СИНТЕТИЧЕСКИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ И СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ Lactococcus lactis subspecies lactis В ЗАКВАСОЧНЫХ КУЛЬТУРАХ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ МОЛОЧНОКИСЛЫХ ПРОДУКТОВ
SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS AND METHOD OF DETECTING Lactococcus lactis subspecies lactis IN STARTER CULTURES WHEN PRODUCING FERMENTED MILK PRODUCTS

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к ДНК-технологиям, и может быть использовано в молокоперерабатывающей промышленности для генотипирования штаммов и культур Lactococcus lactis subspecies lactis.
В настоящее время основным способом кроме микробиологических методов исследований при типировании штаммов и культур Lactococcus lactis является способ, основанный на использовании rep-PCR (repetitive extragenic palindrome-PCR) для acmA гена и RAPD-PCR (randomly amplified polymorphic DNA) для 16S rRNA гена. Осуществляется синтез указанного выше гена, затем проводится электрофорез и сравнение фингерпринтов данного гена с фингерпринтами, полученными одновременно на референтные штаммы Lactococcus lactis, и делается заключение о принадлежности исследуемой культуры к subspecies lactis  and B.Rittich Application of PGR, rep-PCR and RAPD techniques for typing of Lactococcus lactis strains // Folia Microbiologica - 2005. - vol.50. - №2. - P.150-154).
К недостаткам данного способа можно отнести необходимость при проведении идентификации одной культуры проведения двух разнотипных ПЦР и электрофорезов, что обуславливает длительность процесса тестирования и высокую стоимость.
Наиболее близким решением данного изобретения являются RFLP-анализ, включающий синтез олигонуклеотидных праймеров на gadB ген Lactococcus lactis subspecies lactis, проведение ПЦР. Осуществляется синтез последовательности гена и гидролиз эндонуклеазой рестрикции AseI. Затем проводится электрофорез и сравнение паттернов данного гена с паттернами, полученными одновременно на референтные штаммы Lactococcus lactis subspecies lactis, делается заключение о принадлежности исследуемой культуры (М.Nomura, М.Kobayashi and Т.Okamoto Rapid PCR-Based Method Which Can Determine Both Phenotype and Genotype of Lactococcus lactis Subspecies // Applied and Environmental Microbiology. May 2002. - vol.68. - №5. - P.2209-2213).
К недостаткам данного способа можно отнести необходимость проведения гидролиза ампликонов, сравнение каждого с референтными, длительность процесса тестирования и высокую стоимость.
Задачей изобретения является расширение арсенала специфических олигонуклеотидных праймеров и способов выявления Lactococcus lactis subspecies lactis при помощи специфических синтетических олигонуклеотидных праймеров.
Поставленная задача решается тем, что синтезируются синтетические олигонуклеотидные праймеры для выявления Lactococcus lactis subspecies lactis в заквасочных культурах при производстве молочнокислых продуктов, согласно изобретению, праймеры имеют нуклеотидные последовательности:
83F 5′-CACAAGCCAGAGCAAAGGG-3′ и
83R 5′-GGATGCTTTGGCGCACGAGG-3′
Задача решается тем, что в способе выявления Lactococcus lactis subspecies lactis в заквасочных культурах при производстве молочнокислых продуктов, включающем проведение ПЦР с олигонуклеотидными праймерами, согласно изобретению, праймеры имеют нуклеотидную последовательность
83F 5′-CACAAGCCAGAGCAAAGGG-3′ и
83R 5′-GGATGCTTTGGCGCACGAGG-3′,
а в случае выявления фрагмента ДНК размером 449 н.п. делают заключение о наличии в исследуемом биологическом материале Lactococcus lactis subsp. lactis.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Способ получения синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления Lactococcus lactis subspecies lactis в заквасочных культурах при производстве молочнокислых продуктов
Поиск новых специфических праймеров осуществляют на основе выбранного фрагмента ДНК гена транспозона tra983A, характерного только для Lactococcus lactis subsp. lactis, при анализе полных геномов референтных штаммов Lactococcus lactis subspecies lactis: IL1403, KF147, CRL264, представленных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank Search.html). Выбранные фрагменты ДНК тестируют с помощью программы Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).
Окончательный выбор праймеров основывается на следующих критериях: высокий уровень сходства специфического фрагмента ДНК Lactococcus lactis subspecies lactis с ДНК различных штаммов этой бактерии. Олигонуклеотиды должны быть комплементарны последовательности ДНК на границах специфического фрагмента с содержанием оснований GC не менее 50% и не образовывать димеры.
Химический синтез праймеров осуществляют амидофосфитным методом на автоматическом синтезаторе ASM-102U.
Концентрацию специфических олигонуклеотидных праймеров в маточном растворе определяют спектрометрическим методом.
Таким образом, указанный способ позволяет получать синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные ДНК фрагмента гена транспозазы (tra983A), характерного только для Lactococcus lactis subspecies lactis.
Пример 2. Способ применения синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления Lactococcus lactis subspecies lactis в заквасочных культурах при производстве молочнокислых продуктов
Способ осуществляется в несколько этапов.
Этап 1. Выделение ДНК Lactococcus lactis subspecies lactis.
Для выделения ДНК берут суспензии штаммов и изолятов Lactococcus lactis subspecies lactis, выращенных на питательном бульоне из гидролизованного молока (БГМ), а также биоматериал от кисломолочных продуктов.
