СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ АЛЬБУМИНОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ДИНАМИЧЕСКОГО ПОВЕРХНОСТНОГО НАТЯЖЕНИЯ
METHOD FOR ALBUMIN CONTENT DETERMINATION IN BLOOD SERUM BY DYNAMIC SURFACE TENSION RESULTS

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности, к способу определения содержания альбуминов в сыворотке крови, позволяющему на основе измерения динамического поверхностного натяжения сыворотки крови коров с использованием метода регрессии определить содержание в ней альбуминов.
Развитие ветеринарной науки предъявляет новые требования к диагностике, лечению и профилактике заболеваний у животных. Использование методов ранней доклинической диагностики может уменьшить затраты на лечение и предотвратить снижение продуктивности сельскохозяйственных животных. Метод регрессии активно применяется в зарубежной практике для моделирования биологических процессов (Rossau C.D., Mortensen Р.В. Risk factors for suicide in patients with schizophrenia: nested case-control study. The British Journal of Psychiatry. October 1997. vol. 171 (4). P. 355-359; Abraham H.D., Degli-Esposti S, Marino L. Seroprevalence of hepatitis С in a sample of middle class substance abusers. Journal of Addictive Disease 1999. Vol. 18(4). P. 77-87; Watson P., Petrie A. Statistics for Veterinary and Animal Science. John Wiley & Sons, 2013. 408 p.), в то время как в отечественной литературе он встречается значительно реже (Курилович С.А., Решетников О.В., Шахматов С.Г. с соавт. Распространенность и факторы риска развития желчнокаменной болезни в женской популяции Новосибирска. //Терапевтический архив. - 2000. №2. С. 21-26.) Патент РФ № 245692, опубл. 27.07.2012; Патент РФ №2277243, опубл. 27.05.2006). Также сравнительно новым для ветеринарии является и метод определения ДПН сыворотки крови. Известен способ определения поверхностного натяжения сыворотки крови человека (В.Н. Казаков, О.В. Синяченко, Г.А. Игнатенко и др. Межфазная тензиометрия биологических жидкостей в терапии. - Донецк: Донеччина, 2003, 584 с.) для определения эффективности проводимого лечения. В ветеринарной практике определение динамического поверхностного натяжения используется для оценки готовности лошадей к соревнованиям (Патент РФ №2336524, G01N 33/49, опубликовано 20.10.2008). Известен способ определения жира и белка в молоке по результатам динамического поверхностного натяжения с применением регрессионной модели (Патент РФ №2600820, G01N 33/04, опубл. 27.10.2016). Следует отметить, что состав белковой и жировой фракции молока и сыворотки крови имеет принципиальное различие. Так, в понятие «белок молока» входит, прежде всего, казеин, который составляет более 78-85% от всех белков молока. В сыворотке крови основными белками являются альбумины и глобулины, которые известными биохимическими методами определяются как в виде общего белка, так и отдельными фракциями.
Химическое строение казеинов молока и альбуминов крови различно. Альбумин является простым белком, состоящим из одной полипептидной цепи. Для него характерно высокое содержание цистеина и заряженных аминокислот. Тем самым достигается высокая плотность отрицательных зарядов на молекуле белка. Большое количество дисульфидных связей формирует в молекуле 9 петель и обеспечивает стабильность белка.
Казеин принадлежит к фосфопротеидам - в своем составе содержит фосфорную кислоту, присоединенную моноэфирной связью к остаткам серина. Казеин в растворе имеет ряд свободных функциональных групп, которые обусловливают его заряд, характер взаимодействия с водой (гидрофильные свойства) и способность вступать в химические реакции. Носителями отрицательных зарядов и кислых свойств казеина являются карбоксильные группы аспарагиновой и глутаминовой кислот, гидроксильные группы фосфорной кислоты, а также карбоксильные группы сиаловой кислоты; носителями положительных зарядов и основных свойств - аминогруппы лизина, гуанидиновые группы аргинина и имидазольные группы гистидина.
Основная часть казеина в молоке содержится в форме полимеров сферической формы (субмицеллярный и мицеллярный казеин) и лишь в незначительном количестве - в виде мономеров (так называемый растворимый казеин). Мицеллы казеина обладают свойствами гидрофильного золя. В связи с вышеизложенным адсорбционная способность этих соединений (казеинов и альбуминов) существенно отличается (Miller R. et al. Dynamic surface tension and adsorption kinetics of β-Casein at the solution/air interface //Langmuir. - 2004. - T. 20. - №. 3. - C. 771-777. Яхно Т.А. и др. Сравнительная оценка механических свойств адсорбционных слоев в растворах белков сыворотки крови человека //Журнал технической физики. - 2007. - Т. 77. - №. 4. - С. 119-122) что, безусловно, сказывается на параметрах динамического поверхностного натяжения.
