УДАЛЕНИЕ И ВОССТАНОВЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ КЛЕТОК В ОРГАНАХ И ТКАНЯХ
CELL CONTENT REMOVAL AND RECOVERY IN ORGANS AND TISSUES

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к органам и тканям, а конкретнее, к способам и материалам для удаления и восстановления содержания клеток в органах и тканях.
Предпосылки изобретения
Матрицы биологического происхождения были разработаны для тканевой инженерии и регенерации. Однако матрицы, разработанные до настоящего времени, в целом имеют нарушенную матричную структуру и не имеют сосудистого ложа, которое обеспечивает возможность эффективной реконструкции органа или ткани. В настоящем описании описаны способы удаления и восстановления содержания клеток в органах и тканях.
Краткое описание сущности изобретения
Изобретение относится к способам и материалам для удаления клеток из органа и ткани, а также к способам и материалам для восстановления содержания клеток в бесклеточном органе или ткани.
В одном из аспектов, изобретение относится к бесклеточному сердцу млекопитающего. Бесклеточное сердце млекопитающего включает бесклеточную внеклеточную матрицу сердца, которая имеет наружную поверхность. Внеклеточная матрица бесклеточного сердца по существу сохраняет морфологию внеклеточной матрицы перед удалением клеток, и наружная поверхность внеклеточной матрицы является по существу интактной.
Характерные примеры сердца включают без ограничения сердца грызунов, сердца свиней, сердца кроликов, сердца коров, сердца овец или сердца собак. Другой пример сердца представляет собой сердце человека. Бесклеточное сердце может быть трупным. В некоторых вариантах осуществления, бесклеточное сердце представляет собой часть всего сердца. Например, часть всего сердца может включать без ограничения участок сердца, аортальный клапан, митральный клапан, клапан легочной артерии, трехстворчатый клапан, правое предсердие, левое предсердие, правый желудочек, левый желудочек, перегородку, коронарную сосудистую сеть, легочную артерию или легочную вену.
В другом аспекте, изобретение относится к солидному органу. Солидный орган, как указано в описании, включает описанное выше бесклеточное сердце и популяцию регенеративных клеток, прикрепленных к нему. В некоторых вариантах осуществления. регенеративные клетки представляют собой плюрипотентные клетки. В некоторых вариантах осуществления, регенеративные клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки, клетки пупочного канатика, стволовые клетки или клетки-предшественники, полученные у взрослых, клетки, полученные из костного мозга, клетки, полученные из крови, мезенхимальные стволовые клетки (MSC), клетки, полученные из скелетных мышц, мультипотентные взрослые клетки-предшественники (МАРС), стволовые клетки сердца (CSC) или стволовые клетки, происходящие из мультипотентных взрослых сердечных клеток. В некоторых вариантах осуществления, регенеративные клетки представляют собой сердечные фибробласты, клетки микрососудистой системы сердца или аортальные эндотелиальные клетки.
В целом, количество регенеративных клеток, присоединенных к бесклеточному сердцу, составляет по меньшей мере примерно 1000. В некоторых вариантах осуществления, количество регенеративных клеток, присоединенных к бесклеточному сердцу, составляет от примерно 1000 клеток/мг ткани (влажной массы; т.е., массы до удаления клеток) до примерно 10000000 клеток/мг ткани (влажной массы). В некоторых вариантах осуществления регенеративные клетки гетерогенны для бесклеточного сердца. Также, в некоторых вариантах осуществления, солидный орган предназначен для трансплантации пациенту, и регенеративные клетки аутологичны для пациента.
В еще одном аспекте, изобретение относится к способу получения солидного органа. Такой способ в целом включает получение бесклеточного сердца, как описано в описании, и приведение в контакт бесклеточного сердца с популяцией регенеративных клеток в условиях, в которых регенеративные клетки прививаются, размножаются и/или дифференцируются внутри и на бесклеточном сердце. В одном из вариантов осуществления, регенеративные клетки инъецируют или перфузируют в бесклеточное сердце.
В еще одном аспекте, изобретение относится к способу удаления клеток из сердца. Такой способ включает получение сердца, введение канюли в одну или несколько полостей сердца, сосуда и/или протока для получения канюлированного сердца и перфузию канюлированного сердца первой средой, разрушающей клетки, через одну или несколько канюль. Например, перфузия можно осуществлять во многих направлениях из каждой канюлированной полости, сосуда и/или протока. Обычно среда, разрушающая клетки, включает по меньшей мере один детергент, такой как SDS (додецилсульфат натрия), PEG (полиэтиленгликоль) или Triton X.
Такой способ также может включать перфузию канюлированного сердца второй средой, разрушающей клетки, через несколько канюль. Как правило, первая среда, разрушающая клетки, может представлять собой анионный детергент, такой как SDS, а вторая среда, разрушающая клетки, может представлять собой ионный детергент, такой как Triton X. В таких способах, перфузия может продолжаться в течение примерно от 2 до 12 ч/г (влажной массы) сердечной ткани.
Если нет других определений, то все технически и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют значение, понятное среднему специалисту в данной области, к которой относится настоящее изобретение. Хотя способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описаны в настоящем документе, можно использовать в практике или при тестировании настоящего изобретения, ниже описаны подходящие способы и материалы. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными, а не ограничивающими. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, указанные в настоящем описании, полностью включены в него в качестве ссылки в полном объеме. В случае противоречий в настоящем описании, включая раздел «определения», будут сделаны соответствующие указания.
Подробное описание одного или нескольких вариантов осуществления изобретения изложены в сопроводительных чертежах в описании, ниже. Другие признаки, объекты и преимущества изобретения будут очевидны из чертежей и подробного описания, а также из формулы изобретения.
Описание чертежей
На фиг.1 представлен схематический чертеж, показывающий исходную подготовку для удаления клеток сердца. Аорта, легочная артерия и верхняя полая вена канюлированы (соответственно А, В, С), нижняя полая вена, плечеголовная артерия, левая общая сонная артерия и левая подключичная артерия перевязаны. Стрелки показывают направление перфузии в антеградном и ретроградном режиме.
На фиг.2 представлено схематическое изображение одного из вариантов осуществления устройства для удаления/восстановления содержания клеток.
Одинаковые обозначающие символы на различных чертежах указывают на одинаковые элементы.
Подробное описание
Солидные органы, как правило, имеют три основных компонента, внеклеточную матрицу (ЕСМ), располагающиеся в ней клетки и сосудистое ложе. Удаление клеток из солидного органа, как описано в описании, приводит к удалению большинства или всех клеточных компонентов, в то же время по существу сохраняя внеклеточную матрицу (ЕСМ) и сосудистое ложе. Затем бесклеточный солидный орган можно использовать в качестве каркаса для восстановления содержания клеток.
Млекопитающие, у которых можно получить солидные органы, включают без ограничения грызунов, свиней, кроликов, крупный рогатый скот, овец, собак и людей. Органы и ткани, используемые в описанных в описании способах, могут быть трупными.
Указанные в настоящем описании солидные органы включают без ограничения сердце, печень, легкие, скелетные мышцы, мозг, поджелудочную железу, селезенку, почки, матку и мочевой пузырь. Используемый здесь термин «солидный орган» относится к органу, который имеет «по существу закрытую» сосудистую систему. «По существу закрытая» сосудистая система в отношении органа означает, что при перфузии жидкостью большая часть жидкости содержится внутри солидного органа и не вытекает из солидного органа, при условии, что основные сосуды канюлированы, перевязаны или отграничены другим образом. Несмотря на наличие «по существу закрытой» сосудистой системы, многие из перечисленных выше солидных органов имеют определенные сосуды «входа» и «выхода», которые используются для введения и передвижения жидкости по всему органу во время перфузии.
В дополнение к описанным выше солидным органам, другие типы васкуляризированных органов или тканей, такие как, например, все или части суставов (например, коленных, плечевых или тазобедренных), трахея или спинной мозг, можно лишить клеток, используя описанные здесь способы. Кроме того, раскрытые здесь способы можно также использовать для удаления клеток бессосудистых тканей, таких как, например, хрящ или роговица.
Бесклеточный орган или ткань, как описано в описании (например, сердце или печень) или любая их часть (например, аортальный клапан, митральный клапан, клапан легочной артерии, трехстворчатый клапан, легочная вена, легочная артерия, коронарные сосуды, перегородка, правое предсердие, левое предсердие, правый желудочек или левый желудочек) с восстановленным содержанием клеток или без него, можно использовать для трансплантации пациенту. Альтернативно, описанный в настоящем описании орган или ткань с восстановленным содержанием клеток можно использовать для исследования, например, клеток, подвергающихся дифференциации, и/или клеточной организации органа или ткани.
Удаление клеток из органов или тканей
Изобретение относится к способам и материалам для удаления клеток из органа или ткани млекопитающего. Первоначальная стадия удаления клеток из органа или ткани представляет собой, если возможно, канюлирование органа или ткани. Сосуды, протоки и/или полости органа или ткани можно канюлировать, используя способы и материалы, известные в данной области. Следующая стадия удаления клеток из органа или ткани представляет собой перфузию канюлированного органа или ткани средой для разрушения клеток. Перфузия через орган может осуществляться во многих направлениях (например, антеградное или ретроградное).
The Isolated
Perfused Warm-Blooded Heart According to Langendorff,
Перфузия сердца по Лангендорфу широко применяется в данной области, поскольку представляет собой физиологическую перфузию (также известную как четырехкамерная перфузия в рабочем режиме). См., например, Dehnert, In Methods in Experimental Physiology и Pharmacology: Biological Measurement Techniques V.Biomesstechnik-Verlag March GmbH, West Germany, 1988. Коротко, для перфузии по Лангендорфу аорта канюлируется и присоединяется к резервуару, содержащему среду, разрушающую клетки. Среду, разрушающую клетки, можно подавать в ретроградном направлении вниз по аорте или при постоянной скорости потока, поступающем, например, путем вливания или с помощью роликового насоса, или под постоянным гидростатическим давлением. В обоих случаях, аортальные клапаны принуждаются к закрытию, и перфузионная жидкость направляется в устья коронарных артерий (посредством этого перфузируя всю желудочковую массу сердца), которая затем дренируется в правое предсердие через коронарный синус. Для перфузии в рабочем режиме, вторая канюля соединяется с левым предсердием. И перфузию можно сменить с ретроградной на антеградную.
