Способ подготовки препаратов зубов для морфологических исследований эмали в атомно-силовом микроскопе
METHOD FOR PREPARING TOOTH PREPARATIONS FOR MORPHOLOGICAL STUDIES OF ENAMEL IN AN ATOMIC FORCE MICROSCOPE

Изобретение относится к медицине, в частности, стоматологии, гистологии и может применяться для исследования морфологии эмали зубов в продольном направлении, где поверхность имеет разное строение, упаковку, ориентацию и организацию структурных элементов, часто отличается недостаточной стабильностью и зрелостью органического матрикса и минерального компонента, детали которых отчетливо визуализируются в атомно-силовом микроскопе, а зондирование поверхности осуществляется в нанодиапазоне, необходимом для контролируемого исследования отдельных кристаллов эмалевых призм, их взаимоотношений внутри призм и межпризматическом пространстве на всей поверхности, соединительнотканных комплексов различных слоев путем продольного распила зуба.
Известен способ препарирования, представляющий собой комбинацию методов фиксации тканей и заключения их в плотный компаунд эпоксидной смолы с известными техническими приемами изготовления шлифов зубов (Костиленко Ю.П., Бойко И.В. Журнал «Стоматология», №5, 2005).
Зубы после экстракции промывают в физиологическом растворе, дегидратируют и пропитывают эпоксидной смолой, помещают в нее. После полимеризации полученный блок разрезают сепаровочным диском, шлифуют торцевые поверхности до получения ровного шлифа. Затем частично протравливают эмаль в хелатообразуюшем агенте (трилон Б) и наносят на препарат слой электропроводящего вещества. На данном этапе препарат пригоден для изучения в сканирующем электронном микроскопе. Для исследования препарата в трансмиссионном электронном микроскопе при помощи нитроклетчатки снимают отпечатки, с которых готовят угольные реплики путем напыления в вакууме спектрально чистого графита. Реплики наносят на предметные сетки и исследуют (Костиленко Ю.П., Бойко И.В. Метод изготовления препаратов прижизненно сохранных зубов для многоцелевых исследований. Клиническая анатомия и оперативная хирургия 2004; 3:5:63-65).
Недостатком данного способа является недостаточная разрешающая способность исследования отдельных кристаллов эмалевых призм, внутрипризматических и межпризматических промежутков, соединительнотканных комплексов.
Известен способ приготовления препаратов для исследования зубов с применением сканирующего акустического микроскопа. Зубы распиливают при помощи алмазной пилы диаметром 50 мм, толщиной 0,5 мм при скорости 1500 об/мин. Поверхность спила обрабатывают на чугунных планшайбах с применением свободного абразива -корундового порошка со средней величиной зерна 40 мкм (М40). После предварительного выравнивания поверхности образцы дошлифовывают вручную на стеклянных пластинах с использованием абразивных порошков меньшего размера зерна - вплоть до 5 мкм (М5). (Л.А. Денисова. Акустическая гистология тканей зуба.http://www.mediasphera.ru/joumals/stomo/detail/261 /3954.)
Недостатком данного способа является большая вероятность искажений при его применении из-за использования процедуры ручного шлифования на заключительном этапе.
Известна методика морфологического и морфометрического анализа поверхности эмали зуба человека с помощью атомно-силовой микроскопии. При проведении данной методики часть зуба распиливают при помощи алмазного сепарационного инструмента, оставляют образец толщиной 1.5-2.0 мм с сохранением щечной(вестибулярной) поверхности. После этого образец промывают в дистиллированной воде и высушивают при температуре 90°С в течение 5 минут, закрепляют на стеклянной пластине (В.Д. Гончаров, И.Н. Антонова, А.В. Кипчук, А.И. Скоробогатова. Методика морфологического и морфометрического анализа поверхности эмали зуба человека с помощью атомно-силовой микроскопии, Санкт-Петербург, 2016 г.)
Недостатком данного метода является недостаточная механическая и химическая обработка поверхности, которая отличается бугристостью с большим количеством артефактов и не позволяет в необходимом объеме дать объективную количественную оценку исследуемых образцов. Другим существенным недостатком данного способа является высокая субъективная оценка толщины исследуемого участка эмали зуба.
