Фармацевтический аэрозольный состав поливалентного действия
PHARMACEUTICAL AEROSOL COMPOSITION OF POLYVALENT ACTION

Описание изобретения
Настоящее изобретение относится к медицине. Изобретение раскрывает аэрозольный состав для применения в аэрозольных устройствах различных типов, в которых применяется принудительный способ распыления состава для получения аэрозоля с различным размером частиц в зависимости от целей и мишени воздействия генерируемым аэрозолем.
Известны аэрозольные системы, в которых движущей выталкивающей силой служит фторкарбоновый пропеллент 134А или 227, находящийся под давлением в устройстве с клапаном [Терехова, 2014]. Для таких пропеллентных устройств на основе ингибиторов протеаз разработаны фармацевтические аэрозольные составы, в которую входят три компонента пропеллентной систем, а именно: пропеллент, этанол и глицерин, на долю которых приходится более 95% аэрозольного состава, так называемая система «Модулит», [Ganderton et ah 2002; Патенты РФ №2657523; №2711080]. Пропеллентные аэрозольные системы на основе ингибиторов протеаз могут быть приготовлены только определенным способом, чтобы добиться гомогенного смешивания с компонентами пропеллентной выталкивающей системы [Патент РФ №2657523, патент ЕАПО 034991]. Разработанные пропеллентные системы не могут использоваться в аэрозольных устройствах, таких как эжекторные, ультразвуковые небулайзеры, портативные системы «мягкого облака» и мембранного типа Micro-Air «Омрон» (устройство «смэш»), которые могут работать на растворах, не содержащих пропеллентов.
Не разработаны аэрозольные составы на основе водных растворов ингибиторов протеаз, которые скомбинированы с активными веществами, воздействующими на различные мишени патологического процесса при заболеваниях, вызванных вирусами, бактериями, токсинами и другими патологическим агентами, а также, разнообразными формами воспаления и нарушения метаболизма. Не было известно, будут ли такие смеси разнородных фармацевтических веществ смешиваться с ингибиторами протеаз и сохранять свои биологические и фармакологические свойства после распыления и перехода в аэрозольную фазу и при этом не подавлять и не денатурировать друг друга. В настоящем изобретении впервые созданы аэрозольные составы поливалентного фармацевтического действия на основе водного раствора ингибиторов протеаз и их комбинаций с включением в состав дополнительных фармацевтических активных веществ, подавляющих воспаление,
образование оксидных радикалов и патогенез заболевания, а также добавлением веществ, блокирующих размножение вирусов и бактерий, для использования разработанных поливалентных составов в аэрозольных устройствах непропеллентного типа.
Технический результат разработанных аэрозольных составов обусловлен решением следующих задач. (1) Разработанные мультикомпонентные аэрозольные составы делают более удобным процесс лечения, когда при одной процедуре пациент получает комбинированный курс нескольких лекарств неинвазивного типа поливалентного фармакологического действия. (2) Разработанный поливалентный аэрозольный состав повышает фармакологический эффект используемых активных веществ, так как оказывают биологическое действие на несколько мишеней в патогенезе заболевания при более низких концентрациях, чем при индивидуальном применении отдельного вещества и позволяет получить фармакологический эффект в тех случаях, когда при применении индивидуального лекарства такой эффект не возможен. (3) Использование комбинаций активных веществ в аэрозольном составе позволяет снизить лечебные дозы, что, в свою очередь, понижает риск возникновения токсичности от побочных нежелательных реакций их действия на организм. (4) Применение двух и более активных веществ, направленных на различные мишени патогенеза болезни и различные этапы размножения вирусов, бактерий и простейших патогенных организмов, снизит риск возникновения мутантных форм этиологического агента с повышенной вирулентностью для организма и предотвращает возникновение вторичных осложнений. (5) Разработанные аэрозольные составы на водной (непропеллентной) основе дают новые возможности для их универсального медицинского использования против заболеваний с различной локализацией патологического процесса, включая кожные покровы, респираторный тракт, кишечник, органы зрения, органы слуха и т.п., когда пропеллентные аэрозольные составы применяться не могут из-за побочной токсичности пропеллентов для слизистых оболочек организма. (6) Разработка аэрозольных составов на водной основе позволяет исключить побочную токсичность, обусловленную высокой концентрацией компонентов, таких как пропеллент и этанол, необходимых для работы выталкивающей системы, используемой в аэрозольных составах на основе фторкарбоновых пропеллентов. (7) На основе ингибиторов протеаз разработан состав, содержащий активный инфекционный вирус или его субвирусные компоненты (внутренний нуклеокапсид, наружная вирусная мембрана, белковые комплексы и др.), отличающийся повышенной стабильностью и фармакологической активностью вируса и его компонентов, что создает новую лекарственную форму комбинированного лекарства в зависимости от локализации очага при лечении опухолей с помощью ингибиторов протеаз и вирусов, так называемой онколитической виротерапии, а также для приготовления, стабилизации и применения белок содержащих вакцин при инфекционных болезнях различной этиологии и локализации.
Известны многочисленные аэрозольные системы (устройства), в которых движущей выталкивающей силой служит механическое (эжекторные) или ультразвуковое возбуждение состава и дополнительное мембранное распыление (типа "smash") в ряде устройств. К таким устройствам относятся стационарные небулайзеры эжекторного или ультразвукового типов, и ручные ингаляторы механического типа «респимат» или ручные ингаляторы мембранного типа Micro-Air «Омрон» [Терехова, 2013]. При открытии клапана и при запуске аэрозольного возбуждения происходит выталкивание аэрозольного состава и его распыление, так называемое генерирование аэрозоля. Для всех без исключения типов устройств применим разработанный аэрозольный состав поливалентного патогенетического фармакологического действия. Более того, аэрозольный состав на основе ингибиторов протеаз в комбинации с противовирусными, противомикробными и противовоспалительными веществами применим для обширного круга болезней, в которых имеет место нарушение протеазного и окислительного баланса в сочетании с вирусной и бактериальной инфекцией при таких заболеваниях, как грипп, коронавирусная инфекция, респираторно-синцитиальньш бронхиолит, муковисцидоз, респираторная инфекция вирусами парагриппа, хроническая обструктивная болезнь легких, астма, герпетическая болезнь кожных покровов и глаз, кожные и глазные деструктивные поражения при аденовирусной и бактериальной инфекции, деструктивного воспаления, возникающего при полостных хирургических операциях, образование опухоли и ее метастазов и т.д. Помимо прямого патогенетического и лечебного действия, ингибиторы протеаз будут оказывать стабилизирующее фармакологическое действие на активные фармацевтические вещества белковой природы, такие как противовирусные антитела, антитела против цитокинов, цельно вирионные и субъединичные вирусные и бактериальные вакцины и др., поскольку могут инактивировать протеазы, способные инактивировать вирус и разрушать белковые активные вещества как в аэрозольном составе, так и в реципиентом организме и особенно в местах их первоначального контакта с организмом.
Вместе с тем, в изобретении для более эффективного растворения и предотвращения агрегации и взаимной инактивации используемых активных веществ, часть из которых может иметь пониженную растворимость в водном растворе, а также для их стабилизации в аэрозольном составе, в аэрозольном облаке и очаге действия (органе, ткани, отдельных типах клеток и т.п.) предлагается дополнительное включение добавок в аэрозольный состав буферных солевых растворов сорастворителей и поверхностно-активных веществ из группы сурфактантов или органических растворителей, таких как твин-20, твин-80, спан-20, спан-80, нонидет-Р40, тритон Х-100, тритон Х-101, бета-октилглюкозид, этанол, диметилсульфоксид, бензалкониум, этанол, глицерин и другие. Для повышения лечебных и органолептических свойств аэрозольный состав может содержать растительные экстракты, такие как, масло мяты, настой мелисы, настой термопсиса, лютеолин и др. Композиция может быть в виде раствора на водной основе, мелкодисперсной суспензии или коллоидного раствора, но преимущественно в виде раствора.
Решение поставленных целей достигается посредством комбинированного аэрозольного состава и следующих подходов его получения.
