СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ И/ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ ИЗБЫТОЧНОГО ВЕСА, ОЖИРЕНИЯ И/ИЛИ ИХ ОСЛОЖНЕНИЙ ПОСРЕДСТВОМ АНАЛИЗА ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ
METHOD FOR PREDICTION AND/OR PREVENTION OF OVERWEIGHT, OBESITY AND/OR COMPLICATIONS THEREOF BY ANALYSING GENE EXPRESSION

Настоящее изобретение относится к способу прогнозирования и/или профилактики избыточного веса, ожирения и/или нарушений, связанных с избыточным весом, который предусматривает обнаружение продукта экспрессии гена Lrp11 и Lrp11 в сочетании с определенными генами. Указанный способ также позволяет эффективно контролировать кормление грудным молоком или молочными смесями, содержащими лептин, для изменения обнаруженной предрасположенности. Таким образом, настоящее изобретение может быть ограничено областью промышленности по переработке сельскохозяйственных пищевых продуктов.
Уровень техники
В целом, изменения в образе жизни в развитой стране, в частности, все большее потребление жиров или пищевых продуктов с высокой плотностью энергии, связанное с меньшим количеством физических упражнений, были рассмотрены в качестве одной из основных причин увеличения возникновения нарушений обмена веществ. Известно, что ожирение характеризуется генетическим компонентом и экологическим компонентом, и существуют свидетельства, указывающие на то, что окружающая среда, кормление и питание на ранних этапах жизни способно к метаболическому программированию новорожденных, влияя на вероятность страдать от различных видов и степеней избыточного веса/ожирения и других связанных с ними заболеваний в более старшем возрасте (Godfrey and Barker, Am J Clin Nutr, 2000, 71(5 Suppl): 1344S-1352S). Указанное метаболическое программирования выходит за рамки генетического фактора и влияет на развитие органов и ключевых тканей, приводя к различной предрасположенности к избыточному весу и его метаболическим осложнениям во время нормального процесса старения. Существует эпидемиологические доказательства, которые показывает данные связи, представляющие собой историческое исследование в отношении голландского голода. Указанное исследование показало, что мужчины, чьи матери страдали от недоедания во время первого и второго триместра беременности из-за голода, охватившего запад Нидерландов во время Второй мировой войны, более часто страдали от ожирения во взрослом возрасте (Ravelli et al., N Engl J Med 1976, 295(7): 349-353). Кроме того, низкий вес при рождении также был связан с большей вероятностью заполучить избыточный вес во взрослом возрасте (Godfrey and Barker, Am J Clin Nutr, 2000, 71(5 Suppl): 1344S-1352S). Исследования, проведенные на животных моделях, также доказали, что ограничение калорийности пищи в период беременности отрицательно сказывается на потомстве и, в частности, повышает их восприимчивость к развитию избыточного веса/ожирения во взрослом возрасте и другим связанным с ними метаболическим изменениям, особенно резистентности к инсулину и резистентности к лептину а также сердечно-сосудистым заболеваниям, диабету 2-го типа, гипертонии, нарушениям опорно-двигательного аппарата и дыхательной системы, среди прочего (Anguita et al., RM, J Nutr, 1993, 123(8): 1421-1428; Jones and Friedman, Science, 1982, 215(4539): 1518-1519; Jones et al, J Nutr, 1984, 114(8): 1484-1492; Bray and Bellanger, Endocrine, 2006, 29(1): 109-117 и Smith, Am J Med., 2007, 120(3 Suppl 1): S3-S11). Более конкретно, результаты, полученные в исследованиях на крысах, выполненные в лаборатории молекулярной биологии, питания и биотехнологии (LBNB) Университета Балеарских островов, показали, что ограничение калорийности материнской пищи только на 20% в течение первой половины беременности приводит к развитию избыточного веса и другим изменениям, в том числе резистентности к инсулину и лептину во взрослом возрасте (Palou et al., Nutr Metab, 2010, 7: 69-79; Palou et al., J Nutr Biochem, 2012, 23: 1627-1639). Кроме того, эти животные проявляли гиперфагию или чрезмерное потребление, а также увеличение предпочтения к пищевым продуктам, богатым жирами, по отношению к животным контрольной группы (Palou et al., Nutr Metab, 2010, 7: 69-79). Эти изменения пищевого поведения могут быть объяснены изменениями гипоталамических структур, ответственных за контроль потребления и, в частности, дугообразного ядра и паравентрикулярного ядра (Garcia et al., Diab Obes Met, 2010, 12(5): 403-413; Konieczna et al., PlosOne, 2013, 8(11): e81906).
Кроме того, хотя было известно, что пищевые нарушения должны находиться в основании этих типов проблем, гораздо менее было известно, какие конкретные питательные вещества или компоненты пищевых продуктов могут быть основными причинами. В последние годы, лептин был идентифицирован как один из них (Miralles et al., Obesity, 14(8): 1371-1377; Pico et al., Int J Obes, 2007, 31(8): 1199-1209;  et al., Endocrinology, 2008, 149(2): 733-740). Различные исследования показывают, что кормление грудным молоком, по сравнению с искусственным вскармливанием (детской молочной смесью), связано с меньшим риском страдать от различных осложнений во взрослом возрасте, включая в себя избыточный вес и ожирение (Armstrong and Reilly, Lancet, 2002, 359: 2003-2004; Gillman et al., Jama., 2001, 285: 24612567; Kramer, J. Pediatr, 1981, 98: 883887; von Kries et al., Bmj, 1999, 319: 147150).
Идентификация и характеристика новых, сильных и ранних биомаркеров характеризуется решающим значением для возможности обеспечения персонализированных пищевых рекомендаций и мероприятий до возникновения проблемы в области питания, в то же время может выступать в качестве основы для пищевой промышленности как важнейший инструмент в научном обосновании утверждения о полезности для здоровья пищевых продуктов, связанных с профилактикой ожирения, избыточного веса и сопутствующих им заболеваний.
Описание настоящего изобретения
Настоящее изобретение показывает, что изменения в профиле экспрессии гена Lrp11, а также изменения в профиле экспрессии Lrp11 и других специфических генов в клетках крови связаны с риском развития избыточного веса, ожирения или других связанных с этим нарушений или изменений, или заболеваний, или патологий. Кроме того, указанные изменения наблюдаются на ранней стадии развития до появления заболевания. Таким образом, профиль экспрессии этих специфических генов может быть использован в качестве ранних биомаркеров большего риска этих патологий, что позволяет предотвратить их развитие, а также патологий, связанных с ожирением.
Продемонстрировано использование транскриптомного анализа Lrp11, а также Lrp11 в сочетании с другими специфическими генами в клетках крови организма, указанные клетки крови, забираемые и выделенные при рождении или на другой стадии жизни, предпочтительно на ранней стадии в процессе развития, применимы в качестве биомаркера риска или тенденции этих субъектов к возможности в будущем накапливать лишний жир в какой-то части(частях) их тела и/или развитию избыточного веса, ожирения и/или патологии или других сопутствующих изменений или нарушений. Кроме того, настоящее изобретение также позволяет идентифицировать субъекты, которые, хотя и являются чувствительными к указанным нарушениям, могут предотвратить их появление с помощью периода грудного вскармливания или добавки лептина в период грудного вскармливания посредством анализа экспрессии гена Lrp11 и гена Lrp11 в сочетании с другими специфическими генами в выделенном биологическом образце.
Настоящее изобретение позволяет также контролировать субъектов с высоким риском развития ожирения и связанных с ним осложнений, чтобы установить успех лечения с использованием лептина у субъекта путем обнаружения и/или количественной оценки экспрессии гена Lrp11, а также с помощью обнаружения и/или количественной оценки экспрессии гена Lrp11 в сочетании с другими специфическими генами. Настоящее изобретение позволяет идентифицировать, изменили ли эти индивидуумы свою предрасположенность к указанным заболеваниям, с помощью анализа транскриптомного профиля клеток крови после их кормления грудным молоком или молочными смесями с добавлением лептина или любой иной подходящей пищей, которая обеспечивает получение указанного лептина в период грудного вскармливания в виде пищи или дополнения. Согласно конкретному варианту осуществления настоящее изобретение относится к идентификации субъектов, предрасположенных к ранее описанным заболеваниям, и тех, которые характеризуются изменением своей указанной предрасположенности после кормления грудным молоком или молочными смесями с добавлением лептина или какой-либо пищей, которая обеспечивает указанный лептин в период грудного вскармливания, с помощью анализа экспрессии мРНК Lrp11 и Lrp11 в сочетании с конкретными группами генов в клетках крови.
