Способ получения стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью из мезенхимальных стволовых клеток путем использования фракции флоротаннина
METHOD FOR PRODUCING STEM CELLS WITH INDUCED PLURIPOTENCY OF MESENCHIMAL STEM CELLS BY USING PHLOROTANNIN FRACTION

Область изобретения
Изобретение относится к композиции среды стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью из мезенхимальных стволовых клеток, содержащей фракцию флоротаннина, экстрагированного из бурых водорослей, и к способу получения стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью с использованием указанной среды.
Предшествующий уровень техники
Стволовые клетки представляют собой клетки, которые могут быть дифференцированы в различные клетки, формирующие ткань организма и вместе называемые до дифференцировки недифференцированными клетками, которые могут быть получены из каждой ткани эмбриона, зародыша и взрослого организма. Стволовые клетки можно классифицировать различными способами. Один из наиболее распространенных способов зависит от объекта, из которого выделяют стволовые клетки, и указанные стволовые клетки могут быть разделены на эмбриональные стволовые клетки (клетки ES), выделенные у эмбриона, и стволовые клетки взрослых, выделенные у взрослого организма. Еще одна распространенная классификация соответствует способности к дифференцировке стволовых клеток, и стволовые клетки могут быть разделены на плюрипотентные, мультипотентные и унипотентные стволовые клетки. Плюрипотентными стволовыми клетками называют стволовые клетки, обладающие мультифункциональностью, которые могут быть дифференцированы в три зародышевых слоя, формирующие живой организм, и, как правило, им соответствуют эмбриональные стволовые клетки.
Стволовые клетки взрослых могут быть классифицированы на мультипотентные или унипотентные стволовые клетки. Типичные стволовые клетки взрослых включают мезенхимальные стволовые клетки (MSC) и гематопоэтические стволовые клетки (HSC). Известно, что MSC дифференцируются в хондробласт, остеобласт, адипоцит, миоцит и нейрон, а HSC дифференцируются в клетки крови в кровотоке, включающие красные кровяные тельца, белые кровяные тельца, тромбоциты и т.п. Стволовые клетки взрослых могут быть получены из костного мозга, крови, головного мозга, кожи и т.п., что создает меньше этических аспектов, но они обладают ограниченной мультипотентностью по сравнению с эмбриональными стволовыми клетками.
С другой стороны, плюрипотентные стволовые клетки названы стволовыми клетками, обладающими мультифункциональностью, которые могут быть дифференцированы в три зародышевых слоя, формирующих живой организм для дифференцировки на все клетки или ткани органов человеческого организма, и, как правило, им соответствуют эмбриональные стволовые клетки. Эмбриональные стволовые клетки представляют собой плюрипотентные стволовые клетки, обладающие возможностью к дифференцировке в клетки всех тканей, формирующих один субъект, но имеющие серьезные этические аспекты, заключающимися в том, что эмбрионы разрушаются в процессе получения клеток.
В качестве альтернативы для решения этих проблем предприняты различные способы получения адаптированных плюрипотентных стволовых клеток, похожих на эмбриональные стволовые клетки, путем дедифференцировки клеток, полученных у взрослого организма. Известно, что человеческие эмбриональные стволовые клетки получают у эмбрионов, которые могут формировать человеческий организм, и, таким образом, существует множество этических аспектов, однако эмбриональные стволовые клетки обладают превосходной клеточной пролиферацией и мультипотентностью по сравнению со стволовыми клетками взрослых. Стволовые клетки взрослых могут быть получены из костного мозга, крови, головного мозга, кожи и т.п., что создает меньше этических аспектов, но они обладают ограниченной мультипотентностью по сравнению с эмбриональными стволовыми клетками.
В качестве типичного способа существуют следующие способы, например слияние с клеткой ES, перенос ядер соматической клетки, перепрограммирование при помощи генетического фактора и т.п. Слияние с клеткой ES представляет проблему с точки зрения клеточной стабильности, поскольку индуцированные клетки дополнительно имеют две пары генов, а перенос ядер соматической клетки создает проблему, заключающуюся в том, что требуется множество яйцеклеток, и эффективность является слишком низкой. Дополнительно, перепрограммирование при помощи генетического фактора представляет собой способ с использованием вируса, содержащего онкогены, для того, чтобы вызвать дидифференцировку, путем встраивания специфических генов, и, таким образом, имеет высокий риск возникновения рака, а также оно создает проблемы с точки зрения разработки клеточных терапевтических агентов вследствие низкой эффективности и сложности методического аспекта.
Для того чтобы успешно получать большое количество плюрипотентных стволовых клеток, композиция культуры очень важна для культивирования мононуклеарных клеток, получаемых из выделенной пуповины, и, таким образом, требуются исследования, относящиеся к получению большего количества плюрипотентных стволовых клеток при помощи способа индукции с высокой эффективностью.
В то же самое время, в публикации патента Кореи №2009-0043115 раскрыта композиция для лечения или предупреждения атопических заболеваний путем использования Ecklonia cava из бурых водорослей, и в публикации патента Кореи №2012-0126148 раскрыта композиция сурьмы для окислительного окрашивания.
Авторы настоящего изобретения успешно разработали композицию среды для дедифференцировки стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью путем использования экстракта Ecklonia cava (публикация патента Кореи №2015-0050823). Тем не менее, какой именно компонент экстракта Ecklonia cava обладает дедифференцирующим действием на стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью еще не известно.
Подробная информация, описанная в разделе предшествующего уровня техники, приведена только для усиления понимания предшествующего уровня техники по настоящему изобретению и, таким образом, она может содержать информацию, которая не образует предшествующий уровень техники, который уже известен в данной стране специалисту в данной области техники.
Описание изобретения
Техническая проблема, решаемая в изобретении
Авторы настоящего изобретения приложили усилия для разработки высокоэффективного способа индуцирования плюрипотентности стволовых клеток, для того, чтобы организовать серийное производство клеточных терапевтических агентов с высокой стабильностью и высокой эффективностью получения. В результате, авторы изобретения подтвердили, что когда некоторые соединения, экстрагированные и выделенные из бурых водорослей в виде стабильного природного вещества, добавляют в клеточную культуральную среду, тогда могут быть получены стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью со стабильностью и высокой эффективностью путем использования мезенхимальных стволовых клеток, и таким образом, завершили настоящее изобретение.
