НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ-ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ РНК ВИРУСА КУСТИСТОЙ КАРЛИКОВОСТИ МАЛИНЫ
SET OF OLIGONUCLEOTIDES-PRIMERS FOR INDENTIFICATION OF RNA OF RASPBERRY BUSHY DWARF VIRUS

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к молекулярной диагностике, и может быть использовано в биотехнологии растений, фитопатологии, селекции, ягодоводстве и растениеводстве для скрининга генетического материала вируса кустистой карликовости малины (ВККМ) в образцах пробирочных и полевых растений, а также для решения научно-исследовательских задач по изучению ВККМ, его накопления в тканях и взаимодействия с растениями.
В основе скрининга ВККМ лежит метод обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), который является прямым методом выявления генетического материала вируса, и характеризуется высокой степенью чувствительности. Метод ОТ-ПЦР основан на получении кДНК на матрице вирусной РНК с помощью фермента обратной транскриптазы и полимеразно-цепной реакции на полученной кДНК: многократном копировании определенного фрагмента этой кДНК, являющегося специфическим для ВККМ, с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эффективный скрининг вируса с помощью ОТ-ПЦР требует наличия праймеров - синтетических олигонуклеотидов определенного размера, специфичных для каждого вида и типа вируса. Ограниченность использования праймеров обусловлена их видоспецифичностью. Праймеры являются комплементарными к последовательностям специфических фрагментов кДНК на их левой и правой границах и ориентированы таким образом, чтобы синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекал только между ними. В результате на каждом этапе ПЦР происходит удвоение количества копий специфического фрагмента. Точная диагностика исследуемого вируса основана на правильности выбранных праймеров, определяющих специфичность ПЦР.
Известен зарубежный аналог (прототип), представляющий собой набор олигонуклеотидов - праймеров, обеспечивающих специфический синтез продуктов амплификации на матрице ДНК-копии РНК конкретного изолята вируса ВККМ (Harri I. Kokko, Merja Kivineva and Sirpa O. Karenlampi. Single-Step Immunocapture RT-PCR in the Detection of Raspberry Bushy Dwarf Virus. // BioTechniques. - Vol.20, No.5. - 1996. - pp.842-846).
Однако в данном методе используется набор праймеров, который был разработан на основе структуры РНК-3 конкретного R-15 изолята RB-штамма ВККМ (Mayo, МА., С.A. Jolly, A.F.Murant and J.H.Raschke. Nucleotide sequence of raspberry bushy dwarf virus RNA-3. // J. Gen. Virol. - 1991. - V.72. - pp.469-472), без учета вариабельности вируса. В частности, некоторые праймеры попадали в самое начало кодирующей области гена белка оболочки и в 3'-нетранслируемую область после конца структурной части гена, которые не являются консервативными и могут варьировать у различных изолятов. Между тем известно несколько природных и лабораторных изолятов вируса, различающихся по последовательности нуклеотидов гена белка оболочки, а также по вредоносности, серологическим свойствам и способности размножаться в различных растениях - хозяевах, в частности RB-изоляты (resistance breaking), преодолевающие генетическую устойчивость сортов малины, считавшихся резистентными к другим штаммам вируса кустистой карликовости малины.
Вирус кустистой карликовости малины является наиболее распространенным и трудно контролируемым патогеном растений рода Rubus. ВККМ приводит к возникновению хлорозов, некрозов, появлению деформированных и «рассыпчатых» плодов, снижению продуктивности растений более чем на 50%. В естественных условиях этот вирус передается с пыльцой и при семенном размножении, что затрудняет контроль за его распространением в селекционных питомниках и производственных насаждениях.
Распространен он повсеместно, везде, где произрастают растения рода Rubus - есть сообщения из Восточной и Западной Европы, Скандинавии, Северной и Южной Америки. Австралии, Новой Зеландии, Южной Африки. Однако распространенность вируса в России и СНГ не изучена. Состав штаммов, местных изолятов и их свойства не известны. Один из основных симптомов поражения ВККМ, «рассыпчатость» плодов и отсутствие части костянок, очень широко распространился в последние годы в различных регионах РФ. Однако иммуноферментный анализ с использованием импортных наборов реактивов обычно дает отрицательный результат (частное сообщение). Это может являться косвенным свидетельством серологических отличий местных изолятов.
Нами был проведен анализ всех имеющихся в международных банках генов последовательностей нуклеотидов гена белка оболочки разных изолятов ВККМ и синтезированы две пары праймеров к наиболее консервативным участкам гена, способные по этому взаимодействовать одинаково хорошо с последовательностями РНК гена белка оболочки любого изолята. В то же время эти праймеры не имеют существенной гомологии с генами белков оболочки родственных групп вирусов, например, вируса мозаики люцерны.
