ТРИАЗОЛЫ ДЛЯ РЕГУЛЯЦИИ ГОМЕОСТАЗА ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО КАЛЬЦИЯ
TRIAZOLES FOR REGULATION OF INTRACELLULAR CALCIUM HOMEOSTASIS

Область техники
Настоящее изобретение относится к новым замещенным 1,2,3-триазолам, подходящим для улучшения или восстановления функции гомеостаза внутриклеточного кальция в клетках человека и животных. Настоящее изобретение также относится к способам получения указанных соединений, к фармацевтическим композициям, содержащим указанные соединения, и к их применению для предотвращения или лечения скелетно-мышечных, сердечных и нейродегенеративных расстройств.
Уровень техники
Мышечные дистрофии представляют собой разнородные наследственные заболевания, характеризующиеся прогрессирующим ослаблением и атрофией скелетных мышц. Сцепленная с Х-хромосомой мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) является одной из наиболее распространенных форм, поражающих 1 из каждых 3500 мужчин. МДД, как и ее более легкая аллельная форма (мышечная дистрофия Беккера, МДБ), вызывается мутациями в гене, кодирующем дистрофии, белок цитоскелета с молекулярной массой 427 кДа. Генетических исследований недостаточно для искоренения заболевания из-за высокой частоты спорадических случаев, поэтому поиск новых эффективных методов лечения является, соответственно, первоочередной задачей.
Конечностно-поясные мышечные дистрофии (КПМД) представляют собой большую группу наследственных мышечных дистрофий, характеризующихся прогрессирующей проксимальной слабостью, преимущественно в тазовом и плечевом поясе. Среди рецессивных форм КПМД кальпаинопатия, или КПМД2А, является наиболее распространенной и вызывается мутациями в гене, кодирующем кальпаин 3 (CAPN3), нелизосомальную цистеиновую протеазу, необходимую для правильного функционирования и регенерации мышц.
Миотоническая дистрофия 1-го типа (МД1) представляет собой наиболее распространенную форму мышечной дистрофии у взрослых и характеризуется мышечной слабостью, миотонией и поражением нескольких органов. Это аутосомно-доминантное наследственное заболевание, вызванное нестабильной экспансией триплетного повтора CTG, расположенного в 3'-некодирующей области гена DMPK, расположенного на длинном плече 19 хромосомы и преимущественно экспрессируемого в скелетных мышцах.
2+
2+
Изменения гомеостаза внутриклеточного кальция подразделяются на вышеупомянутые изменения, а также другие мышечные дистрофии (такие как, среди прочего, МД2, рецессивная и доминантная КПМД, врожденные или метаболические миопатии). В связи с тем, что изменение концентрации внутриклеточного Са в мышечных волокнах, по всей видимости, представляет собой распространенный основной механизм патогенного действия, разработка терапевтических вмешательств, предотвращающих изменения внутриклеточного Са, является очень важной терапевтической задачей (Vallejo-Illarramendi et al. Expert Rev. Molec. Med. 2014, 16, e16, doi: 10.1017/erm.2014.17 "Dysregulation of calcium homeostasis in muscular dystrophies").
2+
2+
2+
2+
2+
Высокие исходные уровни внутриклеточного Са приводят к активации кальпаина, разложению белков, открытию митохондриальных пор переходной проницаемости (mPTP) и, в конечном итоге, отмиранию мышечного волокна вследствие некроза. Повышение уровней внутриклеточного Са представляет собой сложный процесс, включающий в себя потоки Са через сарколемму, уменьшение уровня кальция в саркоплазматическом ретикулуме (CP) и атипичные уровни Са в СР. У mdx-мышей, животной модели мышечной дистрофии Дюшенна, атипичное S-нитрозилирование цистеиновых остатков рианодиновых рецепторов RyR1 и RyR2 приводит к диссоциации кальстабина из указанного белкового комплекса, который образует нестабильные каналы, через которые происходит потеря кальция в состоянии покоя. Такое нитрозилирование, по всей видимости, вызвано нарушением в регуляции оксида азота, которое вызывает нитрозативный и окислительный стресс в мышцах у mdx-мышей с дистрофией (Dudley et al., Am. J. Pathol. 2006, 168, 1276-1284; Bellinger et al., Nat Med. 2009, 15, 325-330; Fauconier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010, 107, 1559-1564). Кроме того, индуцированная экспрессия микродистрофина в дефицитных по дистрофину микротрубочках приводит к восстановлению повышенного уровня зависимого от инозитол-1,4,5-трисфосфатного рецептора (IP3R) высвобождения кальция до контрольных уровней, что свидетельствует об участии IP3R в изменении гомеостаза Са при МДД.
2+
2+
2+
С помощью иммунопреципитационных исследований было доказано, что кальпаин 3 (CAPN3) взаимодействует с кальсеквестрином (CSQ) - белком, участвующим в гомеостазе кальция. У CAPN3-нокаутных мышей (C3KO, Capn3-/-) снижение уровней RyR1 сопровождается снижением высвобождения Са из СР. В свою очередь, было обнаружено, что после высвобождения кальция из CP у Capn3-/- мышей обратный захват Са в CP происходит медленнее, хотя для изучения принципа этого явления требуются более глубокие исследования. Тем не менее, было отмечено, что потеря протеолитической активности CAPN3 у Capn3 cs/cs мышей не влияет на гомеостаз кальция, что свидетельствует о том, что структурная функция CAPN3 является ключевой для поддержания гомеостаза Са.
Миотоническая дистрофия связана с дисрегуляцией альтернативного сцепления гена CACNA1S, кодирующего альфа-1S-субъединицу дигидропиридинового рецептора DHPR, датчика разности потенциалов, который важен для взаимосвязи типа возбуждение-сокращение (В-С). При МД1 и МД2 имеет место больший пропуск экзона 29 CACNA1S, что увеличивает проводимость канала и чувствительность к разности потенциалов.
2+
2+
2+
i
Некоторые расстройства и заболевания связаны с врожденными или приобретенными модификациями белка RyR1 (Kushmir et al. Recent Pat Biotechnol. 2012, 6, 157-166 "Ryanodine receptor patents"). Указанные расстройства и заболевания включают состояния, связанные со скелетными мышцами, сердцем и нервной системой. Более конкретно они включают, но не ограничиваются ими, врожденные миопатии, мышечные дистрофии, саркопению, усталость скелетных мышц, приобретенную мышечную слабость или атрофию, злокачественную гипертермию, сердечные аритмии, вызванные физической нагрузкой, хроническую сердечную недостаточность, гипертрофическую кардиомиопатию, болезнь Альцгеймера и возрастную потерю памяти. Для всех этих состояний было высказано предположение, что повышение концентраций внутриклеточного Са ([Ca]) в состоянии покоя вносит непосредственный вклад в токсичность клетки (клетки мышечного волокна, кардиомиоцит, нейрон или глиальной клетки), ее разрушение и одновременную активацию Са-зависимых протеаз.
2+
Существует два основных типа связанных с кальцием рианодиновых рецепторов в мышечных волокнах: RyRl, расположенный в скелетной мышце, и RyR2, расположенный в сердечной мышце. Каждый кальциевый канал образован белковым тетрамером RyR, каждый из мономеров RyR способен взаимодействовать с белком кальстабином. RyR1 связывается с FKBP12 (кальстабином 1), a RyR2 связывается с FKBP12.6 (кальстабином 2). Как в сердечной, так и в скелетных мышцах было обнаружено, что атипичная диссоциация кальстабинов и RyR-каналов путем прогрессивного нитрозилирования RyR-каналов вызывает усиление высвобождения Са из саркоплазматического ретикулума во внутриклеточную цитоплазму, уменьшая мышечную деятельность во время сокращения и активируя мышечную дисфункцию в долгосрочной перспективе (Bellinger et at., Nat. Med. 2009, 15, 325-330; Fauconier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010, 107, 1559-1564).
-6
2+
В данной области техники известны некоторые низкомолекулярные соединения, проявляющие терапевтическую активность в поврежденных мышечных тканях. Например, было продемонстрировано, что 4-[3-(4-бензилпиперидинил)-пропаноил]-2,3,4,5-тетрагидро-1,4-бензотиазепин (JTV-519) является подходящим, например, для предотвращения некроза сердечных мышц и инфаркта миокарда. При концентрациях 10 М указанное соединение JTV-519 ингибирует in vitro индуцированный адреналином и кофеином некроз миокарда в левом желудочке сердца крыс, не влияя на частоту или давление в левом желудочке сердца (Kaneko, N. et al. WO 92/12148 A1 "Preparation of 4-[(4-benzylpiperidinyl)-alkanoyl]-2,3,4,5-tetrahydro-1,4-benzothiazepine derivatives for inhibiting the kinetic cell death of cardiac muscles without inhibiting cardiac functions"). Соединение JTV-519 воздействует на ассоциированный с кальстабином 2 рианодиновый рецептор RyR2 (FKBP12.6), повышая сродство FKBP12.6 к фосфорилированному PKA-киназой рецептору RyR2, а также к мутантному рецептору RyR2, который в ином случае обладает пониженным сродством к FKBP12.6 или не связывается с ним. Такое действие JTV-519 устраняет утечку ионов Са в RyR2 (Marks, A. R. et al. US 2004/229781 A1 "Compounds and methods for treating and preventing exercise-induced cardiac arrhythmias").
Также известно, что фармацевтически активные композиции, содержащие соединение S-107 или другие родственные по структуре тетрагидробензотиазепины, эффективны для лечения или предотвращения расстройств или заболеваний, связанных с рецепторами RyR2, которые регулируют функционирование кальциевых каналов в кардиомиоцитах (Marks, A. R. et al. US 2006/194767 A1 "Benzodiazepines as novel agents for preventing and treating disorders involving modulation of the RyR receptors and their preparation and pharmaceutical compositions"; также см.: Mei, Y. et al. PLoS One. 2013, 8: e54208 "Stabilization of the skeletal muscle ryanodine receptor ion channel-FKBP12 complex by the 1,4-benzothiazepine derivative S107"). Также известно, что соединения того же семейства активны в качестве стабилизаторов взаимодействия RyR1-кальстабин 1, снижая мышечную усталость (Marks, A. R. et al. WO 2008/060332 A2 "Methods using tetrahydrobenzothiazepine compounds for treating or reducing muscle fatigue"), и могут быть применены для лечения саркопении (Marks, A. R. et al. WO 2012/019071 A1 "Methods and compositions comprising benzazepine derivatives for preventing and treating sarcopenia").
Было описано, что некоторые производные карведилола способствуют нормализации гомеостаза внутриклеточного кальция посредством воздействия на RyR2-рецепторы, это подтверждает их благоприятное воздействие при терапии сердца (Chen, S. et al. US 2007/025489 A1 "Preparation of carbazoles as ryanodine receptor type 2 (RyR2) antagonists for treatment of cardiac conditions").
Наконец, известно, что изоморф рианодинового рецептора RyR3 регулирует гомеостаз внутриклеточного кальция в тканях головного мозга или других нервных тканях, а его модуляция с применением бензотиазепинов была заявлена для лечения некоторых нервных расстройств (Marks, A. R. et al. WO 2012/037105 A1 "Methods and compositions comprising benzazepine derivatives for treating or preventing stress-induced neuronal disorders and diseases"). Кроме того, и RyRl, и RyR2 экспрессируются в головном мозге, и есть данные, что регуляция кальция и нитроокислительный стресс участвуют в различных заболевания мозга и гибели нейронов. (Kakizawa et al., EMBO J. 2012, 31, 417-428; Liu X et al., Cell 2012, 150, 1055-1067).
Все указанные ранее документы ясно показывают, что разработка соединений, которые позволяют регулировать или модулировать RyR-рецепторы путем регуляции уровней внутриклеточного кальция, обеспечила бы подходящую альтернативу для лечения мышечных расстройств, а также сердечных и нейродегенеративных заболеваний.
Краткое описание настоящего изобретения
Авторы настоящего изобретения разработали новые соединения-производные триазола, в частности 4-[(фенилтио)алкил]-1H-1,2,3-триазолы, подходящие для модулирования RyR-рецепторов, регулирующих функцию кальция в клетках человека или животных. Указанные соединения в настоящем изобретении упоминаются как "AHK".
