СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО СИНДРОМА
COMPOUNDS FOR METABOLIC SYNDROME TREATMENT

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение касается новых β-карболиновых соединений и их применения для лечения болезней обмена веществ, таких как метаболический синдром, диабет I и II типа.
Уровень техники
β-Карболиновые соединения составляют класс индольных алкалоидов, природных и синтетических, обладающих широким диапазоном важных биологических и фармакологических свойств, таких как противомикробная и противовирусная активность, воздействие на метаболизм и мощное антитуморогенное действие (1, 2). Было проведено несколько исследований с целью получения производных β-карболиновых алкалоидов с различными заместителями в положениях 1, 3 и 9 β-карболинового скелета. Так, настоящее изобретение касается синтеза новых β-карболиновых производных, которые могут применяться для лечения метаболического синдрома и, в частности, для лечения диабета, и которые показывают улучшенную терапевтическую активность в сравнении со сходными соединениями, известными в существующем уровне техники, даже в меньших дозировках. Метаболический синдром представляет собой набор факторов, таких как, среди прочих, гипертензия, ожирение, гиперлипидемия и диабет (3), связанных с повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний. Метаболический синдром становится все более распространенным, главным образом в результате распространения ожирения (4). Хотя общепризнано, что главным методом клинического вмешательства при метаболическом синдроме является изменение образа жизни, этого недостаточно для нормализации факторов риска у многих пациентов, и оставшийся риск может быть довольно высоким, вызывая необходимость лекарственной терапии. Наблюдается растущий интерес к терапевтическим стратегиям, которые способны эффективно воздействовать на несколько факторов риска, минимизируя тем самым проблемы, связанные с одновременным назначением нескольких лекарственных средств (3, 4).
WO 2010/080756 касается гармина и производных гармина, применяемых для уменьшения веса тела, снижения процента жира в теле, лечения ожирения, облегчения или стимулирования потери веса, облегчения или стимулирования поддержания желаемого веса тела и профилактики или уменьшения нежелательного набора веса, и в данной заявке упоминается лечение нарушений, связанных с ожирением и с повышенным процентом содержания жира в теле, таких как диабет II типа, непереносимость глюкозы, болезнь коронарных артерий, высокое кровяное давление и атеросклероз.
Раскрытие изобретения
В настоящем изобретении описаны соединения общей формулы I и любые их соли, приемлемые для применения в фармацевтике, косметике или пищевых продуктах:
где, независимо,
1
R может быть выбран из: линейных или циклических моно- или диалкиламинов; аминоалкилспиртов или аминоалкилэфиров;
2
R может быть выбран из: бензольного или гетероциклического колец;
3
R может быть выбран из: Н; углеводородного радикала, выбранного из линейного или разветвленного алкила, содержащего 1-5 атомов углерода; или бензильной группы;
4
R может быть выбран из: Н; углеводородного радикала, выбранного из линейного или разветвленного алкила, содержащего 1-5 атомов углерода; гидрокси- или алкокси-радикалов; или галогена.
Предпочтительными соединениями общей формулы I являются соединения, в которых, независимо,
1
2
n
2
2
n
6
7
R, в случае когда он представляет собой линейный алкиламин, выбран из: NH-(CH)-NH; NH-(CH)-R, при этом n имеет значение от 0 до 4; NH-N=CH-фенил-R;
1
и R, в случае когда он представляет собой циклический амин, выбран из:
1
2
2
2
2
3
R, в случае когда он означает аминоспиртовую группу, представляет собой HNCHCHOH; и, в случае когда он означает аминоалкилэфирную группу, представляет собой HNCHCHOCH
2
R, в случае когда он представляет собой замещенное бензольное кольцо, выбран из:
и, в случае когда он означает гетероциклическое кольцо, представляет собой
3
R, в случае когда он означает углеводородный радикал, выбранный из линейного алкила, содержащего 1-5 атомов углерода, представляет собой метил;
4
4
R, в случае когда он означает углеводородный радикал, выбранный из линейного алкила, содержащего 1 -5 атомов углерода, означает метил; R, в случае когда он означает алкокси-радикал, представляет собой метокси-радикал;
4
и R, в случае когда он означает галоген, представляет собой фтор;
5
R может быть выбран из: Н; алкокси-группы; галогена; гидрокси-группы; или галоген-алкила;
6
7
2
R может быть выбран из: алкила, гидрокси или алкокси-группы; R может быть выбран из: Н или NO;
8
R может быть выбран из: Н; гидрокси-группы; алкокси-группы;
5
5
8
5
8
3
Предпочтительными являются соединения, в которых R может быть выбран из: метокси-группы; хлора, ОН или трифторметила, предпочтительно, когда R представляет собой Н, R представляет собой ОН, и когда R представляет собой ОН, R представляет собой ОСН.
6
Предпочтительными являются соединения, в которых R выбран из: ОН, этила или метокси-группы.
Дополнительно, предпочтительными соединениями являются соединения, имеющие формулу II или III
где, независимо,
1
3
2
n
2
6
R может быть выбран из: ОН, n-ОСН, NH-(CH)-NH, при этом n имеет значение от 0 до 3; или NH-N=CH-фенил-R;
5
3
R может быть выбран из: ОСН или Н;
7
2
R может быть выбран из: Н или n-NO
1
5
3
Более конкретно, предпочтительными являются соединения, в которых, когда R представляет собой группу ОН, R выбран из Н или n-ОСН.
1
5
3
1
5
Предпочтительными являются соединения, имеющие формулу II, выбранные из формулы 1а, в которой R представляет собой группу ОН, и R представляет собой n-ОСН; или из формулы 1b, в которой R представляет собой группу ОН, и R представляет собой Н.
1
3
5
3
Также, предпочтительными являются соединения, в которых, когда R представляет собой группу ОСН, R выбран из Н или n-ОСН.
1
3
5
3
1
3
5
1
3
5
3
1
3
5
Предпочтительными соединениями по настоящему изобретению являются соединения, имеющие формулу II, выбранные из: формулы 2а, в которой R представляет собой группу ОСН, и R представляет собой n-ОСН; из формулы 2b, в которой R представляет собой группу ОСН, и R представляет собой Н; или имеющие формулу III выбранные из формулы 3а, в которой R представляет собой группу ОСН, и R представляет собой n-ОСН, или из формулы 3b, в которой R представляет собой группу ОСН, и R представляет собой Н.
1
2
n
2
5
3
Также, предпочтительными являются соединения, в которых, когда R представляет собой группу NH-(CH)-NH, при этом n=2 или 3, R представляет собой n-ОСН.
1
2
2
2
5
3
1
2
3
2
5
3
Предпочтительными соединениями по настоящему изобретению являются соединения, имеющие формулу III, выбранные из формулы 4а, в которой R представляет собой NH(CH)NH, и R представляет собой n-ОСН; или из формулы 5а, в которой R представляет собой NH(CH)NH, и R представляет собой n-ОСН.
1
2
n
2
5
3
Более предпочтительными соединениями по настоящему изобретению являются соединения, имеющие формулу III, в которой, когда R представляет собой группу NH-(CH)-NH, при этом n=0, R выбран из Н или n-ОСН.
1
2
5
3
1
2
5
В настоящее изобретение также входят соединения, имеющие формулу III, выбранные из формулы 6а, в которой R представляет собой NHNH, и R представляет собой n-ОСН; или из формулы 6b, в которой R представляет собой NHNH, и R представляет собой Н.
1
5
3
1
2
5
Более конкретно, предпочтительными являются соединения, в которых, в формуле III, в случае когда R представляет собой группу NH-N=СН-фенил, R представляет собой n-ОСН и, в случае когда R представляет собой группу NH-N=CH-фенил, замещенную группой n-NO, R представляет собой Н.
1
5
3
1
2
5
В настоящее изобретение также входят соединения, имеющие формулу III, выбранные из формулы 7а, в которой R представляет собой группу NH-N=CH-фенил и R представляет собой n-ОСН; или из формулы 7b, в которой R представляет собой группу NH-N=СН-фенил-n-NO, и R представляет собой Н.
Наиболее предпочтительные соединения по настоящему изобретению выбраны из соединений: 4а, 5а, 7а, 17а, 17b, 17с, 21а, 21b, 21с, 21d, 21е, 21f, 23а, 23b, 23с, 23d, 23е, 23f, 26а или 26b, как показано в таблице 1.
Настоящее изобретение также охватывает все промежуточные соединения в синтезе описанных соединений или ранее описанных соединений. В частности, настоящее изобретение охватывает промежуточные соединения, выбранные из: 1a, 1b, 2а, 2b, 3а, 3b, 6а, 6b, 7b, 8, 9, 13, 14а, 14b, 14c, 15а, 15b, 15с, 16а, 16b, 16с, 18а, 18b, 18с, 18d, 18е, 18f, 19а, 19b, 19с, 19d, 19е, 19f, 20а, 20b, 20с, 20d, 20е, 20f, 22а, 22b, 22с, 22d, 22е, 22f, 24а, 24b, 25а или 25b.
Настоящее изобретение включает фармацевтические, косметические, функциональные пищевые добавки или нутрицевтические композиции, содержащие по меньшей мере любое из ранее упомянутых соединений, представленных общими формулами I, II и III, и их соли или комбинации, приемлемые или допустимые для применения в фармацевтике, косметике или пищевых продуктах, необязательно с каким-либо инертным ингредиентом, носителем, вспомогательным соединением и т.п.
Настоящее изобретение также охватывает любое из соединений описанных выше общих формул I, II или III или любую содержащую их фармацевтическую композицию, для применения в качестве лекарственного средства или для применения в производстве лекарственного средства.
Настоящее изобретение также охватывает любое из соединений описанных выше общих формул I, II или III или любую содержащую их фармацевтическую композицию, для применения в лечении или профилактике метаболического синдрома, метаболического заболевания или метаболических нарушений, или для применения в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики метаболического синдрома, метаболического заболевания или метаболических нарушений.
Предпочтительно, настоящее изобретение охватывает соединения под номерами: 4а, 5а, 7а, 21а, 21b, 21е, 23а, 23b, 23d, 23е, 23f или 26b, по отдельности или в комбинации, или содержащие их фармацевтические композиции, особенно подходящие для применения в лечении или профилактике метаболического синдрома, или для применения в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики метаболического синдрома.
Настоящее изобретение охватывает также любые соединения описанных выше общих формул I, II или III, или содержащие их фармацевтические композиции, для применения в лечении или профилактике диабета, или для применения в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики диабета.
Предпочтительно, настоящее изобретение охватывает соединения под номерами: 4а, 5а, 7а, 21а, 21b, 21е, 23а, 23b, 23d, 23е, 23f или 26b, по отдельности или в комбинации, или содержащие их фармацевтические композиции, особенно подходящие для применения в лечении или профилактике диабета, или для применения в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики диабета.
Настоящее изобретение охватывает также любые соединения описанных выше общих формул I, II или III, или содержащие их фармацевтические композиции, для применения в лечении или профилактике гипертензии, или для применения в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики гипертензии.
Предпочтительно, настоящее изобретение охватывает соединения под номерами: 4а, 5а, 7а, 21а, 21b, 21е, 23а, 23b, 23d, 23е, 23f или 26b, по отдельности или в комбинации, или любые содержащие их фармацевтические композиции, особенно подходящие для применения в лечении или профилактике гипертензии, или для применения в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики гипертензии. Более предпочтительно, соединения 4а, 5а и 7а или любые содержащие их фармацевтические композиции, выбирают для применения в лечении или профилактике гипертензии, или для применения в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики гипертензии.
Настоящее изобретение охватывает также любые соединения описанных выше общих формул I, II или III, или любые содержащие их фармацевтические композиции, для применения в лечении или профилактике гиперлипидемии, главным образом проявляющейся как гиперхолестеринемия, или для применения в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики гиперлипидемии, в целом, и в частности для лечения или профилактики гиперхолестеринемии.
Предпочтительно, настоящее изобретение охватывает соединения под номерами: 4а, 5а, 7а, 21а, 21b, 21е, 23а, 23b, 23d, 23е, 23f или 26b, по отдельности или в комбинации, или любые содержащие их фармацевтические композиции, для применения в лечении или профилактике гиперлипидемии, главным образом проявляющейся как гиперхолестеринемия, или для применения в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики гиперлипидемии, в целом, и в частности для лечения или профилактики гиперхолестеринемии. Более предпочтительно, соединения 4а, 5а и 7а или любые содержащие их фармацевтические композиции, выбирают для применения в лечении или профилактике гиперлипидемии, главным образом проявляющейся как гиперхолестеринемия, или для применения в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики гиперлипидемии, в целом, и в частности для лечения или профилактики гиперхолестеринемии.
Настоящее изобретение охватывает также любые соединения описанных выше общих формул I, II или III, или любые содержащие их фармацевтические композиции, для применения в лечении или профилактике гиперлипидемии, главным образом проявляющейся как гипертриглицеридемия, или для применения в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики гиперлипидемии, в целом, и в частности для лечения или профилактики гипертриглицеридемии.
Предпочтительно, настоящее изобретение охватывает соединения под номерами: 4а, 5а, 7а, 21а, 21b, 21е, 23а, 23b, 23d, 23е, 23f или 26b, по отдельности или в комбинации, или любые содержащие их фармацевтические композиции, особенно подходящие для применения в лечении или профилактике гиперлипидемии, главным образом проявляющейся как гипертриглицеридемия, или для применения в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики гиперлипидемии, в целом, и в частности для лечения или профилактики гипертриглицеридемии. Более предпочтительно, соединение 4а выбирают для применения в лечении или профилактике гиперлипидемии, главным образом проявляющейся как гипертриглицеридемия, или для применения в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики гиперлипидемии, в целом, и в частности для лечения или профилактики гипертриглицеридемии.
Настоящее изобретение охватывает также любые соединения описанных выше общих формул I, II или III, или любые содержащие их фармацевтические композиции, для применения в лечении или профилактике ожирения или избыточного веса, или для применения в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики ожирения или избыточного веса.
