Использование ДНК из фиксированных лимфоцитов для ПЦР~диагностики AZF~микроделеций у человека

СЛУЧАИ ИЗ ПРАКТИКИ

Статья поступила в редакцию 29.05.2015 г.

Волков А.Н., Рытенкова О.И., Цуркан Е.В., Лысенко Д.И.

Кемеровский государственный университет, Кемеровская государственная медицинская академия, Кемеровская областная клиническая больница,

г. Кемерово

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДНК ИЗ ФИКСИРОВАННЫХ ЛИМФОЦИТОВ ДЛЯ ПЦР-ДИАГНОСТИКИ AZF-МИКРОДЕЛЕЦИЙ У человека

Обсуждается случай использования лимфоцитов человека, подготовленных для цитогенетического анализа, в качестве источника нуклеиновых кислот для молекулярно-генетических исследований. После сорбентной экстракции ДНК проведена ПЦР-диагностика AZF-микроделеций Y-хромосомы с электрофоретической детекцией продуктов ПЦР. Образец ДНК характеризовался высокой эффективностью амплификации всех маркеров, не уступая по качеству положительному контрольному образцу.

Ключевые слова: кариотипирование; ПЦР-диагностика; выделение ДНК; AZF.

Volkov A.N., Ritenkova O.I., Tsurkan E.V., Lysenko D.I.

Kemerovo State University,

Kemerovo State Medical Academy,

Kemerovo regional clinical hospital, Kemerovo

APPLICATION OF DNA FROM THE FIXED LYMPHOCYTES FOR PCR DIAGNOSTICS

OF AZF-MICRODELETIONS IN MAN

Discussed a case of application of human lymphocytes prepared for cytogenetic analysis as a source of nucleic acids for molecular genetic analysis. After the sorbent DNA extraction, PCR diagnostics of AZF-microdeletion of the Y chromosome with electrophoretic detection of PCR products were performed. The DNA sample was characterized by high efficiency amplification of all markers, not differ to a positive control sample.

Key words: karyotyping; PCR diagnostics; DNA isolation; AZF.

Генетические нарушения являются частым элементом среди причин репродуктивных дисфункций. По разным оценкам от 15 % до 30-50 % бесплодных мужчин имеют генетические аномалии, представленные хромосомными аберрациями или клинически значимыми мутациями в отдельных генах [1, 2]. Медико-генетические учреждения предлагают таким пациентам широкий спектр лабораторных исследований, от традиционного кариотипирования до секвенирования кандидатных генов или их отдельных экзонов. Широко востребованы и технологии на основе ПЦР целевых участков генома, по-прежнему лидирующие среди молекулярно-генетических методов по соотношению цена/информативность анализа. Одним из популярных видов ПЦР-анализа при мужском бесплодии является выявление микроделе-ций в регионе AZF Y-хромосомы (т.н. «AZF-фактор»), приводящих к азооспермии или олигозооспермии [2, 3].

В такой ситуации врач должен сделать оптимальный выбор теста, показанного именно данному пациенту. Зачастую ограничиваются направлением на одно из генетических исследований, например кари-отипирование. В случае появления необходимости в дополнительных анализах в такой ситуации необхо-

Корреспонденцию адресовать:

ВОЛКОВ Алексей Николаевич,

650029, г. Кемерово, ул. Ворошилова, 22а, ГБОУ ВПО КемГМА Минздрава России.

Тел.: 8 (3842) 73-48-56; +7-905-949-32-85. E-mail: volkov alex@rambler.ru

димо будет провести повторный забор биоматериалов у пациента. В то же время, ранее полученные образцы потенциально могут использоваться и для других генетических анализов. Это избавит пациента от необходимости повторного посещения ЛПУ и прохождения инвазивных процедур.

В ходе данной работы предстояло оценить возможность проведения ДНК-диагностики микроделе-ций в AZF-регионе Y-хромосомы с использованием в качестве источника ДНК лимфоцитов периферической крови в этанол-уксусном фиксаторе, ранее подготовленных для проведения цитогенетического анализа.

