СПОСОБЫ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
METHODS FOR PREDICTING PROSTATE CANCER

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способам мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или статуса прогрессирования рака предстательной железы, где указанный способ позволяет определять статус рака предстательной железы на основании уровня экспрессии вариантов фосфодиэстеразы 4D (PDE4D). Изобретение также относится к способу идентификации индивидуума, подходящего для получения терапии рака предстательной железы. Изобретение также относится к продуктам, используемым для анализа вариантов фосфодиэстеразы 4D (PDE4D), а также к фармацевтическим композициям, модулирующим активность и/или экспрессию вариантов PDE4D.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Рак представляет собой класс заболеваний, при которых группа клеток начинает неконтролируемо расти, проникать в другие органы и иногда метастазировать. Три указанные характеристики злокачественности отличают раковые заболевания от доброкачественных опухолей, которые являются самоограничивающимися, не проникают в другие органы и не метастазируют.
Рак предстательной железы (PCa) является наиболее распространенной злокачественной опухолью отличного от кожи органа у мужчин, причем в 2008 году во всем мире диагностировано 900000 новых случаев. Вследствие старения населения заболеваемость PCa резко возрастет в ближайшие годы. Рутинная диагностика посредством определения в крови уровня простат-специфического антигена (ПСА), цифрового ректального исследования (DRE) и трансректального ультразвукового анализа (TRUS) позволяет в первую очередь диагностировать нераковые доброкачественные состояния простаты: примерно 1 миллион биопсий простаты, ежегодно проводимых только в США, позволяют выявить 250000 новых случаев, причем примерно 75% биопсийных анализов проводят при отсутствии необходимости, а указанные анализы могут вызывать существенные осложнения (уросепсис, кровотечения, задержку мочеиспускания) у пациентов и имеют общую стоимость >2 млрд долларов США (одна процедура биопсии стоит ~2100 долларов США). По меньшей мере 4 из 100 мужчин с отрицательной биопсией с большой вероятностью будут госпитализированы вследствие побочных эффектов, а 9 из 10000 пациентов, подвергавшихся биопсии, могут умереть в результате применяемой в настоящее время процедуры.
Примерно из 250000 случаев PCa, диагностируемых в США ежегодно, примерно 200000 изначально характеризуются как локализованные заболевания, то есть как рак, ограниченный органом простаты. Данное состояние в некоторой степени излечивается с помощью первичной терапии, такой как лучевая терапия или, предпочтительно, частичное или полное удаление предстательной железы хирургическим путем (простатэктомия). Однако указанные вмешательства обычно сопровождаются серьезными побочными эффектами, такими как недержание мочи и/или эректильные дисфункции, которые являются часто встречающимися последствиями простатэктомии. У 50% мужчин, подвергшихся радикальной простатэктомии, развивается недержание мочи. Исследования демонстрируют, что через год после операции от 15 до 50% мужчин все еще сообщают о таких проблемах. Проблемы с эрекцией также являются серьезными побочными эффектами радикальной простатэктомии (RP). Примерно только у половины оперированных мужчин частично восстанавливается способность к эрекции. Кроме того, все обычно используемые способы лечения локализованного PCa являются дорогостоящими (как правило, они стоят порядка 20-30000 долларов США) и прямые ежегодные затраты на них в США в общей сложности составляют 5 млрд долларов США.
В Соединенных Штатах среди ~200000 мужчин с клинически локализованным заболеванием на момент постановки диагноза до 50% имеют очень низкий или низкий риск развития рака. Соответственно, в NCCN (Национальная всеобщая онкологическая сеть) недавно было исправлено руководство по лечению PCa с целью расширения активного надзора (AS) в качестве бережной и удобной альтернативы лечения пациентов с таким низким уровнем риска развития заболевания. У соответствующих пациентов, подвергающихся AS, качество жизни значительно улучшается по сравнению с мужчинами, прошедшими первичное лечение, а стоимость AS в течение 5 лет составляет менее 10000 долларов США на пациента.
Более того, если в качестве способа лечения конкретного пациента выбирают хирургическое вмешательство (вместо AS), AS имеет большое значение для стратификации по степени хирургического вмешательства в зависимости от потенциальной агрессивности опухоли пациента. Например, нервосберегающую технику операции можно более широко применять для мужчин с низким риском развития заболевания, чтобы минимизировать побочные эффекты радикальной простатэктомии, связанные с потенцией. Подобным образом, согласно последним рекомендациям Европейской ассоциации урологов (EAU) по раку простаты, при высоком риске развития рака рекомендуется расширенная диссекция лимфатических узлов, несмотря на то, что эта процедура является сложной, времязатратной и сопровождается повышенной встречаемостью осложнений по сравнению с более ограниченными процедурами. Следовательно, поскольку показано, что при более ограниченной диссекции лимфатических узлов пропускают примерно 50% метастазов в лимфатические узлы, для лечения мужчин с локализованным раком предстательной железы требуется высокоточное дооперационное прогнозирование степени агрессивности опухоли индивидуума, чтобы обеспечить наиболее оптимальный уход за каждым пациентом.
WO 2010/131194 A1 раскрывает способ диагностики или обнаружения злокачественного, гормоночувствительного рака предстательной железы, включающий стадию определения уровня экспрессии варианта фосфодиэстеразы 4D, PDE4D7. В данном документе также раскрывается способ применения индекса PDE, позволяющий эффективно отличать доброкачественные заболевания от злокачественных, в котором экспрессию PDE4D7 нормализуют против PDE4D5, используемого в качестве внутреннего контроля.
В WO 2010/131195 A1 описан способ диагностики гормонорезистентного и гормоночувствительного рака предстательной железы, включающий стадию определения уровня экспрессии PDE4D7. Уровень экспрессии PDE4D7 нормализуют по контрольному гену, в качестве которого можно использовать PDE4D5.
British Journal of Cancer
В статье "The cAMP phosphodiesterase-4D7 (PDE4D7) is downregulated in androgen-independent prostate cancer cells and mediates proliferation by compartmentalizing cAMP at the plasma membrane of VCaP prostate cancer cells", Henderson et al. , Volume 110, Number 5, pages 1278-1287, (2014), приводятся данные, свидетельствующие о том, что PDE4D7 экспрессируется на высоком уровне в андрогеночувствительных клетках рака предстательной железы, но подвергается значительной понижающей регуляции в андрогенонечувствительных клетках рака предстательной железы, позволяя предположить, что PDE4D7 можно использовать в качестве биомаркера андрогенонечувствительного рака предстательной железы, а также в способах лечения.
В EP 1471153 A2 описан анализ транскрипционной активности, в котором биологическую активность соединения определяют путем анализа его способности модулировать экспрессию гена. Возможные продукты экспрессии целевого гена включают изоферменты PDE4D. Соединения, идентифицированные в описанных скринингах, могут представлять собой антитела, которые можно использовать в качестве терапевтических средств для лечения, например, рака молочной железы.
WO 2010/059838 A2 относится к ингибиторам фосфодиэстеразы-4 (PDE4) и их применению в способах лечения и профилактики инсульта, инфаркта миокарда, сердечно-сосудистых воспалительных заболеваний и расстройств, а также расстройств центральной нервной системы.
WO 2004/090157 A1 раскрывает применение PDE4D, в частности PDE4D5 или PDE4D7, в качестве мишени для идентификации соединений, которые можно использовать для лечения атеросклероза или рестеноза.
В US 2003/220273 A1 описаны антисмысловые соединения, композиции и способы модуляции экспрессии фосфодиэстеразы 4D, а также применение указанных соединений для лечения заболеваний, связанных с экспрессией фосфодиэстеразы 4D.
Cellular Signalling
В статье "Roles of цАМФ and цАМФ-dependent protein kinase in the progression of рака простаты: Cross-talk with the androgen receptor", Merkle and Hoffmann, , Volume 23, Number 3, pages 507-515, (2011), описано исследование роли цАМФ и цАМФ-зависимой протеинкиназы в прогрессировании рака предстательной железы. В данном исследовании установлено, что экспрессия PDE4D повышается в раковых тканях.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к идентификации и применению профилей экспрессии, сигнатур или образцов представляющих интерес генов биомаркеров (также называемых маркерными генами), обладающих клинической значимостью в отношении рака предстательной железы. В частности, изобретение основано на анализе экспрессии генов нуклеиновых кислот, предпочтительно транскриптов генов биомаркеров, полученных из биологических образцов. В частности, анализ экспрессии этих маркерных генов используется для определения индекса PDE рака простаты (PDE-индекс), указывающего на статус прогрессирования рака предстательной железы.
Таким образом, PDE-индекс является очень полезным параметром для персонализированной медицины, относящимся к прогнозированию и лечению пациентов с раком предстательной железы. PDE-индекс можно использовать отдельно или в сочетании с другими средствами и методами, которые предоставляют информацию о персональном статусе заболевания пациента или стадии заболевания.
Врачи и/или патологоанатомы могут успешно использовать индекс PDE для подтверждения результатов, полученных с помощью других методов диагностирования, идентификации, прогнозирования пациентов. Таким образом, способы и средства, предлагаемые изобретением, помогают улучшить результаты прогнозирования и т.д., чтобы найти наилучший способ лечения пациента и избежать ненужной операции или других способов лечения, опасных вследствие побочных эффектов, иногда лишних и приводящих к огромным расходам в системе здравоохранения.
Один из аспектов изобретения относится к способу, включающему стадию:
a) определения статуса прогрессирования рака предстательной железы на основе профиля экспрессии генов, включающего уровень экспрессии по меньшей мере двух вариантов фосфодиэстеразы 4D ( PDE4D), выбранных из группы, состоящей из PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 и PDE4D9, где ни один из вариантов PDE4D не используют в качестве стандартного гена.
Другой аспект изобретения относится к способу, включающему стадию:
a) определения наличия или отсутствия гибридного гена TMPRSS2-ERG или уровня экспрессии фактора транскрипции ERG на основе профиля экспрессии генов, включающего уровень экспрессии, по меньшей мере, двух вариантов фосфодиэстеразы 4D (PDE4D), выбранных из группы, состоящей из PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 и PDE4D9, где ни один из вариантов PDE4D не используют в качестве стандартного гена.
В некоторых вариантах осуществления любого из вышеуказанных аспектов профиль экспрессии генов преобразуют, по меньшей мере, в один индекс PDE рака простаты (PDE-индекс), указывающий на статус прогрессирования рака предстательной железы. PDE-индекс позволяет успешно устанавливать прогноз рака простаты, или имеет хорошую эффективность при клинических применениях, как описано в настоящем документе.
Варианты PDE4D, не используемые в качестве стандартного гена, позволяют успешно устанавливать прогноз рака простаты, или имеют хорошую эффективность при клинических применениях, как описано в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления варианты PDE4D выбирают из группы, состоящей из PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8 и PDE4D9. Выбранные гены позволяют успешно устанавливать прогноз рака простаты, или имеют хорошую эффективность при клинических применениях, как описано в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления профиль экспрессии генов представляет собой профиль экспрессии генов в образце, предпочтительно в образце, полученном от индивидуума.
В некоторых вариантах осуществления профиль экспрессии генов является нормализованным профилем экспрессии генов, который получают путем нормализации уровня экспрессии вариантов PDE4D по экспрессии по меньшей мере одного стандартного гена, причем способ необязательно включает перед нормализацией стадию определения уровня экспрессии по меньшей мере одного стандартного гена в образце.
В некоторых вариантах осуществления описанные здесь способы включают способ мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы, или статуса прогрессирования рака предстательной железы.
В некоторых вариантах осуществления описанные здесь способы дополнительно включают идентификацию индивидуума, как подходящего для получения терапии рака предстательной железы, где индекс PDE индивидуума указывает на наличие рака предстательной железы, или где индекс PDE индивидуума позволяет определить статус рака предстательной железы как непрогрессирующего или прогрессирующего заболевания.
В некоторых вариантах осуществления описанные здесь способы дополнительно включают лечение индивидуума, подходящего для получения терапии рака предстательной железы.
В некоторых вариантах осуществления описанные здесь способы дополнительно включают перед стадией a) стадию определения в образце уровня экспрессии по меньшей мере двух вариантов фосфодиэстеразы 4D (PDE4D), выбранных из группы, состоящей из PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 и PDE4D9, с получением профиля экспрессии генов. В одном варианте осуществления вариант PDE4D выбирают из группы, состоящей из PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8 и PDE4D9.
В следующем варианте осуществления рак предстательной железы имеет статус непрогрессирующего или прогрессирующего заболевания.
В одном варианте осуществления одновременно определяют уровень экспрессии обоих вариантов PDE4D1 и PDE4D2.
В другом варианте осуществления варианты PDE4D выбирают из группы, включающей PDE4D5, PDE4D7 и PDE4D9, предпочтительно PDE4D1, PDE4D2, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D7 и PDE4D9.
В одном варианте осуществления на стадии (a) определяют уровень экспрессии по меньшей мере трех вариантов PDE4D.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один PDE-индекс выбирают из нижеследующих:
i) PDE-индекс_1:
PDE4D7_exp - PDE4D5_exp
ii) PDE-индекс_2:
Среднее(PDE4D7_exp и PDE4D5_exp)
iii) PDE-индекс_3:
(Среднее(PDE4D5_exp, PDE4D7_exp и PDE4D9_exp))/(PDE4D4_exp)
iv) PDE-индекс_4:
(Среднее(PDE4D5_exp, PDE4D7_exp и PDE4D9_exp))/(PDE4D1 и PDE4D2_exp)
v) PDE-индекс_5:
(Среднее(PDE4D5_exp, PDE4D7_exp и PDE4D9_exp))
PDE-индекс позволяет успешно устанавливать прогноз рака простаты, или имеет хорошую эффективность при клинических применениях, как описано в настоящем документе.
Кроме того, PDE-индекс_1 можно определять для того, чтобы отличить нераковую простату от раковой простаты.
В другом варианте осуществления, по меньшей мере, один из PDE-индекса_2, PDE-индекса_3, PDE-индекса_4 и PDE-индекса_5 используют для того, чтобы отличить непрогрессирующий рак предстательной железы от прогрессирующего, где значение PDE-индекса_2, PDE-индекса_3, PDE-индекса_4 или PDE-индекса_5, превышающее предопределенное пороговое значение, указывает на непрогрессирующий статус рака предстательной железы, и/или значение PDE-индекса_2, PDE-индекса_3, PDE-индекса_4 или PDE-иднекса_5, находящееся ниже предопределенного порогового значения, указывает на прогрессирующий статус рака предстательной железы.
В следующем варианте осуществления определяют присутствие гибридного гена TMPRSS2-ERG, где способ проводят с использованием образцов, положительных по гибридному гену TMPRSS2-ERG.
В одном варианте осуществления определение уровня экспрессии на стадии (a) проводят, или дополнительно проводят, путем измерения уровня нуклеиновой кислоты или белка, или путем определения биологической активности варианта PDE4D.
В одном варианте осуществления определение уровня экспрессии стандартного гена проводят, или дополнительно проводят, путем измерения уровня нуклеиновой кислоты или белка, или путем определения биологической активности по меньшей мере одного стандартного гена.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один стандартный ген представляет собой ген домашнего хозяйства, предпочтительно TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALPHA-1 (=TUBA1B) или ALAS-1.
В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец ткани, образец мочи, образец осадка мочи, образец крови, образец слюны, образец спермы, образец, содержащий присутствующие в кровотоке опухолевые клетки, образец, содержащий экзосомы, секретируемые простатой, или клеточные линии или линии раковых клеток.
В другом варианте осуществления описанные здесь способы включают дополнительную стадию определения оценки pGleason и/или стадии pT.
В другом варианте осуществления уровень экспрессии гена определяют путем детектирования экспрессии мРНК с использованием одного или нескольких зондов и/или одного или нескольких наборов зондов.
В следующем варианте осуществления уровень экспрессии гена определяют методом, основанным на амплификации, и/или путем анализа с использованием микрочипов и/или секвенирования РНК.
В другом варианте осуществления уровень экспрессии гена определяют методом секвенирования РНК, ПЦР, количественной ПЦР или мультиплексной ПЦР.
В конкретном варианте осуществления индивидуума определяют как подходящего для получения терапии рака предстательной железы, выбранный из хирургии простаты, удаления простаты, химиотерапии, лучевой терапии, ограниченной или расширенной диссекции лимфатических узлов, если PDE-индекс полученного от индивидуума образца указывает на прогрессирующий статус рака предстательной железы.
В следующем варианте осуществления на стадии (c) индивидуума идентифицируют как подходящего для активного наблюдения в качестве терапии рака простаты, если PDE-индекс в образце индивидуума указывает на непрогрессирующий статус рака предстательной железы.
Следующий аспект изобретения относится к продукту, содержащему:
праймеры и/или зонды для определения уровня экспрессии по меньшей мере двух вариантов фосфодиэстеразы 4D (PDE4D), выбранных из группы, состоящей из PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 и PDE4D9;
дополнительно содержащему праймеры и/или зонды для определения уровня экспрессии стандартного гена, предпочтительно гена домашнего хозяйства, более предпочтительно TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALPHA-1 или ALAS-1.
Продукт обеспечивает основу или входные данные, используемые для проведения описанных здесь способов, которые, в свою очередь, обеспечивают успешное установление прогноза рака простаты, или имеет хорошую эффективность при клинических применениях, как описано в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления продукт представляет собой набор, такой как набор для ПЦР, набор для секвенирования РНК или набор для анализа с использованием микрочипов. В другом варианте осуществления продукт представляет собой микрочип. Продукт обеспечивает эффективный способ получения требуемых уровней экспрессии.
В некоторых вариантах осуществления продукт можно использовать при проведении любого из способов, или продукт представляет собой продукт, который можно использовать для мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или статуса прогрессирования рака предстательной железы, или для идентификации индивидуума, подходящего для получения терапии рака предстательной железы.
В некоторых вариантах осуществления продукт представляет собой композицию, содержащую набор молекул нуклеиновых кислот, каждая из которых содержит по меньшей мере две последовательности олигонуклеотидных зондов для анализа экспрессии генов вариантов PDE4D, PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 и PDE4D9, и содержащую по меньшей мере одну последовательность олигонуклеотидного зонда для анализа экспрессии контрольных генов, выбранных из TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALPHA-1 (TUBA1B) или ALAS-1.
В некоторых вариантах осуществления продукт представляет собой нуклеотидный массив, содержащий один или несколько олигонуклеотидных зондов, комплементарных и способных гибридизоваться с кодирующей последовательностью по меньшей мере двух вариантов PDE4D, PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 и PDE4D9, и содержащий один или несколько олигонуклеотидных зондов, комплементарных и способных гибридизоваться по меньшей мере с одним из стандартных генов, выбранных из TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALPHA-1 (TUBA1B) или ALAS-1 для определения PDE-индекса по любому из предшествующих пунктов.
В некоторых вариантах осуществления продукт представляет собой набор для мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или статуса прогрессирования рака предстательной железы с целью идентификации индивидуума, подходящего для получения терапии рака предстательной железы, содержащий: a) определенный выше массив, b) контрольный набор; и c) необязательные инструкции по применению.
Другой аспект изобретения относится к компьютеризованному способу мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или статуса прогрессирования рака предстательной железы, где указанный способ включает стадии, описанные в настоящем документе.
Следующий аспект изобретения относится к компьютерному программному продукту, содержащему машиночитаемый код, хранящийся на машиночитаемом носителе или загружаемый из коммуникационной сети, который при использовании на компьютере выполняет одну или несколько стадий, или все стадии любого из описанных здесь способов.
Следующий аспект изобретения относится к энергонезависимому машиночитаемому носителю данных, на котором хранится исполняемая программа, где программа дает команду микропроцессору выполнить одну или несколько стадий одного из описанных здесь способов.
Следующий аспект изобретения относится к системе, содержащей описанный здесь продукт и описанный здесь компьютерный программный продукт или энергонезависимый машиночитаемый носитель данных.
Следующий аспект изобретения относится к стимуляторной фармацевтической композиции для применения в способе лечения или профилактики рака предстательной железы, которая содержит по меньшей мере один элемент, выбранный из следующей группы:
(а) соединение, непосредственно стимулирующее или модулирующее активность варианта PDE4D, выбранного из группы, состоящей из PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8, PDE4D9, предпочтительно аллостерический агонист ферментативной активности;
(b) соединение, косвенно стимулирующее или модулирующее активность варианта PDE4D по пункту (а);
(c) белок варианта PDE4D по пункту (a) или его биологически активный эквивалент;
(d) нуклеиновая кислота, кодирующая и экспрессирующая вариант PDE4D по пункту (a);
(e) ингибитор микроРНК, специфичный для микроРНК варианта PDE4D по пункту (a);
(f) деметилирующее средство; и
(g) фактор, замещающий фосфодиэстеразу, предпочтительно пептид, пептидомиметик, небольшая молекула, антитело или аптамер,
где вариант PDE4D предпочтительно выбран из группы, состоящей из PDE4D5, PDE4D8, PDE4D9.