Как наглядно показано в экспериментальной части, соединения согласно настоящему изобретению обладают способностью модулировать гомеостаз внутриклеточного кальция в дистрофических мышечных волокнах, снижая наблюдаемые повышенные уровни внутриклеточного кальция. Кроме того, указанные соединения оказывают модулирующее действие на RyR, и была продемонстрирована их способность восстанавливать взаимодействие RyR1-кальстабина с мышечными трубочками здорового человека, подвергшегося нитроокислительному стрессу.
В свою очередь, анализы in vivo наглядно показали, что указанные соединения, кроме того, позволяют увеличить силу хвата у мышей с дистрофией, а также нормализуют гиперэкспрессированные дистрофические гены и уменьшают гистопатологические маркеры дистрофии.
Таким образом, первый аспект настоящего изобретения относится к 1,4-дизамещенному 1,2,3-триазольному соединению формулы (I):
где:
1
1
4
1-4
6-10
2
R представляет собой С-С алкиленовый бирадикал, необязательно замещенный одним или более заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из C алкила, С арила, F, Cl, CN и NO;
2
1
6
2
1
6
1-4
6-10
6-10
1-4
2
1-4
2
1-4
1-4
1-4
2
R представляет собой C-C алкиленовый бирадикал, где 1, 2 или 3 -CH- группы могут быть необязательно заменены группами, выбранными из -О- и -S-; и при этом указанный C-С алкиленовый бирадикал может быть необязательно замещен одной или более группами, независимо выбранными из С алкила, аллила, пропаргила, гидроксиметила, 1-гидроксиэтила, 2-гидроксиэтила, 3-аминопропила, 4-амино бутила, 3-гуанидил пропила, 3-индолилметила, С арила, бензила, 4-гидроксибензила, С гетероарила, F, Cl, ОН, O(C алкила), CN, NO, CO(Cалкила), CO(С алкила), -CONH(C алкила), -CON(C алкил);
3
1-4
6-10
R представляет собой группу, независимо выбранную из Н, С алкила, С арила, F, Cl, Br, I;
m выбран из 0, 1, 2, 3, 4;
n выбран из 0, 1, 2;
1-4
6-10
3
1-4
6-10
1-6
3
1-4
X независимо выбран из группы, состоящей из ОН, O(C алкила), O(С арила), OCF, S(C алкила), S(C арила), С алкила, CF, NHC(O)(C алкила) и галогена; или две X группы могут представлять собой бирадикал метилендиокси, этилендиокси или пропилендиокси; и
2
2
1-4
2
2
3
2
1-4
1-4
2
1-4
3
1-4
Y выбран из группы, состоящей из -ОН, -СОН, -СО(С алкила), -СО(аллила), -CO(бензила), -SOH, -NH, -NH(C алкила), -N(C алкила), N(C алкила)и -N(гетероциклила или гетероарила), где указанный гетероциклил или гетероарил необязательно замещен С алкильной группой и где указанный атом азота (N) является частью гетероциклила или гетероарила;
или относится к его фармацевтически приемлемому стереоизомеру, соли, сольвату или комплексу, или его изотопно-меченному производному или его пролекарству.
Другой аспект настоящего изобретения включает способ получения соединения формулы (I), который включает:
а) взаимодействие алкина формулы (II) с азидом формулы (III),
необязательно в присутствии медного катализатора и необязательно в присутствии основания с получением соединения формулы (I) определенного выше,
где:
1
2
3
группы R, R, R, m, n и X в соединениях формул (II)-(III) имеют значения, определенные выше, и
Y представляет собой группу, определенную выше, необязательно защищенную карбоксизащитной группой, гидроксизащитной группой или аминозащитной группой;
1
2
3
b) в случае, когда n равен 0 в соединении формулы (I), полученном на стадии а), необязательную обработку указанного соединения формулы (I) окисляющим агентом с получением соединения формулы (I), где n равен 1 или 2, R, R, R, m и X имеют значения, определенные выше, a Y представляет собой определенную выше группу, необязательно защищенную карбоксизащитной группой, гидроксизащитной группой или аминозащитной группой; и
1
2
3
c) в случае, когда соединение формулы (I), полученное на стадии а) или b) содержит группу Y, защищенную защитной группой, удаление указанной защитной группы с получением соединения формулы (I), где R, R, R, m, n, X и Y имеют значения, определенные выше.
Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединение формулы (I), определенное выше, совместно с одним или более фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами или носителями.
Другой аспект настоящего изобретения относится к применению соединения формулы (I), определенного выше, для получения лекарственного средства.
Последний аспект настоящего изобретения относится к применению соединения формулы (I), определенного выше, для получения лекарственного средства для лечения и/или предотвращения расстройств или заболеваний, связанных с дисрегуляцией концентрации внутриклеточного кальция или с дисфункцией RyR-рецептора, в частности, скелетно-мышечных расстройств или заболеваний скелетных мышц, сердечных расстройств или заболеваний и расстройств или заболеваний нервной системы.
Краткое описание чертежей
На фигуре 1 представлены кривые токсичности, показывающие токсичность соединений AHK1, AHK2 и S-107 в отношении мышечных трубочек человека после 24-часовой инкубации с применением набора CytoTox 96 для колориметрического анализа.
На фигуре 2 показано действие соединений AHK1 и AHK2 in vitro на уровни внутриклеточного кальция в мышечных волокнах мыши в состоянии покоя: А) Изображение волокна, выделенного из мышцы - короткого сгибателя пальцев, показывающее характерную зонарную структуру. В) Примеры изображений волокон [контрольных волокон (CTRL) и дистрофических волокон (MDX)], нагруженных fura-2AM, после проведения коррекции фона, необходимой для измерения уровней внутриклеточного кальция. С) Гистограмма, показывающая исходные уровни внутриклеточного кальция в разных группах волокон. Число анализируемых волокон (n) показано на указанной гистограмме (критерий Краскела-Уоллиса и U-критерий Манна-Уитни, *р<0,05).
На фигуре 3 показано действие соединений AHK1 и AHK2 in vitro на взаимодействие RyR1 с кальстабином 1 в культурах мышечных трубочек здорового человека, подвергаемых воздействию пероксинитрита.
На фигуре 4 показано действие на силу хвата у MDX-мышей с дистрофией, получавших соединения AHK1 и AHK2. *р<0,05; количество контрольных мышей: n=10 (CTRL); количество mdx-мышей, не получавших лечение: n=11 (MDX); количество mdx-мышей, получавших AHK1: n=10 (MDX+AHK1); и количество mdx-мышей, получавших AHK2: n=6 (MDX+AHK2).
На фигуре 5 показано действие соединений AHK1 и AHK2 in vivo на мышечную дегенерацию/регенерацию у mdx-мышей с дистрофией:
A) Примеры криостатных срезов диафрагм контрольных мышей и мышей с дистрофией, на которых наблюдается меченный при помощи флуоресцентного антитела коллаген IV и ядра, меченные 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI).
B) Число центральных ядер, полученных из срезов контрольных мышей (CTRL), мышей с дистрофией (MDX) и мышей с дистрофией, получавших лечение AHK1 (MDX+AHK1) и AHK2 (MDX+AHK2).*p<0,05; n=3 CTRL; n=7 MDX ND; n=7 MDX+AHK1 и n=4 MDX+AHK2).
На фигуре 6 показано действие обработки AHK1 на уровень экспрессии гена передней большеберцовой мышцы mdx-мышей.
На фигуре 7 показано действие соединения AHK2 in vivo на атипичное функционирование ЦНС у mdx-мышей с дистрофией:
A) 1-минутные траектории контрольных мышей (Ct1), mdx-мышей (mdx) и mdx-мышей, получавших лечение AHK2 (mdx AHK2), после короткой 15-секундной иммобилизации;
B) усиленный защитный ответ после острого стресса, выраженный как процент времени, в течение которого мышь остается неподвижной в течение 1 минуты (серые столбцы): периоды тонической неподвижности по меньшей мере в 1 секунду с 90% чувствительностью при определении неподвижности; (черные столбцы): процент времени неподвижности у неиммобилизированных животных.
*Р<0,05 (непарный t-критерий); #р<0,05 (парный t-критерий); ns - незначимо;
n≥5 мышей на группу, столбцы ошибка ± стандартная ошибка среднего (СОС).
На фигуре 8 показано действие соединения AHK2 in vivo на индуцированную изопротеренолом кардиомиопатию у mdx-мышей.
Верхние изображения: примеры изображений срезов сердца контрольных мышей BL10 (Ct1), mdx-мышей (mdx) и mdx-мышей, получавших лечение AHK2 (mdx AHK2). Калибровочная линейка, 1 мм. Поглощение красителя Evans Blue наблюдают при помощи флуоресцентной микроскопии.
Нижний столбец: процент пораженной заболеванием области в сердце контрольных мышей (Ct1), mdx-мышей (mdx) и mdx-мышей, получавших лечение AHK2 (mdx AHK2), анализировали n=2 мышей на группу; столбцы ошибка ± СОС.
Подробное описание изобретения
В настоящем изобретении предложены новые триазольные соединения, которые обладают способностью лечить или предотвращать расстройства или заболевания, связанные с нарушением регуляции внутриклеточного кальция или дисфункцией RyR-рецептора.
В этой связи, как было упомянуто выше, первый аспект настоящего изобретения относится к соединению формулы (I):
где:
1
1
4
1-4
6-10
2
R представляет собой С-С алкиленовый бирадикал, необязательно замещенный одним или более заместителем, независимо выбранным из группы, состоящей из C алкила, С арила, F, Cl, CN и NO;
2
1
6
2
1
6
1-4
6-10
6-10
1-4
2
1-4
2
1-4
1-4
1-4
2
R представляет собой C-C алкиленовый бирадикал, где 1, 2 или 3 -СН- группы могут быть необязательно заменены группой, выбранной из -О- и -S-; и при этом указанный C-С алкиленовый бирадикал может быть необязательно замещен одной или более группами, независимо выбранными из С алкила, аллила, пропаргила, гидроксиметила, 1-гидроксиэтила, 2-гидроксиэтила, 3-аминопропила, 4-амино бутила, 3-гуанидил пропила, 3-индолилметила, С арила, бензила, 4-гидроксибензила, С гетероарила, F, Cl, ОН, O(C алкила), CN, NO, CO(Cалкила), СО(С алкила), -CONH(C алкила), -CON(C алкила);
3
1-4
6-10
R представляет собой группу, независимо выбранную из Н, С алкила, Сарила, F, Cl, Br, I;
m выбран из 0, 1, 2, 3, 4;
n выбран из 0, 1, 2;
1-4
6-10
3
1-4
6-10
1-6
3
1-4
X независимо выбран из группы, состоящей из ОН, O(C алкила), O(С арила), OCF, S(C алкила), S(C арила), C алкила, CF, NHC(O)(C алкила) и галогена; или две X группы могут представлять собой бирадикал метилендиокси, этилендиокси или пропилендиокси; и
2
2
1-4
2
2
3
2
1-4
1-4
2
1-4
3
1-4
Y выбран из группы, состоящей из -ОН, -СОН, -СО(С алкила), -CO(аллила), -СО(бензила), -SOH, -NH, -NH(C алкила), -N(C алкила) и N(C алкила) и -N(гетероциклила или гетероарила), при этом указанный гетероциклил или гетероарил необязательно замещен С алкильной группой, и где указанный атом азота (N) является частью гетероциклила или гетероарила;
или относится к его фармацевтически приемлемому стереоизомеру, соли, сольвату или комплексу, или его изотопно-меченному производному или пролекарству.
В контексте настоящего изобретения следующие термины, встречающиеся в соединениях формулы (I), имеют приведенные ниже значения.
1
4
1
6
1
2
Термин «алкиленовый бирадикал» относится к бирадикалу, образованному линейной или разветвленной углеводородной цепью, состоящей из атомов углерода и водорода, не содержащей ненасыщенных связей и связанной на своих концах с остальной частью молекулы через одинарные связи, такие как, например, метилен, этилен, пропилен, бутилен и т.д. При указании С-С алкиленового бирадикала имеется в виду бирадикал, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, а при указании C-С алкиленового бирадикала имеется в виду бирадикал, содержащий от 1 до 6 атомов углерода. Указанный алкиленовый бирадикал может быть замещен, как это указано в определениях R и R заместителей в соединении формулы (I).
