СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ПОЛИМЕРНЫХ КОМПЛЕКСОВ РАДИОИЗОТОПОВ
METHOD OF OBTAINING WATER-SOLUBLE POLYMER COMPLEXES OF RADIOISOTOPES

Предложение относится к области химии высокомолекулярных соединений и медицины и касается создания полимерных носителей для радиоизотопов (радиофармпрепаратов (РФП)) для диагностики новообразований организма методами однофотонной эмиссионной томографии (ОФЭКТ), позитронной эмиссионной томографии (ПЭТ) и лечения онкологических заболеваний (бета, гамма-терапия).
В настоящее время известны способы введения радиоизотопов в биоконъюгаты, представляющие собой низкомолекулярные и высокомолекулярные носители радиоизотопов [напр., US 20050169838, 2005; Patent 5102990, 1992]. В качестве носителей для радиоизотопов используются пептиды, стероиды, рецепторные лиганды, жирные кислоты, антитела и др. [например, US 7179444 B2 2009, ЕР 1797904, ЕР 1051980 А2, 1999].
188
99m
99m
1/2
Известны препараты «третьего поколения», а именно, биоконъюгаты, содержащие изотопы Re (терапия) и Tc (диагностика) [Alberto, et al., ″Journal of the American Chemical Society, vol.120, №31, Aug. 12, 1998, pp.7987-7988; US 20060165594, 2011]. В настоящее время в медицинской практике более 80% исследований, проводимых методом ОФЭКТ, приходится на долю радиоизотопа технеций-99m (Tc) по причине его доступности (коммерческие генераторы), оптимальным излучательным характеристикам и достаточно большого периода полураспада (T 6 ч, Eγ 142.7 кЭВ)) [М. Welch, M. Redwanly Handbook of Radiopharmaceuticals, 2003].
Известны биоконъюгаты на основе низкомолекулярных пептидов, например, препарат Octreoscan™ (Mallinkrodt) на основе циклического пептида октреотида с введенным изотопом индия-111 [ЕР 1872800, 1996].
Недостатком указанных аналогов является введение металлов в состав малых туморотропных молекул, что приводит к нарушению нативности биомолекулы и, соответственно, чувствительности метода ОФЭКТ и неконтролируемому накоплению радиоактивности в нецелевых органах и тканях организма.
Оправданной альтернативой являются макромолекулы с высокой молекулярной массой (белки, антитела), поскольку введение тяжелого металла не должно существенным образом отражаться на свойствах полученного конъюгата.
При этом известные близкие аналоги предлагаемой заявки представляют собой, в основном, немодифицированные полимерные структуры, такие как циклопептиды [US 7666392, 2010], макроциклические конъюгаты [US 20110293517, 2009], линейные полиэтиленоксиды [US 5583206, 1996], графтированные декстраны [Mol. Pharmaceutics, 2011, 8 (2), pp. 609-620], синтетические биологически активные полимеры [US 6352682, 2002; 20080064841, 2007; US 7951846, 2011].
Недостатками указанных аналогов являются: сложная процедура выделения, очистки и идентификации «холодных» макромолекул; неконтролируемое введение хелатных узлов для связывания радиоизотопов в макромолекулы по причине наличия большого количества свободных активных функциональных амино- и карбоксильных групп; крайне высокая стоимость конечных РФП.
Наиболее близким прототипом по технической сущности и достигаемому результату является конъюгированный сополимер биотина [US 5482698, 1996]. Способ получения сополимера заключается в следующем: а) синтез полимера носителя с привитым биологическим вектором и хелатными узлами для связывания радиометалла; б) процедура радиомечения; в) хроматографическая очистка конечного продукта с получением приемлемой радиохимической чистотой препарата.
Существенным недостатком известного способа является низкий радиохимический выход целевого продукта, очень сложная процедура очистки прекурсора и выделения целевого препарата.
