Экспрессионный анализ микроРНК для диагностики и прогноза рака молочной железы

Молекулярно-генетические аспекты диагностики

Экспрессионный анализ микроРНК

для диагностики и прогноза рака молочной железы

Н.И. ПОСПЕХОВА1, С.В. ПОЯРКОВ1, Е.Г. ЗЕНИТ-ЖУРАВЛЁВА1, П.В. ШУБИН1, А.В. КАРПУХИН1, Е.В. КАТКОВА2, В.А. ХАйЛЕНКО2

1ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН, Москва

2ФГБУ «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина» РАМН, Москва

В работе проанализированы данные научной литературы последних лет, посвящённые изучению роли микроРНК в возникновении и прогрессировании рака молочной железы, возможности использования этих молекул в качестве биомаркёров рака. Приведены результаты собственных исследований микроРНК. В работе проведен анализ уровней экспрессии 14 микроРНК, ассоциированных с развитием рака молочной железы, в 54 образцах опухолевой и нормальной ткани (27 пациентов). Показано, что паттерны экспрессии микроРНК разнообразны и пациент-специфичны. Установлен ряд закономерностей. Уровень экспрессии miR-182 повышен в 81% случаев. Экспрессия miR-31, супрессора метастазирования, подавлена в 56% случаев.

С использованием кластерного анализа выделен кластер коэкспрессии 5-ти микроРНК с преимущественно повышенной экспрессией miR-10b, miR-21, miR-155, miR-34a и miR-335. Предполагается существование ассоциации ко-экспрессирующихся в этом кластере микроРНК с патоморфологическими признаками, в том числе, преимущественным наличием метастазов. При анализе транскрипционной регуляции показано, что все микроРНК из кластера - транскрипционные мишени p53, RelA и NF-kB.

Кластеризация и выделение групп микроРНК (signature) позволяют классифицировать пациентов по различным параметрам, выделять особенности, связанные с кластерами, что может расширить представление о роли микроРНК в развитии рака.

Ключевые слова: рак молочной железы, микроРНК, анализ экспрессии микроРНК.

Рак молочной железы (РМЖ) является гетерогенным заболеванием. Эта гетерогенность, которая в течение десятилетий характеризовалась на гистологическом уровне, в настоящее время оценивается на молекулярно-генетическом уровне: каждый тип опухоли является самостоятельным заболеванием ^огПе et а1. 2001; Sorlie et а1. 2006]. Высокая гетерогенность опухолей молочной железы делает принципиально важным её молекулярную характеристику, основанную не только на определении генных мутаций и профиля экспрессии генов, но и на новых биологических маркёрах.

Такими новыми биомаркёрами являются микроРНК (microRNA, miRNA, miR) - небольшие молекулы, регулирующие экспрессию генов и участвующие, по-видимому, во всех клеточных процессах. К настоящему времени известно более двух тысяч микроРНК человека (miRBase,

введение

http://www.mirbase.org/, 2012), каждая из которых потенциально может регулировать работу сотен генов-мишеней [Bartel, 2009], (TargetScan, http://www.targetscan.org/, 2012). МикроРНК контролируют экспрессию генов на посттранскрипционном уровне, вызывая деградацию мРнК-мишеней или нарушение трансляции [Janga et al., 2011; Sato et al., 2011]. Значительное количество микроРНК вовлечены в процесс канцерогенеза и изменение их экспрессии способствует образованию и развитию различных типов опухолей [Farazi et al., 2011]. Ассоциация микроРНК с раком молочной железы была установлена в 2005 г. в исследованиях с использованием клеточных линий, клинических образцов и моделей in vivo.

Разные микроРНК могут либо стимулировать, либо супрессировать развитие опухоли и метастазов. Они ассоциированы с разными подтипами рака, могут служить маркерами прогноза ответа на лекарственную терапию. МикроРНК

в качестве маркёров для диагностики РМЖ и прогноза имеют важные преимущества по сравнению с мРнК: в отличие от скрининга значительного числа экспрессируемых генов, может быть достаточным анализ небольшого числа микроРнК; эти молекулы РнК стабильны, и в плазме крови и парафиновых блоках микроРнК остаются в значительной степени интактными. Изучение роли микроРнК в процессах канцерогенеза демонстрирует возможность создания экспрессионных панелей этих молекул (miRNA signatures).

