СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ - ИММУНОГЛОБУЛИНОВ КЛАССА G В СЫВОРОТКЕ КРОВИ К ВОЗБУДИТЕЛЯМ ТЯЖЕЛЫХ ОСТРЫХ РЕСПИРАТОРНЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ, ВКЛЮЧАЯ SARS-COV-2, С ОДНОВРЕМЕННЫМ ПРОГНОЗОМ ТЯЖЕСТИ ПРОТЕКАНИЯ КОРОНАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ COVID-19, НА ГИДРОГЕЛЕВОМ БИОЧИПЕ
METHOD FOR DETECTING ANTIBODIES - CLASS G IMMUNOGLOBULINS IN BLOOD SERUM TO PATHOGENS OF SEVERE ACUTE RESPIRATORY VIRAL INFECTIONS, INCLUDING SARS-COV-2, WITH SIMULTANEOUS PROGNOSIS OF COVID-19 SEVERITY, BASED ON HYDROGEL BIOCHIP

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области молекулярной биологии, иммунологии и медицины, в частности к средствам диагностики острых респираторных вирусных инфекций. Способ предназначен для мультиплексного обнаружения антител класса G против антигенов коронавируса SARS-CoV-2, других вирусов семейства бета-коронавирусов, вирусов гриппа А и В, вирусов парагриппа II и III типов, с одновременным выявлением прогностических аутоантител класса G против интерферонов I типа, ассоциированных с тяжелым течением коронавирусной инфекции COVID-19.
Уровень техники
В настоящее время методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот, являются стандартом для диагностики инфекции, вызванной коронавирусом SARS-CoV-2 в острой фазе заболевания, при которой вирусные частицы присутствуют в клиническом материале больных. Несмотря на быстроту, высокую чувствительность и точность, метод имеет ряд недостатков. Помимо того, что метод является дорогостоящим и трудоемким, ложноотрицательные результаты могут возникать в силу неправильного забора биологического материала и подготовки образцов нуклеиновых кислот, а также из-за относительно узкого "окна" выработки вирионов, поскольку вирусная РНК становится практически не детектируема через 14 дней после начала заболевания. Кроме того, биологическая изменчивость вируса может также повлиять на результат анализа.
Альтернативным подходом к диагностике коронавирусной инфекции являются серологические методы, основанные на выявлении у пациентов антител к белкам (ангигенам) вируса, наиболее распространенным из которых является метод иммуноферментного анализа (ИФА, ELISA). Такой подход позволяет сократить число неподтвержденных случаев заболевания и выявить пациентов, перенесших заболевание в легкой форме или бессимптомно. Геном вируса SARS-CoV-2 кодирует несколько структурных белков, включая шип (S - spike), белок оболочки (Е - envelope), мембраный белок (М - membrane) и нуклеокапсид (N - nucleocapsid). Белок S состоит из двух отдельных субъединиц, S1 и S2. Субъединица S1 содержит рецептор-связывающий домен (RBD), который связывает рецептор ангиотензин-превращающего фермента 2 (АСЕ2) на поверхности клеток-хозяина. При проведении иммуноанализа в сыворотке крови пациентов выявляют специфические антитела, вырабатываемые иммунной системой к белкам вируса в ответ на проникновение SARS-CoV-2. По данным исследований, специфические иммуноглобулины класса М (IgM) антитела к SARS-CoV-2 появляются в крови пациентов через 3 дня после начала заболевания, достигают своего пика к 2-3 неделям и все еще детектируются после первого месяца заболевания. Как IgA, так и IgG антитела к SARS-CoV-2 появляются на 10 день от начала заболевания, поднимаются до высшего уровня в сыворотке на 14 день заболевания. На настоящий момент мало что известно об антительном ответе против SARS-CoV-2. Данные, полученные различными группами о сероконверсии IgM и IgG в случае с SARS-CoV-2, противоречивы. Возможным объяснением может быть неодинаковая чувствительность тестов (в том числе, невалидированных) к различным классам антител. Неизвестно также, как долго сохраняется приобретенный иммунитет к SARS-CoV-2, и насколько эффективно он защищает от повторного инфицирования. [Lee, С.Y.P., Lin, R.Т.P., Renia, L., & Ng, L.F.P. (2020). Serological Approaches for COVID-19: Epidemiologic Perspective on Surveillance and Control. Frontiers in Immunology, 11, 1-7. https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.008791.
