Аллозимная изменчивость дуба черешчатого Quercus robur l (Fagaceae) в изолированных популяциях на восточной границе ареала

Муллагулов Р.Ю., Редькина Н.Н., Янбаев Ю.А.

Сибайский институт (филиал) Башкирского государственного университета

АЛЛОЗИМНАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ДУБА ЧЕРЕШЧАТОГО QUERCUS йОВий L. (FAGACEAE) В ИЗОЛИРОВАННЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ НА ВОСТОЧНОЙ

ГРАНИЦЕ АРЕАЛА

С использованием изоферментных маркеров 17 локусов на территории Башкирского Зауралья исследована генетическая структура двух изолированных популяций дуба черешчатого, находящихся на крайней восточной границе ареала в экстремальных для вида экологических условиях. Выявлена уникальность их генофонда и относительно слабая межвыборочная подразделенность.

В последние два десятилетия значительная часть экологических исследований посвящена изучению генетического разнообразия редких и исчезающих растений. Основанием для этого служат значительные антропогенные изменения среды обитания живых организмов, к которым особенно чувствительна эта категория [3, с. 12]. Видам, для которых угроза генофонду существует на популяционном уровне (для отдельных популяций), придается меньше внимания. Однако некоторые из них, особенно находящиеся вне зоны экологического оптимума, требуют охраны из-за адаптации к местным условиям среды и уникальности генофонда. По ряду причин в этом отношении представляет интерес изучение генетической структуры популяций дуба черешчатого (2иетеиз гоЬиг Ь.) на восточной части ареала.

Цель данного сообщения - оценка генетической изменчивости и дифференциации двух популяций дуба черешчатого из Башкирского Зауралья (Баймакский район Башкортостана). Они изолированы от дубняков западного макросклона Южно-Уральских гор и Башкирского Предуралья полосой сосновоберезовых и березовых лесов шириной более 100 км, протянутой с севера на юг по всему Южному Уралу. Насаждения представляют пример жесткой репродуктивной изоляции в условиях практически полного отсутствия генетического потока извне. Популяция, условно обозначенная нами Агк, насчитывает всего 7 особей репродуктивного возраста. Она находится в условиях горной степи на вершине холма. Другое насаждение (Кш) расположено северо-западнее на расстоянии около 20 км в условиях горной лесостепи, и дуб здесь входит в состав березового древостоя как при-

месь. Всего нами обнаружено 20 деревьев в возрасте плодоношения.

Для лабораторных анализов с каждого дерева в зимнее время бышо срезано по одной ветке и помещено в воду при комнатной температуре. Изоферменты из начавших распускаться почек были использованы для разделения в полиакриламидном диск-электрофорезе в вертикальных пластинах 7,5%-ного геля с рН 8.9. Детальное описание использованных методик электрофоретического анализа и гистохимического окрашивания приведено ранее [2, с. 1566]. Исследована изменчивость следующих ферментов: 6-фосфоглю-конатдегидрогеназы (6PGDH, E.C. 1.1.1.44.), шикиматдегидрогеназы (SKDH, E.C. 1.1.1.25), глутаматдегидрогеназы (E.C. 1.4.1.2.), форми-атдегидрогеназы (FDH, E.C. 1.2.1.2.), алани-наминопептидазы (AAP, E.C. 3.4.11.1.), лейци-наминопептидазы (LAP, E.C. 3.4.11.2.) диафо-разы (DIA, E.C. 1.6.4.З.), НАДНдегидрогена-зы (NADHDH, E.C. 1.6.99.2.), флуоресцентной эстеразы (FE, E.C. 3.1.1...), малатдегидроге-назы (MDH, E.C. 1.1.1.37.), аспартатаминот-рансферазы (AAT, E.C. 2.6.1.1.), малик-энзима (ME, E.C. 1.1.1.40.).

Для исследования генетического разнообразия и дифференциации популяций применены показатели и процедуры, определяемые компьютерной программой BIOSYS-1 [7, с. 281], - частота аллелей rA, доля полиморфных локусов Р, наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность HO (и HE соответственно), параметры F-статистики Райта FIS, FIT и FST, коэффициент инбридинга F, генетическое расстояние М. Нея D, оценка соответствия наблюдаемых распределений генотипов теоретически ожидаемым частотам по правилу Харди - Вайнберга. Характеристика па-

раметров и использованные для расчетов формулы были приведены ранее [2, с. 15бб].

