НОВЫЕ АНАЛОГИ ГЛЮКАГОНА
NOVEL GLUCAGON ANALOGUES

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к новым пептидным аналогам глюкагона с улучшенными физической стабильностью и растворимостью, а также с более длительным профилем действия, к применению указанных пептидов в терапии, к способам лечения, включающим введение указанных пептидов пациентам, и к применению указанных пептидов при изготовлении лекарств.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Человеку, а также другим млекопитающим, жизненно необходима строгая регуляция уровней глюкозы в крови. Точно установлено, что для поддержания правильных уровней глюкозы в крови важны два гормона - инсулин и глюкагон. Тогда как инсулин действует в печени и периферических тканях, снижая уровни глюкозы в крови посредством увеличения поглощения глюкозы периферическими тканями и снижения выработки глюкозы печенью, глюкагон в основном оказывает действие на поджелудочную железу и печень, повышая уровни глюкозы в крови посредством активации глюконеогенеза и гликогенолиза. Также сообщалось, что глюкагон усиливает липолиз, индуцирует избыточное образование кетоновых тел и снижает уровни триглицеридов в плазме [Schade and Eaton, Acta Diabetologica, 1977, 14, 62].
Глюкагон является важной составляющей механизма защиты от гипогликемии, и введение низкой дозы глюкагона может предотвратить индуцированную инсулином гипогликемию или улучшить способность восстанавливаться после гипогликемии. Исследования также показали, что глюкагон действительно снижает потребление пищи и массу тела у крыс и людей [Schulman et al. J. Appl. Physiol. 1957, 11, 419]. Следовательно, глюкагон является приемлемой сигнальной молекулой, которая может быть полезна для ограничения потребления пищи. Кроме того, введение более низкой дозы глюкагона может индуцировать чувство насыщения, не влияя на уровень глюкозы в крови. Большое количество людей, страдающих диабетом, в частности, диабетом 2 типа, имеют избыточную массу тела или ожирение. Ожирение представляет собой фактор высокого риска возникновения серьезных или даже смертельных общих заболеваний, и для большинства больных диабетом в высокой степени желательно, чтобы их лечение не вызывало прибавки массы тела.
Однако глюкагон обладает ограниченным спектром возможных применений в лекарственных препаратах из-за быстрого клиренса из кровообращения, с периодом полувыведения, равным примерно 5 мин. Быстрый клиренс терапевтического агента неудобен в случаях, когда желательно поддерживать его высокий уровень в крови в течение продолжительного периода времени, так как при этом будут необходимы повторные введения. В некоторых случаях можно повлиять на профиль высвобождения пептидов, применяя пригодные фармацевтические композиции, но такой подход обладает различными недостатками и не является общеприменимым.
В настоящее время глюкагон доступен в рекомбинантной форме в виде лиофилизированной готовой лекарственной формы с коротким периодом действия, ограниченным несколькими часами, несмотря на то, что максимальный уровень глюкагона достигает значений, намного превышающих уровни эндогенного глюкагона. Следовательно, имеется потребность в химически модифицированных соединениях глюкагона для их доставки на постоянных уровнях таким образом, чтобы достигался более длительный биологический период полувыведения, т.е., в модифицированных пептидах глюкагона с более длительным профилем действия.
Кроме того, глюкагон не обладает стабильностью в течение очень длительного периода времени при его растворении в водном растворе, так как физическая стабильность глюкагона очень низка, и растворы глюкагона образуют гели и фибриллы в течение нескольких часов или дней (Beaven et al. European J. Biochem. 1969, 11, 37-42), в зависимости от чистоты пептида, концентрации соли, значения рН и температуры. Кроме того, у глюкагона человека очень низкая растворимость при рН 3,5-9,5.
Специалистам известны несколько заявок на патент, раскрывающих различные аналоги на основе глюкагона и GLP-1/коагонистов рецептора глюкагона, такие как, например, патенты WO 2008/086086, WO 2008/101017, WO 2007/056362, WO 2008/152403 и WO 96/29342. Некоторые GLP-1/коагонисты рецептора глюкагона, раскрытые в данных патентах, имеют отношение к специфическим мутациям, отличающим их от нативного глюкагона человека. Другими раскрытыми аналогами глюкагона являются пегилированный (см., например, WO 2007/056362) или ацилированный по специфическим положениям нативный глюкагон человека (см., например, WO 96/29342). Был описан глюкагон для профилактики гипогликемии, например, в заявке на патент US 7314859.
Пептиды по настоящему изобретению относятся к новым модифицированным пептидам глюкагона с более длительным профилем действия и, кроме того, делают возможным получение таких модифицированных пептидов глюкагона в составе стабильных фармацевтических композиций при физиологическом значении рН.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к новым пептидам глюкагона с улучшенными физической стабильностью и растворимостью при нейтральных значениях рН, к применению указанных пептидов в терапии, к способам лечения, включающим введение указанных пептидов пациентам, и к применению указанных пептидов при изготовлении лекарств для применения при лечении диабета, ожирения и сопутствующих им заболеваний и состояний.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили ряд положений в составе глюкагона человека, присоединение к которым заместителей, содержащих три или более отрицательно заряженных фрагмента, таким образом, что при этом один из указанных отрицательно заряженных фрагментов расположен дистально от липофильного фрагмента, приводит к получению агонистов глюкагона с улучшенными физической стабильностью и растворимостью.
10
12
16
17
18
20
21
24
25
27
28
29
30
В первом варианте воплощения (в воплощении 1) настоящее изобретение относится к пептиду глюкагона, содержащему SEQ ID 1, до семи аминокислотных замен в указанном пептиде глюкагона и заместитель, включающий три или более отрицательно заряженных фрагмента, при этом один из указанных отрицательно заряженных фрагментов расположен дистально от липофильного фрагмента, и при этом указанный заместитель присоединен в положении эпсилон в составе Lys, в положении дельта в составе Orn или к атому серы в составе Cys, находящихся в одном или нескольких из следующих положений аминокислот в составе указанного пептида глюкагона: Х, X, X, X, X, X, X, X, X, X, X, X и/или Х, или к его фармацевтически приемлемой соли, амиду, кислоте или пролекарству.
Настоящее изобретение дополнительно относится к применению соединений по настоящему изобретению в терапии, к фармацевтическим композициям, содержащим соединения по изобретению, и к применению соединений по изобретению при изготовлении лекарств.
ОПИСАНИЕ ФИГУР
На фиг.1 показана зависимость растворимости глюкагона (1, черная линия) и соединения из примера 3 (2, серая линия) от значения рН (тест VIII).
На фиг.2 показано суммарное потребление пищи у крыс после подкожного введения 100 нмоль/кг, 300 нмоль/кг или 1000 нмоль/кг аналога глюкагона из примера 3. Данные = среднее значение±стандартная ошибка среднего, n=5-6.
На фиг.3 показано суммарное потребление пищи у крыс после подкожного введения 300 нмоль/кг аналога глюкагона из примера 4. Данные = среднее значение±стандартная ошибка среднего, n=5-6.
На фиг.4 показано суммарное потребление пищи у крыс после подкожного введения 300 нмоль/кг аналога глюкагона из примера 5. Данные = среднее значение±стандартная ошибка среднего, n=5-6.
На фиг.5 представлена фармакокинетика аналога глюкагона из примера 3 после внутривенного и подкожного введения доз крысам. Период полувыведения (в/в) ~ 8,6±0,5 ч, период полувыведения (п/к) ~ 9,4±0,9 ч (среднее значение±стандартная ошибка среднего).
На фиг.6 показано снижение массы тела при алиментарном ожирении у крыс, которым вводили дозы аналога глюкагона из примера 3 отдельно или в сочетании с аналогом GLP-1 - соединением G3. Пунктирные линии обозначают начало введения доз и снижения доз, соответственно.
На фиг.7 показано изменение массы тела на 14 день при алиментарном ожирении у крыс, которым вводили дозы аналога глюкагона из примера 3 отдельно или в сочетании с аналогом GLP-1 - соединением G3. Отрезками показана значимость различий (однофакторный дисперсионный анализ, поправка Бонферрони).
На фиг.8 показаны профили содержания глюкозы в крови на 11 день введения доз при алиментарном ожирении у крыс, которым вводили аналог глюкагона из примера 3 отдельно или в сочетании с аналогом GLP-1 - соединением G3. Пунктирные линии обозначают введение доз.
На фиг.9 показано потребление пищи при алиментарном ожирении у крыс, которым вводили аналог глюкагона из примера 3 отдельно или в сочетании с аналогом GLP-1 - соединением G3.
На фиг.10 показаны уровни инсулина, измеренные в конце исследования, при алиментарном ожирении у крыс, которым вводили аналог глюкагона из примера 3 отдельно или в сочетании с аналогом GLP-1 - соединением G3. Сравнение групп проводили с помощью однофакторного дисперсионного анализа и апостериорного множественного сравнения Дуннета, сопоставляя группы с группой, получавшей пищу с высоким содержанием жиров, которой вводили носитель.
На фиг.11 показаны уровни холестерина, измеренные в конце исследования, при алиментарном ожирении у крыс, которым вводили аналог глюкагона из примера 3 отдельно или в сочетании с аналогом GLP-1 - соединением G3. Сравнение групп проводили с помощью однофакторного дисперсионного анализа и апостериорного множественного сравнения Дуннета, сопоставляя группы с группой, получавшей пищу с высоким содержанием жиров, которой вводили носитель.
На фиг.12 представлена растворимость аналогов глюкагона в буферном растворе 10 мМ HEPES (рН7,5). Буферный раствор добавляли к аналогам глюкагона до достижения номинальной концентрации 250 мкМ и измеряли концентрацию через один час, после центрифугирования. Концентрации оценивали с применением хемилюминесцентного, специфичного к азоту, детектора для ВЭЖХ.
На фиг.13 показана стабильность аналогов глюкагона. К аналогам глюкагона добавляли буферный раствор до номинальной концентрации 250 мкМ и через один час получали хроматограмму с помощью сверхэффективной жидкостной хроматографии (UPLC). Растворы хранили в течение 6 дней при 30°С, после чего пробы профильтровали и получили новую хроматограмму с помощью UPLC. Значения площадей под кривыми для пиков (214 нМ) использовали в качестве показателя концентрации пептида в растворе.
На фиг.14 показано время запаздывания (по левой оси Y) и степень извлечения (по правой оси Y), определенные при проведении теста на образование фибрилл с применением ThT (тиофлавина Т). Столбец 1: время запаздывания и степень извлечения для готовой лекарственной формы 1. Столбец 2А: время запаздывания и степень извлечения для аналога глюкагона из примера 3 в составе готовой лекарственной формы 2. Столбец 2В: степень извлечения аналога инсулина G5 в составе готовой лекарственной формы 2. Столбец 3А: время запаздывания и степень извлечения для аналога глюкагона из примера 3 в составе готовой лекарственной формы 3. Столбец 3В: степень извлечения аналога GLP-1 - соединения G5 - в составе готовой лекарственной формы 3. Столбец 4: время запаздывания и степень извлечения для аналога глюкагона из примера 3 в составе готовой лекарственной формы 4 (степень извлечения аналога GLP-1 - соединения G5 - не определяли по техническим причинам). Столбец 5: время запаздывания и степень извлечения для аналога инсулина G5 в составе готовой лекарственной формы 5. Столбец 6: время запаздывания и степень извлечения для аналога GLP-1 - соединения G1 - в составе готовой лекарственной формы 6.
На фиг.15 показаны результаты инкубирования GLP-1, глюкагона и аналога глюкагона из примера 3 с DPP-IV (2 мкг/мл) при 37°С в буферном растворе HEPES. Определенные периоды полужизни составляли 11 мин., 32 мин. и 260 мин., соответственно.
На фиг.16 показано потребление пищи у крыс после разового подкожного введения аналогов глюкагона из примеров 53 и 54 (тест V).
На фиг.17 представлен фармакокинетический профиль аналога глюкагона из примера 51 после разового подкожного или внутривенного введения крысам (тест VII).
На фиг.18 показано потребление пищи у крыс после разового подкожного введения аналогов глюкагона из примера 51 (тест V).
На фиг.19 показана зависимость растворимости нативного глюкагона (черная линия) и соединения из примера 51 (серая линия) от значения рН (тест VIII).
На фиг.20 показана динамика образования фибрилл по флуоресценции ThT.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Среди дополнительных вариантов воплощения настоящего изобретения представлены следующие:
2. Пептид глюкагона по воплощению 1, при этом указанный пептид глюкагона не содержит ни одной или содержит одну, две, три, четыре, пять, шесть или семь замен аминокислотных остатков в составе указанного пептида глюкагона.
3. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-2, при этом указанный пептид глюкагона не содержит ни одной замены аминокислотных остатков в составе указанного пептида глюкагона.
4. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-2, при этом указанный пептид глюкагона содержит одну замену аминокислотных остатков в составе указанного пептида глюкагона.
5. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-2, при этом указанный пептид глюкагона содержит две замены аминокислотных остатков в составе указанного пептида глюкагона.
6. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-2, при этом указанный пептид глюкагона содержит три замены аминокислотных остатков в составе указанного пептида глюкагона.
7. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-2, при этом указанный пептид глюкагона содержит четыре замены аминокислотных остатков в составе указанного пептида глюкагона.
8. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-2, при этом указанный пептид глюкагона содержит пять замен аминокислотных остатков в составе указанного пептида глюкагона.
9. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-2, при этом указанный пептид глюкагона содержит шесть замен аминокислотных остатков в составе указанного пептида глюкагона.
10. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-2, при этом указанный пептид глюкагона содержит семь замен аминокислотных остатков в составе указанного пептида глюкагона.
2
4
9
10
12
16
17
18
20
21
24
25
27
28
29
30
11. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-10, при этом указанные аминокислотные замены расположены в следующих положениях аминокислот в составе указанного пептида глюкагона: Х, Х, Х, Х, X, X, X, X, X, X, X, X, X, X, X и/или X.
12. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-11, при этом указанные аминокислотные замены могут быть расположены в следующих положениях в составе указанного пептида глюкагона:
2
Х представляет собой Aib или D-Ser;
4
Х представляет собой D-Phe;
9
Х представляет собой Glu;
10
Х представляет собой Cys, Lys, Orn или (p)Tyr;
12
X представляет собой Cys, Lys, Orn, lie, His, Gln, Tyr, Leu или Arg;
16
X представляет собой Cys, Glu, Lys или Orn;
17
X представляет собой Cys, Gln, Lys, His или Orn;
18
X представляет собой Cys, Gln, Ala, Lys, His или Orn;
20
X представляет собой Cys, Arg, Lys, Glu, His или Orn;
21
X представляет собой Cys, Orn, Glu, Arg, His или Lys;
24
X представляет собой Cys, Lys, Arg, His, Glu, Asp, Gly, Ser или Orn;
25
X представляет собой Cys, Arg, Lys, His, Glu, Asp, Gly, Phe, Ser, Tyr, (p)Tyr или Orn;
27
X представляет собой Met(O), Val, lie, Leu, Arg, His, Cys, Lys, Glu, Gln или Orn;
28
X представляет собой Cys, Lys, His, Arg, Ser, Thr, Glu, Asp, Ala, Gln или Orn;
29
X представляет собой Cys, Glu, Asp, Lys, His, Arg, Pro или Orn и
30
Х отсутствует или представляет собой Cys, Lys, Arg, Glu, Gly, Pro или Orn.
4
9
12
16
20
21
24
25
27
28
29
30
13. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-12, при этом указанные аминокислотные замены могут быть расположены в следующих положениях в составе указанного пептида глюкагона: Х представляет собой D-Phe, Х представляет собой Glu, X представляет собой Arg, X представляет собой Lys, X представляет собой Lys или Glu, X представляет собой Glu, X представляет собой Lys или His, X представляет собой Arg или Lys, X представляет собой Leu, Lys, Glu или Gln, X представляет собой Lys или Ser, X представляет собой Lys или Pro, Х отсутствует или представляет собой Lys или Pro.
17
18
21
24
27
14. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-13, где X представляет собой Lys, X представляет собой Lys, X представляет собой Glu, Х представляет собой Lys или Оrn и X представляет собой Leu.
17
18
21
27
15. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-14, где Х представляет собой Lys, X представляет собой Lys, X представляет собой Glu и X представляет собой Leu.
17
21
27
16. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-15, где X представляет собой Lys, X представляет собой Glu и Х представляет собой Leu.
17
21
17. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-16, где X представляет собой Lys и X представляет собой Glu.
2
18. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-17, где Х представляет собой Aib или D-Ser.
4
19. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-18, где Х представляет собой D-Phe.
9
20. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-19, где Х представляет собой Glu.
10
21. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-20, где Х представляет собой Cys, Lys, Orn или (р)Tyr.
10
22. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-21, где Х представляет собой Cys.
10
23. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-22, где Х представляет собой Lys.
10
24. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-23, где Х представляет собой Orn.
12
25. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-24, где X представляет собой Cys, Lys, Orn, lie, His, Gln, Tyr, Leu или Arg.
12
26. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-25, где X представляет собой Arg.
12
27. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-26, где X представляет собой Cys, Lys или Orn.
12
28. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-27, где X представляет собой Lys или Orn.
12
29. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-28, где Х представляет собой Cys.
12
30. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-29, где Х представляет собой Lys.
12
31. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-30, где Х представляет собой Orn.
16
32. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-31, где Х представляет собой Cys, Lys или Orn.
16
33. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-32, где Х представляет собой Cys, Lys или Orn.
16
34. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-33, где Х представляет собой Lys или Orn.
16
35. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-34, где X представляет собой Lys.
16
36. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-35, где Х представляет собой Cys.
16
37. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-36, где Х представляет собой Orn.
17
38. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-37, где X представляет собой Cys, Gln, Lys, His или Orn.
17
39. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-38, где X представляет собой Lys.
17
40. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-39, где Х представляет собой Cys.
17
41. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-40, где X представляет собой Orn.
18
42. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-41, где X представляет собой Gln, Ala, Lys, His или Orn.
20
43. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-42, где Х представляет собой Cys, Arg, Lys, Glu, His или Orn.
20
44. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-43, где Х представляет собой Lys или Glu.
20
45. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-44, где X представляет собой Lys.
20
46. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-45, где Х представляет собой Glu.
20
47. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-46, где Х представляет собой Cys.
20
48. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-47, где Х представляет собой Orn.
21
49. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-48, где X представляет собой Cys, Orn, Glu, Arg, His или Lys.
21
50. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-49, где X представляет собой Glu или Lys.
21
51. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-50, где X представляет собой Glu.
21
52. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-51, где X представляет собой Lys.
21
53. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-52, где Х представляет собой Cys.
21
54. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-53, где X представляет собой Orn.
24
55. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-54, где Х представляет собой Cys, Lys, Arg, His, Glu, Asp, Gly, Ser или Orn.
24
56. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-55, где Х представляет собой Cys, Lys или Orn.
24
57. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-56, где Х представляет собой Lys или Orn.
24
58. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-57, где Х представляет собой Lys или His.
24
59. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-58, где Х представляет собой Lys.
24
60. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-59, где Х представляет собой His.
24
61. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-60, где Х представляет собой Cys.
62. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-61, где Х24 представляет собой Orn.
25
63. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-62, где Х представляет собой Arg, Lys, His, Glu, Asp, Gly, Phe, Ser, Tyr, (p)Tyr или Orn.
25
64. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-63, где X представляет собой His, Lys, lie, Leu, Ala, Met, Cys, Asn, Val, Ser, Gln, Asp, Glu, Thr или (p)Tyr.
25
65. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-64, где X представляет собой His, Arg, Lys или (p)Tyr.
25
66. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-65, где Х представляет собой Arg или Lys.
25
67. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-66, где Х представляет собой Arg.
25
68. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-67, где Х представляет собой Lys.
25
69. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-68, где Х представляет собой Cys.
25
70. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-69, где Х представляет собой От.
27
71. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-70, где Х представляет собой Cys, Met(O), Val, lie, Leu, Arg, His, Lys, Glu, Gln или Orn
27
72. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-71, где Х представляет собой Leu, Lys, Glu или Gln.
27
73. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-72, где Х представляет собой Leu.
27
74. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-73, где Х представляет собой Lys.
27
75. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-74, где X представляет собой Glu.
27
76. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-75, где Х представляет собой Gln.
27
77. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-76, где Х представляет собой Cys, Lys или Orn.
27
78. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-77, где Х представляет собой Lys или Orn.
27
79. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-78, где Х представляет собой Cys.
27
80. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-79, где Х представляет собой Orn.
28
81. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-80, где Х представляет собой Cys, Lys, His, Arg, Ser, Thr, Glu, Asp, Ala, Gln или Orn.
28
82. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-81, где Х представляет собой Lys или Ser.
28
83. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-82, где Х представляет собой Cys, Lys или Orn.
28
84. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-83, где X представляет собой Lys или Orn.
28
85. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-84, где Х представляет собой Cys.
28
86. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-85, где Х представляет собой Orn.
28
87. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-86, где Х представляет собой Lys.
29
88. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-87, где Х представляет собой Cys, Lys или Orn.
29
89. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-88, где Х представляет собой Lys или Orn.
29
90. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-89, где Х представляет собой Orn.
29
91. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-90, где Х представляет собой Lys или Pro.
29
92. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-91, где Х представляет собой Lys.
30
93. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-92, где Х отсутствует или представляет собой Cys, Lys, Arg, Glu, Gly, Pro или Orn.
30
94. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-93, где Х отсутствует или представляет собой Cys, Lys или Orn.
30
95. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-94, где Х отсутствует или представляет собой Lys или Orn.
30
96. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-95, где Х отсутствует или представляет собой Orn.
30
97. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-96, где Х отсутствует или представляет собой Cys.
30
98. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-97, где Х отсутствует или представляет собой Lys или Pro.
30
99. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-98, где Х отсутствует или представляет собой Lys.
30
100. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-99, где Х отсутствует или представляет собой Pro.
101. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-100, при этом указанный заместитель имеет формулу II:
,
где
1
Z представляет собой структуру согласно одной из формул IIa, IIb или IIc;
где n в формуле IIa равно 6-20,
m в формуле IIc равно 5-11;
2
2
1
3
2
3
1
4
группа СООН в формуле Не может быть присоединена в положении 2, 3 или 4 в составе фенильного кольца, символ * в формулах IIa, IIb и IIc указывает место присоединения к атому азота в Z; если Z отсутствует, Z присоединен к атому азота на Z в месте, указанном символом *, и если Z и Z отсутствуют, Z присоединен к атому азота на Z, в месте, указанном символом *;
2
Z отсутствует или представляет собой структуру согласно одной из формул IId, IIc, IIf, IIg, IIh, IIi, IIj или IIk:
где каждый аминокислотный фрагмент независимо обладает стереохимией L или D;
2
3
где Z присоединен через атом углерода, обозначенный *, к атому азота в составе Z, обозначенному *;
3
2
4
если Z отсутствует, Z присоединен через атом углерода, обозначенный *, к атому азота в составе Z обозначенному *;
3
4
2
и если Z и Z отсутствуют, Z, присоединен через атом углерода, обозначенный *, к эпсилон-атому азота в составе лизина или к дельта-атому азота в составе орнитина в пептиде глюкагона.
3
Z отсутствует или представляет собой структуру согласно одной из формул IIm, IIn, IIo или IIp:
3
3
4
4
3
Z присоединен через атом углерода в составе Z, обозначенный символом *, к атому азота в составе Z, обозначенному символом *, если Z отсутствует, Z присоединен через атом углерода, обозначенный *, к эпсилон-атому азота в составе лизина или к дельта-атому азота в составе орнитина в пептиде глюкагона;
4
4
Z отсутствует или представляет собой структуру согласно одной из формул IId, IIe, IIf, IIg, IIh, Iii, IIj или IIk, где каждый аминокислотный фрагмент независимо является либо L-, либо D-формой, при этом Z присоединен через атом углерода, обозначенный *, к эпсилон-атому азота в составе лизина или к дельта-атому азота в составе орнитина в пептиде глюкагона.
102. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-101, при этом указанный заместитель имеет формулу II:
,
где:
1
Z представляет собой структуру согласно одной из формул IIa, IIb или IIc:
где n в формуле IIа равно 6-20,
2
Z отсутствует или представляет собой структуру согласно одной из формул IId, IIc, IIf, IIg, IIh, IIi, IIj или IIk:
где каждый аминокислотный фрагмент независимо обладает стереохимией L или D.
3
Z отсутствует или представляет собой структуру согласно одной из формул IIm, IIn, IIо или IIp:
4
Z отсутствует или представляет собой структуру согласно одной из формул IId, IIc, IIf, IIg, IIh, Iii, IIj или IIk;
где каждый аминокислотный фрагмент независимо обладает стереохимией L или D.
103. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-102, где структуры, представленные формулами IIa-IIp, обладают стереохимией L.
104. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-103, где структуры, представленные формулами IIa-IIp, обладают стереохимией D.
2
4
105. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-104, где Z в составе указанного заместителя формулы II отсутствует, если присутствует Z.
4
2
106. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-105, где Z в составе указанного заместителя формулы II отсутствует, если присутствует Z.
107. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-106, где указанный заместитель представляет собой структуру в соответствии с одной из формул IIIa, IIIb, IIIc, IIId, IIIe, IIIf, IIIg, IIIh, IIIi, IIIj, IIIk, IIIl, IIIm, IIIn или IIIo:
или
4
108. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-107, где Z в составе указанного заместителя отсутствует.
3
4
109. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-108, где Z и Z в составе указанного заместителя отсутствуют.
2
4
110. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-109, где Z и Z в составе указанного заместителя независимо представлены отрицательно заряженными фрагментами, такими как γGlu, Glu и/или Asp.
2
4
111. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-110, где Z и Z в составе указанного заместителя независимо представлены указанными фрагментами в количестве до десяти штук.
2
4
112. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-111, где Z и Z, в составе указанного заместителя независимо представлены тремя указанными фрагментами.
2
4
113. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-112, где Z и Z в составе указанного заместителя независимо представлены четырьмя указанными фрагментами.
2
4
114. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-113, где Z и Z в составе указанного заместителя независимо представлены пятью указанными фрагментами.
2
4
115. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-114, где Z и Z в составе указанного заместителя независимо представлены фрагментами Glu и/или γGlu.
2
4
116. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-115, где Z и Z в составе указанного заместителя независимо представлены γGlu, γGlu-Glu, γGlu-Glu-Glu, γGlu-Glu-Glu-Glu, γGlu-Glu-Glu-Glu-Glu.
2
4
117. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-116, где Z и Z в составе указанного заместителя независимо представлены фрагментами Glu и/или Asp.
2
4
118. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-117, где Z и Z в составе указанного заместителя независимо представлены фрагментами γGlu и/или Asp.
2
4
119. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-118, где Z и Z в составе указанного заместителя независимо представлены фрагментами Asp.
2
4
120. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-119, где Z и Z в составе указанного заместителя независимо представлены Asp, Asp-Asp, Asp-Asp-Asp или Asp-Asp-Asp-Asp.
2
4
121. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-120, где Z и Z в составе указанного заместителя независимо представлены фрагментами Glu.
2
4
122. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-121, где Zи Z в составе указанного заместителя независимо представлены Glu, Glu-Glu, Glu-Glu-Glu, Glu-Glu-Glu-Glu, Glu-Glu-Glu-Glu-Glu.
2
4
123. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-122, где Z и Z в составе указанного заместителя независимо представлены фрагментами γGlu.
2
4
124. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-123, где Z и Z в составе указанного заместителя независимо представлены γGlu, γGlu-γGlu, γGlu-γGlu-γGlu, γGlu-γGlu-γGlu-γGlu, γGlu-γGlu-γGlu-γGlu-γGlu.
125. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-124, при этом указанный заместитель содержит липофильный остаток.
126. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-125, при этом указанный заместитель содержит алкильную группу с линейной цепочкой или разветвленную алкильную группу.
127. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-126, при этом указанный заместитель нековалентно связывается с альбумином.
128. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-127, при этом указанный заместитель отрицательно заряжен при физиологических значениях рН.
Дополнительные варианты воплощения настоящего изобретения относятся к следующему:
129. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-128, при этом указанный заместитель присоединен в положении эпсилон в составе Lys, в положении дельта в составе Orn или к атому серы в составе Cys.
130. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-129, при этом указанный заместитель присоединен в положении эпсилон в составе Lys или в положении дельта в составе Orn.
131. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-130, при этом указанный заместитель присоединен в положении эпсилон в составе Lys.
132. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-131, при этом указанный заместитель присоединен в положении дельта в составе Orn.
133. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-132, при этом указанный заместитель присоединен к атому серы в составе Cys.
