Способ исследования воздействия экзометаболитов Opisthorchis felineus на пролиферативную активность и дифференцировку стволовых клеток почек в эксперименте
METHOD FOR STUDYING THE EFFECT OF OPISTHORCHIS FELINEUS EXOMETABOLITES ON THE PROLIFERATIVE ACTIVITY AND DIFFERENTIATION OF KIDNEY STEM CELLS IN AN EXPERIMENT

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной медицине.
Актуальность заявляемого способа определяется тем, что описторхоз, трематодоз - паразитарное заболевание, вызываемое кошачьей двуусткой - Opisthorchis felineus, имеющее системный характер, и в клинике состояние почек при описторхозе изучено недостаточно.
При описторхозе, трематодозе паразиты повреждают экониши, где они вегетируют - печень, поджелудочную железу, желчный пузырь [Бычков В.Г., Чернов И.А., Хадиева Е.Д. и др. Закономерности пролиферативных реакций при описторхозе: их роль в канцерогенезе и регенерации // Морфология. 2018. Т. 153. №3. С. 52.].
Клиническая и патологоанатомическая практики показывают, что гельминты вызывают существенные изменения в органах и системах, где они не паразитируют, т.е. происходят изменения вне экониш описторхисов: легкие, почки и др., наиболее выражены эти проявления при гиперэозинофильном синдроме, вследствие многочисленных ранних и поздних суперинвазий [Соловьева О.Г. Клинико-патогенетические особенности заболеваний легких при суперинвазионном описторхозе у населения Среднего Приобья: автореферат дис. … доктора медицинских наук. Тюмень, 2011. - 43 с.], [Куликова С.В. Структурно-функциональные изменения сердца и антропометрических показателей у больных суперинвазионным описторхозом: автореферат дис. … кандидата медицинских наук. Тюмень, 2011. - 22 с.].
Описторхисы содержат в составе секретома белок гранулин, который оказывает выраженный пролиферативный эффект, в результате мутаций многочисленных пролиферативных генов [Пахарукова М.Ю. Структурно-функциональная организация системы метаболизма ксенобиотиков у возбудителя описторхоза Opisthorchis felineus (Rivolta, 1884): автореферат дис. … доктора биологических наук. Новосибирск, 2016. - 40 с.], [Помазной М.Ю. Транскриптомный анализ трематоды Opisthorchis felineus: автореферат дис. … кандидата биологических наук. Новосибирск, 2015. - 13 с.]. Ранее было показано, что у лабораторных животных описторхозная инвазия экспрессирует многочисленные гены c-Kit, АРС, K-ras, B-raf, WE6F, VEGFR и др., что объясняется реакцией паразита для обеспечения особей трофическим субстратом - холангиоцитами. Происходит индуцирование регионарных стволовых клеток печени (репликативного потенциала) к пролиферации и дифференцировки по правилу H.Leduc (1964) на холангиоцелюлярный и гепатоцеллюлярный (ГЦД) диффероны; одновременно (15 сут эксперимента) наблюдаются активные процессы неоангиогенеза: васкулогенез - формирование сосудов из прогениторных клеток и ангиогенез - из сосудистой сети, вследствие кинетических процессов эндотелия и перицитов предсуществующих капилляров [Bychkov V.G., Kulikova S.V., Petrov I.M. et al. Hypereosinophilic syndrome, cardiomyopathies, and sudden cardiac death in superinvasive opisthorchiasis // Cardiology research and practice. 2019. P. 1-5.].
