Цитокиновый профиль женщин с угрозой невынашивания беременности и его модуляция препаратом дюфастон

© Н.Ю. Сотникова,

Л.В. Посисеева,

Ю.С. Анциферова,

А.В. Кудряшова, Н.Ю. Борзова

НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию, Иваново

ЦИТОКИНОВЫЙ ПРОФИЛЬ ЖЕНЩИН С УГРОЗОЙ НЕВЫНАШИВАНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ И ЕГО МОДУЛЯЦИЯ ПРЕПАРАТОМ ДЮФАСТОН

Целью работы было оценить in vivo и in vitro влияние дюфастона на синтез IL-2, IFNy и TGFß у женщин с угрозой невынашивания беременности ранних сроков. В условиях гинекологической клиники Ивановского НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию было проведено обследование 12 женщин, поступивших в стационар с симптомами угрожающего аборта в сроке беременности 6-12 недель (основная группа). 10 женщин с неосложненным течением беременности аналогичных сроков гестации составили контрольную группу. Женщинам основной группы был проведен курс лечения препаратом «Дюфастон »

("Solvay Pharma", Франция) по рекомендованной фирмой схеме — по 10 мг два раза в день в течение трех недель. Иммунологическое обследование женщин основной группы проводилось двукратно: до и сразу после проведения курса лечения дюфастоном. Материалом для исследования служила периферическая кровь, взятая из кубитальной вены. Содержание цитокинов в сыворотке крови и супернатантах 24-часовых культур лейкоцитов периферической крови проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа. Установлено, что применение дюфастона приводит к нормализации цитокинового каскада у женщин с угрозой невынашивания на ранних сроках гестации. Благоприятное действие дюфастона на цитокиновый профиль женщин с угрозой невынашивания беременности ранних сроков может быть обусловлено влиянием его на регуляторные Т-клетки и популяции ЕК.

Ключевые слова: невынашивание; прогестерон; регуляция синтеза цитокинов

По данным отечественных и зарубежных авторов частота прерывания беременности составляет 15 % и более [3, 6]. Нарушение продукции цитокинов играет важную роль в патогенезе угрозы невынашивания беременности [3]. Ранее предполагалось, что успешный исход беременности определяется цитокинами Th2 типа (IL-4, IL-10, IL-13), а Th1 комплекс цитокинов (ИЛ-2, ИФНу, ФНОа) способствует развитию клеточно-опосредованного иммунитета и реакции отторжения плода [9]. В то же время не все факты укладываются в рамки данной теории [2, 5]. В последнее время появились новые данные, свидетельствующие о важной роли регуляторных клеток и продуцируемых ими цитокинов в обеспечении благоприятного течения беременности [8, 12]. Однако их роль при угрозе невынашивания остается практически неизученной.

Общеизвестно, что недостаточная продукция прогестерона является одним из патогенетических факторов, лежащих в основе формирования невынашивания беременности [3], поэтому современная стратегия лечения угрожающего аборта направлена на нормализацию уровня прогестерона. Необходимость прогестерона в поддержании беременности была показана в экспериментах, в которых индуцировалось прерывание беременности введением АТ к прогестерону, при этом самопроизвольное прерывание беременности предотвращалось введением прогестерона [11].

Среди прогестагенов наибольший интерес представляет дид-рогестерон (коммерческое название препарата «Дюфастон », "Solvay Pharma", Франция). Применение этого препарата на ранних стадиях беременности показало хороший клинический эффект в лечении угрозы невынашивания [6]. Данные по влиянию прогестерона на цитокиновый каскад немногочисленны. Известно, что прогестерон усиливает продукцию ИЛ-4 и LIF Т-лимфоцитами [13]. Однако действие дюфастона на синтез регуляторных цитоки-нов не изучалось.

В связи с этим целью настоящей работы было оценить in vivo и in vitro влияние дюфастона на синтез IL-2, IFNy и TGFß у женщин с угрозой невынашивания беременности ранних сроков.

