Способ проведения экстракорпорального оплодотворения
METHOD OF IN VITRO FERTILIZATION

Изобретение относится к медицине, а именно к вспомогательным технологиям в акушерстве и может быть использовано для повышения эффективности имплантации эмбрионов к слизистой полости матки при процедуре экстракорпорального оплодотворения (ЭКО)
В течение почти 37 лет применяется и развивается оплодотворение in vitro и перенос эмбриона. Несмотря на технологические успехи, ведущие к повышению частоты зачатий, частота наступления имплантации при подсадке зародышей заметно не улучшилась и остается между 10 и 15%. Поэтому именно наступление или ненаступление имплантации отличает успешный цикл ЭКО от безуспешного.
Неудачная имплантация может быть следствием либо аномалий зародыша, либо аномалий эндометрия. По некоторым оценкам, частота зародышей с аномалиями хромосомного набора, доступных для имплантации, составляет 30%. Однако при подсадке 2-х и более эмбрионов частота результативных ЭКО не увеличивается и остается в том же диапазоне 10-15%. Успешная имплантация прежде всего требует наличия рецептивного эндометрия и нормальных взаимодействий между рецептивным эндометрием и зародышем. Большое значение в этом имеет состояние эндометрия (слизистой оболочки матки).
Эндометрий состоит из железистого эпителия, стромы и лимфомиелоидных клеток. Для поддержки нормальной беременности, эндометрий должен дифференцироваться в децидуальную оболочку. У человека эндометрий превращается в децидуальную оболочку под действием гормонов, лимфоидных и трофобластных клеток. К факторам, которые могут помешать децидуальной функции, относят эндометриты, эндометриоз, полипы эндометрия, подслизистые узлы миомы, внутриматочные сращения и др.
Этап прикрепления эмбриона к эндометрию и его имплантации в настоящий момент является наиболее уязвимым этапом программы экстракорпорального оплодотворения. Доказано, что существенным моментом является первоначальное тесное соприкосновение имплантируемого эмбриона с предецидуальным эндометрием.
Так с целью улучшения контакта эмбриона с эндометрием компанией Vitrolife разработана среда для трансфера (переноса) эмбриона (EmbryoGlue), в состав которой входит гиалуроновая кислота в высокой концентрации и рекомбинантный альбумин. Вязкий раствор EmbryoGlue быстро диффундирует в вязкий секрет матки и эмбрион оказывается в тесном контакте с эндометрием. Эндометрий матки и эмбрион имеют рецепторы к гиалуроновой кислоте, которая «связывает» их друг с другом. Также высокая концентрация гиалуроновой кислоты делает раствор более густым. Это способствует лучшему смешиванию среды, в которой находится эмбрион с естественными жидкостями матки для более комфортного переноса. Рекомбинантный глобулин повышает резерв питания тканей. В результате осуществления трансфера в среде EmbryoGlue повышается вероятность беременностей с 5 до 11,2% (по данным конгресса ESHRE (European Societyof Human Reproduction and Embriology). (Fluori С et al. The effect of EmbryoGlue on clinical outcome P-179 Fertility, 2017, Edinburg, UK, 2017).
Важно понимать, что процесс прикрепления и имплантации эмбриона не является кратковременным. После переноса эмбриона в полость матки он начинает прикрепляться к ее слизистой оболочке в течение нескольких часов, реже - в течение первых суток. В то же время сам процесс имплантации протекает относительно медленно, занимая в среднем около 40 часов (www.tiensmed.ru). Так как перенос эмбриона производят в небольшом объеме питательной среды (обязательным условием для всех переносов не более 30 мкл) и раствор EmbryoGlue быстро смешивается с секретом полости матки, то продолжительность сохранения локальной концентрации раствора в месте подсадки эмбриона занимает очень короткое время и недостаточно для всего периода прикрепления. Так же микрообъем среды переноса не может изменить среду всей полости матки, что является важным при патологии эндометрия. После внедрения в секрет матки эмбрион не прикрепляется в месте подсадки сразу, а вращается, пока он не будет готов к вылуплению. После вылупления эмбрион увеличивается в диаметре в 4-5 раз. Вылупившийся эмбрион выставляет наружу рецепторы и продолжает вращаться и двигаться в полости матки, чтобы зацепиться на поверхности эндометрия в благоприятном для эмбриона месте.
Таким образом, данный способ не учитывает индивидуальное состояние эндометрия и имеет короткий период контакта эмбриона с эндометрием в среде переноса.
