Спектрофотометрическое определение цефазолина в смешанной слюне практически здоровых лиц и больных с инфекционно-соматической патологией

Спектрофотометрическое определение цефазолина в смешанной слюне практически здоровых лиц и больных с инфекционно-соматической патологией

Е. Г. КУЛАПИНА1, А. И. БАРСУКОВА1, О. И. КУЛАПИНА2, И. А. УТЦ2

1 Кафедра аналитической химии и химической экологии

Саратовского государственного университета им. Н. Г. Чернышевского, Саратов

2 Кафедра детских болезней Саратовского государственного медицинского университета, Саратов

Spectrophotometric Determination of Cefazolin in Mixed Saliva of Practically Healthy Subjects and Patients with Infective Somatic Pathology

E. G. KULAPINA A I. BARSUKOVA, O. I. KULAPINA I. A UTS

Department of Analytical Chemistry and Chemical Ecology, after N. G.Chernyshevsky Saratov State University, Saratov Department of Children Diseases, Saratov State Medical University, Saratov

Методом УФ-спектроскопии изучено поведение цефазолина в водных и биологических средах во времени при варьировании концентрации антибиотика. Установлены диапазоны определяемых содержаний, пределы обнаружения цефазолина в жидкости ротовой полости. Разработана методика УФ-спектроскопического определения цефазолина в смешанной слюне больных с инфекцией мочевыводящих путей.

Ключевые слова: цефазолин, водные среды, смешанная слюна, УФ-спектроскопия.

The behaviour of cefazolin in aqueous and biological media with varying the antibiotic concentration was studied by UV-spec-troscopy. Range of the contents and the detection limits of cefazolin were determined. The proсedure of UV-spectroscopy of cefazolin in mixed saliva of patients with urinary tract infection was developed.

Key words: cefazolin, aqueous media, mixed saliva, UV-spectroscopy.

Введение

Цефалоспорины различаются по фармакокинетическим параметрам, по степени всасышания при разных путях введения, скорости наступления эффекта и длительности действия, а, следовательно, и необходимой частоте введения препарата, метаболизму и элиминации. Поэтому необходимо учитывать эти параметры при применении конкретного препарата.

Цефалоспорины, подобно пенициллинам, относятся к в-лактамным антибиотикам, но в основе их химического строения лежит 7-аминоцефалос-порановая кислота. Основными особенностями це-фалоспаринов по сравнению с пенициллинами является их большая резистентность по отношению к пенициллиназам — ферментам, вырабатываемым микроорганизмами и относительно быстро разрушающим пенициллины, а также более широкий спектр действия, включая влияние на грамотрица-тельные микроорганизмы [1, 2].

© Коллектив авторов, 2011

Адрес для корреспонденции: 117105 Москва, Нагатинская ул., д. 3а. Редакция журнала «Антибиотики и химиотерапия»

Цефалоспориновые антибиотики применяются в медицине около 40 лет. За это время синтезировано более 50 соединений этой группы. В основном — это препараты для парентерального применения, которые в настоящее время занимают ведущее место при лечении различныгх инфекций в стационаре.

Известно 4 поколения цефалоспоринов, отличающихся по структуре, спектру действия, антимикробной активности [3, 4].

Для определения цефалоспориновых антибиотиков в биологических средах в настоящее время применяют различные методы [5]. Цефазолин в биосредах определяют методами жидкостной хроматографии с УФ-детектиро-ванием [6, 7], масс-спектрометрии [8], потен-циометрии [9, 10].

В работе [9] при использовании спектрофотометрического метода бышо показано, что по оптической плотности различные серии цефазолина отличаются, что свидетельствует о неодинаковом содержании основного вещества в лекарственных препаратах.

Настоящее исследование посвящено разработке экспрессного спектрофотометрического метода определения содержания цефазолина в смешанной слюне (жидкости ротовой полости, ЖРП) практически здоровых лиц и больных с инфекцией мочевыводящих путей.

Материал и методы

В работе в качестве объекта исследования была выбрана смешанная слюна (жидкость ротовой полости). Жидкость полости рта реализует ионообменные реакции между различными зонами, тканями и органами. Сопоставление данных о концентрации лекарственных веществ в слюне и их свободной несвязанной фракции в плазме крови может позволить использовать в клинических и экспериментальных исследованиях фармакокинетики вместо проб крови более доступные пробы слюны [11—13].

