Способ определения чувствительности культур Mycobacterium tuberculosis к пиразинамиду
METHOD FOR DETERMINING THE SENSITIVITY OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS CULTURES TO PYRAZINAMIDE

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для диагностики чувствительности к пиразинамиду возбудителя туберкулеза.
Предложенный способ позволяет определять активность микобактериального фермента пиразинамидазы, обуславливающего чувствительность микобактерий туберкулеза (МБТ) к пиразинамиду, путем проведения цветной реакции непосредственно в жидкой питательной среде культивирования микобактерий в присутствии пиразинамида и соли Мора.
Пиразинамид - противотуберкулезный препарат (ПТП) первого ряда. Его применение позволяет сократить сроки лечения туберкулеза с 9-12 до 6 месяцев, так как это единственный ПТП, который активен в отношении недедящихся МБТ в кислой среде очага поражения [1, 2]. ВОЗ рекомендует включать пиразинамид и в схемы лечения туберкулеза с лекарственной устойчивостью (в том числе с МЛУ), при условии сохранения чувствительности к этому препарату [3].
Пиразинамид, синтетический пиразиновый аналог никотинамида, является пролекарством. В активную форму - пиразиновую кислоту (РОА), пиразинамид превращается под действием микобактериального фермента - пиразинамидазы. В нейтральной среде цитоплазмы клетки РОА не обладает антимикробной активностью и удаляется из клетки активной транспортной системой мембраны. В кислой среде очага воспаления РОА протонируется (НРОА). Затем протонированная форма может повторно проникнуть в клетку МБТ и, освобождая протоны, закисляет внутриклеточную среду, приводя к гибели МБТ [2].
Золотым стандартом определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам являются культуральные методы.
Классический культуральный метод определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза основан на учете роста культуры на среде с противотуберкулезным препаратом по сравнению с ростом контрольной культуры на среде без препарата.
Традиционно для культивирования МБТ и определения их лекарственной чувствительности используют плотные яичные среды Левенштейна-Йенсена и Финн-II, которые имеют значение кислотности, близкое к нейтральному [4].
Пиразинамид оказывает антимикобактериальное действие только в кислой среде, поэтому в условиях нейтральной рН эффект препарата даже при чувствительности к нему возбудителя проявляться не будет.
Известен способ испытания чувствительности Mycobacterium tuberculosis к лекарственным средствам [RU 2573917, С2, C12Q 1/18, 10.05.2014], включающий следующие этапы:
a) получение обогащенных проб, содержащих Mycobacterium tuberculosis;
b) добавление жидкой питательной среды к обогащенным пробам для получения проб жидкой культуры и, при необходимости, выполнение обогащающего культивирования в течение до 7 дней;
c) нагрев и расплавление твердой среды для получения расплавленной твердой среды и снижение температуры расплавленной твердой среды до соответствующей температуры культивирования проб жидкой культуры или до комнатной температуры, при этом твердая среда имеет температуру плавления 50-95°С и температуру затвердевания 25-45°С для твердой среды, содержащей агар или агарозу и питательные вещества;
d) смешивание проб жидкой культуры с расплавленной твердой средой для получения жидких проб для испытания чувствительности к лекарственным средствам;
e) отверждение жидких проб для испытания чувствительности к лекарственным средствам для получения твердых проб для испытания чувствительности к лекарственным средствам с помощью бумажных полосок, чувствительных к лекарственным средствам;
f) культивирование твердых проб для испытания чувствительности к лекарственным средствам в течение 5-15 дней, последующее добавление к твердой пробе индикатора;
g) наблюдение зоны ингибирования лекарственного средства по уровню индикации индикатора и определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к лекарственным средствам.
Это техническое решение отличается относительно большой сложностью. В частности, согласно этому способу, после серий культивирования микобактерий на жидкой питательной среде для получения достаточной бактериальной массы осуществляют дополнительное культивирование микобактерий туберкулеза на агаре с внесенными препаратами до 15 дней, что значительно увеличивает время получения результата.
