ПРИМЕНЕНИЕ СОЕДИНЕНИЙ ВАНАДИЯ ДЛЯ ПОДДЕРЖАНИЯ НОРМОГЛИКЕМИИ У МЛЕКОПИТАЮЩЕГО
APPLICATION OF VANADIUM COMPOUNDS FOR MAINTAINING NORMOGLYCEMIA IN MAMMALS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу поддержания нормогликемии у млекопитающего, нуждающегося в этом, предпочтительно у пациента в критическом состоянии, страдающего от острого стресса. Настоящее изобретение также относится к способу предотвращения или ограничения почечной ишемии-реперфузии (I/R) у млекопитающего, нуждающегося в этом, предпочтительно у пациента в критическом состоянии, страдающего от острого стресса. Настоящее изобретение также относится к способу предотвращения, ограничения или лечения кардиоренальных расстройств у млекопитающего, нуждающегося в этом, предпочтительно у пациента в критическом состоянии, страдающего от острого стресса. Настоящее изобретение также относится к лекарственной композиции для применения для поддержания нормогликемии у пациента в критическом состоянии, страдающего от острого стресса.
Уровень техники, к которому относится изобретение
У большого количества пациентов, страдающих от острого стресса, например, инсульта или инфаркта миокарда, развивается гипергликемия, даже если ранее у пациента не был диагностирован диабет. Такая индуцированная стрессом гипергликемия связана с высоким риском смертности как после инсульта, так и после инфаркта миокарда. Более того, индуцированная стрессом гипергликемия может являться фактором риска повреждения головного мозга (см. Sarah E. Capes с соавт., Stroke 2001, 32, страница 2426).
К тому же, гипергликемия и инсулинорезистентность являются распространенными у пациента в критическом состоянии в целом, даже при предшествующем нормальном гомеостазе глюкозы (см. US 2005/171503, включенный посредством ссылки).
G. Van den Berghe с соавт. (N. Engl. J. Med. 2001, 345, 1359-1367) обнаружили, что даже умеренная гипергликемия, как у пациентов-диабетиков, так и у пациентов, не страдающих диабетом, вызывает прямое или косвенное повреждение жизненно важных органов и систем. Интенсивная инсулинотерапия снижает общую ICU (Отделение Интенсивной Терапии, ОИТ) смертность с 8% до 4,6%, и с 20,2% до 10,6% среди пациентов, требующих более пяти дней интенсивной терапии. Интенсивная инсулинотерапия также значительно снижает инфекции кровяного русла, длительное воспаление, острую почечную недостаточность, полинейропатию критических состояний и необходимость в трансфузиях. Так, жесткое поддержание нормогликемии с интенсивной инсулинотерапией снижает смертность в интенсивной терапии и больничную смертность, а также заболеваемость взрослых пациентов в критическом состоянии в ОИТ.
Тем не менее, интенсивная инсулинотерапия требует знания уровня сахара в крови пациента, что требует частого забора образцов крови (капиллярного русла). Это делает необходимым тратить значительное время медицинской сестры или лаборанта, и многие пациенты, особенно не страдающие диабетом, находят повторные заборы образцов крови неприемлемыми. Более того, периодически взятые образцы крови могут быть взяты недостаточно часто для составления точной картины уровня сахара в крови. Другие недостатки интенсивной инсулинотерапии включают повышение риска гипогликемии (в области техники известно, что гипогликемия повышает риск развития инфаркта миокарда и желудочковой аритмии; см. US 2005/171503, включенный посредством ссылки), седацию, которая может маскировать гипогликемию, и расхождение мнений о том, когда вводить инсулин и к каким пациентам применить протокол.
Так, хотя инсулинотерапия несомненно имеет преимущества для пациентов в критическом состоянии, как рассмотрено выше, в области техники все еще существует необходимость предоставления способа для управления введением инсулина пациентам в критическом состоянии, в частности пациентам в критическом состоянии, страдающим от острого стресса.
Острая почечная недостаточность (ОПН) представляет собой клинический синдром, характеризующийся быстрым ухудшением функции почек, которое развивается в течение дней. ОПН часто вызывает острый тубулярный некроз (ОТН), который является следствием ишемического и/или нефротоксического поражения. Во всей мировой популяции ежегодно отмечают приблизительно 200 случаев тяжелой ОПН на миллион человек. Некоторые лекарственные средства, например, антиоксиданты, блокаторы кальциевых каналов, диуретики, вазоактивные вещества, факторы роста и противовоспалительные средства, исследуют на предмет их эффективности в клинических испытаниях, но их клиническое применение оказывается небольшим или отсутствует.
US 5300496, US 5527790, US 5620967, US 5866563 и US 5888993, включенные посредством ссылки, раскрывают применение соединений ванадия для лечения сахарного диабета, гипертензии, ожирения и сходных состояний, связанных с хронически повышенным уровнем сахара в крови.
