СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХИТОЗАНА С НИЗКИМ СОДЕРЖАНИЕМ ЭНДОТОКСИНА
METHOD OF PRODUCING CHITOSAN WITH LOW ENDOTOXIN CONTENT

Настоящее изобретение относится к способу получения щелочного хитозана с низким содержанием эндотоксина, а также к способу получения нейтрального хитозана, соли хитозана и производных хитозана с низким содержанием эндотоксина, и к полученным таким способом продуктам.
Хитозан, в частности, используют для получения гемостатических материалов, применяемых для остановки кровотечений.
Хитозан является производным твердых отходов от переработки моллюсков и может быть извлечен из грибковой культуры. Хитозан представляет собой нерастворимый в воде катионный полимерный материал. Прежде чем использовать хитозан в гемостатических материалах, его часто сначала переводят в форму водорастворимой соли. В результате этого соль хитозана может растворяться в крови, образуя гель, который создает препятствие потоку крови.
Соли хитозана идеально подходят для вариантов применения, описанных в настоящем документе, поскольку хитозан легко разрушается в организме. Хитозан превращается в глюкозамин под действием фермента лизоцима и, вследствие этого, выводится из организма естественным путем. Нет необходимости в удалении хитозана из организма. Более того, соли хитозана обладают слабыми антибактериальными свойствами и, вследствие этого, их использование снижает риск инфекции.
Чтобы использовать хитозан в изготовлении гемостатических материалов, которые можно применять для остановки кровотечения, необходимо убедиться, что хитозан имеет достаточно низкую концентрацию эндотоксина.
Эндотоксин представляет собой липополисахарид, присутствующий на поверхности наружной мембраны грамотрицательных бактерий. Эндотоксины обладают высокой токсичностью для млекопитающих, в частности, людей и, как известно, они с трудом поддаются удалению из материалов. Эндотоксины могут становиться пирогенными при попадании в кровоток или другие ткани, где они обычно не встречаются. Таким образом, эндотоксин должен быть удален из фармацевтически приемлемых препаратов.
Процедуры для удаления или разрушения пирогенов, в частности, эндотоксина, называют методами «депирогенизации». Методы депирогенизации материалов, содержащих эндотоксин, включают ионообменную хроматографию, ультрафильтрацию, дистилляцию и различные химические методы, направленные на разрушение эндотоксина.
В WO 2008063503 описан способ удаления эндотоксина из хитозана, включающий следующие стадии:
a) использование стерильного апирогенного оборудования и материалов в стерильных условиях;
b) набухание содержащего эндотоксины хитозана в течение вплоть до 24 часов;
c) растворение хитозана в количестве от 1 кг/25 л до 1,5 кг/25 л в 0,01M - 4,0M едкой щелочи;
d) постоянное перемешивание полученного щелочного раствора хитозана;
e) нагревание раствора при температуре 60-100°C в течение периода времени от 45 минут до 4 часов при перемешивании;
f) промывание раствора примерно 10x объемом ультрачистой свободной от эндотоксина воды;
g) нейтрализация раствора до pH 6,8-7,5;
h) образование ультрачистой суспензии хитозана с низким содержанием эндотоксина и перенос ее в свободную от эндотоксина закрытую систему;
i) удаление избытка воды из суспензии.
Это сложный и дорогостоящий процесс, особенно при необходимости использования стерильного оборудования и необходимости промывания раствора 10x объемом свободной от эндотоксина воды.
В US 2006293509 описан способ получения водорастворимого хитозана с низким содержанием эндотоксина путем:
a) приведения в контакт нерастворимого в воде хитозана со щелочным раствором в течение первого периода времени продолжительностью более 1 часа;
b) промывания нерастворимого в воде хитозана для удаления остаточного щелочного раствора, желательно, свободной от эндотоксина водой;
c) частичного ацетилирования нерастворимого в воде хитозана в реакционном растворе, содержащем агент фазового переноса;
d) растворения частично ацетилированного водорастворимого хитозана в водном растворе, содержащем сурфактант и имеющем pH от примерно 7,0 до примерно 7,4;
e) добавления смешивающегося с водой растворителя в водный раствор и дополнительного доведения pH водного раствора до pH по меньшей мере 8,0, чтобы вызвать осаждение водорастворимого хитозана, имеющего низкое содержание эндотоксина, из смеси водного раствора/смешивающегося с водой растворителя; и
f) необязательно, промывания в осадителе, таком как изопропанол.
Однако этот способ является сложным и дорогим и предпочтительно включает использование больших количеств свободной от эндотоксина воды или других жидкостей. Способ также требует использования агентов фазового переноса и рассчитан на несколько часов.
В TW 593342 описан способ уменьшения содержания эндотоксина в хитозане путем:
a) растворения хитозана, содержащего эндотоксин, в водном растворе;
b) приведения в контакт водного раствора с сурфактантом для образования нерастворимого твердого вещества и водного раствора с пониженным содержанием эндотоксина;
c) использования средств разделения твердого вещества/жидкости для отделения твердого вещества от водного раствора.
Однако этот способ требует применения сурфактанта, вступающего в реакцию с растворенным хитозаном, для получения нерастворимого твердого вещества. Полученное твердое вещество будет смесью хитозана и сурфактанта или продуктом реакции между хитозаном и сурфактантом.
Настоящее изобретение направлено на преодоление вышеуказанных трудностей.
