СОСТАВЫ НА ОСНОВЕ АНТИТЕЛА
ANTIBODY FORMULATIONS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001]
Данная заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №62/358404, поданной 5 июля 2016 года. Данная заявка также испрашивает приоритет на основании европейской заявки на патент №16306090.8, поданной 30 августа 2016 года. Каждая из данных заявок включена посредством ссылки в данный документ во всей своей полноте.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0002]
Настоящее изобретение относится к составам на основе антитела с пролонгированной стабильностью при хранении в стеклянных контейнерах.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0003]
CXCR5, также известный как рецептор лимфомы Беркитта (BLR1), CD185, MDR15 и MGC117347, представляет собой сопряженный с G-белком рецептор, который является представителем семейства CXC-хемокиновых рецепторов. CXCR5 воздействует на миграцию B-клеток и их локализацию в тканях, как продемонстрировано на нокаутных по CXCR5 мышах, у которых отсутствуют периферические лимфатические узлы, и которые имеют меньшее количество пейеровых бляшек и характеризуются сниженными уровнями B-клеток. CXCL13, также известный как BLC, представляет собой лиганд для CXCR5. CXCL13 представляет собой хемоаттрактант для B-клеток. Средства, связывающие CXCR5, подходят для терапевтического применения, и они были составлены в готовые лекарственные формы, которые можно вводить субъектам, в частности субъектам-людям, для лечения воспалительных заболеваний.
[0004]
Фармацевтические составы, содержащие средства, связывающие CXCR5, подходящие для внутривенного или подкожного введения, должны являться высококонцентрированными (от приблизительно 20 мг/мл до приблизительно 100-150 мг/мл, и даже вплоть до 250 мг/мл или более). Однако с такими фармацевтическими составами при высоких концентрациях может быть сопряжено множество проблем, включая повышенную вязкость, сдвиг pH и изменение цвета раствора. Кроме того, при высоких концентрациях связывающего средства повышается вероятность образования видимых и невидимых невооруженным глазом частиц, агрегатов связывающего средства и/или полумолекул связывающего средства. Более того, при высоких концентрациях связывающего средства существует повышенная вероятность взаимодействия между фармацевтическим составом и его контейнером для хранения. Следовательно, остается потребность в улучшенных фармацевтических составах, которые преодолевают такие ограничения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0005]
В данном документе представлены фармацевтические составы на основе антитела к CXCR5 с повышенной стабильностью при хранении в стеклянных контейнерах для хранения.
[0006]
В первом аспекте настоящее изобретение предусматривает состав на основе антитела, подходящий для подкожного введения пациенту. Состав включает от приблизительно 50 до приблизительно 250 мг/мл антитела к CXCR5; цитратный буфер; более приблизительно 0,01% (вес/объем) поверхностно-активного вещества; более приблизительно 50 мМ аминокислоты и более приблизительно 1% сахарозы. pH состава составляет приблизительно pH 6.
[0007]
В одном варианте осуществления первого аспекта антитело к CXCR5 или его фрагмент включают: (a) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12; (b) аминокислотные последовательности RSSKSLLHSSGKTYLY (SEQ ID NO: 58), RMSNLAS (SEQ ID NO: 59), MQHLEYPYT (SEQ ID NO: 60), GFSLIDYGVN (SEQ ID NO: 61), VIWGDGTTY (SEQ ID NO: 62) и IVY (SEQ ID NO: 63); (c) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 15, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16; (d) аминокислотные последовательности RSSKSLLHSSGKTYLY (SEQ ID NO: 58), RLSNLAS (SEQ ID NO: 64), MQHLEYPYT (SEQ ID NO: 60), GFSLIDYGVN (SEQ ID NO: 61), VIWGDGTTY (SEQ ID NO: 62) и IVY (SEQ ID NO: 63); (e) аминокислотные последовательности RSSKSLLHSSGKTYLY (SEQ ID NO: 58), RLSSNLAS (SEQ ID NO: 65), MQHLEYPYT (SEQ ID NO: 60), GFSLIDYGVN (SEQ ID NO: 61), VIWGDGTTY (SEQ ID NO: 62) и IVY (SEQ ID NO: 63); (f) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 21, и вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 23; (g) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 или SEQ ID NO: 32, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 33 или SEQ ID NO: 34; (h) аминокислотные последовательности RSSKSLLHSSGKTYLY (SEQ ID NO: 58), RMSNLA (SEQ ID NO: 66), MQHLEYPYT (SEQ ID NO: 60), GFSLIDYGVN (SEQ ID NO: 61), VIWGDGTTY (SEQ ID N: 62) и IVY (SEQ ID NO: 63); (i) аминокислотные последовательности RSSKSLLHSSGKTYLY (SEQ ID NO: 58), RLSNLA (SEQ ID NO: 67), MQHLEYPYT (SEQ ID NO: 60), GFSLIDYGVN (SEQ ID NO: 61), VIWGDGTTY (SEQ ID NO: 62) и IVY (SEQ ID NO: 63); (j) аминокислотные последовательности RSSKSLLHSSGKTYLY (SEQ ID NO: 58), RLSSLA (SEQ ID NO: 68), MQHLEYPYT (SEQ ID NO: 60), GFSLIDYGVN (SEQ ID NO: 61), VIWGDGTTY (SEQ ID NO: 62) и IVY (SEQ ID NO: 63); (k) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 35, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 37; (l) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 или SEQ ID NO: 43, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 45 или SEQ ID NO: 47; (m) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 55, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 56 или SEQ ID NO: 57; или (n) аминокислотные последовательности RSSKSLLHSSGKTYLYW (SEQ ID NO: 69), RMSNLA (SEQ ID NO: 66), MQHLEYPYT (SEQ ID NO: 60), GFSLIDYGVN (SEQ ID NO: 61), VIWGDGTTY (SEQ ID NO: 62) и IVY (SEQ ID NO: 63).
[0008]
В другом варианте осуществления первого аспекта аминокислота представляет собой аргинин или метионин.
[0009]
В одном варианте осуществления первого аспекта поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат.
[0010]
Во втором аспекте настоящее изобретение предусматривает состав на основе антитела, подходящий для подкожного введения пациенту. Состав включает от приблизительно 100 до приблизительно 175 мг/мл антитела; приблизительно 10 мМ цитратного буфера; приблизительно 0,1% (вес/объем) поверхностно-активного вещества; приблизительно 200 мМ аргинина и от приблизительно 4,5 до 9% сахарозы. pH состава составляет приблизительно pH 6.
[0011]
В одном варианте осуществления второго аспекта антитело представляет собой полностью человеческое антитело к CXCR5.
[0012]
В другом варианте осуществления второго аспекта антитело включает тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 33, и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 32.
[0013]
В дополнительном варианте осуществления второго аспекта антитело содержит одноцепочечный Fv.
[0014]
В другом варианте осуществления второго аспекта антитело представляет собой выделенное антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с внеклеточным доменом CXCR5 человека.
[0015]
В одном варианте осуществления второго аспекта выделенное антитело или его фрагмент содержат аминокислотные последовательности RSSKSLLHSSGKTYLY (SEQ ID NO: 58), RLSSLA (SEQ ID NO: 68), MQHLEYPYT (SEQ ID NO: 60), GFSLIDYGVN (SEQ ID NO: 61), VIWGDGTTY (SEQ ID NO: 62) и IVY (SEQ ID NO: 63).
[0016]
В одном варианте осуществления второго аспекта поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат.
[0017]
В другом варианте осуществления второго аспекта полисорбат представляет собой полисорбат 20 или полисорбат 80.
[0018]
В третьем аспекте настоящее изобретение предусматривает состав на основе антитела, который включает приблизительно 175 мг/мл гуманизированного антитела к CXCR5, представляющего собой IgG4; приблизительно 10 мМ цитратного буфера; приблизительно 1,0 мг/мл полисорбата 80; приблизительно 200 мМ HCl-аргинина и приблизительно 45 мг/мл сахарозы. pH состава составляет приблизительно pH 6.
[0019]
В одном варианте осуществления третьего аспекта гуманизированное антитело к CXCR5, представляющее собой IgG4, включает тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 33, и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 32.
[0020]
В четвертом аспекте настоящее изобретение предусматривает контейнер, содержащий состав на основе антитела в соответствии с любым из предыдущих аспектов или вариантов осуществления.
[0021]
В одном варианте осуществления четвертого аспекта контейнер представляет собой предварительно заполненный шприц, флакон или автоинжектор.
[0022]
В другом варианте осуществления четвертого аспекта контейнер содержит состав на основе антитела в соответствии с любым из предыдущих аспектов или вариантов осуществления в лиофилизированной форме.
[0023]
В пятом аспекте настоящее изобретение предусматривает набор, включающий контейнер по четвертому аспекту и любому из его вариантов осуществления и этикетку или инструкции для введения и применения состава на основе антитела.
[0024]
В одном варианте осуществления пятого аспекта введение осуществляют посредством инъекции.
[0025]
В шестом аспекте настоящее изобретение предусматривает состав на основе антитела в соответствии с любым из предыдущих аспектов или вариантов осуществления для применения в способе диагностики или лечения организма человека или животного.
[0026]
В седьмом аспекте настоящее изобретение предусматривает способ лечения ревматоидного артрита, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, состава на основе антитела в соответствии с любым из предыдущих аспектов или вариантов осуществления.
[0027]
В восьмом аспекте настоящее изобретение предусматривает лиофилизированную форму состава на основе антитела в соответствии с любым из предыдущих аспектов или вариантов осуществления.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0028]
Фиг. 1 представляет собой микрофотоснимок целлюлозного фильтра после фильтрации плацебо для первого состава на основе антитела к CXCR5. Увеличение составляет 50X.
[0029]
Фиг. 2 представляет собой микрофотоснимок целлюлозного фильтра после фильтрации плацебо для второго состава на основе антитела к CXCR5. Увеличение составляет 50X.
[0030]
Фиг. 3 представляет собой микрофотоснимок целлюлозного фильтра после фильтрации плацебо для третьего состава на основе антитела к CXCR5. Увеличение составляет 50X.
[0031]
Фиг. 4 представляет собой микрофотоснимок целлюлозного фильтра после фильтрации первой готовой лекарственной формы на основе антитела к CXCR5 (DP; SAR113244), хранящейся в бутыли Nalgene. Увеличение составляет 50X.
[0032]
Фиг. 5 представляет собой микрофотоснимок целлюлозного фильтра с фиг. 4 при увеличении 200X.
[0033]
Фиг. 6 представляет собой микрофотоснимок целлюлозного фильтра после фильтрации второй DP на основе антитела к CXCR5. Увеличение составляет 50X.
[0034]
Фиг. 7 представляет собой микрофотоснимок целлюлозного фильтра после фильтрации первой контрольной DP на основе антитела к CXCR5. Увеличение составляет 50X. Первая контрольная DP на основе антитела к CXCR5 представляет собой контрольный состав, "не содержащий Stardust" (SAR252067), у которого показано образование частиц, подобных таковым в первой DP на основе антитела к CXCR5, но не частиц Stardust. Такое появление демонстрирует сложность при анализе частиц Stardust.
[0035]
Фиг. 8 представляет собой микрофотоснимок целлюлозного фильтра с фиг. 7 при увеличении 200X.
[0036]
Фиг. 9 представляет собой микрофотоснимок целлюлозного фильтра после фильтрации DP SAR341403. Увеличение составляет 50X.
[0037]
Фиг. 10 представляет собой микрофотоснимок целлюлозного фильтра с фиг. 9 при увеличении 200X.
[0038]
Фиг. 11 представляет собой микрофотоснимок целлюлозного фильтра после фильтрации второй контрольной DP на основе антитела к CXCR5 (SAR341403). Увеличение составляет 50X. Вторая контрольная DP на основе антитела к CXCR5 представляет собой другой контрольный состав, "не содержащий Stardust", у которого показано образование частиц, подобных таковым в первой DP на основе антитела к CXCR5, и он дополнительно демонстрирует сложность при анализе частиц Stardust.
[0039]
Фиг. 12 представляет собой микрофотоснимок целлюлозного фильтра с фиг. 11 при увеличении 200X.
[0040]
Фиг. 13 представляет собой график DLS-измерения распределения по размеру для раствора DP SAR113244, хранящегося в пластиковой бутыли (раствора, не содержащего Stardust).
[0041]
Фиг. 14 представляет собой график DLS-измерения распределения по размеру для раствора DP, хранящегося в стеклянных флаконах (раствора, содержащего Stardust).
[0042]
-1
-1
-1
На фиг. 15 показан спектр FT-IR частицы (верхняя кривая) из образца; нижняя кривая показывает спектр для белка в качестве сравнения; широкая полоса на 3300 см и две амидные полосы на 1650 см, 1520 см соответственно являются типичными для белков.
[0043]
Фиг. 16 представляет собой рамановский спектр частицы, которую идентифицировали как белок; первая кривая показывает спектр частицы из образца; вторая кривая показывает спектр частицы из образца с вычитанием фона; третья кривая показывает сравнение самого лучшего совпадения из базы данных (белка).
[0044]
-1
-1
-1
Фиг. 17 представляет собой спектр FT-IR частицы, которую идентифицировали как белок. Первая кривая показывает спектр FT-IR частицы из образца; вторая кривая показывает самое лучшее совпадение с базой данных (полиэтилен); третья кривая показывает спектр для белка в качестве сравнения; широкая полоса на 3300 см и две амидные полосы на 1650 см, 1520 см соответственно являются типичными для белков.
[0045]
Фиг. 18 представляет собой рамановский спектр частицы, которую идентифицировали как белок. Первая кривая показывает спектр частицы из образца; вторая кривая показывает спектр частицы из образца c вычитанием фона; третья кривая показывает сравнение самого лучшего совпадения из базы данных, которое идентифицировали как полиэтилен.
[0046]
На фиг. 19 проиллюстрированы результаты образования частиц в ходе исследования механического воздействия; темно-серый=видимые частицы, светло-серый=1-2 частицы, белый в точку=в основном прозрачный раствор, белый=раствор, не содержащий частиц; столбики указывают слева направо: составы A, H, B, C и D (см.таблицу № 1).
[0047]
На фиг. 20 проиллюстрированы результаты образования частиц в ходе исследования механического воздействия; темно-серый=видимые частицы, окрашенный в клетку=частицы Stardust или частицы, подобные Stardust, светло-серый=1-2 частицы, белый в точку=в основном прозрачный раствор, белый=раствор, не содержащий частиц; столбики указывают слева направо: составы A, H, E, F и G (см.таблицу № 1).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0048]
Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, как и обычно понимаемое специалистом в данной области техники.
[0049]
Здесь указано, что применяемые в данном описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа также включают ссылку на множественное число, если в контексте прямо не указано иное.
[0050]
Термин "приблизительно" или "примерно" означает в пределах 10%, как, например, в пределах 5% (или 1% или меньше) от указанного значения или диапазона.
[0051]
Термины "вводить" или "введение" относятся к акту инъекции или физической доставки вещества, находящегося вне организма (например,состава по настоящему изобретению), пациенту другим путем, таким как посредством чресслизистой, внутрикожной, внутривенной, подкожной, внутримышечной доставки и/или любого другого способа физической доставки, описанного в данном документе или известного из уровня техники. Если осуществляют лечение заболевания или его симптома, то введение вещества, как правило, осуществляют после начала проявления заболевания или его симптомов. Если осуществляют предупреждение заболевания или его симптома, то введение вещества, как правило, осуществляют до начала заболевания или проявления его симптомов.
[0052]
Применительно к полипептиду термин "аналог" относится к полипептиду, обладающему функцией, подобной или идентичной таковой у полипептида CXCR5, фрагмента полипептида CXCR5, эпитопа CXCR5 или антитела к CXCR5, но не обязательно содержащему аминокислотную последовательность, подобную или идентичную таковой у полипептида CXCR5, фрагмента полипептида CXCR5, эпитопа CXCR5 или антитела к CXCR5, или обладающему структурой, подобной или идентичной таковой у полипептида CXCR5, фрагмента полипептида CXCR5, эпитопа CXCR5 или антитела к CXCR5.
[0053]
Полипептид, который имеет подобную аминокислотную последовательность, относится к полипептиду, который отвечает по меньшей мере одному из следующих требований: (a) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая является на по меньшей мере 30%, на по меньшей мере 35%, на по меньшей мере 40%, на по меньшей мере 45%, на по меньшей мере 50%, на по меньшей мере 55%, на по меньшей мере 60%, на по меньшей мере 65%, на по меньшей мере 70%, на по меньшей мере 75%, на по меньшей мере 80%, на по меньшей мере 85%, на по меньшей мере 90%, на по меньшей мере 95% или на по меньшей мере 99% идентичной аминокислотной последовательности полипептида CXCR5, фрагмента полипептида CXCR5, эпитопа CXCR5 или антитела к CXCR5, описанных в данном документе; (b) полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, которая гибридизируется при жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид CXCR5, фрагмент полипептида CXCR5, эпитоп CXCR5 или антитело к CXCR5 (или его VH- или VL-область), описанные в данном документе, из по меньшей мере 5 аминокислотных остатков, по меньшей мере 10 аминокислотных остатков, по меньшей мере 15 аминокислотных остатков, по меньшей мере 20 аминокислотных остатков, по меньшей мере 25 аминокислотных остатков, по меньшей мере 40 аминокислотных остатков, по меньшей мере 50 аминокислотных остатков, по меньшей мере 60 амино остатков, по меньшей мере 70 аминокислотных остатков, по меньшей мере 80 аминокислотных остатков, по меньшей мере 90 аминокислотных остатков, по меньшей мере 100 аминокислотных остатков, по меньшей мере 125 аминокислотных остатков или по меньшей мере 150 аминокислотных остатков (см.,например, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Нью Йорк; Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Нью Йорк); и (c) полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, которая является на по меньшей мере 30%, на по меньшей мере 35%, на по меньшей мере 40%, на по меньшей мере 45%, на по меньшей мере 50%, на по меньшей мере 55%, на по меньшей мере 60%, на по меньшей мере 65%, на по меньшей мере 70%, на по меньшей мере 75%, на по меньшей мере 80%, на по меньшей мере 85%, на по меньшей мере 90%, на по меньшей мере 95% или на по меньшей мере 99% идентичной нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид CXCR5, фрагмент полипептида CXCR5, эпитоп CXCR5 или антитело к CXCR5 (или его VH- или VL-область), описанные в данном документе. Полипептид со структурой, подобной таковой у полипептида CXCR5, фрагмента полипептида CXCR5, эпитопа CXCR5 или антитела к CXCR5, относится к полипептиду, который имеет вторичную, третичную или четвертичную структуру, подобную таковой у полипептида CXCR5, фрагмента полипептида CXCR5, эпитопа CXCR5 или антитела к CXCR5. Структуру полипептида можно определить с помощью способов, известных специалисту в данной области техники, включающих без ограничения рентгеновскую кристаллографию, ядерный магнитный резонанс и кристаллографическую электронную микроскопию.
[0054]
"Антагонист" или "ингибитор" относится к молекуле, способной ингибировать один или несколько видов биологической активности молекулы-мишени. Антагонисты могут препятствовать связыванию рецептора с лигандом инаоборот путем нейтрализации или уничтожения клеток, активированных лигандом, и/или путем препятствования активации рецептора или лиганда (например,активации тирозинкиназы) или передаче сигнала после связывания лиганда с рецептором. Антагонист может полностью блокировать взаимодействия рецептора и лиганда или может значительно уменьшать такие взаимодействия. Все такие виды воздействия антагониста будут считаться эквивалентными для целей настоящего изобретения.
