Варианты опухолевой прогрессии в исходно фенотипически различных экспериментальных лимфосаркомах

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

ВАРИАНТЫ ОПУХОЛЕВОЙ ПРОГРЕССИИ В ИСХОДНО ФЕНОТИПИЧЕСКИ РАЗЛИЧНЫХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЛИМФОСАРКОМАХ

Евгения Игоревна ВОРОНИНА1, Александра Васильевна СЕНЬКОВА2, Татьяна Августовна АГЕЕВА1, Марина Аркадьевна ЗЕНКОВА2

1 ГБОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Минздрава России

630091, г. Новосибирск, Красный пр., 52

2 ФГБУ Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН 630090, г. Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 8

В эксперименте изучены эффекты полихимиотерапии (ПХТ) на опухолевую ткань в перевиваемых опухолях RLS и RLS40, проявляющих фенотип резистентности к терапии цитостатиками. После воздействия трех курсов ПХТ в опухоли RLS повысилась экспрессия генов mdrlb (в 1,8 раза) и bcl-2 (в 1,3 раза), в опухоли RLS40 эти показатели выросли более значительно. Объемная плотность апоптозов в RLS40 оставалась неизменной, а в RLS число апоптозов нарастало от курса к курсу. Проведение четырех курсов ПХТ сопровождалось увеличением экспрессии маркера пролиферации Ki-67 в опухолевых клетках RLS, что свидетельствует об интенсификации пролиферативного режима в опухоли, обеспечивающего прирост опухоли на фоне активных процессов апоптоза в ней.

Ключевые слова: множественная лекарственная устойчивость, резистентная лимфосаркома, полихимиотерапия, апоптоз, экспрессия генов.

Согласно теории опухолевой прогрессии происходит постоянный стадийный прогрессирующий рост опухоли с нарастанием ее злокачественных свойств, появлением гетерогенной популяции опухолевых клеток. Основными характеристиками опухолевой прогрессии являются усиление пролиферативного потенциала, нарушение механизмов апоптоза, ангиогенез и формирование множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) [1, 2]. Существует большое количество работ, посвященных проблеме опухолевой прогрессии, но при всем многообразии исследований остается много не изученных аспектов. К числу важнейших из них относится формирование МЛУ, что является серьезным препятствием в лечении большинства злокачественных новообразований и приводит к нарастанию злокачественности опухоли и снижению эффективности лечения, это особенно проявляется в опухолях, подвергающихся воздействию полихимиотерапии (ПХТ). Развитие МЛУ может осуществляться за счет нескольких механизмов - это и активное выве-

дение химиопрепаратов посредством трансмембранного белка Р-гликопротеина, кодируемого геном MDR1, и нарушение механизмов апоптоза в результате гиперэкспрессии гена bcl-2 и мутаций в гене р53 [3, 4]. В целом эти механизмы известны, но большой интерес представляет изучение прогрессирования МЛУ в опухолях, изначально имеющих фенотип устойчивости к цитостатикам.

Цель - в фенотипически различных опухолях RLS и RLS40 исследовать эффекты курсовой полихимиотерапии на опухолевую ткань, экспрессию генов множественной лекарственной устойчивости, апоптоза и пролифератив-ный потенциал опухолевых клеток.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследование проведено на мышах-самцах линии СВА из питомника Института цитологии и генетики СО РАН. Животных содержали в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных

Воронина Е.И. - аспирант кафедры патологической анатомии, e-mail: e.voronina83@mail.ru

Сенькова А.В. - к.м.н., научный сотрудник лаборатории нуклеиновых кислот, e-mail: alsenko@mail.ru Агеева Т.А. - д.м.н., проф. кафедры патологической анатомии, e-mail: ageta@mail.ru Зенкова М.А. - д.б.н., проф., зав. лабораторией нуклеиновых кислот, e-mail: marzen@niboch.nsc.ru

животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986), в виварии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН группами по 8-11 особей при естественном режиме освещения и свободном доступе к воде и пище. Животным внутримышечно перевивали клетки лимфосаркомы RLS и лимфосаркомы RLS40 [5], являющихся изначально устойчивыми к циклофосфану, эффект которого опосредуется путем запуска в опухолевых клетках апоптоза. Обе опухоли получены из чувствительной к циклофосфану лимфосаркомы LS и по биологическому поведению и влиянию на организм животных соответствуют агрессивной В-кле-точной неходжкинской лимфоме человека. Устойчивость к апоптогенам была достигнута путем многократных внутримышечных перевивок рецидивов этой опухоли, возникающих после воздействия низких доз циклофосфана. В результате последовательной культивации клеток линии RLS на среде с повышающейся концентрацией винбластина была получена клеточная линия RLS40, которая характеризуется увеличением экспрессии генов МЛУ и поддерживается в культуре при концентрации винбластина 40 нмоль [6]. Суспензию опухолевых клеток RLS в физиологическом растворе (2 х 104 клеток/мл) и RLS40 в физиологическом растворе (1 х 106 клеток/мл) объемом 0,1 мл трансплантировали мышам внутримышечно в правое бедро для роста и формирования солидной опухоли. Через 7 суток роста перевитых опухолей с интервалом в 7 дней животным с RLS провели 4 последовательных введения комплекса цитостатиков (курса ПХТ), а мышам с опухолью RLS40 -3 курса ПХТ. В качестве комбинации антиблас-томных средств использовали стандартную схему CHOP (50 мг/кг циклофосфана, 4 мг/кг док-сорубицина, 0,1 мг/кг винкристина в хвостовую

вену, 5 мг/кг преднизолона внутрибрюшинно), применяемую для лечения гемобластозов в клинике. Были сформированы группы контрольных животных (по 20 особей) с перевитой опухолью RLS или RLS40, которым не проводили ПХТ. Динамику роста опухоли у животных экспериментальных и контрольных групп отслеживали путем измерения размеров опухолевого узла в пораженной лапе штангенциркулем. Забор материала для гистологического и молекулярно-биологического исследования проводили на 7-е сутки после проведения каждого курса ПХТ. В опухолевых клетках методом ОТ-ПЦР с использованием в качестве внутреннего стандарта мРНК ß-актина определяли экспрессию генов, участвующих в формировании МЛУ (mdrla, mdrlb, bcl-2 и р53). Для гистологического и иммуноморфологического исследования ткань опухоли экспериментальных животных фиксировали в 10%-м растворе нейтрального формалина, далее образцы ткани опухоли подвергали стандартной обработке. Приготавливали парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм, окрашивали их гематоксилином и эозином [7]. В опухолевой ткани на гистологических срезах определяли численную плотность (Nv) апоптозов для опухоли RLS и объемную плотность (Vv) - для RLS40 [8,9]. Проводили иммуноморфологичес-кий анализ пролиферативной активности клеток опухоли RLS с помощью первичных антител к белку Ki-67 (Abcam, Великобритания), выполняя иммуногистохимическое исследование с использованием непрямого иммунопероксидаз-ного метода согласно общепринятой методике [10] и инструкциям фирмы-производителя. По окрашенным препаратам определяли индекс мечения Ki-67 ядер опухолевых клеток (% позитивно окрашенных ядер). Для выявления статистической значимости различий использовали параметрический критерий Стьюдента.

о

г

и £

о

1-

я

о

Г"

о § 1-

0§

О .

I I I I I I I I I

7 9 11 14 16 18 21 23 25 28 ПХТ ПХТ ПХТ ПХТ

Время после перевивки опухоли, сут —•—RLS .....-......RLS+ПХТ

б

—I-1-1-1-1-1-1-1-1

6 8 10 13 15 17 20 22 24 ПХТ ПХТ ПХТ Время после перевивки опухоли, сут —|—RLS40 .....-......RLS40+IIXT

Рис. 1. Динамика роста опухоли RLS (а) и RLS 40 (б) без лечения и после проведения курсов полихимиотерапии

РЕЗУЛЬТАТЫ

К 7-м суткам у всех животных в месте трансплантации опухолевых клеток RLS и RLS40 формировался солидный узел. Микроскопически ткань обеих опухолей имела одинаковое строение: была представлена ростом крупных атипичных мономорфных лимфоидных клеток с большим количеством патологических митозов в ядрах, определялся инвазивный рост опухоли с разрушением мышц бедра. На фоне ПХТ у мышей с опухолью RLS40 и RLS отмечали эффект торможения роста опухоли, однако только в случае опухоли RLS40 это сопровож-

RLS

q 25 Экспрессия гена mdrlb в RLS

0,30

I °>25~

I 0,20

0,10-

0,05-

0

3,0п

Е 2,5-

2,0-

1 1,5-

1,0-

£ 0,5-

0

0,5-1

X 0,4-

У 0,3-

со.

