КОМПОЗИЦИИ И МЕТОДЫ КОНЪЮГИРОВАНИЯ АКТИВИРУЕМЫХ АНТИТЕЛ

1. Способ частичного восстановления и конъюгирования агента с активируемым антителом и, тем самым, селективной локализации указанного агента, где указанный способ включает частичное восстановление по меньшей мере одной дисульфидной связи в активируемом антителе под действием восстановителя без разрыва каких-либо внутрицепьевых дисульфидных связей в активируемом антителе, и конъюгирование указанного агента по меньшей мере с одним тиолом, где указанное активируемое антитело включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (AB), которые специфически связываются с мишенью; маскирующую группу (MM), которая ингибирует связывание АВ активируемого антитела в нерасщепленном состоянии с мишенью; и отщепляемую группу (CM), связанную с AB, где CM представляет собой полипептид, который служит субстратом для протеазы.
2. Способ по п. 1, где по меньшей мере одной дисульфидной связью является межцепьевая дисульфидная связь.
3. Способ по п. 1, где по меньшей мере одной дисульфидной связью является дисульфидная связь, расположенная между активируемым антителом и второй молекулой.
4. Способ по п. 3, где второй молекулой является цистеин или глутатион.
5. Способ по п. 1, где активируемое антитело в нерасщепленном состоянии имеет следующую структуру, от N-конца до C-конца: MM-CM-AB или AB-CM-MM.
6. Способ по п. 1, где восстановителем является TCEP.
7. Способ по п. 1, где указанный агент выбран из группы агентов, перечисленных в таблице 4.
8. Способ по п. 1, где указанным агентом является токсин или его фрагмент.
9. Способ по п. 8, где указанным агентом является ингибитор микротрубочек.
10. Способ по п. 8, где указанным агентом является агент, разрушающий нуклеиновую кислоту.
11. Способ по п. 8, где указанным агентом является доластатин, ауристатин или его производное, майтанзиноид или его производное, дуокармицин или его производное или калихеамицин или его производное.
12. Способ по п. 4, где указанным агентом является ауристатин E или его производное.
13. Способ по п. 4, где указанным агентом является монометилауристатин E (MMAE) или монометилауристатин D (MMAD).
14. Способ по п. 4, где указанным агентом является монометилауристатин E (MMAE).
15. Способ по п. 4, где указанным агентом является монометилауристатин D (MMAD).
16. Способ по п. 4, где указанным агентом является DM1 или DM4.
17. Способ по п. 4, где указанный агент конъюгирован с AB посредством линкера.
18. Способ по п. 17, где указанным линкером является расщепляемый линкер.
19. Способ по п. 1, где указанным агентом является детектируемая молекула.
20. Способ по п. 19, где указанной детектируемой молекулой является диагностический агент.
21. Способ по п. 1, где мишень выбирают из группы мишеней, перечисленных в таблице 1.
22. Способ по п. 1, где AB представляет собой антитело или происходящее от него антитело, выбранное из группы, состоящей из антител, перечисленных в таблице 2.
2
23. Способ по п. 1, где антигенсвязывающий фрагмент указанного антитела выбран из группы, состоящей из Fab-фрагмента, F(ab')-фрагмента, scFv, scAb, dAb, тяжелой цепи однодоменного антитела и легкой цепи однодоменного антитела.
24. Способ по п. 1, где константа равновесной реакции диссоциации при связывании MM с AB выше, чем при связывании АВ с мишенью.
25. Способ по п. 1, где MM не влияет на связывание AB активируемого антитела в расщепленном состоянии с мишенью или не конкурирует с указанным АВ за связывание с мишенью.
26. Способ по п. 1, где MM представляет собой полипептид длиной не более, чем 40 аминокислот.
27. Способ по п. 1, где полипептидная последовательность MM отличается от полипептидной последовательности мишени, и полипептидная последовательность MM не более, чем на 50% идентична последовательности любого природного партнера по связыванию с АВ.
28. Способ по п. 1, где аминокислотная последовательность MM не более, чем на 25% идентична последовательности мишени.
29. Способ по п. 1, где аминокислотная последовательность MM не более, чем на 10% идентична последовательности мишени.
30. Способ по п. 1, где CM представляет собой полипептид длиной до 15 аминокислот.
31. Способ по п. 1, где протеаза локализуется вместе с мишенью в ткани и отщепляет CM от активируемого антитела при ее воздействии на это антитело.
32. Способ по п. 1, где активируемое антитело включает линкерный пептид, расположенный между MM и CM.
33. Способ по п. 1, где активируемое антитело включает линкерный пептид, расположенный между CM и AB.
34. Способ по п. 1, где активируемое антитело включает первый линкерный пептид (LP1) и второй линкерный пептид (LP2), и где активируемое антитело в нерасщепленном состоянии имеет следующую структуру, от N-конца до C-конца: MM-LP1-CM-LP2-AB или AB-LP2-CM-LP1-MM.
