СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕТЕРОГЕННОГО ПРЕПАРАТА РАЗЛИЧНОЙ ДИСПЕРСНОСТИ НА ОСНОВЕ БРОМЕЛАЙНА И ХИТОЗАНА
METHOD FOR OBTAINING HETEROGENEOUS PREPARATION OF VARIOUS DISPERSITIES BASED ON BROMELAIN AND CHITOSAN

Изобретение относится к биотехнологии и может применяться в химико-фармацевтической промышленности. Предложен способ получения гетерогенных биокатализаторов на основе цистеиновой протеазы бромелайна. Ферментный препарат может быть использован в области медицины и ветеринарии.
Протеолитические ферменты занимают отдельную нишу в медицинской промышленности. Энзимные препараты используют в качестве регенеративных, ранозаживляющих, антипаразитарных агентов.
Бромелайн (КФ 3.4.22.32) - протеолитический фермент растительного происхождения, получаемый из ананаса. В 1957 г. Хейник и Гортнер сообщили, что у всех исследованных ими растений семейства Bromeliacea активные протеолитические ферменты содержатся не только в плодах, но и в других частях растений. Для всех этих энзимов было предложено одно общее название - бромелайн. Бромелайн и/или другие цистеиновые протеазы входят в состав продуктов для ухода за полостью рта, которые препятствуют образованию зубного налета, разрушают биологические пленки, обладают противовоспалительным действием, замедляют развитие заболеваний полости рта [Патент RU 2380084, МПК А61K 8/21, А61K 8/98, A61Q 11/00, опубл. 27.01.2010]. Бромелайн выступает в роли одного из типов активных соединений в композиции для профилактики и лечения кариеса [Патент RU 2446208, МПК C12N 1/20, опубл. 27.03.2012]. Цистеиновые протеазы входят в состав стоматологической композиции для уменьшения или удаления поверхностных отложений окрашивающих веществ с естественных зубов и зубных протезов, включая контактирующие области зубов и/или зубных протезов [Патент RU 2139037, МПК А61K 7/20, опубл. 10.10.1999]. Растительные протеазы входят в состав идентификационных полосок для экспресс-теста на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента. Предполагается использовать данные полоски во всех областях медицины (хирургия, травматология, реаниматология, акушерство и др.), связанных с переливанием эритроцитов и других компонентов крови [Патент RU 2129281, МПК G01N 33/80, опубл. 20.04.1999].
Использование растворимых энзимов имеет ряд ограничений: быстрая инактивация ферментов под действием различных факторов среды, невозможность отделить продукт реакции от ферментного катализатора, узкие температурные рамки и рамки кислотности среды. Частично решить эти проблемы могут иммобилизованные на нерастворимой матрице, например, на хитозане, ферменты.
Хитозаны являются сополимерами 2-амино-2-дезокси-β-D-глюкозамина и 2-ацетамидо-2-дезокси-β-D-глюкозамина. Молекулы хитозанов содержат гидроксильные и аминогруппы, вследствие этого их матрица позволяет сорбировать различные агенты внутри сетки и на ее поверхности. Производные хитозанов характеризуются нетоксичностью, биоразлагаемостью, биосовместимостью и слабой иммуногенностью. Создана биологически активная композиция для медицинских, косметических целей, а также для использования в качестве пищевой добавки, содержащая хитозановый гель или хитозановую суспензию с размером наногранул шарообразной формы не более 100 нм и ионы благородных металлов в количестве не более 10 мас. % [Патент RU 2471477, МПК А61K 9/00, А61K 31/722, А61Р 17/02, А61K 31/498, А61Р 31/04, опубл. 10.01.2013]. Существует композиция комплекса сукцината хитозана и диоксидина с хлоргексидином, которая обладает антибактериальными и ранозаживляющими свойствами [Патент RU 2193895, МПК A61L 15/28, A61L 15/30, A61L 15/32, опубл. 10.12.2002]. Предложена монослойная пленка для покрытия ран, состоящая из хитозана, коллагена, полисахарида растительного происхождения и латекса каучука. Такое покрытие предлагается для лечения ран, ожогов, трофических язв [RU 2476199, МПК А61K 6/00, А61K 31/14, А61K 33/38, А61K 31/722, А61Р 31/04, опубл. 27.02.2013]. Хитозан входит с состав для дезинфекции и очистки съемных пластиночных протезов. Повышение эффективности дезинфекции частичных и полных съемных пластиночных протезов достигается за счет совокупного действия введенных веществ - сукцината хитозана, ионов серебра и цетримида. Данные вещества обеспечивают выраженное бактерицидное действие в отношении грамположительных, грамотрицательных микроорганизмов, фунгицидное действие в отношении дрожжеподобных грибов, в том числе рода Candida, противовирусное действие (на оболочечные и безоболочечные вирусы), а также эффективны против микобактерии [Патент RU 2380084, МПК А61K 8/21, А61K 8/98, A61Q 11/00, опубл. 27.01.2010].
