Качественное и количественное определение сквалена в маслах и реакционных смесях методом ВЭЖХ

2. Машковский, М.Д. Лекарственные средства в 2-х т. М.: Издательство Новая Волна. 2002.

3. Регистр лекарственных средств России РЛС Энциклопедия лекарств. - 16 й вып. / гл. ред. Г. Л. Вышковский. - М.: «РЛС-2008», 2007. - 1456 с.

4. Государственная фармакопея СССР / Мин-во здравоохранения СССР. Изд.11. Вып.2. Москва, изд. “Медицина”. 1990.

УДК 543.544.5.068.7

Т. С. Терехова, А.В. Фурсова, Е.Н. Офицеров

Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия

КАЧЕСТВЕННОЕ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СКВАЛЕНА В МАСЛАХ И РЕАКЦИОННЫХ СМЕСЯХ МЕТОДОМ ВЭЖХ

Разработан метод качественного и количественного определения сквалена в масле амаранта, получаемого различными методами из семян, муки и жмыха растения. Проанализирована возможность использования данного метода для контроля реакций с участием сквалена.

The method of the qualitative and quantitative determination of squalene in amaranthus oil, derived by different methods from seeds, meal and mill cake of the plant, was developed. The opportunity of using this method for the squalene determination in different reaction mixtures was examined .

В последние 50 лет большое число работ посвящено природному высокоактивному соединению сквалену (2,6,10,15,19,23-гексаметилтетракоза-2,6,10,14,18,22-гексаен, рис. 1). Повышенный интерес к изопреноидной молекуле связан с широким спектром ее биологической активности. Сквален играет важную роль в организме человека: он является ключевым прекурсором в цепи биосинтеза холестерина [1], одним из основных компонентов липидов поверхности кожи, где на его долю приходится порядка 15% [2], обладает антиоксидантными [3],

иммуномодулирующими и ранозаживляющими свойствами [4], способствует интоксикации организма [5]. Есть некоторые предположения об участии продуктов трансформации сквалена в регуляции обмена йода в организме. Все это делает сквален ценным компонентом биологически активных добавок и косметических средств. Его используют в составе адъювантов вакцин, а также ведут активные поиски его биологически активных аналогов или производных с целью получения новых эффективных лекарственных средств для лечения таких заболеваний, как гиперхолестеринэмия (повышенный уровень содержания холестерина в крови), Acne vulgaris, атопические дерматиты и т.д. В последнее время крайне актуален вопрос повышения биологической доступности и получения наночастиц лекарственных средств при помощи сквалена и производных на его основе. В чистом виде сквален активно используют при лечении онкологических заболеваний [6]. Поэтому активно ведутся поиски новых природных источников сквалена и разрабатываются методы его выделения и анализа.

На сегодняшний день основным источником сквалена все еще является масло печени глубоководных акул. Учитывая мировую тенденцию к ограничению вылова морских животных, в скором времени такой способ получения сквалена окажется недопустимым. Альтернативными источниками являются растительные масла. Содержание сквалена в большинстве доступных масел очень низкое и не превышает 0,5%. От 10 до 30% его содержит дистиллят деодорирования оливкового масла, в дистилляте деодорированного соевого масла содержится около 3,5% этого вещества [7]. Самым перспективным источником является масло семян амаранта, содержание сквалена в котором колеблется в пределах от 2,4 до 8% [8-10]. В связи с этим разработка технологии сквалена из масла амаранта является на сегодняшний день достаточно актуальной проблемой. Все больше научных работ посвящено поиску оптимального метода извлечения масла амаранта из семян, включающих холодный отжим, экстракцию органическими растворителями и кукурузным маслом, получившую особую популярность в последнее время экстракцию сверхкритическими флюидами (СКФЭ).

С учетом того, что основная ценность масла заключается в высоком содержании в нем сквалена, необходим простой и удобный метод качественного и количественного определения содержания последнего в продукте. Это особенно важно, т.к. широкое распространение получают продукты экстракции кукурузными маслами, с крайне низким содержанием сквалена, выдаваемые, тем не менее, на рынке России, за чистое амарантовое масло.

