ЛЕЧЕНИЕ СОСУДИСТЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ ДИАБЕТА
TREATING VASCULAR COMPLICATIONS OF DIABETES

Настоящее изобретение касается способов профилактики и лечения сосудистых осложнений диабета.
Сахарный диабет является распространенным нарушением обмена веществ, от которого в мире страдало около 150 миллионов человек в 2000 г., и по прогнозам в 2010 г. число больных может достичь 220 миллионов. Диабет и связанные с ним осложнения стали значительной проблемой для здравоохранения. Сердечно-сосудистые заболевания вызывают большинство случаев осложнений и смертности при сахарном диабете. Взрослые люди с диабетом в 2-4 раза больше подвержены риску сердечно-сосудистых патологий по сравнению с теми, кто не страдает от диабета. На сердечно-сосудистые заболевания приходится до 80% преждевременных смертей среди пациентов с диабетом. Из-за огромной преждевременной заболеваемости и смертности, связанной с этой болезнью, профилактика ее осложнений является ключевой проблемой.
При диабете дисфункция сосудистого эндотелия считается важным фактором в патогенезе диабетической микро- и макроангиопатии. Существует три главных источника, способствующих эндотелиальной дисфункции при диабете: i) гипергликемия и ее непосредственные биохимические последствия прямо изменяют эндотелиальную функцию; ii) высокий уровень глюкозы, опосредованно влияющий на функционирование эндотелиальных клеток через синтез факторов роста и вазоактивных агентов в других клетках и изменяющий проницаемость эндотелиального монослоя; iii) компоненты метаболического синдрома, которые могут влиять на эндотелий (Schalkwijk et al., Clin. Sci. 109(2005), 143-159).
Цель настоящего изобретения состоит в обеспечении средства уменьшения патологического влияния сосудистых осложнений у пациентов с диабетом.
1
2
3
1
2
3
Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает пептид, состоящий из 7-17 аминокислот и включающий смежный гексамер TXEXXE, в котором X, X и Х могут быть любой природной или искусственной аминокислотой, причем пептид не обладает TNF-специфической воспалительной активностью (Hribar et al., Eur. J. Immunol. 1999; Elia et al., AJRCCM 2003; см. также раздел примеров) и является цикличным для лечения и профилактики сосудистых осложнений у пациентов с диабетом.
1
2
3
1
2
3
1
2
3
2
3
X, X и Х предпочтительно выбирают из 20 природных стандартных аминокислот основного набора аминокислот для природного синтеза белка; в еще более предпочтительном варианте X, Х и Х выбирают из числа природных аминокислот с гидрофобной боковой цепью (Ala, Ile, Leu, Met, Val, Pro и Gly). Особенно предпочтительными являются (независимо друг от друга) X=Pro; Х и Х=Gly, Ala, Val, Leu или Ile; ХХ предпочтительно является дипептидом, выбранным из Gly-Ala, Gly-Val, Ala-Gly или Ala-Val.
Предпочтительно пептид согласно настоящему изобретению состоит из 7-17 аминокислот и содержит гексамер TPEGAE (SEQ ID NO. 4), причем пептид является цикличным и не обладает активностью связывания с TNF-рецептором.
Особенно предпочтительный вариант настоящего изобретения касается цикличного пептида, состоящего из последовательности следующих одна за другой аминокислот, выбранных из группы
- QRETPEGAEAKPWY (SEQ ID NO. 5)
- PKDTPEGAELKPWY (SEQ ID NO. 6)
- CGQRETPEGAEAKPWYC (SEQ ID NO. 1) и
- CGPKDTPEGAELKPWYC (SEQ ID NO. 7)
и фрагментов как минимум семи аминокислот, которые включают гексамер TPEGAE, для лечения и профилактики сосудистых осложнений у пациентов с диабетом.
Пептиды согласно настоящему изобретению известны, например, из Европейского патента ЕР 1264599 В1 как применимые для лечения отека легких.
Неожиданно эти пептиды оказались особенно благоприятными для лечения и профилактики сосудистых осложнений у пациентов с диабетом. Таким образом, настоящее изобретение касается применения этих пептидов для производства медикамента для лечения и профилактики сосудистых осложнений у пациентов с диабетом.