Материалы и методы исследования

Было проведено обследование 12 женщин, поступивших в стационар гинекологической клиники Ивановского НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова с симптомами угрожающего аборта в сроке беременности 6-12 недель (основная группа — УН). 10 женщин с неосложненным течением беременности аналогичных сроков гестации составили контрольную группу (ФБ).

Обследованные женщины основной группы относились к группе высокой степени риска на прерывание беременности. У женщин

основной группы в анамнезе аборты отмечались в 7 случаях, привычное невынашивание беременности ранних сроков — в 3 случаях, воспалительные заболевания женских половых органов — в 6 случаях, бесплодие — в 6 случаях, патология шейки матки — в 7 случаях, нарушение менструальной функции — в 3 случаях, аномалии развития матки — в 2 случаях. Из исследования были исключены пациентки с тяжелой соматической патологией, наличием острых инфекционных заболеваний, ранним гестозом, генетической патологией и антифосфолипидным синдромом. Им не проводилась гормональная терапия в течение 6 месяцев, предшествовавших обследованию.

Лечение дюфастоном проводили по рекомендованной фирмой схеме — по 10 мг два раза в день в течение трех недель. Эффективность лечения препаратом оценивалась по исчезновению симптомов угрозы прерывания беременности и переносимости препарата.

Иммунологическое обследование женщин основной группы проводилось двукратно: до и сразу после проведения курса лечения дюфастоном. Иммунологическое обследование женщин контрольной группы проводилось однократно.

Материалом для исследования служила периферическая кровь, взятая из кубитальной вены. Исследования проводились с информированного согласия пациенток. Выделение популяции лейкоцитарных клеток осуществлялось стандартным методом скоростного центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина (d = 1,114).

Для оценки спонтанной продукции цитокинов лейкоцитарными клетками крови in vitro получали супернатанты (СН) суточных культур лейкоцитов. Для этого клетки в концентрации 2 х 106 кл/мл культивировали в течение 24 часов при 37 °С и 5 % СО2 в среде RPMI 1640, содержащей 2 мМ L-глутамина, 10 0% фетальной телячьей сыворотки, 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина. После окончания срока культивации СН удаляли, центрифугировали, замораживали и хранили при -20 °С до момента постановки проб.

Концентрацию цитокинов определяли в сыворотке крови и в супернатантах 24-часовых культур лейкоцитов периферической крови мето-

дом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) на микропланшетном ридере Multiscan EX ("Labsystems", Финляндия). Содержание ин-терлейкина-2 (IL-2) определяли с помощью коммерческой тест-системы фирмы "Cytimmune" (США), предел чувствительности тест-системы — 8 пкг/мл. Концентрацию трансформирующего фактора роста ß2 (TGF-ß2) оценивали с помощью тест-системы фирмы "Bender MedSystems" (Австрия), пороговая чувствительность для этой тест-системы была 10 пкг/мл. Концентрацию IFNy определяли с помощью тест-системы с пределом чувствительности 20 пкг/мл («Цитокин», Россия).

Статистическая обработка данных включала определение среднего арифметического и ошибки среднего арифметического. Достоверность различий рассчитывали по t-критерию Стьюдента.

Результаты исследования

После проведенного курса лечения препаратом дюфастон у всех женщин основной группы купировались симптомы угрозы прерывания беременности. У них отмечалось улучшение общего самочувствия, уменьшение длительности и объема кровянистых выделений из половых путей, болевого синдрома, улучшение функции желтого тела, нормализовались возбудимость и тонус матки. Все пациентки основной группы были выписаны с прогрессирующей беременностью под наблюдение участкового врача акушера-гинеколога. При приеме препарата дюфастон ни у одной женщины нами не было выявлено каких-либо побочных эффектов.

