СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ АТЕРОСКЛЕРОЗА НА ФОНЕ САХАРНОГО ДИАБЕТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
METHOD FOR SIMULATING ATHEROSCLEROSIS AGAINST BACKGROUND OF DIABETES MELLITUS IN EXPERIMENT

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к патофизиологии и сердечно-сосудистой хирургии, и может быть использовано для изучения механизмов возникновения и развития повреждений сердечно-сосудистой системы на фоне сочетанного нарушения метаболизма углеводов и липидов у экспериментальных животных, а также для разработки способов профилактики, консервативного и хирургического видов лечения развивающихся сердечно-сосудистых осложнений.
Сердечно-сосудистые заболевания остаются основной причиной смертности населения, несмотря на некоторое улучшение исходов за счет совершенствования методов ранней диагностики и современных подходов их коррекции, в том числе хирургических [Европейские рекомендации по профилактике сердечно-сосудистых заболеваний в клинической практике (пересмотр 2016 г.)]. Наряду с дислипидемией, являющейся специфическим фактором, ускоряющим развитие сосудистых поражений, ключевым звеном в цепи метаболических и последующих структурно-функциональных расстройств признана гипергликемия [Петрик Г.Г., Павлищук С.А. Оценка влияний параметров метаболизма и гемостаза на прогрессирование диабетических ангиопатий // РКЖ. - 2011. - № 4. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/otsenka-vliyaniy-parametrov-metabolizma-i-gemostaza-na-progressirovanie-diabeticheskih-angiopatiy (дата обращения: 26.05.2020)].
Общие факторы риска развития микро- и макрососудистых осложнений, высокая распространенность поражения органов-мишеней и их главенствующая роль в инвалидизации и смертности больных, позволили сформулировать гипотезу “единой природы” патогенеза кардиоваскулярных нарушений на фоне атеросклероза (АС) и сахарного диабета (СД) [Демидова Татьяна Юрьевна Атеросклероз и сахарный диабет типа 2: механизмы и управление // CardioСоматика. - 2011. - № 2. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/ateroskleroz-i-saharnyy-diabet-tipa-2-mehanizmy-i-upravlenie (дата обращения: 26.05.2020)]. Риск сердечно-сосудистых осложнений у пациентов, страдающих одновременно СД и АС, намного выше, а ожидаемая продолжительность жизни значительно ниже, чем при изолированном АС. Однонаправленность механизмов развития эндотелиальной дисфункции, сходство звеньев развития метаболических нарушений, общность взаимоотягощающих признаков ухудшения качества жизни пациентов еще раз подтверждают тесную связь атеросклероза и СД, особенно 2 типа.
Показано, что интегральным патогенетическим звеном СД является ангиопатия, при этом частота и выраженность ее коррелирует с длительностью и выраженностью метаболических нарушений [Балаболкин М. И., Клебанова Е. М., Креминская В. М. Патогенез ангиопатий при сахарном диабете // Сахарный диабет. - 1999. - № 1. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/patogenez-angiopatiy-pri-saharnom-diabete (дата обращения: 26.05.2020)]. Важно отметить, что в клинической практике, несмотря на профилактическую направленность медицины, в подавляющем большинстве случаев исследуется уже манифестное течение СД и сформировавшиеся сердечно-сосудистые осложнения, изучение же напрямую ранних стадий формирования метаболических нарушений, в частности эндотелиальной дисфункции, затруднено, но может быть реализовано в эксперименте. Кроме того, разработка новых, более эффективных и безопасных методов хирургической коррекции гемодинамических нарушений, также требует их апробации в условиях эксперимента.
Существуют следующие способы моделирования СД: хирургический, химический, эндокринный, иммунный и генетический.
