ВАКЦИНА ПРОТИВ ТРАНСМИССИВНОГО ГАСТРОЭНТЕРИТА СВИНЕЙ И СПОСОБ ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ
SWINE TRANSMISSIBLE GASTROENTERITIS VACCINE AND METHOD FOR PREPARING IT

Изобретение относится к биотехнологии и касается изготовления и применения вакцины для специфической профилактики трансмиссивного гастроэнтерита свиней.
Трансмиссивный гастроэнтерит свиней (ТГС) - инфекционная высококонтагинозная болезнь, главным образом поросят до 3-месячного возраста, характеризующаяся катарально-геморрагическим гастроэнтеритом, рвотой, дегидратацией организма и сопровождающаяся атрофией ворсинок верхнего отдела тонкого кишечника и высокой смертностью (часто до 100%) среди поросят до 2-недельного возраста.
50/мл
Известна вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита и способ ее применения (см. патент РФ №2306951, МПК A61K 39/225, опуб. 27.09.2007), содержащая инактивированный вирулентный штамм «ТВ» вируса ТГС в титре 7,0-8,5 lg ТЦД и адъювант. Вакцины вводят основным и ремонтным свинкам внутримышечно двукратно на 75-80 и 90-100 дней супоросности.
Однако инактивированные вакцины, наряду с положительным действием, в ряде случаев могут вызывать аллергические реакции из-за добавления к ним адъювантов. Их использование трудоемко, предусматривает многократную иммунизацию животных. Кроме этого, они не обеспечивают эффективной защиты из-за отсутствия антигенной идентичности вирулентному возбудителю.
Известна живая вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита свиней на основе штамма «Горский-95» и способ ее применения (см. патент РФ №2140982, МПК C12N 7/00, опуб. 10.11.1999). Данный штамм обозначен как штамм «Горский-95» и депонирован в коллекции штаммов микроорганизмов Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии (ГНУ ВНИИВВиМ) инв. №1941.
Вакцину вводят дважды супоросным свиноматкам перорально соответственно за 6-8 и 2-3 недели до опороса.
5
3
Однако эффективность вакцины невысока ввиду невысокой активности штамма, который способен накапливаться только до 10 ТЦД 50/см, обладает не очень высокой стабильностью (до 50 пассажа), не пригоден для профилактики трансмиссивного гастроэнтерита у поросят всех возрастных групп, включая отъемышей.
50/мл
Наиболее близкой к заявляемой является живая вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита и способ ее применения (см. патент РФ №2347585, МПК A61K 39/225, опуб. 27.02.2008), содержащая вирусный материал из штамма Transmissible gastroenteritis ВГНКИ №5, сахарозу, пептон, пептон ферментативный, казеин, тиомочевину, аэросил AM-1-300 и смолу КБ-4П-2. Биологическая активность препарата составляет не ниже 6,0 lg ТЦД . Вакцину вводят супоросным свиноматкам путем скармливания с сухим кормом перед утренним кормлением в дозе 10 г на голову в течение 3-х дней подряд за 10-14 дней до опороса. На 10-14 день после опороса вакцину дают и поросятам также перед утренним кормлением в дозе 5 г на голову.
Однако данная вакцина предназначена для орального применения. Кроме этого, она требует значительных трудозатрат в изготовлении и применении, так как предусматривает использование сухого корма и трехкратное введение животным. Механизм действия направлен на активизацию только клеточного иммунитета, что обеспечивает лишь колостральную защиту новорожденных поросят и не предотвращает развитие инфекционного процесса у вакцинированных свиноматок.
Изобретение направлено на решение задачи создания авирулентной эффективной живой вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита, простого в эксплуатации способа ее применения, направленных одновременно на активизацию у свиноматок клеточного иммунитета, обеспечивающего колостральную защиту новорожденных поросят, и активизацию у свиноматок гуморального иммунитета, обеспечивающего защиту их от заражения.
50/мл
Для решения поставленной задачи вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита свиней, содержащая вирусный материал и наполнитель, согласно изобретению в качестве вирусного материала содержит материал из штамма «ВН-96» вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней в титре 7,0-7,2 lg ТЦД , а в качестве наполнителя - физиологический раствор при следующем соотношении компонентов (мас.%):
Вирусный материал из штамма «ВН-96» - 0,09-0,1%
Физиологический раствор - остальное.