35. Способ по п. 34, где два линкерных пептида необязательно должны быть идентичными.
36. Способ по п. 34, где каждый из LP1 и LP2 представляет собой пептид длиной приблизительно 1-20 аминокислот.
n
n
n
n
37. Способ по п. 34, где по меньшей мере один из LP1 или LP2 включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (GS), (GGS), (GSGGS) (SEQ ID NO: 21), (GGGS) (SEQ ID NO: 22), GGSG (SEQ ID NO: 23), GGSGG (SEQ ID NO: 24), GSGSG (SEQ ID NO: 25), GSGGG (SEQ ID NO: 26), GGGSG (SEQ ID NO: 27) и GSSSG (SEQ ID NO: 28), где n равно целому числу по меньшей мере 1.
38. Способ по п. 1, где СМ представляет собой субстрат фермента, выбранного из группы, состоящей из ферментов, представленных в таблице 3.
39. Способ по п. 1, где активируемое антитело в нерасщепленном состоянии содержит спейсер, который непосредственно присоединен к MM и имеет следующее структурное положение, в направлении от N-конца к С-концу: спейсер-MM-CM-AB.
40. Конъюгированное активируемое антитело, которое в активированном состоянии связывается с мишенью, где указанное конъюгированное активируемое антитело включает:
антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (AB), которые специфически связываются с мишенью, где АВ конъюгировано с монометилауристатином D (MMAD);
маскирующую группу (MM), которая ингибирует связывание АВ активируемого антитела в нерасщепленном состоянии с мишенью; и
отщепляемую группу (CM), связанную с AB, где CM представляет собой полипептид, который служит субстратом для протеазы.
41. Конъюгированное активируемое антитело по п. 40, где константа равновесной реакции диссоциации при связывании MM с AB выше, чем при связывании АВ с мишенью.
42. Конъюгированное активируемое антитело по п. 40, где MM не влияет на связывание AB активируемого антитела в расщепленном состоянии с мишенью или не конкурирует с указанным АВ за связывание с мишенью.
43. Конъюгированное активируемое антитело по п. 40, где протеаза локализуется вместе с мишенью в ткани и отщепляет CM от активируемого антитела при ее воздействии на это антитело.
44. Конъюгированное активируемое антитело по п. 40, где активируемое антитело в нерасщепленном состоянии имеет следующую структуру, от N-конца до C-конца: MM-CM-AB или AB-CM-MM.
45. Конъюгированное активируемое антитело по п. 40, где активируемое антитело включает линкерный пептид, расположенный между МM и CM.
46. Конъюгированное активируемое антитело по п. 40, где активируемое антитело включает линкерный пептид, расположенный между CM и AB.
47. Конъюгированное активируемое антитело по п. 40, где активируемое антитело включает первый линкерный пептид (LP1) и второй линкерный пептид (LP2), и где активируемое антитело в нерасщепленном состоянии имеет следующую структуру, от N-конца до C-конца: MM-LP1-CM-LP2-AB или AB-LP2-CM-LP1-MM.
48. Конъюгированное активируемое антитело по п. 47, где два линкерных пептида необязательно должны быть идентичными.
49. Конъюгированное активируемое антитело по п. 47, где каждый из LP1 и LP2 представляет собой пептид длиной приблизительно 1-20 аминокислот.
50. Конъюгированное активируемое антитело по п. 40, где MM представляет собой полипептид длиной не более, чем 40 аминокислот.
51. Конъюгированное активируемое антитело по п. 40, где полипептидная последовательность MM отличается от полипептидной последовательности мишени, и полипептидная последовательность MM не более, чем на 50% идентична последовательности любого природного партнера по связыванию с АВ.
52. Конъюгированное активируемое антитело по п. 40, где CM представляет собой полипептид длиной до 15 аминокислот.
53. Конъюгированное активируемое антитело по п. 40, где CM представляет собой субстрат для фермента, выбранного из группы, состоящей из ферментов, представленных в таблице 3.
2
54. Конъюгированное активируемое антитело по п. 40, где антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab-фрагмента, F(ab')-фрагмента, scFv, scAb, dAb, тяжелой цепи однодоменного антитела и легкой цепи однодоменного антитела.
55. Конъюгированное активируемое антитело по п. 40, где мишень для АВ выбрана из группы мишеней, перечисленных в таблице 1.
56. Конъюгированное активируемое антитело по п. 40, где AB представляет собой антитело или происходит от антител, перечисленных в таблице 2.
57. Конъюгированное активируемое антитело по п. 40, где MMAD конъюгируют с AB посредством линкера.
58. Конъюгированное активируемое антитело по п. 56, где линкером является расщепляемый линкер.