Алгоритм лабораторных тестов для прогнозирования церебральных поражений при перинатальной гипоксии

УДК 616.133.33:616.152.21-07

АЛГОРИТМ ЛАБОРАТОРНЫХ ТЕСТОВ ДЛЯ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЦЕРЕБРАЛЬНЫХ ПОРАЖЕНИЙ ПРИ ПЕРИНАТАЛЬНОЙ ГИПОКСИИ

1 Алтайский государственный медицинский университет, г. Барнаул

2 Федеральный центр травматологии, ортопедии и эндопротезирования, г. Барнаул

Шабалина Ю.В.1, Ельчанинова С.А.1, Поповцева А.В.1-2, Дегтярёва Ю.В.1, Кореновский Ю.В.1

В рандомизированном проспективном клиническом исследовании с участием 150 женщин и доношенных новорождённых оценены операционные характеристики тестов пуповинной крови в отношении дифференциальной диагностики перинатальных гипоксических церебральных поражений у новорождённых. Методом многомерного шкалирования установлено, что алгоритм на основе комбинации уровней матриксной металлопротеиназы-9, тиобарбитурат-реактивных продуктов, лактата и эритропоэ-тина в первые часы после рождения позволяет прогнозировать перинатальное гипоксическое церебральное поражение с чувствительностью 85% и специфичностью 90%. Ключевые слова: перинатальная гипоксия, лабораторные биомаркёры.

In a randomized prospective clinical study involving 150 women and newborns are evaluated the operational characteristics of tests of umbilical cord blood in relation to the differential diagnosis of perinatal hypoxic cerebral lesions in newborns. The method of multidimensional scaling is set that the algorithm based on the combination of the levels of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9), thiobarbiturate-reactive substanses (TBARS), erythropoietin and lactate in the first hours after birth allows to predict perinatal hypoxic cerebral lesions with a sensitivity of 85% and a specificity of 90%. Key words: perinatal hypoxia, laboratory biomarkers

Перинатальная гипоксия (ПГ) - патологическое состояние перинатального периода, развивающееся вследствие недостатка поступления кислорода в организм плода и/или его утилизации во время беременности (хроническая внутриутробная гипоксия плода), родов (острая гипоксия плода, асфиксия), раннего неонатального периода [1, 2]. Осложнением ПГ является полиорганное поражение у плода и новорождённого, которое проявляется различными нозологическими формами [3]. При этом 15-20% всех осложнений ПГ как у доношенных, так и у недоношенных новорождённых составляют гипоксически-ишемическая энцефалопатия и внутрижелудочковые кровоизлияния. Эти поражения центральной нервной системы (ЦНС) при ПГ выявляются по неврологическим симптомам и данным ультразвукового исследования, как правило, не ранее третьего-четвёрто-го дня жизни [4-6].

Разнообразие и отсроченность от момента рождения манифестации клинических и ней-ровизуализационных признаков осложнений ПГ существенно затрудняют своевременную диагностику и, соответственно, эффективность профилактики и коррекции поражений органов-мишеней, включая поражения ЦНС [7, 8]. Это стимулирует поиск биохимических маркёров для прогнозирования и ранней диагностики перинатальных гипоксических поражений [9, Ю]. 38

Известно, что ключевыми звеньями патогенеза ПГ являются такие индуцированные гипоксией-реперфузией и взаимосвязанные системные нарушения метаболизма, как усиление молочнокислого брожения, свободно-радикального окисления, повышение активности матриксных металлопротеиназ [11-14]. В качестве компенсаторной реакции при ПГ рассматривают усиление продукции эритропоэтина [15,16].

Целью исследования стала разработка алгоритма прогнозирования поражений ЦНС у новорождённых при ПГ на основе комплекса патогенетических лабораторных показателей системных нарушений метаболизма.

Материалы и методы

В рандомизированное проспективное клиническое исследование было включено 150 беременных женщин и их новорождённые, которые были разделены на две группы в зависимости от наличия/отсутствия признаков перинатальных гипоксических поражений ЦНС у новорожденных в раннем неонатальном периоде.

Критериями исключения были: иммунокон-фликтная и многоплодная беременность; срок родоразрешения менее 28 недель; наличие у женщин нарушений репродуктивной функции в анамнезе, экстрагенитальных заболеваний в стадии субкомпенсации и декомпенсации, пре-эклампсии; лекарственной и/или наркотической и/или токсической (в том числе алкоголь-

ной) зависимости, сахарного диабета; наличие у новорождённых врождённых пороков развития и генетических нарушений метаболизма.

Сформированные группы матерей новорождённых не различались по возрасту, со-

Клиническая харакг

циальному статусу, акушерскому и гинекологическому анамнезу, наличию хронических экстрагенитальных заболеваний. Клиническая характеристика новорождённых представлена в таблице 1.

