Влияние антимикробных пептидов из тромбоцитов сельскохозяйственных животных на способность микроорганизмов к образованию биопленок

УДК 619:57 М.В. Сычёва, Е.В. Шейда,

О.Л. Карташова, И.В. Валышева

ВЛИЯНИЕ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ ИЗ ТРОМБОЦИТОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ НА СПОСОБНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ К ОБРАЗОВАНИЮ БИОПЛЕНОК

В статье изучено влияние тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на способность микроорганизмов к формированию биопленок.

Установлено, что тромбодефенсины разных видов животных увеличивают интенсивность био-пленкообразования. Наиболее выраженный стимулирующий эффект на формирование биопленок микроорганизмами отмечался под действием тромбодефенсинов из кислотного экстракта тромбоцитов птицы.

Ключевые слова: антимикробные пептиды, тромбодефенсины, бактерии, биопленки.

M.V. Sychyova, E.V. Sheida,

O.L. Kartashova, I.V. Valysheva

INFLUENCE OF THE ANTIMICROBIC PEPTIDES FROM THE AGRICULTURAL ANIMAL THROMBOCYTES ON THE MICROORGANISM ABILITY TO BIOMEMBRANE FORMATION

Agricultural animal thrombodefensin influence on the microorganism ability to biomembrane formation is studied in the article.

It is determined, that thrombodefensins of different animal species increase intensity of biomembrane formation. The most marked stimulating effect on biomembrane formation by the microorganisms is registered under the action of thrombodefensins from the poultry thrombocyte acid extract.

Key words: antimicrobial peptides, thrombodefensins, bacteria, biomembrane.

Биопленки представляют собой специфическим образом сформированные сообщества микроорганизмов, компартменты которого выполняют различные функции и имеют единую цель - максимальную адаптацию к данной экологической нише и наиболее эффективное распространение популяции [1]. Микроорганизмы в биопленке лучше выживают при воздействии антибактериальных препаратов и проявляют комплексные свойства, одним из которых является защита популяции от других конкурирующих микроорганизмов и губительного воздействия факторов организма хозяина и внешней среды.

Одним из компонентов врожденного иммунитета макроорганизма являются тромбодефенсины (ТД) -низкомолекулярные катионные пептиды, локализованные в а-гранулах тромбоцитов и обладающие антимикробным, антивирусным и антимикотическим действием [6]. Однако до настоящего времени практически отсутствует информация о влиянии тромбодефенсинов на способность микроорганизмов к пленкообразова-нию (ПО). Изучение данного вопроса представляется интересным и с точки зрения использования ТД в будущем как антимикробных препаратов.

В связи с этим целью настоящего исследования явилось изучение влияния тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на способность микроорганизмов к формированию биопленок.

Материалы и методы

В работе были использованы тромбодефенсины, полученные из тромбоцитов лошадей, крупного рогатого скота и кур методом кислотной экстракции с замораживанием и размораживанием тромбоцитарной массы и последующим центрифугированием. Общее содержание белка в полученных супернатантах определяли по методу Бредфорда [3]. Оценку влияния кислотных экстрактов из тромбоцитов на способность к биопленкооб-разованию in vitro проводили в отношении музейных культур, способных образовывать биопленки: Enterobacter cloacae (3 штамма), Enterobacter agglomerans, Staphylococcus aureus Р 209, Klebsiella pneumoníaе 278. Для этого суточные агаровые культуры культивировали с кислотными экстрактами из тромбоцитов (рН 5,5-5,8) в концентрациях, соответствовавших 1 МПК и 1/4 МПК, установленных нами ранее, в течение 1 часа при 370С, после чего высевали по 0,2 мл на питательный агар и инкубировали 24 часа при 370С. Для определения способности микроорганизмов к образованию биопленок до и после инкубации с кислоторастворимыми белками

ВестникКрасГАУ. 2011. № 1

тромбоцитов учитывали степень связывания кристаллического фиолетового в стерильных 96-луночных полипропиленовых планшетах (Greiner bio-one, Германия). Уровень активности рассчитывали как отношение А492опыт/Аш2контроль. Положительным результатом считали значения больше 1,1 [4].

Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента [2].

Результаты исследований

На основании проведенных исследований выявлено разнонаправленное, но преимущественно стимулирующее влияние тромбодефенсинов на способность микроорганизмов к образованию биопленок (табл.).

Влияние тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на способность микроорганизмов

к образованию биопленок

Микроорганизмы Показатель образования биопленок Sx±х

Контроль МПК 1/4МПК

E. cloacae 1247 ТД лошади 1,33±0,013 1,44±0,041* 1,63±0,039***

E. cloacae 1236 1,31±0,017 1,67±0,019*** 1,72±0,049***

E. cloacae 1479 1,97±0,046 1,86±0,074 1,92±0,022

E. agglomerans 1,63±0,024 1,68±0,029 1,79±0,020**

S. aureus 1,2±0,08 1,11±0,027 1,14±0,043

K. pneumoníaе 1,13±0,008 1,12±0,046 1,15±0,009

E. cloacae 1247 ТД крупного рогатого скота 1,53±0,017 1,65±0,025** 1,86±0,008***

E. cloacae 1236 1,27±0,02 1,28±0,01 1,29±0,017

E. cloacae 1479 1,59*0,036 1,6±0,059 1,45±0,031

E. agglomerans 1,64±0,058 1,63±0,03 1,67±0,031

S. aureus 1,34±0,082 1,17±0,013 1,27±0,072

K. pneumoníaе 1,32±0,035 1,47±0,025* 1,81±0,029***

E. cloacae 1247 d 1— 1,10±0,01 1,31±0,018*** 1,28±0,014***

E. cloacae 1236 1,10±0,016 1,23±0,009** 1,19±0,014*

E. cloacae 1479 1,25±0,012 1,33±0,012 1,35±0,019

E. agglomerans 1,39±0,051 1,54±0,052** 1,57±0,062**

S. aureus 1,04±0,026 1,12±0,044 1,1±0,017

K. pneumoníaе 1,22±0,026 1,21±0,028 1,41±0,03**

Примечания: * достоверность различий показателя биопленкообразования в контроле и после соинкуби-рования с кислотным экстрактом тромбоцитов (р<0,05); ** (р<0,01); *** (р<0,001).

Стимулирующее влияние ТД лошади и крупного рогатого скота на биопленкообразование выявлено в 66,7% случаев, антимикробные белки из тромбоцитов кур усиливали способность микроорганизмов образовывать биопленки в 100% случаев.

Изменение свойств микроорганизмов зависело от вида бактерий и происхождения тромбодефенсинов. Так, под влиянием ТД лошади отмечалось увеличение интенсивности пленкообразования у 80% энтеробактерий: на 1,8% у K. pneumoniae, в среднем на 27% у E. cloacae (р<0,001) и на 9,8% у E. agglomerans (р<0,01) от исходного уровня признака. Под действием тромбодефенсинов лошади отмечалось снижение способности образовывать биопленки у S. aureus и одного штамма E. cloacae, однако уменьшение коэффициента биопленкообразования было в пределах средней арифметической ошибки, а поэтому различия между величинами были недостоверными.

При воздействии ТД крупного рогатого скота в большинстве случаев отмечался стимулирующий эффект в отношении пленкообразующей способности изучаемых микроорганизмов. Способность формировать биопленку увеличивалась в среднем на 11,6% у E. cloacae, на 37,1% у K. pneumoniae (р<0,05) и на 1,8% у E. agglomerans. Выявлен ингибирующий эффект в отношении пленкообразущей способности S. aureus и одного штамма E. cloacae, однако в обоих случаях изменения носили недостоверный характер, т.е. были на уровне тенденций.