Другой аспект изобретения относится к ингибиторной фармацевтической композиции для применения в способе лечения или профилактики рака предстательной железы, которая содержит по меньшей мере один элемент, выбранный из следующей группы:
(а) соединение, непосредственно ингибирующее активность варианта PDE4D, выбранного из группы, состоящей из PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8, PDE4D9,
(b) соединение, косвенно ингибирующее активность варианта PDE4D по пункту (a);
(c) доминантно-негативная форма белка варианта PDE4D по пункту (a) или ее биологически активный эквивалент;
(d) нуклеиновая кислота, кодирующая и экспрессирующая доминантно-негативную форму варианта PDE4D по пункту (a);
(e) микроРНК, специфичная для варианта PDE4D по пункту (a);
(f) антисмысловая молекула варианта PDE4D по пункту (a);
(g) киРНК, специфичная для варианта PDE4D по пункту (a);
(h) аптамер, специфичный для продукта экспрессии варианта PDE4D по пункту (a) или для белка варианта PDE4D по пункту (a);
(i) небольшая молекула или пептидомиметик, способный специфически связываться с белком варианта PDE4D по пункту (a); и
(j) антитело, специфичное для белка варианта PDE4D по пункту (a) и/или вариант антитела, специфичного для белка варианта PDE4D по пункту (a),
где вариант PDE4D предпочтительно выбран из группы, состоящей из PDE4D5, PDE4D8, PDE4D9.
Описанные здесь фармацевтические композиции обеспечивают эффективный подход к лечению ряда типов рака предстательной железы.
В некоторых вариантах осуществления вариант PDE4D выбирают из группы, состоящей из PDE4D5, PDE4D8, PDE4D9.
В некоторых вариантах осуществления стимуляторная или ингибиторная фармацевтическая композиция предназначена для лечения рака предстательной железы, где композицию вводят индивидууму в зависимости от PDE-индекса, свидетельствующего о статусе прогрессирования рака предстательной железы.
В некоторых вариантах осуществления стимуляторная или ингибиторная фармацевтическая композиция предназначена для лечения рака предстательной железы, где композицию вводит индивидууму, и где PDE-индекс образца, полученного от индивидуума, свидетельствует о прогрессирующем статусе рака предстательной железы.
В некоторых вариантах осуществления стимуляторная или ингибиторная фармацевтическая композиция предназначена для лечения рака предстательной железы, где по меньшей один из PDE-индекса_2, PDE-индекса_3, PDE-индекса_4 или PDE-индекса_5 в полученном от индивидуума образце находится ниже предопределенного порога.
Следующий аспект изобретения относится к способу лечения индивидуума, страдающего от рака предстательной железы, где способ включает
(i) выбор индивидуума, страдающего от рака предстательной железы, если PDE-индекс в полученном от индивидуума образце свидетельствует о прогрессирующем статусе рака предстательной железы, и
(ii) введение описанной здесь стимуляторной или ингибиторной фармацевтической композиции выбранному индивидууму.
Указанный способ обеспечивает эффективный подход к лечению ряда типов рака предстательной железы.
В некоторых вариантах осуществления способ включает :
(i) выбор индивидуума, страдающего от рака предстательной железы, если по меньшей мере один из PDE-индекса_2, PDE-индекса_3, PDE-индекса_4 или PDE-индекса_5 в полученном от индивидуума образце находится ниже предопределенного порога, и
(ii) введение описанной здесь стимуляторной или ингибиторной фармацевтической композиции выбранному индивидууму.
Следующий аспект изобретения относится к варианту PDE4D, выбранному из группы, включающей PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8 и PDE4D9, который можно использовать в качестве маркера при определении статуса прогрессирования рака предстательной железы.
Другой аспект изобретения относится к применению варианта PDE4D, выбранного из группы, состоящей из PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8 и PDE4D9, в способе мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или статуса прогрессирования рака предстательной железы.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг.1 показаны наборы зондов Affymetrix Human Exon 1.0 ST Array, содержащие стандартные генные последовательности NCBI, и номера доступа к белковым последовательностям NCPI соответствующих вариантов PDE4D, а также последовательности праймеров и зондов, специфичных для вариантов PDE4D.
На фиг.2 перечислены стандартные гены, ID их транскриптов и ID белков, а также последовательности праймеров и зондов, специфичных для стандартных генов.
На фиг.3 показана эффективность применения PDE4D1 - PDE4D9 и PDE-индекса_1 - PDE-индекса_5 в способе определения нераковой ткани, непрогрессирующего и прогрессирующего рака предстательной железы.
На фиг.4 показаны результаты определения эффективности PDE4D1 - PDE4D9 и PDE-индекса_1 - PDE-индекса_5 в способе различения нераковой ткани и непрогрессирующего рака предстательной железы.
На фиг.5 показаны результаты определения эффективности PDE-индекса_1. Всего рассмотрено восемь групп данных по раку предстательной железы, полученных с использованием в общей сложности >900 образцов пациентов, относящихся к категориям нормальной соседней ткани, доброкачественного поражения, доброкачественной гиперплазии, а также опухолевой ткани.
На фиг.6 показаны результаты определения эффективности PDE-индекса_2, PDE-индекса_3, PDE-индекса_4 и PDE-индекса_5, используемых для различения образцов с непрогрессирующей и прогрессирующей опухолью простаты.
На фиг.7 показаны результаты определения эффективности PDE4D1 - PDE4D9 и PDE-индекса_1 - PDE-индекса_5, используемых для различения образцов нераковой ткани и непрогрессирующей опухоли простаты.
На фиг.8 показана корреляция PDE4D1 - PDE4D9 и PDE-индекса_1 - PDE-индекса_5 с оценкой патологических изменений при раке простаты по Глиссону.
На фиг.9 приведен обзор полезности применения PDE4D1 - PDE4D9 и PDE-индекса_1 - PDE-индекса_5 в дополнение к клиническим данным о выживании в отсутствии прогрессирования в зависимости от статуса опухоли, определяемого гибридом TMPRSS2-ERG.
На фиг.10 показана нормализованная экспрессия PDE4D1/2, PDE4D3, PDE4D4 и PDE4D5 в тканях рака предстательной железы шести разных типов в наборе данных Taylor et al., Integrative Genome Profiling of Human Рака простаты, Cancer Cell 18, 11-22, 2010 (GSE21034 (NCBI GEO)).
На фиг.11 показана нормализованная экспрессия PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 и PDE4D9 в тканях рака предстательной железы шести разных типов в наборе данных Taylor et al., Integrative Genome Profiling of Human Рака простаты, Cancer Cell 18, 11-22, 2010 (GSE21034 (NCBI GEO)).
На фиг.12 показана нормализованная экспрессия PDE4D1/2, PDE4D3, PDE4D4 и PDE4D5 в тканях рака предстательной железы шести разных типов в наборе данных Boormans et al., Identification of TDRD1 as a direct target gene of ERG in primary рака простаты, Int J Cancer 2013 Jul 15; 133(2):335-45 (GSE41410 (NCBI GEO)).
На фиг.13 показана нормализованная экспрессия PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 и PDE4D9 в тканях рака предстательной железы шести разных типов в наборе данных Boormans et al., Identification of TDRD1 as a direct target gene of ERG in primary рака простаты, Int J Cancer 2013 Jul 15; 133(2):335-45 (GSE41410 (NCBI GEO)).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Хотя настоящее изобретение описывается с использованием конкретных вариантов осуществления, указанное описание не следует истолковывать как ограничивающее.
Перед подробным описанием иллюстративных вариантов осуществления настоящего изобретения приведены определения, имеющие важное значение для понимания изобретения.
Если контекст явно не указывает иное, в данном описании и в прилагаемой формуле изобретения единственная форма также включает множественную форму соответствующего термина.
В контексте настоящего изобретения термины "примерно" и "приблизительно" относятся к интервалу точности, который по мнению специалиста в данной области техники еще обеспечивает технический эффект рассматриваемого объекта. Данные термины обычно включают отклонение от указанного численного значения на ±20%, предпочтительно на ±15%, более предпочтительно на ±10% и еще более предпочтительно на ±5%.
Следует понимать, что термин "содержащий" не является ограничивающим. В целях настоящего изобретения термин "состоящий из" считается предпочтительным вариантом термина "содержащий". Если далее группу определяют как содержащую, по меньшей мере, некоторое число вариантов осуществления, такое определение также относится к группе, которая предпочтительно состоит только из указанных вариантов осуществления.
Кроме того, термины "первый", "второй", "третий" или "(а)", "(b)", "(с)", "(d)" и т.п. в описании и формуле изобретения используются для различения похожих элементов и необязательно для описания последовательного или хронологического порядка. Следует понимать, что используемые таким образом термины являются взаимозаменяемыми в соответствующих обстоятельствах, и что при выполнении описанных здесь вариантов осуществления изобретения можно использовать последовательность операций, отличную от описанной или проиллюстрированной в настоящем документе.
Если термины "первый", "второй", "третий" или "(а)", "(b)", "(с)", "(d)" и т.п. относятся к стадиям способа или применения, согласованность стадий по времени или по временным интервалам отсутствует, то есть стадии можно проводить одновременно или с интервалами времени, которые могут длиться минуты, часы, дни, недели, месяцы или даже годы, если в заявке не указано иное выше или ниже. Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается описанными здесь конкретными методологиями, протоколами, белками, бактериями, векторами, реагентами и т.д., поскольку они могут варьировать. Также следует понимать, что используемая здесь терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который ограничивается только прилагаемой формулой изобретения. Если не указано иное, все используемые здесь технические и научные термины имеют традиционные значения, известные специалистам в данной области техники.
Один из аспектов изобретения относится к способу, включающему стадию:
а) определения статуса прогрессирования рака предстательной железы на основе профиля экспрессии генов, включающего уровень экспрессии по меньшей мере двух вариантов фосфодиэстеразы 4D (PDE4D), выбранных из группы, состоящей из PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 и PDE4D9, где ни один из вариантов PDE4D не используют в качестве стандартного гена.
Другой аспект изобретения относится к способу, включающему стадию:
а) определения наличия или отсутствия гибридного гена TMPRSS2-ERG или уровня экспрессии фактора транскрипции ERG на основе профиля экспрессии генов, включающего уровень экспрессии, по меньшей мере, двух вариантов фосфодиэстеразы 4D (PDE4D), выбранных из группы, состоящей из PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 и PDE4D9, где ни один из вариантов PDE4D не используют в качестве стандартного гена.
Термин "транскрипционный вариант PDE4D", или "изоформа PDE4D", или "вариант PDE4D" относится к любому из сплайсинг-вариантов фосфодиэстеразы PDE4D, то есть гена человеческой фосфодиэстеразы PDE4D, такому как PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 и PDE4D9.
Термины "маркер", "маркерный ген", "GOI" или "маркер варианта PDE4D", которые могут использоваться как взаимозаменяемые, относятся к гену, генетическому элементу или генетической последовательности (нуклеотидной последовательности или аминокислотной или белковой последовательности), как определено выше, уровень экспрессии которых увеличивается или уменьшается в злокачественной или доброкачественной клетке, или в ткани рака предстательной железы, или в образце любого типа, содержащем такие клетки или ткани, или их части или фрагменты, по сравнению с контрольным уровнем, предпочтительно по сравнению с уровнем экспрессии в нормальной ткани. Данный термин также относится к любому продукту экспрессии указанного генетического элемента или генетической последовательности, в частности к транскрипту мРНК варианта PDE4D, полипептиду или белку, кодируемому транскриптом варианта PDE4D, или их фрагментам, а также к их гомологичным производным, как описано выше. В частности, термины "маркер", "маркерный ген", "GOI" или "маркер варианта PDE4D" относятся к любому из сплайсинг-вариантов человеческой фосфодиэстеразы PDE4D, то есть гена человеческой фосфодиэстеразы PDE4D, такому как PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 и PDE4D9.
Термин "фосфодиэстераза 4D1" или "PDE4D1" относится к сплайсинг-варианту 1 человеческой фосфодиэстеразы PDE4D, то есть к гену человеческой фосфодиэстеразы PDE4D1, предпочтительно к последовательности, определенной в NCBI как стандартная последовательность: NM_001197222.1, более предпочтительно к нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, соответствующей вышеуказанной стандартной последовательности NCBI транскрипта PDE4D1, кроме того, данный термин относится к соответствующей аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 2, которая соответствует белковой последовательности, определенной как стандартная белковая последовательность NCBI NP_001184151.1, в которой зашифрован полипептид PDE4D1. Термин "фосфодиэстераза 4D1" или "PDE4D1" также относится к ампликону, который можно получить с использованием пары праймеров PDE1D1D2_прямой (SEQ ID NO: 20) и PDE1D1D2_обратный (SEQ ID NO: 21) и обнаружить с помощью зонда SEQ ID NO: 22.
Термин "фосфодиэстераза 4D2" или "PDE4D2" относится к сплайсинг-варианту 2 человеческой фосфодиэстеразы PDE4D, то есть к гену человеческой фосфодиэстеразы PDE4D2, предпочтительно к последовательности, определенной в NCBI как стандартная последовательность: NM_001197221.1, более предпочтительно к нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 3, соответствующей вышеуказанной стандартной последовательности NCBI транскрипта PDE4D2, кроме того, данный термин относится к соответствующей аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 4, которая соответствует белковой последовательности, определенной как стандартная белковая последовательность NCBI NP_001184150.1, в которой зашифрован полипептид PDE4D2. Термин "фосфодиэстераза 4D2" или "PDE4D2" также относится к ампликону, который можно получить с использованием пары праймеров PDE1D1D2_прямой (SEQ ID NO: 20) и PDE1D1D2_обратный (SEQ ID NO: 21) и обнаружить с помощью зонда SEQ ID NO: 22.
Термин "фосфодиэстераза 4D3" или "PDE4D3" относится к сплайсинг-варианту 3 человеческой фосфодиэстеразы PDE4D, то есть к гену человеческой фосфодиэстеразы PDE4D3, предпочтительно к последовательности, определенной в NCBI как стандартная последовательность: NM_006203.4, более предпочтительно к нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 5, соответствующей вышеуказанной стандартной последовательности NCBI транскрипта PDE4D3, кроме того, данный термин относится к соответствующей аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 6, которая соответствует белковой последовательности, определенной как стандартная белковая последовательность NCBI NP_006194.2, в которой зашифрован полипептид PDE4D3.
Термин "фосфодиэстераза 4D4" или "PDE4D4" относится к сплайсинг-варианту 4 человеческой фосфодиэстеразы PDE4D, то есть к гену человеческой фосфодиэстеразы PDE4D4, предпочтительно к последовательности, определенной в NCBI как стандартная последовательность: NM_001104631.1, более предпочтительно к нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 7, соответствующей вышеуказанной стандартной последовательности NCBI транскрипта PDE4D4, кроме того, данный термин относится к соответствующей аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 8, которая соответствует белковой последовательности, определенной как стандартная белковая последовательность NCBI NP_001098101.1, в которой зашифрован полипептид PDE4D4.
Термин "фосфодиэстераза 4D5" или "PDE4D5" относится к сплайсинг-варианту 5 человеческой фосфодиэстеразы PDE4D, то есть к гену человеческой фосфодиэстеразы PDE4D5, предпочтительно к последовательности, определенной в NCBI как стандартная последовательность: NM_001197218.1, более предпочтительно к нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 9, соответствующей вышеуказанной стандартной последовательности NCBI транскрипта PDE4D5, кроме того, данный термин относится к соответствующей аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 10, которая соответствует белковой последовательности, определенной как стандартная белковая последовательность NCBI NP_001184147.1, в которой зашифрован полипептид PDE4D5. Термин "фосфодиэстераза 4D5" или "PDE4D5" также относится к ампликону, который можно получить с использованием пары праймеров PDE1D5_прямой (SEQ ID NO: 23) и PDE1D5_обратный (SEQ ID NO: 24) и обнаружить с помощью зонда SEQ ID NO: 25.
Термин "фосфодиэстераза 4D6" или "PDE4D6" относится к сплайсинг-варианту 6 человеческой фосфодиэстеразы PDE4D, то есть к гену человеческой фосфодиэстеразы PDE4D6, предпочтительно к последовательности, определенной в NCBI как стандартная последовательность: NM_001197223.1, более предпочтительно к нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 11, соответствующей вышеуказанной стандартной последовательности NCBI транскрипта PDE4D6, кроме того, данный термин относится к соответствующей аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 12, которая соответствует белковой последовательности, определенной как стандартная белковая последовательность NCBI NP_001184152.1, в которой зашифрован полипептид PDE4D6.
Термин "фосфодиэстераза 4D7" или "PDE4D7" относится к сплайсинг-варианту 7 человеческой фосфодиэстеразы PDE4D, то есть к гену человеческой фосфодиэстеразы PDE4D7, предпочтительно к последовательности, определенной в NCBI как стандартная последовательность: NM_001165899.1, более предпочтительно к нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 13, соответствующей вышеуказанной стандартной последовательности NCBI транскрипта PDE4D7, кроме того, данный термин относится к соответствующей аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 14, которая соответствует белковой последовательности, определенной как стандартная белковая последовательность NCBI NP_001159371.1, в которой зашифрован полипептид PDE4D7. Термин "фосфодиэстераза 4D7" или "PDE4D7" также относится к ампликону, который можно получить с использованием пары праймеров PDE1D7_прямой (SEQ ID NO: 26) и PDE1D7_обратный (SEQ ID NO: 27) и обнаружить с помощью зонда SEQ ID NO: 28.
Термин "фосфодиэстераза 4D8" или "PDE4D8" относится к сплайсинг-варианту 8 человеческой фосфодиэстеразы PDE4D, то есть к гену человеческой фосфодиэстеразы PDE4D8, предпочтительно к последовательности, определенной в NCBI как стандартная последовательность: NM_001197219.1, более предпочтительно к нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 15, соответствующей вышеуказанной стандартной последовательности NCBI транскрипта PDE4D8, кроме того, данный термин относится к соответствующей аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 16, которая соответствует белковой последовательности, определенной как стандартная белковая последовательность NCBI NP_001184148.1, в которой зашифрован полипептид PDE4D8.
Термин "фосфодиэстераза 4D9" или "PDE4D9" относится к сплайсинг-варианту 9 человеческой фосфодиэстеразы PDE4D, то есть к гену человеческой фосфодиэстеразы PDE4D9, предпочтительно к последовательности, определенной в NCBI как стандартная последовательность: NM_001197220.1, более предпочтительно к нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 17, соответствующей вышеуказанной стандартной последовательности NCBI транскрипта PDE4D9, кроме того, данный термин относится к соответствующей аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 18, которая соответствует белковой последовательности, определенной как стандартная белковая последовательность NCBI NP_001184149.1, в которой зашифрован полипептид PDE4D9. Термин "фосфодиэстераза 4D9" или "PDE4D9" также относится к ампликону, который можно получить с использованием пары праймеров PDE1D9_прямой (SEQ ID NO: 29) и PDE1D9_обратный (SEQ ID NO: 30) и обнаружить с помощью зонда SEQ ID NO: 31.
Термины "PDE4D1", "PDE4D2", "PDE4D3", "PDE4D4", "PDE4D5", "PDE4D6", "PDE4D7", "PDE4D8" и "PDE4D9" также относятся к нуклеотидным последовательностям, обладающим высокой степенью гомологии по отношению к последовательностям PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 и PDE4D9 соответственно, например, к нуклеотидным последовательностям, по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичным последовательностям, описанным в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 или 17 соответственно, или к аминокислотным последовательностям, по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичным последовательностям, описанным в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 или 18 соответственно, или к нуклеотидным последовательностям, кодирующим аминокислотные последовательности, по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичные последовательностям, описанным в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 или 18, или к аминокислотным последовательностям, кодируемым нуклеотидными последовательностями, по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичными последовательностям, описанным в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 или 17.
Используемый здесь термин "уровень экспрессии" относится к количеству транскрипта варианта PDE4D и/или белка PDE4D, которое определяют в конкретном числе клеток или в конкретной части ткани, предпочтительно к количеству транскрипта варианта PDE4D и/или белка варианта PDE4D, полученному с помощью стандартного метода экстракции нуклеиновых кислот (например, РНК) или белков. Специалистам в данной области известны подходящие методы экстракции.
Термин "контрольный уровень" (или "контрольный статус") в настоящем описании относится к уровню экспрессии, который определяют одновременно с уровнем в тестируемом образце, и/или в условиях, аналогичных или сопоставимых с условиями анализа тестируемого образца, например, путем использования (а) образца (образцов), ранее полученных от индивидуума/индивидуумов с известным статусом состояния или заболевания, таким как нераковая, нормальная или доброкачественная опухоль простаты, запущенный рак предстательной железы и т.д., и находившихся на хранении. Термин "статус заболевания" или "статус ракового заболевания" относится к любому статусу или типу клеточного или молекулярного состояния, от неракового статуса клеток до (включая его) терминального статуса раковых клеток. Предпочтительно этот термин включает разные стадии или уровни пролиферации/развития раковой опухоли в организме от (исключая его) неракового статуса клеток до (включая его) терминального статуса раковых клеток. Такие стадии развития могут включать все стадии системы классификации TNM (опухоль, узел, метастаз) злокачественных опухолей, в соответствии с определением UICC, например, стадии 0 и I-IV. Данный термин также включает стадии, предшествующие стадии TNM 0, например, стадии развития, на которых наблюдается изменение экспрессии или характера экспрессии раковых биомаркеров, известных специалистам в данной области.
