ПОРТАТИВНЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗАТОР БИОЧИПОВ ПОВЫШЕННОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ

Полезная модель относится к медицинскому диагностическому оборудованию, в частности к портативным программно-аппаратным анализаторам биочипов для клинических лабораторных исследований, направленных на обнаружение и измерение содержания нуклеиновых кислот или белков с помощью флуоресценции при диагностике и мониторинге протекания широкой группы заболеваний, в том числе онкологических.
Наряду с такими техническими показателями, как чувствительность и функциональные возможности, являющиеся важнейшими при выполнении исследовательских медицинских задач (первая группа показателей), эффективность работы флуоресцентных анализаторов биочипов в клинических условиях лечебных учреждений в значительной степени определяется их надежностью, скоростью проведения диагностики и эксплуатационными свойствами анализаторов, складывающимися из их портативности, удобства использования, уровня подготовки обслуживающего персонала и ценовой доступности рассматриваемого аналитического медицинского прибора (вторая группа показателей).
При приемлемом уровне технических показателей первой группы (чувствительности, определяемой возможностями современной развитой технологии светочувствительных матриц, и функциональных возможностей, наполняемых их базовым ресурсом - развивающейся биочиповой технологией с программным диагностическим обеспечением) основной проблемой проектирования эффективных клинических флуоресцентных анализаторов биочипов, отвечающих изложенным выше высоким техническим показателям второй группы, является задача оптимизации указанных анализаторов, как конструктивно единых устройств, состоящих из их оптических схем и разнородных функциональных блоков оптического, электронного и аппаратно-программного характера, функционирующих на основе их функциональной взаимосвязи.
Такая оптимизация, предусматривающая для клинических задач взаимоувязку совершенствований составляющих устройства анализаторов, повышающую их эффективность в целом, заключается в возбуждении и сборе достаточно интенсивного потока флуоресцентного излучения от рабочей поверхности биочипа, уменьшении времени диагностики и допустимом снижении при этом оптической, электронной и аппаратно-программной насыщенности анализаторов, влияющей на их компактность, надежность и ценовую доступность.
Менее быстрые в получении диагностических результатов флуоресцентные анализаторы биочипов - сканеры, имеющие конфокальную оптическую систему возбуждения и съема флуоресцентного излучения исследуемой поверхности биочипа микробиочипов (такие, как патент US №6646271, G01N 21/64, 2003), в настоящем описании полезной модели не рассматриваются.
Примером менее быстрого сканера для биочипов является германский анализатор биологических микрочипов MArS Ditabis со временем сканирования 4-х слайдов при максимальном разрешении порядка одного часа, сведения о котором размещены на сайте Интернет: http://profilab.spb.ru/?page=4&node=327&item=1240.
Известен более быстрый сканер для флуоресцентной диагностики заболеваний (см. патент РФ №2511262, G01N 21/64, 2014) за счет автоматизации прямых оптоволоконных подачи лазерного возбуждающего излучения и сбора флуоресцентного и рассеянного лазерного излучения с помощью одного и того же общего (торцового) наконечника оптоволоконного пучка и последующего выявления особенностей спектров собранного излучения, низкоэффективный для решения диагностических задач заявляемого анализатора биочипов в связи с оптически ухудшенным съемом (без линзовой оптики) излучения под иной метод идентификации (жидкого) биологического образца, основанный на использовании усложненной аппаратуры (спектрометра), сопровождаемым удорожанием и увеличением габаритов сканера, а также ограничением функциональных возможностей, диагностикой группы заболеваний на основе использования в качестве биологической жидкости крови, плазмы крови, мочи, гноя и/или плевральной жидкости.
Уровень техники в области более быстрых широкопольных флуоресцентных анализаторов биочипов характеризуется известными зарубежными и отечественными разработками, представляющими собой целевые решения, недостаточно эффективные для задачи оптимизации клинических флуоресцентных анализаторов.
