Особенности метаболизма лимфоцитов крови у женщин с диффузным токсическим зобом в процессе лечения

© МАЦЫНИНА В.П., ШАГАРОВА С.Г., САВЧЕНКО А.А., ДОГАДИН С.А.

УДК 612.017.1:616.441

ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ У

ЖЕНЩИН С ДИФФУЗНЫМ ТОКСИЧЕСКИМ ЗОБОМ В ПРОЦЕССЕ

ЛЕЧЕНИЯ

В.П. Мацынина, С.Г. Шагарова, А.А. Савченко, С.А. Догадин

НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН, директор - член-корр. РАМН,

В. Т. Манчук; Эндокринологический центр при КГБУЗ «Краевая клиническая больница», гл. врач - заслуж. врач РФ Е.Е. Корчагин; Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого,

ректор - д.м.н., проф. И.П. Артюхов.

Резюме. В статье представлены данные исследования метаболизма лимфоцитов крови 35 женщин с диффузным токсическим зобом. Обследование проводилось до начала лечения и спустя 1 и 3 месяца на фоне приема тиамазола. Через 1 месяц терапии достигается нормализация уровня тиреоидных гормонов. В процессе лечения метаболизм лимфоцитов на протяжении всего периода наблюдения характеризуется повышенным уровнем макромолекулярного синтеза и антиоксидантной способности клеток, высокой эффективностью малат-аспартатной челночной системы, а также повышенным уровнем реакций аминокислотного обмена.

Ключевые слова: диффузный токсический зоб, метаболизм, лимфоцит.

Мацынина Валентина Петровна - врач эндокринологического центра при КГБУЗ «Краевая клиническая больница»; е-шаП: matsyninaa@gmail.com.

Шагарова Светлана Геннадьевна - к.б.н., ведущий научный сотрудник НИИ Медицинских проблем СО РАМН; e-mail: sv528@mail.ru.

Савченко Андрей Анатольевич - д.м.н., проф., зав. каф. физиологии им. проф. А. Т. Пшоника КрасГМУ; e-mail: aasavchenko@yandex.ru.

Возрастающая частота заболеваний щитовидной железы выводит проблемы тиреоидологии на первый план современной эндокринологии [1,9]. Диффузный токсический зоб (ДТЗ) является одним из наиболее часто встречающихся аутоиммунных заболеваний, его распространенность достигает 0,1% населения [1]. На долю ДТЗ приходится более 80% всех случаев синдрома тиреотоксикоза [1,3]. Болеют преимущественно женщины молодого возраста (в 5 раз чаще мужчин). Пик заболеваемости приходится на возраст между 25 и 40 годами [1,3,8,15]. Даже субклинический тиреотоксикоз у лиц старше 60 лет сопровождается увеличением как общей смертности, так и смертности от сердечно-сосудистых заболеваний [12].

Т-лимфоциты играют центральную роль в развитии ДТЗ [11,15]. Т-лимфоциты главным образом СБ4+-клетки сенсибилизированы к тиреоцитам или отдельным тиреоидным антигенам (тиреоглобулин, тиреопероксидаза, рецептор тиреотропного гормона) [11]. Лимфоциты, обладающие богатым рецепторным аппаратом, являются ферментным зеркалом организма, отражением его обменных процессов [4,7]. Интенсивность метаболизма лимфоцитов определяет их функциональную активность [4,13,14]. Особенно высокой информативностью для исследования метаболизма лимфоцитов обладают окислительно-восстановительные ферменты, так как, осуществляя перенос электронов в клетке, они реализуют и ключевые реакции клеточного метаболизма [2,6,13,14].

Таким образом, целью работы явилось исследование динамики изменений активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов крови у больных ДТЗ в процессе тиреостатической терапии.

