Вариабельные домены лёгких и тяжёлых цепей мышиных моноклональных антител против альфа-дефенсинов 1-3 (HNP 1-3) человека, антигенсвязывающие фрагменты (Fab) против HNP 1-3 человека, содержащие указанные домены
VARIABLE DOMAINS OF LIGHT AND HEAVY CHAINS OF MURINE MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST HUMAN ALPHA-DEFENSINS 1-3 (HNP 1-3), ANTIGEN-BINDING FRAGMENTS (FAB) AGAINST HUMAN HNP 1-3, CONTAINING SAID DOMAINS

Область техники.
Настоящее изобретение относится к антителам, в частности к вариабельным доменам легкой и тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела, связывающегося с альфа-дефенсинами 1-3 (HNP 1-3) человека, и антигенсвязывающему фрагменту (Fab) против альфа-дефенсинами 1-3 (HNP 1-3) человека, содержащему указанные домены.
Предшествующий уровень техники. Общие данные об объекте.
Одним из самых распространенных хирургических вмешательств в клиниках травматологии и ортопедии является операция по эндопротезированию суставов, которая способствует улучшению качества жизни пациентов. Однако такое вмешательство может сопровождаться тяжелыми осложнениями, такими как перипротезное инфицирование. Этот процесс, в случае несвоевременной диагностики и неадекватного лечения может привести к тяжелым последствиям - развитию остеомиелита, образованию дефектов костей, удалению протеза и даже летальному исходу. Современные традиционные способы диагностики не позволяют наиболее полно и достоверно судить о наличии воспаления в суставе на ранней стадии патологического процесса. Существующие диагностические методы обладают либо низкой специфичностью, либо низкой чувствительностью. Это приводит к длительному пребыванию пациента в больнице и, временами, к разрушению импланта.
Цель работы.
Разработка нового метода ранней диагностики внутрисуставной инфекции крупных суставов на основе определения альфа-дефенсина 1,2,3 в синовиальной жидкости.
Для осуществления нового метода получены и исследованы моноклональные антитела против альфа-дефенсина 1,2,3, проведена их очистка и характеризация экспериментальных образцов моноклональных антител против альфа-дефенсина 1,2,3. Полученные антитела оценены, подобрана оптимальная пара антител для оптимизации условий иммунохроматографического анализа для метода ранней диагностики внутрисуставной инфекции крупных суставов.
Область практического использования и применения результатов работ:
Создание антител и способа анализа на их основе будет способствовать диагностике перипротезной инфекции крупных суставов на ранней стадии, уменьшит развитие остеомиелита, образование дефектов костей, которое может привести к удалению эндопротеза и уменьшит риски развития сепсиса.
Создание новой методики актуального, инновационного метода диагностики может характеризоваться экономическим эффектом до нескольких сотен млн. руб. в год и в частично решить проблему импортозамещения. Поэтому, значимость работы заключается в создании актуального инновационного теста внутри страны, импортозамещение зарубежных средств диагностики.
Объект патентования.
Вариабельные домены легких и тяжелых цепей мышиных моноклональных антител против альфа-дефенсинов 1-3 (HNP 1-3) человека, антигенсвязывающие фрагменты (Fab) против HNP 1-3 человека, содержащие указанные домены, их специфическая активность к человеческому альфа-дефенсину 1,2,3 и рекомбинантному фьюзу.
Технический уровень и тенденции развития объекта исследований.
Проведенные патентные исследования в соответствии с регламентом поиска включили анализ порядка 150 патентных и литературных источников информации. Использовались возможности поиска по ключевым терминам: перипротеазная инфекция, альфа дефенсин, моноклональные антитела, mab, mouse, фьюз, иммуноферментный анализ, ИФА, иммунохроматографический анализ, ИХА, Def, DEF1, Defa, DEFA1, DEFA2, Defcr, Defcr1, GB19392, HNP-1, anti-alpha Defensin, Antibodies, neutrophil antibiotic peptide.
Также использовалась возможность поиска по рубрикам МКИ 10-18 редакции:
A61K 39/395, A61K39/00, A61K38/00; A61K38/17, A61P19/00, A61P19/02, A61P31/00, C07K16/00, C07K16/18, C07K14/415; C07K14/47; C12N15/82, C12N 5/10, C12N15/00, G01N33/00; G01N33/53; G01N33/48; G01N33/577.
При выборе объектов исследования учитывалось следующее.
Усилия по поиску более простых и точных средств диагностики перипротезной инфекции (ППИ) в настоящее время сосредоточились на обнаружении биомаркеров в синовиальной жидкости. Было замечено, что у пациентов с инфекцией в суставе в синовиальной жидкости обнаруживаются цитокины и антимикробные белки, многие из которых демонстрируют перспективные диагностические возможности. Одним из таких биомаркеров являются человеческие альфа-дефенсины 1, 2 и 3, которые входят в группу антимикробных пептидов (АМП) и представляют собой небольшие катионные пептиды с молекулярной массой 2-6 кДа. Дефенсины одни из первых обеспечивают неспецифическую защиту организма от бактерий, грибков и некоторых вирусов.
Альфа - дефенсины человека трудны для химического синтеза, поскольку имеют циклическую структуру и три дисульфидные связи. Маленький размер дефенсинов и их токсичность для бактерий и дрожжевых грибов затрудняют производство генно-инженерных дефенсиновых конструкций. Тем не менее, проблема маленького размера и токсичности решается созданием конструкций, где дефенсиновая последовательность соединена с белком HSP70 из M.tuberculosis (фьюз). В дальнейшем, молекулы дефенсина могут быть отделены от белка HSP70, так как конструкция содержит сайт протеолиза
До сих пор разработки антител, направленных против дефенсинов, незначительны и требуют дальнейшего развития.
Таким образом, патентный поиск должен касаться моноклональных антител к белку дефенсину на предмет их способности определения альфа-дефенсина как маркера внутрисуставного воспаления.
Для более подробного анализа отобраны аналоги, наиболее близкие по техническому существу.
В патенте RU 2629598 C1 описан способ диагностики параимплантарного воспаления после эндопротезирования крупных суставов, характеризующийся тем, что производят забор крови, готовят образцы сыворотки крови, осуществляют исследование сыворотки крови с помощью иммуноферментного анализа, определяя количественные значения показателей: фактора, ингибирующего миграцию макрофагов (MIF), и белка, стимулирующего макрофаги (MSP), а также интерлейкинов 1, 4, 8, 10 (IL1, IL4, IL8, IL10).
Патент не раскрывает использование моноклональных антител против дефенсинов.
Патент RU2517069 C1 относится к способу прогнозирования риска развития рецидива воспалительных заболеваний кишечника. Сущность способа состоит в том, что у больных с воспалительными заболеваниями кишечника с помощью иммуноферментного анализа в крови определяют уровень α-дефензина (αД) в нг/мл в плазме крови и содержание β-дефензина (βД) в нг/г и кальпротектина (ФК) в мкг/г в кале. Отмечается, что α-дефензин определяют с помощью иммуноферментоного анализа.
Не раскрываются моноклональные антитела против дефенсинов для диагностики воспаления суставов.
Заявка EA201790929 A1 описывает плазмидную ДНК для транзиентной экспрессии в клетках млекопитающих, представленная остовом, содержащим прокариотические и эукариотические элементы, и полинуклеотидом, кодирующим альфа дефенсин человека HNP-1, либо HNP-2, либо HNP-3 (варианты). Также раскрывается продуцент такой плазмидной ДНК на основе бактериальной клетки (варианты) и анальгетическое средство для применения у млекопитающих, в частности человека, на его основе (варианты).
Патент не раскрывает получение моноклональных антител против дефенсинов.
Найдены международные заявки PCT, в том числе, которые еще могут перейти на национальную фазу в РФ и по которым еще может быть выдан патент РФ:
В международной заявке WO 2019055520 (A1) раскрываются система, устройство и способ измерения маркеров перипротезной инфекции сустава в образце синовиальной жидкости. Оптический датчик маркера представляет собой оптический датчик альфа-дефенсина, сконфигурированный для определения интенсивности света маркера в диапазоне длин волн, специфичном для реакции альфа-дефензин-маркер-реагент.
Не раскрываются искомые моноклональные антитела.