10
12
16
17
18
20
21
24
25
27
28
29
30
134. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-133, при этом указанный заместитель присоединен к одному или нескольким из следующих положений аминокислот в составе указанного пептида глюкагона: Х, X, X, X, X, X, X, X, X, X, X, X и/или X.
12
16
20
24
25
28
29
30
135. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-134, при этом указанный заместитель находится в одном или нескольких из следующих положений аминокислот в составе указанного пептида глюкагона: X, X, X, Х, X, X, X и/или Х.
16
24
28
136. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-135, при этом указанный заместитель находится в одном или нескольких из следующих положений аминокислот в составе указанного пептида глюкагона: X, X и/или Х.
12
137. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-136, при этом указанный заместитель находится в положении аминокислоты X в составе указанного пептида глюкагона.
16
138. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-137, при этом указанный заместитель находится в положении аминокислоты X в составе указанного пептида глюкагона.
20
139. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-138, при этом указанный заместитель находится в положении аминокислоты X в составе указанного пептида глюкагона.
24
140. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-139, при этом указанный заместитель находится в положении аминокислоты X в составе указанного пептида глюкагона.
28
141. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-140, при этом указанный заместитель находится в положении аминокислоты X в составе указанного пептида глюкагона.
29
142. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-141, при этом указанный заместитель находится в положении аминокислоты Х в составе указанного пептида глюкагона.
30
143. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-142, при этом указанный заместитель находится в положении аминокислоты Х в составе указанного пептида глюкагона.
144. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-143, при этом указанный заместитель находится в пяти или менее положениях аминокислот в составе указанного пептида глюкагона.
145. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-144, при этом указанный заместитель находится в четырех или менее положениях аминокислот в составе указанного пептида глюкагона.
146. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-145, при этом указанный заместитель находится в трех или менее положениях аминокислот в составе указанного пептида глюкагона.
147. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-146, при этом указанный заместитель находится в двух положениях аминокислот в составе указанного пептида глюкагона.
148. Пептид глюкагона по любому из. воплощений 1-147, при этом указанный заместитель находится в одном положении аминокислоты в составе указанного пептида глюкагона.
Дополнительные воплощения настоящего изобретения относятся к перечисленным далее вариантам.
Настоящее изобретение относится к новым аналогам глюкагона с улучшенной растворимостью, улучшенной физической стабильностью с точки зрения образования геля и фибрилл и с увеличенным периодом полувыведения.
Авторы изобретения обнаружили, что соединения по настоящему изобретению обладают увеличенным периодом полувыведения и демонстрируют улучшенные фармакокинетические свойства, т.е., оказывают более длительное воздействие in vivo. Кроме того, соединения по настоящему изобретению демонстрируют существенное снижение потребления пищи при подкожном введении, оказывая длительное воздействие в течение периода до 48 ч. Насколько известно авторам изобретения, снижение потребления пищи под влиянием аналога глюкагона продолжительного действия было продемонстрировано впервые.
i
50
Продолжительное действие соединений по настоящему изобретению означает, что период времени, в течение которого они проявляют биологическую активность, увеличен. Действие считают продолжительным, если соединение существенно снижает потребление пищи у подопытных животных в течение периода времени от 24 ч до 48 ч, по сравнению с потреблением пищи в течение того же периода времени у животных в контрольной группе, которым вводят носитель, при проведении «теста IV». Продолжительное действие можно оценить с помощью различных способов испытания связывания, например, продолжительное действие можно оценить с помощью опосредованного испытания связывания альбумина, при котором показатель K, полученный для связывания в присутствии овальбумина, сравнивают со значением ЕС, определенным в присутствии сывороточного альбумина человека (САЧ).
Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что соединения по настоящему изобретению демонстрируют улучшенную растворимость в водных растворах при нейтральных значениях рН или слабощелочных значениях рН. Дополнительно, авторы настоящего изобретения также неожиданно обнаружили, что аналоги глюкагона по настоящему изобретению обладают улучшенной стабильностью с точки зрения образования гелей и фибрилл в водных растворах. Стабильность соединений по настоящему изобретению можно измерить таким способом, как описанный в примере 63.
Улучшенный контроль уровней глюкозы в крови при диабете 1 и 2 типа может быть достигнут совместным введением глюкагона с известными агентами для лечения диабета, такими как инсулин, агонисты GLP-1 и ГИП (глюкозозависимого инсулинотропного пептида). Аналоги глюкагона по изобретению демонстрируют анорексигенное действие у крыс при введении разовой дозы, и на второй день наблюдали, что действие было, по меньшей мере, столь же эффективным, как и действие в день введения дозы, что явно демонстрирует продолжительное действие этих аналогов. Дополнительно, соединения по настоящему изобретению обеспечивают существенное снижение массы тела при введении крысам с алиментарным ожирением. Еще более выраженное снижение массы тела может быть достигнуто с помощью совместного введения с аналогами GLP-1 продолжительного действия, что приводит к дополнительному улучшению контроля содержания глюкозы в крови.
В одном из вариантов воплощения аналоги глюкагона по настоящему изобретению могут входить в одну и ту же лекарственную форму с аналогами GLP-1 или аналогами инсулина, образуя стабильные фармацевтические композиции.
Сочетание терапии с применением инсулина и глюкагона может быть полезно в большей степени, чем терапия с применением только инсулина. В норме в послеобеденный период, когда уровни глюкозы в крови становятся низкими, первым гормональным ответом является снижение выработки инсулина. Когда уровни глюкозы в крови дополнительно снижаются - вторым ответом является выработка глюкагона, приводящая к усилению выхода глюкозы из печени. Когда больные диабетом получают слишком высокую дозу экзогенного инсулина, естественный ответ в виде повышения уровня глюкагона предотвращается из-за присутствия экзогенного инсулина, так как инсулин оказывает ингибирующее действие на выработку глюкагона. Следовательно, даже незначительное превышение дозы инсулина может вызвать гипогликемию. В настоящее время многие пациенты, страдающие диабетом, предпочитают применять дозу инсулина, немного меньшую, чем оптимальная доза, опасаясь вызвать эпизоды гипогликемии, которые могут быть опасны для жизни.
Тот факт, что соединения по настоящему изобретению растворимы при нейтральных значениях рН, может позволить объединять их в одной лекарственной форме с инсулином и дать возможность поддерживать более стабильные уровни глюкозы в крови и снизить количество эпизодов гипогликемии, а также снизить риск возникновения связанных с диабетом осложнений.
Дополнительные воплощения настоящего изобретения относятся к внутримолекулярным мостикам:
i
i+4
149. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-148, дополнительно содержащий внутримолекулярный мостик между боковыми цепочками аминокислоты в положении X и аминокислоты в положении X.
i
i+4
150. Пептид глюкагона по любому из воплощений 149, при этом аминокислота в положении X и аминокислота в положении X соединены посредством лактамного мостика или солевого мостика.
i
i+4
151. Пептид глюкагона по любому из воплощений 149, при этом аминокислота в положении X и аминокислота в положении X соединены посредством лактамного мостика.
i
i+4
152. Пептид глюкагона по воплощению 149, при этом аминокислота в положении X и аминокислота в положении X соединены посредством солевого мостика.
i
12
16
17
20
24
153. Пептид глюкагона по любому из воплощений 149-152, при этом X выбрано из положений X, X, Х, Х или X.
154. Пептид глюкагона по любому из воплощений 149-153, при этом указанный внутримолекулярный мостик расположен между боковыми цепочками аминокислоты в положении 17 и аминокислоты в положении 21.
16
17
20
21
24
155. Пептид глюкагона по любому из воплощений 149-154, при этом одно, два, три или несколько положений X, X, X, X или Х указанного пептида глюкагона замещены α-аминокислотой и/или α-двузамещенной аминокислотой.
16
20
156. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-155, где X представляет собой Glu и X представляет собой Lys.
157. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-156, при этом указанный пептид глюкагона содержит удлинение на С-конце размером до трех аминокислотных остатков.
158. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-157, при этом указанный пептид глюкагона содержит удлинение на С-конце размером до двух аминокислотных остатков.
159. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-158, при этом указанный пептид глюкагона содержит удлинение на С-конце размером в один аминокислотный остаток.
160. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-159, при этом пептид глюкагона содержит С-концевую амидогруппу или С-концевую карбоксильную группу.
161. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-160, при этом указанный пептид глюкагона содержит С-концевую амидогруппу.
162. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-161, при этом указанный пептид глюкагона содержит С-концевую карбоксильную группу.
163. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-162, при этом указанный пептид глюкагона выбран из глюкагона (1-29), глюкагон-(1-29)-амида или их аналогов.
164. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-163, выбранный из группы, состоящей из следующих соединений:
ε24
24
27
N-([(4S)-5-гидрокси-4-[[(4S)-5-гидрокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]-5-оксопентаноил]амино]-5-оксопентаноил])[Lys,Leu]глюкагон
ε28
24
28
N-([(4S)-5-гидрокси-4-[[(4S)-5-гидрокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]-5-оксопентаноил]амино]-5-оксопентаноил])[Leu,Lys]глюкагон
ε29
27
29
N-([(4S)-5-гидрокси-4-[[(4S)-5-гидрокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]-5-оксопентаноил]амино]-5-оксопентанил])[Leu,Lys]глюкагон
α
27
ε
N-([Leu]глюкагонил)-N-([(4S)-5-гидрокси-4-[[(4S)-5-гидрокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]-5-оксопентаноил]амино]-5-оксопентаноил])лизин
ε28
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]-[Leu,Lys]-глюкагон
ε28
27
28
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[Leu,Lys]-глюкагон
ε24
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu,Ser]-глюкагон
ε24
24
27
28
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[Lys,Leu,Ser]-глюкагон
ε16
16
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu]-глюкагон
ε24
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu,Ser]-глюкагон
ε24
12
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg,Lys,Leu]-глюкагон
ε24
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu]-глюкагон
ε24
27
28
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[Leu,Lys]-глюкагон
ε24
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu]-глюкагон
ε25
25
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu]-глюкагон
ε16
16
27
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[Lys,Leu]-глюкагон
ε16
16
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu]-глюкагон
ε28
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Leu,Lys]-глюкагон
ε12
27
29
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Leu,Pro]-глюкагон
ε24
24
27
29
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu,Pro]-глюкагон
ε28
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Leu,Lys]-глюкагонил-Pro
ε12
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Leu]-глюкагон
ε24
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu]-глюкагонил-Pro
ε27
24
29
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Pro]-глюкагон
ε28
27
28
29
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Leu,Lys,Pro]-глюкагон
ε27
12
27
29
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg,Lys,Pro]-глюкагон
ε24
24
27
N-[(2S)-4-карбокси-2-[[(2S)-4-карбокси-2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu]-глюкагон
ε24
24
27
N-[(2S)-4-карбокси-2-[[(2S)-4-карбокси-2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-4-карбокси-2-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu]-глюкагон
ε24
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu]-глюкагон
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
ε24
9
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Glu,Lys,Leu,Ser]-глюкагон
ε24
20
21
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Glu,Glu,Lys,Leu,Ser]-глюкагон
ε24
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu]-глюкагон
ε24
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(11-карбоксиундеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu]-глюкагон
ε24
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(11-карбоксиундеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu]-глюкагон
ε24
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu]-глюкагон
ε20
20
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu]-глюкагон
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[D-Phe4,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
ε16
16
21
25
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Glu,Arg,Leu]-глюкагон
ε24
20
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Glu,Lys,Leu,Ser]-глюкагон
ε24
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu]-глюкагон
ε24
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Gln]-глюкагон
ε24
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Glu]-глюкагон
α
24
27
ε
N([His,Leu]-глюкагонил)-N[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]Lys
ε24
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]-[Lys,Glu]-глюкагон
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys24,Leu27]-глюкагон
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(7-карбоксигептаноиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys24,Leu27]-глюкагон
Дополнительные варианты воплощения настоящего изобретения относятся к введению соединений по настоящему s изобретению совместно с противодиабетическими агентами или агентами от ожирения:
165. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-164 в сочетании с соединением глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1).
166. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-165 в сочетании с соединением инсулина.
167. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-166 в сочетании с эксендином-4.
168. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-167, который находится в двухкамерном устройстве, в составе запасаемой и/или микроинкапсулированной готовой лекарственной формы.
169. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-168 в сочетании с соединением глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1) для получения лекарства для лечения диабета и/или ожирения.
170. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-169 в сочетании с соединением инсулина для получения лекарства для лечения диабета и/или ожирения.
171. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-170 в сочетании с эксендином-4 для получения лекарства для лечения диабета и/или ожирения.
172. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-171, при этом соединение GLP-1 и соединение инсулина представлены формулами G1-G5:
N-эпсилон26-((S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламино-бутирил)[Arg34]GLP-1-(7-37):
N-эпсилон37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-({транс-4-[(19-карбоксинонадеканоиламино)метил]циклогексанкарбонил}амино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][дезаминоНis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37):
N-эпсилон26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37):
N-эпсилон37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(15-карбокси-пентадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил][Aib8,22,35,Lys37]GLP-1-(7-37):
εB29
N-гексадекандииол-γ-Glu-(дез-В30)-инсулин человека
GLP-1 - это инкретиновый гормон, вырабатываемый эндокринными клетками кишечника после приема пищи. GLP-1 является регулятором метаболизма глюкозы и секреции инсулина бета-клетками островков Лангерганса в поджелудочной железе. GLP-1 также вызывает секрецию инсулина при диабете. Однако у самого GLP-1 период полувыведения in vivo очень короткий, таким образом, много внимания уделяется способам увеличения периода полувыведения GLP-1 in vivo.
В WO 98/08871 раскрыты аналоги и производные GLP-1 с более длительным действием, разработанные на основе GLP-1 (7-37) человека (аминокислоты 1-31 в составе SEQ ID NO:3), которые обладают увеличенным периодом полувыведения, в том числе лираглутид, производное GLP-1 для введения один раз в день, разработанное компанией Novo Nordisk A/S и продаваемое на рынке для лечения диабета 2 типа.
Эксенатид - это коммерческий инкретиновый миметик для лечения сахарного диабета 2 типа, производимый и продаваемый на рынке компаниями Amylin Pharmaceuticals и Eli Lilly & Со. Эксенатид создан на основе эксендина-4, гормона, обнаруженного в слюне ящерицы-ядозуба. Он проявляет биологические свойства, схожие со свойствами GLP-1 человека. US 5424286 относится, среди прочего, к способу стимуляции высвобождения инсулина в организме млекопитающего путем введения эксендина-4 (7-45) (SEQ ID NO:1 в этом патенте США).
Термин «соединение GLP-1» при использовании в этом документе означает GLP-1 (7-37) человека (аминокислоты 1-31 в составе SEQ ID NO:3), эксендин-4 (7-45) (аминокислоты 1-39 в составе SEQ ID NO:4), а также их аналоги, химерные пептиды и производные, которые сохраняют активность GLP-1.
Что касается нумерации положений в составе соединений GLP-1, для целей настоящего документа любая аминокислотная замена, делеция и/или вставка указаны относительно последовательностей SEQ ID NO:3 и/или 4. Однако нумерация аминокислотных остатков в перечне последовательностей всегда начинается с №1, тогда как для целей данного документа авторы решили, согласно принятой в данной области практике, начать нумерацию с аминокислотного остатка №7 и назначить ему номер 7. Следовательно, в общем случае, любая ссылка в этом документе на номер положения в составе последовательности GLP-1 (7-37) или эксендина-4 относится к последовательности, начинающейся в обоих случаях с His в положении 7 и заканчивающейся Gly в положении 37 или Ser в положении 45, соответственно.
Соединения GLP-1 можно получить, как описано в примере 65.
Активность GLP-1 можно определить с применением способов, известных специалистам в данной области, например, теста (II), описанного в этом документе (стимулирования образования цАМФ в клеточной линии, экспрессирующей рецептор GLP-1 человека).
Дополнительно, соединение GLP-1 является соединением, которое может:
i) содержать по меньшей мере одну из следующих аминокислот: дезамино-His7, Aib8, Aib2, Arg26, Aib35 и/или Lys37;
ii) являться производным GLP-1, содержащим альбумин-связывающий фрагмент, который включает по меньшей мере одну, предпочтительно - по меньшей мере две, более предпочтительно - три свободные карбоксильные группы аминокислот; или его фармацевтически приемлемой солью;
iii) являться производным GLP-1, содержащим альбумин-связывающий фрагмент, который включает ацильный радикал дикарбоновой кислоты, предпочтительно содержащий в сумме от 12 до 24 атомов углерода, например, С12, С14, С16, С18, С20, С22 или С24, наиболее предпочтительно - С16, С18 или С20; при этом, предпочтительно, а) ацильный радикал присоединен к эпсилон-аминогруппе остатка лизина в составе пептида GLP-1 через линкер; b) линкер содержит по меньшей мере один радикал OEG и/или по меньшей мере один радикал Trx и, возможно, дополнительно содержит по меньшей мере один Glu; и/или
iv) быть выбран из группы, состоящей из соединений N-эпсилон26-((S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламино-бутирил)[Arg34]GLP-1-(7-37):
N-эпсилон37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-({транс-4-[(19-карбоксинонадеканоиламино)метил]циклогексанкарбонил}амино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][дезаминоНis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37):
N-эпсилон26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37):
N-эпсилон37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(15-карбокси-пентадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил][Aib8,22,35,Lys37]GLP-1-(7-37):
и их фармацевтически приемлемыми солями, амидами, алкилами или сложными эфирами.
Термин «инсулин» по изобретению в этом документе следует понимать как инсулин человека, аналог инсулина или производное инсулина.
Соединение инсулина - это соединение, которое может быть представлено, например:
NεВ29-гексадекандииол-γ-Glu-(дез-В30) инсулином человека
Соединения по настоящему изобретению и агенты против ожирения или диабета, указанные в настоящем описании изобретения, можно вводить одновременно или последовательно. Эти факторы можно вводить в форме разовой дозы, при этом разовая доза содержит оба соединения, или в форме набора из нескольких частей, содержащего препарат соединения по настоящему изобретению в качестве первой формы унифицированной дозы и препарат агентов против ожирения или диабета в качестве второй формы унифицированной дозы. В случаях, когда в тексте описания изобретения упомянуты первая или вторая или третья и т.д. унифицированные дозы, это не является указанием на предпочтительный порядок введения, а служит только для удобства.
Под «одновременным» введением дозы препарата соединения по настоящему изобретению и препарата агентов против ожирения или диабета подразумевается введение соединений в форме разовой дозы или введение первого агента с последующим введением второго агента с временным интервалом не более чем 15 мин., предпочтительно - 10, более предпочтительно - 5, более предпочтительно - 2 мин. Первым может быть введен любой из этих факторов.
Под «последовательным» введением дозы подразумевается введение первого агента с последующим введением второго агента с временным интервалом более чем 15 мин. Первой может быть введена любая из двух унифицированных лекарственных форм. Предпочтительно, оба продукта вводят инъекцией в ходе одного и того же внутривенного проникновения.
Как уже указывалось, при всех раскрытых выше терапевтических способах или показаниях соединение по настоящему изобретению может вводиться само по себе. Однако его можно также вводить в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтическими активными агентами, субстанциями или соединениями, либо последовательно, либо одновременно.
Типичная дозировка соединения по изобретению при его применении в способе согласно настоящему изобретению находится в диапазоне от примерно 0,001 до примерно 100 мг/кг массы тела в день, предпочтительно - от примерно 0,01 до примерно 10 мг/кг массы тела, более предпочтительно - от примерно 0,01 до примерно 5 мг/кг массы тела в день, например, от примерно 0,05 до примерно 10 мг/кг массы тела в день или от примерно 0,03 до примерно 5 мг/кг массы тела в день, с введением в виде одной или нескольких доз, например, от 1 до 3 доз. Конкретная величина дозы будет зависеть частоты и способа введения, пола, возраста, массы тела и общего состояния субъекта, который получает лечение, природы и степени тяжести состояния, которое необходимо лечить, любых сопутствующих заболеваний, которые необходимо лечить, и других факторов, очевидных для специалиста в данной области.
Соединения по изобретению в соответствии с еще одним вариантом могут быть приготовлены в виде унифицированной лекарственной формы с применением технологий, хорошо известных специалистам в данной области. В типичном случае унифицированная лекарственная форма, предназначенная для перорального введения один или несколько раз в день, например, от одного до трех раз в день, может, предпочтительно, содержать от примерно 0,05 до примерно 1000 мг, предпочтительно - от примерно 0,1 до примерно 500 мг, например, от примерно 0,5 до примерно 200 мг соединения по изобретению.
Соединения по изобретению включают соединения, которые, как полагают, хорошо подходят для введения с более длительными интервалами, чем, например, один раз в день, соответственно, должным образом приготовленные по рецептуре соединения по изобретению могут быть пригодны, например, для введения два раза в неделю или один раз в неделю с применением подходящего пути введения, такого как один из путей, раскрытых в этом документе.
Как описано выше, соединения по настоящему изобретению можно вводить или применять в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями или субстанциями, и пригодные дополнительные соединения или субстанции могут быть выбраны, например, из противодиабетических агентов, антигиперлипидемических агентов, агентов против ожирения, агентов, снижающих артериальное давление, и агентов для лечения осложнений, вызванных диабетом или ассоциированных с диабетом.
Пригодные противодиабетические агенты включают инсулин, производные или аналоги инсулина, производные или аналоги GLP-1 (глюкагоноподобного пептида 1) [такие как описаны в WO 98/08871 (компания Novo Nordisk A/S), содержание которой включено сюда в качестве ссылки, или другие аналоги GLP-1, такие как эксенатид (Byetta (Биетта), компания Eli Lilly/Amylin; AVE0010, компания Sanofi-Aventis), таспоглутид (Roche), албиглутид (Syncria (Синкриа), компания GlaxoSmithKline)], амилин, аналоги амилина (например, Symlin™ (Симлин)/Pramlintide (Прамлинтид)), а также гипогликемические агенты, обладающие активностью при пероральном приеме.
Пригодные гипогликемические агенты, обладающие активностью при пероральном приеме, включают: метформин, имидазолины; производные сульфонилмочевины; бигуаниды; меглитиниды; оксадиазолидиндионы; тиазолидинедионы; усилители чувствительности рецепторов к инсулину; ингибиторы α-глюкозидазы; агенты, действующие на АТФ-зависимые калиевые каналы β-клеток поджелудочной железы, например, вещества, вызывающие открытие калиевых каналов, такие как описаны в WO 97/26265, WO 99/03861 и WO 00/37474 (Novo Nordisk A/S), которые включены сюда в качестве ссылок; вещества, вызывающие открытие калиевых каналов, такие как ормитиглинид; блокаторы калиевых каналов, такие как натеглинид или BTS-67582; антагонисты рецепторов глюкагона, такие как описаны в WO 99/01423 и WO 00/39088 (Novo Nordisk A/S и Agouron Pharmaceuticals, Inc.), которые включены сюда в качестве ссылок; агонисты рецепторов GLP-1, такие как описаны в WO 00/42026 (Novo Nordisk A/S and Agouron Pharmaceuticals, Inc.), которая включена сюда в качестве ссылки; аналоги амилина (агонисты рецептора амилина); ингибиторы DPP-IV (дипептидилпептидазы-IV); ингибиторы РТРазы (протеин-тирозин-фосфатазы); активаторы глюкокиназы, такие как описаны в WO 02/08209, принадлежащей компании Hoffmann La Roche; ингибиторы ферментов печени, вовлеченных в стимуляцию глюконеогенеза и/или гликогенолиза; модуляторы поглощения глюкозы; ингибиторы GSK-3 (киназы гликогенсинтазы 3); соединения, модифицирующие метаболизм липидов, такие как антигиперлипидемические агенты и антилипидемические агенты; соединения, снижающие потребление пищи; а также агонисты РАПП (рецептора, активируемого пероксисомальным пролифератором) и агонисты RXR (ретиноидного Х рецептора), такие как ALRT-268, LG3-1268 или LG-1069.
Другие примеры пригодных дополнительных терапевтически активных субстанций включают инсулин или аналоги инсулина; производные сульфонилмочевины, например, толбутамид, хлорпропамид, толазамид, глибенкламид, глипизид, глимепирид, гликазид или глибурид; бигуаниды, например, метформин, и меглитиниды, например, репаглинид или сенаглинид/натеглинид.
Другие примеры пригодных дополнительных терапевтически активных субстанций включают тиазолидинедионовые усилители чувствительности рецепторов к инсулину, например, троглитазон, циглитазон, пиоглитазон, росиглитазон, изаглитазон, дарглитазон, энглитазон, CS-011/Cl-1037 или Т 174, или соединения, раскрытые в WO 97/41097 (DRF-2344), WO 97/41119, WO 97/41120, WO 00/41121 и WO 98/45292 (Исследовательский фонд д-ра Редди (Reddy)), содержание которых включено сюда в качестве ссылок.
Другие примеры пригодных дополнительных терапевтически активных субстанций включают усилители чувствительности рецепторов к инсулину, например, GI 262570, YM-440, MCC-555, JTT-501, AR-H039242, KRP-297, GW-409544, CRE-16336, AR-H049020, LY510929, МВХ-102, CLX-0940, GW-501516 и соединения, раскрытые в WO 99/19313 (NN622/DRF-2725), WO 00/50414, WO 00/63191, WO 00/63192 и WO 00/63193 (Исследовательский фонд д-ра Редди (Reddy)) и в WO 00/23425, WO 00/23415, WO 00/23451, WO 00/23445, WO 00/23417, WO 00/23416, WO 00/63153, WO 00/63196, WO 00/63209, WO 00/63190 и WO 00/63189 (Novo Nordisk A/S), содержание которых включено сюда в качестве ссылок.
Другие примеры пригодных дополнительных терапевтически активных субстанций включают: ингибиторы α-глюкозидазы, например, воглибозу, эмиглитат, миглитол или акарбозу; ингибиторы гликогенфосфорилазы, например, соединения, описанные в WO 97/09040 (Novo Nordisk A/S); активаторы глюкокиназы; агенты, действующие на АТФ-зависимые калиевые каналы β-клеток поджелудочной железы, например, толбутамид, глибенкламид, глипизид, гликазид, BTS-67582 или репаглинид.
Другие пригодные дополнительные терапевтически активные субстанции включают антигиперлипидемические агенты и антилипидемические агенты, например, холестирамин, колестипол, клофибрат, гемфиброзил, ловастатин, правастатин, симвастатин, пробукол или декстротироксин.
3-36
Другие агенты, пригодные для применения в качестве дополнительных терапевтически активных субстанций, включают агенты против ожирения и агенты, регулирующие аппетит. Такие субстанции могут быть выбраны из группы, состоящей из агонистов CART (транскрипта, регулируемого кокаином и амфетамином), антагонистов NPY (рецептора нейропептида Y-1 и/или -5), агонистов МС3 (рецептора меланокортина-3), антагонистов МС3, агонистов МС4 (рецептора меланокортина-4), антагонистов рецептора орексина, агонистов TNF (фактора некроза опухоли), агонистов CRF (кортикотропин рилизинг-фактора), антагонистов CRF ВР (белка, связывающего кортикотропин рилизинг-фактор), агонистов урокортина, аналогов нейромедина U (агонистов, действующих на рецептор нейромедина U подтипов 1 и 2), β3 адренергических агонистов, таких как CL-316243, AJ-9677, GW-0604, LY362884, LY377267 или AZ-40140, агонистов МС1 (рецептора меланокортина-1), антагонистов МСН (меланиноконцентрирующего гормона), агонистов ССК (холецистокинина), ингибиторов обратного захвата серотонина (например, флуоксетина, сероксата или циталопрама), ингибиторов обратного захвата серотонина и норэпинефрина, агонистов 5НТ (серотонина), агонистов 5НТ6, агонистов 5НТ2 с, таких как APD356 (US6953787), агонистов бомбезина, антагонистов галанина, гормона роста, факторов роста, таких как пролактин или плацентарный лактоген, соединений, способствующих высвобождению гормона роста, агонистов TRH (тиреотропин рилизинг-гормона), модуляторов UCP 2 или 3 (разобщающего белка 2 или 3), химических разобщающих агентов, агонистов лептинов, агонистов дофамина (бромокриптина, допрексина), ингибиторов липаз/амилаз, модуляторов РАПП, модуляторов RXR, агонистов TR β, адренергических агентов, стимулирующих ЦНС, ингибиторов AGRP (агути-связанного пептида), антагонистов гистаминового рецептора Н3, таких как раскрыты в WO 00/42023, WO 00/63208 и WO 00/64884, содержание которых включено сюда в качестве ссылок, аналогов эксендина-4, аналогов GLP-1, цилиарного нейротрофного фактора, аналогов амилина, пептида YY (PYY3-36) (Batterham et al, Nature 418, 650-654 (2002)), аналогов PYY3-36, агонистов рецептора NPY Y2, агонистов рецептора NPY Y4 и субстанций, действующих как комбинированные агонисты NPY Y2 и NPY Y4, FGF21 и их аналогов, антагонистов µ-опиоидных рецепторов, оксинтомодулина или их аналогов.
