НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ "886-84-ПОДОБНЫХ" ШТАММОВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА
SET OF SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS FOR IDENTIFICATION OF "886-84-LIKE" STRAINS OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии, вирусологии и может быть использовано для идентификации «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита (КЭ), изолированных из различных источников, путем амплификации и последующего секвенирования генома вируса.
Вирус клещевого энцефалита относится к роду Flavivirus семейства Flaviviridae. Геном вируса составляет около 11 тыс. нуклеотидов. Вирус КЭ подразделяется на три субтипа: дальневосточный, сибирский и европейский. В 1984 г. был обнаружен новый штамм - 886-84, который отличается по своим вирусологическим, серологическим и молекулярно-генетическим свойствам от штаммов трех известных субтипов (см Фиг. 1). На фиг.1. представлено филогенетическое древо вируса клещевого энцефалита на основе анализа 165 полногеномных нуклеотидных последовательностей из базы данных GenBank. Черными треугольниками объединены последовательности трех известных субтипов, штамм 886-84 показан отдельно. Древо построено в программе MEGA 5 (Phylogenetic and molecular evolutionary analyses were conducted using MEGA version 5 (Tamura, Peterson, Stecher, Nei, and Kumar 2011). Позднее из клещей Ixodes persulcatus, I. pavlovskyi, мелких млекопитающих, мозга умершего больного клещевым вирусным энцефалитом были выделены «886-84-подобные» штаммы вируса КЭ (Хаснатинов М.А., Данчинова Г.А., Кулакова Н.В., Tungalag K., Арбатская Е.В., Миронова Л.В., Tserennorov D., Bolormaa G., Otgonbaatar D., Злобин В.И. Генетическая характеристика возбудителя клещевого энцефалита в Монголии. // Вопр. вирусол. - 2010. - Т. 55. - №3. - с. 27-32). В связи с тем, что «886-84-подобные» штаммы вируса КЭ выделены, в том числе, и из патологического материала больного, умершего от клещевого вирусного энцефалита, они являются медицински значимыми, идентификация и изучение данных штаммов, является актуальной задачей.
Наборов олигонуклеотидных праймеров для специфической идентификации группы «886-84-подобных» штаммов вируса КЭ не существует.
Целью настоящего изобретения является создание набора олигонуклеотидных праймеров, позволяющих идентифицировать «886-84-подобные» штаммы путем амплификации и последующего секвенирования генома вируса.
Предлагаемый набор включает уникальные олигонуклеотидные праймеры, которые не дают перекрестных реакций с другими субтипами вируса КЭ, позволяют, ограничиваясь двухступенчатой процедурой проведения ПЦР, получить специфические продукты амплификации «886-84-подобных» штаммов вируса КЭ.
Предлагаемый набор синтетических олигонуклеотидных праймеров может использоваться в учреждениях практического здравоохранения, Роспотребнадзора и в научно-исследовательских лабораториях для идентификации (выявления) «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита как в пробах клеточных культур вируса, так и в полевом и патологическом материале, а также для решения научно-исследовательских задач по изучению вируса КЭ.
Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям изобретения «новизна», «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».
Предлагаемый набор содержит 48 олигонуклеотидов, комплементарных нуклеотидной последовательности полного генома «886-84-подобных» штаммов вируса КЭ:
Предложенный набор для идентификации используется следующим образом:
Пример 1. Способ подбора специфичных синтетических олигонуклеотидных праймеров.
Поиск новых специфических праймеров осуществляли на основе полных геномов прототипных штаммов вируса КЭ, представленных в базе данных GenBank (http.//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankSearch.html): дальневосточный субтип JX498940_Sofjin, сибирский субтип AF069066_Vasilchenko, европейский субтип U27495_Neudoerfl и группа «886-84» - EF469662_886-84. Все последовательности выравнивали относительно друг друга в программе BioEdit ver. 7.0.5.3 (Hall Т.A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. - Nucleic Acids Symposium Series. - 1999. - №41. - pp. 95-98.) и выбирали участки генома, специфичные (97-100% гомологии) только для прототипного штамма «886-84» вируса КЭ (EF469662), но не для представителей трех известных субтипов. Для расчета GC-состава, температуры плавления праймеров и возможность образования петель в ПНР, использовали программу Oligo Analyzer (http://www.genelink.com).
