СПОСОБЫ И СИСТЕМЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ НАБОРОВ УНИКАЛЬНЫХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ИНДЕКСОВ С ГЕТЕРОГЕННОЙ ДЛИНОЙ МОЛЕКУЛ И КОРРЕКЦИИ В НИХ ОШИБОК

1. Способ секвенирования молекул нуклеиновой кислоты из образца, включающий
(a) обработку адаптерами фрагментов ДНК в указанном образце с получением продуктов, представляющих собой ДНК-адаптер,
где каждый адаптер содержит неслучайный уникальный молекулярный индекс, и
при этом неслучайные уникальные молекулярные индексы указанных адаптеров характеризуются по меньшей мере двумя разными длинами молекул и образуют набор неслучайных уникальных молекулярных индексов с вариабельной длиной (vNRUMI);
(b) амплификацию указанных продуктов ДНК-адаптер с получением множества амплифицированных полинуклеотидов;
(c) секвенирование указанного множества амплифицированных полинуклеотидов с получением таким образом множества ридов, ассоциированных с указанным набором vNRUMI;
(d) идентификацию среди указанного множества ридов тех ридов, которые ассоциированы с одним и тем же неслучайным уникальным молекулярным индексом с вариабельной длиной (vNRUMI); и
(e) определение последовательности фрагмента ДНК в указанном образце с использованием ридов, ассоциированных с одним и тем же vNRUMI.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что идентификация ридов, ассоциированных с одним и тем же vNRUMI, включает получение для каждого рида из указанного множества ридов показателей выравнивания для указанного набора vNRUMI, при этом каждый из показателей выравнивания является индикатором сходства между частичной последовательностью рида и vNRUMI, где указанная частичная последовательность находится в той области указанного рида, в которой предположительно расположены нуклеотиды, происходящие из указанного vNRUMI.
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что указанные показатели выравнивания основаны на совпадениях нуклеотидов и изменениях нуклеотидов между указанной частичной последовательностью рида и указанным vNRUMI.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что указанные изменения нуклеотидов включают замены, добавления и делеции нуклеотидов.
5. Способ по п. 3, отличающийся тем, что каждый показатель выравнивания включает штраф за несовпадения в начале последовательности, но не включает штраф за несовпадения в конце указанной последовательности.
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что получение показателя выравнивания между ридом и vNRUMI включает:
(a) вычисление показателя выравнивания между vNRUMI и каждой из всех возможных префиксных последовательностей частичной последовательности указанного рида;
(b) вычисление показателя выравнивания между частичной последовательностью указанного рида и каждой из всех возможных префиксных последовательностей указанного vNRUMI; и
(c) получение максимального показателя выравнивания из показателей выравнивания, вычисленных согласно (а) и (b), в качестве показателя выравнивания между указанным ридом и указанным vNRUMI.
7. Способ по п. 2, отличающийся тем, что указанная частичная последовательность имеет длину, равную длине самого длинного vNRUMI в указанном наборе vNRUMI.
8. Способ по п. 2, отличающийся тем, что идентификация ридов, ассоциированных с одним и тем же vNRUMI, согласно (d), дополнительно включает:
выбор для каждого рида из указанного множества ридов по меньшей мере одного vNRUMI из набора vNRUMI на основании показателей выравнивания; и
ассоциацию каждого рида из указанного множества ридов по меньшей мере с одним vNRUMI, выбранным для указанного рида.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что выбор указанного по меньшей мере одного vNRUMI из набора vNRUMI включает выбор vNRUMI с самым высоким значением показателя выравнивания в указанном наборе vNRUMI.
10. Способ по п. 8, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один vNRUMI включает два или более vNRUMI.
11. Способ по п. 10, дополнительно включающий выбор одного из двух или более vNRUMI в качестве одного и того же vNRUMI согласно (d) и (е).
12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что адаптеры, которыми обрабатывают согласно (а), получают путем:
(i) обеспечения набора последовательностей олигонуклеотидов, обладающих по меньшей мере двумя разными длинами молекул;
(ii) выбора поднабора последовательностей олигонуклеотидов из набора последовательностей олигонуклеотидов, где все редакционные расстояния между последовательностями олигонуклеотидов указанного поднабора последовательностей олигонуклеотидов соответствуют пороговому значению, при этом указанный поднабор последовательностей олигонуклеотидов образует указанный набор vNRUMI; и
(iii) синтеза адаптеров, каждый из которых содержит двуцепочечную гибридизованную область, одноцепочечное 5'-плечо, одноцепочечное 3'-плечо и по меньшей мере один vNRUMI из указанного набора vNRUMI.
