Оценка терапевтического потенциала РНК-интерференции интерстициальной коллагеназы для лечения псориаза

ОЦЕНКА ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ ИНТЕРСТИЦИАЛЬНОЙ КОЛЛАГЕНАЗЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПСОРИАЗА

Ю. А. Могулевцева1, А. В. Мезенцев2 С. А. Брускин2

1 Российский государственный аграрный университет-МСХА имени К. А. Тимирязева, Москва

2 Лаборатория функциональной геномики, отдел генетических основ биотехнологии, Институт общей генетики имени Н. И. Вавилова РАН, Москва

Матриксные металлопротеиназы играют важную роль в поддержании гомеостаза кожи, заживлении ран и инициации воспалительного процесса. При псориазе матриксные металлопротеиназы участвуют в структурных перестройках эпидермиса и регуляции проницаемости микрокапилляров дермы, способствуя инфильтрации кожи клетками иммунной системы. В силу этого умение контролировать активность матриксных металлопротеиназ представляется необходимым для успешного лечения псориаза. Целью данной работы являлась оценка возможных изменений в патогенезе псориаза в результате РНК-интерференции интерстициальной коллагеназы в эпидермальных кератиноцитах. Для этого клетки трансдуцировали лентивирусными частицами, кодирующими в геноме малую интерферирующую РНК. Для анализа уровней экспрессии генов использовали метод полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени». Ферментативную активность определяли методом зимографии. Согласно полученным результатам РНК-интерференция привела к снижению уровня экспрессии гена и ферментативной активности интерстициальной коллагеназы в 20 и 4 раза соответственно. При этом экспрессия гомологичных генов (MMP2, -9 и -12) менялась незначительно. Напротив, нами были показаны изменения в уровнях экспрессии генов цитокератинов (KRT1: 16,89 ± 0,97; KRT14: 2,36 ± 0,19; KRT17: 0,12 ± 0,01; KRT18: 0,56 ± 0,02), инволюкрина (0,79 ± 0,11) и филаггрина (6.99 ± 0,97). Помимо этого, РНК-интерференция вызвала существенное снижение скорости миграции клеток, хотя практически не повлияла на их пролиферацию. Таким образом, терапевтический потенциал малых интерферирующих РНК, специфичных к интерстициальной коллагеназе, заключается в нормализации экспрессии важных для патогенеза псориаза генов (IVL, FLG, KRT1, -14 -17 и -18).

Ключевые слова: псориаз, интерстициальная коллагеназа, лентивирусы, трансдукция, трансфекция, малая интерферирующая РНК, цитокератины, инволюкрин, филаггрин

Благодарности: авторы благодарят проф. Элеонору Пирузян (Институт общей генетики имени Н. И. Вавилова РАН) за критический анализ текста рукописи и проф. Марию Лагарькову (Институт общей генетики имени Н. И. Вавилова РАН) — за предоставление необходимых для работы плазмид.

СК] Для корреспонденции: Мезенцев Александр Викторович ул. Губкина, д. 3, г Москва, 119333; mesentsev@vigg.ru

Статья получена: 17.02.2017 Статья принята к печати: 25.03.2017

RNA INTERFERENCE TARGETING INTERSTITIAL COLLAGENASE IS A POTENTIAL THERAPEUTIC TOOL TO TREAT PSORIASIS

Mogulevtseva YuA1, Mezentsev AV2 Bruskin SA2

1 Russian State Agrarian University - Timiryazev Moscow Agricultural Academy, Moscow, Russia

2 Laboratory of Functional Genomics, Department of Genetics and Biotechnology,

Vavilov Institute of General Genetics of the Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia

Matrix metalloproteinases play an important role in maintaining skin homeostasis, promote wound healing, and are involved in triggering inflammation. They are implicated in the structural changes occurring in the epidermis of psoriatic patients and also facilitate infiltration of the skin by immune cells by regulating permeability of dermal capillaries. In this light, control over the enzymatic activity of matrix metalloproteinases is crucial for a successful treatment outcome in patients with psoriasis. The aim of this work was to investigate the effect of RNA interference on the progression of psoriasis by targeting interstitial collagenase of epidermal keratinocytes. As part of the experiment, the latter were transduced with lentiviral particles that encode small hairpin RNA. Gene expression was measured by real time polymerase chain reaction. Enzymatic activity was measured by zymography. RNA interference was found to lead to a 20- and 4-fold decrease in the expression and enzymatic activity of interstitial collagenase, respectively. Expression of homologous genes (MMP2, -9 and -12) changed insignificantly. In contrast, there were marked changes in expression of cytokeratin (KRT1: 16.89 ± 0.97; KRT14: 2.36 ± 0.19; KRT17: 0.12 ± 0.01; KRT18: 0.56 ± 0.02), involucrin (0.79 ± 0.11) and filaggrin (6.99 ± 0.97). Besides, RNA interference caused a significant decline in cell migration rates, although it did not affect cell proliferation. Thus, small hairpin RNAs targeting interstitial collagenase are potentially therapeutic for psoriatic patients due to their ability to regulate expression of genes implicated in psoriasis (IVL, FLG, KRT1, -14 -17, and -18).

Keywords: psoriasis, interstitial collagenase, lentiviruses, transduction, transfection, small hairpin RNA, cytokeratins, involucrin, filaggrin

Acknowledgements: the authors thank Prof. Eleonora Piruzian of Vavilov Institute of General Genetics for a critical analysis of the manuscript and Prof. Maria Lagarkova of Vavilov Institute of General Genetics for the plasmids used in this study.