• Фармацевтический аэрозольный состав поливалентного действия на основе ингибиторов протеаз для устройств с аэрозольным распылением непропеллентного типа, отличающийся тем, что содержит ингибитор протеаз или их комбинации, выбранных из группы апротинин, леупептин, серпин, ингибитор металлопротеаз, камостад, в водо-содержащем растворе в диапазоне рН 4,0-9,0 с концентрацией активных веществ 0,001 мкг - 100 мг на мл состава, который дополнительно содержит активные вещества с иным механизмом фармакологического или патогенетического действия или их комбинации, а именно: гидролитических ферментов, выбранных из группы трипсин, гиалуронидаза, хемаза, каспаза, противовирусных веществ, выбранных из группы ремантадин, осельтамивир, рибавирин, фавипиравир, противовирусные антитела, противомикробных веществ, выбранных из группы тобрамицин, колистин, гентамицин, тетрациклин, противовоспалительных веществ, выбранных их группы ацетилсалициловая кислота, интерферон, антитела против цитокинов, супероксиддисмутаза, вирусы и субвирусные компоненты, выбранные из группы вирусы гриппа, парамиксовирусы, тогавирусы, флавивирусы, пикорнавирусы, аденовирусы, вирусы осповакцины, коронавирусы, вирус герпеса в конечной концентрации 0,001 мкг - 100 мг на мл состава, предназначенный для генерирования аэрозоля с дисперсностью аэрозольных частиц 0,1-300 мкм.
• Состав по п. 1 отличается тем, что водный раствор активного вещества дополнительно содержит поверхностно активные сорастворители, преимущественно твин-20, твин-80, спан-20, спан-80, бета-октилглюкозид, диметилсульфоксид, глицерин, этанол, полиэтилен гликоль, бензалкониум, в концентрации 0,0001% и более.
• Состав по п. 1 отличается тем, что содержит солевой буферный раствор преимущественно хлорид натрия, одно- и двузамещенные натриевые-калиевые соли фосфорной кислоты, соли салициловой кислоты, в концентрации 0,1 мкМ и более.
• Состав по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно содержит добавки растительного происхождения и растительных экстрактов, преимущественно масло мяты, настой мелисы, настой термопсиса, лютеолин, дигидрокверцитин в концентрации 0, 0001% по объему и более.
Разработка стабилизированных аэрозольных составов комбинированного типа, содержащих активные вещества белковой природы, созданных методами генетической инженерии, представляет быстро развивающееся направление в современной медицинской аэрозольной биотехнологии, актуальность которого особенно возрастает в эпоху возникновения новых вирусных пандемий глобального масштаба и эпидемического роста онкологических заболеваний в мире.
Примеры реализации изобретения
Пример 1.
Полипептидные ингибиторы протеаз медицинского назначения и их комбинации.
Пример иллюстрирует список различных ингибиторов протеаз полипептидной природы, а также антипротеазных олигопептидов, состоящих из двух и более аминокислотных остатков, их модифицированных производных или их комбинаций, а также ингибиторы протеаз небелковой природы, которые растворяют в водно-содержащих растворах предлагаемого фармацевтического аэрозольного состава, приготовленного согласно изобретению, для использования в качестве активного компонента в аэрозольных системах непропеллентного типа. Указанные ингибиторы протеаз могут применяться у людей и животных для коррекции патологических процессов и воспаления различной этиологии и патогенеза инфекционной, иммунной, деструктивной, онкологической природы, ингибирования опухолей и ее метастазов, усиления стабильности белковых и пептидных соединений в растворах и реципиентом организме.
Перечисленные антипротеазные ингибиторы используют в аэрозольном составе в комбинации с фармацевтическими веществами, имеющими другой механизм противовирусного и лечебного патогенетического действия. В группу дополнительных (комбинированных) фармацевтически активных веществ включены преимущественно римантадин, рибавирин, фавипиравир, занамивир, триазавирин (группа триазидов), интерферон, ацетилсалициловая кислота, аллопуринол, фамотидин, тетрациклин, лютеолин, тобрамицин, колистин, гентамицин, антитела различной специфичности, вирусы, протеазы различной специфичности и др.
Пример 2.
Комбинированный аэрозольный состав апротинина (ингибитор протеаз) и рибавирина (антивирусное вещество).
Готовили серию растворов, содержащих различные концентрации апротинина и рибавирина, как указано в табл. 2. Для приготовления составов использовали буферный раствор, содержащий (3,3 mM Na2HPO4/NaH2PO4 рН 7,2; 0,9 тМ KCl; 45 тМ NaCl) (ФБ/3), в который добавляли последовательно белок апротинина и вещество рибавирина до соответствующих конечный концентраций.
После приготовления состав вносили в капсулу объемом 4,0 мл для аэрозольного устройства мягкого облака («Респимат»). Далее проводили генерирование аэрозоля посредством 30 пусков. Образовавшееся аэрозольное облако собирали посредством его конденсирования в стеклянную пробирку объемом 10 мл. Сформировавшийся конденсат облака собирали посредством центрифугирования при 1500 об/мин в течении 3 мин. В результирующем конденсате определяли количественное содержание и фармакологические и биологические активности апротинина и рибавирина по их способности ингибировать трипсиновую протеазу (для апротинина) и по способности тормозить размножение вируса гриппа в культуре клеток кишечника человека СаСо-2 (для апротинина и рибавирина). Полученные результаты показаны на Фиг. №1-№5.
Пример 3.
Комбинированный аэрозольный состав леупептина (ингибитор протеаз) и фавипиравира (антивирусное вещество).
Готовили серию растворов, содержащих различные концентрации леупептина и фавипиравира, как указано в табл. 3. Для приготовления составов использовали буферный раствор ФБ/3, в который добавляли последовательно белок леупептин (ингибитор протеаз) и вещество фавипиравира (антивирусное вещество) по прописи согласно таблице 3 до соответствующих конечных концентраций.
После смешивания компонентов аэрозольный состав вносили в капсулу объемом 4,0 мл для аэрозольного устройства мягкого облака («Респимат»). Далее проводили генерирование аэрозоля посредством 30 пусков. Образовавшееся аэрозольное облако собирали посредством его конденсирования в стеклянную пробирку объемом 10 мл. Сформировавшийся конденсат облака собирали посредством центрифугирования при 1500 об/мин в течении 3 мин. В результирующем конденсате определяли количественное содержание и фармакологические и биологические активности леупептина и фавипиравира по их способности ингибировать трипсиновую протеазу (для леупептина) и по способности тормозить размножение коронавируса (штамм KV92) в культуре клеток кишечника человека СаСо-2 (для леупептина и фавипиравира). Полученные результаты показаны на фиг. №6 и №7.
Исследование фармакологической активности аэрозоля леупептина и фавипиравира проводили в культуре клеток млекопитающих, инфицированных коронавирусом по его накоплению в культуральной жидкости в клеточной культуре кишечника человека в присутствии аэрозольного состава. Накопление вируса оценивали методом титрования по гемагглютинирующей активности с мышиными эритроцитами, что характерно для вирусов семейства коронавирусов. формирующихся под действием патогенных коронавирусов животных и человека. Данные такого тестирования приведены на фиг. №7.
Пример 4.
Ингибирование размножения коронавируса аэрозольным составом, содержащим ингибиторы протеаз и антивирусные вещества и их комбинации.
Аэрозольные составы ингибиторов протеаз (апротинин и леупептин) в комбинации с антивирусными веществами, а именно: фавипиравиром, рибавирином готовили на фосфатном буферном растворе ФБ/3, содержащем 0,05% ДМСО. Далее производили распыление в устройстве мягкого облака Респимат, собирали и осаждали аэрозольный конденсат, который добавляли в клеточную питательную среду и вносили начальную дозу коронавируса (штамм KV92), равную 0,001 ФОБ на клетку, и инкубировали при 36,5 град С в CO2-атмосферном инкубаторе. Через 48-72 часов после инкубации исследовали фармакологическое действие аэрозольного состава по уровню накопления вируса в культуральной жидкости клеток.