WO9324139 (A1) раскрывает очищенные кишечные дефенсины - криптдины, имеющие определенную антибактериальную активность против кишечных болезнетворных микроорганизмов, и имеющие последовательность аминокислот: X1-C-X2-C-R-X3-C-X4-E-X5-G-X6-C-X7-C-C-X8, в чем X1 - 3-6 аминокислот; X2 - одна аминокислота; X3 - 2 или 3 аминокислоты; X4 - три аминокислоты; X5 - три аминокислоты; X6 - одна аминокислота; X7 - 6 - 10 аминокислот; и X8 от 0 до 7 аминокислот. Предпочтительные воплощения иллюстрированы как мышиный криптдин-1 (ID NO:9 SEQ), мышиный криптдин -2 (ID NO:10 SEQ), мышиный криптдин -3 (ID NO:11 SEQ), мышиный криптдин -4 (ID NO:12 SEQ), мышиный криптдин -5 (ID NO:13 SEQ), и криптдин крысы-1 (ID NO:14 SEQ). Также раскрывается метод обнаружения воспалительных патологий у пациента и метод лечения инфекционного процесса. Описаны поликлональные и моноклональные анти-криптдиновое антитела, которые могут быть использованы в методе обнаружения воспалительных патологий. Имеют гомологичное сходство с нейрофильными дефенсинами.
Не раскрываются искомые моноклональные антитела.
WO9421672 (A1) раскрывает антимикробные пептиды, выделенные из бычьих нейтрофилов, названные β-дефензинами, антитело, имеющее способность специфично связаться с β-дефензином, которое имеет поликлональное или моноклональное происхождение. Антитела могут использоваться для определения наличия β - дефензинов в биологических образцах, таких как гистологические образцы.
Не раскрываются искомые моноклональные антитела.
WO9616075 (A1) описывает методы обнаружения воспалительных патологий у субъекта и методы лечения воспалительной патологии у субъекта путем применения фармацевтического состава, содержащего дефензиновый пептид, в частности криптдин. Описаны поликлональные и моноклональные анти-криптдиновое антитела, которые могут быть использованы в методе обнаружения воспалительных патологий.
Не раскрываются искомые моноклональные антитела.
WO9911663 (A1) касается нового человеческого полипептида дефензина, гомологичного HNP-4, его геномного DNA и DNAc, векторов, клетки. Заявка также касается диагностических методов и комплектов для определения микробной или паразитарной инфекции и воспаления, или для обнаружения предрасположенности к иммуннодефициту или злокачественным болезням, а также поликлональных или моноклональных антител, полученных иммунологической реакцией человека или организма животных с иммуногенным агентом, состоящим из указанного полипептида.
Нет мышиных моноклональных антител.
WO0222686 (A2) описывает слитый белок, включающий дефензин, слитый с антигеном опухоли или с вирусным антигеном, примененным или как вакцина или для выявления иммунной реакции, эффективный при лечении рака или предотвращении вирусной инфекции.
Не раскрываются искомые моноклональные антитела.
WO2004063219 (A1) относится к новым белкам, называемым INSP 108 и INSP 109, которые определены как члены семейства белков дефензинов, и к использованию этих белков и последовательностей нуклеиновых кислот из кодирующих генов при диагностике, профилактике и лечении заболеваний.
Патент не раскрывает искомые моноклональные антитела против дефенсинов.
Международная заявка WO 2003000863 (A2) касается нуклеотидных последовательностей, кодирующих белки дефенсина. Последовательности могут быть использованы в кассетах экспрессии для мутации развития, путей развития и защитных реакций. Выделенный полипептид можно использовать в качестве иммуногена для генерирования антител, которые связывают дефензины, с использованием стандартных методик получения поликлональных и моноклональных антител. Моноклональное анти-дефензин-подобное антитело может быть идентифицировано и выделено путем скрининга рекомбинантной комбинаторной библиотеки иммуноглобулинов или методом получения гибридом, секретирующих моноклональные антитела.
Заявка не раскрывает искомые моноклональные антитела против дефенсинов.
WO2013049648 (A1) относится к способам и композициям для диагностики, прогнозирования и мониторинга инфекции мочевыводящих путей у субъекта. В одном из вариантов - путем обнаружения дефензинов, например белка дефенсина и / или нуклеиновой кислоты, такой как HD5 (альфа-дефенсин 5 человека) или DEFA5 (ген, кодирующий HD5) в образце пациента.
Патент не раскрывает моноклональные антитела против дефенсинов 1-3.
WO2013112216 (A1) раскрывает способ диагностики инфекции суставов у субъекта, включающий обнаружение наличия биомаркера в синовиальной жидкости, полученной из сустава у субъекта, причем способ, включающий нанесение синовиальной жидкости, полученной из сустава у субъекта, в систему, где система содержит молекулу который специфически связывает биомаркер для инфекции суставов и контрольную молекулу-детектор, которая специфически связывает маркер синовиальной жидкости, причем обнаружение биомаркера и обнаружение маркера синовиальной жидкости диагностирует инфекцию сустава у субъекта. В одном варианте осуществления биомаркер выбран из HNP1-3.
Не раскрываются искомые моноклональные антитела.
WO2017151794 (A1) раскрывает способ диагностики пациента, у которого имеется хирургический имплантат, с инфекцией перипротезного сустава (PJI), включающий:
(а) получение образца сыворотки, содержащего D-димер, от пациента; (б) количественное определение уровня D-димера, присутствующего в образце; а также (c) диагностирование пациента с наличием PJI, где уровень D-димера, превышающий 400 нг / мл в образце, указывает на то, что пациент имеет PJI.
Заявка не раскрывает использование моноклональных антител против дефенсинов 1-3.
WO2004099368 касается методов и комплектов для определения экспрессии внутриклеточного дефенсина в субпопуляциях лейкоцитов. Внутриклеточная экспрессия может быть определена путем измерения сигналов, произведенных от одного или более дефенсин-специфических антител, связывающих дефенсин в клетках. Эти методы могут использоваться, чтобы диагностировать и лечить заболевания и болезни.
Не раскрываются искомые моноклональные антитела.
WO03101394 (A2) касается ингибирования вирусов, например, ВИЧ, используя дефенсины. Заявка также касается набора, который включает антитело против альфа-дефенсин полипептида. Альфа-дефенсин полипептид отобран из группы, состоящей из альфы-дефенсин 1, альфа-дефенсин 2 и альфа-дефенсин 3.
Не раскрываются искомые моноклональные антитела.
Выявлен также ряд патентных источников зарубежных стран, которые могут рассматриваться как уровень техники при оценке патентоспособности объекта:
Патент US 7598080 B2 касается способа диагностики локального воспаления, включающего:
определение экспрессии одного или нескольких генов из клетки или кодируемых ими белков из клинического образца синовиальной жидкости, полученного из участка локального воспаления, и сравнение экспрессии этих генов с их экспрессией в известных контрольных образцах из сопоставимого участка без локального воспаления, чтобы определить, инфицирован ли участок, где уровни экспрессии одного или нескольких генов или кодируемых ими белков, указывающих на бактериальную инфекцию, из участка локального воспаления изменяются, по меньшей мере, в два раза бактериальной инфекцией.
Патент US7700308 B2 раскрывает способ определения, подвержен ли человек кариесу зубов, который включает измерение количества α-дефензинов HNP 1, HNP 2 и HNP 3 в слюне, полученной от человека. Количество α-дефензинов HNP 1, HNP 2 и HNP 3 можно определить с помощью антитела, которое связывается со всеми пептидами HNP 1, HNP 2 и HNP 3.
Не раскрываются моноклональные антитела против дефенсинов для диагностики воспаления суставов.
Патент US7897847 (B2) касается выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, который обладает дефенсиноподобной активностью, где указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 95-процентную идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 216. Также описана возможность получения антител, которые могут быть использованы для идентификации гомологов дефензинов по изобретению.
Не раскрываются искомые моноклональные антитела.
Заявка US2002151009 (A1) относится к новым полипептидам человека и выделенным нуклеиновым кислотам, содержащим кодирующие области генов, кодирующих такие полипептиды. Также предоставлены векторы, клетки-хозяева, антитела и рекомбинантные способы получения полипептидов человека. Заявка, кроме того, относится к диагностическим и терапевтическим способам, полезным для диагностики и лечения расстройств, связанных с этими новыми человеческими полипептидами. Полученные очищенные белки дефенсина полезны в качестве инструментов исследования, идентификации, характеристики и очистки дополнительных молекул, участвующих в врожденном иммунитете и противомикробной активности, и их регуляции. Кроме того отмечается, что идентификация новых генов дефенсинов позволяет разрабатывать ряд производных, агонистов и антагонистов на уровне нуклеиновых кислот и белков, которые, в свою очередь, находят применение в лечении и диагностике широкого спектра состояний, таких как дефицит иммунной системы и заражение микроорганизмами.
Не раскрываются моноклональные антитела против дефенсинов для диагностики воспаления суставов.
Патент US7687062 (B2) относится к способу диагностики рака толстой кишки путем выявления специфического антигена рака толстой кишки, дефензина α6 из крови пациента и диагностического набора для диагностики рака толстой кишки, содержащего антитело против дефензина α6. Раскрывается моноклональное антитело, полученное с помощью линии клеток гибридомы Def-12α, депонированной в Корейском фонде исследований клеточных линий под инвентарным номером KCLRF-BP-00164.
Не раскрываются моноклональные антитела против дефенсинов для диагностики воспаления суставов.