2+
US 5885980, включенный посредством ссылки, раскрывает фармацевтическую композицию для лечения диабета, эта фармацевтическая композиция включает VO-образующий компонент и мелкодисперсный глибурид. Пример 5 в US 5885980 раскрывает лечение пациентки с диабетом I типа, которую госпитализировали в ОИТ по поводу хронической гипергликемии, при помощи комбинации инсулина, ванадилсульфата и глиназы, антидиабетического лекарственного средства типа сульфонилмочевины, которое часто применяют для лечения диабета II типа. Тем не менее, глиназа может вызывать гипогликемию, и гипогликемия, определяемая как снижение уровня глюкозы в крови ниже 0,3 ммоль/л, повышает риск развития инфаркта миокарда и желудочковой аритмии (см. US 2005/171503).
US 6287586, включенный посредством ссылки, раскрывает фармацевтическую композицию конкретных комплексов бигуанида ванадия для лечения гипергликемии и связанных с ней расстройств.
US 6579540, включенный посредством ссылки, раскрывает применение физиологически приемлемых соединений ванадия для профилактического лечения вторичных повреждений тканей, где указанные повреждения тканей являются результатом первичного повреждения и где первичное повреждение вызвано травмой, например, реперфузией после ишемии (инфаркт). US 6579540, тем не менее, не раскрывает применение физиологически приемлемых соединений ванадия для лечения гипергликемии или почечной ишемии-реперфузии у пациента в критическом состоянии.
US 6852760, включенный посредством ссылки, раскрывает применение комбинации соединения сульфонилмочевины, биологически доступного источника хрома и биологически доступного источника ванадия для лечения диабета.
Следовательно, применение соединений ванадия для контролирования гипергликемии у пациента с диабетом известно в области техники. Тем не менее, диабет представляет собой хроническое заболевание. Пациентов в критическом состоянии, тем не менее, госпитализируют на относительно непродолжительный период времени, в частности, от одного до нескольких дней, и в частности, в отделение интенсивной терапии (ОИТ). Так, пациенты, страдающие диабетом, составляют другой класс пациентов, нежели пациенты в критическом состоянии.
P.A. McCullough, Int. J. Nephrol., Volume 2011, Article ID 762590 (дата выпуска: 10.4061/2011/762590) предполагает, что существует взаимосвязь между сердечно-сосудистыми расстройствами и почечными расстройствами. Эту взаимосвязь обозначают как «кардиоренальные» расстройства.
В настоящее время контрасто-индуцированную, предпочтительно радиоконтраст-индуцированную нефропатию лечат при помощи N-ацетилцистеина.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к способу поддержания нормогликемии у млекопитающего, нуждающегося в этом, предпочтительно у пациента в критическом состоянии, страдающего от острого стресса, где фармацевтическую композицию, включающую физиологически приемлемое органическое и/или неорганическое соединение ванадия или комплекс, вводят указанному млекопитающему.
Настоящее изобретение также относится к способу предотвращения или ограничения почечной ишемии-реперфузии (I/R) у млекопитающего, нуждающегося в этом, предпочтительно у пациента в критическом состоянии, страдающего от острого стресса, где фармацевтическую композицию, включающую физиологически приемлемое органическое и/или неорганическое соединение ванадия или комплекс, вводят указанному млекопитающему.
Настоящее изобретение также относится к способу предотвращения, ограничения или лечения кардиоренальных расстройств у млекопитающего, нуждающегося в этом, предпочтительно у пациента в критическом состоянии, страдающего от острого стресса, где фармацевтическую композицию, включающую физиологически приемлемое органическое и/или неорганическое соединение ванадия или комплекс, вводят указанному млекопитающему.
Настоящее изобретение дополнительно относится к фармацевтической композиции для применения для поддержания нормогликемии у пациента в критическом состоянии, страдающего от острого стресса.
Настоящее изобретение дополнительно относится к фармацевтической композиции, включающей физиологически приемлемое органическое и/или неорганическое соединение ванадия или комплекс, для применения для предотвращения или ограничения почечной ишемии-реперфузии (I/R) у пациента в критическом состоянии, страдающего от острого стресса.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей физиологически приемлемое органическое и/или неорганическое соединение ванадия или комплекс, фармакологически приемлемый носитель и второй ингредиент, указанный второй ингредиент выбирают из группы магния, рыбьего жира, калия, меди, селена, витамина D, витамина Е, хрома и смеси вышеперечисленных веществ.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей физиологически приемлемое органическое и/или неорганическое соединение ванадия или комплекс, для применения для предотвращения или лечения контраст-индуцированной нефропатии у млекопитающего, нуждающегося в этом.
Настоящее изобретение дополнительно относится к фармацевтической композиции, включающей физиологически приемлемое органическое и/или неорганическое соединение ванадия или комплекс, для применения для предотвращения, ограничения или лечения кардиоренальных расстройств у млекопитающего, нуждающегося в этом.
