СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА
METHOD FOR EARLY DIAGNOSIS OF PARKINSON'S DISEASE

Изобретение относится к медицине, в частности к неврологии и офтальмологии, и может быть использовано для ранней (доклинической) диагностики болезни Паркинсона (БП), которая бы позволила выявить заболевание до появления моторных симптомов, и расширила возможности для использования нейропротекторную терапию, направленную на замедление нейродегенерации.
В последние годы наблюдается рост НДЗ, в том числе БП, в связи с увеличением продолжительности жизни, ухудшением экологии и т.д. Так, по данным Организации Здравоохранения, в 2009 г. только БП и болезнью Альцгеймера в мире страдало более 40 миллионов человек, а к 2040 г. их число может превысить 100 миллионов, а страдающих глаукомой в мире доходит до 80-100 миллионов человек, причем в ближайшие 10 лет этот показатель увеличится на 10 миллионов человек. (Overk C.R., Masliah Е. Pathogenesis of synaptic degeneration in Alzheimer's disease and Lewy body disease, Biochem. Pharmacol. 2014, Vol. 88, P. 508-516, "Нейродегенеративные заболевания: от генома до целостного организма", под ред. М.В. Угрюмова, Москва, 2014, том 1, с. 22-44, «Глаукома. Национальное руководство» (под ред. проф. Е.А. Егорова) // М.: ГЭОТАР-Медиа. - 2013. - 824 с.). От 16% до 20% всех случаев заболевания глаукомой заканчиваются слепотой (Либман Е.С. Инвалидность вследствие патологии органа зрения (в кн. Офтальмология. Национальное руководство) / Под ред. С.Э. Аветисова, Е.А. Егорова, Л.К. Мошетовой, В.В. Нероева, Х.П. Тахчиди // М.: «ГЭОТАР-Медиа».- 2008.- С. 19-25.). Большинство НДЗ на определенном этапе развития сопровождается появлением деменции (Яхно Н.Н., Преображенский И.С., Захаров В.В. и др., Распространенность когнитивных нарушений при неврологических заболеваниях, Неврология, нейропсихиатрия, психосоматика, 2012, №2, с. 30-35.).
Ключевой особенностью патогенеза БП является гибель дофаминергических нейронов нигростриатной системы, отдела мозга, ответственного за тонкую регуляцию двигательной функции. БП остается хроническим заболеванием, затруднение терапии которого, во многом обусловлено диагностикой на клинической стадии после возникновения специфических моторных симптомов. Структурно-функциональные нарушения в нигростриарной системе и на момент постановки диагноза приводят к недостаточной эффективности традиционной фармакотерапии, основанной на использовании агонистов дофамина или предшественника дофамина. Таким образом, важнейшей задачей является необходимость разработки ранней (доклинической) диагностики БП, которая бы позволила выявить заболевание до появления моторных симптомов, и использовать нейропротекторную терапию, направленную на замедление нейродегенерации (Угрюмов М.В. Разработка доклинической диагностики и превентивного лечения нейродегенеративных заболеваний. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2015;11:4-14).
Имеются сведения о возможной ранней диагностике БП на основе оценки серотонина (https://iz.ru/891671/2019-06-22/obnaruzheny-samye-rannie-priznaki-bolezni-parkinsona). альфа-синуклеина (http://www.vechnayamolodost.ru/news/rannyaya-diagnostika-parkinsonizma/).
Известен способ ранней диагностики БП, заключающийся в определении в плазме крови с помощью ВЭЖХ концентрации норадреналина (НА), дофамина (ДА), 3,4-диоксифениоаланина (L-ДОФА), 3,4-диоксифенилуксусной кислоты (ДОУФК), сравнение концентрации этих показателей с концентрацией, предварительно измеренной у здоровых людей. При снижении концентрации НА на 57-67% диагностируют дрожательную форму. При снижении концентрации норадреналина НА на 80-90% диагностируют ригидную форму. При снижении концентрации ДА в плазме крови на 69-79% диагностируют ригидную форму. При снижении концентрации L-ДОФА на 57-67% диагностируют дрожательную форму болезни Паркинсона. При снижении L-ДОФА на 78-88% диагностируют ригидную форму. При снижении концентрации ДОФУК на 69-79% диагностируют ригидную форму болезни Паркинсона (RU 2606591, 10.01.17). Данный способ принят за ближайший аналог. Недостатком этого метода является инвазивный способ получения материала, а также невозможность оценки наличия ассиметрии в степени выраженности патологических проявлений, характерной для ранних стадий БП.
