Исследование взаимоотношений индигенных и транзиторных микроорганизмов в смешанной культуре на среде с пребиотиком

УДК 641:613.2

С. А. Евдокимова, А. С. Мищенко, Б. А. Кареткин, Е. В. Гусева, И. В. Шакир, В. И. Панфилов

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ ИНДИГЕННЫХ

И ТРАНЗИТОРНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

В СМЕШАННОЙ КУЛЬТУРЕ НА СРЕДЕ С ПРЕБИОТИКОМ

Ключевые слова: пробиотик, пребиотик, конкуренция, транзиторные, индигенные, Lactobacillus plantarum.

Исследованы взаимоотношения между транзиторными (B. cereus) и индигенными (L. plantarum, консорциум бифидобактерий) штаммами микроорганизмов при совместном культивировании на среде с пребиотиком в качестве единственного источника углерода. Показано, что L. plantarum подавляет рост остальных микроорганизмов. При этом рост консорциума бифидобактерий, способного использовать пребиотик в качестве единственного источника углерода, подавлялся в начальный момент ферментации бациллами и лактобактериями даже на среде с пребиотиком в анаэробных условиях.

Keywords: probiotic, prebiotic, competition, transient, indigenous, Lactobacillus plantarum.

The relationship between the transient (B. cereus) and the indigenous (L. plantarum, bifidobacteria consortium) microorganisms strains when co-cultured on a prebiotic containing medium as a sole carbon source has been investigated. It is shown that stain of L. plantarum considered suppresses the growth of other microorganisms. The growth of bifidobacteria consortium capable prebiotic used as the sole carbon source, was suppressed in the initial moment of the fermentation by lactobacillus and bacillus even in the anaerobic fermentation of prebiotic containing medium.

Введение

В настоящее время среди населения большинства стран мира значительно возрастает интерес к здоровому образу жизни и, в частности, к здоровому питанию. В связи с указанной тенденцией возникает повышенный спрос на продукты функционального питания. К компонентам функционального питания относятся, в частности, пробиотики и пребиотики. Согласно определению ВОЗ/ФАО, пробиотики - это живые микроорганизмы, которые при применении в адекватных количествах вызывают улучшение здоровья организма-хозяина [1].

В соответствии с современными представлениями эубиотические микроорганизмы (в том числе пробиотики) относят к конструктивной фракции с делением на доминантные, содоминантные и второстепенные группы [2]. К доминантным (индигенным) сочленам кишечного микробиоценоза, прежде всего, относят представителей родов Bifidobacterium, Lactobacillus, Enterococcus, Bacteroides. Представители тех же родов относятся к содоминантам, присутствующим в кишечном ареале постоянно, но с меньшей плотностью популяции. К второстепенным ценопопуляциям относятся группы транзиторных микроорганизмов, которые в норме постоянно присутствуют в кишечном ареале, но не способны колонизировать пристеночный

микробиотоп (например, некоторые представители рода Bacillus) [3]. Многолетние исследования действия пробиотиков на человеческий организм показали его многообразие. В настоящее время пробиотики используются для предотвращения и лечения различного вида диарей, воспалений кишечника, язвенной болезни, острого панкреатита, облегчения симптомов аллергических реакций и лактозной непереносимости; имеются данные о снижении вероятности заболевания раком кишечника

[1]. Кроме того, было выявлено снижение частоты и длительности ротавирусной инфекции, стимуляция гуморального и клеточного иммунитета [5-7].

Замечено положительное воздействие пребиотиков на рост пробиотиков. Термин пребиотики был введён G. R. Gibson и M. B. Roberfroid, согласно которому «пребиотики - это неусвояемый пищевой ингредиент, который благотворно влияет на организм хозяина, избирательно стимулируя рост и / или активность одного или ограниченного числа бактерий в толстой кишке» [8]. К числу наиболее известных пребиотиков относятся инулин и олигофруктоза, лактулоза, галактоолигасахариды. Олигофруктоза присутствует во многих пищевых продуктах растительного происхождения. Ферментация олигофруктозы в толстой кишке вызывает множество физиологических эффектов: повышение количества бифидобактерий, увеличение всасываемости кальция, причём дополнительный кальций откладывается в костях, уменьшение транзитного времени прохождения через ЖКТ [9].