Предпочтительно, настоящее изобретение охватывает соединения под номерами: 4а, 5а, 7а, 21а, 21b, 21е, 23а, 23b, 23d, 23е, 23f или 26b, по отдельности или в комбинации, или любые содержащие их фармацевтические композиции, которые все особенно подходят для применения в лечении или профилактике ожирения или избыточного веса, или для применения в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики ожирения или избыточного веса. Более предпочтительно, соединение 5а или любые содержащие его фармацевтические композиции, выбирают для применения в лечении или профилактике ожирения или избыточного веса, или для применения в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики ожирения или избыточного веса.
Настоящее изобретение охватывает также любые соединения описанных выше общих формул I, II или III, или любые содержащие их косметические композиции, для применения в качестве косметического средства, в частности для уменьшения ожирения или избыточного веса, или для применения в производстве косметического средства, в частности для уменьшения ожирения или избыточного веса.
Предпочтительно, настоящее изобретение охватывает соединения под номерами: 4а, 5а, 7а, 21а, 21b, 21е, 23а, 23b, 23d, 23е, 23f или 26b, по отдельности или в комбинации, или любые содержащие их косметические композиции, которые особенно подходят для применения в качестве косметического средства, в частности для уменьшения ожирения или избыточного веса, или для применения в производстве косметического средства, в частности для уменьшения ожирения или избыточного веса. Более предпочтительно, соединение 5а или любые содержащие его косметические композиции, выбирают для применения в качестве косметического средства, в частности для уменьшения ожирения или избыточного веса, или для применения в производстве косметического средства, в частности для уменьшения ожирения или избыточного веса.
Настоящее изобретение охватывает также любые соединения описанных выше общих формул I, II или III, или любые содержащие их функциональные пищевые добавки или нутрицевтические композиции, для применения в качестве функциональной пищевой добавки или нутрицевтика, в частности для профилактики или смягчения симптомов, связанных со следующими нарушениями: диабет, повышенный уровень глюкозы в крови, гипертензия, повышенный уровень холестерина в крови, повышенный уровень триглицеридов в крови, ожирение или избыточный вес, или для применения в производстве функциональной пищевой добавки или нутрицевтика, в частности для профилактики или смягчения симптомов, связанных со следующими нарушениями: диабет, повышенный уровень глюкозы в крови, гипертензия, повышенный уровень холестерина в крови, повышенный уровень триглицеридов в крови, ожирение или избыточный вес.
Предпочтительно, настоящее изобретение охватывает соединения под номерами: 4а, 5а, 7а, 21а, 21b, 21е, 23а, 23b, 23d, 23е, 23f или 26b, по отдельности или в комбинации, или любые содержащие их функциональные пищевые добавки или нутрицевтические композиции, которые особенно подходят для применения в качестве функциональной пищевой добавки или нутрицевтика, в частности для профилактики или смягчения симптомов, связанных со следующими нарушениями: диабет, повышенный уровень глюкозы в крови, гипертензия, повышенный уровень холестерина в крови, повышенный уровень триглицеридов в крови, ожирение или избыточный вес, или для применения в производстве функциональной пищевой добавки или нутрицевтика, в частности для профилактики или смягчения симптомов, связанных со следующими нарушениями: диабет, повышенный уровень глюкозы в крови, гипертензия, повышенный уровень холестерина в крови, повышенный уровень триглицеридов в крови, ожирение или избыточный вес.
В настоящем изобретении также раскрыты способы получения различных соединений формул I, II или III.
В частности, раскрыт способ синтеза соединения формулы I и любых его солей, приемлемых для применения в фармацевтике, косметике или пищевых продуктах:
где, независимо,
1
R может быть выбран из: линейных или циклических моно- или диалкиламинов; аминоалкилспиртов или аминоалкилэфиров;
2
R может быть выбран из: бензольного или гетероциклического колец;
3
R может быть выбран из: Н; углеводородного радикала, выбранного из линейного или разветвленного алкила, содержащего 1-5 атомов углерода; или бензильной группы;
4
R может быть выбран из: Н; углеводородного радикала, выбранного из линейного или разветвленного алкила, содержащего 1-5 атомов углерода; гидрокси- или алкокси-радикалов; или галогена, который включает:
i) реакцию конденсации L-триптофана и альдегида, выбранного из анисового альдегида (а) или бензальдегида (b), с получением соединения 1а или 1b, соответственно;
ii) растворение соединений 1а или 1b, соответственно, в спирте и добавление к полученному раствору кислоты; после упаривания спирта полученные продукты нейтрализовывали основанием; затем органическую фазу экстрагировали органическим растворителем, и после сушки и удаления растворителей получали соединения 2а или 2b;
iii) соединения 2а или 2b растворяли в органическом растворителе и добавляли кислоту до выпадения осадка; полученный осадок отфильтровывали и промывали эфиром, получая таким образом соединения 3а или 3b, соответственно;
iv) соединение 3a вводили в реакцию с этилендиамином или пропилендиамином, получая, соответственно, соединения 4а или 5а;
альтернативно, соединения 3а или 3b вводили в реакцию в спиртовом растворе с гидразином до получения осадка; осадок отфильтровывали и промывали спиртом, получая соединения 6а и 6b, соответственно;
v) к раствору соединения 6а или 6b в воде добавляли кислоту и, после растворения, добавляли соответствующий альдегид в спиртовом растворе, бензальдегид для соединения 6а, и п-нитробензальдегид для соединения 6b; после нейтрализации основанием выпадал осадок, который отфильтровывали и перекристаллизовывали из спирта, получая таким образом, соответственно соединения 7а и 7b.
Вариантом осуществления описанного выше способа является вариант, в котором стадию iv) изменяют следующим образом:
iv' соединение 3а растворяют в 1,3-диаминопропане и удаляют избыток диамина; выпавший осадок растирали в ацетоне и отфильтровывали, получая соединение 5а;
Другим вариантом осуществления описанного выше способа является вариант, в котором стадию v) изменяют следующим образом:
v' нагревают суспензию соединения 6а в спирте и затем добавляют бензальдегид в спиртовой раствор до полного растворения; реакционный раствор упаривали до получения твердого остатка, который перекристаллизовывали из спирта, получая соединение 7а.
Дополнительной стадией в описанных выше вариантах осуществления способов получения соединений является стадия, на которой любое полученное соединение, выбранное из соединений 2а, 2b, 3а, 3b, 4а, 5а, 6а, 6b, 7а или 7b, дополнительно вводят в реакцию с кислотой для получения соответствующей соли, предпочтительно, кислотой является HCl, и образующаяся соль представляет собой соответствующий гидрохлорид.
В настоящем изобретении описаны также различные способы получения каждого из заявленных соединений.
Синтез соединений:
А. - Схема I синтеза производных β-карболина:
S: сера;
В контексте настоящего изобретения, связь в виде волнистой черты означает, что соответствующие заместители могут быть аксиальными или экваториальными.
В. - Схема II синтеза карбоксамидных производных:
С. - Схема III синтеза карбогидразидных производных:
D. - Схема IV альтернативного синтеза соединений 4а, 5а и 7а:
MeOH: метанол; S: сера;
E. - Схема V синтеза производных общей формулы I. Различные домены, модифицированные для синтеза указанных производных, показаны на приведенной далее Схеме V:
1
Е1: Варьирование домена 1 (R)
Вариации домена 1 достигаются путем реакций с различными аминами на последней стадии. Синтез изображен на Схеме VI:
2
Е2: Варьирование домена 2 (R)
2
Реакция между метиловым эфиром L-триптофана и различными альдегидами дает соединения с разными R. Синтез изображен на Схеме VII:
3
Е3: Варьирование домена 3 (R)
Вариации домена 3 достигаются с помощью метода синтеза, приведенного на Схеме VIII:
4
Е4. Варьирование домена 4 (R)
4
Для получения соединений с разными R необходимо использовать несколько триптофанов в качестве исходных соединений. Синтез изображен на Схеме IX:
F.- Схема X альтернативного синтеза соединения 4а (IFC-110248S):
G. - Схема XI альтернативного синтеза соединения 5а:
Н. - Схема XII альтернативного синтеза соединения 7а:
Н. - Схема XIII альтернативного синтеза соединения 9:
Краткое описание чертежей
Фиг.1: Гипогликемический эффект 3-(карбогидразил-N'-фенилзамещенный)-1-бензозамещенный-β-карболин-3-карбогидразида (соединение 7а или ANIS-BZ), спустя 1 (А) и 3 (В) дней после перорального введения подопытным животным в дозировке 5 мг/кг, в сравнении с усилением гликемии, вызванным переизбытком глюкозы у нормальных крыс (контрольная группа) и ослаблением гликемии, вызванным метформином (МЕТ). Каждая полоса представляет собой среднее значение ±SEM (среднеквадратичная ошибка) для 6 животных. *Р0.05, **Р0.01, в сравнении с контрольной группой, получавшей только носитель.
Фиг.2: Гипогликемический эффект, спустя 3 дня, 3-(карбогидразил-N'-фенилзамещенный)-1-бензозамещенный-β-карболин-3-карбогидразида (соединение 7а или ANIS-BZ) при дозировке 0.5, 1 и 5 мг/кг, в сравнении с усилением гликемии, вызванным переизбытком глюкозы у нормальных крыс, и ослаблением гликемии, вызванным метформином (МЕТ). Каждая полоса представляет собой среднее значение ±SEM (среднеквадратичная ошибка) для 6 животных. **Р0.01, ***Р<0.001, в сравнении с контрольной группой, получавшей только носитель.
2
Фиг.3: Гипогликемический эффект N(-этиламин)-1-бензозамещенный-β-карболин-3-карбоксамида (соединение 4а или ANIS-NH), через 1 (А) и 3 (В) дней после перорального введения подопытным животным в дозировке 5 мг/кг, в сравнении с усилением гликемии, вызванным переизбытком глюкозы у нормальных крыс (контрольная группа), и ослаблением гликемии, вызванным метформином (МЕТ). Каждая полоса представляет собой среднее значение ±SEM (среднеквадратичная ошибка) для 6 животных. *Р0.05, **Р0.01 в сравнении с контрольной группой, получавшей только носитель.
2
Фиг.4: Гипогликемический эффект, через 3 дня, N(-этиламин)-1-бензозамещенный-β-карболин-3-карбоксамида (соединение 4а или ANIS-NH) при дозировке 0.5, 1 и 5 мг/кг, в сравнении с усилением гликемии, вызванным переизбытком глюкозы у нормальных крыс, и ослаблением гликемии, вызванным метформином (МЕТ). Каждая полоса представляет собой среднее значение ±SEM (среднеквадратичная ошибка) для 6 животных. **Р<0.01 в сравнении с контрольной группой, получавшей только носитель.
Фиг.5: Уровень холестерина в плазме крови у SHR гипертензивных крыс, получавших 4а или 5а или 7а в дозировках 5 мг/кг первые 4 дня, 10 мг/кг следующие 4 дня и 15 мг/кг до конца экспериментального периода (25 дней), или метформин (МЕТ) (положительный контроль, раствор в воде концентрации 300 мг/кг) в сравнении с уровнями холестерина в плазме крови у SHR крыс, не подвергавшихся обработке (группа на носителе, или контрольная). Каждая полоса представляет собой среднее значение ±SEM (среднеквадратичная ошибка) для 6 животных. *Р<0.05 и ***Р<0.001, в сравнении с контрольной группой, получавшей только носитель.
Фиг.6: Уровень триглицеридов в плазме крови у SHR гипертензивных крыс, получавших 4а в дозировках 5 мг/кг первые 4 дня, 10 мг/кг следующие 4 дня и 15 мг/кг до конца экспериментального периода (25 дней), или метформин (МЕТ) (положительный контроль, раствор в воде концентрации 300 мг/кг) в сравнении с уровнями триглицеридов в плазме крови у SHR крыс, не подвергавшихся обработке (группа на носителе, или контрольная). Каждая полоса представляет собой среднее значение ±SEM (среднеквадратичная ошибка) для 6 животных. *P<0.05 в сравнении с контрольной группой, получавшей только носитель.
Фиг.7: Гипогликемический эффект соединений 23b или 21а; через 3 дня после перорального введения подопытным животным в дозировке 10 мг/кг, в сравнении с усилением гликемии, вызванным переизбытком глюкозы у нормальных крыс (контрольная группа, получавшая носитель), и ослаблением гликемии, вызванным метформином (МЕТ). Каждая полоса представляет собой среднее значение для шести животных и вертикальные линии показывают SEM (среднеквадратичное отклонение). *Р<0.05; **Р<0.01; ***Р<0.001, в сравнении с контрольной группой, получавшей только носитель.
Фиг.8: Гипогликемический эффект соединений 21b, 21е, 23е, 23а, 23d или 26b; через 5 дней после перорального введения подопытным животным в дозировке 10 мг/кг, в сравнении с усилением гликемии, вызванным переизбытком глюкозы у нормальных крыс (контрольная группа, получавшая носитель), и ослаблением гликемии, вызванным метформином (МЕТ). Каждая полоса представляет собой среднее значение для пяти-восьми животных, и вертикальные линии показывают SEM (среднеквадратичное отклонение). Звездочки показывают уровень достоверности в сравнении с контрольной группой, получавшей носитель (односторонний ANOVA, затем тест Ньюмана-Кьюлса). (*р<0.05; **р<0.01, ***р<0.001).