Ранее на моделях паркинсонизма мы показали, что в патологический процесс вовлекается, помимо ЦНС и других органов, глазной аппарат, а также веки (Ким А.Р., Павленко Т.А., Катаргина Л.А., Чеснокова Н.Б., Угрюмов М.В., Биохимические и функциональные изменения в глазу как проявление системной деградации нервной системы при паркинсонизме, 2018, том 10, №3 (38), с. 67-72). Далее мы определили объект исследования - слезу пациентов с БП, как доступную биологическую жидкость, отображающую метаболические и биохимические изменения, происходящие при нарушении периферической иннервации слезных желез. Следует отметить, что взятие слезы является неинвазивной процедурой.
В последнее время уделяется большое внимание иммунологическому состоянию пациентов при БП, как в целом организме, так и на локальном уровне (Альперина Е.Л. Вклад дофаминергической системы в механизмы иммуномодуляции, Успехи физиологических наук, 2014, т. 45, №3, стр. 45-56). На данный момент в слезной жидкости у пациентов с БП было обнаружено повышение уровня фактора некроза опухоли (TNF-α - цитокин, участвующий во многих воспалительных реакциях) (,, Асаr М, ,  Tear levels of tumor necrosis factor-alpha in patients with Parkinson's disease, Neurosci Lett. 2013 Oct 11;553:63-7. doi: 10.1016/j.neulet.2013.08.019).
Известно, что альфа2-макроглобулин (α2-МГ), как фактор взаимодействующий не только с TNF-α, но и с другими цитокинами, участвует также во всех воспалительных процессах, обладает мощной антипротеазной и шаперонной активностью (Chesnokova N.B., Kuznetsova Т.Р., Sosulina N.E., Proteolytic enzymes and their inhibitors in the tears in inflammatory corneal diseases of burn origin, Vestn Oftalmol. 1994 Apr-Jun; 110(2):20-2; Niforou K., Cheimonidou C, Trougakos I.P., Redox Biol. 2014 Jan 30;2:323-32. doi: 10.1016/j.redox.2014.01.017., Molecular chaperones and proteostasis regulation during redox imbalance).
Однако наличие и содержание или активность α2-МГ не изучали в слезной жидкости при БП. В литературе имеются сведения, указывающие на важную роль α2-МГ в патогенезе БП, показанную в генетических исследованиях (Tang G., Zhang М., Xie Н., Jiang S., Wang Z, Xu L., Hao Y., Lin D., Lan H., Wang Y., Chen L., Ren D., Alpha-2 macroglobulin 11000 V polymorphism in Chinese sporadic Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Neurosci Lett. 2002 Aug 9;328(2): 195-7; Guo X., Tang P., Li X., Chong L., Zhang X., Li R., Association between two α-2-macroglobulin gene polymorphisms and Parkinson's disease: a meta-analysis, Int J Neurosci. 2016;126(3):193-8. doi: 10.3109/00207454.2014.996641). Также обнаружено, что α2-МГ является компонентом телец Леви при БП (Nicoletti G, Annesi G, Tomaino С, Spadafora P, Pasqua AA, Annesi F, Serra P, Caracciolo M, Messina D, Zappia M, Quattrone A., No evidence of association between the alpha-2 macroglobulin gene and Parkinson's disease in a case-control sample, Neurosci Lett., 2002, 2; 328(1):65-7), a моноамин-активированный α2-МГ вызывает нейродегенеративные процессы в нигростриатной системе (Kоо Р.Н., Liebl D.J., Qiu W.S., Нu Y.Q., Dluzen D.E., Monoamine-activated alpha 2-macroglobulin inhibits neurite outgrowth, survival, choline acetyltransferase, and dopamine concentration of neurons by blocking neurotrophin-receptor (trk) phosphorylation and signal transduction., Ann N Y Acad Sci., 1994,10; 737:460-4.).