Результаты проведенного нами определения сывороточного уровня цитокинов у женщин с УН в 1 триместре представлены в таблице 1.

Как видно из приведенных данных, группа женщин с угрозой невынашивания ранних сроков характеризовалась снижением сывороточного уровня IL-2 (p < 0,01) и повышением содержания IFNy (p < 0,001) и TGFß2 (p < 0,05) по сравнению с таковым в контрольной группе.

Сравнительный анализ данных содержания IL-2, IFNy и TGFß2 в сыворотке крови женщин с угрозой невынашивания до и после лечения дю-

Таблица 1

Параметр, пг/мл ФБ УН до лечения УН после лечения

IL-2 14,92 ± 4,80 N/d** 28,55 ± 8,81»

IFNy 25,80 ± 2,06 117,78 ± 13,26*** 26,84 ± 8,12°°°

TGF-ß2 1118,63 ± 483,38 2919,78 ± 268,06* N/d* °°°

Достоверность различий по сравнению с показателями контрольной группы: * — р < 0,05; ** — р < 0,01; *** — р < 0,001. Достоверность различий по сравнению с показателями группы УН до лечения: 0 — р < 0,05; 00 — р < 0,01; 000 — р < 0,001

Характеристика содержания цитокинов в сыворотке крови женщин с угрозой прерывания беременности до и после курса лечения дюфастоном

Таблица 2

Особенности спонтанной продукции цитокинов периферическими лейкоцитами женщин с угрозой невынашивания беременности ранних сроков до и после лечения дюфастоном

Цитокин, пг/мл ФБ УН до лечения УН после лечения

IL-2 26,04 ± 4,30 9,88 ± 2,75** 27,09 ± 4,06м

IFNy N/d 49,62 ± 12,90** N/d°°

TGF-ß2 N/d 43,25 ± 4,68*** 46,85 ± 13,38**

Достоверность различий по сравнению с показателями контрольной группы: * — р < 0,05; ** — р < 0,01; *** — р < 0,001. Достоверность различий по сравнению с показателями группы УН до лечения: 0 — р < 0,05; 00 — р < 0,01; 000 — р < 0,001

фастоном и женщин с физиологическим течением беременности показал, что после проведенного лечения в сыворотке крови больных нормализовалось изначально сниженное содержание IL-2 и изначально повышенное IFNy (p > 0,05 в обоих случаях при сравнении показателей группы ФБ и УН после лечения). Следует отметить резкое падение (p < 0,001) практически до нулевых значений изначально высокого сывороточного уровня TGFP2 у пациенток, получавших дюфастон, причем содержание TGFP2 после лечения становилось ниже его значений в контрольной группе (Р < 0,05).

Результаты по оценке спонтанной продукции цитокинов лейкоцитами периферической крови in vitro согласуются с данными по их сывороточной концентрации. Данные приведены в таблице 2.

Анализ данных содержания цитокинов в СН 24-часовых культур периферических лейкоцитов показал, что при угрозе невынашивания беременности в 1 триместре достоверно снижалась спонтанная продукция IL-2 (p < 0,01), но возрастала спонтанная продукция IFNy и TGFP2 (p < 0,01 и p < 0,001, соответственно).

После проведения курса лечения дюфастоном у женщин с угрозой невынашивания отмечались значительные позитивные изменения в продукции цитокинов по сравнению с исходным их уровнем до лечения. Так, после проведения курса лечения дюфастоном в супернатантах лейкоцитарных клеток крови женщин с угрозой невынашивания достоверно повышалось содержание IL-2 (p < 0,01), а концентрация IFNy понижалась (p < 0,01), в обоих случаях достигая нормативных значений (p > 0,05 в обоих случаях). Уровень TGFP2 в супернатантах клеток крови у женщин с угрозой прерывания беременности, принимавших дюфастон, не претерпевал значительных изменений относительно показателей до лечения (p > 0,05) и оставался повышенным по сравнению с аналогичным показателем контрольной группы (p < 0,01).

