Изучение эффективности препарата Люромарин при экспериментальном клещевом энцефалите у мышей

Изучение эффективности препарата Люромарин при экспериментальном клещевом энцефалите у мышей

Н. В. КРЫЛОВА1, Г Н. ЛЕОНОВА1, А. М. ПОПОВ2, А. А. АРТЮКОВ2, Э. П. КОЗЛОВСКАЯ2

1 НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, Владивосток

2 Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток

Investigation of Luromarin Efficacy on Mice with Experimental Tick-Borne Encephalitis

N. V. KRYLOVA, G. N. LEONOVA, A. M. POPOV, A. A. ARTYUKOV, E. P. KOZLOVSKAYA

Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Vladivostok Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far East Branch of the Russian Academy of Sciences, Vladivostok

Пероральное применение препарата «Люромарин», выделенного из морской травы Zostera asiatica, эффективно защищает от гибели мышей, инфицированных выгсокопатогенныш штаммом вируса КЭ, удлиняя среднюю продолжительность жизни. «Люромарин» оказывает потенцирующее действие в сочетании с рибавирином и циклофероном.

Ключевые слова: клещевой энцефалит, розмариновая кислота, противовирусная эффективность.

Oral use of Luromarin, extracted from sea algae Zostera asiatica, was efficient in protection of mice from lethal infection induced by highly pathogenic strain of TBE virus, by extending their average lifespan. Luromarin demonstrated potentiating action in combination with ribavirin and cycloferon.

Key words: tick-borne encephalitis, rosmarinic acid, antiviral efficacy.

Введение

Способность вируса клещевого энцефалита (КЭ) длительно персистировать в организме даже после адекватного лечения острых форм инфекции, опасность перехода инфекционного процесса к прогредиентному течению через несколько месяцев или лет после перенесённого заболевания обосновывают необходимость поиска новых противо-вирусныгх и иммунокорригирующих препаратов. В настоящее время получено большое число соединений, обладающих противовирусной активностью. Однако клиническое применение в качестве средств противовирусной терапии КЭ нашли лишь немногие из них. Эти антивирусные препараты по химическому составу, механизму действия, спектру активности и длительности клинического эффекта можно разделить на 3 большие группы: 1) химио-препараты; 2) интерфероны и их индукторы; 3) им-муномодуляторы. Лекарственные средства первой группы, как правило, обладают специфической противовирусной активностью, представители второй и третьей групп — не специфически защищают клетки организма от вирусной атаки.

© Коллектив авторов, 2011

Адрес для корреспонденции: 690087 Владивосток, ул. Сельская, 1. НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН

Цель настоящего исследования — обоснование эффективности применения нового препарата природного происхождения «Люромарина», выделенного из Zostera asiatica, и некоторых офи-цинальных препаратов, используемых при лечении КЭ, а также их сочетаний при экспериментальном клещевом энцефалите у мышей.

Материал и методы

Вирус. В работе использовали вирус КЭ дальневосточного субтипа штамм Р-73, выделенный из мозга человека, умершего от КЭ с очаговой формой инфекции, с инфекционным титром 107 ТЦИД50/0,2 мл.

Животные. Для моделирования экспериментального КЭ использовали неинбредных мышей массой 10—12 г, которых инфицировали вирусом КЭ подкожно в дозе 10 ЛД50/0,2 мл.

Препараты. Люромарин — препарат, выделенный из морской травы Zostera asiatica (Z.asiatica), содержит 95% розмариновой кислоты и 5% биофлавоноида — лютеолина. В качестве препарата сравнения использовали коммерческую розмариновую кислоту (РКком) производства фирмы Sigma (США). При комбинированной терапии использовали химиопрепарат рибавирин (производства ЗАО «Вертекс», Санкт-Петербург) и индуктор интерферона циклоферон (производства НТФФ Полисан, Санкт-Петербург).