В течение последних нескольких лет исследования микроРнК привели к идентификации ряда miRNA, которые аберрантно экспрессируются в опухолях, в том числе в РМЖ. хорошо охарактеризованы функции только небольшой части этих микроРнК. Активно изучаются взаимоотношения микроРнК с генами-мишенями и генами, регулирующими сами miR. В РМЖ, как и в других типах рака, различные микроРнК функционируют или как супрессор опухоли (tumor suppressors miRNA), или как онкогены (oncomir). Таким образом, возникновение и прогрессирование опухоли может быть следствием снижения активности микроРнК, супрессирующих опухоль, и/или избыточной экспрессии онкогенных микроРнК. Большое число исследований посвящено нескольким микроРнК, связанных с РМЖ. Среди них - микроРнК, обладающие онкогенными свойствами: miR-21, miR-155, miR-373/520c, и микроРнК, супрессирующие развитие опухоли: miR-31, miR-34a, miR-125b, miR-200, miR-145. В тоже время число miR, вовлечённых в канцерогенез РМЖ, увеличивается с каждым днём. Значительное число работ посвящено определению генов, являющихся мишенями микроРнК. Изменения в экспрессии таких генов, регулируемые miR, отражают нарушения в клеточных процессах при возникновении и развитии опухоли. Однако взаимодействие микроРнК/мРнК (ген-мишень) далеко не всегда отражается в виде координированной экспрессии этих молекул. Каждая miR потенциально взаимодействует с множеством генов, поэтому выявление конкретных путей действия микроРнК представляет значительную проблему.

Метастатический потенциал опухоли также может быть связан с изменением экспрессии определённых miR: прометастатических и антиметастатических микроРнК (metastamiR). К наиболее известным из них относится miR-10b, а также miR-31, miR-373/520c, miR-335 и ряд других.

Ассоциация экспрессии микроРнК в опухоли с её чувствительностью к химиотерапии проде-

монстрирована для большинства солидных опухолей. Разные микроРнК могут прогнозировать эффективность применения противоопухолевых препаратов. Известно, что микроРнК играют значительную роль в лекарственной устойчивости раковых клеток при терапии ингибиторами эстрогеновых рецепторов. Так, например, miR-221 и miR-222 определяют чувствительность клеток к тамоксифену, участвуя в регуляции экспрессии своего гена-мишени - рецептора эстрогена (ESR1) [Zhao et al., 2008]. Эти микроРнК также определяют чувствительность к фулвестранту (fulvestrant), который применяют при лечении гормоночувствительного РМЖ в случае неэффективности тамоксифена [Rao X. et al., 2011].

Циркулирующие микроРнК могут играть роль диагностического маркёра. В последние годы охарактеризованы некоторые микроРнК, циркулирующие в крови больных раком, в том числе РМЖ. Возможность определять концентрацию этих молекул в плазме (сыворотке) возникает вследствие высокой стабильности микроРнК, которые циркулируют в крови в составе микровезикул (экзосом) или в связанном с белками Argonaut (AGO) виде. Ряд miR с высокой специфичностью и чувствительностью позволяют дифференцировать больных РМЖ и здоровых людей. например, в работе Roth с соавт. [Roth et al., 2010] были использованы miR-10b, miR-34a и miR-155, повышенная концентрация которых детектировалась в крови больных. В тоже время многие исследователи используют новые микроРнК, ассоциированные с РМЖ, в попытках обнаружить высокоспецифичный маркёр на ранней стадии заболевания.

ниже дана краткая характеристика микроРнК, изученных в настоящей работе.

Одной из наиболее изученных при РМЖ является микроРнК-21, охарактеризованная как онкогенная miRNA в ряде исследований. Инги-бирование активности микроРнК-21 запускает апоптоз и угнетает рост раковых клеток in vitro и in vivo через негативную регуляцию экспрессии bcl-2 [Si et al., 2007]. Как онкогенная микроРнК, miR-21 играет важную роль не только в росте опухоли, но и в инвазии и метастазировании опухоли через регуляцию экспрессии ряда генов опухолевых супрессоров, таких как TPM1, Pdcd4 и maspin, являющихся её генами-мишенями [Zhu et al., 2007; Lu et al. 2008].