Таблица 1

ика новорождённых

Показатель Новорождённые без перинатального гипоксиче-ского поражения ЦНС п = 62 Новорождённые с перинатальным гипокси-ческим поражением ЦНС п = 40 Значимость различий, Р

Срок родов 39,3 ± 4,95 34,8 ± 3,1 < 0,001

Вес (кг) 3379,0 ± 461,38 2415,5 ± 892,97 <0,001

Апгар на 1-й мин. 7,2 ± 0,82 6,000 ± 0,96 <0,001

Апгар на 5-й мин. 8,1 ± 0,68 7,1 ± 0,55 <0,001

ИВЛ, п (%) ИВЛ - маска, п (%) 5 (8,1) 0(0) 24 (60) 3 (7,5) < 0,001 < 0,001

Респираторный дистресс-синдром, п (%) 4 (6,4) 30 (75) < 0,001

Кесарево сечение, п (%) Амниотомия, п (%) 28 (90,3) 2 (6,5) 23 (88,5) 2 (7,7) 0,974 0,974

Синдром поражения ЦНС: Угнетение, п (%) Возбуждение, п (%) 3 (4,8) 1 (1,6) 34(85) 2(5) < 0,001 < 0,001

Характер поражения ЦНС: Гипоксическое, п (%) Ишемически-гипоксическое, п (%) 0(0) 4 (6,4) 8(20) 28 (70) < 0,001 < 0,001

Примечание: количественные переменные представлены отклонение).

Диагностировали ПГ по наличию не менее двух из перечисленных симптомов: интрана-тальный дистресс с фетальной брадикардией 100 и больше ударов в минуту по данным карди-отокографии; 6 и менее баллов по шкале Апгар на пятой минуте; потребность в реанимационных мероприятиях с подачей кислорода более одной минуты [4]. Повреждения ЦНС оценивали по признакам гипоксически-ишемических изменений в головном мозге по данным ультразвукового исследования на третьи-четвёртые сутки после рождения. Новорождённые с ПГ переводились в отделение интенсивной терапии, где им проводили необходимые реанимационные мероприятия, включая искусственную вентиляцию лёгких (ИВЛ).

Новорождённым проводились стандартное лабораторное обследование (общий клинический анализ крови, дифференциальный подсчет лейкоцитов, уровень в крови билирубина, мочевины, креатинина, общего белка, аминотранс-фераз, щелочной фосфатазы, глюкозы, лактата, калия, натрия), скрининговое обследование на фенилкетонурию, муковисцидоз, гипотиреоз, адреногенитальный синдром и галактоземию. Для специальных исследований сразу после рождения забирали венозную кровь из артерии пуповины в вакутейнеры с гепаринатом лития

в виде M (средняя арифметическая) ± SD (стандартное

(14 ЕД на 1 мл крови), а также в вакутейнеры с фторидом натрия и К^-ЭДТА (3,3 и 1,2 мг на 1 мл крови соответственно). В плазме крови методом иммуноферментного анализа измеряли концентрацию матриксных металлопротеиназ (ММП-1, ММП-2, ММП-9), тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ (ТИМП-1) с использование тест-систем производства RayBiotech (США); эритропоэтина, белка S100B с использованием тест-систем производства Biomerica (США) и CanAg (Швеция) соответственно; методом абсорбционной фотометрии концентрацию лактата с реагентами Biocon (ФРГ) и продуктов перекисного окисления ли-пидов тиобарбитурат-реактивных продуктов (ТБРП) с реагентами ZeptoMetrix Corporation (США).

Исследование разрешено этическим комитетом ФГБОУ ВО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздрава России, выполнено на клинической базе КГБУЗ «Перинатальный центр (клинический) Алтайского края» (г. Барнаул) в период с 2008 по 2012 гг.

При статистическом анализе результатов исследования с использованием программы SigmaPlot 11.0 оценивали нормальность распределения переменных по критерию Шапиро-Уилка, межгрупповые раз-

личия количественных переменных по U-крите-рию Манна-Уитни, категориальных переменных по критерию хи-квадрат. Математическое моделирование методом многомерного шкалирования, визуализацию диагностического алгоритма и ассоциированные с ней расчёты проводили в программе JMP 7.0 (SAS Institute, США) в режиме Partition, ROC-анализ (receiver operating characteristic analysis) - в программе MedCalc 9.1.0.1. В качестве критического уровня для всех использованных критериев принимали р < 0,05.

