HLA-маркеры сахарного диабета 1 типа в тувинской популяции

I

Проблемы генетики и патогенеза

HLA-маркеры сахарного диабета 1 типа в Тувинской популяции

1 *И.В. Осокина, М.Н. Болдырева, **Р.К. Ширшина, И.А. Гуськова,

I О.В. Богатова, Е.Г. Грудакова, Д.О. Кабдулова, Л.П. Алексеев

Гэсударственный научный центр - Институт иммунологии (дир. - акад. РАМН Р. М. Хаитов) М3 РФ, Москва, *Институт медицинских проблем Севера (дир. - проф. В. Т. Манчук) СО РАМН, Красноярск,

**Окружная больница, Кызыл

Сахарный диабет 1 типа (СД 1) — аутоиммунное заболевание, существенная роль в развитии которого принадлежит наследственной предрасположенности. Установление генетических факторов предрасположенности к СД 1 и патогенетически значимых маркеров заболевания имеет большое значение для выявления лиц, входящих в группу повышенного риска развития болезни, для прогноза течения СД 1, а также для выяснения генетически обусловленных механизмов патогенеза заболевания. Последнее десятилетие ознаменовано новым качественным прорывом в изучении генетики СД 1: открыто большое число генов, имеющих значительную ассоциацию с заболеванием [4], однако ведущими по-прежнему являются гены главного комплекса гистосовместимости (HLA) [5].

Важная роль HLA-молекул класса II в обеспечении предрасположенности / устойчивости к СД 1 объясняется функцией этих молекул. Специфический иммунный ответ инициируется, когда Т(С04+)-лимфоцит «узнает» процессированный фрагмент антигена (пептид), связанный с молекулой класса II. Одна из гипотез предполагает, что высокий риск развития заболеваний, ассоци-рованный с определенными аллелями HLA, объясняется тем, что они представляют аутоантигенные пептиды с высокой аффинностью связывания [6]. Сила сродства между разнообразными молекулами класса II и гипотетическими диабетогенными пептидами может определять результат этого взаимодействия: «отбой» или запуск механизмов «диабетической аутоиммунности».

Предложенный в 1987 г. К. Mullis и F. Faloonaary [3] метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием термостабильной ДНК-полимеразы и применение его в ДНК-геноти-пировании аллелей HLA [2] открыл перспективы в повышении эффективности изучения генетической предрасположенности к СД1, позволил выявлять случаи более высокого относительного риска развития патологии, а также проводить обследование здоровых сибсов для прогноза развития заболевания [1].

Целью настоящего исследования явился анализ ассоциаций генетических маркеров предрасположенности и резистентности к СД 1, локализованных в системе HLA, с помощью ДНК-генотипирования полиморфных аллелей этой системы в тувинской популяции.

Объем и методы исследования

Республика Тува расположена на юге Сибири, на границе с Монголией. Коренное тувинское население (монголоиды) составляет 210 тыс. Среди тувинцев больные СД 1 встречаются с частотой 0.01%, т.е. в 5 раз реже, чем у русских, проживающих в той же географической зоне.

Обследованы 15 тувинцев, больных СД 1. Средняя продолжительность диабета равнялась 7.8±4.3 года. Все пациенты получали инсулинотерапию. Контрольную группу составили 164 произвольно набранных доноров-тувинцев без аутоиммунных заболеваний и отягощенной наследственности по ним.

HLA-типирование больных СД1 и здоровых представителей тувинской национальности выполнялось по трем генам: DRB1 (13 специфичностей на уровне «низкого разрешения» — 01,03,04,07,08,09,10,11,12,13,14,15,16; DQA1 (8 аллелей -0101,0102,0103,0201,0301,0401,0501,0601) и DQB1 (13 аллелей -0201,0301,0302,0303,0304,0305,04,0501,0502/4,0503,0601,0602-8) методом мультипраймерной полимеразной цепной реакции [1]. Идентификацию продуктов амплификации проводили после электрофореза в 3% агарозном геле и окрашивания продуктов амплификации бромистым этидием.

Частоту аллелей и расчет 3 локусных гаплотипов выполняли при помощи компьютерной программы «Арлекин» (ExcofTer, Schneider и KufTer). Относительный риск (ОР) заболеваемости вычисляли по методу Woolf. Статистическую достоверность отличия ОР от 1 (р) определяли по точному двустороннему критерию Фишера с поправкой Бонферрони на количество исследованных аллелей.

Результаты и их обсуждение

При исследовании DRBl-специфичностей установлено (табл. 1), что наиболее частотным у лиц с СД1 был DRB1*03 (26.7% у больных СД 1 против 6.1% в контрольной группе, относительный риск, ОР=6.3, р<0.05). Другие различия частот оказались недостоверными.

При исследовании DQA1 аллелей в тувинской популяции (контрольная группа) и в группе больных диабетом наблюдались значительные отличия (табл. 2) в частоте аллелей DQAP0501 (50% против 24.4%). Для этого аллеля характерен и самый высокий показатель относительного риска (ОР=5.11, р<0,05), т.е. данный ген может рассматриваться как маркер предрасположенности к СД 1 в тувинской популяции. Реже у больных СД 1 по сравнению со здоровыми тувинцами обнаруживали аллели DQA1*0102 и DQA1*0101, эти различия недостоверны.

