Сверхкритические флюидные и лазерные технологии получения лекарственных препаратов пролонгированного действия

СВЕРХКРИТИЧЕСКИЕ ФЛЮИДНЫЕ И ЛАЗЕРНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ПРОЛОНГИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ.

В.К. Попов

Институт проблем лазерных и информационных технологий РАН. e-mail: popov@laser.ru

В докладе представлены результаты разработки нового подхода к созданию лекарственных препаратов пролонгированного действия, основанного на комбинации процессов получения биоактивных полимерных микрочастиц с помощью сверхкритического диоксида углерода и их последующей поверхностно-селективной лазерной обработки. Такой подход, с одной стороны, позволяет получать биорезорбируемые микрочастицы без использования каких бы то ни было органических растворителей, а следовательно и не содержащих их токсичных следов. С другой стороны, он дает возможность прецизионно модифицировать морфологию поверхности микрочастиц (обеспечивая при этом сохранение их биохимической активности), определяя тем самым кинетику выхода из них лекарственных препаратов. Нами были проведены исследования кинетики выхода и биоактивности кристаллического трипсина, а также растительных экстрактов подорожника и календулы инкапсулированных в биорезорбируемые микрочастицы полимолочной кислоты. Анализ полученных результатов продемонстрировал большой потенциал использования предлагаемого подхода для получения новых форм лекарственных препаратов пролонгированного действия на основе широкого класса термически нестабильных и химически неустойчивых соединений.

Повышение эффективности использования лекарственных препаратов с одновременным снижением уровня их негативного побочного влияния на организм за счет разработки и создания новых лекарственных форм адресного и пролонгированного действия является одной из основных тенденций развития современной фармакологии [1]. В связи с этим, сегодня предьявляются особые требования к технологиям получения биорезорбируемых (постепенно растворяющихся в организме) полимерных микрочастиц, содержащих различные биоактивные компоненты [2-3]. Большинство традиционных методов формирования таких частиц основано либо на использовании органических растворителей, либо на применении высоких (100оС и выше) температур в процессе их получения [4]. Помимо наличия следов токсичного растворителя в конечном продукте, его воздействие на содержащиеся в полимерных микрочастицах лекарственные компоненты может приводить к существенному снижению их активности [5]. В свою очередь, высокая температура обработки может приводить как к неконтролируемому изменению свойств самой полимерной матрицы [4], так и к резкому сужению спектра практически ценных, но термически нестабильных препаратов, которые можно было бы использовать для решения многих биомедицинских проблем [6].

Разрабатываемый нами метод получения микрочастиц из пластифицированных сверхкритическим диоксидом углерода (ск-СОЯ) полимеров, позволяет получать биорезорбируемые микрочастицы, однородно наполненные как растворимыми, так и нерастворимыми в сверхкритическом флюиде компонентами [7-8]. Важным обстоятельством является также то, что этот процесс можно проводить при температуре близкой к комнатной (35-40оС) и при этом не требуется применения дополнительных органических растворителей.

Одной из фундаментальных проблем создания лекарственных средств пролонгированного действия является разработка методов управления скоростью

хорошо развитой (в ряде случаев, сильно пористой) поверхности полимерных микрочастиц. Для решения этой задачи мы использовали модификацию предложенного и разработанного нами ранее, метода поверхностно-селективного лазерного спекания (ПСЛС) [9]. Сам метод основан на деликатном размягчении поверхности полимерных микрочастиц за счет ее нагрева, возникающего при поглощении излучения ближнего ИК диапазона распределенными наночастицами углерода. При этом, поскольку ни сам полимер, ни содержащиеся в нем компоненты не поглощают лазерное излучение, удается избежать как термохимической деструкции полимерной матрицы, так и заметного снижения биоактивности инкапсулированных в нее препаратов. Варьируя соответствующие параметры лазерного воздействия (интенсивность, скорость сканирования луча, и т. д.), а также концентрацию частиц в облучаемом слое, можно либо аккуратно оплавлять поверхность микрочастиц, изменяя морфологию их поверхности (что, в свою очередь, приводит к уменьшению первоначальной скорости выхода содержащихся в них компонент), либо реализовывать их послойное спекание по определенной программе, создавая трехмерные матрицы для тканевой инженерии [10].

