Активность н+-АТФазы везикулярных фракций плазмалеммы, очищенных двумя методами, в присутствии бридж 58

2004 ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. Сер. 3 Вып. 2

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ УДК 581.1

E.JI. Рудашевская, А.А. Кирпичникова, М. Ф. Шишова

АКТИВНОСТЬ Н+-АТФАЗЫ ВЕЗИКУЛЯРНЫХ ФРАКЦИЙ ПЛАЗМАЛЕМ-МЫ, ОЧИЩЕННЫХ ДВУМЯ МЕТОДАМИ, В ПРИСУТСТВИИ БРИДЖ 58*

Исследование структуры и свойств мембран растительной клетки, в том числе плазма-леммы, на протяжении почти четырех десятилетий ведется с использованием очищенных везикулярных препаратов. Наиболее интенсивно данный метод применялся как в отечественных [8, 5, 4], так и зарубежных лабораториях [10, 11, 12, 13, 20] при исследовании механизмов регуляции работы Н+-АТФазы, локализованной на плазмалемме и выполняющей широкий спектр функций, включающий в себя поддержание рН цитозоля, регуляцию интенсивности транспорта через плазмалемму, участие в росте растяжением и т.д.

С 1972 г. для получения фракции плазмалеммы используют разработанный Р.Т. Леонардом с соавторами [9,10] метод очистки в градиенте плотности сахарозы, который, по мнению большинства авторов, не позволяет достичь полного разделения эндомембран растительной клетки. Несколько позднее, в 1981 г., для очистки плазмалеммы К. Ларсоном и коллегами был разработан особый подход, основанный на разделении мембран в водной двухфазной системе - ПЭГ/декстран [23,19]. Уже первые результаты указывали, что новый метод позволяет не только достичь гораздо большей степени очистки препарата плазмалеммы, исключая примеси тонопласта и эндоплазматического ретикулума, но и может быть применен к большему числу тканей (в том числе пигменто-содержащим) (см.: [22]). Преимущества данного метода в первую очередь заключаются в том, что разделение везикул идет согласно свойствам поверхности мембраны, но не размерам или плотности везикул, как в случае использования дифференциального центрифугирования и градиента плотности. Поэтому чистота получаемой фракции составляет около 95%, по сравнению с 50-75% при использовании сахарозного градиента [18]. Еще одно чрезвычайно важное свойство разработанного подхода заключается в том, что полученные двухфазным методом везикулы имеют преимущественно нормальную ориентацию [18].

На кафедре физиологии и биохимии растений СПбГУ довольно продолжительное время для очистки плазмалеммы растительных клеток использовали градиент плотности сахарозы [6, 3, 9]. С целью введения нового метода в постоянную практику в задачи данной работы входило получение препарата плазматической мембраны клеток колеоптилей кукурузы с применением водной двухфазной системы выделения - ПЭГ/декстран. Для выяснения возможности сравнения новых данных в перспективе дальнейших исследований, с полученными ранее на сахарозном градиенте, проведено исследование активности Н+-АТФазы плазмалеммы, очищенных двумя методами препаратов и оценка сопоставимости полученных результатов.

Метериалы и методы. Объектом исследования служили колеоптили 4-суточных этиолированных проростков кукурузы (Zea mays L., гибрид ЗПТК-196). В опытах использовали декапитированные на 4 мм колеоптили. .

♦Работа выполнена при поддержке РФФИ (гранты №03-04-48167, 03-04-06103,03-04-06104).

© E.JI. Рудашевская, А.А. Кирпичникова, М.Ф. Шишова, 2004

Получение везикулярной фракции плазмалеммы клеток колеоптилей кукурузы. Микросомаль-ную фракцию получали дифференциальным центрифугированием, как описано ранее [3]. Далее проводили выделение плазмалеммы двумя способами - в градиенте плотности сахарозы и в водной двухфазной системе полиэтиленгликоля/декстрана.

