УСТРОЙСТВО ПОВЫШЕННОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ СВЕТОВОЙ АКТИВНОСТИ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ in vitro

Полезная модель относится к оборудованию для решения задач фотобиологии и медицины в области исследований световой активности широкой группы препаратов (фотосенсибилизаторов) для фотодинамической терапии.
При разработке препаратов для фотодинамической терапии необходимым этапом является исследование их функциональных свойств на клеточных культурах. Анализ световой, или фотодинамической, активности в системе in vitro позволяет проводить скрининг потенциальных фотосенсибилизаторов, осуществлять подбор концентраций, а также оценивать дозу оптического излучения, необходимую для проявления фотодинамического эффекта.
Эффективность исследования световой активности фотосенсибилизаторов in vitro в значительной степени зависит от выбора источника освещения клеточных культур с фотосенсибилизатором в связи с высокими требованиями поддержания режима освещения и температурных условий проведения исследований.
Известно использование для указанного освещения источников широкополосного излучения, таких как газоразрядные галогеновые лампы, лампы накаливания, «белые» светодиоды (см., например статью автора Жуковой О.С. Модели in vitro для скрининга противоопухолевых соединений различной природы. - «Российский биотерапевтический журнал». 2004, Т. 3, №3, с. 12-18; и статью на англ. яз. авторов Mroz P., Bhaumik J., Dogutan D.K., Aly Ζ., Kamal Ζ., Khalid L, Kee H.L., Bocian D.F., Holten D., Lindsey J.S., Hamblin M.R. Imidazole metalloporphyrins as photosensitizers for photodynamic therapy: role of molecular charge, central metal and hydroxyl radical production. - «Cancer Lett». 2009, V. 282, №.1, p. 63-76).
У них есть ряд недостатков, важнейшим из которых является избыточная световая мощность, воздействующая на клеточную культуру, поскольку спектр излучения источников белого света в несколько раз шире спектра поглощения фотосенсибилизаторов: типичная ширина полосы поглощения около 50 нм (см., например статьи на англ. яз. авторов Sakamoto К., Ohno-Okumura Ε. Syntheses and Functional Properties of Phthalocyanines. - «Materials». 2009, V. 2, №3, p.1127-1179; и авторов Wang X., Wang P., Tong W., Liu Q. Comparison of pharmacokinetics, intracellular localizations and sonodynamic efficacy of endogenous and exogenous protoporphyrin IX in sarcoma 180 cells. - «Ultrasonics». 2010, V. 50, №8, p. 803-810). Излучение, выходящее за границы этой спектральной полосы, может приводить к нежелательному нагреву клеток и побочным фотохимическим реакциям, что, в свою очередь, может существенно затруднить интерпретацию результатов эксперимента.
Для выделения необходимой области спектра могут быть использованы методы дополнительной спектральной фильтрации, однако источники освещения с такой фильтрацией значительно усложняют устройства для исследования световой активности фотосенсибилизаторов in vitro (см., например устройство для исследования фотодинамической активности фотосенсибилизаторов in vitro в описании изобретения к патенту РФ №2160897, G01N 33/48, A61B 10/00, G01N 35/00, 2000).
В клинической практике при проведении процедур фотодинамической терапии используются также узкополосные лазерные и светодиодные источники излучения (см., например статью авторов Странадко Е.Ф., Армичев А.В., Гейниц А.В. Источники света для фотодинамической терапии. - «Лазерная медицина». 2011, Т. 15, №3, с. 63-69). Это обусловлено относительной простотой направленной доставки такого излучения посредством гибких оптических волокон при обеспечении необходимой спектральной плотности мощности. Узкополосные источники представляется методологически верным использовать, также при работе на клеточных культурах, что позволяет исследовать световую активность препаратов в условиях, максимально приближенных к клиническим (см., например статьи на англ. яз. авторов Butler M.С, Itotia P.N., Sullivan J.M. A high-throughput biophotonics instrument to screen for novel ocular photosensitizing therapeutic agents. - « Invest Ophthalmol Vis Sci». 2010, V. 51, №5, p.2705-2720; и авторов Zheng G., Chen J., Stefflova K., Jarvi M., Li H., Wilson B.C. Photodynamic molecular beacon as an activatable photosensitizer based on protease-controlled singlet oxygen quenching and activation. - «Proc Natl Acad Sci U S A». 2007, V. 104, №21, p. 8989-8994).
