Способ прогнозирования течения рака мочевого пузыря
METHOD FOR BLADDER CANCER COURSE PREDICTION

Изобретение относится к области медицины, онкоурологии, диагностики с помощью инвазивных методов и может быть использовано для прогнозирования течения рака мочевого пузыря.
Рак мочевого пузыря (РМП) является одним из наиболее распространенных злокачественных новообразований. В 2010 г. в РФ было выявлено 10731 впервые заболевших. В структуре онкологической заболеваемости на долю РМП приходилось 4,5%. Заболеваемость РМП в 2010 г. составила 5,85 на 100000 населения; по сравнению с 2000 г. она увеличилась на 15,65%. Мужчины заболевали в 4,5 раза чаще, чем женщины. Средний возраст заболевших 67 лет.
Повышенный риск имеют рабочие на производстве и применении красителей, текстильных и резиновых предприятиях, водители грузовиков, рабочие химической и нефтяной промышленности, предприятий, производящих алюминий, парикмахеры. Большинство канцерогенов - ароматические амины и их производные (β-нафтиламин, бензидин, 4-аминобифенил, нитрозоамины). Латентный период от контакта с канцерогеном до появления опухоли может составлять около 20 лет. Одной из причин развития РМП традиционно считают курение: курильщики болеют РМП в 2-3 раза чаще, чем некурящие. Установлена связь между развитием плоскоклеточного РМП и хроническим циститом, вызванным Schistosoma haematobium. Заболевание носит эндемический характер и распространено в Северной Африке.
В последние годы обсуждается вопрос иных возможных причин высоких темпов прироста заболеваемости раком мочевого пузыря. Большинство исследователей отмечают значимые различия выживаемости больных и частоты рецидивирования внутри групп пациентов даже с одинаковой глубиной инвазии и степенью дифференцировки. Это затрудняет прогнозирование клинического течения болезни и выбор соответствующей тактики лечения (Аль-Шукри С.Х. и соавт, 2000; Матвеев Б.П., 2003). Проведено большое количество исследований, направленных на выявление дополнительных факторов риска прогрессирования и рецидивирования рака мочевого пузыря, однако, мнения специалистов неоднозначные и универсального прогностического критерия обнаружить не удалось. Поэтому данная задача требует соответствующего решения.
Известно прогнозирование течения рака мочевого пузыря на основе биологических прогностических факторов (Fontana D. et al. Molecular biology in uro-oncology: clinical application. Prognostic factors in bladder cancer// Arch Ital Urol Androl. 1997 Sep;69(4):253-6). При исследовании поверхностной опухоли мочевого пузыря с использованием моноклонального антитела MIB-1 (Ki-67) была отмечена корреляция между показателем пролиферации (P.I.) и уровнем рецидивирования. В частности, наличие P.I. выше 40% коррелирует с большей частотой рецидивов. Аналогично, экспрессия белка р21 коррелирует с большей частотой рецидива. При поверхностном раке мочевого пузыря показана также корреляция между экспрессией белка р53 и более ранним и частым рецидивированием.
Известен способ диагностики и лечения пациентов, страдающих поверхностным раком мочевого пузыря (RU 2284039 С2, 20.02.2006), при котором, помимо определения концентраций канцерогенов: анилина, толуилина, диэтиланилина, дифенила, 1-нафтоламина в моче и нарушения уродинамики, дополнительно оценивают пролиферативную активность уротелия по степени экспрессии Ki-6. Материал, взятый при выполнении мультифокальной биопсии во время проведения трансуретральной резекции опухоли и коррекции шейки мочевого пузыря, визуально не измененной, слизистой мочевого пузыря у пациентов, страдающих переходно-клеточным раком мочевого пузыря, фиксируют в растворе формалина, готовят срезы толщиной 4 мкм и окрашивают Ki-67 с использованием РАР-(пероксидазно-антипероксидазного) метода, с использованием моноклонального антитела Ki-67 Antigen фирмы Dako - клон MIB-1 и проявляющей системы LSAB2 фирмы Dako. Оценку интенсивности окрашивания путем цитофотометрии 50 произвольно выбранных клеток переходно-клеточного эпителия на полученных видеоизображениях окрашенных микропрепаратов проводят с помощью компьютерной микроскопической видеосистемы Quantimet 550 IW фирмы Leica, Англия, для цифрового анализа патоморфологического и цитологического материала и углубленной диагностики с камерой высокого разрешения, позволяющей проводить количественный анализ изображения по реальным цветам или оптическим плотностям с форматом изображения 6000 на 4000 пикселей. Степень экспрессии Ki-67 оценивают в баллах (max-4), учитывая существование прямой зависимости между экспрессией Ki-67 и пролиферативной активностью уротелия (Wu Т. The role of bcl-2 p-53 and Ki-67 index is predicting tumor recurrence for low superficial transitional cell bladder carcinoma. / T. Wu, J.N. Chen, Y. Lee // J. Urol. - 2000. - Vol. 163. - P. 758-760.) В зависимости от степени пролиферативной активности уротелия прогнозируют течение рака мочевого пузыря и, соответственно, определяют дальнейшую тактику лечения. В частности, в случае изменений уродинамики в сторону увеличения объема остаточной мочи с ростом концентрации канцерогенов в послеоперационном периоде (ТУР) сохраняющийся высокий уровень экспрессии Ki-67 после проведенного лечения предлагается рассматривать как неблагоприятный прогноз течения рака мочевого пузыря с необходимостью проведения цистэктомии.