US 6057425 (A) относится к антимикробным пептидам и, более конкретно, к криптдиновым пептидам (семейство дефенсинов), молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим криптдины, и их применению. Раскрыты анти-криптдиновые, в частности моноклональные, антитела, которые можно использовать для определения присутствия криптдина в биологическом образце, таком как гистологический образец.
Не раскрываются моноклональные антитела против дефенсинов для диагностики воспаления суставов.
Заявка CN108484765 (A) раскрывает моноклональное антитело против альфа-дефенсина-1 человека и его применение. Моноклональное антитело против альфа-дефенсина-1 человека содержит тяжелую цепь и легкую цепь, три последовательности комплементарной определяющей области вариабельной области тяжелой цепи, показанные в SEQ ID NO.3-5, и три последовательности комплементарной определяющей области вариабельной области легкой цепи, показанной в SEQ ID NO.7-9. Дается новая идея для разработки лекарственных средств для профилактики или лечения сепсиса.
Не раскрываются мышиные антитела против дефенсинов для диагностики воспаления суставов.
Заявка CN104535771 (A) относится к набору для анализа иммуносорбента, связанного с альфа-дефенсиновым пептидным ферментом человека, и к способу его получения и обнаружения. Набор для иммуноферментного анализа альфа-дефензин-пептидного фермента человека включает планшет для ELISA, покрытый мышиным анти-человеческим HNP-моноклональным антителом, лиофилизированное стандартное вещество белка HNP, поликлональное антитело кроличьего анти-человеческого HNP, меченную пероксидазой хрена козьим кроличьи поликлональные антитела иммуноглобулина, стандартный разбавитель, разбавитель образца, 25-кратный концентрированный промывочный буферный раствор, разбавитель антител, проявляющий раствор ТМВ и раствор для завершения реакции ферментной реакции. Способ получения включает следующие стадии: сочетание альфа-дефенсина и белка-носителя, применение соединительного соединения с оптимальным соотношением связывающего связывания (молярное отношение HNP к SPDP к сывороточному альбумину мыши составляет 1: 5: 1, а молярное отношение От HNP до SPDP к сывороточному альбумину кролика составляет 1: 5: 1, подготовка к получению высокочувствительного антитела с использованием полного антигена и сборка набора с использованием полученного антитела.
Не раскрываются моноклональные антитела для диагностики воспаления суставов.
CN108593924 (A) относится к применению синовиальной жидкости альфа-дефензина или α-антитела к дефенсину для обнаружения и диагностического набора для инфекции протезного сустава. Замена сустава является эффективным методом лечения сопутствующего заболевания на терминальной стадии, а перипротезная инфекция сустава является серьезным осложнением после замены сустава. Синовиальная жидкость альфа-дефенсин обладает высокой чувствительностью и специфичностью для диагностики инфекции протезного сустава.
Не раскрываются характеристики используемого моноклонального антитела.
Выводы:
1. Объект «мышиные моноклональные антитела против альфа дефенсинов 1,2,3; их специфическая активность к человеческому альфа-дефенсину 1,2,3 и рекомбинантному фьюзу» не защищен действующими патентами РФ.
2. Объект исследования может быть объектом для патентования.
Анализ тенденций развития рынка продукции.
Для определения структуры взаимного патентования весь массив отобранных в процессе поиска охранных документов систематизирован по национальным и иностранным заявителям.
Анализ данных по структуре взаимного патентования показывает, что по количеству охранных документов страны распределились следующим образом:
по национальным заявителям: США-33, РФ-3, Китай-3, Франция-1, Швейцария-0 , Корея-0, всего 38 охранных документов;
по иностранным заявителям: США-38, Франция-10, Швейцария-10, РФ-6, Корея-1, Китай-0, всего 65 охранных документов;
Количественные показатели в виде отношения патентов, выданных иностранным фирмам, к национальном патентам корректируют эту последовательность и распределяют страны следующим образом: Франция - 10/1=10, Швейцария - 10/0=0, РФ - 6/3=2, США - 38/33=1,15 , Китай- 0/3=0.
Отсутствие в Китае патентов, выданных иностранным фирмам, свидетельствуют о наличии внутри страны благоприятной патентной ситуации для национальных разработок. В связи с тем, что, как правило, наиболее перспективными для коммерческой реализации являются страны регистрации и выдачи патентов иностранным заявителям, то из приведенных данных справедливо допустить, что наиболее перспективными для реализации являются Франция, Швейцария.
Приведенные данные показывают, что по широте защиты национальных изобретений страны поиска проявляют неодинаковую активность, патентуя свои разработки в других странах.
Наиболее активными странами - заявителями являются США и Китай.
Анализ технической сущности отобранных охранных документов позволил выявить следующие тенденции в данной области:
1- маркеры воспалительных заболеваний, в том числе суставов в крови;
2- методики диагностики перипротезной инфекции с использованием дефенсинов;
3- генетические конструкции, такие как полинуклеотиды, кодирующие дефенсин человека;
4- разработка моноклональных антител против дефенсинов;
5- использование антител против дефенсинов в диагностике.
Как показывает анализ числа охранных документов за исследуемый период по дате публикации не снижается количество патентов в данной области в разных странах. Согласно анализу в диагностике используются как сконструированные полипептидные дефенсины, так и моноклональные антитела против дефенсинов. При этом, хотя и найдены документы, касающиеся использования для диагностики перипротезной инфекции дефенсинов, антител, относящегося к предмету исследования, не обнаружено, и данное направление имеет перспективы.
В целом анализ сущности патентных документов, составляющих изобретательский уровень, показал, что требуются исследования, направленные на создание специфично связывающихся антител, которые могли бы быть использованы в целях диагностики инфекций суставов и протезов.
Что касается научно-технической литературы, то раскрытые в ней исследования касаются дефенсинов, различных конструкций и их роли в диагностике и медицине.
В частности найдены статьи, касающиеся роли дефенсинов как антибиотиков, иммунорегуляторов, агентов контроля экспрессии антимикробных пептидов и как биомаркеров перипротестической инфекции.
Ряд работ касается иммуносорбентного анализа (ELISA) для α-дефенсина (Crp4) в клетках.
Также описано количественное определение дефенсинов из нейтрофильных гранулоцитов с помощью иммуноферментной тест-системы.
Однако практически отсутствуют сведения о диагностических средствах на основе антител против дефенсинов.
Таким образом, тенденции развития данного направления могут быть связаны с выделением высокоочищенных антител, тест полосок и усовершенствованных методик анализа около- и внутрисуставной инфекции.
Заключение.
1. Уровень техники в отношении объекта исследований «мышиные моноклональные антитела против альфа дефенсинов 1,2,3; их специфическая активность к человеческому альфа-дефенсину 1,2,3 и рекомбинантному фьюзу» представлен по состоянию:
- на 10.05.2019 - Официальный бюллетень РФ «Изобретения, полезные модели» № 13 за 2019 г.
- на 2019.30.04- Бюллетень Евразийского патентного ведомства, № 04 за 2019 г.
- на 01.05.2019 - Фонд международных заявок по состоянию на май 2019 г.
2. Из уровня техники выявлены патенты и статьи, касающиеся исследуемой области применения. Объектом интеллектуальной собственности могут быть специфические антитела к дефенсинам 1,2, 3.
3. Данная тема, касающаяся мышиных моноклональных антител против альфа дефенсинов 1,2,3; их специфической активности к человеческому альфа-дефенсину 1,2,3, является перспективным направлением в области биохимии и медицины антител, о чем свидетельствует изобретательская активность в 2015-2019 г.г.
4. В качестве ближайшего аналога (прототипа) может быть принято техническое решение по патенту US7897847 (B2).
5. Необходимость развития этого направления предопределена тем, что для оптимизации условий иммунохроматографического анализа для метода ранней диагностики внутрисуставной инфекции крупных суставов требуется выделение новых отечественных антител.
Краткое описание изобретения.
Целью настоящего изобретения является получение мышиных антител, связывающихся с альфа - дефенсином 1-3 (α-HNP) человека, определение последовательностей вариабельных доменов тяжелых (VH) и легких (VL) цепей указанных антител и антигенсвязывающих фрагментов (Fab) мышиных антител, связывающихся с альфа - дефенсином 1-3 (α-HNP) человека.
Технический результат.
Получены и охарактеризованы два мышиных антитела, HD1 H5 и HD1 F4, обладающих способностью специфического связывания альфа - дефенсинов 1-3 (α-HNP) человека, и определены аминокислотные последовательности их вариабельных участков.
Настоящее изобретение представляет собой вариабельный участок тяжелой цепи (VH) антитела HD1 H5, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1, вариабельный участок легкой цепи (VL) указанного антитела, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2, а также антигенсвязывающий фрагмент (Fab), содержащий указанные вариабельные участки.
