Способ охлаждения и нагрева с постоянной скоростью протяженных калориметрических камер изотермического капиллярного дифференциального титрационного нанокалориметра, предназначенного для работы с короткоживущими объектами
COOLING AND HEATING METHOD WITH CONSTANT SPEED OF EXTENDED CALORIMETRIC CHAMBERS OF ISOTHERMAL CAPILLARY DIFFERENTIAL TITRATION NANOCALORIMETER INTENDED FOR OPERATION WITH SHORT-LIVED OBJECTS

Область применения способа: биохимия и физиология растений - исследование физиологических систем митохондрий, способных рассеивать энергию в виде тепла, биофизика - исследования в области митохондриальной термодинамики.
Исследование физиологических систем митохондрий растительных клеток в режиме сканирования по температуре, направленное на решение проблем устойчивости растений к низким температурам, позволит не только определить функции систем диссипации энергии в митохондриях растительной клетки, но и разработать технологии, направленные на повышение холодо- и морозоустойчивости растений.
Сканирующий режим необходим для выявления температурных областей, в которых в исследуемом образце происходят энергетические изменения, например, связанные с активацией систем, ответственных за термогенез и повышение температуры в митохондриях растений: альтернативной оксидазы за счет перехода неактивной окисленной формы в активную восстановленную и увеличения содержания α-кетокислот; митохондриального разобщающего белка PUMP (Plant Uncoupling Mitochondrial Protein) за счет увеличения количества свободных жирных кислот; стрессового белка холодового шока с мол. массой 310 кДа за счет перехода из неактивной формы в активную во время низкотемпературного стресса. Сканирующий режим обеспечит выявление указанных температурных диапазонов за один эксперимент вместо многократных рутинных экспериментов на изотермическом калориметре по выявлению теплопродукции только в отдельных температурных точках. Теоретический интерес к рассматриваемой проблеме тесно связан с ее важным практическим значением, так как открывает возможности повышения продуктивности и расширения ареала возделывания культурных растений путем поиска механизмов и соединений, снижающих неблагоприятное воздействие экстремальных факторов природной среды [1].
Калориметрия активно внедряется в исследовательскую практику. В работе [2] представлены экспериментальные исследования на калориметре ТАМ-III (ТА Instruments, США) митохондрий риса и отмечается перспективность использования калориметрии в исследованиях разных биологических феноменов клеточного и субклеточного уровня. В указанном приборе образец объемом 1 мл, содержащий 0.3 г митохондрий, размещается в закручивающейся ампуле объемом 4 мл. Чувствительность прибора 0.1 мкВт. В статье представлены кривые термогенеза в митохондриях риса в течение 80 часов. Исследуемый образец, содержащий митохондрии, хранился 15 часов при температуре 0-3°С. Представленные кривые не содержат информации о переходном процессе выхода на режим измерения с момента установки ампулы с образцом в калориметр и, соответственно, информации о возможном термогенезе в митохондриях на данном участке, что исключает возможность использования указанного прибора в калориметрических измерениях теплопродукции митохондрий, являющихся короткоживущим объектом.
В работах [3, 4, 5] сделано теоретическое обоснование реализации линейных режимов нагрева и охлаждения в капиллярном титрационном калориметре, которое обеспечивается благодаря тому, что при линейном изменении температуры экрана температура калориметрических камер изменяется с такой же скоростью, что подтверждено экспериментально в работе [6]. В ней показано, что перепад температур между верхней и нижней частями капиллярной калориметрической камеры при скорости нагрева 0.2 К/мин не превышает 0.1 К [6]. Указанный перепад температур позволяет применить способ в капиллярном калориметре с протяженными калориметрическими камерами. При этом считается, что тепловые контакты между шунтами и камерами, между пассивным тепловым шунтом и экраном камер являются идеальными, что при линейном изменении температуры экрана не возникает перепадов температуры по экрану камер. В патенте [7] приводятся термограммы при нагреве и охлаждении водного раствора poly(N-isopropylacrylamide), полученные на титрационном капиллярном калориметре, иллюстрирующие теоретическое обоснование. Термостатирующая оболочка калориметрических камер экспериментальной модели этого калориметра состояла из двух экранов: из экрана калориметрических камер и охлаждающего экрана, что не обеспечивало постоянную скорость охлаждения и нагрева протяженных калориметрических камер изотермического капиллярного дифференциального титрационного нанокалориметра, что выражалось в невоспроизводимости результатов измерений при проверке на образце водного раствора poly(N-isopropylacrylamide). Этот недостаток связан с влиянием температурных перепадов на охлаждающем экране и на других элементах калориметрического блока.
