ПОДЛОЖКА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СПЕКТРОВ ГИГАНТСКОГО КОМБИНАЦИОННОГО РАССЕЯНИЯ

Подложка для получения спектров гигантского комбинационного рассеяния
Полезная модель относится к области получения и подготовки образцов для исследования, а именно к подложкам для получения спектров гигантского комбинационного рассеяния (ГКР).
Известны подложки для ГКР, в которых наночастицы металла, выбранного из ряда золото, платина, медь, никель, палладий или их сочетания, нанесены на носитель, представляющий собой углеродные нанотрубки, обеспечивающие достаточную шероховатость получаемой подложки (US 20110311729, 22.12.2011).
-1
-1
Такие подложки имеют следующие недостатки. Углеродные нанотрубки имеют широкие характеристические линии в спектрах комбинационного рассеяния - D-линию в районе 1350 см и G-линию в районе 1580 см. Присутствие этих линий затрудняет последующую обработку и сравнение спектров аналитов.
2
Известны ГКР-активные подложки, включающие массивы кластеров наночастиц с многоуровневым усилением сигнала (US 2015185370, 02.07.2015). Массивы кластеров наночастиц размером до 25,4 мкм изготавливаются на пленке золота толщиной 10 нм путем направленной самосборки на участках поверхности, модифицированных тиольными группами, а модифицирование проводится на участках поверхности, освобожденных от покрытия полиметилметакрилатом с помощью электронно-лучевой литографии. Наибольшее усиление спектра наблюдается при количестве наночастиц в кластере, большем или равном 4, и при расстоянии между кластерами в массиве менее 200 нм. Массивы кластеров наночастиц обеспечивают усиление сигнала КР. Применение массивов кластеров наночастиц включает спектральную идентификацию бактерий.
Такие подложки имеют следующие недостатки. Применение электронно-лучевой литографии ограничивает производительность процесса приготовления ГКР-активных подложек, а применение дорогостоящих бифункциональных реактивов в ходе самосборки (амино-ПЭГ-тиолов и карбокси-ПЭГ-тиолов) приводит к удорожанию получаемых ГКР-активных подложек. Получаемые ГКР-активные подложки не позволяют проводить концентрирование аналита. Кроме того, такой способ приготовления ГКР-активных подложек является многостадийным и сложным в осуществлении, так как требует контроля успешного проведения каждой из стадий.
Также известны ГКР-активные подложки (US 7583379, 06.11.2009), включающие массив наностержней золота, нанесенных на носитель под углом. К наностержням на поверхности прививают антитела, специфичные к определенным вирусам, бактериям или биомолекулам. Применение таких ГКР-активных подложек позволяет обнаруживать малые количества вирусов, бактерий или биомолекул и классифицировать их путем анализа полученных спектров ГКР.
Такие подложки обладают следующими недостатками. Применение антител для селективного связывания аналита (вирусов, бактерий или биомолекул) ограничивает срок службы получаемых ГКР-активных подложек и удорожает их. Получаемые ГКР-активные подложки не позволяют проводить концентрирование аналита.
Из известных технических решений наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является подложка для ГКР, в которой наночастицы золота нанесены на магнитные микросферы с последующим нанесением на них слоя оксида кремния. Полученные сложные микрочастицы используют для получения спектров ГКР различных аналитов (например, бензола, толуола, этилбензолов, ксилолов, хлорсодержащих растворителей, тринитротолуола, нервно-паралитических газов, раздражающих газов, ионов металлов, анионов, антигенов, пептидов, нуклеиновых кислот, спор, грибов, вирусов и бактерий) (US 7879625).
Такая подложка имеет следующие недостатки. Получение сложных агрегатов из магнитных микрочастиц, наночастиц золота и слоя оксида кремния является многостадийным процессом, требующим тщательного контроля, что удорожает получаемую подложку для ГКР. Используемые магнитные микрочастицы могут иметь характеристические линии в спектрах комбинационного рассеяния, которые будут затруднять последующую обработку и сравнение спектров аналитов. Слой оксида кремния между наночастицами золота и аналитом будет ослаблять электромагнитное поле поверхности наночастиц вблизи аналита и, таким образом, снижать ГКР-активность получаемых подложек для ГКР.
Задачей настоящего изобретения является создание подложек для получения спектров гигантского комбинационного рассеяния, обеспечивающих получение спектров аналитов, характеризующихся как высокой, так и низкой активностью в спектрах комбинационного рассеяния, а также обеспечивающих возможность автоматической обработки получаемых спектров.