Настоящее изобретение направлено на то, чтобы обеспечить композицию среды, содержащую фракцию флоротаннина, для дедифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью.
Настоящее изобретение также направлено на то, чтобы обеспечить способ получения стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью, включающий дедифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью в среде, включающей фракцию флоротаннина. Кроме того, настоящее изобретение также направлено на то, чтобы обеспечить клеточную терапевтическую композицию, включающую стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью, полученные при помощи способа получения. Другие задачи и преимущества настоящего изобретения станут яснее благодаря подробному описанию изобретения, формуле изобретения и графическим материалам, описанным ниже.
Техническое решение
В одном аспекте настоящего изобретения предложена композиция среды, содержащая фракцию флоротаннина, для дедифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью.
Предпочтительно, фракция флоротаннина может представлять собой биэкольное соединение, представленное следующей химической формулой 1 или ее солями.
[Химическая формула 1]
Предпочтительно фракция флоротаннина может быть экстрагирована и выделена из одного из видов бурых водорослей, выбранных из группы, состоящей из Ecklonia cava, Dictyopteris prolifera Okamura, Dictyota dichotoma Lamouroux, Sargassum horneri C. Agardh, Sargassum patens C. Agardh и Ishige okamurae Yendo, или искусственно синтезирована.
Предпочтительно, фракция флоротаннина может быть экстрагирована и выделена из Ecklonia cava.
Предпочтительно, фракция флоротаннина может быть включена в среду, выбранную из группы, состоящей из DMEM (среда Игла, модифицированная Дульбекко), MEM (минимальная поддерживающая среда), ВМЕ (базальная среда Игла), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM F-12, α-МЕМ (α-минимальная поддерживающая среда), G-MEM (минимальная поддерживающая среда Глазго), IMDM (среда Дульбекко, модифицированная по способу Исков), среды MacCoy's 5А, полной среды AminoMax II и среды MesenCult-XF.
Предпочтительно, фракция флоротаннина может быть включена в количестве от 10 до 500 мкг/мл относительно композиции среды.
Предпочтительно, композиция среды может дополнительно включать от 1 до 10% об./об. энергетической воды.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью, включающий: добавление фракции флоротаннина в клеточную культуральную среду; и дедифференцировку мезенхимальных стволовых клеток в среде в стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью.
Предпочтительно, фракция флоротаннина может представлять собой биэкольное соединение, представленное следующей химической формулой 1 или ее солями.
[Химическая формула 1]
Предпочтительно, в еще одном аспекте настоящего изобретения предложена клеточная терапевтическая композиция, содержащая стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью, полученные при помощи указанного способа.
Преимущества
Особенности и преимущества настоящего изобретения являются следующими.
(1) В настоящем изобретении предложена композиция среды для дедифференцировки стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью путем использования фракции флоротаннина, экстрагированной из бурых водорослей.
(2) Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ получения стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью с использованием композиции среды.
(3) Стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью могут быть эффективно получены путем использования мезенхимальных стволовых клеток путем использования композиции среды по настоящему изобретению, и полученные стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью могут быть дифференцированы в различные клетки, и таким образом могут быть полезны в качестве клеточного терапевтического агента.
Описание графических материалов
На ФИГ. 1 показано условие для выделения фракции из экстракта Ecklonia cava.
На ФИГ. 2 показан результат масс-спектроскопии для 2-O-(2,4,6-тригидроксифенил)-6,6'-биэкола, представленного химической формулой 1.
1
На ФИГ. 3 показан результат спектроскопии H-NMR (ядерный магнитный резонанс) для 2-O-(2,4,6-тригидроксифенил)-6,6'-биэкола, представленного химической формулой 1.
13
На ФИГ. 4 показан результат спектроскопии C-NMR для 2-O-(2,4,6-тригидроксифенил)-6,6'-биэкола, представленного химической формулой 1.
На ФИГ. 5 показан результат масс-спектроскопии для диэкола, представленного химической формулой 2.
1
На ФИГ. 6 показан результат спектроскопии H-NMR для диэкола, представленного химической формулой 2.
13
На ФИГ. 7 показан результат спектроскопии C-NMR для диэкола, представленного химической формулой 2.
На ФИГ. 8 показан результат масс-спектроскопии для флорофукофуроэкола-А (PFF-A), представленного химической формулой 3.
1
На ФИГ. 9 показан результат спектроскопии H-NMR для флорофукофуроэкола-А (PFF-A), представленного химической формулой 3.
13
На ФИГ. 10 показан результат спектроскопии C-NMR для флорофукофуроэкола-А (PFF-A), представленного химической формулой 3.
На ФИГ. 11 показан результат масс-спектроскопии для 974-А, представленного химической формулой 4.
1
На ФИГ. 12 показан результат спектроскопии H-NMR для 974-А, представленного химической формулой 4.
13
На ФИГ. 13 показан результат спектроскопии C-NMR для 974-А, представленного химической формулой 4.
На ФИГ. 14 показан результат масс-спектроскопии для 974-В, представленного химической формулой 4.
1
На ФИГ. 15 показан результат спектроскопии H-NMR для 974-В, представленного химической формулой 5.
13
На ФИГ. 16 показан результат спектроскопии C-NMR для 974-В, представленного химической формулой 5.
На ФИГ. 17 показано образование колоний стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью в зависимости от концентрации за счет обработки фракцией флоротаннина из экстракта Ecklonia cava с использованием способа (экспериментальный пример 1-1) по настоящему изобретению.
На ФИГ. 18 подтверждено, что клетки, индуцированные способом по настоящему изобретению (экспериментальный пример 1-1), представляют собой плюрипотентные стволовые клетки, за счет использования экспрессии SSEA-4 и щелочной фосфатазы, которые представляют собой белки, специфические для плюрипотентных стволовых клеток.
На ФИГ. 19 подтверждено, что клетки, индуцированные способом по настоящему изобретению (экспериментальный пример 1-1), представляют собой плюрипотентные стволовые клетки, за счет использования экспрессии ОСТ4 и SOX2, которые представляют собой гены, специфические для плюрипотентных стволовых клеток.
На ФИГ. 20 показано образование колоний плюрипотентных стволовых клеток, индуцированных в зависимости от концентрации за счет обработки соединением из фракции флоротаннина с использованием способа (экспериментальный пример 1-2) по настоящему изобретению.
