Определение ацикловира и аллопуринола в плазме крови методом ВЭЖХ

М.Л. Пивовар, А.И. Жебентяев

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АЦИКЛОВИРА И АЛЛОПУРИНОЛА В ПЛАЗМЕ КРОВИ

МЕТОДОМ ВЭЖХ

Витебский государственный медицинский университет

Разработана методика определения ацикловира и аллопуринола в плазме крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с твердофазной экстракцией. Определены оптимальные условия сорбции и десорбции ацикловира и аллопуринола из водных растворов на химически модифицированных силикагелях. Изучено влияние ионной силы и pHраствора на сорбционное равновесие. Рассчитаны предельная адсорбция, константы адсорбционного равновесия, свободная энергия Гиббса переноса из водной фазы в фазу сорбента и константы межфазного распределения пуринов на 4-х химически модифицированных силикагелях. Установлено, что лучшими сорбентами для извлечения изученных веществ из водных растворов являются Диасорб-100-С8 и Диасорб-100-С16. Оптимальным диапазоном для извлечения изученных веществ является pH = 4-7. Элюирование ацикловира и аллопуринола с изученных сорбентов рекомендуется проводить этанолом, ацетонитрилом или ацетоном. Градуировочный график для определения содержания ацикловира и аллопуринола в плазме крови линеен в диапазоне концентраций 0,3—15,0 мкг/мл и 0,2—2,0 мкг/мл, соответственно.

Ключевые слова: ацикловир, аллопуринол, твердофазная экстракция, высокоэффективная жидкостная хроматография.

ВВЕДЕНИЕ

Ацикловир и аллопуринол широко используются в медицинской практике, что обусловливает необходимость определять их содержание в биожидкостях и пробах тканей при проведении фармакокинетических исследований или в случае отравления.

Одним из простых и доступных методов разделения и концентрирования является жидкость-жидкостная экстракция. Наши предыдущие исследования показали невысокую эффективность данного метода извлечения для изучаемых веществ [1]. В настоящее время метод твердофазной экстракции широко применяется для извлечения и концентрирования веществ из различных объектов, в т.ч. из биоматериала. Согласно литературным данным, для извлечения ацикловира и аллопуринола из биоматериала используют октадецилсиликагель [2-6]. Выбор данного сорбента в литературе не обосновывается. Актуальным вопрос выбора сорбента делает то, что ацикловир и аллопуринол - полярные вещества (1§Р(октанол/вода) для ацикловира равен -1,56 [7]) и плохо экстрагируются из водных растворов неполярными органическими растворителями.

Согласно литературным данным, определение ацикловира и аллопуринола в подготовленных пробах производится методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием колонок, заполненных октадецилсиликагелем. В литературных источниках приводятся различные

подвижные фазы для хроматографического определения ацикловира и аллопуринола. Например, для определения ацикловира и его метаболитов авторами статьи [3] предлагается производить анализ с использованием в качестве подвижной фазы смеси ацетонитрила (18 %) и 5 мМ раствора натрия доде-цилсульфата в 30 мМ фосфатном буферном растворе (pH = 2,1). В статье [8] предложено использовать аналогичную подвижную фазу с pH = 2,6. Авторами статьи [4] проводилось определение содержания ацикловира методом ВЭЖХ на колонке, заполненной ок-тилсиликагелем с использованием двух различных подвижных фаз. Для анализа проб плазмы крови и амниотической жидкости использовалась подвижная фаза, состоящая из смеси 10 мМ ацетатного или цитратного буферного раствора и 3,7 мМ раствора ок-тансульфоновой кислоты (87,5:12,5; об/об). Для анализа подготовленных проб тканей использовалась подвижная фаза 5 мМ ок-тансульфоновой кислоты в 30 мМ ацетатном или цитратном буферном растворе (рН=3,08) и ацетонитрил (99:1; об/об). Следует отметить, что в большинстве литературных источников не обоснован выбор сорбента для пробоподготовки и условия хроматографического определения данных веществ в биоматериале.

Целью настоящей работы является изучение сорбционных характеристик ацикловира и аллопуринола на химически модифицированных и немодифицированных силикагелях для проведения пробоподготов-

ки при химико-токсикологическом исследовании биоматериала и разработка простой и доступной методики определения данных веществ в плазме крови.