1
4
Термин «алкил» относится к радикалу, образованному линейной или разветвленной углеводородной цепью, состоящей из атомов углерода и водорода, которая не содержит ненасыщенных связей и связана с остальной частью указанной молекулы посредством одинарной связи, примерами являются метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, трет-бутил, н-пентил и т.д. При указании C-С алкила имеется в виду указанный радикал, содержащему от 1 до 4 атомов углерода.
6
10
Термин «С-С арил» относится к радикалу, образованному 6-10-членным ароматическим кольцом, состоящим из атомов углерода и водорода, предпочтительно к фенильному радикалу.
6
10
Термин «С-С гетероарил» относится к радикалу, образованному 6-10-членным ароматическим кольцом, состоящим из атомов углерода и водорода и одного или более гетероатомов, выбранных из О, N и S.
2
Термин «-N(гетероциклил)» относится к радикалу, образованному 5-7-членным циклом, состоящим из атомов углерода и водорода и одного или более гетероатомов, выбранных из О, N и S, по меньшей мере один из которых представляет собой N, а последний непосредственно связан с R радикалом.
2
Термин «-N(гетероарил)» относится к радикалу, образованному 6-10-членным ароматическим кольцом, состоящим из атомов углерода и водорода и одного или более гетероатомов, выбранных из О, N и S, один из которых представляет собой N, а другой непосредственно связан с радикалом R.
2
2
Термин «аллил» относится к радикалу формулы -CH-CH=CH.
Термин «галоген» относится к F, Cl, Br или I.
13
14
15
Выражение «изотопно-меченное производное» относится к соединению формулы (I), в котором по меньшей мере один из его атомов обогащен изотопом. Например, в объем настоящего изобретения входят соединения формулы (I), в которых водород заменен на дейтерий или тритий, углерод заменен на обогащенный С или С атом, или азот заменен на обогащенный N атом.
Термин «фармацевтически приемлемые соли или сольваты» относится к любой фармацевтически приемлемой соли, сложному эфиру, сольвату или любому другому соединению, которое при введении реципиенту обладает способностью обеспечивать (непосредственно или косвенно) соединение формулы (I), описанное в настоящем документе. Указанные соли можно получить при помощи способов, известных из уровня техники.
Например, фармацевтически приемлемые соли соединений, предложенных в настоящем документе, синтезируют из ранее описанного соединения, содержащего основные или кислотные звенья, при помощи традиционных химических способов. Такие соли в целом получают, например, путем взаимодействия свободных кислотных или основных форм этих соединений со стехиометрическим количеством подходящего основания или кислоты в воде, или органическом растворителе, или их смеси. Неводные среды, такие как простой эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил, в целом являются предпочтительными. Примеры солей присоединения кислоты включают соли присоединения минеральных кислот, такие как, например, гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, сульфат, нитрат, фосфат, и соли присоединения органических кислот, такие как, например, ацетат, малеат, фумарат, цитрат, оксалат, сукцинат, тартрат, малат, манделат, метансульфонат и  Примеры солей присоединения основания включают неорганические соли, такие как, например, соли натрия, калия, кальция, аммония, магния, алюминия и лития, и соли присоединения органического основания, такие как, например, соли этилендиамина, этаноламина, N,N-диалкиленэтаноламина, глюкамина и соли основных аминокислот.
Сольваты относятся к солям соединения формулы (I), в которых молекулы фармацевтически подходящего растворителя включены в кристаллическую решетку. Способы сольватации в целом известны из уровня техники. Примерами фармацевтически подходящих растворителей являются этанол, вода и им подобные. В конкретном варианте реализации указанный сольват представляет собой гидрат.
Соединения формулы (I) или их соли или сольваты предпочтительно находятся в фармацевтически приемлемой форме или по существу в чистой форме. Под фармацевтически приемлемой формой понимают, среди прочего, фармацевтически приемлемый уровень чистоты, исключая обычные фармацевтические добавки, такие как разбавители и вспомогательные вещества, и исключая любой материал, считающийся токсичным при нормальных уровнях дозировки. Уровни чистоты для указанного лекарственного средства предпочтительно выше 50%, более предпочтительно выше 70% и еще более предпочтительно выше 90%. В предпочтительном варианте реализации он выше 95% для соединения формулы (I) или его солей или сольватов.
Соединения согласно настоящему изобретению, представленные вышеописанной формулой (I), могут включать любой стереоизомер в зависимости от присутствия хиральных центров, включая энантиомеры и диастереоизомеры, энантиомеры и диастереоизомеры. Отдельные изомеры, энантиомеры или диастереомеры и их смеси входят в объем настоящего изобретения.
Термин «пролекарство» используется в самом широком смысле и включает производные, которые in vivo превращаются в соединения согласно настоящему изобретению. Такие производные включают, в зависимости от функциональных групп, присутствующих в указанной молекуле, и без ограничений, сложные эфиры, сложные эфиры аминокислот, сложные эфиры фосфатов, сложные эфиры сульфонатных солей металлов, карбаматы и амиды. Примеры способов получения пролекарства исследуемого активного соединения известны специалисту в данной области техники и их можно найти, например, в публикации Krogsgaard-Larsen et al. "Textbook of Drug Design and Discovery" Taylor & Francis (Апрель 2002).
1
2
В одном варианте (А) согласно настоящему изобретению радикал R представляет собой -CH-.
2
1-4
6-10
В предпочтительном варианте реализации указанного варианта (A) R представляет собой С алкиленовый бирадикал, необязательно замещенный одним или двумя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из метила, этила, пропила, изопропила, аллила, пропаргила, бутила, изобутила, втор-бутила, трет-бутила, гидроксиметила, 1-гидроксиэтила, 2-гидроксиэтила, 3-аминопропила, 4-аминобутила, 3-гуанидилпропила, 3-индолилметила, фенила, 1-нафтила, 2-нафтила, бензила, 4-гидроксибензила и С гетероарила.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Более предпочтительно R представляет собой бирадикал -СН- или -СН-СН-, необязательно замещенный одним или двумя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящими из метила, изопропила, изобутила и бензила. Еще более предпочтительно, R представляет собой бирадикал -CH-, необязательно замещенный двумя метальными заместителями или одним заместителем, выбранным из группы, состоящей из изопропила, изобутила и бензила, или R представляет собой бирадикал -СН-СН-. Также предпочтительно R представляет собой бирадикал -СН- или -СН-СН-.
3
В другом предпочтительном варианте реализации указанного варианта (А) R представляет собой Н.
В другом предпочтительном варианте реализации указанного варианта (А) m равен 1.
В другом предпочтительном варианте реализации указанного варианта (А) n равен 0.
1-4
В другом предпочтительном варианте реализации указанного варианта (А) X представляет собой -O(C алкил) или галоген, более предпочтительно метокси группу в мета- или пара-положении, или хлор.
В другом предпочтительном варианте реализации указанного варианта (А)
2
2
2
2
3
2
3
Y выбран из группы, состоящей из СОН, СОМе, NH, -NHMe, -NMe, -NMe, -NHEt, -NEt, -NEt,
или фармацевтически приемлемой соли указанных групп.
2
2
2
2
3
2
3
2
2
2
Более предпочтительно Y выбран из группы, состоящей из СОН, СОМе, NH, -NHMe, -NMe, -NMe, -NHEt, -NEt, -NEt, пирролидин-1-ила, пиперидин-1-ила, морфолин-4-ила, 4-пиперазин-1-ила, 4-метил-пиперазин-1-ила, пиридин-1-ила, более предпочтительно СОН и -NMe, еще более предпочтительно Y представляет собой -СОН или его фармацевтически приемлемую соль.
Вариант (А) предусматривает, что соединения формулы (I) выбраны из группы, состоящей из:
1-карбоксиметил-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1Н-1,2,3-триазола,
l-[2-(N,N-диметиламино)этил]-4-[4-(метокси)фенилтиометил]-lH-l,2,3-триазола,
1-карбоксиметил-4-[4-(метокси)фенилтиометил]-1Н-1,2,3-триазола,
(S)-1-(1-карбокси-2-фенилэтил)-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1Н-1,2,3-триазола,
(R)-1-(1-карбокси-2-фенилэтил)-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1Н-1,2,3-триазола,
(S)-1-(1-карбокси-3-метилбутил)-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1Н-1,2,3-триазола,
(R)-1-(1-карбокси-3-метилбутил)-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1Н-1,2,3-триазола,
(S)-1-(1-карбокси-2-метилпропил)-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1Н-1,2,3-триазола,
(R)-1-(1-карбокси-2-метилпропил)-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1Н-1,2,3-триазола,
1-(1-карбокси-1-метилэтил)-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1Н-1,2,3-триазола,
1-(2-гидроксиэтил)-4-[4-(метокси)фенилтиометил]-1Н-1,2,3-триазола,
1-метоксикарбонилметил-4-(фенилсульфинилметил)-1Н-1,2,3-триазола и
1-карбоксиметил-4-[3-(метокси)фенилсульфонилметил]-1Н-1,2,3-триазола,
1-карбоксиметил-4-[3-(хлор)фенилтиометил]-1Н-1,2,3-триазола
или их солей.
1
2
В варианте (В) настоящего изобретения радикал R представляет собой -CH-.
2
1-4
2
1
4
1
4
В предпочтительном варианте указанного варианта (В) R представляет собой C алкиленовый бирадикал, в котором одна или две -СН- группы заменены на -О-, и при этом указанный С-С алкиленовый бирадикал необязательно замещен одной или двумя С-С алкильными группами, предпочтительно выбранными из метила, этила, н-пропила, изопропила, н-бутила и трет-бутила.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Более предпочтительно R представляет собой бирадикал -СН- или -СН-СН-, необязательно замещенный одним или двумя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из метила, изопропила и изобутила. Еще более предпочтительно, R представляет собой бирадикал -СН-, необязательно замещенный двумя метальными заместителями или одним заместителем, выбранным из группы, состоящей из изопропила и изобутила, или R представляет собой бирадикал -СН-СН-.
3
В другом предпочтительном варианте реализации указанного варианта (В) R представляет собой Н.
В другом предпочтительном варианте реализации указанного варианта (В) m равен 1.
В другом предпочтительном варианте реализации указанного варианта (В) n равен 0.
1-4
В другом предпочтительном варианте реализации указанного варианта (В) X представляет собой -O(C алкил) или галоген, более предпочтительно метоксигруппу в мета- или пара-положении, или хлор.
2
1
4
1
4
2
1
4
3
В другом предпочтительном варианте реализации указанного варианта (В), Y выбран из группы, состоящей из NH, -NH(C-C алкила), -N(C-C алкила), -N(C-C алкила),
2
2
3
2
3
2
Более предпочтительно Y выбран из -NH, -NHMe, -NMe, -NMe, -NHEt, -NEt, -NEt, пирролидин-1-ила, пиперидин-1-ила, морфолин-4-ила, 4-пиперазин-1-ила, 4-метил-пиперазин-1-ила, пиридин-1-ила или фармацевтически приемлемой соли указанных групп. Более предпочтительно Y представляет собой -NMe или его фармацевтически приемлемую соль.
1
2
В варианте (С) согласно настоящему изобретению радикал R представляет собой -СН-.
2
1-4
6-10
В другом предпочтительном варианте реализации указанного варианта (С) R представляет собой С алкиленовый бирадикал, необязательно замещенный одним или двумя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из метила, этила, пропила, изопропила, аллила, пропаргила, бутила, изобутила, втор-бутил, трет-бутила, гидроксиметила, 1-гидроксиэтила, 2-гидроксиэтила, 3-аминопропила, 4-аминобутила, 3-гуанидилпропила, 3-индолилметил, фенила, 1-нафтила, 2-нафтила, бензила, 4-гидроксибензила и С гетероарила.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Более предпочтительно R представляет собой бирадикал -СН- или -CH-СН-, необязательно замещенный одним или двумя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из метила, изопропила, изобутила и бензила. Еще более предпочтительно, R представляет собой бирадикал -СН-, необязательно замещенный двумя метальными заместителями или одним заместителем, выбранным из группы, состоящей из изопропила, изобутила и бензила, или R представляет собой бирадикал -СН-СН-. Также предпочтительно R представляет собой бирадикал -СН- или -СН-СН-.