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что указанное пороговое значение равно 3.
14. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный набор vNRUMI содержит vNRUMI из 6 нуклеотидов и vNRUMI из 7 нуклеотидов.
15. Способ по п. 1, отличающийся тем, что (е) включает объединение ридов, ассоциированных с одним и тем же vNRUMI, в группу с получением консенсусной последовательности нуклеотидов для последовательности указанного фрагмента ДНК в указанном образце.
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что указанную консенсусную последовательность нуклеотидов получают частично на основе показателей качества ридов.
17. Способ по п. 1, отличающийся тем, что (е) включает:
идентификацию среди ридов, ассоциированных с одним и тем же vNRUMI, ридов, которые характеризуются тем же положением или аналогичными положениями рида в референсной последовательности, и
определение последовательности указанного фрагмента ДНК с использованием ридов, которые (i) ассоциированы с одним и тем же vNRUMI и (ii) характеризуются тем же положением рида или аналогичными положениями рида в указанной референсной последовательности.
18. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный набор vNRUMI включает не более чем приблизительно 10000 разных vNRUMI.
19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанный набор vNRUMI включает не более чем приблизительно 1000 разных vNRUMI.
20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что указанный набор vNRUMI включает не более чем приблизительно 200 разных vNRUMI.
21. Способ по п. 1, отличающийся тем, что обработка адаптерами указанных фрагментов ДНК в указанном образце включает обработку адаптерами обоих концов указанных фрагментов ДНК в указанном образце.
22. Способ получения адаптеров для секвенирования, включающий:
(a) обеспечение набора последовательностей олигонуклеотидов по меньшей мере с двумя разными длинами молекул;
(b) выбор поднабора последовательностей олигонуклеотидов из указанного набора последовательностей олигонуклеотидов, где все редакционные расстояния между последовательностями олигонуклеотидов указанного поднабора последовательностей олигонуклеотидов соответствуют пороговому значению, и указанный поднабор последовательностей олигонуклеотидов образует набор неслучайных уникальных молекулярных индексов с вариабельной длиной (vNRUMI); и
(с) синтез множества адаптеров для секвенирования, причем каждый адаптер для секвенирования содержит двуцепочечную гибридизованную область, одноцепочечное 5'-плечо, одноцепочечное 3'-плечо и по меньшей мере один vNRUMI из указанного набора vNRUMI.
23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что (b) включает:
(i) выбор последовательности олигонуклеотидов из указанного набора последовательностей олигонуклеотидов;
(ii) добавление выбранного олигонуклеотида к расширяемому набору последовательностей олигонуклеотидов и удаление указанного выбранного олигонуклеотида из указанного набора последовательностей олигонуклеотидов для получения сокращенного набора последовательностей олигонуклеотидов;
(iii) выбор текущей последовательности олигонуклеотидов из указанного сокращенного набора, которая максимизирует функцию расстояния, где функция расстояния представляет собой минимальное редакционное расстояние между указанной текущей последовательностью олигонуклеотидов и любыми последовательностями олигонуклеотидов в указанном расширяемом наборе, причем указанная функция расстояния соответствует указанному пороговому значению;
(iv) добавление указанного текущего олигонуклеотида к указанному расширяемому набору и удаление указанного текущего олигонуклеотида из указанного сокращенного набора;
(v) повторение (iii) и (iv) по меньшей мере один раз; и
(vi) обеспечение указанного расширяемого набора в качестве указанного поднабора последовательностей олигонуклеотидов, образующих указанный набор vNRUMI.
24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что (v) включает повторение (iii) и (iv) до тех пор, пока указанная функция расстояния не перестанет соответствовать указанному пороговому значению.
25. Способ по п. 23, отличающийся тем, что (v) включает повторение (iii) и (iv) до тех пор, пока указанный расширяемый набор не достигает заданного размера.