Тип диабета, поддающегося лечению или профилактике согласно настоящему изобретению, может быть любым типом распространенного диабета, преимущественно диабетом 1 типа, диабетом 2 типа, гестационным диабетом, врожденным диабетом, связанным с кистозным фиброзом диабетом, стероидным диабетом (вызванным высокими дозами глюкокортикоидов), и может включать несколько форм моногенного диабета; однако Тип I и Тип II являются преобладающими заболеваниями, являющимися предметом настоящего изобретения, в особенности диабет Типа II. Настоящее изобретение обеспечивает способ лечения и профилактики сосудистых осложнений у пациентов с диабетом, причем эффективное количество пептида согласно настоящему изобретению (или смеси таких пептидов) вводят пациенту с диабетом, подверженному риску развития сосудистого осложнения, как описывается авторами.
Диабет характеризуется рецидивной или устойчивой гипергликемией и диагностируется через проявление любого из следующих признаков:
- Уровень глюкозы в плазме натощак 7,0 ммоль/л или выше (126 мг/дл согласно действующему (ВОЗ) определению, причем два измерения уровня глюкозы натощак, показывающие свыше 126 мг/дл (7,0 ммоль/л), рассматриваются как симптоматические для сахарного диабета).
- Уровень глюкозы в плазме 11,1 ммоль/л (200 мг/дл) или выше через два часа после пероральной нагрузки 75 г глюкозы, как в тесте на переносимость глюкозы.
- Симптомы гипергликемии и случайный уровень глюкозы в плазме 11,1 ммоль/л или выше (200 мг/дл).
- Гликозилированный гемоглобин (гемоглобин А1С) на уровне 6,5 или выше (этот критерий был рекомендован Американской ассоциацией диабетологов в 2010 г.; на данный момент он ожидает утверждения со стороны ВОЗ).
Пациенты с уровнем глюкозы натощак от 100 до 125 мг/дл (от 5,6 до 6,9 ммоль/л) считаются пациентами с нарушенным уровнем глюкозы натощак. Пациенты с уровнем глюкозы в плазме 140 мг/дл (7,8 ммоль/л) или выше, но не превышающим 200 мг/дл (11,1 ммоль/л) через два часа после пероральной нагрузки 75 г глюкозы считаются пациентами с нарушенной переносимостью глюкозы. Из этих двух предиабетических состояний последнее, в частности, является главным фактором риска прогрессирования до полностью развившегося сахарного диабета, а также сердечно-сосудистого заболевания (в качестве серьезного сосудистого осложнения у пациентов с диабетом).
Сосудистые осложнения у пациентов с диабетом могут быть вызваны микро- и макроангиопатией. Ретинальная и почечная микроангиопатия вызывает диабетическую ретинопатию и нефропатию, соответственно, и микроангиопатия малых кровеносных сосудов играет важную роль в патогенезе невропатии. Макроангиопатия при диабете состоит, главным образом, из ускоренной формы атеросклероза и поражает коронарную, сонную и периферические артерии, таким образом, повышая риск инфаркта миокарда, инсульта и синдрома диабетической стопы. Крупномасштабные клинические исследования диабета Типа I и Типа II продемонстрировали, что гипергликемия играет важную роль в патогенезе микрососудистых осложнений, таких как повышенная проницаемость сердечных капилляров. Гипертония, курение, гиперхолестеринемия, дислипидемия, ожирение и гипергомоцистеинемия являются дополнительными серьезными причинами микроангиопатии.
Риск макроангиопатии по-видимому, сильно не связан с гипергликемией, однако связан с общими факторами риска атеротромбоза, такими как возраст, курение, гипертония, гиперхолестеринемия, дислипидемия, ожирение и гипергомоцистеинемия. Все вышеперечисленные факторы создают состояние постоянного и прогрессирующего повреждения стенок сосудов, проявляющегося в процессе слабого воспаления и эндотелиальной дисфункции. Как было указано выше (Schalkwijk et al., 2005) дисфункция сосудистого эндотелия считается важным фактором в патогенезе микро- и макроангиопатии. Параметрами, задействованными в сосудистых осложнениях во время диабета, являются дисфункциональная вазорелаксация и повышенная проницаемость сердечных сосудов.