Для тестирования фармакологической активности аэрозоля ингибиторов протеаз и их комбинаций с веществами иного механизма действия исследовали размножение коронавируса (штамм KV92) в культуре клеток млекопитающих. Уровень подавления вируса оценивали по снижению вирусного накопления в культуральной среде, используя для этого тест вирусной гемагглютинации эритроцитов мыши методом двух-кратных разведений. Результаты показаны на фиг. 8.
Пример 5.
Фармакологическая активность комбинированного аэрозольного состава, содержащего ингибиторы протеаз, антивирусные вещества, растительное вещество.
Комбинированный аэрозольный состав, содержащий апротинин (ингибитор протеаз) 50 мкгр/мл, лютеолин (растительный экстракт, ингибитор протеаз) 10 мкгр/мл, рибавирин (антивирусное вещество) 25 мкгр/мл, детергент твини-20 (10 мкгр/мл), масло мяты 1 мкгр/мл) и глицерин 0,3%, готовили на буфере ФБ/3. Далее производили распыление в устройстве мягкого облака Респимат, собирали и осаждали аэрозольный конденсат.Фармакологическую активность полученного аэрозольного конденсата исследовали по подавлению размножения коронавируса в культуре клеток почки быка (линия MDBK), ингибированию активности трипсина.
Конденсат добавляли в клеточную питательную среду и вносили начальную дозу коронавируса (штамм KV92), равную 0,001 ФОБ на клетку, и инкубировали при 36,5 град С в CO2-атмосферном инкубаторе. Через 48-72 часов после инкубации исследовали фармакологическое действие аэрозольного состава по уровню накопления вируса в культуральной жидкости клеток. Уровень подавления вируса оценивали по снижению вирусного накопления в культуральной среде, используя для этого тест вирусной гемагглютинации эритроцитов мыши методом двух-кратных разведений.
Антипротеазную активность аэрозольного конденсата тестировали по ингибированию трипсина. Для этого стандартный раствор трипсина смешивали с аэрозольным конденсатом и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. После инкубации смеси конденсата с трипсином определяли остаточную активность трипсина методом гидролитического расщепления хромогенного субстрата L-ZAPA (Z-Arg-pNA), ведущего к образованию окрашенного соединения нитроанилида (NA), которое регистрируется при длине волны 405 нм (ОП/405). Для тестирования в исследуемую смесь вносят субстрат L-ZAPA (25 мкл раствора с концентрацией 1 мг/мл), инкубируют 15 мин при 20 град. С, гидролитическую реакцию останавливают добавлением 25 мкл 1М раствора соляной кислоты и измеряют величину ОП/405, которая показывает уровень остаточного активного (не ингибированного) трипсина. Результаты показаны в таблице 4.
(1) Фармакологическое действие на вирус оценивали по ингибированию размножения коронавируса в культуре клеток млекопитающих. Размножение вируса определяли по титру вируса в культуральной жидкости методом агглютинации эритроцитов мыши. Обозначения: «+» - титр вируса 1/4000 и выше; «+/-» - титр вируса 1/32 и ниже (ингибирование более 10 раз).
(2) Фармакологическое действие аэрозольного состава по ингибированию гидролитической активности протеаз. Аэрозольный конденсат тестировали методом ингибирования гидролитического расщепления хромогенного субстрата L-ZAPA (Z-Arg-pNA) трипсином, которое регистрируется по нарастанию окрашивания инкубационной смеси в случае отсутствия активных ингибиторов протеаз в аэрозольном составе. Оценку окрашивания проводят при длине волны 405 нм (ОП/405). Обозначения: «+» - эффективное расщепление субстрата исходным раствором трипсина; «-» - отсутствие регистрируемой активности трипсина в инкубационной смеси.
Пример 6
Фармакологические свойства комбинированного аэрозольного состава, содержащего ингибитор протеаз, антивирусное вещество, сорастворитель
Комбинированный аэрозольный состав, содержащий камостад (ингибитор протеаз) 15 мкгр/мл, осельтамивир (антивирусное вещество) 10 мкгр/мл, детергент твини-20 (2 мкгр/мл), масло мяты 0,5 мкгр/мл) и глицерин 0,3%, готовили на буфере ФБ/3. Далее производили распыление в эжекторном устройстве Бореаль, собирали и осаждали аэрозольный конденсат.Фармакологическую активность полученного аэрозольного конденсата исследовали по подавлению размножения вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) в культуре клеток кишечника человека (линия Сасо-2) и ингибированию активности трипсина.
Конденсат добавляли в клеточную питательную среду и вносили начальную дозу вируса гриппа, равную 0,001 ФОБ на клетку, и инкубировали при 36,5 град С в CO2-атмосферном инкубаторе. Через 72 часа после инкубации оценивали фармакологическое действие аэрозольного состава по уровню накопления вируса в культуральной жидкости клеток. Уровень подавления вируса оценивали по снижению вирусного накопления в культуральной среде, используя для этого тест вирусной гемагглютинации эритроцитов человека группы 1(0) методом двух-кратных разведений.
Антипротеазную активность аэрозольного конденсата тестировали по ингибированию трипсина. Для этого стандартный раствор трипсина смешивали с аэрозольным конденсатом и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. После инкубации смеси конденсата с трипсином определяли остаточную активность трипсина методом гидролитического расщепления хромогенного субстрата L-ZAPA (Z-Arg-pNA), ведущего к образованию окрашенного соединения нитроанилида (NA), которое регистрировалось при длине волны 405 нм (ОП/405). Для тестирования в исследуемую смесь вносили субстрат L-ZAPA (25 мкл раствора с концентрацией 1 мг/мл), инкубировали 15 мин при 20 град. С, гидролитическую реакцию останавливали добавлением 25 мкл 1М раствора соляной кислоты и измеряли величину ОП/405, показывающую уровень остаточного активного (не ингибированного) трипсина. Результаты показаны в таблице 5.
(1) Фармакологическое действие на вирус оценивали по ингибированию размножения коронавируса в культуре клеток млекопитающих. Размножение вируса определяли по титру вируса в культуральной жидкости методом агглютинации эритроцитов мыши. Обозначения: «+» - титр вируса 1/4000 и выше; «+/-» - титр вируса 1/32 и ниже (ингибирование более 10 раз).
(2) Фармакологическое действие аэрозольного состава по ингибированию гидролитической активности протеаз. Аэрозольный конденсат тестировали методом ингибирования гидролитического расщепления хромогенного субстрата L-ZAPA (Z-Arg-pNA) трипсином, которое регистрируется по нарастанию окрашивания инкубационной смеси в случае отсутствия активных ингибиторов протеаз в аэрозольном составе. Оценку окрашивания проводят при длине волны 405 нм (ОП/405). Обозначения: «+» - эффективное расщепление субстрата исходным раствором трипсина; «-» - отсутствие регистрируемой гидролитической активности трипсина в инкубационной смеси.
Пример 7.
Фармакологическая активность аэрозольного состава ингибитора протеаз и бактериального антибиотика.
Бактерии E.Coli (штамм НВ110; XL1) культивировали в бульоне LB в течении 2 часов. Далее полученную культуру делили на 2 части. Одну часть смешивали с конденсатом аэрозольного состава в соотношении 3:1 и продолжали инкубацию при 33 град. С в течении 2 часов, после чего измеряли оптическую плотность суспензии, что отражало рост микробов. Полученные величины оценивали следующим образом: «+» - прирост ОП на 0,5 ЕД и более; «+/-» - средний уровень прироста плотности не более 0,2 ЕД; «-» - низкий уровень отсутствие прироста. Во второй части суспензии микробов осаждали при 6000 об/мин в течении 20 мин, микробный осадок суспендировали в ФБ/3 и микробы разрушали ультразвуком (Соникатор DVE/модель GS (Германия); 3 цикла по 15 сек каждый в ледяной бане). Бактериальные гомогенаты смешивали с равным объемом аэрозольного конденсата и определяли гидролитическую активность смеси по расщеплению хромогенного субстрата L-ZAPA (Z-Arg-pNA), как описано в разделе 3. Результаты оценивали по следующей шкале:
«+» - сильная гидролитическая активность в контрольной пробе без конденсата 100%;
«+/-» - средняя активность не более 30%; «-» - слабая активность не более 10%. Полученные результаты представлены в табл. 6.