Известны способы определения антител разных классов к белкам SARS-CoV-2 (например: CN 111239392 A «Novel coronavirus pneumonia (COVID-19) serological diagnosis kit»; CN 111856027 A «New coronavirus antibody detection kit suitable for examination of patients without obvious symptoms», CN 111505310 A «Application of specific IgA and IgM in early evaluation of COVID-19 disease risk»; RU 2730897 C1 «Method of using recombinant proteins sars-cov-2 as part of a test system for elisa test with determining igm, igg, iga class antibody levels in blood serum/plasma of covid-19 patients»). В области мультиплексного анализа описаны способы одновременного определения как антител IgM и IgG против SARS-CoV-2, так и антигена нового коронавируса (например: CN 111024954 A «Colloidal gold immunochromatography device for combined detection of COVID-19 antigen and antibody and use method thereof», CN 111426847 «A Microfluidic chip, detection kit, microfiuidic detection system and application thereof»). Разработан способ комбинированного измерения в лунках иммунологического планшета уровня IgG антител против 5 антигенов SARS-CoV-2 вируса, а именно против доменов RBD и NTD (N-терминального домена) S-субъединицы, а также против белков N, S1 и S2 [Gillot, Constant et al. 2020. "An Original ELISA-Based Multiplex Method for the Simultaneous Detection of 5 SARS-CoV-2 IgG Antibodies Directed against Different Antigens." Journal of Clinical Medicine 9(11):3752]. Hartog и соавторы разработали мультиплексный количественный анализ на основе микросфер для измерения концентраций антител к SI, RBD и N белкам SARS-CoV-2 [Den Hartog at al 2020. "SARS-CoV-2-Specific Antibody Detection for Seroepidemiology: A Multiplex Analysis Approach Accounting for Accurate Seroprevalence." Journal of Infectious Diseases 222(9):1452-61]. Известен биосенсор на основе плазмонного резонанса для определения антител классов G, М и А к S1, S2 и N белкам SARS-CoV-2 вируса [Cady, Nathaniel С. at al 2021. "Multiplexed Detection and Quantification of Human Antibody Response to COVID-19 Infection Using a Plasmon Enhanced Biosensor Platform." Biosensors and Bioelectronics 171(9):112679]. Также предложен мультиплексный способ выявления IgG к шести циркулирующим в настоящее время коронавирусам, а именно HCoV-OC43, HCoV-HKU1, HCoV-229E, HCoV-NL63, MERS-CoV S1; SARS-CoV-2 S1 и N [van Tol, Sophieet all. 2020. "Accurate Serology for SARS-CoV-2 and Common Human Coronaviruses Using a Multiplex Approach." Emerging Microbes and Infections 9(1):1965-73.] Однако ни один из данных способов не позволяет одновременно выявить IgG против белков не только вируса SARS-CoV-2, но и антигенов других коронавирусов, вирусов гриппа, а также антигенов вирусов, вызывающих ОРВИ.
Важной задачей ИФА-диагностики является не только выявление иммуноглобулинов различных классов, но и скрининг в сыворотке крови маркеров, ассоциированных с прогнозом протекания коронавирусной инфекции. Высокий процент скрытого носительства аутоантител к интерферонам I типа был недавно выявлен в когорте пациентов с тяжелым течением коронавирусной инфекции COVID-19 [Bastard, Paul et all. 2020. "Autoantibodies against Type I IFNs in Patients with Life-Threatening COVID-19." (2020) Science (New York, N.Y.) 370(6515). DOI: 10.1126/science.abd4585]. Авторы обнаружили аутоантитела по крайней мере к одному из интерферонов (интерферону-ω, интерферону-α-2) у 13,7% пациентов с тяжелой (жизне-угрожающей) пневмонией, вызванной COVID-инфекцией (n=987), при этом у 10,2% эти антитела были нейтрализующими. Присутствие аутоантител коррелировало с низкой концентрацией IFN-α в сыворотке. Данные аутоантитела не были идентифицированы у пациентов с асиптоматическим или легким течением коронавирусной инфекции COVID-19 (n=987) и были обнаружены только у 0,33% (4/1227) здоровых пациентов, не инфицированных SARS-CoV-2. Аутоантитела против INF-ω и IFN-α-2 предшествовали инфицированию SARS-CoV-2 и были причиной тяжелого течения заболевания у данных пациентов. В связи с этим, предложенный в настоящем изобретении способ может быть использован для оценки уровня аутоантител к интерферонам первого типа среди инфицированных SARS-CoV-2 пациентов.
Настоящее изобретение направлено на преодоление недостатков известных из уровня техники способов дифференциальной серодиагностики респираторных вирусных инфекций, в том числе COVID-19, и позволяет в одном анализе выявлять антитела - иммуноглобулины класса G к антигенам различных вирусов - возбудителей тяжелых острых респираторных инфекций, включая SARS-CoV-2, а также прогностические аутоантитела класса G против интерферонов I типа, ассоциированные с тяжелым течением коронавирусной инфекции COVID-19.
