СПОСОБ ПОДГОТОВКИ СУСПЕНЗИИ НАНОЧАСТИЦ МЕТАЛЛОВ ДЛЯ НАРУЖНОГО И ВНУТРЕННЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
METHOD FOR PREPARATION OF SUSPENSION OF METAL NANOPARTICLES FOR EXTERNAL AND INTERNAL APPLICATION

Изобретение относится к медицине, ветеринарии, фармацевтической промышленности, сельскому хозяйству, рыбоводству и другим областям техники.
Способ представляет собой модель подготовки препаратов из наночастиц металлов на водной основе для наружного и внутреннего применения.
Наночастицы металлов и их соединения в настоящее время нашли широкое применение в различных областях, в том числе в биологии и медицине в качестве препаратов микроэлементов. Наличие низкой токсичности для организма в сравнении с широко применяемыми препаратами микроэлементов, высокая биодоступность, определяемая малыми размерами, явилась определяющим в их повсеместном применении [1, 2, 3, 4].
В этой связи определенный интерес представляют исследования, направленные на создание новых препаратов на основе наночастиц.
Одним из направлений в вопросе создания и совершенствования нанопрепаратов является уточнение размера наночастиц и способ их подготовки. Установлены различия в биологических свойствах препаратов, содержащих высокодисперсные частицы разного размера, уменьшение их размера повышает абсорбцию элемента [5, 6, 7].
Известен способ применения препарата наночастиц в виде мазей или свечей, характеризующийся пролонгированным действием и стабильностью при хранении [8].
Однако данный способ применения препарата на основе наночастиц является узконаправленным, применим для наружного применения, только в области фармакологии и требует при производстве нескольких дополнительных компонентов.
В связи с этим альтернативным решением является способ подготовки препаратов наночастиц на водной основе, позволяющей использовать препарат как для наружного, так и для внутреннего применения.
Для исследования нами были использованы наночастицы меди со следующими физико-химическими характеристиками: средний размер, имеющий сферическую форму, составляет 103±2 нм; содержание кристаллической меди в ядре частиц - 96±4,5%; оксида меди - 4±0,4%; толщина оксидной пленки на поверхности наночастиц - 6 нм [9, 10]. Наночастицы меди получали методом высокотемпературной конденсации на установке Миген-3 [11].
С целью повышения стабилизации полезных биологических и химических свойств водных препаратов высокодисперсных частиц меди вместо дистиллированной воды использовали электрохимически активированный католитный водный раствор со стабилизатором со следующими параметрами Eh=-300 мВ, рН 7-8. Стабилизатор представляет собой аминокислоту треонин в количестве не менее 0,01 мас. % [12, 13].
Электрохимическая активация воды осуществлялась на установке «ЭСПЕРО-1» Ташкентской фирмы.
Согласно изобретению предлагается на стадии подготовки суспензии осуществлять ультразвуковое диспергирование наночастиц меди с католитной водной средой, что улучшает смачивание наночастиц и дает возможность увеличить их удельную поверхность и, таким образом, снизить скорость осаждения и повысить равномерность распределении частиц в суспензии. Процесс ведут при температуре не выше 40°С. Соотношение компонентов суспензии определяется в зависимости от назначения.
Определение времени диспергирования суспензии наночастиц меди проводилось нами путем обработки ультразвуком частотой 35 кГц (f - 35 кГц, N - 300 Вт, А - 10 мкм) в течение 0,33; 0,66; 1; 1,5; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15 и 30 мин. Полученные образцы стерилизовали ультрафиолетом.
Определение морфометрических характеристик частиц в полученных образцах проводилось методом атомно-силовой микроскопии в контактном режиме с использованием мультимикроскопа SMM-2000 (ОАО «ПРОТОН-МИЭТ», Россия). Опытные образцы препарата меди в объеме 20 мкл наносили на свежий скол слюды и высушивали при комнатной температуре. В процессе сканирования использовались кантилеверы MSCT-AUNM (Pack Scientific Instruments, США) с жесткостью балки 0,01 Н/м и радиусом кривизны иглы 15-20 нм. Количественный морфометрический анализ полученных изображений проводили с использованием штатного программного обеспечения микроскопа.
