СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВАРИАНТА В* БЕТА-ЛАКТОГЛОБУЛИНА У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
METHOD FOR DETECTION OF BOVINE BETA-LACTOGLOBULINE VERSION B*

Изобретение относится к молекулярной генетике, а именно к способам определения полиморфизма генов белков молока, а именно бета-лактоглобулина, и может быть использовано в селекции крупного рогатого скота и пищевой промышленности.
В настоящее время до 30% населения планеты страдают аллергическими болезнями, среди которых значительную часть занимает пищевая аллергия. Проблема аллергии к коровьему молоку довольно остро стоит в современном мире. По данным Messina (1996) у 1-7% подростков наблюдаются аллергические реакции к коровьему молоку. Основным аллергеном в молоке коров является белок BLG (Heinzmann A. et al., 1999, Sélo I et al., 1999). BLG очень стабилен к действию кислот и устойчив к пищеварительным ферментам и, следовательно, проходит желудок без структурных и функциональных изменений. Как целые молекулы протеина, так и фрагменты пептидов могут проникать через стенки кишечника и, таким образом, приводят уже у новорожденных к известной аллергии на материнское молоко.
Одним из способов снижения аллергенных свойств коровьего молока является уменьшение содержания BLG в молоке. Известен аллель В* бета-лактоглобулина (BLG), характеризующегося пониженной экспрессией в молоко коров.
BLG впервые был выделен в кристаллической форме в 1934 году из коровьего молока (Palmer A.N.,1934). Первичная структура гена BLG была определена у крупного рогатого скота в 1967 году (Frank G., Braunizer G.,1967). У парнокопытных BLG встречается как стабильный димер в интервале рН 3,0-7,0, в то время как моногастричные животные обладают только мономерами (Liberatoti J.,1977).
Ген BLG имеет размер 4662 п.о. и состоит из 7 экзонов и 6 интронов (Harris et al., 1988). В настоящее время известно 10 генетически обусловленных аллельных вариантов гена BLG - А, В, С, D, Е, F, G, I, J, W.
A
G
G
С
Наиболее часто встречаются четыре аллеля - А, В, С и D, которые отличаются друг от друга аминокислотным составом. Редкий вариант D отличается от вариантов А, В, С, в позиции 45, имея замену аминокислоты Glu→Gln. Отличие варианта В выявляется в позиции 64, где в результате замены второго основания триплета GT→GT происходит замена Asp→Gly. Вариант С характеризуется заменой последнего основания в триплете CA на СА, что влечет за собой образование His вместо Gln в позиции 59 BLG. Исследовав полиморфизм локуса BLG, Rottmann и Schlee (1992), установили, что отличие аллеля А от В определяется в аминокислотной позиции 64 (Asp в A, Gly в В) и в позиции 118 (Val в А, Аlа в В) и идентифицируется с помощью эндонуклеазы НаеIII или с использованием метода AC-PCR (Schlee, et al.,1992).
В качестве ближайших аналогов заявленного способа можно считать:
Mazhar с соавторами [1992] провели идентификацию аллелей А и В гена BLG коров посредством ПЦР анализа фрагмента гена, включающего экзоны II и III и интрон II, с последующим гидролизом продуктов амплификации рестриктазой HphI.
Для генотипирования скота, разводимого в Словакии, по гену BLG Uhrin с соавторами [1995] применили метод ПЦР. Оригинальная модификация, позволяющая существенно сократить время реакции, выявила существенное сходство тестированных пород по частоте аллеля В BLG -77% у пинцгаусской породы, 74% у голштино-фризов, 64% у черно-пестрого скота немецкого типа и 62% у симменталов.
Braunschweig с соавторами [1999] сообщили о диагностике полиморфизма локуса BLG у бурых швицов. Удалось идентифицировать аллель D при помощи рестриктазы Pvu II. Данные ПЦР-ПДРФ согласуются с результатами электрофоретического анализа белков молока и метод может быть использован в генотипировании животных вне зависимости от пола и времени лактации.
Eigel с соавторами [1984], Godovac-Zimmermann с соавторами [1990] сообщили об идентификации с помощью ПЦР-ПДРФ аллеля BLG, имеющего аминокислотные замены в позициях 59 Gln→Lys и 192 Glu→Gly. По данным этих авторов аллели Е и D в популяциях немецкого скота не встречаются, аллель А встречается крайне редко.
A
G
G
С
Исследованием последовательностей аллельных вариантов гена BLG крупного рогатого скота, полученных из генного банка, было установлено, что его полиморфизм обусловлен точковыми мутациями (базовыми заменами) в позициях 2206 в экзоне I, а также в позициях 3065 и 3109 экзона II (генный банк №Z48305). В результате этого редкий вариант D отличается от вариантов А, В и С аминокислотной заменой Glu→Gln в позиции 45. Отличие варианта В выявляется в позиции 64, где в результате мутации второго основания триплета GT→GT происходит замена Asp→Gly. Вариант С характеризуется заменой последнего основания в триплете CA на СА, что влечет за собой образование His вместо Gln в позиции 59 BLG.