Преимущества анализа слюны по сравнению с анализом крови заключаются в следующем: безболезненность взятия пробы, простота, удобство, отсутствие риска внесения инфекции, невозможность травмы кожи и стенки сосуда, адекватность концентрации вещества в полости рта фармакоте-рапевтическому эффекту. Концентрации антибиотиков в слюне в большинстве случаев в десятки раз ниже соответствующих концентраций в крови [11—13], вследствие чего для их определения необходим высокочувствительный количественный метод.

В работе использовались натриевые соли цефазолина (Cef) фармакопейной чистоты (ОАО «Синтез» г. Курган).

Исходные 1^10-2 М водные растворы цефазолина готовили по точным навескам препарата в дистиллированной воде, рабочие 1^10-2 — 1^10-6 М растворы получали последовательным разведением. Использовали свежеприготовленные растворы, так как антибиотик гидролизуется [3, 4]. В работе были исследованы водные растворы цефазолина и на фоне ЖРП.

Спектрофотометрические исследования проводились на спектрофотометре Shimadzu UV-1800, совмещённом с IBM PC, использовались кюветы из кварцевого стекла 1=1 см. Концентрацию цефазолина в смешанной слюне определяли способом градуировочного графика.

Для отделения белковых компонентов из смешанной слюны использовали центрифугу Wirowka MPW-6.

Правильность определения цефазолина в ЖРП контролировали методом ВЭЖХ. Снятие хроматограмм проводилось на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Стайер» (Аквилон, Россия) градиентном со спектрофотометрическим детектированием; рабочая длина волны 270 нм. Неподвижной фазой являлся силикагель С18, подвижной фазой являлась смесь: 0,1 М фосфатный буфер — ацетонитрил в соотношении 85:15.

Исследования проведены на здоровых пациентах (n=12, средний возраст 14+2 года). В подготовленные пробы смешанной слюны вводили стандартные растворы цефазолина, тщательно перемешивали и снимали спектры поглощения. Строили зависимости оптической плотности (А) от концентрации стандартных растворов антибиотиков. Для больных с инфекцией мочевыводящих путей (n=12, средний возраст 11+2 года) отбор проб жидкости ротовой полости проводили через 2—3 часа после внутримышечного введения 1,0 г цефазолина. Известно [14—16], что к этому моменту концентрация антибиотика достигает максимального значения. Определение проводили способом градуировочного графика. Статическую обработку проводили согласно [17].

Полученные данные были статистически обработаны с помощью программы EXCEL для персонального компьютера. Рассчитывались следующие статистические параметры: среднее арифметическое значение, стандартное

отклонение среднего результата, стандартная ошибка. Рассчитывались параметры линейной регрессии (коэффициенты а и Ь).

Методика спектрофотометрического определения цефазолина в смешанной слюне. Пробоподготовка ЖРП. Отбор проб смешанной слюны больных с инфекцией мочевыводящих путей осуществляли путем сплевывания ротовой жидкости в чистые сухие полиэтиленовые пробирки. Пробу отбирали спустя 1—2 часа после приёма пищи, перед сбором ротовую полость ополаскивали водой. Пробу ЖРП центрифугировали в течение 15 мин при 3500 об/мин.

Приготовление стандартного раствора цефазолина 0,5 мг/мл.

Для получения исходного раствора цефазолина навеску 0,025 г антибиотика переносили в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводили до метки дистиллированной водой, хорошо перемешивали (отбирали 2,5 мл исходного раствора цефазолина в мерную колбу вместимостью 25 мл, получали раствор с концентрацией 50 мкг/мл).

Построение градуировочного графика. Для приготовления серии растворов цефазолина на фоне ЖРП в кювету дозатором последовательно помещали 0,1; 0,2; 0,4; 0,5; 0,6; 0,8 мл антибиотика (с = 50 мкг/мл) и до 3 мл добавляли насадочной жидкости смешанной слюны. Концентрация цефазолина в ЖРП составляла с=2; 4; 6; 8; 10 мкг/мл. Растворы перемешивали и измеряли оптическую плотность относительно ЖРП (Я=266 нм).