Таким образом, настоящее изобретение особенно применимо к профилактике или лечению микро- и макроангиопатии, инфаркта миокарда, повышенной проницаемости сердечных капилляров, инсульта, невропатии, ретинопатии, нефропатии или синдрома диабетической стопы у пациентов с диабетом.
Настоящее изобретение обеспечивает возможность лечения или профилактики сосудистых осложнений у пациентов с диабетом. Поскольку диабет в настоящее время является болезнью, которая не может быть окончательно излечена, "лечение" в контексте настоящего изобретения следует понимать как включающее обеспечение ослабления сосудистых осложнений пациенты с диабетом по сравнению с обычным прогрессированием этих осложнений. Подобным образом "профилактика" согласно настоящему изобретению также подразумевает, что сосудистые осложнения у пациентов с диабетом возникают на более поздней стадии заболевания благодаря настоящему изобретению по сравнению с обычным возникновением этих осложнений у пациентов с диабетом.
Особенно предпочтительный пептид согласно настоящему изобретению состоит из аминокислотной последовательности CGQRETPEGAEAKPWYC и циклизирует через С остатки (в позиции 1 и 17).
Циклизация согласно настоящему изобретению может достигаться путем прямой внутримолекулярной циклизации функциональных групп аминокислотных остатков, предпочтительно через С-С связь (через дисульфидную связь между двумя С остатками). Пептид также может быть соединен (например, через две цистерны) с веществом-носителем. Таким образом, пептиды согласно настоящему изобретению предпочтительно имеют цистеиновые остатки в начале и на конце молекулы. Другие функциональные группы, способные к циклизации пептида, могут использоваться, например, аминной или спиртовой группой аминокислотного остатка, что приводит к замыканию амидного или сложноэфирного кольца (к ним относятся, например, аминокислоты аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота с серином, треонином, тирозином, аспарагином, глутамином или лизином, которые предпочтительно могут быть циклизированы внутримолекулярно). Таким образом, другими предпочтительными пептидами согласно изобретению являются, например, CGQKETPEGAEAKPWYC (SEQ ID NO. 8), CGQRETPEGAEARPWYC (SEQ ID NO. 9), CGQRETPEGAEAKPC (SEQ ID NO. 10), CQRETPEGAEAKPWYC (SEQ ID NO. 11) или CGQRETPEGAEAKFWYC (SEQ ID NO. 12).
Приемлемыми носителями являются все традиционно применяемые фармацевтические носители, имеющие подходящие связующие группы для связывания с пептидами согласно настоящему изобретению, например носители, реагирующие с SH-группами цистеинов для образования ковалентной связи. Другими подходящими носителями являются смежные бифункциональные группы (например, кислотная группа поблизости от аминной или спиртовой группы). В этом контексте важно заметить, что "циклизация" согласно настоящему изобретению включает как внутримолекулярную циклизацию, так и участие носителя (от которого выступает связанный пептид (где N- и С-конец пептида связывается с носителем для образования петли на носителе)). В обоих вариантах осуществления цикличный пептид демонстрирует цикличную пространственную структуру и соответственно стабилизируется. В некоторых вариантах осуществления предпочтение отдают внутримолекулярной циклизации, в частности в случае, когда отсутствие молекулы носителя является предпочтительным из соображений растворимости или из соображений молекулярной массы или размера молекул.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение касается фармацевтической композиции, содержащей пептид согласно настоящему изобретению (или смесь пептидов согласно настоящему изобретению) и фармацевтический носитель. Эту фармацевтическую композицию применяют для лечения или профилактики сосудистых осложнений у пациентов с диабетом.