3
4
Известен способ приготовления препаратов зубов для исследования с применениематомно-силового и инвертированного микроскопов. Препарат шлифуют нашлифовально-полировальном станке шлифовальными кругами «hermes». После шлифования препарат промывают струей дистиллированной воды в течение 2 минут, затем полируют на шлифовально-полировальном станке «Нейрис» с использованием полиэтиленового полировального круга с алмазной суспензией и охлаждают дистиллированной водой под струей дистиллированной воды в течение 2 минут. Препарат высушивают с использованием горелки ГП при температуре 35°С в течение 3 минут. Травят поверхность препарата 37% ортофосфорной кислотой НРО в течение2 секунд и промывают под струей дистиллированной воды в течение 2 секунд. Высушивают препарат с использование горелки ГП при температуре 39°С в течение 5 минут и укладывают препарат на предметный стол АСМ или предметный столик инвертированного микроскопа для исследования. (Патент RU 2458975 С1 от 04.05.2011 г.)
Недостатки данного способа заключаются в том, что его применение невозможно при исследовании большой площади эмали. Каждый слой эмали возможно исследовать только после предварительной подготовки. Количество сошлифованных тканей эмали носит субъективный характер и, как следствие, получаемый участок шлифа поверхности эмали разнороден на всем своем протяжении. Также указанный способ является достаточно трудоемким и затруднительным для исследования серийных групп. Данный метод взят нами за прототип.
Заявляемый способ изготовления препаратов зубов для морфологических исследований эмали зубов в атомно-силовоммикроскопе удобен в применении, отличается высокой точностью и позволяет изготавливать и одновременно исследовать максимально качественные образцы эмали различных слоев на продольном распиле зуба.
Техническим результатом заявленного изобретения является усовершенствование способа изготовления препаратов зубов для исследований ультраструктуры эмали различных слоев в атомно-силовом микроскопе, под точным и объективным контролем сошлифовывания необходимой толщины эмали, позволяющей исследовать рисунок не только эмалевых призм, но и отдельных внутрипризматических и межпризматических кристаллов, межпризматических промежутков, соединительных комплексов по всей полированной поверхности эмали различных слоев на продольном срезе.
Технический результат достигается тем, что в способе изготовления препаратов зубов для морфологических исследований ультраструктуры эмали различных слоев в атомно-силовом микроскопе (АСМ), включающий дозированное шлифование с дополнительной ультразвуковой обработкой поверхности и комбинированное полирование кругами и пастой ГОИ, поверхность которой получают 14Б класса чистоты и протравливают 37% ортофосфорной кислотой в течение 20 секунд, под точным и объективным контролем сошлифовывания необходимой толщины эмали. Метод позволяет точно дифференцировать не только эмалевые призмы и межпризматические промежутки, но и внутрипризматические и межпризматические кристаллы, их соединительные комплексы. Применение пасты ГОИ позволяет устранить микротрещины и сколы, возникающие во время механической обработки, ультразвуковая отчистка улучшает качество подготовки препарата, сохраняет гладкий и ровный рельеф исследуемой поверхности.
Способ изготовления препаратов зубов для морфологических исследований ультраструктуры эмали различных слоев в продольном направлении осуществляют следующим образом. На первом этапе зуб после экстракции помещают в 40% раствор формальдегида, затем его фиксируют в столярной струбцине, с помощью алмазного диска диаметром 20 мм с охлаждением в дистиллированной воде производят вертикальную сепарацию зуба в мезио-дистальном направлении, тем самым получая продольный срез. Готовят патрон из полипропиленовой трубы с внутренним диметром 30 мм, толщиной стенки 5 мм, путем удаления фрагмента с помощью ножниц для резки труб ПВХ. Получают заготовку высотой 10 мм, внутренним диаметром 30 мм, толщиной стенки 5 мм. Алмазным надфилем убирают неровности заготовки, штангенциркулем измеряют и контролируют высоту, параллельность. Подготовленный ранее фрагмент зуба помещают в патрон, размещенный на ровной горизонтальной поверхности, срезом вниз, заливают двухкомпонентной эпоксидной смолой на 24 часа. Получают препарат.