3
В другом предпочтительном варианте реализации указанного варианта (С) R представляет собой Н.
В другом предпочтительном варианте реализации указанного варианта (С) m равен 1.
В другом предпочтительном варианте реализации указанного варианта (С) n равен 0.
1-4
В другом предпочтительном варианте реализации указанного варианта (С) X представляет собой -O(C алкил) или галоген, более предпочтительно метоксигруппу в мета- или пара-положении, или хлор.
2
2
1
4
2
1
4
1
4
2
1
4
3
В другом предпочтительном варианте реализации указанного варианта (С) Y выбран из группы, состоящей из СОН, СО(С-С алкила), NH, -NH(C-Cалкила), -N(C-C алкила), -N(C-C алкила),
или фармацевтически приемлемой соли указанных групп.
2
2
3
2
3
Более предпочтительно Y выбран из -NH, -NHMe, -NMe, -NMe, -NHEt, -NEt, -NEt, пирролидин-1-ила, пиперидин-1-ила, морфолин-4-ила, 4-пиперазин-1-ила, 4-метил-пиперазин-1-ила, пиридин-1-ила или фармацевтически приемлемой соли указанных групп.
2
2
Более предпочтительно Y выбран из группы, состоящей из СОН и -NMe или их фармацевтически приемлемой соли.
Способ получения соединений согласно настоящему изобретению
Соединения формулы (I) согласно настоящему изобретению можно получить при помощи способов, которые включают взаимодействие алкина формулы (II) с азидом формулы (III):
1
2
3
где R, R, R, m, n и X в соединениях формул (II)-(III) имеют значения, определенные для соединений формулы (I), и где Y представляет собой группу, определенную для соединения формулы (I), необязательно защищенную карбоксизащитной группой, гидроксизащитной группой или аминозащитной группой в зависимости от природы указанной группы Y.
Такую реакцию можно осуществить в присутствии медного катализатора, такого как, например, сульфат меди (II)/аскорбат натрия, иодид меди (I) или ацетат меди (I).
Кроме того, в предпочтительном варианте реализации указанную реакцию между соединением формулы (II) и соединением формулы (III) проводят в присутствии основания, такого как, например, ацетат натрия, диизопропиламин или триэтиламин.
В конкретном варианте реализации в случае, когда n равен 0, соединение формулы (I), полученное в соответствии с указанным выше способом, можно обработать окисляющим агентом с получением соединения формулы (I), где n равен 1 или 2.
Примеры окисляющих агентов включают, например, 3-хлорпербензойную кислоту или трет-бутилгидропероксид.
1
2
3
В другом конкретном варианте реализации в случае, когда соединение формулы (I), полученное в соответствии с предыдущим способом, содержит Y-группу, защищенную защитной группой, указанную защитную группу удаляют, получая соединение формулы (I), где R, R, R, m, n, X и Y имеют значения, определенные для соединения формулы (I). Указанную защитную группу можно удалить при помощи следующих способов, известных специалисту в области органического синтеза.
Фармацевтические композиции
В настоящем изобретении также предложены фармацевтические композиции, содержащие соединение формулы (I), или его фармацевтически приемлемый стереоизомер, соль, сольват или комплекс, или его изотопно-меченное производное, или его пролекарство; или один или более фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ или носителей.
Фармацевтически приемлемый носитель должен быть приемлемым с точки зрения его совместимости с другими ингредиентами указанной композиции и не должен наносить вред его реципиенту. Указанный фармацевтически приемлемый носитель можно выбрать из органических и неорганических веществ, которые применяются в фармацевтических составах и включены в качестве обезболивающих агентов, регуляторов рН, связывающих агентов, разрыхлителей, разбавителей, эмульгаторов, наполнителей, скользящих агентов, солюбилизаторов, стабилизаторов, суспендирующих агентов, агентов для регуляции тоничности и загустителей. Кроме того, могут быть добавлены фармацевтические добавки, такие как антиоксиданты, ароматические агенты, красители, агенты, улучшающие запах, консерванты и подсластители.
Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают, среди прочих, карбоксиметилцеллюлозу, кристаллическую целлюлозу, глицерин, камедь акации, лактозу, стеарат магния, метилцеллюлозу, солевой раствор, альгинат натрия, сахарозу, крахмал, тальк и воду.
Фармацевтические составы согласно настоящему изобретению получают при помощи способов, хорошо известных в области фармацевтики. Например, соединения формулы (I) смешивают с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом или носителем в виде суспензии или раствора. Выбор носителя зависит от растворимости и химической природы соединений, выбранного пути введения и стандартной фармацевтической практики.
Соединения или композиции согласно настоящему изобретению можно вводить субъекту, представляющему собой человека или животное, любым из известных способов, включая, без ограничения, пероральное введение, подъязычное или буккальное введение, парентеральное введение, абсорбцию через кожу, путем закапывания в нос или ингаляцию через нос, вагинальное, ректальное и внутримышечное введения.
В конкретном варианте реализации введение осуществляют парентерально, например, при помощи подкожной инъекции, внутримышечной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, внутривенной инъекции. Для парентерального введения, соединения согласно настоящему изобретению объединяют со стерильным водным раствором, который изотоничен крови субъекта. Состав такого типа получают путем растворения находящегося в твердом виде активного ингредиента в воде, содержащей физиологически совместимые вещества, такие как хлорид натрия, глицин и им подобные, и имеющей буферный рН, совместимый с рН при физиологическом состоянии. Указанный состав представлен в упаковках для однократного или многократного введения, таких как закрытые флаконы или ампулы.
В другом конкретном варианте реализации введение осуществляют перорально. В этом случае состав соединений согласно настоящему изобретению может быть представлен в форме капсул, таблеток, порошков, гранул или в виде суспензии или раствора. Указанный состав может содержать общераспространенные добавки, такие как лактозу, маннитол, крахмал и т.д.; связующие вещества, такие как кристаллическая целлюлоза, производные целлюлозы, камедь акации, кукурузный крахмал или желатины; разрыхлители, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал или натрий карбоксиметилцеллюлоза; смазывающие вещества, такие как тальк или стеарат магния.
Применения
Соединения согласно настоящему изобретению являются подходящими для модулирования RyR-рецепторов, которые регулируют функцию кальция в клетках человека и животных, таким образом, они обладают способностью лечить или предотвращать расстройства или заболевания, связанные с нарушением регуляции внутриклеточного кальция, в основе которой лежит дисфункция RyR-рецептора.
Под «нарушением регуляции внутриклеточного кальция» следует понимать атипичную регуляцию уровней кальция и кальциевых потоков в клетках.
2+
2+
2+
Следовательно, увеличение концентрации внутриклеточного кальция (Са) в состоянии покоя приводит к повреждению токсичных мышечных клеток (мышечных волокон) и одновременной активации Са-зависимых протеаз, таких как кальпаин. Учитывая, что активность кальпаина увеличивается в некротических мышечных волокнах mdx-мышей, и что дисфункция кальпаина приводит к тазово-плечевой форме мышечной дистрофии, предотвращая активность кальций-зависимых протеаз путем ингибирования приращений внутриклеточного Са, это позволяет предотвратить атрофию мышц и, следовательно, лечить такие заболевания, как мышечная дистрофия Дюшенна или мышечная дистрофия Беккера.
Проведенные с соединением согласно настоящему изобретению анализы in vitro продемонстрировали возможность этих соединений снижать повышенные уровни внутриклеточного кальция в мышечных волокнах, что свидетельствует о том, что эти соединения осуществляют такое восстановление посредством механизма, включающего модуляцию RyR-канала. Кроме того, указанные соединения также продемонстрировали способность наполовину уменьшать число генов, гиперэкспрессируемых в дистрофической MDX-мышце, причем один из указанных генов связан с потерей или атрофией скелетных мышц.
RyR-рецепторы, регулирующие функцию внутриклеточного кальция, включают RyR1, RyR2 и RyR3, а также белок RyR или аналог RyR. Аналог RyR относится к функциональному варианту белка RyR с биологической активностью, обладающему 60% и большей гомологией в аминокислотной последовательности к белку RyR.
В контексте согласно настоящему значению под «биологической активностью RyR» следует понимать активность белка или пептида, проявляющего способность физически связываться с FKBP 12 (кальстабин-1) или связываться с ним в случае RyR1 и RyR3, и с FKBP12.6 (кальстабин-2) в случае RyR2 в условиях проведения анализов, описанных в настоящем документе.
Соединения согласно настоящему изобретению можно применять для ограничения или предотвращения или снижения уровня связанного с RyR FKBP (кальстабина) в клетках субъекта. На основании того, что описано предыдущем абзаце, связанный с RyR FKBP относится к связанному с RyR1 FKBP12 (кальстабин-1), связанному с RyR2 FKBP 12.6 (кальстабин-2) и связанному с RyR3 FKBP12 (кальстабин-1).
Снижение уровня связанного с RyR FKBP в клетках субъекта ограничивается или предотвращается в случае, когда указанное снижение каким-либо образом останавливают, блокируют, задерживают, затрудняют или уменьшают посредством введения соединений согласно настоящему изобретению, так что уровень связанного с RyR FKBP в клетках субъекта выше, чем если бы он был случае отсутствия указанного вводимого соединения.
Уровень связанного с RyR FKBP у субъекта определяют с применением стандартных анализов или методик, известных специалисту в данной области техники, таких как иммунологические методы, гибридизационный анализ, метод иммунопреципитации, вестерн-блон анализ, методы флуоресцентной визуализации и/или обнаружения излучения, а также любых других анализов или методов, подобных тем, которые раскрыты в экспериментальной части настоящего документа.
В конкретном варианте реализации снижение уровня связанного с RyR FKBP (кальстабина) происходит в результате воздействия на клетки субъекта нитроокислительного стресса. Фактически экспериментальные анализы, проведенные с соединениями согласно настоящему изобретению, наглядно показали то, что указанные соединения позволяют минимизировать дегенеративные эффекты нитроокислительного стресса в отношении мышечных трубочек здорового человека посредством увеличения сродства взаимодействия RyRl с кальстабином 1.
Соответственно было продемонстрировано, что соединения согласно настоящему изобретению предотвращают расстройства или состояния с участием модулирования RyR-рецептора или увеличением внутриклеточного кальция, тем самым позволяя регулировать его уровни. Примеры указанных расстройств или состояний включают расстройства и заболевания скелетных мышц (связанные с модуляцией RyRl), расстройства сердечной деятельности и заболевания сердца (связанные с модуляцией RyR2) и расстройства и заболевания нервной системы (связанные с модуляцией RyRl, RyR2 или RyR3).
Таким образом, дополнительный аспект настоящего изобретения относится к применению соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемому стереоизомеру, соли, сольвату или комплексу, или его изотопно-меченному производному, или его пролекарству для получения лекарственного средства для лечения и/или предотвращения скелетно-мышечных расстройств и заболеваний скелетных мышц, расстройств сердечной деятельности и заболеваний сердца и расстройств и заболеваний нервной системы.
В конкретном варианте реализации скелетно-мышечные расстройства и заболевания скелетных мышц выбраны из мышечной дистрофии, врожденных миопатий, метаболических миопатий и мышечной атрофии. Предпочтительно, указанное скелетно-мышечное расстройство или заболевание скелетных мышц представляет собой мышечную дистрофию Дюшенна или мышечную дистрофию Беккера.
В другом конкретном варианте реализации, расстройства сердечной деятельности и заболевания сердца выбраны из сердечной недостаточности, ишемии сердца, сердечной аритмии и кардиомиопатии.
В другом конкретном варианте реализации, расстройства и заболевания нервной системы выбраны из инсульта, болезни Альцгеймера, лобно-височной деменции и когнитивного нарушения.
В предпочтительном варианте реализации соединения в соответствии с вариантом (А) согласно настоящему изобретению представляют собой те соединения, которые применяют для получения лекарственного средства для лечения скелетно-мышечных расстройств и заболеваний скелетных мышц, а также для лечения расстройств сердечной деятельности и заболеваний сердца, таких как те, которые описаны выше.