EK] Correspondence should be addressed: Aleksandr Mezentsev ul. Gubkina, d. 3, Moscow, Russia, 119333; mesentsev@vigg.ru

Received: 17.02.2017 Accepted: 25.03.2017

Псориаз является наиболее распространенным дерматозом [1]. К числу основных признаков псориаза обыкновенного, на который приходится до 90 % вновь регистрируемых случаев болезни, относятся видоизменение внешнего облика кожных покровов (образование псориатических бляшек), хроническое воспаление кожи и, как следствие, инфильтрация кожи клетками иммунной системы. На молекулярном уровне для заболевания характерно изменение уровней экспрессии генов, связанных с дифферен-цировкой эпидермальных кератиноцитов: в пораженной болезнью коже разнонаправленно изменяются уровни экспрессии генов цитокератинов (уменьшение экспрессии и KRT14 и увеличение — и ^Л8), инволю-

крина и филаггрина.

К сожалению, вылечить псориаз пока нельзя, а существующие медицинские препараты позволяют контролировать болезнь только в течение определенного периода времени. По этой причине поиск новых подходов к лечению псориаза остается актуальной социально значимой задачей, которая требует безотлагательного решения. Очевидно, что для разработки эффективных методов лечения заболевания необходимо знать, каким образом происходит образование псориатических бляшек и как можно воздействовать на этот процесс. В свою очередь, для этого необходимо установить основных участников патогенеза псориаза и охарактеризовать их роль в развитии патологии.

Объектом наших исследований является интерсти-циальная коллагеназа (ИК), которая при псориазе играет важную роль в структурных перестройках эпидермиса, взаимодействии эпидермальных кератиноцитов друг с другом, а также в регуляции проницаемости микрокапилляров дермы для клеток иммунной системы [2]. Также известно, что нарушения в экспрессии генов некоторых матриксных металлопротеиназ, включая ИК, совпадают по времени с обострением псориаза, а содержание кодируемых ими белков в пораженной болезнью ткани коррелирует со степенью тяжести заболевания. По этой причине нам представляется важным уметь контролировать ме-таллопротеиназную активность в пораженных болезнью участках кожи.

Ранее для контроля активности матриксных металло-протеиназ предполагалось использовать их специфичные ингибиторы. Однако разработка таких веществ и их внедрение в клиническую практику были признаны нецелесообразными. В одних случаях причиной отказа от использования ингибиторов была их низкая эффективность [3], в других — тяжелые побочные эффекты, которые могли представлять серьезную угрозу для жизни пациентов [4]. Одним из способов контроля экспрессии генов матрикс-ных металлопротеиназ может стать РНК-интерференция («нокдаун») целевого гена, т. е. воздействие на пораженную болезнью область кожи препаратами, способными избирательно разрушать его транскрипты (молекулы мРНК). Например, такие препараты могли бы содержать невирулентные вирусные частицы, которые при попадании в клетку нарабатывали бы в ней специфичную малую интерферирующую РНК (эИРНК) [5, 6].

Важно отметить, что, согласно данным литературы, разные линии клеток характеризуются разной эффективностью трансфекции даже при использовании одного и того же протокола. Так, по сравнению с клетками эмбрионального почечного эпителия человека НЕК293, эффективность трансфекции и трансдукции эпидермальных ке-ратиноцитов человека НаСаТ сравнительно невелики [7].

Это может происходить, по меньшей мере, по двум причинам. Во-первых, несмотря на то, что НаСаТ — это иммор-тализованные клетки, в них в отличие от других клеточных линий продолжают работать механизмы, защищающие клетку от попадания чужеродной РНК. В частности, НаСаТ экспрессируют рецепторы Т1_Я3 и Т1_Я7, ответственные за ее распознавание [8, 9]. Во-вторых, по своему происхождению НаСаТ относятся к эпидермальным кератино-цитам. В живом организме эти клетки выполняют, прежде всего, барьерную функцию, предотвращая попадание в него микробов и вредных химических соединений, а также ослабляют действие вредного излучения (например, УФ или ионизирующей радиации). В силу этого не удивительно, что клетки НаСаТ более устойчивы к действию транс-фекционных реагентов чем, например, клетки внутренних органов [10]. Поэтому доставка эИРНК в первичные клетки, например при проведении аналогичных экспериментов на животных, особенно в клетки кожи, представляется нам весьма нетривиальной задачей.

В работе были оценены изменения в патогенезе псориаза, вызываемые РНК-интерференцией ИК в эпидермаль-ных кератиноцитах человека.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Культивирование клеток

Клетки культивировали в среде DMEM, которая содержала L-глутамин («ПанЭко», Россия), антибиотик-антимикотик и 5 % эмбриональной сыворотки теленка (Thermo Fisher Scientific, США). В процессе роста клеток культуральную среду меняли через день. При покрытии клетками 70-75 % ростовой поверхности чашки культуру пересевали. В каждую новую чашку переносили пятую часть собранных клеток. Для подсчета клеток использовали камеру Горяева. Для анализа фотографических изображений трансдуци-рованных клеток (измерений площади, занятой клетками, и определения долей клеток, обладающих флуоресценцией) использовали сервисные опции Freehand selection и Cell counter программы ImageJ (NIH, США) соответственно.

Получение трансгенных эпидермальных кератиноцитов

Для получения генетически модифицированных вирионов, в геноме которых закодированы нужные для нашей работы shPHK, нами была проведена трансфекция клеток эмбрионального почечного эпителия человека HEK293 (одной из так называемых packaging cell lines) набором из четырех плазмид: pMDLg-pRRE, pREV-TRE, pCMV_VSV_G и pGPV. Плазмиды pMDLg-pRRE, pREV-TRE, pCMV_VSV_G, которые кодировали гены, участвующие в сборке вирионов, были любезно предоставлены проф. М. А. Лагарьковой (Институт общей генетики имени Н. И. Вавилова РАН). Векторы лентивирусного происхождения pGPV-17019250-ММП1 и pGPV-17019250-кММт, в геноме которых были закодированы shPHK, были получены, как описано ранее [11, 12]. Соответственно, вектор pGPV-17019250-ММШ использовали для получения клеток с «нокдауном» ИК, а вектор pGPV-17019250-кММШ — для получения контрольных клеток, которые экспрессировали «бессмысленную» (контрольную) shPHK. Немаловажно также, что в исходном векторе pGPV были также закодированы гены фактора устойчивости к пуромицину и зеленого флюоресцентного белка (PuroR и copGFP соответственно),