ОПИСАНИЕ СЛУЧАЯ

В медико-генетическую консультацию ГАУЗ КОКБ (г. Кемерово) врачом-андрологом был направлен пациент П. для проведения процедуры кариотипиро-вания при выявлении причин мужского бесплодия. Периферическая кровь обследуемого забиралась в асептических условиях процедурного кабинета и доставлялась в цитогенетическую лабораторию для дальнейшего культивирования лимфоцитов. Все манипуляции с биоматериалом, включая фиксацию и приготовление цитогенетических препаратов, выполняли согласно ранее опубликованному руководству [4]. Цитогенетический анализ проводился специалистами МГК в соответствии с действующими требованиями [5].

Суспензия лимфоцитов в этанол-уксусном фиксаторе, полученная в ходе предыдущей процедуры,

Оifauiwa Medicine

в Кузбассе

T. 14 № 3 2015

63

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДНК ИЗ ФИКСИРОВАННЫХ ЛИМФОЦИТОВ ДЛЯ ПЦР-ДИАГНОСТИКИ AZF-МИКРОДЕЛЕЦИЙ У ЧЕЛОВЕКА

в дальнейшем доставлялась в лабораторию молекулярно-генетических исследований ЦНИЛ Кемеровской государственной медицинской академии. Выделение ДНК осуществляли с использованием комплекта реагентов «Универсальная пробоподготовка». Для выявления микроделеций в субрегионах AZFa, AZFb и AZFc Y-хромосомы в образцах ДНК применяли набор реагентов «AZF-делеции» с электрофоретической схемой детекции результата. Все процедуры проводились согласно инструкциям производителей реагентов.

На первом этапе исследования был проведен цитогенетический анализ хромосом в лимфоцитах периферической крови пациента. Y-хромосома мужчины характеризовалась необычной морфологией (рис. 1). Величина длинного плеча хромосомы оказалась заметно уменьшенной по сравнению с «типичной» Y-хромосомой, наблюдаемой у большинства фертильных мужчин (рис. 2). Данная хромосома считается полиморфной благодаря изменению величины хорошо различимого темного блока гетерохроматина, расположенного дистальнее участка q11.23. Его уменьшение визуально приводит к эффекту «укорочения» длинного плеча. Согласно распространенному мнению, такие вариации не имеют патологических эффектов, поскольку гетерохроматин не является носителем функционально активных участков генома [6]. В таком случае формула кариотипа пациента П. может быть записана как 46,X,Yqh-.

Однако, учитывая наличие у пациента П. репродуктивных проблем, следует рассмотреть и альтернативную точку зрения. Согласно этому мнению, уменьшение величины гетерохроматина длинного плеча хромосомы Y связано с протяженной делецией материала хромосомы. Такая делеция может захватывать и смежные дистальные области эухроматина в сегменте q11.23, где располагаются некоторые элементы «фактора азооспермии».

Субрегионы AZF-области картированы в различных участках длинного плеча Y-хромосомы, практически от центромеры (сегмент Yq11.21) до области гетерохроматина (сегмент Yq11.23) [7], поэтому протяженные делеции любого участка длинного плеча хромосомы могут затрагивать и эти значимые локусы. В частности, потеря части гетерохроматина может сопровождаться микроделециями в смежных с ним субрегионах AZFb и AZFc. Прямые доказательства этого предположения были получены в ходе недавнего исследования по выявлению делеций в этих локусах у бесплодных мужчин с кариотипом 46,X,Yqh-. У 7 из 30 таких пациентов (23 %!) установлены мик-роделеции в субрегионах AZFb и AZFc Y-хромосомы [8].

Рисунок 1

Кариотип и Y-хромосома пациента

Figure 1

Karyotype and Y-chromosome of the patient

Таким образом, мужчинам с вариантами Y-хромосомы должны быть назначены генетические тесты на выявление AZF-микроделеций. Но, поскольку пациент П. не был направлен на такой анализ, в распоряжении лаборатории не оказалось биологического материала, подходящего для ДНК-диагностики. Традиционно для выделения ДНК используются образцы венозной крови, стабилизированной ЭДТА, тогда как для культивирования лимфоцитов периферической крови подходят пробы венозной крови с Li-гепарином в качестве антикоагулянта. К тому же, на момент получения цитогенетического заключения цельная кровь пациента уже отсутствовала. Было возможно получить такой материал в ходе дополнительной инвазивной процедуры, повторно вызвав пациента в медицинское учреждение. С другой стороны, можно было попытаться выделить нуклеиновые кислоты из ранее приготовленных лимфоцитов.