Определения
2
В настоящем изобретении, термин "метаболический синдром" относится к набору факторов (метаболические нарушения), таких как, среди прочих, гипертензия, ожирение, гиперлипидемия, диабет, общее ожирение, гипергликемия, гипертензия и жировая инфильтрация печени, связанных с повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний. Метаболический синдром становится все более распространенным, главным образом в результате распространения ожирения (4). Согласно определению международной диабетической ассоциации, критерием метаболического синдрома является общее ожирение (индекс массы тела >30 кг/м) и два или более из следующих параметров: 1) уровень триглицеридов >150 мг/дл; 2) уровень липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) <40 мг/дл у мужчин, <50 мг/дл у женщин, или необходимость специфического лечения по причине низкого уровня ЛПВП; 3) повышенное кровяное давление (КД), например систолическое КД>130 мм. рт.ст. или диастолическое КД>85 мм. рт.ст., или необходимость лечения по причине высокого КД, или более раннее диагностирование высокого КД; и 4) уровень глюкозы в крови натощак >100 мг/дл или более раннее диагностирование диабета 2 типа. В рамках данной патентной заявки, термины "метаболический синдром", "метаболическое заболевание" или "метаболическое нарушение" следует считать синонимами.
В настоящем изобретении, термин "диабет" относится к группе болезней обмена веществ, при которых человек имеет высокий уровень сахара в крови, либо вследствие недостаточной выработки организмом инсулина, либо вследствие того, что клетки не реагируют на вырабатываемый инсулин. Существует три основных типа диабета: (1) диабет 1 типа (T1D): является результатом неспособности организма вырабатывать инсулин, и в настоящий момент требует введения пациенту инсулина. (Его называют также инсулин-зависимым сахарным диабетом, коротко IDDM, и ювенильным диабетом.) (2) диабет 2 типа (T2D): является результатом устойчивости к инсулину, состояние, при котором клетки не могут надлежащим образом использовать инсулин, иногда в комбинации с абсолютным дефицитом инсулина. (Ранее назывался также инсулин-независимым сахарным диабетом, сокращенно NIDDM, и диабетом взрослого возраста.) (3) Гестационный диабет (GD): в случаях когда беременная женщина, у которой раньше никогда не было диабета, имеет повышенный уровень глюкозы в крови во время беременности. Он может предшествовать развитию T2D.
В настоящем изобретении, термин "гиперлипидемия или гиперлипопротеинемия, или гиперлипедемия" относится к состоянию ненормально повышенных уровней в крови какого-либо или всех липидов и/или липопротеинов.
В настоящем изобретении, термин "гиперхолестеринемия" относится к высоким уровням содержания холестерина в крови. Этот термин тесно связан с терминами "гиперлипидемия" (повышенные уровни содержания липидов в крови) и "гиперлипопротеинемия" (повышенные уровни содержания липопротеинов в крови).
В настоящем изобретении, термин "гипертриглицеридемия" относится к высоким уровням содержания всех глицеридов, включая моноглицериды, диглицериды и триглицериды. Он связан с сердечно-сосудистыми заболеваниями, например атеросклерозом, даже в отсутствие гиперхолестеринемии (высокий уровень холестерина).
В настоящем изобретении, термин "гипертензия или высокое кровяное давление или артериальная гипертензия" относится к хроническому медицинскому состоянию, при котором повышено давление крови в артериях. Это требует более усиленной, чем в нормальном состоянии, работы сердца для обеспечения циркуляции крови через кровеносные сосуды. Нормальное кровяное давление в состоянии покоя находится в диапазоне от 100-140 мм. рт.ст. систолическое (верхний предел) до 60-90 мм. рт.ст. диастолическое (нижний предел). О высоком кровяном давлении говорят в случаях, когда оно постоянно составляет или превышает 140/90 мм. рт.ст.. Гипертензия является главным фактором риска для инсульта, инфаркта миокарда (сердечные приступы), сердечной недостаточности, аневризмы артерий (например, аневризмы аорты), заболеваний периферических артерий, и является причиной хронической болезни почек. Даже среднее повышение артериального давления связано с уменьшением прогнозируемой продолжительности жизни.
2
2
В настоящем изобретении, термин "ожирение или центральное ожирение" относится к медицинскому состоянию, при котором избыток жира в теле накапливается в такой степени, что может оказывать отрицательное влияние на здоровье, приводя к уменьшению прогнозируемой продолжительности жизни и/или усилению проблем со здоровьем. Индекс массы тела (ИМТ), в котором сравнивается вес и рост, оценивает состояние людей как «избыточный вес» (пре-ожирение) если их ИМТ составляет от 25 до 30 кг/м, и «ожирение» - когда значение составляет более 30 кг/м.
В настоящем изобретении, термин "нутрицевтическое питание" означает любое вещество, которое может служить пищей или частью пищи и которое дает медицинские преимущества или преимущества для здоровья, включая профилактику и лечение заболеваний.
Осуществление изобретения
Настоящее изобретение далее описано с помощью примеров, которые приведены в целях иллюстрации, а не ограничения.
Пример 1. Синтез производных 1-бензозамещенной тетрагидро-(3-карболин-3-карбоновой кислоты (соединения 1а и 1b):
5
3
(1a) R=n-ОСН (п="пара" положение)
5
(1b) R=Н
Производные 1-бензозамещенного 3-карбокси-тетрагидро-β-карболина (соединения 1а и 1b) получали конденсацией коммерчески доступного L-триптофана (5.0 ммоль) и 1.1 эквивалентов следующих альдегидов: анисовый альдегид (а) и бензальдегид (b). Полученную смесь кипятили примерно 2 часа в ледяной уксусной кислоте (20 мл), после чего pH доводили до pH=5 концентрированным раствором гидроксида аммония, и выпавший осадок промывали водой и фильтровали на воронке Бюхнера. Реакции давали смеси цис и транс продуктов (R-β и R-α группа). Продукты 1а или 1b получали с выходом 92% и 87%, соответственно.
Пример 2. Синтез метил-1-бензозамещенный-тетрагидро-β-карболин-3-карбоксилатных производных (соединения 2а и 2b):
5
(2b) R=H
2
4
К раствору 1-бензозамещенного 3-карбокси-тетрагидро-β-карболина (соединения 1a и 1b) (3.5 ммоль), в MeOH (10 мл) добавляли 1.0 мл конц. HSO. Раствор кипятили и перемешивали примерно 48 часов. После полного упаривания метанола, полученный продукт нейтрализовывали добавлением 10%-ного раствора бикарбоната натрия. Органическую фазу экстрагировали этилацетатом (3×10 мл), сушили безводным сульфатом натрия, и после отфильтровывания осушителя, удаляли растворитель на роторном испарителе. Получали соединения (2a или 2b), соответственно, с выходом от 82 до 87%.
Пример 3. Синтез метил 1-бензозамещенных β-карболин-3-карбоксилатов (соединения 3a или 3b):
5
3
(3а) R=п-ОСН
5
(3b) R=Н
К раствору 2.0 ммоль метил-тетрагидро-β-карболин-3-карбоксилата (соединения 2a или 2b) в ксилоле (25 мл) добавляли 2.5 экв. серы. Раствор кипятили и перемешивали 12 часов и затем перемешивали 3 часа при 0°C. Выпавший осадок отфильтровывали на воронке Бюхнера и промывали петролейным эфиром. Получали продукты (3a и 3b) с выходом от 70 до 73%.
Пример 4. Синтез N(-этиламин)-1-бензозамещенный-β-карболин-3-карбоксамида (соединение 4a) и N(-пропиламин)-1-бензозамещенный-β-карболин-3-карбоксамида (соединение 5a):
Соединение 3a (2.0 ммоль) и примерно 6.0 мл этилендиамина перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. После упаривания амина и перекристаллизации из метанола получали соединение 4a с выходом 55%.
3
Пропиламиновое производное β-карболина (соединение 5a) получали добавлением к метил-β-карболин-3-карбоксилатному производному (соединение 3a) (1.7 ммоль) эквимольного количества пропилендиамина в CHCl/МеОН 1:1 при кипячении в течение примерно 32 часов. Реакционную смесь отслеживали методом ТСХ. После полного упаривания хлороформа и метанола на роторном испарителе, продукт перекристаллизовывали из смеси метанол/ацетон с выходом 68%.
Пример 5. Синтез N-(гидразил)-1-бензозамещенного β-карболин-3-карбогидразида (соединения 6a и 6b):
7
3
(6а) R=п-ОСН
7
(6b) R=Н
К раствору соединения (3a) или (3b) (2.97 ммоль) в этаноле (40 мл), добавляли 48.2 ммоль гидразингидрата. Реакционную смесь кипятили 72 часа. Выпавший осадок отфильтровывали на воронке Бюхнера и промывали этанолом. Продукты 6a и 6b получали с выходом от 72 до 76%.
Пример 6. Синтез 3-(карбогидразил-n'-фенилзамещенный)-1-бензозамещенный-β-карболин-3-карбогидразида (соединения 7a и 7b):
К раствору N-гидразил-β-карболина (1.0 ммоль) (соединение 6a) или (соединение 6b) в воде (10 мл) добавляли 2 капли концентрированной серной кислоты. Полученную смесь перемешивали при 65°C до полного растворения. После этого добавляли 1.50 ммоль соответствующих ароматических альдегидов (бензальдегид для соединения 6a или n-нитробензальдегид для соединения 6b) в этаноле (10 мл) и кипятили раствор 24 часа. Полученную смесь помещали на ледяную баню и нейтрализовывали 10%-ным раствором бикарбоната натрия, выпавший осадок отфильтровывали на воронке Бюхнера и перекристаллизовывали из метанола. Продукты 7a и 7b получали с выходом от 58 до 60%.
Пример 7. Синтез соединения 17a (IFC-1201-04):
3
2
4
2
К суспензии 5-метил-DL-триптофана (1 г; 4.58 ммоль) в МеОН (10 мл) при 0°C прикапывали тионилхлорид (0.4 мл; 5.49 ммоль). Полученную смесь кипятили (80°C). Через 4 часа порциями добавляли в кипящий раствор п-анисовый альдегид (613 мг; 5.03 ммоль). ВЭЖХ-МС через 10 час показал присутствие двух диастереомеров. Полученную смесь охлаждали до комнатной температуры и упаривали досуха. Полученный сырой продукт растворяли в воде (50 мл). Добавляли ДХМ (20 мл) и насыщенный раствор NaHCO до значения pH=7. Слои разделяли и экстрагировали водную фазу дихлорметаном. Органические слои промывали водой и насыщенным раствором хлорида натрия. Слои разделяли, сушили органический слой над NaSO, фильтровали и упаривали досуха. Остаток очищали методом флэш-хроматографии (SiO, Гексан/ацетон 20%), получая 837 мг смеси диастереомеров. Выход: 52%. ВЭЖХ-МС: 99% (IFC-1201-01CF2).
К раствору соединения 14a (820 мг; 2.37 ммоль) в ксилоле (смесь; 40 мл) добавляли серу (229 мг; 7.11 ммоль). Полученную смесь кипятили. Анализ методом ВЭЖХ через 20 часов подтвердил полную конверсию. Реакционную смесь охлаждали и перемешивали 2 часа. Выпавший твердый осадок отфильтровывали. Полученный твердый продукт промывали петролейным эфиром. Получали 597 г соединения 15a. Выход: 73%, ВЭЖХ-МС: 98%. (IFC-1201-03S1) Температура плавления (Т.пл.): 285-286°C.
Соединение 15a (597 мг, 1.72 ммоль) растворяли в этилендиамине (4.6 мл, 69 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. ВЭЖХ-МС подтвердил полную конверсию. Растворитель упаривали досуха, и полученное твердое вещество сушили в печи при 45°C.Получали 552.9 мг соединения 16a. Выход: 86%, ВЭЖХ-МС: 98%. (IFC-1201-04 свободное основание). Т.пл.: 207-208°C
Наконец, 520 мг (1.39 ммоль) соединения 16a растворяли в этаноле (13 мл) и прикапывали 1.25 М раствор HCl в этаноле (5 мл) при комнатной температуре в течение 2 часов. Выпавший твердый осадок отфильтровывали, получая 489 мг соединения 17a (IFC-1201-04). Выход: 96%, ВЭЖХ-МС: 98%. (IFC-1201-04). Т.пл.: 255-256°C.
Пример 8. Синтез соединения 17b (IFC-1201-05):
К суспензии 6-фтор-D,L-триптофана (1,5 г; 6.75 ммоль) в МеОН (7.5 мл) при 0°C прикапывали тионилхлорид (0.6 мл; 8.1 ммоль). Полученную смесь кипятили в течение 4 часов. ВЭЖХ-МС показал отсутствие исходного соединения, в кипящий раствор добавляли п-анисовый альдегид (756 мг; 1.1 экв.), и полученную смесь перемешивали в течение ночи. ВЭЖХ-МС через 14 часов показал присутствие двух диастереомеров (66%).
3
2
4
2
Полученную смесь охлаждали до комнатной температуры и упаривали досуха. Полученный сырой продукт разделяли между водой (50 мл) и ДХМ (20 мл), и добавляли насыщенный раствор NaHCO до pH=7. Слои разделяли, и водную фазу экстрагировали дихлорметаном (2×20 мл). Органические слои промывали водой и насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над NaSO, фильтровали и упаривали досуха. Остаток (1.9 г) очищали методом флэш-хроматографии (SiO, Гексан/AcOEt 2:1→1:2), получая 870 мг смеси диастереомерных соединений (14b или JHG-1117-50CF2). Выход: 36%. ВЭЖХ-МС: 91%.
К раствору соединения 14b (860 мг; 2.43 ммоль) в ксилоле (смесь; 31 мл) добавляли серу (390 мг; 12.14 ммоль). Полученную смесь кипятили. Анализ методом ВЭЖХ через 16 часов подтвердил полную конверсию. Реакционную смесь охлаждали в холодильнике в течение ночи. Выпавший твердый осадок отфильтровывали и промывали петролейным эфиром (2×20 мл), получая 620 мг целевого соединения 15b (JHG-1117-54S). Выход: 73%, ВЭЖХ-МС: 100%. Т.пл.: 275-276°C.
Соединение 15b (580 мг; 16.57 ммоль) растворяли в этилендиамине (4.4 мл; 66.29 ммоль), и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. ТСХ-анализ подтвердил полную конверсию. Полученную смесь упаривали досуха, и остаток растирали в воде (25 мл) в течение ночи. Белый твердый продукт отфильтровывали и сушили, получая 550 мг (ВЭЖХ-МС 97%; Выход: 88%) соединения 16b (JHG-1117-57T). Т.пл.: 186-187°C.
