СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ТЕРАПИИ ПРИ НЕЙРОБЛАСТОМАХ У ДЕТЕЙ
METHOD OF ASSESSING ANTICANCER CLINICAL EFFECTIVENESS IN NEUROBLASTOMAS IN CHILDREN

Изобретение относится в медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для контроля эффективности лечения детей с нейробластомами.
В лечении детей со злокачественными новообразованиями, в частности нейробластомами, химиотерапия является обязательным компонентом комплексного лечения. При относительно хорошей переносимости детьми лечения цитостатиками следует учитывать не только ранние, но и поздние осложнения, которые могут нанести непоправимый вред растущему организму. Поэтому своевременный прогноз отсутствия эффекта от применения цитостатиков и замена их на химиопрепараты, к которым опухоль конкретного ребенка окажется чувствительной, а следовательно, и лечение эффективным, необходимы.
Известен способ оценки эффективности лечения больных по уровню экскреции полиаминов с мочой (Берлинских Н.К., Залеток С.П., Зиневич А.К., Евтушенко А.В. Определение экскреции полиаминов в диагностике злокачественных опухолей и для оценки эффективности лечения онкологических больных. Методические рекомендации. Киев. 1980. 12 с.).
Метод основан на экстракции полиаминов из мочи н-бутанолом, затем фракционировании их при помощи электрофореза на бумаге и количественном определении колориметрическим методом. Для этого мочу больного собирают в течение 24 ч. Затем 20 мл мочи выдерживают при 4°С в течение 18-24 ч. В ампулы наливают 3-5 мл мочи и равный объем 6 н. НС1, запаивают и помещают на 14-16 ч в термостат с температурой 120°С. После окончания гидролиза проводят экстракцию н-бутанолом. С помощью универсальной индикаторной бумаги доводят рН мочи сперва до 9,0, а затем - до 9,5-10,0. При этом контролируют рН по рН-метру. В течение двух часов н-бутаноловую фракцию встряхивают на шутель-аппарате, после чего выпаривают на кипящей водяной бане. Сухой остаток растворяют в 0,2 мл 0,1 н. HCl и в количестве 20 мкл наносят на полосу хроматографической бумаги, помещенную в прибор для электрофореза, и в течение 40 мин проводят электрофорез. Электрофореграммы высушивают в термостате при 70°С в течение 20 мин, затем обрызгивают из распылителя нингидриновым красителем и снова помещают в термостат при 70°С на 20 мин для проявления окраски. Окрашенные пятна, которые соответствуют индивидуальным полиаминам, вырезают, помещают в химические пробирки, заливают элюирующим раствором и убирают на 25 мин в темное место. После чего проводят измерение величины поглощения растворов на спектрофотометре при длине волны 505 нм. Количество полиаминов определяют по калибровочной кривой, построенной по стандартным полиаминам.
Однако применение этого способа ограничивают и затрудняют такие его недостатки, как длительность проведения исследования, которое затягивается на 4-5 суток. По этой же причине он не может быть использован для коррекции применяемой специфической терапии. Кроме того, применение указанного метода требует большого количества оборудования и реактивов, что влечет за собой большие затраты.
Известен способ оценки эффективности лечения больных раком пищевода, основанный на изучении ряда иммунологических, биохимических и гематологических параметров (Рубцов В.Р. Консервативное лечение местнораспространенного рака пищевода. Автореф. дисс. … докт. мед. наук. Л., 1989), выбранный нами в качестве прототипа.
Принцип метода состоит в том, что после окончания курса химиоиммунолучевого лечения анализируют выбранные показатели гормонального и иммунологического статуса, изменения которых происходят в результате применения терапии у больных с полной либо с неполной регрессией опухоли пищевода. Проводится градация значения всех признаков, максимально отличающихся в весе для различных классов. В результате вычисления информативности каждого признака для прогнозирования полной регрессии опухоли пищевода после химиоиммунолучевого лечения отбирали 10 наиболее информативных показателей. Ими оказались: 1) размер опухоли по длине органа; 2) экскреция с мочой свободных 17-ОКС; 3) уровень активности ТТГ в сыворотке крови; 4) уровень активности АКТГ; 5) уровень активности тироксина; 6) уровень активности ЛГ; 7) количество лейкоцитов; 8) процентное содержание сегментоядерных нейтрофилов; 9) процентное содержание лимфоцитов; 10) общее число Е-РОК.