Таким образом, α2-МГ должен играть важную роль в патогенезе БП.
Задачей предлагаемого изобретения является определение связи активности α2-МГ в слезе с развитием БП.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является возможность ранней диагностики и своевременного начала лечения БП и контроля эффективности терапии.
Технический результат достигается за счет определения активности α2-МГ в слезной жидкости каждого глаза.
Мы впервые предлагаем проводить определение активности α2-МГ в слезной жидкости, как маркера ранней стадии развития БП, с целью оценки влияния дофаминергической терапии на нейрохимические процессы, ассциированные с заболеванием, что должно позволить проводить и контролировать лечение уже на ранних стадиях развития.
Нами были проведены сначала исследования в эксперименте на мышах с нейротоксической моделью на доклинической и ранней клинической стадии БП (Ким А.Р., Павленко Т.А., Катаргина Л.А., Чеснокова Н.Б., Угрюмов М.В., Биохимические и функциональные изменения в глазу как проявление системной деградации нервной системы при паркинсонизме, 2018, том 10, №3 (38), с. 67-72), а затем исследования по измерению активности α2-МГ в пробах слезы, взятых у больных с БП, как с лечением, так и без лечения.
Экспериментальные исследования.
В работе использовали 31 самца мышей линии C57BL/6 в возрасте 2-2.5 месяцев и массой 22-26 г, полученных из питомника «Пущино». Животных содержали в стандартных условиях вивария (22±1°С, свет с 8.00 часов до 20.00 часов) со свободным доступом к пище и воде. Для моделирования БП на доклинической стадии проводили двукратное подкожное введение 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП) (Sigma, США) в разовой дозе 8 мг/кг, для моделирования БП на клинической стадии - четырехкратное подкожное введение МФТП в разовой дозе 10 мг/кг. Интервал между инъекциями в обоих случаях составлял 2 часа. Контрольная группа получала 0.9% NaCl по аналогичной схеме. Через 2 недели после введения МФТП или NaCl мышей оценивали по показателю пройденного пути в тесте «открытое поле» с помощью установки для анализа поведения животных PhenoMaster (TSE Systems, Германия). Далее у животных собирали слезную жидкость с помощью стерильных полосок из фильтровальной бумаги (шириной 2,5 мм). Взятие слезы проводили у мышей, находящихся под изофлурановым наркозом, аналогично методике, описанной выше для людей. От каждой мыши слезную жидкость объединяли из обоих глаз в один эппендорф.
В результате проведенной работы было обнаружено повышение активности α2-МГ в слезе у мышей не только с ранней симптоматической моделью (8,42±1,12 нмоль/мин*мл, р<0,006), но и на досимптомной стадии паркинсонизма обнаружено повышение активности (4±0,5 нмоль/мин*мл, р<0,03) по сравнению с контролем (контроль - 2,6±0,15 нмоль/мин*мл).
Пример 1. Мышь №1 (NaCl 0,9%) из группы контроля. Активность α2-МГ в слезе из обоих глаз 2,27 нмоль/мин*мл.
Пример 2. Мышь №3 из группы досимптомной стадии паркинсонизма. Активность α2-МГ в слезе из обоих глаз 5,51 нмоль/мин*мл.
Пример 3. Мышь №4 из группы с ранними симптомными проявлениями паркинсонизма. Активность α2-МГ в слезе из обоих глаз 12,10 нмоль/мин*мл.
В результате у мышей с досимптомной и ранней симптомной стадией паркинсонизма наблюдается достоверное повышение активности α2-МГ в слезе по сравнению с контролем.