Для определения следов сквалена был разработан сверхчувствительный метод ГХ-ХМ [11]. Это было сделано в связи с подозрением на то, что сквален, широко используемый в Европе в составе адъювантов вакцин, мог стать причиной появления в американских войсках, так называемого, «Синдрома войны в персидском заливе». Метод, дающий такой низкий предел обнаружения и обладающий рядом недостатков, связанных с его сложностью и дороговизной, не является необходимым и может использоваться лишь крайне редко.

Наиболее простым, удобным и не дорогостоящим методом определения качественного и количественного содержания компонентов в смеси является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Высокоэффективная жидкостная хроматография - один из самых простых и точных, а потому и самых употребляемых, способов качественного и количественного определения сквалена. Разработаны методы ВЭЖХ в различных матрицах с использованием С8 или С18 колонок. В качестве подвижных фаз используются метанол [12, 13], смесь метанола и ТГФ [14,15], ацетонитрил [16] и смесь метилтретбутиловый эфир:пропанол-2 в соотношении 80:20 [17].

Цель настоящего исследования - разработка простого, недорогого и удобного метода определения сквалена в пробах на основе ВЭЖХ. Это необходимо для контроля результатов работы по экстракции масла амаранта из жмыха методом СКФЭ и для контроля реакций по синтезу функциональных производных сквалена [18], проводимых нами.

Для построения градуировочной зависимости (табл. 1) использовали сквален марки Sigma (Австралия, 98%), дополнительно очищенный методом колоночной хроматографии. Анализ проводили на жидкостном микроколоночном хроматографе “МИЛИХРОМ А-02” (ЗАО "Институт хроматографии", г. Новосибирск) с УФ-детектором на длинах волн 210 и 220 нм при 40°С в течение 12 минут для каждой пробы при скорости прохождения подвижной фазы 200 мкл/мин. В качестве элюента использовали 100% ацетонитрил.

Для хроматографирования использовалась колонка с обращенной фазой (ProntoSil-120-5-C18 AQ Размер: 2.0х75 мм Зерно: 5.0 мкм). Полученные данные

обрабатывали в программе «Мультихром 9х» табличным методом внешнего стандарта.

Рис. 2. Хроматограмма раствора сквалена. По оси х объем элюента в микролитрах.

По оси у единицы оптической плотности

В результате процедуры градуировки по 7 точкам построена зависимость площади пика от концентрации сквалена (рис. 2) со средним относительным отклонением ±0,03. Градуировочная зависимость Q=0,01586A, где A - это площадь под пикома а Q - это концентрация в мг/мл; СКО = 2,5%, Коэффициент корреляции: 0,9995.

Таблица 1. Данные экспериментального определения сквалена

№ т. Концентрация, мг/мл Площадь пика Среднее значение Диспер- сия Абсолютное стандартное отклонение Относительное отклонение

1 2 3

1 1 192,9 192,6 190,9 192,13 1,16 1,08 0,01

2 0,8 146,2 150,2 151,6 149,33 7,85 2,80 0,02

3 0,6 112,3 111,9 113 112,40 0,31 0,56 0,00

4 0,4 73,58 73,58 71,55 72,90 1,37 1,17 0,02

5 0,2 37,34 38,56 38,8 38,23 0,61 0,78 0,02

6 0,1 15,54 16,88 19,59 17,34 4,26 2,06 0,12

7 0,01 1,804 1,96 1,943 1,90 0,01 0,09 0,04

Как мы видим, градуировка соответствует линейной зависимости, как и предполагалось. Для проверки градуировки была приготовлена проба заранее известной концентрации (0,88 мг/мл). Найдены концентрации 0,88 мг/мл, 0,89 мг/мл и 0,9 мг/мл. Значения должны укладываться в интервал 0,88±0,03 т. е. от 0,85 до 0,91. Это доказывает, что измерение с помощью градуировки дает результат с погрешностью ±3%.