Аналог - калориметр ТАМ-III (ТА Instruments. США) не обеспечивает работу с короткоживущими объектами.
Аналог - титрационный калориметр [8] не обеспечивает работу с короткоживущими объектами и, кроме этого, не обеспечивает режим сканирования по температуре.
Титрационный калориметр [7], в котором реализован способ сканирования по температуре, не обладает требуемой воспроизводимостью результатов измерений, необходимой для практической работы.
Таким образом, эти аналоги не могут быть выбраны для реализации заявляемого способа, так как ни один из описанных выше калориметров не обеспечивает решение задачи заявляемого изобретения.
В качестве прибора для реализации заявляемого способа выбран калориметр [9, 10], который снабжен дополнительным экраном, расположенным между экраном камер и охлаждающим экраном, что обеспечивает требуемую воспроизводимость результатов измерений, необходимую для практической работы.
Задача изобретения: обеспечение нагрева и охлаждения с постоянной скоростью протяженных калориметрических камер изотермического капиллярного дифференциального титрационного нанокалориметра, предназначенного для работы с короткоживущими объектами.
Способ охлаждения и нагрева с постоянной скоростью протяженных калориметрических камер изотермического капиллярного дифференциального титрационного нанокалориметра, предназначенного для работы с короткоживущими объектами заключающийся в том, что обеспечивают равенство температуры калориметрических камер и температуры первого термостатирующего экрана в изотермическом режиме за счет теплопередачи между ними по пассивному шунту, температуру активного теплового шунта поддерживают равной температуре первого термостатирующего экрана с помощью автоматической системы регулирования температуры шунта, температуру второго термостатирующего экрана поддерживают на постоянном уровне, а температуру охлаждающего экрана поддерживают циркуляционным термостатом на заданном значении, при этом обеспечивают сканирующий режим охлаждения или нагрева калориметрических камер с помощью управления системой автоматического регулирования температуры первого экрана, а температурой второго термостатирующего экрана автоматически управляют с помощью системы автоматического регулирования температуры второго экрана с обеспечением заданной разницы температур между первым термостатирующим экраном и вторым термостатирующим экраном, при этом поддерживают необходимую разницу температур между вторым термостатирующим экраном и охлаждающим экраном, температуру которого изменяют за счет автоматического управления циркуляционным термостатом.
Очевидный способ управления температурой калориметра [8] предусматривает охлаждение ближайшего к калориметрическим камерам экрана элементами Пельтье, хотя это и усложняет калориметр. Квазистационарный режим охлаждения первого экрана в заявляемом способе не использует традиционного охлаждения первого экрана элементами Пельтье и, несмотря на простоту использованного заявленного способа, он обеспечивает в калориметре все температурные режимы калориметрических камер: изотермический, линейный нагрев, линейное охлаждение, в то время как калориметр [8] работает только в изотермическом режиме.