Обсуждение результатов

Результаты нашего исследования свидетельствуют о снижении уровня и продукции IL-2 при

угрозе невынашивания беременности на ранних сроках. ^-2 является одним из цитокинов, действие которого при беременности до конца не установлено. Данные, касающиеся его продукции при беременности, противоречивы. С одной стороны, в ряде работ различных авторов указывалось на усиление продукции ^-2 у женщин со спонтанными выкидышами по сравнению с таковой при физиологической беременности, на основании чего был сделан вывод о негативном значении повышенной продукции ^-2 в развитии беременности на ранних сроках гестации [17]. С другой стороны, известно, что ^-2 необходим для поддержания экспансии активированных клонов лимфоцитов [1]. В настоящее время считается доказанным, что лимфоциты беременной женщины находятся в активированном состоянии [2, 9]. Вероятно, усиление активации лимфоцитов в начале физиологической беременности происходит именно под влиянием ^-2, а снижение его уровня при УН ведет к нарушению активации периферических лимфоцитов.

Кроме того, установлено, что при неослож-ненной беременности в ранней плаценте накапливается уникальная популяция ЕК клеток с фенотипом CD56+CD16-. Она составляет до 80 % лейкоцитов, инфильтрирующих децидуальную оболочку плаценты, и обладает высоким функциональным потенциалом, который активируется под действием цитокинов ТЫ [16]. ^-2 является потенциальным стимулятором развития данной популяции клеток. Вероятно, продукция имму-нокомпетентными клетками ^-2 в начале беременности, особенно на системном уровне, является физиологичной и определяет формирование специфического иммунного ответа матери на АГ плода. Снижение продукции ^-2, отмечаемое у женщин с угрозой прерывания беременности, может приводить к извращению реакции материнской иммунной системы на развивающийся плод, по-видимому, за счет нарушения активации лимфоцитов, что может быть одним из неблагоприятных факторов, обуславливающих включение механизмов досрочного прерывания беременности.

ШКу является цитокином с абортивным эффектом [17]. Известно, что он подавляет рост и диф-ференцировку клеток трофобласта [4], вызывает

усиление экспрессии антигенпрезентирующих молекул на поверхности децидуальных стромаль-ных клеток [14]. Таким образом, обнаруженная нами повышенная продукция ШКу хорошо согласуется с литературными данными. Повышение концентрации ^Ку может вести к формированию недостаточности фетоплацентарного комплекса и прерыванию беременности на ранних ее этапах. С другой стороны, известно, что ШКу активирует ЕК и макрофаги, усиливая их цитотоксичность, фагоцитарную активность, продукцию цитоки-нов, супероксидных и нитроксидных радикалов, простагландинов [1]. В свою очередь, чрезмерная активация врожденного иммунитета является важным патогенетическим механизмом невынашивания беременности [15].

Нами было также показано достоверное увеличение сывороточного содержания и спонтанной продукции TGF-P2 у женщин с угрозой невынашивания ранних сроков. Согласно исследованиям последних лет, TGF-P является одним из цитоки-нов, вырабатываемых так называемыми Тг клетками, или регуляторными Т-лимфоцитами [7]. По данным литературы, TGF-P2 оказывает антипро-лиферативное воздействие на Т-хелперы [7]. Было показано, что TGF-P2 блокирует дифференциров-ку как 1Ъ1, так и ^2, а также ингибирует активацию макрофагов и их способность к продукции провоспалительных цитокинов [10]. Вероятно, высокий уровень TGF-P в сыворотке крови при угрозе невынашивания может быть обусловлен увеличением содержания Т-регуляторных клеток, обладающих супрессорным действием. Кроме того, высокий уровень продукции TGF-P2 при угрозе невынашивания ранних сроков может быть непосредственно связан с отмечаемой нами низкой продукцией ^-2, поскольку известно, что TGF-Р2 непосредственно ингибирует продукцию ^-2 CD4+ лимфоцитами [10].

