СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ИЛИ МИНИМИЗАЦИИ ЭПИТЕЛИАЛЬНО-МЕЗЕНХИМАЛЬНОГО ПЕРЕХОДА
METHODS AND COMPOSITIONS FOR PREVENTING OR MINIMIZING EPITHELIAL-MESENCHYMAL TRANSITION

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[001] Данное изобретение относится к способам предотвращения или минимизации эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) и соответствующим применениям для приготовления лекарственного средства для предотвращения или минимизации эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП). Более конкретно, данное изобретение относится к препаратам альбумина и их применению в различных медицинских целях. Препарат альбумина не содержит про-ЭМП агента или содержит низкую концентрацию про-ЭМП агента; или анти-ЭМП агент, при этом соотношение про-ЭМП агент: анти-ЭМП агент составляет от 7:3 до 0:10. Анти-ЭМП агент представляет собой жирную кислоту, содержащую алкильную цепь из 9-14 атомов углерода, или ее соль, или ее моноглицерид, или ее диглицерид, или ее триглицерид, или их комбинацию. Про-ЭМП агент представляет собой октановую кислоту (С8-жирная кислота) или соль октановой кислоты (соль С8 жирной кислоты).
[002] Данное изобретение также относится к способам и применениям анти-ЭМП агента при лечении различных заболеваний.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Альбумин
[003] Человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) является наиболее распространенным белком, присутствующим в плазме крови человека (концентрация 35-50 г/л). ЧСА является растворимым в плазме и существует в виде мономера белка (MW = 66500). Он вырабатывается в печени и выполняет несколько функций, большинство из которых связаны с транспортом небольших молекул. ЧСА преимущественно связывает гидрофобные карбоновые кислоты. Молекулы, которые связываются и транспортируются ЧСА, включают свободные жирные кислоты, гормоны, такие как гормон щитовидной железы, неконъюгированный билирубин и различные лекарственные средства. Таким образом, ЧСА может продлить время полужизни лекарственных средств, связывая их, что приводит к последующей задержке катаболических процессов. Благодаря относительно высокой концентрации ЧСА в большом круге кровообращения, он поддерживает коллоидно-осмотическое (онкотическое) давление в системе кровообращения. Онкотическое давление возникает прежде всего из-за неспособности макромолекулы ЧСА выйти через стенки кровеносных сосудов.
Термическая обработка альбумина
[004] Таким образом, ЧСА широко используется для лечения гиповолемии. Гиповолемия относится к состоянию, которое возникает в результате значительного уменьшения объема крови в результате потери плазмы крови. Несколько причин могут привести к гиповолемии, которые включают травму, ожоги или хирургическое вмешательство. Обычный ЧСА получают низкотемпературным фракционированием этанолом плазмы крови: методом Кона (разработанный во время Второй мировой войны) и его вариантами. Однако очищенный ЧСА может содержать вирусные патогены, что требует процесса термической обработки при 60°C в течение 10 часов или тепловой пастеризации. Альбумин подвержен денатурации и последующему образованию нерастворимых (нефункциональных) агрегатов во время термической обработки (например, стерилизации). Следовательно, чтобы минимизировать денатурацию ЧСА вследствие термической обработки, коммерческие составы готовят путем добавления среднецепочечной жирной кислоты, октановой кислоты и N-ацетилтриптофана перед пастеризацией. Было показано, что октаноат натрия защищает мономерный ЧСА от нагревания, а N-ацетилтриптофан защищает от окислительного стресса; M. Anraku et al., Biochim. Biophys. ACTA 1702(1), 9-17 (2004). Стабилизация альбумина с использованием среднецепочечных и длинноцепочечных жирных кислот также описана в Shrake et al., Biopolymers 81(4), 235-248 (2006), заявка на патент США 2015/0165000 и патент США 7351800. В частности, из-за своей доступности и большей растворимости по сравнению с длинноцепочечными жирными кислотами октаноат натрия является основным стабилизатором, используемым в настоящее время в качестве стабилизатора для коммерческих препаратов альбумина. Кроме того, после десятилетий применения было установлено, что ЧСА, стабилизированный октаноатом натрия и N-ацетилтриптофаном, является относительно безопасным для применения у субъектов со здоровой печенью, способных метаболизировать октаноат натрия и N-ацетилтриптофан.
Применение в терапевтических целях препаратов альбумина
[005] Препараты, содержащие альбумин, часто обеспечивают в терапевтических целях людям и животным. Например, препараты, содержащие альбумин, обычно вводят людям по одному или более из следующих показаний: гиповолемия, с шоком или без него; гипоальбуминемия, которая может возникнуть в результате недостаточной продукции альбумина (возникшей вследствие недоедания, ожогов, серьезных травм, врожденной анальбуминемии, заболеваний печени, инфекции, злокачественного новообразования или болезней эндокринной системы), чрезмерный катаболизм (возникший вследствие ожогов, серьезных травм, панкреатита, тиреотоксикоза, пузырчатки или нефропатии), потеря альбумина организмом (возникшая вследствие кровоизлияния, чрезмерной почечной экскреции, ожогового экссудата, экссудативной энтеропатии или эксфолиативных дерматитов) и/или перераспределение альбумина в организме (например, возникшее вследствие обширного хирургического вмешательства, цирроза с асцитом или различными воспалительными состояниями); до или во время операции в условиях искусственного кровообращения; и для лечения ожогов или цирроза печени.
[006] Ряд различных препаратов, содержащих альбумин (обычно в концентрации 5 или 25%) для терапевтического применения, имеются или были коммерчески доступны, включая, например:
• Albuminar-25 (Centeon/Aventis Behring) содержит стерильный водный раствор 25% альбумина, который получают из больших пулов венозной плазмы взрослого человека с помощью низкотемпературного контролируемого фракционирования в соответствии с методом Кона. Его стабилизируют 0,02 М N-ацетилтриптофана натрия и 0,02 М каприлата натрия и пастеризуют при 60°С в течение 10 часов.
• Buminate (Baxter Laboratories) представляет собой стерильный водный раствор альбумина, приготовленный из человеческой венозной плазмы с использованием метода холодного фракционирования этанолом по Кону, доведенный до физиологического pH с помощью бикарбоната натрия и/или гидроксида натрия и стабилизированный N-ацетилтриптофаном (0,016 M) и каприлатом натрия (0,016 M). Buminate 5% содержит 5% (масса/объем) альбумина и стабилизируется N-ацетилтриптофаном (0,004 М) и каприлатом натрия (0,004 М). Buminate 25% содержит 25% (масса/объем) альбумина и стабилизируется N-ацетилтриптофаном (0,02 М) и каприлатом натрия (0,02 М). Содержание ионов натрия составляет 145 ± 15 мэкв/л. Растворы не содержат консервантов и факторов свертывания крови, обнаруженных в свежей цельной крови или плазме.
• Plasbumin-25 (Grifols) представляет собой стерильный раствор альбумина 25% (масса/объем) в водном разбавителе. Препарат стабилизируют 0,02 М каприлата натрия и 0,02 М N-ацетилтриптофана и забуферивают карбонатом натрия. Содержание алюминия в продукте не более 200 мкг/л. Приблизительное содержание ионов натрия в продукте составляет 145 мэкв/л.
• Albutein 25% (Grifols) представляет собой стерильный водный раствор, содержащий 25% (масса/объем) человеческого альбумина, который получают методом холодного фракционирования этанолом из объединенной человеческой плазмы, полученной из венозной крови. Продукт стабилизируют 0,08 ммоль каприлата натрия и 0,08 ммоль N-ацетилтриптофана натрия на грамм альбумина. 0,08 ммоль каприлата натрия на грамм альбумина соответствует 0,02 М каприлата натрия в растворе 25% альбумина. 25% раствор Albutein содержит 130-160 миллиграмм-эквивалентов иона натрия на литр и имеет рН 6,9 ± 0,5. Продукт не содержит консервантов.
• Albumarc (Американский Красный Крест) представляет собой стерильный водный раствор 5% или 25% (масса/объем) альбумина, полученный из человеческой венозной плазмы с использованием метода холодного фракционирования этанолом по Кону, доведенный до физиологического рН с помощью бикарбоната натрия и/или гидроксида натрия и стабилизированный каприлатом натрия и N-ацетилтриптофаном натрия.
• Recombumin Prime (Albumedix/Novozymes) представляет собой рекомбинантный человеческий альбумин (rAlbumin), произведенный по стандартам ICH Q7. Источником Recombunin является культивирование рекомбинантных Saccharomyces cerevisiae (пекарских дрожжей), и он производится без использования материалов животного или человеческого происхождения. Recombumin Prime продается в стеклянном флаконе типа II объемом 50 мл, содержащем 20% (масса/объем) белкового раствора. Он стабилизируется 32 мМ каприлата натрия, 145 мМ хлорида натрия и 15 мг/л полисорбата 80.
• Recombumin 20% Alpha (Albumedix/Novozymes) представляет собой рекомбинантный человеческий альбумин (rAlbumin), произведенный по стандартам ICH Q7. Источником Recombunin является культивирование рекомбинантных Saccharomyces cerevisiae (пекарских дрожжей), и он производится без использования материалов животного или человеческого происхождения. Recombumin Alpha продается в стеклянном флаконе типа II объемом 50 мл, содержащем 20% (масса/объем) белкового раствора. Он стабилизируется 16 мМ каприлата натрия и 145 мМ хлорида натрия.
• Recombumin 10% Alpha (Albumedix/Novozymes) представляет собой рекомбинантный человеческий альбумин (rAlbumin), произведенный по стандартам ICH Q7. Источником Recombunin является культивирование рекомбинантных Saccharomyces cerevisiae (пекарских дрожжей), и он производится без использования материалов животного или человеческого происхождения. Recombumin Alpha продается в стеклянном флаконе типа II объемом 50 мл, содержащем 10% (масса/объем) белкового раствора. Он стабилизируется 8 мМ каприлата натрия и 145 мМ хлорида натрия.
• Albagen 5% (New Century Pharmaceuticals) представляет собой рекомбинантный человеческий альбумин (rAlbumin), произведенный с использованием Pichia pastoris. Получен из последовательности прототипного человеческого сывороточного альбумина с одной делецией на N-конце (Asp). Он обладает всеми биологическими свойствами человеческого сывороточного альбумина со сниженной аффинностью к никелю и меди. Стерильный 5% раствор в PBS, содержащий 4 мМ каприлата натрия и 4 мМ N-ацетилтриптофана.
• Kedbumin (Kedrion Biopharma) представляет собой стерильный водный раствор для однократного внутривенного введения дозы, содержащий 25%-ный альбумин, который получают путем холодного фракционирования этанолом из объединенной человеческой плазмы. Продукт стабилизируют добавлением 0,08 ммоль каприлата натрия и 0,08 ммоль N-ацетилтриптофана натрия на грамм альбумина. 0,08 ммоль каприлата натрия на грамм альбумина соответствует 0,02 М каприлата натрия в растворе 25% альбумина. Кроме того, каждый литр материала содержит 130-160 мг-экв ионов натрия и ≤200 мкг алюминия. Продукт не содержит консервантов.
[007] Таким образом, коммерческие препараты человеческого альбумина обычно стабилизируют с использованием октановой/каприловой кислоты (или октаноата/каприлата натрия).
Альбумин как средство доставки лекарств
[008] ЧСА считается потенциальным средством доставки липофильных противоопухолевых препаратов. Например, Abraxane™ (наночастицы альбумин-связанного паклитаксела) был одобрен в США для лечения метастатического рака молочной железы (2005 г.), немелкоклеточного рака легкого (2012 г.) и метастатического рака поджелудочной железы (2013 г.). В этом случае липофильный паклитаксел составлен в виде связанных с альбумином наночастиц (средний размер: 130 нМ) для использования в качестве инъецируемой суспензии после восстановления 0,9% хлоридом натрия; ЧСА предварительно обрабатывали октаноатом натрия (каприлатом натрия) и N-ацетил триптофаном (N-ацетилтриптофанатом натрия). Потенциальное применение ЧСА в качестве средства доставки для других плохо растворимых в воде лекарств от рака было задокументировано в литературе. Например, Q. Li et al., Int. J. Nanomedicine 6, 397-405 (2011) сообщают, что конъюгированные с фолатом наночастицы, нагруженные ЧСА-10-гидроксикампотецином, продемонстрировали свойство с замедленным высвобождением и эффективную систему доставки для поглощения лекарства раковыми клетками. Более поздняя публикация в том же журнале продемонстрировала, что конъюгированные с глицирризиновой кислотой наночастицы альбумина, нагруженные 10-гидроксикамптотецином, являются перспективным средством доставки для терапии, направленной на гепатоцеллюлярную карциному; Y. Zu et al., Int. J. Nanomedicine 8, 1207-1222 (2013). Наночастицы альбумина также были изучены в качестве средства доставки для доксорубицина, лекарства против рака, например, S. Abbasi et al. (J. Drug Delivery 2012: Article ID 686108, 8 стр.) сообщают, что модификация наночастиц ЧСА путем добавления покрытия из полиэтиленимина обеспечила катионную наночастицу альбумина, которая улучшает терапевтический индекс доксорубицина против клеток рака молочной железы MCF-7. Наблюдалось, что наночастицы с чистым положительным зарядом улучшали проникновение в раковые клетки (по сравнению с ЧСA), тем самым оказывая более сильное цитотоксическое действие на раковые клетки в течение более длительного периода времени.
[009] Существует постоянная потребность в стабильных и безопасных препаратах альбумина.
[0010] Данное описание относится к ряду документов, содержание которых включено в данный документ посредством ссылки во всей их полноте.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0011] Данное изобретение относится к следующим пунктам:
[0012] Пункт 1: Способ лечения заболевания или патологического состояния композицией, содержащей альбумин, с одновременным предотвращением или минимизацией эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), причем указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества указанной композиции, при этом указанная композиция не содержит октановую кислоту и/или соль октановой кислоты, или содержит сниженное количество октановой кислоты и/или соли октановой кислоты, причем указанное уменьшенное количество составляет менее 0,08 миллимоль на грамм альбумина.
[0013] Пункт 2: Способ по п. 1, отличающийся тем, что сниженное количество октановой кислоты и/или соли октановой кислоты составляет менее 0,05 ммоль на грамм альбумина.
[0014] Пункт 3: Способ по п. 1, отличающийся тем, что сниженное количество октановой кислоты и/или соли октановой кислоты составляет менее 0,005 ммоль на грамм альбумина.
[0015] Пункт 4: Способ по п. 1, отличающийся тем, что сниженное количество октановой кислоты и/или соли октановой кислоты составляет менее 0,0005 ммоль на грамм альбумина.
[0016] Пункт 5: Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная композиция по существу не содержит октановую кислоту или соль октановой кислоты.
[0017] Пункт 6: Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная композиция не содержит октановую кислоту или соль октановой кислоты.
[0018] Пункт 7: Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная композиция содержит количество жирной кислоты и/или ее соли, которое меньше или равно 0,08 миллимоль на грамм альбумина, при этом по меньшей мере 30% от указанного количества жирной кислоты и/или ее соли представляет собой С9-С14 жирную кислоту и/или ее соль.
[0019] Пункт 8: Способ по п. 7, отличающийся тем, что по меньшей мере 50% указанной жирной кислоты и/или ее соли представляет собой С9-С14 жирную кислоту и/или ее соль.
[0020] Пункт 9: Способ по п. 7, отличающийся тем, что по меньшей мере 70% указанной жирной кислоты и/или ее соли представляет собой С9-С14 жирную кислоту и/или ее соль.
[0021] Пункт 10: Способ по п. 7, отличающийся тем, что по меньшей мере 90% указанной жирной кислоты и/или ее соли представляет собой С9-С14 жирную кислоту и/или ее соль.
[0022] Пункт 11: Способ по п. 7, отличающийся тем, что по меньшей мере 95% указанной жирной кислоты и/или ее соли представляет собой С9-С14 жирную кислоту и/или ее соль.
[0023] Пункт 12: Способ по п. 7, отличающийся тем, что по меньшей мере 100% указанной жирной кислоты и/или ее соли представляет собой С9-С14 жирную кислоту и/или ее соль.
[0024] Пункт 13: Способ по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что указанная композиция представляет собой водный препарат альбумина, содержащий от около 1% до около 40% (масса/объем) альбумина.
[0025] Пункт 14: Способ по п. 13, отличающийся тем, что указанная композиция представляет собой водный препарат альбумина, содержащий от около 5% до около 25% (масса/объем) альбумина.
[0026] Пункт 15: Способ по п. 13, отличающийся тем, что указанная композиция представляет собой водный препарат альбумина, содержащий от около 20% до около 25% (масса/объем) альбумина.
[0027] Пункт 16: Способ по любому из пп. 7-12, отличающийся тем, что указанная C9-C14 жирная кислота и/или ее соль представляет собой C9-C12 жирную кислоту и/или ее соль.
[0028] Пункт 17: Способ по п. 16, отличающийся тем, что указанная С9-С12 жирная кислота и/или ее соль представляет собой декановую кислоту или соль декановой кислоты.