(*) Аэрозольные составы готовили на ФБ/3 с концентрациями активных веществ: леупептин (ЛЕУ) (10 мкгр/мл), тетрациклин (ТЕТ) 20 мкгр/мл), апротинин (АПР) (30 мкгр/мл).
Приведенные результаты показывают, что при распылении аэрозольного состава ингибитора протеаз и бактериального антибиотика сохраняется фармакологическая активность обоих активных компонентов аэрозольного состава и не происходит взаимной инактивации активных веществ в комбинированном аэрозольном составе. Результирующий аэрозоль имеет мультивалеитное фармакологическое действие.
Пример 8.
Фармакологическая активность аэрозольного состава, содержащего ингибитор протеаз, бактериальный антибиотик и сорастворитель.
Кишечная палочка (E.Coli) штамм НВ101, либо XL1 выращивали в бульоне LB (содержит 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl на 1 литр среды) в течение 2 часов при 33 град. С.Далее одну часть микробной суспензии смешивали с конденсатом аэрозольного состава в соотношении 3:1 и продолжали инкубацию при 33 град. С в течении 2 часов, после чего измеряли ОП суспензии, как показатель роста микробов. Вторую часть микробной суспензии осаждали при 6000 об/мин в течении 20 мин, микробный осадок суспендировали в ФП/3 и микробы разрушали ультразвуком (Соникатор DVE/модель GS (Германия); 3 цикла по 15 сек в ледяной бане). Бактериальные гомогенаты смешивали с равным объемом аэрозольного конденсата и определяли протеазную активность смеси по расщеплению хромогенного субстрата - N-а-бензоил-DL-аргинин-4-нитроанилида (БАПНА), который при расщеплении приобретает окраску, которую регистрируют по интенсивности окрашивания при длине волны 405 нм. Результаты оценивали по следующей шкале: «+» - сильная протеазная активность в контрольной пробе без конденсата, 100%; «-» - слабая активность не более 20% по сравнению в контрольной пробой. Полученные результаты представлены в таблице 7.
(*) Аэрозольные составы готовили на ФБ/3 с указанными концентрациями активных веществ: леупептин (ЛБУ) (10 мкгр/мл), гентамицин (ГЕН) 15 мкгр/мл), апротинин (АПР) (30 мкгр/мл), с добавлением следующих сорастворителей: глицерин (до конечной концентрации 5%) (смесь №1), твин-20 (до конечной концентрации 0,1%) (смесь №2), диметилсульфоксид - ДМСО (до конечной концентрации 0,05%) (смесь №3).
Полученные результаты показывают совместимость различных по структуре и активности веществ друг с другом и сорастворителями, отсутствие взаимной инактивации при приготовлении аэрозольных составов и при их распылении, сохранение фармакологической активности активных веществ. Результирующий аэрозоль имеет мультивалентное фармакологическое действие.
Пример 9.
Фармакологическая активность аэрозольного состава, содержащего ингибитор протеаз, антивирусное вещество, бактериальный антибиотик и сорастворитель.
Готовили комбинированный аэрозольный состав по схеме, представленной в примере 12 с использованием следующих компонентов: апротинин (100 мкгр/мл), рибавирин (30 мкгр/мл), тетрациклин (20 мкгр/мл). Раствор готовили на буфере ФБ/3, содержащем 1% глицерина. Полученные составы распыляли в устройстве респимат, получали конденсаты и исследовали фармакологические свойства активных веществ. Результат представлены в таблице 8.
(1) Фармакологическое действие на вирус оценивали в тесте ингибирования образования инфекционных фокусов вируса, как описано в примере 3. Обозначения: «+» - ингибирование не более 50 раз; «++» - сильное ингибирование в 100 раз и более.
(2) Фармакологическое действие аэрозольного состава на микробы оценивали по ингибированию роста микроба в жидкой среде, как описано в примере 11. Обозначения: «+» - полное ингибирование роста микроба в присутствии исследуемого аэрозольного конденсата; «+/-» - частичное ингибирование роста микроба до уровня оптической плотности около 0,3 и менее; «-» - отсутствие ингибирующего эффекта на рост микроба, который достигал уровня оптической плотности 1,0 и более.
(3) Защитное действие на клетки-мишени оценивали по снижению цитотоксического (деструктивного) действия парамиксовируса Сендай на монослой клеток почки обезьяны (линия VERO), используя тест клеточного окрашивания трипановым голубым. Обозначения: «++» - выраженное защитное действие, более 50% клеток сохраняют жизнеспособность; «+» - умеренное снижение количества мертвых клеток в монослое до уровня 15-50%; «+/-» - слабое снижение количества мертвых клеток в монослое на уровне 15% и менее; «-» - отсутствие защитного эффекта и практически 100% гибель клеток.
Результаты, представленные в таблице 8, показывают сохранение полного комплекса фармакологических свойств комбинированного аэрозольного состава после его распыления и отсутствие инактивации активных веществ фармацевтической композиции аэрозоля.
Пример 10.
Стабилизация инфекционности вируса в комбинированном аэрозольном составе.
Готовили комбинированный аэрозольный состав, содержащий активный парамиксовирус болезни Ньюкасла (штамм LaSota), приготовленный на растворе ФБ/3, содержащем 5% глицерина. Состав инкубировали 48 часов при температуре 30 град С и помещали в аэрозольное устройство Респимат. Далее генерировали аэрозоль, получали аэрозольный конденсат, который тестировали на наличие инфекционного вируса. Инфекционность вируса определяли методом титрования инфекционных фокусов в культуре клеток почки собаки (клеточная линия МДСК) (таблица 9).
6
(*) Аэрозольный состав готовили на буферном растворе ФБ/3, в который вносили вирус болезни Ньюкасла (ВБН) до титра около 3-6 ×10 инфекционных вирионов в мл аэрозольного состава, глицерин до конечной концентрации 5% и активное вещество ингибитора протеаз апротинин (до концентрации 50 мкгр/мл), леупептин (до концентрации 15 мкгр/мл) либо оба ингибитора в комбинации. Полученные состав помещали в капсулу Респимат, делали 30 выпусков, собирали конденсат и инфекционность вируса определяли методом инфекционных фокусов в культуре клеток МДСК. Фокусы определяли методом иммунного окрашивания специфическими анти-НДВ антителами, как описано выше в примере 2.
(**) Для определения инфекционного титра вируса готовили 10-кратные разведения аэрозольного конденсата, которые вносили в культуру клеток и через 20 часов считали количество вирусных фокусов в клеточном монослое. Количество вируса рассчитывали по числу фокусов на мл объема аэрозольного состава.
Результаты проведенного тестирования указывают на то, что включение в аэрозольный состав ингибиторов протеаз широкого антипротеазного спектра действия (апротинина и леупептина) тормозило инактивацию инфекционных вирусных частиц в аэрозольном составе.
Пример 11.
Фармакологическое действие комбинированного аэрозольного состава по предотвращению формирования вирусных мутантов.