В настоящее время разработаны и применяются в промышленном производстве способы получения основных пребиотических веществ, однако интерес научного сообщества к поиску новых пребиотиков, а также новых объектов, содержащих уже известные пребиотики, не ослабевает. В совокупности с увеличением производства указанные обстоятельства влекут за собой необходимость применения доступного (in vitro) и при этом максимально достоверного метода оценки пребиотической активности и стандартизации показателя качества пребиотиков, основанного на количественной оценке.

Обычно для оценки пребиотической активности веществ in vitro применяется культивирование на средах с пребиотиком в качестве источника углерода [10, 11]. Преобладают методы, в которых в качестве посевного материала используются чистые культуры пробиотических микроорганизмов, либо фекальные культуры здорового человека. Недостатки такого подхода в том, что в первом случае не учитывается влияние различных культур микроорганизмов друг на друга, которое в реальной системе (микрофлоре кишечника) играет важную роль, а во втором -повышается сложность исследования и моделирования биохимических и

микробиологических процессов, протекающих в системе в ходе роста микроорганизмов. Использование смешанных культур ограниченного числа отдельных штаммов (включающих в себя транзиторные и индигенные микроорганизмы) позволяет приблизить тест к реальным процессам, происходящим в кишечном биоценозе, но в меньшей степени усложняет описание механизмов взаимодействия.

В данной работе исследовано влияние пребиотиков на активность роста транзиторных и индигенных микроорганизмов при раздельном и совместном культивировании. Конечной целью исследований являлась разработка нового метода определения пребиотической активности.

Экспериментальная часть

Микробными объектами исследования являлись следующие индигенные штаммы (ИШ): Lactobacillusfermentum 90T-C4 - грамположительные факультативно анаэробные неспорообразующие молочнокислые бактерии; Bifidobacterium bifidum №1 - неспорообразующие, грамположительные палочки, анаэробы, некоторые палочки имеют характерные булавовидные утолщения или раздвоения на конце; Lactobacillus plantarum 8P-A3 - грамположительные факультативно анаэробные неспорообразующие молочнокислые бактерии; консорциум

бифидобактерий из препарата Бифидум-мульти-3 (Б-М-3): B. bifidum 791, B. bifidum ЛВА-3, B. longum В379М, B. longum Я-3, B. adolescentis Г7513, B. adolescentis ГО-13 [12]. В качестве транзиторных штаммов (ТШ) были рассмотрены Bacillus cereus БП-46 - вид грамположительных, спорообразующих палочек, аэробы, и Escherichia coli M-17 - вид грамотрицательных палочковидных бактерий;

Для получения инокулята B. cereus, L. plantarum, L. fermentum, E coli использовали среду MRS следующего состава (г/л): глюкоза - 20; пептон - 10; мясной экстракт - 10; дрожжевой экстракт - 5; K2HPO4- 3H2O - 2; CH3COONa • 3H2O - 5; MgSO4 • 7H2O - 0,2; цитрат аммония - 2; MnSO4 • 4H2O - 0,05; рН - 7,0. Для получения инокулята всех штаммов бифидобактерий использовали Бифидум-среду (ФГУП ГосНИИПМ). Для контроля численности B. cereus, как в чистой, так и в смешанной культурах, использовали агаризованную среду MRS (2,0 % агара); L. fermentum и L. plantarum -агаризованную среду MRS, в которой глюкозу заменили на лактозу (20 г/л), а рН - 5,0

(исключен рост B. cereus). Для контроля численности E. coli использовали среду следующего состава (г/л): пептон - 10; K2HPO4 -3,5; Na2SO3- 2,5; агар - 20; лактоза - 10; спиртовой раствор фуксина - 0,2 мл/л среды. Для контроля численности бифидобактерий использовали среду BFM (г/л): пептон - 10; мясной экстракт - 5; дрожжевой экстракт - 7; крахмал - 2; L-цистеин гидрохлорид - 0,5; NaCl -5; лактулоза - 5; рибофлавин - 1 мг/л; тиамин хлорид - 1 мг/л; метиленовый синий - 16 мг/л; лития цитрат - 3,3; пропионовая кислота - 5 мл/л; в полуагаризованной (п/а) (0,2 %) и агаризованной (2,0 %) форме. Для достижения анаэробиоза при контроле

численности бифидобактерий на чашках Петри культивирование проводили в атмосфере азота.

Как пребиотический объект использовали олигофруктозу (ОФ) (Synergy, Orafti).