[0029] Пункт 18: Способ по любому из пп. 7-12 и 16-17, отличающийся тем, что соль представляет собой соль натрия, калия, лития, аммония, кальция, магния, марганца, цинка, железа или меди.
[0030] Пункт 19: Способ по п. 18, отличающийся тем, что соль представляет собой соль натрия или калия.
[0031] Пункт 20: Способ по п. 18, отличающийся тем, что соль представляет собой соль натрия.
[0032] Пункт 21: Способ по любому из пп. 1-20, отличающийся тем, что указанный альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин (ЧСА).
[0033] Пункт 22: Способ по любому из пп. 1-21, отличающийся тем, что указанная композиция находится в жидкой форме и дополнительно содержит один или более фармацевтически приемлемых регуляторов осмоляльности.
[0034] Пункт 23: Способ по п. 22, отличающийся тем, что указанные один или более регуляторов осмоляльности содержат натриевую соль, калиевую соль или обе.
[0035] Пункт 24: Способ по любому из пп. 1-23, отличающийся тем, что указанная композиция находится в жидкой форме и дополнительно содержит по меньшей мере один фармацевтически приемлемый антиоксидант или стабилизатор.
[0036] Пункт 25: Способ по п. 24, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один фармацевтически приемлемый антиоксидант или стабилизатор представляет собой антиоксидантную аминокислоту или ее производное.
[0037] Пункт 26: Способ по п. 24, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один фармацевтически приемлемый антиоксидант или стабилизатор представляет собой N-ацилметионин или N-ацилтриптофанат.
[0038] Пункт 27: Способ по любому из пп. 1-21, отличающийся тем, что композиция находится в форме наночастиц.
[0039] Пункт 28: Способ по любому из пп. 1-27, отличающийся тем, что композиция дополнительно содержит фармацевтически активный агент.
[0040] Пункт 29: Способ по п. 27, отличающийся тем, что композиция дополнительно содержит фармацевтически активный агент; и при этом указанный фармацевтически активный агент инкапсулирован в наночастицах.
[0041] Пункт 30: Способ по п. 28 или п. 29, отличающийся тем, что указанный фармацевтически активный агент представляет собой противораковое лекарственное средство.
[0042] Пункт 31: Способ по п. 30, отличающийся тем, что указанное противораковое лекарственное средство представляет собой таксан, камптотецин, иринотекан, гемцитабин, цитоксан или доксорубицин.
[0043] Пункт 32: Способ по п. 31, отличающийся тем, что указанный таксан представляет собой паклитаксел или доцетаксел.
[0044] Пункт 33: Способ по любому из пп. 1-30, отличающийся тем, что указанное заболевание или патологическое состояние представляет собой кровотечение, гиповолемический шок, ожоги, острую печеночную недостаточность, гипоальбуминемию, синдром острой дыхательной недостаточности у взрослых, цирроз, гемолитическую болезнь новорожденных, операцию в условиях искусственного кровообращения, нефроз или рак.
[0045] Пункт 34: Способ по любому одному из пп. 30-32, отличающийся тем, что указанное заболевание или патологическое состояние представляет собой рак.
[0046] Пункт 35: Применение композиции, содержащей альбумин, для лечения заболевания или патологического состояния с одновременным предотвращением или минимизацией эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), причем указанная композиция не содержит октановой кислоты и/или соли октановой кислоты или содержит уменьшенное количество октановой кислоты и/или соли октановой кислоты, при этом указанное уменьшенное количество составляет менее 0,08 миллимоль на грамм альбумина.
[0047] Пункт 36: Применение по п. 35, отличающееся тем, что указанная композиция содержит некоторое количество жирной кислоты и/или ее соли, причем указанное количество равно или меньше 0,08 миллимоль на грамм альбумина, при этом по меньшей мере 30% от указанного количества жирной кислоты и/или ее соли представляет собой С9-С14 жирную кислоту и/или ее соль.
[0048] Пункт 37: Применение композиции, содержащей альбумин, для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания или патологического состояния с одновременным предотвращением или минимизацией эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), причем указанная композиция не содержит октановой кислоты и/или соли октановой кислоты или содержит уменьшенное количество октановой кислоты и/или соли октановой кислоты, при этом указанное уменьшенное количество составляет менее 0,08 миллимоль на грамм альбумина.
[0049] Пункт 38: Применение по п. 37, отличающееся тем, что указанная композиция содержит некоторое количество жирной кислоты и/или ее соли, при этом по меньшей мере 30% от указанного количества жирной кислоты и/или ее соли представляет собой С9-С14 жирную кислоту и/или ее соль.
[0050] Пункт 39: Композиция, содержащая альбумин, для применения в лечении заболевания или патологического состояния с одновременным предотвращением или минимизацией эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), причем указанная композиция не содержит октановой кислоты и/или соли октановой кислоты или содержит уменьшенное количество октановой кислоты и/или соли октановой кислоты, при этом указанное уменьшенное количество составляет менее 0,08 миллимоль на грамм альбумина.
[0051] Пункт 40: Композиция по п. 39, содержащая некоторое количество жирной кислоты и/или ее соли, которое равно или меньше 0,08 миллимоль на грамм альбумина, причем по меньшей мере 30% указанного количества жирной кислоты и/или ее соли составляет C9-С14 жирная кислота и/или ее соль.
[0052] Пункт 41: Композиция, содержащая альбумин, и
• некоторое количество октановой кислоты и/или соли октановой кислоты, которое составляет менее 0,08 миллимоль на грамм альбумина; и/или
• некоторое количество жирной кислоты и/или ее соли, при этом по меньшей мере 30% от указанного количества жирной кислоты и/или ее соли представляет собой С9-С14 жирную кислоту и/или ее соль.
[0053] Пункт 42: Композиция по п. 41, отличающаяся тем, что количество октановой кислоты и/или соли октановой кислоты составляет менее 0,05 миллимоль на грамм альбумина.
[0054] Пункт 43: Композиция по п. 42, отличающаяся тем, что количество октановой кислоты и/или соли октановой кислоты составляет менее 0,005 миллимоль на грамм альбумина.
[0055] Пункт 44: Композиция по п. 43, отличающаяся тем, что количество октановой кислоты и/или соли октановой кислоты составляет менее 0,0005 миллимоль на грамм альбумина.
[0056] Пункт 45: Композиция по любому из пп. 41-44, отличающаяся тем, что концентрация альбумина составляет от 1% до 40%.
[0057] Пункт 46: Композиция по п. 45, отличающаяся тем, что концентрация альбумина составляет от 5% до 25%.
[0058] Пункт 47: Композиция по любому из пп. 41-46, дополнительно содержащая фармацевтически активный агент.
[0059] Пункт 48: Композиция по п. 47, отличающаяся тем, что фармацевтически активный агент представляет собой противораковое лекарственное средство.
[0060] Пункт 49: Композиция по п. 48, отличающаяся тем, что указанное противораковое лекарственное средство представляет собой таксан, камптотецин, иринотекан, гемцитабин, цитоксан или доксорубицин.
[0061] Пункт 50: Композиция по п. 49, отличающаяся тем, что указанный таксан представляет собой паклитаксел или доцетаксел.
[0062] Пункт 51: Композиция по любому из пп. 48-50, отличающаяся тем, что композиция по существу не содержит октановую кислоту и/или соль октановой кислоты.
[0063] Пункт 52: Композиция по любому из пп. 41-51 для применения при лечении заболевания или патологического состояния с одновременным предотвращением или минимизацией эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП).
[0064] Пункт 53: Композиция п. 52, отличающаяся тем, что указанное заболевание или патологическое состояние представляет собой кровотечение, гиповолемический шок, ожоги, острую печеночную недостаточность, гипоальбуминемию, синдром острой дыхательной недостаточности у взрослых, цирроз печени, гемолитическую болезнь новорожденных, операцию в условиях искусственного кровообращения или нефроз.
[0065] Пункт 54: Композиция по любому из пп. 48-50 для применения при лечении заболевания или патологического состояния с одновременным предотвращением или минимизацией эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), отличающаяся тем, что указанное заболевание или патологическое состояние представляет собой рак.
[0066] Пункт 55: Способ предотвращения, минимизации или уменьшения эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) у субъекта, нуждающегося в этом, причем указанный способ включает введение субъекту композиции, содержащей эффективное количество С9-С14 жирной кислоты и/или ее соли, и/или триглицерида С9-С14 жирной кислоты.
[0067] Пункт 56: Способ по п. 55, отличающийся тем, что указанная C9-C14 жирная кислота и/или ее соль, и/или триглицерид C9-C14 жирной кислоты представляет собой C9-C12 жирную кислоту и/или ее соль, и/или триглицерид C9-C12 жирной кислоты.
[0068] Пункт 57: Способ по п. 55, отличающийся тем, что указанная C9-C14 жирная кислота и/или ее соль, и/или триглицерид C9-C14 жирной кислоты представляет собой C10-C12 жирную кислоту и/или ее соль, и/или триглицерид C10-C12 жирной кислоты.
[0069] Пункт 58: Способ по п. 55, отличающийся тем, что указанная С9-С14 жирная кислота и/или ее соль, и/или триглицерид С9-С14 жирной кислоты представляет собой деканоат.
[0070] Пункт 59: Способ по п. 55, отличающийся тем, что указанная С9-С14 жирная кислота и/или ее соль, и/или триглицерид С9-С14 жирной кислоты представляет собой деканоат натрия.
[0071] Пункт 60: Способ по п. 55, отличающийся тем, что указанная С9-С14 жирная кислота и/или ее соль, и/или триглицерид С9-С14 жирной кислоты представляет собой декановую кислоту.
[0072] Пункт 61: Способ по п. 55, отличающийся тем, что указанная С9-С14 жирная кислота и/или ее соль, и/или триглицерид С9-С14 жирной кислоты представляет собой глицерилтридеканоат.
[0073] Пункт 62: Способ по любому из пп. 55-58, отличающийся тем, что указанная композиция содержит соль жирной кислоты, при этом соль представляет собой соль натрия, калия, лития, аммония, кальция, магния, марганца, цинка, железа или меди.
[0074] Пункт 63: Способ по п. 62, отличающийся тем, что указанная соль представляет собой соль натрия или калия.
[0075] Пункт 64: Способ по п. 62, отличающийся тем, что указанная соль представляет собой соль натрия.
[0076] Пункт 65: Способ по любому из пп. 55-64, отличающийся тем, что указанное эффективное количество составляет от 5 мг/кг до 300 мг/кг на дозу для перорального или местного применения.
[0077] Пункт 66: Способ по п. 65, отличающийся тем, что указанное эффективное количество составляет от 10 мг/кг до 100 мг/кг на дозу для перорального или местного применения.
[0078] Пункт 67: Способ по любому из пп. 55-63, отличающийся тем, что указанное эффективное количество составляет от 0,5 до 100 мг/кг на дозу при внутривенном, внутрибрюшинном, ректальном, внутримышечном или подкожном введении.
[0079] Пункт 68: Способ по п. 67, отличающийся тем, что указанное эффективное количество составляет от 0,5 до 4 мг/кг на дозу при внутривенном, внутрибрюшинном, ректальном, внутримышечном или подкожном введении.
[0080] Пункт 69: Способ по любому из пп. 55-64, отличающийся тем, что указанную композицию применяют местно.
[0081] Пункт 70: Способ по п. 69, отличающийся тем, что указанный субъект страдает от ожогов или рубцов.
[0082] Пункт 71: Способ по любому из пп. 55-64 и 67-68, отличающийся тем, что указанное заболевание или патологическое состояние представляет собой кровотечение, гиповолемический шок, ожоги, острую печеночную недостаточность, гипоальбуминемию, синдром острой дыхательной недостаточности у взрослых, цирроз печени, гемолитическую болезнь новорожденных, операцию в условиях искусственного кровообращения или нефроз.
[0083] Пункт 72: Применение С9-С14 жирной кислоты и/или ее соли, и/или триглицерида С9-С14 жирной кислоты для предотвращения, минимизации или уменьшения эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) у субъекта.
[0084] Пункт 73: Применение С9-С14 жирной кислоты и/или ее соли, и/или триглицерида С9-С14 жирной кислоты, для приготовления лекарственного средства для предотвращения, минимизации или уменьшения эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) у субъекта.
[0085] Пункт 74: Применение по п. 72 или п. 73, отличающееся тем, что указанный способ включает введение субъекту эффективного количества декановой кислоты и/или соли декановой кислоты.
[0086] Пункт 75: Применение по п. 72 или п. 73, отличающееся тем, что указанный способ включает введение субъекту эффективного количества глицерилтридеканоата.
[0087] Пункт 76: Применение композиции альбумина для приготовления лекарственного средства для лечения заболевания или патологического состояния у субъекта, нуждающегося в получении композиции альбумина для лечения указанного заболевания или патологического состояния, причем композиция альбумина ингибирует или уменьшает эпителиальное мезенхимальный переход (ЭМП) и
- не содержит про-ЭМП агент или содержит низкую концентрацию про-ЭМП агента; и/или
- содержание про-ЭМП агента и анти-ЭМП агента в соотношении про-ЭМП агент: анти-ЭМП агент, которое составляет от 7: 3 до 0: 10;
при этом:
- про-ЭМП агент представляет собой октановую кислоту, соль октановой кислоты или их комбинацию;
- анти-ЭМП агент представляет собой C9-C14 жирную кислоту, соль C9-C14 жирной кислоты, моноглицерид C9-C14 жирной кислоты, диглицерид C9-C14 жирной кислоты, триглицерид C9-C14 жирной кислоты или их комбинацию; и
- указанная низкая концентрация про-ЭМП агента составляет менее чем 0,08 миллимоль на грамм альбумина;
- при условии, что, когда про-ЭМП агент и анти-ЭМП агент представляют собой жирные кислоты, они являются отдельными жирными кислотами или частью диглицерида или триглицерида.
[0088] Пункт 77: Применение по п. 76, отличающееся тем, что низкая концентрация про-ЭМП агента составляет 0,04 ммоль на грамм альбумина или менее.
[0089] Пункт 78: Применение по п. 76, отличающееся тем, что низкая концентрация про-ЭМП агента составляет 0,007% (масса/масса) или менее.
[0090] Пункт 79: Применение по п. 76, отличающееся тем, что соотношение про-ЭМП агент: анти-ЭМП агент составляет от 5: 5 до 0: 10.
[0091] Пункт 80: Применение по любому из пп. 76-79, отличающееся тем, что анти-ЭМП агент представляет собой C9-C12 жирную кислоту, соль C9-C12 жирной кислоты, моноглицерид C9-C12 жирной кислоты, диглицерид C9-C12 жирной кислоты, триглицерид С9-С12 жирной кислоты или их комбинацию.
[0092] Пункт 81: Применение по п. 80, отличающееся тем, что анти-ЭМП агент представляет собой C10-C12 жирную кислоту, соль C10-C12 жирной кислоты, моноглицерид C10-C12 жирной кислоты, диглицерид C10-C12 жирной кислоты, триглицерид С10-С12 жирной кислоты или их комбинацию.
[0093] Пункт 82: Применение по п. 81, отличающееся тем, что анти-ЭМП агент представляет собой C10 жирную кислоту, соль C10 жирной кислоты или их комбинацию.
[0094] Пункт 83: Применение по любому из пп. 76-82, отличающееся тем, что указанная композиция представляет собой водный препарат альбумина, содержащий от около 1% до около 40% (масса/объем) альбумина.
[0095] Пункт 84: Применение по любому из пп. 76-83, отличающееся тем, что соль представляет собой соль натрия, калия, лития, аммония, кальция, магния, марганца, цинка, железа, меди или их комбинацию.
[0096] Пункт 85: Применение по п. 84, отличающееся тем, что соль представляет собой соль натрия.
[0097] Пункт 86: Применение по любому из пп. 76-85, отличающееся тем, что композиция дополнительно содержит фармацевтически активный агент.
[0098] Пункт 87: Применение по п. 86, отличающееся тем, что указанный активный агент представляет собой противораковое лекарственное средство, и лекарственное средство предназначено для лечения рака.
[0099] Пункт 88: Применение по п. 87, отличающееся тем, что противораковое лекарственное средство представляет собой таксан.
[00100] Пункт 89: Применение по п. 88, отличающееся тем, что таксан представляет собой паклитаксел или доцетаксел.
[00101] Пункт 90: Применение по любому из пп. 76-86, отличающееся тем, что композиция альбумина рекомендована врачом для лечения указанного заболевания или патологического состояния.
[00102] Пункт 91: Применение по любому из пп. 76-90, отличающееся тем, что лекарственное средство предназначено для лечения заболевания или патологического состояния, которое представляет собой кровоизлияние, гиповолемию, ожог, острую печеночную недостаточность, нарушение функции печени, гипоальбуминемию, синдром острой дыхательной недостаточности у взрослых, цирроз печени, гемолитическую болезнь новорожденных, операцию в условиях искусственного кровообращения, нефроз, рак, гепаторенальный синдром, сепсис, перфузию органов или реперфузию органов.
