ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЕВЫХ НУКЛЕИНОВОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ПУТЕМ РАСЩЕПЛЕНИЯ ЗОНДИРУЮЩЕГО ОЛИГОНУКЛЕОТИДА И ГИБРИДИЗАЦИИ
DETERMINATION OF TARGET NUCLEIC ACID SEQUENCES BY SPLITTING OLIGONUCLEOTIDE PROBE AND HYBRIDISATION

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке.
СВЕДЕНИЯ О РОДСТВЕННОМ УРОВНЕ ТЕХНИКИ
Основанные на гибридизации ДНК технологии были бы чрезвычайно полезным средством в определении конкретной нуклеиновокислотной последовательности и были бы, несомненно, необходимы в области клинической диагностики, генетических исследований и лабораторной судебно-медицинской экспертизы. Помимо гибридизационных способов с использованием зондов были предложены различные подходы с использованием дополнительных ферментативных реакций, например, способ с применением TaqMan™ -зондов.
В способе с применением TaqMan™-зондов меченый зонд, гибридизованный с нуклеиновокислотными последовательностями-мишенями, расщепляется под действием 5′-нуклеазной активности ДНК-полимеразы, зависимой от располагающегося "вверх по течению" праймера (патенты США №№ 5210015, 5538848 и 6326145). Высвобождение меченого фрагмента указывает на расщепление зонда, в конечном итоге указывая на присутствие последовательностей-мишеней. Детекцию этого меченого фрагмента можно осуществить, используя анализ по размеру, такой как гель-электрофорез, седиментация в градиентах, гель-проникающая хроматография и гомохроматография. Расщепление зондов может быть осуществлено в режиме реального времени с использованием системы двух взаимодействующих меток.
Согласно способу с применением TaqMan™-зондов предлагается два подхода для генерации сигнала: зависимое от полимеризации расщепление и независимое от полимеризации расщепление. При зависимом от полимеризации расщеплении удлинение располагающегося "вверх по течению" праймера должно происходить до того, как полимераза нуклеиновых кислот встретится с 5′-концом меченого зонда. По мере продолжения реакции удлинения полимераза постепенно расщепляет 5′-конец меченого зонда. При независимом от полимеризации расщеплении располагающийся "вверх по течению" праймер и меченый зонд гибридизуются с нуклеиновой кислотой-мишенью в непосредственной близости, так что связывание полимеразы нуклеиновых кислот с 3′-концом располагающегося "вверх по течению" праймера приводит ее в контакт с 5′-концом меченого зонда, результатом чего является высвобождение метки. Кроме того, в способе с применением TaqMan™ -зондов описывается, что меченый зонд, имеющий на своем 5′-конце 5′-хвостовой участок, не гибридизующийся с последовательностями-мишенями, также расщепляется с образованием фрагмента, содержащего данный 5′-хвостовой участок.
Сообщалось о некоторых способах, в которых зонды, имеющие 5′-хвостовой участок, некомлементарный последовательностям-мишеням, расщепляются под действием 5′-нуклеазы с высвобождением фрагмента, содержащего данный 5′-хвостовой участок, и детекцию мишени осуществляют с использованием фрагмента, содержащего данный 5′-хвостовой участок.
Например, в патенте США № 5691142 описывается расщепляемая структура, которая должна перевариваться под действием 5′-нуклеазной активности ДНК-полимеразы. Приводится пример данной расщепляемой структуры, в которой олигонуклеотид, содержащий 5′-концевой участок, некомплементарный матрице, и 3′-концевой участок, комплементарный матрице, гибридизуется с данной матрицей, и в непосредственной близости, с этой матрицей гибридизуется располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид. Такая расщепляемая структура расщепляется ДНК-полимеразой, обладающей 5′-нуклеазной активностью, или модифицированной ДНК-полимеразой со сниженной способностью к синтезу с высвобождением 5′-концевого участка, некомплементарного данной матрице. Высвободившийся 5′-концевой участок далее гибридизуется с олигонуклеотидом, имеющим шпилечную структуру с образованием расщепляемой структуры, индуцируя ввиду этого прогрессирующие реакции расщепления, необходимые для детекции последовательностей-мишеней.
В патенте США № 7381532 описывается способ, в котором расщепляемая структура, содержащая располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид с блокированным 3′-концом, расщепляется ДНК-полимеразой, обладающей 5′-нуклеазной активностью, или нуклеазой FEN (флэп-эндонуклеазой) с высвобождением некомплементарного 5′-концевого одноцепочечного "свисающего" участка (флэпа), и детекцию этого высвободившегося 5′-концевого "свисающего" участка осуществляют, используя анализ по размеру или систему двух взаимодействующих меток.
В публикации заявки на патент США 2008/0241838 описывается способ детекции мишени с использованием расщепления зондов с одиночной меткой, имеющих 5′-концевой участок, некомплементарный мишени, и зондов захвата, иммобилизованных на твердой подложке. Одиночная метка расположена на некомплементарном 5′-концевом участке меченого зонда. Меченые зонды, гибридизованные с мишенью, расщепляются с высвобождением фрагментов, после чего эти фрагменты далее гибридизуются с зондами захвата для детекции присутствия последовательности-мишени. В этом способе необходимо, чтобы нерасщепленный/интактный зонд не гибридизовался с зондом захвата. Чтобы это осуществить данным способом, необходимо предотвратить гибридизацию нерасщепленного целевого зонда (target probe) с иммобилизованным зондом захвата посредством регулирования ориентации иммобилизуемого олигонуклеотида при его иммобилизации и расстояния от него до поверхности твердой подложки. Однако такое ограничение приводит к снижению эффективности гибридизации на твердой подложке и к затруднениям в оптимизации реакционных условий.
m
m
m
В публикации заявки на патент США 2008/0193940 также описывается способ детекции мишени с использованием зондов, в составе которых имеется некомплементарная мишени последовательность (последовательность, содержащую тег (или маркировку; tag) или "свисающий" участок (флэп)), а также зондов захвата, иммобилизованных на твердых подложках. Метка также располагается на некомплементарном участке зондов. Нерасщепленные зонды образуют шпилечную структуру и не гибридизуются с зондами захвата. В противоположность этому когда зонды расщепляются, содержащие метку фрагменты далее гибридизуются с зондами захвата, тем самым осуществляется детекция присутствия нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней. Однако, имеются серьезные проблемы, связанные с необходимостью тщательного контроля реакционных условий, при рассмотрении величины Т для гибридизации последовательностей-мишеней с зондами, а также при рассмотрении величины Тдля шпилечной структуры нерасщепленных зондов, равно как и величины Т для гибридизации расщепленных фрагментов с зондами захвата.
Таким образом, в данной области сохраняется давно назревшая необходимость в разработке новых подходов к детекции последовательности-мишени на твердой фазе, в частности, лишенных недостатков традиционных технологий, посредством использования зондов, несущих содержащую тег последовательность, и зондов захвата, иммобилизованных на твердых подложках.
По всей этой заявке сделаны ссылки на различные патенты и публикации, и упоминания о них приведены в круглых скобках. Тем самым описание этих патентов и публикаций во всей своей полноте включено в эту заявку посредством ссылок с целью более полного описания данного изобретения и состояния области, к которой это изобретение имеет отношение.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования с целью разработки новых подходов для детекции последовательностей-мишеней, характеризующихся более высокой точностью и удобством, помимо прочего, в режиме множественной детекции. В результате авторы изобретения разработали новые протоколы для детекции последовательностей-мишеней с использованием зондирующего олигонуклеотида (РО) и захватывающего олигонуклеотида (СО), в которых детекция мишени осуществляется посредством реакции расщепления зонда и дополнительной гибридизации зонда (то есть, 5′-нуклеолитической реакции с участием РО и реакции гибридизации между расщепленным/нерасщепленным РО и СО). Протоколы по настоящему изобретению с резко повышенной специфичностью к мишени хорошо адаптированы к реакциям на твердой фазе, и это дает возможность осуществлять множественную детекцию последовательностей-мишеней с более высокой точностью и более удобным образом.
Соответственно, данным изобретением решается задача разработки способа детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке.
Другой задачей данного изобретения является разработка набора для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке.
Другие задачи и преимущества настоящего изобретения станут очевидны из следующего далее подробного описания в сочетании с прилагаемой формулой изобретения и графическими материалами.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На Фиг. 1 схематически показаны структуры РО (зондирующего олигонуклеотида (probing oligonucleotide)) и СО (захватывающего олигонуклеотида (capturing oligonucleotide)), использованных в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО). РО включает нетегированный (т.е. немаркированный; англ. non-tagged) РО и тегированный РО, который далее подразделяют на 3′-тегированный РО и 5′-тегированный РО. Предпочтительно 3′-конец РО блокируют, чтобы не допустить его удлинения (Фиг. 1А). СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО. СО иммобилизуют на твердой подложке через его 3′-конец или 5′-конец. Предпочтительно 3′-конец СО, иммобилизованного через 5′-конец, блокируют, чтобы не допустить его удлинения (Фиг. 1В).
На Фиг. 2 схематически представлен РОСН-анализ с использованием нетегированного РО, имеющего одиночную флуоресцентную метку на 5′-конце своего узнающего мишень участка (targeting portion).
На Фиг. 3 схематически представлен РОСН-анализ с использованием нетегированного РО, имеющего одиночную флуоресцентную метку на 3′-конце своего узнающего мишень участка.
На Фиг. 4 схематически представлен РОСН-анализ с использованием 3′-тегированного РО, имеющего одиночную флуоресцентную метку на 5′-конце своего узнающего мишень участка.
На Фиг. 5 схематически представлен РОСН-анализ с использованием 5′-тегированного РО, имеющего одиночную флуоресцентную метку на 3′-конце своего узнающего мишень участка.
На Фиг. 6 схематически представлен РОСН-анализ с использованием 5′-тегированного РО, имеющего одиночную флуоресцентную метку на 3′-конце своего узнающего мишень участка, и СО, дополнительно содержащего матричный участок (templating portion), служащий в качестве матрицы для удлинения тегирующего участка (tagging portion), гибридизованного с СО.
На Фиг. 7 схематически представлен РОСН-анализ с использованием нетегированного РО, имеющего донорную молекулу и акцепторную молекулу в системе двух взаимодействующих меток, для измерения сигнала от акцепторной молекулы. Донорная молекула и акцепторная молекула локализованы таким образом, что сигнал от донорной молекулы гасится акцепторной молекулой при образовании дуплекса нерасщепленный РО/СО.
На Фиг. 8 схематически представлен РОСН-анализ с использованием 3′-тегированного РО, имеющего донорную молекулу и акцепторную молекулу в системе двух взаимодействующих меток, для измерения сигнала от акцепторной молекулы. Донорная молекула и акцепторная молекула локализованы таким образом, что сигнал от донорной молекулы гасится акцепторной молекулой при образовании дуплекса нерасщепленный РО/СО.
На Фиг. 9 схематически представлен РОСН-анализ с использованием 5′-тегированного РО, имеющего донорную молекулу и акцепторную молекулу в системе двух взаимодействующих меток, для измерения сигнала от акцепторной молекулы. Донорная молекула и акцепторная молекула локализованы таким образом, что сигнал от донорной молекулы гасится акцепторной молекулой при образовании дуплекса нерасщепленный РО/СО.
На Фиг. 10 схематически представлен РОСН-анализ с использованием нетегированного РО, имеющего донорную молекулу и акцепторную молекулу в системе двух взаимодействующих меток, для измерения сигнала от донорной молекулы. Донорная молекула и акцепторная молекула локализованы таким образом, что сигнал от донорной молекулы не гасится акцепторной молекулой при образовании дуплекса нерасщепленный РО/СО.
На Фиг. 11 схематически представлен РОСН-анализ с использованием 3′-тегированного РО, имеющего донорную молекулу и акцепторную молекулу в системе двух взаимодействующих меток, для измерения сигнала от донорной молекулы. Донорная молекула и акцепторная молекула локализованы таким образом, что сигнал от донорной молекулы гасится акцепторной молекулой при образовании дуплекса нерасщепленный РО/СО.
На Фиг. 12 схематически представлен РОСН-анализ с использованием 5′-тегированного РО, имеющего донорную молекулу и акцепторную молекулу в системе двух взаимодействующих меток, для измерения сигнала от донорной молекулы. Донорная молекула и акцепторная молекула локализованы таким образом, что сигнал от донорной молекулы гасится акцепторной молекулой при образовании дуплекса нерасщепленный РО/СО.
На Фиг. 13 схематически представлен РОСН-анализ с использованием интеркалирующего агента.
На Фиг. 14 представлены результаты детекции мишени посредством РОСН-анализа с использованием нетегированного РО с одиночной меткой.
На Фиг. 15 представлены результаты детекции мишени посредством РОСН-анализа с использованием 3′-тегированного РО с одиночной меткой.
На Фиг. 16 представлены результаты детекции мишени посредством РОСН-анализа с использованием 5′-тегированного РО с одиночной меткой.
На Фиг. 17 представлены результаты детекции мишени посредством РОСН-анализа с использованием 3′-тегированного РО с двойной меткой.
На Фиг. 18 представлены результаты детекции мишени посредством РОСН-анализа с использованием ПЦР-амплификации. РО представляет собой нетегированный РО с одиночной меткой.
На Фиг. 19 представлены результаты детекции мишени посредством РОСН-анализа с использованием ПЦР-амплификации. РО представляет собой 3′-тегированный РО с одиночной меткой.
На Фиг. 20 представлены результаты детекции в режиме реального времени нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней посредством РОСН-анализа с использованием 3′-тегированного РО с одиночной меткой. На Фиг. 20А показаны флуоресцентные изображения в зависимости от числа циклов при РОСН-анализе, а на Фиг. 20В показано изменение интенсивности флуоресценции в зависимости от числа циклов при РОСН-анализе.
На Фиг. 21 схематически представлен РОСН-анализ с использованием 5′-тегированного РО для детекции одиночной нуклеотидной вариации.
На Фиг. 22 схематически представлен РОСН-анализ с использованием 5′-тегированного РО, имеющего искусственный некомплементарный нуклеотид (mismatch nucleotide) в качестве группировки, не подходящей для спаривания оснований (non-base pairing moiety), с целью детекции одиночной нуклеотидной вариации.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ДАННОГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования с целью разработки новых подходов для детекции последовательностей-мишеней, характеризующихся более высокой точностью и удобством, помимо прочего, в режиме множественной детекции. В результате авторы изобретения разработали новые протоколы для детекции последовательностей-мишеней с использованием зондирующего олигонуклеотида (РО) и захватывающего олигонуклеотида (СО), в которых детекция мишени осуществляется посредством реакции расщепления зонда и дополнительной гибридизации зонда (то есть, 5′-нуклеолитической реакции с участием РО и реакции гибридизации между расщепленным/нерасщепленным РО и СО). Протоколы по настоящему изобретению с резко повышенной специфичностью к мишени хорошо адаптированы к реакциям на твердой фазе, и это дает возможность осуществлять множественную детекцию последовательностей-мишеней с более высокой точностью и более удобным образом.
Настоящее изобретение относится к новому протоколу для детекции последовательностей-мишеней на твердой подложке с использованием комбинации РО и СО.
Основополагающий принцип настоящего изобретения состоит в детекции наличия расщепления РО посредством использования СО, иммобилизованного на твердой подложке. Помимо этого, следует отметить, что, когда в образце отсутствует последовательность-мишень, нерасщепленный РО гибридизуется с СО, иммобилизованным на твердой подложке. Согласно настоящему изобретению, окончательный подлежащий измерению сигнал будет различным в зависимости от того, образуется или нет дуплекс - нерасщепленный РО/СО, что может указывать на присутствие или отсутствие последовательности-мишени.
В настоящем изобретении выполняют детекцию последовательности-мишени в соответствии с описанным выше принципом осуществления, и изобретение подразделяют на три воплощения в зависимости от выбранных систем меток.
Настоящее изобретение будет изложено ниже в данном описании более подробно.
I. Способ детекции мишени посредством РОСН с использованием одиночной метки
В одном из аспектов настоящего изобретения предложен способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке, включающий:
(a) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и зондирующим олигонуклеотидом (РО); при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО содержит узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО имеет одиночную метку; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РО; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РО ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РО; при этом, когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, происходит расщепление РО под действием фермента, обладающего 5′-нуклеазной активностью, с получением содержащего одиночную метку фрагмента;
(c) осуществление реакции гибридизации путем приведения в контакт продукта со стадии (b) с захватывающим олигонуклеотидом (СО), иммобилизованным на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО; причем реакцию гибридизации проводят в таких условиях, что содержащий одиночную метку фрагмент не гибридизуется с СО, а нерасщепленный РО гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО; и
(d) детекцию наличия расщепления РО путем измерения сигнала от одиночной метки на твердой подложке; тем самым наличие расщепления РО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
Предложено осуществлять определение присутствия последовательности-мишени посредством гибридизации отщепленного фрагмента целевого зонда с олигонуклеотидом, иммобилизованным на твердой подложке (см. публикации заявок на патент США №№2008/0241838 и 2008/0193940). Согласно традиционному способу присутствие или отсутствие последовательности-мишени определяют только посредством гибридизации расщепленного зонда с олигонуклеотидом, иммобилизованным на твердой подложке. Нерасщепленный зонд не вовлекается в гибридизацию с иммобилизованным олигонуклеотидом. Чтобы это осуществить традиционным способом, необходимо предотвратить гибридизацию нерасщепленного целевого зонда с иммобилизованным олигонуклеотидом путем конструирования целевого зонда с тегирующим участком таким образом, чтобы он имел шпилечную структуру, или посредством регулирования ориентации иммобилизуемого олигонуклеотида при его иммобилизации и расстояния от него до поверхности твердой подложки.
Традиционный способ, требующий наличия целевого зонда, имеющего шпилечную структуру, обладает серьезными недостатками, заключающимися в том, что конструкция целевого зонда и реакционные условия должны быть определены с учетом как условий гибридизации между целевым зондом, имеющим шпилечную структуру, и последовательностью-мишенью, так и условий, при которых не происходит гибридизация между целевым зондом и иммобилизованным олигонуклеотидом. Таким образом, традиционные способы являются очень неудобными и непрактичными с точки зрения конструирования целевого зонда и иммобилизованного олигонуклеотида и определения реакционных условий.
В отличие от традиционных способов согласно настоящему изобретению используется гибридизация между нерасщепленным РО и иммобилизованным СО, не имеющая недостатков, характерных для традиционных способов.
Согласно настоящему изобретению, окончательный подлежащий измерению сигнал, указывающий на присутствие или отсутствие последовательности-мишени, будет различным в зависимости от того, гибридизуется с СО, иммобилизованным на твердой подложке, отщепленный фрагмент РО, или с иммобилизованным СО гибридизуется нерасщепленный РО.
Поэтому способ по настоящему изобретению называется "Анализ с расщеплением и гибридизацией РО (РОСН)".
Настоящее изобретение будет описано более подробно далее.
Стадия (а). Гибридизация располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида и РО с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью
Согласно настоящему изобретению нуклеиновокислотная последовательность-мишень сначала гибридизуется с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и РО (зондирующим олигонуклеотидом).
Используемый в данном описании термин "нуклеиновая кислота-мишень", "нуклеиновокислотная последовательность-мишень" или "последовательность-мишень" относится к представляющей интерес для детекции нуклеиновокислотной последовательности, на которой отжигают зонд или праймер, либо которую гибридизуют с зондом или праймером в условиях гибридизации, отжига или амплификации.
