Подавление активности гидролитических ферментов личинок колорадского жука растительными белками

раздел БИОЛОГИЯ и МЕДИЦИНА

УДК 581:635.21:632.7 ББК 28.5:42.15:44.6

ПОДАВЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ЛИЧИНОК КОЛОРАДСКОГО ЖУКА РАСТИТЕЛЬНЫМИ БЕЛКАМИ Шпирная И.А., Ибрагимов Р.И., Умаров И.А.

Из личинок колорадского жука Leptinotarsa decemlineata, выделены гидролитические ферменты, протеиназы и а-амилаза. Изучена протеолитическая активность на разных субстратах и взаимодействие с белками - ингибиторами гидролаз из растений различных видов. Приводятся данные о содержании ингибиторов протеиназ в вегетативных органах картофеля Solanum tuberosum.

Показана связь между устойчивостью растений к вредителям и содержанием в них белков - ингибиторов протеиназ.

Колорадский жук является основным вредителем посадок картофеля во многих странах. Для регуляции его численности используются в основном, химические средства защиты, которые обладают побочным вредным эффектом воздействия на природные экосистемы [1]. В связи с этим, является актуальным исследования теоретических и практических аспектов взаимоотношений растений и насекомых - для разработки новых, экологически безопасных способов защиты растений от вредителей.

В комплексе свойств, определяющих степень агрессивности и вирулентности фитопатогенов и вредителей, существенная роль принадлежит их гидролитическим ферментам, при помощи которых вредные организмы, перерабатывая ткани растения хозяина, обеспечивают себе условия для роста и дальнейшего развития [2]. Другой стороной этих взаимодействий являются особенности кормового растения, выражающиеся в различных факторах, препятствующих действию гидролаз на растительные ткани. Среди них особое значение имеют белки-ингибиторы, которые присутствуют в семенах и вегетативных органах растений многих семейств: пасленовых, злаковых, бобовых и др.[3]. Эти молекулы способны инактивировать гидролазы чужеродных организмов, что является одним из факторов устойчивости растений.

Несмотря на то, что исследования взаимодействия ферментов насекомых и природных ингибиторов ведутся уже долгое время, роль ингибиторов как факторов иммунитета остается невыясненной. Очевидно, что для получения целостных представлений о физиологической роли этих молекул необходимы исследования как самих растительных ингибиторов, так и ферментов насекомых, на которые направлено их действие [4].

Целью нашей работы было изучение действия белков-ингибиторов из вегетативных органов растений на активность протеиназ и а- амилаз личинок колорадского жука.

МЕТОДИКА

Объектами служили личинки колорадского жука (далее ЛКЖ) размером 6-8 мм; клубни, ростки до 1см, листья и стебли, сортов картофеля Романо, Удача, Невский, Луговской, Снегирь, листья и плоды растений различных видов.

Гидролитические ферменты выделяли из ЛКЖ, ингибиторы гидролаз - из растительных тканей, в качестве экстрагента использовали дистиллированную воду, подробное описание методики выделения приведено в публикациях [2;5]. В экстрактах ЛКЖ определяли протеолитическую, амилазную активность методам агарозных пластин [6] для определения активности протеиназ, гидролизующих К,а-бензоил-ЭЬ-аргинин-4-нитроанилид (БАПНА) использовали метод Эрлангера [7]. Содержание белка определяли по методу Бредфорд

[8]. Статистическую обработку проводили в программе Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что в тканях личинок колорадского жука функционирует комплекс гидролитических ферментов

[9], в связи с этим нами исследовалась способность протеиназ колорадского жука к гидролизу различных субстратов.

Выделенные ферменты оказались способными гидролизовать различные белки (казеин, гемоглобин, желатин, яичный белок).

За единицу активности (ПЕ) принимали такое количество фермента, которое гидролизовало 1 мм2 субстрата.

Высокую активность эти протеиназы проявляли к желатину, гемоглобину, яичному белку. Как видно, активность протеиназ ЛКЖ по отношению к различным субстратам определяется сопоставимо с уровнем активности высокоочищенных коммерческих препаратов ферментов. Так, активность ЛКЖ по отношению к желатине составляет 32 % от активности проназы E (протеиназы актиномицетов) в концентрации 1 мг/мл (рис.1).