Отличительной чертой данных способов является, что все они направлены на выявление уже известных 10 вариантов гена BLG и используют имеющиеся сайты рестрикции.
Отличие нашего способа заключается в выявлении мутантного аллеля В* гена BLG благодаря введению в амплифицируемый фрагмент сайта рестрикции, что делает идентификацию аллеля В* эффективной и надежной.
Следует отметить, что простота и высокая чувствительность нашего способа ПЦР-ПДРФ анализа аллеля В* гена BLG позволит использовать его в селекционной практике в качестве маркера для получения молока с пониженным содержанием бета-лактоглобулина на всех стадиях онтогенеза животных.
Также аналогами заявленного способа можно считать:
Ramos PR и др., (1992) провели гель-электрофорез молока, с помощью которого были выявлены два варианта (А и В) гена BLG.
Недостатками данного способа являются трудоемкость, большие затраты времени, зависимость от пола животных и необходимость получения молока от коров.
Наш способ позволит уже непосредственно после рождения животных определить, является ли теленок носителем аллеля В* BLG.
В качестве прототипа заявленного способа можно считать секвенирование гена βLG, в результате которого был выявлен мутантный аллель В* гена βLG (М.Н.Braunschweig I and T. Leeb Aberrant Low Expression Level of Bovine β-Lactoglobulin Is Associated with а С to A Transversion in the BLG Promoter Region// J. Dairy Sci. 89:4414-4419, American Dairy Science Association, 2006).
Отличием заявленного изобретения от известных способов диагностики аллелей BLG заключается в том, что моделируемый способ базируется на методике ПЦР с введением в амплифицируемый фрагмент сайта рестрикции CCGG. Такой подход позволит проводить идентификацию результатов с помощью метода электрофореза в агарозном геле без использования лазерной детекции, что обеспечит относительно невысокую стоимость разрабатываемого способа.
Принцип действия разрабатываемого способа основан на введении нуклеотидной замены в праймер таким образом, что образуется сайт узнавания для рестриктазы MspI  При этом у аллеля В*, обуславливающего низкий синтез BLG, не образуется сайта рестрикции, в то время как у нормального (не мутантного) аллеля образуется сайт рестрикции, что позволяет дифференцировать мутантные и немутантные аллели гена BLG методом ПЦР-ПДРФ.
Способ отличается тем, что с применением нескольких технически простых и не требующих дорогостоящих реактивов, оборудования, затрат сил и времени методов, возможно выявление аллеля В* гена BLG, что позволит применить данный метод в селекции животных.
При создании настоящего изобретения задача состояла в разработке способа обнаружения варианта В* гена BLG для улучшения качества молока, а именно снижения содержания в молоке основного аллергена - BLG.
Задача нашего изобретения - создание эффективного и универсального способа определения В*-аллеля гена BLG крупного рогатого скота для использования в животноводстве, селекции и пищевой промышленности.
Сущность изобретения - определение В*-аллеля гена BLG крупного рогатого скота методом ПЦР-ПДРФ.
Разрабатываемый способ базируется на определении нуклеотидной трансверсии С→А в позиции 215 «вверх по течению» участка инициирования трансляции гена бета-лактоглобулина. С этой целью выбран участок гена BLG с мутацией, связанной с низким синтезом матричной РНК. В электронной базе была найдена нуклеотидная последовательность интересующего нас участка ДНК (номер Z48305 в GenBank).
Определение В*-аллеля гена BLG выполняли следующим образом.
1. Исходя из последовательности гена, были подобраны олигонуклеотидные праймеры, амплифицирущие участок гена длиной фрагмента 241 пара оснований (п.о.) (генный банк Z48305):
BLG1 For(позиции 1821-1846)5'-ACAGTCACATGGTTTGGAGGAGATG-3'
BLG2 Rer (позиции 2037-2061) 5'-CCTTCTTCCATTCGAGGCCAAGCCG-3'.
4
2
4
2
2
2. Выполняли 30 циклов ПЦР в 20 мкл реакционной смеси следующего состава: 1хПЦР буфер (16.6 мМ (NH)SO, 67.7 мМ Трис-HCl, рН 8.8, 0.1% (v/v) Tween 20, 1.5 мМ MgCl), 0,2 мМ дНТФ, 10 пмол каждого из праймеров, 2 мМ MgCl, 1 Ед Taq-полимеразы и 1 мкл ДНК при следующем температурно-временном режиме: 1 цикл - 95°С 7 мин, 30 циклов последовательно - 94°С - 0,5 мин, 67°С - 0,5 мин, 72°С - 0,5 мин, заключительная элонгация при 72°С - 7 мин.
3. Проверку результативности прохождения ПЦР диагностировали методом гель-электрофореза, нанося по 5 мкл амплификата в 2% агарозный гель, электрофоретически разделяли в 1х ТАЕ буфере 20 мин при 100 V и детектировали под ультрафиолетовым светом (УФ).
2
4. В оставшиеся 15 мкл амплификатов добавляли 1,5 мкл Buffer В (10мМ Tris-HCl; pH 7,6 (at 25°С); 10мМ MgCl; 1мM DDT) и рестриктазу MspI 0,3 мкл в каждую лунку плашки. Центрифугировали 5000 об/мин в течение 15 секунд. Далее добавляли минеральное масло 5 мкл.