Из уровня техники, известен способ проведения экстракорпорального оплодотворения, включающий оплодотворение in vitro, перенос эмбриона и создание в полости матки условий обеспечивающих улучшение контакта эмбриона с эндометрием (пат. RU 2444315, кл. А61В 17/435, публ. 2012 г.).
Для создания условий, обеспечивающих улучшение контакта эмбриона с эндометрием, используют воздушную смесь, состоящую из 89% кислорода и 11% азота, которую вводят в матку через катетер с коническим концом и сеткой рассекателем. Конический конец катетера прижимают к наружному отверстию цервикального канала шейки матки, затем впрыскивают воздушную смесь в полость матки, которая проходя через сетку-рассекатель равномерно распределяется в полости матки.
Способ позволяет создать давление в полости матки, необходимое для более тесного контакта эмбриона с эндометрием.
Недостатком данного метода является короткий период экспозиции воздушной смеси и отсутствие создания среды для усиления рецепторного взаимодействия с предецидуальным эндометрием, что особенно важно у пациенток с патологией эндометрия.
Важно напомнить, что после внедрения в секрет матки эмбрион не прикрепляется механически, а выставляет наружу рецепторы для взаимодействия с рецепторами эндометрия.
В соответствии с этим, поставлена задача, направленная на повышение эффективности способа и расширение его возможностей за счет создания в полости матки среды с использованием концентрата плазменного аутофибронектина, обладающего свойствами «молекулярного клея», что обеспечивает «слипание» переносимого в полость матки эмбриона с предецидуальным эндометрием даже в случаях нарушения децидуальной функции у пациентки за счет патологии эндометрия.
Эта задача решена тем, что в способе проведения экстракорпорального оплодотворения, включающем оплодотворение in vitro перенос эмбриона и создание в полости матки условий, обеспечивающих улучшение контакт эмбриона с эндометрием, предложено в качестве условий, обеспечивающих улучшение контакта эмбриона с эндометрием, предварительно перед переносом эмбриона в полости матки создавать среду, для чего, использовать, концентрат плазменного аутофибронектина, который с помощью катетера в объеме 1,0-1,5 мл, вводить в шейку матки, равномерно распределять его по стенкам, затем в течение 1,5-2 ч выдерживать препарат для экспозиции к слизистой матки.
Помимо свойств «клея» фибринонектин обладает регенеративной способностью, противовоспалительным и антибактериальным действием, что улучшает состояние эндометрия в процедуре ЭКО.
Фибронектин - один из ключевых адгезивных белков межклеточного матрикса, неколлагеновый структурный гликопротеин. Фибронектин способен связываться с клеточными рецепторами, коллагенами, фибрином и протеогликанами, гиалуроновой кислотой. Благодаря своей структуре фибронектин может выполнять интегрирующую роль в организации межклеточного вещества, а также способствовать адгезии клеток. Такая особенность строения фибронектина придает ему свойство «молекулярного клея».
Экспозиция концентрата плазменного аутофибронектина в течение 1,5-2 часов выбрана экспериментальным путем и является необходимой и достаточной для полной равномерной диффузии препарата в среду полости и всасывания слизистой матки излишек жидкости, которая может привести к нежелательному «скольжению» эмбриона.
Известны способы получения фибронектина.
Способ лечения пациентов с трофическими язвами (С.А, Васильев и др. «Плазменный гепариновый преципитат как источник фибронектина для лечения больных с трофическими поражениями кожи» - «Терапевтический архив» 1987 г, №6, с. 127-130.
Известен способ получения аутофибронектина по И.В. Макарову, Н.Н. Навасардян «Применение концентрата плазменного аутофибронектина в комплексном лечении пациентов с трофическими язвами нижних конечностей».- «Казанский медицинский журнал», 2008 г., том 89, №3, с. 227-280. Полученный концентрат аутофибронектина применялся у пациентов с трофическими язвами нижних конечностей на фоне хронической венозной недостаточности.
Способ осуществляют следующим образом.
Первоначально пациентке проводят эксфузию крови путем пункции периферических вен в пластиковые контейнеры типа «Гемакон 500/300», кровь центрифугируется в режиме 3200 об/мин 7 минут. По окончании центрифугирования 350-450 мл плазмы переводят в отдельный контейнер, а оставшийся концентрат эритроцитов возвращается пациентке. Удаляемый объем плазмы замещается адекватным количеством 0,9% раствора натрия хлорида в изоволемическом режиме.
