Разработка тест-системы на основе полимеразной цепной реакции (пцр) в реальном времени для дифференциальной диагностики микобактерий

РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ

ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР) В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ

МИКОБАКТЕРИЙ

Н.И. Потапова3, Т.В. Гребенникова1, А.Д. Забережный1, М.А. Краснова2, О.И. Скотникова2, Т.И. Алипер1, Е.А. Непоклонов1

1 Институт вирусологии им. Ивановского, ул. Гамалеи, 16,

123098, Москва, Россия

2 Московский городской научно-практический центр борьбы с туберкулёзом при Департаменте здравоохранения г. Москвы, ул. Стромынка, 10, 107014, Москва, Россия 3Кафедра фармацевтической и токсикологической химии, медицинский

факультет, РУДН, ул. Миклухо-Маклая, 8, 117198, Москва, Россия

В статье представлена разработка тест-системы на основе ПЦР в реальном времени для дифференциальной диагностики М.tuberculosis и M.bovis в культурах клеток и в первичном биологическом материале. Было проанализировано 50 образцов ДНК, полученных из культур и образцов мокроты туберкулезных больных. Результаты сравнения тест-системы ПЦР в реальном времени и двух тест-систем на основе ПЦР показывают высокую сходимость результатов. Показана возможность проведения мультиплексной ПЦР в реальном времени.

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время туберкулез является одним из самых распространенных в мире инфекционных заболеваний.

Возбудитель туберкулеза - грамположительная бактерия, устойчивая к действию различных физических воздействий и химических агентов.

По уровню смертности от инфекционной патологии туберкулез занимает первое место в мире [1].

К 1993 году туберкулезом была инфицирована 1/3 населения планеты. По прогнозам экспертов ВОЗ к 2020 году в мире появится ещё 200 млн. новых случаев туберкулеза, 70 млн. человек умрет от этой инфекции. Главную опасность представляют лекарственно устойчивые штаммы микобактерий, способные превратить туберкулез в неизлечимое заболевание.

Вполне понятно, что основным методом борьбы с туберкулезом является своевременное выявление заболевания и его лечение (Барри Р., 2000).

Диагностика туберкулеза осложнена наличием более 70 самостоятельных видов рода Mycobacterium, которые обладают различной патогенностью.

Традиционные микробиологические методы выявления возбудителя в настоящее время уже не удовлетворяют клиницистов. Быстрый метод бастериоскопии обладает низкой чувствительностью: для обнаружения микобактерий необходимо, чтобы 1 мл материала содержал не менее 100 тыс. микробных клеток. Люминесцентная микроскопия имеет большую

чувствительность, чем стандартные методы микроскопии на 10-30%. Чувствительность бактериологического посева значительно выше - 20-100 микобактерий туберкулеза, однако исследование занимает длительное время - один-два месяца [2].

В последние годы широко используется метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), основанный на ферментативной амплификации специфических участков генома [4]. Метод ПЦР отличается высокой чувствительностью, специфичностью, быстротой проведения анализа, позволяет определять как активные, так и латентные формы возбудителей заболеваний.

Самой современной и эффективной модификацией метода ПЦР является метод ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR) [5]. Отличительными особенностями метода являются: более высокая скорость проведения анализа по сравнению с обычной ПЦР, повышение чувствительности метода за счет наличия внутреннего праймера (зонда), возможность не только качественного, но и количественного определения исходного генетического материала, Существенными преимуществами метода являются также снижение риска контаминации за счет проведения всех стадий ПЦР в одной пробирке, отсутствие стадии электрофореза, возможность создания мультиплексных систем, позволяющих определять несколько возбудителей в одной пробирке.

В данной статье представлена разработка тест-системы на основе ПЦР в реальном времени для дифференциальной диагностики микобактерий. Показана возможность дифференциальной диагностики M.tuberculosis и M.bovis с использованием образцов культур клеток и мокроты от пациентов на разных этапах развития туберкулезного процесса, полученных из Московского научно-практического центра борьбы с туберкулезом. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ДНК микобактерий. Для исследования использовали 50 образцов ДНК микобактерий, выделенных из культур (10 образцов) и мокроты пациентов с разными формами туберкулёза (40 образцов), находившихся на лечении в Московском научно-практическом центре борьбы с туберкулёзом при Департаменте здравоохранения г. Москвы (МГНПЦБТ). Данные образцы также были ранее охарактеризованы бактериологическим методом.