Поставленная задача достигается тем, что подложка для получения спектров гигантского комбинационного рассеяния состоит из носителя, выполненного из материала с характеристическими пиками в спектре комбинационного рассеяния, сорбента, с толщиной, обеспечивающей отсутствие характеристических пиков материала носителя в спектре комбинационного рассеяния, исследуемого аналита и наноматериала со свойством поверхностного плазмонного резонанса вблизи длины волны лазерного возбуждения, причем указанный сорбент нанесен на носитель, а аналит и наноматериал нанесены на сорбент последовательно слой за слоем. В предпочтительных вариантах реализации полезной модели:
- в качестве носителя используют тканые или волоконные материалы;
- в качестве сорбента используют высокодисперсные оксид кремния, силикагель, оксид алюминия, галлуазит;
- в качестве аналита используют химические вещества или биологические объекты;
- в качестве наноматериала используют коллоидные частицы металлов, выбранных из ряда золото, серебро, медь или их сочетания.
Достигаемый технический результат заключается в исключении паразитных пиков подложки в получаемых спектрах аналита с одновременным обеспечением возможности концентрирования аналита в составе подложки.
Сущность способа иллюстрируется рисунком 1, на котором приведено схематическое изображение приготовленной подложки для получения спектров гигантского комбинационного рассеяния и примерами конкретной реализации, которые иллюстрируются рис. 2-6, где на рис. 2. приведен спектр гигантского комбинационного рассеяния поверхности спор бактерий Bacillus mucoides, полученный по примеру 1, на рис. 3 - спектр гигантского комбинационного рассеяния красителя родамин 6G, полученный по примеру 2, на рис. 4 - спектры гигантского комбинационного рассеяния полиароматических углеводородов, полученные по примеру 3: 1 - антрахинондисульфонат натрия; 2 - нафталин; 3 - аценафтен; 4 - флуорен, на рис. 5 - спектр гигантского комбинационного рассеяния поверхности клеток бактерий Micrococcus luteus, полученный по примеру 5, на рис. 6 - спектр гигантского комбинационного рассеяния поверхности клеток бактерий Escherichia coli, полученный по примеру 7.
На чертеже приняты следующие обозначения: 1 - носитель, 2 - сорбент, 3 - исследуемый аналит, 4 - наноматериал.
Сущность способа заключается в следующем.
Для приготовления подложек для получения спектров гигантского комбинационного рассеяния применяют носитель 1 в виде сплошной основы, тканой основы или волоконной основы. Носитель 1 покрывают сорбентом 2, характеризующимся отсутствием выраженных пиков в спектрах комбинационного рассеяния, причем толщина слоя сорбента 2 выбирается таким образом, что при снятии спектра комбинационного рассеяния в полученном спектре отсутствуют характеристические пики носителя 1, и получаемый спектр идентичен спектру чистого сорбента 2.
После нанесения слоя сорбента 2 на носитель 1 становится возможным концентрировать на нем аналит 3 путем фильтрования раствора или суспензии аналита через носитель и сорбент либо путем нанесения раствора или суспензии аналита на слой сорбента по каплям с последующим высушиванием.
Аналит 3 и наноматериал 4, способный участвовать в возбуждении спектров гигантского комбинационного рассеяния, наносят на слой сорбента 2 последовательно. Таким образом приготавливают подложку для получения спектров гигантского комбинационного рассеяния, включающую в себя как основу из носителя 1 и сорбента 2, так и смесь аналита 3 и наноматериала 4. При облучении приготовленной таким образом подложки сфокусированным лучом лазера возбуждается спектр гигантского комбинационного рассеяния в точках контакта аналита 3 и наноматериала 4, по которому определяют природу аналита 3.
В качестве носителя 1 возможно использовать как сплошные материалы (например, стекло, кварц, алюминий), так и пористые мембраны (например, полипропиленовые или политетрафторэтиленовые), тканые материалы (стеклоткань, хлопчатобумажная ткань, полиэфирная ткань), а также волоконные материалы (например, фильтровальная бумага, регенерированная целлюлоза, полипропилен, лавсан). Для обеспечения возможности эффективного концентрирования аналита на приготавливаемой подложке предпочтительно использовать в качестве носителя 1 тканые или волоконные материалы, через которые возможно фильтровать раствор или суспензию аналита.