Хирургический способ моделирования СД основан на полном или частичном удалении поджелудочной железы. У лабораторных животных с таким СД отмечается глюкозурия в сочетании с полиурией, выраженный голод, быстрая потеря веса и астения. Уровень глюкозы крови резко повышается, отмечается кетонурия, запас гликогена в органах практически исчезает. Недостатком этого способа является гибель экспериментальных животных в ранние сроки послеоперационного периода, еще до появления морфологической картины ангиопатии [Баранов В.Г. Экспериментальный сахарный диабет: монография / В.Г. Баранов // Л.: Наука, 1983. – 240 с.].
Более распространенными способами моделирования СД являются химические, которые индуцируются различными препаратами (аллоксан, стрептозотоцин, дитизон и др.), избирательно воздействующими на β-клетки островков Лангерганса [Etuk E.U. Animals models for studying diabetes mellitus / Agric. Biol. J. N. Am. – 2010. - Vol. 1, № 2, P. 130–134; Fazan S.V.P., De Vasconcelos C.C.A., Valença M.M., Nessler R., Moore K.C. Diabetic peripheral neuropathies: a morphometric overview / Int. J. Morphol. – 2010. - Vol. 28, № 1. - P. 51–64].
Аллоксан оказывает прямое токсическое действие на β-клетки поджелудочной железы, накапливаясь в них посредством поглощения с помощью транспортера GLUT-2 глюкозы и вызывая окисление ДНК и белков за счет образования активных форм кислорода, что приводит к их деструкции и развитию СД 1 типа [Баранов В.Г. Экспериментальный сахарный диабет: монография / В.Г. Баранов. – Л.: Наука, 1983.– 240 с.; Mozheyko L.A. Eksperimental’nye modeli dlya izucheniya sakharnogo diabeta chast’ I. Alloksanovyy diabet [Experimental models for studying diabetes mellitus part 1. Alloxan diabetes]. Zhurnal Grodnenskogo gosudarstvennogo meditsinskogo universiteta [Journal of Grodno State Medical University], 2013, no. 3 (43), pp. 26–29]. Недостатками этого способа являются высокая летальность экспериментальных животных, связанная с токсичностью препарата, а также тот факт, что выжившие в эксперименте животные рано погибают от агрессивного течения СД еще до развития ангиопатий [Способ моделирования аллоксанового диабета / Данилова И.Г. с соавт URL: https://yandex.ru/patents/doc/RU2534411C1_20141127 (дата обращения 13.04.2020 г.)].
Стрептозотоцин вызывает  гибель β-клеток поджелудочной железы за счет алкилирующей активности его метильной группы и подавления синтеза ДНК, а также активации свободнорадикального окисления, связанного с генерацией пероксинитрита из избыточно образующегося оксида азота, донатором которого является нитрозогруппа стрептозотоцина [Мазо В.К. Стрептозотоциновые модели сахарного диабета / В.К. Мазо, Ю.С. Сидорова, С.Н. Зорин, А.А. Кочеткова // Вопросы питания. – 2016. – Т. 85, № 4. – С. 14–21; Байрашева, В.К. Моделирование сахарного диабета и диабетической нефропатии в эксперименте / В. К.Байрашева // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 4]. Стептозотоциновая модель СД характеризуется гипергликемией, кетонурией, снижением веса и изменением шерсти животных, появлением многочисленных геморрагий и некротизированных участков на коже, конечностях и хвосте, а также сопровождается выраженной полидипсией и полиурией. Отмечаются поражения век и конъюнктивы, помутнение зрачка и склеры, с большим количеством кровоизлияний различной величины [Хейфец И.А. Изучение гипогликемической активности субетты и росилиглитазона на модели стрептозотоцинового диабете у крыс / И.А. Хейфец, А.А. Спасов, М.П. Воронкова, Ю.Л. Дугина, О.И. Эпштейн // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2012. – Т. 153, № 1. – С. 62–64; Arison R.N. Light and electron microscopy of lesions in rats rendereddiabetic with streptozotocin / R.N. Arison, E.I. Ciaccio, M.S. Glitzer, J.A. Cassaro, M.P. Pruss // Diabetes. – 1967. – Vol. 16, № 1. – P. 51–56]. Недостатками этого способа являются высокая летальность экспериментальных животных, связанная с токсичностью препарата, а также ранняя гибель выживших в остром эксперименте животных от агрессивного течения СД [Tesch GH, Allen TJ. Rodent models of streptozotocin-induced diabetic nephropathy / Nephrolog (Carlton). 2007;12(3): 261-266].
