Абзимная активность поликлональных иммуноглобулинов при спондилоартропатиях

Медицинская Иммунология 2009, Т. 11, № 2-3, стр. 215-220 © 2009, СПб РО РААКИ

Оригинальные статьи

АБЗИМНАЯ АКТИВНОСТЬ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ПРИ СПОНДИЛОАРТРОПАТИЯХ

Кундер Е.В.

УО «Витебский государственный медицинский университет», кафедра госпитальной терапии, г. Витебск, Беларусь

Резюме. Использовались поликлональные иммуноглобулины класса G подклассов 1, 2, 4, выделенные из сыворотки 255 пациентов и 69 здоровых лиц комбинированным риванолаффиннохроматографическим методом. Постановка реакций осуществлялась согласно методикам, разработанным и апробированным нами ранее при оценке абзимной активности у больных с различной патологией. Уровни ДНКазной (дезоксирибонуклеазной), протеолитической БАПНА-амидазной (бензоиларгинин-паранитроанилид-амидазной) и супероксиддисмутазной абзимной активности при спондилоартропатиях оказались достоверно (р < 0,001) выше по сравнению с контрольной группой. Каталазная активность иммуноглобулинов при изучаемых заболеваниях была сопоставима с контрольным уровнем (р > 0,05). Анализ взаимоотношений между абзимной активностью и клиниколабораторными признаками заболеваний обнаружил ряд достоверных взаимосвязей. Установлено преобладание абзимной ДНКазной активности у пациентов с псориатическим артритом по сравнению с реактивным артритом и анкилозирующим спондилитом (р < 0,001).

Ключевые слова: спондилоартропатии, абзимная активность.

Kunder E.V.

ABZYME ACTIVITY OF POLYCLONAL IMMUNOGLOBULINS IN SPONDYLOARTHROPATHIES

Abstract. Polyclonal immunoglobulins G

Введение

Спондилоартопатии объединяют заболевания, характеризующиеся прогрессирующим хроническим воспалительным процессом с поражением осевого скелета и периферических суставов и имеющих некоторые общие этиопатогенети-ческие и клинические признаки. Типичными

Адрес для переписки:

Кундер Елена Владимировна,

210038, Беларусь, г. Витебск, пр. Победы, д. 2, кв. 48. Тел.: (375) 296-778-220.

E-mail: elsid7@mail.ru

представителями этой патологии являются псориатический артрит (ПА), реактивные артриты (РеА) и анкилозирующий спондилит (АС). На роль перспективного направления изучения спондилоартропатий может претендовать абзимо-логия, развитие которой открывает значительные возможности для исследования различных иммунологических изменений [3]. К настоящему времени доказано существование абзимов — антител и иммуноглобулинов (Ig), катализирующих большинство значимых биоорганических реакций. Абзимная активность изучается при системных заболеваниях соединительной ткани, ревматоидном

215

Кундер Е.В.

Медицинская Иммунология

Рисунок 1. Электрофорез выделенных препаратов IgG в 12% ПАГ в присутствии SDS-Na, окраска Coomassie R250

артрите, при заболеваниях щитовидной железы, инфекционной патологии [5,7,8,12]. Предварительные результаты в этом направлении дают основания для дальнейших исследований, в том числе и с целью разработки новых методов диагностики спондилоартропатий.

Материалы и методы

В исследовании приняли участие 255 пациентов (98 — с псориатическим артритом, 51 — с анки-лозирующим спондилитом и 106 — с реактивным хламидиоиндуцированным артритом). Контрольную группу составили 69 здоровых лиц. Принадлежность заболеваний к спондилоартропатиям устанавливалась в соответствии с классификационными критериями Amor B. et al. [9]. Средний возраст пациентов равнялся 40,1±0,8 года, мужчин было 153 (60%), женщин — 102 (40%).

Диагноз ПА выставлялся согласно критериям Mathies [11] и критериям Института ревматологии РАМН (1989) [1]. Активность воспаления

1 степени определена в 42 случаях (43%), 2 степени — в 41 (42%), 3 степени — в 15 (15%). Рентгенологическая 1 стадия артрита не была выявлена,

2 стадия — у 63 (64%), 3 стадия — у 24 (23%), 4 стадия — у 12 пациентов (13%).

В группе больных РеА для диагностики урогенитальной инфекции использовались методы микроскопии, бактериологические методы, РИФ

и ПЦР, а также культуральный метод. У 85 больных (80%) констатировано наличие хламидийной инфекции, у 17 больных (13%) — сочетание хламидийной инфекции и трихомониаза, у 4 (3%) — сочетание хламидийной, уреаплазменной инфекции и трихомониаза.