Строили градуировочный график в координатах оптическая плотность — концентрация антибиотика, мкг/мл.

Снимали спектр поглощения проб смешанной слюны больныгх с инфекцией мочевыводящих путей, принимающих цефазолин. По градуировочному графику определяли концентрацию антибиотика.

Результаты и обсуждение

Цефалоспорины в растворённом состоянии, как и пенициллины, неустойчивы. Стабильность растворов цефалоспоринов зависит от таких факторов, как температура, pH раствора и пр. Ранее бышо установлено, что водные растворы цефалоспоринов устойчивы в течение суток: они подвержены гидролизу [3, 4].

В данной работе спектрофотометрическим методом быши исследованы водные растворы цефазолина при варьировании их концентрации; также проведено исследование цефазолина на фоне смешанной слюны.

Для спектров поглощения цефазолина на фоне ЖРП установлено наличие сдвига Атах в коротковолновую область спектра (Атах = 266 нм) и уменьшение Атах; Атах = 271 нм в водных средах (рис. 1, а, б).

Зависимости оптической плотности от концентрации водных растворов цефазолина и на фоне ЖРП линейны (у=0,027х+0,007 (а); у=0,027х-0,189 (б)), коэффициент корреляции практически равен 1, что свидетельствует о незначительном разбросе точек от усреднённой зависимости (рис. 2, а, б).

Диапазон определяемых содержаний цефазолина в водных растворах и в ЖРП составляет 2—40 мкг/мл, минимально определяемое содержание антибиотика составляет 2 мкг/мл.

Для изучения состояния водных растворов цефазолина во времени готовили серию рас-

А, нм

Рис. 1. Спектры поглощения.

а — свежеприготовленных растворов цефазолина различных концентраций, М: 1 • 10-6 (1), 2,5 • 10-5 (2), 5• 10-5(3); 1 • 10-4 (4); б —на фоне ЖРП С, М: 2,5• 10-6(1); 5 • 10-5 (2); 7,5 • 10-5 (3); 8,5 • 10-5 (4).

творов с концентрациями 5^10-6, 1 • 10-5,

2,5^10-5, 5 • 10-5 М путем последовательного разведения из исходного 1^10-2 М. Растворы не менялись на протяжении всего эксперимента, хранились при комнатной температуре в защищённом от света месте. На рис. 3 в качестве примера приведены спектры поглощения водного раствора цефазолина при различной длительности хранения.

На рис. 3 видно, что со временем наблюдается сдвиг max и уменьшение Amax — батохромный сдвиг и гипохромный эффект (AAmax = 0,28; Amax = 14 нм), что свидетельствует об изменении состояния антибиотика и его концентрации, обусловленных протеканием протолитических процессов. Состояние равновесия характеризуется изобестической точкой.

На рис. 4, а, б представлены зависимости оптической плотности цефазолина от времени для водных растворов (а) и на фоне ЖРП (б).

Наблюдается уменьшение оптической плотности водных растворов цефазолина при хране-

а

С, мкг/мл

С, мкг/мл

Рис. 2. Зависимость оптической плотности от концентрации водных растворов цефазолина (а) и растворов цефазолина на фоне ЖРП (б).

Рис. 3. Спектры поглощения водного раствора цефазолина (С=5*10-5 М; 11,9 мкг/мл) при различной длительности хранения.

1 — свежеприготовленный; 2 — 4 сут; 3 — 6 сут; 4 —11 сут; 5 —14 сут; 6 —19 сут.

Рис. 4. Изменения оптической плотности водного раствора цефазолина (С=20 мкг/мл) от времени (а) и на фоне ЖРП (С=4 мкг/мл) (б).

ЛИТЕРАТУРА

1. Яковлев В. П., Яковлев С. В. Рациональная антимикробная фармакотерапия. М.: Литтерра. 2007; 784.

2. Яковлев В. П., Яковлев С. В. Антибактериальные препараты: современное состояние и перспективы. Антибиотики и химиотер 2001; 46: 11: 19—22.

3. Егоров Н. С. Основы учения об антибиотиках. М.: Наука; 2004; 528.