В другом предпочтительном варианте реализации соединения в соответствии с вариантом (В) согласно настоящему изобретению представляют собой те соединения, которые применяют для получения лекарственного средства для лечения расстройств и заболеваний нервной системы, таких как те, которые описаны выше.
Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к соединению формулы (I) или его фармацевтически приемлемому стереоизомеру, соли, сольвату или комплексу, или его изотопно-меченному производному, или его пролекарству для применения для лечения и/или предотвращения скелетно-мышечных расстройств и заболеваний скелетных мышц, расстройств сердечной деятельности и заболеваний сердца, и расстройств и заболеваний нервной системы.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения и/или предотвращения скелетно-мышечных расстройств и заболеваний скелетных мышц, расстройств сердечной деятельности и заболеваний сердца и расстройств и заболеваний нервной системы, при этом указанный способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемого стереоизомера, соли, сольвата или комплекса, или его изотопно-меченного производного, или его пролекарства.
Под «терапевтически эффективным» количеством следует понимать количество, достаточное для достижения благоприятных или желаемых результатов, представляющих собой профилактический и/или терапевтический ответ, предотвращающих или по существу смягчающих нежелательные побочные эффекты.
В конкретном варианте реализации соединения согласно настоящему изобретению вводят субъекту в количестве, эффективном для модулирования атипичных концентраций внутриклеточного кальция. Такое количество может легко определить специалист в данной области техники с применением известных способов. Например, высвобождение внутриклеточного кальция через RyR-каналы можно определить количественно с применением чувствительных к кальцию флуоресцентных красителей, таких как Fluo-3 или Fura-2, и отслеживания зависимых от кальция флуоресцентных сигналов при помощи фотоумножителя и подходящего программного обеспечения (Brillantes, et al. Cell, 1994, 77, 513-523, "Stabilization of calcium release channel (ryanodine receptor) function by FK506-binding protein"; Gillo, et al. Blood, 1993, 81, 783-792).
Концентрацию соединений согласно настоящему изобретению в сыворотке субъекта, представляющего собой человека или животного, можно определить при помощи следующих способов, известных в данной области техники (Thebis, М. et al. Drug Test. Analyspaben 2009, 1, 32-42 "Screening for the calstabin-ryanodine receptor complex stabilizers JTV-519 and S-107 in doping control analysis"). Вводимое количество соединений формулы (I), которое эффективно для ограничения или предотвращения атипичных уровней внутриклеточного кальция, будет зависеть от относительной эффективности выбранного соединения, серьезности подвергающегося лечению расстройства и массы тела страдающего заболеванием субъекта. Тем не менее, соединения обычно вводят один раз в день или чаще, например, 1, 2, 3 или 4 раза в день, при этом общие обычные ежедневные дозы находятся в диапазоне между примерно 1 мг/кг/сутки и 100 мг/кг/сутки, и более предпочтительно между 10 мг/кг/сутки и 40 мг/кг/сутки, или в количестве, достаточном для достижения уровней в сыворотке между примерно 1 нг/мл и 500 нг/мл.
Соединения формулы (I) можно применять по отдельности, в сочетании друг с другом или в сочетании с другими лекарственными средствами, обладающими терапевтической активностью, включая, но не ограничиваясь ими, экзонный энхансер сплайсинга мРНК, модуляторы транскрипции генов, диуретики, антикоагулянты, тромбоцитарные агенты, антиаритмические препараты, инотропные агенты, хронотропные агенты, α- и β-блокаторы, ангиотензиновые ингибиторы и вазодилататоры.
Указанные лекарственные средства могут быть частью одной и той же композиции, или они могут быть представлены в виде отдельной композиции для введения в один и тот же или разные моменты времени.
Настоящее изобретение также включает способ in vitro для определения возможности соединения модулировать уровни внутриклеточного кальция и предотвращать диссоциацию кальстабина из белкового RyR-комплекса, при этом указанный способ включает: (а) получение или образование культуры клеток, содержащей RyR-рецепторы; (b) приведение в контакт указанных клеток с анализируемым соединением; (с) воздействие на указанные клетки мере одним или более из известных условиев, которые изменяют регуляцию внутриклеточного кальция или приводят к образованию посттрансляционных модификаций в указанном RyR-рецепторе; (d) определение того, модулирует ли указанное соединение уровни внутриклеточного кальция; и (е) определение того, ограничивает или предотвращает указанное соединение диссоциацию кальстабина из указанного белкового RyR-комплекса.
В конкретном варианте реализации условия, которые изменяют регуляцию внутриклеточного кальция или приводят к образованию посттрансляционных модификаций в RyR-рецепторе, представляют собой окислительный стресс или нитрозативный стресс.
Настоящее изобретение также предусматривает способ диагностики расстройства или заболевания, при этом указанный способ включает:
- получение от субъекта образца ткани или клетки, содержащего RyR-рецепторы;
- инкубирование указанных образцов ткани или клетки, полученных на стадии а) с соединением формулы (I), и
- определение того:
(a) наблюдается ли усиление взаимодействия RyR с кальстабином при сравнении взаимодействия RyR-кальстабин в контрольных клетках или ткани;
или
(b) наблюдается ли снижение уровней внутриклеточного кальция по сравнению с отсутствием такого снижения в контрольных клетках или ткани;
где усиление взаимодействия RyR с кальстабином в (а) или снижение уровня внутриклеточного кальция в (b) указывает на наличие расстройства или заболевание у указанного субъекта.
В конкретном варианте реализации соединение формулы (I), применяемое в способе диагностики, представляет собой соединение в соответствии с вариантом (С) согласно настоящему изобретению.
В другом конкретном варианте реализации указанный образец ткани представляет собой образец мышечной ткани.
В конкретном варианте реализации в случае, когда RyR представляет собой RyR1, расстройство или заболевание, подлежащее диагностике, представляет собой скелетно-мышечное расстройство или заболевание скелетных мышц.
В конкретном варианте реализации в случае, когда RyR представляет собой RyR2, расстройство или заболевание, подлежащее диагностике, представляет собой расстройство сердечной деятельности или заболевание сердца.
В конкретном варианте реализации в случае, когда RyR представляет собой RyRl, RyR2 или RyR3, расстройство или заболевание, подлежащее диагностике, представляет собой расстройство или заболевание нервной системы.
Усиление взаимодействия RyR с кальстабином и снижение уровней внутриклеточного кальция можно измерить методами, известными специалисту в данной области техники, таких как метод иммунопреципитации, методы близкого лигирования in situ (PLA) и метод визуализации кальция в режиме реального времени с применением флуоресцентных зондов.
Примеры
Аббревиатуры применяемых соединений, реагентов, растворителей или методов определяются следующим образом:
1
- AHK1: соединение в соответствии с формулой (I), содержащее группы: R =
2
3
2
2
R=-СН-; R=Н; m=1; n=0; X=3-МеО; Y=COH,
1
- AHK2: соединение в соответствии с формулой (I), содержащее группы: R =
2
2
2
2
2
3
-СН-; R=-СНСН-; R=Н; m=1; n=0; X=4-МеО; Y=NMe,
- S-107: соединение, применяемое для сравнительных целей в проводимых биологических анализах, структура которого приведена в дополнительном разделе данного документа.
t
- BuOH: трет-бутанол,
- DAPI: 4',6-диамино-2-фенилиндол,
- ESI: ионизация электрораспылением,
- EtOAc: этилацетат,
- HRMS: масс-спектрометрия высокого разрешения,
- ИК: инфракрасная спектроскопия,
- mdx: животная модель сцепленной с Х-хромосомой мышечной дистрофии Дюшенна,
- ТП: температура плавления,
- ЯМР: ядерный магнитный резонанс,
- SIN1: агент, образующий 3-морфолино-сиднонимин, пероксинитрит и оксид азота,
- ТГФ: тетрагидрофуран,
- ТВТА: трис[(1-бензил-1Н-1,2,3-триазол-4-ил)метил]амин.
Следующие примеры предназначены для илюстративных целей и не ограничивают объем настоящего изобретения.
Пример 1: 1-метоксикарбонилметил-4-[4-(метокси)фенилтиометил]-1H-1,2,3-триазол
t
-1
1
13
4
2
2
2
2
4
3
3
13
16
3
3
Раствор 1-(4-метоксифенилтио)-2-пропина (2 ммоль, 356 мг), метилазидоацетата (2,00 ммоль, 230 мг) и ТВТА (катализатор) в ТГФ/BuOH (1:1, 4 мл) получали в условиях атмосферы азота. Затем добавляли два дегазированных водных раствора CuSO (0,4 ммоль, 63 мг) в HO (1 мл) и аскорбата натрия (0,8 ммоль, 158 мг) в НО (1 мл), и указанную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. После завершения реакции, растворитель выпаривали, добавляли 28% водный раствор аммония (10 мл), и указанный продукт подвергали экстракции CHCl (3×20 мл). Объединенные органические экстракты сушили (MgSO) и растворитель выпаривали при пониженном давлении. Продукт очищали с помощью колоночной хроматографии (силикагель; 1:3 EtOAc/гексан). Выход: 477 мг (78%). Желтоватое масло. ИК (см): 2953, 2837 (С-Н), 1750 (С=O), 1219, 1174 (триазол). Н ЯМР (500 МГц, CDC1): δ 7,38 (s, 1H), 7,30 (d, J=8,7 Гц, 2Н), 6,81 (d, J=8,7 Гц, 2Н), 5,09 (s, 3Н), 4,12 (s, 2Н), 3,78 (s, 3Н), 3,77 (s, 3Н). С ЯМР (125 МГц, CDCl): δ 166,7, 159,4, 145,8, 134,0, 125,4, 123,5, 114,7, 55,4, 53,1, 50,8, 30,9. HRMS (ESI+, m/z) для CHNOS, рассчитано: 294,0912; определено: 294,0916.
Пример 2: 1-метоксикарбонилметил-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1H-1,2,3-триазол
-1
1
13
3
3
13
16
3
3
Получение проводили согласно способу из Примера 1, начиная с 1-(3-метоксифенилтио)-2-пропина (2,00 ммоль, 356 мг) и метилазидоацетата (2,00 ммоль, 230 мг). Выход: 537 мг (88%). Желтоватое масло. ИК (см): 2953, 2837 (С-Н), 1749 (С=O), 1220, 1180 (триазол). Н ЯМР (500 МГц, CDCl): δ 7,51 (s, 1H), 7,18 (t, J=8,0 Гц, 1H), 6,92 (d, J=7,7 Гц, 1H), 6,90-6,87 (m, 1H), 6,73 (dd, J=8,2, 1,8 Гц, 1H) 5,11 (s, 2Н), 4,26 (s, 2Н), 3,78 (s, 3Н), 3,77 (s, 3Н). С ЯМР (125 МГц, CDCl): δ 166,7, 159,9, 145,7, 136,8, 129,9, 123,6, 121,5, 114,6, 112,5, 55,4, 53,1, 50,8, 28,7. HRMS (ESI+, m/z) для CHNOS, рассчитано: 294,0912; определено: 294,0917.
Пример 3: (S)-1-(1-метоксикарбонил-2-фенилэтил)-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1Н- 1,2,3-триазол
D
2
2
3
3
20
22
3
3
25
-1
1
13
Получение проводили согласно способу из Примера 1, начиная с 1-(3-метоксифенилтио)-2-пропина (2,00 ммоль, 384 мг) и метилового сложного эфира (S)-2-азидо-3-фенилпропановой кислоты (2,00 ммоль, 358 мг). Выход: 668 мг (87%). Желтоватое масло. [α]=-56,1° (с. 1,01 г/100 мл, CHCl). ИК (см): 2952, 2836 (С-Н), 1744 (С=O), 1228, 1172 (триазол). Н ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 7,47 (s, 1H), 7,27-6,62 (m, 9Н), 5,50 (dd, J=8,5, 6,2 Гц, 1H), 4,12 (q, J=14,9 Гц, 2Н), 3,75 (s, 3Н), 3,73 (s, 3Н), 3,46 (dd, J=14,0, 5,8 Гц, 1Н), 3,36 (dd, J=13,9, 9,2 Гц, 1Н). С ЯМР (101 МГц, CDCl): δ 168,6, 159,9, 145,1, 136,8, 134,7, 129,9, 128,9, 127,6, 122,4, 121,5, 114,5, 112,5, 64,3, 55,4, 53,2, 38,9, 28,7. HRMS (ESI+, m/z) для CHNOS, рассчитано: 384,1382; определено: 384,1392.
