Новая накопительная питательная среда и методика ее применения для выделения сальмонелл из водных объектов

апрель №4

31

НОВАЯ НАКОПИТЕЛЬНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА И МЕТОДИКА ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ САЛЬМОНЕЛЛ ИЗ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ

О.П. Панасовец1, В.В. Алешня1, П.В. Журавлев1, Г.В. Айдинов2, М.М. Швагер2

THE NEW CUMULATIVE CULTURE MEDIUM AND METHOD OF ITS APPLICATION FOR ISOLATION OF SALMONELLA FROM WATER OBJECTS

O.P. Panasovets, V.V. Aleshnya, P.V. Zhuravlev, G.V. Aydinov, M.M. Shvager 'ФБУН «Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии», г. Ростов-на-Дону, 2ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ростовской области», г. Ростов-на-Дону

В статье представлена новая среда накопления для выделения сальмонелл из водных объектов. Приведены данные по определению свойств среды (чувствительность, эффективность накопления, ингибирование сопутствующей микрофлоры), разработаны методические подходы к применению данной среды. Среда прошла натурные испытания при мониторинге санитарно-бактериологического качества воды открытых водоемов, сточных вод и водопроводной воды. В экспериментальных и натурных исследованиях показано преимущество ее использования по сравнению со средами накопления, широко применяемыми в практическом здравоохранении.

Ключевые слова: новая накопительная среда, сальмонеллы, водные объекты.

The article presents a new cumulative medium for isolation of Salmonella from water objects. The data to determine the properties of the medium (sensitivity, accumulation efficiency, inhibition of the associated microflora) are provided, methodical approaches to the use of the medium are developed. The medium passed field tests in monitoring the sanitary-bacteriological water quality of open water bodies, wastewater and running water. The advantage of its use as compared with the cumulative media, widely used in medical practice, was shown in experimental and field studies.

Keywords: new cumulative medium, Salmonella, water objects.

В настоящее время возрастает роль острых кишечных инфекций (ОКИ), передаваемых водным путем, в т. ч. и вызываемых бактериями рода Salmonella [3]. Исследованиями установлено, что сальмонеллы обладают значительной устойчивостью в окружающей среде, не всегда полностью уничтожаются дезинфицирующими средствами, используемыми для обеззараживания питьевой воды и сточных вод [2; 5]. Кроме того, широко применяемые в лабораторной практике среды накопления для предварительного подращивания сальмонелл (среды с селенитом натрия, с хлоридом магния, тетратионатные среды и ряд других сред) могут оказывать подавляющее действие не только на сопутствующую микрофлору, но и на менее устойчивые с измененными свойствами серовары сальмонелл, что не обеспечивает получения объективных результатов [1; 4].

Цель данной работы — оценка эффективности новой накопительной питательной среды для выделения сальмонелл из водных объектов.

Материалы и методы. Для выделения сальмонелл из водных объектов использовалась разработанная авторами питательная среда для накопления сальмонелл, готовая к применению (РНС) и широко применяемая в бактериологических лабораториях сухая коммерческая магниевая среда для обнаружения патогенных энтеробактерий (ТУ 9229-072-00419785-97), которая до настоящего времени считалась наиболее результативной при выделении сальмонелл из воды в сравнении с селенитовой и тетратионатными средами.

На питательную среду РНС получен патент № 2312136 от 10.12.2007 г., утверждена нормативно техническая документация: Технические условия 9385-001-01898776-2008, Пусковой регламент на производство питательной среды № 0189877605-2008 и получено регистрационное удостоверение № ФСР 2009/05759 от 29.09.2009 г.

Питательная среда представляет собой стерильную прозрачную жидкость зеленого цвета, рН среды от 6,4 до 6,8, аминный азот — от 0,05 до 0,1 %. Среда обеспечивает через 22 ± 2 ч инкубации при температуре 37 ± 1 °С накопление сальмонелл не менее чем в 105 раз и ингибирует рост кишечных палочек в 100 раз. Для сохранения ростовых свойств питательной среды ее стерильность достигается путем фильтрации через мембранные стерилизующие пластины.