Наконец, соединение 16b (510 мг; 1.35 ммоль) растворяли в этаноле (13 мл) и добавляли 1.25М раствор HCl в EtOH (5 мл). Полученную суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 3 час и фильтровали. Продукт получали в виде желтого твердого вещества 17b (IFC-1201-05): 528 мг; ВЭЖХ-МС 99%. Выход: 97%. Т.пл.: 249-250°C.
Пример 9. Синтез соединения 17с (IFC-1201-07):
К суспензии 5-метокси-L-триптофана (1 г; 4.27 ммоль) в МеОН (5 мл) при 0°C прикапывали тионилхлорид (0.37 мл; 5.12 ммоль). Полученную смесь кипятили в течение 4 часов. ВЭЖХ-МС показал отсутствие исходного соединения. Пара-анисовый альдегид добавляли в кипящий раствор (756 мг; 1.1 экв.), и полученную смесь перемешивали в течение ночи. ВЭЖХ-МС через 14 часов показал присутствие двух диастереомеров (79%).
3
2
4
2
Смесь охлаждали до комнатной температуры и упаривали досуха. Полученный сырой продукт растворяли в воде (50 мл). Добавляли ДХМ (20 мл) и насыщенный раствор NaHCO до значения pH=7. Слои разделяли, и водную фазу экстрагировали дихлорметаном. Объединенные органические слои промывали водой и насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над NaSO, фильтровали и упаривали досуха. Остаток (1.85 г) очищали методом флэш-хроматографии (SiO, Гексан/AcOEt 3:1), получая 226 мг смеси диастереомеров соединения 14c (JHG-1117-49CF1). Выход: 15%. ВЭЖХ-МС: 95%. Получали также другую неидентифицированную примесь (800 мг), скорее всего продукт деструкции.
2
К раствору соединения 14c (180 мг; 0.49 ммоль) в ксилоле (смесь; 7 мл) добавляли серу (80 мг; 2.46 ммоль). Полученную смесь кипятили. Анализ методом ВЭЖХ через 16 часов подтвердил полную конверсию. Реакционную смесь охлаждали и добавляли МТБЭ. Раствор ставили в холодильник на 2 часа. Выпавший твердый осадок отфильтровывали и промывали петролейным эфиром, получая 140 мг целевого соединения. Фильтрат упаривали и очищали методом флэш-хроматографии (SiO, ДХМ→ДХМ/AcOEt 9:1), получая еще 14 мг соединения 15c (JHG-1117-56S). Оба твердых продукта объединяли, общий вес составил 154 мг. Выход: 87%, ВЭЖХ-МС: 97%.
2
Соединение 15c (155 мг; 0.428 ммоль) растворяли в этилендиамине (1.1 мл; 17.12 ммоль), и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. ТСХ-анализ подтвердил полную конверсию. Полученную смесь упаривали досуха, затем упаривали совместно с HO и EtOH для удаления следов этилендиамина. Получали соединение 16c (IFC-1201-07 свободное основание): 190 мг (ВЭЖХ-МС 97%).
Наконец, соединение 16c (190 мг; 0.428 ммоль) растворяли в этаноле (4.2 мл) и добавляли 1.25М раствор HCl в EtOH (1.6 мл). Выпадал желтый твердый осадок. Полученную суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов и фильтровали. Получали продукт в виде желтого твердого вещества 17c (IFC-1201-07): 160 мг; ВЭЖХ-МС 96%. Выход: 90% (IFC-1201-07). Т.пл.: 215-216°C.
Пример 10. Синтез соединения 21a (IFC-1102-79):
3
3
К суспензии L-триптофана (700 мг; 3.42 ммоль) в МеОН (7 мл) при 0°C добавляли тионилхлорид (0.3 мл; 1.2 экв.) по каплям. Наблюдалось полное растворение. Полученную смесь кипятили (80°C). ВЭЖХ-МС (Жидкостная хроматография - масс-спектрометрия) через 2 часа подтвердила полную конверсию в метиловый эфир. Добавляли в кипящий раствор альдегид (403 мг; 1.1 экв.) порциями. Полученную смесь кипятили еще 9 часов. Выпадал желтый осадок, который делал невозможным перемешивание. Твердый осадок отфильтровывали и промывали метанолом. Получали желтое твердое вещество: 390 мг. Данные ВЭЖХ-МС анализа показали, что это соединение 19a (94%; М=303) в форме гидрохлорида. Спектр ЯМР (ядерный магнитный резонанс) подтвердил структуру. Твердый продукт растворяли в воде и добавляли насыщенный раствор NaHCO до значения pH=8. Наблюдали суспензию белого твердого вещества. Осадок отфильтровывали, получая продукт 19a (IFC-1102-75S2): 280 мг, ВЭЖХ-МС 99%; Выход: 27%. Спектр ЯМР подтвердил структуру. Первый фильтрат от реакции упаривали досуха, растворяли остаток в воде и доводили до pH=8 насыщенным раствором NaHCO. Получали бежевое твердое вещество. Осадок отфильтровывали, получая 509 мг смеси соединений 18a (62%) и 19a (IFC-1102-75S2) (7%).
Соединение 19a (180 мг; 0.59 ммоль) растворяли в этилендиамине (1.6 мл; 40.6 экв.), и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. ТСХ (тонкослойная хроматография) подтвердил полную конверсию. Полученную смесь упаривали досуха. Получали бежевое твердое вещество: 191.5 мг; ВЭЖХ-МС: 96% продукта 20a (IFC-1102-79 свободное основание); Выход: 98%.
Наконец, соединение 20a (188 мг) растворяли в этаноле (5 мл) и прикапывали 1.25М раствор HCl в этаноле (2.3 мл). Выпадал желтый твердый осадок. Полученную суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов и фильтровали.
Получали продукт в виде желтого твердого вещества 21a (IFC-1102-79): 197 мг; ВЭЖХ-МС 99%. Выход: 95%. Данное соединение получали в виде двух партий.
Пример 11. Синтез соединения 21b (IFC-1102-92):
3
4
К суспензии L-триптофана (1 г; 4.89 ммоль) в МеОН (10 мл) при 0°C по каплям добавляли тионилхлорид (0.43 мл; 1.2 экв.). Наблюдалось полное растворение. Полученную смесь кипятили (80°C). ВЭЖХ-МС через 2 часа подтвердил полную конверсию в метиловый эфир. Порциями добавляли в кипящий раствор альдегид (756 мг; 1.1 экв.). ВЭЖХ-МС через 10 часов показал наличие 3 пиков с целевой массой. Два из них соответствовали диастереомерам 18b, а оставшийся скорее всего соответствует промежуточному имину. Полученную смесь кипятили еще 8 часов для завершения реакции. Анализ методом ВЭЖХ через 8 часов показал отсутствие прогресса в реакции, в смеси оставалось 30% имина. Полученную смесь охлаждали до комнатной температуры и упаривали досуха. Полученный сырой продукт растворяли в воде и добавляли насыщенный раствор NaHCO до значения pH=8. Выпадал белый твердый осадок. Его экстрагировали дихлорметаном. Органический слой промывали водой и насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над MgSO и упаривали. Получали белое твердое вещество: 1.65 г (ВЭЖХ показал наличие продукта 18b и имина). Полученный твердый продукт очищали методом флэш-хроматографии, получая 440 мг 18b (IFC-1102-82-C2F2) (ВЭЖХ-МС 96%); Выход: 28%.
К раствору соединения 18b (250 мг; 0.73 ммоль) в ксилоле (смесь; 12 мл) добавляли серу (64 мг; 2.7 экв.). Полученную смесь кипятили. Анализ методом ВЭЖХ через 20 часов показал присутствие небольшое количества исходного вещества 18b, поэтому добавляли еще серу (0.7 экв.). Анализ методом ВЭЖХ через 4 часа подтвердил полную конверсию. Реакционную смесь охлаждали в бане с ледяной водой 3 часа. Выпавшее в осадок красновато-коричневое твердое вещество отфильтровывали и промывали петролейным эфиром. Получали продукт 19b (IFC-1102-88S1) в виде коричневого твердого вещества: 189 мг; ВЭЖХ-МС 99%; Выход: 77%.
Соединение 19b (169 мг; 0.50 ммоль) растворяли в этилендиамине (1.6 мл; 48 экв.) и перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Анализ методом ТСХ подтвердил полную конверсию. Полученную смесь упаривали досуха. Получали продукт 20b в виде бежевого твердого вещества: 174 мг; ВЭЖХ-МС 98%. ЯМР показал наличие небольшого количества этилендиамина, поэтому продукт промывали водой, фильтровали и сушили. Получали чистый продукт 20b (IFC-1102-92 свободное основание): 155 мг; Выход: (77%).
Соединение 20b (155 мг; 0.42 ммоль) растворяли в этаноле (5 мл) и прикапывали 1.25М раствор HCl в EtOH (2 мл). Выпадал желтый твердый осадок. Полученную суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов и фильтровали. Получали продукт в виде желтого твердого вещества 21b (IFC-1102-92): 125 мг; ВЭЖХ-МС 98%. Выход: 74%. Данное соединение получали в виде двух партий.
Пример 12. Синтез соединения 21c (IFC-1102-93):
3
К суспензии L-триптофана (1 г; 4.89 ммоль) в МеОН (10 мл) при 0°C прикапывали тионилхлорид (0.43 мл; 1.2 экв.). Наблюдалось полное растворение. Смесь кипятили (80°C). ВЭЖХ-МС через 2 часа подтвердил полную конверсию в метиловый эфир. В кипящий раствор порциями добавляли альдегид (818 мг; 1.1 экв.). ВЭЖХ-МС через 10 часов показал наличие 3 пиков с целевой массой. Два из них соответствовали диастереомерам 18c, а оставшийся скорее всего соответствует промежуточному имину. Полученную смесь кипятили еще 8 часов для завершения реакции. Анализ методом ВЭЖХ через 8 часов показал небольшой прогресс в реакции, в смеси оставалось 12% имина. Полученную смесь охлаждали до комнатной температуры и упаривали досуха. Полученный сырой продукт растворяли в воде и добавляли насыщенный раствор NaHCO до значения pH=8. Выпадал белый твердый осадок. Его отфильтровывали и промывали водой. Получали белое твердое вещество: 1.03 г (ВЭЖХ показал наличие продукта 18c (80%) и имина). Полученное твердое вещество очищали методом колоночной хроматографии на силикагеле, получая 810 мг 18c (IFC-1102-83CF1) (ВЭЖХ-МС 99%); Выход: 47%.
К раствору соединения 18c (250 мг; 0.71 ммоль) в ксилоле (смесь; 12 мл) добавляли серу (64 мг; 2.8 экв.). Полученную смесь кипятили. Анализ методом ВЭЖХ через 20 часов показал присутствие небольшое количества исходного вещества 18c, поэтому добавляли еще серу (0.7 экв.). Анализ методом ВЭЖХ через 4 часа подтвердил полную конверсию. Реакционную смесь охлаждали на ледяной бане в течение 3 часов. Полученное светло-желтое твердое вещество отфильтровывали и промывали петролейным эфиром. Получали продукт 19c (IFC-1102-89S1) в виде желтого твердого вещества: 170 мг; ВЭЖХ-МС 92%; Выход: 69%.
Соединение 19 с (155 мг; 0.44 ммоль) растворяли в этилендиамине (1.6 мл; 54 экв.) и перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Метод ВЭЖХ-МС подтвердил полную конверсию. Полученную смесь упаривали досуха. Получали продукт 20c (IFC-1102-93 свободное основание) в виде бежевого твердого вещества: 160 мг; ВЭЖХ-МС 98%; Выход: (97%).
Соединение 20c (150 мг; 0.40 ммоль) растворяли в этаноле (5 мл) и прикапывали 1.25 М раствор HCl в EtOH (2 мл). Выпадал желтый твердый осадок. Полученную суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов и фильтровали. Получали продукт в виде желтого твердого вещества 21c (IFC-1102-93): 133 мг; ВЭЖХ-МС 97%. Выход: 72%. (IFC-1102-93). Данное соединение получали в виде двух партий.
Пример 13. Синтез соединения 21d (IFC-1102-94):
3
2
К суспензии L-триптофана (3 г; 14.69 ммоль) в МеОН (30 мл) при 0°C прикапывали тионилхлорид (1.3 мл; 17.9 ммоль). Наблюдалось полное растворение. Полученную смесь кипятили (80°C). ВЭЖХ-МС через 2 часа подтвердил полную конверсию в метиловый эфир. Порциями добавляли в кипящий раствор альдегид (1.97 г; 16.13 ммоль). Анализ методом ВЭЖХ-МС через 28 часов подтвердил полную конверсию. Полученную смесь охлаждали до комнатной температуры и упаривали досуха. Полученный сырой продукт растворяли в воде и добавляли насыщенный раствор NaHCO до значения pH=8. Выпадал белый твердый осадок. Его отфильтровывали и промывали водой. Получали коричневое твердое вещество: 3.45 г (HPLC: 90%). Полученное твердое вещество очищали методом колоночной хроматографии на силикагеле (SiO Гексан/ацетон 30%), получая 1.08 г соединения 18d (IFC-1102-85CF1) (ВЭЖХ-МС 99%); Выход: 23%.
К раствору соединения 18d (500 мг; 1.55 ммоль) в ксилоле (смесь; 25 мл) добавляли серу (140 мг; 4.34 ммоль). Полученную смесь кипятили. Анализ методом ВЭЖХ через 64 часа подтвердил полную конверсию. Реакционную смесь охлаждали до 0°C в течение ночи. Полученное светло-желтое твердое вещество отфильтровывали и промывали петролейным эфиром. Соединение 19d (IFC-1102-91 SI) получали в виде желтого твердого вещества: 170 мг; ВЭЖХ-МС 96%; Выход: 82%. Т.пл.: 260-261°C.