Дополнительными пригодными агентами против ожирения являются бупропион (антидепрессант), топирамат (противосудорожное средство), экопипам (антагонист дофамина D1/D5) и налтрексон (антагонист опиоидов) и их сочетания. Сочетания этих агентов против ожирения могут быть, например, следующими: фентермин + топирамат, бупропион пролонгированного действия + налтрексон пролонгированного действия, зонисамид пролонгированного действия и бупропион пролонгированного действия. Среди вариантов воплощения пригодных агентов против ожирения для применения в способе по изобретению в качестве дополнительных терапевтически активных субстанций в сочетании с соединением по изобретению представлены лептин и аналоги или производные лептина.
Дополнительными вариантами воплощения пригодных агентов против ожирения являются ингибиторы обратного захвата серотонина и норэпинефрина, например, сибутрамин.
Другими вариантами воплощения пригодных агентов против ожирения являются ингибиторы липаз, например, орлистат.
Дополнительными вариантами воплощения пригодных агентов против ожирения являются адренергические агенты, стимулирующие ЦНС, например, дексамфетамин, амфетамин, фентермин, мазиндол, фендиметразин, диэтилпропион, фенфлурамин или дексфенфлурамин.
Другие примеры пригодных дополнительных терапевтически активных соединений включают агенты, снижающие артериальное давление. Примерами агентов, снижающих артериальное давление, являются β-блокаторы, такие как альпренолол, атенолол, тимолол, пиндолол, пропранолол и метопролол, ингибиторы АСЕ (ангиотензин-превращающего фермента), такие как беназеприл, каптоприл, эналаприл, фозиноприл, лизиноприл, квинаприл и рамиприл, блокаторы кальциевых каналов, такие как нифедипин, фелодипин, никардипин, исрадипин, нимодипин, дилтиазем и верапамил, и α-блокаторы, такие как доксазозин, урапидил, празозин и теразозин.
Соединения по настоящему изобретению обладают более высокой селективностью в отношении рецепторов глюкагона, по сравнению с пептидами, описанными ранее в данной области. Пептиды по настоящему изобретению также обладают увеличенным периодом полувыведения in vivo. Соединения по настоящему изобретению могут представлять собой растворимые агонисты рецепторов глюкагона, например, с растворимостью по меньшей мере 0,2 ммоль/л, по меньшей мере 0,5 ммоль/л, по меньшей мере 2 ммоль/л, по меньшей мере 4 ммоль/л, по меньшей мере 8 ммоль/л, по меньшей мере 10 ммоль/л, или по меньшей мере 15 ммоль/л.
В данном контексте, если не указано иначе, термины «растворимый», «растворимость», «растворимый в водном растворе», «растворимость в водном растворе», «растворимый в воде», «водорастворимый», «растворимость в воде» и «водорастворимость» относятся к растворимости соединения в воде или в водном солевом растворе или в водном буферном растворе, например, в 10 мМ растворе фосфата, или в водном растворе, содержащем другие соединения, но не содержащем органические растворители.
Термины «полипептид» и «пептид» при использовании в этом документе означают соединение, состоящее из по меньшей мере пяти мономеров -аминокислот, соединенных пептидными связями. Входящие в состав аминокислоты могут принадлежать к группе аминокислот, кодируемых генетическим кодом, и могут являться природными аминокислотами, которые не кодируются генетическим кодом, а также синтетическими аминокислотами. Природными аминокислотами, которые не кодируются генетическим кодом, являются, например гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, орнитин, фосфосерин, D-аланин и D-глутамин. Синтетические аминокислоты включают аминокислоты, полученные химическим синтезом, т.е., D-изомеры аминокислот, кодируемых генетическим кодом, такие как D-аланин и D-лейцин, Aib (α-аминоизомасляная кислота), Abu (α-аминомасляная кислота), Tie (трет-бутил глицин), β-аланин, 3-аминометилбензойная кислота, антраниловая кислота.
Термин «аналог» при использовании в этом документе в отношении полипептида означает модифицированный пептид, в котором один или несколько аминокислотных остатков пептида были заменены другими аминокислотными остатками и/или в котором один или несколько аминокислотных остатков были удалены из пептида и/или в котором один или несколько аминокислотных остатков были добавлены в пептид. Такие добавления или удаления аминокислотных остатков могут происходить на N-конце пептида и/или на С-конце пептида. Для описания аналогов применяется простая система. Формулы пептидных аналогов и их производных изображают с применением стандартного однобуквенного или трехбуквенного сокращения названий аминокислот, согласно номенклатуре ИЮПАК-МБС (Международного союза теоретической и прикладной химии - Международного биохимического союза).
Термин «производное» при использовании в этом документе в отношении пептида означает химически модифицированный пептид или его аналог, при этом по меньшей мере один заместитель отсутствует в немодифицированном пептиде или его аналоге, т.е., это пептид, который был ковалентно модифицирован. Типичными модификациями являются добавление амидов, углеводов, алкильных групп, образование сложных эфиров и т.п.
Предполагается, что все аминокислоты, для которых не указан оптический изомер, являются L-изомером.
Термин «пептид глюкагона» при использовании в этом документе означает пептид глюкагона, соединение глюкагона, соединение по настоящему изобретению, соединение согласно настоящему изобретению, соединение формулы I, аналог глюкагона, производное глюкагона или производное аналога глюкагона человека, принадлежащий человеку глюкагон (1-29), глюкагон (1-30), глюкагон (1-31), глюкагон (1-32), а также их аналоги, химерные белки и производные, которые сохраняют активность глюкагона.
1
29
Что касается нумерации положений в составе соединений глюкагона, для целей настоящего документа любая аминокислотная замена, делеция и/или вставка указаны относительно последовательностей нативного глюкагона человека (1-29) (SEQ ID 1). В этом документе положения аминокислот 1-29 в составе глюкагона человека являются такими же, как положения аминокислот X-X. Глюкагон (1-29) человека имеет следующую последовательность: His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr (SEQ ID 1).
Глюкагон (1-30) обозначает глюкагон человека с добавлением одной аминокислоты на С-конце, глюкагон (1-31) обозначает глюкагон человека с добавлением двух аминокислот на С-конце и глюкагон (1-32) обозначает глюкагон человека с добавлением трех аминокислот на С-конце.
Термин «дистальный» при использовании в этом документе означает расположение, наиболее удаленное от точки присоединения (концевое).
Термин «отрицательно заряженный фрагмент» при использовании в этом документе означает химические фрагменты, которые могут нести отрицательный заряд, включая в качестве неограничивающих примеров карбоновую кислоту, сульфоновую кислоту или тетразольный фрагмент.
2
n
Термин «липофильный фрагмент» при использовании в этом документе означает алкильную цепочку -(СН)-, где n=5-20.
Термин «заместитель» при использовании в этом документе означает химический фрагмент или группу, замещающую атом водорода.
В вариантах воплощения изобретения было модифицировано вплоть до 17 аминокислот в составе аналога глюкагона (замещено, делегировано, добавлено или изменено с применением любого сочетания этих модификаций), по сравнению с глюкагоном человека (1-29). В вариантах воплощения изобретения модификации подвергнуты не более 15 аминокислот в составе аналога глюкагона. В вариантах воплощения изобретения модификации подвергнуты не более 10 аминокислот в составе аналога глюкагона. В вариантах воплощения изобретения модификации подвергнуты не более 8 аминокислот в составе аналога глюкагона. В вариантах воплощения изобретения модификации подвергнуты не более 7 аминокислот в составе аналога глюкагона. В вариантах воплощения изобретения модификации подвергнуты не более 6 аминокислот в составе аналога глюкагона. В вариантах воплощения изобретения модификации подвергнуты не более 5 аминокислот в составе аналога глюкагона. В вариантах воплощения изобретения модификации подвергнуты не более 4 аминокислот в составе аналога глюкагона. В вариантах воплощения изобретения модификации подвергнуты не более 3 аминокислот в составе аналога глюкагона. В вариантах воплощения изобретения модификации подвергнуты не более 2 аминокислот в составе аналога глюкагона. В вариантах воплощения изобретения модификации подвергнута 1 аминокислота в составе аналога глюкагона.
Дополнительные варианты воплощения настоящего изобретения относятся к следующему:
173. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-172, при этом указанный пептид глюкагона является соединением, защищенным от действия пептидазы DPP-IV.
174. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-173, при этом указанный пептид глюкагона стабилизирован в отношении действия пептидазы DPP-IV.
175. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-174, при этом указанный пептид глюкагона является агонистом рецептора глюкагона.
50
176. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-175, при этом указанный пептид глюкагона является агонистом рецептора глюкагона, обладая EC<1 нМ.
Термин «защищенный от действия пептидазы DPP-IV» при использовании в этом документе в отношении полипептида означает полипептид, который был химически модифицирован с целью придания указанному соединению устойчивости к действию находящейся в плазме пептидазы - дипептидилпептидазы-4 (DPP-IV). Известно, что в плазме фермент DPP-IV участвует в деградации нескольких пептидных гормонов, например, глюкагона, GLP-1, GLP-2, оксинтомодулина и т.д. Таким образом, затрачено существенное усилие для разработки аналогов и производных полипептидов, чувствительных к гидролизу, опосредованному DPP-IV, с целью снижения скорости деградации под действием DPP-IV.
Дополнительно, соединения по настоящему изобретению стабилизированы в отношении расщепления под действием DPP-IV при проведении анализа без альбумина, как описано в разделе «Тест VI».
50
Термин «агонист глюкагона» при использовании в этом документе относится к любому пептиду глюкагона, который полностью или частично активирует рецептор глюкагона человека. В предпочтительном варианте воплощения «агонист глюкагона» является любым пептидом глюкагона, который связывается с рецептором глюкагона, предпочтительно с константой аффинности (KD) или эффективностью (ЕС) менее 1 мкМ, например, менее 100 нМ или менее 1 нМ, при измерении способами, известными специалистам в данной области, и демонстрирует инсулинотропную активность, при этом инсулинотропную активность можно измерить с помощью тестов in vivo или in vitro, известных специалистам в данной области. Например, можно ввести агонист глюкагона животному и определять изменение концентрации инсулина с течением времени.
В данном контексте подразумевается, что термин «агонист» обозначает субстанцию (лиганд), которая активирует рассматриваемый тип рецептора.
В данном контексте подразумевается, что термин «антагонист» обозначает субстанцию (лиганд), которая блокирует, нейтрализует или противодействует функции агониста.
В частности, лиганды рецептора можно классифицировать следующим образом.
Агонисты рецептора, которые активируют рецептор; частичные агонисты также активируют рецептор, но с более низкой эффективностью, чем полные агонисты. Частичный агонист ведет себя как частичный антагонист рецептора, частично ингибируя действие полного агониста.
Нейтральные антагонисты рецептора, которые блокируют действие агониста, но не влияют собственно на присущую рецептору активность.
Обратные агонисты рецептора, которые блокируют действие агониста и одновременно подавляют присущую рецептору активность. Полный обратный агонист полностью подавляет присущую рецептору активность; частичный обратный агонист подавляет присущую рецептору активность в меньшей степени.
При использовании в этом документе термин «антагонист» включает нейтральные антагонисты и частичные антагонисты, а также обратные агонисты. Термин «агонист» включает полные агонисты, а также частичные агонисты.
В данном контексте предполагается, что термин «фармацевтически приемлемая соль» обозначает соль, которая не являются вредной для пациента. Такие соли включают фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли, фармацевтически приемлемые соли металлов, соли аммония и алкилированного аммония. Кислотно-аддитивные соли включают соли неорганических кислот, а также органических кислот. Представительные примеры пригодных неорганических кислот включают хлористоводородную, бромистоводородную, иодистоводородную, фосфорную, серную и азотную кислоты и т.п. Представительные примеры пригодных органических кислот включают муравьиную, уксусную, трихлоруксусную, трифторуксусную, пропионовую, бензойную, коричную, лимонную, фумаровую, гликолевую, молочную, малеиновую, яблочную, малоновую, миндальную, щавелевую, пикриновую, пиррвиноградную, салициловую, янтарную, метансульфоновую, этансульфоновую, винную, аскорбиновую, памоевую, бисметиленсалициловую, этандисульфоновую, глюконовую, цитраконовую, аспарагиновую, стеариновую, пальмитиновую, ЭДТА, гликолевую, р-аминобензойную, глутаминовую, бензенсульфоновую, р-толуолсульфоновую кислоты и т.п. Дополнительные примеры фармацевтически приемлемых аддитивных солей неорганических и органических кислот включают фармацевтически приемлемые соли, перечисленные в публикации J. Pharm. Sci. (1977) 66, 2, содержание которой включено сюда в качестве ссылки. Примеры пригодных солей металлов включают соли лития, натрия, калия и магния и т.п. Примеры солей алкилированного аммония включают соли метиламмония, диметиламмония, триметиламмония, этиламмония, гидроксиэтиламмония, диэтиламмония, бутиламмония и тетраметиламмония и т.п.
При использовании в этом документе «терапевтически эффективное количество» соединения означает количество, достаточное для того, чтобы вылечить, ослабить или частично прекратить клинические проявления данного заболевания и/или его осложнений. Количество, достаточное для достижения этой цели, называется «терапевтически эффективным количеством». Эффективные количества для каждой цели будут зависеть от степени тяжести заболевания или травмы, а также от массы тела и общего состояния субъекта. Понятно, что определение соответствующей дозировки может быть достигнуто путем проведения стандартных экспериментальных исследований, путем построения матрицы значений и тестирования различных точек этой матрицы, и все эти способы хорошо известны прошедшим обучение врачам и ветеринарам.
При использовании в этом документе термины «лечение», «проведение лечения» и другие их варианты означают проведение терапии и оказание помощи пациенту с целью борьбы с таким состоянием, как заболевание или нарушение. Предполагается, что термины включают полный спектр способов терапии для данного состояния, от которого страдает пациент, таких как введение рассматриваемого активного соединения (соединений) для ослабления симптомов или их осложнений, для замедления прогрессирования заболевания, нарушения или состояния, для вылечивания или избавления от заболевания, нарушения или состояния, и/или для профилактики состояния, при этом под профилактикой следует понимать проведение терапии и оказание помощи пациенту с целью борьбы с заболеванием, нарушением или состоянием, которые включают введение рассматриваемого активного соединения (или соединений) с целью предотвращения возникновения симптомов или осложнений. Пациент, лечение которого проводится, предпочтительно является млекопитающим, в частности, человеком, но лечение других животных, таких как собаки, кошки, коровы, лошади, овцы, козы или свиньи, также входит в объем изобретения.
При использовании в этом документе термин «сольват» относится к комплексу с заданной стехиометрией, образованному между растворенным веществом (в данном случае - соединением по настоящему изобретению) и растворителем. Растворители могут включать, например, воду, этанол или уксусную кислоту.
Настоящее изобретение также относится к заместителям, которые могут иметь общую формулу:
,
где
Z1 может являться липофильной углеводородной цепочкой с отрицательно заряженной группой, такой как карбоксильная группа, или тетразол-5-илом на конце,
2
4
Z и Z могут содержать один или несколько фрагментов гамма-глутаминовой кислоты или глутаминовой кислоты, и
3
4
Z может содержать один или несколько остатков Ado. Примером заместителя по настоящему изобретению, в котором отсутствует фрагмент Z, может служить:
где символ * указывает точку присоединения к пептиду.
10
12
16
17
18
20
21
24
25
27
28
29
30
В одном из вариантов воплощения заместитель присоединен через эпсилон-положение лизина или через дельта-положение орнитина и может располагаться в одном или нескольких следующих положениях в составе пептида формулы I: Х, X, X, X, X, X, X, X, Х, Х, Х, Х и/или Х.
12
16
24
25
27
28
29
30
В еще одном варианте воплощения заместитель присоединен через эпсилон-положение лизина или через дельта-положение орнитина и может располагаться в одном или нескольких следующих положениях в составе пептида формулы I: X, X, Х, Х, Х, Х, Х и/или Х.
24
28
29
30
В еще одном варианте воплощения заместитель присоединен через эпсилон-положение лизина или через дельта-положение орнитина и может располагаться в одном или нескольких следующих положениях в составе пептида формулы I: Х, Х, Х и/или Х.
24
28
29
30
В еще одном варианте воплощения заместитель присоединен через эпсилон-положение лизина или через дельта-положение орнитина и может располагаться в одном или нескольких следующих положениях в составе пептида формулы I: Х, Х, Х и/или Х.
Дополнительные варианты воплощения настоящего изобретения относятся к заместителю:
177. Заместитель формулы II:
,
1
где Z представляет собой структуру согласно одной из формул IIа, IIb или IIc:
где n в формуле IIa равно 6-20,
m в формуле IIc равно 5-11;
2
2
1
3
2
3
1
4
группа СООН в формуле IIc может располагаться в положении 2, 3 или 4 в составе фенильного кольца, символ * в формулах IIa, IIb и IIc указывает место присоединения к атому азота в Z; если Z отсутствует, Z присоединен к атому азота на Z в месте, указанном символом *, и если Z и Z отсутствуют, Z присоединен к атому азота на Z в месте, указанном символом *;
2
Z отсутствует или представляет собой структуру согласно одной из формул IId, IIc, IIf, IIg, IIh, Iii, IIj или IIk:
где каждая аминокислота обладает стереохимией L или D;
2
3
где Z присоединен через атом углерода, обозначенный *, к атому азота в составе Z, обозначенному *;
3
2
4
если Z отсутствует, Z присоединен через атом углерода, обозначенный *, к атому азота в составе Z, обозначенному *; и
3
4
2
если Z и Z отсутствуют, Z, присоединен через атом углерода, обозначенный *, к эпсилон-атому азота лизина или дельта-атому азота орнитина в составе пептида глюкагона;
3
Z отсутствует или представляет собой структуру согласно одной из формул IIm, IIn, IIo или IIp:
3
3
4
4
3
Z соединен через атом углерода в Z, обозначенный символом *, с атомом азота в Z, обозначенным символом *, если Z отсутствует, Z соединен через атом углерода, обозначенный *, с эпсилон-атомом азота в составе лизина или с дельта-атомом азота в составе орнитина в пептиде глюкагона;
4
4
Z отсутствует или представляет собой структуру согласно одной из формул IId, IIc, IIf, IIg, IIh, Iii, IIj или IIk, где каждый аминокислотный фрагмент независимо имеет стехиометрию либо L, либо D, при этом Z, соединен через атом углерода, обозначенный символом*, с эпсилон-атомом азота в составе лизина или с дельта-атомом азота в составе орнитина в пептиде глюкагона.
178. Заместитель по воплощению 177, где:
1
Z представляет собой структуру согласно одной из формул IIa, IIb или IIc:
где n в формуле IIа равно 6-20,
2
Z отсутствует или представляет собой структуру согласно одной из формул IId, IIc, IIf, IIg, IIh, IIi, IIj или IIk:
где каждый аминокислотный фрагмент независимо обладает стереохимией L или D.
3
Z отсутствует или представляет собой структуру согласно одной из формул IIm, IIn, IIo или IIp:
4
Z отсутствует или представляет собой структуру согласно одной из формул IId, IIe, IIf, IIg, IIh, Iii, IIj или IIk;
где каждый аминокислотный фрагмент независимо обладает стереохимией L или D.
2
4
179. Заместитель по любому из воплощений 177-178, где Z отсутствует, если присутствует Z.
4
2
180. Заместитель по любому из воплощений 177-178, где Z отсутствует, если присутствует Z.
181. Заместитель по любому из воплощений 177-180, который выбран из структур в соответствии с одной из формул IIIa, IIIb, a, IIIb, IIIc, IIId, IIIc, IIIf, IIIg, IIIh, IIIi, IIIj, IIIk, IIIl, IIIm, IIIn или IIIo:
или
182. Заместитель по любому из воплощений 177-180, который представляет собой структуру формулы IIIa:
4
183. Заместитель по любому из воплощений 177-182, где Z отсутствует.
3
4
184. Заместитель по любому из воплощений 177-182, где Z и Z отсутствуют.
Термин «альбумин-связывающий радикал» при использовании в этом документе означает радикал, который нековалентно связывается с сывороточным альбумином человека. Альбумин-связывающий радикал, присоединенный к терапевтическому пептиду, в типичном случае обладает аффинностью к сывороточному альбумину человека менее 10 мкМ, и предпочтительно - менее 1 мкМ. Известен целый ряд альбумин-связывающих радикалов, принадлежащих к линейным и разветвленным липофильным фрагментам, содержащим 4-40 атомов углерода.
Другие варианты воплощения настоящего изобретения относятся к фармацевтическим композициям:
185. Фармацевтическая композиция, содержащая пептид глюкагона по любому из воплощений 1-176.
186. Фармацевтическая композиция по воплощению 185, дополнительно содержащая одно или несколько дополнительных терапевтически активных соединений или субстанций.
187. Фармацевтическая композиция по любому из воплощений 185-186, дополнительно содержащая соединение GLP-1.
188. Фармацевтическая композиция по любому из воплощений 185-186, где соединение GLP-1 выбрано из группы, состоящей из:
N-эпсилон26-((S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламино-бутирил)[Arg34]GLP-1-(7-37):
N-эпсилон37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-({транс-4-[(19-карбоксинонадеканоиламино)метил]циклогексанкарбонил}амино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][дезаминоНis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37):
N-эпсилон26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37):
N-эпсилон37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(15-карбокси-пентадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил][Aib8,22,35,Lys37]GLP-1-(7-37):
и их фармацевтически приемлемых солей, амидов, алкилов или сложных эфиров.
189. Фармацевтическая композиция по любому из воплощений 185-188, дополнительно содержащая соединение инсулина.
190. Фармацевтическая композиция по воплощению 189, при этом соединение инсулина является следующим соединением:
NεВ29-гексадекандииол-γ-Glu-(дез-В30) инсулином человека
191. Фармацевтическая композиция по любому из воплощений 185-190, в виде унифицированной лекарственной формы, содержащая от примерно 0,05 мг до примерно 1000 мг, например, от примерно 0,1 мг до примерно 500 мг, от примерно 2 мг до примерно 5 мг, например, от примерно 0,5 мг до примерно 200 мг, пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177.
192. Фармацевтическая композиция по любому из воплощений 185-190, которая пригодна для парентерального введения.
193. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177 для применения в терапии.
Дополнительные воплощения настоящего изобретения относятся к следующему:
194. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью лечения или профилактики гипергликемии, диабета 2 типа, нарушения толерантности к глюкозе, диабета 1 типа и ожирения.
195. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью замедления или профилактики прогрессирования заболевания при диабете 2 типа.
196. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью лечения ожирения или профилактики избыточной массы тела.
197. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью снижения потребления пищи.
198. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью повышения расхода энергии.
199. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью снижения массы тела.
200. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью замедления прогрессирования от состояния нарушения толерантности к глюкозе (преддиабета) к диабету 2 типа.
201. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью замедления прогрессирования от диабета 2 типа до диабета с потребностью в инсулине.
202. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью регуляции аппетита.
203. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью индуцирования насыщения.
204. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью профилактики повторного повышения массы тела после успешного снижения массы тела.
205. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью лечения заболевания или состояния, связанного с избыточной массой тела или ожирением.
206. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью лечения булимии.
207. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью лечения компульсивного переедания.
208. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью лечения атеросклероза.
209. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью лечения гипертонии.
210. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью лечения диабета 2 типа.
211. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью лечения нарушения толерантности к глюкозе.
212. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью лечения дислипидемии.
213. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью лечения коронарной болезни сердца.
214. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью лечения жировой дегенерации печени.
215. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью лечения жировой дегенерации печени.
216. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью лечения отравления бета-блокаторами.
217. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью подавления подвижности желудочно-кишечного тракта, что может быть полезно в связи с исследованиями желудочно-кишечного тракта с применением таких методик, как рентгеноскопическое исследование, компьютерная томография или ЯМР-сканирование.
218. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью лечения или профилактики гипогликемии.
219. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью лечения или профилактики гипогликемии, вызванной инсулином.
220. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью лечения или профилактики реактивной гипогликемии.
221. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью лечения или профилактики диабетической гипогликемии.
222. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью лечения или профилактики недиабетической гипогликемии.
223. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью лечения или профилактики гипогликемии голодания.
224. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью лечения или профилактики гипогликемии, вызванной приемом лекарств.
225. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью лечения или профилактики гипогликемии, вызванной шунтированием желудка.
226. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью лечения или профилактики гипогликемии при беременности.
227. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью лечения или профилактики алкогольной гипогликемии.
228. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью лечения или профилактики инсулиномы.
229. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения с целью лечения или профилактики болезни Гирке.
Дополнительные воплощения настоящего изобретения относятся к следующим способам:
230. Способ лечения или профилактики гипергликемии, диабета 2 типа, нарушения толерантности к глюкозе, диабета 1 типа и ожирения, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
231. Способ замедления или профилактики прогрессирования заболевания при диабете 2 типа, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
232. Способ лечения ожирения или профилактики избыточной массы тела, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
233. Способ снижения потребления пищи, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
234. Способ применения с целью повышения расхода энергии, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
235. Способ применения с целью снижения массы тела, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
236. Способ применения с целью замедления прогрессирования от состояния нарушения толерантности к глюкозе (преддиабета) к диабету 2 типа, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
237. Способ применения с целью замедления прогрессирования от диабета 2 типа до диабета с потребностью в инсулине, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
238. Способ применения с целью регуляции аппетита, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
239. Способ применения с целью индуцирования насыщения, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
240. Способ применения с целью профилактики повторного повышения массы тела после успешного снижения массы тела, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
241. Способ применения с целью лечения заболевания или состояния, связанного с избыточной массой тела или ожирением, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
242. Способ применения с целью лечения булимии, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
243. Способ применения с целью лечения компульсивного переедания, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
244. Способ применения с целью лечения атеросклероза, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
245. Способ применения с целью лечения гипертонии, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
246. Способ применения с целью лечения диабета 2 типа, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
247. Способ применения с целью лечения нарушения толерантности к глюкозе, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
248. Способ применения с целью лечения дислипидемии, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
249. Способ применения с целью лечения коронарной болезни сердца, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
250. Способ применения с целью лечения жировой дегенерации печени, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
251. Способ применения с целью лечения отравления бета-блокаторами, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
252. Способ применения с целью подавления подвижности желудочно-кишечного тракта, что может быть полезно в связи с исследованиями желудочно-кишечного тракта с применением таких методик, как рентгеноскопическое исследование, компьютерная томография или ЯМР-сканирование, при этом способ включает введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
253. Способ применения с целью лечения или профилактики гипогликемии, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
254. Способ применения с целью лечения или профилактики гипогликемии, вызванной инсулином, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
255. Способ применения с целью лечения или профилактики реактивной гипогликемии, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
256. Способ применения с целью лечения или профилактики диабетической гипогликемии, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
257. Способ применения с целью лечения или профилактики недиабетической гипогликемии, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
258. Способ применения с целью лечения или профилактики гипогликемии голодания, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
259. Способ применения с целью лечения или профилактики гипогликемии, вызванной приемом лекарств, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
260. Способ применения с целью лечения или профилактики гипогликемии, вызванной шунтированием желудка, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
261. Способ применения с целью лечения или профилактики гипогликемии при беременности, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
262. Способ применения с целью лечения или профилактики алкогольной гипогликемии, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
263. Способ применения с целью лечения или профилактики инсулиномы, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
264. Способ применения с целью лечения или профилактики болезни Гирке, включающий введение пациенту, которому это необходимо, эффективного количества пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
Дополнительные воплощения настоящего изобретения относятся к следующим применениям:
265. Применение пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177 для получения лекарства.
266. Применение пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177 для получения лекарства для лечения или профилактики гипергликемии, диабета 2 типа, нарушения толерантности к глюкозе, диабета 1 типа и ожирения.
