Алгоритм компьютерного VNTR-типирования на основе неполных сиквенсов ДНК-штаммов Vibrio cholerae, выделенных на Гаити в 2010 г

28

ЗНиСО

март №3

Таким образом, установлены приоритетные факторные комплексы по воздействию на здоровье школьников. Получены показатели, отражающие вклад каждого из указанных факторов внутришкольной среды в формирование здоровья школьников. Влияние экологических рисков на здоровье школьников одинаково для всех типов образовательных учреждений, однако в гимназиях и лицеях дополнительное влияние на здоровье оказывают еще и риски образовательного процесса, а в обычных школах — риски социального неблагополучия. При составлении профилактических программ для образовательных учреждений следует учитывать, что для каждого типа учреждения характерны свои сочетания рисков для здоровья и, соответственно, разные приоритетные факторы.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Баранов А.А., Сухарева Л.М. Особенности состояния здоровья современных школьников / А.А. Баранов, Л.М. Су-

харева // Вопросы современной педиатрии. — 2006 — № 6. - С. 23—32.

2. Гребняк Н.П., Вытрищак C.B. Состояние здоровья детского населения мегаполиса / Н.П. Гребняк, С.В. Вытрищак // Гигиена и санитария. — 2004. — № 2. — С. 50-54.

3. Куинджи, Н.Н. Валеология: Пути формирования здоровья школьников. — М.: Аспект Пресс, 2000. — 139 с.

4. Кучма, В.Р., Сухарева, Л.М., Степанова, М.И. Гигиенические проблемы школьных инноваций. — М.: Научный центр здоровья детей РАМН, 2009. — 240 с.

5. Кучма В.Р. Научные основы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия детей и подростков в современных условиях / Актуальные проблемы здоровья детей и подростков и пути их решения. — 2012. — С. 28—34.

Контактная информация:

Зорина Ирина Геннадьевна, тел.: 8 (351) 263-06-43, е-mail: stat@uzag74.ru

Contact information: Zorina Irina,

phone: 8 (351) 263-24-01, е-mail: stat@uzag74.ru

-♦+♦-

АЛГОРИТМ КОМПЬЮТЕРНОГО VNTR-ТИПИРОВАНИЯ НА ОСНОВЕ НЕПОЛНЫХ СИКВЕНСОВ ДНК-ШТАММОВ VIBRIO CHOLERAE,

ВЫДЕЛЕННЫХ НА ГАИТИ В 2010 г.

А.С. Водопьянов, С.О. Водопьянов, Б.Н. Мишанькин, И.П. Олейников

г-Ь

COMPUTER VNTR-GENOTYPING ALGORITHM BASED ON THE PARTIAL SEQUENCE DATA OF VIBRIO CHOLERAE STRAINS FROM HAITIAN OUTBREAK

A.S. Vodop'yanov, S.O. Vodop'yanov, B.N. Mishan'kin, I.P. Olejnikov

ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора

Разработан алгоритм компьютерного VNTR-типирования штаммов Vibrio cholerae на основе неполных данных о нуклеотидных последовательностях. Проведено типирование штаммов V cholerae, выделенных на о. Гаити в 2010 г. Кластерный анализ позволил установить, что эпидемический процесс на о. Гаити был вызван двумя независимыми клонами V cholerae.

Ключевые слова: Vibrio cholerae, холера, VNTR, типирование, компьютерное моделирование, in silico, алгоритм.

It was developed the algorithm to computer simulation for VNTR-genotyping based on the partial sequence data. By used this program, we genotyping Vibrio cholerae isolates from Haiti. Cluster analysis showed two distinct clones of V. cholerae coexisted in Haitian outbreak (2010).

Keywords: Vibrio cholerae, cholera, VNTR, genotyping, computer simulation, in silico, algorithm.

Метод УКТЯ-типирования, разработанный на основе полиморфизма локусов вариабельных тандемных повторов возбудителя холеры, нашел широкое применение в практике эпидемиологического анализа [1; 3].

Важнейшим аспектом молекулярного типи-рования является анализ коллекций штаммов, выделенных в разные периоды времени и на разных территориях, который позволяет сравнивать вновь выделенные штаммы с уже исследованными ранее и определять происхождение и наличие связей между изолятами в случае вспышек заболеваний. С этой целью ранее была создана геоинформационная система «Холера. Штаммы — УКТЯ», содержащая информацию о 630 штаммах холерного вибриона [2]. Однако проведение УОТЯ-типирования требует наличия, по крайней мере, образцов ДНК исследуемых штаммов.