Указанный выше уровень экспрессии предпочтительно представляет собой уровень экспрессии вариантов PDE4D, как описано ранее в настоящем документе. Альтернативно или дополнительно уровень экспрессии также может представлять собой уровень экспрессии любого другого подходящего гена или генетического элемента, экспрессируемого в клетке, например, уровень экспрессии гена домашнего хозяйства или уровень экспрессии сочетания генов домашнего хозяйства, таких как TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALPHA-1 (=TUBA1B) или ALAS-1. В предпочтительном варианте осуществления уровень экспрессии определяют для сочетания стандартных генов.
В другом предпочтительном варианте осуществления сочетание стандартных генов включает TBP, HPRT1 и по меньшей мере один, по меньшей мере два или по меньшей мере три дополнительных стандартных гена, выбранных из группы, содержащей ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALPHA-1 или ALAS -1.
В другом предпочтительном варианте осуществления сочетание стандартных генов включает TBP, HPRT1 и по меньшей мере два дополнительных стандартных гена, выбранных из группы, содержащей ACTB, RPLP0, PUM1, K-ALPHA-1 или ALAS-1.
Особенно предпочтительное сочетание включает TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0. Другое особенно предпочтительное сочетание включает TBP, HPRT1, PUM1, K-ALPHA-1, ALAS-1.
Термин "раковый" в контексте настоящего изобретения относится к раковому статусу заболевания, описанному в настоящем документе.
Термин "нераковый" в контексте настоящего изобретения относится к состоянию, при котором не детектируется ни доброкачественная, ни злокачественная пролиферация. Подходящие способы такой детекции известны в данной области техники.
Предпочтительным контрольным уровнем в контексте настоящего изобретения является уровень экспрессии варианта PDE4D в нормальной, то есть здоровой или нераковой ткани, или уровень экспрессии варианта PDE4D в ткани доброкачественной опухоли простаты. Термин "доброкачественная опухоль предстательной железы" в данном документе относится к опухоли предстательной железы, в которой отсутствуют все три показателя злокачественности, а именно неограниченный агрессивный рост, способность прорастать в окружающие ткани и способность метастазировать. Как правило, доброкачественная опухоль простаты представляет собой легкую и непрогрессирующую болезнь предстательной железы, связанную с новообразованием или опуханием, не обладающую инвазивными свойствами рака. Кроме того, доброкачественные опухоли предстательной железы обычно инкапсулируются, что препятствует появлению у них злокачественных признаков. Доброкачественную опухоль или здоровое состояние можно диагностировать с помощью любого подходящего независимого молекулярного, гистологического или физиологического анализа, известного специалистам в данной области.
Более предпочтительный контрольный уровень в контексте настоящего изобретения представляет собой уровень экспрессии варианта PDE4D в нормальной, то есть здоровой или нераковой ткани, или уровень экспрессия варианта PDE4D в ткани непрогрессирующей опухоли предстательной железы.
Контрольный уровень экспрессии можно определить статистическим методом, основанным на результатах, полученных путем анализа ранее определенного уровня (уровней) экспрессии маркерного гена (маркерных генов) настоящего изобретения в образцах пациентов с известным статусом заболевания. Кроме того, контрольный уровень можно определить с использованием базы данных, содержащей сведения о характерах экспрессии или уровнях экспрессии, полученные ранее при тестировании пациентов, тканей или клеток. Контрольный уровень можно определить в стандартном образце, полученном от пациента, у которого диагностирован рак предстательной железы, такой как гормононезависимый или гормонорезистентный рак предстательной железы. Кроме того, уровень экспрессии маркерных генов настоящего изобретения в тестируемом биологическом образце можно сравнить с несколькими контрольными уровнями, где указанные контрольные уровни определяют, используя несколько стандартных образцов. Можно использовать контрольный уровень, определенный в стандартном образце, полученном из ткани того же типа, что и биологический образец пациента. Особенно предпочтительно использовать образец (образцы), полученный от пациента со злокачественным заболеванием, описанным выше.
Альтернативно стандартные образцы могут содержать материал, полученный из клеточных линий, таких как линии иммортализованных раковых клеток, или они могут быть получены из тканевых ксенотрансплантатов. Предпочтительно стандартный образец настоящего изобретения содержит материал, полученный из линий клеток рака простаты, или материал, полученный из ксенотрансплантатов ткани человеческой простаты, такой как ткань доброкачественной и опухолевой простаты человека. Примеры предпочтительных линий раковых клеток включают линии клеток PC346P, PC346B, LNCaP, VCaP, DuCaP, PC346C, PC3, DU145, PC346CDD, PC346Flu1, PC346Flu2. Примеры предпочтительных ксенотрансплантатов включают PC295, PC310, PC-EW, PC82, PC133, PC135, PC324 и PC374. Предпочтительно используют всю панель клеточных линий и ксенотрансплантатов, например, человеческую панель PC346.
В другой предпочтительной альтернативе стандартные образцы могут быть получены из тканей пациента или панелей тканей или коллекций тканей, полученных в клинических условиях. Образцы можно получить, например, от пациентов мужского пола, перенесших операцию. Образцы можно получить из любой подходящей ткани, например, из ткани предстательной железы или лимфатических узлов. Предпочтительные примеры коллекций тканей пациентов получают при проведении хирургических процедур (таких как простатэктомия).
Кроме того, предпочтительно использовать стандартное значение уровня экспрессии маркера варианта PDE4D настоящего изобретения в популяции с известным статусом заболевания, такой как популяция с непрогрессирующей опухолью предстательной железы, или здоровая популяция. Стандартное значение можно получить с помощью любого известного в данной области способа. Например, в качестве стандартного значения можно использовать диапазон среднее значение ±2SD (стандартное отклонение) или среднее значение ±3SD.
Кроме того, контрольный уровень также можно определять одновременно с уровнем в тестируемом образце, и/или в условиях, аналогичных или сопоставимых с условиями анализа тестируемого образца, путем использования (а) образца (образцов), ранее полученных от индивидуума/индивидуумов с известным раковым статусом заболевания, то есть, от индивидуумов, у которых был диагностирован рак простаты, в частности злокачественный, гормональночувствительный рак простаты, и находящихся на хранении.
В контексте настоящего изобретения контрольный уровень, определенный в биологическом образце, который заведомо не является раковым, таком как образец здоровой ткани или образец непрогрессирующей опухоли простаты, называют "нормальным контрольным уровнем".
Если контрольный уровень определяют в раковом биологическом образце, таком как образец, полученный от индивидуума с независимо диагностированным гормонорезистентным раком, его можно назвать "раковый контрольный уровень".
Термин "рак предстательной железы" относится к раку предстательной железы мужской репродуктивной системе, который возникает, когда клетки предстательной железы мутируют и начинают бесконтрольно размножаться. Как правило, рак предстательной железы связан с повышенным уровнем простат-специфического антигена (PSA). В одном варианте осуществления настоящего изобретения термин "рак простаты" относится к раку, характеризующемуся уровнем PSA выше 4,0. В другом варианте осуществления этот термин относится к раку, характеризующемуся уровнем PSA выше 2,0. Термин "уровень PSA" относится к концентрации PSA в крови в нг/мл.
Термин "непрогрессирующий статус рака предстательной железы" означает, что значения параметров в образце индивидуума не указывают на "биохимический рецидив" и/или "клинический рецидив".
Термин "прогрессирующий статус рака предстательной железы" означает, что значения параметров в образце индивидуума указывают на "биохимический рецидив" и/или "клинический рецидив".
В контексте настоящей заявки выражение "биохимический рецидив" относится, например, к повторяющимся биологическим показателям, таким как повышенный уровень PSA, указывающим на присутствие клеток рака предстательной железы в образце. Однако можно использовать и другие маркеры, которые могут свидетельствовать о присутствия или о вероятности такого присутствия.
В контексте настоящей заявки термин "клинический рецидив" относится к наличию клинических признаков, указывающих на присутствие опухолевых клеток, которые можно измерить, например, путем визуализации in vivo.
Термины "повышенный", или "повышенный уровень экспрессии", или "повышающая регуляция уровня экспрессии", или "повышение уровня экспрессии" (которые могут использоваться как синонимы) в контексте настоящего изобретения относятся к повышению уровня экспрессии при сравнении значений уровня экспрессии в разных подлежащих анализу образцах, например, при сравнении значения уровня в образце пациента и контрольного значения, которое может представлять собой либо значение нормального контрольного уровня, либо значение ракового контрольного уровня, определенное для любой подходящей опухоли предстательной железы или стадии рака, известной специалисту в данной области. Уровни экспрессии считают "повышенными", если экспрессия гена варианта PDE4D, например, в образце, подлежащем анализу, увеличивается, например, на 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% или более чем на 50% по сравнению с контрольным уровнем, или по меньшей мере в 0,1 раза, по меньшей мере в 0,2 раза, по меньшей мере в 1 раз, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 10 раз или более по сравнению с контрольным уровнем. Контрольный уровень может представлять собой либо нормальный контрольный уровень, либо раковый контрольный уровень, как определено выше. При проведении сравнения с раковым контрольным уровнем предпочтительно дополнительно провести сравнение с нормальным контрольным уровнем. Такое дополнительное сравнение позволяет определить тенденцию изменения, например, оно позволяет наблюдать значение увеличения уровня экспрессии и/или сделать соответствующие выводы. Предпочтительно проводить сравнение с доброкачественной опухолью предстательной железы, или со здоровой тканью, или с образцом, полученным от здорового индивидуума.
В следующем варианте осуществления дополнительное сходство общих характеров экспрессии гена в образце, полученном от индивидуума, и в контрольном образце, определенном выше, который является раковым, указывает на то, что индивидуум страдает от рака предстательной железы. В другом варианте осуществления настоящего изобретения диагностика может сочетаться с определением уровней экспрессии других раковых биомаркеров, в частности биомаркеров рака предстательной железы. Подходящие биомаркеры, в частности биомаркер рака предстательной железы, известны специалистам в данной области. Например, можно тестировать экспрессию таких биомаркеров, как PSA.
Злокачественный, гормоночувствительный рак предстательной железы можно считать диагностированным, если уровень экспрессии маркера варианта PDE4D настоящего изобретения увеличивается по сравнению с нормальным контрольным уровнем, как определено выше.
На наличие прогрессирующего рака может указывать уменьшение определенного выше уровня экспрессии PDE4D1 в тестируемом образце на величину, составляющую от 20 до 80%, предпочтительно на величину, составляющую 30, 40, 50, 60 или 70%, по сравнению с контрольным уровнем. Контрольный уровень может представлять собой либо нормальный контрольный уровень, либо раковый контрольный уровень, как определено выше. В особенно предпочтительном варианте осуществления на наличие прогрессирующего рака предстательной железы может указывать уменьшение определенного выше уровня экспрессии PDE4D1 в тестируемом образце в 1,5-10 раз, предпочтительно в 2-3 раза по сравнению с нормальным контрольным уровнем, например, в здоровой ткани или непрогрессирующей опухоли предстательной железы.
На наличие прогрессирующего рака может указывать уменьшение определенного выше уровня экспрессии PDE4D2 в тестируемом образце на величину, составляющую от 20 до 80%, предпочтительно на величину, составляющую 30, 40, 50, 60 или 70%, по сравнению с контрольным уровнем. Контрольный уровень может представлять собой либо нормальный контрольный уровень, либо раковый контрольный уровень, как определено выше. В особенно предпочтительном варианте осуществления прогрессирующий рак предстательной железы может считаться диагностированным, если определенный выше уровень экспрессии PDE4D2 уменьшается в тестируемом образце в 1,5-10 раз, предпочтительно в 2-5 раз по сравнению с нормальным контрольным уровнем, например, в здоровой ткани или непрогрессирующей опухоли предстательной железы.
На наличие прогрессирующего рака может указывать уменьшение определенного выше уровня экспрессии PDE4D3 в тестируемом образце на величину, составляющую от 20 до 80%, предпочтительно на величину, составляющую 30, 40, 50, 60 или 70%, по сравнению с контрольным уровнем. Контрольный уровень может представлять собой либо нормальный контрольный уровень, либо раковый контрольный уровень, как определено выше. В особенно предпочтительном варианте осуществления на наличие прогрессирующего рака предстательной железы может указывать уменьшение определенного выше уровня экспрессии PDE4D3 в тестируемом образце в 1,5-10 раз, предпочтительно в 2-5 раз по сравнению с нормальным контрольным уровнем, например, в здоровой ткани или непрогрессирующей опухоли предстательной железы.
На наличие прогрессирующего рака может указывать уменьшение определенного выше уровня экспрессии PDE4D4 в тестируемом образце на величину, составляющую от 20 до 80%, предпочтительно на величину, составляющую 30, 40, 50, 60 или 70%, по сравнению с контрольным уровнем. Контрольный уровень может представлять собой либо нормальный контрольный уровень, либо раковый контрольный уровень, как определено выше. В особенно предпочтительном варианте осуществления на наличие прогрессирующего рака предстательной железы может указывать уменьшение определенного выше уровня экспрессии PDE4D4 в тестируемом образце в 1,5-10 раз, предпочтительно в 2-5 раз по сравнению с нормальным контрольным уровнем, например, в здоровой ткани или непрогрессирующей опухоли предстательной железы.
На наличие прогрессирующего рака может указывать уменьшение определенного выше уровня экспрессии PDE4D5 в тестируемом образце на величину, составляющую от 20 до 80%, предпочтительно на величину, составляющую 30, 40, 50, 60 или 70%, по сравнению с контрольным уровнем. Контрольный уровень может представлять собой либо нормальный контрольный уровень, либо раковый контрольный уровень, как определено выше. В особенно предпочтительном варианте осуществления на наличие прогрессирующего рака предстательной железы может указывать уменьшение определенного выше уровня экспрессии PDE4D5 в тестируемом образце в 1,5-10 раз, предпочтительно в 2-5 раз по сравнению с нормальным контрольным уровнем, например, в здоровой ткани или непрогрессирующей опухоли предстательной железы.
На наличие прогрессирующего рака может указывать уменьшение определенного выше уровня экспрессии PDE4D6 в тестируемом образце на величину, составляющую от 20 до 80%, предпочтительно на величину, составляющую 30, 40, 50, 60 или 70%, по сравнению с контрольным уровнем. Контрольный уровень может представлять собой либо нормальный контрольный уровень, либо раковый контрольный уровень, как определено выше. В особенно предпочтительном варианте осуществления на наличие прогрессирующего рака предстательной железы может указывать уменьшение определенного выше уровня экспрессии PDE4D6 в тестируемом образце в 1,5-10 раз, предпочтительно в 2-5 раз по сравнению с нормальным контрольным уровнем, например, в здоровой ткани или непрогрессирующей опухоли предстательной железы.
На наличие прогрессирующего рака может указывать уменьшение определенного выше уровня экспрессии PDE4D7 в тестируемом образце на величину, составляющую от 20 до 80%, предпочтительно на величину, составляющую 30, 40, 50, 60 или 70%, по сравнению с контрольным уровнем. Контрольный уровень может представлять собой либо нормальный контрольный уровень, либо раковый контрольный уровень, как определено выше. В особенно предпочтительном варианте осуществления на наличие прогрессирующего рака предстательной железы может указывать уменьшение определенного выше уровня экспрессии PDE4D7 в тестируемом образце в 1,5-10 раз, предпочтительно в 2-5 раз по сравнению с нормальным контрольным уровнем, например, в здоровой ткани или непрогрессирующей опухоли предстательной железы.
На наличие прогрессирующего рака может указывать уменьшение определенного выше уровня экспрессии PDE4D8 в тестируемом образце на величину, составляющую от 20 до 80%, предпочтительно на величину, составляющую 30, 40, 50, 60 или 70%, по сравнению с контрольным уровнем. Контрольный уровень может представлять собой либо нормальный контрольный уровень, либо раковый контрольный уровень, как определено выше. В особенно предпочтительном варианте осуществления на наличие прогрессирующего рака предстательной железы может указывать уменьшение определенного выше уровня экспрессии PDE4D8 в тестируемом образце в 1,5-10 раз, предпочтительно в 2-5 раз по сравнению с нормальным контрольным уровнем, например, в здоровой ткани или непрогрессирующей опухоли предстательной железы.
На наличие прогрессирующего рака может указывать уменьшение определенного выше уровня экспрессии PDE4D9 в тестируемом образце на величину, составляющую от 20 до 80%, предпочтительно на величину, составляющую 30, 40, 50, 60 или 70%, по сравнению с контрольным уровнем. Контрольный уровень может представлять собой либо нормальный контрольный уровень, либо раковый контрольный уровень, как определено выше. В особенно предпочтительном варианте осуществления на наличие прогрессирующего рака предстательной железы может указывать уменьшение определенного выше уровня экспрессии PDE4D9 в тестируемом образце в 1,5-10 раз, предпочтительно в 2-5 раз по сравнению с нормальным контрольным уровнем, например, в здоровой ткани или непрогрессирующей опухоли предстательной железы.
Стадию непрогрессирующего рака предстательной железы можно детектировать по увеличению уровня экспрессии маркера PDE4D7 по сравнению с нормальным контрольным уровнем, как указано выше. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения непрогрессирующий рак предстательной железы можно детектировать в том случае, если уровень экспрессии маркера PDE4D7 аналогичен уровню его экспрессии в установленной, например, независимо установленной, клетке рака предстательной железы, или в такой клеточной линии, как линия клеток непрогрессирующего рака.
Стадию прогрессирующего рака предстательной железы можно детектировать по уменьшению уровня экспрессии маркера PDE4D7 по сравнению с нормальным контрольным уровнем, например, в здоровой ткани или в непрогрессирующей опухоли. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения прогрессирующий рак предстательной железы можно детектировать в том случае, если уровень экспрессии маркера PDE4D7 аналогичен уровню его экспрессии в установленной, например независимо установленной, клетке прогрессирующего рака предстательной железы, или в такой клеточной линии, как линия клеток прогрессирующего рака предстательной железы.
Непрогрессирующий или прогрессирующий рак предстательной железы можно детектировать по уменьшению уровня экспрессии по меньшей мере одного из маркеров PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8 и PDE4D9 по сравнению с нормальным контрольным уровнем, как указано выше. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения непрогрессирующий или прогрессирующий рак предстательной железы можно детектировать в том случае, если уровень экспрессии по меньшей мере одного из маркеров PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8 и PDE4D9 аналогичен уровню его экспрессии в установленной, например независимо установленной, клетке или клеточной линии рака предстательной железы.
Термин "мониторинг рака предстательной железы" в настоящем описании относится к проведению диагностики или детекции ракового заболевания или расстройства предстательной железы, например, в качестве сопровождения процедуры лечения, или в течение определенного периода времени, как правило, в течение 2 месяцев, 3 месяцев, 4 месяцев, 6 месяцев, 1 года, 2 лет, 3 лет, 5 лет, 10 лет или любого другого периода времени. Термин "сопровождение" означает, что указанные выше статусы заболевания и, в частности, изменение статусов заболевания можно детектировать путем сравнения уровня экспрессии маркера варианта PDE4D настоящего изобретения в тестируемом образце с нормальным контрольным уровнем, как указано выше, предпочтительно с контрольным уровнем экспрессии, определенным в контрольном образце прогрессирующей опухоли, в контрольном образце непрогрессирующей опухоли, или в контрольном образце здоровой ткани, или с уровнем экспрессии в установленной, например независимо установленной, клетке или клеточной линии рака предстательной железы, или в клеточной линии с любым периодическим интервалом времени, например, каждую неделю, каждые 2 недели, каждый месяц, каждые 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев, каждые 1,5 года, каждые 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 лет, в течение любого периода времени, например в течение 2 недель, 3 недель, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 месяцев, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или 20 лет, соответственно. Установленную, например, независимо установленную клетку или клеточную линию рака предстательной железы, используемую для определения дополнительного контрольного уровня, можно получить из образцов, соответствующих разным стадиям развития рака, например, стадиям 0 и I-IV классификационной системы TNM. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения этот термин относится к сопровождению диагностированного рака предстательной железы, более предпочтительно прогрессирующего или непрогрессирующего рака предстательной железы. Мониторинг также может включать детекцию экспрессии других генов или генетических элементов, например, генов домашнего хозяйства.