Синтез олигонуклеотидных праймеров был произведен фирмой «Beagle» (г.Санкт-Петербург).
Пример 2. Способ применения синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления генетического материала (идентификации) «886-84-подобных» штаммов вируса КЭ.
Этап 1. Выделение суммарной нуклеиновой кислоты (НК) и реакция обратной транскрипции (ОТ).
Из образцов мозга сосунков беспородных белых, зараженных «886-84-подобными» штаммами вируса КЭ, готовили 10% суспензии в физиологическом растворе (0,9% хлорид натрия). Из полученных суспензий выделяли суммарную нуклеиновую кислоту сертифицированным коммерческим набором реагентов «АмплиПрайм РИБО-преп» (ООО «НекстБио», Москва), в соответствии с инструкциями изготовителя. Таким же способом выделяется суммарная НК из патологического материала, культуры клеток и других источников.
Для обнаружения РНК ВКЭ применяли метод обратной транскрипции с последующей ПЦР (ОТ-ПЦР), используя набор реагентов «Реверта-L» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва). Полученную комплементарную ДНК (кДНК) использовали для постановки ПЦР в амплификаторах с нагревающейся крышкой типа BioRad и Eppendorf.
Этап 2. Амплификация участков кДНК, перекрывающих полный геном «886-84-подобных» штаммов вируса КЭ (получение продуктов ПЦР).
2
Амплификацию участков кДНК «886-84-подобных» штаммов вируса КЭ проводили с разработанными праймерами и набором реактивов «ПЦР-РВ» («Синтол», Москва), в соответствии с инструкциями изготовителя. Каждую пару праймеров (1L/2R, 3L/4R, 5L/6R, 7L/8R, 9L/10R, 11L/12R, 13L/14R, 15L/16R, 17L/18R, 19L/20R, 21L/22R, 23L/24R, 25L/26R, 27L/28R, 29L/30R, 31L/32R, 33L/34R, 35L/36R, 37L/38R,39L/40R, 41L/42R, 43L/44R, 45L/46R, 47L/48) добавляли в отдельную пробирку с реакционной смесью (всего 24 пробирки). Таким образом, к реакционной смеси (25 мкл), включающей ПЦР-буфер (60 mM Tris-HCl [рН 8.5], 1,5 мМ MgCl, 25 mM КС1, 10 мМ 2-меркаптэтанола, 0,1% Тритон Х-100), 0,2 мМ dNTP, 1.25 е.а. Taq-ДНК-полимераза («Синтол», Москва), 5 мкл кДНК, добавляли по 0,1 мкг каждого праймера из соответствующей пары праймеров (L и R праймеры каждой пары). Отрицательный контроль ПЦР (вода вместо кДНК) проводили с каждой парой праймеров.
Температурный режим проведения ПЦР: 95°С - 30 сек.; 95°С - 10 сек., 63°С - 20 сек., 72°С - 30 сек., 5 циклов; 95°С - 10 сек., 61°С - 20 сек., 72°С - 30 сек., 30 циклов. В результате получали 24 продукта ПЦР.
Этап 3. Определение размера продуктов ПЦР.