[0055]
Например, "антагонист" или "ингибитор" CXCR5 относится к молекуле, способной ингибировать один или несколько видов биологической активности CXCR5, таких как передача сигнала. Таким образом, в объем настоящего изобретения включены антагонисты (например,нейтрализующие антитела), которые связываются с CXCR5, CXCL13 или другими лигандами CXCR5, или комплексом CXCR5 и его лиганда, такого как CXCL13; варианты аминокислотной последовательности или производные CXCR5 или CXCL13, которые оказывают антагонистическое воздействие на взаимодействие между CXCR5 и лигандом, таким как CXCL13; растворимый CXCR5, необязательно слитый с гетерологичной молекулой, такой как область иммуноглобулина (например,иммуноадгезин); комплекс, содержащий CXCR5 в ассоциации с другим рецептором или биологической молекулой; пептиды с синтетической или нативной последовательностью, которые связываются с CXCR5 и т.д.
[0056]
Термины "антитело", "иммуноглобулин" или "Ig" могут использоваться в данном документе взаимозаменяемо. Термин "антитело" включает без ограничения синтетические антитела, моноклональные антитела, полученные рекомбинантным путем антитела, полиспецифические антитела (включая биспецифические антитела), человеческие антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, внутриклеточные антитела, одноцепочечные Fv (scFv) (включая, например,моноспецифические, биспецифические и т.д.), камелизованные антитела, Fab-фрагменты, F(ab′)-фрагменты, связанные дисульфидной связью Fv (sdFv), антиидиотипические (анти-Id) антитела и эпитоп-связывающие фрагменты любого из приведенного выше. В частности, антитела предусматривают молекулы иммуноглобулина и иммунологически активные части молекул иммуноглобулина,т.е. антигенсвязывающие домены или молекулы, которые содержат антигенсвязывающий участок, который специфически связывается с антигеном CXCR5 (например,одну или несколько областей, определяющих комплементарность (CDR), антитела к CXCR5). Антитела к CXCR5 могут принадлежать к любому типу (например,IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), любому классу (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или любому подклассу (например,IgG2a и IgG2b) молекулы иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления антитела к CXCR5 являются гуманизированными, такими как гуманизированные моноклональные антитела к CXCR5. В определенных вариантах осуществления антитела к CXCR5 представляют собой антитела, представляющие собой IgG, и, в частности, антитела, представляющие собой гуманизированный IgG4.
[0057]
Как используется в данном документе, термин "антитело к CXCR5" означает антитело или полипептид, происходящий из него (производное), которые специфически связываются с CXCR5 человека, как определено в данном документе, включая без ограничения молекулы, которые ингибируют или значительно снижают связывание CXCR5 с его лигандами и/или ингибируют активность CXCR5. Например, предусмотренное антитело к CXCR5 включает выделенное антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с внеклеточным доменом CXCR5 человека, такие как раскрываемые в патенте США №8647622, включенном в данный документ посредством ссылки для всех целей. В частности, предусмотренные антитела к CXCR5 по настоящему изобретению имеют вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 32, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 33, из патента США №8647622. В другом варианте осуществления выделенное антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с внеклеточным доменом CXCR5 человека, содержат аминокислотные последовательности RSSKSLLHSSGKTYLY (SEQ ID NO: 58), RLSSLA (SEQ ID NO: 68), MQHLEYPYT (SEQ ID NO: 60), GFSLIDYGVN (SEQ ID NO: 61), VIWGDGTTY (SEQ ID NO: 62) и IVY (SEQ ID NO: 63) из патента США №8647622.
[0058]
Термин "активность B-клеток" означает более высокие, чем в норме, уровни B-клеток, которые могут являться локальными или представлять собой свидетельство биологического проявления или функционирования B-клетки, таких как экспрессия антител, присутствие или активность тирозинкиназы Брутона, экспрессия или присутствие CD19, экспрессия или присутствие фактора активации B-клеток и т.д.
[0059]
Термин "связывающее средство" означает любую молекулу, такую как антитело, siRNA, нуклеиновая кислота, аптамер, белок или низкомолекулярное органическое соединение, которая связывается или специфически связывается с CXCR5 или его вариантом или фрагментом.
[0060]
Термин "побочный продукт" включает нежелательные продукты, которые уменьшают или снижают относительное содержание в указанном составе терапевтического/профилактического связывающего средства, такого как антитело. Например, типичные побочные продукты включают агрегаты антитела, фрагменты антитела, например,образуемые вследствие распада антител при дезамидировании или гидролизе, или их смеси. Как правило, агрегаты представляют собой комплексы, которые характеризуются молекулярной массой, большей, чем у мономерного антитела. Продукты распада антител могут включать, например, фрагменты антитела, например, образующиеся при дезамидировании или гидролизе. Как правило, продукты распада представляют собой комплексы, которые характеризуются молекулярной массой, меньшей, чем у мономерного антитела. В случае антитела, представляющего собой IgG, размер таких продуктов распада составляет менее приблизительно 150 кДа.
[0061]
Подразумевается, что термины "композиция" и "состав" охватывают продукт, содержащий указанные ингредиенты (например,антитело к CXCR5) необязательно в указанных количествах, а также любой продукт, который непосредственно или опосредованно получают в результате комбинирования указанных ингредиентов необязательно в указанных количествах.
[0062]
Термины "константная область" и "константный домен" относятся к карбокси-концевой части легкой и тяжелой цепей, которая не вовлечена непосредственно в связывание антитела с антигеном, но проявляет разные эффекторные функции, такие как взаимодействие с Fc-рецептором. Термины относятся к части молекулы иммуноглобулина, имеющей более консервативную аминокислотную последовательность по сравнению с другой частью иммуноглобулина, вариабельным доменом, который содержит антигенсвязывающий участок. Константный домен содержит CH1-, CH2- и CH3-домены тяжелой цепи и CHL-домен легкой цепи.
[0063]
Термин "CXCR5" относится к встречающейся в природе молекуле, которая, как известно, находится на лимфоцитах, в частности, B-клетках и, в частности, наивных B-клетках; к такой молекуле, выделенной из таких клеток; к такой молекуле, полученной рекомбинантным путем с применением известных материалов и способов и с применением нуклеиновой кислоты, кодирующей CXCR5; а также к частям CXCR5, таким как внеклеточный (EC) домен, который сохраняет характеристики и свойства, относящиеся к осуществлению на практике настоящего изобретения, такому как связывание с CXCL13. Растворимая молекула CXCR5 по существу может состоять из EC-домена CXCR5, который обычно включает приблизительно первые шестьдесят аминокислот молекулы, то есть представляет собой амино-концевую часть CXCR5.
[0064]
in vivo
CXCR5 представляет собой непромискуитетный рецептор. CXCL13 представляет собой лиганд CXCR5 и конститутивно экспрессируется на стромальных клетках, таких как фолликулярные дендритные клетки, и в лимфоидных тканях. CXCL13 специфически привлекает B-клетки и небольшую подгруппу T-клеток, называемых B-хелперными фолликулярными T-клетками, TFH. Это и не удивительно, учитывая множество взаимодействий между популяциями T-клеток и B-клеток в иммунной системе. Более того, активированные T-клетки индуцируют или повышают экспрессию CXCR5. Было обнаружено, что инфильтрация лимфоцитов в третичные эктопические герминативные центры (GC) хорошо коррелирует с повышенной тяжестью заболевания и утратой толерантности при некоторых нарушениях, при которых присутствуют такие атипические структуры, подобные лимфатическим узлам. В случае применения  мышиных моделей, таких как CXCR5-/- и CXCL13-/- мыши, отсутствие либо рецептора, либо лиганда приводит к измененной тонкой структуре GC вследствие измененной локализации и, возможно, взаимодействия T- и B-клеток. Такие мыши также защищены от развития тяжелого коллаген-индуцированного артрита (CIA). Поскольку CXCR5 селективно экспрессируется на зрелых B-клетках, которые связаны с патогенезом RA, то блокирование данного рецептора будет модулировать артритогенный ответ у пораженных индивидуумов. Было показано, что лечение ревматоидного артрита с помощью биологических препаратов (т.е. антитела к TNF-α и антитела к CD20, ритуксимаба) является клинически эффективным; в частности, пациенты, получающие терапию, направленную на B-клетки, показали стойкие улучшения клинических признаков и симптомов. Селективное нацеливание на CXCR5, который экспрессируется только на зрелых B-клетках и B-хелперных T-клетках, не будет оказывать воздействия на развитие B-клеток или снижать иммунологическую реактивность пациента. В отличие от ритуксимаба антитело к CXCR5 по настоящему изобретению представляет собой нейтрализующее антитело, которое не опосредует клеточную цитотоксичность.
[0065]
"Заболевание, связанное с CXCR5" представляет собой недомогание, нарушение, заболевание, состояние, аномалию и т.д., которые характеризуются или обусловлены сверхэкспрессией или повышенными уровнями CXCL13 или другого лиганда CXCR5, повышенными уровнями B-клеток, повышенными уровнями активности B-клеток, повышенными уровнями CXCR5 или неправильным метаболизмом и активностью CXCR5.
[0066]
Термин "эпитоп" относится к ограниченной области на поверхности антигена, такого как полипептид CXCR5 или фрагмент полипептида CXCR5, которая способна связываться с одной или несколькими антигенсвязывающими областями связывающего средства, такого как антитело, и которая обладает антигенной или иммуногенной активностью у животного, такого как млекопитающее, например человек, то есть способна обеспечивать иммунный ответ. Эпитоп, обладающий иммуногенной активностью, представляет собой часть полипептида, который обеспечивает иммунный ответ с образованием антител у животного. Эпитоп, обладающий антигенной активностью, представляет собой часть полипептида, с которой специфически связывается антитело, что определяют с помощью любого способа, хорошо известного из уровня техники, например, такого как иммунологический анализ. Эпитопы антигена не обязательно должны являться иммуногенными. Эпитопы обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты и/или боковые цепи сахаров, и обладают специфическими характеристиками трехмерной структуры, а также специфическими характеристиками заряда. Область полипептида, участвующая в образовании эпитопа, может представлять собой смежные аминокислоты полипептида, или эпитоп может быть образован двумя или более несмежными областями полипептида. Эпитоп может представлять собой характерный признак поверхности антигена, имеющий трехмерную структуру, или не быть таковым. Антитела к CXCR5 могут специфически связываться с эпитопом одномерной (денатурированной) формы CXCR5, эпитопом трехмерной (нативной) формы CXCR5 или как одномерной (денатурированной) формы, так и трехмерной (нативной) формы CXCR5.
[0067]
Термин "наполнители" относится к инертным веществам, которые обычно применяют в качестве разбавителя, среды-носителя, консерванта, связующего средства, стабилизатора и т.д. для лекарственных средств, и он включает без ограничения белки (например,сывороточный альбумин и т.д.), аминокислоты (например,аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, лизин, аргинин, глицин, гистидин и т.д.), жирные кислоты и фосфолипиды (например,алкилсульфонаты, каприлат и т.д.), поверхностно-активные вещества (например,SDS, полисорбат, неионогенное поверхностно-активное вещество и т.д.), сахариды (например,сахарозу, мальтозу, трегалозу и т.д.) и полиолы (например,маннит, сорбит и т.д.). См.также, Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, Pa., который настоящим включен посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.
[0068]
in vivo
Применительно к пептиду или полипептиду термин "фрагмент" относится к пептиду или полипептиду, который содержит меньше, чем полноразмерную аминокислотную последовательность. Такой фрагмент можно получить, например, за счет усечения на амино-конце, усечения на карбокси-конце и/или внутренней делеции остатка (остатков) в аминокислотной последовательности. Фрагменты можно получить в результате, например, альтернативного сплайсинга РНК или протеазной активности . В определенных вариантах осуществления фрагменты hCXCR5 включают полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность из по меньшей мере 5 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 10 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 15 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 20 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 25 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 40 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 50 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 60 смежных амино остатков, по меньшей мере 70 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 80 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 90 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 100 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 125 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 150 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 175 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 200 смежных аминокислотных остатков или по меньшей мере 250 смежных аминокислотных остатков из аминокислотной последовательности полипептида CXCR5 или антитела, которое специфически связывается с полипептидом CXCR5. В конкретном варианте осуществления фрагмент полипептида CXCR5 или антитело, которое специфически связывается с антигеном CXCR5, сохраняют по меньшей мере 1, по меньшей мере 2 или по меньшей мере 3 функции полипептида или антитела.
[0069]
et al.
et al.
Термины "полностью человеческое антитело" или "человеческое антитело" используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к антителу, которое содержит человеческую вариабельную область и возможно человеческую константную область. В конкретных вариантах осуществления термины относятся к антителу, которое содержит вариабельную область и константную область, происходящие из человеческого антитела. В конкретном варианте осуществления антитела представляют собой полностью человеческие антитела. Термин "полностью человеческое антитело" включает антитела, имеющие вариабельные и константные области, соответствующие последовательностям иммуноглобулинов зародышевого типа человека, как описано в Kabat  (См. Kabat  (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Способы получения полностью человеческих антител известны из уровня техники.
[0070]
et al
in vitro
in vivo
in vivo
Фраза "рекомбинантное человеческое антитело" включает человеческие антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют с помощью рекомбинантных способов, такие как антитела, экспрессируемые с применением рекомбинантного вектора экспрессии, трансфицированного в клетку-хозяина, антитела, выделенные из комбинаторной библиотеки рекомбинантных человеческих антител, антитела, выделенные из животного (например,мыши или коровы), которое является трансгенным и/или трансхромосомным в отношении генов иммуноглобулина человека (см.,например,Taylor, L. D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295), или антитела, полученные, экспрессируемые, созданные или выделенные с помощью любых других способов, которые предусматривают сплайсинг последовательностей гена иммуноглобулина человека в другие ДНК-последовательности. Такие рекомбинантные человеческие антитела могут иметь вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулина зародышевого типа человека (См.Kabat ., 1991). В определенных вариантах осуществления, однако, такие рекомбинантные человеческие антитела подвергают мутагенезу  (или, если применяют животное, трансгенное по последовательностям человеческого Ig, то соматическому мутагенезу ), и, таким образом, аминокислотные последовательности VH- и VL-областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые хотя и получены из последовательностей VH и VL зародышевого типа человека и родственны им, могут не существовать в природе в пределах репертуара антител зародышевого типа человека .
[0071]
Оба выражения "связывающее средство на основе IgG4" или "связывающее средство, содержащее по меньшей мере часть Fc-области IgG4" относятся к связывающим средствам, описанным в данном документе, которые включают по меньшей мере фрагмент Fc IgG4. В определенных вариантах осуществления фрагмент содержит 10, 20, 30, 40, 50, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210 или 220 аминокислот Fc-области IgG4. В других вариантах осуществления фрагмент включает 10-50, 50-100, 100-150 или 150-200 аминокислот Fc-области IgG4. В других вариантах осуществления часть Fc-области IgG4 может характеризоваться некоторой степенью гомологии с Fc-областью IgG4. Например, связывающее средство на основе IgG4 может включать часть белка, характеризующуюся более чем 50, 60, 70, 80, 90, 93, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% гомологией с Fc-областью IgG4. Иллюстративные Fc-области IgG4 описаны на всем протяжении данного описания.
[0072]
Термин "тяжелая цепь", применяемый в отношении антитела, относится к пяти различным типам, называемым альфа (α), дельта (Δ), эпсилон (ε), гамма (γ) и мю (μ), выделяемым на основании аминокислотной последовательности константного домена тяжелой цепи. Данные различные типы тяжелых цепей хорошо известны из уровня техники и служат основанием для выделения пяти классов антител, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM соответственно, включающих четыре подкласса IgG, а именно IgG1, IgG1, IgG3 и IgG4. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь представляет собой человеческую тяжелую цепь.
[0073]
et al
et al.
et al
et al
et al
et al
"Гуманизированные" формы отличных от человеческих (например,мышиных) антител представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как, Fv, Fab, Fab′, F(ab′)2 или другие мишень-связывающие подпоследовательности антител), которые в отличие от человеческого антитела содержат последовательности, полученные из иммуноглобулина, отличного от иммуноглобулина человека. В большинстве случаев гуманизированное антитело будет содержать практически полностью один а, как правило, два вариабельных домена, в которых все или практически все CDR-области соответствуют таковым в иммуноглобулине, отличном от иммуноглобулина человека, и все или практически все FR-области получены из последовательности-матрицы иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело также может содержать по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, как правило, таковую из выбранной матрицы иммуноглобулина человека. В большинстве случаев цель заключается в получении молекулы антитела, обладающей минимальной иммуногенностью в организме человека. Таким образом, представляется возможным, что одну или несколько аминокислот в одной или нескольких CDR также можно заменить на аминокислоту, которая является менее иммуногенной для человека-хозяина, без значительного снижения функции специфического связывания с CXCR5 или CXCL13 у одной или нескольких CDR. В качестве альтернативы FR может являться отличной от человеческой, но наиболее иммуногенные аминокислоты в ней заменены на менее иммуногенные. Тем не менее, привитие CDR представляет собой не единственный способ получения гуманизированного антитела. Например, модификации только CDR-областей может быть недостаточно, поскольку в определении трехмерной структуры петель CDR и общей аффинности антитела к своему лиганду нередко играют роль остатки каркасной области. Следовательно, на практике можно применять любые способы, чтобы модифицировать исходную молекулу отличного от человеческого антитела таким образом, чтобы сделать ее менее иммуногенной для человека, и при этом глобальная идентичность последовательности человеческому антителу не всегда необходима. Таким образом, гуманизации также можно достигнуть, например, всего лишь путем замены только нескольких остатков, в частности, находящихся на поверхности молекулы антитела, а не остатков, погруженных внутрь молекулы, и следовательно, не являющихся легкодоступными для иммунной системы хозяина. Такой способ описан в данном документе в отношении замены "мобильных" или "гибких" остатков на поверхности молекулы антитела, при этом цель заключается в снижении или ослаблении иммуногенности полученной молекулы, без затрагивания специфичности антитела в отношении его эпитопа или детерминанты. См.,например, Studnicka ., Prot Eng 7(6)805-814, 1994; Lazar ,Mol Immunol. 2007 Mar;44(8):1986-98 (2007); Sims ., J Immunol 151:2296 (1993); Chothia ., J Mol Biol 196:901 (1987); Carter ., Proc Natl Acad Sci USA 89:4285 (1992); Presta ., J Immunol 151:2623 (1993), WO 2006/042333 и патент США №5869619.
[0074]
"Выделенное" или "очищенное" связывающее средство, такое как антитело, практически не содержит клеточный материал или другие загрязняющие белки из клеточного или тканевого источника, из которого получено связывающее средство, или практически не содержит химических предшественников или других веществ, если оно получено путем химического синтеза. Например, выражение "практически не содержит клеточный материал" включает препараты антител, в которых антитело отделено от клеточных компонентов клеток, из которых оно выделено или в которых оно получено рекомбинантным путем. Таким образом, антитело, практически не содержащее клеточный материал, включает препараты антитела, имеющие менее приблизительно 30%, 20%, 10% или 5% (по сухому весу) гетерологичного белка (также называемого в данном документе "загрязняющим белком"). Если антитело получено рекомбинантным путем, также желательно, чтобы оно практически не содержало культуральную среду,т.е. чтобы культуральная среда составляла менее приблизительно 20%, 10% или 5% от объема белкового препарата. Если антитело получено путем химического синтеза, то в некоторых вариантах осуществления оно практически не содержит химических предшественников или других веществ,т.е. оно отделено от химических предшественников или других веществ, которые вовлечены в синтез белка. Соответственно, такие препараты антитела содержат менее приблизительно 30%, 20%, 10% или 5% (по сухому весу) химических предшественников или соединений, отличных от антитела, представляющего интерес. В некоторых вариантах осуществления антитела к CXCR5 являются выделенными или очищенными.