Aнализ электрофореграмм показал, что аспартатаминотрансфераза в гелях обнаруживается в виде двух мономорфных зон активности, из них электрофоретически более подвижная область выявляется лишь при длительном инкубировании.

Малатдегидрогеназа окрашивается в виде трех инвариантных зон активности MDH-1, MDH-2, MDH-3.

При окрашивании гелей на выявление диафоразы наблюдаются минимум три зоны активности без изменчивости. Две из них, в ближней к катоду части геля, представляют аллозимы HAДHдегидрогеназы. Они выявляются и при отсутствии субстрата диафо-разы при наличии только кофактора HAДH (являющегося субстратом NADHDH). Гистохимически наиболее активная зона контролируется мономорфным локусом Dia-1.

Малик-энзим кодируется одним моно-морфным локусом с высокой гистохимической активностью его изофермента.

Частоты аллозимов (изоферментов одного локуса) изменчивых ферментов приведены в табл.

У флуоресцентной эстеразы обнаружены три зоны изоферментов, из которых две ближние к катоду зоны мономорфны. В FE-1 обнаружен слабый полиморфизм, а фермент, по-видимому, димер - у гетерозигот наблюдаются трехполосные спектры.

6-Фосфоглюконатдегидрогеназа выявляется в виде одной зоны активности 6PGD-1 с одно- и трехполосными фенотипами у отдельных деревьев, что доказывает димерность фермента у дуба черешчатого. Среди изученных 26 деревьев мы обнаружили 3 аллозима, один из которых доминирует в обеих выборках. В ближней к катоду части геля наблюдалась дополнительная относительно слабая гистохимическая активность, однако надежная интерпретация изменчивости в этой зоне не была возможна.

Шикиматдегидрогеназа также выявлялась в виде двух областей активности, из которых надежной интерпретации поддавалась зона Skdh-1 с большей электрофоретической подвижностью. Мономерность фермента

доказывается наличием двухполосных фенотипов ферментов у гетерозиготных и однополосных - у гомозиготных деревьев. В обоих насаждениях найдены по два аллозима, один из которых доминирует по частоте.

Единственная зона глутаматдегидроге-назы выявляется в виде четких одинарных полос у гомозигот. У гетерозиготных деревьев образуется диффузная зона активности, включающая, видимо, гибридные молекулы. При длительном разделении глутаматдегид-рогеназы в диффузной зоне удается различить до 7 полос, как это наблюдается у гек-самерных ферментов. ^ибольшую частоту имеет первый по электрофоретической подвижности аллозим.

При окрашивании гелей для выявления аланинаминопептидазы наблюдается активность в двух областях. Aллозимы ближайшей к катоду зоны активности одинаково выявляются при использовании субстратов как аланинаминопептидазы, так и лейцинамино-пептидазы. Обнаружены два аллозима с сопоставимыми частотами. Электрофоретичес-ки более подвижная зона при использовании субстрата лейцинаминопептидазы состоит из множества полос. Спектр представляет собой сумму аллозимов лейцинаминопептидазы и аланинаминопептидазы, причем из-за перекрывания изоферментных полос диагностировать изоферменты не представляется возможным. Если используется субстрат алани-наминопептидазы, в гелях выявляются лишь ее три аллозима. У отдельных гетерозиготных деревьев образуются двухполосные фенотипы Aар-1 и Aар-2, что характерно для мономерных ферментов.

Формиатдегидрогеназа контролируется одним локусом Fdh-1 с 3 аллелями, две из которых являются относительно частыми. Третий редкий аллель встречается лишь в выборке Ark. Фермент у дуба черешчатого является димером - у гетерозиготных деревьев наблюдаются трехполосные фенотипы.

Таким образом, использованная нами методика электрофоретического анализа позволила нам выявить 10 мономорфных ло-кусов и надежно идентифицировать аллозимы 7 полиморфных локусов. Полученные нами данные об особенностях генетической

изменчивости изученных ферментов в целом соответствуют данным по дубу черешчато-му из других регионов [3, с. 29-30]. У видов дуба аллозимы формиатдегидрогеназы ранее не были исследованы.

