ОЧИСТКА БЕЛКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИС-ТРИС БУФЕРА

1. Способ очистки белка из раствора, включающий:
(a) первую хроматографическую стадию, включающую:
- прохождение указанного раствора через первую хроматографическую колонку;
- элюирование неочищенного белка из первой хроматографической колонки, используя первый элюционный буфер;
и
(b) вторую хроматографическую стадию, включающую:
- прохождение элюента неочищенного белка, полученного в конце стадии (a), через вторую хроматографическую колонку;
- извлечение очищенного белка из второй хроматографической колонки, используя второй элюционный буфер,
причем каждый из буферов содержит Бис-Трис.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что каждая из двух хроматографических стадий включает:
- прохождение уравновешивающего буфера через хроматографическую колонку;
- прохождение раствора или элюента неочищенного белка через хроматографическую колонку;
- прохождение уравновешивающего буфера через хроматографическую колонку;
- необязательно, прохождение промывного и обеззараживающего буфера через хроматографическую колонку;
- необязательно, прохождение уравновешивающего буфера через хроматографическую колонку;
- элюирование элюента неочищенного белка или извлечение очищенного белка из хроматографической колонки, используя элюционный буфер,
причем каждый из буферов содержит Бис-Трис.
3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что каждый из буферов состоит из различающихся концентраций одних и тех же химических соединений.
4. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что каждый из буферов состоит из Бис-Трис, уксусной кислоты, NaCl и воды.
5. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что способ очистки белка из раствора включает только две хроматографические стадии.
6. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что одна из хроматографических колонок представляет собой колонку для аффинной хроматографии, конкретнее, отличающийся тем, что одна из хроматографических колонок представляет собой колонку белка A для аффинной хроматографии.
7. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что одна из хроматографических колонок представляет собой хроматографическую колонку с мультимодальной смолой.
8. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что стадия (a) дополнительно включает регулирование pH элюента неочищенного белка с использованием раствора Бис-Трис, в частности, отличающийся тем, что стадия (a) дополнительно включает регулирование pH элюента неочищенного белка до величины в диапазоне от 6 до 7 с использованием раствора Бис-Трис.
9. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что элюент
неочищенного белка, полученный в конце стадии (a), непосредственно проходит через вторую хроматографическую колонку, не подвергаясь никакой обработке, такой как регулирование pH, обмен буфера или разбавление.
10. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что указанный способ включает следующие стадии:
(a) первую хроматографическую стадию, включающую:
(i) прохождение уравновешивающего буфера через первую хроматографическую колонку;
(ii) прохождение раствора через первую хроматографическую колонку;
(iii) прохождение уравновешивающего буфера через первую хроматографическую колонку;
(iv) прохождение промывного и обеззараживающего буфера через первую хроматографическую колонку;
(v) прохождение уравновешивающего буфера через первую хроматографическую колонку;
(vi) элюирование элюата неочищенного белка из первой хроматографической колонки, используя первый элюционный буфер; и
(vii) необязательно, регулирование pH элюента неочищенного белка, используя раствор Бис-Трис;
и
(b) вторую хроматографическую стадию, включающую:
(i) прохождение уравновешивающего буфера через вторую хроматографическую колонку;
(ii) прохождение элюента неочищенного белка со стадии (a) через вторую хроматографическую колонку;
(iii) прохождение уравновешивающего буфера через вторую хроматографическую колонку; и
(iv) извлечение очищенного белка из второй хроматографической колонки, используя второй элюционный буфер.
11. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что первая хроматографическая колонка представляет собой колонку для аффинной хроматографии, конкретнее, отличающийся тем, что первая хроматографическая колонка представляет собой колонку белка A для аффинной хроматографии.
12. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что вторая хроматографическая колонка представляет собой хроматографическую колонку с мультимодальной смолой.
13. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный способ включает следующие стадии:
(a) первую хроматографическую стадию, включающую:
(i) прохождение уравновешивающего буфера через первую хроматографическую колонку;
(ii) прохождение раствора через первую хроматографическую колонку;
(iii) прохождение уравновешивающего буфера через первую хроматографическую колонку;
(iv) элюирование элюата неочищенного белка из первой хроматографической колонки с использованием первого элюционного буфера; и
(v) необязательно, регулирование pH элюента неочищенного белка с использованием раствора Бис-Трис;
и
(b) вторую хроматографическую стадию, включающую:
(i) прохождение уравновешивающего буфера через вторую хроматографическую колонку;
(ii) прохождение элюента неочищенного белка со стадии (a) через вторую хроматографическую колонку;
(iii) прохождение уравновешивающего буфера через вторую хроматографическую колонку;
(iv) прохождение промывного и обеззараживающего буфера через вторую хроматографическую колонку;
(v) прохождение уравновешивающего буфера через вторую хроматографическую колонку; и
(vi) извлечение очищенного белка из второй хроматографической колонки с использованием второго элюционного буфера.
14. Способ по любому из пп. 1, 2 или 13, отличающийся тем, что первая хроматографическая колонка представляет собой хроматографическую колонку с мультимодальной смолой.
15. Способ по любому из пп. 1, 2 или 13, отличающийся тем, что вторая хроматографическая колонка представляет собой колонку для аффинной хроматографии, конкретнее, отличающийся тем, что вторая хроматографическая колонка представляет собой колонку белка A для аффинной хроматографии.
16. Способ по любому из пп. 1, 2 или 13, отличающийся тем, что белок представляет собой антитело, конкретнее, отличающийся тем, что антитело представляет собой моноклональное антитело, еще конкретнее, белок представляет собой моноклональное антитело, выбранное из группы, состоящей из антитела, которое специфически связывается с протофибриллярной формой человеческого β-амилоидного белка, антитела, которое специфически связывается с поли-N-ацетилглюкозамином (PNAG) бактериального поверхностного полисахарида, и антитела, которое специфически связывается с трансмембранным гликопротеином CD38.
17. Способ по любому из пп. 1, 2 или 13, дополнительно включающий, после стадии (b), стадию (c) прохождения элюента неочищенного белка через мембранный поглотитель.
18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что указанный мембранный поглотитель представляет собой толерантный к взаимодействию с солью хроматографический мембранный поглотитель.
19. Способ по любому из пп. 1, 2 или 18, дополнительно включающий стадию нанофильтрации после стадии (b) или (c).
20. Способ по п. 19, дополнительно включающий стадию ультрафильтрации и диафильтрации после стадии нанофильтрации.
21. Способ по любому из пп. 1, 2 или 20, отличающийся тем, что первый элюционный буфер содержит от 15 до 25 мМ Бис-Трис и от 15 до 25 мМ NaCl, pH которого доводят до диапазона от 3 до 4 уксусной кислотой.
22. Способ по любому из пп. 1, 2 или 20, отличающийся тем, что второй элюционный буфер:
- содержит от 15 до 25 мМ Бис-Трис и от 15 до 25 мМ NaCl, pH которого доводят до диапазона от 4 до 5 уксусной кислотой, или
- содержит от 15 до 25 мМ Бис-Трис и от 150 до 250 мМ NaCl, pH которого доводят до диапазона от 8 до 9 уксусной кислотой.
23. Способ по любому из пп. 1, 2 13 или 20, отличающийся тем, что первый элюционный буфер:
- содержит от 15 до 25 мМ Бис-Трис и от 15 до 25 мМ NaCl, pH которого доводят до диапазона от 4 до 5 уксусной кислотой, или
- содержит от 15 до 25 мМ Бис-Трис и от 150 до 250 мМ NaCl, pH которого доводят до диапазона от 8 до 9 уксусной кислотой.
24. Способ по любому из пп. 1, 2, 13 или 20, отличающийся тем, что второй элюционный буфер содержит от 15 до 25 мМ Бис-Трис и от 15 до 25 мМ NaCl, pH которого доводят до диапазона от 3 до 4 уксусной кислотой.
25. Способ по любому из пп. 2, 13 или 20, отличающийся тем, что уравновешивающий буфер содержит от 15 до 25 мМ Бис-Трис и от 15 до 25 мМ NaCl, pH которого доводят до диапазона от 7 до 8 уксусной кислотой.