Соединение 19d (372 мг; 1.17 ммоль) растворяли в этилендиамине (3.1 мл; 46.8 ммоль.) и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Метод ВЭЖХ-МС подтвердил полную конверсию. Полученную смесь упаривали досуха. Получали продукт 20d (IFC-1102-94 свободное основание) в виде бежевого твердого вещества: 417 мг; ВЭЖХ-МС 94%; Выход: (количественный). Т.пл.: 238-239°C.
Соединение 20d (400 мг; 1.15 ммоль) растворяли в этаноле (5 мл) и прикапывали 1.25М раствор HCl в EtOH (5 мл). Выпадал желтый твердый осадок. Полученную суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов и фильтровали. Твердый осадок промывали этанолом и сушили в печи при 45°C.Получали продукт в виде желтого твердого вещества 21d (IFC-1102-94): 309 мг; ВЭЖХ-МС 98%. Выход: 70%. Т.пл.: 301-303°C. Данное соединение получали в виде двух партий.
Пример 14. Синтез соединения 21е (IFC-1102-96):
2
3
L-Триптофан (2.62 г, 12.84 ммоль) суспендировали в МеОН (5.47 мл) и охлаждали до 0°C. Прикапывали SOCl (1.14 мл, 15.52 ммоль), и реакционную смесь кипятили 2 часа. LC-MS (Жидкостная хроматография - масс-спектрометрия) показала отсутствие исходного вещества. Добавляли 4-(трифторметил)-бензальдегид (2.03 мл, 11.89 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при кипячении 6 часов. После проверки полноты протекания реакции, реакционную смесь упаривали досуха. Остаток растворяли в воде (27 мл), нейтрализовывали насыщенным раствором NaHCO (17.28 мл) и промывали этилацетатом (3×54 мл). Фазы разделяли, и органический слой упаривали досуха. Сырой продукт очищали методом флэш-хроматографии, применяя в качестве элюента смесь гексан/EtOAc от 5:1 до 1:1. Соединение 18e (AST-1112-83) (2.18 г, Выход: 45.4%) получали в виде коричневого твердого вещества. Lc-Ms=95.6%.
Соединение 18e (2.18 г, 5.82 ммоль) суспендировали в смеси ксилолов (81 мл) и добавляли серу (0.465 г, 14.55 ммоль). Полученную смесь кипятили в течение ночи. LC-MS показала отсутствие исходного вещества. Реакционную смесь охлаждали до 4°C, отфильтровывали осадок и промывали петролейным эфиром (10 мл). Соединение 19e (AST-1112-84) (1.4 г, выход 65%) получали в виде коричневого твердого вещества. LC-MS=98.5%.
Соединение 19e (1.0 г; 2.7 ммоль) растворяли в этилендиамине (7.2 мл; 40 экв.) и перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Метод ВЭЖХ-МС подтвердил полную конверсию. Полученную смесь упаривали досуха, продукт 20e (IFC-1102-96) получали в виде бежевого твердого вещества: 1.07 г; ВЭЖХ-МС 98%. Выход: 99%.
Соединение 20e (513 мг; 1.28 ммоль) растворяли в этаноле (13 мл) и прикапывали 1.25 М раствор HCl в EtOH (5 мл). Выпадал желтый твердый осадок. Полученную суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов и фильтровали. Получали продукт 21e (IFC-1102-96) в виде желтого твердого вещества: 465 мг; ВЭЖХ-МС 98%. Выход: 84%. Т.пл.: 283-284°C.
Пример 15. Синтез соединения 21f (IFC-1201-06):
2
3
L-Триптофан (2.00 г, 9.88 ммоль) суспендировали в МеОН (20 мл) и охлаждали до 0°C. Прикапывали SOCl (0.87 мл, 12 ммоль) и реакционную смесь кипятили 2 часа. LC-MS показал отсутствие исходного вещества. Добавляли 3-гидроксибензальдегид (1.31 г, 10 ммоль) и перемешивали реакционную смесь при кипячении в течение ночи. После проверки полноты протекания реакции, смесь упаривали досуха. Остаток растворяли в воде (27 мл) и нейтрализовывали насыщенным раствором NHCO (17.28 мл). Образовавшийся коричневый осадок отфильтровывали. Полученный твердый продукт очищали методом флэш-хроматографии, используя в качестве элюента смесь гексан/ацетон от 7:3 до 1:1. Соединение 18f (IFC-1102-90CF1) (945 мг, Выход: 30%) получали в виде коричневого твердого вещества. Lc-Ms=98%.
Соединение 18f (445 мг, 1.38 ммоль) суспендировали в смеси ксилолов (25 мл) и добавляли S (133 мг, 4.15 ммоль). Полученную смесь кипятили в течение 44 часов. Lc-Ms показал отсутствие исходного вещества. Реакционную смесь охлаждали до 4°C, выпавший осадок отфильтровывали и промывали петролейным эфиром (10 мл). Соединение 19f (IFC-1201-02S1) (263 мг, выход 60%) получали в виде коричневого твердого вещества. Lc-Ms=90%.
Соединение 19f (263 мг; 0.82 ммоль) растворяли в этилендиамине (2.6 мл; 39 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Метод ВЭЖХ-МС подтвердил полную конверсию. Полученную смесь упаривали досуха. Продукт 20f (IFC-1201-06) получали в виде бежевого твердого вещества: 196.8 мг; ВЭЖХ-МС 91%. Выход: 75%).
Соединение 20f (196 мг; 0.61 ммоль) растворяли в этаноле (4 мл) и прикапывали 1.25 М раствор HCl в EtOH (1.5 мл). Выпадал желтый твердый осадок. Полученную суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов и фильтровали. Получали продукт 21f (IFC-1201-06) в виде желтого твердого вещества: 108 мг; ВЭЖХ-МС 96%. Выход: 52%.
Пример 16. Синтез соединения 23a (JHG-1117-24):
2
1
L-Триптофан (20 г, 0.098 моль) суспендировали в метаноле (100 мл). Полученную суспензию охлаждали до 0°C и прикапывали SOCl (8.75 мл, 0.12 моль). Затем реакционную смесь кипятили 2.5 часа. За это время исходное вещество полностью растворялось, и раствор становился темно-оранжевым. Через 2 часа аликвотную пробу упаривали досуха и анализировали методом ВЭЖХ-МС (99% соединения 6 (IQT-11-37)), а тест методом Н-ЯМР показал, что исходного соединения не наблюдалось.
2
3
2
4
П-анисовый альдегид (32.5 мл, 0.28 моль) добавляли в ранее полученный раствор, и полученную смесь кипятили в течение 15 часов. По истечении указанного времени реакционный раствор анализировали методом ВЭЖХ-МС. Исходного соединения не наблюдалось. Реакционную смесь упаривали досуха. Остаток растворяли в HO (250 мл) и нейтрализовывали до значения pH~7 насыщенным раствором NaHCO (~100 мл). Полученный раствор экстрагировали этилацетатом (3×400 мл). Органический слой промывали водой (2×400 мл) и насыщенным раствором NaCl (2×200 мл). Органический слой сушили над NaSO, фильтровали и упаривали досуха, получая 30 г соединения 2a (IQT-11-37) (Выход: 91%) сырого продукта (ВЭЖХ-МС (чистота): 94% смесь двух диастереомеров. Полученный неочищенный продукт использовали в следующей стадии без дополнительной очистки.
Соединение 2 (29.22 г, 0,087 моль) суспендировали в смеси ксилолов (1080 мл) и добавляли S (13.9 г, 0.43 моль). Полученную смесь кипятили в течение 22 часов. ТСХ и LC-MS: отсутствие исходного вещества. По истечении указанного времени реакционный раствор охлаждали до 3°C и перемешивали в течение ночи. Коричневый осадок отфильтровывали и промывали петролейным эфиром. Анализ методами ВЭЖХ-МС (94% 3а и 3% ксилола) и 1Н-ЯМР подтвердили, что соединение За не чистое. Коричневое твердое вещество (21.5 г) очищали методом флэш-хроматографии на силикагеле (ДХМ→ДХМ-AcOEt 9:1), получая чистое соединение 3а (IQT-11-37) (15.1 г; Выход: 52%).
К суспензии соединения 3а (400 мг, 1.20 ммоль) в EtOH (4 мл) при комнатной температуре добавляли морфолин (0.5 мл; 6 ммоль). Исходное вещество растворялось, и полученную смесь нагревали до кипения. Через 43 часа LC-MS анализ показал отсутствие исходного вещества (42% соединения 22а). Полученную смесь охлаждали до комнатной температуры и добавляли воду (15 мл). Полученную смесь перемешивали 30 минут и фильтровали. Полученное кремовое твердое вещество (260 мг) очищали методом колоночной хроматографии на силикагеле (Гексан: AcOEt 1:1), получая чистое соединение 22а (JHG-1117-11-CF1) (140 мг; LC-MS: 100%; Выход: 30%).
К соединению 22а (136 мг; 0.340 ммоль) добавляли 1.25 М раствор HCl (газ) в EtOH (13.6 мл; 17.0 ммоль) и перемешивали в течение ночи. Выпавшее бледно-желтое твердое вещество фильтровали и промывали холодным EtOH, получая чистое соединение 23 а (JHG-1117-24) (130 мг; LC-MS: 99%; Выход: 83%). 118 мг получали в две партии.
Пример 17. Синтез соединения 23b (JHG-1117-24):
Соединение 3a (0.60 г, 1.80 ммоль) (см. Пример 16) растворяли и перемешивали в N,N-диметилэтилендиамине (8.2 мл, 75.1 ммоль) при комнатной температуре в течение ночи. ТСХ-анализ через 15 часов показал отсутствие исходного вещества. Полученную смесь нагревали до 50°C и через 4 часа реакция заканчивалась. Полученную смесь упаривали досуха для удаления избытка диметилэтилендиамина. Полученный сырой продукт растирали в воде и фильтровали, получая 490 мг твердого коричневого вещества, которое очищали методом флэш-хроматографии на силикагеле (Ацетон→Ацетон: EtOH 9:1). Чистое соединение 22b (JHG-1117-5-CF1) получали в виде бледно-желтого твердого вещества (240 мг; LC-MS: 100%; Выход: 34%).
К соединению 22b (240 мг; 0.618 ммоль) добавляли 1.25 М раствор HCl (газ) в EtOH (24.7 мл; 30.9 ммоль). Полученный оранжевый раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 15 часов. Удаляли растворитель, и полученное красноватое масло 2 часа растирали в изопропаноле. Полученный твердый осадок отфильтровывали и промывали МТБЭ, получая чистое соединение 23b (JHG-1117-26) (170 мг; LC-MS: 100%; Выход: 65%). Получали 120 мг (две партии).
1
2
2
3
2
(23b) R:HNCHCHN(CH)
Пример 18. Синтез соединения 23 с (JHG-1117-28):
К суспензии соединения 3a (см. Пример 16) (400 мг, 1.20 ммоль) в EtOH (4 мл) при комнатной температуре добавляли N-метилпиперазин (5.4 мл; 48.7 ммоль). Исходное вещество растворялось, и полученный желтый раствор нагревали до кипения. Через 137 часов LC-MS показал отсутствие исходного вещества (27% соединения 22c). Полученную смесь охлаждали до комнатной температуры и упаривали досуха. Полученное черное масло высаживали в воде (10 мл), полученный твердый коричневый осадок отфильтровывали, промывали водой и сушили. Полученный твердый продукт (330 мг; 49% 22 с согласно LC-MS) очищали методом флэш-хроматографии на силикагеле (Ацетон→Ацетон: EtOH 10:1), получая чистое соединение 22c (JHG-1117-10-CF1) (147 мг; LC-MS: 96%; Выход: 30%).
К соединению 22c (136 мг; 0.340 ммоль) добавляли 1.25 М раствор HCl (газ) в EtOH (13.6 мл; 17.0 ммоль) и перемешивали в течение ночи. Выпавший бледно-желтый твердый осадок отфильтровывали и промывали холодным EtOH, получая чистое соединение 23c (JHG-1117-28) (148 мг; LC-MS: 97%; Выход: 99%). Получали 132 мг (две партии).
Пример 19. Синтез соединения 23d (JHG-1117-30S):
Смесь соединения 3a (см. Пример 16) (0.50 г, 1.50 ммоль) и 2-аминоэтанола (2.7 мл, 45 ммоль) нагревали до 100°C и перемешивали 5 часов. ТСХ-анализ показал отсутствие исходного соединения. Полученную смесь охлаждали до комнатной температуры и добавляли воду (20 мл). Через 10 минут отфильтровывали выпавший белый осадок и сушили его в вакууме, получая соединение 22d (JHG-1117-3OS) (500 мг; LC-MS: 99%; Выход: 92%).
Суспензию соединения 22d (370 мг; 1.02 ммоль) в 1.25 М растворе HCl (газ) в EtOH (24.6 мл; 30.72 ммоль) перемешивали 5 часов. По истечении указанного времени, исходного соединения не наблюдалось согласно ТСХ-анализу. Выпавшее в осадок соединение 23d (JHG-1117-41) отфильтровывали и сушили в вакууме в течение ночи (330 мг; LC-MS: 100%; Выход: 81%). Получали 126 мг (две партии).
Пример 20. Синтез соединения 23e (JHG-1117-8):
К раствору соединения 3a (см. Пример 16) (0.50 г, 1.50 ммоль) в ДХМ (5 мл) добавляли 1,4-диаминобутан (2.65 г, 30 ммоль), и перемешивали полученную смесь при комнатной температуре в течение ночи. ТСХ-анализ через 22 часа показал отсутствие исходного соединения. Добавляли воду (15 мл), и фазы разделяли. Органический слой промывали водой (8×30 мл) и насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и упаривали досуха. Полученное желтое масло (700 мг) очищали методом колоночной хроматографии на силикагеле (Ацетон→Ацетон: EtOH 9:1), затем добавляли МТБЭ и упаривали досуха (данную обработку повторяли дважды), получая соединение 22e (JHG-1117-8) в виде зеленоватого твердого вещества (420 мг; LC-MS: 97%; Выход: 72%).
