Анализ роли цитрата и ЭДТА в регуляции поступления кадмия и обмена минеральных катионов у растений фасоли

УДК 581.133.1 ВестникСПбГУ. Сер. 3,2006, вып. 2

Н. Г. Осмоловская, Е. М. Лукашева, 3. К. Кудряшова, Е. О. Смирнова

АНАЛИЗ РОЛИ ЦИТРАТА И ЭДТА В РЕГУЛЯЦИИ ПОСТУПЛЕНИЯ КАДМИЯ И ОБМЕНА МИНЕРАЛЬНЫХ КАТИОНОВ У РАСТЕНИЙ ФАСОЛИ

Введение. Загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами (ТМ), ведущее к их аккумуляция в растениях, представляет серьезную экологическую проблему [1, 2, 4]. Кадмий относится к числу наиболее токсичных металлов [9, 14]. В отличие от многих других ТМ он находится в почвах преимущественно (на 55-90%) в свободной ионной форме, что определяет его высокую подвижность и легкость передвижения по пищевым цепям [9]. Согласно современным представлениям кадмий поступает в растения не специфически, а конкурируя с другими ионами, предположительно при участии транспортных систем Fe, Zn или Cu при его низких внешних концентрациях и через Са- или Mg-каналы - при более высоких концентрациях [6, 7, 9]. В то же время, имеются данные, что поглощение кадмия усиливается при возрастании уровня хлорида в среде, что связывают с возможностью формирования комплексов CdCI„" 1 и их поступлением в растения [4, 5, 9, 12], однако механизм транспорта подобных комплексов через плазматическую мембрану остается невыясненным [9]. Достаточно противоречивыми являются и сведения, касающиеся формирования комплексов кадмия с органическими хелаторами [4, 5, 8, 9]. В отношении ряда ТМ (Fe, Cu, Pb) показан положительный эффект внесения в почву таких природных или синтетических хелаторов, как цитрат или ЭДТА, для усиления извлечения этих металлов из загрязненных почв и повышения их аккумуляции в надземных органах растений в целях фиторемедиации среды [2, 11]. Данные, сообщаемые разными авторами в отношении кадмия, весьма неоднозначны и свидетельствуют как об усилении, так и об ослаблении его аккумуляции в растениях под влиянием хелаторов [5, 10, 13]. В этой связи в задачу настоящего исследования входило изучение действия хелаторов цитрата и ЭДТА на аккумуляцию кадмия в органах растений фасоли и их влияния на обмен минеральных катионов в растениях.

Материалы и методы исследования. Объектом исследования служили растения фасоли спаржевой Phaseolus vulgaris L. сорта Сакса без волокна 615, которые выращивали в водной культуре в условиях фитостата при фотопериоде 14/10 ч и температуре 24/18 °С. Питательный раствор для выращивания растений содержал основные минеральные катионы и анионы (К+, Са2+, Mg2+, Na\ N03~, Н:РО<-, сг, so43o в концентрациях 2,5 мг-экв/л с добавлением микроэлементов (мкмоль/л): Fe - 90; Мп - 7; Zn - 0,7; Cu - 0,8.

Семена фасоли предварительно замачивали на 4 ч в 1%-ном растворе КМп04 и далее проращивали в гравии в световой установке, используя для полива дистиллированную воду. 14-суточные проростки фасоли пересаживали в 3 л сосуды, заполненные питательным раствором, по три растения на сосуд, и помещали в фитотрон в те же световые и микроклиматические условия, что и ранее. Постоянную аэрацию корней в сосудах с раствором осуществляли автоматически с помощью микрокомпрессорной системы. Для эксперимента использовали 21-суточные растения, которые переводили в опытный режим питания. Время экспозиции - 7 суток. В качестве источника кадмия в опытах использовали CdS04 в концентрациях 30 и 100 мкмоль/л. Хелаторы ЭДТА и цитрат в концентрации соответственно 2,5 и 2,0 ммоль/л вносили в растворы в виде их комплексов с Na.

По окончании опыта растения расчленяли на органы, взвешивали и для дальнейших анализов отбирали пробы корней, нижних и верхних листьев. Материал фиксировали в термостате при 105 °С в течение 1 ч, а затем доводили до абсолютно сухого веса при 60 °С и измельчали. Для проведения анализов навески растительного материала (0,1 г) озоляли в 5 мл смеси (4:1) концентрированных азотной и хлорной кислот, полученный остаток разводили водой до 25 мл и использовали для последующих определений Cd, К, Са. Содержание кадмия в пробах определяли на атомно-абсорбционном спектрофотометре AAS-3 (при содействии ЭУНЦ НИИ Земной Коры СПбГУ). Содержание калия и кальция определяли на пламенном фотоморе FLAPHO-4 фирмы Carl Zeiss. Полученные данные обрабатывались статистически с использованием программы Excel ХР Professional.