Предложен способ, который позволяет производить шовный хирургический материал, обладающий достаточной прочностью, хорошей завязываемостью, биосовместимостью и атравматичностью. Названные выше эффекты достигаются тем, что лавсановую нить покрывают оболочкой из хитозана [Патент RU 2080126, МПК A61L 17/00, опубл. 09.08.1994].
В качестве прототипа служил СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГНОЙНО-НЕКРОТИЧЕСКИХ РАН (SU 1814764, МПК А61K 31/557, А61K 47/48, опубл. 20.03.1995), включающий иммобилизацию ферментного препарата, с целью повышения лечебного эффекта средства, иммобилизацию проводили путем обработки 2%-ного геля хитозана 2%-ным раствором глутарового альдегида в фосфатном буфере при pH 7.5, взятых в соотношении 1:1, выдерживания его при температуре 18-20°C в течение 30 мин, после чего пропускали через гель экстракт гепатопанкреаса камчатского краба, содержащего комплекс ферментов: ДНК-азу в количестве 100-120 ед/мг белка, РНК-азу - 100-120 ед/мг, щелочную фосфатазу - 0.05-0.07 ед/мг, фосфодиэстеразу 1 типа - 0.05-0.06 ед/мг и протеазу - 120 кд/мг, предварительно растворенный в фосфатном буфере pH 7.5 при соотношении хитозан : экстракт 1:2.5-5 (по массе).
Технический результат заключается в разработке способа получения гетерогенного препарата различной дисперсности на основе бромелайна и хитозана, который позволит сократить расход ранозаживляющего средства благодаря высокой стабильности препарата при температурах выше физиологических и пролонгированному действию препарата.
Действующим веществом предлагаемого нами средства является бромелайн, который обладает противовоспалительным действием, ускоряет процессы репарации тканей в результате деполимеризации межклеточных структур и модификации проницаемости сосудов. Противовоспалительный и антиагрегантный эффекты фермента обусловлены его способностью изменять метаболизм арахидоновой кислоты. Температурный оптимум функционирования бромелайна составляет порядка 60°С [H.J. Suh [et al.] Purification and characterization of bromelain isolated from pineapple // J. Han'guk Nonghwa Hakhoechi - 1992. - Vol. 35. - P. 300-307], иммобилизация фермента на матрице нерастворимого полимера дает эффект дополнительной стабилизации препарата [R. Mahmood [et al.] Additional stabilization of stem bromelain coupled to a thermosensitive polymer by uniform orientation and using polyclonal antibodies // Biochemistry. - 2007. - Vol. 72. - P. 307-312]. Кроме того, в качестве носителя для иммобилизации бромелайна (основы повязки) нами был выбран хитозан различной молекулярной массы и степени дисперсности, который сам обладает противовоспалительными, противомикробными, противогрибковыми и ранозаживляющими свойствами, не вызывая при этом аллергических реакций.