Очистку в градиенте плотности сахарозы проводили по методу Леонарда и Ходжеса с модификациями [3]. Мембранный препарат собирали на границе двух слоев сахарозы с плотностью 1,13 и 1,17 г/см3. Везикулы загружали с помощью осмотического шока средой следующего состава: 150 ммоль/л K2S04, 150 ммоль/л сахарозы, 1 ммоль/л Трис-MES, рН 6,8. Загруженные везикулы переосаждали в течение 1 ч при 99 500 g для удаления избытка среды загрузки. Осадок везикул ресуспендировали в среде переосаждения из расчета 150 мкл среды на 15 г ткани.

Разделение мембран в водной двухфазной системе ПЭГ/декстран проводили согласно методике Ларсона [18, 17, 2]. Общую микросомальную фракцию, гомогенизированную в фосфатном буфере (5 ммоль/л), содержащем 330 ммоль/л сахарозу и 3 ммоль/л КС1, вносили в двухфазную смесь следующего состава: 6,2% ПЭГ, 6,2% декстран, 330 ммоль/л сахароза, 3 ммоль/л КС1, 5 ммоль/л КН2Р04. После тщательного перемешивания систему центрифугировали 3 мин при 1500 g. После разделения верхнюю фазу, содержащую ПЭГ и плазмалемму, снимали и помещали на новую нижнюю фазу. Такую очистку проводили 3 раза. Затем верхнюю фазу разбавляли три раза средой осаждения (300 ммоль/л сахарозы на 10 ммоль/л Трис-MES, рН 7,2) и центрифугировали при 95 000 g в течение 1 ч. Осадок везикул ресуспендировали в среде переосаждения из расчета 150 мкл среды на 15 г ткани.

Определение активности АТФазы везикулярной фракции плазмалеммы. Полученную суспензию везикул разбавляли раствором 150 ммоль/л сахарозы на 1 ммоль/л Трис-MES, рН 6,8 (в случае использования градиента плотности сахарозы) и 300 ммоль/л сахарозы на 10 ммоль/л Трис-MES, рН 7,0 (в случае двухфазной системы). Полную активность фермента определяли в присутствии 0,05% бридж 58. АТФазную реакцию фермента фракций плазмалеммы проводили в инкубационной среде следующего состава: 30 ммоль/ji Трис-MES, рН 6-Д КС1 50 ммоль/л, АТФ 3 ммоль/л, MgCl2 3 ммоЛь/л. Работу фермента начинали добавлением к инкубационной среде 0,2 мл мембранного препарата, содержащего 1-5 мкг белка. Инкубацию проводили в течение 30 мин при 37 °С на шейкере. Реакцию останавливали 20%трихлоруксусной кислотой на ледяной бане. Активность АТФазы мембранной фракции определяли спектрофотометрически по количеству неорганического фосфата (Фн)* накапливающегося в среде в ходе ферментативной реакции гидролиза АТФ. Для определения содержания Фн использовали молибденовый реактив, согласно методу Линдемана с модификациями [7]. Измерения интенсивности окрашивания проводили на спектрофотометре Spekol-211 при длине волны 750 нм. АТФазную активность препарата выражали в мкмоль Фн/мг белка в час. Определение содержания белка в мембранной фракции проводили по методу М.М. Bradford [10]. Опыты проводили в 3-6 биологических и 3-4 аналитических повторностях. На рисунках приведены средние арифметические значения и ошибки среднего.

Результаты и обсуждение. Используемые для получения мембранных препаратов методы включают в себя механическое разрушение растительной ткани, получение с помощью дифференциального центрифугирования общей микросомальной фракции, которую можно далее подвергнуть дополнительной очистке и разделению на фракции! Каждый этап такой предварительной подготовки с получением общей микросомальной фракции имеет большое значение для количества и качества получаемого препарата. Как правило, окончательный выбор условий выделения мембранных препаратов отрабатывается экспериментально для каждого объекта исследования.