26. Способ по п. 23, отличающийся тем, что указанная текущая последовательность олигонуклеотидов или последовательность олигонуклеотидов в указанном расширяемом наборе короче самой длинной последовательности олигонуклеотидов в указанном наборе последовательностей олигонуклеотидов, указанный способ дополнительно включает до осуществления (iii), (1) прибавление тиминового основания, или тиминового основания наряду с любым из четырех оснований к указанной текущей последовательности олигонуклеотидов или к указанной последовательности олигонуклеотидов в указанном расширяемом наборе, с формированием таким образом дополненной последовательности, имеющей такую же длину, что и указанная самая длинная последовательность олигонуклеотидов в указанном наборе последовательностей олигонуклеотидов, и (2) использование указанному дополненной последовательности для вычисления минимального редакционного расстояния.
27. Способ по п. 22, отличающийся тем, что указанные редакционные расстояния представляют собой расстояния Левенштейна.
28. Способ по п. 22, отличающийся тем, что указанное пороговое значение равно трем.
29. Способ по п. 22, дополнительно включающий, до осуществления (b), удаление определенных последовательностей олигонуклеотидов из указанного набора последовательностей олигонуклеотидов с получением отфильтрованного набора последовательностей олигонуклеотидов; и обеспечение указанного отфильтрованного набора последовательностей олигонуклеотидов в качестве набора последовательностей олигонуклеотидов, из которого выбирают указанный поднабор.
30. Способ по п. 29, отличающийся тем, что указанные определенные последовательности олигонуклеотидов содержат последовательности олигонуклеотидов, включающие три или более последовательных идентичных оснований.
31. Способ по п. 29, отличающийся тем, что указанные определенные последовательности олигонуклеотидов содержат последовательности олигонуклеотидов, общее число гуаниновых и цитозиновых оснований в которых меньше 2, и последовательности олигонуклеотидов, общее число гуаниновых и цитозиновых оснований в которых больше 4.
32. Способ по п. 29, отличающийся тем, что указанные определенные последовательности олигонуклеотидов содержат последовательности олигонуклеотидов, включающие одно и то же основание в последних двух положениях.
33. Способ по п. 29, отличающийся тем, что указанные определенные последовательности олигонуклеотидов содержат последовательности олигонуклеотидов, включающие частичную последовательность, совпадающую со 3'-концом одного или более праймеров для секвенирования.
34. Способ по п. 29, отличающийся тем, что указанные определенные последовательности олигонуклеотидов содержат последовательности олигонуклеотидов, включающие тиминовое основание в последнем положении указанных последовательностей олигонуклеотидов.
35. Способ по п. 22, отличающийся тем, что указанный набор vNRUMI содержит vNRUMI из 6 нуклеотидов и vNRUMI из 7 нуклеотидов.
36. Способ секвенирования молекул нуклеиновой кислоты из образца, включающий
(а) обработку адаптерами фрагментов ДНК в указанном образце с получением продуктов, представляющих собой ДНК-адаптер,
где каждый адаптер содержит неслучайный уникальный молекулярный индекс, и
при этом неслучайные уникальные молекулярные индексы указанных адаптеров характеризуются по меньшей мере двумя разными длинами молекул и образуют набор неслучайных уникальных молекулярных индексов с вариабельной длиной (vNRUMI);
(b) амплификацию указанных продуктов ДНК-адаптер с получением множества амплифицированных полинуклеотидов;
(c) секвенирование указанного множества амплифицированных полинуклеотидов с получением таким образом множества ридов, ассоциированных с указанным набором vNRUMI; и
(d) идентификацию среди указанного множества ридов тех ридов, которые ассоциированы с одним и тем же неслучайным уникальным молекулярным индексом с вариабельной длиной (vNRUMI).
37. Способ по п. 36, дополнительно включающий осуществление подсчет ридов, ассоциированных с одним и тем же vNRUMI.
38. Способ секвенирования молекул нуклеиновой кислоты из образца, включающий
(a) обработку адаптерами фрагментов ДНК в указанном образце с получением продуктов, представляющих собой ДНК-адаптер,
где каждый адаптер содержит уникальный молекулярный индекс (UMI), и
при этом уникальные молекулярные индексы (UMI) указанных адаптеров характеризуются по меньшей мере двумя разными длинами молекул и образуют набор уникальных молекулярных индексов (vUMI) с вариабельной длиной;
(b) амплификацию указанных продуктов ДНК-адаптер с получением множества амплифицированных полинуклеотидов;
(c) секвенирование указанного множества амплифицированных полинуклеотидов с получением таким образом множества ридов, ассоциированных с указанным набором vUMI; и
(d) идентификацию среди указанного множества ридов тех ридов, которые ассоциированы с одним и тем же уникальным молекулярным индексом с вариабельной длиной (vUMI).
