Способ прогнозирования степени вероятности полной регрессии при проведении неоадъювантной химиотерапии у пациенток с люминальным В молекулярно-генетическим субтипом рака молочной железы
METHOD FOR PREDICTION OF DEGREE OF FULL REGRESSION PROBABILITY DURING NEOADJUVANT CHEMOTHERAPY IN PATIENTS WITH LUMINAL MOLECULAR-GENETIC SUBTYPE OF BREAST CANCER

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и касается способа прогнозирования степени вероятности полной регрессии при проведении неоадъювантной химиотерапии у пациенток с люминальным В молекулярно-генетическим субтипом рака молочной железы.
Заболеваемость раком молочной железы стабильно занимает первое место среди онкологической патологии у женщин и количество больных с каждым годом только растет [1, 2, 3]. В связи с этим имеется необходимость в совершенствовании методов диагностики и лечения данной патологии, в частности одного из этапов терапии - неоадъювантной химиотерапии [4, 5, 6]. Предоперационная химиотерапия имеет большое значение, так как позволяет не только уменьшить размер первичной опухоли и, как следствие, объем оперативного вмешательства, но и определить потенциальную чувствительность к цитостатическим препаратам [5, 7, 8, 9].
При лечении люминального В рака молочной железы довольно широко используется неоадъювантная химиотерапия, однако, несмотря на применение современных схем полихимиотерапии нередко эффективность лечения низкая, либо вообще отсутствует [10, 11, 12, 13]. В 90% случаев данное состояние связывают с возникновением феномена множественной лекарственной устойчивости [9]. Указанный феномен характеризуется возникновением широкой перекрестной резистентности к большому количеству противоопухолевых препаратов и возникает в результате работы трех ключевых молекулярных механизмов: активации белков семейства ABC-транспортеров, системы глутатион-трансферазы, активацией онкогенов и дезактивацией протоонкогенов, регулирующих апоптоз клеток [9, 14, 15, 16, 17, 18].
В настоящее время изучению проблем работы данных механизмов и выявлению морфологических и молекулярно-биологических маркеров для прогнозирования возникновения химиорезистентности уделяется все возрастающее внимание, но данные исследований, касающиеся феномена лекарственной устойчивости у больных раком молочной железы, весьма разрознены, противоречивы и посвящены преимущественно изучению процесса in vitro. В связи с этим особую значимость приобретают клинические исследования характеристик первичного опухолевого узла у больных раком молочной железы, сопряженных с чувствительностью и резистентностью к цитостатическим препаратам, которые позволят прогнозировать ответ на неоадъювантную химиотерапию и обеспечат индивидуализированный подход в терапии рака молочной железы.
Новый технический результат - разработка способа прогнозирования вероятности полной регрессии при проведении неоадъювантной химиотерапии у пациенток с люминальным В молекулярно-генетическим субтипом рака молочной железы обладающего высокой чувствительностью и специфичностью.
1
2
3
4
5
Для достижения нового технического результата в способе прогнозирования степени вероятности полной регрессии при проведении неоадъювантной химиотерапии у пациенток с люминальным В молекулярно-генетическим субтипом рака молочной железы осуществляют гистологическое исследование препаратов ткани первичного новообразования до проведения неоадъювантной химиотерапии, включающий изготовление гистологических препаратов, далее, на светооптическом уровне в препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, оценивают инфильтративный компонент, в котором определяют наличие трабекулярных, тубулярных, альвеолярных, солидных структур и дискретных групп опухолевых клеток, также оценивают стромальный компонент, в каждом случае в инфильтративном компоненте опухоли определяют наличие или отсутствие дискретных групп опухолевых клеток, в строме опухоли оценивают выраженность воспалительной инфильтрации, степень злокачественности по модифицированной схеме на основании оценки количества тубулярных структур, митозов и выраженности клеточного полиморфизма, также с помощью иммуногистохимического исследования оценивают экспрессию bcl-2, Р-гликопротеина в клетках воспалительного инфильтрата, наличие мембранной экспрессии MRP2 в опухолевых клетках. Определяют степень злокачественности X и при первой степени оценивают в 1 балл, при второй в 2 балла, третьей в 3 балла; определяют присутствие в инфильтративном компоненте дискретных групп клеток Х и оценивают отсутствие в 1 балл, присутствие в 2 балла; определяют присутствие в воспалительном инфильтрате bcl-2-позитивных клеток Х в 2 балла, отсутствие в 1 балл; оценивают позитивную экспрессию Р-гликопротеина в клетках воспалительного инфильтрата Х в 2 балла, отсутствие в 1 балл; оценивают наличие мембранной экспрессии MRP2 в опухолевых клетках Х в 2 балла, отсутствие в 1 балл.