необходимые для отбора клеток, устойчивых к упомянутому антибиотику. Непосредственно перед началом эксперимента упомянутые выше плазмиды смешивали в весовом соотношении 10 : 5 : 2 : 10. К полученному водному раствору плазмид добавляли необогащенную питательную среду (DMEM) и реагент для трансфекции метафектен (Metafectene; Biontex, Германия), следуя указаниям фирмы-производителя. По окончании 15-минутной инкубации, которую проводили при комнатной температуре, раствор добавляли в культуру клеток HEK293, которая находилась в активной фазе роста (30-40 % покрытия ростовой поверхности чашки). Через 6 ч после начала трансфекции культуральную среду меняли на свежую. В течение последующих за трансфекцией четырех дней проводили отбор среды, содержавшей вирионы. Собранную среду фильтровали от попавших в нее клеток (диаметр пор фильтра — 0,4 мкм) и использовали для трансдукции клеток HaCaT.

Для проведения трансдукции использовали культуры эпидермальных кератиноцитов человека HaCaT, находившиеся в фазе активного роста (не более 60 % покрытия ростовой поверхности чашки) и питательную среду, собранную при проведении трансфекции клеток HEK293. В течение 4 дней, следующих за трансфекцией HEK293, питательную среду в чашках с HaCaT заменяли фильтрованной средой, собранной при трансфекции HEK293. Затем в течение недели, следующей за трансдукцией, клетки культивировали в питательной среде, которая содержала 5 мкг/мл пуромицинa (Thermo Fisher Scientific), для того чтобы провести их селекцию на устойчивость к данному антибиотику. Таким образом, в результате трансдукции были получены две новые линии клеток (HaCaT-ИК и HaCaT-KTP) с различным уровнем экспрессии ИК.

Получение клеточного гомогената

Для получения гомогенатов использовали культуры клеток, покрывавшие 60-70 % ростовой поверхности чашки. Клетки ресуспендировали в буфере RIPA следующего состава: 25 мМ ТРИС, 150 мМ NaCl, 0,1 % додецилсульфат натрия, 0,5 % дезоксихолат натрия, 1 % NP-40, pH 7.4 (Thermo Fisher Scientific). Буфер охлаждали до температуры 2-8 °C до полного разрушения клеток (1-2 мин) из расчета 500 мкл буферного раствора на флакон (общая площадь флакона — 25 см3).

Определение концентрации белка

Для определения концентрации белка использовали флуориметрический метод и набор реагентов Qubit Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с указаниями фирмы-производителя.

Электрофорез белков в полиакриламидном геле и зимография

Для проведения электрофореза в полиакриламидном геле использовали метод Лэммли [13, 14]. Концентрация акриламида в разделяющем и концентрирующем гелях составляла 10 и 5 % соответственно. Для проведения зи-мографии использовали 10 % полиакриламидный гель, содержавший 4 мг/мл коллагена (Thermo Fisher Scientific). Компоненты геля смешивали на ледяной бане при температуре 2-8 °C, а его полимеризацию проводили при комнатной температуре. Для электрофоретического раз-

деления белков и последующей обработки геля использовали ранее опубликованный протокол [15]. Количественную оценку ферментативной активности ИК проводили методом денситометрии, используя сервисную опцию Gels программы ImageJ.

Получение суммарной РНК

Для выделения суммарной РНК из клеток использовали TRIZOL (Thermo Fisher Scientific), как описано ранее [16]. Качество препаратов РНК проверяли методом электрофореза в 1,5 % агарозном геле в неденатурирующих условиях. Для измерения концентрации РНК использовали флюориметрический метод и набор реагентов Qubit RNA BR Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с указаниями фирмы-производителя.

ПЦР в режиме «реального времени»

Перед проведением эксперимента из образцов выделенной РНК получали кДНК, используя набор реагентов MMLV RT («Евроген») в соответствии с указаниями фирмы-производителя. При проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме «реального времени» использовали праймеры выбранных генов из базы данных Probe [17], образцы кДНК и набор реагентов qPCRmix-HS SYBR + HighROX («Евроген»). Для приготовления проб указанные компоненты смешивали между собой в соответствии с указаниями фирмы-производителя. Общий объем пробы составлял 25 мкл, конечная концентрация праймеров — 1 мкМ, а предполагаемая концентрация кДНК — 4 мкг/мл. Эксперименты проводили на приборе Eco (Illumina, США) в 48-луночных планшетах, предоставленных фирмой-производителем прибора, в соответствии с прилагаемыми инструкциями. Температура амплификации составляла 60 °С. Перед началом эксперимента планшеты запечатывали прозрачной пленкой. После этого, чтобы избежать неравномерного распределения содержимого проб в лунках, планшеты центрифугировали (100 g; 3 мин; 18 °С). Полученные результаты нормализовали к уровню экспрессии гена ACTB. Результаты анализировали при помощи программы Eco, предоставленной производителем прибора. Экспериментальный дизайн предполагал использование трех биологических повторов для каждой из проб. Помимо этого каждый эксперимент повторяли трижды.

Количественная оценка пролиферации клеток

Для количественной оценки пролиферации в 6-луночные планшеты высевали по 40 000 клеток на лунку. Ежедневно случайно выбранные образцы обрабатывали 0,25 % раствором трипсина-ЭДТА («ПанЭко»), после чего, используя камеру Горяева, в них определяли количество клеток. Данные по образцам использовали для построения кривых роста. Результаты представляли в линейных координатах. Каждый эксперимент повторяли трижды.