Получение общей микросомальной фракции из клеток колеоптилей кукурузы проведено нами с использованием отработанной ранее схемы [3]. Для дальнейшего получения препарата плазмалеммы был использован как апробированный во многих лабораториях метод разделения мембран в водной двухфазной системе - полиэтиленгликоль/декстран, так и использованный в предыдущих наших работах способ, основанный на очистке в градиенте плотности сахарозы [9]. Таким образом, мы могли сравнивать свойства мембранных препаратов, различия которых определялись исключительно способом их очистки, так как они были получены из максимально выровненного исходного материала (общей микросомальной фракции).

При использовании двухфазной системы выделения для различных объектов исследования производят подбор оптимальных условий разделения мембран, варьируя плотность водной двухфазной смеси, которая может составлять 6,2-6,8% декстрана и ПЭГ, и солевой состав. Состав смеси влияет на разделение мембран и выход фракции плазмалеммы [19]. При выделении мембран из клеток колеоптилей в ряде работ использовали 6,2% смесь и 3 ммоль/л KCl, поэтому в нашей работе мы использовали аналогичную плотность. Выход фракции плазмалеммы по содержанию белка составил 0,2758 ± 0,0513 мкг/мкл. В случае очистки в градиенте плотности сахарозы фракция, обогащенная плазмалеммой, содержала 0,2748 ± 0,0402 мкг/мкл белка. Как видно, содержание белка в обоих случаях оказалось одинаковым, поэтому мы остановились в дальнейшем на использовании выбранного.состава смеси выделения.

Полученная с использованием двухфазного метода выделения фракция была подвергнута исследованию на наличие АТФазной активности. Активность АТФазы полученной фракции составила 5 мкмоль Фн/мг белка в час (рис. 1). Поскольку препараты плазмалеммы, получаемые двухфазным методом, состоят из преимущественно нормально ориентированных везикул [18,19], активные центры фермента оказываются недоступными для субстратов реакции. Ранее для получения полной активности везикулярной фракции нами использовался аламетицин. Аламетицин представляет собой пептидный антибиотик, образующий в мембранах крупные поры [1] диаметром до 20 А [2], достаточные для прохождения молекул АТФ и кофакторов реакции к активным центрам фермента, локализованным на внутреннней поверхности везикул. Однако в данном случае происходит нарушение целостности мембраны, как и в случае использования детергентов.

Бридж 58, %

Рис.1. Влияние бридж 58 в различных концентрациях на АТФазную активность везикулярной фракции, полученной с использованием двухфазного метода очистки в системе ПЭГ/декстран.

А - активность Н+-АТФазы везикулярной фракции

В настоящее время для работы с мембранными препаратами широко используется бридж 58. Показано, что присутствие в реакционной среде бридж 58 в концентрации 0,05% значительным образом стимулирует перенос протона через мембрану везикул плазмалеммы, тогда как классические детергенты (например, бридж 96) предотвращают формирование Н+ градиента [17]. Бридж 58 увеличивает АТФазную активность препаратов с выходом на плато в концентрации от 0,01 до 0,1%. Бридж 96 увеличивает активность АТФазы в низких концентрациях; но ингибирует ее с увеличением концентрации. При этом бридж 58 не изменяет ни транспортную, ни гидролазную активности самой Н+-АТФазы [17]. Поэтому в нашей работе для выявления полной активности везикулярного препарата и определения оптимальной концентрации используемого детергента во фракцию мембран вводили бридж 58 в различных концентрациях. Как видно из рис.1, бридж 58 значительно увеличивал АТФазную активность мембранной фракции, начиная с минимальной из использованных концентраций. Изменение активности препарата под влиянием различных концентраций бридж соответствовало данным, указанным в литературе [17]. Оптимальной выбрана 0,05% концентрация бридж 58, как общепринятая и соответствующая полученным нами результатам. В дальнейшем исследование мембранной фракции проводили в присутствии бридж 58.