МА ТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали образцы ацикловира и аллопуринола фармакопейной чистоты.

Для изучения сорбционных характеристик использовали химически модифицированные силикагели - Диасорб-100-CN, Диасорб-100-ЫН2, Диасорб-100-Фенил,

Диасорб-100-С1, Диасорб-100-С8, Диасорб-100-С 16 («Биохиммак», Россия) и немоди-фицированный силикагель - Силохром-С120 (диаметр пор 40-45 нм). Силохром-С120 перед экспериментом гидроксилировали кипячением (3 часа) в 0,1 М кислоте хлороводородной, после чего его отмывали водой очищенной до нейтральной реакции промывных вод и отрицательной реакции на хлорид-ионы. После этого сорбент сушили до постоянной массы при 70-75°С. Химически модифицированные силикагели дополнительной подготовке не подвергались.

Для создания ионной силы использовали натрия хлорид (ч.д.а.), значения pH создавали растворами кислоты хлороводородной или натрия гидроксида и контролировали при помощи иономера И-130.

В работе использовали органические растворители: этанол (ч.д.а.), ацетон (ч.д.а.), ацетонитрил (2 сорт). При ВЭЖХ определении использовали воду деионизированную (Millipore).

Для регулирования скорости пропускания жидкостей через патроны твердофазной экстракции (ТФЭ) использовали систему вакуумной пробоподготовки Visiprep SPE Vacuum Manifolds (Supelco).

Методика изучения сорбции в статических условиях. Температура при изучении сорбционных характеристик составляла 20±1 °С. Точные навески сорбентов (0,100 г) помещали во флаконы объемом 12 мл. Перед добавлением водной фазы все химически модифицированные силикагели смачивали 200 мкл этанола. Затем прибавляли 10 мл водных растворов метилксантинов с известным значением pH и ионной силой и перемешивали на шейкере. Затем флаконы центрифугировали при 3000 об/мин 5 мин для ускорения осаждения взвеси сорбента. Анализ водной фазы осуществляли УФ -спектрофотометрическим методом на регистрирующем спектрофотометре Specord 250.

Методика изучения десорбции в динамических условиях. Сорбционные патроны готовили непосредственно перед выполне-

нием операции суспензионным методом. Навеску 1,00 г сорбента суспендировали в З,0 мл этанола и переносили в полипропиленовые патроны длиной 80 мм и диаметром 10 мм. Слой сорбента уплотняли под вакуумом. Патрон кондиционировали З мл этанола, затем 1,5 мл воды очищенной дважды. Пропускали раствор аналита и промывали патрон 1,5 мл воды очищенной дважды. Патрон подсушивали в токе воздуха и элюировали аналит различными органическими растворителями (порциями по 0,5 мл). Скорость элюирования на всех этапах составляла 0,5 мл/мин. Элюат высушивали в токе воздуха при температуре 40 °С. Остаток растворяли в 500 мкл воды очищенной и анализировали на жидкостном хроматографе Agilent 1100 с фотодиодноматричным детектором. Условия хроматографирования: хроматографическая колонка - Zorbax SB С-18 4,б*250 мм, зернение 5 мкм, температура колонки 30 °С. Разделение проводили в изократиче-ском режиме. Подвижная фаза: вода деионизированная: ацетонитрил (98:2; об/об). Расход элюента - 1,0 мл/мин. Детектирование осуществляли при длине волны Х=25З нм, объем инжектируемой пробы 20 мкл.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Время установления равновесия. В

результате проведения предварительных исследований нами установлено, что ацикловир и аллопуринол практически не сорбируются немодифицированными силикагелями, а также химически модифицированными полярными сорбентами Диасорб-100-CN и Диасорб-100-КШ. Сорбционное равновесие для изученных химически модифицированных силикагелей (Диасорб-100-Фенил, -С1, -С 8 и -С1б) устанавливается за 7-10 мин, что позволяет использовать данные сорбенты при выделении метилксантинов в динамических условиях.

Влияние pH и ионной силы водной фазы. Присутствие сильных электролитов в растворе оказывает одинаковое влияние на сорбцию всех изученных веществ. Ионная сила раствора в диапазоне значений 0,01-0,1 практически не влияет на сорбцию аналитических количеств ацикловира и аллопури-нола. При дальнейшем увеличении ионной силы до 0,5-1,0 наблюдается незначительное увеличение сорбции на всех изученных сорбентах. Данное явление можно объяснить, очевидно, высаливанием молекул изучаемых веществ из раствора.

