ХИМЕРНЫЙ АНТИГЕННЫЙ РЕЦЕПТОР, КОТОРЫЙ СВЯЗЫВАЕТ HLA-DR, И CAR-T-КЛЕТКА
HLA-DR-BINDING CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR AND CAR-T CELL

Область техники
[0001] Настоящее изобретение относится к химерным антигенным рецепторам и CAR-T-клеткам, которые связывают HLA-DR.
Уровень техники
[0002] Т-клетки, полученные для экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR), обладают высоким терапевтическим потенциалом в лечении рака (Grupp et al., 2013; Kochenderfer et al., 2010, 2015; Porter et al., 2011).
[0003] Клиническая эффективность этих клеток является результатом гибридной структуры CAR, в которой искусственно связаны различные сигнальные домены и антигенсвязывающие домены с различной авидностью (Maus et al., 2014; van der Stegen et al., 2015).
[0004] CAR относится к синтетическим молекулам на основе внеклеточно экспрессируемого антигенсвязывающего домена, который распознает антиген-мишень, включающего сайт узнавания, трансмембранный домен (модуль), один или более костимулирующих сигнальных доменов и химерный внутриклеточный сигнал, который несет сигнал активации (Jensen and Riddell, 2015).
[0005] Связывание Т-клеток, имеющих CAR, с эпитопами опухолевых клеток не зависит от главного комплекса гистосовместимости (MHC) и может индуцировать апоптоз и гибель опухолевых клеток посредством механизма действия цитотоксических Т-клеток (Ramos and Dotti, 2011).
[0006] В последние годы CAR-T, нацеленные на CD19 (кластер дифференцировки 19), показали значительные результаты в лечении пациентов с рецидивирующим/рефрактерным острым лимфоцитарным лейкозом (ALL) (Kochenderfer J.N. et al. (2010) Blood 116: 4099-4102; Porter D. L. et al. (2011) N. Engl. J. Med., 365: 725-733; Grupp S.A. et al. (2013) N. Engl. J. Med., 368: 1509-1518; Kochenderfer J.N. et al. (2015) J. Clin. Oncol., 33: 540-549; Brown C.E. et al. (2016) N. Engl. J. Med., 375: 2561-2569).
[0007] Несмотря на то, что терапия CD19 CAR-T-клетками была эффективной в лечении рецидивирующей/рефрактерной В-клеточной неходжкинской лимфомы, частота объективного ответа была повышена с 20-30% до 79%, с полной ремиссией в 30-50% случаев. Данный показатель в 7 раз превышает предыдущие результаты (Crump et al., 2016; Locke et al., 2017).
[0008] Для варианта рецептора злокачественных опухолей (MVR), используемого в данном описании, спленоциты выделяли от мышей Balb/c, многократно иммунизированных клетками B-клеточной лимфомы человека и гибридизировали с клетками миеломы SP2/0 для получения пулов гибридом, и анти-MVR гибридомы отбирали из пула гибридом, которые специфически реагировали только на В-клеточную лимфому и проявляли высокую реактивность (WO2016-094304).
[0009] CD19 экспрессируется как в нормальных, так и в опухолевых клетках, таким образом, антитело к CD19 не может точно различить нормальные клетки и опухолевые клетки, но антитело к MVR может точно различать нормальные и опухолевые клетки, тем самым обеспечивая высокий терапевтический эффект и безопасность (Han et al., 2018).
[0010] Существует проблема, заключающаяся в том, что CAR-T-клетки не продуцируются из определенных T-клеток типа HLA-DR, обладающих высокой аффинностью. Для улучшения это, в настоящем патенте были приготовлены антитела, обладающие различной аффинностью связывания, и, наконец, было выбрано антитело, подходящее в качестве терапевтического средства на основе CAR-T-клеток.
[0011] Настоящее изобретение представляет собой патент, разработанный для обеспечения различных аффинностей связывания с антигеном за счет изменения последовательности мышиного анти-MVR-антитела; ожидается, что само антитело можно использовать в качестве терапевтического агента или его можно использовать в терапевтических средствах с использованием антитела (CAR-T-клеточные терапевтические средства) и т.п. Кроме того, для антитела по настоящему изобретению получено гуманизированное антитело с использованием мышиного анти-MVR-антитела для минимизации иммуногенности. Кроме того, при обнаружении антител, имеющих различную аффинность связывания, можно ожидать, что продукция CAR-T превосходит продукцию родительского антитела при применении CAR-T, и может применяться к терапевтическим средствам на основе CAR-T-клеток для лечения рака крови.
Подробное описание изобретения
Техническая проблема для решения
[0012] Целью настоящего изобретения является обеспечение MVR, который может применяться в клинической практике, и обеспечение CAR-T-клеток, обладающих высоким терапевтическим эффектом. В частности, настоящее изобретение относится к костимулирующему домену, который можно ввести в различные CAR-T-клетки в качестве костимулирующего домена, который играет основную роль в его функции в CAR-T-клетках второго поколения. Кроме того, целью настоящего изобретения является обеспечение различных антигенсвязывающих доменов, которые способны связываться с антигенами, экспрессируемыми на поверхности определенных раковых клеток, и способны образовывать CAR-T-клетки.
Средства решения технической проблемы
[0013] 1. Антигенсвязывающая молекула, содержащая вариабельную область тяжелой цепи, включающую определяющий комплементарность участок тяжелой цепи 1 (HCDR1), содержащий аминокислотную последовательность, представленную последовательностью № 1, HCDR2, содержащий аминокислотную последовательность, представленную последовательностью № 2, и HCDR3, содержащий аминокислотную последовательность, представленную последовательностью № 3; вариабельную область легкой цепи, включающую определяющий комплементарность участок 1 легкой цепи, (LCDR1), содержащий аминокислотную последовательность, представленную последовательностью № 4; LCDR2, содержащий аминокислотную последовательность, представленную последовательностью № 5; и LCDR3, содержащий аминокислотную последовательность, представленную последовательностью № 6; где антигенсвязывающая молекула представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR).
[0014] 2. Антигенсвязывающая молекула в соответствии с п.1, содержащая вариабельную область тяжелой цепи, представленную последовательностью № 7, и вариабельную область легкой цепи, представленную последовательностью № 8.
[0015] 3. Антигенсвязывающая молекула в соответствии с п.1, содержащая аминокислотную последовательность, представленную последовательностью № 9.
[0016] 4. Антигенсвязывающая молекула в соответствии с п.1, дополнительно содержащая аминокислотную последовательность, представленную последовательностью № 13.
[0017] 5. Антигенсвязывающая молекула в соответствии с п.1, дополнительно содержащая аминокислотную последовательность, представленную последовательностью № 14.
[0018] 6. Антигенсвязывающая молекула в соответствии с п.1, дополнительно содержащая трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен для активации Т-клеток.
[0019] 7. Антигенсвязывающая молекула в соответствии с п.6, где указанный трансмембранный домен выбран из группы, состоящей из альфа-цепи Т-клеточного рецептора, бета-цепи Т-клеточного рецептора, дзета-цепи Т-клеточного рецептора, CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD 137 и CD154, где указанный внутриклеточный сигнальный домен представляет собой сигнальный домен CD3дзета и костимулирующий сигнальный домен.
[0020] 8. Антигенсвязывающая молекула в соответствии с п.7, где костимулирующий сигнальный домен выбран из группы, состоящей из CD28, OXO40, CD27, ICAM-1, CD278 и CD137.
[0021] 9. Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует антигенсвязывающую молекулу в соответствии с любым из пп.1-8.
[0022] 10. Экспрессионный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии с п.9.
[0023] 11. Клетка, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии с п.9.
[0024] 12. Клетка в соответствии с п.11, которая является Т-клеткой.
[0025] 13. Клетка по п.12, где Т-клетки представляют собой CD8+ Т-клетки и/или CD4+ Т-клетки.
[0026] 14. Клетка в соответствии с п.11, которая представляет собой Т-клетку, модифицированную химерным рецептором антигена (CAR-T).
[0027] 15. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая клетку в соответствии с п.11 в качестве фармацевтически эффективного ингредиента.
[0028] 16. Фармацевтическая композиция в соответствии с п.15, где рак представляет собой аденокарциному пищевода, колоректальный рак, меланому, меланому глаза, мелкоклеточный рак легкого, нейробластому, тератому, фетальный рак, плоскоклеточную карциному, плоскоклеточную карциному головы и шеи, тимому, лимфолейкоз, B-клеточную лимфому, диффузную B-крупноклеточную лимфому, лейкоз, острый миелоидный лейкоз и т.п.
[0029] 17. Способ лечения рака, включающий стадию введения пациенту, страдающему раком, фармацевтической композиции, содержащей Т-клетку, содержащую терапевтически эффективное количество антигенсвязывающей молекулы в соответствии с любым из пп.1-8.
[0030] 18. Способ лечения рака в соответствии с п.17, где фармацевтическая композиция содержит CD8+ Т-клетки или содержит CD4+ Т-клетки и CD8+ Т-клетки.
[0031] 19. Способ лечения рака в соответствии с п.18, где соотношение количества CD4+ Т-клеток к CD8+ Т-клеткам составляет в основном 1:1.
[0032] 20. Способ получения Т-клетки с модифицированным химерным антигенным рецептором (CAR-T) для лечения рака, включающий стадию трансфекции Т-клетки нуклеиновыми кислотами, которые кодируют антигенсвязывающую молекулу, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, включающую определяющий комплементарность участок 1 тяжелой цепи (HCDR1), содержащий аминокислотную последовательность, представленную последовательностью № 1, HCDR2, содержащий аминокислотную последовательность, представленную последовательностью № 2, и HCDR3, содержащий аминокислотную последовательность, представленную последовательностью № 3; вариабельную область легкой цепи, включающую определяющий комплементарность участок легкой цепи 1 (LCDR1), содержащий аминокислотную последовательность, представленную последовательностью № 4, LCDR2, содержащий аминокислотную последовательность, представленную последовательностью № 5, и LCDR3, содержащий аминокислотную последовательность, представленную последовательностью № 6; где антигенсвязывающая молекула представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR).
[0033] 21.Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая в качестве фармацевтически эффективного ингредиента Т-клетки, содержащие антигенсвязывающую молекулу в соответствии с любым из пп.1-8.
[0034] 22. Фармацевтическая композиция в соответствии с п.21, где фармацевтическая композиция содержит CD8+ Т-клетки или содержит CD4+ Т-клетки и CD8+ Т-клетки.
[0035] 23. Терапевтическая фармацевтическая композиция в соответствии с п.18, где соотношение количества CD4+ Т-клеток к CD8+ Т-клеткам составляет в основном 1:1.
Эффект изобретения
[0036] В случае MVR, разработанного в настоящем изобретении, повышенный уровень HLA-DR может избирательно распознаваться в опухолевых клетках, и когда CAR-T-клетки получены с его использованием, то MVR демонстрирует высокую эффективность in vitro и высокую эффективность на животных.
[0037] Также имеется эффект повышения эффективности за счет добавления пяти аминокислот к обычному костимулирующему домену 4-1BB.
Краткое описание фигур
[0038] На фиг. 1 показана соответствующая аминокислотная последовательность VH мышиного анти-MVR-антитела и 2 полученных гуманизированных антител (huMVR.L1H1, huMVR.L2H2).
[0039] На фиг. 2 показана соответствующая аминокислотная последовательность VL мышиного анти-MVR-антитела и 2 полученных гуманизированных антител (huMVR.L1H1, huMVR.L2H2).
[0040] На фиг. 3 показаны результаты анализа авидности muMVR и 2 гуманизированных антител (huMVR.L1H1, huMVR.L2H2).
[0041] На фиг. 4 показано молекулярное моделирование и прогнозирование «горячих точек» аффинности гуманизированного антитела huMVR.M2H2, которое представляет собой MVR.
[0042] На фиг. 5 показаны результаты анализа авидности 15 типов мутантов, для которых был использован метод «горячих точек» аффинности.
[0043] На фиг.6а схематически показаны конструкции CD19 CAR, CD19CAR_euCD137 и huMVR.L2H2CAR_euCD137. В CD19CAR использовали 214-255aa домена 4-1 (CD137) в костимулирующем домене, и CD19CAR_euCD137 и huMVR.L2H2CAR_euCD137 использовали 209-255aa в домене 4-1 (CD137).
[0044] На фиг.6b показаны лентивирусные векторы и соответствующие гены, показывающие основные функции CAR-T-клеток и последовательность гена конструкции CD19 CAR. В частности, показана лидерная последовательность CD8, включая промотор EF1 альфа, scFv huMVR.L2H2, шарнир CDα и трансмембранный домен CD8 человека, и сигнальные домены 4-1BB и CD3дзета для повышения уровня экспрессии CAR. Также показаны соответствующие гены, необходимые для получения безопасных лентивирусов.
[0045] На фиг.7 показаны лентивирусные векторы и соответствующие гены, показывающие основные функции CAR-T-клеток и последовательность гена конструкции CD19 CAR. В частности, показана лидерная последовательность CD8, включая промотор EF1-альфа, scFv MVR.L2H2, шарнир CDα и трансмембранный домен CD8 человека, и сигнальные домены 4-1BB и CD3дзета для повышения уровня экспрессии CAR. Также показаны соответствующие гены, необходимые для получения безопасных лентивирусов.
[0046] На фиг.8 показан способ получения MVR CAR-T-клеток.
[0047] На фиг. 9 показаны результаты экспериментов, подтверждающие апоптотическую функцию MVR CAR-T in vitro.
[0048] На фиг. 10 показан уровень продукции и результаты оценки эффективности для двух типов CD19 CAR-T-клеток, в которые были введены CD19CAR и CD19CAR_euCD137. A: через 14 суток после получения 2 CD19 CAR-T-клеток, CD8 и CAR-T были окрашены, и показана доля продукции CAR-T с использованием FACS. B: показано сравнение цитотоксичности соответствующего CAR-T после проведения анализа с люциферазой через 4 ч после взаимодействия 2 видов полученных CAR-T с мишенью.
[0049] На фиг. 11 показана экспрессия HLA-DR в клеточной линии и авидность scFv huMVR L2H2 с использованием FACS перед оценкой эффекта huMVR CAR-T на животной модели.
[0050] На фиг. 12 показана оценка эффективности, проведенная на животной модели с использованием линии CAR-T-клеток, после определения доли продукции CAR-T-клеток и цитотоксичности с использованием клеточной линии, представленной на фиг. 9. A: результаты использования устройства для визуализации IVIS для оценки эффективности CAR-T после воспроизведения подкожной опухолевой модели на животных с подкожным введением мышам линии опухолевых клеток, экспрессирующих люциферазу. B: результаты оценки и графическое изображение фотонных значений для каждой мыши после визуализации.