Диагноз АС выставлялся в соответствии с модифицированными Нью-Йоркскими критериями [14]. Центральная форма заболевания была выявлена у 41 пациентов (80%), ризомелическая — у 8 (16%), периферическая — у 2 (4%). Активность заболевания 1 степени была выявлена у 12 больных (24%), 2 — у 24 (47%), 3 — у 15 пациентов (29%). Рентгенологическая 1 стадия выявлена не была, 2-я определялась у 12 пациентов (24%), 3-я — у 19 (36%), 4-я — у 20 больных (40%).

Контрольная группа состояла из 69 здоровых доноров Витебской областной станции переливания крови, мужчин было 44 (64%), женщин — 25 (36%). Средний возраст в контрольной группе составил 36,1±1,1 года.

Выделение препаратов поликлональных Ig класса, G 1, 2 и 4 подклассов из сыворотки крови проводили комбинированным риванолаффиннохроматографическим методом [3]. Контроль чистоты полученных Ig проводили с помощью электрофореза в полиакриаламидном геле в системе буферов по Laemmli с использованием 10% или 12% разделяющего геля в присутствии додецилсульфата натрия по методам, изложенным в [3]. Исходно гель окрашивали Кумасси R250. По результатам электрофореза обнаруживалась одна белковая полоса, мигрирующая в зоне гамма-глобулинов (рис. 1А). Увеличение белковой нагрузки на трек (рис. 1Б), а также окрашивание гелей нитратом серебра дополнительных полос не выявило, что свидетельствовало о гомогенности полученных IgG.

Дополнительные доказательства принадлежности каталитической активности антителам были получены под руководством профессора Г.А. Невинского в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН с использованием предоставленных нами препаратов антител [12]. Изучалась ДНКазная активность антител in situ методом диссоциирующего электрофореза, а также путем FPLC хроматографии антител в диссоциирующих условиях. Полученные результаты подтвердили принадлежность каталитической активности антителам.

Нами исследованы следующие виды абзим-ной активности: деполимеризующая (ДНКазная и протеолитическая БАПНА (бензоиларгинин-паранитроанилид-амидазная) и оксидоредук-тазная (каталазная и супероксиддисмутазная (СОД)). Постановка реакций каталитической

216

2009, Т. 11, № 2-3

Абзимы при спондилоартропатиях

активности Ig осуществлялась согласно методикам, разработанным нами и апробированным на различных биологических моделях [4, 5]. Проводился визуальный учет реакции ДНКазной активности, при этом сгусткообразование оценивали в баллах. Отсутствие активности — компактный сгусток — 0 баллов; 1 балл — минимальная активность — рыхлый сгусток; 2 балла — слабая активность — рыхлый сгусток, хлопья, нити; 3 — умеренная активность — хлопья, нити; 4 — высокая активность — распад сгустка, хлопья, нити; 5 баллов — максимальная активность — полный распад сгустка ДНК с образованием гомогенной взвеси.

Уровни каталазной и СОД активности выражали в условных единицах (УЕ), БАПНА-амидаз-ной — в единицах оптической плотности (ЕОП). Для каталазной и СОД реакций формула расчета активности имела следующий вид:

Ek - Eo)

= Ek*100% ’

где А — активность препарата, Ек — средняя оптическая плотность контрольных проб, Ео — средняя оптическая плотность опытных проб.

Для БАПНА-амидазной реакции формула расчета активности имела следующий вид:

A = Eo - Ek,

где А — активность препарата, Ек — средняя оптическая плотность контрольных проб, Ео — средняя оптическая плотность опытных проб.

Достоверность различий определяли с помощью параметрических (Стьюдента) в случае нормального распределения и непараметрических (Манна-Уитни) критериев статистики. Для оценки диагностической точности разработанных лабораторных тестов проводился расчет операционных характеристик [6].

Результаты

Уровень ДНКазной активности Ig при спондилоартропатиях достоверно (р < 0,001) отличался от величины данной активности у здоровых лиц (2,8±0,08 по сравнению с 0,43±0,08). ДНКаз-ная активность Ig при ПА достоверно (р < 0,001) отличалась от контрольного уровня (3,7±0,08 по сравнению с 0,43±0,08). ДНКазная активность у больных РеА достоверно (р < 0,001) отличалась от контрольной (2,5±0,1 по сравнению с 0,43±0,08). ДНКазная активность при АС достоверно (р < 0,001) отличалась от контрольного значения (1,5±0,14 по сравнению с 0,43±0,08). Уровень ДНКазной активности Ig при ПА достоверно (р < 0,001) преобладал над данным видом активности у всех обследованных лиц со спонди-лоартропатиями (р < 0,001).

