ШТАММ ВИРУСА ГРИППА A/teal/Chany/444/09/ H8N8-СУБТИПА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНСОДЕРЖАЩЕГО ПРЕПАРАТА, ПОЛИКЛОНАЛЬНОЙ СЫВОРОТКИ И ПРИМЕНЕНИЯ В КАЧЕСТВЕ КОНТРОЛЬНОГО РЕФЕРЕНС-ОБРАЗЦА ПРИ ОЦЕНКЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ ТЕСТ-СИСТЕМ НА ОСНОВЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
INFLUENZA VIRUS OF STRAIN OF A/teal/Chany/444/09/H8N8-SUBTYPE TO OBTAIN ANTIGEN-CONTAINING DRUG, POLYCLONAL SERUM AND USE AS CONTROL REFERENCE SAMPLE IN ASSESSMENT OF SPECIFICITY OF TEST SYSTEMS BASED ON POLYMERASE CHAIN REACTION

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и микробиологии, а именно к штамму вируса гриппа H8N8-субтипа для приготовления антигенсодержащего субстрата и сыворотки для серодиагностики гриппа H8-субтипа в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) как компонентов панели поликлональных сывороток к различным субтипам вируса гриппа A (H1-H16) для типирования вновь выделяемых из природы вариантов вируса гриппа в РТГА, а также выявления антител к вирусу гриппа H8-субтипа в сыворотках крови диких животных для оценки популяционного иммунитета к вирусу гриппа данного субтипа в РТГА.
Обоснование
Субтип вируса гриппа Н8 был обнаружен у птиц семейств утиные (Anatidae) и фазановые (Phasianidae). Данный субтип образует отдельную филогенетическую линию, генетически наиболее близкую к Н12-субтипу вируса гриппа.
Ранее вирусы с субтипом Н8 были обнаружены на территории США, Канады, Австралии, Норвегии, Германии, Испании, Японии, Таиланда, Иране, Швеции и Нидерландов (Gonzalez-Reiche AS, Morales-Betoulle ME, Alvarez D, Betoulle JL, Muller ML, Sosa SM, Perez DR. 2012. Influenza a viruses from wild birds in Guatemala belong to the North American lineage. PLoS One 7: e32873; Fereidouni SR, et al. 2010. Avian influenza virus monitoring in wintering waterbirds in Iran, 2003-2007. Virol J 7:43; Hansbro PM, et al. 2010. Surveillance and analysis of avian influenza viruses, Australia. Emerg Infect Dis 16:1896-1904; Germundsson A, Madslien KI, Hjortaas MJ, Handeland K, Jonassen CM. 2010. Prevalence and subtypes of influenza A viruses in wild waterfowl in Norway 2006-2007. Acta Vet Scand 52:28).
Данный субтип был выделен от кряквы (Anas platyrhynchos), дикой утки (Anas sp.), американской черной кряквы (Anas rubripes), американского чирка-свистунка (Anas carolinensis), широконоски (Anas clypeata), дикого гуся (Anser sp.), голубокрылого чирка (Anas discors), шилохвости (Anas acuta), индюка (Meleagris gallopavo).
Проведенный сравнительный анализ данных мониторинга вируса гриппа в ряде Европейских стран и Северной Америки показал что вирус гриппа Н8-субтипа выделяется крайне редко и не является широко распространенным (Wallensten A, et al. 2007. Surveillance of influenza A virus in migratory waterfowl in northern Europe. Emerg Infect Dis 13:404-411).
По данным международной базы данных GenBank вирус гриппа Н8-субтипа в России ранее выделен не был. Однако это не исключает возможности его появления, поэтому существует необходимость готовности его диагностики.
Все упомянутые источники содержат информацию о некоторых свойствах штаммов вируса гриппа Н8-субтипа. Однако в этих работах не была сделана попытка использовать свойства при разработке диагностических препаратов, в том числе с использованием метода РТГА.
Все вышеперечисленные факты делают актуальным эффективную диагностику вируса гриппа Н8-субтипа в области медицины, ветеринарии, экологии. Однако, в указанных выше источниках литературы присутствует информация только о некоторых свойствах вируса гриппа Н8-субтипа, которой недостаточно для использования штаммов при создании на их основе диагностических препаратов. Вместе с тем, описанные штаммы по причине быстрой изменчивости вируса гриппа А могут значительно отличаться антигенно от современных вариантов вируса гриппа Н8-субтипа. При этом для корректной и достоверной диагностики необходимо использовать современные варианты вируса гриппа Н8-субтипа как компоненты диагностических тест-систем.
