Особенности обмена аденозина и лактата в клетках крови при аденокарциноме желудка

148

Евразийский Союз Ученых (ЕСУ) # 8 (17), 2015 | БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

Physiological cross-sectional area of human leg muscles based on magnetic resonance imaging. // J. Orthop. Res., 1992, v. 10, p. 926-934.

18. Fukunaga T., Ichinose Y., Ito M., Kawakami Y., Fukashiro S. Determination of fascicle length and pennation in a contracting human muscle in vivo. // J. Appl. Physiol., 1997, v. 82, p. 354-358.

19. Gans C., Bock W.J. The functional significance of muscle architecture — a theoretical analysis. // Ergeb. Anat. Entwicklungsgesch, 1965, v. 38, p. 115-142.

20. Gazenko O.G., Grigoriev A.I., Kozlovskaya I.B. Mechanisms of acute and chronic effects of microgravity. // Physiologist, 1987, v. 30, p. S1-S5.

21. Gorassini M., Yang J.F., Siu M., Bennett D.J. Intrinsic

activation of human motoneurons: possible

contribution to motor unit excitation. // J. Neurophysiol., 2002, v. 87, p. 1850-1858.

22. Heckman C.J., Gorassini M.A., Bennett D.J. Persistent inward currents in motoneuron dendrites: implications for motor output. // Muscle Nerve, 2005, v. 31, p. 135156.

23. Kawakami Y., Abe T., Fukunaga T. Muscle-fiber pennation angles are greater in hypertrophied than in normal muscles. // J. Appl. Physiol., 1993, v. 74, p. 2740-2744.

24. Kawakami Y., Akima H., Kubo K., Muraoka Y., Hasegawa H., Kouzaki M., Imai M., Suzuki Y., Gunji A., Kanehisa H., Fukunaga T. Changes in muscle size, architecture and neural activation after 20 days of bed rest with and without countermeasures. // Eur. J. Appl. Physiol., 2001, v. 84, p. 7-12.

25. Khaslavskaia S, Sinkjaer T Motor cortex excitability following repetitive electrical stimulation of the common peroneal nerve depends on the voluntary drive. // Exp. Brain Res., 2005, v. 162, p. 497-502.

26. Koryak Yu. Effects of surface electrostimulation on human skeletal muscle. // Proc. 5th Vienna Inter. Workshop. Functional Electrostimulation. 1995, p. 297-300.

27. Koryak Yu. The effect of 120-days of bed rest with and without countermeasures on the mechanical properties of the triceps surae muscle in young female. Eur J Appl Physiol 1998a, v. 78: 128-135

28. Koryak Yu. Electromyographic study of the contractile and electrical properties of the human triceps surae muscle in a simulated microgravity environment. // J. Physiol., 1998b, v. 510, p. 287-295.

29. Koryak Yu. Electrically evoked and voluntary properties of the human triceps surae muscle: effects of long-term spaceflights. // Acta Physiol. Pharmacol. Bulg., 2001, v. 26, p. 21-27.

30. Koryak Yu. “Dry” immersion induces neural and contractile adaptations in the human triceps surae muscle. // Environ. Med., 2002, v. 46, p. 17-27.

31. Koryak Yu. Contractile properties and fatiguability of the human triceps surae muscle after exposure to simulated weightlessness. // From Basic Motor Control to Functional Recovery III. Varna. Univ. Press. (ed Gantchev N), 2003, pp. 369-380.

32. Kozlovskaya I., Dmitrieva I., Grigorieva L., Kirenskaya A., Kreydich Yu. Gravitational

mechanisms in the motor sistem. Stydies in real and simulated weightlessness. // Stance and Motion. (eds Gurfinkel V.S., Ioffe M.Ye., Massion J.), Plenum, NY., 1988, pp. 37-48.

33. Kubo K., Akima H., Kouzaki M., Ito M., Kawakami Y., Kanehisa H., Fukunaga T. Changes in the elastic properties of tendon structures following 20 days bed rest in humans. // Eur. J. Appl. Physiol., 2000, v. 83, p. 463-468.

34. LeBlanc A., Schneider V.S., Krebs J., Schonfeld E., Evans H. Calf muscle area and strength changes after five weeks of horizontal bed rest. // Am. J. Sport Med., 1988, v. 16, p. 624-629.

35. Narici M.V., Capodaglio P., Minetti A.E., Ferrari-Bardile A., Maini M., Cerretelli P. Changes in human skeletal muscle architecture induced by disuse atrophy. // J. Physiol., 1998, v. 59, p. 506P.