Определение белковой фракции сыворотки крови, а именно альбуминов,  посредством измерения ее динамического поверхностного натяжения из уровня техники не известно.
Обычно компоненты сыворотки крови определяются биохимически. В основе биохимического метода анализа лежат цветные реакции, в ходе которых происходит изменение окраски реакционной среды. В свою очередь, интенсивность изменения цвета пропорциональна содержанию в исследуемом материале метаболита и определяется фотометрически. Метод дорогостоящий вследствие высокой цены используемых приборов и наборов реагентов.
Обязательным условием при проведении такого анализа является изначальная прозрачность сыворотки крови и слегка желтоватый оттенок.
Таким образом, метод имеет ограничения при наличии в исследуемом образце, например, хилеза - в этом случае помутнение обусловлено повышенным уровнем триглицеридов в сыворотке крови, что придает ей мутность, белый цвет, сметанообразную консистенцию. При этом невозможно выделить отдельные компоненты, а значит и провести анализ. Аналогичные проблемы возникают при наличии в образце разрушенных эритроцитов (гемолиз) или превышении концентрации желчных пигментов (иктеричность).
Межфазная тензиометрия позволяет проводить измерения в окрашенных средах, что существенно расширяет возможности биохимического анализа.
Новизна предлагаемого технического решения определяется также тем, что корректно данным методом можно определить содержание именно альбуминовой фракции, а не общего белка. Использование метода определения общего белка с помощью параметров ДПН и привлечения формул регрессионно-корреляционного анализа дает ошибку около 10%, что для биохимического анализа неприемлемо.
Предлагаемый способ направлен на определение альбуминов в зависимости от динамического поверхностного натяжения сыворотки крови, измеренного методом максимального давления в пузырьке на тензиометре ВРА-1Р. Способ позволит значительно сократить расходы не только на дорогостоящие приборы для биохимических исследований, но и на химические реагенты, расходуемые для анализа, а также ускорить получение результата.
Таким образом, техническим результатом, достигаемым при реализации предлагаемого способа, является существенное удешевление, ускорение, упрощение определения содержания альбуминов в сыворотке крови на основе измерения динамического поверхностного натяжения (ДПН).
Указанный технический результат достигается тем, что у пробы сыворотки крови любого качества (включая наличие хилеза, гемолиза и иктеричности) объемом 1-3 мл измеряют динамическое поверхностное натяжение на тензиометре, работающем по принципу максимального давления в пузырьке. Может быть использована не только свежая сыворотка крови, но и после двух- или трехкратной заморозки и после хранения в холодильнике до 4-х дней; при использовании биохимического способа анализа допускается только однократная заморозка и хранение в холодильнике не более суток. По полученным значениям динамического поверхностного натяжения определяют содержание альбуминов в сыворотке крови с использованием формул регрессионно-корреляционного анализа, определяющих взаимосвязь между содержанием альбуминов в сыворотке крови с его динамическим поверхностным натяжением. Для измерения динамического поверхностного натяжения пробу сыворотки крови вводят в ячейку прибора.
Определение ДНЯ проводится на тензиометре ВРА-1Р (Maximum Bubble Pressure Tensiometer) (ФРГ, Sinterface Technologies). Значительными преимуществами такой методики являются простота в эксплуатации оборудования и программного обеспечения прибора; отсутствие расходных материалов, что сказывается на итоговой себестоимости проведения исследования; настройка и калибровка прибора проходит по воде, что не требует дополнительных расходов на калибраторы и нормы; возможность использования консервантов в работе, что позволяет проводить отсроченные исследования; возможность использовать уже измеренные образцы для других исследований.
0
1
2
3
0
1
-1/2
1/2
-1/2
Принцип работы прибора довольно прост. Воздух от компрессора поступает в капилляр, который опущен в исследуемую жидкость (сыворотку крови). С помощью электрического преобразователя определяется избыточное давление в системе (максимальное давление в пузырьке), которое используется для расчета поверхностного натяжения. Электрические сигналы от измерительных систем поступают в электронный блок, который посредством аналого-цифрового преобразователя соединен с персональным компьютером. В результате проведенных измерений прибор позволяет получать графики зависимости от времени поверхностного натяжения в приграничном слое жидкости. На тензиограммах с помощью программы определяются точки, соответствующие t→0 (σ), t=0,02 с (σ), t=1 с (σ), a также рассчитывается равновесное ПН t→∞ (σ) путем экстраполяции кривой в координатах σ/(t). В ходе компьютерной обработки данных (программа ASD) меняется система координат: при определении угла наклона начального участка кривой (λ) используют координаты σ/(t), а для конечного участка кривой (λ) координаты σ/(t).
