Биотехнологический способ переработки цитрусовых для получения осветленных соков

ИНГРЕДИЕНТЫ ТЕМА

ИНГРЕДИЕНТЫ НОМЕрА

для ПРОИЗВОДСТВА ПИВА и НАПИТКОВ

УДК 663.813

Биотехнологический способ

переработки цитрусовых

для получения осветленных соков

С. К. А. Алсивар,

аспирант; Е. И. Курбатова,

канд. техн. наук, доцент; Е. Н. Соколова, канд. биол. наук; Л. В. Римарева,

д-р техн. наук, профессор ВНИИ пищевой биотехнологии

Ключевые слова:

биокатализ; мандарины; соки; ферментные препараты; цитрусовые; экстрактивные вещества. Keywords:

biocataiysis; tangerines; juices; fermentai preparations; citrus; extractive substances.

Реферат

Разработан эффективный биохимический способ переработки плодов мандарина для получения осветленного сока на основе направленного использования комплексных ферментативных систем.

Abstracts

Developed an effective biochemical way to processing of mandarin fruit for juice clarified on the basis of the directed use of complex enzyme systems.

Фрукты и овощи — неотъемлемая часть рациона здорового питания человека, причем не только ввиду их освежающего вкуса и аромата, но и благодаря высокой питательной и физиологической ценности.

Во всем мире производство соков — важный сегмент рынка безалкогольных напитков, общий объем которого оценивается в 30 млрд л в год при обороте около 30 млрд долл. США. Основные мировые центры производства соков в настоящее время — Европа, Северная Америка, Австралия, о чем свидетельствуют как показатели объемов производства соков, так и статистические данные по потреблению продукта на душу населения в этих регионах. Значительную долю на рынке сокопродуктов занимают напитки на основе цитрусовых (апельсин, лимон и мандарин), потребление которых составляет более 50% от общего объема потребления соков в мире. На сегодняшний день производство апельсинового и мандаринового сока без предварительного восстановления широко распространено в США и Европе [1].

Во ВНИИ пищевой биотехнологии были проведены многочисленные исследования по разработке биотехнологических способов повышения эффективности переработки растительного сырья для получения продуктов с улучшенными качественными показателями [2-6]. Однако в основном они касались аспектов биотехнологической переработки плодово-ягодного сырья средней полосы России, таких как яблоки, клюква, облепиха, рябина, смородина и др.

Цель данных исследований — создание эффективной биотехнологии переработки плодов мандарина для получения осветленного сока на основе использования подобранных комплексных ферментативных систем.

Плоды цитрусовых культур характеризуются ценным биохимическим составом, отличающимся высоким содержанием углеводов, органических кислот, пектиновых, веществ, биофлавоноидов, витаминов, микроэлементов (на 100 г продукта): вода — 88,5 г; белки — 0,8; жиры — 0,3; углеводы — 9,2; клетчатка — 0,6; пектин — 0,4; органические кислоты — 1 г; калий — 155 мг; кальций — 35; магний — 11; натрий — 12; фосфор — 17 мг; железо — 100 мкг; витамин А — 0,06 мг; витамин Е (токоферол) — 0,2; витамин С (аскорбиновая кислота — 38; витамин В1 (тиамин) — 0,06; витамин В2 (рибофлавин) — 0,03; витамин РР (ниацин) — 0,2 мг.

В промышленности плоды мандаринов используют очень широко: для производства соков, морсов, экстрактов, красителей, а также при производстве эфирных масел [1, 7].

Эффективность извлечения сока (экстракта) из растительного сырья зависит от степени воздействия де-структурирующего фактора на растительную ткань. Каждая растительная клетка имеет свою собственную оболочку, окружающую протоплазму и защищающую клетку от внешних воздействий, придавая ей прочность. Отдельные клетки скрепляются между собой с помощью межклеточного

18 ПИВО и НАПИТКИ 4 • 2013

вещества, образующего срединную пластинку [8, 9].

По своему строению плод мандарина — многогнездная ягода. Поверхность плода мелкоямчатая. Наружная (окрашенная), более плотная часть оболочки носит название «флаведо», внутренняя белая, более рыхлая оболочка — «альбедо» (рис. 1). Мякоть плода состоит из радиально расположенных долек гнезд плода, имеющих мягкие, но плотные стенки, в зрелом плоде легко отделяющиеся друг от друга. В каждой дольке находится большое количество веретеновидных сочных телец — соковых мешочков [8, 10].