Было принято решение использовать в качестве источника ДНК лимфоциты периферической крови, подготовленные для цитогенетического исследования и хранившиеся в виде суспензии в этанол-уксусном фиксаторе при температуре +4°С на протяжении месяца. При этом было необходимо определить адекватный способ выделения нуклеиновых кислот. По

Сведения об авторах:

ВОЛКОВ Алексей Николаевич, канд. биол. наук, доцент, ФГБОУ ВПО КемГУ; ст. науч. сотрудник, ЦНИЛ, ГБОУ ВПО КемГМА Минздрава России, г. Кемерово, Россия. E-mail: volkov_alex@rambler.ru

РЫТЕНКОВА Оксана Ивановна, врач-лабораторный генетик высшей квалификационной категории, медико-генетическая консультация, ГАУЗ «КОКБ», г. Кемерово, Россия.

ЦУРКАН Елена Владимировна, биолог, медико-генетическая консультация, ГАУЗ «КОКБ», г. Кемерово, Россия.

ЛЫСЕНКО Денис Игоревич, врач, зав. медико-генетической консультацией, ГАУЗ «КОКБ», г. Кемерово, Россия.

64

T. 14 № 3 2015 MediciinnLass

СЛУЧАИ ИЗ ПРАКТИКИ

Рисунок 2

Кариотип фертильного мужчины с Y-хромосомой «типичной» морфологии

Figure 2

Fertile male karyotype with Y-chromosome of «typical» morphology

!i II i| it

» I  I

и И n Si !! м

it is s* it

Y

Рисунок 3

Электрофореграмма результатов ПЦР при анализе AZF-микроделеций Y-хромосомы у пациента и в контрольных образцах

Figure 3

Electrophoregram of PCR results in the analysis of AZF-microdeletions of the Y chromosome in the patient and control samples

СИСТЕМА A

ZFXT s Y2tt

яУШ<А2ГЬ)

K+ Д

П

СИСТЕМА В

результатам анализа методической документации и литературных данных нам не удалось обнаружить специального способа экстракции ДНК из зафиксированных лимфоцитов. В такой ситуации нами была выбрана технология сорбентного выделения ДНК из биологического материала с использованием комплекта реагентов «Универсальная пробоподготовка».

Полученные образцы ДНК в дальнейшем использовались для ПЦР-диагностики AZF-делеций Y-хромосомы с помощью одноименной тест-системы. В качестве мишеней для ПЦР используются STS-маркеры, локализованные в субрегионах AZFa (sY84 и sY86), AZFb (sY127 и sY134), AZFc (sY254 и sY255) (рис. 3). Данные маркеры рекомендованы Европейской академией андрологии для анализа AZF-микроделеций [9]. Мишенями внутреннего контроля являются участки локусов ZFX/Y и SRY, расположенные в коротком плече хромосомы Y. Для каждого исследуемого образца одновременно выполняются 2 теста (система А и система В), что повышает надежность анализа.

В качестве положительного контрольного образца была использована ДНК фертильного мужчины,

SRY

*Y134

K+

П

входящая в комплект реагентов (К+). Образцом для сравнения также послужила ДНК мужчины с деле-цией субрегионов AZFb и AZFc (Д). Как видно, образец ДНК пациента (П) характеризовался высокой эффективностью ПЦР по всем маркерам, не уступая по качеству положительному контрольному образцу. Это свидетельствует, с одной стороны, об отсутствии деградации ДНК в ходе самой процедуры выделения и о высокой ее концентрации в конечном растворе.

Information about authors:

VOLKOV Aleksey Nikolayevich, candidate of biological sciences, docent, Kemerovo State University; the senior research assistant, central research laboratory, Kemerovo State Medical Academy, Kemerovo, Russia. E-mail: volkov_alex@rambler.ru

RITENKOVA Oksana Ivanovna, doctor-laboratory geneticist, medical-genetic consultation department, Kemerovo Regional Clinical Hospital, Kemerovo, Russia.

TSURKAN Elena Vladimirovna, biologist, medical-genetic consultation department, Kemerovo Regional Clinical Hospital, Kemerovo, Russia. LYSENKO Denis Igorevich, doctor, chief of medical-genetic consultation department, Kemerovo Regional Clinical Hospital, Kemerovo, Russia.