[0051] На фиг. 13 показана доля и абсолютное количество CAR-T, находящихся в крови, с использованием FACS после отбора крови из орбитального венозного синуса у мышей с 3-4-дневными интервалами. A: график, показывающий общую долю CD19 CAR-T в крови, с помощью окрашивания FACS клеток CD8+/CAR+. B: график, показывающий долю CD8 и CD4 CAR-T после подтверждения общей доли CAR-T. C: график, показывающий количество CAR-T-клеток, находящихся в крови, с использованием счетных гранул FACS во время окрашивания FACS.
[0052] На фиг. 14 показаны результаты оценки эффективности CD8 huMVR CAR-T и CD4/CD8 huMVR CAR-T с использованием внутрибрюшинной опухолевой модели на животных. A: результаты визуализации IVIS эффектов CD8 huMVR CAR-T и CD4/CD8 huMVR CAR-T после воспроизведения животных моделей введением клеток опухолевых линий, экспрессирующих люциферазу, в брюшную полость мыши. B: графики, показывающие фотонные значения опухолевых клеток на животной модели при введении в брюшную полость.
[0053] На фиг. 15 показаны результаты оценки эффективности MVR CAR-T с использованием животной модели. A: результаты визуализации IVIS, показывающие эффект MVR CAR-T после воспроизведения животных моделей введением мышам клеток опухолевых линий, экспрессирующих люциферазу. B: графики, показывающие размеры опухолей, развившихся после подкожной прививки, после измерения автоматическими штангенциркулями.
[0054] На фиг. 16 представлен график, показывающий жизнеспособность мышей в каждой группе на основе фиг. 15.
[0055] На фиг. 17 показана доля и количество CAR-T, находящихся в крови, с использованием FACS после отбора крови из орбитального венозного синуса у мышей с 3-4-дневными интервалами после введения MVR CAR-T. A: график, показывающий долю hCD45+/CAR+ клеток в крови мышей. B: график, показывающий количество клеток MVR CAR-T в крови мышей, с использованием счетных гранул FACS во время окрашивания FACS.
Наилучший способ осуществления изобретения
[0056] Настоящее изобретение относится к клетке, экспрессирующей химерный антигенный рецептор, фармацевтической композиции, содержащей его, и способу лечения рака с его использованием.
[0057] В рамках настоящего изобретения, термин «химерный антигенный рецептор (CAR)» относится к антигенсвязывающему домену, который функционирует через рецептор, экспонированный на внешней стороне клетки и распознающий молекулу-мишень; включающий один или более шарнирных доменов или спейсерных доменов; трансмембранные домены; один или более внутриклеточных костимулирующих сигнальных доменов; и внутриклеточный стимулирующий домен.
[0058] В рамках настоящего изобретения, термин «Т-клетка» относится к лимфоцитам, происходящим из тимуса, и играет важную роль в клеточном иммунитете. Т-клетки включают CD4+ Т-клетки, CD8+ Т-клетки, Т-клетки памяти, регуляторные Т-клетки, естественные Т-клетки-киллеры и т.п. В одном варианте осуществления настоящего изобретения Т-клетки, в которые вводится CAR, представляют собой CD8+ Т-клетки или CD8+ Т-клетки и CD4+ Т-клетки.
2
2
[0059] В рамках настоящего изобретения, термины «антитело» и «антигенсвязывающий белок» могут использоваться взаимозаменяемо, и «антигенсвязывающий белок» по настоящему изобретению охватывает не только полную форму антитела, но также функциональные фрагменты молекулы антитела. Полное антитело представляет собой структуру, имеющую две полноразмерные легкие цепи и две полноразмерные тяжелые цепи, и каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью дисульфидной связью. Функциональные фрагменты молекул антител относятся к фрагментам, обладающим антигенсвязывающей функцией, и включают Fab, F(ab'), F(ab'), Fv и т.п. Из этих фрагментов антител Fab имеет один антигенсвязывающий сайт со структурой, включающей легкую цепь, вариабельную область тяжелой цепи, константную область легкой цепи и первую константную область тяжелой цепи (CH1). Fab’ отличается от Fab тем, что он имеет шарнирную область, содержащую, по меньшей мере, один остаток цистеина на С-конце домена CH1 тяжелой цепи. F(ab')антител получают образованием дисульфидных связей между остатками цистеина в шарнирной области Fab'.
2
[0060] Рекомбинантные методы создания фрагментов Fv с минимальным количеством фрагментов антител, в которых Fv имеет только вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, раскрыты в опубликованных международных патентных заявках WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 и WO 88/09344. Двухцепочечный Fv (dsFv) представляет собой связанные дисульфидной связью Fv-фрагменты, где вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи связаны, и короткоцепочечный Fv (scFv) обычно ковалентно связан с вариабельной областью тяжелой цепи и легкой цепи через пептидный линкер. Такие фрагменты антител могут быть получены с использованием протеолитических ферментов (например, полное антитело можно обработать папаином и получить Fab, и расщепление пепсином дает фрагмент F(ab')).
[0061] В рамках настоящего описания, HLA-DR (человеческий лейкоцитарный антиген-антиген D связанный) относится к молекуле класса II главного комплекса гистосовместимости (Shackelford D.A. et al., (1982) Immunol. Rev., 66: 133-187). HLA-DR, который представляет собой пептид из девяти или более аминокислот, и его лиганд представляет собой лиганд для TCR. Молекулы HLA-DR активируются в ответ на передачу сигналов. В случае инфекции пептиды (например, пептиды энтеротоксина I стафилококка) связываются с молекулой DR и поступают в ряд многочисленных Т-клеточных рецепторов, обнаруженных в Т-хелперных клетках. Эти клетки связываются с поверхностными антигенами В-клеток, которые стимулируют пролиферацию В-клеток.
[0062] Основная функция HLA-DR состоит в том, чтобы презентировать чужеродные пептидные антигены, которые первоначально отсутствовали в иммунной системе, для индукции или ингибирования ответа хелперных Т-клеток, чтобы вызвать продукцию антител к этому пептидному антигену. HLA-DR представляет собой α,β-димер и рецептор клеточной поверхности; каждая субъединица включает два внеклеточных домена, мембранный домен и цитоплазматический хвост. Обе α- и β-цепи присоединены к клеточной мембране. N-концевой домен зрелого белка образует альфа-спираль, которая составляет открытую часть связывающей группы, и С-концевая цитоплазматическая область взаимодействует с другими цепями с образованием бета-складок под связывающей группой через клеточную мембрану. Большинство контактных участков пептида находятся на первых 80 остатках каждой цепи.
[0063] HLA-DR экспрессируется в ограниченной степени в антигенпрезентирующих клетках, таких как дендритные клетки, макрофаги, моноциты и В-клетки. За счет того, что большого количества «антигенов» DR на поверхности клетки часто отвечает на стимулы, то DR также является маркером иммунного действия за счет высокой экспрессии HLA-DR в клеточных злокачественных новообразованиях и ограниченного спектра экспрессии в нормальных клетках; были разработаны антитела против HLA-DR и тестированы на B-клеточных злокачественных новообразованиях в доклинических и клинических исследованиях (Nagy Z.A. et al. (2002) Nat. Med., 8: 801-807; DeNardo G.L. et al. (2005) Clin. Cancer Res., 11: 7075s-7079s; Ivanov А. et al. (2009) J. Clin. Invest., 119: 2143-2159; Lin Т.S. et al. (2009) Leuk. Lymphoma, 50: 1958-1963). Несмотря на то, что серьезная токсичность не была установлена в фазе I/II клинических испытаний, дальнейшие исследования были остановлены за счет ограниченной эффективности (Lin T.S. et al. (2009) Leuk. Lymphoma, 50: 1958-1963). С учетом потенциала CAR-T-клеток в усилении терапевтической эффективности моноклональных антител посредством включения антигенной специфичности в масштабные Т-клеточные ответы, полагается, что HLA-DR-нацеленные CAR-T-клетки могут быть пригодными терапевтическими средствами для лечения В-клеточных злокачественных опухолей.
[0064] В одном варианте осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий белок включает scFv и имеет форму, в которой трансмембранный домен, костимулирующий сигнальный домен и внутриклеточный сигнальный домен функционально связаны. Для трансмембранного домена можно привести альфа-, бета- или дзета-цепь Т-клеточного рецептора или один или более из CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 или CD154, не ограничиваясь этим. Внутриклеточный сигнальный домен в основном представляет собой первичный сигнальный домен CD3дзета; в качестве костимулирующего сигнального домена можно использовать один или более из CD28, OXO40, CD27, ICAM-1, ICOS (CD278) и 4-1BB (CD137), но это не ограничивается этим. В одном варианте настоящего изобретения трансмембранный домен представляет собой CD8, и костимулирующий сигнальный домен представляет собой 4-1BB.
2
3
6
8
n
3
[0065] scFv по настоящему изобретению включает вариабельную область легкой цепи (VL) и вариабельную область тяжелой цепи (VH) и имеет структуру VL-VH или VH-VL, и VL и VH могут быть связаны напрямую или соединены через линкер. Когда используется линкер, то необязательно может быть использован линкер, известный в данной области, например, (GGGGS), (GGGGS), (Gly), (Gly) или (EAAAK) (где n представляет любое целое число от 1 до 3), не ограничиваясь этим. В одном варианте осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий белок содержит конструкцию VL-линкер-VH, и линкер представляет собой (GGGGS).
[0066] scFv антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению специфически связывается с антигеном, представленным на поверхности клетки; такой антиген, в частности, представляет собой белок клеточной поверхности, который специфически экспрессируется в клетках-мишенях, например опухолевых клетках, или сверхэкспрессируется в опухолевых клетках, и может быть, например, по меньшей мере, одним, выбранным из группы, состоящей из CD30, CD20, CD19, CD22 и CD138. В одном варианте осуществления настоящего изобретения антиген представляет собой HLA-DR.
[0067] В одном варианте осуществления настоящего изобретения scFv представляет собой huMVR, антитело против HLA-DR. huMVR содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую определяющий комплементарность участок тяжелой цепи 1 (HCDR1), содержащий аминокислотную последовательность, представленную последовательностью № 1, HCDR2, содержащий аминокислотную последовательность, представленную последовательностью № 2, и HCDR3, содержащий аминокислотную последовательность, представленную последовательностью № 3; вариабельную область легкой цепи, включающую определяющий комплементарность участок легкой цепи 1 (LCDR1), содержащий аминокислотную последовательность, представленную последовательностью № 4, LCDR2, содержащий аминокислотную последовательность, представленную последовательностью № 5, и LCDR3, содержащий аминокислотную последовательность, представленную последовательностью № 6; где антигенсвязывающая молекула представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR). В одном варианте осуществления настоящего изобретения scFv содержит вариабельную область тяжелой цепи, представленную последовательностью № 7, и вариабельную область легкой цепи, представленную последовательностью № 8; в еще одном варианте осуществления настоящего изобретения scFv содержит аминокислотную последовательность, представленную последовательностью № 9 huMVR.
[0068] Антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR), имеющий scFv в качестве антигенсвязывающего сайта; в одном варианте настоящего изобретения антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит трансмембранный домен на С-конце scFv и внутриклеточный сигнальный домен для активации Т-клеток.
[0069] В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения CAR содержит аминокислотную последовательность, представленную последовательностью № 7 или последовательностью № 8. В одном варианте осуществления настоящего изобретения трансмембранный домен выбран из группы, состоящей из альфа-цепи Т-клеточного рецептора, бета-цепи Т-клеточного рецептора, дзета-цепи Т-клеточного рецептора, CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD 137 и CD154 и их варианты, где указанный внутриклеточный сигнальный домен представляет собой сигнальный домен и костимулирующий сигнальный домен CD3дзета; в одном варианте осуществления настоящего изобретения костимулирующий сигнальный домен выбран из группы, состоящей из CD28, OX40, CD27, ICAM-1, CD278 и CD137.
[0070] «Выделенный полипептид», «выделенный пептид» или «выделенный белок» относится к полипептиду или белку, который по существу не содержит соединений, с которыми он обычно связан в естественном состоянии (например, другие белки или полипептиды, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды). «Выделенный» не означает удаление искусственных или синтетических смесей с другими соединениями, удаление примесей, которые не мешают биологической активности, или удаление примесей, которые могут присутствовать, например, за счет добавления стабилизатора к промежуточному продукту или составу фармацевтически приемлемого препарата.
[0071] Термин «вариабельная область» относится к части молекулы антитела, которая имеет множество вариаций последовательности при выполнении функции специфического связывания с антигеном; CDR1, CDR2 и CDR3 находятся в вариабельной области. «Определяющие комплементарность участки (CDR)» представляют собой сайты, участвующие в распознавании антигена; эти сайты важны для определения специфичности антитела к антигену в соответствии с изменениями в последовательности этого сайта. Между CDR находится «каркасная область (FR)» в правильной ориентации, которая поддерживает CDR-петли; в частности, присутствуют FR1, FR2, FR3 и FR4.
nd
[0072] В одном варианте осуществления настоящего изобретения еще один антигенсвязывающий белок по настоящему изобретению может быть гуманизированным антителом. В настоящем изобретении термин «гуманизированное антитело» обычно относится к антителу, которое не является иммуногенным или имеет низкую иммуногенность для людей, как описано выше. Гуманизированные антитела представляют собой измененные антитела, и аминокислотная последовательность антитела может быть реорганизована для достижения желаемой цели. Эти возможные изменения являются многочисленными и могут варьироваться от изменения одной или более аминокислот до полной реконфигурации вариабельной или константной области антитела. В общем, в то время как модификация вариабельной области выполняется для увеличения авидности и аффинности к антигену, изменение константной области выполняется для увеличения внутриклеточного действия, такого как связывание комплемента, взаимодействие с мембраной и функции других эффективных агентов. Гуманизированные антитела, обеспеченные в настоящем изобретении, можно комбинировать со всеми видами константных областей рекомбинантными методами. Константная область тяжелой цепи относится к типам гамма (γ), мю (μ), альфа (α), дельта (δ) эпсилон (ε) и подклассифицируется на гамма 1 (γ1) гамма 2 (γ2) гамма 3 (γ 3) гамма 4 (γ4) альфа1 (α1), альфа2 (α2). Константные области легких цепей имеют каппа (κ) и лямбда (λ) типы (Coleman et al., Fundamental Immunology, 2 Ed., 1989, 55-73).
[0073] Термин «фрагмент», использованный по отношению к полинуклеотидным или полипептидным последовательностям, относится к последовательности нуклеиновой кислоты или пептидной последовательности, которая имеет меньшую длину по сравнению с вышеупомянутой нуклеиновой кислотой или белком и включает, по меньшей мере, участок, который идентичен нуклеотидной последовательности или пептидной последовательности указанной выше нуклеиновой кислоты или белка. Такие фрагменты нуклеиновой кислоты и полипептидные фрагменты по настоящему изобретению могут, если необходимо, входить в состав более крупных полинуклеотидов или полипептидов в качестве их компонентов. Такие фрагменты могут содержать или состоять из олигонуклеотидов или олигопептидов, имеющих непрерывные нуклеотидные или пептидные последовательности из нуклеиновой кислоты или белка по настоящему изобретению, длиной, по меньшей мере, 6, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 39, 40, 42, 45, 48, 50, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 70, 75, 78, 80, 90, 100, 105, 120 , 135, 150, 200, 300, 500, 720, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000 остатков или более.