Тест системы на основе ПЦР. Использованы тест-системы на основе ПЦР производства НПО «НАРВАК» (ТУ 9388-040-00008064-99) и Cobas Amplicor фирмы La Roche (Швейцария). Анализ проводился по методике производителей.

Электрофорез ДНК в агарозном геле. Фрагменты ДНК анализировали методом гель-электрофореза, используя Трис-ацетатный буфер, содержащий бромистый этидий в концентрации 0,4 - 0,5 мкг/мл. Г ели анализировали, используя трансиллюминатор с ультрафиолетовым светом с длиной волны 254 нм. Фотографирование гелей осуществлялось фотокамерой «Полароид» с оранжевым светофильтром.

Синтетические олигонуклеотиды, флуоресцентные зонды. Подбор олигонуклеотидов (праймеров) произведен на компьютере Power Macintosh 6100/66 с помощью программ: Amplify 1,0; Oligo 4,0-s; AssemblylIGN.

Для проведения ПЦР в реальном времени были подобраны 4 пары специфических олигонуклеотидных праймеров. Первая пара олигонуклеотидов mtp40F-mtp40R, с помощью которых получен фрагмент в 119 пар оснований, имела специфические места посадки на гене, присутствующем только в геноме М.tuberculosis. Вторая пара олигонуклеотидов mpb70F- mpb70R, с помощью которых получен фрагмент в 84 пары оснований, специфична гену, входящему в состав генома не только M.tuberculosis, но и M.bovis. Флуоресцентные зонды имеют места посадки внутри последовательностей, ограниченных первой и второй парой олигонуклеотидов и имеют следующие пары краситель-гаситель флуоресценции: 5TAM-3TAMRA и 5'TAMRA-3'BHQ2. Синтез олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов произведен в ЗАО «Синтол» г.Москва.

Проведение ПЦР в реальном времени. ПЦР в реальном времени проводили на приборе Applied Biosystems ABI PRISMTM 7700 Sequence Détection System. Использовали следующие параметры ПЦР: 1 цикл -95°С, 10 минут; 45 циклов - 95°С, 15 секунд, 60°С, 1 минута. Реакционная смесь, конечным объемом 25 мкл, содержала 5 мкл ДНК, 10 pmol каждого олигонуклеотидного праймера, 2 pmol флуоресцентного зонда и 12,5 PCR-раствора, содержащего ДНК-полимеразу, дезоксирибонуклеотид-трифосфаты, буфер, пассивный контроль (краситель ROX). Результаты ПЦР в реальном времени отслеживались на экране монитора компьютера в виде графиков.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В последнее время получили широкое распространение такие молекулярные методы диагностики микобактерий как полимеразная цепная реакция (ПЦР), метод молекулярной гибридизации и секвенирования различных участков ДНК. ПЦР является удобным методом, сочетающим высокую чувствительность, специфичность и быстроту. В настоящее время разработаны различные тест-системы с использованием полимеразной цепной реакции, которые широко используются в лабораториях в качестве дополнительного метода определения микобактерий [6,7]. Метод ПЦР позволяет проводить анализ в довольно короткие сроки, что является очень важным в диагностике туберкулеза. Целью данной работы была разработка нового метода молекулярной диагностики туберкулеза на основе ПЦР в реальном времени и использование его для определения ДНК патогенных микобактерий, дифференцирования их от «атипичных» видов, а в будущем - осуществления мониторинга лечения.

Создание тест-системы видовой диагностики туберкулеза на основе ПЦР в реальном времени.