Раскрытие сущности изобретения
В настоящем изобретении предложен способ мультиплексного обнаружения антител - иммуноглобулинов класса G к различным вирусам - возбудителям тяжелых острых респираторных инфекций, включая коронавирус SARS-CoV-2 и вирусы гриппа, с одновременным обнаружением аутоантител к интерферонам I типа, ассоциированных с тяжелым течением коронавирусной инфекции COVID-19, на биочипе, представляющим собой матрицу трехмерных гидрогелевых элементов на подложке. Предложенный способ позволяет одновременно дифференцировать коронавирусную инфекцию от гриппа и других ОРВИ, а также выявлять среди инфицированных COVID-19 пациентов носителей аутоантител к интерферонам I типа - прогностических маркеров тяжелого течения коронавирусной инфекции. Аутоантитела класса G к интерферонам I типа также высокочувствительны (к интерферону-ω (IFN- ω) - 99,4%, к интерферону-α-2 (IFN-α-2) - 95,4%) и высокоспецифичны (к интерферону-ω - 100%; к интерферону-α-2 - 99,9%) для пациентов с редким моногенным заболеванием - аутоиммунный полигландулярньш синдром первого типа [Meloni A, Furcas М, Cetani F, et al. Autoantibodies against Type I Interferons as an Additional Diagnostic Criterion for Autoimmune Polyendocrine Syndrome Type I. 2008;93:4389-4397. doi:10.1210/jc. 2008-0935].
Заявленный способ основан на проведении мультиплексного иммуноанализа образца сыворотки крови на гидрогелевом биочипе. Гидрогелевый биочип, согласно настоящему изобретению, представляет собой подложку, на которой нанесена матрица трехмерных гидрогелевых элементов, в каждом из которых по всему объему равномерно распределены иммобилизованые белки. Технология гидрогелевых биочипов разработана в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ИМБ РАН) и основана на одновременном формировании гидрогелевых ячеек с иммобилизацией молекулярных зондов. Поскольку структура геля предотвращает контакт соединений с гидрофобной подложкой, и обеспечивает нативное водное окружение биологических молекул, иммобилизация белков в геле стабилизирует их нативную структуру и сохраняет биологическую активность, таким образом данный метод по своим характеристикам выгодно отличается от классических методов планарной иммобилизации [Rubina AY, Dementieva EI, Stomakhin AA, Darii EL, Pan'kov SV, Barsky VE, Ivanov SM, Konovalova EV, Mirzabekov AD. Hydrogel-based protein microchips: manufacturing, properties, and applications. Biotechniques. 2003 May; 34(5):1008-14, 1016-20, 1022. https://doi.org/10.2144/03345rr01].
Согласно настоящему изобретению для одновременного выявления антител и аутоантител проводят последовательно: инкубацию содержащего иммобилизованные белки гидрогелевого биочипа с образцом, инкубацию со смесью меченных вторичных антивидовых антител против иммуноглобулинов человека классов G, регистрацию и обработку флуоресцентных сигналов. Способ включает следующие стадии:
а) обеспечение биочипа, представляющего собой матрицу элементов, в которых иммобилизованы белки, в том числе рецептор-связывающий домен белка Spike коронавируса SARS-CoV-2, белок Spike коронавируса HCoV ОС43, белок Spike коронавируса SARS-CoV, белок Spike коронавируса HCoV-HKU1, белок Spike коронавируса MERS-CoV, нуклеопротеин вируса гриппа А, нуклеопротеин вируса гриппа В, смесь вирусных белков инактивированного вируса парагриппа II типа, смесь вирусных белков инактивированного вируса парагриппа III типа, интерферон омега, интерферон альфа-2-a, при этом каждый из белков - в четырех отдельных элементах, контрольных элементов, содержащих человеческие иммуноглобулины классов G, антивидовые антитела против иммуноглобулинов человека класса G, и контрольных элементов, не содержащих иммобилизованных белков;
б) взаимодействие образца сыворотки крови человека с элементами биочипа с образованием специфичных бинарных иммунных комплексов белков, иммобилизованных в элементах биочипа, с антителами, находящимися в образце сыворотки крови;
в) детекцию образовавшихся иммунных комплексов;
г) регистрацию и интерпретацию результатов анализа.