[0074] «Вариант» полипептида или белка относится к любому аналогу, фрагменту, производному или мутанту, происходящему от этого полипептида или белка, и сохраняющему, по меньшей мере, одно биологическое свойство этого полипептида или белка. В природе могут находиться различные варианты такого полипептида или белка. Эти варианты могут представлять собой аллельные варианты, характеризующиеся различными нуклеотидными последовательностями структурного гена, кодирующего белок, или могут включать дифференцированные сплайсинговые или посттрансляционные модификации. Специалист в данной области может получить варианты, содержащие одну или более аминокислотных замен, делеций, добавлений или замещений. Эти варианты могут включать: (а) вариант, в котором один или более аминокислотных остатков заменены консервативными или неконсервативными аминокислотами, (b) вариант, в котором одна или более аминокислот добавлены к полипептиду или белку, (c) вариант, в котором одна или более аминокислот содержат заместитель, и (d) вариант, в котором полипептид или белок слит с другим полипептидом, таким как сывороточный альбумин.
[0075] Консервативные варианты также относятся к аминокислотным последовательностям, имеющим изменения последовательности, которые не влияют отрицательно на биологическую функцию белка. Если измененная последовательность нарушает или полностью отменяет биологическую функцию, связанную с белком, то замена, вставка или делеция относятся к отрицательно влияющим на белок. Например, общий заряд, структура или гидрофобность-гидрофильность белка могут быть изменены без неблагоприятного воздействия на биологическую активность. Соответственно, аминокислотная последовательность может быть изменена таким образом, чтобы, например, пептид проявлял более высокую гидрофобность или гидрофильность без неблагоприятного воздействия на биологическую активность белка. Способы получения таких вариантов, которые включают генетические (супрессию, делецию, мутацию и т.п.), химические и ферментативные методы, известны специалистам в данной области.
[0076] В одном варианте осуществления настоящего изобретения раскрыта молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антигенсвязывающую молекулу. Молекула нуклеиновой кислоты может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную последовательностью № 7, или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную последовательностью № 7.
[0077] В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты может содержать последовательность для кодирования scFv, представленного последовательностью № 9. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, представленный последовательностью № 15 или № 16. Кроме того, в еще одном варианте осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98% или, по меньшей мере, 99% гомологию для кодирования полипептида, который имеет ту же аминокислотную последовательность, что и белок, кодированный вышеуказанной последовательностью, или который имеет, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98% или, по меньшей мере, 99% гомологию.
[0078] Термины «нуклеиновая кислота», «молекула нуклеиновой кислоты», «олигонуклеотид» и «полинуклеотид» в настоящем изобретении используются взаимозаменяемо и относятся к одноцепочечным или двухцепочечным формам спиралей фосфатных эфиров рибонуклеозидов (аденозина, гуанозина, уридина или цитидина; «молекулы РНК») или дезоксирибонуклеозидов (дезоксиаденозина, дезоксигуанозина, дезокситимидина или дезоксицитидина; «молекулы ДНК»); или фосфоротиоату или любому аналогу фосфатного эфира, такому как тиоэфир. Из них возможны спиральные ДНК-ДНК, ДНК-РНК и РНК-РНК. Термин «молекула нуклеиновой кислоты» и, в частности, молекула ДНК или РНК относится только к первичной и вторичной структурам молекулы и не ограничивается какой-либо конкретной формой третичной структуры. Таким образом, данный термин включает среди этих молекул линейные или циклические молекулы ДНК (например, фрагменты рестрикционных ферментов), плазмиды, суперспиральную ДНК и двухцепочечную ДНК, обнаруженную в хромосомах. При обсуждении структуры конкретной двухцепочечной молекулы ДНК в этом описании, структура может быть описана в соответствии с общим соглашением, согласно которому последовательность представлена только в направлении от 5' к 3' вдоль нетранскрибируемой цепи ДНК (т.е. цепь с последовательностью, соответствующей мРНК). «Рекомбинантные молекулы ДНК» представляют собой молекулы ДНК, которые подверглись молекулярно-биологическим манипуляциям. ДНК включает кДНК, геномную ДНК, плазмидную ДНК, синтетическую ДНК и полусинтетическую ДНК, не ограничиваясь этим.
[0079] Как известно в данной области, термин «процент идентичности» означает взаимосвязь между двумя или более полипептидными последовательностями или двумя или более полинуклеотидными последовательностями, как определено сравнением последовательностей. Кроме того, в данной области термин «идентичность» относится, в зависимости от обстоятельств, к степени соответствия последовательностей между полипептидными или полинуклеотидными последовательностями, что определяется степенью соответствия между участками последовательностей. «Идентичность» и «сходство» можно легко определить известными методами, включая, не ограничиваясь этим, методы, описанные в Computational Molecular Biology ((Lesk A.M., ed.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, DW, ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, AM, and Griffin, HG, eds.) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987) и Sequence Analysis Primer (Gribskov M. and Devereux J., eds.) Stockton Press, New York (1991).
[0080] Предпочтительные методы определения идентичности разработаны для обеспечения оптимального соответствия между тестируемыми последовательностями. Методы определения идентичности и сходства лежат в основе общедоступных компьютерных программ. Выравнивание последовательностей и расчеты процента идентичности могут быть выполнены с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей, такого как программа Megaalign из пакета компьютерных программ LASERGENE для биоинформатики (DNASTAR Inc., Madison, Wis.). Множественное выравнивание последовательностей может быть выполнено с использованием метода выравнивания Clustal с параметрами по умолчанию (штраф за гэп=10, штраф за удлинение гэпа=10) (Higgins et al., CABIOS. 5: 151 (1989)). Параметры по умолчанию для парного выравнивания с использованием метода Clustal могут быть выбраны из KTUPLE 1, штраф за гэп=3, окно=5 и сохраненные диагонали=5. Как известно в данной области техники, «сходство» между 2 видами полипептидов определяется сравнением аминокислотной последовательности и консервативных аминокислотных замен полипептида с последовательностью 2-го полипептида. Идентичность или гомология к этим последовательностям в настоящей заявке относится к выравниванию последовательностей и введению гэпов, необходимых для достижения максимального процента гомологии, без учета каких-либо консервативных замен как части идентичности последовательностей, и затем определяется как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, идентичной известным пептидам. Удлинение, делецию или инсерцию в пептидной последовательности на N-конце, C-конце или внутри не следует рассматривать в качестве влияющих на гомологию.
[0081] Термин «гомология» относится к процентной идентичности между двумя полинуклеотидами или двумя полипептидными фрагментами. Соответствие между последовательностями одной части и другой части можно определить методами, известными в данной области техники. Например, гомологию можно определить выравниванием известных последовательностей и прямым сравнением известной последовательности между двумя полипептидными молекулами с использованием доступных компьютерных программ. В противном случае гомология может быть определена путем гибридизации полинуклеотидов в условиях, которые образуют стабильный дуплекс между областями одного и того же типа, с последующим расщеплением нуклеазой, специфичной для одной цепи, и определением размера отщепленных фрагментов.
[0082] В данном описании все грамматические и орфографические формы термина «гомология» относятся к соответствию между белками «общего эволюционного происхождения» (Reeck et al., Cell, 50: 667 (1987)), включая белки из суперсемейства (например, суперсемейства иммуноглобулинов) и гомологичные белки разных видов (например, легкая цепь миозина и т.п.). Эти белки (и гены, которые их кодируют) имеют гомологию последовательностей за счет высокого сходства их последовательностей. Однако при общем использовании и в настоящей заявке, когда он модифицирован наречием, таким как «очень», термин «гомологичный» относится к гомологии последовательностей и не указывает на общий источник эволюции.
[0083] Таким образом, термин «сходство последовательностей» во всех грамматических формах относится к степени идентичности или соответствия между последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот, которые могут иметь или не иметь общее эволюционное происхождение (Reeck et al., Cell, 50: 667 (1987)). В одном варианте осуществления, когда примерно 50% (например, по меньшей мере, примерно 75%, 90% или 95%) нуклеотидов соответствуют последовательности ДНК определенной длины или более, то две последовательности ДНК являются «по существу гомологичными» или «по существу сходными». По существу гомологичные последовательности могут быть идентифицированы сравнением последовательностей с использованием доступного стандартного программного обеспечения с банком данных последовательностей или, например, экспериментов с саузерн-гибридизацией в жестких условиях, определенных для конкретной системы. Определение подходящих условий гибридизации находится в пределах технических возможностей данной области (см., например, Sambrook et al. 1989).
[0084] В рамках настоящего описания, термин «по существу сходный» относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, в котором изменение одного или более азотистых оснований вызывает замену одной или более аминокислот, но не влияет на функциональные свойства белка, который эта последовательность ДНК кодирует. «По существу сходные» также относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, в котором изменение одного или более азотистых оснований не влияет на способность фрагмента нуклеиновой кислоты опосредовать изменения в экспрессии генов с помощью методов антисмысловой или косупрессии. «По существу сходные» также относится к модификациям фрагментов нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, таким как делеции или вставки одного или более азотистых оснований, которые существенно не влияют на функциональные свойства полученного транскрипта. Следовательно, следует понимать, что настоящее изобретение также включает конкретные показанные последовательности. Каждая из предлагаемых модификаций известна специалистам в данной области с обычной квалификацией, например, для определения сохранения биологической активности кодированного продукта.
[0085] Кроме того, специалистам в данной области понятно, что по существу сходные последовательности, охватываемые настоящим изобретением, определяются способностью гибридизоваться с последовательностями, приведенными в настоящем описании, в жестких условиях (0,1× SSC, 0,1% SDS, 65°C и 0,1× SSC, 0,1% SDS после отмывки 2× SSC, 0,1% SDS). По существу сходные фрагменты нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению представляют собой фрагменты нуклеиновой кислоты, последовательности ДНК которых, по меньшей мере, примерно на 70%, 80%, 90% или 95% идентичны последовательностям ДНК фрагментов нуклеиновых кислот, приведенных в данном описании.
[0086] В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к экспрессионному вектору, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует антигенсвязывающий белок по настоящему изобретению. Термин «экспрессия» относится к биологической продукции продукта, кодированного кодирующей последовательностью. В большинстве случаев последовательность ДНК, содержащая кодирующую последовательность, транскрибируется с образованием информационной РНК (мРНК). Затем информационная РНК транслируется с образованием полипептидного продукта, обладающего соответствующей биологической активностью. Кроме того, процесс экспрессии может включать дополнительную стадию процессинга продуктов транскрипции РНК (например, сплайсинг для удаления интронов) и/или посттрансляционный процессинг полипептидного продукта.
[0087] В рамках настоящего изобретения, термин «экспрессионный вектор» относится к вектору, плазмиде или носителю, сконструированным для трансформации хозяина после экспрессии встроенной последовательности нуклеиновой кислоты.
[0088] Клонированные гены, а именно встроенные последовательности нуклеиновых кислот, обычно находятся под контролем регуляторных элементов, таких как промоторы, минимальные промоторы, энхансеры и т.п. Специалистам в данной области хорошо известны многочисленные регуляторные области или промоторы, которые можно использовать для индукции экспрессии нуклеиновых кислот в желаемой клетке-хозяине. Любой промотор, способный существенно индуцировать экспрессию этих генов, включает, помимо прочего, вирусные промоторы, бактериальные промоторы, промоторы животных, промоторы млекопитающих, синтетические промоторы, конститутивные промоторы, тканеспецифические промоторы, промоторы, связанные с патогенезом или заболеванием, промоторы, специфичные для стадии развития, индуцибельные промоторы, светорегулируемые промоторы и т.п.; и включает, не ограничиваясь этим, промоторы, содержащие область раннего (SV40) промотора SV40 и длинный 3'-концевой повтор (LTR) вируса саркомы Рауса (RSV); E1A-промотор аденовируса (Ad) или главный поздний промотор (MLP); предранние промоторы цитомегаловируса человека (HCMV); промоторы тимидинкиназы (ТК) вируса простого герпеса (HSV); промоторы бакуловируса IE1; промоторы фактора элонгации 1 альфа (EF1); промоторы глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GSPDH), промоторы фосфоглицераткиназы (PGK); промоторы убиквитина С (Ubc); промоторы альбумина; промоторы мышиного металлотионеина-L и регуляторные последовательности транскрипционных регуляторных областей; повсеместные промоторы (HPRT, виментина, β-актина, тубулина и т.п.); промежуточные филаменты (десмин, нейрофибриллы, кератин, GFAP и т.п.), промоторы терапевтических генов (MDR, CFTR или формы фактора VIII и т.п.), промоторы начала развития или связанные с заболеванием промоторы; и промоторы, которые использовались у трансгенных животных и проявляют тканеспецифичность, такие как регуляторные области генов эластаз, которые активны в ацинарных клетках поджелудочной железы (таких как ацинарные клетки поджелудочной железы); регуляторные области гена инсулина, активные в бета-клетках поджелудочной железы; регуляторные области гена иммуноглобулина, активные в лимфоидных клетках; регуляторные области вируса рака молочной железы мыши, активные в семенниках, молочной железе, лимфатических узлах и макрофагах; регуляторные области генов альбумина, активные в печени; регуляторные области Apo AI и Apo AII, регуляторные области гена альфа-фетопротеина, активные в печени; регуляторные области гена альфа-1-антитрипсина, активные в печени; регуляторные области гена бета-глобина, активные в клетках костного мозга; регуляторные области основного белка миелина, активные в олигодендроцитах головного мозга; регуляторные области гена легкой цепи миозина-2, активные в скелетных мышцах, и гонадотропин-рилизинг гормона, активные в гипоталамусе; промоторы пируваткиназы; промоторы виллина; промоторы кишечного белка, связывающего жирные кислоты; промоторы β-актина в гладкомышечных клетках.
[0089] Термин «вектор» охватывает как невирусные, так и вирусные носители для введения нуклеиновых кислот в клетки in vitro, ex vivo или in vivo.
[0090] Вектор может представлять собой репликон с другим фрагментом ДНК, присоединенным для амплификации присоединенного фрагмента. Термин «репликон» относится к любому генетическому элементу (например, плазмиде, фагу, космиде, хромосоме, вирусу), который способен функционировать в качестве автономной единицы репликации ДНК in vivo, то есть реплицироваться под своим собственным контролем. Многие векторы, известные в данной области, можно использовать для получения нуклеиновых кислот, включения реактивных элементов и промоторов в гены и т.п. Предпочтительные векторы включают, например, плазмиды или модифицированные вирусы, включая, например, аденовирусы, ретровирусы, аденоассоциированные вирусы, вирусы герпеса или плазмиды, такие как производные плазмиды PBR322 или pUC или векторы Bluescript. Например, фрагменты ДНК, соответствующие реакционным элементам и промоторам, могут быть вставлены в подходящие векторы объединением соответствующих фрагментов ДНК с выбранными векторами, имеющими комплементарные липкие концы. Если они отсутствуют, то концы молекул ДНК можно ферментативно модифицировать или можно создать любой сайт связыванием нуклеотидной последовательности (линкера) с концами ДНК. С такими векторами можно манипулировать таким образом, чтобы они содержали селективный ген-маркер для скрининга клеток, которые включили маркер в геном клетки. Такие маркеры позволяют идентифицировать и/или скринировать клетки-хозяева, экспрессирующие белок, кодированный маркером.