Определение биологической активности полученных суспензий было изучено в тесте ингибирования бактериальной люминесценции. В качестве объекта использован генно-инженерный люминесцирующий штамм Есherichia coli K12 TG1, конститутивно зкспрессирующий luxСDАВЕ-гены природного морского микроорганизма Photobacterium leiongnathi 54D10, производство HBO «Иммунотех» (Россия, Москва) в лиофилизированном состоянии под коммерческим названием «Эколюм». Непосредственно перед проведением исследований данный препарат восстанавливали добавлением охлажденного электрохимически активированного католитного водного раствора со стабилизатором и стандартизировали до оптической плотности 0,3 при длине волны 600 нм. Суспензию выдерживали при температуре +2… +4°С в течение 30 мин, после чего доводили температуру бактериальной суспензии до 15-25°С.
Водные католитные суспензии наночастиц меди для оценки биологической активности готовились в концентрации 20 мМ, характеризующейся как биотическая в отношении живой клетки [14].
При проведении теста использовался алгоритм, аналогичный использованному Д.Г. Дерябиным с соавт. (2011) при анализе биотоксичности ионов, нано- и микрочастиц металлов. Для этого в ячейки 96-луночных планшетов вносили тестируемые препараты с суспензией люминесцирующих бактерий в соотношении 1:1, после чего планшет помещали в измерительный блок анализатора микропланшетного Infinite PRO F200 (TECAN, Австрия), осуществляющего регистрацию интенсивности свечения полученных смесей в течение 180 мин с интервалом 3 мин. Результаты влияния препарата наночастиц меди на интенсивность бактериальной биолюминесценции (I) оценивали с использованием формулы
,
где Ik и Io - интенсивность свечения контрольных к опытных проб на 0-й и n-й минутах измерения.
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программного пакета «Statistica 6.0», включая определение средней арифметической величины (М) и стандартной ошибки средней (m). Достоверными считали результаты при Р≤0,05.
Проведенные нами исследования показали, что наиболее интенсивное разрушение агломератов наночастиц частиц меди на более мелкие происходит в первые 5-6 мин обработки ультразвуком, тогда как последующее увеличение времени диспергирования не приводит к значительным разрушениям агломератов наночастиц. Динамика значений размеров при увеличении времени воздействия ультразвуком показана на фиг. 1.
Агломераты препарата меди на основе электрохимически активированного антиокислительного католитного водного раствора со стабилизатором, полученные в результате диспергирования в течение первых 14 минут, были неоднородны по размерам.
Агломераты в образцах, подвергшихся обработке ультразвуком в течение 0,33-1,5 мин до 85%, были представлены частицами сферической формы размером от 200 до 980 нм. Средний размер агломераций наночастиц меди, полученных в течение первых 0,33 мин воздействия ультразвуком, составил 937±24,6 нм. Увеличение времени воздействия ультразвуком на опытные образцы от 2 до 14 мин позволило уменьшить размер с 515 до 200 нм. Препараты, полученные в результате обработки ультразвуком в течение 15 и 30 мин на 92 и 98%, были представлены отдельными наночастицами, на 8 и 2% агломератами, размером в среднем 200-400 нм.
Реализация теста ингибирования бактериальной биолюминесценции при контакте E.сoli TG1 с водными образцами препарата меди, полученными при диспергировании в течении 0,33-15 мин. в концентрации 20 мМ и содержащими агломераты наночастиц, показала отсутствие значимого изменения динамики свечения бактерий в сравнении с контролем. В тоже время оценка интенсивности биолюминесценции при контакте с водными образцами, полученными при обработке ультразвуком в течение 30 мин и содержащими наночастицы, показало проявление биологической активности препарата сохраняющейся в течение эксперимента.