[0075]
Термины "CXCR5 человека", "hCXCR5" или "полипептид hCXCR5" и подобные термины относятся к полипептидам ("полипептиды", "пептиды" и "белки" используются в данном документе взаимозаменяемо), раскрытым в патенте США №8647622 и синтезированным или выделенным из подходящего клеточного источника, и родственным полипептидам, включая их SNP-варианты. Родственные полипептиды включают аллельные варианты (например,SNP-варианты); сплайс-варианты; фрагменты; производные; варианты с заменой, делецией и вставкой; слитые полипептиды и межвидовые гомологи, которые в некоторых вариантах осуществления сохраняют активность CXCR5 и/или являются достаточными для индуцирования иммунного ответа на CXCR5. Также охватываются растворимые формы CXCR5, которые являются достаточными для индуцирования иммунологической реакции на CXCR5. Как будет понятно специалисту в данной области техники, средство, связывающее CXCR5, такое как антитело, может связываться с полипептидом CXCR5, фрагментом полипептида, антигеном и/или эпитопом, поскольку эпитоп представляет собой часть более крупного антигена, который представляет собой часть более крупного фрагмента полипептида, который, в свою очередь, представляет собой часть более крупного полипептида.
[0076]
See
et al
et al
Термин "нумерация по Kabat" и подобные термины признаны в данной области техники и относятся к системе нумерации аминокислотных остатков, которые являются более вариабельными (т.е.гипервариабельными), чем остальные аминокислотные остатки в вариабельной области тяжелой и легкой цепей антитела или его антигенсвязывающей части. ( Kabat . (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391 and Kabat . (1991)).
[0077]
Термин "легкая цепь", применяемый в отношении антитела, относится к двум различным типам, называемым каппа (κ) или лямбда (λ), выделяемым на основании аминокислотной последовательности константных доменов. Аминокислотные последовательности легкой цепи хорошо известны из уровня техники. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь представляет собой человеческую легкую цепь.
[0078]
Термины "контролировать", "контролирующий" и "контроль" относятся к благоприятным эффектам, которые субъект получает от средства терапии (например,профилактического или терапевтического средства), которые не приводят к излечению от инфекции. В определенных вариантах осуществления субъекту вводят одно или несколько средств терапии (например,профилактических или терапевтических средств, таких как состав по настоящему изобретению) для "контроля" заболевания, опосредованного CXCR5 (например,ревматоидного артрита) или одного или нескольких его симптомов, чтобы предупредить прогрессирование или ухудшение течения заболевания.
[0079]
et al
et al
Термин "моноклональное антитело" относится к антителу, получаемому из популяции однородных или практически однородных антител, и каждое моноклональное антитело, как правило, будет распознавать один эпитоп на поверхности антигена. В некоторых вариантах осуществления "моноклональное антитело" представляет собой антитело, продуцируемое одной гибридомой или другой клеткой. Термин "моноклональный" не ограничен каким-либо конкретным способом получения антитела. Например, моноклональные антитела можно получать с помощью способа с применением гибридом, описываемого в Kohler .; Nature, 256:495 (1975), или их можно выделять из фаговых библиотек. Другие способы получения клональных линий клеток и моноклональных антител, экспрессируемых в них, хорошо известны из уровня техники (см., например, Chapter 11 в Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed.; Ausubel ., eds., John Wiley and Sons, New York).
[0080]
Термин "фармацевтически приемлемый" означает одобренный регуляторным органом федерального правительства или правительства штата или перечисленный в Фармакопее США, Европейской фармакопее или другой общепризнанной фармакопее для применения у животных и, более конкретно, у человека.
[0081]
Под "фармацевтически приемлемым наполнителем" подразумевают любое инертное вещество, которое объединяют с активной молекулой, такой как моноклональное антитело, для получения подходящей или удобной лекарственной формы. "Фармацевтически приемлемый наполнитель" представляет собой наполнитель, который в используемых дозировках и концентрациях не токсичен для получающих его пациентов и совместим с другими ингредиентами состава, содержащего моноклональное антитело.
[0082]
Термины "предупреждать", "предупреждающий" и "предупреждение" относятся к полному или частичному подавлению развития, рецидива, начала проявления или распространения заболевания, опосредуемого CXCR5, и/или связанного с ним симптома, в результате введения средства терапии или комбинации средств терапии, предусмотренных в данном документе (например,комбинации профилактических или терапевтических средств, таких как состав по настоящему изобретению).
[0083]
Термин "профилактическое средство" относится к любому средству, которое может полностью или частично подавлять развитие, рецидив, начало проявления или распространение заболевания, опосредованного CXCR5, и/или симптома, связанного с ним, у субъекта. В определенных вариантах осуществления термин "профилактическое средство" относится к составу по настоящему изобретению. В определенных других вариантах осуществления термин "профилактическое средство" относится к средству, отличному от состава по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления профилактическое средство представляет собой средство, о котором известно, что оно является применимым, либо его применяли, либо применяют в настоящее время для предупреждения заболевания, опосредованного CXCR5, и/или симптома, связанного с ним, или препятствует началу проявления, развитию, прогрессированию и/или увеличению тяжести заболевания, опосредованного CXCR5, и/или симптома, связанного с ним. В конкретных вариантах осуществления профилактическое средство представляет собой полностью человеческое антитело, такое как полностью человеческое моноклональное антитело, или гуманизированное антитело к CXCR5, такое как гуманизированное моноклональное антитело к CXCR5.
[0084]
Термин "антиген CXCR5" относится к такой части полипептида CXCR5, с которой специфически связывается связывающее средство, такое как антитело. "Антиген CXCR5" также относится к аналогу или производному полипептида CXCR5 или его фрагмента, с которыми специфически связывается связывающее средство, такое как антитело. Область полипептида CXCR5, участвующая в образовании эпитопа, может представлять собой смежные аминокислоты полипептида, или эпитоп может быть образован двумя или более несмежными областями полипептида. Эпитоп может представлять собой характерный признак поверхности антигена, имеющий трехмерную структуру, или не быть таковым. Ограниченная область на поверхности антигена CXCR5, которая способна обеспечивать иммунный ответ, представляет собой эпитоп CXCR5. Эпитоп может представлять собой характерный признак поверхности антигена, имеющий трехмерную структуру, или не быть таковым.
[0085]
Термины "заболевание, опосредованное CXCR5" и "нарушение, опосредованное CXCR5" используются взаимозаменяемо и относятся к любому заболеванию, которое полностью или частично обусловлено CXCR5 или представляет собой результат его воздействия. В определенных вариантах осуществления CXCR5 на аномальном уровне (например,высоком) экспрессируется на поверхности клетки. В некоторых вариантах осуществления экспрессия CXCR5 может быть аномально повышена на клетках конкретного типа. В других вариантах осуществления нормальная, аномальная или избыточная передача сигнала в клетке обусловлена связыванием CXCR5 с лигандом CXCR5. В определенных вариантах осуществления лиганд CXCR5 представляет собой CXCL13. В определенных вариантах осуществления заболевание, опосредованное CXCR5, представляет собой ревматоидный артрит (RA).
[0086]
Термин "сахарид" относится к классу молекул, которые представляют собой производные многоатомных спиртов. Сахариды обычно называют углеводами, и они могут содержать различные количества сахарных (сахаридных) звеньев, например, моносахариды, дисахариды и полисахариды.
[0087]
Термины "специфически связывается" или "специфическое связывание" означают специфическое связывание с антигеном или его фрагментом и отсутствие специфического связывания с другими антигенами. Например, антитело, которое специфически связывается с антигеном, может связываться с другими пептидами или полипептидами с более низкой аффинностью, определяемой, например,с помощью радиоиммунологических анализов (RIA), твердофазных иммуноферментных анализов (ELISA), BIACORE или других анализов, известных из уровня техники. Антитела или их варианты, или фрагменты, специфически связывающиеся с антигеном, могут проявлять перекрестную реактивность с родственными антигенами. В некоторых вариантах осуществления антитела или их варианты или фрагменты, которые специфически связываются с антигеном, не реагируют перекрестно с другими антигенами. Антитело или его вариант или фрагмент, которые специфически связываются с антигеном CXCR5, можно идентифицировать, например, с помощью иммунологических анализов, BIACORE или других методик, известных специалисту в данной области техники. Интенсивность специфической или селективной реакции, как правило, будет по меньшей мере в два раза превышать фоновый сигнал или шум и, в более типичном случае, более чем в 10 раз превышать фоновый уровень. См., например,Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology Second Edition, Raven Press, New York на страницах 332-336, в отношении обсуждения, касающегося специфичности антител.
[0088]
"Стабильный" или "стабилизированный" состав представляет собой состав, в котором связывающее средство, такое как антитело, находящееся в нем, по существу сохраняет свою физическую стабильность, идентичность, целостность, и/или химическую стабильность, идентичность, целостность, и/или биологическую активность при хранении. Из уровня техники доступны разные аналитические методики измерения стабильности белков и они рассматриваются, например, в Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) и Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90 (1993). Стабильность можно измерять при выбранной температуре и других условиях хранения в течение определенного периода времени. Стабильность можно определять с помощью по меньшей мере одного из способов, выбранных из группы, состоящей из визуального осмотра, SDS-PAGE, IEF, HPSEC, RFFIT и ELISA каппа/лямбда-цепей. Например, антитело "сохраняет свою физическую стабильность" в фармацевтическом составе, если оно не проявляет признаков агрегации, осаждения и/или денатурации после визуального исследования цвета и/или прозрачности или согласно измерениям с помощью рассеянияУФ-света, SDS-PAGE или с помощью эксклюзионной хроматографии (высокого давления) (HPSEC). В некоторых вариантах осуществления при применении составов по настоящему изобретению, 5% или меньше, типично 4% или меньше, типично 3% или меньше, более типично 2% или меньше и, в частности, 1% или меньше антител образуют агрегаты согласно измерениям с помощью HPSEC или любого другого подходящего способа для измерения образования агрегации. Например, антитело считается стабильным в конкретном составе, если мономерное антитело характеризуется чистотой, составляющей приблизительно 90%, как правило, приблизительно 95%, в частности, приблизительно 98%, после хранения в течение заранее определенного заданного периода времени при определенных условиях хранения в конкретном составе. Химическую стабильность можно оценить путем выявления и количественного определения химически измененных форм белка. Химическое изменение может включать модификацию размера (например,отсечение), которую можно оценить, например, с применением (HP)SEC, SDS-PAGE и/или матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации/времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI/TOF MS). Другие типы химического изменения включают изменение заряда (например,происходящее в результате дезамидирования), которое можно оценить, например, с помощью ионообменной хроматографии. Антитело "сохраняет свою биологическую активность" в фармацевтическом составе в определенный момент времени, если биологическая активность антитела в определенный момент времени составляет по меньшей мере приблизительно 90% (в пределах ошибок анализа) от биологической активности, проявляемой в момент получения фармацевтического состава, что определяется, например, в анализе связывания антигена или анализе нейтрализации вируса.
[0089]
В одном конкретном варианте осуществления состав на основе антитела может являться "устойчивым к образованию частиц Stardust", что относится к составу на основе антитела, в котором не образуются частицы Stardust при хранении в стеклянном контейнере в условиях ускоренной деградации в течение периода времени 6 месяцев.
[0090]
Термины "субъект" и "пациент" могут использоваться взаимозаменяемо. Как используется в данном документе, как правило, субъект представляет собой млекопитающее, такое как млекопитающее, отличное от примата (например,коровы, свиньи, лошади, кошки, собаки, крысы и т.п.), или примата (например,обезьяна и человек), и в некоторых вариантах осуществления человека. В одном варианте осуществления субъект представляет собой млекопитающее, такое как человек, имеющий заболевание, опосредованное CXCR5. В другом варианте осуществления субъект представляет собой млекопитающее, такое как человек, находящееся в группе риска развития заболевания, опосредованного CXCR5.
[0091]
Термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству средства терапии (например,состава по настоящему изобретению), достаточному для снижения и/или уменьшения тяжести и/или продолжительности указанного заболевания и/или симптома, связанного с ним. Данный термин также охватывает количество, необходимое для снижения или уменьшения интенсивности продвижения или прогрессирования указанного заболевания, снижения или уменьшения интенсивности рецидива, развития или проявления указанного заболевания и/или для улучшения или усиления профилактического (профилактических) или терапевтического(терапевтических) эффекта(эффектов) другого средства терапии (например,средства терапии, отличного от состава по настоящему изобретению). В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество антитела по настоящему изобретению составляет от приблизительно 0,1 мг/кг (мг антитела на кг веса субъекта) до приблизительно 100 мг/кг. В определенных вариантах осуществления терапевтически эффективное количество антитела, находящегося в нем, составляет приблизительно 0,1 мг/кг, приблизительно 0,5 мг/кг, приблизительно 1 мг/кг, 3 мг/кг, 5 мг/кг, приблизительно 10 мг/кг, приблизительно 15 мг/кг, приблизительно 20 мг/кг, приблизительно 25 мг/кг, приблизительно 30 мг/кг, приблизительно 35 мг/кг, приблизительно 40 мг/кг, приблизительно 45 мг/кг, приблизительно 50 мг/кг, приблизительно 60 мг/кг, приблизительно 70 мг/кг, приблизительно 80 мг/кг, приблизительно 90 мг/кг или приблизительно 100 мг/кг (или в данном диапазоне). В некоторых вариантах осуществления "терапевтически эффективное количество", как используется в данном документе, также относится к количеству антитела по настоящему изобретению для достижения указанного результата (например,ингибирования биологической активности CXCR5 в клетке, такой как связывание с CXCL13).
[0092]
Термин "терапевтическое средство" относится к любому средству, которое можно применять в лечении, контроле или уменьшении интенсивности заболевания, опосредованного CXCR5, и/или симптома, связанного с ним. В определенных вариантах осуществления термин "терапевтическое средство" относится к составу по настоящему изобретению. В определенных других вариантах осуществления термин "терапевтическое средство" относится к средству, отличному от состава по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой средство, о котором известно, что оно является применимым, либо его применяли, либо применяют в настоящее время для лечения, контроля или уменьшения интенсивности заболевания, опосредованного CXCR5, или одного или нескольких симптомов, связанных с ним.
[0093]
Термин "терапия" относится к любому протоколу, способу и/или средству, которые можно применять в предупреждении, контроле, лечении и/или уменьшении интенсивности заболевания (например,IBD или GVHD) или заболевания, опосредованного CXCR5 (например,ревматоидного артрита). В определенных вариантах осуществления термины "виды терапии" и "терапия" относятся к биологической терапии, поддерживающей терапии и/или другим видам терапии, применимым в предупреждении, контроле, лечении и/или уменьшении интенсивности заболевания, опосредованного CXCR5, известным специалисту в данной области, такому как медицинский персонал.
[0094]
Термины "лечить", "лечение" и "осуществление лечения" относятся к снижению или уменьшению интенсивности прогрессирования, тяжести и/или продолжительности заболевания опосредованного CXCR5 (например,ревматоидного артрита), в результате введения одного или нескольких средств терапии (включая без ограничения введение одного или нескольких профилактических или терапевтических средств, таких как состав по настоящему изобретению). В конкретных вариантах осуществления, касающихся CXCR5, такие термины относятся к снижению или ингибированию связывания CXCR5 с CXCL13, и/или подавлению или снижению одного или нескольких симптомов, ассоциированных с заболеванием, опосредованным CXCR5, таким как ревматоидный артрит.
[0095]
et al.
et al.
th
Термины "вариабельная область" или "вариабельный домен" относятся к частям легкой и тяжелой цепей, как правило, содержащим от приблизительно 120 до 130 аминоконцевых аминокислот в тяжелой цепи и от приблизительно 100 до 110 аминокислот в легкой цепи, которые значительно отличаются своей последовательностью у разных антител и используются при связывании каждого конкретного антитела со своим конкретным антигеном и определении специфичности антитела. В этих областях, называемых областями, определяющими комплементарность (CDR), сосредоточена вариабельность последовательностей, при этом более высококонсервативные области вариабельного домена называют каркасными областями (FR). CDR легкой и тяжелой цепей в первую очередь ответственны за взаимодействие антитела с антигеном. Нумерация положений аминокислот приведена в соответствии с EU-индексом согласно Kabat  (1991) Sequences of proteins of immunological interest. (U.S. Department of Health and Human Services, Washington, D.C.) 5 ed. ("Kabat "). В некоторых вариантах осуществления вариабельная область представляет собой человеческую вариабельную область.
[0096]
Как используется в данном документе, термины "Stardust" и "частицы Stardust" могут использоваться взаимозаменяемо в отношении частиц, появляющихся в стеклянных контейнерах в сочетании с присутствием состава на основе антитела внутри контейнера.
B. Составы
[0097]
Составы по настоящему изобретению могут находиться в форме жидкостей и лиофилизированных порошков, которые содержат средство, связывающее CXCR5. Кроме того, такие составы могут содержать буферные средства, поверхностно-активные вещества, средства, регулирующие тоничность, аминокислоты и другие наполнители.
Связывающие средства
[0098]
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело к CXCR5 представляет собой гуманизированное или полностью человеческое антитело. Примеры изотипов гуманизированных и полностью человеческих антител включают IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. В некоторых вариантах осуществления антитело к CXCR5 представляет собой антитело, представляющее собой IgG. Существуют четыре формы IgG. В некоторых вариантах осуществления антитело к CXCR5 представляет собой антитело, представляющее собой IgG4. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело к CXCR5 представляет собой антитело, представляющее собой гуманизированный IgG4.
[0099]
Определенные варианты осуществления составов по настоящему изобретению также включают варианты средств, связывающих CXCR5, таких как антитела. Варианты антител к CXCR5 могут обладать подобными физико-химическими свойствами вследствие их высокого сходства и, следовательно, также включены в объем настоящего изобретения. Варианты определены как антитела c аминокислотной последовательностью, которая является на по меньшей мере 95%, на по меньшей мере 97%, например, на по меньшей мере 98% или 99% гомологичной таковой у антитела к CXCR5, и способные к конкуренции за связывание с полипептидом CXCR5, фрагментом полипептида CXCR5 или эпитопом CXCR5. В некоторых вариантах осуществления варианты будут уменьшать, нейтрализовать или иным образом ингибировать биологическую активность CXCR5 (например,связывание CXCL13 с CXCR5). Определение конкуренции за связывание с мишенью можно выполнять обычными способами, известными специалисту в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления варианты представляют собой человеческие антитела, и в некоторых вариантах осуществления представляют собой молекулы IgG4. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность варианта является на по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной таковой у предусмотренного антитела, раскрытого в данном документе. Термин "вариант" относится к антителу, содержащему аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько аминокислот изменены по сравнению с аминокислотными последовательностями антитела к CXCR5. Вариант может обладать консервативными модификациями последовательности, включая аминокислотные замены, модификации, добавления и/или делеции.