Так известна схема на прохождение возбуждающего излучения через биочип при широкопольном оптическом формировании его изображения (см. патент TWI226437, G01N 21/63, 2005), уменьшающая время диагностики (в связи с увеличением площади возбуждающего лазерного освещения рабочей поверхности биочипа с обратной стороны прозрачного носителя и одновременным оптическим формированием полного изображения рабочей поверхности биочипа на ПЗС-матрице) в сравнении со сканерами для биочипов, но предусматривающая использование ограниченных по виду - прозрачных носителей биочипов, понижающих в данной схеме из-за светового поглощения в носителях коэффициент использования возбуждающей световой энергии.
Известны также целевые решения, направленные на улучшение собираемого флуоресцентного излучения в результате осуществления особенностей широкопольного возбуждающего освещения рабочей поверхности биочипа на ограниченном по виду прозрачном носителе, исключающем использование распространенных непрозрачных носителей:
в считывателе биочипов по патенту US №6620623, G01N 21/25, G01N 21/64, 2003 достигается снижение неравномерности широкопольного лазерного или светодиодного возбуждающего освещения рабочей поверхности биочипа из толщи прозрачного носителя за счет оптоволоконного подвода возбуждающего излучения к торцам носителя - стеклянной подложки, что приводит к снижению коэффициента использования возбуждающей световой энергии из-за освещения из толщи подложки всей ее поверхности, несущей биочип, и как следствие к увеличению уровня фона и уменьшению в результате чувствительности;
в устройстве для диагностики с использованием биочипов по патенту РФ №237721, G01N 33/483, G01N 21/64, G02B 21/00, G01J 1/58, 2008 достигается гашение отражения широкопольного светодиодного возбуждающего излучения с зоной освещения над рабочей поверхностью биочипа за счет специальных отражательных элементов прозрачного носителя и дополнительных поглощающих слоев светодиодных осветителей, значительно усложняющих конструкцию устройства и снижающих надежность и технологичность изготовления этого устройства;
в считывателе биочипов по патенту JP №3783826, C12M 1/00, C12Q 1/68, G01N 21/55, G01N 21/64, 2001 достигается устранение флуоресцентного излучения от пылевых включений на рабочей поверхности биочипа в результате его затухания за счет подбора критического угла направления широкопольного потока возбуждающего освещения лазерным источником света или источником белого света на рабочую поверхность биочипа с обратной стороны прозрачного носителя или со стороны расположения рабочей поверхности биочипа в сочетании со средством усиления затухания указанного помехового излучения - дополнительным источником затухающего поля в виде специального прозрачного электрода - пленки оксида индия-олова, нанесенной на прозрачный носитель и расположенной под рабочей поверхностью биочипа, что скорее может быть востребовано в исследовательских флуоресцентных анализаторах биочипов, а для клинического широкопольного анализатора - излишне, т.к. приводит к группе практически значимых недостатков от снижения коэффициента использования возбуждающей световой энергии, повышения требований к настройке анализатора и уменьшения его надежности до необходимости оснащения анализатора биочипами на прозрачных носителях с ухудшенной технологичностью их изготовления.
Наконец, известна схема широкопольного детектирования биочипов по патенту TWI247115, G01N 21/64, G01N 33/50, 2006, в соответствии с которой осуществлено широкопольное возбуждающее освещение рабочей поверхности биочипа через фильтр широкополосным источником света с зоной освещения над рабочей поверхностью биочипа на носителе без ограничений его вида, например на непрозрачном носителе, и на одном универсальном источнике возбуждающего излучения, за счет введения в конструкцию системы первого поворотного устройства для смены фильтра, размещенного между широкополосным источником света и биочипом, и второго поворотного устройства для смены фильтра, размещенного между биочипом и детектором на ПЗС-матрице, что недостаточно эффективно для надежной работы клинического переносного портативного анализатора биочипов из-за снижения стабильности и качества не лазерного возбуждающего излучения.