БАПНА-амидазная активность Ig у больных спондилоартропатиями достоверно (р < 0,05) отличалась от контрольных значений (0,042±0,009 по сравнению с 0,01±0,001). БАПНА-амидазная активность при ПА достоверно (р<0,05) превышала контрольную (0,051±0,017 по сравнению с 0,01±0,001). БАПНА-амидазная активность при РеА также достоверно (р < 0,05) превышала таковую у здоровых лиц (0,061±0,023 по сравнению с 0,01±0,001). БАПНА-амидазная активность при АС достоверно отличалась (р < 0,05) от контрольной (0,02±0,024 по сравнению с 0,01±0,001).

Уровень каталазной активности Ig при спондилоартропатиях достоверно (р > 0,05) не отличался от величины данного вида активности у здоровых лиц (4,7±0,46 по сравнению с 4,3±0,625). Каталазная активность ИГ у больных ПА достоверно не превышала (р > 0,05) контрольные значения (4,18±0,48 по сравнению с 4,3±0,625). Каталазная активность Ig при РеА также достоверно превышала (р < 0,05) таковую у здоровых лиц (5,98±0,85 по сравнению с 4,3±0,625). Каталазная активность Ig у пациентов с АС имела значения, не отличающиеся достоверно (р > 0,05) от контрольных значений (4,9±0,68 по сравнению с 4,3±0,625).

СОД активность у всех больных достоверно (р < 0,001) превышала контрольные значения (23,6±0,84 по сравнению с 4,1±0,67). При ПА данная активность достоверно (р < 0,001) отличалась от контрольной (24,7±1,1 по сравнению с 4,1±0,67). СОД активность Ig у больных РеА также достоверно (р < 0,001) отличалась от величины активности среди доноров (21,7±1,2 по сравнению с 4,1±0,67). Уровень СОД активности при достоверно (р < 0,001) отличался от донорского значения (16,4±1,23 по сравнению с 4,1±0,67).

При проведении корреляционного анализа между величинами каталитической активности Ig и клиническими данными, а также лабораторными изменениями получены результаты, представленные в таблице 1.

В результате расчета операционных характеристик разработанного метода дифференциальной диагностики спондилоартропатий для различных величин ДНКазной активности Ig, выраженной в баллах, было установлено, что оптимальные уровни данных операционных характеристик соответствуют ДНКазной активности, равной 4 баллам. Результаты расчета операционных характеристик определения ДНКазной активности Ig представлены в таблице 2.

Согласно рекомендациям Американской коллегии ревматологов [13] наиболее полезными для диагностики ревматических заболеваний являются лабораторные тесты с ОП+ > 5 и ОП- < 0,2; полезными — с ОП+ > 2 и <5, ОП- > 0,2 и < 0,5;

217

Кундер Е.В.

Медицинская Иммунология

ТАБЛИЦА 1. РЕЗУЛЬТАТЫ КОРРЕЛЯЦИОННОГО АНАЛИЗА ПОКАЗАТЕЛЕЙ АБЗИМНОЙ АКТИВНОСТИ и клинико-лабораторных признаков сПОНдИЛОАРТРОПАТИй

Коррелирующие признаки Показатели корреляции

Коэффициент корреляции, r Уровень значимости, р Число наблюдений, n

Спондилоартропатии

ДНКазная активность ИГ и наличие артрита 0,5 < 0,001 255

ДНКазная активность и поражение кожи 0,57 < 0,001 245

Псориатический артрит

ДНКазная активность ИГ и экссудативный псориаз 0,6 < 0,001 98

ДНКазная активность ИГ и непрерывно рецидивирующее течение псориаза 0,74 < 0,001 57