гиперэкспрессия микроРнК-21 связана с определёнными клинико-патологическими свойствами РМЖ. например, повышенный уровень miR-21 ассоциирован со стадией рака, наличием метастазов в регионарных лимфоузлах,

выживаемостью больных [Yan et al., 2008]. Высокий уровень микроРНК-21, циркулирующей в крови больных РМЖ, значительно коррелирует (P<0,001) с наличием висцеральных метастазов [Asaga et al., 2011]. Наряду с другими микроРНК, miR-21 используется в качестве прогностического фактора. Показана корреляция уровня этой микроРНК с общей выживаемостью больных [Voliniaa et al., 2012].

МикроРНК-155 представляет собой многофункциональную микроРНК. Она имеет различные профили экспрессии и играет важную роль в различных физиологических и патологических процессах, в том числе в канцерогенезе. Имеющиеся экспериментальные доказательства того, что микроРНК-155 гиперэкспрессирована в большинстве злокачественных опухолей, позволяют считать эту молекулу микроРНК в числе наиболее значимых факторов в диагностике рака и прогнозе течения заболевания.

При РМЖ микроРНК-155 играет важнейшую роль в регуляции выживаемости раковых клеток и определяет чувствительность опухоли к некоторым химиопрепатарам, негативно регулируя FOXO3a [Kong et al., 2010]. MiR-155 участвует в развитии процесса эпителиально-мезенхималь-ного перехода (ЭМП), и её экспрессия часто повышена в инвазивном РМЖ [Kong et al., 2008]. Кроме того, показана взаимосвязь между ми-кроРНК-155 и воспалительными процессами при опухолевом развитии [Taganov et al., 2006]. Интересно, что известный опухолевый супрессор BRCA1 эпигенетически контролирует экспрессию микроРНК-155 [Chang et al., 2011].

Опухолевый супрессор SOCS1 (suppressor of cytokine signaling 1) идентифицирован как мишень для микроРНК-155. Гиперэкспрессия ми-кроРНК-155 негативно регулирует SOCS1, а также, по-видимому, приводит к активации STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3) через сигнальный путь JAK-STAT, а также стимуляции раковых клеток интерфероном IFN-gamma и интерлейкином-6. Эти данные свидетельствуют о связующей роли микроРНК-155 между воспалением и раком молочной железы [Jiang et al., 2010].

Одной из ключевых микроРНК, дисрегуляция которой часто выявляется при РМЖ, является miR-10b. Её гиперэкспрессия, индуцируемая фактором транскрипции Twist, ассоциирована с развитием процесса эпителиально-мезенхимально-го перехода (ЭМП) [Foubert et al., 2010]. Опухоли, гиперэкспрессирующие miR-10b, обладают выраженной инвазивностью и метастатическим потенциалом.

МикроРНК-31 является ещё одной из известных miR, потенциально регулирующих метастатическое прогрессирование РМЖ [Valastyan et al.,

2009]. Исследования показали обратную зависимость между уровнем экспрессии микроРНК-31 и метастатическим потенциалом 15 различных эпителиальных клеточных линий РМЖ. Также было показано, что уровень микроРНК-31 в опухолях молочной железы обратно пропорционально связан с формированием отдалённых метастазов. Авторы отмечают, что в отличие от большинства других биомаркёров корреляция между экспрессией микроРнК-31 и тенденцией к рецидиву заболевания существует независимо от молекулярного подтипа первичной опухоли.

В тоже время в линиях раковых клеток агрессивного, базально-подобного подтипа отсутствует экспрессия микроРНК-31, а при исследовании опухолей получена обратная корреляция между уровнем экспрессии микроРНК-31 и стадией РМЖ. [Sossey-Alaoui et al., 2011]. Одним из основных механизмов потери экспрессии ми-кроРНК-31 при РМЖ, и, в частности, в трижды-негативном раке (triple-negative breast cancer, TNBC) является гиперметилирование промотера гена LOC554202, в первом интроне которого и картируется микроРНК-31 [Augoff et al., 2012].