Описание фигур
Фиг.1 показывает исходное (BSLN) среднее артериальное (art.) давление и через 30 минут ишемии и 90 минут реперфузии (R 90 мин).
Фиг.2 показывает исходную (BSLN) почечную сосудистую резистентность (vasc. res.) (верхний ряд), почечный кровоток (средний ряд) и почечную доставку кислорода (нижний ряд) и через 30 минут ишемии и 90 минут реперфузии (R 90 мин).
2
Фиг.3 показывает исходное (BSLN) почечное микрососудистое напряжение кислорода (μPO) в корковом слое (верхний ряд) и мозговом слое (нижний ряд) и через 30 минут ишемии и 90 минут реперфузии (R 90 мин).
Фиг.4 показывает исходное (BSLN) почечное потребление кислорода (верхний ряд), количество требуемого для реабсорбции натрия кислорода (VO2/Tna+) (средний ряд) и клиренс креатинина (creat. clear.) (нижний ряд) и через 30 минут ишемии и 90 минут реперфузии (R 90 мин).
Фиг.5 показывает исходный (BSLN) диурез и через 30 минут ишемии и 90 минут реперфузии (R 90 мин).
Фиг.6 показывает экспрессию IL-6 и iNOS (индуцибельная синтаза оксида азота) (верхний ряд) и появление MPO-меченных лейкоцитов (нижний ряд) через 30 минут ишемии и 90 минут реперфузии (R 90 мин).
Фиг.7 показывает экспрессию IL-6 и iNOS  (верхний ряд) и появление MPO-меченных лейкоцитов (нижний ряд) через 30 минут ишемии и 90 минут реперфузии (R 90 мин).
Подробное описание изобретения
Определения
Глагол «включать», как применяют в этом описании и в формуле изобретения, и его формы спряжения применяют в его неограниченном значении для обозначения того, что предмет, следующий за словом, включен, но предметы, конкретно не обозначенные, не исключены. В дополнение, единственное число подразумевает возможность использования множественного числа, за исключением случаев, когда контекст ясно требует наличие одного и только одного элемента.
В этом документе термин “пациенты в критическом состоянии” относится к группе пациентов, которых госпитализируют на относительно короткий промежуток времени, в частности от одного до нескольких дней, более конкретно от одного до семи дней, в отделение интенсивной терапии (ОИТ). Предпочтительно термин “пациенты в критическом состоянии” относится к группе пациентов, страдающих от острого стресса, в частности от острой почечной недостаточности (ОПН), острой сердечной недостаточности (ACI) или от обоих заболеваний. Предполагают, что почечная ишемия-реперфузия (I/R) почки, которая может развиться в результате или во время операции на сердце или сосудах, трансплантации почки, избирательного восстановления аневризмы аорты и шока (например, кардиогенного, геморрагического или септического шока), влияет на микроциркуляцию, которая предотвращает правильную реперфузию тканей. Это может привести к нежелательным эффектам, таким как гипоксия почки, оксидативный стресс и необратимое повреждение с органной недостаточностью.
Термин “кардиоренальные расстройства” определяют как расстройства работы органов, таких как сердце и почки, при которых острая или хроническая дисфункция одного органа может вызвать острую или хроническую дисфункцию другого органа. Предложено несколько возможных патофизиологических механизмов для каждого расстройства.
Настоящее изобретение, таким образом, относится к способу поддержания нормогликемии у млекопитающего, нуждающегося в этом, предпочтительно у пациента в критическом состоянии, страдающего от острого стресса, где фармацевтическую композицию, включающую физиологически приемлемое органическое или неорганическое соединение ванадия или комплекс, вводят указанному млекопитающему.
Настоящее изобретение дополнительно относится к способу предотвращения или ограничения почечной ишемии-реперфузии (I/R) у млекопитающего, нуждающегося в этом, предпочтительно у пациента в критическом состоянии, страдающего от острого стресса, где фармацевтическую композицию, включающую физиологически приемлемое органическое или неорганическое соединение ванадия или комплекс, вводят указанному млекопитающему. Более конкретно настоящее изобретение дополнительно относится к способу предотвращения или ограничения почечной ишемии-реперфузии (I/R) почки млекопитающего, нуждающегося в этом, предпочтительно у пациента в критическом состоянии, страдающего от острого стресса, где фармацевтическую композицию, включающую физиологически приемлемое органическое или неорганическое соединение ванадия или комплекс, вводят указанному млекопитающему.
Неожиданно обнаружено, что фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением значительно повышает микрососудистую оксигенацию в корковом слое почки и в мозговом слое у млекопитающего, нуждающегося в этом, предпочтительно у пациента в критическом состоянии, где ранее микрососудистая оксигенация была снижена из-за I/R повреждения.