Для разработки тест-системы на основе ПЦР в реальном времени необходимо было подобрать специфические праймеры для проведения полимеразной реакции на матрице M.tuberculosis и М.bovis, а также дополнительный праймер-зонд, специфичный внутренней области фрагмента ПЦР. Наличие такого зонда составляет особенность ПЦР в реальном времени - за счет такого зонда повышается специфичность реакции по сравнению с обычной ПЦР. Существует несколько вариантов проведения ПЦР в реальном времени. Мы выбрали такую модификацию, при которой праймер-зонд имеет флуоресцентный краситель на 5'-конце и гаситель флуоресценции на 3'-конце. Краситель и гаситель - химические соединения, производные флуоресцеина и родамина, имеющие различные коэффициенты абсорбции и эмиссии. В процессе реакции в каждом цикле происходит накопление в реакционной смеси как продуктов амплификации, так и флуоресцентного красителя, отщепляющегося благодаря 5'- 3'-экзонуклеазной активности термостабильной ДНК-полимеразы. Удобство метода заключается в том, что регистрацию прироста флуоресценции, а, следовательно, и результаты амплификации можно проследить в процессе протекания реакции. Результаты выводятся на экран монитора в виде графика, характеризующего амплификацию фрагмента ДНК.

Для создания тест-системы были подобраны олигонуклеотидные последовательности и зоды, позволяющие дифференцировать M.tuberculosis и М.bovis. Испытание олигонуклеотидов с помощью метода ПЦР в реальном времени дали положительные результаты при использовании ДНК, выделенной из культур M.tuberculosis и М.bovis (табл. 1).

Таблица 1

Результаты испытания тест-системы на основе ПЦР в реальном времени, получен-

№ образца Результаты бактериоло- гии Результаты, полученные методом ПЦР

Нестед-ПЦР ПЦР в реальном времени

обнаружение ДНК M.tuberculosis обнаружение ДНК M.bovis обнаружение ДНК M.tuberculosis обнаружение ДНК M.bovis

1 М. bovis - + - +

2 M.bovis - + - +

3 М. bovis - + - +

4 M.bovis - + - +

5 M.tuberculosis + - + -

6 M.tuberculosis + - + -

7 M.tuberculosis + - + -

8 M.tuberculosis + - + -

9 M.bovis BCG - + - +

10 M.bovis BCG - + - +

Создание мультиплексной тест-системы на основе ПЦР в реальном времени.

Одним из главных преимуществ метода ПЦР в реальном времени является возможность создания мультиплексной тест-системы, что заключается в возможности проведения в одной пробирке определения не-

скольких видов возбудителя. Для рутинной ПЦР также создаются тест-системы на основе множественной ПЦР, однако разработка таких тест-систем является сложным и трудоемким процессом. Нами произведена попытка создания такой тест-системы. Для исследования использовались 40 проб, полученных от пациентов из МНПЦБТ. При постановке мультиплексной или множественной ПЦР в реальном времени в реакционную смесь добавляли две пары праймеров и два зонда. В нашем случае исследования были направлены на обнаружение одновременно ДНК M.tuberculosis и М.bovis. В образце присутствовали ДНК М.tuberculosis и M.bovis одновременно. Результат эксперимента показывает возможность определения двух видов возбудителей в одной реакции ПЦР (рис. 1).

- 1

''

-0.201 i 1 i l .li I. i I il .1 i IJiilitl 1 til LLJ „Ü..!,,! 11J

1 3 6 7 0 11 13 16 1 7 19 21 23 25 27 29 31 33 3S 37 39

номер цикла

Рис 1. Результаты испытаний мультиплексной тест-системы для одновременного обнаружения ДНК M.tuberculosis

Такая методика, несомненно, уменьшает временные затраты при проведении дифференциальной диагностики микобактерий.

Сравнительный анализ тест-систем на основе ПЦР и ПЦР в реальном времени с использованием проб мокроты, полученных от пациентов МНПЦ борьбы с туберкулёзом

Разработанную тест-систему на основе ПЦР в реальном времени сравнивали с тест-системами НПО «НАРВАК» и фирмы «La Roche». Для этого ДНК, выделенную из проб мокроты больных, анализировали методом ПЦР, используя тест-системы НПО «НАРВАК» и фирмы «La Roche», а также разработанной тест-системой на основе ПЦР в реальном времени.