Показано, что экспрессия микроРНК-195 значительно выше в опухоли, чем в нормальной ткани молочной железы, особенно в HER2-позитивном РМЖ [Mattie et al., 2006]. Имеются данные о специфичности гиперэкспрессии ми-кроРНК-195 именно для РМЖ [Heneghan et al.,

2010].

МикроРНК-125Ь дифференциально экспрес-сируется в HER2-позитивном и HER2-негативном РМЖ [Mattie et al., 2006]. Эта микроРНК является потенциальным супрессором опухоли, повышенная экспрессия которой приводит к снижению количества мРНК генов HER2 и HER3 и соответствующего белка [Scott et al., 2007]. Опухоли, гиперэкспресирующие микроРНК-125Ь, демонстрируют значительно больший процент пролиферирующих клеток, и, наоборот, меньшее число апоптотических клеток [Wang et al., 2012]. В этой же работе показана ассоциация количества микроРНК-125Ь, циркулирующей в крови больных, с устойчивостью к неоадъювантной химиотерапии.

В настоящее время роль микроРНК-182 в развитии РМЖ слабо изучена. Известно, что геном-мишенью для miR-182 является FOXO1 -транскрипционный фактор, экспрессия которого понижена в опухоли молочной железы [Guttilla et al., 2009]. Высокий уровень экспрессии ми-

кроРНК-182 детектируется в клеточной линии MCF-7, для которой характерен очень низкий уровень белка FOXO1. Эти данные позволяют предполагать, что miR-182 относится к онкоген-ным микроРНК.

Установлено, что miR-221 and miR-222 участвуют в развитии агрессивного базально-подоб-ного РМЖ, их гиперэкспрессия характерна для эстрогенрецептор-негативных опухолей. Они функционируют в RAS-RAF-MEK сигнальном каскаде, ингибируют экспрессию транскрипционного фактора TRPS1, мишенью которого в свою очередь является супрессор ЭМП белок ZEB2. Увеличение уровня ZEB2, прямо ингибирующего E-cadherin и активирующего vimentin, запускает процесс ЭМП [Shah & Calin, 2011].

Следует отметить, что исследование ми-кроРНК находится всё же на начальных этапах, однако в будущем они могут быть использованы для формирования панели маркёров для диагностики и прогноза рака.

материалы и методы

Исследованы 54 образца опухолевых и гистологически нормальных тканей, полученных при проведении оперативного лечения (27 больных РМЖ). Все больные до операции не были подвержены ни лучевой, ни химиотерапии. Образцы тканей хранили при -70оС. Опухоли классифицированы в соответствии с TNM-классификацией Международного противоракового союза (UICC) и гистологически верифицированы на основании критериев классификации Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ).

Выделение суммарной (тотальной) РНК.

Суммарную РНК выделяли из образцов с помощью набора «RNeasy Mini Kit», Qiagen по протоколу производителя. Качество выделения РНК проверяли при электрофорезе продукта в 1,8% агарозном геле. Продукт окрашивали бромистым этидием и анализировали на трансиллюминаторе Whatman-Biometra TL-3 в ультрафиолетовом свете. Концентрацию выделенной РНК измеряли на спектрофотометре Nanodrop 1000.

Проведение реакции обратной транскрипции.

Обратную транскрипцию проводили, используя набор ImProm-II™ Reverse Transcriptase (Promega). Для каждой микроРНК использовали синтезированный специфичный олигонуклео-тидный праймер. После проведения реакции измеряли концентрацию кДНК на спектрофотометре Nanodrop 1000.

ПЦР в реальном времени.

Уровень экспрессии микроРНК измеряли с помощью прибора StepOnePlus (Applied Biosystems, США). Условия проведения ПЦР - объем смеси 20 мкл, состав: 100-200 нг кДНК; 10 рМ специфичного для каждой микроРНК (F) праймера; 10 рМ универсального (R) праймера, 2 мМ dNTP, 0,5 е. а. Taq-ДНК-полимеразы («СибЭнзим», Россия), буфер для ПЦР, краситель EvaGreen. Нормализацию полученных значений Ct для исследуемых микроРНК проводили по Ct мРНК U6. Изменение уровня экспрессии рассчитывали, используя метод AACt.