Результаты полокусного генетического анализа приведены в табл. В среднем для 17 локусов из выборок Kus и Ark получены следующие величины генетического разнообразия: число аллелей A = 1.52 ± 0.2 и A = 1.47 ± 0.2, доля полиморфных локусов в обоих местообитаниях P = 0.412 и P = 0.353, ожидаемая гетерозиготность HE = 0.124 ± 0.051 и HE = 0.118 ± 0.046, наблюдаемая HO- = 0.145 ± 0.053 и HO = 0.138 ± 0.049 соответственно. Эти оценки ниже, чем сообщается [6, с. 191] для покрытосеменных (A = 2.10, P = 0.595, HE = 0.183) и коренных (A = 2.27, P = 0.660, HE = 0.182) видов, растений лесной и лесостепной зон (A = 2.58, P = 0.825, HE = 0.206), организмов, распространяющих семена с использованием гравитационного механизма (A = 2.48, P = 0.619, HE = 0.144). Для дуба черешчатого из западного макросклона Южно-Уральских гор, по нашим данным [1, с. 15], показатели генетического разнообразия следующие: (A = 3.76, P = 0.71, HE = 0.264). В локусах дуба черешчатого в 9 популяциях Южного Урала выявлено большее аллельное разнообразие [1, с. 14]. В частности,

у 6Pgdh-1, Gdh-1 Fdh-1, в отличие от выборок Kus и Ark, обнаружены по 5 аллелей, в Dia-1 - 6, в Aap-2 - 7 и в Aap-1 - 9. Таким образом, сравнительно низкие уровни генетической изменчивости дуба черешчатого в Башкирском Зауралье обусловлены, видимо, особенностями их генетической структуры.

В малых изолированных популяциях, аналогичных изученным нами (крайне малая численность, полная генетическая изоляция), теоретически должны ощущаться последствия воздействия дрейфа генов [2, с. 1569]. Однако выявленный феномен относительно низкой генетической изменчивости, видимо, обусловлен лишь статистическими причинами - небольшие выборки уже благодаря ограниченности объема не могут представлять большую часть генофонда. Дрейф генов стремится к фиксации аллелей - доведению их частот до 0 или 1.000. Но в таких полиморфных локусах, как Aap-1, Aap-2, Gdh-1, Fdh-1 и 6Pgdh-1, альтернативные аллели имеют сопоставимые частоты, локусы характеризуются высокой гетерозиготностью, обнаружены редкие аллели. Кроме того, при воздействии этого микроэволюционного фактора в каждой изолированной малой популяции фиксация происходит для разных аллелей. А выборки Kus и Ark похожи по частоте как доминирующих, так и относительно редких

Таблица. Генетическое разнообразие в изолированных местообитаниях Quercus robur L.

Локус Na га He Ho F D FST

Kus Ark Kus Ark Kus Ark Kus Ark

Aap-1 1 2 3 0.474 0.184 0.342 0.286 0.143 0.574 0.625 0.571 0.632 0.571 (+) 0.011 0 0.116 0.036

Aap-2 1 2 0.289 0.711 0.143 0.857 0.411 0.245 0.368 0.286 (+) 0.105 (-) 0.167 0.025 0.032

Gdh-1 1 2 0.737 0.263 0.786 0.214 0.388 0.337 0.211 0.143 (+) 0.456 (+) 0.576 0.003 0.003

Fdh-1 1 2 3 0.395 0 0.605 0.143 0.071 0.786 0.478 0.357 0.579 0.429 (-) 0.211 (-) 0.202 0.085 0.057

Skdh-1 1 2 0.026 0.974 0.214 0.786 0.051 0.337 0.053 0.429 (-) 0.040 (-) 0.273 0.029 0.083

6Pgdh-1 1 2 3 0.026 0.816 0.158 0 0.786 0.214 0.309 0.337 0.211 0.143 (+) 0.317 (+) 0.576 0.003 0.004

Fe-1 1 2 0.079 0.079 0 1.000 0.145 0 0.053 0 (+) 0.634 0 0.004 0.041

Примечания: NA и rA - номера и частоты аллелей, * - с учетом мономорфных локусов.