4. Машковский М. Д. Лекарственные средства. М.: Новая волна; 2006; 1206.

5. Кулапина Е. Г., Баринова О. В., Кулапина О. И. и др. Современные методы определения антибиотиков в биологических и лекарственных средах. Антибиотики и химиотер 2009; 9—10: 53—60.

6. Bompadre S., Leone L, Ferrante L. et. al. Determination of cefazolin in human serum by high performance liquid chromatography with on-line solid phase extraction. J Liq Chromatogr and Relat Technol 1998; 21: 3: 417—426.

7. Соколова Л. И., Черняев А. П. Определение антибиотиков цефало-споринового ряда в биологических объектах методом обращено-фазовой ВЭЖХ. Хим-фарм журн 2002; 36: 5: 39—45.

8. Katami G, Low C. L,Valerie T. T. H. et. al. HPLC determination of cefazolin in plasma, urine and dialysis fluid. J Pharm and Pharmakol 1998; 50:118.

9. Кулапина О. И., Барагузина В. В., Скобликова Н. В. Определение цефазолина в биологических средах с применением ионоселективных электродов. Хим-фарм журн 2008; 42: 8: 41—44.

ним, особенно при высоких концентрациях (2,5*10-5, 5*10-5 М), а при низких концентрациях (5*10-6, 1*10-5 М) оптическая плотность практически не изменяется; на фоне ЖРП оптическая плотность оставалась практически постоянной в течение 5 ч, а затем резко уменьшалась.

Из литературы известно [14], что в зависимости от введённых количеств цефалоспоринов (0,25 и 1 г) в сыворотке крови методом ВЭЖХ обнаруживаются 30,2 и 70,75 мкг/мл через час и 6,9 и 41,1 мкг/мл через 12 часов соответственно. Полученные нами данные по интервалу определяемых концентраций и СтЬ позволяют рекомендовать спектроскопию в УФ области для определения антибиотиков цефалоспоринового ряда в биосредах (ЖРП).

Проведено определение цефазолина в смешанной слюне больных с инфекцией мочевыводящих путей. Снимали спектры поглощения цефазолина в ЖРП больных, содержание антибиотика определяли по градуировочному графику (рис. 2, б) определили содержание антибиотика. При внутримышечном введении 1,0 г цефазолина среднее значение концентрации в ЖРП составило (2,38 ± 0,9) мг/мл при индивидуальных колебаниях от 4,5 до 1,6 мкг/мл. Результаты подтверждены методом ВЭЖХ.

10. Kumar S., Kundu S., Pakshirajan К. et. al. Cephalosporins determination with a novel microbial biosensor based on permeabilized Pseudomonas aeruginosa. Appl Biochem Biotechnol 2008; 151: 2-3: 653—664.

11. Гаврилова О. А. Количественная характеристика физико-химических свойств ротовой жидкости у школьников. Стоматология 2004; 2: 54—56.

12. Лакин Е. М., Зорян Е. В., Кац М. М. и др. Определение содержания лекарственных веществ в слюне в клинических и экспериментальных исследованиях фармакокинетики. Фармакология и ток-сикол 1987; 50: 4: 93—100.

13. Стародубцев А. К.., Золкина И. В., Кондратенко С. Н. и др. Изучение фармакокинетики пентоксифиллина по динамике его распределения в крови и слюне здоровых добровольцев. Хим-фарм журн 2008; 42: 1: 3—5.

14. Ющенко О. М., Кабанова И. А., Лосева О. К. и др. Фармакокинетические характеристики и эффективность лечения цефтриаксоном больных вторичным и ранним скрытым сифилисом. Инфекция и антибиотикотер 2003; 5: 3: 40—46.

15. Яковлев С. В. Современное значение цефалоспоринов в стационаре. Росс мед журн. Антибиотики 2005; 13: 10: 25—29.

16. Лазарева Н. Б., Архипов В. В., Кукес В. Г. Фармакодинамика антибактериальных препаратов. Фармация 2006; 2: 49—59.

17. Платонов А. Е. Статистический анализ в медицине и биологические задачи. Термины, логика, компьютерные методы. М.: РАМН. 2000; 52.