На ФИГ. 21 подтверждено, что клетки, индуцированные способом по настоящему изобретению (экспериментальный пример 1-2), представляют собой плюрипотентные стволовые клетки, за ьсчет использования экспрессии SSEA-4 и щелочной фосфатазы, которые представляют собой белки, специфические для плюрипотентных стволовых клеток.
На ФИГ. 22 подтверждено, что клетки, индуцированные способом по настоящему изобретению (экспериментальный пример 1-2), представляют собой плюрипотентные стволовые клетки, за счет использования экспрессии ОСТ4 и SOX2, которые представляют собой гены, специфические для плюрипотентных стволовых клеток.
Осуществление изобретения
В соответствии с аспектом настоящего изобретения в настоящем изобретении предложена композиция среды, содержащая фракцию флоротаннина, экстрагированную и выделенную из бурых водорослей, для дедифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью.
Авторы настоящего изобретения сделали попытку разработать способ индуцирования плюрипотентности с высокой эффективностью у стволовых клеток, для того, чтобы запустить в серийное производство разработку клеточных терапевтических агентов, обладающих стабильностью и высокой эффективностью продукции без этического аспекта повреждения эмбрионов. В результате подтвердили, что когда фракцию флоротаннина, выделенную из экстракта бурых водорослей в виде стабильного природного экстракта, предпочтительно, экстракта Ecklonia cava, добавляют в клеточную культуральную среду, то неожиданно с высокой эффективностью могут быть получены стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью.
В соответствии с иллюстративным воплощением настоящего изобретения экстракт из бурых водорослей может представлять собой водный экстракт из бурых водорослей, этанольный экстракт из бурых водорослей, метанольный экстракт из бурых водорослей или экстракт из бурых водорослей при использовании смешанного растворителя из двух или более чем двух, выбранных из воды, этанола и метанола.
В соответствии с иллюстративным воплощением настоящего изобретения водный экстракт из бурых водорослей может быть приготовлен путем экстрагирования бурых водорослей водой при температуре от 40 до 100°С в течение от 2 до 48 часов. Этанольный экстракт из бурых водорослей может быть приготовлен путем экстрагирования бурых водорослей 35-80% этанолом при 20-60°С в течение от 2 до 36 часов. Кроме того, метанольный экстракт из бурых водорослей может быть приготовлен путем экстрагирования бурых водорослей 35-80% метанолом при 20-60°С в течение от 2 до 36 часов.
Ecklonia cava среди бурых водорослей, включенных в композицию среды по настоящему изобретению, представляет собой многолетнюю водоросль из бурых водорослей laminariaceous laminariales, которые преимущественно обитают на южном берегу, берегу острова Чеджу и берегу острова Уллеунгдо, в основном представляя собой корм для морского ушка, turban и т.п, и используется в качестве основного сырьевого материала для получения альгината или йодида калия либо в пищевом продукте.
Экстракт Ecklonia cava, включенный в настоящее изобретение, может быть экстрагирован путем использования воды и органических растворителей, включающих (а) безводный или содержащий воду низший спирт, имеющий от 1 до 4 атомов углерода (метанол, этанол, пропанол, бутанол, н-пропанол, изопропанол, н-бутанол и т.п.), (б) смешанный растворитель из низшего спирта и воды, (в) ацетон, (г) этилацетат, (д) хлороформ, (е) 1,3-бутиленгликоль, (ж) гексан, (з) диэтиловый эфир и т.п., и предпочтительно может быть экстрагирован путем использования смешанного растворителя из метанола или этанола и воды. В случае экстракции экстракта Ecklonia cava путем использования смешанного растворителя содержание метанола или этанола может составлять от 50 до 80% об./об. Тем не менее, настоящее изобретение не обязательно ограничено ими.
Флоротаннин, выделенный из экстракта бурых водорослей, представляет собой основанное на полифеноле соединение, содержащее флороглюцинол в качестве основной составляющей единицы. Флоротаннин обнаружен во множестве морских растений, в частности, в бурых водорослях в природе, и сообщается о том, что флоротаннин обладает различными полезными эффектами, такими как антибактериальный эффект, антиоксидантный эффект, гепатопротекторное действие, ингибирующее эластазу действие, ингибирующее гиалуронидазу действие, эффект защиту сердечно-сосудистой системы, и противовирусное действие.
В настоящем изобретении, в частности, биэкольное соединение, представленное следующей химической формулой 1, диэкольное соединение, представленное следующей химической формулой 2, флорофукофуроэкольное соединение, представленное следующей химической формулой 3, основанное на эколе соединение, представленное следующей химической формулой 4, и основанное на эколе соединение, представленное следующей химической формулой 5, выделены и идентифицированы из фракции флоротаннина экстракта из Ecklonia cava, и экспрессирующая способность стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью подтверждена. Когда биэкольное соединение, представленное следующей химической формула 1, среди других соединений добавляют в клеточную культуральную среду, то подтверждается, что стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью могут быть получены с высокой эффективностью.
[Химическая формула 1]
[Химическая формула 2]
[Химическая формула 3]
[Химическая формула 4]
[Химическая формула 5]
Более конкретно, химическая формула 1 представлена 2-O-(2,4,6-тригидроксифенил)-6,6'-биэколом, химическая формула 2 представлена диэколом, химическая формула 3 представлена флорофукофуроэколом-А (PFF-A), химическая формула 4 представлена 974-А и химическая формула 5 представлена 974-В, и в настоящем изобретении соединения могут быть добавлены в клеточную культуральную среду сами по себе или в их комбинации.
Используемый в настоящем изобретении термин "эмбриональные стволовые клетки" относится к клеткам, обладающим плюрипотентностью, таким как клетки, выделенные и культивируемые из внутренней клеточной массы бластоциста на раннем этапе его развития после оплодотворения. Используемый в настоящем изобретении термин "плюрипотентные стволовые клетки" относится к стволовым клеткам, обладающим плюрипотентностью, которые могут быть дифференцированы в три зародышевых слоя, формирующих взрослый организм, а именно эндодерму, мезодерму и эктодерму.
Используемый в настоящем изобретении термин "дифференцировка" означает, что по мере того, как клетки делятся, пролиферируют и растут, их структуры и функции специализируются, то есть, формы или функции меняются для того, чтобы осуществлять задачи, которые заданы клеткам, тканям, и т.п. в организме.
