунку в течение 1 часа при 37 °С в 1 мл жидкой полной куль-

туральной среды. Определяли цитотоксичность самих порошков фосфатов кальция (1 мг/мл культуры клеток) и их 7-дневных экстрактов. Стерильные экстракты порошков получали согласно требованиям КО 10993-5 (1992 г) в условиях их культивирования в концентрации

0.1 мг/мл в 0.9 % раствора хлорида натрия при 37 °С. В лунки с культурой клеток добавляли экстракты в титрах 1:8 и 1:4 от конечного объема культуральной среды (1 мл). После культивирования миелокариоциты разделяли на прилипающую и неприлипающую фракции. Подсчитывали жизнеспособность (по способности исключать внутриклеточное поступление 0.4 % трипано-вого синего) неприлипающих кариоцитов до и через 1 час после добавления синтетических порошков фосфатов кальция либо их экстрактов. Тест с трипановым синим показывает грубые некротические нарушения клеточной мембраны, вызванные токсическим агентом [7]. Количество прилипающих к пластику клеток, окрашенных азуром 11-эозином, выявляли методом компьютерной морфометрии цифровых изображений при изучении 2 лунок для каждого образца. Это позволяет выявлять количественные параметры прилипающих к

Таблица 2

Показатели оптической плотности культуры миелокариоцитов после 1 часа культивирования с 7-дневными экстрактами порошков синтетического и биологического гидроксиапатита, Х, Рг

№ образца Экстракт порошка гидроксилапатита Количество прилипающих клеток костного мозга, условные единицы оптической плотности

Титр экстрактов 1: 8 Титр экстрактов 1: 4

1 Са9НРО4(РО4)5(ОН) + 14Н2О; 15.516 ± 0.989 9.986 ± 0.756

(Са/Р)ат. = 1.5 п = 10, # < 0.05 п = 10, # < 0.001, * < 0.001

2 Са9 6(РО4)6(ОН)12+ 15Н2О; 16.190 ± 0.574 14.445 ± 0.425

(Са/Р)ат. = 1.6 п = 15, # < 0.01, * < 0.02 п = 12, # < 0.001, * < 0.001

3 Са10(РО4)6(ОН)2 + 15Н2О; 18.525 ± 0.529 20.881 ± 0.730

(Са/Р)ат. = 1.67 п = 16, * < 0.001 п = 12

4 Са108(РО4)6(ОН)3 6 + 15Н2О; 18.042 ± 0.501 19.358 ± 0.569

(Са/Р)ат = 1.8 п=16, * < 0.001 п = 12

5 Са10К0.04(РО4),04(ОН)2 + 15Н2О 18.021 ± 0.546 18.706 ± 0.445

п = 12, * < 0.001 п = 10

6 Са10(Си, (РО4)6(ОН)2Л6 14.628 ± 1.288 22.280 ± 0.931

п = 10, # < 0.02 п = 7, # < 0.02, * < 0.02

7 Са,Ва(РО4)6(ОН)2 + 23Н2О 10.299 ± 0.554 11.142 ± 0.477

п = 12, # < 0.001, * < 0.05 п = 12, # < 0.001, * < 0.001

8 Са^(РО4)6(ОН)2 + 14Н2О 17.801 ± 0.719 17.096 ± 0.742

п = 13, * < 0.01 п = 15

9 гидроксилапатит биологический # 18.063 ± 0.319 18.824 ± 0.783

п = 18, * < 0.001 п = 10

10 Изотонический раствор* 13.204 ± 1.016 18.460 ± 0.967

хлорида натрия (растворитель) п = 10 п = 12

Примечание: Символами отмечены статистически значимые различия синтетических гидроксилапатитов по отношению к физиологическому раствору (*) и гидроксилапатиту биологическому (#) согласно г-критерию Стьюдента; п — число блоков измерений оптической плотности в 2 лунках

цию (нестехиометрические) апатиты обладают повышенной резорбируемостью [2], способствующей выходу ионов в растворитель.

Ионам кальция принадлежит важная роль в процессах клеточной адгезии [10]. Другие катионы также обладают выраженной биологической активностью [11].