В клинике состояние почек при описторхозе изучено недостаточно. У пациентов с хроническим описторхозом наблюдали протеинурию, гематурию, цииндрурию, многие исследователи связывают эти проявления с аллергической реакцией на описторхисов [Рычкова Е.К., Козина О.И., Сазонова Л.В. Поражение почек при описторхозе // Материалы 1-го съезда терапевтов Тюменской области. Тюмень, 1970. С. 88-90.], [Озерецковская Н.Н., Зальнова Н.С., Тумольская Н.И. Клиника и лечение гельминтозов. Инфекционные и паразитарные заболевания. Л.: Медицина 1985 г. 184 с.] также были описаны случаи иммунного гломерулонефрита с нефротическим синдромом при остром описторхозе, проявлением которого служит выраженная нефропатия [Шульцев Т.П., Цаленчук Я.П., Ольхин В.А. Нефротический синдром при описторхозе // Клиническая медицина. 1973. т. 51. №8. С. 132-135.], [Калюжин В.В., Коваль В.В., Калюжина Е.В. и др. Поражение почек при хроническом описторхозе. Мед. паразитол. и паразитарные болезни 2008; 4: 14-16.]. Морфогенетических исследований по инициациии и кинетике собственных стволовых клеток почек при описторхозе не проводилось, остается неизвестной реакция репликативного потенциала почек на инициирующий субстрат описторхисов - секретом (гранулин), что является важным при выявлении репаративных процессов при частичных резекциях этого органа и в профилактике смертельных осложнений при хронической болезни почек.
Техническая проблема, на решение которой направлено заявляемое изобретение - выявить пролиферативную активность и дифференцировку стволовых клеток почек при суперинвазионном описторхозе в эксперименте.
Ожидаемый технический результат - повышение пролиферативной активности и дифференцировка стволовых клеток почек у лабораторных животных за счет выявления репликативного потенциала почек при различных формах описторхоза.
Технический результат достигается тем, что в способе исследования воздействия экзометаболитов Opisthorchis felineus на пролиферативную активность и дифференцировку стволовых клеток почек в эксперименте, при котором производят заражение животных метацеркариями, моделируют суперинвазионную форму описторхоза, на 7, 15, 30 сутки выводят животных из эксперимента, берут образцы почечной ткани животных, фиксируют в формалине, заливают в парафин, срезы окрашивают гематоксилином и эозином, проводят иммуногистохимическое исследование, вычисляют индекс пролиферативной активности клеток, определяют число почечных капилляров в самом клубочке, по увеличению показателей маркера CD31 строме почек и в стенке канальцев и умеренной экспрессии маркера CD34 в клубочковом аппарате делают вывод об активации стволовых клеток в данных структурах и выраженной пролиферации стволовых и прогениторных клеток в формирующихся сосудах, а также эпителиальных структур канальцев.
Способ осуществляется следующим образом.
+
Эксперимент проведен на 60 сирийских хомяках-самцах (Syrian golden hamster) массой 95,0±100,0 г. Животные разделяют на 3 группы: 1-ая - контрольная - 10 животных, 2-ая - опытная - 25 хомяков, проводят заражение животных 50 метацеркариями Opisthorchis felineus. 3-ая - моделирование суперинвазионной формы описторхоза - заражение 50 личинками О. felineus, повторное заражение 50 метацеркариями проводят через 14 и 25 сут. Метацеркарии выделялись по методике Г.А. Глазкова из язей (Leuciscus idus) одного биотопа. Все манипуляции выполняются в соответствии с принципами, изложенными в Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (Страсбург, Франция, 1986) и после получения разрешения этического комитета ГБОУ ВПО «Тюменский ГМУ» Минздрава России. Из эксперимента животных выводят посредством передозировки наркоза с последующей декапитацией на 7, 15, 30 сут опыта. Образцы почечной ткани фиксируют в 10% нейтральном формалине, заливают в парафин. Срезы окрашивают гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону. Депарафинирование, демаскировку антигеном и ИГХ-реакции проводят в соответствии со стандартными протоколами с использованием автостейнера Leica Bond Мах. Иммуногистохимические исследования проводят с применением маркеров CD34 (клон - QBEnd/10, Cell Marque, фирмы Lab Vision Corportation), CD31 (клон - JC70, Cell Marque, фирмы Novokastra), Oct-4 (клон - MRQ-10, Cell Marque, фирмы Lab Vision Corportation), CD117 (клон - YR145, Cell Marque, фирмы Lab Vision Corportation) и Ki-67 (клон - MIB-1, Agilent/Dako, RTU). Результаты ИГХ оценивают путем полуколичественного и количественного характеристик: интенсивность реакции по шкале от 0 до 3 баллов (0 - реакция отсутствует, 1 - слабая реакция, 2 - умеренная реакция, 3 - выраженная реакция) и количество позитивно окрашенных клеток в 1 поле зрения (при увеличении ×400). Подсчет количества позитивно окрашенных клеток выполняют на 10 п.з. ×400 и рассчитывают среднее арифметическое. Вычисляют индекс пролиферативной активности клеток (%) по формуле:  где n - число меченых ядер, N - общее число ядер в поле зрения микроскопа. Изучение гистологических препаратов и микрофотосъемка производят на микроскопе Axio Lab.A1 (производитель Carl Zeiss Microscopy, Германия) со встроенной цветной камерой Axiocam ICc 5, окуляр W-PI 10х/20 мм, объективы Achroplan: 5х/0,12, 20х/0,45, 40х/0,60, 63x/0,80 и 100х/1,25 oil с дальнейшим морфометрическим анализом.