Количественная оценка миграции клеток

Для проведения количественной оценки миграции клетки культивировали до тех пор, пока они полностью не покрывали поверхность культуральной чашки. Перед началом эксперимента, используя носик для автоматической пипетки, по поверхности чашки проводили прямую линию, очищая от клеток полосу шириной ~1,25 мм. Полученные

таким образом образцы культивировали в течение 5-6 дней, ежедневно фотографируя участки не занятых клетками областей. Для количественной оценки свободной от клеток ростовой поверхности использовали сервисную опцию Freehand selection программы ImageJ.

Статистическая обработка результатов

трансдуцированных клеток морфологические признаки: границы образованных ими колоний были «размыты», а по достижении конфлюэнтности клетки образовывали правильный монослой.

Особенности профиля генной экспрессии в трансдуцированных клетках

Результаты измерений представляли в виде: среднее значение ± стандартное отклонение (т ± БЭ). Для сравнения средних значений двух и более групп использовали од-нофакторный дисперсионный анализ. Если вероятность ошибки при отклонении нулевой гипотезы не превышала 0,05, то статистические различия между средними величинами считали статистически значимыми.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Получение лентивирусных частиц

При проведении трансфекции флуоресценция трансфи-цированных НЕК293 была заметна уже на следующий день после начала эксперимента, а в последующие дни доля флуоресцирующих клеток возрастала до 75-85 % (рис. 1А). Помимо этого, нами было установлено, что транс-фекция вектором, который кодирует shРНК, специфичную к ИК, влияет на прикрепление клеток к ростовой поверхности. Так, в отличие от клеток, трансфицированных вектором, кодирующим контрольную shРНК (НЕК293-КТР), клетки, трансфицированные вектором, кодирующим специфичную shРНК (НЕК293-ИК), остаются в прикрепленном состоянии при «подкислении» среды, которое можно было наблюдать при их продолжительном культивировании, и требуют обработки трипсином при необходимости пересеять культуру.

Получение эпидермальных кератиноцитов с экспрессией э1пРНК и их последующая селекция на устойчивость к пуромицину

При проведении трансдукции клеток НаСаТ флуоресценция в трансдуцированных клетках была заметна на второй день проведения эксперимента. При этом доля флуоресцирующих клеток в образцах не превышала ~10 % (рис. 1Б). На третий и четвертый день доля клеток НаСаТ с флуоресценцией возрастала до 35-50 %.

Полученные образцы клеток проверяли на устойчивость к антибиотику пуромицину. В течение первых 3 дней культивирования происходило резкое снижение количества клеток. При этом нетрансдуцированные клетки (отрицательный контроль) оказались неустойчивы к действию антибиотика (рис. 1В). Напротив, количество жизнеспособных клеток в других образцах составило ~15-25 % от общего числа клеток, обработанных антибиотиком.

Помимо этого, нами было установлено, что клетки, трансдуцированные вирионами, кодирующими shРНК, специфичную к ИК (НаСаТ-ИК), и контрольную shРНК (НаСаТ-КТР), различаются по своим морфологическим признакам. Так, клетки НаСаТ-ИК образовывали колонии с резко очерченными границами (рис. 2А). При этом сами клетки часто располагались одна над другой, что свидетельствовало об образовании между ними более прочных по сравнению с клетками НаСаТ-КТР контактов (рис. 2Б). Напротив, НаСаТ-КТР сохраняли характерные для не-

Использование РНК-интерференции позволило снизить уровень экспрессии гена ИК примерно в 20 раз. При этом анализ уровней экспрессии генов, кодирующих матрикс-ные металлопротеиназы (ММР2, ММР9 и ММР12), проведенный методом количественной ПЦР, не выявил статистически значимых изменений (рис. 3А). Напротив, нами были обнаружены изменения в уровнях экспрессии генов инво-люкрина и филаггрина (0.79 ± 0.11 и 6.99 ± 0.97 соответственно, рис. 3Б). В здоровой коже упомянутые гены играют ключевую роль в дифференцировке эпидермальных кератиноцитов. Помимо этого, в клетках с недостатком ИК происходят изменения в экспрессии генов, кодирующих характерные для эпидермиса здоровой и пораженной псориазом кожи цитокератины (рис. 3В). Так, в клетках НаСаТ-ИК по сравнению с клетками НаСаТ-КТР экспрессия первых (^Т1 и ^Т14) возрастала в 16,89 ± 0,97 и 2,36 ± 0,19 раз соответственно, а экспрессия вторых (№Т17 и ^Т18) снижалась до 0,12 ± 0,01 и 0,56 ± 0.02 соответственно.

100

'5 80

60

в- 40 -

20

60 -

45 -

я 30

& 15

3

2

3

Время культивирования, дни

120

100

* 80

60

40 -

20

ТРД НТР

а

1

2

3

Время культивирования, дни

Рис. 1. Лентивирусная трансдукция клеток. (А) Изменение доли флуоресцирующих клеток НЕК293 при проведении трансфекции; (Б) Изменение доли флуоресцирующих клеток НаСаТ при проведении трансдукции; (В) Изменение числа клеток в образцах при отборе клеток, устойчивых к пуромицину. ТРД — трансдуцированные клетки; НТР — нетрансдуцированные клетки (отрицательный контроль). Трансдукцию и трансфекцию клеток проводили так, как описано в разделе «Материалы и методы»

0

0

2

4

0

0

4

5

Пролиферация и миграция трансдуцированных клеток

Анализ кривых роста клеток НаСаТ-ИК и НаСаТ-КТР не выявил достоверных отличий (рис. 4А). Напротив, сравнение скоростей миграции клеток показало, что РНК-интерференция ИК влияет на скорость миграции (рис. 4Б). В то время как клетки НаСаТ-КТР за 5 дней культивирования покрывали ~85 % свободной поверхности, аналогичный показатель для НаСаТ-ИК составил менее 40 % (рис. 4В).