Ацикловир и аллопуринол в водных растворах могут ионизироваться, что будет влиять на сорбцию из водных растворов.

На рисунке 1 представлена зависимость влияния pH на сорбцию ацикловира.

Как видно из приведенной графической зависимости, максимальная сорбция ацикловира наблюдается при pH = 5-8. Согласно литературным данным [7], значения pKBH+ и pKa ацикловира соответственно равны 2,3 и 9,2, поэтому такое поведение ацикловира можно объяснить тем, что в данном диапазоне значений pH ацикловир находится в виде молекул. При pH менее 4 увеличивается

доля ионов ацикловира в растворе и сорбция уменьшается. Следует заметить, что подобные зависимости указывают на преимущественно гидрофобный механизм сорбции ацикловира.

Сорбция аллопуринола (pKa=9,4 [7]), как и ацикловира, в диапазоне pH = 4-8 практически не зависит от концентрации протонов (рисунок 2). При малых значениях pH равновесного раствора наблюдается уменьшение сорбции аллопуринола, что может быть свя-

Рисунок 1 - Зависимость сорбции (Г) ацикловира от pH равновесного раствора

Рисунок 2 - Зависимость сорбции (Г) аллопуринола от pH равновесного раствора

зано с достижением изоэлектрической точки силикагеля (порядка 1,8) и перезарядкой не-модифицированных участков поверхности.

Изотермы сорбции. Определение параметров сорбции изучаемых веществ из водных растворов производилось при ионной силе 0,01 и pH=6,0. Изотермы сорбции изучаемых веществ удовлетворительно описываются уравнением Ленгмюра (1):

с

Г

1

К Г Г

где: с - равновесная концентрация сор-бата в растворе, моль/л; Г - равновесная адсорбция при данной концентрации, моль/г; Гш - предельная адсорбция, моль/г; К - кон -станта адсорбционного равновесия.

Константу межфазного распределения (К) и свободную энергию Гиббса переноса из водной фазы в фазу сорбентов рассчитывали по уравнениям (2) и (3), соответственно:

К, = К •Г., ДО=-2,3ЯГ ^ КЛ

Результаты определения сорбционных характеристик ацикловира и аллопуринола приведены в таблице 1.

Как видно из приведенных данных, максимальные значения предельной адсорбции, констант межфазного распределения и свободной энергии Гиббса наблюдаются при сорбции ацикловира и аллопуринола на обращено-фа-зовых сорбентах Диасорб-100-С8 и -С16.

Десорбция ацикловира и аллопуринола. Для изучения десорбции метилксантинов использовали патроны, заполненные сорбентом Диасорб-100-С16. В качестве элюентов использовали широко распространенные

органические растворители: этанол, ацетонитрил и ацетон. Кривые десорбции ацикловира изображены на рисунке 3. Изученные органические растворители равноэффективны и для элюирования 95% ацикловира с 1 г сорбента достаточно 2,5-3,0 мл элюен-та. Аналогичные зависимости наблюдаются при десорбции аллопуринола.

Методика определения ацикловира и аллопуринола в плазме крови. Патроны ТФЭ, содержащие 0,30 г (для определения ацикловира) или 0,2 г (для определения аллопуринола) сорбента Диасорб-100-С16, кондиционировали 1 мл этанола и промывали водой очищенной по 1,5 мл дважды. К пробе плазмы крови (1,0 мл) предварительно добавляли 1,0 мл воды очищенной и 100 мкл раствора внутреннего стандарта (растворы с концентрацией 100 мкг/мл ацикловира или аллопуринола). Пробу перемешивали на шейкере и пропускали через патрон ТФЭ со скоростью 0,5-1,0 мл/ мин. Затем патрон промывали 1,5 мл воды очищенной дважды и сушили в токе воздуха 5-7 мин. Аналит элюировали 1,0 мл этанола со скоростью 0,5 мл/мин. Элюат высушивали при 40 С в токе воздуха. Остаток растворяли в 100 мкл воды очищенной и хроматографировали.

