СПОСОБ СОЗДАНИЯ ЗУБА
METHOD FOR TOOTH CREATION

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу создания зуба, обладающего требуемым размером.
Предшествующий уровень техники
Зуб является органом, имеющим эмаль в качестве внешнего слоя и твердую ткань, называемую дентином, внутри данного слоя, при этом одонтобласты образуют дентин на внутренней стороне с пульпой зуба в центре. Зубы могут быть утеряны из-за кариеса и пародонтоза, и в связи с тем, что наличие зубов оказывает большое влияние на внешность человека и на вкус пищи, растет озабоченность по поводу методов воспроизводства зубов. Кроме того, озабоченность относительно методов воспроизводства зубов также растет ради, например, поддержания здоровья и поддержания высокого качества жизни.
Зуб является функциональной единицей, которая формируется индукцией процесса образования во время эмбрионального периода и формируется множеством типов клеток. Зуб не образован системой стволовых клеток, в которой типы клеток образуются из стволовых клеток, таких как гематопоэтические стволовые клетки и мезенхимальные стволовые клетки у взрослых, и в настоящее время, следовательно, зубы не могут быть регенерированы только трансплантацией стволовых клеток, осуществляемой регенеративной медициной. Хотя были исследованы возможности регенерации зубов путем идентификации генов, задействованных в процессе образования зубов, и искусственной индукции зубного зачатка, полная индукция регенерации зубов не может быть достигнута одной лишь идентификацией генов.
Поэтому в последние годы был изучен способ получения регенерированного зуба путем реконструирования зубного зачатка с помощью выделенных тканей и клеток, полученных из зачатка зуба, с последующей трансплантацией реконструированного зачатка зуба.
Авторы настоящего изобретения выяснили, что размещение первой клеточной массы и второй клеточной массы в контакте друг с другом внутри поддерживающего носителя, изготовленного из коллагенового геля, где первая клеточная масса образована в основном из мезенхимальных либо из эпителиальных клеток, полученных из зачатка зуба, а вторая клеточная масса образована в основном из оставшегося типа клеток, и что затем путем культивирования первой и второй клеточных масс внутри поддерживающего носителя можно эффективно индуцировать дифференцировку клеток, и возможно получение регенерированного зубного зачатка и регенерированного зуба, обладающего специфическим расположением клеток и направленностью (например, см. Документ 1 из списка Патентной литературы).
Более того, авторы настоящего изобретения показали, что регенерированный зубной зачаток и регенерированный зуб, обладающие определенным расположением клеток и направленностью, подобным образом могут быть получены даже с помощью эпителиальных клеток полости рта на первой стадии их культивирования как эпителиальных клеток (например, см. Документ 2 из списка Патентной литературы), или могут быть получены с применением клеток, полученных из амниона в качестве мезенхимальных клеток (например, см. Документ 3 из списка Патентной литературы), или получены другим образом с применением клеток, полученных индукцией дифференцировки тотипотентных стволовых клеток, в качестве мезенхимальных клеток (например, см. Документ 3 из списка Патентной литературы).
Также в регенерированном зубном зачатке и в регенерированном зубе размер зуба отличается в зависимости от его позиции, и этот размер также варьирует среди индивидуумов. Следовательно, важно контролировать данный размер для регенерации зуба, подходящего для помещения на место утраченного зуба. Однако в указанных выше документах способ контроля размера регенерированного зуба не был рассмотрен. Более того, вышеуказанным способом также может быть получен набор регенерированных зубов. В таком случае каждый зуб отделяют из набора и используют в качестве трансплантата, однако вероятно возникновение трудностей при контролировании числа зубов и размера каждого зуба в наборе из-за недостаточного развития технологии трехмерных операций с клетками и недостаточного понимания механизма контроля формы в биологии развития.
Также в качестве способа создания регенерированных зубов, обладающих требуемым размером и формой, предлагался способ инокуляции клеточной смеси зубного зачатка, включающей мезенхимальные клетки, полученные из пульпы зуба, которые образуют зубной сосочек и дентин, а также включающей эпителиальные клетки, которые участвуют в образовании эмали, в каркасе, полученном при отвердении биодеградируемого полимера, сделанного из сополимера полигликолевой кислоты и полимолочной кислоты, с последующей трансплантацией в тело животного для формирования зуба. В данном способе контроль формы зуба пробовали осуществлять с помощью каркаса требуемой формы. Однако регенерированный зуб получают из зубного зачатка, состоящего из слоя эпителиальных клеток и слоя мезенхимальных клеток, а зубной зачаток, как известно, растет в определенной хронологии благодаря эпителиально-мезенхимальному взаимодействию, которое происходит между клетками. Таким образом, при использовании каркаса не происходит достаточного взаимодействия клеток. Следовательно, применение каркаса не может быть предпочтительным (например, см. Документ 1 из списка Непатентной литературы). Более того, скорость образования зуба больше скорости разрушения каркаса. Следовательно, зуб может быть образован с некоторой частью каркаса, примешанного к нему, и вероятно, что воспроизводимость расположения клеток и формы зуба будет невысокой.
С другой стороны, считалось, что в целом нормальная форма коронки зуба не может быть получена до тех пор, пока мезенхимальные ткани в реконструированном зубной зачатке не будут совершенными. Однако сообщалось, что даже если вместо мезенхимальной ткани применять массу мезенхимальных клеток (массу, полученную центрифугированием после разделения тканей ферментной обработкой), то если количество клеток большое, то в in vitro культуре получают сравнительно большой размер зубного зачатка и количество бугорков коронки зуба также будет увеличено (например, см. Документ 1 из списка Непатентной литературы). Однако даже после трансплантации данного зубного зачатка внутрь живого организма форма зубной коронки и количество бугорков зубной коронки меняются по сравнению с нормальным зубом и зуб с правильной формой не получается. В соответствии с сообщением, зуб с правильной формой не получается даже при реконструировании с применением комбинации эпителиальной и мезенхимальной клеточных масс. В соответствии с этими данными при реконструировании с помощью эпителиальной ткани и мезенхимальной клеточной массы правильная форма может быть получена, если используется мезенхимальная ткань, однако ограничение, накладываемое применением однородных мезенхимальных клеток в ходе получения зубов, указывает на то, что частичное решение достигается путем увеличения количества клеток.
Более того, было показано, что при получении реконструированного зубного зачатка из эпителиальной ткани и мезенхимальной клеточной массы, увеличение количества полученных зубов достигается с увеличением количества мезенхимальных клеток, однако на размер зубов данное условие не действует (Документ 2 из списка Непатентной литературы). В соответствии с этими данными конечный размер зуба и бугорка коронки зуба определяются внутренними факторами мезенхимальной или эпителиальной ткани, т.е. делается вывод, что мезенхимальные и эпителиальные клетки обладают внутренней памятью относительно конечного размера зуба и бугорка зубной коронки соответственно.
Кроме того, авторы настоящего изобретения предложили применять для образования агрегата эпителиальных клеток такое количество эпителиальных тканей в области конфигурации эмалевого узелка, какое необходимо для требуемого количества зубов при получении реконструированного зубного зачатка с помощью агрегата эпителиальных клеток и агрегата мезенхимальных клеток, в качестве способа контроля количества и формы получаемых зубов (Документ 5 из списка Патентной литературы). В соответствии со способом может быть получен агрегат зубов, имеющий требуемое количество зубов. Однако для образования области конфигурации эмалевого узелка должно быть получено столько эпителиальных тканей, сколько соответствует количеству требуемых зубов. Кроме того, в Документе 5 из списка Патентной литературы не рассматривается контроль размера зубов.
Уровень техники
Патентная литература
Документ Патентной литературы 1 - WO 2006/129672
Документ Патентной литературы 2 - нерассмотренная патентная заявка Японии No. 2008-29756
Документ Патентной литературы 3 - нерассмотренная патентная заявка Японии No. 2008-206500
Документ Патентной литературы 4 - нерассмотренная патентная заявка Японии No. 2008-200033
Документ Патентной литературы 5 - нерассмотренная патентная заявка Японии No. 2008-29757
Непатентная литература
Документ Непатентной литературы 1 - Нu et al. Tissue Engineering Volume 12, Number 8,2006,2069-2075
Документ Непатентной литературы 2-3. Cai et al. Developmental Biology 304 (2007) 499-507
Краткое изложение сущности изобретения
Проблемы, решаемые настоящим изобретением
Размер и форма зубов, подходящие для их функций, зависят от участка, на котором они выросли, и в зависимости от участка размер и форма различаются даже для одного и того же коренного зуба. Более того, размер зуба варьирует от индивидуума к индивидууму. Следовательно, при создании регенерированного зубного зачатка и регенерированного зуба для лечения утраченных зубов, очень важно контролировать размер, так чтобы зуб мог соответствующим образом функционировать в индивидууме, в которого он трансплантирован.
Кроме того, в соответствии с опытом авторов размер регенерированного зубного зачатка может меняться из-за различных условий, а из-за «памяти», характерной для клеток, не получаются зубы с хорошей воспроизводимостью и одинакового размера.
Следовательно, задача настоящего изобретения заключается в обеспечении способа создания зуба, обладающего требуемым размером, в частности зуба, в котором ширина зубной коронки имеет требуемую длину.
Средства решения
В результате интенсивных исследований для разрешения вышеуказанных проблем авторы настоящего изобретения обнаружили, что ширина коронки регенерированного зуба зависит от длины контакта в заданном направлении агрегата мезенхимальных клеток и агрегата эпителиальных клеток в поддерживающем носителе и не зависит от количества каждого типа клеток, и, следовательно, ширину коронки регенерированного зуба можно контролировать путем коррекции длины контакта. Кроме того, было обнаружено, что при формировании агрегата мезенхимальных клеток и агрегата эпителиальных клеток соответственно в форме почти столбчатой структуры, и при последующем контролировании длины контакта в осевом направлении столбчатой структуры может быть сформирован зуб, имеющий требуемую длину в одном направлении; конкретнее, при установлении длины контакта в пределах диапазона плюс/минус 25% (±25%) от требуемой длины может быть получен регенерированный зуб, обладающий требуемой длиной; вместе с осуществлением контроля размера зуба также можно контролировать количество бугорков зубной коронки; и при установлении длины ниже заданного числового значения может быть получен одиночный зуб и, соответственно, в этом заключается сущность настоящего изобретения.