Разработка новых типов праймеров позволяет проводить анализ других изолятов или штаммов вирусов. Этот принцип широко используется при выявлении различных вирусов - возбудителей болезней животных и человека, например в патенте 19) RU (11) 2209830 (13) С2. Петров B.C., Петрова И.Д., Тюнников Г.И., Серегин С.В., Яшина Л.Н., Кузина И.И. Набор олигонуклеотидов праймеров для идентификации РНК вируса крымской конго геморрагической лихорадки.
Техническим результатом заявляемого изобретения является разработка набора праймеров для индикации генетического материала вируса кустистой карликовости малины, позволяющего проводить определение этого вируса на территории России.
Указанный результат достигается разработкой набора олигонуклеотидов-праймеров для идентификации РНК вируса кустистой карликовости малины, содержащего две пары дезоксирибоолигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции, имеющих следующую структуру:
5'ttcttttgtcgggttcagtgag3' - RBDV-CP+2;
5'aactattgtggaggatttgc3' - RBDV-CP-2;
5'gacatgtatatgtctgctaagg3' - RBDV-CP+3;
5'tgtcgtcgacggcaccgccc3' - RBDV-CP-3.
В набор также включена в качестве положительного контроля плазмидная ДНК, содержащая клонированный фрагмент вируса кустистой карликовости малины, обеспечивающая проведение ПЦР с амплификацией всего набора специфических фрагментов.
Апробация праймеров была осуществлена с использованием РНК, выделенной из растений малины с явными признаками поражения ВККМ, произрастающих на Кокинском опорном пункте ВСТИСП (с.Кокино, Выгоничского р-на. Брянской обл.). Было показано, что применение данных праймеров для индикации РНК вируса ВККМ в пробах обеспечивает синтез фрагментов ДНК рассчитанного размера в условиях ОТ-ПЦР. Причем при использовании различных пар праймеров образуются четко различающиеся по длине специфические фрагменты.
Пара праймеров RBDV-CP+3 и RBDV-CP-3 расположена внутри последовательности РНК ограниченной праймерами RBDV-CP+2 и RBDV-CP-2 (фиг.1), что позволяет получать во втором раунде ПНР фрагменты другой длины и проводить гнездовой или полугнездовой ПНР анализ. Кроме того, праймер RBDV-CP-3 содержит сайт рестрикции Sal I, что позволяет проводить дополнительную оценку специфичности продуктов амплификации рестрикционным анализом.
Прямой праймер
Обратный праймер
Длина амплифицируемого фрагмента
RBDV-CP+2
RBDV-CP-2
706
RBDV-CP+2
RBDV-CP-3
426
RBDV-CP+3
RBDV-CP-2
653
RBDV-CP+3
RBDV-CP-3
374
Продемонстрирована высокая чувствительность метода: он позволяет обнаружить ВККМ в полевых растениях малины в течение всего периода вегетации в вегетативных и генеративных органах при выраженных и отсутствующих внешних симптомах заражения, а также в пробирочных растениях малины в процессе клепального микроразмножения.
Кроме того, разработаны условия ОТ-ПЦР с использованием ферментов и прибора для амплификации отечественного производства (Ампли или Терцик), что является важным обстоятельством, так как зарубежные наборы для ОТ-ПЦР чрезвычайно дорогостоящи.
Таким образом, заявляемый набор праймеров апробирован для индикации местных изолятов вируса ВККМ в тканях полевых и пробирочных растений малины и показал высокую чувствительность.
Пример 1. Методика выявления вируса ВККМ в пробах полевого растительного материала с помощью набора праймеров для ОТ-ПЦР.
Выделение тотальной РНК из листьев полевых растений и ягод ремонтантной малины гуанидин изогиоционат-фенол хлороформенным методом.
К 1000 мг растительной ткани (свежие и замороженные листья, ягоды, цветы, почки) добавляли 2 мл фенол-хлороформенной смеси, уравновешенной буфером (1:1, рН=8,8), 500 мкл 4% SDS в STE-буфере (содержащем меркаптоэтанол) и растирали при 4°С в стерильной фарфоровой чашке до образования гомогенной суспензии. Смесь переносили в центрифужную пробирку и добавляли 1000 мкл 2% SDS в STE-буфере (содержащем меркаптоэтанол), встяхивали на vortex. Центрифугировали при максимальной скорости (15000 об/мин) в течение 5 минут.