(*) Готовили комбинированный аэрозольный состав на основе раствора ФБ/3, содержащего апротинин, осельтамивир и ацетилсалициловую кислоту согласно следующего соотношения активных веществ: концентрация осельтамивира карбоксилата (ОСТМ) и апротинина (АПР) в аэрозольном составе составляло 2 мкМ и 40 мкгр/мл, соответственно. Использованная низкая концентрация апротинина вызывала частичное торможение размножение вируса гриппа в культуре клеток легкого человека (Calu-3). Действие комбинированного аэрозольного состава проверяли в клеточной культуре инфицированной вирусом гриппа A/PR/8/34 (H1N1) со множественностью около 0,001 ФОБ на клетку. В культуру клеток вносили 2 мл питательной среды с добавлением 70 мкл конденсированного аэрозольного состава, содержащего указанные активные вещества, и инкубировали при 37 град. С. Через 48 часов среду отбирали, смешивали 1 к 10 с новой порцией среды с аэрозольным составом и инкубировали на клеточной культуре 48 часов (пассаж №2). Таким образом, повторяли 6 последовательных пассажей в клеточной культуре Calu-3. После пассажа №3 и №6 клетки окрашивали на наличие вируса с помощью антител, конъюгированных с пероксидазой, красителем ТМБ. Результаты оценивали следующим образом: (-) - отсутствие инфицированных вирусом клеток (полное ингибирование вируса). (+/-) вирусом заражено не более 10% клеток во всем монослое (частичное ингибирование вируса). (+) - все 100% клеток заражены вирусом (появление резистентных штаммов вируса, отсутствие терапевтического эффекта).
Пример 12.
Фармакологическое действие аэрозольного состава ингибитора протеаз и ацетилсалициловой кислоты (АСК).
(*) Готовили комбинированный аэрозольный состав на основе раствора ФБ/3, содержащего апротинин, АСК с соотношением активных веществ, как указано в таблице. Далее полученные составы вносили в устройство мягкого облака, распыляли аэрозоль и готовили конденсат аэрозольного облака, как описано в примере 2. Фармакологическую активность состава исследовали по ингибированию размножения вируса гриппа А в куриных эмбрионах. 9-дневные куриные эмбрионы заражали вирусом гриппа человека A/Aichi/68 введением в аллантоисную полость эмбриона около 1000 вирионов и дополнительно вводили 100 мкл двух кратных разведений конденсированного аэрозольного состава, полученного по прописи в таблице 18. Брали по 5 эмбрионов на одно разведение состава. После 36 часов инкубации эмбрионов при 37 град С отбирали аллантоисную жидкость из куриных эмбрионов и определяли количество синтезированного инфекционного вируса методом инфекционных фокусов в культуре клеток МДСК по количеству вирусных частиц на мл аллантоисной жидкости. В качестве контроля брали эмбрионы, которые заражали вирусом гриппа без введения аэрозольного состава. Определяли концентрацию активных веществ в аэрозольном конденсате, при которой отмечалось 100-кратное снижение титра вируса по сравнению с контролем (эффективная концентрация препарата).
Приведенный пример №12 демонстрируют сохранение противовирусного действия активных веществ в комбинированном аэрозольном составе и синергидное усиление их терапевтического эффекта, который выражается в снижении эффективной лечебной дозы каждого активного вещества и предотвращении возникновения вирусных мутантных вариантов при применении комбинированного аэрозольного состава. Для достижения лечебного противовирусного эффекта требуются концентрации препаратов, которые более чем в 10 раз ниже концентраций при их индивидуальном применении. При применении комбинированного аэрозольного состава достигается снижение лечебной концентрации препаратов и понижение уровня и опасности развития их побочной токсичности.
Пример 13.
Аэрозольный состав вируса с ингибитором протеаз
Готовили аэрозольный состав, содержащий низко инфекционный вируса гриппа, содержащий нерасщепленный гемагглютинин НА0 (м.м. 75 кДа), ингибитор протеаз (апротинин) или протеазу (трипсин) в концентрации 0.7, 250 и 10 мкгр на мл, соответственно. Состав готовили на буфере ФБ/3, содержащем 0,3% глицерина и 0,001% ДМСО. Затем проводили распыление в аэрозольном устройстве Респимат, собирали конденсат аэрозольного облака и исследовали его фармакологическую активность в тесте ингибирования протеазы (трипсина) и в тесте инфицирования клеток млекопитающих вирусом. Результаты приведены на фиг. 19 и в таблице 12.
(*) Готовили комбинированный аэрозольный состав, содержащий вирус гриппа A/Aichi/2/68, выращенный в культуре клеток МДСК, апротинин и трипсин, как указано в таблице. Вирус гриппа подвергали очистке методом осаждения через 30% раствор глицерина, приготовленный на буфере ФБ, при центрифугировании в роторе SW55.1 ультрацентрифуги Spinko L-65 при 25000 об/мин в течение 2 часов при +4 град С. Полученные осадок очищенного вируса суспендировали в буфере ФБ/3 и использовали для приготовления аэрозольного состава. Далее полученные составы вносили в устройство мягкого облака, распыляли аэрозоль и готовили конденсат результирующего аэрозоля. Фармакологическую активность полученных аэрозольных составов исследовали тремя тестами: (1) по ингибированию протеазы; (2) по гидролизу хромогенного протеазного субстрата L-ZAPA (Z-Arg-pNA); (3) по инфекционности в культуре клеток легкого человека (линия клеток Calu-3), как описано в примере 2. Инфекционность вируса определяли методом инфекционных фокусов в культуре клеток Calu-3 с идентификацией вирусных фокусов методом иммунного окрашивания специфическими анти-Aichi антителами, как описано выше в примере 2. В таблице представлен инфекционный титр вируса в 1 мл аэрозольного конденсата.
Полученные результаты показывают совместимость компонентов аэрозольного состава, сохранение фармакологических свойств активных веществ состава и отсутствие взаимного ингибирования активных веществ, стабилизация инфекционности вируса в аэрозольном составе ингибитором протеаз. Аэрозольные составы данного типа могут использоваться для приготовления вирусных вакцин и для местного применения при онколитической виротерапии живыми вирусами различных типов опухолей.
Пример 14.
Комбинированный аэрозольный состав на основе ингибитора протеаз и протеазы иной специфичности.
Готовили аэрозольный состав, содержащий ингибитор клеточных протеаз смерти (каспаз) и протеолитический фермент трипсин (сериновая протеаза) на основе буфера ФБ/3 с 0,1% глицерина. Концентрации активных веществ составляли 10 и 20 мкгр на мл состава для ингибитора каспаз и трипсина, соответственно. Для генерации аэрозоля использовали устройство респимат, производили распыление и собирали конденсат исследуемого состава. Фармакологическую активность конденсата исследовали в тесте ингибирования каспазы 3 человека и трипсина по расщеплению соответствующих субстратов N-a-бензоил-DL-аргинин-4-нитроанилида (БАПНА) для трипсина и Ac-DEVD-pNA для каспазы 3. Реакцию расщепления субстратов соответствующими протеазами оценивали по изменению цвета раствора, которое сопровождается окрашиванием раствора измеряемое по интенсивности поглощения при длине волны 405 нм. Результат показан на Фиг. 10.
Пример 15.
Комбинированный аэрозольный состав, содержащий ингибитор протеаз, супероксиддисмутазу, сорастворитель
Готовили аэрозольный состав, содержащий апротинин (ингибитор протеаз) и супероксиддисмутазу (СОД - фермент утилизации активных форм кислорода и оксидных радикалов) на основе буфера ФБ/3 с 0,03% глицерина. Концентрации активных веществ составляли 250 и 700 мкгр на мл состава для ингибитора протеаз и СОД, соответственно. Для генерации аэрозоля использовали устройство мягкого облака Респимат, производили распыление и собирали конденсат исследуемого состава. Фармакологическую активность конденсата исследовали в тесте подавления цитопатогенного действия (ЦПД) вируса гриппа на клетки легкого человека (линия Calu-3) и в тесте ингибирования гидролитической активности трипсина по расщеплению хромогенного субстрата N-а-бензоил-DL-аргинин-4-нитроанилида (БАПНА). Реакцию расщепления субстрата трипсином оценивали по изменению цвета раствора, которое сопровождается окрашиванием раствора измеряемое по интенсивности поглощения при длине волны 405 нм.
ЦПД исследовали колориметрическим тетразолиевым методом (МТТ тест) с использованием красителя 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромида, который переходит в пурпурный формазан под действием НАДФ-Н-зависимых клеточных оксидоредуктазных ферментов жизнеспособных клеток. Количество формазана, которое определяют фотометрически при 590 нм, отражает количество живых клеток.
