СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО КОНЦЕНТРАТА ИЗ ПАНТОВ
METHOD FOR PREPARING BIOLOGICALLY ACTIVE CONCENTRATE OF VELVET ANTLERS

Изобретение относится к производству фармакологических препаратов с выраженной биологической активностью, в частности к препаратам с высоким содержанием гормонов и факторов роста, и может быть использовано в косметической промышленности, а также в медицине и ветеринарии.
Известен способ получения пантолизата (жидкого концентрата), включающий кислотно-ферментативный гидролиз измельченных пантов в искусственном желудочном соке. Пантолизат содержит в своем составе значительное количество макро- и микроэлементов и незаменимых аминокислот. Процесс ферментации проводят при температуре от 20 до 42°С. Однако использование кислот обуславливает обязательное наличие операции нейтрализации с последующим удалением солей, а также необратимое разрушение белка кислотой (см. патент RU 2112396, МКИ A23J 1/10, A23J 3/34, А61К 35/32).
Известен способ приготовления биологически активного препарата из пантов - пантолизата (жидкого концентрата), включающий ферментативный гидролиз измельченных пантов и фильтрацию гидролизата. Степень размола пантов не более 100 мкм, при этом перед ферментацией муку замешивают при комнатной температуре в двойном объеме дистиллированной воды и через 1,5-2 часа добавляют ферментативный комплекс суспензии поджелудочной железы из расчета 10% к массе муки. Смесь перемешивают и гидролиз проводят в течение 6 часов при 38-40°С. Полученный гидролиз экстрагируют водой в соотношении 1:5 в течение 6 часов и перед фильтрацией центрифугируют (см. патент RU 2268059, МКИ А61К 35/32 - прототип).
Однако жидкая форма препарата обладает ограниченным сроком хранения, неудобна в транспортировке и применении, так, при внесении препарата в продукт необходимо учитывать наличие в препарате воды, что влечет за собой ряд лишний технологических приемов по ликвидации данного фактора. Кроме этого биологическая активность пантовых препаратов до настоящего времени определялась в основном по наличию в них аминокислот, макро- и микроэлементов, витаминов, жирных кислот и нескольких гормонов, в то время как исследованиямя биохимического состава пантовой продукции выявлено достаточное количество ранее не фигурирующих гормонов и факторов роста, при этом известные способы производства, как показали исследования, не обеспечивают максимального процента извлечения данных веществ из пантового сырья.
Необходима разработка способа получения биологически активного концентрата из пантов, удобного в применении и обеспечивающего за счет максимального извлечения гормонов и факторов роста (при высокой степени содержания аминокислот, макро- и микроэлементов, витаминов) высокую биологическую активность и расширение сферы использования биологически активного продукта из пантов.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения концентрата из пантов оленей, включающем ферментативный гидролиз пантовой муки со степенью размола не более 100 мкм в присутствии воды и гомогената поджелудочной железы животного из расчета 100 г железы на 1 кг пантовой муки с последующей водной экстракцией гидролизата, центрифугированием и фильтрацией, ферментативный гидролиз осуществляют в присутствии поджелудочной железы пантовых оленей при весовом соотношении пантовая мука:вода 1:1,5 в течение 3-4 часов при температуре не более 50°С. Экстракцию гидролизата проводят при весовом соотношении гидролизат:вода 1:1,5 в течение 3-х часов, а после центрифугирования фильтрации экстракт, содержащий целевой продукт, сушат при температуре не выше 50°С и давлении 0,9 атм.