Согласно предпочтительному воплощению располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер или располагающийся "вверх по течению" зонд.
РО, используемый в настоящем изобретении, предпочтительно представляет собой зонд.
Используемый в данном описании термин "зонд" относится к молекуле одноцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащей участок или участки, по существу комплементарный(ые) нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
Термин "праймер", как он использован в данном описании, относится к олигонуклеотиду, который способен действовать в качестве точки инициации синтеза в случае его помещения в условия, при которых индуцируется синтез продукта удлинения праймера, комплементарного цепи нуклеиновой кислоты (матрице), т.е. в присутствии нуклеотидов и агента для полимеризации, такого как ДНК-полимераза, и при подходящих значениях температуры и рН. Предпочтительно праймер представляет собой молекулы одноцепочечных дезоксирибонуклеотидов.
Зонды или праймеры, используемые в данном изобретении, могут содержать природный dNMP (дезоксинуклеозид-монофосфат) (т.е. dAMP, dGMP, dCMP и dTMP), модифицированный нуклеотид или неприродный нуклеотид. Зонды или праймеры также могут включать рибонуклеотиды.
Праймер должен иметь достаточную длину, чтобы праймировать синтез продуктов удлинения в присутствии агента для полимеризации. Точная длина праймеров будет зависеть от многих факторов, включая температуру способ применения и источник праймера. Термин "отжиг" или "праймирование ", как он использован в данном описании, относится к присоединению олигодезоксинуклеотида или нуклеиновой кислоты к являющейся матрицей нуклеиновой кислоте, при этом данное присоединение позволяет полимеразе осуществлять полимеризацию нуклеотидов с образованием молекулы нуклеиновой кислоты, которая комплементарна нуклеиновой кислоте, являющейся матрицей, или ее части.
Термин "гибридизация", используемый в данном описании, относится к образованию двухцепочечной нуклеиновой кислоты из комплементарных одноцепочечных нуклеиновых кислот. Гибридизация может осуществляться между двумя цепями нуклеиновой кислоты, полностью сопоставимыми или в значительной степени сопоставимыми при некотором количестве ошибочных спариваний. Комплементарность, необходимая для гибридизации, может зависеть от условий гибридизации, в частности от температуры.
Гибридизация нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и РО может быть осуществлена в подходящих условиях гибридизации, определенных в установленном порядке путем оптимизации методик. Такие условия, как температура, концентрация компонентов, продолжительность гибридизации и промывки, компоненты буферов, их рН и ионная сила, могут быть изменены в зависимости от различных факторов, включая длину и GC-состав олигонуклеотида (располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида и РО) и нуклеотидных последовательностей-мишеней. Например, когда используется относительно короткий олигонуклеотид, предпочтительно, чтобы были приняты условия низкой жесткости. Подробные условия гибридизации можно найти в Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); и M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc., N.Y. (1999).
He предполагается различия между терминами "отжиг" и "гибридизация", и эти термины будут использованы взаимозаменяемо.
Располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид и РО содержат гибридизующиеся нуклеотидные последовательности, комплементарные нуклеиновокислотной последовательности-мишени. Термин "комплементарный" используется в данном описании для указания на то, что праймеры или зонды являются в достаточной степени комплементарными, чтобы селективно гибридизоваться с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью в намеченных условиях отжига или в жестких условиях, охватывая термины "по существу комплементарный" и "полностью комплементарный", предпочтительно "полностью комплементарный".
Используемый в данном описании термин "зондирующий олигонуклеотид (РО)" означает олигонуклеотид, содержащий узнающий мишень участок, служащий в качестве зонда,
Согласно предпочтительному воплощению РО включает нетегированный РО без тегирующего участка, имеющего нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и тегированный РО с тегирующим участком, имеющим нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени (Фиг. 1А).
Согласно предпочтительному воплощению РО представляет собой 3′-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 3′-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, или 5′-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 5′-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени (Фиг. 1А).
Тегирующий участок РО предпочтительно представляет собой тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени. Термин "некомплементарный" используется в данном описании для указания на то, что праймеры или зонды являются в достаточной степени некомплементарными, чтобы не гибридизоваться селективно с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью в намеченных условиях отжига или в жестких условиях, охватывая термины "по существу некомплементарный" и "полностью некомплементарный", предпочтительно "полностью некомплементарный".
Предпочтительно тегированный РО используется для селективной гибридизации с СО благодаря наличию тегирующего участка.
Для РО не предусматривается какой-либо конкретной длины. Нетегированный РО может иметь любую длину, достаточную для специфической гибридизации с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, например, его длина может составлять 10-60 нуклеотидов, 10-50 нуклеотидов, 10-40 нуклеотидов, 10-30 нуклеотидов, 15-60 нуклеотидов, 15-50 нуклеотидов, 15-40 нуклеотидов, 15-30 нуклеотидов, 20-60 нуклеотидов, 20-50 нуклеотидов, 20-40 нуклеотидов или 20-30 нуклеотидов. Тегированный РО может иметь длину 15-80 нуклеотидов, 15-60 нуклеотидов, 15-40 нуклеотидов, 20-80 нуклеотидов, 20-60 нуклеотидов, 20-40 нуклеотидов, 30-80 нуклеотидов, 30-60 нуклеотидов или 30-40 нуклеотидов. Узнающий мишень участок РО может быть любой длины при условии, что он специфически гибридизуется с нуклеиновокислотными последовательностями-мишенями. Например, длина узнающего мишень участка РО может составлять 10-50 нуклеотидов, 10-40 нуклеотидов, 10-30 нуклеотидов, 15-50 нуклеотидов, 15-40 нуклеотидов, 15-30 нуклеотидов, 20-50 нуклеотидов, 20-40 нуклеотидов или 20-30 нуклеотидов. Тегирующий участок тегированного РО может быть любой длины при условии, что он специфически гибридизуется с СО. Например, длина тегирующего участка РО может составлять 5-50 нуклеотидов, 5-40 нуклеотидов, 5-30 нуклеотидов, 5-20 нуклеотидов, 10-50 нуклеотидов, 10-40 нуклеотидов, 10-30 нуклеотидов, 10-20 нуклеотидов, 15-50 нуклеотидов, 15-40 нуклеотидов, 15-30 нуклеотидов или 15-20 нуклеотидов.
На 3′-конце РО может находиться группа 3′-ОН. Предпочтительно 3′-конец РО "блокируют", чтобы не допустить его удлинения.
Блокирование может быть достигнуто традиционными методами. Например, блокирование можно осуществить путем добавления к 3′-гидроксильной группе последнего нуклеотида химической группировки, такой как биотин, метка, фосфатная группа, алкильная группа, ненуклеотидный линкер, фосфоротионат или алкандиол. Альтернативно, блокирование может быть выполнено посредством удаления 3′-гидроксильной группы последнего нуклеотида или путем использования нуклеотида, лишенного 3′-гидроксильной группы, такого как дидезоксинуклеотид.
m
Альтернативно, РО может быть сконструирован так, чтобы принимать такую вторичную структуру, как шпилечная структура. Поскольку в настоящем изобретении нерасщепленный РО гибридизуется с олигонуклеотидами, иммобилизованными на твердой подложке, шпилечная структура должна быть сконструирована таким образом, чтобы не препятствовать гибридизации нерасщепленного РО с иммобилизованным СО. Предпочтительно шпилечная структура РО имеет величину Т меньше таковой у дуплекса, образованного между нерасщепленным РО и иммобилизованным СО.
Между тем, в соответствии с традиционным методом, для детекции последовательности-мишени посредством применения реакции расщепления целевого зонда, имеющего тегирующий участок, и гибридизации с олигонуклеотидом, иммобилизованным на твердой подложке, необходимо, чтобы целевой зонд имел шпилечную структуру, препятствующую гибридизации нерасщепленного целевого зонда с иммобилизованным олигонуклеотидом.
Когда используют тегированный РО, гибридизацию с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью осуществляют в жестких условиях, при которых его узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а его тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью. Фраза "тегирующий участок РО не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью" означает, что он не образует стабильного дуплекса с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью в условиях конкретно определенной жесткости. Предпочтительно тегирующий участок тегированного РО не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, оставаясь в виде одиночной цепи.
Располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РО, когда осуществляется его гибридизация с нуклеиновой кислотой-мишенью. Располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь, гибридизованная с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, индуцирует расщепление РО, гибридизованного с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью.
Индукция расщепления РО при посредстве располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида может протекать двумя путями: (1) как индукция расщепления, независимая от удлинения (т.е. полимеризации) располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида; и (2) как индукция расщепления, зависимая от удлинения располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида.
В том случае, когда располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован достаточно близко к РО, чтобы индуцировать расщепление РО ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью, тогда фермент, связавшийся с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом, расщепляет РО без реакции удлинения. В отличие от этого, когда располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован в отдалении от РО, тогда фермент, обладающий полимеразной активностью, (например, матричная полимераза) катализирует удлинение располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида (например, располагающегося "вверх по течению" праймера), а фермент, обладающий 5′-нуклеазной активностью, связавшийся с удлиненным продуктом, расщепляет РО.
Следовательно, располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид может быть локализован относительно РО двумя способами. Располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид может быть локализован достаточно близко к РО, чтобы индуцировать расщепление РО независимым от удлинения (т.е. полимеризации) образом. Альтернативно, располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид может быть локализован достаточно далеко от РО, чтобы индуцировать расщепление РО зависимым от удлинения образом.
Используемый в данном описании термин "расположенный в непосредственной близости" в отношении расположений или локализаций означает, что располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован вблизи узнающего мишень участка РО с образованием "ника" (одноцепочечного разрыва). Кроме того, этот термин означает, что располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован на расстоянии 1-30 нуклеотидов, 1-20 нуклеотидов или 1-15 нуклеотидов от узнающего мишень участка РО.
Согласно предпочтительному воплощению располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован на достаточном отдалении от РО, чтобы индуцировать расщепление РО зависимым от удлинения образом.
Используемый в данном описании термин "отдаленный" в отношении расположений или локализаций не имеет ограничений, как и термин "расположенный в непосредственной близости", включая в себя любые расположения или локализации, достаточные для обеспечения протекания реакций удлинения. Например, термин "отдаленный" может включать в себя локализацию с образованием "ника".
Согласно предпочтительному воплощению располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер или располагающийся "вверх по течению" зонд. Располагающийся "вверх по течению" праймер подходит для индукции независимого от удлинения расщепления или для индукции зависимого от удлинения расщепления, а располагающийся "вверх по течению" зонд подходит для индукции независимого от удлинения расщепления.
Альтернативно, располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид имеет последовательность, частично перекрывающуюся с узнающим мишень участком РО. Предпочтительно, чтобы длина перекрывающейся последовательности составляла 1-10 нуклеотидов, более предпочтительно 1-5 нуклеотидов, еще более предпочтительно 1-3 нуклеотида. В том случае, когда используется 5′-тегированный РО, имеющий частично перекрывающуюся последовательность, 3′-концевой узнающий мишень участок может быть частично расщеплен вместе с расщеплением тегирующего участка в реакции расщепления на стадии (b). Помимо этого, присутствие перекрывающейся последовательности позволяет расщеплять желаемый сайт узнающего мишень участка.
Согласно предпочтительному воплощению располагающийся "вверх по течению" праймер индуцирует посредством своей удлиненной цепи расщепление РО ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью.
В настоящем изобретении могут быть применены традиционные технологии для реакций расщепления с использованием располагающихся "вверх по течению" олигонуклеотидов при условии, что располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид индуцирует расщепление РО, гибридизованного с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью. Например, в настоящем изобретении могут быть применены способы, описанные в патентах США №№5210015, 5487972, 5691142, 5994069 и 7381532 и публикации заявки на патент США №2008/0241838.
Согласно предпочтительному воплощению выполнение способа по настоящему изобретению осуществляют в присутствии располагающегося "вниз по течению" праймера. Располагающийся "вниз по течению" праймер дополнительно образует нуклеиновокислотную последовательность-мишень, которая будет гибридизоваться с РО, повышая чувствительность детекции мишени.
В тех случаях, когда дополнительно используют располагающийся "вниз по течению" праймер, кроме того используют второй РО, локализованный "вниз по течению" относительно располагающегося "вниз по течению" праймера.
Согласно предпочтительному воплощению, когда используют располагающийся "вверх по течению" праймер и располагающийся "вниз по течению" праймер, для удлинения этих праймеров применяют матричную полимеразу нуклеиновых кислот. Матричная полимераза нуклеиновых кислот может служить в качестве фермента, обладающего 5′-нуклеазной активностью, для расщепления РО.
Согласно предпочтительному воплощению располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид (располагающийся "вверх по течению" праймер или располагающийся "вверх по течению" зонд) и/или располагающийся "вниз по течению" праймер имеют структуру олигонуклеотида с двойным праймированием (DPO), разработанную авторами настоящего изобретения. Олигонуклеотиды, имеющие структуру DPO, демонстрируют значительно улучшенную специфичность к мишени по сравнению с традиционными праймерами и зондами (см. WO 2006/095981; Chun et. al., Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene, Nucleic Acid Research, 35: 6е40(2007)).
Согласно предпочтительному воплощению узнающий мишень участок РО имеет структуру модифицированного олигонуклеотида с двойной специфичностью (mDSO), разработанную авторами настоящего изобретения. Структура модифицированного олигонуклеотида с двойной специфичностью (mDSO) демонстрирует значительно улучшенную специфичность к мишени по сравнению с традиционными зондами (см. WO 2011/028041).
Термин "традиционный олигонуклеотид" относится к олигонуклеотидам (праймеру или зонду), не имеющим структуры DSO или mDSO.
Используемый в данном изобретении РО имеет одиночную метку. Одиночная метка обеспечивает поступление сигнала, указывающего на присутствие или отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени. Данная метка будет более подробно описана на стадии (d).
Стадия (b). Расщепление РО
Далее, продукт со стадии (а) приводят в контакт с ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РО.
РО, гибридизованный с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, переваривается ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью, высвобождая фрагмент, содержащий одиночную метку (см. Фиг. 2-6). Если нуклеиновокислотная последовательность-мишень отсутствует, РО не переваривается ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью.
2
Используемый в данном описании термин "условия для расщепления РО" означает условия, достаточные для переваривания РО, гибридизованного с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью, такие как температура, рН, ионная сила, буфер, длина и последовательность олигонуклеотидов и ферменты. Например, когда в качестве фермента, обладающего 5′-нуклеазной активностью, используют Taq ДНК-полимеразу, условия для расщепления РО включают трис-HCl буфер, KCl, MgCl и температуру.
Для проведения реакции расщепления РО может быть применено большое число традиционных технологий. Сайты расщепления РО варьируют в зависимости от типа располагающихся "вверх по течению" олигонуклеотидов (располагающегося "вверх по течению" зонда или располагающегося "вверх по течению" праймера), сайтов гибридизации располагающихся "вверх по течению" олигонуклеотидов и условий расщепления (см. патенты США №№ 5210015, 5487972, 5691142, 5994069 и 7381532 и публикацию заявки на патент США № 2008/0241838).
Длина и последовательность содержащего одиночную метку фрагмента могут варьировать в зависимости от выбранной технологии расщепления. В частности, когда используют тегированный РО, может быть получен его фрагмент, содержащий частичную или полную последовательность тегирующего участка. Благодаря корректировке локализации одиночной метки на тегированном РО эта одиночная метка может не находиться во фрагменте, содержащем частичную или полную последовательность тегирующего участка.
Как правило, начальным сайтом расщепления РО после удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера является исходная точка двойной цепи между РО и нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью или сайт на расстоянии 1-3 нуклеотида от этой исходной точки. Длина расщепленного РО становится меньше, ввиду этого он диссоциирует из комплекса с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью. Когда используют 3′-тегированный РО или 5′-тегированный РО, может быть получен фрагмент, содержащий тегирующий участок и часть узнающего мишень участка. Когда применяют реакцию расщепления, независимую от удлинения располагающихся "вверх по течению" олигонуклеотидов, сайт расщепления РО определяется в зависимости от локализации располагающихся "вверх по течению" олигонуклеотидов. Когда используют 3′-тегированный РО или 5′-тегированный РО, полученный фрагмент РО может содержать (1) часть тегирующего участка, (2) тегирующий участок или (3) тегирующий участок и часть узнающего мишень участка.
Используемый в данном описании термин "фрагмент, содержащий тегирующий участок или часть тегирующего участка" в отношении расщепления тегированного РО ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью, применяется для обозначения (1) тегирующего участка, (2) тегирующего участка и близлежащей неполной последовательности узнающего мишень участка и (3) части тегирующего участка.
Термин "часть", используемый в отношении РО, как например, часть 5′-концевого тегирующего участка РО и 5′-концевая часть 3′-концевого узнающего мишень участка РО, относится к нуклеотидной последовательности, содержащей 1-40, 1-30, 1-20, 1-15, 1-10 или 1-5 нуклеотидов, предпочтительно 1, 2, 3 или 4 нуклеотида.
Согласно предпочтительному воплощению фермент, обладающий 5′-нуклеазной активностью, представляет собой ДНК-полимеразу, обладающую 5′-нуклеазной активностью, или нуклеазу FEN, более предпочтительно термостабильную ДНК-полимеразу, обладающую 5′-нуклеазной активностью, или нуклеазу FEN.
Подходящей ДНК-полимеразой, обладающей 5′-нуклеазной активностью, в данном изобретении является термостабильная ДНК-полимераза, полученная из ряда бактериальных видов, включая Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosiphoafricanus, Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyss/, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus и Aquifex aeolieus. Наиболее предпочтительно, чтобы термостабильная ДНК-полимераза представляла собой Taq полимеразу
Альтернативно, в настоящем изобретении можно использовать ДНК-полимеразы, обладающие 5′-нуклеазной активностью, модифицированные с целью уменьшения полимеразной активности.
Используемая нуклеаза FEN (флэп-эндонуклеаза) представляет собой флэп-специфичную 5′-нуклеазу.
Подходящая для настоящего изобретения нуклеаза FEN включает нуклеазы FEN, полученные из ряда бактериальных видов, включая Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus zilligii, Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii, Aeropyrum pernix и Archaeaglobus veneficus.
Когда располагающийся "вверх по течению" праймер используют на стадии (а), предпочтительно, чтобы условия для расщепления РО включали реакцию удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера.
Согласно предпочтительному воплощению на стадии (а) используют располагающийся "вверх по течению" праймер, для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера используют матричную полимеразу, и эта матричная полимераза идентична ферменту, обладающему 5′-нуклеазной активностью.
Возможно, что на стадии (а) используют располагающийся "вверх по течению" праймер, для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера используют матричную полимеразу, и эта матричная полимераза отличается от фермента, обладающего 5′-нуклеазной активностью.
Стадия (с). Гибридизация с СО на твердой фазе
Продукт со стадии (b) приводят в контакт с СО (захватывающим олигонуклеотидом), иммобилизованным на твердой подложке, для осуществления реакции гибридизации.
В настоящем изобретении детекцию расщепления РО осуществляют, используя СО, иммобилизованный на твердой подложке. Когда РО не расщепляется на стадии (b), содержащий одиночную метку нерасщепленный РО гибридизуется с СО, иммобилизованным на твердой подложке, в результате чего поступает сигнал от одиночной метки на твердой подложке. Когда РО расщепляется на стадии (b), содержащий одиночную метку отщепленный фрагмент не гибридизуется с СО, в результате чего сигнала от одиночной метки на твердой подложке не поступает.