Анализ аналогов
В международной базе данных Genbank по состоянию на 7 июля 2014 г. информация о выделении вируса гриппа H8N8-cyбтипa на территории России отсутствует. В базе данных есть информация о 118-ти штаммах вируса Н8-субтипа.
Все они были выделены на территории Северной Америки, Австралии, некоторых стран Европы (Норверии, Швеции, Нидерландах, Германии, Испании), а также в Китае, Японии, Таиланде и Гватемале. Первый штамм датируется 1967 годом выделения.
Поэтому предлагаемый штамм является единственным известным штаммом вируса гриппа Н8-субтипа, выделенным на территории России и единственным известным в мире штаммом вируса гриппа H8N8-субтипа с опубликованной последовательностью нуклеотидных остатков всех сегментов генома. Случаи выделения штаммов ΒΓΑ H8N8 субтипа были опубликованы ранее Gerardo В. Abenes (Abenes GB. 1983. Isolation and characterization of influenza viruses and paramyxoviruses from feral birds, and antigenic differentiation between paramyxoviruses, pigeon/otaru/76 and dove/tennessee/75. Japan J of Vet Res 32(2):79) и Luke T. Daum (Daum LT, Canas LC, Arulanandam BP, Niemeyer D, Valdes JJ, Chambers JP. 2007. Real-time RT-PCR assays for type and subtype detection of influenza A and В viruses. Influenza Other Respir Viruses 1:167-175), однако информация о нуклеотидных последовательностях данных штаммов отсутствует. Очевидна необходимость использования его при разработке современной диагностической системы вируса гриппа различных субтипов в РТГА.
За рубежом для РТГА используются следующие референс-штамм (Fouchier RA, Munster V, Wallensten A, Bestebroer ТМ, Herfst S, Smith D, Rirnmelzwaan GF, Olsen B, Osterhaus AD. Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from black-headed gulls. J Virol. 2005 Mar; 79(5):2814-22):
A/turkey/Ontario/6118/68 (H8N4)
Однако по причине быстрой изменчивости вируса гриппа А, его антигенных свойств крайне необходимо постоянно отслеживать антигенные изменения (в частности, поверхностного гликопротеина гемагглютинина НА) для своевременной замены штамма-продуцента для серодиагностики вируса гриппа А. На сегодняшний день коммерческого антигена и сыворотки для диагностики вируса гриппа Н8-субтипа в России в РТГА не существует.
Нами получена поликлональная сыворотка путем внутривенного заражения 6-недельных кур Род-Айленд (кросс Изобраун). Сыворотка была отобрана на 21 сутки после инфицирования. Титр сыворотки в РТГА с антигеном предлагаемого штамма составил 1/320-1/640. Диагностическим является значение титра сыворотки в РТГА≥1/40 (WHO, 2009). Таким образом, получена сыворотка к предлагаемому штамму A/teal/Chany/444/2009 H8N8, которая обладает значимым титром в РТГА. Она позволит выявлять вирус гриппа Н8-субтипа гемагглютинина наиболее близких в антигенном отношении вариантов.
В настоящее время в основном используются тест-системы для определения субтипов вируса гриппа на основе полимеразной цепной реакции, на основе микрочипов (В.А. Рябинин, Е.В. Костина, Г.А. Максакова, А.Н. Синяков. Типирование гемагглютинина вируса гриппа а с использованием гибридизационного микрочипа // Биоорганическая Химия, 2010, том 36, №6, с. 849-852; Михайлович, В.М. Идентификация инфекционных агентов, генетических детерминант патогенности и лекарственной устойчивости микроорганизмов и вирусов на биологических микрочипах: дис. … доктор. биол. наук / В.М. Михайлович. - Москва, 2009. - 197 с.; Qin ZF, Sun J, Lu TK, Zeng SL, Hua QY, Ling QY, Chen SK, Lv JQ, Zhang CH, Cheng B, Ruan ZX, Bi YZ, Giambrone JJ, Wu HZ. Subtyping animal influenza virus with general multiplex RT-PCR and Liquichip high throughput (GMPLex). Virol Sin. 2012 Apr; 27(2):120-31.; Inoue E, Wang X, Osawa Y, Okazaki K. Full genomic amplification and subtyping of influenza A virus using a single set of universal primers. Microbiol Immunol. 2010 Mar; 54(3):129-34; Jindal N, Chander Y, de Abin M, Sreevatsan S, Stallknecht D, Halvorson DA, Goyal SM. Amplification of four genes of influenza A viruses using a degenerate primer set in a one step RT-PCR method. J Virol Methods. 2009 Sep; 160(1-2):163-6). Однако при апробации этих тест-систем необходимо применять контрольный референс-штамм Н8-субтипа, наиболее близкий к циркулирующим в настоящее время в природе. В вышеупомянутых исследованиях проверки систем в отношении штамма вируса гриппа Н8 проведено не было. Это связано, в том числе, с отсутствием на отечественном рынке коммерческого референс-штамма Н8.
