Определение содержания клозапина и норклозапина в плазме крови методом тандемной масс-спектрометрии

© КОЛЛЕКТИВАВТОРОВ, 2014 УДК 615.214.2

Определение содержания клозапина и норклозапина в плазме крови методом тандемной масс-спектрометрии

Л.М. Красных1, А.И. Платова2, Н.В. Баймеева2, Г.Ф.Василенко1

1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения»

Министерства здравоохранения Российской Федерации, 127051, Москва, Россия

2 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр психического здоровья» РАМН, 115522, Москва, Россия

Резюме: Клозапин является трициклическим производным дибензодиазепина, применяется для лечения при острых и хронических формах шизофрении и некоторых других расстройств психики. Цель работы — оптимизации метода количественного определения клозапина в биологических жидкостях для фармакинетических исследований. В результате проведенных авторами исследований разработана быстрая и легко воспроизводимая методика определения клозапина в плазме крови с применением ВЭЖХ в сочетании с двойным масс-спектрометрическим детектором (Agilent 6410-2K Triple Quad LC-MS(QQQ)). Детектирование целевого соединения проводили в положительном режиме ионизации молекулы электроспреем, в качестве протонирующего агента использовали муравьиную кислоту (MRM переход клозапина 327,2 ^ 270.0 m/z). Хроматографическое разделение проводили на колонке Zorbax SB-C18, 30x2,1 мм, 3.5 мкм (Agilent), в качестве внутреннего стандарта применяли карбамазепин. В этих условиях время удерживания клозапина составило 1,08+0,11 мин, карбамазе-пина — 4,23+0,13 мин. Для извлечения клозапина из биопроб использовали жидкостную экстракцию диэтиловым эфиром с предварительным подщелачиванием 1,55 М NaOH. Процент экстракции из образцов плазмы крови достигал 91,1+4.5%. Предел обнаружения разработанной методики составлял 1 нг/мл. Чувствительность разработанного метода позволяет использовать его для терапевтического мониторинга содержания препарата и обнаружения следовых микроколичеств в биологических жидкостях человека.

Ключевые слова: ВЭЖХ-МС (LC-MS); тандемная хроматомасс-спектрометрия; клозапин; плазма крови.

measurement of clozapine and norclozapine in blood plasma by tandem mass spectrometry

L.M. Krasnykh1, A.Yu. Platova2, N.v. Baymeeva2, G.F. Yasilenko1

1 Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation, 127051, Moscow, Russia 2 Federal State Budgetary Institution «Scientific Center of Mental Health» of the Russian Academy of Medical Sciences, 115522, Moscow, Russia

Abstract: : Clozapine is a tricyclic dibenzodiazepine derivative, used for treating acute and chronic forms of schizophrenia and other mental disorders. The purpose of the present study is to optimize the assay of clozapine in biological fluids for pharmacokinetic studies. The research resulted in designing a quick and easily reproducible method of measuring clozapine in blood plasma using HPLC in combination with dual mass spectrometric detector (Agilent 6410-2K Triple Quad LC-MS (QQQ)). The detection of the target compound was carried out in positive electrospray molecule ionization mode with formic acid as a protonating agent (MRM transition of clozapine 327.2 ^ 270.0 m/z). Chromatographic separation was performed on Zorbax SB-C18 column, 30x2.1 mm, 3.5 um (Agilent), carbamazepine was used as an internal standard. Under the mentioned conditions, the retention time for clozapine equaled 1,08 ± 0,11 min, and for carbamazepine - 4,23 ± 0,13 min. The extraction of clozapine from the sample was performed by liquid extraction method with diethyl ether and preliminary alkalization with 1.55 M NaOH. The extraction percentage from blood plasma samples reached 91.1 ± 4.5%. The detection limit for the developed method equaled 1 ng/ml. The sensitivity of the described method can be used for therapeutic drug content monitoring as well as for detecting trace quantity in human biological fluids.

Key words: HPLC-MS (LC-MS); tandem gas chromatography mass-spectrometry; clozapine; blood plasma.

Клозапин (МНН: Clozapine) является трициклическим производным дибензодиазепина, имеющим элементы сходства в структуре с трициклическими антидепрессантами и частично с бензодиазепиновыми транквилизаторами: 8-хлор-11-(4-метил-1-пиперазинил)-5Я-дибензо-[й, е] [1,4]-диазепин. Клозапин представляет собой зеленовато-желтый мелкокристаллический порошок, хорошо растворимый в хлороформе, слабо растворимый в ацетоне, ацетонитриле, этилацетате, этаноле; практически нерастворимый в воде.

По фармакологическому действию клозапин относится к «атипичным» антипсихотическим средствам. Применяется для лечения при острых и хронических формах шизофрении, маниакальных состояниях, психомоторном возбуждении и некоторых других расстройствах психики [1].