[0091] Вектор обеспечивает необходимые регуляторные последовательности (например, элементы транскрипции и трансляции) для регуляции экспрессии слитого белка в соответствующей клетке-хозяине. Регуляторные последовательности могут включать промоторные области, энхансерные области, сайты терминации транскрипции, сайты связывания рибосомы, кодоны инициации, сигналы сплайсинга, интроны, сигналы полиаденилирования, последовательности трансляции Шайна/Далгарно и консенсусные последовательности Козак. Регуляторная последовательность выбирается с учетом клетки-хозяина, в которой будет продуцироваться гибридный белок. Подходящие бактериальные промоторы включают, не ограничиваясь ими, бактериофага λpL или pR, T6, T7, T7/lacO, lac, recA, gal, trp, ara, hut и trp-lac. Подходящие эукариотические промоторы включают, не ограничиваясь ими, промоторы PRBI, GAPDH, металлотионеина, тимидинкиназы, вирусного LTR, цитомегаловируса, SV40 или тканеспецифические или опухолеспецифические промоторы, такие как промотор α-фетопротеина, амилазы, катепсина E, мускаринового рецептора M1 или γ-глутамилтрансферазы.
[0092] Дополнительные векторы включают липоплексы (комплексы катионная липосома-ДНК), полиплексы (комплексы катионный полимер-ДНК) и комплексы белок-ДНК. В дополнение к нуклеиновым кислотам вектор может также содержать одну или более регуляторных областей и/или селектируемые маркеры, пригодные для селекции, оценки и мониторинга результатов доставки нуклеиновой кислоты (доставка в определенную ткань, продолжительности экспрессии и т.п.).
[0093] Векторы могут быть введены в желаемую клетку-хозяин методом, известным в данной области, таким как инъекция, трансфекция, электропорация, микроинъекция, трансдукция, слияние клеток, липофекция, осаждение фосфатом кальция (Graham F.L. et al., Virology, 52: 456 (1973); и Chen and Okayama, Mol. Cell. Biol., 7: 2745-2752 (1987)), метод, опосредованный липосомами (Wong T.K. et al., Gene, 10:87 (1980); Nicolau and Sene, Biochim. Biophys.Acta, 721: 185-190 (1982); и Nicolau et al., Methods Enzymol., 149: 157-176 (1987)), обработка DEAE-декстраном (Gopal, Mol. Cell Biol., 5: 1188-1190 (1985)), бомбардировка генов (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 9568-9572 (1990)) с использованием видов генов или переносчиков ДНК-векторов (см. например, Wu et al., J. Biol. Chem. 267: 963 (1992); Wu et al., J. Biol. Chem. 263: 14621 (1988); и Hartmut et al., заявка на патент Канады № 2012311).
[0094] Вирусные векторы использовались в широком диапазоне применений для переноса генов в клетки, а также на живых животных. Вирусные векторы, которые можно использовать, включают, не ограничиваясь ими, вирусные векторы на основе аденовируса, ретровируса, вируса осповакцины, поксвируса, аденоассоциированного вируса, вируса простого герпеса, лентивируса, бакуловируса, вируса Сендай, вируса кори, обезьянего вируса 40 и вируса Эпштейна-Барра. Невирусные векторы включают плазмиды, липоплексы (комплексы катионная липосома-ДНК), полиплексы (комплексы катионный полимер-ДНК) и комплексы белок-ДНК. В дополнение к нуклеиновым кислотам вектор может содержать одну или более регуляторных областей и/или селектируемые маркеры, пригодные для скрининга, оценки и мониторинга результатов доставки нуклеиновых кислот (доставка в ткань, сохранение экспрессии и т.п.).
[0095] Полинуклеотиды по настоящему изобретению можно вводить in vivo липофекцией. В последние десятилетия использование липосом для инкапсуляции и трансфекции нуклеиновых кислот in vitro возросло. Синтетические катионные липиды, предназначенные для ограничения трудностей и рисков, с которыми сталкивается опосредованная липосомами трансфекция, можно использовать для приготовления липосом для трансфекции генов in vivo (Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413 (1987)); Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8027 (1988); и Ulmer et al., Science, 259: 1745 (1993)). Использование катионных липидов может способствовать инкапсуляции отрицательно заряженных нуклеиновых кислот, и также может способствовать слиянию с отрицательно заряженными клеточными мембранами (Feigner et al., Science, 337: 387 (1989)). Особенно пригодные липидные соединения и композиции для доставки нуклеиновых кислот описаны в WO95/18863, WO96/17823 и патенте США № 5459127. Использование липофекции для введения экзогенных генов в определенные ткани in vivo имеет несколько практических преимуществ. Молекулярное нацеливание липосом на определенные клетки представляет собой одно из преимуществ. Очевидно, что прямая трансфекция в определенные типы клеток будет особенно желательной для тканей с клеточной гетерогенностью, таких как поджелудочная железа, печень, почки и головной мозг. Липиды можно химически связать с другими молекулами для нацеливания (Mackey et al., 1988). Пептиды-мишени, такие как гормоны или нейромедиаторы, и белки, такие как антитела, или непептидные молекулы, можно химически связать с липосомами.
[0096] В рамках настоящего изобретения, термин «трансфекция» относится к захвату экзогенной или гетерологичной РНК или ДНК клеткой. Когда экзогенная или гетерологичная РНК или ДНК вводится в клетку, то клетка «трансфектируется» такой РНК или ДНК. Когда текстурированная РНК или ДНК типа вызывает фенотипические изменения, то клетка «трансформируется» экзогенной или гетерологичной РНК или ДНК. РНК или ДНК, вызывающие эту трансформацию, могут быть вставлены (ковалентно) в хромосомную ДНК, чтобы стать частью генома клетки.
[0097] В рамках настоящего изобретения, термин «трансформация» относится к доставке фрагментов нуклеиновой кислоты в организм-хозяин, приводящей к генетически стабильному наследованию. Организмы-хозяева, содержащие трансформированные фрагменты нуклеиновых кислот, относятся к «трансгенным», «рекомбинантным» или «трансформированным» организмам.
[0098] В рамках настоящего изобретения, термин «рекомбинантный вектор» относится к генной конструкции, которая представляет собой экспрессионный вектор, способный экспрессировать целевой белок в подходящей клетке-хозяине, и включает необходимые регуляторные элементы, которые функционально связаны таким образом, чтобы экспрессировать вставленный ген.
[0099] Другие молекулы, такие как катионные олигопептиды (например, WO95/21931), пептиды, происходящие из ДНК-связывающих белков (например, WO96/25508), или катионные полимеры (например, WO95/21931), также можно использовать для обеспечения трансфекции нуклеиновых кислот in vivo.
[0100] Также можно ввести вектор in vivo в виде плазмиды с «голой» ДНК (см. патенты США № 5693622, 5589466 и 5580859). Также можно использовать опосредованную рецептором доставку ДНК (Curiel et al., Hum. Gene Ther., 3: 147 (1992); и Wu et al., J. Biol. Chem., 262: 4429 (1987)).
[0101] В одном варианте настоящего изобретения раскрыта клетка, которая содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует антигенсвязывающий белок по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления настоящего изобретения клетка представляет собой Т-клетку; в другом варианте осуществления Т-клетка представляет собой CD8+ Т-клетку и/или CD4+ Т-клетку; и в еще одном варианте осуществления клетка представляет собой Т-клетку с химерным антигенным рецептором (CAR-T).
[0102] В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения рака, содержащей в качестве фармацевтически эффективного ингредиента клетку, экспрессирующую антигенсвязывающий белок.
[0103] В рамках настоящего изобретения, термин «противораковый» включает «профилактику» и «лечение»; «профилактика» означает любое действие, при котором рак подавляется или замедляется введением композиции по настоящему изобретению, и «лечение» означает любое действие, которое ослабляет или благоприятно изменяет симптомы рака введением антитела по настоящему изобретению. Профилактика может быть полной, например, полное исчезновение симптомов у субъекта. Профилактика также может быть частичной, например, если симптомы у субъекта стали менее выраженными, чем это было бы без применения настоящего изобретения.
[0104] «Композиция», раскрытая в настоящем изобретении, относится к комбинации цитотоксических Т-клеток по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента и неактивных ингредиентов, таких как природные или искусственные носители, метки или детекторы, активных ингредиентов, таких как адъюванты, разбавители, связующие агенты, стабилизаторы, буферы, соли, липофильные растворители и консерванты, и включает фармацевтически приемлемый носитель. Носитель может также включать фармацевтические эксципиенты и дополнительные белки, пептиды, аминокислоты, липиды и углеводы (например, моносахариды; дисахариды; трисахариды; тетрасахариды; олигосахариды; альдит, альдоновую кислоту, полисахариды, производные сахара, такие как этерифицированный сахар или сахарный полимер или тому подобное), отдельно или в комбинации, в количестве от 1 до 99,99 мас.% или об.%. Белковые наполнители включают, например, человеческий сывороточный альбумин, рекомбинантный человеческий альбумин, желатин, казеин и тому подобное, но не ограничиваются этим.
[0105] Типичные аминокислотные компоненты, которые могут играть роль буфера, включают, например, аланин, аргинин, глицин, бетаин, гистидин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, цистеин, лизин, лейцин, изолейцин, валин, метионин, фенилаланин, аспартам, и т.п., не ограничиваясь этим. Углеводные наполнители также включают, например, моносахариды, такие как фруктоза, мальтоза, галактоза, глюкоза, D-манноза, сорбоза; дисахариды, такие как лактоза, сахароза, трегалоза, целлобиоза; полисахариды, такие как рафиноза, мальтодекстрин, декстран и крахмал; и альдиты, такие как маннит, ксилит, мальтит, лактит, сорбит и миоинозит; не ограничиваясь этим.
[0106] Специалист в данной области может составить фармацевтическую композицию по настоящему изобретению с помощью способов, известных в данной области. Например, при необходимости ее можно использовать парентерально в форме инъекционного стерильного раствора или суспензии с водой или другой фармацевтически приемлемой жидкостью. Например, ее можно подходящим образом комбинировать с фармацевтически приемлемыми носителями или средами, в частности стерильной водой или физиологическим раствором, растительным маслом, эмульгатором, суспендирующим агентом, поверхностно-активным веществом, стабилизатором, эксципиентом, носителем, консервантом, связующим веществом и тому подобное; композицию можно приготовить смешиванием с получением разовой лекарственной формы согласно требованиям общепринятой фармацевтической практики. Количество активного ингредиента, используемое в составе, является таким, что может быть обеспечена подходящая дозировка в указанном диапазоне.
[0107] Кроме того, стерильные композиции для инъекций могут быть составлены в соответствии с общепринятой практикой формуляции композиций с использованием жидких эксципиентов, таких как дистиллированная вода для инъекций. В качестве водного раствора для инъекций можно использовать, например, комбинации физиологического раствора; изотонические растворы, содержащие глюкозу или другие вспомогательные агенты, например D-сорбит, D-маннозу, D-маннит, хлорид натрия, и подходящие добавки для растворения, например спирты, в частности этанол, и полиспирты, например пропиленгликоль, полиэтиленгликоль; и неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбат 80™, HCO-50. Масляные жидкости включают, например, кунжутное масло и соевое масло, и их можно использовать в комбинации с бензилбензоатом и бензиловым спиртом в качестве средства, способствующего растворению.
[0108] Составы для инъекций можно, например, вводить внутривенной инъекцией, внутриартериальной инъекцией, селективной внутриартериальной инъекцией, внутримышечной инъекцией, внутрибрюшинной инъекцией, подкожной инъекцией, внутрижелудочковой инъекцией, внутричерепной инъекцией, интрамедуллярной инъекцией и тому подобное, однако предпочтительно их вводить внутривенной инъекцией.
[0109] Композиция по настоящему изобретению содержит фармацевтически эффективное количество Т-клеток. Эффективное количество может быть легко определено специалистами в данной области техники на основании раскрытия, приведенного здесь.
th
th
st
[0110] Как правило, фармацевтически эффективное количество определяется посредством первого введения в низкой концентрации активного ингредиента, и затем с постепенным повышением концентрации до достижения желаемого эффекта у субъекта без проявления каких-либо побочных эффектов (например, симптомы, связанные с раком, ослабляются или элиминируются). Способы определения подходящих доз или интервалов между введениями для введения композиций по настоящему изобретению описаны, например, Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman et al., eds., 11 Edition, McGraw-Hill 2005, and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20 and 21 Editions, Gennaro and University of the Sciences in Philadelphia, Eds., Lippencott Williams & Wilkins (2003 and 2005).
[0111] Способ введения композиции по настоящему изобретению можно определить с учетом различных факторов у субъекта, таких как тип рака, возраст, масса тела, пол, состояние здоровья, тяжесть заболевания, способ введения и другие лекарственные средства, которые назначают самостоятельно. Следовательно, несмотря на то, что способ введения может сильно различаться, его можно определить в соответствии с обычно используемым способом.
[0112] Количество композиции по настоящему изобретению, которое следует вводить субъекту, может определяться с учетом множества факторов, таких как способ введения, состояние здоровья субъекта, масса тела и рекомендации врача; все эти факторы находятся в пределах компетенции специалиста в данной области техники.
6
6
6
6
6
6
6
6
6
7
7
7
7
7
7
7
7
7
8
8
8
8
8
8
8
8
8
[0113] Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать примерно 1×10 клеток/мл или более, примерно 2×10 клеток/мл или более, примерно 3×10 клеток/мл или более, примерно 4×10 клеток/мл или более, примерно 5×10 клеток/мл или более, примерно 6×10 клеток/мл или более, примерно 7×10 клеток/мл или более, примерно 8×10 клеток/мл или более, примерно 9×10 клеток/мл или более, 1×10 клеток/мл или более, примерно 2×10 клеток/мл или более, 3×10 клеток/мл или более, примерно 4×10 клеток/мл или более, примерно 5×10 клеток/мл или более, примерно 6×10 клеток/мл или более, примерно 7×10 клеток/мл или более, примерно 8×10 клеток/мл или более, примерно 9×10 клеток/мл или более, примерно 1×10 клеток/мл или более, примерно 2×10 клеток/мл или более, примерно 3×10 клеток/мл или более, примерно 4×10 клеток/мл или более, примерно 5×10 клеток/мл или более, примерно 6×10 клеток/мл или более, примерно 7×10 клеток/мл или более, примерно 8×10 клеток/мл или более или примерно 9×10 клеток/мл или более CAR-T-клеток, но специалист в данной области может корректировать титр CAR-T-клеток в пределах диапазона, в котором могут быть получены аналогичные эффекты. На назначение могут по-разному влиять такие факторы, как способы приготовления, способы введения, возраст пациента, масса тела, пол, болезненность, рацион, время введения, способ введения, скорость выведения и чувствительность к ответу.