Материалы и методы

В трехмесячное открытое проспективное исследование было включено 35 женщин в возрасте от 18 до 55 лет с верифицированным диагнозом ДТЗ до начала лечения тиреотоксикоза и через 1 и 3 месяца на фоне лечения тиамазолом. Критериями исключения являлись мужчины, беременные и лактирующие женщины, больные в период ремиссии ДТЗ, наличие других аутоиммунных заболеваний (в том числе аутоиммунной офтальмопатии), узловые образования в щитовидной железе, а также наличие сопутствующих заболеваний, требующих параллельного лечения. Все больные до начала исследований тиреостатики не получали (впервые выявленный ДТЗ или впервые выявленный рецидив ДТЗ). В качестве группы сравнения обследованы 100 практически здоровых женщин без отягощенного анамнеза по заболеваниям щитовидной железы, сопоставимых по возрасту. Обследование всех женщин репродуктивного возраста проводилось в 1-ую фазу менструального цикла.

Лечение проводилось тиреостатическим препаратом тиамазолом («Тирозол», «Мерк КГаА», Германия) по общепринятой схеме «блокируй» со стартовой дозы 30мг/сут с постепенным снижением до поддерживающей под контролем данных объективного и гормонально-лабораторного статусов. Критерием эффективности лечения являлись нормализация уровней тиреоидных гормонов.

Концентрация тиреотропного (ТТГ) и тиреоидных (Т3, св.Т4) гормонов в сыворотке крови определялась радиоиммунологическим методом («Иммунотех», Чешская Республика), АТ-ТПО - иммуноферментным анализом («Мультитест», Россия) при постановке диагноза и через 1 и 3 месяца лечения. Нормативные показатели для ТТГ: 0,17 - 4,05 мкЕд/мл, Т3: 1,2 - 2,8 нмоль/л, св.Т4: 11,5 - 23 пмоль/л, АТ-ТПО: 0 - 30 мЕд/л.

Выделение лимфоцитов производили в градиенте плотности фиколл-верографина по методу А. Воуит (1968) [10].

Определение активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах проводили биолюминесцентным методом [5]. Определяли активность следующих ферментов: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (Г3ФДГ), НАД- и НАДН-зависимой

лактатдегидрогеназы (ЛДГ и НАДНЛДГ), НАД- и НАДН-зависимой малатдегидрогеназы (МДГ и НАДНМДГ), малик-фермента (НАДФМДГ), НАДФ- и НАДФН-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДФГДГ и НАДФНГДГ), НАД- и НАДН-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДГДГ и НАДНГДГ), НАД- и НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы (НАДИЦДГ и НАДФИЦДГ) и глутатионредуктазы (ГР). Активность дегидрогеназ выражали в ферментативных единицах на 104 клеток (1Е=1мкмоль/мин).

Статистический анализ проводился с помощью пакета программ Statistica 8,0 (StatSoft, США). Нормальность распределений проверялась методом Колмогорова-Смирнова. Данные представлены в виде медианы (Ме), нижнего и верхнего квартилей (25;75). Статистическую значимость различий независимых групп оценивали с помощью критерия Манна-Уитни, связанных групп -критерия Вилкоксона. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимался равным 0,05.

Результаты и обсуждение

При манифестном тиреотоксикозе у больных уровень тиреоидных гормонов значительно повышен, через месяца тиреостатической терапии наблюдается снижение показателей до нормального диапазона (табл.1). Изначально низкий уровень ТТГ через месяц лечения начинает повышаться и через 3 месяца лечения достигает нормы. Содержание Т3 и св.Т4 до лечения у больных значительно превышает норму, через 1 и 3 месяца выявляется снижение концентрации, которая, тем не менее, остается статистически выше контрольных уровней. На протяжении всего периода наблюдения уровень АТ-ТПО оставался высоким (табл. 1).