267. Применение пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177 для получения лекарства для замедления или профилактики прогрессирования заболевания при диабете 2 типа, лечения ожирения или профилактики избыточной массы тела, снижения потребления пищи, повышения расхода энергии, снижения массы тела, замедления прогрессирования от состояния нарушения толерантности к глюкозе (преддиабета) к диабету 2 типа; замедления прогрессирования от диабета 2 типа до диабета с потребностью в инсулине; регуляции аппетита; индуцирования насыщения; профилактики повторного повышения массы тела после успешного снижения массы тела; лечения заболевания или состояния, связанного с избыточной массой тела или ожирением; лечения булимии; лечения компульсивного переедания; лечения атеросклероза, гипертонии, диабета 2 типа, нарушения толерантности к глюкозе, дислипидемии, коронарной болезни сердца, жировой дегенерации печени, лечения отравления бета-блокаторами, для применения с целью подавления подвижности желудочно-кишечного тракта, что может быть полезно в связи с исследованиями желудочно-кишечного тракта с применением таких методик, как рентгеноскопическое исследование, компьютерная томография или ЯМР-сканирование.
268. Применение пептида глюкагона по любому из воплощений 1-177 для получения лекарства для лечения или профилактики гипогликемии, гипогликемии, вызванной инсулином, реактивной гипогликемии, диабетической гипогликемии, недиабетической гипогликемии, гипогликемии голодания, гипогликемии, вызванной приемом лекарств, гипогликемии, вызванной шунтированием желудка, гипогликемии при беременности, алкогольной гипогликемии, инсулиномы и болезни Гирке.
Дополнительные воплощения настоящего изобретения относятся к следующему:
269. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-268, при этом указанный пептид глюкагона демонстрирует степень извлечения более 70% в тесте на образование фибрилл с применением ThT.
270. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-268, при этом указанный пептид глюкагона демонстрирует степень извлечения более 90% в тесте на образование фибрилл с применением ThT.
271. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-270, при этом указанный пептид глюкагона демонстрирует степень извлечения примерно 100% в тесте на образование фибрилл с применением ThT.
272. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-271, при этом указанный пептид глюкагона демонстрирует время запаздывания более 7 ч в тесте на образование фибрилл с применением ThT.
273. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-271, при этом указанный пептид глюкагона демонстрирует время запаздывания более 20 ч в тесте на образование фибрилл с применением ThT.
274. Пептид глюкагона по любому из воплощений 1-272, при этом указанный пептид глюкагона демонстрирует время запаздывания 45 ч или более в тесте на образование фибрилл с применением ThT.
В некоторых воплощениях применений и способов по настоящему изобретению пептид глюкагона по настоящему изобретению может быть введен или применен в сочетании с более чем одним из указанных выше пригодных дополнительных терапевтически активных соединений или субстанций, например, в сочетании с: метформином и сульфонилмочевиной, такой как глибурид; сульфонилмочевиной и акарбозой; натеглинидом и метформином; акарбозой и метформином; сульфонилмочевиной, метформином и троглитазоном; инсулином и сульфонилмочевиной; инсулином и метформином; инсулином, метформином и сульфонилмочевиной; инсулином и троглитазоном; инсулином и ловастатином; и т.д.
В случае, в частности, введения пептида глюкагона по изобретению, возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями или субстанциями, как описано выше, для целей, связанных с лечением или профилактикой ожирения или избыточной массы тела, т.е., связанных со снижением или профилактикой чрезмерного адипоза, может быть уместно применение такого введения в сочетании с хирургическим вмешательством для целей достижения потери массы тела или профилактики повышения массы тела, например, в сочетании с бариатрическим хирургическим вмешательством. Примеры часто применяемых методик бариатрической хирургии включают в качестве неограничивающих примеров следующие методики: вертикальная гастропластика (известная также как «ушивание желудка»), при которой часть желудка отделяется с помощью скоб с образованием меньшего по размеру пред-желудочного отдела, который служит в качестве нового желудка; бандажирование желудка, например, с помощью регулируемой системы для бандажирования желудка (такой как Swedish Adjustable Gasmpuc Band (SAGB), LAP-BAND™ или MIDband™), при котором меньший по размеру пред-желудочный отдел, который будет служить в качестве нового желудка, создают с помощью эластомерного (например, силиконового) бандажа, размер которого может регулироваться пациентом; и хирургическое шунтирование желудка, например, шунтирование желудка с гастроеюноанастомозом по Py («Roux-en-Y»), при котором с помощью степлерного устройства создают маленький по размеру отдел желудка и соединяют его с дистальным отделом тонкой кишки, при этом верхняя часть тонкой кишки повторно присоединяется в конфигурации, напоминающей по форме букву Y.
Введение пептида глюкагона по изобретению (возможно, в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями или субстанциями, как описано выше) может происходить в течение периода, предшествующего проведению рассматриваемого бариатрического хирургического вмешательства, и/или в течение определенного периода времени после него. Во многих случаях может быть предпочтительно начать введение соединения по изобретению после того, как было проведено бариатрическое хирургическое вмешательство.
Термин «ожирение» подразумевает наличие избытка жировой ткани. Когда потребление энергии превышает расход энергии, избыток калорий запасается в жировой ткани, и если состояние такого положительного результирующего остатка сохраняется в течение длительного периода, это приводит к ожирению, т.е., имеется два компонента, влияющих на равновесное состояние массы тела, и отклонение на стороне любого из них (потребления или расхода) может привести к ожирению. В этом контексте ожирение лучше всего рассматривать как любую степень избытка жировой ткани, которая создает риск для здоровья. Различие между индивидуумами с нормальным весом и ожирением можно оценить лишь приблизительно, тогда как риск для здоровья, создаваемый ожирением, по-видимому, непрерывно возрастает, с увеличением количества жировой ткани. Однако в контексте настоящего изобретения индивидуумы с индексом массы тела (ВМ1, который равен массе тела в килограммах, деленной на квадрат роста, выраженного в метрах) более 25 будут рассматриваться как страдающие ожирением.
Дополнительные воплощения настоящего изобретения относятся к следующему:
275. Соединение формулы I:
где
2
Х представляет собой Ser, Aib или D-Ser;
6
Х представляет собой Phe или Gln;
7
Х представляет собой Thr, Lys или Orn;
10
Х представляет собой Туг, Lys, Orn или (р)Tyr;
12
X представляет собой Lys, Orn или Arg;
16
X представляет собой Ser, Glu, Thr, Lys или Orn;
17
X представляет собой Arg, Gln, Lys или Orn;
18
X представляет собой Arg, Gln, Ala, Lys или Orn;
20
Х представляет собой Arg, Gln, Lys или Orn;
21
X представляет собой Asp, Glu или Lys;
24
Х представляет собой Gln, Lys, Arg, His, Glu, Asp, Gly, Pro, Ser или Orn;
25
X представляет собой Trp, Arg, Lys, His, Glu, Asp, Gly, Pro, Phe, Ser, Tyr, (p)Tyr или Orn;
27
X представляет собой Met, Met(O), Val, Pro, Leu, Arg, Lys или Orn;
28
X представляет собой Asn, Lys, Arg, Ser, Thr, Glu, Asp, Ala, Gln, Pro или Orn;
29
X представляет собой Thr, Glu, Asp, Lys, Arg, Pro или Orn и
30
Х отсутствует или представляет собой Lys, Gly, Pro или Orn, и
7
10
12
16
17
18
20
21
24
25
27
28
29
30
альбумин-связывающий радикал, содержащий две или несколько отрицательно заряженных групп, где одна из указанных отрицательно заряженных групп является концевой для указанного альбумин-связывающего радикала, и где альбумин-связывающий радикал присоединен в положении эпсилон в составе Lys или в положении дельта в составе Orn, в одном или нескольких положениях аминокислот в составе соединения формулы I: Х, Х, X, X, X, X, X, X, Х, X, X, X, X и/или Х.
или его фармацевтически приемлемая соль, амид, кислота или пролекарство.
276. Соединение по воплощению 181, выбранное из группы, состоящей из пептидов глюкагона, указанных в примерах.
277. Соединение по любому из воплощений 275-276, при этом указанный альбумин-связывающий радикал имеет формулу II:
,
где
1
Z представляет собой структуру согласно одной из формул IIa, IIb или IIc:
где n в формуле IIa равно 6-20,
m в формуле IIc равно 5-9;
группа СООН в формуле Не может быть присоединена в положении 2, 3 или 4 в составе фенильного кольца,
2
3
4
символ * в формулах IIa, IIb и IIc указывает место присоединения к атому азота в Z, Z или Z,
2
Z отсутствует или представляет собой структуру согласно одной из формул IId, IIc, IIf, IIg, IIh, Iii, IIj или IIk:
где каждый аминокислотный фрагмент независимо обладает стереохимией L или D;
2
3
4
при этом Z присоединен через атом углерода, обозначенный *, к атому азота в Z, Z или к эпсилон-атому азота в составе лизина или к дельта-атому азота в составе орнитина в пептиде глюкагона;
3
Z отсутствует или представляет собой структуру согласно одной из формул IIm, IIn, IIo или IIp:
3
3
4
Z соединен через атом углерода в Z, обозначенный символом*, с атомом азота в Z, обозначенным символом*, или с эпсилон-атомом азота в составе лизина или с дельта-атомом азота в составе орнитина в пептиде глюкагона;
4
4
Z отсутствует или представляет собой структуру согласно одной из формул IId, IIc, IIf, IIg, IIh, Iii, IIj или IIk, где каждый аминокислотный фрагмент независимо имеет стехиометрию либо L, либо D, при этом Z соединен через атом углерода, обозначенный символом*, с эпсилон-атомом азота в составе лизина или с дельта-атомом азота в составе орнитина в пептиде глюкагона.
278. Альбумин-связывающий радикал по воплощению 277, который выбран из структур согласно одной из формул IIIa, IIIb, IIIc, IIId, IIIe, IIIf или IIIg:
или
279. Альбумин-связывающий радикал по воплощению 276-278, выбранный из структур, соответствующих одной из формул: IVa, IVb, IVc или IVd:
или
280. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по любому из воплощений 275-277.
281. Фармацевтическая композиция по любому из воплощений 275-277, дополнительно содержащая одно или несколько дополнительных терапевтически активных соединений или субстанций.
282. Фармацевтическая композиция по любому из воплощений, дополнительно содержащая соединение GLP-1.
283. Фармацевтическая композиция по любому из воплощений, дополнительно содержащая соединение инсулина.
284. Фармацевтическая композиция по любому из воплощений, которая пригодна для парентерального введения.
285. Соединение по любому из воплощений для применения в терапии.
286. Применение соединения по любому из воплощений для получения лекарства.
287. Применение соединения по любому из воплощений для получения лекарства для лечения или профилактики гипергликемии, диабета 2 типа, нарушения толерантности к глюкозе, диабета 1 типа и ожирения.
288. Применение соединения по любому из воплощений для получения лекарства для замедления или профилактики прогрессирования заболевания при диабете 2 типа, лечения ожирения или профилактики избыточной массы тела, снижения потребления пищи, повышения расхода энергии, снижения массы тела, замедления прогрессирования от состояния нарушения толерантности к глюкозе (преддиабета) к диабету 2 типа; замедления прогрессирования от диабета 2 типа до диабета с потребностью в инсулине; регуляции аппетита; индуцирования насыщения; профилактики повторного повышения массы тела после успешного снижения массы тела; лечения заболевания или состояния, связанного с избыточной массой тела или ожирением; лечения булимии; лечения компульсивного переедания; лечения атеросклероза, гипертонии, диабета 2 типа, нарушения толерантности к глюкозе, дислипидемии, коронарной болезни сердца, жировой дегенерации печени, лечения отравления бета-блокаторами, для применения с целью подавления подвижности желудочно-кишечного тракта, что может быть полезно в связи с исследованиями желудочно-кишечного тракта с применением таких методик, как рентгеноскопическое исследование, компьютерная томография или ЯМР-сканирование.
289. Применение соединения по любому из воплощений для получения лекарства для лечения или профилактики гипогликемии, гипогликемии, вызванной инсулином, реактивной гипогликемии,, диабетической гипогликемии, недиабетической гипогликемии, гипогликемии голодания, гипогликемии, вызванной приемом лекарств, гипогликемии, вызванной шунтированием желудка, гипогликемии при беременности, алкогольной гипогликемии, инсулиномы и болезни Гирке.
Сокращенные обозначения аминокислот, используемые в данном контексте, имеют следующие значения:
Ado
<img file="00000103.tif" he="15" wi="68" img-content="undefined" img-format="tif" />
Aib
2-Аминоизомасляная кислота
Ala
Аланин
Asn
Аспарагин
Asp
Аспарагиновая кислота
Arg
Аргинин
Cit
Цитруллин
Cys
Цистеин
Gln
Глутамин
Glu
Глутаминовая кислота
γ-Glu
<img file="00000104.tif" he="29" wi="53" img-content="undefined" img-format="tif" />
α-атом азота и γ-карбоксильная группа образуют амидные связи между двумя соседними остатками
Gly
Глицин
His
Гистидин
Hyp
4-гидроксипролин
lie
Изолейцин
Leu
Лейцин
Lys
Лизин
Met
Метионин
Met(O)
<img file="00000105.tif" he="34" wi="35" img-content="undefined" img-format="tif" />
Orn
Орнитин
Phe
Фенилаланин
Pro
Пролин
Ser
Серин
Thr
Треонин
Tyr
Тирозин
P(Tyr)
<img file="00000106.tif" he="39" wi="57" img-content="undefined" img-format="tif" />
Trp
Триптофан
Val
Валин
Сокращенные обозначения аминокислот, начинающиеся с D- с последующим трехбуквенным сокращением, такие как D-Ser, D-His и т.д., обозначают D-энантиомер соответствующей аминокислоты, например, D-серин, D-гистидин и т.д.
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ
th
Фармацевтические композиции, содержащие соединение по настоящему изобретению, могут быть получены с применением стандартных способов, например, как описано в публикациях Remington: Pharmaceutical Sciences, 1985 или Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19 edition, 1995.
Как уже упоминалось, одной из особенностей настоящего изобретения является то, что оно направлено на создание фармацевтической лекарственной формы, содержащей соединение по настоящему изобретению, которое присутствует в концентрации от примерно 0,01 мг/мл до примерно 25 мг/мл, например, от примерно 0,1 мг/мл до примерно 5 мг/мл и от примерно 2 мг/мл до примерно 5 мг/мл, и при этом указанная лекарственная форма имеет значение рН от 2,0 до 10,0. Фармацевтическая лекарственная форма может содержать соединение по настоящему изобретению, которое присутствует в концентрации от примерно 0,1 мг/мл до примерно 50 мг/мл, и при этом указанная лекарственная форма имеет значение рН от 2,0 до 10,0. Лекарственная форма может дополнительно содержать буферную систему, консервант(ы), изотонический агент (или агенты), хелатирующий агент (или агенты), стабилизаторы и поверхностно-активные вещества. В одном из вариантов воплощения изобретения фармацевтическая лекарственная форма является водной лекарственной формой, т.е., лекарственной формой, содержащей воду. Такая лекарственная форма в типичном случае представляет собой раствор или суспензию. В дополнительном варианте воплощения изобретения фармацевтическая лекарственная форма является водным раствором. Термин «водная лекарственная форма» определяется как лекарственная форма, содержащая по меньшей мере 50% (об./об.) воды. Схожим образом, термин «водный раствор» определяется как раствор, содержащий по меньшей мере 50% (об./об.) воды, и термин «водная суспензия» определяется как суспензия, содержащая по меньшей мере 50% (об./об.) воды.
В другом варианте воплощения фармацевтическая лекарственная форма является лиофилизированной лекарственной формой, к которой врач или пациент добавляет растворители и/или разбавители перед применением.
В другом варианте воплощения фармацевтическая лекарственная форма является высушенной лекарственной формой (например, лиофилизированной или высушенной распылением), готовой для применения без предварительного растворения.
Дополнительной особенностью изобретения является то, что оно относится к фармацевтической лекарственной форме, содержащей водный раствор соединения по настоящему изобретению и буферный раствор, при этом указанное соединение присутствует в концентрации от 0,1 мг/мл или выше, и при этом указанная лекарственная форма имеет значение рН от примерно 2,0 до примерно 10,0.
Дополнительной особенностью изобретения является то, что оно относится к фармацевтической лекарственной форме, содержащей водный раствор соединения по настоящему изобретению и буферный раствор, при этом указанное соединение присутствует в концентрации от 0,1 мг/мл или выше, и при этом указанная лекарственная форма имеет значение рН от примерно 7,0 до примерно 8,5.
В еще одном варианте воплощения изобретения значение рН лекарственной формы выбрано из списка, состоящего из 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 и 10,0. Предпочтительно, значение рН лекарственной формы равно значению, отличающемуся по меньшей мере на 1 единицу рН от изоэлектрической точки соединения по настоящему изобретению, еще более предпочтительно, значение рН лекарственной формы равно значению, отличающемуся по меньшей мере на 2 единицы рН от изоэлектрической точки соединения по настоящему изобретению.
В дополнительном варианте воплощения изобретения буфер выбран из группы, состоящей из ацетата натрия, карбоната натрия, цитрата, глицилглицина, гистидина, глицина, лизина, аргинина, дигидрофосфата натрия, гидрофосфата двунатрия, фосфата натрия и трис-(гидроксиметил)-аминометана, HEPES, бицина, трицина, яблочной кислоты, сукцината, малеиновой кислоты, фумаровой кислоты, винной кислоты, аспарагиновой кислоты или их смесей. Каждый из этих указанных буферов составляет альтернативный вариант воплощения изобретения.
th
В дополнительном варианте воплощения лекарственная форма также содержит фармацевтически приемлемый консервант. В дополнительном варианте воплощения изобретения консервант выбран из группы, состоящей из фенола, о-крезола, m-крезола, р-крезола, метил-р-гидроксибензоата, пропил-р-гидроксибензоата, 2-феноксиэтанола, бутил-р-гидроксибензоата, 2-фенилэтанола, бензилового спирта, этанола хлоробутанола и тиомерсала, бронопола, бензойной кислоты, имидомочевины, хлоргексидина, дегидроацетата натрия, хлорокрезола, этил-р-гидроксибензоата, хлорида бензетония, хлорфенезина (3-(р-хлорфенокси)пропан-1,2-диола) или их смесей. В дополнительном варианте воплощения изобретения консервант присутствует в концентрации от 0,1 мг/мл до 30 мг/мл. В дополнительном варианте воплощения изобретения консервант присутствует в концентрации от 0,1 мг/мл до 20 мг/мл. В дополнительном варианте воплощения изобретения консервант присутствует в концентрации от 0,1 мг/мл до 5 мг/мл. В дополнительном варианте воплощения изобретения консервант присутствует в концентрации от 5 мг/мл до 10 мг/мл. В дополнительном варианте воплощения изобретения консервант присутствует в концентрации от 10 мг/мл до 20 мг/мл. Каждый из этих указанных консервантов составляет альтернативный вариант воплощения изобретения. Применение консерванта в фармацевтических композициях хорошо известно специалистам в данной области. Для удобства приведена ссылка на: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19 edition, 1995.
th
В дополнительном варианте воплощения лекарственная форма также содержит изотонический агент. В дополнительном варианте воплощения изобретения изотонический агент выбран из группы, состоящей из соли (например, хлорида натрия), сахара или сахарного спирта, аминокислоты (например L-глицина, L-гистидина, аргинина, лизина, изолейцина, аспарагиновой кислоты, триптофана, треонина), альдита (например глицерола (глицерина), 1,2-пропандиола (пропиленгликоля), 1,3-пропандиола, 1,3-бутандиола) полиэтиленгликоля (например ПЭГ400) или их смесей. Можно применять любой сахар, такой как моно-, ди-, или полисахариды или водорастворимые глюканы, включая, например, фруктозу, глюкозу, маннозу, сорбозу, ксилозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, трегалозу, декстран, пуллулан, декстрин, циклодекстрин, растворимый крахмал, гидроксиэтилкрахмал и карбоксиметилцеллюлозу-Na. В одном из вариантов воплощения добавка в виде сахара представлена сахарозой. Сахарные спирты определяют как углеводороды С4-С8, содержащие по меньшей мере одну группу -ОН, и они включают, например, маннитол, сорбитол, инозитол, галактитол, дульцитол, ксилитол и арабитол. В одном из вариантов воплощения добавка в виде сахарного спирта представлена маннитолом. Сахара или сахарные спирты, упомянутые выше, можно применять по отдельности или в сочетании. Отсутствует установленное ограничение на применяемое количество, при условии, что сахар или сахарный спирт растворим в жидком препарате и не оказывает нежелательного воздействия на стабилизирующие эффекты, достигнутые благодаря применению способов по изобретению. В одном из вариантов воплощения концентрация сахара или сахарного спирта составляет от примерно 1 мг/мл до примерно 150 мг/мл. В дополнительном варианте воплощения изобретения изотонический агент присутствует в концентрации от 1 мг/мл до 50 мг/мл. В дополнительном варианте воплощения изобретения изотонический агент присутствует в концентрации от 1 мг/мл до 7 мг/мл. В дополнительном варианте воплощения изобретения изотонический агент присутствует в концентрации от 8 мг/мл до 24 мг/мл. В дополнительном варианте воплощения изобретения изотонический агент присутствует в концентрации от 25 мг/мл до 50 мг/мл. Каждый из этих указанных изотонических агентов составляет альтернативный вариант воплощения изобретения. Применение изотонического агента в фармацевтических композициях хорошо известно специалистам в данной области. Для удобства приведена ссылка на: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19 edition, 1995.
th
В дополнительном варианте воплощения лекарственная форма дополнительно содержит хелатирующий агент. В дополнительном варианте воплощения изобретения хелатирующий агент выбран из солей этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), лимонной кислоты и аспарагиновой кислоты и их смесей. В дополнительном варианте воплощения изобретения хелатирующий агент присутствует в концентрации от 0,1 мг/мл до 5 мг/мл. В дополнительном варианте воплощения изобретения хелатирующий агент присутствует в концентрации от 0,1 мг/мл до 2 мг/мл. В дополнительном варианте воплощения изобретения хелатирующий агент присутствует в концентрации от 2 мг/мл до 5 мг/мл. Каждый из этих указанных хелатирующих агентов составляет альтернативный вариант воплощения изобретения. Применение хелатирующего агента в фармацевтических композициях хорошо известно специалистам в данной области. Для удобства приведена ссылка на: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19 edition, 1995.
th
В дополнительном варианте воплощения лекарственная форма дополнительно содержит стабилизирующий агент. Применение стабилизирующего агента в фармацевтических композициях хорошо известно специалистам в данной области. Для удобства приведена ссылка на: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19 edition, 1995.
В частности, композиции по изобретению являются стабилизированными жидкими фармацевтическими композициями, терапевтически активные компоненты которых включают полипептид, который, возможно, демонстрирует образование агрегатов во время хранения в составе жидких фармацевтических лекарственных форм. Под «образованием агрегатов» подразумевается физическое взаимодействие между полипептидными молекулами, которое приводит к образованию олигомеров, которые могут оставаться растворимыми, или крупных видимых невооруженным глазом агрегатов, которые выпадают в осадок из раствора. Под термином «во время хранения» подразумевается, что жидкая фармацевтическая композиция или лекарственная форма не вводится субъекту сразу же после получения. Вместо этого после получения ее упаковывают для хранения, либо в жидкой форме, либо в замороженном состоянии, или в высушенной форме для дальнейшего восстановления в жидкую форму или в другую форму, пригодную для введения субъекту. Под «высушенной формой» подразумевается, что жидкая фармацевтическая композиция или лекарственная форма высушена посредством сублимационной сушки (т.е., лиофилизации; см., например, Williams and Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38: 48-59), сушки распылением (см. Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5th ed; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp.491-676; Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18: 1169-1206; и Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11: 12-20) или сушки воздухом (Carpenter and Crowe (1988) Cryobiology 25: 459-470; and Roser (1991) Biopharm. 4: 47-53). Образование агрегатов полипептида во время хранения жидкой фармацевтической композиции может оказывать нежелательное влияние на биологическую активность этого полипептида, приводя к потере терапевтической эффективности фармацевтической композиции. Кроме того, образование агрегатов может вызывать другие проблемы, такие как закупорка трубок, мембран или насосов, в случае, если содержащую полипептид фармацевтическую композицию вводят с применением инфузионной системы.
Фармацевтические композиции по изобретению могут дополнительно содержать некоторое количество основной аминокислоты, достаточное для снижения образования агрегатов полипептида во время хранения композиции. Под «основной аминокислотой» подразумевается аминокислота или сочетание аминокислот, при этом любая данная аминокислота присутствует либо в форме свободного основания, либо в форме их соли. В случае применения сочетания аминокислот все эти аминокислоты могут присутствовать в форме свободных оснований, все могут присутствовать в форме своих солей или некоторые из них могут присутствовать в форме свободных оснований, тогда как другие - в форме своих солей. В одном из вариантов воплощения аминокислоты, применяемые при получении композиций по изобретению, - это аминокислоты, несущие заряд на боковой цепочке, такие как аргинин, лизин, аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота. В одном из вариантов воплощения аминокислота, используемая для получения композиций по изобретению, является глицином. Любой стереоизомер (т.е., L- или D-изомер) конкретной аминокислоты (например, метионина, гистидина, имидазола, аргинина, лизина, изолейцина, аспарагиновой кислоты, триптофана, треонина и их смесей) или сочетания этих стереоизомеров могут присутствовать в фармацевтических композициях по изобретению при условии, что конкретная аминокислота присутствует либо в форме свободного основания, либо в форме своей соли. В одном из вариантов воплощения применяют L-стереоизомер. Композиции по изобретению также могут быть приготовлены с применением аналогов этих аминокислот. Под «аналогом аминокислоты» подразумевается производное встречающейся в природе аминокислоты, которое вызывает требуемый эффект снижения образования агрегатов полипептида во время хранения жидких фармацевтических композиций по изобретению. Пригодные аналоги аргинина включают, например, аминогуанидин, орнитин и N-моноэтил-L-аргинин, пригодные аналоги метионина включают этионин и бутионин и пригодные аналоги цистеина включают 3-метил-L цистеин. Что касается других аминокислот, аналоги аминокислот включают в состав композиций либо в форме свободного основания, либо в форме их солей. В дополнительном варианте воплощения аминокислоты или аналоги аминокислот применяют в концентрации, достаточной для предотвращения или замедления агрегации белка.
В дополнительном варианте воплощения изобретения метионин (или другие серосодержащие аминокислоты или аналоги аминокислот) могут быть добавлены с целью ингибирования окисления остатков метионина до сульфоксида метионина в случае, когда полипептид, действующий в качестве терапевтического агента, является полипептидом, содержащим по меньшей мере один остаток метионина, подверженный такому окислению. Под «ингибированием» подразумевается минимальное накопление окисленных форм метионина с течением времени. Ингибирование окисления метионина приводит к общему усилению сохранения правильной молекулярной формы полипептида. Могут применяться любой стереоизомер метионина (L-, D-изомер или их смесь). Количество, которое будет добавлено, должно быть количеством, достаточным для ингибирования окисления остатков метионина, таким образом, чтобы количество сульфоксида метионина было приемлемым согласно указаниям органов государственного регулирования. В типичном случае это означает, что композиция содержит не более чем от примерно 10% до примерно 30% сульфоксида метионина. В общем случае этого можно достичь добавлением метионина в таком количестве, чтобы соотношение добавленного метионина к остаткам метионина находилось в диапазоне от примерно 1:1 до примерно 1000:1, например, от 10:1 до примерно 100:1.
В дополнительном варианте воплощения изобретения лекарственная форма дополнительно содержит стабилизирующий агент, выбранный из группы высокомолекулярных полимеров или низкомолекулярных соединений. В дополнительном варианте воплощения изобретения стабилизирующий агент выбран из полиэтиленгликоля (например, ПЭГ3350), поливинилового спирта (PVA), поливинилпирролидона, карбокси- или гидроксицеллюлозы или их производных (например, гидроксипропилцеллюлозы: НРС, HPC-SL, HPC-L и гидроксипропил метилцеллюлозы: НРМС), циклодекстринов, серосодержащих субстанций, таких как монотиоглицерин, тиогликолевая кислота и 2-метилтиоэтанол, и различных солей (например, хлорида натрия). Каждый из этих указанных стабилизирующих агентов составляет альтернативный вариант воплощения изобретения.
Фармацевтические композиции также могут содержать дополнительные стабилизирующие агенты, которые дополнительно усиливают стабильность содержащегося в них терапевтически активного полипептида. Стабилизирующие агенты, представляющие особый интерес для настоящего изобретения, включают в качестве неограничивающих примеров метионин и ЭДТА, которые защищают полипептид от окисления метионина, и неионное поверхностно-активное вещество, которое защищает полипептид от агрегации, связанной с процессами замораживания-оттаивания или механического сдвигового воздействия.

