Иммуномодулирующее действие гликозаминогликанов и гликозидаз при тепловых поражениях

Экспериментальная биология и медицина УДК 616-001.16:577.152.321:615.032

ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ И ГЛИКОЗИДАЗ ПРИ ТЕПЛОВЫХ ПОРАЖЕНИЯХ

© Суняйкина О.А., Быстрова Н.А., Бровкина И.Л.

Кафедра биологической химии Курского государственного медицинского университета

Изучено иммуномодулирующее действие гликозаминогликанов и гликозидаз при тепловых поражениях (тепловой стресс, тепловой шок). Исследовались показатели гуморального и клеточного иммунитета, функционально-метаболическая активность (ФМА) полиморфноядерных лейкоцитов (ПЯЛ), окислительный резерв нейтрофилов. Установлено, что растительные гликозаминогликаны, N-ацетилнейраминовая кислота, гиалуронидаза и лизоцим вызывают иммуномодулирующий эффект при тепловом стрессе и тепловом шоке. Сочетанное введение N-ацетилнейраминовой кислоты и лизоцима нормализует ФМА ПЯЛ, стимулирует развитие обоих форм иммунного ответа. N-ацетилнейраминовая кислота усиливает иммуномодулирующее действие лизоцима.

Ключевые слова: тепловое поражение, гликозаминогликаны, гликозидазы, N-ацетилнейраминовая кислота, иммуномодуляция.

THE IMMUNOMODULATING ACTION OF GLYCOSAMINOGLYCANS AND GLYCOSIDASES

IN THERMAL DAMAGE Sunyaikina O.A., Bystrova N.A., Brovkina I.L.

Biochemistry Department of the Kursk State Medical University

The immunomodulating action of glycosaminoglycans and glycosidaseshas been studied in thermal damages (thermal stress, thermal shock). The indices of humoral immune response and hypersensitivity of the delayed type, functional and metabolic activity of polymorfnonucleus leucocytes, and the oxidative reserve of neutrophils have been investigated. It has been established that plant glycosaminoglycans, N-acetylnuromine acid, gyaluronidase and lysozyme cause the immunomodulating effect in thermal stress and thermal shock. The combinatory administration of N-acetylnuromine acid and lysozyme normalizes functional and metabolic activity of polymorfonucleus leucocytes, stimulates the development of generous forms of immune response. N-acetylnuromine acid enhances the immunomodulating action of lysozyme.

Key words: thermal damage, glycosaminoglycans, glycosidases, N-acetylnuromine acid, immunomodulation.

Действие на организм высокой температуры окружающей среды в режиме, вызывающем возникновение теплового стресса и теплового шока, приводит к снижению фагоцитарно-метаболической активности полиморфноядерных лейкоцитов, подавлению пролиферативной активности лимфоцитов, угнетению развития гуморального иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа [10].

Уменьшение выраженности нарушений иммунологических функций, вызываемых тепловым стрессом, наблюдается при введении животным стабилизаторов клеточных мембран - эссенциале и рибоксина. При тепловом шоке применение этих препаратов малоэффективно [2].

Целью настоящей работы было изучение иммуномодулирующей эффективности гли-

козаминогликанов и гликозидаз при действии на организм высокой температуры, вызывающей возникновение теплового стресса и теплового шока.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на крысах Вис-тар массой 180-200 г. Животных прогревали в тепловой камере 60 мин при 400С или 60 мин при 42оС. Прогревание при 40оС не приводило к обездвиживанию и гибели животных, после прогревания при 42оС крыса в течении 5-6 мин не двигались, 20-30% животных погибали в течение 5 суток. Учитывая это состояние, животных после прогревания при 40оС условно обозначали как тепловой стресс

(Соловьев А. С., 1994). Крыс иммунизировали эритроцитами барана (ЭБ) непосредственно после температурных воздействий. О выраженности гуморального иммунного ответа (ГИО) судили по количеству антителообразующих клеток (АОК) в селезенке [7], интенсивность гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) оценивали по разнице массы регионарных и контралатеральных лимфатических узлов (РМЛ) [11]. О функциональнометаболической активности (ФМА) полиморфноядерных лейкоцитов (ПЯЛ) судили по величинам фагоцитарного индекса (ФИ) и фагоцитарного числа (ФЧ). Окислительный резерв нейтрофилов (ОРН) оценивали по показателям спонтанного и индуцированного зимозаном НСТ-тестов [12].