[00103] Пункт 92: Применение композиции для приготовления лекарственного средства для ингибирования или уменьшения эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) у субъекта, причем композиция
- не содержит про-ЭМП агент или содержит низкую концентрацию про-ЭМП агента; и/или
- содержание про-ЭМП агента и анти-ЭМП агента в соотношении про-ЭМП агент: анти-ЭМП агент, которое составляет от 7: 3 до 0: 10;
при этом:
- про-ЭМП агент представляет собой октановую кислоту, соль октановой кислоты или их комбинацию;
- анти-ЭМП агент представляет собой C9-C14 жирную кислоту, соль C9-C14 жирной кислоты, моноглицерид C9-C14 жирной кислоты, диглицерид C9-C14 жирной кислоты, триглицерид C9-C14 жирной кислоты или их комбинацию; и
- указанная низкая концентрация про-ЭМП агента составляет менее 0,02 М;
- при условии, что, когда про-ЭМП агент и анти-ЭМП агент представляют собой жирные кислоты, они являются отдельными жирными кислотами или частью диглицерида или триглицерида.
[00104] Пункт 93: Применение по п. 92, отличающееся тем, что низкая концентрация про-ЭМП агента составляет 0,01 М или менее.
[00105] Пункт 94: Применение по п. 92, отличающееся тем, что низкая концентрация про-ЭМП агента составляет 0,001 М или менее.
[00106] Пункт 95: Применение по п. 92, отличающееся тем, что соотношение про-ЭМП агент: анти-ЭМП агент составляет от 5: 5 до 0: 10.
[00107] Пункт 96: Применение по п. 95, отличающееся тем, что соотношение про-ЭМП агент: анти-ЭМП агент составляет около 0: 10.
[00108] Пункт 97: Применение по любому из пп. 92-96, отличающееся тем, что анти-ЭМП агент представляет собой C9-C12 жирную кислоту, соль C9-C12 жирной кислоты, моноглицерид C9-C12 жирной кислоты, диглицерид C9-C12 жирной кислоты, триглицерид С9-С12 жирной кислоты или их комбинацию.
[00109] Пункт 98: Применение по п. 97, отличающееся тем, что анти-ЭМП агент представляет собой C10-C12 жирную кислоту, соль C10-C12 жирной кислоты, моноглицерид C10-C12 жирной кислоты, диглицерид C10-C12 жирной кислоты, триглицерид С10-С12 жирной кислоты или их комбинацию.
[00110] Пункт 99: Применение по п. 98, отличающееся тем, что анти-ЭМП агент представляет собой C10 жирную кислоту, соль C10 жирной кислоты, моноглицерид C10 жирной кислоты, диглицерид C10 жирной кислоты, триглицерид C10 жирной кислоты или их комбинацию.
[00111] Пункт 100: Применение по любому из пп. 92-99, отличающееся тем, что соль представляет собой соль натрия, калия, лития, аммония, кальция, магния, марганца, цинка, железа, меди или их комбинацию.
[00112] Пункт 101: Применение по п. 100, отличающееся тем, что соль представляет собой соль натрия.
[00113] Пункт 102: Применение по любому из пп. 92-101, отличающееся тем, что композиция дополнительно содержит фармацевтически активный агент.
[00114] Пункт 103: Применение по п. 102, отличающееся тем, что указанный активный агент представляет собой противораковое лекарственное средство, и лекарственное средство предназначено для лечения рака.
[00115] Пункт 104: Применение по п. 103, отличающееся тем, что противораковое лекарственное средство представляет собой таксан.
[00116] Пункт 105: Применение по п. 104, отличающееся тем, что таксан представляет собой паклитаксел или доцетаксел.
[00117] Пункт 106: Применение по любому из пп. 92-102, отличающееся тем, что лекарственное средство предназначено для лечения заболевания или патологического состояния, которое представляет собой кровоизлияние, гиповолемию, ожог, острую печеночную недостаточность, нарушение функции печени, гипоальбуминемию, синдром острой дыхательной недостаточности у взрослых, цирроз печени, гемолитическую болезнь новорожденных, операцию в условиях искусственного кровообращения, нефроз, рак, гепаторенальный синдром, сепсис, перфузию органов или реперфузию органов, образование рубцов, псориаз или экзему.
[00118] Пункт 107: Применение по любому из пп. 92-102, отличающееся тем, что общая концентрация про-ЭМП агента и анти-ЭМП агента составляет от 5 мг/кг до 300 мг/кг для субъекта на дозу при пероральном или местном применении.
[00119] Пункт 108: Применение по п. 107, отличающееся тем, что указанная общая концентрация составляет от 10 мг/кг до 100 мг/кг на дозу.
[00120] Пункт 109: Применение по любому из пп. 92-102, отличающееся тем, что указанная общая концентрация составляет от 0,5 мг/кг до 100 мг/кг для субъекта на дозу для внутривенного, внутрибрюшинного, ректального, внутримышечного или подкожного введения.
[00121] Пункт 110: Применение по п. 109, отличающееся тем, что указанная общая концентрация составляет от 0,5 мг/кг до 4 мг/кг на дозу.
[00122] Пункт 111: Применение по любому из пп. 92-102, 107 и 108, отличающееся тем, что указанную композицию применяют местно, и лекарственное средство предназначено для лечения ожогов, для предотвращения образования рубцов или для лечения рубцов, псориаза или экземы.
[00123] Пункт 112: Способ лечения заболевания или патологического состояния у субъекта, нуждающегося в получении композиции альбумина для лечения указанного заболевания или патологического состояния, включающий введение композиции альбумина, которая ингибирует или уменьшает стимуляцию эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) и которая
- не содержит про-ЭМП агент или содержит низкую концентрацию про-ЭМП агента; или
- содержание про-ЭМП агента и анти-ЭМП агента в соотношении про-ЭМП агент: анти-ЭМП агент, которое составляет от 7: 3 до 0: 10;
при этом:
- про-ЭМП агент представляет собой октановую кислоту, соль октановой кислоты или их комбинацию;
- анти-ЭМП агент представляет собой C9-C14 жирную кислоту, соль C9-C14 жирной кислоты, моноглицерид C9-C14 жирной кислоты, диглицерид C9-C14 жирной кислоты, триглицерид C9-C14 жирной кислоты или их комбинацию; и
- указанная низкая концентрация про-ЭМП агента составляет менее чем 0,08 миллимоль на грамм альбумина;
- при условии, что, когда про-ЭМП агент и анти-ЭМП агент представляют собой жирные кислоты, они являются отдельными жирными кислотами или частью диглицерида или триглицерида.
[00124] Пункт 113: Способ ингибирования или уменьшения эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) у субъекта, включающий введение композиции, которая
- не содержит про-ЭМП агент или содержит низкую концентрацию про-ЭМП агента; и/или
- содержание про-ЭМП агента и анти-ЭМП агента в соотношении про-ЭМП агент: анти-ЭМП агент, которое составляет от 7: 3 до 0: 10;
при этом:
- про-ЭМП агент представляет собой октановую кислоту, соль октановой кислоты или их комбинацию;
- анти-ЭМП агент представляет собой C9-C14 жирную кислоту, соль C9-C14 жирной кислоты, моноглицерид C9-C14 жирной кислоты, диглицерид C9-C14 жирной кислоты, триглицерид C9-C14 жирной кислоты или их комбинацию; и
- указанная низкая концентрация про-ЭМП агента составляет менее 0,02 М;
- при условии, что, когда про-ЭМП агент и анти-ЭМП агент представляют собой жирные кислоты, они являются отдельными жирными кислотами или частью диглицерида или триглицерида.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[00125] На прилагаемых графических материалах:
[00126] На Фиг. 1 показаны хроматограммы ВЭЖХ: раствор 40 мМ каприлата натрия (верхняя панель), раствор 40 мМ деканоата натрия (средняя панель) и композиция 5% альбумина после замены октаноата натрия деканоатом натрия, как описано в Примере 1 (нижняя панель).
[00127] На Фиг. 2 показана продукция маркера ЭМП (коллагена) в анализе in vitro, описанном в Примере 4, для композиций, содержащих соотношение октаноат натрия: деканоат натрия 100: 0, 95: 5, 70: 30, 50: 50, 30: 70, 5: 95 или 0: 100, с альбумином и без альбумина.
[00128] На Фиг. 3 показана аминокислотная последовательность нативного белка-предшественника ЧСА (SEQ ID NO: 1, эталонная последовательность NCBI: NP 000468.1, UniProtKB: P02768).
[00129] На Фиг. 4 показано влияние октаноата натрия и деканоата натрия в присутствии и в отсутствии альбумина на экспрессию мРНК коллагена 1a1 (маркер ЭМП) в ТФР-β-индуцированных микрососудистых эндотелиальных клетках человека (HMEC).
[00130] На Фиг. 5 показано влияние октаноата натрия и деканоата натрия в присутствии и в отсутствии альбумина на экспрессию мРНК коллагена 1a1 (маркер ЭМП) в индуцированной ТФР-β клеточной линии гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2.
[00131] На Фиг. 6 показано влияние октаноата натрия и деканоата натрия в присутствии и в отсутствии альбумина на экспрессию мРНК коллагена 1a1 (маркер ЭМП) в индуцированном ТФР-β эпителиоците легкого человека A549.
[00132] На Фиг. 7 представлены снимки анализа методом зарастания царапины с использованием обработанной митомицином ЭФР-индуцированной клетки PC-3, демонстрирующие влияние октаноата натрия и деканоата натрия в присутствии и в отсутствии альбумина на миграцию клеток.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[00133] Данное изобретение относится к композициям альбумина, не содержащим
• жирную кислоту или ее соль, или
• про-ЭМП агент, или
• содержащим низкую концентрацию про-ЭМП агента, и/или
• соотношение про-ЭМП агент: анти-ЭМП агент, которое составляет от 7: 3 до 0: 10,
при этом указанный про-ЭМП агент представляет собой октановую кислоту, соль октановой кислоты или их комбинацию; и причем указанный анти-ЭМП агент представляет собой жирную кислоту, имеющую алкильную цепь с 9, 10, 11, 12, 13 или 14 атомами углерода (т.е. C9-C14 жирная кислота), соль C9-C14 жирной кислоты, моноглицерид C9-C14 жирной кислоты, диглицерид C9 -C14 жирной кислоты, триглицерид C9 -C14 жирной кислоты или их комбинацию.
[00134] Данное изобретение основано на открытии того, что октановая кислота и соль октановой кислоты являются про-ЭМП, то есть октановая кислота и соль октановой кислоты стимулируют эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП). Стимуляция ЭМП является вредной при многих патологических состояниях, когда врачи назначают прием препаратов альбумина, таких как тяжелые ожоги, поскольку стимуляция ЭМП способствует чрезмерному образованию рубцов. Другие терапевтические показания, где стимуляция ЭМП является вредной, описаны в данном документе ниже.
[00135] Авторы изобретения также обнаружили, что другие жирные кислоты, их соли и их триглицериды являются анти-ЭМП. Указанный анти-ЭМП агент представляет собой C9 жирную кислоту, такую как нонановая кислота или пеларгоновая кислота, соль жирной C9 кислоты, такую как соль нонановой кислоты, моноглицерид C9 жирной кислоты, диглицерид C9 жирной кислоты, триглицерид C9 жирной кислоты, такой как триглицерид октановой кислоты или глицерилтринонаноат, C10 жирную кислоту, такую как декановая кислота или каприновая кислота, соль C10 жирной кислоты, такую как соль декановой кислоты или соль каприновой кислоты, моноглицерид C10 жирной кислоты, диглицерид C10 жирной кислоты, триглицерид C10 жирной кислоты, такой как триглицерид декановой кислоты или глицерилтридеканоат или глицерилтрикаприн), C11 жирную кислоту, такую как ундекановая кислота или ундециловая кислота, соль C11 жирной кислоты, такую как соль ундекановой кислоты, моноглицерид C11 жирной кислоты, диглицерид C11 жирной кислоты, триглицерид C11 жирной кислоты, такой как триглицерид ундекановой кислоты или глицерилтриундеканоат, C12 жирную кислоту, такую как додекановая кислота или лауриновая кислота, соль C12 жирной кислоты, такую как соль додекановой кислоты, моноглицерид C12 жирной кислоты, диглицерид C12 жирной кислоты, триглицерид C12 жирной кислоты, такой как триглицерид додекановой кислоты или трилаурин глицерин, C13 жирную кислоту, такую как тридекановая кислота или тридециловая кислота, соль C13 жирной кислоты, такая как соль тридекановой кислоты, моноглицерид C13 жирной кислоты, диглицерид C13 жирной кислоты, триглицерид C13 жирной кислоты, такой как триглицерид тридекановой кислоты или глицерилтридодеканоат, C14 жирную кислоту, такую как тетрадекановую кислоту, соль C14 жирной кислоты, такая как тетрадекановая соль, моноглицерид жирной кислоты C14, диглицерид жирной кислоты C14, триглицерид жирной кислоты C14, такой как триглицерид тетрадекановой кислоты или глицерилтритетрадеканоат или глицерилтримиристин или их комбинацию. Влияние триглицеридов С9, С10, С11, С12, С13 и С14 жирных кислот было проверено, и, поскольку триглицерид расщепляется на одну молекулу глицерина и три жирные кислоты после его прохождения в кишечнике, можно ожидать, что соответствующий моноглицерид и диглицерид будут обеспечивать одинаковую эффективность, как только количество моноглицерида или диглицерида будет отрегулировано таким образом, чтобы высвобождать такое же количество жирных кислот, что и соответствующий триглицерид. Анти-ЭМП эффект триглицеридов, диглицеридов и моноглицеридов подтверждается активностью C9-C14 жирной кислоты, которая высвобождается in vivo.
[00136] Когда в препарате альбумина присутствует анти-ЭМП агент, его концентрация представлена соотношением про-ЭМП: анти-ЭМП агент, которое составляет от 7: 3 до 0: 10, включая 7: 3, 6: 4, 5: 5, 4: 6; 3: 7, 2: 8, 1: 9 и 0:10. В одном варианте осуществления содержание про-ЭМП агента и анти-ЭМП агента в соотношении про-ЭМП агент: анти-ЭМП агент, которое составляет от 7: 3 до 0: 10, представлено триглицеридом, состоящим из двух октановых кислот и одной C9-C14 жирной кислотой (т.е. соотношение 2: 1, как показано в Примере 4) или одной октановой кислотой и двух C9-C14 жирных кислот (то есть соотношение 1: 2) или диглицеридом, состоящим из одной октановой кислоты и одной С9-С14 жирной кислоты (то есть соотношение 5: 5). В одном варианте осуществления содержание про-ЭМП агента в композиции не находится в низкой концентрации (низкая концентрация про-ЭМП агента определена ниже), но содержание анти-ЭМП агента таково, что соотношение про-ЭМП агент: анти-ЭМП агент составляет от 7: 3 до 0: 10, предпочтительно 2: 1, также предпочтительно 1: 1, еще более предпочтительно 1: 2, а также предпочтительно от 1: 1 до 0: 1. В другом варианте осуществления содержание про-ЭМП-агента в композиции отсутствует или находится в низкой концентрации (низкая концентрация про-ЭМП-агента определена ниже), а содержание анти-ЭМП-агента таково, что отношение про-ЭМП агент: анти-ЭМП агент составляет от 7: 3 до 0: 10, предпочтительно 2: 1, 6: 4, 1: 1, 1: 2, 3: 7, 2: 8, 1: 9 или 0: 10.
[00137] Указанный анти-ЭМП агент предпочтительно представляет собой С9-С14 жирную кислоту, ее соль, ее моноглицерид, ее диглицерид или ее триглицерид. Анти-ЭМП агент предпочтительно представляет собой С9 жирную кислоту, ее соль, ее моноглицерид, ее диглицерид или ее триглицерид. Анти-ЭМП агент предпочтительно представляет собой С10 жирную кислоту, ее соль, ее моноглицерид, ее диглицерид или ее триглицерид. Анти-ЭМП агент предпочтительно представляет собой С11 жирную кислоту, ее соль, ее моноглицерид, ее диглицерид или ее триглицерид. Анти-ЭМП агент предпочтительно представляет собой С12 жирную кислоту, ее соль, ее моноглицерид, ее диглицерид или ее триглицерид. Анти-ЭМП агент предпочтительно представляет собой С13 жирную кислоту, ее соль, ее моноглицерид, ее диглицерид или ее триглицерид. Анти-ЭМП агент предпочтительно представляет собой С14 жирную кислоту, ее соль, ее моноглицерид, ее диглицерид или ее триглицерид. Анти-ЭМП агент предпочтительно представляет собой С9-12 жирную кислоту, ее соль, ее моноглицерид, ее диглицерид или ее триглицерид. Анти-ЭМП агент предпочтительно представляет собой С10-12 жирную кислоту, ее соль, ее моноглицерид, ее диглицерид или ее триглицерид. Анти-ЭМП агент предпочтительно представляет собой С10 жирную кислоту, ее соль или ее триглицерид. Анти-ЭМП агент предпочтительно представляет собой С10 жирную кислоту или ее соль. Анти-ЭМП агент предпочтительно представляет собой соль С10 жирной кислоты. Анти-ЭМП агент предпочтительно представляет собой С11 жирную кислоту, ее соль или ее триглицерид. Анти-ЭМП агент предпочтительно представляет собой С11 жирную кислоту или ее соль. Анти-ЭМП агент предпочтительно представляет собой соль С11 жирной кислоты. Анти-ЭМП агент предпочтительно представляет собой С12 жирную кислоту, ее соль или ее триглицерид. Анти-ЭМП агент предпочтительно представляет собой С12 жирную кислоту или ее соль. Анти-ЭМП агент предпочтительно представляет собой соль С12 жирной кислоты. Анти-ЭМП агент предпочтительно представляет собой С9 жирную кислоту, ее соль или ее триглицерид. Анти-ЭМП агент предпочтительно представляет собой С9 жирную кислоту или ее соль. Анти-ЭМП агент предпочтительно представляет собой соль С9 жирной кислоты. Анти-ЭМП агент предпочтительно представляет собой С10 жирную кислоту, ее соль или ее триглицерид. Анти-ЭМП агент предпочтительно представляет собой С13 жирную кислоту или ее соль, или ее триглицерид. Анти-ЭМП агент предпочтительно представляет собой С13 жирную кислоту или ее соль. Анти-ЭМП агент предпочтительно представляет собой соль С13 жирной кислоты. Анти-ЭМП агент предпочтительно представляет собой С14 жирную кислоту, ее соль или ее триглицерид. Анти-ЭМП агент предпочтительно представляет собой С14 жирную кислоту или ее соль. Анти-ЭМП агент предпочтительно представляет собой соль С10 жирной кислоты.