Интересно отметить, что мукопротеид яичного белка, подавляющий активность трипсина [10], не ингибировал протеолитическую активность ЛКЖ.

Проназа Е

желатин казеин гемоглобин яичный белок

Рис.1. Гидролиз белков протеолитическими ферментами

Кроме различных белков, протеиназы ЛКЖ активно гидролизовали синтетический субстрат БАПНА.

Эти факты свидетельствуют о том что, в протеолитическом комплексе личинок содержатся протеиназы различных типов.

Из литературных источников известно, что у растений ингибиторы протеиназ локализуются в основном в семенах и других запасающих органах [3; 11], в связи с этим нас интересовала активность ингибиторов протеиназ ЛКЖ и проназы Е из вегетативных органов картофеля, разных сортов. Использовали субстрат БАПНА, за 1 единицу (Е) активности фермента принимали такое его количество, которое в стандартных условиях, образует 1|іМ п-нитроанилид за 1 мин. За единицу ингибиторной активности (ИЕ) принимали такое количество ингибитора, которое на 100% подавляет активность 1 единицы фермента.

Как показали наши эксперименты (табл.1,2) вегетативные органы содержат белки - ингибиторы, подавляющие активность БАПНА- гидролизующих протеиназ. Наибольшей удельной активностью белков -ингибиторов БАПНА-аз ЛКЖ обладали стебли, возможно это один из факторов их устойчивости, наименьшей -листья картофеля, как известно, самая уязвимая часть при поражении вредителем. Белки картофеля неодинаково влияют на активность проназы Е и протеиназы колорадского жука. Как видно из табл. 2 вегетативные органы разных сортов картофеля незначительно отличаются активностью ингибиторов проназы, наибольшей удельной активностью обладают ростки, наименьшей - стебли картофеля

Таблица 1

Активность ингибиторов БАПНА-азы ЛКЖ из вегетативных органах картофеля________________________

Сорт Ингибиторы БАПНА-азы ЛКЖ

клубни ростки листья стебли

ИЕ/г массы мИЕ/мг белка ИЕ/г массы мИЕ/мг белка ИЕ/г массы мИЕ/мг белка ИЕ/г массы мИЕ/мг белка

Романо 0,22±0,02 0,9±0,06 0,3±0,011 3,3±0,2 0,32±0,01 1,1 ±0,07 0,41±0,02 4,3±0,31

Удача 0,2±0,03 0,8±0,03 0,33±0,013 3,9±0,31 0,56±0,04 1,9±0,1 0,42±0,02 2,6±0,12

Снегирь 0,3±0,02 1,5±0,12 0,29±0,02 2,4±0,15 0,27±0,02 1,2±0,09 0,56±0,04 4,13±0,36

Луговской 0,33±0,05 1,56±0,11 0,28±0,015 2,5±0,08 - - 0,3±0,011 2,4±0,14

Невский 0,28±0,02 1,09±0,09 0,27±0,018 2,3±0,03 0,37±0,025 1,4±0,11 0,56±0,041 4,13±0,25

- данные отсутствуют

Т аблица 2

__________________Активность ингибиторов проназы Е из вегетативных органах картофеля______________________

Сорт Ингибиторы проназы Е

клубни ростки листья стебли

ИЕ/г массы мИЕ/мг белка ИЕ/г массы мИЕ/мг белка ИЕ/г массы мИЕ/мг белка ИЕ/г массы мИЕ/мг белка

Романо 1,2±0,1 5,01±0,41 0,8±0,01 8,9±0,7 0,84±0,04 2,9±0,2 0,08±0,002 0,8±0,07

Удача 1,04±0,09 4,0±0,37 0,44±0,01 5,14±0,42 0,73±0,06 2,5±0,15 0,4±0,02 2,3±0,15

Снегирь 1,06±0,05 5,3±0,34 0,9±0,03 7,3±0,63 0,8±0,05 3,6±0,28 0,3±0,015 2,2±0,01

Луговской 1,05±0,07 5,01 ±0,28 0,9±0,03 7,8±0,52 0,7±0,05 2,5±0,16 0,08±0,002 0,6±0,04