2
Важным параметром является размер области светового воздействия, который определяет возможность работы с культуральными сосудами разной площади. Облучение клеток в чашках Петри диаметром 35-60 мм с использованием распределенных источников света при размере светового пятна более 1 см (см., например статью на англ. яз. авторов Pogue B.W., Ortel В., Chen Ν., Redmond R.W., Hasan T. A photobiological and photophysical-based study of phototoxicity of two chlorins. - «Cancer Res». 2001, V. 61, №2, p. 717-724) в значительной степени затрудняет проведение экспериментов с большим числом биологических повторностей. В этом случае требуется большой объем используемых расходных материалов и существенные временные затраты, связанные с невозможностью одновременного облучения набора экспериментальных образцов. В связи с этим более удобным представляется использование многолуночных планшетов (см., например, статьи на англ. яз. авторов Vrouenraets M.В., Visser G.W.M., Stigter M., Oppelaar H., Snow G.В., van Dongen G.A.M.S. Targeting of Aluminum (III) Phthalocyanine Tetrasulfonate by Use of Internalizing Monoclonal Antibodies. - «Cancer Research». 2001. V. 61, №5, p. 1970-1975; и авторов Song К., Li J., Li L, Zhang P., Geng F., Dong R., Yang Q., Qu X., Kong B. Intracellular metabolism, subcellular localization and phototoxicity of HMME/HB in ovarian cancer cells. - «Anticancer Res». 2011. V. 31, №10, p. 3229-3235).
В качестве наиболее близкого аналога заявляемого устройства (прототипа) заявителем выбрано известное устройство повышенной эффективности для исследования световой активности фотосенсибилизаторов in vitro (см. указанное устройство в описании изобретения «Способ определения фотодинамической активности in vitro» к патенту РФ №2185103, A61B 10/00, G01N 33/48, 2002), содержащее многолуночный культуральный планшет и источник узкополосного света, выполненный на основе лазера ЛД-680-2000 со световодом TF-FC-5m-600-SMA для освещения клеточной культуры с фотосенсибилизатором или без него, расположенной в лунках культурального планшета, повышающего эффективность освещения, но усложняющего и удорожающего устройство.
Кроме того, устройство-прототип не обеспечивает высокой точности исследований в связи с отсутствием в нем термостата, отвечающего за стабилизацию температуры клеточной культуры в лунках в условиях ее освещения с высокой плотностью мощности светового излучения.
Технический результат заявляемой полезной модели - повышение точности исследований световой активности фотосенсибилизаторов in vitro за счет прецизионного контроля и стабилизации температурного режима с помощью термостата при высокой эффективности освещения в результате выполнения светодиодной панели из узкополосных светодиодов повышенной мощности (до 100 мВт/кристалл) со встроенным теплоотводом светодиодов и наружным радиатором с принудительным воздушным охлаждением, смонтированным на внешней стенке светодиодной панели, а также уменьшение стоимости устройства в связи с исключением использования узкополосного лазерного источника со световодом.
Кроме того, введение в конструкцию предлагаемого устройства терморегулятора, выполненного, например совмещено с термостатом, обеспечивает проведение исследований при различных температурных режимах нагрева или охлаждения клеточной культуры в лунках культурального планшета и, соответственно расширение функциональных возможностей предлагаемого устройства.
Для достижения указанного технического результата в устройстве повышенной эффективности для исследования световой активности фотосенсибилизаторов in vitro, содержащем многолуночный культуральный планшет и источник узкополосного света для освещения клеточной культуры с фотосенсибилизатором или без него, расположенной в лунках культурального планшета, указанный источник узкополосного света выполнен в виде светодиодной панели, размещенной над упомянутым планшетом с соблюдением условия освещения каждым ее светодиодом клеточной культуры с фотосенсибилизатором или без него, расположенной в соответствующей лунке культурального планшета.
Причем указанная светодиодная панель выполнена из узкополосных светодиодов с повышенной мощностью излучения, например с мощностью излучения до 100 мВт/кристалл, снабженных каждый своим теплоотводом, и снабжена наружным радиатором с принудительным воздушным охлаждением, а культуральный планшет размещен в посадочном углублении термостата.
В частном случае для проведения исследований при различных температурных режимах нагрева или охлаждения клеточной культуры в лунках культурального планшета устройство для исследования световой активности фотосенсибилизаторов in vitro может быть оснащено терморегулятором для изменения температуры клеточных культур в лунках, имеющим, например исполнение, совмещенное с термостатом.