Ферментативная АТФазная активность препарата мембран, полученного из клеток коле-оптилей кукурузы с использованием двухфазного метода, в присутствии 0,05% бридж 58 составила 106 мкмоль Фн/мг белка в час (см. рис.1). Следует отметить, что условия проведения ферментативной реакции, описанные в разделе «Материалы и методы», соответствуют оптимальным условиям работы К+-стимулируемой, 1У^2+-зависимой Н+-АТФазы плазмалеммы. При тестировании активности АТФазы мембранной фракции при различных значениях рН реакционной среды максимальная активность фермента наблюдалась при рН 6,0 (рис. 2), что соот-

рн

Рис.2. Зависимость АТФазной активности везикулярной фракции, полученной с использованием двухфазного метода очистки, от значения рН реакционной среды.

ветствует значению, оптимальному для работы Н+-АТФазы плазмалеммы. Неспецифичный ингибитор плазмалеммной Н+-АТФазы - дициклогексилкарбодиимид (ДЦКД, 5 - Ю-5 моль/л) и более специфичный - ортованадат натрия (Ыа3У04,4 -10"4 моль/л) приводили к значительному снижению АТФ-гидролазной активности везикулярной фракции - на 75 и 72% соответственно (рис. 3). При этом наблюдалась также меньшая чувствительность фракции к ванадату. Таким образом, в полученном из клеток колеогггилей кукурузы мембранном препарате выявлена высокая активность маркерного фермента плазмалеммы - Н+-АТФазы.

Рис.3. Влияние ингибиторов на активность АТФазы везикулярной фракции, полученной с использованием двухфазного метода очистки, выраженную в процентах от полной активности в отсутствии ингибиторов.

1-КецУ04 0,4 ммоль/л, 2 - ДЦКД 0,05 ммоль/л, 3 - Ш3 50 ммоль/л, 4-Ка2Мо04 0,2 ммоль/л, 5 - олигомицин 5мкг/мл.

Важной характеристикой очищенной в двухфазной системе фракции плазмалеммы является отсутствие примесей других мембран клетки. Для выяснения чистоты полученного нами препарата плазмалеммы проведен ингибиторный анализ на наличие примесей тонопласта (как частой примеси при получении мембран на градиент плотности сахарозы), мембран митохондрий и активности неспецифических фосфатаз. Тестирование проводили при значениях рН среды 5,5; 7,2 и 8,5, оптимальных для работы соответствующих маркерных ферментов - неспецифической фосфатазы, вакуолярной АТФазы и митохондриальной АТФазы (соответственно). Нитрат (специфичный ингибитор тонопластной АТФазы, 50 ммоль/л), олигомицин (специфичный ингибитор митохондриальной АТФазы, 5 мкг/мл) и молибдат (ингибитор неспецифичной фосфатазы, 0,2 ммоль/л) не приводили к снижению активности мембранного препарата (см. рис. 3), что указывает на отсутствие соответствующих примесей. Таким образом, использование двухфазного метода выделения позволило получить препарат плазмалеммы высокой чистоты, который состоит на 95% из нормально ориентированных везикул, что соответствует характеру фракций плазмалеммы, получаемых согласно данной методике выделения.

Активность Н+-АТФазы плазмалеммы фракции, полученной с использованием градиента плотности сахарозы, составляет 28,7 мкмольФн/мг белка в час (рис. 4). В присутствии бридж 58 активность фракции увеличивается до 67,7 мкмольФн/мг белка в час. Данный результат показывает, что количество инвертированных (обращенных внутренней стороной наружу) везикул фракции составляет 42,8%. В предыдущих наших работах при использовании аламетицина в качестве агента, выявляющего полную АТФазную активность фракции плазма-леммы, получено сходное соотношение инвертированных и нормально ориентированных везикул (50,9% инвертированных везикул) [9]. Полная активность фракции составляла 64,9 мкмольФн/мг [9]. Таким образом, активность фракции плазмалеммы при использовании бридж 58 не отличалась от активности, полученной ранйе в присутствии аламетицина.

