МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 3-ГИДРОКСИИЗОМАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ

1. Клетка, генетически модифицированная по сравнению с диким ее типом таким образом, что она синтезирует больше 3-гидроксиизомасляной кислоты или полигидроксиалканоатов на основе 3-гидроксиизомасляной кислоты.
2. Клетка по п.1, причем синтез 3-гидроксиизомасляной кислоты или полигидроксиалканоатов на основе 3-гидроксиизомасляной кислоты происходит с метилмалоновым полуальдегидом в качестве исходного продукта.
3. Клетка по п.2, причем клетка синтезирует 3-гидроксиизомасляную кислоту или полигидроксиалканоаты на основе 3-гидроксиизомасляной кислоты с сукцинил-коферментом А в качестве промежуточного продукта.
1
4. Клетка по п.3, причем клетка обладает повышенной по сравнению со своим диким типом активностью фермента E, который катализирует преобразование сукцинил-кофермента А в метилмалонил-кофермент А.
1
5. Клетка по п.4, причем фермент E представляет собой метилмалонил-кофермент А-мутазу (ЕС 5.4.99.2).
2
4
6. Клетка по одному из пп.3-5, причем клетка имеет повышенную по сравнению со своим диким типом активность по меньшей мере одного из следующих ферментов от Е до Е:
2
фермента Е, катализирующего преобразование метилмалонил-кофермента А в метилмалонат;
3
фермента Е, катализирующего преобразование метилмалоната в метилмалоновый полуальдегид;
4
фермента Е, катализирующего преобразование метилмалонового полуальдегида в 3-гидроксиизобутират;
7. Клетка по п.6, причем ферменты следующие:
2
E метилмалонил-кофермент А-гидролаза (ЕС 3.1.2.17),
3
Е альдегид-дегидрогеназа (ЕС 1.2.1.3) или альдегид-оксидаза (ЕС 1.2.3.1) и
4
Е 3-гидроксиизобутират-дегидрогеназа (ЕС 1.1.1.31) или 3-гидроксиацил-кофермент А-дегидрогеназа (ЕС 1.1.1.35).
4
5
4
7
8. Клетка по одному из пп.3-5, причем клетка имеет повышенную по сравнению со своим диким типом активность по меньшей мере одного из следующих ферментов от Е, E, Е и Е:
6
фермента Е, катализирующего преобразование (R)-метилмалонил-кофермента А в (S)-метилмалонил-кофермент А;
7
фермента Е, катализирующего преобразование (S)-метилмалонил-кофермента А в пропионил-кофермент А;
5
фермента E, катализирующего преобразование пропионил-кофермента А в метилмалоновый полуальдегид;
4
фермента Е, катализирующего преобразование метилмалонового полуальдегида в 3-гидроксиизомасляную кислоту;
9. Клетка по п.8, причем ферменты следующие:
6
Е метилмалонил-кофермент А-эпимераза (ЕС 5.1.99.1),
7
Е метилмалонил-кофермент А-декарбоксилаза (ЕС 4.1.1.41),
5
E дегидрогеназа метилмалонового полуальдегида (ЕС 1.2.1.27) и
4
Е 3-гидроксиизобутират-дегидрогеназа (ЕС 1.1.1.31) или 3-гидроксиацил-кофермент А-дегидрогеназа (ЕС 1.1.1.35).
4
5
4
7
10. Клетка по одному из пп.3-5, причем клетка имеет повышенную по сравнению со своим диким типом активность по меньшей мере одного из следующих ферментов от Е, E, Е и Е:
7
фермента Е, катализирующего преобразование метилмалонил-кофермента А в пропионил-кофермент А;
5
фермента E, катализирующего преобразование пропионил-кофермента А в метилмалоновый полуальдегид;
4
фермента Е, катализирующего преобразование метилмалонового полуальдегида в 3-гидроксиизомасляную кислоту;
11. Клетка по п.10, причем ферменты следующие:
7
Е метилмалонил-кофермент А-декарбоксилаза (ЕС 4.1.1.41),
5
E дегидрогеназа метилмалонового полуальдегида (ЕС 1.2.1.27) и
4
Е 3-гидроксиизобутират-дегидрогеназа (ЕС 1.1.1.31) или 3-гидроксиацил-кофермент А-дегидрогеназа (ЕС 1.1.1.35).
2
4
12. Клетка по одному из пп.3-5, причем клетка имеет повышенную по сравнению со своим диким типом активность по меньшей мере одного из следующих ферментов от Е до Е:
46
фермента E, катализирующего преобразование L-глутамата в 2-оксоглутарат;
28
фермента Е, катализирующего преобразование 2-оксоглутарата в сукцинил-кофермент А.