Исследованиями последних лет было показано, что прогестерон напрямую регулирует ряд функций иммунной системы, влияя на параметры клеточной активации, апоптоза, адгезии иммуно-компетентных клеток, особенно ЦТЛ [11]. В ряде работ J. Szekeгes-Baгtho и соавт. (1999) было показано, что в организме иммунный эффект прогестерона опосредован PIBF (индуцированным прогестероном блокирующим фактором). PIBF непосредственно регулирует активность ЕК, снижая продукцию мононуклеарными клетками ^-12 и экспрессию перфорина [11]. При низком содержании прогестерона или при поражении рецепторов к нему, как при привычных спонтанных абортах, возникает дефицит Р1ВЕ Это ведет к сдвигу иммунного ответа в сторону лимфоки-нактивированных CD56+CD16+ КК и усилению

синтеза цитокинов Th1 типа, в том числе IFNy [11], что наблюдалось в нашем исследовании у женщин с УН до лечения дюфастоном. По данным J. Szekeres-Bartho и соавт. (1999), прогестерон сдвигает иммунный ответ в сторону Th2 типа [11]. В связи с этим отмечаемая нами нормализация уровня IFNy в крови под влиянием лечения дюфастоном может быть связана с усилением дифференцировки Th2 клеток под влиянием прогестерона. Менее ясен механизм влияния дюфас-тона на продукцию TGF-ß2, и этот факт требует для своего объяснения проведение дальнейших исследований. Можно предположить, что дюфас-тон оказывает влияние на Т-регуляторные лимфоциты, которые имеют непосредственное отношение к регуляции материнского иммунного ответа во время беременности [12]. По-видимому, лечение дюфастоном, снижая изначально высокую системную продукцию супрессорного цитокина TGF-ß2, снимает блок продукции цитокинов Т-хелперами и способствует повышению продукции IL-2.

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что применение дю-фастона приводит к нормализации цитокинового каскада у женщин с угрозой невынашивания на ранних сроках гестации, что может лежать в основе выраженного позитивного клинического эффекта дюфастона. По-видимому, благоприятное действие дюфастона на цитокиновый профиль женщин с угрозой невынашивания беременности ранних сроков может быть обусловлено не только его влиянием на дифференцировку Т-хелперов в сторону Th2, но и на регуляторные Т-клетки и популяции ЕК.

Литература

1. Ковальчук Л.В. Система цитокинов, вомплемента и современные методы иммунного анализа / Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Хорева М.В., Соколова Е.В. - М.: РГМУ, 2001. - 158 с.

2. Локальный иммунный ответ в динамике неосложнен-ной беременности / Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Крошкина Н.В. [и др.] // Медицинская иммунология. -2000. - Т. 2, № 2. - С. 194-195.

3. Сидельникова В.М. Привычное невынашивание беременности / Сидельникова В.М. - М.: Триада-Х, 2000. - 304 с.

4. Aboagye-Mathiesen G. Functional characteristics of human trophoblast interferons / Aboagye-Mathiesen G., Toth F. D., Zdravkovic M., Ebbesen P. //Am. J. Reprod. Immunol. -1996. - Vol. 35. - P. 309-317.

5. Characterization of type 1 and type 2 cytokine production profile in physiologic and pathologic human pregnancy / Marzi M., Vigano A., Trabattoni D. [et al.] // Clin. Exp. Immunol. - 1996. - Vol. 106. - P. 127-133.

6. Genazzani A.R. Dydrogesterone insights / Genazzani A.R. // IX World congress of Gynecol. Endocrinology. - N-Y, 2001. -P. 5. - (Solvay Pharmaceuticals Satelite Symposium).

7. GorelikL. Transforming growth factor-beta in T-cell Biology / Gorelik L., Flavell R.A. // Nat. Rev. Immunol. - 2002. -Vol. 2. - P. 46-53.