Продукты ПЦР анализировали методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле с бромистым этидием (0,5 мкг/мл) в стандартном трис-боратном буфере (рН 8,0). 5 мкл ПЦР-продукта смешивали с 1 мкл буфера для нанесения образца (0,25% бромфеноловый синий, 40% сахароза) и вносили в лунку агарозного геля. Электрофорез проводили при напряжении 10 в/см до тех пор, пока краситель не пройдет от старта не менее половины геля (примерно 30 минут). Результаты электрофореза учитывали, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм и документируя результат на приборе Gel Doc XR + System (США). Для оценки соответствующей длины ПЦР-продукта в последнюю лунку агарозного геля вносили генетический маркер (маркер длин фрагментов ДНК) (Thermo Scientific Ltd., Москва). На фиг. 2-10 представлены результаты визуализации (электрофореграммы) ПЦР-продуктов (фрагментов генома «886-84-подобного» штамма вируса КЭ), полученных с помощью разработанных праймеров, где 1L/2R … 47L/48R - пары праймеров; K- - отрицательный контроль, М - генетический маркер.
Длина продукта амплификации пары праймеров 1L/2R составляет 617 пар нуклеотидов (п.н.), пары праймеров 3L/4R - 586 п.н., пары праймеров 5L/6R - 499 п.н., пары праймеров 7L/8R - 578 п.н., пары праймеров 9L/10R - 591 п.н., пары праймеров 11L/12R - 470 п.н., пары праймеров 13L/14R - 591 п.н., 15L/16R - 535 п.н., пары праймеров 17L/18R - 661 п.н., пары праймеров 19L/20R - 727 п.н., пары праймеров 21L/22R - 644 п.н., пары праймеров 23L/24R - 645 п.н., пары праймеров 25L/26R - 634 п.н., пары праймеров 27L/28R - 644 п.н., пары праймеров 29L/30R - 664 п.н., пары праймеров 31L/32R - 939 п.н., пары праймеров 33L/34R - 460 п.н., 35L/36R - 665 п.н., 37L/38R - 603 п.н., 39L/40R - 475 п.н., 41L/42R - 535 п.н., 43L/44R - 621 п.н., 45L/46R - 776 п.н., 47L/48R - 679 п.н. Длины амплифицированных фрагментов соответствовали полосам генетического маркера в пределах от 400 до 950 п.н.
Этап 4. Очистка ПЦР-продуктов.
Полученные ПЦР-продукты очищали энзиматическим методом с помощью набора ExoSAP от непрореагировавших нуклеотидов и праймеров. Набор включает ферменты экзонуклеазу (Ехо - Exonuclease I) и щелочную фосфатазу (SAP - Shrimp Alkaline Phosphatase).
Состав реакционной смеси для очистки ПЦР-продукта:
ПЦР-продукт - 5 мкл.
Ехо - 0,5 мкл. (10 е.а.)
SAP - 1 мкл. (1 е.а.)
Условия проведения реакции: 37°С - 15 мин, 85°С - 15 мин.
Этап 5. Секвенирование ПЦР-продуктов фрагментов генома «886-84-подобных» штаммов вируса КЭ.
Состав реакционной смеси для проведения секвенирующей реакции (10 мкл.):
BigDye™ Terminator 3.1 Ready Reaction Mix - 2 мкл.
BigDye™ Terminator v1.l & v3.1 5X Sequencing Buffer - 2 мкл.
Primer (3.2 μM) - 1 мкл.
Deionized water (RNase/DNase-free) - варьирутся.
ГЩР-продукт (5-20 ng) - варьирутся.
Условия проведения реакции:
1) денатурация: 96°С - 10 сек,
2) отжиг праймеров: 50°С - 5 сек,
3) элонгация: 60°С - 4 мин, 25 циклов.
Анализ продуктов секвенирующей реакции проводили на приборе Genetic Analyzer 3500 xL (Applied Biosystems, Япония) с помощью программы Sequencing Analysis ver. 5.4. Сборку расшифрованных фрагментов каждого штамма проводили в программе BioEdit ver. 7.0.5.3 (Hall Т.А. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. - Nucleic Acids Symposium Series. - 1999. - №41. - pp. 95-98.). Затем осуществляли сравнение анализируемой последовательности ДНК как с референсной последовательностью штамма «886-84» (номер GenBank EF469662), так и со всеми полногеномными последовательностями вируса КЭ, депонированными в базе данных GenBank, с помощью программы BLASTn в режиме «online» на сервере (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). В результате была определена наибольшая степень гомологии расшифрованных нуклеотидных последовательностей со штаммом «886-84» (номер GenBank EF469662), но не с последовательностями известных субтипов вируса КЭ.