Первый аспект настоящего изобретения относится к способу получения щелочного хитозана, хитина или их производных с низким содержанием эндотоксина, включающему стадии:
(a) приведения в контакт хитозана, хитина, производного хитозана или производного хитина со щелочным раствором, имеющим концентрацию менее 0,25M, для получения смеси; и
(b) оставления смеси на период времени менее 12 часов.
Способ по настоящему изобретению может дополнительно включать стадию (c) высушивания смеси.
Способ по настоящему изобретению является эффективным способом получения щелочного хитозана, хитина, производного хитозана или производного хитина с низкой концентрацией эндотоксина. В качестве преимущества, способ не требует стадии промывания, стадии споласкивания, применения сурфактанта или агентов фазового переноса, стерильного оборудования и/или использования свободной от эндотоксина воды. Кроме того, также не требуется специальной фильтрации воздуха или стерильных условий. Способ по настоящему изобретению предпочтительно не включает стадию ацетилирования хитозана. Кроме того, в способе по настоящему изобретению не используют свободное от эндотоксина оборудование. Это особенно выгодно, поскольку это снижает затраты, связанные с данным способом, по сравнению со способами, для которых необходимо такое оборудование.
Используемый в настоящем документе термин «производное хитозана» означает частично деацетилированный хитин, который может иметь различную степень деацетилирования, по желанию. Как правило, частично деацетилированный хитин, подходящий для использования по настоящему изобретению, имеет степень деацетилирования выше примерно 50%, чаще выше примерно 75% и в большинстве случаев, как правило, 5 выше примерно 85%.
В настоящем документе термин «производные» также охватывает продукты реакции хитозана или хитина с другими соединениями. Такие продукты реакции включают, но не ограничиваются ими, карбоксиметилхитозан, гидроксибутилхитин, N-ацилхитозан, O-ацилхитозан, N-алкилхитозан, O-алкилхитозан, N-алкилиденхитозан, O-сульфонилхитозан, сульфатированный хитозан, фосфорилированный хитозан, нитрованный хитозан, щелочной хитин, щелочной хитозан, или хелаты металлов с хитозаном и так далее.
Хотя первый аспект настоящего изобретения относится к способу получения хитозана, хитина или их производных с низким содержанием эндотоксина, способ описан далее в настоящем документе применительно к хитозану исключительно для удобства и иллюстративных целей.
Хитозан может представлять собой коммерчески доступный хитозан, такой как пищевой, медицинский или фармацевтический хитозан. Способ по настоящему изобретению, таким образом, можно использовать для получения щелочного хитозана с низким содержанием эндотоксина из коммерчески доступного хитозана. Это отличается от некоторых способов, в которых эндотоксины можно удалять или уменьшать их количество в процессе производства хитозана. Преимуществом является то, что способ по настоящему изобретению можно использовать для получения щелочного хитозана с низким содержанием эндотоксина из готового хитозана, который иначе был бы непригоден для использования в медицинских целях из-за концентрации в нем эндотоксина.
Термин «щелочной хитозан» используют в настоящем документе для обозначения композиции хитозана, имеющей значение pH выше, чем pH 7,5.
Используемый в настоящем документе термин «щелочной раствор» относится к раствору, имеющему значение pH выше, чем pH 7,5.
Поскольку молекулярная масса эндотоксинов может существенно варьироваться, концентрацию эндотоксина измеряют в единицах эндотоксина (ЕЭ) (EU) на грамм материала. Измерение концентрации эндотоксина представляет собой количественную оценку уровней эндотоксина относительно определенного количества эталонного эндотоксина.
Например, в настоящем изобретении концентрацию эндотоксина измеряют в единицах эндотоксина (ЕЭ) на грамм хитозана. Используемый в настоящем документе термин «низкое содержание эндотоксина» означает концентрацию эндотоксина менее 50 единиц эндотоксина (ЕЭ) на грамм хитозана.
Таким образом, способ по настоящему изобретению подходит для получения щелочного хитозана, имеющего концентрацию эндотоксина менее 50 ЕЭ/г.
Предпочтительно, полученный щелочной хитозан имеет концентрацию эндотоксина менее 30 ЕЭ/г, более предпочтительно менее 20 ЕЭ/г, более предпочтительно менее 15 ЕЭ/г, даже более предпочтительно менее 10 ЕЭ/г и наиболее предпочтительно менее 5 ЕЭ/г.
Было обнаружено, что щелочной раствор в низких концентрациях обеспечивает получение продукта с желаемыми свойствами. Концентрация щелочного раствора, используемого в данном способе, может составлять 0,2M или менее. Предпочтительно, концентрация щелочного раствора составляет от примерно 0,01M до 0,2M. Более предпочтительно, концентрация щелочного раствора составляет от примерно 0,02M до 0,1M. Концентрация щелочного раствора может составлять от примерно 0,04M до 0,06M, как правило, 0,05M. Концентрации щелочного раствора могут составлять вплоть до примерно 0,01M, 0,05M, 0,10M, 0,15M, 0,20M или 0,25M. Хорошие результаты были получены при использовании концентрации щелочного раствора 0,1M.