39. Способ по п. 38, дополнительно включающий определение последовательности фрагмента ДНК в указанном образце с использованием ридов, ассоциированных с одним и тем же vUMI.
40. Способ по п. 38, дополнительно включающий осуществление подсчета ридов, ассоциированных с одними и теми же vUMI.
41. Способ секвенирования молекул нуклеиновой кислоты из образца, включающий
(a) обработку адаптерами фрагментов ДНК в указанном образце с получением продуктов ДНК-адаптер, при этом каждый адаптер содержит уникальный молекулярный индекс (UMI) из набора уникальных молекулярных индексов (UMI);
(b) амплификацию указанных продуктов ДНК-адаптер с получением множества амплифицированных полинуклеотидов;
(c) секвенирование указанного множества амплифицированных полинуклеотидов с получением таким образом множества ридов, ассоциированных с указанным набором UMI;
(d) получение для каждого рида из указанного множества ридов показателей выравнивания для указанного набора UMI, при этом каждый из полученных показателей является индикатором сходства между частичной последовательностью рида и UMI;
(e) идентификацию среди указанного множества ридов тех ридов, которые ассоциированы с одним и тем же UMI, с использованием указанных показателей выравнивания; и
(е) определение последовательности фрагмента ДНК в указанном образце с использованием ридов, ассоциированных с одним и тем же UMI.
42. Способ по п. 41, отличающийся тем, что указанные показатели выравнивания основаны на совпадениях нуклеотидов и изменениях нуклеотидов между частичной последовательностью указанного рида и указанного UMI.
43. Способ по п. 42, причем каждый показатель выравнивания включает штраф за несовпадения в начале последовательности, но не включает штраф за несовпадения в конце указанной последовательности.
44. Способ по п. 41, отличающийся тем, что указанный набор UMI содержит UMI по меньшей мере с двумя разными длинами молекул.
45. Компьютерный программный продукт, содержащий энергонезависимый машиночитаемый носитель, в котором хранится программный код, который при исполнении одним или более процессорами компьютерной системы приводит к осуществлению указанной компьютерной системой способа секвенирования молекул нуклеиновой кислоты из образца, причем указанный программный код включает:
(a) код для получения множества ридов множества амплифицированных полинуклеотидов, где каждый полинуклеотид из указанного множества амплифицированных полинуклеотидов содержит адаптер, присоединенный к фрагменту ДНК,
причем указанный адаптер содержит неслучайный уникальный молекулярный индекс, и
при этом неслучайные уникальные молекулярные индексы указанных адаптеров характеризуются по меньшей мере двумя разными длинами молекул, образуя набор неслучайных уникальных молекулярных индексов с вариабельной длиной (vNRUMI);
(b) код для идентификации в указанном множестве ридов тех ридов, которые ассоциированы с одними и теми же vNRUMI; и
(c) код для определения с использованием ридов, ассоциированных с одним и тем же vNRUMI, последовательности фрагмента ДНК в указанном образце.
46. Компьютерная система, включающая:
один или более процессоров;
системную память; и
один или более машиночитаемых носителей для хранения данных с хранящимися на них машиноисполняемыми инструкциями, обеспечивающими осуществление указанной компьютерной системой способа определения информации о последовательности представляющей интерес последовательности в образце, причем указанные инструкции включают:
(a) получение множества ридов множества амплифицированных полинуклеотидов, где каждый полинуклеотид из указанного множества амплифицированных полинуклеотидов содержит адаптер, присоединенный к фрагменту ДНК,
причем указанный адаптер содержит неслучайный уникальный молекулярный индекс, и
при этом неслучайные уникальные молекулярные индексы указанных адаптеров характеризуются по меньшей мере двумя разными длинами молекул, образуя набор неслучайных уникальных молекулярных индексов с вариабельной длиной (vNRUMI);
(b) идентификацию среди указанного множества ридов тех ридов, которые ассоциированы с одними и теми же vNRUMI; и
(c) определение с использованием ридов, ассоциированных с одним и тем же vNRUMI, последовательности фрагмента ДНК в указанном образце.