Экспериментальное исследование применения аутологичных мононуклеаров крови в лечении эндотелиально- эпителиальной дистрофии роговицы

ЛИТЕРАТУРА

1. Aгаджанян, H.A. Магнитное поле земли и организм человека / H.A. Aгаджанян, И.И. Макарова // Экология человека. - 2005. -№ 9. - С. 3-8.

2. Виксман М.Е. Способ оценки функциональной активности нейтрофилов человека по реакции восстановления нитросинего тетразолия: метод. реком. / Виксман М.Е., Маянский A.H. - Казань, 1979. - 14 с.

3. Гаврилов, В.Г. Aнализ методов определения продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови по тесту с тиобарбиту-ратовой кислотой / В.Г. Гаврилов, A.P. Гаврилова, Л.М. Мажуль // Вопросы медицинской химии. - 1987. - №»1. - С.118-121.

4. Горбунова, Е.Л. Определение интенсивности магнитного поля Земли и его влияния на организм животных в условиях свиноводческого хозяйства Увельского района Челябинской области / Е.Л. Горбунова O.P. Сухова // Молочно-хозяйственный вестник. - 2014. - №>1 (13). - С.13-18.

5. Горго, Ю.П. Некоторые механизмы влияния изменений магнитного поля земли на биологические объекты / Ю.П. Горго, Ю.Я. Садовская // Электронный научно-образовательный вестник «Здоровье и образование в XXI веке». - 2007. - Т.9, .№5. - С.194-195.

6. Гублер, Е.В. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях. Изд. 2-е / Е.В. Гублер, A.A. Генкин - Л.: Медицина, 1973. - 141 с.

7. Камышников, В.С. Клинико-биохимическая лабораторная диагностика: справочник. В 2 т. / В.С. Камышников. - Минск: Ин-терпрессервис, 2003. - Т.2. - 463 с.

8. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин - М.: Высш. школа, 1980. - 293 с.

9. Майчук, Ю.Ф. Конъюнктивиты. Современная лекарственная терапия / Ю.Ф. Майчук. - М., 2014. - 58 с.

10. Меньшиков, В.В. Лабораторные методы исследования в клинике / В.В. Меньшиков - М.: Медицина, 1987. - 240 с.

11. Метод определения активности каталазы / МА. Королюк [и др.] // Лабораторное дело. - 1988. - №»1. - С.16-18.

12. Показатели перекисного окисления липидов, состояние антиоксидантной системы и водного компонента сыворотки крови у лиц, страдающих ишемической болезнью сердца, при изменении магнитного поля Земли / И.И. Макарова [и др.] // Электронный научно-образовательный вестник «Здоровье и образование в XXI веке». - 2007. - Т.9, №12. - С.477.

13. Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета программ Statistica / О.Ю. Реброва - М.: Ме-диасфера, 2002. - 312 с.

14. Спирина, Ю.В. Подготовка пациенток, страдающих хроническим эндометритом, к программам вспомогательных репродуктивных технологий / Ю.В. Спирина, И.Д. Евтушенко // Сибирский медицинский журнал. - 2008. - Т. 23. - N° 4-1. - С.84-85.

15. Mirsa H.P.The role of super oxide anion in the antioxidation of epinephrine and simple assay for superoxide dismutase I H.P. Mirsa, Y. Fredovich II IAMA. - 1972. - Vol. 247, №10. - P.3170-3175.

УДК 617.713-089.843

© Е.О. Филиппова, О.И. Кривошеина, И.В. Запускалов, 2016

Е.О. Филиппова, О.И. Кривошеина, И.В. Запускалов ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ АУТОЛОГИЧНЫХ МОНОНУКЛЕАРОВ КРОВИ В ЛЕЧЕНИИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНО-ЭПИТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСТРОФИИ РОГОВИЦЫ

ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Томск

Изучены закономерности развития репаративной регенерации при эндотелиально-эпителиальной дистрофии (ЭЭД) роговицы на фоне внутрикамерного применения аутологичных мононуклеаров крови. Выполнена серия экспериментов на крысах породы Wistar (основная группа) которым производили внутрикамерное введение и наслоение аутологичных суспензий мононуклеарных клеток на заднюю поверхность роговицы с предварительно индуцированной ЭЭД. Животные группы сравнения получали традиционное консервативное лечение.