В качестве наиболее близкого аналога-прототипа заявляемого портативного флуоресцентного анализатора биочипов выбран широкопольный портативный анализатор с двумя фотообъективами «Чипдетектор-01» 2008-го года выпуска изготовителя - ООО «Биочип-ИМБ» (см. фото основных узлов указанного изделия со снятыми стенками его корпуса на фиг. 1), представляющий собой производственную реализацию анализатора на основе устройства для анализа биологических микрочипов по патенту РФ №2510959, G01N 21/64, G01N 21/00, G01N 21/62, 2013 (или по международной заявке WO 201109835, G01N 21/64, 2011), содержащий держатель биочипа, широкопольное кольцевое оптоволоконное средство освещения диагностируемого участка биочипа с двумя лазерными источниками возбуждающего излучения с разными длинами волн и зоной освещения, расположенной над диагностируемым участком биочипа, блок оптического формирования потока прямого флуоресцентного излучения от диагностируемого участка биочипа с фильтровым выделением указанного потока, выполненный на основе двух фотообъективов, направленных навстречу друг другу и расположенных над диагностируемым участком биочипа, оптоэлектронный детектор на ПЗС-матрице, чувствительный к указанному флуоресцентному излучению и одновременно воспринимающий полное изображение флуоресцирующего диагностируемого участка биочипа, и компьютерный блок обработки с помощью программного обеспечения Imageware (адаптированного под диагностику инфекционных заболеваний) флуоресцентных сигналов от диагностируемого участка биочипа, подключаемый к оптоэлектронному детектору и загружаемый указанным программным обеспечением на диске, прилагаемом к данному изделию-анализатору.
Данный портативный флуоресцентный анализатор биочипов недостаточно эффективен в связи с частичным решением задачи его оптимизации для клинической эксплуатации.
Усиление блока оптического формирования потока прямого флуоресцентного излучения от диагностируемого участка биочипа двумя фотообъективами, позволившее обеспечить работу анализатора без программной компенсации неравномерности освещения биочипа при построении цифрового изображения флуоресцирующего диагностируемого участка биочипа, привело к усложнению анализатора при отсутствии преимуществ блока с двумя объективами по поперечным аберрациям перед блоком с одним объективом и ухудшении настройки резкости из-за складывающихся продольных аберраций в блоке с двумя объективами, а равномерное широкопольное лазерное возбуждающее освещение с помощью кольцевого оптоволоконного средства освещения диагностируемого участка биочипа также конструктивно усложнило анализатор и понизило технологичность его изготовления и коэффициент использования возбуждающей световой энергии и при фиксированной настройке возбуждающего освещения лишило анализатор-прототип возможности эксплуатационной корректировки настройки.
В результате анализатор-прототип недостаточно надежен в клинических условиях и имеет повышенную стоимость.
Технический результат заявляемой полезной модели - разработка портативного флуоресцентного анализатора биочипов повышенной эффективности в результате оптимизации его устройства за счет упрощения, повышения надежности и снижения стоимости анализатора в связи с предлагаемым выполнением каждого источника возбуждающего излучения - широкопольным, в частности в виде лазерного источника с расширяющим микрообъективом, увеличивающим поле освещения биочипа, блока оптического формирования потока прямого флуоресцентного излучения от диагностируемого участка биочипа - на основе одного фотообъектива, в частности широкоугольного фотообъектива с фиксированным фокусным расстоянием, и блока обработки флуоресцентных сигналов от диагностируемого участка биочипа с помощью программного обеспечения - с возможностью стабильной программной компенсации неравномерности освещения диагностируемого участка биочипа и восприятия его полного изображения светочувствительной матрицей оптоэлектронного детектора при пиксельном построении цифрового изображения флуоресцирующего диагностируемого участка биочипа и его несложного программного диагностического тестирования при одновременном значительном увеличении срока службы анализатора, его ремонтопригодности и технологичности его изготовления из доступных малотребовательных типовых комплектующих, а также при обеспечении надежной работоспособности анализатора в результате обеспечения достаточно высокого уровня интенсивности прямого флуоресцентного потока излучения от рабочей поверхности биочипа в условиях уменьшения его поглощения при прохождении через один фотообъектив с уменьшенным количеством линзовых элементов и увеличения коэффициента использования возбуждающей энергии широкополосных источников без ее оптоволоконной доставки и точности диагностики широкой группы заболеваний на основе минимизации расхода оптических и электронных приборостроительных ресурсов.
