Способ моделирования длительно незаживающих ран для оценки ранозаживляющего действия биомедицинских клеточных продуктов
METHOD FOR SIMULATING LONG-TERM NON-HEALING WOUNDS TO ASSESS WOUND-HEALING ACTION OF BIOMEDICAL CELL PRODUCTS

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, в частности к способу моделирования длительно незаживающих ран для научно-исследовательских экспериментальных работ и доклинических испытаний биомедицинских клеточных продуктов, и предназначено для оценки эффективности лечения длительно незаживающих ран. Моделирование длительно незаживающей раны на мелких лабораторных животных может быть использовано для возможности дальнейшего наблюдения за процессами репарации и регенерации при различных способах лечения, в частности при доклинических испытаниях новых лекарственных средств.
Уровень техники
Длительно незаживающая рана - рана, сроки заживления которой превышают нормальный период регенерации, характерный для данного биологического вида. К длительно незаживающим ранам относят трофические язвы, в том числе ишемизированные, диабетические язвы, незаживающие раны, возникающие в месте травмы, оперативного вмешательства, термического или химического поражения кожных покровов, пролежни.
Известны способы и устройства для моделирования ран различной этиологии. Например, способ моделирования трофической язвы венозной этиологии в эксперименте, включающий иссечение кожи в исследуемой зоне у экспериментального животного до поверхностной фасции в виде круга, после чего по краям раны накладывают кисетный шов, а также кожно-фасциальные узловые швы, отличающийся тем, что у кролика линии Шиншилла интраоперационно на внутренней поверхности бедра обеспечивают оперативный доступ к бедренной вене с последующим прошиванием через центр сосуда проленом 7/0 и перевязкой 1/2 вены до сужения просвета в 2 раза; далее на той же конечности ниже уровня перевязки после выполнения иссечения кожи в исследуемой зоне до поверхностной фасции в виде круга диаметром 40 мм на поверхности дна образованной раны выполняют рассечение поверхностной фасции поперечными и продольными взаимно перпендикулярными разрезами, по краям раны накладывают кисетный шов, стягивают, доводя рану в диаметре до 20 мм, накладывают кожно-фасциальные узловые швы. (Патент РФ №2618653, 23.05.2016).
К недостаткам известного способа следует отнести:
- способ обеспечивает ухудшение кровоснабжения раны, однако, не полное его прекращение;
- образование трофической язвы происходит только через две недели после нанесения раны указанным способом;
- использование для моделирования дорогих более крупных лабораторных животных накладывает ограничения на количество животных в экспериментальных группах, что относится к причинам, препятствующим достижению технического результата в области оценки результата лечения в связи с малой статистической выборкой животных в эксперименте;
- локализация раны на лапе животного неудобна для наложения на рану биомедицинского клеточного продукта и для наблюдения за состоянием раны. Причиной, препятствующей достижению результата при моделировании раны в такой локации, является: высокая вероятность повреждения собственной раны животным (например, вылизывание, расчесывание и сгрызание повязок, удаление швов);
- наличие хирургических швов по краям раны технически не соответствует человеческой патологии и способствует возникновению побочных эффектов (например, нетипичному образованию рубцов по краям раны в местах наложения швов), что является причиной несоответствия данного процесса таковому у человека.
- рассечение поверхностной фасции поперечными и продольными взаимно перпендикулярными разрезами приводит к активному кровотечению, что неблагоприятно для испытаний биомедицинских клеточных продуктов по причине раннего лизосомного лизиса биомедицинского клеточного продукта;
- механическое бритье перед оперативным вмешательством травматично для кожи и может повлиять на течение регенеративных процессов.
Известно устройство для моделирования ран кожи, выполненное в виде кольца со средствами фиксации, отличающееся тем, что кольцо выполнено плоским из полимера, а средства фиксации выполнены в виде нерассасывающихся шелковых лигатур, которые проходят через отверстия в кольце, расположенные равномерно по окружности, равноудаленной от наружной и внутренней стенок кольца, причем оси отверстий параллельны оси кольца. Данное устройство позволяет моделировать длительно незаживающие раны кожи у резистентных животных с устойчивой регенерацией кожных покровов при длительном сроке полной эпителизации раны и может быть использовано при исследовании кинетических, патоморфологических, микробиологических и биохимических процессов длительного ранозаживления в условиях экспериментальной лаборатории; например, при изучении средств, ускоряющих репаративные процессы в коже: лекарственных, физиотерапевтических, перевязочного материала и трансплантатов (Патент РФ №72348 (U1), 06.11.2007).