Для определения активности ингибитора протеаз использовали тест ингибирования трипсина. Конденсат после аэрозольного распыления комбинированного состава конденсат смешивали с трипсином в присутствии субстрата БАПНА, инкубировали 20 мин при 30 град С и определяли интенсивность окрашивания (ОП-оптическую плотность) раствора при 405 нм. Результаты показаны в таблице 13.
1) Цитопатогенное (ЦПД; цитодеструктивное) действие исследовали методом МТТ, так называемый, МТТ тест. Клетки инфицировали вирусом гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2), вносили среду с аэрозольным конденсатом и инкубировали 48 часов при 36 град. С.Затем клетки инкубировали с тетразолиевым красителем и определяли уровень образования формазана по стандартной МТТ методике по оптической плотности при 590 нм. Обозначения: «+» - значение оптической плотности в контрольной пробе, которое принимали за 100%; «+/-» - частичное ЦПД на уровне 5-40%; «-» - минимальный уровень ЦПД на уровне 5% и ниже.
2) Аэрозольные конденсаты смешивали с равным объемом стандартного трипсина и определяли гидролитическую активность смеси по расщеплению хромогенного субстрата L-ZAPA (Z-Arg-pNA), как описано в примере 2. Результаты оценивали по следующей шкале: «+» - контрольная гидролитическая активность в пробе трипсина без конденсата, которую принимали за 100%; «+/-» - средняя активность не более 30%; «-»- слабая активность не более 5%. Полученные результаты представлены в табл. 13.
Полученные результаты показывают сохранение фармакологической активности как ингибитора протеазы, так и супероксиддисмутазы после аэрозольного распыления комбинированного аэрозольного состава.
Пример 16.
Комбинированный аэрозольный состав ингибитора протеаз и антивирусных антител.
Готовили аэрозольные составы, содержащие активные вещества апротинина, леупептина и антитела кролика против белка НА вируса гриппа человека штамм A/Aich/2/68 (H3N2) в концентрации 40, 15 и 10 мкгр на мл, соответственно, в отдельности или вместе. В качестве базового раствора использовали буфер ФБ/3 (рН 7,2), содержащий 0,07% глицерина. После распыления приготовленного состава в устройстве Респимат или Бореаль (модель 4000) получали конденсат аэрозольного состава. Далее брали вирус гриппа в дозе 100 ФОБ, смешивали с равным объемом аэрозольного конденсата, вносили в культуру клеток почки собаки (линия МДСК) и инкубировали при 36 град С в CO2 атмосфере. Через 10-15 часов клетки фиксировали и инфицированные клетки окрашивали мышиными антителами к вирусному белку NP с помощью метода "True Blue", как описано в примере 2. Результат показан на фиг. 11.
Пример 17.
Комбинированный аэрозольный состав интерферона и ингибитора протеаз.
Готовили аэрозольные составы, содержащие активные вещества апротинина и интерферона альфа-2в человека в концентрации 40 и 15 мкгр на мл, соответственно, в отдельности или вместе. В качестве базового раствора использовали буфер ФБ/3 (рН 7,2), содержащий 0,1% глицерина. После распыления приготовленного состава в устройстве Респимат получали конденсат аэрозольного состава. Далее среду для клеток смешивали аэрозольным конденсатом в соотношении 3 к 1 и вносили в культуру клеток легкого человека (линия Calu-3) и инкубировали при 36 град С в CO2 атмосфере в течение 2 часов. Затем в культуру вносили вирус гриппа человека A/PR/8/34 (H1N1) в дозе 100 ФОБ на клеточный монослой в чашке диаметром 3 см и инкубировали при 36 град С в CO2 атмосфере в течение 10 часов. Затем клетки фиксировали и инфицированные клетки окрашивали антителами кролика, полученными к вирусу, и окрашивали вторичными антителами с пероксидазой с помощью метода "True Blue", как описано в примере 2. Результат показан на фиг. 12.
Пример 18.
Профиль дисперсности аэрозольного облака при распылении комбинированного аэрозольного состава ингибитора протеаз и рибавирина, содержащего глицерин.
Исследовали пригодность аэрозольного состава для генерирования мелкодисперсного аэрозоля за счет выталкивающей силы в устройстве мягкого облака. Аэрозольный состав готовится согласно прописи состава №3, указанного в таблице 2 с добавлением глицерина в конечной концентрации 0,5%. Определение дисперсности проводили микроскопически после выпуска аэрозоля на стекло. Делают выпуск аэрозольного состава на чистую обезжиренную матрицу, расположенную перпендикулярно направлению распыления на расстоянии 5 см от выходного отверстия устройства. Определение величины влажных частиц осуществляют с помощью микроскопа при 450-кратном увеличении сразу после напыления аэрозоля на стекло. Диаметр частиц определяют на матрице, имеющей размеченную сетку. Подсчет проводят на 10 полях зрения (Фиг. 13). Измерение проводят 3 раза из одного баллона на разных сроках выпуска аэрозоля и далее рассчитывают распределение частиц по фракциям с определенным диапазоном по диаметру частиц в процентах от общего количества частиц на стекле в поле зрения. Аэрозольное облако, генерированное из аэрозольного состава ингибитора протеаз, имело преимущественный диапазон дисперсности от 0,1 до 300 мкм, пригодный для медицинского применения. Результат показан на Фиг. 13.
Краткое описание фигур (рисунков).
Фиг. 1. Содержание рибавирина в конденсате генерированного аэрозоля.
Аэрозольный составы, приготовленные согласно прописи в таблице 1, распыляли и получали растворы соответствующих аэрозольных конденсатов. Далее готовили разведения конденсата и определяли концентрации рибавирина по интенсивности характерного для рибавирина поглощения ультрафиолетового спектра излучения при длине волны 206 нм (ОП/206). Стрелкам показано положение на кривой значений для аэрозольных составов, указанных в таблице 2 составом с концентрацией рибавирина: 20, 150 и 250 мкгр на мл. Калибровочная кривая построена на основании значений растворов с известной концентрацией рибавирина.
Фиг. 2. Содержание апротинина в конденсате генерированного аэрозоля.
Полученные образцы аэрозольного конденсата, как указано в таблице 2, анализировали в полиакриламидном геле (ПАГе). Из собранных порций аэрозольного состава отбирают аликвоты (~15 мкл), которые смешивают с 5 мкл диссоциирующего раствора, содержащего 5% додецилсульфата натрия (ДСН) и 200 мкМ дитиотреитола (ДТТ), нагревают в течение 10 мин при 700 С и наносят на гель. Фокусирующий и разделительный гели готовили в буферной системе по методу Laemmli (1970). Электрофорез проводят при 70V на пластину ПАГ шириной 8 см в течение 2 часов. После окончания электрофореза полипептиды в геле окрашивают Кумаси Голубым R-350 (0,1%), который растворяли в смеси вода: этанол: уксусная кислота в соотношении по объему 5:5:1 при комнатной температуре. Не связавшуюся краску отмывают из геля в смеси вода: этанол: уксусная кислота с соотношением 88:5:7, соответственно. Для сравнения в качестве стандартного образца апротинина используют коммерческий препарат очищенного апротинина, выделенного из легких крупного рогатого скота (фирма Sigma, США). Стрелками показано положение апротинина в геле, что соответствует полипептиду с молекулярной массой (м.м.) 6,5 кДа.
Эти данные показывают, что апротинин не изменял свои структурные свойства при распылении аэрозоля из аэрозольного состава. В образцах аэрозольного конденсата не обнаружено белковых агрегатов в высокомолекулярной зоне (ВМЗ) с м.м. массой 120-275 кДа, что указывало на отсутствие агрегатов и денатурации апротинина в процессе смешивания и распыления аэрозольных составов. Дорожки №2, №2, №3 - образцы согласно таблице 2. Дорожка №4 - маркерные белки определенной молекулярной массы.