Далее рассчитывают значение уравнения регрессии Y по формуле:
1
2
3
4
5
Y=5-3,0X-18,5Х-25,5Х+75,6X-19,8Х,
5 - коэффициент регрессии свободного члена;
1
X - степень злокачественности (1 - первая, 2 - вторая, 3 - третья),
-3,0 - коэффициент регрессии этого признака;
2
Х - присутствие в инфильтративном компоненте опухоли дискретных групп клеток (1 - нет, 2 - есть),
-18,5 - коэффициент регрессии этого признака;
3
Х - присутствие в воспалительном инфильтрате bcl-2-позитивных клеток (1 - нет, 2 -есть),
-25,5 - коэффициент регрессии этого признака;
4
Х - позитивная экспрессия Р-гликопротеина в клетках воспалительного инфильтрата (1 - нет, 2 - есть),
75,6 - коэффициент регрессии этого признака;
5
Х - наличие мембранной экспрессии в опухолевых клетках MRP2 (1 - нет, 2 - есть),
-19,8 - коэффициент регрессии этого признака;
далее, значение вероятности достижения полной регрессии опухоли Р определяют по формуле:
Y
Y
Р=e/(1+e), где
е - математическая константа, равная 2,72;
и при Р≥0,5 прогнозируют высокую, а при Р<0,5 - низкую вероятности полной регрессии при проведении неоадъювантной химиотерапии.
Способ осуществляют следующим образом
Производят забор материала первичного новообразования до проведения неоадъювантной химиотерапии и фиксируют в 10-12% растворе нейтрального формалина. Проводку материала и изготовление гистологических препаратов осуществляют по стандартной методике. Препараты окрашивают гематоксилином и эозином. Гистологический тип рака устанавливают согласно рекомендациям ВОЗ (Женева, 2012).
На светооптическом уровне в препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, оценивают инфильтративный компонент, в котором определяют наличие трабекулярных, тубулярных, альвеолярных, солидных структур и дискретных групп опухолевых клеток, также оценивают стромальный компонент. В каждом случае в инфильтративном компоненте опухоли определяют наличие или отсутствие дискретных групп опухолевых клеток. В строме опухоли оценивают выраженность воспалительной инфильтрации. Оценивают также степень злокачественности по модифицированной схеме P. Scarff, Н. Bloom и W. Richardson (1957) в модификации C.W. Elston (1991) на основании оценки количества тубулярных структур, митозов и выраженности клеточного полиморфизма.