Снимали супернатант, содержащий неочищенную РНК, которую осаждали одним объемом изопропанола. выдерживая смесь 20 минут при -20°С. Центрифугировали при максимальной скорости в течение 5 минут до образования осадка РНК. Осадок промывали 70% спиртом и высушивали при +37°С.
Растворяли сухой осадок РНК в 500 мкл 4М гуанидин-изотиоционатного буфера (рН=8,8) и встряхивали на vortex. С целью осаждения нерастворяющихся примесей, центрифугировали при 13400 об/мин в течение 90 секунд. Снимали супернатант, содержащий неочищенную РНК, которую осаждали двумя объемами этанола, выдерживая смесь 20 минут при -20°С. Центрифугировали при максимальной скорости в течение 5 минут до образования осадка РНК. Осадок промывали 70% спиртом и высушивали при +37°С.
Растворяли сухой осадок РНК в 500 мкл 2% SDS в STE (с меркаптоэтанолом), встряхивая на vortex. Добавляли 500 мкл фенол-хлороформенной смеси (1:1, рН=8,8), vortex (30 с). Центрифугировали смесь (9500 об/с) в течение 1 минуты. Экстракцию повторяли 2-3 раза, пока интерфаза между слоями не исчезнет.
К супернатанту приливали 0,1 объем 3М ацетата натрия (рН 5.2) и 2 объема этанола для осаждения RNA. Выдерживали при -20°С 20 мин и центрифугировали при максимальной скорости 10 мин. Осадок промывали 70% спиртом и высушивали при +37°С, хранили под спиртом.
Проведение реакции обратной транскрипции
Смесь, содержащая РНК и праймер (обратный специфический или гексапраймер), подвергалась денатурации в течение 5 минут при +70°С. Оптимальное количество специфического прямого праймера для обратной транскрипции 15-20 пмолей, случайных гексапраймеров 0.5 мкг. Объем смеси не превышал 20 мкл. Отжиг праймеров проводился при температуре, рассчитанной для каждой пары в течение 10 минут. С целью уменьшения некомплементарного взаимодействия праймеров с РНК матрицей температура отжига предварительно немного повышалась (+55°С в течение 10 минут), для улучшения взаимодействия с комплементарными участками снижалась (+45°С). Температура отжига гексапраймеров +25°С (рекомендуемая «Силекс»).
4
2
4
2
Далее в реакционную смесь добавлялись M-MLV обратная транскриптаза (100 единиц), 2 мкл нуклеотидтрифосфатов (2.5 mM каждого), 2,5 мкл 10-кратного буфера. Буфер (х10) для ревертазы имел состав: 700 mM Трис-HCl, рН 8.3 / 25°С. 166 mM (NH)SO, 75 mM MgCl. Конечный объем составлял 25 мкл. Синтез кДНК осуществлялся в течение 1 часа при +37°С. После элонгации с целью инактивации фермента смесь выдерживалась в течение 5 минут при +70°С, замораживалась и хранилась при -20°С.
Проведение полимеразной цепной реакции.
4
2
4
2
Смесь, образовавшаяся в ходе обратной транскрипции и содержащая кДНК, вносилась в PCR-смесь, содержащую праймеры, 2,5 mM каждого нуклеозидтрифосфата, 2.5 единицы Taq-полимеразы и 2.5 мкл 10-кратного буфера для полимеразы. Состав буфера: 700 mM Трис-HCl, рН 8.6/25°С, 166 mM (NH)SO, 25 mM MgCl. Оптимальное количество каждого специфического праймера 50 пмолей. Конечный объем составлял 25 мкл. Для предотвращена испарения на смесь наслаивалось минеральное масло (равный объем).
Температурные условия для PCR. подобраны с учетом температуры отжига праймеров и длины амплифицируемого фрагменга. Для амплификации участка гена белка оболочки РНК-2 длиной 374 п.н. ограниченного последовательностями праймеров RBDV СР+З и RBDV-СР-3.
1. Предварительная денатурация 94°С - 3 мин
2. 30 циклов: Денатурация 94°С - 1 мин
Отжиг 50°С - 1 мин
Синтез 72°С - 1 мин
3. Заключительная элонгация - 3 мин
Для амплификации участка РНК-2 длиной 706 п.н. ограниченного последовательностями праймеров RBDV-CP+2 и RBDV-CP-2.