Фиг. 3. Подавление трипсина ингибитором протеаз после генерирования аэрозоля. Готовили стандартный раствор трипсина, который смешивали с аэрозольным конденсатом и инкубировали в течении часа при комнатной температуре. Исследовали конденсаты, полученные из свеже приготовленных аэрозольных составов и из составов, хранившихся 5 лет при температуре +10 град. С. После инкубации смеси конденсата с трипсином определяли остаточную активность трипсина методом торможения гидролитического асщепления хромогенного субстрата L-ZAPA (Z-Arg-pNA), ведущего к образованию нитроанилида (NA), дающего желтое окрашивание, которое регистрируется при длине волны 405 нм (ОП/405). Для тестирования в исследуемую смесь вносят субстрат L-ZAPA (25 мкл раствора с концентрацией 1 мг/мл), инкубируют 15 мин при 20 град. С, гидролитическую реакцию останавливают добавлением 25 мкл 1М раствора соляной кислоты и измеряют величину ОП/405, которая показывает уровень остаточного активного (не ингибированного) трипсина (Фиг. 3).
Аэозольные составы ингибиторов протеаз готовили на буфере ФБ/3, содержащем 1% глицерина и следующие ингибиторы протеаз: апротинин (20 мкгр/мл), камостад (0,5 мкгр/мл), леупептин (2 мкгр/мл), смесь трех перечисленных ингибиторов с теми же концентрациями, соответственно пробы 2-5 по оси абсцисс. Поси ординат откладывали активность трипсина, которую выражали в оптических единицах поглощения при ОП/405, при этом величину ОП/405 контрольной пробы с трипсином без аэрозольного конденсата (столбик №1) принимали за 100%. Как показано на фиг. 3, исследуемые пробы аэрозольного конденсата и их разведения в 10 раз полностью ингибировали активность трипсина. Таким образом, это тестирование показывает, что ингибитор протеаз остается стабильным в аэрозольном составе и устойчиво сохраняет антипротеазную активность на исходном уровне в процессе хранения. Сохранение антипротеазной активности состав наблюдалось, по крайней мере, в течение 5 лет.
Фиг. 4. Ингибирование размножения вируса гриппа комбинированным аэрозольным составом после генерирования аэрозоля.
Для тестирования фармакологической активности аэрозоля ингибиторов протеаз и их комбинаций с веществами иного механизма действия использовали метод подавления вирусных инфекционных фокусов в культуре клеток млекопитающих, формирующихся под действием патогенных для человека вирусов гриппа. Вирус гриппа формировал цитолитические инфекционные фокусы в культуре клеток кишечника человека (линия СаСо-2), формирование которых подавлялось исследуемыми аэрозольными составами после их аэрозольного распыления. Данные такого тестирования приведены на фиг. 4.
Аэрозольные составы ингибиторов протеаз (апротинин и леупептин) в комбинации с антивирусными веществами, а именно: фавипиравиром, рибавирином, ацетил салициловый кислотой, осельтамивиром готовили на фосфатном буферном растворе ФБ/3. Далее производили распыление в устройстве эжекторного типа «Бореаль», собирали и осаждали аэрозольный конденсат, который добавляли в клеточную питательную среду и вносили равную дозу вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2). Через 15-17 часов после инкубации при 37 град. С клеточную культуру фиксировали 4%-ым раствором параформальдегида и вирусные фокусы окрашивали с помощью специфических противовирусных антител (субтип анти-Н3) и пероксидазных конъюгатов, используя в качестве хромогенного субстрата препарат "True Blue". Результаты, представленные на фиг. 4, показывают количество инфицированных вирусом клеток и отражают снижение их количества, которое формировалось под действием аэрозольных составов.
Окрашенные с помощью антивирусных антител клеточные культуры фотографировали в световом микроскопе под увеличением х80. Лунка 1 - показывают клеточные пробы, инкубированные без конденсата (состав №7), 2 - лунка с 30 мкл конденсата, полученного распылением из устройства (состав №2), 3 - лунка с 30 мкл конденсата аэрозольного состава, хранившегося 5 лет (состав №2), соответственно.
Фиг. 5. Ингибирование размножения коронавируса конденсатом аэрозольного состава после генерирования аэрозоля.
Для тестирования фармакологической активности аэрозоля ингибиторов протеаз и их комбинаций с веществами иного механизма действия использовали метод подавления вирусных инфекционных фокусов в культуре клеток млекопитающих, формирующихся под действием патогенных коронавирусов крупного рогатого скота. Коронавирус штамм KV-92 формировал цитолитические инфекционные фокусы в культуре клеток почки быка (линия MDBK), формирование которых подавлялось исследуемыми аэрозольными составами после их аэрозольного распыления. Данные такого тестирования приведены на фиг. 5.
Аэрозольные составы ингибиторов протеаз (апротинин и леупептин) в комбинации с антивирусными веществами, а именно: фавипиравиром, рибавирином готовили на фосфатном буферном растворе ФБ/3, содержащем 0,05% ДМСО. Далее производили распыление в устройстве мягкого облака Респимат, собирали и осаждали аэрозольный конденсат, который добавляли в клеточную питательную среду и вносили начальную дозу коронавируса (штамм KV-92), равную 0,001 ФОБ на клетку, и инкубировали при 36,5 град С в CO2-атмосферном инкубаторе. Через 48-72 часов после инкубации определяли антивирусную фармакологическую активность при 37 град. С клеточную культуру фиксировали 4%-ым раствором параформальдегида и вирусные фокусы окрашивали с помощью специфических противовирусных антител и пероксидазных конъюгатов, используя в качестве хромогенного субстрата препарат "True Blue". Результаты показаны на фиг. 5. Результаты показывают количество инфицированных вирусом клеток и отражало уровень вирусного поражения, снижение которых формировалось под действием аэрозольных составов.
Конденсаты исследуемых аэрозолей вносили в культуру клеток почки быка, инфицированных коронавирусом, и инкубировали в течение 50-70 часов при 36 град С.Клеточные культуры окрашивали антивирусными антителами, указывающими на наличие инфицированных клеток в клеточном монослое. Количество и размер окрашенных зон показывает интенсивность развития коронавируса в клеточной пробе. Пробы: (1) -контрольная инфицированная культура с конденсатом плацебо (состав №7); (2) клеточная культура с конденсатом аэрозольного состава №6; (3) - клеточная культура с конденсатом аэрозольного состава №1; (4) - культура клеток с конденсатом аэрозольного состава №5. Результат показывает существенное усиление фармакологического вирус ингибирующего действия комбинации ингибитора протеаз и антивирусного вещества.
Фиг. 6. Определение концентрации фавипиравира в конденсате аэрозольного состава.
Калибровочная кривая построена по поглощению раствора фавипиравира с известной концентрацией по поглощению при длине волны 206 нм (спектр поглощения характерный для вещества фавипиравира). Стрелками показаны образцы аэрозольного конденсата полученное после генерирования аэрозоля составов №1, №2 и №3, представленных в таблице 3, соответственно. По оси абсцисс показаны величины поглощения при длине волны 325 нм, по оси ординат отложены Lg концентрации фавипиравира в растворе. Оптическую плотность (ОП) измеряли на спектрофотометре ULTRASPEC II model 4050 при максимальной длине поглощения 325 нм.
Фиг. 7. Торможение размножения коронавируса комбинированным аэрозольным составом.
5
Аэрозольные составы ингибитора протеаз (леупептин) в комбинации с антивирусным веществом (фавипиравир) готовили на фосфатном буферном растворе ФБ/3. Далее производили распыление в устройстве эжекторного типа «Бореаль, модель F4000», собирали и осаждали аэрозольный конденсат, который добавляли в клеточную питательную среду и вносили коронавирус KV92 в дозе около 30 ФОЕ на одну лунку, содержащую около 10 клеток MLDK. Через 65 часов после инкубации при 37 град, в культуральной жидкости клеток определяли количество накопившегося вируса методом гемагглютинации мышиных эритроцитов. Полученные результаты показывают, что в присутствии аэрозольного конденсата заметно (в 5 и более раз) снижается размножение и накопление вируса. Методом световой микроскопии клеточного монослоя регистрировали практическая 100% гибель в контрольных клетках без аэрозольного конденсата, частичную гибель в пробах с аэрозольным составом леупептина и фавипиравира. В клетках с комбинированным составом леупептина и фавипиравира отмечалось заметное снижение гибели клеток. Проведенные исследования показали, что комбинированный аэрозольный состав фавипиравира (антивирусного вещества) и леупептина (ингибитора протеаз) сохранял фармакологические свойства активных веществ после аэрозольной генерации состава по ингибированию размножения вируса (антивирусное действие) и снижению деструкции клеточного монослоя (антидеструктивное действие).