Результаты и обсуждение

Анализ показал, что распределение под

]ЮС-кривой значений всех исследованных показателей, за исключением концентрации ТИМП-1, а также расчётные показатели (отношения уровня определенной матриксной металло-протеиназы к уровню ТИМП-1) значимо отличались от распределения с площадью 0,5 (таблица 1). Это указывает на возможность использования этих показателей в качестве биомаркёров для прогнозирования поражений ЦНС при ПГ. Наибольшая площадь под 1ЮС-кривой установлена для эритропоэтина, ТБРП, лактата, ММП-2 и отношения ММП-2/ТИМП-1.

В таблице 3 представлены операционные характеристики исследованных показателей.

Таблица 2

Площадь под ЯОС-кривой для тестов в плазме венозной крови из артерии пуповины новорождённых в отношении прогноза церебральных поражений при перинатальной гипоксии

Тест п Площадь под ROC-кривой (ДИ95%) Р

Эритропоэтин 56/85 0,807 (0,732-0,869) <0,0001

ТБРП 57/87 0,807 (0,733-0,868) <0,0001

Лактат 55/85 0,782 (0,705-0,848) <0,0001

ММП-2 55/84 0,699 (0,616-0,774) <0,0001

ММП-2/ТИМП-1 51/79 0,679 (0,591-0,758) 0,0007

ММП-1 58/85 0,672 (0,589-0,748)аЬ 0,0004

ММП-1/ТИМП-1 53/78 0,667 (0,580-0,747)аЬс 0,0005

ММП-9 54/84 0,646 (0,560-0,726)аЬс 0,0099

Белок S100B 59/84 0,610 (0,525-0,690)аЬс 0,0304

ММП-9/ТИМП-1 50/81 0,610 (0,521-0,694)аЬс 0,0368

ТИМП-1 54/85 0,527 (0,440-0,612)аЬс 0,5903

Примечания: ДИ95% - 95% доверительный интервал; п - количество новорожденных с церебральным поражением при перинатальной гипоксии/количество новорожденных без такового; р - значимость отличия площади под ROC-кривой в сравнении с площадью 0,5; abc - р<0,05 для площади под ROC-кривой относительно таковой для ТБРП, эритропоэтина и лактата соответственно.

Таблица 3

Операционные характеристики тестов в плазме венозной крови из артерии пуповины новорождённых в отношении прогноза церебральных поражений при перинатальной гипоксии

Тест Порог ч(ДИ95%) С(ДИ95%) +LR/-LR +PV/-PV

Эритропоэтин, мЕд/мл >56,2 57,1 (43,2-70,3) 91,8 (83,8-96,6) 6,94/0,4 7 82,1/76,5

ТБРП, ммоль/л >31,9 75,4 (62,2-85,9) 79,3 (69,3-87,3) 3,65/0,31 70,5/83,1

Лактат, ммоль/л >8,5 63,6 (49,6-76,2) 82,4 (72,6-89,8) 3,61/0,44 70,0/77,8

ММП-2, нг/мл <49,2 47,3 (33,7-61,2) 95,2 (88,3-98,7) 9,93/0,55 86,7/73,4

ММП-2/ТИМП-1 <1,98 51,0 (36,6-65,2) 86,1 (76,5-92,8) 3,66/0,57 70,3/73,1

ММП-1, нг/мл >305,7 62,1 (48,4-74,5) 71,8 (61,0-81,0) 2,20/0,53 60,0/73,5

ММП-1/ТИМП-1 <0,014 71,7 (57,7-83,2) 57,7 (46,0-68,8) 1,69/0,49 53,5/75,0

ММП-9, нг/мл >107,1 50,0 (36,1-63,9) 95,2 (88,3-98,7) 10,50/0,53 87,1/74,8

Белок, S100B, нг/л >0,99 45,8 (32,7-59,2) 79,8 (69,6-87,7) 2,26/0,68 61,4/67,7

ММП-9/ТИМП-1 >4,16 44,0 (30,0-58,7) 82,7 (72,7-90,2) 2,55/0,68 61,1/70,5

ТИМП-1, нг/мл >21,9 81,5 (68,6-90,7) 34,1 (24,2-45,2) 1,24/0,54 44,0/74,4

Примечание: С — специфичность; Ч — чувствительность; +1Л - положительное отношение шансов; -ЬЯ - отрицательное отношение шансов; +РУ - точность определения положительных результатов; -РУ - точность определения отрицательных результатов.

Рисунок 1

Алгоритм дифференциальной диагностики перинатального гипоксического поражения центральной

нервной системы у новорождённых на основе лабораторных тестов в пуповинной крови. Единицы концентрации как в таблице 3; штриховкой показаны пороги, идентифицирующие новорождённых с перинатальным гипоксическим поражением ЦНС. Как следует из представленных данных, ра-

ционального для клиническои практики сочетания высокой чувствительности и высокой специфичности в отношении поражений ЦНС у новорождённых при ПГ не выявлено ни для одного из исследованных показателей. В связи с этим представлялся логичным поиск комбинации тестов с высокой чувствительностью и тестов с высокой специфичностью.