В некоторых вариантах осуществления количество щелочного раствора относительно хитозана может находиться в диапазоне от примерно 1 части хитозана на примерно 10 частей щелочного раствора вплоть до примерно 10 частей хитозана на примерно 1 часть щелочного раствора. Предпочтительно, количество щелочного раствора относительно хитозана составляет примерно 1 часть щелочного раствора на примерно 2 части хитозана, более предпочтительно примерно 1 часть щелочного раствора на примерно 1 часть хитозана.
Щелочной раствор может содержать щелочной или щелочноземельный компонент, выбранный из перечисленных далее, либо отдельно, либо в сочетании: гидроксиды металлов, карбонаты металлов, бисульфиты металлов, персиликаты металлов, сопряженные основания и гидроксид аммония.
Подходящие металлы включают натрий, калий, кальций или магний.
Предпочтительно, щелочной компонент представляет собой гидроксид натрия, гидроксид калия или карбонат натрия. Как правило, используют гидроксид натрия.
Контакт щелочного раствора с хитозаном можно создавать любыми подходящими способами, известными в данной области. Например, щелочной раствор можно распылять на хитозан или хитозан можно смешивать со щелочным раствором. Предпочтительно, щелочь, контактирующую с хитозаном, распределяют равномерно.
Предпочтительно, хитозан смешивают со щелочным раствором. При низких молекулярных массах хитозан может полностью или частично растворяться в щелочном растворе. Хитозан можно смешивать со щелочным раствором на стадии (a) примерно на 30 минут, более предпочтительно примерно на 10 минут. В некоторых вариантах осуществления хитозан можно смешивать со щелочным раствором более чем на 30 минут.
В некоторых вариантах осуществления хитозан не растворяется в щелочном растворе.
В некоторых вариантах осуществления хитозан не набухает в щелочном растворе.
В некоторых вариантах осуществления щелочной раствор смачивает хитозан без растворения или набухания хитозана.
В некоторых вариантах осуществления смесь хитозана и щелочного раствора можно периодически перемешивать на протяжении всей стадии (b).
Смесь хитозана и щелочного раствора оставляют на период времени, за который достаточное количество эндотоксина разрушается. Смесь хитозана и щелочного раствора оставляют на период времени менее 12 часов. Установлено, что оставление хитозана и щелочного раствора, имеющего концентрацию менее 0,25M, на период времени менее 12 часов перед последующей обработкой приводит к желаемой низкой концентрации эндотоксина в полученном щелочном хитозане.
Преимуществом способа по настоящему изобретению является то, что смесь можно оставлять без необходимости в непрерывном перемешивании хитозана со щелочным раствором.
В некоторых вариантах осуществления смесь можно оставлять на стадии (b) на период времени менее 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 часов. Смесь можно оставлять на стадии (b) на период времени менее 10 часов, предпочтительно менее 8 часов, более предпочтительно менее 6 часов, даже более предпочтительно менее 4 часов и наиболее предпочтительно менее 2 часов.
В некоторых вариантах осуществления смесь можно оставлять на стадии (b) на период времени более 1, но менее 12 часов; более 2, но менее 12 часов; более 3, но менее 12 часов; более 4, но менее 12 часов; более 5, но менее 12 часов; более 6, но менее 12 часов; более 7, но менее 12 часов; более 8, но менее 12 часов; более 9, но менее 12 часов; более 10, но менее 12 часов или более 11, но менее 12 часов. В некоторых вариантах осуществления смесь можно оставлять на стадии (b) на период времени от 1 до 11 часов, от 1 до 10 часов, от 1 до 9 часов, от 1 до 8 часов, от 1 до 7 часов, от 1 до 6 часов, от 1 до 5 часов, от 1 до 4 часов, от 1 до 3 часов или от 1 до 2 часов. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления смесь можно оставлять на период времени от 2 до 10 часов, от 4 до 8 часов или от 5 до 7 часов.
В некоторых вариантах осуществления смесь можно оставлять на стадии (b) на период времени менее 1 часа, в том числе, менее 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 или 5 минут. Смесь можно оставлять на период времени менее трех минут, менее двух минут или менее одной минуты.
В некоторых вариантах осуществления смесь можно оставлять на стадии (b) только на период времени, который необходим для подготовки смеси к последующей стадии обработки, например, стадии высушивания (c). Хорошие результаты получали, когда смесь высушивали немедленно после приведения в контакт хитозана со щелочным раствором на стадии (a). В данном контексте «немедленно» означает, что смесь оставляют на стадии (b) только на период времени, который необходим для подготовки смеси к стадии высушивания (c). Как правило, это составляет менее примерно 30 секунд, предпочтительно менее 20 секунд и наиболее предпочтительно менее 10 секунд.
Таким образом, один из аспектов настоящего изобретения относится к способу получения щелочного хитозана, хитина или их производных с низким содержанием эндотоксина, включающему стадии:
(a) приведения в контакт хитозана, хитина, производного хитозана или производного хитина со щелочным раствором, имеющим концентрацию менее 0,25M, для получения смеси; и
(b) немедленного высушивания смеси.
В таком способе смесь оставляют на стадии (b) только на то время, которое необходимо для подготовки ее к следующей стадии обработки. Например, смесь можно оставлять на стадии (b) на то время, которое необходимо для подготовки ее к высушиванию. Затем смесь можно высушивать на стадии высушивания (c).
Смесь можно оставлять стоять на стадии (b) при комнатной температуре и давлении. Комнатная температура и давление означает температуру примерно 20-25°C и давление примерно 1 атмосферу (атм). Преимуществом является то, что нет необходимости оставлять смесь в стерильных условиях.