36. Quandt F., Hummel F.C. The influence of functional electrical stimulation on hand motor recovery in stroke patients: a review. // Exp. Transl. Stroke Med., 2014, v. 6: p. 1-7.

37. Woo S.L., Gomez M.A., Woo Y.K., Akeson W.H. Mechanical properties of tendons and ligaments. II. The relationships of immobilization and exercise on tissue remodeling. // Biorheology, 1982, v.19, p. 397408.

ОСОБЕННОСТИ ОБМЕНА АДЕНОЗИНА И ЛАКТАТА В КЛЕТКАХ КРОВИ ПРИ АДЕНОКАРЦИНОМЕ ЖЕЛУДКА

Миронова Ксения Александровна

Донецкий национальный медицинский университет им. М. Горького

АННОТАЦИЯ

Цель исследования - исследовать активность АДА и ЛДГ клеток крови здоровых людей и больных АКЖ. Сопоставить с молярной концентрацией аденозина в эритроцитах и состоянием их мембраны.

Материалы и методы: с применением биохимических и клинико-лабораторных методов исследования проведено изучение активности АДА, ЛДГ, уровня аденозина, ВНиСММ, ОРЭ и ССЭ в клетках крови и плазме при АКЖ.

Результаты: установлено снижение активности АДА в эритроцитах и лимфоцитах при АКЖ (в 3 и 6 раза соответственно, р < 0,001), а также повышение активности в тромбоцитах (в 3 раза, р < 0,01). В эритроцитах больных АКЖ установлено достоверное увеличение концентрации аденозина по сравнению с контролем (1,4 раза, р< 0,001). Уровень аденозина в плазме крови больных АКЖ также был достоверно выше (р<0,001). Получена линейная корреляционная связь между содержанием аденозина в эритроцитах и плазме здоровых людей (показатель корреляции Пирсона R=0,708, р=0,050), при АКЖ такая связь отсутствует.

Активность ЛДГ при АКЖ достоверно снижалась в эритроцитах (1,7 раза, p < 0,05) и лимфоцитах (2,3 раза, p<0,05), и повышалась в тромбоцитах (в 1,9раза, p < 0,05).

Евразийский Союз Ученых (ЕСУ) # 8 (17), 2015 | БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

149

Дисметаболические процессы в клетках крови сопровождаются изменениями сорбционной способности глико-каликса мембраны эритроцитов, ОРЭ у больных АКЖ.

Выводы: 1. Нарушения обмена аденозина и лактата в клетках крови приводит к изменению их функционального состояния при АКЖ. 2. Дисметаболические процессы клеток крови ассоциированы с мембранной дисфункцией. ABSTRACT

The aim of study was to investigate ADA and LDH activity in blood cells of healthy individuals and patients with adenocarcinoma of stomach (ACS). To compare an obtained data with adenosine levels in erythrocytes and the state of their membrane.

Methods: the activity of ADA, LDH, adenosine levels, the level of low and medium molecular weight substances (LMMWS), osmotic resistance of erythrocytes (ORE) and sorption capacity were determined in blood cells and plasma using biochemical and clinical laboratory methods.

Results: in patients with ACS ADA activity in erythrocytes and lymphocytes were found to be lowered significantly (3 and 6 times, respectively, p <0.001), whereas in platelets it was raised (3-times; p <0.001). Adenosine levels in erythrocytes of patients with ACS were significantly higher compared to control (1.4 times, p <0.001). The level of adenosine in blood plasma ofpatients ACS was also increased significantly (p <0.001). A positive correlation existed between the content of adenosine in erythrocytes and plasma of healthy individuals (Pearson correlation index R = 0,708, p = 0.050), while patients with ACS had no such correlation.

LDH activity in patients with ACS were significantly decreased in erythrocytes (1.7 times, p <0,05) and lymphocytes (2.3 times, p <0,05), while increased in platelets (1.9 times, p <0, 05). Dysmetabolicprocesses in blood cells accompanied with

changes in the distribution of LMMWS in erythrocytes and plasma, ORE in patients with the ACS. Sorption capacity remained unchanged in ACS.

Conclusions: 1. Adenosine and lactate exchange disorders in blood cells leads to their functional state change in patients with ACS. 2. Dysmetabolic processes associated with blood cell membrane dysfunction.