50/мл
Способ применения живой вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита свиней заключается во внутримышечной однократной иммунизации супоросных свиноматок за 40-45 дней до опороса в дозе 4,5-5 мл на голову, при этом в качестве вакцины используют вакцину, содержащую вирусный материал из штамма «ВН-96» вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней в титре 7,0-7,2 lg ТЦД  и физиологический раствор при следующем соотношении компонентов (мас.%): вирусный материал из штамма «ВН-96» - 0,09-0,1%, физиологический раствор - остальное.
Для обеспечения дополнительной зашиты поросят в послеотъемный период осуществляют иммунизацию поросят-сосунов в возрасте 23-27 дней однократно внутримышечно в дозе 3,0-3,5 мл.
В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описано живой вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита свиней и простого в эксплуатации способа ее применения, обеспечивающих эффективную профилактику заболевания за счет одновременной активизации у свиноматок клеточного и гуморального иммунитетов, что способствует колостральной защите новорожденных поросят и самих свиноматок от заражения.
50/мл
Однократное введение вакцины на основе смеси вирусного материала из штамма «ВН-96» вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней в титре 7,0-7,2 lg ТЦД  с физиологическим раствором в соотношениях (1-0,9):(999-999,1).
Известные на сегодняшний день вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита свиней направлены, в основном, на активизацию клеточного иммунитета. Ни одна из известных вакцин не позволяет осуществлять одновременную активизацию клеточного (в большей степени) и гуморального (в меньшей степени) иммунитетов.
Сказанное позволяет сделать вывод о наличии изобретательского уровня в данном изобретении.
Штамм, предназначенный для изготовления вакцины, депонирован во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и кормов (ВГНКИ) (справка о депонировании №1103/19 от 27 мая 2009).
Штамм «ВН-96» выделен в 1988 году из вакцины «Римс» (ГДР) путем 30-кратного пассирования в перевиваемой культуре клеток почки эмбриона свиньи и методом предельных разведений с последующим 5-кратным клонированием микробляшек исходного вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, всего проведено 96 пассажей.
Место хранения производственного штамма «ВН-96»-ДЕП вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней - Коллекция микроорганизмов Государственного научного учреждения Саратовский научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ Саратовский НИВИ Россельхозакадемии).
Штамм характеризуется следующими свойствами.
Морфологические признаки
При электронно-микроскопическом исследовании вируссодержащего материала установлено, что вирус штамма «ВН-96» является оболочечным, плеоморфным, диаметром 80-150 нм, имеет один слой булавовидных отростков (пепломеров) в виде короны длиной 12-20 нм, т.е. штамм морфологически тождественен представителям рода Coronavirus семейства Coronaviridae.
Культуральные признаки
Штамм «ВН-96» вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней размножается в перевиваемой линии клеток почки эмбриона свиньи - СПЭВ (ГНУ ВНИИВВиМ). Допустимое количество пассажей - 10.
50/см
50/см
3
3
Инфекционная активность штамма в культуре СПЭВ составляет 5,25±0,25 lg ТЦЦ  . После 7-го пассажа титр вируса ТГЭС штамма «ВН-96» составляет 7,0-7,2 lg ТЦЦ  , дальнейшее пассирование к повышению титра вируса не приводит.
Антигенные свойства
2
Штамм «ВН-96» вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней вызывает образование вируснейтрализующих и преципитирующих антител к вирусу ТГЭС в организме свиней и кроликов в титрах 4-6 log.
Вирулентные свойства
Не вирулентен.
Патогенность для естественно-восприимчивых и лабораторных животных
50/см
3
Штамм «ВН-96» апатогенен для поросят всех возрастных групп при пероральном и подкожном методах введения в дозах 5,0-6,5 lg ТЦЦ  .
Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами
Не контаминирован.
Молекулярно-генетическая особенность штамма
Штамм «ВН-96» является РНК-содержащим вирусом. Методом ОТ-ПЦР был амплифицирован участок генома вируса ТГЭС, включающий 800 н.о. на 5'-конце S-гена.
Вирус содержит 3 главных структурных белка: крупный поверхностный гликопротеин (S) с молекулярной массой 170-200 кДа, нуклеокапсидный белок (N) с молекулярной массой 50-62 кДа и мелкий оболочечный гликопротеин (М) с молекулярной массой 25-35 кДа.