Пример 4: (R)-1-(1-метоксикарбонил-2-фенилэтил)-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1Н-1,2,3-триазол
D
2
2
20
22
3
3
25
Получение проводили согласно способу из Примера 1, начиная с 1-(3-метоксифенилтио)-2-пропина (2,00 ммоль, 384 мг) и метилового сложного эфира (R)-2-азидо-3-фенилпропановой кислоты (2,00 ммоль, 358 мг). Выход: 653 мг (85%). Желтоватое масло. [α] = +39,4° (с. 2,71 г/100 мл, CHCl). HRMS (ESI+, m/z) для CHNOS, рассчитано: 384,1382; определено: 384,1382. Данные ЯМР идентичны данным Примера 3.
Пример 5: (S)-1-(1-метоксикарбонил-3-метил-бутил)-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1Н-1,2,3-триазол
D
2
2
3
3
25
1
13
Получение проводили согласно способу из Примера 1, начиная с 1-(3-метоксифенилтио)-2-пропина (2,00 ммоль, 384 мг) и метилового сложного эфира (S)-2-азидо-4-метилпентановой кислоты (2,00 ммоль, 342 мг). Выход: 677,9 мг (97%). Желтоватое масло. [α] = +10,7° (с. 1,00 г/100 мл, CHCl). Н ЯМР (500 МГц, CDCl): δ 7,51 (s, 1H), 7,16 (t, J=8,0 Гц, 1H), 6,90 (d, J=7,7 Гц, 1H), 6,87 (s, 1H), 6,72 (dd, J=8,2, 1,8 Гц, 1H), 5,38 (t, J=8,0 Гц, 1H), 4,24 (q, J=14,8 Гц, 2Н), 3,76 (s, 3Н), 3,73 (s, 3Н), 1,94 (t, J=7,5 Гц, 2Н), 1,19 (dt, J=13,4, 6,7 Гц, 1H), 0,90 (d, J=6,5 Гц, 3Н), 0,84 (d, J=6,6 Гц, 3Н). С ЯМР (125 МГц, CDCl): δ 169,8, 159,9, 145,3, 136,6, 129,8, 122,1, 115,1, 112,7, 61,1, 55,3, 53,1, 41,4, 29,1, 24,7, 22,7, 21,3.
Пример 6: (R)-1-(1-метоксикарбонил-3-метил-бутил)-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1Н-1,2,3-триазол
D
2
2
25
Получение проводили согласно способу из Примера 1, начиная с 1-(3-метоксифенилтио)-2-пропина (2,00 ммоль, 384 мг) и метилового сложного эфира (R)-2-азидо-4-метилпентановой кислоты (2,00 ммоль, 342 мг). Выход: 653 мг (93%). Желтоватое масло. [α] = -12,1° (с. 1,03 г/100 мл, CHCl). Данные ЯМР были идентичны данным Примера 5.
Пример 7: (S)-1-(1-метоксикарбонил-2-метил-пропил)-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1Н-1,2,3-триазол
D
2
2
3
3
25
1
13
Получение проводили согласно способу из Примера 1, начиная с 1-(3-метоксифенилтио)-2-пропина (2,00 ммоль, 384 мг) и метилового сложного эфира (S)-2-азидо-3-метилбутановой кислоты (2,00 ммоль, 314 мг). Выход: 616 мг (92%). Желтоватое масло. [α] = +21,5° (с. 1,03 г/100 мл, CHCl). H ЯМР (500 МГц, CDCl): δ 7,63 (s, 1H), 7,16 (t, J=7,9 Гц, 1H), 6,92 (d, J=7,5 Гц, 1H), 6,88 (s, 1H), 6,72 (d, J=6,8, 1H), 5,06 (d, J=8,7 Гц, 1H), 4,24 (q, J=14,7 Гц, 2H), 3,76 (s, 6H), 2,44-2,30 (m, 1H), 0,96 (d, J=6,6 Гц, 3Н), 0,73 (d, J=6.6 Гц, 3Н). C ЯМР (125 МГц, CDCl): δ 168,8, 159,6, 144,7, 136,3, 129,5, 121,9, 115,0, 112,3, 68,5, 55,0, 52,5, 32,0, 28,8, 18,8, 18,1.
Пример 8: (R)-1-(1-метоксикарбонил-2-метил-пропил)-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1Н-1,2,3-триазол
D
2
2
25
Получение проводили согласно способу из Примера 1, начиная с 1-(3-метоксифенилтио)-2-пропина (2,00 ммоль, 384 мг) и метилового сложного эфира (R)-2-азидо-3-метилбутановой кислоты (2,00 ммоль, 314 мг). Выход: 626 мг (93%). Желтоватое масло. [α] = -19,5° (с. 1,06 г/100 мл, CHCl). Данные ЯМР были идентичны данным Примера 7.
Пример 9: 4-[3-(метокси)фенилтиометил] -1-(1 -метил-1 -метоксикарбонилэтил)-1Н-1,2,3-триазол
1
13
3
3
Получение проводили согласно способу из Примера 1, начиная с 1-(3-метоксифенилтио)-2-пропина (2,00 ммоль, 384 мг) и метил-2-азидоизобутирата (2,00 ммоль, 386 мг). Выход: 258 мг (40%). Желтоватое масло. H ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 7,44 (s, 1H), 7,11 (t, J=7,7 Гц, 1H), 6,85 (d, J=7,6 Гц, 1H), 6,82 (s, 1H), 6,67 (d, J=7,6 Гц, 1H), 4,17 (s, 2H), 3,69 (s, 3H), 3,62 (s, 3H), 1,82 (s, 6H). C ЯМР (101 МГц, CDCl) δ 171,6, 159,7, 144,3, 136,7, 129,6, 121,6, 121,0, 114,8, 112,3, 64,3, 55,1, 53,1, 28,8, 25,5.
Пример 10: 1-(2-гидроксиэтил)-4-[4-(метокси)фенилтиометил]-1H-1,2,3-триазол
1
13
3
3
12
15
3
2
Получение проводили согласно способу из Примера 1, начиная с 1-(4-метоксифенилтио)-2-пропина (2,00 ммоль, 384 мг) и 2-азидоэтанола (2,00 ммоль, 174 мг). Выход: 520 мг (98%). Желтоватое масло. H ЯМР (400 МГц, CDCl) δ 7,40 (s, 1H), 7,29 (d, J=8,3 Гц, 2Н), 6,80 (d, J=8,2 Гц, 2Н), 4,40 (s, 2Н), 4,09 (s, 2Н), 3,99 (s, 2H), 3,77 (s, 3Н), 3,18 (s, 1H). C ЯМР (101 МГц, CDCl): δ 159,5, 144,9, 133,9, 125,4, 123,5, 114,8, 61,1, 55,5, 52,9, 30,9. HRMS (ESI+, m/z) для CHNOS, рассчитано: 266,0963; определено: 266,0965.
Пример 11: 1-карбоксиметил-4-[4-(метокси)фенилтиометил]-1H-1,2,3-триазол
2
4
3
3
12
14
3
3
-1
1
13
Моногидрат гидроксида лития (2,00 ммоль, 84 мг) добавляли к раствору 1-метоксикарбонилметил-4-[4-(метокси)фенилтиометил]-1H-1,2,3-триазола (1,00 ммоль, 305 мг, Пример 1) в ТГФ/НО (1:1,8 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатой температуре в течение одного часа. Органический растворитель выпаривали, полученную водную смесь окисляли при помощи 1М HCl, и раствор подвергали экстракции EtOAc (2×10 мл). Объединенные органические фазы сушили (MgSO) и растворитель выпаривали при пониженном давлении. Выход: 158 мг (54%). Белое твердое вещество. ТП: 163-170°С. ИК (см): 2923, 2848 (С-Н), 1730 (С=O), 1223, 1188 (триазол). H ЯМР (500 МГц, CDOD): 7,66 (s, 1H), 7,28 (d, J=8,8 Гц, 2Н), 6,84 (d, J=8,8 Гц, 2Н), 5,19 (s, 2Н), 4,07 (s, 2Н), 3,76 (s, 3Н). С ЯМР (125 МГц, CDOD): δ 169,7, 161,1, 146,3, 135,6, 126,3, 115,7, 55,8, 51,6, 31,5. HRMS (ESI+, m/z) для CHNOS, рассчитано: 280,0756; определено: 280,0760.
Пример 12: 1-карбоксиметил-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1H-1,2,3-триазол
-1
1
13
3
3
12
14
3
3
Получение проводили согласно способу из Примера 11, начиная с 1-метоксикарбонилметил-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1H-1,2,3-триазола (1,00 ммоль, 305 мг, пример 2). Выход: 274 мг (94%). Белое твердое вещество. ТП: 115-119°С.ИК (см): 2999, 2971 (С-Н), 1707 (С=O), 1229 (триазол). Н ЯМР (500 МГц, CDOD): δ 7,80 (s, 1Н), 7,18 (t, J=8,0 Гц, 1H), 6,96-6,86 (m, 2Н), 6,76 (dd, J=8,3, 1,8 Гц, 1H), 5,19 (s, 2Н), 4,23 (s, 2Н), 3,75 (s, 3Н). С ЯМР (125 МГц, CDOD): δ 169,7, 161,4, 146,1, 138,0, 130,9, 125,9, 123,1, 116,1, 113,6, 55,7, 51,7, 29,3. HRMS (ESI+, m/z) для CHNOS, рассчитано: 280,0756; определено: 280,0753.
Пример 13: (S)-1-(1-карбокси-2-фенилэтил)-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1H-1,2,3-триазол
D
2
2
3
3
20
22
3
3
24
-1
1
13
Получение проводили согласно способу из Примера 11, начиная с (S)-1-(1-метоксикарбонил-2-фенилэтил)-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1H-1,2,3-триазола (1,00 ммоль, 383 мг, пример 3). Выход: 318 мг (86%). Белое твердое вещество. ТП: 79-83°С. [α] = -23,3° (с. 1,12 г/100 мл, CHCl). ИК (см): 2931 (С-Н), 1727 (С=O), 1246, 1229 (триазол). Н ЯМР (500 МГц, CDOD): δ 7,77 (s, 1H), 7,20-6,71 (m, 9Н), 5,56 (dd, J=10,8, 4,6 Гц, 1H), 4,15 (s, 2Н), 3,73 (s, 3Н), 3,56 (dd, J=14,3, 4,5 Гц, 1H), 3,40 (dd, J=14,3, 10,9 Гц, 1H). С ЯМР (125 МГц, CDOD): δ 171,1, 161,4, 145,9, 137,9, 137,2, 130,8, 129,9, 128,1, 124,8, 122,9, 115,9, 113,5, 65,8, 55,7, 38,9, 29,0. HRMS (ESI+, m/z) для CHNOS, рассчитано: 384,1382; определено: 384,1392.
Пример 14: (R)-1-(1-карбокси-2-фенилэтил)-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1H-1,2,3-триазол
20
22
3
3
D
2
2
24
Получение проводили согласно способу из Примера 11, начиная с (R)-1-(1-метоксикарбонил-2-фенилэтил)-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1H-1,2,3-триазола (1,00 ммоль, 383 мг, пример 4). Выход: 280 мг (76%). Белое твердое вещество. ТП: 78-86°С. HRMS (ESI+, m/z) для CHNOS, рассчитано: 384,1382; определено: 384,1382. [α] = +16,5° (с. 0,98 г/100 мл, CHCl). Данные ЯМР идентичны данным Примера 13.