На 7 сутки после заражения в опытной группе при макроскопическом и гистологическом исследовании фиксируют минимальные изменения в почках. Морфологические изменения были сходны и соответствовали морфологической картине, наблюдаемой в контрольной группе. В группе с СО отмечался очаговый отек интерстиция и незначительная лимфоидная инфильтрация в корковом веществе; в клубочках значимых изменений не обнаружено.
Микроскопическая картина почек на 15 сут эксперимента у животных II и III групп значительно отличалась от группы I (контроль), отмечались морфологические изменения разной степени в различных отделах нефрона. Наблюдалось увеличение размера клубочков с умеренным сдавлением капиллярных петель, в некоторых из них выявлялся очаговый склероз капсулы и капиллярных петель. В корковом веществе наблюдалась вакуолизация цитоплазмы некоторых клеток эпителия извитых канальцев. В проксимальных канальцах присутствовали признаки гиалиново-капельной дистрофии, фокально имелись признаки некробиоза. Происходило частичное слущивание десквамированного эпителия с образованием мелких очагов денудации, также обнаруживались очаги фиброза и склероза. Установлено, что при СО до 28% клубочков были гипертрофированными, тогда как во второй группе они наблюдались на поздних сроках, при этом до 10% клубочков находились в колабированном состоянии с начинающимися признаками гломерулосклероза, что сопровождалось стазом в капиллярах почечного тельца.
В строме почек и в стенке канальцев во второй группе (разовое заражение метацеркариями Opisthorchis felineus) наблюдалось увеличение показателей маркера CD31, в клубочковом аппарате наблюдалась умеренная экспрессия маркера CD34, что свидетельствует об активации стволовых клеток в данных структурах (Фиг. 1, 2, 3). Кроме этого, определялось повышение числа почечных капилляров в самом клубочке (в I группе -31±12,74). В третьей группе (суперинвазионная форма описторхоза) наблюдалась выраженная пролиферация стволовых и прогениторных клеток в формирующихся сосудах, а также эпителиальных структур канальцев (Таблица №1).
На 30 сутки эксперимента в просвете извитых канальцев наблюдались зернистые цилиндры. Вблизи клубочков обнаружены воспалительные инфильтраты в виде лимфомононуклеаров. В препаратах выявляют очаговый интерстициальный фиброз, который был существенно более выражен, чем в опытной группе. Наблюдается сегментация клубочков, сопровождающаяся увеличением количества капилляров почечного тельца. Они были гипертрофированными, располагались близко друг к другу, часть находилась в выраженном склерозе в сравнении со второй группой эксперимента (Фиг. 4). Кроме этого, определяется выраженная пролиферация многослойного переходного эпителия в лоханке (Фиг. 5)
В нефронах регистрируют статистически значимое увеличение диаметра клубочка, определялось увеличение площади самого клубочка в сравнении со второй группой (Фиг. 6). Здесь имелась выраженная экспрессия маркеров CD31 и Oct-4 (Фиг. 7, 8).
В ходе эксперимента было установлено, что в стенке почечных канальцев выявляется более высокий регенераторный потенциал по сравнению с клубочками, т.к. в данных структурах при суперинвазионном описторхозе наблюдается экспрессия маркера CD34, Oct-4, CD 117. При исследовании пролиферативной активности экспрессия маркера Ki-67 в данных структурах выше, чем в клубочковом аппарате.