[00138] Композиция предпочтительно, по существу, не содержит октановой кислоты или соли октановой кислоты. C9-C14 жирная кислота представляет собой жирную кислоту с длиной цепи от 9 до 14 атомов углерода. Октановую кислоту также можно назвать каприловой кислотой или С8 жирной кислотой, которая представляет собой жирную кислоту с длиной цепи в 8 атомов углерода. Данное изобретение также относится к применениям композиции, описанной в данном документе, например, для лечения заболевания или патологического состояния у субъекта без нежелательных явлений, связанных со стимуляцией эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) у субъекта, то есть путем предотвращения или предупреждения стимуляции ЭМП или ингибирования ЭМП. Данное изобретение также относится к способу лечения заболевания или патологического состояния без нежелательной стимуляции ЭМП у субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение субъекту композиции, описанной в данном документе, то есть с одновременным предотвращением или минимизацией ЭМП. Такие применения и способы приводят к тому, что ЭМП не увеличивается или практически не увеличивается, и/или в вариантах осуществления может ингибировать или уменьшать ЭМП у субъекта.
[00139] Было обнаружено, что анти-ЭМП агент, описанный в данном документе, в присутствии и без присутствия альбумина, ингибирует ЭМП. Следовательно, данное изобретение также относится к применению анти-ЭМП агента или комбинации анти-ЭМП агента для лечения различных патологических состояний. Данное изобретение также относится к применению анти-ЭМП агента или комбинации анти-ЭМП агента для минимизации или уменьшения эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) у субъекта. Также включена композиция для применения для предотвращения, ингибирования, минимизации или уменьшения эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) у субъекта, содержащая анти-ЭМП агент или комбинацию анти-ЭМП агентов.
[00140] Соль, согласно данному изобретению, предпочтительно представляет собой фармацевтически приемлемую соль.
Эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) и эндотелиально-мезенхимальный переход (ЭндоМП)
[00141] Эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) и обратный процесс, МЭП (мезенхимально-эпителиальный переход), являются критическими процессами для развития многих тканей и органов во время эмбриогенеза. С недавних пор эндотелиально-мезенхимальный переход (ЭндоМП), новый признанный тип клеточной трансдифференцировки, стал еще одним возможным источником миофибробластов ткани. ЭндоМП представляет собой сложный биологический процесс, при котором эндотелиальные клетки теряют свои специфические маркеры, приобретают мезенхимальный фенотип и экспрессируют продукты мезенхимных клеток, такие как α-актин гладких мышц (α-SMA) и коллаген I типа. Подобно ЭМП, ЭндоМП может быть индуцирован трансформирующим фактором роста (ТФР-β). В целях упрощения текста данного изобретения термин «ЭМП» используется в данном документе и предназначен для охвата как процессов ЭМП, так и ЭндоМП, которые идентичны процессам клеточной трансформации/дифференцировки.
[00142]  Эпителиальные (или эндотелиальные) и мезенхимальные клетки отличаются друг от друга в отношении клеточного фенотипа и функции. Эпителиальные и эндотелиальные клетки тесно связаны друг с другом плотными соединениями, щелевидными соединениями и адгезивными соединениями, проявляют клеточную полярность (апико-базальная полярность, поляризация цитоскелета) и связаны базальной пластинкой. В то время как мезенхимальные клетки лишены этой клеточной поляризации, они обладают веретенообразной морфологией и минимально взаимодействуют друг с другом. Кроме того, эпителиальные и эндотелиальные клетки экспрессируют характерные клеточные маркеры, такие как E-кадгерин и β-катенин, в то время как мезенхимные клетки экспрессируют клеточные маркеры, такие как N-кадгерин, фибронектин, виментин и α-SMA (актин гладких мышц). Кроме того, мезенхимальные клетки обладают повышенной способностью мигрировать по сравнению с эпителиальными клетками. Таким образом, процесс ЭМП приводит к глубокому изменению морфологии и фенотипа клеток. Вообще говоря, ЭМП происходит во время трех процессов: эмбриогенеза, пролиферации и миграции клеток и заживления ран. Поскольку ингибирование ЭМП является желательным при определенных патологических состояниях, таких как рак или чрезмерное заживление ран (образование рубцов), были предприняты исследования в отношении обнаружения потенциальных лекарственных средств для ингибирования ЭМП. Поскольку ЭМП характерен для клеток, подвергающихся пролиферации, он индуцируется белковыми факторами роста, такими как ТФР (трансформирующий фактор роста), CTGF (фактор роста соединительной ткани - Connective Tissue Growth Factor), ЭФР (эпидермальный фактор роста), ФРГ (фактор роста гепатоцитов) и ИФР (инсулиноподобный фактор роста). Следовательно, ингибиторы факторов роста имеют потенциал в качестве ингибиторов ЭМП. Например, низкомолекулярный (MW = 384) замещенный имидазолилбензамид SB-431542 представляет собой ингибитор рецептора ТФР-β1 (активин-рецептороподобная киназа; Inman et al. (2002), Molecular Pharmacol. 62 (1) 65-74), который ослабляет стимулирующие опухоль эффекты ТФР-β, в том числе ЭМП, индуцированные ТФР-β. Аналогично, другая малая молекула EW-7203 блокирует ТФР-β1-опосредованную ЭМП в эпителиальных клетках молочной железы (Park et al. (2011), Cancer Sci. 102(1):1889-96). Было также обнаружено, что ингибирование незаменимой киназы (PAK: активированная р21 серин-треониновая протеинкиназа) ингибирует процесс ЭМП (см., например, заявку на патент США 2009/0286850).
[00143] Было обнаружено, что С8 жирная кислота или ее соль увеличивают ЭМП, тогда как любая из С9-С14 жирной кислоты, ее соли, ее моноглицерида, ее диглицерида и ее триглицерида снижают ЭМП. Следовательно, чтобы предотвратить стимуляцию ЭМП введением композиции альбумина, содержание в ней С8 жирной кислоты или ее соли преимущественно снижают или полностью исключают. В качестве альтернативы было обнаружено, что замена части по меньшей мере 30% С8 жирной кислоты или ее соли в композиции альбумина анти-ЭМП агентом будет компенсировать отрицательное воздействие С8 жирной кислоты или ее соли. Альтернативно, данное изобретение также предусматривает добавление анти-ЭМП агента в композицию альбумина таким образом, чтобы анти-ЭМП агент соответствовал по меньшей мере 30% от общего содержания про-ЭМП агента и анти-ЭМП агента.
[00144] Также обеспечен способ предотвращения, ингибирования, минимизации или уменьшения эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) у субъекта, нуждающегося в этом, причем указанный способ включает введение субъекту композиции альбумина, не содержащей про-ЭМП агента или содержащей небольшое количество про-ЭМП агента; и/или содержащей количество анти-ЭМП-агента, которое соответствует по меньшей мере 30% от общего количества про-ЭМП и анти-ЭМП агентов.
[00145] Также обеспечено применение композиции, содержащей альбумин, для предотвращения, ингибирования, минимизация или уменьшения эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) у субъекта, нуждающегося в этом, причем указанная композиция альбумина не содержит про-ЭМП агента или содержит небольшое количество про-ЭМП агента; и/или содержит количество анти-ЭМП агента, которое соответствует по меньшей мере 30% от общего количества про-ЭМП агента и анти-ЭМП агента.
[00146] Также обеспечено применение композиции, содержащей альбумин, для приготовления лекарственного средства для предотвращения, ингибирования, минимизация или уменьшения эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) у субъекта, нуждающегося в этом, причем указанная композиция альбумина не содержит про-ЭМП агента или содержит небольшое количество про-ЭМП агента; и/или содержит количество анти-ЭМП агента, которое соответствует по меньшей мере 30% от общего количества про-ЭМП агента и анти-ЭМП агента.
[00147] Также обеспечена композиция, содержащая альбумин, для применения в предотвращении, ингибировании, минимизации или уменьшении эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) у субъекта, нуждающегося в этом, причем указанная композиция альбумина не содержит про-ЭМП агент или содержит небольшое количество про-ЭМП агента; и/или содержит количество анти-ЭМП агента, которое соответствует по меньшей мере 30% от общего количества про-ЭМП агента и анти-ЭМП агента.
[00148] Предполагается, что применения и способы, описанные в данном документе, предназначены для предотвращения, минимизации, уменьшения, ингибирования, уменьшения стимуляции, минимизации стимуляции, для не стимуляции или для исключения стимуляции эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП). Данное изобретение также относится к композиции альбумина, в которой отсутствуют про-ЭМП агент и анти-ЭМП агент, поскольку она не будет стимулировать ЭМП. В альтернативном варианте осуществления изобретения анти-ЭМП агент присутствует в композиции альбумина. В альтернативном варианте осуществления изобретения про-ЭМП агент отсутствует в композиции альбумина. В альтернативном варианте осуществления изобретения про-ЭМП агент присутствует в «низкой концентрации» в композиции альбумина, причем указанная «низкая концентрация» ниже концентрации, которая обычно используется в коммерческих композициях альбумина (то есть около 0,08 ммоль соли октановой кислоты на грамм альбумина). Предпочтительно низкая концентрация про-ЭМП агента составляет от 0,0007 до 0,07 миллимоль на грамм альбумина, или от 0,0007 до 0,007 миллимоль на грамм альбумина, или от 0,007 до 0,07 миллимоль на грамм альбумина, или от 0,005 до 0,05 миллимоль на грамм альбумина, или от 0,0005 до 0,05 миллимоль на грамм альбумина, или от 0,002 до 0,02 миллимоль на грамм альбумина, от 0,0002 до 0,02 миллимоль на грамм альбумина, от 0,04 до 0,08 миллимоль на грамм альбумина, от 0,04 до 0,07 миллимоль на грамм альбумина, от 0,05 до 0,07 миллимоль на грамм альбумина. Как описано в данном документе, «низкая концентрация» и «низкое количество» представляют собой два выражения, которые обозначают одно и то же, поскольку низкое количество является относительным по отношению к количеству альбумина в композиции. В альтернативном варианте осуществления композиция альбумина не лишена какого-либо про-ЭМП агента. В другом варианте осуществления про-ЭМП агент присутствует в композиции альбумина в концентрации от 0,008 миллимоль на грамм альбумина до 0,007% (масса/масса). В другом варианте осуществления из данного изобретения исключено применение композиции альбумина с целью детоксикации субъекта или применение композиции альбумина с целью детоксикационной терапии, или субъект, нуждающийся в детоксикации. Композиция альбумина для детоксикации субъекта раскрыта в патенте США 8877711. В одном варианте осуществления субъект нуждается в предупреждении ЭМП или уменьшении стимуляции ЭМП, или предотвращении чрезмерного рубцевания, или уменьшении стимуляции чрезмерного рубцевания, или предотвращении дифференцировки клеток, или уменьшении стимуляции дифференцировки клеток.
[00149] Данное изобретение также относится к применениям (i) указанной композиции альбумина, не содержащей ни про-ЭМП агента, ни небольшого количества про-ЭМП агента; и/или содержащей количество анти-ЭМП агента, которое соответствует по меньшей мере 30% от общего количества про-ЭМП агента и анти-ЭМП агента в композиции альбумина, и (ii) указанной композиции анти-ЭМП агента, например, для ее терапевтического применения при лечении заболевания, связанного с ЭМП, или патологического состояния, связанного с ЭМП, или заболевания или патологического состояния, когда стимуляция ЭМП нежелательна или не подходит, и/или когда экспрессия коллагена нежелательна или не подходит, среди которых кровоизлияние, гиповолемия, ожог, острая печеночная недостаточность, нарушение функции печени, гипоальбуминемия, синдром острой дыхательной недостаточности у взрослых, цирроз печени, гемолитическая болезнь новорожденных, операция в условиях искусственного кровообращения, нефроз, рак, гепаторенальный синдром, сепсис, перфузия органов, реперфузия органов, образование рубцов, псориаз и экзема; и в комбинации с плохо растворимыми в воде лекарственными средствами для лечения заболевания или патологического состояния, когда стимуляция ЭМП не подходит или нежелательна, такими как противораковые лекарственные средства. Данное изобретение также относится к применению композиции альбумина в соответствии с данным изобретением для приготовления лекарственного средства для лечения заболевания или патологического состояния, при котором врач рекомендует введение композиции альбумина. Лечение заболевания или патологического состояния, при котором врач рекомендует введение композиции альбумина, включает, но не ограничивается этим, гиповолемию с шоком или без него; гипоальбуминемию (например, возникшей вследствие недоедания, ожогов, серьезных травм, врожденной анальбуминемии, заболевания печени, нарушения функции печени, инфекции, злокачественного новообразования, химиотерапии, болезней эндокринной системы), чрезмерный катаболизм (например, возникшей вследствие ожогов, серьезных травм, панкреатита, тиреотоксикоза, пузырчатки, нефроза или другого), потерю альбумина из организма (например, возникшую вследствие кровоизлияния, чрезмерного выделения почек, ожогового экссудата, экссудативной энтеропатии, эксфолиативных дерматитов или другого) и/или перераспределение альбумина в организме (например, возникшего вследствие обширного хирургического вмешательства, ортопедической операции, цирроза с асцитом, перитонитом, адгезией, дивертикулитом, различными воспалительными состояниями или другими причинами); до или во время операции в условиях искусственного кровообращения, ожоги, цирроз печени, диализ альбумина у пациентов с острой печеночной недостаточностью или тяжелой декомпенсацией хронического заболевания печени (например, экстракорпоральная поддержка печени), отравление, инфекции, хирургические осложнения, септический шок, тяжелый сепсис. Данное изобретение также относится к применению композиции альбумина согласно данному изобретению к технологии приготовления лекарственного средства, чтобы стабилизировать лекарственное средство или сделать лекарственное средство более растворимым, или повысить эффективность лекарственного средства или для других целей, или для средства доставки лекарства. В этом контексте термины «лекарственное средство» и «или активный агент» могут быть взаимозаменяемыми. Данное изобретение также относится к применению композиции альбумина согласно данному изобретению для криоконсервации стволовых клеток или эмбрионов для терапии стволовыми клетками или экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).
[00150] В одном варианте осуществления концентрация всей С8-14 жирной кислоты, ее соли, ее моноглицерида, ее диглицерида или ее триглицерида, которая присутствует в композициях согласно данному изобретению, выше или равна, или меньше, чем 0,08 миллимоль на грамм альбумина. В одном варианте осуществления общее количество С8-14 жирной кислоты, ее соли, ее моноглицерида, ее диглицерида или ее триглицерида составляет по меньшей мере 30% анти-ЭМП агента.
[00151] Данное изобретение также относится к применению композиции альбумина, содержащей количество С8-14 жирной кислоты, ее соли, ее моноглицерида, ее диглицерида или ее триглицерида, которое выше или равно или меньше, чем 0,08 миллимоль на грамм альбумина, причем количество про-ЭМП агента соответствует низкой концентрации по отношению к количеству альбумина, присутствующего в композиции, или про-ЭМП агент отсутствует, и при этом по меньшей мере 30%, или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 50%, или по меньшей мере 60% указанного количества С8-14 жирной кислоты, ее соли, ее моноглицерида, ее диглицерида или ее триглицерида представляет собой анти-ЭМП агент или их комбинацию. Указанные применения включают термостабилизацию сывороточного альбумина. Для данного изобретения также предусмотрено, что композицию альбумина модифицируют после пастеризации с тем, чтобы уменьшить или истощить содержание про-ЭМП агента и/или увеличить содержание анти-ЭМП агента в соответствии с заявленной концентрацией и/или пропорцией.
[00152] Использование терминов в единственном числе и аналогичных ссылках в контексте описания изобретения (особенно в контексте следующей формулы изобретения) должно толковаться как охватывающее как единственное, так и множественное число, если иное не указано в данном документе или явно не противоречит контексту.