Тест-система НПО «НАРВАК» основана на одной из модификаций ПЦР - «гнездовой» ПЦР и позволяет проводить дифференциальную диагностику микобактерий. В тест-системе используются праймеры к спе-

цифическим фрагментам геномов различных микобактерий и позволяющие дифференцировать М. tuberculosis и М. bovis от других «атипичнах» штаммов микобактерий. Тест-система была проверена более чем на 1500 образцов от животных и клинических образцов от людей и показала высокую сходимость результатов диагностики методом ПЦР с классическими методами детекции микобактерий [9].

Тест-система фирмы «La Roche» позволяет эффективно определять микобактерии туберкулезного комплекса в культурах и первичном биологическом материале [10].

Таблица 2

Результаты сравнения ПЦР и ПЦР в реальном времени с использованием первич-

ного биологического материала

№ образца ПЦР с использованием тест-системы «La Roch» Нестед-ПЦР с использованием тест-системы НПО

12 + + +

13 + + +

14 + + -

15 + -/+ +

16 + - -

17 + + +

18 + + +

19 + + +

20 + + +

21 + - -

22 + + +

23 + -/+ +

24 + + +

25 + -(+ +

26 + - -

27 + - -

28 + - -

29 + + +

30 + + +

31 + - -

32 + + -

33 + + +

34 + -/+ +

35 + + +

36 + + +

37 + + +

38 + + +

39 + - -

40 -t- + -

41 + + +

42 + + +

43 + + +

44 + + -

45 + + +

46 + + +

47 -/+ +

48 + - -

49 + + -

50 + + +

51 + - +

Результаты сравнения трех тест-систем представлены в табл. 2. Подробно рассмотрим случаи несовпадения результатов ПЦР и ПЦР в реаль-

ном времени. В пяти случаях мы получили положительный результат при использовании ПЦР и отрицательный результат - при использовании ПЦР в реальном времени (образцы № 14, 32, 40, 44 и 49). Причина таких результатов может заключаться в наличии специфических ингибиторов ПЦР в реальном времени, снижающих эффективность ПЦР. В пяти случаях мы получили слабый сигнал при использовании ПЦР, вероятно причиной явилось очень низкое содержание микобактерий в мокроте (образцы №15, 23, 25, 34, 47). Однако ПЦР в реальном времени показала положительный результат при анализе этих образцов. Шесть образцов (№ 16, 26, 27, 28, 31, 39), положительных при исследовании тест-системой фирмы «La Roche», были отрицательные по результатам тестирования генома микобактерий тест-системой НПО «НАРВАК» и ПЦР в реальном времени. Это объясняется тем, что тест-система фирмы «La Roche» определяет ДНК микобактерий туберкулезного комплекса, а в состав микобактерий туберкулезного комплекса может входить не только М. tuberculosis, но и M.bovis, M.bovis BCG, M.africanum и M.microti. Результаты, представленные в таблице для тест- системы НПО «НАРВАК» и тест-системы на основе ПЦР в реальном времени, показывают наличие генома М. tuberculosis. Более подробное исследование проб подтверждает такое объяснение.

Исследование показало, что ПЦР в реальном времени можно использовать при работе с первичным материалом без предварительного культивирования. Результаты исследований с помощью ПЦР в реальном времени анализировались на экране монитора в виде графика зависимости интенсивности флуоресценции от количества циклов (рис. 2 А, Б).

А Б

11 13 IS 17 18 71 23 25 77 29 31 33 36 37 39

номер цикла

7 9 11 13 15 17 1* 21 23 2Í 27 2в 31 33 3S 37 39

номер цикла

Рис.2. Результаты обнаружения ДНК МЛиЬегсикшз (А) н ДНК М.Ыпчв (Б) методом ПЦР в реальном времени. Цифры справа соответствуют номерам проб в табл.1. К - отрицательный контроль

Таким образом, сравнительный анализ двух тест-систем на основе метода ПЦР с разработанной тест-системой ПЦР в реальном времени показал высокую сходимость результатов. Чувствительность ПЦР в реальном времени не ниже чувствительности «гнездовой» ПЦР и составляет 10'15 г ДНК микобактерий в образце. Однако при постановке ПЦР в реальном времени исключается получение ложноположительных результатов, за счет исключения стадии электрофореза и необходимости открытия пробирки после амплификации.