Плазму в стерильных условиях инкубируют с нефракционированным гепарином 20-30 МЕ/мл и помещают на 12-16 часов в морозильную камеру npnt минус 20С, затем размораживают при t+4-5 С и центрифугируют при 3500-4000 об/мин в течение 10-15 минут, получают осадок в виде плотного белого сгустка желеобразной консистенции. Выделенный гепариновый аутопреципитат растворяют в стерильном физиологическом растворе или 4% растворе бикарбоната натрия при t+37C. Полученный препарат хранят в замороженном состоянии и размораживают перед употреблением. Из 350-450 мл аутоплазмы получают до 10-15 доз концентрата по 3-5 мл, расфасовывают в стерильные одноразовые шприцы и перед использованием размораживают дозированно при комнатной температуре. Полученный фибронектин в замороженном состоянии можно хранить до 1 года, при хранении при +4°С фибронектин сохраняет свою активность до 2 недель.
Предварительно до переноса эмбриона (эмбрионов) в шейку матки вводят наконечник имплантатора в форме катетера, через который в полость матки вводят концентрат плазменного аутофибронектина в объеме 1,0-1,5 мл, распределяя по стенкам матки, в течение 1,5-2 ч создают экспозицию препарата к слизистой матки.
Через 1,5-2 часа после введения концентрата плазменного аутофибронектина проводят перенос эмбриона.
Конкретные примеры.
Пациентка Г.Ю., 35 лет. Бесплодие II на фоне хронического эндометриоза, спаечного процесса в малом тазу. С 2015-2018 гг. 8 неэффективных протоколов ЭКО, 1 неразвивающаяся беременность в 9 недель (после ЭКО). В предыдущих протоколах проводилось лечение курсами плазмафереза, гирудотерапией, введение внутривенного иммуноглобулина. Пациентке был проведен успешный протокол ЭКО данным способом. Предварительно, перед пересадкой эмбрионов в полость матки ввели 1,5 мл концентрата плазменного аутофибронектина, после чего выдерживали его в течение 2 часов для экспозиции с слизистой матки. Затем была проведена подсадка 2-х эмбрионов. Наступила беременность двойней. К настоящему моменту беременность 12 недель, прогрессирующая, протекала без осложнений.
Пациентка Т.О., 40 лет. Бесплодие 1-15 лет, 1 внематочная беременность в 2016 г., тубэктомия с обеих сторон (гидросальпингс). Второй брак. Бесплодие II (абсолютный трубный фактор, снижение овариального резерва, мужской фактор, множественная миома матки). В анамнезе 4 неудачи ЭКО в 2017 г., 2018 г. с использованием донорских яйцеклеток. Пациентке проведен протокол ЭКО с яйцеклеткой донора и с использованием концентрата плазменного аутофибронектина, наступила беременность.
Пациентка А.Н., 30 лет, Бесплодие II (в анамнезе медицинский аборт). У пациентки выявлены спаечный процесс в малом тазу, наружный генитальный эндометриоз, трубно-перитонеальный фактор, миома матки, хронический эндометрит. Проводилось лечение - резекция правого яичника по поводу эндометриодной кисты, миомэктомия, хирургической удаление очагов эндометриоза в 2016 г. Проведено 4 неэффективных протокола ЭКО с 2016-2018 гг. После проведения протокола ЭКО с концентратом плазменного аутофибронектина наступила беременность. К настоящему моменту беременность 24 недели.
Положительным результатом протоколов ЭКО с использованием концентрата плазменного аутофибронектина нами считается не только наступление, но и прогрессирование беременности. Проведено 35 переносов эмбрионов с применением аутофибронектина у пациенток 2 групп с наиболее отягощенным акушерским анамнезом - с многократными неэффективными протоколами ЭКО (более 3), во всех случаях с патологией эндометрия. Первую группу составили пациентки позднего репродуктивного возраста со снижением овариального резерва, вторую группу только с патологией эндометрия.
Анализ статистических данных результатов наступления беременностей в 2-х группах пациенток приведен в табл. 1
Как видно из таблицы 1 высокий процент результативных ЭКО было в обеих группах пациенток с патологией эндометрия, ниже результативность наблюдалась в группе пациенток позднего репродуктивного возраста.
Использование данного способа позволит повысить возможность удачной имплантации эмбриона к эндометрию с последующим его развитием за счет создания в полости матки среды, улучшающей контакт «слипание» переносимого в полость матки эмбриона с предецидуальным эндометрием, в том числе у пациенток с многократными неэффективными проколами ЭКО из-за патологии эндометрия.