Термин "прогнозирование рака предстательной железы" в настоящем описании относится к предсказанию течения или исхода диагностированного или детектированного рака предстательной железы, например, в течение определенного периода времени, во время лечения или после лечения. Данный термин также относится к определению вероятности выживания или выздоровления от этого заболевания, а также к прогнозу ожидаемого времени выживания индивидуума. Прогноз, в частности, может включать определение вероятности выживания индивидуума в течение последующего определенного периода времени, например, в течение 6 месяцев, 1 года, 2 лет, 3 лет, 5 лет, 10 лет или любого другого периода времени.
Используемый здесь термин "транскрипционный фактор ERG" относится к ядерному белку, который связывает богатые пурином последовательности ДНК, кодируемые онкогеном ERG (ETS-родственный ген). ERG является членом семейства транскрипционных факторов ETS (специфичных для эритробластной трансформации). Транскрипционный регулятор ERG участвует в адгезии тромбоцитов к субэндотелию и регулирует гемопоэз. Он содержит ДНК-связывающий домен и домен PNT (направляющий).
В некоторых вариантах осуществления повышающая регуляция экспрессии PDE4D указывает на повышающую регуляцию уровня экспрессии фактора транскрипции ERG, или на наличие гибридного гена TMPRSS2-ERG.
Используемый здесь термин "стандартный ген" или "контрольный ген" относится к любому подходящему гену, например, к любому постоянно экспрессируемому в выбранном организме и непрерывно детектируемому гену, генному продукту, продукту экспрессии, белку или белковому варианту. Данный термин также включает генные продукты, такие как экспрессированные белки, пептиды, полипептиды, а также их модифицированные варианты. Следовательно, изобретение также относится к стандартным белкам, продуцируемым стандартным геном. Кроме того, изобретение охватывает все виды транскриптов, кодируемых стандартным геном, а также их модификации или связанные с ними вторичные параметры. Альтернативно или дополнительно другие стандартные параметры также можно использоваться в целях сравнения, например, концентрации метаболиов, размеры клеток и т.д.
Экспрессию предпочтительно проводят в том же образце, то есть уровень варианта PDE4D и стандартного гена определяют в одном образце. Если тестирование проводят в одном и том же образце, можно использовать один способ детекции или мультиплексной детекции, как описано в настоящем описании. При проведении мультиплексной детекции можно изменять концентрацию олигонуклеотидов, используемых в качестве праймеров и/или зондов. Кроме того, концентрацию и дополнительные ингредиенты, такие как буферы, ионы и т.д., можно изменять, например, увеличивать или уменьшать по сравнению с рекомендациями производителей.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения можно определить экспрессию нескольких стандартных генов или стабильно экспрессируемых генов. Например, можно определить экспрессию 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 30 или более стандартных генов. Результаты таких измерений можно рассчитывать по отдельности, или их можно объединять с получением среднего индекса экспрессии. Кроме того, характер экспрессии стандартного гена можно определить и/или использовать в качестве основы для последующих стадий. Такой характер может быть основан на известных схемах экспрессии генов в некоторых раковых опухолях, в частности на некоторых стадиях или состояниях рака предстательной железы.
Кроме того, результаты экспрессии можно сравнить с уже известными результатами, полученными с использованием стандартных образцов или баз данных. Сравнение может дополнительно включать процедуру нормализации, позволяющую улучшить статистическую значимость результатов.
В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения вместо уровня экспрессии стандартного гена в образце можно определить экспрессию другого ракового маркера или непостоянно экспрессируемого гена. Например, можно определить экспрессию гена, которая заведомо уменьшается при гормонорезистентном раке предстательной железы, или которая заведомо увеличивается при гормональночувствительном раке предстательной железы.
В следующем варианте осуществления можно определить экспрессию обоих типов, то есть экспрессию стандартного гена и экспрессию другого ракового или биомаркерного гена.
Типичные контрольные гены включают , в числе прочих, TATA-связывающий белок Homo sapiens (TBP), гипоксантинфосфорибозилтрансферазу 1 Homo sapiens (HPRT1), мРНК актина бета Homo sapiens (ACTB), мРНК кислого рибосомального фосфопротеина P0 Homo sapiens 60S (RPLP0), член РНК-связывающего семейства pumilio Homo sapiens (PUM1), полипептид А полимеразы (РНК) II (ДНК-зависимой) 220 кДа (POLR2A), бета-2-микроглобулин (B2M), тубулин-альфа-1b (K-ALPHA-1), аминолевулинат-дельта-синтаза (ALAS-1).
В конкретном варианте осуществления в описанных здесь способах проводят стадии (а2) определения уровня экспрессии стандартного гена в образце; (а3) нормализации уровня экспрессии варианта PDE4D, измеренного на стадии (а), по уровню экспрессии стандартного гена с получением нормализованного профиля экспрессии гена;
где статус прогрессирования рака простаты и/или индекс прогрессирования рака простаты определяют на основе нормализованного профиля экспрессии гена варианта PDE4D, определенного на стадии (а3).
Выражение "где ни один из вариантов PDE4D не используют в качестве стандартного гена" означает, что вариант PDE4D не используют в качестве стандартного гена для нормализации измеренного уровня экспрессии.
В частности, PDE4D5 не используют в качестве стандартного гена.
Более конкретно, ни один из вариантов PDE4D не используют в качестве стандартного гена для нормализации уровня экспрессии PDE4D7.
В еще более конкретном варианте осуществления PDE4D5 не используют в качестве стандартного гена для нормализации уровня экспрессии PDE4D7.
Результаты экспрессии можно нормализовать с помощью любого подходящего способа, известного специалисту в данной области. Как правило, такие тесты или соответствующие формулы, известные специалистам в данной области, используют для стандартизации значений экспрессии, чтобы отличить реальные изменения уровней экспрессии генов от изменений, обусловленных способом измерения. При применении микрочипов в качестве метода нормализации можно использоваться Robust Multi-array Average (RMA).
В конкретном варианте осуществления нормализованные значения определяют по следующей формуле:
Cq
Cq
Cq
исследуемого гена
стандартного гена
исследуемого гена
N()=Среднее()-()
Cq
Cq
Cq
исследуемого гена
стандартного гена
исследуемого гена
Где N() представляет собой нормализованное значение экспрессии исследуемого гена; Среднее() представляет собой среднее арифметическое полученных методом ПЦР значений Cq выбранного сочетания стандартных генов; и () представляет собой полученное методом ПЦР значение Cq исследуемого гена.
В конкретном варианте осуществления нормализованные значения определяют по следующей формуле:
Cq
Cq
Cq
исследуемого гена
стандартного гена
исследуемого гена
N()=Среднее()-()
Cq
Cq
Cq
исследуемого гена
стандартного гена
исследуемого гена
Где N() представляет собой нормализованное значение экспрессии исследуемого гена; Среднее() представляет собой среднее арифметическое полученных методом ПЦР значений Cq по меньшей мере двух стандартных генов, выбранных из TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0, POLR2A, B2M, PUM1, K-ALPHA-1 и ALAS-1; и () представляет собой полученное методом ПЦР значение Cq исследуемого гена.
В конкретном варианте осуществления нормализованные значения определяют по следующей формуле:
Cq
Cq
Cq
исследуемого гена
стандартного гена
исследуемого гена
N()=Среднее()-()
Cq
Cq
Cq
исследуемого гена
стандартного гена
исследуемого гена
Где N() представляет собой нормализованное значение экспрессии исследуемого гена; Среднее() представляет собой среднее арифметическое полученных методом ПЦР значений Cq стандартных генов TBP, HPRT1, ACTB и RPLP0; и () представляет собой полученное методом ПЦР значение Cq исследуемого гена.
В конкретном варианте осуществления нормализованные значения определяют по следующей формуле:
Cq
Cq
Cq
исследуемого гена
стандартного гена
исследуемого гена
N()=Среднее()-()
Cq
Cq
Cq
исследуемого гена
стандартного гена
исследуемого гена
Где N() представляет собой нормализованное значение экспрессии исследуемого гена; Среднее() представляет собой среднее арифметическое полученных методом ПЦР значений Cq стандартных генов TBP, HPRT1, PUM1, K-ALPHA-1 и ALAS-1; и () представляет собой полученное методом ПЦР значение Cq исследуемого гена.
Типичные стандартные гены включают , в числе прочих, TATA-связывающий белок Homo sapiens (TBP), гипоксантинфосфорибозилтрансферазу 1 Homo sapiens (HPRT1), мРНК актина бета Homo sapiens (ACTB), мРНК кислого рибосомального фосфопротеина P0 Homo sapiens 60S (RPLP0), член РНК-связывающего семейства pumilio Homo sapiens (PUM1), полипептид А полимеразы (РНК) II (ДНК-зависимой) 220 кДа (POLR2A), бета-2-микроглобулин (B2M), тубулин-альфа-1b (K-ALPHA-1), аминолевулинат-дельта-синтаза (ALAS-1). Особенно предпочтительным очетанием является TBP, HPRTl, ACTB, RPLP0. Другим особенно предпочтительным сочетанием является TBP, HPT1, PUM 1, K-ALPHA-1, ALAS-1.
В другом предпочтительном варианте осуществления сочетание стандартных генов включает TBP, HPRT1 и по меньшей мере один, по меньшей мере два или по меньшей мере три других контрольных гена, выбранных из группы, включающей ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALPHA-1 (TUBA1B) или ALAS-1.
В другом предпочтительном варианте осуществления сочетание стандартных генов включает TBP, HPRTl и по меньшей мере два других контрольных гена, выбранных из группы, включающей ACTB, RPLP0, PUM1, K-ALPHA-1 (TUBA1B) или ALAS-1.
Особенно предпочтительным сочетанием является TBP, HPRTl, ACTB, RPLP0. Другим особенно предпочтительным сочетанием является TBP, HPRTl, PUM1, K-ALPHA-1, ALAS-1.
Подробное описание стандартных генов, содержащее ID их транскриптов (NCBI RefSeq) и SEQ ID NO соответствующих нуклеотидных последовательностей, ID белков (номера доступа белковых последовательностей) и SEQ ID NO соответствующих аминокислотных последовательностей приведены на фиг.2. Кроме того, на фиг. 2 для каждого стандартного гена приведены последовательности прямого и обратного праймеров, с помощью которых можно получить ампликон, специфичный для стандартного гена, и последовательность зонда, способного специфически связываться с ампликоном.
В частности, стандартный ген не является вариантом PDE4D.
В конкретном варианте осуществления варианты PDE4D выбирают из группы, содержащей PDE4D1, PDE4D2, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D7 и PDE4D9.
В другом конкретном варианте осуществления варианты PDE4D выбираются из группы, содержащей PDE4D1, PDE4D2, PDE4D5, PDE4D7 и PDE4D9.
В следующем варианте осуществления варианты PDE4D выбирают из группы, содержащей PDE4D4, PDE4D5, PDE4D7 и PDE4D9.
В другом конкретном варианте осуществления варианты PDE4D выбирают из группы, содержащей PDE4D5 и PDE4D7.
В другом конкретном варианте осуществления варианты PDE4D выбирают из группы, содержащей PDE4D5, PDE4D7 и PDE4D9.
В другом конкретном варианте осуществления варианты PDE4D выбирают из группы, состоящей из PDE4D5 и PDE4D7.
В предпочтительном варианте осуществления на стадии (а) выбирают уровень экспрессии по меньшей мере трех вариантов PDE4D, по меньшей мере четырех вариантов PDE4D, по меньшей мере 5 вариантов PDE4D.
В более предпочтительном варианте осуществления на стадии (а) выбирают уровень экспрессии по меньшей мере трех вариантов PDE4D.
В следующем варианте осуществления уровень экспрессии разных вариантов PDE4D определяют вместе, например, с помощью зонда, который позволяет одновременно обнаруживать несколько вариантов PDE4D.
В предпочтительном варианте осуществления уровень экспрессии PDE4D1 и PDE4D2 определяют для обоих вариантов вместе. Это означает, что только один зонд используется для получения одновременной информации об экспрессии указанных близкородственных вариантов PDE4D, PDE4D1 и PDE4D2.
В контексте настоящего изобретения термины "диагностика" и "прогнозирование" также предназначаются для обозначения прогнозов и анализов вероятности. Соответственно, варианты PDE4D как маркеры можно использовать в клинике при принятии решений относительно методов лечения, включающих терапевтическое вмешательство или диагностические методы, такие как наблюдение за течением заболевания. В соответствии с настоящим изобретением можно получить промежуточный результат для изучения состояния индивидуума. Такой промежуточный результат можно объединить с дополнительной информацией, чтобы помочь врачу, медсестре или другому практическому специалисту диагностировать заболевание у индивидуума. Альтернативно настоящее изобретение можно использовать для обнаружения раковых клеток в ткани, полученной от индивидуума, и предоставления врачу полезной информации для диагностики заболевания у индивидуума.
Субъект или индивидуум, подлежащий диагностике, мониторингу или прогнозированию рака предстательной железы или статуса прогрессирования рака предстательной железы в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой животное, предпочтительно млекопитающее, более предпочтительно человека.
Особенно предпочтительно использовать средства молекулярной визуализации, известные специалистам в данной области техники, такие как магнитно-резонансная томография (MRI) и/или технология визуализации методом магнитного фотонного резонанса (MPI), в контексте применения вариантов PDE4D в качестве маркеров для диагностики, мониторинга или прогнозирования злокачественного, гормоночувствительного рака простаты или прогрессирования гормоночувствительного рака простаты до злокачественного статуса. Например, варианты PDE4D можно использовать в качестве маркеров для диагностики, мониторинга или прогнозирования рака простаты или статуса прогрессирования рака простаты в таких методах, как MRI или MPI, позволяющих проводить онлайн-детекцию диагностических маркеров в организме человека.
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или статуса прогрессирования рака предстательной железы, включающим стадии
(а) определения уровня экспрессии в образце по меньшей мере двух вариантов PDE4D, выбранных из группы, содержащей PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 и PDE4D9, с получения профиля экспрессии гена;
(b) определение по меньшей мере одного PDE-индекса, указывающего на статус прогрессирования рака предстательной железы, на основе профиля экспрессии гена, полученного на стадии (а).
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу идентификации индивидуума, подходящего для лечения рака простаты, включающему :
(а) определение в образце, полученном от индивидуума, уровня экспрессии по меньшей мере двух вариантов PDE4D, выбранных из группы, содержащей PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 и PDE4D9, с получением профиля экспрессии генов;
(b) определение по меньшей мере одного показателя прогрессирования рака простаты на основе профиля экспрессии генов вариантов PDE4D, свидетельствующего о статусе прогрессирования рака предстательной железы на стадии (a);
(c) идентификацию человека как подходящего для получения терапии рака простаты, где PDE-индекс образца индивидуума указывает на наличие рака предстательной железы, или где PDE-индекс образца индивидуума указывает на непрогрессирующий или прогрессирующий статус рака предстательной железы.
Термин "PDE-индекс" относится к объединению значений экспрессии по меньшей мере двух изоформ PDE4D в единую модель данных. Таким образом, PDE-индекс представляет собой значительно улучшенный классификационный показатель, позволяющий предсказывать статус прогрессирования рака предстательной железы.
В конкретном варианте осуществления статус прогрессирования рака предстательной железы является непрогрессирующим или прогрессирующим.
PDE-индекс может представлять собой, например:
i) PDE-индекс_1:
PDE4D7_exp - PDE4D5_exp
ii) PDE-индекс_2:
Среднее(PDE4D7_exp и PDE4D5_exp)
iii) PDE-индекс_3:
(Среднее(PDE4D5_exp, PDE4D7_exp и PDE4D9_exp))/(PDE4D4_exp)
iv) PDE-индекс_4:
(Среднее(PDE4D5_exp, PDE4D7_exp и PDE4D9_exp))/(PDE4D1 и PDE4D2_exp)
v) PDE-индекс_5:
(Среднее(PDE4D5_exp, PDE4D7_exp и PDE4D9_exp))
Термин "PDE4D4_exp" обозначает нормализованный (по стандартным генам) уровень экспрессии PDE4D4, термин "PDE4D5_exp" обозначает нормализованный (по стандартным генам) уровень экспрессии PDE4D5, термин "PDE4D7_exp" обозначает нормализованный (по стандартным генам) уровень экспрессии PDE4D7, и термин "PDE4D9_exp" обозначает нормализованный (по стандартным генам) уровень экспрессии PDE4D9. Термин "PDE4D1 и PDE4D2_exp" обозначает нормализованные (по стандартным генам) уровни экспрессии PDE4D1 и PDE4D2, определенные одновременно в одном анализе.
Показатель прогрессирования рака простаты PDE-индекс_1 определяют по формуле PDE4D7_exp - PDE4D5_exp. PDE-индекс_1, в частности, позволяет отличать нераковую простату от рака предстательной железы. Предпочтительно PDE-индекс_1 позволяет отличать нераковую простату от раковой простаты.
Например, значение PDE-индекса_1 ниже предопределенного порогового уровня свидетельствует о нераковой простате, а значение PDE-индекса_1 выше предопределенного порогового уровня указывает на наличие рака предстательной железы.
PDE-индекс_2 определяют по формуле Среднее(PDE4D7_exp и PDE4D5_exp). PDE-индекс_2 позволяет различать непрогрессирующий и прогрессирующий статусы рака.
Например, значение PDE-индекса_2 ниже предопределенного порогового уровня свидетельствует о прогрессирующем статусе опухоли предстательной железы, а значение PDE-индекса_2 выше предопределенного порогового уровня свидетельствует о непрогрессирующем статусе рака предстательной железы.
В другом варианте осуществления значение PDE-индекса_2 ниже контрольного уровня свидетельствует о прогрессирующем статусе опухоли предстательной железы, а значение PDE-индекса_2 выше контрольного уровня свидетельствует о непрогрессирующем статусе опухоли предстательной железы.
PDE-индекс_3 определяют по формуле (Среднее(PDE4D5_exp, PDE4D7_exp и PDE4D9_exp))/(PDE4D4_exp).
PDE-индекс_3 позволяет различать непрогрессирующий и прогрессирующий статусы рака.
Например, значение PDE-индекса_3 ниже предопределенного порогового уровня свидетельствует о прогрессирующем статусе опухоли предстательной железы, а значение PDE-индекса_3 выше предопределенного порогового уровня свидетельствует о непрогрессирующем статусе рака предстательной железы.
PDE-индекс_4 определяют по формуле (Среднее(PDE4D5_exp, PDE4D7_exp и PDE4D9_exp))/(PDE4D1 и PDE4D2_exp).
PDE-индекс_4 позволяет различать непрогрессирующий и прогрессирующий статусы рака.
PDE-индекс_5 определяют по формуле (Среднее(PDE4D5_exp, PDE4D7_exp и PDE4D9_exp)).
PDE-индекс_5 позволяет различать непрогрессирующий и прогрессирующий статусы рака.
Например, значение PDE-индекса_4 ниже предопределенного порогового уровня свидетельствует о прогрессирующем статусе опухоли предстательной железы, а значение PDE-индекса_4 выше предопределенного порогового уровня свидетельствует о непрогрессирующем статусе рака предстательной железы.
"Предопределенный пороговый уровень" можно определить на основе контрольного уровня, то есть значения PDE-индекса, определенного для нераковой ткани или непрогрессирующей ткани простаты. В конкретном варианте осуществления пороговый уровень может быть равен контрольному уровню. В другом варианте осуществления пороговый уровень может отличаться от контрольного уровня.
Значение PDE-индекса_1 ниже контрольного уровня свидетельствует о нераковой простате, а значение PDE-индекса_1 выше контрольного уровня представляет собой предопределенное пороговое значение, указывающее на наличие рака предстательной железы.
Значение PDE-индекса_1 ниже контрольного уровня свидетельствует о нераковой простате, а значение PDE-индекса_1 выше контрольного уровня представляет собой предопределенное пороговое значение, указывающее на наличие рака предстательной железы, где контрольный уровень соответствует PDE-индексу_1 в нераковой ткани.
В другом варианте осуществления значение PDE-индекса_2 ниже контрольного уровня указывает на прогрессирующий статус опухоли предстательной железы, а значение PDE-индекса_2 выше контрольного уровня указывает на непрогрессирующий статус рака предстательной железы.
В предпочтительном варианте осуществления значение PDE-индекса_2 ниже контрольного уровня указывает на прогрессирующий статус опухоли предстательной железы, а значение PDE-индекса_2 выше контрольного уровня указывает на непрогрессирующий статус рака предстательной железы, где контрольный уровень соответствует значению PDE-индекса_2 в ткани непрогрессирующей опухоли.
В другом варианте осуществления значение PDE-индекса_3 ниже контрольного уровня указывает на прогрессирующий статус опухоли предстательной железы, а значение PDE-индекса_3 выше контрольного уровня указывает на непрогрессирующий статус рака предстательной железы.
В предпочтительном варианте осуществления значение PDE-индекса_3 ниже контрольного уровня указывает на прогрессирующий статус опухоли предстательной железы, а значение PDE-индекса_3 выше контрольного уровня указывает на непрогрессирующий статус рака предстательной железы, где контрольный уровень соответствует значению PDE-индекса_3 в ткани непрогрессирующей опухоли
В другом варианте осуществления значение PDE-индекса_4 ниже контрольного уровня указывает на прогрессирующий статус опухоли предстательной железы, а значение PDE-индекса_4 выше контрольного уровня указывает на непрогрессирующий статус рака предстательной железы.