В ходе эксперимента выявлена высокая эффективность внутрикамерного применения: площадь тканевых полостей в строме роговицы на 3-и сутки в основной группе сократилась в 2,2 раза, в группе сравнения - в 1,04 раза. Начиная с 7-х суток в основной группе обнаруживались признаки пролиферации эндотелиального слоя роговой оболочки, который к 14-м суткам был представлен слоем отростчатых клеток. В группе сравнения эндотелиальный слой роговицы на 21-е сутки от начала лечения содержал дистрофически измененные клетки.

Таким образом, внутрикамерное ввведение аутологичных мононуклеаров крови с их наслоением на внутреннюю поверхность роговицы при ЭЭД стимулирует регенерацию эндотелиального слоя, способствуя восстановлению его барьерной функции и уменьшению отека роговой оболочки.

Ключевые слова: эндотелиально-эпителиальная дистрофия, аутологичные мононуклеары крови, полипотентность клеток, микроокружение, репаративная регенерация.

E.O. Filippova, O.I. Krivosheina, I.V. Zapuskalov EXPERIMENTAL STUDY OF AUTOLOGOUS MONONUCLEARS OF BLOOD CELLS IN THE TREATMENT OF ENDOTHELIAL EPITHELIAL

CORNEAL DYSTROPHY

The present work have studied patterns of reparative regeneration development in the corneal endothelial-epithelial dystrophy with intracameral use of autologous mononuclear blood cells. Several experiments on Wistar rats have been made. The main group of rats has been injected intracameral mononuclear cell suspension onto the rear surface of the cornea after the corneal endothelialepithelial dystrophy simulation. Animals of the control group have been treated using traditional conservative methods.

The experiment revealed a high efficiency of intracameral mononuclear cells treatment. The area of tissue cavities in the corneal stroma was 2.2 times less in the main group than in control group on the third day after operation. On the seventh day after the operation the regeneration signs were observed in the main group. On the fourteenth day the corneal endothelium was represented by a layer of normal endothelial cells. In the control group the corneal endothelium consisted of dystrophycally changed endothelial cells on the twenty first day.

Therefore, intracameral mononuclear cells treatment of corneal endothelial-epithelial dystrophy stimulates endothelium regeneration, contributing to corneal barrier function restoration and decrease of corneal edema.

Key words: endothelial-epithelial corneal dystrophy, autologous mononuclear blood, multipotency of cells, microenvironment, reparative regeneration.

В основе эндотелиально-эпителиальной дистрофии (ЭЭД) роговицы лежит развитие хронического отека ткани роговой оболочки, сопровождающееся значительным снижением остроты зрения и выраженным болевым синдромом [1,2].

Одним из наиболее радикальных и патогенетически обоснованных методов лечения данного заболевания является кератопластика с заменой эндотелиального слоя, обеспечивающая лечебный и оптический эффект. Тем не менее этот способ лечения несет в себе высокий риск развития гнойных осложнений и отторжения трансплантата в послеоперационном периоде [3]. На наш взгляд, использование клеточной терапии может быть альтернативой радикальной хирургии при лечении ЭЭД роговицы. В связи с этим особый интерес представляют аутологичные мононукле-арные клетки крови, обладающие высоким секреторным потенциалом и способностью адаптироваться к микроокружению и меняющимся условиям среды.

Цель исследования - изучить в эксперименте in vivo закономерности развития ре-паративной регенерации при ЭЭД роговицы на фоне внутрикамерного применения ауто-логичных мононуклеаров крови.

Материал и методы

Выполнена серия экспериментов на 24 половозрелых крысах-самцах породы Wistar массой 250 г, полученных из вивария ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России.