8

1/21

Проблемы генетики и патогенеза

Сахарный диабет

Таблица 1

Сравнение распределения специфичностей гена 0НВ1 у больных СД 1 и у здоровых тувинцев

Аллель Больные СД 1 n= 15 Контроль n = 1 64 OP

01 0,0 0,01524 нд

03 0,26667 0,06098 6,3**

04 0,13333 0,15854 нд

07 0,06667 0,08841 нд

08 0,03333 0,05488 нд

09 0,03333 0,05183 нд

10 0,0 0,02744 нд

11 0,03333 0,06707 нд

12 0,10000 0,04878 нд

13 0,20000 0,15549 нд

14 0,06667 0,12500 нд

15 0,066670 0,13720 нд

16 0,0 0,00915 нд

* г р<0.05; нд - недостоверно.

Таблица 2

Сравнение распределения специфичностей гена ООА1 у больных СД 1 и у здоровых тувинцев

Аллель Больные СД 1 п= 15 Контроль п = 164 ОР

0101 0,06667 0,13110 нд

0102 0,06667 0,14939 нд

0103 0,13333 0,12500 нд

0201 0,06667 0,09146 нд

0301 0,16667 0,21646 нд

0401 О о" 0,03659 нд

0501 0,50000 0,24390 5,11**

0601 0,0 0,00610 нд

** р<0.05; нд - недостоверно.

При исследовании распределения БОВ 1-аллелей (табл. 3) наиболее частотными аллелями у больных СД 1 оказались ЭОВ 1*0201 (33.33% у пациентов с СД 1 против 13.72% в контрольной группе) и ООВ1*0302 (10% у больных СД1 против 6.1% у здоровых). Среди вычисленных показателей относительного риска единственно значимое значение отмечено для аллеля ЭС)В1*0201 (ОР=4.22, р<0.5). Это значение ОР свидетельствует о положительной ассоциации данного аллеля с СД 1. Указанный аллель может рассматриваться как маркер предрасположенности к СД 1.

Анализ НЬА ОЯВ1-О0А1-О0В1 гаплотипов и генотипов (табл. 4) у больных СД 1 тувинцев и в контрольной группе продемонстрировал, что маркерны м гаплотипом для тувинской популяции является 03-0501-0201, ОР развития заболевания при наличии которого составляет 6,3. ОР развития СД 1 при наличии другого «классического» маркерного гаплотипа 04-0301-0302 составил 2,31 (показатель недостоверен в связи с малочисленностью группы больных). Наиболее значимым оказался показатель ОР для генотипа, включающего оба «маркерных» гаплотипа (03-0501-0201, 04-0301-0302), ОР составил 409,8. Такой генотип не был обнаружен ни у одного из 164 здоровых тувинцев.

Таблица 3

Сравнение распределения специфичностей гена ООВ1 у больных СД 1 и у здоровых тувинцев

Аллель Больные СД 1 п= 15 Контроль п = 164 ОР

0201 0,33333 0,13720 4,22*

0301 0,23333 0,25000 нд

0302 0,10000 0,06098 нд

0303 0,06667 0,07622 нд

0401 0,0 0,07012 нд

0501 0,0 0,05183 нд

0502/4 0,06667 0,04268 нд

0503 0,0 0,04268 нд

0601 0,03333 0,04268 нд

0602-8 0,16667 0,22561 нд

** р<0.5; нд - недостоверно.

Таблица 4

Гаплотипы и генотипы генов II класса HLA у больных СД 1 и у здоровых тувинцев

Гаплотипы генотипы СД 1 n= 15 Контроль n= 164 OP

DRB1 *03-DQAl *0501-DQB1 *0201 0,26667 0,06098 6,3*

DRB1 *04-DQA1 *0301-DQB1 *0302 0,10000 0,05183 2,31 нд

DRB1 *03-DQAl ‘0501-DQB1 *0201

DRB1 ‘04-DQA1 *0301-DQB1 *0302 0,10000 0,0 409,8***

р<0.5; нд - недостоверно.

Выводы

1. Генотипирование аллелей HLA-DRB1, HLA-DQA1 и HLA-DQB1 у больных СД1 и у здоровых доноров в тувинской популяции обнаружило маркеры предрасположенности к сахарному диабету 1 типа.

2. Сравнение частот выявленных аллелей в норме и

у больных сахарным диабетом 1 типа показало наличие выраженной положительной ассоциации СД1 как с отдельными аллелями DRB1*03, DQA1*0501,

DQB1*0201, так и с гаплотипом DRB1*03-DQA1*0501-DQB1*0201.

3. Наиболее выраженная ассоциация обнаружена для «классического» маркерного генотипа DRB1*03-DQA1*0501-DQB1*0201/DRB1*04-DQA1*0301-DQB1*0302, не встречающегося среди здоповых тувинцев.

. JKl

Литература ЯК

1. Никонова Т.В., Дедов И.И., Алексеев Л.П., Болдырева М.Н.,

Смирнова О.М., Дубинкин И.В. Сахарный диабет, 2000, №2, с.2-5.

2. Bugavan, T.L., R.K.Saiki, C.H.Levenson, R.M.Watson, and H.A.Erlich.. Bio/Technology. 1988, 6:943-947.

3. Mullis,K.B., and F.A.Faloona. Methods Enzymol. 1987, 155:335-350.

4. Owerbach D., Gabbay K.H. Diabetes 1996, 45:544-551.

5. Risch N. Am.J.Hum.Genet. 1987; 40:1-14.

6. Sinha A.A., Lopez M.T., McDevitt H.O. Science 1990; 248:1380-1388.