Ann. Thorac. Surg.,
Transpl. Int.,
Clin. Sci. (Lond.)
Brain Res.,
J. Artif. Organs,
В данной области известны способы перфузии других органов и тканей. В качестве примера, в следующих ссылках описана перфузия легких, печени, почек, мозга и конечностей. Van Putte et al., 2002, 74(3):893-8; den Butter et al., 1995, 8:466-71; Firth et ak., 1989, 77(6):657-61; Mazzetti et al., 2004, 999(1):81-90;Wagner et al., 2003, 6(3):183-91.
Для удаления клеток из органа или ткани можно использовать одну или несколько сред для разрушения клеток. Среды для разрушения клеток в целом включают по меньшей мере один детергент, такой как SDS, PEG или Triton X. Среды для разрушения клеток могут включать воду, если среда осмотически несовместима с клетками. Альтернативно, среды для разрушения клеток могут включать буфер (например, PBS (солевой раствор с фосфатным буфером)) для осмотической совместимости с клетками. Среды для разрушения клеток могут также включать ферменты, такие как без ограничения одна или несколько коллагеназ, одна или несколько диспаз, одна или несколько ДНаз, или протеаза, такая как трипсин. В некоторых случаях, среды для разрушения клеток могут также или альтернативно включать ингибиторы одного или нескольких ферментов (например, ингибиторов протеазы, ингибиторов нуклеазы и/или ингибиторов коллагеназы).
В определенных вариантах осуществления, канюлированный орган или ткань можно перфузировать последовательно двумя различными средами для разрушения клеток. Например, первая среда для разрушения клеток может включать анионный детергент, такой как SDS, а вторая среда для разрушения клеток может включать ионный детергент, такой как Triton X. После перфузии по меньшей мере одной средой для разрушения клеток, например, промывочными растворами и/или растворами, содержащими один или несколько ферментов, таких как ферменты, раскрытые в настоящем описании.
Чередование направления перфузии (например, антеградного и ретроградного) может помочь эффективно удалить клетки из всего органа или ткани. Описанное в настоящем описании удаление клеток по существу удаляет клетки органа наружу, приводя к очень небольшому повреждению ЕСМ. Клетки из органа или ткани можно удалять при подходящей температуре от 4 до 40°С. В зависимости от размера и массы органа или ткани, и конкретного детергента (детергентов) и концентрации детергента (детергентов) в разрушающей клетки среде, орган или ткань в целом перфузируется разрушающей клетки средой примерно от 2 до 12 ч/г солидного органа или ткани. Включая промывания, орган можно перфузировать в течение периода до примерно от 12 до примерно 72 ч/г ткани. Перфузия в целом приближается к физиологическим условиям, включая пульсирующий поток, скорость и давление.
Как указано в настоящем описании, бесклеточный орган или ткань состоит по существу из компонента внеклеточной матрицы (ЕСМ) всех или большинства областей органа или ткани, включая компонент ЕСМ сосудистого дерева. Компоненты ЕСМ могут включать любой или все из следующих компонентов: фибронектин, ламинин, эластин, членов семейства коллагена (например, коллаген I, III и IV), гликозоаминогликаны, молотое вещество, ретикулярные волокна и тромбоспондин, которые могут оставаться организованными в виде определенных структур, таких как базальная пластинка. Успешное удаление клеток определяется как отсутствие выявляемых мышечных нитей, эндотелиальных клеток, гладкомышечных клеток и ядер в гистологических срезах с использованием стандартных процедур гистологического окрашивания. Предпочтительно, но необязательно, остаточные клеточные осколки также удалялись из бесклеточного органа или ткани.
Для эффективного восстановления содержания клеток и создания органа или ткани, важно, чтобы сохранялась морфология и архитектура ЕСМ (т.е., оставалась по существу интактной) во время и после процесса удаления клеток. Используемый здесь термин «морфология» относится к общей форме органа или ткани ЕСМ, тогда как используемый здесь термин «архитектура» относится к наружной поверхности, внутренней поверхности и ЕСМ между ними.
Морфологию и архитектуру ЕСМ можно исследовать визуально и/или гистологически. Например, базальную пластинку наружной поверхности солидного органа или внутри сосудистой сети органа или ткани не следует удалять или значительно повреждать во время удаления клеток. Кроме того, фибриллы ЕСМ должны быть такими же, как в органе или ткани, которые не были лишены клеток, или значимо не измененными.
Одно или несколько соединений можно вносить в бесклеточный орган или ткань или наносить на них, например, для сохранения бесклеточного органа, или для подготовки бесклеточного органа или ткани к удалению клеток и/или для содействия клеткам или стимуляции их во время процесса восстановления содержания клеток. Такие соединения включают без ограничения один или несколько факторов роста (например, VEGF (сосудистый эндотелиальный фактор роста), DKK-1 (ген, ингибирующий активность остеобластов), FGF (фактор роста фибробластов), BMP-1, BMP-4 (белки, участвующие в остеогенезе), SDF-1 (фактор-1, полученный из стромальных клеток), IGF (инсулиноподобный фактор роста) и HGF (фактор роста гепатоцитов)), иммуномодулирующих агентов (например, цитокинов, глюкокортикоидов, антагонистов IL2R, антагонистов лейкотриена) и/или факторов, которые модифицируют каскад свертывания (например, аспирина, белков, связывающих гепарин, и гепарина). Кроме того, бесклеточный орган или ткань можно, кроме того, обработать, например, облучением (например, УФ, гамма) для уменьшения или устранения присутствия любого типа микроорганизма, остающегося на бесклеточном органе или ткани или в них.
Восстановление содержания клеток в органах или тканях
Изобретение относится к материалам и способам создания органа или ткани. Орган или ткань можно создавать путем приведения в контакт описанных в описании бесклеточного органа или ткани с популяцией регенеративных клеток. Используемый в настоящем описании термин «регенеративные клетки» обозначает любые клетки, используемые для восстановления содержания клеток в бесклеточном органе или ткани. Регенеративные клетки могут представлять собой тотипотентные клетки, плюрипотентные клетки или мультипотентные клетки, и могут быть некоммитированными или коммитированными. Регенеративные клетки могут также представлять собой клетки одной линии дифференцировки. Кроме того, регенеративные клетки могут представлять собой недифференцированные клетки, частично дифференцированные клетки или полностью дифференцированные клетки. Указанные в настоящем описании регенеративные клетки включают эмбриональные стволовые клетки (по данным определения Национального Института Здоровья (NIH), см., например, глоссарий на сайте Интернета www.stemcells.nih.gov). Регенеративные клетки также включают недифференцированные клетки, клетки-предшественники и полученные «взрослые» стволовые клетки, включая клетки пупочного канатика и фетальные стволовые клетки.
Примеры регенеративных клеток, которые можно использовать для восстановления содержания клеток в органе или ткани, включают без ограничения эмбриональные стволовые клетки, клетки крови пупочного канатика, полученные из ткани стволовые клетки или клетки-предшественники, полученные из костного мозга стволовые клетки или клетки-предшественники, мезенхимальные стволовые клетки (MSC), клетки, полученные из скелетных мышц, или мультипотентные взрослые недифференцированные клетки-предшественники (МАРС). Дополнительные регенеративные клетки, которые можно использовать, включают сердечные стволовые клетки (CSC), мультипотентные взрослые, полученные из сердца стволовые клетки, сердечные фибробласты, эндотелиальные клетки сердечной микрососудистой системы, или эндотелиальные клетки аорты. В качестве регенеративных клеток можно также использовать полученные из костного мозга стволовые клетки, такие как мононуклеарные клетки костного мозга (BM-MNC), эндотелиальные или сосудистые стволовые клетки или недифференцированные клетки-предшественники (ЕРС).
Количество регенеративных клеток, которые вводятся в бесклеточный орган или на него для генерирования органа или ткани, зависит и от органа (например, какой орган, размер и масса органа) или ткани, и от типа и стадии развития регенеративных клеток. Различные типы клеток могут иметь различные тенденции в отношении плотности популяции, которую достигнут те клетки. Аналогичным образом, различные органы или ткани могут быть заполнены клетками с различной плотностью. В качестве примера, бесклеточный орган или ткань может «засеваться» по меньшей мере примерно 1000 (например, по меньшей мере 10000, 100000, 1000000, 10000000 или 100000000) регенеративных клеток; или иметь примерно от 1000 клеток/мг ткани (влажной массы, т.е., перед удалением клеток) до примерно 10000000 клеток/мг ткани (влажной массы), прикрепленных к ней.
Регенеративные клетки можно ввести («засеять») в бесклеточный орган или ткань инъекцией в один или несколько участков. Кроме того, в бесклеточный орган или ткань можно ввести более одного типа клеток (т.е., смесь клеток). Например, смесь клеток можно инъецировать в множественные положения в бесклеточный орган или ткань, или различные типы клеток можно инъецировать в различные части бесклеточного органа или ткани. Альтернативно, или в дополнение к инъекции, регенеративные клетки или смесь клеток можно ввести перфузией в канюлированный орган или ткань. Например, регенеративные клетки можно перфузировать в бесклеточный орган, используя перфузионную среду, которую можно затем заменить средой экспансии и/или дифференциации для индукции роста и/или дифференциации регенеративных клеток.