В предпочтительном варианте осуществления значение PDE-индекса_4 ниже контрольного уровня указывает на прогрессирующий статус опухоли предстательной железы, а значение PDE-индекса_4 выше контрольного уровня указывает на непрогрессирующий статус рака предстательной железы, где контрольный уровень соответствует значению PDE-индекса_4 в ткани непрогрессирующей опухоли.
В другом варианте осуществления значение PDE-индекса_5 ниже контрольного уровня указывает на прогрессирующий статус опухоли предстательной железы, а значение PDE-индекса_5 выше контрольного уровня указывает на непрогрессирующий статус рака предстательной железы.
В предпочтительном варианте осуществления значение PDE-индекса_5 ниже контрольного уровня указывает на прогрессирующий статус опухоли предстательной железы, а значение PDE-индекса_5 выше контрольного уровня указывает на непрогрессирующий статус рака предстательной железы, где контрольный уровень соответствует значению PDE-индекса_5 в ткани непрогрессирующей опухоли.
et al.
В конкретном варианте осуществления изобретения определяют присутствие гена TMPRSS2-ERG, то есть определяют, является ли образец TMPRSS2-ERG-положительным или TMPRSS2-ERG-отрицательным. В частности, определяют, экспрессируется ли TMPRSS2-ERG, как описано в Tomlins, S. A. ʺRecurrent fusion of TMPRSS2 and ETS transcription factor genes in рака простаты.ʺ Science 310, 644-648 (2005). TMPRSS2-ERG образуется в результате геномной перегруппировки андроген-регулируемой сериновой протеазы TMPRSS2 и транскрипционного фактора ERG2, который является членом транскрипционного семейства ETS. Описанные здесь способы значительно улучшают классификационные возможности, позволяющие прогнозировать прогрессирование рака предстательной железы в образцах, в которых можно детектировать ген TMPRSS2-ERG или экспрессию TMPRSS2-ERG.
В предпочтительном варианте осуществления способы настоящего изобретения применяются к образцам, в которых присутствует TMPRSS2-ERG.
Уровень варианта PDE4D можно определить как уровень нуклеиновой кислоты, уровень белка или уровень активности, как описано в данном документе. Предпочтительно определяют количество транскрипта (транскриптов) и/или белка PDE4D. Кроме того, можно определить уровень контрольного гена в образце.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанные выше мониторинг или прогнозирование проводят на образце, полученном от индивидуума. Используемый здесь термин "образец, полученный от индивидуума" относится к любому биологическому материалу, полученному от индивидуума с помощью подходящих методов, известных специалистам в данной области. Образец, используемый в контексте настоящего изобретения, предпочтительно собирают в клинических условиях с помощью подходящего способа, более предпочтительно с помощью способа, позволяющего сохранять нуклеиновые кислоты (в частности, РНК) или белки.
Биологические образцы могут включать ткани и жидкости организма, такие как кровь, пот и моча. Кроме того, биологический образец может содержать клеточный экстракт, полученный из популяции клеток, таких как эпителиальные клетки, предпочтительно раковые эпителиальные клетки или эпителиальные клетки, полученные из ткани, предположительно являющейся злокачественной. Еще более предпочтительно биологический образец содержит популяцию клеток, полученных из железистой ткани, например, образец может быть получен из предстательной железы индивидуума мужского пола. Кроме того, при необходимости клетки можно очистить от полученных тканей и жидкостей организма, а затем использовать в качестве биологического образца.
Образцы, в особенности после первоначальной обработки, можно объединять. Однако можно использовать не объединенные образцы.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения содержимое биологического образца также можно подвергнуть стадии обогащения. Например, образец можно привести в контакт с лигандами, специфичными для мембраны или органелл клеток определенных типов, таких как клетки предстательной железы, функционализированные, например, магнитными частицами. Вещество, сконцентрированное под действием магнитных частиц, можно затем использовать на стадиях детекции и анализа, описанных в данном документе выше или ниже.
В конкретном варианте осуществления изобретения можно получить и/или использовать образцы, полученные в процессе биопсии или резекции. Такие образцы могут содержать клетки или клеточные лизаты.
Кроме того, клетки, например, опухолевые клетки, можно обогатить путем фильтрации текучих или жидких образцов, таких как кровь, моча и т.д. Процессы фильтрации также можно объединить с описанными выше стадиями обогащения на основе лиганд-специфических взаимодействий.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения образец может представлять собой образец ткани, биопсийный образец, образец мочи, образец осадка мочи, образец крови, образец слюны, образец спермы, образец, содержащий присутствующие в кровотоке опухолевые клетки, или образец, содержащий экзосомы, секретируемые предстательной железой. Образец крови может представлять собой, например, образец сыворотки или образец плазмы.
В вариантах осуществления изобретения характер экспрессии маркерного гена (или PDE-индекс) можно сопоставлять с уровнями PSA до или после операции, оценкой Глисона и стадией pT.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения описанный здесь способ включает дополнительную стадию определения оценки Глисона и/или стадии pT.
В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения описанный здесь способ включает дополнительную стадию определения оценки pGleason и стадии pT.
Термин "оценка Глисона" или "pGleason" относится к классификации образца рака предстательной железы квалифицированным патологом по системе Глисона, в соответствии с которой образцу присваивают оценку Глисона с использованием чисел от 1 до 5 на основании сходства клеток образца ткани простаты с раковой тканью или нормальной тканью предстательной железы. Ткани, которая выглядит очень похожей на обычную ткань простаты, присваивается балл или оценка 1, а ткани, которая не имеет нормальных признаков и содержит клетки, беспорядочно распределенные по всей простате, присваивают балл или оценку 5. Оценки или баллы от 2 до 4 включительно соответствуют признакам, находящимся между указанными состояниями. Однако, поскольку рак предстательной железы может иметь участки, характеризующиеся разными оценками или баллами, двум участкам, которые составляют большую часть ткани, присваиваются разные оценки или баллы. Использование двух оценок или баллов приводит к получению оценки Глисона (или суммы Глисона) от 2 до 10.
В дополнительном аспекте анализ уровней экспрессии можно проводить в сочетании с другими анализами или определением других показателей рака предстательной железы, или вместо них. В некоторых вариантах осуществления анализ проводят в сочетании с методом определения степени рака предстательной железы в образце индивидуума, содержащем клетки рака предстательной железы. В других вариантах осуществления анализ уровней экспрессии проводят в сочетании со способом определения стадии рака предстательной железы в образце. Третьей возможностью является анализ уровней экспрессии в сочетании с детекцией или определением уровней PSA у индивидуума, необязательно перед процедурой, используемой для выделения раковых клеток предстательной железы. Разумеется, можно использовать сочетание с одним, двумя или тремя из указанных иллюстративных примеров. Использование анализов нескольких типов дает многофакторный анализ. Настоящее изобретение специально охватывает возможные сочетания описанных здесь анализов как многофакторные варианты осуществления.
Как правило, можно использовать любой приемлемый способ оценки степени и/или стадии рака простаты, известный специалистам в данной области. В некоторых случаях способ определения степени рака простаты включает определение оценки Глисона (или класса Глисона). В других случаях определение стадии рака предстательной железы проводят по Системе определения стадии опухоли Американского объединенного онкологического комитета (AJCC). Причем, как описано в настоящем документе, анализ уровня экспрессии гена (последовательности) можно проводить вместо определения оценки Глисона или стадии опухоли по AJCC. Анализ уровня PSA можно проводить до простатэктомии, которую используют для получения образца, содержащего клетки рака предстательной железы, подходящего для применения в любом описанном здесь способе.
В следующем варианте осуществления настоящего изобретения описанный выше способ также можно объединить с одним или несколькими аналогичными способами идентификации экспрессии одного или нескольких других биомаркеров. Предпочтительным является определение уровня простат-специфического антигена (PSA) в крови. Так, если уровень PSA в крови находится в диапазоне от 2 до 5 нг/мл или более, предпочтительно от 2,2 до 4,8 нг/мл или более, от 2,4 до 4,4 нг/мл или более, от 2,6 до 4,2 нг/мл или более, или от 2,8 до 4,0 нг/мл или более, более предпочтительно от примерно 2,5 до 4 нг/мл или более, считают, что индивидуум может страдать от злокачественного гормоно-чувствительного рака предстательной железы, или у него может развиться злокачественный гормоно-чувствительный рак предстательной железы в ближайшем будущем, то есть в течение следующих 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 14, 48 месяцев. Тестирование экспрессии вариантов PDE4D можно проводить в соответствии с описанными здесь стадиями. В качестве контролей или контрольных образцов можно использовать описанные выше контрольные образцы. В особенно предпочтительном варианте осуществления на стадиях тестирования используют антитела, способные специфически связываться с конкретным вариантом PDE4D, или с несколькими вариантами PDE4D, например, коммерчески доступное антитело против PDE4D7, такое как NB300-652 или GTX14629.
В одном варианте осуществления уровень экспрессии гена определяют путем детекции экспрессии мРНК с использованием одного или нескольких зондов и/или одного или нескольких наборов зондов.
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или статуса прогрессирования рака предстательной железы, например, у индивидуума, включающим , по меньшей мере, стадию определения уровня маркерного гена (генов) или GOI в образце. Термины "определение уровня маркерного гена (генов) или GOI", или "определение уровня экспрессии гена", или "определение уровня экспрессии вариантов PDE4D" относятся к определению наличия или количества маркерного гена (генов), или GOI, или продуктов экспрессии вариантов PDE4D. Таким образом, термин "уровень маркерного гена (генов) или GOI" относится к присутствию или количеству маркерного гена (генов) или продуктов экспрессии GOI, например, транскрипта (транскриптов), и/или к определению наличия или количества маркерного гена (генов) или GOI. Определение присутствия или количества маркерного гена (генов) или продуктов экспрессии GOI можно проводить любыми способами, известными в данной области.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения определение присутствия или количества маркерного гена (генов) или продуктов экспрессии GOI осуществляют путем измерения количества нуклеиновой кислоты. Таким образом, уровень (уровни) экспрессии можно определить с помощью способа, включающего детекцию мРНК, кодируемой геном.
Например, уровень нуклеиновой кислоты маркерного гена (генов) или экспрессии GOI можно определить путем выделения молекул нуклеиновых кислот (например, РНК или кДНК) из образца с последующей гибридизацией их со специфическими олигонуклеотидными зондами, как определено выше. Сравнение уровней экспрессии можно проводить визуально или с помощью соответствующего устройства. Способы детекции мРНК или продуктов экспрессии известны специалистам в данной области.
Альтернативно уровень нуклеиновой кислоты маркерного гена (генов) или экспрессии GOI можно детектировать с помощью ДНК-чипа или микрочипа. Как правило, образцы нуклеиновых кислот, полученные от пациентов, подлежащих тестированию, обрабатывают и метят, предпочтительно флуоресцентной меткой. Затем такие молекулы нуклеиновых кислот можно использовать для гибридизации с иммобилизованными улавливающими зондами, соответствующими маркерным генам настоящего изобретения. Специалистам в данной области известны подходящие способы проведения анализов с использованием микрочипов.
В стандартной системе ДНК-чип или микрочип содержит иммобилизованные с высокой плотностью зонды для детекции ряда генов. Содержащиеся в чипе зонды являются комплементарными одному или нескольким фрагментам последовательностей маркерных генов. Как правило, в качестве зондов используют кДНК, продукты ПЦР и олигонуклеотиды.
Способ детекции с исспользованием ДНК-чипа или микрочипа обычно включает следующие стадии: (1) выделение мРНК из образца и необязательно конвертация мРНК в кДНК с последующим мечением указанной РНК или кДНК. Способы выделения РНК, конвертации ее в кДНК и мечения нуклеиновых кислот описаны в руководствах по технологии микрочипов. (2) Гибридизация нуклеиновых кислот, полученных на стадии 1, с зондами, специфичными для маркерных генов. Нуклеиновые кислоты из образца можно метить красителем, таким как флуоресцентный краситель Cy3 (красный) или Cy5 (синий). Как правило, контрольный образец метят другим красителем. (3) Детекция гибридизации нуклеиновых кислот из образца с помощью зондов и определение, по меньшей мере качественное, более предпочтительно количественное, количества мРНК в образце, исследуемом на содержание маркерных генов. Разницу в уровнях экспрессии в образце и контроле можно оценить по разнице в интенсивностях сигнала. Интенсивность сигнала можно измерить и проанализировать с помощью соответствующего программного обеспечения, включающего , без ограничения, программное обеспечение, поставляемое, например, Affymetrix.
Ограничения по числу зондов, присутствующих на ДНК-чипе и соответствующих используемым маркерным генам, отсутствуют. Кроме того, маркерный ген может быть представлен двумя или более зондами, способными гибридизоваться с разными фрагментами гена. Зонды конструируют для каждого выбранного маркерного гена. Такой зонд обычно представляет собой олигонуклеотид, содержащий 5-50 нуклеотидных остатков. Более длинные ДНК можно синтезировать методом ПЦР или химически. Способы синтеза таких олигонуклеотидов и их нанесения на подложку хорошо известны в области технологии микрочипов. Гены, отличные от маркерных, также можно детектировать с помощью ДНК-чипа. Например, зонд, специфичный для гена, уровень экспрессии которого существенно не меняется, можно использовать в составе ДНК-чипа для нормализации результатов анализа или для сравнения результатов анализа нескольких чипов или разных анализов.
Альтернативно уровень нуклеиновой кислоты маркерного гена (генов) или экспрессии GOI можно определить методом количественной ОТ-ПЦР, предпочтительно методом ПЦР в режиме реального времени, после обратной транскрипции представляющих интерес транскриптов. Как правило, на первой стадии транскрипт подвергают обратной транскрипции с получением молекулы кДНК любым подходящим способом, известным специалистам в данной области. Затем можно провести метод количественный ПЦР или ПЦР в режиме реального времени с испольхованием первой цепи ДНК, полученной по описанному выше способу.
Предпочтительно для количественного определения методом ПЦР используют зонды Taqman или Molecular Beacon в качестве основных зондов FRET данного типа. В обоих случаях зонды используют в качестве внутренних зондов в сочетании с парой противонаправленных праймеров, которые фланкируют представляющий интерес фрагмент мишени, предпочтительно набор специфических олигонуклеотидов маркерного гена (генов), как определено выше. После амплификации целевого сегмента зонд может селективно связываться с продуктами по идентифицирующей последовательности между участками праймера, тем самым вызывая увеличение сигнала FRET относительно увеличения частоты мишени.
Предпочтительно зонд Taqman, используемый в методе количественной ПЦР, в соответствии с настоящим изобретением может содержать описанный выше специфический олигонуклеотид, состоящий примерно из 22-30 оснований, который по обоим концам метят парой FRET. Как правило, к 5'-концу присоединяют флуорофор с меньшей длиной волны, такой как флуоресцеин (например, FAM), а 3'-конец обычно метят флуоресцентным гасителем с большей длиной волны (например, TAMRA), или нефлуоресцентным гасителем (таким как Black Hole Quencher). Предпочтительно зонды, используемые в методе количественной ПЦР, в частности описанные выше зонды, не содержат гуанин (G) на 5'-конце, по соседству с репортерным красителем,, чтобы избежать гашения флуоресценции репортера после деградации зонда.
Зонд Molecular Beacon, используемый для проведения количественной ПЦР, в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно участвует в генерации FRET-взаимодействий, позволяющих детектировать и количественного определить продукт ПЦР, причем каждый зонд на 5'-конце содержит флуоресцентную метку, а на 3'-конце - гаситель. Таким образом, зонд имеет структуру "шпильки" или "петли на стебле", которая предпочтительно содержит стебель с двумя короткими самосвязывающимися концами и петлю с длинным внутренним мишень-специфичным участком, состоящим примерно из 20-30 оснований.
Альтернативные механизмы детекции, которые также можно использовать в контексте настоящего изобретения, включают применение зонда, содержащего только петлеобразную структуру и не содержащего короткий комплементарный стеблевой участок. Альтернативный метод количественной ПЦР на основе FRET, который также можно использовать в контексте настоящего изобретения, включает применение двух гибридизационных зондов, которые связываются с соседними участками на мишени, где первый зонд содержит флуоресцентную донорную метку на 3'-конце, а второй зонд содержит флуоресцентную акцепторную метку на 5'-конце.
В конкретном варианте осуществления уровень экспрессии генов определяют методом амплификации, и/или анализа микрочипов, и/или секвенирования РНК.
В конкретном варианте осуществления на стадии (с) способа идентификации индивидуума как подходящего для получения терапии рака предстательной железы, индивидуума идентифицируют как подходящего для получения терапии рака предстательной железы, выбранный из хирургии простаты, удаления простаты, химиотерапии, лучевой терапии, ограниченной или расширенной диссекции лимфатических узлов, если показатель прогрессирования рака простаты в образце индивидуума указывает на прогрессирующий статус рака предстательной железы.
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу идентификации индивидуума, подходящего для получения терапии рака простаты, включающему :
(а) определение в образце, полученном от индивидуума, уровня экспрессии по меньшей мере двух вариантов PDE4D, выбранных из группы, состоящей из PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 и PDE4D9, с получением профиля экспрессии гена;
(b) определение, по меньшей мере, одного показателя прогрессирования рака простаты на основе профиля экспрессии генов вариантов PDE4D, свидетельствующих о статусе прогрессирования рака предстательной железы, указанных на стадии (a);
(c) идентификацию индивидуума как подходящего для получения терапии рака предстательной железы, где PDE-индекс индивидуума указывает на наличие рака предстательной железы, или где PDE-индекс образца индивидуума указывает на непрогрессирующий или прогрессирующий статус рака предстательной железы.
В предпочтительном варианте осуществления на стадии (с) способа идентификации индивидуума, подходящего для получения терапии рака предстательной железы, индивидуума идентифицируют как подходящего для получения терапии рака предстательной железы, выбранной из хирургии простаты, удаления простаты, химиотерапии, лучевой терапии, ограниченной или расширенный диссекции лимфатических узлов, если показатель прогрессирования рака простаты в образце индивидуума указывает на прогрессирующий статус рака предстательной железы, и индивидуума идентифицируют как подходящего для активного наблюдения в качестве терапии рака предстательной железы, если показатель прогрессирования рака простаты в образце индивидуума указывает на непрогрессирующий статус рака предстательной железы.
Другой аспект изобретения относится к продукту, содержащему:
праймеры и/или зонды для определения уровня экспрессии по меньшей мере двух вариантов фосфодиэстеразы 4D (PDE4D), выбранных из группы, состоящей из PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 и PDE4D9;
и, кроме того, содержащему праймеры и/или зонды для определения уровня экспрессии стандартного гена, предпочтительно гена домашнего хозяйства, более предпочтительно TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALPHA-1 или ALAS-1.
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к композиции, содержащей набор молекул нуклеиновых кислот, каждая из которых содержит по меньшей мере одну последовательность олигогнуклеотидного зонда для анализа экспрессии генов по меньшей мере двух вариантов PDE4D, PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 и PDE4D9, и содержащей по меньшей мере одну последовательность олигонуклеотидного зонда для анализа экспрессии контрольных генов, выбранных из TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALPHA-1 (TUBA1B) или ALAS-1.
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к нуклеотидному чипу, содержащему один или несколько олигонуклеотидных зондов, комплементарных последовательностям, кодирующим по меньшей мере два варианта PDE4D, выбранных из PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 и PDE4D9, и способных гибридизоваться с ними, и содержащему один или несколько олигонуклеотидных зондов, комплементарных по меньшей мере одному из стандартных генов, выбранных из TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALPHA-1 (TUBA1B) или ALAS-1, и способных гибридизоваться с ним, где чип используют для определения PDE-индекса, как указано выше.
2
2
2
2
"Микрочип" представляет собой линейный или двумерный массив, состоящий из дискретных сегментов, каждый из которых занимает определенный участок на поверхности, как правило, твердой подложки, включающей , без ограничения, стеклянную, пластиковую или синтетическую мембрану. Плотность дискретных сегментов на микрочипе, определяемая суммарным числом иммобилизованных олигонуклеотидов, детектируемых на поверхности одной твердофазной подложки, может составлять в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере примерно 50/см, по меньшей мере примерно 100/см, по меньшей мере примерно 500/см, но менее чем примерно 1000/см. Массивы могут содержать всего примерно 500, примерно 1000, примерно 1500, примерно 2000, примерно 2500 или примерно 3000 иммобилизованных олигонуклеотидов. В настоящем описании ДНК-микрочип представляет собой массив олигонуклеотидов, или олигонуклеотидов, помещенных на чип или другие поверхности, используемых для гибридизации с олигонуклеотидами из образца с целью их амплификации или клонирования. Поскольку положение каждой конкретной группы олигонуклеотидов в массиве известно, природу олигонуклеотидов из образца можно определить по их связыванию с конкретным участком микрочипа.