α
α
α
В дополнительном варианте воплощения изобретения лекарственная форма дополнительно содержит поверхностно-активное вещество. В дополнительном варианте воплощения изобретения поверхностно-активное вещество выбрано из детергента, этоксилированного касторового масла, полигликированных глицеридов, ацетилированных моноглицеридов, сложных эфиров сорбитана с жирными кислотами, блок-полимеров полиоксипропилена-полиоксиэтилена (например, полиоксамеров, таких как Плюроник F68, полоксамер 188 и 407, Тритон Х-100), сложных эфиров полиоксиэтиленсорбитана с жирными кислотами, звездообразного ПЭО, производных полиоксиэтилена и полиэтилена, таких как алкилированные и алкоксилированные производные (твины, например Твин-20, Твин-40, Твин-80 и Brij-35), полиоксиэтиленгидроксистеарата, моноглицеридов или их этоксилированных производных, диглицеридов или их полиоксиэтилен-производных, спиртов, глицерина, лектинов и фосфолипидов (например фосфатидилсерина, фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилинозитола, дифосфатидилглицерина и сфингомиелина), производных фосфолипидов (например дипальмитоилфосфатидной кислоты) и лизофосфолипидов (например пальмитоиллизофосфатидил-L-серина и сложных эфиров 1-ацил-sn-глицеро-3-фосфата и этаноламина, холима, серина или треонина) и алкил-, алкоксил- (сложных эфиров алкилов), алкокси- (простых эфиров алкилов)-производных лизофосфатидила и фосфатидилхолинов, например, лаурил- и миристоил-производных лизофосфатидилхолина, дипальмитоилфосфатидилхолина, и модификаций полярной группы головки, а именно - холинов, этаноламинов, фосфатидной кислоты, серинов, треонинов, глицеринов, инозитола и положительно заряженных DODAC, DOTMA, DCP, BISHOP, лизофосфатидилсерина и лизофосфатидилтреонина, и глицерофосфолипидов (например, цефалинов), глицерогликолипидов (например, галактопиранозида), сфингогликолипидов (например церамидов, ганглиозидов), додецилфосфохолина, лизолектина куриного яйца, производных фусидовой кислоты (например тауродигидрофусидата натрия и т.д.), длинноцепочечных жирных кислот и их солей С6-С12 (например олеиновой кислоты и каприловой кислоты), ацилкарнитинов и производных, N-ацилированных производных лизина, аргинина или гистидина, или ацилированных по боковой цепочке производных лизина или аргинина, N-ацилированных производных дипептидов, содержащих любое сочетание лизина, аргинина или гистидина и нейтральной или кислой аминокислоты, N-ацилированного производного трипептида, содержащего любое сочетание нейтральной аминокислоты и двух заряженных аминокислот, DSS (докузата натрия, регистрационный номер CAS [577-11-7]), докузата кальция, регистрационный номер CAS [128-49-4]), докузата калия, регистрационный номер CAS [7491-09-0]), ДСН (додецилсульфата натрия или лаурилсульфата натрия), каприлата натрия, холевой кислоты или ее производных, желчных кислот и их солей и конъюгатов глицина или таурина, урсодезоксихолевой кислоты, холата натрия, дезоксихолата натрия, таурохолата натрия, гликохолата натрия, N-гексадецил-N,N-диметил-3-аммонио-1-пропансульфоната, анионных (алкил-арил-сульфонаты) одновалентных сурфактантов, цвиттерионных сурфактантов (например, N-алкил-N,N-диметиламмонио-1-пропансульфонатов, 3-холамидо-1-пропилдиметиламмонио-1-пропансульфоната, катионных сурфактантов (оснований четвертичного аммония) (например, бромида цетилтриметиламмония, хлорида цетилпиридиния), неионных сурфактантов (например додецил β-D-глюкопиранозида), полоксаминов (например, Tetronic), которые являются тетрафункциональными блок-сополимерами, полученными путем последовательного добавления пропиленоксида и этиленоксида к этилендиамину, или же сурфактант может быть выбран из группы производных имидазолина, или их смесей. Каждое из этих указанных поверхностно-активных веществ составляет альтернативный вариант воплощения изобретения.
th
Применение поверхностно-активного вещества в фармацевтических композициях хорошо известно специалистам в данной области. Для удобства приведена ссылка на: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19 edition, 1995.
В фармацевтической лекарственной форме по настоящему изобретению также могут присутствовать дополнительные ингредиенты. Такие дополнительные ингредиенты могут включать смачивающие агенты, эмульгирующие агенты, антиоксиданты, объемообразующие агенты, модификаторы тоничности, хелатирующие агенты, ионы металлов, маслянистые носители, белки (например, сывороточный альбумин человека, желатин или белки) и цвиттер-ион (например, аминокислоту, такую как бетаин, таурин, аргинин, глицин, лизин и гистидин). Такие дополнительные ингредиенты, несомненно, не должны оказывать нежелательного воздействия на общую стабильность фармацевтической лекарственной формы по настоящему изобретению.
Фармацевтические композиции, содержащие соединение по настоящему изобретению, можно вводить пациенту, которому необходимо такое лечение, в нескольких областях тела, например, местно, например, в области кожи или слизистой оболочки, в областях, которые позволяют исключить этап всасывания, например, путем введения в артерию, в вену, в сердце, и в областях, которые включают этап всасывания, например, при введении в кожу, под кожу, в мышцу или в брюшную полость.
Введение фармацевтических композиций по изобретению может производиться несколькими путями, например, лингвально, сублингвально, буккально, в ротовую полость, перорально, в желудок и в кишечник, интраназально, внутрилегочно, например, через бронхиолы и альвеолы, или с помощью сочетания этих путей, эпидермально, дермально, трансдермально, вагинально, ректально, в глаз, например, через слизистую оболочку глаза, через уретру и парентерально пациентам, которым необходимо такое лечение.
Композиции по настоящему изобретению могут быть введены в виде нескольких лекарственных форм, например, в виде растворов, суспензий, эмульсий, микроэмульсий, гетерогенной эмульсии, пен, целебных мазей, паст, пластырей, мазей, таблеток, таблеток с оболочкой, полосканий, капсул, например твердых желатиновых капсул и мягких желатиновых капсул, суппозиториев, ректальных капсул, капель, гелей, распыляемых растворов, порошка, аэрозолей, лекарственных форм для ингаляции, глазных капель, офтальмологических мазей, офтальмологических полосканий, вагинальных суппозиториев, вагинальных колец, вагинальных мазей, инъекционного раствора, растворов, трансформирующихся in situ, например, превращающихся in situ в гель, затвердевающих in situ, осаждающихся in situ, кристаллизующихся in situ, раствора для инфузии и имплантатов.
Композиции по изобретению могут быть дополнительно смешаны или присоединены, например, посредством ковалентных, гидрофобных и электростатических взаимодействий, с носителем лекарственного средства, системой доставки лекарственного средства и усовершенствованной системой доставки лекарственного средства с целью дополнительного повышения стабильности соединения, повышения биодоступности, повышения растворимости, снижения риска нежелательных эффектов, выполнения режима хронотерапии, хорошо известного специалистам в данной области, и повышения степени приверженности пациента терапии или любого сочетания этих свойств. Примеры носителей, систем доставки лекарственного средства и усовершенствованных систем доставки лекарственного средства включают в качестве неограничивающих примеров полимеры, например целлюлозу и ее производные, полисахариды, например декстран и его производные, крахмал и его производные, поливиниловый спирт, акрилатные и метакрилатные полимеры, полимолочную и полигликолевую кислоту и их блок-сополимеры, полиэтиленгликоли, транспортные белки, например альбумин, гели, например системы, превращающиеся в гель при нагревании, такие как блок-сополимерные системы, хорошо известные специалистам в данной области, мицеллы, липосомы, микросферы, наночастицы, жидкие кристаллы и их дисперсии, L2-фазу и ее дисперсии, хорошо известные специалистам в области фазового поведения систем липид-вода, полимерные мицеллы, гетерогенные эмульсии, самоэмульгирующиеся системы, самомикроэмульгирующиеся системы, циклодекстраны и их производные и дендримеры.
Композиции по настоящему изобретению полезны в составе твердых, полутвердых лекарственных форм, порошков и растворов для легочного введения соединения с применением, например, ингалятора для дозирования аэрозоля, ингалятора для сухого порошка и небулайзера, все из которых являются устройствами, хорошо известными специалистам в данной области.
Композиции по настоящему изобретению особенно полезны в лекарственных формах в виде систем доставки лекарственного средства с контролируемым, непрерывным, длительным, с задержкой и замедленным высвобождением. В частности, в качестве неограничивающих примеров, композиции полезны в лекарственных формах в виде систем для парентерального контролируемого высвобождения и непрерывного высвобождения (при этом обе системы позволяют во много раз снизить количество введений), хорошо известных специалистам в данной области. Еще более предпочтительными являются системы контролируемого высвобождения и непрерывного высвобождения, вводимые подкожно. Не ограничивая объем изобретения, примеры полезных систем и композиций контролируемого высвобождения включают гидрогели, маслянистые гели, жидкие кристаллы, полимерные мицеллы, микросферы, наночастицы.
Способы получения систем контролируемого высвобождения, полезных для композиций по настоящему изобретению, включают в качестве неограничивающих примеров кристаллизацию, конденсацию, ко-кристаллизацию, преципитацию, ко-преципитацию, эмульгирование, диспергирование, гомогенизацию высоким давлением, инкапсуляцию, сушку распылением, микроинкапсуляцию, коацервацию, разделение фаз, испарение растворителя с получением микросфер, экструзию и процессы в сверхкритической жидкости. Приведена общая ссылка на руководства Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D.L, ed. Marcel Dekker, New York, 2000) и Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Formulation and Delivery (MacNally, E.J., ed. Marcel Dekker, New York, 2000).
Парентеральное введение может проводиться путем подкожной, внутримышечной, интраперитонеальной или внутривенной инъекции с помощью шприца, возможно, шприца-ручки. В соответствии с другим вариантом парентеральное введение может быть осуществлено с применением инфузионного насоса. Дополнительной особенностью является композиция, которая может представлять собой раствор или суспензию для введения соединения по настоящему изобретению в форме назального или легочного аэрозоля. Еще одной дополнительной особенностью является то, что фармацевтические композиции, содержащие соединение по изобретению, также могут быть адаптированы к трансдермальному введению, например, посредством безыгольной инъекции или с помощью пластыря, возможно, пластыря для ионтофореза, или к введению через слизистую, например, через буккальную поверхность.
Термин «стабилизированная лекарственная форма» относится к лекарственной форме с повышенной физической стабильностью, повышенной химической стабильностью или повышенной физической и химической стабильностью.
Термин «физическая стабильность» белковой лекарственной формы при использовании в этом документе относится к склонности белка образовывать биологически неактивные и/или нерастворимые агрегаты белков в результате воздействия на белок экстремальных температурных и механических факторов и/или взаимодействия с границами раздела фаз и поверхностями, которые оказывают дестабилизирующее влияние, например, с гидрофобными поверхностями и границами раздела фаз. Физическую стабильность водных белковых лекарственных форм оценивают с помощью визуального осмотра и/или измерения мутности после воздействия на лекарственную форму, помещенную в пригодные контейнеры (например, картриджи или флаконы), экстремальных механических или физических факторов (например, взбалтывания) при различных значениях температуры в течение различных периодов времени. Визуальный осмотр лекарственных форм проводят в остро сфокусированном свете с темным фоном. Мутность лекарственной формы охарактеризовывают с помощью визуальной оценки степени мутности, например, по шкале от 0 до 3 (при этом лекарственная форма, в которой мутность отсутствует, соответствует визуальной оценке 0, а лекарственная форма, в которой мутность видна при дневном свете, соответствует визуальной оценке 3). Лекарственную форму относят к физически нестабильной с точки зрения агрегации белков, если она демонстрирует мутность при визуальной оценке при дневном свете. В соответствии с другим вариантом, мутность лекарственной формы можно оценить с помощью простых измерений мутности, хорошо известных специалистам в данной области. Физическую стабильность водных белковых лекарственных форм также можно оценить с применением спектроскопического агента или зонда, свидетельствующего о конформационном состоянии белка. Зонд предпочтительно является малой молекулой, которая, предпочтительно, связывается с белком, находящимся в ненативной конформации. Одним из примеров низкомолекулярного спектроскопического зонда для исследования структуры белка является тиофлавин Т. Тиофлавин Т - это флуоресцентный краситель, который широко применяется для детекции амилоидных фибрилл. В присутствии фибрилл и, вероятно, также других белковых агрегатов, тиофлавин Т, связанный с фибрильной формой белка, приобретает новый максимум поглощения при 450 нм и демонстрирует повышенное испускание примерно при 482 нм. Несвязанный тиофлавин Т при этих длинах волн в существенной степени лишен флуоресцентных свойств.
В качестве зондов для выявления изменений структуры белка с нативной на ненативную могут применяться и другие малые молекулы. Например, зонды типа «гидрофобной заплатки», которые связываются предпочтительно с экспонированными гидрофобными областями белка. В общем случае гидрофобные области скрыты внутри третичной структуры белка, находящегося в нативном состоянии, но становятся экспонированными, когда белок начинает разворачиваться или денатурировать. Примерами таких низкомолекулярных спектроскопических зондов являются ароматические гидрофобные красители, такие как антрацен, акридин, фенантролин или им подобные. Другим типом спектроскопических зондов являются комплексы металлов с аминокислотами, такие как комплексы кобальта с гидрофобными аминокислотами, например, с фенилаланином, лейцином, изолейцином, метионином и валином или им подобными.
Термин «химическая стабильность» белковой лекарственной формы при использовании в этом документе относится к химическим ковалентным изменениям в структуре белка, ведущим к образованию продуктов химической деградации с потенциально более низкой биологической активностью и/или потенциально повышенной иммуногенностью, по сравнению с белком, имеющим нативную структуру. Различные продукты химической деградации могут образовываться в зависимости от типа и природы нативного белка и условий окружающей среды, которые воздействуют на белок. Скорее всего, невозможно полностью избежать потерь, вызванных химической деградацией, и, как хорошо известно специалистам в данной области, часто при хранении и применении белковой лекарственной формы наблюдаются возрастающие количества продуктов химической деградации. Большинство белков склонны к дезаминированию, процессу, при котором аминогруппа боковой цепочки глутаминилового или аспарагинилового остатков гидролизуется с образованием свободной карбоновой кислоты. Другие пути деградации включают образование высокомолекулярных продуктов трансформации, при котором две или несколько молекул белка ковалентно связываются друг с другом в результате реакции трансамидации и/или дисульфидных взаимодействий, что ведет к образованию ковалентно связанных димерных, олигомерных и полимерных продуктов деградации (Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahem. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992). Окисление (например, остатков метионина) можно упомянуть как еще один вариант химической деградации. Химическую стабильность белковой лекарственной формы можно оценить, измерив количество продуктов химической деградации в различных временных точках после воздействия различных условий окружающей среды (образование продуктов деградации часто может быть ускорено, например, при повышении температуры). Количество каждого отдельного продукта деградации часто определяют разделением продуктов деградации в зависимости от размеров и/или заряда их молекул с помощью различных хроматографических методик (например, эксклюзионной ВЭЖХ и/или обратнофазовой ВЭЖХ).
Следовательно, как кратко описано выше, термин «стабилизированная лекарственная форма» относится к лекарственной форме с повышенной физической стабильностью, повышенной химической стабильностью или повышенной физической и химической стабильностью. В общем случае лекарственная форма должна быть стабильна в течение периода применения и хранения (при соблюдении рекомендованных условий применения и хранения) до достижения даты, до которой действует срок годности.
В одном из вариантов воплощения изобретения фармацевтическая лекарственная форма, содержащая соединение по настоящему изобретению, стабильна в течение более чем 6 недель применения и более чем 3 лет хранения.
В другом варианте воплощения изобретения фармацевтическая лекарственная форма, содержащая соединение по настоящему изобретению, стабильна в течение более чем 4 недель применения и более чем 3 лет хранения.
В дополнительном варианте воплощения изобретения фармацевтическая лекарственная форма, содержащая соединение по настоящему изобретению, стабильна в течение более чем 4 недель применения и более чем двух лет хранения.
В дополнительном варианте воплощения изобретения фармацевтическая лекарственная форма, содержащая соединение, стабильна в течение более чем 2 недель применения и более чем двух лет хранения.
Фармацевтические композиции, содержащие пептид глюкагона по настоящему изобретению, можно парентерально вводить пациентам, которым необходимо такое лечение. Парентеральное введение может проводиться путем подкожной, внутримышечной или внутривенной инъекции с помощью шприца, возможно, шприца-ручки. В соответствии с другим вариантом парентеральное введение может быть осуществлено с применением инфузионного насоса. Дополнительной особенностью является композиция, которая может представлять собой порошок или жидкость для введения пептида глюкагона в форме назального или легочного аэрозоля. Еще одной дополнительной особенностью является то, что пептиды глюкагона по изобретению также можно вводить трансдермально, например, из пластыря, возможно, из пластыря для ионтофореза, или через слизистую, например, трансбуккально.
Таким образом, инъекционные композиции пептида глюкагона по настоящему изобретению можно получить с применением стандартных способов фармацевтической промышленности, которые включают растворение и смешивание ингредиентов в установленном порядке с получением требуемого конечного продукта.
В соответствии с одним из воплощения настоящего изобретения предложен пептид глюкагона в форме композиции, пригодной для введения посредством инъекции. Такая композиция может быть либо инъекционным раствором, готовым для применения, либо определенным количеством композиции в виде твердого вещества, например, лиофилизированным продуктом, который необходимо растворить в растворителе перед инъекцией. Инъекционный раствор предпочтительно содержит не менее чем примерно 2 мг/мл, предпочтительно - не менее чем примерно 5 мг/мл, более предпочтительно - не менее чем примерно 10 мг/мл пептида глюкагона и, предпочтительно, не более чем примерно 100 мг/мл пептида глюкагона.
Пептиды глюкагона изобретению могут применяться для лечения различных заболеваний. Конкретный пептид глюкагона, который будет применяться, и оптимальный уровень дозы для каждого пациента будут зависеть от заболевания, которое необходимо лечить, и от различных факторов, включая эффективность применяемого специфического производного пептида, возраст, массу тела, физическую активность и диету пациента, от возможного сочетания с другими лекарствами и от степени тяжести состояния. Рекомендуется, чтобы определение дозировки пептида глюкагона по настоящему изобретению проводил для каждого конкретного пациента специалист в данной области.
В частности, исследования показали, что пептид глюкагона полезен для получения лекарства с удлиненным профилем действия для лечения инсулиннезависимого сахарного диабета и/или для лечения ожирения.
Еще одной особенностью настоящего изобретения является то, что оно относится к применению соединения по изобретению для получения лекарства.
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение относится к применению соединения по изобретению для получения лекарства для лечения гипергликемии, диабета 2 типа, нарушения толерантности к глюкозе, диабета 1 типа, ожирения, гипертонии, синдрома X, дислипидемии, апоптоза β-клеток, дефицита β-клеток, инфаркта миокарда, синдрома воспаленного кишечника, диспепсии, когнитивных расстройств (например, для усиления когнитивной функции), нейропротекции, атеросклероза, коронарной болезни сердца и других нарушений сердечно-сосудистой системы.
В другом варианте воплощения настоящее изобретение относится к применению соединения по изобретению для получения лекарства для лечения синдрома укороченной тонкой кишки, синдрома воспаленного кишечника или болезни Крона.
В еще одном варианте воплощения настоящее изобретение относится к применению соединения по изобретению для получения лекарства для лечения гипергликемии, диабета 1 типа, диабета 2 типа или дефицита β-клеток.
Лечение соединением по настоящему изобретению также можно сочетать со второй или с несколькими фармакологически активными субстанциями, например, выбранными из противодиабетических агентов, агентов против ожирения, агентов для регуляции аппетита, агентов, снижающих артериальное давление, агентов для лечения и/или профилактики осложнений, вызванных диабетом или ассоциированных с ним, и агентов для лечения и/или профилактики осложнений и нарушений, вызванных ожирением или ассоциированных с ним. В данном контексте выражение «противодиабетический агент» включает соединения для лечения и/или профилактики инсулинорезистентности и заболеваний, при которых инсулинорезистентность является патофизиологическим механизмом.
Примерами таких фармакологически активных субстанций являются: инсулин, агонисты GLP-1, производные сульфонилмочевины (например толбутамид, глибенкламид, глипизид и гликазид), бигуаниды, например метформин, меглитиниды, ингибиторы глюкозидазы (например, акорбоза), антагонисты глюкагона, ингибиторы DPP-IV (дипептидилпептидазы-IV), ингибиторы ферментов печени, вовлеченных в стимуляцию глюконеогенеза и/или гликогенолиза; модуляторы поглощения глюкозы, тиазолидиндионы, такие как троглитазон и циглитазон, соединения, модифицирующие метаболизм липидов, такие как антигиперлипидемические агенты, как ингибиторы ГМГ-КоА (статины), соединения, снижающие потребление пищи, агонисты RXR и агенты, действующие на АТФ-зависимые калиевые каналы β-клеток, например глибенкламид, глипизид, гликазид и репаглинид; холестирамин, колестипол, клофибрат, гемфиброзил, ловастатин, правастатин, симвастатин, пробукол, декстротироксин, нетеглинид, репаглинид; β-блокаторы, такие как альпренолол, атенолол, тимолол, пиндолол, пропранолол и метопролол, ингибиторы АСЕ (ангиотензин-превращающего фермента), такие как беназеприл, каптоприл, эналаприл, фозиноприл, лизиноприл, алатриоприл, квинаприл и рамиприл, блокаторы кальциевых каналов, такие как нифедипин, фелодипин, никардипин, исрадипин, нимодипин, дилтиазем и верапамил, и α-блокаторы, такие как доксазозин, урапидил, празозин и теразозин; агонисты CART (транскрипта, регулируемого кокаином и амфетамином), антагонисты NPY (нейропептида Y), агонисты МС4 (меланокортина 4), антагонисты орексина, агонисты TNF (фактора некроза опухоли), агонисты CRF (кортикотропин рилизинг фактора), антагонисты CRF BP (белка, связывающего кортикотропин рилизинг фактор), агонисты урокортина, агонисты β3, агонисты MSH (меланоцитостимулирующего гормона), антагонисты МСН (меланиноконцентрирующего гормона), агонисты ССК (холецистокинина), ингибиторы обратного захвата серотонина, ингибиторы обратного захвата серотонина и норадреналина, соединения со смешанным серотонин- и норадреналинергическим действием, агонисты 5НТ (серотонина), агонисты бомбезина, антагонисты галанина, гормон рост, соединения, способствующие высвобождению гормона роста, агонисты TRH (тиреотропин рилизинг гормона), модуляторы UCP 2 или 3 (разобщающего белка 2 или 3), агонисты лептина, агонисты дофамина (бромокриптин, допрексин), ингибиторы липаз/амилаз, модуляторы RXR (ретиноидного Х рецептора), агонисты TR β; антагонисты гистаминового рецептора Н3.
Следует понимать, что подразумевается, что любое пригодное сочетание соединения по изобретению с одним или несколькими из упомянутых выше соединений и, возможно, одной или несколькими другими дополнительными фармакологически активными субстанциями входит в объем настоящего изобретения.
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими далее примерами, которые, однако, не должны рассматриваться как ограничивающие объем охраны. Особенности, раскрытые в предшествующем описании и в следующих далее примерах, по отдельности или в любом их сочетании могут служить исходным материалом для осуществления изобретения в различных его формах.
ПРИМЕРЫ
Список используемых сокращений
DCM: дихлорметан
Dde: 1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогексилиден)этил DIC: диизопропилкарбодиимид
DIPEA: диизопропилэтиламин
Fmoc: 9-флуоренилметилоксикарбонил
HATU: (0-(7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат)
HBTU: (2-(1Н-бензотриазол-1-ил-)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат)
HFIP: 1,1,1,3,3,3-гексафторо-2-пропанол, или гексафтороизопропанол
HOAt: 1-гидрокси-7-азаабензотриазол
HOBt: 1-гидроксибензотриазол
ВЭЖХ: Высокоэффективная жидкостная хроматография
ivDde: 1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогексилиден)-3-метилбутил
ЖХ-МС Жидкостная хроматография с последующей масс-спектрометрией (LCMS):
МеОН: Метанол
Mmt: 4-метокситритил
Mtt: 4-метилтритил
NMP: N-метилпирролидон
OEG: 8-амино-3,6-диоксактановая кислота
OtBu: трет-бутиловый сложный эфир
PBS: фосфатно-солевой буфер
ОФ: обращенная фаза
ОФ-ВЭЖХ: Обратнофазовая высокоэффективная жидкостная хроматография
Комн. темп.: Комнатная температура
Rt: Время удерживания
SPPS: твердофазный пептидный синтез
TFA: трифторуксусная кислота
TIPS: триизопропилсилан
Trt: трифенилметил, или тритил
UPLC: Сверхэффективная жидкостная хроматография
Общие способы
Данный раздел относится к способам синтеза связанного со смолой пептида (способам SPPS, в том числе способам снятия защиты аминокислот, способам отщепления пептида от смолы и его очистки), а также к способам детекции и охарактеризования полученного в результате пептида (способам ЖХ-МС и UPLC).
Синтез пептида, связанного со смолой SPPS, способ А
Способ А твердофазного пептидного синтеза относится к пептидному синтезу с применением химических свойств Fmoc, в пептидном синтезаторе Prelude Solid Phase Peptide Synthesizer производства компании Protein Technologies (Tucson, AZ85714, CUJA).
Примененные Fmoc-защищенные производные аминокислот представляли собой рекомендованные стандарты: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-lie-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH и Fmoc-Val-OH, поставляемые, например, компаниями. Anaspec, Bachem, Iris Biotech или Novabiochem.
В случаях, когда на боковой цепочке лизина присутствовал альбумин-связывающий радикал, эпсилон-аминогруппа лизина, которую необходимо было ацилировать, была защищена с помощью Mtt (например, Fmoc-Lys(Mtt)-OH), a N-концевая альфа-аминогруппа была защищена с помощью Вое. Схожим образом, когда на боковой цепочке орнитина присутствовал альбумин-связывающий радикал, дельта-аминогруппа орнитина, которую необходимо было ацилировать, была защищена с помощью Mtt (например, Fmoc-Orn(Mtt)-OH).
Пригодной смолой для синтеза аналогов глюкагона с С-концевой карбоксильной группой является предварительно загруженная, с низкой емкостью смола Wang, доступная для приобретения в компании Novabiochem (например, смола с низкой емкостью fmoc-Thr(tBu)-Wang, LL, 0,27 ммоль/г). Пригодной смолой для синтеза аналогов глюкагона с С-концевой амидной группой является смола PAL-ChemMatrix, доступная для приобретения в компании Matrix-Innovation. Снятие защитных групп Fmoc осуществляли с применением обработки 20% пиперидином в NMP - 2 раза в течение 3 мин. Реакцию конденсации проводили с применением DIC/HOAt/коллидина в NMP. Растворы аминокислот/HOAt (0,3 М/0,3 М в NMP, при 3-10-кратном молярном избытке) добавили к смоле, а затем добавили такое же количество молярных эквивалентов DIC (3 М в NMP), после чего добавили коллидин (3 М в NMP). Например, в зависимости от масштаба реакции, применяли для каждой реакции конденсации следующие количества раствора 0,3 М аминокислота/HOAt: (масштаб/мл) 0,05 ммоль/1,5 мл, 0,10 ммоль/3,0 мл, 0,25 ммоль/7,5 мл. Время проведения реакции конденсации в общем случае составляет 30 мин. Все реакции конденсации повторяли для обеспечения полного прохождения конденсации.
Удаление защитных групп для защищенного Mtt лизина проводили в пептидном синтезаторе Prelude Solid Phase Peptide Synthesizer или с помощью синтеза вручную.
Синтез вручную: Mtt-группу удаляли промывкой смолы с помощью DCM и суспендированием смолы в HFIP/DCM/TIPS (70:28:2) (2×20 мин.) и последующей промывкой, последовательно, с помощью DCM (3x), 5% DIPEA в DCM (1x), DCM 4х) nNMP-DCM(4:1).
Синтезатор Prelude: Mtt-группу удаляли промывкой смолы с помощью HFIP/DCM (75:25) (2×2 мин.), промывкой с помощью DCM и суспендированием смолы в HFIP/DCM (75:25)(2×20 мин) и последующей промывкой, последовательно, с помощью пиперидина/NMP (20:80), DCM(1x), NMP(1x), DCM(1x), NMP(1x)
SPPS, способ В - присоединение заранее полученного альбумин-связывающего фрагмента
Раствор заранее полученного альбумин-связывающего фрагмента в форме карбоновой кислоты, такой как 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусная кислота, (4 экв.), HOAt (4 экв.) и DIC (4 экв.) в NMP-DCM (4:1) перемешивали в течение 30 мин., а затем добавили к смоле. Смолу перемешивали в этой смеси в течение 30 мин., после чего добавили коллидин (4 экв.) Смолу перемешивали в течение 16 ч, а затем промыли NMP (5х) и DCM (5х).