На фиг. 1 представлена функциональная схема капиллярного титрационного нанокалориметра, выбранного для реализации заявляемого способа. На основании нанокалориметра 1 установлены калориметрический блок 2 с центрующим фланцем 3, расположенным вертикально, и титрационный узел 4. Калориметрический блок 2 содержит рабочую 5 и эталонную 6 камеры, которые установлены перпендикулярно центрующему фланцу 3, с размещенными на них тепловыми шунтами: активным 7 и пассивным 8. Входящая в калориметрический блок термостатирующая оболочка состоит из экранов: первого термостатирующего 9, второго термостатирующего 10, охлаждающего 11 и шунтов: активного 7 и пассивного 8. Калориметрический блок снабжен защитным корпусом 12. Титрационный узел 4 состоит из дозирующих шприцов, заключенных в общий держатель 13, на котором установлены датчик температуры 14 держателя и элемент Пельтье 15 с теплообменником 16 для охлаждения горячих спаев. Указанный держатель установлен на подвижной платформе 17, которая служит для перемещения держателя шприцов 13 по направляющей 18. При этом направляющая 18 выполнена в виде уголка, который закреплен на центрующем фланце 3 перпендикулярно его плоскости в положении, при котором обеспечивается надежный прижим подшипников подвижной платформы 17 к направляющим плоскостям уголка благодаря действию сил, равнодействующей которых является сила веса подвижной платформы 17. Указанное расположение элементов обеспечивает требуемые условия для перемещения держателя шприцов 13, при котором дозирующие иглы 19 могут опускаться соосно калориметрическим камерам 5 и 6 на всю глубину камер, а также подниматься снизу до самого верха калориметрических камер. Перемещение подвижной платформы 17 обеспечивается винтовым механизмом с шаговым двигателем 20. Винтовой механизм 21 обеспечивает перемещение поршней 22 дозирующих шприцов, что позволяет производить инъекцию добавки в калориметрические камеры требуемой величины, от долей микролитров до десятков микролитров. В состав калориметра входят циркуляционный термостат 23, выход которого подключен к входному штуцеру змеевика охлаждения охлаждающего экрана 11, а входной штуцер указанного термостата 23 подключен к одному из штуцеров теплообменника 16 элемента Пельтье 15, другой штуцер которого подключен к выходному штуцеру змеевика охлаждения охлаждающего экрана 11.
Указанный капиллярный титрационный нанокалориметр снабжен измерителем мощности тепловых процессов, состоящим из измерительной термобатареи 24, связанной своим выходом с входом нановольтметра 25, который снабжен интерфейсом RS-232, связывающим нановольтметр с компьютером 26. На активном шунте установлен датчик температуры 27, на первом термостатирующем экране установлен датчик температуры 28, на втором термостатирующем экране установлен датчик температуры 29. Датчики температуры 27, 28, 29 и 14 подсоединены к многоканальному измерительному усилителю 30, связанному с компьютером 26, содержащим многоканальный АЦП NI PCIe 6341 и модуль счетчиков/таймеров NI PCI-6602, связанные с блоком усилителей мощности 31, соединенным с нагревателем 32 активного шунта, с нагревателем 33 первого термостатирующего экрана, с нагревателем 34 второго термостатирующего экрана, с шаговыми двигателями титрационного узла 20 и 21, с элементом Пельтье 15, установленном на держателе шприцов 13.
Капиллярный титрационный нанокалориметр, выбранный для реализации заявляемого способа, работает следующим образом. Тепловая мощность, для измерения которой предназначен предложенный калориметр, возникает в рабочей калориметрической камере следующим образом: например, в режиме введения добавки при движении дозирующей иглы в камеру в рабочей камере 5 реагент добавки выделяется из иглы непосредственно в объем камеры. Сигнал разбаланса по температуре между камерами поступает на вход цифрового нановольтметра 25. Практически во всех современных калориметрах для этих целей используются высокочувствительные цифровые вольтметры, имеющие интерфейс RS-232. При пороге чувствительности нановольтметра на уровне 2 нВ в современных калориметрах обеспечивается порог чувствительности по мощности порядка 50 нВт. Сигнал разбаланса тепловой мощности поступает на СОМ-порт компьютера 26, считывается управляющей программой, индицируется на экране управляющего компьютера и архивируется для дальнейшей обработки. В процессе опускания дозирующих игл в объем камеры реагент добавки распределяется равномерно по всей длине камеры. В рабочую камеру дозируется реагент добавки, а в эталонную камеру дозируется такое же количество нейтрального вещества (буфер и др.). Часть калориметрических камер ниже границы теплового шунта 8 является измерительным объемом. При прохождении сопла дозирующей иглы в зоне шунта 8 тепловой эффект от взаимодействия реагента добавки с образцом не дает вклад в сигнал от измеряемой тепловой мощности, так как полностью шунтируется в системе шунтов 7 и 8.