+
+
-5
Известен способ прогнозирования агрессивного течения уротелиальной карциномы путем исследования иммунологической реакции по отношению к молекулярным подтипам уротелиальной карциномы, с оценкой прогностического эффекта инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL) и связанных с опухолью макрофагов (ТАМ) в срезах тканей из мышечно-инвазивных опухолей мочевого пузыря (Sjodahl G. et al. Infiltration of CD3 and CD68 cells in bladder cancer is subtype specific and affects the outcome of patients with muscle-invasive tumors// Urol Oncol. 2014 Aug; 32(6):791-7). Тканевые микрочипы с 296 опухолями, охватывающими все патологические стадии и классы, анализировали с использованием антител к CD3, CD8, FOXP3, CD68 и CD163. Случаи были классифицированы по следующим молекулярным подтипам: уробазальная, геномно-неустойчивая и плоскоклеточная карцинома с использованием иммуногистохимии и гистологии. Оценивали регрессию Кокса и анализ Каплана-Мейера в отношении выживаемости без прогрессирования и выживаемостью по конкретным заболеваниям в качестве конечных точек. Молекулярные подтипы уротелиальной карциномы демонстрируют разную степень иммунологических ответов: уробазальный подтип индуцирует слабый ответ, геномно-неустойчивый подтип индуцирует промежуточный ответ, а подсемейство, похожее на плоскоклеточный рак, вызывает сильный отклик. Эти специфичные ответы подтипа не зависят от стадии опухоли и включают как TIL, так и ТАМ. Наличие инфильтрирующих CD3 (+) TIL было значимо связано с хорошим прогнозом в случаях мышечно-инвазивной опухоли (Р<0,01). Эта положительная ассоциация была модулирована присутствием CD68 (+) ТАМ. Значимая связь с прогнозом плохого выживания наблюдалась при высоком соотношении между CD68 и CD3 (Р=7×10). Таким образом, молекулярные подтипы уротелиальной карциномы вызывали иммунологические ответы на разных уровнях. Высокое соотношение CD68 / CD3 определяло группу неблагоприятного прогноза среди случаев мышечно-инвазивной уротелиальной карциномы.
Известен также способ прогнозирования течения и степени переходно-клеточной карциномы мочевого пузыря по уровню фактора роста гепатоцитов в сыворотке крови (Gohji K. et al. Independent prognostic value of serum hepatocyte growth factor in bladder cancer// J Clin Oncol. 2000 Aug; 18(16):2963-71). Уровни фактора роста гепатоцитов в сыворотке и тканях пациентов с поверхностным раком и мышечно-инвазивным измеряли с помощью иммуноадсорбентного анализа, с использованием антител к факторам роста гепатоцитов. Уровни фактора роста гепатоцитов в сыворотке и тканях пациентов с мышечно-инвазивным раком были значительно выше, чем у пациентов с поверхностным раком мочевого пузыря (Р<0,0001 и Р=0,0054 соответственно). Степень повышения уровня над нормальным уровнем фактора роста гепатоцитов в сыворотке первых (61,1%) была значительно выше, чем у последних (8,4%, Р<0,0001). Среди пациентов с поверхностным раком мочевого пузыря общая выживаемость пациентов с низким уровнем фактора роста гепатоцитов в сыворотке оказалась значительно выше, чем у пациентов с высокими уровнями (Р=0,005). Среди пациентов с минимально инвазивным раком мочевого пузыря безрецидивная и общая выживаемость пациентов с высоким уровнем фактора роста гепатоцитов в сыворотке была значительно ниже, чем у тех, у которых были низкие уровни (Р<0,001 и Р=0,0028, соответственно). Таким образом, уровень фактора роста гепатоцитов в сыворотке крови может быть предсказателем выживаемости пациента и степени рака мочевого пузыря.