Невский 1,05±0,1 4,05±0,36 0,9±0,025 7,2±0,29 0,64±0,03 2,4±0,14 0 0

Следует отметить, что белки из разных частей картофеля неодинаково подавляют активность проназы и протеиназы ЛКЖ. Еще более наглядно эта закономерность проявляется при анализе средних значений данных по активности ингибиторов протеиназ из пяти сортов картофеля. На рис.2 представлены средние значения активности ингибиторов протеиназ: ЛКЖ и проназы Е из клубней, ростков, листьев и стеблей. Из рис.2 видно, что, к примеру стебли картофеля при наибольшей активности ингибиторов протеиназ ЛКЖ (сравнительно с другими органами картофеля), характеризуются наименьшей активностью ингибиторов проназы Е.

Рис.2. Активность ингибиторов проназы Е и ингибиторов протеиназы ЛКЖ из картофеля.

Данные различия - свидетельство высокоспецифичного взаимодействия белка с ферментом, и как следствие растения и насекомого.

Интересные закономерности обнаруживаются при сравнительном анализе активности белков ингибиторов протеиназ, из различных частей растений (табл.3)., разных видов.

Т аблица 3

Объект Часть растения Ингибиторы проназы Е Ингибиторы п ротеиназы ЛКЖ Содержание белка, мкг/мл

ИЕ/г массы мИЕ/мг белка ИЕ/г массы мИЕ/мг белка

Одуванчик (Taraxacum sp.) листья 1,5±0,21 8,8±0,35 0,36±0,02 2,1±0,14 170

Т ополь (Populus nigra L.) листья 0 0 0,31±0,018 6,2±0,34 50

Морковь (Daucus carota) листья 0,85±0,06 4,0±0,28 * * 215

корнеплод 0 0 * * 165

ингибитор трипсина из сои (ком. препарат) * * * * 1000

(U 3 (Я о X ;(U 4 ä С Томат (Solanum lycopersicum) листья 1,2±0,09 4,6±0,36 0,54±0,03 2,1±0,17 260

плоды 0 0 * * 90

Баклажан (Solanum melongena) листья 1,4±0,12 6,1±0,45 0,22±0,011 0,96±0,05 230

Физалис (Physalis sp.) листья 0,36±0,01 1,6±0,09 0 0 230

Картофель (Solanum tuberosum) листья 0,74±0,05 2,8±0,18 0,3±0,019 1,12±0,07 290

ростки 0,8±0,03 7,3±0,51 0,3±0,015 2,9±0,22 100

стебли 0,74±0,03 2,8±0,12 0,45±0,03 3,5±0,24 130

клубни 1,08±0,09 4,7±0,41 0,27±0,02 1,2±0,09 220

цветы 0,8±0,03 4,7±0,39 0,28±0,02 1,65±0,06 170

Примечание: *- полное подавление активности ферментов (активность БАПНА-азы ЛКЖ составила - 45,8 мЕ/мл; активность проназы Е - 190 мЕ/мл.

Растения из семейства пасленовых, известные как неустойчивые культуры к колорадскому жуку, обладают высоким содержанием белков ингибиторов проназы, и напротив, сниженной, по сравнению с растениями других семейств активностью ингибиторов к протеиназе ЛКЖ.

Белки из плодов томата и корнеплодов моркови подавляют активность протеиназы жука, однако активность ингибиторов проназы в них не выявлена. По-видимому, низкая активность ингибиторов микроорганизмов в них обясняет низкую устойчивость к болезням, вызванными бактериями и патогенными грибами.

Таким образом, ингибиторы протеолитических ферментов, наряду с другими растительными веществами играют существенную роль в устойчивости растения к насекомым вредителям. Однако активность природных ингибиторов ферментов не стабильна. Она колеблется в онтогенезе и зависит от условий внешней среды [2].

В табл.4 приведены данные, полученные методом агарозных пластин, по активности гидролаз ЛКЖ (контроль). Здесь же показано как ингибиторы из вегетативных органов картофеля, разных сортов, добавленные к экстракту ЛКЖ, в соотношении 1:1, действуют на активность ферментов.

За единицу активности ингибитора (ИЕ) принимали такое количество, которое подавляет 1 единицу активности фермента.