Ключевые слова: аденозин, лактат, аденокарцинома желудка, клетки крови, состояние мембраны.

Key words: adenosine, lactate, adenocarcinoma of the stomach, blood cells, membrane state.

Клетки крови имеют важное значение в обеспечении адекватной оксигенации тканей, формировании противоопухолевого иммунного ответа и поддержании системы гемостаза. Нарушение функционального состояния эритроцитов, тромбоцитов и лимфоцитов приводит к развитию микроциркуляторных, иммунных нарушений и гипоксии, которые являются важными факторами патогенеза онкологической патологии. Функциональная активность клеток крови тесно связана с метаболизмом углеводов и нуклеотидов в этих клетках [2,4]. Известно, что метаболизм сигнальных молекул - аденозина и лактата взаимосвязан с оксигенацией клеток [1,4,6]. В связи с этим актуальным является изучение особенностей обмена этих метаболитов в эритроцитах, тромбоцитах и лимфоцитах при аденокарциноме желудка.

Был выбран ключевой фермент гликолиза - лактатдегидрогеназа (ЛДГ), поскольку он регулирует именно те звенья метаболических процессов, которые дают клеткам энергию, влияют на состояние клеточной мембраны, хорошо отражают степень гипоксических процессов, т.е. необходимы для нормального функционирования клеток крови. Аденозин - это широко распространенный пуриновый нуклеозид, он играет фундаментальную роль во многих биологических процессах, таких как энергообразование, метаболизм белков, также обладает гормональными и нейротрансмиттерными свойствами и т.д. [6,7]. Также известно, что аденозин — это медиатор, вовлеченный в патогенез многих воспалительных процессов [7]. Регулирует функции иммунокомпетентных клеток [2,7]. Уровни аденозина контролируются ферментами его биосинтеза и распада. Аденозиндезаминаза - ключевой фермент катаболизма пуринового нуклеозида.

Известно, что у онкологических больных часто наблюдаются изменения реологических свойств крови, из-за повышения вязкости, изменения фосфолипидного состава плазматических мембран и появление патологических форм эритроцитов. Поэтому параллельно интересно было изучить некоторые функциональные показатели состояния мембраны эритроцитов, поскольку ей присущи общие принципы молекулярной организации плазматических мембран, а именно осмотическую резистентность

эритроцитов (ОРЭ), сорбционную способность эритроцитов (ССЭ) и веществ низкой и средней молекулярной массы (ВНиСММ) в гемолизатах эритроцитов больных с аденокарциномой желудка (АКЖ). Одной из функций эритроцитов является сорбирование и транспорт определенного количества ВНиСММ. Среди них и токсических, концентрация которых повышается при канцерогенезе. Увеличение уровня ВНиСММ в плазме крови может превышать возможности гликокаликса и служить показателем мембранной дисфункции.

Цель - исследовать активность аденозиндезами-назы (АДА, КФ 3.5.4.4) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ, КФ 1.1.1.27) клеток крови здоровых людей и онкологических болных. Сопоставить с молярной концентрацией аденозина в эритроцитах и состоянием их мембраны.

Материал и методы. Исследование проведено с использованием крови 26 пациентов с аденокарциномой желудка Т3-4Ш-хМ0-1 в возрасте 50-65 лет. В контрольную группу вошли 30 условно здоровых лиц того же возраста. Клетки крови получали по общеизвестному методу. Активность ЛДГ оценивалась по скорости окисления НАДН, который регистрировался спектрофотометрически на СФ-46 (Ломо, Россия) по снижению оптической плотности при длине волны 340 нм. Определение АДА основано на регистрации изменений оптической плотности реакционной смеси при длине волны 260 нм, обусловленных дезаминированием аденозина в инозин, которое регистрируется спектрофотометрически (водородная лампа) [1]. Молярная концентрация аденозина определялась путем регистрации оптической плотности на СФ-46 в супернатанте плазмы или эритроцитов после осаждения белков трихлоруксусной кислотой. Концентрация рассчитывалась с использованием калибровочного графика. Количество ВНиСММ определяли путем регистрации их в супернатанте в ультрафиолетовом диапазоне (254-310 нм). ОРЭ определяли по известному методу Лимбека (1957). ССЭ -путем регистрации оптической плотности до и после инкубации эритроцитов с 0,025% метиленовым синим.