Поскольку возможность осуществления расщепления РО зависит от присутствия нуклеиновокислотной последовательности-мишени, наличие этой нуклеиновокислотной последовательности-мишени можно зарегистрировать путем измерения гашения или уменьшения сигнала от одиночной метки на твердой подложке.
СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО. Этот термин, используемый в данном описании, или "способная к гибридизации последовательность" в сочетании с СО относится к последовательности, способной к образованию стабильного дуплекса с нерасщепленным РО на стадии (с). Например, последовательность СО, способная к гибридизации с РО, может содержать последовательность, комплементарную всему узнающему мишень участку РО или части этого участка; всему тегирующему участку РО или части этого участка; всему узнающему мишень участку и части тегирующего участка РО; части узнающего мишень участка и всему тегирующему участку РО; или части узнающего мишень участка и части тегирующего участка РО.
Не предполагается различия между терминами "нуклеотидная последовательность, способная к гибридизации" и "нуклеотидная последовательность, комплементарная", и эти термины будут использованы взаимозаменяемо.
Реакцию гибридизации на стадии (с) проводят в таких условиях, что содержащий одиночную метку фрагмент не гибридизуется с СО, а нерасщепленный РО гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО.
В одном из воплощений данного изобретения СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с узнающим мишень участком О. Нуклеотидная последовательность, способная к гибридизации с узнающим мишень участком РО, содержит последовательность, комплементарную всему узнающему мишень участку РО или части этого участка, и обладает комплементарностью и длиной, достаточными для образования стабильного дуплекса между нерасщепленным РО и СО в реакции гибридизации на стадии (с).
Как проиллюстрировано на Фиг. 2 и 3, СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с узнающим мишень участком РО. Когда присутствует нуклеиновокислотная последовательность-мишень, содержащий одиночную метку фрагмент, образованный в результате реакции расщепления, имеет меньшую длину чем нерасщепленный РО, и поэтому не обладает способностью гибридизоваться с СО в условиях определенной жесткости (в частности, при определенной температуре). В результате, одиночная метка не будет присутствовать на твердой подложке.
Альтернативно, СО можно сконструировать таким образом, чтобы он не имел последовательности, способной гибридизоваться с содержащим одиночную метку фрагментом, для предотвращения гибридизации содержащего одиночную метку фрагмента с СО.
Следовательно, в случае присутствия нуклеиновокислотной последовательности-мишени образования дуплекса между нерасщепленным РО и СО не происходит и никакого сигнала от одиночной метки не поступает.
В случае отсутствия нуклеиновокислотной последовательности-мишени нерасщепленный РО образует дуплекс с СО, и одиночная метка будет присутствовать на твердой подложке.
Когда процессы, проиллюстрированные на Фиг. 2 и 3, проводят с использованием полимеразы, обладающей 5′-нуклеазной активностью, нетегированный РО, гибридизованный с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, не расщепляется. Поскольку нетегированный РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, его гибридизацию с СО можно предотвратить в тщательно выверенных условиях, обеспечивающих отсутствие какого-либо сигнала от одиночной метки. Однако, в случае использования ферментов, обладающих 5′-нуклеазной активностью, как в настоящем изобретении, РО, гибридизованный с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, расщепляется, и наличие расщепления определяют в удобных общепринятых условиях с целью точной детекции присутствия нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
Как проиллюстрировано на Фиг. 4 и 5, СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с тегирующим участком РО. Одиночная метка на тегированном РО располагается таким образом, что эта одиночная метка не остается на содержащем тегирующий участок фрагменте, который высвобождается в результате расщепления тегированного РО и гибридизуется с СО. Даже когда фрагмент, содержащий тегирующий участок, гибридизуется с СО, никакого сигнала от одиночной метки не поступает, поскольку фрагмент, содержащий тегирующий участок, не несет одиночной метки. Сигнал поступает в результате гибридизации нерасщепленного тегированного РО с СО.
В случае присутствия нуклеиновокислотной последовательности-мишени образования дуплекса между нерасщепленным РО и СО не происходит ввиду расщепления РО, приводящего к гашению (или уменьшению) сигнала от одиночной метки на твердой подложке, что указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
Согласно предпочтительному воплощению с использованием тегированного РО, нуклеотидная последовательность СО, способная к гибридизации с тегирующим участком РО, содержит последовательность, комплементарную ко всему тегирующему участку РО или части этого участка, и обладает комплементарностью и длиной, достаточными для образования стабильного дуплекса между нерасщепленным тегированным РО и СО в реакции гибридизации на стадии (с).
Альтернативно, когда используют тегированный РО, СО может содержать нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с частью (или со всем) тегирующего(им) участка(ом) и с частью (или со всем) узнающего(им) мишень участка(ом) тегированного РО. Место расположения одиночной метки на тегированном РО определяют с учетом способа расщепления, сайта расщепления и последовательности СО, и расщепление тегированного РО осуществляют в таких условиях, при которых содержащий одиночную метку фрагмент не гибридизуется с СО. Предпочтительно одиночная метка располагается таким образом, что она остается на фрагменте, который высвобождается в результате расщепления тегированного РО и не гибридизуется с СО.
Согласно предпочтительному воплощению с использованием 5′-тегированного РО, СО может дополнительно содержать матричный участок, служащий в качестве матрицы для удлинения тегирующего участка, гибридизованного с СО (см. Фиг. 6). Продукт удлинения дает возможность осуществления более стабильной гибридизации с СО. Для проведения удлинения может понадобиться дополнительная ДНК-полимераза.
СО иммобилизован на твердой подложке через свой 5′-конец или 3′-конец.
Согласно предпочтительному воплощению РО представляет собой 3′-тегированный РО, и СО СО иммобилизован на твердой подложке через свой 5′-конец (Фиг. 4). Предпочтительно РО представляет собой 5′-тегированный РО, и СО иммобилизован на твердой подложке через свой 3′-конец (Фиг. 5).
Согласно предпочтительному воплощению твердая подложка, на которой иммобилизуют СО, представляет собой микрочип. СО иммобилизован непосредственно или опосредованно (предпочтительно опосредованно) через свой 5′-конец или 3′-конец на поверхности твердой подложки. Кроме того, СО может быть иммобилизован на поверхности твердой подложки ковалентным или нековалентным образом. В тех случаях, когда иммобилизованные СО представляют собой СО, иммобилизованные на поверхности твердой подложки опосредованно, используют подходящие линкеры. Линкеры, полезные в данном изобретении, могут включать любые линкеры, используемые для иммобилизации зондов на поверхности твердой подложки. Например, алкильные или арильные соединения с аминной функциональной группой либо алкильные или арильные соединения с тиоловой функциональной группой служат в качестве линкеров для иммобилизации СО. Помимо этого, в качестве линкеров может служить поли(Т)-хвост или поли(А)-хвост. Предпочтение отдается поли(Т)-хвосту или поли(А)-хвосту по той причине, что он способен уменьшать стерические ограничения (space hindrance) при действии фермента (например, в ферментативной реакции расщепления) и повышать эффективность гибридизации. Поли(Т)-хвост или поли(А)-хвост не рассматривается как последовательность зондов.
2
Микрочип, обеспечивающий соблюдение условий реакции в данном изобретении, может включать любой из микрочипов, которые известны специалисту в данной области. Все процессы в настоящем изобретении, то есть гибридизацию с нуклеиновокислотными последовательностями-мишенями, расщепление и детекцию осуществляют на микрочипе. Иммобилизованные на микрочипе СО служат в качестве способных к гибридизации элементов чипа. Твердая подложка для изготовления микрочипа включает металлы (например, золото, сплав золота и меди, аллюминий), оксид металла, стекло, керамику, кварц, кремний, полупроводник, пластинку из Si/SiO, германий, арсенид галия, углерод, углеродную нанотрубку, полимеры (например, полистирол, полиэтилен, полипропилен и полиакриламид), сефарозу агарозу и коллоиды, но этим не ограничивается. Большинство используемых в данном изобретении иммобилизованных СО могут быть иммобилизованы на доступном участке или двух или более доступных участках на твердой подложке, которая может содержать 2-1000000 доступных участков. Чтобы получить микрочип или микрочипы для заданного применения, иммобилизованные СО могут быть изготовлены с использованием традиционных технологий изготовления, таких как фотолитография, технология струйной печати, механическое точечное нанесение пятен и их варианты.
Согласно настоящему изобретению, осуществляемому на твердой фазе, можно проводить одновременную детекцию множества нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней с использованием метки даже одного типа, поскольку метки на иммобилизованных СО физически отделены друг от друга. В этом отношении, количество нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней, детекция которых будет осуществлена на твердой фазе согласно настоящему изобретению, является неограниченным.
Используя конфокальные устройства для проведения детекции на твердой подложке, можно осуществлять детекцию только сигнала с твердой подложки без какого-либо влияния сигнала от меток, присутствующих в реакционном растворе.
Длина СО может варьировать в широких пределах. СО может иметь любую длину при условии, что ее достаточно для образования дуплекса с нерасщепленным РО. Например, длина СО составляет 5-80 нуклеотидов, 5-60 нуклеотидов, 5-40 нуклеотидов, 5-30 нуклеотидов, 10-80 нуклеотидов, 10-60 нуклеотидов, 10-40 нуклеотидов, 10-30 нуклеотидов, 10-20 нуклеотидов, 15-80 нуклеотидов, 15-60 нуклеотидов, 15-40 нуклеотидов, 15-30 нуклеотидов или 15-20 нуклеотидов.
Согласно предпочтительному воплощению с использованием 5′-тегированного РО, когда СО дополнительно содержит матричный участок для удлинения тегирующего участка, гибридизованного с СО, СО также может дополнительно содержать 5-100 нуклеотидов в данном матричном участке.
Согласно предпочтительному воплощению 3′-конец СО блокируют, чтобы не допустить его удлинения. Не допускающее удлинения блокирование СО может быть достигнуто традиционными методами. Например, блокирование можно осуществить путем добавления химической группировки, такой как биотин, метки, фосфатная группа, алкильная группа, ненуклеотидный линкер, фосфоротионат или алкандиол, к 3′-гидроксильной группе последнего нуклеотида СО. Альтернативно, блокирование может быть выполнено посредством удаления 3′-гидроксильной группы последнего нуклеотида или путем использования нуклеотида, лишенного 3′-гидроксильной группы, такого как дидезоксинуклеотид.
Гибридизация на стадии (с) может быть описана более подробно со ссылкой на описания, приведенные на стадии (а).
Гибридизацию на стадии (с) проводят в таких условиях, что содержащий одиночную метку фрагмент не гибридизуется с СО, а нерасщепленный РО гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО. Условия гибридизации могут быть определены в установленном порядке традиционными методами, известными специалисту в данной области. Например, условия гибридизации можно регулировать посредством изменения температуры, концентрации компонентов, продолжительности гибридизации, компонентов буфера и его рН и ионной силы.
Согласно предпочтительному воплощению условия гибридизации на стадии (с) регулируют посредством изменения температуры при проведении гибридизации. Альтернативно, условия гибридизации на стадии (с), в частности условия, позволяющие содержащему одиночную метку фрагменту не гибридизоваться с СО, можно обеспечить путем исключения из СО последовательности, способной стабильно гибридизоваться с содержащим одиночную метку фрагментом.
РО и СО могут состоять из природных dNMP. Альтернативно, РО и СО могут состоять из модифицированных нуклеотидов или неприродных нуклеотидов, таких как PNA (пептидо-нуклеиновая кислота), см. публикацию РСТ №WO 92/20702) и LNA ("закрытая" нуклеиновая кислота), см. публикации РСТ №№WO 98/22489, WO 98/39352 и WO 99/14226). РО и СО могут содержать универсальные основания, такие как дезоксиинозин, инозин, 1-(2′-дезокси-бета-O-рибофуранозил)-3-нитропиррол и 5-нитроиндол. Термин "универсальное основание" относится к основанию, способному образовывать пары оснований с каждым из природных оснований ДНК/РНК с небольшим различением в отношении их.
Стадия (d). Детекция расщепления РО, указывающая на присутствие последовательности-мишени
По окончании реакции гибридизации проводят детекцию наличия расщепления РО путем измерения сигнала от одиночной метки на твердой подложке, тем самым наличие расщепления РО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
Как обсуждалось выше, картины гибридизации РО с СО отчетливо различаются в зависимости от того, произошло или нет расщепление РО. Такая разница в картине гибридизации обуславливает различие в сигнале на твердой подложке. Следовательно, присутствие или отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени может быть определено путем детекции сигнала от одиночной метки на твердой подложке.
Стадию (d) проводят, измеряя сигнал от одиночной метки, связанной с РО, на твердой подложке.
Одиночная метка на РО может быть описана как репортерная молекула.
Используемая одиночная метка включает, но не ограничивается этим, химические метки (например, биотин), ферментативные метки (например, щелочную фосфатазу, пероксидазу β-галактозидазу и β-глюкозидазу), флуоресцентные метки, люминесцентные метки, хемилюминесцентные метки, электрохимические метки и металлические метки. Предпочтительно одиночная метка включает флуоресцентную метку.
Одиночная метка располагается таким образом, что она не остается на фрагменте, который высвобождается в результате расщепления РО и гибридизуется с СО.
Когда используется нетегированный РО, одиночная метка может быть присоединена в любом месте. Предпочтительно одиночная метка присоединена к 5′-концевому или 3′-концевому участку нетегированного РО. Более предпочтительно она локализована на 5′-конце или 3′-конце либо на расстоянии 1-20 нуклеотидов (еще более предпочтительно 1-10 нуклеотидов) от 5′-конца или 3′-конца нетегированного РО, еще более предпочтительно на 5′-конце или 3′-конце.
Согласно предпочтительному воплощению с использованием тегированного РО, одиночная метка располагается таким образом, что она не остается на содержащем тегирующий участок фрагменте, который высвобождается в результате расщепления тегированного РО. Более предпочтительно одиночная метка располагается таким образом, что она не остается на содержащем тегирующий участок фрагменте, который высвобождается в результате расщепления тегированного РО и гибридизуется с СО.
Место расположения одиночной метки может быть определено с учетом способов расщепления, сайтов расщепления и высвобождения расщепленного РО из нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
Более предпочтительно одиночная метка локализована на 5′-концевом участке или на расстоянии 1-20 нуклеотидов (еще более предпочтительно 1-10 нуклеотидов) от 5′-конца 3′-тегированного РО, и локализована на 3′-концевом участке или на расстоянии 1-20 нуклеотидов (еще более предпочтительно 1-10 нуклеотидов) от 3′-конца 5′-тегированного РО. Еще более предпочтительно одиночная метка локализована на 5′-конце 3′-тегированного РО и локализована на 3′-конце 5′-тегированного РО.
Согласно предпочтительному воплощению тегированный РО имеет одиночную метку; одиночная метка располагается на узнающем мишень участке тегированного РО; одиночная метка располагается таким образом, что она не остается на содержащем тегирующий участок фрагменте, который высвобождается в результате расщепления РО на стадии (b); и дуплекс между фрагментом, содержащим тегирующий участок, и СО не имеет одиночной метки, а дуплекс -нерасщепленный РО/СО имеет одиночную метку (см. Фиг. 4 и 5). Дуплекс -(фрагмент, содержащий тегирующий участок)/СО, иммобилизованный на твердой подложке, не в состоянии обеспечить поступление сигнала ввиду отсутствия одиночной метки; однако, дуплекс - нерасщепленный РО/СО обеспечивает поступление сигнала ввиду присутствия одиночной метки на нерасщепленном РО.
Как описано выше, детекцию присутствия нуклеиновокислотной последовательности-мишени осуществляют, измеряя сигнал от одиночной метки на твердой подложке.
Согласно предпочтительному воплощению с использованием РО с одиночной меткой окончательный измеренный сигнал сравнивают с сигналом от отрицательного контроля, не имеющего нуклеиновокислотной последовательности-мишени. Далее, для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени определяют гашение (или уменьшение) сигнала.
Согласно предпочтительному воплощению с использованием РО с одиночной меткой, когда детекцию на твердой подложке осуществляют непрерывно вместе с повторением расщепления РО, число расщепленных РО увеличивается по мере повторения числа реакций расщепления, и происходит ослабление сигнала одновременно с увеличением числа расщепленных РО. В этом случае, детекцию нуклеиновокислотной последовательности-мишени можно осуществлять в режиме реального времени. В противоположность этому, в отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени изменения сигнала не наблюдается.
Одиночные флуоресцентные метки, полезные в настоящем изобретении, могут включать любые молекулы, известные в данной области техники. Примерами их являются: Су2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), кальцеин (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), родамин 110 (520), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), родамин 123 (529), Magnesium Green™ (531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOT01 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Су3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), фикоэритрин R&B (575), родамин-фаллоидин (575), Calcium Orange™ (576), пиронин Y (580), родамин В (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), техасский красный (615), нильский красный (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-фикоцианин (642), С-фикоцианин (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), тиадикарбоцианин (671) и Су5.5 (694), HEX (556), TET (536), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), флуоресцеин (520), флуоресцеин-С3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) и Quasar 705 (610). Числа в скобках представляют собой длину волны, соответствующую максимуму излучения, в нанометрах. Предпочтительно одиночные флуоресцентные метки включают JOE, FAM, TAMRA, ROX и метку на основе флуоресцеина.
Одиночная метка может быть присоединена к РО рядом методов, известных специалисту в данной области. Предпочтительно, одиночная метка может быть присоединена к РО через спейсер, содержащий по меньшей мере три атома углерода (например, 3-х углеродный спейсер, 6-ти углеродный спейсер и 12-ти углеродный спейсер).
II. Способ детекции мишени посредством РОСН с использованием двойной метки
Настоящее изобретение демонстрирует превосходные характеристики при использовании системы двух взаимодействующих меток для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
В другом аспекте данного изобретения предложен способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке, включающий:
(a) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и зондирующим олигонуклеотидом (РО); при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО содержит узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО имеет систему двух взаимодействующих меток, содержащую донорную молекулу и акцепторную молекулу; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РО; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РО ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РО; при этом, когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, происходит расщепление РО под действием фермента, обладающего 5′-нуклеазной активностью, с разделением системы двух взаимодействующих меток, в результате чего образуются содержащий донорную молекулу фрагмент и содержащий акцепторную молекулу фрагмент;
(c) осуществление реакции гибридизации путем приведения в контакт продукта со стадии (b) с захватывающим олигонуклеотидом (СО), иммобилизованным на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО; причем реакцию гибридизации проводят в таких условиях, что по меньшей мере один из фрагментов, содержащий донорную молекулу фрагмент и содержащий акцепторную молекулу фрагмент, не гибридизуется с СО, а нерасщепленный РО гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО; при этом сигнал от дуплекса нерасщепленный РО/СО отличается от сигнала, поступающего тогда, когда по меньшей мере один из фрагментов, содержащий донорную молекулу фрагмент и содержащий акцепторную молекулу фрагмент, не гибридизуется с СО; и
(d) детекцию наличия расщепления РО путем измерения сигнала от системы двух взаимодействующих меток на твердой подложке; тем самым наличие расщепления РО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
Поскольку второе воплощение данного изобретения является таким же, как и первое воплощение с использованием одиночной метки, за исключением применения системы меток, общее для них описание опущено, чтобы избежать излишнего дублирования, приводящего к усложнению данного описания.
Система двух взаимодействующих меток - донор/акцептор присоединена к РО.