Опыты проводили при 37 °С на среде MRS, содержащей 10 г/л глюкозы (контрольный вариант), либо 10 г/л ОФ вместо глюкозы (тестовый вариант). Среды инокулировали культурами в равных концентрациях клеток (оценивали по оптической плотности исходной суспензии).

На первом этапе исследований была проведена оценка способности каждого из выше перечисленных штаммов и консорциумов потреблять ОФ в качестве единственного источника углерода. Для этого тестовую среду с ОФ инокулировали исследуемыми культурами по отдельности. Рост оценивали визуально. При подтверждении роста делали вывод о способности штамма потреблять ОФ, в противном случае - о неспособности ферментировать ОФ. Результаты этих исследований приведены в табл.1. Необходимо отметить, что выбранный штамм E. coli характеризовался слабым ростом в микроаэрофильных условиях не только на среде с ОФ, но и с глюкозой.

Таблица 1 - Оценка способности исследуемых штаммов ферментировать ОФ

На основе полученных результатов были составлены следующие консорциумы для проведения дальнейших исследований (в скобках указана способность ферментировать ОФ):

Консорциум 1: ТШ - В. сегеш (ОФ+), ИШ -Ь fermentum (ОФ-), В. bifldum №1 (ОФ-) в микроаэрофильных условиях;

Исследованный штамм Способен (+) или

неспособен

потреблять ОФ

L. fermentum -

L. plantarum +

S B. bifidum №1 -

Консорциум Б-М-3 +

B. cereus +

Р E. coli -

Консорциум 2: ТШ -В. сегеш (ОФ+), ИШ -L. р1аМагит (ОФ+), консорциум Б-М-3 (ОФ+).

При исследовании роста консорциума 1 на контрольной и тест-среде оценку численности бактерий и кислотности среды проводили спустя 12 и 24 часа после посева. Результаты показаны на рис. 1.

9.0

B.c.

Рис. 1 - Совместное культивирование консорциума 1 в микроаэрофильных условиях на контрольной (гл) и тестовой (ОФ) средах

Титры клеток B. cereus и L. fermentum в контрольной среде были выше, чем в тестовой. В тестовой среде также наблюдалось отмирание клеток L. fermentum после 12 часов роста, что говорит о значительном подавлении их роста в результате конкуренции с B. cereus. В контрольной среде в результате ферментации глюкозы рН упал до 5,0 уже после 12 часов. Необходимо отметить, что чистая культура L. fermentum может снижать рН до 3,5. Предположительно, на уровень кислотности культуральной жидкости повлияло присутствие культуры B. cereus, которая защелачивает среду при использовании белка в качестве энергетического субстрата. В тестовой среде рН снизился незначительно, что соотносится со слабым рост L. fermentum и доминированием B. cereus. Таким образом, оба микроорганизма в среде с пребиотиком росли хуже, чем в контрольной, причем B. cereus подавлял L. fermentum.

Уже после 12-ти часов ферментации наличие бифидобактерий в среде методом высевов выявить не удалось (данные не показаны). Очевидно, рост бифидобактерий был крайне слабым или отсутствовал.

В результате проведённых исследований показано, что микроорганизмы, неспособные потреблять ОФ в качестве единственного источника углерода в чистой культуре (L. Fermentum, B. hifidum №1), также не способны расти на тестовой среде и в присутствии микроорганизма, имеющего такую способность.

На следующем этапе была проведена серия экспериментов по культивированию консорциума 2. Опыты проводили в стационарных условиях на контрольной и тестовой средах. Определение титра клеток проводили дополнительно в начальной (0 ч) точке процесса. Результаты показаны на рис. 2 (данные на 24 часа не приведены, т.к. они достоверно не различаются с данными на 12 часов роста).

Юч 12 ч

L, р

В.с

Рис. 2 - Совместное культивирование консорциума 2 в микроаэрофильных условиях на контрольной (гл) и тестовой (ОФ) средах

Из рисунка 2 видно, что в контрольной среде L. р1а^атт подавил рост В. сегеш. Возможно, причиной стала более высокая начальная концентрации лактобацилл. В тестовой среде L. р1а^атт также показал большую скорость роста, по сравнению с В.сегеш.

Начальный титр бифидобактерий на обеих средах оказался значительно ниже титра L. р1а^атт и В. сегеш, а после 12-ти часов ферментации их наличие в среде культуральными методами выявить не удалось (данные не показаны). Бифидобактерии не обнаружили и при микроскопии фиксированных препаратов.

