СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ И ДИНАМИКИ ДЕСТРУКТИВНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ В ЛЕГОЧНОЙ ТКАНИ ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗЕ ЛЕГКИХ
METHOD FOR EVALUATING CLINICAL EFFECTIVENESS AND DYNAMICS OF DESTRUCTIVE CHANGES IN PULMONARY TISSUE ACCOMPANYING PULMONARY TUBERCULOSIS

Изобретение относится к клинической медицине, а именно фтизиатрии и иммунологии, и может быть использовано для оценки эффективности лечения туберкулеза легких.
В настоящее время резко возросла заболеваемость туберкулезом и смертность от этой инфекции. При этом отмечается множественная лекарственная устойчивость возбудителей заболевания. В связи с этим, а также в связи с многообразием форм туберкулеза легких, различным течением заболевания и различным ответом больных на химиотерапию большое значение имеет постоянный мониторинг за эффективностью проводимой терапии и оценка динамики патологических изменений в легочной ткани больного. Имеет значение также особенность иммунореактивности организма больного, определяющая характер патологических процессов в легочной ткани и скорость развития репаративных процессов при лечении туберкулеза. Такой мониторинг важен как для своевременного выявления больных с низкой отвечаемостью на проводимую терапию, так и для своевременного заключения об излечении туберкулеза. Последнее имеет большое значение в связи с длительностью и высокой стоимостью лечения туберкулеза, а также большим риском развития побочных эффектов.
В настоящее время основными методами оценки эффективности лечения туберкулеза являются клинические показатели, методы лучевой диагностики и микробиологические методы, а основными критериями эффективности лечения - исчезновение (уменьшение) клинических признаков заболевания, положительная рентгенологическая динамика и прекращение бактериовыделения.
Данные подходы имеют определенные ограничения. Клинические симптомы не являются специфичными. Рентгенологическое обследование обладает рядом побочных эффектов и является дорогостоящим, а рентгенологическая оценка динамики туберкулезного процесса является достаточно субъективной. Основными ограничениями микробиологических и молекулярно-биологических методов являются слабая чувствительность (микроскопия мазков мокроты), длительность получения результатов (посев мокроты на микобактерии, время ожидания результата - 1-3 месяца), недоступность ускоренных методов для обычных клинических лабораторий (ВАСТЕС, ПЦР), а также необходимость использования мокроты, получение которой не всегда возможно, особенно у пациентов с ограниченными деструктивными процессами в легочной ткани. Кроме того, результаты микробиологических методов не позволяют судить о характере патологических изменений в легочной ткани, прогнозировать и мониторировать течение патологического процесса в легочной ткани.
Поскольку состояние иммунной системы больного зависит от интенсивности инфекционного процесса и характера поражения ткани в очаге инфекции, иммунологические тесты потенциально могут быть использованы для мониторинга течения туберкулеза и эффективности проводимой терапии.
Существуют различные иммунологические методы, используемые во фтизиатрической практике, однако большинство из используемых методов имеют те или иные недостатки и не решают вопрос о мониторинге эффективности лечения туберкулеза легких.
+
Определение содержания различных популяций и субпопуляций лимфоцитов (B-лимфоциты, T-лимфоциты CD4, T-лимфоциты CD8, NK клетки) методом проточной цитометрии является современным методом, точным и быстрым, однако не позволяет получить информацию о функциональном состоянии иммунитета; в большинстве случаев результаты исследования не отражают активности туберкулезного процесса и не могут быть использованы для оценки эффективности проводимой терапии.
Определение антиген-индуцированной продукции интерферона-гамма и других цитокинов клетками крови позволяет оценить функциональное состояние иммунной системы больного и выявить наличие антиген-специфического иммунного ответа, но не позволяют дать однозначную оценку активности туберкулезного процесса и эффективности проводимой терапии. Например, низкий уровень продукции интерферона-гамма может наблюдаться как при низкой активности туберкулезного процесса (вследствие низкой антигенной нагрузки и, соответственно, низкой активации клеток в организме), так и при тяжелом течении туберкулеза (вследствие постоянной активации клеток в условиях высокой антигенной нагрузки и «истощении» иммунной системы больного). К другим недостаткам данного и других функциональных тестов относятся необходимость культивирования клеток in vitro, обусловливающая трудоемкость и длительность получения результатов.