ПЦР-анализ показал, что в треках вирусной нуклеиновой кислоты выявлена единственная характерная фракция специфического продукта ПЦР (кДНК величиной 886 пн), свидетельствующая о наличии генома вируса ТГЭС в достаточно большом количестве.
Условия хранения
50/см
3
Штамм «ВН-96» хранят в лиофилизированном виде в герметически закрытых ампулах при температуре минус 20-40°С в течение 5 лет. В течение срока хранения допускается снижение активности не более чем на 1,5 lg ТЦЦ  .
Стабильность основных свойств штамма
Штамм «ВН-96» стабилен в течение 10 серийных пассажей в культуре клеток СПЭВ.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1
50/мл
Для получения вирусного материала из штамма «ВН-96» используют культуру СПЭВ, выращенную в течение 3-х дней при температуре 37°C со сформированным монослоем клеток с посевной дозой 150 тыс./мл. Ростовую среду заменяют поддерживающей средой того же состава, но без сыворотки, и добавляют вирус в соотношении 1:10. Инфицированную культуру выдерживают в течение 3 суток при температуре 37°C, затем трехкратно замораживают и оттаивают. Полученную суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 минут. Надосадочную жидкость отбирают и титруют. Отбирают тот вирусный материал, титр которого составляет 7,0-7,2 lg ТЦД .
Вирусный материал хранят при температуре минус 18-20°C.
Пример 2
Вакцину готовят следующим образом.
50/мл
Берут 1 мл вирусного материала с титром 7,0-7,2 lg ТЦД .
Добавляют его в 999 мл физиологического раствора. Смесь перемешивают и используют для профилактики ТГЭ.
Готовая вакцина представляет собой прозрачную жидкость, без цвета и запаха.
Пример 3
Обоснование титра вируса трансмиссивного гастроэнтерита и процентного соотношения компонентов вакцины против ТГЭ.
50/мл
50/мл
50/мл
Эксперименты проводили в неблагополучном по ТГЭ хозяйстве. Вакцину вводили свиноматкам за 40-45 дней до опороса в разных титрах вируса. Первой группе (174 свиноматки) - в титре 6,0-6,2 lg ТЦД , второй (195 свиноматок) - в титре 7,0-7,2 lg ТЦД , третьей (270 свиноматок) - в титре 8,0-8,2 lg ТЦД . Контрольными являлись 311 свиноматок.
Эффективность вакцинации оценивали по количеству деловых поросят, полученных на одну опоросившуюся свиноматку.
Результаты представлены в таблице 1.
50/мл
Из таблицы 1 следует, что наибольший выход деловых поросят на одну опоросившуюся свиноматку (6,5) получен в группе, которая подвергалась однократной иммунизации за 40-45 дней до опороса вакциной с титром вируса 7,0-7,2 lg ТЦД  и при соотношении компонентов 1:999. Уменьшение или увеличение титра вируса и соотношения компонентов вакцины снижали ее эффективность.
Таблица 1
Результаты эффективности вакцинации свиноматок при разных титрах вируса ТГЭ и соотношениях компонентов вакцины
Характеристика групп свиноматок
Кол-во свиноматок в группе
Титр вируса lg TЦД <sub>50/мл</sub>
Соотношение компонентов вакцины (вес. части)
Получено деловых поросят
всего
на одну свином.
1 опытная
174
6,0-6,2
1:99
820
4,7
2 опытная
195
7,0-7,2
1:999
1274
6,5
3 опытная
270
8,0-8,2
1:9999
1526
5,7
Контрольная
311
-
-
1451
4,7
Пример 4
Обоснование кратности введения вакцины проводили на трех группах свиноматок (по 80 голов в каждой), одна из которых являлась контрольной, а две другие - опытными. Первую опытную группу свиноматок иммунизировали однократно, вторую - двукратно с интервалом 14 дней.
50/мл
Вакцину с титром вируса 7,0-7,2 lg ТЦД  вводили свиноматкам внутримышечно за 40-45 дней до опороса в дозе 5 мл на голову. Эффективность вакцинации оценивали по количеству полученных поросят. За поросятами вели клинические наблюдения, регистрировали заболеваемость и падеж до отъемного возраста. Результат представлен в таблице 2.