"Олигонуклеотид" представляет собой полимерную форму, состоящую из нуклеотидов, либо рибонуклеотидов, либо дезоксирибонуклеотидов. Этот термин относится только к первичной структуре молекулы. Так, данный термин включает двух- и одноцепочечные ДНК и РНК. Он также охватывает известные типы модификаций, такие как присоединение меток, известных в данной области, метилирование, "кэпирование", замещение одного или нескольких природных нуклеотидов аналогами, межнуклеотидные модификации, такие как незаряженные связи (например, фосфоротиоатные связи, фосфородитиоатные связи и т.д.), а также немодифицированные формы олигонуклеотидов.
Термин "амплифицировать" используется в широком смысле и относится к получению продукта амплификации, которое можно проводить ферментативным способом с использованием ДНК- или РНК-полимераз. В данном описании термин "амплификация" обычно относится к способу получения нескольких копий целевой последовательности, в частности, последовательности из образца. Термин "несколько копий" относится по меньшей мере к 2 копиям. Термин "копия" не обязательно означает, что последовательность полностью комплементарна или идентична последовательности матрицы. Чтобы идентифицировать последовательности GOI можно дополнительно использовать любой способ секвенирования, известный в данной области.
Термин "соответствующий" может относиться, в требуемых случаях, к молекуле нуклеиновой кислоты, последовательность которой в значительной степени идентична последовательности другой молекулы нуклеиновой кислоты. Значительная степень означает по меньшей мере 95%, предпочтительно по меньшей мере 98% и более предпочтительно по меньшей мере 99%, где идентичность последовательностей определяют с помощью алгоритма BLAST, как описано в Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215: 403-410 (используя опубликованные параметры по умолчанию, то есть следующие параметры: w=4, t=17). Способы амплификации мРНК широко известны в данной области и включают ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), а также способы, описанные в патентной заявке США № 10/062857 (поданной 25 октября 2001 г), предварительных заявках на патент США 60/298847 (поданной 15 июня 2001 г) и 60/257801 (поданной 22 декабря 2000 г), которые настоящим все включены в качестве ссылки во всей полноте, как если бы они были полностью изложены. Другим подходящим способом является количественная ПЦР (или количПЦР). Альтернативно, РНК можно непосредственно метить, как соответствующую кДНК, с помощью способов, известных в данной области.
Поскольку изобретение основано на идентификации генов (или экспрессируемых последовательностей), которые экспрессируются на повышенном или пониженном уровне, один вариант осуществления изобретения относится к определению экспрессии в клетке образца путем гибридизации мРНК или ее амплифицированной или клонированной версии (такой как ДНК или кДНК) с олигонуклеотидом, специфичным для конкретной последовательности генов. Олигонуклеотиды данного типа могут содержать по меньшей мере примерно 20, по меньшей мере примерно 22, по меньшей мере примерно 24, по меньшей мере примерно 26, по меньшей мере примерно 28, по меньшей мере примерно 30 или по меньшей мере примерно 32 смежные пары оснований из последовательности гена, которые отсутствуют в других генных последовательностях. Термин "примерно", используемый в предыдущем предложении, относится к значению, отличающемуся от указанного численного значения на 1 в большую или меньшую сторону. В других вариантах осуществления можно использовать олигонуклеотиды, состоящие из по меньшей мере или примерно 50, по меньшей мере или примерно 100, по меньшей мере или примерно 150, по меньшей мере или примерно 200, по меньшей мере или примерно 250, по меньшей мере или примерно 300, по меньшей мере или примерно 350, или по меньшей мере или примерно 400 пар оснований последовательности гена, которые отсутствуют в других генных последовательностях. Термин "примерно", используемый в предыдущем предложении, относится к значению, отличающемуся от указанного численного значения на 10% в большую или меньшую сторону. Такие олигонуклеотиды также могут включать олигонуклеотидные зонды, способные гибридизоваться с последовательностями генов или их уникальными фрагментами, описанными в настоящем документе. Во многих случаях условия гибридизации представляют собой жесткие условия, включающие применение от примерно 30% об/об до примерно 50% формамида и от примерно 0,01 М до примерно 0,15 М соли в качестве условий гибридизации и от примерно 0,01 М до примерно 0,15 М соли в качестве условий промывания, при температуре примерно от 55 до 65°С или выше, или эквивалентные им условия.
В других вариантах осуществления олигонуклеотидные зонды, подходящие для применения в настоящем изобретении, могут иметь последовательности, примерно на 95% или примерно на 96%, примерно на 97% или примерно на 98%, или примерно на 99% идентичные последовательностям маркерного гена, экспрессия которого подлежит определению. Идентичность определяют с помощью алгоритма BLAST, как описано выше. Указанные зонды также можно охарактеризовать на основе их способности гибридизоваться с экспрессируемыми маркерными генами, используемыми в способах настоящего изобретения, в описанных выше строгих условиях, или эквивалентных им условиях.
Во многих случаях последовательностями представляют собой последовательности мРНК, кодируемые маркерными генами, последовательности кДНК, соответствующие таким мРНК, и/или амплифицированные варианты таких последовательностей. В некоторых вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные зонды иммобилизуют на чипе, других устройствах или в отдельных зонах локализации зондов.
Подходящие метки, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают радиоизотопы, нуклеотидные хромофоры, ферменты, субстраты, флуоресцентные молекулы, хемилюминесцентные фрагменты, магнитные частицы, биолюминесцентные фрагменты и т.п. Таким образом, меткой является любая композиция, которую можно детектировать с помощью спектроскопических, фотохимических, биохимических, иммунохимических, электрических, оптических или химических средств. Термин "подложка" относится к традиционным подложкам, таким как гранулы, частицы, измерительные щупы, волокна, фильтры, мембраны и силановые или силикатные подложки, такие как стеклянные пластинки.
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к набору для мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или статуса прогрессирования рака предстательной железы с целью идентификации индивидуума, подходящего для получения терапии рака простаты, содержащему: а) массив, содержащий один или несколько олигонуклеотидных зондов, комплементарных последовательностям, кодирующим по меньшей мере два варианта PDE4D, выбранные из PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 и PDE4D9, и способных гибридизоваться с ними, и необязательно содержащему один или несколько олигонуклеотидных зондов, комплементарных последовательностям по меньшей мере одного из стандартных генов, выбранных из TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALPHA-1 (TUBA1B) или ALAS-1, и способных гибридизоваться с ними, используемых для определения PDE-индекса, как определено в любом из предыдущих пунктов, b) контроль набора; и c) необязательные инструкции по применению.
Как правило, набор настоящего изобретения содержит одно или несколько средств, позволяющих специфически диагностировать маркерный ген (гены) или GOI, как определено выше. Средства или ингредиенты, входящие в состав набора настоящего изобретения, могут содержаться в одном или нескольких контейнерах или в отдельных структурных элементах. Природа средств определяется способом детекции, для которого предназначен набор.
Кроме того, набор может содержать количество известной молекулы нуклеиновой кислоты, которое можно использовать для калибровки набора или в качестве внутреннего контроля. Как правило, набор для детекции маркерного гена (генов) или продуктов экспрессии GOI может содержать вспомогательные ингредиенты, такие как ПЦР-буферы, dNTP, полимераза, ионы, такие как двухвалентные катионы или одновалентные катионы, растворы для гибридизации и т.д. Такие ингредиенты, известные специалистам в данной области, могут варьировать в зависимости от способа детекции. Кроме того, набор может содержать листок-вкладыш с инструкцией и/или информацию, касающуюся полученных результатов.
Дополнительный аспект изобретения относится к устройству для осуществления описанного здесь способа, содержащему: а) базу данных, включающую записи, содержащие значения экспрессии стандартных генов, связанные со статусами прогрессирования рака простаты, причем каждый стандартный профиль содержит уровни экспрессии по меньшей мере двух вариантов PDE4D, выбранных из группы, состоящей из PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 и PDE4D9, и/или b) пользовательский интерфейс, способный принимать и/или вводить выборку значений экспрессии генов из набора генов, причем набор содержит уровни экспрессии, по меньшей мере, двух вариантов PDE4D, выбранных из группы, состоящей из PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D7, PDE4D8 и PDE4D9, для применения в сравнении с профилями экспрессии стандартных генов из базы данных; c) выходное устройство, которое отображает прогноз статуса рака в соответствии с уровнями экспрессии набора генов.
Следующий аспект относится к компьютеризованному способу мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или статуса прогрессирования рака предстательной железы, включающему описанные здесь стадии.
В контексте настоящей заявки выражение "компьютеризованный способ мониторинга или прогнозирования рака предстательной железы или статуса прогрессирования рака предстательной железы" относится к способу, в котором программные алгоритмы вычисляют PDE-индекс и на основе его выводят прогноз для обследуемого пациента, причем в указанном способе используются необработанные данные, полученные при измерении уровня экспрессии упомянутых здесь генов, которые превращают в PDE-индекс с помощью указанного выше уравнения.
Другой аспект изобретения относится к стимуляторной фармацевтической композиции, предназначенной для применения в способе лечения или профилактики рака предстательной железы, которая содержит по меньшей мере один элемент, выбранный из следующей группы:
(а) соединение, непосредственно стимулирующее или модулирующее активность варианта PDE4D, выбранного из группы, состоящей из PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8, PDE4D9, предпочтительно аллостерический агонист ферментативной активности;
(b) соединение, косвенно стимулирующее или модулирующее активность варианта PDE4D по пункту (а);
(c) белок варианта PDE4D по пункту (a) или его биологически активный эквивалент;
(d) нуклеиновая кислота, кодирующая и экспрессирующая вариант PDE4D по пункту (a);
(e) ингибитор микроРНК, специфичный для микроРНК варианта PDE4D по пункту (a);
(f) деметилирующее средство; и
(g) фактор, замещающий фосфодиэстеразу, предпочтительно пептид, пептидомиметик, небольшая молекула, антитело или аптамер.
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к стимуляторной фармацевтической композиции, предназначенной для применения в способе лечения или профилактики рака предстательной железы, которая содержит по меньшей мере один элемент, выбранный из следующей группы:
(а) соединение, непосредственно стимулирующее или модулирующее активность варианта PDE4D, выбранного из группы, состоящей из PDE4D5, PDE4D8 и PDE4D9, предпочтительно аллостерический агонист ферментативной активности;
(b) соединение, косвенно стимулирующее или модулирующее активность варианта PDE4D по пункту (а);
(c) белок варианта PDE4D по пункту (a) или его биологически активный эквивалент;
(d) нуклеиновая кислота, кодирующая и экспрессирующая вариант PDE4D по пункту (a);
(e) ингибитор микроРНК, специфичный для микроРНК варианта PDE4D по пункту (a);
(f) деметилирующее средство; и
(g) фактор, замещающий фосфодиэстеразу, предпочтительно пептид, пептидомиметик, небольшая молекула, антитело или аптамер.
Другой аспект изобретения относится к ингибиторной фармацевтической композиции, предназначенной для применения в способе лечения или профилактики рака предстательной железы, которая содержит по меньшей мере один элемент, выбранный из следующей группы:
а) соединение, непосредственно ингибирующее активность варианта PDE4D, выбранного из группы, состоящей из PDE4D1, PDE4D2, PDE4D3, PDE4D4, PDE4D5, PDE4D6, PDE4D8, PDE4D9,
(b) соединение, косвенно ингибирующее активность варианта PDE4D по пункту (a);
(c) доминантно-негативная форма белка варианта PDE4D по пункту (a) или ее биологически активный эквивалент;
(d) нуклеиновая кислота, кодирующая и экспрессирующая доминантно-негативную форму варианта PDE4D по пункту (a);
(e) микроРНК, специфичная для варианта PDE4D по пункту (a);
(f) антисмысловая молекула варианта PDE4D по пункту (a);
(g) киРНК, специфичная для варианта PDE4D по пункту (a);
(h) аптамер, специфичный для продукта экспрессии варианта PDE4D по пункту (a), или для белка варианта PDE4D по пункту (a);
(i) небольшая молекула или пептидомиметик, способный специфически связываться с белком варианта PDE4D по пункту (a); и
(j) антитело, специфичное для белка варианта PDE4D по пункту (a) и/или вариант антитела, специфичного для белка варианта PDE4D по пункту (a),
где вариант PDE4D предпочтительно выбран из группы, состоящей из PDE4D5, PDE4D8, PDE4D9.
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к стимуляторной или ингибиторной фармацевтической композиции для лечения рака простаты, где композицию вводят индивидууму в зависимости от PDE-индекса, указывающего на статус прогрессирования рака простаты.
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к стимуляторной или ингибиторной фармацевтической композиции для лечения рака простаты, где композицию вводят индивидууму, если PDE-индекс в образце индивидуума указывает на прогрессирующий статус рака простаты.
В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере один из PDE-индекса_2, PDE-индекса_3, PDE-индекса_4 или PDE-индекса_5 в образце индивидуума имеет значение ниже предопределенного порогового уровня.
В другом предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере один из PDE-индекса_2, PDE-индекса_3, PDE-индекса_4 или PDE-индекса_5 в образце индивидуума имеет значение ниже контрольного уровня.
В другом предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере один из PDE-индекса_2, PDE-индекса_3, PDE-индекса_4 или PDE-индекса_5 в образце индивидуума имеет значение ниже контрольного уровня, где контрольный уровень представляет собой значение PDE-индекса_2, PDE-индекса_3, PDE-индекса_4 или PDE-индекса_5 соответственно в образце индивидуума.
Другой аспект изобретения относится к способу лечения индивидуума, страдающего от рака простаты, где способ включает
(i) выбор индивидуума, страдающего от рака предстательной железы, если PDE-индекс в полученном от индивидуума образце свидетельствует о прогрессирующем статусе рака предстательной железы, и
(ii) введение описанной здесь стимуляторной или ингибиторной фармацевтической композиции.
Другой аспект изобретения относится к способу лечения индивидуума, страдающего от рака простаты, где способ включает
(i) выбор индивидуума, страдающего от рака предстательной железы, если PDE-индекс в полученном от индивидуума образце свидетельствует о прогрессирующем статусе рака предстательной железы, и
(ii) введение описанной здесь стимуляторной или ингибиторной фармацевтической композиции.
Способ лечения индивидуума, страдающего от рака простаты, где способ включает
(i) выбор индивидуума, страдающего от рака предстательной железы, если по меньшей мере один из PDE-индекса_2, PDE-индекса_3, PDE-индекса_4 или PDE-индекса_5 в образце индивидуума имеет значение ниже предопределенного порогового уровня, и
(ii) введение описанной здесь стимуляторной или ингибиторной фармацевтической композиции.
Способ лечения индивидуума, страдающего от рака простаты, где способ включает
(i) выбор индивидуума, страдающего от рака предстательной железы, если по меньшей мере один из PDE-индекса_2, PDE-индекса_3, PDE-индекса_4 или PDE-индекса_5 в образце индивидуума имеет значение ниже предопределенного порогового уровня, and
(ii) введение описанной здесь стимуляторной или ингибиторной фармацевтической композиции.
2+
2+
Термин "соединение, непосредственно стимулирующее или модулирующее активность варианта PDE4D," в данном описании относится к соединению, способному увеличивать активность варианта PDE4D, заключающуюся в деградации цАМФ в результате ее непосредственного взаимодействия с вариантом PDE4D. Такое соединение может представлять собой непосредственный интерактор PDE4D, оказывающий положительное влияние на каталитическую активность варианта PDE4D. Указанное соединение предпочтительно представляет собой аллостерический агонист каталитической активности варианта PDE4D, например, гомотропный аллостерический модулятор. Предпочтительными аллостерическими агонистами варианта PDE4D являются цАМФ и аналоги цАМФ. Другие непосредственно стимулирующие соединения, охватываемые настоящим изобретением, представляют собой ионы, предпочтительно биологически активные моно- и бивалентные катионы, такие как Ca, Mg.
2+
2+
Термин "соединение, непосредственно стимулирующее или модулирующее активность PDE4D," в данном описании относится к соединению, способному увеличивать активность PDE4D, независимо от конкретного варианта, заключающуюся в деградации цАМФ в результате ее непосредственного взаимодействия с PDE4D. Такое соединение может представлять собой непосредственный интерактор PDE4D, оказывающий положительное влияние на каталитическую активность PDE4D. Указанное соединение предпочтительно представляет собой аллостерический агонист каталитической активности PDE4D, например, гомотропный аллостерический модулятор. Предпочтительными аллостерическими агонистами варианта PDE4D являются цАМФ и аналоги цАМФ. Другие непосредственно стимулирующие соединения, охватываемые настоящим изобретением, представляют собой ионы, предпочтительно биологически активные моно- и бивалентные катионы, такие как Ca , Mg .
Термин "соединение, непосредственно стимулирующее или модулирующее активность PDE4D," в данном описании относится к соединению, способному увеличивать активность PDE4D, независимо от конкретного варианта, заключающуюся в деградации цАМФ в результате ее взаимодействия с непосредственным интерактором PDE4D ("косвенный интерактор"), или посредством непрямого рабочего пути, не включающего взаимодействие с PDE4D. Такое соединение может представлять собой любой непосредственный интерактор интерактора PDE4D. Эффект, передающийся непосредственным интерактором интерактора PDE4D, может быть положительным, если интерактор PDE4D сам оказывает положительное влияние на активность PDE4D, или отрицательным, если интерактор PDE4D оказывает отрицательное влияние на активность PDE4D. Как правило, положительные косвенные интеракторы могут оказывать агонистический эффект по отношению к непосредственным интеракторам, например, они могут способствовать увеличению концентрации аллостерически работающих соединений, таких как цАМФ или его аналоги, путем ингибирования процессов деградации цАМФ, в которых не участвует PDE4D7, путем повышения продукции цАМФ и т.д.
Альтернативно такие положительно действующие косвенные интеграторы могут вызывать изменение характера связывания белков, непосредственно участвующих в связывании, приводя к увеличению активности PDE4D, независимо от конкретного варианта. Как правило, отрицательно действующие косвенные интеграторы могут оказывать ингибиторный эффект на ингибиторы PDE4D. Примерами таких интеракторов являются ингибиторы ферментативной активности, приводящей к деградации PDE4D, или белки, способные связываться с ингибиторами PDE4D и гасить их. Альтернативно такие интеракторы могут ингибировать активность, приводящую к деградации PDE4D, например, они могут представлять собой ингибиторы протеиназы. Другие примеры и способы их применения известны специалистам в данной области.
Термин "соединение, непосредственно стимулирующее или модулирующее активность варианта PDE4D," в данном описании относится к соединению, способному увеличивать активность варианта PDE4D, заключающуюся в деградации цАМФ в результате ее взаимодействия с непосредственным интерактором PDE4D7 ("косвенный интерактор"), или посредством непрямого рабочего пути, не включающего взаимодействие с вариантом PDE4D. Такое соединение может представлять собой любой непосредственный интерактор интерактора варианта PDE4D. Эффект, передающийся непосредственным интерактором интерактора варианта PDE4D, может быть положительным, если интерактор варианта PDE4D сам оказывает положительное влияние на активность варианта PDE4D, или отрицательным, если интерактор варианта PDE4D оказывает отрицательное влияние на активность варианта PDE4D. Как правило, положительные косвенные интеракторы могут оказывать агонистический эффект по отношению к непосредственным интеракторам, например, они могут способствовать увеличению концентрации аллостерически работающих соединений, таких как цАМФ или его аналоги, путем ингибирования процессов деградации цАМФ, в которых не участвует PDE4D7, путем повышения продукции цАМФ и т.д.
Альтернативно такие положительно действующие косвенные интеграторы могут вызывать изменение характера связывания белков, непосредственно участвующих в связывании, приводя к увеличению активности варианта PDE4D. Как правило, отрицательно действующие косвенные интеграторы могут оказывать ингибиторный эффект на ингибиторы варианта PDE4D. Примерами таких интеракторов являются ингибиторы ферментативной активности, приводящей к деградации варианта PDE4D, или белки, способные связываться с ингибиторами варианта PDE4D и гасить их. Альтернативно такие интеракторы могут ингибировать активность, приводящую к деградации варианта PDE4D, например, они могут представлять собой ингибиторы протеиназы. Другие примеры и способы их применения известны специалистам в данной области.
Альтернативно косвенная стимуляция активности PDE4D может осуществляться соединениями, участвующими в активации, защите или поддержании экспрессии эндогенного гена PDE4D. Примерами таких соединений являются специфические факторы транскрипции PDE4D, факторы, стабилизирующие мРНК, специфичную для PDE4D или варианта PDE4D, или факторы сплайсинга PDE4D/PDE4D-специфичные факторы сплайсинга. Другие примеры и способы их применения известны специалистам в данной области.
