ЭЛЕКТРОАНАЛИТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА НА ОСНОВЕ БИОСЕНСОРА КОНЦЕНТРИРУЮЩЕЙ КОЛОНКИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИЗКИХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ЛАКТАТА
ELECTROANALYTIC SYSTEM BASED ON ACCUMULATIVE COLUMN BIOSENSOR FOR DETERMINATION OF LOW LACTATE CONCENTRATIONS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к электроаналитическим системам. Электроаналитическая система включает проточный детектор типа wall-jet (работающий в режиме непрерывного потока) с интегрированным в него высокоэффективным лактатным биосенсором, относящимся к классу электрохимических биосенсоров, а также колонку для сорбционного концентрирования. Концентрирование основано на ионном обмене.
Уровень техники
Лактат является одним из наиболее важных химических соединений с точки зрения клинической диагностики. Он является маркером гликолиза, анаэробного метаболизма. приводящего к гибели тканей живого организма. Спортивная медицина рассматривает мониторинг лактата как средство определения так называемого «лактатного порога» [О. Faude, W. Kindermann, Т. Meyer. Lactate threshold concepts how valid are they? Sports Medicine 39 (2009) 469-90], [H. Heck, R. Beneke. 30 years of lactate thresholds - what remains to be done? Deutsche Zeitschrift Fur Sportmedizin 59 (2008) 297-302), показывающего уровень тренированности спортсмена. Лактат как продукт ферментации [S.Q. Liu. Practical implications of lactate and pyruvate metabolism by lactic acid bacteria in food and beverage fermentations. International Journal of Food Microbiology 83 (2003) 115-31] может служить маркером натуральности продуктов питания.
Не удивительно, что лактат-чувствительные электроды были в числе первых биосенсоров [D.L. Williams, A.R. Doig, A. Korosi. Electrochemical-enzymatic analysis of blood glucose and lactate. Analytical Chemistry 42 (1970) 118-21]. Впоследствии было разработано большое число лактатных биосенсоров [I. Karube, Т. Matsunaga, N. Teraoka, S. Suzuki. Microbioassay of phenylalanine in blood sera with a lactate electrode. Analytica Chimica Acta 119 (1980) 271-6], |M. Mascini, D. Moscone, G. Palleschi. A lactate electrode with lactate oxidase immobilized on nylon net for blood-serum samples in flow systems. Analytica Chimica Acta 157 (1984) 45-51], [F. Mizutani, К. Sasakl, Y. Shlmura. Sequential determination of l-lactate and lactate dehydrogenase with immobilized enzyme electrode. Analytical Chemistry 55 (1983) 35-8], [J.G. Schindler, M. Vongulich. L-lactate flow-through electrode with immobilized lactate oxidase. Fresenius Zeitschrift Fur Analytische Chemie 308 (1981) 434-6], [D.L. Wang, A. Heller. Miniaturized flexible amperometric lactate probe. Analytical Chemistry 65 (1993) 1069-73], включая последний, обладающий наилучшими аналитическими характеристиками [E.I. Yashina, A.V. Borisova, E.E. Karyakina. O.I. Shchegolikhina, M.Y. Vagin, D.A. Sakharov, A.G. Tonevitsky, A.A. Karyakin. Sol-gel immobilization of lactate oxidase from organic solvent: Toward the advanced lactate biosensor. Analytical Chemistry 82 (2010) 1601-4]. Тем не менее, для всех известных систем нижняя граница определяемых содержаний составляла не менее нескольких микромолей. Этого, в частности, недостаточно для анализа неинвазивно собираемого конденсата выдыхаемого воздуха, уровень лактата в котором, как сообщается в статье E.M. Marek et al., лежит в диапазоне единиц микромолей в литре [E.M. Marek, J. Volke, I. Hawener, P. Platen, K. Muckenhoff, W. Marek. Measurements of lactate in exhaled breath condensate at rest and after maximal exercise in young and healthy subjects. Journal of Breath Research 4 (2010)].