В качестве сорбента 2 возможно использовать различные материалы, характеризующиеся отсутствием выраженных пиков в спектрах комбинационного рассеяния, например, оксид кремния, силикагель, оксид алюминия, галлуазит. Для обеспечения возможности эффективного концентрирования аналитов, представляющих собой клетки микроорганизмов, на приготавливаемой подложке предпочтительно использовать в качестве сорбента 2 высокодисперсные оксид кремния, силикагель, оксид алюминия, галлуазит, с обеспечением порога отсечения фильтра, получающегося при нанесении слоя сорбента 2 на носитель 1, менее 1 мкм, более предпочтительно в интервале 0,1-0,5 мкм, наиболее предпочтительно на уровне около 0,2 мкм.
В качестве аналита 3 возможно использовать как химические вещества, так и биологические объекты, например, клетки микроорганизмов. Так как явление гигантского комбинационного рассеяния наиболее перспективно применять для обнаружения химических веществ в низких концентрациях, предпочтительно из химических веществ использовать в качестве аналита такие химические вещества, которые обладают высокой активностью в спектрах комбинационного рассеяния, в частности, химические вещества, включающие одну или более структурную часть, имеющую ароматический характер, например, полиароматические углеводороды. Из биологических объектов предпочтительно использовать в качестве аналита 3 клетки микроорганизмов. Под клетками микроорганизмов понимаются при этом одиночные или сгруппированные клетки бактерий, архей, цианобактерий, простейших, дрожжей, низших грибов, высших грибов, а также споры любых из перечисленных микроорганизмов. При использовании в качестве аналита 3 клеток микроорганизмов возможно использовать предварительное концентрирование клеток микроорганизмов из объема суспензии в ходе ее фильтрации через слой сорбента 2, нанесенного на носитель 1. Также возможна фильтрация газов (например, воздуха), предположительно содержащих споры микроорганизмов, через слой сорбента 2, нанесенного на носитель 1 с целью концентрирования аналита на подложке.
В качестве наноматериала 4 возможно использовать коллоидные частицы металлов, выбранных из ряда золото, серебро, медь или их сочетания. Коллоидные частицы металлов могут при этом иметь форму сфер, многогранников, стержней, пластинок, звезд или иметь неправильную форму. Так как явление гигантского комбинационного рассеяния наблюдается на участках металла с большой кривизной поверхности на наномасштабе (от 10 до 100 нм), предпочтительно в качестве наноматериала 4 использовать коллоидные частицы металлов, имеющие острые выступы или резкие углубления, например, коллоидные частицы металлов в виде стержней или звезд. Наиболее предпочтительно использовать в качестве наноматериала 4 звездоподобные частицы, состоящие из золота и серебра в соотношении 30:1.
Подложку изготавливают следующим образом.
Выбирают носитель 1 из соображений соответствия его задаче обнаружения аналита 3. Так, если аналит 3 предполагается наносить из раствора или суспензии путем нанесения с последующим высушиванием, возможно использовать сплошной носитель 1. В этом случае предпочтительно выбирать носитель 1 с наименьшей активностью в спектрах комбинационного рассеяния, например, металлический алюминий в виде бруска, листа или фольги. Если же аналит 3 предполагается наносить из раствора или суспензии путем фильтрования, предпочтительно использовать носитель 1 в виде тканой или волоконной основы, например, хлопчатобумажная ткань, полиэфирная ткань, бумага, регенерированная целлюлоза, полипропилен, лавсан. В качестве носителя 1 возможно использовать коммерчески доступные фильтрующие материалы или же готовые фильтры (например, фильтры бумажные для аналитической химии). После выбора носителя 1 получают спектр комбинационного рассеяния носителя 1, предпочтительно в тех же условиях и в том же режиме, в котором предполагается получать спектры комбинационного рассеяния в присутствии аналита 3. Отмечают характеристические пики в спектре носителя 1 в диапазоне рамановских сдвигов, в котором предполагается получать спектры гигантского комбинационного рассеяния аналита 3.
Далее выбирают сорбент 2 из соображений соответствия его задаче обнаружения аналита 3. Так, если аналит представляет собой химическое вещество или смесь химических веществ, целесообразно выбирать такой сорбент 2, который эффективно сорбирует аналит 3. При выборе сорбента 2 получают спектр комбинационного рассеяния сорбента 2, предпочтительно в тех же условиях и в том же режиме, в котором предполагается получать спектры комбинационного рассеяния в присутствии аналита 3. Отмечают отсутствие характеристических пиков в спектре сорбента 2 в диапазоне рамановских сдвигов, в котором предполагается получать спектры гигантского комбинационного рассеяния аналита 3. На носитель 1 наносят слой сорбента 2, причем толщину слоя сорбента 2 выбирают таким образом, чтобы при получении спектров комбинационного рассеяния после нанесения в спектрах отсутствовали характеристические пики носителя 1.