[00153] Термины «содержащий», «имеющий», «включающий» и «содержащий» следует толковать как неограничивающие термины (то есть означающие «включающий, но не ограничивающийся»), если не указано иное.
[00154] Перечисление диапазонов значений в данном документе просто предназначено для того, чтобы служить кратким способом индивидуальной ссылки на каждое отдельное значение, попадающее в этот диапазон, если в данном документе не указано иное, и каждое отдельное значение включается в описание, как если бы оно было отдельно указано в данном документе. Все подмножества значений в пределах диапазонов также включены в спецификацию, как если бы они были по отдельности указаны в данном документе.
[00155] Все способы, описанные в данном документе, могут быть выполнены в любом подходящем порядке, если иное не указано в данное документе или иное явно не противоречит контексту.
[00156] Использование любого и всех примеров или иллюстративных формулировок (например, «таких как»), представленных в данном документе, предназначено только для лучшей иллюстрации изобретения и не налагает ограничения на объем изобретения, если не заявлено иное.
[00157] Ни одна формулировка в описании не должна истолковываться как указывающая на какой-либо не заявленный элемент как существенный для практического осуществления изобретения.
[00158] В данном документе термин «около» имеет свое обычное значение. Термин «около» используется для указания того, что значение включает изначально присущую вариацию ошибки для устройства или способа, используемого для определения значения, или охватывает значения, близкие к приведенным значениям, например, в пределах 10% или 5% от перечисленных значений (или диапазона значений).
[00159] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области техники, к которой относится данное изобретение.
[00160] В исследованиях, описанных в данном документе, авторы данного изобретения продемонстрировали, что октановая кислота и ее соль, или в свободной форме, или в комплексе с альбумином, стимулируют эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП), что оценивается по увеличению ТФР-β-индуцированной экспрессии коллагена (маркер ЭМП) в эпителиальных клетках проксимальных канальцев человека. Напротив, снижение ТФР-β-индуцированной экспрессии коллагена эпителиальными клетками проксимальных канальцев человека (т.е. указывающее на ингибирование ЭМП) было обнаружено после обработки другими насыщенными жирными кислотами (то есть C9-C14 жирными кислотами) или их триглицеридами, или в свободной форме и/или в комплексе с альбумином. Таким образом, результаты, представленные в данном документе, свидетельствуют о том, что использование ЧСА, стабилизированного октановой кислотой, может быть связано с нежелательными биологическими эффектами, особенно при определенных патологических состояниях, таких как рак или чрезмерное заживление ран (рубцевание), при которых стимуляцию ЭМП следует избегать/минимизировать, и что использование ЧСА, стабилизированного С9-С14 жирной кислотой, которая оказывает ингибирующее действие на ЭМП, является предпочтительным.
[00161] Данное изобретение также относится к способу предотвращения, минимизации или уменьшения стимуляции эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) у субъекта, нуждающегося в этом, причем указанный способ включает введение субъекту композиции, которая не содержит альбумин и
- не содержит про-ЭМП агент или содержит низкую концентрацию про-ЭМП агента; и/или
- содержание про-ЭМП агента и анти-ЭМП агента в соотношении про-ЭМП агент: анти-ЭМП агент, которое составляет от 7: 3 до 0: 10.
[00162] Про-ЭМП агент представляет собой такой, как описанные выше для композиции альбумина, а именно октановую кислоту, соль октановой кислоты или их комбинацию. Анти-ЭМП агент представляет собой такой, как описанные выше для композиции альбумина, а именно C9-C14 жирную кислоту, соль C9-C14 жирной кислоты, моноглицерид C9-C14 жирной кислоты, диглицерид C9-C14 жирной кислоты, триглицерид С9-С14 жирной кислоты или их комбинацию Концентрация про-ЭМП агента преимущественно не слишком высока и предпочтительно превышает 0,02 М. В вариантах осуществления концентрация про-ЭМП агента составляет 0,01 М или менее, 0,001 М или менее, 0,0001 М или менее. В данных вариантах осуществления, в которых композиция не содержит альбумин, про-ЭМП агент и анти-ЭМП агент, когда они представляют собой жирные кислоты, они могут быть разделены или отличаться друг от друга, или они являются частью диглицерида или триглицерида при сохранении того же самого соотношения. Пример этого варианта осуществления приведен в Таблице 2, где тестируемый триглицерид содержит 2 цепи октановой кислоты и одну цепь декановой кислоты, обеспечивая соотношение 2: 1.
[00163] Данное изобретение также охватывает применение композиции для приготовления лекарственного средства для ингибирования или уменьшения эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) у субъекта, причем композиция содержит эффективное количество анти-ЭМП агента, как описано выше. В одном варианте осуществления эффективное количество анти-ЭМП агента составляет от 5 мг/кг до 300 мг/кг субъекта, или от 5 мг/кг до 200 мг/кг, или от 5 мг/кг до 100 мг/кг, или от 10 мг/кг до 100 мг/кг на дозу при пероральном или местном применении для человека. В одном варианте осуществления эффективное количество анти-ЭМП агента составляет от 0,5 мг/кг до 100 мг/кг или от 0,5 мг/кг до 50 мг/кг, или от 0,5 мг/кг до 25 мг/кг, или от 0,5 мг/кг до 10 мг/кг, или от 0,5 мг/кг до 4 мг/кг субъекта на дозу для внутривенного, внутрибрюшинного, ректального, внутримышечного или подкожного введения человеку. Указанная доза вводится один или более раз в течение периода лечения. В варианте осуществления указанный способ повторяется каждые сутки, каждые двое суток, каждые трое суток, два раза в неделю или еженедельно. Указанный период лечения предпочтительно определяется врачом или до тех пор, пока не будут достигнуты желаемые медицинские результаты.
[00164] Эффективное количество можно вводить один раз или многократно. Повторное введение - от двух до четырех раз в сутки, один раз в сутки, каждые двое суток дня, каждые трое суток, два раза в неделю или один раз в неделю.
[00165]  В одном варианте осуществления анти-ЭМП агент присутствует в фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
[00166] Используемый в данном документе термин «жирная кислота» относится к карбоновой кислоте с алифатической цепью (или насыщенной, или ненасыщенной), обычно от 4 до 28 атомов углерода. Термин «С9-С14 жирная кислота» относится к жирной кислоте с алифатической цепью из 9, 10, 11, 12, 13 или 14 атомов углерода или любой их смеси. В варианте осуществления алифатическая цепь является насыщенной. Термин «триглицерид C9-C14 жирной кислоты» относится к молекуле глицерина, сложноэфирно связанной с тремя C9-C14 жирными кислотами, и может быть представлен следующей формулой:
[00167] где R’, R’’ и R’’’ независимо выбирают из насыщенной жирной кислоты или соли, содержащей 9, 10, 11, 12, 13 или 14 атомов углерода в углеродном скелете, эстерифицированной по скелету глицерина. Термин «моноглицерид C9-C14 жирной кислоты» относится к молекуле глицерина, сложноэфирно связанной с одной C9-C14 жирной кислотой; и термин «диглицерид C9-C14 жирной кислоты» относится к молекуле глицерина, сложноэфирно связанной с двумя C9-C14 жирными кислотами. Жирная кислота, ее соль и триглицерид жирной кислоты могут быть получены любым способом, известным в данной области техники, таким как прямая эстерификация, перегруппировка, фракционирование, переэстерификация или тому подобное. Например, липиды могут быть выделены или получены из источника растительного масла, такого как кокосовое масло, посредством процесса перегруппировки или тому подобное. Длина и распределение длины цепи могут варьироваться в зависимости от исходного масла. Коммерческие источники C9-C14 жирных кислот, их солей и триглицеридов C9-C14 жирных кислот доступны и известны специалисту в данной области техники.
[00168] В одном варианте осуществления композиция альбумина содержит одну жирную кислоту с 9, 10, 11, 12, 13 или 14 атомами углерода или ее соль. В другом варианте осуществления композиция альбумина содержит любую смесь двух или более жирных кислот с 9, 10, 11, 12, 13 или 14 атомами углерода и/или их солей.
[00169] В вариантах осуществления по меньшей мере около 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% жирной кислоты и/или соли жирной кислоты, содержащейся в композиции альбумина, представляет собой C9-C14 жирную кислоту и/или ее соль. В одном варианте осуществления 100% жирной кислоты и/или соли жирной кислоты, содержащейся в композиции альбумина, представляет собой C9-C14 жирную кислоту и/или ее соль.
[00170] В вариантах осуществления 60%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% или 5% или менее жирной кислоты и/или соли жирной кислоты, содержащейся в композиции альбумина, представляет собой C8 жирную кислоту («октановую кислоту» или «каприловую кислоту») и/или ее соль. В одном варианте осуществления жирная кислота, содержащаяся в композиции альбумина, не содержит или по существу не содержит октановую кислоту и/или соль октановой кислоты.
[00171] Термины «октановая кислота» или «каприловая кислота» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к насыщенной жирной кислоте, содержащей 8 атомов углерода. Она имеет следующую структуру:
[00172] Термины «октаноат», «соль октановой кислоты», «каприлат» и «соль каприловой кислоты» используются в данном документе взаимозаменяемо.
[00173] Оба выражения «уменьшенное количество про-ЭМП агента» и «низкая концентрация про ЭМП-агента» относятся к количеству октановой кислоты и/или соли октановой кислоты, которое меньше количества октановой кислоты и/или соли октановой кислоты, которое в настоящее время используется в коммерческих препаратах альбумина на рынке. Коммерческие препараты альбумина используют 0,02 М каприлата натрия для приготовления 25% альбумина и около 0,004 М для приготовления 5% альбумина. Следовательно, коммерчески используемая концентрация каприлата натрия составляет 0,02 М для 25% альбумина, и она составляет 0,08 миллимоль на грамм альбумина. Следовательно, уменьшенное количество октановой кислоты и/или соли октановой кислоты составляет менее 0,08 миллимоль на грамм альбумина, или менее 0,05 миллимоль на грамм альбумина, или менее 0,01 миллимоль на грамм альбумина или 0,005 миллимоль на грамм альбумина, или 0,001 миллимоль на грамм альбумина, или менее 0,0005 миллимоль на грамм альбумина, или менее 0,0001 миллимоль на грамм альбумина.
[00174] Используемый в данном документе термин «по существу не содержит октановую кислоту и/или соль октановой кислоты» относится к концентрации октановой кислоты и/или соли октановой кислоты, которая не поддается количественной оценке или не обнаруживается обычными методами. С помощью методов, известных и используемых авторами изобретения, уровень количественного определения и обнаружения составляет 0,1 мМ, что соответствует 0,0005 миллимоль на грамм альбумина. Следовательно, «по существу не содержащий октановую кислоту и/или соль октановой кислоты» составляет менее 0,0005 миллимоль на грамм альбумина или менее 0,0001 миллимоль на грамм альбумина.
[00175] Используемый в данном документе термин «не содержит октановую кислоту и/или соль октановой кислоты» относится к отсутствию октановой кислоты и/или соли октановой кислоты или к ее следам. Например, композиция альбумина, которая не содержит октановую кислоту и/или ее соль, представляет собой композицию, в которую октановая кислота и/или ее соль не была добавлена, или композицию, в которую октановая кислота и/или ее соль была добавлена, а затем удалена/истощена. Например, количество октановой кислоты и/или ее соли может быть добавлено для стабилизации альбумина во время пастеризации и удалено после пастеризации. Например, чистый альбумин Sigma, который используется в Примере 3, считается не содержащим жирных кислот, хотя в описании продукта указано, что в нем содержится след жирных кислот в 0,007% (масса/масса) или меньше. Для целей данного изобретения можно использовать несколько способов удаления жирных кислот (про-ЭМП агент), такие как (i) ультрафильтрация/диафильтрация (UF/DF) для обмена с анти-ЭМП агентом с использованием мембраны, такой как полые волокна, литые мембраны или другие; (ii) диализ с диализной трубкой для обмена с анти-ЭМП агентом; (iii) гель-фильтрация с использованием колонки для эксклюзионной хроматографии или колонки для обессоливания; (iv) адсорбция активированным углем при низком pH с последующей фильтрацией/очисткой для удаления активированного угля; (v) адсорбция на твердой фазе, такой как частицы углерода или различные минеральные порошки, включая цеолиты, диоксид кремния и др.; (vi) хроматография; (vii) с помощью гидрофобной колоночной хроматографии с использованием Lipidex 1000 (25 грамм с С15 углеводородными группами) при 37°С; (viii) добавление этанола, необязательно снижение рН с последующим нагреванием и фильтрацией для удаления нестабильных осажденных белков, и UF/DF (ультрафильтрация/диафильтрация) для вытеснения любых остаточных жирных кислот при удалении этанола и/или корректировке pH ближе к нейтральному; (ix) ионный обмен с анионными и катионообменными смолами, а также путем диализа, (x) разворачивание альбумина для истощения про-ЭМП агента и повторное сворачивание с анти-ЭМП агентом (т.е. разворачивание с использованием хаотропа (например, мочевины или гидрохлорида гуанидина), необязательно в присутствии восстановителя (например, меркаптоэтанола), чтобы развернуть альбумин и высвободить связанный про-ЭМП агент, необязательно приступают к разбавлению или диализу/диафильтрации для удаления любых следов про-ЭМП агента и повторно сворачивают в присутствии анти-ЭМП агента, удаляя присутствие хаотропа путем разбавления, диализа, диафильтрации или других); или комбинация этих способов.
[00176] В варианте осуществления по меньшей мере 30% или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 50%, или по меньшей мере 60%, или по меньшей мере 70%, или по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95%, или 96%, или 97%, или 98%, или 99%, или 100% от содержания C8-C14 жирной кислоты, ее соли, ее моноглицерида, ее диглицерида или ее триглицерида, или их комбинации (то есть% от общего содержания про-ЭМП агента и анти-ЭМП агента), которая присутствует в композиции, представляет собой С9-С14 жирную кислоту, соль жирной кислоты, ее соль, ее моноглицерид, ее диглицерид или ее триглицерид; или предпочтительно C9-C12 жирную кислоту, соль жирной кислоты, ее соль, ее моноглицерид, ее диглицерид или ее триглицерид, или предпочтительно C10-C12 жирную кислоту, соль жирной кислоты, ее соль, моноглицерид, ее диглицерид или ее триглицерид, или предпочтительно С10 жирную кислоту, соль жирной кислоты, ее соль, ее моноглицерид, ее диглицерид или ее триглицерид, или предпочтительно декановую кислоту и/или соль декановой кислоты. В варианте осуществления жирная кислота, соль жирной кислоты, ее соль, ее моноглицерид, их диглицерид или их триглицерид, которые присутствуют в композиции, не мечены радиоактивным изотопом.
[00177] Термины «декановая кислота» или «каприновая кислота» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к насыщенной жирной кислоте, содержащей 10 атомов углерода. Она имеет следующую структуру:
[00178] Термин «соль деканоат» относится к соли декановой кислоты, соли каприновой кислоты или капрату.
[00179] Преимущественно, соль является фармацевтически приемлемой. Примеры фармацевтически приемлемых солей С9-С14 жирных кислот включают соли натрия, калия, лития, аммония, кальция, магния, марганца, цинка, железа и меди; предпочтительно соли натрия, или соли калия, или комбинацию солей натрия и калия. В одном варианте осуществления соль представляет собой соль натрия. В одном варианте осуществления соль C9-C14 жирной кислоты представляет собой соль натрия, такую как деканоат натрия.
[00180] В одном варианте осуществления количество жирной кислоты и/или ее соли в композиции альбумина представляет собой количество, которое подходит для стабилизации альбумина во время процесса пастеризации, которое составляет около 0,02 М для концентрации 25% альбумина. Более низкие концентрации альбумина стабилизируются пропорционально меньшим количеством жирной кислоты и/или ее соли. В данном документе предполагается, что стабилизацию альбумина можно проводить с помощью октановой кислоты и/или соли октановой кислоты и что после необходимости стабилизации (то есть процесса пастеризации) октановую кислоту и/или соль октановой кислоты удаляют из композиции альбумина. Такое удаление называется снятием или истощением. Результатом такого удаления является композиция альбумина, не содержащая или практически не содержащая жирной кислоты или ее соли, которая также называется композицией чистого альбумина. Применение композиции чистого альбумина предусмотрено данным изобретением для предотвращения или минимизации ЭМП. Альтернативно, жирная кислота или ее соль, используемая для стабилизации альбумина, не является чистой октановой кислотой и/или ее солью и содержит по меньшей мере 30%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% C9-C14 жирной кислоты и/или ее соли, или C9-12 жирной кислоты и/или ее соли, или C10-C12 жирной кислоты и/или ее соли, или С10 жирной кислоты и/или ее соли. В тех случаях, когда по меньшей мере 30% содержания жирной кислоты и/или ее соли составляет C9-C14 жирная кислота и/или ее соль, удаление жирной кислоты и/или ее соли после необходимости стабилизации (т.е. процесс пастеризации), не является необходимым для целей данного изобретения.