За рубежом для исследований и в качестве компонента панели референс-штаммов для РТГА и ПЦР применяют целый ряд вирусов.
Для исследования мембранного слияния используют штамм A/turkey/Ontario/6118/1968_H8N4 (Dr. David Steinhauer; mailto:dsteinh@emory.edu):
Штаммы H8N4 ΤΚ/OΝΤ/6188/67 и Η8Ν8 DK/VIC/8211-18-1400/92 применялись как контрольные при апробации ПЦР-системы детекции вирусов гриппа А и В в реальном времени (Daum LT, Canas LC, Arulanandam BP, Niemeyer D, Valdes JJ, Chambers JP. Real-time RT-PCR assays for type and subtype detection of influenza A and В viruses. Influenza Other Respi Viruses. 2007 Jul; 1(4):167-75).
При проведении исследований методом нейтрализации с моноклональными антителами к H5N1 (ELISA), в качестве контрольного был использован также штамм A/Turkey/Ontario/6118/1967 (H8N4) (Oh S, Selleck Ρ, Temperton NJ Chan PK, Capecchi B, Manavis J, Higgins G, Burrell CJ, Kok Т. Neutralizing monoclonal antibodies to different clades of Influenza A H5N1 viruses. J Virol Methods. 2009 May; 157(2):161-7).
Этот же штамм A/Turkey/Ontario/6118/1967 был использован в качестве контрольного для разработки и исследования иммуномагнитной ПЦР ловушки вируса гриппа (Dhumpa R, Handberg KJ, JØrgensen PH, Yi S, Wolff A, Bang DD. Rapid detection of avian influenza virus in chicken fecal samples by immunomagnetic capture reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay. Diagn Microbiol Infect Dis. 2011 Mar; 69(3):258-65).
Для апробации тест-системы экспресс-диагностики высокопатогенного вируса гриппа Н7 была применена панель контрольных штаммов вируса гриппа различных субтипов, которая включала штамм A/turkey/Ontario/6118/1968. Нуклеотидная последовательность этого же штамма была использована для филогенетического анализа штаммов вируса гриппа, выделенных на территории Японии (Rashid Manzoor. Studies on the Diagnosis and Molecular Epidemiology of Avian Influenza. 2008, Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers: HUSCAP. P. 4-21). В этой же работе были использованы оригинальные азиатские штаммы
Dk/Hokkaido/124/03 (H8N4)
Mig-dk/Hong Kong/MP2553/03 (H8N4)
Dk/Hokkaido/380/00 (H8N4)
Для апробации экспресс тест-системы Н5 Dot ELISA на основе двух комплементарных моноклональных антител к вирусу гриппа Н5 субтипа в качестве контроля был использован штамм A/duck/Yangzhou/02/05 (H8N4) (Не F, Soejoedono RD, Murtini S, Goutama Μ, Kwang J. Complementary monoclonal antibody-based dot ELISA for universal detection of H5 avian influenza virus. BMC Microbiol. 2010 Dec 30; 10:330).
На мировом рынке компания Sino Biological Inc. предлагает продукцию, компонентом которой является рекомбинантный штамм H8N4 A/pintail duck/Alberta/114/1979.
В панели по диагностике вируса гриппа методом РТГА применяют штамм A/turkey/Ontario/6118/1968 (H8N4).
Таким образом, для производства коммерческих систем и наборов, а также для научных исследований в настоящее время используется несколько штаммов вируса гриппа Н8-субтипа. Однако все они имеют ряд недостатков.
Основная масса штаммов была выделена более двадцати лет назад, и антигенно может быть отличной от ныне существующих вариантов (данные о сравнительных исследованиях отсутствуют). Отсутствует и подробная антигенная характеристика, поэтому применение его в дальнейшем как компонента диагностических систем является нецелесообразным.