Система двух взаимодействующих меток представляет собой генерирующую сигнал систему, в которой происходит передача энергии между донорной молекулой и акцепторной молекулой без участия радиоактивности. В качестве репрезентативной системы взаимодействующих меток система меток при FRET (резонансном переносе энергии флуоресценции) включает флуоресцентную репортерную молекулу (донорную молекулу) и молекулу-гаситель (акцепторную молекулу). При FRET донор энергии является флуоресцентным, а акцептор энергии может быть флуоресцентным или не быть флуоресцентным. Для другой формы систем взаимодействующих меток донор энергии не является флуоресцентным, например, хромофор, а акцептор энергии является флуоресцентным. Для еще одной формы систем взаимодействующих меток донор энергии является люминесцентным, например биолюминесцентным, хемилюминесцентным, электрохемилюминесцентным, а акцептор является флуоресцентным.
Согласно предпочтительному воплощению РО имеет систему двух взаимодействующих меток, более предпочтительно FRET-метку, еще более предпочтительно двойную метку, содержащую донорную молекулу и акцепторную молекулу (см. Фиг. 7-13).
Донорная молекула и акцепторная молекула, полезные в данном изобретении, включают любые молекулы, известные специалисту в данной области, и их примеры могут быть описаны со ссылкой на упомянутые выше флуоресцентные метки.
nd
th
Подходящие пары донор-акцептор описаны в ряде публикаций, которые приведены ниже: Pesce et al., editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2 Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Color and Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland R.P, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6 Edition (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996); патенты США №№3996345 и 4351760.
В передающей сигнал системе, содержащей репортер и гаситель, адаптированные к РО, репортер включает в себя донора FRET, а гаситель включает в себя другого партнера (акцептора) FRET. Например, в качестве репортера используют краситель на основе флуоресцеина, а в качестве гасителя краситель на основе родамина.
Донорная (репортерная) молекула и акцепторная молекула (гаситель), присоединенные к РО, могут быть флуоресцентными или не быть флуоресцентными. Например, в данном изобретении можно использовать нефлуоресцентный темный гаситель, способный гасить флуоресценцию в более широком диапазоне длин волн или на определенной длине волны. Когда акцепторная молекула (гаситель) является флуоресцентной, сигнал от флуоресцентной акцепторной молекулы (гасителя) может быть использован для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
Настоящее изобретение будет описано более подробно далее.
Стадия (а). Гибридизация располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида и РО с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью
Стадия (а) второго воплощения настоящего изобретения может быть понята со ссылкой на описание стадии (а) первого воплощения.
РО имеет систему двух взаимодействующих меток, содержащую донорную молекулу и акцепторную молекулу, которая обеспечивает получение сигнала, указывающего на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
Стадия (b). Расщепление РО
Стадия (b) второго воплощения данного изобретения может быть понята со ссылкой на описание стадии (b) первого воплощения.
Продукт со стадии (а) приводят в контакт с ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РО.
РО, гибридизованный с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, переваривается ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью, с разделением системы двух взаимодействующих меток, в результате чего образуются содержащий донорную молекулу фрагмент и содержащий акцепторную молекулу фрагмент (см. Фиг. 7-13).
Согласно предпочтительному воплощению донорная молекула и акцепторная молекула на РО разделены сайтом расщепления для фермента, обладающего 5′-нуклеазной активностью.
В отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени РО не переваривается ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью, и ввиду этого не происходит разделения системы двух взаимодействующих меток.
Стадия (с). Гибридизация с СО на твердой фазе
Продукт со стадии (b) приводят в контакт с СО (захватывающим олигонуклеотидом), иммобилизованным на твердой подложке, для осуществления реакции гибридизации.
Стадия (с) второго воплощения настоящего изобретения может быть понята со ссылкой на описание стадии (с) первого воплощения. Реакцию гибридизации проводят в таких условиях, что по меньшей мере один из фрагментов, содержащий донорную молекулу фрагмент и содержащий акцепторную молекулу фрагмент, не гибридизуется с СО, а нерасщепленный РО гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО. Условия гибридизации могут быть определены в установленном порядке традиционными методами, известными специалисту в данной области. Например, условия гибридизации можно регулировать посредством изменения температуры, концентрации компонентов, продолжительности гибридизации, компонентов буфера и его рН и ионной силы.
Согласно предпочтительному воплощению такие условия гибридизации, что по меньшей мере один из фрагментов, содержащий донорную молекулу фрагмент и содержащий акцепторную молекулу фрагмент, не гибридизуется с СО, регулируют посредством изменения температуры при проведении гибридизации. Альтернативно, условия гибридизации на стадии (с) можно обеспечить путем исключения из СО последовательности, способной стабильно гибридизоваться с содержащим метку фрагментом.
Когда присутствует нуклеиновокислотная последовательность-мишень, по меньшей мере один из фрагментов, содержащий донорную молекулу фрагмент и содержащий акцепторную молекулу фрагмент, не гибридизуется с СО. В случае отсутствия нуклеиновокислотной последовательности-мишени нерасщепленный РО, имеющий систему двух взаимодействующих меток, гибридизуется с СО.
Сигнал, поступающий от дуплекса нерасщепленный РО/СО, (то есть в отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени) заметно отличается от сигнала, поступающего тогда, когда по меньшей мере один из фрагментов, содержащий донорную молекулу фрагмент и содержащий акцепторную молекулу фрагмент, не гибридизуется с СО (то есть в присутствии нуклеиновокислотной последовательности-мишени). Следовательно, сигнал от системы двух взаимодействующих меток генерируется по-разному в зависимости от присутствия или отсутствия нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
Стадия (d). Детекция расщепления РО, указывающего на присутствие последовательности-мишени
По окончании реакции гибридизации осуществляют детекцию наличия расщепления РО путем измерения сигнала от системы двух взаимодействующих меток на твердой подложке, тем самым наличие расщепления РО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
Как обсуждалось выше, картины гибридизации РО с СО отчетливо различаются в зависимости от того, произошло или нет расщепление РО. Такая разница в картине гибридизации обуславливает различие в сигнале на твердой подложке. Следовательно, присутствие или отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени может быть определено путем детекции сигнала от системы двух взаимодействующих меток на твердой подложке.
В случае использования системы двух взаимодействующих меток сигнал измеряют двумя способами. Первый способ состоит в измерении сигнала, генерированного акцепторной молекулой, а второй способ состоит в измерении сигнала, генерированного донорной молекулой.
Первый способ измерения проиллюстрирован на Фиг. 7-9.
На Фиг. 7 представлено воплощение с использованием нетегированного РО для измерения сигнала от акцепторной молекулы. Согласно предпочтительному воплощению нуклеотидная последовательность в СО, способная к гибридизации с РО, содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с узнающим мишень участком РО. В этом случае, система двух взаимодействующих меток предпочтительно локализована таким образом, что сигнал от донорной молекулы гасится акцепторной молекулой при образовании дуплекса нерасщепленный РО/СО, при этом при проведении стадии (d) осуществляют детекцию сигнала от акцепторной молекулы.
Как представлено на Фиг. 7, когда донорная молекула и акцепторная молекула расположены в непосредственной близости друг от друга на нетегированном РО таким образом, что между донорной молекулой и акцепторной молекулой (например, расположенными в непосредственной близости, что способствует протеканию явления FRET) происходит передача энергии, нетегированный РО, гибридизованный с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, расщепляется с образованием фрагмента, содержащего донорную молекулу, и фрагмента, содержащего акцепторную молекулу. Следовательно, взаимодействие между донорной молекулой и акцепторной молекулой отсутствует до тех пор, пока оба фрагмента, и фрагмент, содержащий донорную молекулу, и фрагмент, содержащий акцепторную молекулу, гибридизованы с СО на стадии (с), в результате никакого сигнала с твердой подложки не поступает.
Используемое в данном описании выражение "донорная молекула и акцепторная молекула расположены в непосредственной близости" означает, что донорная молекула и акцепторная молекула разделены некоторым количеством нуклеотидов в зонде таким образом, что между донорной молекулой и акцепторной молекулой происходит передача энергии. Предпочтительно донорная молекула и акцепторная молекула разделены 1-20, 1-15 и 1-10 нуклеотидами.
В том случае, когда нуклеиновокислотная последовательность-мишень отсутствует, нерасщепленный нетегированный РО гибридизуется с СО, и осуществляется взаимодействие между донорной молекулой и акцепторной молекулой, посредством чего обеспечивается получение сигнала от акцепторной молекулы. Облучение светом с длиной волны возбуждения для донорной молекулы вызывает флуоресценцию донорной молекулы, которая затем гасится акцепторной молекулой, что в конечном итоге обеспечивает получение флуоресцентного сигнала от акцепторной молекулы.
В присутствии нуклеиновокислотной последовательности-мишени образования дуплекса нерасщепленный РО/СО не происходит ввиду расщепления РО, и поэтому сигнал от акцепторной молекулы не поступает. Измерение гашения (или уменьшения) сигнала от акцепторной молекулы на твердой подложке дает возможность определить присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
На Фиг. 8 и 9 представлены воплощения с использованием тегированного РО для измерения сигнала от акцепторной молекулы. Согласно предпочтительному воплощению РО представляет собой 3′-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 3′-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, или 5′-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 5′-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, а нуклеотидная последовательность в СО, способная к гибридизации с РО, содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с тегирующим участком РО. Система двух взаимодействующих меток предпочтительно локализована таким образом, что сигнал от донорной молекулы гасится акцепторной молекулой при образовании дуплекса нерасщепленный РО/СО, при этом при проведении стадии (d) осуществляют детекцию сигнала от акцепторной молекулы.
Как проиллюстрировано на Фиг. 8 с использованием 3′-тегированного РО, когда донорная молекула и акцепторная молекула конформационно расположены в непосредственной близости друг от друга таким образом, что между донорной молекулой и акцепторной молекулой происходит передача энергии, 3′-тегированный РО, гибридизованный с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, расщепляется с образованием фрагмента, содержащего донорную молекулу, и фрагмента, содержащего акцепторную молекулу. Содержащий акцепторную молекулу фрагмент, содержащий тегирующий участок, гибридизуется с СО, содержащим нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с тегирующим участком 3′-тегированного РО, но фрагмент, содержащий донорную молекулу, не вовлечен в гибридизацию с СО, таким образом, сигнала от акцепторной молекулы не поступает.
Используемное в данном описании выражение "донорная молекула и акцепторная молекула конформационно расположены в непосредственной близости" означает, что донорная молекула и акцепторная молекула пространственно приближены друг к другу благодаря наличию конформационной структуры у части РО или РО, такой как случайная спираль или шпилечная структура.
В том случае, когда нуклеиновокислотная последовательность-мишень отсутствует, нерасщепленный 3′-тегированный РО гибридизуется с СО, и осуществляется взаимодействие между донорной молекулой и акцепторной молекулой, посредством чего обеспечивается получение сигнала от акцепторной молекулы.
В присутствии нуклеиновокислотной последовательности-мишени образования дуплекса нерасщепленный РО/СО не происходит ввиду расщепления 3′-тегированного РО, и поэтому сигнал от акцепторной молекулы не поступает. Измерение гашения (или уменьшения) сигнала от акцепторной молекулы на твердой подложке дает возможность определить присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
Согласно предпочтительному воплощению донорная молекула и акцепторная молекула на 3′-тегированном РО расположены в непосредственной близости друг от друга таким образом, что между ними происходит передача энергии. Донорная молекула и акцепторная молекула локализованы в 3′-тегированном РО в направлении 5′→3′ или направлении 3′→5′.
Согласно предпочтительному воплощению, как донорная молекула, так и акцепторная молекула локализованы на узнающем мишень участке 3′-тегированного РО, либо одна из них локализована на узнающем мишень участке, а другая локализована на тегирующем участке 3′-тегированного РО.
Как проиллюстрировано на Фиг. 9 с использованием 5′-тегированного РО, когда донорная молекула и акцепторная молекула конформационно расположены в непосредственной близости друг от друга таким образом, что между донорной молекулой и акцепторной молекулой происходит передача энергии, 5′-тегированный РО, гибридизованный с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, расщепляется с образованием фрагмента, содержащего донорную молекулу, и фрагмента, содержащего акцепторную молекулу. Содержащий донорную молекулу фрагмент, содержащий тегирующий участок, гибридизуется с СО, содержащим нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с тегирующим участком 5′-тегированного РО, но фрагмент, содержащий акцепторную молекулу, не вовлечен в гибридизацию с СО, таким образом, сигнала от акцепторной молекулы не поступает.
В том случае, когда нуклеиновокислотная последовательность-мишень отсутствует, нерасщепленный 5′-тегированный РО гибридизуется с СО, и осуществляется взаимодействие между донорной молекулой и акцепторной молекулой, посредством чего обеспечивается получение сигнала от акцепторной молекулы.
В присутствии нуклеиновокислотной последовательности-мишени образования дуплекса нерасщепленный РО/СО не происходит ввиду расщепления 5′-тегированного РО, и поэтому сигнал от акцепторной молекулы не поступает. Измерение гашения (или уменьшения) сигнала от акцепторной молекулы на твердой подложке дает возможность определить присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
Согласно предпочтительному воплощению донорная молекула и акцепторная молекула на 5′-тегированном РО расположены в непосредственной близости друг от друга таким образом, что между ними происходит передача энергии. Донорная молекула и акцепторная молекула локализованы в 5′-тегированном РО в направлении 5′→3′ или направлении 3′→5′.
Согласно предпочтительному воплощению, как донорная молекула, так и акцепторная молекула локализованы на узнающем мишень участке 5′-тегированного РО, либо одна из них локализована на узнающем мишень участке, а другая локализована на тегирующем участке 5′-тегированного РО.
Второй способ измерения проиллюстрирован на Фиг. 10-12.
На Фиг. 10 представлено воплощение с использованием нетегированного РО для измерения сигнала от донорной молекулы. Согласно предпочтительному воплощению нуклеотидная последовательность в СО, способная к гибридизации с РО, содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с узнающим мишень участком РО. Реакцию гибридизации на стадии (с) проводят в таких условиях, что фрагмент, содержащий донорную молекулу, не гибридизуется с СО; при этом система двух взаимодействующих меток локализована таким образом, что сигнал от донорной молекулы не гасится акцепторной молекулой при образовании дуплекса нерасщепленный РО/СО, и при проведении стадии (d) осуществляют детекцию сигнала от акцепторной молекулы.
Как представлено на Фиг. 10, когда донорная молекула и акцепторная молекула конформационно расположены в непосредственной близости друг от друга на нетегированном РО таким образом, что между донорной молекулой и акцепторной молекулой происходит передача энергии, нетегированный РО, гибридизованный с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, расщепляется с образованием фрагмента, содержащего донорную молекулу, и фрагмента, содержащего акцепторную молекулу Гибридизацию осуществляют на стадии (с) в таких условиях, при которых фрагмент, содержащий донорную молекулу, не гибридизуется с СО. Следовательно, сигнала от донорной молекулы на твердой подложке не поступает.
В том случае, когда нуклеиновокислотная последовательность-мишень отсутствует, нерасщепленный нетегированный РО гибридизуется с СО, разделяя донорную молекулу и акцепторную молекулу, что приводит к предотвращению взаимодействия между донорной молекулой и акцепторной молекулой. Облучение светом с длиной волны возбуждения для донорной молекулы (например, репортерной молекулы) вызывает флуоресценцию донорной молекулы, которая не гасится акцепторной молекулой, что в конечном итоге обеспечивает получение сигнала флуоресценции от донорной молекулы.
В присутствии нуклеиновокислотной последовательности-мишени образования дуплекса нерасщепленный РО/СО не происходит ввиду расщепления РО и ввиду того, что содержащий донорную молекулу фрагмент не гибридизуется с СО, поэтому сигнала от донорной молекулы не поступает. Измерение гашения (или уменьшения) сигнала от донорной молекулы на твердой подложке дает возможность определить присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
Согласно предпочтительному воплощению донорная молекула и акцепторная молекула локализованы в нетегированном РО в направлении 5′→3′ или направлении 3′→5′, более предпочтительно в направлении 5′→3′.
На Фиг. 11 и 12 с использованием тегированного РО представлены воплощения для измерения сигнала от донорной молекулы. Согласно предпочтительному воплощению РО представляет собой 3′-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 3′-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, или 5′-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 5′-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, а нуклеотидная последовательность в СО, способная к гибридизации с РО, содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с тегирующим участком РО. Содержащий донорную молекулу фрагмент содержит тегирующий участок, способный к гибридизации с СО, и в реакции гибридизации на стадии (с) фрагмент, содержащий донорную молекулу, гибридизуется с СО. Система двух взаимодействующих меток предпочтительно локализована таким образом, что сигнал от донорной молекулы гасится акцепторной молекулой при образовании дуплекса нерасщепленный РО/СО, при этом при проведении стадии (а) осуществляют детекцию сигнала от донорной молекулы.
Как проиллюстрировано на Фиг. 11 с использованием 3′-тегированного РО, когда донорная молекула и акцепторная молекула конформационно расположены в непосредственной близости друг от друга таким образом, что между донорной молекулой и акцепторной молекулой происходит передача энергии, 3′-тегированный РО, гибридизованный с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, расщепляется с образованием фрагмента, содержащего донорную молекулу, и фрагмента, содержащего акцепторную молекулу Содержащий донорную молекулу фрагмент, содержащий тегирующий участок, гибридизуется с СО, содержащим нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с тегирующим участком 3′-тегированного РО, но фрагмент, содержащий акцепторную молекулу, не вовлечен в гибридизацию с СО, что таким образом обеспечивает получение сигнала от донорной молекулы.
В том случае, когда нуклеиновокислотная последовательность-мишень отсутствует, нерасщепленный 3′-тегированный РО гибридизуется с СО, и осуществляется взаимодействие между донорной молекулой и акцепторной молекулой, что приводит к передаче энергии от донорной молекулы к акцепторной молекуле, не вызывая тем самым никакой флуоресценции от донорной молекулы.
В присутствии нуклеиновокислотной последовательности-мишени 3′-тегированный РО расщепляется и содержащий донорную молекулу фрагмент, содержащий тегирующий участок, гибридизуется с СО, обеспечивая получение сигнала от донорной молекулы. Измерение генерации (или увеличения) сигнала от донорной молекулы на твердой подложке дает возможность определить присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
Согласно предпочтительному воплощению донорная молекула и акцепторная молекула на 3′-тегированном РО расположены в непосредственной близости друг от друга таким образом, что между ними происходит передача энергии. Акцепторная молекула и донорная молекула локализованы в 3′-тегированном РО в направлении 5′→3′.
Согласно предпочтительному воплощению, как акцепторная молекула, так и донорная молекула локализованы на узнающем мишень участке 3′-тегированного РО, либо акцепторная молекула локализована на узнающем мишень участке, а донорная молекула локализована на тегирующем участке 3′-тегированного РО.
Как проиллюстрировано на Фиг. 12 с использованием 5′-тегированного РО, когда донорная молекула и акцепторная молекула конформационно расположены в непосредственной близости друг от друга таким образом, что между донорной молекулой и акцепторной молекулой происходит передача энергии, 5′-тегированный РО, гибридизованный с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, расщепляется с образованием содержащего акцепторную молекулу фрагмента и содержащего донорную молекулу фрагмента, содержащего тегирующий участок. Содержащий донорную молекулу фрагмент, содержащий тегирующий участок, гибридизуется с СО, содержащим нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с тегирующим участком 5′-тегированного РО, но фрагмент, содержащий акцепторную молекулу не вовлечен в гибридизацию с СО, что таким образом обеспечивает получение сигнала от донорной молекулы, указывающего на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени. В том случае, когда нуклеиновокислотная последовательность-мишень отсутствует, нерасщепленный 5′-тегированный РО гибридизуется с СО, и осуществляется взаимодействие между донорной молекулой акцепторной молекулой, что приводит к передаче энергии донорной молекулы к акцепторной молекуле, не вызывая тем самым никакой флуоресценции от донорной молекулы.