Дитизоновая модель СД отличается манифестным течением и сопровождается высокой гипергликемией, глюкозурией, кетонурией, полиурией, полидипсией и уменьшением массы тела, что приводит к гибели животного от состояния, напоминающего диабетическую кому [Основы патологии. Учебное пособие / В.Т. Долгих. – М.: Издательство Юрайт. – 2019. – С. 180]. Недостатком данного способа является быстрое развитие декомпенсации заболевания, что не позволяет планировать хронические эксперименты, направленные на изучение микро- и макроангиопатий.
Способ эндокринного моделирования СД основан на действии контринсулярных гормонов. Для этого применяется длительное введение гормонов аденогипофиза – соматотропного, адренокортикотропного гормонов, вызывающих гипофизарный диабет, и введение глюкокортикоидов, вызывающих стероидный диабет [Чурилов, Л. П. Метаболическая логистика стресса, сахарный диабет и труды Бернардо Альберто Усая / Л. П. Чурилов, В. И. Утехин // Педиатр. – 2015.– Т. 6, № 3. – С. 104–111]. Общим  недостатком данных моделей является развитие, наряду с СД, других состояний, характерных для эндокринопатии.
Для иммунного способа моделирования СД  животным вводят антитела против инсулина, что более соответствует патогенезу СД 1 типа, при котором
организм вырабатывает антитела против собственного инсулина, а также против клеток островков Лангерганса. В результате возникает аутоиммунное повреждение β-клеток поджелудочной железы, приводящее к абсолютной недостаточности инсулина в организме [Баранов, В. Г. Экспериментальный сахарный диабет: монография / В. Г. Баранов. – Л.: Наука, 1983.
– 240 с.]. Недостаток данного метода заключается в сложности получения необходимых антител по сравнению с химическими моделями. Еще одним ограничением является быстрая гибель экспериментальных животных еще до первых признаков формирования ангиопатий.
Генетический диабет моделируется у специально выведенных, линейных, животных с генетической предрасположенностью к формированию различных видов СД [Гвазава, И. Г. Патогенез сахарного диабета 1 типа и экспериментальные модели на лабораторных грызунах / И. Г. Гвазава, О. С. Роговая, М. А. Борисов, Е. А. Воротеляк, А. В. Васильев // Acta Naturae. – 2018. – Т. 10, № 1 (36). – С. 25–35; Титок, Т. Г. Модели сахарного диабета, их выбор и использование в экспериментальных исследованиях / Т. Г. Титок, А. А. Евсеенко, Ф. Аджамиян, В. А. Кордюм // Биополимеры и клетка. – 1999. – Т. 15, № 2. –
С. 103–108.]. Основным недостатком этого способа моделирования является гибель животных от осложнений основного заболевания еще до формирования ангиопатий.