Статистическую обработку полученных результатов исследования проводили с использованием лицензи-

150

Евразийский Союз Ученых (ЕСУ) # 8 (17), 2015 | БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

онной программы «MedStat». Для проверки распределения на нормальность использовался критерий W Шапиро -Уилка, что позволяло корректно проводить проверку при небольших объемах выборки. Сравнение выборочных средних значений проводили с использованием критерия Стьюдента для независимых выборок. Для выявления статистического линейной связи между признаками использовались методы корреляционного анализа, рассчитывался показатель ранговой корреляции Пирсона.

Результаты и обсуждение.

При анализе активности АДА в клетках крови у больных с АКЖ, было установлено достоверное снижение активности фермента в эритроцитах

(табл.1.). Изменение активности АДА в эритроцитах и лимфоцитах свидетельствует об угнетении дезаминирования аденозина в клетках и его накоплении. Это согласуется с изменениями молярной концентрации аденозина. При определении сравнительного содержания аденозина в эритроцитах и плазме крови больных АКЖ установлено достоверное увеличение концентрации аденозина по сравнению с контролем (р<0,001) (Диаграмма 1). Наиболее выраженное повышение уровня аденозина отмечено в эритроцитах, по сравнению с плазмой крови больных АКЖ. Интересно отметить, что получена линейная корреляционная связь между содержанием аденозина в эритроцитах и плазме здоровых людей (R=0,708, р=0,050), у пациентов с АКЖ такая связь отсутствует.

Диаграмма 1

Молярная концентрация аденозина, ммоль/мл

Установленное накопление аденозина в лимфоцитах снижает функциональную готовность Т- и В-лимфо-цитов, что подтверждается иммунологическими исследованиями и согласуется с литературными данными [1,2,7].

В тромбоцитах интенсивное дезаминирование аденозина увеличивает способность тромбоцитов к агрегации [2], а образующиеся при этом агрегаты способствуют ухудшению микроциркуляции и усиливают ишемию слизистой (рис.1).

Рис.1 Эффекты изменения уровня аденозина в клетках крови у пациентов с АКЖ

При исследовании ЛДГ, нами установлено достоверное снижение активности в эритроцитах (1,7 раза, p < 0,05) и лимфоцитах (2,3 раза, p<0,05), и повышение активности фермента в тромбоцитах (в 1,9 раза, p < 0,05) при АКЖ, по сравнению с контролем (табл.1). Одновременное

угнетение активности фермента гликолиза при повышенном уровне аденозина свидетельствует о напряженном энергообмене в этих клетках. Снижение ЛДГ в эритроцитах уменьшает синтез 2,3-ДФГ - регулятора сродства Hb

Евразийский Союз Ученых (ЕСУ) # 8 (17), 2015 | БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

151

к кислороду, что ухудшает оксигенацию ткани. Недостаточность восстановленного кофермента НАДН влияет на эффективность работы метгемоглобинредуктазной системы. Снижение ЛДГ в лимфоцитах у больных АКЖ свидетельствует об угнетении анаэробного гликолиза и энергодефиците.

Активация анаэробного гликолиза в тромбоцитах на фоне роста активности АДА определяет активное функциональное состояние тромбоцитов, так как известно, что первая фаза активации тромбоцитов происходит за счет энергии анаэробного гликолиза.

Таблица 1

Активность ферментов в клетках крови онкологических больных, нмоль/мин* мг белка

Диагноз АДА ЛДГ

Эритроциты

Контроль (n=30) 20,0±2,85 2,15±0,24 90±8,5 25,1±2 0,24±0,02 8,3±1,5

АКЖ (n=26) 5,9±1,5** 6,38±0,61** 11,8±4,45** 15,1±2* 0,46±0,04* 3,05±0,71*

Примечание: * -р<0,05, ** -р<0,001 относительно контрольной группы

Длина волны, нм

Рис. 2 Спектры ВНиСММ в плазме и эритроцитах в ультрафиолетовом диапазоне (254-310 нм). Здоровый человек.

Удельное содержание ВНиСММ в эритроцитах у пациентов с АКЖ составило 26,7±1,1 у.е. (контроль -11,2±1,9 у.е., р<0,05). В плазме крови - 16,3±2,2 у.е. ( контроль - 9,3 ± 2 у.е., р<0,05). У пациентов с АКЖ уровень ВНиСММ повышен в 2 раза по сравнению с контролем. Также у больных отмечено повышение катаболического пула низкомолекулярных веществ, которые поглощают свет при более низкой длине волны и считаются наиболее токсичными (рис. 2,3). Полученные данные свидетельствует о перегруженности гликокаликса мембраны эритроцитов.