Пример 15: (S)-1-(1-карбокси-3-метилбутил)-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1Н-1,2,3-триазол
D
2
2
3
3
25,6
1
13
Получение проводили согласно способу из Примера 11, начиная с (S)-1-(1-метоксикарбонил-3-метил-бутил)-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1H-1,2,3-триазола (1,00 ммоль, 349 мг, пример 5). Выход: 265 мг (76%). Белое твердое вещество. ТП: 96-105°С. [α] = +9,3° (с. 1,11 г/100 мл, CHCl). Н ЯМР (500 МГц, CDCl): δ 11,88 (s, 1H), 7,54 (s, 1H), 7,12 (t, J=7,9 Гц, 1H), 6,92-6,77 (m, 2Н), 6,70 (dd, J=8,1, 1,7 Гц, 1H), 5,38 (dd, J=10,7, 5,0 Гц, 1Н), 4,23 (dd, J=40,8, 14,9 Гц, 2H), 3,70 (s, 3Н), 2,03-1,86 (m, 2H), 1,17 (dt, J=19,8, 6,5 Гц, 1H), 0,88 (d, J=6,5 Гц, 3Н), 0,82 (d, J=6,5 Гц, 3Н). C ЯМР (125 МГц, CDCl): δ 171,2, 159,8, 144,7, 135,9, 129,8, 122,6, 122,4, 115,6, 112,9, 61,8, 55,3, 41,2, 28,5, 24,7, 22,6, 21,1.
Пример 16: (R)-1-(1-карбокси-3-метилбутил)-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1H-1,2,3-триазол
D
2
2
25,4
Получение проводили согласно способу из Примера 11, начиная с (R)-l-(l-метоксикарбонил-3-метил-бутил)-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1Н-1,2,3-триазола (1,00 ммоль, 349 мг, пример 6). Выход: 301 мг (86%). Твердое белое вещество. ТП: 97-104°С. [α] = -12,1° (с. 0,95 г/100 мл, CHCl). Данные ЯМР аналогичны данным Примера 15.
Пример 17: (S)-1-(1-карбокси-2-метилпропил)-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1H-1,2,3-триазол
D
2
2
3
3
25,6
1
13
Получение проводили согласно способу из Примера 11, начиная с (S)-1-(1-метоксикарбонил-2-метил-пропил)-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1H-1,2,3-триазола (1,00 ммоль, 335 мг, пример 7). Выход: 279 мг (87%). Белое твердое вещество. ТП: 115-121°С. [α] = +4,5° (с. 1,06 г/100 мл, CHCl). H ЯМР (500 МГц, CDCl): δ 11,53 (s, 1H), 7,68 (s, 1H), 7,12 (t, J=7,8 Гц, 1H), 6,87 (d, J=7,4 Гц, 1H), 6,84 (s, 1Н), 6,70 (d, J=6,8 Гц, 1H), 5,13 (d, J=7,6 Гц, 1H), 4,23 (dd, J=43,5, 14,5 Гц, 2H), 3,71 (s, 3H), 2,44 (d, J=6,4 Гц, 1H), 0,96 (d, J=6,4 Гц, 3Н), 0,75 (d, J=6,4 Гц, 3Н). C ЯМР (125 МГц, CDCl): δ 170,7, 159,9, 144,6, 136,1, 129,9, 122,9, 122,8, 115,8, 113,0, 69,3, 55,4, 32,2, 28,7, 19,2, 18,3.
Пример 18: (R)-1-(1-карбокси-2-метилпропил)-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1Н-1,2,3-триазол
D
2
2
25,6
Получение проводили согласно способу из Примера 11, начиная с (R)-l-(l-метоксикарбонил-2-метил-пропил)-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1H-1,2,3-триазола (1,00 ммоль, 335 мг, пример 8). Выход: 290 мг (90%). Белое твердое вещество. ТП: 114-123°С. [α] = -6,7° (с.1,01 г/100 мл, CHCl). Данные ЯМР идентичны данным Примера 17.
Пример 19: 1-(1-карбокси-1-метилэтил)-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1Н-1,2,3-триазол
1
13
3
3
Получение проводили согласно способу из Примера 11, начиная с 4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1-(1-метил-1-метоксикарбонилэтил)-1H-1,2,3-триазола (0,8 ммоль, 258 мг, пример 9). Выход: 246 мг (100%). Желтоватое твердое вещество. ТП: 109-121°С. Н ЯМР (400 МГц, CDOD): δ 7,77 (s, 1H), 7,09 (t, J=8,0 Гц, 1H), 6,82 (d, J=8,0 Гц, 1H), 6,79 (s, 1H), 6,67 (d, J=8,3 Гц, 1H), 4,12 (s, 2Н), 3,65 (s, 3Н), 1,78 (s, 6Н). С ЯМР (101 МГц, CDOD) δ 174,2, 161,3, 145,3, 137,9, 130,8, 123,4, 116,5, 113,7, 65,9, 55,7, 29,5, 25,9.
Пример 20: 1-[2-(N,N-диметиламино)этил]-4-[4-(метокси)фенилтиометил]-1H-1,2,3-триазол
3
4
3
3
14
21
4
-1
1
13
Триэтиламин (8,80 ммоль, 1,22 мл) мезилхлорид (4,39 ммоль, 0,34 мл) последовательно добавляли к раствору 1-(2-гидроксиэтил)-4-[4-(метокси)фенилтиометил]-1H-1,2,3-триазола (2,92 ммоль, 776 мг, пример 10) в безводном ТГФ (16 мл) и охлаждали при 0°С в условиях атмосферы азота. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Затем добавляли гидрохлорид диметиламина (8,00 ммоль, 652 мг), триэтиламин (8,80 ммоль, 1,22 мл), NaI (0,13 ммоль, 20 мг) и дополнительное количество безводного ТГФ (8 мл), и указанную смесь перемешивали при 50°С в течение ночи. После завершения реакции, растворители выпаривали при пониженном давлении, полученный остаток растворяли в EtOAc (20 мл) и последовательно промывали насыщенным водным раствором NaHCO (30 мл) и солевым раствором (10 мл). Органический слой сушили (MgSO) и упаривали под вакуумом до сухого состояния. Выход: 572 мг (84%). Белое твердое вещество. ТП: 35-40°С. ИК (см): 2943 (N-H), 2860, 2771 (С-Н), 1242 (триазол). Н ЯМР (400 МГц, CDCl) δ 7,41 (s, 1H), 7,30 (d, J=7,6 Гц, 2H), 6,81 (d, J=7,8 Гц, 2H), 4,37 (s, 2Н), 4,11 (s, 2Н), 3,77 (s, 3Н), 2,71 (s, 2Н), 2,25 (s, 6Н). С ЯМР (101 МГц, CDCl): 159,2, 144,8, 133,7, 125,5, 122,6, 114,5, 58,6, 55,3, 48,0, 45,3, 30,9. HRMS (ESI+, m/z) для CHNOS, рассчитано: 293,1436; определено 293,1440.
Пример 21: 1-метоксикарбонилметил-4-(фенилсульфинилметил)-1Н-1,2,3-триазол
-1
1
13
1
3
3
2
2
3
Получение проводили согласно способу из Примера 11, начиная с фенилтио-2-пропина (2,00 ммоль, 268 мг) и мети лазид о ацетата (2,00 ммоль, 230 мг). Выход: 342 мг (65%). Белое твердое вещество. ТП: 70-74°С. ИК (см): 2953, 2837 (С-Н), 1749 (С=O), 1220, 1180 (триазол). H ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 7,49 (s, 1H), 7,34 (d, J=7,6 Гц, 2Н), 7,31-7,22 (m, 2Н), 7,20 (m, 1H), 5,11 (s, 2H), 4,27 (s, 2H), 3,78 (s, 3Н). C ЯМР (101 МГц, CDCl): δ 166,5, 144,6, 135,1, 129,1, 128,6, 126,1, 123,5, 52,6, 50,3, 28,3. К полученному раствору 1-(метоксикарбонилметил)-4-(фенилтиометил)-1H-1,2,3-триазола (1,00 ммоль, 263 мг) в безводном хлороформе (30 мл) при 0°С добавляли м-хлорпербензойную кислоту (1,00 ммоль, 172 мг) и указанную смесь перемешивали при той же температуре в течение 30 минут. Смесь упаривали и остаток очищали с помощью колоночной хроматографии (силикагель; 5:95 МеОН/CHCl). Бесцветное масло. Выход: 161 мг (58%). Н ЯМР (500 МГц, CDCl): δ 7,72 (s, 1H), 7,49 (s, 5Н), 5,24-5,10 (dd, J=5,13 Гц, 2Н), 4,29-4,15 (dd, J=4,28 Гц, 2Н), 3,82 (s, 3Н).
Пример 22: 1-карбоксиметил-4-[3-(метокси)фенилсульфонилметил]-1H-1,2,3-триазол
2
2
3
12
14
3
5
1
м-Хлорпербензойную кислоту (2,50 ммоль, 437 мг) добавляют к раствору 1-(карбоксиметил)-4-[3-(метокси)фенилтиометил]-1H-1,2,3-триазола (1,00 ммоль, 279 мг, Пример 12) в 1:1 безводной смеси хлороформ/ацетонитрил (3 мл) при 0°С и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Смесь упаривают и остаток очищают с помощью колоночной хроматографии (силикагель; 5:95 МеОН/CHCl). Выход: 203 мг (65%). Белое твердое вещество. ТП: 106-115°С. Н ЯМР (500 МГц, CDCl): 7,91 (s, 1H), 7,50-7,29 (Ar, 4Н), 4,99 (s, 2Н), 4,71 (s, 2Н), 3,84 (s, 3Н). HRMS (ESI+, m/z) для CHNOS, рассчитано: 312,0654; определено: 312,0662.
Пример 23: 1-карбоксиметил-4-[3-(хлор)фенилтиометил]-1Н-1,2,3-триазол
4
3
3
11
10
3
2
-1
1
13
Раствор бромуксусной кислоты (10 ммоль, 1,38 г) и азида натрия (40 ммоль, 2,60 г) в воде (4 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Затем раствор нейтрализовали с помощью 3М NaOH и ацетонитрила (15 мл), последовательно добавляли 1-(3-хлорфенилтио)-2-пропин (8 ммоль, 1,45 г), ацетат натрия (30 ммоль, 2,46 г) и ацетат меди (I) (2 ммоль, 242 мг). Полученную смесь перемешивали при 45°С в течение 6 часов, растворитель выпаривали, подкисляли 1М HCl и экстрагировали EtOAc (3×20 мл). Объединенные органические фазы сушили (MgSO) и растворитель выпаривали при пониженном давлении. Выход: 1,49 г (66%). бело твердое вещество. ТП: 146-148°С. ИК (см): 2928, 2850 (С-Н), 1731 (С=O), 1224, 1184 (триазол). H ЯМР (500 МГц, CDOD): 7,86 (s, 1H), 7,39 (s, 1H), 7,28-7,21 (m, 3Н), 5,22 (s, 2Н), 4,29 (s, 2Н). С ЯМР (125 МГц, CDOD): δ 168,5, 144,1, 137,9, 134,4, 130,0, 128,8, 127,6, 126,3, 124,6, 50,4, 27,7. HRMS (ESI+, m/z) для CHClNOS, рассчитано: 283,0182; определено: 283,0190.
Пример 24: Биологический анализ токсичности в клетках человека in vitro
Данные анализы проводили на контрольных мышечных трубочках человека LHCN-M2 после 14 дней в среде для дифференцировки. Для определения токсичности различных анализируемых соединений, в частности AHK1 и AHK2 в соответствии с настоящим изобретением, данные соединения добавляли в среду для культивирования в течение 24 часов при 37°С при различных концентрациях (0-2 мМ). Для сравнения такой же анализ проводили путем добавления эталонного соединения S-107. Жизнеспособность клеток определяли с помощью колориметрического анализа Cytotox 96 (Promega), следуя инструкциям в руководстве.
Результаты показаны на фигуре 1, на которой можно увидеть, что соединения в соответствии с настоящим изобретением не проявляют острой токсичности in vitro в отношении мышечных трубочек человека при концентрациях между 10 нМ и 2 мМ. Действие соединений AHK1 и AHK2 после 24 часов инкубации противоположно 100% клеточной токсичности, обнаруживаемой для эталонного соединения S-107 при концентрации 1 мМ в идентичных условиях. Эти результаты демонстрируют, что соединения в соответствии с настоящим изобретением обладают более низкой токсичностью, чем у S-107, что свидетельствует о том, что соединения AHK могут быть лучшими кандидатами для терапевтического лечения расстройств, включая атипичный гомеостаз кальция у людей.