Термин "клеточный терапевтический агент" по настоящему изобретению, относящийся к лекарственному средству, используемому для лечения, диагностики и предупреждения за счет использования клеток и тканей, которые получают путем выделения у человека, культивирования и специфических манипуляций, означает лекарственное средство, используемое для лечения, диагностики и предупреждения путем серий действий, таких как пролиферация и скрининг гомогенных или гетерогенных клеток для восстановления функций клеток или тканей, изменения биологических характеристик клеток при помощи еще одного способа и т.п. Клеточный терапевтический агент, главным образом, классифицируют на терапевтический агент на основе соматических клеток, терапевтический агент на основе стволовых клеток в соответствии с дифференцировкой клеток, и настоящее изобретение в частности относится к терапевтическому агенту на основе стволовых клеток.
Мезенхимальные стволовые клетки по настоящему изобретению представляют собой клетки, выделенные из эмбриональных стволовых клеток или зрелых стволовых клеток, полученных от млекопитающего, предпочтительно мезенхимальных стволовых клеток, полученных из пуповины, и более предпочтительно, мезенхимальных стволовых клеток, полученных из человеческой пуповины. Стволовые клетки могут быть экстрагированы и получены из пуповины, которая связывает плаценту и плод в организме человека. Экстракция мезенхимальных стволовых клеток из пуповины может быть осуществлена путем использования различных способов, и например, пуповину экстрагируют из человеческого организма, промывая DPBS (фосфатно-солевым буфером Дульбекко) до тех пор, пока кровь не будет течь, и промытую пуповину режут при помощи лезвия скальпеля и инкубируют при 37°С для получения раствора, содержащего мононуклеарные клетки.
Используемый в настоящем изобретении термин "среда" обозначает смесь для культивирования или дифференцировки клеток in vitro, таких как стволовые клетки, которая содержит требуемые элементы для роста и пролиферации клеток, включающие сахара, аминокислоты, различные питательные вещества, сыворотку крови, факторы роста, неорганические вещества и т.п.
Различные среды запущены в серийное производство, и могут быть искусственно приготовлены и использованы в области техники. В качестве запущенной в серийное производство среды включены DMEM (среда Игла, модифицированная Дульбекко), MEM (минимальная поддерживающая среда), ВМЕ (базальная среда Игла), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM F-12, α-MEM (α-минимальная поддерживающая среда), G-MEM (минимальная поддерживающая среда Глазго), IMDM (среда Дульбекко, модифицированная по способу Исков), AmnioMax, полная среда AminoMaxII (Gibco, Newyork, USA), среда MesenCult-XF и т.п., и могут быть использованы в качестве основной среды, включенной в композицию среды дополнительно к среде, которая может быть искусственно приготовлена.
В основную среду могут быть добавлены типично добавляемые компоненты сыворотки крови (например, фетальная телячья сыворотка (FBS)), антибиотики (например, пенициллин и стрептомицин) и т.п. Концентрация компонента сыворотки крови или антибиотического компонента, которые добавляют в основную среду, могут быть модифицированы в пределах диапазона, который может обеспечивать достижение эффекта настоящего изобретения, и предпочтительно могут быть добавлены 10% FBS, 100 Е/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и т.п.
В то же самое время, концентрация соединения, добавляемого к DMEM, может быть модифицирована в пределах диапазона, который может обеспечить достижение эффекта настоящего изобретения.
Кроме того, среда по настоящему изобретению может дополнительно включать питательную смесь. Питательная смесь представляет собой смесь, содержащую различные аминокислоты, витамины, неорганические соли и т.п., которые обычно используют в клеточной культуре, и может использоваться питательная смесь, которую готовят путем смешивания аминокислот, витаминов, неорганических солей и т.п., или которая приготовлена путем запуска в серийное производство. Приготовленная путем запуска в серийное производство питательная смесь может включать М199, MCDB110, MCDB202, MCDB302 и т.п. в качестве примера, но не ограничиваясь ими.
Кроме того, среда по настоящему изобретению может дополнительно включать энергетическую воду для индукции и стабилизации плюрипотентности стволовых клеток. Энергетическую воду предпочтительно добавляют в количестве от 0,05 до 20% об./об., и более предпочтительно от 0,1 до 10% об./об.
Композиция среды по настоящему изобретению представляет собой специфическую среду для индукции плюрипотентности стволовых клеток, и может быть получена путем добавления фракции флоротаннина, выделенной из экстракта бурых водорослей в основной среде, и может включать фракцию флоротаннина, выделенную из экстракта Ecklonia cava предпочтительно в концентрации от 1 до 1000 мкг/мл и более, предпочтительно в концентрации от 10 до 50 мкг/мл относительно полной композиции среды.
Кроме того, по меньшей мере один тип, выбранный из группы, состоящей из 2-O-(2,4,6-тригидроксифенил)-6,6'-биэкола химической формулы 1, диэкола химической формулы 2, флорофукофуроэкола-А (PFF-A) химической формулы 3, 974-А химической формулы 4 и 974-В химической формулы 5, можно использовать в количестве от 10 до 200 мкг/мл, более предпочтительно, от 20 до 150 мкг/мл относительно полной композиции среды.
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения в настоящем изобретении предложен способ получения стволовых клеток с индуцированной плюрипотентностью, включающий: добавление фракции флоротаннина, выделенной из экстракта Ecklonia cava, в клеточную культуральную среду; и дедифференцировку мезенхимальных стволовых клеток в стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью в этой среде.
2
В этом случае, мононуклеарные клетки, полученные из пуповины, добавляют в основную композицию среды, содержащую 2-O-(2,4,6-тригидроксифенил)-6,6'-биэкол, или смесь, содержащую 2-O-(2,4,6-тригидроксифенил)-6,6'-биэкол, и могут быть инкубированы в инкубаторе в условиях влажности 95%, 37°С и 5% СО.
В иллюстративном воплощении настоящего изобретения мононуклеарные клетки, полученные из пуповины, инкубируют в инкубаторе в указанных условиях, и затем клеточный супернатант отбирают через 5 суток, и клетки инкубируют, заменяя среду каждые 3-4 суток. Когда стволовые клетки инкубируют путем использования композиции культуральной среды, содержащей 2-O-(2,4,6-тригидроксифенил)-6,6'-биэкол, тогда обнаруживают индукцию плюрипотентности стволовых клеток в зависимости от концентрации 2-O-(2,4,6-тригидроксифенил)-6,6'-биэкола. Среду DMEM F-12 используют в качестве контрольной группы, а среду, содержащую -O-(2,4,6-тригидроксифенил)-6,6'-биэкол в среде DMEM F-12, используют в качестве экспериментальной группы, и мезенхимальные стволовые клетки, полученные из человеческой пуповины, инкубируют в среде, обработанной каждой концентрацией.