результаты

Для анализа экспрессии микроРНК использовали 14 микроРНК, полученных при анализе данных литературы, которые потенциально могли быть ассоциированы с прогрессией рака молочной железы (РМЖ). Экспрессию микроРНК в тканевых образцах группы пациентов с РМЖ (N=27), гетерогенной по TNM классификации, проанализировали методом ПЦР в реальном времени. Учитывали более чем 2-кратное изменение уровня экспрессии каждой микроРНК. Хотя экспрессия микроРНК была гетерогенна, паттерны экспрессии разнообразны и пациент-специфичны, оказалось возможным выделить ряд закономерностей.

Так уровень экспрессии miR-182 был повышен у 22 из 27 пациентов (81%) и понижен в 2-х образцах (7,4%), (рис.1). При этом miR-182 гипе-рэкспрессирована - увеличение экспрессии более чем в 10 раз - в 16 образцах опухоли (59%). Экспрессия miR-31, известного супрессора мета-стазирования, была подавлена в 56% (15 из 27) образцов РМЖ. Следует отметить, что уровни экспрессии miR-10b и miR-155 разделяются на 3 группы с повышенной, пониженной и неизмененной экспрессией (рис.1).

Анализ экспрессии бимодальных микроРНК -miR-10b и miR-155 позволил разбить образцы на несколько групп. Используя кластерный анализ, мы смогли выделить 9 образцов из 27 проанализированных (33%), которые составляют кластер коэкспрессии 5-ти микроРНК с преимущественно повышенной экспрессией miR-10b, miR-21, miR-155, miR-34a и miR-335 (рис.2).

При сравнительном анализе клинико-пато-логических и экспрессионных данных в кластере оказались 4 из 7 образцов с локальным ме-тастазированием в лимфоузлы. Этот кластер полностью представлен образцами с ЭР+ и ПР+ статусом, кроме этого в нем представлены все

Рис.1. Уровни экспрессии miR-182, miR-10b и miR-155 в образцах опухолевой ткани при раке молочной железы относительно условно нормальной ткани.

Рис.2. Кластеризация экспрессионных данных. Желтым выделены образцы с метастазированием в локальные лимфоузлы (ТхШ-2М0). Красный цвет - повышенная экспрессия miR, голубой цвет - пониженная экспрессия miR, белый цвет - экспрессия не изменена.

образцы с инфильтративно-дольковым (ИД) и смешанным вариантами (инфильтративно-доль-ковый в сочетании с инфильтративно-протоко-вым) РМЖ. Это позволяет предположить существование ассоциации ко-экспрессирующихся в этом кластере микроРНК с патоморфологически-ми признаками, в том числе, и с преимущественным наличием метастазов.

Далее был проведён анализ транскрипционной регуляции. Как видно, рис.3., большинство микроРНК кластера регулируется 2-мя транскрипционными факторами: NF-kB (RelA) и p53, кроме того, 2 микроРНК регулируются эстроге-новым рецептором.

обсуждение

Стремительный прогресс в раскрытии роли микроРНК в развитии рака дает возможность использовать их как потенциальные биомаркеры и предикторы прогноза. Рак молочной железы - гетерогенная группа, хотя и существует классификация по профилю экспрессии генов, и ряд пре-диктивных сигнатур (signature), определяющих агрессивность, наличие метастазов и прогноз. [Ogino et al., 2012]. В дополнение к экспрессион-ным данным по генам, экспрессионные профили микроРНК позволяют существенно улучшить классификацию РМЖ [Eo et al, 2012].

Повышенная экспрессия miR-182 более чем в 80% образцов может объясняться важной ролью этой микроРНК для развития РМЖ. Ряд работ показали ассоциацию miR-182 с РМЖ [Moskwa et

al., 2010]. miR-182 регулируется TGF-beta/SMAD сигнальными каскадами, известно, что при развитии РМЖ эти сигнальные пути часто дерегули-рованы, кроме того, как и miR-10b, miR-182 активирует NF-kB сигнальный путь.