SPPS, способ С - присоединение альбумин-связывающего фрагмента, пошаговая методика
Альбумин-связывающий фрагмент можно присоединять с помощью пошаговой методики в пептидном синтезаторе Prelude, как описано выше (SPPC, способ А), с применением должным образом защищенных стандартных блоков, за исключением того, что конденсацию аминокислот и производных жирных кислот, включая Fmoc-Ado-OH, Fmoc-Glu-OtBu и моно-трет-бутиловый сложный эфир октадекандикарбоновой кислоты (или аналогичные моно-трет-бутиловые сложные эфиры С8-, С10-, С12-, С14- С16-, С20-дикарбоновых кислот), на каждом этапе проводили в течение 6 ч. После каждого этапа конденсации проводили кэпирование непрореагировавшего пептидного промежуточного продукта с помощью ангидрида уксусной кислоты и коллидина, добавленного в избытке (>10 экв.).
Отщепление от смолы
После проведения синтеза смолу промыли с помощью DCM и провели отщепление пептида от смолы посредством обработки в течение 2-3 ч с помощью смеси TFA/TIS/вода (95/2,5/2,5) с последующим осаждением с помощью диэтилового эфира. Осадок промыли диэтиловым эфиром.
Очистка и количественное определение
Неочищенный пептид растворяют в пригодной смеси воды и MeCN, например, в смеси вода/MeCN (4:1), и проводят очистку с помощью обратнофазовой препаративной ВЭЖХ (Waters Deltaprep 4000 или Gilson) на колонке с силикагелем С18. Элюцию проводят возрастающим градиентом раствора MeCN в воде, содержащего 0,1% TFA. Проверку значимых фракций проводят с помощью аналитической ВЭЖХ или UPLC. Фракции, содержащие чистый целевой пептид, смешивают и концентрируют при пониженном давлении. Полученный в результате раствор анализируют (UPLC, ВЭЖХ и ЖХ-МС) и проводят количественное определение продукта с помощью хемилюминесцентного, специфичного к азоту, детектора для ВЭЖХ (Antek 8060 HPLC-CLND) или путем измерения УФ-поглощения при 280 нм. Продукт переносят в стеклянные флаконы. Флаконы закрывают с помощью фильтров для предварительной очистки из стекловолокна производства компании Millipore. В результате лиофилизации получают трифторацетат пептида в виде белого твердого вещества.
Способы детекции и охарактеризования
Способы ЖХ-МС
ЖХ-МС
Способ: LCMS_2
После элюции с колонки в системе для ВЭЖХ Perkin Elmer Series 200 для определения масс компонентов пробы применяли масс-спектрометр Perkin Elmer Sciex API 3000. Элюенты: А: 0,05% трифторуксусная кислота в воде; В: 0,05% трифторуксусная кислота в ацетонитриле. Колонка: Waters Xterra MS C-18 X 3 мм (внутр. диам.), 5 мкм. Градиент: 5% - 90% В в течение 7,5 мин. при скорости 1,5 мл/мин.
Способ: LCMS_4
LCMS_4 проводили на установке, состоящей из системы для сверхэффективной жидкостной хроматографии Waters Acquity UPLC и масс-спектрометра LCT Premier ХЕ компании Micromass.
Элюенты: А: 0,1% муравьиная кислота в воде.
В: 0,1% муравьиная кислота в ацетонитриле.
Анализ проводили при комнатной температуре, вводя соответствующий объем пробы (предпочтительно - 2-10 мкл) в колонку, которую элюировали градиентом растворов А и В. Условия проведения UPLC, установки детектора и установки масс-спектрометра были следующими: колонка: Waters Acquity UPLC ВЕН, С-18, 1,7 мкм, 2,1 мм × 50 мм. Градиент: линейный 5% - 95% ацетонитрила в течение 4,0 мин. (в соответствии с другим вариантом: 8,0 мин.) при скорости 0,4 мл/мин. Детекция: 214 нм (аналоговые данные от TUV (настраиваемого УФ-детектора)). Способ ионизации при МС: API-ES (ионизация при атмосферном давлении в режиме электрораспыления).
Сканирование: 100-2000 а.е.м. (в соответствии с другим вариантом: 500-2000 а.е.м.), с шагом 0,1 а.е.м.
Способ: LCMS_AP
После элюции с колонки в системе для ВЭЖХ, состоящей из модуля для бинарного градиента Waters 2525, модуля для управления пробами Waters 2767, детектора на фотодиодной матрице Waters 2996 и испарительного детектора светорассеяния Waters 2420, для определения масс компонентов пробы применяли масс-спектрометр Micromass Quatro micro API. Элюенты: А: 0,1% трифторуксусная кислота в воде; В: 0,1% трифторуксусная кислота в ацетонитриле. Колонка: Phenomenex Synergi MAXRP, 4 мкм, 75×4,6 мм. Градиент: 5% - 95% В в течение 7 мин. при скорости 1,0 мл/мин.
Способы UPLC
Способ 04_А3_1
UPLC (способ 04_А3_1): Анализ с обращением фаз проводили с применением системы Waters UPLC, оборудованной двухдиапазонным детектором. Данные УФ-детекции при 214 нм и 254 нм собирали с применением колонки ACQUITY UPLC ВЕН130, С18, 130Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, при 40°С.
Система для UPLC была соединена с двумя сосудами с элюентом, содержащими:
2
3
А: 90% HO, 10% CHCN, 0,25 М бикарбонат аммония
3
2
В: 70% CHCN, 30% HO.
Применяли следующий линейный градиент: 75% А, 25% В до 45% А, 55% В в течение 16 мин. при скорости потока 0,35 мл/мин.
Способ 04_А4_1
UPLC (способ 04_А4_1): Анализ с обращением фаз проводили с применением системы Waters UPLC, оборудованной двухдиапазонным детектором. Данные УФ-детекции при 214 нм и 254 нм собирали с применением колонки ACQUITY UPLC ВЕН130, С18, 130Å, 1,7 мкм, 2,1 мм х 150 мм, при 40°С.
Система для UPLC была соединена с двумя сосудами с элюентом, содержащими:
2
3
А: 90% HO, 10% CHCN, 0,25 М бикарбонат аммония
3
2
В: 70% CHCN, 30% HO.
Применяли следующий линейный градиент: 65% А, 35% В до 25% А, 65% В в течение 16 мин. при скорости потока 0,35 мл/мин.
Способ: 04_А2_1
2
3
3
2
Анализ с обращением фаз проводили с применением системы Waters UPLC, оборудованной двухдиапазонным детектором. Данные УФ-детекции при 214 нм и 254 нм собирали с применением колонки ACQUITY UPLC ВЕН130, С18, 130Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, при 40°С. Система для UPLC была соединена с двумя сосудами с элюентом, содержащими: А: 90% HO, 10% CHCN, 0,25 М бикарбонат аммония; В: 70% CHCN, 30% HO. Применяли следующий линейный градиент: 90% А, 10% В до 60% А, 40% В в течение 16 мин. при скорости потока 0,40 мл/мин.
Способ: 04_А6_1
2
3
2
Анализ с обращением фаз проводили с применением системы Waters UPLC, оборудованной двухдиапазонным детектором. Данные УФ-детекции при 214 нм и 254 нм собирали с применением колонки ACQUITY UPLC ВЕН130, С18, 130Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, при 40°С. Система для UPLC была соединена с двумя сосудами с элюентом, содержащими: А: 10 мМ TRIS, 15 мМ сульфат аммония, 80% HO, 20%, рН 7,3; В: 80% CHCN, 20% HO. Применяли следующий линейный градиент: 95% А, 5% В до 10% А, 90% В в течение 16 мин. при скорости потока 0,35 мл/мин.
Способ: 04_А7_1
2
3
2
Анализ с обращением фаз проводили с применением системы Waters UPLC, оборудованной двухдиапазонным детектором. Данные УФ-детекции при 214 нм и 254 нм собирали с применением колонки ACQUITY UPLC ВЕН130, С18, 130Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, при 40°С. Система для UPLC была соединена с двумя сосудами с элюентом, содержащими: А: 10 мМ TRIS, 15 мМ сульфат аммония, 80% HO, 20%, рН 7,3; В: 80% CHCN, 20% HO. Применяли следующий линейный градиент: 95% А, 5% В до 40% А, 60% В в течение 16 мин. при скорости потока 0,40 мл/мин.
Способ: 04_А9_1
2
4
2
4
2
4
2
3
3
2
Анализ с обращением фаз проводили с применением системы Waters UPLC, оборудованной двухдиапазонным детектором. Данные УФ-детекции при 214 нм и 254 нм собирали с применением колонки ACQUITY UPLC ВЕН Shield RP18, С18, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, при 60°С. Система для UPLC была соединена с двумя сосудами с элюентом, содержащими: А: 200 мМ NaSO + 20 мМ NaHPO + 20 мМ NaHPO в смеси 90% НО/10% CHCN, рН 7,2; В: 70% CHCN, 30% HO. Применяли следующий ступенчатый градиент: 90% А, 10% В до 80% А, 20% В в течение 3 мин., 80% А, 20% В до 50% А, 50% В в течение 17 мин. при скорости потока 0,40 мл/мин.
Способ 05_В5_1
Анализ с обращением фаз проводили с применением системы Waters UPLC, оборудованной двухдиапазонным детектором. Данные УФ-детекции при 214 нм и 254 нм собирали с применением колонки ACQUITY UPLC BEH130, С18, 130Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, при 40°С.
Система для UPLC была соединена с двумя сосудами с элюентом, содержащими:
2
4
3
4
3
А: 0,2 М NaSO, 0,04 М HPO, 10% CHCN (рН3,5)
3
2
В: 70% CHCN, 30% HO.
Применяли следующий линейный градиент: 60% А, 40% В до 30% А, 70% В в течение 8 мин. при скорости потока 0,35 мл/мин.
Способ: 05_В7_1
2
4
3
4
3
3
2
Анализ с обращением фаз проводили с применением системы Waters UPLC, оборудованной двухдиапазонным детектором. Данные УФ-детекции при 214 нм и 254 нм собирали с применением колонки ACQUITY UPLC BEH130, С18, 130Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, при 40°С. Система для UPLC была соединена с двумя сосудами с элюентом, содержащими: А: 0,2 М NaSO, 0,04 М HPO, 10% CHCN (рН3,5); В: 70% CHCN, 30% HO. Применяли следующий линейный градиент: 80% А, 20% В до 40% А, 60% В в течение 8 мин. при скорости потока 0,40 мл/мин.
Способ: 05_В8_1
2
4
3
4
3
3
2
Анализ с обращением фаз проводили с применением системы Waters UPLC, оборудованной двухдиапазонным детектором. Данные УФ-детекции при 214 нм и 254 нм собирали с применением колонки ACQUITY UPLC BEH130, С18, 130Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, при 40°С. Система для UPLC была соединена с двумя сосудами с элюентом, содержащими: А: 0,2 М NaSO, 0,04 М HPO, 10% CHCN (рН3,5); В: 70% CHCN, 30% HO. Применяли следующий линейный градиент: 50% А, 50% В до 20% А, 80% В в течение 8 мин. при скорости потока 0,40 мл/мин.
Способ: 05_В9_1
2
4
3
4
3
3
2
Анализ с обращением фаз проводили с применением системы Waters UPLC, оборудованной двухдиапазонным детектором. Данные УФ-детекции при 214 нм и 254 нм собирали с применением колонки ACQUITY UPLC BEH130, С18, 130Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, при 40°С. Система для UPLC была соединена с двумя сосудами с элюентом, содержащими: А: 0,2 М NaSO, 0,04 М HPO, 10% CHCN (pH3,5); В: 70% CHCN, 30% HO. Применяли следующий линейный градиент: 70% А, 30% В до 20% А, 80% В в течение 8 мин. при скорости потока 0,40 мл/мин.
Способ: 05_В10_1
2
4
3
4
3
3
2
Анализ с обращением фаз проводили с применением системы Waters UPLC, оборудованной двухдиапазонным детектором. Данные УФ-детекции при 214 нм и 254 нм собирали с применением колонки ACQUITY UPLC BEH130, С18, 130Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, при 40°С. Система для UPLC была соединена с двумя сосудами с элюентом, содержащими: А: 0,2 М NaSO, 0,04 М HPO, 10% CHCN (рН3,5); В: 70% CHCN, 30% НО. Применяли следующий линейный градиент: 40% А, 60% В до 20% А, 80% В в течение 8 мин. при скорости потока 0,40 мл/мин.
Способ: 07_В4_1
Анализ с обращением фаз проводили с применением системы Waters UPLC, оборудованной двухдиапазонным детектором. Данные УФ-детекции при 214 нм и 254 нм собирали с применением колонки ACQUITY UPLC BEH130, С18, 130Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, при 40°С.
2
3
Система для UPLC была соединена с двумя сосудами с элюентом, содержащими: А: 99,95% HO, 0,05% TFA; В: 99,95% CHCN, 0,05% TFA. Применяли следующий линейный градиент: 95% А, 5% В до 5% А, 95% В в течение 16 мин. при скорости потока 0,40 мл/мин.
Способ: 09_В2_1
2
3
Анализ с обращением фаз проводили с применением системы Waters UPLC, оборудованной двухдиапазонным детектором. Данные УФ-детекции при 214 нм и 254 нм собирали с применением колонки ACQUITY UPLC BEH130, С18, 130Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, при 40°С. Система для UPLC была соединена с двумя сосудами с элюентом, содержащими: А: 99,95% HO, 0,05% TFA; В: 99,95% CHCN, 0,05% TFA. Применяли следующий линейный градиент: 95% А, 5% В до 40% А, 60% В в течение 16 мин. при скорости потока 0,40 мл/мин.
Способ: 09_В4_1
2
3
Анализ с обращением фаз проводили с применением системы Waters UPLC, оборудованной двухдиапазонным детектором. Данные УФ-детекции при 214 нм и 254 нм собирали с применением колонки ACQUITY UPLC BEH130, С18, 130Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, при 40°С. Система для UPLC была соединена с двумя сосудами с элюентом, содержащими: А: 99,95% НО, 0,05% TFA; В: 99,95% CHCN, 0,05% TFA. Применяли следующий линейный градиент: 95% А, 5% В до 5% А, 95% В в течение 16 мин. при скорости потока 0,40 мл/мин.
Способ 08_В2_1
Анализ с обращением фаз проводили с применением системы Waters UPLC, оборудованной двухдиапазонным детектором. Данные УФ-детекции при 214 нм и 254 нм собирали с применением колонки ACQUITY UPLC BEH130, С18, 130Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, при 40°С.
Система для UPLC была соединена с двумя сосудами с элюентом, содержащими:
2
А: 99,95% НО, 0,05% TFA
3
В: 99,95% CHCN, 0,05% TFA.
Применяли следующий линейный градиент: 95% А, 5% В до 40% А, 60% В в течение 16 мин. при скорости потока 0,40 мл/мин.
Способ 08_В4_1
Анализ с обращением фаз проводили с применением системы Waters UPLC, оборудованной двухдиапазонным детектором. Данные УФ-детекции при 214 нм и 254 нм собирали с применением колонки ACQUITY UPLC BEH130, С18, 130Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, при 40°С.
Система для UPLC была соединена с двумя сосудами с элюентом, содержащими:
2
А: 99,95% HO, 0,05% TFA
3
В: 99,95% CHCN, 0,05% TFA.
Применяли следующий линейный градиент: 95% А, 5% В до 5% А, 95% В в течение 16 мин. при скорости потока 0,40 мл/мин.
Способ 10_В4_2
Анализ с обращением фаз проводили с применением системы Waters UPLC, оборудованной двухдиапазонным детектором. Данные УФ-детекции при 214 нм и 254 нм собирали с применением колонки ACQUITY UPLC BEH130, С18, 130Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, при 50°С.
Система для UPLC была соединена с двумя сосудами с элюентом, содержащими:
2
А: 99,95% HO, 0,05% TFA
3
В: 99,95% CHCN, 0,05% TFA.
Применяли следующий линейный градиент: 95% А, 5% В до 5% А, 95% В в течение 12 мин. при скорости потока 0,40 мл/мин.
Способ 10_В5_2
Анализ с обращением фаз проводили с применением системы Waters UPLC, оборудованной двухдиапазонным детектором. Данные УФ-детекции при 214 нм и 254 нм собирали с применением колонки ACQUITY UPLC BEH130, С18, 130Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, при 50°С.
Система для UPLC была соединена с двумя сосудами с элюентом, содержащими:
А: 70% MeCN, 30% воды.
2
4
3
4
В: 0,2 М NaSO, 0,04 М HPO, 10% MeCN, pH2,25.
Применяли следующий линейный градиент: 40% А в течение 1 мин., от 40 до 70% А в течение 7 мин. при скорости потока 0,40 мл/мин.
Способ: 10_В14_1
2
3
Анализ с обращением фаз проводили с применением системы Waters UPLC, оборудованной двухдиапазонным детектором. Данные УФ-детекции при 214 нм и 254 нм собирали с применением колонки ACQUITY UPLC ВЕН ShieldRP18, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, при 50°С. Система для UPLC была соединена с двумя сосудами с элюентом, содержащими: А: 99,95% HO, 0,05% TFA; В: 99,95% CHCN, 0,05% TFA. Применяли следующий линейный градиент: 70% А, 30% В до 40% А, 60% В в течение 12 мин. при скорости потока 0,40 мл/мин.
Способ: АР_В4_1
Анализ с обращением фаз проводили с применением системы Waters UPLC, оборудованной двухдиапазонным детектором. Данные УФ-детекции при 214 нм и 254 нм собирали с применением колонки ACQUITY UPLC BEH130, С18, 130Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм, при 30°С.
2
3
Система для UPLC была соединена с двумя сосудами с элюентом, содержащими: А: 99,95% HO, 0,05% TFA; В: 99,95% CHCN, 0,05% TFA. Применяли следующий линейный градиент: 95% А, 5% В до 5% А, 95% В в течение 16 мин. при скорости потока 0,30 мл/мин.
Пример 1
ε24
2
24
27
N-([2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксоостадеканоил)амино]5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]])[D-Ser,Lys,Leu]глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 08_В4_1: 8,3 мин.
UPLC 04_А4_1: 6,3 мин.
UPLC 05_В5_1: 5,8 мин.
LCMS: m/z 1494,8 (М+3Н)3+, 1046,6 (М+4Н)4+, 837,5 (М+5)5+
Получение стандартного блока 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусной кислоты:
2-Хлортритиловую смолу, 100-200 меш (42,6 г, 42,6 ммоль), оставили набухать в безводном дихлорметане (205 мл) в течение 20 мин. Добавили к смоле раствор {2-[2-(9Н-флуорен-9-илметоксикарбониламино)-этокси]-этокси}-уксусной кислоты (13,7 г, 35,5 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламина (23,5 мл, 135 ммоль) в безводном дихлорметане (30 мл) и встряхивали смесь в течение 3 ч. Смолу отфильтровали и обработали раствором N,N-диизопропилэтиламина (12,4 мл, 70,9 ммоль) в смеси метанол/дихлорметан (4:1, 250 мл, 2×5 мин.). Затем смолу промыли с помощью N,N-диметилформамида (2×150 мл), дихлорметана (3×150 мл) и N,N-диметилформамида (3×150 мл). Fmoc-группу удалили путем обработки раствором 20% пиперидина в диметилформамиде (1×5 мин., 1×30 мин., 2×150 мл). Смолу промыли с помощью N,N-диметилформамида (3×150 мл), 2-пропанола (2×150 мл) и дихлорметана (200 мл, 2×150 мл). Добавили к смоле раствор {2-[2-(9Н-флуорен-9-илметоксикарбониламино)-этокси]-этокси}-уксусной кислоты (20,5 г, 53,2 ммоль), O-(6-хлорбензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония тетрафторбората (TCTU, 18,9 г, 53,2 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламина (16,7 мл, 95,7 ммоль) в N,N-диметилформамиде (100 мл) и дихлорметане (50 мл) и встряхивали смесь в течение 1 ч. Смолу отфильтровали и промыли с помощью N,N-диметилформамида (2×150 мл), дихлорметана (3×150 мл) и N,N-диметилформамида (155 мл). Fmoc-группу удалили путем обработки раствором 20% пиперидина в диметилформамиде (1×5 мин., 1×30 мин., 2×150 мл). Смолу промыли с помощью N,N-диметилформамида (3×150 мл), 2-пропанола (2×150 мл) и дихлорметана (200 мл, 2×150 мл). Добавили к смоле раствор Fmoc-Glu-OtBu (22,6 г, 53,2 ммоль), O-(6-хлор-бензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония тетрафторбората (TCTU, 18,9 г, 53,2 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламина (16,7 мл, 95,7 ммоль) в N,N-диметилформамиде (155 мл) и встряхивали смесь в течение 1 ч. Смолу отфильтровали и промыли с помощью N,N-диметилформамида (2×150 мл), дихлорметана (2×150 мл) и N,N-диметилформамида (150 мл). Fmoc-группу удалили путем обработки раствором 20% пиперидина в диметилформамиде (1×5 мин., 1×30 мин., 2×150 мл). Смолу промыли с помощью N,N-диметилформамида (3×150 мл), 2-пропанола (2×150 мл) и дихлорметана (200 мл, 2×150 мл). Добавили к смоле раствор моно-трет-бутилового сложного эфира октадекандикарбоновой кислоты (19,7 г, 53,2 ммоль), O-(6-хлорбензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония тетрафторбората (TCTU, 18,9 г, 53,2 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламина (16,7 мл, 95,7 ммоль) в смеси N,N-диметилформамид/дихлорметан (1:4, 200 мл). Смолу встряхивали в течение 2 ч, отфильтровали и промыли с помощью N,N-диметилформамида (3×150 мл), дихлорметана (2×150 мл), метанола (2×150 мл) и дихлорметана (300 мл, 6×150 мл). Отщепление продукта от смолы проводили с помощью обработки 2,2,2-трифторэтанолом (200 мл) в течение 19 ч. Смолу отфильтровали и промыли с помощью дихлорметана (2×150 мл), смеси 2-пропанол/дихлорметан (1:1, 2×150 мл), 2-пропанола (150 мл) и дихлорметана (2×150 мл). Растворы объединили; провели выпаривание растворителя и очистили неочищенный продукт с помощью колоночной флэш-хроматографии (силикагель 60, 0,040-0,060 мм; элюент: смесь дихлорметан/метанол 1:0-9:1). Очищенный продукт высушили в вакууме и получили в виде желтой маслянистой жидкости.
Выход: 25,85 г (86%).
F
2
R (SiO, хлороформ/метанол, 85:15): 0,25.
1
3
H
H ЯМР-спектр (300 МГц, CDCl, δ): 7,8 (bs, 1H); 7,08 (bs, 1H); 6,61 (d, J=7,5 Гц, 1H); 4,43 (m, 1H); 4,15 (s, 2H); 4,01 (s, 2H); 3,78-3,39 (m, 16H); 2,31 (t, J=6,9 Гц, 2H); 2,27-2,09 (m, 5H); 2,01-1,84 (m, 1H); 1,69-1,50 (m, 4H); 1,46 (s, 9H); 1,43 (s, 9H); 1,24 (bs, 24H).
Чистота согласно ЖХ-МС: 100%.
+
Rt при ЖХ-МС (Sunfire 4,6 мм × 100 мм, ацетонитрил/вода от 60:40 до 0:100+0,1% FA): 7,89 мин. ЖХ-МС m/z: 846,6 (M+H).
Пример 2
ε24
2
16
24
27
N-([2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]])[D-Ser,Glu,Lys,Leu]глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 08_В4_1: 8,4 мин.
UPLC 08_B2_1: 12,6 мин.
UPLC 05_B5_1: 6,2 мин.
UPLC 04_А3_1: 9,3 мин.
LCMS: m/z 1408,08 (М+3Н)3+, 1056,08 (М+4Н)4+, 845,10 (М+5)5+
Пример 3
ε24
17
18
21
24
27
N-([2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]])[Lys,Lys,Glu,Lys,Leu]глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 08_B4_1: 8,2 мин.
UPLC 08_B2_1: 12,5 мин.
UPLC 05_B5_1: 6,1 мин.
UPLC 04_A3_1: 11,0 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1380,09 (М+3Н)3+, 1035,10 (М+4Н)4+, 828,31 (М+5)5+
Пример 4
ε24
17
21
24
27
N-([2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]])[Lys,Glu,Lys,Leu]глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 08_B4_1: 8,5 мин.
UPLC 08_B2_1: 12,9 мин.
UPLC 05_B5_1: 5,8 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1389,32 (М+3Н)3+, 1042,24 (М+4Н)4+, 833,99 (М+5)5+
Пример 5
ε24
16
17
21
27
N-([2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]])[Lys,Lys,Glu,Leu]глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 08_B4_1: 8,6 мин.
UPLC 08_B2_1: 13,0 мин.
UPLC 05_B5_1: 6,0 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1402,99 (M+3H)3+, 1052,5 (М+4Н)4+, 842,21 (М+5)5+
Пример 6
εl6
16
17
18
21
27
N-([2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]])[Lys,Lys,Lys,Glu,Leu]глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-окси-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 08_B4_1: 8,5 мин.
UPLC 08_B2_1: 12,9 мин.
UPLC 05_B5_1: 6,0 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1393,67 (М+3Н)3+, 1045,50 (М+4Н)4+, 836,61 (М+5)5+
Пример 7
ε25
25
27
N-([2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]]) [Lys,Leu] глюкагон.
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и UPLC 10_В5_2: 7,0 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1374,65 (М+3Н)3+, 1031,24 (М+4Н)4+, 825,02 (М+5)5+
Пример 8
ε28
27
28
N-([2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]])[Leu,Lys]глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и UPLC 10_В5_2:7,8 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1399,34 (M+3H)3+, 1049,76 (М+4Н)4+, 840,01 (М+5)5+
Пример 9
ε28
27
N-([2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]])[Leu]глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и UPLC 10_В5_2: 6,8 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1399,4 (M+3H)3+
Пример 10
ε29
27
29
N-([2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]])[Leu,Lys]глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и UPLC 10_В4_2: 8,5 мин. UPLC 10_В5_2: 8,1 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1403,32 (M+3H)3+, 1052,50 (М+4Н)4+, 842,19 (М+5)5+
Пример 11
α
27
ε
N([Leu]глюкагонил)N[(4S)-5-гидрокси-4-[[(4S)-5-гидрокси-4-[[(4S)-5-гидрокси-4-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(20-гидрокси-20-оксо-икозаноил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]-5-оксо-пентаноил]амино]-5-оксо-пентаноил]амино]-5-оксо-пентаноил]лизин
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и UPLC 10_В4_2: 8,5 мин. UPLC 10_В5_2: 7,9 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1437,02 (M+3H)3+, 1078,01 (М+4Н)4+, 862,41 (М+5)5+
Пример 12
εl2
12
27
N-([2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]])[Lys,Leu]глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и UPLC 10_В4_2: 8,7 мин. UPLC 10_В5_2: 8,4 мин.
UPLC 05_B5_1: мин.
UPLC 04_A3_1: мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1394,35 (M+3H)3+, 1045,99 (М+4Н)4+
Пример 13
ε28
16
24
27
28
N-([2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]])[Thr,Lys,Leu,Ser]глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 05_B5_1: 5,1 мин.
UPLC 04_A3_1: 12,6 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1389,79 (M+3H)3+, 1042,58 (М+4Н)4+, 834,28 (М+5)5+
Пример 14
ε24
24
27
28
N-([2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]])[Lys,Leu,Ser]глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 04_А4_1: 6,7 мин.
UPLC 05_B5_1: 4,9 мин.
UPLC 04_A3_1: 12,0 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1385,41 (M+3H)3+, 1039,06 (М+4Н)4+, 831,45 (М+5)5+
Пример 15
ε24
24
27
28
N-([2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]])[Lys,Leu,Thr]глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(1 в-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 04_А4_1: 6,4 мин.
UPLC 05_В5_1: 4,8 мин.
UPLC 04_А3_1: 11,7 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1389,77 (M+3H)3+, 1042,58 (М+4Н)4+, 834,27 (М+5)5+
Пример 16
ε24
24
27
N-([2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]])[Lys,Leu]глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 04_А4_1: 6,3 мин.