Можно предположить, что в условиях анаэробиоза бифидобактерии покажут большую скорость роста, чем в микроаэрофильных условиях. Поэтому на следующем этапе изучили культивирование консорциума 2 на контрольной и тестовой средах в анаэробных условиях (в атмосфере азота) при перемешивании (170 об./мин). Определяли динамику концентрации белка в среде культивирования, рН и титр бактерий. Результаты показаны на рисунках 3 и 4.

7,5

ы  О

&5,5

4,5

2,5

I

V / <.— л ——— , , ♦—♦------ х--*--*............и

—♦ -В. cereus

L. plantarum )( Bifidobacterium ~àr PH

7,0

6,5

I а

6.0

5,0

0 2 4 6 8 10 12 14 16 Время, ч

3 - Совместное

20 22 24

Рис. 3 - совместное культивирование консорциума 2 в контрольной среде с глюкозой в анаэробных условиях

При рассмотрении кривой роста бифидобактерий следует отметить отсутствие фазы ускоренного роста и тенденцию к вымиранию. Лизис клеток бифидобактерий в контрольной среде начинался раньше, чем в тестовой (6 часов против 8-ми). Следует отметить,

что точка начала отмирания лежит в том же временном промежутке, что и выход лактобацилл на стационарный участок и начало защелачивания среды. Результаты подтверждены также микроскопическими исследованиями: небольшое количество бифидобактерий было выявлено только в препаратах, в начальных точках ферментации (порядка 1-2 клеток с характерной морфологией примерно на 1000 клеток лактобацилл). В дальнейших пробах бифидобактерий обнаружено не было.

9,5

8,5 7,5 6,5

7,5

ZiT-Г-.

н

i, 5,5 oi ^

4,5

3,5 1 2,5

/

S

—♦ -В. cereus L. plantarum Bifidobacterium -k- PH

7,0

6,5

6,0

5,5

5,0

0 2

6 8 10 12 14 16 20 22 24 Время, ч

Рис. 4 - Совместное культивирование консорциума 2 в тестовой среде с ОФ в анаэробных условиях

Как и в предыдущих экспериментах, в контрольной среде В. сегеш имеет более продолжительную лаг-фазу, чем Ь. р1аМагит, в результате чего культура Ь. р1аМагыт в первые 6 часов процесса преобладает в среде, что также объясняет резкое падение кислотности среды в этот период времени. Интенсивный рост В. сегеш и повышение рН, видимо связано с исчерпанием в среде углеводов. При этом, культура В. сегеш на среде с ОФ показывает более продолжительную

экспоненциальную фазу, чем на контрольной среде, и в течение 8 часов достигает численности, равной титру лактобацилл.

Содержание белка оценивали по методу Лоури. Колебания полученных значений концентраций не выходили за пределы ошибки метода, поэтому можно утверждать, что снижения концентрации белка в культуральной жидкости не было (данные не показаны).

Таким образом, во всех рассмотренных вариантах, в частности, в условиях строгого анаэробиоза, численность Ь. р1аМагыт в результате ферментации была либо заметно больше, либо сопоставима с численностью других представителей консорциумов. Интересно, что в присутствии пребиотика именно в анаэробных условиях Ь. Р1а^агыт и В. сегеш обладали практически равными

метаболическими потенциалами в отношении С-субстрата, хотя длительность лаг-фазы последнего была заметно больше. В данном случае нельзя исключать частичное потребление бациллами пептидов в качестве источника энергии, что отчасти подтверждается повышением рН. С другой стороны, данные по снижению в культуральной жидкости концентрации белка по Лоури не дают достоверного подтверждения данной гипотезы.

Неожиданной оказалась низкая активность роста бифидобактерий на контрольной и тестовой средах, в том числе в атмосфере азота. Нельзя отрицать, что одной из основных причин была их низкая посевная доза (примерно на 3 порядка ниже лактобацилл), в то время как в ЖКТ человека в норме бифидобактерий содержится на 1-2 порядка больше, чем остальных микроорганизмов. Таким образом, выявление оптимального соотношения инокулятов бифидобактерий, L. plantarum и B. cereus представляется наиболее перспективным направлением дальнейшей работы.

Определённые сложности для решения поставленных задач создаёт также использование культурального метода. В качестве альтернативы могут быть использованы современные методы количественного учёта клеток, например молекулярно-биологические методы учета и определения активности микроорганизмов без выделения в чистые культуры (метод флуоресцентной гибридизации с использованием олигонуклеотидных зондов, комплементарных специфическим участкам гена 16S рРНК) [13, 14].