Фиг. 8. Фармакологическое действие ингибиторов протеаз в комбинации с антивирусными веществами против коронавируса.
Аэрозольные составы готовили на ФБ/3 с концентрациями активных веществ: апротинин (50 мкгр/мл), рибавирин (20 мкгр/мл), фавипиравир (65 мкгр/мл), леупептин (15 мкгр/мл). По оси абсцисс показаны номера проб аэрозольного состава, содержащего: (1) - контрольный аэрозольный состав без активных веществ; (2) - апротинин; (3) - рибавирин; (4) фавипиравир; (5) - апротинин+рибавирин; (6) - апротинин + фавипиравир; (7) - леупептин; (8) - леупептин + рибавирин; (9) - леупептин+фавипиравир. По оси ординат отложены двоичный логарифм разведения исследуемой культуральной, в котором наблюдалась вирус-индуцированная гемагглютинация эритроцитов.
Представленные данные показывают сохранение фармакологических свойств ингибиторов протеаз и их комбинаций с антивирусными веществами различного механизма действия после аэрозольного распыления. Приведенный пример дополнительно показывает усиление фармакологического противовирусного эффекта комбинированного аэрозольного состава, содержащего ингибиторы протеаз и антивирусное вещество, по сравнению с применением индивидуального фармакологического вещества.
Фиг. 9. Белковый профиль используемого в аэрозольном составе слабо инфекционного вируса гриппа A/Aichi/2/68.
Дорожка 1 - исходный вирус гриппа, выращенный в культуре клеток МДСК и содержащий нерасщепленный гемагглютинин НАО (м.м. 75 кДа). вирус гриппа; 2 - вирус гриппа после инкубации аэрозольного конденсата, содержащего вирус и апротинин, с клетками Calu-3, содержит нерасщепленный НА0; 3 - вирус гриппа в аэрозольном составе, содержащем трипсин, содержит расщепленный НА1 (м.м. 55 кДа); (4) - вирус гриппа в аэрозольном конденсате без апротинина после контакта с клетками Calu-3 содержит расщепленный НА1 (м.м. 55 кДа).
Фиг. 10. Сохранение фармакологической активности ингибитора протеаз и протеазы после распыления смешанного аэрозольного состава с данными активными веществами.
Для определения сохранения активности ингибитора протеаз в аэрозольном конденсате смешивали конденсат и раствор активной каспазы 3, инкубировали 20 мин при 30 град С и определяли интенсивность поглощения при длине волны 405 нм. Для определения сохранения активности трипсина после его аэрозольного распыления комбинированного состава конденсат смешивали с субстратом БАПНА, инкубировали 20 мин при 30 град С и определяли интенсивность окрашивания раствора при 405 нм. Панель А: (1) - контрольный раствор исходной активной протеазы; (2) раствор трипсина с конденсатом исследуемого конденсата; (3) - раствор субстрата без протеазы (негативный контроль). (4) - конденсат, полученный из аэрозольного состава трипсина без ингибитора каспазы. Панель Б: (1) -контрольный раствор исходной активной каспазы 3 (положительный контроль); (2) раствор каспазы 3 с исследуемым конденсатом; (3) - раствор субстрата без конденсата и без протезы (негативный контроль). (4) - конденсат, полученный из аэрозольного состава ингибитора каспазы без трипсина.
Полученные результаты показывают сохранение фармакологической активности как ингибитора протеазы, так и протеазы иной специфичности при распылении их комбинированного аэрозольного состава.
Фиг. 11. Фармакологическое действие аэрозоля антител на клетки-мишени, инфицированные вирусом гриппа.
В культуру прикрепленных клеток МДСК вносили вирус гриппа A/Aichi/2/68, инкубировали в присутствии исследуемых аэрозольных конденсатов и далее окрашивали для выявления клеток, инфицированных вирусом. Цифрами показаны пробы: (1) - контрольные клетки, инфицированные вирусом и инкубированные без аэрозольного конденсата; (2) - клетки с вирусом гриппа, инкубированные с аэрозольным конденсатом, содержащим ингибиторы протеаз апротинин, леупептин и противовирусные антитела.
Как показано на фиг. 11, в пробе с ингибиторами протеаз и антителами практически полностью отсутствуют признаки инфекции вирусом. Этот пример демонстрирует сохранение фармакологических свойств антител против самого вируса и против его деструктивного действия на клеточный монослой после аэрозольного распыления антител из комбинированного аэрозольного состава с ингибиторами протеаз и глицерина.
Фиг. 12. Фармакологическое действие аэрозольного состава с интерфероном на клетки-мишени, инфицированные вирусом гриппа.
В культуру прикрепленных клеток человека Calu-3 вносили конденсат аэрозольного состава с рекомбинантным интерфероном альфа-2в и ингибитором протеаз (апротинином), дополнительно для заражения клеток вносили вирус гриппа A/PR/8/34 и инкубировали 10 часов для развития инфекции. Затем клетки фиксировали и окрашивали для выявления клеток, инфицированных вирусом. Цифрами показаны пробы: (1) - контрольные клетки, инфицированные вирусом и инкубированные без аэрозольного конденсата; (2) - клетки с вирусом гриппа, инкубированные в присутствии конденсата с ингибитором протеаз апротинина; (3) - клетки, инкубированные с аэрозольным конденсатом, содержащим ингибитор протеаз и интерферон.
Как демонстрирует на фиг. 12, в пробе с интерфероном значительно снижены признаки инфекции вирусом и количество инфекционных фокусов. Этот пример демонстрирует сохранение фармакологических свойств интерферона по подавлению размножения вируса после его аэрозолирования из комбинированного аэрозольного состава с ингибиторами протеаз и глицерина.
Фиг. 13. Профиль дисперсности аэрозоля.
По оси ординат показано содержание (%) фракции в аэрозольном облаке. По оси ординат цифрами показаны диапазоны диаметра частиц в аэрозольном облаке: 1 - (0,1-10 мкм); 2 - (10-50 мкм); 3 - 50-100 мкм); 4 - (100-240 мкм); 5 - (>250 мкм).
Источники литературы
1. Терехова Е.П. 2014. Ингаляционные устройства, применяемые для лечения бронхиальной астмы. Практическая Пульмонология. №4, стр. 45-52.
2. Терехова Е.П. 2013. Современные ингаляционные устройства, применямые для лечения бронхиальной астмы (лекции для врачей). Эффективная фармакотерапия 2013, т. 39 (№3), стр. 24-39.
3. Ganderton D, Lewis D, Davies R, Meakin B, Brambilla G, Church T. 2002. Modulite: a means of designing the aerosols generated by pressurized metered dose inhalers. Respir Med. 96 Suppl D: S3-8.
4. Мещерякова H.H. 2006. Модулит - новая технология в дозированных аэрозольных ингаляторах. Ингаляционная терапия. Атмосфера. Пульмонология и аллергология. №2, 40-42.
5. Black D.L., McQuay M.Q., M.P. Bonin. 1996. Laser-based techniques for particle-size measurement: A review of sizing methods and their industrial applications. Progress in Energy and Combustion Science. Vol. 22 (3), pages 267-306.
6. Патент ЕАПО №034991. «Фармацевтический аэрозольный состав ингибитора протеаз».
7. Патент РФ №2657523. «Фармацевтический аэрозольный состав ингибиторов протеаз с озон-сберегающим пропеллентом и его получение».
8. Патент РФ №2711080. «Комбинированный аэрозольный состав на основе ингибиторов протеаз и его получение».
9. Laemmli U. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature 227, 680-685 (1970). https://doi.org/10.1038/227680a0