Изменения ферментативной активности ИК в трансдуцированных клетках

Сравнение ферментативной активности секретируемой ИК показало, что обе линии трансдуцированных клеток синтезируют секретируемые коллагеназы (ИК, ММР2 и ММР9) и секретируют их в питательную среду (рис. 5А и Б). При этом в НаСаТ-ИК по сравнению с НаСаТ-КТР уровень экспрессии ИК, согласно результатам денсито-метрии, снижен в 4 раза (рис. 5В). В дополнение анализ клеточных гомогенатов позволяет детектировать незначительные количества про-ММР1 в образцах, полученных из НаСаТ-КТР. При этом в клеточных гомогенатах НаСаТ-ИК существенного накопления ИК не происходит (рис. 5Б и В).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В данной работе нами были получены клеточные линии иммортализованных эпидермальных кератиноцитов человека: НаСаТ-КТР, экспрессировавшие «бессмысленную» (контрольную) эИРНК, которые в дальнейшем использовали в качестве контроля, и НаСаТ-ИК, экспрессировавшие эИРНК, специфичную к ИК. Нами были охарактеризованы морфологические особенности клеток НаСаТ-КТР и НаСаТ-ИК (рис. 2). Мы также показали, что экспрессия эИРНК, специфичной к ИК, влияет на скорость миграции клеток (рис. 4В), но практически не влияет на скорость их пролиферации (рис. 4А). Наконец, нами были установлены изменения в уровнях экспрессии генов цитокератинов (КНТ1, -14, -17 и -18) , а также генов инволюкрина (^Ц) и филаггрина (РЦв), которые играют ключевую роль в диф-ференцировке эпидермальных кератиноцитов (рис. 3).

Примечательно, что в процессе культивирования трансдуцированных клеток мы наблюдали между ними отличия по морфологическим признакам. При культивировании НаСаТ-ИК колонии этих клеток имели резко очерченные границы, а многие из клеток располагались друг над другом (рис. 2А). Напротив, клетки НаСаТ-КТР сохраняли облик, характерный для нетрансфицированных

Рис. 2. Влияние экспрессии миРНК на морфологические характеристики трансдуцированных клеток. (А) Клетки, экспрессирующие контрольную эИРНК. (Б) Клетки, экспрессирующие эИРНК, специфичную к интерстици-альной коллагеназе. Трансдукцию клеток НаСаТпроводили так, как описано в разделе «Материалы и методы»

клеток. Границы колоний, образованных этими клетками, были размыты, а при продолжительном культивировании НаСаТ-КТР образовывали правильный монослой (рис. 2Б). По причине же того, что геномы клеток отличались только по одному из генов (гену, который кодировал эИРНК), мы сделали заключение, что наблюдаемые морфологические различия между НаСаТ-ИК и НаСаТ-КТР вызваны непосредственно РНК-интерференцией ИК.

Согласно данным литературы (например, [2]), ИК регулирует образование межклеточных контактов, а также перемещение клеток, например при повреждении кожных покровов. Например, клетки с высоким уровнем экспрессии ИК (такие как инвазивные раковые клетки) слабо взаимодействуют друг с другом, но при этом обладают высокой мобильностью. Напротив, подавление экспрессии ИК в этих клетках, например при помощи специфичной РНК-интерференции, способствует образованию между ними межклеточных контактов, а также замедляет их

ММР1 ММР2 ММР9 ММР12

20

15 -

10 -

5 -

1 -1

0.75 -

1-

КЯТ1 КЯТ14

я 1.00 -

0.75 -

й 0.25-

^ 0.50 -

0.25

1 0.00

М_

КНТ17 КИГ18

тивв

вЛРОН

Рис. 3. Оценка изменений генной экспрессии в трансдуцированных эпидермальных кератиноцитах человека методом количественной ПЦР

0

миграцию, что, в свою очередь, снижает риск образования метастазов в удаленных органах и тканях животных-реципиентов [18]. В силу этого неудивительно, что в наших экспериментах были получены похожие результаты. Клетки НаСаТ-ИК образовывали более прочные межклеточные контакты между собой и мигрировали со скоростью примерно в 2,5 раза меньшей, чем клетки НаСаТ-КТР (рис. 4Б и В). Аналогичные изменения, такие как более прочное взаимодействие клеток с ростовой поверхностью, мы также наблюдали и при проведении трансфекции НЕК293 вектором, который кодировал shРНК, специфичную к ИК.

Далее, принимая во внимание особенности строения эпидермиса, следует заметить, что способностью к миграции обладают, как правило, недифференцированные и слабодифференцированные клетки базального слоя, число которых возрастает в пораженных псориазом участках кожи. Напротив, клетки, находящиеся на более поздних стадиях дифференцировки, прочно связаны друг с другом десмосомами. По этой причине мы предположили, что наблюдаемые морфологические изменения в НаСаТ-ИК могут быть связаны не только со снижением активности ИК, но и с инициацией процесса дифференцировки этих клеток.

Как уже было показано ранее, резкие изменения в экспрессии одного из генов, такие как его «суперэкспрессия» или «нокаут» способны кардинальным образом перестроить работу всего организма и вызвать существенные изменения в экспрессии, по меньшей мере, нескольких сотен других генов [20, 21]. РНК-интерференция, напротив, позволяет откорректировать уровень генной экспрессии до необходимого значения, например за счет использования в эксперименте нуклеотидных последовательностей с различным сродством к специфичной мРНК, а также подбора необходимого для проведения трансдукции количества вирусных частиц. Так, сравнение уровней экспрессии генов в НаСаТ-ИК и НаСаТ-КТР, выполненное методом количественной ПЦР, показало, что почти двадцатикратное снижение уровня экспрессии гена, кодирующего ИК (ММР1), вследствие РНК-интерференции не привело к существенным изменениям в уровне экспрессии генов других (гомологичных) матриксных металлопротеиназ, таких как ММР2, -9 и -12 (рис. 3А).