Также неожиданно обнаружено, что фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением повышает почечную эффективность потребления кислорода у млекопитающего, нуждающегося в этом, предпочтительно у пациента в критическом состоянии, вызванном ранее развившимся I/R повреждением.
Более того, неожиданно обнаружено, что фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением значительно снижает повреждение почки у млекопитающего, нуждающегося в этом, предпочтительно у пациента в критическом состоянии, вызванном ранее развившимся I/R повреждением.
Настоящее изобретение также относится к способу предотвращения или лечения контраст-индуцированной, предпочтительно радиоконтраст-индуцированной нефропатии, которая представляет собой форму острой почечной недостаточности (ОПН) у млекопитающего, нуждающегося в этом, где фармацевтическую композицию, включающую физиологически приемлемое органическое или неорганическое соединение ванадия или комплекс, вводят указанному млекопитающему.
В соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения пациенты в критическом состоянии не страдают диабетом.
В соответствии с настоящим изобретением является предпочтительным, чтобы острый стресс был вызван повреждением, инсультом, травмой, медицинским лечением, инфекцией, ударом, операцией сосудистого или коронарного шунтирования, шоком, предпочтительно кардиогенным, геморрагическим или септическим, или лечением инфаркта миокарда.
Предпочтительно уровни глюкозы в крови поддерживают у млекопитающего, предпочтительно у пациента в критическом состоянии, на уровне между приблизительно 80 и приблизительно 110 мг/дл (от приблизительно 4,4 до приблизительно 6,1 ммоль/л). Предпочтительно уровни глюкозы в крови поддерживают между приблизительно 85 и приблизительно 100 мг/дл.
В соответствии с вариантом осуществления фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим изобретением, которое включает физиологически приемлемое органическое или неорганическое соединение ванадия или комплекс, вводят парентерально. В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения фармацевтическую композицию вводят внутривенно.
Поскольку пациентов в критическом состоянии госпитализируют в отделение интенсивной терапии (ОИТ), способы в соответствии с настоящим изобретением проводят в течение от одного до семи дней, предпочтительно от одного до шести дней, более предпочтительно от одного до пяти дней, еще более предпочтительно от одного до четырех дней, еще более предпочтительно от одного до трех дней, еще более предпочтительно от одного до двух дней и, в частности, в течение только одного дня.
В соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения предпочтительно, что инсулин или аналог инсулина совместно вводят млекопитающему, предпочтительно пациенту в критическом состоянии.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения антиаритмическое лекарственное средство совместно вводят млекопитающему, предпочтительно пациенту в критическом состоянии.
В соответствии с еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения пищевую добавку совместно вводят млекопитающему, предпочтительно пациенту в критическом состоянии. Предпочтительно пищевую добавку выбирают из группы магния, рыбьего жира, калия, меди, селена, витамина D, витамина Е и смеси вышеперечисленных веществ.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения физиологически приемлемым органическим и/или неорганическим соединением ванадия или комплексом является бис(мальтолато)оксованадий (IV) (также известный как BMOV). BMOV и способы его получения известны в области техники (CAS 38213-69-3).
Настоящее изобретение, таким образом, также относится к фармацевтическим композициям, включающим физиологически приемлемое органическое и/или неорганическое соединение ванадия или комплекс, фармацевтически приемлемый носитель и второй ингредиент, где указанный второй ингредиент выбирают из группы магния, рыбьего жира, калия, меди, селена, витамина D, витамина Е и смеси вышеперечисленных веществ.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей физиологически приемлемое органическое и/или неорганическое соединение ванадия или комплекс, для поддержания нормогликемии у пациента в критическом состоянии, страдающего от острого стресса.
Предпочтительно, чтобы пациенты в критическом состоянии не страдали диабетом, как описано выше.
Предпочтительно острый стресс вызван повреждением, инсультом, травмой, медицинским лечением, инфекцией, ударом, операцией сосудистого или коронарного шунтирования или лечением инфаркта миокарда.
В соответствии с настоящим изобретением является предпочтительным, что фармацевтическую композицию вводят в достаточных количествах так, чтобы поддерживать уровни глюкозы в крови между приблизительно 80 и приблизительно 110 мг/дл (от приблизительно 4,4 до приблизительно 6,1 ммоль/л), предпочтительно между приблизительно 85 и приблизительно 100 мг/дл.
Предпочтительно фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим изобретением вводят парентерально или внутривенно.
Предпочтительно фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим изобретением вводят в течение от одного до семи дней, предпочтительно от одного до шести дней, более предпочтительно от одного до пяти дней, еще более предпочтительно от одного до четырех дней, еще более предпочтительно от одного до трех дней, еще более предпочтительно от одного до двух дней и, в частности, в течение только одного дня.
Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может также включать инсулин или аналог инсулина, антиаритмическое лекарственное средство, пищевую добавку или комбинацию вышеперечисленных веществ. Предпочтительно пищевую добавку выбирают из группы магния, рыбьего жира, калия, меди, селена, витамина D, витамина Е, хрома и смеси вышеперечисленных веществ.
Настоящее изобретение дополнительно относится к фармацевтической композиции, включающей физиологически приемлемое органическое и/или неорганическое соединение ванадия или комплекс, для применения для предотвращения или ограничения почечной ишемии-реперфузии (I/R) у пациента в критическом состоянии, страдающего от острого стресса.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей физиологически приемлемое органическое и/или неорганическое соединение ванадия или комплекс, фармацевтически приемлемый носитель и второй ингредиент, где указанный второй ингредиент выбирают из группы магния, рыбьего жира, калия, меди, селена, витамина D, витамина Е и смеси вышеперечисленных веществ.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей физиологически приемлемое органическое и/или неорганическое соединение ванадия или комплекс, для применения для предотвращения или лечения контраст-индуцированной нефропатии у млекопитающего, нуждающегося в этом. Предпочтительно млекопитающим является пациент в критическом состоянии, страдающий от острого стресса.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей физиологически приемлемое органическое и/или неорганическое соединение ванадия или комплекс, для применения для предотвращения, ограничения или лечения кардиоренальных расстройств у млекопитающего, нуждающегося в этом. Предпочтительно млекопитающим является пациент в критическом состоянии, страдающий от острого стресса.
Примеры
Материалы и методы
Животные
Этот протокол исследования рассмотрен и одобрен институционным Комитетом по экспериментам над животными Академического медицинского центра при университете Амстердама. Уход и обращение с животными соответствуют инструкциям Института для лабораторных животных по исследованию ухода и использования лабораторных животных.
В этом исследовании использовали тридцать две крысы Wistar мужского пола (Harlan Netherlands BV, Horst, Нидерланды) со средней массой тела 280±30 г. Животные находились на карантине до начала исследования в течение 1 недели для акклиматизации к их новой среде обитания, их разместили попарно в обычных клетках в комнате с управляемым светом при 22±1°С с относительной влажностью 55±10%. Все животные получали стандартный лабораторный крысиный корм и воду для потребления в неограниченном количестве.
Хирургическая операция
2
2
Всех животных предварительно анестезируют при помощи смеси кетамина (Nimatek, Eurovet Animal Health BV, Bladel, Нидерланды; 90 мг/кг), дексмедетомидина (Dexdomitor, Pfizer Animal Health BV, Capelle aan den Ijssel, Нидерланды; 0,5 мг/кг) и атропина сульфата (Centrafarm BV, Etten-Leur, Нидерланды; 0,05 мг/кг) интраперитонеально. После проведения анестезии область между рукояткой грудины, нижней челюстью и левым боком в проекции левой почки бреют и очищают до начала хирургической процедуры. В течение оставшегося хирургического вмешательства и экспериментальных процедур анестезию поддерживают при помощи трахеотомии и механической вентиляции с содержанием кислорода во вдыхаемом воздухе (FiO) 0,4. Температуру тела поддерживают на уровне 37±0,5°С в течение всего эксперимента. Настройки вентилятора изменяют для поддержания артериального рСО между 35 и 40 мм рт. ст.
2
Для введения лекарственного средства и жидкости, а также для мониторинга гемодинамики канюлируют три сосуда при помощи полиэтиленовых катетеров (наружный диаметр = 0,9 мм; Braun, Melsungen, Германия). Катетер в правой сонной артерии связан с датчиком давления для мониторинга артериального давления и частоты сердечных сокращений. Правую яремную вену канюлируют для длительных инфузий лактата Рингера (Baxter, Utrecht, Нидерланды) со скоростью 15 мл/кг/ч. Бедренную артерию канюлируют для забора образцов крови для анализа газов крови. Животные находятся под общей анестезией в течение всех экспериментов и получают длительно внутривенно разведенный кетамин или анальгетические лекарственные средства. Выделяют левую почку, декапсулируют, иммобилизуют в Lucite (т.е., в поли(метилметакрилате); PMMA) в специально изготовленной чашке через приблизительно 4-сантиметровый разрез по левому боку. Почечную артерию и вену аккуратно выделяют для сохранения окружающих нервов и надпочечника. Периваскулярный ультразвуковой датчик транзиторной пробы вдыхаемого воздуха (тип 0,7 RB; Transonic Systems, Ithaca, Нью-Йорк, США) размещают вокруг левой почечной артерии и соединяют с расходомером (T206; Transonic Systems, Ithaca, Нью-Йорк, США) для длительного измерения почечного кровотока (RBF). Изолируют левый мочеточник, перевязывают и канюлируют при помощи полиэтиленового катетера (внешний диаметр = 0,9 мм; Braun, Melsungen, Германия) для сбора мочи. Маленький кусочек алюминиевой фольги (10×10 мм) размещают по тыльной стороне почечной вены для предотвращения вклада расположенных и подлежащих тканей от помех сигналам фосфоресценции в измерении венозного рО. После протокола операции (приблизительно 60 минут) одно оптическое волокно размещают на 1 мм выше декапсулированной почки, а другое оптическое волокно на 1 мм выше почечной вены для измерения оксигенации при помощи технологии времени жизни фосфоресценции (20). Затем внутривенно вводят Оксифор G2 (Oxygen Enterprises, Филадельфия, Пенсильвания, США; 6 мг/кг) в течение 5 минут, после чего в течение 30 минут наступает время стабилизации.