UPLC 05_В5_1: 4,6 мин.
UPLC 04_А3_1: 11,6 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1394,46 (M+3H)3+, 1045,84 (М+4Н)4+, 836,88 (М+5)5+
Пример 17
ε16
16
27
N-([2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]])[Lys,Leu]глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(43)-5-трет-бутокси-4-[(1 6-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 08_B4_1: 8,5 мин.
UPLC 08_B2_1: 12,9 мин.
UPLC 05_B5_1: 4,8 мин.
UPLC 04_A3_1: 11,9 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1407,65 (M+3H)3+, 1055,97 (М+4Н)4+, 845,2 (М+5)5+
Пример 18
εl8
18
27
N-([2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]])[Lys,Leu]глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(43)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту. UPLC-MC в системе с LCT Premier: Rt 2,11 мин., m/z: 1384,58 ((M/3)+3); 1038,69 ((М/4)+4).
UPLC 08_B4_1: 8,9 мин.
UPLC 08_B2_1: 13,5 мин.
UPLC 05_B5_1: 5,1 мин.
UPLC 04_A3_1: 11,5 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1384,58 (M+3H)3+, 1038,69 (М+4Н)4+
Пример 19
ε17
17
27
N-([2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]])[Lys,Leu]глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC-MC в системе с LCT Premier: Rt 2,06 мин., m/z: 1384,81 ((M/3)+3); 1038,62 ((М/4)+4).
UPLC 08_B4_1: 8,7 мин.
UPLC 08_B2_1: 13,2 мин.
UPLC 05_B5_1: 4,9 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1384,81 (M+3H)3+, 1038,62 (М+4Н)4+
Пример 20
ε24
12
24
27
N-([2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]])[Arg,Lys,Leu]глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 08_B4_1: 8,74 мин.
UPLC 05_B5_1: 5,25 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: 4208,0
Пример 21
ε24
21
24
27
N-([2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]])[Glu,Lys,Leu]глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-
пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту. UPLC 08_В4_1: 8,50 мин. Способ ЖХ-МС: LCMS_4: 4193
Пример 22
α
ε
N-глюкагонил-N[(4S)-5-гидрокси-4-[[(4S)-5-гидрокси-4-[[(4S)-5-гидрокси-4-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(20-гидрокси-20-оксо-икозаноил)амино]-6-оксо-пентаноил]амино]-6-оксо-пентаноил]амино]-5-оксо-пентаноил]амино]-5-оксо-пентаноил]лизиниламид
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
UPLC 08_В4_1: 8,7 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 4450
Пример 23
α
ε24
2
20
N-(N[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил][D-Ser,Lys]глюкагонил)лизиниламид
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
UPLC 08_B4_1: 7,87 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z4181
Пример 24
ε24
16
24
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил][Glu,Lys]глюкагон пептидамид
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 05_В5_1: Rt=6,2 мин.
UPLC 04_А3_1: Rt=11,7 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1413,8 (M+3H)3+, 1060,7 (М+4Н)4+, 848,8 (М+5)5+
Пример 25
([Glu16
ε
N]глюкагонил)N-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил])лизиниламид
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту
UPLC 08_B2_1: Rt=12,3
UPLC 08_B4_1: Rt=8,2
UPLC 05_B5_1: Rt=5,0
UPLC 04_A3_1: Rt=10,9
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1457 (M+3H)3+, 1093 (М+4Н)4+, 874 (М+5)5+
Пример 26
([Glu16
17
20
ε
N,Gln,Arg]глюкагонил)N-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил])лизиниламид
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 08_B2_1: Rt=12,2
UPLC 08_B4_1: Rt=8,1
UPLC 05_B5_1: Rt=4,8
UPLC 04_A3_1: Rt=11,1
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1457 (M+3H)3+, 1092 (M+4H)4+, 874 (M+5)5+
Пример 27
([Glu16
17
18
20
ε
N,Gln,Ala,Arg]глюкагонил)N-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил])лизиниламид
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 08_B2_1: Rt=12,9
UPLC 08_B4_1: Rt=8,6
UPLC 05_B5_1: Rt=5,7
UPLC 04_A3_1: Rt=11,3
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1428 (M+3H)3+, 1071 (М+4Н)4+, 857 (М+5)5+
Пример 28
ε24
16
24
27
N-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил])[Glu,Lys,Met(O)]глюкагон пептидамид
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 05_B5_1: Rt=4,7
UPLC 04_A4_1: Rt=4,1
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1419,2 (M+3H)3+, 1064,7 (М+4Н)4+, 852,0 (М+5)5+
Пример 29
ε24
2
16
24
27
N-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил])[Aib,Glu,Lys,Leu]глюкагон пептидамид
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 08_В4_1: Rt=8,4
UPLC 04_A4_1: Rt=7,2
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1407,8 (M+3H)3+, 1056,4 (М+4Н)4+, 845,6 (М+5)5+
Пример 30
ε24
2
16
17
18
20
24
27
N-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил])[D-Ser,Glu,Gln,Ala,Arg,Lys,Leu]глюкагон пептидамид
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 05_B5_1: Rt=7,1
UPLC 04_A4_1: Rt=7,7
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1380,4 (M+3H)3+, 1035,6 (М+4Н)4+, 828,7 (М+5)5+
Пример 31
ε24
21
24
25
27
N-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил])[Glu,Lys,ArgLeu,]глюкагон пептидамид
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 05_B5_1:Rt=5,8
UPLC 08_B4_1: Rt=7,6
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1388,7 (M+3H)3+, 1041,8 (М+4Н)4+, 833,7 (М+5)5+
Пример 32
ε24
16
24
27
28
N-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил])[Glu,Lys,Leu,Ala]глюкагон пептидамид
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
UPLC 05_B9_1: Rt=8,2,
UPLC 08_В4_1: Rt=8,5
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1393,7 (M+3H)3+
Пример 33
ε24
17
24
27
28
(N-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил])[Glu,Lys,Val,Lys]глюкагонил)-Gly-Pro амид
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С. UPLC 08_B4_1: Rt=8,0
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1436,3 (M+3H)3+
Пример 34
εl6
16
17
21
27
N-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил])[Lys,Lys,Glu,Leu]глюкагон пептидамид
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 08_B2_1: Rt=12,9
UPLC 08_B4_1: Rt=8,5
UPLC 05_B5_1: Rt=6,4
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1402,7 (M+3H)3+, 1052,3 (М+4Н)4+, 842,2 (М+5)5+
Пример 35
ε24
17
21
24
27
N-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил])[Lys,Glu,Lys,Leu]глюкагон пептидамид
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 08_В2_1: Rt=12,8
UPLC 08_В4_1: Rt=8,5
UPLC 05_В5_1: Rt=6,2
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1389,3 (M+3H)3+, 1042,0 (М+4Н)4+, 833,1 (М+5)5+
Пример 36
ε24
16
17
18
21
24
24
N-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил])[Glu,Lys,Ala,Glu,Lys,Leu]глюкагон пептидамид
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 08_B2_1: Rt=13,7
UPLC 08_B4_1: Rt=9,0
UPLC 05_B5_1: Rt=7,1
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1374,7 (M+3H)3+, 1031,2 (М+4Н)4+
Пример 37
ε24
17
18
21
24
27
N-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил])[Lys,Ala,Glu,Lys,Leu]глюкагон пептидамид
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-Трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 08_B2_1: Rt=13,6
UPLC 08_B4_1: Rt=8,9
UPLC 05_B5_1: Rt=7,1
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1361,0 (M+3H)3+, 1020,75 (М+4Н)4+
Пример 38
ε24
16
17
21
24
27
N-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил])[Glu,Lys,Glu,Lys,Leu]глюкагон пептидамид
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 08_B2_1: Rt=12,9
UPLC 08_B4_1: Rt=8,5
UPLC 05_B5_1: Rt=6,1
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1403,3 (M+3H)3+, 1052,5 (М+4Н)4+, 842,2 (М+5)5+
Пример 39
εl6
2
16
17
21
27
N-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил])[Aib,Lys,Lys,Glu,Leu]глюкагон пептидамид
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 05_В5_1: Rt=5,0
UPLC 04_A3_1: Rt=14,5
UPLC 04_A4_1:Rt=9,2
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1402,5 (M+3H)3+, 1051,85 (М+4Н)4+, 841,7 (М+5)5+
Пример 40
ε24
17
21
24
27
28
N-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил])[Lys,Glu,Lys,Leu,Ser]глюкагон пептидамид
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 09_B2_1: Rt=12,8
UPLC 09_B4_1: Rt=8,5
UPLC 05_B5_1: Rt=5,6
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1380,2 (M+3H)3+, 1035,1 (М+4Н)4+, 828,3 (М+5)5+
Пример 41
ε24
17
21
24
27
28
N-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил])[Lys,Glu,Lys,Leu,Glu]глюкагон пептидамид
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 08_B2_1: Rt=12,8
UPLC 08_B4_1: Rt=8,5
UPLC 05_B5_1: Rt=5,4
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1394,1 (M+3H)3+, 1045,6 (М+4Н)4+, 836,7 (М+5)5+
Пример 42
17
21
27
ε
N-([Lys,Glu,Leu]глюкагонил)N-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил])лизиниламид
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 08_B2_1: Rt=12,4
UPLC 08_B4_1: Rt=8,2
UPLC 05_B5_1: Rt=4,6
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1431,9 (M+3H)3+, 1074,2 (М+4Н)4+, 859,4 (М+5)5+
Пример 43
ε24
17
21
27
28
N-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил])[Lys,GluLeu,Lys]глюкагон пептидамид
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 08_B2_1: Rt=12,7
UPLC 08_B4_1: Rt=8,5
UPLC 05_B5_1: Rt=5,2
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1393,9 (M+3H)3+, 1045,7 (М+4Н)4+, 836,6 (М+5)5+
Пример 44
ε25
17
21
25
27
N([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил])[Lys,Glu,LysLeu]глюкагон пептидамид
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 05_В5_1: Rt=4,5
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1369,5 (M+3H)3+, 1027,4 (М+4Н)4+, 822,1 (М+5)5+
Пример 45
ε27
17
21
27
N([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил])[Lys,Glu,Lys]глюкагон пептидамид
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 05_В5_1: Rt=4,2
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1394,2 (M+3H)3+, 1045,6 (М+4Н)4+, 836,7 (М+5)5+
Пример 46
ε29
17
21
27
29
N([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил])[Lys,Glu,Leu,Lys]глюкагон пептидамид
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-Трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 05_В5_1: Rt=4,930 мин.; чистота 93%.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 1398,2 (M+3H)3+, 1048,6 (М+4Н)4+, 839,1 (М+5)5+
Пример 47
ε24
12
24
27
N-([2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]])[Arg,Lys,Leu]глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 08_B4_1: Rt=8,7
UPLC 05_B5_1: Rt=5,2
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 4208
Пример 48
ε24
21
24
27
N-([2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]])[Glu,Lys,Leu]глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 08_В4_1: Rt=8,5
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 4193
Пример 49
ε24
18
21
24
27
N-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]])[Glu,Glu,Lys,Leu]глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 08_B4_1: Rt=8,7
UPLC 05_B5_1: Rt=5,6
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z4166
Пример 50
ε24
24
25
27
N-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]])[Lys,His,Leu]глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 08_В4_1: Rt=7,8
UPLC 05_B5_1: Rt=4,3
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z4131
Пример 51
ε24
24
27
N-([(4S)-5-гидрокси-4-[[(4S)-5-гидрокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]-5-оксопентаноил]амино]-5-оксопентаноил])[Lys,Leu]глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
UPLC 09_B2_1: Rt=12,7, UPLC 09_B4_1: Rt=8,4
Способ ЖХ-МС: LCMS_4 m/z: 4439,00 (M)+; 1480,15 ((М/3)+3); 1110,11 ((М/4)+4); 888,29 ((М/5)+5).
Пример 52
ε28
27
28
N-([(4S)-5-гидрокси-4-[[(4S)-5-гидрокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]-5-оксопентаноил]амино]-5-оксопентаноил])[Leu,Lys]глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
UPLC 08_В2_1: Rt=12,7, UPLC 08_В4_1: Rt=8,4
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z 4452,50 (М)+; 1484,79 ((М/3)+3); 1113,59 ((М/4)+4);891,08((М/5)+5).
Пример 53
ε29
27
29
N-([(4S)-5-гидрокси-4-[[(4S)-5-гидрокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]-5-оксопентаноил]амино]-5-оксопентанил])[Leu,Lys]глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С. UPLC 08_B2_1: Rt=12,6, UPLC 08_B4_1: Rt=8,4
Способ ЖХ-МС: LCMS_4 m/z: 4465,50 (M)+; 1489,12 ((М/3)+3); 1117,09 ((М/4)+4); 893,67 ((М/5)+5).
Пример 54
α
27
ε
N-([Leu]глюкагонил)N-([(4S)-5-гидрокси-4-[[(4S)-5-гидрокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]-5-оксопентаноил]амино]-5-оксопентаноил])лизин
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С. UPLC 08_В2_1: Rt=12,6, UPLC 08_B4_1: Rt=8,4
Способ ЖХ-МС: LCMS_4 m/z: 4465,50 (М)+; 1489,12 ((М/3)+3); 1117,09 ((М/4)+4); 893,67 ((М/5)+5).
Пример 55
ε24
17
18
21
24
27
28
N-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил])[Lys,Lys,Glu,Lys,Leu,Ser]глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С. UPLC 08_В2_1: Rt=12,9, UPLC 08_В4_1: Rt=8,5
Способ ЖХ-МС: LCMS_4 m/z: 4110,50 (М)+; 1370,92 ((М/3)+3); 1028,19 ((М/4)+4); 822,75 ((М/5)+5).
Пример 56
ε24
24
25
27
N-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил])[Lys,(p)Tyr,Leu]глюкагон
2
2
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя Fmoc-Tyr(PO(NMe))-OH при синтезе пептида и 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту. Удаление защитных групп с фосфотирозина проводили добавлением воды до суммарного содержания 10% (об./об.) после отщепления от смолы. Чтобы обеспечить удаление защитных групп с фосфотирозина смесь TFA и воды выдерживали в течение 16 ч.
UPLC 09_B2_1: Rt=12,7
UPLC 09_В4_1: Rt=8,4
Способ ЖХ-МС: LCMS_4 m/z: 4237,00 (М)+; 1413,04 ((М/3)+3); 1059,78 ((М/4)+4); 848,26 ((М/5)+5).
Пример 57
ε10
10
27
N-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]-ацетил])[Lys,Leu]глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 08_B4_1: Rt=8,3
UPLC 05_B5_1: Rt=5,0
Способ ЖХ-МС: LCMS_4 m/z: 1382,18 ((M/3)+3); 1036,89 ((М/4)+4); 829,72 ((М/5)+5).
Пример 58
ε24
21
24
25
27
N-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил])[Glu,Lys,Arg,Leu]глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 08_B4_1: Rt=8,55
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: 4164,8
Пример 59
α
17
18
21
27
ε
N-([Lys,Lys,Glu,Leu]глюкагонил)N-([2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]-5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]-ацетил])лизин
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и В, применяя 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(18-трет-бутокси-18-оксо-октадеканоил)амино]-5-оксо-пентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]уксусную кислоту.
UPLC 08_В4_1: Rt=8,45
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: 4266,5
Пример 60
Тест на образование фибрилл с применением ThT для оценки физической стабильности белковых лекарственных форм
Низкая физическая стабильность пептида может привести к образованию амилоидных фибрилл, которые наблюдаются в виде строго упорядоченных, нитеподобных макромолекулярных структур в пробе, и со временем этот процесс приводит к образованию геля. Традиционно данный процесс измеряли путем визуального наблюдения за пробой. Однако измерение такого типа носит очень субъективный характер и зависит от наблюдателя. Следовательно, более полезным является применение низкомолекулярного индикаторного зонда. Тиофлавин Т (ThT) является подобным зондом, и его флуоресцентные свойства обладают характерными особенностями при связывании с фибриллами [Naiki et al. (1989) Anal. Biochem. 177, 244-249; LeVine (1999) Methods. Enzymol. 309, 274-284].
Динамику образования фибрилл можно описать с помощью сигмоидальной кривой, отображающей следующее уравнение [Nielsen et al. (2001) Biochemistry 40, 6036-6046]:
арр
В этом уравнении F - это флуоресценция ThT во временной точке t. Константа t0 - это время, необходимое для достижения уровня флуоресценции, равного 50% от максимального. Двумя важными параметрами, описывающими образование фибрилл, являются время запаздывания, вычисляемое как t0 - 2τ, и кажущаяся константа скорости, К, равная 1/τ (см. Фиг.20).
Образование частично свернувшегося промежуточного продукта пептида считают основным механизмом инициации образования фибрилл. Несколько таких промежуточных продуктов объединяются в ядро нуклеации, образуя матрикс, с которым могут ассоциировать другие промежуточные продукты, и продолжится формирование фибриллы. Время запаздывания соответствует интервалу, в течение которого накапливается критическая масса ядер нуклеации, а кажущаяся константа скорости - это скорость, с которой образуется сама фибрилла.
2
Перед каждым тестом подготавливали свежие пробы. Композиция каждой пробы описана в легендах фигур. Значение рН пробы подводили до требуемого с помощью соответствующих количеств концентрированных NaOH и HCl. Тиофлавин Т добавляли в пробы из исходного раствора в HO до конечной концентрации 1 мкМ.
Аликвоты пробы по 200 мкл наносили на 96-луночный титрационный микропланшет (Packard OptiPlate™-96, белый полистирол). Обычно от четырех до восьми повторов каждой пробы (соответствующей одному условия испытания) располагали в одном столбце лунок. Планшет запечатывали с помощью Scotch Pad (Qiagen).
Инкубацию при заданной температуре, встряхивание и измерение испускания флуоресценции ThT проводили во флуоресцентном спектрофотометре для чтения планшетов Fluoroskan Ascent FL (Thermo Labsystems). Температуру устанавливали на требуемом уровне, в типичном случае от 30°С до 37°С. Планшеты инкубировали либо без встряхивания (без внешней физической нагрузки), либо с орбитальным встряхиванием при 960 об./мин с амплитудой 1 мм. Измерение флуоресценции осуществляли путем возбуждения при длине волны 444 нм и определения испускания при длине волны 485 нм.
Каждое испытание начинали инкубацией планшета при температуре проведения анализа в течение 10 мин. Считывание показателей с планшета проводили каждые 20 мин. в течение требуемого периода времени. Между каждой парой измерений планшет встряхивали и подогревали как описано.
По завершении теста с ThT объединили от четырех до восьми повторов каждой пробы и центрифугировали при 20000 об./мин. в течение 30 мин. при 18°С. Супернатант профильтровали через фильтр 0,22 мкм и перенесли аликвоту во флакон для проведения ВЭЖХ.
Концентрацию пептида в исходной пробе и в профильтрованном супернатанте определяли с помощью обратнофазовой ВЭЖХ, используя в качестве образца сравнения соответствующий стандарт. Процентную долю, которую составляет концентрация профильтрованной пробы в концентрации исходной пробы, регистрировали в качестве показателя степени извлечения.
Измеренные значения сохраняли в формате Microsoft Excel для дальнейшей обработки, а построение кривой по данным точкам проводили с помощью программы GraphPad Prism. Фоновое испускание, производимое ТПТ в отсутствие фибрилл, было пренебрежимо малым. Точки данных в типичном случае представляли собой среднее значение для 4-8 проб и показаны с планками погрешностей, демонстрирующими стандартное отклонение. На конкретном графике представлены только данные, полученные в одном и том же эксперименте (т.е., для проб на одном и том же планшете), что позволило учесть относительную меру вариации в процессах образования фибрилл между экспериментами. Набор данных можно описать Ур. (1). Однако время запаздывания перед образованием фибрилл можно оценить посредством визуального исследования кривой, определив временную точку, в которой флуоресценция ТПТ значимо превышает уровень фона.
Пример 61
Растворимость пептидов
Растворимость пептидов и белков зависит от значения рН раствора. Часто белок или пептид осаждается в изоэлектрической точке (pI), в которой суммарный заряд равен нулю, или при близком к ней значении рН. При низких значениях рН (т.е., ниже, чем pI) белки и пептиды в типичном случае заряжены положительно, при значениях рН, выше чем pi, они заряжены отрицательно.
В случае терапевтического пептида преимуществом является его растворимость при достаточном уровне концентрации при данном значении рН, которое пригодно как для приготовления стабильной готовой лекарственной формы, так и для введения готовой лекарственной формы пациенту, например, путем подкожной инъекции.
Кривые зависимости растворимости от значения рН определяли следующим образом: приготавливали лекарственную форму или раствор пептида в воде и подводили значение рН в аликвотах до требуемого диапазона с помощью добавления HCl и NaOH. Пробы оставляли уравновешиваться при комнатной температуре на 2-3 дня. Затем пробы центрифугировали. Из каждой пробы отбирали небольшую аликвоту для анализа с помощью обратнофазовой ВЭЖХ с целью определения концентрации белков в растворе. После центрифугирования измеряли значение рН в каждой пробе и строили кривую зависимости концентрации каждого белка от измеренного значения рН.
Пример 62
Растворимость пептидов при рН 7,5
Испытание растворимости при pH7,5 нативного глюкагона и аналогов глюкагона проводили с целью выяснения, достигается ли улучшение растворимости аналогов глюкагона при значениях рН, близких к физиологическому, по сравнению с нативным глюкагоном.
Пробу нативного глюкагона или аналога глюкагона (в типичном случае - 250 нмоль) добавляли в HEPES-буфер (в типичном случае - 1 мл) до номинальной концентрации 250 мкМ. Смесь выдерживали в течение 1 ч при комнатной температуре с периодическим встряхиванием, после чего из раствора отбирали пробу 200 мкл. Пробу центрифугировали (6000 об./мин., 5 мин.), после чего проводили количественный анализ супернатанта с применением хемилюминесцентного, специфичного к азоту, детектора для ВЭЖХ (Antek 8060 HPLC-CLND).
Пример 63
Растворимость/стабильность пептидов

Испытание на стабильность аналогов глюкагона проводили с целью выяснения, достигается ли повышение стабильности растворов, по сравнению с растворами нативного глюкагона. Пробу аналога глюкагона (в типичном случае - 250 нмоль) добавляли в HEPES-буфер (в типичном случае - 1 мл) до номинальной концентрации 250 мкМ. Смесь выдерживали в течение 1 ч при комнатной температуре с периодическим встряхиванием, после чего из раствора отбирали пробу 200 мкл. Пробу центрифугировали (6000 об./мин., 5 мин.), проводили анализ супернатанта с применением сверхэффективной жидкостной хроматографии (UPLC) и определяли площадь пика (по поглощению УФ при 214 нм) в качестве значения показателя при t=0. Из-за плохой растворимости глюкагона при рН7,5 для сравнения включили пробу глюкагона: ГлюкаГен ГипоКит (GlucaGen hypokit), Novo Nordisk, раствор в воде, 250 мкМ, рН2-3. Растворы выдерживали при 30°С в течение 6 дней, после чего раствор профильтровали (фильтровальная установка Millex-GV, 0,22 мкм, мембрана Durapore) и провели анализ с помощью UPLC. Определяли площадь пика (по поглощению УФ при 214 нм) в качестве значения показателя при t=6 дней.
Пример 64
Общая лекарственная форма, содержащая аналог глюкагона (пример 3) и аналог GLP-1 - G1, аналога GLP-1 - G3 и аналог инсулина G5
Исследовали общую лекарственную форму, содержащую аналог глюкагона (пример 3) и ряд пептидов, пригодных для лечения ожирения и диабета. Приготовили следующие лекарственные формы:
1. 250 мкМ аналог глюкагона (пример 3), 10 мМ HEPES рН7,5.
2
2. 250 мкМ аналог глюкагона (пример 3), 0,6 мМ аналог инсулина G5, 0,5 мМ Zn(Ac), 16 мМ м-крезол, 16 мМ фенол, 213 мМ глицерин, рН7,6.
3. 250 мкМ аналог глюкагона (пример 3), 1,6 мМ аналог GLP-1 - G1, 58 мМ фенол, 10 мМ фосфат, рН8,15.
4. 250 мкМ аналог глюкагона (пример 3), 1,2 мМ аналог GLP-1 - G1, 58 мМ фенол, 10 мМ фосфат, рН7,4.
2
5. 0,6 мМ аналог инсулина G5, 0,5 мМ Zn(Ac), 16 мМ м-крезол, 16 мМ фенол, 213 мМ глицерин, рН7,6.
6. 1,6 мМ аналог GLP-1 - G1, 58 мМ фенол, 10 мМ фосфат, рН8,15.
Лекарственную форму 2 получали разведением исходного раствора в воде соответствующего аналога инсулина G5, добавлением м-крезола и фенола и последующим добавлением ацетата цинка. Аналог глюкагона был последним добавляемым компонентом. Схожим образом получали лекарственную форму 5.
Для данных 6 лекарственных форм провели тест на образование фибрилл с применением ТПТ. Пробы инкубировали при 37°С в течение 45 ч при энергичном встряхивании (960 об./мин.) В этих условиях ни в одной из проб не наблюдалось флуоресцентного сигнала от ТПТ и было продемонстрировано полное извлечение из лекарственных форм как аналога глюкагона, так и добавленных пептидов (анализ аналога GLP-1 - G3 не проводили по техническим причинам). Таким образом, объединение в общей лекарственной форме аналога глюкагона (пример 3) с другими пептидами не приводило к снижению стабильности лекарственных форм, по сравнению с лекарственными формами, содержащими отдельные пептиды (лекарственными формами 1, 5 и 6).
Пример 65: Получение производных GLP-1
Были получены следующие соединения GLP-1 (все они являются производными аналогов GLP-1 (7-37)):
Соединение G1:
34
26
ε
N-эпсилон26-((S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламино-бутирил)[Arg34]GLP-1-(7-37), который также можно обозначить как ArgLys(N-(γ-глутамил(Nα-гексадеканоил)))-GLP-1(7-37)-OH:
Соединение G2:
N-эпсилон37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-({транс-4-[(19-карбоксинонадеканоиламино)метил]циклогексанкарбонил}амино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][дезаминоНis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37):
Соединение G3:
N-эпсилон26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(3)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)
Соединение G4:
N-эпсилон37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(15-карбокси-пентадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил][Aib8,22,35,Lys37]GLP-1-(7-37)
Соединение G1 получали, как описано в примере 37 в WO 98/08871. Соединение G2 получали, как описано в примере 26 в WO 09030771. Соединение G3 получали, как описано в примере 4 в WO 2006/097537.
Новое соединение G4 получали способом, схожим со способами, описанными в WO 09/030771, с применением пептидного синтезатора СЕМ Liberty.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: m/z=1046 (М/4)
Расчетное значение (М)=4184.8
Пример 66
ε28
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]-[Leu,Lys]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_A6_1: Rt=5,2 мин.
Способ UPLC: 09_В4_1: Rt=8,3 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=2,0 мин., m/3=1485; m/4=1114; m/5=891
Пример 67
ε28
27
28
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[Leu,Lys]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_А6_1: Rt=5,2 мин.
Способ UPLC: 09_В4_1: Rt=8,3 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=2,1 мин., m/3=1485; m/4=1114; m/5=891
Пример 68
ε24
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu,Ser]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_A6_1: Rt=5,8 мин.
Способ UPLC: 09_В2_1: Rt=12,6 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=2,1 мин., m/3=1471; m/4=1103; m/5=883
Пример 69
ε24
24
27
28
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu,Ser]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_А6_1: Rt=5,8 мин.
Способ UPLC: 09_В2_1: Rt=12,6 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=2,0 мин., m/3=1470; m/4=1103; m/5=883
Пример 70
ε16
16
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_A6_1: Rt=6,41 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=1,9 мин., m/3=1494; m/4=1121; m/5=897
Пример 71
ε24
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu,Ser]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_А6_1: Rt=6,1 мин.
Способ UPLC: 09_В4_1: Rt=8,5 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=2,1 мин., m/3=1374; m/4=1030; m/5=824
Пример 72
ε24
12
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg,Lys,Leu]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_A6_1: Rt=5,9 мин.
Способ UPLC: 09_В4_1: Rt=8,4 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=2,1 мин., m/3=1490; m/4=1118; m/5=894
Пример 73
ε24
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С. Способ UPLC: 04_A9_1: Rt=12,4 мин. Способ UPLC: 08_B2_1: Rt=12,7 мин.
Способ UPLC: 04_В4_1: Rt=8,4 мин.