В наших экспериментах, в качестве модельных соединений для исследования процессов инкапсуляции и контроля кинетики выхода биоактивных компонентов, были использованы три вещества: кристаллический трипсин ("Самсон-Мед", Санкт-Петербург), а также растительные экстракты подорожника (Plantago major) и календулы (Calendula officinalis) (ГНЦ НИОПИК, Москва) в форме мелкодисперсных порошков. Эти вещества в количестве до 20 весовых процентов тщательно смешивались с порошком поли-(Б,Ь)-лактида (полимолочной кислоты) (Medisorb 100 DL HIGH IV "Alkermes Inc.", Boston, USA; Mw=84 000), который затем пластифицировался под действием сверхкритического диоксида углерода при 10МПа и 40оС в течение одного часа. После этого, в результате контролируемого сброса давления до атмосферного значения, формировался пористый композит, который измельчался до микрочастиц размером порядка 0.1 мм, которые впоследствии использовались для изучения кинетики выхода из них биоактивных соединений. Для исследования влияния поверхностно-селективной лазерной обработки на кинетику выхода инкапсулированных компонентов, а также зависимости уровня биоактивности конечного продукта от плотности мощности и скорости сканирования лазерного излучения полученные микрочастицы тщательно перемешивались с 0.1 вес.% наночастиц углерода (характерный размер агломератов - 250^350нм), игравших роль сенсибилизатора лазерно-индуциованного нагрева полимерной поверхности. Лазерная модификация морфологии поверхности полимерных микрочастиц осуществлялась на установке селективного лазерного спекания СЛС-100 (ИПЛИТ РАН, Шатура/Троицк, Московской обл.) при превышении мощности лазерного излучения над пороговой мощностью размягчения микрочастиц полилактида в 1.5, 3 и 6 раз.

Изучение кинетики выхода растительных экстрактов и трипсина в физиологический раствор при комнатной температуре проводились по измерению оптической плотности супернатантов на длине волны 330 нм. Активность трипсина до и после лазерного воздействия на полимерные микрочастицы определялась с помощью стандартной методики гидролиза хромогенного субстрата p-нитроанилида бензоиларгинина Bz-Arg-pNA (n- nitroaniline substratum) в Tris*HCl буферном растворе по определению оптической плотности раствора на длине волны 410 нм.

Скорость выхода биоактивных компонентов из микрочастиц полилактида до проведения лазерной обработки составляла от 40 до 70 % от их общего количества (в зависимости от типа инкапсулированных компонентов и условий их синтеза) в

течение первого часа измерений с последующим монотонным ростом до 6G-9G % за время всего периода наблюдений (1B часов). Поверхностно-селективное лазерное воздействие позволяло проводить деликатное оплавление микрочастиц, приводившее к уплотнению их приповерхностных слоев и уменьшению общей площади их поверхности. Это, в свою очередь, позволило резко (почти в три раза -с 4G^45 до 15^17%) уменьшить первоначальную (в течение первого часа измерений) скорость выхода биоактивных компонентов в физиологический раствор. При этом, абсолютная величина подавления начального всплеска концентрации инкапсулированных компонент ("burst") была прямо пропорциональна как мощности, так и дозе лазерного излучения.

Экспериментальные результаты исследования зависимости биоактивности трипсина инкапсулированного в полилактидные микрочастицы от плотности мощности и скорости сканирования лазерного излучения показали, что уровень его активности снижается с увеличением вложенной энергии. Тем не менее, он остается достаточно высоким. Так, при 3-х кратном превышением интенсивности лазерного воздействия над порогом размягчения полилактида активность трипсина оставалась на уровне 5б% от исходной. При этом начальная скорость выхода трипсина в физиологический раствор уменьшалась более, чем в два раза (с 45 до 2G%). Учитывая, что предложенные и разработанные нами методы сверхкритической флюидной инкапсуляции позволяют получать гораздо более высокие концентрации биоактивных компонентов (до BG^9G вес.%) в биорезорбируемых полимерных микрочастицах по сравнению с традиционными методами, такими как, например, метод "двойных эмульсий" (1G^15 вес.%), такое снижение активности может быть легко скомпенсировано увеличением общего количества лекарственного препарата.

В целом, анализ полученных результатов продемонстрировал большой потенциал использования предлагаемого подхода для получения новых лекарственных форм пролонгированного действия на основе широкого класса термически нестабильных и химически неустойчивых соединений. Так, в частности, дальнейшее развитие этой работы предполагает разработку и создание препаратов на основе разнообразных пептидов, имитирующих действие тромбина в процессах

репарации различных тканей и ранозаживления, а также стресс-протективных пептидов, использующихся для ускоренной пост-инфарктной и пост-инсульной реабилитации.