Технический результат достигается тем, что в способе получения гетерогенного препарата различной дисперсности на основе бромелайна и хитозана, включающем иммобилизацию ферментного препарата в буферном растворе, инкубирование и промывку, согласно изобретению, иммобилизацию бромелайна проводят на матрицу кислоторастворимого хитозана среднемолекулярного или высокомолекулярного в соотношении 20 мл раствора фермента в концентрации 5 мг/мл на 1 г носителя; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 50 мМ трис-глициновый буфер с pH 9.0 для среднемолекулярного и с pH 8.5 для высокомолекулярного хитозана; инкубация проводится в течение 4 часов для среднемолекулярного и 5 часов для высокомолекулярного хитозана при комнатной температуре; образовавшийся осадок промывают 50 мМ трис-HCl буфером (pH 7.5) до отсутствия в промывных водах белка.
На фиг. 1 приведена диаграмма содержания белка (мг/г носителя) в препаратах бромелайна, иммобилизованных на матрице кислоторастворимых среднемолекулярного (СМ) и высокомолекулярного (ВМ) хитозанов. На фиг. 2 приведена диаграмма общей каталитической активности (ед/мл раствора) в препаратах бромелайна, иммобилизованных на матрице кислоторастворимых среднемолекулярного (СМ) и высокомолекулярного (ВМ) хитозанов. На фиг. 3 приведена диаграмма удельной каталитической активности (ед/мг белка) в препаратах бромелайна, иммобилизованных на матрице кислоторастворимых среднемолекулярного (СМ) и высокомолекулярного (ВМ) хитозанов.
Объектом исследования был выбран бромелайн фирмы «Sigma-Aldrich». В качестве нерастворимой матрицы для адсорбции мы использовали кислоторастворимые среднемолекулярный (Mr=200 кДа, степень деацетилирования - 82%) и высокомолекулярный (Mr=350 кДа, СД=94.85%) хитозаны производства ЗАО «Биопрогресс». В роли иммобилизационной среды тестировали следующие растворы: 0.05 М глициновый (pH 8.6-10.0), 0.05 М ацетатный (pH 4.0-5.0), 0.05 М боратный буфер с добавлением KCl (pH 8.0-10.0) и 0.05 М трис-глициновый буфер (pH 8.5-9.0).
Иммобилизацию бромелайна на матрице хитозана осуществляли адсорбционным методом. К 1 г хитозана добавляли 20 мл буферного раствора фермента в концентрации 5 мг/мл (с использованием различных буферов в диапазоне pH от 4.0 до 10.5), инкубировали в течение 4 часов с периодическим перемешиванием для среднемолекулярного (СМ) хитозана, а при использовании высокомолекулярного (ВМ) хитозана инкубировали 5 часов. После окончания времени инкубации образовавшийся осадок промывали 50 мМ трис-HCl буфером (pH 7.5) до отсутствия в промывных водах белка (контроль этого факта осуществляли на спектрофотометре СФ-2000 при λ=280 нм).
Содержание белка в иммобилизованных препаратах определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - P. 265-275]. Определение протеолитической активности иммобилизованного бромелайна проводили спектрофотометрически с использованием азоказеина (Fluka) в качестве субстрата. К 50 мг образца добавляли 200 мкл трис-HCl буфера, pH 7.5, 800 мкл азоказеина (0.5% в 50 мМ трис-HCl буфере, pH 7.5) и инкубировали 2 часа при 37°С. Далее приливали 800 мкл ТХУ (5%), инкубировали 10 минут при -4°С, затем центрифугировали в течение 3 мин при 13000 об/мин для удаления негидролизованного азоказеина. К 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл 3% NaOH для нейтрализации кислоты, после чего измеряли оптическую плотность опытной пробы при 410 нм в 1 см кювете. Контрольная проба содержала 800 мкл азоказеина, 800 мкл трихлоруксусной кислоты, 50 мг образца и 200 мкл буфера (без предварительной инкубации с субстратом). За единицу каталитической активности принимали количество фермента, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ субстрата за 1 мин. Удельную протеолитическую активность бромелайна рассчитывали по формуле:
ПА=D*1000/120/200/С,
где ПА - протеолитическая активность, мкМ/мин на 1 мг белка, D - оптическая плотность при 410 нм, С - концентрация белка в пробе, мг/мл, измеренная по методу Лоури, 120 - время инкубации в минутах, 200 - объем пробы, 1000 - пересчет в мкМ.