На фигуре схематически изображено заявляемое устройство повышенной эффективности для исследования световой активности фотосенсибилизаторов in vitro.
Предлагаемое устройство повышенной эффективности для исследования световой активности фотосенсибилизаторов in vitro (см. фиг. 1) содержит многолуночный культуральный планшет 1, размещенный в посадочном углублении 2 термостата 3, и светодиодную панель 4, состоящую из 96 малогабаритных узкополосных диодов повышенной мощности излучения 5, и блок 6 регулирования мощности излучения светодиодной панели 4.
При этом светодиодная панель 4 размещена над многолуночным планшетом 1 с соблюдением условия освещения каждым светодиодом 5 клеточной культуры с фотосенсибилизатором или без него, размещенной в соответствующей лунке 7 культурального планшета 1 и снабжена смонтированным на ее внешней стенке радиатором 8 с принудительным воздушным охлаждением.
Светодиодная панель 4 и блок 6 регулирования мощности излучения светодиодной панели 4 выполнены в соответствии с выбранной электрической схемой питания светодиодной панели 4, обеспечивающей, например возможность матричного включения/выключения групп светодиодов 5.
Для включения блока 6 предусмотрен тумблер включения 9, для регулирования общей мощности светодиодной панели 4 предусмотрена поворотная ручка регулирования мощности 10 и для включения/выключения в настоящем примере отдельных групп светодиодов 5 предусмотрены тумблеры включения/выключения 11.
Для регулирования температурного режима нагрева или охлаждения клеточной культуры в лунках 7 планшета 1 в устройстве может быть использован терморегулятор, имеющий, например исполнение, совмещенное с термостатом 3.
В качестве узкополосных светодиодов 5 могут быть использованы малогабаритные узкополосные светодиоды для поверхностного монтажа (SMD) производства фирмы High Power Lighting Corporation серии HPL-H44 с размерами основания 4,4 мм × 4,4 мм со спектральным диапазоном 400-700 нм и шириной спектра излучения 20 нм, каждый со встроенными фокусирующей линзой и теплоотводом и мощностью излучения до 100 мВт/кристалл, а в качестве термостата 3 может быть использован термостат с функциями терморегулятора марки Thermostat plus фирмы Eppendorf.
Предлагаемое устройство используют следующим образом.
В лунки 7 культурального планшета 1 в настоящем примере помещается суспензия опухолевых клеток в культуральной среде, например среде DMEM (отечественный изготовитель - ООО «Компания «ПанЭко»), и через 12 часов добавляется фотосенсибилизатор, например «Фотосенс» (отечественный изготовитель - ГНЦ «НИОПИК»).
После чего подготовленные указанным выше образом опухолевые клетки в лунках 7 культурального планшета 1 инкубируются в течение 12 часов, затем указанные клетки отмываются от культуральной среды с добавленным ранее фотосенсибилизатором и в лунки 7 с этими клетками добавляется свежая культуральная среда DMЕМ, далее планшет размещается в посадочное углубление 2 термостата 3, терморегулятором указанного термостата устанавливается необходимая температура клеточной культуры в лунках 7, содержимое этих лунок (а также лунок с указанной клеточной культурой без фотосенсибилизатора для контрольного сравнения) освещается с помощью светодиодной панели 4 и через 48 часов производится оценка жизнеспособности освещенных опухолевых клеток с помощью теста на жизнеспособность, например МТТ-теста (см. руководство автора Фрешни Р.Я. Культура животных клеток: практическое руководство. М., «БИНОМ. Лаборатория знаний», 2010, с. 413-416).
В процессе проведения изложенного исследования световой активности фотосенсибилизатора in vitro предлагаемое устройство создает возможность повышения точности исследований в результате прецизионного контроля и стабилизации температуры клеточной культуры в лунках 7 планшета 1 с помощью термостата 3 при высокой эффективности освещения клеточной культуры с фотосенсибилизатором с помощью узкополосных светодиодов 5 повышенной мощности излучения со встроенным теплотводом в каждом из них, что стало возможным благодаря оптимизации освещения с высокой плотностью мощности излучения и термостатирования клеточной культуры с фотосенсибилизатором в лунках 7 планшета 1 в сочетании с воздушным охлаждением светодиодной панели 4.
А регулирование температуры нагрева или охлаждения клеточной культуры с фотосенсибилизатором в лунках 7 планшета 1 обеспечивает различные температурные режимы проведения исследований и, соответственно расширение функциональных возможностей предлагаемого устройства.