Однако применение известного способа ограничивают и затрудняют такие его недостатки, как необходимость математического вычисления прогностических критериев с обязательным использованием таблиц, предлагаемых автором, что может явиться причиной субъективной ошибки; длительность и сложность технического выполнения ряда гормональных исследований; невозможность получения прогностического решения в течение одного дня, что исключает амбулаторное применение данного способа. Учитывая специфику развития нейробластом, применение этого способа у детей с указанной патологией не может дать возможность своевременной оценки эффективности лечения и его коррекции.
Целью изобретения является ускорение и упрощение контроля эффективности лечения детей с нейробластомами.
Поставленная цель достигается тем, что "Способ оценки эффективности противоопухолевой терапии при нейробластомах у детей при проведении неоадъювантного этапа комбинированного лечения цитостатками, заключающийся в том, что перед каждым курсом химиотерапии и после него производят забор крови из периферической вены, определяют в крови активность плазминогена и плазмина, вычисляют соотношение первого ко второму и при повышении этого показателя после химиотерапии прогнозируют наступление клинического эффекта от проводимого лечения, а в случае снижения показателя, либо его неизменности на протяжении двух курсов химиотерапии прогнозируют отсутствие эффекта, что является основанием для смены цитостатиков для обеспечения адекватного лечения".
Изобретение "Способ оценки эффективности противоопухолевой терапии при нейробластомах у детей" является новым, так как оно неизвестно из уровня медицины при контроле эффективности лечения детей с нейробластомами.
Анализ известных способов определения эффективности неоадъювантной противоопухолевой терапии дает основания говорить о новизне предлагаемого способа, который представлен соотношением объективных показателей исследования в крови уровней плазминогена и плазмина после проведения каждого из запланированных курсов химиотерапии на первом этапе комбинированного лечения больных. Изучение признанных интегральных маркеров, характеризующих биологические свойства опухоли создавать автономную систему кровеносных сосудов, в данном случае компонентов системы плазминоген - плазмин, позволяет определить адекватность использования применяемого лечения для каждого больного ребенка, определить тактику дальнейшего ведения и индивидуальный прогноз заболевания.
В отличие от прототипа предлагаемый «Способ оценки эффективности противоопухолевой терапии при нейробластомах у детей» осуществляется в течение 1 рабочего дня и дает возможность проводить коррекцию химиотерапии в соответствии с исследуемой объективной реакцией организма с растущей в нем злокачественной опухолью на конкретные химиопрепараты и своевременно изменять план лечения больных детей.
Разработанный способ обладает изобретательским уровнем, так как явным образом не следует для специалиста из известного уровня развития медицины и оценки эффективности неоадъювантной химиотерапии. В известных источниках информации России, стран СНГ и за рубежом подобный способ не обнаружен.
Изобретение является промышленно применимым, так как оно может быть многократно воспроизведено в лечебных учреждениях онкологического профиля, располагающих биохимическими лабораториями.
Способ осуществляется следующим образом.
Перед проведением каждого из запланированных курсов химиотерапии у ребенка утром натощак из локтевой вены производят забор 2 мл крови, которую центрифугируют при 3000 об. в течение 15 мин и отбирают плазму крови. Затем в ней определяют активность плазминогена и плазмина по методу Robbins, Summaria (1963) в модификации Пасхиной Т.С. и соавт. («Состояние кининовой системы при ожоговом шоке и ранней токсемии» // Вопр. мед. химии, 1976. - Т.22. - №5. - С.696-707). Определение проводят следующим образом. Опытная проба: 0,4 мл разведенной в 20 раз плазмы крови смешивают с 0,1 мл 0,05М трис-HCl буфера рН 8,0, пробу выдерживают 5 мин при 37°С, после чего добавляют 0,5 мл 2% раствора казеина и инкубируют 1 ч при 37°С. Реакцию останавливают добавлением 2,5 мл 10% ТХУ, через 30 мин осадок белка отделяют центрифугированием. Контрольная проба отличается от опытной пробы тем, что 2,5 мл 10% ТХУ добавляют для фиксации фермента перед добавлением казеина. Измеряют поглощение при 280 нм против буфера. Активность плазмина вычисляют по разности опытной и контрольной проб и выражают числом казеиновых единиц (КЕ) в 1 мл жидкости.