В одном из воплощений способ характеризуется тем, что биочип представляет собой подложку с гидрогелевыми элементами, полученными способом химической или фотоиндуцируемой сополимеризации и содержащими иммобилизованные белки. Перечень белков, используемых для изготовления биочипа, приведен в Таблице 1.
В другом воплощении способ характеризуется тем, что стадию детекции иммунных комплексов в элементах биочипа проводят, добавляя флуоресцентно-меченные антивидовые антитела против иммуноглобулинов человека класса G, с образованием тройного комплекса «иммобилизованный белок - антитело  -антивидовое флуоресцентно-меченное антитело».
В следующем воплощении способ характеризуется тем, что на стадии регистрации и интерпретации результатов определяют значения флуоресцентных сигналов элементов биочипа с использованием анализатора флуоресценции и программного обеспечения.
В следующем воплощении способ характеризуется тем, что на стадии регистрации и интерпретации результатов, для каждой группы элементов, содержащих одинаковые белки, результирующее значение сигнала рассчитывают как медиану значений сигналов от четырех соответствующих элементов, а для группы контрольных элементов, не содержащих иммобилизованных белков, результирующее значение сигнала рассчитывают как медиану значений от сигналов соответствующих элементов.
В следующем воплощении способ характеризуется тем, что на стадии регистрации и интерпретации результатов, наличие антитела против соответствующего вирусного антигена в сыворотке крови определяют в случае, если отношение результирующего сигнала группы элементов с соответствующим иммобилизованным белком к результирующему сигналу группы контрольных элементов превышает установленное пороговое значение.
Наконец, в еще одном воплощении способ характеризуется тем, что на стадии регистрации и интерпретации результатов, в случае выявления антител к SARS-CoV-2, проводят анализ групп элементов, содержащих интерферон омега, интерферон альфа-2-а, и в случае, если отношение результирующего сигнала группы элементов с соответствующим иммобилизованным белком к результирующему сигналу группы контрольных элементов превышает пороговое значение, делают заключение о наличии прогностических аутоантител класса G против интерферонов I типа, ассоциированных с тяжелым течением коронавирусной инфекции COVID-19.
Далее изобретение будет раскрыто подробнее со ссылками на фигуры, которые приводятся исключительно с целью иллюстрации и пояснения сущности заявленного изобретения, но которые не предназначены для ограничения объема притязаний.
Краткое описание фигур и таблиц
Фигура 1. Схема биочипа.
Схема размещения элементов биочипа для обнаружения антител к различным респираторным вирусам, включая коронавирус SARS-CoV-2 и вирусы гриппа, с одновременным обнаружением аутоантител к интерферонам I типа. Элементы биочипа представлены в виде кругов. Элементы собраны в функциональные и две контрольные группы. Биочип также включает четыре элемента, обозначенных 'М', содержащих флуоресцентный маркер для обработки сигналов элементов биочипа после проведения анализа. Контрольная группа из восьми элементов 'Empty', не содержащих иммобилизованных белков, предназначена для вычисления значения фонового сигнала. Получение флуоресцентных сигналов от элементов контрольной группы 'human IgG' и 'anti-human IgG', включающих иммуноглобулины человека соответствующего класса и антитела к ним, является необходимым условием для контроля соблюдения условий проведения анализа, исключения грубых мануальных ошибок, а также контроля сохранности способности детектирующих антител узнавать свою мишень, а иммобилизованных белков сохранять свою биологическую активность. Функциональные группы включают элементы с иммобилизованными белками (RBD домен белка Spike коронавируса SARS-CoV-2, белок Spike коронавируса HCoV ОС43, белок Spike коронавируса SARS-CoV, белок Spike коронавируса HCoV-HKU1, белок Spike коронавируса MERS-CoV, нуклеопротеин вируса гриппа A (FluA), нуклеопротеин вируса гриппа В (FluB), смесь вирусных белков инактивированного вируса парагриппа II типа (PIV-2), смесь вирусных белков инактивированного вируса парагриппа III типа (PIV-3), интерферон омега (IFN-ω), интерферон альфа-2-a (IFN-α-2a), каждый из белков - в четырех отдельных элементах. Характеристика белков, иммобилизованных на биочипе, приведена в Таблице 1.