В настоящее время активно обсуждается вопрос об этиологической роли инфекционных агентов, в частности, вирусов, в генезе развития различных злокачественных опухолей, в том числе и рака мочевого пузыря, их влиянии на частоту рецидивирования и развития инвазивных и метастатических форм. Так, считается доказанной этиологическая роль высокоонкогенных типов вируса папилломы человека (ВПЧ) при плоскоклеточном раке шейки матки и верхних дыхательных путей (Тюляндин С.А., 2008). Вместе с тем, появились публикации, указывающие на влияние ВПЧ на возникновение рака мочевого пузыря, однако, данные весьма противоречивы (Мяндина Г.И., Пягай П.Э., Иткес А.В., 2003; Frank G., Zavalishina L., Andreeva Y.Y. 2006; Андреева Ю.Ю., 2008). В литературе также имеются публикации о роли герпес-вирусов в этиологии рака мочевого пузыря как моноинфекции, так и в сочетании с вирусом папилломы человека (ВПЧ), внутриклеточными микроорганизмами (в частности, с хламидийной инфекцией). Однако вновь получены весьма неоднозначные результаты (Мяндина Г.И., Пягай П.Э., Иткес А.В., 2003; Youshya S, Purdie K, Breuer J, Proby С, 2005; Frank G., Zavalishina L., Andreeva Y.Y. 2006; Андреева Ю.Ю., 2008; Abol-Enein H., 2009).
Следует отметить возможную роль вируса простого герпеса 2 типа (ВПГ 2 типа) в качестве кофактора канцерогенеза, инициирующего развитие клеточной дисплазии и поддерживающего ее в состоянии стабилизации. В литературе есть указания на онкомодулирующий эффект цитомегаловируса (ЦМВ) при глиобластомах, опухолях кишечника. Вирус Эпштейн-Барра (ВЭБ) является представителем онкогенных ДНК-содержащих вирусов, и диапазон онкологических заболеваний, ассоциированных с ним, постоянно увеличивается: доказано участие ВЭБ в развитии лимфомы Беркитта, назофарингеальной карциномы, рака желудка.
Известна связь частоты рецидивирования и развития инвазивных и метастатических форм рака мочевого пузыря с возрастающими титрами ряда противовирусных антител (Лоран О.Б. с соавт. Роль некоторых вирусов в канцерогенезе рака мочевого пузыря// Ж. "Экспериментальная и клиническая урология", вып. 3, 2015 г.). Так, было проведено обследование и лечение 54 больных (44 мужчин и 10 женщин) в возрасте от 38 до 90 лет (средний возраст 64,6±9,93), поступивших в урологическое отделение в большинстве случаев в экстренном порядке в связи с макрогематурией. Всем пациентам выполнены общий анализ крови, мочи, УЗИ почек, мочевого пузыря, анализ крови на IgG, IgM к герпесу (ВПГ) I и II типа, цитомегаловирусу (ЦМВ), вирусу Эпштейна-Барр (ВЭБ), ПЦР мочи к вышеуказанным вирусам, соскоб из уретры на выявление ВПЧ высокого онкогенного риска. В работе использовали общепринятые методы статистической обработки. Для определения связи между изучаемыми параметрами применяли корреляционный анализ Пирсона (r) или Спирмена (R). Статистически значимыми принимались различия при p<0,05. При этом у 53 больных был диагностирован рак мочевого пузыря, в одном случае выявлена папиллома мочевого пузыря. Стадия опухолевого процесса соответствовала T1N×М0 в 61% случаев (33 больных), T2N×M0 в 22,2% (12 больных), в 14,8% случаях имел место местно-распространенный процесс. Примерно в половине случаев (у 28 больных) выявлено множественное поражение мочевого пузыря, в остальных - единичные опухолевые образования.
Антитела класса иммуноглобулинов М (IgM) к ЦМВ не были выявлены ни у одного пациента. Что касается уровней антител класса IgG к ЦМВ, то у пациентов с высокодифференцированным, первично выявленным, не мышечно-инвазивным уротелиальным раком мочевого пузыря уровень IgG-антител был практически в два раза ниже, чем у больных с низкодифференцированным (p=0,2), рецидивным (p=0,02), местно-распространенным процессом (p=0,0014). Различий между уровнем анти-ЦМВ IgG у пациентов с единичными или множественными опухолями мочевого пузыря не выявлено. Отмечается высокая корреляция между уровнем анти-ЦМВ IgG и стадией процесса, рецидивным характером опухоли и уровнем антител к ранним антигенам ВЭБ. Значимых изменений между уровнем IgG к ВПГ I и II типов и стадией процесса, степенью анаплазии и рецидивным характером опухоли не было выявлено.
Однако некоторые различия в данном известном исследовании оказались статистически недостоверными из-за небольшого количества больных, включенных в исследование, и неравномерности их распределения по группам.
На фоне ЦМВ может развиваться инфицирование другими видами вирусов или бактериями, т.е. суперинфекция. Доказано, что ЦМВ инфицирует В-клетки, латентно инфицированные ВЭБ, более эффективно, чем ВЭБ-негативные. М. Michaeles и соавт. считают, что ЦМВ может инфицировать опухолевые клетки (не являясь онкогенным вирусом) и модулировать свойства опухоли в сторону появления инвазивных свойств и способности ее к метастазированию, тем самым оказывая онкомодулирующий эффект. Для оказания такого действия необходима длительная персистенция вируса в организме. При этом ЦМВ не способен инициировать подобные изменения в неопухолевых клетках. Высокие титры анти-ЦМВ IgG у больных раком мочевого пузыря, особенно рецидивным, свидетельствуют о длительной персистенции этого вируса и периодической его активации.