Определение индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофилов в ответ на их стимуляцию инактивированной вакциной БЦЖ и опсонизированным [RU 2389020, G01N 33/49, 10.05.2010] предлагается для диагностики ТБ, но не используется для оценки течения ТБ процесса и эффективности проводимой терапии.
В пролиферативных тестах (реакция бласттрансформации) определяют уровень пролиферации лимфоцитов в ответ на антигены микобактерий и дают заключение о наличии инфицирования микобактериями. Способы используются, в основном, для диагностики туберкулеза, но не для оценки его активности или мониторинга за эффективностью его лечения. Примером является способ диагностики туберкулезной инфекции у детей, основанный на реакции пролиферации лимфоцитов в микрокультурах [RU 2315315, C2, G01N 33/53, G01N 33/60, 20.01.2008]. У пациентов определяют уровень пролиферации лимфоцитов в микрокультурах цельной крови по реакции бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) с аллергеном туберкулином (ППД-Л). Оценивают индекс стимуляции специфического клеточного ответа и при показателях индекса менее 3,2 диагностируют отсутствие инфицирования микобактериями туберкулеза, при индексе более 3,2 диагностируют инфицирование микобактериями туберкулеза, а при показателе более 12,1 - активный туберкулезный процесс. Данный способ может быть использован для диагностики туберкулезной инфекции, но малоинформативен для мониторинга течения ТБ процесса или оценки эффективности его лечения. Кроме того, способ предложен для применения у детей, но не у взрослых, а достоверность диагностики ТБ данным способом относительно невысока.
Интерфероновые тесты основаны на определении количества клеток, продуцирующих интерферон-гамма (метод T-SPOT), или уровня продукции интерферона-гамма (метод QuantiFERON-TB) клетками периферической крови при стимуляции образцов крови антигенами микобактерий. Метод иммунологической диагностики и мониторинга туберкулезной инфекции T-SPOT (USPTO Applicaton №20070196878) основан на определении количества клеток, продуцирующих интерферон-гамма в ответ на стимуляцию образцов крови антигенами микобактерий ESAT-6 и CFP-10. Данный метод был предложен для диагностики туберкулеза, дифференциальной диагностики активного туберкулеза и латентной инфекции и мониторинга течения ТБ. Однако, по данным большинства исследователей, основной областью применения данного метода является диагностика туберкулеза, а не мониторинг его активности или эффективности лечения (Streitz М, Tesfa L, Yildirim V, Yahyazadeh A, Ulrichs T, et al: 2007 Loss of Receptor on Tuberculin-Reactive T-Cells Marks Active Pulmonary Tuberculosis. PLoS ONE 2(8): e735. doi:10.1371/journal.pone.0000735). Помимо этого, метод является сложным и трудоемким, требует культивирования клеток в стерильных условиях и дорогостоящих реагентов.
Метод QuantiFERON-TB Gold in-tube основан на определении уровня продукции интерферона-гамма клетками периферической крови в ответ на стимуляцию клеток антигенами микобактерий ESAT-6 и CFP-10. Метод используется для диагностики туберкулезной инфекции, однако не позволяет проводить дифференциальную диагностику активной и латентной туберкулезной инфекции, оценивать активность туберкулезного процесса или эффективность лечения.