Смесь предпочтительно хранят в чистом контейнере. Смесь можно хранить в инертной атмосфере.
Смесь может дополнительно содержать консервант. Преимуществом является то, что консервант может исключать риск микробного роста, который может иметь место, например, когда смесь оставляют на длительный срок. Консервант может быть любым консервантом, который является биосовместимым и подходящим для использования в щелочной среде. Подходящие консерванты включают ионы серебра, ионы цинка, хлоргексидин или их сочетания.
Способ по настоящему изобретению может включать или не включать стадию высушивания. Стадию высушивания можно выполнять любыми общепринятыми методами высушивания, известными в данной области. Предпочтительно, стадию высушивания выполняют в печи или пропусканием продукта через воздушную сушилку. Опять-таки, для стадии высушивания не требуется специальное стерильное оборудование.
Было обнаружено, что, после того, как смесь была высушена на стадии высушивания, уровень эндотоксина сухой смеси не увеличивается заметно с течением времени. Преимущество этого заключается в том, что смесь можно хранить в течение некоторого периода времени до дальнейшей обработки.
Таким образом получают щелочной хитозан с низким содержанием эндотоксина, имеющий концентрацию эндотоксина менее 50 ЕЭ/г. Щелочной хитозан с низким содержанием эндотоксина может быть нерастворим в воде. Имеющий низкую молекулярную массу щелочной хитозан с низким содержанием эндотоксина может в некоторой степени растворяться в воде.
Следующий аспект настоящего изобретения относится к щелочному хитозану, хитину или их производным с низким содержанием эндотоксина, которые получают способом, описанным в настоящем документе.
Следующий аспект настоящего изобретения относится к щелочному хитозану, хитину или их производным, имеющим концентрацию эндотоксина менее 50 ЕЭ/г.
Щелочной хитозан, хитин или их производные предпочтительно имеют концентрацию эндотоксина менее 30 ЕЭ/г, предпочтительно менее 20 ЕЭ/г, более предпочтительно менее 15 ЕЭ/г, даже более предпочтительно менее 10 ЕЭ/г и наиболее предпочтительно менее 5 ЕЭ/г.
Щелочной хитозан, хитин или их производные с низким содержанием эндотоксина содержат щелочь, имеющую концентрацию менее 0,25M. Предпочтительно, концентрация составляет примерно 0,2M или менее, более предпочтительно примерно 0,15M или менее и даже более предпочтительно примерно 0,1M или менее.
Щелочной хитозан с низким содержанием эндотоксина можно использовать в качестве промежуточного соединения при производстве других хитозановых продуктов, таких как, например, производные или сополимеры, либо в производстве низкомолекулярного хитозана или хитозановых олигосахаридов. Щелочной хитозан с низким содержанием эндотоксина также можно использовать в качестве исходного материала для производства других форм хитозана, либо производных или сополимеров, например, хитозановых волокон, тканей, покрытий, пленок, гелей, растворов, листов или пены.
В частности, щелочной хитозан с низким содержанием эндотоксина можно использовать в получении других полезных хитозановых продуктов, имеющих низкие концентрации эндотоксина, включая нейтральный хитозан и соли хитозана, а также другие производные хитозана, например, карбоксиметилхитозан, гидроксиэтилхитозан, ацилхитозан, алкилхитозан, сульфонилхитозан, фосфорилированный хитозан, алкилиденхитозан, хелаты с металлами, хлорид хитозана, лактат хитозана, ацетат хитозана, малат хитозана, глюконат хитозана.
Таким образом, следующий аспект настоящего изобретения относится к способу получения нейтрального хитозана, соли хитозана или производного хитозана с низким содержанием эндотоксина, включающему стадию приведения в контакт щелочного хитозана, полученного способом, описанным ранее в настоящем документе, с кислотой.
Данный способ позволяет получать полезный в медицине нейтральный хитозан, соль хитозана или другое производное хитозана с низкой концентрацией эндотоксина.
Стадию приведения в контакт щелочного хитозана с кислотой можно выполнять до стадии высушивания (c), описанной выше в настоящем документе в способе получения щелочного хитозана с низким содержанием эндотоксина.
Альтернативно, стадию приведения в контакт щелочного хитозана с кислотой можно выполнять после стадии высушивания (c), описанной выше в настоящем документе в способе получения щелочного хитозана с низким содержанием эндотоксина. В таких вариантах осуществления способ получения нейтрального хитозана, соли хитозана или производного хитозана с низким содержанием эндотоксина может включать дополнительную стадию высушивания после стадии приведения в контакт щелочного хитозана с кислотой. Стадию высушивания можно выполнять любыми общепринятыми методами высушивания, известными в данной области. Предпочтительно, стадию высушивания выполняют в печи или пропусканием продукта через воздушную сушилку.
Контакт кислоты со щелочным хитозаном можно создавать любыми подходящими способами, известными в данной области. Например, кислоту можно распылять на щелочной хитозан или щелочной хитозан можно смешивать с кислотой.
Предпочтительно, щелочной хитозан смешивают с кислотой.
В настоящем документе «нейтральный хитозан» означает композицию хитозана, имеющую значение pH от примерно pH 6,5 до примерно pH 7,5, и предпочтительно примерно pH 7.