Согласно другому конкретному варианту осуществления настоящее изобретение предназначено для анализа экспрессии мРНК Lrp11 и Lrp11 в сочетании с определенными генами, экспрессия которых была изменена в предыдущем анализе, после кормления индивидуумов грудным молоком или молочными смесями, дополненными лептином, или какой-либо пищей, которая обеспечивает указанный лептин в период грудного вскармливания. Таким образом, настоящее изобретение позволяет добиться успеха в обращении вспять идентифицированного риска развития избыточного веса, ожирения и/или связанных патологий. Другой аспект настоящего изобретения представляет собой, следовательно, возможность с достаточной уверенностью идентифицировать, характеризуется ли индивидуум обращением вспять своей предрасположенности к ранее определенным нарушениям, посредством транскриптомного анализа этих генов в клетках крови после кормления грудным молоком или молочными смесями с добавлением лептина или любой иным образом подходящей пищи, которая обеспечивает указанный лептин в период грудного вскармливания. В настоящем изобретении показано, что если один Lrp1 или в сочетании с множеством генов, описанных в таблице 1 (в общей сложности до 218 генов), восстановил свою экспрессию по отношению к предыдущему измененному состоянию, которое он проявлял в анализе до кормления с лептином в период грудного вскармливания, индивидуум изменяет свою предрасположенность к ранее указанным заболеваниям. Поэтому другой конкретный вариант осуществления настоящего изобретения позволяет устанавливать альтернативные стратегии вмешательства в свете отсутствия изменения с целью предупреждения развития заболеваний, риск развития которых индивидуумы имеют в дальнейшем.
Преимущества, которые предоставляет настоящее изобретение, заключаются в том, что:
- оно позволяет идентифицировать людей с высоким риском избыточного веса или ожирения, или других связанных с ними заболеваний на ранней стадии, еще до развития любого увеличения веса или появления ожирения, или патологических симптомов, предшествующих заболеванию или связанных нарушений, позволяя проводить более эффективное вмешательство.
- оно позволяет осуществлять опережающее вмешательство для того, чтобы предотвратить развитие заболевания посредством кормления этих индивидуумов грудным молоком или молочными смесями с добавлением лептина или любой иным образом подходящей пищи, которая обеспечивает указанный лептин в период грудного вскармливания.
- оно позволяет контролировать индивидуумов для того, чтобы определить, характеризуются ли они обращенным вспять риском развития заболевания после кормления грудным молоком или молочными смесями с добавлением лептина или любой иным образом подходящей пищи, которая обеспечивает указанный лептин в период грудного вскармливания.
"Период грудного вскармливания" в контексте настоящего изобретения понимается как первые месяцы жизни млекопитающего и, в частности, хотя и не исключительно, человека.
"Исключительно грудное вскармливание" понимается как кормление грудного ребенка до шести месяцев исключительно грудным молоком.
"Ранняя стадия" в контексте настоящего изобретения понимается как стадия жизни, которая включает в себя стадии от плода до подросткового возраста.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к анализу профиля экспрессии генов клеток крови для идентификации субъектов, восприимчивых к развитию пагубного влияния питательного ограничения в течение эмбриональной стадии или других неблагоприятных условий в дородовой стадии, которое включает в себя без ограничения: избыточный вес, ожирение, гиперфагию, сахарный диабет 2-го типа, резистентность к инсулину, резистентность к лептину, дислипидемию и т.д. Согласно конкретному варианту осуществления настоящего изобретения оно относится к ограничению калорийности пищи на стадии беременности.
Таким образом, первый аспект настоящего изобретения относится к способу получения данных, применимых для прогнозирования и/или профилактики избыточного веса, ожирения и/или их осложнений, который предусматривает обнаружение и/или количественное определение продукта экспрессии гена Lrp11 в биологическом образце, выделенном из субъекта. Он будет упоминаться далее как "первый способ согласно настоящему изобретению".
"Избыточный вес" понимается как избыточное накопление жира в организме, которое появляется, когда потребление энергии превосходит ее расходование. Избыточный вес в контексте настоящего изобретения понимается как весь избыток массы от незначительной избыточной массы (индекс массы тела, ИМТ>25) до клинически явного ожирения (ИМТ>30). Поэтому ожирение следует понимать, как избыточное накопление жира, которое связано с ИМТ>30.
"Осложнения" (или называемые также "патологиями, связанными с избыточным весом", "связанные осложнения", "связанные нарушения" или "сопутствующие заболевания") понимаются как любая патология, которая может быть связана с состоянием избыточного веса или ожирением. Не ограничивающие примеры этих патологий представляют собой: сахарный диабет 2-го типа, резистентность к инсулину, резистентность к лептину, гиперфагию, дислипидемию, гипертриглицеридемию, гиперхолестеринемию, метаболический синдром, жировую дегенерацию печени, гипертонию, сердечно-сосудистое заболевание, обструктивное апноэ сна, злокачественную опухоль, артрит, артроз и психиатрические осложнения.
Используемый в настоящем документе термин "субъект" относится ко всем животным, классифицируемым как млекопитающие, и включает в себя без ограничения домашних животных, сельскохозяйственных животных, приматов и человека, например, человека, нечеловекообразных приматов, коров, лошадей, свиней, овец, коз, собак, кошек или грызунов. Субъект предпочтительно представляет собой человека мужского или женского пола любой расы.
Термин "биологический образец" включает в себя без ограничения биологические ткани и/или жидкости индивидуума, полученные с помощью любого способа, известного специалисту в настоящей области техники, который служит для этой цели. Биологический образец может включать в себя клетки крови. "Клетки крови" понимают как все клетки крови, мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) или любые клетки из крови с присущим генетическим материалом и емкостью экспрессии, которые могут быть выделены из крови. Клетки, в дополнение к возможности обнаружения в крови, понимаются также как обнаруженные в любом другом биологическом образце, например, в слюне или тканях. Указанный образец может быть получен с помощью различных описанных выше способов, известных специалисту в настоящей области техники. Образцы крови включают в себя, например, образцы периферической крови, крови сердца и образцы крови из пуповины.
Термин "профилактика", как это понимается в настоящем изобретении, заключается в предотвращении появления заболевания или относящихся к нему нарушений, т.е. предотвращении заболевания или патологического состояния, или аномалии у субъекта (предпочтительно млекопитающих и, более предпочтительно, человека), в частности, у тех, кто приобретает предрасположенность к развитию относящихся к нему нарушений, т.е. ожирение, избыточный вес и их осложнения.
Предпочтительный вариант осуществления первого аспекта настоящего изобретения относится к способу, при котором продукт экспрессии гена Gls и/или Ubash3b также обнаруживают и/или количественно определяют. Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления гены Lrp11, Gls и Ubash3b обнаруживают и/или количественно определяют.
Согласно более предпочтительному варианту осуществления также обнаруживают и/или количественно определяют продукт экспрессии по меньшей мере одного из генов, выбранных из перечня, содержащего: Crmp1, Gla, Paox, Rnf10, Selenbp1 и Tmsb4x или любые их комбинации. Продукт экспрессии генов Lrp11, Gls, Ubash3b, Crmp1, Gla, Paox, Rnf10, Selenbp1 и Tmsb4x предпочтительно обнаруживают и/или количественно определяют.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления первого аспекта настоящего изобретения способ также предусматривает обнаружение и/или количественное определение продукта экспрессии по меньшей мере одного из генов, выбранных из перечня, содержащего: Smagp, Diexf, Gabra6, Fyco1, Fosl1, Bucs1, Chrnd, Cacna1c, Slc7a5, Myo3b, Myt1, Aloxe3 и Grm6 или любые их комбинации. Продукт экспрессии генов Lrp11, Gls, Ubash3b, Crmp1, Gla, Paox, Rnf10, Selenbp1, Tmsb4x, Smagp, Diexf, Gabra6, Fyco1, Fosl1, Bucs1, Chrnd, Cacna1c, Slc7a5, Myo3b, Myt1, Aloxe3 и Grm6 предпочтительно обнаруживают и/или количественно определяют.