Содержание пектина наибольшее в альбедо, поэтому крупноплодные цитрусовые как промышленный сырьевой источник пектина оценивают по массе альбедо. Так, содержание пектиновых веществ у мандаринов составляет в альбедо и флаведо 9,3 и 6,8% соответственно. При этом в мякоти зрелых плодов примерно две трети общего количества пектиновых веществ находится в форме протопектина.

Для получения продукции высокого качества сырье должно быть однородным по степени зрелости. В процессе созревания происходит непрерывное изменение строения растительной ткани и ее химического состава, ткань зрелых плодов становится менее грубой, более доступной для действия пищеварительных ферментов, при перезревании в клетках происходят необратимые изменения, нарушается явление тургора, ткань размягчается, становится дряблой.

I/игг\17 П1ЛГиТ1 I ппа ППА^ОПЛГТ^ТИЛ гидрд I л LI А ЛIДТ1/ЛО

ИНГРЕДИЕНТЫ для ПРОИЗВОДСТВАПИВА и НАПИТКОВ

W

Щелевидный канал

Флаведо

' Масляная железа

Альбедо

Сердцевина плода

Разделительная мембрана сегментов

Наружный эпидермис

Вакуоли с соком

Рис. 1. Плод мандарина в разрезе

Повышение выхода сока из растительных тканей связано с интенсификацией процессов деструкции пектиновых веществ, целлюлозы, гемицеллюлоз, белковых веществ в составе клеточной стенки. Однако эффективность проведения ферментативной обработки сырья зависит от сортовых особенностей культуры, места произрастания, степени зрелости плодов.

На первом этапе работы были проведены исследования биохимического состава различных сортов мандаринов, импортированных из Аргентины, отличающихся сроком сбора урожая, а именно: Satsuma (апрель-май), Clementina (май-июнь), Ellendale

Таблица 1

Показатель Сорт мандаринов

Satsuma Clementina Ellendale W. Murcott

Вода, % 91,5 90,8 90,2 88,5

Белок, % 0,6 0,7 0,7 0,8

Сумма редуцирующих Сахаров, % 7,4 8,2 8,8 9,2

Клетчатка, % 0,4 0,5 0,5 0,6

Пектин, % 0,2 0,4 0,5 0,6

Органические кислоты, мг 0,6 0,7 0,7 0,8

Витамин С, мг% 28 32 36 38

Таблица 2

Сорт мандаринов Пектинэстераза, ед/ г (ед/ см3) Эндополигалактуроназа, ед/см3 Экзополигалактуроназа, ед/см3

Satsuma 0,165 Следы 0,131

Clementina 0,173 0,135

Ellendale 0,18 0,14

W. Murcott 0,21 0,15

(июль-август), Мигеой (август-октябрь) (табл. 1).

Важный показатель сырья — содержание высокомолекулярных веществ, участвующих в структу-рообразовании растительной ткани, таких как полисахариды (пектин, целлюлозы, гемицеллюлозы) и белковые вещества. С удлинением срока зрелости мандаринов содержание полимеров увеличивается. Так, например, ранний сорт содержит 0,4% нейтральных полисахаридов и 0,2% пектиновых веществ, тогда как более поздние, осенние сорта — 0,6% клетчатки и 0,6% пектиновых веществ. Полученные данные по составу полимеров сырья необходимо учитывать в дальнейшей работе по подбору состава ферментативного комплекса для деструкции клеточной стенки мандариновой мякоти.

Плодово-ягодное сырье, в том числе мандарины, содержит собственные ферменты, катализирующие гидролиз пектиновых веществ [11]. Ввиду того что данный вопрос практически не изучен, представилось интересным исследовать возможность использования собственных ферментов, катализирующих гидролиз пектиновых веществ плодов мандарина в процессе разработки биотехнологии получения осветленного сока. Активность ферментов изучали непосредственно в мандариновом соке после прессования и отделения твердой фракции сырья (табл. 2).

0

I <

§

ш I-

4 • 2013

ПИВО и НАПИТКИ 19

0

1 <

§

ш h

Выявлено незначительное наличие экзополигалактуроназного, а также пектинэстеразного фермента, при этом их активность возрастает при более позднем созревании плодов. Ферменты, наиболее необходимые при получении осветленных соков (эндополигалактуроназы), обнаружены в следовых количествах.