Тестирование экстрактов, полученных при растворении синтетических порошков гидроксилапатита с различным соотношением Са/Р и добавками микроэлементов, показало неоднозначные результаты (табл. 2). Экстракты «кислых» гидроксилапатитов (Са/Р < 1.67) в использованных концентрациях однозначно угнетали способность клеток прилипать к пластику по сравнению с биологическим гидроксилапатитом (титр 1:8 и 1:4) и растворителем (титр 1:4). При этом угнетение показателя имело статистически значимый (р < 0.05) дозозависимый характер. Это согласуется с некоторыми литературными ссылками о цитотоксичности аморфных (растворимых) кальций фосфатов [12, 13]. По мнению авторов работы [14], увеличение скорости растворения керамики в организме стимулирует остеоиндуцирующую активность, но снижает биосовместимость биоматериала.

Повышение соотношения ионов кальция к фосфору в молекуле синтетического гидроксилапатита сопровождалось выраженным усилением адгезирующей активности клеток костного мозга, особенно при высокой

пластику клеток посредством измерения их оптических характеристик [7].

Плотность объекта (условные единицы оптической плотности, у.е.о.п.) вычисляли при помощи программы Adobe PhotoShop 6.0 согласно статистике серых уровней с выделением области интересов ^О1), состоящей из блоков с фиксированной площадью [8].

Интегральный коэффициент отражения:

КЯ, G, В = 5К, G, в/Щ G, В ,

где 5 — яркость тестируемого участка; Ж — яркость белого стандарта (255).

Оптическую плотность прилипающих клеток (ф) определяли согласно формуле [9] с учетом различного отражения фона:

ф = 100^(5Ф/ 5Т).

Статистическую обработку результатов проводили согласно г-критерию Стьюдента р и непараметрическому ^-критерию Вилкоксона-Манна-Уитни Ри.

3. Результаты исследований и обсуждение

Рентгенофазовый анализ и инфракрасная спектроскопия показали возможность синтеза гидроксилапати-тов с замещением в молекуле атомов кальция на другие катионы (табл. 1). Известно, что дефицитные по каль-

концентрации экстрактов (табл. 2). Экстракты стехиометрического (Ca/P = 1.67) и «щелочного» гидроксил-апатита по эффекту на адгезию клеток соответствовали экстрактам биологического гидроксилапатита. Более того, в титре 1:8 экстракты порошка «щелочного» гидро-ксилапатита даже повышали выживаемость клеток в культуре по сравнению с биологическим аналогом.

С другой стороны, биологическую активность гидроксилапатитов, синтезированных механохимичес-ким методом, можно регулировать введением в решетку апатита различных микро- и макроэлементов. Так, однозначным негативным эффектом на прилипание миело-кариоцитов в культуре обладала растворимая фракция порошков апатита при замещении одного иона кальция на барием (табл. 2). В то же время, введение в структуру гидроксилапатита атома калия либо магния может, по-видимому, стимулировать прилипание клеток (титр 1:8, табл. 2). При этом растворы гидроксилапатитов с частичным замещением кальция на магний несколько увеличивали жизнеспособность костномозговых клеток.

Экстракты гидроксилапатитов, содержащих в структуре ионы меди и цинка, в высокой концентрации оказывали максимальное стимулирующее влияние на адгезию клеток. Различия в оптической плотности культуры достигали статистического уровня с показателями как для контроля растворителя, так и биологического гидрокси-лапатита (табл. 2).

Как микроэлементы организма, медь и цинк модулируют различные функции клеток и тканей через зависимые металлоферменты [15]. В то же время, они обладают явными бактерицидными свойствами [16].

В связи с этим, синтетические гидроксилапатиты со встроенными в молекулу атомами меди и цинка могут оказаться полезными для формирования объемных изделий и покрытий на металлы, обладающих как регуляторной, так и антимикробной активностью. Это будут изделия нового класса, которые, по мнению авторов [17], должны комплексно решать проблемы на границе кость/имплантат и, следовательно, обладать улучшенной биосовместимостью.

Экстракты всех образцов обладали удовлетворительными показателями токсичности в культуре клеток in vitro. Тестирование самих порошков также свидетельствует о возможности их применения in vivo. Таким образом, порошки гидроксилапатита, полученные методом механохимии, не вызывают грубых повреждений клеток. Более того, они биоактивны и, в зависимости от добавок микроэлементов, могут иметь разнонаправленное регуляторное действие на костный мозг и костную ткань.