Также настоящее изобретение представляет собой вариабельный участок тяжелой цепи (VH) антитела HD1 F4, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, вариабельный участок легкой цепи (VL) указанного антитела, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 4, а также антигенсвязывающий фрагмент (Fab), содержащий указанные вариабельные участки.
Также настоящее изобретение представляет собой антигенсвязывающий фрагмент (Fab), содержащий указанные вариабельные участки антитела HD1 H5 или указанные вариабельные участки антитела HD1 F4.
Краткое описание рисунков.
На фиг. 1 показан электрофорез образцов моноклональных антител HD1 H5 и HD1 F4 в восстанавливающих условиях где, дорожка 1 - маркеры, кДа, дорожка 2 - HD1 F4, дорожка 3 - HD1 H5.
На фиг. 2 показаны результаты сэндвич ИФА моноклональных антител HD1 H5 и HD1 F4 с суставными жидкостями и стандартом. Суставные жидкости титровали от разведения  с шагом 3, дефенсин разводили от 300 нг/мл с шагом 3. Видно, что пара антител HD1 F4 - HD1 H5 способна определять натуральные человеческие дефенсины в суставных жидкостях. Нижний порог детекции дефенсинов в подобранных условиях составяет около 10 нг/мл. При наличии воспаления, вызванного бактериальной инфекцией, концентрация дефенсинов превышает 50 мкг/мл, при неинфекционном воспалении колеблется около 5 мкг/мл, при отсутствии инфекции и воспаления может опускаться ниже 0,5 мкг/мл.
На фиг. 3 показан электрофорез 12% SDS-ПААГ фьюза HD2-HSP70 до и после расщепления энтерокиназой, на нем видно расщепление HD2 фьюза дефенсина энтерокиназой.
На фиг. 4 показаны результаты иммуноблота, полученного после электрофореза фьюза HD2-HSP70 до и после расщепления энтерокиназой в невосстанавливающих и в восстанавливающих условиях с использованием МоАт HD1F4. МоАт HD1F4 окрашивают полосы с фьюзом HD2 как в восстанавливающих, так и в невосстанавливающих условиях. При этом, не окрашивают расщепленные энтерокиназой фьюзы, так как молекулы отщепившегося дефенсина в силу своей малой молекулярной массы вышли из геля вниз в электродный буфер. Так же, отсутствует окрашивание белка - носителя - HSP70.
На фиг. 5 показаны результаты иммуноблота фьюза HD2-HSP70 до и после расщепления энтерокиназой в невосстанавливающих и в восстанавливающих условиях с использованием неспецифических МоАт TS481 - анти HSP70. МоАт TS481 окрашивают все полосы потому что все они содержат HSP70 или продукты его деградации.
На фиг. 6 показаны результаты Вестерн-блот фьюза HD2-HSP70 до и после расщепления энтерокиназой в невосстанавливающих и в восстанавливающих условиях; контроль конъюгата.
На фиг. 7 показаны результаты иммуноблота фьюза HD3-HSP70 до и после расщепления энтерокиназой в восстанавливающих условиях. Специфическое МоАт HD1F4 слева, неспецифическое МоАт TS481 - анти HSP70, справа. МоАт HD1F4 окрашивают полосы с фьюзом HD3 в восстанавливающих условиях. При этом, не окрашивают расщепленный энтерокиназой фьюз, так как молекулы отщепившегося дефенсина в силу своей малой молекулярной массы вышли из геля вниз в электродный буфер. Так же, отсутствует окрашивание белка - носителя - HSP70. Напротив, МоАт TS481 - анти HSP70 окрашивают все полосы потому что все они содержат HSP70 или продукты его деградации.
На фиг. 8 показана принципиальная схема проведения иммунохроматографического анализа для обнаружения альфа - дефенсинов 1-3 (α-HNP) человека в синовиальных жидкостях с помощью МоАт HD1 H5 и HD1 F4. Внизу справа показаны результаты теста - отрицательный с окрашиванием одной контрольной (верхней) полосы и положительный, с окрашиванием двух полос - контрольной (верхней) и тестовой (нижней).
На фиг. 9 показаны иммунохроматографические тест полоски, где серийные разведения дефенсина определяли с помощью МоАт HD1 H5 и HD1 F4. Видно окрашивание тестовой полосы при концентрации 50 мкг/мл и менее интенсивное при 16,6 - 1,9 мкг/мл.
Подробное описание настоящего изобретения.
Антитела обычно состоят из двух тяжелых цепей, связанных между собой дисульфидными связями, и легких цепей, ассоциированных с N-концом каждой из тяжелых цепей. Каждая тяжелая цепь содержит на N-конце вариабельный домен с константным доменом на другом конце. Каждая легкая цепь также содержит на N-конце вариабельный домен с константным доменом. Вариабельные домены каждой пары легкой и тяжелой цепей образуют антигенсвязывающий фрагмент (Fab). Вариабельные домены легкой и тяжелой цепей обладают похожей общей структурой, и каждый домен включает каркас из четырех участков, последовательности которых являются относительно консервативными, связанных посредством трех участков, определяющих комплементарность (complementarity determining regions, CDRs). Четыре каркасных участка формируют конформацию типа бета-складчатого слоя, а CDRs образуют петли, связывающие конструкцию из бета-складчатого слоя. Участки CDRs расположены в непосредственной близости друг от друга благодаря каркасным участкам и вносят вклад в образование антигенсвязывающего участка. Участки CDRs и каркасные участки антител могут быть определены путем ссылки на нумерационную систему Кабата (Kabat numbering system, Kabat et al., (1987) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office) в сочетании in conjunction with x-ray crystallography, as set forth in WO91/09967.
Для получения антитела, которое может связываться с каким-либо специфическим антигеном, обычно используют методику Kohler и Milstein (Kohler et al., (1976) Nature 256:495-497), получившую название гибридóмной технологии. Суть метода сводится к получению культуры «бессмертных» гибридов (гибридóм) путем слияния плазматической клетки (В-лимфоцита, продуцирующего антитела) и опухолевой клетки (миеломы или плазмоцитомы). Полученная гибридóма способна продуцировать моноклональные антитела (как В-клетка) и при этом бесконечно делится (как опухолевая клетка), что позволяет достаточно долгое время секретировать in vitro или in vivo антитело, специфическое для целевого антигена.
Слияние клеток происходит под действием полиэтиленгликоля, изолецитина или вируса Сендай. На следующем этапе необходимо отобрать неслившиеся с лимфоцитами миеломные клетки (неслившиеся лимфоциты убирать не нужно: через недолгое время они погибнут сами). В процессе такой селекции гибридóмные клетки высаживают на среды, содержащие вещества, блокирующие синтез нуклеотидов миеломными клетками. Для этого выведены специальные мутантные миеломные клеточные линии, дефектные по некоторым ферментам, участвующим в синтезе нуклеотидов.
Отбор гибридóм, секретирующих нужные антитела, проводится путем проверки среды, в которой росли клетки, на предмет наличия в ней антител нужной специфичности.
Таким образом, отбирают клетки, секретирующие антитела стабильно и в достаточном количестве. Большой объем антител нарабатывают или in vitro, или путем введения гибридом в перитонеальную полость мышей для получения асцита (Свешников, П.Г. Введение в молекулярную иммунологию и гибридомную технологию / П.Г. Свешников, В.В. Малайцев, И.М. Богданова, О.Н. Солопова, изд. МГУ, М., 2006).
Получение материала, использующегося в качестве антигена, для инъекций животных включают в себя методики, хорошо известные из уровня техники. Например, используют полноразмерный белок, либо пептид, выбранный из иммуногенных участков белка. Либо антиген модифицируют такими способами как, связывание с динитрофенолом, связывание с арсаниловой кислотой, денатурация антигена, связывание антигена с белком-переносчиком, таким как, гемоцианин улитки, пептидами, содержащими участки связывания с рецепторами Т-клеток класса II, с бусинами, а также любыми другими методами, известными из уровня техники. Смотри, например, Harlow и др. Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1988.
В частности, антителами, обладающими способностью к связыванию с альфа-дефенсином 1-3 (α-HNP 1-3) человека, являются антитела, содержащие вариабельные домены тяжелой и легкой цепи согласно настоящему изобретению. Указанные вариабельные домены тяжелой цепи (VH) мышиного моноклонального антитела HD1 H5 содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, а VH моноклонального антитела HD1 F4 SEQ ID NO: 3. Вариабельные домены легкой цепи антитела (VL) содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 для HD1 H5 и SEQ ID NO: 4 для HD1 F4, необходимые для функционирования указанных антител. Изолированный антигенсвязывающий фрагмент (Fab) согласно настоящему изобретению, селективно связывающийся с α-HNP 1-3 человека, включает в себя вариабельный домен тяжелой цепи (VH) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 1 и вариабельный домен легкой цепи (VL) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 2 для HD1 H5; или вариабельный домен тяжелой цепи (VH) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 3 и вариабельный домен легкой цепи (VL) с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 4 для HD1 F4.