Отсутствие статистически значимых изменений в уровне экспрессии этих генов важно, по крайней мере, по двум причинам. Прежде всего, это говорит в пользу того, что нам удалось селективно блокировать биосинтез ИК, не затрагивая экспрессию генов, сиквенс которых имеет высокую степень гомологии с мРНК ИК. Кроме того, полученный результат представляется нам также очень важным в контексте специфичности наблюдаемых нами фенотипи-ческих изменений клеток (рис. 2).

В то же время количественная оценка активности ИК, выполненная методом денситометрии, показала, что РНК-интерференция приводит только к четырехкратному снижению активности фермента в культуральной среде (рис. 5Б). При этом мы не наблюдали существенного накопления ИК внутри клеток (рис. 5Б). Наблюдаемые различия в изменениях уровня экспрессии гена И К (рис. 3А) и уровне ферментативной активности белка (рис. 5Б), по нашему мнению, вызваны превышением верхней границы чувствительности метода денситометрии. Дело в том, что интенсивность наблюдаемых в геле полос может расти пропорционально до определенного предела. Соответственно, сравнительно небольшая разница в оценке

Рис. 4. Влияние экспрессии shPHK, специфичной к интерстициальной кол-лагеназе (ИК), на пролиферацию и миграцию трансдуцированных клеток. Анализ кривых роста (А) и количественная оценка скорости миграции (Б) клеток HaCaT, экспрессирующих shPHK, специфичную к ИК и контрольную shPHK. (В) Миграция трансдуцированных клеток: состояние культур на следующий день после начала эксперимента и по его окончании. Детали экспериментальных процедур описаны в разделе «Материалы и методы»

12 12

Культурная Гомогенаты

среда клеток

Рис. 5. Оценка ферментативной активности интерстициальной коллагеназы (ИК) в трансдуцированных эпидермальных кератиноцитах клеточном гомо-генате и культуральной среде. (А) Зимография образцов питательной среды, собранных при культивировании трансдуцированных клеток: 1 — клетки, экспрессировавшие контрольную эИРНК; 2 — клетки, экспрессировавшие эИРНК, специфичную к ИК. Стрелками указано месторасположение матрикс-ных металлопротеиназ в геле. (Б) Зимография образцов клеточного гомогената, собранных при культивировании трансдуцированных клеток: 1 — клетки, экспрессировавшие контрольную эИРНК; 2 — клетки, экспрессировавшие эИРНК, специфичную к ИК. (В) Количественная оценка ферментативной активности. Время культивирования клеток до начала сбора образцов — 48 ч. Конфлюэнтность клеток на момент сбора образцов — 60 %. Культивирование клеток, получение гомогената, а также проведение белкового электрофореза и зимографии описаны в разделе «Материалы и методы»

ферментативной активности между образцами могла быть вызвана «перегрузом» ИК в образце, полученном из НаСаТ-КТР.

Между тем, сравнение уровней генной экспрессии в клетках НаСаТ-ИК и НаСаТ-КТР позволило нам установить статистически значимые изменения в уровнях экспрессии генов цитокератинов (КНТ1,-14,-17 и -18). Примечательно, что наблюдаемые изменения носили разнонаправленный характер (рис. 3В). В частности, нами было установлено, что экспрессия КНТ1 и КЯТ14 возрастала, тогда как экспрессия КИТ17 и КНТ18 — снижалась. Согласно данным литературы, изменения в уровнях экспрессии упомянутых генов имеют важное физиологическое и клиническое значение. С одной стороны, нормальный уровень экспрессии КНТ1 и КЯТ14 в эпидермисе здоровой кожи важен для правильной дифференцировки эпидермальных кератино-цитов [22]. С другой стороны, в области кожи, пораженной псориазом, где процесс дифференцировки клеток нарушен, возрастает экспрессия КЯТ17 и КНТ18, а экспрессия КНТ1 и КИТ14 — снижается [23, 24]. Согласно же полученным нами данным (рис. 3В), РНК-интерференция ИК может иметь важный терапевтический эффект в случае псориаза, поскольку она частично нормализует экспрессию генов упомянутых цитокератинов (снижает экспрессию КИТ17 и КНТ18 и увеличивает экспрессию КНТ1 и КНТ14).

Помимо этого, РНК-интерференция ИК приводит к изменениям в уровнях экспрессии генов V и ГЬО (рис. 3Б). Белки, кодируемые этими генами (инволюкрин и фи-лаггрин соответственно), являются важными структурными элементами верхнего (рогового) слоя эпидермиса. Они относятся к числу маркеров «ранней» и «поздней» стадий дифференцировки эпидермальных кератиноцитов. В свою

очередь, образование псориатических бляшек сопровождается нарушениями в экспрессии упомянутых генов: экспрессия V увеличивается, а экспрессия ГЬО снижается [25]. Соответственно, нарушается состав и структура роговой оболочки и меняется внешний облик кожных покровов. Согласно полученным нами данным (рис. 3Б), РНК-интерференция ИК частично нормализует экспрессию № и ГЬО в трансдуцированных клетках, что усиливает ее терапевтический эффект.

Примечательно, что в отличие от других исследуемых в нашей работе генов (рис. 3А-В) экспрессия генов «домашнего хозяйства» ТиВВ и ОАРОН, широко используемых в современной лабораторной практике в качестве внутреннего контроля, существенно не меняется (рис. 3Д). Это, в свою очередь, свидетельствует о возможности использования данных об уровне экспресси гена АСТВ для нормализации результатов ПЦР в режиме «реального времени» в клетках НаСаТ-КТР и НаСаТ-ИК.

ВЫВОДЫ

В заключение мы бы хотели отметить, что полученные нами клеточные линии эпидермальных кератиноцитов — НаСаТ-ИК с экспрессией вИРНК, специфичной к ИК, и НаСаТ-КТР с экспрессией контрольной вИРНК — различаются по своим морфологическим признакам и способности к миграции. Сравнительный анализ генной экспрессии в трансду-цированных клетках показал, что РНК-интерференция ИК обладает потенциальным терапевтическим эффектом, поскольку приводит к коррекции уровней экспрессии ряда важных для патогенеза псориаза генов: !У1_, РШ, КНТ1, -14, -17 и -18.

