ХИМИОПРОТЕКТОРЫ ИЗ СЕМЯН И РОСТКОВ РАСТЕНИЙ СЕМЕЙСТВА КРЕСТОЦВЕТНЫХ
CHEMOPROTECTOR OF CRUCIFERAE SEEDS AND SPROUTS

Настоящее изобретение относится к химиопротекторным соединениям и способу получения химиопротекторных соединений, которые могут быть включены в различные продовольственные продукты. Более конкретно, изобретение относится к способу экстракции, являющемуся эффективным для получения экстракта, имеющего высокое отношение химиопротекторных соединений к менее желательным соединениям, обеспечивая высокий выход химиопротекторных соединений. Повышенные выход и соотношения химиопротекторных соединений обеспечиваются водным способом экстракции, используемым в сочетании с адсорбентами.
Предпосылки создания изобретения
Общеизвестно, что диета играет большую роль в контроле риска развития раковых заболеваний и что увеличенное потребление фруктов и овощей может уменьшить количество случаев рака у людей. Наличие определенных минорных химических компонентов в растениях может обеспечить главный защитный механизм при доставке в клетки млекопитающих.
Овощи семейства крестоцветных содержат фитохимические предшественники активных химиопротекторов, особенно глюкорафанин и сопутствующий продукт его переработки сульфорафан, которые, будучи доставлены в клетки млекопитающих, запускают механизмы детоксикации канцерогенного вещества. В дополнение к снижению риска развития некоторых видов рака, как недавно показано, глюкорафанин через биоактивный продукт его переработки, сульфорафан, эффективен для уничтожения микроорганизма, вызывающего развитие большинства язв желудка, и может предоставить новые подходы для уменьшения риска развития сердечно-сосудистых и глазных заболеваний. Предпринимаются усилия для получения разрешения на правовую защиту маркировки продовольственных продуктов либо с природным высоким содержанием этих веществ, либо пищевых продуктов, содержащих добавку крестоцветных химиопротекторов. Продукты, содержащие химиопротекторные добавки, хотя и без правовых притязаний, уже представлены на рынке.
Овощи семейства крестоцветных также содержат другие соединения, такие как индолглюкозинолаты, которые представляют собой проблемы для поддержания хорошего здоровья. Эти соединения не только представляют собой слабые индукторы системы детоксикации канцерогенного вещества, но также они могут индуцировать системы, которые могут биоактивировать определенные проканцерогены. Кроме того, продукты разрушения индолглюкозинолатов, образующиеся в желудке в процессе переваривания, могут действовать подобно диоксину, очень активному токсину. Следовательно, является преимущественным производить глюкорафанинсодержащие препараты, содержащие настолько небольшое остаточное количество глюкозинолатов индола или других неблагоприятных соединений, насколько возможно.
В нескольких патентах описана разработка высокохимиопротективной зародышевой плазмы растений семейства крестоцветных со значительно улучшенным соотношением глюкорафанина и индолглюкозинолатов (увеличение соотношения от приблизительно 0,2 до приблизительно 30). См., например, патенты США №№ 6521818, 6242018, 6177122, 5968567, 5968505 и 5725895; однако разработка зародышевой плазмы от лаборатории до полевых испытаний и до поступления на рынок будет требовать значительного времени, вплоть до 5 лет, и без гарантии успеха. Следовательно, существует потребность обеспечения альтернативных способов производства высоких выходов глюкорафанина с высоким соотношением глюкорафанина к индолглюкозинолатам.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение направлено на композиции предшественников химиопротекторов, представленные семенами и ростками крестоцветных, и способы их получения. Обработка водных экстрактов семян или ростков крестоцветных с адсорбентами существенно увеличивает отношение определенных высокохимиопротекторных соединений-предшественников (алкилглюкозинолатов, таких как глюкорафанин, т.е. глюкозинолат сульфорафана) к нежелательным соединениям, таким как индолглюкозинолаты (например, 4-гидроксиглюкобрассицин). Способ обеспечивает получение экстракта, который имеет отношение глюкорафанина к 4-гидроксиглюкобрассицину приблизительно 70 или более. Полученный в результате экстракт имеет улучшенный цвет и запах и может быть высушен или использоваться непосредственно как добавка в различных пищевых продуктах.