[00100]
Примеры модификаций включают без ограничения гликозилирование, ацетилирование, пегилирование, фосфорилирование, амидирование, дериватизацию с помощью известных защитных/блокирующих групп, протеолитическое расщепление и образование связи с клеточным лигандом или другим белком. Аминокислотные модификации можно вводить в нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела, с помощью стандартных методик, известных из уровня техники, таких как сайт-направленный мутагенез, молекулярное клонирование, направленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов и случайный опосредованный ПЦР мутагенез. Консервативные аминокислотные замены включают замены, при которых аминокислотный остаток замещается аминокислотным остатком, обладающим подобными структурными или химическими свойствами. Семейства аминокислотных остатков, имеющих подобные боковые цепи, были определены в уровне техники. Данные семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например,лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например,аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например,аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например,глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например,треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например,тирозин, фенилаланин, триптофан). Специалисту в данной области техники будет очевидно, что можно также применять классификации семейств аминокислотных остатков, отличные от применяемой выше. Кроме того, вариант может характеризоваться неконсервативными аминокислотными заменами, например,замещением аминокислоты аминокислотным остатком, обладающим различными структурными или химическими свойствами. Подобные минорные вариации могут также включать аминокислотные делеции или вставки, или и то и другое. Руководство по определению того, какие аминокислотные остатки можно заменить, модифицировать, вставить или удалить без уничтожения иммунологической активности, можно найти с применением компьютерных программ, хорошо известных из уровня техники. Компьютерные алгоритмы, такие как, среди прочего, Gap или Bestfit, известные специалисту в данной области техники, можно применять для оптимального выравнивания аминокислотных последовательностей, подлежащих сравнению и определению подобных или идентичных аминокислотных остатков. Варианты могут характеризоваться такими же или различными, либо более высокими, либо более низкими значениями аффинности связывания по сравнению с антителом к CXCR5, но по-прежнему способны к специфическому связыванию с CXCR5 и могут характеризоваться такой же, более высокой или более низкой биологической активностью по сравнению с антителом к CXCR5.
[00101]
Варианты осуществления настоящего изобретения также включают антигенсвязывающие фрагменты средств, связывающих CXCR5, таких как антитела. Термин "антигенсвязывающий домен", "антигенсвязывающая область", "антигенсвязывающий фрагмент" и подобные термины относятся к той части антитела, которая содержит аминокислотные остатки, взаимодействующие с антигеном и придающие связывающему средству его специфичность и аффинность в отношении антигена (например,области, определяющие комплементарность (CDR)). Антигенсвязывающая область может происходить от любых видов животных, таких как грызуны (например,кролик, крыса или хомяк) и человек. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающая область будет происходить из человеческого антитела. Неограничивающие примеры антигенсвязывающих фрагментов включают: Fab-фрагменты, F(ab′)2-фрагменты, Fd-фрагменты, Fv-фрагменты, одноцепочечные молекулы Fv (scFv), dAb-фрагменты и минимальные распознающие единицы, состоящие из аминокислотных остатков, имитирующих гипервариабельную область антитела.
[00102]
in vivo
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения средства, связывающие CXCR5 (или их вариант, или их антигенсвязывающий фрагмент), будут уменьшать, нейтрализовать или иным образом ингибировать биологическую активность CXCR5  (например,связывание CXCL13 с CXCR5).
[00103]
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения средства, связывающие CXCR5 (или их вариант, или их антигенсвязывающий фрагмент), представляют собой средства, связывающие антагонист, которые уменьшают, нейтрализуют или иным образом ингибируют биологическую активность CXCR5 in vivo (например,связывание CXCL13 с CXCR5).
[00104]
В некоторых вариантах осуществления средство, связывающее CXCR5 (или его вариант, или его антигенсвязывающий фрагмент), присутствует в составах в количестве от приблизительно 50 до приблизительно 500 мг/мл, от приблизительно 25 до приблизительно 400 мг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 250 мг/мл, от приблизительно 5 мг/мл до приблизительно 280 мг/мл, от приблизительно 5 мг/мл до приблизительно 200 мг/мл, от приблизительно 5 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл, от приблизительно 5 мг/мл до приблизительно 75 мг/мл, от приблизительно 5 мг/мл до приблизительно 50 мг/мл и от приблизительно 5 мг/мл до приблизительно 25 мг/мл. Например, средство, связывающее CXCR5, может присутствовать в составе в количестве, составляющем приблизительно 5 мг/мл, приблизительно 10 мг/мл, приблизительно 15 мг/мл, приблизительно 20 мг/мл, приблизительно 25 мг/мл, приблизительно 30 мг/мл, приблизительно 35 мг/мл, приблизительно 40 мг/мл, приблизительно 45 мг/мл, приблизительно 50 мг/мл, приблизительно 55 мг/мл, приблизительно 60 мг/мл, приблизительно 65 мг/мл, приблизительно 70 мг/мл, приблизительно 75 мг/мл, приблизительно 80 мг/мл, приблизительно 85 мг/мл, приблизительно 90 мг/мл, приблизительно 95 мг/мл, приблизительно 100 мг/мл, приблизительно 105 мг/мл, приблизительно 110 мг/мл, приблизительно 115 мг/мл, приблизительно 120 мг/мл, приблизительно 125 мг/мл, приблизительно 130 мг/мл, приблизительно 135 мг/мл, приблизительно 140 мг/мл, приблизительно 145 мг/мл, приблизительно 150 мг/мл, приблизительно 155 мг/мл, приблизительно 160 мг/мл, приблизительно 165 мг/мл, приблизительно 170 мг/мл, приблизительно 175 мг/мл, приблизительно 180 мг/мл, приблизительно 185 мг/мл, приблизительно 190 мг/мл, приблизительно 195 мг/мл, приблизительно 200 мг/мл, приблизительно 205 мг/мл, приблизительно 210 мг/мл, приблизительно 215 мг/мл, приблизительно 220 мг/мл, приблизительно 225 мг/мл, приблизительно 230 мг/мл, приблизительно 235 мг/мл, приблизительно 240 мг/мл, приблизительно 245 мг/мл, приблизительно 250 мг/мл, приблизительно 255 мг/мл, приблизительно 260 мг/мл, приблизительно 265 мг/мл, приблизительно 270 мг/мл, приблизительно 275 мг/мл или приблизительно 280 мг/мл.
[00105]
В альтернативных вариантах осуществления средство, связывающее CXCR5, может присутствовать в составе в количестве от приблизительно 5 до приблизительно 25 мг/мл, от приблизительно 26 до приблизительно 50 мг/мл, от приблизительно 51 до приблизительно 75 мг/мл, от приблизительно 76 до приблизительно 100 мг/мл, от приблизительно 101 до приблизительно 125 мг/мл, от приблизительно 126 до приблизительно 150 мг/мл, от приблизительно 151 до приблизительно 175 мг/мл, от приблизительно 176 до приблизительно 200 мг/мл, от приблизительно 201 мг/мл до приблизительно 225 мг/мл, от приблизительно 226 мг/мл до приблизительно 250 мг/мл, от приблизительно 251 до приблизительно 280 мг/мл, от приблизительно 5 до приблизительно 25 мг/мл, от приблизительно 40 до приблизительно 60 мг/мл, от приблизительно 75 до приблизительно 85 мг/мл или от приблизительно 90 до приблизительно 110 мг/мл.
[00106]
В первом конкретном варианте осуществления предусмотренное антитело представляет собой выделенное антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с внеклеточным доменом CXCR5 человека. Антитело или его фрагмент могут включать: (a) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12; (b) аминокислотные последовательности RSSKSLLHSSGKTYLY (SEQ ID NO: 58), RMSNLAS (SEQ ID NO: 59), MQHLEYPYT (SEQ ID NO: 60), GFSLIDYGVN (SEQ ID NO: 61), VIWGDGTTY (SEQ ID NO: 62) и IVY (SEQ ID NO: 63); (c) вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 15, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16; (d) аминокислотные последовательности RSSKSLLHSSGKTYLY (SEQ ID NO: 58), RLSNLAS (SEQ ID NO: 64), MQHLEYPYT (SEQ ID NO: 60), GFSLIDYGVN (SEQ ID NO: 61), VIWGDGTTY (SEQ ID NO: 62) и IVY (SEQ ID NO: 63); (e) аминокислотные последовательности RSSKSLLHSSGKTYLY (SEQ ID NO: 58), RLSSNLAS (SEQ ID NO: 65), MQHLEYPYT (SEQ ID NO: 60), GFSLIDYGVN (SEQ ID NO: 61), VIWGDGTTY (SEQ ID NO: 62) и IVY (SEQ ID NO: 63); (f) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 21, и вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 23; (g) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 или SEQ ID NO: 32, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 33 или SEQ ID NO: 34; (h) аминокислотные последовательности RSSKSLLHSSGKTYLY (SEQ ID NO: 58), RMSNLA (SEQ ID NO: 66), MQHLEYPYT (SEQ ID NO: 60), GFSLIDYGVN (SEQ ID NO: 61), VIWGDGTTY (SEQ ID N: 62) и IVY (SEQ ID NO: 63); (i) аминокислотные последовательности RSSKSLLHSSGKTYLY (SEQ ID NO: 58), RLSNLA (SEQ ID NO: 67), MQHLEYPYT (SEQ ID NO: 60), GFSLIDYGVN (SEQ ID NO: 61), VIWGDGTTY (SEQ ID NO: 62) и IVY (SEQ ID NO: 63); (j) аминокислотные последовательности RSSKSLLHSSGKTYLY (SEQ ID NO: 58), RLSSLA (SEQ ID NO: 68), MQHLEYPYT (SEQ ID NO: 60), GFSLIDYGVN (SEQ ID NO: 61), VIWGDGTTY (SEQ ID NO: 62) и IVY (SEQ ID NO: 63); (k) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 35, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 37; (l) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 или SEQ ID NO: 43, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 45 или SEQ ID NO: 47; (m) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 55, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 56 или SEQ ID NO: 57; или (n) аминокислотные последовательности RSSKSLLHSSGKTYLYW (SEQ ID NO: 69), RMSNLA (SEQ ID NO: 66), MQHLEYPYT (SEQ ID NO: 60), GFSLIDYGVN (SEQ ID NO: 61), VIWGDGTTY (SEQ ID NO: 62) и IVY (SEQ ID NO: 63).
[00107]
Во втором конкретном варианте осуществления предусмотренное антитело представляет собой выделенное антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с внеклеточным доменом CXCR5 человека. Антитело или его фрагмент содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 32, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 33.
[00108]
В третьем конкретном варианте осуществления предусмотренное антитело представляет собой выделенное антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с внеклеточным доменом CXCR5 человека. Антитело или его фрагмент содержат аминокислотные последовательности RSSKSLLHSSGKTYLY (SEQ ID NO: 58), RLSSLA (SEQ ID NO: 68), MQHLEYPYT (SEQ ID NO: 60), GFSLIDYGVN (SEQ ID NO: 61), VIWGDGTTY (SEQ ID NO: 62) и IVY (SEQ ID NO: 63).
[00109]
H1
H2
H3
L
В любом из первого, второго или третьего конкретных вариантов осуществления, приведенных выше, антитело или его фрагмент могут дополнительно включать одну или несколько константных областей. Один или несколько доменов константной области могут состоять из C, C, C и/или C. Одна или несколько константных областей может быть получена из антитела, представляющего собой IgG, которое может представлять собой, например, антитело, представляющее собой IgG4.
[00110]
В любом из первого, второго или третьего конкретных вариантов осуществления, приведенных выше, антитело или его фрагмент могут представлять собой одноцепочечный Fv.
[00111]
В одном варианте осуществления предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество антитела или его фрагмента из любого из первого, второго или третьего конкретных вариантов осуществления, приведенных выше, и фармацевтически приемлемый носитель.
Буферные средства
[00112]
Составы по настоящему изобретению могут содержать цитратный буфер в качестве буферного средства. Также можно применять другие буферы. Буферное средство поддерживает уровень pH, подходящий с физиологической точки зрения. Кроме того, буферное средство улучшает изотоничность и химическую стабильность состава. В некоторых вариантах осуществления цитратный буфер присутствует в составах в концентрации, составляющей от приблизительно 0,5 мМ до приблизительно 50 мМ, например,от приблизительно 5 мМ до приблизительно 15 мМ. Например, цитратный буфер может присутствовать в составе в концентрации, составляющей приблизительно 5 мМ, приблизительно 6 мМ, приблизительно 7 мМ, приблизительно 8 мМ, приблизительно 9 мМ, приблизительно 10 мМ, приблизительно 11 мМ, приблизительно 12 мМ, приблизительно 13 мМ, приблизительно 14 мМ, приблизительно 15 мМ, приблизительно 16 мМ, приблизительно 17 мМ, приблизительно 18 мМ, приблизительно 19 мМ, приблизительно 20 мМ, приблизительно 21 мМ, приблизительно 22 мМ, приблизительно 23 мМ, приблизительно 24 мМ, приблизительно 25 мМ, приблизительно 26 мМ, приблизительно 27 мМ, приблизительно 28 мМ, приблизительно 29 мМ, приблизительно 30 мМ, приблизительно 31 мМ, приблизительно 32 мМ, приблизительно 33 мМ, приблизительно 34 мМ, приблизительно 35 мМ, приблизительно 36 мМ, приблизительно 37 мМ, приблизительно 38 мМ, приблизительно 39 мМ, приблизительно 40 мМ, приблизительно 41 мМ, приблизительно 42 мМ, приблизительно 43 мМ, приблизительно 44 мМ, приблизительно 45 мМ, приблизительно 46 мМ, приблизительно 47 мМ, приблизительно 48 мМ, приблизительно 49 мМ или приблизительно 50 мМ. В некоторых вариантах осуществления цитратный буфер присутствует в составе в концентрации, составляющей от приблизительно 7 мМ до приблизительно 13 мМ, такой как от приблизительно 9 мМ до приблизительно 11 мМ. В некоторых вариантах осуществления цитратный буфер присутствует в концентрации, составляющей приблизительно 10 мМ.
[00113]
В определенных вариантах осуществления составы по настоящему изобретению характеризуются значением pH на уровне pH 6 или ниже. В некоторых вариантах осуществления значение pH составов находится в диапазоне от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,0. Например, значение pH составов может составлять приблизительно 5,0, приблизительно 5,1, приблизительно 5,2, приблизительно 5,3, приблизительно 5,4, приблизительно 5,5, приблизительно 5,6, приблизительно 5,7, приблизительно 5,8, приблизительно 5,9 и приблизительно 6,0. В некоторых вариантах осуществления значение pH составов может находиться в диапазоне от приблизительно 5,5 до приблизительно 6,0. В некоторых вариантах осуществления значение pH составляет или приблизительно 5,5, или приблизительно 6,0. Значение pH состава можно измерять любыми способами, известными специалисту в данной области техники. Способ измерения значения pH представляет собой применение pH-метра с микроэлектродом. Значение pH состава можно регулировать с применением любых способов, известных из уровня техники. Иллюстративные вещества для изменения значений pH составов представляют собой хлористоводородную кислоту (HCl) и гидроксид натрия (NaOH).
[00114]
В определенных вариантах осуществления составы по настоящему изобретению характеризуются значением pH на уровне изоэлектрической точки (pI) связывающего средства, такого как антитело, или ниже. Изоэлектрическая точка представляет собой значение pH, при котором конкретная молекула или поверхность не несет суммарного электрического заряда. pI средства, связывающего CXCR5, можно определять любыми способами, известными специалисту в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления pI антитела к CXCR5 определяют с помощью изоэлектрического фокусирования в денатурирующих условиях. pI полностью человеческого антитела, представляющего собой IgG4, предусмотренного в данном документе, может находиться в диапазоне от приблизительно 6,9 до приблизительно 9,1.
[00115]
Например, предусмотренный состав содержит средство, связывающее CXCR5, и цитратный буфер, где значение pH состава находится на уровне приблизительно pH 6 и изоэлектрической точки (pI) связывающего средства или ниже их. Составы по настоящему изобретению обеспечивают значительные улучшения по сравнению с традиционными составами со связывающим средством на основе IgG4 (например,составами с забуференным фосфатно-солевым раствором (PBS)), в которых образуются нежелательные побочные продукты при повышении концентрации связывающего средства в составе. В частности, составы по настоящему изобретению характеризуются сниженным количеством агрегатов, полумолекул, продуктов распада, низкомолекулярных белков (LMWP), высокомолекулярных белков (HMWP) и перегруппировок кислотных, основных и нейтральных изоформ связывающего средства в составах.
Поверхностно-активные вещества
[00116]
Составы по настоящему изобретению необязательно могут дополнительно содержать поверхностно-активное вещество, также известное в качестве стабилизатора. Поверхностно-активные вещества/стабилизаторы представляют собой химические соединения, которые взаимодействуют и стабилизируют биологические молекулы и/или обычные фармацевтические наполнители в составе. В определенных вариантах осуществления поверхностно-активные вещества можно применять в сочетании с хранением при низких температурах. Обычно поверхностно-активные вещества защищают связывающее средство от воздействий, индуцируемых на границе раздела воздух/раствор, и воздействий, индуцируемых на границе раздела раствор/поверхность, которые в ином случае могут приводить к агрегации белка. Поверхностно-активные вещества могут включать без ограничения полисорбаты, глицерин, дикарбоновые кислоты, щавелевую кислоту, янтарную кислоту, фумаровые кислоты, фталевые кислоты и их комбинации. Специалисту в данной области техники известно, что можно применять другие поверхностно-активные вещества, например, неионогенные или ионогенные детергенты, при условии, что они являются фармацевтически приемлемыми, т.е.подходят для введения субъектам. В некоторых вариантах осуществления поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат. Примеры полисорбатов включают полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 60, полисорбат 65 и полисорбат 80.
[00117]
В иллюстративных вариантах осуществления поверхностно-активное вещество присутствует в составах в количестве, составляющем от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,1% (вес/объем). Например, поверхностно-активное вещество может присутствовать в составах в количестве, составляющем приблизительно 0,001% (вес/объем), приблизительно 0,002% (вес/объем), приблизительно 0,003% (вес/объем), приблизительно 0,004% (вес/объем), приблизительно 0,005% (вес/объем), приблизительно 0,006% (вес/объем), приблизительно 0,007% (вес/объем), приблизительно 0,008% (вес/объем), приблизительно 0,009% (вес/объем), приблизительно 0,01% (вес/объем), приблизительно 0,02% (вес/объем), приблизительно 0,03% (вес/объем), приблизительно 0,04% (вес/объем), приблизительно 0,05% (вес/объем), приблизительно 0,06% (вес/объем), приблизительно 0,07% (вес/объем), приблизительно 0,08% (вес/объем), приблизительно 0,09% (вес/объем) и приблизительно 0,1% (вес/объем). В конкретных вариантах осуществления поверхностно-активное вещество присутствует в составах в количестве, составляющем от приблизительно 0,003% до приблизительно 0,05% (вес/объем), от приблизительно 0,004% до приблизительно 0,025% (вес/объем) или от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,02% (вес/объем), например,приблизительно 0,005% (вес/объем). Например, полисорбат 20 может присутствовать в количестве, составляющем от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,1% (вес/объем), от приблизительно 0,002% до приблизительно 0,01% (вес/объем), от приблизительно 0,003% до приблизительно 0,008% (вес/объем) и от приблизительно 0,004% до приблизительно 0,006% (вес/объем), например,приблизительно 0,005% (вес/объем). В альтернативных вариантах осуществления полисорбат 20 присутствует в количестве, составляющем от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,1% (вес/объем), от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,05% (вес/объем) и от приблизительно 0,0075% до приблизительно 0,025% (вес/объем), например,приблизительно 0,01% (вес/объем). В дополнительных альтернативных вариантах осуществления полисорбат 20 присутствует в количестве, составляющем от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,1% (вес/объем), от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,05% (вес/объем) и от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,03% (вес/объем), например,приблизительно 0,02% (вес/объем).