Существует большое количество способов моделирования атеросклеротического поражения артерий [способ моделирования атеросклероза путем скармливания животным «Западной диеты»: метод имеет ряд недостатков обусловленных необоснованностью  выбора пола и возраста опытных животных, отсутствием комплексного воздействия факторов риска заболевания, в том числе стрессовых факторов, долгосрочность формирования атеросклероза (до 4-5 месяцев) [Jawieñ J. Mouse model sof experimental atherosclerosis. / J. Jawieñ, P. nasta£ek, R. Korbut/Joumal of physiology and Pharmacology. - 2004. - V.55. - №3, - р.503-517]; Способ моделирования атеросклероза путем скармливания экспериментальным животным атерогенной диеты с избытком витамина D2, ионов кальция на фоне угнетения функции щитовидной и паращитовидной желез мерказолилом [Крепкова Л.В. Использование модели гиперлипидемии и атеросклероза у крыс в токсикологическом эксперименте/ Л.В. Крепкова // Биомедицина.- 2011. - №3. - с.103- 105]; п. RU 2524127 C1 – моделирование осуществляют на крысах самцах, возраст которых превышает 1 год, которым на протяжении 46-60 суток моделирования атеросклероза, с частотой 1 раз в двое суток перорально вводят витамин D2 в количестве от 35000 МЕ/кг до 60000 МЕ/кг массы тела; кл. G09В 23/28, 1995 - способ моделирования атеросклероза, включающий кормление исследуемых животных атерогенным рационом, состоящий из добавления в корм порошка холестерина в количестве 1%, маргарина 10%, мерказолила 10 мг/кг и витамина D - 2,5 ME на кг массы тела крысы, отличающийся тем, что наряду с кормлением атерогенным рационом животным проводят операцию, состоящую из наложения лигатуры на почечную ножку левой почки нерассасывающимся шовным материалом и прошивания верхнего полюса правой почки, при этом оставляя 2/3 органа;], однако представленные модели предусматривают введение медикаментозных препаратов: обзидана - 1 мг на 100 г массы [п. RU № 2033646], суспензии гидрокортизона ацетата - 1,5 мг на 100 г массы животного [п. RU 2192048 C2], уридина в дозе 50 мг на 1 кг массы тела один раз в сутки в течение 6-8 дней [п. RU 2127113 C1] на фоне диеты, обогащенной жирами. Существенным недостатком известных способов моделирования АС является искусственное изменение метаболизма животного, что не отражает формирование истинных механизмов, играющих основную роль в развитии атеросклероза [Григорюк А.А., Турмова Е.П., Маркелова Е.В. Способ моделирования атеросклероза URL: https://patents.google.com/patent/RU2500041C1/ru Дата обращения: 26.05.2020 г.].
В этой связи создание воспроизводимого способа моделирования АС на фоне СД в эксперименте, применимого для изучения повреждений сердечно-сосудистой системы и их коррекции, представляется актуальной.
Технической задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка в эксперименте способа моделирования АС на фоне СД, заключающейся в развитии атерогенной дислипидемии, дисфункции β-клеток поджелудочной железы, инсулинорезистентности периферических тканей, к ангиопатиям смешанного генеза.
Способ моделирования АС на фоне СД в эксперименте осуществляется следующим образом:
Кроликов содержат в условиях 12/12-часового светотемнового режима на фоне специальной диеты, предусматривающей ежедневный прием на протяжении всего эксперимента продуктов, содержащих 0,8-1 г холестерина на 1 кг массы тела при свободном доступе к 5% раствору глюкозы. Среднесуточная калорийность при этом составляет 4000-5000 ккал. Через 3 недели от начала диеты,  проводится анализ липидного и гликемического профиля цельной крови кроликов с определением индекса атерогенности для констатации факта дислипидемии, а также исследование гликозилированного гемоглобина, являющегося интегральным показателем конечного гликозилирования в тканях. Далее производится однократное внутривенное введение дитизона в дозе 25 мг/кг. Через 24 часа после инъекции дитизона определяют уровень глюкозы в капиллярной крови  кроликов при помощи глюкометра и повторно исследуют гликозилированный гемоглобин. После введения дитизона кролики продолжают находиться на указанной диете, уровень глюкозы крови корректируют подкожным введением инсулина короткого действия, поддерживая его в диапазоне 10-12 ммоль/л. Через 6 месяцев от начала эксперимента развитие АС на фоне СД у кроликов подтверждают исследованием биохимических показателей крови, данными ультразвуковой допплерографии артерий конечностей, морфологического исследования сердца и артерий после выведения животного из эксперимента.
Полученные данные свидетельствуют о том, что предлагаемый в качестве изобретения способ моделирования АС на фоне СД в эксперименте, позволяет изучать течение сочетанного нарушения метаболизма углеводов и липидов у кроликов, а также использовать данную модель для разработки способов профилактики, консервативного и хирургического лечения развивающихся сердечно-сосудистых осложнений.