Литература

1. Sabat R, Philipp S, Höflich C, Kreutzer S, Wallace E, Asadullah K et al. Immunopathogenesis of psoriasis. Exp Dermatol. 2007; 16 (10): 779-98. PubMed PMID: 17845210.

2. Mezentsev A, Nikolaev A, Bruskin S. Matrix metalloproteinases

and their role in psoriasis. Gene. 2014; 540 (1): 1-10. PubMed PMID: 24518811.

3. Corbitt CA, Lin J, Lindsey ML. Mechanisms to inhibit matrix metalloproteinase activity: where are we in the development of

clinically relevant inhibitors? Recent Pat Anticancer Drug Discov. 2007; 2 (2): 135-42. PubMed PMID: 18221058.

4. Peterson JT. The importance of estimating the therapeutic index in the development of matrix metalloproteinase inhibitors. Cardiovasc Res. 2006; 69 (3): 677-87. PubMed PMID: 16413004.

5. Shi Q, Zhang XL, Dai KR, Benderdour M, Fernandes JC. siRNA therapy for cancer and non-lethal diseases such as arthritis and osteoporosis. Expert Opin Biol Ther. 2011; 11 (1): 5-16. PubMed PMID: 21058934.

6. Schambach A, Baum C. Clinical application of lentiviral vectors - concepts and practice. Curr Gene Ther. 2008; 8 (6): 474-82. PubMed PMID: 19075630.

7. Naldini L, Blomer U, Gallay P, Ory D, Mulligan R, Gage FH et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 1996; 272 (5259): 263-7. PubMed PMID: 8602510.

8. Kollisch G. Kalali BN, Voelcker V, Wallich R, Behrendt H, Ring J et al. Various members of the Toll-like receptor family contribute to the innate immune response of human epidermal keratinocytes. Immunology. 2005; 114 (4): 531-41. PubMed PMID: 15804290.

9. Olaru F, Jensen LE. Chemokine expression by human keratinocyte cell lines after activation of Toll-like receptors. Exp Dermatol. 2010; 19 (8): e314-6. PubMed PMID: 20100199.

10. Proksch E, Brandner JM, Jensen JM. The skin: an indispensable barrier. Exp Dermatol. 2008; 17 (12): 1063-72. PubMed PMID: 19043850.

11. Могулевцева Ю., Мезенцев A. В. Клонирование последовательности малой ингибирующей РНК, специфичной к метал-лопротеиназе 1 человека, в экспрессионный вектор pGPV-17019250. Wschodnioeuropejskie Czasopismo Naukowe. 2016; (9): 85-92.

12. Могулевцева Ю., Мезенцев A. В. Молекулярный дизайн и клонирование контрольной РНК для проведения экспериментов по РНК-интерференции интерстициальной коллагеназы человека. В сб.: Сборник статей студентов, магистрантов, аспирантов, молодых ученых и преподавателей «Развитие современной науки: теоретические и прикладные аспекты»; 4 августа 2016 г; Пермь, 2016; (6): 70-7.

13. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227 (5259): 6805. PubMed PMID: 5432063.

14. Meyer TS, Lamberts BL. Use of coomassie brilliant blue R250

for the electrophoresis of microgram quantities of parotid saliva proteins on acrylamide-gel strips. Biochim Biophys Acta. 1965; 107 (1): 144-5. PubMed PMID: 4159310.

15. Gogly B, Groult N, Hornebeck W, Godeau G, Pellat B. Collagen zymography as a sensitive and specific technique for the determination of subpicogram levels of interstitial collagenase. Anal Biochem. 1998; 255 (2): 211-6. PubMed PMID: 9451506.

16. Chomczynski P, Mackey K. Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide- and proteoglycan-rich sources. Biotechniques. 1995; 19 (6): 942-5. PubMed PMID: 8747660.

17. Probes [Интернет]. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US); [процитировано 10 февраля 2017 г]. Доступно по ссылке: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/

18. Kessenbrock K, Plaks V, Werb Z. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment. Cell. 2010; 141 (1): 52-67. PubMed PMID: 20371345.

19. Momota Y, Suzuki N, Kasuya Y, Kobayashi T, Mizoguchi M, Yokoyama F et al. Laminin a3 LG4 module induces keratinocyte migration: involvement of matrix metalloproteinase-9. J Recept Signal Transduct Res. 2005; 25 (1): 1-17. PubMed PMID: 15960391.

20. Swindell WR, Johnston A, Carbajal S, Han G, Wohn C, Lu J et al. Genome-wide expression profiling of five mouse models identifies similarities and differences with human psoriasis. PLoS One. 2011; 6 (4): e18266. PubMed PMID: 21483750.

21. Zhang X, Jin JY, Wu J, Qin X, Streilein R, Hall RP et al. RNA-Seq and ChIP-Seq reveal SQSTM1/p62 as a key mediator of JunB suppression of NF-KB-dependent inflammation. J Invest Dermatol. 2015; 135 (4): 1016-24. PubMed PMID: 25501661.

22. Matsui T, Amagai M. Dissecting the formation, structure and barrier function of the stratum corneum. Int Immunol. 2015; 27 (6): 269-80. PubMed PMID: 25813515.

23. Rao KS, Babu KK, Gupta PD. Keratins and skin disorders. Cell Biol Int. 1996; 20 (4): 261-74. PubMed PMID: 8664850.

24. Al Robaee AA. Molecular genetics of Psoriasis (Principles, technology, gene location, genetic polymorphism and gene expression). Int J Health Sci (Qassim). 2010; 4 (2): 103-27.

25. Iizuka H, Takahashi H, Honma M, Ishida-Yamamoto A. Unique keratinization process in psoriasis: late differentiation markers are abolished because of the premature cell death. J Dermatol. 2004; 31 (4) 271-6.