В клинических исследованиях для анализа нами были использованы пробы слезы из обоих глаз, взятые у одной группы пациентов без патологий глаз с установленным диагнозом БП (длительность течения болезни от 1 до 3 лет) до начала антипаркинсонической терапии, у другой группы пациентов - после лечения (длительность течения болезни от 1 до 10 лет), и у добровольцев (группа контроля) без нейродегенеративных заболеваний и патологии глаз. Степень прогрессирования БП оценивали по шкалам Хён и Яру (Hoehn М.М., Yahr M.D.., Parkinsonism: onset, progression and mortality. Neurology. 1967 May;17(5):427-42, Parkinsonism: onset, progression, and mortality, 1967, Hoehn M.M., Yahr M.D., Neurology, 2001 Nov; 57 (10 Suppl 3): S. 11-26) и Унифицированной шкале оценки болезни Паркинсона (УШОБП) (Movement Disorder Society-sponsored revision of the Unified Parkinson's Disease Rating Scale (MDS-UPDRS): Process, format, and clinimetric testing plan C. Goetz, S. Fahn, P. Martinez-Martin, W. Poewe, C. Sampaio, G. Stebbins, M. Stern, B. Tilley, R. Dodel, B. Dubois, R. Holloway, J. Jankovic, J. Kulisevsky, A. Lang, A. Lees, S. Leurgans, P. LeWitt, D. Nyenhuis, C. Olanow, O. Rascol, A. Schrag, J. Teresi, J. Van Hilten, N. LaPelle. Movement Disorders 2007; 22(1):41-47). Отмечалась также сторона начала заболевания.
В результате исследования выявлено: уровень нормы (12,6±0,6 нмоль/мин*мл) и повышение активности α2-МГ в слезе у пациентов с БП, причем, в группе без лечения наблюдалась наибольшая активность (23,8±0,3 нмоль/мин*мл, р<0,007), после лечения активность была снижена (19,4±2,3 нмоль/мин*мл, р<0,008). Кроме того, обнаружена значительная ассиметрия показателя у пациентов с начальной формой БП (разница активности α2-МГ между парными глазами в среднем составляла 16,6±4,2 нмоль/мин*мл, р<0,02) по сравнению с нормой (3,1±0,6 нмоль/мин*мл), у пациентов с лечением ассиметрия достоверно уменьшилась (разница активности α2-МГ между парными глазами составляла 8,6±2,4 нмоль/мин*мл, р<0,05 по сравнению с пациентами до начала лечения.
Таким образом, обнаружено повышение активности α2-МГ в слезе у пациентов на ранних стадиях БП, что указывает на развитие локального нейровоспаления, вероятно, связанного с нарушением состояния местного иммунитета, связанного с нейродегенеративными процессами в дофаминергической системе при БП (Альперина Е.Л. Вклад дофаминергической системы в механизмы иммуномодуляции, Успехи физиологических наук. 2014. Т. 45. №3. С. 45-56). При этом выявлена значительная ассиметрия активности α2-МГ у данных больных в парных глазах. Ассиметрия патологических проявлений является важным клиническим признаком при БП особенно на ранних стадиях. После лечения препаратами, направленными на восполнение недостаточности дофаминергической системы, у пациентов с БП происходила локальная нормализация активности α2-МГ и уменьшалась ассиметрия активности α2-МГ в парных глазах. Корреляция с симптомами со стороны глаз (сухость глаз, слезотечение, гиперемия конъюнктивы) и активностью α2-МГ в слезе у пациентов с БП как с лечением, так и без него не обнаружена.
Полученные экспериментальные данные совпадают с клиническими и выбранный нами маркер является перспективным в ранней диагностике БП.
Анализ полученных данных позволил выявить критериальные значения α2-МГ в слезе, а также значимые показатели ассиметрии данного параметра для ранней диагностики БП.
Таким образом, полученные данные подтверждают возможность использования показателя активности α2-МГ в слезе для ранней диагностики БП и оценки эффективности лечения.