Таким образом, до даты подачи настоящей заявки на изобретение было известно выявление высоких титров анти-ЦМВ IgG у больных раком мочевого пузыря, причем их уровень был значительно выше у больных с рецидивным характером опухоли, высокой степенью анаплазии и высокой стадией процесса. Были определены высокие коррелятивные связи между уровнем анти-ЦМВ IgG и стадией процесса, рецидивным характером опухоли и уровнем ранних антител к ВЭБ.
Из публикации Лоран О.Б. с соавт. (Латентная герпес-вирусная инфекция в онкогенезе рака мочевого пузыря, Портал Consilium Medicum: 2015, номер 3, http://con-med.ru/magazines/contemporary/contemporary-03-2015/) также известно статистически достоверное повышение уровня вирусных антител у больных рецидивным, местно-распространенным раком мочевого пузыря высокого потенциала злокачественности; статистически значимые коррелятивные связи между наличием вирусных ДНК ЦМВ и ВЭБ в опухоли, уровнем их антител, стадией процесса и рецидивным характером опухоли.
Среднее значение иммуноглобулина G (IgG) к капсидному антигену (VCA) в данном исследовании составило 365±269 ед/мл (положительный результат - более 20 ед/мл). При этом уровень антител при первичном поражении и высокодифференцированных опухолях был несколько выше, чем при рецидивных и низкодифференцированных (372±43,81 ед/мл и 388±233,88 ед/мл по сравнению с 344,85±274,87 ед/мл и 377±50,88 ед/мл соответственно, р>0,05). Однако данные были статистически недостоверны из-за небольшой выборки и неравномерного распределения их в группе.
Антитела класса иммуноглобулинов G (IgG) к раннему антигену (early antigen - ЕА) достигают высокого титра на 3-4-й неделе острой ВЭБ инфекции и исчезают через 2-6 месяцев. Они появляются при реактивации и отсутствуют при атипичной форме заболевания. Высокие титры антител к раннему антигену выявляют при хронической ВЭБ инфекции, раковых и аутоиммунных заболеваниях, иммунодефицитных состояниях. IgG-EA более 40 ед/мл (положительный) был выявлен у 5 больных с низкодифференцированными опухолями, в одном случае опухоль была рецидивная, у трех был выявлен мышечно-инвазивный рак (Т2-Т4), в двух случаях в опухоли была выявлена ДНК ВЭБ. При сомнительных результатах (от 20 до 40 ед/мл) у двух больных со стадией T1N0M0 выявлена низкодифференцированная опухоль с безрецидивным периодом около 4 месяцев в одном случае. У двух больных имел место местно-распространенный рак.
Антитела класса иммуноглобулинов G к ядерному антигену ВЭБ (EBNA) (положительный результат более 20 ед/мл) появляются через 1-6 месяцев после первичной инфекции. Затем их титр уменьшается и сохраняется в течение всей жизни. При реактивации ВЭБ инфекции происходит повторное увеличение их титра и возможно развитие различных клинических форм (аутоиммунных процессов, генерализованной инфекции, гемофагоцитарного синдрома и т.д.), в том числе развитие онкологических заболеваний. При этом уровень антител IgG-EBNA у больных с рецидивными опухолями примерно в два раза выше, чем с первичными (р=0,03), то есть реактивация вирусной инфекции у этой категории больных в течение жизни происходит чаще, что, возможно, и обуславливает возникновение рецидива. Аналогична картина и в отношении степени анаплазии и стадии процесса. Так, средний уровень этих антител при низкодифференцированных опухолях по данным упомянутой выше публикации составил 173,3±221,21 ед/мл, при высокодифференцированных - 129±135,05 ед/мл (р>0,05). При стадии Т1 средний уровень антител колебался в пределах 156,88±179,5 ед/мл, тогда как при местно-распространенном раке мочевого пузыря их уровень составил 167,6±267,4 ед/мл (р>0,05). Несмотря на статистическую недостоверность результатов, в данном известном исследовании имела место тенденция к увеличению уровня анти-ВЭБ IgG-EBNA в зависимости от стадии процесса и степени анаплазии.
Таким образом, высокий уровень антител к ядерному белку (EBNA) ВЭБ свидетельствует о высокой частоте реактивации вирусной инфекции у этой категории больных, причем у больных с рецидивным течением, высоким потенциалом злокачественности и местно-распространенным процессом реактивация происходит чаще, чем у больных с первичной опухолью низкого потенциала злокачественности и неинвазивным раком мочевого пузыря. У больных с высоко дифференцированными опухолями и изначально местно-распространенным раком изменяется уровень антител к капсидному белку (анти-ВЭБ IgG-VCA). У наиболее тяжелой категории больных с опухолями высокого потенциала злокачественности, распространенным процессом, высокой частотой рецидивирования имело место повышение уровня белков ранней фазы (анти-ВЭБ Ig-EA). Титр различных антител коррелирует с повышенным уровнем антител других вирусов, наличием ВЭБ и других вирусов в опухоли, стадией процесса.