5. Подготовленные таким образом пробы помещали в термостат на 10-12 часов при 37°С.
6. Проверку результативности прохождения ПЦР-ПДРФ диагностировали методом гель-электрофореза, нанося по 5 мкл амплификата в 3% агарозный гель, электрофоретически разделяли в 1хТАЕ буфере 20 мин при 100 V и детектировали под ультрафиолетовым светом (УФ) (прил. рис.1).
7. Определенные таким образом для каждого животного аллели суммировали в электронной таблице Microsoft Excel. Полученная матрица генотипов служила основой для статистической обработки результатов.
Пример. Контрольное использование предложенного способа выявления В*-аллеля гена BLG было апробировано на 598 головах крупного рогатого скота пяти пород: бурой швицкой (n=189), сычевской (n=108), симментальской (n=209), серой украинской (n=21), черно-пестрой (n=53), лебединской (n=3) и местной монгольской (n=15).
Желательный аллель В* гена BLG был выявлен у животных бурой швицкой (4,23%) и симментальской пород (0,96%).
Были рассчитаны частоты встречаемости желательного аллеля В* гена BLG в симментальской (0,5%) и бурой швицкой (3,7%) породах.
Таким образом, разработанный способ может быть использован для выявления животных, являющихся носителями мутации В* в гене BLG и, как следствие, естественными производителями молока с пониженным содержанием BLG.
Предложенный способ может быть использован в генетике сельскохозяйственных животных для выявления полиморфизма В* гена BLG крупного рогатого скота с целью последующего использования полученных результатов в популяционной генетике, разведении и селекции крупного рогатого скота.
Список используемой литературы
1. Braunschweig M., Stranzinger G., Puhan Z. A PvuII PCR-RFLP test for the bovine J3-lactoglobulin D allele // Animal Genetics. 1999. - V. 30. -P. 76.
2. Eigel W.N., Butler J.E, Ernstrom C.A, Farrell Jr. KM., Harwalkal V.R., Jenness R., Whitney R. Mc.L. Nomenclature of proteins of cow's milk:
fifth revision.// J. Dairy Sci., Champaign, III.- 1984. V. 67. - P. 1599-1631.
3. Frank G., Braunizer G., Milchwissenschaft. -1967. -V.20. -P. 361-365.
4. Godovac-ZimmeriTiann J., Krause I., Buchberger J. A novel wild-type (3-lactoglobulin W and its primary sequence // Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 1990.V. 371. P.255-260.
5. Heinzmann A., Blattmann S., Spuergin P., Forster J., Deichmann K.A. The Recognition Pattern of Sequential B Cell Epitopes of Beta-Lactoglobulin Does Not Vary with the Clinical Manifestations of Cow's Milk Allergy Int Arch Allergy Immunol 1999; 120:280-286
6. Flan-is S, Ali S, Anderson S, Archibald A L, and dark A J Complete nucleotide sequence of the genomic ovine beta-lactoglobulin gene. // Nucleic Acids Res. 1988 November 11; 16(21): 10379-10380.
7. Liberatoti J., p -lactoglobulins. Chemikal and structural studies // Folia Vet. Lat. -1977. V. 7. P. 205-222.
8. M. H. Braunschweig and T. Leeb Aberrant Low Expression Level of Bovine β-Lactoglobulin Is Associated with a C' to A Transversion in the BLG Promoter Region\\ J. Dairy Sci. 89:4414-4419, American Dairy Science Association, 2006
9. Messina K. Dietitian's Guide to Vegetarian Diets, 1996, 267-286.
10. Mazhar K., Savva D., Skidmor C.J. Analysis of polymorphisms of the bovine.3-lactoglobulingene by PCR//Anim. Genet. 1992. - V.23. Suppl. 1.-P.65.
11. Palmer, A. H.(l 934). J.biol. Chem. 104,359.
12. Ramos PR., Urtado SL, Almeida MR, Bortblozzi J, Silva ET. An improved electrophoretic method for the determination of serum milk protein variants in Gyr-Holstein cows. // Braz J Med Biol Res. - 1992; 25(11):1107-12.
13. Selo I, Clement G, Bernard H, Chatel J, Creminon C, Peltre G, Wal J., Allergy to bovine beta-lactoglobulin: specificity of human IgE to tryptic peptides.ClinExp Allergy. 1999 Aug; 29(8):10'55-63.
14. Schlee P, Rottmann 0, Buchberger J, Grami R, Aumann J, Binser R, Pirchner F. Die Milchproteingene des Fleckviehbullen "Haxi" und dessen Einfluss aufdie Allelfrequenzen // Zuchtungskunde. 1992. - V. 64. - No 5. -S. 312-322.
15. Uhrin P., Chrenek P., Vasivek D., Bauerova M., Bulla J. Genotyping of B-lactoglobulin gene in different breeds of cattle in Slovakia // Zivoc. vyroba. -1995. -V. 40.-№2.-P.49-52.