То есть настоящее изобретение относится к:
[1] способу создания зуба, обладающего требуемой длиной в одном направлении, включающему:
стадию расположения первого агрегата клеток и второго агрегата клеток в тесном контакте внутри поддерживающего носителя, где первый агрегат клеток и второй агрегат клеток соответственно состоят либо из мезенхимальных, либо из эпителиальных клеток; и
стадию культивирования первого и второго агрегатов клеток внутри поддерживающего носителя,
где размер зуба корректируется путем коррекции длины контакта первого агрегата клеток и второго агрегата клеток в заданном одном направлении;
[2] способу создания зуба, обладающего требуемой длиной в одном направлении, включающему:
стадию получения множества типов структур, в которых первый агрегат клеток и второй агрегат клеток расположены в близком контакте внутри поддерживающего носителя, путем изменения длины контакта первого агрегата клеток и второго агрегата клеток в одном заданном направлении, где первый агрегат клеток и второй агрегат клеток соответственно состоят либо из мезенхимальных, либо из эпителиальных клеток;
стадию культивирования каждого из множества типов структур внутри поддерживающего носителя;
стадию измерения длины зуба, полученного на предшествующей стадии, в одном направлении, и определения корреляции между данной длиной и длиной контакта;
стадию основанного на корреляции расчета длины контакта первого агрегата клеток и второго агрегата клеток, которая требуется для получения зуба, обладающего требуемой длиной в одном направлении.
стадию расположения первого агрегата клеток и второго агрегата клеток в тесном контакте внутри поддерживающего носителя таким образом, чтобы они имели рассчитанную на предшествующей стадии длину контакта, где первый агрегат клеток и второй агрегат клеток соответственно состоят либо из мезенхимальных, либо из эпителиальных клеток; и
стадию культивирования первого и второго агрегатов клеток внутри поддерживающего носителя;
[3] способу создания зуба, обладающего требуемой длиной в одном направлении, включающему:
стадию получения множества типов структур, в которых первый агрегат клеток и второй агрегат клеток в форме почти столбчатой структуры расположены в близком контакте внутри поддерживающего носителя, так что осевые направления каждой столбчатой структуры являются параллельными, путем изменения длины контакта первого агрегата клеток и второго агрегата клеток в осевом направлении, где первый агрегат клеток и второй агрегат клеток соответственно состоят либо из мезенхимальных, либо из эпителиальных клеток.
стадию культивирования каждого из множества типов структур внутри поддерживающего носителя;
стадию измерения длины зуба, полученного на предшествующей стадии, в одном направлении, и определения корреляции между данной длиной и длиной контакта;
стадию основанного на корреляции расчета длины контакта первого агрегата клеток и второго агрегата клеток, которая требуется для получения зуба, обладающего требуемой длиной в одном направлении.
стадию расположения первого агрегата клеток и второго агрегата клеток в форме почти столбчатой структуры в тесном контакте внутри поддерживающего носителя, так чтобы длина контакта по осевому направлению являлась длиной, рассчитанной в предшествующей стадии, и осевые направления каждой из столбчатых структур являлись параллельными, где первый агрегат клеток и второй агрегат клеток соответственно состоят либо из мезенхимальных клеток, либо из эпителиальных клеток; и
стадию культивирования первого и второго агрегатов клеток внутри поддерживающего носителя;
[4] способу создания коренного зуба, обладающего требуемой длиной в мезио-дистальном и/или щечно-язычном направлении, включающему:
стадию получения множества типов структур, в которой первый агрегат клеток и второй агрегат клеток в форме почти столбчатой структуры расположены в близком контакте внутри поддерживающего носителя так, чтобы осевые направления каждой из столбчатых структур являлись параллельными, путем изменения длины контакта первого агрегата клеток и второго агрегата клеток в осевом направлении и/или длины контакта в направлении, перпендикулярном оси, где первый агрегат клеток и второй агрегат клеток соответственно состоят либо из мезенхимальных клеток, либо из эпителиальных клеток;
стадию культивирования каждого из множества типов структур внутри поддерживающего носителя;
стадию измерения длины коренного зуба, полученного на предшествующей стадии, в мезио-дистальном направлении и/или щечно-язычном направлении, с последующим определением корреляции между длиной контакта в осевом направлении и длиной коренного зуба в мезио-дистальном направлении, и/или корреляции между длиной контакта, перпендикулярного оси и длиной коренного зуба в щечно-язычном направлении;
стадию основанного на корреляции расчета длины контакта первого агрегата клеток и второго агрегата клеток в осевом направлении и/или длины контакта в направлении, перпендикулярном оси, которая необходима для получения коренного зуба требуемой длины в мезио-дистальном направлении и/или в щечно-язычном направлении;
стадию расположения первого агрегата клеток и второго агрегата клеток в форме почти столбчатой структуры в тесном контакте внутри поддерживающего носителя, так чтобы длина контакта по осевому направлению и/или длина контакта по направлению, перпендикулярному оси, являлась длиной, рассчитанной в предшествующей стадии и осевые направления каждой из столбчатых структур являлись параллельными, где первый агрегат клеток и второй агрегат клеток соответственно состоят либо из мезенхимальных, либо из эпителиальных клеток; и
стадию культивирования первого и второго агрегатов клеток внутри поддерживающего носителя;
[5] способу создания зуба, обладающего требуемой длиной в одном направлении, включающему:
стадию расположения первого агрегата клеток и второго агрегата клеток в форме почти столбчатой структуры в тесном контакте внутри поддерживающего носителя так, чтобы осевые направления каждой из столбчатых структур являлись параллельными, на основании чего длина контакта первого агрегата клеток и второго агрегата клеток в осевом направлении находится в пределах диапазона плюс/минус 25% от требуемой длины, где первый агрегат клеток и второй агрегат клеток соответственно состоят из либо мезенхимальных, либо из эпителиальных клеток; и
стадию культивирования первого и второго агрегатов клеток внутри поддерживающего носителя;
[6] способу в соответствии с представленным выше [5], в котором стадия расположения первого и второго клеточных агрегатов внутри поддерживающего носителя включает:
стадию получения множества структур, в которой первый и второй клеточные агрегаты расположены внутри поддерживающего носителя;
стадию измерения длины контакта первого и второго агрегатов клеток в осевом направлении и
стадию выбора структуры, в которой измеренная длина контакта находится примерно в пределах диапазона плюс/минус 25% от требуемой длины.
[7] способу создания одиночного зуба, включающему:
стадию расположения первого агрегата клеток и второго агрегата клеток в тесном контакте внутри поддерживающего носителя, где первый агрегат клеток и второй агрегат клеток соответственно состоят либо из мезенхимальных, либо из эпителиальных клеток; и
стадию культивирования первого и второго агрегатов клеток внутри поддерживающего носителя,
где максимальная длина контакта первого агрегата клеток и второго агрегата клеток равна или меньше, чем заданное значение.
[8] способу в соответствии с любым из представленных выше [1]-[7], в котором оба агрегата клеток являются клеточными массами;
[9] способу в соответствии с любым из представленных выше [1]-[8], в котором, по меньшей мере, либо мезенхимальная клетка, либо эпителиальная клетка получена из зубного зачатка;
[10] способу восстановления утраченной части зубов в ротовой полости, включающему:
стадию трансплантации зуба, полученного способом в соответствии с любым из представленных выше [1]-[9], в область утраты зуба;
[11] способу, в соответствии с представленным выше [10], в котором зуб, полученный способом в соответствии с любым из представленных выше [1]-[9], трансплантируют как есть в область утраты зуба без деления зуба на две или несколько частей;
[12] способу в соответствии с представленными выше [10] или [11], в котором мезенхимальная клетка и эпителиальная клетка получены от индивидуума, у которого часть зубов была утрачена;
[13] способу в соответствии с любым из представленных выше [10]-[12], в котором ротовая полость является ротовой полостью немлекопитающего;
[14] способу проектирования способа создания зуба, обладающего требуемой длиной в одном направлении, при заданных условиях,
в котором способ проектирования включает способ для определения длины контакта обоих агрегатов клеток в одном заданном направлении, которая требуется для получения зуба, обладающего требуемым размером, в условиях, когда первый агрегат клеток и второй агрегат клеток располагаются в тесном контакте внутри поддерживающего носителя и первый агрегат клеток и второй агрегат клеток соответственно состоят либо из мезенхимальных клеток, либо из эпителиальных клеток, и
в котором способ определения длины контакта дополнительно включает:
стадию получения множества типов структур, в которых первый агрегат клеток и второй агрегат клеток расположены в близком контакте внутри поддерживающего носителя, путем изменения длины контакта первого агрегата клеток и второго агрегата клеток в одном заданном направлении, где первый агрегат клеток и второй агрегат клеток соответственно состоят либо из мезенхимальных, либо из эпителиальных клеток;
стадию культивирования каждого из множества типов структур внутри поддерживающего носителя;
стадию измерения длины зуба, полученного на предшествующей стадии в одном направлении, и последующего определения корреляции между длиной контакта и длиной зуба в одном направлении; и
стадию основанного на корреляции расчета длины контакта первого агрегата клеток и второго агрегата клеток, которая требуются для получения зуба, обладающего требуемой длиной в одном направлении.
[15] способу проектирования способа создания одиночного зуба при заданных условиях,
в котором способ проектирования включает способ для определения максимальной длины контакта обоих клеточных агрегатов, которая требуются для получения одиночного зуба, в условиях, когда первый агрегат клеток и второй агрегат клеток располагаются в тесном контакте внутри поддерживающего носителя и первый агрегат клеток и второй агрегат клеток соответственно состоят либо из мезенхимальных клеток, либо из эпителиальных клеток, и
в котором способ определения максимальной длины контакта дополнительно включает:
стадию получения множества типов структур, в которых первый агрегат клеток и второй агрегат клеток расположены в близком контакте внутри поддерживающего носителя, путем изменения максимальной длины контакта первого и второго агрегатов клеток, где первый агрегат клеток и второй агрегат клеток соответственно состоят либо из мезенхимальных, либо из эпителиальных клеток;
стадию культивирования каждого из множества типов структур внутри поддерживающего носителя;
стадию измерения количества зубов, полученных в предшествующей стадии, и определения максимальной длины контакта первого агрегата клеток и второго агрегата клеток, которая необходима для получения одиночного зуба; и
[16] способу в соответствии с любым из представленных выше [14] или [15], где, по меньшей мере, либо мезенхимальная клетка, либо эпителиальная клетка получена из зубного зачатка;
Осуществление изобретения
В соответствии с настоящим изобретением, если агрегат мезенхимальных клеток и агрегат эпителиальных клеток размещают в тесном контакте внутри поддерживающего носителя, то в таком случае путем корректировки длины контакта мезенхимальных клеток и эпителиальных клеток в заданном направлении можно контролировать ширину коронки зуба в направлении длины контакта в регенерированном зубном зачатке и в полученном регенерированном зубе.
Конкретно, если агрегат мезенхимальных клеток и агрегат эпителиальных клеток формируется в виде почти столбчатой структуры, то в таком случае путем контроля длины контакта в осевом направлении столбчатой структуры может быть образован зуб, обладающий требуемой длиной в осевом направлении.
