Подложка для связывания ориентированным образом молекул образца для последующей модификации свойств молекул образца

Полезная модель относится к области физических исследований по управлению свойствами молекул, в частности, для связывания молекул образца ориентированным образом. Пространственная ориентация молекул образца на ультратонком носителе необходима для максимизации среднего дипольного момента ансамбля молекул образца, что позволяет максимально эффективно изменять физические и химические свойства молекул, помещенных в резонаторные ячейки, что важно при проведении научно-исследовательских и прикладных работ, направленных на получение материалов с измененными свойствами.
Модификация свойств органических и неорганических молекул является важной научной и прикладной задачей, что актуально при получении материалов с новыми или измененными свойствами, например, измененной скоростью прохождения химических реакций или измененными константами связывания и равновесия, и может применяться для создания лекарственных препаратов, химических или биологических сенсоров, или фотовольтаических устройств. Изменение свойств молекул становится возможным благодаря расщеплению энергетических уровней вследствие взаимодействия электро-магнитного поля и вещества образца, известному как расщепление Раби. Обычно это производится путем помещения образца в оптическую резонаторную ячейку, образованную двумя отражающими структурами, которые расположены так, чтобы собственная электромагнитная мода отражающих структур совпадала с электронным или колебательным переходом молекул образца. При этом происходит образование резонансной сильной связи, когда вместо независимых собственных уровней энергии молекул образца и электро-магнитной моды отличающихся по энергии, что и называется расщеплением Раби. Сила эффекта изменения свойств молекул образца зависит от силы связывания локализованного электромагнитного поля отражающих структур и среднего дипольного момента ансамбля молекул образца. Для усиления данного взаимодействия необходима максимизация среднего дипольного момента ансамбля молекул образца, которая достигается, когда все молекулы образца пространственно ориентированы в одном направлении. Таким образом, для максимального изменения свойств молекул необходима подложка, которая позволит иммобилизовывать молекулы образца и ориентировать их в одном направлении. Кроме того, необходимо чтобы данная подложка минимально взаимодействовала с локализованным электромагнитным полем отражающих структур, то есть была максимально прозрачной для электромагнитного излучения видимого и инфракрасного диапазона.
Известна подложка для иммобилизации молекул образца, описанная в заявке [1], которая представляет собой тонкую пленку из серебра. При этом молекулы образца иммобилизуются на тонких серебряных пленках, покрытых полидиметилсилоксаном или полиметилметакрилатом. К недостаткам известного решения относится то, что пленки серебра имеют достаточно узкий диапазон прозрачности излучения около 326 нм, кроме того известная подложка не позволяет наносить молекулы ориентированным образом, что важно с точки зрения получения максимального среднего дипольного момента ансамбля молекул образца.
Известна подложка для иммобилизации молекул образца, описанная в заявке [2], представляющая собой тонкую пленку из золота, а исследуемые молекулы иммобилизуются на ней методом нанесения в поле центробежной силы. К недостаткам предложенной подложки стоит отнести то, что, во-первых, данная подложка не позволяет наносить молекулы образца ориентированным в пространстве образом, а также обладает низкой прозрачностью, особенно для инфракрасной области спектра, где ее прозрачность падает до 30% при 800 нм.
Ближайший аналог предлагаемому нами техническому решению для пространственно ориентированной иммобилизации молекул образца для последующей модификации их свойств не обнаружен.
Технический результат предлагаемой полезной модели заключается в создании подложки, которая позволяет пространственно-ориентировано иммобилизовывать биологические молекулы, а сама подложка обладает минимальным поглощением излучения в видимой и инфракрасной области спектра, для усиления эффекта модификации свойств биологических молекул, причем структура подложки позволяет контролировать соотношение и направление пространственной ориентации биологических молекул одного и более видов, что позволяет проводить одновременную модификацию свойств различных биологических молекул, а также анализировать этот процесс при различном их соотношении, ориентации и взаимном расположении.
Технический результат достигается тем, что применена подложка для связывания ориентированным образом молекул образца для последующей модификации свойств молекул образца, состоящая из производных графена, на поверхности которых иммобилизованы молекулы глутатиона, а также молекулы кислот для удержания ионов двухвалентных переходных металлов.