[0114] Фармацевтическую композицию также можно комбинировать с буферами, например фосфатными буферными растворами или буферными растворами на основе ацетата натрия; анальгетиками, например прокаином гидрохлоридом; стабилизаторами, например бензиловым спиртом, фенолами и антиоксидантами. Приготовленный раствор для инъекций обычно разливается в подходящие ампулы.
[0115] Суспензии и эмульсии могут содержать в качестве носителей, например, природные камеди, агар, альгинат натрия, пектин, метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу или поливиниловый спирт. Суспензии или растворы для внутримышечной инъекции вместе с активным соединением содержат фармацевтически приемлемые носители, такие как стерильная вода, оливковое масло, этилолеат, гликоли, например, пропиленгликоль, и, при необходимости, соответствующие количества лидокаина гидрохлорида.
[0116] Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить субъекту, например, внутривенной инъекцией (болюсной инъекцией) или непрерывной инфузией. Например, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить, по меньшей мере, 1 раз, по меньшей мере, 2 раза, по меньшей мере, 3 раза, по меньшей мере, 4 раза или, по меньшей мере, 5 раз, непрерывно или через определенные промежутки времени, в течение, по меньшей мере, 30 мин, по меньшей мере, 1 ч, по меньшей мере, 2 ч, по меньшей мере, 3 ч, по меньшей мере, 4 ч, по меньшей мере, 8 ч, по меньшей мере, 12 ч, по меньшей мере, 1 дня, по меньшей мере, 2 дней, по меньшей мере, 3 дней, по меньшей мере, 4 дней, по меньшей мере, 5 дней, по меньшей мере, 6 дней, по меньшей мере, 7 дней, по меньшей мере, 2 недель, по меньшей мере, 3 недель, по меньшей мере, 4 недель, по меньшей мере, 1 месяца, по меньшей мере, 3 месяцев, по меньшей мере, 6 месяцев или, по меньшей мере, интервалы определяются клиническим заключением. Инъекционные препараты можно формулировать в виде ампулы или в виде разовой лекарственной формы в многодозовом контейнере. Однако специалисту в данной области будет понятно, что дозировка фармацевтической композиции по настоящему изобретению может варьироваться в зависимости от различных факторов, таких как возраст, вес, рост, пол субъекта, общее состояние здоровья и предыдущая история лечения.
[0117] В рамках настоящего изобретения, термин «рак» относится к любому из многочисленных заболеваний или расстройств, вызванных аномальным неконтролируемым ростом клеток. Клетки, которые могут вызывать рак, называются раковыми клетками, и они обладают уникальными типологическими характеристиками, такими как неконтролируемая пролиферация, бессмертие, метастатический потенциал, быстрый рост и пролиферация. Часто раковые клетки могут быть в форме опухоли, но такие клетки могут присутствовать индивидуально у млекопитающих или могут быть неопухолевыми клетками, такими как лейкозные клетки. Рак можно диагностировать клиническим или радиологическим методом с детектированием опухолей; посредством тестирования клеток из опухолей или других биологических образцов, полученных с помощью биопсии; детектированием маркеров рака крови, таких как CA125, PAP, PSA, CEA, AFP, HCG, CA 19-9, CA 15-3, CA 27-29, LDH и NSE; или детектированием генотипов маркеров рака, таких как TP53 и ATM. Однако отрицательный результат вышеописанного способа не обязательно означает диагноз отсутствия рака: например, субъект, у которого было обнаружено полное излечение рака, может все еще болеть раком; что подтверждается в виде рецидива.
[0118] В рамках настоящего изобретения, термин «примерно» можно понимать в пределах диапазона, обычно используемого в данной области, например, в пределах 2 стандартных отклонений от среднего значения. «Примерно» может означать в пределах 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% или 0,01% от указанного значения.
[0119] В рамках настоящего изобретения, термин «введение» означает введение пациенту определенного вещества; введение можно проводить любым подходящим способом, так что путь введения композиции, содержащей антитело по настоящему изобретению, можно вводить любым общим путем, при условии, что оно может достигать ткани-мишени. Введение может осуществляться внутрибрюшинным введением, внутривенным введением, внутримышечным введением, подкожным введением, внутрикожным введением, пероральным введением, местным введением, интраназальным введением, пульмонарным введением или ректальным введением, не ограничиваясь этим. Однако в случае перорального введения, поскольку белок расщепляется, то желательно составить пероральную композицию таким образом, чтобы покрыть активный агент или защитить его от расщепления в желудке.
[0120] Кроме того, фармацевтическую композицию можно вводить с помощью любого устройства, из которого активное вещество способно мигрировать к клетке-мишени.
[0121] В одном варианте осуществления настоящего изобретения рак может представлять собой солидный рак или рак крови. Более конкретно, в одном варианте осуществления настоящего изобретения с помощью фармацевтической композиции по настоящему изобретению можно лечить такие типы рака, как аденокарцинома пищевода, колоректальный рак, меланома, меланома глаза, мелкоклеточный рак легкого, нейробластома, тератома, фетальный рак, плоскоклеточная карцинома, плоскоклеточная карцинома головы и шеи, тимома, лимфоцитарный лейкоз, B-клеточная лимфома, диффузная B-крупноклеточная лимфома, лейкоз, острый миелоидный лейкоз и тому подобное.
[0122] Другой вариант осуществления настоящего изобретения раскрывает способ лечения рака введением фармацевтической композиции пациенту, страдающему раком. Фармацевтическая композиция включает CD8+ Т-клетки, или включает CD4+ Т-клетки и CD8+ Т-клетки, или включает как CD4+ Т-клетки, так и CD8+ Т-клетки; соотношение CD4+ Т-клеток и CD8+ Т-клеток в зависимости от количества клеток составляет в основном 1:1.
[0123] В одном варианте осуществления настоящего изобретения раскрывается способ получения Т-клетки с модифицированным химерным антигенным рецептором (CAR-T) для лечения рака, включающий стадию трансфекции Т-клетки нуклеиновыми кислотами, которые кодируют антигенсвязывающую молекулу, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, включающую определяющий комплементарность участок тяжелой цепи (HCDR1), содержащий аминокислотную последовательность, представленную Последовательностью № 1, HCDR2, содержащий аминокислотную последовательность, представленную последовательностью № 2, и HCDR3, содержащий аминокислотную последовательность, представленную последовательностью № 3; вариабельную область легкой цепи, включающую определяющий комплементарность участок легкой цепи 1 (LCDR1), содержащий аминокислотную последовательность, представленную последовательностью № 4, LCDR2, содержащий аминокислотную последовательность, представленную последовательностью № 5, и LCDR3, содержащий аминокислотную последовательность, представленную последовательностью № 6; где антигенсвязывающая молекула представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR).
[0124] В рамках настоящего изобретения, термин «конструкция» обычно относится к композиции, которая отсутствует в природе. Конструкции могут быть получены синтетическими методами (например, получение и экспрессия рекомбинантной ДНК) или методами химического синтеза нуклеиновых кислот или аминокислот. Конструкции также могут быть созданы путем добавления или связывания одного вещества с другим, так что в результате получается форма, которой не существует в природе.
Экспериментальный пример 1: гуманизация мышиных анти-MVR-антител
[0125] Получение гуманизированного антитела из мышиного анти-MVR-антитела (WO2015-133817 A1) было разработано в двух вариантах, с низкой авидностью и высокой авидностью соответственно, для использования в оптимизации авидности.
1.1 Гуманизация вариабельной области тяжелой цепи
[0126] Для выбора каркаса VH человеческого антитела для получения гуманизированных антител, были выбраны каркасы VH с использованием Blastp (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins') с последовательностями, сходными с мышиными анти-MVR-антителами (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAV40168.1).
[0127] На основе этого 3 CDR VH были определены согласно системе нумерации по Kabat, и комбинацию выбранной каркасной области человеческого антитела и CDR определенного анти-MVR-антитела использовали для секвенирования варианта VH с низкой авидностью (huMVR.H1, последовательность № 10).
[0128] Кроме того, вариант VH с высокой авидностью получали обратной мутацией VH27, VH29, VH48, VH67, VH71, VH73, VH78 из huMVR.H1 (huMVR.H2, последовательность № 7) (фиг. 1)
1.2 Гуманизация вариабельной области легкой цепи
[0129] Для выбора каркаса VL человеческого антитела для получения гуманизированных антител, был выбран каркас VL трастузумаба (заявка на патент США 5821047 A, последовательность № 25), который, как известно, обладает высокой стабильностью. На основе этого 3 CDR VL были определены согласно системе нумерации по Kabat, и выбранную каркасную область человеческого антитела и CDR определенного анти-MVR-антитела объединяли, и для введения человеческой консенсусной последовательности получали вариант VL с низкой авидностью из «комбинации hu4D5 каркасная область-CDR анти-MVR» мутацией K в R в VL24, I в L в VL48, S в R в VL53, T в S в VL56, R в G в VL66, F в Y в VL71, Q в G в VL100 (huMVR.L1, последовательность № 11). Кроме того, по отдельности VL49, VL69 и VL71 были подвергнуты обратной мутации из «комбинации hu4D5 каркасная область-CDR анти-MVR», и вариант VL с высокой авидностью получали мутацией R в G в VL66 (huMVR.L2, последовательность № 8) (фиг. 2)
3
[0130] Сконструированный ген гуманизированного антитела, представляющего собой huMVR.L1H1 (huMVR.L1 и huMVR.H1) (последовательность № 10, последовательность № 11, последовательность № 12), huMVR.L2H2 (huMVR.L2 и huMVR.H2) (последовательность № 7, последовательность № 8, последовательность № 9), получали с 2 антителами. В частности, было приготовлено два гуманизированных антитела в форме scFv VL- (G4S)-VH в плазмиде pOptivec (Invitrogen), которая представляет собой экспрессионный вектор для клеток животных, и метку 6× His конъюгировали с С-концом для получения гена. Плазмиды, в которые был вставлен ген, экспрессировали в форме scFv с использованием экспрессионной системы Expi293 (Invitrogen) и очищали с использованием колонки purifier AktaPure (GE healthcare) и HisTrap (GE healthcare).
Экспериментальный пример 2: анализ авидности для линий раковых клеток крови
5
[0131] Линии лимфобластоидных клеток B-клеточной лимфомы, полученные из PBMC, готовили в пробирках для образцов FACS (Falcon, номер по каталогу 352052) с 1×10 клеток на образец и затем обрабатывали muMVR scFv, huMVR.L1H1 scFv (с низким связыванием), и scFv huMVR.L2H2 (с высоким связыванием) при 0,5 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 0,05 мкг/мл, полученными с использованием клеток Expi293F (Invitrogen, A14527), и каждый образец инкубировали при 4°C в течение 15 мин. После этого в каждую пробирку с образцом добавляли 3 мл промывочного буфера (0,5% FBS, 0,1% азида натрия в PBS). Каждый образец центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин, супернатант удаляли и добавляли конъюгированные с фикоэритрином анти-His антитела (BioLegend, номер по каталогу 362603) в разведении 1:200 до достижения общего объема 200 мкл. Все образцы инкубировали при 4°C в течение 15 мин.
[0132] После этого 3 мл промывочного буфера (0,5% FBS, 0,1% азида натрия в PBS) добавляли в каждую пробирку с образцом, каждый образец центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин и супернатант удаляли. После разбавления 4% параформальдегида (Biosessang, P2031) до 1% клетки иммобилизовали добавлением 200 мкл к каждому образцу; иммобилизованные образцы анализировали с помощью проточного цитофлуориметра FACS Celesta (BD Biosciences).
[133] Два вида (huMVR.L1H1, huMVR.L2H2) scFv гуманизированного антитела, связанного с антигенами-мишенями, которые экспрессируются в клетках в зависимости от дозы, и huMVR.L2H2 проявляли сходную авидность с мышиным scFv MVR при концентрации антител 1 мкг/мл, тогда как huMVR.L1H1 показал очень низкую авидность (фиг. 3)
Экспериментальный пример 3: прогнозирование «горячих точек» аффинности для оптимизации активности гуманизированных антител
[0134] Для получения мутантов, обладающих различной авидностью связывания между двумя гуманизированными антителами, прогнозировали «горячие точки» аффинности на основе мышиного анти-MVR-антитела. Молекулярное моделирование проводили с использованием швейцарской модели (https://swissmodel.expasy.org/) (фиг.4) на основе результата анализа авидности двух гуманизированных антител и двух «горячих точек» аффинности в каркасе вариабельной области тяжелой цепи (VH27, VH71) и «горячих точек» аффинности (VL91, VL92) в CDR вариабельной области легкой цепи (таблица 1). 15 одиночных мутантов scFv типа готовили для 4 «горячих точек» аффинности с использованием huMVR.L2H2 в качестве матрицы, экспрессировали и очищали аналогично тому, как описано выше.
Таблица 1
«Горячие точки»
Мутантные аминокислоты
VH_27F
Y, L, G
VH_71K
H, L, V
VL_91Y
F, S, V, W, A
VL_91W
F, Y, L, A
Экспериментальный пример 4: анализ авидности 15 мутантов, использованных для мутации «горячих точек» аффинности
5
[0135] Линии лимфобластоидных клеток B-клеточной лимфомы, полученные из PBMC, получали в пробирках для образцов FACS (Falcon, номер по каталогу 352052) с 1×10 клеток на образец, и затем обрабатывали muMVR scFv или huMVR.L2H2, полученными с использованием клеток Expi293F (Invitrogen, A14527) или 15 видами мутантов в концентрации 0,1 мкг/мл, и каждый образец инкубировали при 4°C в течение 15 мин.
[0136] После этого в каждую пробирку с образцом добавляли 3 мл промывочного буфера (0,5% FBS, 0,1% азида натрия в PBS). Каждый образец центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин, супернатант удаляли и добавляли конъюгированные с фикоэритрином анти-His антитела (BioLegend, номер по каталогу 362603) в разведении 1:200 до достижения общего объема 200 мкл. Все образцы инкубировали при 4°C в течение 15 мин. После этого в каждую пробирку с образцом добавляли 3 мл промывочного буфера (0,5% FBS, 0,1% азида натрия в PBS), каждый образец центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин и супернатант удаляли.
[0137] После разбавления 4% параформальдегида (Biosessang, P2031) до 1% клетки иммобилизовали, добавляя 200 мкл к каждому образцу, и иммобилизованные образцы анализировали с помощью проточного цитофлуориметра FACS Celesta (BD Biosciences).
[138] 15 видов мутантного scFv huMVR.L2H2 (последовательность № 9) проявляли различную авидность к клеткам LCL, и из них huMVR.L2H2.F27L, huMVR.L2H2.K71H, huMVR.L2H2.Y91F, huMVR.L2H.Y91W имели последовательно более низкую аффинность, чем muMVR и huMVR.L2H2 (последовательность № 9) (фиг. 5).