Соединение 22e (390 мг; 1.00 ммоль) растворяли в 1.25 М растворе HCl (газ) в EtOH (35 мл; 43.7 ммоль). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 часов. Удаляли растворитель, и полученное красноватое масло растирали в изопропаноле 2 часа, отфильтровывали и промывали смесью iPrOH-МТБЭ 1:1, получая светло-коричневое твердое вещество (LC-MS: 87% 23e). Полученный твердый продукт суспендировали в горячем iPrOH (15 мл) и перемешивали 3 часа. Теплую суспензию фильтровали и сушили, получая чистое соединение 23e (JHG-1117-27-S2) в виде бежевого твердого вещества (160 мг; LC-MS: 97%; Выход: 38%). Получали 124 мг соединения 23e (две партии).
1
2
4
2
(23e) R:HN-(СН)-NH
Пример 21. Синтез соединения 23f ((IFC-1201-09):
Соединение 3a (получено методом, описанным в Примере 16) (1.0 г, 3.0 ммоль) растворяли в 2-метоксиэтиламине (6,7 мл, 78 ммоль), и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 дней. По истечении указанного времени выпадал белый твердый осадок. Полученный твердый продукт отфильтровывали, промывали водой и сушили в печи при 45°C. Получали 616 мг соединения 22f (IFC-1201-09 свободное основание) (LC-MS: 98%; Выход: 55%). Т.пл.: 200-200°C.
Соединение 22f (362 мг; 0.93 ммоль) растворяли в этаноле (9 мл) и добавляли 1.25 М раствор HCl (газ) в EtOH (3.5 мл). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Выпавший желтый твердый осадок отфильтровывали и промывали этанолом, получая 300.7 мг желтого твердого вещества (Выход: 75%, LC-MS: 87% 23f). Получали (IFC-1201-09) (две партии). Т.пл.: 109-110°C.
1
2
2
3
(23f) R:HNCCHOCH
Пример 22. Синтез соединения 26a (JHG-1117-29):
К раствору соединения 3a (см. Пример 15) (300 мг, 0.9 ммоль) в безводном ДМФА (5 мл), в атмосфере азота при комнатной температуре добавляли NaH 60%-ная дисперсия в минеральном масле (55 мг, 1.35 ммоль) (смесь превращалась в красный раствор). Полученную смесь перемешивали 10 минут и прикапывали MeI (0.17 мл; 2.7 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при той же температуре в течение ночи. LC-MS показал отсутствие исходного соединения. Добавляли воду (25 мл) и AcOEt (25 мл), и фазы разделяли. Органический слой промывали водой (2х) и насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и упаривали досуха. Полученное желтое масло (370 мг) очищали методом флэш-хроматографии на силикагеле (Гексан-AcOEt 2:1→1:1), получая соединение 24a (JHG-1117-14-CF1) в виде бледно-желтого твердого вещества (260 мг; LC-MS: 100%; Выход: 84%).
К раствору соединения 24a (0.50 г, 1.50 ммоль) в ДХМ (3 мл) добавляли этилендиамин (2 мл; 30 ммоль), и перемешивали полученную смесь при комнатной температуре в течение ночи. ТСХ-анализ через 15 часов показал отсутствие исходного соединения. Добавляли воду (10 мл) и упаривали ДХМ. Выпавший кремовый осадок отфильтровывали и промывали несколько раз водой (3×10 мл) для удаления избытка этилендиамина. Чистое соединение 25a (JHG-1117-19-S) получали в виде бежевого твердого вещества (270 мг; LC-MS: 98%; Выход: 96%).
К соединению 25a (260 мг; 0.694 ммоль) добавляли при комнатной температуре 1.25 М раствор HCl (газ) в EtOH (18 мл; 22.5 ммоль) и исходный раствор превращался в суспензию через 5 минут перемешивания. Спустя 15 часов при той же температуре, смесь фильтровали, промывали дополнительным количеством холодного EtOH и сушили в вакууме в течение ночи (285 мг; LC-MS: 98%; Выход: Количественный). Получали 132 мг соединения 26a (JHG-1117-29) (две партии).
Пример 23. Синтез соединения 26b (JHG-1117-43):
4
К раствору соединения 3a (см. Пример 16) (500 мг, 1.5 ммоль) в безводном ДМФА (10 мл) в атмосфере азота при комнатной температуре добавляли NaH (60%-ная дисперсия в минеральном масле, 90 мг, 2.25 ммоль) (смесь превращалась в красный раствор). Полученную смесь перемешивали 10 минут и прикапывали бензилбромид (0.72 мл; 6.02 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при той же температуре 4.5 часа. ТСХ-анализ показал отсутствие исходного соединения. Добавляли воду (50 мл) и AcOEt (20 мл), и фазы разделяли. Органический слой промывали водой (3х), насыщенным раствором NHCl и насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и упаривали досуха. Полученное твердое вещество (1.5 г) растирали в ацетоне, получая белое твердое вещество (210 мг; LC-MS: 99%; JHG-1117-31-S). Фильтрат упаривали (900 мг) и очищали методом флэш-хроматографии на силикагеле (Гексан-AcOEt 4:1→3:1), получая другое белое твердое вещество (280 мг; LC-MS: 100%; JHG-1117-31-CF1). Оба твердых продукта объединяли, получая соединение 24b (JHG-1117-31) 490 мг (Выход: 77%).
2
CHPh: Бензильная группа
К раствору соединения 24b (450 мг, 1.066 ммоль) в ДХМ (7 мл) добавляли этилендиамин (2 мл; 30 ммоль), и перемешивали полученную смесь при комнатной температуре в течение ночи. ТСХ-анализ через 15 часов показал отсутствие исходного соединения. Добавляли воду (15 мл) и упаривали ДХМ. Взвешенный в воде оранжевый осадок растирали до тех пор, пока не получали твердый продукт. Отфильтровывали, промывали водой и сушили полученный продукт, получая чистое соединение 25b (JHG-1117-37-S2) (404 мг; LC-MS: 99%; Выход: 84%).
К соединению 25b (400 мг; 0.889 ммоль) добавляли при комнатной температуре 1.25 М раствор HCl (газ) в EtOH (21.3 мл; 26.67 ммоль), и исходный раствор превращался в суспензию после 5 минут перемешивания. Через 2 часа перемешивания при той же температуре, смесь фильтровали, промывали дополнительным количеством холодного EtOH и сушили в вакууме в течение ночи (230 мг; LC-MS: 100%; Выход: 53%). Получали 127 мг (JHG-1117-43) (две партии).
Пример 24. Альтернативный синтез соединения 4a (IFC-1102-48S):
2
1
Для получения соединения 8, L-триптофан (50 г, 0.24 моль) суспендировали в метаноле (100 мл). Полученную суспензию охлаждали до 0°C и прикапывали SOCl (21.5 мл, 0.29 моль). Затем реакционную смесь кипятили 2 часа. За это время исходное вещество полностью растворялось, и раствор становился темным. Спустя 2 часа аликвотную пробу упаривали досуха и анализировали методом ВЭЖХ-МС и Н-ЯМР, которые показали, что было получено соединение 6a, и исходного соединения не наблюдалось.
2
3
2
4
2
Для получения соединения 2a, сначала добавляли анисовый альдегид (32.5 мл, 0.28 моль) в ранее полученный раствор, и смесь кипятили в течение 8 часов. По истечении указанного времени реакционный раствор анализировали методом ВЭЖХ-МС. Исходного соединения не наблюдалось. Реакционную смесь упаривали досуха. Остаток растворяли в HO (500 мл) и нейтрализовывали добавлением насыщенного раствора NHCO (~320 мл). Полученный раствор экстрагировали этилацетатом (3×1 л). Органический слой промывали водой (2×1 л) и насыщенным раствором NaCl (2×500 мл). Органический слой сушили над NaSO, фильтровали и упаривали досуха, получая 82.9 г сырого продукта (ВЭЖХ-МС (чистота): 76% смесь двух диастереомеров). Полученный сырой продукт очищали методом флэш-хроматографии на SiO (элюенты: гексан/EtOAc 3:1→EtOAc). В данном случае (это не являлось необходимым) авторы разделили два диастеремера для их анализа. Затем их объединяли, получая соединение 3а. Получали 54.88 г (выход: 67%) смеси диастереомеров с чистотой выше 90%.
Для получения соединения 3a, ранее полученное соединение 2 (50.0 г, 0,148 моль) суспендировали в смеси ксилолов (1800 мл) и добавляли S (23.68 г, 0.74 моль). Полученную смесь кипятили в течение 22 часов. По истечении указанного времени реакционную смесь охлаждали до 4°C и перемешивали в течение ночи. Получали светло-коричневое твердое вещество. Полученный твердый продукт промывали петролейным эфиром и анализировали методами ВЭЖХ-МС и 1H-ЯМР. Получали 39.11 г (выход: 79%) соединения 3a.
Наконец, для получения соединения 4a, ранее полученное соединение 3а (5.6 г, 0.017 моль) суспендировали в этилендиамине (51 мл, 0.73 моль), и раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь контролировали методом ТСХ. Реакционную смесь упаривали досуха для удаления избытка этилендиамина. Получали 7.4 г соединения 4a. Полученное соединение перекристаллизовывали из метанола (90 мл) и оставляли в холоде на ночь. Полученное твердое вещество отфильтровывали. Наконец, получали 4.8 г (выход: 78%) соединения 4a (IFC-1102-48S) описанным способом с выходом 98.6%.
Для получения гидрохлорида соединения 4a (4a HCl), к соединению 4a (0.1 г, 0.27 ммоль) добавляли при комнатной температуре 1.25 М раствор HCl (газ) в EtOH (0.43 мл, 0.54 ммоль), и исходный раствор превращался в суспензию после 5 часов перемешивания. Образовывался белый осадок (57 мг соединения 4a HCl). Его отфильтровывали и промывали холодным EtOH. Для установления того, является ли соединение 4a HCl моно- или дигидрохлоридом, необходимо проводить элементный анализ или, например, ВЭЖХ, LC-MS и т.д.. Полученное соединение растворимо в воде. Структура была подтверждена методом ЯМР.
Пример 25. Альтернативный синтез соединения 5a (IFC-1102-57S):
1
Соединение 3a (6.0 г; 18 ммоль) (получено методом, описанным в Примере 24) растворяли в 1,3-диаминопропане (60 мл; 40 экв.) и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Спустя 16 часов анализ методом ВЭЖХ-МС подтвердил полную конверсию. Избыток диамина удаляли на роторном испарителе. Получали коричневое твердое вещество. Полученный твердый продукт растирали в ацетоне в течение 2 часов и затем отфильтровывали, получая белое твердое вещество, соответствующее соединению 5a (ВЭЖХ-МС (чистота: 98%). Н-ЯМР анализ полученного твердого вещества показал наличие остатков диамина, поэтому было необходимо промыть продукт водой. Твердый осадок отфильтровывали и сушили в вакуумной печи при 40°C. Твердый осадок промывали снова ацетоном, фильтровали и сушили. Получали 5.42 г (выход: 80%) соединения 5a в виде белого твердого вещества (чистота ВЭЖХ-МС: 99%).
Пример 26. Альтернативный синтез соединения 7a (PGP-11048SR1):
Соединение 3a (13 г; 39.15 ммоль) (получено методом, описанным в Примере 24) суспендировали в этаноле (500 мл) и добавляли гидразин моногидрат (20 мл; 626.4 ммоль) при комнатной температуре. Реакционную смесь кипятили в течение 29 часов. По истечении указанного времени реакционную смесь охлаждали и отфильтровывали сырой продукт. Полученное твердое вещество промывали EtOH (70 мл) и сушили, получая 12.2 г (выход: 94%) соединения 9 (чистота ВЭЖХ-МС: 93%) в виде белого твердого вещества.
Метод А:
2
2
4
3
Соединение 9 (12 г; 36.14 ммоль) суспендировали в HO (360 мл) и HSO (0.6 мл; 0.011 ммоль) при комнатной температуре. Реакционную смесь кипятили в течение 30 минут (температура нагревателя 100°C. Полного растворения не наблюдалось). Затем медленно добавляли раствор бензальдегида (5.5 мл; 54.21 ммоль) в EtOH (360 мл) в течение 40 минут. Реакционную смесь кипятили в течение 20 часов. Смесь охлаждали до 0°C и нейтрализовывали 10%-ным раствором NaHCO (pH~7). Сырой продукт отфильтровывали и сушили. Полученное твердое вещество перекристаллизовывали из МеОН (15.9 г в 1.85 л МеОН), получая 10.5 г соединения 7a (чистота ВЭЖХ-МС: 99%; Выход: 69%) в виде белого твердого вещества.
Метод В:
Соединение 9 (400 мг; 1.2 ммоль) суспендировали в EtOH (12 мл) и нагревали до кипения. Медленно добавляли бензальдегид (0.18 мл; 1.8 ммоль) в EtOH (12 мл) (по окончании добавления достигалось полное растворение). Реакционную смесь кипятили в течение 18 часов. Смесь упаривали, получая твердый остаток (700 мг). Полученный твердый продукт перекристаллизовывали из МеОН (700 мг в 70 мл МеОН), получая 418 мг соединения 7a (чистота ВЭЖХ-МС:99%; Выход: 83%) в виде белого твердого вещества.
Пример 27. Пре-клинические исследования на подопытных животных. Эффект, оказываемый 3-(карбогидразил-N'-фенилзамещенный)-1-бензозамещенный-β-карболин-3-карбогидразидным производным (соединение 7a или ANIS-BZ) в пероральном тесте толерантности к глюкозе на нормогликемических крысах.