Средства, регулирующие тоничность
[00118]
Составы по настоящему изобретению необязательно могут дополнительно содержать средство, регулирующее тоничность. Как правило, средства, регулирующие тоничность, применяют для регулирования или поддержания осмоляльности составов, чтобы приблизить ее к осмотическому давлению жидкостей организма, таких как кровь или плазма. Средства, регулирующие тоничность, также могут поддерживать уровни связывающего средства в составе. Отчасти средство, регулирующее тоничность, вносит вклад в сохранение уровня, соотношения или доли терапевтически активного связывающего средства, присутствующего в составе. Как используется в данном документе, термин "тоничность" относится к свойствам биологических компонентов в жидкой окружающей среде или растворе. Изотонические растворы обладают таким же осмотическим давлением, как плазма крови, и их можно вливать субъекту внутривенно, не изменяя осмотическое давление в плазме крови субъекта. В самом деле, в определенных вариантах осуществления настоящего изобретения, средство, регулирующее тоничность, присутствует в количестве, достаточном для того, чтобы сделать состав пригодным для внутривенного вливания. Зачастую средство, регулирующее тоничность, также выступает в качестве объемообразующего средства или стабилизатора. В связи с этим, средство, регулирующее тоничность, может обеспечивать преодоление связывающим средством различных воздействий, таких как замораживание и сдвиг. Средства, регулирующие тоничность, могут включать без ограничения сахариды, сахара, глицерин, сорбит, маннит, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид магния и другие неорганические соли. Специалисту в данной области техники известно, что можно применять другие средства, регулирующие тоничность, при условии, что они являются фармацевтически приемлемыми, т.е.подходят для введения субъектам.
[00119]
В определенных варианта осуществления средство, регулирующее тоничность, присутствует в составах в количестве, составляющем от приблизительно 0,1% до 10% (вес/объем). Например, средство, регулирующее тоничность, может присутствовать в составе в количестве, составляющем приблизительно 0,1% (вес/объем), приблизительно 0,2% (вес/объем), приблизительно 0,3% (вес/объем), приблизительно 0,4% (вес/объем), приблизительно 0,5% (вес/объем), приблизительно 0,6% (вес/объем), приблизительно 0,7% (вес/объем), приблизительно 0,8% (вес/объем), приблизительно 0,9% (вес/объем), приблизительно 1% (вес/объем), приблизительно 2% (вес/объем), приблизительно 3% (вес/объем), приблизительно 4% (вес/объем), приблизительно 4,5% (вес/объем), приблизительно 5% (вес/объем), приблизительно 5,5% (вес/объем), приблизительно 6% (вес/объем), приблизительно 7% (вес/объем), приблизительно 8% (вес/объем), приблизительно 9% (вес/объем) и приблизительно 10% (вес/объем). В качестве альтернативы средство, регулирующее тоничность, может присутствовать в составе в количестве, составляющем от приблизительно 2% до приблизительно 8% (вес/объем), от приблизительно 3% до приблизительно 7% (вес/объем) и от приблизительно 4% до приблизительно 6% (вес/объем). В дополнительных альтернативных вариантах осуществления средство, регулирующее тоничность, может присутствовать в составе в количестве, составляющем от приблизительно 0,1% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,5%, от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,3% и приблизительно 0,2%.
[00120]
В определенных иллюстративных вариантах осуществления средство, регулирующее тоничность, представляет собой сахарид. Примеры сахаридов включают глюкозу, сахарозу (которая также известна как тростниковый сахар), мальтозу, трегалозу, декстрозу, ксилит, фруктозу и маннит. Например, маннит может присутствовать в количестве, составляющем от приблизительно 1% до приблизительно 10% (вес/объем), от приблизительно 2% до приблизительно 8% (вес/объем) или от приблизительно 3% до приблизительно 5% (вес/объем), например,приблизительно 4% (вес/объем). В качестве альтернативы сахароза (которая также известна как тростниковый сахар) может присутствовать в количестве, составляющем от приблизительно 1% до приблизительно 10% (вес/объем), от приблизительно 3% до приблизительно 8% (вес/объем) или от приблизительно 4% до приблизительно 6% (вес/объем), например,приблизительно 4,5, 5, 5,5 или 6% (вес/объем).
[00121]
В других определенных иллюстративных вариантах осуществления средство, регулирующее тоничность, представляет собой хлорид натрия. Например, хлорид натрия может присутствовать в количестве, составляющем приблизительно 0,1% (вес/объем), приблизительно 0,2% (вес/объем), приблизительно 0,3% (вес/объем), приблизительно 0,4% (вес/объем), приблизительно 0,5% (вес/объем), приблизительно 0,6% (вес/объем), приблизительно 0,7% (вес/объем), приблизительно 0,8% (вес/объем), приблизительно 0,9% (вес/объем) и приблизительно 1% (вес/объем). В качестве альтернативы, хлорид натрия может присутствовать в составе в количестве, составляющем от приблизительно 0,1% до приблизительно 1%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,5%, от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,3% и приблизительно 0,2%.
[00122]
В дополнительных иллюстративных вариантах осуществления составы могут содержать одно или несколько средств, регулирующих тоничность. Например, составы могут содержать одно или несколько из приведенных выше средств, регулирующих тоничность, в приведенных выше концентрациях. В определенных конкретных вариантах осуществления составы могут содержать сахарозу и хлорид натрия, где концентрация каждого из сахарозы и хлорида натрия составляет от приблизительно 0,1% до приблизительно 10% (вес/объем). В некоторых вариантах осуществления концентрация сахарозы составляет приблизительно 6%, и при этом концентрация хлорида натрия составляет приблизительно 0,2%. В качестве альтернативы концентрация сахарозы составляет приблизительно 4,5%, и при этом концентрация хлорида натрия составляет приблизительно 0,2%.
[00123]
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения осмоляльность составов находится в диапазоне от приблизительно 200 мосмоль/кг до приблизительно 350 мосмоль/кг, от приблизительно 270 мосмоль/кг до приблизительно 330 мосмоль/кг, от приблизительно 280 мосмоль/кг до приблизительно 320 мосмоль/кг или от приблизительно 290 мосмоль/кг до приблизительно 310 мосмоль/кг, например,приблизительно 300 мосмоль/кг. Другими словами, в некоторых вариантах осуществления составы по настоящему изобретению являются практически изотоническими, т.е. характеризуются практически таким же осмотическим давлением, как кровь человека. Осмоляльность можно измерять с помощью любого способа, известного специалисту в данной области техники, такого как с применением осмометров парофазного типа или по точке замерзания. Осмоляльность составов по настоящему изобретению можно регулировать, например, с помощью одного или нескольких описанных в данном документе средств, регулирующих тоничность.
Аминокислоты
[00124]
Составы по настоящему изобретению необязательно могут дополнительно содержать аминокислоту. Примеры аминокислот включают без ограничения глицин, аланин, аспарагиновую кислоту, лизин, серин, тирозин, цистеин, глутамин, метионин, аргинин и пролин. В иллюстративных вариантах осуществления аминокислота присутствует в составах в количестве, составляющем от приблизительно 0,1% до 5% (вес/объем). Например, аминокислота может присутствовать в составе в количестве, составляющем приблизительно 0,1% (вес/объем), приблизительно 0,2% (вес/объем), приблизительно 0,3% (вес/объем), приблизительно 0,4% (вес/объем), приблизительно 0,5% (вес/объем), приблизительно 0,6% (вес/объем), приблизительно 0,7% (вес/объем), приблизительно 0,8% (вес/объем), приблизительно 0,9% (вес/объем), приблизительно 1,0% (вес/объем), приблизительно 1,1% (вес/объем), приблизительно 1,2% (вес/объем), приблизительно 1,3% (вес/объем), приблизительно 1,4% (вес/объем), приблизительно 1,5% (вес/объем), приблизительно 1,6% (вес/объем), приблизительно 1,7% (вес/объем), приблизительно 1,8% (вес/объем), приблизительно 1,9% (вес/объем), приблизительно 2,0% (вес/объем), приблизительно 3% (вес/объем), приблизительно 4% (вес/объем) и приблизительно 5% (вес/объем). В качестве альтернативы аминокислота присутствует в составе в количестве, составляющем от приблизительно 1,3% до приблизительно 1,8% (вес/объем) или от приблизительно 1,4% до приблизительно 1,6% (вес/объем), например,приблизительно 1,5% (вес/объем). В дополнительных альтернативных вариантах осуществления аминокислота присутствует в составе в количестве, составляющем от приблизительно 0,5% до приблизительно 1,5% (вес/объем) или от приблизительно 0,8% до приблизительно 1,2% (вес/объем), например,приблизительно 1,0% (вес/объем). Иллюстративная аминокислота представляет собой пролин или аргинин. Например, пролин может присутствовать в составе в количестве, составляющем от приблизительно 1% до приблизительно 2% (вес/объем), от приблизительно 1,3% до приблизительно 1,8% (вес/объем), от приблизительно 1,4% до приблизительно 1,6% (вес/объем), например,приблизительно 1,5% (вес/объем). В качестве альтернативы аргинин может присутствовать в составе в количестве, составляющем от приблизительно 0,5% до приблизительно 1,5% (вес/объем) или от приблизительно 0,8% до приблизительно 1,2% (вес/объем), например,приблизительно 1,0% (вес/объем).
Другие наполнители
[00125]
th
Кроме того, составы по настоящему изобретению могут содержать другие наполнители, включая без ограничения воду для инъекций, разбавители, солюбилизирующие средства, смягчающие средства, дополнительные буферы, неорганические или органические соли, антиоксиданты и т.п. Однако в некоторых вариантах осуществления составы по настоящему изобретению не содержат других наполнителей, за исключением описанных выше. Другие фармацевтически приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы, такие как описываемые в Remington's Pharmaceutical Sciences 16 edition, Osol, A. Ed. (1980), можно включить в состав, при условии, что они не оказывают негативного воздействия на требуемые характеристики состава. В конкретном варианте осуществления состав практически не содержит консервантов, хотя в альтернативных вариантах осуществления при необходимости можно добавлять консерванты. Например, в лиофилизированные составы можно включить криопротекторы или лиопротекторы.
Жидкие или лиофилизированные составы
[00126]
Составы по настоящему изобретению могут представлять собой жидкие составы или лиофилизированные составы. В некоторых вариантах осуществления жидкие составы готовы для введения путем инъекции, или их можно разбавлять перед введением путем инъекции. В качестве альтернативы, составы могут представлять собой лиофилизированные порошки. В некоторых вариантах осуществления лиофилизированные порошки готовы для объединения с одним из целого ряда объемов растворителя с достижением требуемой концентрации непосредственно перед введением.
Иллюстративные составы
[00127]
В одном варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение предусматривает стабильный жидкий состав на основе антитела, подходящий для подкожного введения, при этом состав содержит:
a) более приблизительно 100 мг/мл, например,от приблизительно 100 до приблизительно 175 мг/мл полностью человеческого антитела к CXCR5, содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 33, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 32;
b) приблизительно 10 мМ цитратного буфера;
c) приблизительно 0,1% (вес/объем) полисорбата 20 или полисорбата 80 и
d) приблизительно 200 мМ аргинина;
e) приблизительно 4,5-9% сахарозы,
где значение pH состава составляет приблизительно pH 6.
[00128]
В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение предусматривает стабильный состав на основе антитела, содержащий:
a) от приблизительно 150 до приблизительно 175 мг/мл гуманизированного антитела к CXCR5, представляющего собой IgG4, содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 33, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 32;
b) приблизительно 10 мМ цитратного буфера;
c) приблизительно 0,1% (вес/объем) полисорбата 80 и
d) приблизительно 200 мМ аргинина;
e) приблизительно 4,5% сахарозы,
где значение pH состава составляет приблизительно pH 6,0.
[00129]
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение предусматривает стабильный состав на основе антитела, содержащий:
a) приблизительно 175 мг/мл гуманизированного антитела к CXCR5, представляющего собой IgG4, содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 33, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 32;
b) приблизительно 10 мМ цитратного буфера;
c) приблизительно 0,1% полисорбата 80 и
d) приблизительно 200 мМ аргинина;
e) приблизительно 4,5% сахарозы,
где значение pH состава составляет приблизительно pH 6,0.
Стабильность
[00130]
Предусмотренные составы являются стабильными при 5°C в течение по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев или более и, как правило, по меньшей мере приблизительно 12, 18 или 24 месяца или больше. В иллюстративных вариантах осуществления они являются стабильными при 5°C в течение по меньшей мере приблизительно 6 месяцев или больше. В других иллюстративных вариантах осуществления они являются стабильными при 5°C в течение по меньшей мере приблизительно 9 месяцев. В дополнительных иллюстративных вариантах осуществления они являются стабильными при 5°C в течение по меньшей мере приблизительно 1 года или больше и, как правило, более приблизительно 2 лет или более приблизительно 4 лет.
Способы введения
[00131]
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения составы подходят для парентерального, внутривенного, внутримышечного, внутрикожного, подкожного введения или их комбинации. Составы по настоящему изобретению подходят для доставки с помощью ряда методик.
Дозировки и лекарственные формы
[00132]
Эффективные дозы составов по настоящему изобретению варьируют в зависимости от многих различных факторов, включая способ введения, участок-мишень, физиологическое состояние субъекта, вне зависимости от того, представляет ли собой субъект человека или животное, другие вводимые лекарства и то, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Обычно субъект представляет собой человека, но также можно подвергать обработке отличных от человека млекопитающих, включая трансгенных млекопитающих. Может существовать необходимость в подборе лечебных дозировок для оптимизации безопасности и эффективности.
[00133]
Составы по настоящему изобретению можно вводить несколько раз. Интервалы между отдельными введениями доз могут составлять сутки, неделю, две недели, месяц или год. Интервалы также могут являться нерегулярными. В некоторых способах дозировку регулируют для достижения определенной концентрации связывающего средства, такого как антитело, в плазме крови. Дозировку и частоту будут варьировать в зависимости от периода полувыведения средства, связывающего CXCR5, такого как антитело, у субъекта. В большинстве случаев человеческие антитела демонстрируют наибольший период полувыведения, при этом после них располагаются гуманизированные антитела, химерные антитела и антитела, отличные от человеческих.
[00134]
В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую единичную лекарственную форму, содержащую терапевтически эффективное количество состава по настоящему изобретению для лечения одного или нескольких заболеваний у субъекта посредством введения лекарственной формы субъекту. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой человека. Человек может являться взрослым или может представлять собой ребенка. Термин "фармацевтическая единичная лекарственная форма" относится к физически дискретной единице, подходящей в качестве стандартной дозировки для субъектов, подлежащих лечению, при этом каждая единица содержит заранее определенное количество активного соединения, рассчитанное для получения требуемого терапевтического/профилактического эффекта, в сочетании с необходимым цитратным буфером и значением pH.
[00135]
Единичная лекарственная форма может представлять собой контейнер, содержащий состав. Подходящие контейнеры включают без ограничения запаянные ампулы, флаконы, бутыли, шприцы и пробирки. Контейнеры можно производить из целого ряда материалов, таких как стекло или пластик, и при этом они могут иметь стерильную входную зону (например, контейнер может представлять собой флакон, имеющий пробку, которую можно проколоть иглой для подкожных инъекций). В некоторых вариантах осуществления контейнер представляет собой флакон. В целом, контейнер должен поддерживать стерильность и стабильность состава.
[00136]
В конкретных вариантах осуществления составы упакованы во флаконы объемом 4 мл (флаконы 2R согласно ISO), изготовленные из прозрачного бесцветного стекла типа I, закрытые пробкой (бромбутил, покрытый фторполимером), запечатанной с помощью обжимных колпачков с фланцем (полипропилен). В некоторых вариантах осуществления флаконы заполнены 1,7 мл составов, так что флакон имеет избыточный объем, составляющий приблизительно 0,2 мл на флакон, и извлекаемый объем, составляющий 1,5 мл. Например, это означает, что данная доза антитела (например,175 мг/мл) будет содержаться в 1,5 мл раствора.
[00137]
В одном конкретном варианте осуществления составы вторично упакованы в контейнер, такой как картонная коробка, которая защищает флаконы от света.
Наборы
[00138]
Определенные варианты осуществления настоящего изобретения включают набор, содержащий состав по настоящему изобретению. Набор может дополнительно содержать один или несколько контейнеров, содержащих фармацевтически приемлемые наполнители, и включать другие материалы, требуемые с коммерческой и пользовательской точки зрения, включая фильтры, иглы и шприцы. Вместе с наборами можно предоставлять инструкции, обычно включаемые в коммерческие упаковки терапевтических, профилактических или диагностических продуктов, в которых содержится информация, например, о показаниях, применении, дозировке, изготовлении, введении, противопоказаниях и/или мерах предосторожности, касающихся применения таких терапевтических, профилактических или диагностических продуктов. С набором также можно предоставлять этикетку, которая может представлять собой любой вид носителя данных (например,вкладыш, бирку, чип, оттиск или штрих-код), содержащий информацию. В определенных вариантах осуществления инструкции и т.д., перечисляемые выше, могут содержаться в этикетке или на ней. Набор может дополнительно содержать устройство для введения состава и, в частности, устройство, которое содержит состав, т.е.предварительно заполненное устройство, такое как без ограничения предварительно заполненный шприц или предварительно заполненный автоинжектор. Набор также может содержать контейнер, содержащий состав, т.е.предварительно заполненный контейнер, такой как предварительно заполненный флакон, картридж, саше или ампула.
Комбинация различных вариантов осуществления
[00139]
В контексте настоящего изобретения любой из описанных в данном документе вариантов осуществления можно объединять с одним или несколькими другими описанными в данном документе вариантами осуществления, если явно не указано противоположное. В частности, любые из описанных в данном документе связывающих средств и антител и описанных в данном документе их составов можно применять в комбинации с любым из наборов, предварительно заполненных устройств или предварительно заполненных контейнеров, или можно применять в способах лечения или видах медицинского применения, описываемых в данном документе в связи с соответствующим антителом (например,стабильные составы, содержащие антитела к CXCR5, можно объединять с любым из описанных в данном документе наборов, контейнеров или устройств). Любое из описанных в данном документе связывающих средств, специфически связывающих антиген (например,связывающее средство, специфически связывающее CXCR5), также можно применять в любом из способов лечения, которые описаны в данном документе в связи с соответствующими антителами (т.е.антителом к CXCR5) инаоборот.
ПРИМЕРЫ
[00140]
Следующие примеры иллюстрируют конкретные варианты осуществления настоящего изобретения. Они изложены лишь с целью пояснения, и их не следует рассматривать в качестве ограничения настоящего изобретения.
Пример № 1 Анализ образования частиц Stardust
A)
Введение
[00141]
Готовая лекарственная форма (DP), обозначенная Sanofi как SAR113244, представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, представляющее собой IgG (mAb), которое селективно связывается с CXCR5 человека и раскрыто в патенте США №8647622. Ее разрабатывали для парентерального подкожного введения в виде раствора для инъекций с концентрацией, составляющей 100 мг/мл. Раствор DP для инъекций упаковывали в прозрачные и бесцветные флаконы (стекло I типа) объемом 2 мл, закрытые пробками (бромбутиловый каучук, покрытый фторполимером) и обжимными колпачками (полипропилен) с фланцем (алюминий).
[00142]
Разработка состава с mAb SAR113244 завершилась получением состава для клинического исследования фазы I, который содержал аргинин в концентрации, составляющей 10 мг/мл, NaCl в концентрации, составляющей 2 мг/мл, полисорбат 20 в концентрации, составляющей 0,01% и цитратный буфер в концентрации, составляющей 10 мМ и характеризовался значением pH 6 (далее в данном документе он обозначен как "раствор DP"). Данный состав являлся стабильным касательно химической стабильности и касательно возникновения невидимых невооруженным глазом частиц. Однако, если состав хранили в стеклянном первичном упаковочном материале, например, флаконах или предварительно заполненных шприцах, то спустя примерно один год происходило образование видимых частиц. Образование видимых частиц не происходило, если первичный упаковочный материал являлся пластиковым (пакет или флакон).