-
-
+
-
Наиболее близким по своей сущности к методу, предложенному в данном изобретении, является подход, описанный Streitz и соавт.(Streitz M, Tesfa L, Yildirim V, Yahyazadeh A, Ulrichs T, et al. (2007) Loss of Receptor on Tuberculin-Reactive T-Cells Marks Active Pulmonary Tuberculosis. PLoS ONE 2(8):e735. doi:10.1371/journal.pone.0000735). В данном подходе образцы периферической крови стимулируют антигеном (ППД или пептидами, входящими в антиген миокбактерий ESAT-6). После окончания стимуляции клетки обрабатывают антителами, специфичными к маркерам CD4 и CD27, а также к внутриклеточному интерферону-гамма, и среди лимфоцитов, отвечающих на стимуляцию антигеном продукцией интерферона-гамма (лимфоциты IFN-γ+), определяют долю лимфоцитов CD27. Содержание лимфоцитов CD27 выше 49% от всех лимфоцитов CD4, продуцирующих IFN-γ, свидетельствует об активном туберкулезе, ниже 49% - о латентной инфекции. Способ позволяет диагностировать активный ТБ и латентную инфекцию. Ограничениями способа являются: а) невозможность его применения для мониторинга туберкулеза и оценки эффективности лечения вследствие того, что процент лимфоцитов CD27 среди лимфоцитов, продуцирующих IFN-γ, в процессе лечения не изменяется; б) необходимость культивирования клеток in vitro, приводящая к трудоемкости и высокой стоимости метода.
Задачей, решаемой данным изобретением, является разработка способа, который позволял бы осуществлять мониторинг течения ТБ процесса, давать объективную оценку эффективности его лечения и динамики патологических изменений в легочной ткани, основываясь на анализе поверхностного фенотипа клеток крови, без их культивирования и внутриклеточного окрашивания.
+
-
-
+
-
-
+
-
-
+
Решение задачи достигается тем, что оценивают процентное содержание в крови лимфоцитов CD4, имеющих фенотип CD62LCD27, по отношению ко всем лимфоцитам CD4, а не к лимфоцитам, продуцирующим IFN-γ (как в способе Streitz и соавт). Проведенные нами исследования показали, что процент лимфоцитов CD62LCD27 среди всей популяции лимфоцитов CD4 зависит от интенсивности деструктивных процессов в легочной ткани и изменяется в процессе лечения туберкулеза. Характер изменения процентного содержания лимфоцитов CD62LCD27 (снижение, увеличение, отсутствие изменений) зависит от эффективности проводимой терапии и позволяет проводить мониторинг эффективности лечения. Вторым отличием предлагаемого способа является то, что он не требует культивирования клеток и трудоемкой процедуры окрашивания клеток на внутриклеточные цитокины, поскольку основан на определении экспрессии рецепторов CD27 и CD62L на поверхности лимфоцитов CD4.
+
-
-
+
-
-
+
+
-
+
-
-
Изобретение основано на открытии того факта, что процентное содержание в периферической крови лимфоцитов, CD4, экспрессирующих фенотип CD62LCD27, зависит от активности туберкулезного процесса и целостности полостей распада в легочной ткани. Эффекторные лимфоциты CD4 (лимфоциты CD4CD62L) образуются из наивных лимфоцитов при стимуляции последних антигеном и костимуляционными сигналами. Начальные стадии дифференцировки эффекторных лимфоцитов происходят за пределами легочной ткани, в лимфоидных органах. На этих стадиях эффекторные лимфоциты CD4 экспрессируют маркер CD27 и имеют фенотип CD62LCD27 (Kapina MA, Shepelkova GS, Bogacheva PV, Mischenko VV, Sayles P, Winslow G, Apt ASD, Lyadova IV. CD27lo CD4 lymphocytes that accumulate in the mouse lung tissue during mycobacterial infection differentiate from CD27hi precursors in situ, produce IFN-γ, and protect the host against TB infection. J. Immunol., 2007, 178:976-985). При попадании в очаг инфекции, находящийся в легочной ткани, эффекторные лимфоциты CD62LCD27 теряют экспрессию молекул CD27 и превращаются в эффекторные лимфоциты CD62L CD27. Образовавшиеся клетки могут выходить в кровоток, причем интенсивность этого процесса, по-видимому, зависит от степени деструкции легочной ткани в очаге инфекции.