Учитывая охарактеризованные выше известные исследования, можно сделать вывод, что высокие титры анти-ЦМВ IgG и ряда других антител у больных раком мочевого пузыря характерны для рецидивного характера опухоли. Также имеет место тенденция к увеличению их уровня в зависимости от стадии процесса и степени анаплазии. Значительное повышение IgG-EA свидетельствовало о неблагоприятном течении заболевания (высокая степень злокачественности, быстрое наступление рецидива, распространенность процесса). Однако приведенные в исследованиях данные не были статистически достоверны.
Приведенная публикация Лоран О.Б. с соавт. может быть выбрана в качестве ближайшего аналога данного изобретения.
При этом задачей заявленного нами способа прогнозирования течения рака мочевого пузыря являлось создание четких количественных критериев достоверного прогнозирования, независимо от его стадии и типа, рецидивирования и инвазивного течения рака мочевого пузыря.
Техническим результатом, достигаемым при решении поставленной задачи изобретения является точность, достоверность прогнозирования, независимо от его стадии и типа, неблагоприятного (рецидивирования и инвазивного течения) и благоприятного течения рака мочевого пузыря, при использовании обычного иммуноферментного анализа на выявление уровней определенных противовирусных антител.
Для достижения данного технического результата способ прогнозирования течения рака мочевого пузыря осуществляют следующим образом.
У пациента натощак осуществляют забор крови из локтевой вены и проводят иммуноферментный анализ на выявление уровней антител IgG в сыворотке крови к следующим вирусам: Эпштейна-Барр анти-ВЭБ IgG-EBNA, анти-ВЭБ IgG-VCA, анти-ВЭБ IgG-EA, цитомегаловируса анти-ЦМВ IgG, вирусов простого герпеса 1 и 2 типов анти-ВПГ IgG,
и при выявлении любого из следующих значений уровней антител делают вывод о достоверном риске неблагоприятного течения рака мочевого пузыря, независимо от его стадии и типа, в виде раннего рецидивирования и увеличения инвазивного роста:
- анти-ВЭБ IgG-EBNA не менее 275 ед/мл,
- анти-ВЭБ IgG-VCA не менее 583 ед/мл,
- анти-ЦМВ IgG не менее 670 ед/мл,
- анти-ВПГ IgG не менее 19,5 ед/мл,
при выявлении анти-ВЭБ IgG-EA не более 10,0 ед/мл делают вывод о достоверно благоприятном прогнозе течения рака мочевого пузыря - неинвазивном росте и низком риске рецидивирования опухоли.
Для поиска критериальных, достоверных значений уровней перечисленных антител нами было проведено обследование 100 больных (72 мужчин и 28 женщин) в возрасте от 38 до 90 лет (средний возраст 65±10) с диагнозом рак мочевого пузыря. В процессе обследования были выполнены: анализ крови на IgG, М к ВПГ 1 и 2 типов, ЦМВ, ВЭБ. Ткань опухоли и моча у пациентов взяты на ПЦР-диагностику наличия вирусов ВПГ 1 и 2 типов, ВПЧ высокого онкогенного риска, ЦМВ, ВЭБ. У больных была произведена оценка воспалительной инфильтрации в опухолевой ткани и подлежащей строме. Полуколичественно от 0 до 3 баллов (отсутствие, слабая, умеренная и выраженная степень) оценивались следующие признаки:
1. Лимфоцитарно-плазмоцитарный инфильтрат: а) в опухоли, б) рассеянный в подлежащей строме, в) периваскулярная инфильтрация, г) очаговая гиперплазия лимфоидной ткани в виде лимфоидных фолликулов.
2. Активность воспаления: а) степень лейкоцитарного инфильтрата, б) степень эозинофильной инфильтрации.
3. Цитопатические изменения: а) внутриклеточные включения (койлоцитоз), б) внутриядерные включения.