Операционное поле закрывают увлажненным марлевым компрессом в течение всего эксперимента для предотвращения высыхания выделенных тканей в операционном поле. Технология времени жизни фосфоресценции описана более подробно в другом месте (20). Эксперимент прекращают путем инфузии 1 мл 3 моль хлорида калия. Наконец, почку удаляют, взвешивают и передают для гистологического исследования. Правильное размещение катетеров также проверяют посмертно.
Протокол эксперимента
После выполнения хирургической операции и 30 минут стабилизации животных случайным образом распределяют в следующие группы: BMOV 7 мг/кг (n=6); BMOV 15 мг/кг (n=6); I/R контроль (n=8); контроль времени (n=3). Инфузию BMOV начинают за 15 минут до 30-минутного периода ишемии и продолжают в течение всего эксперимента.
Параметры гемодинамики и газов крови
Среднее артериальное давление (MAP) длительно мониторируют по правой общей сонной артерии. Дополнительно почечный артериальный кровоток [RBF; мл/мин] записывают длительно при помощи транзитно-временного датчика потока (тип 0,7 RB; Transonic Systems Inc., Ithaca, Нью-Йорк). Образцы артериальной крови (0,5 мл) забирают из сонной артерии в начале (BSLN) и через 90 минут после ишемии (R 90 мин). Образцы крови замещают таким же объемом HES130/0,4 (Voluven, 6% HES130/0,4; Fresenius Kabi Nederland B.V., Schelle, Бельгия). Образцы используют как для определения значений газов крови (ABL505 анализатор газов крови; Radiometer, Копенгаген, Дания), так и для определения концентрации гемоглобина, сатурации гемоглобина кислородом, а также концентраций натрия и калия (OSM 3; Radiometer).
2
Почечная микрососудистая и венозная рО
2
2
2
2
2
2
Кислород-связывающее фосфоресцирующее время жизни систематически вводимого, нацеленного на альбумин (и таким образом ограничивающего кровоток) фосфоресцирующего контраста (Oxyphor G2; Oxygen Enterprises, Ltd. Philadelphia, PA, США) измеряют при помощи двойного длинноволнового пространственно-временного фосфориметра, и также применяют для определения изменений в микрососудистом и венозном рО(μPO). Oxyphor G2 (двухслойный глутамат дендример тетра-(4-карбоксифенил)бензопорфирина) имеет два пика раздражения (λ раздражения 1 = 440 нм, λ раздражения 2 = 632 нм) и один пик эмиссии (λ эмиссии = 800 нм), что позволяет одновременно измерять время жизни в корковом слое почки и внешнем мозговом слое из-за разницы оптической глубины проникания возбуждающего света. Для измерения почечного венозного рО (PrvO) применяют монодлинноволновой частотный фосфориметр. Корреляцию между измеренным временем жизни и значением рОвыражают при помощи уравнения Stern-Volmer: l/τ=(l/τ0)+kq [О], где τ обозначает измеренное время жизни, τ0 обозначает время жизни при концентрации кислорода, равной нулю мм рт.ст. и где kq является известной связывающей константой.
Функция почек
Образцы мочи из левого мочеточника собирают для анализа объема мочи и концентрации креатинина. Образцы плазмы для анализа концентрации креатинина получают в середине периода сбора мочи. Концентрации креатинина в моче и плазме определяют при помощи колориметрии. Клиренс креатинина (Clearcrea [мл/мин]) определяют как индекс уровня гломерулярной фильтрации.
Расчеты клиренса производят, применяя стандартную формулу:
crea
crea
crea
Clear=(U×V)/P,
crea
crea
где U обозначает концентрацию креатинина в моче, V обозначает объем мочи за единицу времени и P - концентрацию креатинина в плазме.
+
+
Na+
Более того, все образцы мочи анализируют на предмет концентрации натрия (Na). Экскреторную фракцию Na (EF[%]) применяют в качестве маркера тубулярной функции и рассчитывают следующим образом:
Na+
Na+
crea
Na+
crea
EF=(U×P)/(P×U)×100,
Na+
Na+
+
+
где Uобозначает концентрацию Na в моче и P - концентрацию Na в плазме.
crea
Na+
Clearи EF определяют в начале и после реперфузии.