Содержание плазминогена определяют из данных по активности плазмина в центрифугате ткани, предварительно инкубированном со стрептокиназой: 0,4 мл разведенного в 20 раз центрифугата преинкубируют 5 мин при 37°С с 0,1 мл 0,01% раствора стрептокиназы в 0,05М трис-HCl буфере рН 8,0, далее анализ проводят так, как описано для определения плазмина. Из полученной величины вычитают значение пробы, не обработанной стрептокиназой, и результат выражают в КЕ в 1 мл.
Затем рассчитывают коэффициент соотношения плазминогена (ПГ) и плазмина (П): ПГ/П.
Для доказательства приводим выписки из историй болезни, подтверждающих клинический эффект лечения предлагаемым способом.
Пример клинического применения №1.
Больная О-ко Д.Н. 2007 г.р., история болезни №С-7212/ю.
ДИАГНОЗ: Нейробластома забрюшинного пространства слева, st. III, кл. группа 2. Состояние после комплексного лечения. Полная ремиссия.
Объективно (исходный статус при поступлении):
состояние средней тяжести, самочувствие нарушено из-за астении, диспепсических проявлений. Сознание ясное, в контакт вступает легко. Правильного телосложения. Масса - 8600 г, длина тела 71 см, кожа чистая, обычной окраски, слизистые чистые. Лицо несколько отечно. Зев спокоен, стоматита нет. Дыхание над легкими пуэрильное, хрипов и одышки нет, ЧД 35 в мин. Тоны сердца ритмичные, ЧСС - 126 в мин. Живот значительно увеличен в размерах, пупок выбухает, вздут, напряженный при пальпации. Всю левую половину живота занимает огромная опухоль: плотная, округлая, малоподвижная, размером до 15,0 см. Печень и селезенка пальпаторно не увеличены. Стул - (со слов матери) неустойчивый, мочеиспускание не нарушено. Периферические лимфоузлы, доступные для пальпации, не увеличены.
При определении в сыворотке крови показателей фибринолитической системы имели:
Уровень активности плазмина - 3,99 КЕ
Уровень активности плазминогена - 1,12 КЕ
Соотношение К=ПГ/П - 0,28±0,035
При первичном УЗИ органов брюшной полости и забрюшинного пространства - в эпимезогастрии слева определяется объемное узловое солидное образование размерами 14,0×15,0 см, с неровными, нечеткими контурами, неоднородной структуры с кальцинированными включениями, гиперваскулярной архитектоникой в центральной и периферической зонах преимущественно артериоартериального типа MAC 26-53 см/с, ИР 0,3. Опухоль поражает сосуды левой почечной ножки, сегментарные, междолевые и дуговые артерии, инфильтрирует просвет брюшной аорты по левой боковой передней стенкам, стенозируя просвет. Произведена ПАБ под УЗ-контролем опухоли Ц.А. №28516 нейробластома.
После 5-го курса аутогемохимиотерапии состояние пациентки было вполне удовлетворительным.
При определении в сыворотке крови показателей фибринолитической системы имели:
Уровень активности плазмина - 0,1 КЕ
Уровень активности плазминогена - 2,9 КЕ
Соотношение К=ПГ/П - 29±3,6
3
При УЗИ брюшной полости и забрюшинного пространства в динамике уменьшение размеров опухоли на 60% с положительными гемодинамическими изменениями внутриопухолевого кровотока новообразования. В эпимезогастрии определяется объемное узловое солидное новообразование размерами 5,2×6,3×5,4 см, V 88,6 см, структура опухоли гипоэхогенная с множественными гиперэхогенными включениями, контуры неровные, нечеткие.
При ДГ отмечается значительная гиповаскуляризация опухоли в центральной зоне со снижением параметров MAC. Брюшная аорта без признаков выраженной инфильтрации. Сосуды левой почечной ножки без инфильтративных изменений. Незначительный стеноз левой почечной артерии за счет сдавления извне опухоли.