Разработанный метод ПЦР в реальном времени можно с успехом использовать для быстрой и эффективной диагностики микобактерий как в культурах так и в образцах первичного биологического материала. Показана возможность определения двух видов возбудителя в ходе одной ПЦР реакции в реальном времени, что позволит существенно сократить время проведения анализа. Все это делает метод ПЦР в реальном времени незаменимым для лабораторной диагностики туберкулеза и проведения мониторинга лечения.

ЛИТЕРАТУРА

1. Raviglion М., Snnider D.E., Kochi А. (1995) Global epidemiology of tuberculosis: morbidity and mortality of a orldwid epidemic. JAMA, 273: 220-226.

2. Бочкарев Е.Г., Денисова T.C., Генерозов Э.В., Говорун В.М., Никитченко ЕЮ., Чер-ноусова Л.Н., Кузнецов П.В. Генодиагностика во фтизиатрии /Пособие для врачей.-М.: НИИ физико-химической медицины М3 РФ, Центральный НИИ туберкулеза РАМН, Новосибирский НИИ туберкулеза М3 РФ, НПФ «Литех» 2000г.

3. Туберкулез. Патогенез, защита, контроль: Пер. с англ./ Под ред. Барри Р.Блума.- М.: Медицина, 2002.- 696 с.: ил.

4. Mullis К. В. and Faloona F. АЛ Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. - Method Enzymol. - 1987. - №155. - P. 335-350

5. Izhar U. H. Khan, Jagjit S. Yadav 11 Real-time PCR assay for genus-specific detection and quantification of culturable and non-culturable mycobacteria and pseudomonads in metalworking fluids. - Molecular and Cellular Probes. - 2004. - №18. - P. 67-73.

6. Liebana E., Aranaz A., Mateos A., Vilafranca М., Gomes-Mampaso E., Tercero J. C., Alemany J., Suares G., Domingo N.. Dominques L.H Simple and rapid detection of Mycobacterium tuberculosis complex organisms in bovine tissue samples by PCR. -Journal of clinical Microbiology. - 1995. - Vol. 33. - №1. - P. 33-36.

7. Zvizdic S., Dizdarevic Z., Ridanovic Z. II Modem methods in the diagnosis of tuberculosis: PCR-polymerase chain reaction. - Med. Arh. - 1999. - Vol. 53. -№ 1. - P. 13-7.

8. Grebennikova T. V., Nepoklonov E. A., II Detection and identification of Mycobacteria isolates from human clinical samples.// 1999, 9th ECCMID, March 21-24, Berlin, Germany, p. 204.

9. Гребенникова Т. В., Грабовецкий. И. И., Шумский Н. И., Кальнов С. Л., Непоклонов E. А. II Дифференциальная диагностика микобактерий методом полимеразной цепной реакции. - 1999. - Ветеринарияю - №3. - Р. 17-20.

10. Ninet В, Rohner Р, Metral С, Auckenthaler R И Assessment of use of the COBAS AMPLICOR system with BACTEC 12B cultures for rapid detection of frequently identified mycobacteria. - J. Clin. Microbiol. - 1999. - Vol. 37. - № 3. - P. 782-784.

DEVELOPMENT OF TEST-SYSTEM BASED ON REAL-TIME PCR FOR DIFFERENTIAL DIAGNOSTIC OF MYCOBACTERIA

N.I. Potapova3, T.V. Grebennikova1, A.D. Zaberezhny1,

M.A. Krasnova2,0.I. Skotnikova2, T.I. Aliper1, E.A. Nepoklonov1

1Ivanovsky Virology Institute, Gamalei str., 16, 123098, Moscow, Russia

2 Moscow City Research Center for Tuberculosis Control, Moscow Health department, Stromunka str., 10, 107014, Moscow, Russia

3 Department ofpharmaceutical and toxicological chemistry, medical faculty, RPFU, Miklukho-Maklaya, 8, 117198, Moscow, Russia

In the paper we present development of the test-system for differential detection of M.tuberculosis and M.bovis by Real-time PCR and comparison of this method with classical PCR. Fifty samples of DNA, isolated from cell cultures and sputum of patient with tuberculosis. Comparison of two test-systems based on PCR and Real-time PCR showing high correlation between the data sets. The possibility of Multiplex Real-time PCR has been demonstrated.