Введение добавок осуществляется следующим образом: при введении дозы производится продольное перемещение держателя шприцов 13 на всю длину калориметрических камер винтовым механизмом, управляемым шаговым двигателем 20. Одновременно с этим производится перемещение связанных пластиной штоков поршней 22 винтовым механизмом, управляемым шаговым двигателем 21. За счет различной величины перемещений винтовых механизмов шприцами осуществляется дозирование заданного количества реагентов. Управление шаговыми двигателями 20 и 21 осуществляется компьютером 26. При этом добавка распределяется в исследуемом образце по всей длине рабочего объема калориметрической камеры в виде тонкого слоя. В процессе эксперимента добавка может вводиться многократно.
Термостатирование калориметрических камер обеспечивается термостатирующей оболочкой, состоящей из экранов: первого термостатирующего 9, второго термостатирующего 10, охлаждающего 11, и тепловыми шунтами 7 и 8, на которых соответственно установлены датчики температуры 27, 28 и 29, подключенные к многоканальному измерительному усилителю 30. Температура термостатирующей оболочки и активного теплового шунта автоматически регулируется по сигналам датчиков соответственно 27, 28 и 29, связанных с компьютером через многоканальный измерительный усилитель. Сигналы с усилителя 30 поступают в компьютер на многоканальный АЦП NI PCIe 6341. Сформированные сигналы ШИМ с выходов таймеров модуля NI PCI-6602 подаются в нагреватели термостатирующей оболочки и нагреватель шунта через усилитель мощности, обеспечивая автоматическое регулирование температуры в соответствии с уставкой, заданной на компьютере.
При реализации заявляемого способа в выбранном для этого калориметре режим охлаждения нанокалориметра в сканирующем режиме обеспечивается следующим образом. Устанавливается температура начальной точки температурного сканирования путем выполнения следующих операций: температура первого экрана автоматически переводится в начальную точку, температура второго экрана, который установлен между первым экраном и охлаждающим экраном, автоматически переводится на температуру ниже температуры первого экрана на заданную величину, а температура внешнего экрана автоматически устанавливается циркуляционным термостатом ниже температуры второго экрана на требуемую величину. В процессе линейного охлаждения первого экрана уменьшаются в автоматическом режиме температуры экранов с одинаковой скоростью с сохранением установленных температурных перепадов между ними. Таким образом, охлаждение осуществляется в квазистационарном режиме, характеризующимся минимальными возмущениями, действующими на системы регулирования первого экрана и второго экрана, что исключает возникновение возмущающих воздействий из внешней среды и обеспечивает линейное изменение температуры первого экрана. При достижении конечной точки охлаждения прекращается изменение уставок всех регуляторов экранов и калориметр переходит в изотермический режим в достигнутой конечной точке.
Режим линейного нагрева калориметрических камер осуществляется аналогично и отличается от режима охлаждения тем, что во время сканирования осуществляется линейное увеличение температуры регулируемых объектов.
На фиг. 2 показана термограмма базовой линии в режиме охлаждения от 18 до 5°С со скоростью 0.1 К/мин протяженных калориметрических камер изотермического капиллярного дифференциального титрационного нанокалориметра, предназначенного для работы с короткоживущими объектами, что подтверждает решение задачи изобретения с использованием указанного калориметра. Термограмма снята на максимальной чувствительности (коэффициент преобразования равен 83 нВ/мкВт), при которой получены экспериментальные данные, представленные в работе [11]. Кривая 1 - термограмма базовой линии нанокалориметра, кривая 2 - температура калориметрических камер в режиме охлаждения, Р - тепловая мощность, зарегистрированная нанокалориметром и возникшая из-за технологического различия масс эталонной и рабочей камер. Величина Р сохраняется постоянной на интервале охлаждения камер и равна нулю в изотермическом режиме. Это указывает на то, что охлаждение калориметрических камер от 18 до 5°С произведено в линейном режиме.