В результате можно видеть, что когда мезенхимальные стволовые клетки инкубируют в композиции среды по настоящему изобретению, тогда образуются колонии, такие как колонии плюрипотентных стволовых клеток. Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из человеческой пуповины, образуют колонии стволовых клеток в среде по настоящему изобретению на 10-14 сутки. То есть, можно видеть то, что в композиции культуральной среды по настоящему изобретению образуются колонии плюрипотентных стволовых клеток из мезенхимальных стволовых клеток, полученных из человеческой пуповины (см. Фиг. 17-19).
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения в настоящем изобретении предложены стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью, полученные при помощи способа получения.
Стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью по настоящему изобретению обладают той же самой дифференцировкой как эмбриональные стволовые клетки, и почти являются такими же, как эмбриональные стволовые клетки, даже по форме клеток. В соответствии с примером воплощения настоящего изобретения эмбриональные стволовые клетки исследовали в отношении экспрессии специфического гена (Nanog, Oct4, Sox2, Klf) и белка (SSEA-4), и в результате можно видеть, что указанные ген и белок экспрессируются в плюрипотентных стволовых клетках, индуцированных при помощи настоящего изобретения, таких как эмбриональные стволовые клетки (см. Фиг. 19).
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения в настоящем изобретении предложена клеточная терапевтическая композиция, содержащая стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью, полученные при помощи способа получения.
Можно видеть, что стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью по настоящему изобретению обладают той же самой плюрипотентностью, что и эмбриональные стволовые клетки, и в соответствии с примером воплощения настоящего изобретения обладают плюрипотентностью, то есть могут быть дифференцированы в эктодерму, мезодерму и эндодерму.
Соответственно, стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью по настоящему изобретению могут быть использованы в качестве эффективного клеточного терапевтического агента.
Композиция по настоящему изобретению может быть введена при помощи любого пути введения, в частности, способа, такого как перитонеальное введение или введение в грудную полость, подкожное введение, внутривенное или внутрисосудистое введение, внутримышечное введение, местное введение путем инъекции и т.п.
В настоящем изобретении композиция может быть введена в форме, такой как инъекции, суспензии и эмульсии на основе общего способа, и, при необходимости, может быть суспендирована в адъюванте, таком как полный адъювант Фрейнда, или введена вместе с веществом, обладающим адъювантной активностью, таким как BCG (БЦЖ). Композиция стерилизована или может содержать адъюванты, включающие стабилизаторы, увлажнители или ускорители эмульгирования, соли или буферы для приведения к осмотическому давлению и т.п. и другие терапевтически ценные вещества, и может быть приготовлена путем общего смешивания, гранулирования или нанесения оболочки.
Клеточная терапевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может содержать фармацевтически приемлемые носители или добавки, и может содержать дополнительно к активным ингредиентам разбавители (например, декстрозу, сорбит, целлюлозу, глицин, лактозу, сахарозу и маннит), связывающие вещества (например, силикат магния и алюминия, крахмальную пасту, трагакантовую камедь, карбоксиметилцеллюлозу натрия), разрыхлители (например, крахмал, агар, альгиновую кислоту или ее натриевые соли), или смесь для кипения и/или абсорбирующие агенты, подсластители, корригенты и красители.
Клеточная терапевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть применена в отношении артрита, неврологических расстройств, эндокринных расстройств, заболеваний печени и т.п. и обеспечивает возможность для более позднего проявления результатов аллогенного терапевтического агента для человека в соответствии с результатами клинического исследования.
Далее настоящее изобретение более подробно будет описано при помощи примеров. Тем не менее, настоящее изобретение не ограничивается раскрытыми ниже примерами воплощений, а может быть реализовано в различных формах. Следующие примеры воплощений описаны для того, чтобы дать возможность специалисту в данной области техники воплотить и осуществить практическую реализацию изобретения.
Примеры
Пример 1: Приготовление фракции флоротаннина и соединений химических формул 1-5
Пример 1-1: Приготовление фракции флоротаннина из экстракта Ecklonia cava
Используемые в эксперименте образцы растительного медицинского препарата приобретали в Jeju Island, получали оценку эксперта и использовали в эксперименте. 100 г высушенного образца растительного медицинского препарата добавляли в 1 л 70% метанола, экстрагировали путем кипения с обратным холодильником в течение 16 часов, и фильтровали с использованием фильтра. Фильтрат концентрировали в ротационном вакуумном испарителе и немедленно лиофилизировали для приготовления экстракта Ecklonia cava.
5 г экстракта Ecklonia cava растворяли в 500 мкл метанола, абсорбировали на смоле С4 (Sepia tech), подвергали вакуумной сушке при 30°С при использовании ротационного вакуумного испарителя, и разделяли для каждого растворителя путем использования Diaion НР-20 для небольших фракций. Прикладывали градиент, и готовили метанольные растворители, имеющие концентрации 0%, 25%, 50%, 75% и 100% для получения фракций. Разделяли на 5 небольших фракций и контролировали профиль HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография) (см. Фиг. 1). Отбирали фракцию, имеющую самый высокий пик HPLC среди пяти небольших фракций.
Пример 1-2: Выделение и очистка фракции флоротаннина
Фракции, полученные в примере 1-1, подвергали обращенно-фазовой С-18 HPLC в условиях градиента растворителя в течение 60 мин: ацетонитрил в течение 10 мин, от 20 до 55% ацетонитрила в течение 40 мин, и от 55 до 100% ацетонитрила в течение 10 мин при использовании колонки С18 (оборудование Phenomenex Luna С18, 10 мкм, 21,2 × 250 мм) и при использовании в качестве растворителей ацетонитрил, содержащий 0,02% TFA (трифторуксусная кислота), и воду, при скорости потока 10 мл/мин и УФ 243 нм, с получением пиков С (RT 25 мин), Е (RT 33 мин), G (RT 37,5 мин), Н (RT 38 мин) и I (RT 38,5 мин). Фракция от времени удерживания 0 до пика С названа с, фракция между пиком С и пиком Е названа D, фракция между пиками Е и G названа F и фракция после пика I названа J.