Разработанный метод качественного и количественного определения сквалена может с успехом применяться для определения сквалена в различных экстрактах, в том числе и в экстрактах муки, семян жмыха амаранта и для контроля реакций с его участием. С помощью разработанного метода определено содержание сквалена в СО2 экстрактах муки амаранта. Концентрация сквалена в анализируемой пробе составила 0,06мг/мл. С учетом погрешности прибора 0,06±0,002. Следовательно, концентрация сквалена в экстракционном масле лежит в пределах 11,64-12,4%.

А

Рис. 2 График градуировочной зависимости площади под пиком от концентрации сквалена

Рис. 4 Хроматограмма реакционной смеси эпоксидирования сквалена

В настоящее время активно синтезируются производные сквалена, используемые в качестве ингибиторов сквален-гопен циклазы и 2,3-оксидоскваленциклазы [19], для получения наночастиц и для увеличения биодоступности лекарственных средств с противораковой активностью. Данный метод позволяет успешно идентифицировать сквален и определять его концентрацию в реакционных смесях при получении бромгидринов и эпоксидов сквалена.

Пример количественного анализа полученной нами реакционной смеси синтеза 2,3-оксидосквалена (рис. 5) представлен на рис. 4. В данном случае в результате анализа показано, что в реакционной смеси концентрация сквалена составляет 21%, т.е. степень его трансформации составила 79%.

Рис. 5. Схема реакции эпоксидирования сквалена

С помощью метода ВЭЖХ, описанного в статье была определена концентрация сквалена в масле, полученном методом экстракции сверхкритическими флюидами CO2 и в реакционной смеси. Содержание сквалена составляет 12 и 18%, это высокий показатель для масла, что свидетельствует о селективности метода СКФЭ. Полученные данные не противоречат ранним исследованиям амарантового масла.

Таким образом, ВЭЖХ рекционных смесей с учасьтием сквалена и масла амаранта на микроколоночном хроматографе «Милихром-А02» позволяет определять содержание сквалена с погрешностью 3% в диапазоне конценьтраций от 0,01 до 1 мг/мл.

Библиографический список

1.Squalene Recovery from Olive Oil Deodorizer Distillates/ Paolo Bondioli, Carlo Mariani, Armando Lanzani, Enzo Fedeli and Adam Muller// J.Am. Oil Chem. Soc.- 1993.-V. 70, No 8.- P.-763-766.

2.Де Люка Кьяра// Сквален как акцептор прооксидантных воздействий на кожу: Диссертация на соискание уч. степени канд. биол. наук.- М.- 2002. - 110 с.

3.M. K. Govind Rao, K. T. Acaya / Antioxidant Activity of Squalene// J. Am. Oil Chem. Soc.-1967,- V. 45, No 4.

4. The Endogenous Adjuvant Squalene Can Induce a Chronic T-Cell-Mediated Arthritis in Rats/ Barbro C[a o]//Am. J. Patbiol, - 2000,-V. 156. No 6,-P- 2057-2065.

5. Enhanced elimination of theophylline, Phenobarbital and strychnine from the bodies of rats and mice by squalene treatment/ Kamimura H.//J. Pharmacoboidyn.,-1992,- V. 15.-P-215-221.

6. Desai K.N., Wei H., Lamartiniere C.A. The preventive and therapeutic potential of the squalene-containing compound. Roidex on tumor promotion and regression// Cancer Lett,-1996,-V. 101.-P- 93-96.

7. Separation of tocopherols from deodorizer condensates by countercurrent extraction with carbon dioxide, J. supercrit/ Brunner G[a o]// Fluids- 1991.-V. 4.-P.- 72-80.

8.Lehmann J.W. Case history of grain amaranth as an alternative crop//Cereal Foods World-1996.- V. 41. 399-411.