Проведенные исследования выявили у больных ДТЗ в процессе лечения изменения уровней активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфацитах периферической. Уровни активности Г6ФДГ, НАДНМДГ, ГР, а также НАД(Ф)-и НАД(Ф)Н-зависимых реакций глутаматдегидрогеназ повышены при снижении активности НАДФИЦДГ в лимфоцитах больных женщин до начала лечения по сравнению с группой контроля (рис. 1 и 2). Через 1 месяц лечения больных ДТЗ в лимфоцитах крови уровни активности Г6ФДГ, НАДНМДГ, ГР и НАД(Ф)- и НАД(Ф)Н-зависимых реакций глутаматдегидрогеназ остаются статистически значимо повышенными относительно контрольных диапазонов. Дополнительно обнаружено увеличение активности Г3ФДГ относительно контрольного уровня. Через 3 месяц лечения больных ДТЗ в лимфоцитах крови уровни активности Г6ФДГ, НАДНМДГ, ГР, НАДФНГДГ и НАД(Ф)-зависимых реакций глутаматдегидрогеназ остаются статистически достоверно повышенными относительно контрольных диапазонов. Однако, выявляется статистически достоверное увеличение активности Г6ФДГ и ЛДГ в лимфоцитах у больных на данном этапе лечения относительно исходного уровня. И наоборот, уровни активности НАДНМДГ и НАДНГДГ статистически достоверно снижаются относительно исходных диапазонов.

Активизация пентозофосфатного пути окисления углеводов характеризуется повышением активности инициализирующего и лимитирующего фермента Г6ФДГ. Вследствие этого повышается содержание НАДФН и уровень синтеза пентозофосфатов (рибозофосфата и дезоксирибозофосфата) являющихся основой для образования нуклеиновых кислот. Исходно повышенная активность Г6ФДГ нарастает в динамике лечения, что характеризует повышение интенсивности процессов макромолекулярного синтеза.

Глутатионредуктаза восстанавливает окисленный глутатион, следовательно, увеличение активности фермента отражает повышение уровня процессов перекисного окисления в лимфоцитах больных ДТЗ, обеспечивая повышение антиоксидантной и пролиферативной способности клеток на протяжении 3 месяцев наблюдения.

Вместе с тем, значительного изменения интенсивности протекания реакций гликолиза и последующего аэробного окисления в митохондриях лимфоцитов периферической крови у женщин с ДТЗ не обнаружено. Установлено повышение уровня активности аэробной реакции ЛДГ после начала лечения. На 3 месяце лечения в лимфоцитах крови больных ДТЗ повышается активность Г3ФДГ, что характеризует усиление переноса продуктов липидного катаболизма на гликолиз.

Малат-аспартатный шунт, связывая анаэробное и аэробное окисление, осуществляет транспорт восстановленного в гликолизе НАДН в митохондрии для окисления в цепи дыхательных ферментов и обратно окисленный НАД+ в цитоплазму для непрерывного протекания реакций гликолиза. Увеличение активности НАДНМДГ в течение всего периода наблюдения указывает на активацию малат-аспартатного шунта. Повышенная активность этого фермента характеризует усиление окислительно-восстановительных процессов в цитоплазме, которая, возможно, вызвана недостатком АТФ в лимфоцитах больных ДТЗ, так как высокие дозы тиреоидных гормонов разобщают окислительное фосфорилирование. Поэтому при снижении содержания тиреоидных гормонов у пациенток с ДТЗ через 3 месяца после начала лечения в лимфоцитах крови выявлено снижение активности НАДНМДГ, относительно показателя группы больных ДТЗ до начала лечения.

Вместе с тем, изменений активности исследуемых дегидрогеназ цикла трикарбоновых кислот в лимфоцитах у больных ДТЗ в процессе лечения не обнаружено. До начала лечения выявляется низкая активность НАДФИЦДГ (вспомогательной дегидрогеназной реакции лимонного цикла), уровень активности которой затем нормализуется. В процессе лечения значительно изменяются уровни активности НАД(Н)- и НАДФ(Н)-зависимых глутаматдегидрогеназ. Установлено, что уровни активности НАД- и НАДФ-зависимых глутаматдегидрогеназ на всем протяжении лечения в лимфоцитах больных ДТЗ повышены, что характеризует высокий уровень притока продуктов аминокислотного обмена на реакции цикла трикарбоновых кислот. В то же

время, активность НАДНГДГ в процессе лечения снижается, что определяет снижение НАДН-зависимого оттока субстратов с лимонного цикла на реакции аминокислотного обмена, тогда как уровень НАДФН-зависимого оттока также остается в процессе лечения постоянно высоким.