Каждый пик очищали путем использования колонки С18 (оборудование Phenomenex Luna С18, 10 мкм, 21,2 × 250 мм) при использовании в качестве растворителей ацетонитрил, содержащий 0,02% TFA, метанол и воду при скорости потока 4 мл/мин и УФ 230 нм для каждого в изократических условиях. При изократических условиях с 28% ацетонитрилом соответственно очищали пик Е (RT 10 мин), пик G (RT 22 мин), пик Н (RT 23 мин) и пик I (RT 27 мин).
Тем не менее, при анализе результата после очистки подтвердили, что в пике С смешаны два вещества, и затем два вещества повторно разделяли на С-1 (RT 10 мин) и С-2 (RT 13,5 мин) в изократических условиях с 26% метанолом.
Пример 1-3: Структурный анализ основанного на полифеноле соединения
1
13
Молекулярную массу и молекулярную формулу соединения, очищенного в примере 1-2, определяли путем использования высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (HPLC-MS), и структурную идентификацию соединения осуществляли путем анализа спектров Н NMR и C-NMR при помощи ядерного магнитного резонанса (NMR).
В качестве результата идентифицировали, что химическая формула 1 представляла собой 2-O-(2,4,6-тригидроксифенил)-6,6'-биэкол, химическая формула 2 представляла собой диэкол, химическая формула 3 представляла собой флорофукофуроэкол-А, химическая формула 4 представляла собой 974-А, химическая формула 3 представляла собой 974-В. Структура выделенного основанного на полифеноле соединения проиллюстрирована в следующей таблице 1, и структурные особенности каждого соединения были следующими.
[Химическая формула 1] 2-O-(2,4,6-тригидроксифенил)-6,6'-биэкол
1) Молекулярная масса: 866,65
42
26
21
2) Молекулярная формула: СНО
1
3) Н NMR (400 МГц, DMSO (диметилсульфоксид)) δ 9.28, 9.25, 9.14, 9.09, 9.06, 9.04, 8.95, 8.66, 8.61, 6.09, 6.07, 6.05, 5.91 (d, J=2,0 Гц, 1Н), 5.84, 5.80,6, 5.75 (d, J=2,0 Гц, 1Н).
13
4) С NMR (100 МГц, DMSO) δ 160.6, 160.5, 158.9, 158.9, 154.8, 151.5, 151.4, 151.2, 147.4, 146.5, 144.6, 144.6, 141.7, 141.6, 141.5, 141.5, 137.4, 137.4, 125.0, 123.9, 123.0, 123.0, 122.8, 122.3, 122.3, 99.9, 99.8, 98.1, 98.1, 98.0, 96.2, 96.2, 96.1, 95.0, 94.3, 94.1.
1
13
На Фиг. 2 показан масс-спектр 2-O-(2,4,6-тригидроксифенил)-6,6'-биэкола. Кроме того, на Фиг. 3 и 4 показаны спектр H-NMR и спектр C-NMR для 2-O-(2,4,6-тригидроксифенил)-6,6'-биэкола, соответственно, и значения, указанные для каждого пика, соответствуют значениям, указанным в химических формулах на Фиг. 3 и 4.
[Химическая формула 2] Диэкол
1) Молекулярная масса: 742,08
36
22
18
2) Молекулярная формула: СНО
1
3) Н NMR (400 МГц, MeOD) δ 6.16 (s, 1Н), 6.14 (s, 1Н), 6.10 (s, 2Н), 6.07 (d, J=2,9 Гц, 1H), 6.06 (d, J=2,9 Гц, 1H), 5.99 (d, J=2,8 Гц, 1H), 5.96 (d, J=2,8 Гц, 1H).
13
4) С NMR (125 и МГц, MeOD) δ 162.70, 160.95, 160.91, 158.63, 156.82, 155.34, 153.22, 148.17, 148.13, 147.97, 147.75, 145.11, 144.95, 144.22, 144.13, 139.46, 139.29, 127.22, 126.98, 126.42, 126.37, 125.66, 125.40, 125.34, 100.65, 100.51, 100.25, 100.14, 98.44, 96.99, 96.63, 96.55, 96.15.
1
13
На Фиг. 5 показан масс-спектр для диэкола. Кроме того, на Фиг. 6 и 7 показаны спектр H-NMR и спектр C-NMR для диэкола, соответственно, и значения, указанные для каждого пика, соответствуют значениям, указанным в химических формулах на Фиг. 6 и 7.
[Химическая формула 3] флорофукофуроэкол-А
1) Молекулярная масса: 602,07
30
18
14
2) Молекулярная формула: СНО
1
3) Н NMR (400 МГц, MeOD) δ 6.63 (s, 1Н), 6.40 (s, 1Н), 6.26 (s, 1Н), 5.96 (d, J=2,1 Гц, 2Н), 5.955.93 (t. подобный, 1Н), 5.92 (t, J=2,1 Гц, 1Н), 5.88(d, J=2,1 Гц, 2Н).
13
4) С NMR (125 МГц, MeOD) δ 161.87, 161.84, 160.18, 153.15, 151.73, 151.15, 148.31, 148.21, 145.97, 143.92, 138.37, 135.29, 128.04, 124.94, 124.64, 122.27, 105.29, 99.91, 99.28, 97.69, 97.57, 96.18, 95.35, 95.29.
1
13
На Фиг. 8 показан масс-спектр для флорофукофуроэкола-А (PFF-A). Кроме того, на Фиг. 9 и 10 показаны спектр H-NMR и спектр C-NMR для PFF-A, соответственно, и значения, указанные для каждого пика, соответствуют значениям, указанным в химических формулах на Фиг. 9 и 10.
[Химическая формула 4] 974-А
1) Молекулярная масса: 974,73
48
30
23
2) Молекулярная формула: СНО
1
3) Н NMR (400 МГц, MeOD) δ 6.63 (s, 1Н), 6.40 (s, 1Н), 6.25 (s, 1Н), 6.20 (d, J=2,3 Гц, 1Н), 6.18 (d, J=2,3 Гц, 1Н), 6.12 (d, J=2,3 Гц, 1Н, 6.04 (d, J=2,8 Гц, 1H), 5.92 (s, 2H), 5.925.91 (m, 1H), 5.90 (d, J=2,3 Гц, 1H), 5.87(d, J=2,1 Гц, 2H), 5.74 (d, J=2,8 Гц, 1H).