Обработка ферментными препаратами основана на воздействии пектолитических ферментов на пектиновые вещества, цементирующие отдельные клетки растительной ткани между собой и входящие в состав внешних оболочек клеток. При этом происходит деструкция биополимеров как в составе мембран, так и в клеточном соке, что приводит к снижению вязкости сока, увеличению его выхода, а также облегчению и ускорению процесса прессования сырья. Однако использование индивидуальных пектиназ не позволяет максимально извлечь ценные пищевые и биологически активные компоненты сырья, что приводит к необходимости введения комплексных каталитических систем для более полного использования ценных растительных ресурсов.

С целью выявления отличительных особенностей ферментных препаратов пектолитического действия был проведен анализ каталитической способности препаратов по отношению к различным субстратам [12, 13] (табл. 3).

Ферментный состав исследуемых препаратов значительно отличался как по уровню активностей основных ферментов (пектинэстеразная, поли-

Таблица 3

Препарат Каталитическая активность, ед/г белка

ПэС Эндо-ПгС ПлА (рН 5,0) КС ЦС

Extrapect Press 14 944 1696 70 976 832 960

Extrapect Super Clar 14 548 1806 2073 2692 1124

Extrapect Color 15 439 1586 67 865 705 634

Sunson 11 234 2203 18 088 3932 3864

Pectase KDN 13 649 3478 835 2783 904

Пектиназа МА 71 400 15 866 0 50 0

Пектиназа 1 14 697 4723 123 368 3070 1181

Пектиназа 2 19 374 2672 840 738 3875 1296

Aumgeme 8630 1079 3094 3867 1120

галактуроназная, пектинлиазная), так и по содержанию ферментов, катализирующих гидролиз некрахмальных полисахаридов (целлюлолитические ферменты). Наиболее высокие пекто-литические активности (полигалак-туроназа, пектинэстераза) отмечены в препарате Пектиназа МА, при этом препарат не содержит ферментов ли-азного действия.

Высокоактивная пектинлиаза обнаружена в препаратах Пектиназа 1, Пектиназа 2. Препарат БипБоп выделялся из ряда исследуемых препаратов наибольшей целлюлолитической активностью ферментного белка.

С целью выявления наиболее эффективного состава ферментного комплекса для обработки растительного сырья необходимо исследовать действие ферментных препаратов непосредственно на сырье (плодах мандарина). Поэтому на первом этапе работы были проведены исследования для изучения специфичности действия препаратов с различным

составом пектолитического комплекса для гидролиза мандариновой мякоти.

Ферментативную обработку проводили после измельчения мандариновой мякоти при температуре процесса 50 °С в течение 2 ч при периодическом перемешивании. Для оценки эффективности препаратов при гидролизе мандариновой мякоти изучали выход полученных экстрактов, а также их биохимические показатели: концентрацию экстрактивных веществ [растворимых сухих веществ (РСВ)] с использованием рефрактометра, нарастание редуцирующих сахаров (РВ) методом Вознесенского, белковых веществ методом Лоури (рис. 2) [14, 15]. В качестве контроля рассматривали показатели экстракта, полученного без введения ферментов.

Все используемые в ходе работы ферментные препараты пектиназ привели к увеличению выхода сока-самотека на 12-27% по сравнению с контрольным образцом, при этом

140 -г

130 -

80 -

70 "

60 -

50

Контроль Pectase KDN Пектиназа МА Sunson Пектиназа 1 Пектиназа 2 Extrapect Extrapect Extrapect Aumgeme

Color Press Super Clar

Ц РСВ Концентрация РВ Выход сока-самотека Концетрация белковых веществ

Рис. 2. Влияние пектолитических комплексов на изменение показателей получаемых экстрактов из мандариновой мякоти

2 120 -

110 -

100 -

90 "

150 -г

130 -

110 -

90 -

70 "

tiiiihii

50

Sunson Sunson + Sunson + Пектиназа 1 Пектиназа 1 + Пектиназа 1 + Пектиназа 2 Пектиназа 2 + Пектиназа 2 +

+ Брюзайм + Целловиридин + Брюзайм + Целловиридин + Брюзайм + Целловиридин

Ц Выход сока-самотека РСВ РВ Концетрация белковых веществ Ц Динамическая вязкость

Рис. 3. Влияние состава МЭК на биохимические показатели мандариновых экстрактов

наибольший выход отмечали после использования препаратов Пектиназа 1, Пектиназа 2, Extrapect Super Clar (на 24-27% выше контроля).