Далее выбирают наноматериал 4 из соображений соответствия его задаче обнаружения аналита 3. При выборе наноматериала 4 получают спектр комбинационного рассеяния наноматериала 4, предпочтительно в тех же условиях и в том же режиме, в котором предполагается получать спектры комбинационного рассеяния в присутствии аналита 3. Отмечают отсутствие характеристических пиков в спектре наноматериала 4 в диапазоне рамановских сдвигов, в котором предполагается получать спектры гигантского комбинационного рассеяния аналита 3.
Далее на слой сорбента 2 наносят последовательно аналит 3 и наноматериал 4, причем выбор способа нанесения производят из соображений соответствия его задаче обнаружения аналита 3. Так, если аналит 3 представляет собой раствор химического вещества или смеси химических веществ, для которых сложно подобрать эффективно сорбирующий их сорбент 2, то целесообразно наносить аналит 3 на слой сорбента 2 путем нанесения раствора с последующим высушиванием. Если же аналит 3 представляет собой раствор химического вещества или смеси химических веществ, для которых возможно подобрать эффективно сорбирующий их сорбент 2, или же аналит 3 представляет собой суспензию химического вещества или смеси химических веществ, или клеток микроорганизмов, то целесообразно наносить аналит 3 на слой сорбента 2 путем фильтрования. При этом целесообразно проводить концентрирование аналита 3 на слое сорбента 2 из возможно большего объема раствора или суспензии, чтобы затем нанести наноматериал 4 на сконцентрированный на слое сорбента 2 аналит 3 путем фильтрования или же нанесения с последующим высушиванием.
Далее получают спектры гигантского комбинационного рассеяния аналита 3 в составе подложки. Благодаря тому, что в диапазоне рамановских сдвигов, в котором получают спектры гигантского комбинационного рассеяния, отсутствуют характеристические пики носителя 1, сорбента 2 и наноматериала 4, возможно осуществить автоматическое вычитание собственных спектров носителя 1, сорбента 2, наноматериала 4, а также спектра флуоресценции аналита 3. Для этого возможно воспользоваться известными алгоритмами автоматического вычитания, например, алгоритмом Либера-Махадеван-Янсен [Lieber & Mahadevan-Jansen (2003) Automated Method for Subtraction of Fluorescence from Biological Raman Spectra // Applied Spectroscopy, 57, pp. 1363-1367. DOI: 10.1366/000370203322554518].
Ниже приведены примеры конкретной реализации предлагаемого способа, не ограничивающие его применение.
Пример 1
Синтез золотых наночастиц в форме звезд проводили по методике [Cheng, L.С., Huang, J.Н., Chen, Н.М., Lai, Т.С., Yang, K.Y., Liu, R.S., … & Tsai, D.P. (2012). Seedless, silver-induced synthesis of star-shaped gold/silver bimetallic nanoparticles as high efficiency photothermal therapy reagent. Journal of Materials Chemistry, 22(5), 2244-2253]. Для приготовления наночастиц в форме звезд приготавливали раствор, содержащий 20 мкл 10 мМ раствора тетрахлорзолотой кислоты и 2 мкл 10 мМ раствора нитрата серебра в 1 мл деионизированной воды. Затем к приготовленному раствору быстро добавляли 4 мкл 100 мМ водного раствора аскорбиновой кислоты и интенсивно встряхивали раствор в течение 20 секунд. Цвет раствора изменялся на голубой. В спектрах поглощения полученных звездообразных наночастиц наблюдается широкий пик в области 700-800 нм, что включает длину волны 785 нм используемого лазера. Полученные наночастицы золота в форме звезд использовали в качестве наноматериала 4.
Подложку для получения спектров гигантского комбинационного рассеяния изготавливали путем нанесения на бактериальный фильтр с порогом отсечения 0,2 мкм, представляющий собой пористую мембрану из поламидного пластика, слоя галлуазита в виде суспензии с последующим высушиванием до тех пор, пока спектр комбинационного рассеяния такой подложки не оказывался идентичен спектру комбинационного рассеяния исходного галлуазита. Аналит (суспензию спор бактерий Bacillus mucoides) наносили на слой галлуазита по каплям с высушиванием каждой капли перед нанесением последующей. Таким образом, обеспечивали концентрирование клеток на малой площади подложки. Суспензию наночастиц золота в виде звезд наносили на ту же самую область подложки, что и суспензию спор бактерий, получая таким образом подложку, пригодную для получения спектров гигантского комбинационного рассеяния. Спектры гигантского комбинационного рассеяния получали, фокусируя луч лазера с длиной волны около 785 нм на дне капли суспензии наночастиц золота, возбуждая таким образом с помощью наночастиц золота спектр гигантского комбинационного рассеяния поверхности спор бактерий Bacillus mucoides. Флуоресцентную составляющую в спектре вычитали автоматически по алгоритму Либера-Махадеван-Янсен. Пример получаемого спектра показан на рисунке 2. Пример 2.