К недостаткам данного способа можно отнести:
- Устройство для моделирования хронических ран кожи в виде кольца из полимера является массивной конструкцией, которая может быть удалена животным из раны на любых сроках эксперимента, что является причиной, препятствующей достижению указанного технического результата в связи с тем, что рана в отсутствие кольца переходит из длительно незаживающей в острую;
- наличие хирургических швов из нерассасывающихся шелковых лигатур по краям раны способствует возникновению побочных эффектов, что является причиной несоответствия течения данного процесса таковому у человека.
- наличие непрозрачного пластикового кольца на краю раны препятствует визуальной оценке состояния кожи вокруг края раны и оценке регенеративной активности биомедицинских клеточных продуктов во время экспериментов.
Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является способ моделирования ишемизированных ран, описанный в статье [Biswas S., Roy S., Banerjee J. et al. Hypoxia inducible microRNA 210 attenuates keratinocyte proliferation and impairs closure in a murine model of ischemic wounds / Biswas S.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2010. - 107(15). - 6976-81]. Использовали 8-недельных мышей линии C57BL/6. Животным после анестезии сбривали шерсть на спине, стерилизовали места разреза и проводили два полнослойных параллельных разреза длиной 30 мм, расстояние между разрезами 10 мм, формировали лоскут на двух ножках. Края разрезов каутеризировали. Посередине лоскута формировали рану диаметром 3 мм.
К недостаткам данного способа относятся:
- механическое бритье перед оперативным вмешательством травматично для кожи и может повлиять на течение регенеративных процессов;
- данный способ выполняется на 8-недельных мышах линии C57BL/6. Длительно незаживающая рана является преимущественно патологией людей зрелого возраста, а возраст 8 недель является молодым для мышей, что отдаляет данную модель от человеческой патологии.
-линия C57BL/6 характеризуется достаточно быстрым протеканием регенеративных процессов, что затрудняет моделирование раны, существующей на протяжении длительного времени.
- размер раны 3 мм является неудобным для аппликации биомедицинского клеточного продукта;
- наличие ран с двух сторон от лоскута создает фон, что ухудшает валидируемость результатов эксперимента;
- отсутствие повязки делает невозможным трансплантации в рану биомедицинского клеточного продукта в связи с невозможностью его фиксации в ране, а так же с высоким риском инфицирования раны;
- каутеризация краев лоскута способствует возникновению побочных эффектов, что является причиной несоответствия течения данного процесса таковому у человека;
- нанесения параллельных разрезов на кожу без лигирования всех сосудов, кровоснабжающих лоскут недостаточно для развития ишемии.
Раскрытие сущности изобретения
Поскольку одной из ключевых причин, приводящих к приобретению раной статуса длительно незаживающей, является ишемия в кожном лоскуте, в качестве разновидности длительно незаживающей раны для моделирования нами была выбрана ишемизированная длительно незаживающая рана. Задачей настоящего изобретения является подбор модельного животного и создание способа моделирования раны, который бы обеспечивал продолжительный период раневого заживления, необходимое ишемическое микроокружение кожи в области раны, протекание раневого процесса у животного адекватно течению данного процесса у человека.
Чтобы решить поставленную задачу мы предлагаем способ моделирования длительно не заживающей раны, заключающийся в том, что с кожи лабораторного животного в межлопаточной области удаляют волосяной покров, затем по центру межлопаточной области иссекают кожу до поверхностной фасции в виде круга диаметром 5-7 мм, формируя круглую рану, затем проводят два полнослойных параллельных разреза кожи, симметричных по отношению к круглой ране, длиной 30 мм, на расстоянии 10 мм друг от друга, полностью отсекают от полученного лоскута все крупные сосуды, затем накладывают на края лоскута хирургические швы.
Край раны не содержит удерживающих конструкций (колец), что приближает предложенную модель к человеческой кожной ране.