"Белок варианта PDE4D", входящий с состав стимуляторной фармацевтической композиции, может представлять собой описанный выше белок варианта PDE4D. В частности, он может представлять собой белок, кодируемый сплайсинг-вариантом 1, 2, 4, 5, 6, 8, 9 человеческой фосфодиэстеразы PDE4D, как указано в настоящем описании. В данном контексте "белок варианта PDE4D" также содержит аминокислотные последовательности, по меньшей мере на 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичные последовательности, описанной в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 или 18, и аминокислотные последовательности, кодируемые нуклеотидными последовательностями, по меньшей мере на 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичными последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 9, 7, 9, 11, 15 или 17.
"Белок PDE4D", входящий в состав стимуляторной фармацевтической композиции, может представлять собой описанный выше белок варианта PDE4D, смесь нескольких вариантов PDE4D, или укороченную версию варианта PDE4D, образование которой характерно, по меньшей мере, для двух вариантов PDE4D.
Термин "биологически активныей эквивалент PDE4D" в данном описании относится к белку PDE4D, способному выполнять все функции PDE4D, или большую часть функций PDE4D, свойственных нескольким вариантам PDE4D. Предпочтительно он относится к белкам, способным разрушать цАМФ.
Термин "биологически активныей эквивалент варианта PDE4D" в данном описании относится к белку варианта PDE4D, способному выполнять все функции варианта PDE4D, или большую часть функций варианта PDE4D. Предпочтительно он относится к белкам, способным разрушать цАМФ.
PDE4D, варианты PDE4D, или биологически активные эквиваленты PDE4D или варианты PDE4D настоящего изобретения можно получить рекомбинантным способом с использованием любого подходящего метода, известного специалистам в данной области. Таким образом, настоящее изобретение также охватывает способы получения PDE4D, вариантов PDE4D, или биологически активных эквивалентов PDE4D или вариантов PDE4D.
Соответственно, настоящее изобретение охватывает векторы, содержащие олигонуклеотиды, кодирующие описанные выше PDE4D, варианты PDE4D, или биологически активные эквиваленты PDE4D или варианты PDE4D, клетки-хозяева, а также способы получения PDE4D или биологически активных эквивалентов PDE4D рекомбинантными методами.
Подходящий вектор может представлять собой, например, фаг, плазмиду, вирусный или ретровирусный вектор. Ретровирусные векторы могут быть компетентными по репликации, или дефектными по репликации. В последнем случае размножение вируса, как правило, происходит только в клетках-хозяевах. Полинуклеотиды, кодирующие PDE4D, варианты PDE4D, или биологически активные эквиваленты PDE4D или варианты PDE4D, можно присоединить к вектору или носителю, содержащему селектируемый маркер для размножения в организме хозяина. Соответствующая полинуклеотидная вставка может быть функционально связана с подходящим промотором, таким как промотор фага лямбда PL, промоторы E. coli lac, trp, phoA и tac, ранний и поздний промоторы SV40, а также промоторы ретровирусных LTR, или промотор PSA. Другие подходящие промоторы известны специалистам в данной области. Конструкции, обеспечивающие экспрессию, также могут содержать участки инициации и терминации транскрипции, а в транскрибируемой последовательности они могут содержать участок связывания с рибосомой, необходимый для трансляции. Кодирующий фрагмент транскриптов, экспрессируемых конструкциями, предпочтительно содержит кодон инициации трансляции в начале и кодон терминации (UAA, UGA или UAG), соответственно, расположенный в конце транслируемой последовательности, кодирующей полипептид.
Полипептиды или белки могут быть гликозилированными или негликозилированными, или они могут быть модифицированы другим способом. Кроме того, полипептиды или белки также могут содержать в начале модифицированный остаток метионина, в некоторых случаях образующийся в результате процессов, протекающих в организме хозяина. Кроме того, полипептид, белок или пептид можно модифицировать путем ацетилирования, пегилирования, HESилирования, формилирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации с использованием известных защитных/блокирующих групп, путем специфического химического расщепления, протеолитического расщепления, образования связи с клеточным лигандом или другим белком, гапилирования, т.е. присоединения обогащенного глицином гомоаминокиислотного полимера (HAP), и др. Такие модификации можно осуществлять с помощью подходящих методов, известных специалистам в данной области. Кроме того, полипептид, пептид или вариант может содержать одну или несколько неклассических аминокислот.
Кроме того, PDE4D, варианты PDE4D, или биологически активные эквиваленты PDE4D или варианты PDE4D настоящего изобретения можно синтезировать химически с помощью известных в данной области способов, например, с использованием пептидного синтезатора.
"Полинуклеотид" представляет собой полимерную форму, состоящую из нуклеотидов, либо рибонуклеотидов, либо дезоксирибонуклеотидов. Этот термин относится только к первичной структуре молекулы. Так, данный термин включает двух- и одноцепочечные ДНК и РНК. Он также охватывает известные типы модификаций, такие как присоединение меток, известных в данной области, метилирование, "кэпирование", замещение одного или нескольких природных нуклеотидов аналогами, межнуклеотидные модификации, такие как незаряженные связи (например, фосфоротиоатные связи, фосфородитиоатные связи и т.д.), а также немодифицированные формы олигонуклеотидов.
"Нуклеиновая кислота, кодирующая и экспрессирующая PDE4D," входящая в состав описанной выше стимуляторной фармацевтической композиции, может представлять собой любой подходящий элемент-носитель, например, описанный выше, который содержит экспрессируемый ген PDE4D.
"Нуклеиновая кислота, кодирующая и экспрессирующая вариант PDE4D," входящая в состав описанной выше стимуляторной фармацевтической композиции, может представлять собой любой подходящий элемент-носитель, например, описанный выше, который содержит экспрессируемый ген PDE4D. Предпочтительно такой элемент-носитель может содержать нуклеотидную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15 или 17. Такой элемент-носитель также может содержать нуклеотидную последовательность, обладающую высокой степенью гомологии с вариантом PDE4D, например, нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15 или 17, или нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную последовательности, описанной в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 или 18. Альтернативно носитель может содержать геномную последовательность PDE4D, предпочтительно последовательность, указанную в базе данных ENSEMBL как ENSG00000113448 (версия ENSG00000113448.8, выпуск Ensembl 53 - март 2009), которая соответствует SEQ ID NO: 19, или последовательность, полученную из Genbank под № AC008934 (версия AC008934.5, GI:17386235, 24 марта 2009), в сочетании с последовательностью Genbank № AC034234 (версия AC034234.4, GI:18390182, 24 марта 2009), или последовательность, полученную Wang et al., 2003, Cell Signal., 15(9): 883-91. Более предпочтительно, носитель может содержать геномную последовательность PDE4D, описанную в SEQ ID NO: 19.
Кроме того, описанные выше биологически активные эквиваленты PDE4D или варианты PDE4D могут входить в состав носителя настоящего изобретения.
Полинуклеотид, кодирующий PDE4D или варианты PDE4D, предпочтительно присоединяют к вектору, содержащему селектируемый маркер для размножения в клетке человека. В предпочтительном варианте осуществления полинуклеотидная вставка может быть функционально связана с промотором PSA.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения нуклеиновые кислоты, кодирующие и экспрессирующие PDE4D или варианты PDE4D, как указано выше, можно получить с использованием живых терапевтических систем. Термин "живые терапевтические системы" означает, что описанные выше PDE4D, или варианты PDE4D, или биологически активные эквиваленты PDE4D или варианты PDE4D, экспрессируются в любом подходящем живом носителе. Соответственно, настоящее изобретение относится к соответствующим полинуклеотидам, подходящим для экспрессии в живой клетке. Настоящее изобретение также относится к векторам, содержащим такие полинуклеотиды, подходящим клеткам-хозяевам, и к рекомбинантным способам получения полипептидов в указанных клетках-хозяевах.
Термин "живой носитель" относится к любым подходящим живым клеткам-хозяевам или вирусам, известным специалистам в данной области. Типичные примеры подходящих хозяев включают , без ограничения, бактериальные клетки, такие как Escherichia coli или Lactobacillus, грибковые клетки, такие как клетки дрожжей, клетки простейших, клетки насекомых или клетки животных. Предпочтительно данный термин относится к ослабленным бактериям, ослабленным грибковым клеткам ослабленным простейшим. Типичные примеры подходящих вирусов включают аденовирусы, ретровирусы или лентивирусы, предпочтительно ослабленные вирусы из группы аденовирусов, ретровирусов или лентивирусов. В предпочтительном варианте осуществления можно использовать пробиотические бактериальные клетки, в частности пробиотические клетки Escherichia coli или Lactobacillus. Более предпочтительно используют клетки Escherichia coli Nissle 1973 и еще более предпочтительно используют клетки Lactobacillus casei или Lactobacillus zeae 393.
"Ингибитор микроРНК, специфичный для микроРНК PDE4D", входящий в состав описанной здесь стимуляторной фармацевтической композиции, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую нуклеотидную последовательность, комплементарную микроРНК PDE4D или молекуле микроРНК, не обладающей селективностью в отношении конкретного варианта PDE4D.
"Ингибитор микроРНК, специфичный для микроРНК варианта PDE4D", входящий в состав описанной здесь стимуляторной фармацевтической композиции, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую нуклеотидную последовательность, комплементарную микроРНК варианта PDE4D молекуле микроРНК.
Термин "комплементарность" в данном описании относится к полной комплементарности нуклеиновой кислоты-ингибитора микроРНК (смысловая молекула) и микроРНК (антисмысловая молекула) при отсутствии каких-либо несовпадений, а также случаев, в которых нуклеиновая кислота содержат несовпадающие основания и/или дополнительные нуклеотиды или пропуски нуклеотидов по сравнению с молекулой микроРНК. В других вариантах осуществления две молекулы содержат одно или несколько несовпадений оснований, или различаются по общему числу нуклеотидов (вследствие добавлений или делеций). В других вариантах осуществления "комплементарная" молекула нуклеиновой кислоты-ингибитор микроРНК содержит по меньшей мере десять смежных нуклеотидов, полностью комплементарных последовательности, входящей в состав молекулы микроРНК.
Как правило, молекулы нуклеиновых кислот-ингибиторы микроРНК представляют собой природные молекулы ДНК или РНК, или синтетические молекулы нуклеиновых кислот, содержащие в своей последовательности один или несколько модифицированных нуклеотидов, которые могут относится к одному типу, или к нескольким разным типам.
Настоящее изобретение охватывает такую молекулу нуклеиновой кислоты-ингибитор микроРНК, которая содержит по меньшей мере один элемент рибонуклеотидного скелета и по меньшей мере один элемент дезоксирибонуклеотидного скелета. Кроме того, молекула нуклеиновой кислоты-ингибитор микроРНК может содержать одну или несколько модификаций РНК-скелета, включающих образование 2'-O-метильной группы или 2'-O-метоксиэтильной группы (также называемых "2'-O-метилирование"), которые предотвращают деградацию под действием нуклеазы в культуральной среде и, что важно, также предотвращают эндонуклеолитическое расщепление под действием нуклеазы индуцированного РНК комплекса сайленсинга, приводящее к необратимому ингибированию микроРНК. Другая возможная модификация, функционально эквивалентная 2'-O-метилированию, приводит к образованию запертых нуклеиновых кислот (LNA), представляющих собой аналоги нуклеиновых кислот, содержащие в качестве мономеров один или несколько LNA-нуклеотидов, как указано выше.
Другой класс соединений, приводящих к сайленсингу экспрессии микроРНК и подходящих для применения в контексте настоящего изобретения, включает химически сконструированные олигонуклеотиды, называемые "антагомирами", которые представляют собой одноцепочечные молекулы РНК, конъюгированные с холестерином. Молекула указанного соединения может содержать от 19 до 25 нуклеотидов. Предпочтительно такая молекула содержит 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов. Более предпочтительно молекула содержит 23 нуклеотида (более подробное описание можно найти в Krutzfeldt et al., 2005, Nature, 438: 685-689).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения описанные выше ингибиторы микроРНК могут предоставляться в составе векторов экспрессии, предназначенных для введения в ткань или клетки. Альтернативно такие векторы также можно вводить в описанные выше живые терапевтические системы.
Как правило, РНК получают с использованием трансгенов, поставляемых векторами или носителями, обеспечивающими трансфекцию или транзиентную экспрессию. Например, конкурентные ингибиторы микроРНК можно получить в виде транскриптов, экспрессированных с использованием сильных промоторов, которые содержат более одного, предпочтительно несколько тандемных участков связывания представляющей интерес микроРНК. "МикроРНК-губка", описанная в Ebert et al., 2007, Nat. Methods, 4: 721-726, является неограничивающим примером такого метода.
"Деметилирующее средство", входящее в состав описанной здесь стимуляторной фармацевтической композиции, представляет собой средство, способное деметилировать структуры хроматина, предпочтительно участки промоторов, более предпочтительно участки промотора PDE4D или варианта PDE4D. Примерами деметилирующих средств, подходящих для применения в контексте настоящего изобретения, являются 5-аза-2'-дезоксицитидин и 5-азацитидин, способные реактивировать гены, подвергшиеся ненадлежащему сайленсингу в результате структурных изменений хроматина, включающих метилирование ДНК, где указанные средства способны аннулировать данные изменения и, следовательно, восстановить основные клеточные пути. Как правило, это приводит к возобновлению экспрессии гена и обратному развитию некоторых аспектов трансформированного состояния. 5-Азацитидин и 5-аза-2'-дезоксицитидин обычно инактивируют цитозин(C5)-ДНК-метилтрансферазу посредством образования стабильных комплексов между остатками 5-аза-2'-дезоксицитидина в молекуле ДНК и ферментом, имитируя стабильную промежуточную фазу переходного состояния при связывании с ферментом метилтрансферазой.
Другим средством, которое может входить в состав стимуляторной фармацевтической композиции настоящего изобретения, само по себе, или в сочетании с 5-аза-2'-дезоксицитидином и/или 5-азацитидином, является трихостатин A (TSA).
"Фактор замещения фосфодиэстеразы", входящий в состав описанной выше стимуляторной фармацевтической композиции, представляет собой соединение, способное препятствовать взаимодействию, или нарушать взаимодействие фосфодиэстераз, в частности PDE4D, независимо от конкретного варианта PDE4D, с партнером по взаимодействию или интерактором. Такой процесс в конечном счете может привести к ассоциации PDE, в частности PDE4D, независимо от конкретного варианта PDE4D, с другими партнерами по взаимодействию, отличными от упомянутых ранее, и, как следствие, к перераспределению PDE. Такие новые партнеры по взаимодействию могут блокировать PDE, в частности PDE4D, независимо от конкретного варианта PDE4D, и, соответственно, модифицировать клеточные параметры, например, они могут оказывать влияние на связывание рецепторов, или на другие нижестоящие формы активности. Примерами белковых партнеров, которые могут участвовать в такой реакции замещения и/или блокировать PDE, в частности PDE4D7, являются якорные белки, такие как AKAP, каркасные белки, такие как DISC1, бета-аррестин или RACK1, регуляторные белки, такие как XAP2/AIP/ARA9, цАМФ-связывающие белки, такие как субъединицы PKA-R или EPAC, или рецепторы, такие как бета1-адренорецептор, а также ферменты, такие как ERK.
Предпочтительными факторами замещения фосфодиэстераз являются пептиды, пептидомиметики, малые молекулы, антитела и аптамеры.
Термин "пептид", используемый в применении к фактору замещения фосфодиэстераз, относится к последовательности аминокислот, присутствующей в молекуле фосфодиэстеразы, или составляющей молекулу фосфодиэстеразы, которая может являться общей для нескольких вариантов PDE4D, или специфической для определенного варианта PDE4D, или которая может взаимодействовать или блокировать белок, как указано выше. Длина аминокислотной последовательности, входящей в состав пептида, может составлять от 5 до 100 аминокислот, предпочтительно от 10 до 50 аминокислот, более предпочтительно от 20 до 30 аминокислот. Последовательности могут быть полностью идентичными последовательностям PDE или белка-интерактора, или их фрагментам, или они могут содержать вариации. Например, пептидная последовательность может содержать модифицированные аминокислотные остатки, составляющие до 25% от всех положений, предпочтительно она содержит модификации, которые не изменяют структурные свойства или связывающие свойства молекулы. Альтернативно аминокислотная последовательность, входящая в состав пептида, может образовывать пространственные домены PDE или белка-интерактора и, следовательно, может содержать в непосредственной близости аминокислотные цепочки, которые не соприкасаются в первичной последовательности молекулы.
Термин "пептидомиметик", используемый в применении к фактору замещения фосфодиэстераз, относится к маленькой протеиноподобной цепи, имитирующей пептид. Такой пептидомиметик можно получить в результате модификации существующего пептида, например, описанного выше пептида, приводящей к изменению свойств молекулы. Пептидомиметик можно получить в результате модификации, изменяющей стабильность или связывающую способность молекулы. Указанные модификации обычно представляют собой изменения пептида, которые не встречаются в природе. Например, пептидомиметик настоящего изобретения может содержать измененный пептидный скелет или неприродные аминокислоты. Предпочтительно пептидомиметик настоящего изобретения может представлять собой последовательность молекулы фосфодиэстеразы, либо общую для нескольких вариантов PDE4D, либо специфическую для определенного варианта PDE4D, или последовательность взаимодействующего или блокирующего белка, описанного выше.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения пептидомиметик может блокировать взаимодействие PDE, либо нескольких вариантов PDE4D, либо селективно конкретного варианта PDE4D, с ее интерактором. В другом варианте осуществления настоящего изобретения пептидомиметик может усиливать взаимодействие PDE, либо нескольких вариантов PDE4D, либо селективно конкретного варианта PDE4D, с ее интерактором.
Способы и методы получения пептидомиметиков, а также анализы, используемые для тестирования пептидомиметиков, известны специалистам в данной области.
Термин "малая молекула", используемый в применении к фактору замещения фосфодиэстераз, относится к низкомолекулярному органическому соединению, которое предпочтительно обладает биологической активностью, т.е. представляет собой биомолекулу, но предпочтительно не является полимером. Такое органическое соединение может иметь любую подходящую форму, или обладать любыми химическими свойствами. Такое соединение может представлять собой природное соединение, такое как вторичный метаболит, или искусственное соединение, сконструированное и полученное de novo. В одном варианте осуществления настоящего изобретения малая молекула способна блокировать взаимодействие PDE, либо нескольких вариантов PDE4D, либо селективно конкертного варианта PDE4D, с ее интерактором. В другом варианте осуществления настоящего изобретения малая молекула может усиливать взаимодействие PDE, в частности PDE4D7, с ее интерактором. Способы и методы идентификации и получения малых молекул, а также анализы, используемые для тестирования малых молекул, известны специалистам в данной области.
Термины "антитело" или "аптамер", используемые в применении к фактору замещения фосфодиэстераз, относятся к антителу, специфичному к PDE4D, либо к нескольким вариантам PDE4D, либо селективно к конкретному варианту PDE4D, или к описанному выше варианту или фрагменту антитела, или к автамеру, специфичному к PDE4D7, либо к нескольким вариантам PDE4D, либо селективно к конкретному варианту PDE4D, как указано выше, где антитело или аптамер способны препятствовать взаимодействию, или нарушать взаимодействие PDE, либо нескольких вариантов PDE4D, либо селективно конкретного варианта PDE4D, с одним или несколькими из ее интеракторов. Альтернативно данные термины также могут относиться к антителам или аптамерам, способным связываться с одним или несколькими из интеракторов PDE4D/варианта PDE4D, как описано выше, и подобным образом обладающим способностью препятствовать взаимодействию, или нарушать взаимодействие PDE, либо нескольких вариантов PDE4D, либо селективно конкретного варианта PDE4D, с одним или несколькими из ее интеракторов. Способы получения или тестирования антител или аптамеров описаны выше и/или известны специалистам в данной области.
Следующий аспект изобретения относится к компьютерному программному продукту, содержащему машиночитаемый код, хранящийся на машиночитаемом носителе или загружаемый из коммуникационной сети, который при использовании на компьютере выполняет одну или несколько стадий, или все стадии любого из описанных здесь способов.
Можно использовать любое сочетание одного или нескольких машиночитаемых носителей. Машиночитаемый носитель может представлять собой машиночитаемый носитель сигнала или машиночитаемый носитель данных. Машиночитаемый носитель данных может включать , без ограничения, электронные, магнитные, оптические, электромагнитные, инфракрасные или полупроводниковые системы, аппараты или устройства, или их любые подходящие сочетания. Более конкретные примеры (неполный перечень) машиночитаемого носителя данных включают: электрическое соединение, имеющее один или несколько проводов, портативную компьютерную дискету, жесткий диск, оперативное запоминающее устройство (ОЗУ), постоянное запоминающее устройство (ПЗУ), стираемое программируемое постоянное запоминающее устройство (EPROM или флэш-память), оптическое волокно, портативное запоминающее устройство для чтения компакт-дисков (CD-ROM), оптическое запоминающее устройство, магнитное запоминающее устройство или их любое подходящее сочетание. В контексте этого документа машиночитаемый носитель данных может представлять собой любой материальный носитель, который может содержать или хранить программу для использования или в связи с системой, аппаратом или устройством для выполнения команд.