Интенсивность свечения Е.соli с клонированными luxCDABЕ-генами Р. leiognathi при контакте с опытными образцами суспензий препарата меди, подвергшихся ультразвуковому воздействию в течение 0,33, 0,66, 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 и 30 мин, показана на фиг. 2; где контроль «K» представляет собой водный электрохимический активированный католитный раствор без внесения препарата меди.
Зависимость времени ультразвукового диспергирования суспензий наночастиц меди в водном католите на равномерность и однородность распределения отдельных наночастиц в нашем эксперименте показана интенсивностью свечения бактерий в течение 180 мин.
В результате проведенного эксперимента было установлено, что для получения однородных, биологически и химически активных препаратов наночастиц металлов на основе электрохимически активированного католитното водного раствора со стабилизатором, не оказывающих токсического действия, необходима обработка ультразвуковым излучением в течение 30 мин частотой 35 кГц.
Список литературы
1. Zhang I, Wang Н, Yan X, Zhang L. 2005. Comparison of short-term toxicity between Nano-Se and selenite in mice. LifeSci. Jan 21; 76(10):1099-109.
2
2. Hao L, Wang Z, Xing B. 2009. Effect of sub-acute exposure to ТiO nanoparticles on oxidative stress and histopathological changes in Juvenile Carp (Cyprinuscarpio). J EnvironSci (China); 21(10):1459-66.
3. Wang H, Sun X, Liu Z, Lei Z. 2014. Creation of nanopores on graphene planes with MgO template for preparing high-performance supercapacitor electrodes. Nanoscale. May 7.
4. Rohner F, Ernst FO, Arnold M, Hilbe M, Biebinger R, Ehrensperger F, Pratsinis SE, Langhans W, Hurrell RF, Zimmermann MB. 2007. Synthesis, characterization, and bioavailability in rats of ferric phosphate nanoparticles. I Nutr.Mar; 137(3):614-9.
5. Yang L, Kuang H, Zhang W, Aguilar ZP, Xiong Y, Lai W, Xu H, Wei H. 2014 Size dependent biodistribution and toxicokinetics of iron oxide magnetic nanoparticles in mice. Nanoscale. Dec 11; 7(2):625-36. doi: 10.1039/c4nr05061d.
6. Cho WS, Kim S, Han BS, Son WC, Jeong J. 2009. Comparison of gene expression profiles in mice liver following intravenous injection of 4 and 100 nm-sized PEG-coated gold nanoparticles. Toxicol Lett.; 191:96-102.
7. Prietl B, Meindl C, Roblegg E, Pieber TR, Lanzer G, . 2014. Nano-sized and micro-sized polystyrene particles affect phagocyte function. Cell BiolToxicol. Feb; 30(1):1-16. doi. 10.1007/s10565-013-9265-y. Epub 2013 Nov 29.
8. Патент на изобретение RU №2296571 Ранозаживляющий состав и способ его получения. Опубликовано 10.04.2007.
9. Нотова С.В., Тимашева А.Б., Лебедев С.В., Сизова Е.А., Мирошников С.А. Элементы статус и биохимический состав крови лабораторных животных при внутримышечном введении аспаргината и наночастиц, меди // Вестник Оренбургского государственного университета, №122, 2013. - С. 159-163.
10. Яушева Е.В., Мирошников С.А., Иван О.В. Оценка влияния наночастиц металлов на морфологические показатели периферической крови животных // Вестник Оренбургского государственного университета, №12, 2013. - С. 203-207.
11. Ген М.Я., Миллер А.В. Авторское свидетельство СССР №814432, 1981. Бюл. №11.
12. Патент на изобретение RU №2234945 Стабилизатор водного раствора и водосодержащего сырья с самопроизвольно изменяющимися окислительно-восстановительными свойствами. Опубликовано 27.08.2004.
13. Патент на изобретение RU №2367513 Способ получения полимерного покрытия на поверхности наночастиц. Опубликовано 20.09.2009.
14. Дерябин Д.Г., Алешина Е.С., Дерябина Т.Д., Ефремова Л.В. 2011. Биологическая активность ионов, нано- и микрочастиц Сu и Fe в тесте ингибирования бактериальной биолюминесценции // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химий. №6. С. 31-36.