Таким образом, для получения нейтрального хитозана щелочной хитозан можно смешивать с кислотой, имеющей соответствующий объем и/или концентрацию для образования нейтрального раствора, имеющего значение pH от 6,5 до 7,5. Объем и/или концентрация кислоты, необходимые для нейтрализации щелочного хитозана, будут зависеть от pH щелочного хитозана.
Альтернативно, для получения соли хитозана или производного хитозана щелочной хитозан можно смешивать с кислотой, имеющей объем и/или концентрацию в избытке по сравнению с тем, что необходимо для получения нейтрального хитозана.
Подходящую кислоту для использования по настоящему изобретению можно выбирать из перечисленных далее, либо отдельно, либо в сочетании: органические кислоты, карбоновые кислоты, жирные кислоты, аминокислоты, кислоты Льюиса, одноосновные кислоты, двухосновные кислоты, многоосновные кислоты, нуклеиновые кислоты и неорганические кислоты.
Подходящие органические кислоты можно выбирать из перечисленных далее, либо отдельно, либо в сочетании: уксусная кислота, винная кислота, лимонная кислота, аскорбиновая кислота, ацетилсалициловая кислота, глюконовая кислота и молочная кислота.
Подходящие жирные кислоты можно выбирать из перечисленных далее, либо отдельно, либо в сочетании: миристолеиновая кислота, пальмитолеиновая кислота, сапиеновая кислота, олеиновая кислота, элаидиновая кислота, вакценовая кислота, линолевая кислота, линоэлаидиновая кислота, α-линоленовая кислота, арахидоновая кислота, эйкозапентаеновая кислота, эруковая кислота, докозагексаеновая кислота, каприловая кислота, каприновая кислота, лауриновая кислота, миристиновая кислота, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, арахиновая кислота, бегеновая кислота, лигноцериновая кислота, церотиновая кислота.
Подходящие аминокислоты можно выбирать из перечисленных далее, либо отдельно, либо в сочетании: гистидин, лизин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, глутамин, глицин, пролин, таурин.
Подходящие неорганические кислоты можно выбирать из перечисленных далее, либо отдельно, либо в сочетании: соляная кислота, серная кислота и азотная кислота. Предпочтительно, кислота, выбираемая для нейтрализации, является соляной кислотой.
Кислота может иметь концентрацию от примерно 0,001M кислоты до максимально возможной концентрации кислоты. Например, типичная максимальная концентрация для серной кислоты составляет примерно 98% серной кислоты. Кислота может иметь концентрацию от примерно 0,01M до 5M, от 0,01M до 3M или от 0,1M до 2M. Предпочтительно, кислота имеет концентрацию примерно 1M. Концентрация кислоты может составлять до примерно 0,01M, 0,05M, 0,10M, 0,15M, 0,20M, 0,25M, 0,30M, 0,35M, 0,40M, 0,45M, 0,50M, 0,55M, 0,60M, 0,65M, 0,70M, 0,75M, 0,80M, 0,85M, 0,90M, 0,95M или 1,0M.
Кислота может присутствовать в виде кислого раствора, содержащего кислоту и осадитель. Осадитель может быть любым растворителем, в котором хитозан нерастворим. Типичные осадители включают этиллактат, этилацетат, метилацетат, этанол, ацетон или их смеси. Предпочтительно, осадитель представляет собой этилацетат или этанол. Более предпочтительно, осадитель представляет собой смесь этанола и воды в соотношении 80:20. Преимуществом является то, что, как было установлено, реакция протекает быстрее при использовании осадителя, содержащего смесь этанола и воды в соотношении 80:20.
Соотношение хитозана и кислого раствора может составлять от примерно 5 к 1 до примерно 1 к 5. Предпочтительно, соотношение хитозана и кислого раствора составляет примерно 2 к 1.
В некоторых вариантах осуществления щелочной хитозан с низким содержанием эндотоксина можно смешивать с кислотой на срок до примерно 30 минут или менее, более предпочтительно на примерно 10 минут или менее, и наиболее предпочтительно на примерно пять минут или менее. Затем реакция может протекать при высушивании смеси.
Продукт, получаемый из смеси щелочного хитозана с кислотой, может содержать кислую соль. Предпочтительно, щелочной раствор и кислоту выбирают с гарантией того, что образовавшаяся соль является биосовместимой. Например, щелочной раствор может представлять собой гидроксид натрия, и кислота может представлять собой соляную кислоту. В таком примере кислая соль будет представлять собой биосовместимую соль хлорид натрия.
Кислая соль образуется как побочный продукт реакции между щелочным хитозаном и кислотой.
Установлено, что присутствие кислой соли в продукте может влиять на полезность получаемого хитозанового продукта. Например, было обнаружено, что хитозан в меньшей степени образует гель в солевом растворе, чем в воде, и в еще меньшей степени в солевом растворе с двойной концентрацией. Считается, что двойной концентрированный солевой раствор, упоминаемый в настоящем документе, содержит 1,8% хлорида натрия. Следовательно, желательно иметь настолько малое количество кислой соли в полученном хитозановом продукте, насколько это возможно, и, в идеале, такой уровень кислой соли, который будет изменять незначительно или практически не изменять эффективность хитозанового продукта.