1. Предварительная денатурация 94°С - 3 мин
2. 10 циклов: Денатурация 94°С - 1 мин
Отжиг 50°С - 1 мин
Синтез 72°С - 1 мин
3. 30 циклов: Денатурация 94°С - 1 мин
Отжиг 45°С - 1 мин
Синтез 72°С - 1 мин
4. Заключительная элонгация - 3 мин.
Продукты RT-PCR подвергались гель-электрофорезу в 1,5-% агарозном геле, содержащем этидий бромид, и визуализировались на УФ-трансилюминаторе. В качестве маркера молекулярной массы использовалась ДНК плазмиды pUC-19, обработанная рестриктазой Msp I.
На фиг.2. показаны результаты анализа ВККМ в полевых растениях с помощью набора праймеров-олигонуклеотидов для ОТ-ПЦР.
Пример 2. Методика выявления вируса ВККМ в пробах растительного материала с помощью набора праймеров для ОТ-ПЦР.
Выделение тотальной РНК из растений малины, культивируемой in vitro, методом экстракции горячим фенолом.
100-150 мг свежего или замороженного растительного материала (свежие и замороженные листья, ягоды, цветы, почки) помещали в 1,5 мл пробирку эппендорф, которую предварительно замораживали в жидком азоте (ЖА). В пробирку добавляли немного ЖА, растирали пестиком, также замороженным в ЖА. Смешивали буфер для горячей экстракции (содержащий LiCl) с фенолом (без хлороформа) в соотношении 1:1 (конечный объем смеси 500 мкл), нагревали на водяной бане при +80°С.
В пробирку с гомогенатом добавляли 500 мкл горячей смеси буфер/фенол и пипетировали. Встряхивали на vortex 30 с добавляли 250 мкл хлороформа, затем vortex 15 с. Центрифугировали 5 мин при 13000 об/с. Супернатант переносили в новый эппендорф, добавляли 1 объем 4М LiCl, оставляли на ночь при +4°С.
2
Центрифугировали 10 мин при 13000 об/с. Осадок растворяли в 250 мкл HO, добавляли 0,1 объем 3М ацетата натрия (рН 5.2) и 2 объема этанола. Выдерживали при -20°С 20 мин, и центрифугировали при максимальной скорости 10 мин. Осадок растворяли в 500 мкл 70% этанола и ресуспендировали. Центрифугировали 10 мин, высушивали при +37°С. хранили под спиртом.
Проведение реакции обратной транскрипции и полимеразно-цепной реакции описано выше.
На фиг.3 показаны результаты анализа ВККМ в пробирочных растениях с помощью набора праймеров-олигонуклеотидов для ОТ-ПЦР.
Фиг.1. Схема расположения праймеров и амплифицируемых фрагментов в гене белка оболочки ВККМ.
Фиг.2. Результаты анализа ВККМ в полевых растениях.
Треки: 1, 15 - маркер молекулярных масс pUC-19/Msp I,
2, 3 - распускающиеся почки (праймеры +2, -2),
4, 5 - распускающиеся почки (праймеры +3, -3),
6, 7 - листья и ягоды полевых экземпляров (праймеры +2, -2),
8, 9 - листья и ягоды полевых экземпляров (праймеры +3, -3),
10, 11 - зима, покоящиеся почки (праймеры +2, -2),
12, 13 - зима, покоящиеся почки (праймеры +3, -3),
14 - отрицательный контроль.
Треки 5, 9, 13 - на стадии обратной транскрипции используется праймер - 2.
Фиг.3. Результаты анализа ВККМ растениях некоторых сортов и генотипов ремонтантной малины, размножаемых in vitro.
В опыте были использованы праймеры +3, -3.
Треки: 1, 13 - маркер молекулярной массы pUC-19/Msp I,
2-12 - растения разных сортов и генотипов, размножаемых in vitro,
12 - «отрицательный контроль».
Источники информации
1. Harri I. Kokko, Merja Kivineva and Sirpa O. Karenlampi. Single-Step Immunocapture RT-PCR in the Detection of Raspberry Bushy Dwarf Virus. // BioTechniques. - Vol.20, No.5. - 1996. - pp.842-846.
2. Mayo, MA., C.A. Jolly, A.F. Murant and J.H. Raschke. Nucleotide sequence of raspberry bushy dwarf virus RNA-3. // J. Gen. Virol. - 1991. V.72. - pp.469-472.
3. Патент 19) RU (11) 2209830 (13) C2. Петров B.C., Петрова И.Д., Тюнников Г.И., Серегин С.В., Яшина Л.Н., Кузина И.И. Набор олигонуклеотидов праймеров для идентификации РНК вируса крымской конго геморрагической лихорадки.