СЛИТЫЕ БЕЛКИ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ТЕРАПИИ

1. Одноцепочечный полипептид слитый белок, который включает:
(a) нецитотоксическую протеазу, способную расщеплять белок по экзоцитозному пути клетки-мишени;
(b) нацеливающий фрагмент, способный к связыванию с участком для связывания на клетке-мишени, при этом участок для связывания способен претерпевать эндоцитоз с тем, чтобы быть включенным в эндосому внутри клетки-мишени;
(c) домен транслокации, способный перемещать протеазу из эндосомы через мембрану эндосомы в цитозоль клетки-мишени;
(d) первый участок протеолитического расщепления, где слитый белок способен расщепляться первой протеазой, при этом первый участок протеолитического расщепления расположен между нецитотоксической протеазой и доменом транслокации;
(e) второй участок протеолитического расщепления, где слитый белок способен расщепляется второй протеазой, при этом второй участок протеолитического расщепления расположен между доменом транслокации и нацеливающим фрагментом; и
(f) ковалентную связь между нацеливающим фрагментом и доменом транслокации, при этом, после протеолитического расщепления на втором участке протеолитического расщепления, нацеливающий фрагмент остается связанным с доменом транслокации посредством указанной ковалентной связи;
где после расщепления на первом и втором участках расщепления нацеливающий фрагмент способен реагировать с участком для связывания на клетке-мишени посредством взаимодействия между N-концевым доменом нацеливающего фрагмента и доменом участка связывания и одновременно посредством взаимодействия между C-концевым доменом нацеливающего фрагмента и доменом участка связывания.
2. Слитый белок по п.1, где домен транслокации расположен между нецитотоксической протеазой и нацеливающим фрагментом.
3. Слитый белок по п.1, где нацеливающий фрагмент расположен между нецитотоксической протеазой и доменом транслокации; и где, кроме того, первый участок протеолитического расщепления расположен между нецитотоксической протеазой и нацеливающим фрагментом.
4. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, где нецитотоксическая протеаза расположена на N-конце белка.
5. Слитый белок по п. 1, где ковалентная связь представляет собой дисульфидную связь.
6. Слитый белок по п. 1, где между доменом транслокации и нацеливающим фрагментом расположен короткий полипептид, который обеспечивает формирование вторичной структуры полипептида, и где указанная вторичная структура полипептида действует таким образом, что нацеливающий фрагмент сближается с доменом транслокации, в результате чего образование ковалентной связи становится энергетически более благоприятным.
7. Слитый белок по п. 1, где нацеливающий фрагмент содержит первый и второй домены, и где первый и второй домены разделены не более чем 10 аминокислотными остатками, предпочтительно, не более чем 5 аминокислотными остатками и, более предпочтительно, нулем аминокислотных остатков.
8. Слитый белок по п.7, где первый и второй домены нацеливающего фрагмента получены из лигандов к различным рецепторам.
2
9. Слитый белок по п. 1, где нацеливающий фрагмент включает или состоит из пептида, выбранного из группы, которая содержит: пептид гонадотропин-высвобождающего гормона (GnRH), опиоидный пептид, пептид бета-эндорфин, пептид брадикинин, пептид BAM, пептид ноцицептин, пептид динорфин, пептид галанин, пептид энкефалин, пептид вещества P, пептид кортикотропин-высвобождающего фактора (CRF), гастрин-высвобождающий пептид (GRP), пептид нейромедин B, пептид бомбезин, пептид гастрин, пептид ССК, пептид соматостатин (SST), пептид кортистатин (CST), пептид гормона, высвобождающего гормон роста (GHRH), пептид PAR, пептид паратиреоидного гормона (PTH), вазоинтестинальный пептид (VIP), пептид агониста бета адренорецептора, гастрин-высвобождающий пептид, пептид, связанный с геном кальцитонина, пептид тиреотропного гормона (TSH), пептид инсулин, пептид инсулиноподобного фактора роста, пептид гонадорелин, пептид кортикотропин-высвобождающего гормона (CRH), пептид адренокортикотропного гормона (ACTH), пептид, активирующий аденилциклазу гипофиза (РАСАР).