Согласно другому еще более предпочтительному варианту осуществления первого аспекта настоящего изобретения способ также предусматривает обнаружение и/или количественное определение продукта экспрессии по меньшей мере одного из генов, выбранных из перечня, содержащего: Itgal, Prm1, Pcmtd2, Crtc1, Olr1075, Ctla2a, Olr1500, Txnip, Bcap29, Stk4, Myc, Tsc22d3, Msh4, Zc3h15, Uri1, Il10, Zfp503, Ldlrap1, Cirh1a, Аср6, Olr1394, Osbpl1a, Cd2, Bcl2, Meis3, Serpinf2, Pkia, Cd40lg, Slc9a3r1, Bcap31, Prmt3, Ebpl, Cd247, Wash2, Tgm1 и Rps19 или любые их комбинации. Продукт экспрессии следующих генов предпочтительно обнаруживают и/или количественно определяют: Lrp11, Gls, Ubash3b, Crmp1, Gla, Paox, Rnf10, Selenbp1, Tmsb4x, Smagp, Diexf, Gabra6, Fyco1, Fosl1, Bucs1, Chrnd, Cacna1c, Slc7a5, Myo3b, Myt1, Aloxe3, Grm6, Itgal, Prm1, Pcmtd2, Crtc1, Olr1075, Ctla2a, Olr1500, Txnip, Всар29, Stk4, Myc, Tsc22d3, Msh4, Zc3h15, Uri1, Il10, Zfp503, Ldlrap1, Cirh1a, Аср6, Olr1394, Osbpl1a, Cd2, Bcl2, Meis3, Serpinf2, Pkia, Cd40lg, Slc9a3r1, Bcap31, Prmt3, Ebpl, Cd247, Wash2, Tgm1 и Rps19.
Согласно другому еще более предпочтительному варианту осуществления первого аспекта настоящего изобретения способ также предусматривает обнаружение и/или количественное определение продукта экспрессии по меньшей мере одного из генов, выбранных из перечня, содержащего гены, описанные в таблице 7. Продукт экспрессии генов, описанных в таблице 1, предпочтительно обнаруживают и/или количественно определяют.
Согласно другому еще более предпочтительному варианту осуществления первого аспекта настоящего изобретения оно относится к способу прогнозирования и/или профилактики осложнений, связанных с избыточным весом или ожирением, выбранных из списка, содержащего: сахарный диабет 2-го типа, резистентность к инсулину, резистентность к лептину, гиперфагию, дислипидемию, гипертриглицеридемию, гиперхолестеринемию, метаболический синдром, жировую дегенерацию печени, гипертонию, сердечно-сосудистое заболевание, обструктивное апноэ сна, злокачественную опухоль, артрит, артроз и психиатрические осложнения.
"Диабет 2-го типа" или "сахарный диабет 2-го типа" понимается как метаболическое заболевания, характеризующееся высоким содержанием глюкозы в крови с нарушением инсулиновой системы.
"Резистентность к инсулину" понимается как физиологическое состояние, при котором клетки не отвечают на обычные действия гормона инсулина.
"Резистентность к лептину" понимается как физиологическое состояние, при котором клетки не отвечают на нормальные действия гормона лептина.
"Гиперфагия" понимается как чрезмерное увеличение чувства аппетита или чрезмерное потребление продуктов питания.
"Дислипидемия" понимается как ряд патологических состояний, общим элементом которых является изменение метаболизма липидов с последующим их изменением состояний липидов и липопротеинов в крови. Гипертриглицеридемия и гиперхолестеринемия предпочтительно понимаются как дислипидемия.
Типерхолестеринемия" понимается как наличие высокого уровня холестерина в крови.
"Метаболический синдром", также известный как "синдром X", "плюриметаболический синдром" или "синдром резистентности к инсулину", понимается как сочетание различных заболеваний или факторов риска у того же индивидуума, которые увеличивают вероятность развития сердечно-сосудистых заболеваний или сахарного диабета.
"Жировая дегенерация печени", также известная как "стеатоз печени", понимается как многофакторное нарушение обмена веществ, которое происходит от накопления жира в печени без связи с потреблением алкоголя.
"Гипертония" или "артериальная гипертензия" понимается как хроническое заболевание, характеризующееся непрерывным увеличением значений артериального давления в артериях.
"Сердечно-сосудистое заболевание" понимается все виды заболеваний, связанные с сердцем или кровеносными сосудами.
"Обструктивное апноэ сна", "синдром апноэ-гипопноэ сна", "синдром гиперсомнии с периодическим дыханием" или "пиквикский синдром, связанный с ожирением" понимаются как нарушения дыхания, которые происходят во время сна и которые характеризуются повторными эпизодами обструкции или коллапса верхних дыхательных путей в связи с тем, что дыхательные пути сужаются, блокируются или становятся гибкими.
"Злокачественная опухоль" понимается как заболевание, вызванное группой клеток, которые реплицируются неконтролируемо и автономно, локально и удаленно вторгаясь в другие ткани.
"Артрит" понимается как наличие воспаления в любом суставе.
"Артроз", также называемый "остеоартрит", понимается как заболевание, вызываемое изнашиванием хряща, ткани, которая действует как амортизатор для защиты концов костей и которая облегчает движение сустава.
"Психические осложнения", связанные с ожирением, понимаются как те, которые могут быть получены в результате ожирения, включая в себя низкую самооценку, социальную изоляцию, тревогу, депрессию, эмоциональные нарушения и т.д.
Второй аспект настоящего изобретения относится к способу in vitro для прогнозирования и/или профилактики избыточного веса, ожирения и/или их осложнений у субъекта, предусматривающему:
a. Обнаружение и/или количественное определение продукта экспрессии гена Lrp11 в биологическом образце, выделенном из субъекта;
b. Сопоставление обнаружения существенного изменения экспрессии с неблагоприятным прогнозом.
Он будет упоминаться далее как "второй способ согласно настоящему изобретению".
Термин "in vitro" относится к тому факту, что способ согласно настоящему изобретению осуществляют вне организма субъекта.
В настоящем изобретении показано, что, например, в случае гена Lrp11, увеличение экспрессии этого гена по отношению к контрольному эталонному значению связано с неблагоприятным прогнозом.
Предпочтительный вариант осуществления второго аспекта настоящего изобретения относится к способу, который также предусматривает сравнение данных, полученных из биологического образца, выделенного из субъекта на стадии (а) с эталонными значениями экспрессии, например, контроля, таким образом, что если существует значительная разница, то считается, что продукт экспрессии изменяется и указанное изменение связано с неблагоприятным прогнозом. Указанное изменение может представлять собой, как значительное увеличение (сверхэкспрессию), так и значительное снижение (недостаточную экспрессию). Изменение может быть определено с помощью кратности изменения, определенной любым способом, известным специалисту в настоящей области техники.
Термин "анализ профиля экспрессии мРНК", как понимается в настоящем изобретении, относится к количественному или полуколичественному анализу уровней экспрессии мРНК генов с помощью следующих, имеющихся в настоящее время техник, без взаимоисключения: микроматричный анализ экспрессии, SAGE (серийный анализ экспрессии генов), ПЦР в реальном времени (количественная или полуколичественная), Нозерн-блоттинг, дот-блоттинг и т.д. Согласно конкретному варианту осуществления уровни экспрессии мРНК выбранных генов-мишеней определяют с помощью количественной ПЦР, предпочтительно ПЦР в реальном времени.
-ΔCt
Для того чтобы нормализовать значения экспрессии мРНК между различными образцами, можно сравнить соответствующие уровни экспрессии мРНК в подлежащих исследованию образцах с экспрессией эталонной РНК. Используемый в настоящем документе термин "эталонная РНК" относится к РНК, уровни экспрессии которой не изменяются или изменяются только в ограниченных количествах между различными индивидуумами, например, между контрольным субъектом и субъектом с вероятностью развития ожирения во взрослом возрасте. Эталонная РНК предпочтительно представляет собой мРНК, полученную из генов домашнего хозяйства, которые кодируют белки, которые конститутивно экспрессируются и которые осуществляют основные клеточные функции. Примеры генов домашнего хозяйства для использования в настоящем изобретении включают в себя 18S, GDI1, GAPDH, SURF4, PSMA6 и β-актин. Согласно одному варианту осуществления количественное определение относительной экспрессии гена вычисляют в соответствии со сравнительным способом Ct с использованием эталонного гена в качестве эндогенного контроля. Конечные результаты определяют в соответствии с описанной ранее формулой 2 (Pfaffl, Nucleic Acids Res, 2001, 29(9): e45).
"Неблагоприятный прогноз" в настоящем изобретении понимается как увеличение риска избыточного веса, ожирения и/или связанных с ними заболеваний. "Благоприятный прогноз" следует понимать как противоположность.
Согласно предпочтительному варианту осуществления второго аспекта настоящего изобретения продукт экспрессии Gls и/или Ubash3b также обнаруживают и/или количественно определяют на стадии а); и изменение экспрессии указанных генов связывают с неблагоприятным прогнозом на стадии b). Предпочтительно, продукт экспрессии Lrp11, Gls и Ubash3b обнаруживают и/или количественно определяют на стадии а); и изменение экспрессии указанных генов связывают с неблагоприятным прогнозом на стадии b).