Экспериментальный пример 5: конструирование CAR_euCD137
[0139] В настоящем изобретении для повышения иммунологической эффективности в цитоплазматическом сигнальном домене 4-1BB, euCD137 (4-lBB aa209-255, последовательность № 14), к которому добавляли 5 аминокислот (4-1BB aa 209-213) в цитоплазматический домен 4-1BB 214-255aa (последовательность № 3), использовали в CAR-T, в качестве костимулирующего сигнального фактора, для получения нового вектора экспрессии CAR (CAR_euCD137) (Kwon et al., (1989) Cellular Immunology, 121: 414-422, Kwon et al., (1998) Biochemical and Biophysical Research Communication 242:613-620). Полная конструкция содержит анти-CD19 или связывающий домен huMVR.L2H2 анти-MVR, который представляет собой scFv, включающий промотор EFI-альфа, шарнирную область и трансмембранный домен человеческого CD8, и внутриклеточный сигнальный домен. В частности, внутриклеточный сигнальный домен состоит из стимулирующего домена и костимулирующего сигнального домена. Для трансмембранного домена можно использовать альфа-, бета- или дзета-цепь Т-клеточного рецептора или один или более из CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 или CD154, не ограничиваясь этим. Из них в настоящем изобретении использовали CD8. Внутриклеточные сигнальные домены в основном представляют собой костимулирующие сигнальные домены в первичном сигнальном домене CD3дзета, выбранные из CD28, OX40, CD27, ICAM-1, ICOS (CD278), 4-1BB (CD 137) и 4-1BB 5aa (euCD137). В настоящем изобретении использовали 4-1BB, костимулирующий сигнальный домен, к которому добавляли 5 последовательных аминокислот, с которым был связан CD3дзета. В конечном итоге полученный фрагмент гена CAR конъюгировали с лентивирусными экспрессионными векторами ELPS, расщепленными BamH I и Sal I. Кроме того, клонирование выполняли с использованием рестрикционного фермента BamH I/Nhe I для замены только части scFv (фиг. 6).
[0140] Кроме того, готовили химерный антигенный рецептор (huMVR CAR), содержащий 2 типа цитоплазматических сигнальных доменов (4-1BB, CD3ζ) для активации Т-клеток, с использованием huMVR.L2H2, гуманизированного антитела к MVR (huMVR), разработанного для минимизации иммуногенности на основе мышиных анти-MVR-антител, которые представляют собой scFv, подходящие для разработок терапевтических CAR-T. В частности, в настоящем изобретении для повышения иммунологической эффективности к цитоплазматическому сигнальному домену 4-1BB, конструкция (MVR CAR_euCD137), к которому добавляли 5 последовательных аминокислот RFSVV, содержит промотор EF1-альфа и содержит только связывающий домен scFv huMVR.L2H2 анти-MVR, и также шарнирную область CD8 и трансмембранный домен, и также euCD137 и внутриклеточный сигнальный домен.
Экспериментальный пример 6: получение рекомбинантного лентивируса huMVR
2
[0141] Культура клеток 293T, используемая для получения рекомбинантных лентивирусов, содержит среду, включающую 10% FBS (Millipore, TMS-013-BKR) и 1 мкл P/S (Gibco, 15140-122) в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (Welgene, LM001 -05). Клетки 293T инкубировали в среде DMEM, содержащей 10% FBS, в течение 24 ч перед трансдукцией в термостате с 5% CO при 37°C. На следующий день для трансфекции реагент для трансфекции и четыре лентивирусные плазмиды смешивали в подходящем соотношении и инкубировали в течение 48 ч. Затем собирали супернатант, содержащий лентивирус, и центрифугировали при 400× g в течение 10 мин. Кроме того, супернатант фильтровали через шприцевой фильтр 0,45 мкм с использованием шприца на 50 мл. Полученный супернатант смешивали в соотношении 3:1 с реагентом набора для обогащения лентивирусов (Clontech, 631231) и подвергали взаимодействию при 4°C в течение 24-48 ч. Затем проводили центрифугирование в течение 2 ч при 4°C и 4000 об/мин для получения вируса, который ресуспендировали в 0,5 мл среды RPMI (Welgene, LM001-01), не содержащей FBS, с получением лентивируса.
6.1: определение количества инфицированных лентивирусных частиц с использованием flag, конъюгированного с N-концевым химерным антигеном
5
10
2
[0142] Трансдуцирующие единицы (ТЕ/мл) определяли анализом количества частиц лентивирусов, реально способных к трансдукции, с использованием клеток Jurkat. В первый день клетки Jurkat высевали в 96-луночные планшеты из расчета 1×10 клеток/100 мкл на лунку. На второй день готовили серийные разведения лентивируса «шагом» 1/3 в 96-луночных планшетах и проводили лентивирусную трансдукцию на уже высеянных клетках Jurkat. В это время в среду RPMI (10% FBS и 1× P/S) добавляли полибрен (Millipore) для дополнительного повышения трансдукции лентивируса. После центрифугирования при 1200× g и 25°C в течение 2 ч клетки инкубировали в течение 3 ч в термостате с 5% CO при 37°C и добавляли только 100 мкл среды RPMI на лунку. На день 5 flag лентивируса, введенного в клетку, окрашивали анти-Flag-DYKDDDDK (Biolegend, номер по каталогу № 637310) для определения процента трансдуцированных клеток, с помощью проточного цитометра. Используя это, рассчитывали титр, как описано в публикации Follenzi and Naldini, 2002 (Follenzi and Naldini, 2002), и результат оказался равным 1,4×10 МЕ/мл.
Экспериментальный пример 7: размораживание и активность Т-клеток
[0143] Замороженные мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) размораживали в течение 5 мин на бане с постоянной температурой 37°C и суспендировали в среде RPMI1640. Затем проводили центрифугирование при 1500 об/мин в течение 5 мин и супернатант удаляли. Т-клетки выделяли с использованием CD4 микрогранул (Miltenyi Biotec, 130-045-101) и CD8 микрогранул (Miltenyi Biotec, 130-045-201). Для метода выделения CD4, CD8 Т-клеток использовали протокол с CD4,CD8 микрогранулами (DS_130-045-101, DS_130-045-201).
6
6
2
[0144] После доведения плотности выделенных клеток до 1×10 клеток/мл, среду для CAR-T (базальная среда IL Optimizer CTS+26 мл оптимизатора CTS+50 мл смеси CTS immune Cell SR+10 мл пенициллина-стрептомицина+10 мл GlutaMAX-1), и добавляли IL-2 в концентрации 20 МЕ/мл. Кроме того, добавляли 10 мкл активатора T-cell TransAct (Miltenyi Biotec, 130-111-160) на 1×10 клеток, помещали в колбу T75 или 24-луночный планшет и инкубировали в термостате (37°C, 5% CO) в течение 2 дней (фиг. 8)
Экспериментальный пример 8: трансдукция CAR и инкубация CAR-T-клеток
6
6
6
6
2
[0145] Т-клетки, активированные в течение 2 дней, добавляли из расчета 2×10 клеток на 1 лунку 24-луночного планшета, и добавляли лентивирус, содержащий ген CAR, при множественности инфекции (MOI) 1-3. Добавляли протамина сульфат (номер продукта ADR301) и суспендировали до конечной концентрации 10 мкг/мл. 24-луночный планшет центрифугировали при 400× g и 32°C в течение 2 ч и после суспендирования клеток в 20 мл среды CAR-T (IL-2 200 МЕ/мл) их помещали в колбу T75 и инкубировали в термостате (37°C, 5% CO) в течение 2 дней. Через 2 дня подсчитывали число клеток, плотность клеток доводили до 0,5×10 клеток/мл, и клетки добавляли в среду CAR-T и IL-2 добавляли из расчета 200 МЕ/мл для общего количества инкубационного бульона. Если плотность клеток была ниже 0,5×10 клеток/мл, то добавляли 200 МЕ/мл IL-2 относительно общего количества культуральной жидкости без добавления среды CAR-T. После этого каждые 2 дня проводили подсчет клеток и добавляли среду CAR-T (IL-2 200 МЕ/мл) при стандартной плотности клеток 0,5×10 клеток/мл. CAR-T-клетки собирали между 7 и 14 днями после начала инкубации (фиг. 7).
Экспериментальный пример 9: анализ цитотоксичности
[0146] Цитотоксичность CAR-T-клеток для клеток-мишеней определяли с помощью анализа на основе люциферазы. Клетки-мишени инфицировали вирусом EBV, несущим ген люциферазы, для получения клеток-мишеней, несущих ген люциферазы. Совместное культивирование с эффекторными клетками проводили при соотношении эффектор-мишень (E/T) в течение 24 ч при 37°C. После совместного культивирования и последующей обработки реагентом CytoTox-Glo Cytotoxicity (promega, G9290) значения RLU для живых клеток-мишеней измеряли с помощью микропланшетного люминометра Fluroskan FL (Thermo).
5
4
4
2
[0147] Более конкретно, пробы в трех повторностях готовили в 96-луночном белом планшете с плоским дном (COSTAR, 3917) с эффекторными клетками в количестве 4,5×10 клеток/50 мкл, при соотношении E/T 3:1 в расчете на 1,5×10 клеток-мишеней и разбавляли 1/3 для получения соотношений E/T 3:1, 1:1, 0,3:1 и 0,1:1. В каждой лунке эффекторные клетки вместе с 1,5×10 клетками-мишенями (50 мкл) совместно культивировали в термостате (37°C, 5% CO) в течение 18-24 ч, и затем добавляли 100 мкл CytoTox-Glo Cytotoxicity (Promega, G9290), блокировали свет, и через 5 мин измеряли значение люминесценции с помощью микропланшетного люминометра Fluroskan FL (Thermo).
[0148] В результате было установлено, что huMVR CAR-T проявляли 95,4% цитотоксическую активность в соотношении Е/Т 3:1 (фиг. 8).
Экспериментальный пример 10: инкубация клеточной линии
[0149] Клеточные линии CBKLCL-Luc и KHJ LCL-Luc (далее по тексту LCL-Luc), из Национального института рака, инкубировали в среде RPMI1640 (Welgene, номер по каталогу LM011-01) с 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS, Millipore, номер по каталогу TMS-013-KBR) и 1% смесью пенициллин/стрептомицин (Gibco, номер по каталогу 15140-122).
Экспериментальный пример 11: определение двух типов CD19CAR-T-клеток, в которые были введены CD19CAR и CD19CAR_euCD137
[0150] Для повышения иммунологической эффективности, CD19CAR (последовательность № 17, последовательность № 12 в заявке на патент США 8906682) и CD19CAR_euCD137 (последовательность № 18), в которых домен 4-1BB в CD19CAR был заменен на euCD137, получали по отдельности и культивировали с CD19CAR-Т-клетками для оценки вновь установленной эффективности вектора, экспрессирующего CAR (CAR_euCD137), с euCD137 (4-1BBaa209-255, последовательность № 14) в качестве костимулирующего сигнального фактора.
5
[0151] Окрашивание клеток для FACS выполняли для определения доли продукции двух видов CAR-T-клеток через 14 дней инкубации. Для каждого типа CAR-T-клеток от 2×10 клеток собирали в пробирки для FACS (FALCON, номер по каталогу 352052), затем добавляли 2 мл буфера для FACS и центрифугировали в течение 5 мин при 2000 об/мин с использованием центрифуги (Термо, СТ16). После удаления супернатанта добавляли 0,5 мкл/пробирку анти-CD8 APC (SKI, Biolegend, номер по каталогу 344722), 0,5 мкл/пробирку анти-CD4 BV650 (RPA-T4, Biolegend, номер по каталогу 300536) и 0,125 мкл/пробирку анти-flag (L5, Biolegend, номер по каталогу 637310) и проводили окрашивание при комнатной температуре в течение 30 мин. После добавления 2 мл буфера для FACS и центрифугирования при 2000 об/мин в течение 5 мин данную процедуру повторяли еще раз, для окрашивания выживших/мертвых клеток добавляли 1 мкл/пробирку 7-AAD (Biolegend, номер по каталогу 420404), и смесь оставляли на 5 мин при комнатной температуре, и затем анализировали с использованием FACS (BD, FACSCelesta).
[0152] Перед тестированием на подкожной опухолевой модели на животных эффекта CD19 CAR-T с использованием конструкции CAR (CD19CAR_euCD137, последовательность № 18), в которой euCD137 (аминокислоты 209-255, последовательность № 14) добавляли к 4- 1BB (аминокислоты 214-255, последовательность № 13), содержащий пять аминокислот, и обычную конструкцию (CD19CAR, последовательность № 17, последовательность № 12 в заявке на патент США 8906682), определяли долю CAR-T-клеток с использованием метода, описанного в экспериментальном примере 2. Анализ относительного количества продуцированных CD19 CAR-T-клеток с использованием окрашивания FACS подтвердило, что в случае улучшенной конструкции CD19 CAR-T-клеток (5aa CD19 CAR-T) соотношение клеток составляло CD4+/CAR+ 29,4%, CD8+/CAR+ 50,8% и в целом CAR-T 80,2%. Было установлено, что в неулучшенной конструкции CAR-T-клеток (CD19 CAR-T), соотношение клеток составляло 42,7% для CD4+/CAR+, 29,3% для CD8+/CAR+ и 72,0% для CAR-T в целом.
[0153] Следовательно, было показано, что 5aa CD19 CAR-T-клетки имели на 8,2% более высокую экспрессию CAR, чем CD19 CAR-T-клетки, и CD8+/CAR+ клетки составляли 21,5%, или примерно в 2 раза больше (фиг. 9-A).
Экспериментальный пример 12: оценка цитотоксичности полученных CD19CAR-T-клеток
5
5
4
4
4
2
[0154] Для оценки цитотоксичности двух типов CAR-T-клеток, культивированных в течение 14 дней, соотношение CAR-T (E):LCL (T) доводили до 30:1, 10:1, 3:1 и 1:1 в 96-луночных белых планшетах (Corning, номер по каталогу 3917). Сначала CAR-T-клетки помещали в лунки из расчета 6×10 клеток/50 мкл, 2×10 клеток/50 мкл, 9×10 клеток/50 мкл и 2×10 клеток/50 мкл, соответственно. Затем линию клеток-мишеней, а именно линию клеток CBK LCL-Luc, добавляли к 2×10 клеткам/50 мкл в термостате с CO при 37°C (Mammert, INCO153med) и оставляли взаимодействовать в течение 4 ч. Через 4 ч в каждую лунку добавляли 100 мкл Bright-Glo™ (Promega, номер по каталогу E2620), и через 5 мин измеряли относительные световые единицы (RLU) с помощью ELISA (Thermo, Fluorescan FL).
[0155] Не было установлено различий в цитотоксичности между CART, в которые был введен обычный 4-1BB, и CAR-T-клетками, в которые был введен euCD137, содержащий пять аминокислот, добавленных к домену 4-1BB.