Изобретение относится к способу экстракции химиопротекторных предшественников из семян или ростков крестоцветных. Вообще, способ включает образование водного экстракта семян или ростков крестоцветных. Водный экстракт вступает в контакт с адсорбентом. Водный экстракт отделяют от адсорбента, чтобы обеспечить повышение химиопротективности экстракта. Способ является эффективным для получения экстракта с повышенной химиопротективностью, имеющего отношение количества алкилглюкозинолатов, особенно глюкорафанина, к индолглюкозинолатам, конкретно, 4-гидроксиглюкобрассицину, от приблизительно 30 до приблизительно 1000 или более, предпочтительно от приблизительно 100 до приблизительно 1000.
Было установлено, что овощи семейства крестоцветных представляют собой хороший источник растительных химиопротекторных химических веществ-предшественников. Было обнаружено, что семена и ростки крестоцветных представляют собой особенно хороший источник химиопротекторных веществ-предшественников. Семена и ростки крестоцветных, которые являются особенно полезными, включают брокколи, капусту, листовую капусту, вьющуюся капусту, кормовую капусту, тысячеголовую капусту, китайскую капусту, цветную капусту, португальскую капусту, брюссельскую капусту, кольраби, капусту Свитера, савойскую капусту, листовую капусту, браунколи, редис и подобные, а также их смеси. В наиболее важном аспекте используются семена крестоцветных или семена и ростки брокколи.
J Agric. Food Chem.
Когда в качестве исходного материала используются семена крестоцветных, они могут использоваться непосредственно или могут обрабатываться перед водной экстракцией. В одном аспекте семена крестоцветных могут обезжириваться перед образованием водного экстракта с использованием общеизвестных способов обезжиривания. Например, West, L. et al.,  2004, 52, 916-926, который включен здесь в качестве ссылки. В еще одном аспекте семена крестоцветных могут перемалываться, измельчаться или смешиваться перед добавлением водного экстракта или одновременно с добавлением водного экстракта.
Экстракция семян или ростков может проводиться с водой или водой, содержащей органический растворитель, такой как этиловый спирт. В еще одном альтернативном аспекте водный экстракт семян или ростков крестоцветных образуется посредством помещения семян или ростков крестоцветных в воду, имеющую температуру от 60 до 110°C в течение, по крайней мере, 5 минут.
Водный экстракт семян или ростков вступает в контакт с адсорбентом. Водный экстракт может отделяться от клеточных материалов и освобождаться от клеточных материалов семян и ростка. Альтернативно, водный экстракт с клеточными материалами может контактировать непосредственно с адсорбентами. Адсорбенты, которые могут использоваться, включают активированный уголь, диоксид кремния, химически модифицированный диоксид кремния, отбеливающую глину и подобное, так же, как и их смеси. В очень важном аспекте адсорбент представляет собой активированный уголь. Обычно с водным экстрактом смешивается от приблизительно 1 до приблизительно 20 мас.% адсорбента. В очень важном аспекте с водным экстрактом смешивается от приблизительно 8 приблизительно до 12 мас.% адсорбента.
В еще одном аспекте водный экстракт семян или ростков добавляют к колонке, содержащей адсорбентные материалы. В этом аспекте колоночная обработка эффективна для получения экстракта, имеющего отношение алкилглюкозинолатов, особенно глюкорафанина, к индолглюкозинолатам, конкретно 4-гидроксиглюкобрассицину, от приблизительно 30 до приблизительно 1000 или более, предпочтительно от приблизительно 100 до приблизительно 1000.
В еще одном аспекте предоставлены продовольственные продукты, которые включают экстракт с повышенным содержанием химиопротектора или предшественника химиопротектора. Экстракт может быть включен непосредственно в продовольственные продукты или высушен, охлажден, заморожен или сублимирован и затем включен в продовольственные продукты. Продовольственный продукт, в который может быть включен экстракт, включает пищевые добавки, напитки, коктейли, выпечку, чаи, супы, зерновые, пилюли, таблетки, салаты, бутерброды, гранолы, заправки к салату, соусы, кофе, сыры, йогурты, питательные батончики и подобное, а также их смеси. В данном аспекте продовольственный продукт может содержать количество экстракта, эффективное для предоставления продовольственного продукта с от 0,003 мас.% до 0,05 мас.% глюкорафанина.
Краткое описание чертежей
Чертеж представляет общее описание способов экстракции химиопротекторных соединений из семян или ростков крестоцветных.
Подробное описание изобретения
Как показано на чертеже, семена и/или ростки крестоцветных могут обрабатываться множеством различных способов. Водный экстракт семян или ростков может образовываться и затем смешиваться с адсорбентами или наноситься на адсорбентсодержащую колонку. Альтернативно, семена или ростки могут смешиваться непосредственно с водным экстрактом и адсорбентами. Семена или ростки могут экстрагироваться со смешиванием, гомогенизацией или измельчением с использованием общеизвестных способов.
