СПОСОБ КРИОКОНСЕРВАЦИИ

1. Способ криоконсервации стволовых клеток/клеток-предшественников панкреатического дерева человека, включающий
(i) сбор стволовых клеток/клеток-предшественников панкреатического дерева человека;
(ii) добавление к клеткам криоконсервирующего раствора, который содержит
(a) базальную среду, содержащую липиды, (b) гиалуронаны (HA) в концентрации примерно от 0,05% до 0,15%, (c) криопротектор,
(d) антиоксидант и (e) альбумин в концентрации примерно от 1 до 5%; и
(iii) охлаждение клеток с начальной температуры до конечной температуры, при которой они замораживаются.
2. Способ по п. 1, в котором гиалуронан присутствует в концентрации около 0,1%.
3. Способ по п. 1, в котором криопротектор выбран из сахара, глицерина и диметилсульфоксида (DMSO), необязательно в концентрации примерно от 1% до 20%.
4. Способ по п. 3, в котором криопротектором является DMSO в концентрации около 10%.
5. Способ по п. 1, в котором антиоксидант выбран из селена, витамина E, витамина C и восстановленного глутатиона.
6. Способ по п. 1, в котором альбумин присутствует в концентрации около 3%.
7. Способ по п. 1, в котором альбумин представляет собой очищенный альбумин.
8. Способ по п. 1, в котором альбумин представляет собой человеческий альбумин, необязательно человеческий альбумин плазмы крови, или рекомбинантный человеческий альбумин.
9. Способ по п. 1, в котором криоконсервирующий раствор содержит среду Кубота, RPMI-1640, DME/F12 или заменяющую сыворотку среду Knockout от GIBCO.
10. Способ по п. 1, в котором стадия (iii) включает понижение начальной температуры при скорости примерно 1°C/мин до достижения конечной температуры.
11. Способ по п. 1, в котором стадия (iii) включает
(a) охлаждение клеток с начальной температуры до конечной температуры около -80°C с использованием твёрдого диоксида углерода или
(b) охлаждение клеток с начальной температуры до конечной температуры около -196°C с использованием жидкого азота.
12. Способ размораживания криоконсервированных стволовых клеток/клеток-предшественников панкреатического дерева человека, предусматривающий
(i) размораживание клеток, криоконсервированных согласно способу по п. 1;
(ii) добавление первого буферного раствора, содержащего сыворотку крови или заменяющую сыворотку среду;
(iii) отделение клеток от криоконсервирующей среды и первого буферного раствора; и
(iv) ресуспендирование клеток во втором буферном растворе, содержащем сыворотку крови или заменяющую сыворотку среду.
13. Способ по п. 12, в котором сыворотка крови является эмбриональной телячьей сывороткой, или заменяющая сыворотку среда является заменяющей сыворотку средой Knockout от GIBCO либо средой Кубота, дополненной альбумином, необязательно человеческим сывороточным альбумином.
14. Способ по п. 12, в котором сыворотка присутствует в концентрации примерно от 2% до 20%, необязательно - примерно от 10% до 20%, примерно 10% или примерно 20%.
15. Способ по п. 12, в котором среда, заменяющая сыворотку, содержит альбумин в концентрации примерно от 1% до 5%, необязательно человеческий сывороточный альбумин.
16. Способ по п. 12, в котором культуральная среда и/или буферный раствор содержит размораживающий буфер.
17. Способ по п. 12, в котором стадия (ii) включает
(a) центрифугирование клеток;
(b) фильтрацию клеток через сито или фильтр; или
(c) проведение фильтрации типа френч-пресса.
18. Способ культивирования размороженных криоконсервированных стволовых клеток/клеток-предшественников панкреатического дерева человека, предусматривающий
(i) посев на чашки клеток, размороженных по п. 12;
(ii) культивирование клеток в инкубаторе;
(iii) удаление буферного раствора; и
(iv) замену буферного раствора культуральной средой, предназначенной для роста и/или дифференцировки стволовых клеток/клеток-предшественников панкреатического дерева человека.
19. Способ по п. 18, в котором стадия (ii) проводится в течение примерно от 6 до 7 часов.
20. Способ по п. 18, в котором культуральная среда, предназначенная для роста и/или дифференцировки стволовых клеток/клеток-предшественников панкреатического дерева человека, включает среду Кубота и/или среду с определённым гормональным составом (HDM) для дифференцировки клеток (например, для линиеспецифической рестрикции в гепатоциты, далее HDM-H).
21. Композиция, содержащая множество криоконсервированных стволовых клеток/клеток-предшественников панкреатического дерева человека, полученных способом по п. 1.
22. Композиция по п. 21, в которой множество криоконсервированных стволовых клеток/клеток-предшественников панкреатического дерева человека являются размороженными.
23. Композиция по п. 22, в которой множество криоконсервированных стволовых клеток/клеток-предшественников панкреатического дерева человека являются размороженными согласно способу по п. 12.
24. Композиция по п. 21, в которой множество криоконсервированных стволовых клеток/клеток-предшественников панкреатического дерева человека являются замороженными.