Кроме того, предлагаемый анализатор расширяет арсенал медицинской диагностической аппаратуры в области биочиповой технологии, что актуально для немногочисленных аналогов, являющихся широкополосными анализаторами, в отличие от распространенных сканеров.
Для достижения указанного технического результата в портативном флуоресцентном анализаторе биочипов, содержащем держатель биочипа, широкопольное средство освещения биочипа с источниками возбуждающего излучения и зоной освещения, расположенной над диагностируемым участком биочипа, блок оптического формирования потока прямого флуоресцентного излучения от диагностируемого участка биочипа с фильтровым выделением указанного потока, оптоэлектронный детектор, чувствительный к указанному флуоресцентному излучению и одновременно воспринимающий полное изображение флуоресцирующего диагностируемого участка биочипа, и блок обработки флуоресцентных сигналов от диагностируемого участка биочипа с помощью программного обеспечения, каждый источник возбуждения флуоресцентного излучения выполнен с возможностью широкопольного освещения биочипа с полным световым охватом его диагностируемого участка, блок оптического формирования потока прямого флуоресцентного излучения от диагностируемого участка биочипа выполнен на основе одного фотообъектива, снабженного для снижения энергетических потерь от поглощения при прохождении через него флуоресцентного излучения минимизированным линзовым составом и расположенного над диагностируемым участком биочипа, а блок обработки флуоресцентных сигналов от диагностируемого участка биочипа с помощью программного обеспечения выполнен с возможностью программной компенсации неравномерности освещения детектируемого участка биочипа и восприятия его полного изображения светочувствительной матрицей оптоэлектронного детектора при пиксельном построении цифрового изображения флуоресцирующего диагностируемого участка биочипа и его программного диагностического тестирования по цифровому эталонному образцу.
Для развития эксплуатационных свойств этого анализатора:
в качестве фотообъектива блока оптического формирования потока прямого флуоресцентного излучения от диагностируемого участка биочипа может быть использован широкоугольный фотообъектив с фиксированным фокусным расстоянием;
широкопольное средство освещения биочипа может быть выполнено на основе двух лазерных источников возбуждающего излучения с разными длинами волн, каждый из которых снабжен штатным серийным расширяющим микрообъективом;
источники возбуждающего излучения могут быть установлены с расположением их оптических осей излучения под регулируемым углом к поверхности диагностируемого участка биочипа с возможностью обеспечения ее максимального освещения при минимальном отражении возбуждающего излучения, попадающего на вход оптоэлектронного детектора;
блок оптического формирования прямого флуоресцентного излучения от диагностируемого участка биочипа может быть снабжен двухполосным фильтром, расположенным между фотообъективом блока оптического формирования потока прямого флуоресцентного излучения от диагностируемого участка биочипа и оптоэлектронным детектором;
оптоэлектронный детектор может быть выполнен на основе ПЗС-матрицы;
блок обработки флуоресцентных сигналов от диагностируемого участка биочипа с помощью программного обеспечения может иметь функциональный интерфейс, реализованный на основе специализированного микропроцессора, встроенного в корпус анализатора.
На фиг. 1 показан общий вид (фото) основных узлов анализатора-прототипа (со снятыми стенками его корпуса без компьютерного блока обработки флуоресцентных сигналов от диагностируемого участка биочипа); на фиг. 2 - структурная блок-схема заявляемого анализатора.