[00181] В одном варианте осуществления количество альбумина в препарате составляет от около 5% до менее чем около 40% (масса/объем). В одном варианте осуществления количество альбумина в препарате составляет от около 5% до около 25% (масса/объем). В одном варианте осуществления количество альбумина в препарате составляет от около 20% до около 25% (масса/объем). В одном варианте осуществления количество альбумина в препарате составляет около 5% (масса/объем). В одном варианте осуществления количество альбумина в препарате составляет около 20% (масса/объем). В одном варианте осуществления количество альбумина в препарате составляет около 25% (масса/объем). Термины «композиция альбумина», «альбуминовая композиция» и «препарат альбумина» используются в данном документе взаимозаменяемо и означают композицию, содержащую альбумин.
[00182] Термин «альбумин» означает белок, имеющий такую же и/или очень похожую третичную структуру, как человеческий сывороточный альбумин (ЧСА). В варианте осуществления альбумин представляет собой нативный ЧСА или его вариант, который сохраняет функции/свойства ЧСА. На Фиг. 3 показана аминокислотная последовательность нативного белка-предшественника ЧСА (SEQ ID NO: 1, эталонная последовательность NCBI: NP_000468.1, UniProtKB: P02768). Следует отметить, что природные вариации аминокислотной последовательности нативного белка-предшественника ЧСА могут возникать от одного индивидуума к другому.
[00183] Кодированный препропротеин подвергается протеолитической обработке для получения зрелого белка ЧСА, который содержит остатки 25-609 препропротеина (остатки 1-18 определяют сигнальный пептид, а остатки 19-24 определяют пропептид).
[00184] Некоторые из основных функций/свойств альбумина: i) его способность регулировать объем плазмы, ii) длительный период полувыведения из плазмы, составляющий приблизительно 19 суток ± 5 суток, iii) связывание с лигандом, например, связывание эндогенных молекул, таких как липофильные соединения карбоновых кислот, включая билирубиновые жирные кислоты, гемин и тироксин (см. также Таблицу 1 Kragh-Hansen et al., 2002, Biol. Pharm. Bull. 25, 695), iv) связывание небольших органических соединений с кислотными или электроотрицательными свойствами, например, препараты, такие как варфарин, диазепам, ибупрофен и паклитаксел (см. также Таблицу 1 Kragh-Hansen et al., 2002, выше).
[00185] Термин «вариант» означает полипептид, содержащий изменение, то есть замену, вставку и/или делецию, в одном или более (нескольких) положениях относительно нативного ЧСА. Измененный полипептид (вариант) может быть получен путем вмешательства человека посредством модификации полинуклеотидной последовательности, кодирующей нативный альбумин, или может происходить естественным путем. Аминокислотная последовательность варианта альбумина на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична остаткам 1-609 SEQ ID NO: 1 и которая предпочтительно поддерживает по меньшей мере одну из функций/свойств нативного ЧСА. Например, вариант альбумина согласно данному изобретению включает фрагмент последовательности 3-585. Идентичность последовательностей между двумя аминокислотными последовательностями может быть определена с использованием хорошо известных алгоритмов, например, алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), реализованного в программе Needle пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277). Идентичность последовательностей также может быть определена с использованием алгоритма BLAST, описанного в Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-10 (используя опубликованные настройки по умолчанию). Программное обеспечение для проведения анализа BLAST может быть доступно через Национальный центр биотехнологической информации.
[00186] Таким образом, в варианте осуществления данное изобретение охватывает композицию альбумина, которая содержит альбумин, имеющий по меньшей мере 70% идентичности с нативным зрелым белком альбумина (то есть остатки 25-609 выше). В вариантах осуществления данное изобретение охватывает применение альбумина, имеющего по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с нативным зрелым белком альбумина. Такие варианты нативного зрелого белка ЧСА могут содержать аминокислотную делецию(и), замену(ы) и/или добавление(я) относительно нативного зрелого белка альбумина.
rd
[00187] Альбумин, присутствующий в препарате, определенном в данном документе, может быть выделен/получен из любого источника, например, из крови, плазмы, фракционированной человеческой сыворотки или с помощью генной инженерии (рекомбинантный альбумин). Альбумин из фракционированной человеческой сыворотки может быть получен, например, при помощи низкотемпературного фракционирования этанолом плазмы крови (например, метод Кона и его варианты). Альбумин также может быть очищен от плазмы с помощью хроматографии. Альбумин может быть получен через ряд аффинных и ионообменных колонок, применяемых к плазме, и в результате может быть получен очищенный альбумин Очищенный альбумин обычно подвергают термической обработке при 60°С в течение 10 часов или термической пастеризации для стерилизации. Чтобы свести к минимуму денатурацию альбумина вследствие термической обработки, альбумин образует комплекс с жирной кислотой (или ее солью). Альбумин также может быть получен рекомбинантно с использованием cтандартных методов генной инженерии (см., например, Sambrook et al. (1989) in Molecular Cloning: A Laboratory Manual; and Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3 edition; Cold Spring Harbor Laboratory). Например, рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид альбумина, может быть введен в клетку, например клетку-хозяина (бактериальную или эукариотическую клетку), которая может включать живую клетку, способную экспрессировать область, кодирующую белок, из определенного рекомбинантного вектора экспрессии. Векторы могут быть введены в клетки с помощью стандартных методов трансформации или трансфекции, включая совместное осаждение фосфатом кальция или хлоридом кальция, ДЭАЭ-декстран-опосредованную трансфекцию, липофекцию, электропорацию, микроинъекцию и вирус-опосредованную трансфекцию. Подходящие способы трансформации или трансфекции клеток-хозяев можно найти, например, в Sambrook et al. (выше), Sambrook и Russell (выше) и других лабораторных руководствах. Альбумин, присутствующий в композиции согласно данному изобретению, включает слитый белок альбумина и альбумин, конъюгированный с белком через ковалентную связь. Например, слитие может приводить к получению альбумина, который генетически слит с С-концом или N-концом аминокислотной последовательности (представляющей белок или его фрагмент) через гибкий глицин-сериновый линкер или другой линкер. Например, конъюгация может происходить с белком, модифицированным малеимидной группой, которая реагирует и ковалентно связывается с тиольной группой альбумина.
[00188] Варианты ЧСА, сохраняющие по меньшей мере одну из функций/свойств нативного ЧСА, хорошо известны в данной области техники. Примеры рекомбинантного сывороточного альбумина, которые могут быть использованы в данном документе, включают те, которые ранее раскрыты в патенте США № 5780594, и патенте США № 5948609. Кроме того, модифицированный или укороченный человеческий альбумин, такой как раскрытый в патенте США № 6787636 также может быть использован в изобретении. Как указано в данном документе, сывороточный альбумин может быть таким, который имеет укорочение на одну или две аминокислоты на своем N-терминальном конце или любую другую мутацию на N-терминальном конце, которой достаточно для того, чтобы вызвать стерическое затруднение на N-терминальном конце, чтобы уменьшить аффинность альбумина к микропримесям металлов, таким как медь и/или никель, тем самым уменьшая вероятность возникновения аллергической реакции на микропримесь металла (т.е. гипоаллергенный ЧСА). Другие формы ЧСА также могут быть пригодны для определенных применений, таких как, например, варианты альбумина с измененным периодом полувыведения из плазмы, раскрытые, например, в WO2011/051489 и патенте США № 8822417, WO2011/124718 и WO2012/059486.
[00189] В вариантах осуществления рН препарата, описанного в данном документе, составляет от около 5 до около 7,5, например, от около 5,5 до около 7,5, предпочтительно, от около 6,5 до 7,4.
[00190] Один или более антиоксидантов или стабилизаторов также могут быть добавлены к препарату, например, серосодержащие аминокислоты, соли аминокислот или их производные, которые, как известно, проявляют антиоксидантную или стабилизирующую активность, такие как цистеин, цистин, метионин или N-ацильные (например, N-ацетильные) производные, такие как N-ацетилметионин (см. патент США № 7351800) или другие антиоксиданты или стабилизаторы, такие как N-ацетилтриптофан (или N-ацетилтриптофанат). Таким образом, в варианте осуществления препарат или композиция, определенные в данном документе, содержат один или более фармацевтически приемлемых антиоксидантов или стабилизаторов, например, вышеуказанные антиоксиданты или стабилизаторы. В дополнительном варианте осуществления один или более фармацевтически приемлемых антиоксидантов или стабилизаторов включают N-ацетилметионин и/или N-ацетилтриптофан.
[00191] В одном варианте осуществления один или более фармацевтически приемлемых антиоксидантов или стабилизаторов в препарате составляют от около 0,001 М до около 0,5 М, от около 0,005 до около 0,1 М, от около 0,01 до около 0,1 М, от около 0,01 до около 0,08 М, или от около 0,01 до около 0,05 М, например, около 0,01 М, около 0,02 М, около 0,03 М, около 0,04 М, или около 0,05 М, или диапазон между любыми двумя числовыми значениями, приведенными выше.
[00192] В одном варианте осуществления один или более фармацевтически приемлемых наполнителей или носителей включают, например, красители, стабилизаторы, антисептики, разбавители, регуляторы рН (например, основную аминокислоту, кислотную аминокислоту, соляную кислоту, уксусную кислоту, яблочную кислоту или натрий гидроксид), регулятор осмоляльности (например, электролит, такой как хлорид натрия, хлорид калия, глюконат калия, сульфат магния, бикарбонат натрия, хлорид кальция, глюконат кальция или лимонная кислота) и/или поверхностно-активное вещество. В одном варианте осуществления один или более фармацевтически приемлемых наполнителей или носителей содержат регулятор осмоляльности (например, электролиты). В одном варианте осуществления регулятор осмоляльности находится в концентрации от около 10 мМ до около 500 мМ. В дополнительных вариантах осуществления регулятор осмоляльности находится в концентрации от около 50 мМ до около 300 мМ, от около 100 мМ до около 200 мМ, от около 120 мМ до около 180 мМ или от около 125 мМ до около 175 мМ. В одном варианте осуществления регулятор осмоляльности содержит натрий, калий или оба. В дополнительном варианте осуществления регулятор осмоляльности содержит натрий и калий. В одном варианте осуществления натрий находится в количестве от около 130 до около 160 мМ. В варианте осуществления калий находится в количестве от около 1 мМ до около 5 мМ, например, около 2 мМ.
[00193] Описанные в данном документе препараты альбумина могут быть получены путем равномерного смешивания i) жирной кислоты или ее соли, или ее моноглицерида, или ее диглицерида, или ее триглицерида, или их комбинации, и ii) одного или более фармацевтически приемлемых наполнителей или носителей с iii) водным раствором альбумина (например, буфером, таким как фосфатный буфер, который можно вводить в виде фармацевтических препаратов, водой для инъекций или физиологическим раствором). После растворения раствор смеси перерабатывают в состав, подходящий для введения субъекту, например, для парентерального введения, такой как препарат для внутривенного введения жидкости или раствор для инъекций. В вариантах осуществления эти препараты могут вводиться подкожно или внутривенно.
[00194] В одном варианте осуществления препараты альбумина и композиции анти-ЭМП агента, описанные в данном документе, могут использоваться для медицинских показаний, для которых в настоящее время используются имеющиеся на рынке препараты альбумина, таких как гиповолемия, с шоком или без него; гипоальбуминемия, которая может возникнуть в результате недостаточной продукции альбумина (например, возникшей вследствие недоедания, ожогов, серьезных травм, врожденной анальбуминемии, заболеваний печени, инфекции, злокачественного новообразования, химиотерапии или болезней эндокринной системы), чрезмерный катаболизм (например, возникший вследствие ожогов, серьезных травм, панкреатита, тиреотоксикоза, пузырчатки или нефропатии), потеря альбумина организмом (например, возникшая вследствие кровоизлияния, чрезмерной почечной экскреции, ожогового экссудата, экссудативной энтеропатии или эксфолиативных дерматитов) и/или перераспределение альбумина в организме (например, возникшее вследствие обширного хирургического вмешательства, ортопедической операции, цирроза с асцитом, перитонитом, адгезией, дивертикулитом или различными воспалительными состояниями); до или во время операции в условиях искусственного кровообращения; и для лечения ожогов или цирроза печени. В одном варианте осуществления препараты или композиции альбумина, описанные в данном документе, используются для альбуминового диализа альбумина у пациентов с тяжелой печеночной недостаточностью или острой декомпенсацией хронического заболевания печени (например, экстракорпоральная поддержка печени). В одном варианте осуществления препараты альбумина, описанные в данном документе, используются для лечения отравления. В одном варианте осуществления препараты альбумина, описанные в данном документе, используются для лечения инфекций, послеоперационных осложнений, септического шока или тяжелого сепсиса. В одном варианте осуществления препараты альбумина, описанные в данном документе, используют для приготовления лекарственного средства, чтобы стабилизировать лекарственное средство, или чтобы сделать лекарственное средство более растворимым, или для повышения эффективности лекарственного средства или для других целей, или для средства доставки лекарства. В этом контексте термины «лекарственное средство» и «или активный агент» могут быть взаимозаменяемыми. В одном варианте осуществления препараты альбумина, описанные в данном документе, используются для криоконсервации стволовых клеток или эмбрионов для терапии стволовыми клетками или экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).
[00195] Таким образом, данное изобретение относится к способу лечения пациента, нуждающегося в лечении альбумином, причем указанный способ включает введение указанному субъекту эффективного количества препаратов или композиций альбумина, описанных в данном документе. Данное изобретение обеспечивает применение описанных в данном документе препаратов альбумина для лечения пациента, нуждающегося в лечении альбумином. Данное изобретение обеспечивает препараты альбумина, описанные в данном документе, для применения при лечении пациента, нуждающегося в лечении альбумином.
[00196] В варианте осуществления указанное введение или применение не стимулирует или не увеличивает ЭМП у указанного субъекта. В другом варианте осуществления указанное введение или применение предотвращает или минимизирует ЭМП или уменьшает стимуляцию ЭМП у указанного субъекта. В варианте осуществления такое введение или применение не приводит к или почти не приводит к увеличению ЭМП, и в другом варианте осуществления ингибирует или уменьшает ЭМП у субъекта. Используемый в данном документе термин «не стимулирует или не повышает ЭМП», «предотвращает или минимизирует ЭМП» или «не приводит к или по существу не приводит к увеличению ЭМП» означает, что введение или применение композиции или препарата, описанных в данном документе, не приводит к или по существу не приводит к увеличению ЭМП по сравнению с коммерчески известными препаратами альбумина. Эти выражения также означают, что введение или применение композиции или препарата, описанных в данном документе, приводит к более низкому уровню ЭМП у субъекта по сравнению с уровнем ЭМП, возникающим в результате лечения октановой кислотой и/или солью октановой кислоты или композицией, содержащей альбумин и октановую кислоту и/или соль октановой кислоты в концентрации 0,08 миллимоль на грамм альбумина или в отсутствии анти-ЭМП агента. «Ингибирует или снижает ЭМП» означает, что введение или применение композиции или препарата, описанных в данном документе, не только не приводит к увеличению или по существу не приводит к увеличению ЭМП, но также снижает уровень ЭМП у субъекта по сравнению с уровнем ЭМП у субъекта до лечения. Термин «по существу не увеличивает ЭМП», используемый в данном документе, означает, что введение или применение не приводит к значительному увеличению ЭМП, что в вариантах осуществления относится к менее чем 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1% увеличения ЭМП по сравнению с периодом до лечения субъекта композицией или препаратом, описанными в данном документе.
[00197] ЭМП может оцениваться различными способами, известными в данной области техники, например, путем оценки экспрессии или уровня одного или более маркеров, связанных с ЭМП. Примеры включают определение экспрессии или уровня эпителиального биомаркера и/или экспрессии или уровня мезенхимального биомаркера. Кроме того, в продаже имеются многочисленные реактивы, продукты и наборы для оценки ЭМП. В одном варианте осуществления ЭМП может быть определена путем оценки ТФР-β-индуцированной экспрессии коллагена в эпителиальных клетках проксимальных канальцев человека, причем увеличение ТФР-β-индуцированной экспрессии коллагена в эпителиальных клетках проксимальных канальцев человека указывает на увеличение ЭМП, и снижение ТФР-β-индуцированной экспрессии коллагена в эпителиальных клетках проксимальных канальцев человека свидетельствует о снижении ЭМП.
[00198] В варианте осуществления препараты альбумина или композиции анти-ЭМП агентов, описанных в данном документе, используются для лечения заболевания или патологического состояния, при котором было бы полезно предотвращать или минимизировать ЭМП (для предотвращения или минимизации чрезмерного заживления ран или образования рубцов), например, у пациентов, страдающих от ожогов (например, тяжелых ожогов или метастазирования), пациентов, перенесших трансплантацию органов, пациентов с гепаторенальным синдромом (например, для предотвращения или уменьшения поражений органов, связанных с такими патологическими состояниями), или пациентов с раком (например, повышение эффективности химиотерапии), или пациенты с раковыми заболеваниями (например, предотвращение стимуляции ЭМП, которая участвует в процессе метастазирования).