в Кузбассе

Medicine

in Kuzbass

T. 14 № 3 2015

65

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДНК ИЗ ФИКСИРОВАННЫХ ЛИМФОЦИТОВ ДЛЯ ПЦР-ДИАГНОСТИКИ AZF-МИКРОДЕЛЕЦИЙ У ЧЕЛОВЕКА

Кроме того, в пробе отсутствуют ингибиторы ПЦР или их содержание не достаточно для существенного ухудшения качества ПЦР.

По результатам генотипирования удалось сделать заключение о присутствии всех изучаемых STS-маркеров в Y-хромосоме пациента П, что свидетельствует об отсутствии у него AZF-микроделеций. Ранее установленная формула кариотипа может быть сохранена, а морфологические изменения хромосомы Y в данном случае могут считаться вариантом нормы.

Завершая описание случая, мы заключаем, что в ходе выяснения причин мужского бесплодия целесообразно предусмотреть возможность проведения различных генетических исследований и единовременно осуществить забор подходящих образцов биоматериалов. Лимфоциты периферической крови, подготовленные для цитогенетического исследования в этанолуксусном фиксаторе, могут быть использованы как источник ДНК для последующей ПЦР-диагностики. Эффективным способом выделения ДНК из фиксированных лимфоцитов является сорбентный метод.

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES:_________________________________________________________________________________

1. Foresta C, Ferlin A, Gianaroli L et al. Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples. European Journal of Human Genetics. 2002;

10: 303-312.

2. Chernykh VB, Kurilo LF, Shileiko LV et al. Microdeletion analysis of AZF locus in infertile males: cooperative experience of research work. Medical genetics. 2003; 2

3. Longepied G, Saut N, Aknin-Seifer I et al. Complete deletion of the AZFb interval from the Y chromosome in an oligozoospermic man. Human Reproduction. 2010; 25(10): 2655-2663.

4. Baranov VS, Kuznetsova TV. Cytogenetics of human embryonic development. St. Petersburg., «Publisher N-L», 2007. 640 p. Russian (Баранов В.С., Кузнецова Т.В. Цитогенетика эмбрионального развития человека СПб.: «Издательство Н-Л», 2007. 640 c.).

5. Shaffer LJ, McGowan-Jordan J, Schmid M. ISCN 2013. An International System for Human Cytogenetic Nomenclature (2013). Karger, 2013. 140 p.

6. Tsvetkova TG Polymorphism of human chromosomes: methodical aspects and interpretation of findings. Medical genetics. 2007; 6(10): 32-36. Russian (Цветкова Т.Г. Полиморфизм хромосом в цитогенетической диагностике при медико-генетическом консультировании: методические аспекты и интерпретация результатов //Медицинская генетика. 2007. Т. 6., № 10. С. 32-36.).

7. Vogt PH, Edelmann A, Kirsch S et al. Human Y chromosome azoospermia factor (AZF) mapped to different subregions in Yqll. Hum. Mol. Genet. 1996;

5(7): 933-943.

8. Dong Y, Jiang Y, Du R et al. Impact of chromosomal heteromorphisms on reproductive failure and analysis of 38 heteromorphic pedigrees in Northeast China. J Assist Reprod Genet. 2013; 30: 275-281.

9. Krausz C, Hoefsloot L, Simoni M et al. EAA/EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions: state-of-the-art 2013. Andrology. 2014; 2: 5-19.

a

Статья поступила в редакцию 21.05.2015 г.

Субботин А.В., Семенов В.А., Смирнов В.Д., Мошнегуц С.В., Зуева С.А.

Кемеровская государственная медицинская академия, Кемеровская областная клиническая больница,

г. Кемерово

НЕИРОВИЗУАЛИЗАЦИЯ

ХРОНИЧЕСКОГО КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА

Предмет наблюдения. Представлена магнитно-резонансная картина начальных проявлений хронического клещевого энцефалита с судорожно-гиперкинетическим синдромом у вакцинированного пациента.

Цель исследования - новые представления МР-картины при ХКЭ.

Методы исследования. МРТ, ЭЭГ, иммунологические исследования.

Основные результаты. Мелкие периваскулярные очаги глиоза и нейродегенерации, соответствующие васкулиту при ХКЭ. Область их применения. Лучевая диагностика, неврология, инфекционные болезни.

Выводы. При ХКЭ выявляются нейродистрофические изменения, соответствующие периваскулярному домену. Ключевые слова: хронический клещевой энцефалит; МРТ.

66

T. 14 № 3 2015

Medicine

in Kuzbass

в Кузбассе