2
Сущность способа заключается в следующем. До последнего времени оценка оптимальности технологических параметров процесса производства биологически активных препаратов из пантовой продукции проводилась по наличию в них в основном аминокислот, витаминов, макро- и микроэлементов и ряда гормонов, и игнорировалось влияние на биологическую активность факторов роста, так как технологические режимы были направлены на оптимальный выход вышеперечисленных веществ и, как показали исследования, факторы роста извлекались в небольших количествах. В то же время факторы роста, подобно гормонам, обладают широким спектром биологического воздействия на многие клетки организма - стимулируют или ингибируют митогенез, хемотаксис и дифференцировку (созревание) клеток. Так, клетки делятся под действием инсулиноподобного (IGF) и эпидермального (EGF) факторов роста, а созревают при помощи трансформирующего (TGF) фактора роста. Факторы роста отодвигают «плановую старость» клетки, то есть оказывают омолаживающее действие на ткани и весь организм: заново запускают отключившиеся по старости или из-за болезни гены, тем самым продлевая жизнь клетки, увеличивают число деления клеток, направленно стимулируют в них обмен веществ. Факторы роста стимулируют рост ребенка, особенно развитие костно-мышечной системы, что особенно важно в подростковом возрасте. По последним данным клинических исследований факторы роста облегчают течение заболеваний пищеварительного тракта, наиболее эффективно применяются при острых кишечных заболеваниях. Изучается влияние факторов роста для предотвращения развития гиперпластических процессов (мастопатия, миома матки, эндометриоз) и уменьшения прогрессирования онкологических заболеваний. В частности, фактор роста нервов (NGF) играет важную роль в процессах развития и функционирования нервной системы, а также в регенерации поврежденных нейрональных структур. Трансформирующий фактор (TGF) является ангиогенным фактором, участвует в пролиферации клеток, а также в регуляции роста опухолевых клеток. В процессе метаболизма дегидроэпиандростерона (ДГЭА) в периферических тканях образуется тестостерон и дегидротестостерон. Эпидермальный фактор (EGF) контролирует и стимулирует пролиферацию эпидермальных и эпителиальных клеток, включая фибробласты, почечный эпителий, глиальные клетки, клетки гранулезы яичников. Цилиарный нейротрофический фактор (CNTF) рассматривается как ключевой фактор дифференцировки для развивающихся нейронов и глиальных клеток. Костный морфогенетический протеин (ВМР-4) обладает ярко выраженным терапевтическим эффектом при артритах по регенерации костных тканей. Инсулиноподобный фактор роста (IGF) осуществляет эндокринную, аутокринную и паракринную регуляцию процессов роста, развития и дифференцировки клеток и тканей организма. Следует сказать, что действие факторов роста необходимо рассматривать в связи с другими стимуляторами, прежде всего с гормонами, а именно, гормоны в биологически активных препаратах из пантовой продукции при надлежащей технологии производства (кстати сказать, довольно близкой по технологическим параметрам, как показали исследования, к технологии оптимального выхода факторов роста) находятся в достаточном количестве.
Таким образом, разработка способа производства биологически активного продукта из пантов, обеспечивающего высокий выход факторов роста, тем более с выходом продукта в виде сухого концентрата, расширит сферу применения продукта при более удобном его использовании.
При разработке способа были проведены исследования по выявлению гормонов и факторов роста в целых пантах маралов, целых пантах северных оленей, основе пантов северных оленей, порошке из кожи и волоса от консервированных пантов северных оленей. Содержание гормонов и факторов роста определяли иммуноферментным методом с применением стандартных диагностических наборов немецкой фирмы JBL, американских DSL, EGF, B&D Systems, CHEMICON, австрийской Bender Medsystems по общепринятым методикам. Результаты исследований отражены в таблице 1.
Таблица 1
Наименование
Сырье
1
2
3
4
5
Панты марала целые
Панты северного оленя целые
Основа пантов северного оленя
Порошок из кожи и волос пантов северных оленей
Жмых из пантов северных оленей
Тестостерон (пг/г)
718
443
639
849
804
Дегидроэпиандростерон (ДГЭА), нг/г
14,8
6,1
3,6
12,7
33
Инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1), нг/г
213
173
10,4
22
0
Инсулиноподобный фактор роста 2 (IGF 2), нг/г
314
148
40
48
34
Альфа-трансформирующий фактор роста (TGF-α), пг/г
162
44
58,2
14
11,2
Бета-трансформирующий фактор роста (TGF-β), нг/г
29,5
30,2
7,5
8,8
14,5
Эпидермальный фактор роста (EGF), пг/г
26,8
46,3
43
32,0
46,0
Фактор роста нервов (NGF), нг/г
33,4
47,0
38,0
158,0
33,0
Цилиарный нейротрофический фактор (NGF<sub>3</sub>, CNTF), пг/г
134
23,5
26,9
42,3
65,3
Костный морфогенетический протеин - 4 (ВМР-4),пг/г
51,6
35,4
20,1
26,4
9,1
Начальным этапом разработки способа явился поиск фермента животного происхождения, наиболее приемлемого для получения пантового концентрата. В таблице 2 приведены данные биологической активности пантолизатов, изготовленных из пантов северных оленей с использованием в качестве ферментов в процессе их приготовления ферментативных комплексов суспензий поджелудочной железы крупного рогатого скота и суспензии поджелудочной железы северных оленей по технологическим параметрам прототипа. Дополнительно в данном опыте задействована температура ферментации 50°С. Ферментативные комплексы представляют собой размолотые на гомогенизаторе поджелудочные железы (далее гомогенаты) крупного рогатого скота и пантовых оленей. Результаты опыта отражены в таблице 2.