Термин "фармацевтическая композиция" относится к любой композиции или препарату, которые содержат пептид, как определено выше, который позволяет ослабить, излечить или предотвратить вышеописанные состояния. В частности, выражение "фармацевтическая композиция" относится к композиции, включающей пептид согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель или формообразующее (оба термина являются взаимозаменяемыми). Подходящие носители или формообразующие известны специалистам в данной области, например солевой раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы, буферы, раствор Хэнка, везикулообразующие соединения (например, липиды), жирные масла, этилолеат, 5% декстроза в солевом растворе, вещества, повышающие изотоничность и химическую устойчивость, буферы и консерванты. К другим подходящим носителям относятся любые носители, которые сами не вызывают вырабатывание у пациента антител, которые являются вредными для пациента. Примерами могут быть хорошо переносимые белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевая кислота, полимерные аминокислоты и аминокислотные сополимеры. Как уже было описано выше, пептиды согласно настоящему изобретению могут быть циклизированы с таким носителем через прямую ковалентную связь. Эта фармацевтическая композиция (в качестве медикамента) может вводиться соответствующими способами, известными специалистам в данной области. Предпочтительным путем введения является парентеральное введение, в частности, путем ингаляции (аэрозоль) или внутривенное введение. Для парентерального введения фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению предусматривается в предназначенной для инъекций единичной лекарственной форме, например в форме раствора, суспензии или эмульсии, рецептированной в сочетании с определенными выше фармацевтически приемлемыми формообразующими. Однако дозирование и способ введения зависят от индивидуальных особенностей пациента, подвергаемого лечению. Как правило, пептид согласно настоящему изобретению вводят в дозе от 1 мкг/кг до 10 мг/кг, более предпочтительно - от 10 мкг/кг до 5 мг/кг, наиболее предпочтительно - от 0,1 до 2 мг/кг. Предпочтительно композицию вводят как внутрибрюшинную болюсную дозу. Также может применяться непрерывная инфузия. В этом случае пептид вводят путем инфузии в дозе от 5 до 20 мкг/кг/мин, более предпочтительно - от 7 до 15 мкг/кг/мин.
Согласно настоящему изобретению особенно предпочтительный пептид согласно настоящему изобретению (также называемый "АР 301") имеет следующую аминокислотную последовательность:
SEQ ID NO:1
2
(NH)Cys-Gly-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-Cys(COOH).
Далее изобретение описывается на представленных ниже примерах и фигурах, которые являются лишь пояснительными и не ограничивают объем изобретения.
Фиг.1 показывает вызванное ацетилхолином расширение суженных при помощи U46619 межжелудочковых коронарных артерий у контрольных получавших стрептозоцин (STZ) или получавших TIP пептид + STZ крыс через 4 недели после инъекции STZ (n=3);
Фиг.2 показывает, что лечение TIP пептидом не влияет на уровень глюкозы в крови у получавших STZ крыс (n=3);
Фиг.3 показывает, что лечение TIP пептидом в зависимости от дозы немного снижает объем мочи у получавших STZ крыс (n=3);
Фиг.4 показывает полученные при флуоресцентной микроскопии изображения перфузированных сердец крыс (Langendorff) с использованием FITC-BSA;
Фиг.5 показывает воздействие TIP пептида (125 мкг/крысу в течение 4 недель внутрибрюшинно) на сердечную проницаемость (определяемую путем введения альбумина-FITC с применением способа Лангендорфа).
ПРИМЕРЫ
1. Воздействие взятого из TNF TIP пептида на эндотелиальную релаксацию во время вызванного стрептозоцином диабета у крыс
Стрептозоцин (STZ) представляет собой антибиотик, который может вызывать разрушение β-клеток поджелудочной железы, поэтому его широко применяют в экспериментах в качестве агента, способного вызывать инсулинозависимый сахарный диабет (IDDM), также известный как сахарный диабет 1 типа (T1DM).