Задачей и положительным результатом заявленного технического решения является разработка способа получения водорастворимых металл-полимерных комплексов радиоизотопов переходных металлов и лантаноидов для лечения и диагностики новообразований организма за счет использования в качестве полимеров-носителей (прекурсоров) синтетических водорастворимых поликатионов - сополимеров N-винилпирролидона (ВП) с с N-аллиламином (АА), содержащих в макромолекуле хелатные узлы в виде иминодиацетатных фрагментов (остатки иминодиуксусной кислоты - ИДУК) и образующих металл-полимерные комплексы.
В результате создаются гибридные водорастворимые системы с полифункциональной биологической активностью для диагностики и терапии новообразований, обладающих собственной иммуностимулирующей активностью (сополимеры ВП), несущие противоопухолевые агенты (радиоизотопы) и обладающие вектором целевого транспорта в злокачественные клетки (поликатионы, получающиеся в результате введения в систему ненасыщенных аминов).
Это позволяет получить синергический эффект при химиотерапии опухолей и снижение иммунодепрессантного эффекта.
99m
+
188
+
161
+
3
3
3
Указанная задача и технический результат достигаются за счет того, что способ получения водорастворимых полимерных комплексов включает синтез полимера носителя с привитым биологическим вектором и хелатными узлами для связывания радиометалла и процедуры радиомечения, при этом в качестве полимера носителя используют водорастворимый сополимер N-винилпирролидона с N-аллиламином и молекулярной массой 5000-50000 Да, содержанием хелатных узлов в виде иминодиацетатных фрагментов иминодиуксусной кислоты (ИДУК) 1-20 мол. %, введенных в макромолекулу путем алкилирования звеньев аминосодержащего сополимера монохлоруксусной кислотой в водном щелочном растворе с рН 8-10, содержанием винилпирролидона m=99-80 мол. % и n=1-20 мол. %, в качестве радиоактивного компонента используют соединения переходных металлов и лантаноидов в виде следующего ряда [Tc(СО)], [Re(CO)], [Tb(CO)], а взаимодействие полимера носителя хелатных узлов с радиоактивным компонентом проводят в спирте, в воде или водно-спиртовом растворе в атмосфере инертного газа при температуре 70°С и с концентрацией полимера 10 масс. % в течение 20 минут с получением радиоактивного металл-полимерного конъюгата в различных степенях окисления (+1÷+3) следующего строения:
На фиг. 1 представлены структурные формулы сополимеров N-винилпирролидон с N-аллиламином (ВП-АА) и N-винилпирролидон с N-виниламином (ВП-ВА);
на фиг. 2 - схема синтеза сополимеров-прекурсоров;
99m
+
3
на фиг. 3 - хроматограмма конъюгата сополимера с трикарбонилтехнецием [Tc(CO)], полученным при pH=5.5;
99m
+
3
на фиг. 4 - хроматограмма конъюгата сополимера с трикарбонилтехнецием [Tc(CO)], полученным при pH=8.0.
99m
+
3
Поставленная задача решена также описываемым способом получения прекурсора, который включает: на первой стадии синтез сополимеров ВП-АА или N-винилпирролидона с N-виниламином (ВП-ВА); на второй стадии, введение в макромолекулу сополимера остатков иминодиуксусной кислоты (ИДУК) в виде иминодиацетатных фрагментов, путем алкилирования звеньев иминосодержащего сополимера монохлоруксусной кислоты в водном щелочном растворе с pH=8÷10; на третьей стадии связывание полученных хелатных иминодиацетатных групп сополимера с металлоорганическим фрагментом, несущим радиоселективную метку, например, с технецием-99m, причем ввод радиоизотопа осуществляется с использованием низковалентного металлорганического фрагмента трикарбонилтехнеция [Tc(CO)] в качестве предшественника по схеме:
Поставленная задача решается также путем использования сополимеров со строго заданными молекулярными массами (ММ), 5000-50000 Да и составом-содержанием звеньев ИДУК 1-20 мол.%.