Фигура 2. Флуоресцентные изображения биочипов после анализа образцов сывороток:
A) пациента, переболевшего коронавирусной инфекцией COVID-19. Положительные сигналы элементов чипа соответствуют наличию иммуноглобулинов класса G против RBD белка Spike коронавируса SARS-CoV-2, белка Spike коронавируса ОС43, белка Spike коронавируса HKU1, нуклеопротеинов вирусов гриппа А и гриппа В;
Б) пациента без признаков ОРВИ. Положительные сигналы элементов чипа соответствуют наличию иммуноглобулинов класса G против нуклеопротеина вирусов гриппа А и В, вирусных белков инактивированного вируса парагриппа II типа, белка Spike коронавируса ОС43, белка Spike коронавируса HKU1;
B) пациента с подтвержденным диагнозом «коронавирусная инфекция COVID-19». Положительные сигналы элементов чипа соответствуют наличию иммуноглобулинов класса G против RBD белка Spike коронавируса SARS-CoV-2, нуклеопротеинов вируса гриппа А и В, белка Spike коронавируса ОС43, белка Spike коронавируса HKU1, вирусных белков инактивированных вирусов парагриппа II и III типов;
Г) пациента с аутоиммунным полигландулярным синдромом I типа без коронавирусной инфекции и ОРВИ. Положительные сигналы элементов чипа соответствуют наличию иммуноглобулинов класса G против ω-интерферона-и α2-интерферона, вирусных белков инактивированного вируса парагриппа II типа, и вирусных белков инактивированного вируса парагриппа III типа, белка Spike коронавируса ОС43, белка Spike коронавируса HKU1.
n
ref
Фигура 3. Сравнение результатов выявления антител класса IgG к SARS-CoV-2, полученных на биочипе, с результатами, полученными с помощью хемилюминесцентного анализатора Mindray CL-2000i. Столбцы, обозначенные «Mindray» (голубая заливка) соответствуют концентрации антител IgG к SARS-CoV-2 в Ед/мл, полученных с помощью хемилюминисценции. Столбцы, обозначенные «Биочип» (светлая заливка) соответствуют нормированным сигналам I/I от групп элементов с иммобилизованным на биочипе рецептор-связывающий доменом белка Spike коронавируса SARS-CoV-2, умноженных на 5 с целью приведения данных, полученных двумя разными методами, к единой шкале.
Фигура 4. Определение антител класса IgG к SARS-CoV-2 на гидрогелевом биочипе.
SARS-CoV-2
ref
А) Значения I/I по результатам анализа на биочипе образцов сыворотки крови, с выявленными референсным методом IgG к SARS-CoV-2;
Б) с отсутствующими IgG к SARS-CoV-2 по результатам анализа референсным методом.
Фигура 5. Определение антител класса IgG к другим вирусам на гидрогелевом биочипе в образцах сыворотки крови.
SARS-CoV-2
ref
MERS-CoV
ref
A) Значения I/I  и I/I по результатам анализа на биочипе образцов сыворотки крови;
HCoV
OC43
ref
HCoV-HKU1
ref
Б) Значения I/I и I/I по результатам анализа на биочипе образцов сыворотки крови;
FLUA
ref
FLUB
ref
B) Значения I/I и I/I по результатам анализа на биочипе образцов сыворотки крови;
PIV-2
ref
PIV-3
ref
Г) Значения I/I и I/I антитела класса IgG против белков вируса парагриппа II и III типов.
Таблица 1. Перечень и характеристики белков, иммобилизованных в гидрогелевых элементах биочипа
Осуществление изобретения
Целью изобретения являлось создание способа выявления антител против белков вирусов - возбудителей острых респираторных вирусных инфекций, включая SARS-CoV-2, с одновременным выявлением аутоантител против интерферонов I типа в сыворотке крови на гидрогелевом биочипе. Схема биочипа представлена на Фигуре1. Биочип для осуществления заявляемого способа представляет собой матрицу трехмерных гидрогелевых элементов на подложке из стекла или пластика [Rubina, А.Y., Filippova, М.A., Feizkhanova, G.U., Shepeliakovskaya, А.О., Sidina, Е.I., Boziev, К.М, °… Grishin, Е.V. (2010). Simultaneous detection of seven staphylococcal enterotoxins: Development of hydrogel biochips for analytical and practical application. Analytical Chemistry, 82(21), 8881-8889. https://doi.org/10.1021/ac10166341. Технология основана на иммобилизации молекул в трехмерных ячейках в виде микрокапель, закрепленных на твердой подложке. Макропористая структура гидрогелевых элементов формируется за счет сополимеризации мономера - производного метакриловой кислоты, бифункционального кроссшивающего агента и иммобилизуемых белков, имеющих в своей структуре соответствующие функциональные группы аминокислот (N-концевые аминогруппы, е-аминогруппы лизинов, сульфгидрильные группы цистеинов и др.).