Таблица 2
Вид фермента
Доза, грамм
Продолжительность ферментации, час
Температура процесса ферментации, °С
Продолжительность экстракции, час
Биологическая активность пантолизата, %
Ферментативный комплекс суспензии поджелудочной железы крупного рогатого скота (СПЖ КРС)
100
6
40
6
29,6±2,1
50
31,4±2,3
Ферментативный комплекс суспензии поджелудочной железы пантовых оленей (СПЖ ПО)
100
6
40
6
33,6±2,7
50
35,1±1,4
Гомогенаты поджелудочных желез содержат ряд ферментов: трипсиноген (претрипсин), трипсин А и В, химотрипсин, карбокситрепсидазу и эластазу, расщепляющие белки до аминокислот; аминопепсидазу, расщепляющую полипептиды, амилазу (диастазу), инвертазу и лактазу, превращающие сложные углеводы в простые.
Как видно из таблицы 2, биологическая активность пантолизатов с использованием в процессе их приготовления гомогената поджелудочных желез пантовых оленей выше в среднем на 12,6% и на 6,1, 4,5% выше при использовании в процессе ферментации температуры 50°С.
В процессе выявления оптимальных параметров способа, обеспечивающих высокий выход гормонов и факторов роста (при высоком содержании аминокислот), было проведено 3 опыта по приготовлению концентратов из пантов северных оленей:
1-6 опыт - доза гомогената поджелудочных желез оленей - 100 г на 1 кг размолотых (до 100 мкм) пантов;
- время ферментации 3, 4, 6 часов при температуре 50°С и разбавлении 1:1,5 (на 1 кг пантов 1,5 л воды). Вес гидролизата 2,5 кг;
- время экстракции 3 и 6 часов при весовом соотношении гидролизат: вода 1:1,5;
- сушка пантолизата в вакуумной сушилке при температуре 50°С и давлении 0,9 атм;
7 опыт - доза гомогената поджелудочных желез крупного рогатого скота 100 г на 1 кг размолотых пантов;
- время ферментации, экстракции и степень разведения в соответствии с оптимальным режимом первых шести опытов (3 опыт);
- сушка пантолизата по режиму 1-6 опытов;
8 опыт (прототип) - доза гомогената поджелудочных желез крупного рогатого скота - 100 г на 1 кг размолотых пантов;
- время ферментации, экстракции и степень разведения в соответствии с технологическим режимом прототипа;
- сушка пантолизата по режиму 1-6 опыта.
Результаты исследований отражены в таблице 3.
Как видно из таблицы 3, с ростом продолжительности ферментации наблюдался небольшой рост выхода общих аминокислот (в среднем на 3%) и свободных аминокислот (в среднем на 5,9%) и, несмотря на то, что выход сухого вещества также повышался с увеличением времени ферментации, выход гормонов и факторов роста значительно снижался. Процесс снижения выхода гормонов и факторов роста был отмечен и при увеличении времени экстракции. Так, процент снижения тестостерона колебался от 4,1% (при 3-часовой ферментации) до 33,7% (при 6-часовой ферментации), дегидроэпиандростерона от 7,6 до 41,2%, эстрадиола от 7 до 22,6%, инсулиноподобного фактора роста от 6,6 до 24,4%, эпидермального фактора от 15,3 до 17,6%, фактора роста нервов от 10,0 до 15,7%, соответственно (и т.д.). Оптимальным технологическим режимом, обеспечивающим высокий выход гормонов и факторов роста, следует считать 3-4 часовую ферментацию при соотношении (весовом) панты:вода 1:1,5 и температуре не более 50°С при 3-часовой экстракции и разбавлении гидролизата 1:1,5. Таким образом, на 1 кг размолотых пантов в заявленном способе расход воды составляет 6,25 литра в отличие от 12 л воды по прототипу. Малое количество воды обусловлено необходимостью сушки при производстве концентрата. В таблице 3 отражен сравнительный анализ использования в качестве фермента гомогената поджелудочных желез пантовых оленей (опыт 3) и крупного рогатого скота (опыт 7). В концентрате с использованием гомогената поджелудочной железы крупного рогатого скота содержание гормонов и факторов роста ниже на 10,6-25,5%, а в концентрате, приготовленном по прототипу (опыт 8), снижение этих показателей еще выше (от 26,5 до 72,2%).
