СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
METHOD OF SEPARATING HAEMATOPOIETIC STEM CELLS

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к выделению гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови, и может быть использовано при культивировании стволовых клеток с последующим их использованием в клеточной терапии.
На сегодняшний день существуют различные способы выделения гемопоэтических стволовых клеток (ГСК).
+
+.
+
Известен способ выделения ГСК мыши с использованием прямой иммуномагнитной сепарации с использованием антител к антигенам стволовых клеток -1 (SCA-1), CD 117. Этот способ заключается в выделении из первичной суспензии клеток только SCA-1 клеток (Catalog 2010 StemCell Technologies, Канада. P.236). Однако на сегодняшний день не выделен какой-либо один специфический маркер ГСК. Таким образом, происходит существенная потеря клеток и снижается выход целевого продукта.
-
Известен также способ выделения ГСК мыши с использованием непрямой иммуномагнитной сепарации, ориентированной лишь на один маркер ГСК, в данном случае отрицательный маркер Lin (Catalog 2010 StemCell Technologies, Канада. P.236).
Наиболее близким техническим решением к заявляемому является способ выделения гемопоэтических стволовых клеток методом непрямой иммуномагнитной сепарации с использованием буфера, состоящего из 0,5% BSA (интерактивной фетальной бычьей сыворотки) и 2 ммоль ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) (Goodel MA, Rosenweig М., Kim Н, et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med. 1977; 3 (12): 1337-1345 / (Biology).
Данный способ позволяет получить суспензию, обогащенную гемопоэтическими стволовыми клетками, однако выход жизнеспособных клеток, полученных таким образом, недостаточно высок - 82%. Техническим результатом изобретения является получение максимально возможного выхода целевого продукта - ГСК за счет увеличения содержания жизнеспособных клеток.
Технический результат достигается тем, что в способе выделения гемопоэтических стволовых клеток методом непрямой иммуномагнитной сепарации с использованием инактивированной фетальной бычьей сыворотки и этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) инактивированную фетальную бычью сыворотку (BSA) вводят в количестве 4%, а ЭДТА - в количестве 0,5 ммоль и дополнительно в полученный состав вводят 5%-ный водный раствор аквакомплекса глицеросольвата титана (АГТ).
Сущность изобретения состоит в использовании непрямой иммуномагнитной сепарации с измененным составом буфера, который обеспечивает угнетение запрограммированной гибели клеток (апоптоз) за счет увеличения факторов роста BSA и АГТ. В результате появляется возможность выделить отдельно ГСК и клетки крови, отличающиеся от ГСК по набору поверхностных антигенов. Изменение состава буфера для иммуномагнитной сепарации (БИМС) позволяет получить более высокое содержание целевого продукта. Содержание инактивированной фетальной бычьей сыворотки (BSA) в количестве 4%, ЭДТА - 0,5 ммоль с добавлением в полученный состав БИМС 5%-ного водного раствора аквакомплекса глицеросольвата титана (АГТ) в количестве 1% от количества полученного состава способно существенно увеличить содержание жизнеспособных ГСК, т.е. увеличить выход целевого продукта - ГСК.
Из анализа научно-технической и патентной литературы заявляемого состава буфера для иммуномагнитной сепарации в совокупности с аквакомплексом глицеросольвата титана (АГТ), позволяющего существенно увеличить содержание жизнеспособных гемопоэтических стволовых клеток, нами не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».
Изобретение осуществляется следующим образом.
2+
2+
После получения пуповинной крови лабораторных мышей доводят объем выделенной крови до 1,0 мл с помощью буфера для окрашивания. При этом состав буфера для окрашивания берут следующий: фосфатный буфер без ионов Са и Mg с добавлением 3% инактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS). Производят подсчет клеток в камере Горяева (Е.А.Кост. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. - М., Медицина, 1975, с.33-34, 137-138). К полученной таким образом суспензии клеток добавляют мышиные антитела к CD16C/CD32 в соотношении 0,25 мкг/млн клеток. Инкубируют 15 мин на льду. После чего добавляют коктейль антител (Anti-mouse CD3e, clone 145-2С11, Anti-mouse CD45R/B220, clone RA3-6B2, Anti-mouse TER-119 / Erythroid Cell, clone TER-119, Anti-mouse CD11, clone M1/70, Anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (Gr-1), clone RB 6-8C5) в концентрации 5 мкл/млн клеток. Полученный состав инкубируют 15 мин на льду. Ресуспендируют полученную суспензию клеток в 1,0 мл БИМС (фосфатный буфер с содержанием 4% BSA и 0,5 ммоль ЭДТА) +10,0 мкл (1% от 1,0 мл БИМС) 5%-ного водного раствора АГТ. Затем центрифугируют при 300 g в течение 7 минут. Полученный осадок клеток ресуспендируют в БИМС до объема 1,1 мл. Добавляют частицы для сепарации Streptavidin Particles Plus - DM 5 мкл/млн клеток. Охлаждают 30 мин при 6-12°С. После чего меченые антителами клетки переносят в 5 мл пробирку Falcon. Инкубируют 8 мин на иммуномагнитном сепараторе (ИМС). Удаляют супернатант (суспензия, полученная с помощью негативной селекции, содержащая обогащенную фракцию ГСК в новую пробирку Falcon. Добавляют БИМС и ресуспендируют 10-15 раз, затем инкубируют 8 мин на ИМС. Удаляют супернатант в прежнюю пробирку Falcon. Пробирку с суспензией клеток после негативной селекции инкубируют 8 минут на ИМС. Удаляют супернатант - это и будет конечная фракция, обогащенная ГСК методом ИМС. Используя набор антител определяют содержание гемопоэтических стволовых клеток в полученной суспензии.
Выход целевого продукта (ГСК) по изобретению и по прототипу приведены в таблице.
Таблица
Показатель
Изобретение
Прототип
1. Общее содержание ГСК (от исходного содержания всех клеток пуповинной крови), в %
2
2
2. Содержание жизнеспособных ГСК (от общего содержания ГСК), в %
99
82
Как видно из таблицы, при одинаковом общем выходе ГСК содержание жизнеспособных клеток в них, полученных заявляемым способом, на 17% выше, чем полученных по прототипу.