Для выявления антител против белков вирусов-возбудителей острых респираторных вирусных инфекций, включая SARS-CoV-2, и одновременного выявлением аутоантител против интерферонов I типа в сыворотке крови, проводят последовательно: инкубацию содержащего иммобилизованные белки гидрогелевого биочипа с анализируемой пробой, инкубацию с флуоресцентно-меченными вторичными антивидовыми антителами против иммуноглобулинов человека класса G, регистрацию и интерпретацию флуоресцентного изображения биочипа.
n
ref
ref
n
ref
n
ref
Анализируемая проба представляет собой сыворотку крови человека, предварительно разведенную в 100 раз буфером 100 мМ Трис-HCl с 0,1% Triton Х-100. После отмывки непрореагировавших компонентов реакции связавшиеся с иммобилизованными белками антитела детектируют антивидовыми флуоресцентно-меченными антителами против иммуноглобулинов класса G. Во время инкубации ячеек биочипа с антивидовыми флуоресцентно-меченными антителами происходит образование тройных комплексов «иммобилизованный белок - антитело - антивидовое флуоресцентно-меченное антитело». После финальной отмывки проводят регистрацию флуоресцентных изображений биочипов, используя анализаторы флуоресценции или сканеры микрочипов со специальным программным обеспечением, позволяющим вычислить значения флуоресцентного сигнала каждого элемента биочипа. Интерпретацию результатов выполняют посредством сравнения интенсивностей сигналов элементов с иммобилизованными белками и интенсивностей сигналов элементов контрольной группы, не содержащих белков. Для каждой функциональной группы элементов п, содержащих одинаковые иммобилизованные белки, результирующее значение сигнала I рассчитывают как медиану значений от четырех соответствующих элементов. В группе из восьми элементов 'Empty', не содержащих иммобилизованных белков, результирующее значение сигнала I рассчитывают как медиану значений от 8 соответствующих сигналов элементов. Наличие антитела в сыворотке крови определяют в случае, если отношение результирующего сигнала 1п к результирующему сигналу I превышает пороговое значение. Экспериментально были установлены пороговые значения, характеризующие наличие антител в сыворотке крови по результатам анализа с использованием заявленного способа: I/ I≥5,0 для элементов, содержащих белок Spike коронавируса HCoV ОС43, белок Spike коронавируса HCoV-HKU1, смесь вирусных белков инактивированного вируса парагриппа II типа, смесь вирусных белков инактивированного вируса парагриппа III типа, IFN-ω и IFN-α-2a и I/I≥2,0 для элементов, содержащих RBD белка Spike коронавируса SARS-CoV-2, белок Spike коронавируса SARS-CoV, белок Spike коронавируса MERS-CoV, нуклеопротеин вируса гриппа А, нуклеопротеин вируса гриппа В.
Заявленный способ мультиплексного обнаружения антител позволяет одновременно выявлять диагностические антитела класса G против вирусных белков SARS-CoV-2, других вирусов семейства бета-коронавирусов, вирусов гриппа А и В, вирусов парагриппа II и III типов, и выявлять аутоантитела класса G против интерферонов I типа, что позволяет идентифицировать группу пациентов с высоким риском тяжелого течения COVID-инфекции.
Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами, которые предназначены для обеспечения лучшего понимания сущности заявленного изобретения, но не должны рассматриваться как ограничивающие данное изобретение
Пример 1. Выявление антител в образцах сыворотки крови.
Гидрогелевые биочипы изготавливали методом сополимеризационной иммобилизации по методике, описанной ранее [Rubina, A.Y., Filippova, М.А., Feizkhanova, G.U., Shepeliakovskaya, А.О., Sidina, Е.I., Boziev, К.М, … Grishin, Е.V. (2010). Simultaneous detection of seven staphylococcal enterotoxins: Development of hydrogel biochips for analytical and practical application. Analytical Chemistry, 82(21), 8881-8889. https://doi.org/10.1021/ас1016634]. Схема размещения элементов изготовленного биочипа для выявления антител приведена на Фигуре 1. Образцы сьюороток крови пациентов разводили 1:100 буфером 100 мМ Трис-HCl с 0,1% Triton Х-100 и наносили на ячейки биочипа (120 мкл). После инкубации в течение ночи при +37°С, промежуточной отмывки (PBS с 0,01% Tween 20, 20 мин), ополаскивания и высушивания, биочипы проявляли 50 мкл смеси флуоресцентно-меченных антивидовых антител в рабочей концентрации 5 мкг/мл (F(ab')2-Goat anti-Human IgG Fc gamma Secondary Antibody, 31163, (Invitrogen), меченных Cy5) в буфере PBS с 0,14% поливинилового спирта (50 кДа) и 0,14% поливинилпирролидона (360 кДа). После инкубации (30 мин, +37°С) биочипы отмывали (PBS с 0,01% Tween 20, 30 мин), споласкивали, высушивали центрифугированием. Флуоресцентные изображения биочипов получали с помощью биочип-анализатора с лазерным возбуждением, разработанного в ИМБ РАН, Москва [Lysov, Y., Barsky, V., Urasov, D., Urasov, R., Cherepanov, A., Mamaev, D., … Zasedatelev, A. (2017). Microarray analyzer based on wide field fluorescent microscopy with laser illumination and a device for speckle suppression. Biomedical Optics Express, 8(11), 4798. https://doi.org/10.1364/boe.8.0047981. Вычисление флуоресцентных сигналов осуществляли с помощью программного обеспечения Image Assay (ИМБ РАН, Москва).