Из более ранних научных публикаций известно, что данные морфологические изменения свидетельствуют о неблагоприятном прогнозе течения рака мочевого пузыря в отношении его рецидивирования и инвазивного роста. Так, в отношении неблагоприятного прогноза течения рака при инфильтративных, лимфоцитарных, активных воспалительных изменениях, см., например: Ayari С. et al. High level of mature tumor-infiltrating dendritic cells predicts progression to muscle invasion in bladder cancer// Hum Pathol. 2013 Aug; 44(8): 1630-7; Nomura S. et al. Plasmacytoid variant of urothelial carcinoma of urinary bladder: a case report// Nihon Hinyokika Gakkai Zasshi. 2013 Jan; 104(1):26-9); Sato K. et al. Plasmacytoid urothelial carcinoma of the urinary bladder: a case report and immunohistochemical study// Pathol Res Pract. 2009; 205(3):189-94; Suzuki T. et al. Intravesical mass consisting of mucosa-associated lymphoid tissue// Int J Urol. 2004 Nov; 11(11):1028-30; Korabecna M. et al. Molecular diagnosis of Epstein-Barr virus in paraffin-embedded tissues of tumors with abundant lymphoid infiltration// Neoplasma. 2003; 50(1):8-12; Kimura M. et al. Carcinoma of the urinary bladder with a lymphomatous appearance// Pathol Int. 2001 Jul; 51(7):555-9; Valli V.E. et al. Pathology of canine bladder and urethral cancer and correlation with tumour progression and survival// J Comp Pathol. 1995 Aug; 113(2):113-30; Flamm J. et al. The value of tumor-associated tissue inflammatory reaction in primary superficial bladder cancer// Urol Res. 1990; 18(2): 113-7;  A.V. et al. Relation of the stage of disease and degree of cellular anaplasia to lymphoid-cellular stromal infiltration in bladder cancer patients// Urol Nefrol (Mosk). 1986 Jul-Aug; (4):35-8; Gamallo C. et al. Lymph node pattern and peritumoral lymphoid infiltration in cancer of the bladder. Prognostic value// Arch Esp Urol. 1978 Jan-Feb; 31(1):11-26.
В отношении цитопатических включений (койлоцитоз, внутриядерные включения): Hartveit F. et al. Koilocytosis in neoplasia of the urinary bladder// Br J Urol. 1992 Jan; 69(1):46-8; Feuer G.A. et al. Vulvar Paget's disease: the need to exclude an invasive lesion// Gynecol Oncol. 1990 Jul; 38(1):81-9; Hartveit F. et al. One of 8 women with bladder neoplasia may have concomitant gastrointestinal pathology, including cancer// J Urol. 1989 Sep; 142(3):716-8.
В нашем исследовании были установлены уровни противовирусных антител, при которых выявляются данные морфологические изменения, которые, по вышеупомянутым данным литературы, являются доказанными факторами неблагоприятного прогноза течения опухолевого процесса в мочевом пузыре.
Таким образом, были установлены четкие корреляционные взаимоотношения конкретных уровней противовирусных антител с морфологическими изменениями, позволяющие с большой долей вероятности, достоверно спрогнозировать дальнейшее течение опухолевого процесса в мочевом пузыре.
Данный вывод позволяет производить прогнозирование течения рака мочевого пузыря, не требуя биопсии, определения стадии процесса, типа опухоли, поскольку иммуноферментное исследование противовирусных антител может быть выполнено в любой лаборатории с использованием минимально инвазивного исследования - взятия на анализ венозной крови пациента.
При наших исследованиях применялся ROC (Receiver Operator Characteristic) анализ для выявления показателей уровня противовирусных антител в качестве прогностического фактора. Для этого вычисляли параметр - площадь под кривой (AUC) для определения качества модели. Качество модели в зависимости от AUC (площадь под кривой): 0,9-1,0 - отличное; 0,8-0,9 - очень хорошее; 0,7-0,8 - хорошее; 0,6-0,7 - среднее; до 0,6 - неудовлетворительное.
У пациентов с рецидивным характером опухоли имело место повышение уровня анти-ЦМВ IgG (616,5±501,46 vs 339,06±306,61, р=0.0017) и анти-ВЭБ IgG-EBNA (254,99±222,23 vs 143,54±169,89, р=0.0118). Для прогноза рецидива опухолевого роста на основании показателя анти-ЦМВ IgG получена модель очень хорошего качества, выявлена точка «cutoff» = 670 ед/мл, т.е. прогностическое значение показателя, разделяющее больных с рецидивным характером опухоли от первичного поражения мочевого пузыря (рис. 1). Для больных со стадией процесса Т1 точка разбиения также составила 670 ед/мл. Относительный риск OP(RR)=2,96, 95% д.и. (1,41-6,23).
Учитывая наличие коррелятивных связей между морфологическими изменениями (рис. 2, 3), в частности, лимфоидно-плазмоцитарного звена, цитопатическими изменениями и стадией процесса, а также степенью анаплазии, мы попытались найти точки разбиения уровня противовирусных антител и упомянутых морфологических изменений как показателей неблагоприятного течения опухолевого процесса.
Суммируя сводные данные диаграммы 1 (рис. 2), можно сказать, что чем более выражены цитопатические изменения (наличие внутриядерных включений) и изменения лимфоцитарно-плазмоцитарного звена, тем выше стадия процесса. В отношении степени анаплазии (рис. 3) прослеживается та же тенденция: чем выше степень анаплазии, тем более выражены изменения лимфоцитарно-плазмоцитарного звена. Наличие папилломатоза свидетельствует, наоборот, о более благоприятном течении опухолевого процесса, что соответствует данным литературы (Epstein J.I. et al. Biopsy interpretation of the bladder. 2-nd Ed.: Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2004, p. 271; Chow N. et al. Papillary urothelial hyperplasia is a clonal precursor to papillary transitional cell bladder cancer// Int J Cancer 2000; 89:514).