Литература

1. Joint FAO/WHO Working Group, Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food. - 2002 - p. 34-50.

2. Григорьев А.В.Вариант классификации эндотрофной микрофлоры биотопов человека //Лжи Украши.-2002.-№ 3, С. 46-48.

3. Григорьев А.В., Общие принципы формирования кишечного микробиоценоза человека // Медичнийвсесвгг. 2002. Т. 2, № 1-2. С. 168-173.

4. E. Weichselbaum, Journal compilation, British Nutrition Foundation Nutrition Bulletin, Probiotics and health: a review of the evidence, London, 2009, p. 340-373.

5. Andrea T. Borchers, Carlo Selmi, Journal Gastroenterolgy: Probiotics and immunity, 2009, p. 26-46.

6. J. Schrezenmeir, M. de Vrese, Probiotics, prebiotics, and synbiotics—approaching a definition, American Society for Clinical Nutrition, 2001 г.

7. S.J. Allen, B. Okoko, E.G Martinez, The Cochrane Collaboration: Probiotics for treating infectious diarrhea, 2009 г., p. 120.

8. Gibson, G.R., Roberfroid, M.B. Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics // J. Nutr. - 1995. - Vol. 125. - P. 1401- 1412.

9. Narinder Kaur, Anil K. Gupta, Applications of inulin and oligofructose in health and nutrition, - 2002 - p. 703714.

10. L. Makras, Gerald Van Acker, Luc De Vuyst, Applied and Environmental. Microbiology: inulin-type fructans-degrading lactobacillus strains, - 2005 - Vol. 71, No. 11, p. 6531-6537.

11. Y. Nebra, A. R. Blanch, Applied and Environmental. Microbiology: a new selective medium for Bifidobacterium spp., - 1999 - Vol. 65, No. 11, p. 51735176.

12. Амерханова А. М. Научно-производственная разработка новых препаратов синбиотиков и клинико-лабораторная оценка их эффективности //Клиниколабораторная оценка их эффективности: Автореферат диссертации д-ра биол. наук: 03.00. 07. НИИЭМ им. ГН Габричевского.—М., 2009.—47 С. -2009.

13. Рахманкулова З.Ш., Кирилина Т.В., Сироткин А.С., Особенности нитрифицирующих биопленок //Сборник материалов XV международной конференции молодых ученых "Пищевые технологии и биотехнологии". -Казань,2016. - С. 221-222.

14. Macfarlane S., Macfarlane G. T. Composition and metabolic activities of bacterial biofilms colonizing food residues in the human gut //Applied and environmental microbiology. - 2006. - T. 72. - №. 9. - C. 6204-6211.

© С. А. Евдокимова - студ. каф. биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева, Россия, Москва, s.a.evdokimova@gmail.com; А. С. Мищенко - студ. каф. кибернетики химико-технологических процессов и управления РХТУ им. Д.И. Менделеева, asm_25@mail.ru; Б. А. Кареткин - к.т.н., м.н.с. каф. биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева, boris.karetkin@gmail.com; Е. В. Гусева - к.т.н., доцент каф. кибернетики химико-технологических процессов РХТУ им. Д.И. Менделеева, eguseva@)rally-online.ru; И. В. Шакир - к.т.н., доцент каф. биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева, irina_shakir@mail.ru; В. И. Панфилов -д.т.н, профессор, зав. каф. биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева, vip@muctr.ru.

© S. A. Evdokimova - 4th year student of the Department of Biotechnology Faculty of Biotechnology and Industrial Ecology D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia e-mail: s.a.evdokimova@gmail.com; A. S. Mishchenko - 4th year student of the Department of Cybernetics of chemical-engineering processes Faculty of Information Technology and Management D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia,e-mail: asm_25@mail.ru; B. A. Karetkin - Ph.D., junior researcher Department of Biotechnology D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, e-mail: boris.karetkin@gmail.com; E. V. Guseva - Ph.D., Associate Professor of the Department of Cybernetics of chemical-engineering processes D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, e-mail: eguseva@rally-online.ru; I V. Shakir - Ph.D., Associate Professor, Department of Biotechnology D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, e-mail: irina_shakir@mail.ru; V. I Panfilov - Doctor of Technical Sciences, Professor, Head of the Department of Biotechnology D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, e-mail: vip@muctr.ru.