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления второго аспекта настоящего изобретения продукт экспрессии по меньшей мере одного из генов, выбранных из следующего перечня, также обнаруживают и/или количественно определяют на стадии a): Crmp1, Gla, Paox, Rnf10, Selenbp1 и Tmsb4x или любые их комбинации, а также изменение экспрессии указанных генов связывают с неблагоприятным прогнозом на стадии b). Предпочтительно, гены, обнаруженные и/или количественно определенные и изменение экспрессии которых связано с неблагоприятным прогнозом, представляют собой Lrp11, Gls, Ubash3b, Crmp1, Gla, Paox, Rnf10, Selenbp1 и Tmsb4x.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления второго аспекта настоящего изобретения продукт экспрессии по меньшей мере одного из генов, выбранных из следующего перечня, также обнаруживают и/или количественно определяют на стадии a): Smagp, Diexf, Gabra6, Fyco1, Fosl1, Bucs1, Chrnd, Cacna1c, Slc7a5, Myo3b, Myt1, Aloxe3 и Grm6 или любые их комбинации, и изменение экспрессии указанных генов связывают с неблагоприятным прогнозом на стадии b). Предпочтительно, гены, обнаруженные и/или количественно определенные и изменение экспрессии которых связано с неблагоприятным прогнозом, представляют собой Lrp11, Gls, Ubash3b, Crmp1, Gla, Paox, Rnf10, Selenbp1, Tmsb4x, Smagp, Diexf, Gabra6, Fyco1, Fosl1, Bucs1, Chrnd, Cacna1c, Slc7a5, Myo3b, Myt1, Aloxe3 и Grm6.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления второго аспекта настоящего изобретения продукт экспрессии по меньшей мере одного из генов, выбранных из следующего перечня, также обнаруживают и/или количественно определяют на стадии a): Itgal, Prm1, Pcmtd2, Crtc1, Olr1075, Ctla2a, Olr1500, Txnip, Bcap29, Stk4, Myc, Tsc22d3, Msh4, Zc3h15, Uri1, Il10, Zfp503, Ldlrap1, Cirh1a, Аср6, Olr1394, Osbpl1a, Cd2, Bcl2, Meis3, Serpinf2, Pkia, Cd40lg, Slc9a3r1, Bcap31, Prmt3, Ebpl, Cd247, Wash2, Tgm1 и Rps19 или любые их комбинации, и изменение экспрессии указанных генов связывают с неблагоприятным прогнозом на стадии b). Предпочтительно, гены, обнаруженные и/или количественно определенные и изменение экспрессии которых связано с неблагоприятным прогнозом, представляют собой: Lrp11, Gls, Ubash3b, Crmp1, Gla, Paox, Rnf10, Selenbp1, Tmsb4x, Smagp, Diexf, Gabra6, Fyco1, Fosl1, Bucs1, Chrnd, Cacna1c, Slc7a5, Myo3b, Myt1, Aloxe3, Grm6, Itgal, Prm1, Pcmtd2, Crtc1, Olr1075, Ctla2a, Olr1500, Txnip, Bcap29, Stk4, Myc, Tsc22d3, Msh4, Zc3h15, Uri1, Il10, Zfp503, Ldlrap1, Cirh1a, Аср6, Olr1394, Osbpl1a, Cd2, Bcl2, Meis3, Serpinf2, Pkia, Cd40lg, Slc9a3r1, Bcap31, Prmt3, Ebpl, Cd247, Wash2, Tgm1 и Rps19.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления второго аспекта настоящего изобретения продукт экспрессии по меньшей мере одного из генов, выбранных из перечня, содержащего описанные в таблице 7 гены, также обнаруживают и/или количественно определяют на стадии а) и изменение экспрессии указанных генов связывают с неблагоприятным прогнозом на стадии b). Предпочтительно, продукт экспрессии генов, описанных в таблице 1, обнаруживают и/или количественно определяют на стадии а) и изменение экспрессии указанных генов связывают с неблагоприятным прогнозом на стадии b).
Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления второго аспекта настоящего изобретения осложнения выбирают из списка, содержащего: сахарный диабет 2-го типа, резистентность к инсулину, резистентность к лептину, гиперфагию, дислипидемию, гипертриглицеридемию, гиперхолестеринемию, метаболический синдром, жировую дегенерацию печени, гипертонию, заболевание сердечно-сосудистой системы, обструктивное апноэ сна, злокачественную опухоль, артрит, артроз и психиатрические осложнения.
Третий аспект настоящего изобретения относится к способу in vitro для разработки лечения, индивидуально подобранного для субъекта, который предусматривает обнаружение и/или количественное определение продукта экспрессии гена Lrp11 в биологическом образце; причем изменение экспрессии указывает на то, что лечение заключается во введении лептина или содержащей лептин композиции. Он упоминается далее как "третий способ согласно настоящему изобретению".
Согласно предпочтительному варианту осуществления третьего аспекта настоящего изобретения продукт экспрессии генов Gls и/или Ubash3b также обнаруживают и/или количественно определяют. Продукт экспрессии генов Lrp11, Gls и/или Ubash3b предпочтительно обнаруживают и/или количественно определяют и при этом изменение экспрессии указанных генов указывает на то, что лечение заключается во введении лептина или содержащей лептин композиции.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления третьего аспекта настоящего изобретения также обнаруживают и/или количественно определяют продукт экспрессии по меньшей мере одного из генов, выбранных из следующего перечня: Crmp1, Gla, Paox, Rnf10, Selenbp1 и Tmsb4x или любые их комбинации, и причем изменение экспрессии указанных генов указывает на то, что лечение заключается во введении лептина или содержащей лептин композиции. Продукт экспрессии генов Lrp11, Gls, Ubash3b, Crmp1, Gla, Paox, Rnf10, Selenbp1 и Tmsb4x предпочтительно обнаруживают и/или количественно определяют, и при этом изменение экспрессии указанных генов указывает на то, что лечение заключается во введении лептина или содержащей лептин композиции.
Согласно другому более предпочтительному варианту осуществления третьего аспекта настоящего изобретения способ также предусматривает обнаружение и/или количественное определение продукта экспрессии по меньшей мере одного из генов, выбранных из перечня, содержащего: Smagp, Diexf, Gabra6, Fyco1, Fosl1, Bucs1, Chrnd, Cacna1c, Slc7a5, Myo3b, Myt1, Aloxe3 и Grm6 или любые их комбинации, и причем изменение экспрессии указанных генов указывает на то, что лечение заключается во введении лептина или содержащей лептин композиции. Продукт экспрессии генов Lrp11, Gls, Ubash3b, Crmp1, Gla, Paox, Rnf10, Selenbp1, Tmsb4x, Smagp, Diexf, Gabra6, Fyco1, Fosl1, Bucs1, Chrnd, Cacna1c, Slc7a5, Myo3b, Myt1, Aloxe3 и Grm6 предпочтительно обнаруживают и/или количественно определяют, и при этом изменение экспрессии указанных генов указывает на то, что лечение заключается во введении лептина или содержащей лептин композиции.
Согласно другому еще более предпочтительному варианту осуществления третьего аспекта настоящего изобретения способ также предусматривает обнаружение и/или количественное определение продукта экспрессии по меньшей мере одного из генов, выбранных из перечня, содержащего: Itga1, Prm1, Pcmtd2, Crtc1, Olr1075, Ctla2a, Olr1500, Txnip, Bcap29, Stk4, Myc, Tsc22d3, Msh4, Zc3h15, Uri1, Il10, Zfp503, Ldlrap1, Cirh1a, Аср6, Olr1394, Osbpl1a, Cd2, Bcl2, Meis3, Serpinf2, Pkia, Cd40lg, Slc9a3r1, Bcap31, Prmt3, Ebpl, Cd247, Wash2, Tgm1 и Rps19 или любые их комбинации, и причем изменение экспрессии указанных генов указывает на то, что лечение заключается во введении лептина или содержащей лептин композиции. Продукт экспрессии генов Lrp11, Gls, Ubash3b, Crmp1, Gla, Paox, Rnf10, Selenbp1, Tmsb4x, Smagp, Diexf, Gabra6, Fyco1, Fosl1, Bucs1, Chrnd, Cacna1c, Slc7a5, Myo3b, Myt1, Aloxe3, Grm6, Itgal, Prm1, Pcmtd2, Crtc1, Olr1075, Ctla2a, Olr1500, Txnip, Bcap29, Stk4, Myc, Tsc22d3, Msh4, Zc3h15, Uri1, Il10, Zfp503, Ldlrap1, Cirh1a, Аср6, Olr1394, Osbpl1a, Cd2, Bcl2, Meis3, Serpinf2, Pkia, Cd40lg, Slc9a3r1, Bcap31, Prmt3, Ebpl, Cd247, Wash2, Tgm1 и Rps19 предпочтительно обнаруживают и/или количественно определяют, и при этом изменение экспрессии указанных генов указывает на то, что лечение заключается во введении лептина или содержащей лептин композиции.
Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления третьего аспекта настоящего изобретения способ также предусматривает обнаружение и/или количественное определение продукта экспрессии по меньшей мере одного из генов, выбранных из перечня, содержащего гены, описанные в таблице 7, и при этом изменение экспрессии указанных генов указывает на то, что лечение заключается во введении лептина или содержащей лептин композиции. Продукт экспрессии генов, описанных в таблице 1, предпочтительно обнаруживают и/или количественно определяют, и при этом изменение экспрессии указанных генов указывает на то, что лечение заключается во введении лептина или содержащей лептин композиции.
Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления третьего аспекта настоящего изобретения композиция, которая содержит лептин, представляет собой грудное молоко.
Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления третьего аспекта настоящего изобретения осложнения выбирают из списка, содержащего: сахарный диабет 2-го типа, резистентность к инсулину, резистентность к лептину, гиперфагию, дислипидемию, гипертриглицеридемию, гиперхолестеринемию, метаболический синдром, жировую дегенерацию печени, гипертонию, сердечно-сосудистое заболевание, обструктивное апноэ сна, злокачественную опухоль, артрит, артроз и психиатрические осложнения.
Четвертый аспект настоящего изобретения относится к способу in vitro для оценки эффективности лечения с использованием лептина или содержащей лептин композиции, который предусматривает обнаружение и/или количественное определение продукта экспрессии генов Lrp11 в выделенном биологическом образце субъекта, который получил указанное лечение.
Согласно предпочтительному варианту осуществления четвертого аспекта настоящего изобретения продукт экспрессии генов Gls и/или Ubash3b также обнаруживают и/или количественно определяют. Продукт экспрессии генов Lrp11, Gls и Ubash3b предпочтительно обнаруживают и/или количественно определяют.
Согласно более предпочтительному варианту осуществления четвертого аспекта настоящего изобретения также обнаруживают и/или количественно определяют продукт экспрессии по меньшей мере одного из генов, выбранных из следующего перечня: Crmp1, Gla, Paox, Rnf10, Selenbp1 и Tmsb4x или любые их комбинации. Продукт экспрессии генов Lrp11, Gls, Ubash3b, Crmp1, Gla, Paox, Rnf10, Selenbp1 и Tmsb4x предпочтительно обнаруживают и/или количественно определяют.
Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления четвертого аспекта настоящего изобретения способ также предусматривает обнаружение и/или количественное определение продукта экспрессии по меньшей мере одного из генов, выбранных из перечня, содержащего: Smagp, Diexf, Gabra6, Fyco1, Fosl1, Bucs1, Chrnd, Cacna1c, Slc7a5, Myo3b, Myt1, Aloxe3 и Grm6 или любые их комбинации. Продукт экспрессии генов Lrp11, Gls, Ubash3b, Crmp1, Gla, Paox, Rnf10, Selenbp1, Tmsb4x, Smagp, Diexf, Gabra6, Fyco1, Fosl1, Bucs1, Chrnd, Cacna1c, Slc7a5, Myo3b, Myt1, Aloxe3 и Grm6 предпочтительно обнаруживают и/или количественно определяют.
Согласно другому еще более предпочтительному варианту осуществления четвертого аспекта настоящего изобретения способ также предусматривает обнаружение и/или количественное определение продукта экспрессии по меньшей мере одного из генов, выбранных из перечня, содержащего: Itgal, Prm1, Pcmtd2, Crtc1, Olr1075, Ctla2a, Olr1500, Txnip, Bcap29, Stk4, Myc, Tsc22d3, Msh4, Zc3h15, Uri1, Il10, Zfp503, Ldlrap1, Cirh1a, Аср6, Olr1394, Osbpl1a, Cd2, Bcl2, Meis3, Serpinf2, Pkia, Cd40lg, Slc9a3r1, Bcap31, Prmt3, Ebpl, Cd247, Wash2, Tgm1 и Rps19 или любые их комбинации. Продукт экспрессии генов Lrp11, Gls, Ubash3b, Crmp1, Gla, Paox, Rnf10, Selenbp1, Tmsb4x, Smagp, Diexf, Gabra6, Fyco1, Fosl1, Bucs1, Chrnd, Cacna1c, Slc7a5, Myo3b, Myt1, Aloxe3, Grm6, Itgal, Prm1, Pcmtd2, Crtc1, Olr1075, Ctla2a, Olr1500, Txnip, Bcap29, Stk4, Myc, Tsc22d3, Msh4, Zc3h15, Uri1, Il10, Zfp503, Ldlrap1, Cirh1a, Аср6, Olr1394, Osbpl1a, Cd2, Bcl2, Meis3, Serpinf2, Pkia, Cd40lg, Slc9a3r1, Bcap31, Prmt3, Ebpl, Cd247, Wash2, Tgm1 и Rps19 предпочтительно обнаруживают и/или количественно определяют.
Согласно другому еще более предпочтительному варианту осуществления четвертого аспекта настоящего изобретения способ также предусматривает обнаружение и/или количественное определение продукта экспрессии по меньшей мере одного из генов, выбранных из перечня, содержащего гены, описанные в таблице 7. Продукт экспрессии генов, описанных в таблице 1, предпочтительно обнаруживают и/или количественно определяют.
"Продукт экспрессии" понимается как матричная РНК (мРНК) или белок.
Еще более предпочтительный вариант осуществления первого, второго, третьего и четвертого аспектов настоящего изобретения относится к указанным способам, при которых продукт экспрессии представляет собой мРНК.
Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления первого, второго, третьего и четвертого аспекта настоящего изобретения биологический образец выбирают из списка, содержащего кровь, периферическую кровь, кровь сердца, пуповинную кровь, слюну, мочу и лимфу.
Согласно другому еще более предпочтительному варианту осуществления первого, второго, третьего и четвертого аспекта настоящего изобретения субъект представляет собой новорожденного.
Согласно другому еще более предпочтительному варианту осуществления первого, второго, третьего и четвертого аспекта настоящего изобретения субъект представляет собой человека.
Субъект согласно настоящему изобретению может испытывать пищевое ограничение.
"Пищевое ограничение" понимается как ежедневное ограничение потребления питательных веществ ниже базальных потребностей в питательных веществах, не зависимо от того, представляет ли оно собой общее ограничение энергии или калорий или сокращение энергии, ограничение одного или нескольких макроэлементов, например, углеводов, белков и/или липидов, ограничение одного или различных питательных микроэлементов, таких как витаминов, минералов и т.д., или любую комбинацию вышеперечисленного. Пищевому ограничению могут подвергаться во время фетальной стадии.
"Фетальная стадия" или "стадия беременности" понимается как время, которое проходит между моментом зачатия и рождением, весь период или только фрагмент указанного рассматриваемого периода.
Пятый аспект настоящего изобретения относится к применению продукта экспрессии гена Lrp11 в качестве биомаркера для прогнозирования и/или профилактики избыточного веса, ожирения и/или их осложнений у субъекта.
"Биомаркер" понимается как характеристика, которая объективно количественно определяется и доступна в качестве показателя нормальных биологических процессов, патологических процессов или ответа на терапевтическое вмешательство.
Предпочтительный вариант осуществления пятого аспекта настоящего изобретения относится к применению, которое также предусматривает применение продукта экспрессии генов Gls и/или Ubash3b. Гены представляют собой предпочтительно Lrp11, Gls и Ubash3b.
Более предпочтительный вариант осуществления пятого аспекта настоящего изобретения относится к применению, которое также предусматривает применение генов, выбранных из перечня из Crmp1, Gla, Paox, Rnf10, Selenbp1 и Tmsb4x или любых их комбинаций. Гены представляют собой предпочтительно: Lrp11, Gls, Ubash3b, Crmp1, Gla, Paox, Rnf10, Selenbp1 и Tmsb4x.
Еще более предпочтительный вариант осуществления пятого аспекта настоящего изобретения относится к применению, которое также предусматривает применение генов, выбранных из перечня, содержащего: Smagp, Diexf, Gabra6, Fyco1, Fosl1, Bucs1, Chrnd, Cacna1c, Slc7a5, Myo3b, Myt1, Aloxe3 и Grm6 или любые их комбинации. Гены представляют собой предпочтительно Lrp11, Gls, Ubash3b, Crmp1, Gla, Paox, Rnf10, Selenbp1, Tmsb4x, Smagp, Diexf, Gabra6, Fyco1, Fosl1, Bucs1, Chrnd, Cacna1c, Slc7a5, Myo3b, Myt1, Aloxe3 и Grm6.
