Синбиотическая композиция для подавления микробных возбудителей кишечных инфекций и способ ее получения
SYNBIOTIC COMPOSITION FOR SUPPRESSING MICROBIAL PATHOGENS OF INTESTINAL INFECTIONS AND METHOD FOR PRODUCTION THEREOF

Область техники, к которой относится изобретение.
Изобретение относится к биотехнологии, фармацевтической и пищевой промышленности и представляет собой синбиотическую композицию на основе бифидобактерий и фруктанов корней лопуха. Заявленная композиция может быть использована для подавления возбудителей кишечных инфекций в фармацевтических препаратах, специализированных продуктах питания и БАД, а также в качестве кормовой добавки.
Уровень техники.
Синбиотики представляют собой комбинацию пробиотичсеких микроорганизмов и пребиотических веществ, синергически усиливающих действие друг друга. Одной из особенностей действия пробиотиков является подавление ими роста микроорганизмов-возбудителей инфекционных заболеваний. К пребиотическим относятся вещества, селективно стимулирующие рост и/или активность полезных представителей микробного сообщества кишечника. В данном ключе синергическое действие пребиотика можно соотнести с усилением антагонизма пробиотических микроорганизмов против патогенов, а также снижение скорости роста патогенов в результате дефицита легкоусвояемого субстрата.
Известны пребиотические свойства фруктанов (инулина и фруктоолигосахаридов), широко представленных в качестве запасных веществ в растениях преимущественно семейства сложноцветных: цикории, топинамбуре, эхинацеи, чесноке, лопухе и др. При этом получение и применение фруктанов, накапливаемых в корнях лопуха, в настоящее время не нашло широкого применения и фактически не реализовано в промышленных масштабах.
Например, описан способ (RU 2360927 С1), который предусматривает получение инулина из измельченных корней лопуха большого с помощью исчерпывающей экстракции в течение 3÷5 суток, осаждением и перекристаллизацией при обработке 96%-ным этиловым спиртом при температуре ниже минус 15°С. Недостатком данного способа является высокая длительность процесса, понижающая выход продукта с единицы оборудования и повышающая риск контаминации.
Другой способ (RU 2254138 С1) состоит в приготовление мелкодисперсного порошка одного или более чем одного растения, в частности, корней лопуха, и экстракции водным раствором этанола. Однако известно, что с повышением степени полимеризации фруктанов их растворимость в водных растворах этанола снижается. С другой стороны, растворимость растительных соединений фенольной природы водных растворах этанола может быть высока. Поэтому применение данного подхода для выделения фруктанов не является рациональным.
Известен способ (RU 2604934 С2), по которому измельченные корни лопуха обыкновенного подвергают трехкратной экстракции проводят при соотношении сырье: экстрагент 1:30, при температуре 80°С в ультразвуковой ванне в течение 30 мин. Растительный материал отделяют путем фильтрации, а водорастворимые полисахариды осаждают троекратным количеством 95%-ного этанола при перемешивании, охлаждая в морозильной камере при температуре -18°С в течение 1 часа, фильтруют под вакуумом, промывают и высушивают.Хотя выход фруктанов в данном случае высок, а процесс является интенсивным, балластные вещества, такие как белки, не растворимы в водно-спиртовых растворах и будут загрязнять целевой продукт.
Необходимо отметить, что в указанных способах не проведена оценка пребиотического потенциала полученных веществ, что ограничивает возможность их применения в синбиотических композициях. Ранее показано, что фруктаны различной степени полимеризации, могут быть получены, путем фракционного осаждения растворами вода-органический осадитель различной концентрации (Wack М., Blaschek W., 2006), и способны обладать различным действием на рост пробиотических бактерий (Rossi et al., 2005). Тем не менее ни один из приведенных способов не позволяет получить определенную фракцию лопуха с требуемыми свойствами.
Известны композиции, включающие пробиотические микроорганизмы, в т.ч., бифидобактерии, а также экстракты растительного сырья, в частности, корней лопуха (ЕР 1281403 А1). Однако для данной композиции не показана пребиотическая активность фруктанов. Также экстракты лопуха содержат значительное количество веществ фенольной природы, которые способны оказывать ингибирующее действие на рост микроорганизмов, в том числе, пробиотиков.