[0156] В данном эксперименте было установлено, когда две линии CAR-T-клеток и линии клеток CBK LCL-Luc инкубировали вместе в соотношении 30:1, то цитотоксичность составляла примерно 80% через 4 ч, и когда клетки инкубировали в соотношении 10:1, то цитотоксичность равнялась примерно 50%. Поскольку соответствующее число CAR-T-клеток, инкубированных с опухолевыми клетками, уменьшалось в 3 раза, то цитотоксичность снижалась примерно в 3 раза; кроме того, когда 5 аминокислот были добавлены к домену 4-1BB in vitro, то было показано, что это не оказывало отрицательного влияния на цитотоксичность (фиг. 9B)
Экспериментальный пример 13: оценка экспрессии HLADR и анализ авидности HuMVR L2H2 scFv в клеточных линиях
5
[0157] FACS-анализ выполняли с использованием культивированной клеточной линии LCL-Luc, для оценки экспрессии HLADR в клеточной линии и анализа авидности разработанного scFv huMVR L2H2. После переноса 2×10 клеток линии LCL-Luc в пробирку для FACS добавляли 2 мл буфера для FACS и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин с использованием центрифуги. После удаления супернатанта добавляли анти-HLADR APC-H7 (G46-6, BD Pharmigen™, номер по каталогу 561358) в количестве 0,5 мкл/пробирку и полученное авторами изобретения MVR L2H2 из расчета 1,0 мкг/пробирку, и проводили окрашивание при комнатной температуре в течение 30 мин. Для промывки добавляли 2 мл буфера для FACS, затем проводили центрифугирование при 2000 об/мин в течение 5 мин, и супернатант отбрасывали. Эту процедуру повторяли еще раз. Для вторичного окрашивания huMVR L2H2 scFv добавляли 1 мкл/пробирку анти-His PE (Biolegend, номер по каталогу 362603) и проводили окрашивание в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем процедуру промывания с использованием буфера для FACS повторяли дважды, и добавляли 100 мкл буфера для FACS, и затем проводили анализ с использованием FACS.
[0158] Окрашивание и анализ FACS проводили для оценки экспрессии HLA DR, который является мишенью для huMVR L2H2, и авидности scFv huMVR L2H2 в опухолевых клетках.
[0159] Результаты оценки экспрессии HLA DR в клеточной линии LCL-Luc показали, что экспрессируется 100% HLA DR. Когда анализ авидности выполняли с использованием scFv huMVR L2H2, то было показано, по меньшей мере, 97% связывание с экспрессированным HLA DR (фиг. 10)
Экспериментальный пример 14: воспроизведение подкожных опухолевых моделей на животных и оценка CAR-T с помощью автоматического штангенциркуля и визуализации IVIS
6
3
6
6
6
3
6
6
6
[0160] В качестве экспериментальных животных использовали мышей NSG (NOD-scidIL2rγµL1) (The Jackson Laboratory) и содержали их в постоянных условиях в питомнике для животных. Температура составляла 23±2°C с 12-ч циклом свет/темнота и влажностью 50±10%; корм и воду давали ad libitum. В экспериментах по оценке эффективности с использованием CD19CAR-T (5aaCD19CAR-T) с пятью аминокислотами, добавленными к домену 4-1BB, клеточные линии CBK LCL-Luc готовили из расчета 2×10 клеток/100 мкл DPBS/голову и вводили подкожно 6-недельным самкам мышей для воспроизведения подкожной опухолевой модели на животных. Когда размер опухолей достигал от 50 до 100 мм при измерении с помощью автоматического штангенциркуля (Youngbio, TM900), вводили улучшенную конструкцию CD19 CAR-T-клеток и неулучшенную конструкцию CD19 CAR-T-клеток из расчета 2×10 клеток/100 мкл DPBS/голову (доза 1) и 6×10 клеток/100 мкл DPBS/голову (доза 2) однократно через хвостовую вену для оценки эффективности. В следующем эксперименте эффективность huMVR CAR-T-клеток оценивали на животной модели с использованием конструкции (huMVR CAR_euCD137, фиг. 6C), которая была сконструирована для экспрессии huMVR в конструкции CAR, содержащей пять аминокислот в домене 4-1BB. Подкожные опухолевые модели на животных индуцировали подкожной инъекцией клеток LCL-Luc 6-недельным самкам мышей в количестве 4×10 клеток/100 мкл DPBS/голову. Для оценки эффективности, когда размер опухолей достигал диапазона 50-100 мм, вводили однократную дозу MVR CAR-T из расчета 1×10 клеток/100 мкл DPBS/голову, 2×10 клеток/100 мкл DPBS/голову (доза 1) и 5×10 клеток/100 мкл DPBS/голову (доза 3) через хвостовую вену. Во всех экспериментах на животных периодически определяли размер и жизнеспособность опухолей.
[0161] Более конкретно, размер опухолей и фотонные значения определяли с использованием автоматических штангенциркулей и устройства для визуализации IVIS (PerkinElmer, Luna III) с 3- и 4-дневными интервалами после введения CAR-T. В случае использования TM900 размер опухолей определяли после помещения оборудования в месте локализации опухолей. При визуализации и определения фотонных значений с помощью устройства для визуализации IVIS, сначала вводили мышам внутрибрюшинно 150 мг/кг XenoLight™ D-люциферина (PerkinElmer, номер по каталогу 122799). Через 15 мин проводили ингаляционную анестезию изофлураном, и через 5 мин использовали IVIS для визуализации наличия опухолевых клеток. После визуализации проводили нормализацию, и затем определяли значения люциферазы (фотонные значения) и строили график.
[0162] Более конкретно, после воспроизведения подкожной опухолевой модели на животных с использованием линии клеток CBK LCL-Luc эффекты CD19 CAR-T и 5aa CD19 CAR-T клеток сравнивали с использованием визуализации IVIS. Как показано на фиг. 11A, эффект наблюдался в течение 1 недели после введения 2 видов CAR-T-клеток.
6
6
6
[0163] В опытной группе, в которой CD19 CAR-T с CD19CAR_euCD137 вводили в количестве 2×10 клеток/100 мкл DPBS/голову и 6×10 клеток/100 мкл DPBS/голову, опухолевые клетки наблюдали при визуализации IVIS через 1 неделю после введения. Кроме того, в группе, получавшей неулучшенную конструкцию CD19 CAR-T, когда вводили 6×10 клеток/100 мкл DPBS/голову, опухолевые клетки редко наблюдали с помощью визуализации в течение 1 недели после введения. Однако опухолевые клетки были идентифицированы в опытной группе, которой вводили неулучшенный CD19 CAR-T через 1 неделю.
6
6
6
6
[0164] Через 1 неделю после введения CAR-T, как показано на изображениях, определяли значение люциферазы, у каждого животного после процесса визуализации; значения люциферазы были подтверждены только в группе, которой вводили CD19 CAR-T в количестве 2×10 клеток/100 мкл DPBS/голову. При наблюдении через 3 недели или более после этого опухоли продолжали расти у мышей, которым не вводили CAR-T-клетки, и в трех опытных группах, в которых опухолевые клетки элиминировались изначально, не было выявлено опухолевых клеток. Однако через 10 дней уровни люциферазы снизились в группе, получавшей 2×10 клеток/100 мкл DPBS/голову для CD19 CAR-T, но опухолевые клетки не исчезали полностью через 3 недели. При введении улучшенной конструкции 5aa CD19 CAR-T из расчета 2×10 клеток/100 мкл DPBS/голову, с помощью экспериментальной визуализации опухолевых клеток было обнаружено, что эффективность была аналогична таковой в группе, получавшей CD19 CAR-T в количестве 6×10 клеток/100 мкл DPBS/голову. Результаты показали, отсутствовало различие в цитотоксичности 5aa CD 19 CAR-T и CD 19 CAR-T in vitro, но было показано, что эффективность была в 5 раз выше для 5aa CD19 CAR-T на животных моделях (фиг. 11).
Экспериментальный пример 15: определение доли CD19 CAR-T с 5 добавленными аминокислотами в домене 4-1BB на животной модели in vivo
[0165] После введения CAR-T-клеток на подкожной опухолевой модели на животных для оценки эффективности улучшенной конструкции CAR-T-клеток, определяли присутствие CAR-T по анализу крови мышей.
[0166] Более конкретно, забор крови из орбитального венозного синуса мышей проводили с 3- и 4-дневными интервалами после введения CAR-T. Во время каждого отбора крови собирали 70 мкл крови и 60 мкл крови использовали для определения доли CAR-T-клеток и подсчета клеток. 60 мкл крови помещали в пробирку для FACS емкостью 5 мл, и проводили окрашивание живых/мертвых клеток с использованием Zombie Aqua BV510 (Biolegend, номер по каталогу 423101). После достижения концентрации 0,1 мкл/100 мкл DPBS/пробирку окрашивание проводили при комнатной температуре в течение 10 мин. Добавляли счетные гранулы (Molecularprobes, номер по каталогу C36950), анти-CD45 FITC (HI30, Biolegend, номер по каталогу 304006), анти-CD8 BV786 (SK-1, Biolegend, номер по каталогу 344740), анти-CD4 BV650 и анти-flag PE и окрашивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Каждое антитело смешивали из расчета 0,5 мкл/100 мкл буфера FACS на пробирку и добавляли 25 мкл счетных гранул. Через 30 мин добавляли 2 мл IX буфера для лизиса эритроцитов (Biolegend, номер по каталогу 422401), и подвергали взаимодействию при комнатной температуре в течение 5 мин. После центрифугирования в течение 5 мин при 2000 об/мин с использованием центрифуги весь супернатант удаляли.
[0167] В эту пробирку добавляли 2 мл промывочного буфера для FACS и проводили центрифугирование в течение 5 мин при 2000 об/ мин. Эту процедуру повторяли еще раз, и затем добавляли 50 мкл буфера для FACS и анализировали с помощью FACS.
6
6
6
6
6
6
6
6
6
[0168] Через одну неделю после введения CAR-T-клеток в группе с введением 5aa CD19 CAR-T примерно 20% 5aa CD19 CAR-T-клеток находились в крови как в группах с 2×10 клеток/100 мкл DPBS/голову, так и в группах с 6×10 клеток/100 мкл DPBS/голову; но в группе, которым вводили CD19 CAR-T, при введении 6×10 клеток/100 мкл DPBS/голову было подтверждено наличие только 5% CD19 CAR-T. Через 3 дня число и доля CAR-T-клеток в организме мыши достигали максимума и затем снижались. В течение одной недели в 3 опытных группах, в которых были обнаружены CAR-T-клетки (5aa CD19 CAR-T; 2×10 клеток/100 мкл DPBS/голову и 6×10 клеток/100 мкл DPBS/голову, CD19 CAR-T; 6×10 клеток/100 мкл DPBS/голову), опухолевые клетки быстро погибали, вероятно, за счет того, они могли контактировать с относительно большим количеством CAR-T-клеток, прежде чем они пролиферировали в организме мыши. Однако в опытной группе, мышам которой вводили CD19CAR-T в количестве 2×10 клеток/100 мкл DPBS/голову, доля и количество CAR-T-клеток достигли максимума через 2 недели, и доля CAR-T составляла примерно 25% при том, что опухолевые клетки относительно хорошо пролиферировали. Улучшенная конструкция 5aa CD 19 CAR-T была более стабильной по количеству, чем CD19 CAR-T, после того, как доля CAR-T сначала увеличилась, и затем уменьшилась. Однако в случае CD19 CAR-T, доля CAR-T-клеток увеличивалась и уменьшалась на более поздние сроки, и, следовательно, для исчезновения опухолей в организме мыши требовалось больше времени. В результате, как показывают данные этого эксперимента, группа, которой вводили 5aa CD19 CAR-T в количестве 2×10 клеток/100 мкл DPBS/голову, показала аналогичные уровни CAR-T и эффекты у мышей с группой, которой вводили CD19 CAR-T из расчета 6×10 клеток/100 мкл DPBS/голову, что указывает на то, что 5aa CD19 CAR-T имеет более высокий эффект (фиг. 12).
Экспериментальный пример 16: воспроизведение внутрибрюшинной опухолевой модели на животных и оценка эффективности CD8 и CD4/CD8 huMVR CAR-T (CAR_euCD137) на внутрибрюшинной опухолевой модели на животных
6
6
6
6
6
[0169] Экспериментальные животные, использованные для воспроизведения внутрибрюшинной опухолевой модели на животных, были такими же, как и животные, использованные в экспериментальном примере 14, и содержались в аналогичных условиях. Конструировали CD8 huMVR CAR-T и CD4/CD8 huMVR CAR-T с использованием усовершенствованной конструкции CAR (CAR_euCD137), и эффективность оценивали на внутрибрюшинной опухолевой модели на животных. Для воспроизведения внутрибрюшинной опухолевой модели на животных, в брюшную полость вводили клетки линии LCL-Luc, экспрессирующие люциферазу, в количестве 2×10 клеток/100 мкл DPBS/голову, и через девять дней животных распределяли на пять групп в соответствии с фотонными значениями. После разделения на соответствующие группы вводили CD8 MVR CAR-T инъекцией в хвостовую вену в дозе 0,5×10 клеток/ 100 мкл DPBS/голову (доза 1), 2,0×10 клеток/100 мкл DPBS/голову (доза 2) и 10×10 клеток/100 мкл DPBS на голову (доза 3), или 0,5×10 клеток CD4 и CD8 huMVR CAR-T соответственно смешивали и вводили однократно. Во всех опытах на животных периодически определяли размер и жизнеспособность опухолей (фиг.13). Конкретный экспериментальный метод был таким же, как описанный в примере 14.
[0170] После выделения CD4 и CD8 из PBMC, полученных из крови здорового взрослого, scFv huMVR экспрессировали в модифицированной конструкции CAR, и проводили оценку эффективности на внутрибрюшинной опухолевой модели на животных с использованием huMVR CAR-T.
Эффективность huMVR CAR-T оценивали визуализацией и определением фотонных значений, показанных экспрессирующими люциферазу опухолевыми клетками.
6
6
6
[0171] После проведения оценки 2 раза в неделю с использованием устройства для визуализации IVIS, через 27 дней после введения CAR-T опытным группам, в контрольной группе мышей, у которых были опухоли, и CAR-T не вводили, все животные пали. Однако все мыши, у которых развились опухоли и которым вводили huMVR CAR-T, выживали в течение, по меньшей мере, 27 дней. В группе мышей, которым вводили CD8 huMVR CAR-T в низкой дозе (0,5×10 клеток/100 мкл DPBS/голову), опухоли имели тенденцию к уменьшению размеров, и затем снова к увеличению через 10 дней; в группе, которой вводили CD8 huMVR CAR-T в средней дозе (2,0×10 клеток/100 мкл DPBS/голову), имелась тенденция к медленному снижению фотонных значений в течение 27 дней. Однако, когда CD8 huMVR CAR-T вводили в высокой дозе (10,0×10 клеток/голову) было установлено, что все опухоли исчезли через 13 дней. Кроме того, когда CD4 и CD8 MVR CAR-T вводили вместе в низких дозах, то было показано, что опухоли исчезли у большинства мышей (у 3 из 5 мышей) примерно к дню 27, хотя они не были такими же эффективными, как CD8 huMVR CAR-T в высокой дозе. Следовательно, результаты данного опыта показали, что huMVR CAR-T оказывает эффект в средней дозе или выше, и при использовании вместе с CD4, и не только с CD8, эффект имеет место даже при использовании в более низкой дозе CAR-T (фиг.13).