2
2
Во время восстановления содержания клеток, орган или ткань поддерживаются в условиях, при которых по меньшей мере некоторые из регенеративных клеток могут размножаться и/или дифференцироваться внутри и на бесклеточном органе или ткани. Эти условия включают без ограничения соответствующую температуру и/или давление, электрическую и/или механическую активность, силу, соответствующие количества О и/или СО, соответствующее количество влажности и стерильные или почти стерильные условия. Во время восстановления содержания клеток, бесклеточный орган или ткань и регенеративные клетки, прикрепленные к ним, поддерживаются в подходящей среде. Например, для регенеративных клеток могут потребоваться питательные добавки (например, питательные вещества и/или источник углерода, например, глюкоза), экзогенных гормонов или факторов роста, и/или определенного рН.
Регенеративные клетки могут быть аллогенными для бесклеточного органа или ткани (например, бесклеточного человеческого органа или ткани человека, засеянных человеческими регенеративными клетками), или регенеративные клетки могут быть ксеногенными для бесклеточного органа или ткани (например, бесклеточного органа или ткани свиньи, засеянных регенеративными клетками человека). Используемый в настоящем описании термин «аллогенные» относится к клеткам, полученным у того же вида, как вид, от которого происходит орган или ткань (например, родственных или не родственных индивидуумов), тогда как используемый в настоящем описании термин «ксеногенные» относится к клеткам, полученным от вида, отличного от вида, от которого происходит орган или ткань.
В некоторых случаях, орган или ткань, генерированные способами, описанными в настоящем описании, трансплантируется пациенту. В этих случаях, регенеративные клетки, используемые для восстановления содержания клеток в бесклеточном органе или ткани, можно получить у пациента, так что регенеративные клетки являются «аутологичными» для пациента. Регенеративные клетки пациента можно получить, например, из крови, костного мозга, тканей или органов на различных стадиях жизни (например, пренатально, неонатально или перинатально, во время подросткового периода или в качестве взрослого), используя способы, известные в данной области. Альтернативно, регенеративные клетки, используемые для восстановления содержания клеток в бесклеточном органе или ткани, могут быть сингенными (т.е., от идентичных близнецов) для пациента; регенеративные клетки могут представлять собой клетки, подобранные по лимфоцитарному антигену человека (HLA), например, от родственника пациента или от подобранного по HLA индивидуума, не являющегося родственником пациента; или аллогенные клетки могут быть аллогенными для пациента, например, от донора, не подобранного по HLA.
Независимо от источника регенеративных клеток (например, аутологичные или нет), бесклеточный солидный орган может быть аутологичным, аллогенным или ксеногенным для пациента.
В определенных случаях, в бесклеточном органе содержание клеток можно восстановить клетками in vivo (например, после трансплантации органа или ткани индивидууму). Восстановление содержания клеток in vivo можно осуществить, как описано выше (например, инъекцией или перфузией), например, любыми из описанных в настоящем описании регенеративных клеток. Альтернативно или дополнительно, засевание in vivo бесклеточного органа или ткани эндогенными клетками может происходить естественно или может быть опосредовано факторами, доставляемыми в ткань с восстановленным содержанием клеток.
Развитие регенеративных клеток можно контролировать во время восстановления содержания клеток. Например, количество клеток на органе или ткани или в них можно оценить взятием биопсии в одну или несколько точек времени во время восстановления содержания клеток. Кроме того, количество дифференциации, которой подверглись клетки, можно контролировать определением того, присутствуют или нет различные маркеры в клетке или популяции клеток. Маркеры, связанные с различными типами клеток и различными стадиями дифференциации для этих типов клеток, известны в данной области, и их можно легко выявить, используя антитела и стандартные иммуноанализы. См., например, Current Protocols in Immunology, 2005, Coligan et al., Eds., John Wiley & Sons, Chapter 3 and 11. Анализы нуклеиновых кислот, а также морфологическую и/или гистологическую оценку можно использовать для мониторинга восстановления содержания клеток.
Система регуляции для удаления и восстановления содержания клеток в органе или ткани
Изобретение также относится к системе (например, биореактору) для удаления и восстановления содержания клеток в органе или ткани. Такая система в целом включает по меньшей мере одно устройство для канюлирования органа или ткани, перфузионный аппарат для перфузии органа или ткани через канюлю (канюли), и средство (например, устройство для помещения содержимого) для поддержания стерильной среды для органа или ткани. Канюлирование и перфузия представляют собой хорошо известные методики в данной области. Устройство для канюлирования в целом включает полую трубку соответствующего размера для введения в сосуд, проток, и/или полость органа или ткани. Обычно, в органе канюлируются один или несколько сосудов, протоков и/или полостей. Аппарат для перфузии может включать удерживающий контейнер для жидкости (например, среды для разрушения клеток) и механизм для продвижения жидкости через орган (например, насос, воздушное давление, сила тяжести) через одну или несколько канюль. Стерильность органа или ткани во время удаления и/или восстановления содержания клеток можно поддерживать с использованием разнообразных методик, известных в данной области, таких как регулирование и фильтрация воздушного потока и/или перфузия, например, антибиотиками, противогрибковыми препаратами или другими противомикробными средствами для предотвращения роста нежелательных микроорганизмов.
2
2
С помощью описанной в настоящем описании системы для удаления и восстановления содержания клеток в органах или тканях можно контролировать определенные перфузионные характеристики (например, давления, объема, типа потока, температуры, газов, рН), механические силы (например, движения и напряжения стенок желудочков) и электрическую стимуляцию (например, навязывания ритма). Поскольку коронарное сосудистое ложе изменяется в ходе удаления и/или восстановления содержания клеток (например, сосудистое сопротивление, объем), аппарат для перфузии, контролируемый давлением, имеет преимущества во избежание больших колебаний. Эффективность перфузии можно оценить в вытекающей жидкости и в срезах ткани. Объем перфузии, типа потока, температуру, парциальное давление О и СО и рН можно контролировать, используя стандартные способы.
Для мониторинга устройства (например, биореактора) и/или органа или ткани можно использовать датчики. Сономикрометрию, микроманометрию и/или измерения проводимости можно использовать для получения информации о зависимости объема от давления или задействованной ударной работе при преднагрузке в отношении движения и функции стенки миокарда. Например, датчики можно использовать для мониторинга давления жидкости, протекающей через канюлированный орган или ткань; окружающей температуры в устройстве и/или температуры органа или ткани; рН и/или скорости потока жидкости, протекающей через канюлированный орган или ткань; и/или биологической активности восстановления содержания клеток в органе или ткани. В дополнение к наличию датчиков для мониторинга таких признаков, устройство для удаления и восстановления содержания клеток в органе или ткани может также включать средство для поддержания или регулирования таких признаков. Средство для поддержания или регулирования таких признаков может включать такие компоненты как термометр, термостат, электроды, датчики давления, клапаны перелива, клапаны для изменения скорости потока жидкости, клапаны для открытия и закрытия жидкостных соединений для растворов, используемых для изменения рН раствора, баллончик, внешний электростимулятор и/или камера растяжимости. Для содействия обеспечению стабильных условий (например, температуры), камеры, резервуары и трубки могут быть заключены в водяные кожухи.
Во время восстановления содержания клеток может иметь преимущество - воздействие механической нагрузки на орган и прикрепленные к нему клетки. В качестве примера, для воздействия механического напряжения на сердце, в левый желудочек через левое предсердие можно ввести баллончик. Поршневой насос, который обеспечивает возможность регулировки объема и скорости, можно соединить с баллоном для имитации движения и напряжения стенки левого желудочка. Для мониторинга движения и напряжения стенки, движение и давление стенки левого желудочка можно измерить, используя микроманометрию, и/или сономикрометрию. В некоторых вариантах осуществления, внешний электростимулятор может быть соединен с поршневым насосом для обеспечения синхронизированной стимуляции при каждом опорожнении желудочкового баллона (которое эквивалентно систоле). Периферическую ЭКГ можно регистрировать с поверхности сердца для обеспечения возможности регулировки напряжения электростимуляции, мониторинга де- и реполяризации, и для предоставления упрощенной поверхностной карты в процессе или после восстановления содержания клеток в сердце.
Механическое растяжение желудочка можно также достичь присоединением перистальтического насоса к канюле, введенной в левый желудочек, через левое предсердие. Аналогично описанной выше процедуре с использованием баллона, растяжение желудочка, достигаемое периодическим движением жидкости (например, пульсирующим потоком) через канюлю, можно синхронизировать электрической стимуляцией.
Используя описанные в настоящем описании способы и материалы, можно удалить и восстановить содержание клеток в сердце млекопитающего при поддержании его в соответствующих условиях, можно создать функционально полноценное сердце, которое выполняет сократительную функцию и реагирует на стимулы электростимуляции, и/или фармакологические средства. Это функционирующее сердце с восстановленным содержанием клеток можно трансплантировать млекопитающему, и оно может функционировать в течение некоторого периода времени.
На фиг.2 показан один из вариантов осуществления устройства для удаления и/или восстановления содержания клеток в органе или ткани (например, биореактора). Показанный вариант осуществления представляет собой биореактор для удаления и/или восстановления содержания клеток в сердце. Этот вариант осуществления имеет перистальтический насос (А) с регулируемой скоростью и объемом; поршневой насос с регулируемой скоростью и объемом, соединенный со внутрижелудочковым баллоном (В); внешний электростимулятор с регулируемым напряжением, частотой и амплитудой (С); регистратор ЭКГ (D); датчик давления в «артериальной магистрали» (которое равно давлению в коронарных артериях) (Е); датчик давления в «венозной» магистрали (которое равно давлению в коронарном синусе) (F); и синхронизацию между электростимулятором и поршневым насосом (G).
Система создания органа или ткани можно регулировать считываемой компьютером средой хранения в сочетании с программируемым процессором (например, используемая в настоящем описании считываемая компьютером среда хранения имеет хранящиеся на ней инструкции для вызова выполнения программируемым процессором определенных стадий). Например, такая среда хранения, в комбинации с программируемым процессором, может получать и обрабатывать информацию одного или нескольких из датчиков. Такая среда хранения, в комбинации с программируемым процессором, может также передавать информацию и инструкции назад в биореактор и/или орган или ткань.