В этом эксперименте самцов крыс Sprague-Dawley (от 240 до 265 г, n=3) разделяли на три группы: 1. Контрольных крыс, получавших только инъекции наполнителя, 2. Крыс с вызванным STZ диабетом (50 мг/кг, внутрибрюшинно) и 3. Получавших STZ крыс, которые параллельно получали TIP пептид (125 мкг, внутрибрюшинно) раз в три дня, в первый раз - за два дня до инъекции STZ, в течение четырех недель. Крысы, у которых уровень в крови составлял >350 мг/дл, считались диабетическими. Межжелудочковые коронарные артерии крыс препарировали, как было описано выше (Romero et al., 2008). В общих чертах, отрезки коронарных артерий закрепляли в миографе для малых сосудов (Danish Myo Technology), сжимали при помощи аналога тромбоксана А2 U46619 9,11-дидезокси-9а,11a-метаноэпоксипростагландина F2a
(Химическое название: (5Z)-7-[(1R,4S,5S,6R)-6-[(1Е,3S)-3-гидрокси-1-октенил]-2-оксабицикло[2.2.1]гепт-5-ил]-5-гептеновая кислота)
и испытывали на их способность к расширению в ответ на увеличение концентрации ацетилхолина. Сосудорасширяющие реакции выражаются как процент от максимального контрольного расширения. Как показано на Фиг.1, межжелудочковые коронарные артерии, взятые у крыс с вызванным STZ диабетом, продемонстрировали значительно сниженную способность к расширению по сравнению с сосудами контрольных крыс. Параллельное лечение диабетических крыс взятым из TNF TIP пептидом АР301 значительно улучшало проявляемую через расширение сосудов реакцию в межжелудочковых коронарных артериях. Эта модель животного с подтвержденным диабетом показывает, что взятый из TNF TIP пептид АР301 может улучшить эндотелиальную вазорелаксацию во время диабета.
Также исследовали воздействие лечения TIP пептидом согласно настоящему изобретению у этих крыс на уровень глюкозы в крови, кровяное давление, объем мочи и массу (Фиг.2 и 3). Получавшие TIP пептид демонстрировали сравнимый уровень глюкозы с STZ-группой, однако у них наблюдался меньший объем мочи и более высокое кровяное давление по сравнению с STZ-группой. Они также демонстрировали повышенную потерю веса. TIP пептид согласно настоящему изобретению также препятствует связанной с STZ сердечной проницаемости in vivo.
Согласно тому же протоколу, как было описано выше, сердца контрольных, получавших STZ и получавших TIP/STZ крыс отделяли через 4 недели. Сердца перфузировали, применяя способ Лангендорфа с BSA-FITC (Di Napoli et al., Nitric Oxide 16 (2007), 228-236). Затем сердца замораживали в жидком азоте и нарезали на слои при помощи микротома. Затем определяли флуоресценцию в 4 слоях каждого сердца и записывали суммарные показатели флуоресцентной реакции. Как показано на Фигурах 4 и 5, TIP пептид АР301 значительно препятствует повышенной проницаемости сердечных сосудов: флуоресцентная микроскопия желудочков перфузированных FITC-альбумином сердец крыс обнаружила значительно меньшее флуоресцентное окрашивание в присутствии TIP пептида (Фиг.5) по сравнению с экспериментами без TIP пептида (Фиг.4).
Представленная на животном модель демонстрирует, что вызванный STZ диабет Типа I у крыс вызывает сосудистую дисфункцию, характеризующуюся нарушенным эндотелиально-зависимым расширением сосудов и повышенной проницаемостью сосудов сердца.
Данные, представленные для этой модели, демонстрируют, что лечение с применением типичного представителя пептидов согласно настоящему изобретению ("TIP пептида"; "АР301"; SEQ ID No.1) позволяет эффективно лечить и предотвращать диабетические сосудистые осложнения у этих животных. Эти данные подтверждают, что лечение пептидами согласно настоящему изобретению представляет собой перспективный подход к новым методам терапии для лечения диабетических сосудистых осложнений также и у людей.
2. Ex vivo оценка провоспалительных свойств пептида АР301 в цельной крови человека
Ех vivo фармакологическое исследование безопасности пептида АР301 в цельной крови человека осуществляли, чтобы определить, приводит ли пептид АР301 к высвобождению провоспалительного маркера интерлейкина-6 (IL-6) из свежевзятой цельной крови человека (то есть препятствует ли APN 301 TNF-специфической воспалительной активности).
В этом исследовании использовали свежевзятую цельную кровь человека, поскольку она представляет прогностическую модельную систему для оценки воспалительной реакции in vivo.