В настоящем изобретении фраза “антитело или Fab, обладающие способностью к связыванию с альфа-дефенсином 1-3 (α-HNP 1-3) человека” означает молекулу, которая связывается с альфа-дефенсином 1-3 (α-HNP 1-3) человека, образует с ней стабильный комплекс. Стабильным комплексом является комплекс, в котором связывание между партнерами происходит на период времени, достаточный для того, чтобы произвести детектирование указанного комплекса с использованием описанных здесь методов (но не ограничивается ими). Термин “селективно связывается с альфа-дефенсином 1-3 (α-HNP 1-3)” означает способность указанной молекулы предпочтительно связываться с альфа-дефенсином 1-3 (α-HNP 1-3) человека в отличие от связывания с белками, не имеющими отношения к альфа-дефенсинам 1-3 (α-HNP 1-3) человека, или связывания с небелковыми компонентами, присутствующими в образце. Антитело или Fab, которые предпочтительно связываются с альфа-дефенсином 1-3 (α-HNP 1-3) человека, являются антитело или Fab, которые связываются с альфа-дефенсином 1-3 (α-HNP 1-3) человека, но не связываются в существенной степени с другими молекулами или компонентами, которые могут присутствовать в образце. Такое существенное связывание предполагает, например, связывание антитела или Fab, связывающихся с альфа-дефенсином 1-3 (α-HNP 1-3) человека, с молекулой, не являющейся альфа-дефенсином 1-3 (α-HNP 1-3) человека, с аффинностью или силой достаточной для того, чтобы помешать способности антитела, связывающегося с альфа-дефенсином 1-3 (α-HNP 1-3) человека, определить уровень альфа-дефенсином 1-3 (α-HNP 1-3) человека в образце. Примерами таких молекул и компонентов, которые могут присутствовать в образце, являются, но не ограничиваются ими, белки, не являющиеся альфа-дефенсином 1-3 (α-HNP 1-3), липиды и углеводы.
Способность антитела или Fab к связыванию с антигеном может быть определена специалистом в данной области с использованием методов, включающих, но не ограничивающихся методом ELISA, вестерн блот, иммунохроматография, равновесным диализом и т.д. Методы определения аффинности и силы связывания хорошо известны специалисту в данной области техники, подробно описаны Janeway и др. (Immunobiology: The Immune System in Health and Disease (Garland Publishing Company, 1996)).
Антитела или Fab, обладают способностью к связыванию с альфа-дефенсином 1-3 (α-HNP 1-3) из раствора (например, ИФА, сэндвич ИФА, ИХА, вестерн-блот), когда концентрация альфа-дефенсина 1-3 (α-HNP 1-3) человека составляет от около 500 нг/мл и до около 10 нг/мл. Такие антитела и Fab описаны в сопутствующих разделах.
Fab моноклональных мышиных антител в соответствии с настоящим изобретением, которые селективно связываются с альфа-дефенсином 1-3 (α-HNP 1-3) человека, также могут быть получены с использованием подходящей могут быть выращены в питательной среде, и накопленные антитела могут быть выделены. Здесь и далее термин "выращиваемые клетки" относится к или другим линиям клеток, которые производят антитела. Способы получения и проверки таких выращиваемых клеток описаны Harlow и др. (см. выше). Методы получения антигенного материала для инъекций в животное включают в себя методы, известные из уровня техники, например, использование полноразмерного белка, пептидов, выбранных из иммуногенного участка этого белка, модифицирование антигена такими способами как, например, связывание с динитрофенолом, связывание с арсаниловой кислотой, денатурация антигена, связывание антигена с белком-переносчиком, таким как, например, гемоцианин улитки, с пептидами, содержащими участки связывания с рецепторами Т-клеток класса II, с бусинами, а также любыми другими методами, известными из уровня техники. Смотри Harlow и др. (см. выше).
Моноклональные антитела и Fab, связывающиеся с альфа-дефенсином 1-3 (α-HNP 1-3) человека, согласно настоящему изобретению, могут включать в себя многофункциональные молекулы, например, бифункциональные молекулы, содержащие, по крайней мере, одну функциональную часть, которая специфически связывается с альфа-дефенсином 1-3 (α-HNP 1-3) человека. Такие многофункциональные молекулы могут включать в себя, например, химерные молекулы, включающие в себя молекулу, которая связывается с альфа-дефенсином 1-3 (α-HNP 1-3) человека, и вторую часть, которая дает возможность данной химерной молекуле связываться с субстратом или позволяет детектировать ее способом, при котором связывание с альфа-дефенсином 1-3 (α-HNP 1-3) человека не ухудшаются. Примерами таких вторых частей являются, но не ограничиваются ими, фрагменты молекулы иммуноглобулина, флуоресцентный белок, фермент, молекулы биотина, коллоидного золота и др.
Термин "взаимодействие", использованный здесь, означает введение, добавление образца, предположительно содержащего альфа-дефенсин 1-3 (α-HNP 1-3) человека, к моноклональным антителам или Fab, связывающим альфа-дефенсин 1-3 (α-HNP 1-3) человека, например, путем объединения или смешения образцов. В случае, если альфа-дефенсин 1-3 (α-HNP 1-3) человека присутствует в образце, образуется комплекс антитело или Fab с альфа-дефенсином 1-3 (α-HNP 1-3) человека; образование такого комплекса означает способность этого антитела или Fab селективно связываться с альфа-дефенсином 1-3 (α-HNP 1-3) человека с образованием стабильного комплекса, который может быть детектирован. Детектирование может быть качественным, количественным или полуколичественным. Связывание альфа-дефенсина 1-3 (α-HNP 1-3) человека из образца с антителами или Fab происходит в условиях, подходящих для формирования комплекса. Такие условия (например, подходящие концентрации, буферы, температура, время реакции), а также методы оптимизации таких условий хорошо известны специалисту в данной области техники. Связывание может быть обнаружено и измерено с использованием множества методов, являющихся стандартными в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, ферментативные методы иммунохимии (например, ELISA), иммунохроматографии, иммунопреципитации, методы иммуноблотинга и другие методы иммунохимии, описанные, например, Sambrook и др. ((“Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) и Harlow и др.
Методы получения плазмидной ДНК, расщепления и лигирования ДНК, трансформации, подбора олигонуклеотидов в качестве праймеров, и подобные методы могут быть стандартными методами, хорошо известными специалисту в данной области техники. Эти методы описаны, например в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., (“Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).
Осуществление изобретения.
Последующие примеры приведены для целей объяснения и не ограничивают каким-либо образом рамки настоящего изобретения.
Пример 1. Получение мышиных антител против альфа-дефенсина 1-3 (α-HNP 1-3) человека.
Малый размер и высокая стоимость нативных дефенсинов (около 3 кДа) представляет определенную проблему для работы привычными микробиологическими методами. Как правило, белки с низкой молекулярной массой и пептиды оказываются неимунногенными и плохо сорбируются на пластик, что затрудняет скрининг. Поэтому для иммунизации мышей использовать генноинженерные фьюзы дефенсина 2 и дефенсина 3 - HSP70 а также, конъюгировали синтетический дефенсин 1 (AnaSpec, cat# 60743) с адъювантом.
Мышей линии balb/c иммунизировали дважды с 2-недельным интервалом в подушечки задних лап антигенами: химически синтезированным HD1 (AnaSpec, № 60743), конъюгированным с HSP70. Все иммунные сыворотки тестировали методом непрямого ИФА на HD1 (AnaSpec, № 60743).
Для проведения гибридизации выбирали животных с лучшими результатами сывороток.
Так же, для иммунизации использовали фьюзы белков HD2-HSP70 и HD3- HSP70 для получения антител к HD2 и HD3 соответственно. Процедуры иммунизации проводили как описано выше; сыворотки тестировали с помощью иммуноферментного анализа используя соответствующие фьюзы или HSP70 в качестве контроля.
Гибридизацию клеток подколенных лимфоузлов иммунных мышей с клетками миеломы линии sp2/0 проводили по стандартной методике с использованием полиэтиленгликоля с молекулярной массой 4000 (Monoclonal Antibody Production. National Research Council (US) Committee on Methods of Producing Monoclonal Antibodies. Washington (DC): National Academies Press (US); 1999.) Скрининг проводили методом ИФА. Клоны против HD1 проверяли путем прямого ИФА следующим образом: анти-мышиные поликлональные антитела сорбировали в лунки 96-луночного планшета (Corning, № 9018), а затем инкубировали супернатанты гибридом, затем после промывки планшета инкубировали с синтетическим HD1 меченным биотином. Таким образом, мы избегали конформационных изменений HD1 во время сорбции антигена. Клоны против HD2 и HD3 тестировали в 3-х вариантах: во-первых, супернатанты тестировали методом непрямого ИФА с использованием соответствующего фьюза; во-вторых, путем непрямого ИФА с использованием HSP70 в качестве отрицательного контроля; в-третьих, используя меченые биотином HD1, как описано выше.