Неожиданно было обнаружено, что использование щелочного раствора, имеющего низкую концентрацию, например, менее 0,25M и предпочтительно от примерно 0,01M до примерно 0,2M, позволяет достигать желаемой низкой концентрации эндотоксина, при этом также приводя к тому, что меньше побочного продукта в виде кислой соли образуется в последующем процессе получения нейтрального хитозана, соли хитозана или производного хитозана. Преимуществом является то, что, как установлено, меньшее количество побочного продукта в виде кислой соли приводит к получению хитозанового продукта, который имеет улучшенные гелеобразующие свойства по сравнению с продуктами, содержащими большее количество кислой соли. Способ по настоящему изобретению позволяет получать хитозановый продукт с соответствующим низким содержанием кислой соли без необходимости промывания или споласкивания хитозанового продукта. Это также имеет то дополнительное преимущество, что нет необходимости в использовании свободной от эндотоксина воды на стадии промывания или споласкивания.
Кроме того, обнаружено, что использование низких концентраций щелочного раствора, описанных в настоящем документе, вызывает меньшее снижение вязкости хитозана при получении нейтрального хитозана, соли хитозана или производного хитозана.
Низкие концентрации щелочи означают концентрации менее 0,25M, предпочтительно от примерно 0,01M до 0,2M. В некоторых вариантах осуществления концентрация щелочи может составлять от 0,02M до 0,1M, предпочтительно от 0,05M до 0,1M. Хорошие результаты были получены при использовании щелочи в концентрации примерно 0,1M. В некоторых вариантах осуществления концентрация щелочи может быть такой, как указано выше в настоящем документе. Таким образом, преимуществом использования низких концентраций щелочного раствора в данном способе является меньшее повреждение хитозана. Таким образом, можно удалять эндотоксин из хитозана, при этом вызывая лишь минимальное изменение вязкости. Желательно, чтобы вязкость хитозана в процессе снижалась на менее чем примерно 25%, предпочтительно на менее чем примерно 15% и более предпочтительно на менее чем примерно 10%.
Если данным способом получают нейтральный хитозан с низким содержанием эндотоксина, этот продукт подходит для использования в качестве промежуточного соединения при получении других продуктов на основе хитозана. Одно конкретное применение заключается в получении солей хитозана, абсорбирующие свойства которых делают их желательными для использования в гемостатических препаратах для остановки кровотечений. Предпочтительно, если соли хитозана являются водорастворимыми.
Таким образом, в другом варианте осуществления настоящего изобретения соль хитозана с низким содержанием эндотоксина можно получать путем приведения в контакт нейтрального хитозана с низким содержанием эндотоксина, полученного способом, описанным в настоящем документе, с кислотой.
Кислота может быть любой кислотой, подходящей для получения нужной соли хитозана. Например, если нужно получить ацетат хитозана, можно использовать уксусную кислоту; если нужно получить сукцинат хитозана, можно использовать янтарную кислоту, и так далее. Любую из кислот, описанных в настоящем документе, можно использовать в настоящем способе для получения соли хитозана с низким содержанием эндотоксина.
Способ получения соли хитозана или производного хитозана с низким содержанием эндотоксина может дополнительно включать стадию высушивания смеси нейтрального хитозана с низким содержанием эндотоксина и кислоты. Стадию высушивания можно выполнять любыми общепринятыми методами высушивания, известными в данной области. Предпочтительно, стадию высушивания выполняют в печи или пропусканием продукта через воздушную сушилку.
Таким образом получают нейтральный хитозан, соль хитозана или производное хитозана с низким содержанием эндотоксина, имеющие концентрацию эндотоксина менее 50 ЕЭ/г.
Нейтральный хитозан с низким содержанием эндотоксина может быть нерастворим в воде.
Соль хитозана с низким содержанием эндотоксина может быть водорастворимой.
Следующий аспект настоящего изобретения относится к нейтральному хитозану, соли хитозана или производному хитозана с низким содержанием эндотоксина, которые получают любым из способов, описанных в настоящем документе.
Следующий аспект настоящего изобретения относится к нейтральному хитозану, соли хитозана или производному хитозана, имеющим концентрацию эндотоксина менее 50 ЕЭ/г.
Нейтральный хитозан, соль хитозана или производное хитозана могут иметь концентрацию эндотоксина менее 30 ЕЭ/г, предпочтительно менее 20 ЕЭ/г, более предпочтительно менее 15 ЕЭ/г, даже более предпочтительно менее 10 ЕЭ/г, и наиболее предпочтительно менее 5 ЕЭ/г.
Соль хитозана с низким содержанием эндотоксина по настоящему изобретению подходит для использования в качестве гемостатического средства для остановки кровотечений.
Таким образом, следующий аспект настоящего изобретения относится к соли хитозана с низким содержанием эндотоксина, описанной в настоящем документе, для использования в качестве гемостатического средства для остановки кровотечений. Соль хитозана с низким содержанием эндотоксина можно использовать в качестве гемостатического средства для остановки внутреннего или наружного кровотечения. Для соли хитозана, используемой в хирургии для остановки внутреннего кровотечения, желательно, чтобы концентрация эндотоксина составляла менее 5 ЕЭ/г.
Соль хитозана с низким содержанием эндотоксина по настоящему изобретению можно включать в раневую повязку при поверхностном не угрожающем жизни кровотечении или угрожающем жизни кровотечении.
Таким образом, следующий аспект настоящего изобретения относится к соли хитозана с низким содержанием эндотоксина, описанной в настоящем документе, для использования в раневой повязке при поверхностном не угрожающем жизни кровотечении или угрожающем жизни кровотечении.