Экспериментальный пример 17: оценка эффективности CD4/8 huMVR CAR-T на подкожных опухолевых моделях на животных
[0172] В экспериментальном примере 13 было показано, что продуцирование huMVR CAR-T с использованием CD4 и CD8 Т-клеток вместе при конструировании MVR CAR-T является более эффективным в экспериментах на животных. Основываясь на вышеприведенном примере, получали CD4/CD8 huMVR CAR-T и вводили в низких, средних и высоких дозах, и эффективность CAR-T оценивали с использованием подкожной опухолевой модели на животных.
6
6
6
[0173] Когда рост опухолей оценивали с использованием автоматического штангенциркуля, то в группе, получавшей высокую дозу (5,0×10 клеток/100 мкл/голову; доза 3), рост опухолей замедлялся на день 10, рост опухолей имел обратную тенденцию на день 14, и большая часть опухолей исчезала на день 17. Как показано на фиг. 14А, опухоли было трудно обнаружить на изображениях на день 21. Даже в группах, которым вводили среднюю дозу (2,0×10 клеток/100 мкл/голову; доза 2) и низкую дозу (1,0×10 клеток/100 мкл/голову; доза 1), рост опухолей замедлялся, начиная со дня 17 после введения CAR-T, и опухоли уменьшались со дня 21. Однако в результате использования устройства для визуализации были некоторые мыши, у которых опухолевые клетки оставались в организме более 4 недель, и хотя эффект проявлялся в средней и низкой дозе, эффект был замедленным по сравнению с высокой дозой. Когда опухолевые клетки визуализировали с помощью визуализации IVIS, хотя опухолевая модель воспроизводилась подкожной прививкой, со временем было установлено, что опухоли распространялись на лимфатические узлы. Однако когда вводили MVR CAR-T, то все метастатические опухолевые клетки погибали.
[0174] (Фиг.15) Кроме того, когда в данном эксперименте была подтверждена жизнеспособность животных за счет введения huMVR CAR-T, в контрольной группе все мыши, которым не вводили CAR-T, пали на день 18, но все мыши выживали в группе, которой вводили MVR CAR-T (фиг.16).
Экспериментальный пример 18: идентификация in vivo CD4/8 MVR CAR-T на животных моделях
[0175] Кровь, полученную от мыши, использованной в экспериментальном примере 17, подвергали анализу для определения доли и количества CAR-T, присутствующего в теле животного. Анализ крови показал, что доля CAR-T была низкой у мышей, которым вводили CAR-T через 3 дня, и количество CAR-T быстро увеличивалось с 7% до 31% в группе с высокой дозой через 10 дней. Это была точка, на которой размер опухолей и фотонные значения снижались в группе с высокой дозой MVR. Кроме того, в случае средней и низкой доз huMVR CAR-T доля CAR-T увеличивалась со дня 17 после введения, и размер опухолей и фотонные значения уменьшались со дня 21 (фиг. 17).
Таблица 2
Номер последовательности
Информация
1
CDR1 тяжелой цепи huMVR.H2
2
CDR2 тяжелой цепи huMVR.H2
3
CDR3 тяжелой цепи huMVR.H2
4
CDR1 легкой цепи huMVR.L2
5
CDR2 легкой цепи huMVR.L2
6
CDR3 легкой цепи huMVR.L2
7
Вариабельная область тяжелой цепи huMVR.H2
8
Вариабельная область легкой цепи huMVR.L2
9
scFv huMVRL2H2
10
Вариабельная область тяжелой цепи huMVR.H1
11
Вариабельная область легкой цепи huMVR.L1
12
scFv huMVRL1H1
13
сигнальный домен 4-IBB
14
euCD137
15
MVR.L2H2 CAR
16
MVR.L2H2 CAR_euCD137
17
CD19 CAR
18
CD19 CAR_euCD137
19
EF1a-промотор
20
лидерная последовательность CD8-α
21
Flag
22
CD19scFv
23
CD8/шарнир/трансмембранная последовательность
24
CD3z
25
сурок/PRE
26
R/область
[0176] Например, для целей построения формулы изобретения не предполагается, что формула, приведенная ниже, должна толковаться каким-либо образом уже, чем ее буквальный язык, и, таким образом, не предполагается, что примерные варианты осуществления из описания будут в формуле изобретения. Соответственно, следует понимать, что настоящее изобретение было описано для иллюстрации, и не для ограничения объема формулы изобретения. Соответственно, настоящее изобретение ограничивается только следующей формулой изобретения. Все публикации, выданные патенты, заявки на патенты, книги и журнальные статьи, цитированные в этой заявке, включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей своей полноте.
Свободный текст списка последовательностей
--->
Список последовательностей
<110>  Eutilex Co., Ltd.
<120>  ХИМЕРНЫЙ АНТИГЕННЫЙ РЕЦЕПТОР, КОТОРЫЙ СВЯЗЫВАЕТ HLA-DR, И
CAR-T-КЛЕТКА
<130>  47683-0032002
<140>  16/715,462
<141>  2019-12-16
<150>  62/717,267
<151>  2018-08-10
<150>  62/867,503
<151>  2019-06-27
<150>  PCT/KR2019/010244
<151>  2019-08-12
<160>  30
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетический полипептид
<210>    1
<211>    5
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    CDR1 тяжелой цепи huMVR.H2
<400>    1
Arg Tyr Ser Val His
1               5
<210>    2
<211>    16
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    CDR2 тяжелой цепи huMVR.H2
<400>    2
Met Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1               5                  10                  15
<210>    3
<211>    13
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    CDR3 тяжелой цепи huMVR.H2
<400>    3
Asn Glu Gly Asp Thr Thr Ala Gly Thr Trp Phe Ala Tyr
1               5                  10
<210>    4
<211>    11
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    CDR1 легкой цепи huMVR.L2
<400>    4
Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp Leu Ala
1               5                  10
<210>    5
<211>    7
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    CDR2 легкой цепи huMVR.L2
<400>    5
Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr
1               5
<210>    6
<211>    9
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    CDR3 легкой цепи huMVR.L2
<400>    6
Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Phe Thr
1               5
<210>    7
<211>    121
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Вариабельная область тяжелой цепи huMVR.H2
<400>    7
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr
20                  25                  30
Ser Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50                  55                  60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Asn Glu Gly Asp Thr Thr Ala Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>    8
<211>    107
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Вариабельная область легкой цепи huMVR.L2
<400>    8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>    9
<211>    243
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    scFv huMVRL2H2
<400>    9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100                 105                 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu
115                 120                 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys
130                 135                 140
Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr Ser Val His Trp Ile Arg
145                 150                 155                 160
Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Met Ile Trp Gly Gly
165                 170                 175
Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser
180                 185                 190
Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr
195                 200                 205
Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Glu Gly Asp Thr
210                 215                 220
Thr Ala Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
225                 230                 235                 240
Val Ser Ser
<210>    10
<211>    121
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Вариабельная область тяжелой цепи huMVR.H1
<400>    10
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Arg Tyr
20                  25                  30
Ser Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Asn Glu Gly Asp Thr Thr Ala Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>    11
<211>    107
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Вариабельная область легкой цепи huMVR.L1
<400>    11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35                  40                  45
Tyr Gly Ala Thr Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>    12
<211>    243
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    scFv huMVRL1H1
<400>    12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35                  40                  45
Tyr Gly Ala Thr Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100                 105                 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu
115                 120                 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys
130                 135                 140
Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Arg Tyr Ser Val His Trp Ile Arg
145                 150                 155                 160
Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met Ile Trp Gly Gly
165                 170                 175
Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser
180                 185                 190
Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr
195                 200                 205
Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Glu Gly Asp Thr
210                 215                 220
Thr Ala Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
225                 230                 235                 240
Val Ser Ser
<210>    13
<211>    42
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Сигнальный домен 4-1BB
<400>    13
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1               5                  10                  15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20                  25                  30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35                  40
<210>    14
<211>    47
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    euCD137
<400>    14
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
1               5                  10                  15
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
20                  25                  30
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35                  40                  45
<210>    15
<211>    1401
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    последовательность CAR MVR.L2H2
<400>    15
gatattcaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc         60
atcacctgca aggccagtga ccacatcaac aactggctgg cctggtatca acagaaacca        120
ggaaaagctc cgaaactact gatcagcggc gccacctctc tggaaaccgg agtcccttct        180
cgcttctctg gttccggatc tgggaaggat tacactctga ccatcagcag tctgcagccg        240
gaagacttcg caacttatta ctgtcagcag tactggtcca cccccttcac cttcggacag        300
ggtaccaagg tggagatcaa aggcggaggc ggatctggcg gcggaggaag tggcggaggg        360
ggatctcagg tgcagctgca ggagtcgggc ccaggactgg tgaagccttc ggagaccctg        420
tccctcacct gcactgtctc tggtttctcc ctgagtcggt actctgtgca ttggatccgg        480
cagcccccag ggaagggact ggagtggctg gggatgatct ggggaggcgg cagcaccgac        540
tacaacagcg ccctgaagtc ccgactgacc atatcaaagg acaactccaa gaaccaggtg        600
tccttgaagc tgagctctgt gaccgctgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagaaat        660
gagggcgata ccaccgccgg cacttggttt gcctattggg gccagggaac cctggtcacc        720
gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgctagc        780
cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg        840
agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg        900
gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg        960
tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt       1020
agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg       1080
agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta       1140
ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg       1200
ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag       1260
atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac       1320
gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg       1380
caggccctgc cccctcgcta a                                                 1401
<210>    16
<211>    1416
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    последовательность CAR_euCD137 MVR.L2H2
<400>    16
gatattcaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc         60
atcacctgca aggccagtga ccacatcaac aactggctgg cctggtatca acagaaacca        120
ggaaaagctc cgaaactact gatcagcggc gccacctctc tggaaaccgg agtcccttct        180
cgcttctctg gttccggatc tgggaaggat tacactctga ccatcagcag tctgcagccg        240
gaagacttcg caacttatta ctgtcagcag tactggtcca cccccttcac cttcggacag        300
ggtaccaagg tggagatcaa aggcggaggc ggatctggcg gcggaggaag tggcggaggg        360
ggatctcagg tgcagctgca ggagtcgggc ccaggactgg tgaagccttc ggagaccctg        420
tccctcacct gcactgtctc tggtttctcc ctgagtcggt actctgtgca ttggatccgg        480
cagcccccag ggaagggact ggagtggctg gggatgatct ggggaggcgg cagcaccgac        540
tacaacagcg ccctgaagtc ccgactgacc atatcaaagg acaactccaa gaaccaggtg        600
tccttgaagc tgagctctgt gaccgctgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagaaat        660
gagggcgata ccaccgccgg cacttggttt gcctattggg gccagggaac cctggtcacc        720
gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgctagc        780
cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg        840
agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg        900
gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgccgtt tctctgttgt taaacggggc        960
agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa       1020
gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga       1080
gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtacaagc agggccagaa ccagctctat       1140
aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg       1200
gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa       1260
ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg       1320
aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac       1380
gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgctaa                                 1416
<210>    17
<211>    1398
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    последовательность CAR CD19
<400>    17
gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc         60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca        120
gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca        180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa        240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg        300
gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc        360
ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg        420
tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc        480
cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac        540
tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt        600
ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat        660
tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc        720
tcctcaacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgctagccag        780
cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg        840
gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc        900
cttctcctgt cactggttat caccctttac tgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat        960
atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc       1020
tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc       1080
gcagacgccc ccgcgtacaa gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga       1140
cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga       1200
aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg       1260
gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat       1320
ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag       1380
gccctgcccc ctcgctaa                                                     1398
<210>    18
<211>    1420
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    последовательность CAR_euCD137 CD19
<400>    18
gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc         60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca        120
gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca        180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa        240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg        300
gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc        360
ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg        420
tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc        480
cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac        540
tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt        600
ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat        660
tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc        720
tcctcaacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgctagccag        780
cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg        840
gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc        900
cttctcctgt cactggttat caccctttac tgccgtttct ctgttgttaa acggggcaga        960
aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag       1020
gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg       1080
aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg tacaagcagg gccagaacca gctctataac       1140
gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac       1200
cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg       1260
cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg       1320
ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac       1380
gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc taagtcgaca                             1420
<210>    19
<211>    1184
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    EF1a-промотор
<400>    19
cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt         60
tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg        120
aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa        180
gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa        240
gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt        300
gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg        360
ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg        420
cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg        480
ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt        540
tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg        600
gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc        660
tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg        720
tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg        780
caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc tgctgcaggg agctcaaaat        840
ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aaaagggcct        900
ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccactgagta ccgggcgccg tccaggcacc        960
tcgattagtt ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg ttggggggag gggttttatg       1020
cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt taggccagct tggcacttga       1080
tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc ttggttcatt ctcaagcctc       1140
agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc gtga                        1184
<210>    20
<211>    69
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    лидерная последовательность CD8-a
<400>    20
ggatccatgg ccttaccagt gaccgccttg ctcctgccgc tggccttgct gctccacgcc         60
gccaggccg                                                                 69
<210>    21
<211>    24
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Flag
<400>    21
gactacaagg acgacgatga caag                                                24
<210>    22
<211>    726
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    CD19scFv
<400>    22
gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc         60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca        120
gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca        180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa        240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg        300
gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc        360
ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg        420
tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc        480
cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac        540
tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt        600
ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat        660
tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc        720
tcctca                                                                   726
<210>    23
<211>    207
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    CD8/Шарнир/Трансмембранная последовательность
<400>    23
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgctag ccagcccctg         60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg        120
gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc        180
ctgtcactgg ttatcaccct ttactgc                                            207
<210>    24
<211>    339
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    CD3z
<400>    24
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc         60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc        120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat        180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc        240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc        300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa                               339
<210>    25
<211>    591
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Woodchuck/PRE
<400>    25
atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc         60
cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta        120
tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt        180
ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg        240
gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta        300
ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt        360
tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaagctgac gtcctttcca tggctgctcg        420
cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca        480
atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc        540
gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgcct g                 591
<210>    26
<211>    98
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    R/область
<400>    26
gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca         60
ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttca                                 98
<210>  27
<211>  121
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетический полипептид
<400>  27
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr
20                  25                  30
Ser Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50                  55                  60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65                  70                  75                  80
Glu Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Asn Glu Gly Asp Thr Thr Ala Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  28
<211>  121
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетический полипептид
<400>  28
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Asn Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Val Met Gly Ile Ala Ala Ala Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  29
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетический полипептид
<400>  29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Tyr Leu Ser Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Gly Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Thr
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  30
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетический полипептид
<400>  30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<---