Laboratory Textbook of Anatomy и Physiology
Current Protocols in Cell Biology
Орган или ткань, подвергающиеся восстановлению содержания клеток, можно контролировать на наличие биологической активности. Биологическая активность может представлять собой биологическую активность самого органа или ткани, такую как электрическая активность, механическая активность, механическое давление, сократимость и/или напряжение стенки органа или ткани. Кроме того, биологическую активность клеток, прикрепленных к органу или ткани, можно контролировать, например, на активность транспорта/обмена железа, клеточное деление и/или жизнеспособность клеток. См., например, (2001, Wood, Prentice Hall) и (2001,Bonifacino et al., Eds, John Wiley & Sons). Как обсуждалось выше, может быть полезно имитировать активную нагрузку на орган во время восстановления содержания клеток. Считываемую компьютером среду хранения по изобретению в комбинации с программируемым процессором можно использовать для координации компонентов, необходимых для контроля и поддержания активной нагрузки на орган или ткань.
В одном варианте осуществления, массу органа можно ввести в описанную здесь считываемую компьютером среду хранения, которая, в комбинации с программируемым процессором, может рассчитывать интервалы времени воздействия и величины давления перфузии для данного конкретного органа или ткани. Такая среда хранения может регистрировать преднагрузку и постнагрузку (соответственно давление до и после перфузии) и скорость потока. В настоящем варианте осуществления, считываемая компьютером среда хранения в комбинации с программируемым процессором может регулировать перфузионное давление, направление перфузии и/или тип перфузионного раствора через один или несколько насосов и/или клапанные регуляторы.
В соответствии с настоящим изобретением, можно использовать обычные методики молекулярной биологии, микробиологии, биохимии и клеточной биологии, известные в данной области. Такие методики подробно описаны в литературе. Далее изобретение будет описано в следующих примерах, которые не ограничивают объем изобретения, описанный в формуле изобретения.
ПРИМЕРЫ
Раздел А. Удаление клеток (Часть I)
Пример 1 – Получение солидного органа для удаления клеток
Во избежание образования посмертных тромбов, крысам-донорам системно вводили гепарин в дозе 400 ЕД гепарина/кг массы донора. После введения гепарина сердце и примыкающие крупные сосуды осторожно удаляли.
Сердце помещали в физиологический солевой раствор (0,9%), содержащий гепарин (2000 ЕД/мл) и держали при 5°С до дальнейшей обработки. В стерильных условиях, соединительную ткань отделяли от сердца и крупных сосудов. Нижние полые вены и левые и правые легочные вены перевязывали дистальнее правого и левого предсердия, используя одноволоконные, нерассасываемые лигатуры.
Пример 2 – Канюлирование и перфузия солидного органа
Сердце для перфузии устанавливали на аппарат для удаления клеток (фиг.1). Нисходящую грудную аорту канюлировали для обеспечения возможности ретроградной коронарной перфузии (фиг.1, канюля А). Ветви грудной аорты (например, плечеголовной ствол, общую сонную артерию, левую подключичную артерию) перевязывали. Легочную артерию канюлировали перед ее делением на левую и правую легочную артерию (фиг.1, канюля В). Верхнюю полую вену канюлировали (фиг.1, канюля С). Эта конфигурация обеспечивает возможность и ретроградной, и антеградную коронарную перфузию.
Когда положительное давление подавалось на аортальную канюлю (А), перфузия происходила из коронарных артерий через капиллярное ложе в коронарную венозную систему в правое предсердие и верхнюю полую вену (С). Когда положительное давление подавалось на канюлю верхней полой вены (С), перфузия происходила из правого предсердия. Коронарный синус и коронарные вены через капиллярное ложе в коронарные артерии и аортальную канюлю (А).
Пример 3 – Удаление клеток
После установки сердца на аппарат для удаления клеток, антеградную перфузию начинали холодным, лишенным кальция раствором с фосфатным буфером, содержащим 1-5 ммоль аденозина на 1 л перфузата для восстановления постоянного коронарного потока. Коронарный поток оценивали измерением коронарной перфузии и потока, и расчетом коронарного сопротивления. После 15 мин устойчивого потока, начинали процесс удаления клеток на основе детергента.
Детали процедур описаны ниже. Однако вкратце, сердце перфузировали антеградно детергентом. После перфузии, сердце ретроградно промывали буфером (например, PBS). Затем сердце перфузировали PBS, содержащим ДНазу I. затем сердце перфузировали 1% бензалконием хлоридом для снижения микробного заражения и для предотвращения будущего микробного заражения. А затем перфузировали PBS для промывания органа от каких-либо остаточных клеточных компонентов, ферментов или детергента.
Пример 4 – Удаление клеток из трупного крысиного сердца
Сердца изолировали у 8 самцов «голых» крыс (250-300 г). Сразу после отсечения, дугу аорты канюлировали, и сердца ретроградно перфузировали указанным детергентом. 4 различных последовательности операций удаления клеток на основе детергента (см. ниже) сравнивали в отношении их пригодности и эффективности при (а) удалении клеточных компонентов и (b) сохранения сосудистых структур.
Удаление клеток в целом включало следующие стадии: стабилизация солидного органа, удаление клеток из солидного органа, ренатурация и/или нейтрализация солидного органа, промывание солидного органа, разрушение любой ДНК, остающейся на органе, дезинфекция органа и гомеостаз органа.
А) Последовательность операций №1 удаления клеток (PEG)
Сердца промывали 200 мл PBS, содержащего 100 ЕД/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина, и 0,25 мг/мл амфотерицина В без рециркуляции. Затем из сердец удаляли клетки 35 мл полиэтиленгликоля (PEG; 1 мг/мл) в течение периода до 30 мин при ручной рециркуляции. Затем орган промывали 500 мл PBS в течение периода до 24 ч, используя насос для рециркуляции. Стадию промывания повторяли каждый раз по меньшей мере дважды в течение по меньшей мере 24 ч. На сердца воздействовали 35 мл ДНазы I (70 ЕД/мл) в течение по меньшей мере 1 ч при ручной рециркуляции. Органы промывали снова 500 мл PBS в течение по меньшей мере 24 ч.
В) Последовательность операций №2 удаления клеток (Triton X и трипсин)
Сердца промывали 200 мл PBS, содержащего 100 ЕД/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина, и 0,25 мг/мл амфотерицина В в течение по меньшей мере примерно 20 мин без рециркуляции. Затем из сердец удаляли клетки 0,05% трипсином в течение периода 30 мин с последующей перфузией 500 мл PBS, содержащего 5% Triton-X и 0,1% аммонийгидроксид в течение примерно 6 ч. Сердца перфузировали деионизированной водой в течение примерно 1 ч, и затем перфузировали PBS в течение 12 ч. Затем сердца промывали 3 раза в течение 24 ч 500 мл PBS, используя насос для рециркуляции. Сердца перфузировали 35 мл ДНазы I (70 ЕД/мл) в течение 1 ч при ручной рециркуляции и промывали дважды в 500 мл PBS в течение по меньшей мере 24 ч, каждый раз используя насос для рециркуляции.
С) Последовательность операций №3 удаления клеток (1% SDS)
Сердца промывали 200 мл PBS, содержащего 100 ЕД/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина, и 0,25 мг/мл амфотерицина В течение по меньшей мере примерно 20 мин без рециркуляции. Из сердец удаляли клетки 500 мл воды, содержащей 1% SDS в течение примерно 6 ч, используя насос для рециркуляции. Затем сердца промывали деионизированной водой в течение примерно 1 ч и промывали PBS в течение примерно 12 ч. Сердца промывали 3 раза 500 мл PBS в течение по меньшей мере примерно 24 ч, каждый раз используя насос для рециркуляции. Затем сердца перфузировали 35 мл ДНазы I (70 ЕД/мл) в течение примерно 1 ч, используя ручную рециркуляцию, и промывали 3 раза 500 мл PBS в течение по меньшей мере примерно 24 ч, каждый раз используя насос для рециркуляции.
D) Последовательность операций №4 удаления клеток (Triton X)
Сердца промывали 200 мл PBS, содержащего 100 ЕД/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина, и 0,25 мг/мл амфотерицина В в течение по меньшей мере 20 мин без рециркуляции. Затем из сердец удаляли клетки 500 мл воды, содержащей 5% Triton X и 0,1 % гидроксидом аммония в течение по меньшей мере 6 ч, используя насос для рециркуляции. Затем сердца перфузировали деионизированной водой в течение примерно 1 ч, и затем PBS в течение примерно 12 ч. Затем сердца перфузией 500 мл PBS 3 раза в течение по меньшей мере 24 ч, каждый раз используя насос ля рециркуляции. Сердца затем перфузировали 35 мл ДНазы I (70 ЕД/мл) в течение примерно 1 ч, используя ручную рециркуляцию, и промывали 3 раза в 500 мл PBS, каждый раз в течение примерно 24 ч.
2
Для начальных экспериментов, аппарат для удаления клеток устанавливали внутрь вытяжного шкафа с ламинарным потоком. Сердца перфузировали при коронарном перфузионном давлении 60 см НО. Хотя это и не требуется, сердца в описанных выше экспериментах устанавливали в камере для удаления клеток и полностью погружали и перфузировали PBS, содержащим антибиотики, в течение 72 ч в режиме рециркуляции при непрерывном потоке 5 мл/мин для вымывания сколько возможно большого количества клеточных компонентов и детергента.
Успешное удаление клеток определяли как отсутствие мышечных волокон и ядер в гистологических срезах. Успешное сохранение сосудистых структур оценивали перфузией 2% Эвансом синим перед заливкой срезов ткани.
2
Высоко эффективное удаление клеток происходило, когда сердце сначала перфузировали антеградно ионным детергентом (1% додецилсульфат натрия (SDS), приблизительно 0,03 М), растворенным в НО при постоянном коронарном пефузионном давлении, а затем перфузировали антеградно неионным детергентом (1% Triton X-100) для удаления SDS и, предположительно, для ренатурации белков внеклеточной матрицы (ЕСМ). Сердце периодически перфузировали ретроградно раствором с фосфатным буфером для очистки закупоренных капилляров и мелких сосудов.