-
-
+
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. К 200 мкл крови, стабилизированной гепарином (50 ед./мл), добавляют антитела, специфичные к антигенам CD4, CD62L, CD27, инкубируют полученную смесь при комнатной температуре 15 мин, после чего лизируют эритроциты и смесь отмывают трижды центрифугированием в забуференном физиологическом растворе с добавлением белка. Полученные клетки анализируют на проточном цитофлуориметре и определяют процентное содержание лимфоцитов CD62LCD27 среди всех лимфоцитов CD4. Исследование проводят в начале лечения ТБ и несколько раз в процессе лечения.
-
-
+
Оценка результатов. У здоровых доноров лимфоциты CD62LCD27 составляют 5-12% от всех лимфоцитов CD4 периферической крови.
-
-
У больных туберкулезом исследуемый показатель колеблется от 3 до 60%. Значения показателя ниже 12% могут наблюдаться как у больных с отсутствием клинических признаков заболевания, так и у больных с выраженными клиническими проявлениями туберкулезной инфекции. При значении исследуемого показателя менее 12% у больных с отсутствием выраженных клинических проявлений туберкулеза (интоксикации, изменений клинического анализа крови и др.) делают вывод о низкой активности туберкулезного процесса и прогнозируют его благоприятное течение. При значении исследуемого показателя менее 12% у больных с выраженными клиническими проявлениями заболевания делают вывод об истощении иммунной системы больного и прогнозируют тяжелое, трудно поддающееся лечению течение инфекции. При значениях процентного содержания лимфоцитов CD62LCD27 более 12% делают вывод об активном туберкулезном процессе, при значениях выше 25% - о крайне высокой активности туберкулезного процесса.
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Определение процентного содержания лимфоцитов CD62LCD27 в процессе лечения туберкулеза позволяет сделать вывод о динамике туберкулезного процесса в легочной ткани. У больных с исходно высоким значением процента лимфоцитов CD62L CD27 (более 12%) снижение исследуемого показателя до нормальных (менее 12%) значений является признаком закрытия полостей распада в легочной ткани и эффективного лечении туберкулеза. Снижение исходно высокого показателя без достижения нормального значения (процент лимфоцитов CD62LCD27 остается выше 12%) свидетельствует о положительной динамике туберкулезного процесса, уменьшении деструктивных процессов в легких, но сохранении полостей распада в легочной ткани. Отсутствие изменений в процентном содержании лимфоцитов CD62LCD27 при его исходно высоком значении свидетельствует об отсутствии динамики патологических изменений в легких, и низкой отвечаемости больного на проводимую терапию. Увеличение процентного содержания лимфоцитов CD62LCD27 является показателем прогрессирования ТБ и увеличения процессов распада в легочной ткани.
-
-
-
-
-
-
У больных с исходно низким (менее 12%) значением процентного содержания лимфоцитов CD62LCD27 нa фоне выраженных клинических признаков туберкулезного процесса лечение может сопровождаться повышением процента лимфоцитов CD62LCD27, что является признаком восстановления иммунной системы больного. У больных с исходно низким (менее 12%) значением процентного содержания лимфоцитов CD62LCD27 и отсутствием выраженных клинических признаков инфекционного процесса значение исследуемого показателя в процессе лечения, как правило, не изменяется.
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Предложенные критерии подобраны на основании клинических исследований 40 больных туберкулезом легких (17 мужчин и 23 женщины) в возрасте от 20 до 70 лет. Обследование больных проводилось в первые дни поступления в стационар. Кровь забирали из вены утром натощак и анализировали согласно описанному способу. На основе полученных результатов, больные были разделены на две основные группы: с исходно низким (нормальным, менее 12%) и высоким (более 12%) процентным содержанием лимфоцитов CD62LCD27 в периферической крови. Повторное исследование проводили через 2-3 месяца после начала лечения. Ряд больных обследовали также через 5-6 или 12 месяцев после начала лечения. На основании динамики изменения исследуемого показателя, больные с исходно высоким содержанием лимфоцитов CD62LCD27 были разделены на группы: а) больные с полной нормализацией показателя в процессе лечения (уменьшение процента лимфоцитов CD62LCD27 до значений менее 12%); б) больные с частичной динамикой (снижение процента CD62LCD27 по сравнению с исходным, но без достижения нормальных значений); в) больные без динамики (отсутствие изменений исследуемого показателя); г) больные с отрицательной динамикой (возрастание процентного содержания лимфоцитов CD62LCD27 по сравнению с исходным). Больные с исходно низким содержанием лимфоцитов CD62LCD27 были разделены на две группы: больные с выраженными признаками туберкулезной интоксикации и больные без признаков туберкулезной интоксикации. Для всех больных двойным слепым методом собирали данные рентгенологических исследований о динамике туберкулезного процесса в легких и анализировали зависимость между динамикой туберкулезного процесса, оцененной рентгенологическими методами, и динамикой процентного содержания лимфоцитов CD62LCD27.