Методика определения активности α2-МГ в слезе осуществляется следующим образом. Сбор слезы проводили утром с помощью стерильных полосок из фильтровальной бумаги (шириной 5 мм), аналогичных полоскам Ширмера. Слезную жидкость собирали в течение 5 мин из каждого глаза. Длину намокшей части полоски фиксировали для последующего расчета объема собранной слезы. После сбора полоски помещали в пробирки с 0,9% NaCl, центрифугировали, далее в элюате проводили определение активности комплекса α2-МГ с трипсином по отношению к синтетическому низкомолекулярному субстрату N-бензоил-DL-аргинин-п-нитроанилиду (БАПНА) (Chesnokova N.B., Kuznetsova Т.Р., Sosulina N.E., Proteolytic enzymes and their inhibitors in the tears in inflammatory corneal diseases of burn origin, Vestn Oftalmol. 1994 Apr-Jun;110(2):20-2, Chuang W.H., Lee K.K., Liu P.C., Characterization of alpha-2-macroglobulin from groupers, Fish Shellfish Immunol. 2013 Aug;35(2):389-98. doi: 10.1016/j.fsi.2013.04.050).
Способ осуществляют следующим образом. Проводят определение активности альфа2-макроглобулина (α2-МГ) в слезе каждого глаза. При ее величине более 22 нмоль/мин*мл в одном из глаз и наличии ассиметрии значений этого показателя между парными глазами более чем 10 нмоль/мин*мл диагностируют БП.
Пример 1.
У добровольца №5 (68 лет, женщина) без патологии глаз и нейродегенеративных заболеваний проводили сбор слезы утром из обоих глаз. Активность α2-МГ в слезе составляла в (OD) - 10,8 нмоль/мин*мл, в (OS) - 8,78 нмоль/мин*мл. Активность α2-МГ в обоих глазах была в пределах нормы, ассиметрия уровня активности А2МГ в парных глазах не выявлена.
Пример 2.
У пациента №7 (72 года, мужчина) с длительностью течения БП не более двух лет (стадия по шкале Hoehn-Yahr - 2, УШОБП2 - 10, УШОБПЗ - 27, сторона начала заболевания - слева) без патологии глаз проводили сбор слезы из обоих глаз утром во время первичного посещения до начала лечения. Было выявлено повышение активности α2-МГ в 2 раза в слезе правого глаза (OD) - 17,61 нмоль/мин*мл, в 3 раза - левого глаза (OS) - 31,32 нмоль/мин*мл. Обнаружена значительная ассиметрия уровня активности α2-МГ между парными глазами. Повышение активности А2МГ указывает на наличие локального нейровоспаления, а ассиметрия проявлений характерно для БП.
Пример 3.
У пациента №3 (74 года, мужчина) с длительностью течения БП 10 лет, (стадия по Hoehn-Yahr - 3, УШОБП 2 - 19, УШОБП 3 - 43, сторона начала заболевания - справа, терапия - Леводопа 300 мг). Обнаружена близкая к норме активность α2-МГ в слезе (OD) - 12,96 нмоль/мин*мл, (OS) - 12,15 нмоль/мин*мл. Таким образом, на фоне длительной терапии активность α2-МГ выше нормы, но меньше, чем у больного без лечения. У данного больного ассиметрия активности α2-МГ в парных глазах не наблюдалась. Данные изменения указывают на локальную нормализацию активности α2-МГ в слезе, что указывает на уменьшение местного нейровоспалительного процесса, связанного с проведением терапии.
Таким образом, наблюдалось повышение активности α2-МГ в слезе у пациентов с БП, особенно без лечения. Причем, у данных больных часто наблюдалась значительная ассиметрия активности α2-МГ в парных глазах. При проведении соответствующей терапии при БП активность α2-МГ в слезе снижалась, ассиметрия активности сохранялась только в некоторых случаях.
Таким образом, предлагается использовать определение активности α2-МГ в слезе в качестве прогностического теста для выявления ранних стадий БП, что важно для раннего прогноза развития данного заболевания. Предложенный маркер позволяет прогнозировать развитие БП, а, следовательно, формировать группы риска для динамического наблюдения и выбора превентивных лечебных мероприятий.