аллелей (табл.). О сходстве генофонда свидетельствуют и небольшая величина генетических расстояний, в том числе их полокус-ные значения. В среднем Б = 0.011 - это уровень, характерный для близко расположенных популяций таких видов, как сосна обыкновенная и ель сибирская [1, с. 18]. Кроме того, в среднем по 7 полиморфным локусам показатель межвыборочной подразделенно-сти Р8Т = 0.034. Другими словами, из общей изменчивости двух популяций 94.6% представлены внутрипопуляционной компонентой, а межвыборочная составляющая равна всего 3.4%. Еще одним аргументом в пользу отсутствия воздействия дрейфа генов на генофонд двух изученных популяций является то, что состав генотипов сбалансирован и статистически достоверно не отличается от распределения, ожидаемого по правилу Харди - Вайнберга. В то же время нельзя исключить, что в следующих поколениях популяций дрейф генов будет формировать генетическую структуру в качестве ведущего мик-роэволюционного фактора.

В малых изолированных популяциях теоретически должно ощущаться влияние и другого фактора - инбридинга. Однако наши данные не позволяют подтвердить его существенную роль в формировании генетической структуры изученных двух популяций. Конечно, коэффициенты инбридинга особей относительно изученной популяции и вида в целом, вычисленные для 7 полиморфных локусов , выше нуля (в среднем Б18 = + 0.106 и БГТ=

+ 0.136). Но положительные значения индекса фиксации характерны для дуба черешча-того и в больших по объему популяциях [5, с. 186]. Так как вероятность самоопыления у дубов низка, дефицит гетерозигот объясняется семейной кластеризацией деревьев из-за небольшого радиуса распределения пыльцы и семян, сильного варьирования сроков фенологических фаз [4, с. 91]. Для южноуральских популяций коэффициент инбридинга в среднем на одну выборку составил F = + 0.230 [3, с. 30], то есть больше, чем в популяциях Kus и Ark с крайне малой численностью (для 7 полиморфных локусов F = + 0.145).

Изученные нами популяции, находящиеся вне основного ареала вида и обладающие уникальной генетической структурой, представляют интерес в качестве объектов сохранения генофонда. Безусловно, их в первую очередь нужно охранять in situ. Кроме того, семенной материал обоих насаждений мы рекомендуем использовать для искусственного лесовозобновления в условиях засушливого Башкирского Зауралья с сильно континентальным климатом. По проведенным наблюдениям в обоих насаждениях образуется достаточно много семян, формируется подрост. Использование в лесокультурных целях в регионе семенного материала из исследованных популяций (что будет сохранением генофонда популяций ex situ) представляется предпочтительнее из-за большей вероятности лучшей адаптации к местным жестким лесорастительным условиям.

Список использованной литературы:

1. Янбаев Ю.А., Байрамгулов Н.Р., Редькина Н.Н. и др. Межпопуляционная дифференциация родиолы иремельской (Rhodiola iremelica Boriss., Grassulaceae) на Южном Урале / // Генетика. - 2007. - Т. 43. - №11. - С. 1565-1570.

2. Янбаев Ю.А., Косарев М.Н., Бахтиярова Р.М. и др. Генетические аспекты сохранения биологического разнообразия. - Уфа: БГУ, 2000. - 108 с.

3. Янбаев Ю.А. Эколого-популяционные аспекты адаптации лесообразующих видов к условиям природной и техногенной среды / Автореф. дисс. докт. биол. наук. - Тольятти: Институт экологии Волжского бассейна РАН, 2004. - 35 с.

4. Dicousso A., Michaud H., Lumaret R. Reproduction and gene flow in the genus Quercus L. // Ann. Sci. - 1993. Vol. 50. Suppl. 1. 91s - 106s.

5. Kremer A., Petit R.J. Gene diversity in natural populations of oak species // Ann. Sci. For. - 1993. - Vol. 50 (Suppl. 1). - P. 186-202.

6. Hamrick J.L., Godt M.J.W. Allozyme diversity in plant species //Plant population genetics, breeding, and genetic resources. (Brown H.D., Clegg M.T., Kahler A.L., Weir B.S. eds.) - 1989. - P. 43-63.

7. Swofford D.L., Selander R.B. BIOSYS-1: a FORTRAN program for the comprehensive analysis of electrophoretic data in population genetics and systematics // J. Heredity. 1981. V. 71. P. 281-283.

Статья рекомендована к публикации 08.01.08