13. Клетка по п.12, причем ферменты следующие:
46
Е глутамат-синтаза (ЕС 1.4.1.13 или ЕС 1.4.1.14), глутамат-дегидрогеназа (ЕС 1.4.1.2, ЕС 1.4.1.3 или ЕС 1.4.1.4) или аспартат-трансаминаза (ЕС 2.6.1.1 или ЕС 2.6.1.2) и
28
Е 2-оксоглутарат-синтаза (ЕС 1.2.7.3).
14. Клетка по п.2, причем клетка синтезирует 3-гидроксиизомасляную кислоту или полигидроксиалканоаты на основе 3-гидроксиизомасляной кислоты с пропионил-коферментом А в качестве промежуточного продукта.
4
5
47
52
15. Клетка по п.14, причем клетка имеет повышенную по сравнению со своим диким типом активность по меньшей мере одного из следующих ферментов Е, E и от Е до E:
47
фермента Е, катализирующего преобразование ацетил-кофермента А в малонил-кофермент А;
48
фермента Е, катализирующего преобразование малонил-кофермента А в метилмалоновый полуальдегид;
49
фермента Е, катализирующего преобразование метилмалонового полуальдегида в 3-гидроксипропионат;
50
фермента E, катализирующего преобразование 3-гидроксипропионата в 3-гидроксипропионил-кофермент А;
51
фермента E, катализирующего преобразование 3-гидроксипропионил-кофермента А в акрилоил-кофермент А;
52
фермента Е, катализирующего преобразование акрилоил-кофермента А в пропионил-кофермент А;
5
фермента E, катализирующего преобразование пропионил-кофермента А в метилмалоновый полуальдегид;
4
фермента Е, катализирующего преобразование метилмалонового полуальдегида в 3-гидроксиизобутират.
16. Клетка по п.15, причем ферменты следующие:
4
Е 3-гидроксиизобутират-дегидрогеназа (ЕС 1.1.1.31) или 3-гидроксиацил-кофермент А-дегидрогеназа (ЕС 1.1.1.35),
5
E дегидрогеназа метилмалонового полуальдегида (ЕС 1.2.1.27),
47
Е малонил-кофермент А-декарбоксилаза (ЕС 4.1.1.9), малонил-кофермент А-трансфераза (ЕС 2.8.3.3), метилмалонил-кофермент А-карбокситрансфераза (ЕС 2.1.3.1) или ацетил-кофермент А-карбоксилаза (ЕС 6.4.1.2),
48
Е дегидрогеназа малонового полуальдегида (ЕС 1.2.1.18),
49
Е 3-гидроксипропионат-дегидрогеназа (ЕС 1.1.1.59),
50
Е 3-гидроксиизобутирил-СоА-гидролаза (ЕС 3.1.2.4) и
51
E еноил-кофермент А-гидратаза (ЕС 4.2.1.17), и
52
Е ацил-кофермент А-дегидрогеназа (ЕС 1.3.99.3).
17. Клетка по п.2, причем клетка синтезирует 3-гидроксиизомасляную кислоту или полигидроксиалканоаты на основе 3-гидроксиизомасляной кислоты с акрилоил-коферментом А в качестве промежуточного продукта.
10
12
56
72
73
18. Клетка по п.17, причем клетка имеет повышенную по сравнению со своим диким типом активность по меньшей мере одного из следующих ферментов от Е до E, E, Е и Е:
72
фермента Е, катализирующего преобразование бета-аланина в бета-аланин-кофермент А;
73
фермента Е, катализирующего преобразование бета-аланин-кофермента А в акрилил-кофермент А;
56
фермента Е, катализирующего преобразование акрилил-кофермента А в метилмалонил-кофермент А;
10
фермента Е, катализирующего преобразование метилмалонил-кофермента А в метилмалонат;
11
фермента Е, катализирующего преобразование метилмалоната в метилмалоновый полуальдегид;
12
фермента E, катализирующего преобразование метилмалонового полуальдегида в 3-гидроксиизомасляную кислоту;
19. Клетка по п.18, причем ферменты следующие:
72
Е кофермент А-трансфераза (ЕС 2.8.3.1) или кофермент А-синтетаза, предпочтительно кофермент А-трансфераза,
73
Е лизаза бета-аланил-кофермент-А-аммония (ЕС 4.3.1.6),
56
Е кротонил-кофермент А-декарбоксилаза,
10
Е метилмалонил-кофермент А-гидролаза (ЕС 3.1.2.17),
11
Е альдегид-дегидрогеназа (ЕС 1.2.1.3) или альдегид-оксидаза (ЕС 1.2.3.1) и
12
E 3-гидроксиизобутират-дегидрогеназа (ЕС 1.1.1.31) или 3-гидроксиацил-кофермент А-дегидрогеназа (ЕС 1.1.1.35).