В связи с нарушениями энергообмена в эритроцитах было оценено состояние осмотической стойкости эритроцитов у пациентов с АКЖ. Минимальный - 0,40 ± 0,03 % NaCl (0,48 ± 0,03, р<0,05) и максимальный - 0,20 ± 0,02 % NaCl (0,25 ± 0,02, р<0,05) показатели ОРЭ у пациентов с АКЖ были достоверно ниже, чем в контрольной группе. Полученные результаты отражают напряжение эритропоэза, появление молодых форм эритроцитов, что вероятно приводит к истощению эритрона у больных с АКЖ.

Достоверных изменений ССЭ не было выявлено. Таким образом, целостность клеточных мемран в этой группе больных не нарушена, что согласуется с изменениями ОРЭ.

Дисметаболические процессы клеток крови ассоциированы с мембранной дисфункцией. АКЖ влияет также на механические свойства мембран эритроцитов и взаимосвязаны с нарушениями обмена аденозина и лактата, при-

Длина волны, нм

Рис. 3 Спектры ВНиСММ в плазме и эритроцитах в ультрафиолетовом диапазоне (254-310 нм). Рак тела желудка 4 ст., T3N3M0.

водит к изменению функционального состояния этих клеток, что согласуется с литературными даннями о раннем развитии анемии, повышенной склонностью к тромбозам и иммунной депрессией у больных РЖ.

Список литературы

1. Борзенко Б.Г. Роль ферментативной особенности гипоксии при язвенной болезни / Б. Г. Борзенко, Е. М. Бакурова, Т. Н. Кухнина // Врачебное дело. -2003. - № 1. - С. 67.

2. Борзенко Б.Г. Патогенетические особенности метаболизма клеток крови при различном течении язвенной болезни у //Б.Г. Борзенко, Е.М. Бакурова, К.А. Миронова, Я.Г. Жебеленко, Е.В. Богатырева / Таврический медико-биологический вестник. -2012. том 15. № 3, ч. 2 (59). - С. 47-50.

3. Кленова Н.А. Строение, метаболизм и функциональная активность эритроцитов человека в норме и патологии / Н.А. Кленова, Р. О. Кленов; Федер. агентство по образованию, Самар. гос. ун-т. - Самара: Самар. университет, 2009. - 114 с.: ил. с. 92112.

4. Baranowska-Bosiacka, at al. Disorders of purine metabolism in human erythrocytes in the state of lead contamination. Polish Journal of Environmental Studies Vol. 13, No. 5 (2004), 467-476.

5. Gorlach A. Control of adenosine transport by hypoxia / A. Gorlach //Circulation Research. - 2005. - Vol. 97. -P. -3.

152

Евразийский Союз Ученых (ЕСУ) # 8 (17), 2015 | БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

6. Philp A. Lactate -a signal coordinating cell and systemic function / A. Philp,A. L. Macdonald, P. W. Watt // J. Exp. Biol. - 2005. - Vol. 208, Pt. 24. - P.4561-4575.

7. Sharma, J., Menon, B.K., Vijayan, V.K. and Bansal,

S.K. (2015) Changes in Adenosine Metabolism in

Asthma. A Study on Adenosine, 5-NT, Adenosine Deaminase and Its Isoenzyme Levels in Serum, Lymphocytes and Erythrocytes. Open Journal of Respiratory Diseases, 5, 33-49.

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ЧЕТЫРЕХ ПОПУЛЯЦИЙ PINUS SYLVISTRIS L.

НА ВОСТОКЕ РУССКОЙ РАВНИНЫ

Пришнивская Яна Викторовна

Аспирант, Пермский государственный национальный исследовательский университет (ПГНИУ), Инженер-исследователь, Естественный научный институт ПГНИУ, г. Пермь

Нечаева Юлия Сергеевна

Аспирант, ассистент каф. ботаники и генетики растений, Пермский государственный национальный исследовательский университет (ПГНИУ), г. Пермь Красильников Виталий Павлович, Мартыненко Никита Александрович

Магистрант, Пермский государственный национальный исследовательский университет (ПГНИУ), г. Пермь

АННОТАЦИЯ

В четырех изученных популяциях Pinus sylvestrys L. выявлено 107ISSR-PCR маркеров, из которых 94 были полиморфными (P95 = 0,879). Ожидаемая гетерозиготность (HE) на общую выборку составила 0,156. Показатели генетического разнообразия выше в популяции, расположенной в Коротнинском лесничестве республики Марий Эл (P95 = 0,679; HE = 0,217; ne = 1,370), а самые низкие их значения отмечены в популяции в Уренском лесничестве Нижегородской области (P95 = 0,506; HE = 0,101; ne = 1,157). Анализ генетической структуры четырех популяций P. sylvestrys показал, что на межпопуляционную компоненту приходиться 53,7% генетического разнообразия.