[00143]
В ходе проведения исследования на совместимость, запланированного для клинического исследования фазы 1, видимые частицы обнаруживали в растворе DP, хранимом в стеклянных флаконах 2R согласно ISO (Schott, Элмсфорд, Нью-Йорк). Частицы являются очень мелкими, блестящими и суспендированными и, вследствие этого, получили название "частицы Stardust". Обнаружение частиц Stardust обусловило прекращение исследования, и при этом партии раствора DP помещали на карантинное хранение. Задействовали план немедленных действий, и поточное фильтрационное оборудование исследовали и применяли в клиническом исследовании. Это кратко изложили в дополнении, которое получило одобрение регулирующих органов здравоохранения без комментариев, и исследование можно было возобновить. Однако для дополнительных клинических исследований требовалось разработать состав без частиц Stardust. В данном документе описан способ получения высококонцентрированного состава, содержащего SAR113244, который не содержит частицы Stardust.
[00144]
Частицы Stardust не присутствовали в растворах DP, хранящихся в пакетах или хранящихся в бутылях Nalgene. Частицы Stardust также не присутствовали в растворах DP, хранящихся в стеклянных флаконах, непосредственно после процесса производства. Полагают, что частицы Stardust появлялись в стеклянных флаконах примерно спустя один год хранения. Другие продукты (например, белковые терапевтические средства), которыми заполняли флаконы такого же типа, с применением тех же пробок, с применением той же линии розлива, с применением того же оборудования проверяли на наличие частиц, и в них никогда не образовывались частицы Stardust.
[00145]
При применении в отношении раствора DP визуализации Microflow или исследования частиц методом затенения результаты измерений невидимых невооруженным глазом частиц всегда находились в диапазоне приемлемых значений, независимо от присутствия частиц Stardust. В ходе исследований стабильности у образцов непосредственно после производства и образцов с длительным сроком хранения, составлявшим ≥1 года, не было выявлено никаких отличий, касающихся невидимых невооруженным глазом частиц. Чтобы избавиться от частиц Stardust, впоследствии для клинических исследований фазы II разрабатывали новый состав, не содержащий Stardust. В конечном счете данный состав демонстрирует стабильность в стеклянных контейнерах в течение 6 месяцев в условиях ускоренной деградации (40°C) и в течение 12 месяцев при 2-8°C.
B)
Способы
[00146]
Визуальный осмотр раствора DP
. Визуальный осмотр раствора DP проводил обученный персонал непосредственно после завершения изготовления партии DP. Флаконы тестировали путем однократного или двукратного переворачивания флаконов и последующего наблюдения за флаконами в течение от 5 до 15 секунд (лаборатория 1: Liquid Inspection Viewer Apollo II; лаборатория 2: Black Box) или наблюдения за вращающимися флаконами без переворачивания (лаборатория 3: устройство для осмотра флаконов с увеличителем от Seidenader). Освещенность, создаваемая источником света, составляла 2000-3750 лк.
[00147]
Расслоение стекла у контейнеров с раствором DP.
2
Расслоение стекла анализировали в четырех различных партиях (3 клинические партии, одна техническая партия). С этой целью тестировали по 10 мл раствора DP на партию, чтобы определить количество элементов стекла, а именно Si, B, Ca и Al, выщелоченных в раствор. Для данного исследования применяли четыре набора контейнеров: SCHOTT плюс I типа (флаконы, покрытые SiO), SCHOTT из стандартного Fiolax, SCHOTT DC (с контролем расслоения) и предварительно заполняемые шприцы BD. Различные растворы хранили при 60°C и анализировали в три различные моменты времени (спустя 1, 4 и 12 недель). Визуальный осмотр на предмет присутствия "хлопьевидных" и/или "нехлопьевидных" частиц проводили невооруженным глазом и с применением увеличивающей видеокамеры. В каждый момент времени тестировали по десять контейнеров. Кроме того, проводили оптический контроль 5 пустых контейнеров на контрольный набор образцов с применением стереомикроскопии с увеличенной глубиной фокуса, чтобы количественно определять присутствие любых признаков коррозии стекла или реакционных зон на внутренних поверхностях контейнеров. Дополнительно анализировали по 10 опустошенных контейнеров на набор образцов и контрольную точку внутри периода тестирования с помощью стереомикроскопии с увеличенной глубиной фокуса, чтобы определять присутствие любых признаков коррозии стекла или реакционных зон на внутренней поверхности. На внутренней поверхности двух "худших" контейнеров на набор для каждой контрольной точки внутри периода тестирования проводили поперечный SEM-анализ. В целом, анализировали 10 мл раствора плацебо (содержащего 10 мМ цитратного буфера, 2 г/л NaCl, 10 г/л HCl-аргинина, 45 г/л сахарозы (4,5%) и 0,01% полисорбата 20), объединенного из контейнеров для каждого набора образцов для каждой контрольной точки внутри периода тестирования, чтобы количественно определить количество элементов стекла, выщелоченных в раствор.
[00148]
Исследования механической стабильности.
Чтобы определить, вносит ли механическое воздействие вклад в образование частиц Stardust в растворе DP, проводили исследования механического воздействия. В ходе производства раствор DP добавляли в смесительный сосуд и добавляли наполнители. 8 различных составов объемом 10 мл (см. таблицу № 1 ниже - каждую композицию составляли на основе цитратного буфера) перемешивали при 200 об/мин в течение или 30 мин, или 2 ч. После смешивания наполнителей раствор проверяли на возникновение видимых частиц. Затем раствор фильтровали и заполняли им стеклянные флаконы 2R. После этого проводили визуальный осмотр, и растворы хранили при 40°C в течение 4 недель и осматривали каждую неделю.
[00149] Таблица № 1. Обзор тестируемых составов
<b>Образец</b>
<b>Композиция</b>
A
Цитратный буфер, pH 6, 100 мг/мл, без DP
B
100 мг/мл DP с 0,01% PS 20
C
100 мг/мл DP с 0,05% PS 20
D
100 мг/мл DP с 0,1% PS 20
E
100 мг/мл DP с 0,01% PS 80
F
100 мг/мл DP с 0,05% PS 80
G
100 мг/мл DP с 0,1% PS 80
H
100 мг/мл DP без PS
DP - готовая лекарственная форма (SAR113244).
[00150]
Исследования RapID (фильтрация, рамановская спектроскопия и FT-IR).
В ходе данного исследования анализировали 5 образцов раствора DP. Сначала проводили визуальный осмотр растворов DP в закрытых контейнерах. Растворы каждого образца фильтровали через отдельные покрытые золотом поликарбонатные мембранные фильтры (размер пор составляет 0,8 мкм) с диаметром активной площади, составляющим 4 мм. Опустошенные флаконы ополаскивали с помощью 2×2 мл воды, не содержащей частиц, и при этом пробку ополаскивали с помощью 1×2 мл воды, не содержащей частиц. Чтобы гарантировать то, что все частицы перенесены на фильтр, воронку внутри фильтрационного оборудования ополаскивали с помощью 8 мл воды, не содержащей частиц. Фотографии наблюдаемых частиц получали с помощью видеомикроскопа. Некоторые из самых крупных частиц (>50 мкм) анализировали дополнительно, применяя различные спектроскопические способы. Исследования с применением рамановской спектроскопии проводили вручную путем анализа изображений с применением Single Particle Explorer (SPE), произведенного rap.ID particle Systems GmbH. Данное устройство работает при длине волны лазера, составляющей 532 нм. Для FT-IR- и/или ATR-спектроскопии применяли FT-IR-спектрометр LUMOS (порядковый № 190), произведенный Bruker. Одну из анализируемых частиц дополнительно исследовали с помощью сканирующего электронного микроскопа SEM-EDX (TM 3000), произведенного Bruker.
[00151]
Фильтрация - микроскопия.
Частицы выделяли из 5 флаконов каждой партии, применяя фильтр из нитроцеллюлозы с размером пор, составляющим 0,45 мкм. Полученные частицы анализировали с помощью оптической микроскопии. Дополнительно характеристики частиц определяли с помощью IR-спектроскопии с применением IR-микроскопа Hyperion 2000 при увеличении, составляющем 15×.
[00152]
Измерение невидимых невооруженным глазом частиц.
Оптический счетчик частиц
1. . Оптический счетчик частиц (HIAC, Hach) применяли для измерения количества невидимых невооруженным глазом частиц в составе на основе белка. В соответствии с фармакопеей (Фармакопеей США, Европейской Фармакопеей) исследовали частицы крупнее 10 мкм и 25 мкм. Выявление частиц выполняли с помощью фотодетекторов, которые выявляют оптически наблюдаемые возмущения облучения светом, обусловленные частицами в изучаемом объеме.
Микроскопия с визуализацией потока
2. . Микроскопию с визуализацией потока (Micro-flow imaging (MFI), Protein simple) применяли для измерения количества невидимых невооруженным глазом частиц в составе на основе белка. В соответствии с фармакопеей (Фармакопеей США, Европейской Фармакопеей) исследовали частицы крупнее 10 мкм и 25 мкм. Частицы выявляли с помощью цифровой камеры.
SEC
3. . Относительное количество растворимых агрегатов в нанометровом диапазоне размеров измеряли с применением эксклюзионной хроматографии (SEC). Кроме того, отмечали чистоту или относительное количество мономера.
DLS
4. . Присутствие агрегатов и частиц в нанометровом диапазоне размеров определяли с применением динамического рассеяния света (DLS) (Zetasizer Nano-ZS, Malvern). Определяли гидродинамический диаметр и полидисперсность.
C)
Результаты и обсуждение
[00153]
Эксперименты с фильтрацией
[00154]
Чтобы понять механизм появления частиц Stardust, предпринимали попытки выделить частицы из готовой лекарственной формы SAR113244 (раствор DP). Выделения частиц из суспензии можно достигать за счет фильтрации или попыток извлечения частиц с помощью пипетки или шпателя. Однако определение характеристик частиц Stardust было крайне сложным, поскольку их нельзя было выделить. Посредством фильтрации через целлюлозный фильтр частицы Stardust выделить не удавалось (см.таблицу № 2 и фиг. 1-3). В то время как фильтрация трех растворов плацебо не приводила к обнаружению каких-либо частиц на фильтре, в случае раствора DP из бутыли Nalgene показано значительное количество блестящих частиц (фиг. 4 и 5). Хотя казалось, что абсолютное число частиц на фильтре было ниже, чем в образцах подвергнутых негативному воздействию "Stardust", их вид и размер не отличаются значительным образом от частиц, выделенных ранее. Следовательно, пригодность способа вакуумной фильтрации для выделения частиц "Stardust" должна быть поставлена под сомнение, поскольку для раствора DP из бутыли Nalgene не было показано наличие каких-либо частиц Stardust. В случае лекарственного вещества SAR113244 также показаны частицы на фильтре (фиг. 6), несмотря на то, что лекарственное вещество не содержит частиц Stardust: лекарственное вещество хранили только в пластиковом пакете в цитратном буфере (старое лекарственное вещество из процесса фазы 1), и при проведении визуального осмотра в нем не было показано присутствие частиц, но после фильтрации частицы можно было видеть на фильтре.
[00155]
Для образцов из различных терапевтических средств на основе белка (SAR252067 и SAR341403) снова было показано присутствие частиц на фильтре (фиг. 7-12), хотя растворы являлись прозрачными (не содержали частиц Stardust). Такие данные показывают, что при вакуумной фильтрации высококонцентрированных растворов антител возможен риск того, что составляющие раствора осаждаются на фильтре и делают невозможной идентификацию вероятных невидимых невооруженным глазом или видимых частиц, присутствующих в растворе.
[00156] Таблица № 2. Присутствие частиц на фильтровальной бумаге
Образец
Присутствие частиц Stardust в составе на основе белка
Присутствие частиц на целлюлозном фильтре после фильтрации
SAR113244
Да
Да
SAR252067
Нет
Да
SAR341403
Нет
Да
Раствор плацебо I
Нет
Нет
Раствор плацебо II
Нет
Нет
Раствор плацебо III
Нет
Нет
[00157]
Измерение с помощью DLS
[00158]
Результаты измерения белковых агрегатов, полученные с помощью динамического рассеяния света, действительно показали, что раствор DP, хранящийся в пластиковых бутылях и не содержащий частиц Stardust (фиг. 13), характеризуется более низким коэффициентом полидисперсности, чем содержащий Stardust раствор DP, хранящийся в стеклянных флаконах (фиг. 14). Это может служить показателем того, что конформационные изменения в молекуле SAR113244 могли представлять собой исходную причину образования частиц Stardust. Данный результат, в дополнение к визуальному осмотру, указывает на то, что стеклянный контейнер играет роль в образовании Stardust.
[00159]
Исследование расслоения
[00160]
Одной возможной причиной образования частиц Stardust было происходящее расслоение стеклянных флаконов. Следовательно, проводили исследования расслоения. Исследование расслоения проводили с раствором плацебо, содержащим 10 мМ цитратного буфера, 2 г/л NaCl, 10 г/л HCl-аргинина, 45 г/л (4,5%) сахарозы и 0,01% полисорбата 20. Растворы плацебо хранили в стеклянных флаконах различного типа, указанных в таблице № 3.
[00161] Таблица № 3. Первичная упаковка, применяемая для исследования расслоения
Образец
Первичный упаковочный материал
128A
Флаконы 2R согласно ISO (FC)
128B
Флаконы 2R плюс I типа (TIP) согласно ISO
128C
Флаконы 2R согласно ISO с контролем расслоения (DC)
128D
Предварительно заполненный шприц (BD Biotech, Hypak SCF, "BD-шприц")
[00162]
Расслоения не обнаруживали в условиях ускоренной деградации (60°C) (см. таблицы №№ 4A и 4B) спустя 1, 4 или 12 недель.
[00163] Таблица № 4A
Обобщенные результаты для контрольных образцов (нестерилизованные)
<b>Образец</b>
<b>01</b>(TIP)
<b>02</b>(FC)
<b>03</b>(DC)
Расслоение подтверждено<sup>a</sup>
нет
нет
нет
Ранние признаки расслоения<sup>b</sup>
нет
нет
нет
Разъедание стекла<sup>c</sup>
нет
нет
нет
Прочее<sup>d</sup>
да
да
да
Обобщенные результаты для контрольных образцов (стерилизованные)
<b>05</b>(TIP)
<b>06</b>(FC)
<b>07</b>(DC)
<b>08</b>(BD-шприц)
Расслоение подтверждено<sup>a</sup>
нет
нет
нет
нет
Ранние признаки расслоения<sup>b</sup>
нет
нет
нет
нет
Разъедание стекла<sup>c</sup>
нет
да
да
нет
Прочее<sup>d</sup>
да
да
да
да
Обобщенные результаты для t0 (исходные)
<b>10</b>(128A)
<b>11</b>(128B)
<b>12</b>(128C)
<b>13</b>(128D)
Расслоение подтверждено<sup>a</sup>
нет
нет
нет
нет
Ранние признаки расслоения<sup>b</sup>
нет
нет
нет
нет
Разъедание стекла<sup>c</sup>
нет
нет
нет
нет
Прочее<sup>d</sup>
да
да
да
да
Обобщенные результаты для t1 (1 неделя, 60°C)
<b>20</b>(128A)
<b>21</b>(128B)
<b>22</b>(128C)
<b>23</b>(128D)
Расслоение подтверждено<sup>a</sup>
нет
нет
нет
нет
Ранние признаки расслоения<sup>b</sup>
нет
нет
нет
нет
Разъедание стекла<sup>c</sup>
нет
нет
нет
нет
Прочее<sup>d</sup>
да
да
да
да
[00164] Таблица № 4B. Краткое описание коррозии (разъедания стекла) и расслоения стекла
Обобщенные результаты для t2 (4 недели, 60°C)
<b>Образец</b>
<b>30</b>(128A)
<b>31</b>(128B)
<b>32</b>(128C)
<b>33</b>(128D)
Расслоение подтверждено<sup>a</sup>
нет
нет
нет
нет
Ранние признаки расслоения<sup>b</sup>
нет
нет
нет
да
Разъедание стекла<sup>c</sup>
да
да
да
да
Прочее<sup>d</sup>
да
да
да
да
Обобщенные результаты для t3 (12 недель, 60°C)
<b>40</b>(128A)
<b>41</b>(128B)
<b>42</b>(128C)
<b>43</b>(128D)
Расслоение подтверждено<sup>a</sup>
нет
нет
нет
нет
Ранние признаки расслоения<sup>b</sup>
нет
нет
нет
да
Разъедание стекла<sup>c</sup>
да
да
да
да
Прочее<sup>d</sup>
да
да
да
да
a
b
d
расслоение подтверждено: четкие края или расслоенные области (SEM);  ранние признаки: реакционная зона на внутренней поверхности (SEM), степень окрашивания, наблюдаемого при визуальном осмотре, не менее "слабой" (SM), соотношение концентрации Si/B ниже или равно 5, а при этом концентрация Si (ICP) превышает 10 мг/мл (объем заполнения составляет от 1 мл вплоть до 2 мл);  прочее: неглубокие ямки, небольшие бугорки, маленькие отверстия, отложения (SEM), слабое среднее светорассеяние, наблюдаемое при визуальном осмотре (SM), локальная реакционная зона (горизонтальный размер менее 20 мкМ) (SEM).
[00165]
Однако повышенную концентрацию компонентов стекла (Al, Si, B, Ca) выявляли в растворе при длительном хранении (12 недель, 60°C) (см.таблицу № 5).
[00166] Таблица № 5. Концентрации растворенных элементов стекла (ICP-анализы) в условиях ускоренной деградации
Элемент
Единица измерения
Способ
Предел количественного определения (LOQ)
Маточный раствор плацебо
B
мг/л
ICP-OES
0,5
<0,5
Al
мг/л
ICP-MS
0,01
<0,01
Ca
мг/л
ICP-MS
0,05
0,087
Si
мг/л
ICP-OES
0,5
<0,5
t0 Исходные образцы
Элемент
Единица измерения
Способ
Образец 10128A
Образец 11128B
Образец 12128C
Образец 13128D
B
мг/л
ICP-OES
<0,5
<0,5
<0,5
<0,5
Al
мг/л
ICP-MS
0,047
<0,01
0,057
<0,01
Ca
мг/л
ICP-MS
0,19
0,11
0,23
0,10
Si
мг/л
ICP-OES
0,70
0,61
0,60
0,71
t1 1 неделя при 60°C
Элемент
Единица измерения
Способ
Образец 20128A
Образец 21128B
Образец 22128C
Образец 23128D
B
мг/л
ICP-OES
<0,5
<0,5
0,52
<0,5
Al
мг/л
ICP-MS
0,52
<0,01
0,55
0,018
Ca
мг/л
ICP-MS
0,29
0,10
0,32
0,13
Si
мг/л
ICP-OES
3,4
6,8
3,7
0,69
t2 4 недели при 60°C
Элемент
Единица измерения
Способ
Образец 30128A
Образец 31128B
Образец 32128C
Образец 33128D
B
мг/л
ICP-OES
1,36
<0,5
1,28
0,75
Al
мг/л
ICP-MS
1,8
0,21
1,9
0,99
Ca
мг/л
ICP-MS
0,48
0,17
0,50
0,20
Si
мг/л
ICP-OES
12,5
19,6
12,6
11,0
[00167]
На основании данных наблюдений, весьма вероятно, что компоненты стекла (Al, Si, B, Ca) приводят к образованию частиц, поскольку это является единственным отличием, которое наблюдали при сравнении состава на основе mAb во флаконах с составом, хранящимся в бутыли Nalgene. При исследованиях с плацебо расслоение не наблюдалось, но отмечалось выщелачивание некоторых компонентов, которые также можно было предполагать в случае растворов DP с белком. Более того, в данном исследовании устанавливали, что частицы Stardust не появляются в отсутствие белка.