20. Клетка по п.1, причем синтез 3-гидроксиизомасляной кислоты или полигидроксиалканоатов на основе 3-гидроксиизомасляной кислоты происходит с гидроксибутирил-коферментом А в качестве исходного продукта.
21. Клетка по п.20, причем клетка синтезирует 3-гидроксиизомасляную кислоту или полигидроксиалканоаты на основе 3-гидроксиизомасляной кислоты с сукцинил-коферментом А в качестве промежуточного продукта.
76
79
60
61
8
22. Клетка по п.21, причем клетка имеет повышенную по сравнению со своим диким типом активность по меньшей мере одного из следующих ферментов от E до Е, Е, E и Е:
76
фермента E, катализирующего преобразование пирувата в 2-ацетолактат;
77
фермента Е, катализирующего преобразование 2-ацетолактата в 2,3-дигидроксиизовалерат;
78
фермента E, катализирующего преобразование 2,3-дигидроксиизовалерата в 2-оксоизовалерат;
79
фермента Е, катализирующего преобразование 2-оксоизовалерата в изобутирил-кофермент А;
60
фермента Е, катализирующего преобразование изобутирил-кофермента А в метакрилил-кофермент А;
61
фермента E, катализирующего преобразование метакрилил-кофермента А в 3-гидроксиизобутирил-коферментА;
8
фермента Е, катализирующего преобразование 3-гидроксиизомасляной кислоты в 3-гидроксиизобутирил-кофермент А.
23. Клетка по п.22, причем ферменты следующие:
8
Е 3-гидроксиизобутирил-СоА-гидролаза (ЕС 3.1.2.4),
76
E ацетолактат-синтаза (ЕС 2.2.1.6),
77
Е дигидроксиизовалерат-дегидрогеназа (ЕС 1.1.1.86),
78
E 2,3-дигидроксиизовалерат-дегидратаза (ЕС 4.2.1.9),
79
Е 2-оксоизовалерат-дегидрогеназа (ЕС 1.2.1.25 или ЕС 1.2.4.4),
60
E ацил-кофермент А-дегидрогеназа (ЕС 1.3.99.3), бутирил-кофермент А-дегидрогеназа (ЕС 1.3.99.2) или 2-метилацил-кофермент А-дегидрогеназа (ЕС 1.3.99.12), и
61
E еноил-кофермент А-гидратаза (ЕС 4.2.1.17).
8
60
61
79
80
24. Клетка по п.21 или 22, причем клетка имеет повышенную по сравнению со своим диким типом активность по меньшей мере одного из следующих ферментов Е, от Е до E и от Е до Е:
80
фермента Е, катализирующего преобразование L-валина в 2-оксоизовалерат;
79
фермента Е, катализирующего преобразование 2-оксоизовалерата в изобутирил-кофермент А.
60
фермента Е, катализирующего преобразование изобутирил-кофермента А в метакрилил-кофермент А;
61
фермента E, катализирующего преобразование метакрилил-кофермента А в 3-гидроксиизобутирил-кофермент А;
8
фермента Е, катализирующего преобразование 3-гидроксиизомасляной кислоты в 3-гидроксиизобутирил-кофермент А.
25. Клетка по п.24, причем ферменты следующие:
8
Е 3-гидроксиизобутирил-СоА-гидролаза (ЕС 3.1.2.4),
60
Е еноил-кофермент А-гидратаза (ЕС 4.2.1.17),
61
E ацил-кофермент А-дегидрогеназа (ЕС 1.3.99.3), бутирил-кофермент А-дегидрогеназа (ЕС 1.3.99.2) или 2-метилацил-кофермент А-дегидрогеназа (ЕС 1.3.99.12),
79
E 2-оксоизовалерат-дегидрогеназа (ЕС 1.2.1.25 или ЕС 1.2.4.4) и
80
E Трансфераза аминокислоты (ЕС 2.6.1.42).
26. Клетка по п.20, причем клетка синтезирует 3-гидроксиизомасляную кислоту или полигидроксиалканоаты на основе 3-гидроксиизомасляной кислоты с сукцинил-коферментом А в качестве промежуточного продукта.
8
53
54
82
27. Клетка по п.26, причем клетка имеет повышенную по сравнению со своим диким типом активность по меньшей мере одного из следующих ферментов от Е, Е, E и Е:
53
фермента Е, катализирующего преобразование ацетил-кофермента А в ацетоацетил-кофермент А;
54
фермента Е, катализирующего преобразование ацетоацетил-кофермента А в 3-гидроксибутирил-кофермент А;
81
фермента E, катализирующего преобразование 3-гидроксибутирил-кофермента А в 3-гидроксиизобутирил-кофермент А;
8
фермента Е, катализирующего преобразование 3-гидроксиизомасляной кислоты в 3-гидроксиизобутирил-кофермент А.