Еще более предпочтительный вариант осуществления пятого аспекта настоящего изобретения относится к применению, которое также предусматривает применение генов, выбранных из перечня, содержащего: Itgal, Prm1, Pcmtd2, Crtc1, Olr1075, Ctla2a, Olr1500, Txnip, Bcap29, Stk4, Myc, Tsc22d3, Msh4, Zc3h15, Uri1, Il10, Zfp503, Ldlrap1, Cirh1a, Аср6, Olr1394, Osbpl1a, Cd2, Bcl2, Meis3, Serpinf2, Pkia, Cd40lg, Slc9a3r1, Bcap31, Prmt3, Ebpl, Cd247, Wash2, Tgml и Rps19 или любые их комбинации. Гены представляют собой предпочтительно Lrp11, Gls, Ubash3b, Crmp1, Gla, Paox, Rnf10, Selenbp1, Tmsb4x, Smagp, Diexf, Gabra6, Fyco1, Fosl1, Bucs1, Chrnd, Cacna1c, Slc7a5, Myo3b, Myt1, Aloxe3, Grm6, Itgal, Prm1, Pcmtd2, Crtc1, Olr1075, Ctla2a, Olr1500, Txnip, Bcap29, Stk4, Myc, Tsc22d3, Msh4, Zc3h15, Uri1, Il10, Zfp503, Ldlrap1, Cirh1a, Аср6, Olr1394, Osbpl1a, Cd2, Bcl2, Meis3, Serpinf2, Pkia, Cd40lg, Slc9a3r1, Bcap31, Prmt3, Ebpl, Cd247, Wash2, Tgm1 и Rps19.
Другой еще более предпочтительный вариант осуществления пятого аспекта настоящего изобретения относится к применению, которое также предусматривает применение генов, описанных в таблице 7. Предпочтительные гены описаны в Таблице 1.
Другой еще более предпочтительный вариант осуществления пятого аспекта настоящего изобретения относится к применению, при котором продукт экспрессии представляет собой мРНК.
Другой еще более предпочтительный вариант осуществления пятого аспекта настоящего изобретения относится к применению, при котором осложнения выбирают из перечня, содержащего: сахарный диабет 2-го типа, резистентность к инсулину, резистентность к лептину, гиперфагию, дислипидемию, гипертриглицеридемию, гиперхолестеринемию, метаболический синдром, жировую дегенерацию печени, гипертонию, сердечно-сосудистое заболевание, обструктивное апноэ сна, злокачественную опухоль, артрит, артроз и психиатрические осложнения.
Другой еще более предпочтительный вариант осуществления пятого аспекта настоящего изобретения относится к применению, при котором субъект представляет собой новорожденного.
Другой еще более предпочтительный вариант осуществления пятого аспекта настоящего изобретения относится к применению, при котором субъект представляет собой человека.
Шестой аспект настоящего изобретения относится к набору, содержащему праймеры, зонды и/или специфические антитела для обнаружения и/или количественного определения продукта экспрессии гена Lrp11. Продукт экспрессии генов Gls и/или Ubash3b также предпочтительно обнаруживают и количественно определяют, более предпочтительно, продукт экспрессии генов Lrp11, Gls и Ubash3b обнаруживают и/или количественно определяют.
Предпочтительный вариант осуществления шестого аспекта настоящего изобретения относится к набору, который также содержит праймеры, зонды и/или специфические антитела для обнаружения и/или количественного определения продукта экспрессии по меньшей мере одного из генов, выбранных из перечня, содержащего: Crmp1, Gla, Paox, Rnf10, Selenbp1 и Tmsb4x или любые их комбинации, предпочтительно из генов Lrp11, Gls, Ubash3b, Crmp1, Gla, Paox, Rnf10, Selenbp1 и Tmsb4x.
Другой предпочтительный вариант осуществления шестого аспекта настоящего изобретения относится к набору, который также содержит праймеры, зонды и/или специфические антитела для обнаружения и/или количественной оценки продукта экспрессии по меньшей мере одного из генов, выбранных из перечня, содержащего: Smagp, Diexf, Gabra6, Fyco1, Fosl1, Bucs1, Chrnd, Cacna1c, Slc7a5, Myo3b, Myt1, Aloxe3 и Grm6 или любые их комбинации. Предпочтительно из генов Lrp11, Gls, Ubash3b, Crmp1, Gla, Paox, Rnf10, Selenbp1, Tmsb4x, Smagp, Diexf, Gabra6, Fyco1, Fosl1, Bucs1, Chrnd, Cacna1c, Slc7a5, Myo3b, Myt1, Aloxe3 и Grm6.
Другой предпочтительный вариант осуществления шестого аспекта настоящего изобретения относится к набору, который также содержит праймеры, зонды и/или специфические антитела для обнаружения и/или количественной оценки продукта экспрессии по меньшей мере одного из генов, выбранных из перечня, содержащего: Itgal, Prm1, Pcmtd2, Crtc1, Olr1075, Ctla2a, Olr1500, Txnip, Bcap29, Stk4, Myc, Tsc22d3, Msh4, Zc3h15, Uri1, Il10, Zfp503, Ldlrap1, Cirh1a, Аср6, Olr1394, Osbpl1a, Cd2, Bcl2, Meis3, Serpinf2, Pkia, Cd40lg, Slc9a3r1, Bcap31, Prmt3, Ebpl, Cd247, Wash2, Tgm1 и Rps19 или любые их комбинации. Предпочтительно из генов Lrp11, Gls, Ubash3b, Crmp1, Gla, Paox, Rnf10, Selenbp1, Tmsb4x, Smagp, Diexf, Gabra6, Fyco1, Fosl1, Bucs1, Chrnd, Cacna1c, Slc7a5, Myo3b, Myt1, Aloxe3, Grm6, Itgal, Prm1, Pcmtd2, Crtc1, Olr1075, Ctla2a, Olr1500, Txnip, Bcap29, Stk4, Myc, Tsc22d3, Msh4, Zc3h15, Uri1, Il10, Zfp503, Ldlrap1, Cirh1a, Аср6, Olr1394, Osbpl1a, Cd2, Bcl2, Meis3, Serpinf2, Pkia, Cd40lg, Slc9a3r1, Bcap31, Prmt3, Ebpl, Cd247, Wash2, Tgm1 nRps19.
Другой еще более предпочтительный вариант осуществления шестого аспекта настоящего изобретения относится к набору, который также содержит праймеры, зонды и/или специфические антитела для обнаружения и/или количественного определения продукта экспрессии по меньшей мере одного из генов, выбранных из перечня, содержащего гены, описанные в таблице 7. Предпочтительно он содержит праймеры, зонды и/или специфические антитела для обнаружения и/или количественного определения продукта экспрессии генов, описанных в таблице 1.
Другой предпочтительный вариант осуществления шестого аспекта настоящего изобретения относится к набору, в котором продукт экспрессии представляет собой мРНК.
Седьмой аспект настоящего изобретения относится к применению набора шестого аспекта настоящего изобретения для прогнозирования и/или профилактики избыточного веса, ожирения и/или их осложнений у субъекта.
Восьмой аспект настоящего изобретения относится к применению набора шестого аспекта настоящего изобретения для разработки индивидуально подобранного лечения, применимого для прогнозирования и/или профилактики избыточного веса, ожирения и/или их осложнений у субъекта.
Девятый аспект настоящего изобретения относится к применению набора шестого аспекта настоящего изобретения для оценки эффективности лечения с использованием лептина у субъекта.
Предпочтительный вариант осуществления седьмого, восьмого и девятого аспектов настоящего изобретения относится к применению, при котором осложнения выбирают из перечня, содержащего: сахарный диабет 2-го типа, резистентность к инсулину, резистентность к лептину, гиперфагию, дислипидемию, гипертриглицеридемию, гиперхолестеринемию, метаболический синдром, жировую дегенерацию печени, гипертонию, сердечно-сосудистое заболевание, обструктивное апноэ сна, злокачественную опухоль, артрит, артроз и психиатрические осложнения.
Другой предпочтительный вариант осуществления седьмого, восьмого и девятого аспекта настоящего изобретения относится к применению, при котором субъект представляет собой новорожденного.
Другой предпочтительный вариант осуществления седьмого, восьмого и девятого аспекта настоящего изобретения относится к применению, при котором субъект представляет собой человека.