Иммуногистохимический анализ
2
2
Ткани почки фиксируют в 4% растворе формалина и погружают в парафин. Срезы почки (5 мкм) депарафинируют при помощи ксилена и регидратируют при помощи этанола снижающейся концентрации и, наконец, при помощи воды. Извлечение антигена завершается путем нагревания стекол в цитратном буфере (pH 6,0) (Thermo Scientific, AP-9003-500) в течение 10 минут. Стекла оставляют для охлаждения на 20 минут при комнатной температуре и затем промывают дистиллированной водой. Окружение срезов маркируют при помощи PAP ручки. Активность эндогенной пероксидазы блокируют при помощи 3% раствора HO в течение 10 минут при комнатной температуре и далее промывают дистиллированной водой и PBS. Блокирующий реагент (Lab Vision, TA-125-UB) наносят на каждый срез, после чего в течение 5 минут при комнатной температуре в камере влажности проводят инкубацию. Срезы почки инкубируют в течение ночи при 4°C с кроличьим поликлональным iNOS антителом (iNOS, Ab-1, Rabbit Pab, RB-1605-P, NeoMarkers Fremont, CA) и IL-6 (Abcam, 6672) и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре с антимиелопероксидазными (MPO) антителами (Myeloperoxidase Ab-1, RB-373-А, NeoMarkers, Fremont, CA), липокалин 2 антителом (NGAL) (abcam 41105), поликлональным антителом крысы L-FABP (Hycult Biotect HP8010). Антитела разводят в большом объеме растворителя UltrAb (Thermo Scientific, TA-125-UD). Срезы промывают в PBS трижды в течение 5 минут для каждого раза и далее инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре с биотинилированными козьими антикроличьими антителами (LabVision, TP-125-BN). После промывания срезов в PBS наносят меченный стрептавидинпероксидазой реагент (LabVision, TP-125-HR) на 30 минут при комнатной температуре в камере влажности. Окрашенный продукт дорабатывают путем инкубирования с AEC. Стекла докрашивают при помощи гематоксилина Mayer (LabVision, TP-125-MH) и приготавливают для визуального исследования (LabVision, TP-060-UG) после промывания дистиллированной водой. Оценивают как интенсивность, так и распределение окрашивания iNOS, IL-6, L-FABP, NGAL и MPO. Для каждого образца значение гистологического показателя (HSCORE) получают путем суммирования процентов клеток, который окрашиваются при каждой интенсивности, умножая на определенную интенсивность окрашивания [HSCORE = S Pi (i+1), где i обозначает показатель интенсивности, а Pi является соответствующим процентным содержанием клеток] (Senturk с соавт., 1999). Авторы оценивают MPO реакцию клубочков из 240 клубочков и в 240 перитубулярных зонах под световым микроскопом с увеличением ×400. Авторы указывают 1, если лейкоциты видны в клубочке, и 0, если нет (Demirci с соавт., 2006, Legrand с соавт., 2009).
Статистический анализ
Анализ данных проводится при помощи GraphPad Prism версии 5.0 для Windows (GraphPad Software Inc., La Jolla, Калифорния, США). Все данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Сравнительный анализ параметров между группами и временными точками производят путем двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с post hoc тестами Bonferroni. Различия со значениями P-величин менее 0,05 считаются статистически значимыми. Таблица 1 показывает результаты контрольного времени. Эти результаты показывают, что среднее артериальное давлением снижается I/R повреждением, что BMOV не влияет на среднее артериальное давление, и что эффекты BMOV не являются дозозависимыми.
Таблица 1
BSLN
R 90 (мин)
p-Величина
Среднее артериальное давление
103,5±4,2
98,5±4,5
>0,05
Резистентность почечных сосудов
22±2
22±2
>0,05
Почечный кровоток
4,7±0,6
4,6±0,5
>0,05
Почечное DO<sub>2</sub>
1,2±0,2
1,2±0,1
>0,05
CμPO<sub>2</sub>
65±7
60±6
>0,05
MμPO<sub>2</sub>
52±6
49±7
>0,05
Почечное VO<sub>2</sub>
0,13±0,07
0,19±0,06
>0,05
Объем мочи
0,0022±0,0007
0,0020±0,0007
>0,05
Среднее артериальное давление
Как ясно из Фиг.1, BMOV не влияет на среднее артериальное давление (Фиг.1 демонстрирует исходное среднее артериальное давление (BSLN) и через 30 минут ишемии и 90 минут реперфузии (R 90 мин). nsp>0,05 (незначимо), *p<0,05, **p<0,01 и ***p<0,001 по сравнению с BSLN).
Почечная гемодинамика и доставка кислорода
Данные показывают, что резистентность почечных сосудов не подвергается влиянию I/R повреждения, но почечный кровоток и доставка кислорода значительно снижаются. Данные также показали, что BMOV не влияет на почечный кровоток и доставку кислорода, и что эффекты BMOV не являются дозозависимыми.