Таким образом, специфическая идентификация полных геномов «886-84-подобных» штаммов вируса КЭ возможна только при получении всех 24 продуктов ПЦР и последующего секвенирования с разработанным набором олигонуклеотидных праймеров.
На фиг. 11 представлено филогенетическое древо, построенное на основе сравнения секвенированных последовательностей полных геномов исследуемых «886-84-подобных» штаммов и 171 полногеномной нуклеотидной последовательности вируса КЭ. Черными треугольниками объединены последовательности трех известных субтипов вируса КЭ из базы данных GenBank. Группа «886-84-подобных» штаммов выделена прямоугольником. Древо построено в программе MEGA 5 (Phylogenetic and molecular evolutionary analyses were conducted using MEGA version 5 (Tamura, Peterson, Stecher, Nei, and Kumar 2011).
С использованием предлагаемого набора олигонуклеотидных праймеров была проведена амплификация и секвенирование шести штаммов вируса КЭ из коллекции ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, изолированных с 1999 по 2010 гг.от иксодовых клещей и мелких млекопитающих. Среди изученных штаммов два оказались «микс» штаммами, в которых ранее было определено наличие фрагментов нуклеиновой кислоты двух групп вируса КЭ: дальневосточного субтипа и группы «886-84»; сибирского субтипа и группы «886-84». С помощью предлагаемого набора праймеров удалось получить ПЦР-продукты и провести специфическую идентификацию только «886-84-подобных» штаммов в «микс» (гетерологичных) образцах.
Также для контроля специфичности предлагаемого набора олигонуклеотидных праймеров были взяты по одному штамму дальневосточного и сибирского субтипов вируса КЭ. Получить продукты амплификации для дальнейшего полногеномного секвенирования штаммов дальневосточного и сибирского субтипов вируса КЭ с помощью предлагаемого набора олигонуклеотидных праймеров не удалось.
Таким образом, разработанный набор праймеров показал высокую специфичность и универсальность при проведении ПЦР и расшифровки полногеномной нуклеотидной последовательности «886-84-подобных» штаммов вируса КЭ, изолированных из различных источников (иксодовые клещи, мелкие млекопитающие). Высокий уровень специфичности установлен при наработке ПЦР-продуктов и секвенировании «микс» штаммов, в которых было определено наличие нуклеиновой кислоты двух групп вируса КЭ: дальневосточного субтипа и «886-84-подобных» штаммов; сибирского субтипа и «886-84-подобных» штаммов. Универсальность разработанных праймеров заключается в том, что получение ПЦР-продуктов, перекрывающих полный геном «886-84-подобных» штаммов вируса КЭ, происходит в одном режиме амплификации.