[00168]
RapID-исследование.
-1
Целью данного исследования было определение того, из чего состоят частицы Stardust. Предыдущие исследования с фильтрацией были безрезультатными, поскольку было невозможно выделить частицы на фильтрах. RapID предоставляет решение с помощью золотых фильтров. В данном случае раствор DP фильтровали через золотой фильтр и затем анализировали с применением FT-IR (фиг. 15) и рамановской спектроскопии (фиг. 16). Результаты показали, что в 3 из 5 флаконов выявляли белковые частицы. В остальных флаконах выявляли полиэтилен (фиг. 17 и 18). Образцы, которые содержат полиэтилен, наиболее вероятно, также содержат белок, поскольку типичные пики поглощения для белка, превышающие 3000 см, также наблюдали при FT-IR-анализе (фиг. 17). Нужно отметить, что данные образцы являются очень старыми (4 года - срок хранения = 3 года). Следовательно, следует провести дополнительные исследования с образцами, в которых частицы Stardust только были выявлены. Однако, как полагают, по меньшей мере частично в основе образования частиц Stardust в составе лежит агрегация белка. Следовательно, полагают, что новые составы на основе антитела, разработанные для недопущения агрегации белка, смогут не допустить образования частиц Stardust в составе.
[00169]
Кроме того, хотя частицы Stardust обнаруживали и описывали в связи с конкретным антителом к CXCR5, полагают, что у других антител могут проявляться подобные проблемы при хранении, и, таким образом, они потенциально смогут получить преимущество от предлагаемых составов на основе антитела, представленных в данном документе.
Пример № 2. Разработка составов, не содержащих частиц Stardust
A)
Введение
[00170]
Чтобы не допустить образования частиц Stardust, был разработан новый состав. В ходе данного процесса были одинаково важны химическая стабильность и отсутствие невидимых невооруженным глазом частиц.
B)
Способы и результаты
[00171]
Чтобы получить устойчивый состав, который не подвержен образованию агрегатов в течение длительного периода времени, на разных экспериментальных образцах проводили исследования механического воздействия. Образцы подвергали воздействию с применением магнитной мешалки и после фильтрации и хранения в условиях ускоренной деградации образцы тестировали в отношении образования частиц Stardust (визуальный осмотр). С помощью исследования механического воздействия можно увидеть, что повышение концентраций полисорбата 20 или полисорбат 80 снижает количество частиц в составе на основе антитела. На основании данных результатов проводили исследование стабильности, в котором высококонцентрированные составы SAR113244 с концентрацией, составляющей вплоть до 175 мг/мл, тестировали в стеклянных флаконах и предварительно заполненных шприцах. Частиц Stardust не наблюдали при любой концентрации SAR113244, если концентрация полисорбата 20 или полисорбата 80 составляла 0,1%. Даже в условиях ускоренной деградации (6 месяцев, 40°C) видимые частицы не присутствовали. Следовательно, высококонцентрированные составы, содержащие 100-175 мг/мл, подвергали исследованию стабильности и частицы Stardust в них не образовывались. Химической стабильности достигали, когда состав содержал приблизительно 100-175 мг/мл SAR113244, приблизительно 200 мМ аргинина, приблизительно 4,5-9% сахарозы, приблизительно 0,1% полисорбата 20 или приблизительно 0,1% полисорбата 80 и приблизительно 10 мМ цитратного буфера.
[00172]
Исследования механического воздействия
.Экспериментальные составы получали посредством добавления в смесительный сосуд вначале готовой лекарственной формы (SAR113244) и последовательного добавления наполнителей (см.таблицу № 1 выше). После смешивания наполнителей растворы фильтровали и добавляли в стеклянный флакон. Наконец, производили визуальный осмотр конечных составов.
[00173]
Флаконы подвергали исследованию механического воздействия, как описано выше. Результаты показаны на фиг. 19 и 20.С помощью исследования механического воздействия было показано, что частицы образуются во время хранения даже после фильтрации. Однако интенсивность данного процесса образования видимых частиц можно снизить и даже остановить его путем повышения концентрации полисорбата. На основании данных результатов было высказано предположение, что состава, не содержащего частиц Stardust, можно достигнуть путем повышения концентрации полисорбата. Более того, составов, не содержащих частиц Stardust, можно достигнуть с применением или полисорбата 20, или полисорбата 80.
[00174]
Исследование стабильности
. Включение поверхностно-активных веществ в белоксодержащие фармацевтические составы является широко известным и обычные поверхностно-активные вещества представляют собой полисорбат 20 и полисорбат 80. Применение аминокислот, таких как аргинин и метионин, в качестве стабилизаторов также известно. Однако авторы настоящего изобретения наблюдали, что в случае антитела SAR113244 образование частиц происходит после хранения (12 месяцев) только тогда, когда первичный упаковочный материал состоит из стекла. Чтобы идентифицировать стабильные составы SAR113244, получали составы на основе антитела, подходящие для фармацевтического применения, с концентрациями полисорбата, превышающими 0,01%, и концентрациями аминокислоты, превышающими 50 мМ (см.таблицу № 6 ниже). Такие составы хранили в стеклянных флаконах или стеклянных шприцах и подвергали исследованиям стабильности в условиях ускоренной деградации (при 40°C) и измеряли образование частиц (см.таблица № 7).
[00175]
Результаты исследования стабильности показали, что большое количество аргинина (200 мМ) приводит к получению стабильного состава, не содержащего частиц Stardust в течение 6 месяцев, даже если содержание полисорбата составляет 0,01%. Требуется достигнуть даже более высоких концентраций mAb и достигнуть состава, который является стабильным в течение длительного периода времени. Предварительные результаты показали, что высокая концентрация аргинина в составе (таблица № 5) и большое количество полисорбата (фиг. 19 и 20) являются благоприятными. Данные наблюдения учитывали и новое исследование стабильности проводили с применением большого количества аргинина и полисорбата.
[00176] Таблица № 6. Композиция состава, тестируемого в течение 6 месяцев
<b>Образец</b>
<b>Композиция</b>
SAR113244_14_124A
150 мг/мл SAR113244, 45 г/л сахарозы, 200 мМ HCl-аргинина, 2 мг/мл NaCl, 0,1 мг/мл PS20, 10 мМ цитратного буфера, pH 6,0
SAR113244_14_124B
150 мг/мл SAR113244, 45 г/л сахарозы, 200 мМ HCl-аргинина, 0,1 мг/мл PS20, 10 мМ цитратного буфера, pH 6,0
SAR113244_14_124C
150 мг/мл SAR113244, 60 г/л сахарозы, 200 мМ HCl-аргинина, 0,1 мг/мл PS20, 10 мМ цитратного буфера, pH 6,0
SAR113244_14_124D
150 мг/мл SAR113244, 90 г/л сахарозы, 200 мМ HCl-аргинина, 0,1 мг/мл PS20, 10 мМ цитратного буфера, pH 6,0
[00177]
Образцы из таблицы № 6 хранили при различных температурах (5°C, 25°C, 40°C и -20°C) во флаконах 2R согласно ISO в течение 2 недель (T0,5), 1 месяца (T1), 3 месяцев (T3) и 6 месяцев (T6) для определения их стабильности с применением способов, описанных в примере № 1. Контрольный набор образцов также измеряли в день ноль (T0). Результаты показаны в таблице № 7.
[00178] Таблица № 7. Результаты исследования стабильности составов 124A-D в условиях ускоренной деградации
Образец
SEC [% мономера]
MFI [частицы ≥10 мкм]
MFI [частицы ≥25 мкм]
DLS [нм]
HIAC [частицы ≥10 мкм]
HIAC [частицы ≥25 мкм]
SAR113244_14_124A T0
97,6
88
0
12,21
28
0
SAR113244_14_124B T0
97,6
92
0
12,39
5
2
SAR113244_14_124C T0
97,5
153
42
12,87
23
5
SAR113244_14_124D T0
97,6
4
0
13,99
85
2
SAR113244_14_124A T0,5 40°C
97,5
12,49
SAR113244_14_124B T0,5 40°C
97,5
12,44
SAR113244_14_124C T0,5 40°C
97,4
12,92
SAR113244_14_124D T0,5 40°C
97,5
13,9
SAR113244_14_124A T1 -20°C
97,6
12,18
2
0
SAR113244_14_124A T1 5°C
97,7
12,24
5
0
SAR113244_14_124A T1 25°C
97,8
12,12
7
0
SAR113244_14_124A T1 40°C
96,8
12,41
57
0
SAR113244_14_124B T1 -20°C
97,6
12,42
5
0
SAR113244_14_124B T1 5°C
97,7
12,34
0
0
SAR113244_14_124B T1 25°C
97,8
12,23
38
0
SAR113244_14_124B T1 40°C
96,8
12,52
35
2
SAR113244_14_124C T1 -20°C
97,5
12,64
5
0
SAR113244_14_124C T1 5°C
97,7
12,81
2
0
SAR113244_14_124C T1 25°C
97,8
12,56
7
0
SAR113244_14_124C T1 40°C
96,8
12,81
7
0
SAR113244_14_124D T1 -20°C
97,6
13,94
10
0
SAR113244_14_124D T1 5°C
97,6
13,88
10
0
SAR113244_14_124D T1 25°C
97,8
13,58
2
0
SAR113244_14_124D T1 40°C
96,9
13,93
12
2
SAR113244_14_124A T3 -20°C
97,6
338
54
12,25
13
2
SAR113244_14_124A T3 5°C
97,8
54
3
12,12
12
1
SAR113244_14_124A T3 25°C
97,7
80
14
12,33
17
1
SAR113244_14_124A T3 40°C
93,8
63
0
13,28
13
1
SAR113244_14_124B T3 -20°C
97,6
101
6
12,2
6
1
SAR113244_14_124B T3 5°C
97,7
17
6
12,18
9
1
SAR113244_14_124B T3 25°C
97,7
195
23
12,11
6
1
SAR113244_14_124B T3 40°C
94,0
109
0
13,02
15
0
SAR113244_14_124C T3 -20°C
97,6
224
3
12,87
5
0
SAR113244_14_124C T3 5°C
97,7
635
84
12,67
10
2
SAR113244_14_124C T3 25°C
97,7
75
0
12,62
7
0
SAR113244_14_124C T3 40°C
93,9
995
138
13,59
6
1
SAR113244_14_124D T3 -20°C
97,5
172
14
13,98
11
1
SAR113244_14_124D T3 5°C
97,8
20
3
14,45
15
0
SAR113244_14_124D T3 25°C
97,7
118
6
13,45
3
0
SAR113244_14_124D T3 40°C
94,3
204
29
13,7
5
0
SAR113244_14_124A T6 -80°C
97,6
SAR113244_14_124A T6 -20°C
97,6
SAR113244_14_124A T6 5°C
97,7
SAR113244_14_124A T6 25°C
97,5
SAR113244_14_124A T6 40°C
88,5
SAR113244_14_124B T6 -80°C
97,5
SAR113244_14_124B T6 -20°C
97,5
SAR113244_14_124B T6 5°C
97,7
SAR113244_14_124B T6 25°C
97,4
SAR113244_14_124B T6 40°C
88,3
SAR113244_14_124C T6 -80°C
97,6
SAR113244_14_124C T6 -20°C
97,6
SAR113244_14_124C T6 5°C
97,7
SAR113244_14_124C T6 25°C
97,4
SAR113244_14_124C T6 40°C
88,4
SAR113244_14_124D T6 -80°C
97,5
SAR113244_14_124D T6 -20°C
97,5
SAR113244_14_124D T6 5°C
97,7
SAR113244_14_124D T6 25°C
97,5
SAR113244_14_124D T6 40°C
88,5
[00179]
В последующем тесте получали новые составы на основе состава 124D с даже более высокой концентрацией mAb и тестировали в отношении стабильности, как описано выше. Кроме того, также тестировали повышенные концентрации полисорбата, учитывая результаты, связанные с таблицей № 5. Новые составы описаны в таблице № 8 ниже, при этом составы A и B хранили во флаконах 2R согласно ISO, и при этом составы C и D хранили в предварительно заполненных шприцах (Hypak BD объемом 1 мл).
[00180] Таблица № 8. Композиция состава, подвергаемого испытанию стабильности в течение 6 месяцев
Образец
Композиция
SAR113244_15_133A
150 мг/мл SAR113244, 45 г/л сахарозы, 200 мМ HCl-аргинина, 1,0 мг/мл PS80, 10 мМ цитратного буфера, pH 6,0
SAR113244_15_133B
175 мг/мл SAR113244, 45 г/л сахарозы, 200 мМ HCl-аргинина, 1,0 мг/мл PS80, 10 мМ цитратного буфера, pH 6,0
SAR113244_15_133C
150 мг/мл SAR113244, 45 г/л сахарозы, 200 мМ HCl-аргинина, 1,0 мг/мл PS80, 10 мМ цитратного буфера, pH 6,0
SAR113244_15_133D
175 мг/мл SAR113244, 45 г/л сахарозы, 200 мМ HCl-аргинина, 1,0 мг/мл PS80, 10 мМ цитратного буфера, pH 6,0
[00181]
Стабильность тестировали у составов из таблицы № 8, и результаты показаны в таблице № 9.
[00182] Таблица № 9. Стабильность составов 133A-D в условиях ускоренной деградации
Образец
SEC [% мономера]
HIAC [частицы ≥10 мкм]
HIAC [частицы ≥25 мкм]
DLS [нм]
SAR113244_15_133A T0
98,8
10
0
13,754
SAR113244_15_133B T0
98,7
5
0
14,072
SAR113244_15_133C T0
98,7
140
8
13,41
SAR113244_15_133D T0
98,7
18
0
14,072
SAR113244_15_133A T1 -20°C
98,7
33
2
13,084
SAR113244_15_133A T1 5°C
98,7
3
0
13,302
SAR113244_15_133A T1 25°C
98,7
5
0
13,156
SAR113244_15_133A T1 40°C
97,8
8
0
13,452
SAR113244_15_133B T1 -20°C
98,4
3
0
13,758
SAR113244_15_133B T1 5°C
98,6
3
0
13,774
SAR113244_15_133B T1 25°C
98,8
20
3
13,856
SAR113244_15_133B T1 40°C
97,8
2
0
14,074
SAR113244_15_133C T1 -20°C
98,7
288
5
13,346
SAR113244_15_133C T1 5°C
98,8
187
2
13,388
SAR113244_15_133C T1 25°C
98,7
60
3
13,424
SAR113244_15_133C T1 40°C
97,9
77
0
13,526
SAR113244_15_133D T1 -20°C
98,6
82
3
13,878
SAR113244_15_133D T1 5°C
98,8
218,3
2
13,818
SAR113244_15_133D T1 25°C
98,8
373
10
13,72
SAR113244_15_133D T1 40°C
97,7
147
17
14,142
SAR113244_15_133A 2Mo -20°C
98,8
13,49
SAR113244_15_133A 2Mo 5°C
98,8
13,44
SAR113244_15_133A 2Mo 25°C
98,8
13,458
SAR113244_15_133A 2Mo 40°C
96,7
14,044
SAR113244_15_133B 2Mo -20°C
98,8
7,014
SAR113244_15_133B 2Mo 5°C
98,8
13,998
SAR113244_15_133B 2Mo 25°C
98,6
13,906
SAR113244_15_133B 2Mo 40°C
96,3
14,566
SAR113244_15_133A,T3 3Mo -20°C
98,8
30
2
13,55
SAR113244_15_133A,T3 3Mo 5°C
98,8
17
0
13,6
SAR113244_15_133A, T3 3Mo 25°C
98,7
5
0
13,43
SAR113244_15_133A,T3 3Mo 40°C
95,0
3
2
13,92
SAR113244_15_133B,T3 3Mo -20°C
98,7
3
0
13,96
SAR113244_15_133B, T3 3Mo 5°C
98,8
7
0
13,92
SAR113244_15_133B,T3 3Mo 25°C
98,7
2
2
13,73
SAR113244_15_133B,T3 3Mo 40°C
94,4
10
0
14,54
SAR113244_15_133C,T3 3Mo -20°C
98,8
197
12
13,02
SAR113244_15_133C,T3 3Mo 5°C
98,8
172
2
13,36
SAR113244_15_133C, T3 3Mo 25°C
98,8
100
2
13,47
SAR113244_15_133C,T3 3Mo 40°C
95,0
73
0
14,33
SAR113244_15_133D,T3 3Mo -20°C
98,7
213
7
13,97
SAR113244_15_133D, T3 3Mo 5°C
98,8
105
3
13,87
SAR113244_15_133D,T3 3Mo 25°C
98,7
52
2
13,86
SAR113244_15_133D,T3 3Mo 40°C
94,4
72
3
14,63
SAR113244_15_133A,T6 6Mo -80°C
98,7
30
10
13,54
SAR113244_15_133A,T6 6Mo -20°C
98,8
62
0
13,44
SAR113244_15_133A,T6 6Mo +5°C
98,8
53
2
13,16
SAR113244_15_133A, T6 6Mo +25°C
98,6
20
5
13,27
SAR113244_15_133A,T6 6Mo +40°C
89,5
7
0
15,56
SAR113244_15_133B,T6 6Mo -80°C
98,6
10
0
14,02
SAR113244_15_133B,T6 6Mo -20°C
98,6
22
0
13,91
SAR113244_15_133B,T6 6Mo +5°C
98,6
7
2
13,7
SAR113244_15_133B, T6 6Mo +25°C
98,4
15
0
13,71
SAR113244_15_133B,T6 6Mo +40°C
88,2
22
3
16,26
SAR113244_15_133C,T6 6Mo -80°C
98,7
75
5
13,5
SAR113244_15_133C,T6 6Mo -20°C
98,8
233
25
13,4
SAR113244_15_133C,T6 6Mo +5°C
98,8
113
12
13,38
SAR113244_15_133C, T6 6Mo +25°C
98,5
218
12
13,27
SAR113244_15_133C,T6 6Mo +40°C
90,0
130
17
15,49
SAR113244_15_133D,T6 6Mo -80°C
98,6
147
5
13,9
SAR113244_15_133D,T6 6Mo -20°C
98,6
85
5
13,8
SAR113244_15_133D,T6 6Mo +5°C
98,7
67
5
13,7
SAR113244_15_133D,T6 6Mo +25°C
98,3
87
0
13,84
SAR113244_15_133D,T6 6Mo +40°C
88,5
67
10
16,03
[00183]
На основании результатов исследования стабильности показано, что достигнут состав с высокой концентрацией антитела, препараты которого не содержат частиц Stardust. В самом деле, концентрация антитела, составляющая вплоть до 175 мг/мл, является стабильной в условиях ускоренной деградации (40°C) в течение 6 месяцев (см., например,состав B). Количество частиц, выявленных в случае применения предварительно заполненных шприцев в качестве первичного упаковочного материала, является немного повышенным относительно флаконов 2R согласно ISO, но все еще хорошо соответствует критериям приемлемости регулирующих органов. Достижение практически полного отсутствия невидимых невооруженным глазом частиц в тестовых условиях ускоренной деградации (40°C в течение 6 месяцев) в случае экспериментальных составов, имеющих такие высокие концентрации белка, склонного к агрегации, было абсолютно неожиданным и представляет собой огромный прорыв в создании высокостабильных высококонцентрированных составов на основе антитела. В самом деле, такие составы с высокой концентрацией антитела могут обеспечивать возможность применения автоинжекторов для введения составов на основе антитела. Более того, такие составы на основе антитела могли бы привести к даже более длительному сроку хранения для антител, хранящихся в стеклянных контейнерах в течение продолжительных периодов времени при высоких концентрациях.