Кроме того, в этом техническом решении нет указаний, какие именно противотуберкулезные препараты можно испытывать этим способом. Однако, учитывая механизм действия пиразинамида, становится очевидным, что предложенное техническое решение не подходит для тестирование лекарственной чувствительности к пиразинамиду, т.к. агаровая среда, предлагаемая как питательная основа для роста микобактерий, не закислена, и, следовательно, подавление роста культуры в присутствии пиразинамида не произойдет.
Известна также питательная среда с пиразинамидом для определения лекарственной устойчивости возбудителей туберкулеза и их идентификации [RU 2099417, C1 C12Q 1/18, 20.12.1997], содержащая калий фосфорнокислый однозамещенный, магний сернокислый, бриллиантовый зеленый, глицерин, гомогенизированную яичную массу и воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит натрий лимоннокислый, железо (III) сернокислое аммиачное, железо (II) сернокислое аммиачное, аминоуксусную кислоту, а-аминоянтарную кислоту, янтарную кислоту, аммоний янтарнокислый, натрий фосфорнокислый однозамещенный, гидролизин, пенициллин, пиразинамид при следующем количественном соотношении компонентов:
Калий фосфорнокислый однозамещенный, г 4,0-9,0;
Магний сернокислый, г 0,2-0,6;
Натрий лимоннокислый, г 0,3-0,9;
Железо (III) сернокислое аммиачное, г 0,01-0,04;
Железо (II) сернокислое аммиачное, г 0,01-0,04;
Аминоуксусная кислота г 0,5-1,3;
α-аминоянтарная кислота, г 0,3-0,9;
Янтарная кислота, г 0,8-1,6;
Аммоний янтарнокислый, г 1,2-2,4;
Натрий фосфорнокислый однозамещенный, г 1,3-2,4;
Бриллиантовый зеленый, г 0,01-0,04;
Глицерин, мл 7,0-17,0;
Гидролизин, мл 15,0-50,0;
Гомогенизированная яичная масса, мл 200-500;
Пиразинамид, мкг/мл 50-200;
Пенициллин, ед/мкл 100000-300000;
Вода, л. до 1,0.
Однако этот способ имеет относительно ограниченную область применения, т.к. согласно Приказа МЗ РФ №109, определение чувствительности к пиразинамиду на плотных питательных средах не разрешено [4]
Известен также способ, рекомендуемым ВОЗ для определения фенотипической чувствительности к пиразинамиду, известный как метод пропорций на жидкой среде Middlebrook 7Н9 в системе автоматизированной детекции роста микобактерий ВАСТЕС MGIT 960 (BD, США) [5].
Недостатком этого способа является его сложность и высокие материальные затраты, т.к. для его реализации необходимо дорогостоящее оборудование и расходные материалы, в частности, для постановки теста лекарственной чувствительности к пиразинамиду требуется закупка специально предназначенного для этого набора пробирок MGIT и реагентов [6].
Известен способ выявления устойчивых к пиразинамиду изолятов Mycobacterium tuberculosis [RU 2552214, С2, C12N 15/00, 10.10.2014] путем определения наличия мутаций в гене рпсА, ассоциированных с формированием устойчивости к пиразинамиду, посредством проведения ПЦР в режиме «реального времени» с использованием HRM-анализа, согласно которому, проводят амплификацию на смеси равного количества тестируемой ДНК и ДНК дикого типа с использованием праймеров:
формируют гетеродуплексы за счет одновременной коамплификации ДНК дикого типа и тестируемой ДНК, при этом, на первом этапе ПЦР проводят уравнивание концентрации с помощью количественной ПЦР с использованием той же пары праймеров (Pncl8U/Pncl5R) с построением калибровочной кривой и использованием регрессионного уравнения.
Недостатком способа является его относительно высокая сложность, т.к. предполагает необходимость проведения трудоемких процедур, требующих высокой квалификации специалистов, наличия дорогостоящего оборудования (например, амплификатора с оптическим модулем и возможностью построения кривых плавления), что ограничивает его широкое применение.
Кроме того, в настоящее время нет однозначного подтверждения, что любая мутация на уровне pncA приводит к нарушению работы фермента и, следовательно, к устойчивости МБТ к пиразинамиду.