Пример 25. Анализы in vitro для определения уровней внутриклеточного кальция в мышечных волокнах у мышей
2+
Волокна, выделенные из мышцы короткого сгибателя пальцев мышей, культивировали в течение ночи в присутствии или отсутствии соединений AHK1 и AHK2 при концентрации 150 нМ. Исходные уровни внутриклеточного кальция оценивали путем инкубации волокон с ратиометрическим флуорохромом Fatio 2-АМ (4 мкМ) и плюроновой кислотой (0.02%) в течение 30 минут при 37°С в среде для культивирования. Волокна рассматривали с помощью цифровой камеры высокого разрешения, а внутриклеточный [Са] оценивали по скорости возбуждения при 340 нм/380 нм.
На фигуре 2 показано действие соединений AHK1 и AHK2 in vitro на уровни внутриклеточного кальция в состоянии покоя в указанных мышечных волокнах мышей. Можно увидеть то, как необработанные дистрофические волокна (MDX) показали значимое увеличение уровней кальция по сравнению с контрольными волокнами (CTRL). Обработка в течение ночи MDX-волокон AHK1 и AHK2 понизила уровни внутриклеточного кальция до контрольных уровней, что демонстрирует возможность снижения наблюдаемых увеличенных уровней внутриклеточного кальция в мышечных волокнах. С учетом данных результатов утверждается, что соединения в соответствии с настоящим изобретением осуществляют такое снижение посредством механизма, включающего модуляцию RyR-канала.
Пример 26. Анализ исследования взаимодействия RyRl с кальстабином in vitro
Данный анализ проводили на контрольных мышечных трубочках человека LHCN-M2 после 9 дней в среде для дифференцировки. Указанные мышечные трубочки предварительно обрабатывали в течение 12 часов соединениями AHK1 и AHK2 при концентрации 150 нМ. После обработки мышечные трубочки подвергали индуцированному пероксинитритом нитро-окислительному стрессу путем добавления SIN1 (5 мМ) в течение 30 минут.
Колокализацию RyR1-кальстабина анализировали при помощи метода близкого лигирования in situ (in situ PLA), для которого применяли набор Duolink II Network Fluorescence от компании Sigma и специфичные к RyR1 и кальстабину-1 антитела. Данный метод позволяет определить точное местоположение двух антигенов, расположенных на расстоянии менее 40 нм друг от друга. Для определения колокализации RyRl-кальстабин-1, для каждого состояния количественно оценивали 3 фотографии с примерно 9 мышечными трубочками в поле, применяя программное обеспечение Image J (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html). Область колокализации в каждом изображении нормировали по области экспрессии миозина, которую определяли при помощи метода иммунофлуоресценции в присутствии конъюгированного с флуоресцеином специфического антитела.
Как показано на фигуре 3, соединения AHK1 и AHK2 в соответствии с настоящим изобретением обладают способностью частично восстанавливаться после ослабления взаимодействия RyR1-кальстабин-1 в культурах мышечных трубочках здорового человека после того, как они подверглись нитро-окислительному стрессу. Анализ взаимодействия RyRl-кальстабин-1 при помощи метода PLA продемонстрировал, что в присутствии SIN1 происходит диссоциация указанного комплекса RyR1-кальстабин-1, и что указанную диссоциацию можно частично предотвратить путем предварительной обработки соединениями AHK1 и AHK2. В верхней части фигуры 3 показана количественная оценка PLA-изображений с использованием Image J, тогда как в нижней части показаны примеры PLA-изображений каждого из состояний, где точки представляют собой взаимодействие RyR1 с кальстабином-1 (калибровочный столбец 50 мкм). Таким образом, анализируемые соединения в соответствии с настоящим изобретением не только улучшают функциональность дистрофических по типу Дюшенна или Беккера мышечных трубочек, но также минимизируют дегенеративные эффекты нитро-окислительного стресса на мышечные трубочки здорового человека путем повышения сродства взаимодействия RyR1-кальстабин-1.
В соответствии с данными результатами, соединения согласно настоящему изобретению могут быть подходящими для применения в качестве терапевтических агентов против заболеваний, вызванных уменьшением сродства взаимодействия RyR1-кальстабин-1 в условиях нитроокислительного стресса.
Пример 27. Биологические анализы на мышах in vivo
Для исследования использовали одномесячных самцов mdx-мышей с дистрофией, приобретенных в Лаборатории Джексона (https://www.jax.org/strain/001801). Биологические анализы для измерения действия соединений Ahulken (AHK) на мышечную функцию проводили на одномесячных мышах, тогда как анализы in vivo для определения действия на сердце и ЦНС были выполнены на четырехмесячных мышах. Мыши в возрасте одного месяца получали лечение соединением AHK1 или соединением AHK2 в течение 5 недель, при котором указанные соединения вводили в питьевой воде в концентрации 0,25 мг/мл. Мышечную силу передних лап измеряли каждую неделю с применением измерителя силы хвата, и полученное значение нормировали по массе тела животного. Для этого следовали указаниям, описанным в протоколе нервно-мышечной сети TREAT-NMD (http://www.treat-nmd.eu/downloads/file/sops/dmd/мDX/DMD_M.2.2.001.pdf). У дистрофических мышей наблюдали значимое уменьшение силы хвата. Однако через 2 недели лечения сила значимо возрастала у mdx-мышей, получавших AHK1 или AHK2, по сравнению с однопометными мышами, не получавшими лечение. Через 5 недель лечения мышечная сила значимо увеличилась на 20% (фигура 4).
Эти данные свидетельствуют о том, что соединения в соответствии с настоящим изобретением могут быть эффективны для лечения пациентов с мышечными дистрофиями путем улучшения мышечной функции или предотвращения мышечной слабости.
После завершения 5-недельного лечения, получали переднюю мышцу большеберцовой кости и обрабатывали ее для последующего биохимического и иммуногистологического анализа для определения степени повреждения мышц. Регенерацию, обусловленную гибелью клеток, определяли в криосрезах мышц путем количественного определения процентного содержания центральных ядер с применением стандартных методов иммунофлуоресценции для определения коллагена IV и ядер клеток. На фигуре 5 показаны примеры криостатных срезов диафрагм контрольных и дистрофических мышей, меченных для визуализаци коллагена IV и DAPI для визуализации ядер. Лечение mdx-мышей в течение 5 недель при помощи AHK1 и AHK2 значимо уменьшило процентное содержание центральных ядер, что наглядно показывает способность указанных соединений снижать гистопатологические маркеры мышечной дистрофии после 5 недель лечения. Эти результаты свидетельствуют о том, что соединения согласно настоящему изобретению эффективны in vivo и достигают скелетных мышц.
В свою очередь, биохимический анализ передней мышцы большеберцовой кости проводили путем выделения РНК и анализа профиля экспрессии генов у контрольных мышей, mdx-мышей и мышей, получавших различное лечение. Для этого применяли чипы для ПЦР в режиме реального времени (RT Profiler PCR Array) (PAHS-099Z, QIAGEN) с применением клеток скелетных мышц человека, клеток в состоянии миогенеза и миопатических клеток, используя смеси кДНК по меньшей мере 3 мышей на группу. Таким образом, был проанализирован профиль экспрессии 84 генов, участвующих в физиопатологических механизмах скелетной мышцы. Эксперименты проводили на приборе для ПЦР в режиме реальном времени Applied Biosystems 7300, а полученные результаты анализировали с применением онлайн-программного обеспечения QIAGEN (http://www.sabiosciences.com/dataanalysis.php).
Лечение mdx-мышей соединением AHK1 в течение 5 недель приводит к частичному восстановлению профиля экспрессии генов у mdx-мышей, как это показано при сравнении экспрессии генов WT- и mdx-мышей на фигуре 5. Имелось 40 генов, экспрессия которых была увеличена у mdx-мышей по сравнению с контрольными, и это число снизилось до 20 у мышей, получавших AHK1 (MDX+AHK1). Ген считали гиперэкспрессированным, когда его экспрессия увеличивалась по меньшей мере в 1,75 раза по сравнению с контролем. В таблице 1 приведен список генов, экспрессия которых увеличивается у mdx-мышей и снижается до контрольных значений, которые частично снижаются или не изменяются при лечении с применением AHK1.
В частности, полученные результаты наглядно показывают, что соединения согласно настоящему изобретению демонстрируют способность наполовину уменьшать число генов, гиперэкспрессируемых в дистрофической mdx-мышце. Гены, которые можно модулировать с помощью соединений АНК, включают, но не ограничиваются ими, Akt1, Bcl2, Casp3, Cast, Cav3, Cryab, Ctnnb1, Dag1, Des, Dysf, Fоксо3, Igfbp3, Igfbp5, Ikbkb, Mapk3, Myod1, Nfkb1, Ppargc1b, Prkaa1, Rps6kb1, Utr, Casp3, Igf2, Il1b, I16, Lmna, Mmp9, Myog, Tgfb1, Tnnc1 и Tnnt1. В этом списке Akt1, Il1b, Mapk3, Mmp9 и Utr представляют собой гены, связанные с потерей или атрофией скелетных мышц.
Для определения того, как соединения согласно настоящему изобретению действуют на сердце и ЦНС, четырехмесячные мыши в течение 5 недель получали лечение соединением AHK2 в питьевой воде в концентрации 0,25 мг/мл. Четырехмесячные mdx-мыши демонстрируют усиленную защитную реакцию после острого стресса, которая не зависит от двигательной, сердечной и дыхательной недостаточности и контролируется центральными механизмами (фигура 7). Острый стресс вызывали при помощи ручной иммобилизации в течение 15 секунд в положении, обычно используемом для проведения внутрибрюшинных инъекций. После острого стресса за указанными мышами наблюдали в течение 1 минуты и рассчитывали % времени, в течение которого мышь остается неподвижной, или периоды тонической неподвижности по меньшей мере в 1 секунду с 90% чувствительностью при определении неподвижности. В неподвижности мышей, которые не подвергались стрессу, не наблюдалось никаких различий, а это свидетельствует о том, что усиленный защитный ответ, демонстрируемый mdx-мышами, не зависит от двигательных нарушений. Лечение AHK2 в течение 5 недель значительно улучшает связанный с усиленным защитным ответом фенотип ЦНС у mdx-мышей. Эти результаты свидетельствуют о том, что соединения согласно настоящему изобретению эффективны in vivo для лечения изменений в функции головного мозга и достигают ЦНС.
Миокард четырехмесячных дистрофических mdx-мышей очень чувствителен к механическому стрессу, и соединение изопротеренол вызывает у этих мышей кардиомиопатию (фигура 8). Целостность сарколеммы кардиомиоцитов определяли путем измерения поглощения красителя Evans Blue, который накапливается в кардиомиоцитах с поврежденной мембраной. Краситель Evans Blue вводили за 24 часа до извлечения сердца в концентрации 10 мг/мл при путем внутрибрюшинной инъекции (10 мкл/г массы тела). Повреждение мембраны изопротеренолом осуществляли с помощью 3 последовательных внутрибрюшинных инъекций бета-изопротеренола (350 нг/г массы тела) через 18, 20 и 22 часа после введения Evans Blue для определения степени повреждения мышц. Регенерацию, обусловленную гибелью клеток, определяли в криосрезах мышц путем количественного определения процентного содержания центральных ядер с применением стандартных методов иммунофлуоресценции для определения коллагена IV и ядер клеток. На фигуре 8 показаны примеры криостатных срезов сердец контрольных мышей и дистрофических мышей с инъецированным красителем Evans Blue для визуализации повреждения сердца, вызванного изопротеренолом. Лечение mdx-мышей AHK2 в течение 5 недель повышает целостность сарколеммы кардиомиоцитов у mdx-мышей и защищает миокард от повреждения, вызванного изопротеренолом, что свидетельствует о том, что указанное соединение достигает сердечной мышцы, способно модулировать рианодиновый рецептор типа 2 (RyR2) и является эффективным для предотвращения кардиомиопатий in vivo.