Наиболее близким к осуществляемому изобретению является композиция, включающая лактобактерии штамма Lactobacillus rhamnosus HN001 и фруктаны, которые, как указывают авторы, могут быть получены, в том числе, из корней лопуха (ЕР 2525811 В2). Однако эффективность данной композиции не оценена с точки зрения возможностей применения различных фракций получаемых фруктанов. Также для данной композиции не рассматривается возможность применения бифидобактерий.
Таким образом, представлено большое число как способов получения фруктанов лопуха, так и композиций пробиотических бактерий с растительными экстрактами, в том числе, из корней лопуха, а также фруктанами из них. Тем не менее, обоснование эффективности указанных композиций против микробных контаминантов пищи и патогенов пищевого происхождения, обуславливающих риск развития пищевых инфекций, не приведено, а связь между технологией получения фруктанов, определяющая их фракционный состав, и указанной эффективностью не продемонстрирована.
Раскрытие сущности изобретения.
Задачей данного изобретения является создание такой синбиотической композиции в которая отличалась бы экспериментально обоснованной, наибольшей эффективностью против различных возбудителей кишечных инфекций.
Техническим результатом изобретения является синбиотическая композиция бифидобактерий и фракции фруктанов корней лопуха, полученной экстракцией, очисткой и последующим осаждением водно-спиртовыми растворами определенной концентрации, т.е. полученной по определенному способу и при определенных параметрах процесса, что обуславливает ее эффективность против тестовых штаммов, а также указанный способ получения заявленной композиции. Экспериментально подтверждено наибольшее стимулирующее действие выбранной фракции на рост бифидобактерий и наибольшая эффективность против возбудителей кишечных инфекций, выраженная в подавлении роста тест-штаммов в смешанной культуре.
Осуществление изобретения.
Для получения фруктанов из корней лопуха сухие корни лопуха (лекарственное растительное сырье) моют, измельчают до частиц размером 0,5-1 мм, смешивают с водой в соотношении 1:8-1:12 и проводят экстракцию при повышенной температуре. Экстракт I отделяют вакуум-фильтрацией, промывают осадок теплой водой. Осадок подвергают повторной экстракции в тех же условиях, получая экстракт II. Полученный объединенный экстракт (I и II) содержит балластные вещества белковой и фенольной природы. При этом, первые могут стать пищей для патогенных микроорганизмов, что вызовет эффект, обратный желаемому, а вторые могут ингибировать рост пробиотических бифидобактерий. Отделение от высокомолекулярных соединений (пептидов и полифенолов) проводят путем ультрафильтрации через мембраны с порогом удержания 20 кДа. Полученный пермеат обрабатывают древесным активированным углем для удаления низкомолекулярных примесей (таких как олигопептиды, фурфурол), пропуская через колонку с адсорбентом. Получают прозрачный водный раствор фруктанов.
Фракционирование фруктанов проводят осаждением из водно-спиртовых растворов, содержащих от 20 до 80% об. этанола. С этой целью полученные водные растворы упаривают под вакуумом при температуре не выше 45°С, что предотвращает гидролиз фруктанов, добавляют расчетное количество этилового спирта 95%, и помещают на холод на 48 часов. Полученный осадок фруктанов фильтруют и высушивают под вакуумом. Сухой осадок измельчают на вальцовой или ножевой мельнице до частиц размером 100-300 мкм.
8
10
Высушенные фракции фруктанов смешивают с предварительно измельченной на ножевой мельнице лиофилизированной биомассой бифидобактерий из расчета от 10 до 10 КОЕ в 1 г получаемой синбиотической композиции. Готовую смесь фасуют в форме порошка в пакеты или капсулируют.
Проверку эффективности синбиотической композиции проводили путем ее совместного культивирования с тест-штаммами возбудителей кишечных инфекций Staphylococcus aureus и Bacillus cereus в питательной среде подходящего состава, в которой единственным углеводным субстратом является соответствующая фракция фруктанов корней лопуха. Наиболее выраженное стимулирующее действие на рост бифидобактерий и подавляющее действие (до 1,8 раз) на тест-штаммы (до 26 раз) по сравнению с контролем показано при использовании фракций фруктанов корней лопуха, полученных осаждением 20% этанолом.
Пример 1
Получение высушенных фракций фруктанов корней лопуха.