Автор выражает глубокую благодарность и признательность своим коллегам Е.Н. Антонову, В.Н. Баграташвили, Е.А. Марквичевой, Л.Д. Румшу и Б.М. Фельдману за совместную работу и плодотворные обсуждения ее результатов. Работа была выполнена при финансовой поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (Проекты №№ G5-GB-5G266 и G6-G2-GB125) и правительства Москвы в рамках Научно-технической программы «Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения онкологических, инфекционных и других опасных заболеваний» на 2GG7-2GG9 г.

1. I.D. Morris, A.M. Palmer. "Therapeutic strategies for tissue regeneration", Drug News Perspectives, V.1B, pp.525-53G, 2GG5.

2. A.H.L. Chow, H.H.Y. Tong, P. Chattopadhyay, B.Y. Shekunov. "Particle Engineering for Pulmonary Drug Delivery", Pharmaceutical Research, V.24, pp.411-437, 2GG7.

3. A. H. L. Chow, H. Y. Tong, and B. Y. Shekunov. Control of physical forms of pharmaceutical substances. In P. York, U. B.Kompella and B. Y. Shekunov (eds.),

Supercritical Fluid Technology for Drug Product Development, Marcel Dekker Series, New York, 2004, pp. 283-342..

4. L.G. Griffith. "Polymeric biomaterials", Acta Mater., V.48, pp.263-277, 2000.

5. A. Millqvist-Fureby, M. Malmsten, B. Bergenstahl. "Spray drying of trypsin - surface characterisation and activity preservation", Int. J. Pharm., V.188, pp.243-253, 1999.

6. O. Soga, C.F. Van Nostrum, M. Fens, C.J.F. Rijcken. "Thermosensitive and biodegradable polymeric micelles for paclitaxel delivery", J. Control Release, V.103, pp.341-53, 2005.

7. S.M. Howdle, F.S. Mandel, M.S. Watson, V.K. Popov, KM. Shakesheff. "Supercritical fluid mixing: A new solvent-free and low temperature technology for fabricating controlled release systems", Proc. 27th Int. Symp. on Controlled Release of Bioactive Materials, Boston, USA, 2000, pp.1024-1025.

8. В.Н. Баграташвили, С.Э. Богородский, А.Н. Коновалов, А.П. Кубышкин, А.А. Новицкий, В.К. Попов, К. Уптон, С.М. Хоудл. "Получение микрочастиц биорезорбируемых полимеров с помощью сверхкритических сред", Сверхкритические Флюиды: Теория и Практика, т.2, , сс.53-60, 2007.

9. Е.К Аntonov, V.N. Bagratashvili, S.M. Howdle, А.К ^novalov, V.K Popov, K M. Shakesheff, МХ Whitaker. "3-D Bioactive and Biodegradable Scaffolds Fabricated by Selective Laser Sintering", Advanced Materials, V.17, pp.327-330, 2005.

10. Е.К Аntonov, V.N. Bagratashvili, S.M. Howdle, А.К ^novalov, V.K Popov, V.Ya. Panchenko. "Fabrication of polymer scaffolds for tissue engineering using surface selective laser sintering", Laser Physics, V.16, pp.774-787, 2006.

SUPERCRITICAL FLUIDS AND LASER TECHNOLOGIES FOR CONTROLLABLE DRUG RELEASE.

V.K. Popov

Institute of Laser and Information Technologies RAS, Troitsk, Russia. e-mail: popov@laser.ru

We proposed and developed a new approach to controlled drug release system fabrication based on combination of supercritical carbon dioxide assisted bioactive polymer microparticle generation followed by their surface selective laser treatment. This approach, from one hand, enables generation of bioresorbable microparticles without usage of any organic solvent, avoiding trapping of their toxic additives. From another hand, it is allows precise modification of microparticle surface morphology (providing preservation of their biochemical activity), controlling drug release kinetics. Both bioactivity and release kinetics studies of crystalline trypsin, plantain and calendula plant extracts encapsulated into bioresorbable polylactic acid microparticles were performed and discussed. Analysis of our results demonstrated an impressive potential of the proposed approach application for advanced drug release forms fabrication based on thermoliable and chemically unstable components.