Для прогнозирования наличия лимфоцитов в опухоли (рис. 4) и периваскулярной лимфоидной инфильтрации (рис. 5) на основании показателя анти-ВЭБ IgG-EBNA получена модель хорошего качества, выявлена точка «cutoff» = 61,2 ед/мл для обоих показателей. Следует отметить, однако, что специфичность данных для показателя наличия лимфоцитов в опухоли крайне низка. Таким образом, повышение уровня анти-ВЭБ IgG-EBNA более 61,2 ед/мл свидетельствует о появлении у пациентов, страдающих раком мочевого пузыря, как периваскулярной, инфильтрации, так и лимфоцитов в опухоли, что может свидетельствовать о тенденции к неблагоприятному течению.
Койлоцитоз был выявлен у 44 из 71 пациента (62,0%). Были выявлены умеренные коррелятивные связи между наличием койлоцитоза и уровнем анти-ВПГ IgG (R=0,266, р=0,026). Для прогноза наличия койлоцитоза на основании показателя уровня анти-ВПГ IgG получена модель хорошего качества, выявлена точка «cutoff» = 17,2 ед/мл (рис. 6). Вполне возможно, что именно вирусы простого герпеса выступают в качестве ко-фактора ВПЧ инфекции.
Наличие деструктивных изменений клеток коррелирует со стадией заболевания, поэтому на основании показателя анти-ВЭБ IgG-EBNA для прогноза наличия деструкции поверхности опухолевых клеток была получена модель очень хорошего качества, выявлена точка «cutoff» = 180 ед/мл. Таким образом, можно предполагать прогрессию опухолевого роста при повышении уровня анти-ВЭБ IgG-EBNA более 180 ед/мл (рис. 7).
Если рассматривать прогностические точки (точки разбиения) уровня противовирусных антител у больных мышечно-неинвазивным раком мочевого пузыря, то, несмотря на то, что не все данные были статистически достоверными, мы получили модели хорошего и отличного качества с высоким доверительным интервалом. Сводные данные представлены в таблице 1.
Для каплевидного (щупальцеобразного) вида инвазии характерны обратные коррелятивные связи со степенью дифференцировки опухоли (R=-0,215, р=0,051). Поэтому данный признак также может свидетельствовать о возможном неблагоприятном дальнейшем развитии рака мочевого пузыря. В отношении каплевидного типа инвазии как признака возможного начала инвазивного роста на основании уровня анти-ВПГ 1 и 2 типов IgG, мы получили модель хорошего качества. Выявлена точка «cutoff» = 19,5 ед/мл, рис. 8.
Таким образом, при наличии общей тенденции соответствия определенных уровней антител определенным морфологическим изменениям в тканях мочевого пузыря - уже имеющимся, либо только развивающимся - для наиболее достоверного прогноза неблагоприятного течения рака мочевого пузыря мы принимаем наиболее высокие из выявленных нами значений уровней анти-ВЭБ IgG-EBNA, анти-ВЭБ IgG-VCA, анти-ЦМВ IgG, анти-ВПГ IgG антител, которые мы и указали в формуле изобретения. При этом следует отметить, что более низкие их значения не исключают неблагоприятного прогноза (просто недостаточно достоверны) и, напротив, не являются свидетельством прогноза благоприятного. Эти значения приведены лишь для демонстрации как таковых определенных и упомянутых здесь четких корреляционных связей между уровнями противовирусных антител и морфологическими изменениями, для которых, в свою очередь, известны корреляции с более благоприятным или менее благоприятным течением рака мочевого пузыря. Наличие таких корреляций и позволяет нам говорить о возможности достоверного прогнозирования течения рака мочевого пузыря по уровням соответствующих антител.
В качестве клинического примера, подтверждающего достоверность прогнозирования по заявленному способу, приводим следующие данные.
Обследовали, в соответствии с заявленным способом, 112 больных (82 мужчин и 30 женщин) в возрасте от 36 до 85 лет с диагнозом рак мочевого пузыря. Наибольшую группу представлял собой переходноклеточный инвазивный рак (инфильтративная уротелиальная карцинома). В группу с переходноклеточным раком также были включены 8 случаев развития рака на фоне паппиломатоза и/или инвертированной папилломы. Инвазия в мышечный слой (мышечно-инвазивный рак) наблюдалась в 23 случаях, и наибольшее распространение процесса (стадия Т3-4) - в 18 случаях. Для всех опухолей определялась степень дифференцировки (степень анаплазии). Данные распределения по степени анаплазии представлены в таблице 2.
Более выраженная степень лимфоидной инфильтрации как в подлежащей строме, так и непосредственно в опухоли, имела место у пациентов с наличием ДНК вирусов в опухоли (2 балла - 20,7% vs 45,2%, р=0,025, 3 балла - 44,8% vs 14,3%, р=0,005; 3 балла в опухоли - 34,5% vs 4,8%, р=0,002). Такое усиление иммунологической активности в сочетании с высокими показателями вирусных антител свидетельствовало о хронической вирусной инфекции, локализации ее в стенке мочевого пузыря с возможной индукцией опухолевого процесса и изменения степени анаплазии в сторону более низкодифференцированных форм, т.е. большей злокачественности течения.