В дальнейшем для определения молекулярно-генетического субтипа рака молочной железы проводят иммуногистохимическое исследование по стандартной методике. Применяют антитела фирмы Dako к рецепторам эстрогена (клон 1D5, RTU, мышиные), к рецепторам прогестерона (клон PgR636, RTU, мышиные), к онкопротеину с-еrbВ-2 (HER2/neu статус) (рабочее разведение 1:500, кроличьи), к Ki-67 (клон MIB-1, RTU, мышиные). Оценку экспрессии рецепторов к половым гормонам проводят количественным методом гистосчета (Histo-Score). При этом подсчитывают процент позитивных клеток и показатель экспрессии в баллах (Петров С.В., 2012). HER2/neu-негативными считают случаи с отсутствием окрашивания или слабым прерывистым мембранным окрашиванием. К HER2/neu-позитивным относят случаи с интенсивным непрерывным мембранным окрашиванием более чем в 30% клеток. Случаи с умеренным непрерывным мембранным окрашиванием более чем в 30% клеток или интенсивным непрерывным мембранным окрашиванием менее чем в 10% клеток, требующие выявления наличия амплификации гена HER2/neu методом FISH или CICH/SISH, не включают в исследование. На основании сочетания экспрессии рецепторов к эстрогенам, прогестерону, HER2/neu статуса и Ki-67 определяют 4 основных молекулярно-генетических типа: люминальный А (при позитивной экспрессии рецепторов к эстрогенам и/или к прогестерону, негативный HER2/neu статус, экспрессия Ki-67 <20%); люминальный В (при позитивной экспрессии рецепторов к эстрогенам и/или к прогестерону, негативный HER2/neu статус, экспрессия Ki-67≥20%); трижды негативный (при негативной экспрессии рецепторов к эстрогенам, к прогестерону, негативный HER2/neu статус); тип с гиперэкспрессией HER2/neu (негативная экспрессия рецепторов к эстрогенам, к прогестерону, позитивный HER2/neu статус).
Применяют антитела фирмы «Novocastra» к bcl-2 (клон bcl2/100/D5, рабочее разведение 1:80); фирмы «Аbсаm» к Р-гликопротеину (клон JSB-1, рабочее разведение 1:40), к MRP2 (клон М2 III-6, рабочее разведение 1:200.
Оценивают экспрессию bcl-2, Р-гликопротеина в клетках воспалительного инфильтрата, мембранную экспрессию MRP2 в опухолевых клетках.
1
2
3
4
5
Определяют степень злокачественности X и при первой степени оценивают в 1 балл, при второй в 2 балла, третьей в 3 балла; определяют присутствие в инфильтративном компоненте дискретных групп клеток Х и оценивают отсутствие в 1 балл, присутствие в 2 балла; определяют присутствие в воспалительном инфильтрате bcl-2-позитивных клеток Х в 2 балла, отсутствие в 1 балл; оценивают позитивную экспрессию Р-гликопротеина в клетках воспалительного инфильтрата Х в 2 балла, отсутствие в 1 балл; оценивают наличие мембранной экспрессии MRP2 в опухолевых клетках Х в 2 балла, отсутствие в 1 балл.
Далее рассчитывают значение уравнения регрессии Y по формуле:
1
2
3
6
5
Y=5-3,0X-18,5Х-25,5Х+75,6X-19,8Х,
5 - коэффициент регрессии свободного члена;
1
X - степень злокачественности (1 - первая, 2 - вторая, 3 - третья),
-3,0 - коэффициент регрессии этого признака;
2
Х - присутствие в инфильтративном компоненте опухоли дискретных групп клеток (1 -нет, 2 - есть),
-18,5 - коэффициент регрессии этого признака;
3
Х - присутствие в воспалительном инфильтрате bcl-2-позитивных клеток (1 - нет, 2 - есть),
-25,5 - коэффициент регрессии этого признака;
4
X - позитивная экспрессия Р-гликопротеина в клетках воспалительного инфильтрата (1 - нет, 2 - есть),
75,6 - коэффициент регрессии этого признака;
5
Х - наличие мембранной экспрессии в опухолевых клетках MRP2 (1 - нет, 2 - есть), -19,8 - коэффициент регрессии этого признака;
далее, значение вероятности достижения полной регрессии опухоли Р определяют по формуле:
Y
Y
Р=e/(1+e), где
е - математическая константа, равная 2,72;
и при Р≥0,5 прогнозируют высокую, а при Р<0,5 - низкую вероятности полной регрессии при проведении неоадъювантной химиотерапии.
Способ основан на результатах клинических исследований.
Изучался биопсийный материал от 26 пациенток с инвазивным раком молочной железы. Материал первичного новообразования до проведения неоадъювантной химиотерапии фиксировали в 10-12% растворе нейтрального формалина. Проводку материала и изготовление гистологических препаратов осуществляли по стандартной методике. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Гистологический тип рака устанавливали согласно рекомендациям ВОЗ (Женева, 2012). Во всех случаях (26 пациенток) гистологический тип новообразований соответствовал инвазивной карциноме неспецифического типа.