Краткое описание методологии
Цель этого исследования состояла в определении провоспалительной сигнальной способности пептида АР301. Использовали культуры цельной крови и секрецию интерлейкина-6 (IL-6), высокочувствительного маркера провоспалительной стимуляции, количественно определяли путем ELISA-анализа.
Испытательная система
Испытательная система
Для анализов использовали 25 мл свежевзятой гепаринизированной крови 5 здоровых добровольцев (HV).
Исследуемый образец
Обозначение
Пептид АР301 (доза: от 1 нг/мл до 10 мкг/мл; однократное введение в растворе)
Описание
Белый порошок, степень чистоты 96%
Культуры цельной крови
Культивирование цельной крови (WB) осуществляли путем перенесения пипеткой 1 мл WB в лунки 24-луночных планшетов. В каждом эксперименте использовали нестимулированные и контроль-стимулированные культуры.
По возможности вещества и стимуляторы, подлежащие исследованию, в каждом эксперименте добавляли в одинаковом объеме в каждую лунку, не более 10% от общего объема, содержащегося в лунке. Для нестимулированного контроля использовали PBS. Регулирование дозы и разбавление для различных режимов лечения также осуществляли с использованием PBS.
2
Содержимое каждой лунки смешивали и планшеты инкубировали при 37°С и 5% CO в течение 24 часов. После инкубации содержимое каждой лунки переносили в чистую 1,5 мл микротрубку и центрифугировали при 8000-9000 x g в течение 15 минут. Супернатант каждого образца отдельно переносили в две 1,5 мл микротрубки и хранили при -20°С до использования.
Обнаружение интерлейкина-6
Интерлейкин-6 количественно определяли путем специфичного ELISA-анализа (Human IL-6 ELISA Set, BD Biosciences, Cat. No. 555220) с применением антитела против человеческого IL-6 в качестве иммобилизованного антитела, биотинилированного идентифицирующего антитела против человеческого IL-6, конъюгата авидина - пероксидазы хрена в качестве ферментного реагента и рекомбинантного IL-6 в качестве стандарта. Измерение оптической плотности осуществляли при 450 нм с применением Packard FusionReader.
Анализ данных
Результаты для каждого планшета хранили и оценивали при помощи программы FusionDataAnalysis.
Краткое описание результатов исследования
Цель этого исследования состояла в определении провоспалительной сигнальной способности пептида АР301. Использовали культуры цельной крови и секрецию IL 6, высокочувствительного маркера провоспалительной стимуляции, количественно определяли путем ELISA-анализа.
Образцы цельной крови пяти здоровых добровольцев оставляли нестимулированными (отрицательный контроль), стимулировали высокими и низкими дозами LPS (положительный контроль) или инкубировали с пептидом в девяти степенях полулогарифмического разведения от 10 мкг/мл до 1 нг/мл.
Таблица
Высвобождение интерлейкина-6 из свежевзятой цельной крови человека после добавления пептида АР301 и LPS
АР301 пептид
Положительный контроль (LPS)
Концентрация IL-6 (пг/мл, n=5)
Концентрация
0 (отрицательный контроль)
менее 0,5
менее 0,5
10 мг/мл
менее 0,5
195,640
1 мг/мл
менее 0,5
108,370
3 нг/мл
менее 0,5
34,867
1 нг/мл
менее 0,5
не определено
Результаты четко показывают, что пептид АР301 не вызывает заметного уровня секреции IL-6 ни в одной из испытанных концентраций. Положительный контроль (LPS) в результате вызывал сильную секрецию IL-6.
Обсуждение
Эксперименты осуществляли для того, чтобы определить, является ли пептид АР301 посредником в возникновении провоспалительной реакции. Параметром считывания была вызванная секреция IL-6 в культурах цельной крови пяти здоровых доноров. Результаты четко продемонстрировали, что пептид АР301 не вызывал заметного уровня IL-6 ни в одной из донорских культур. Таким образом, было продемонстрировано, что пептид АР301 пептид не вызывает провоспалительной реакции в выбранной ex vivo модели.