[00199] Описанные в данном документе препараты альбумина, как правило, вводят взрослому человеку в дозе от 5 до 12,5 г альбумина за раз. Описанные в данном документе препараты альбумина или композиции анти-ЭМП агента могут вводиться один раз в неделю, два раза в неделю, каждые трое суток, каждые двое суток, один раз в сутки или примерно от двух до четырех доз в сутки или только один раз, в зависимости от патологического состояния.
[00200] В одном варианте осуществления альбумин в любых композициях, упомянутых в данном документе, находится в концентрации от 1% до 40%, от 2% до 40%, от 5% до 40%, от 5% до 30%, от 5% до 25%, от 20% до 25%, около 5%, около 10%, около 15%, около 20% или около 25%.
[00201] В одном варианте осуществления препарат альбумина или композиция анти-ЭМП агента, описанные в данном документе, дополнительно содержит активный ингредиент. В варианте осуществления активный ингредиент конъюгирован с альбумином. В другом варианте осуществления активный ингредиент не конъюгирован с альбумином.
[00202] Термин «активный агент» можно заменить на «активный ингредиент». Фармацевтически активный агент может быть выбран из множества известных классов лекарств, включая, например, аналгезирующие средства, анестетики, противовоспалительные агенты, противопаразитарные (например, антигельминтики), противоаритмические средства, противоастматические средства, антибиотики, противоопухолевые средства, антикоагулянты, антидепрессанты, противодиабетические средства, противоэпилептические средства, антигистаминные средства, противокашлевые средства, гипотензивные средства, антимускариновые средства, противомикобактериальные средства, антинеопластические средства, антиокислительные агенты, противолихорадочные средства, иммунодепрессанты, иммуностимуляторы, антитиреоидные агенты, противовирусные агенты, анксиолитики (снотворные и нейролептические средства), вяжущие средства, бактериостатические средства, агенты, блокирующие бета-адренорецепторы, препараты и заменители крови, бронхолитические средства, буферные агенты, сердечные инотропные агенты, химиотерапевтические средства, контрастные вещества, кортикостероиды, средства от кашля (отхаркивающие и муколитические средства), диагностические средства, средства диагностической визуализации, диуретики, дофаминергические средства (противопаркинсонические средства), средства для захвата свободных радикалов, факторы роста, кровоостанавливающие препараты, иммунологические агенты, липидрегулирующие агенты, миорелаксанты, белки, пептиды и полипептиды, парасимпатомиметики, паратгормон, кальцитонин и бисфосфонаты, простагландины, радиофармацевтические препараты, гормоны, половые гормоны (включая стероиды), связывающие вещества с замедленным высвобождением, антиаллергические средства, стимуляторы и анорексигенные средства, стероиды, симпатомиметики, тиреоидные вещества, вакцины, сосудорасширяющие средства и ксантины.
[00203] В варианте осуществления фармацевтически активный ингредиент нерастворим или слабо растворим в воде. Примеры фармацевтически активного ингредиента, который может быть включен с альбумином в композицию, включают аминоглутетимид, азатиоприн, блеомицина сульфат, бусульфан, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, циклофосфамид, циклоспорин, дакарбазин, дактиномицин, даунорубицин, амицин, этопозид, фторурацил, интерферон-α, ломустин, меркаптопурин, метотрексат, митотан, прокарбазина гидрохлорид, тиогуанин, винбластина сульфат, винкристина сульфат, таксаны (например, паклитаксел, доцетаксел, кабазитаксел, гидрофобные производные доцетаксела, такие как 2’-O-гексаноилдоцетаксел, и 2’-бензоилдоцетаксел); макролиды, такие как рапамицин и его производные (например, темсиролимус и эверолимус), эпотилон В и его производные, танеспимицин и его производные; камптотецины, включая, но не ограничиваясь этим, 10-гидроксикамптотецин, SN-38 и его производные; антрациклиновые антибиотики, включая, но не ограничиваясь этим, аклациномицин и пирарубицин; или другие фармацевтически активные ингредиенты, включая колхицин и его производные, димер тиоколхицина, амиодарон, лиотиронин, циклоспорин, экземестан, флутамид, фулвестрант, ромидепсин, семустин, ибупрофен, циклоспорин, пропофол, винбластин и тому подобное. В некоторых вариантах осуществления активный ингредиент представляет собой противораковое лекарственное средство, например, таксан, камптотецин, иринотекан, гемцитабин, циклофосфамид (Cytoxan™), доксорубицин или цисплатин, предпочтительно таксан, такой как паклитаксел или доцетаксел. В конкретных вариантах осуществления активный ингредиент представляет собой паклитаксел.
[00204] В одном варианте осуществления альбумин находится в форме наночастиц. Таким образом, в другом аспекте данное изобретение относится к наночастицам, содержащим (i) альбумин, (ii) анти-ЭМП агент; и (iii) фармацевтически активный (например, терапевтический) агент, включенный или инкапсулированный в указанный альбумин. Таким образом, в другом аспекте данное изобретение обеспечивает наночастицу, содержащую (i) альбумин, (ii) не содержащую октановую кислоту и/или соль октановой кислоты или содержащую низкую концентрацию октановой кислоты и/или соли октановой кислоты. Упомянутая «низкая концентрация» описана выше. Наночастицы, содержащие альбумин и фармацевтически активный агент, и способы их получения раскрыты, например, в публикациях РСТ № WO2015/018380 и WO2016/000653.
[00205] Используемый в данном документе термин «наночастицы» относится к частицам, имеющим размер в наномасштабе, например, на уровне около 1 нм, около 10 нм, около 100 нм или около 500 нм. В варианте осуществления наночастицы имеют размер от около 1 нм до около 500 нм, от около 10 нм до около 200 нм, например, от около 30, 50, 70, 80 или 100 до около 120, 140, 160, 180 или 200 нм, или в диапазоне между любыми двумя числовыми значениями выше.
[00206] В одном варианте осуществления массовое соотношение альбумина к фармацевтически активному ингредиенту в композиции (например, наночастиц) составляет от около 0,01: 1 до около 100: 1. В других вариантах осуществления массовое соотношение альбумина к фармацевтически активному ингредиенту в композиции (наночастицы) составляет от около 0,02: 1 до около 50: 1; от около 0,05: 1 до около 20: 1; от около 0,1: 1 до около 10: 1; или от около 0,2: 1 до около 5: 1, или диапазон между любыми двумя числовыми значениями выше.
[00207] В варианте осуществления фармацевтическая композиция в жидкой форме содержит от около 0,1% до около 40% (масса/объем), например, от около 0,5% (масса/объем), 1% (масса/объем) или 2% (масса/объем) до около 5% (масса/объем), около 10% (масса/объем), около 15% (масса/объем), около 20% (масса/объем), около 30% (масса/объем) или около 35% (масса/объем) альбумина. В некоторых вариантах осуществления композиция в жидкой форме содержит от около 20% до около 25% (масса/объем) альбумина или в диапазоне между любыми двумя числовыми значениями, приведенными выше.
[00208] Используемый в данном документе термин «около» означает +/- 10% от значения, определенного термином «около», и предпочтительно +/- 5% от значения, определенного термином «около».
nd
th
[00209]  В варианте осуществления данное изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую композицию или препарат, определенные в данном документе, и дополнительно содержащую один или более фармацевтически приемлемых носителей или наполнителей. Такие фармацевтические композиции могут быть получены способом, хорошо известным в области фармацевтики. Носитель/наполнитель может быть подходящим, например, для внутривенного, парентерального, подкожного, внутримышечного, внутричерепного, интраорбитального, периокулярного, внутрижелудочкового, внутрисуставного, интраспинального, интратекального, эпидурального, интрацистернального, ректального, внутрибрюшинного, интраназального или ингаляционного (например, аэрозольного) введения (см. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Loyd V Allen, Jr, 2012, 22 edition, Pharmaceutical Press; Handbook of Pharmaceutical Excipients, Rowe et al., 2012, 7 edition, Pharmaceutical Press). Терапевтические составы готовят с использованием стандартных способов, известных в данной области техники, путем смешивания композиции или препарата, имеющих желаемую степень чистоты, с одним или более необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями и/или стабилизаторами.
[00210] Используемый в данном документе термин «наполнитель» имеет обычное значение в данной области техники и представляет собой любой ингредиент, который сам не является активным ингредиентом (лекарственным средством). Наполнители включают, например, буферы, разбавители, смазывающие вещества, стабилизатор и другие компоненты. «Фармацевтически приемлемый наполнитель» в контексте данного описания относится к любому наполнителю, который не влияет на эффективность биологической активности активных ингредиентов и который не токсичен для субъекта, то есть представляет собой тип наполнителя и/или предназначен для применения в количестве, которое не токсично для субъекта. Наполнители хорошо известны в данной области техники, и данная система не ограничена в этом отношении. Специалистам в данной области техники понятно, что один наполнитель может выполнять более двух функций одновременно, например, он может действовать как связывающий агент и загуститель. Специалистам также будет понятно, что эти термины необязательно являются взаимоисключающими.
[00211] В одном варианте осуществления препарат альбумина или композиция анти-ЭМП агента, описанные в данном документе, представляют собой суспензию или раствор, например, суспензию или раствор для инъекций. Композиция или препарат альбумина могут быть суспендированы или растворены в любой подходящей жидкости или разбавителе, таком как фармацевтически приемлемая или физиологически приемлемая жидкость, которая может иметь или может не быть, или содержать наполнитель, носитель или стабилизатор. Он включает любые растворители и дисперсионные среды. Примеры жидкостей или разбавителей включают буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, в том числе аскорбиновую кислоту. Предпочтительными являются водные жидкости или разбавители, такие как вода (например, вода для инъекций), физиологический раствор, такой как физиологический раствор 0,9% NaCl (масса/объем), или pH буферный водный раствор.
[00212] Композиции для парентерального введения могут, например, содержать наполнители, стерильную воду, физиологический раствор или полиалкиленгликоли, такие как полиэтиленгликоль. Биосовместимый, биоразлагаемый полимер лактида, сополимер лактида и гликолида, или сополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена могут быть использованы для контроля высвобождения соединений. Другие потенциально полезные парентеральные системы доставки для препарата альбумина или композиции анти-ЭМП агента, описанные в данном документе, включают частицы сополимера этиленвинилацетата, осмотические насосы, имплантируемые инфузионные системы и липосомы. Композиции для ингаляции могут содержать наполнители (например, лактозу) или могут быть водными растворами, содержащими, например, лауриловый эфир полиоксиэтилена-9, гликохолат и дезоксихолат, или могут быть масляными растворами для введения в форме капель для носа или в виде геля.
[00213] Описанный в данном документе препарат альбумина или композиция анти-ЭМП агента может находиться в сухом составе (таком как лиофилизированная композиция) или суспендироваться в биосовместимой среде. В вариантах осуществления, где фармацевтическая композиция находится в форме лиофилизированного порошка, она содержит один или более наполнителей для лиофилизации, такие как стабилизатор(ы) и объемообразующий агент(ы), маннит, сахароза, лактоза, мальтоза, трегалоза, декстран, буфер, вода или еще, или их смесь. Подходящие биосовместимые среды включают, но не ограничиваются ими, воду, забуференные водные среды, физиологический раствор, забуференный солевой раствор, необязательно забуференные растворы аминокислот, необязательно забуференные растворы белков, необязательно забуференные растворы сахаров, необязательно забуференные растворы витаминов, необязательно забуференные растворы синтетических полимеров, липидсодержащие эмульсии и тому подобное. В некоторых вариантах композиция находится в стерильном лиофилизированном порошке. В некоторых вариантах композицию восстанавливают стерильной или водой, или буфером. Например, композиция (такая как фармацевтическая композиция) может быть восстановлена в растворе хлорида натрия, таком как буфер 0,9% хлорида натрия.
[00214] В другом варианте осуществления препарат альбумина или композиция анти-ЭМП агента, описанные в данном документе, предназначены для местного применения. Форма препарата для местного применения может представлять собой любую форму, такую как крем, эмульсия, масло, пена, гель, лосьон, мазь, паста, спрей или суспензия. Препарат/композиция для местного применения необязательно содержит один или более местно приемлемых вспомогательных агентов, которые включают, например, носители, наполнители, эмульгаторы, поверхностно-активные вещества, консерванты, масла, загустители, полимеры, гелеобразователи, регуляторы консистенции, антиоксиданты, пеногасители, антистатики, смолы, растворители, усилители растворимости, нейтрализующие агенты, стабилизаторы, стерилизующие агенты, распыляющие вещества, водорастворимые или диспергируемые кремнийсодержащие полимеры, увлажнители, смягчающие средства или любые их смеси. Обычные гелеобразующие агенты, которые могут быть включены в составы для местного применения, включают один или более из следующих, но не ограничиваются ими, гидроксиэтилцеллюлозу, карбомер, гомополимер полиэтилена, сополимер полиэтилена с винилацетатом, сополимер полиэтилена с акриловой кислотой, азелаиновую кислоту, алоэ вера, лецитин, термообратимые полисахариды и цетилгидроксиэтилцеллюлозу.
[00215] При желании фармацевтическая композиция для введения может также содержать незначительные количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие агенты, рН-буферные агенты и тому подобное, например, ацетат натрия, сорбитанмонолаурат, триэтаноламин ацетат натрия, олеат триэтаноламина и т.д. При желании также могут быть добавлены красители.
[00216] В другом аспекте данное изобретение относится к способам применения препарата альбумина или композиции анти-ЭМП агента, описанных в данном документе. Препарат альбумина или композиция анти-ЭМП агента, описанные в данном документе, могут быть использованы для лечения любых заболеваний или расстройств, которые реагируют на активный ингредиент.
[00217] Например, препарат альбумина или композиция анти-ЭМП агента, описанные в данном документе, могут содержать один или более противораковых агентов и могут использоваться для лечения рака, такого как рак печени, рак предстательной железы и рак легкого. Дополнительные заболевания или расстройства, которые можно лечить, включают рак молочной железы, множественную миелому, отторжение трансплантата, рак толстой кишки или лимфому. В одном варианте осуществления рак не является раком поджелудочной железы.
[00218] В конкретном аспекте данное изобретение относится к способу лечения рака, который включает введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции или наночастиц, представленных в данном документе, субъекту, нуждающемуся в этом, причем фармацевтически активный ингредиент представляет собой противоопухолевый или химиотерапевтический агент.
[00219] В конкретных вариантах осуществления субъект представляет собой млекопитающее, включая, но не ограничиваясь этим, человека, собаку, мышь и крысу. В конкретных вариантах осуществления альбумин является сингенным по отношению к субъекту.
[00220] Любое подходящее количество фармацевтической композиции может быть введено субъекту. Дозы будут зависеть от многих факторов, включая способ введения.
[00221] Для предотвращения, лечения или снижения тяжести данного заболевания или патологического состояния, подходящая доза композиции будет зависеть от типа заболевания или патологического состояния, подлежащего лечению, серьезности и течения заболевания или патологического состояния, от того, будет ли композиция вводится в профилактических или терапевтических целях, от предыдущей терапии, истории болезни пациента и реакции на композицию, и усмотрения лечащего врача. Композицию удобно вводить пациенту одноразово или в течение серии курсов лечения. Предпочтительно желательно определить кривую доза-эффект in vitro, а затем на подходящих животных моделях до тестирования на людях. Данное изобретение обеспечивает дозы для соединений и композиций, содержащих их. В случае повторных введений в течение нескольких суток или более, в зависимости от патологического состояния, лечение продолжают до достижения желаемого подавления симптомов заболевания. Однако, могут быть полезными другие схемы приема лекарственного средства. Эффективность такой терапии легко контролировать при помощи традиционных методик и методов анализа.
Примеры
[00222] Варианты осуществления данного изобретения приведены ниже в качестве примеров.
Пример 1: Приготовление композиции альбумина и деканоата натрия путем истощения/замены октаноата натрия
[00223] В качестве исходного материала использовали человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) в концентрации 200 г/л в растворе 0,12 М NaCl, 30 мМ каприлата (октаноата натрия) (Sigma, каталожный № C5038-1KG). Данный образец разбавляли 1:20 в 0,12 М NaCl, что приводило к получению раствора альбумина в концентрации около 10 г/л. Затем этот образец подвергали диафильтрации (т.е. замене буфера) 8 раз с 0,12 М NaCl и повторно концентрировали до около 50 г/л альбумина. Затем выполняли вторую стадию диафильтрации с раствором, содержащим 30 мМ деканоата натрия и 0,12 М NaCl для 3 диафильтрационных объемов, и образец доводили до конечной концентрации альбумина 200 г/л с 30 мМ деканоата натрия.
[00224] Количественное определение деканоата натрия в композиции человеческого сывороточного альбумина проводили в соответствии со способом, описанным в Примере 2.