На I этапе животным в условиях операционной под наркозом моделировали ЭЭД путем механического повреждения и удаления эндотелия роговицы одного из глаз. На II этапе через две недели после развития патологического процесса животные в зависимости от планируемого лечения были разделены на 2 группы:

- основная - 12 крыс (24 глаза), которым выполняли внутрикамерное введение аутологичных мононуклеаров крови. В условиях операционной после обработки операционного поля с соблюдением правил асептики и антисептики, под наркозом каждому животному выполняли два парацентеза в роговице, в один из которых устанавливали ирригационную систему с подачей стерильного воздуха в переднюю камеру, через другой парацен-тез с помощью шприца в переднюю камеру на границу между внутренней поверхностью ро-

говой оболочки и воздухом аккуратно наслаивали суспензию аутологичных мононуклеаров крови. Затем ирригационную систему удаляли, края парацентезов гидратировали. Моно-нуклеарные клетки из крови экспериментальных животных выделяли методом фракционирования в градиенте плотности на разделяющем растворе фиколл-верографина [4]. Чистота мононуклеаров, полученных на градиенте плотности, составляла 96 -98%.

- сравнения - 12 крыс (24 глаза), которым проводилось традиционное консервативное лечение (метаболические средства, кера-топротекторы).

Общая продолжительность эксперимента составила 35 суток. В ходе эксперимента проводили наружный осмотр и фоторегистрацию. Забор материала осуществляли на 3, 7, 14 и 21-е сутки от начала эксперимента. Полученный материал фиксировали для световой микроскопии и окрашивали гематоксилином и эозином и по методу Ван-Гизона.

Результаты и обсуждение

Сравнительный анализ результатов лечения ЭЭД роговицы в эксперименте выявил высокую эффективность внутрикамерного применения аутологичных мононуклеаров крови: на 3-и сутки от начала лечения по данным наружного осмотра у животных основной группы отмечено существенное уменьшение роговичного синдрома, на 14-е сутки прозрачность роговицы восстанавливалась полностью. У животных группы сравнения на протяжении всего эксперимента сохранялись роговичный синдром и диффузный отек роговицы.

В ходе морфологического исследования были получены следующие данные. На 3-и сутки от начала лечения у животных основной группы среди клеток переднего эпителия роговой оболочки обнаруживались единичные клетки с явлениями баллонной дистрофии. Собственное вещество было представлено рыхло расположенными коллагеновыми волокнами с общей площадью тканевых щелей 567±95 мкм2. Эндотелий отсутствовал. У животных группы сравнения передний эпителий был представлен дистрофически измененными эпителиоцитами. Коллагенновые волокна стромы расположены рыхло с полостями между ними общей площадью 1197±110 мкм2. Эндотелий отсутствовал.

На 7-е сутки от начала лечения в основной группе передний эпителий имел нормаль-

ное строение. В собственном веществе роговицы ход коллагеновых волокон на уровне передних 2/3 стромы становился более упорядоченным. Площадь полостей между волокнами уменьшалась до 449±63 мкм2. Со стороны эндотелия обнаруживалась выраженная пролиферация клеток отростчатой формы.

У животных группы сравнения большинство эпителиоцитов переднего эпителия было подвержено баллонной дистрофии. Кол-лагеновые волокна собственного вещества роговицы - с явлениями отека. Площадь тканевых полостей - 986±90,5 мкм2. Эндотелий отсутствовал.

На 14-е сутки от начала лечения у животных основной группы передний эпителий сохранял нормальное строение. Коллагеновые волокна стромы вблизи задней пограничной мембраны были незначительно раздвинуты отечной жидкостью. Общая площадь тканевых полостей не превышала 195±44 мкм2. Эндотелий был представлен одним слоем от-ростчатых клеток.

В группе сравнения в значительном количестве обнаруживались дистрофически измененные эпителиоциты. Среди коллагеновых волокон основного вещества сохранялись явления отека. Площадь тканевых полостей составила 665±93 мкм2. Местами обнаруживались новообразованные сосуды. Эндотелий представлял собой неравномерный, местами слущивающийся слой дистрофически измененных клеток.