120

5 юо

т

го

^

с; ш ю

I—

I

е

-О

с;

-бридж 58 +бридж 58

80

60

40

20

1 2

Рис.4. Активность Н+-АТФазы везикулярной фракции плазмалеммы, полученной с помощью: двухфазного метода (/), градиента плотности сахарозы, в присутствии 0,05% бридж 58 (2).

Сравнение активностей АТФазы фракций, полученных разными методами, показало, что активность фермента мембран, полученных двухфазным методом выше, чем при использовании сахарозного градиента (см. рис. 4). Учитывая, что активность АТФазы рассчитывалась на общее содержание белка, т.е. включая примеси, большая активность фракции, полученной двухфазным методом, может объясняться большей ее чистотой. Кроме того, как показано ранее [6], загрузка везикул плазмалеммы клеток колеоптилей кукурузы сульфатом калия, что имело место при выделении везикул на сахарозном градиенте, снижает активность фракции примерно на 45%.

Таким образом, с использованием водной двухфазной системы ПЭГ/декстран нами получена фракция плазмалеммы клеток колеоптилей кукурузы, отличающаяся высокой чистотой и на 95% состоящая из нормально ориентированных везикул. Выявленная в присутствии бридж 58 активность Н+-АТФазы фракции плазмалеммы сопоставима с активностью фракции, обогащенной плазмалеммой и полученной на градиенте плотности сахарозы.

Авторы выражают признательность докт. биол. наук М.Н.Трофимовой, канд. биол. наук И.Н. Андрееву, проф. R. Napier, проф. G. Scherer за помощь в освоении методики.

Summary

Rudashevskaya E.L., Kirpichnikova А.А., Shishova M.F. H+-ATPase activity of plasma membrane vesicle fractions obtained by two different methods of purification.

The comparison of two different systems of plasma membrane purification, based on a sucrose density or PEG/dextran separation, was made. PEG/dextran system led to higher purification of plasma membrane from maize coleoptile cells and higher hydrolysis activity of H+-ATPase in fraction.