4. Выводы

1. Порошки гидроксилапатита, синтезированные ме-ханохимическим методом, биоактивны. В зависимости от состава они могут оказывать разнонаправленное ре-

гуляторное влияние на функциональную активность клеток костного мозга посредством растворения в биологических жидкостях.

2. Все протестированные синтетические фосфаты кальция обладают удовлетворительной цитотоксичностью. Однако дефицитный по кальцию апатит (Ca/P <

< 1.67), а также замещение одного иона кальция в элементарной ячейке на барий, подавляет адгезирующую активность миелокариоцитов in vitro.

3. Введение в структуру синтетического гидроксил-апатита атомов меди и цинка, напротив, способствует адгезии клеток. При этом данные металлы обладают противомикробным эффектом, что важно для профилактики постимплантационной инфекции.

Литература

1. Дубок В.А. Биокерамика — вчера, сегодня, завтра // Порошковая металлургия. - 2000. - № 7/8. - C. 69-86.

2. Малышева А.Ю., Белецкий Б.И. Регулирование биологической сов-

местимости апатитсодержащих имплантационных материалов // Неорганические материалы. - 2001. - Т. 37. - № 2. - С. 233-236.

3. Daculsi G. New technology for calcium phosphate bioactive ceramics in bone repair // Proc. EMBEC’99, Vienna, Austria, 4-7 November 1999. - Vienna, 1999. - V. 37. - Part II. - P. 1598-1599.

4. LeGeros R.Z. Calcium phosphates in oral biology and medicine. -Basel, 1991. - 221 p.

5. Kokoubo T., Kushitani H., Ohtsuki C. Chemical reaction of bioactive glass and glass-ceramics with a simulated body fluid // J. Mater. Sci. Mater. Med. - 1992. - V. 3. - P. 79-83.

6. Чайкина М.В. Механохимия природных и синтетических апатитов. - Новосибирск: Изд-во СО РАН, филиал «ГЕО», 2002. - 223 с.

7. Фрешни Р. Культура животных клеток. Методы. - М., 1989. - 333 с.

8. Lee S., Park S.H., Pyo H.B., Kim S. Measurement of bone mineral density using trabecular patterns of conventional X-rays films // Medical & Biological Engineering & Computing. - 1999. - V. 37. -Suppl. 2. - P. 1066-1067.

9. Синичкин Ю.П., Утц С.Р. In vivo отражательная и флуоресцентная спектроскопия кожи человека. - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2001. - 92 с.

10. Георгиевский В.И., Анненков Б.Н., Самохин В.Т. Минеральное питание животных. - М., 1979. - 471 с.

11. Лившиц В.М., Сидельников В.И. Биохимические анализы в клинике: Справочник. - М., 1998. - 303 с.

12. Katsufumi H., Takao Y., Yoshihiko K. et al. The influence of calcium phosphate ceramics and glass-ceramics on cultured cells and their surrounding media // J. Biomed. Mater. Res. - 1989. - V. 23. - P. 10491066.

13. Oreffo R.O.C. Driessens F.C.M., Planell J.A., Triffitt J.T. Growth and differentiation of human bone marrow osteoprogenitors on novel calcium phosphate cements // Biomaterials. - 1998. - V. 19. - P. 18451854.

14. Taranobu O. et al. The influence of sintering condition and surface shape of hidroxyapatite ceramics for the osteoconductivity / Ed. by O. Taranobu, J. Nailo, N. Takahashi et al. // Oral. Implantol. and Biomater: Proc. 3rd Jnt. Congr. Implantos. and Biomater. Stomatol., Osaka, Apr. 27-29, 1988. - Amsterdam, 1989. - P. 233-238.

15. Хейхоу Ф.Г., Кваглино Д. Гематологическая цитохимия. - М., 1983.- 320 с.

16. Sheridan R., Doherty PJ., Gilchrist T., Healy D. The effect of antibacterial agents on the behaviour of mouse fibroblasts in vitro // 12th European Conference on Biomaterials, Porto, Portugal, Sept. 10-13, 1995. - P. 182.

17. Bruijn J.D. Calcium phosphate biomaterials: Bone-bonding and biodegradation properties. - Leiden, 1993. - 170 p.