В целях улучшения аналитических характеристик методов анализа, а именно понижения предела обнаружения и повышения чувствительности и селективности широко используются методы концентрирования, основанные, в частности, на ионном обмене, когда определяемое вещество захватывается подходящим сорбентом в картридже или колонке, а затем десорбируется и определяется уже в десорбате [Jia Q., Kong X., Zhou W., Bi L. Flow-injection on-line preconcentration with an ion-exchange resin coupled with microwave plasma torch-atomic emission spectrometry for the determination of trace rare earth elements. Microchemistry 89 (2008) 82-87]. Подобные методы отличаются простотой аппаратурного оформления, дешевизной и возможностью автоматизации.
Аналогом изобретения является система проточно-инжекционного анализа (ПИА) на основе лактатного биосенсора с наилучшими аналитическими характеристиками, описанная в работе [E.I. Yashina, A.V. Borisova, E.E. Karyakina, O.I. Shchegolikhina, M.Y. Vagin, D.A. Sakharov, A.G. Tonevitsky, A.A. Karyakin. Sol-gel immobilization of lactate oxidase from organic solvent: Toward the advanced lactate biosensor. Analytical Chemistry 82 (2010) 1601-4]. Данная электроаналитическая система на основе биосенсора состоит из двух перистальтических насосов, петли инжектора, проточной амперометрической ячейки типа wall-jet с интегрированным биосенсором, потенциостата.
Как уже сказано, существующие лактатные биосенсоры и электроаналитические системы на их основе не обладают достаточной чувствительностью для неинвазивной диагностики и, в частности, анализа конденсата выдыхаемого воздуха. Кроме того, пероксид водорода, являющийся медиатором большинства биосенсоров, включая описанный в прототипе, входит в состав многих реальных объектов и может искажать результаты определения низких концентраций веществ. Таким образом, существует также необходимость повышения селективности анализа.
Раскрытие изобретения
Задачей, решаемой авторами настоящего изобретения, является разработка электроаналитической системы для определения лактата, позволяющей определять низкие концентрации лактата. Технический результат данного изобретения состоит в повышении селективности и чувствительности определения, снижении предела обнаружения лактата. Предложенная система позволяет осуществлять неивазивное определение концентрации лактата, например, при использовании в качестве исследуемого образца пота или мочи. Указанный технический результат достигается за счет того, что в инжекционную петлю дополнительно включена концентрирующая колонка.
Предложенное изобретение представляет собой электроаналитическую проточно-инжекционную систему, включающую систему перекачивания жидкости, содержащий петлю инжектор, проточную электрохимическую ячейку с интегрированным лактатным биосенсором, потенциостат и регистратор сигнала, отличающуюся тем, что для повышения чувствительности и селективности анализа в петлю инжектора включена концентрирующая колонка.
Несмотря на кажущуюся простоту системы, сочетание сорбционной концентрирующей колонки с биосенсором представляло крайне сложную задачу. Сложность разработки настоящего изобретения заключается в том, что, с одной стороны, ионный обмен мало селективен, а лактат представляет собой довольно маленькую гидрофильную молекулу, поэтому подобрать селективный метод концентрирования для него крайне сложно. С другой стороны, лактатный биосенсор чувствителен к любым изменениям ионной силы. Для разработки электроаналитической системы и преодоления данных затруднений тщательно выбирались схема лабораторной установки и условия проведения экспериментов. А именно, была изучена возможность использования нескольких ионнообменных сорбентов; установлено, что наиболее эффективная сорбция лактата наблюдается при использовании ионообменных сорбентов, способных хорошо удерживать лактат, в частности сорбента Strata SAX - силикагель с привитыми четвертичными аммониевыми группами.
Согласно настоящему изобретению может быть оптимизирован объем колонки для концентрирования, т.к. при выборе слишком большой колонки возникают проблемы на стадии сорбции, а при использовании маленькой - низкая степень извлечения. Так же может быть оптимизирован состав десорбирующего раствора для количественной сорбции лактата, который не затрудняет определение лактата с помощью биосенсоров. В частном варианте воплощения был оптимизирован объем пропускаемого раствора на всех стадиях, скорость потока, длина колонки - 10 мм, диаметр - 2 мм.
Предлагаемая электроаналитическая система с предварительным концентрированием схематически изображена на Фигуре. 1. Она состоит из системы перекачивания жидкости (в качестве которой могут быть использованы два перистальтических насоса), инжектора, проточной электрохимической ячейки с включенным лактатным биосенсором,  подключенным к потенциостату и регистратору сигнала. В петлю инжектора включена колонка для концентрирования. В частном варианте воплощения настоящего изобретения в качестве электрохимической ячейки может быть использована амперометрическая проточная ячейка. В качестве лактатного биосенсора может быть использован, например, планарный электрод, модифицированный Берлинской лазурью с иммобилизованным ферментом лактатоксидазой.