Условия хроматографирования: хроматографическая колонка - 2огЬах ХЭВ С-18 4,6^150 мм, зернение 5 мкм, температура ко -лонки 30 С. Разделение проводили в изокра-тическом режиме. Подвижная фаза: вода деионизированная: ацетонитрил (98:2; об/об). Расход элюента 1,0 мл/мин. Детектирование осуществляли при длине волны Х=253 нм, объем инжектируемой пробы 10 мкл.

Стабилизация pH подвижной фазы буферными растворами не осуществлялась, т. к. данные вещества в диапазоне pH=5,0 - 7,0 не

Таблица 1 - Параметры адсорбции ацикловира и аллопуринола на различных сорбентах __________________________________(п = 6; а = 0,05)_______________________________

Сорбент а±Да М0-3± ±ДМ0-3 г Г -106, ад 7 моль/г К-10-3, л/моль К. л/кг ДО, кДж/моль

Ацикловир

Диасорб-100-Фенил 117±6 87,4±33,9 0,96 11,4 0,746 9 -5,18

Диасорб-100-С1 148±4 125±43 0,97 8,01 0,842 7 -4,61

Диасорб-100-С8 83,1±0,5 15,8±6,2 0,97 63,3 0,190 12 -6,01

Диасорб-100-С16 97,8±0,4 6,35±2,14 0,97 158 0,065 10 -5,62

Аллопуринол

Диасорб-100-Фенил 186±2 21,2±6,8 0,97 47,3 0,114 5 -4,07

Диасорб-100-С1 151±2 18,1±2,7 0,99 55,1 0,120 7 -4,56

Диасорб-100-С8 104±1 14,8±3,4 0,99 67,7 0,142 10 -5,47

Диасорб-100-С16 103±1 9,86±1,94 0,99 101 0,096 10 -5,49

где: г - коэффициент корреляции уравнения Ленгмюра; а±Да и Ь±ДЬ - коэффициенты (с доверительными интервалами) уравнения Ленгмюра в линейной форме.

Рисунок 3 - Кривые десорбции ацикловира с Диасорба-100-С16

ионизируются и параметры их удерживания не изменяются.

Основные метрологические характеристики методики. Определение ацикловира и аллопуринола производилось методом градуировочного графика. Для построения градуировочного графика использовались пробы плазмы, содержащие точно известные количества изучаемых веществ. В результате количественного определения ацикловира и аллопуринола в плазме крови по методу «введено-найде-но» было установлено, что относительное стандартное отклонение, рассчитанное для каждой точки градуировочного графика, не превышает 10 %, а для точек с концентрацией 0,2-0,4 мкг/мл - 15 %.

Линейный диапазон определяемых концентраций ацикловира по предложенной методике составляет 0,3-15 мкг/мл в плазме

крови. Для аллопуринола диапазон определяемых концентраций по данной методике составляет 0,2-2,0 мкг/мл. Данный диапазон позволяет определять терапевтические и субтерапевтические концентрации изучаемых веществ в плазме крови [7]. Предел определения (при соотношении сигнал/ шум=10) для ацикловира и аллопуринола составляет 50,0 нг/мл.

Эффективность колонки по пику ацикловира составила около 3600, аллопуринола

- 3900 теоретических тарелок. Разрешение пиков ацикловира и аллопуринола более 1,5. Хроматограмма смеси ацикловира и аллопуринола представлена на рисунке 4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Определены оптимальные условия сорбции и десорбции ацикловира и аллло-

Таблица 2 - Результаты количественного определения ацикловира и аллопуринола

в плазме крови

Введено ацикловира, мкг/мл Найдено ацикловира, мкг/мл X ± АХ Б г Введено аллопуринола, мкг/мл Найдено аллопуринола, мкг/мл X ± АХ Б г

0,30 0,29+0.12 0,150 0,20 0,19+0.06 0,124

0,40 0,41+0.13 0,128 0,40 0,42+0.08 0,079

0,50 0,49+0.10 0,082 0,60 0,65+0.20 0,124

1,0 0,89+0.09 0,097 0,80 0,79+0.10 0,049

5,0 5,2+1.3 0,039 1,0 1,09+0.26 0,095

15 14,9+0.4 0,011 1,5 1,53+0.25 0,066

- - - 2,0 1,96+0.20 0,042

где: Б - относительное стандартное отклонение.