Примеры
-
-
Пример 1. Больной А. Диагноз: кавернозный туберкулез в фазе инфильтрации и обсеменения, МБТ-. Процент лимфоцитов CD62LCD27: в начале лечения - 43%. Через 2 месяца после начала лечения - 19% (положительная динамика). Результаты рентгенологического обследования и компьютерной томографии. При поступлении в клинику: в верхней доле правого легкого определяется крупная каверна с неравномерно утолщенными стенками и более мелкие полости распада, очаги обсеменения в окружающей легочной ткани. Через 2.5 месяца после начала лечения - положительная рентгенологическая динамика в виде уменьшения объема каверны в два раза, частичного рассасывания и уплотнения очагов.
-
-
Пример 2. Больная Б. Диагноз: инфильтративный туберкулез верхней доли правого легкого в фазе распада и обсеменения. Процент лимфоцитов CD62LCD27: в начале лечения - 17%. Через 3,5 месяца после начала лечения - 12% (нормализация). Результаты рентгенологического обследования и компьютерной томографии. На момент поступления в клинику: наличие полости распада размеров 2×1,8 см с инфильтративными стенками и множества полиморфных очагов. Через 3,5 месяца после начала лечения: положительная динамика в виде исчезновения полостей распада, частичного рассасывания инфильтративных и очаговых изменений.
-
-
Пример 3. Больной В. Диагноз ФКТ легких в фазе инфильтрации и обсеменения. Процент лимфоцитов CD62LCD27: в начале лечения - 18%. Через 2 месяца после начала лечения - 18%) (без динамики). Результаты рентгенологического обследования и компьютерной томографии. При поступлении в клинику: в левом легком - система разновеликих полостей, в верхней доли правого легкого - средних размеров толстостенные каверны, множество полиморфных разнокалиберных очагов с нечеткими контурами. Через 2 месяца после лечения - отсутствие рентгенологической динамики слева, некоторая положительная динамика справа в виде частичного рассасывания и уплотнения очагов и инфильтративных изменений с сохранением полостей распада.
-
-
Пример 4. Больной М. Диагноз: инфильтративный туберкулез верхних долей легких в фазе распада и обсеменения. Процент лимфоцитов CD62LCD27: в начале лечения - 12,5%, через 2 месяца после начала лечения - 13%. Через 9 месяцев - 27% (резко выраженная отрицательная динамика). Результаты рентгенологического обследования и компьютерной томографии. При поступлении в клинику: инфильтрация верхних долей легкого без четких контуров с наличием полостей от 0,5 до 2 см, множество полиморфных очагов в окружающей легочной ткани. Через 2 месяца после начала лечения - уменьшение полостей распада слева, частичное рассасывания инфильтративных и очаговых изменений справа (частичная положительная динамика). Через 9 месяцев - обострение процесса, на компьютерной томографии - отрицательная динамика в виде увеличения полости деструкции слева до размеров 1,5-1,9 см, появления дополнительных очагов отсева в обоих легких.
Способ, предлагаемый в настоящем изобретении, отличается от других существующих методов тем, что: а) основан на анализе небольших образцов периферической крови; б) позволяет оценивать динамику патологических процессов в легочной ткани, прогрессирование заболевания, эффективность его лечения; в) не требует культивирования клеток, стерильных условий и длительного времени для получения результатов (исследование проводится в течение одного дня).