Ряд работ по экспрессии микроРНК в РМЖ показал основные изменения в экспрессии miR-10b, miR-21, miR-155 - онкогенных микроРНК, роль которых в развитии, прогрессии опухолей и метастазирования хорошо известна для многих типов рака [Gabriely et al., 2011; Mattiske et al., 2012; Niu et al., 2012]. Ко-ассоциация этих микроРНК в одном кластере не случайна, что подтверждается анализом транскрипционной регуляции - все они транскрипционные мишени p53 и RelA (NF-kB). Известно, что активация NF-kB часто ассоциирована с различными типами рака, в том числе и РМЖ. Выделение кластера NF-kB-зависимых микроРНК и роль их в прогрессии и метастазировании нуждаются в дальнейшем изучении.

Интересно отметить присутствие в кластере miR-335, роль которой в качестве oncomir противоречива. Так при раке желудка [Yan et al., 2012], глиоме [Jiang et al., 2012], колоректальном раке [Vickers et al., 2012] повышенная экспрессия ассоциирована с метастазированием и плохим прогнозом, при этом в РМЖ - это онкосупрессор-ная микроРНК [Png et al., 2011].

Предпринималось достаточно много попыток описать различные signature на основе кластерного анализа. [Lyng et al., 2012]. В нашей работе описан кластер (примерно 30% пациентов), в

Рис.3. Транскрипционная регуляция 5-ти микроРНК, образующих кластер.

котором корегулированы 5 разных oncomir. Повышенная экспрессия miR-34а в кластере заслуживает внимания, так как в РМЖ эта микроРНК выполняет онкосупрессорную функцию. Часто её гиперэкспрессия связана с повышенной агрессивностью опухоли, но при этом повышение экспрессии связано с увеличением средней выживаемости и периода без метастазов [Peurala H et al., 2011]. Кроме того, повышенная экспрессия этой miR ассоциирована с устойчивостью к доце-такселю [Kastl et al., 2011]. С этой точки зрения роль и значение этой микроРНК в метастазиро-вании требует дальнейшего изучения. Все микроРНК из кластера являются транскрипционными мишенями p53, что может свидетельствовать о дерегуляции этого звена в кластере, связанной, например, с мутантным p53.

Комплексная природа дерегуляции экспрессии микроРНК не позволяет однозначно трактовать результаты экспрессионых данных, тем более для отдельных miR, так как почти для каждой микроРНК роль в развитии опухолевого процесса имеет зависимость от контекста. Кластеризация и выделение групп микроРНК (signature) позволяют классифицировать пациентов по различным параметрам, выделять особенности, связанные с этими кластерами, что может расширить представление о роли микроРНК в развитии рака.

заключение

Таким образом, открытие и изучение ми-кроРНК значительно расширили наше понима-

ние биологии рака. Наши знания в этой области исследований стремительно растут. Опухоль-су-прессирующая и онкогенная роли этих молекул в определённых типах рака позволяют считать, что микроРНК могут быть использованы в качестве биомаркёров и, возможно, экспрессионные характеристики комплекса miR применимы для достижения клинического эффекта.

литература

1. Asaga S., Kuo C., Nguyen T. et al. Direct Serum Assay for MicroRNA-21 Concentrations in Early and Advanced Breast Cancer.// Clinical Chemistry. - 2011. - V. 57. - P. 184-91.

2. Augoff K., McCue B., Plow E. and Sossey-Alaoui K. miR-31 and its host gene lncRNA L0C554202 are regulated by promoter hypermethylation in triple-negative breast cancer.// Mol. Cancer - 2012. - V. 11. - P. 5-17.

3. Bartel D.P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.// Cell. - 2009. - V. 136(2). - P. 215-33.

4. Chang N., Wang R., Akagi K. et al. Tumor suppressor BRCA1 epigenetically controls oncogenic microR-NA-155.// Nature Medicine - 2011. - V. 17. - P. 12751283.

5. Eo H.S., Heo J.Y., Choi Y. et al. A pathway-based classification of breast cancer integrating data on differentially expressed genes, copy number variations and Mi-croRNA target genes. // Mol. Cells. - 2012.

6. Farazi T.A., Spitzer J.I., Morozov P., Tuschl T. miRNAs in human cancer.// J Pathol. - 2011. - V. 223(2). - P. 102-15.