гч ,1 0,2-

U <5 од-

0

RLS ПХТ1 ПХТ2 ПХТЗ ПХТ4 Экспрессия гена mdrla в RLS

f-

далось увеличением продолжительности жизни животных по сравнению с контролем (рис. 1, б). У мышей с опухолью RLS эффекты торможения роста опухоли в сравнении с животными без лечения были менее выраженными, размеры узла поступательно увеличивались (рис. 1, а). При сопоставимых размерах солидных опухолевых узлов в месте введения продолжительность жизни животных контрольной и опытной групп мышей с RLS достигла 29 суток, в то время как у мышей с перевитой RLS40 она составляла 20 и 24 дней соответственно. Это позволило животным с опухолью RLS провести

RLS ПХТ1 ПХТ2 ПХТЗ ПХТ4

Экспрессия гена bcl-2 в RLS 1

«

§ и

3 Ё

и Б

S ?

•в" еа

¡s >

я В

U 5,

к К

и о

« &

О)

I

1,6 1,41,2" 1,00,8 0,6 0,4—| 0,2 0

» у

f 3 к i 02.

к Тн и" S u

в R о о

И &

С

1,6-1 1,41,21,00,80,60,40,20

U г

и 5 С Я

К I

-О* СО.

к Тз

& I

в ч и о

И &

fll 1-< С

RLS ПХТ1 ПХТ2 ПХТЗ ПХТ4

3,5 3,0 2,52,01,51,00,50

RLS40

Экспрессия гена mdrla в RLS40

i

RLS40 ПХТ1 ПХТ2 ПХТЗ Экспрессия гена mdrla в RLS40

i

RLS40 ПХТ1 ПХТ2 ПХТЗ

Экспрессия гена bcl-2 в RLS40 i

RLS40 ПХТ1 ПХТ2 ПХТЗ

0,160,120,080,040

Экспрессия гена р53 в RLS

RLS ПХТ1 ПХТ2 ПХТЗ ПХТ4

1,0 0,9 0,84 0,70,6 0,5 0,4- - 0,3-g & 0,2-1-с 0,10

» у

f 3 к i 02-

к Тн И" S u

в Et о о

Экспрессия гена р53 в RLS40

I

I

~г

~г

~г

RLS40 ПХТ1 ПХТ2 ПХТЗ

п

Рис. 2. Экспрессия генов в опухолях RLS и RLS40 до и после проведения полихимиотерапии

4 курса введения комплекса цитостатиков, а с RLS40 - только 3 курса.

Методом ОТ-ПЦР установлено, что до проведения курсов ПХТ в клетках опухоли RLS преобладала экспрессия гена bcl-2, а RLS40 характеризовалась увеличением экспрессии mdrlb (рис. 2). После воздействия трех курсов ПХТ в клетках опухоли RLS повысилась экспрессия генов mdrlb (в 1,8 раза) и bcl-2 (в 1,3 раза), в то время как в опухоли RLS40 эти показатели выросли более значительно: в 2,8 и 2,0 раза соответственно (см. рис. 2). Экспрессия гена p53 изначально была выше в опухоли RLS40, после первого курса ПХТ сначала существенно снизилась (в 4,4 раза), затем, после третьего курса ПХТ, несколько повысилась (рис. 3) при неизменной объемной плотности апоптозов независимо от количества проведенных курсов ПХТ: 12,2 ± 1,5 % в RLS40 до лечения и 12,5 ± 2,3 % после трех курсов ПХТ. В клетках опухоли RLS экспрессия гена р53 после первого введения комплекса цитостатиков также сначала снизилась на 32 %, а затем повысилась до исходного уровня (см. рис. 3) при незначительно нарастающей от курса к курсу численной плотности апоптозов в опухолевой ткани, которая после первого курса составляла 0,56 ± 0,08, а после 4 курса - 1,27 ± 0,08.

Выявленный диссонанс в молекулярно-био-логическом поведении опухоли RLS (низкий эффект торможения опухоли после ПХТ при снижении экспрессии p53 и нарастающей численной плотности апоптозов в опухолевых клетках) обосновал целесообразность оценки пролифера-тивного режима опухоли RLS. Оказалось, что проведение четырех курсов ПХТ сопровождается увеличением экспрессии Ki-67 в опухолевых клетках: до проведения ПХТ индекс мечения составил 34,03 ± 0,95, после проведения 1 курса ПХТ он возрос на 8,8 %, затем продолжал по-