За последние годы в мире произошел мощный прорыв в области полногеномного секвенирова-ния живых организмов, в рамках которого разработано несколько типов высокопроизводительных ДНК-секвенаторов, и созданы программные продукты по обработке получаемых данных. Достигнутые успехи позволили провести секве-нирование генома множества штаммов различных возбудителей, включая Vibrio cholerae [4]. Результатом секвенирования поначалу являются данные о структуре множества сравнительно коротких фрагментов ДНК длиной от нескольких сот нуклеотидов. Производительность ДНК-секвенаторов превышает возможности программного обеспечения, используемого для обсчета результатов сиквенса и выдачи полной структуры геномов, что в случае с возбудителем холеры привело к тому, что в настоящее время в базе дан-

март №3

29

ных Genbank содержится информация только о '— 7 полных геномах, хотя доступными остаются сведения о 131 неполном сиквенсе геномов различных штаммов вибрионов, представленных в виде -чт набора контигов разной длины. ^ Зная последовательность праймеров для ^ VNTR-типирования и располагая информацией о нуклеотидной последовательности, теоретически можно осуществить компьютерное моделирование ПЦР (in silico) и определить VNTR-генотип штамма. Таким образом, появляется возможность проведения VNTR-типирования при отсутствии образцов ДНК, опираясь при этом только на доступные через Genbank структуры с помощью современных информационных технологий.

Недавняя вспышка холеры на острове Гаити в 2010 г. привела к внушительному числу человеческих жертв и значительным финансовым затратам. Из объектов внешней среды и от заболевших было выделено множество штаммов V. cholerae, часть из которых была подвергнута полногеномному секвенированию [5]. Однако в настоящее время в Genbank нет сведений ни об одном полном геноме штаммов вибрионов, вызвавших вспышку заболевания, т. к. вся информация представлена в виде набора фрагментов генома (контигов).

Цель настоящей работы — разработка алгоритма VNTR-типирования in silico с использованием локальной базы данных неполных геномов Vibrio cholerae, выделенных в ходе вспышки холеры на острове Гаити в 2010 г.

На первом этапе работы создавалась локальная база данных последовательностей ДНК неполных геномов штаммов возбудителя холеры с о. Гаити, для чего по запросу из Genbank были скачаны свыше 22 тыс. последовательностей ДНК. Суммарный объем созданной локальной базы данных по 61 неполному сиквенсу штаммов составил свыше 450 млн нуклеотидов.

Далее была разработана компьютерная программа, позволяющая выявлять нуклеотидные последовательности с локусами тандемных повторов VcA, VcB, VcC, VcD и VcG. С помощью такой программы проведено компьютерное моделирование ПЦР с определением размера продуктов амплификации с праймерами, фланкирующими локусы тандемных повторов [1].

В ходе проведения ПЦР in silico установлено, что локусы VcA и VcD присутствуют среди нуклео-тидных последовательностей у 61 штамма, тогда как локусы VcC и VcG были идентифицированы лишь у 56 штаммов. Поскольку среди изучен-

ных вибрионов, лишенных локусов VcC и VcG, не обнаружено, то подобный факт указывает на неполное проведение сиквенса ДНК некоторых штаммов.

Ситуация с локусом VcB оказалась сложнее: его содержали только 32 штамма из 61. Однако учитывая довольно частые встречи подобных штаммов в природе, данный факт рассматривался как доказательство реального отсутствия указанного участка ДНК у вибрионов [3]. Ранее было показано, что наличие локуса VcB в геноме штаммов возбудителя холеры коррелирует с присутствием генов ctxA и особенно tcpA, поэтому выделенные на территории РФ из объектов внешней среды атоксигенные штаммы возбудителя холеры, как правило, были лишены локуса VcB [3]. С учетом таких данных с последовательностями локальной базы была поставлена виртуальная ПЦР с праймерами к генам ctxA и tcpA, показавшая, что у штаммов, лишенных локуса VcB, отсутствовали гены ctxA и tcpA. Верность такого вывода дополнительно подтвердилась при анализе происхождения выделения культур: восемь штаммов вибрионов были обозначены авторами аббревиатурой «HE» (Haiti Environment), которая указывает на их выделение из объектов внешней среды (остальные группы культур изолированы от человека) [4]. Следует учесть, что все восемь указанных штаммов были лишены локусов VcB, ctxA и tcpA, но содержали локусы VcA, VcC, VcD и VcG, что позволило отнести данную группу штаммов к атоксигенным. Поэтому для дальнейшего VNTR-типирования были отобраны только 53 штамма, содержащие локусы VcA, VcC, VcD и VcG, в т. ч. 30 токсигенных (ctxA+ и tcpA+), содержащих еще и локус VcB.