Пример 2: Обнаружение деканоата натрия в сравнении с октаноатом натрия в растворе альбумина
[00225] Количественный метод определения октаноата натрия в растворе альбумина основан на публикации Dengler T. et al.,  Infusionstherapie 15: 273-274 (6/1988). Внутренним стандартом для обращенной фазы был деканоат натрия. Для количественного определения деканоата натрия в качестве стандарта использовали октаноат натрия, а деканоат натрия был комплексообразующим агентом. Для определения относительного ответа при 214 нм и относительного извлечения октановой и декановой кислот, выделенных из композиции человеческого сывороточного альбумина
[00226] Композиция альбумина, полученная в результате замены октаноата натрия деканоатом натрия, и растворы 40 мМ каприлата натрия (октаноата натрия) и 40 мМ деканоата натрия были подвергнуты анализу методом ВЭЖХ для подтверждения того, что октаноат натрия полностью заменен деканоатом натрия в композиции альбумина.
[00227] Подготовка образца: 250 мкл тестируемых композиций добавляли к 800 мкл метанола и встряхивали в течение 20 секунд. Осадок центрифугировали при 10 тысяч об/мин в течение 5 минут, и супернатант удаляли и фильтровали через фильтр Millex™ HV с диаметром пор 0,45 мкм. Аликвоты были перенесены во флаконы автоматического дозатора. Обращенно-фазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию экстрактов проводили на колонке Nucleosil-C18 (5 мкм) 4,6×250 мм с 0,1% трифторуксусной кислотой (TFA) в смеси метанол/вода (4: 1) в качестве подвижной фазы при скорости потока 0,8 мл/мин. Вводили 20 мкл. Детектирование осуществляли по ультрафиолетовому (УФ) поглощению при 214 нм. Каждый образец экстракта вводили три раза и площадь пика усредняли. Анализ методом ВЭЖХ проводили на Hewlett Packard Model 1100 HPLC с диодно-матричным детектором G1315B, насосом для четырехкомпонентных смесей G1311A, термостатируемым автоматическим дозатором G1329A, термостатируемым колоночным отделением G1316A и компьютером HP Compaq d530c (WIN XP) с использованием программного обеспечения Chemstation 10.02. Выполняли обращенно-фазовый изократический анализ с использованием колонки Alltech Nucleosil C-18, 4,6 мм × 250 мм, 5 мкм.
[00228] Как показано на Фиг. 1, было обнаружено, что в композиции альбумина, полученной в Примере 1, не остается детектируемого количества октаноата натрия. Это означает, что октаноат натрия, первоначально комплексированный с альбумином, был успешно удален и заменен деканоатом натрия.
Пример 3: Приготовление композиции альбумина, содержащей деканоат натрия и чистый человеческий альбумин
[00229] Для этого эксперимента использовали человеческий сывороточный альбумин (ЧСА - свободная жирная кислота) от Sigma-Aldrich (№ A1887). Этот человеческий сывороточный альбумин также называют «чистым человеческим альбумином», он содержит только следы жирных кислот в 0,007% (масса/масса) или меньше. ЧСА растворяли в PBS до получения концентрации 6,6% (6,6 г / 100 мл) и фильтровали с использованием фильтра с размером пор 0,2 мкм. 75 мкл октаноата натрия или 10 мМ деканоата натрия смешивали с 75 мкл ЧСА 6,6% (без вихревой мешалки) и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. 100 мкл этой смеси использовали в анализе Примера 4 в конечном объеме 1 мл (разведение 1:10).
Пример 4: Модуляция ЭМП в ТФР-β-индуцированных эпителиальных клетках (клетки HK-2)
[00230] Был проведен анализ для определения влияния различных композиций на ТФР-β-индуцированную экспрессию коллагена 1, который является маркером ЭМП, в иммортализованных эпителиальных клетках проксимальных канальцев человека (клетки HK-2). Клетки HK-2 обрабатывали ТФР-β (индуктором ЭМП) в концентрации 10 нг/мл. Экспрессию мРНК маркера ЭМП коллагена-1 определяли при помощи количественной ПЦР в реальном времени.
-4
[00231] Композиции альбумина, полученные способом по Примеру 1 или Примеру 3, готовили или с 2,5, или с 5,0 × 10 М деканоата натрия или октаноата натрия. Чистый деканоат натрия и октаноат натрия (то есть без альбумина) в одинаковых концентрациях, а также нонановую кислота, ундекановую кислоту и лаурат натрия в указанных концентрациях испытывали параллельно.
[00232] В таблице 1 показано, что деканоат натрия, отдельно или составленный с альбумином, снижает (или ингибирует) экспрессию коллагена в ТФР-β-индуцированных клетках HK-2. Нонановая кислота, ундекановая кислота и лаурат натрия, используемые отдельно, также ингибировали экспрессию коллагена в ТФР-β-индуцированных клетках HK-2. Напротив, экспрессия коллагена была увеличена (или стимулирована) в ТФР-β-индуцированных клетках, обработанных только октаноатом натрия или составленных с альбумином. Таким образом, деканоат натрия и октаноат натрия оказывали противоположное влияние на ЭМП, что оценивалось по экспрессии ТФР-β-индуцированного коллагена 1 в клетках HK-2, причем деканоат натрия ингибировал ЭМП, а октаноат натрия стимулировал ЭМП, и такие эффекты сохранялись в присутствии альбумина. Нонановая кислота, ундекановая кислота и лаурат натрия, по-видимому, оказывает эффект на ЭМП, сходный с эффектом деканоата натрия. Присутствие и отсутствие альбумина в композиции не влияет на ЭМП, что свидетельствует о том, что ингибирование или стимуляция ЭМП является результатом присутствия в композиции жирной кислоты или соли. «ЧСА» относится к композиции альбумина, полученной из чистого альбумина в соответствии с Примером 3. «ALB» относится к композиции альбумина, полученной обеднением октаноата натрия и заменой деканоатом натрия в соответствии с Примером 1.
Таблица 1: Экспрессия мРНК коллагена клетками HK-2 после обработки C8-C12 жирной кислотой или ее солью; отдельно или в комбинации с альбумином.
Соединение(я)
Число углеродных атомов жирной кислоты
Концентрация жирной кислоты
Изменения в экспрессии мРНК коллагена (относительно клеток, обработанных ТФР-β)
Октаноат натрия
8
5,0×10<sup>-4</sup> M
24,1% повышение
2,5×10<sup>-4</sup> M
42,2% повышение
ЧСА / октаноат натрия
8
5,0×10<sup>-4</sup> M
58,3% повышение
2,5×10<sup>-4</sup> M
28,7% повышение
ALB / октаноат натрия
8
5,0×10<sup>-4</sup> M
37,0% повышение
2,5×10<sup>-4</sup> M
28,7% повышение
Нонановая кислота
9
6,3×10<sup>-7</sup> M
51,4% повышение
Декановая кислота
10
5,8×10<sup>-7</sup> M
105,4% повышение
Деканоат натрия
10
5,0×10<sup>-4</sup> M
103,4% повышение
2,5×10<sup>-4</sup> M
66,6% повышение
ЧСА / деканоат натрия
10
5,0×10<sup>-4</sup> M
54,1% повышение
2,5×10<sup>-4</sup> M
19,1% повышение
ALB / деканоат натрия
10
5,0×10<sup>-4</sup> M
86,7% снижение
2,5×10<sup>-4</sup> M
71,7% снижение
Ундекановая кислота
11
2,7×10<sup>-7</sup> M
120,95% снижение
Лаурат натрия
12
1,0×10<sup>-4</sup> M
113,7% снижение
[00233] Было также проверено влияние свободных C10-C14 триглицеридов (с насыщенными углеродными цепями) на экспрессию мРНК коллагена клетками HK-2. Результаты представлены в Таблице 2.
Таблица 2: Экспрессия мРНК коллагена клетками HK-2 после обработки композициями, содержащими C10-C14 триглицериды
Название триглицерида
Число углеродных атомов в цепях
Концентрация триглицерида
Изменения в экспрессии мРНК коллагена (относительно клеток, обработанных ТФР-в)
Трикаприн
C10
5%
120,4% снижение
Триглицерид, состоящий из двух C8 жирных кислот и одной C10 жирной кислоты
C8 и C10в соотношении 2: 1
5%
46,05% снижение
Трилаурин
C12
5%
84,6% снижение
Тримиристин
C14
5%
52,3% снижение
[00234] Сравнивая результаты в Таблице 2 для трикаприна и смеси триглицеридов, имеющей 70% C8 цепи и 30% C10 цепи, можно отметить, что присутствие 70% C8 цепи снижает ингибирование экспрессии коллагена.
[00235] Соотношения октаноат натрия: деканоат натрия 100: 0, 95: 5, 70: 30, 50: 50, 30: 70, 5: 95 и 0: 100 были протестированы в композициях с альбумином и без альбумина в вышеописанной модели in vitro. Различные комбинации соли жирной кислоты и альбумина были получены способом, описанным в Примере 3. Экспрессия мРНК коллагена 1α1 представлена на Фиг. 2. В ПЦР в реальном времени использовали анализ экспрессии генов человека TaqMan, нормализованный к эндогенному контролю ГАФДГ человека. Стандартом является контроль ТФР-ß1 (RQ = 1). * и ** означают р-значение 0,05 и 0,01, соответственно, по сравнению со стандартом. Исследуемая концентрация смеси октаноата натрия и деканоата натрия составляет 500 мкМ. Количество экспериментов составляет 3 (n = 3).
[00236] Во-первых, результаты, приведенные на Фиг. 2, подтверждают, что альбумин не влияет на экспрессию коллагена, и, следовательно, не влияет на ЭМП. Во-вторых, можно отметить, что экспрессия коллагена зависит от соотношения деканоата натрия к октаноату натрия. В-третьих, можно отметить, что значительное снижение экспрессии коллагена наблюдается, когда деканоат натрия присутствует в количестве 30% от общего содержания соли жирных кислот или более. Соотношения 70:30, 50:50, 30:70, 5:95 и 0: 100 октаноат натрия: деканоат натрия значительно уменьшают или ингибируют экспрессию коллагена. Это подтверждает, что соотношение 70:30 октаноат натрия: деканоат натрия является минимальным соотношением, при котором ингибирующий эффект деканоата натрия успешно компенсирует стимулирующий эффект октаноата натрия. Стимулирующий эффект октаноата натрия подтверждается в этом исследовании в соотношениях 100: 0 и 95: 5 октаноат натрия: деканоат натрия, где наблюдаемая экспрессия коллагена поднимается выше уровня контроля (клетки HK-2, обработанные ТФР-β1).
Пример 5: Модуляция ЭМП в ТФР -β-индуцированных микрососудистых эндотелиальных клетках человека (HMEC)
[00237] Эндотелиальный мезенхимальный переход (ЭндоМП), который включен в определение выражения ЭМП, как используется в данном описании, может быть индуцирован трансформирующим фактор роста (ТФР-β). Был проведен анализ ЭндоМП, и метод анализа описан в Примере 4. В ПЦР в реальном времени использовали анализ экспрессии генов человека TaqMan, нормализованный к эндогенному контролю ГАФДГ человека. Стандартом является контроль ТФР- ß1 (RQ = 1). ** и *** означают р-значение 0,01 и 0,001, соответственно, по сравнению со стандартом. Исследуемая концентрация октаноата натрия и деканоата натрия составляет 500 мкМ. Количество экспериментов составляет 3 (n = 3).
[00238] На Фиг. 4 показана индукция ЭндоМП при помощи ТФР-β, и она выражается в увеличении экспрессии мРНК коллагена 1a1. На Фиг. 4 также показано, что деканоат натрия, как в присутствии альбумина (с ЧСА), так и в отсутствии альбумина (без ЧСА), значительно уменьшил мезенхимальный переход, который был индуцирован ТФР-β, в отличие от октаноата натрия. Следовательно, анти-ЭМП агент согласно данному изобретению успешно ингибирует или уменьшает ЭМП в эндотелиальных клетках.
Пример 6: Модуляция ЭМП в ТФР-β-индуцированных клетках гепатоцеллюлярной карциномы человека: HepG2
[00239] Анализ ЭМП проводили, следуя способу, который описан в Примере 4, в человеческой клеточной линии гепатоцеллюлярной карциномы HepG2. Эти клетки высоко дифференцированы и обладают многими генотипическими признаками нормальных клеток печени (Sassa et al. 1987). Следовательно, клетки HepG2 можно использовать для скрининга на ЭМП, и, как показано на Фиг. 5, ТФР-β также увеличивает экспрессию мРНК коллагена 1a1, маркера ЭМП. В ПЦР в реальном времени использовали анализ экспрессии генов человека TaqMan, нормализованный к эндогенному контролю ГАФДГ человека. Стандартом является контроль ТФР-ß1 (RQ = 1). *, ** и **** означают р-значение 0,05, 0,01 и 0,0001, соответственно, по сравнению со стандартом. Исследуемая концентрация октаноата натрия и деканоата натрия составляет 500 мкМ. Количество экспериментов составляет 3 (n = 3).
[00240] На Фиг. 5 показано, что деканоат натрия, как в присутствии альбумина (с ЧСА), так и в отсутствии альбумина (без ЧСА), значительно уменьшил мезенхимальный переход, который был индуцирован ТФР-β, в отличие от октаноата натрия. Следовательно, анти-ЭМП агент согласно данному изобретению успешно ингибирует или уменьшает ЭМП в клетках печени.
Пример 7: Модуляция ЭМП в ТФР-β-индуцированной эпителиальной клетке легкого человека A549
[00241] Анализ ЭМП также проводили способом, описанным в Примере 4, в эпителиальной клетке легкого человека A549. ТФР-β также увеличивает экспрессию мРНК коллагена 1a1 в эпителиальной клетке легкого человека A549, маркере ЭМП. В ПЦР в реальном времени использовали анализ экспрессии генов человека TaqMan, нормализованный к эндогенному контролю ГАФДГ человека. Стандартом является контроль ТФР-ß1 (RQ = 1). *** и **** означают р-значение 0,001 и 0,0001, соответственно, по сравнению со стандартом. Исследуемая концентрация октаноата натрия и деканоата натрия составляет 500 мкМ. Количество экспериментов составляет 3 (n = 3).
[00242] На Фиг. 6 показано, что деканоат натрия, как в присутствии альбумина (с ЧСА), так и в отсутствии альбумина (без ЧСА), значительно уменьшил мезенхимальный переход, индуцированный ТФР-β, в отличие от октаноата натрия, который не дал значительных результатов. Следовательно, анти-ЭМП агент согласно данному изобретению успешно ингибирует или уменьшает ЭМП в клетках легкого.
Пример 8: Модуляция ЭМП в ТФР-β-индуцированной клетке PC-3 рака предстательной железы человека
[00243] Эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) представляет собой процесс, при котором эпителиальные клетки теряют свою клеточную полярность и клеточную адгезию и приобретают миграционные и инвазивные свойства, превращаясь в мезенхимальные стволовые клетки; это мультипотентные стромальные клетки, которые могут дифференцироваться в различные типы клеток. ЭМП необходим для многих процессов развития, включая формирование мезодермы и нервной трубки. Также было показано, что ЭМП происходит при заживлении ран, в процессе рубцевания и в начале метастазирования в прогрессировании рака.
2
[00244] Данный эксперимент иллюстрирует анализ ЭМП раковых клеток посредством инвазии/миграции клеток PC-3 в «анализе методом зарастания царапины».  Данный анализ основан на наблюдении, что после создания нового искусственного разрыва, так называемой «царапины», на монослое сливающихся клеток, клетки на краю вновь созданного разрыва будут двигаться в направлении разрыва, чтобы закрыть царапину. ЭФР (эпидермальный фактор роста) использовали для индукции миграции/инвазии клеток PC-3 в царапину. Вкратце, культуральные вставки помещают в 24-луночный планшет для культивирования клеток. Клетки РС-3 высевают в культуральные вставки и инкубируют в течение ночи при 37°С в CO-инкубаторе. Затем клетки культивируют в бессывороточной среде в течение еще 24 часов. Вставка удаляется, оставляя видимый бесклеточный зазор в 500 мкм. Клетки обрабатывали в течение 24 часов ЭФР при 50 нг/мл и митомицином C при 10 мкг/мл (митомицин + ЭФР) и про-ЭМП агентом, октаноатом натрия (митомицин + ЭФР + октаноат натрия) или анти-ЭМП агентом, деканоатом натрия (митомицин + ЭФР + деканоат натрия) с ЧСА (второй ряд на Фиг. 7) и без ЧСА (первый ряд на Фиг. 7). Снимки делают через 1 час после обработки в качестве контроля степени смыкания монослоя для каждой группы. Через 24 часа клетки фиксируют с окрашиванием Crystal Violet (кристаллический фиолетовый) и сушат на воздухе перед тем, как сделать снимок через 24 часа после обработки. Фотографии представлены на Фиг. 7.
[00245] На Фиг. 7 можно отметить, что ЭФР способствует миграции или инвазии клеток PC-3, обработанных митомицином. На Фиг. 7 продемонстрировано, что добавление деканоата натрия (с альбумином и без него) к клеточной культуре вызывает ингибирование ЭФР-индуцированной миграции или инвазии PC-3, тогда как октаноат натрия не ингибирует миграцию клеток. Эта миграция увеличивается, когда октаноат натрия комбинируется с альбумином.
* * *
[00246] Объем формулы изобретения не должен ограничиваться предпочтительными вариантами осуществления, изложенными в примерах, но должен иметь самую широкую интерпретацию, согласующуюся с описанием в целом.