J. Nutr
В рамках настоящей заявки термины "химиопротекторы" и "химиопротекторные соединения" относятся к веществам, источником которых являются растения, которые являются эффективными для уменьшения восприимчивости млекопитающих к токсическим и неопластическим эффектам канцерогенных веществ. "Предшественники" химиопротекторов относятся к средствам, которые дают начало химиопротекторам посредством ферментативных и/или химических средств, Talalay, et al, P.,  2001, 131 (11 Suppl), 30275-30335. Примеры таких предшественников химиопротекторов включают алкилглюкозинолаты, такие как глюкорафанин.
В рамках настоящей заявки "водный экстракт" означает экстракты, полученные со 100% воды или с добавлением вплоть до 25% органического растворителя, такого как этиловый спирт.
J. Chromatogr.
Chromatogr.
J. Chromatogr.
Другие способы, которые могут использоваться для селективной концентрации химиопротекторов и предшественников химиопротекторов, включают препаративную жидкостную хроматографию, мембранную ультрафильтрацию, селективную преципитацию, препаративный электрофорез и методы препаративного противоточного распределения. Troyer, J. и др.,  2001, 919, 299-304; West, L. и др. J.  2002, 966, 227-232; Fahey, J. и др.  2003, 966, 85-93; и Iori, R., патентная заявка B098A 000425 1998. В еще одной альтернативе, чтобы далее очистить экстракты, основанные на молекулярной массе, экстракт с повышенным содержанием предшественника химиопротектора можно подвергнуть ультрафильтрации через >500 MWCO (предел пропускания по молекулярной массе) фильтры.
Семена и ростки крестоцветных
Семена и ростки крестоцветных представляют собой пригодные исходные материалы. Отношение глюкорафанина к индолглюкозинолатам в природе является более высоким в семенах (в среднем ~4, с интервалом от 0,4 до 11), чем в вегетативной ткани. Семена и ростки являются более предпочтительными в качестве исходного материала, так как они имеют более высокие количества глюкорафанина по сравнению со зрелыми растениями. Семена и ростки более легко подвержены обработке и являются менее дорогими, чем зрелые растения.
Ростки, пригодные в качестве источников раковых химиопротекторов, в общем случае являются ростками крестоцветных (семейство Brassicaceae). Предпочтительно ростки представляют собой Brassica oleracea ssp., выбранные из группы разнообразных видов, состоящей из acephala (капуста, листовая капуста, дикая капуста, вьющаяся капуста), medullosa (кормовая капуста), ramose (тысячеголовая капуста), alboglabra (китайская капуста), botrytis (цветная капуста, проросшая брокколи), costata (португальская капуста), gemmifera (брюссельская капуста), gogylodes (кольраби), italica (брокколи), palmifolia (джерсийская капуста), sabauda (савойская капуста), sabellica (листовая капуста) и selensia (браунколи) среди прочих. Известны многочисленные способы культивирования ростков, что продемонстрировано патентами США № 3733745, 3643376, 3495148, 4130964, 4292769 и 4086725, которые все включены в данное описание в качестве ссылки. Ростки могут быть получены в промышленных устройствах для прорастания с обеспечением водой (6 раз/день) в течение 5-дневного периода.
Особенно применимыми культивируемыми сортами брокколи для применения в заявленном способе являются Saga, De Cicco, Everest, Emerald City, Packman, Corvet, Dandy, Early, Emperor, Mariner, Green Comet, Green Valiant, Arcadia, Calabrese Caravel, Chancellor, Citation, Cruiser, Early Purple Sprouting Red Arrow, Eureka, Excelsior, Galleon, Ginga, Goliath, Green Duke, Greenblet, Italian Sprouting, Late Purple Sprouting, Late Winter Sprouting, White Star, Legend, Leprechaun, Marathon, Mariner, Minaret (Romanesco), Paragon, Patriot, Premium Crop, Rapine (Spring Raab), Rosalind, Salade (Fall Raab), Samurai, Shogun, Sprinter, Sultan, Taiko, Trixie, San Miguel, Arcadia, Gypsy, Everest, Patron, Southern Comet, Green Comet, Destiny, Climax и Pirate. Однако пригодными являются многие другие культивируемые сорта брокколи.