Следовательно, в данной работе прослежено регулирующее действие тиреоидных гормонов на метаболизм лимфоцитов крови у больных ДТЗ в гипертиреоидном состоянии. Тиреоидные гормоны способны повышать экспрессию многих генов, в том числе генов ферментов, определяющих различные биохимические процессы и клеточные функции [1, 3].

Таким образом, у больных ДТЗ до начала лечения в состоянии гипертиреоза выявлено перераспределение субстратных потоков и преобразование метаболизма в лимфоцитах периферической крови, которое определяется усилением макромолекулярного синтеза, перекисных процессов,

аминокислотного обмена при увеличении активности аэробного окисления. В течение 3 месяцев лечения сохраняется повышенным уровень макромолекулярного синтеза и антиоксидантной активности лимфоцитов, интенсифицированы малат-аспартатная челночная система и аминокислотный обмен. Вследствие значительного нарушения эндокринной регуляции метаболизма лимфоцитов достижение нормализации уровня тиреоидных гормонов через 3 месяца лечения не привело к нормализации метаболических показателей что возможно и лежит в основе высокой частоты рецидива ДТЗ после прекращения лечения.

PECULIAR PROPERTIES OF METABOLISM OF BLOOD LYMPHOCYTES IN WOMEN WITH DIFFUSE TOXIC GOITER DURING

TREATMENT

V.P. Macinina, S.G. Shagarova, A.A. Savchenko, S.A. Dogadin

State Scientific Research Institute for Medical Northern Problems of Siberian Division of RAMS, The endocrinological center of “Krasnoyarsk Regional Hospital

Abstract. The paper presents the data of study of metabolism of blood lymphocytes of 35 women with diffuse toxic goiter. The survey was conducted before treatment and after 1 and 3 months in patients receiving Tiamazol. After 1 month of therapy it was achieved the normal level of thyroid hormones. In the treatment of the metabolism of lymphocytes throughout the observation period is characterized by elevated level of macromolecular synthesis and antioxidant capacity of cells, high efficiency malate-aspartate shuttle system, as well as increased the level of amino acid exchange reactions.

Key words: diffuse toxic goiter, metabolism, lymphocyte.

Литература

1. Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. Фундаментальная и клиническая тироидология. - М.: Медицина, 2007. -816 с.

2. Захарова Л.Б., Манчук В.Т., Нагирная Л.А. Метаболизм

иммунокомпетентных клеток жителей Севера в онтогенезе.-

Новосибирск, 1999. - 144 с.

3. Кандрор В.И. Механизмы развития болезни Грейвса и действия тиреоидных гормонов // Клинич. и эксперим. тиреодология. - 2008. - Т.4, №1. - С. 26-34.

4. Нарциссов Р.П. Прогностические возможности клинической

цитохимии // Советская педиатрия. - М.: Медицина, 1984. - Вып.2. - С. 267-275.

5. Савченко А.А. Биолюминесцентное определение активности НАДи НАДФ-зависимых глутаматдегидрогеназ лимфоцитов // Лабораторное дело. - 1991. - № 11. - С.22-25.

6. Савченко А.А., Кадричева С.Г., Догадин С.А. и др.

Информативность показателей активности ферментов лимфоцитов у больных аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы // Пробл. эндокринологии. - 2003. - Т.49, №3. - С. 18-22.

7. Труфакин В.А., Шурлыгина А.В., Дергачева Т.И. и др. Циркадные вариации метаболической реакции лимфоцитов крови людей на гормональные стимулы в норме и при развитии иммунодефицита

// Бюл. эксперим. биологии и медицины - 1995.- Т.119, №28. - С. 181183.

8. Фадеев В.В., Мельниченко Г.А. Болезнь Грейвса // Рус. медиц. журн. - 2005. - №6. - С. 253-256.

9. Эндокринология: национальное руководство / под ред. И.И. Дедова, Г.А.Мельниченко.- М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. - С. 497-504.