Верность проведенного секвенирования была подтверждена определением величины виртуального фрагмента ПЦР. Зная участок посадки праймеров, размер и кратность повтора, были рассчитаны возможные варианты длины ампликонов в зависимости от кратности повтора. Во всех случаях размеры виртуального и ожидаемого ампли-конов совпали, что послужило дополнительным доказательством высокой точности секвенирова-ния. На основании размеров виртуальных фрагментов были определены уникальные аллельные формулы 53 изученных штаммов.

Аллельные формулы штаммов возбудителя холеры, выделенных во время вспышки холеры на о. Гаити в 2010 г., были добавлены в ГИС «Холера. Штаммы-VNTR» и подвергнуты анализу с помо-

VNTR-генотипы штаммов возбудителя холеры, выделенных во время вспышки холеры на о. Гаити в 2010 г.

Кластер Число штаммов/ VNTR-генотипы VNTR-генотипы/ число штаммов данного генотипа Свойства кластера

A 7/ 3 A61 /1, A62/ 5, A63/1 ctx+ , tcpA +

C 23/ 11 C2/ 3, C3/ 2, C4/ 6, C5/ 1, C6/ 2, C7/ 1, C8/ 1, C9/ 2, C10/ 3, C12/ 1, C13/ 1 ctx+ , tcpA +

F 16/ 10 F18/ 1б, А19/ 1б, А20/ 2б, А21/ 1б А24/ 1б, А25/ 2б, А26/ 3б, А27/ 3б, А28/ 1б, А29/ 1 ctx- , tcpA -

G 3/ 3 G/51/ 1, G64/ 1, G72/ 1 ctx- , tcpA -

J 3/ 2 J5/ 2, J6/ 1 ctx- , tcpA -

I 1/ 1 I6/ 1 ctx- , tcpA -

30

ЗНиСО

март №3

Дендрограмма распределения УЫТЯ-генотипов V. еИо1егае (о. Гаити, 2010), построенная с помощью ГИС «Холера. Штаммы — VNTR». Кластеры обозначены буквами латинского алфавита

щью интегрированного авторского программного обеспечения. На момент проведения исследования в состав ГИС была введена информация о 630 штаммах возбудителя холеры, генотипы которых были определены лабораторным путем.

По результатам VNTR-типирования неполных сиквенсов 53 изученных штаммов было выявлено 30 уникальных VNTR-генотипов, которые по результатам анализа были сгруппированы в шесть кластеров (см. рис.). При этом все 30 токсиген-ных штаммов (йхЛ+ и 1ерЛ+) характеризовались высокой степенью генетического родства и вошли в состав двух четко дискриминируемых кластеров Л и С.

В кластер А вошли 7 штаммов, 5 из которых принадлежали мажорному VNTR-генотипу А62. В состав кластера С вошли 23 штамма, сформировавшие 11 VNTR-генотипов, где мажорным генотипом явился VNTR-генотип С4 (6 штаммов). Полученные данные указывают на циркуляцию среди заболевших штаммов, относящихся к двум генетически разным популяциям вибрионов, что свидетельствует в пользу двух возможных случаев заноса возбудителя на о. Гаити, и генетические различия (появление минорных VNTR-генотипов) могут быть обусловлены естественной изменчивостью холерного вибриона.

Атоксигенные штаммы ^еВ- йхЛ- и 1ерЛ-) характеризовались более высокой степенью гетерогенности по сравнению с токсигенными штаммами и сформировали четыре изолированных кластера

(F, G, J и I), которые четко дифференцировались от токсигенных изолятов (см. табл., рис.).

Заключение. Суммируя полученные данные, можно сделать вывод, что эпидемический процесс на о. Гаити в 2010 г. был обусловлен заносом двух независимых клонов токсигенных холерных вибрионов, относящихся к мажорным виртуальным VNTR-генотипам А62 и С4. В ходе эпидемии при длительной циркуляции на острове сформировались 12 минорных генотипов, входящих в кластеры А и С. На наш взгляд, необходимы дальнейшие исследования с целью установления возможной связи выявленных VNTR-генотипов гаитянского происхождения среди штаммов, выделенных на территории РФ. Предложенный алгоритм VNTR-типирования in silico (на основе неполных сиквенсов) показал реальную возможность его использования при проведении молекулярного типирования в условиях ограниченного объема информации о полных геномах V. cholerae.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Мишанькин М.Б. и др. Вариабельные тандемные повторы, выявленные при компьютерном анализе генома Vibrio cholera / А.С. Водопьянов [и др.] // Биотехнология. — 2001. — № 6. — С. 85—88.

2. Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Сучков И.Ю. и др. База данных «Геоинформационная система «Холера. Штаммы VNTR» / А.С. Водопьянов [и др.] // Свидетельство об официальной регистрации базы данных № 2007620389 от 8 ноября 2007.