ДНКазная активность ИГ и длительность ониходистрофии 0,36 0,0056 57

ДНКазная активность и стадия артрита -0,3 0,026 57

ДНКазная активность ИГ и наличие сакроилеита 0,42 < 0,001 98

СОД активность ИГ и наличие экссудативного псориаза 0,58 0,0012 28

Реактивные артриты

ДНКазная активность ИГ и уровень СОЭ 0,33 < 0,001 < 0,001

ДНКазная активность ИГ и число лейкоцитов в крови 0,37 < 0,001 < 0,001

ДНКазная активность ИГ и число эритроцитов в крови -0,25 0,0275 106

ДНКазная активность ИГ и количество Т-лимфоцитов 0,31 0,04 42

Анкилозирующий спондилит

ДНКазная активность ИГ и стадия сакроилеита 0,3 0,035 51

ДНКазная активность ИГ и лечение сульфасалазином -0,36 0,05 29

БАПНА-амидазная активность ИГ и стадия сакроилеита -0,61 0,0059 19

БАПНА-амидазная активность и стадия спондилита -0,58 0,0044 22

БАПНА-амидазная активность и BASDAI -0,63 0,0018 22

таблица 2. результаты расчета операционных характеристик определения днказной активности иммуноглобулинов у обследованных пациентов

Характеристики теста ПА и АС ПА и РеА ПА и

Диагностическая чувствительность 73% 73% 73%

Диагностическая специфичность 90% 80% 84%

Предсказательная ценность положительного результата 93% 77% 73%

Предсказательная ценность отрицательного результата 63% 76% 83%

Диагностическая эффективность 78,5% 76,5% 79%

Отношение правдоподобия положительного результата (ОП+) 7,4 3,7 4,4

Отношение правдоподобия отрицательного результата (ОП-) 0,3 0,34 0,33

218

2009, Т. 11, № 2-3

Абзимы при спондилоартропатиях

не имеющими пользы — с ОП+ < 2 и ОП- > 0,5. Таким образом, использование определения ДНКазной активности Ig соответствует критериям полезных диагностических тестов.

Обсуждение

Таким образом, в крови пациентов со спон-дилоартропатиями циркулируют антитела, обладающие собственной деполимеризующей и оксидоредуктазной активностью. Наибольшие уровни ДНКазной активности отмечены при ПА, что доказывает более выраженную аутоиммунную агрессию при данном заболевании по сравнению с другими заболеваниями из группы спондило-артропатий. Принимая во внимание выявление при псориазе антинуклеарных антител, антител к двухспиральной ДНК, к РНП, антиперинукле-арных антител [10], нельзя исключить, что абзимы с ДНКазной активностью на ранних этапах заболевания имеют приспособительное значение, разрушая избыток нуклеиновых кислот, появляющихся в процессе цитолиза. В дальнейшем обладающие ДНКазной активностью антитела могут оказывать повреждающее воздействие на ткани, реализуя цитотоксические эффекты. Абзимы регулируют клеточное развитие, участвуют в процессах апоптоза, а при псориазе нарушения апоптотического процесса являются одной из причин гиперпролиферации эпидермиса [2]. ДНКазная активность антител находится в прямой корреляционной зависимости с различными клиническими (наличие артрита, пролиферативные явления в суставах, поражение кожи, длительность ониходистрофии, наличие сакроилеита и др.) и лабораторными показателями (количеством лейкоцитов, эритроцитов, Т-лимфоцитов), что доказывает ее участие в патогенетических процессах при хроническом аутоиммунном воспалении. Отрицательная корреляция ДНКазной активности Ig с рентгенологической стадией заболеваний, вероятно, свидетельствует о том, что наибольшие уровни абзимной активности характерны для ранних стадий заболеваний, а по мере формирования структурных изменений костно-суставной системы происходит снижение величин этой активности и степени аутоиммунной агрессии. Корреляция ДНКазной активности с непрерывно рецидивирующим течением псориаза может иметь диагностическое значение. У пациентов с данным вариантом течения кожного псориаза наличие высоких уровней ДНКазной активности может служить маркером скорой реализации суставного синдрома и должно стать поводом для обследования больного на наличие бессимптомной артропатии. Отрицательная корреляция между ДНКазной активностью Ig и приемом сульфасалазина подтверждает необходимость назначения базисной терапии.

Каталазная активность Ig при спондилоартро-патиях сопоставима с контрольными значениями. БАПНА-амидазная активность Ig при спондилоартропатиях достоверно превышает контрольные величины, однако демонстрирует однообразные и достаточно низкие уровни, что снижает ее диагностическую ценность при данных заболеваниях. БАПНА-амидазная активность при АС отрицательно коррелирует со стадией спондилита, сакроилеита, индексом BASDAI. По нашим данным, этот вид активности также имеет максимальные значения у пациентов с ранними формами АС, что объясняет выявленные корреляционные отношения.