10. Boyum A. Isolation of lymphocytes from blood and bone marrow // Scand. J. Clin. Lab. Invest. - 1968.- Vol.21, Suppl.97.- P.77-80.

11. De Groot L.J., Weetman A.P. Autoimmunity of the Thyroid Gland [Электронный ресурс]. - 2010. - Режим доступа: www.thyroidmanager.org.

12. Di Bello V., Aghini-Lombardi F., Monzani F. et al. Early abnormalities of left ventricular myocardial characteristics associated with subclinical hyperthyroidism // J. Endocrinol. Invest. - 2007. - Vol.30, №7. - P.564-571.

13. Maciver N.J., Jacobs S.R., Wieman H.L. Glucose metabolism in lymphocytes is a regulated process with significant effects on immune cell function and survival // J. Leukoc. Biol. - 2008. - Vol.84, № 4. - Р.949-957.

14. Pearce E.L. Metabolism in T cell activation and differentiation // Curr. Opin. Immunol. - 2010. - Vol.22, № 3. - Р.314-320.

15. Volpe R. Autoimmune diseases of the Endokrine System // Boca Raton. - 1990. - 364 р.

Таблица 1

Концентрация тиреоидных, тиреотропного гормонов и АТ-ТПО в сыворотке крови больных диффузным токсическим зобом в процессе

лечения Ме [25;75]

Показател ь Здоров ые 1 Больные ДТЗ р

до лечения 2 через 1 месяц лечения 3 через 3 месяца лечения 4

n 98 35 35 35

Т3, нмоль/л 1,72 [1,50;2,02] 5,80 [3,86;7,07] 2,53 [1,80;3,16] 2,40 [1,93;2,60] ри<0,001 ри<0,001 р2,3<0,001 р1,4<0,001 р2,4<0,001

св.Т4, пмоль/л 14,9 [13,1;15,6] 49,4 [38,6;64,9] 18,1 [8,6;22,4] 12,3 [10,0;14,3] р1,2<0,001 р2 3<0,001 р!,4<0,01 р2,4<0,001 0,1>р3>0, 05

ТТГ, мкЕд/мл 1,19 [0,86;1,51] 0,09 [0,06;0,11] 0,11 [0,08;0,15] 0,61 [0,09;3,68] р1,2<0,001 р2,3<0,05 р2,4<0,001

АТ-ТПО, мЕд/л о °, о [0, 79,0 [7,0;243,0] 78,0 [12,0;300,0] 40,0 [5,0;216,0] р1,2<0,001 р1,3<0,001 рх,4<0,001

8G

6G

4G

2G

G

Pl,3<0,05 _

T *

t « J

н

° 5 4

а з ° 2 1 G

<

s

Ї

300

2GG

1GG

^ G

Pl,3< >,01

* •  *

L.

0

Ч

< И 1 '6

£ s и

еа

s

н

а

<

6G

4G

2G

22G

17G

12G

7G

2G

Pl,3<0,05

1 t 1

1 * i I

12G

^ 8G

4G

Рис. 1. Активность НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в

лимфоцитах крови у больных ДТЗ в процессе лечения.

Здесь и далее: сплошная линия - контроль; группы больных ДТЗ: 1 - до лечения, 2 - через 1 месяц после начала терапии, 3 - через 3 месяца после начала терапии,

* -достоверные различия с группой контроля.

з

1

2

з

*

1

2

з

1

2

з

G

1

2

з

1

2

з

80 “ 60 * 40 20

s

0

f

i

100

80

60

40

20

0

T ' Р1,3<0,01

1 .

*

1 II

i

16

12

8

4

0

tn

4 L.

X 0

4

и

A «

H u о Я ва s н a <

400

300

100

0

i=4

t

Рис. 2. Активность НАД- и НАДФ-зависимых глутаматдегидрогеназ в лимфоцитах крови у больных ДТЗ в процессе лечения.

*

1

2

3

1

2

3

*

ж

ж

1

2

3

1

2

3