Пример 5 – Оценка органов, бесклеточных
Для демонстрации сохранных сосудистых структур после удаления клеток, бесклеточное сердце окрашивали посредством перфузии по Лангендорфу Эвансом синим для окрашивания сосудистой основной мембраны и количественного определения плотности макро- и микрососудов. Далее, частицы полистирола можно перфузировать в сердце и через него для количественного определения объема, уровня утечки из сосудов и для оценки распределения перфузии анализом коронарного оттока и срезов ткани. Комбинацию трех критериев оценивали и сравнивали с изолированным не бесклеточным сердцем: 1) равномерное распределение частиц полистирола, 2) значимое изменение проницаемости на некотором уровне, 3) плотность микрососудов.
Ann Biomed Eng.,
Ориентацию волокон оценивали методикой микроскопии в поляризованном свете of Tower et al., (2002, Fiber alignment imaging during mechanical testing of soft tissues, 30(10):1221-33), которую можно применять в реальном масштабе времени к образцу, подверженному одноосевому или двухосевому напряжению. Во время перфузии по Лангендрофу регистрируются основные механические свойства бесклеточной ЕСМ (растяжимость, эластичность, давление разрыва) и сравниваются с вновь изолированными сердцами.
Раздел В. Удаление клеток (Часть II)
Пример 1 – Удаление клеток из сердца крыс
2
Самцов 12-недельных крыс F344 Fischer (Harlan Labs, PO Box 29176 Indianapokis, IN 46229) анестезировали, используя внутрибрюшинную инъекцию 100 мг/кг кетамина (Phoenix Pharmaceutical, Inc., St. Joseph, MO) и 10 мг/кг ксилазина (Phoenix Pharmaceutical, Inc., St. Joseph, MO). После системного введения гепарина (American Pharmaceutical Partners, Inc., Schaumberg, IL)через левую бедренную вену, выполняли срединную стернотомию и вскрывали перикард. Загрудинное жировое тело удаляли, восходящую грудную аорту отсекали и ее ветви перевязывали. Полые и легочные вены, легочную артерию и грудную аорту пересекали, и сердце удаляли из грудной полости. Предварительно заполненную аортальную канюлю диаметром 1,8 мм (Radnoti Glass, Monrovia, CA) вводили в восходящую аорту для обеспечения возможности ретроградной коронарной перфузии (по Лангендрофу). Сердца перфузировали гепаринизированным PBS (Hyclone, Logan, UT), содержащим 10 мкМ аденозина, при коронарном перфузионном давлении 75 см НО в течение 15 мин с последующей перфузией 1% раствором додецилсульфатом натрия (SDS) или 1% полиэтиленгликолем 1000 (PEG 1000) (EMD Biosciences, La Jolla, Germany) или 1% Triton-X 100 (Sigma, St. Louis, MO) в деионизированной воде в течение 2-15 ч. За этим следовала перфузия в течение 15 мин деионизированной водой и перфузия 30 мин Triton-X (Sigma, St. Louis, MO) в деионизированной воде. Затем сердца постоянно перфузировали содержащим антибиотики PBS (100 ЕД/мл пенициллина-G (Gibco, Carlsbad, CA), 100 ЕД/мл стрепотимицина (Gibco, Carlsbad, CA) и 0,25 мкг/мл амфотерицина В (Sigma, St. Louis, MO) в течение 124 ч.
После 420 мин ретроградной перфузии или 1% PEG, 1% Triton-X 100 или 1% SDS, перфузия PEG и Triton-X 100 вызывала отечный, мутный вид, тогда как перфузия SDS привела к более резкому изменению, ведущему к почти прозрачному трансплантату в виде мутных элементов, очень медленно вымываемых. Сердца, подвергнутые всем трем последовательностям операций, оставались в основном неизмененными, без данных за разрыв коронарных артерий или недостаточности аортального клапана в течение всей последовательности перфузионных операций (при постоянном коронароном перфузионном давлении 77,4 мм рт.ст.). Коронарный поток уменьшался при всех трех последовательностях операций в течение первых 60 мин перфузии, затем нормализовался в течение перфузии SDS, тогда как остальной увеличивался при перфузии Triton-X и PEG. Перфузия SDS вызывала самое высокое первоначальное увеличение рассчитанного коронарного сопротивления (до 250 мм рт.ст./с/мл), за ней следовала перфузия Triton-X (до 200 мм рт.ст./с/мл) и PEG (до 150 мм рт.ст./с/мл).
При использовании гистологических срезов ткани сердец, перфузированных детергентом, было продемонстрировано, что удаление клеток в течение наблюдавшегося периода времени было неполным в сердцах, обработанных и PEG, и Triton-X 100; окрашивание гематоксилином-эозином (H&E) показало наличие ядер и поперечнополосатых волокон. Напротив, в срезах сердец, перфузированных SDS, не выявлялись ни ядра, ни сократительные волокна. Однако в сердцах, обработанных SDS, сосудистые структуры и направление волокон ЕСМ были сохранены.
Для удаления ионного SDS из ЕСМ после первоначального удаления клеток, орган перфузировали в течение 30 мин Triton-X 100. В дополнение к обеспечению полного вымывания всех детергентов к восстановлению физиологического рН, бесклеточный орган обильно перфузировали деионизированной водой и PBS в течение 124 ч.
Пример 2 – Удаление клеток из почек крыс
Для выделения почек, все содержимое брюшной полости оборачивали в влажной марлей и осторожно перемещали в сторону для обнажения забрюшинного пространства. Брыжеечные сосуды перевязывали и рассекали. Брюшную аорту перевязывали и пересекали ниже отхождения почечных артерий. Грудную аорту пересекали непосредственно выше диафрагмы и канюлировали, используя аортальную канюлю диаметром 1,8 мм (Radnoti Glass, Monrovia, CA). Почки осторожно удаляли из забрюшинного пространства и погружали в стерильный PBS (Hyclone, Logan, UT) для минимизации воздействия силы тяги на почечные артерии. За 15 мин перфузии гепаринизированным PBS следовала перфузия в течение 2-16 ч 1% SDS (Invitrogen, Carlsbad, CA) в деионизированной воде и перфузия в течение 30 мин 1% Triton-X (Sigma, St. Louis, MO) в деионизированной воде. Затем почку непрерывно перфузировали содержащим антибиотики PBS (100 ЕД/мл пенициллина-G (Gibco, Carlsbad, CA), 100 ЕД/мл стрептомицина-G (Gibco, Carlsbad, CA), 0,25 мкг/мл амфотерицина В (Sigma, St. Louis, MO)) в течение 124 ч.
Через 420 мин перфузии SDS с последующей перфузией Triton-X 100 был получен полностью бесклеточный каркас почек ЕСМ с неизмененной сосудистой сетью и архитектурой органа. Перфузия Эвансом синим подтвердила неизмененное состояние сосудистой сети, аналогичное бесклеточной сердечной ЕСМ. Окрашивание пентахромом Movat коры бесклеточных почек показала неизмененные клубочки и основные мембраны проксимальных и дистальных извитых канальцев. Окрашивание бесклеточного мозгового слоя почек показало неизменные основные мембраны канальцев и собирающего протока. SEM (сканирующая электронная микроскопия) бесклеточной почечной коры подтвердила неизмененные основные мембраны клубочков и канальцев. Характерные структуры, такие как капсула Боумэна, отделяющая клубочек от окружающих проксимальных и дистальных канальцев и клубочковые капиллярные основные мембраны внутри клубочков были сохранными. Полученные с помощью SEM изображения бесклеточного мозгового слоя почек показали неизмененные медуллярные пирамиды, достигающие почечной лоханки, при неизмененных основных мембранах собирающего протока, ведущих в направлении сосочка. Таким образом, все основные структуры почки были неизменными после удаления клеток.
Пример 3 – Удаление клеток из легких крыс
Легкие (с трахеей) осторожно удаляли из грудной полости и погружали в стерильный PBS (Hyclone, Logan, UT) для минимизации воздействия силы тяги на легочные артерии. За 15 мин перфузии гепаринизированным PBS следовала перфузия в течение 2-12 ч 1% SDS (Invitrogen, Carlsbad, CA) в деионизированной воде и перфузия в течение 15 мин 1% Triton-X (Sigma, St. Louis, MO) в деионизированной воде. Затем легкие непрерывно перфузировали содержащим антибиотики PBS (100 ЕД/мл пенициллина-G (Gibco, Carlsbad, CA), 100 ЕД/мл стрептомицина-G (Gibco, Carlsbad, CA), 0,25 мкг/мл амфотерицина В (Sigma, St. Louis, MO)) в течение 124 ч.
Через 180 мин перфузии SDS с последующей перфузией Triton-X 100 был получен полностью бесклеточный каркас легких ЕСМ с неизмененными дыхательными путями и сосудами. Окрашивание пентахромом Movat коры гистологических срезов показала присутствие компонентов ЕСМ в легких, включающих основные структурные белки, такие как коллаген и эластин, а также растворимые элементы, такие как протеогликаны. Однако ни ядра, ни неизмененные клетки не сохранились. Дыхательные пути были сохранными от главного бронха до терминальных бронхиол, альвеолярных протоков и альвеол. Сосудистое ложе от легочных артерий до капиллярного уровня и легочных вен оставалось неизмененным. Микрофотографии с использованием SEM бесклеточных легких показали сохраненные бронхиальные, альвеолярные и сосудистые основные мембраны без данных о наличии сохраненных клеток. Сеть эластических и ретикулярных волокон, обеспечивающая основную структурную опору для межальвеолярной перегородки, а также перегородочная основная мембрана были неизмененными, включая плотную сеть капилляров внутри легочного интерстиция.
Полученные с помощью SEM микрографии бесклеточной трахеи показали неизмененную архитектуру ЕСМ с бесклеточными гиалиновыми хрящевыми кольцами и шероховатой просветной основной мембраной без дыхательного эпителия.