Таблица 2
Эффективность вакцинации свиноматок в зависимости от кратности введения вакцины.
Характеристика групп свиноматок
Кол-во поросят в группе
Заболело
Пало
голов
%
голов
%
1 Опытная (вакцинированы двукратно)
528
528
100,0
327
61,7
2 Опытная (вакцинированы однократно)
542
125
23,1
72
13,3
Контрольная
532
532
100,0
394
74,1
Из таблицы 2 следует, что все поросята от невакцинированных свиноматок заболели ТГЭ, из них пало 394 головы (74,1%).
В опытной группе свиноматок, вакцинированных двукратно, также заболели все поросята, из них пало 327 голов (61,9%). В опытной группе свиноматок, вакцинированных однократно, из 542 поросят заболело только 125 (23,1%), пало 73 (13,3%).
Таким образом, однократное введение вакцины обеспечивает наибольшую защиту поросят-сосунов от заболевания.
Пример 5
Обоснование дозы введения вакцины проводили на двух группах свиноматок (по 50 голов в каждой), при этом одной группе свиноматок вводили вакцину в дозе 4,5-5 мл на голову, а второй группе - по 6-8 мл на голову.
Эффективность вакцинации оценивали по количеству полученных поросят. За поросятами вели клинические наблюдения, регистрировали заболеваемость и падеж до отъемного возраста. Результат представлен в таблице 3.
Таблица 3
Эффективность вакцинации свиноматок в зависимости от дозы введения вакцины
Доза вакцины
Кол-во поросят в группе
Заболело
Пало
голов
%
голов
%
4,5-5 мл
357
105
29,4
57
16,0
6-8 мл
363
295
81,3
151
41,6
Из таблицы 3 следует, что от первой группы свиноматок, которым вводили вакцину в дозе 4,5-5 мл, было получено 357 поросят, из которых 105 (29,4%) заболело и 57 (16,0%) пало. От второй группы свиноматок, которым вакцину вводили в дозе 6-8 мл, было получено 363 поросенка, из которых 295 (81,3%) заболело и 151 (41,6%) пало.
Таким образом, увеличение дозы вакцинации (более 5 мл) уменьшает защиту поросят-сосунов от трансмиссивного гастроэнтерита в неблагополучных хозяйствах. Аналогичные результаты получены при дозе, меньшей 4,5 мл.
Пример 6
Обоснование сроков вакцинации свиноматок
50/мл
Для этого было сформировано 5 групп свиноматок, из которых 4 были опытными и одна - контрольная. Все свиноматки первых четырех групп подвергались иммунизации вакциной с титром вируса 7,0-7,2 lg ТЦД . Вакцину вводили внутримышечно в дозе 5 мл на голову. Первую опытную группу (48 свиноматок) иммунизировали за 9-10 дней до опороса. Вторую (46 голов) - за 22-25 дней до опороса, третью (41 голова) - за 30-32 дня до опороса, четвертую (43 головы) - за 40-45 дней до опороса.
Эффективность вакцинации оценивали по количеству полученных поросят. За поросятами вели клинические наблюдения, регистрировали заболеваемость и падеж до отъемного возраста. Результат представлен в таблице 4.
Таблица 4
Эффективность вакцинации свиноматок в зависимости от сроков введения вакцины до опороса
Характеристика групп свиноматок
Кол-во свиноматок
Кол-во поросят в группе
Заболело
Пало
голов
%
голов
%
1 Опытная (вакц. за 9-10 дней до опороса)
48
432
303
70,1
230
53,2
2 Опытная (вакц. за 22-25 дней до опороса)
46
414
81
19,6
27
6,5
3 Опытная (вакц. за 30-32 дня до опороса)
41
369
20
5,4
8
2,2
5 Опытная (вакц. за 40-45 дней до опороса)
43
387
10
2,6
2
0,5
Контрольная
25
225
135
60,0
103
45,8
Из таблицы 4 следует, что наименьшее количество заболевших (2,6%) и павших (0,5%) поросят наблюдалось при вакцинации свиноматок за 40-45 дней до опороса.