9.Wild Amaranthus caudatus seed oil, a nutraceutical resource from Ecuadorian flora/ Bruni R[a o]// J. Agric. Food Chem-2001.-V. 49.-P.- 5455-5460.

10. Determination of lycopene, a-carotene and P-carotene in serum by liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry with selected-ionmonitoring/ Hagiwara T., Yasuno T., Funayama F., Sukeji S./ / J Chromatogr. - 1998.-V. 708.-P- 67-73.

11.J. W. Ralls, B. Riegel/ Preparation of Modified Squalenes // J. Am. Chem. Soc.-1955,- V. 77(22),-P-6073 -6075.

12. Development and application of an analytical method for the determination of squalene in formulations of anthrax vaccine adsorbed/ R. J. Spanggord, B. Wu, M. Sun, P. Lim, W. Y. Ellis// J. Pharm.Biomed. Anal.- 2002,-V. 29.-P-183-193.

13. Solid phase extraction in the analysis of squalene and tocopherols in olive oil/D. Grigoriadoua, A. Androulaki, E. Psomiadoub, M.Z. Tsimidou//Food Chemistry-2007,-V. 105.-P.- 675-680.

14. Sulpice J. C., Ferezou J./ Squalene isolation by HPLC and quantitative comparison by HPLC and GLC//Lipids- 1984.-V. 19.-P- 631-635.

15. A Simplified Squalene Epoxidase Assay Based on an HPLC Separation and Time-Dependent UV. Visible Determination of Squalene /Grieveson L., Ono T., Sakakibara J., Derrick J., Dickinson J., McMahon A., Higson S./ /Anal. Biochem.- 1997.-V. 252.-P- 19-23.

16. Ronald J /Development and application of an analytical method for the determination of squalene in formulations of anthrax vaccine adsorbed/ / J. of Pharm. Biomed. Anal. -2002,V. 29.-P- 183-193.

17. Enhancement of an analytical method for the determination of squalene in anthrax vaccine adsorbed formulations / R. J. Spanggorda,, M. Suna, P. Lima, W. Y. Ellisb // J. Pharm. Biomed. Anal. - 2006, - V. 42. - P - 494-499.

18.Фурсова А.В., Офицеров Е.Н/ К синтезу ингибиторов 1,2-оксидоскваленэпоксидазы на основе сквалена реакцией Михаэлиса-Беккера// Бутлеровские сообщения.- 2011, т.25, №7, стр. 76-80.

19. Фурсова А.В., Офицеров Е.Н/ Ингибирование биосинтеза и метаболизма сквалена//Бутлеровские сообщения.-2011, т. 25, №7, стр. 50-75

УДК 547.835.5:54.03

Яр Зар Хтун, Т.Н. Кудрявцева

Курский государственный университет, Курск, Россия

РОЛЬ УЛЬТРАЗВУКОВОГО ИЗЛУЧЕНИЯ В СИНТЕЗЕ ДИФЕНИЛАМИН-2-КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ И АКРИДОНОВ

Исследованы синтез дифениламин-2-карбоновых кислот и их циклизация в акридоны в условиях ультразвукового излучения. Определены кинетические параметры циклизации и показано, что применение ультразвукового излучения приводит к снижению энергии активации.

The synthesis of diphenylamine-2-carboxylic acids and their cyclization under the conditions of ultrasonic radiation are investigated. The kinetic parameters of cyclization were determinated. It is set that application of ultrasonic radiation assists the decline of energy of activating of reaction.

Поиск и разработка новых энергосберегающих, экономичных и экологически безопасных химико-технологических процессов является одной из важнейших задач. В связи с этим поиск новых путей активации химических реакций приобретает большое значение. В частности, значительный интерес проявляется к химическим реакциям, протекающим в условиях ультразвукового излучения (УЗИ).

Применение таких методов может сопровождаться протеканием побочных реакций и приводить к образованию примесей, отсутствующих в продуктах, полученных традиционными способами. Это особенно важно для синтеза биологически