ABSTRACT

In the four populations studied Pinus sylvestrys L. identified 107ISSR- PCR markers, of which 94 were polymorphic (P95=0,879). The expected heterozygosity (HE) for the total sample was 0,156. High levels of genetic diversity established in the population located in Korotninskom forestry, the Republic of Mari El (P95 = 0,679; HE = 0,217; ne = 1,370), and the lowest observed in the population at Uren forestry, Nizhny Novgorod region (P95 = 0,506; HE = 0,101; ne = 1,157). Analysis of the genetic structure of 4 populations of P. sylvestrys has shown that interoperation component account for 53.7% of the genetic diversity.

Ключевые слова: генетический полиморфизм, ISSR-PCR маркеры, генетическая структура, Pinus sylvestrys L.

Keywords: genetic polymorphism, ISSR-PCR markers, genetic structure, Pinus sylvestrys L.

Сохранение генетического разнообразия древесных растений возможно только при условии изучения популяционно-хорологической структуры вида и идентификации каждой элементарной популяции [1]. Основным критерием выделения популяций является специфика их генофондов [2], изучить которую можно с помощью методов молекулярно-генетического анализа.

Объектами исследований являлись четыре популяции Pinus sylvestris L. (Pinaceae), расположенные на востоке Русской Равнины: Ps_1 - в Ежихинском лесничестве Кировской области; Ps_2 - в Уренском лесничестве Нижегородской области; Ps_3 - в Коротнинском лесничестве Республики Марий Эл; Ps_4 - в Кокшайском лесничестве Республики Марий Эл.

Выделение ДНК проводили по методике С. Роджерса (S. Rogers) [3], модифицированный использованием в качестве сорбента PVPP (polyvinylpolypyrrolidone). Для проведения молекулярно-генетического анализа была выделена ДНК из свежих почек индивидуально у 46 деревьев каждой популяции. Навеска составляла 100 мг. Анализ полиморфизма ДНК проведен у 184 проб ДНК с пятью праймерами посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для изучения генетической изменчивости популяций P. sylvestris амплифицировано 920 проб ДНК. Концентрацию и качество ДНК определяли на спектрофотометре «NanoDrop 2000» (Thermo Fisher Scientific, США) и выравнивали до 10 нг/мкл.

Для молекулярно-генетического анализа был избран ISSR-метод (Inter Simple Sequence Repeats, [4]). Он

основан на использовании полимеразной цепной реакции с одним или несколькими праймерами длиной 15-24 нуклеотида [4; 5] с достаточно высокой точностью отжига. ISSR-праймеры состоят из тандемных коротких 2-4 нуклеотидных повторов и одного селективного нуклеотида на 3'-конце праймера [5; 6].

Для полимеразной цепной реакции объемом 25 мкл мы использовали реакционную смесь следующего состава: 2 единицы Tag-полимеразы, 2,5 мкл стандартного 10х буфера для ПЦР, 25 пМ праймера, 2,5 мМ Mg2+, 0,25 мМ dNTP, 5мкл тотальной ДНК. Амплификацию проводили в амплификаторе GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, США) по следующей программе: предварительная денатурация 94°C, 2 мин.; первые пять циклов 94°С, 20 сек.; t° отжига, 10 сек.; 72°С, 10 сек.; в последующих тридцати пяти циклах 94°С, 5 сек.; to отж., 5 сек.; 72°С, 5 сек. Последний цикл элонгации длился 2 мин при 72°С. Температура отжига в зависимости от G/С-состава праймеров варьировала от 52 до 64°С. Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 1,7% агарозном геле в 1х ТВЕ буфере. Гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете в системе Gel-Doc XR («Bio-Rad», США).

В изученных популяциях P. sylvestris выявлено 109 ISSR-PCR маркеров, из которых 94 были полиморфными. Доля полиморфных локусов (P95) в выборке в зависимости от ISSR-праймера колебалась от 0,826 до 0,950 и в