Фигура 2 иллюстрирует флуоресцентные изображения биочипов после проведения анализа образцов сывороток крови.
SARS-CoV-2
ref
HCoV
OC43
ref
HCoV-HKU1
ref
FLUA
ref
FLUB
ref
Для образца сыворотки крови пациента, переболевшего коронавирусной инфекцией COVID-19, на длине волны, соответствующей флуоресценции красителя Су5, на биочипе зарегистрированы положительные сигналы от групп элементов с иммобилизованными RBD белка Spike коронавируса SARS-CoV-2, белками Spike коронавирусов ОС43, HKU1, белками нуклеопротеинов вирусов гриппа А и В (Фигура 2А). Медиана значений сигналов данных групп элементов превышала пороговое значение, т.е. выполнялись условия I/I≥2,0; I/I≥5,0; I/I≥5,0; I/I≥2,0; I/I≥2,0. Таким образом, у данного пациента были выявлены иммуноглобулины класса G против RBD белка Spike коронавируса SARS-CoV-2, белка Spike коронавируса ОС43, белка Spike коронавируса HKU1, нуклеопротеинов вирусов гриппа А и В.
FLUA
ref
FLUB
ref
PIV-2
ref
HCoV
OC43
ref
HCoV-HKU1
ref
Для образца сыворотки крови пациента без признаков ОРВИ на биочипе зарегистрированы положительные сигналы от групп элементов с иммобилизованными белками нуклеопротеинов вирусов гриппа А и В, белком Spike коронавируса ОС43, белком Spike коронавируса HKU1, вирусных белков инактивированного вируса парагриппа II (Фигура 2Б). Медиана значений сигналов данных групп элементов превышала пороговое значение, т.е. выполнялись условия I/I≥2,0; I/I≥2,0; I/I≥5,0; I/I≥5,0; I/I≥5,0. Таким образом, у данного пациента были выявлены иммуноглобулины класса G против нуклеопротеина вируса гриппа А, нуклеопротеина вируса гриппа В, вируса парагриппа II типа, белка Spike коронавируса ОС43, белка Spike коронавируса HKU1.
SARS-CoV-2
ref
FLUA
ref
FLUB
ref
HCoV
OC43
ref
HCoV-HKU1
ref
PIV-2
ref
PIV-3
ref
Для образца сыворотки крови пациента с подтвержденным диагнозом «коронавирусная инфекция COVID-19» на биочипе зарегистрированы положительные сигналы от групп элементов с иммобилизованными RBD белка Spike SARS-CoV-2, нуклеопротеинами вируса гриппа А и В, белком Spike коронавируса ОС43, белком Spike коронавируса HKU1, вирусными белками инактивированных вирусов парагриппа II и III типов (Фигура 2В). Медиана значений сигналов данных групп элементов превышала пороговое значение, т.е. выполнялось условие I/I≥2,0; I/I≥2,0; I/I≥2,0; I/I≥5,0, I/I≥5,0;. I/I≥5,0; I/I≥5,0. Таким образом, у данного пациента были выявлены иммуноглобулины класса G против RBD белка Spike коронавируса SARS-CoV-2, нуклеопротеинов вируса гриппа А и В, белка Spike коронавирусов ОС43 и HKU1, вирусов парагриппа II и III типов.
n
ref
Для образца сыворотки крови пациента с аутоиммунным полигландулярным синдромом первого типа на биочипе зарегистрированы положительные сигналы от групп элементов с иммобилизованными белками интерферон-ω, интерферон-α-2а, смесями белков инактивированных вирусов парагриппа II и III типов, белками Spike коронавируса ОС43 и коронавируса HKU1 (Фигура 2Г). Медиана значений сигналов данных групп элементов превышала пороговое значение, т.е. выполнялось условие I/I≥5,0 для интерферона-ω, интерферона-α-2а, белка Spike коронавируса HCoV ОС43, белка Spike коронавируса HCoV-HKU1 и вирусных белков инактивированных вирусов парагриппа II и III типов. Таким образом, у данного пациента были выявлены иммуноглобулины класса G - аутоантитела против интерферона-ω, интерферона-α-2а, а также антитела к вирусам парагриппа II и III типов, белкам Spike коронавирусов ОС43 и HKU1 .