Препараты Люромарин и РКком в дозах 12,5, 25, 50 и 100 мг/кг вводили животным интраперитонеально и перорально через 1 час после заражения вирусом и в дальнейшем на протяжении 7 дней дважды в сутки. Рибавирин вводили перо-рально в дозах 50 и 10 мг/кг в течение 10 дней, а циклоферон парентерально в дозе 60 мг/кг в течение 5 дней. Контрольны-

Таблица 1. Выживаемость животных, инфицированных вирусом КЭ, при разных дозах и способах введения препаратов

Препарат Доза Способ введения Защита Увеличение

препарата, мг/кг препарата от гибели, % СПЖ, сут

Люромарин 25 интраперитонеально 21,7+6,3 2,2+0,5

50 внутрижелудочно 36,7+5,8* 3,7+0,4*

Розмариновая кислота (ком) 25 интраперитонеально 0 1,1+0,5

50 перорально 15,0+5,8 1,7+0,3

Примечание. * - достоверное (р<0,05) различие между препаратами; летальность мышей в контрольной группе была 100%, СПЖ составила 9,8±0,42 сут.

Таблица 2. Выживаемость животных, инфицированных вирусом КЭ, при комбинированном применении различных доз и способов введения препаратов

Препарат Доза Способ введения Защита Увеличение

препарата, мг/кг препарата от гибели, % СПЖ, сут

Люромарин 25 интраперитонеально 21,7+6,3 2,2+0,5

50 перорально 36,7+5,8 3,7+0,4

Рибавирин 50 перорально 13,3+5,8 1,2+0,3

100 перорально 0 -1,1+0,2

Циклоферон 60 парентерально 30,0+10,0 3,3+0,6

Люромарин + рибавирин 25+50 интраперитонеально+перорально 16,7+3,3 1,6+0,2

25+100 интраперитонеально+перорально 13,3+5,8 1,0+0,4

50+50 перорально+перорально 41,7+6,3 4,2+0,5

50+100 перорально+перорально 51,7+6,3* 4,9+0,4*

Люромарин + циклоферон 25+60 интраперитонеально+парентерально 23,3+5,8 2,5+0,3

50+60 перорально+парентерально 60,0+10,0* 6,0+0,6*

Примечание. * - достоверное (р<0,05) различие между монопрепаратом (люромарином) и комбинацией препаратов; летальность мышей в контрольной группе была 100%, СПЖ составила 9,8±0,42 сут.

ми группами служили неинфицированные мыши, получавшие испытуемые препараты, а также инфицированные вирусом КЭ мыши, не получавшие препараты. За животными наблюдали 21 день. У всех выживших животных методом иммуноферментного анализа (ИФА) определяли наличие вируса КЭ в мозге и селезёнке.

Оценку противовирусной эффективности используемых препаратов проводили согласно требованиям, изложенным в руководстве [1]. Основными критериями её in vivo были показатели защиты животных от гибели и средняя продолжительность жизни (СПЖ) животных в группе.

Все опыты повторяли трёхкратно. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ GeoStat и Biostatistics (Version 4.03). Различие двух сравниваемых величин считали достоверным, если вероятность их тождества была меньше 5% (р<0,05).

Результаты и обсуждение

При оценке протективного действия различных доз препаратов (12,5, 25, 50 и 100 мг/кг) и способов их введения было установлено, что Лю-ромарин оказывает дозозависимое защитное действие и увеличивает среднюю продолжительность жизни инфицированных животных. Наибольший эффект был зарегистрирован при его интрапери-тонеальном (в дозе 25 мг/кг) и пероральном (в дозе 50 мг/кг) применении (табл. 1).

Достоверные различия действия Люромарина с препаратом сравнения — коммерческой розмариновой кислотой наблюдались лишь в группах животных, получавших препараты перорально. При этом способе введения защитная эффективность Люромарина составила 36,7%, увеличение

средней продолжительности жизни — 3,7 сут. Применение РКком при тех же условиях защищало только 15,0% животных, увеличивая среднюю продолжительность жизни мышей на 1,7 сут по сравнению с контрольной группой. Характерно, что у всех выживших животных, получавших препараты, вирус КЭ в мозге и селезёнке не был обнаружен.