Пример 4 – Удаление клеток печени крыс
Для выделения печени, нижнюю полую вену обнажали через срединную лапаротомию, рассекали и канюлировали, используя мышиную аортальную канюлю (Radnoti Glass, Monv\rovia, CA). Печеночную артерию и вену и желчный проток пересекали, и печень осторожно удаляли из брюшной полости и погружали в стерильный PBS (Hyclone, Logan, UT) для минимизации воздействия силы тяги на воротную вену. За 15 мин перфузии гепаринизированным PBS следовала перфузия в течение 2-12 ч 1% SDS (Invitrogen, Carlsbad, CA) в деионизированной воде и перфузия в течение 15 мин 1% Triton-X (Sigma, St. Louis, MO) в деионизированной воде. Затем печень непрерывно перфузировали содержащим антибиотики PBS (100 ЕД/мл пенициллина-G (Gibco, Carlsbad, CA), 100 ЕД/мл стрептомицина-G (Gibco, Carlsbad, CA), 0,25 мкг/мл амфотерицина В (Sigma, St. Louis, MO)) в течение 124 ч.
Перфузия SDS в течение 120 мин с последующей перфузией Triton-X 100 были достаточны для создания полностью бесклеточной печени. Окрашивание пентахромом Movat бесклеточной печени подтвердило сохранение характерной почечной организации при центрально вене и портальном пространстве, содержащем печеночную артерию, желчный проток и воротную вену.
Пример 5 – Способы и материалы, используемые для оценки гистологии бесклеточных органов и иммунофлюоресценции
.
Окрашивание пентахромом Movat выполняли на залитых в парафин бесклеточных тканях, следуя инструкциям изготовителей (American Mastertech Scientific, Lodi, CA). Коротко, лишенные парафина микроскопические препараты окрашивали, используя эластический краситель Verhoeff, ополаскивали, дифференцировали в 2% хлориде трехвалентного железа, споласкивали, помещали в 5% тиосульфат натрия, споласкивали, блокировали в 3% ледяной уксусной кислоте, окрашивали в 1% растворе алциана синего, споласкивали, окрашивали в кроцеиновом алом – кислом фуксине, споласкивали, погружали в 1% ледяную уксусную кислоту, удаляли краситель в 5% фосфорно-вольфрамовой кислоте, погружали в 1% ледяную уксусную кислоту, обезвоживали, помещали в спиртовой раствор шафрана, обезвоживали, устанавливали и покрывали.
Иммунофлюоресцентное окрашивание выполняли на бесклеточных тканях. Извлечение антигена выполняли на залитой в парафин ткани (ткани с восстановленным содержанием клеток), но не на замороженных срезах (ткани, бесклеточной), следующим образом: из парафиновых срезов удаляли воск и регидратировали 2 заменами ксилола по 5 мин каждая, затем последовательным воздействием спиртового градиента и споласкиванием в холодной текущей водопроводной воде. Затем микроскопические препараты помещали в раствор для извлечения антигена (2,94 г тринатрийцитрата, 22 мл 0,2 М раствора хлористоводородной кислоты, 978 мл сверх чистой воды и доводили до рН 6,0) и кипятили в течение 30 мин. После споласкивания под текущей холодной водопроводной водой в течение 10 мин, начинали иммуноокрашивание. Замороженные срезы фиксировали 4% параформальдегидом (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) в 1X PBS (Mediatech, Herndon, VA) в течение 15 мин при комнатной температуре перед окрашиванием. Микроскопические препараты блокировали 4% фератльной телячьей сывороткой (FBS; HyClone, Logan, UT) в 1X PBS в течение 30 мин при комнатной температуре. Образцы последовательно инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с разведенными первичными и вторичными антителами (Ab). Между каждой стадией, микроскопические препараты промывали 3 раза (5-10 мин каждое) 1X PBS. Первичные Ab против коллагена I (козий поликлональный IgG (каталожный №sc-8788), Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA), коллаген III (козий поликлональный IgG (каталожный №sc-2405), Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA), фибронектин (козий поликлональный IgG (каталожный №sc-6953), Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA), и ламинин (кроличий поликлональный IgG (каталожный №sc-20142), Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA), использовали при разведении 1:40 блокирующим буфером. Вторичные Ab бычий анти-козий IgG фикоэритин (каталожный №sc-3747, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA), и бычий анти-кроличий IgG фикоэритин (каталожный №sc-3750, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) использовали при разведении 1:80 блокирующим буфером. Микроскопические препараты покрывали покровным стеклом (Fisherbrand 22×60, Pittsburg, PA) в твердеющей среде для заключения гистологических препаратов, содержащей 4',6-диамидин-2-фенилиндол (DAPI) (Vectashield, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Изображэения регистрировали, используя ImagePro Plus 4.5.1 (Mediacybernetics, Silver Spring, MD) на инвертированном микроскопе Nikon Eclipse TE200 (Fryer Co. Inc., Huntley, IL), с использованием ImagePro Plus 4.5.1 (Mediacybernetics, Silver Spring, MD).
Сканирующая электронная микроскопия. Нормальные и бесклеточные ткани фиксировали перфузией 2,5% глутаральдегидом (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) в 0,1 М какодилатном буфере (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) в течение 15 мин. Затем ткани споласкивали 2 раза в 0,1 М какодилатном буфере в течение 15 мин. Постфиксацию выполняли 1% тетроксидом осмия (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) в течение 60 мин. Затем образцы ткани обезвоживали в возрастающих концентрациях EtOH (50% в течение 10 мин, 70% в течение 10 мин 2 раза, 80% в течение 10 мин, 95% в течение 10 мин 2 раза, 100% в течение 10 мин 2 раза). Затем образцы ткани подвергали сушке при критической точке в Tousimis Samdri-780A (Tousimis, Rockville, MD). Покрытие выполняли напылением в течение 30 с в вакуумном испарителе Denton DV-502A Vacuum Evaporator (Denton Vacuum, Moorestown, NJ). Изображения сканирующей электронной микроскопии получали, используя сканирующий электронный микроскоп Hitachi S4700 Field Emission Scanning Electrom Microscope (Hitachi High Technologies America, Pleasanton, CA).
Механическое испытание
. Кресты из ткани миокарда вырезали из левого желудочка крыс так, чтобы площадь центра была приблизительно 5 мм × 5 мм, а оси креста были совмещены в окружном и продольном направлениях сердца. Исходную толщину тканевых крестов измеряли микрометром и обнаружили, что она составляла 3,59 ± 0,14 мм в центре тканевого креста. Кресты также вырезали из бесклеточной ткани левого желудочка в такой же ориентации и с таким же размером площади центра. Исходная толщина бесклеточных образцов составила 238,5 ± 38,9 мкм. Кроме того, испытывали механические свойства гелей фибрина, другого полученного методами инженерии каркаса ткани, используемого в сосудистой и сердечной ткани, созданной методами инженерии. Фибриновые гели отливали в крестовидные формы при конечной концентрации 6,6 мг фибрина/мл. Средняя толщина фибриновых гелей составляла 165,2 ± 67,3 мкм. Все образцы прикрепляли к устройству двухосевого механического испытания (Instron Corporation, Norwood, MA) посредством зажимов, погружали в PBS, и растягивали по двум осям до натяжения 40%. Для точного тестирования статических пассивных механических свойств, образцы растягивали с приросте натяжения на 4% и давали возможность расслабиться при каждой величине натяжения в течение по меньшей мере 60 с. Силы преобразовывали в напряжение при инженерии путем нормализации величин силы при площади поперечного сечения в определенном направлении оси (5 мм × исходную толщину). Напряжение при инженерии рассчитывали как смещение, нормализованное исходной длиной. Для сравнения двух осей, а также групп образцов, тангенциальный модуль рассчитывали следующим образом:
[(T(ε = натяжение 40%) – T(ε = натяжение 36%)]/ натяжение 4%
где Т представляет собой напряжение при инженерии, и ε представляет собой натяжение при инженерии. Величины тангенциального модуля усредняли и сравнивали 2 оси (окружной и продольной), а также 2 группы.
Пример 6 – Оценка биологической совместимости бесклеточного органа
3
Для оценки биологической совместимости, 100000 стволовых клеток мышиных эмбрионов (mESC) суспендировали в 1 см стандартных сред размножения (модифицированной по Iscov среды Дульбекко (Gibco, Carlsbad, CA), 10% фетальной телячьей сыворотки (HyClone, Logan, UT), 100 ЕД/мл пенициллина-G (Gibco, Carlsbad, CA), 100 ЕД/мл стрептомицина-G (Gibco, Carlsbad, CA), 2ммоль/л L-глутамина (Invitrogen, Carlsbad, CA), 0,1 ммоль/л 2-меркаптоэтанола (Gibco, Carlsbad, CA) высевали на срезы ЕСМ и на контрольные планшеты без стимуляции специфических факторов роста или подложки питающих клеток. В среды для культур клеток добавляли 4',6-диамидин-2-фенилинждол (DAPI) в концентрации 10 мкг/мл для метки клеточных ядер и для обеспечения возможности количественного определения прикрепления и размножения клеток. Изображения регистрировали под УФ светом т фазовом контрасте на исходном уровне и через 24, 48 и 72 ч после этого, используя ImagePro Plus 4.5.1 (Mediacybernetics, Silver Spring, MD) на инвертированном микроскопе Nikon Eclipse TE200 (Fryer Co. Inc., Huntley, IL).
Бесклеточная ЕСМ была совместима с жизнеспособностью, прикреплением и пролиферацией клеток. Высеянные mESC прививались на каркасы ЕСМ и начинали внедряться в матрицу в пределах 72 ч от момента высевания клеток.
Пример 7 – Оценка бесклеточных органов
Состоятельность аортального клапана и целостность коронарного сосудистого ложа сердца крысы, бесклеточного с использованием SDS, оценивали перфузией по Лангендрофу с 2% красителем Эванса синего. Заполнение левого желудочка красителем не наблюдали, что указывало на неизмененный аортальный клапан. Макроскопически, было подтверждено заполнение коронарных артерий до точки четвертого разветвления без признаков утечки красителя. В срезах ткани, перфузия крупных (150 мкм) и мелких (20 мкм) артерий и вен была в последующем подтверждена красной флюоресценцией сосудистой основной мембраны, окрашенной Эвансом синим.