В присутствии нуклеиновокислотной последовательности-мишени происходит расщепление 5′-тегированного РО, и содержащий донорную молекулу фрагмент, содержащий тегирующий участок, гибридизуется с СО, обеспечивая получение сигнала от донорной молекулы. Измерение генерации (или увеличения) сигнала от донорной молекулы на твердой подложке дает возможность определить присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
Согласно предпочтительному воплощению донорная молекула и акцепторная молекула на 5′-тегированном РО расположены в непосредственной близости друг от друга таким образом, что между ними происходит передача энергии. Донорная молекула и акцепторная молекула локализованы в 5′-тегированном РО в направлении 5′→3′.
Согласно предпочтительному воплощению, как донорная молекула, так и акцепторная молекула локализованы на узнающем мишень участке 5′-тегированного РО, либо акцепторная молекула локализована на узнающем мишень участке, а донорная молекула локализована на тегирующем участке 5-тегированного РО.
При альтернативном использовании тегированного РО, СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с частью (или со всем) тегирующего(им) участка(ом) и частью (или со всем) узнающего(им) мишень участка(ом) тегированного РО. Место расположения системы двух взаимодействующих меток на РО определяют с учетом способа расщепления и сайта расщепления, а также последовательности СО.
III. Способ детекции мишени посредством РОСН с использованием интеркалирующего агента
Настоящее изобретение демонстрирует превосходные характеристики при использовании интеркалирующего агента для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
В другом аспекте данного изобретения предложен способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке, включающий:
(a) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и зондирующим олигонуклеотидом (РО); при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО содержит узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РО; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РО ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РО; при этом, когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, происходит расщепление РО под действием фермента, обладающего 5′-нуклеазной активностью с получением отщепленного фрагмента;
(c) осуществление реакции гибридизации в присутствии интеркалируюшего агента путем приведения в контакт продукта со стадии (b) с захватывающим олигонуклеотидом (СО), иммобилизованным на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО; причем реакцию гибридизации проводят в таких условиях, что отщепленный фрагмент не гибридизуется с СО, а нерасщепленный РО гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО; и (а) детекцию наличия расщепления РО путем измерения сигнала от интеркалирующего агента на твердой подложке; тем самым наличие расщепления РО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
Поскольку третье воплощение данного изобретения является таким же, как и первое воплощение с использованием одиночной метки, за исключением применения системы меток, общее для них описание опущено, чтобы избежать излишнего дублирования, приводящего к усложнению данного описания.
Согласно предпочтительному воплощению реакцию гибридизации проводят в таких условиях, что отщепленный фрагмент, полученный в результате расщепления РО, не гибридизуется с СО.
Примеры интеркалирующих красителей, полезных в данном изобретении, включают SYBR™ Green I, PO-PRO™-1, BO-PRO™-1, SYTO™43, SYTO™44, SYTO™45, SYTOX™Blue, POPO™-1, POPO™-3, BOBO™-1, BOBO™-3, LO-PRO™-1, JO-PRO™-1, YO-PRO™1, TO-PRO™1, SYTO™11, SYTO™13, SYTO™15, SYTO™16, SYTO™20, SYTO™23, TOTO™-3, YOYO™3, GelStar™ и триазоловый оранжевый. Эти интеркалирующие красители специфически интеркалируют в двухцепочечные молекулы нуклеиновых кислот, генерируя сигналы.
Когда нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует, образования дуплекса нерасщепленный РО/СО не происходит ввиду расщепления РО, и поэтому сигнал от интеркалирующего агента не поступает. Измерение гашения (или уменьшения) сигнала от интеркалирующего агента на твердой подложке дает возможность определить присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени (см. Фиг. 13).
Согласно предпочтительному воплощению способ дополнительно включает повторение стадий (а)-(b), (а)-(с) или (a)-(d) с денатурацией между повторяющимися циклами. Это повторение позволяет амплифицировать нуклеиновокислотную последовательность-мишень и/или сигнал от мишени.
Согласно предпочтительному воплощению стадии (a)-(d) осуществляют в реакционном сосуде или в отдельных реакционных сосудах. Более предпочтительно стадии (а)-(b) и стадии (c)-(d) осуществляют в реакционном сосуде или в отдельных реакционных сосудах.
Предпочтительно стадии (а)-(b) и стадии (c)-(d) могут быть проведены по отдельности даже в одном реакционном сосуде. Например, когда гибридизацию между узнающим мишень участком РО и нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью осуществляют в условиях более высокой жесткости по сравнению с условиями для гибридизации между фрагментом из РО и СО, можно выполнить повторение стадий (а)-(b), не приступая к стадиям (c)-(d). По окончании повторения стадий (а)-(b) можно последовательно выполнить стадии (c)-(d).
В том случае, когда стадии (а)-(b) и стадии (c)-(d) могут быть проведены по отдельности, стадии (а)-(b) выполняют многократно с денатурацией между повторяющимися циклами.
Когда настоящее изобретение с использованием располагающегося "вверх по течению" праймера осуществляют путем повторения стадий с денатурацией между повторяющимися циклами, предпочтительно применять данный способ в присутствии располагающегося "вниз по течению" праймера. Наиболее предпочтительно способ по настоящему изобретению осуществляют в соответствии с ПЦР (полимеразной цепной реакцией).
Когда настоящее изобретение с использованием располагающегося "вверх по течению" праймера осуществляют путем повторения стадий с денатурацией между повторяющимися циклами, предпочтительно применять данный способ в присутствии располагающегося "вниз по течению" праймера.
В настоящем изобретении не требуется, чтобы нуклеиновокислотные последовательности-мишени, подлежащие детекции и/или амплификации, имели какую-либо определенную последовательность или длину, включая любые молекулы ДНК (гДНК и кДНК) и РНК.
Если в качестве исходного материала используют мРНК, перед проведением стадии отжига необходима стадия обратной транскрипции, детали которой можно найти в Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); и Noonan K.F. et al., Nucleic Acids Res., 16: 10366 (1988)). Для обратной транскрипции можно использовать случайный гексамер или олигонуклеотид dT в качестве праймера, способный гибридизоваться с мРНК.
Нуклеиновокислотные последовательности-мишени, которые могут подлежать детекции и/или амплификации, включают любую прокариотическую, эукариотическую (например, из простейших и паразитов, грибов, дрожжей, высших растений, низших и высших животных, в том числе млекопитающих и человека), вирусную (например, из вируса герпеса, ВИЧ, вируса гриппа, вируса Эпштейна-Барр, вируса гепатита, полиовируса и т.д.) или вироидную нуклеиновую кислоту природного происхождения.
Нуклеиновокислотная последовательность-мишень, подлежащая детекции согласно настоящему изобретению, включает большое разнообразие нуклеиновокислотных последовательностей, например, последовательности в геноме, искусственно выделенные или фрагментированные последовательности и синтезированные последовательности (например, последовательности кДНК и штрихкодовые последовательности). Например, Нуклеиновокислотная последовательность-мишень включает нуклеиновокислотные маркерные последовательности для иммуно-ПЦР (иПЦР). В и ПЦР применяют конъюгаты, образованные между нуклеиновокислотными маркерными последовательностями и антителами, совместно с ПЦР, что широко используется для детекции различных типов мишеней, включая белки (см. Sano et al., Science, 258, pp. 120-122 (1992), патент США №5665539, Niemeyer et al., Trends in Biotechnology, 23. pp. 208-216 (2005), публикацию заявки на патент США №2005/0239108 и Ye et al., Journal of Environmental Science, 22, pp. 796-800 (2010)).
Термин "нуклеотидная вариация", используемый в данном описании, относится к любым одиночным или множественным нуклеотидным заменам, делециям или вставкам в последовательности ДНК в конкретном положении среди непрерывных сегментов ДНК, которые в других случаях являются одинаковыми в последовательности.
Такие непрерывные сегменты ДНК включают ген или любую другую часть хромосомы. Такие нуклеотидные вариации могут быть результатом мутации или представлять собой вариации полиморфных аллелей. Например, нуклеотидная вариация, детектируемая в настоящем изобретении, включает SNP (однонуклеотидный полиморфизм), мутацию, делецию, вставку замену и транслокацию. Примером нуклеотидной вариации являются многочисленные вариации в геноме человека (например, вариации в гене MTHFR (метилентетрагидрофолат-редуктазы)), вариации, вовлеченные в возникновение лекарственной устойчивости у патогенных микроорганизмов, и приводящие к онкогенезу вариации. Термин "нуклеотидная вариация", используемый в данном описании, включает любую вариацию в конкретном положении в молекуле ДНК. Другими словами, термин "нуклеотидная вариация" включает дикий тип и любой его мутантный тип в конкретном положении в молекуле ДНК.
В настоящем изобретении для детекции нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени в том случае, когда используемые праймеры или зонды имеют последовательность, комплементарную этой нуклеотидной вариации в данной нуклеиновокислотной последовательности-мишени, нуклеиновокислотная последовательность-мишень, содержащая такую нуклеотидную вариацию, описывается в данном изобретении как сопоставимая матрица (matching или match template). В том случае, когда используемые праймеры или зонды имеют последовательность, некомплементарную этой нуклеотидной вариации в данной нуклеиновокислотной последовательности-мишени, нуклеиновокислотная последовательность-мишень, содержащая такую нуклеотидную вариацию, описывается в данном изобретении как несопоставимая матрица (mismatching или mismatch template).
Для детекции нуклеотидных вариаций 3′-конец располагающегося "вверх по течению" праймера можно сконструировать таким образом, чтобы он располагался напротив сайта нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени. Согласно предпочтительному воплощению 3′-конец располагающегося "вверх по течению" праймера имеет последовательность, комплементарную данной нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени. 3′-конец располагающегося "вверх по течению" праймера, имеющего последовательность, комплементарную данной нуклеотидной вариации в этой нуклеиновокислотной последовательности-мишени, отжигают с сопоставимой матрицей и удлиняют, чтобы индуцировать расщепление РО. В отличие от этого, когда 3′-конец располагающегося "вверх по течению" праймера не соответствует нуклеотидной вариации в несопоставимой матрице, он не удлиняется в условиях, необходимых для отжига 3′-конца праймеров и являющихся существенными для удлинения, даже когда располагающийся "вверх по течению" праймер гибридизуется с несопоставимой матрицей, ввиду этого никакого расщепления РО не происходит.
Альтернативно, можно использовать расщепление РО в зависимости от гибридизации РО, имеющего последовательность, комплементарную нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени. Например, в регулируемых условиях РО, имеющий последовательность, комплементарную этой нуклеотидной вариации в данной нуклеиновокислотной последовательности-мишени, гибридизуется с сопоставимой матрицей и затем расщепляется. Вместе с тем в данных регулируемых условиях РО не гибридизуется с несопоставимой матрицей, имеющей некомплементарную последовательность в месте расположения нуклеотидной вариации, и не расщепляется. В этом случае предпочтительно чтобы последовательность, комплементарная последовательности данной нуклеотидной вариации в РО, была расположена в середине его 3′-концевого узнающего мишень участка РО.
Альтернативно, в настоящем изобретении используется РО, имеющий сайт распознавания нуклеотидной вариации, расположенный в 5′-концевой части 3′-концевого узнающего мишень участка, для селективного узнавания РО конкретной нуклеотидной вариации. 5′-Концевая часть 3′-концевого узнающего мишень участка РО ориентирована по отношению к нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени для детекции этой нуклеотидной вариации, и 5′-Концевая часть 3′-концевого узнающего мишень участка РО имеет последовательность, комплементарную последовательности данной нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
Используемый в данном описании термин "сайт распознавания нуклеотидной вариации" в отношении РО означает сайт, (1) содержащий последовательность, комплементарную последовательности данной нуклеотидной вариации в нуклеиновой кислоте-мишени, и (2) расположенный в 5′-концевой части 3′-концевого узнающего мишень участка.
Когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой комплементарна последовательности сайта распознавания данной нуклеотидной вариации (т.е. с сопоставимой матрицей), 5′-Концевая часть 3′-концевого узнающего мишень участка образует двойную цепь с сопоставимой матрицей; однако, когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой не комплементарна последовательности сайта распознавания данной нуклеотидной вариации (т.е. с несопоставимой матрицей), 5′-Концевая часть 3′-концевого узнающего мишень участка не образует двойной цепи с несопоставимой матрицей.
Следует отметить, что такие различные картины гибридизации в случае представляющей интерес нуклеотидной вариации ответственны за различия в начальных сайтах расщепления РО.
5′-Нуклеаза, используемая в настоящем изобретении, представляет собой фермент, способный расщеплять одну цепь двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты в направлении 5′→3′ экзонуклеолитически или эндонуклеолитически. Как правило, сайт расщепления РО под действием 5′-нуклеазы может варьировать в зависимости от гибридизации 5′-концевой части РО.
Когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой комплементарна последовательности сайта распознавания данной вариации (т.е. с сопоставимой матрицей), 5′-концевая часть 3′-концевого узнающего мишень участка образует двойную цепь с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, индуцируя расщепление в первом начальном сайте расщепления.
Когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой не комплементарна последовательности сайта распознавания данной вариации (т.е. с несопоставимой матрицей), 5′-концевая часть 3′-концевого узнающего мишень участка не образует двойной цепи с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, индуцируя расщепление во втором начальном сайте расщепления, локализованном "вниз по течению" относительно первого начального сайта расщепления.
Следует отметить, что второй начальный сайт расщепления локализован "вниз по течению" относительно первого начального сайта расщепления.
Используемый в данном описании термин "первый начальный сайт расщепления" в отношении РО означает сайт расщепления РО, который расщепляется первым, когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой комплементарна последовательности сайта распознавания данной вариации. Используемый в данном описании термин "второй начальный сайт расщепления" в отношении РО означает сайт расщепления РО, который расщепляется первым, когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой не комплементарна последовательности сайта распознавания данной вариации.
Согласно предпочтительному воплощению сайт распознавания нуклеотидной вариации локализован на расстоянии 10 нуклеотидов, более предпочтительно 8 нуклеотидов, еще более предпочтительно 6 нуклеотидов, еще более предпочтительно 4 нуклеотидов, 3 нуклеотидов, 2 нуклеотидов или 1 нуклеотида от 5′-конца 3′-концевого узнающего мишень участка РО. Предпочтительно сайт распознавания нуклеотидной вариации локализован на 5′-конце 3′-концевого узнающего мишень участка РО.
Термин "сайт" со ссылкой или на сайт распознавания нуклеотидной вариации в зондах, или на сайт нуклеотидной вариации в последовательностях-мишенях, используется в данном описании, охватывая не только один нуклеотид, но также некоторое количество нуклеотидов.
РО, имеющий сайт распознавания нуклеотидной вариации, расположенный в 5′-концевой части 3′-концевого узнающего мишень участка, может быть применен для детекции нуклеотидной вариации совместно с блокатором, устойчивым к расщеплению ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью.
Например, РО имеет блокирующий участок, содержащий в качестве блокатора по меньшей мере один нуклеотид, устойчивый к расщеплению ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью, и этот блокирующий участок расположен в сайте, подлежащем первоначальному расщеплению после гибридизации РО с несопоставимой матрицей. Когда РО, имеющий блокирующий участок, гибридизуется с сопоставимой матрицей, это затрагивает расщепления, начинающегося от первого начального сайта расщепления. Однако, когда РО, имеющий блокирующий участок, гибридизуется с несопоставимой матрицей, блокирующий участок предотвращает расщепление, начинающееся от второго начального сайта расщепления.
Число блокаторов, содержащихся в блокирующим участке, может быть неограниченным, предпочтительно 1-10, более предпочтительно 2-10, еще более предпочтительно 3-8, наиболее предпочтительно 3-6 блокаторов. Блокаторы, присутствующие в зондах, могут быть расположены непрерывно или через промежутки, предпочтительно непрерывно. Нуклеотиды, служащие в качестве блокаторов, имеющие остов, устойчивый к 5′→3′-экзонуклеазной активности, включают любые нуклеотиды, известные специалисту в данной области. Например, они содержат различные фосфоротиоатные связи, фосфонатные связи, фосфороамидатные связи и модификации по 2′-положению углеводов. Согласно более предпочтительному воплощению нуклеотиды, имеющие остов, устойчивый к 5′→3′-экзонуклеазе, содержат фосфоротиоатную связь, алкилфосфотриэфирную связь, арилфосфотриэфирную связь, алкилфосфонатную связь, арилфосфонатную связь, гидрофосфонатную связь, алкилфосфороамидатную связь, арилфосфороамидатную связь, фосфороселенатную связь, модификацию 2′-O-аминопропил, модификацию 2′-O-алкил, модификацию 2′-O-аллил, модификацию 2′-O-бутил, α-аномерный олигодезоксинуклеотид и модификацию 1-(4′-тио-β-O-рибофуранозил).
Возможно, детекцию нуклеотидных вариаций можно осуществить путем соответствующего выбора локализации метки с учетом локализации первого начального сайта расщепления и второго начального сайта расщепления без какого-либо использования блокаторов.
Когда используют одиночную метку, подходящие места локализации одиночной метки дают возможность для следующего: содержащий одиночную метку фрагмент, образованный в результате расщепления РО, гибридизованного с сопоставимой матрицей, не гибридизуется с СО, а содержащий одиночную метку фрагмент, образованный в результате расщепления РО, гибридизованного с несопоставимой матрицей, гибридизуется с СО. Гибридизация между СО и содержащим одиночную метку фрагментом, образованным в результате расщепления РО, гибридизованного с несопоставимой матрицей, обеспечивает получение сигнала, идентичного сигналу, полученному в результате гибридизации между нерасщепленным РО и СО, что тем самым позволяет осуществлять детекцию нуклеотидных вариаций.
Согласно более предпочтительному воплощению одиночная метка, присоединенная к РО, локализована на нуклеотиде между первым начальным сайтом расщепления и вторым начальным сайтом расщепления.
В случае, когда используется система двух взаимодействующих меток, подходящие места локализации такой двойной метки дают возможность для следующего: (1) после расщепления РО, гибридизованного с сопоставимой матрицей, происходит отделение меток в этой двойной метке друг от друга, и по меньшей мере один из фрагментов, содержащий донорную молекулу фрагмент и содержащий акцепторную молекулу фрагмент, не гибридизуется с СО; (2) после расщепления РО, гибридизованного с несопоставимой матрицей, не происходит отделения меток в этой двойной метке друг от друга, и фрагмент, содержащий двойную метку, гибридизуется с СО. Гибридизация между СО и фрагментом, содержащим двойную метку, образованным в результате расщепления РО, гибридизованного с несопоставимой матрицей, обеспечивает получение сигнала, идентичного сигналу, полученному в результате гибридизации между нерасщепленным РО и СО, что тем самым позволяет осуществлять детекцию нуклеотидных вариаций.
Согласно более предпочтительному воплощению, когда используют РО с двойной меткой, одна из меток в этой двойной метке присоединена к нуклеотиду, располагающемуся "вверх по течению" относительно первого начального сайта расщепления, а другая - к нуклеотиду, располагающемуся между первым начальным сайтом расщепления и вторым начальным сайтом расщепления.