Наиболее близким к заявляемому является способ определения чувствительности к пиразинамиду [Wayne LG. Simple pyrazinamidase and urease tests for routine identification of mycobacteria. Am Rev Respir Dis. 1974 Jan;109(l):147-51], который основан на том, что перевод препарата в активную форму происходит под действием пиразинамидазы, и, следовательно, активность этого фермента будет ключевой для чувствительности МБТ к пиразинамиду.
4
4
2
4
2
В основе способа положен тот факт, что пиразиновая кислота - активный метаболит пиразинамида, образующийся у чувствительных к пиразинамиду штаммов МБТ под воздействием пиразинамидазы, является окислителем и, в частности, способна окислять ион Fe2+ до Fe3+ и, следовательно, использование соли Мора (сульфат аммония-железа(), FeSO⋅(NH)SO⋅6HO) позволяет провести цветную реакцию, при которой в присутствии пиразиновой кислоты происходит окрашивание раствора соли Мора в коричнево-розовый цвет, что свидетельствует об активности фермента пиразинамидазы. Если пиразинамидаза неактивна (у устойчивых к пиразинамиду штаммов), пиразинамид не преобразуется в пиразиновую кислоту, и, следовательно, добавление к культуре соли Мора не приведет к окрашиванию.
Кратко, наиболее близкое техническое решение заключается в следующем.
Для получения достаточного количества бактериальной массы проводят предварительное культивирование штамма МБТ на плотных или жидких питательных средах. Готовят специальную агаровую среду, содержащую пиразинамид в концентрации 100 мкг/мл или 200 мкг/мл. Далее культуру МБТ засевают в стеклянные пробирки на агаровую среду с пиразинамидом и инкубируют при 37°С в течение 7 дней. Затем на поверхность среды добавляют 1 мл 1% соли Мора. Результат считывают визуально сразу или, если окрашивание не произошло, через 4 дня инкубации при 37°С. Красная полоса на поверхности агаровой среды свидетельствует о положительной активности пиразинамидазы.
В более поздней модификации метода Wayne LG для повышения чувствительности реакции в среду добавляется пиразинамид в концентрации 400 мкг/мл [8].
Эта модификация способа определения активности пиразинамидазы, как маркера чувствительности к пиразинамиду, используется в коммерческом Наборе для пиразинамидазного теста для микобактерий (Pyrazinamidase Test Kit for Mycobacteria), HiMedia, Индия (РУ ФСЗ 2012/12473 от 02.11.2012).
Недостатком наиболее близкого технического решения является его относительно высокая сложность и относительно низкая чувствительность и достоверность, связанная с визуализацией и интерпретацией результата, так как колориметрическая реакция оценивается по узкой полосе на поверхности агаровой среды, из-за чего возникает низкая интенсивность окрашивания. Это снижает эффективность известного способа и сужает арсенал технических средств, которые могут быть использованы для определения чувствительности культур Mycobacterium tuberculosis к пиразинамиду.
Задачей изобретения является создание высокоэффективного и простого в осуществлении способа определения чувствительности к пиразинамиду микобактерий туберкулеза, обладающего высокой чувствительностью и достоверностью, а также расширение арсенала технических средств, которые могут быть использованы для определения чувствительности культур Mycobacterium tuberculosis к пиразинамиду.
Требуемый технический результат заключается в повышении чувствительности и достоверности детекции результата при сокращении материальных и трудозатрат с одновременным расширением арсенала технических средств, которые могут быть использованы для определения чувствительности культур Mycobacterium tuberculosis к пиразинамиду.
Поставленная задача решается, а требуемый технический результат достигается тем, что для определения чувствительности культур Mycobacterium tuberculosis к пиразинамиду проводят цветную реакцию окисления двухвалентного железа до трехвалентного в присутствии пиразиновой кислоты, синтезированной из пиразинамида под действием микобактериального фермента пиразинамидазы, согласно изобретению, цветную реакцию проводят непосредственно в жидкой питательной среде культивирования при обеспечении времени инкубации культуры в течение 1 суток, причем, концентрацию культуры проводят путем осаждения, а регистрацию результата цветной реакции по всему реакционному объему осуществляют в течение 15 минут.