Сравнительная оценка специфической активности и ингибирующих свойств среды РНС и магниевой среды, как наиболее используемой в практических лабораториях, проводилась согласно МУК 2.4.2316—08 на музейных и свежевыде-ленных штаммах. Для исследований были взяты 7 культур микроорганизмов, полученных из коллекции ФГБУ «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Минздравсоцразвития РФ: Salmonella typhi 1196, Salmonella paratyphi B 506, Salmonella paratyphi B 8006, Salmonella typhimurium 301, Salmonella typhimurium 9640, Escherichia coli 3912/41 (О55:К59), Staphylococcus aureus 6538 — pATCC и 9 культур, свежевыделенных из воды открытого водоема: Salmonella anatum, Salmonella infantis, Salmonella derby, Salmonella typhimurium, Salmonella london, Salmonella enteritidis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumonia.

Была исследована водопроводная вода централизованных систем питьевого водоснабжения, вода открытых водоемов (в местах водозаборов, зон рекреаций и селитебной территории) и сточная вода до и после очистки. Для количественного учета сальмонелл авторами были разработаны следующие схемы посева: при исследовании питьевой воды — 3 объема по 100 мл, 3 объема по 10 мл и 3 объема по 1 мл; при исследовании воды открытых водоемов — 2 объема по 100 мл, 2 объема по 10 мл, 2 объема по 1 мл и по 2 объема из разведений от

32

ЗНиСО апрель №4

Таблица 1. Показатели ингибиции роста сопутствующей микрофлоры испытуемой и контрольной средой

Тест-штамм Среда РНС Магниевая среда

«Нулевой» посев M ± m (КОЕ/мл) Через 24 ч инкубации M ± m (КОЕ/мл) Показатель ингибиции «Нулевой» посев M ± m (КОЕ/мл) Через 24 ч инкубации M ± m (КОЕ/мл) Показатель ингибиции

S. aureus 6538 6,83х103 ± ± 0,81х103 Н.О.* Полная ингибиция 6,83х103± ±0,81х103 Н.О. Полная ингибиция

E. coli 3912/41 6,46х103 ± ± 0,52х103 0,16х102 ± ± 0,05х102 4,0х102 6,46х103± ±0,52х103 6,66 х 103 ± ± 0,96 х 103 0,96

E. coli 7,6х103 ± ± 1,7х103 0,3х102 ± ± 0,04х102 2,5х102 7,6х103 ± ±1,7х103 1х107 ± ± 8х106 0,00076

K. pneumonia 1х103 ± 0,2х103 Н.О. Полная ингибиция 1х103± ± 0,2х103 7,3х103 ± ± 1,6х103 0,13

E. faecalis 6,0х103 ± ± 0,65х103 Н.О. Полная ингибиция 6,0х103 ± 0,65х103 1,3х102 ± ± 0,16х102 46,1

Примечание: * - не обнаружено

10-1 до 10-3; если предполагается значительное загрязнение водоема, ряд разведений может быть продолжен до 10-5; при исследовании сточных вод до очистки — 2 объема по 1 мл и 2 объема из разведений от 10-1 до 10-7, после очистки — 2 объема по 100 мл, 2 объема из разведений от 10-1 до 10-3.

Посев воды в объеме 100 мл производился во флаконы со 100 мл среды; 10 мл во флаконы с 10 мл среды, 1 мл и последующие разведения в пробирки с 9 мл среды. Посевы воды в среде накопления инкубировались при температуре 37 ± 1°С в течение 22 ± 2 ч, затем пересевались на 2 чашки с висмут-сульфит агаром. Если не было роста, то оставляли еще на 22 ± 2 ч. Идентификация сальмонелл проводилась согласно общепринятым методикам. При выполнении количественного анализа наиболее вероятная величина индекса сальмонелл (НВЧ) в 1000 мл воды определялась по таблицам Хоскинса-Мура.

Результаты и обсуждение. Полученные данные свидетельствуют, что показатель эффективности накопления сальмонелл в среде РНС составил 105—106, а в магниевой среде — 103—106. Магниевая среда значительно уступает по эффективности накопления некоторых сероваров сальмонелл: наиболее низкий показатель накопления (103) имели свежевыделенные из водоема S. enteritidis, S. derby и S. infantis, что может свидетельствовать об ингибирующих свойствах среды по отношению к некоторым сероварам сальмонелл.

Среды различаются также и по степени инги-биции к сопутствующей микрофлоре (табл. 1). Ингибирующие свойства среды РНС по отношению ко всем используемым штаммам как музейным, так и свежевыделенным из воды, выше, чем у магниевой среды. И только лишь S. aureus 6538 угнетается полностью как магниевой, так и средой РНС.