Результаты исследований и их обсуждение. Результаты опыта показали, что внесение в питательный раствор кадмия в концентрациях 30 и 100 мкмоль/л привело к значительному торможению

© Н. Г. Осмоловская. Е. М. Лукашева, 3. К. Кудряшова, Е. О. Смирнова, 2006

роста растений, что выразилось в снижении веса сырой биомассы корней ло 60 и 56,5% к контролю, а листьев - до 51,1 и 47.8% соответственно (рис. 1). Эффект, вызываемый добавлением в растворы с кадмием Ма-ЭДТА или Х:а-цитрата. оказался различен. Использование в качестве хелатирующего агента Ыа-ЭДТА (2,5 ммоль/л) при содержании Сс1 в среде 30 мкмоль/л не только устранило негативные проявления действия кадмия на растения, но и оказало явное стимулирующее действие на формирование сырой биомассы, особенно листьев, которая возросла на 31% по сравнению с контрольным вариантом. Эффект использования цитрата был значительно ниже, и несмотря на некоторое улучшение роста растений их биомасса не превышала 70% к контролю (см. рис. 1).

Контроль СйЗО Сс130+ЭДТА СсИОО СсИОО+цитрат

Рис. 1. Влияние присугствия Сё и комплексонов в среде на формирование сырой биомассы растений фасоли.

Анализ содержания кадмия в органах фасоли подтвердил ранее установленный факт, что этот металл у фасоли аккумулируется в основном в корнях, где его концентрация в среднем на два порядка превышала аккумуляцию кадмия в листьях (таблица). В отсутствии хелаторов наблюдалась прямая зависимость накопления Сс1 в растениях от его концентрации во внешней среде, а именно, увеличение концентрации С<1 в растворе с 30 до 100 мкмоль/л, т. е. в 3,3 раза, сопровождалось ростом его аккумуляции в корнях в 3,2 раза. Внесение в раствор №-ЭДТА практически полностью блокировало поступление кадмия в растения, в то время как использование в качестве хелатирующего агента цитрата Ка привело лишь к незначительному (на 10,4%) снижению накопления кадмия в корнях фасоли (см. таблиц)). При этом достоверных отличий в аккумуляции кадмия листьями растений при использовании цитрата не наблюдалось.

Влияние содержания кадмия и комплексонов в среде на аккумуляцию кадмия в корнях и листьях фасоли

Органы рас гения Сё, 30 мкмоль/л Сс1, 100 мкмоль/л

Сё Са+ЭДТА Сс) С с1+цитрат

Корни 2885±130 25±4 9250±410 8294±380

Листья 21±3 6±1 51±7 49±6

Результаты исследования также показали, что содержание основных минеральных катионов в органах фасоли находится в зависимости от внесения кадмия в питательную среду в ионной форме или совместно с одним из хелаторов. При использовании кадмия в ионной форме характерным проявлением его токсического действия явилось резкое снижение уровня калия в клетках корней, о чем свидетельствуют данные, приведенные на рис. 2. При внесении кадмия в концентрации 30 мкмоль/л содержание К в корнях фасоли упало с 156 до 34 мг-экв. Введение в опытный раствор ЭДТА способствовало удержанию содержания калия в корнях на уровне, близком к контролю, и одновременно увеличивало поступление калия в листья. В опытах с применением более высокой концентрации Сё в

среде (100 мкмоль/л) уровень калия в корнях фасоли в отсутствии хелатора снижался еще более резко, в то время как в листьях содержание этого катиона несколько возрастало. Использование цитрата в качестве хелатирующего агента в данном случае не дало положительного эффекта, и, напротив, привело к еще большему снижению уровня калия в корнях.

160

ю 120

О

80

о о

£ Ц

о 5

40

а корни

0 нижние листья  верхние листья

К1 СсШ Сс!30+ЭДТА К2 Сс1100 СсЛОО+цитрат

Рис. 2. Влияние внесения ко.чплексонов в среду с Сс1 на содержание К в органах растений фасоли (Сё - 30 и 100 мкмоль/л, ЭДТА - 2,5 ммоль/л, цитрат - 2 ммоль/л).

К1, К2 - контроль (то же для рис. 3).

Различия, связанные с использованием цитрата или ЭДТА, наблюдались также в отношении аккумуляции кальция у растений, экспонированных на растворе с кадмием. Внесение ЭДТА способствовало снижению обшего содержания кальция в корнях вдвое по отношению к контролю, тогда как цитрат, напротив, увеличивал концентрации кальция как в корнях, так и в верхних листьях (рис. 3). Таким образом, характерные изменения уровней калия и кальция в корнях фасоли, обусловленные присутствием ионов кадмия в среде, практически нивелировались или ослаблялись в присутствии ЭДТА и, напротив, усиливались в присутствии цитрата.

- 100 -О

о

о

03 5 о

ю

80

о

X

о

о о

т— "2 с; о

60

40

20

го О

И корни

Ш нижние листья  верхние листья

К1 Сс130 Сс130+ЭДТА К2 Сс1100 Сс1100+цитрат

Рис. 3. Влияние внесения комплексонов в среду с Сс1 на содержание Са в органах растений фасоли (Сс1 - 30 и 100 мкмоль/л, ЭДТА - 2,5 ммоль/л, цитрат - 2 ммоль/л).