Технический результат заявляемого изобретения заключается в следующем. Для моделирования используются мелкие лабораторные животные, дешевизна содержания и использования которых позволяет провести эксперимент на большем количестве животных и, следовательно, получить большую статистическую выборку и повысить достоверность полученных данных. Шерсть животного не сбривают, а состригают, а затем депилируют кремом для депиляции, что обеспечивает меньшее раздражение кожи в области нанесения раны. Рана наносится на спину животного, что препятствует ее повреждению самими животным в процессе эксперимента. Необходимая степень ишемии в области раны достигается путем формирования лоскута, отсеченного от всех крупных сосудов, что обеспечивает повышение точности моделирования длительно не заживающей раны.
Также при использовании предлагаемого способа отсутствуют такие негативные факторы, как:
- активное кровотечение в ране;
- наличие вспомогательных конструкций (швов, колец) по краям раны, что позволяет моделировать заживление раны не через контракцию (стягивание раны), а через рубцевание и эпителизацию.
- использование цитотоксичных антисептических растворов;
- локализация раны, затрудняющая проведение эксперимента.
Способ осуществляется следующим образом
Моделирование длительно незаживающей кожной раны в эксперименте проводят на мышах линии balb/c. Предварительно животное наркотизируют с помощью препарата авертин, который вводят в дозе 300 мг/кг внутрибрюшинно. Затем производят выстригание шерсти ножницами и депиляцию с последующим удалением волос при помощи крема для депиляции («Veet» или аналогичного) на участке по центру спины мыши в лопаточной области размером 20×40 мм.
После депиляции по центру спины в лопаточной области иссекают полнослойное циркулярное отверстие с диаметром 5-7 мм по центру спины. Затем наносят два полнослойных параллельных разреза кожи от шейного отдела к нижней части спины мыши, симметричных относительно отверстия. Длина разрезов составляет 30 мм, расстояние между разрезами 10 мм. Участок кожи между разрезами отделяют от подкожной фасции и всех сосудов, кровоснабжающих полученный лоскут с краниальной и каудальной стороны, а также располагающихся латерально относительно лоскута. Края кожного лоскута вворачивают внутрь раны и на них накладывают хирургические швы, по 6 с каждой стороны. Таким образом, получается Н-образный ишемизированный кожный лоскут с круглой раной по центру.
Краткое описание чертежей и иных поясняющих материалов.
На фиг. 1 изображена схема осуществления способа нанесения длительно незаживающей раны на спину мыши.
1. - Хирургические швы, наложенные на края ишемизированного кожного лоскута.
2. - Длительно незаживающая циркулярная рана по центру лоскута.
3. - Параллельные разрезы, формирующие Н-образный кожный лоскут;
4. - Кровеносные сосуды, отсекаемые при формировании ишемизированного лоскута.
Осуществление изобретения.
Изобретение иллюстрируется следующим примером.
Мышей линии balb/c после предварительной депиляции кремом «Veet» и обработки кожи в асептических условиях 70% спиртом под наркозом (с помощью препарата авертин в дозе 300 мг/кг) иссекают полнослойное циркулярное отверстие с диаметром 5-7 мм по центру спины. Затем наносят два полнослойных параллельных разреза кожи от шейного отдела к нижней части спины мыши, симметричных относительно позвоночника. Длина разрезов составляет 30 мм, расстояние между разрезами 10 мм. На участке кожи между разрезами проводят отсечение подкожной фасции и всех сосудов, кровоснабжающих полученный лоскут с краниальной и каудальной стороны, а также располагающихся латерально относительно лоскута. Края кожного лоскута вворачивают внутрь раны и фиксируют герметичными узловыми лигатурами. С каждой стороны накладывают по 6 лигатур шелковой нитью.
Через 14 суток после операции при гистологическом исследовании длительно незаживающая рана на ишемизированном кожном лоскуте характеризовалась отсутствием эпителизации и зрелого рубца, преобладанием клеточного компонента над волокнами. При иммуногистохимическом исследовании была выявлена положительная окраска на маркеры некроптоза RIPK-1 и RIPK-3, характерные также для воспалительных клеток. Наличие воспалительных клеток в раневом ложе на 14 сутки является аномальным и свидетельствует о длительно незаживающем статусе раны.
Предлагаемый способ был произведен в 3 сериях экспериментов и показал стабильность воспроизведения, был доступен, не требовал дорогостоящего оборудования. Способ может применяться для изучения процессов регенерации и клеточной гибели в раневом заживлении, а также для доклинических исследований медицинских препаратов, предназначенных для терапии длительно незаживающих ран.