Для подтверждения сохранения основных компонентов сердечной ЕСМ, выполняли иммунофлюоресцентное окрашивание каркасов ЕСМ, бесклеточных с использованием SDS. Это подтвердило присутствие основных компонентов сердечной ЕСМ, таких как коллагены I и III, фибронектин и ламинин, но не обеспечило доказательств сохраненных неизмененных ядер или сократительных элементов, включая тяжелую цепь сердечного миозина, или саркомерный альфа актин.
Сканирующая электронная микроскопия (SEM) сердечной ЕСМ, бесклеточных с использованием SDS, продемонстрировала, что ориентация и состав волокон были сохранными в стенке аорты и створках аортального клапана при отсутствии клеток по всей толщины ткани. Бесклеточная стенка левого и правого желудочка сохранила состав (переплетения, подпорки, спирали) и ориентацию волокон ЕСМ, в то время как мышечные волокна были полностью удалены. Внутри сохраненной ЕСМ обоих желудочков наблюдались неизмененные основные мембраны сосудов различных диаметров без эндотелиальных или гладкомышечных клеток. Кроме того, был сохранен тонкий слой плотных эпикардиальных волокон под неизмененной эпикардиальной основной пластинкой.
Для оценки механических свойств бесклеточной сердечной ткани, выполняли двухосевое тестирование и сравнивали с гелями фибрина, который часто используется в качестве искусственного каркаса АСМ при инженерии сердечной ткани. Нормальный желудочек крыс и бесклеточные образцы были высоко анизотропными в отношении поведения напряжения-натяжения. Наоборот, в образцах фибринового геля, свойства напряжения-натяжения были крайне схожими между двумя основными направлениями. Зависимость поведения напряжения-натяжения от направления присутствовала во всех образцах в нормальном желудочке крыс и бесклеточных группах, и изотропная природа свойств напряжения-натяжения была типична для всех образцов в группе фибринового геля.
Для сравнения свойств напряжения-натяжения между этими двумя группами, а также между основными осями сердец, рассчитывали тангенциальный модуль при натяжении 40% (см. уравнение в примере 5) и в окружном, и в продольном направлении. Следует отметить, что в обоих направлениях в группе бесклеточных образцов был значимо более высокий модуль, чем в нормальном желудочке крыс, и в группе образцов фибринового геля. Однако имелось значимое различие между модулями в двух направлениях и для нормального желудочка крыс, и для бесклеточной матрицы, но не для фибринового геля.
Для интактной ткани левого желудочка, напряжение при 40% натяжении изменялось в диапазоне между 5 и 14 кПа в продольном направлении и между 15 и 24 кПа в окружном направлении, что согласуется с ранее опубликованными данными. И в ткани желудочков крыс, и в бесклеточной ткани желудочков крыс окружное направление было жестче, чем продольное направление, вероятнее всего вследствие ориентации мышечных волокон сердца. Хотя ориентация волокон изменяется по толщине сердечной ткани, большинство волокон были ориентированы в окружном направлении, и, таким образом, следовало бы ожидать, что это направление будет жестче. Бесклеточная ткань была значительно жестче, чем интактная ткань. Этого также следовало бы ожидать, поскольку внеклеточная матрица жестче, чем сами клетки, и комбинация ЕСМ и клеток была бы, вероятно, не столь жесткой, как лишь одна ЕСМ. Хотя величины тангенциального модуля бесклеточной ткани представляются достаточно большими, они лишь несколько больше, чем величины модуля Юнга для очищенного эластина (приблизительно 600 кПа), и меньше чем модуль Юнга одиночного коллагенового волокна (5 мПа), помещая определенные здесь величины в пределы целесообразного интервала.
Пример 8 – Удаление клеток из других органов и тканей
В дополнение к крысиному сердцу, легким, почке и печение, аналогичные результаты были получены применением описанной в настоящем описании последовательности операций перфузионного удаления клеток к скелетным мышцам, поджелудочной железе, тонкой и толстой кишке, пищеводу, желудку, селезенке, головному мозгу, спинному мозгу и кости.
Пример 9 – Удаление клеток из почки свиньи
Почки свиней выделяли у самцов животных после введения гепарина. Для обеспечения возможности перфузии изолированных органов, почечную артерию канюлировали, и кровь вымывали перфузией PBS в течение 15 мин. Перфузию 27 л 1% SDS в деионизированной воде выполняли в течение 35,5 ч при давлении 50-100 мм рт.ст. Перфузию 1% Triton-X в деионизированной воде начинали для удаления SDS из каркаса ЕСМ. Затем выполняли промывание и забуферивание бесклеточных почек перфузией содержащим антибиотики PBS в течение 120 ч для удаления детергентов и получения биологически совместимого рН.
Очистка органа наблюдалась в пределах 2 ч от начала перфузии. Светло-белый цвет преобладал в течение 12 ч перфузии. Удаление клеток прекращали, когда орган был белым и полупрозрачным.
Пример 10 – Трансплантация бесклеточного сердца
Сердца от крыс F344 получали канюлированием аорты дистальнее аортального клапана и перевязкой всех других крупных сосудов и легочных сосудов, кроме левой ветви ствола легочной артерии (дистальнее его разветвления) и нижней полой вены (IVC). Удаления клеток достигали, используя ретроградную коронарную перфузию по Лангендорфу 2 л 1% SDS в течение 12-16 ч. Затем сердца ренатурировали 35 мл 1% Triton-X в течение 30-40 мин, и затем промывали PBS, содержащим антибиотики и противогрибковые препараты, в течение 72 ч. IVC перевязывали перед трансплантацией.
Крупную (массой 380-400 г) крысу готовили в качестве реципиента бесклеточного сердца. Тупоугольный «москитный» зажим накладывали и на IVC, и на брюшную аорту животного-хозяина для обеспечения изоляции областей анастомоза. Аорту бесклеточного сердца анастомозировали с брюшной аортой хозяина проксимальнее и ниже ответвления почечных артерий, используя шелковую нить 8-0. Левую ветвь ствола легочной артерии бесклеточного сердца анастомозировали с ближайшей областью IVC хозяина для минимизации физического напряжения на ствол легочной артерии.
После того как оба сосуда были вшиты животному-хозяину, зажим освобождали, и бесклеточного сердце заполняли кровью животного-хозяина. Давление в брюшной аорте животного-реципиента наблюдали визуально в бесклеточном сердце и аорте. Бесклеточное сердце становилось растянутым и красным от крови. В участках анастомозов кровотечение было минимальным. Гепарин вводили через 3 мин после снятия зажима (начала перфузии), и сердце фотографировали и помещали в брюшную полость для минимизации напряжения в участках анастомозов. Брюшную полость ушивали в стерильных условиях, и контролировали восстановление животного. Через 55 ч после трансплантации, животное подвергали эвтаназии, и бесклеточное сердце эксплантировали для наблюдения. У животных, которые не получали гепарин, проявился большой тромбоз в левом желудочке после рассечения и оценки. Кровь также наблюдалась в коронарных артериях и в правом, и в левом отделах сердца.
В других экспериментах трансплантации, зажим снимали после вшивания обоих сосудов животному, и бесклеточное сердце заполняли кровью животного-хозяина. Давление в брюшной аорте животного-реципиента наблюдали визуально в бесклеточном сердце и аорте. Бесклеточное сердце становилось растянутым и красным, и в участках анастомозов кровотечение было минимальным. Гепарин (3000 МЕ) вводили внутрибрюшинной инъекцией через 3 мин после снятия зажима (начала перфузии). Сердце фотографировали и помещали в брюшную полость для минимизации напряжения в участках анастомозов. Брюшную полость ушивали в стерильных условиях, и контролировали восстановление животного. Животное было обнаружено мертвым в результате кровотечения приблизительно через 48 ч после трансплантации. На момент проведения испытаний, длительность трансплантации находилась в интервале от 55 до 70 мин.
Раздел С. Восстановление содержания клеток
Пример 1 - Восстановление содержания клеток в срезах сердечной ЕСМ
5
Для оценки биологической совместимости бесклеточной ЕСМ, срезы толщиной 1 мм одного бесклеточного сердца культивировали с линиями миогенных и эндотелиальных клеток. 2×10 миобластов крысиных скелетных мышц, мышиных миобластов С2С12, эндотелиальных клеток человеческого пупочного канатика (ВРЕС) высевали на тканевые срезы и совместно культивировали в стандартных условиях в течение 7 дней. Миогенные клетки мигрировали через ЕСМ и размножались внутри нее и совмещались с первоначальной ориентацией волокон. Эти миогенные клетки проявили увеличенную пролиферацию и полностью вновь заселяли большие части среза ЕСМ. Линии эндотелиальных клеток проявили менее инвазивный тип роста, образуя монослой на поверхности трансплантата. В этих условиях не было выявляемых антипролиферативных эффектов.
Пример 2 - Восстановление содержания клеток в сердечной ЕСМ коронарной перфузией
2
2
6
6
Для определения эффективности высевания регенеративных клеток на бесклеточную ЕСМ и внутрь нее путем коронарной перфузии, бесклеточное сердце переносили в органную камеру и непрерывно перфузировали оксигенированными культуральными средами в условиях клеточной культуры (5% СО, влажность 60%, 37°С). 120×10 HUVEC, меченых PKH, (суспендированных в 50 мл сред роста эндотелиальных клеток) вливали при давлении коронарной перфузии 40 см НО. Оттекающий коронарный перфузат сохраняли, и клетки подчитывали. Затем оттекающий коронарный перфузат рециркулировали и снова перфузировали для доставки максимального количества клеток. Рециркуляцию повторяли 2 раза. После третьего прохождения, приблизительно 90×10 клеток удерживались в сердце. Сердце непрерывно перфузировали 500 мл рециркулирующей окисгенированной среды для эндотелиальных клеток в течение 120 ч, затем сердце удаляли и заливали для приготовления криосрезов. Нахождение HUVEC ограничивалось артериальными и венозными остатками по всему сердцу, но они еще не были полностью диспергированы по внесосудистой ЕСМ.