Задачей предлагаемого изобретения является получение такого штамма-продуцента вируса гриппа птиц Н8-субтипа, который обладал бы более высоким антигенным сродством к современным вариантам вируса гриппа Н8 и был пригоден для получения поликлональной сыворотки для определения принадлежности вируса гриппа к Н8-субтипу, а также мог быть использован как контрольный референс-образец при оценке специфичности тест-систем на основе ПЦР.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является расширение ассортимента штаммов вирусов и панели сывороток, используемых для диагностики вируса гриппа птиц, повышение точности современной диагностической системы вируса гриппа различных субтипов в РТГА с учетом изменчивости вируса гриппа А, расширения ассортимента нуклеотидных последовательностей генов вирусов гриппа А, используемых для разработки диагностических наборов олигонуклеотидов-праймеров для полимеразной цепной реакции.
Указанный задача решена путем получения штамма вируса гриппа птиц A/teal/Chany/444/09/ H8N8-субтипа, используемого для приготовления антигенсодержащего препарата и поликлональной сыворотки для диагностических целей, а также для применения его в качестве контрольного референс-образца при оценке специфичности тест-систем на основе полимеразной цепной реакции, депонированного в государственной Коллекции вирусных инфекций и риккетсиозов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (р.п. Кольцово, Новосибирской обл.) под регистрационным номером V-562.
Предлагаемый штамм является единственным известным штаммом вируса гриппа Н8-субтипа, выделенным на азиатской территории России за последние 5 лет. Очевидна необходимость использования его при разработке современной диагностической системы вируса гриппа различных субтипов в РТГА.
По причине быстрой изменчивости вируса гриппа А, его антигенных свойств крайне необходимо постоянно отслеживать антигенные изменения (в частности поверхностного гликопротеина гемагглютинина НА) для своевременной замены штамма-продуцента для серодиагностики вируса гриппа А. На сегодняшний день коммерческого антигена и сыворотки для диагностики вируса гриппа Н8-субтипа в России в РТГА не существует.
Характеристика штамма
Штамм принят на патентное депонирование под регистрационным номером V-562 в Коллекцию микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (п. Кольцово, Новосибирская обл.).
Штамм был выделен от чирка (Anas sp.) на территории Новосибирской области. Принадлежность к H8N8-субтипу определена методом PCR. Подтвержден в реакции PCR с типирующими праймерами на гемагглютинин (H1-H16) и нейраминидазу (N1-N9) (Manual on animal influenza diagnosis and surveillance. World Health Organization (WHO). - 2002. - 105 P.; Bao-Feng Qiu et al. A reverse transcription-PCR for subtyping of the neuraminidase of avian influenza viruses // Journal of Virological Methods. - 2009. - 155. - P. 193-198). Принадлежность гемагглютинина штамма к Н8-субтипу подтверждена определением и сравнительным анализом нуклеотидной последовательности фрагмента гена гемагглютинина (1701 н.о.). Обладает 97% идентичностью нуклеотидной последовательности гена НА со штаммами A/mallard/Netherlands/1/2006(H8N4) и A/duck/Thailand/SP-355/2007(H8N4).
Определены первичные последовательности полного генома исследуемого штамма. Нуклеотидные последовательности задепонированны в базу данных GenBank под номерами CY098521, CY098522, CY098523, CY098524, CY098525, CY098526, CY098527, CY098528. Нуклеотидные последовательности генов представлены на фиг. 1.
Был проведен филогенетический анализ гена геагглютинина методом максимального правдоподобия с бутстреп анализом (1000 повторов). На фиг. 2 представлено филогенетическое дерево гена гемагглютинина Н8-субтипа. Как видно из дендрограммы, наиболее родственен штаммам, выделенным ранее на территории Европы, Таиланда и Японии. Данный результат может свидетельствовать о персистенции данной генетический линии Н8-субтипа на территории Евразийского континента. При сравнении исследуемого штамма с референс-штаммом A/turkey/Ontario/6118/68 (H8N4) было показано, что штаммы филогенетически различны. Штаммы не только принадлежат генетически отдаленным линиям вируса, но и разделены достаточно длительным промежутком времени. А в связи с быстрой изменчивостью вируса гриппа, это может приводить к значительным генетическим изменениям. Что и показано с помощью филогенетического анализа.
Анализ показывает актуальность и целесообразность использования штамма A/teal/Chany/444/2009 H8N8-субтипа для создания антигенсодержащего препарата вируса гриппа Н8-субтипа далее может быть использован при проведении реакции торможения гемагглютинации для детектирования антител к гемагглютинину вируса гриппа Н8-субтипа.