Синтез золотых сферических наночастиц диаметром 50 нм проводили по методике [Bastús, N.G., Comenge, J., & Puntes, V. (2011). Kinetically controlled seeded growth synthesis of citrate-stabilized gold nanoparticles of up to 200 nm: size focusing versus Ostwald ripening. Langmuir, 27(17), 11098-11105.]. К 150 мл 2,2 мМ раствора цитрата натрия, нагретого до кипения по каплям при перемешивании добавляли 1 мл 25 мМ раствора тетрахлорзолотой кислоты. Затем полученную суспензию охлаждали до 90°C и добавляли 1 мл 25 мМ раствора тетрахлорзолотой кислоты. Выжидали 30 минут. Затем добавляли такое же количество раствора тетрахлорзолотой кислоты и оставляли на 30 минут. Затем отбирали образец суспензии (55 мл) и добавляли в реакционную колбу 53 мл деионизированной воды и 2 мл 60 мМ раствора цитрата натрия. Затем процесс повторяли, начиная с добавления 1 мл 25 мМ раствора тетрахлорзолотой кислоты до достижения необходимого размера наночастиц (50 нм). Полученные сферические наночастицы золота предкоагулировали добавлением к суспензии наночастиц раствора сульфата магния до достижения концентрации сульфата магния на уровне 0,02 моль/л, отмечали изменение окраски суспензии и появление широкого пика в спектрах поглощения суспензии в области 600-800 нм. Предкоагулированные сферические наночастицы использовали в качестве наноматериала 4.
Подложку для получения спектров гигантского комбинационного рассеяния изготавливали аналогично Примеру 1, используя предкоагулированные сферические наночастицы золота в качестве наноматериала 4 и суспензию клеток бактерий Micrococcus luteus в качестве аналита.
Спектры гигантского комбинационного рассеяния получали, фокусируя луч лазера с длиной волны около 785 нм на дне капли суспензии наночастиц золота, возбуждая таким образом с помощью наночастиц золота спектр гигантского комбинационного рассеяния поверхности клеток бактерий Micrococcus luteus. Пример получаемого спектра показан на рисунке 3.
Пример 3.
Синтез наночастиц типа золотое ядро-серебряная оболочка, стабилизированных цитрат-анионами, проводили по методике [Yang, Y., Shi, J., Kawamura, G., & Nogami, M. (2008). Preparation of Au-Ag, Ag-Au core-shell bimetallic nanoparticles for surface-enhanced Raman scattering. Scripta Materialia, 58(10), 862-865].
1 мл 1% (масс.) раствора тетрахлорзолотой кислоты и 2 мл 28,8 мМ раствора цитрата натрия последовательно добавляли к 90 мл кипящей деионизированной воды. После того, как раствор приобретал красную окраску, его быстро охлаждали в ледяной бане.
Далее 10 мл полученной суспензии и 1 мл 38,8 мМ раствора цитрата натрия добавляли к 30 мл деионизированной воды. Затем к раствору последовательно добавляли 1,2 мл 10 мМ раствора нитрата серебра и 0,4 мл 100 мМ водного раствора аскорбиновой кислоты при перемешивании. Полученные сферические наночастицы типа золотое ядро-серебряная оболочка использовали в качестве наноматериала 4.
Приготовление подложки и получение спектров гигантского комбинационного рассеяния производили аналогично Примеру 2.
Пример 4.
Стержнеобразные наночастицы золота получали по методике [Sau, Т.K., & Murphy, С.J. (2004). Seeded high yield synthesis of short Au nanorods in aqueous solution. Langmuir, 20(15), 6414-6420.].
Подложку для получения спектров гигантского комбинационного рассеяния изготавливали аналогично Примеру 1, используя стержнеобразные наночастицы золота в качестве наноматериала 4 и суспензию клеток бактерий Escherichia coli в качестве аналита. Спектры гигантского комбинационного рассеяния получали аналогично Примеру 1.
Пример получаемого спектра показан на рисунке 4.