Фармакокинетические параметры клозапина имеют большие индивидуальные колебания, которые зависят от возраста, пола и курения табака: у молодых концентрация клозапина в крови выше,

у мужчин — примерно на 30% ниже, чем у женщин, у курильщиков — на 30% ниже, чем у некурящих [2].

Для количественного определения клозапина в биологических субстратах используют высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), а для его обнаружения применяют спектрофотометриче-ский [3] или флуориметрический детекторы [4].

В настоящее время в практике количественного определения содержания лекарственных веществ в биологических субстратах все большее применение находят так называемые «гибридные» методы. По этой причине метод хроматомасс-спектрометрии (HPLC-MS или LC-MS) становится преобладающим в фармацевтическом анализе биологических образцов, так как позволяет анализировать нелетучие и термонестабильные вещества [5-7].

Целью настоящего исследования являлась разработка высокочувствительной и воспроизводимой методики количественного определения клозапина с использованием тандемной LC-MS в режиме детектирования заданных масс.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для пробоподготовки и проведения количественного анализа использовали субстанции: Клозапин, Карбамазепин, внутренний стандарт (субстанция), а также следующие реактивы и органические растворители: диэтиловый эфир (Merck, Германия); NaOH, кислота муравьиная, ацетонитрил HPLC (Sigma, Германия); метанол, HPLC (Biosolve, Нидерланды); вода деионизированная (сопротивление 18 мОм); азот особой чистоты 99,999 % (ООО «НИИ КМ», Россия).

Оборудование: центрифугирование образцов проводили на центрифуге FP-350 Labsystems Oy (Финляндия), для равномерного перемешивания проб использовали вибромиксер типа «Vortex» фирмы Labomed (Германия), для экстракции — горизонтальный встряхиватель IKA HS 260 basic (Германия), для производства азота особой чистоты — генератор NitroFlowLab фирмы Parker Filtration (Нидерланды). Деионизированную воду получали с помощью установки Simplicity UV System фирмы Millipore (Франция). В исследовании также использовали электронные весы Ohaus Discovery (Ohaus Europe, Швейцария) и концентратор образцов — TurboVap LV (Caliper LifeSciences, США).

Маточные растворы (1 мг/мл) клозапина и внутреннего стандарта (карбамазепина) готовили в смеси метанол/ вода (1:1, по объему). Маточные растворы стабильны при температуре 4 °C в течение 1 месяца. Рабочие растворы для построения калибровочных графиков готовили ex tempore путем соответствующего разбавления маточного раствора смесью метанол/ вода.

Для получения плазмы (0,5 мл) пробы крови, собранные в гепаринизированные пробирки, центрифугировали в течение 15 мин при 4000 об/мин, в дальнейшем плазма крови замораживалась и хранилась при -20°С до начала анализа.

Для извлечения клозапина из плазмы крови использовали жидкостную экстракцию диэтиловым эфиром с предварительным подщелачиванием биоматериала 1,55 М NaOH. К 500 мкл плазмы добавляли внутренний стандарт — карбамазепин (50 мкл раствора с концентрацией 5 мкг/мл) и 50 мкл смеси метанол/вода, подщелачивали 150 мкл 1.55М NaOH и экстрагировали 2 мл диэтилового эфира в течение 10 мин на горизонтальном встряхивателе. Далее пробирки центрифугировали 5 мин при 5000 об/мин. Полученный супернатант (органический слой) переносили в чистые пробирки и выпаривали в токе азота при 40 °С досуха. Сухой остаток растворяли при встряхивании в 250 мкл смеси метанол/вода и 10 мкл вводили в аналитическую систему. Степень экстракции клозапина из образцов плазмы крови достигала 91,1+4,5%.

Количественное определение клозапина в биоматериале — LC-MS условия. Анализ биопроб проводили на жидкостном хроматографе Agilent 1200 Series LC (США), включающем дегазатор, бинарный насос, автоинжектор, термостаты автоинжектора и колонок, спектрофотометрический детектор с переменной длиной волны в диапазоне 190—600 нм и совмещенном с квадрупольным масс-спектрометром Agilent 6410-2K Triple Quad LC-MS(QQQ) (США). В качестве источника ионов в масс-спектрометре использовали электрораспылительный модуль, работающий в режиме положительных ионов.

Условия хроматографического анализа: стационарная фаза — колонка «Zorbax SB-C18» фирмы Agilent (США) с обращённо-фазным сорбентом C18 (30x2,1 мм; 3,5 мкм); подвижная фаза — элюент А: 0,2% раствор муравьиной кислоты в воде, элюент В: 0,2% раствор муравьиной кислоты в смеси метанол/ ацетонитрил, 1:1, по объему; состав подвижной фазы — 80% элюента А: 20% элюента В, по объему; скорость подвижной фазы — 1 мл/мин; изократический режим работы насоса; объем пробы, вводимой в аналитическую систему — 10 мкл; температура термостата колонки — 40 °С, температура термостата автоинжектора — 20 °С. В этих условиях время удерживания клозапина составило 1,08+0,11 мин, карбамазепина (внутреннего стандарта) — 4,23+0,13 мин. Предел обнаружения целевого вещества в этих условиях составлял 1 нг/мл.