Таким образом, полученные данные достаточно убедительно свидетельствуют, что внесение синтетических или природных хелаторов в питательный раствор, содержащий ионы кадмия, может оказать различное действие на аккумуляцию кадмия и обмен катионов в растениях фасоли в зависимости от химической природы хелагирующего агента. В случае использования ЭДТА, по-видимому, имеет место перевод ионов кадмия в недоступную для растений форму посредством образования устойчивых комплексов Cd-ЭДТА, плохо транспортируемых через плазмалемму клеток корня. В результате блокирования притока ионов Cd~4 в корни устраняются вызываемые им в отсутствии хелато-ра нарушения катионного обмена у растений.

Отмеченное в случае использования цитрата лишь незначительное ограничение притока и аккумуляции кадмия в корнях фасоли дает основание полагать, что либо кадмий формирует неустойчивый экзогенный комплекс с цитратом, либо этот комплекс способен транспортироваться через клеточные мембраны. В литературе представлены данные, свидетельствующие как об ограничении поглощения кадмия в комплексе с цитратом [2, 10], так и об усилении фитоэкстракции кадмия в присутствии цитрата [5, 11], причем в последнем случае не исключается возможность мембранного транспорта комплекса Cd-цитрат при участии цитратного транспортера [5]. Тот факт, что внешние проявления кадмиевой токсичности и «утечка» калия из корней в наших опытах не предотвращались внесением цитрата, позволяет полагать, что, по крайней мере, часть поглощенного растениями кадмия находилась при этом в корнях фасоли в токсичной ионной форме.

Summary

Osmolovskciya У. С., L.ukasheva Е. М, Kudryashova Z. К., Smirnova Е. О. Analysis of citrate and EDTA role in regulation of Cd and mineral cations uptake in bean plants.

The effect of chelators EDTA and citrate on Cd and mineral cations accumulation by 21-days bean plants grown in a water culture is studied. EDTA (2,5 mmol/1) blocked Cd uptake and accumulation in roots along with prevention of potassium leakage from roots. Citrate (2 mmol/1) poorly inhibited Cd uptake and did not prevent potassium efflux. It is concluded that visible effect of EDTA could be caused by forming stable Cd-EDTA complexes badly transported across plasmalemma, whereas in the case of Cd-citrate exogene complex forming it could be unstable or capable for membrane transport via citrate transporter.

Литература

1. Автухович И. E. Индуцированная фитоэкстракция почвенного кадмия. М., 2003. 2.Галиу-лин Р. В., Галиулина Р. А. Фитоэкстракция тяжелых металлов из загрязненных почв // Агрохимия. 2003. №3. С. 77-85. 3. Челтыгмашева И. С., Черных Н. А. Качество растениеводческой продукции в условиях загрязнения тяжелыми металлами. М., 2004. 4. Arienzo М. Processes and factors regulating the behavior and uptake of trace elements in the rhizosphere // Trace and ultratrace elements in plants and soil / Ed. by I. Shtangeeva. Southampton, Boston, 2004. P. 69-96. 5. Berkelaar E., h'aie B. A. Accumulation of cadmium by durum wheat roots: bases for citrate-mediated exceptions to the free ion model // Environm. Toxicol. Chemistry. 2003. Vol.22, N5. P. 1155-1161. 6. Briat J.-F.. Lebrim M. Plant responses to metal toxicity // Plant biology and pathology. 1999. Vol. 322. P. 43-54. 7. Clemens S. Molecular mechanisms of plants metal tolerance and homeostasis // Planta. 2001. Vol.212, N4. P. 475-486. 8. Lombi E., Nolan A. Metal and arsenic bioavailability and uptake by hyperaccumulator plants // Trace and ultratrace elements in plants ana soil / Ed. by I. Shtangeeva. Southampton; Boston, 2004. P. 96-127. 9. Punshon Т., Neal A. L, Jackson B. P. Cadmium // Trace and ultratrace elements in plants and soil / Ed. by 1. Shtangeeva. Southampton: Boston, 2004. P. 171-208. 10.RomerW.. Kang D.-K.. EgleK., GerkeJ., Keller H. The acquisition of cadmium by Lupinus albus L., Lupinus angiistifolius L., and Lolium multiflomm Lam. // J. Plant Nutr. Soil Sci. 2000. Vol. 163, N6. P. 623-628. II. Salt D. E„ Smith R. D., Raskin 1. Phytoremediation // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Moi. Biol. 1998. Vol.49. P. 643-668. 12. Smolders E„ McLaughlin M. J. Effect of CI and Cd uptake by swiss chard in a nutrient solution // Plant and Soil. 1996. Vol.179. P. 57-64. 13. Stanhope K. G., Young S. D., Hutchinson J. J., Kamath R. Use of isotopic dilution techniques to assess the mobilization of nonlabile Cd by chelating agents in phytoremediation // Environ. Sci. Technol. 2000. Vol. 34, N 19. P. 4123-4127. 14. Sanita di Toppi L., Gabrielli R. Responses to cadmium in higher plants // Environmental and Experimental Botany. 1999. Vol. 41. P. 105-130.

Статья поступила в редакцию 1 декабря 2005 г.