В описании и формуле изобретения слово "содержит" и его варианты не предназначены для исключения других технических характеристик, дополнений, компонентов или стадий. Другие цели, преимущества и отличительные признаки настоящего изобретения будут очевидны специалисту в настоящей области техники частично из описания, а частично из реализации настоящего изобретения. Следующие примеры и графические материалы приведены в качестве иллюстрации и не предназначены для ограничения настоящего изобретения.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1. Краткое изложение основных процессов, в которые вовлечены 224 гена, которые испытали изменения в своей экспрессии в РВМС, от крыс возрастом 25 дней в результате ограничения калорийности пищи матери во время беременности.
ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение проиллюстрировано ниже посредством выполненных авторами настоящего изобретения исследований, которые показывают эффективность настоящего изобретения.
Материалы и способы:
Общий способ для выбора подлежащих изучению групп крыс
Крысят, подвергнутых ограничению калорийности пищи во время беременности их матери (как наиболее склонная к развитию ожирения группа), исследовали и подвергали воздействию при грудном вскармливании физиологическими дозами лептина. Для того чтобы получить их, неоплодотворенных самок крыс линии Вистар весом 200-250 г скрещивали с самцами крыс. Успешность оплодотворения определяли путем проверки наличия спермы во влагалищном мазке. После спаривания и подтвержденного оплодотворения каждого самца помещали в отдельную клетку со свободным доступом к воде. Крыс содержали в помещении с контролируемой температурой (22°С) и циклом света/темноты, составляющим 12 часов. Первую группу контрольных крыс (n=7) содержали при свободном доступе к стандартному корму для животных (3000 ккал/кг).
Вторую группу крыс подвергали ограничению калорийности пищи на 20% по отношению к контрольной группе матерей в течение первых 12 дней беременности (n=10), следующий день оплодотворения рассматривается как день 0. Через 12 дней пищевого ограничения они имели свободный доступ к корму для животных. В первый день рождения количество детенышей доводили до 10 на мать и распределяли их случайным образом на две группы: одну группу, которая получала носитель, и одну группу, которая получала лептин. В частности, с 1 до 20-й день грудного вскармливания и в течение первых двух часов светового цикла, 20 мкл носителя (воды) давали ежедневно и перорально с помощью пипетки группе CR, или раствор мышиного лептина, растворенного в воде, давали ежедневно и перорально группе, получавшей лептин (CR-лептин). Количество лептина, которое получали животные, постепенно увеличивали от 1 нг лептина в день 1 до 43,8 нг лептина в 20-й день; эти величины были рассчитаны, чтобы поставлять пятикратное среднее количество суточного потребления лептина, взятого из грудного молока (Pico et al., Int. J. Obes., 2007, 31(8): 1199-1209).
Детеныши контрольных матерей, называемые контрольной группой, также получали 20 мкл носителя (воды) ежедневно с 1-го дня по 20-й день жизни. После отнятия от груди на 21-й день все детеныши пребывали на нормолипидной диете до умерщвления в возрасте 25 дней.
Были исследованы образцы трех групп самцов крыс: детеныши матерей, получавших питание ad libitum (контроль) (n=10-11), крысята, подвергнутые ограничению калорийности пищи в течение первой половины беременности их матерей (CR) (n=10-11), и детеныши CR, получавшие дополнительно ежедневно физиологическую дозу лептина перорально в течение всего периода грудного вскармливания (CR-лептин) (n=10-11).
За исследуемый период проводили контроль массы тела и потребления. В день умерщвления собирали образцы крови, чтобы впоследствии получить плазму и выделить РВМС. Проводили матричный анализ всего генома.
Общий способ анализа профиля экспрессии генов РВМС с помощью микрочипов.
Выделение образцов РНК из РВМС проводили путем экстракции с колонками набора EZNA TOTAL RNA kit I (Omega Bio-Tek Inc., Norcross, GA, USA) в соответствии с коммерческими инструкциями.
Образцы РНК анализировали на бионализаторе Agilent 2100 с наночипами РНК 6000 (Agilent Technologies, South Queensferry, Соединенное Королевство). Для того чтобы обеспечить высокое количество РНК, использовали только образцы с номером целостности РНК (RIN)≥8 для микрочипов (n=8/группа). Затем, 0,08 мкг РНК каждого образца обратно транскрибировали к комплементарной ДНК (кДНК) с использованием набора Agilent Low Input Quick Amp Labeling (Agilent Technologies, Inc., штат Калифорния, США) в соответствии с протоколом производителя. Половину кДНК каждого образца использовали для линейной амплификации кДНК и маркировки цианином-3 (Cy3) или Cy5. Условия транскрипции и маркировки представляли собой: 40°С в течение 2 часов. Маркированную и амплифицированную кДНК затем очищали с использованием колонок Qiagen Rneasy MiniSpin (Qiagen, Мадрид, Испания). Включение маркировки и концентрирование кДНК количественно оценивали с помощью спектрофотометрии NanoDrop ND 1000 (NanoDrop Technologies, Ins., Wilmington, DE). 20 из 24 образцов отбирали для анализа микрочипов. 825 нг кДНК каждого образца маркировали Cy5, и 825 нг смеси кДНК всех образцов, маркированных Cy3, гибридизовали в микрочипах Agilent всего генома крысы 4×44K G4131F (Agilent Technologies, Inc., Санта-Клара, штат Калифорния, США) в течение 17 часов при 65°С в гибридизационных камерах внутри печи при перемешивании со скоростью 10 оборотов в минуту (Agilent Technologies). Массивы затем промывали промывочным буфером GE 2 в течение 1 мин при 37°С, а затем ацетонитрилом в течение 1 мин при комнатной температуре и, наконец, их отмывали стабилизирующим раствором и сушили в течение 30 мин при комнатной температуре, следуя инструкциям производителя (Agilent Technologies).
Массивы сканировали с помощью сканера для микрочипов Agilent (Agilent Technologies). Количественно оценивали интенсивность сигнала каждого пятна и извлекали необработанные данные с помощью программного обеспечения Feature Extraction версии 10.10.1.1 (Agilent Technologies). Коррекцию фона осуществляли с помощью Babelomics ((Medina et al., Nucleic Acids Res, 2010, 38: W210-W213), набор онлайн-инструментов для анализа данных микрочипов. Различие в экспрессии генов между различными группами животных, CR по сравнению с контролем; CR по сравнению с группой CR-лептин; CR-лептин по сравнению с контролем, проводили с использованием пакета Limma (Smyth, Stat. Appl. Genet. Mol Biol, 3, Article3, 2004) из Bioconductor (Gentleman et al., Genome Biol, 5(10), R80, 2004), реализованного в онлайн-платформе Babelomics. Методология Limma осуществляет t-статистику, которую рассчитывают для каждого гена; включая в себя значения р и значения кратных изменений (FC). Порог значимости фиксировали на отметке р≤0,010. Список генов со статистикой затем анализировали вручную в соответствии с их биологической информацией, полученной с использованием доступных баз данных (GeneCards, KEGG, NCBI, Reactome, UniProt, USCN, WikiPathways) на основе ключевых биологических доменов, таких как их молекулярная функция и биологический процесс. Все гены были отнесены к различным биологическим процессам в соответствии с их функцией.
Пример 1. Изменения в транскриптомном профиле РВМС после ограничения калорийности пищи матери во время беременности.
При анализе микрочипов исследовали 45220 зондов (4×44K G2519F; Agilent Technologies). В общей сложности экспрессия 473 генов значительно отличалась среди животных контрольной группы и групп CR. Из них 249 классифицировали как неизвестные и поэтому они не были приняты во внимание для последующего анализа. Из оставшихся 224, 166 сверхэкспрессировались и 58 недостаточно экспрессировались в группе CR по отношению к контрольной группе. Основные процессы, в которых были вовлечены эти гены, могут быть охвачены в следующем: процессе транскрипции и трансляции, иммунной системе, сигнализации, клеточном цикле, метаболизме белков и полиаминов, транспорте, липидном обмене и т.д. (фиг. 1).
Перечень 224 генов, которые характеризовались измененной экспрессией у животных группы CR по отношению к контрольной группе, представлен в таблице 2, включая в себя величину р значимости и FC (по отношению к контрольной группе) для каждого гена в результате проведенного статистического анализа. Положительное значение FC указывает на сверхэкспрессию в группе CR относительно контрольной группы (166 генов), а отрицательное значение FC указывает на недостаточную экспрессию в группе CR относительно контрольной группы (58 генов).