Заявляемый портативный флуоресцентный анализатор содержит (см. фиг. 2):
держатель 1 биочипа 2, представляющего собой в настоящем примере выполнения носитель-подложку в виде предметного стекла (прозрачность подложки практического значения для предлагаемого анализатора не имеет - подложка может быть непрозрачной) с размещенным на нем диагностируемым участком 3 размером 3,1×4 мм, содержащем 20 ячеек, размером 0,4 мм каждая и расстоянием между ячейками - 0,5 мм, состоящих из ковалентно связанных с поверхностью нуклеиновых кислот (или белков), меченных красителем (Су3 и/или Су5), что позволяет регистрировать сигнал флуоресценции в результате воздействия возбуждающего освещения на диагностируемый участок биочипа,
широкопольное средство освещения диагностируемого участка биочипа с двумя источниками 4 и 5 возбуждающего излучения с разными длинами волн, выполненными в виде двух лазерных источников (лазера KLM-A532-20-5 фирмы ЗАО «ФТИ-ОПТРОНИК», Санкт-Петербург с длиной волны 532 нм - зеленый луч и лазера KLM-D650-16-5 этой же фирмы с длиной волны 650 нм - красный луч), снабженными для широкопольного освещения штатными серийными расширяющими микрообъективами, и зоной освещения, расположенной над диагностируемым участком 3 биочипа 2,
блок оптического формирования потока прямого флуоресцентного излучения от диагностируемого биочипа, выполненный на основе расположенного над рабочей поверхностью биочипа одного фотообъектива 6 (широкоугольного фотообъектива Canon с фиксированным фокусным расстоянием 24 мм и кольцом фокусировки), имеющего для снижения энергетических потерь от поглощения при прохождении через него флуоресцентного излучения уменьшенный линзовый состав (в сравнении с фотообъективом с регулируемым фокусным расстоянием), и снабженный для частотного выделения указанного потока флуоресцентного излучения двухполосным светофильтром 7 (XF3066 595-700 DBEM OMEGA OPTICAL), расположенным между фотообъективом 6 и оптоэлектронным детектором 8,
оптоэлектронный детектор 8, выполненный на основе ПЗС-матрицы с размерами не менее 1/2″ (Canyon USB камеры, имеющей разрешение 640×480.0,3 Мп), чувствительной к флуоресцентному излучению от диагностируемого участка биочипа 2 и одновременно воспринимающий (фиксирующий) ее полное изображение,
блок обработки флуоресцентных сигналов от диагностируемого участка биочипа с помощью программного обеспечения, выполненный с возможностью программной компенсации неравномерности освещения диагностируемого участка 3 биочипа 2 и восприятия его полного изображения светочувствительной матрицей оптоэлектронного детектора 8 при пиксельном построении с помощью малогабаритного персонального компьютера 9 цифрового изображения флуоресцирующего диагностируемого участка биочипа и его программного диагностического тестирования по цифровому эталонному образцу.
При этом фотообъектив 6 установлен для проецирования изображения диагностируемого участка 3 биочипа 2 на ПЗС-матрице оптоэлектронного детектора 8 в масштабе 1:1 между держателем 1 и оптоэлектронным детектором 8 на двойном фокусном расстоянии от диагностируемого участка биочипа 2 и ПЗС-матрицы детектора 8, а для обеспечения максимального освещения лазерными источниками 4 и 5 при минимальном отражении их возбуждающего излучения, попадающего на вход оптоэлектронного детектора 8, поворотные лазерные источники 4 и 5 оснащены, соответственно средствами 10 и 11 регулирования угла расположения их оптических осей излучения к поверхности диагностируемого участка 3 биочипа 2, и для компенсации неравномерности освещения диагностируемого участка 3 биочипа 2 из-за неравномерности распределения интенсивности возбуждающего излучения в поперечном сечении лазерного пучка обеспечивают симметричное поле освещения в результате избыточного охвата диагностируемого участка 3 биочипа 2 широкопольным пучком возбуждающего излучения лазерных источников 4 и 5 с расширяющими микрообъективами.