Согласно настоящему изобретению в качестве регистратора сигнала может быть использовано любое устройство, обеспечивающее возможность считывания сигнала, в частности персональный компьютер.
Электроаналитическая система работает следующим образом. В ходе эксперимента перистальтический насос (2) непрерывно прокачивает через систему фоновый электролит из сосуда (9). При положении ручки инжектора (3) в режиме «загрузка» перистальтический насос (1) прокачивает анализируемый раствор из сосуда (7) через концентрирующую колонку (6), включенную в петлю инжектора (3), при этом лактат из анализируемого раствора сорбируются на анионообменнике, заполняющем колонку (6). После того как аликвота анализируемого раствора пройдет через концентрирующую колонку (6) и уйдет в слив (8), ручка инжектора поворачивается в режим «инжекция», при этом перистальтический насос (2) прокачивает фоновый электролит из сосуда (9) через концентрирующую колонку (6). На этой стадии происходит десорбция лактата, который в концентрированном по отношению к исходному анализируемому раствору виде прокачивается до лактатного биосенсора в проточной амперометрической ячейке (4). При этом потенциостат (5) регистрирует пик на амперограмме.
Изобретение иллюстрируется приведенными ниже примерами.
Краткое описание чертежей
На Фигуре 1 схематически изображен частный вариант предлагаемой электроаналитической системы с предварительным концентрированием. Она состоит из двух перистальтических насосов (1) и (2), инжектора (3), проточной амперометрической ячейки с включенным лактатным биосенсором (4), подключенным к персональному компьютеру потенциостата (5). В петлю инжектора (3) включена колонка для концентрирования (6). Другие позиции на чертеже: (7) - сосуд для анализируемого раствора; (8) - слив; (9) - сосуд для фонового электролита, выполняющего также роль десорбирующего раствора.
На Фигуре 2 представлены градуировочные зависимости аналитического сигнала от концентрации лактата в образцах для электроаналитической системы на основе лактатного биосенсора с концентрированием и без него.
Осуществление изобретения
Пример 1. Определение лактата в системе проточно-инжекционного анализа с предварительным концентрированием.
2
4
Эксперименты проводили в системе ПИА в фосфатном буфере (0.1М KCl, 0.05М KHPO, pH 6.0). Скорость потока буферного раствора 0.40 мл/мин. Рабочий потенциал 0.0 В отн. ХСЭ (хлорсеребряного электрода).
Градуировочные зависимости аналитического сигнала от концентрации лактата в образцах для электроаналитической системы на основе лактатного биосенсора с концентрированием и без него представлены на Фиг.2. Видно, что система ПИА с концентрированием обеспечивает повышение чувствительности в среднем в 50 раз и понижение предела обнаружения более чем на порядок.
-3
Согласно имеющимся данным, концентрация пероксида водорода в конденсате выдыхаемого воздуха (КВВ) не превышает 5,0×10 М.
Пример 2. Повышение селективности (на примере образна потовой пробы).
2
4
Эксперименты проводили в системе ПИА в фосфатном буфере (0.1М KCl, 0.05М KHPO, pH 6.0). Скорость потока буферного раствора 0.40 мл/мин. Рабочий потенциал 0.0 В отн. ХСЭ.
Повышение селективности (на примере образца потовой пробы)
Анализируемая проба
Разбавление, раз
Метод
С лактата, М
Пот
500
ПИА (P=0.95, n=4)
(3.4±0,1)×10<sup>-2</sup>
Пот + 2×10<sup>-4</sup> MH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
(4.6±0,3)×10<sup>-1</sup>
Пот
25000
ПИА+конц-е (Р=0.95, n=3)
(3.3±0,5)×10<sup>-2</sup>
Пот + 2×10<sup>-3</sup> MH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
(3.4±0,6)×10<sup>-2</sup>
Как видно из таблицы, пероксид водорода даже в значительном количестве не мешает определению лактата в системе ПИА с концентрированием.
Таким образом, достигнут заявленный технический эффект (повышение селективности и чувствительности определения, снижение предела обнаружения).