Эти результаты показывают, что ограничение калорийности пищи матери во время беременности способно приводить к изменениям в профиле экспрессии генов РВМС потомства в раннем возрасте, до начала появления изменений, описанных для этих животных во взрослом возрасте. Таким образом, изменение профиля экспрессии генов этих генов в клетках крови может быть использовано в качестве инструмента для идентификации ранних биомаркеров заболеваний.
Пример 2. Лечение лептином
Из 224 генов, которые характеризовались измененной экспрессией вследствие ограничения калорийности пищи матери во время беременности (таблица 2), 218 восстановили нормальности полностью или частично в группе CR-лептин (таблица 1). 22 гена были полностью реверсированы (таблица 5) и 196 выполнили реверсию частично. Таким образом, эти результаты подтверждают, что лечение с использованием лептина способно обращать вспять негативные эффекты, связанные с ограничением энергии во время эмбриональной стадии.
Во-первых, 218 генов, которые восстановили нормальность полностью или частично в группе CR-лептин, представлены в таблице 1. 22 первых гена представляют собой те, которые значительно восстановили свою экспрессию у животных группы CR-лептин по сравнению с группой CR, включая в себя конкретную величину значимости и FC (по отношению к группе CR) каждого гена, представляя собой результат проведенного статистического анализа (включены в Таблицу 5). 196 следующих генов соответствуют тем, которые частично восстановили свою экспрессию у животных группы CR-лептин, по сравнению с группой CR, включая в себя величину значимости и FC (по отношению к группе CR) каждого гена, представляя собой результат проведенного статистического анализа. Кроме того, включен ген IRX3, который показывает профиль подобных изменений, не достигая статистического порога значимости предыдущих генов, из-за более ясной их биологической правдоподобности, связанной с ожирением, по сравнению с любым другим геном, описанным до сих пор. Аналогично, также включена величина значимости и FC сравнения группы CR с контролями. Для каждого из сравнений положительное значение FC указывает на сверхэкспрессию, а отрицательное значение FC указывает на недостаточную экспрессию. В качестве примера, в случае Lrp11 в группе CR наблюдается сверхэкспрессия по сравнению с контрольной группой, и эта сверхэкспрессия восстанавливается при лечении с использованием лептина.
Выбор и упорядочивание по приоритетам генов проводили в соответствии со значением "р" при сравнении уровней экспрессии между контрольной группой и группой CR по результатам микроматричного анализа. В то же время, из 22 генов, в которых было обнаружено полное обращение уровней экспрессии при лечении лептином (таблица 5), а также все с очень хорошим "р", которые легко поддавались количественной оценке с помощью кПЦР в реальном времени, также принимались во внимание при определении приоритетов (т.е. экспрессия была обнаружена посредством кПЦР в реальном времени, выполненная в нормальных условиях, без необходимости использования конкретных условий для повышения чувствительности), и профиль экспрессии, описанный для самцов, был таким же и у самок. Это позволило выбрать 9 генов (таблица 4) в группе из 22 (таблица 5), которые следуют аналогичному профилю у самцов и у самок, и в которых обращение наблюдалось при лечении лептином, когда выполняли совместный анализ обоих полов. Кроме того, в пределах этих 9 генов, которые показывают сходный профиль у самцов и у самок, выбрали группу из 3 генов (таблица 3), для которых авторами настоящего изобретения была получена более значимая величина посредством кПЦР в реальном времени, как у самцов, так и у самок, проанализированных по отдельности, как при сравнении группы CR с контрольной группой, так и при сравнении группы CR-лептин с группой CR. В упомянутой группе из трех генов было отмечено, что ген Lrp11 был лучшим с точки зрения связанного с ним "р".
Эти полученные результаты представляют собой неожиданные, так как ранее проведенные исследования в исследовательской группе LBNB показали, что крысята, подвергнутые ограничению калорийности пищи во время беременности их матери, приобретают большую вероятность развития ожирения и связанных с ним метаболических нарушений во взрослом возрасте (Palou et al., Nutr Metab, 2010, 7: 69-79; Palou et al., J Nutr Biochem, 2012, 23, 1627-1639). Указанные изменения не очевидны в раннем возрасте, а как правило, проявляются во взрослом возрасте. При исследовании возможного применения измерения в клетках крови или других легко получаемых образцах уровней или концентраций многих тысяч параметров (многих тысяч различных мРНК), авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что определенные комбинации уровней экспрессии мРНК специфических генов (Lrp11 и комбинации этого гена с другими генами, которые описаны в таблицах 3, 4, 5, 6 и 1) надежно представляли собой ранние биомаркеры того, что развивающийся организм из-за предшествующей недостаточности питания или по другим причинам приобрел вероятность накопления избытка жира, который может привести к различной степени избыточного веса или даже ожирения и другим связанным с ними изменениям или заболеваниям на разных этапах их будущей жизни.
Другой неожиданный аспект настоящего изобретения относится к тому, что посредством способов настоящего изобретения можно идентифицировать субъектов с высоким риском появления избыточного веса или связанных с ним осложнений во взрослом возрасте и тех, которые представляют собой потенциальных кандидатов для получения исключительного грудного вскармливания или кормления коммерческими молочными смесями с добавлением лептина в период грудного вскармливания. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что пероральные добавки лептина в физиологических дозах во время грудного вскармливания могут аннулировать изменения, произведенные в профиле экспрессии генов РВМС, вызванные ограничением в пищи матери. Таким образом, настоящее изобретение позволяет идентифицировать субъектов с высоким риском развития избыточного веса или других осложнений во взрослом возрасте, которые могут, возможно, избежать или предотвратить их развитие путем исключительного кормления материнским грудным молоком или молоком, дополненным лептином, в течение периода грудного вскармливания.
Таблица 1. Группа из 219 генов, используемых для установления риска появления ожирения или связанных с ним изменений. В первую очередь она включает в себя 22 гена, экспрессии которых очень существенно изменяются у субъектов, которые испытывали ограничение калорийности в эмбриональный период и которые обращают вспять указанные изменения посредством получения пероральной добавки лептина в физиологических дозах во время грудного вскармливания, вместе со 196 генами, экспрессия которых изменяется с большим значением после того, как субъекты испытывали ограничение калорийности в эмбриональный период и они частично обращают вспять указанные изменения посредством получения пероральной добавки лептина в физиологических дозах во время грудного вскармливания. Кроме того, включен ген IRX3, который демонстрирует профиль подобных изменений, не достигая статистического порога значимости предыдущих генов из-за демонстрируемой им биологической правдоподобности, связанной с ожирением. Таблица включает в себя: обозначение, которое представляет собой официальное сокращение гена; ID, идентификационный код базы данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI); полное официальное название гена на английском языке. Точно так же, уровень значимости (р) и множественные значения кратности изменений (FC), представляющие собой результат статистического анализа примеров 1 и 2, также включены для сравнения группы CR с контрольной группой, группы CR-лептин с группой CR и группы CR-лептин с контрольной группой.
Таблица 2. Перечень из 224 генов, в которых произошли изменения в профиле экспрессии в РВМС от 25-дневных крыс в результате ограничения калорийности пищи матери во время беременности. Кроме того, включен ген IRX3, который показывает профиль подобных изменений, не достигая статистического порога значимости предыдущих генов, из-за демонстрируемого им биологического правдоподобия, связанного с ожирением. Таблица включает в себя: обозначение, которое представляет собой официальное сокращение гена; ID, идентификационный код базы данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI); полное официальное название гена на английском языке и биологический процесс, в котором участвует соответствующий ген.
Таблица 3. Группа из 3 генов, используемых для установления риска ожирения или связанных с ним изменений. Таблица включает в себя: обозначение, представляющее собой официальное сокращение гена; ID, идентификационный код базы данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI); полное официальное название гена на английском языке.
Таблица 4. Группа из 9 генов, используемых для установления риска ожирения или связанных с ним изменений. Таблица включает в себя: обозначение, представляющее собой официальное сокращение гена; ID, идентификационный код базы данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI); полное официальное название гена на английском языке.
Таблица 5. Группа из 22 генов, используемых для установления риска ожирения или связанных с ним изменений. Таблица включает в себя: обозначение, представляющее собой официальное сокращение гена; ID, идентификационный код базы данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI); полное официальное название гена на английском языке.
Таблица 6. Группа из 58 генов, используемых для установления риска ожирения или связанных с ним изменений. Таблица включает в себя: обозначение, представляющее собой официальное сокращение гена; ID, идентификационный код базы данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI); полное официальное название гена на английском языке.
Таблица 7. Оставшаяся группа из 161 генов, используемая для установления риска ожирения или связанных с ним изменений. Таблица включает в себя: обозначение, представляющее собой официальное сокращение гена; ID, идентификационный код базы данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI); полное официальное название гена на английском языке.