Например, когда применяют 5′-тегированный РО, имеющий сайт распознавания нуклеотидной вариации, расположенный в 5′-концевой части 3′-концевого узнающего мишень участка, совместно с СО, подлежащим гибридизации с 5′-тегирующим участком, подходящая локализация меток позволяет осуществить детекцию нуклеотидных вариаций без какого-либо использования блокаторов.
Когда используют 5′-тегированный РО с одиночной меткой, эта одиночная метка, присоединенная к 5′-тегированному РО, предпочтительно локализована на нуклеотиде между первым начальным сайтом расщепления и вторым начальным сайтом расщепления.
На Фиг. 21 представлены воплощения для детекции нуклеотидной вариации с использованием 5′-тегированного РО с одиночной меткой. Сайт распознавания нуклеотидной вариации расположен на расстоянии 1 нуклеотида от 5′-конца 5′-концевой части 3′-концевого узнающего мишень участка. Одиночная метка присоединена к нуклеотиду, расположенному между первым начальным сайтом расщепления и вторым начальным сайтом расщепления.
Когда 5′-тегированный РО, содержащий одиночную метку, гибридизуется с сопоставимой матрицей, он расщепляется в первом начальном сайте расщепления, и образуется фрагмент, содержащий 5′-тегирующий участок без одиночной метки. Поскольку СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с тегирующим участком РО, то содержащий одиночную метку фрагмент, образованный в результате расщепления РО, гибридизованного с сопоставимой матрицей, не гибридизуется с СО. Когда 5′-тегированный РО, содержащий одиночную метку, гибридизуется с несопоставимой матрицей, он расщепляется во втором начальном сайте расщепления, и образуется фрагмент с одиночной меткой, содержащий 5′-тегирующий участок. Поскольку СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с тегирующим участком РО, то содержащий одиночную метку фрагмент, образованный в результате расщепления РО, гибридизованного с несопоставимой матрицей, гибридизуется с СО. Гибридизация между СО и содержащим одиночную метку фрагментом, образованным в результате расщепления РО, гибридизованного с несопоставимой матрицей, обеспечивает получение сигнала, идентичного сигналу, полученному в результате гибридизации между нерасщепленным РО и СО.
Следовательно, в зависимости от присутствия нуклеотидных вариаций могут быть получены различные сигналы.
Когда используют 5′-тегированный РО с двойной меткой, предпочтительно, чтобы одна из меток в этой двойной метке была присоединена к нуклеотиду, располагающемуся "вверх по течению" относительно первого начального сайта расщепления (например, на 5′-конце 5′-тегирующего участка РО), а другая - к нуклеотиду, располагающемуся между первым начальным сайтом расщепления и вторым начальным сайтом расщепления.
Когда 5′-тегированный РО, содержащий двойную метку, гибридизуется с сопоставимой матрицей, он расщепляется в первом начальном сайте расщепления, и происходит отделение меток в этой двойной метке друг от друга с образованием фрагмента, содержащего донорную молекулу, и фрагмента, содержащего акцепторную молекулу. Один из этих фрагментов содержит 5′-тегирующий участок, и он гибридизуется с СО, содержащим нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с данным тегирующим участком 5′-тегированного РО. Когда 5′-тегированный РО, содержащий двойную метку, гибридизуется с несопоставимой матрицей, он расщепляется во втором начальном сайте расщепления, образуя фрагмент, содержащий 5′-тегирующий участок, с двойной меткой. Фрагмент, содержащий 5′-тегирующий участок, с двойной меткой гибридизуется с СО, и продукт гибридизации обеспечивает получение сигнала, идентичного сигналу, полученному в результате гибридизации между нерасщепленным 5′-тегированным РО и СО.
Следовательно, в зависимости от присутствия нуклеотидных вариаций могут быть получены различные сигналы.
Согласно предпочтительному воплощению желательно, чтобы 5′-концевая часть 3′-концевого узнающего мишень участка РО содержала группировку, не подходящую для спаривания оснований, локализованную на расстоянии 1-10 нуклеотидов (более предпочтительно 1-5 нуклеотидов) от сайта распознавания нуклеотидной вариации.
На Фиг. 22 представлены воплощения для детекции нуклеотидной вариации с использованием группировки, не подходящей для спаривания оснований.
Группировка, не подходящая для спаривания оснований, не позволяет 5′-концевой части 3′-концевого узнающего мишень участка образовывать двойную цепь с нуклеотидной последовательностью-мишенью, когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой не комплементарна последовательности сайта распознавания данной вариации.
Использование группировки, не подходящей для спаривания оснований, (например, некомплементарного нуклеотида) усиливает возможность распознавания РО нуклеотидных вариаций.
Согласно предпочтительному воплощению группировка, не подходящая для спаривания оснований, не ингибирует образования двойной цепи между 5′-концевой частью и нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, имеющей нуклеотидную вариацию, последовательность которой комплементарна последовательности сайта распознавания данной нуклеотидной вариации.
Согласно предпочтительному воплощению, группировка, не подходящая для спаривания оснований, увеличивает расстояние между первым начальным сайтом расщепления на гибридной структуре, образованной РО и сопоставимой матрицей, и вторым начальным сайтом расщепления на гибридной структуре, образованной РО и несопоставимой матрицей.
Группировка, не подходящая для спаривания оснований, включает любые группировки, не образующие пары оснований между нуклеиновокислотными последовательностями-мишенями. Предпочтительно группировка, не подходящая для спаривания оснований, представляет собой (1) нуклеотид, содержащий искусственное некомплементарное основание, основание, не подходящее для спаривания оснований (non-base pairing base), модифицированное таким образом, что оно не способно образовывать пару оснований, или универсальное основание, (2) нуклеотид, не подходящий для спаривания оснований (non-base pairing nucleotide), модифицированный таким образом, что он не способен образовывать пару оснований, или (3) химическое соединение, не подходящее для спаривания оснований.
Например, группировка, не подходящая для спаривания оснований, содержит алкиленовую группу, рибофуранозил-нафталин, дезоксирибофуранозил-нафталин, метафосфат, фосфоротиоатную связь, алкилфосфотриэфирную связь, арилфосфотриэфирную связь, алкилфосфонатную связь, арилфосфонатную связь, гидрофосфонатную связь, алкилфосфороамидатную связь и арилфосфороамидатную связь. В качестве группировок, не подходящих для спаривания оснований, также часто используют традиционные углеродные спейсеры. Универсальные основания в качестве группировок, не подходящих для спаривания оснований, полезны для регулирования сайтов расщепления РО.
Группировка, не подходящая для спаривания оснований, введенная в 5′-концевую часть, содержит предпочтительно 1-10, более предпочтительно 1-5, еще более предпочтительно 1-2 группировки. Ряд группировок, не подходящих для спаривания оснований, могут быть расположены в 5′-концевой части непрерывно или через промежутки. Предпочтительно группировка, не подходящая для спаривания оснований, содержит 2-5 следующих друг за другом группировок.
Предпочтительно группировка, не подходящая для спаривания оснований, представляет собой не подходящее для спаривания оснований химическое соединение.
Согласно предпочтительному воплощению сайт распознавания нуклеотидной вариации и группировка, не подходящая для спаривания оснований, локализованы в РО на расстоянии 10 нуклеотидов (более предпочтительно 8 нуклеотидов, 7 нуклеотидов, 6 нуклеотидов, 5 нуклеотидов, 4 нуклеотидов, 3 нуклеотидов, 2 нуклеотидов или 1 нуклеотида, еще более предпочтительно 1 нуклеотида) от 5′-конца 3′-концевого узнающего мишень участка.
Согласно предпочтительному воплощению группировка, не подходящая для спаривания оснований, локализована "вниз по течению" относительно первого начального сайта расщепления.
Согласно предпочтительному воплощению используемая в настоящем изобретении нуклеиновокислотная последовательность-мишень представляет собой нуклеиновокислотную последовательность, предварительно амплифицированную с использованием амплификационного праймера.
Преимущества настоящего изобретения могут быть особо отмечены при одновременной (множественной) детекции по меньшей мере двух нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней. Согласно предпочтительному воплощению способ осуществляют с целью детекции по меньшей мере двух типов (более предпочтительно по меньшей мере трех типов, еще более предпочтительно по меньшей мере пяти типов) нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней. Располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит по меньшей мере два типа (более предпочтительно по меньшей мере три типа, еще более предпочтительно по меньшей мере пять типов) олигонуклеотидовов, РО содержит по меньшей мере два типа (более предпочтительно по меньшей мере три типа, еще более предпочтительно по меньшей мере пять типов) РО, и СО содержит по меньшей мере два типа (более предпочтительно по меньшей мере три типа, еще более предпочтительно по меньшей мере пять типов) СО.
В воплощении с использованием тегированного РО тегирующие участки по меньшей мере двух РО могут иметь идентичную друг другу последовательность или отличающуюся друг от друга последовательность. Например, если настоящее изобретение осуществляют для скрининга нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней (например, детекции нуклеиновокислотной последовательности среди множества нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней), можно использовать РО, имеющие тегирующие участки с идентичной последовательностью.
Кроме того, один тип СО может быть использован для детекции множества нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней. Например, когда для скрининга нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней применяют РО, имеющие идентичную последовательность в своих тегирующих участках, может быть использован один тип СО.
Согласно предпочтительному воплощению способ по настоящему изобретению может быть осуществлен с использованием по меньшей мере двух располагающихся "вниз по течению" праймеров.
Предпочтительные воплощения изобретения
В предпочтительном воплощении данного изобретения предложен способ детекции нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке, включающий:
(a) гибридизацию нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней с парой праймеров, содержащей располагающийся "вверх по течению" праймер и располагающийся "вниз по течению" праймер, и РО (зондирующим олигонуклеотидом); при этом каждый из праймеров, располагающийся "вверх по течению" праймер и располагающийся "вниз по течению" праймер, содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО содержит узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО имеет одиночную метку; РО блокирован по своему 3′-концу, чтобы не допустить его удлинения; узнающий мишень участок РО локализован между располагающимся "вверх по течению" праймером и располагающимся "вниз по течению" праймером; удлиненная цепь располагающегося "вверх по течению" праймера индуцирует расщепление РО под действием матричной полимеразы нуклеиновых кислот, обладающей 5′-нуклеазной активностью;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с матричной полимеразой нуклеиновых кислот, обладающей 5′-нуклеазной активностью в условиях, подходящих для удлинения праймеров и для расщепления РО; при этом, когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотными последовательностями-мишенями, РО расщепляется под действием матричной полимеразы нуклеиновых кислот, обладающей 5′-нуклеазной активностью, с получением содержащего одиночную метку фрагмента;
(c) осуществление реакции гибридизации путем приведения в контакт продукта со стадии (b) с захватывающим олигонуклеотидом (СО), иммобилизованным на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО; причем реакцию гибридизации проводят в таких условиях, что содержащий одиночную метку фрагмент не гибридизуется с СО, а нерасщепленный РО гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО;
(d) денатурацию продукта со стадии (с);
(e) повторение стадий (a)-(d) по меньшей мере дважды; и
(f) детекцию наличия расщепления РО путем измерения сигнала от одиночной метки на твердой подложке; тем самым наличие расщепления РО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
Альтернативно, после стадии (b) выполняют стадию (b-1), проводя денатурацию продукта со стадии (b), и стадию (b-2), повторяя стадии (а)-(b-1) по меньшей мере дважды. В этом случае возможно проведение стадий (d) и (е).
Измерение сигнала от одиночной метки может быть осуществлено для каждого из повторяющихся циклов после повторения стадии (d) или через предварительно определенные интервалы времени в процесс повторения стадии (d).
В другом предпочтительном воплощении данного изобретения предложен способ детекции нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке, включающий:
(а) гибридизацию нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней с парой праймеров, состоящей из располагающегося "вверх по течению" праймера и располагающегося "вниз по течению" праймера, и РО (зондирующим олигонуклеотидом); при этом каждый из праймеров, располагающийся "вверх по течению" праймер и располагающийся "вниз по течению" праймер, содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО содержит узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО имеет систему двух взаимодействующих меток, содержащую донорную молекулу и акцепторную молекулу; РО блокирован по своему 3′-концу, чтобы не допустить его удлинения; узнающий мишень участок РО локализован между располагающимся "вверх по течению" праймером и располагающимся "вниз по течению" праймером; удлиненная цепь располагающегося "вверх по течению" праймера индуцирует расщепление РО под действием матричной полимеразы нуклеиновых кислот, обладающей 5′-нуклеазной активностью;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с матричной полимеразой нуклеиновых кислот, обладающей 5′-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для удлинения праймеров и для расщепления РО; при этом, когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотными последовательностями-мишенями, происходит расщепление РО под действием фермента, обладающего 5′-нуклеазной активностью, с разделением системы двух взаимодействующих меток, в результате чего получаются фрагмент, содержащий донорную молекулу и фрагмент, содержащий акцепторную молекулу;
(c) осуществление реакции гибридизации путем приведения в контакт продукта со стадии (b) с захватывающим олигонуклеотидом (СО), иммобилизованным на твердой подложке; причем реакцию гибридизации проводят в таких условиях, что по меньшей мере один из фрагментов, содержащий донорную молекулу фрагмент и содержащий акцепторную молекулу фрагмент, не гибридизуется с СО, а нерасщепленный РО гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО; при этом сигнал от дуплекса нерасщепленный РО/СО, отличается от сигнала, поступаемого тогда, когда по меньшей мере один из фрагментов, содержащий донорную молекулу фрагмент и содержащий акцепторную молекулу фрагмент, не гибридизуется с СО; и
(d) денатурацию продукта со стадии (с);
(e) повторение стадий (a)-(d) по меньшей мере дважды; и
(f) детекцию наличия расщепления РО путем измерения сигнала от системы двух взаимодействующих меток на твердой подложке; тем самым наличие расщепления РО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
Альтернативно, после стадия (b) выполняют стадию (b-1), проводя денатурацию продукта со стадии (b), и стадию (b-2), повторяя стадии (а)-(b-1) по меньшей мере дважды. В этом случае возможно проведение стадий (d) и (е).
В еще одном предпочтительном воплощении данного изобретения предложен способ детекции нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке, включающий:
(а) гибридизацию нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней с парой праймеров, содержащей располагающийся "вверх по течению" праймер и располагающийся "вниз по течению" праймер, и РО (зондирующим олигонуклеотидом); при этом каждый из праймеров, располагающийся "вверх по течению" праймер и располагающийся "вниз по течению" праймер, содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО содержит узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО блокирован по своему 3′-концу, чтобы не допустить его удлинения; узнающий мишень участок РО локализован между располагающимся "вверх по течению" праймером и располагающимся "вниз по течению" праймером; удлиненная цепь располагающегося "вверх по течению" праймера индуцирует расщепление РО под действием матричной полимеразы нуклеиновых кислот, обладающей 5′-нуклеазной активностью;
b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с матричной полимеразой нуклеиновых кислот, обладающей 5′-нуклеазной активностью в условиях, подходящих для удлинения праймеров и для расщепления РО; при этом, когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотными последовательностями-мишенями, РО расщепляется под действием матричной полимеразы нуклеиновых кислот, обладающей 5′-нуклеазной активностью, с получением содержащего одиночную метку фрагмента;
(c) осуществление реакции гибридизации в присутствии интеркалирующего агента путем приведения в контакт продукта со стадии (b) с захватывающим олигонуклеотидом (СО), иммобилизованным на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО; причем реакцию гибридизации проводят в таких условиях, что содержащий одиночную метку фрагмент не гибридизуется с СО, а нерасщепленный РО гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО;
(d) денатурацию продукта со стадии (с);
(e) повторение стадий (a)-(d) по меньшей мере дважды; и
(f) детекцию наличия расщепления РО путем измерения сигнала от интеркалирующего агента на твердой подложке; тем самым наличие расщепления РО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
Альтернативно, после стадии (b) выполняют стадию (b-1), проводя денатурацию продукта со стадии (b), и стадию (b-2), повторяя стадии (а)-(b-1) по меньшей мере дважды. В этом случае возможно проведение стадий (d) и (е).
IV. Способ детекции мишени в РОСН-анализе, основанном на использовании 5′-нуклеазной активности, независимой от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида
В следующем аспекте настоящего изобретения предложен способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке, включающий:
(а) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с зондирующим олигонуклеотидом (РО); при этом РО содержит узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО имеет одиночную метку;
b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РО; при этом, когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, происходит расщепление РО под действием фермента, обладающего 5′-нуклеазной активностью, с получением содержащего одиночную метку фрагмента;
(c) осуществление реакции гибридизации путем приведения в контакт продукта со стадии (b) с захватывающим олигонуклеотидом (СО), иммобилизованным на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО; причем реакцию гибридизации проводят в таких условиях, что содержащий одиночную метку фрагмент не гибридизуется с СО, а нерасщепленный РО гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО;
(d) детекцию наличия расщепления РО путем измерения сигнала от одиночной метки на твердой подложке; тем самым наличие расщепления РО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
В еще одном аспекте данного изобретения предложен способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке, включающий:
(а) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с зондирующим олигонуклеотидом (РО); при этом РО содержит узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО имеет систему двух взаимодействующих меток, содержащую донорную молекулу и акцепторную молекулу;
b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РО; при этом, когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, происходит расщепление РО под действием фермента, обладающего 5′-нуклеазной активностью, с разделением системы двух взаимодействующих меток, в результате чего получаются фрагмент, содержащий донорную молекулу, и фрагмент, содержащий акцепторную молекулу;
(c) осуществление реакции гибридизации путем приведения в контакт продукта со стадии (b) с захватывающим олигонуклеотидом (СО), иммобилизованным на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО; причем реакцию гибридизации проводят в таких условиях, что по меньшей мере один из фрагментов, содержащий донорную молекулу фрагмент и содержащий акцепторную молекулу фрагмент, не гибридизуется с СО, а нерасщепленный РО гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО; при этом сигнал от дуплекса нерасщепленный РО/СО, отличается от сигнала, поступаемого тогда, когда по меньшей мере один из фрагментов, содержащий донорную молекулу фрагмент и содержащий акцепторную молекулу фрагмент, не гибридизуется с СО; и
(d) детекцию наличия расщепления РО путем измерения сигнала от системы двух взаимодействующих меток на твердой подложке; тем самым наличие расщепления РО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
В еще одном аспекте данного изобретения предложен способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке, включающий:
(а) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с зондирующим олигонуклеотидом (РО); при этом РО содержит узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени;
b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РО; при этом, когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, происходит расщепление РО под действием фермента, обладающего 5′-нуклеазной активностью, с получением отщепленного фрагмента;
(с) осуществление реакции гибридизации в присутствии интеркалирующего агента путем приведения в контакт продукта со стадии (b) с захватывающим олигонуклеотидом (СО), иммобилизованным на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО; причем реакцию гибридизации проводят в таких условиях, что отщепленный фрагмент не гибридизуется с СО, а нерасщепленный РО гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО;
(d) детекцию наличия расщепления РО путем измерения сигнала от интеркалирующего агента на твердой подложке; тем самым наличие расщепления РО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
Настоящее изобретение может быть осуществлено без использования располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида. Расщепление РО может быть проведено с использованием 5′-нуклеазной активности, независимой от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида. В таком случае можно использовать традиционные ферменты, обладающие 5′-нуклеазной активностью, независимой от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида.
Например, можно использовать 5′-нуклеазу FEN, обладающую 5′-экзонуклеазной активностью и/или 5′-эндонуклеазной активностью, независимой от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида.