Способ UPLC: 05_В5_1: Rt=4,7 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=2,1 мин., m/3=1480; m/4=1110; m/5=888
Пример 74
ε24
24
27
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[Lys,Leu]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_А9_1: Rt=11,7 мин.
Способ UPLC: 08_В2_1: Rt=12,6 мин.
Способ UPLC: 08_В4_1: Rt=8,3 мин.
Способ UPLC: 05_В5_1: Rt=4,6 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=2,1 мин., m/3=1780; m/4=1110; m/5=888
Пример 75
ε24
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_А9_1: Rt=11,3 мин.
Способ UPLC: 09_В4_1: Rt=8,4 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=2,1 мин., m/3=1383; m/4=1038; m/5=830
Пример 76
ε25
25
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_А9_1: Rt=10,1 мин.
Способ UPLC: 09_В4_1: Rt=8,0 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=2,1 мин., m/4=1096; m/5=877
Пример 77
ε16
16
27
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[((4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[Lys,Leu]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_A9_1: Rt=11,6 мин.
Способ UPLC: 09_В2_1: Rt=12,5 мин.
Способ UPLC: 09_В4_1: Rt=8,3 мин.
Способ UPLC: 05_В5_1: Rt=4,3 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=2,0 мин., m/3=1494; m/4=1120; m/5=896
Пример 78
ε16
16
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_А9_1: Rt=10,9 мин.
Способ UPLC: 09_В2_1: Rt=12,5 мин.
Способ UPLC: 09_В4_1: Rt=8,3 мин.
Способ UPLC: 05_B5_1: Rt=4,3 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=2,0 мин., m/3=1494; m/7=1120; m/5=896
Пример 79
ε28
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Leu,Lys]глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_А9_1: Rt=10,8 мин.
Способ UPLC: 09_В2_1: Rt=12,7 мин.
Способ UPLC: 09_В4_1: Rt=8,4 мин.
Способ UPLC: 05_В5_1: Rt=4,6 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=2,1 мин., m/3=1387; m/4=1040; m/5=832
Пример 80
ε12
27
29
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Leu,Pro]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_A9_1: Rt=12,9 мин.
Способ UPLC: 09_В4_1: Rt=8,6 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=2,2 мин., m/3=1479; m/4=1110; m/5=888
Пример 81
ε24
24
27
29
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu,Pro]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_А9_1: Rt=12,6 мин.
Способ UPLC: 09_В4_1: Rt=8,4 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=2,1 мин., m/3=1479; m/4=1109; m/5=888
Пример 82
ε28
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Leu,Lys]-глюкагонил-Pro
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_A9_1: Rt=12,4 мин.
Способ UPLC: 09_В2_1: Rt=12,6 мин.
Способ UPLC: 09_В4_1: Rt=8,4 мин.
Способ UPLC: 05_В5_1: Rt=4,9 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Р1=2,0 мин., m/3=1517; m/4=1138; m/5=910
Пример 83
ε12
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)буганоил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Leu]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_A9_1: Rt=12,7 мин.
Способ UPLC: 09_В2_1: Rt=13,0 мин.
Способ UPLC: 09_В4_1: Rt=8,6 мин.
Способ UPLC: 05_В5_1: Rt=5,1 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=2,1 мин., m/3=1480; m/4=1110
Пример 84
ε24
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu]-глюкагонил-Pro
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_А9_1: Rt=12,7 мин.
Способ UPLC: 09_В2_1: Rt=12,6 мин.
Способ UPLC: 09_В4_1: Rt=8,3 мин.
Способ UPLC: 05_В5_1: Rt=5,1 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=2,0 мин., m/3=1512; m/4=1134; m/5=907
Пример 85
ε27
24
29
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Pro]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_А9_1: Rt=11,1 мин.
Способ UPLC: 09_В4_1: Rt=8,2 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_2: Rt=4,4 мин., m/3=1485; m/4=1114; m/5=891;
Пример 86
ε28
27
28
29
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Leu,Lys,Pro]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_A9_1: Rt=12,0 мин.
Способ UPLC: 09_В4_1: Rt=8,6 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_2: Rt=4,4 мин., m/3=1484; m/4=1113; m/5=891
Пример 87
εi27
12
27
29
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg,Lys,Pro]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_A9_1: Rt=9,9 мин.
Способ UPLC: 09_В4_1: Rt=8,2 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_2: Rt=4,2 мин., m/3=1494; m/4=1121; m/5=897
Пример 88
ε24
24
27
N-[(2S)-4-карбокси-2-[[(2S)-4-карбокси-2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: АР_В4_1.: Rt=9,0 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_AP: Rt=9,0 мин., m/3=1480; m/4=1110
Пример 89
ε24
24
27
N-[(2S)-4-карбокси-2-[[(2S)-4-карбокси-2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(2S)-4-карбокси-2-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: АР_В4_1: Rt=9,1 мин. 9204-0000-0163
Способ ЖХ-МС: LCMS_AP: Rt=9,0 мин., m/3=1480; m/4=1111
Пример 90
ε24
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: АР_В4_1: Rt=9,1 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_AP: Rt=8,9 мин, m/3=1437; m/4=1078
Пример 91
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPP3 А и С.
Способ UPLC: 04_A9_1: Rt=13,6 мин.
Способ UPLC: 09_В4_1: Rt=8,6 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=2,2 мин., m/3=1428; m/4=1071; m/5=857
Пример 92
ε24
9
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Glu,Lys,Leu,Ser]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_A9_1: Rt=13,2 мин.
Способ UPLC: 09_В4_1: Rt=8,6 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=3,7 мин., m/3=1428; m/4=1071; m/5=857
Пример 93
ε24
20
21
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Glu,Glu,Lys,Leu,Ser]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_А9_1: Rt=12,5 мин.
Способ UPLC: 09_В4_1: Rt=8,6 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=3,7 мин., m/3=1428; m/4=1071; m/5=857
Пример 94
ε24
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_A9_1: Rt=12,3 мин.
Способ UPLC: 08_В2_1: Rt=11,8 мин.
Способ UPLC: 08_B4_1: Rt=7,8 мин.
Способ UPLC: 05_В5_1: Rt=4,2 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=2,0 мин., m/3=1471; m/4=1103; m/5=882
Пример 95
ε24
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(11-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_A9_1: Rt=10,6 мин.
Способ UPLC: 08_В2_1: Rt=10,6 мин.
Способ UPLC: 08_В4_1: Rt=7,0 мин.
Способ UPLC: 05_В7_1: Rt=6,7 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=1,8 мин., m/3=1452; m/4=1089; m/5=871
Пример 96
ε24
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(13-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_А9_1: Rt=11,2 мин.
Способ UPLC: 09_B2_1: Rt=11,2 мин.
Способ UPLC: 09_В4_1: Rt=7,4 мин.
Способ UPLC: 05_В7_1: Rt=7,2 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=1,9 мин., m/3=1461; m/4=1096; m/5=877
Пример 97
ε24
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_А9_1: Rt=13,6 мин.
Способ UPLC: 09_В2_1: Rt=12,7 мин.
Способ UPLC: 09_В4_1: Rt=8,4 мин.
Способ UPLC: 05_В5_1: Rt=5,1 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=2,1 мин., m/3=1576; m/4=1182; m/5=946
Пример 98
S20
20
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_A9_1: Rt=13,9 мин.
Способ UPLC: 09_В2_1: Rt=13,1 мин.
Способ UPLC: 09_В4_1: Rt=8,7 мин.
Способ UPLC: 05_В5_1: Rt=5,3 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=2,2 мин., m/3=1480; m/4=1110; m/5=888
Пример 99
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[D-Phe4,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_А9_1: Rt=13,4 мин.
Способ UPLC: 09_В4_1: Rt=8,7 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=2,3 мин., m/3=1501; m/4=1126; m/5=901
Пример 100
ε16
16
21
25
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Glu,Arg,Leu]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_А9_1: Rt=11,7 мин.
Способ UPLC: 08_В2_1: Rt=11,5 мин.
Способ UPLC: 08_В4_1: Rt=7,6 мин.
Способ UPLC: 05_В5_1: Rt=4,2 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=2,2 мин., m/3=1488; m/4=1116; m/5=893
Пример 101
ε24
20
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Glu,Lys,Leu,Ser]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_A9_1: Rt=11,5 мин.
Способ UPLC: 09_В4_1: Rt=8,6 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=3,8 мин., m/3=1472; m/4=1104; m/5=884
Пример 102
ε24
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Leu]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_А9_1: Rt=11,1 мин.
Способ UPLC: 09_В2_1: Rt=11,1 мин
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=1,9 мин., m/3=1478; m/4=1109; m/5=888
Пример 103
ε24
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]э токси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Gln]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_A9_1: Rt=11,4 мин.
Способ UPLC: 09_В2_1: Rt=12,1 мин.
Способ UPLC: 09_В4_1: Rt=8,0 мин.
Способ UPLC: 05_В5_1: Rt=3,5 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=1,9 мин., m/3=1485; m/4=1114; m/5=891
Пример 104
ε24
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys,Glu]-гпюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_A9_1: Rt=8,9 мин.
Способ UPLC: 09_В2_1: Rt=12,3 мин.
Способ UPLC: 09_В4_1: Rt=8,2 мин.
Способ UPLC: 05_В5_1: Rt=3,8 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=2,0 мин., m/3=1486; m/4=1114; m/5=892
Пример 105
α
24
27
ε
N([His,Leu]-глюкагонил)-N[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]Lys
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
UPLC: Способ: 04_А6_1: Rt=6,0 мин.
UPLC: Способ: 09_В4_1_214 нм: Rt=8,1 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=2,7 мин., m/3=1526, m/4=1145, m/5=763
Пример 106
ε24
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]-[Lys,Glu]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 04_A9_1: Rt=7,7 мин.
Способ UPLC: 09_В2_1: Rt=12,3 мин.
Способ UPLC: 09_В4_1: Rt=8,2 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=3,9 мин., m/3=1443; m/4=1082; m/5
Пример 107
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys24,Leu27]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С.
Способ UPLC: 09_В2_1: Rt=13,7 мин.
Способ UPLC: 09_В4_1: Rt=9,1 мин.
Способ UPLC: 09_А9_1: Rt=13,1 мин.
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=2,3 мин, m/3=1489,7; m/4=1117,3; m/5=894,2
Пример 108
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(7-карбоксигептаноиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Lys24,Leu27]-глюкагон
Пептид получали в существенной степени как описано в способах SPPS А и С. Способ UPLC: 09_В2_1: Rt=9,7
Способ UPLC: 09_В4_1: Rt=6,5
Способ UPLC: 04_А9_1: Rt=8,4
Способ ЖХ-МС: LCMS_4: Rt=1,8 мин, m/3=1434; m/4=1075,5; m/5=860,8
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ СПОСОБЫ
Тест (I) Активность глюкагона
2
Ген рецептора глюкагона клонировали в клетки НЕК-293, имеющие мембранно-связанный биосенсор молекул цАМФ (ACTOne™). Клетки (14000 на лунку) инкубировали (37°С, 5% CO) в течение ночи в 384-луночных планшетах. На следующий день клетки нагрузили чувствительным к ионам кальция красителем, который распределяется только по цитоплазме. Для того чтобы краситель не выходил из клеток, добавили пробенецид - ингибитор переносчиков органических анионов. Для предотвращения деградации цАМФ добавили ингибитор фосфодиэстеразы. Планшеты помещали в установку FLIPRTETPA и добавляли аналоги глюкагона. Данные в конечной точке собирали через 6 мин. Увеличение количества внутриклеточного цАМФ было пропорционально повышению концентраций ионов кальция в цитоплазме. При связывании ионов кальция с красителем генерировался флуоресцентный сигнал. Значения показателя ЕС50 вычисляли в программе Prism5.
Таблица 1
Данные по связыванию с рецептором in vitro
№ примера
Структура
Tec (I), глюкагон [ЕС50] (нМ)
Глюкагон человека
<img file="00000215.tif" he="12" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,003
Пример 1
<img file="00000216.tif" he="25" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,093
Пример 2
<img file="00000217.tif" he="22" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,149
Пример 3
<img file="00000218.tif" he="22" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,019
Пример 4
<img file="00000219.tif" he="19" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,022
Пример 5
<img file="00000220.tif" he="15" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,020
Пример 6
<img file="00000221.tif" he="15" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,020
Пример 7
<img file="00000222.tif" he="31" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,155
Пример 8
<img file="00000223.tif" he="28" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,022
Пример 9
<img file="00000224.tif" he="28" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,128
Пример 10
<img file="00000225.tif" he="22" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,046
Пример 11
<img file="00000226.tif" he="26" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,019
Пример 12
<img file="00000227.tif" he="18" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,034
Пример 13
<img file="00000228.tif" he="20" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,016
Пример 14
<img file="00000229.tif" he="20" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,020
Пример 15
<img file="00000230.tif" he="21" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,024
Пример 16
<img file="00000231.tif" he="21" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,017
Пример 17
<img file="00000232.tif" he="18" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,003
Пример 18
<img file="00000233.tif" he="19" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,206
Пример 19
<img file="00000234.tif" he="16" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,094
Пример 20
<img file="00000235.tif" he="21" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,109
Пример 21
<img file="00000236.tif" he="21" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,021
Пример 22
<img file="00000237.tif" he="28" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,960
Пример 23
<img file="00000238.tif" he="32" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,540
Пример 24
<img file="00000239.tif" he="25" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,027
Пример 25
<img file="00000240.tif" he="22" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,397
Пример 26
<img file="00000241.tif" he="22" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,192
Пример 27
<img file="00000242.tif" he="22" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,406
Пример 28
<img file="00000243.tif" he="28" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,027
Пример 29
<img file="00000244.tif" he="22" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,135
Пример 30
<img file="00000245.tif" he="21" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,137
Пример 31
<img file="00000246.tif" he="22" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,043
Пример 32
<img file="00000247.tif" he="28" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,0235
Пример 33
<img file="00000248.tif" he="34" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,942
Пример 34
<img file="00000249.tif" he="15" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,018
Пример 35
<img file="00000250.tif" he="19" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,016
Пример 36
<img file="00000251.tif" he="19" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,048
Пример 37
<img file="00000252.tif" he="19" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,033
Пример 38
<img file="00000253.tif" he="19" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,015
Пример 39
<img file="00000254.tif" he="15" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,007
Пример 40
<img file="00000255.tif" he="21" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,007
Пример 41
<img file="00000256.tif" he="21" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,003
Пример 42
<img file="00000257.tif" he="22" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,017
Пример 43
<img file="00000258.tif" he="22" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,003
Пример 44
<img file="00000259.tif" he="20" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,012
Пример 45
<img file="00000260.tif" he="21" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,007
Пример 46
<img file="00000261.tif" he="22" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,003
Пример 47
<img file="00000262.tif" he="19" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,109
Пример 48
<img file="00000263.tif" he="19" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,021
Пример 49
<img file="00000264.tif" he="20" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,150
Пример 50
<img file="00000265.tif" he="20" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,194
Пример 51
<img file="00000266.tif" he="15" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,051
Пример 52
<img file="00000267.tif" he="16" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,055
Пример 53
<img file="00000268.tif" he="18" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,095
Пример 54
<img file="00000269.tif" he="18" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,056
Пример 55
<img file="00000270.tif" he="15" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,009
Пример 56
<img file="00000271.tif" he="22" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,171
Пример 58
<img file="00000272.tif" he="20" wi="116" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,074
Таблица 2
Данные по связыванию с рецептором in vitro, время запаздывания и степень извлечения согласно тесту с ThT
Пример
Тест (I), глюкагон [ЕС50] (нМ)
Тест с ThT [время запаздывания] (ч)
Тест с ThT [степень извлечения] (%)
Глюкагон человека
H-HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT-OH
0,011
1,5
2,5
K10(yGlu-YGIU-C16) глюкагон-NH2
<img file="00000273.tif" he="47" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,006
14
0
16
<img file="00000274.tif" he="19" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,017
1,3
0
51
<img file="00000275.tif" he="15" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,051
45
100
52
<img file="00000276.tif" he="15" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,055
30
95
53
<img file="00000277.tif" he="18" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,095
12
91
54
<img file="00000278.tif" he="18" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,056
5
87
66
<img file="00000279.tif" he="59" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,093
45
100
67
<img file="00000280.tif" he="53" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,116
15
94
68
<img file="00000281.tif" he="46" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,106
45
100
69
<img file="00000282.tif" he="42" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,115
45
100
70
<img file="00000283.tif" he="47" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,105
15
44
71
<img file="00000284.tif" he="34" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,094
45
100
72
<img file="00000285.tif" he="59" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,127
39
100
73
<img file="00000286.tif" he="50" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,079
45
100
74
<img file="00000287.tif" he="53" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,093
45
100
75
<img file="00000288.tif" he="31" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,170
45
100
76
<img file="00000289.tif" he="58" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,988
30
97
77
<img file="00000290.tif" he="38" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,081
2
59
78
<img file="00000291.tif" he="39" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,122
4
59
79
<img file="00000292.tif" he="32" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,141
8
68
80
<img file="00000293.tif" he="58" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
1,577
n.d
n.d
81
<img file="00000294.tif" he="47" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,156
40
100
82
<img file="00000295.tif" he="60" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,128
45
100
83
<img file="00000296.tif" he="51" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
1,878
45
100
84
<img file="00000297.tif" he="39" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,142
45
100
85
<img file="00000298.tif" he="45" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
1,173
7
100
86
<img file="00000299.tif" he="60" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,189
10
82
87
<img file="00000300.tif" he="64" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
2,114
0
95
88
<img file="00000301.tif" he="60" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,037
45
100
89
<img file="00000302.tif" he="44" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,087
45
100
90
<img file="00000303.tif" he="59" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,018
29
84
91
<img file="00000304.tif" he="66" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,053
45
100
92
<img file="00000305.tif" he="63" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
2,2
45
100
93
<img file="00000306.tif" he="48" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,12
45
100
94
<img file="00000307.tif" he="53" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,009
45
100
95
<img file="00000308.tif" he="47" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,009
45
100
96
<img file="00000309.tif" he="52" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,010
45
100
97
<img file="00000310.tif" he="32" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,033
45
100
98
<img file="00000311.tif" he="38" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,058
1
26
99
<img file="00000312.tif" he="56" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,044
45
100
100
<img file="00000313.tif" he="51" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,450
45
100
101
<img file="00000314.tif" he="56" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,307
45
100
102
<img file="00000315.tif" he="53" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,007
45
100
103
<img file="00000316.tif" he="51" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,118
45
100
104
<img file="00000317.tif" he="47" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,101
32
100
105
<img file="00000318.tif" he="51" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,100
1,3
16
106
<img file="00000319.tif" he="66" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,067
2,3
63
107
<img file="00000320.tif" he="28" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
0,116
g
100
108
<img file="00000321.tif" he="22" wi="104" img-content="undefined" img-format="tif" />
1,011
45
100
n.d. - не определено
Тест (II)
Активность GLP-1
2
Ген рецептора GLP-1 клонировали в клетки НЕК-293, имеющие мембранно-связанный биосенсор молекул цАМФ (ACTOne™). Клетки (14000 на лунку) инкубировали (37°С, 5% CO) в течение ночи в 384-луночных планшетах. На следующий день клетки нагрузили чувствительным к ионам кальция красителем, который распределяется только по цитоплазме. Для того чтобы краситель не выходил из клеток, добавили пробенецид - ингибитор переносчиков органических анионов. Для предотвращения деградации цАМФ добавили ингибитор фосфодиэстеразы. Планшеты помещали в установку FLIPRTETPA и добавляли аналоги глюкагона. Данные в конечной точке собирали через 6 мин. Увеличение количества внутриклеточного цАМФ было пропорционально повышению концентраций ионов кальция в цитоплазме. При связывании ионов кальция с красителем генерировался флуоресцентный сигнал. Значения показателя ЕС50 вычисляли в программе Prism5.
Тест (III)
Тест LOCI
Пробы проанализировали на содержание пептида с применением иммунолюминесцентного анализа с каналированием кислорода (LOCI). Донорные шарики были покрыты стрептавидином, а акцепторные шарики были конъюгированы с моноклональным антителом (1F120), специфичным к глюкагону. Другое связывающее глюкагон моноклональное антитело (2F7) было биотинилировано. Три реагента объединяли с аналитом с образованием иммунного комплекса с двумя сайтами связывания. При облучении комплекса из донорных шариков высвобождались синглетные атомы кислорода. Их движение было каналировано к акцепторным шарикам и запускало образование хемилюминесценции, которую измеряли в спектрофотометре для прочтения планшетов EnVision. Количество испущенного излучения было пропорционально концентрации пептида. Один микролитр пробы/калибровочного маркера/контрольной пробы вносили в лунки 384-луночных планшетов для LOCI, затем добавляли 15 мкл смеси покрытых антителом акцепторных шариков (0,5 мкг/лунку) и биотинилированного антитела. Планшеты инкубировали в течение 1 ч при 21-22°С. Затем добавляли в каждую лунку 30 мкл покрытых стрептавидином донорных шариков (2 мкг/лунку) и инкубировали в течение 30 мин. при 21-22°С. Считывание данных с планшетов проводили в спектрофотометре для прочтения многолуночных планшетов Envision при 21-22°С с фильтром, имеющим ширину полосы пропускания 520-645 нм, после возбуждения лазером с длиной волны 680 нм. Суммарное время измерения составило для каждой лунки 210 мс, в том числе 70 мс - время возбуждения.
Тест (IV)
Потеря массы тела у крыс с алиментарным ожирением
В данном исследовании использовали шестьдесят четыре крысы Спрейг-Даули с диетой с высоким содержанием жиров (Research Diet D12492) и восемь - с диетой с низким содержанием жиров (Research Diet D12450B), полученных от компании Taconic Europe. Масса тела крыс перед введением доз препарата составляла примерно 970 г и 730 г, соответственно. У крыс был свободный доступ к воде, и их содержали по отдельности, что позволяло проводить ежедневный мониторинг потребления пищи. Освещение было выключено в период с 10 часов утра до 10 часов вечера.
Крыс разделили на группы по восемь особей и вводили подкожно (п/к) один раз в день дозы препарата, содержащие две испытуемые субстанции, в течение 15 дней; объем дозы составлял 0,5 мл/кг. Перед началом введения доз крыс ежедневно приучали к манипуляциям и к п/к введению дозы в течение 5 дней. Крысам вводили дозы аналога глюкагона - N-эпсилон24-([2-[2-[2-[[(4S)-5-гидрокси-4-[(18-гидрокси-18-оксооктадеканоил)амино]5-оксопентаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]-этокси]этокси]ацетил]])[Lys17,Lys18,Glu21,Lys24,Leu27]-глюкагона (пример 3) или G3.
Экспериментальные группы с диетой с высоким содержанием жиров были следующими: группа 1: носитель (получили две инъекции носителя), группа 2: аналог глюкагона (пример 3): 30 нмоль/кг и одна инъекция носителя; группа 3: аналог глюкагона (пример 3) 300 нмоль/кг и одна инъекция носителя; группа 4: G3 1 нмоль/кг и одна инъекция носителя; группа 5: аналог глюкагона (пример 3) 30 нмоль/кг и G3 1 нмоль/кг; группа 6: аналог глюкагона (пример 3) 300 нмоль/кг и G3 1 нмоль/кг; группа 7: две инъекции носителя и получение такого же питания, что и группа 6. Группе 8 давали питание с низким содержанием жира и сделали две инъекции носителя. На пятый день введения дозы аналога глюкагона (пример 3) скорректировали с 30 нмоль/кг до 3 нмоль/кг и с 300 нмоль/кг до 30 нмоль/кг из-за резкой потери крысами массы тела.
На 11 день у крыс был определен профиль содержания глюкозы в крови. Крыс умерщвляли на 15 или 16 день и отбирали пробы крови для измерения уровней инсулина и холестерола.
Тест (V)
Экспериментальный протокол испытания эффективности влияния на аппетит производного глюкагона с применением модели на крысах, имеющих свободный доступ к пище
В экспериментах использовали крыс Спрейг-Даули (SD), полученных от компании Taconic Europe (Дания). В начале эксперимента масса тела крыс составляла 200-250 г. Крыс доставляли за 14 дней до начала эксперимента, чтобы дать им акклиматизироваться в экспериментальных условиях. За этот период с крысами два раза проводили манипуляции. После доставки крыс содержали по одной в течение одной недели в условиях обращенного цикла чередования света и темноты (что означает, что освещение было выключено в дневное время и включено в ночное время) в течение двух недель. Так как крысы в норме активны и поглощают основную часть пищи из объема ежедневного потребления в течение темного периода, крысам вводили дозы препарата утром, непосредственно перед выключением освещения. Такие условия проведения эксперимента позволяют получить наименьшую вариабельность данных и наибольшую чувствительность испытания. Эксперимент проводили в клетках, в которых содержались крысы, при этом крысы имели свободный доступ к пище и воде в течение периода акклиматизации и периода проведения эксперимента. Каждую дозу производного соединения испытывали в группе из 5 крыс. В каждый набор групп для испытания была включена группа из 6-7 крыс, которым вводили носитель. Крысам один раз вводили подкожно (п/к) в растворе дозу, соответствующую массе тела, из расчета 0,01-3 мг/кг. После введения дозы крыс возвращали в их клетки, где у них был доступ к пище и воде. Потребление пищи записывали отдельно для каждой крысы: непрерывно, с помощью регистрации в режиме он-лайн, или вручную ежечасно в течение 7 часов, а затем через 24 ч и еще раз - через 48 ч. По окончании эксперимента животных подвергали эвтаназии. Данные для каждой крысы заносили в таблицы программы Microsoft Excel. Выбросы значений исключали после применения критерия Граббса для статистической оценки выбросов. Данные приводили в виде зависимости суммарного потребления пищи от времени. Было проведено сравнение между группой, которой вводили носитель, и экспериментальными группами с применением t-критерия Стьюдента или однофакторного дисперсионного анализа.
Тест (VI)
Испытание стабильности к действию DPP-IV
10 мкМ пептидов инкубировали с DPP-IV (2 мкг/мл) в двух повторных пробах при 37°С в HEPES-буфере с добавлением 0,005% Твин-20. В этом эксперименте в качестве положительного контроля применяли GLP-1 человека. Отбирали аликвоты пробы во временных точках 3, 15, 30, 60, 120 и 240 мин. и добавляли три объема этанола для остановки реакции. Пробы анализировали с помощью ЖХ-МС на содержание исходного пептида. По данным строили график, описывающий кинетику реакции первого порядка, и определяли стабильность как значение периода полужизни.
Тест (VII)
Фармакокинетический профиль
Пятнадцать самцов крыс (Спрейг-Даули, 400 г, Taconic Europe) разделили на три группы по пять крыс. Крысам вводили дозы во временной точке t=0:15 нмоль/кг внутривенно, 30 нмоль/кг подкожно или 100 нмоль/кг, соответственно. Внутривенное введение осуществляли в хвостовую вену во время кратковременного воздействия на крысу анестезии с применением фторированного простого эфира. Отбирали пробы крови из подъязычной вены во временных точках t=-15 мин., 5 мин. (только у крыс, получавших дозу внутривенно), 15 мин., 30 мин., 1 ч, 1,5 ч, 2 ч, 4 ч, 6 ч, 12 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч. Пробы плазмы хранили замороженными до проведения анализа с применением ЖХ-МС.
Тест (VIII)
Зависимость растворимости от значения рН
Растворимость пептидов и белков зависит от значения рН раствора. Часто белок или пептид осаждается в изоэлектрической точке (pI), в которой суммарный заряд равен нулю, или при близком к ней значении рН. При низких значениях рН (т.е., ниже, чем pI) белки и пептиды в типичном случае заряжены положительно, при значениях рН, выше чем pI, они заряжены отрицательно.
В случае терапевтического пептида преимуществом является его растворимость при достаточном уровне концентрации при данном значении рН, которое пригодно как для приготовления стабильной готовой лекарственной формы, так и для введения готовой лекарственной формы пациенту, например, путем подкожной инъекции.
Кривые зависимости растворимости от значения рН определяли следующим образом: приготавливали лекарственную форму или раствор пептида в воде и подводили значение рН в аликвотах до требуемого диапазона с помощью добавления HCl и NaOH. Пробы оставляли уравновешиваться при комнатной температуре на 2-4 дня. Затем пробы центрифугировали. Из каждой пробы отбирали небольшую аликвоту для анализа с помощью обратнофазовой ВЭЖХ с целью определения концентрации белков в растворе. После центрифугирования измеряли значение рН в каждой пробе и строили кривую зависимости концентрации каждого белка от измеренного значения рН.