На светооптическом уровне в препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, оценивали инфильтративный компонент, в котором определяли наличие трабекулярных, тубулярных, альвеолярных, солидных структур и дискретных групп опухолевых клеток, также оценивали стромальный компонент. В каждом случае в инфильтративном компоненте опухоли определяли наличие или отсутствие дискретных групп опухолевых клеток. В строме опухоли оценивали выраженность воспалительной инфильтрации. Оценивали также степень злокачественности по модифицированной схеме P. Scarff, Н. Bloom и W. Richardson (1957) в модификации C.W. Elston (1991) на основании оценки количества тубулярных структур, митозов и выраженности клеточного полиморфизма.
В дальнейшем для определения молекулярно-генетического субтипа рака молочной железы проводили иммуногистохимическое исследование по стандартной методике. Применяли антитела фирмы Dako к рецепторам эстрогена (клон 1D5, RTU, мышиные), к рецепторам прогестерона (клон PgR636, RTU, мышиные), к онкопротеину с-еrbВ-2 (HER2/neu статус) (рабочее разведение 1:500, кроличьи), к Ki-67 (клон MIB-1, RTU, мышиные). Оценку экспрессии рецепторов к половым гормонам проводили количественным методом гистосчета (Histo-Score). При этом подсчитывали процент позитивных клеток и показатель экспрессии в баллах (Петров С.В., 2012). HER2/neu-негативными считались случаи с отсутствием окрашивания или слабым прерывистым мембранным окрашиванием. К НЕР2/neu-позитивным относили случаи с интенсивным непрерывным мембранным окрашиванием более чем в 30% клеток. Случаи с умеренным непрерывным мембранным окрашиванием более чем в 30% клеток или интенсивным непрерывным мембранным окрашиванием менее чем в 10% клеток, требующие выявления наличия амплификации гена HER2/neu методом FISH или CICH/SISH, не включали в исследование. На основании сочетания экспрессии рецепторов к эстрогенам, прогестерону, HER2/neu статуса и Ki-67 определяли 4 основных молекулярно-генетических типа: люминальный А (позитивная экспрессия рецепторов к эстрогенам и/или к прогестерону, негативный HER2/neu статус, экспрессия Ki-67<20%); люминальный В (позитивная экспрессия рецепторов к эстрогенам и/или к прогестерону, негативный HER2/neu статус, экспрессия Ki-67≥20%); трижды негативный (негативная экспрессия рецепторов к эстрогенам, к прогестерону, негативный HER2/neu статус); тип с гиперэкспрессией HER2/neu (негативная экспрессия рецепторов к эстрогенам, к прогестерону, позитивный HER2/neu статус). Во всех случаях (26 пациенток) молекулярно-генетический субтип рака молочной железы соответствовал трижды негативному.
Применяли антитела фирмы «Novocastra» к bcl-2 (клон bcl2/100/D5, рабочее разведение 1:80); фирмы «Аbсаm» к Р-гликопротеину (клон JSB-1, рабочее разведение 1:40), к MRP2 (клон М2 III-6, рабочее разведение 1:200), к BCRP (клон ВХР-21, рабочее разведение 1:20).
Оценивали экспрессию bcl-2, Р-гликопротеина в клетках воспалительного инфильтрата, мембранную экспрессию MRP2 в опухолевых клетках.
1
2
3
4
5
Определяли степень злокачественности Х и при первой степени оценивали в 1 балл, при второй в 2 балла, третьей в 3 балла; определяли присутствие в инфильтративном компоненте дискретных групп клеток Х и оценивали отсутствие в 1 балл, присутствие в 2 балла; определяли присутствие в воспалительном инфильтрате bcl-2-позитивных клеток Х в 2 балла, отсутствие в 1 балл; оценивали позитивную экспрессию Р-гликопротеина в клетках воспалительного инфильтрата Х в 2 балла, отсутствие в 1 балл; оценивали наличие мембранной экспрессии MRP2 в опухолевых клетках Х в 2 балла, отсутствие в 1 балл.