Для автоматического включения и выключения лазерных источников 4 и 5 в блок-схему предлагаемого анализатора введен исполнительный микроконтроллер 12, а для управления основным функционированием анализатора служит малогабаритный персональный компьютер 9, подключенный к оптоэлектронному детектору 8 через USB-хаб концентратор 13 и к микроконтроллеру 12 через подсоединенный к концентратору 13 переходник 14 USB-COM (см. фиг. 2). Блок обработки флуоресцентных сигналов от диагностируемого участка биочипа с помощью программного обеспечения в составе предлагаемого анализатора может иметь функциональный интерфейс, реализованный на основе специализированного микропроцессора, встроенного в корпус анализатора, с соответствующей упрощенной узкофункциональной интерфейсной кнопочной клавиатурой, размещенной на панели управления на корпусе анализатора, вместо персонального компьютера 9. Питание анализатора осуществляется посредством блока питания 15.
Работает предлагаемый флуоресцентный анализатор биочипов следующим образом.
В результате широкопольного возбуждающего лазерного освещения диагностируемого участка 3 биочипа 2 и его флуоресценции, формируется с помощью оптической схемы, построенной на одном фотообъективе 6, снижающем световые потери, и одном двухполосном фильтре 7, поток флуоресцентного излучения с полным изображением флуоресцирующего диагностируемого участка 3, который направляется на вход оптоэлектронного детектора 8, одновременно воспринимающего с помощью ПЗС-матрицы полное указанное изображение, которое в цифровом виде в персональном компьютере 9 подвергается программной обработке, заключающейся в компенсации оставшейся части неравномерности освещения диагностируемого участка 3 биочипа 2 из-за погрешностей настройки лазерного освещения и в устранении неравномерности восприятия полного изображения диагностируемого участка 3 биочипа 2 ПЗС-матрицей, а также в диагностическом тестировании этого изображения по цифровому эталонному образцу с помощью функциональной подпрограммы, входящей в разработанную специализированную программу управления анализатором.
Специализированная программа управления анализатором состоит из двух подпрограмм, объединенных общим интерфейсом пользователя.
Первая исполнительная подпрограмма служит для управления включения отрегулированных по угловому положению лазерных источников 4 и 5 путем посылки команд в микроконтроллер 12 и получения информации о включении или выключения лазерных источников 4 и 5 программой микроконтроллера 12. В качестве интерфейса программирования используются встроенные функции специализированной программы персонального компьютера 9 для работы с СОМ портом микроконтроллера 12. Команды управления представляют собой набор ASCП символов, код которых согласован с программой микроконтроллера 12.
Вторая функциональная подпрограмма (разработанная заявителем) служит для обработки цифрового изображения диагностируемого участка 3 биочипа 2, получаемого с оптоэлектронного детектора 8, включающей компенсирующее неравномерность освещения диагностируемого участка 3 биочипа 2 и восприятия светочувствительной матрицей оптоэлектронного детектора 8 полного изображения диагностируемого участка 3 биочипа 2 удельное нормирование указанного цифрового изображения по пиксельному максимуму с учетом поправочного коэффициента измерительного распределения пикселей и тестовую оценку преобразованного цифрового изображения диагностируемого участка 3 биочипа 2 в соответствии с контрольной маской размещения эталонных меток.
Перечисленные доступные комплектующие анализатора с широкопольной оптической схемой формирования полного изображения рабочей поверхности, построенной на одном объективе, подтверждают достижение изложенного выше технического результата предлагаемой полезной модели.
Использование заявляемого анализатора в клинических условиях для лабораторной диагностики онкологических заболеваний показали высокие скорость (не более 10 секунд на анализ одного биочипа) и точность диагностики, а также превосходные эксплуатационные свойства, включающие удобство и повышенную надежность портативного анализатора в пользовании в результате повышения его устойчивости при значительно уменьшенной высоте корпуса анализатора (H=180 мм, L=200 мм и D=160 мм) в сравнении с анализатором-прототипом (см. на фиг. 1 H=270 мм, L=140 мм и D=120 мм) при одинаковых габаритах персонального компьютера в составе сравниваемых анализаторов.