Среди матричных полимераз существует несколько ферментов, обладающих 5′-нуклеазной активностью (5′-экзонуклеазной активностью и/или 5′-эндонуклеазной активностью), независимой от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, например, Taq ДНК-полимераза (см. lawyer et al., Genome Res., 2, pp. 275-287 (1993), WO 2008/011004 и Lyamichev et. al., Science, 260, pp. 778-783 (1993)).
Согласно предпочтительному воплощению расщепление РО под действием матричной полимеразы, обладающей независимой от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида 5′-нуклеазной активностью, зависит от расположения меток или типа связи с метками, присутствующими в РО. Предпочтительно, когда метка присоединена к 5′-концу нетегированного РО, расщепление нетегированного РО под действием матричной полимеразы, обладающей 5′-нуклеазной активностью, может быть более эффективным, если эта метка присоединена к фосфатной группе 5′-конца нетегированного РО, в частности, через углеродный спейсер. Когда метка присоединена к основанию на 5′-конце нетегированного РО или когда не используется углеродный спейсер, расщепление нетегированного РО маловероятно.
Эффективность расщепления в случае 5′-нуклеазной активности, зависимой от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, может быть выше, чем в случае 5′-нуклеазной активности, независимой от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида.
5′-Нуклеазная активность, независимая от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, более чувствительна к условиям реакции (например, типам ферментов, составам буферов и последовательностям РО).
С учетом амплификации нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней и эффективности расщепления РО РОСН-анализ по настоящему изобретению предпочтительно проводят с использованием располагающихся "вверх по течению" олигонуклеотидов.
Наборы для детекции мишени
В другом аспекте данного изобретения предложен набор для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке, содержащий:
(a) зондирующий олигонуклеотид (РО), содержащий узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени;
(b) располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РО; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РО ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью, и
(с) захватывающий олигонуклеотид (СО), иммобилизованный на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО, в результате чего РО, не расщепленный под действием фермента, обладающего 5′-нуклеазной активностью, гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО.
Поскольку набор по данному изобретению составлен для осуществления описанного выше способа детекции по настоящему изобретению, общее для них описание опущено, чтобы избежать излишнего дублирования, приводящего к усложнению данного описания.
Согласно предпочтительному воплощению РО содержит одиночную метку или систему двух взаимодействующих меток.
Согласно предпочтительному воплощению РО представляет собой 3′-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 3′-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, или 5′-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 5′-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и нуклеотидная последовательность в СО, способная к гибридизации с РО, содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с тегирующим участком РО.
Согласно предпочтительному воплощению РО представляет собой 3′-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 3′-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, или 5′-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 5′-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и нуклеотидная последовательность в СО, способная к гибридизации с РО, содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с частью тегирующего участка и частью узнающего мишень участка РО.
Согласно предпочтительному воплощению РО представляет собой 3′-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 3′-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и СО иммобилизован на твердой подложке через свой 5′-конец.
Согласно предпочтительному воплощению РО представляет собой 5′-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 5′-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и СО иммобилизован на твердой подложке через свой 3′-конец.
Согласно предпочтительному воплощению располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер или располагающийся "вверх по течению" зонд.
Согласно предпочтительному воплощению набор дополнительно содержит фермент, обладающий 5′-нуклеазной активностью, более предпочтительно термостабильную ДНК-полимеразу, обладающую 5′-нуклеазной активностью, или нуклеазу FEN.
Согласно предпочтительному воплощению располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован в непосредственной близости от РО таким образом, что этот располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид индуцирует расщепление РО ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью.
Согласно предпочтительному воплощению располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид имеет частично перекрывающуюся последовательность с узнающим мишень участком РО.
Согласно предпочтительному воплощению располагающийся "вверх по течению" праймер индуцирует посредством своей удлиненной цепи расщепление РО ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью.
Согласно предпочтительному воплощению располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер, а фермент, обладающий 5′-нуклеазной активностью, представляет собой матричную полимеразу нуклеиновых кислот, обладающую 5′-нуклеазной активностью.
Согласно предпочтительному воплощению набор дополнительно содержит интеркалирующий агент.
Согласно предпочтительному воплощению набор используют для детекции по меньшей мере двух типов нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней. Располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит по меньшей мере два типа располагающихся "вверх по течению" олигонуклеотидов, РО содержит по меньшей мере два типа РО, и СО содержит по меньшей мере два типа СО.
Согласно предпочтительному воплощению набор дополнительно содержит располагающийся "вниз по течению" праймер.
Согласно еще одному дополнительному аспекту данного изобретения предложен набор для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке, содержащий:
(a) зондирующий олигонуклеотид (РО), содержащий узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; и
(b) захватывающий олигонуклеотид (СО), иммобилизованный на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО, в результате чего РО, не расщепленный под действием фермента, обладающего 5′-нуклеазной активностью, гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО.
Признаки и преимущества данного изобретения будут обобщены ниже.
(а) В настоящем изобретении осуществляют детекцию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с использованием РОСН-анализа, согласно которому РО (зондирующий олигонуклеотид), гибридизованный с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, расщепляется, и детекцию расщепления РО осуществляют посредством гибридизации с СО (захватывающим олигонуклеотидом). В настоящем изобретении нерасщепленный зонд гибридизуется с олигонуклеотидом, иммобилизованным на твердой подложке.
Согласно традиционным технологиям с применением целевого зонда и иммобилизованного зонда захвата необходимо предотвратить гибридизацию нерасщепленных целевых зондов с иммобилизованными олигонуклеотидами путем (1) конструирования целевого зонда, имеющего шпилечную структуру, и регулирования как условий гибридизации с последовательностями-мишенями, так и условий гибридизации с иммобилизованными олигонуклеотидами; или (2) конструирования иммобилизованных олигонуклеотидов с учетом ориентации иммобилизованных олигонуклеотидов при их иммобилизации и расстояния от них до поверхности твердой подложки. Ввиду этого традиционные методы являются очень неудобными в плане конструирования целевых зондов и иммобилизованных олигонуклеотидов и разработки реакционных условий.
В отличие от них настоящее изобретение лишено таких недостатков и ограничений. В настоящем изобретении конструирование РО и СО является удобной процедурой, и оптимизация реакционных условий обычно осуществляется легко.
(b) Когда в настоящем изобретении детекцию сигнала на твердой подложке осуществляют непрерывно вместе с повторением циклов расщепления РО, число расщепленных РО увеличивается по мере повторения числа реакций расщепления, и сигнал изменяется параллельно с изменением числа расщепленных РО. В этом случае детекцию нуклеиновокислотной последовательности-мишени можно осуществить в режиме реального времени.
(c) Настоящее изобретение дает возможность осуществить одновременную детекцию множества нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней с использованием метки даже одного типа. Поскольку детекцию расщепления РО осуществляют посредством гибридизации с СО, иммобилизованным на твердой подложке, то для детекции множества нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней не требуется наличия у РО различных меток для каждой нуклеиновой кислоты-мишени.
(d) В целом, специалисту в данной области будет очевидно, что с применением способов детекции мишеней, в которых используется непосредственная гибридизация между нуклеиновокислотными последовательностями-мишенями и зондами, иммобилизованными на твердых подложках, нельзя получить эффективные и достоверные результаты гибридизации вследствие лимитирующих реакцию внешних условий, присущих реакции на твердой фазе. В противоположность этому, в настоящем изобретении применяется гибридизация между РО и СО без участия нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней на твердой подложке, что обеспечивает получение более эффективных и достоверных результатов в типичных для реакции на твердой подложке окружении и условиях.
(e) В тех случаях, когда в настоящем изобретении используют тегированный РО и СО, имеющий нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с тегирующим участком РО, последовательность тегирующего участка РО и последовательность СО могут быть выбраны без какого-либо рассмотрения нуклеиновокислотной последовательности-мишени. Это дает возможность для предварительного конструирования набора последовательностей, полезных в настоящем изобретении. В частности, СО может быть получен стандартным образом без какого-либо рассмотрения или каких-либо знаний о нуклеиновокислотных последовательностях-мишенях. Такие признаки обеспечивают значительные преимущества в анализе на микрочипах с использованием СО, иммобилизованных на твердой подложке.
Теперь настоящее изобретение будет описано более подробно в примерах. Специалистам в данной области техники будет очевидно, что эти примеры предназначены для более конкретного иллюстрирования, и объем настоящего изобретения, как он изложен в прилагаемой формуле изобретения, не ограничивается данными примерами.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1. Оценка анализа с расщеплением и гибридизацией зондирующего олигонуклеотида (РОСН) с использованием нетегированного зондирующего олигонуклеотида (РО) с одиночной меткой
Проводили оценку применимости нового анализа - анализа с расщеплением и гибридизацией зондирующего олигонуклеотида (РОСН) для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени, используя нетегированный РО с одиночной меткой (см. Фиг. 2). Расщепление РО проводили в пробирке и аликвоту полученного продукта переносили в микрочип, на котором был иммобилизован захватывающий олигонуклеотид (СО).
10
Для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера и расщепления РО использовали Taq ДНК-полимеразу, обладающую 5′-нуклеазной активностью. Нетегированный РО содержит узнающий мишень участок, комплементарный нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и Quasar570 в качестве флуоресцентной репортерной молекулы на своем 5′-конце. СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с узнающим мишень участком РО. РО и СО блокируют углеродным спейсером по их 3′-концам. СО имеет поли(Т) в качестве линкерной ножки, и иммобилизован на поверхности стеклянной пластинки с использованием аминогруппы (аминоС6) через его 5′-конец, Маркерный зонд, имеющий флуоресцентную репортерную молекулу (Quasar570) на своем 5′-конце, был иммобилизован на поверхности стеклянной пластинки с использованием аминогруппы на его 3′-конце. В качестве матрицы использовали синтетический олигонуклеотид для Neisseria gonorrhoeae (NG).
Последовательности синтетической матрицы, располагающегося "вверх по течению" праймера, РО, СО и маркера, использованных в этом примере, представляют собой:
Для изготовления СО и маркера (SEQ ID NO: 4 и 5) использовали NHS-пластинки NSB9 (NSBPOSTECH Korea). CO и маркер, растворенные в NSB-буфере для точечного нанесения в конечной концентрации 50 мкм, печатали на NSB9 NHS-пластинках с использованием споттера для микрочипов (microarray spotter) PersonalArrayer™16 (CapitalBio, China). CO и маркер наносили в виде пятен по одной линии в формате 2×1 (пятна в двух повторах) и полученный микрочип инкубировали в камере с поддержанием ~85%-ной влажности в течение ночи. Затем пластинки промывали в буферном растворе, содержащем 2×SSPE (0,3 М хлорид натрия; 0,02 М гидрофосфат натрия и 2,0 мМ EDTA), рН 7,4, и 7,0 мМ SDS, при 37°С в течение 30 мин для удаления неспецифически связавшихся СО и маркера и промывали дистиллированной водой. Затем ДНК-функционализированные пластинки сушили с использованием центрифуги для пластинок и хранили в темноте при 4°С до применения.
2
Реакцию расщепления проводили в конечном объеме 50 мкл, содержащем 2 пмоль синтетической матрицы (SEQ ID NO:1) для гена NG, 10 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO: 2), 1 пмоль РО (SEQ ID NO: 3) и 25 мкл смеси 2× Master Mix, содержащей 2,5 мМ MgCl, 200 мкМ dNTP и 4 единицы H-Taq ДНК-полимеразы (Solgent, Korea); пробирку, содержащую реакционную смесь, помещали в термоциклер для проведения ПЦР в режиме реального времени (CFX96, Bio-Rad); реакционную смесь подвергали денатурации в течение 15 мин при 95°С и подвергали 30 циклам по 30 с при 95°С и 60 с при 60°С.
30 мкл полученной смеси помещали в камеру собранную на поверхности стеклянной пластинки NSB, к которой был пришит СО (SEQ ID NO: 4). Пластинку располагали на блоке в термоциклере (GenePro B4I, China). Реакцию гибридизации проводили в течение 30 мин при 55°С. Получение изображений осуществляли с применением конфокального лазерного сканирующего устройства Ахоп GenePix4100A (Molecular Device, US) со сканированием при разрешении с размером пикселя 5 мкм. Интенсивность флуоресценции анализировали с применением программного обеспечения для количественного анализа микрочипов GenePix pro7.0 (Molecular Device, US). Интенсивность флуоресценции выражали в виде средних значений по пятнам после вычитания локального фона. Для проверки воспроизводимости каждое пятно анализировали в двух повторах. Интенсивность флуоресценции указывает среднюю величину для дублированных пятен.
Как показано на Фиг. 14 и в Таблице 1, в присутствии нуклеиновокислотной последовательности-мишени детектировали уменьшенный флуоресцентный сигнал (RFU: 9006±20,5) по сравнению с флуоресцентным сигналом (RFU: 65484±0,7) в отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
Эти результаты указывают на то, что РОСН-анализ применим для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
ПРИМЕР 2. Оценка РОСН-анализа с использованием 3′-тегированного РО с одиночной меткой
Далее авторы изобретения проводили оценку применимости РОСН-анализа для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени, используя 3′-тегированный РО с одиночной меткой (см. Фиг. 4). Расщепление РО проводили в пробирке и аликвоту полученного продукта переносили в микрочип, на котором был иммобилизован СО.
Для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера и расщепления РО использовали Taq ДНК-полимеразу, обладающую 5′-нуклеазной активностью. 3′-тегированный РО содержит узнающий мишень участок, комплементарный нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и 3′-тегирующий участок, некомплементарный нуклеиновокислотной последовательности-мишени. 3′-тегированный РО имеет Quasar570 в качестве флуоресцентной репортерной молекулы на своем 5′-конце. СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с 3′-тегирующим участком РО. 3′-Тегированный РО и СО блокируют углеродным спейсером по их 3′-концам. СО имеет поли(Т)5 в качестве линкерной ножки и иммобилизован на поверхности стеклянной пластинки с использованием аминогруппы (аминоС6) через его 5′-конец. Маркерный зонд, имеющий флуоресцентную репортерную молекулу (Quasar570) на своем 5′-конце, был иммобилизован на поверхности стеклянной пластинки с использованием аминогруппы на его 3′-конце. В качестве матрицы использовали синтетический олигонуклеотид для Neisseria gonorrhoeae (NG).
Последовательности синтетической матрицы, располагающегося "вверх по течению" праймера, 3′-тегированного РО, СО и маркера, использованных в этом примере, представляют собой:
(Подчеркнутыми буквами отмечен 3′-тегирующий участок РО).
Подготовку пластинок проводили в соответствии с протоколом, аналогичным примененному в Примере 1, за исключением того, что использовали СО с SEQ ID NO: 7 вместо СО с SEQ ID NO: 4.
2
Реакцию расщепления проводили в конечном объеме 50 мкл, содержащем 2 пмоль синтетической матрицы (SEQ ID NO:1) для гена NG, 10 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO: 2), 1 пмоль РО (SEQ ID NO: 6) и 25 мкл смеси 2× Master Mix, содержащей 2,5 мМ MgCl, 200 мкМ dNTP и 4 единицы H-Taq ДНК-полимеразы (Solgent, Korea); пробирку, содержащую реакционную смесь, помещали в термоциклер для проведения ПЦР в режиме реального времени (CFX96, Bio-Rad); реакционную смесь подвергали денатурации в течение 15 мин при 95°С и подвергали 30 циклам по 30 с при 95°С и 60 с при 60°С.
30 мкл полученной смеси помещали в камеру собранную на поверхности стеклянной пластинки NSB, к которой был пришит СО (SEQ ID NO: 7). Пластинку располагали на блоке в термоциклере (GenePro B41, China). Реакцию гибридизации проводили в течение 30 мин при 55°С. Получение изображений осуществляли с применением конфокального лазерного сканирующего устройства Ахоn GenePix4100A (Molecular Device, US) со сканированием при разрешении с размером пикселя 5 мкм. Интенсивность флуоресценции анализировали с применением программного обеспечения для количественного анализа микрочипов GenePix pro7.0 (Molecular Device, US). Интенсивность флуоресценции выражали в виде средних значений по пятнам после вычитания локального фона. Для проверки воспроизводимости каждое пятно анализировали в двух повторах. Интенсивность флуоресценции указывает среднюю величину для дублированных пятен.
Как показано на Фиг. 15 и в Таблице 2, в присутствии нуклеиновокислотной последовательности-мишени детектировали уменьшенный флуоресцентный сигнал (RFU: 10217±73,5) по сравнению с флуоресцентным сигналом (RFU: 65464±6,4) в отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
Эти результаты указывают на то, что РОСН-анализ с использованием 3′-тегированного РО с одиночной меткой применим для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
ПРИМЕР 3. Оценка РОСН-анализа с использованием 5′-тегиро ванного РО с одиночной меткой
Далее авторы изобретения проводили оценку применимости РОСН-анализа для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени, используя 5′-тегированный РО с одиночной меткой (см. Фиг. 5). Расщепление РО проводили в пробирке и аликвоту полученного продукта переносили в микрочип, на котором был иммобилизован СО.
10
Для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера и расщепления РО использовали Taq ДНК-полимеразу, обладающую 5′-нуклеазной активностью. 5′-тегированный РО содержит узнающий мишень участок, комплементарный нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и 5′-тегирующий участок, некомплементарный нуклеиновокислотной последовательности-мишени. 5′-тегированный РО имеет Quasar570 в качестве флуоресцентной репортерной молекулы на своем 3′-конце. СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с 5′-тегирующим участком РО. СО имеет поли(Т) в качестве линкерной ножки и иммобилизован на поверхности стеклянной пластинки с использованием аминогруппы (аминоС7) через его 3′-конец. Маркерный зонд, имеющий флуоресцентную репортерную молекулу (Quasar570) на своем 5′-конце, был иммобилизован на поверхности стеклянной пластинки с использованием аминогруппы на его 3′-конце. В качестве матрицы использовали синтетический олигонуклеотид для Neisseria gonorrhoeae (NG).
Последовательности синтетической матрицы, располагающегося "вверх по течению" праймера, 5′-тегированного РО, СО и маркера, использованных в этом примере, представляют собой:
(Подчеркнутыми буквами отмечен 5′-тегирующий участок РО). Подготовку пластинок проводили в соответствии с протоколом, аналогичным примененному в Примере 1, за исключением того, что использовали СО с SEQ ID NO: 9 вместо СО с SEQ ID NO: 4.
2
Реакцию расщепления проводили в конечном объеме 50 мкл, содержащем 2 пмоль синтетической матрицы (SEQ ID NO:1) для гена NG, 10 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO: 2), 1 пмоль РО (SEQ ID NO: 8) и 25 мкл смеси 2× Master Mix, содержащей 2,5 мМ MgCl, 200 мкМ dNTP и 4 единицы H-Taq ДНК-полимеразы (Solgent, Korea); пробирку, содержащую реакционную смесь, помещали в термоциклер для проведения ПЦР в режиме реального времени (CFX96, Bio-Rad); реакционную смесь подвергали денатурации в течение 15 мин при 95°С и подвергали 30 циклам по 30 с при 95°С и 60 с при 60°С.
30 мкл полученной смеси помещали в камеру собранную на поверхности стеклянной пластинки NSB, к которой был пришит СО (SEQ ID NO: 9). Пластинку располагали на блоке в термоциклере (GenePro B4I, China). Реакцию гибридизации проводили в течение 30 мин при 55°С. Получение изображений осуществляли с применением конфокального лазерного сканирующего устройства Axon GenePix4100A (Molecular Device, US) со сканированием при разрешении с размером пикселя 5 мкм. Интенсивность флуоресценции анализировали с применением программного обеспечения для количественного анализа микрочипов GenePix pro7.0 (Molecular Device, US). Интенсивность флуоресценции выражали в виде средних значений по пятнам после вычитания локального фона. Для проверки воспроизводимости каждое пятно анализировали в двух повторах. Интенсивность флуоресценции указывает среднюю величину для дублированных пятен.