Далее рассчитывали значение уравнения регрессии Y по формуле:
1
2
3
4
5
Y=5-3,0X-18,5Х-25,5Х+75,6X-19,8Х,
5 - коэффициент регрессии свободного члена;
1
X - степень злокачественности (1 - первая, 2 - вторая, 3 - третья),
-3,0 - коэффициент регрессии этого признака;
2
Х - присутствие в инфильтративном компоненте опухоли дискретных групп клеток (1 - нет, 2 - есть),
-18,5 - коэффициент регрессии этого признака;
3
Х - присутствие в воспалительном инфильтрате bcl-2-позитивных клеток (1 - нет, 2 - есть),
-25,5 - коэффициент регрессии этого признака;
4
X - позитивная экспрессия Р-гликопротеина в клетках воспалительного инфильтрата (1 - нет, 2 - есть),
75,6 - коэффициент регрессии этого признака;
5
Х - наличие мембранной экспрессии в опухолевых клетках MRP2 (1 - нет, 2 - есть),
-19,8 - коэффициент регрессии этого признака.
Далее, значение вероятности достижения полной регрессии опухоли Р определяют по формуле:
Y
Y
Р=e/(1+е),где
е - математическая константа, равная 2,72.
и при Р≥0,5 прогнозировали высокую, а при Р<0,5 - низкую вероятности полной регрессии при проведении неоадъювантной химиотерапии.
2
Полученная модель имеет высокую степень достоверности: χ=12,05; р=0,03. Чувствительность модели составила 100%, специфичность - 100%.
Сущность предлагаемого способа иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Пациентка И., 51 год с инвазивной карциномой неспецифического типа, II В клинической стадии (T2N1M0) люминальным В молекулярно-генетическом подтипом. При гистологическом исследовании биопсионного материала в инфильтративном компоненте ИКНТ отсутствовали дискретные опухолевые клетки (1 балл), степень злокачественности была второй (2 балла). При иммуногистохимическом-исследовании в опухолевых клетках отсутствовала мембранная экспрессия MRP2 (1 балл), отсутствовала позитивная экспрессия bcl-2 в клетках воспалительного инфильтрата (1 балл), отсутствовала экспрессия Р-гликопротеина в клетках воспалительного инфильтрата (1 балл). Далее было определено значение Y по уравнению
Y=5-3,0*2-18,5*1-25,5*1+75,6*1-19,8*1=10,8;
10,8
10,8
Р=[2,72/(1+2,72)]=0,99.
Полученное значение Р=0,99 позволило отнести пациентку к группе высокого риска развития местного рецидива. После проведения 4 курсов НАХТ по схеме FAC у пациентки наблюдалась полная морфологическая регрессия опухоли. При гистологическом исследовании операционного материала подтверждена IV степень лечебного патомофроза.
Пример 2. Пациентка Т., 44 года с инвазивной карциномой неспецифического типа, II В клинической стадии (T2N1M0) люминальным В молекулярно-генетическом подтипом. При гистологическом исследовании биопсионного материала в инфильтративном компоненте ИКНТ присутствовали дискретные опухолевые клетки (2 балла), степень злокачественности была третьей (3 балла). При ИГХ-исследовании в опухолевых клетках присутствовала позитивная мембранная экспрессия MRP2 (2 балла), отсутствовала позитивная экспрессия bcl-2 в клетках воспалительного инфильтрата (1 балл), отсутствовала экспрессия Р-гликопротеина в клетках воспалительного инфильтрата (1 балл). Далее было определено значение Y по уравнению:
Y=5-3,0*3-18,5*2-25,5*1+75,6*1-19,8*2=-30,5;
-30,5
-30,5
Р=[2,72/(1+2,72)]=0.
Рассчитанное по формуле значение Р составило 0, что позволило отнести пациентку к группе с низкой вероятностью развития полной регрессии новообразования. После проведения 4 курсов НАХТ по схеме FAC у пациентки наблюдалась частичная регрессия опухоли. При гистологическом исследовании операционного материала в опухолевой ткани отмечена I степень лечебного патоморфоза.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет с большей точностью и информативностью прогнозировать вероятность развития полной регрессии при проведении неоадъювантной химиотерапии у пациенток с люминальным В молекулярно-генетическим субтипом рака молочной железы.