Следующим этапом работы явилось изучение эффективности совместного применения Люромарина с официнальными препаратами — рибави-рином и циклофероном при инфицировании животных вирусом КЭ. Выбор химиопрепарата рибавирина обусловлен тем, что он подавляет репликацию РНК- и некоторых ДНК-содержащих вирусов и является стандартным препаратом при терапии многих флавивирусных инфекций, в том числе и при КЭ [2]. Показано (табл. 2), что применение рибавирина в виде монопрепарата в дозе 50 мг/кг защищает от гибели лишь 13,3% животных, инфицированных вирусом КЭ, увеличивая среднюю продолжительность жизни на 1,2 сут по сравнению с контролем. Введение рибавирина в дозе 100 мг/кг приводило к 100% гибели мышей и сокращению их СПЖ на 1,1 сут по сравнению с контролем. Проведённые нами исследования, как и данные литературы, свидетельствуют о том, что, хотя рибавирин на модели in vitro проявляет высокую вирусингибирующую активность в отношении вируса КЭ, у животных, инфицированных

этим вирусом, а также другими флавивирусами, препарат защищает недостаточно эффективно [3]. При других флавивирусных инфекциях (гепатит С) монотерапия рибавирином у больных оказывается также малоэффективной [4, 5].

Как видно из представленных данных (табл. 2), комбинация рибавирина с Люромарином (при пе-роральном применении препаратов) значительно повышала выживаемость животных и срок их жизни. Так, рибавирин в дозе 100 мг/кг совместно с Люромарином защищает 51,7% животных и увеличивает их СПЖ на 4,9 сут. При этом эффективность комбинации этих веществ была достоверно выше таковой каждого монопрепарата.

В настоящее время одними из наиболее эффективных средств в терапии вирусных инфекций различной этиологии являются индукторы эндогенного интерферона (в том числе и цикло-ферон), которые хорошо сочетаются с иммуно-модуляторами, химиотерапевтическими средствами. Комбинированное введение их с другими препаратами часто приводит к аддитивному или синергидному эффекту [6].

В результате проведённых исследований установлено (табл. 2), что применение циклоферо-на в виде монопрепарата в дозе 60 мг/кг защищает от гибели 30% животных, инфицированных

ЛИТЕРАТУРА

1. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р. У. Хабрие-ва, М.: 2005.

2. Crance J. M, Scaramozzino N, Jouan A. et al. Interferon, ribavirin, 6-azauridine and glycyrrhizin: antiviral compounds active against pathogenic flaviviruses. Antiviral Research 2003; 58: 73—79.

3. Leyssen P., Drosten C, Paning M. et al. Interferons, interferon inducers and interferon-ribavirin in treatment of flavivirus-induced encephalitis in mice. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47: 2: 777—782.

вирусом КЭ, увеличивая среднюю продолжительность жизни на 3,3 сут по сравнению с контролем. В свою очередь, защитное действие совместного применения Люромарина с циклофероном составило 60,0%, увеличивая СПЖ на 6,0 сут. Следует отметить, что эффективность их комбинации была достоверно выше таковой каждого монопрепарата.

Заключение

Таким образом, пероральное применение препарата Люромарин, выделенного из морской травы Z.asiatica, в дозе 50 мг/кг эффективно защищает от гибели мышей, инфицированных высокопатогенным штаммом вируса КЭ. Исследуемый препарат по защитному действию превосходит коммерческую розмариновую кислоту. Комбинация препаратов с различным механизмом действия (Люромарина с рибавири-ном и Люромарина с циклофероном) оказывает выраженный защитный эффект аддитивного характера.

Полученные в настоящей работе результаты протективного действия препарата Люромарин при экспериментальном КЭ позволяют рекомендовать его для дальнейших испытаний, особенно при комбинированной терапии клещевого энцефалита.

4. Lee J. H, von Wagner M., Roth W. K. et al. Effect of ribavirin on virus load and quasispecies distribution in patients infected with hepatitis C. virus. J Hepatol 1998; 29: 29-35.

5. Zoulim F., Haem J., Ahmed S. S. et al. Ribavirin monotherapy in patients with chronic hepatitis C: a retrospective study of 95 patients. J Viral Hepatol 1998; 5: 193-198.

6. Ершов Ф. И., Коваленко А. Я., Романцов M. Г. и др. Циклоферон. Клиническая фармакология и терапия: Руководство для врачей. М.; СПб.: 1998.