Пример 3 - Восстановление содержания клеток в бесклеточном сердце крысы сердечными клетками новорожденной крысы
Выделение и получение кардиоцитов новорожденных крыс
2
. В 1-й день, у 8-10 новорожденных крысят SPF Fisher-344 в возрасте 1-3 дней (Harlan Labs, Indianapolis, IN) вызывали седативный эффект ингаляцией 5% изофлюрана (Abbott Laboratories, North Chicago, IL), орошали 70% EtOH и быстро выполняли стернотомию в стерильных условиях. Сердца иссекали и немедленно помещали в 50-мл коническую пробирку на льду, содержащую HBSS (сбалансированный солевой раствор Хенкса), реагент №1 из устройства для выделения кардиомиоцитов новорожденных (Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ). Надосадочную жидкость удаляли и цельные сердца однократно промывали холодным HBSS энергичным вихревым перемешиванием. Сердца переносили в 100 мм культуральную чашку, содержащую 5 мл холодного HBSS. Соединительную ткань удаляли. И оставшуюся ткань измельчали на кусочки <1 мм. Добавляли дополнительный HBSS для доведения общего объема до 9 мл, к которому добавляли 1 мл трипсина (реагент №2, набор Worthington) для получения конечной концентрации 50 мкг/мл. Планшеты инкубировали в течение ночи в холодильнике при 5°С.
На 2-й день, планшеты удаляли из холодильника и помещали в стерильный кожух на льду. Ткань и содержащий трипсин буфер переносили в 50 мл конические пробирки на льду, используя пипетки с широким отверстием. Ингибитор трипсина (реагент №3) растворяли 1 мл HBSS (реагента №1) и добавляли в 50 мл коническую пробирку и осторожно смешивали. Ткань оксигенировали в течение 60-90 с пропусканием воздуха по поверхности жидкости. Затем ткань согревали до 37°С и медленно добавляли коллагеназу (300 единиц/мл), растворенную в 5 мл Leibovitz L-15. Ткань помещали в теплую (37°С) ванну-вибростенд на 45 мин. Затем ткань титровали 10 раз, используя 10 мл пипетку для высвобождения клеток (3 мл/с) и затем фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Ткань промывали еще 5 мл среды L-15, титровали второй раз и собирали в такую же 50 мл коническую пробирку. Затем раствор клеток инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин и центрифугировали при 50×g в течение 5 мин для осаждения клеток. Надосадочную жидкость осторожно удаляли и клетки повторно суспендировали в желаемом объеме, используя среду для кардиомицитов новорожденных.
Среды и растворы
Среда Worthington Leibovitz L-15
Среда кардиомиоцитов новорожденных
. Все среды были подвергнуты фильтрационной стерилизации и хранились в темноте в холодильнике при 5°С. Набор для выделения Worthington содержит предлагаемую среду, Leibovitz L-15, для культуры. Эту среду использовали только для обработки ткани на 2-ой день. Для культивирования использовали альтернативную, содержащую кальций среду, которая описана в настоящем описании. : порошок среды Leibovitz растворяли, используя 1 л воды сорта для клеточной культуры. Среда Leibovitz L-15 содержит 140 мг/мл CaCl, 93,68 мг/мл MgCl и 97,67 мг/мл MgS. : В модифицированную по Iscov среду Дульбекко (Gibco, каталожный №12440-053) добавляли 10% фетальную телячью сыворотку (HyClone), 100 ЕД/мл пенициллина-G (Gibco), 100 ЕД/мл стрепотимицина (Gibco), 2 ммоль/л L-глутамина (Invitrogen) и 0,1 ммоль/л 2-меркаптоэтанола (Gibco, каталожный №21985-023) и перед использованием подвергали стерилизационной фильтрации. При необходимости, добавляли амфотерицин-В (конечная концентрация 0,25 мкг/мл). Эта среда была усилена 1,2 мМ CaCl (Fisher Scientific, каталожный №С614-500) и 0,8 мМ MgCl (Sigma, каталожный №М-0250).
Анализ восстановления содержания клеток культивированием in vitro
6
. В качестве шага в направлении создания биологического искусственного сердца, содержание клеток в изолированной ЕСМ восстанавливали клетками, полученными из сердца новорожденных крысят. В полностью бесклеточные сердца (полученные как описано в настоящем описании) инъецировали комбинацию 50 ×10 недавно изолированных кардиомиоцитов, фиброцитов, эндотелиальных и гладкомышечных клеток новорожденных крыс. Затем делали срезы ткани сердца и срезы культивировали in vitro для испытания биологической совместимости бесклеточной ЕСМ и способности полученных конструктов для развития в кольца миокарда.
Минимальные концентрации внутри полученных колец наблюдали микроскопически через 24 ч, демонстрируя, что трансплантированные клетки были способны прикрепиться и приживиться на бесклеточной ЕСМ. Микроскопически, клетки ориентировались вдоль направления волокон ЕСМ. Иммунофлюоресцентное окрашивание подтвердило выживание и приживление кардиомиоцитов, экспрессирующих тяжелую цепь сердечного миозина. В пределах четырех дней, на бесклеточной матрице наблюдались кластеры бляшек сокращающихся клеток, которые в 8-му дню прогрессировали до синхронно сокращающихся тканевых колец.
Через 10 дней эти кольца устанавливали между двумя стержнями для измерения сократительной силы в условиях различной преднагрузки. Кольца можно было электрически стимулировать до частоты 4 Гц, и они создавали сократительную силу до 3 мН в условиях преднагрузки до 0,65 г. Таким образом, при этом подходе к восстановлению содержания клеток с использованием культуры ткани in vitro, получали сократительную ткань, которая генерировала силу, одинаково эффективную с той, которая генерировалась оптимизированными созданными инженерией кольцами сердечной ткани с использованием искусственных конструктов ЕСМ.
Восстановление содержания клеток в бесклеточном сердце посредством перфузии
6
2
2
. Каркасы с восстановленным содержанием клеток (50×10 недавно выделенных кардиомицитов, фиброцитов, эндотелиальных и гладкомышечных клеток новорожденных крысят) устанавливали в перфузируемый биореактор (n=10), который имитировал физиологию крысиного сердца, включая связанное с сокращением пульсирующее изменение размеров левого желудочка при постепенно увеличивающейся преднагрузке и постнагрузке (1-й день: преднагрузка 4-12 мм рт.ст., постнагрузка 3-7 мм рт.ст.), пульсирующий коронарный кровоток (1-й день: 7 мл/мин) и электрическую стимуляцию (2-ой день: 1 Гц) в стерильных условиях культуры сердечной ткани (5% СО, 60% НО, 37°С). Перфузируемую культуру органа поддерживали в течение 1-4 недель. Величины давления, потока и ЭКГ регистрировали в течение 30 с через каждые 15 мин в течение всего периода культивации. Производили видео запись развивающихся биоискусственных сердец через 4, 6 и 10 дней после посева.
Через 10 дней после посева клеток, проводили более углубленную функциональную оценку, включая введение датчика давления в левый желудочек для регистрации давления в левом желудочке (LVP) и виде запись движения стенок по мере постепенного увеличения частоты стимуляции от 0,1 Гц до 10 Гц и выполняли фармакологическую стимуляцию фенилэфрином (РЕ). Сердца с восстановленным содержанием клеток проявили сократительную реакцию на одиночные импульсы со спонтанными сокращениями после стимулированных сокращений с соответствующим увеличением LVP. После одиночной стимуляции, сердца производили 3 спонтанных сокращения и затем переходили в фибриллирующее состояние. Аналогично стимулированным сокращениям, спонтанные деполяризации вызывали соответствующее увеличение LVP и регистрируемые комплексы QRS, возможно указывающие на формирование развивающегося устойчивого типа проведения.
После увеличения частоты стимуляции до 0,4 Гц, в среднем 2 спонтанных сокращения происходили после каждого индуцированного сокращения; при частоте электростимуляции до 1 Гц, происходило только одно спонтанное сокращение; и при частоте электростимуляции 5 Гц, спонтанные сокращения не происходили. Максимальная частота захвата составила 5 Гц, что согласуется с рефрактерным периодом 250 мс для зрелого миокарда. После перфузии 100 мкМ РЕ, регулярные спонтанные деполяризации происходили при частоте 1,7 Гц и были связаны с соответствующим увеличением LVP.
Гистологический анализ через 10 дней выявил дисперсию и врастание клеток по всей толщине стенки левого желудочка (0,5-1,2 мм). Кардиомиоциты совмещались с направлением желудочковых волокон и образовывали области плотных, организованных трансплантатов, напоминающих зрелый миокард, и менее плотные незрелые трансплантаты, подобные развивающемуся миокарду. Иммунофлюоресцентное окрашивание на тяжелую цепь сердечного миозина подтвердило фенотип кардиомиоцитов. Высокая плотность капилляров сохранялась по всему вновь развившемуся миокарду при среднем расстоянии между капиллярами приблизительно 20 мкм, которое аналогично расстоянию между капиллярами, о котором сообщалось для зрелого крысиного миокарда. Фенотип эндотелиальных клеток был подтвержден иммунофлюоресцентным окрашиванием на фактор фон Виллебранда (vWF). Жизнеспособность клеток сохранялась по всей толщине трансплантата, указывая на достаточное снабжение кислородом и питательными веществами посредством коронарной перфузии.
Другие варианты осуществления
Следует понимать, что хотя изобретение было описано в сочетании с его подробным описанием, предшествующее описание предназначено для иллюстрации, а не ограничения объема изобретения, который определяется объемом прилагаемой формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации охватываются объемом следующей формулы изобретения.