99m
+
3
Следует отметить, что в отличие от приведенных аналогов радиохимический синтез целевого полимерного препарата по предлагаемому способу позволяет достигать 90-95% конверсии исходного [Tc(CO)] в зависимости от pH и времени реакции и не требует дополнительной очистки конечного продукта, что является существенным преимуществом.
Излагаемая сущность данного способа раскрывается ниже на примерах его экспериментального осуществления.
Пример 1. Методика синтеза полимера-носителя (прекурсора) ВП-АА или ВП-ВА с последующим введением в макромолекулярную цепь хелатных групп - остатков иминодиуксусной кислоты (ИДУК).
Сополимеризацию проводили в атмосфере аргона при 60°C в этаноле в течение 48 ч. Массовая концентрация мономеров составляла 50 масс. %, концентрация инициатора АИБН (2,2 - динитрил азоизомасляной кислоты) - 1 масс. % от содержания мономера. Полимеры выделяли осаждением в диэтиловый эфир и очищали диализом на мембране с пределом исключения 1000 Да (Spectra/Por 7, USA) водным 2% раствором NaCl в течение 24 ч и водой также в течение 24 ч. Затем сополимеры подвергали лиофильной сушке.
Введение в состав сополимеров ВП-АА и ВП-ВА остатков иминодиуксусной кислоты осуществляли реакцией первичных аминогрупп сополимеров с монохлоруксусной кислотой (МХУК) в водном растворе при 90°C и pH 10.
К раствору 3,0 г сополимера ВП-АА (5,3 моль % звеньев АА, ММ=30000) в 10 мл воды добавили 0,556 г МХУК, мольное соотношение МХУК: звено амина - 4:1. С помощью 6 N раствора KОН pH реакционной смеси довели до 10,0. Реакцию проводили при 90°C в течение 12 часов. Затем смесь подвергали диализу против воды в течение 48 часов. Использовали диализные мембраны Spectra/Por 7 фирмы ″Spectrum Lab. Inc.″ (США), позволяющие удалять соединения с М≤1000. Сополимеры, содержащие 4,9 мол.% звеньев ИДУК, выделяли с помощью лиофильной сушки.
max
Состав полученных полимеров был подтвержден 1) данными УФ спектроскопии по поглощению комплекса первичных аминогрупп с 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой при λ=420 нм, 2) данными потенциометрического титрования звеньев АА 0,1 N раствором HCl. Молекулярные массы (ММ) были определены методами вискозиметрии и эксклюзионной жидкостной хроматографии (ЭЖХ). Значения характеристической вязкости растворов полимеров [η] были определены в 0.1 М растворе ацетата натрия при 25°C в вискозиметре Уббелоде.
Реакцию свободных аминогрупп полимеров и монохлоруксусной кислоты проводили в водном растворе KОН. Содержание хелатных групп определяли по убыли свободных аминогрупп.
Примеры 2-5 выполнены в условиях примера 1. Полученные результаты приведены в Таблице 1.
99m
+
3
Пример 2. Радиомечение полимерного носителя (прекурсора) трикарбонилом технеция [Tc(CO)]. Проводили по оптимизированному протоколу.
2
3
2
3
n
<mrow><mmultiscripts><mi>T</mi><mprescripts /><none /><mrow><mn>99</mn><mi>m</mi></mrow></mmultiscripts><mi>c</mi><msubsup><mi>O</mi><mn>4</mn><mo>−</mo></msubsup></mrow>
-4
99m
+
Реакционный набор (кит) ″ISOLINK™″ производства (″TYCO - Mallincrodt″), состоящий из KBHCO, фосфатного буфера и элюата
(pH 5.5), нагревали при 150°C в условиях микроволновой активации (450 В, 15 с), после чего нейтрализовали до pH 6.5 фосфатным буфером. Полученный раствор разбавляли до 0,5 мл. К водному раствору ВП-АА-ИДУК (13000 Да) (С=10 М, 0,3 мл) добавляли 10 мкл разбавленного раствора [Tc(CO)] и нагревали при 70°C в течение 20 мин. Реакцию контролировали методом ВЭЖХ на ультракоротких CIM™ (GMA-EDMA) колонках BIASeparations (Austria) в изократическом режиме, элюент - 0,1% TFA, 0,3 мл/мин, детектирование - спектрофотометрическое (λ=210 нм) и радиометрическое (у-радиометрия).