Соль хитозана с низким содержанием эндотоксина по настоящему изобретению подходит для использования в изготовлении гемостатической раневой повязки для остановки кровотечения. Следующий аспект настоящего изобретения относится к гемостатической раневой повязке, содержащей соль хитозана с низким содержанием эндотоксина, описанную в настоящем документе.
Следующий аспект настоящего изобретения относится к гемостатическому материалу, содержащему соль хитозана с низким содержанием эндотоксина, описанную в настоящем документе.
Гемостатический материал и/или соль хитозана могут быть в любой подходящей форме, например, в форме частиц, порошка, гранул, хлопьев, волокон, геля, пены, листа, пленки или жидкости.
Следующий аспект настоящего изобретения относится к способу остановки кровотечения, включающему стадии: необязательно, очищения области раны, по возможности; нанесения на указанную область раны гемостатической раневой повязки, содержащей соль хитозана с низким содержанием эндотоксина, описанную в настоящем документе, и оказания постоянного давления на область раны до тех пор, пока не образуется гелевый сгусток.
На область раны оказывают постоянное давление предпочтительно в течение примерно трех минут или более.
Преимуществом является то, что, чем ниже концентрация щелочного раствора, используемого при изготовлении гемостатического материала по настоящему изобретению, тем лучше материал действует с точки зрения способности к проникновению, свертывания крови и гемостаза.
Варианты осуществления настоящего изобретения далее будут описаны в следующих неограничивающих примерах со ссылкой на прилагаемые чертежи, в которых:
Фигура 1 представляет собой график, демонстрирующий влияние различных концентраций побочного продукта в виде кислой соли на вязкость хитозанового продукта в различных средах.
Тест на эндотоксин
1. Готовят раствор для экстракции в соответствии с USP (Фармакопея США), как подробно описано в USP, для тестирования хитозана на эндотоксин (4,6 мл 1M HCl и 45,4 мл свободной от эндотоксина воды);
2. Проводят экстракцию путем добавления 0,1 г тестируемого хитозанового продукта в 9,9 мл раствора для экстракции USP и оставляют на 48 часов при температуре 37°C;
3. Через 48 часов разбавляют 100 мкл экстракта в 0,9 мл свободной от эндотоксина воды; и
4. Смешивают 100 мкл вышеуказанного раствора с 100 мкл эндотоксин-специфического (ЭС) буфера производства компании Charles River.

Полученный экстракт тестируют при помощи портативного спектрофотометра Endosafe-PTS™, в котором используют лицензированные FDA одноразовые картриджи. При анализе экстракта используют разбавление 2000x и минимальный предел обнаружения теста составляет 10 ЕЭ/г.
Примеры
Пример 1:
50 г хитозана смешивали с 50 г 0,1M NaOH в течение 10 минут. Полученную влажную крошку щелочного хитозана немедленно сушили в сушилке с псевдоожиженным слоем при температуре 40°C.
Исходное содержание эндотоксина в сыром хитозане: 64,8 ЕЭ/г
Высушенный обработанный щелочной хитозан: 16,3 ЕЭ/г.
Пример 2:
50 г хитозана смешивали с 50 г 0,05M NaOH в течение 10 минут. Полученную влажную крошку щелочного хитозана немедленно сушили в сушилке с псевдоожиженным слоем при температуре 40°C.
Исходное содержание эндотоксина в сыром хитозане: 64,8 ЕЭ/г
Высушенный обработанный щелочной хитозан: 20,0 ЕЭ/г.
Пример 3:
50 г хитозана смешивали с 50 г 0,01M NaOH в течение 10 минут. Полученную влажную крошку щелочного хитозана немедленно сушили в сушилке с псевдоожиженным слоем при температуре 40°C.
Исходное содержание эндотоксина в сыром хитозане: 64,8 ЕЭ/г
Высушенный обработанный щелочной хитозан: <30 ЕЭ/г.
Пример 4:
50 г хитозана смешивали с 50 г 0,1M NaOH в течение 8 часов. Полученную влажную крошку щелочного хитозана немедленно сушили в сушилке с псевдоожиженным слоем при температуре 40°C.
Исходное содержание эндотоксина в сыром хитозане: 64,8 ЕЭ/г
Высушенный обработанный щелочной хитозан: 23,4 ЕЭ/г.
Способ можно масштабировать и использовать для получения более крупных партий.
Способ можно использовать для хитозана, находящегося в разных физических формах, таких как хитозановое волокно или хитозановая ткань.
В способе также можно использовать иную щелочь, чем гидроксид натрия, например, гидроксид калия.
Примеры 1-4 относятся к получению щелочного хитозана с низким содержанием эндотоксина. Этот щелочной хитозан с низким содержанием эндотоксина впоследствии можно использовать в качестве исходного материала для получения других продуктов на основе хитозана. Например, щелочной хитозан можно нейтрализовать до pH 7, получая нейтральный хитозан, путем добавления небольшого количества соответствующей кислоты, которая будет вступать в реакцию со щелочью, с образованием биосовместимой соли. Например, если гидроксид натрия используют в щелочном растворе, его можно нейтрализовать добавлением соляной кислоты. Продукт будет содержать низкие количества остаточного хлорида натрия.