28. Клетка по п.27, причем ферменты следующие:
8
Е 3-гидроксиизобутирил-СоА-гидролаза (ЕС 3.1.2.4),
53
Е β-кетотиолаза (ЕС 2.3.1.9),
54
Е ацетоацетил-кофермент А-редуктаза (ЕС 1.1.1.36) и
82
Е изобутирил-кофермент А-мутаза (ЕС 5.4.99.13).
29. Способ создания генетически модифицированной клетки, которая в состоянии синтезировать метилмалоновый полуальдегид или изобутирил-кофермент А в качестве исходных продуктов синтеза 3-гидроксиизомасляной кислоты или полигидроксиалканоатов на основе 3-гидроксиизомасляной кислоты, включающий в себя этап повышения в клетке активности по меньшей мере одного из указанных в пп.2-28 ферментов.
30. Способ синтеза 3-гидроксиизомасляной кислоты или полигидроксиалканоатов на основе 3-гидроксиизомасляной кислоты, включающий в себя этап создания контакта клетки по одному из пп.1-28 с питательной средой, содержащей в качестве источника углерода углеводы, глицерин, диоксид углерода, метанол, L-валин или L-глутамат, в условиях, в которых из источника углерода образуются 3-гидроксиизомасляная кислота или полигидроксиалканоатов на основе 3-гидроксиизомасляной кислоты, а также, при необходимости, отделение 3-гидроксиизомасляной кислоты от питательной среды.
31. Способ получения метакриловой кислоты или эфиров метакриловой кислоты, включающий в себя этапы:
IA) синтез 3-гидроксиизомасляной кислоты посредством способа по п.30, а также, при необходимости, нейтрализации 3-гидроксиизомасляной кислоты,
IB) дегидратация 3-гидроксиизомасляной кислоты с образованием метакриловой кислоты, а также, при необходимости, этерификации метакриловой кислоты.
32. Способ получения метакриловой кислоты или эфиров метакриловой кислоты, включающий в себя этапы:
IIA) получения полигидроксиалканоатов на основе 3-гидроксиизомасляной кислоты с помощью способа по п.31,
IIB) расщепление полигидроксиалканоатов на основе 3-гидроксиизомасляной кислоты с получением 3-гидроксиизомасляной кислоты, а также, при необходимости, нейтрализации 3-гидроксиизомасляной кислоты,
IIC) дегидратация 3-гидроксиизомасляной кислоты с образованием метакриловой кислоты, а также, при необходимости, этерификации метакриловой кислоты.
33. Способ получения полиметакриловой кислоты или эфиров полиметакриловой кислоты, включающий в себя этапы:
IIIA) получение метакриловой кислоты по п.31 или 32,
IIIB) радикальная полимеризация метакриловой кислоты,
причем, при необходимости, до или после радикальной полимеризации возможна по меньшей мере частичная этерификация карбоксильных групп или карбоксилатной группы метакриловой кислоты.
34. Изолированная ДНК, выбранная из следующих последовательностей:
a) последовательность, соответствующая SEQ.-ID-Nr. 03,
b) не содержащая интронов последовательность, которая происходит от последовательности а) и которая кодирует тот же белок или пептид, что и последовательность SEQ.-ID-Nr. 03,
c) последовательность, кодирующая белок или пептид, включающий в себя последовательность аминокислот согласно SEQ.-ID-Nr. 04,
d) последовательность, совпадающая с последовательностями от а) до с) по меньшей мере на 80%,
e) последовательность, которая гибридизирована или могла бы быть с учетом вырожденности генетического кода гибридизирована с противоположной цепью одной из последовательностей от а) до d),
f) полученное замещением, дополнением, инверсией и/или делецией мере одного или нескольких оснований производное одной из групп от а) до е), а также
g) последовательность, комплементарная одной из последовательностей одной из групп от а) до f).
35. Вектор, включающий последовательность ДНК по одной из групп от а) до f), как определено по п.34.
36. Применение вектора по п.35 для преобразования клетки.
37. Изолированный полипептид, имеющий последовательность аминокислот, обозначенную как SEQ.-ID-Nr. 04, или последовательность аминокислот, которую получают в случае проведения делеции, инсерции, замены или прикрепления к С- и/или N-концу последовательности аминокислот, обозначенной как SEQ.-ID-Nr. 04, самое большее 10 аминокислот.