Положительные клоны клонировались 3-5 раз методом предельных разбавлений. Клетки нарабатывали в культуральной среде DMEM (HyClone SH30003.04).
В результате селекции и клонирования мышиных гибридом получили панель генетически стабильных клонов, секретирующих моноклональные антитела. Субизотипы тяжелых цепей мышиных антител определяли при помощи набора ISO-2 (Sigma, США) согласно инструкции, результаты в таблице 1.
Таблица 1 - Субизотипы тяжелых цепей МоАт против альфа-дефенсинов.
HD1 F4
IgG1
HD1 H5
IgG1
Субизотип антител HD1 H5 и HD1 F4 был определен как IgG1.
Всего получили 13 клонов: три после иммунизации HD1, восемь после иммунизации HD2, два после иммунизации HD3. Из которых затем были отобраны 2 антитела HD1 H5 и HD1 F4, обладающих наибольшей активностью.
Для получения асцитных жидкостей, клетки инъецировались внутрибрюшинно мышам линии BALB/c. Асциты забирали и тестировали в прямом и непрямом ИФА как описано для супернатантов.
Очистку антител из асцитных жидкостей проводили методом аффинной хроматографии на колонке с србентом белок G - сефарозой (GE Healthcare, №17-0618-05) по стандартной методике (Jungbauer, A. и др. Comparison of protein A, protein G and copolymerized hydroxyapatite for the purification of human monoclonal antibodies, J. Chromatogr. 1989, 476: 257-268) и переводили диализом в ФСБ. Чистоту выделенных антител контролировали при помощи SDS-ПААГ электрофореза в 12% полиакриламидном геле в присутствии SDS и DTT в ступенчатой буферной системе Лэмлли, используя Mini PROTEAN 3 Electrophoresis System BIO-RAD, Catalog N 165-3301 (Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 1970, 227: 680-685) (фиг 1). Чистота всех полученных антител составила не менее 95%.
Количественный анализ состава проводили с образцами в восстанавливающих условиях. Гель сканировали в камере ChemiDoc™ XRS + System (BIO-RAD, США) и обрабатывали изображение при помощи программы Quantity One 1-D Analysis Software # 170-9600, (BIO-RAD, США). Результаты расчетов показаны в таблице 2.
Таблица 2 - Количественный анализ.
Lane
Band
Mol. Wt.
Relative
Number
Number
KDa
Qty
HD1 F4
1
59.433
74.877
HD1 F4
2
26.743
24.873
HD1 H5
1
58.599
74.078
HD1 H5
2
26.631
4.404
HD1 H5
3
25.857
21.395
Пример 2. Иммунологическая характеризация моноклональных антител против альфа дефенсинов 1,2,3 методом ИФА.
Специфичность моноклональных антител определяли в прямом, непрямом, сэндвич (таблицы 3 - 8) и конкурентном ИФА с использованием коммерческих HD (Athens Research and Technology (Human Neutrophil Peptides, 16-14-081416)) и фьюзов, а также методом Вестерн-блота с использованием фьюзов (рисунки 4 - 7). Иммуноферментный анализ показал, что все антитела распознавали как все коммерческие дефенсины, так и все синтетические молекулы, но не реагировали с HSP70. Те же результаты были достигнуты и с помощью иммуноблоттинга. Клоны HD1 F4 и HD1 H5 показали высокую аффинность и их использовали для аналитических и препаративных целей.
Для постановки сэндвич-ИФА моноклональные антитела были конъюгированы с (ПХ) периодатным методом.
Полученные конъюгаты проверяли на способность связывать целевой антиген методом ИФА.
2
4
Для этого смесь натуральных, выделенных из нейтрофилов человека и очищенных, альфа-дефенсинов 1,2,3 сорбировали в концентрации 2 мкг/мл ночь при + 4°C в ФСБ. После трехкратной отмывка ФСБ-Т, все конъюгаты титровали от 1/5000 с шагом 2 и инкубировали 1 час при 37°C. После инкубации отмывали пять раз ФСБ-Т и наносили субстратный буфер ТМБ. Реакцию останавливали HSO. Результаты измеряли на спектрофотометре Multiscan при длине волны 450нм. В качестве контроля и для определения неспецифической сорбции конъюгаты титровали по сорбированному БСА и по несорбированному планшету. Первичные данные приведены в таблицах 3, 4, 5.
Таблица 3 - ИФА. Раститровка конъюгатов МоАт с ПХ на смеси выделенных из нейтрофилов человека и очищенных, альфа-дефенсинов 1,2,3.
Сорбировали
Выделенные из нейтрофилов человека и очищенные, альфа-дефенсины 1,2,3 (HNP), 2 мкг/мл
Серийные разведения конъюгатов
F4
H5
2500
3,087
3,124
5000
2,771
3,156
10000
2,315
3,207
20000
1,559
2,831
40000
1,016
2,151
80000
0,615
1,317
160000
0,368
0,753
320000
0,216
0,426
640000
0,139
0,245
1280000
0,099
0,152
2560000
0,077
0,105
0
0,056
0,057
На таблице 3 видно, что пероксидазные конъюгаты МоАт HD1 F4 и HD1 H5 специфическа связываются с альфа-дефенсином 1-3 (HNP) с нижней  точкой титрования при разведении 1/640000 и 1/1280000 соответственно.
Таблица 4 - ИФА. Раститровка конъюгатов МоАт с ПХ на БСА (отрицательный контроль).
Сорбировали
БСА
Серийные разведения конъюгатов
F4
H5
2500
0,064
0,051
5000
0,047
0,046
10000
0,044
0,045
20000
0,044
0,046
40000
0,044
0,045
80000
0,046
0,046
160000
0,048
0,048
320000
0,046
0,048
640000
0,047
0,048
1280000
0,047
0,048
2560000
0,047
0,049
0
0,050
0,051
На таблице 4 видно отсутствие неспецифического связывания с БСА.
Таблица 5 - ИФА. Раститровка конъюгатов МоАт с ПХ без сорбции (отрицательный контроль).
Сорбировали
Без сорбции
Серийные разведения конъюгатов
F4
H5
2500
0,066
0,052
5000
0,049
0,047
10000
0,047
0,046
20000
0,047
0,047
40000
0,047
0,046
80000
0,048
0,047
160000
0,050
0,049
320000
0,048
0,049
640000
0,049
0,049
1280000
0,049
0,049
2560000
0,049
0,050
0
0,052
0,052
На таблице 5 видно отсутствие неспецифической сорбции на пластик планшета.
По результатам титрования конъюгатов МоАт с пероксидазой хрена выбирали оптимальные разведения, дающие максимальное значение оптической плотности при минимальном фоне, что составило 1/30000.
Постановка сэндвич-ИФА.
По предварительным данным были отобраны клоны HD1 F4 в качестве антитела захвата и HD1 H5 в качестве антитела детекции.
Для проведения сэндвич-ИФА МоАт (HD1 F4) сорбировали ночь при + 4°С в ФСБ в концентрации 5 мкг/мл, отмывали трижды в ФСБ-Т. Смесь натуральных альфа-дефенсинов 1,2,3 в серийных разведениях инкубировали 1 час при 37°C. Дефенсин разводили от 400 нг/мл с шагом 2. Отмывали три раза в ФСБ-Т. Пероксидазный конъюгат антител разводили в ФСБ-АТ 1/10000, 1/20000, 1/30000 и инкубировали 1 час при 37°C, отмывали пять раз в ФСБ-Т. После, наносили субстратный буфер ТМБ. Реакцию останавливали H2SO4. Результаты измеряли на спектрофотометре Multiscan при длине волны 450нм. Результаты представлены в таблице 6.
Таблица 6 - Подбор разведения пероксидазного конъюгата в сэндвич ИФА
Конц. АГ, нг/мл
МоАт HD1 F4- 5мкг
400
1,639
1,084
0,874
200
1,383
0,947
0,544
100
1,224
0,801
0,33
50
1,057
0,664
0,206
25
0,478
0,313
0,14
12,5
0,185
0,128
0,1
6,25
0,099
0,079
0,101
0
0,063
0,056
0,068
Разведение
1/10 тыс
1/20 тыс
1/30 тыс
конъюгата
HD1 H5+ПХ
Аналогично проводили сэндвич-ИФА с учетом оптимального разведения пероксидазного конъюгата. Результаты представлены в таблице 7.
Таблица 7 - Сэндвич ИФА с использованием смеси нативных человеческих HNP 1-3 и рекомбинантного HNP1.
Сорбировали
МоАт HD1 F4 - 5 мкг/мл
Титр., нг/мл
Def/HNP 1-3
HNP1 рекомб.