7. Foubert E., De Craene B. and Berx G. Key signalling nodes in mammary gland development and cancer. The Snail1-Twist1 conspiracy in malignant breast cancer progression // Breast Cancer Res. - 2010. - V. 12. - P. 206-217.

8. Heneghan H.M., Miller N., Kelly R. et al. Systemic miRNA-195 differentiates breast cancer from other malignancies and is a potential biomarker for detecting noninvasive and early stage disease. // Oncologist. - 2010. - V. 15(7) - P. 673-82.

9. Gabriely G., Teplyuk N.M., Krichevsky A.M. Context effect: microRNA-10b in cancer cell proliferation, spread and death. //Autophagy. - 2011 - V. 7(11). - P. 1384-6.

10. Guttilla I.K., White B.A. Coordinate regulation of F0X01 by miR-27a, miR-96, and miR-182 in breast cancer cells // J Biol Chem. - 2009. - V. 284(35). - P. 23204-16.

11. Janga S.C., Mittal N. Construction, structure and dynamics of post-transcriptional regulatory network directed by RNA-binding proteins.// Adv. Exp. Med. Biol. -2011. - V. 722. - P. 103-17.

12. Jiang J., Sun X., Wang W. et al. Tumor microR-NA-335 expression is associated with poor prognosis in human glioma//. Med. Oncol. - 2012. May 27

13. Jiang S., Zhang H.W., Lu M.H. et al. MicroRNA-155 functions as an OncomiR in breast cancer by targeting the suppressor of cytokine signaling 1 gene.// Cancer Res. -2010. - V. 70(8). - P. 3119-27.

14. Kastl L., Brown I., Schofield A.C. miRNA-34a is associated with docetaxel resistance in human breast cancer cells.// Breast Cancer Res. Treat. - 2012. - V. 131(2).

- P.445-54.

15. Kong W., He L., CoppolaM. et al. MicroRNA-155 Regulates Cell Survival, Growth, and Chemosensitivity by Targeting FOXO3a in Breast Cancer.// J. Biol. Chem. -2010. - V. 285(23). - P. 17869-17879.

16. Kong W., Yang H., He L. et al. MicroRNA-155 is regulated by the transforming growth factor beta/Smad pathway and contributes to epithelial cell plasticity by targeting RhoA.// Mol. Cell. Biol. - 2008. - V. 28. - P. 6773-6784.

17. Lu Z., Liu M., Stribinskis V. et al. microRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene. // Oncogene. - 2008. - V. 27. - P. 43734379.

18. Lyng M.B., L^nkholm A.V., S0kilde R. et al. Global microRNA expression profiling of high-risk ER+ breast cancers from patients receiving adjuvant tamoxifen mono-therapy: a DBCG study.// PLoS One. - 2012. - V. 7(5). e36170

19. Mattie M.D., Benz C.C., Bowers J. et al. Optimized high-throughput microRNA expression profiling provides novel biomarker assessment of clinical prostate and breast cancer biopsies.// Mol. Cancer - 2006. - V. 5. - P. 24.

20. Mattiske S., Suetani R.J., Neilsen P.M., Callen DF. The Oncogenic Role of miR-155 in Breast Cancer.// Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. - 2012. - V. 21(8). - P. 1236-43.

21. Moskwa P., Buffa F.M., Pan Y. et al. miR-182-me-diated downregulation of BRCA1 impacts DNA repair and sensitivity to PARP inhibitors.// Mol. Cell. - 2011. -V.41(2). - P. 210-20.

22. Niu J., Shi Y., Tan G. et al. DNA damage induces NF-KB-dependent microRNA-21 up-regulation and promotes breast cancer cell invasion.// J. Biol. Chem. - 2012. - V. 287(26). - P. 21783-95.

23. Ogino S., Fuchs C.S., Giovannucci E. How many molecular subtypes? Implications of the unique tumor principle in personalized medicine.// Expert Rev. Mol. Di-agn. - 2012. - V. 12(6). - P. 621-8.

24. Peurala H., Greco D., Heikkinen T. et al. MiR-34a expression has an effect for lower risk of metastasis and associates with expression patterns predicting clinical outcome in breast cancer.// PLoS One. - 2011. - V. 6(11):e26122.