Более того, также на основе настоящего изобретения можно спроектировать способ создания зуба, включающий определение длины контакта, который позволяет получить зуб, обладающий требуемым размером.
Более того, в соответствии со способом настоящего изобретения вне зависимости от числа клеток, включенных в каждую клеточную массу, при условии получения заданной длина контакта может быть получен зуб, имеющий требуемую длину и, следовательно, требуемый размер может быть получен с большой эффективностью при использовании меньшего количества клеток.
Более того, в настоящем изобретении путем установки длины контакта между клеточными массами ниже заданного значения, вместо агрегата множества зубов может быть получен одиночный зуб. Следовательно, вместо прохождения стадии разделения, зуб может быть использован как есть в форме трансплантата.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 показана фазово-контрастная микроскопия органной культуры в день ноль, второй день, пятый день и седьмой день, в тех случаях, когда длина контакта агрегата эпителиальных клеток и агрегата мезенхимальных клеток в ходе воспроизводства восстановленного зубного зачатка установлена меньше чем 450 мкм, между 450 мкм и 900 мкм и между 900 мкм и 1500 мкм. Стрелки-указатели на фигуре показывают оба конца области коронки зуба, которая сформирует будущую коронку зуба.
Фиг.2 является схематической диаграммой, демонстрирующей ширину области коронки зуба, которая сформирует будущую коронку зуба, измеренную в форме индексов, демонстрирующих размер регенерированного зубного зачатка на седьмой день органной культуры.
Фиг.3 является столбцовой диаграммой, демонстрирующей отношение длины контакта агрегата эпителиальных клеток и агрегата мезенхимальных клеток в ходе воспроизводства реконструированного зубного зачатка и размера регенерированного зубного зачатка на седьмой день органной культуры.
Фиг.4 является диаграммой, демонстрирующей отношение длины контакта агрегата эпителиальных клеток и агрегата мезенхимальных клеток в ходе производства реконструированного зубного зачатка и размера регенерированного зубного зачатка на седьмой день органной культуры.
Фиг.5 является схематическим рисунком, демонстрирующим ширину коронки зуба, измеренную в форме индексов, демонстрирующих размер регенерированного зуба, образованного трансплантацией регенерированного зубного зачатка под субренальную капсулу.
На фиг.6 показано стереомикроскопическое изображение регенерированного зуба на 21 день проведения анализа на субренальной капсуле, в том случае, когда длина контакта агрегата эпителиальных клеток и агрегата мезенхимальных клеток в ходе получения реконструированного зубного зачатка установлена меньше чем 450 нм, между 450 нм и 900 нм и между 900 нм и 1500 нм. Стрелки-указатели на фигуре показывают оба конца зубной коронки.
Фиг.7 является столбцовой диаграммой, демонстрирующей отношение длины контакта агрегата эпителиальных клеток и агрегата мезенхимальных клеток в ходе воспроизводства реконструированного зубного зачатка и ширины коронки регенерированного зуба на 21-й день проведения анализа на субренальной капсуле.
Фиг.8 является диаграммой, демонстрирующей отношение длины контакта агрегата эпителиальных клеток и агрегата мезенхимальных клеток в ходе воспроизводства реконструированного зубного зачатка и ширины коронки регенерированного зуба на 21-й день проведения анализа на субренальной капсуле.
На фиг.9 показано КТ-изображение регенерированного зуба на 21 день проведения анализа на субренальной капсуле, в тех случаях, когда длина контакта агрегата эпителиальных клеток и агрегата мезенхимальных клеток в ходе воспроизведения реконструированного зубного зачатка установлена меньше чем 450 нм, между 450 нм и 900 нм и между 900 нм и 1500 нм.
Фиг.10 является диаграммой, демонстрирующей отношение длины контакта агрегата эпителиальных клеток и агрегата мезенхимальных клеток в ходе воспроизводства реконструированного зубного зачатка и количества бугорков коронки регенерированного зуба на 21-й день проведения анализа на субренальной капсуле.
На фиг.11 представлены результаты измерения ширины области коронки зуба регенерированного зубного зачатка, полученные в том случае, когда длина контакта агрегата цилиндрических эпителиальных клеток и агрегата мезенхимальных клеток в реконструированном зубной зачатке установлена в фиксированном диапазоне, а количество клеток, включенных в каждый агрегат, изменено.
На фиг.12 представлены результаты измерения ширины коронки зуба регенерированного зуба, полученные в том случае, когда длина контакта агрегата цилиндрических эпителиальных клеток и агрегата мезенхимальных клеток в реконструированном зубной зачатке установлена в фиксированном диапазоне, а количество клеток, включенных в каждый агрегат, изменено.
На фиг.13 представлены результаты измерения количества бугорков регенерированного зуба, полученные в том случае, когда длина контакта агрегата цилиндрических эпителиальных клеток и агрегата мезенхимальных клеток в реконструированном зубной зачатке установлена в фиксированном диапазоне, а количество клеток, включенных в каждый агрегат, изменено.
Описание различных вариантов осуществления изобретения
Способ создания требуемого зуба в соответствии с настоящим изобретением включает: стадию расположения первого агрегата клеток и второго агрегата клеток состоящих соответственно либо из мезенхимальных клеток, либо из эпителиальных клеток, в тесном контакте внутри поддерживающего носителя; и стадию культивирования первого и второго агрегатов клеток внутри поддерживающего носителя, где размер зуба корректируется путем коррекции длины контакта первого и второго агрегатов клеток в одном направлении.
В настоящем изобретении под определением «зуб» подразумевается ткань, содержащая слой дентина на внутренней стороне и слой эмали на внешней стороне и имеющая направленность, которая включает коронку зуба и корень зуба. Направленность зуба может быть идентифицирована по расположению коронки зуба и корня зуба. Коронка зуба и корень зуба могут быть измерены визуально, основываясь на форме и гистологическом окрашивании. Коронка зуба обладает слоистой структурой, содержащей эмаль и дентин, а корень зуба не имеет слоя эмали.
Дентин и эмаль могут быть легко идентифицированы морфологически специалистом в данной области с помощью гистологического окрашивания и т.п. Более того, эмаль может быть идентифицирована по наличию эмалевых бластных клеток (клеток-предшественников), а наличие эмалевых бластных клеток может быть подтверждено по наличию амелогенина. С другой стороны, дентин может быть идентифицирован по наличию одонтобластов, а наличие одонтобластов может быть подтверждено по наличию сиалопротеина дентина. Подтверждение наличия амелогенина и сиалопротеина дентина может быть легко осуществлено хорошо известными в данной области способами, например можно применить in situ гибридизацию и окрашивание антителами.
В настоящем изобретении «зубной зачаток» и «зубная почка» являются выражениями, используемыми для обозначения различных стадий образования зубов. В данном случае, зубной зачаток относится к исходному зачатку зуба, который станет зубом в будущем, и отражает период развития со стадии почки до стадии «колокольчика», которые обычно используются для обозначения стадии образования зуба, и является тканью, в которой накопление дентина и эмали, которые обозначаются как твердые ткани зуба, еще не определяется. С другой стороны, термин «зубная почка», используемый в настоящем изобретении, обозначает ткань после стадии «зубного зачатка» и представляет собой ткань, которая изменяется в пределах от стадии, когда начинает формироваться накопление дентина и эмали, обозначаемых как твердые ткани зуба, вплоть до стадии прорезывания зуба из десны и в целом начала функционирования зуба. Образование зуба из зубного зачатка происходит через стадию почки, стадию «шапочки», раннюю стадию «колокольчика» и позднюю стадию «колокольчика». На стадии почки в эпителиальные клетки внедряются мезенхимальные клетки, что приводит к утолщению, а в стадии «шапочки» внедряющиеся эпителиальные клетки окружают мезенхимальные клетки. Затем приходит очередь ранней и поздней стадии «колокольчика», при этом часть эпителиальных клеток становится внешней эмалью, а часть мезенхимальных клеток формирует дентин на внутренней стороне. Образование зубного зачатка контролируется межклеточным взаимодействием между эпителиальными клетками и мезенхимальными клетками посредством цитокина, что приводит к формированию зуба.
В настоящем изобретении «мезенхимальные клетки» относятся к клеткам, происходящим из мезенхимальной ткани, а также к клеткам, полученным культивированием таких клеток, а «эпителиальные клетки» относятся к клеткам, происходящим из эпителиальной ткани, а также к клеткам, полученным культивированием таких клеток.
Кроме того, в настоящем изобретении, «ткань периодонта» относится к альвеолярной кости и периодонтальной мембране, образованной, главным образом, на внешнем слое зуба. Специалист в данной области легко сможет идентифицировать форму альвеолярной кости и корневой оболочки с помощью гистологического окрашивания.
В настоящем изобретении «стадия размещения первого агрегата клеток и второго агрегата клеток состоящих соответственно либо из мезенхимальных клеток, либо из эпителиальных клеток, в тесном контакте внутри поддерживающего носителя (именуемая в дальнейшем «стадией размещения») описана, например, в документах 1-5 Патентной литературы, и полное содержание этих документов включено в настоящий документ в справочных целях.
Вышеупомянутые первый агрегат клеток и второй агрегат клеток образованы по существу только из мезенхимальных или эпителиальных клеток соответственно. «Образован в основном из мезенхимальных клеток» подразумевает, что в настоящем изобретении один из агрегатов клеток выполняет такие же функции, как если бы он состоял только из мезенхимальных клеток, и не включает, насколько это возможно, клетки, отличные от мезенхимальных клеток. То же самое применимо к «образован в основном из эпителиальных клеток».
В данном документе агрегат клеток относится к находящимся в тесном контакте клеткам, который может быть клеточной массой, приготовленной из разобщенных клеток, а в некоторых случаях даже тканью. Применение ткани обладает преимуществом, которое позволяет легко получить зубы с правильными расположением клеток и формой, но количество, которое может быть получено, является ограниченным. В качестве клеточной массы могут быть использованы культивируемые клетки, которые сравнительно легко можно получить, и, следовательно, они являются более предпочтительными. В соответствии со способом настоящего изобретения регенерированный зуб с правильным расположением клеток и формой может быть получен даже при использовании клеточной массы.
Мезенхимальные и эпителиальные клетки, формирующие агрегат клеток, могут быть получены из любой ткани живого организма при условии, что регенерированный зуб может быть образован из регенерированного зубного зачатка, образованного при использовании этих клеток. С точки зрения эффективного образования зуба, имеющего определенную структуру и направленность, путем репродуцирования клеток, расположенных внутри живого организма, предпочтительно, если, по меньшей мере, один из этих агрегатов клеток был получен из зубного зачатка. Более предпочтительно, если и мезенхимальные, и эпителиальные клетки получены из зубного зачатка. С точки зрения ювенильности и гомогенности на стадии дифференцировки клеток желательно, если зубной зачаток находится в стадии между стадией почки и стадией «шапочки».