Адсорбенты
Семена или ростки крестоцветных или водные экстракты семян или ростков крестоцветных могут быть смешаны непосредственно с адсорбентами в периодическом режиме, полунепрерывном режиме или непрерывном режиме (например, с использованием адсорбентной колонки). В настоящем описании адсорбенты относят к соединениям, которые являются эффективными для предпочтительной адсорбции индолглюкозинолатов по сравнению с алкилглюкозинолатами. Применимые адсорбенты включают активированный уголь, включая гранулированные Norit A и Darco, с фракцией 12-20 меш. Дополнительные адсорбенты, демонстрирующие некоторую эффективность, включают оксид кремния, химически модифицированный оксид кремния (так называемый С-18 нагруженный) и отбеливающую глину (обычно используемую при обработке растительного масла). Обнаружено, что неэффективные адсорбенты включают оксид алюминия (нейтральный, кислый и основной) и землю Фуллера (монтмориллонит).
Обработка экстрактов
Экстракты семян крестоцветных с повышенным содержанием предшественника химиопротекторов могут быть включены в различные пищевые продукты. Экстракт может быть высушен, охлажден, заморожен или лиофилизирован с использованием известных способов. Альтернативно, экстракты могут быть дополнительно обработаны, например, с применением мембранной обработки или диализа для удаления соединений с высокой молекулярной массой, таких как белки и полисахариды.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Периодическая обработка семян брокколи
J. Chromatogr. A
30 мл образца водного экстракта из 1 г размельченных обезжиренных семян брокколи (вид Gypsy) обрабатывают 100 мг активированного угля (Darco G-60) с фракцией 12-20 меш посредством кипячения в течение 1 мин в 30 мл воды с последующей фильтрацией для удаления отработанного адсорбента и получения водного экстракта. Первоначальное отношение глюкорафанин/4-гидроксиглюкобрассицин, составляющее ~11 в исходных семенах, увеличивается до ~70 в обработанном материале. Потеря глюкорафанина составляет ~4%, что определено посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), West, L. Et al.,  2002, 966, 227-232.
Пример 2: Колоночная обработка семян брокколи
30 мл образца водного экстракта из 1 г размельченных обезжиренных семян брокколи (вид Gypsy) пропускают через колонку, содержащую 1000 мг графитизированной углеродной сажи. Первоначальное отношение глюкорафанин/4-гидроксиглюкобрассицин, составляющее ~11 в исходных семенах, увеличивается до >1000. Потеря глюкорафанина составляет ~13%, что определено с помощью ВЭЖХ.
Пример 3: Обработка семян брокколи кипящей водой
100 мг навеску активированного угля (Darco G-60) замешивают с 1 г размельченных обезжиренных семян брокколи (вид Gypsy) и экстрагируют в кипящей воде с последующим центрифугированием для удаления агрегатов частиц. Первоначальное отношение глюкорафанин/4-гидроксиглюкобрассицин, составляющее ~11 в исходных семенах, увеличивается до >30. Потеря глюкорафанина составляет ~2%, что определено с помощью ВЭЖХ.
Пример 4: Обработка семян брокколи с помощью ультрафильтрации
200 г навеску размельченных и обезжиренных семян брокколи (вид Premium Crop) добавляют к 2 л кипящей воды. Через 5 мин при температуре кипящей воды смесь отфильтровывают для удаления остаточного растительного материала и водный экстракт обрабатывают 20 г активированного угля (Darco G-60) кипячением в течение ~1 мин с последующими центрифугированием и фильтрацией для удаления отработанного адсорбента. Осветленный экстракт подвергают ультрафильтрации, используя мембрану 3000 MWCO, в то же время удерживая ультрафильтрат. После сушки порошок желтовато-коричневого цвета анализируют ВЭЖХ и обнаруживают, что он содержит свыше 30 мас.% глюкорафанина и отношение глюкорафанин/4-гидроксиглюкобрассицин составляет более 1000.
Пример 5: Обработка ростков брокколи с использованием смешивания и ультрафильтрации
500 г образца цельных свежих ростков брокколи с возрастом ~5 дней (проращенных из вида Premium Crop) добавляют к 2 л кипящей воды. Через 10 мин при температуре кипящей воды смесь переносят в смеситель, работающий при высокой скорости для разрыва растительной ткани с целью дополнительного высвобождения глюкорафанина. После фильтрации для удаления остаточного растительного материала водный экстракт обрабатывают 20 г активированного угля (Darco G-60) кипячением в течение ~1 мин с последующими центрифугированием и фильтрацией для удаления отработанного адсорбента. Осветленный экстракт подвергают ультрафильтрации, используя мембрану 3000 MWCO, в то же время удерживая ультрафильтрат. После сушки порошок белого цвета анализируют ВЭЖХ и обнаруживают, что он содержит свыше 10 мас.% глюкорафанина и отношение глюкорафанин/4-гидроксиглюкобрассицин составляет более 1000.