[00184]
Описав настоящее изобретение подробно и посредством ссылок на конкретные варианты его осуществления, будет очевидно, что возможны модификации и вариации без отклонения от объема настоящего изобретения, определенного в прилагаемой формуле изобретения. Более конкретно, несмотря на то, что некоторые аспекты настоящего изобретения определены в данном документе как особенно преимущественные, следует иметь в виду, что настоящее изобретение не обязательно ограничено данными конкретными аспектами настоящего изобретения. В альтернативных вариантах осуществления, процентные доли, раскрытые в данном документе, в иных случаях могут варьировать в количестве на ±10, 20 или 30% от значений, раскрытых в данном документе.
ТАБЛИЦА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
SEQ ID NO: 1
MNYPTLEMDLENLEDLFWELDRLDNYNTSLVENHLC
SEQ ID NO: 2
cttccggaattcsargtnmagctgsagsagtc
SEQ ID NO: 3
cttccggaattcsargtnmagctgsagsagtcwgg
SEQ ID NO: 4
ggaggatccatagacagatgggggtgtcgttttggc
SEQ ID NO: 5
ggagctcgayattgtgmtsacmcarwctmca
SEQ ID NO: 6
tatagagctcaagcttggatggtgggaagatggatacagttggtgc
SEQ ID NO: 7
ccaagctgtgtcctrtcc
SEQ ID NO: 8
cgacaagtcgactagcccttgaccaggcatcc
SEQ ID NO: 9
wtctctrgagtcagtggg
SEQ ID NO: 10
cgactagtcgactggtgggaagatggatacag
SEQ ID NO: 11
DIVMTQAAPSVAVTPRESVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 12
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLIDYGVNWIRQPPGKGLEWLGVIWGDGTTYYNSALKSRLSIRKDNSQSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARIVYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO: 13
DIVMTQSALSVAVTPGESVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLKISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 14
DIVMTQSALSVAVTPGESVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRLSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLKISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 15
DIVMTQSALSVAVTPGESVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRLSSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLKISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 16
QVQLQESGPGLVAPSESLSITCTVSGFSLIDYGVNWIRQPPGKGLEWLGVIWGDGTTYYNPSLKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLTAADTAMYYCARIVYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 17
MGWSCIILFLVATATGVHSDIVMTQSALSVAVTPGESVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLKISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 18
gctagcaccatgggctggagctgcatcatcctgttcctggtggccaccgccaccggcgtgcacagcgacatcgtgatgacccagagcgccctcagcgtggccgtgacccccggcgagagcgtgagcatcagctgccgcagcagcaagagcctgctgcacagcagcggcaagacctacctgtactggttcctgcagcgccccggccagagcccccagctgctgatctaccgcatgagcaacctggccagcggcgtgcccgaccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgccttcaccctgaagatcagccgcgtggaggccgaggacgtgggcgtgtactactgcatgcagcacctggagtacccctacaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagcgtacggtggccgctccttccgtgttcatcttccctccctccgacgagcagctgaagtccggcaccgcctccgtggtgtgtctgctgaacaacttctaccctcgggaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccaggagtccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctccaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgtgaggtgacccaccagggcctgtccagccctgtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgctgaagctt
SEQ ID NO: 19
MGWSCIILFLVATATGVHSDIVMTQSALSVAVTPGESVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRLSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLKISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 20
gctagcaccatgggctggagctgcatcatcctgttcctggtggccaccgccaccggcgtgcacagcgacatcgtgatgacccagagcgccctcagcgtggccgtgacccccggcgagagcgtgagcatcagctgccgcagcagcaagagcctgctgcacagcagcggcaagacctacctgtactggttcctgcagcgccccggccagagcccccagctgctgatctaccgcctgagcaacctggccagcggcgtgcccgaccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgccttcaccctgaagatcagccgcgtggaggccgaggacgtgggcgtgtactactgcatgcagcacctggagtacccctacaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagcgtacggtggccgctccttccgtgttcatcttccctccctccgacgagcagctgaagtccggcaccgcctccgtggtgtgtctgctgaacaacttctaccctcgggaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccaggagtccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctccaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgtgaggtgacccaccagggcctgtccagccctgtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgctgaagctt
SEQ ID NO: 21
MGWSCIILFLVATATGVHSDIVMTQSALSVAVTPGESVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRLSSLASGVPDRFSGSGSGTAFTLKISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 22
gctagcaccatgggctggagctgcatcatcctgttcctggtggccaccgccaccggcgtgcacagcgacatcgtgatgacccagagcgccctcagcgtggccgtgacccccggcgagagcgtgagcatcagctgccgcagcagcaagagcctgctgcacagcagcggcaagacctacctgtactggttcctgcagcgccccggccagagcccccagctgctgatctaccgcctgagcagcctggccagcggcgtgcccgaccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgccttcaccctgaagatcagccgcgtggaggccgaggacgtgggcgtgtactactgcatgcagcacctggagtacccctacaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagcgtacggtggccgctccttccgtgttcatcttccctccctccgacgagcagctgaagtccggcaccgcctccgtggtgtgtctgctgaacaacttctaccctcgggaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccaggagtccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctccaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgtgaggtgacccaccagggcctgtccagccctgtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgctgaagctt
SEQ ID NO: 23
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLQESGPGLVAPSESLSITCTVSGFSLIDYGVNWIRQPPGKGLEWLGVIWGDGTTYYNPSLKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLTAADTAMYYCARIVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
SEQ ID NO: 24
gctagcaccatgggctggagctgcatcatcctgttcctggtggccaccgccaccggcgtgcacagccaggtgcagctgcaggagagcggccccggcctggtggcccccagcgagagcctgagcatcacctgcaccgtgagcggcttcagcctgatcgactacggcgtgaactggatccgccagccccccggcaagggcctggagtggctgggcgtgatctggggcgacggcaccacctactacaaccccagcctgaagagccgcctgagcatctccaaggacaacagcaagagccaggtgttcctgaagatgaacagcctgaccgccgccgacaccgccatgtactactgcgcccgcatcgtgtactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgccagcaccaagggcccttccgtgttccctctggccccttgctcccggtccacctccgagtccaccgccgctctgggctgcctggtgaaggactacttccctgagcctgtgaccgtgtcctggaactctggcgccctgacctccggcgtgcacaccttccctgccgtgctgcagtcctccggcctgtactccctgtcctccgtggtgaccgtgccttcctcctccctgggcaccaagacctacacctgtaacgtggaccacaagccttccaacaccaaggtggacaagcgggtggagtccaagtacggccctccttgcccttcctgccctgcccctgagttcctgggcggacctagcgtgttcctgttccctcctaagcctaaggacaccctgatgatctcccggacccctgaggtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccaggaggaccctgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaacgccaagaccaagcctcgggaggagcagttcaattccacctaccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagaatacaagtgtaaggtctccaacaagggcctgccctcctccatcgagaaaaccatctccaaggccaagggccagcctagggagcctcaggtgtacaccctgcctcctagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtgaagggcttctacccttccgacatcgccgtggagtgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccacccctcctgtgctggactccgacggctccttcttcctgtactccaggctgaccgtggacaagtcccggtggcaggagggcaacgtcttttcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgtctctgggctgaagctt
SEQ ID NO: 25
KPGQPPRLLIYDASNRATGIPA
SEQ ID NO: 26
TDDTAMYYCARI
SEQ ID NO: 27
SEDSALYYCARD
SEQ ID NO: 28
DIVMTQAAPSVAVTPRESVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 29
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLIDYGVNWIRQPPGKGLEWLGVIWGDGTTYYNSALKSRLSIRKDNSQSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARIVYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO: 30
DIVMTQAAPSVAVTPGASVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 31
DIVMTQAAPSVAVTPGASVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRLSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 32
DIVMTQAAPSVAVTPGASVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRLSSLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 33
QVQLKESGPGLVAPSESLSITCTVSGFSLIDYGVNWIRQPPGKGLEWLGVIWGDGTTYYNPSLKSRLSISKDNSKSQVFLKVTSLTTDDTAMYYCARIVYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO: 34
EVQLKESGPGLVAPGGSLSITCTVSGFSLIDYGVNWIRQPPGKGLEWLGVIWGDGTTYYNAPLKGRLSISKDNSKSQVFLQMNSLKTDDTAMYYCARIVYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 35
MGWSCIILFLVATATGVHSDIVMTQAAPSVAVTPRESVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 36
gctagcaccatgggctggagctgcatcatcctgttcctggtggccaccgccaccggcgtgcacagcgacatcgtgatgacccaggccgcccccagcgtggccgtgaccccccgcgagagcgtgagcatcagctgccgcagcagcaagagcctgctgcacagcagcggcaagacctacctgtactggttcctgcagcgccccggccagagcccccagctgctgatctaccgcatgagcaacctggccagcggcgtgcccgaccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgccttcaccctgcgcatcagccgcgtggaggccgaggacgtgggcgtgtactactgcatgcagcacctggagtacccctacaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagcgtacggtggccgctccttccgtgttcatcttccctccctccgacgagcagctgaagtccggcaccgcctccgtggtgtgtctgctgaacaacttctaccctcgggaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccaggagtccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctccaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgtgaggtgacccaccagggcctgtccagccctgtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgctgaagctt
SEQ ID NO: 37
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLIDYGVNWIRQPPGKGLEWLGVIWGDGTTYYNSALKSRLSIRKDNSQSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARIVYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
SEQ ID NO: 38
gctagcaccatgggctggagctgcatcatcctgttcctggtggccaccgccaccggcgtgcacagccaggtgcagctgaaggagagcggccccggcctggtggcccccagccagagcctgagcatcacctgcaccgtgagcggcttcagcctgatcgactacggcgtgaactggatccgccagccccccggcaagggcctggagtggctgggcgtgatctggggcgacggcaccacctactacaacagcgccctgaagagccgcctgagcatccgcaaggacaacagccagagccaggtgttcctgaagatgaacagcctgcagaccgacgacaccgccatgtactactgcgcccgcatcgtgtactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcgccgccagcaccaagggcccttccgtgttccctctggccccttgctcccggtccacctccgagtccaccgccgctctgggctgcctggtgaaggactacttccctgagcctgtgaccgtgtcctggaactctggcgccctgacctccggcgtgcacaccttccctgccgtgctgcagtcctccggcctgtactccctgtcctccgtggtgaccgtgccttcctcctccctgggcaccaagacctacacctgtaacgtggaccacaagccttccaacaccaaggtggacaagcgggtggagtccaagtacggccctccttgcccttcctgccctgcccctgagttcctgggcggacctagcgtgttcctgttccctcctaagcctaaggacaccctgatgatctcccggacccctgaggtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccaggaggaccctgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaacgccaagaccaagcctcgggaggagcagttcaattccacctaccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagaatacaagtgtaaggtctccaacaagggcctgccctcctccatcgagaaaaccatctccaaggccaagggccagcctagggagcctcaggtgtacaccctgcctcctagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtgaagggcttctacccttccgacatcgccgtggagtgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccacccctcctgtgctggactccgacggctccttcttcctgtactccaggctgaccgtggacaagtcccggtggcaggagggcaacgtcttttcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgtctctgggctgaagctt
SEQ ID NO: 39
MGWSCIILFLVATATGVHSDIVMTQAAPSVAVTPGASVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 40
gctagcaccatgggctggagctgcatcatcctgttcctggtggccaccgccaccggcgtgcacagcgacatcgtgatgacccaggccgcccccagcgtggccgtgacccccggcgccagcgtgagcatcagctgccgcagcagcaagagcctgctgcacagcagcggcaagacctacctgtactggttcctgcagcgccccggccagagcccccagctgctgatctaccgcatgagcaacctggccagcggcgtgcccgaccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgccttcaccctgcgcatcagccgcgtggaggccgaggacgtgggcgtgtactactgcatgcagcacctggagtacccctacaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagcgtacggtggccgctccttccgtgttcatcttccctccctccgacgagcagctgaagtccggcaccgcctccgtggtgtgtctgctgaacaacttctaccctcgggaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccaggagtccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctccaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgtgaggtgacccaccagggcctgtccagccctgtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgctgaagctt
SEQ ID NO: 41
MGWSCIILFLVATATGVHSDIVMTQAAPSVAVTPGASVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRLSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 42
gctagcaccatgggctggagctgcatcatcctgttcctggtggccaccgccaccggcgtgcacagcgacatcgtgatgacccaggccgcccccagcgtggccgtgacccccggcgccagcgtgagcatcagctgccgcagcagcaagagcctgctgcacagcagcggcaagacctacctgtactggttcctgcagcgccccggccagagcccccagctgctgatctaccgcctgagcaacctggccagcggcgtgcccgaccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgccttcaccctgcgcatcagccgcgtggaggccgaggacgtgggcgtgtactactgcatgcagcacctggagtacccctacaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagcgtacggtggccgctccttccgtgttcatcttccctccctccgacgagcagctgaagtccggcaccgcctccgtggtgtgtctgctgaacaacttctaccctcgggaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccaggagtccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctccaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgtgaggtgacccaccagggcctgtccagccctgtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgctgaagctt
SEQ ID NO: 43
MGWSCIILFLVATATGVHSDIVMTQAAPSVAVTPGASVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRLSSLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 44
gctagcaccatgggctggagctgcatcatcctgttcctggtggccaccgccaccggcgtgcacagcgacatcgtgatgacccaggccgcccccagcgtggccgtgacccccggcgccagcgtgagcatcagctgccgcagcagcaagagcctgctgcacagcagcggcaagacctacctgtactggttcctgcagcgccccggccagagcccccagctgctgatctaccgcctgagcagcctggccagcggcgtgcccgaccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgccttcaccctgcgcatcagccgcgtggaggccgaggacgtgggcgtgtactactgcatgcagcacctggagtacccctacaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagcgtacggtggccgctccttccgtgttcatcttccctccctccgacgagcagctgaagtccggcaccgcctccgtggtgtgtctgctgaacaacttctaccctcgggaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccaggagtccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctccaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgtgaggtgacccaccagggcctgtccagccctgtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgctgaagctt
SEQ ID NO: 45
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLKESGPGLVAPSESLSITCTVSGFSLIDYGVNWIRQPPGKGLEWLGVIWGDGTTYYNPSLKSRLSISKDNSKSQVFLKVTSLTTDDTAMYYCARIVYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
SEQ ID NO: 46
gctagcaccatgggctggagctgcatcatcctgttcctggtggccaccgccaccggcgtgcacagccaggtgcagctgaaggagagcggccccggcctggtggcccccagcgagagcctgagcatcacctgcaccgtgagcggcttcagcctgatcgactacggcgtgaactggatccgccagccccccggcaagggcctggagtggctgggcgtgatctggggcgacggcaccacctactacaaccccagcctgaagagccgcctgagcatcagcaaggacaacagcaagagccaggtgttcctgaaggtgaccagcctgaccaccgacgacaccgccatgtactactgcgcccgcatcgtgtactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcgccgccagcaccaagggcccttccgtgttccctctggccccttgctcccggtccacctccgagtccaccgccgctctgggctgcctggtgaaggactacttccctgagcctgtgaccgtgtcctggaactctggcgccctgacctccggcgtgcacaccttccctgccgtgctgcagtcctccggcctgtactccctgtcctccgtggtgaccgtgccttcctcctccctgggcaccaagacctacacctgtaacgtggaccacaagccttccaacaccaaggtggacaagcgggtggagtccaagtacggccctccttgcccttcctgccctgcccctgagttcctgggcggacctagcgtgttcctgttccctcctaagcctaaggacaccctgatgatctcccggacccctgaggtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccaggaggaccctgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaacgccaagaccaagcctcgggaggagcagttcaattccacctaccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagaatacaagtgtaaggtctccaacaagggcctgccctcctccatcgagaaaaccatctccaaggccaagggccagcctagggagcctcaggtgtacaccctgcctcctagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtgaagggcttctacccttccgacatcgccgtggagtgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccacccctcctgtgctggactccgacggctccttcttcctgtactccaggctgaccgtggacaagtcccggtggcaggagggcaacgtcttttcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgtctctgggctgaagctt
SEQ ID NO: 47
MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLKESGPGLVAPGGSLSITCTVSGFSLIDYGVNWIRQPPGKGLEWLGVIWGDGTTYYNAPLKGRLSISKDNSKSQVFLQMNSLKTDDTAMYYCARIVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
SEQ ID NO: 48
gctagcaccatgggctggagctgcatcatcctgttcctggtggccaccgccaccggcgtgcacagcgaggtgcagctgaaggagagcggccccggcctggtggcccccggcggcagcctgagcatcacctgcaccgtgagcggcttcagcctgatcgactacggcgtgaactggatccgccagccccccggcaagggcctggagtggctgggcgtgatctggggcgacggcaccacctactacaacgcccccctgaagggccgcctgagcatcagcaaggacaacagcaagagccaggtgttcctgcagatgaacagcctgaagaccgacgacaccgccatgtactactgcgcccgcatcgtgtactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgccagcaccaagggcccttccgtgttccctctggccccttgctcccggtccacctccgagtccaccgccgctctgggctgcctggtgaaggactacttccctgagcctgtgaccgtgtcctggaactctggcgccctgacctccggcgtgcacaccttccctgccgtgctgcagtcctccggcctgtactccctgtcctccgtggtgaccgtgccttcctcctccctgggcaccaagacctacacctgtaacgtggaccacaagccttccaacaccaaggtggacaagcgggtggagtccaagtacggccctccttgcccttcctgccctgcccctgagttcctgggcggacctagcgtgttcctgttccctcctaagcctaaggacaccctgatgatctcccggacccctgaggtgacctgtgtggtggtggacgtgtcccaggaggaccctgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaacgccaagaccaagcctcgggaggagcagttcaattccacctaccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagaatacaagtgtaaggtctccaacaagggcctgccctcctccatcgagaaaaccatctccaaggccaagggccagcctagggagcctcaggtgtacaccctgcctcctagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtgaagggcttctacccttccgacatcgccgtggagtgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccacccctcctgtgctggactccgacggctccttcttcctgtactccaggctgaccgtggacaagtcccggtggcaggagggcaacgtcttttcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgtctctgggctgaagctt
SEQ ID NO: 49
ELLGG
SEQ ID NO: 50
MISRT
SEQ ID NO: 51
HHHHHH
SEQ ID NO: 52
PGKAPQLLIYRMSNL
SEQ ID NO: 53
PGKAPKLLIYAASSL
SEQ ID NO: 54
SLIDYGVNWIRQPPG
SEQ ID NO: 55
DIVMTQAAPSVAVTPGQSVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYWFLQHPGKAPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLTISGVQAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 56
QVQLQESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLIDYGVNWIRQPPGKGLEWLGVIWGDGTTYYNSALKSRLSISKDTSKSQVFLKMNSLTTDDTAMYYCARIVYWGQGTLVTVSAAK
SEQ ID NO: 57
QVQLQESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLIDYGVNWIRQPPGKGLEWLGVIWGDGTTYYPSALKSRLSISKDTSKSQVFLKMNSLTTDDTAMYYCARIVYWGQGTLVTVSAAK
SEQ ID NO: 58
RSSKSLLHSSGKTYLY
SEQ ID NO: 59
RMSNLAS
SEQ ID NO: 60
MQHLEYPYT
SEQ ID NO: 61
GFSLIDYGVN
SEQ ID NO: 62
VIWGDGTTY
SEQ ID NO: 63
IVY
SEQ ID NO: 64
RLSNLAS
SEQ ID NO: 65
RLSSNLAS
SEQ ID NO: 66
RMSNLA
SEQ ID NO: 67
RLSNLA
SEQ ID NO: 68
RLSSLA
SEQ ID NO: 69
RSSKSLLHSSGKTYLYW