Примеры мезенхимальных клеток, полученных не из зубного зачатка, включают клетки, полученные из других мезенхимальных тканей живого организма. Предпочтительно, если они являются клетками костного мозга и мезенхимальные клетки не содержат клетки крови, более предпочтительно, если они являются мезенхимальными клетками полости рта, клетками костного мозга внутри челюстной кости, мезенхимальными клетками, полученными из клеток краниального нервного валика, мезенхимальными клетками-предшественниками, которые могут дифференцироваться в мезенхимальные клетки и их стволовыми клетками. Поскольку рассматриваются мезенхимальные клетки, пример использования полученных из амниона клеток описывается в документе 3 из списка Патентной литературы, а пример использования клеток, полученных индукцией дифференцировки тотипотентных стволовых клеток, в качестве мезенхимальных клеток, описан в документе 4 из списка Патентной литературы, и полное содержание этого документа включено в настоящий документ в справочных целях.
Эпителиальные клетки также могут происходить не из зубного зачатка, примерами подобных клеток являются клетки, полученные из других эпителиальных тканей живого организма. Предпочтительные примеры эпителиальных клеток включают эпителиальные клетки кожи, слизистой и десны в полости рта, а более предпочтительные примеры эпителиальных клеток включают незрелые эпителиальные клетки-предшественники, которые могут образовать дифференцированные, например кератинизированные или паракератинизированные эпителиальные клетки, такие как клетки кожи или слизистой. Примеры таких незрелых эпителиальных клеток-предшественников включают некератинизированные эпителиальные клетки и их стволовые клетки. Пример использования эпителиальных клеток из полости рта и клеток, полученных на первой стадии культивирования эпителиальных клеток, описано в документе 2 из списка Патентной литературы, и полное содержание этого документа включено в данный документ путем ссылки в справочных целях.
Зубной зачаток и другие ткани могут быть отобраны из челюстной кости или т.п. различных животных-млекопитающих, таких как собаки и кошки, а кроме того, приматов, таких как люди и обезьяны, и копытных, таких как свиньи, коровы и лошади; и небольших млекопитающих, таких как грызуны, например мыши, крысы и кролики. Для сбора зубного зачатка и ткани, как правило, могут быть применены немодифицированные условия для сбора ткани и зубной зачаток и ткань могут быть собраны в стерильных условиях и сохранены в соответствующем консервирующем растворе. Примеры человеческого зубного зачатка включают зубной зачаток третьего коренного зуба, который также называется зубом мудрости, а также эмбриональный зубной зачаток, и с точки зрения использования аутогенных тканей применение зачатка зуба мудрости является предпочтительным. В случае мышей можно применять зубной зачаток мыши в эмбриональном возрасте 10-16 дней.
В ходе приготовления мезенхимальных и эпителиальных клеток из зубного зачатка, зубной зачаток, выделенный из окружающей ткани, вначале разделяют на мезенхимальную ткань зубного зачатка и эпителиальную ткань зубного зачатка, основываясь на их форме. Для облегчения выделения в этот момент могут быть применены ферменты. Примеры ферментов включают диспазу, коллагеназу и трипсин.
Клеточные массы по настоящему изобретению означают массу клеток, полученных из мезенхимальной или эпителиальной ткани, и могут быть получены агрегацией клеток, полученных дисперсией мезенхимальной или эпителиальной ткани, или агрегацией клеток, полученных из первой стадии или пассаже культуры данных клеток.
2
Для дисперсии клеток могут быть применены ферменты, такие как диспаза, коллагеназа и трипсин. Для получения достаточного количества клеток среда, обычно используемая для культуры животных клеток, такая как Модифицированная Дульбекко Среда Игла (англ. Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM), может быть применена в качестве среды для культивирования на первой стадии или пассаже культуры диспергированных клеток перед приготовлением клеточной массы. Для стимуляции роста клеток может быть добавлена сыворотка, или в качестве альтернативы сыворотке может быть добавлен клеточный фактор роста, такой как FGF, EGF или PDGF, или известный компонент сыворотки, такой как трансферрин. В случаях когда добавляют сыворотку, ее концентрация может быть изменена соответствующим образом в зависимости от стадии культивирования и может, как правило, составлять около 10%. Для клеточной культуры могут быть применены нормальные культуральные условия, например культивирование в инкубаторе при 37°С с 5% СO. В случае необходимости может быть добавлен антибиотик, такой как стрептомицин.
7
9
8
9
Для агрегации клеток клеточную суспензию центрифугируют. При формировании тесного контакта мезенхимальной и эпителиальной клеточных масс для обеспечения взаимодействия клеток необходимо поддерживать их высокую плотность. Состояние высокой плотности означает, что плотность почти эквивалентна плотности, при которой создается ткань, например высокая плотность находится в диапазоне от 5×10 клеток/мл до 1×10 клеток/мл, предпочтительно от 1×10 клеток/мл до 1×10 клеток/мл, а более предпочтительно от 2×10 клеток /мл до 8×10 клеток/мл. Способ получения клеточной массы, обладающей такой высокой клеточной плотностью, ничем не ограничен, например клетки могут быть агрегированы и осаждены центрифугированием. Центрифугирование является особенно предпочтительным, поскольку оно удобно для достижения высокой плотности без ослабления клеточной активности. Такое центрифугирование может быть проведено при частоте вращения, эквивалентной центрифужной силе в размере от 300×g до 1200×g, а предпочтительно от 500×g до 1000×g в течение трех-десяти минут. Центрифугирование на скорости ниже 300×g может оказаться неспособным достаточно увеличить плотность клеток, тогда как центрифугирование на скорости выше чем 1200×g может вызвать повреждение клеток.
В случаях когда высокоплотные клеточные массы получают центрифугированием, центрифугирование, как правило, проводят после получения суспензии клеток в контейнере, таком как пробирка для центрифугирования клеток, а надосадочную жидкость удаляют в максимально возможной степени, оставляя клетки в виде осадков. В данном документе объем компонентов, отличных от представляющих интерес клеток (например, объем культуральной среды или буферного раствора), предпочтительно не больше объема клеток, а наиболее предпочтительно, если компоненты, отличные от представляющих интерес клеток, отсутствуют. Если такие высокоплотные агрегаты клеток находятся в тесном контакте друг с другом внутри поддерживающего носителя в соответствии со способом, описанным далее, то получаются плотно упакованные клетки и взаимодействие клеток эффективно проявляется.
Поддерживающий носитель, применяемый в настоящем изобретении, может быть носителем, в котором клетки можно культивировать, и предпочтительно является смесью с вышеописанной средой. Материал поддерживающего носителя ничем конкретным не ограничен, например могут быть использованы коллаген, агарозный гель, карбоксиметилцеллюлоза, желатин, агар, гидрогель, «Cellmatrix» (торговое название), «Mebiol Gel» (торговое название), «Matrigel» (торговое название), эластин, фибрин, ламинин, смесь внеклеточного матрикса, полигликолевая кислота (англ. polyglycolic acid, PGA), полимолочная кислота (англ. polylactic acid, PLA) и сополимер молочной кислоты/гликолевой кислоты (англ. lactic acid/glycolic acid copolymer, PLGA). Эти поддерживающие носители могут обладать плотностью, посредством которой клетки фактически могут быть поддерживаться в местах, в которые были помещены агрегаты клеток, и примеры этих поддерживающих носителей включают те, которые находятся в форме геля, волокна и твердого вещества. Среди них наиболее предпочтительными являются материалы, обладающие соответствующей плотностью и удерживаемостью, такие как коллаген, агарозный гель, карбоксиметилцеллюлоза, желатин, агар, гидрогель, «Cellmatrix», «Mebiol Gel», «Matrigel», смесь внеклеточного матрикса, эластин, фибрин и ламинин. В данном случае плотность, посредством которой клетки могут фактически поддерживаться на своих местах, может быть плотностью, которая применима к трехмерной культуре, то есть плотностью, при которой может сохраняться положение клеток, притом что гипертрофия клеток, происходящая из-за их роста, не ингибируется, и такая плотность может быть легко определена специалистом в данной области.
Более того, поддерживающий носитель, применяемый в настоящем изобретении, может обладать удерживаемостью, посредством которой клетки могут сохранять тесный контакт клеточных агрегатов, не переходя в диспергированное состояние. «Тесный контакт» означает, что вышеупомянутые высокоплотные агрегат мезенхимальных клеток и агрегат эпителиальных клеток сохраняют тот же уровень плотности даже в непосредственной близости от поверхности контакта мезенхимальных клеток и эпителиальных клеток. Если поддерживающий носитель, который может сохранять тесный контакт, является коллагеном, то, например, его применение в конечной концентрации от 2 мг/мл до 3 мг/мл, то есть при прочности желе от 120 г до 250 г согласно способу, соответствующему JIS-K6503-1996 (измеряемой как нагрузки, необходимой для продавливания на 4 мл поршня диаметром 12,7 мм), обеспечивает соответствующую плотность. Другие типы поддерживающих носителей могут использоваться в настоящем изобретении при получении подобной прочности с аналогичным способом оценки. Более того, поддерживающий носитель с плотностью, эквивалентной требуемой прочности желе, также может быть получен объединением вместе одного или нескольких типов поддерживающих носителей.
Способ расположения первого агрегата клеток и второго агрегата клеток внутри поддерживающего носителя ничем конкретным не ограничен, но если агрегаты клеток являются клеточной массой, например осадком, полученным центрифугированием, как указано выше, то их можно вводить внутрь поддерживающего носителя и располагать в нем, например, с помощью микрошприца. Если клеточный агрегат является тканью, то он может быть расположен в любой позиции внутри поддерживающего носителя с помощью острия иглы шприца.
В настоящем изобретении способы расположения первого агрегата клеток и второго агрегата клеток в поддерживающем носителе в тесном контакте друг с другом ничем конкретно не ограничены, например после расположения одного клеточного агрегата в поддерживающем носителе другой клеточный агрегат может быть позиционирован так, чтобы он оказывал давление на первый агрегат клеток, и, таким образом, оба агрегата могут быть установлены в тесном контакте друг с другом. Более конкретно путем соответствующего изменения позиции кончика вышеупомянутой иглы шприца в поддерживающем носителе один из агрегатов клеток может оказывать давление на другой агрегат клеток. При использовании в качестве агрегата клеток эпителиальной ткани или мезенхимальной ткани поверхность ткани, которая была в контакте с мезенхимальной тканью или эпителиальной тканью в исходном зубном зачатке, может быть расположена так, чтобы она находилась в контакте с другим агрегатом клеток.