Статистическую обработку результатов проводили при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.
Анализ содержания белка в гетерогенных препаратах показал, что наибольшее количество бромелайна (в мг на г носителя) сорбируется на кислоторастворимом среднемолекулярном хитозане при использовании боратного буфера с добалением KCl с pH 8.0-10.0, ацетатного буфера с pH 4.5-5.8 и глицинового буфера с pH 8.6-10.5. При иммобилизации на высокомолекулярном хитозане наибольшее количество бромелайна сорбируется при использовании трис-глицинового буфера с pH 8.5-9.0, глицинового буфера с pH 8.6-10.5, боратного буфера с добавлением KCl с pH 8.0-10.0, а также ацетатного буфера с pH 5.0-5.8 (фиг. 1).
Общая активность (в ед на мл раствора) бромелайна, иммобилизованного на среднемолекулярном хитозане, оказалась выше при использовании следующих буферов: ацетатный с pH 4.5, 5.8, боратный с добавлением KCl в диапазоне pH 8.0-10.0 и трис-глициновый с pH 9.0. При иммобилизации на высокомолекулярном хитозане общая активность бромелайна оказалась выше при использовании трис-глицинового буфера с pH 8.5 и ацетатного буфера в диапазоне pH 5.0-5.8 (фиг. 2).
Наибольшую удельную активность показали препараты бромелайна, иммобилизованные на матрице среднемолекулярного и высокомолекулярного хитозанов, при использовании трис-глицинового буфера с pH 8.5-9.0 и с pH 8.5 соответственно (фиг. 3).
Оптимальное соотношение содержания белка (мг на г носителя), общей активности (в ед на мл раствора) и удельной активности (в ед на мг белка) выявлено при иммобилизации бромелайна при использовании трис-глицинового буфера на матрице среднемолекулярного хитозана с pH 8.5-9.0 и на матрице высокомолекулярного хитозана с pH 8.5.
Из вышеизложенного материала следует, что оптимальными для создания гетерогенных препаратов на основе бромелайна являются следующие два варианта:
Пример 1. К 1 г кислоторастворимого среднемолекулярного хитозана добавляли 20 мл раствора бромелайна в 50 мМ трис-глициновом буфере со значением pH 8.5-9.0, инкубировали в течение 4 часов. После окончания инкубации образовавшийся осадок промывали 50 мМ трис-HCl буфером (pH 7.5) до отсутствия в промывных водах белка (контроль этого факта осуществляли на спектрофотометре СФ-2000 при λ=280 нм).
Пример 2. К 1 г кислоторастворимого высокомолекулярного хитозана добавляли 20 мл раствора бромелайна в 50 мМ трис-глициновом буфере со значением pH 8.5, инкубировали в течение 5 часов. После окончания инкубации образовавшийся осадок промывали 50 мМ трис-HCl буфером (pH 7.5) до отсутствия в промывных водах белка (контроль этого факта осуществляли на спектрофотометре СФ-2000 при λ=280 нм).
Таким образом, была разработана методика получения гетерогенного биокатализатора различной степени дисперсности на основе бромелайна, иммобилизованного на матрице кислоторастворимых средне- и высокомолекулярного хитозанов для применения в медицинских и ветеринарных целях.