Таким образом,
0
σ [мН/м] - поверхностное натяжение при начале измерения (t→0)
1
σ [мН/м] - поверхностное натяжение при времени t=0,02,
2
σ [мН/м] - поверхностное натяжение при времени t=1 с,
3
σ [мН/м] - поверхностное натяжение при времени t=10 с,
0
1/2
1/2
λ - [мН/м⋅с] - угол наклона начального участка кривой в координатах σ/(t),
1
-1/2
-1/2
λ - [мН/м⋅с] - угол наклона конечного участка кривой в координатах σ/(t).
Для определения влияния количества альбуминов в сыворотке крови на параметры ее ДПН проводится корреляционный анализ между ними в программе Microsoft Excel.
На основе регрессионной модели выведены следующие формулы для расчета:
0
1
2
3
0
[Альбумины] =0,98σ-0,25σ-0,39σ+0,01σ-0,22λ+10,22;
0
1
2
1
[Общий белок] =0,64σ-0,46σ-0,43σ+0,31λ+76,4,
0
где σ [мН/м] - поверхностное натяжение при начале измерения (t→0),
1
σ [мН/м] - поверхностное натяжение при времени t=0,02 с,
2
σ [мН/м] - поверхностное натяжение при времени t=1 с,
3
σ [мН/м] - поверхностное натяжение при времени t=10 с,
0
1/2
1/2
λ [мН/м⋅с] - угол наклона начального участка кривой в координатах σ/(t),
1
-1/2
1/2
λ [мН/м⋅с] - угол наклона конечного участка кривой в координатах σ/(t-).
Для упрощения процесса расчетов используется программа статистической обработки данных R (версия 3.1.2.).
Полученные согласно предлагаемому способу данные могут быть использованы для определения содержания альбуминов в сыворотке крови, что позволяет установить состояние организма животных.
Процедура измерения ДПН заключается в следующем: исследуемая проба сыворотки крови (1-3 мл) наливается в стеклянный стаканчик диаметром 1 см, высотой 2 см, ставится под капилляр прибора (радиус капилляра 0,13 мм), запускается программное обеспечение и начинается процедура измерения.
Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1 (сравнительный).
0
1
2
1
-1
1/2
По процедуре, описанной выше, определено динамическое поверхностное натяжение сыворотки крови коровы черно-пестрой породы, проба 1. Получены параметры ее ДПН: σ - 73,32 мН/м, σ - 73,15 мН/м, σ - 54,74 мН/м; угол наклона: λ - 17,71 мН⋅м с. Параллельно, для сравнения, известным биохимическим методом на биохимическом анализаторе URIT-8030 (компания Urit Medical Electronic Co., Ltd, Китай) измерено содержание общего белка - 65,7 г/л.
Согласно представленной выше формуле проведен расчет содержания общего белка (г/л): [Общий белок]=0,64⋅73,3-0,46⋅73,15-0,43⋅54,74+0,31⋅ ⋅17,71+76,4≈71,6 г/л. Таким образом, содержание общего белка, определенное сравнительным биохимическим методом по предложенному способу с использованием формул регрессионно-корреляционного анализа, различается на 9%.
Пример 2 (по изобретению).
0
1
2
3
0
1
-1
-1/2
-
1/2
По процедуре, описанной выше, определено динамическое поверхностное натяжение сыворотки крови коровы черно-пестрой породы, проба 2. Получены параметры ее ДПН: σ - 72,91 мН/м; σ - 72,87 мН/м, σ - 60,3 мН/м, σ - 40,24 мН/м; углы наклона: λ - 12,27 мH⋅м с и λ - 22,13 мН⋅мс. Параллельно, для сравнения, известным биохимическим методом на биохимическом анализаторе URIT-8030 (компания Urit Medical Electronic Co., Ltd, Китай) измерено содержание альбуминов - 38,1 г/л. Согласно представленной выше формуле проведен расчет содержания альбуминов (г/л):
[Альбумины]=0,98⋅72,91-0,25⋅72,87-0,39⋅60,3+0,01⋅40,24-0,22⋅2,27+10,22=37,69 г/л. Таким образом, содержание альбуминов, определенное сравнительным биохимическим методом и по предложенному способу, практически совпадает (разница составляет 1%).
Определение динамического поверхностного натяжения позволяет более полно описать физико-химические свойства сыворотки крови, что может быть применено в мероприятиях по контролю физиологического состояния и здоровья животных.
Исследование выполнено за счет Российского научного фонда (проект №14-16-00046).