26. Способ по любому из пп. 2, 13 или 20, отличающийся тем, что промывной и обеззараживающий буфер содержит от 15 до 25 мМ Бис-Трис и от 0,9 до 1,1 мМ NaCl, pH которого доводят до диапазона от 7 до 8 уксусной кислотой.
27. Способ по любому из пп. 1, 2 13 или 20, отличающийся тем, что очищенный белок извлекается с выходом по меньшей мере 85%.
28. Способ по любому из пп. 1, 2 13 или 20, отличающийся тем, что извлеченный очищенный белок демонстрирует чистоту по меньшей мере 95%.
29. Способ по любому из пп. 1, 2 13 или 20, дополнительно включающий стадию включения извлеченного очищенного белка в состав фармацевтической композиции.
30. Способ получения буферов, пригодных для использования в способе по любому из пп. 1-29, включающему стадии:
i) получения раствора с конечной концентрацией от 15 до 25 мМ Бис-Трис и от 15 до 25 мМ NaCl;
ii) доведения pH раствора до величины в диапазоне от 7 до 8 уксусной кислотой;
iii) сбора половины раствора, посредством этого получая уравновешивающий буфер;
iv) доведения pH оставшейся половины раствора со стадии (iii) до величины в диапазоне от 4 до 5 уксусной кислотой;
v) сбора половины раствора, полученного на стадии (iv), посредством этого получая элюционный буфер;
vi) доведения pH оставшейся половины раствора со стадии (v) до величины в диапазоне от 3 до 4 уксусной кислотой, посредством этого получая дополнительный элюционный буфер;
vii) сбора половины уравновешивающего буфера, полученного на стадии (iii), и добавления NaCl для получения конечной концентрации NaCl в диапазоне от 0,9 до 1,1 мМ, посредством этого получая промывной и обеззараживающий буфер.
31. Способ получения буферов, пригодных для использования в способе по любому из пп. 1-29, включающий стадии:
i) получения раствора с конечной концентрацией от 15 до 25 мМ Бис-Трис и от 15 до 25 мМ NaCl;
ii) доведения pH раствора до величины в диапазоне от 8 до 9 уксусной кислотой;
iii) сбора одной четверти раствора, посредством этого получая элюционный буфер;
iv) доведения pH оставшегося раствора со стадии (iii) до величины в диапазоне от 7 до 8 уксусной кислотой;
v) сбора двух третей раствора, полученного на стадии (iv), посредством этого получая уравновешивающий буфер;
vi) доведения pH оставшегося раствора со стадии (v) до величины в диапазоне от 3 до 4 уксусной кислотой, посредством этого получая дополнительный элюционный буфер;
vii) сбора половины уравновешивающего буфера, полученного на стадии (v), и добавления NaCl для получения конечной концентрации NaCl в диапазоне от 0,9 до 1,1 мМ (например, 1М), посредством этого получая промывной и обеззараживающий буфер.
32. Набор, содержащий:
(a) хроматографическую колонку с мультимодальной смолой и/или хроматографическую колонку для аффинной хроматографии, такую как колонка белка A;
и
(b) по меньшей мере один буфер, содержащий или состоящий из Бис-Трис, уксусной кислоты, NaCl и воды.
33. Набор, содержащий:
(a) хроматографическую колонку с мультимодальной смолой и/или хроматографическую колонку для аффинной хроматографии, такую как колонка белка A;
и
(b) инструкции по получению по меньшей мере одного буфера, содержащего или состоящего из Бис-Трис, уксусной кислоты, NaCl и воды.
34. Применение буфера, содержащего или состоящего из Бис-Трис, уксусной кислоты, NaCl и воды, для очистки белка из раствора по меньшей мере одной хроматографической стадией.
35. Применение по п. 34, отличающееся тем, что хроматографическая стадия представляет собой стадию хроматографии на колонке с мультимодальной смолой и/или на колонке для аффинной хроматографии, такой как колонка белка A.