Для максимально эффективной модификации свойств молекул образца необходимо, чтобы дипольные моменты отдельных молекул были ориентированы в одном направлении. Это связано с тем, что в основе метода модификации свойств молекул образца лежит эффект «связывания» энергетических состояний молекул с локализованным электромагнитным полем, эффективность которого напрямую зависит от ориентации среднего дипольного момента ансамбля молекул относительно пространственного распределения поля оптической моды. Пространственно-ориентированная иммобилизация молекул обеспечивает одинаковую ориентацию индивидуальных дипольных моментов, что позволяет повысить средний дипольный момент ансамбля молекул и увеличит силу связи не только для ансамбля, но и для каждой отдельной молекулы. Иммобилизация на поверхности производных графена, в частности оксида графена, молекул кислот, которые способны координировать ионы двухвалентных переходных металлов, позволяет специфично связывать биологические молекулы, меченные гекса-гистидиновой меткой на N- или С-конце молекулы, благодаря чему достигается их ориентированная иммобилизация. Иммобилизация на поверхности производных графена, в частности восстановленного оксида графена, молекул глутатиона, позволяет специфически связывать биологические молекулы, меченные глутатион-S-трансферазой на N- или С-конце молекулы, что также позволяет задать их пространственную ориентацию на подложке. Контролируя степень окисления и восстановления оксида графена, а также пространственную упорядоченность данных модификаций можно добиться пространственно-ориентированной и упорядоченной иммобилизации различных соотношений биологических молекул с гекса-гистидиновой меткой и меткой на основе глутатион-S-трансферазы. Причем, данные метки можно связывать не только с биологическими молекулами одного типа, но и разных типов, что позволит одновременно изменять свойства двух, трех и более различных биологических молекул, при этом дипольный момент каждого типа биологических молекул будет ориентирован в одном направлении. Известно, что графен и его производные поглощают всего около 2,5% падающего на них света, что позволяет использовать различные длины волн с минимальным их поглощением материалом подложки.
Возможен первый частный случай, в котором в качестве производных графена применен однослойный или многослойный графен, однослойный или многослойный оксид графена, однослойный или многослойный восстановленный оксид графена, или их комбинации.
Возможен второй частный случай, когда в качестве производных графена применен однослойный или многослойный графен с различной степенью окисления и восстановления.
Возможен третий частный случай, когда в качестве производных графена применен однослойный или многослойный графен в котором позиции атомов окисления и восстановления пространственно упорядочены.
Возможен четвертый частный случай, в котором молекулы кислот иммобилизованы на поверхности производных графена через диэтилентриамин.
Возможен пятый частный случай, в котором в качестве молекул кислот применены нитрилотриуксусная кислота, карбоксиметил аспартат или иминодиуксусная кислота.
Возможен шестой частный случай, когда молекулы глутатиона иммобилизованы на производных графена через N- гидроксисукцимид-4-меламидобутират.
На фиг. 1 представлена принципиальная схема, иллюстрирующая конкретный пример подложки для связывания ориентированным образом молекул образца. На фиг. 1 цифрами обозначены следующие элементы: частично восстановленный лист оксида графена - 1; нитрилотриуксусная кислота - 2; глутатион - 3.
Принцип применения предлагаемой подложки для связывания ориентированным образом молекул образца и изменение свойств молекул раскрывается следующими примерами.
Пример 1 - Иммобилизация ориентированным образом молекул зеленого флуоресцентного белка GFP на подложке и изменение спектров его поглощения.
Подложку получают следующим образом. Проводят активацию карбоксильной группы нитрилотриуксусной кислоты (НТА) с помощью 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид гидрохлорида (ЭДК) и N-гидроксисукцимида (НГС), в соотношении НТА:ЭДК:НГС 2:1:1 при перемешивании в течение двух часов. Затем добавляют оксид графена (ОГ), диэтилентриамин (ДЭТ) в соотношении НТА:ДЭТ:ОГ равном 2:1:2. После этого проводят инкубацию полученной смеси при 80°С, в течение 6 часов с интенсивным перемешиванием. Затем полученную подложку промывают бидистиллированной водой 3 раза по 15 минут, при интенсивном перемешивании. Очищенный препарат GFP, меченный на N-конце гексагистидиновой меткой, наносят на изготовленную подложку в 20 мМ фосфатно-солевом буфере со 100 мМ хлорида натрия.