При культивировании в системе развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) данного штамма инфекционный титр достигал 5,43 lg EID50/мл. Максимальная продукция гемагглютинина в аллантоисной жидкости РКЭ составляла 1280 ГАЕ/мл. Данные свойства позволяют эффективно использовать предлагаемый штамм для получения антигена штамма A/teal/Chany/444/2009 H8N8.
В эксперименте штамм имеет одинаковые титры в реакции гемагглютинации с эритроцитами следующих видов животных: курица, гусь, лошадь.
Пример 1. Получение поликлональной сыворотки на штамм A/teal/Chany/444/2009 вируса гриппа H8N8-субтипа.
Четырем 8-недельным курицам породы Род-Айленд (кросс Изобраун) была внутривенно (в подкрыльцовую вену) введена вируссодержащая жидкость, содержащая 640 ГАЕ/мл. Жидкость представляла собой раствор вируссодержащей аллантоисной жидкости в физиологическом растворе (1:1). Объем вируссодержащего раствора составил 2,5 мл на каждое животное. До заражения у каждого животного была отобрана кровь (1 мл) для контрольной постановки РТГА сыворотки с антигеном штамма A/teal/Chany/444/2009. РТГА дала отрицательный результат. По истечении 21 суток после инфицирования была тотально отобрана кровь и получена сыворотка крови в объеме 5-10 мл от каждого животного.
Через 10 суток после инфицирования была отобрана кровь для постановки промежуточной реакции торможения гемагглютинации.
Титр сыворотки в РТГА с антигеном предлагаемого штамма составил 1/320-1/640 (табл. 2). Диагностическим является значение титра сыворотки в РТГА≥1/40 (WHO, 2009). Таким образом, при заражении кур получена сыворотка, которая может использоваться для определения принадлежности к Н15-субтипу вариантов вируса гриппа, антигенно близких штамму A/teal/Chany/444/2009.
Пример 2. Приготовление антигенсодержащего диагностического препарата на основе штамма вируса гриппа A/teal/Chany/444/2009 H8N8-субтипа.
Для приготовления антигенсодержащего препарата вируссодержащую аллантоисную жидкость инактивируют 0,05% β-пропиолактоном при температуре 37°С в течение 2 ч. Далее необходимо подтвердить инактивацию вируса заражением чувствительной системы - 3 пассажа (РКЭ). Полученный антигенсодержащий субстрат хранится при температуре +4-+7°С, без снижения гемагглютинирующего титра в течение 12 месяцев.
Таким образом, полученный антигенсодержащий препарат вируса гриппа Н15-субтипа далее может быть использован при проведении реакции торможения гемагглютинации для детектирования антител к гемагглютинину вируса гриппа Н15-субтипа в сыворотке крови. Применение предлагаемого штамма в качестве антигена для проведения РТГА описано в примере 1 (табл. 2).
Пример 3. Определение специфичности разработанного праймера, предназначенного для диагностики Н8-субтипа гемагглютинина методом ПЦР.
Для типирования изолятов методом ПЦР амплификацию проводили набором Fast PCR Mix (Fermentas, США) с парами подтипспецифичных праймеров - для определения подтипов изолятов
Состав реакционной смеси:
1) MasterMix - 10 мкл
2) кДНК - 2 мкл
3) Прямой праймер (2 o.u) - 1 мкл
4) Обратный праймер (2 o.u) - 1 мкл
5) Вода Nuclease-free - 4 мкл
Для наработки ПЦР продукта для определения первичной последовательности проводили амплификацию с праймерами специфичными к генам НА и NA.
Программа для амплификатора
1) Т=95°C, 10 секунд,
2) Т=52°C*, 30 секунд
3) Т=72°C, 20 секунд
4) Т=4°C хранение.
В табл. 3 приведены результаты контрольной реакции ПЦР с использованием разработанного праймера Η16. В качестве контрольных используются штаммы референс-панели (St. Jude Research Hospital, США) и предлагаемый штамм A/teal/Chany/444/09/ H8N8
Таким образом, штамм A/teal/Chany/444/09/ H8N8-субтипа был использован как контрольный при постановке реакции ПЦР с использованием разработанного праймера для субтипирования H16 гемагглютинина. Положительный результат получен исключительно со штаммом A/teal/Chany/444/09/ H8N8. Праймер не проявил специфичности к контрольным референс-штаммам всех остальных субтипов (H1-H15).