<mrow><mmultiscripts><mi>T</mi><mprescripts /><none /><mrow><mn>99</mn><mi>m</mi></mrow></mmultiscripts><mi>c</mi><msubsup><mi>O</mi><mn>4</mn><mo>−</mo></msubsup></mrow>
-4
99m
3
Пример 3. Кит ″ISOLINK™″ производства (″TYCO - Mallincrodt″) нагревали при 150°C в условиях микроволновой активации (450 В, 15 с) с элюатом
, после чего нейтрализовали до pH 6.5 фосфатным буфером. Полученный раствор разбавляли до 0,5 мл при pH 7. К водному раствору ВП-АА-ИДУК (9000 Да) (С=10 М, 0,3 мл) добавляли 10 мкл разбавленного раствора Тс(CO) и нагревали при 70°C в течение 20 мин  РХЧ-80%.
<mrow><mmultiscripts><mi>T</mi><mprescripts /><none /><mrow><mn>99</mn><mi>m</mi></mrow></mmultiscripts><mi>c</mi><msubsup><mi>O</mi><mn>4</mn><mo>−</mo></msubsup></mrow>
-4
99m
3
Пример 4. Кит ″ISOLINK™″ производства (″TYCO - Mallincrodt″) нагревали при 150°C в условиях микроволновой активации (450 В, 15 с) с элюатом
, после чего нейтрализовали до pH 6.5 фосфатным буфером. Полученный раствор разбавляли до 0,5 мл при pH 8. К водному раствору ВП-АА-ИДУК (9000 Да) (С=10 М, 0,3 мл) добавляли 10 мкл разбавленного раствора Tc(CO) и нагревали при 70°C в течение 20 мин РХЧ-90%.
<mrow><mmultiscripts><mi>T</mi><mprescripts /><none /><mrow><mn>99</mn><mi>m</mi></mrow></mmultiscripts><mi>c</mi><msubsup><mi>O</mi><mn>4</mn><mo>−</mo></msubsup></mrow>
-4
99m
3
Пример 5. Кит производства Mallinckrodt™ Кит ″ISOLINK™″ производства (″TYCO - Mallincrodt″) нагревали при 150°C в условиях микроволновой активации (450 В, 15 с) с элюатом
, после чего нейтрализовали до pH 6.5 фосфатным буфером. Полученный раствор разбавляли до 0,5 мл при pH 5.5. К водному раствору ВП-АА-ИДУК (9000 Да) (С=10 М, 0,3 мл) добавляли 10 мкл разбавленного раствора Tc(CO) и нагревали при 70°C в течение 20 мин. Радиохимическая чистота - 40%.
Таким образом, разработанные водорастворимые полимерные комплексы радиоизотопов на основе сополимеров N-винилпирролидона (ВП) с N-виниламином (ВА) или с N-аллиламином (АА) с хелатными узлами, содержащими остатки иминодиуксусной кислоты, и способ их получения позволяют создать новые гибридные радиофармпрепараты, обладающие комбинированным действием и не требующие сложных процедур выделения и очистки. Поэтому эти водорастворимые полимерные комплексы радиофармпрепаратов могут быть востребованы в медицине для диагностики новообразований организма методами однофотонной эмиссионной томографии (ОФЭКТ), позитронной эмиссионной томографии (ПЭТ) и лечения онкологических заболеваний (бета, гамма-терапия), - это свидетельствует о соответствии данного технического решения всем требуемым критериям изобретения, защищаемым Патентом.