Кроме того, после расположения также предпочтительно организовать стадию затвердевания поддерживающего носителя. Это позволит клеткам дополнительно агрегировать, что в результате даст состояние высокой плотности. Например, если применяют коллагеновый гель, то затвердевания можно достичь, оставив гель при температуре культивирования на период от нескольких минут до нескольких десятков минут. К этапу времени уменьшается до минимума количество отличных от клеток компонентов внутри агрегата и достигается состояние высокой плотности.
В настоящем изобретении «стадия культивирования первого и второго агрегатов клеток внутри поддерживающего носителя (именуемая в дальнейшем «стадией культивирования») описана в документах 1-5 из списка Патентной литературы, полное содержание которых включено в данный документ в справочных целях.
Период культивирования варьирует в зависимости от количества клеток, размещенных в поддерживающем носителе, и от состояний клеточных масс, равно как и от условий, в которых проводится стадия культивирования, и от типа животного, при этом специалист в данной области может надлежащим образом выбрать период времени. В случае трансплантации внутрь ротовой полости для того, чтобы прорезался функциональный зуб, требуется как минимум однодневный период культивирования, а более предпочтительно трехдневный или больший период.
Путем увеличения продолжительности периода культивирования может быть достигнут большой прогресс при формировании реконструированного зубного зачатка, включая формирование накоплений дентина и эмали, формирование коронки зуба и формирование зубного корня. Для достижения желаемого состояния культивирование осуществляется, например, в течение 6 дней или более, 30 дней или более, 50 дней или более, 100 дней или более, или 300 дней или более, а также в ходе культивирования могут быть изменены среда и условия культивирования.
Стадия культивирования внутри поддерживающего носителя может быть осуществлена либо только при наличии поддерживающего носителя, который включает первый и второй агрегаты клеток, либо культивирование может быть осуществлено в присутствии других клеток животных.
В случаях когда культивирование осуществляется только при наличии поддерживающего носителя, культивирование может быть осуществлено в нормальных условиях, используемых для культивирования клеток животных. В данном случае к культуре могут быть добавлены сыворотка, полученная из млекопитающих, и различные клеточные факторы, которые известны как эффективные при росте и дифференцировке таких клеток. Примеры таких клеточных факторов включают FGF и BMP.
С точки зрения газообмена и снабжения питательными веществами агрегатов клеток, а также с точки зрения осуществления полных стадий in vitro без какого-либо контакта или смешивания с другими клетками животных предпочтительно применение органной культуры для культивирования внутри поддерживающего носителя. В органной культуре, как правило, культивирование осуществляют посредством пористой мембраны, плавающей на среде, подходящей для роста клеток животных, и посредством размещения поддерживающего носителя с первым и вторым агрегатами клеток на мембране. Пористая мембрана, применяемая в данном документе, предпочтительно является мембраной с множеством пор с диаметром от 0,3 до 5 мкм, а конкретные примеры включают «Cell Culture Insert» (торговое название) и «Isopore Filter» (торговое название).
С другой стороны, осуществление культивирования внутри поддерживающего носителя в присутствии других клеток животных делает возможным раннее образование зуба, обладающего определенным расположением клеток, в ответ на действия различных цитокинов и т.п. из клеток животных. Такое культивирование в присутствии других клеток животных может быть осуществлено путем культивирования ex vivo с помощью выделенных клеток или культивируемых клеток, а кроме того, поддерживающий носитель с первым и вторым агрегатами клеток может быть трансплантирован в живой организм для проведения культивирования in vivo.
Такая трансплантация и культивирование in vivo являются особенно предпочтительными, поскольку зуб и/или ткань периодонта могут сформироваться на ранней стадии. Предпочтительные примеры животных, которые могут использоваться в качестве живого организма, включают млекопитающих, предпочтительно млекопитающих, не являющихся человеком, таких как свиньи и мыши, и животное предпочтительно происходит из того же вида, что и ткань зубного зачатка. В случаях когда культивирование осуществляют трансплантацией в животное, которое не принадлежит к тому же виду, что и ткань зубного зачатка, предпочтительно использовать животное, в которое внесено изменение, которое делает его иммунодефицитным. Примеры подходящего для роста in vivo участка в живом организме, в котором орган или ткань клеток животных развиваются, насколько это возможно, нормально, предпочтительно включают область под субренальной капсулой, брыжейку (сальник) и подкожный участок.
Период культивирования после трансплантации варьирует в зависимости от размера зуба в момент трансплантации и размера развитого зуба и может составлять, как правило, от 3 до 400 дней. Например, период времени трансплантации под субренальной капсулой предпочтительно составляет от 7 до 60 дней, хотя он варьирует в зависимости от размера зубного зачатка для трансплантации и размера регенерируемого зуба.
Предварительное культивирование ex vivo может быть осуществлено до трансплантации в живой организм. Предварительное культивирование укрепляет связи между клетками и связь между первым и вторым агрегатами клеток, делая межклеточное взаимодействие более сильным. В результате межклеточное взаимодействие может быть усилено и общий период роста может быть сокращен.
Период предварительного культивирования ничем конкретным не ограничен. Предпочтительно период составляет три дня или дольше, еще более предпочтительно семь дней или дольше, поскольку зубная почка может развиться из зубного зачатка в течение данного периода и, таким образом, период культивирования после трансплантации может быть сокращен. Например, в случае трансплантации и культивирования под субренальной капсулой органной культуры в качестве предварительной культуры период времени предпочтительно составляет от 1 до 7 дней.
Зуб, образованный в соответствии с вышеупомянутой стадией расположения и стадией культивирования, обладает специфичным для зубов расположением клеток (структурой), имеет дентин внутри и эмаль снаружи и предпочтительно обладает направленностью, то есть имеет вершину (коронку зуба) и корень зуба в правильной позиции, позволяющей ему в достаточной степени функционировать как зуб. Следовательно, образованный зуб может широко использоваться в качестве альтернативы зуба. Более того, его можно использовать в исследовании для выяснения процесса образования зубов.
Кроме того, за счет удлинения периода культивирования в дополнении к самому зубу могут быть сформированы ткани периодонта, такие как альвеолярная кость и периодонтальная мембрана, которые поддерживают и стабилизируют зубы на челюстной кости. В результате практичность зуба после трансплантации может быть дополнительно улучшена. Кроме того, только ткань периодонта может быть выделена и использована.
Настоящее изобретение характеризуется тем, что длина полученного таким образом зуба в одном направлении корректируется коррекцией длины контакта первого агрегата клеток и второго агрегата клеток в заданном одном направлении в вышеупомянутой стадии расположения.
Длина контакта может быть скорректирована в зависимости от размера, формы и позиции агрегата клеток, который должен быть расположен внутри поддерживающего носителя. Например, при расположении клеточной массы внутри поддерживающего носителя с помощью микрошприца, размер, форма и позиция агрегата клеток может быть изменена соответствующим образом изменением диаметра иглы шприца и перемещением кончика иглы внутри поддерживающего носителя при выдавливании клеточной массы и длина контакта двух агрегатов клеток в любом направлении может быть скорректирована. Если в качестве агрегата клеток используется мезенхимальная ткань и эпителиальная ткань, то форма и размер ткани могут быть скорректированы до расположения ткани внутри поддерживающего носителя, а путем коррекции позиции их расположения внутри поддерживающего носителя может быть скорректирована длина контакта двух агрегатов клеток.
Кроме того, путем получения множества типов структур, в которых первый и второй агрегаты клеток были расположены в тесном контакте друг с другом внутри поддерживающего носителя, а затем измерением длины контакта обоих агрегатов клеток и выбором структуры, в которой измеренная длина контакта является требуемой длиной, может быть получен реконструированный зубной зачаток, обладающий требуемой длиной контакта, и такая стадия также включена в «коррекцию длины контакта» в настоящем изобретении. Измерение длины контакта может быть исполнено, например, путем наблюдения в фазово-контрастном микроскопе.
В данном случае длина зуба в одном направлении относится к ширине коронки зуба в любом направлении, например ширина в щечно-язычном направлении (направлении перпендикулярном зубному ряду) и ширина в мезио-дистальном направлении (направлении, параллельном зубному ряду) идеально подходят, но направления не ограничивается ими. Измерение ширины коронки зуба может быть исполнено должным образом специалистом в данной области.
Следует отметить, что если регенерированный зубной зачаток образован коррекцией длины контакта первого агрегата клеток и второго агрегата клеток в одном заданном направлении, то, как правило, в коронке образованного зуба корректируется длина в том же направлении, что и длина контакта.
В соответствии с настоящим изобретением один из аспектов способа получения зуба, обладающего требуемой длиной в одном направлении, включает: стадию получения множества типов структур, в которых первый агрегат клеток и второй агрегат клеток расположены в тесном контакте внутри поддерживающего носителя, путем изменения длины контакта первого агрегата клеток и второго агрегата клеток в одном заданном направлении; стадию культивирования каждого из множества типов структур внутри поддерживающего носителя; стадию измерения длины полученного на предшествующей стадии зуба в одном направлении, с тем чтобы определить корреляцию между длиной контакта и длиной зуба в одном направлении; и стадию расчета, основанного на корреляции, длины контакта первого агрегата клеток и второго агрегата клеток, требуемую для получения зуба, обладающего требуемой длиной в одном направлении.
Стадия получения множества типов структур, в которых первый агрегат клеток и второй агрегат клеток расположены в тесном контакте внутри поддерживающего носителя, путем изменения длины контакта первого агрегата клеток и второго агрегата клеток в одном направлении и последующая стадия культивирования каждого из множества типов структур внутри поддерживающего носителя могут быть выполнены в соответствии вышеупомянутым объяснением стадии расположения, стадии культивирования и способа корректировки длины контакта.
Корреляцию между длиной контакта и длиной зуба в одном направлении можно определить согласно хорошо известному способу или аналогичному способу. Например, могут быть созданы различные диаграммы, выражающие отношение длины контакта и длины зуба (ширина зубной коронки), или формула, выражающая отношение длины контакта и длины зуба. Кроме того, может быть проанализировано распределение длины контакта, обеспечивающее длину одного зуба, и может быть определен диапазон длин контактов, обеспечивающий заданный размер зуба.
Стадия расчета длины контакта первого агрегата клеток и второго агрегата клеток, требуемая для получения зуба, обладающего требуемой длиной в одном направлении, основана на полученной корреляции и может быть осуществлена подстановкой величины запрашиваемого размера зуба в вышеупомянутые формулу и диаграмму.