Изучали иммуномодулирующее действие гликозаминогликанов (ГАГ), выделенных из соцветий лекарственных растений семейств Asteraceae, Tulliaceae и Polygonaceae (Г АГ -А, ГАГ-Т и ГАГ-Р) [5], мономеров ГАГ глюко-замина (ГА), N-ацетилнейраминовой кислоты (АНК), гиалуронидазы (лидазы) и лизоцима. Препараты вводили внутримышечно 5-кратно с 12-часовым интервалом. Разовые дозы ГАГ равнялись 5 мг/кг, ГА - 5 мг/кг, АНК -5 мг/кг, гиалуронидазы - 2 ИЕ/кг, лизоцима -1 мг/кг.

Результаты подвергали статистической обработке с применением критериев Стью-дента и Манна-Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ большого числа работ (более 300), опубликованных за последние 10 лет, показал, что эффективными иммуномодуляторами являются выделяемые из лекарственных растений биофлавоноиды, сапонины и ГАГ [9]. Кислые и нейтральные полисахаридные комплексы усиливают поглотительную и переваривающую функции мононуклеаров крови, макрофагов печени и селезенки, повышают спонтанную и митоген-индуцированную пролиферацию лимфоцитов, стимулируют развитие различных форм иммунного ответа. Растительные ГАГ вызывают иммуномодулирующий эффект при интенсивных физических нагрузках, токсическом поражении печени, холодовом стрессе [1, 4, 5]. Не изучено влияние растительных полисахаридов на иммунологическую реактивность организма и на функции иммуноцитов при тепловых поражениях организма.

Прогревание в режиме, вызывающем ТС, угнетало функции мононуклеаров, супресси-ровало развитие ГИО и ГЗТ. Введение после прогревания ГАГ-А, ГАГ-Т и ГАГ-Р усиливало, но не нормализовало ФМА ПЯЛ, развитие ГИО и ГЗТ (табл. 1). Прогревание, вызывавшее тепловой шок, усиливало выраженность супрессирующих эффектов, наблюдавшихся при тепловом стрессе. При тепловом

Таблица 1

Влияние гликозаминогликанов на функционально-метаболическую активность полиморфноядерных лейкоцитов, развитие гуморального иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа при тепловом стрессе

Условия опыта ИАФ, ед ОРН, ед АОК, тыс/селезенка РМЛ, мг

1. Контроль 70,1±7,3 17,3±1,8 28,2±3,0 4,8±0,5

2. Тепловой стресс * 1 33,2±3,б 1 9,5±1,0*1 1б,3±1,9^ 3,4±0,3*1

3. ТС, введение ГАГ-А 53,4±4,8*1,2 12,2±1,3*1,2 23,4±2,5*1,2 4,1±0,4*1

4. ТС, введение ГАГ-Т 49,7±5,0*1,2 11,7±1,5*1,2 21,7±2,3*1,2 3,3±0,4*1

5. ТС, введение ГАГ-Р 52,б±5,4*1,2 13,0±1,4*1,2 23,1±2,4*1,2 4,0±0,4Ф1

Примечание: индекс активности фагоцитов ИАФ - (ФИ х ФЧ); окислительный резерв нейтрофилов ОРН - (НСТинд. - НСТсп.).

* - р < 0,05, цифра рядом со звездочкой указывает, по отношению к показателю какой группы различия достоверны.