Для всех образцов, флуоресцентные изображения которых представлены на Фигуре 2, зарегистрированы сигналы контрольных элементов биочипа, содержащих anti-human IgG, и human IgG. При проведении анализа на стадии взаимодействия образца сыворотки крови с элементами биочипа, иммобилизованные в контрольных элементах иммобилизованные антивидовые иммуноглобулины против иммуноглобулинов человека классов взаимодействуют с аутоантителами класса G, формируя бинарные комплексы «иммобилизованные антивидовые антитела - антитела соответствующего класса из сыворотки крови». На стадии детекции образовавшихся иммунных комплексов в ячейках биочипа, содержащих anti-human IgG образуются тройные комплексы «иммобилизованные антивидовые антитела - антитела класса G из сыворотки крови-детектирующие антивидовые антитела», одновременно, в ячейках биочипа, содержащих human Ig класса G, образуются двойные комплексы «иммобилизованные антитела класса G человека - детектирующие антивидовые антитела».
Пример 2. Обнаружение антител класса IgG к SARS-CoV-2 с помощью заявляемого способа и референсного метода на основе хемилюминесценции.
n
ref
SARS-CoV-2
ref
SARS-CoV-2
ref
Заявляемым способом по методике, описанной в Примере 1, были проанализированы образцы сывороток крови от 20 пациентов. Все они были охарактеризованы референсным методом с использованием иммунологического хемилюминесцентного анализатора Mindray CL-2000i как положительные по IgG к SARS-CoV-2 (n=10), так и отрицательные по IgG к SARS-CoV-2 (n=10). Все образцы были отрицательны по IgM к SARS-CoV-2. Сравнение результатов, полученных с использованием референсного и заявленного способа, приведено на Фигуре 3. Была продемонстрирована высокая сходимость двух методов, в анализируемой выборке пациентов не было зафиксировано ложно-положительных или ложно-отрицательных результатов. На Фигуре 4 показаны значения сигналов I/I от групп элементов с иммобилизованным RBD коронавируса SARS-CoV-2 на длине волны, соответствующей флуоресценции красителя Су5. Для образцов сыворотки крови с выявленными референсным методом IgG к SARS-CoV-2 на биочипе соблюдалось условие I/I≥2,0 (Фигура 4А). Таким образом, с использованием заявленного способа для всех положительных образцов были выявлены антитела класса G против домена RBD белка S коронавируса SARS-CoV-2. Для образцов, в которых референсным методом IgG к SARS-CoV-2 выявлены не были, соблюдалось условие I/I<2,0 (Фигура 4Б). Таким образом, с использованием заявленного способа для всех отрицательных образцов не было выявлено антител класса G против домена RBD белка S коронавируса SARS-CoV-2.
Пример 3. Обнаружение антител класса IgG к другим вирусам с помощью заявленного способа.
Для каждого образца сыворотки крови пациентов, описанных в Примере 2, с помощью разработанного способа были получены данные о наличие антител класса IgG к вирусным белкам, иммобилизованным на биочипе. Результаты анализа образцов на биочипе продемонстрированы на Фигуре 5. В анализируемых образцах не были обнаружены антитела класса IgG против белков Spike коронавирусов SARS-CoV и MERS-CoV (Фигура 5А). Для данной выборки была показана высокая встречаемость (17/20) антител класса IgG против белков Spike коронавирусов HCoV ОС43 и HCoV-HKU1 (Фигура 5Б), при этом сигналы, превышающие пороговые значения были зафиксированы для большинства пациентов одновременно как для иммобилизованного белка Spike коронавируса HCoV ОС43, так и для иммобилизованного белка Spike коронавируса HCoV-HKU1. Антитела класса IgG против нуклеопротеина N вируса гриппа А были выявлены у 9 из 20 пациентов, против нуклеопротеина N вируса гриппа В - у 15 из 20 пациентов (Фигура 5В). Антитела класса IgG против белков вирусов парагриппа были выявлены у 15 из 20 пациентов для иммобилизованной смеси вирусных белков инактивированного вируса парагриппа II типа, и у 11 из 20 пациентов для иммобилизованной смеси вирусных белков инактивированного вируса парагриппа III типа (Фигура 5Г).