Таким образом, после определения требуемой длины контакта может быть получен зуб с требуемым размером путем расположения первого агрегата клеток и второго агрегата клеток с требуемой длиной контакта в тесном контакте друг с другом внутри поддерживающего носителя почти в тех же самых условиях, что и в вышеупомянутой стадии расположения множества типов структур, с последующим осуществлением культивирования почти в таких же условиях, что и вышеупомянутые условия культивирования множества типов структур. В данном документе «почти такие же условия» относятся к условиям, в которых зуб, обладающий такой же длиной в одном направлении, может быть получен с хорошей воспроизводимостью, если длина контакта установлена такой же. В стадии расположения и стадии культивирования для определения длины контакта и в стадии расположения и стадии культивирования для получения зуба, обладающего требуемой длиной в одном направлении, желательно, например, чтобы условия культивирования, такие как тип поддерживающего носителя, температура, состав среды и расположение культуры (либо органной культуры, либо in vivo культуры) были теми же самыми.
Кроме того, при расположении первого и второго агрегатов клеток внутри поддерживающего носителя желательно, чтобы длина контакта части, которая, как ожидается, образует положение, которое должно иметь заданную длину в зубе, который образуется в будущем, имела длину, рассчитанную выше. Специалист в данной области может надлежащим образом определить, какое из направлений поверхности контакта первого и второго агрегатов клеток станет направлениями в зубе, который образуется в будущем. Например, при получении коренного зуба, в котором длина А мезио-дистального направления длиннее, чем длина В щечно-язычного направления, поверхность контакта первого и второго агрегатов клеток в общем должна быть прямоугольной и более длинная сторона должна формировать длину контакта, которая обеспечивает длину А в мезио-дистальном направлении.
Другой аспект способа получения зуба, обладающего требуемой длиной в одном направлении в соответствии с настоящим изобретением, включает: стадию получения множества типов структур, в которых первый агрегат клеток и второй агрегат клеток в форме почти столбчатой структуры, состоящие соответственно либо из мезенхимальных клеток, либо из эпителиальных клеток, расположены в тесном контакте внутри поддерживающего носителя так, чтобы осевые направления каждой из столбчатых структур являлись параллельными, путем изменения длины контакта первого агрегата клеток и второго агрегата клеток в осевом направлении; стадию культивирования каждого из множества типов структур внутри поддерживающего носителя; стадию измерения длины зуба в одном направлении, полученного в предшествующей стадии, с тем чтобы определить корреляцию между длиной контакта и длиной; и стадию основанного на корреляции расчета длины контакта первого агрегата клеток и второго агрегата клеток, которая необходима для получения зуба, обладающего требуемой длиной в одном направлении.
Стадия получения множества типов структур с различными длинами контакта и последующее осуществление стадии культивирования может быть выполнено в соответствии с вышеупомянутым объяснением стадии расположения, стадии культивирования и способа для корректировки длины контакта. Как описано выше, корреляция между длиной контакта и длиной зуба в одном направлении может быть выражена формулой или диаграммой, также может быть определен диапазон длины контакта, обеспечивающий заранее определенную длину зуба. После этого на основе этих корреляций может быть определена длина контакта первого и второго агрегатов клеток, необходимая для получения зуба, обладающего требуемой длиной в одном направлении.
В настоящем изобретении «форма почти столбчатой структуры» относится к удлиненной форме, протяженной в одном направлении, такой как почти цилиндрическая форма и почти призматическая форма. Если агрегатом клеток является ткань, то ткань может быть сформирована в форме почти столбчатой структуры, а затем расположена внутри поддерживающего носителя. Более того, если агрегат клеток является клеточной массой, то, например, кончик иглы микрошприца может быть помещен внутри поддерживающего носителя и клеточная масса может быть расположена в почти в цилиндрической форме внутри поддерживающего носителя путем выдавливания клеток во время движения кончика иглы.
Таким образом, после определения необходимой длины контакта зуб, обладающий требуемой длиной в одном направлении, может быть получен расположением первого агрегата клеток и второго агрегата клеток в форме почти столбчатой структуры при данной длине контакта в тесном контакте друг с другом внутри поддерживающего носителя почти в тех же самых условиях, что и в вышеупомянутой стадии расположения множества типов структур, с последующим осуществлением культивирования почти в таких же условиях, что и вышеупомянутые условия культивирования множества типов структур.
Другой аспект способа получения зуба в соответствии с настоящим изобретением является способом получения коренного зуба, обладающего требуемой длиной в мезио-дистальном направлении и/или в щечно-язычном направлении и включает: стадию получения множества типов структур, в которых первый агрегат клеток и второй агрегат клеток в форме почти столбчатой структуры, состоящие соответственно либо из мезенхимальных клеток, либо из эпителиальных клеток, расположены в тесном контакте внутри поддерживающего носителя так, чтобы осевые направления каждой из столбчатых структур являлись параллельными, путем изменения длины контакта первого агрегата клеток и второго агрегата клеток в осевом направлении и/или длины контакта в направлении, перпендикулярном оси; стадию культивирования каждого из множества типов структур внутри поддерживающего носителя; стадию измерения длины коренного зуба, полученного в предшествующей стадии в мезио-дистальном направлении и/или в щечно-язычном направлении, с тем чтобы определить корреляцию между длиной контакта в осевом направлении и длиной коренного зуба в мезио-дистальном направлении и/или корреляцию между длиной контакта, перпендикулярного оси, и длиной коренного зуба в щечно-язычном направлении.
Как описано выше, как правило, из-за того, что ширина коренного зуба в щечно-язычном направлении длиннее, чем ширина в мезио-дистальном направлении, если агрегат клеток сформирован в форме столбчатой структуры, то ширину зубной коронки в мезио-дистальном направлении можно контролировать путем контроля длины контакта в осевом направлении, а ширину зубной коронки в щечно-язычном направлении можно контролировать путем контроля длины контакта, перпендикулярного оси.
Длина контакта в осевом направлении и длина контакта, перпендикулярного к оси, могут быть изменены с помощью любого способа, например, можно изменить длину агрегата клеток в форме столбчатой структуры, диаметр, дистанцию между осями обоих агрегатов клеток. Если агрегат клеток является тканью, то формируя ее с требуемым диаметром и длиной перед расположением внутри поддерживающего носителя с последующей корректировкой ее расположения внутри поддерживающего носителя, можно изменить длину контакта в осевом направлении и длину контакта, перпендикулярного к оси. Кроме того, если агрегат клеток является клеточной массой, то, например, при размещении ее внутри поддерживающего носителя с помощью микрошприца диаметр агрегата клеток может быть изменен путем изменения диаметра иглы, а путем изменения дистанции, на которую кончик иглы перемещается внутрь поддерживающего носителя, можно изменить длину агрегата клеток в осевом направлении. Кроме того, после размещения одного агрегата клеток путем корректировки положения, в котором располагается другой агрегат клеток, можно изменить дистанцию между осями обоих агрегатов клеток. За счет уменьшения дистанции между обеими осями, так чтобы они оказывали давление друг на друга, поверхность контакта агрегата клеток становится в целом больше, и, таким образом, можно изменить длину контакта в осевом направлении и длину контакта в направлении, перпендикулярном оси.
Вдобавок к этому стадию расположения, стадию культивирования и стадии определения корреляции между различными длинами можно осуществить в соответствии с ранее упомянутыми способами.
Таким образом, после определения длины контакта в осевом направлении и/или длины контакта в направлении, перпендикулярном оси, коренной зуб, обладающий требуемой длиной в мезио-дистальном направлении и/или в щечно-язычном направлении, может быть получен расположением первого агрегата клеток и второго агрегата клеток в форме почти столбчатой структуры при заданной длине контакта в тесном контакте друг с другом внутри поддерживающего носителя почти в тех же самых условиях, что и в вышеупомянутой стадии расположения множества типов структур, с последующим осуществлением культивирования почти в таких же условиях, что и вышеупомянутые условия культивирования множества типов структур.
Кроме того, другой аспект способа получения зуба, обладающего требуемой длиной в одном направлении в соответствии с настоящим изобретением, включает стадию расположения первого и второго агрегатов клеток в форме почти столбчатой структуры в тесном контакте в стадии расположения, так чтобы осевые направления каждой из столбчатых структур являлись параллельными, а длина контакта в осевом направлении первого и второго агрегатов клеток находилась в пределах диапазона плюс/минус 25%, предпочтительно ±10% от вышеупомянутой требуемой длины.
Как описано ниже, авторы изобретения обнаружили, что если массу мезенхимальных клеток и массу эпителиальных клеток в форме, близкой к цилиндрической, располагают в тесном контакте внутри поддерживающего носителя так, чтобы осевые направления каждой из столбчатых структур являлись параллельными, длина полученного таким образом зуба зависит от длины контакта в осевом направлении столбчатых структур. Кроме того, было обнаружено, что путем установки длины контакта приблизительно в пределах диапазона плюс/минус 25%, предпочтительно ±10% от требуемой длины, может быть получен зуб, в котором ширина зубной коронки в мезио-дистальном направлении имеет требуемую длину. Следовательно, например, если получают зуб, в котором ширина зубной коронки в мезио-дистальном направлении примерно равна Х мкм, то первый агрегат клеток и второй агрегат клеток могут быть образованы в форме почти столбчатой структуры, а длина контакта в осевом направлении может быть установлена между 0,75Х мкм и 1,25Х мкм, предпочтительно между 0,9Х мкм и 1,1 мкм.
Способ контроля длины контакта первого и второго агрегатов клеток в форме почти столбчатой структуры может быть осуществлен согласно уже объясненному способу.
Кроме того, вместо того чтобы получать агрегат клеток, обладающий требуемой длиной в осевом направлении, можно получить множество типов структур, в которых первый агрегат клеток и второй агрегат клеток в форме почти столбчатой структуры расположены в тесном контакте внутри поддерживающего носителя, длину контакта обоих агрегатов клеток в осевом направлении можно измерить, структуру, в которой измеренная длина контакта является требуемой длиной, можно выбрать и провести через стадию культивирования. Измерение длины контакта можно осуществить, например, наблюдением в фазово-контрастном микроскопе.
Способ получения одиночного зуба в соответствии с настоящим изобретением включает: стадию расположения первого агрегата клеток и второго агрегата клеток состоящих соответственно либо из мезенхимальных клеток, либо из эпителиальных клеток в тесном контакте внутри поддерживающего носителя; и стадию культивирования первого и второго агрегатов клеток внутри поддерживающего носителя, где максимальная длина контакта первого агрегата клеток и второго агрегата клеток равна или меньше, чем заданное значение.
Когда в соответствии со способом из документа 1 из списка Патентной литературы был получен неожиданный агрегат зубов, авторы поняли, что путем контроля длины контакта первого и второго агрегатов клеток и путем контроля размера зуба, можно получить одиночный зуб с хорошей воспроизводимостью. Вероятно, это происходит из-за того, что первый эмалевый узелок, который определяет количество зубов, образуемых из зубного зачатка, не образуется в количестве больше чем один в пределах заданной дистанции. Если можно получить одиночный зуб, то нет необходимости осуществлять выделение до трансплантации приобретенного зуба.