Как видно из Фиг.2, BMOV не влияет на почечную гемодинамику и доставку кислорода (Фиг.2 показывает исходную (BSLN) резистентность почечных сосудов (vasc.res.) (верхний ряд), почечный кровоток (средний ряд) и доставку кислорода к почке (нижний ряд), а также через 30 минут ишемии и 90 минут реперфузии (R 90 мин). nsp>0,05 (незначимо), *p<0,05, **p<0,01 и ***p<0,001 по сравнению с BSLN).
Почечная микрососудистая оксигенация
Данные показывают, что микрососудистая оксигенация в корковом слое почки и мозговом слое значительно снижается при I/R повреждении. Данные также показывают, что BMOV значительно повышает микрососудистую оксигенацию в корковом и мозговом слоях почки, и что эффекты BMOV не являются дозозависимыми.
2
Как видно из Фиг.3, BMOV значительно повышает микрососудистую оксигенацию (Фиг.3 показывает исходное (BSLN) ренальное микрососудистое напряжение кислорода (μPO) в корковом слое (верхний ряд) и мозговом слое (нижний ряд) и через 30 минут ишемии и 90 минут реперфузии (R 90 мин). nsp>0,05 (незначимо), *p<0,05, **p<0,01 и ***p<0,001 по сравнению с BSLN).
Функция почки
2
Данные показывают, что ренальное потребление кислорода и клиренс креатинина не подвергаются влиянию I/R повреждения, но количество кислорода, требующегося для реабсорбции натрия (VOTna+) повышается, демонстрируя эффективность ренальной утилизации кислорода. Данные также показывают, что BMOV повышает эффективность ренальной утилизации кислорода и что эффекты BMOV не являются дозозависимыми.
2
Фиг.4 также показывает, что BMOV повышает эффективность ренальной утилизации кислорода (Фиг.4 показывает исходное (BSLN) ренальное потребление кислорода (верхний ряд), количество требуемого для реабсорбции натрия кислорода (VO/Tna+) (средний ряд) и клиренс креатинина (creat. clear.) (нижний ряд) и через 30 минут ишемии и 90 минут реперфузии (R 90 мин). nsp>0,05 (незначимо), *p<0,05, **p<0,01 и ***p<0,001 по сравнению с BSLN).
Фиг.5 показывает исходный (BSLN) диурез и через 30 минут ишемии, и через 90 минут реперфузии (R 90 мин). nsp>0,05 (незначимо).
Биомаркеры активации воспаления
Данные также показывают, что I/R повреждение приводит к активации воспаления. Данные также показывают, что BMOV значительно снижает активацию воспаления и что эффекты BMOV не являются дозозависимыми, т.е. экспрессия iNOS значительно ниже у группы, получающей лечение высокой дозой BMOV, по сравнению с уровнями в группе, получающей низкую дозу.
Как видно из Фиг.6, BMOV значительно снижает активацию воспаления (Фиг.6 показывает экспрессию IL-6 и iNOS (верхний ряд) и появление MPO-меченных лейкоцитов (нижний ряд) через 30 минут ишемии и 90 минут реперфузии (R 90 мин). nsp>0,05 (незначимо), *p<0,05, **p<0,01 и ***p<0,001 по сравнению с I/R контролем).
Биомаркеры повреждения почки
Данные показывают, что I/R ведет к повреждению почки. Данные также показывают, что BMOV значительно снижает повреждение почки и что эффекты BMOV не являются дозозависимыми, т.е. уровни NGAL значительно ниже у группы, получающей лечение высокой дозой BMOV, по сравнению с уровнями в группе, получающей низкую дозу.
Как видно из Фиг.7, BMOV значительно снижает повреждение почки (Фиг.7 показывает экспрессию IL-6 и iNOS  (верхний ряд) и появление MPO-меченных лейкоцитов (нижний ряд) через 30 минут ишемии и 90 минут реперфузии (R 90 мин). nsp>0,05 (незначимо), *p<0,05, **p<0,01 и ***p<0,001 по сравнению с I/R контролем и +p<0,05 по сравнению с BMOV 7 мг/кг).
Выводы
Почечная I/R приводит к
1) снижению среднего артериального давления;
2) снижению почечного кровотока и доставки кислорода;
3) снижению микрососудистой оксигенации в корковом и мозговом веществах почки;
4) снижению эффективности почечной утилизации кислорода;
5) активации воспаления и
6) повреждению почки.
BMOV не влияет на
1) среднее артериальное давление и
2) почечную гемодинамику и доставку кислорода.
BMOV
1) повышает микрососудистую оксигенацию;
2) повышает эффективность почечной утилизации кислорода;
3) снижает активацию воспаления и
4) снижает повреждение почки.