10. Слитый белок по п. 1, где нецитотоксическая протеаза и первый участок протеолитического расщепления разделены не более чем 10 аминокислотными остатками, предпочтительно, не более чем 5 аминокислотными остатками и, более предпочтительно, нулем аминокислотных остатков.
11. Слитый белок по п. 1, где домен транслокации и первый участок протеолитического расщепления разделены не более чем 10 аминокислотными остатками, предпочтительно, не более чем 5 аминокислотными остатками и, более предпочтительно, нулем аминокислотных остатков.
12. Слитый белок по п. 1, где домен транслокации и второй участок протеолитического расщепления разделены не более чем 10 аминокислотными остатками, предпочтительно, не более чем 5 аминокислотными остатками и, более предпочтительно, нулем аминокислотных остатков.
13. Слитый белок по п. 1, где нацеливающий фрагмент и второй участок протеолитического расщепления разделены не более чем 10 аминокислотными остатками, предпочтительно, не более чем 5 аминокислотными остатками и, более предпочтительно, нулем аминокислотных остатков.
14. Слитый белок по п. 1, где первая протеаза и вторая протеазы одинаковы.
15. Слитый белок по п. 1, где нецитотоксическая протеаза представляет собой L-цепь клостридиального нейротоксина или ее фрагмент.
N
16. Слитый белок по п. 1, где домен транслокации представляет собой домен H клостридиального нейротоксина или его фрагмент.
17. Слитый белок по п. 1, где слитый белок содержит метку очистки.
18. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид слитый белок по любому из предшествующих пунктов.
19. ДНК-вектор, содержащий промотор, последовательность нуклеиновой кислоты по п.18 и терминатор; где указанная последовательность нуклеиновой кислоты расположена в прямом направлении от промотора; и где указанный терминатор расположен в прямом направлении от последовательности нуклеиновой кислоты.
20. Комплементарная цепь ДНК последовательности ДНК по п.18.
21. Способ получения одноцепочечного полипептида слитого белка по любому из пп.1-17, включающий экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты по п.18 или ДНК-вектора по п.19 в клетке-хозяине.
22. Способ получения нецитотоксического агента, включающий:
a. приготовление раствора, содержащего одноцепочечный полипептид слитый белок по настоящему изобретению;
b. добавление к указанному раствору первой протеазы, способной расщеплять первый участок протеолитического расщепления, и второй протеазы, способной расщеплять второй участок протеолитического расщепления; и
c. расщепление первого участка протеолитического расщепления и второго участка протеолитического расщепления;
при этом образуется трехцепочечный слитый белок.
23. Нецитотоксический полипептид, полученный способом по п.22, где полипептид представляет собой трехцепочечный полипептид и где:
a. первая цепь содержит нецитотоксическую протеазу, способную расщеплять белок по экзоцитозному пути клетки-мишени;
b. вторая цепь содержит домен транслокации, который способен перемещать нецитотоксическую протеазу из эндосомы через мембрану эндосомы в цитозоль клетки-мишени;
c. третья цепь включает нацеливающий фрагмент, способный к связыванию с участком связывания на клетке-мишени, при этом участок связывания способен подвергаться эндоцитозу с тем, чтобы быть включенным в эндосому в клетке-мишени;
d. первая и вторая цепи связаны друг с другом посредством дисульфидной связи; а второй и третий домены связаны друг с другом посредством ковалентной связи.
24. Применение одноцепочечного полипептида слитого белка по любому из п.п.1-17 или нецитотоксического полипептида по п.23 для лечения, предотвращения или облегчения заболевания.
25. Применение по п.24, где заболевание выбрано из боли, (хронического) нейрогенного воспаления, урогенитальных-неврологических заболеваний, таких как гиперактивность мочевого пузыря, из рака предстательной железы, рака легкого, рака молочной железы или рака ободочной и прямой кишки.