Следует отметить, что в способе получения одиночного зуба в соответствии с настоящим изобретением «максимальная длина контакта» относится к длине наиболее длинной прямой линии среди прямых линий, включенных в поверхность контакта первого агрегата клеток и второго агрегата клеток.
Кроме того, если способ получения одиночного зуба в соответствии с настоящим изобретением применяется на мышах, то длина контакта первого и второго агрегатов клеток предпочтительно равна или меньше чем 3000 мкм, а более предпочтительно равна или меньше чем 1500 нм. Следует отметить, что длина контакта предпочтительно равна или больше чем 100 мкм, а более предпочтительно равна или больше чем 200 мкм. Длину контакта можно контролировать согласно уже упомянутому описанию.
В настоящем изобретении одиночный зуб относится к структуре зуба, которая может быть трансплантирована в живой организм и которая характеризуется наличием зубной коронки, корня зуба, пульпы зуба и дентина образованных неразрывно с периодонтальной костью и альвеолярной костью, которые формируются вокруг каждого зуба. Специалист в данной области легко может определить количество полученных зубов.
Способ восстановления утраченной части зубов в ротовой полости в соответствии с настоящим изобретением включает стадию трансплантации в область утраты зуба, полученного способом для получения зуба в соответствии с настоящим изобретением. В соответствии с этим способом зуб, подходящий по размеру к области утраты, может быть получен и трансплантирован.
В способе для восстановления утраченной части зубов в ротовой полости в соответствии с настоящим изобретением существует возможность трансплантации зубного зачатка или зуба в любой стадии, которые получены в способе создания зуба согласно настоящему изобретению. Если формирование коронки зуба можно увидеть, то предпочтительно разместить коронку зуба во внутренней части ротовой полости. Если формирование зубной коронки нельзя увидеть, то предпочтительно расположить слой эпителиальных клеток, соответствующий части зубной коронки, или слой эпителиальных клеток реконструированного зубного зачатка по направлению к внутренней стороне ротовой полости. Кроме того, предпочтительно расположить открытую часть слоя эпителиальных-мезенхимальных клеток реконструированного зубного зачатка на стороне, противоположной внутренней стороне ротовой полости. Таким образом, кончик зуба (коронка зуба) будет направлен к внутренней стороне ротовой полости и будет иметь такую же направленность, что и окружающие зубы.
Под областью утраты зуба подразумевается расположенная в десне часть с утраченными зубами, и ее форма ничем конкретным не ограничена. Поскольку регенерированный зубной зачаток или зуб могут быть встроены, нет конкретных ограничений, касающихся области утраты зуба и типа требуемого зуба.
Область утраты зуба, как правило, расположена в челюстной кости или альвеолярной кости внутри ротовой полости. Кроме того, вместе с потерей зубов, если альвеолярная костная масса также повреждена, то для увеличения недостающей части костной массы можно применить хорошо известный клинический способ восстановления кости для облегчения встраивания импланта, например метод GTR (Направленная регенерация тканей; англ. Guided Tissue Regeneration). После размещения зубного зачатка или зуба в полости предпочтительно наложить на участок шов согласно нормальному процессу.
В способе для восстановления утраченной части зубов в ротовой полости в соответствии с настоящим изобретением животное, в которое будет осуществляться трансплантация, предпочтительно должно быть того же вида, что и то, из которого извлечен зубной зачаток, используемый для получения зуба, а более предпочтительно должно быть тем же индивидуумом, из которого извлечен зубной зачаток. В качестве животных могут быть использованы млекопитающие, такие как люди, коровы, лошади, свиньи, собаки, кошки и мыши. Немлекопитающие также могут быть использованы.
Кроме того, настоящее изобретение также предлагает способ проектирования способа получения зуба, обладающего требуемой длиной в одном направлении при заданном условии. «Заданные условия» подразумевают условия, в которых определены поддерживающий носитель, среда и способ культивирования. При выполнении при заданном условии способа получения, спроектированного согласно способу для проектирования способа получения зуба, обладающего требуемой длиной в одном направлении при заданном условии, можно получить зуб, обладающий требуемой длиной в одном направлении.
Вышеупомянутый способ проектирования в соответствии с настоящим изобретением включает способ для определения, при условии когда первый агрегат клеток и второй агрегат клеток состоящие соответственно либо из мезенхимальных клеток, либо из эпителиальных клеток расположены в тесном контакте внутри поддерживающего носителя, длины контакта обоих клеточных агрегатов, которая требуется для получения зуба, обладающего заданной длиной в одном направлении.
В данном случае способ определения длины контакта включает: стадию получения множества типов структур, в которых первый агрегат клеток и второй агрегат клеток, состоящие соответственно либо из мезенхимальных клеток, либо из эпителиальных клеток, расположены в тесном контакте внутри поддерживающего носителя, путем изменения длины контакта первого агрегата клеток и второго агрегата клеток в заданном одном направлении; стадию культивирования каждого из множества типов структур внутри поддерживающего носителя; стадию измерения длины зуба, полученного на предшествующей стадии, в одном направлении, с тем чтобы определить корреляцию между длиной контакта и длиной зуба в одном направлении; и стадию основанного на корреляции расчета длины контакта первого агрегата клеток и второго агрегата клеток необходимой для получения зуба, обладающего требуемой длиной в одном направлении.
Кроме того, настоящее изобретение также предлагает способ проектирования способа получения одиночного зуба в заданных условиях.
Вышеупомянутый способ проектирования в соответствии с настоящим изобретением включает способ для определения, при условии когда первый агрегат клеток и второй агрегат клеток, состоящие соответственно либо из мезенхимальных клеток, либо из эпителиальных клеток, расположены в тесном контакте внутри поддерживающего носителя, длины контакта обоих клеточных агрегатов, которая необходима для получения одиночного зуба.
Кроме того, способ определения максимальной длины контакта включает: стадию получения множества типов структур, в которых первый агрегат клеток и второй агрегат клеток, состоящие соответственно либо из мезенхимальных клеток, либо из эпителиальных клеток, расположены в тесном контакте внутри поддерживающего носителя, изменением максимальной длины контакта первого агрегата клеток и второго агрегата клеток; стадию культивирования каждого из множества типов структур внутри поддерживающего носителя и стадию измерения количества зубов, полученных на предшествующей стадии, с тем чтобы определить максимальную длину контакта первого агрегата клеток и второго агрегата клеток, необходимую для получения одиночного зуба.
Следует отметить, что термины, используемые в данном документе, используются для объяснения конкретного воплощения и не предназначены для ограничения изобретения.
Более того, используемый в данном документе термин «включать», предназначен для обозначения присутствия описанной сущности (члена, стадии, элемента, числа и т.п.) за исключением случая, когда в свете контекста возможно разное осмысление, и не исключает присутствие сущности, отличной от вышеописанной сущности (члена, стадии, элемента, числа и т.п.).
Если нет другого определения, используемые в данном документе термины (включая технические термины и научные термины) несут то же значение, которое широко известно специалистам в области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Используемые в данном документе термины должны толковаться как несущие целостное по отношению к настоящему изобретению и связанной технической области значение, если иное определение прямо не предусмотрено, и, таким образом, их не следует ни идеализировать, ни толковать в чрезмерно поверхностном значении.
Случай, когда воплощение настоящего изобретения объясняется со ссылкой на схематический рисунок и когда используется схематическая диаграмма, в целях подробного объяснения может быть введено расширенное объяснение.
Термины «первый», «второй» и т.п. применяют для выражения различных элементов, и понятно, что эти элементы не должны ограничиваться данными терминами. Эти термины используют всего лишь для того, чтобы отличить один элемент от другого элемента. Например, возможно описать первый элемент как второй элемент, и точно так же второй элемент как первый элемент, не отходя от объема притязаний настоящего изобретения.
Даже в вышеупомянутом способе проектирования мезенхимальные клетки и эпителиальные клетки могут происходить из любой ткани живого организма при условии, что регенерированный зуб может быть получен из реконструированного зубного зачатка, сформированного с помощью этих клеток. Предпочтительно, если, по меньшей мере, один тип этих клеток получен из зубного зачатка, а более предпочтительно, если оба типа клеток получены из зубного зачатка.
Далее по тексту настоящее изобретение будет описано более подробно с отсылкой на примеры. Однако настоящее изобретение может быть воплощено различными способами, и настоящее изобретение не должно толковаться как ограниченное примерами, описанными в данном документе.
Примеры
(1) Получение эпителиальных клеток зубного зачатка и мезенхимальных клеток зубного зачатка
Зубной зачаток реконструировали для образования зуба. В качестве экспериментальной модели использовали мышей.
2+
2+
Из эмбриона (внутриутробный возраст 14,5 дней) мышей C57BL/6N (приобретенных в «Japan SLC, Inc.»), под микроскопом удаляли обычным способом ткань зубного зачатка нижнего моляра. Ткань зубного зачатка нижнего моляра промывали фосфатным буфером, не содержащим Ca, Mg (PBS(-)), и обрабатывали при комнатной температуре в течение двух минут раствором фермента, который представляет собой (PBS(-)), с добавлением 40 Ед./мл (конечная концентрация) Диспазы (производства «BD», Массачусетс, США). После этого три раза промывали DMEM (среза Игла в модификации Дульбекко) (производства «Sigma», Сент-Луис, Монтана) с добавлением 10% FBS (эмбриональная телячья сыворотка) (производства «Invitrogen», Карлсбад, Калифорния). Следующим шагом добавляли раствор ДНКазы I (производства «Takara», Сига, Япония) до конечной концентрации 70 Ед./мл для диспергирования ткани зубного зачатка, и хирургическим путем разделяли эпителиальную и мезенхимальную ткани зубного зачатка с помощью 25 G инъекционной иглы (производства «Terumo», Токио, Япония).
Эпителиальную ткань зубного зачатка отмывали три раза PBS(-), обрабатывали при 37°С в течение 30 минут раствором фермента, который представляет собой PBS(-) с растворенной в нем 100 Ед./мл (конечная концентрация) Коллагеназой I (производства «Worthington», Лэйквуд, Нью-Джерси) и этот процесс повторяли дважды. Клетки из осадка, полученного центрифугированием, обрабатывали при 37°С в течение 10 минут раствором фермента, который представляет собой PBS(-) с растворенным в нем 0,25% трипсином (конечная концентрация) (производства «Sigma»). После этого три раза отмывали клетки DMEM (производства «Sigma») с добавлением 10% FBS (производства «Invitrogen»). Следующим шагом добавляли к клеткам раствор ДНКазы I (производства «Takara») до конечной концентрации 70 Ед./мл и получали суспензию эпителиальных клеток зубного зачатка, разделенных пипетированием.