Щелочной хитозан с низким содержанием эндотоксина, полученный в примерах 1-4, также можно использовать для получения водорастворимой соли хитозана или других производных хитозана с низким содержанием эндотоксина. Преимуществом является то, что для достижения этого нет необходимости в стерильных условиях, в использовании больших количеств дорогой свободной от эндотоксина воды, а также нет необходимости в споласкивании или промывании. Например, щелочной хитозан с низким содержанием эндотоксина может вступать в реакцию с большим количеством соответствующей кислоты. Небольшая часть кислоты будет вступать в реакцию со щелочью, с образованием биосовместимой соли.
В другом примере щелочной хитозан с низким содержанием эндотоксина также можно использовать в качестве исходного материала для получения производных хитозана с низким содержанием эндотоксина, таких как карбоксиметилхитозан.
Эффект кислой соли на вязкость
В процессе реакции щелочного хитозана с низким содержанием эндотоксина с кислотой для получения либо хитозана с нейтральным pH, либо соли хитозана, образуется побочный продукт в виде кислой соли. Присутствие этого побочного продукта может влиять на характеристики хитозанового продукта. Например, количество побочного продукта может влиять на вязкость хитозанового продукта в солевом растворе.

На фигуре 1 показаны результаты добавления лактата натрия в солевой раствор при различных концентрациях, и полученный от этого эффект на вязкость 2-г образца продающегося в настоящее время хитозанового продукта, CELOX, в 20 г раствора различных сред через три минуты.
Базовой средой был солевой раствор из жидкостей организма, к которому добавляли различные количества лактата натрия. Лактат натрия представлял собой побочный продукт реакции между гидроксидом натрия и молочной кислотой.
Результаты приведены в таблице 1 и на фигуре 1.
<b>Таблица 1</b>
Вязкость
Концентрация
Тест 1
Тест 2
Тест 3
Среднее
Солевой раствор
55000
62000
59000
58667
1,5%
54000
52000
61000
55667
2,5%
50000
43000
39000
44000
5,0%
35000
51000
31000
39000
7,5%
35000
34000
38000
35667
10,0%
37000
32000
36000
35000

Из фигуры 1 ясно, что при возрастании количества добавленной соли вязкость CELOX в среде падает. Таким образом, преимуществом является то, что лишь небольшое количество остаточного солевого побочного продукта будет присутствовать в хитозановых продуктах по настоящему изобретению.
Эффект низкой концентрации щелочного раствора на вязкость
Можно тестировать щелочной хитозан с низким содержанием эндотоксина по настоящему изобретению для демонстрации эффекта обработки кислотой на вязкость хитозанового полимера, считающейся мерой молекулярной массы. Тест включает следующие стадии метода:
a) взвешивают 5 г гранул щелочного хитозана с низким содержанием эндотоксина;
b) взвешивают 4,95 г уксусной кислоты в 600-мл стакане;
c) добавляют 490,05 г деионизированной воды в стакан, получая 495 г 1% раствора уксусной кислоты;
d) помещают стакан на пластину мешалки и включают перемешивание (увеличивают по мере возрастания вязкости раствора;
e) добавляют гранулы хитозана в раствор уксусной кислоты;
f) проверяют раствор регулярно до тех пор, пока все гранулы не растворятся, и увеличивают скорость перемешивания по мере возрастания вязкости раствора, если необходимо;
g) оставляют раствор в общей сложности на 24 часа, считая с того момента, когда гранулы хитозана поместили в раствор уксусной кислоты;
h) присоединяют шпиндель 64 к вискозиметру Брукфилда
i) устанавливают шпиндель на 10 об/мин;
j) вводят шпиндель в раствор до отметки на шпинделе, включают вискозиметр и дают возможность стабилизироваться;
k) регистрируют вязкость (сПз) через выбранные временные интервалы.
Эффект снижения концентрации щелочного раствора
in-vivo
Эффект использования пониженной концентрации щелочного раствора в способе по настоящему изобретению можно тестировать в трех экспериментах с акцентом на (1) процент проникновения солевого раствора в тестируемый образец; (2) период времени до свертывания крови и (3) процент гемостаза в  моделях разрыва в эпигастрии.
Общий метод тестирования для (1) процента проникновения в солевой раствор заключается в следующем: 5 мл дистиллированной воды добавляют в пробирку. Каплю красного пищевого красителя добавляют в воду. 3 г образца гемостатического порошка осторожно наносят на поверхность воды таким образом, что образуется слой. Через 1 минуту измеряют расстояние, проходимое водой в гемостатическом порошке, и регистрируют как процент проникновения.
Общий метод тестирования для (2) периода времени до свертывания крови заключается в следующем: 0,75 г образца гемостатического порошка добавляют в пробирку, в которую добавляют 5 мл гепаринизированной крови кролика. Затем пробирку переворачивают и регистрируют время, необходимое для полного сворачивания крови в гелеобразную массу.
in-vivo
Общий метод тестирования для (3) процента гемостаза в  моделях разрыва в эпигастрии заключается в следующем: 3-5-см разрыв производят в эпигастральной артерии в модели на свинье (без гепаринизации). Наносят гемостатический материал в гранулированной форме и прижимают на 1 минуту. Если кровотечение возобновляется, прижимают еще на 1 минуту.
Следует, безусловно, понимать, что настоящее изобретение не должно быть ограничено вышеизложенными примерами, приведенными лишь для наглядности.