Для решения этой задачи проведено математическое моделирование лабораторного алгоритма прогнозирования церебральных по-

ражении у новорожденных при перинатальной гипоксии. В результате моделирования установлено, что, судя по доле истинно положительных и истинно отрицательных результатов, наилучший результат дифференцирования новорождённых по рассматриваемой патологии даёт применение уровней ТБРП, лактата, ММП-9 и эритропоэтина. При количественной оценке комбинаций этих тестов выявлено, что последовательный анализ уровней ММП-9, ТБРП, лактата, эритропоэтина (рис.) позволяет уже в первые часы после рождения выявить 85,0%

новорождённых с перинатальным гипоксиче-ским поражением ЦНС (чувствительность 85%) и 90,0% новорождённых без данной патологии (специфичность 90%).

Следует отметить, что при моделировании алгоритма на основе максимального коэффициента разделения на группы «болезнь есть - болезни нет» несколько изменяются пороги включённых в алгоритм тестов относительно порогов, установленных ROC-анализом (рисунок 1, таблица 3). Это, в свою очередь, ведёт к изменению чувствительности и специфичности тестов, а также созданию циклов - возврата при определённых результатах тестов к тестам предшествующего уровня. При этом циклический характер алгоритма не требует дополнительных лабораторных исследований, а лишь несколько усложняет интерпретацию результатов на постаналитическом этапе.

Заключение

Разработанный алгоритм прогнозирования гипоксических церебральных поражений у новорождённых на основе четырёх тестов в плазме пуповинной крови перспективен для валидации в проспективных исследованиях. В плане практического внедрения алгоритма рациональна разработка экспресс-методов измерения уровней ММП-9 и эритропоэтина в плазме крови и компьютерной программы для анализа результатов тестов.

Список литературы

1. Гомелла Т.Л., Каннигам М.Д. Неонато-логия. Москва, 2002.

2. Михайлов A.B., Тунелл Р. Клиническое руководство по асфиксии плода и новорождённого. Санкт-Петербург, 2001.

3. Gazzolo D., Abella R. et. al. Circulating biochemical markers of brain damage in infants complicated by ischemia reperfusion injury. Cardiovasc. Hematol. Agents Med. Chem. 2009; 7:108-126.

4. Захарова Л.А. Взаиморегуляция развития нейрэндокринной и иммунной систем. Онтогенез. 2010; 6 (41): 414-424.

5. Inder Т.Е., Volpe J.J. Mechanisms of perinatal brain injury. Semin. Neonatol. 2000; 1 (5): 3-16.

6. Jensen A., Gamier Y., Middelanis J., Berger R. Perinatal brain damage - from

pathophysiology to prevention. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 2003; 110 (Suppl. 1): 70-79.

7. Пальчик А.Б., Н.П. Шабалов. Гипоксиче-скм-ишемическая энцефалопатия новорожденных. Москва, 2011.

8. Buonocore G., Perrone S. Biomarkers of hypoxic brain injury in the neonate. Clin. Perinatal. 2004; 1 (31): 107-116.

9. Risso F.M., Sannia A., Gavilanes D.A. et. al. Biomarkers of brain damage in preterm infants. }. Matern. Fetal Neonatal Med. 2012; 4:101-104.

10. Tonni G., Leoncini S., Signorini C. Pathology of perinatal brain damage: background and oxidative stress markers, 2014.

11. Кореновский Ю.В., Ельчанинова С.A. Биохимические маркёры гипоксических перинатальных поражений центральной нервной системы у новорождённых. Клиническая лабораторная диагностика. 2012; 2: 3-7.

12. Dennery Р.А. Role of redox in fetal development and neonatal diseases. Antioxid. Redox Signal. 2004; 6:147-153.

13. Evrard P. Pathophysiology of perinatal brain damage. Dev. Neurosci. 2001; 23: 171174.

14. Kurinczuk J.J. Epidemiology of neonatal encephalopathy and hypoxic-ischaemic encephalopathy. Early Hum. Dev. 2010; 6 (86): 329-338.

15. Maier R.F. Cord blood erythropoietin in relation to different markers of fetal hypoxia. Obstet. Gynecol. 1993; 4 (81): 575580.

16. Shalak L., Perlman J.M. Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant-current concepts. Early Hum. Dev. 2004; 80:125-141.

Контактные данные:

Автор, ответственный за переписку - Шабалина Юлия Вадимовна, ассистент кафедры общей и биологической химии, клинической лабораторной диагностики ФГБОУ ВО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Барнаул. 656038, г. Барнаул, пр. Ленина, д. 40 Тел.: (3852) 241392. Email: timidin@gmail.com