Выявлено наличие вирусных ДНК в опухолевой ткани у 34 пациентов (21 мужчины и 13 женщин). Инфицирование ткани ВЭБ имело место в 27 случаях, в 6 случаях - ЦМВ, у 5 больных - ВПЧ высокого онкогенного риска (16, 39, 45, 52, 59), в одном случае выявлен ВПГ 1, 2 типов. ДНК нескольких вирусов из 34 больных выявлено у четверых (ВПЧ+ВЭБ в одном случае, ВЭБ+ЦМВ - у двоих пациентов, ЦМВ+ВЭБ+ВПЧ - у одного больного). В 56% случаев опухоли являлись низкодифференцированными.
Наиболее часто ДНК ВЭБ была обнаружена у пациентов с низкодифференцированной опухолью.
Койлоцитоз умеренной степени как показатель цитопатических изменений клеток был более выражен у вирус-негативных пациентов (2 балла - 10,3% vs 28,6%, р=0,046), тогда как выраженный койлоцитоз, наоборот, был более характерен для пациентов с выявленной вирусной ДНК в опухоли (27,6% vs 9,5%, р=0,06). По всей видимости, у данной категории больных имеет место суперинфекция, т.е. сочетание ВПЧ и других вирусов, что и приводит к более выраженным цитопатическим изменениям. Нельзя не отметить также высокий уровень герпес-вирусных антител у этой категории больных.
Внутриядерные включения слабой степени выраженности и деструкция поверхности клетки умеренной степени были статистически достоверно выше в группе пациентов с отсутствием вируса в опухоли (10,7% vs 28,6%, р=0,053; 4% vs 22%, р=0,02).
При последующем сравнении морфологических изменений у пациентов с первичной и рецидивной опухолями выявлено большее количество лимфоцитов (62,5% vs 40,8%, р=0.059), очаговой гиперплазии лимфоидной ткани (62,5% vs 36,8%, р=0,025), эозинофилов (62,5% vs 35,5%, р=0,02) у пациентов с рецидивными формами. Тогда как наличие папилломатоза, характеризующегося образованием сосочков, выростов с пролиферацией эпителия на поверхность, (71,4% vs. 33,3%), выраженного койлоцитоза (3 балла - 22% vs 4,8%) было более характерно для первичных форм рака мочевого пузыря.
Выявлены преимущественно умеренные коррелятивные связи между наличием ДНК ЦМВ в опухоли и очаговой гиперплазией лимфоидной ткани в виде фолликулов (R=0,33, р=0,008), периваскуярной инфильтрацией (R=0,206, р=0,085), койлоцитозом (R=0,237, р=0,046), наличием лейкоцитов и эозинофилов (R=0,241, р=0,047 и R=0,22, р=0,068). Тогда как наличие ДНК ВЭБ в опухоли коррелировало с рассеянной лимфоидной инфильтрацией как в подлежащей строме (R=0,326, р=0,006), так и в опухоли (R=0,348, р=0,003) и периваскулярной инфильтрацией (R=0,288, p=0,019).
Имела место обратная зависимость между уровнем анти-ЦМВ IgG и наличием папилломатоза мочевого пузыря (R=-0,386, р=0,006), и прямая между уровнем анти-ВПГ IgG и койлоцитозом (R=0,26, р=0,026).
Если рассматривать выявленные нами морфологические изменения в зависимости от стадии процесса и степени дифференцировки, видно, что для более распространенного процесса характерно увеличение количества лимфоцитов, лейкоцитов, эозинофилов, деструктивных изменений клеток, а также как очаговой, так и периваскулярной лимфоидной инфильтрации. Тогда как папилломатоз более характерен для начальных стадий рака мочевого пузыря. Практически те же самые изменения мы наблюдаем при низко дифференцированной градации опухоли. Папилломатоз более характерен для высокодифференцированных опухолей мочевого пузыря, т.е. для более благоприятного его течения.
В катамнезе, на протяжении трех лет были прослежены 98 из 112 больных, для которых прогнозирование течения рака мочевого пузыря по заявленному способу полностью подтвердилось: независимо от типа и стадии опухоли, с которыми больной первично поступал в клинику и проходил соответствующее лечение, рецидивирование леченной опухоли, возникшее не позднее двух лет после лечения, подтвердилось в 92% случаев прогноза, увеличение степени инвазии - в 89%, благоприятный прогноз (отсутствие рецидивов и усиления инвазивного роста) - в 93% случаев прогнозирования, в соответствии с установленными у пациентов уровнями противовирусных антител при их первичном обращении в клинику.
Таким образом, установленные значения уровней противовирусных антител можно рассматривать как критерии достоверного прогнозирования, соответственно, благоприятного или неблагоприятного течения рака мочевого пузыря, независимо от его стадии и типа.