Рисунок 4 - Хроматограмма чистой плазмы крови

пуринола на химически модифицированных силикагелях.

2. Рассчитаны параметры адсорбции ацикловира и аллопуринола на различных сорбентах.

3. Лучшими сорбентами для извлечения изученных веществ из водных растворов являются Диасорб-100-С8 и Диасорб-100-С16.

4. Предложена эффективная методика определения ацикловира и аллопуринола в плазме крови методом ВЭЖХ в сочетании с твердофазной экстракцией.

SUMMARY

M.L. Pivavar, A.I. Zhebentyaev DETERMINATION OF ACYCLOVIR AND ALLOPURINOL IN BLOOD PLASMA BY HPLC

A procedure for the quantification of acyclovir and allopurinol in plasma by high-performance liquid chromatography has been developed. The optimal conditions for sorption and desorption of acyclovir and allopurinol from aqueous solutions on chemically modified silica gels have been revealed. We have studied the effect of ionic strength and pH of the solution on the sorption equilibrium. The maximum adsorption, adsorption equilibrium constants, Gibbs free energy of transfer from the aqueous phase to the sorbent and constants of interfacial distribution of purines on 4 chemically modified silica gels have been calculated. We have established that the best sorbents for the extraction of the investigated substances from aqueous solutions are Diacorb-100-C8 and Diacorb-100-C16. The

optimum range for the extraction of the investigated substances is pH = 4-7. Ethanol, aceto-nitrile and acetone are the optimal solvents for the elution of methylxanthines from cartridges of solid phase extraction. The graduation graph was lined over a concentration range of G,3 -15,G p,g/ml for the acyclovir and G,2 - 2,G p,g/ml for the allopurinol.

Keywords: acyclovir, allopurinol, solid phase extraction, high-performance liquid chromatography.

ЛИТЕРАТУРА

1. Пивовар, М.Л. Экстракция ацикловира и аллопуринола органическими раство-ригелями / М.Л. Пивовар, А.И. Жебентяев // Вестник фармации. - 2G1G. - Т.49, № 3. -С. 78-84.

2. Swart, K.J. Automated high-performance liquid chromatographic method for the determination of acyclovir in plasma / K.J. Swart, H.K. Hundt, A.M. Groenewald. // J. Chro-matogr. A. - 1994. - Vol. бб3, № 1. - P. б5-б9.

3. Svensson J.O. Determination of acyclovir and its metabolite 9-carboxymethoxy-methylguanine in serum and urine using solid-phase extraction and high-performance liquid chromatography / J.O. Svensson, L. Barkholt, J. Sawe // J. Chromatogr. B. - 1997. - Vol. 69G, № 1-2. - P 3б3-3бб.

4. Determination of acyclovir in maternal plasma, amniotic fluid, fetal and placental tissues by high-performance liquid chromatography /

S.D. Brown [et al] // J. Chromatogr. B. - 2gG2.

- Vol. 772, № 2. - P. 327-334.

5. Comparative pharmacokinetics of 8GG mg of acyclovir-containing Telviran and Zovirax tablets in healthy volunteers / N.K. Baloghn [et al] // Acta. Pharm. Hung. - 1999. - Vol. б9, № 1. - P. 3б-45.

6. Determination of allopurinol and oxypu-rinol in rat plasma, intestinal wash, and bile by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection (HPLC/EC) following automated solid-phase extraction / E.J. Ei-senberg [et al] // Pharm. Res. - 1991. - Vol. 8, № 5. - P. б53-б55.

7. Moffat, A.C. Clarke’s isolation and identification of drugs in pharmaceuticals / A.C. Moffat. - Second Edition. - London: The pharmaceutical press, 198б. - 1б84 p.

8. Technique validation by liquid chro-

matography for the determination of acyclovir in plasma / M. Fernandez [et al] // J. Chromatogr. B. - 2003. - Vol. 791, № 1-2.

- P. 357-363.

Адрес для корреспонденции:

210023, Республика Беларусь, г. Витебск, пр. Фрунзе, 27,

Витебский государственный медицинский университет, кафедра токсикологической и аналитической химии, тел. раб.: 8 (0212) 37-00-06,

Пивовар М.Л.

Поступила 20.01.2011 г.