Предложенный способ реализуется следующим образом.
Отработка и оптимизация условий предлагаемого способа были проведены на 20-ти штаммах МБТ с известной фенотипической чувствительностью к пиразинамиду, определенной в системе ВАСТЕС MGIT 960 (10 чувствительных к пиразинамиду, 10 устойчивых к пиразинамиду).
Способ может быть осуществлен в двух вариантах, в зависимости от оснащенности бактериологических лабораторий.
Вариант 1 (для лабораторий, использующих для культуральной диагностики туберкулеза систему ВАСТЕС MGIT 960).
7
В исследование берется контрольная пробирка MGIT, оставшаяся после постановки теста лекарственной чувствительности в системе ВАСТЕС MGIT 960 к ПТП 1-го ряда, не содержащая препаратов, с числом ростовых единиц МБТ не менее 400 GU (около 10 КОЕ/м).
Пробирку с культурой дополнительно инкубируют 1 неделю в термостате при 37°С для наращивания бактериальной массы. После инкубации культуру концентрируют путем осаждения. Для этого из пробирки аккуратно, стараясь не взмучивать микобактериальные клетки со дна, отбирают стерильной одноразовой пастеровской пипеткой 7,5 мл среды, не содержащей микобактерий. К оставшейся в объеме 800 мкл культуре МБТ добавляют 100 мкл разведенной чистой субстанции пиразинамида до конечной концентрации 800 мкг/мл. Далее пробирки с МБТ и пиразинамидом инкубируют 1 сутки при температуре 37°С в термостате. Через сутки инкубации в пробирку добавляют 200 мкл раствора соли Мора концентрацией 0,04 г/мл. Результат оценивают не раньше, чем через 1 минуту и не позже, чем через 15 минут инкубации при комнатной температуре.
Появление розовато-коричневой окраски среды свидетельствует о чувствительности изолята МБТ к пиразинамиду, отсутствие окраски - об устойчивости к пиразинамиду.
Вариант 2 (для лабораторий, проводящих культуральную диагностику туберкулеза на плотных питательных средах).
В стеклянную или прозрачную пластиковую пробирку наливают 800 мкл жидкой питательной среды Middlebrook 7Н9, в которую добавляют 2-3 полные петли диаметром 3 мм свежей культуры МБТ, выросшей на плотной яичной питательной среде (например, Левенштейна-Йенсена или Финн-II), и инкубируют в термостате при 37°С 7 дней для адаптации МБТ к новым условиям культивирования. Затем к культуре МБТ добавляют 100 мкл разведенной чистой субстанции пиразинамида до конечной концентрации 800 мкг/мл.
Далее пробирки с МБТ и пиразинамидом инкубируют 1 сутки при температуре 37°С в термостате. Через сутки инкубации в пробирку добавляют 200 мкл раствора соли Мора концентрацией 0,04 г/мл. Результат оценивают не раньше, чем через 1 минуту и не позже, чем через 15 минут инкубации при комнатной температуре.
Появление розовато-коричневой окраски среды свидетельствует о чувствительности изолята МБТ к пиразинамиду, отсутствие окраски - об устойчивости к пиразинамиду.
Примеры реализации способа.
Пример 1
Определение чувствительности к пиразинамиду культур МБТ, выросших в пробирках MGIT в системе ВАСТЕС MGIT 960.
Представленным способом (вариант 1) было исследовано 230 культур МБТ, выросших в системе ВАСТЕС MGIT 960. Для этих же культур определяли фенотипическую чувствительность к пиразинамиду в системе ВАСТЕС MGIT 960 с набором PZA-kit (BD, США) (референтый метод).