Использовали самцов крыс Wistar, полученных от Mato Grosso из Sul's Federal University's Biotherium. До начала проведения экспериментов, животные имели свободный доступ к пище и воде. Комнатную температуру поддерживали на уровне 22±2°C, в условиях чередования свет/темнота по 12 часов. Все методики предоставлялись в Комиссию по этичному обращению с подопытными животными (Animal Experimentation Ethics Committee).
Тест толерантности к глюкозе является стандартным методом диагностики диабета или непереносимости глюкозы (5).
Отдельным группам крыс перорально вводили, 1 раз в день, 3-(карбогидразил-N'-фенилзамещенный)-1-бензозамещенный-β-карболин-3-карбогидразид (соединение 7a или ANIS-BZ) в дозировках: 0.5, 1 или 5 мг/кг или носитель (контрольная группа) в течение 3 дней. Аналогично, другая группа крыс получала метформин (референтный препарат, применяемый для понижения уровня глюкозы в плазме крови) в дозировке 300 мг/кг перорально, один раз в день в течение 3 дней. Пероральный тест толерантности к глюкозе проводили путем введения раствора глюкозы (2 г/кг веса тела). Гликемию замеряли в нулевой момент времени (до перорального введения) и через 60 минут после избыточного введения глюкозы.
На фиг.1A показано, что в первый день пероральное введение 3-(карбогидразил-N'-фенилзамещенный)-1-бензозамещенный-β-карболин-3-карбогидразида (соединение 7а или ANIS-BZ) в дозировке 5 мг/кг, понижает гликемический индекс у животных, которые получили избыточное количество глюкозы перорально, в сравнении с контрольной группой. Аналогично, пероральное лечение с метформином вызвало уменьшение гликемического индекса, но при дозировках в 60 раз выше.
На фиг.1B показано, что за 3 дня перорального введения 3-(карбогидразил-1N'-фенил-замещенный)-1-бензозамещенный-β-карболин-3-карбогидразид (соединение 7a или ANIS-BZ), в дозировке 5 мг/кг, понижает гликемический индекс у животных, которые получили избыточное количество глюкозы перорально, в сравнении с контрольной группой. Аналогично, пероральное лечение с метформином вызвало уменьшение гликемического индекса, но при дозировках в 60 раз выше.
На фиг.2 показано, что за 3 дня перорального введения 3-(карбогидразил-N-фенил-замещенный)-1-бензозамещенный-β-карболин-3-карбогидразид (соединение 7a или ANIS-BZ) только в дозировке 1 и 5 мг/кг статистически значимо понижал гликемический индекс у животных, которые получили избыточное количество глюкозы перорально, в сравнении с контрольной группой. Аналогично, пероральное лечение с метформином вызвало уменьшение гликемического индекса, но при дозировках в 60 раз выше.
Пример 28. Пре-клинические исследования на подопытных животных. Эффект, оказываемый N(-этиламин)-1-бензозамещенный-β-карболин-3-карбоксамидом (соединение 4a или ANIS-NH2) в пероральном тесте толерантности к глюкозе на нормогликемических крысах.
Отдельным группам крыс перорально вводили, 1 раз в день, N-(этиламин)-1-бензозамещенный-β-карболин-3-карбоксамид (соединение 4a или ANIS-NH2) в дозировках: 0.5, 1 или 5 мг/кг или носитель (контрольная группа) в течение 3 дней. Аналогично, другая группа крыс получала метформин (референтный препарат, применяемый для понижения уровня глюкозы в плазме крови) в дозировке 300 мг/кг перорально, один раз в день в течение 3 дней. Пероральный тест толерантности к глюкозе проводили путем введения раствора глюкозы (2 г/кг веса тела). Гликемию замеряли в нулевой момент времени (до перорального введения) и через 60 минут после избыточного введения глюкозы.
На фиг.3A показано, что в первый день пероральное введение N-этиламин)-1-бензозамещенный-β-карболин-3-карбоксамида (соединение 4a или ANIS-NH2) в дозировке 5 мг/кг, понижает гликемический индекс у животных, которые получили избыточное количество глюкозы перорально, в сравнении с контрольной группой. Аналогично, пероральное лечение с метформином вызвало уменьшение гликемического индекса, но при дозировках в 60 раз выше.
На фиг.3B показано, что за 3 дня перорального введения Н(-этиламин)-1-бензозамещенный-β-карболин-3-карбоксамид (соединение 4a или ANIS-NH2), в дозировке 5 мг/кг, понижает гликемический индекс у животных, которые получили избыточное количество глюкозы перорально, в сравнении с контрольной группой. Аналогично, пероральное лечение с метформином вызвало уменьшение гликемического индекса, но при дозировках в 60 раз выше.
На фиг.4 показано, что за 3 дня перорального введения N-этиламин)-1-бензозамещенный-β-карболин-3-карбоксамид (соединение 4a или ANIS-NH2) только в дозировке 1 и 5 мг/кг статистически значимо понижал гликемический индекс у животных, которые получили избыточное количество глюкозы перорально, в сравнении с контрольной группой. Аналогично, пероральное лечение с метформином вызвало уменьшение гликемического индекса, но при дозировках в 60 раз выше.
Пример 29. Пре-клинические исследования на подопытных животных. Эффект, оказываемый соединениями 4a (IFC-1102-48S), 5a (IFC-1102-57S) и 7a (PGP-11048SR1) в тесте систолического кровяного давления на SHR гипертензивных крысах.
1
Самцов спонтанно гипертензивных крыс (SHR) получали от Charles Rver Laboratories (USA). До начала проведения экспериментов, животные имели свободный доступ к пище и воде. Комнатную температуру поддерживали на уровне 22±2°C, в условиях чередования свет/темнота по 12 часов. Все методики предоставлялись в Комиссию по этичному обращению с подопытными животными (Animal Experimentation Ethics Committee).
Отдельным группам крыс перорально вводили 1 раз в день 5 мг/кг соединений 4a или 5a или 6a в течение первых 4 дней, 10 мг/кг в течение следующих 4 дней и 15 мг/кг до конца экспериментального периода, или носитель (контрольная группа) в течение такого же количества дней. Аналогично, другая группа крыс получала метформин (МЕТ, референтный препарат, применяемый для понижения уровня глюкозы в плазме крови) в дозировке 300 мг/кг перорально, с 1-го дня до конца эксперимента. Уровень холестерина в плазме крови замеряли в трех повторах через 12 часов после введения лекарства методом с применением холестерин оксидазы/пероксидазы (BioSystems S.A, Barcelona, Spain). Образцы крови получали пункцией бедренной вены. Этот метод был выбран вследствие своего неинвазивного характера, который делает возможным ежедневные измерения на одних и тех же крысах на протяжении всего периода эксперимента.
Соединения 4a, 5a и, в меньшей степени, соединение 7a, описанные в настоящем изобретении, продемонстрировали на SHR крысах ингибирующее действие на систолическое кровяное давление при различных дозировках и в разные моменты времени после введения. Этот эффект при дозировках 5-15 мг/кг выше, чем эффект метформина в дозировке 300 мг/кг. У крыс, получавших соединение 4a (p<0.001), 5a (p<0.001) и 7a (p<0.05) статистически значимо понижалось систолическое кровяное давление на 5-7%, по сравнению с контрольной группой, которой вводили носитель.
Пример 30. Пре-клинические исследования на подопытных животных. Эффект, оказываемый соединениями 4a (IFC-1102-48S), 5a (IFC-1102-57S) и 7a (PGP-11048SR1) в тесте уровня холестерина в плазме крови на SHR гипертензивных крысах.
Самцов SHR крыс получали от Charles River Laboratories (USA). До начала проведения экспериментов, животные имели свободный доступ к пище и воде. Комнатную температуру поддерживали на уровне 22±2°C, в условиях чередования свет/темнота по 12 часов. Все методики предоставлялись в Комиссию по этичному обращению с подопытными животными (Animal Experimentation Ethics Committee).
Отдельным группам крыс перорально вводили 1 раз в день 5 мг/кг соединений 4a или 5a или 6a в течение первых 4 дней, 10 мг/кг в течение следующих 4 дней и 15 мг/кг до конца экспериментального периода, или носитель (контрольная группа) в течение такого же количества дней. Аналогично, другая группа крыс получала метформин (референтный препарат, применяемый для понижения уровня глюкозы в плазме крови) в дозировке 300 мг/кг перорально, с 1-го дня до конца эксперимента. Кровяное давление замеряли в трех повторах через 4 часа после введения лекарства у обогретых обездвиженных находящихся в сознании крыс методом с применением хвостовой манжеты, используя компьютеризованную систему с осциллометрическим регистратором (Nyprem system 645, Cibertec). Этот метод был выбран вследствие своего неинвазивного характера, который делает возможным ежедневные измерения на одних и тех же крысах на протяжении всего периода эксперимента.
Соединения 4a, 5a и 7a, описанные в настоящем изобретении, продемонстрировали на SHR крысах ингибирование уровня холестерина в плазме крови через 25 дней после приема (15 мг/кг), аналогичное метформину (300 мг/кг) (фиг.5), хотя последний проявлял такой эффект при намного более высокой концентрации (в 20 раз выше). Этот результат показывает, что указанные соединения являются кандидатами на то, чтобы стать лекарственными средствами для лечения гиперхолестеринемии или метаболического синдрома. Эффект, оказываемый в тесте уровня холестерина в плазме крови, был более выраженным для соединений 5a и 7a (фиг.5).
Пример 31. Пре-клинические исследования на подопытных животных. Эффект, оказываемый соединением 4a (IFC-1102-48S) в тесте уровня триглицеридов в плазме крови, проводимом на SHR гипертензивных крысах.
Самцов SHR крыс получали от Charles River Laboratories (USA). До начала проведения экспериментов, животные имели свободный доступ к пище и воде. Комнатную температуру поддерживали на уровне 22±2°C, в условиях чередования свет/темнота по 12 часов. Все методики предоставлялись в Комиссию по этичному обращению с подопытными животными (Animal Experimentation Ethics Committee).
Отдельным группам крыс перорально вводили 1 раз в день 5 мг/кг соединения 4a в течение первых 4 дней, 10 мг/кг в течение следующих 4 дней и 15 мг/кг до конца экспериментального периода, или носитель (контрольная группа) в течение такого же количества дней. Аналогично, другая группа крыс получала метформин (референтный препарат, применяемый для понижения уровня глюкозы в плазме крови) в дозировке 300 мг/кг перорально, с 1-го дня до конца эксперимента. Уровень триглицеридов в плазме крови замеряли в трех повторах через 12 часов после введения лекарства методом с применением глицеринфосфат оксидазы/пероксидазы (BioSystems S.A, Barcelona, Spain). Образцы крови получали пункцией бедренной вены. Этот метод был выбран вследствие своего неинвазивного характера, который делает возможным ежедневные измерения на одних и тех же крысах на протяжении всего периода эксперимента.
Как показано на фиг.6, описанное в настоящем изобретении соединение 4a продемонстрировало на SHR крысах статистически значимое (p<0.05) ингибирование уровня триглицеридов в плазме крови через 25 дней приема (5-15 мг/кг).
Пример 32. Пре-клинические исследования на подопытных животных. Эффект, оказываемый соединением 5a (IFC-1102-57S) на вес тела у SHR гипертензивных крыс.
Самцов SHR крыс получали от Charles River Laboratories (USA). До начала проведения экспериментов, животные имели свободный доступ к пище и воде. Комнатную температуру поддерживали на уровне 22±2°C, в условиях чередования свет/темнота по 12 часов. Все методики предоставлялись в Комиссию по этичному обращению с подопытными животными (Animal Experimentation Ethics Committee).
Отдельным группам крыс перорально вводили 1 раз в день 5 мг/кг соединения 5a в течение первых 4 дней, 10 мг/кг в течение следующих 4 дней и 15 мг/кг до конца экспериментального периода, или носитель (контрольная группа) в течение такого же количества дней. Аналогично, другая группа крыс получала метформин (референтный препарат, применяемый для понижения уровня глюкозы в плазме крови) в дозировке 300 мг/кг перорально, с 1-го дня до конца эксперимента. Крыс взвешивали в камере CHYO МК2000 В для прецизионного взвешивания.
Соединение 5a продемонстрировало статистически значимое уменьшение веса тела SHR крыс по сравнению с контрольной группой крыс, не получавших лекарственного препарата (p<0.05).
Пример 33. Пре-клинические исследования на подопытных животных. Эффект, оказываемый соединением 4a (IFC-1102-48S) в тесте уровня глюкозы в крови на SHR гипертензивных крысах.
Самцов SHR крыс получали от Charles River Laboratories (USA). До начала проведения экспериментов, животные имели свободный доступ к пище и воде. Комнатную температуру поддерживали на уровне 22±2°C, в условиях чередования свет/темнота по 12 часов. Все методики предоставлялись в Комиссию по этичному обращению с подопытными животными (Animal Experimentation Ethics Committee).
Отдельным группам крыс перорально вводили 1 раз в день 5 мг/кг соединения 4a в течение первых 4 дней, 10 мг/кг в течение следующих 4 дней и 15 мг/кг до конца экспериментального периода, или носитель (контрольная группа) в течение такого же количества дней. Аналогично, другая группа крыс получала метформин в дозировке 300 мг/кг перорально, с 1-го дня до конца эксперимента. Уровень глюкозы в крови измеряли в трех повторах через 12 часов после приема лекарственного средства с помощью прибора GLUCOCARD ТМ G, GT-1810. Результаты сравнивали с эффектом метформина, оказываемым в той же дозировке, как для описанного соединения. Образцы крови получали пункцией бедренной вены. Этот метод был выбран вследствие своего неинвазивного характера, который делает возможным ежедневные измерения на одних и тех же крысах на протяжении всего периода эксперимента.