Для сбора и обработки хроматографических данных использовали программный софт MassHunter B.01.04 (Agilent, США). Количественную оценку кло-запина в хроматографических фракциях проводили методом внутреннего стандарта.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Масс-спектрометрическое детектирование проводилось в режиме положительной ионизации электроспреем при атмосферном давлении (ESI/API, Positive). В масс-спектре клозапина, полученном при ионизации вещества в электроспрее в режиме MS с одним квадрупольным анализатором, наблюдался интен-

Рис. 1. Масс-спектр клозапина, полученный в режиме MS

сивный пик с m/z 327,2 (рис. 1), соответствующий протонированному молекулярному иону (М+Н)+ целевого вещества (в масс-спектре карбамазепина в аналогичных условиях — пик с m/z 237,0).

В количественном анализе лекарственных веществ наиболее распространен мониторинг одного выбранного иона (selected ion monitoring, SIM), когда первый анализатор (MS1) настроен на пропускание ионов с одним фиксированным значением m/z (для клозапина 327.2), второй анализатор (MS2) фиксирует количество прошедших ионов либо по одному (SIM), либо по нескольким (MRM) каналам с заданными значениями m/z фрагментов (m/z выбранного дочернего иона клозапина — 270.0, рис. 2), т.е. в итоге получаем переход 327.2 m/z (Молекулярный ион Клозапина (М+Н)+) ^ 270.0 m/z (Дочерний ион), по которому будет осуществляться детектирование.

Такой режим детекции в русском варианте называется режимом детектирования заданных масс или масс-селективной регистрации (английский эквивалент Multiple Reaction Monitoring — MRM). Режим MRM обеспечивает высокую эффективность в отсекании фона и, как следствие, значительно снижает предел обнаружения, повышая чувствительность и селективность. Подобным образом проводился поиск MRM перехода для внутреннего стандарта — карбамазепина: 237,0 m/z (Молекулярный ион Карбамазепина (М+Н)+) ^ 194,1 m/z (Дочерний ион).

Параметры работы детектора подбирались для достижения максимального выхода MRM как целевого соединения, так и внутреннего стандарта (табл. 1).

Хроматограммы холостой пробы и стандартного образца с концентрацией клозапина 2 нг/мл представлены на рис. 3. В стандартных образцах пик клозапина симметричный, отвечает гауссову распре-

Рис. 2. Масс-спектр клозапина, полученный в режиме Product Ion

о сц

о ^

<

CL <

в

сс <

о

Таблица 1

ПАРАМЕТРЫ РАБОТЫ MS(QQQ) ДЕТЕКТОРА

Вещество Клозапин Карбамазепин

Молекулярный ион 327.2 m/z 237.0 m/z

Дочерний ион 270.0 m/z 194.1 m/z

параметры источника ионизации

Расход газа азота 9 л/мин

Температура газа 350°C

Напряжение капилляра 4000 В

Давление распылителя 25 psi

параметры фрагментации

Энергия фрагментации 150 В 50 В

Энергия столкновения 30 эВ 35 эВ

делению, без признаков размывания и раздвоения со временем удерживания 1,08 мин (время удерживания внутреннего стандарта — 4,25 мин) (рис. 3Б).

При регрессионном анализе выявлена линейная зависимость между концентрацией клозапина в интервале 2 ^ 500 нг/мл и отношением площадей хроматографических пиков клозапина и внутреннего стандарта ^1А2=0,004хС+0,9; r2=0,9989), что соответствует стационарным концентрациям, измеряемым при многократном введении препарата. Калибровочный график представлен на рис. 4.

Предел количественного обнаружения клозапина (Low Limit of Quantitation — LOQ) составлял 1 нг/мл при соотношении сигнал— шум 5:1.

Рис. 3. Хроматограммы холостой пробы (А) и калибровочной пробы (Б) с концентрацией клозапина 2 нг/мл (внутренний стандарт — 500 нг/мл). Время удерживания клозапина — 1,08мин, карбамазепина — 4,25мин

Рис. 4. Калибровочный график клозапина

Таким образом, чувствительность разработанного метода позволяет использовать его для терапевтического мониторинга содержания препарата и обнару-

жения следовых микроколичеств в биологических жидкостях человека.