Таблица 2

Влияние гликозаминогликанов на функционально-метаболическую активность полиморфноядерных лейкоцитов, развитие гуморального иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа при тепловом шоке

Условия опыта ИАФ, ед ОРН, ед АОК, тыс/селезенка РМЛ, мг

1. Контроль 70,1±7,3 17,3±1,8 28,2±3,0 4,B±0,5

2. Тепловой шок * 1 11, 9± 1, 3 1 5,9±0,7*1 11,7±1,4*1 2,3±0,2*1

3. ТШ, введение Г АГ -А * 1 12,5±1,5 1 5,7±0,B*1 12,9±1,5*1 2,1±0,2*1

4. ТШ, введение ГАГ-Т 11,3±1,5*1 б,2±0,9*1 12,2±1,4*1 2,4±0,3*1

5. ТШ, введение ГАГ-Р 12,2±1,4*1 б,0±0,В*1 13,1±1,б*1 2,2±0,2*1

Обозначение: см. таблицу 1.

шоке все исследованные препараты ГАГ оказались не эффективными (табл. 2).

Постоянными компонентами молекулярного окружения клеток разных органов человека и животных являются гликозаминогли-каны, протеогликаны и продукты их гидролиза, участвующие в сложных процессах регуляции пролиферации клеток, межклеточного узнавания и взаимодействия [3]. Эти соединения синтезируются и выделяются стимулированными макрофагами [13]. Действие на организм стрессирующих агентов приводит к изменению концентрации гликозаминоглика-нов, а также их фрагментов в крови и содержанию их в клетках.

Изучена иммуномодулирующая активность мономеров гликозаминогликанов -

глюкозамина и ацетилнейраминовой кислоты (АНК) на ФМА ПЯЛ, развитие различных форм иммунного ответа в норме и при тепловом стрессе и тепловом шоке (табл. 3).

Введение глюкозамина не влияло на ФМА ПЯЛ и иммуннологическую реактивность ин-тактных крыс и животных, подвергнутых действию высокой внешней температуры. В отличие от этого, инъекции АНК повышали ФМА ПЯЛ и стимулировали развитие ГИО и ГЗТ у здоровых животных и уменьшали выраженность угнетения этих процессов при тепловом стрессе. Введение АНК не влияло на показатели, характеризующие ФМА ПЯЛ, а также развитие ГИО и ГЗТ при тепловом шоке.

Таблица 3

Влияние глюкозамина и ацетилнейраминовой кислоты на функционально-метаболическую активность полиморфноядерных лейкоцитов, развитие гуморального иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа при тепловом стрессе и тепловом шоке

Условия опыта ИАФ, ед ОРН, ед АОК, тыс/селезенка РМЛ, мг

1. Контроль (без прогревания и введения Г АГ) 70,1±7,3 17,3±1,8 28,2±3,0 4,B±0,5

2. Тепловой стресс * 1 33,2±3,б 1 9,5±1,0*1 1б,3±1,9*1 3,4±0,3*1

3. ТС, введение глюкозами-на 34,8±3,9*1 10,1±1,2#1 1В,0±2,1Ф1 3,б±0,3

4. ТС, введение АНК 52,б±5,7*1-3 13,7±1,4*1-3 23,4±2,5*1-3 4,1±0,4*1-3

5. Тепловой шок 11,9±1,3*1"4 5,9±0,В*1-4 11,7±1,4*1-4 2,3±0,2*1-4

6. ТШ, введение АНК 13,2±1,4*1-4 б,4±0,В*1-4 12,9±1,5*1-4 2,5±0,2*1-4

Обозначение: см. таблицу 1.

ФЧ

Контроль без прогревания и введения препаратов

Тепловой стресс

Тепловой стресс + гиалуронидаза

Тепловой стресс + лизоцим

Рис. 1. Иммуномодулирующее действие гиалуронидазы и лизоцима при тепловом стрессе.