Содержание экстрактивных веществ (РСВ) в полученных соках увеличилось на 4,7-15,5% в сравнении с контрольным образцом, при этом наибольший выход РСВ отмечен после использования препарата Sunson, отличающегося от остальных пекти-наз наибольшей целлюлолитической активностью. Аналогичные результаты получены при оценке выхода редуцирующих сахаров, которые, в свою очередь, отражают деструктивное воздействие изученных ферментных препаратов на полисахариды в составе растительной ткани. Наибольший выход отмечен при действии препаратов Sunson (на 27,5% выше контрольного образца), а также Пектиназа 1 и Пектиназа 2 (на 17-18 % выше контроля), что, безусловно, связано с наличием целлюлаз в составе данных комплексов.

Исследовано влияние ферментных препаратов на выход белковых веществ в экстракт, которое может вызывать ухудшение органолепти-ческих показателей полученных соков в процессе хранения [8]. Используемые ферментные препараты пектолитического действия не проявили значительного влияния на изменение белковых веществ в составе мандариновой мякоти, концентрация белковых веществ в соках находилась на уровне контроля (см. рис. 2).

Для получения стабильно прозрачного готового продукта необходимо

частично разрушить коллоидную систему, удалив из сока часть пектиновых, белковых и других веществ коллоидной степени дисперсности. Многочисленные работы доказывают неоднозначный и сложный механизм гидролиза целлюлозы растительного сырья ввиду строгой специфичности к субстрату индивидуальных ферментов [9]. Поэтому предобработку сырья целесообразно проводить путем использования мультиэнзим-ных композиций (МЭК), состоящих из строго подобранных ферментов индивидуально для каждого вида сырья.

В связи с вышеизложенным на следующем этапе работы подбирали состав эффективной МЭК для деструкции мандариновой мякоти для получения осветленных соков. В качестве источников пектолитических комплексов были выбраны препараты, проявившие наиболее эффективное действие непосредственно на мандариновой мякоти, а именно БипБоп, содержащий комплекс гидролаз и лиазу, Пектиназа 1. Для дополнительного воздействия на полисахариды в составе клеточных стенок сырья использовали препараты с высоким уровнем целлю-лолитической активности Целловиридин (Trichoderma viride) и Брюзайм (Trichoderma longibrachiatum). В качестве контроля рассматривали традиционный способ получения сока (без использования ферментных препаратов). Результаты представлены на рис. 3.

Наибольшее увеличение выхода сока-самотека как фактора, отража-

ющего деструктивное воздействие ферментов на клеточные стенки растительного сырья, удалось достигнуть при совместном использовании комплексов пектиназ с Целловиридином (на 25-33% больше контрольного). При этом количество выделенных экстрактивных веществ (РСВ) увеличилось при использовании Пекти-назы 1 и Пектиназы 2 с Целловиридином (на 8 и 14% выше контрольного соответственно), а редуцирующих сахаров на 34 и 32% соответственно.

Снижение динамической вязкости (фактора, отражающего содержание коллоидных форм полимеров) отмечали во всех опытных образцах. Вязкость соков, обработанных ферментативными комплексами, снижалась на 38-47,5% по сравнению с контрольным образцом (см. рис. 3).

Однако использование выбранных мультиэнзимных систем привело к увеличению выхода белковых веществ в сок. Как было сказано ранее, присутствие белков в экстрактах может привести к ухудшению показателей соков в процессе хранения. Для исключения данного явления, а также для более полной деструкции белковых полимеров в мандариновой мякоти в состав МЭК вводили проте-олитический ферментный препарат. Так как выбранный объект исследования (мандариновая мякоть) отличается низким значением рН, в качестве источника протеаз использовали комплексный препарат, содержащий пептидазы и протеиназы с оптимумом действия в кислой зоне рН, — Амило-протооризин (АП) [16].

4 • 2013 ПИВО и НАПИТКИ 21

140 -

120 -

100 -

80 "

60 "

160 -г

130 -120 -

100 -90 -

60 -

50

Sunson Sunson + Sunson + Пектиназа 1 Пектиназа 1 + Пектиназа 1 + Пектиназа 2 Пектиназа 2 + Пектиназа 2 +

Целловиридин + Целловиридин + + Целловиридин + Целловиридин + + Целловиридин + Целловиридин +

+ АП + АП + АП

Выход сока-самотека РСВ

РВ

Рис. 4. Влияние различных МЭК на биохимические показатели мандариновых соков

На следующем этапе работы исследовали влияние различных ферментативных комплексов, содержащих пектиназу, целлюлазу, протеазу, на биохимический состав полученных экстрактов. Конструирование МЭК проводили на основе выбранных на предыдущем этапе исследования пектолитических ферментных препаратов, в качестве источника цел-люлаз использовали препарат Цел-ловиридин. Результаты представлены на рис. 4.