В то же время мезенхимальную ткань зубного зачатка отмывали три раза PBS(-) и обрабатывали при 37°С в течение 20 минут раствором фермента, который представляет собой PBS(-) с растворенным в нем 100 Ед./мл (конечная концентрация) Коллагеназы I (производства «Worthington»). Затем дополнительно обрабатывали PBS(-) с добавлением 0,25% Трипсина (производства «Sigma») в течение десяти минут. Следующим шагом добавляли 70 Ед./мл ДНКазы I (производства Takara) для получения суспензии мезенхимальных клеток зубного зачатка, разделенных пипетированием.
(2) Изготовление реконструированного зубного зачатка
Далее проводили реконструкцию зубного зачатка, используя приготовленные эпителиальные и мезенхимальные клетки зубного зачатка. В 1,5 мл микропробирку (производства «Eppendorf», Гамбург, Германия) с нанесенной силиконовой смазкой добавляли эпителиальные или мезенхимальные клетки зубного зачатка, суспендированные в DMEM (производства «Sigma») с добавлением 10% FBS (производства «Invitrogen») и собирали клетки центрифугированием (в течение трех минут при 600×g) в виде осадков. После центрифугирования удаляли настолько насколько это возможно надосадочную жидкость культуральной среды и опять проводили центрифугирование в течение трех минут при 600×g, с последующим полным удалением культуральной среды, оставшейся вокруг осадков клеток, под стереоскопическим микроскопом с помощью «GELoader Tip 0.5-20 u.1» (производства «Eppendorf»).
К чашкам Петри, на которые была нанесена силиконовая смазка, добавляли покапельно 30 мкл «Cellmatrix type I-A» (производства «Nina gelatin», Осака, Япония) для того, чтобы получить капли коллагенового геля в качестве поддерживающего носителя. В этот раствор помещали количественно с помощью шприца Гамильтона (7105КН РТ-3, производства «HAMILTON», Рено, Невада) полученный после центрифугирования мезенхимальных клеток зубного зачатка осадок, для приготовления клеточной массы в форме агрегата клеток цилиндрической формы. Следующим шагом эпителиальные клетки зубного зачатка в количестве, равном количеству мезенхимальных клеток зубного зачатка, располагали таким же образом с формированием клеточной массы, так чтобы соответствующие стороны обеих клеточных масс находились в контакте друг с другом, а осевое направление являлось параллельным клеточной массе цилиндрической формы, приготовленной ранее из мезенхимальных клеток зубного зачатка, и получали реконструированный зубной зачаток.
2
После этого капли коллагенового геля затвердевали в течение 20 минут при 37°С, при этом связь между двумя клеточными массами становилась сильной. Готовили культуральный сосуд, так чтобы DMEM (производства «Sigma») с добавлением 10% FBS (производства «Invitrogen») находилась в контакте со вставками «Cell Culture Inserts» (ПЭТ-мембрана, имеющая размер пор 0,4 мкм; производства «BD»). Затвердевший реконструированный зубной зачаток переносили на мембрану вставок «Cell Culture Inserts» в культуральном сосуде для проведения органной культуры на вставке «Cell Culture Insert» традиционным способом при 37°С, 95% ОВ и 5% СO.
(3) Анализ размера регенерированного зубного зачатка, полученного из органной культуры
Агрегаты клеток цилиндрической формы эпителиальных и мезенхимальных клеток располагали в контакте друг с другом при длине контакта меньше чем 450 мкм, между 450 мкм и 900 мкм и между 900 мкм и 1500 мкм с образованием трех групп реконструированных зубных зачатков, и реконструированный зубной зачаток был создан с использованием органной культурой (фиг.1). Длину контакта между обеими клеточным массами измеряли с помощью фазово-контрастной микроскопии.
Для анализа ширины области коронки зуба регенерированного зубного зачатка на седьмой день органной культуры в регенерированном зубном зачатке с помощью фазово-контрастной микроскопии измеряли отмеченную стрелками-указателями на фиг.2 ширину области коронки зуба, которая в будущем станет коронкой зуба. Область измерения также показана стрелками на фотографии седьмого дня на фиг.1.
Результаты измерений представлены на фиг.3. Для длины контакта менее чем 450 мкм ширина области зубной коронки составила 366±103,1 мкм, для длины контакта между 450 мкм и 900 мкм ширина области коронки зуба составила 584,0±103,3 мкм, и для длины контакта между 900 мкм и 1500 мкм ширина области коронки зуба составила 934,9±239,8 мкм. Это указывает на то, что чем длиннее контакт агрегата эпителиальных клеток и агрегата мезенхимальных клеток в ходе образования реконструированного зубного зачатка, тем шире область зубной коронки на регенерированном зубном зачатке.
Кроме того, фиг.4 является диаграммой рассеивания измеренных значений длины контакта и ширины области коронки, и линейная аппроксимация к прямой линии осуществляется на фигуре методом наименьших квадратов. Формула прямой линии - y=0,7114x+133,95.
(4) Исследование размера регенерированного зуба с помощью анализа на субренальной капсуле
На восьминедельных мышах C57BL/6 под анестезией на спине сбривали волосы, расположенные над почками, кожу и брюшину вскрывали примерно на 1 см, и с помощью кольцевых щипцов (производства «Natsume», Токио, Япония) вынимали почки. В субренальной капсуле делали надрез на 2-3 мм с помощью лезвия (производства «Feather», Токио, Япония). В пространство между почкой и субренальной капсулой, вставляли три группы реконструированных зубных зачатков с различными длинами контакта с коллагеновым гелем, как представлено в примере (2), почки помещали обратно и мышечное покрытие и кожу сшивали.
Регенерированный зуб извлекали на 21 день после начала анализа на субренальной капсуле. Регенерированный зуб, который был извлечен, показан на фиг.6. Часть, отмеченную стрелками-указателями на фиг.6, измеряли с помощью стереоскопического микроскопа как ширину коронки зуба.
Результаты измерений представлены в таблице 1.
Таблица 1
А
В
С
D
Длина контакта в реконструированном зубном зачатке (мкм)
Фактическое измеренное значение ширины коронки регенерированного зуба (мкм)
Расхождение в размере коронки зуба; (В-А) (мкм)
Процент расхождения; |B-A|/A×100(%)
437,91
482,29
44,38
10,13
410,77
529,76
118,99
28,97
318,38
317,34
(1,04)
0,33
336,77
386,35
49,58
14,72
460,00
491,92
31,92
6,94
619,87
762,57
142,70
23,02
549.87
578,28
28,41
5,17
295,25
387,88
92,63
31,37
446,70
459,61
12,91
2,89
458,72
490,37
31,65
6,90
511,48
402,97
(108,51)
21,22
384,75
502,64
117,89
30,64
426,23
468,40
42,17
9,89
924,66
1017,47
92,81
10,04
1020,24
1240,64
220,40
21,60
996,84
979,63
(17,21)
1,73
1000,00
1083,81
83,81
8,38
1223,27
1293,17
69,90
5,71
915,86
989,76
73,90
8,07
Среднее значение процента, обозначенное как D в таблице, составило 13,03, а стандартное отклонение было равно 10,00.
Кроме того, ширина коронки зуба, полученная делением вышеупомянутых результатов измерения на три основанных на длине контакта группы меньше чем 450 мкм, между 450 мкм и 900 мкм и между 900 мкм и 1500 мкм, представлена на фиг.7. Для длины контакта менее чем 450 мкм ширина области зубной коронки составила 497±118,0 мкм, для длины контакта между 450 мкм и 900 мкм ширина области коронки зуба составила 727,0±271,4 мкм, а для длины контакта между 900 мкм и 1500 мкм ширина области коронки зуба составила 1073,9±186,0 мкм. Это указывает на то, что чем длиннее контакт агрегата эпителиальных клеток и агрегата мезенхимальных клеток в ходе образования реконструированного зубного зачатка, тем шире коронка зуба на регенерированном зубе.
Кроме того, фиг.8 является диаграммой рассеивания измеренных значений длины контакта и ширины коронки, и линейная аппроксимация к прямой линии осуществляется на фигуре методом наименьших квадратов. Прямую линию выражает формула y=0,7257x+272,15.
(5) Анализ количества бугорков на регенерированном зубе с помощью микро КТ
С помощью 3D-микрорентгеновской КТ для экспериментальных животных (производства «RIGAKU», Токио, Япония) регенерированный зуб, полученный способом, представленным в (4), фотографировали при напряжении 90,0 кВ, электрическом токе 150,0 А с 10 мкм/пиксель. Результаты представлены на фиг.9.
2
Далее изображение анализировали с помощью «i-View» (производства «RIGAKU», Токио, Япония), получали 3D изображение регенерированного зуба, и подсчитывали количество бугорков на регенерированном зубе. Если нанести на график длину контакта клеточных масс эпителиальных клеток и мезенхимальных клеток в ходе получения реконструированного зубного зачатка и количество бугорков регенерированного зуба, полученного под субренальной капсулой, и рассчитать коэффициент корреляции, то можно увидеть сильную корреляцию, существующую между длиной контакта в ходе реконструкции и количеством бугорков регенерированного зуба (R=0,658) (фиг.10). Это указывает на то, что чем длиннее контакт эпителиальных и мезенхимальных клеток в ходе реконструкции, тем больше бугорков образуется в регенерированном зубе.
(6) Исследование реконструированного зубного зачатка путем изменения количества клеток и длины контакта агрегата клеток в фиксированном диапазоне.
Длина контакта клеточных масс была установлена в диапазоне от 300 до 500 мкм. Путем приготовления клеточной массы с помощью суспензии клеток объемом примерно 0,05 мкл и шприца Гамильтона, имеющего внутренний диаметр 0,330 мм (7105КН РТ-3, производства «HAMILTON», Рено, Невада), используемого в примере (2), и приготовления клеточной массы с помощью суспензии клеток объемом примерно 0,02 мкл и шприца Гамильтона, имеющего внутренний диаметр 0,203 мм (7002КН РТ-3, производства «HAMILTON»), получали зубной зачаток, в котором количество клеток, использованных в клеточных массах, было изменено. Формы регенерированного зубного зачатка и регенерированного зуба, образованного из этого реконструированного зубного зачатка, анализировали способами, представленными в примерах (3), (4) и (5).
Ширина области зубной коронки регенерированного зубного зачатка представлена на фиг.11, ширина коронки регенерированного зуба представлена на фиг.12, а количество бугорков в регенерированном зубе представлено на фиг.13. Даже если количество клеток изменяется при поддержании длины контакта в пределах фиксированного диапазона, не наблюдали каких-либо значительных изменений в форме регенерированного зубного зачатка и регенерированного зуба.