При выделении из бактериальной культуры клетки осаждают в бляшку центрифугированием 1-2 мин при 5000-7000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют. 100 мкл культуры добавляют к 400 мкл подогретого до +80°C 10% СТАВ, перемешивают и инкубируют при +80°C в течение 40 минут. Затем охлаждают до комнатной температуры и добавляют 0,5 объема (250-300 мкл) смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25:24:1), плавно перемешивают 2-3 раза в течение 1-2 мин и центрифугируют в течение 10 мин при 13000 об/мин. Водную фазу переносят в другую пробирку и к ней приливают 300 мкл смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1), перемешивают 1 мин и центрифугируют 6 мин при 13000 об/мин. К водной фазе прибавляют 50 мкл (1/10 объема) 3M ацетата натрия рН 4,8 и 1000 мкл этанола, перемешивают и помещают на 1 час при -20°C. Пробу центрифугируют 10 мин при 13000 об/мин, осадок промывают 70% этанолом, высушивают при наклонном положении пробирки при +37°C в течение 25-30 мин и растворяют в 30-50 мкл автоклавированной бидистиллированной воды.
Этап 2. Проведение полимеразной цепной реакции.
4
4
Состав реакционной смеси: Для каждой исследуемой пробы ДНК готовят ПЦР-смесь: 650 мМ трис-HCl рН 8,9; 160 мМ (NH)SO; 30 мМ MgCl; 0,5% Tvin-20; 2,5 мМ dNTP, по 0,25 мкМ каждого праймера; 0,5 е.а. Taq-ДНК полимеразы; 2 мкл пробы ДНК и автоклавированной бидистиллированной воды до 25 мкл.
Температурный режим проведения ПЦР: Программа амплификации состоит из следующих температурных режимов: прогревание реакционной смеси при 95°C в течение 3 мин - 1 цикл, затем денатурация при 94°C 0,2 мин, отжиг при 56°C 0,2 мин, элонгация при 72°C 0,4 мин - 35 циклов и досинтез при 72°C в течение 0,8 мин.
Этап 3. Определение размера продуктов ПЦР.
Электрофорез ампликонов продят в 0,5х трис-боратном буфере, приготовленном из 5х ТБЕ буфера (0,089 М трис-борат; 0,089 М борная кислота; 0,002 М ЭДТА).
Продукты ПЦР визуализировали путем электрофореза в 1%-ном геле агарозы с бромистым этидием при силе тока 40 мА в течение 25-30 мин. 12,5 мкл ампликона смешивают с 3 мкл буфера для нанесения (0,25% бромфенолового синего, 30% глицерин в бидистиллированной воде) и вносят в лунки геля под электрофорезный буфер. Электрофорез проводят при напряжении 10 В/см длины геля до тех пор, пока краситель пройдет от старта не менее 2,0-2,5 см геля (примерно 35 минут). Результаты электрофореза учитывают, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор».
В качестве маркера используют ДНК pUC18, гидролизованную AluI (на фрагменты 667, 521, 251, 226 и 131 н.п.) или ДНК pBLSK, гидролизованную MspI (на фрагменты 710, 489, 404, 328, 242, 190 н.п.).
Результат ПЦР считают положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента ДНК в 449 нуклеотидных пар.
Пример 3. Определение специфичности ПЦР
Результаты исследований по определению специфичности реакции с праймерами 83F и 83R представлены в таблице 1, которые показывают, что положительные анализы продуктов ПЦР получают только тогда, когда
Таблица 1
№ п/п
Наименование культуры
ПЦР с праймерами 83F и 83R
1
Staphylococcus aureus
Отрицательно
2
Staphylococcus albus
Отрицательно
3
Streptococcus pyogenes
Отрицательно
4
Streptococcus epidermitis
Отрицательно
5
Escherihia coli
Отрицательно
6
Proteus vulgaris
Отрицательно
7
Streptococcus termophilus 1244 Коллекция ВНИИМС, Углич
Отрицательно
8
Streptococcus termophilus 28-2 Коллекция ВНИИМС, Углич
Отрицательно
9
Lactococcus lactis subsp. lactis №49 Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул
Положительно
10
Lactococcus lactis subsp. lactis 283 Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул
Положительно
11
Lactococcus lactis subsp. lactis 344-4 Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул
Положительно
12
Lactococcus lactis subsp. lactis 430-4 Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул
Положительно
13
Lactococcus lactis subsp. lactis 505-2 Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул
Положительно
14
Lactococcus lactis subsp. lactis 86-38 Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул
Положительно
15
Lactococcus lactis subsp. lactis 31-4 Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул
Положительно
16
Дистиллированная вода
Отрицательно
в качестве матрицы используют ДНК фрагмента гена транспозона tra983A, характерного только для Lactococcus lactis subsp. lactis. Анализы были отрицательными, когда использовали ДНК других бактерий.
Для подтверждения специфичности тестируемого фрагмента гена транспозона tra983A, характерного только для Lactococcus lactis subsp. lactis, наработали фрагмент на матрице ДНК штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 49 (Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул) и провели секвенирование.
Анализ нуклеотидных последовательностей синтезируемых фрагментов провели методами выравнивания с другими опубликованными последовательностями полных геномов референтных штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis: IL1403, KF147, CRL264, представленных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank Search.html). Установили, что рассматриваемая нуклеотидная последовательность штамма Lactococcus lactis subsp. lactis №49 (Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул) совпадала с нуклеотидной последовательностью вышеназванных референтных штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis.
Таким образом, разработанные синтетические олигонуклеотидные праймеры для выявления ДНК гена транспозона tra983A, характерного только для Lactococcus lactis subsp. lactis, обладают высокой специфичностью и позволяют эффективно проводить идентификацию штаммов и культур Lactococcus lactis subsp. lactis, используемых в заквасочных культурах молокоперерабатывающей промышленности.