Таким образом, подобрана эффективная МЭК для деструкции полимеров мандариновой мякоти, содержащая комплекс ферментов, гидролизующих пектиновые вещества (пектинлиаза, пектинэстераза, эндополигалактуроназа), а также целлюлолитические и протеолити-ческие ферменты, позволяющая увеличить выход сока-самотека на 57%, экстрактивных веществ на 31%, редуцирующих сахаров на 40%, также снизить вязкость на 47,6% по сравнению с традиционной технологией переработки плодов мандарина для получения осветленного сока.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ларина, Т. Н. Тропические и субтропические плоды: справочник товароведа/Т. Н. Ларина. — М.: ДеЛи принт, 2002. — 255 с.

2. Оптимизация процессов ферментации плодово-ягодного сырья с целью получения соков и морсов для ликероводоч-ного производства/Л. В. Римарева [и др.] // Тезисы Международного научно-

практического симпозиума «Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК». — М., 2004. — 248 с.

3. Курбатова, Е. И. Подбор комплексной ферментативной системы для эффективной мацерации плодово-ягодного сырья в ликероводочном производстве/Е. И. Курбатова, Л. В. Римарева, В. В. Трифонова // V Международная научно-практическая конференция «О состоянии и направлениях развития производства спирта этилового из пищевого сырья и ликероводочной продукции». — М., 2005. — 349 с.

4. Римарева, Л. В. Подбор оптимальных муль-тиэнзимных систем и условий биокаталаза полимеров плодово-ягодного сырья с целью повышения качества соков и морсов — полуфабрикатов изделий/Л. В. Ри-марева, Е. И. Курбатова, В. В. Трифонова // Сб. научных трудов «Микробные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК. — М.: ВНИИПБТ, 2006. — С. 208-228.

5. Курбатова Е. И. Влияние мультиэнзим-ных систем на деструкционные процессы плодово-ягодного сырья при получении соков и морсов для ликероводочного про-изводства/Е. И. Курбатова, Л. В. Римарева // Материалы международной научно-практической конференции. — М., 2008. — 235 с.

6. Поляков, В. А. Перспективность использования ферментативных систем направленного действия при деструкционных изменениях плодово-ягодного сырья в ли-кероводочной промышленности/В. А. Поляков, Л. В. Римарева, Е. И. Курбатова // Сб. научных трудов «Микробные биокатализаторы и их роль в нано- и биотехнологиях». — М., 2008. — С. 230-238.

7. Румянцева, Г. Н. Биокатализ: концепция и практическое изпользование: учеб. пособие/Г. Н. Румянцева, Н. И. Дунченко. — М.: ДеЛи принт, 2010. — 118 с.

8. Шобингер, У. Фруктовые и овощные соки: научные основы и технологии/У. Шобингер; пер. А. Ю. Колеснова, Н. Ф. Бересте-ня и А. В. Орещенко. — СПб.: Профессия, 2004.

9. Бутова, С. Н. Биотехнологическая деградация отходов растительного сырья/С. Н. Бутова. — М.: Типография Россельхозакаде-мии, 2004. — 320 с.

10. Análisis de productos obtenidos de los desechos derivados de la extraccion de jugo de cuatro especies de citricos que se cultivan en Yucatan./C. E. M. Quijano [et al.] // Universidad Autónoma de Yucatán. — 1995. — 153 р.

11. Mililnd, S. L. Citrus fruit, Biology, Techonology and Evaluation/S. L. Mililnd. — Goa, India: Elsevier, 2008. — 574 p.

12. ГОСТ20264.3—81. Препараты ферментные. Методы испытаний.

13. Синицын, А. П. Биоконверсия лигноцел-люлозных материалов/А. П. Синицын, А. В. Гусаков, В. А. Черноглазов. — М.: МГУ, 1995. — 144 с.

14. Юркевич, В. В. Малый практикум по биохимии/В. В. Юркевич. — М.: Изд-во Московского университета, 1998. — 125 с.

15. Protein measurement with folin phenol reagent/O. H. Lowery [et al.] // J. Biol. Chem. — 1951. — V. 193. — № 1. — P. 265275.

16. Пат. № 2315096 С1 Российская Федерация. Штамм гриба Aspergillus oryzae — продуцент комплекса протеиназ, пептидаз, Р-глюканазы, а-амилазы и ксиланазы/ Л. В. Римарева, М. В. Оверченко, К. А. Морозова. Опубл. 20.01.2008. — 6 с. <S

150 -

140 -

80 -

70 -