Соединение 4a показало статистически значимое (p<0.01) уменьшение содержания глюкозы в крови на 5-7% в диапазоне дозировок от 5 до 15 мг/кг после периодов приема 4-15 дней, в сравнении с контрольной группой, получавшей носитель. Метформин (300 мг/кг в течение 23 дней) оказывал несколько больший эффект на содержание глюкозы в крови, хотя дозировка была намного выше, чем для исследуемых соединений. Хотя SHR крысы не являются наилучшей моделью для изучения гликемии, полученные результаты были аналогичны полученным ранее на других животных моделях диабета и подтверждали, что описанные в настоящем тексте протестированные соединения оказывают положительный эффект на регуляцию содержания сахара в крови.
Пример 34. Токсикологическое исследование соединений 4a (IFC-1102-48S), 5a (IFC-1102-57S) и 7a (PGP-11048SR1) на модели Drosophila melanogaster (Oregon-R линия).
Целью настоящего исследования было протестировать и сравнить потенциальные токсическое воздействие соединений 5a, 6a и 7a на выживаемость «из личинки в имаго» и время развития у мушек Drosophila melanogaster (Oregon-R). Данные исследования имеют релевантную предсказательную силу для оценки возможных побочных токсических эффектов, которые могут иметь место в пре-клинических испытаниях на животных, предпочтительно млекопитающих. Кроме того, получаемые данные имеют ярко выраженный количественный характер.
Методики испытаний были проверены и одобрены согласно руководствам по защите прав животных в Европейском Союзе и Ведомственным Комитетом по Исследованию Животных в Университете Балеарских Островов (Испания).
Мушки Drosophila melanogaster (Oregon-R) были получены Университетом Балеарских Островов (Испания). Личинки имели неограниченный доступ к пище во время испытаний. Личинок помещали на стандартную пищевую среду с добавкой определенных доз испытуемых соединений. Каждое соединение испытывали при растворении в стандартном питательном субстрате в концентрациях 1, 10, 100, 1000 и 2000 мкг/мл.
Мушек Drosophila melanogaster (Oregon-R strain) содержали при последовательном переносе в 150-миллилитровых флаконах, содержащих 30 мл дрожжевой среды (вода, агар, соль, сахар и неактивные дрожжи), с добавлением фунгицида (метил-4-гидроксибензоат), антибактериального вещества (пропионовая кислота) и порошка активных дрожжей на поверхности, при 25°C и 65%-ной влажности в условиях чередования дня и ночи. Имаго мушек переносили с помощью системы последовательного переноса во флаконы со свежей пищей на 24 часа. Имаго 5-дневного возраста помещали в устройства по сбору яиц (слои), содержащие смесь агара, воды, уксусной кислоты и этилового спирта, с каплей активных дрожжей. Каждые 2 часа меняли стеклянные слои, и таким образом яйца на стекле все примерно одного возраста, с максимальной разницей между собой в 2 часа. Стекла слоев выдерживали при 25°C по меньшей мере 22 часа в чашках Петри до выведения личинок. Отбирали пятьдесят личинок ланцетом под стереоскопическим микроскопом и помешали в пиалы 10×2 см, содержащие 5 мл пищи. В виалы были добавлены соединения 4a, 5a и 7a в концентрации 1, 10 и 100 мкг/мл. В качестве положительного контроля использовали ацетат меди (токсичен) в концентрации 350 мкг/мл.
Число взрослых мушек, выводящихся в каждой виале, подсчитывали ежедневно до исчерпания культуры. Определяемыми параметрами были выживаемость «из личинки в имаго» (V) и время развития.
Выживаемость выражается уравнением V=NA/NL, где NL это количество помещаемых личинок (25 в нашем случае), a NA это количество взрослых особей, развившихся из этих NL личинок. Время развития определяли в днях по формуле DT=ΣNidi/ΣNi, где Ni это количество мушек, появившихся в день di после помещения личинок в среду.
Полученные данные представлены в виде средних значений ±SEM из 3 независимых экспериментов, включая три повтора виал с указанными количествами мушек.
Значения V и DT для контрольных групп личинок составили приблизительно 85% и 12 дней, соответственно. Предоставленные результаты показывают, что на выживаемость «из личинки в имаго» и время развития не повлияли соединения 4a, 5a и 7a в протестированных концентрациях (таблицы 6, 7 и 8). Эти результаты показывают потенциальный профиль безопасности для соединений 4a, 5a и 7a в протестированных дозировках, хотя по меньшей мере для соединений 5a и 7a профиль безопасности может достигать дозировок до 2000 мкг/мл.
Таблица 6
Эффект, оказываемый соединением 4a (IFC-1102-48S) на выживаемость «из личинки в имаго» и время развития Drosophila melanogaster.
Соединение 4a (мкг/мл)
Выживаемость «из личинки в имаго» (% развившихся взрослых мушек)
Время развития «из личинки в имаго» (дней)
0
85.46±2.5
11.90±0.2
1
86.19±2.2
10.96±0.2
10
79.96±3.9
10.37±0.6
100
85.91±1.9
10.70±0,1
Ацетат меди (350 мкг/мл)
0
Неприменимо
Таблица 7
Эффект, оказываемый соединением 5a (IFC-1102-57S) на выживаемость «из личинки в имаго» и время развития Drosophila melanogaster.
Соединение 5a (мкг/мл)
Выживаемость «из личинки в имаго» (% развившихся взрослых мушек)
Время развития «из личинки в имаго» (дней)
0
85.46±2.2
11.90±0,2
1
86.91±6.2
12.96±0,6
10
93.48±3.0
12.12±0,2
100
80.74±4.6
11.81±0,5
Ацетат меди (350 мкг/мл)
0
Неприменимо
Таблица 8
Эффект, оказываемый соединением 7a (PGP-11048SR1) на выживаемость «из личинки в имаго» и время развития Drosophila melanogaster.
Соединение 7a (мкг/мл)
Выживаемость «из личинки в имаго» (% развившихся взрослых мушек)
Время развития «из личинки в имаго» (дней)
0
85.46±2.5
11.90±0,2
1
92.23±3.0
11,03±0,2
10
92,32±2.6
10,51±1,6
100
99.51±4.9
11,52±0,4
Ацетат меди (350 мкг/мл)
0
Неприменимо
Пример 35. Токсикологическое исследование соединений 4a (IFC-1102-48S), 5a (IFC-1102-57S) и 7a (PGP-11048SR1) на мышиной модели.
Эксперименты проводили на самках домовой мыши (20-30 г), которых содержали в условиях 12-часового чередования день/ночь, контролируемой влажности (60-80%) и температуры (22±1°C). Мыши имели неограниченный доступ к пище и воде.
Самкам мышей (n=6) перорально вводили (2000 мг/кг) однократные дозы 4a, 5a и 7a для наблюдения за симптомами острой токсичности в течение 14 дней. После введения, за животными наблюдали в течение первого часа, и затем каждый час до 6 часов, и затем ежедневно в течение 14 суток. Наблюдения охватывали поведение и проявления токсических симптомов, и проводились в соответствии с рекомендациями Организации Экономического Сотрудничества и Развития (ОЭСР, 2008).
Все соединения растворяли в стерильном физрастворе и вводили мышам перорально через катетер, в расчете на их вес, например 20 мкл на 20 г.
Полученные экспериментальные данные представлены в виде среднего значения ±S.E.M.. Статистический уровень значимости определяли методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA), с последующим применением критерия Ньюмана-Кейлса. Значение p<0.05 рассматривали как статистически значимый. Построение диаграмм и статистический анализ проводили с помощью программного обеспечения GraphPad Prism version 5.00 для Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
Пероральное (2000 мг/кг) введение соединений 4a, 5a или 7a не приводило к гибели мышей или каких-либо нарушений поведения, при наблюдении в течение 14 дней.
Пример 36. Эффект, оказываемый соединениями 23b или 21a в пероральном тесте толерантности к глюкозе на нормогликемических крысах.
Использовали самцов крыс Уистара (200-300 г), полученных от Mato Grosso do Sul's Federal University's Biotherium. До начала проведения экспериментов, животные имели свободный доступ к пище и воде. Комнатную температуру поддерживали на уровне 22±2°C, с контролируемым уровнем влажности (60-80%), в условиях чередования свет/темнота по 12 часов.
Все методики предоставлялись в Комиссию по этичному обращению с подопытными животными (Animal Experimentation Ethics Committee).
Тест толерантности к глюкозе проводили как описано Al-Awaki et al (6).
Крыс случайным образом распределяли на шесть групп по четыре животных, которые представляли собой контрольную группу, получавшую просто физраствор, группу на соединении 23b (10 мг/кг), группу на соединении 21a (10 мг/кг) и группу на метформине (300 мг/кг). Соответствующее введение проводили перорально, ежедневно на протяжении 5 дней.
В день 1, 3 и 5 различные группы крыс выдерживали без пищи в течение ночи (по меньшей мере 12 часов) перед тестированием, но с неограниченным доступом к воде. Пероральный тест толерантности к глюкозе проводили путем введения раствора глюкозы (2 г/кг веса тела) по методике Al-Awadi et al (6). Гликемию замеряли в образцах крови, взятых из хвостовой вены в момент времени -30 минут (непосредственно перед введением экстракта перорально), в момент времени 0 (перед введением избыточной дозы глюкозы) и через 60 минут после избыточного введения глюкозы. Концентрации глюкозы в плазме крови измеряли методом с применением глюкоза оксидазы (7), используя коммерческий набор (Accuchek-performa (Roche)) согласно инструкциям производителя.
Животные получали соединения 23b или 21a в дозировке 10 мг/кг перорально в виде единственной дозы в день, на третий день наблюдали существенное снижение уровня содержания глюкозы, индуцируемое соединениями 23b и 21a (фиг.7). Аналогично, пероральное введение метформина вызывало снижение гликемических индексов, но в дозировках в 30 раз выше (фиг.11). На пятый день, только соединение 23b и метформин (но в дозировках в 30 раз выше) уменьшали содержание глюкозы по сравнению с контрольной группой.
Пример 37. Эффект, оказываемый соединениями 21b, 21e, 23e, 23a, 23d или 26b в пероральном тесте толерантности к глюкозе на нормогликемических крысах.
Использовали самцов крыс Уистара (200-300 г), полученных от Mato Grosso do Sul's Federal University's Biotherium. До начала проведения экспериментов, животные имели свободный доступ к пище и воде. Комнатную температуру поддерживали на уровне 22±2°C, с контролируемым уровнем влажности (60-80%), в условиях чередования свет/темнота по 12 часов. Все методики предоставлялись в Комиссию по этичному обращению с подопытными животными (Animal Experimentation Ethics Committee).
Тест толерантности к глюкозе проводили как описано Al-Awaki et al (6).
Соединения 21b, 23a и 23d сначала разводили в 20 мкл этанола и затем в 980 мкл физраствора. Соединения 21e, 23e и 26b растворяли в стерильном физрастворе и вводили перорально через зонд крысам, из расчета на их вес, примерно 200 мкл на 200 г.
54 крысы случайным образом распределяли на семь групп по 5-8 животных, которые представляли собой контрольную группу (n=8), получавшую только раствор носителя, группу на соединении 21b (n=5) (10 мг/кг), группу на соединении 21e (n=5) (10 мг/кг), группу на соединении 23e (n=5) (10 мг/кг), группу на соединении 23a (n=5) (10 мг/кг), группу на соединении 23d (n=5) (10 мг/кг), группу на соединении 26b (n=5) (10 мг/кг) и группу на метформине (n=6) 300 мг/кг. Введение осуществляли перорально и ежедневно, в течение пяти дней.
В день 1, 3 и 5 различные группы крыс выдерживали без пищи в течение ночи (по меньшей мере 12 часов) перед тестированием, но с неограниченным доступом к воде. Пероральный тест толерантности к глюкозе проводили путем введения раствора глюкозы (2 г/кг веса тела) по методике Al-Awadi et al (6). Гликемию замеряли в образцах крови, взятых из хвостовой вены в момент времени - 30 минут (непосредственно перед введением экстракта перорально), в момент времени 0 (перед введением избыточной дозы глюкозы) и через 60 минут после избыточного введения глюкозы. Концентрации глюкозы в плазме крови измеряли методом с применением глюкоза оксидазы (7), используя коммерческий набор (Accuchek-performa (Roche)) согласно инструкциям производителя.
Животные получали соединения 21b, 21e, 23e, 23d или 26b в дозировке 10 мг/кг перорально в виде единственной дозы в день. В первый день наблюдали существенное снижение уровня содержания глюкозы, индуцируемое соединениями 21e, 23e и 23a, и положительным контролем с метформином, но в дозировках в 30 раз выше. На третий день наблюдалось существенное понижение уровней содержания глюкозы, индуцируемое соединением 21e и 23e, и положительным контролем с метформином. На пятый день, соединения 21b, 21e, 23e, 23d или 26b и метформин (но в дозировках в 30 раз выше) понижали уровни содержания глюкозы в сравнении с контрольной группой (фиг.8).
Литература
1. Molina Р, Fresneda РМ, Garcia-Zafra S, Almendros P. Tetrahedron Letters 1994, 35, 8851.
2. Moty A, Sakai S, Aimi N, Takayama H, Kitajima M, Shorbagi A, Ahmed AN, Omar NM. European Journal Medicinal Chemistry 1997, 32, 1009.
3. Grundy SM. Drug therapy of the metabolic syndrome: minimizing the emerging crisis in polypharmacy. Nat Rev Drug Discov. 2006 5(4):295-309.
4. Crunkhorn (2011). Metabolic disease: Birch bark compound combats metabolic syndrome. Nature Reviews Drug Discovery 10, 175.
5. Gross JL, Silveiro SP, Camargo JL, Reichelt AJ, Azevedo MJ. Diabetes Melito: Diagnostico, Classificacao e Avaliacao do Controle Glicemico. Arq Bras Endocrinol Metab 46(1) 2002.
6. Al-Awadi FM, Khattar MA, Gumaa KA: On the mechanism of the hypoglycaemic effect of a plant extract. Diabetologia. 1985 Jul; 28(7):432-4.
7. Trinder P.: Determination of blood glucose using an oxidase-peroxidase system with a non-carcinogenic chromogen. J Clin Pathol. 1969 Mar; 22(2):158-61.