Литература

1. Болдырев А.А., Лопина О.Д., Рубцов A.M., Свинухова И.А. Биохимия активного транспорта ионов и транспортные АТФазы. Изд-во Моск. ун-та, 1983. 2. Теннис Р. Биомембраны. М., 1997. 3. Инге-Вечтомова Н.И., Максимов Г.Б., Батов А.Ю. и др. Сравнительный анализ свойств плазмалеммы из клеток корней и колеоптилей кукурузы в модельной системе // Биоэлектрические явления и мембранный транспорт у растений. Изд-во Горьк. ун-та, 1987. С. 34-41. 4. Инге-Вечтомова Н.И., Щипа-рев С.М., Калинин В.Д., Шишова М.Ф., Выхвалов К.А. Изучение пассивного и активного транспорта ионов через плазмалемму клеток колеоптилей кукурузы с помощью флюоресцентных зондов // Физи-ол. и биох. культ, раст. 1993. Т. 25, № 2. С. 119-126. 5. Максимов Г.Б., Батов А.Ю., Кренгауз JI.M., Малахов А.В. Влияние градиента рН на АТФазную активность везикул цитоплазматических мембран ратистельных клеток // Биоэлектрогенез и транспорт веществ у растений. Изд-во Горьк. ун-та 1986, С. 33-39. 6. Максимов Г.Б., Инге-Вечтомова Н.И., Батов А.Ю. Электрофизиологические характеристики плазмалеммы клеток корней и колеоптилей кукурузы // Электрофизиологические методы в изучении функционального состояния растений. М„ 1988. С. 60-71.7. Тихая Н.И., МаксимовГ.Б., Коренькова Н.В., Вахмистров Д.Б. Полная активность К, Mg-АТФазы и ориентация везикул мембранных препаратов растительных клеток // Физиология растений. 1984. Т. 31, №5. С. 882-888. 8. Швец ИМ., Орлова О.В., Молокоедова С.В. Изучение кинетики АТФазной реакции плазматических мембран клеток растений в связи с исследованием вторичного транспорта Сахаров // Биоэлектрическая активность и мембранный транспорт у растений. Изд-во Горьк. ун-та, 1988. С. 56-61. 9. Шишова М.Ф., Рудашевская E.J1., Инге-Вечтомова Н.И. и др. Изменение ауксин-индуцированных реакций в зависимости от возраста проростков кукурузы // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2001. Вып. 1, (№ 3). С. 50-56. 10. Bradford М.М. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein binding // Anal. Biochem. 1976. Vol.72. P.248-254. 11. Br is kin D.P., Gawienowski M.C. Role of the plasma membrane H+-ATPase in K+ transport // Plant Physiol. 1996. Vol.111, № 4. P. 1199-1207. 12. Costa M.S., de Meis L. Regulation of plasma membrane H+-ATPase from corn-root by Mg2+ and pH // Bioch. et Bioph. Acta 1996. Vol. 1279. P. 214-218. 13. Desbrosses G., StellingJ., RenaudinJ.-P. Dephosphorilation activates the purified plant plasma membrane H+-ATPase // Eur. J. Biochem. 1998. Vol. 251. P. 496 - 503. 14. Francois J.-M., Berville A., Rossignol M. Development and line dependent variations of Petunia plasma membrane H+-ATPase sensitivity to auxin // Plant Science. 1992. Vol. 87. P. 19-27. 15 .Hodges Т.К., Leonard R.T., Broker C.E., Kennan T.W. Purification of an ion-stimulated adenosine triphosphatase from plant roots: association with plasma membrane//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1972. Vol. 69, N 11. P. 3307.16. Hodges Т.К., Leonard R.T. Purification of a plasma membrane-bound adenosine triphosphatase from plant roots // Methods Enzymol. 1974. Vol. 32. P. 392- 406. 17. Johansson F., Olbe M., Larsson C., Sommarin M. «Non-detergent behavior» of Brij 58, a polyoxyethylene ether, creates membrane vesicles of uniform sidedness: formation of 100 per cent inside-out (cytoplasmic side-out) plasma membrane vesicles // Proseedings of the phytochemical society of Europe. Plant Membrane Biology / Ed. By I.M. Moller, P. Brodelius. Oxford, 1996. P. 264-273.18. Larsson C., Kjellbom P., Widell S., Lundborg T. Sidedness of plant plasma membrane vesicles perified by partitioning in aqueous two-phase systems//FEBS Letters. 1984. Vol. 171. P. 271-276.19. Larsson C., Widell S., Kjellbom P. Preparation of high-purity plasma membranes 11 Methods in enzymology. 1987. Vol. 148. P. 558-568. 20. Lundborg Т., Widell S., Larsson C. Distribution of ATPases in wheat root membranes separated by phase partition // Physiol. Plant. 1981. Vol. 52. P. 89-95. 21. Olivari C., Meanti C., De

Michelis M.I., Rasi-Caldogno F. Fusicoccin binding to its plasma membrane receptor and the activation of the plasma membrane H+-ATPase // Plant Physiol. 1998. Vol. 116. P. 529-537. 22. Palmgren M.G., AskerlundP, Fredrikson K., Widell S., Sommarin M., Larsson C. Sealed inside-out and right-side-out plasma membrane vesicles. Optimal conditions for formation and separation // Plant Physiology 1990. Vol. 92. P. 871-880. 23. Sandelius A.S., Morre D.J. Plasma membrane isolation, based on membrane vesicle surface properties // In The Plant Plasma Membrane - Structure, Function and Molecular Biology / Ed. by C. Larsson, I.M. Moller. Vol. 44. Berlin and Heidelberg, 1990. P. 52-65. 24. Widell S., Larsson С. II Physiol. Plant. 1981. Vol. 51. P. 368.

Статья поступила в редакцию 14 декабря 2003 г.