Фрагментация ГАГ осуществляется набором ферментов, важнейшим из которых является гиалуронидаза. Этот фермент расщепляет гиалуроновую кислоту до тетрасахарида, содержащего по 2 остатка глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамина. Другой гли-колитический фермент, лизоцим, катализирует гидролиз гликозидной связи С-4 N-ацетилглюкозамина. Можно было предположить, что продукты катализируемого гиалу-ронидазой и лизоцимом гидролиза ГАГ вызывают иммуностимулирующий эффект в норме и при различных состояниях, характеризующихся возникновением иммунодефицита.

Изучено влияние препарата гиалуронида-зы (лидазы) и лизоцима на ФМА мононук-леаров крови и развитие различных форм иммунного ответа в норме и при тепловых поражениях. Препараты вводили по схеме, указанной для ГАГ.

Установлено, что инъекции гиалуронида-зы или лизоцима повышали ФМА мононук-леаров, стимулировали развитие ГИО и ГЗТ у здоровых животных. Гиалуронидаза уменьшала выраженность угнетения ФМА моно-нуклеаров, ГИО и ГЗТ при тепловом стрессе. Лизоцим нормализовал ФМА мононуклеаров, развитие ГИО и ГЗТ при тепловом стрессе (рис. 1). Введение гиалуронидазы не оказывало влияния на ФМА ПЯЛ, развитие ГИО и

ГЗТ при тепловом шоке. Инъекции лизоцима повышали ФМА мононуклеаров, усиливали (но не нормализовали) развитие ГИО и ГЗТ в условиях теплового шока.

Сочетанное введение АНК и лизоцима в дозах, равных половине тех, которые применяли по отдельности, нормализовали показатели, характеризующие активность ФМА ПЯЛ и иммунологическую реактивность при тепловом шоке (рис. 2).

Результаты проведенных экспериментов позволяют считать, что АНК усиливает иммуномодулирующее действие лизоцима. Это обосновывает перспективность дальнейшего изучения влияния совместного применения лизоцима и АНК на иммунометаболическое состояние организма при различных формах стресса и патологии.

Принципиальное значение для понимания механизмов действия лизоцима и АНК имеет выяснение следующих вопросов: 1) оказывают ли эти соединения прямое влияние на функции иммуноцитов или действие их опосредуется цитокинами лейкоцитов крови и макрофагов лимфоидных органов; 2) участвуют ли эритроциты в реализации иммуномодулирующего действия лизоцима и АНК и выделяющихся под их влиянием цитокинов. Принимая во внимание данные литературы о механизме иммуномодулирующего действия протеолитических ферментов, вероятной

ФЧ

Контроль без прогревания и введения препаратов

Тепловой шок

Тепловой шок + гиалуронидаза

Тепловой шок + ли-зоцим

Тепловой шок + ли-зоцим + ацетилней-раминовая кислота

Рис. 2. Иммуномодулирующее действие гиалуронидазы, лизоцима, ацетилнейраминовой кислоты при тепловом шоке.

представляется такая последовательность событий, приводящая к усилению иммунологических функций после введение лизоцима: фермент —>эритроциты —> клетки селезенки —> цитокины —> клетки-эффекторы. Неясной остается точка приложения действия АНК. Это соединение может влиять на активность свободного лизоцима или лизоцима, фиксированного на мембране клеток. Не исключено также, что АНК повышает чувствительность макрофагов к модифицированным лизоцимом эритроцитам или клеток-эффекторов к цитокинам моноцитов. Выяснение этих вопросов позволит обосновать схемы сочетанного применения лизоцима и АНК для эффективной иммунокоррекции при различных формах стресса и патологии.

Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о высокой иммуномодулирующей эффективности цитокинов прилипающих к стеклу клеток селезенки при сложных формах иммунодефицита, не поддающихся коррекции с помощью препаратов, индуцирующих выделение таких цитокинов [1]. Изучение иммуномодулирующей активности цитоки-нов прилипающих и неприлипающих клеток лимфоузлов крыс, получавших инъекции ли-зоцима, показало, что введение супернатантов прилипающих клеток лимфоузлов этих животных прогретым крысам не влияло на развитие у них ГИО, индуцированного ЭБ, а

инъекции супернатанта неприлипающих клеток уменьшали выраженность угнетения ГИО и ГЗТ. При совместном введении супернатантов прилипающих и неприлипающих к стеклу клеток имела место нормализация величин показателей, характеризующих ГИО, а также существенное усиление интенсивности ГЗТ у прогретых крыс. Результаты этих экспериментов позволяют считать, что при резко выраженных иммунодефицитах цитокины могут оказаться более эффективными иммуномодуляторами, чем средства, индуцирующие выделение клетками этих цитокинов. Особенно выраженное иммуномодулирующее действие в условиях этих экспериментов оказывало не раздельное, а совместное введение цитоки-нов, выделяемых прилипающими и неприлипающими к стеклу клетками периферических лимфатических узлов. Это находится в соответствии с сетевым принципом реализации действия цитокинов, согласно которому передаваемая клеткой информация заключена не в индивидуальном пептиде, а в наборе регуляторных молекул. При этом цитокины действуют как синергисты или антагонисты, каскадно индуцируя выработку друг друга и трансмодулируя мембранные рецепторы к другим медиаторам [10].

Контроль функции нелимфоидных клеток осуществляется сложной сетью как позитивных, так и негативных взаимодействий. Эф-

фективность действия цитокинов в значительной степени зависит от типа клеток-мишеней, их функциональной активности, экспрессии мембранных цитокиновых рецепторов, локальной концентрации цитокинов, присутствия других взаимодействующих с клетками информонов. Цитокины в комбинации дают количественно и качественно иные эффекты, чем каждый в отдельности. При взаимодействии цитокинов их эффект проявляется в более низких дозах [6].

ЛИТЕРАТУРА

1. Быстрова Н.А., Князев А.И. Иммунометабо-лический эффект тепловых воздействий // Окислительный, энергетический и иммунный гомеостаз (нарушение и коррекция). - Курск, 2003. - С. 171-200.

2. Зимина Н.П., Рыкова В.И., Архипов И.А. Про-

теогликаны животных тканей как нерегуляторные биополимеры: информативность

структуры и контроль биосинтеза // Успехи современной биологии. - 1992. - Т. 112, вып. 4. - С. 571-590.

3. Ласкова И.Л., Сипливая Л.Е. О взаимосвязи иммунологической реактивности физической работоспособности организма // Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 1993. -

Т. 79, № 2. - С. 76-82.

4. Мальберг К., Зигль Э. Иммунологические методы (ред. Г. Фримель). - М.: Медицина, 1987. - С. 57-72.

5. Мецлер Д. Биохимия. Химические реакции в живой клетке / Пер. с англ. - М.: Мир, 1980. -Т. 2, 606 с.

6. Прокопенко Л.Г., Конопля А.И., Бровкина И.Л. Средства метаболической иммуномодуляции // Метаболическая иммуномодуляция. -Курск, 2000. - С. 27-44.

7. Соловьев А.С. Состояние клеточного и гуморального иммунитета при общей экзогенной гипертермии // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 1994. - № 2. -С. 31-33.

8. Федосеева В.Н., Порядин Г.В., Ковальчук Л.В. и др. Руководство по иммунологическим и аллергологическим методам в гигиенических исследованиях. - М., 1993. - 319 с.

9. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология. - М., 1995. -220 с.

10. Kittlick P., Engelmann D. The glycosaminogli-cans in cultures of stimulated rats peritoneal macrophages. Patten and biosynthesis of glyco-saminoglicans // Exp. and Toxicol. Pathol. -1992. - V. 44, № 7. - Р. 407-413.