References

1. Sabat R, Philipp S, Höflich C, Kreutzer S, Wallace E, Asadullah K et al. Immunopathogenesis of psoriasis. Exp Dermatol. 2007; 16 (10): 779-98. PubMed PMID: 17845210.

2. Mezentsev A, Nikolaev A, Bruskin S. Matrix metalloproteinases and their role in psoriasis. Gene. 2014; 540 (1): 1-10. PubMed PMID: 24518811.

3. Corbitt CA, Lin J, Lindsey ML. Mechanisms to inhibit matrix metalloproteinase activity: where are we in the development of clinically relevant inhibitors? Recent Pat Anticancer Drug Discov. 2007; 2 (2): 135-42. PubMed PMID: 18221058.

4. Peterson JT. The importance of estimating the therapeutic index in the development of matrix metalloproteinase inhibitors. Cardiovasc Res. 2006; 69 (3): 677-87. PubMed PMID: 16413004.

5. Shi Q, Zhang XL, Dai KR, Benderdour M, Fernandes JC. siRNA therapy for cancer and non-lethal diseases such as arthritis and osteoporosis. Expert Opin Biol Ther. 2011; 11 (1): 5-16. PubMed PMID: 21058934.

6. Schambach A, Baum C. Clinical application of lentiviral vectors - concepts and practice. Curr Gene Ther. 2008; 8 (6): 474-82. PubMed PMID: 19075630.

7. Naldini L, Blömer U, Gallay P, Ory D, Mulligan R, Gage FH et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 1996; 272 (5259): 263-7. PubMed PMID: 8602510.

8. Köllisch G. Kalali BN, Voelcker V, Wallich R, Behrendt H, Ring J et al. Various members of the Toll-like receptor family contribute to

the innate immune response of human epidermal keratinocytes. Immunology. 2005; 114 (4): 531-41. PubMed PMID: 15804290.

9. Olaru F, Jensen LE. Chemokine expression by human keratinocyte cell lines after activation of Toll-like receptors. Exp Dermatol. 2010; 19 (8): e314-6. PubMed PMID: 20100199.

10. Proksch E, Brandner JM, Jensen JM. The skin: an indispensable barrier. Exp Dermatol. 2008; 17 (12): 1063-72. PubMed PMID: 19043850.

11. Mogulevtseva Yu, Mezentsev AV. Klonirovanie posledovatel'nosti maloy ingibiruyushchey RNK, spetsifichnoy k metalloproteinaze 1 cheloveka, v ekspressionnyy vektor pGPV-17019250. Wschodnioeuropejskie Czasopismo Naukowe. 2016; (9): 85-92. Russian.

12. Mogulevtseva Yu, Mezentsev AV. Molekulyarnyy dizayn i klonirovanie kontrol'noy RNK dlya provedeniya eksperimentov po RNK-interferentsii interstitsial'noy kollagenazy cheloveka. In: Sbornik statey studentov, magistrantov, aspirantov, molodykh uchenykh i prepodavateley «Razvitie sovremennoy nauki: teoreticheskie i prikladnye aspekty»; 2016 Aug 4; Perm, 2016; (6): 70-7. Russian.

13. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227 (5259): 6805. PubMed PMID: 5432063.

14. Meyer TS, Lamberts BL. Use of coomassie brilliant blue R250 for the electrophoresis of microgram quantities of parotid saliva proteins on acrylamide-gel strips. Biochim Biophys Acta. 1965;

107 (1): 144-5. PubMed PMID: 4159310.

15. Gogly B, Groult N, Hornebeck W, Godeau G, Pellat B. Collagen zymography as a sensitive and specific technique for the determination of subpicogram levels of interstitial collagenase. Anal Biochem. 1998; 255 (2): 211-6. PubMed PMID: 9451506.

16. Chomczynski P, Mackey K. Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide- and proteoglycan-rich sources. Biotechniques. 1995; 19 (6): 942-5. PubMed PMID: 8747660.

17. Probes [Internet]. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US); [cited 2017 Feb 10]. Available from: https://www.ncbi.nlm. nih.gov/probe/

18. Kessenbrock K, Plaks V, Werb Z. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment. Cell. 2010; 141 (1): 52-67. PubMed PMID: 20371345.

19. Momota Y, Suzuki N, Kasuya Y, Kobayashi T, Mizoguchi M, Yokoyama F et al. Laminin a3 LG4 module induces keratinocyte migration: involvement of matrix metalloproteinase-9. J Recept Signal Transduct Res. 2005; 25 (1): 1-17. PubMed PMID: 15960391.

20. Swindell WR, Johnston A, Carbajal S, Han G, Wohn C, Lu J et al. Genome-wide expression profiling of five mouse models identifies similarities and differences with human psoriasis. PLoS One. 2011; 6 (4): e18266. PubMed PMID: 21483750.

21. Zhang X, Jin JY, Wu J, Qin X, Streilein R, Hall RP et al. RNA-Seq and ChIP-Seq reveal SQSTM1/p62 as a key mediator of JunB suppression of NF-KB-dependent inflammation. J Invest Dermatol. 2015; 135 (4): 1016-24. PubMed PMID: 25501661.

22. Matsui T, Amagai M. Dissecting the formation, structure and barrier function of the stratum corneum. Int Immunol. 2015; 27 (6): 269-80. PubMed PMID: 25813515.

23. Rao KS, Babu KK, Gupta PD. Keratins and skin disorders. Cell Biol Int. 1996; 20 (4): 261-74. PubMed PMID: 8664850.

24. Al Robaee AA. Molecular genetics of Psoriasis (Principles, technology, gene location, genetic polymorphism and gene expression). Int J Health Sci (Qassim). 2010; 4 (2): 103-27.

25. Iizuka H, Takahashi H, Honma M, Ishida-Yamamoto A. Unique keratinization process in psoriasis: late differentiation markers are abolished because of the premature cell death. J Dermatol. 2004; 31 (4) 271-6.