Наши исследования показывают, что в клубнях и стеблях присутствует активность ингибиторов желатиназы ЛКЖ, в листьях такой активности не обнаружили.

Неочищенный экстракт личинок обладал также, способностью к гидролизу крахмала, т.е. проявлял амилазную активность. Белки из клубней и стеблей способны незначительно подавлять активность а-амилазы ЛКЖ. В листьях ингибирующей активности к амилазе не фиксировали (табл.4).

Т аблица 4

Активность ингибиторов желатиназы (Иж) и ингибиторов амилазы (Иа) личинок колорадского жука в различных ____________________________________________сортах картофеля_____________________________________________________

Сорт картофеля клубни, ИЕ стебли, ИЕ листья, ИЕ желатиназа ,ПЕ амилаза, АЕ

Иж Иа Иж Иа Иж Иа

Невский 18,1 50,2 16,7 15,1 0 0 113,04 78,5

Удача 18,1 40 18 28,3 0 0

Луговской 34,5 40 12 14,8 0 0

Рамона 34,5 34,3 18 18,2 0 0

Снегирь 26,5 34,3 20,2 21,8 0 0

В итоге проведенных исследований мы можем сделать следующие выводы:

Протеолитические ферменты личинок колорадского жука, обладают широкой субстратной специфичностью.

Взаимодействие с белками - ингибиторами из разных частей растений различных видов приводит к частичному или полному подавлению их активности.

Растения из семейства пасленовых обладают сниженной, по сравнению с растениями из других семейств, активностью белков-ингибиторов протеиназ личинок колорадского жука.

ЛИТЕРАТУРА

1. Методические рекомендации по индикации и мониторингу процессов адаптации колорадского жука к генетически модифицированным сортам картофеля// Павлюшин В.А., Вилкова Н.А., Сухорученко Г.И., Фасулати С.Р. и др. издательство ВИЗР, ВНИИБЗР. Санкт-Петербург, 47 с.

2. Применение методов биохимии в исследованиях по защите растений (Методические указания) п/р К.В.Новожилова, С.Л.Тютерева, издательство ВИЗР, Ленинград, 1976 с.61-62

3. Мосолов ВВ, Валуева ТА. Ингибиторы протеиназ и их функции у растений//Прикладная биохимия и микробиология. -2005.-Т .41 №3.-с.261-282

4. Фомичева Ю.А. Пищеварительные а-амилазы и протеиназы насекомых как элемент специфичного взаимодействия в системе растение - насекомое -фитофаг: Автореф. канд.дис. Санкт -Петербург,1992. 15 с.

5. Шевченко Н.Д., Шпирная И.А. Выделение и свойства протеолитических ферментов личинок Leptinotarsa decemplineata// Тез. докладов второго международного симпозиума Сигнальные системы клеток растений: Роль в адаптации и иммунитете. Казань. 2006. С.228-229

6. Шпирная И.А.,Шевченко Н.Д. Определение активности протеолитических ферментов и их ингибиторов методом гелевых пластин// Тез. докладов второго международного симпозиума Сигнальные системы клеток растений: Роль в адаптации и иммунитете. Казань. 2006. С.230-231

7. Erlanger B.F., Kokowski N., Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrutes of trypsin // Arch. Biochem. Biophys.- 1961.- V. 95, N 2.- P. 271-278.

8. Bradford M.M. A rapide and sensetive method for the quantitasion of microgramm quantities of protein utilising the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. - 1976. - V.172, N 1. - P. 248 - 254.

9. Конарев Ал.В. Ингибиторы протеиназ и устойчивость картофеля к колорадскому жуку//Современные системы защиты и новые направления в повышении устойчивости картофеля к колорадскому жуку.-М. Наука, 2000.- С.35-40

10. Велобова Е. Н. Переваривание белков. Киев: гродынец,1993, 29 с.

11. Ибрагимов Р.И. Содержание ингибиторов протеиназ в семенах сельскохозяйственных культур // Качество продукции растениеводства и приемы его повышения.- Уфа: Баш. гос. агр. ун-т. - 1998.-С. 146-149.

Поступила в редакцию 14.09.06 г.