СОД-активность Ig при спондилоартропати-ях превышает контрольные величины. Антитела, обладающие СОД-активностью, могут являться акцептором свободных кислородных радикалов, осуществляя торможение перекисного окисления липидов и белков. Эти абзимы способны защитить клетку от свободно радикального повреждения. Вероятно, при псориазе СОД-активность имеет протективное значение, разрушая избыточное количество супероксида, основными источниками которого являются лейкоциты в процессе фагоцитоза, цепи переноса электронов (митохондрии), некоторые флавинсодержащие оксидоредуктазы, а также процессы аутоокисления белков и метаболитов.

Проведенная оценка ДНКазной активности Ig у больных демонстрирует достоверное преобладание этого параметра у больных ПА по сравнению с другими заболеваниями из данной группы. Если за диагностический уровень псориатического артрита принять ДНКазную активность иммуноглобулинов, равную 4 баллам и более, то чувствительность метода составляет 73%, а специфичность равна 84%. Отношение правдоподобия положительного результата теста (ОП+) равняется 4,4, отношение правдоподобия отрицательного результата теста (ОП-) равно 0,33. Определение ДНКазной активности Ig может использоваться в качестве дополнительного диагностического критерия псориатического артрита.

Исследования проведены по теме ГНТП 01.12 «Лечебные и диагностические технологии», подпрограмма «Терапия» (2006-2008 г.г.), а также при поддержке БРФФИ (№ Б03-345), РФФИ-БФФИ (04-04-81017).

Список литературы

1. Агабабова Э.Р., Бадокин В.В, Эрдес Ш. Разработка и апробация диагностических критериев псориатического артрита // Терапевтический архив. -1989. - № 12. - С. 117-121.

219

Кундер Е.В.

Медицинская Иммунология

2. Антилевский В.В., Мяделец О.Д., Сала-рев В.В. Морфофункциональная характеристика кожи больных псориазом. Актуальная дерматология. — М.: Медицинская книга, 2000. — С.133-153.

3. Генералов И.И. Абзимная активность иммуноглобулинов. — Витебск. — 2000. — 167 с.

4. Генералов И.И., Борисевич Т.Н., Кундер Е.В. Методические подходы к определению окислительно-восстановительной активности антител // Вестник ВГМУ — 2005. — № 3. — С. 16-21.

5. Генералов И.И., Сидорская Е.В. Абзимная активность препаратов IgG у больных ревматоидным артритом и системной красной волчанкой // Иммунология. —1998. — № 3. — С. 54-56.

6. Насонов Е.Л., Александрова Е.Н. Современные стандарты лабораторной диагностики ревматических заболеваний. — М., 2006. — 70 с.

7. Хитров А.Н,, Мальцев К.А., Введенская О.Ю. Каталитические аутоантитела как новый молекулярный инструмент в ревматологической практике // Терапевтический архив. —

2006. - № 6. - С. 59-62.

8. Хитров А.Н., Ромаданова Н.Б., Огнева Е.А. Хитров А.Н., Ромаданова Н.Б., Огнева Е.А., Наумова Т.Е., Алекберова З.С., Воробьев И.И., Габибов А.Г., Панаморенко Н.А., Сучков С.В. ДНК-абзимы при ревматоидном артрите: патогенетическая и клиническая значимость // Терапевтический архив. — 2005. — № 11. — С. 75-80.

9. Amor B., Dougados M., Listrar V. Les criteries de spondyloarthropathies de classification et/ou daide au diagnostic? // Rev. Rheumatol. — 1995. — Vol.62. — P 11-16.

10. Calzavara-Pinton PG.,Franceschini F., Manera C. Incidence of antiperinuclear factor in patients with psoriatic arthritis // Adv. Exp. Med. Biol. — 1999. — Vol. 455. — P 215-220.

11. Mathies H. Psoriatic arthritis // Acta Med. Austriaca. — 1974. — ЛЫ. 11. — P 3-12.

12. Parkhomenko T.A., Odintsova E.S.,

Buneva V.N., Kunder E.V., Zhyltsov I.V.,

Senkovich S.A., Generalov I.I., Nevinsky G.A. DNA-hydrolyzing activity of IgG antibodies from the sera of patients with diseases caused by different bacterial infections // J. Cell. Mol. Med. — 2008. — Vol.12, N5. — P 1-13.

13. Shojania, K. What laboratory tests are needed? // CMAJ. — 2000. — Vol. 162. — P 743-746.

14. Van der Linden S., Valkenburg H.A., Cats A. Evaluation of diagnostic criteria for ankylosing spondylitis: a proposal for modification of the New York criteria // Arthritis Rheum. — 1984. — Vol. 27. — P. 361-368.

поступила в редакцию 13.01.2009 отправлена на доработку 03.02.2009 принята к печати 12.02.2009

220