400
1,358
1,413
200
1,054
1,036
100
0,678
0,755
50
0,495
0,474
25
0,202
0,289
12,5
0,129
0,138
6,25
0,076
0,078
0
0,063
0,064
°
HD1 H5+ПХ 1/10 тыс
Вывод: антитела HD1 H5, HD1 F4 способны связывать альфа-дефенсин 1-3 (α-HNP 1-3) человека, находящийся в растворе.
Количественный анализ альфа-дефенссина в синовиальной жидкости.
Для определения количества дефенсина в суставных жидкостях провели следующий сэндвич ИФА.
2
4
МоАт (HD1 F4) сорбировали ночь при + 4°C в ФСБ в концентрации 5 мкг/мл, отмывали трижды в ФСБ-Т. Суставные жидкости и смесь натуральных альфа-дефенсинов 1,2,3 в серийных разведениях инкубировали 1 час при 37°C. Суставные жидкости титровали от разведения  с шагом 3, дефенсин разводили от 300 нг/мл с шагом 3. Отмывали три раза в ФСБ-Т. Пероксидазный конъюгат антител разводили в ФСБ-АТ 1/30000 и инкубировали 1 час при 37°C, отмывали пять раз в ФСБ-Т. После, наносили субстратный буфер ТМБ. Реакцию останавливали HSO. Результаты измеряли на спектрофотометре Multiscan при длине волны 450нм. Результаты представлены в фиг. 2.
Таким образом:
- пара антител HD1 F4 -HD1 H5 способна определять натуральные человеческие дефенсины в суставных жидкостях
- нижний порог детекции дефенсинов в подобранных условиях составил около 10 нг/мл
- при наличии воспаления, вызванного бактериальной инфекцией, концентрация дефенсинов превышает 50 мкг/мл, при неинфекционном воспалении колеблется около 5 мкг/мл, при отсутствии инфекции и воспаления может опускаться ниже 0,5 мкг/мл.
Пример 3. Иммунологическая характеризация моноклональных антител против альфа дефенсинов 1,2,3 методом иммуноблоттинга.
В работе использовали два очищенных фьюза - HD2 и HD3. Специфичность МоАт к дефенсинам каждого фьюза доказывали Вестерн-блотом где использовали как цельные фьюзы, так и протеолизные. Для этого молекулы дефенсина отделяли от белка HSP70 по сайту протеолиза добавлением энтерокиназы (ЕК).
Условия расщепления выбирали индивидуально для каждого фьюза. Подбирали как различные соотношения ЕК и белкового субстрата, так и время протеолиза. Эффект расщепления подтверждали электрофорезом. Один из SDS- ПААГ показан на рисунке 3.
Всего приготовили 4 образца SDS-ПААГ в одинаковых условиях. 1 дорожка - стандарты молекулярных масс, 2 и 3 дорожкки - исходный фьюз HD2 до расщепления ЕК, 4 и 5 дорожки - фьюз HD2 после 1 часа инкубации при температуре 37°C с EK (1МЕ на 100 мкг фьюза), 6 и 7 - HSP70. Все образцы кроме стандарта наносились в невосстанавливающих и восстанавливающих условиях.
Первый из четырех гелей окрашивали Coomassie brilliant blue R250 (фиг. 3). Остальные три переносили на нитроцеллюлозные мембраны и инкубировали с анти-дефенсиновыми антителами HD1F4 (фиг. 4), анти- HSP70 TS481 (Фиг. 5) или без антител (контроль конъюгата) (фиг. 6).
Иммуноблотинг фьюзов HD2, HD3.
Степень протеолиза контролировали Вестерн-блотом, используя антитело против дефенсина HD1F4 и антитело к HSP70 - TS431.
2
4
На первом этапе проводили электрофоретическое разделение цельных и расщепленных ЕК фьюзов с помощью электрофореза в 12% полиакриламидном геле (SDS-ПААГ) в невосстанавливающих и в восстанавливающих, как показано выше. Затем осуществляли электрофоретический перенос (электроблоттинг) разделенных белков из геля на твердую подложку. В качестве твердой подложки использовали Memebrane filters cellulose nitrate; pore size 0,45 μm (ADVANTEC, Япония). Перенесенные белки выявляли на полученном блоте с помощью непрямого иммуноферментного анализа, используя моноклональные антитела против HD, против HSP70, а также соответствующий антивидовой пероксидазный конъюгат. Для этого мембрану блокировали раствором 5% БСА в течение ночи при температуре +4°C и трижды промывали ФСБ-Т (10 mM KHPO, pH 7.5, 0.145 M NaCl, 0,05% Tween20). Нитроцеллюлозную мембрану разрезали и помещали в растворы антител с концентрацией 10 мкг/мл, отрицательный контроль и инкубировали 1 час при температуре +37°C. После трехкратной промывки мембраны инкубировали с антивидовыми пероксидазными конъюгатами поликлональных антител в течение 1 часа при температуре +37°C. После повторной пятикратной промывки в ФСБ-Т добавляли субстрат (3,3- диаминобензидин, 4- хлор-1- нафтол и перекись водорода), инкубировали 15 минут и останавливали реакцию, промывая дистиллированной водой. Результаты иммуноблота приведены на фиг. 4, 5, 6, 7. На них видно, что МоАт HD1F4 окрашивают полосы с фьюзами HD2 и HD3 как в восстанавливающих, так и в невосстанавливающих условиях. При этом, не окрашивают расщепленные энтерокиназой фьюзы, так как молекулы отщепившегося дефенсина в силу своей малой молекулярной массы вышли из геля вниз в электродный буфер. Так же, отсутствует окрашивания белка - носителя - HSP70. Напротив, МоАт TS481 - анти HSP70 окрашивают все полосы потому что все они содержат HSP70 или продукты его деградации. Контроль конъюгата показывает полное отсутствие неспецифического связывания. Тем самым была доказана специфическая активность МоАт против дефенсинов.
Выводы.
Анализ проведенных экспериментов позволил сделать следующие выводы:
1) То, что МоАт, полученные после иммунизации синтетическим HD распознают фьюзы HD-HSP70 и наоборот, указывает на конформационное сходство молекул дефенсина в составе фьюзов и коммерческих искусственных дефенсинов.
2) Молекула дефенсина имеет гидрофильную часть (выделина жирным шрифтом и подчеркнута в таблице 8) и гидрофобную (остальную часть последовательности), и все МоАт, вероятно, связывают гидрофильную область. Все дефенсины и аналоги имеют одинаковую гидрофильную часть, поэтому все МоАт связывают и не различают HD1-3 и их аналоги. Кроме того моноклональне антитела реагируют с денатурированным (Вестерн-блот) и нативным (ИФА) дефенсином.
Таблица 8 - Аминокислотные последовательности общих участков для трех дефенсинов. Желтым цветом выделена гидрофильная часть молекулы дефенсина. Остальная часть - гидрофобная.
Дефенсин
Аминокислотная последовательность
HD1
CYCRIPACI AGERRYGTCI YQGRLWAFCC
HD2
CYCRIPACI AGERRYGTCI YQGRLWAFCC
HD3
CYCRIPACI AGERRYGTCI YQGRLWAFCC
Пример 4. Иммунологическая характеризация моноклональных антител против альфа дефенсинов 1,2,3 методом иммунохроматографического анализа.
Первую модель иммунохроматографического анализа разрабатывали по схеме, где на мембрану тест-полоски нанесены две полосы: тестовая - стрептавидин, контрольная - антивидовые поликлональные антитела (анти-мышь). Реакция образования иммунного комплекса происходит в объеме 100 мкл буффера, в который добавляются антитела захвата (HD1 F4) меченые биотином, антитела детекции меченые частицами коллоидного золота (HD1 H5), антиген содержащая субстанция. Результат считывается по наличию либо отсутствию выраженного окрашивания тестовой (нижней) полосы: при наличии - позитивный, при отсутствии - негативный. Контрольная полоса указывает на правильность выполнения теста.
Принципиальная схема теста показана на фиг. 8.
Также, на фиг. 8 внизу справа показаны результаты теста - отрицательный с окрашиванием одной контрольной (верхней) полосы и положительный, с окрашиванием двух полос - контрольной (верхней) и тестовой (нижней).
Вторая модель показала результаты схожие с предыдущими.
Отличие от предыдущего формата состояло в том, что антитело детекции (HD1 H5), меченное частицами коллоидного золота, наносили на специализированную мембрану для нанесения конъюгата (Millipore, GFDX203000, США) и высушивали. Антитело связывания (HD1 F4) и антивидовое наносили на рабочую мембрану (MDI, CNPC 15, Индия) и высушивали. При такой схеме анализа реакция связывания с образованием иммунного комплекса проходит в потоке, на мембране (фиг. 9).