Поглощение GFP обусловлено двумя переходами 2,53 эВ (490 нм) и 2,67 эВ (465 нм), а пик флуоресценции находится на 508 нм (2,44 эВ). Применяется универсальная резонаторная ячейка, аналогичная описанной нами в патенте RU 2666853 C1, в которой в качестве отражающих структур применены зеркала, состоящие из стеклянной подложки толщиной 175 мкм, с нанесенной пленкой алюминия толщиной 50 нм и покрытые слоем оксида кремния толщиной 2 нм. Радиус кривизны плоско-выпуклого зеркала 78 мм. Коэффициенты отражения плоского зеркала 0,81, а плоско-выпуклого 0,91. Полученная подложка с иммобилизованными молекулами GFP известным способом под действием центробежной силы была нанесена на плоское зеркало. Для сравнения эффективности использовали образец, в котором эквимолярное количество GFP было нанесено на непосредственно на поверхность плоского зеркала. Расчеты параметров универсальной резонаторной ячейки проводились в среде COMSOL Multiphysics, после чего устанавливалось расчетное расстояние между зеркалами, чтобы собственная мода резонаторной ячейки была порядка 490 нм, то есть соответствовала спектру поглощения GFP. Спектры поглощения и флуоресценции GFP приведены на фиг. 2, спектр поглощения GFP нанесенного без подложки - 1; спектр поглощения GFP нанесенного с применением предлагаемой подложки - 2; спектр флуоресценции GFP нанесенного без подложки - 3; спектр флуоресценции GFP нанесенного с применением предлагаемой подложки - 4. Из этого примера видно, что применение предлагаемой подложки позволяет более эффективно модифицировать свойства молекул образца.
Пример 2 - Иммобилизация ориентированным образом молекул зеленого и желтого флуоресцентных белков (GFP и YFP) на подложке и изменение спектра флуоресценции GFP и поглощения YFP. Выбор этой пары обусловлен хорошим сопряжением спектра флуоресценции GFP (максимум около 510 нм) и спектра поглощения YFP (максимум около 515 нм).
Подложку получают следующим образом. Проводят активацию карбоксильной группы НТА с помощью ЭДК и НГС, в соотношении НТА:ЭДК:НГС 2:1:1 при перемешивании в течение двух часов. Затем добавляют частично восстановленный оксид графена, диэтилентриамин (ДЭТ) и глутатион (ГТ) в 50 мм фосфатно-солевом буфере (рН 6). Соотношение количеств ДЭТ:ТГ:НТА равно 2:1:2. Количество производных графена равно половине суммы масс используемых НТА и ГТ. После этого проводят инкубацию полученной смеси при 80°С в течение 6 часов с интенсивным перемешиванием. Затем полученную подложку промывают бидистиллированной водой 3 раза по 15 минут, при интенсивном перемешивании. Очищенные препараты GFP, меченного на N-конце гексагистидиновой меткой, и YFP, меченного на N-конце глутатион-S-трансферазой, наносят на изготовленную подложку в 15 мМ фосфатно-солевом буфере со 100 мМ хлорида натрия. Полученная подложка с иммобилизованными молекулами GFP и YFP известным способом под действием центробежной силы была нанесена на плоское зеркало. Расчеты параметров универсальной резонаторной ячейки проводились в среде COMSOL Multiphysics, после чего устанавливалось расчетное расстояние между зеркалами, чтобы собственная мода резонаторной ячейки была порядка 515 нм, то есть соответствовала спектру флуоресценции GFP и спектру поглощения YFP. Спектры флуоресценции GFP и YFP приведены на фиг. 3, спектр поглощения GFP без выполнения условий сильной связи - 1; спектр поглощения GFP при выполнении условия сильной связи - 2; спектр флуоресценции YFP без выполнения условий сильной связи - 3; спектр флуоресценции YFP при выполнении условия сильной связи - 4. При облучении резонаторной ячейки излучением с длиной волны 490 нм, что соответствует спектру поглощения GFP, в условиях реализации сильной связи, наблюдается снижение флуоресценции YFP, что свидетельствует о различном изменении спектров флуоресценции GFP и поглощения YFP.
Предложенная подложка позволяет иммобилизовывать на ней ориентированным образом молекулы образца одного, двух и более видов в различных соотношениях, обеспечивая максимизацию среднего дипольного момента ансамбля молекул, что позволяет упростить процесс подготовки образцов, а также усилить эффект изменения свойств молекул образца, благодаря увеличению силы связи не только для ансамбля, но и для каждой отдельной молекулы, а также за счет снижения поглощения излучения материалом подложки.
Источники информации
1. James A. Hutchison, Tal Schwartz, Cyriaque Genet, Eloise DEVAUX, Thomas W. EBBESEN, Paolo SAMORI. Method and device to modify properties of molecules or materials. Заявка WO 2013017961 A2.
2. James A. Hutchison, Cyriaque Genet, Thomas W. Ebbesen, Paolo SAMORI, Emanuele Orgiu, Jino George, Francesco Stellacci. Method and device to modify the electrical properties of an organic and/or molecular material. Заявка ЕР 3014351 A2.