Как показано на Фиг. 16 и в Таблице 3, в присутствии нуклеиновокислотной последовательности-мишени детектировали уменьшенный флуоресцентный сигнал (RFU: 17586±152,0) по сравнению с флуоресцентным сигналом (RFU: 65455±0,7) в отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
Эти результаты указывают на то, что РОСН-анализ с использованием 5′-тегированного РО с одиночной меткой применим для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
ПРИМЕР 4. Оценка РОСН-анализа с использованием 3′-тегированного РО с двойной меткой
Далее авторы изобретения проводили оценку применимости РОСН-анализа для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени, используя 3′-тегированный РО с двойной меткой (см. Фиг. 11). Расщепление РО проводили в пробирке и аликвоту полученного продукта переносили в микрочип, на котором был иммобилизован СО.
5
Для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера и расщепления РО использовали Taq ДНК-полимеразу, обладающую 5′-нуклеазной активностью. 3′-тегированный РО содержит узнающий мишень участок, комплементарный нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и 3′-тегирующий участок, некомплементарный нуклеиновокислотной последовательности-мишени. 3′-тегированный РО содержит BHQ-2 в качестве акцепторной молекулы на своем 5′-конце и Quasar570 в качестве донорной молекулы на своем 3′-конце узнающего мишень участка. СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с 3′-тегирующим участком РО. Для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени измеряли сигнал от донорной молекулы. 3′-тегированный РО и СО блокируют углеродным спейсером по их 3′-концам. СО имеет поли(Т) в качестве линкерной ножки и иммобилизован на поверхности стеклянной пластинки с использованием аминогруппы (аминоС6) через его 5′-конец. Маркерный зонд, имеющий флуоресцентную репортерную молекулу (Quasar570) на своем 5′-конце, был иммобилизован на поверхности стеклянной пластинки с использованием аминогруппы на его 3′-конце. В качестве матрицы использовали синтетический олигонуклеотид для Neisseria gonorrhoeae (NG).
Последовательности синтетической матрицы, располагающегося "вверх по течению" праймера, 3′-тегированного РО, СО и маркера, использованных в этом примере, представляют собой:
(Подчеркнутыми буквами отмечен 3′-тегирующий участок РО).
Подготовку пластинок проводили в соответствии с протоколом, аналогичным примененному в Примере 1, за исключением того, что использовали СО с SEQ ID NO: 7 вместо СО с SEQ ID NO: 4.
2
Реакцию расщепления проводили в конечном объеме 50 мкл, содержащем 2 пмоль синтетической матрицы (SEQ ID NO: 1) для гена NG, 10 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO: 2), 1 пмоль РО (SEQ ID NO: 10) и 25 мкл смеси 2× Master Mix, содержащей 2,5 мМ MgCl, 200 мкМ dNTP и 4 единицы Н-Taq ДНК-полимеразы (Solgent, Korea); пробирку, содержащую реакционную смесь, помещали в термоциклер для проведения ПЦР в режиме реального времени (CFX96, Bio-Rad); реакционную смесь подвергали денатурации в течение 15 мин при 95°С и подвергали 30 циклам по 30 с при 95°С и 60 с при 60°С.
30 мкл полученной смеси помещали в камеру собранную на поверхности стеклянной пластинки NSB, к которой был пришит СО (SEQ ID NO: 7). Пластинку располагали на блоке в термоциклере (GenePro B4I, China). Реакцию гибридизации проводили в течение 30 мин при 55°С. Получение изображений осуществляли с применением конфокального лазерного сканирующего устройства Axon GenePix4100A (Molecular Device, US) со сканированием при разрешении с размером пикселя 5 мкм. Интенсивность флуоресценции анализировали с применением программного обеспечения для количественного анализа микрочипов GenePix pro7.0 (Molecular Device, US). Интенсивность флуоресценции выражали в виде средних значений по пятнам после вычитания локального фона. Для проверки воспроизводимости каждое пятно анализировали в двух повторах. Интенсивность флуоресценции указывает среднюю величину для дублированных пятен.
Поскольку акцепторная молекула гасит флуоресцентный сигнал от донорной молекулы, в дуплексе (нерасщепленный 3′-тегированный РО)/СО отсутствует какой-либо сигнал от донорной молекулы. При этом, содержащий донорную молекулу фрагмент расщепленного 3′-тегированного РО, гибридизованного с СО, в состоянии обеспечить поступление флуоресцентного сигнала.
Как показано на Фиг. 17 и в Таблице 4, в присутствии нуклеиновокислотной последовательности-мишени детектировали увеличенный флуоресцентный сигнал (RFU: 65469±0,7) по сравнению с флуоресцентным сигналом (RFU: 13349±441,2) в отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
Эти результаты указывают на то, что РОСН-анализ с использованием 3′-тегированного РО с двойной меткой применим для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
ПРИМЕР 5. Детекция нуклеиновокислотной последовательности-мишени в РОСН-анализе
Авторы изобретения применили РОСН-анализ для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени, дополненный амплификацией последовательности-мишени. Для изучения возможности такого применения использовали нетегированный РО с одиночной меткой и 3′-тегированный РО с одиночной меткой, соответственно. Расщепление РО в процессе амплификации мишени посредством ПЦР проводили в пробирке и аликвоту полученного продукта переносили в микрочип, на котором был иммобилизован СО.
Располагающийся "вверх по течению" праймер участвует в расщеплении РО под действием фермента, обладающего 5′-нуклеазной активностью, и также участвует в амплификации нуклеиновокислотной последовательности-мишени вместе с располагающимся "вниз по течению" праймером в процессе ПЦР. Для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера и располагающегося "вниз по течению" праймера и расщепления РО использовали Taq ДНК-полимеразу, обладающую 5′-нуклеазной активностью.
Нетегированный РО содержит узнающий мишень участок, комплементарный нуклеиновокислотной последовательности-мишени. СО для нетегированного РО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с узнающим мишень участком РО. 3′-Тегированный РО содержит узнающий мишень участок, комплементарный нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и S′-тегирующий участок, некомплементарный нуклеиновокислотной последовательности-мишени. СО для 3′-тегированного РО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с 3′-тегирующим участком РО.
10
5
Нетегированный РО и 3′-Тегированный РО содержат Quasar570 в качестве флуоресцентной репортерной молекулы на своих 5′-концах. РО и СО блокируют углеродным спейсером по их 3′-концам. СО для нетегированного РО имеет поли(Т) в качестве линкерной ножки и иммобилизован на поверхности стеклянной пластинки с использованием аминогруппы (аминоС6) через его 5′-конец. СО для 3-тегированного РО имеет поли(Т) в качестве линкерной ножки и иммобилизован на поверхности стеклянной пластинки с использованием аминогруппы (аминоС6) через его 5′-конец. Маркерный зонд, имеющий флуоресцентную репортерную молекулу (Quasar570) на своем 5′-конце, был иммобилизован на поверхности стеклянной пластинки с использованием аминогруппы на его 3′-конце. В качестве матрицы-мишени использовали геномную ДНК из Neisseria gonorrhoeae (NG).
5-1. РОСН-анализ с использованием нетегированного РО с одиночной меткой
Последовательности располагающегося "вверх по течению" праймера, располагающегося "вниз по течению" праймера, РО, СО и маркера, использованных в этом примере, представляют собой:
Подготовку пластинок проводили в соответствии с протоколом, аналогичным примененному в Примере 1.
2
Реакцию расщепления проводили в конечном объеме 50 мкл, содержащем 100 пг геномной ДНК из NG, 10 пмоль располагающегося "вниз по течению" праймера (SEQ ID NO: 11), 10 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO: 12), 1 пмоль РО (SEQ ID NO: 3) и 25 мкл смеси 2× Master Mix, содержащей 2,5 мМ MgCl, 200 мкМ dNTP и 4 единицы Н-Tag ДНК-полимеразы (Solgent, Korea); пробирку, содержащую реакционную смесь, помещали в термоциклер для проведения ПЦР в режиме реального времени (CFX96, Bio-Rad); реакционную смесь подвергали денатурации в течение 15 мин при 95°С и подвергали 60 циклам по 30 с при 95°С и 60 с при 60°С.30 мкл полученной смеси помещали в камеру, собранную на поверхности стеклянной пластинки NSB, к которой был пришит СО (SEQ ID NO: 4). Пластинку располагали на блоке в термоциклере (GenePro B4I, China). Реакцию гибридизации проводили в течение 30 мин при 55°С. Получение изображений осуществляли после каждой промывки с применением конфокального лазерного сканирующего устройства Axon GenePix4100A (Molecular Device, US) со сканированием при разрешении с размером пикселя 5 мкм. Интенсивность флуоресценции анализировали с применением программного обеспечения для количественного анализа микрочипов GenePix pro7.0 (Molecular Device, US). Интенсивность флуоресценции выражали в виде средних значений по пятнам после вычитания локального фона. Для проверки воспроизводимости каждое пятно анализировали в двух повторах. Интенсивность флуоресценции указывает среднюю величину для дублированных пятен.
Как показано на Фиг. 18 и в Таблице 5, в присутствии нуклеиновокислотной последовательности-мишени детектировали уменьшенный флуоресцентный сигнал (RFU: 1650±97,6) по сравнению с флуоресцентным сигналом (RFU: 64474±0,0) в отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
5-2. РОСН-анализ с использованием 3′-тегированного РО с одиночной меткой
Последовательности располагающегося "вверх по течению" праймера, располагающегося "вниз по течению" праймера, 3′-тегированного РО, СО и маркера, использованных в этом примере, представляют собой:
(Подчеркнутыми буквами отмечен 3′-тегирующий участок РО). Подготовку пластинок проводили в соответствии с протоколом, аналогичным примененному в Примере 2.
2
Реакцию расщепления проводили в конечном объеме 50 мкл, содержащем 100 пг геномной ДНК из NG, 10 пмоль располагающегося "вниз по течению" праймера (SEQ ID NO: 11), 10 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO: 2), 1 пмоль РО (SEQ ID NO: 6) и 25 мкл смеси 2× Master Mix, содержащей 2,5 мМ MgCl, 200 мкМ dNTP и 4 единицы H-Taq ДНК-полимеразы (Solgent, Korea); пробирку, содержащую реакционную смесь, помещали в термоциклер для проведения ПЦР в режиме реального времени (CFX96, Bio-Rad); реакционную смесь подвергали денатурации в течение 15 мин при 95°С и подвергали 60 циклам по 30 с при 95°С и 60 с при 60°С. 30 мкл полученной смеси помещали в камеру, собранную на поверхности стеклянной пластинки NSB, к которой был пришит СО (SEQ ID NO: 7). Пластинку располагали на блоке в термоциклере (GenePro B4I, China). Реакцию гибридизации проводили в течение 30 мин при 55°С. Получение изображений осуществляли после каждой промывки с применением конфокального лазерного сканирующего устройства Axon GenePix4100A (Molecular Device, US) со сканированием при разрешении с размером пикселя 5 мкм. Интенсивность флуоресценции анализировали с применением программного обеспечения для количественного анализа микрочипов GenePix pro7.0 (Molecular Device, US). Интенсивность флуоресценции выражали в виде средних значений по пятнам после вычитания локального фона. Для проверки воспроизводимости каждое пятно анализировали в двух повторах. Интенсивность флуоресценции указывает среднюю величину для дублированных пятен.
Как показано на Фиг. 19 и в Таблице 6, в присутствии нуклеиновокислотной последовательности-мишени детектировали уменьшенный флуоресцентный сигнал (RFU: 9969±217,1) по сравнению с флуоресцентным сигналом (RFU: 65470±1,4) в отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
Эти результаты указывают на то, что детекцию нуклеиновокислотной последовательности-мишени можно проводить в РОСН-анализе, дополненном амплификацией мишени с использованием процесса ПЦР.
ПРИМЕР 6. Детекция нуклеиновокислотной последовательности-мишени в РОСН-анализе в режиме реального времени
Авторы изобретения применили РОСН-анализ для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в режиме реального времени. Для изучения возможности такого применения использовали 3′-тегированный РО. Расщепление РО и гибридизацию РО с СО проводили совместно с амплификацией мишени в процессе ПЦР на микрочипе с иммобилизованным СО. Измеряли изменение флуоресцентного сигнала в зависимости от числа циклов. В качестве матрицы-мишени использовали геномную ДНК Neisseria gonorrhoeae (NG).
В этом Примере использовали те же самые олигонуклеотиды (располагающийся "вверх по течению" праймер, располагающийся "вниз по течению" праймер, 3′-тегированный РО, СО и маркер), что и в примере 5-2. Подготовку пластинок проводили в соответствии с протоколом, аналогичным примененному в Примере 2.
2
Смесь для РОСН-анализа готовили в конечном объеме 30 мкл, содержащем 100 пг геномной ДНК из NG, 10 пмоль располагающегося "вниз по течению" праймера (SEQ ID NO: 11), 10 пмоль располагающегося "вверх по течению" праймера (SEQ ID NO: 2), 1 пмоль РО (SEQ ID NO: 6) и 25 мкл смеси 2× Master Mix, содержащей 2,5 мМ MgCl, 200 мкМ dNTP и 4 единицы Н-Taq ДНК-полимеразы (Solgent, Korea); смесь целиком помещали в камеру, собранную на поверхности стеклянной пластинки NSB, к которой был пришит СО (SEQ ID NO: 7). Пластинку располагали на блоке в термоциклере (GenePro B4I, China). Для проведения анализа в циклическом режиме готовили пять одинаковых пластинок. Реакцию с РОСН проводили следующим образом: денатурация в течение 15 мин при 95°С и затем 0, 5, 30, 40 или 60 циклов по 30 с при 95°С, 60 с при 60° и 30 мин при 55°С. После прохождения соответствующего числа циклов получение изображений осуществляли с применением конфокального лазерного сканирующего устройства Axon GenePix4100A (Molecular Device, US) со сканированием при разрешении с размером пикселя 5 мкм. Интенсивность флуоресценции анализировали с применением программного обеспечения для количественного анализа микрочипов GenePix pro7.0 (Molecular Device, US). Интенсивность флуоресценции выражали в виде средних значений по пятнам после вычитания локального фона. Для проверки воспроизводимости каждое пятно анализировали в двух повторах. Интенсивность флуоресценции указывает среднюю величину для дублированных пятен.
Как показано на Фиг. 20А и 20В и в Таблице 7, флуоресцентный сигнал уменьшался после 30 циклов (0 циклов_RFU: 65438±0,0; 20 циклов_RFU: 65445±2,1; 30 циклов_RFU: 65480±0,0; 40 циклов_RFU: 8844±1485,6 и 60 циклов_RFU: 4878±169,7) в присутствии матрицы. Не наблюдали никакого изменения флуоресцентного сигнала в зависимости от числа циклов в отсутствие матрицы.
Эти результаты указывают на то, нуклеиновокислотную последовательность-мишень можно детектировать в режиме реального времени в РОСН-анализе.
ПРИМЕР 7. Оценка РОСН-анализа с использованием расщепления РО, не зависимого от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида
Далее авторы изобретения проводили оценку применимости РОСН-анализа для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени без использования располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида. Расщепление РО, не зависимое от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, проводили в пробирке без располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида и аликвоту полученного продукта переносили в микрочип, на котором был иммобилизован СО.
10
Для расщепления РО, не зависимого от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, использовали Taq ДНК-полимеразу, обладающую 5′-нуклеазной активностью. Нетегированный РО содержит узнающий мишень участок, комплементарный нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и FAM в качестве флуоресцентной репортерной молекулы на своем 5′-конце. СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с узнающим мишень участком РО. РО и СО блокируют углеродным спейсером по их 3′-концам. СО имеет поли(Т) в качестве линкерной ножки и иммобилизован на поверхности стеклянной пластинки с использованием аминогруппы (аминоС6) через его 5′-конец. Маркерный зонд, имеющий флуоресцентную репортерную молекулу (Quasar570) на своем 5′-конце, был иммобилизован на поверхности стеклянной пластинки с использованием аминогруппы на его 3′-конце. В качестве матрицы использовали синтетический олигонуклеотид для Neisseria gonorrhoeae (NG).
Последовательности синтетической матрицы, РО, СО и маркера, использованных в этом примере, представляют собой:
Для изготовления СО и маркера (SEQ ID NO: 4 и 5) использовали NHS-пластинки NSB9 (NSBPOSTECH Korea). CO и маркер, растворенные в NSB-бусрере для точечного нанесения в конечной концентрации 50 мкм, печатали на NSB9 NHS-пластинках с использованием споттера для микрочипов PersonalArrayer™16 (CapitalBio, China). CO и маркер наносили в виде пятен по одной линии в формате 2×1 (пятна в двух повторах) и полученный микрочип инкубировали в камере с поддержанием ~85%-ной влажности в течение ночи. Затем пластинки промывали в буферном растворе, содержащем 2×SSPE (0,3 М хлорид натрия; 0,02 М гидрофосфат натрия и 2,0 мМ EDTA), рН 7,4 и 7,0 мМ SDS, при 37°С в течение 30 мин для удаления неспецифически связавшихся СО и маркера и промывали дистиллированной водой. Затем ДНК-функционализированные пластинки сушили с применением центрифуги для пластинок и хранили в темноте при 4°С до применения.
2
Реакцию расщепления проводили в конечном объеме 50 мкл, содержащем 2 пмоль синтетической матрицы (SEQ ID NO: 1) для гена NG, 1 пмоль РО (SEQ ID NO: 12) и 25 мкл смеси 2× Master Mix, содержащей 2,5 мМ MgCl, 200 мкМ dNTP и 4 единицы H-Taq ДНК-полимеразы (Solgent, Korea); пробирку, содержащую реакционную смесь, помещали в термоциклер для проведения ПЦР в режиме реального времени (CFX96, Bio-Rad); реакционную смесь подвергали денатурации в течение 15 мин при 95°С и подвергали 30 циклам по 30 с при 95°С и 60 с при 60°С.
30 мкл полученной смеси помещали в камеру, собранную на поверхности стеклянной пластинки NSB, к которой был пришит СО (SEQ ID NO: 4). Пластинку располагали на блоке в термоциклере (GenePro B4I, China). Реакцию гибридизации проводили в течение 30 мин при 55°С. Получение изображений осуществляли с применением конфокального лазерного сканирующего устройства Axon GenePix4100A (Molecular Device, US) со сканированием при разрешении с размером пикселя 5 мкм. Интенсивность флуоресценции анализировали с применением программного обеспечения для количественного анализа микрочипов GenePix pro7.0 (Molecular Device, US). Интенсивность флуоресценции выражали в виде средних значений по пятнам после вычитания локального фона. Для проверки воспроизводимости каждое пятно анализировали в двух повторах. Интенсивность флуоресценции указывает среднюю величину для дублированных пятен.
В присутствии нуклеиновокислотной последовательности-мишени детектировали уменьшенный флуоресцентный сигнал по сравнению с флуоресцентным сигналом в отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
Эти результаты указывают на то, что РОСН-анализ с использованием расщепления РО, не зависимого от располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, применим для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
Основываясь на описании предпочтительного воплощения настоящего изобретения, следует понимать, что его варианты и модификации, соответствующие сущности изобретения, могут стать очевидными специалистам в данной области, и объем данного изобретения следует определять прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.