25. Png K.J., Yoshida M., Zhang X.H. et al. MicroR-NA-335 inhibits tumor reinitiation and is silenced through genetic and epigenetic mechanisms in human breast cancer.// Genes Dev. - 2011. - V. 25(3). - P. 226-31.

26. Rao X., Di Leva G., Li M. et al. MicroRNA-221/222 confers breast cancer fulvestrant resistance by regulating multiple signaling pathways.// Oncogene. - 2011. - V. 30(9). - P. 1082-97.

27. Roth C., Rack B., Müller V. et al. Circulating mi-croRNAs as blood-based markers for patients with primary and metastatic breast cancer // Breast Cancer Res.

- 2010. - V. 12, R90.

28. Sato F., Tsuchiya S., Meltzer S.J., Shimizu K. Mi-croRNAs and epigenetics.// FEBS J. - 2011. - V. 278(10).

- P. 1598-609.

29. Scott G.K., Goga A., Bhaumik D. Et al. Coordinate suppression of ERBB2 and ERBB3 by enforced expression of micro-RNA miR-125a or miR-125b.//J. Biol. Chem. -2007. - V. 282(2). - P. 1479-86.

30. Shah M. & Calin G. MicroRNAs miR-221 and miR-222: a new level of regulation in aggressive breast cancer // Genome Medicine - 2011. - V. 3. - P. 56-59.

31. Si M.L., Zhu S., Wu H. et al. miR-21-mediated tumor growth. // Oncogene. - 2007. - V. 26. - P. 2799-803.

32. Sorlie T., Perou C.M., Tibshirani R. et al. Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2001. - V. 98. - P. 10869-74.

33. Sorlie T., Wang Y., Xiao C. et al. Distinct molecular mechanisms underlying clinically relevant subtypes of breast cancer: gene expression analyses across three different platforms.// BMC. - Genomics. - 2006. - V. 7. - P. 127.

34. Sossey-Alaoui K., Downs-Kelly E., Das M. et al. WAVE3, an actin remodeling protein, is regulated by the metastasis suppressor microRNA, miR-31, during the invasion-metastasis cascade.// Int. J. Cancer - 2011. - V. 129(6). - P. 1331-1343.

35. Taganov K.D., Boldin M.P., Chang K.J., Baltimore D. NF-kappaB-dependent induction of microRNA miR-146, an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses.// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 2006.

- V. 103. - P. 12481-12486.

36. Valastyan S., Reinhardt F., Benaich N. et al. A pleiotropically acting microRNA, miR-31, inhibits breast cancer metastasis.// Cell - 2009. - V. 137. - P. 1032-46.

37. Vickers M.M., Bar J., Gorn-Hondermann I. et al. Stage-dependent differential expression of microRNAs in colorectal cancer: potential role as markers of metastatic disease. // Clin. Exp. Metastasis. - 2012. - V. 29(2).

- P. 123-32.

38. Voliniaa S., Galassoa M., Sanaa M. et al. Breast cancer signatures for invasiveness and prognosis defined by deep sequencing of microRNA. // PNAS - 2012. - V. 109. - P. 3024-3029.

39. Wang H., Tan G., Dong L. et al. Circulating MiR-125b as a marker predicting chemoresistance in breast cancer.// PLoS One. - 2012. - V. 7(4):e34210.

40. Yan L., Huang X., Shao Q. et al. MicroRNA miR-21 overexpression in human breast cancer is associated with advanced clinical stage, lymph node metastasis and patient poor prognosis // RNA. - 2008 - V. 14(11). - P. 2348-60.

41. Yan Z., Xiong Y., Xu W. et al. Identification of hsa-miR-335 as a prognostic signature in gastric cancer.// PLoS One. - 2012. - V. 7(7):e40037.

42. Zhao J.J., Lin J., Yang H. et al. MicroRNA-221/222 negatively regulates estrogen receptor alpha and is associated with tamoxifen resistance in breast cancer. //J. Biol. Chem. - 2008. - V. 283(45). - P. 31079-86.

43. Zhu S., Si M.L., Wu H. et al. microRNA-21 targets the tumor suppressor gene tropomyosin 1 (TPM1).// J. Biol. Chem. - 2007. - V. 282. - P. 14328-14336.