Важную роль в состояниях играет микроциркуляторное русло почки, а именно перициты. Как известно, они активно экспрессируют васкулоэндотелиальные факторы роста (VEGF), поэтому выявленная активность маркера CD31 до 3 баллов, что подтверждает факт того, что подоциты, образуя обширную сеть вокруг капилляров, активно участвуют в процессе ангиогенеза и созревании сосудов при воздействии секретома Opisthorchis felineus. Кроме этого, при использовании гистохимических окрасок было подтверждено, что умеренные склеротические изменения вокруг клубочкового аппарата являются следствием активации фибробластического дифферона. Число петель в клубочках при СО увеличивается на 24,3% (67,4±3,6).
Таким образом, выявлено, что секретом Opisthorchis felineus инициирует активацию стволовых клеток в почечных канальцах и перицитов микроциркуляторного русла. Наблюдается выраженная пролиферация переходного эпителия лоханок и начальных отделов мочеточника. Кроме этого, под действием секретома паразита наблюдается выраженная пролиферация стволовых клеток непосредственно в петлях клубочков.
Использование секретома описторхов возможно в профилактике развития почечной недостаточности при хронической болезни почек (из-за образования большого количества новых петель в клубочках), что соответствует принципам парадигмы превентивно-предиктивной и персонализированной медицины.
Список использованной литературы:
1. Бычков В.Г., Иванюженко Н.Д., Шевчук О.Н. Описторхоз в сочетании с алкогольной интоксикацией у людей и в эксперименте. Клинико-морфологическое исследование // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 1986. №5. С. 30-33.
2. Бычков В.Г., Чернов И.А., Хадиева Е.Д. и др. Закономерности пролиферативных реакций при описторхозе: их роль в канцерогенезе и регенерации // Морфология. 2018. Т. 153. №3. С. 52.
3. Соловьева О.Г. Клинико-патогенетические особенности заболеваний легких при суперинвазионном описторхозе у населения Среднего Приобья: автореферат дис. … доктора медицинских наук. Тюмень, 2011. - 43 с.
4. Куликова С. В. Структурно-функциональные изменения сердца и антропометрических показателей у больных суперинвазионным описторхозом: автореферат дис. … кандидата медицинских наук. Тюмень, 2011. - 22 с.
5. Пахарукова М.Ю. Структурно-функциональная организация системы метаболизма ксенобиотиков у возбудителя описторхоза Opisthorchis felineus (Rivolta, 1884): автореферат дис. … доктора биологических наук. Новосибирск, 2016. - 40 с.
6. Помазной М.Ю. Транскриптомный анализ трематоды Opisthorchis felineus: автореферат дис. … кандидата биологических наук. Новосибирск, 2015. - 13 с.
7. Bychkov V.G., Kulikova S.V., Petrov I.M. et al. Hypereosinophilic syndrome, cardiomyopathies, and sudden cardiac death in superinvasive opisthorchiasis // Cardiology research and practice. 2019. P. 1-5.
8. Рычкова E.K., Козина О.И., Сазонова Л.В. Поражение почек при описторхозе // Материалы 1-го съезда терапевтов Тюменской области. Тюмень, 1970. С. 88-90.
9. Озерецковская Н.Н., Зальнова Н.С., Тумольская Н.И. Клиника и лечение гельминтозов. Инфекционные и паразитарные заболевания. Л.: Медицина 1985 г. 184 с.
10. Шульцев Т.П., Цаленчук Я.П., Ольхин В.А. Нефротический синдром при описторхозе // Клиническая медицина. 1973. т. 51. №8. С. 132-135.
11. Калюжин В.В., Коваль В.В., Калюжина Е.В. и др. Поражение почек при хроническом описторхозе. Мед. паразитол. и паразитарные болезни 2008; 4: 14-16.
12. Глазков Г.А. Выделение метацеркариев некоторых трематод из пораженной ткани рыб методом переваривания в искусственном желудочном соке. Болезни и паразиты рыб ледовитоморской провинции (в пределах СССР). Томск, 1979. С. 72-82.