60 504 40 302010-

0

1ПХТ 2ПХТ ЗПХТ 4ПХТ Без ПХТ

Рис. 3. Индекс мечения Ki-67 в клетках опухоли RLS

вышаться и к 4 курсу ПХТ увеличился на 50 % от исходного значения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, на фоне 4-кратного введения комплекса цитостатиков, несмотря на изначально разный уровень экспрессии гена mdrlb, продолжает нарастать МЛУ в клетках как опухоли RLS, так и опухоли RLS40 с селекцией еще более лекарственно устойчивого клона опухолевых клеток. При этом в изначально более агрессивной опухоли RLS40 на фоне цитостатического лечения наращивание лекарственной устойчивости идет интенсивнее за счет активации гена mdrlb. Однако опухоль RLS, являющаяся изначально фенотипически более «благоприятной» и имеющая меньший прирост экспрессии гена mdrlb на фоне курсов ПХТ, продемонстрировала более значимую опухолевую прогрессию за счет интенсификации пролиферативного режима и возможного формирования вторичных мутаций генома. Выявленные молекулярно-биологические особенности опухолевой прогрессии изначально фено-типически различающихся экспериментальных лимфосарком RLS и RLS40, формирующихся под воздействием введения комплекса цитоста-тиков, свидетельствуют о том, что в клинической онкологии индивидуальные молекулярные характеристики микроскопически однотипных опухолей могут в итоге определять прогноз болезни и эффективность лечения у каждого пациента. Данное обстоятельство диктует необходимость дальнейшего изучения механизмов опухолевой прогрессии для индивидуализации и повышения эффективности программ лечения онкобольных.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Поспелова Т.И., Лосева М.И., Ковынев И.Б. и др. Основы опухолевой прогрессии гемобласто-зов // Бюл. СО РАМН. 2004. (2). 73-76.

2. Fuller G.M., Shields D. Molecular basis of medical cell biology. Stamford: Appleton & Lange, 1998. 231 p.

3. Filipits M. Mechanisms of cancer: multidrug resistance // Drug Discov. Today. 2004. 1. 229-234.

4. Ставровская А.А. Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток // Биохимия. 2000. 65. (1). 112126.

5. Сенькова А.В., Агеева Т.А., Зенкова М.А. Взаимоотношение процессов прогрессирования множественной лекарственной устойчивости в

опухоли и морфологических изменений в печени у мышей с перевиваемой лимфосаркомой RLS40 в условиях полихимиотерапии // Бюл. СО РАМН. 2011. (2). 87-93.

6. Mironova N., Shklyaeva O., Andreeva E. et al. Animal model of drug-resistant tumor progression // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2006. 1091. 490-500.

7. Саркисов Д.С., Перов Ю.Л. Микроскопическая техника. М., 1996. 542 с.

8. Автандилов Г.Г. Медицинская морфомет-рия. М., 1990. 382 с.

9. Weibel E.R. Stereological methods. London: Acad. Press., 1979. 415 p.

10. Dabbs D.J. Diagnostic immunohistochemis-try. Edinburgh: Churchill Livingstone, 2006. 848 p.

THE VARIANTS OF NEOPLASTIC PROLIFERATION IN INITIALLY PHENOTYPIC DIFFERENT EXPERIMENTAL LYMPHOSARCOMAS

Evgeniya Igorevna VORONINA1, Aleksandra Vasil'yevna SEN'KOVA2, Tat'yana Avgustovna AGEEVA1, Marina Arkad'yevna ZENKOVA2

1 Novosibirsk State Medical University of Minzdrav of Russia 630091, Novosibirsk, Krasnyi av., 52

2 Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS 630090, Novosibirsk, Akademic Lavrent'yev av., 8

The effects of polychemotherapy (PCT) on the tumor tissue in transplanted tumors RLS and RLS40 manifested a phenotype of resistance to cytotoxic therapy have been investigated in the study. After the 3-course of polychemotherapy exposure to tumors RLS the level of gene expression increased: for mdrlb - in 1.8 times, for bcl-2 - in 1.3 times; after the exposure to tumor RLS40 the gene expression indices increased more significantly. The volume density of apoptosis in RLS40 remained unchanged after polychemotherapy but in RLS the number of apoptosis increased from course to course. The 4th courses of polychemotherapy realization was accompanied with the increase in expression of proliferation marker Ki-67 in tumor cells RLS, that testified to the intensification of proliferative regime in tumor which supported the neoplasm increases against the background of apoptosis active processes in it.

Key words: multidrug resistance, resistant lymphosarcoma, polychemotherapy, gene expression.

Voronina E.I. - postgraduate student of the chair for pathological anatomy, e-mail: e.voronina83@mail.ru Senkova A.V. - candidate of medical sciences, researcher of the laboratory for nucleonic acids, e-mail: alsenko@mail.ru

Ageeva T.A. - doctor of medical sciences, professor of the chair for pathological anatomy, e-mail: ageta@mail.ru Zenkova M.A. - doctor of biological sciences, professor, head of the laboratory for nucleonic acids, e-mail: marzen@niboch.nsc.ru