3
4
На втором этапе препарат шлифуют на шлифовально-полировальном станке «МР-1BGrinderPolisher» шлифовальными кругами «dexter» зернистостью 800 grit в течение 3 минут с охлаждением в дистиллированной воде, при этом сошлифовывают1 мм наружного слоя препарата. Обрабатывают шлифовальным кругом «dexter» зернистостью 1000 grit в течение2 минут с охлаждением в дистиллированной воде, где сошлифовывают 0,5 мм препарата. Контроль сошлифованного слоя осуществляют с помощью штангенциркуля. После чего производят последовательную обработку шлифовальными кругами «dexter» зернистостью 1500, 2000, 2500grit в течение1 минуты с охлаждением в дистиллированной воде, при этом сошлифовывают0,5 мм препарата. После шлифования и измерения толщины эмали препарат очищают в ультразвуковой ванне в течение 1 минуты. Полученный препарат полируют на шлифовально-полировальном станке «МР-1BGrinderPolisher» с использованием полировального круга из войлока с пастой ГОИ для пластмасс в течение 2 минут, охлаждают в дистиллированной воде. Далее проводят окончательное полирование нашлифовально-полировальном станке «МР-1BGrinderPolisher» с использованием полировального круга из плюша с алмазной суспензией Akasel 1 микрон в течение 30 секунд. После полирования препарат окончательно обрабатывают в ультразвуковой ванне в течение 2 минут. Высушивают препарат с использованием строительного фена при температуре 36°С в течение 30 секунд. Протравливают поверхность 37% ортофосфорной кислотой НРО в течение 20 секунд. Промывают под струей дистиллированной воды в течение 15 секунд. Высушивают препарат с использованием строительного фена при температуре 36°С в течение 30 секунд и укладывают препарат на предметный стол атомно-силового микроскопа для исследования. Применение описанного способа шлифования и полирования эмали зуба позволяет подготовить поверхность образца 14Б класса чистоты в пределах эмали на продольном шлифе для исследования в атомно-силовом микроскопе.
Возникающая после подготовки ровная и гладкая поверхность образца пригодна для эффективного зондирования в заданном диапазоне, который необходим для высокоточных исследований ультраструктуры эмалевых призм, внутрипризматических и межпризматических кристаллов, межпризматических промежутков и соединительных комплексов. Данный способ позволяет изготавливать до 10 высокоточных препаратов за один лабораторный день одним препаратором, что делает возможным контролируемое исследование морфологии эмали на значительных выборках.
Пример 1. Пациентка У., 21 год.
Жалобы: обратилась с целью подготовки к ортодонтическому лечению.
План лечения: 1. Санация рта. 2. Удаление зуба 38. 3. Подготовка и морфологическое исследование препарата зуба 38 в атомно-силовом микроскопе.
Пациентке проведено удаление зуба 38, который поместили в 40% раствор формалина. Зуб фиксировали в столярной струбцине и произвели его распил с помощью алмазного диска диаметром 20 мм в мезио-дистальном направлении. Изготовили патрон, с помощью ножниц для резки труб ПВХ отрезали от полипропиленовой трубы с внутренним диаметром 30 мм, толщиной стенок 5 мм, получили заготовку высотой 10 мм с внутренним диаметром 30 мм, толщиной стенок 5 мм, алмазным надфилем сошлифовали неровности, провели контроль толщины и параллельности заготовки с помощью штангенциркуля. Патрон разместили на ровной горизонтальной поверхности, в него поместили фрагмент зуба срезом вниз, залили двухкомпонентной эпоксидной смолой на 24 часа.
3
4
Провели поэтапное и последовательное шлифование препарата на станке «МР-1 В GrinderPolisher» шлифовальными кругами «Dexter» зернистостью 800, 1000, 1500, 2000, 2500 grit с охлаждением в дистиллированной воде. Осуществили контроль снимаемого слоя поверхности препарата с помощью штангенциркуля, при этом шлифовальным кругом «Dexter» зернистостью 800 grit сошлифовали 1,0 мм наружного слоя препарата, затем обработали шлифовальным кругом «Dexter» зернистостью 1000 grit, сошлифовали 0,5 мм препарата, после чего обработали шлифовальными кругами «Dexter» зернистостью 1500, 2000, 2500 grit, сошлифовали еще 0,5 мм препарата, произвели очистку препарата в ультразвуковой ванне в течение 1 минуты, после провели полирование на шлифовально-полировальном станке «МР-1В GrinderPolisher» с использованием войлочного полировального круга с пастой ГОИ для пластмасс в течение 2 минут, охладили и промыли в дистиллированной воде, провели окончательное полирование на шлифовально-полировальном станке «МР-1BGrinderPolisher» с использованием полировального круга из плюша с алмазной суспензией Akasel 1 микрон в течение 30 секунд, окончательно очистили в ультразвуковой ванне в течение 2 минут, высушили препарат с использованием строительного фена при температуре 36°С в течение 30 секунд, протравили поверхность препарата 37% ортофосфорной кислотой НРО в течение 20 секунд, промыли под струей дистиллированной воды в течение 15 секунд, высушили препарат с использованием строительного фена при температуре 36°С в течение 30 секунд Полученный препарат зуба 38 поместили в поле зрения атомно-силового микроскопа NTEGRA и получили ряд изображений, с помощью которых описали ультраструктуру эмали (большие размеры и плотная упаковка эмалевых призм, плотная упаковка межпризматических и внутрипризматических кристаллов, эмалевые призмы и кристаллы с ровными четкими контурами, встречается большое количество соединительных комплексов в межпризматическом пространстве, что указывает на высокий уровень зрелости эмали зуба) (Рисунок 1).