При проверке ростовых свойств селенитовой и тетратионатных сред установлено, что при показателе ингибиции сопутствующей микрофлоры 102 эффективность накопления сальмонелл была низкой и находилась на уровне 103—104, что значительно ниже эффективности как среды РНС, так и магниевой среды.

В натурных условиях, с использованием среды РНС и магниевой среды, проведен сравнительный количественный анализ 173 проб воды открытых водоемов, 56 проб хозяйственно-бытовых сточных вод до и после очистки и 540 проб питьевой воды. Определение НВЧ сальмонелл проводилось в 1 л воды.

Использование РНС, помимо увеличения процента выделения и НВЧ, повышает количество выделенных культур и сероваров сальмонелл (табл. 2). Как при применении среды РНС, так и магниевой, наиболее часто выделяются сальмонеллы группы В и среди них — S. typhimurium и S. derby.

Таким образом, среда РНС обладает высокой ингибирующей активностью по отношению к сопутствующей микрофлоре и обеспечивает высокую степень накопления различных серова-ров сальмонелл, наиболее часто встречающихся в водной среде, и является более эффективной, чем среды, рекомендуемые в методических документах по выделению сальмонелл из водных объектов. При ее использовании при посеве воды с различной степенью бактериального загрязнения процент выделения сальмонелл повышается в 1,3—1,7 раза, НВЧ — в 20—40 раз, количество выделенных культур в 2 раза. Необходимо отметить, что в питьевой воде сальмонеллы были обнаружены только с использованием среды РНС, по-видимому, за счет ее способности восстанавливать биологические свойства сальмо-

апрель №4

33

Таблица 2. Сравнительная оценка выделения сальмонелл из водных объектов с использованием двух сред накопления

Объект исследования Количество проб Число положительных проб HB4/1000 мл Количество сероваров Количество выделенных культур

РТС магниевая среда РТС магниевая среда РТС магниевая среда РТС магниевая среда

количество % выделения количество % выделения

Вода открытых водоемов 173 146 84 85 49 421,5 i 78,8 21,1 i 6,2 57 гр B, C, D, E 34 гр B, С, D, E 342 141

Сточная вода до очистки 28 28 100 28 100 5997 i 2022,4 150 i 25,8 36 гр B, C, D, E 17 гр B, C, D, E 124 50

Сточная вода после очистки 28 19 67 15 53 683 i 156,5 18,5 i 2,9 18 гр B, C, D, E 11 гр B, C, D 80 42

Питьевая вода 540 14 2,6 0 0 4 КО.* 6 гр BA D,E КО.* 14 КО.*

нелл, утраченные в процессе обеззараживания. Наблюдается более разнообразный пейзаж серо-варов выделенных сальмонелл. Преимуществом среды РНС является так же то, что она готова к применению и не требует дополнительных манипуляций при подготовке к посевам по сравнению с сухими коммерческими средами.

Выводы.

1. Применение среды РНС и рациональной методики посева, разработанной авторами, целесообразно как для определения наличия, так и количественного содержания сальмонелл в водных объектах.

2. Высокий процент обнаружения и широкий спектр выделенных сальмонелл может свидетельствовать о способности среды РНС восстанавливать утраченные в процессе пребывания в водной среде биологические свойства.

3. Использование питательной среды в практических лабораториях дает возможность унифицировать методические подходы к выделению сальмонелл из водных объектов различной степени биологического загрязнения и получать сопоставимые результаты анализов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Калина Г.П. Сальмонеллы в окружающей среде / М.: Медицина, 1978, 160.

2. Недачин А.Е., Артемова ТЗ., Дмитриева Р.А. с со-авт. Проблемы эпидемической безопасности питьевого водопользования населения России //Гигиена и санитария. 2005. № 6. С. 14—18.

3. Онищенко Г.Г. О состоянии питьевого водоснабжения в Российской Федерации //Гигиена и санитария. 2006. № 4. С. 3—7.

4. Панасовец О.П. Разработка жидкой питательной среды накопления для выделения сальмонелл из водных объектов / Автореф. к.б.н., М., 2007.

5. Oliver J.D., Dagher M., Linden K. Induction of Escherichia coli and Salmonella typhimurium into the viable but nonculturable state following chlorination of wastewater //J. of water and health. 2005. № 3 (3). P. 249—257.

Контактная информация:

Панасовец Ольга Петровна, тел.: 8 (863) 234-70-55

Contact information: Panasovets Olga, phone: 8 (863) 234-70-55