В таблице 4 приведены сравнительные данные по содержанию полезных веществ в пантолизате и концентрате.
Таблица 4
Показатели
Вид продукта
Общие аминокислоты (мг/г)
пантолизат
14,0
концентрат
676,2
Свободные аминокислоты (мг/г)
пантолизат
3,7
концентрат
179,8
Коллаген (мг/г)
пантолизат
9,6
концентрат
462,5
Витамины (мг/100 г)
пантолизат
14,6
концентрат
708,9
Макроэлементы (мгк/г)
пантолизат
384,1
концентрат
18600
Микроэлементы (мгк/г)
пантолизат
1,1
концентрат
52,08
Тестостерон (пг/г)
пантолизат
32
концентрат
1559
Дегидроэпиандростерон (ДГЭА), нг/г
пантолизат
0,1
концентрат
4,28
Эстрадиол, пг/г
пантолизат
1,8
концентрат
89,0
Инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1), нг/г
пантолизат
1,2
концентрат
57,2
Эпидермальный фактор роста (EGF), пг/г
пантолизат
0,4
концентрат
19,8
Фактор роста нервов (NGF), нг/г
пантолизат
1,8
концентрат
86,8
Альфа-трансформирующий фактор роста (TGF-α), пг/г
пантолизат
3,8
концентрат
186,0
Бета-трансформирующий фактор роста (TGF-β), нг/г
пантолизат
1,27
концентрат
61,5
Цилиарный нейтрофический фактор роста (NGF<sub>3</sub>, CNTF), пг/г
пантолизат
2,0
концентрат
94,8
Костный морфогенетический протеин (ВМР-4), пг/г
пантолизат
4,9
концентрат
237,1
Как видно из таблицы 4, насыщенность концентрата полезными компонентами в 48 раз выше, чем пантолизата, а поскольку биологическая активность препарата - это его способность изменять функциональные возможности компонентов организма (in vitro или in vivo), то заявленный способ получения биологически активного концентрата с учетом большего выхода факторов роста обеспечивает (исходя из лечебных свойств этих факторов) высокую биологическую активность.
Пример. Способ осуществляется следующим образом. Пантовую муку (размолотые панты северных оленей) со степенью размола не более 100 мкм) замешивают с дистиллированной водой из расчета 1 кг размолотых пантов с 1,5 литрами воды, содержащей 100 г гомогената поджелудочной железы оленей, т.е. при использовании свежей или замороженной поджелудочной железы ее размалывают до гомогенного состояния.
После тщательного перемешивания субстрат помещают в термостат на 3-4 часа при температуре не более 50°С. По окончании срока ферментации к гидролизату добавляют воду в соотношении гидролизат:вода 1:1,5 и экстрагируют в течение 3-х часов на установке РК5М с последующим центрифугированием и фильтрацией. Объем пантолизата составляет 4,6 литра. Сушку пантолизата проводят на вакуумной сушилке при температуре не выше 50°С (т.е. при температурном режиме ферментации) и давлении 0,9 атм до 6% влажности. Концентрат упаковывают в полиэтиленовые пакеты или иную стерильную герметичную тару.
У северных оленей железу собирают с изолированных внутренних органов, при нутровке туши. В период массовых забоев железу заготавливают в виде порошка, сушку гомогенной массы железы осуществляют в вакуумной сушилке при температуре не выше 45°С до 6% влажности и хранят в закрытой стерильной посуде.
Таким образом, заявленный способ получения биологически активного концентрата из пантов обеспечивает за счет высокого содержания гормонов и факторов роста, их терапевтических свойств (при достаточном содержании прочих полезных компонентов) высокую биологическую активность, что позволит расширить сферу применения концентрата. Концентрат удобен в транспортировке, хранении и применении.