Пример 2. Пациентка Н., 25 лет.
Жалобы: обратилась с целью санации рта, профилактического осмотра.
План лечения: 1. Санация полости рта. 2. Удаление зуба 48. 3. Подготовка и морфологическое исследование препарата зуба 48 в атомно-силовом микроскопе.
Пациентке проведено удаление зуба 48, который поместили в 40% раствор формалина. Зуб фиксировали в столярной струбцине и произвели его распил с помощью алмазного диска диаметром 20 мм в мезио-дистальном направлении. Изготовили патрон, с помощью ножниц для резки труб ПВХ отрезали от полипропиленовой трубы с внутренним диаметром 30 мм, толщиной стенок 5 мм, получили заготовку высотой 10 мм с внутренним диаметром 30 мм, толщиной стенок 5 мм, алмазным надфилем сошлифовали неровности, провели контроль толщины и параллельности заготовки с помощью штангенциркуля. Патрон разместили на ровной горизонтальной поверхности, в него поместили фрагмент зуба срезом вниз, залили двухкомпонентной эпоксидной смолой на 24 часа.
3
4
Провели поэтапное и последовательное шлифование препарата на станке «МР-1В GrinderPolisher» шлифовальными кругами «Dexter» зернистостью 800, 1000, 1500, 2000, 2500 grit с охлаждением в дистиллированной воде. Осуществили контроль снимаемого слоя поверхности препарата с помощью штангенциркуля, при этом шлифовальным кругом «Dexter» зернистостью 800 grit сошлифовали 1,0 мм наружного слоя препарата, затем обработали шлифовальным кругом «Dexter» зернистостью 1000 grit, сошлифовали 0,5 мм препарата, после чего обработали шлифовальными кругами «Dexter» зернистостью 1500, 2000, 2500 grit, сошлифовали еще 0,5 мм препарата, произвели очистку препарата в ультразвуковой ванне в течение 1 минуты, после провели полирование на шлифовально-полировальном станке «МР-1В GrinderPolisher» с использованием войлочного полировального круга с пастой ГОИ для пластмасс в течение 2 минут, охладили и промыли в дистиллированной воде, провели окончательное полирование на шлифовально-полировальном станке «МР-1BGrinderPolisher» с использованием полировального круга из плюша с алмазной суспензией Akasel 1 микрон в течение 30 секунд, окончательно очистили в ультразвуковой ванне в течение 2 минут, высушили препарат с использованием строительного фена при температуре 36°С в течение 30 секунд, протравили поверхность препарата 37% ортофосфорной кислотой НРО в течение 20 секунд, промыли под струей дистиллированной воды в течение 15 секунд, высушили препарат с использованием строительного фена при температуре 36°С в течение 30 секунд
Полученный препарат зуба 48 поместили в поле зрения атомно-силового микроскопа NTEGRA и получили ряд изображений, с помощью которых описали ультраструктуру эмали (маленькие размеры и низкий уровень упаковки эмалевых призм, недостаточная упаковка межпризматических и внутрипризматических кристаллов, эмалевые призмы и кристаллы с ровными четкими контурами, встречается большое количество соединительных комплексов в межпризматическом пространстве, которые хаотично расположены, что указывает на недостаточный уровень зрелости эмали зуба) (Рисунок 2).
Следовательно, предложенный способ подготовки препаратов зубов для морфологических исследований эмали в атомно-силовом микроскопе позволяет подготовить высококачественные препараты для исследования с максимальным сохранением рельефа минерального компонента и органического матрикса.