13
4) C NMR (125 МГц, MeOD) δ 163.16, 162.88, 161.83, 160.16, 159.64, 159.54, 159.14, 159.09, 156.55, 156.49, 156.48, 153.85, 153.35, 152.26, 151.92, 151.77, 151.18, 148.21, 147.78, 145.82, 144.31, 138.15, 135.16, 127.62, 124.93, 124.90, 124.25, 124.22, 122.27, 119.40, 118.15, 105.22, 105.21, 102.62, 102.44, 99.91, 99.24, 98.61, 98.32, 97.68, 97.57, 96.34, 96.11, 95.28, 95.20, 94.37, 94.18.
1
13
На Фиг. 11 показан масс-спектр для 974-А. Кроме того, на Фиг. 12 и 13 показаны спектр H-NMR спектр и спектр C-NMR для 974-А, соответственно, и значения, указанные для каждого пика, соответствуют значениям, указанным в химических формулах на Фиг. 12 и 13.
[Химическая формула 5] 974-В
1) Молекулярная масса: 947,73
48
30
23
2) Молекулярная формула: СНО
1
3) Н NMR (400 МГц, MeOD) δ 6.69 (s, 1Н), 6.38 (s, 1Н), 6.21 (d, J=2,3 Гц, 1Н), 6.19 (d, J=2.,3 Гц, 1Н), 6.17 (s, 1Н), 6.14 (d, J=2,3 Гц, 1Н), 6.05 (d, J=2,8 Гц, 1Н), 6.00 (s, 2Н), 5.91 (t, J=2,1 Гц, 1Н), 5.89 (d, J=2,3 Гц, 1Н), 5.87 (d, J=2,1 Гц, 2Н), 5.76 (d, J=2,8 Гц, 1Н).
13
4) С NMR (125 МГц, MeOD) δ 161.85, 160.16, 159.64, 159.53, 159.19, 158.97, 157.45, 156.81, 156.63, 156.47, 153.79, 152.65, 152.22, 151.95, 151.66, 150.89, 148.32, 147.03, 143.86, 142.83, 138.07, 137.95, 127.35, 125.23, 124.65, 124.01, 123.93, 122.11, 109.85, 106.33, 102.68, 102.49, 99.62, 99.47, 98.61, 98.32, 97.61, 97.56, 96.45, 95.28, 95.13, 94.23, 92.83.
1
13
На Фиг. 14 показан масс-спектр для 974-В. Кроме того, на Фиг. 15 и 16 показаны спектр H-NMR и спектр C-NMR для 974-В, соответственно, и значения, указанные для каждого пика, соответствуют значениям, указанным в химических формулах на Фиг. 15 и 16.
Пример 2: Выделение и инкубирование мезенхимальных стволовых клеток из человеческой пуповины
Пример 2-1: Выделение человеческой пуповины
Ткань пуповины отбирали непосредственно после рождения. Образец сначала промывали дочиста перед доставкой в лабораторию и затем немедленно переносили в стерильный стеклянный сосуд объемом 500 мл, содержащий среду F-12, к которой была добавлена среда для переноса (50 мкг/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (приобретенного в Invitrogen)). В лаборатории стволовые клетки экстрагировали в вытяжном шкафу класса 100 в стерильных условиях. Образец сначала переносили в контейнер из нержавеющей стали. Образец несколько раз промывали PBS и затем образцы ткани пуповины нарезали на куски длиной 2 см и переносили в чашку для культур клеток диаметром 10 см и дополнительно промывали и обрабатывали 70% этанолом для предотвращения инфекции, и затем несколько раз промывали PBS, добавляемым со смесью антибиотиков (50 мкг/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (приобретенных в Invitrogen) до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.
Пример 2-2: Выделение и инкубирование стволовых клеток из человеческой пуповины
Для того чтобы отделить вартонов студень (основание пуповины) от кровеносного сосуда пуповины и других внутренних элементов, сначала нарезали ткань пуповины. Вартонов студень, выделенный после удаления кровеносного сосуда, нарезали на небольшие кусочки размером (0,5 см × 0,5 см) для экстракции клеток. Эксплантацию осуществляли путем добавления кусочков вартонова студня пуповины в различные чашки для культуры ткани, которые имеют условия для культивирования клеток, подходящие для экстракции эпителиальных стволовых клеток или мезенхимальных стволовых клеток.
Для выделения/инкубирования мезенхимальных стволовых клеток эксплантированную ткань погружали в 5 мл DMEM (среда Игла, модифицированная Дульбекко) F-12 (Gibco) с добавлением 10% фетальной телячьей сывороткой (FBS, Hyclone), 10% FBS, 100 Е/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина и поддерживали при 37°С в клеточном инкубаторе с диоксидом углерода. Среду заменяли каждые 3 или 4 суток. Разрастание клеток контролировали при помощи оптического микроскопа. Разросшиеся клетки обрабатывали трипсином (0,125% трипсин/0,05% EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота)) для дополнительного разрастания и охлаждали (с использованием DMEM/10% FBS).
Среду заменяли каждые 3 или 4 суток. Разрастание клеток из эксплантированной ткани контролировали при помощи оптического микроскопа.
6
Для экстракции мезенхимальных стволовых клеток осадки клеток ресуспендировали и подсчитывали в среде DMEM F-12 (Gibco), 10% FBS, 100 Е/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина, и инокулировали на чашку для культивирования клеток размером 10 см с плотностью 1×10 клеток/чашку. Среду заменяли каждые 3 или 4 суток. Разрастание и образование колоний клеток контролировали при помощи оптического микроскопа. При приблизительно 90% количестве клеток (конфлюэнтность), клетки субкультивировали, как описано выше.
Экспериментальный пример 1: Индукция плюрипотентных стволовых клеток из мезенхимальных стволовых клеток
Экспериментальный пример 1-1: Получение плюрипотентных стволовых клеток из мезенхимальных стволовых клеток, полученных от человека, в зависимости от концентрации фракции флоротаннина.