литература

references

1. Naheed M, Green B. Focus on clozapine. Curr Med Res Opin 2001; 17(3): 223-29.

2. Waschgler R, Hubmann MR, Conca A et al. Simultaneous quantification of citalopram, clozapine, fluoxetine, norfluoxetine, maprotiline, desmethyl-maprotiline, and trazodone in human serum by HPLC analysis. Int J Clin Pharmacol Ther 2002; 40(12): 554-59.

3. Lerena A, Berecz R, Norberto MJ, de la Rubia A. Determination of clozapine and its N-desmethyl metabolite by high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection. J Chromatography B. 2001; 755: 349-54.

4. Rostami-Hodjegan A, Amin AM, Spencer EP et al. Influence of dose, cigarette smoking, age, sex, and metabolic activity on plasma clozapine concentrations: a predictive model and nomograms to aid clozapine dose adjustment and to assess compliance in individual patients. J Clin Psycho-pharmacol. 2004; 24(1): 70-78.

5. Мирошниченко ИИ, Федотов ЮА, Горшкова ЕВ, Иващенко АА. Хроматомасс-спектрометрия в фармакокинетических исследованиях. Качественная клиническая практика 2008; 3: 29-36.

6. Weinmann W, Muller C, Vogt S, Frei A. LC-MS-MS Analysis of the Neuroleptics Clozapine, Flupentixol, Haloperidol, Penfluridol, Thioridazine, and Zuclopenthixol in Hair Obtained from Obtained from Psychiatric Patients. J of Analytical Toxicology 2002; 26: 303-07.

7. Zhao LS, Li Q, Guo CW et al. Mass spectrometry technology and its application in analysis of biological samples. Acta Pharm Sin 2012; 47: 158-62.

об авторах:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Российская Федерация, 127051, Москва, Петровский бульвар, 8.

Красных Людмила Михайловна. Начальник отдела клинической фармакокинетики Центра клинической фармакологии. Канд. биол. наук. Василенко Галина Федоровна. Ведущий научный сотрудник отдела клинической фармакокинетики Центра клинической фармакологии.

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр психического здоровья» РАМН. Российская Федерация, 115522, Москва, Каширское шоссе, 34.

Платова Ангелина Игоревна. Младший научный сотрудник лаборатории фармакокинетики

Баймеева Наталья Викторовна. Младший научный сотрудник лаборатории фармакокинетики.

1. Naheed M, Green B. Focus on clozapine. Curr Med Res Opin 2001; 17(3): 223-29.

2. Waschgler R, Hubmann MR, Conca A et al. Simultaneous quantification of citalopram, clozapine, fluoxetine, norfluoxetine, maprotiline, desmethyl-maprotiline, and trazodone in human serum by HPLC analysis. Int J Clin Pharmacol Ther 2002; 40(12): 554-59.

3. Lerena A, Berecz R, Norberto MJ, de la Rubia A. Determination of clozapine and its N-desmethyl metabolite by high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection. J Chromatography B. 2001; 755: 349-54.

4. Rostami-Hodjegan A, Amin AM, Spencer EP et al. Influence of dose, cigarette smoking, age, sex, and metabolic activity on plasma clozapine concentrations: a predictive model and nomograms to aid clozapine dose adjustment and to assess compliance in individual patients. J Clin Psycho-pharmacol. 2004; 24(1): 70-78.

5. Miroshnichenko II, Fedotov YuA, Gorshkova EV, Ivaschenko AA. Chroma-tography-mass spectrometry in pharmacokinetic studies. Kachestven-naya klinicheskaya praktika 2008; 3: 29-36 (in Russian).

6. Weinmann W, Muller C, Vogt S, Frei A. LC-MS-MS Analysis of the Neuroleptics Clozapine, Flupentixol, Haloperidol, Penfluridol, Thioridazine, and Zuclopenthixol in Hair Obtained from Obtained from Psychiatric Patients. J of Analytical Toxicology 2002; 26: 303-07.

7. Zhao LS, Li Q, Guo CW et al. Mass spectrometry technology and its application in analysis of biological samples. Acta Pharm Sin 2012; 47: 158-62.

authors:

Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation, 8 Petrovsky Boulevard, Moscow, 127051, Russian Federation. Krasnykh LM. Head of Clinical Pharmacokinetics Department of Clinical Pharmacology Center. Candidate of Biological Sciences.

Vasilenko GF. Leading researcher of Clinical Pharmacokinetics Department of Clinical Pharmacology Center. Candidate of Biological Sciences.

Federal State Budgetary Institution «Scientific Center of Mental Health» of the Russian Academy of Medical Sciences, 34 Kashirskoe highway, Moscow, 115522, Russian Federation.

Platova AI. Junior Researcher of Laboratory of pharmacokinetics. Baymeeva NV. Junior Researcher of Laboratory of pharmacokinetics.

адрес для переписки:

Красных Людмила Михайловна, lkrasnykhLM59@mail.ru

Статья поступила 28.03.2914 г.

Принята к печати 28.03.2914г.