8. Heikkinen J. Phenotypic characterization of regulatory T cells in the human deciduas / Heikkinen J., Mottonen M., Alanen A., Lassila O. // Clin. Exp. Immunol. - 2004. - Vol. 136. - P. 373-378.

9. Immunomodulation in normal pregnancy and pre-eclampsia / Sargent I.L., Sacks G.P., Knight M. [et al.] // Reprodictaive Immunology / Ed. Gupta S.K. — New Delhi: Narosa Publishing House, 1999. - P. 198-204.

10. Levings M. The role of IL-10 and TGF-ß in the differentiation and effector function of T regulatory cells / Levings M., Bacchetta R., Schultz U., Roncarolo M.G. // Int. Arch. Allergy Immunol. — 2002. — Vol. 129. — P. 263-276.

11. Nonspecific immunological mechanisms and hormones / Szekeres-Bartho J., Barakonyi A., Polgar B. [et al.] // Reproductive Immunology / Ed. Gupta S.K. — New Delhi: Narosa Publishing House, 1999. — P. 218-223.

12. Normal human pregnancy is associated with an elevation in the immune suppressive CD4+CD25+ regulatory T-cell subset / Somerset D.A., Zheng Y., Kilby M.D. [et al.] // Immunol. — 2004. — Vol. 112. — P. 38-43.

13. Piccini M.P. T-cell cytokines in pregnancy / Piccini M.P. // Am. J. Reprod. Immunol. — 2002. — Vol. 47. — P. 289-294.

14. Ruiz C. Modulation of antigenic phenotype by IL-1beta, IFNgamma and TGFbeta on cultured human decidual stromal cells / Ruiz C., Reyes-Botella C., Garcia-Martinez O., Montes M.J. // Biosci.Rep. — 2004. — Vol. 24. — P. 55-62.

15. Sacks G.P. An innate view pf human pregnancy / Sacks G.P., Sargent K., Redman C.W.G. // Immunol. Today. — 1999. — Vol. 20. — P. 114-118.

16. Saito S. Cytokine network in the human decidua. In: Reproductive Immunology / Saito S. // Ed. Gupta S.K. — New Delhi: Narosa Publishig House. — 1999. — P. 78-87.

17. Th1 and Th2 cytokine profiles in successful pregnancy and unexplained recurrent abortions / Raghupathy R., Makhseed M., Azizieh F. [et al.] // Reproductive Immunology / ed. S.K. Gupta. — New Delhi: Narosa Pbl. House, 1999. — P. 149-158.

18. Wegmann T.G. Bidirectional cytokine interactions in the maternal-fetal relationship: is successful pregnancy a Th2 phenomenon? / Wegmann T.G., Lin H., Guilbert L., Mosmann T.R. // Immunol. Today. - 1993. - Vol.14. -P. 353-356.

Статья представлена С.А. Сельковым

НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН,

Санкт-Петербург

THE CYTOKINE PROFILE IN WOMEN WITH THREATENED ABORTION AND ITS MODULATION BY DUFASTON

Sotnikova N.Y., Posiseeva L.V., Anciferova Y.S., Kudryashova A.V., Borzova N.U.

Summary: The aim of study was in vivo and in vitro evaluation of Dufaston influence on IL-2, IFNy and TGFp synthesis in women with threatened abortion in early pregnancy. The basic group consisted of 12 women with threatened abortion symptoms in 6-12 weeks of pregnancy. Control group included 10 women with uncomplicated pregnancy. Patients of basic group were treated with Dufaston, 10 mg, bpd, 3 weeks. Immunological examination of these patients were performed twice: before and at once after Dufaston therapy. There were established that Dufaston using led to cytokine cascade normalization in women with threatened abortion in early pregnancy. It may be connected with Dufaston influence on regulator T-cells and EK populations.

Key words: spontaneous abortion; progesteron; cytokine synthesis regulation