На фиг. 9 видно, что иммунохроматографические тест полоски, имеют окрашивание тестовой полосы при концентрации 50 мкг/мл и менее интенсивное при 16,6 - 1,9 мкг/мл. При том, что по протоколам оптическая плотность КЗ в 10 раз меньше, чем в первой модели, можно констатировать, что есть потенциальная возможность повышения чувствительности.
Так же, моноклональные антитела HD1 H5 и HD1 F4 были опробовали в иммунохроматографическом анализе с использованием суставных жидкостей. Для этого синовиальные жидкости от разных пациентов разделили на три серии по шесть штук в каждой. Каждую серию анализировали в различной лаборатории различные операторы в разное время. Каждый образец хранили в двух вариантах - при +4°С и -20°С. Результаты ИХА сравнивали с результатами посева, теста на лейкоцитарную эстеразу, СОЭ, и др. Данные частично приведены в таб. 9.
Таблица 9 - Сравнение результатов ИХА с результатами посева.
№
Материал
Хранение
ДефенсТест
Инфекция по посеву
Примечания
1
Синовиальная жидкость
+4
Слабо положит.
нет
Геморрагическое воспаление ТБС
2
Синовиальная жидкость
+4
Отрицат.
нет
Артрит
3
Синовиальная жидкость
+4
Резко положит.
S.aureus
ППИ, гнойное воспаление
4
Синовиальная жидкость
+4
Отрицат.
S.heamolyticus
После ревизии - инфекции нет
5
Синовиальная жидкость
+4
Резко положит.
данных нет
ППИ, гнойное воспаление
6
Синовиальная жидкость
-20
Слабо положит.
нет
Геморрагическое воспаление ТБС
7
Синовиальная жидкость
-20
Отрицат.
нет
Артрит
8
Синовиальная жидкость
-20
Резко положит.
S.aureus
ППИ, гнойное воспаление
9
Синовиальная жидкость
-20
Отрицат.
S.heamolyticus
После ревизии - инфекции нет
10
Синовиальная жидкость
-20
Резко положит.
данных нет
ППИ, гнойное воспаление
11
HD-HNP
-70
Контроль
Выводы.
Антитела HD1 H5, HD1 F4 конъюгируются сохраняя специфическую активность.
Антитела HD1 H5, HD1 F4 имеют достаточную чувствительность и специфичность для использования их в ИХА при обнаружении дефенсина.
Два варианта иммунохроматографического анализа на основе МоАт HD1 H5, HD1 F4 детектируют наличие дефенсина как в тестовых растворах, так и в синовиальных жидкостях человека.
Результаты иммунохроматографического анализа показывают высокую схожесть с результатами бактериологического посева.
Присутствие дефенсина в суставной жидкости указывает на высокую вероятность наличия инфекционного воспаления.
Антитела пригодны для создания диагностических тест систем для обнаружения альфа-дефенсинов 1-3 (α-HNP 1-3) человека с дальнейшим применением в клинической практике.
Пример 5. Клонирование генов, кодирующих антитела и Fab фрагменты мышиных моноклональных антител против альфа-дефенсин 1-3 (α-HNP 1-3) человека, используя мРНК из подходящих линий клеток в качестве матриц.
Гены, кодирующие антитела клонировали и секвенировали последовательности кДНК, кодирующие вариабельные домены мышиных антител HD1 H5, HD1 F4 к альфа-дефенсину 1-3 (α-HNP 1-3) человека. Для этого была выделена суммарная РНК из клеток гибридом, проведена реакция обратной транскрипции-амплификации. Полученные фрагменты ДНК клонировали и секвенировали. Результаты секвенирования ДНК различных клонов сравнивали между собой и с базами данных GeneBank (IgBlast). В результате были найдены нуклеотидные последовательности, на основании которых были определены аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 вариабельных доменов указанных антител. Участки CDRs были определены по номенклатуре Международной информационной системы по иммуногенетике (International Immunogenetics Information System, www.imgt.org).
В частности, антителами согласно настоящему изобретению являются моноклональные антитела, обладающее способностью к связыванию альфа-дефенсинов 1-3 (α-HNP 1-3) человека в растворе и на твердой фазе как самостоятельно, так и в паре.
Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи мышиного антитела HD1 H5 против альфа-дефенсина 1-3 (α-HNP 1-3) человека приведена в перечне аминокислотных последовательностей под номером SEQ ID NO: 1.
Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи мышиного антитела HD1 H5 против альфа-дефенсина 1-3 (α-HNP 1-3) человек приведена в перечне аминокислотных последовательностей под номером SEQ ID NO: 2.
Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи мышиного антитела HD1 F4 против альфа-дефенсина 1-3 (α-HNP 1-3) человек приведена в перечне аминокислотных последовательностей под номером SEQ ID NO: 3.
Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи мышиного антитела HD1 F4 против альфа-дефенсина 1-3 (α-HNP 1-3) человек приведена в перечне аминокислотных последовательностей под номером SEQ ID NO: 4.
Хотя настоящее изобретение было подробно описано со ссылкой на предпочтительные варианты его осуществления, для специалиста в данной области техники ясно, что могут быть сделаны различные замены и применены эквиваленты, которые не выходят за рамки настоящего изобретения.
--->
Перечень последовательностей
<110> Варламов Николай Евгеньевич, Varlamov Nikolai Evgenievich
<120> Вариабельные домены легких и тяжелых цепей мышиных моноклональных антител против альфа-дефенсинов 1-3 (HNP 1-3) человека, антигенсвязывающие фрагменты (Fab) против HNP 1-3 человека, содержащие указанные домены.
<140> RU 2019129111
<141> 2019-09-16
<160> 4
<210> 1
<211> 122
<212> PRT
<213> Mus musculus
<300>
<301> Ошкуков С.А., Волошин В.П., Еремин А.В., Варламов Н.Е
<302> Ранняя диагностика перипротезной инфекции крупных суставов
<303> Актуальные вопросы травматологии
<305> Материалы конференции молодых ученых Северо-Западного федерального округа 14 апреля 2017
<306> 84-86
<307> 2017-06-23
<400> 1
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
1        5          10         15
Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr
20         25         30
Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys
35         40         45
Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr
50         55         60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser
65         70         75
Lys Asn Gln Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp
80         85         90
Thr Ala Thr His Tyr Cys Ala Arg Ser Pro Leu Leu Leu Arg Pro
95         100         105
Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
110         115         120
Ser Ala
<140> RU 2019129111
<141> 2019-09-16
<210> 2
<211> 112
<212> PRT
<213> Mus musculus
<300>
<301> Ошкуков С.А., Волошин В.П., Еремин А.В., Варламов Н.Е
<302> Ранняя диагностика перипротезной инфекции крупных суставов
<303> Актуальные вопросы травматологии
<305> Материалы конференции молодых ученых Северо-Западного федерального округа 14 апреля 2017
<306> 84-86
<307> 2017-06-23
<400> 2
Asp Val Val Val Ser Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Phe
1        5          10         15
Gly Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ala
20         25         30
Asn Ser Tyr Gly Asn Ala Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys Pro
35         40         45
Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Arg Phe
50         55         60
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
65         70         75
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Thr Ile Lys Pro Glu Asp Leu Gly Met
80         85         90
Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Thr His Gln Pro Leu Thr Phe Gly Ala
95         100         105
Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
110
<140> RU 2019129111
<141> 2019-09-16
<210> 3
<211> 122
<212> PRT
<213> Mus musculus
<300>
<301> Ошкуков С.А., Волошин В.П., Еремин А.В., Варламов Н.Е
<302> Ранняя диагностика перипротезной инфекции крупных суставов
<303> Актуальные вопросы травматологии
<305> Материалы конференции молодых ученых Северо-Западного федерального округа 14 апреля 2017
<306> 84-86
<307> 2017-06-23
<400> 3
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
1        5          10         15
Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr
20         25         30
Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys
35         40         45
Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr
50         55         60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser
65         70         75
Lys Asn Gln Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp
80         85         90
Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Pro Leu Leu Leu Arg Pro
95         100         105
Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
110         115         120
Ser Ala
<140> RU 2019129111
<141> 2019-09-16
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> Mus musculus
<300>
<301> Ошкуков С.А., Волошин В.П., Еремин А.В., Варламов Н.Е
<302> Ранняя диагностика перипротезной инфекции крупных суставов
<303> Актуальные вопросы травматологии
<305> Материалы конференции молодых ученых Северо-Западного федерального округа 14 апреля 2017
<306> 84-86
<307> 2017-06-23
<400> 4
Asp Val Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Leu Ser Phe
1        5          10         15
Gly Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Pro
20         25         30
Asn Thr Tyr Gly Thr Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys Pro
35         40         45
Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Arg Phe
50         55         60
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
65         70         75
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Thr Ile Lys Pro Glu Asp Leu Gly Met
80         85         90
Tyr Tyr Cys Leu Gln Thr Thr His Gln Pro Leu Thr Phe Gly Ala
95         100         105
Gly Thr Glu Leu Glu Leu Lys
110
<---