Как показали исследования, антимикробные пептиды из тромбоцитов кур оказывали наибольший стимулирующий эффект на способность микроорганизмов к формированию биопленок. Усиление биопленкооб-

разования было отмечено в 100% случаев, причем у E. cloacae коэффициент ПО достоверно увеличился в среднем на 12,2%, у E. agglomerans - на 13% (р<0,01), у K. pneumoniae - на 15,6% (р<0,01) и у S. aureus - на 5,8% от исходного уровня признака.

Независимо от природы тромбодефенсинов наибольший стимулирующий эффект в отношении пленкообразующей способности микроорганизмов наблюдался при соинкубировании бактерий с тромбодефенси-нами в концентрации, соответствующей 1/4 МПК.

Как видно из представленных результатов, обнаружено модифицирующее влияние антимикробных пептидов из тромбоцитов сельскохозяйственных животных на образование биопленок микроорганизмами. Поскольку биопленки - многофакторный феномен, то, вероятно, ТД действуют на различные этапы их развития по нескольким механизмам. Возможно, под воздействием антимикробных пептидов из тромбоцитов in vitro большая часть микробной популяции гибнет, а сохранившие жизнеспособность клетки-персистеры, присутствующие в бактериальной популяции до ее контакта с тромбодефенсинами, обеспечивают более активное формирование биопленок [5].

Литература

1. Доброхотский О.Н., Хомяков Ю.Н., Хомякова Т.И. Эпидемиологическое значение формирования биопленок в технических системах // Научная деятельность. - 2008. - №4. - С. 78-80.

2. Лакин Г. Ф. Биометрия. - М.: Высш. шк., 1990. - 288 с.

3. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing

the principle of protein-dye binding // Anal. Biochev. - 1976. - Vol. 72. - P. 248-254.

4. Merritt J. H., Kadouri D.E., O’Toole G.A. Growing and Analyzing Static Biofilms // Curr. Protoc. Microbiol. -2005.

5. Persister Cells and the Mechanism of Multidrug Tolerance in Escherichia coli / I. Keren, D. Shah, A. Spoering

[et al.] // Specialized J. Bacteriol. - 2004. - Vol. 186. - P. 8172-8180.

6. Tang Y., Yeaman M.R., Selsted M.E. Antimicrobial peptides from human platelets // Infection and Immunity. -2002. - Vol. 70. - №. 12. - P. 6524-6533.

УДК 591.11:598.2:577.3-578.088 Е.Г. Турицына, Г.В. Макарская, С.В. Тарских

ВЛИЯНИЕ АНТИГЕННЫХ СТИМУЛЯЦИЙ ВИРУСВАКЦИНАМИ НА ПАРАМЕТРЫ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ

КЛЕТОК ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ КУР

В статье представлены результаты исследования влияния многократных антигенных стимуляций живыми вирусвакцинами на параметры генерации активных форм кислорода клетками цельной крови кур. Ключевые слова: куры, кровь, вакцинация, хемилюминесценция, активные формы кислорода.

E.G. Turitsyna, G.V. Makarskaya, S.V. Tarskikh

INFLUENCE OF THE ANTIGENIC STIMULATIONS BY THE VIRUS VACCINES ON THE CHEMILUMINESCENCE

PARAMETERS OF HEN WHOLE BLOOD CELLS

The research results of influence of the repeated antigenic stimulations by the live virus vaccines on the parameters of active oxygen form generation by the hen whole blood cells are given in the article.

Key words: hens, blood, vaccination, chemiluminescence, active oxygen forms.

Программы профилактики инфекционных болезней на птицефабриках предусматривают многократные и разнообразные по антигенному составу стимуляции с целью выработки у привитого поголовья специфических антител, способных при необходимости защитить птицу от инфекции. Основными чертами общих структурных изменений в организме при вакцинациях являются гиперпластические процессы со сторо-