Пример 7
Обоснование сроков и дозы вакцинации поросят
Экспериментальным путем доказано, что для обеспечения дополнительной защиты поросят в послеотъемный период осуществляют их иммунизацию в возрасте 23-27 дней. Данные сроки являются обоснованными, поскольку в первые 3 недели жизни у поросят превалирует естественная - колостральная защита, передающаяся им через молоко свиноматок. К 21-30-дневному возрасту происходит значительное снижение колостральной защиты, а в возрасте 35-40 дней поросята становятся незащищенными от заражения.
Доза вакцинации поросят 3-3,5 мл также была подобрана экспериментальным путем с учетом массы животных.
Пример 8
Изучение антигенной активности вакцины проводилось на первоопоросках и свиноматках, опоросившихся два и более раз. Вакцину вводили внутримышечно однократно за 40 дней до опороса в дозе 5 мл на голову. Титр антител определяли: в сыворотке крови за 1-2 дня до опороса, молозиве - в первые 12 часов после рождения, молоке - на 5-6 сутки после начала лактации.
Таблица 5
Титр антител в сыворотке крови, молозиве и молоке вакцинированных и невакцинированных свиноматок
№ группы
Характеристика свиноматок
Кол-во исследов. проб
Титр антител (Ig<sub>2</sub>) в
сыворотке крови
молозиве
молоке
Первоопороски
1
- вакцинированные
12
4,4±0,40
7,5±0,56
5,8±0,74
2
- контрольные
17
0,9±0,29
4,3±0,47
1,3±0,24
Опоросившиеся два и более раз
3
- вакцинированные
12
4,6±0,47
7,6±0,48
6,6±0,40
4
- контрольные
23
2,8±0,33
4,5±0,29
2,4±0,15
Как видно из таблицы 5, средний титр антител у вакцинированных свиноматок в сыворотке крови, молозиве, молоке достоверно выше аналогичных показателей невакцинированных животных.
А именно у вакцинированных животных происходит повышение гуморального и клеточного иммунитетов. О повышении гуморального иммунитета свидетельствует изменение титра в сыворотке крови с 0,9±0,29 до 4,4±0,40 у первоопоросок и с 2,8±0,33 до 4,6±0,47 у свиноматок, опоросившихся два и более раз. Это обеспечивает защиту вакцинированных свиноматок от заражения ТГЭ.
О повышении клеточного иммунитета свидетельствует изменение титра в молозиве и молоке также у всех свиноматок. К примеру, у первоопоросок титр повышается с 4,3±0,47 до 7,5±0,56. Это обеспечивает защиту новорожденных поросят от заражения ТГЭ.
Пример 9
Изучение иммуногенной активности вакцины проводилось на свиноматках, которым вводили вакцину внутримышечно однократно за 45 дней до опороса в дозе 5 мл на голову.
Определяли титры специфических иммуноглобулинов различных классов в молозиве всех свиноматок в первые сутки после опороса. Титры иммуноглобулинов определяли путем постановки реакции непрямой иммунофлуоресценции с использованием специфического эритроцитарного дагностикума против трансмиссивного гастроэнтерита свиней и специфических антител к определенным классам иммуноглобулинов. Результаты представлены в таблице 6.
Таблица 6
Титры специфических иммуноглобулинов различных классов в молозиве свиноматок к вирусу ТГЭ
Характеристика свиноматок
Титр иммуноглобулинов (Ig<sub>2</sub>) в реакции иммунофлуоресценции
IgA
SIgA
IgG
IgM
Опытные
1,44±0,60
5,33±0,76
6,11±0,65
3,78±0,30
Контрольные
1,56±0,58
2,60±0,76
7,89±0,48
0,78±0,40
Из таблицы 6 следует, что после вакцинации свиноматок в первые сутки после опороса наблюдается активизация секреторных иммуноглобулинов SIgA (с 2,60±0,76 до 5,33±0,76) и иммуноглобулинов IgM (с 0,78±0,40 до 3,78±0,30). Достоверное увеличение данных показателей свидетельствует об усилении колостральной защиты новорожденных поросят.
Таким образом, заявляемая живая вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита свиней эффективна, проста в эксплуатации, позволяет одновременно активизировать у свиноматок клеточный и гуморальный иммунитета, при этом клеточный иммунитет обеспечивает колостральную защиту новорожденных поросят, а гуморальный - защиту самих свиноматок от заражения трансмиссивным гастроэнтеритом.