Корни лопуха (лекарственное растительное сырье, ФС.2.5.0025.15) в количестве 70 г мыли холодной водопроводной водой до полного удаления загрязнений, просушивали на воздухе и измельчали на ножевой мельнице до частиц размером 0,5-1 мм. Измельченное сырье помещали в емкость и заливали водой дистиллированной в соотношении 1:8-1:12 по сухому весу корней. Проводили экстрацию, для чего емкость помещали в водяной термостат, устанавливали сверху мешалку и проводили экстракцию при температуре от 60 до 90°С в течение 30 мин. Выходы фруктанов в зависимости от параметров экстракции представлены в табл.1.
Экстракт отделяли от твердого остатка фильтрованием под вакуумом, осадок промывали теплым экстрагентом в количестве примерно 20% от взятого на экстракцию. Получали экстракт I. Осадок возвращали в емкость и повторяли процесс экстракции с теми же параметрами. После фильтрации и промывки получали экстракт II. Оба экстракта объединяли.
Для удаления высокомолекулярных примесей использовали ультрафильтрацию через мембрану УПМ-20 в тангенциальном потоке. Концентрирование проводили в примерно 10 раз от первоначального объема, получая 1,45 л пермеата (фильтрата). Полученный фильтрата пропускали через колонку, содержащую уголь активированный марки ОУ-Б, в соотношении 10 г на 1 л очищаемого раствора в течение 3-5 циклов (до получения бесцветного раствора).
2
Очищенный раствор фруктанов помещали в роторно-пленочный испаритель из расчета примерно 54 от объема колбы, вакуум составлял 0,94-0,98 кгс/см, температуру постепенно повышали от комнатной, для поддержания равной скорости испарения воды, но не выше 45°С. В полученный концентрат добавляли спирт этиловый 95% из расчета его конечного содержания 20, 40, 60 или 80% об. Концентраты выдерживали при температуре 3-6°С в течение 48 часов, до образования осадка. Надосадок декантировали, осадок высушивали в вакуум-сушильном шкафу до остаточной влажности не более 5% в течение 12-15 часов. Выходы фракций фруктанов от сухой массы сырья в зависимости от концентрации осадителя приведены в табл.2
Пример 2
Получение синбиотических композиций
8
9
10
Лиофилизированную биомассу бифидобактерий Bifidobacterium bifidum 8 ВКПМ Ас-2136, полученную известными ранее способами, измельчали на ножевой мельнице в атмосфере инертного газа (аргон, азот). Рассчитывали массы навесок биомассы, исходя из численности бифидобактерий в 1 г готовой композиции 1⋅10, либо 1⋅10, либо 1⋅10 КОЕ, что соответствует примерно от 0,2 до 20% масс, и навесок фруктанов. Композиции получали путем смешения навесок фракций фруктанов с лиофилизированной биомассой в лабораторном смесителе для сыпучих продуктов. Готовую смесь фасовали в пакеты или капсулировали.
Пример 3
Проверка эффективности композиций против тест-штаммов
7
Вносили образцы композиций, получение которых описано выше, из расчета 1 г на 100 мл в безуглеводную питательную среду, содержащую казеиновый триптон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, цистеин и минеральные компоненты и предварительно проавтоклавированную при 115°С в течение 30 мин. Инкубировали 30 минут в атмосфере 2% углекислого газа и 98% азота при 37°С и встряхивании с частотой 120 об./мин для полного растворения компонентов и активации культуры бифидобактерий. Далее вносили инокулят тест-штамма из расчета начальной численности 1⋅10 КОЕ/мл. Инкубировали при тех же условиях 10 часов. Определяли конечную численность бифидобактерий и микроорганизмов тест-штамма путем высева на селективные среды. В качестве контроля использовали смеси лиофилизированной биомассы бифидобактерий и коммерческих фруктоолигосахаридов, в тех же пропорциях, как и исследуемые композиции. Как видно из полученных результатов (табл.3), композиция эффективно подавляет рост тестового штамма, в особенности при использовании фракций фруктанов корней лопуха, полученных осаждением 20% этанолом.
Библиография
1. Wack М., Blaschek W. Determination of the structure and degree of polymerisation of fructans from Echinacea purpurea roots. Carbohydr Res. 2006, Vol.341, No 9, p 1147-53. doi: 10.1016/j.carres.2006.03.034.
2. Rossi M. et al. Fermentation of fructooligosaccharides and inulin by bifidobacteria: a comparative study of pure and fecal cultures //Appl. Environ. Microbiol. - 2005. - T. 71. - №. 10. - C. 6150-6158.