Машиночитаемый носитель сигнала может включать передаваемый сигнал данных с машиночитаемым программным кодом, воплощенным в нем, например, в полосе частот или как часть несущей волны. Такой распространяемый сигнал может принимать любую из ряда форм, включающих , без ограничения, электромагнитную, оптическую или их любое подходящее сочетание. Машиночитаемый носитель сигнала может представлять собой любой машиночитаемый носитель, который не является машиночитаемым носителем данных и который может передавать, распространять или транспортировать программу для использования или в связи с системой, аппаратом или устройством выполнения команд.
Программный код, воплощенный на машиночитаемом носителе, может быть передан с использованием любого подходящего носителя, включающего , без ограничения, беспроводной, проводной, волоконно-оптический кабель, RF и т.д., или их любое подходящее сочетание.
Компьютерный программный код для выполнения операций в соответствии с аспектами настоящего изобретения может быть написан с использованием любого сочетания одного или нескольких языков программирования, включая объектно-ориентированный язык программирования, такой как Java, Smalltalk, C++ и т.п., и обычные языки программирования процедур, такие как язык программирования "C" или аналогичные языки программирования. Программный код может выполняться полностью на компьютере пользователя, частично на компьютере пользователя в виде автономного программного пакета, частично на компьютере пользователя и частично на удаленном компьютере, или полностью на удаленном компьютере или сервере. В последнем случае удаленный компьютер может быть соединен с компьютером пользователя через сеть любого типа, включая локальную сеть (LAN) или глобальную сеть (WAN), или может быть выполнено соединение с внешним компьютером (например, через Интернет посредством Интернет-провайдера).
Указанные инструкции для компьютерной программы также могут храниться на машиночитаемом носителе и определенным образом направлять работу компьютера, другого программируемого устройства для обработки данных или другого устройства, так, чтобы с помощью инструкций, хранящихся на машиночитаемом носителе, включая инструкции, которые реализуют указанную здесь функцию/действие, можно было получить изделие производства.
Инструкции для компьютерной программы также можно загрузить на компьютер, другое программируемое устройство для обработки данных, или на другие устройства, чтобы инициировать ряд рабочих стадий, которые должны выполняться на компьютере, другом программируемом устройстве, или других устройствах, и осуществить выполняемый компьютером процесс так, чтобы инструкции, которые выполняются на компьютере или другом программируемом устройстве, обеспечивали выполнение процессов для реализации указанных здесь функций/действий.
ПРИМЕРЫ
Выбор гена для определения индекса PDE (PDE-индекса) рака простаты:
Чтобы выбрать гены-кандидаты для определения PDE-индекса, транскрипты разных PDE4D (выбранных из девяти описанных в настоящее время изоформ PDE4D1 - PDE4D9) исследуют на корреляцию с общепризнанным прогностическим генным маркером PDE4D7, описанным в WO2010131194 и WO2010131195.
Чтобы определить PDE-индекс рака простаты, используют следующие наборы данных:
4) Taylor BS et al. Integrative Genomic Profiling of Human Prostate Cancer. Cancer Cell 18, 11-22, 2010 <i>(GEO data set ID: GSE21032)</i>
5) Boormans JL et al. Identification of TDRD1 as a direct target gene of ERG in primary prostate cancer. Int J Cancer 2013 Jul 15; 133(2):335-45 <i>(GEO data set ID: GSE41408)</i>
6) Brase JC et al; TMPRSS2-ERG -specific transcriptional modulation is associated with prostate cancer biomarkers and TGF-b signaling. BMC Cancer 2011, 11, 507-515<i> (GEO data set ID: GSE29079)</i>
<u>Для дополнительной проверки и подтверждения PDE-индекса рака простаты используют следующий набор данных</u>:1) Erho N et al. Discovery and Validation of a Prostate Cancer Genomic Classifier that Predicts Early Metastasis Following Radical Prostatectomy. PLoS One 8(6), e66855 (2013)<i> (GEO data set ID: GSE46691)</i>
Обработка данных по экспрессии гена GSE
Соответствующие файлы CEL загружают из GEO (Gene Expression Omnibus): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/. Данные, содержащиеся в файле CEL, загружают в экспрессионную консоль (Affymetrix Inc; Build 1.3.1.187) и предварительно обрабатывают с использованием файлов, содержащих описание подходящего набора зондов, поставляемых Affymetrix Inc., если это необходимо, т.е., наборы данных обрабатывают на платформе Affymetrix Inc: GSE21032, GSE41408, GSE25136.
Значения экспрессии отдельных изоформ PDE4D, PDE4D1-PDE4D9, определяют, используя значения полученных от экзонового чипа сигналов наборов зондов Affymetrix Human Exon 1.0 ST Array, как показано на фигуре 1. Примечание: при анализе экспрессии близкородственных изоформ PDE4D1 и PDE4D2 используют только один набор зондов и соответствующую активность указывают для обоих изоформ вместе (PDE4D1&2). Для транскриптов всех других PDE4D используют несколько наборов зондов, чтобы рассчитать экспрессию соответствующей изоформы, приведенную в виде среднего значения, полученного для одного варианта PDE4D при использовании разных наборов зондов.
Процедура нормализации результатов количПЦР в режиме реального времени (количественной ПЦР в режиме реального времени)
Cancer Res.,
Genome Biol.,
Стандартные гены характеризуются стабильной экспрессией независимо от исследуемого образца, что позволяет их использовать в качестве внутреннего стандарта для нормализации выходных значений Cq, полученных с помощью анализа ПЦР, чтобы результаты можно было сопоставлять независимо от количества используемого на входе образца. Хотя такие гены должны быть стабильными, в их экспрессии всегда присутствует некоторая вариабельность, кроме того, их стабильность также может зависеть от типа анализируемой ткани. По этой причине рекомендуется использовать несколько стандартных генов для нормализации значений Cq ПЦР, кроме того рекомендуется использовать набор генов, которые характеризуются низкой вариабельностью в ткани/образце конкретного типа, подлежащих анализу C. L. Andersen, J. L. Jensen, and T. F. Ørntoft, "Normalization of Real-Time Quantitative Reverse Transcription-PCR Data: A Model-Based Variance Estimation Approach to Identify Genes Suited for Normalization, Applied to Bladder and Colon Cancer Data Sets," vol. 64, no. 15, pp. 5245-5250, Aug. 2004, J. Vandesompele, K. De Preter, F. Pattyn, B. Poppe, N. Van Roy, A. De Paepe, and F. Speleman, "Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes," vol. 3, no. 7, p. RESEARCH0034, Jun. 2002).
Genome Biol.,
Проводят первоначальный выбор 9 стандартных генов для использования в данном исследовании. Окончательный выбор набора стандартных генов, используемых для нормализации всех анализируемых клинических образцов, проводят с помощью программного обеспечения Biogazelle Software (qBase+ с анализом GeNorm J. Hellemans, G. Mortier, A. D. Paepe, F. Speleman, and J. Vandesompele, "qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data," vol. 8, no. 2, p. R19, Feb. 2007).
Выходные значения Cq, полученные с помощью анализа ПЦР, являются внутренне логарифмическими (основание 2) и обратно пропорциональными количеству мРНК, присутствующей в образце. Авторы используют следующую формулу для нормализации исходных значений Cq:
Cq
Cq
Cq
исследуемого гена
стандартного гена
исследуемого гена
N()=Среднее()-()
Cq
Cq
Cq
исследуемого гена
стандартного гена
исследуемого гена
Где N() представляет собой нормализованное значение экспрессии исследуемого гена; Среднее() представляет собой среднее арифметическое полученных методом ПЦР значений Cq выбранного сочетания стандартных генов; и () представляет собой полученное методом ПЦР значение Cq исследуемого гена.
Если для измерения экспрессии стандартных генов или исследуемых генов используют технологии, отличные от количПЦР в режиме реального времени, значение Cq PCR заменяют нормализованным значением, используемым в соответствующей технологии (таким как RMA (робастное среднее от нескольких массивов), нормализованное значение экспрессии генов, определяемой с помощью микрочипов ДНК, или FPKM (число фрагментов на тысячу оснований экзона на миллион картированных фрагментов) - нормализованное значение экспрессии генов, полученное методом секвенирования РНК).
Нормализованные уровни экспрессии транскриптов PDE4D в разных тканях рака простаты, полученные из двух наборов данных Taylor et al,, Integrative Genome Profiling of Human Prostate Cancer, Cancer Cell 18, 11-22, 2010 (GSE21034 (NCBI GEO)) и Boormans et al., Identification of TDRD1 as a direct target gene of ERG in primary prostate cancer, Int J Cancer 2013 Jul 15; 133(2):335-45 (GSE41410 (NCBI GEO)) показаны на фигурах 10-13. Экспрессию транскриптов нормализуют по следующим стандартным генам: HPRT1, PUM1, TBP и TUBA1B. Используемые данные включают общедоступные результаты экспрессии массива экзонов, то есть измеряют экспрессию разных экзонов одного гена с использованием ряда наборов зондов экзонов, направленных на разные экзоны соответствующего гена, как описано выше. На первой стадии log2 экспрессии всех наборов зондов для стандартных генов используют для вычисления среднего значения экспрессии стандартного гена. Аналогичную процедуру проводят для разных наборов зондов, направленных на отдельные транскрипты 4D. Затем среднее значение стандартных генов вычитают из среднего значения экспрессии транскрипта 4D. Результатом является нормализованное значение уровня экспрессии транскрипта PDE4D. Как можно видеть, разные транскрипты 4D подвергаются изоформа-специфичной регуляции в разных тканях (варьирующих от нормальной простаты, первичного рака простаты с разным потенциалом до рака, прогрессирующего после первичного лечения (BCR=биохимический рецидив, CR=клинический рецидив с метастазами) с образованием метастатических тканей (гормон-наивных, т.е. еще не подвергавшихся антиандрогенной терапии, и гормоноустойчивых, то есть подвергавшихся антиандрогенной терапии). Например, PDE4D3 и PDE4D6 не экспрессируются на высоком уровне по сравнению с другими транскриптами 4D, экспрессия PDE4D4 по существу не изменяется в разных тканях, экспрессия PDE4D5 и PDE4D9 снижается при переходе от нормальных тканей к гормоноустойчивым, тогда как PDE4D7 экспрессируется на повышенном уровне в тканях первичного рака простаты, а затем снова снижается в других тканях.
Определение PDE-индекса с помощью компьютера (на основе результатов количественной ПЦР в режиме реального времени)
i) PDE-индекс_1: PDE4D7_exp - PDE4D5_exp,
где
Cq
Cq
PDE4D7
PDE4D5
PDE4D7_exp представляет собой (N()), а PDE4D5_exp представляет собой(N())
ii) PDE-индекс_2: Среднее(PDE4D7_exp и PDE4D5_exp),
где
Cq
Cq
PDE4D7
PDE4D5
PDE4D7_exp представляет собой (N()), а PDE4D5_exp представляет собой (N())
iii) PDE-индекс_3: (Среднее(PDE4D5_exp, PDE4D7_exp и PDE4D9_exp))/(PDE4D4_exp)
где
Cq
Cq
Cq
Cq
PDE4D5
PDE4D7
PDE4D9
PDE4D4
PDE4D5_exp представляет собой (N()), PDE4D7_exp представляет собой (N()), PDE4D9_exp представляет собой (N()), а PDE4D4_exp представляет собой (N())
и где
(Среднее(PDE4D5_exp, PDE4D7_exp и PDE4D9_exp)) представляет собой среднее арифметическое от PDE4D5_exp, PDE4D7_exp и PDE4D9_exp
iv) PDE-индекс_4: (Среднее(PDE4D5_exp, PDE4D7_exp и PDE4D9_exp))/(PDE4D1 и PDE4D2_exp)
где
Cq
Cq
Cq
Cq
PDE4D5
PDE4D7
PDE4D9
PDE4D1
_2
PDE4D5_exp представляет собой (N()), PDE4D7_exp представляет собой (N()), PDE4D9_exp представляет собой (N()), а PDE4D1 и PDE4D2_exp представляет собой (N())
и где
(Среднее(PDE4D5_exp, PDE4D7_exp и PDE4D9_exp)) представляет собой среднее арифметическое от PDE4D5_exp, PDE4D7_exp и PDE4D9_exp
v) PDE-индекс_5: (Среднее(PDE5_exp, PDE7_exp и PDE4D9_exp))
где
Cq
Cq
Cq
PDE4D5
PDE4D7
PDE4D9
PDE4D5_exp представляет собой (N()), PDE4D7_exp представляет собой (N()), и PDE4D9_exp представляет собой (N())
и где
(Среднее(PDE4D5_exp, PDE4D7_exp и PDE4D9_exp)) представляет собой среднее арифметическое от PDE4D5_exp, PDE4D7_exp и PDE4D9_exp
Рассчитанные PDE-индексы можно использовать в любых других статистических анализах данных.
Анализ корреляции PDE-индекса с клиническими параметрами с определением результативности лечения пациента
Все статистические анализы (например, анализ логистической регрессии, анализ ROC, анализ регрессии COX и т.д.) PDE-индексов и их корреляцию с результатами лечения пациентов по сравнению с такими клиническими параметрами, как PSA, pGleason, стадия pT, проводят с использованием XLSTAT версии 2014.1.03
Результаты
На фигуре 3 показан обзор дифференциальной нормированной экспрессии отдельных изоформ PDE4D, а также четырех вариантов PDE-индексов для сравнения в разных группах пациентов по двум наборам данных экспрессии генов. Проводят следующие попарные сравнения пациентов:
i) NAT и первичный PCa, NP
ii) Первичный PCa, NP, и первичный PCa, BCR&CR
iii) Первичный PCa, NP&BCR, и первичный PCa, CR
iv) Первичный PCa (все типы) и метастазы
v) Первичный PCa (все типы) и CRPC
где
- NAT представляет собой нормальную соседнюю ткань, то есть ткань, собранную вблизи опухолевого поражения из материала пациента, по результатам гистологии не являющегося раковым
- Первичный PCa, NP, представляет собой ткань первичной опухоли, собранную у пациента, у которого отсутствует прогрессирование опухоли на протяжении периода клинического наблюдения
- Первичный PCa, BCR&CR, представляет собой ткань первичной опухоли, собранную у пациента, у которого отсутствует прогрессирование опухоли на протяжении периода клинического наблюдения до первого биохимического и последующего клинического рецидива
- Первичный PCa, NP&BCR, представляет собой ткань первичной опухоли, собранную у пациента, у которого отсутствует прогрессирование опухоли на протяжении периода клинического наблюдения или наблюдается первый биохимический рецидив
- Первичный PCa, CR, представляет собой ткань первичной опухоли, собранную у пациента, у которого отсутствует прогрессирование опухоли на протяжении периода клинического наблюдения до клинического рецидива
- Метастазы представляют собой метастатическую опухолевую ткань, собранную у гормоно-наивного пациента
- CRPC представляют собой ткань, собранную у пациента с заболеванием, резистентным к кастрации
Как можно видеть из полученных результатов, PDE-индексы можно использовать в разных способах диагностики рака простаты и/или прогнозирования прогрессии рака простаты.
Вариант
PDE-индекс, вариант_1: PDE4D7_Expression - PDE4D5_Expression
наиболее часто используется для различения нормальной соседней ткани (NAT) и ткани первичной раковой опухоли предстательной железы с высокой степенью достоверности (см. фиг.3). Вычисление этого индекса с использованием разных других наборов данных с целью различения NAT и первичного рака простаты по сравнению с другими вариантами PDE-индекса (см. фиг.4) подтверждает, что PDE-индекс, вариант_1, позволяет различать ткани с высокой эффективностью. Аббревиатура "BL" обозначает доброкачественные поражения, а "H" обозначает доброкачественную гиперплазию предстательной железы.
На фиг.5 приведен обзор всего восьми групп данных по раку предстательной железы, полученных с использованием в общей сложности >900 образцов пациентов, относящихся к категориям нормальной соседней ткани, доброкачественного поражения, доброкачественной гиперплазии, а также опухолевой ткани. Все попарные сравнения разных категорий тканей демонстрируют очень высокую эффективность различения групп тканей с использованием варианта_1 PDE-индекса.
Из фиг.3 также можно видеть, что варианты PDE-индекса PDE-индекс_2, PDE-индекс_3 и PDE-индекс_4 коррелируют с более агрессивным заболеванием.
PDE-индекс_2 (вариант_2 PDE-индекса):
Среднее(PDE4D7_exp и PDE4D5_exp)
PDE-индекс_3 (вариант_3 PDE-индекса):
(Среднее(PDE4D5_exp, PDE4D7_exp и PDE4D9_exp))/(PDE4D4_exp)
PDE-индекс_4 (вариант_4 PDE-индекса):
(Среднее(PDE4D5_exp, PDE4D7_exp и PDE4D9_exp))/(PDE4D1 и PDE4D2_exp)
PDE-индекс_5 (вариант_5 PDE-индекса):
(Среднее(PDE4D5_exp, PDE4D7_exp и PDE4D9_exp))
Где термин "PDE4D4_exp" обозначает уровень экспрессии PDE4D4, термин "PDE4D5_exp" обозначает уровень экспрессии PDE4D5, термин "PDE4D7_exp" обозначает уровень экспрессии PDE4D7, и термин "PDE4D9_exp" обозначает уровень экспрессии PDE4D9. Термин "PDE4D1 и PDE4D2_exp" обозначает уровни экспрессии PDE4D1 и PDE4D2, определенные одновременно с использованием одного зонда.
При попарном сравнении следующих групп пациентов обычно получают значительно различающиеся значения экспрессии (см. фиг.3):
i) Первичный PCa, NP, и первичный PCa, BCR&CR
ii) Первичный PCa, NP&BCR, и первичный PCa, CR
iii) Первичный PCa (все типы) и метастазы
iv) Первичный PCa (все типы) и CRPC
Это также подтверждают результаты анализа ROC, как показано для PDE-индексов 2-4 на фигуре 6. Значения AUC (площадь под кривой), определенные при проведении вышеуказанных попарных сравнений с помощью анализа ROC, демонстрирует положительную эффективность различения. Полученные данные подчеркивают прогностическую эффективность применения сочетаний разных транскриптов PDE4D для прогнозирования прогрессии рака простаты.
Авторы также тестируют разные PDE-индексы, соответствующие разной экспрессии в TMPRSS2-ERG-отрицательных и TMRSS2-ERG-положительных опухолях по сравнению с нормальной соседней тканью (NAT, TMRPSS2-ERG-отрицательная). Результаты представлены на фиг.7. Интересно отметить, что наблюдается сильная корреляция между присутствием гибридного гена TMPRSS2-ERG и экспрессией изоформы PDE4D7, тогда как экспрессия другого транскрипта PDE4D (в частности, PDE4D1 и 2, PDE4D5 и PDE4D9) больше коррелирует с отсутствием гибридного гена TMPRSS2-ERG. Данный эффект отчетливо выражен в случае PDE4D5. Указанное наблюдение, т.е. положительная корреляция экспрессии PDE4D7 и присутствия гибридного гена TMPRSS2-ERG и положительная корреляция экспрессии PDE4D5 и отсутствия гибридного гена TMPRSS2-ERG, которое подтверждено в четырех независимых наборах данных по раку простаты (фиг.7), дает веское основание для применения сочетания PDE4D5 и PDE4D7 при определении варианта_1 PDE-индекса, позволяющего эффективно отличать раковую ткань простаты от нераковой (см. также фиг.5).
Далее авторы анализируют корреляцию вариантов PDE-индекса с оценками патологии Глисона, полученными с использованием набора данных по раку простаты. Анализ проводят с учетом статуса гибридного гена TMPRSS2-ERG, специфичного для рака простаты (Tomlins S. et al., Nature, 2005). Указанный гибридиный ген образуется в результате геномной перегруппировки между андроген-регулируемой серин-протеазой TMPRSS2 и транскрипционным фактором ERG2, который является членом семейства факторов транскрипции ETS. Как показано на фигуре 8, обнаружена выраженная положительная корреляция PDE-индексов 2-4 с присутствием гибрида TMPRSS2-ERG.
На фиг.9 приведен обзор полезности применения значений PDE-индексов в дополнение к клиническим данным (биохимическим и клиническим) по выживанию в отсутствии прогрессирования в зависимости от статуса опухоли, определяемого гибридом TMPRSS2-ERG. Дополнительную полезность определяют по увеличению AUC в анализе ROC только клинической модели (pGleason и стадия pT) по сравнению с комбинированной моделью PDE-индекс, pGleason и стадия pT. Следует отметить, что значительное увеличение AUC можно обнаружить только для исследуемых вариантов PDE-индекса в случае наличия гибрида TMPRSS2-ERG для обеих тестируемых конечных точек, а именно для выживаемости в отсутствии биохимического прогрессирования, и для выживаемости в отсутствии клинического прогрессирования.