Источники информации
1. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2012 г. / под ред. М.И. Давыдов, Е.М. Аксель. - М.: Издательская группа РОНЦ, 2014. - С. 46.
2. Lakhani S.R. IARC world health organization classification of tumours. WHO classification of tumours of the breast / S.R. Lakhani [et al.] - Lyon: WHO Press, 2012. - 240 p.
3. Youlden D.R. The descriptive epidemiology of female breast cancer: an international comparison of screening, incidence, survival and mortality / D.R. Youlden [et al.] // Cancer Epidemiology. - 2012. - Vol. 36, N 3. - P. 237-248.
4. Минимальные клинические рекомендации Европейского Общества Медицинской Онкологии (ESMO): пер. с англ.- М.: Издательская группа РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, 2010. - С. 8-32.
5. Gampenrieder S.P. Neoadjuvant Chemotherapy and Targeted Therapy in Breast Cancer: Past, Present, and Future / S.P. Gampenrieder, G. Rinnerthaler, R. Greil // J. Oncol. - 2013. - 732047. Epub 2013 Aug 20.
6. Redden M.H. Neoadjuvant chemotherapy in the treatment of breast cancer / M.H. Redden, G.M. Fuhrman // Surg. Clin. North Am. - 2013. - Vol.93, N 2. - P. 493-499.
7. Cazzaniga M. Breast cancer chemoprevention: old and new approaches / M. Cazzaniga, B. Bonanni // J. Biomed. Biotechnol. - 2012. - doi: 10.1155/2012/985620.
8. von Minckwitz G. Update on neoadjuvant/preoperative therapy of breast cancer: experiences from the German Breast Group / G. von Minckwitz, M. Untch, S. Loibl // Curr. Opin. Obstet. Gynecol. - 2013. - Vol.25, N 1. - P. 66-73.
9. Wind N.S. Multidrug resistance in breast cancer: from in vitro models to clinical studies / N.S. Wind, I. Holen. // Int. J. Breast Cancer. - 2011. - doi: 10.4061/2011/967419
10. Perou C.M. Molecular portraits of human breast tumours / CM. Perou [et al.] // Nature. - 2000. - Vol. 406. - P. 747-752.
11. Sorlie T. Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications / T. Sorlie [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2001. - Vol. 98, N 19. - P. 10869-10874.
12. Anders C.K. Biology, metastatic patterns, and treatment of patients with triple-negative breast cancer / C.K. Anders, L.A. Carey // Clin. Breast Cancer. - 2009. - Suppl. 2. - P. 73-81.
13. Cheang M.C Ki67 index, HER2 status, and prognosis of patients with luminal В breast cancer / M.C Cheang [et al.] // J. Natl. Cancer. Inst. - 2009. - Vol. 101, N 10. - P. 736-750.
14. Stavrovskaya A.A. Cellular mechanisms of multidrug resistance of tumor cells / A.A. Stavrovskaya // Biochemistry. - 2000. - Vol.65, N 1. - P. 95-106.
15. Fukuda Y. ABC transporters and their role in nucleoside and nucleotide drug resistance / Y. Fukuda, J.D. Schuetz // Biochem. Pharmacol. - 2012. - Vol. 83, N 8. - P. 1073-1083.
16. Kathawala R.J. The modulation of ABC transporter-mediated multidrug resistance in cancer: a review of the past decade / R.J. Kathawala [et al.] // Drug Resist. Urdat. - 2015. - Vol. 18. - P. 1-17.
17. Videira M. Deconstructing breast cancer cell biology and the mechanisms of multidrug resistance / M. Videira, R.L. Reis, M.A. Brito // Biochim. Biophys. Asta. - 2014. - Vol. 1846, N 2. - P. 312-325.
18. Wikens S. Structure and mechanism of ABC transporters / S. Wikens // F1000Prime Rep. - 2015. - Vol. 3. - P. 14.