2
2
3
3
2
3
2
2
2
4
Осуществляли эксперимент по измерению способности к индукции плюрипотентных стволовых клеток из мезенхимальных стволовых клеток, полученных из пуповины человека, в зависимости от концентрации фракции флоротаннина, приготовленной в примере 1-1. В контрольной группе DMEM F-12 (Gibco) использовали в качестве специализированной среды MSC, 10% FBS, 100 Е/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина использовали в качестве основной среды (Normal), а в экспериментальной группе использовали мезенхимальные стволовые клетки, полученные у человека, которые подвергали трем процедурам субкультивирования, и в среду добавляли фракции флоротаннина, имеющие концентрации 1 мкг/мл, 20 мкг/мл, 50 мкг/мл, 100 мкг/мл, 400 мкг/мл, 800 мкг/мл и 1000 мкг/мл и 0,1% об./об. энергетическую воду (очищенная деионизированная вода, содержащая SiO, AlO, TiO, FeO, CaO, NaO, KO, и LiO, STC). Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из человеческой пуповины, выделяли и промывали, и мононуклеарные клетки инокул провал и в 6-луночный планшет (чашку) в количестве 1×10 клеток поддерживали и инкубировали при 37°С и 5% CO.
Плюрипотентные стволовые клетки, индуцированные при помощи способа по настоящему изобретению, анализировали в отношении того, экспрессируют ли они стадиеспецифический эмбриональный антиген 4 (SSEA-4), щелочную фосфатазу (АР), ОСТ4 и SOX2 в качестве специфических для эмбриональных стволовых клеток белков путем использования антител к ним и способа иммунохимического окрашивания. Во время процесса окрашивания клетки сначала фиксировали путем использования 4% параформальдегида и промывали PBS, и блокировали 1% раствором BSA. Клетки обрабатывали первичными антителами против ОСТ4, SOX2 и SSEA-4, и реакцию осуществляли при 4°С в течение 18 часов, и затем промывали PBS, обрабатывали вторичными антителами с флуоресценцией (FITC (флуоресцеин изотиоцианат)) против первичных антител, и подвергали реакции при комнатной температуре в течение 1 часа. Клетки промывали PBS, и затем экспрессию анализировали путем использования конфокального микроскопа. BF обозначает светлое поле, и на втором изображении показан результат окрашивания для определения белковой экспрессии, а на третьем изображении показано объединение двух изображений (смотри Фиг. 19А, 19В, 20А и 20В). Окрашивание АР осуществляли с использованием проницаемого для клеток флуорогенного субстрата-красителя для щелочной фосфатазы, где флуорогенный краситель для АР разбавляли в культуральном растворе DMEM F-12, которым обрабатывали колонии, и затем подвергали реакции в течение от 20 до 30 мин, дважды промывали культуральным раствором DMEM F-12, и экспрессию анализировали путем использования конфокального микроскопа, и результат проиллюстрирован на Фиг. 17.
В результате в экспериментальной группе обнаружили, что только когда концентрация фракции флоротаннина составляла от 10 до 500 мкг/мл, образовывались колонии через 10 суток (см. Фиг. 17), и подтвердили, что только колонии, окрашиваемые ОСТ4, SOX2, SSEA-4 и АР в качестве маркеров, специфических для плюрипотентных стволовых клеток, представляют собой плюрипотентные стволовые клетки (см. Фиг. 18 и 19).
Экспериментальный пример 1-2: Получение плюрипотентных стволовых клеток из мезенхимальных стволовых клеток, полученных у человека, в зависимости от концентрации соединения во фракции флоротаннина
2
2
3
3
2
3
2
2
2
4
Осуществляли эксперимент по измерению способности индукции плюрипотентных стволовых клеток из мезенхимальных стволовых клеток, полученных от человека, в зависимости от концентрации соединения 1 среди соединений, выделенных в примере 1-2. В контрольной группе DMEM F-12 (Gibco) использовали в качестве специализированной среды MSC, 10% FBS, 100 Е/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина использовали в качестве основной среды (Normal), и в экспериментальной группе использовали мезенхимальные стволовые клетки, полученные из человеческой пуповины, которые подвергали трем процедурам субкультивирования, и в среду добавляли биэкольное соединение 1, представленное химической формулой 1, имеющее концентрации 1 мкг/мл, 20 мкг/мл, 50 мкг/мл, 100 мкг/мл, 400 мкг/мл, 800 мкг/мл и 1000 мкг/мл, и 0,1% об./об. энергетической воды (очищенной деионизированной воды, содержащей SiO, AlO, TiO, FeO, CaO, NaO, KO, и LiO, STC). Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из человеческой пуповины, выделяли и промывали, и мононуклеарные клетки инокулировали в 6-луночный планшет (чашку) в количестве 1×10 клеток, и поддерживали и инкубировали при 37°С и 5% CO.
Стволовые клетки с индуцированной плюрипотентностью, анализировали в отношении того, экспрессируют ли они стадиеспецифический эмбриональный антиген 4 (SSEA-4), щелочную фосфатазу, ОСТ4 и SOX2 в качестве специфических для эмбриональных стволовых клеток белков путем использования антител к ним и способа иммунохимического окрашивания. Во время процесса окрашивания клетки сначала фиксировали путем использования 4% параформальдегида и промывали PBS, и блокировали 1% раствором BSA. Клетки обрабатывали первичными антителами против ОСТ4, SOX2 и SSEA-4, и реакцию осуществляли при 4°С в течение 18 часов, и затем промывали PBS, обрабатывали вторичными антителами с флуоресценцией (FITC) против первичных антител, и подвергали реакции при комнатной температуре в течение 1 часа. Клетки промывали PBS, и затем экспрессию анализировали путем использования конфокального микроскопа, и результат проиллюстрирован на Фиг. 20. BF обозначает светлое поле, на втором изображении показан результат окрашивания для определения белковой экспрессии, а на третьем изображении показано объединение двух изображений (см. Фиг. 21А, 21В, 22А и 22В).
Окрашивание АР осуществляли с использованием проницаемого для клеток флуорогенного субстрата-красителя для щелочной фосфатазы, где флуорогенный краситель для АР разбавляли в культуральном растворе DMEM F-12, которым обрабатывали колонии, и затем подвергали реакции в течение от 20 до 30 мин, дважды промывали культуральным раствором DMEM F-12, и экспрессию анализировали путем использования конфокального микроскопа, и результат проиллюстрирован на Фиг. 22В.
В результате в экспериментальной группе обнаружили, что только когда концентрация биэкольного соединения 1, представленного химической формулой 1, составляла от 50 до 100 мкг/мл, образовывались колонии через 14 суток (см. Фиг. 20), и подтвердили, что только колонии, окрашиваемые ОСТ4, SOX2, SSEA-4 и АР в качестве маркеров, специфических для плюрипотентных стволовых клеток, представляют собой плюрипотентные стволовые клетки (см. Фиг. 21 и 22).