Добавление соли Мора к концентрированной культуре МБТ, инкубированной в течение 1 недели с пиразинамидом, привело к окрашиванию среды в 117-ти из 124-х пробирок с чувствительными к пиразинамиду изолятами МБТ. Окрашивание среды в пробирках с устойчивыми к пиразинамиду изолятами МБТ наблюдалось в 1 случае из 106-ти. Следовательно, в 222-х из 230-ти случаев (96,52%) результат определения чувствительности к пиразинамиду у изолятов МБТ представленным способом совпал с референтным.
Пример 2
Определение чувствительности к пиразинамиду культур МБТ, выросших на плотной питательной среде.
Представленным способом (вариант 2) было исследовано 50 культур МБТ, выросших на плотной питательной среде Левенштейна-Иенсена. Для этих же культур определяли фенотипическую чувствительность к пиразинамиду в системе ВАСТЕС MGIT 960 с набором PZA-kit (референтый метод). Добавление соли Мора к культуре МБТ, рекультивированной на жидкой питательной среде Middlebrook 7Н9 и инкубированной в течение 1 недели с пиразинамидом, привело к окрашиванию среды в 22-х из 25-ти пробирок с чувствительными к пиразинамиду изолятами МБТ. Окрашивания среды в пробирках с устойчивыми к пиразинамиду изолятами МБТ не наблюдалось. Следовательно, в 47-ти из 50-ти случаев (94%) результат определения чувствительности к пиразинамиду у изолятов МБТ представленным способом совпал с референтным.
Преимуществами предлагаемого способа по сравнению с существующими прототипами является:
- минимизация контаминации проб и лабораторной ошибки за счет того, что реакция проводится непосредственно в среде культивирования микобактерий;
- повышение чувствительности анализа за счет концентрирования культуры микобактерий, что приводит к повышению содержания фермента и, как следствие, пиразиновой кислоты в реакционном объеме, что увеличивает интенсивность окрашивания;
- повышение объективности оценки результата за счет детекции окраски во всем реакционном объеме.
Таким образом, благодаря усовершенствованию известного способа, достигается требуемый технический результат, который заключается в повышении чувствительности и достоверности детекции результата при сокращении материальных и трудозатрат с одновременным расширением арсенала технических средств, которые могут быть использованы для определения чувствительности культур Mycobacterium tuberculosis к пиразинамиду.
Источники информации
1. Steele MA, Des Prez RM. The role of pyrazinamide in tuberculosis chemotherapy. Chest 1988; 94:845-50.
2. Zhang Y., Mitchison D. The curious characteristics of pyrazinamide: a review. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2003; 7:6-21.
3. World Health Organization. 2019. WHO consolidated guidelines on drug-resistant tuberculosis treatment. Geneva: World Health Organization; 2019. WHO/CDS/TB/2019.7
4. Приказ Министерства Здравоохранения Российской Федерации №109 от 21 марта 2003 года (с изменениями на 5 июня 2017 года) "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации"
5. World Health Organization. 2009. Guidelines for surveillance of drug resistance in tuberculosis, 4th ed. WHO/HTM/TB/2009.422. World Health Organization, Geneva, Switzerland.
6. Siddiqi S.H., Rusch-Gerdes S. MGIT Procedure Manual for ВАСТЕС MGIT 960TB System. - Руководство по работе с системой ВАСТЕС MGIT 960. 2006. 89 с.
7. Wayne LG. Simple pyrazinamidase and urease tests for routine identification of mycobacteria. Am Rev Respir Dis. 1974 Jan; 109(1): 147-51.
8. Singh P, Wesley C, Jadaun GP, Malonia SK, Das R, Upadhyay P, Faujdar J, Sharma P, Gupta P, Mishra AK, Singh K, Chauhan DS, Sharma VD, Gupta UD, Venkatesan K, Katoch VM. Comparative evaluation of Lowenstein-Jensen proportion method, BacT/ALERT 3D system, and enzymatic pyrazinamidase assay for pyrazinamide susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 2007;45(l):76-80.
9. Aono A, Chikamatsu K, Yamada H, Igarashi Y, Murase Y, Takaki A, Mitarai S. A simplified pyrazinamidase test for pyrazinamide drug susceptibility in Mycobacterium tuberculosis. J Microbiol Methods. 2018;154:52-54.