Заявленный способ позволит в одном эксперименте получать не только данные о термодинамике взаимодействия изучаемых систем, но и полное термодинамическое описание нативного состояния биомолекул и их промежуточных состояний, которые проявляются под воздействием температурного сканирования.
Литература
1. Войников В.К. Митохондрии растений при температурном стрессе. - Новосибирск: Академическое издательство ГЕО, 2011. - 163 с.
2. Studies on the energy release of rice mitochondria under different conditions by means of microcalorimetry Zhou P.-J., Zhou H.-T., Liu Y., Qu S.-S., Zhu Y.-G., Wu Z.-B. // Journal of Biochemical and Biophysical Methods. - 2001.- Vol. 48.- P. 1-11.
3. METHOD OF SEPARATING THE SENSITIVE VOLUME OF CALORIMETRIC CELLS IN A DIFFERENTIAL TITRATION CALORIMETER / G.V. Kotelnikov, S.P. Moiseyeva. E.V. Mezhburd and V.P. Krayev // Journal of Thermal Analysis and Calorimetry.-2000. - Vol. 62. - P. 39-50.
4. New isothermal titration calorimeter for investigations on very small samples. Theoretical and experimental studies / Kotelnikov G.V., Moiseyeva S.P., Mezhburd E.V., Krayev V.P. // Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. - 2002. - Vol. 68(3).- P. 803-818.
5. MODULATED CAPILLARY TITRATION CALORIMETER Theoretical and experimental studies / G.V. Kotelnikov, S.P. Moiseyeva and E.V. Mezhburd // Journal of Thermal Analysis and Calorimetry.- 2008.-Vol. 92(2).-P. 631-634.
6. Котельников Г.В., Моисеева С.П. МОДУЛЯЦИОННЫЙ НАНОКАЛОРИМЕТР В ИССЛЕДОВАНИЯХ ТЕРМИЧЕСКОЙ ДЕНАТУРАЦИИ БЕЛКОВ // Научное приборостроение. - 2015. - Т. 25(2). - С. 40-44.
7. Патент РФ 2347201 МПК G01K 17/00 (2006.01) СПОСОБ ИЗМЕРЕНИЯ ТЕПЛОВОЙ МОЩНОСТИ НА КАПИЛЛЯРНОМ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОМ ТИТРАЦИОННОМ КАЛОРИМЕТРЕ / Котельников Г.В., Моисеева С.П. // Бюллетень Изобретения. Полезные модели. - Москва: ФГУ ФИПС, 2009. - 5.
8. Patent U.S. 8,449,175, Int.CI.6: G01K 17/00, B01L 3/02, G01N 25/20. Isothermal titration microcalorimeter apparatus and method of use / Plotnikov V.V. and A. Rochalski - 6p.: fig. 6.
9. Патент РФ №2618670 МПК G01K 17/00 (2006.01), G01N 25/20 (2006.01), G01N 25/48 (2006.01), G01N 35/10 (2006.01) Капиллярный титрационный калориметр для исследования митохондрий / Котельников Г.В., Моисеева С.П., Ласуков Ю.И. // Бюллетень Изобретения. Полезные модели. - Москва: ФГУ ФИПС, 2017. - 13.
10. КАЛОРИМЕТРИЧЕСКИЕ ИЗМЕРЕНИЯ ТЕПЛОПРОДУКЦИИ В МИТОХОНДРИЯХ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК / С.П. Моисеева, Г.В. Котельников, О.И. Грабельных, Т.П. Побежимова, В.К. Войников // Научное приборостроение. - 2018. - Т. 28(3).-С. 21-23.
11. Калориметрические измерения тепловых процессов при трансформации и диссипации энергии в митохондриях / Г.В. Котельников, С.П. Моисеева, Е.В. Гришина, Е.И. Маевский // Приоритетные направления развития науки и технологий: тезисы докладов XV всероссийской научно-техн. конф.; под общ. ред. В.М. Панарина. - Тула: Инновационные технологии. - 2014. - с. 21-27.