Из вышеприведенных примеров видно, что создан набор синтетических олигонуклеотидных праймеров для идентификации генетического материала «886-84-подобных» штаммов вируса КЭ, изолированных из различных источников.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ  ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Federal Government Health Institution “Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East” of the Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers’ Rights Protection and Human Welfare)
<120> НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ «886-84-ПОДОБНЫХ» ШТАММОВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА
<160>  48
<210>  1
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 1L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  1
agattttctt  gcacgtgcgt  gc  22
<210>  2
<211>  23
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 2R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  2
agtgagtcat  cacaccatga  tcc  23
<210>  3
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер  3L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  3
gatgcggcaa  cccaggtg  18
<210>  4
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 4R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  4
tggtagatgg  agtcaagcca  ca  22
<210>  5
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 5L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  5
actggcactc  agggaaccac  20
<210>  6
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 6R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400> 6
agtctcccat  ggtcaagatg  gt  22
<210>  7
<211>  25
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 7L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  7
aagattgtgt  acacagtcaa  agttg  25
<210>  8
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 8R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  8
catgaccact  gtgtcatgtc  c  21
<210>  9
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер  9L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  9
tgatggaacc  aagtaccacc  tg  22
<210>  10
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 10R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  10
attcctcatg  ttcaggccca  ac  22
<210>  11
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 11L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  11
aggcgctgca  cacagtcct  19
<210>  12
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 12R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  12
tgggatcgag  tttgtccacc a  21
<210>  13
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 13L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  13
gacttgaaat  ggccatgtgg  ag  22
<210>  14
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 14R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  14
ggtatcctgt  tgtaccagga  tc  22
<210>  15
<211>  23
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 15L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400> 15
atgaagtccg  tgagaaatga  cac  23
<210>  16
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 16R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  16
ctcctccgga  tgacgtattc  20
<210>  17
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 17L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  17
acagactgtt  ggtatgccat  gg  22
<210>  18
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 18R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  18
ttctgttctc  tgtgtcctcg  g  21
<210>  19
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 19L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  19
ttggtgctgg  aactgggact  20
<210>  20
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 20R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  20
agcatttctg  acagcgtcca  ca  22
<210>  21
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер  21L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  21
cacctgacag  agcttgagaa  ag  22
<210>  22
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 22R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  22
gatgctgctg  acgtaggtct  20
<210>  23
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер  23L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  23
gataggggca  gtgccaattg  at  22
<210>  24
<211>  23
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 24R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  24
actggtgatt  gctccattgg  att  23
<210>  25
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 25L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  25
cgtatgtcaa  cagacggctg  20
<210>  26
<211>  25
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 20R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  26
tcatcacatt  gtccagagta  tatgt  25
<210>  27
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 27L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  27
gctcacaggg  accagacgt  19
<210>  28
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 28R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  28
ccaggttcct  catgcatcag  20
<210>  29
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 29L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  29
gacgtgacat  cagagaattc  gt  22
<210>  30
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 30R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  30
ctggtggatt  atgtatggtg  tgaa  24
<210>  31
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 31L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  31
cagagaagca  gtgatgacaa  ca  22
<210>  32
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 32R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  32
gttccgtctc  caggatgcc  19
<210>  33
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 33L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  33
tggacgatgc  cagtggcct  19
<210>  34
<211>  23
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 34R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  34
cttgtcacca  tctttggagt  ctc  23
<210>  35
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 35L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  35
tcgcctggct  tgaggaacg  19
<210>  36
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 36R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  36
cactgatcct  ctcctgcaca  t  21
<210> 37
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 37L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  37
atgtattact  caaccgctgt  cact  24
<210>  38
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 38R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  38
accacctgtt  ctgctcatca  ga  22
<210>  39
<211>  22
<212>  ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 39L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  39
atgtgcagca  gagaggaatt  ca  22
<210>  40
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 40R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  40
tcttcatcct  ctaggtctgc  g  21
<210>  41
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер  41L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  41
gtggagggaa  taagcctgaa  ct  22
<210>  42
<211>  23
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 42R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  42
gccatgtcat  tcagaaagta  gag  23
<210>  43
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 43L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  43
gtctcggaag  aatgctcgtg  20
<210>  44
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 44R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  44
ttggcccact  ctgccctct  19
<210>  45
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 45L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  45
cgtctggaac  agggtgtgga  20
<210>  46
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 46R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  46
gtcgccactc  tcactgacgt  20
<210>  47
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 47L для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  47
tggaatgatg  cggcagcgc  19
<210>  48
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер 48R для амплификации фрагмента генома «886-84-подобных» штаммов вируса клещевого энцефалита.
<400>  48
cgggtgtttt  tccgagtcac  20
<---