На 21-е сутки от начала лечения у животных основной группы собственное вещество роговой оболочки содержало компактно расположенные коллагеновые волокна. Эндотелий представлял собой слой отростчатых клеток. У животных группы сравнения в переднем эпителии сократилось число клеток с признаками баллонной дистрофии. Площадь тканевых полостей в строме роговицы между

волокнами коллагена составляла 485±79 мкм2. Увеличивалось число новообразованных сосудов. Эндотелий представлял собой слой дистрофически измененных клеток.

Результаты проведенного эксперимента позволяют предположить, что аутологичные мононуклеары крови после введения в переднюю камеру глаза животных основной группы и наслоения на внутреннюю поверхность роговой оболочки с ЭЭД адгезируются к десцеметовой оболочке, оказываясь на пути циркулирующей в определенном направлении внутриглазной жидкости. Наличие направленного движения жидкости через моно-нуклеарные клетки, как было показано в эксперименте шуйго [5] вызывает в них биохимические и морфологические изменения. Как известно, в клетках поддержание постоянства внутренней среды осуществляется путем непрерывного регулирования работы генов. При этом одни из них находятся в активном состоянии, другие - в репрессированном. Экспрессия же генов регулируется, с одной стороны, цитоплазмой клеток, с другой - клеточным окружением. При воздействии факторов микроокружения, по-видимому, возникает моди-фикационная изменчивость клеток, связанная с репрессией и активацией иных, в отличие от исходной «запланированной» детерминации генов. Как следствие определенная фракция мононуклеаров дифференцируется в эндоте-лиальные клетки, выстилающие заднюю поверхность роговицы в виде монослоя.

Заключение

В ходе эксперимента показано, что внутрикамерное введение аутологичных мо-нонуклеаров крови с последующим их наслоением на внутреннюю поверхность роговой оболочки при ЭЭД способствует регенерации эндотелиального слоя, что обеспечивает быстрое уменьшение отека стромы и восстановление прозрачности роговицы.

Сведения об авторах статьи:

Филиппова Екатерина Олеговна - аспирант кафедры офтальмологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России. Адрес: 634050, г. Томск, Московский тракт, 2. E-mail: katerinabosix@mail.ru.

Кривошеина Ольга Ивановна - профессор кафедры офтальмологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России. Адрес: 634050, г. Томск, Московский тракт, 2. E-mail: oikr@yandex.ru.

Запускалов Игорь Викторович - профессор, зав. кафедрой офтальмологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России. Адрес: 634050, г. Томск, Московский тракт, 2. E-mail: izapuskalov@yandex.ru.

ЛИТЕРАТУРА

1. Егоров, В.В. Поиск возможностей повышения эффективности лечения тяжелых индуцированных дистрофий роговицы методом эксимерной хирургии / В.В. Егоров, В.Д. Посвалюк, Е.Л. Сорокин // Офтальмология. - 2008. - Т. 5, № 3. - С. 35-40.

2. Мамиконян, В.Р. Современные технологии пересадки роговицы / В.Р. Мамиконян, С.В. Труфанов, Г.А. Осипян // Тезисы докладов IX съезда офтальмологов России. - М.: Печатная мануфактура, 2010. - С. 311.

3. Каспаров, А.А. Послеоперационная буллезная кератопатия: трансплантационные и нетрансплантационные методы лечения / А.А. Каспаров, Е.А. Каспарова, С.В. Труфанов // Тезисы докладов IX съезда офтальмологов России. - М.: Печатная мануфактура, 2010. - С. 307.

4. Введение в методы культуры клеток, биоинженерии органов и тканей / под ред. В.В. Новицкого, В.П. Шахова. - Томск: STT, 2005. - 167 с.

5. Запускалов, И.В. Биомеханика «периферического сердца» в тканях глаза / И.В. Запускалов, О.В. Кривошеина, Ю.И. Хороших. -Томск: Иван Федоров, 2013. - 140 с.