После 10 курсов лекарственной терапии при определении в сыворотке крови показателей фибринолитической системы имели:
Уровень активности плазмина - 0,1 КЕ
Уровень активности плазминогена - 6,3 КЕ
Соотношение К=ПГ/П - 63±7,8
Клинический эффект от проводимого лечения при УЗИ брюшной полости и забрюшинного пространства в динамике уменьшение размеров опухоли на 75%. В области левого надпочечника определяется объемное узловое гипоэхогенное новообразование, неоднородной структуры с зонам кальциноза до 5 мм, контуры неровные, нечеткие, размерами 3,2×2,8 см. При ЦДК опухолевый кровоток не определяется. Левая почка интактна. Артериовенозная сосудистая ножка левой почки проходима, без признаков стеноза, верхняя граница проходит по огибающей по нижней границе опухоли. Сегментарные, междолевые, дуговые сосуды левой почки без признаков экстравазальной компрессии. Брюшная аорта не изменена. Медиальная граница опухоли прилежит к наружной стенке брюшной аорты, без инвазии ее просвета. После 10 курса ПХТ ребенку выполнена операция - произведена лапаротомия, адреналнефрэктомия. Удаление опухоли. ГА №47492-497/09 - нейробластома с отложением большого количества петрификатов. Ткань почки имеет обычное строение. Послеоперационный период - без осложнений. С 29.07.09 по 05.08.09 проведен этап локального контроля - ДГТ на S левую брюшной полости в СОД=10,8 ГР. Лечение перенесла удовлетворительно. Комплексное лечение окончено с полным клиническим эффектом.
Через месяц после операции при определении в сыворотке крови показателей фибринолитической системы имели:
Уровень активности плазмина - 0,3 КЕ
Уровень активности плазминогена - 4,3 КЕ
Соотношение К=ПГ/П - 14,3±3,6
При УЗИ - в проекции ложа удаленной почки патологические образования не определяются.
Общее состояние пациентки удовлетворительное, жалоб нет. В настоящее время ребенок находится под динамическим наблюдением.
Это наблюдение забрюшинной нейробластомы, которая оказалась чувствительной к лекарственной терапии. Указанные выше показатели уровня активности плазмина, плазминогена и ультрасонографические данные у этой пациентки хорошо коррелировали с клиническими признаками.
Пример клинического применения №2.
Больная К-на А.А. 1994 г.р. история болезни №С-527/ю.
ДИАГНОЗ: Нейробластома забрюшинного пространства с метастазами в левое легкое и костный мозг, st. IV, высокая группа риска. Состояние после 4-х курсов АГХТ. Прогрессия заболевания
Объективно (исходный статус при поступлении):
состояние средней тяжести, самочувствие нарушено из-за астении, диспепсических проявлений. Сознание ясное, в контакт вступает легко. Правильного телосложения. Кожа чистая, обычной окраски, слизистые чистые. Зев спокоен, стоматита нет. Дыхание над легкими везикулярное, хрипов и одышки нет, ЧД 35 в мин. Тоны сердца ритмичные, ЧСС - 75 в мин. Живот значительно увеличен в размерах, напряженный при пальпации. Всю правую половину живота занимает огромная опухоль: плотная, округлая, малоподвижная, размером до 17,0 см. Печень и селезенка пальпаторно не увеличены. Стул, мочеиспускание не нарушено. Периферические лимфоузлы, доступные для пальпации, не увеличены.
При определении в сыворотке крови показателей фибринолитической системы имели:
Уровень активности плазмина - 2,6 КЕ
Уровень активности плазминогена - 1,48 КЕ
Соотношение К=ПГ/П - 0,56±0,01
При первичном УЗИ органов брюшной полости и забрюшинного пространства - в проекции верхнего полюса правой почки определяется объемное узловое солидное образование изоэхогенной плотности размерами 17,7×12,1×22 см, с ровными, нечеткими контурами, неоднородной структуры с кальцинированными включениями, при ЦДК кровоток гипоинтенсивный.
Произведена ПАБ под УЗ-котролем опухоли Ц.А. №28516 нейробластома.
После 2-го курса аутогемохимиотерапии состояние пациентки было без существенных изменений.
При определении в сыворотке крови показателей фибринолитической системы имели:
Уровень активности плазмина - 3,41 КЕ
Уровень активности плазминогена - 2,02 КЕ
Соотношение К=ПГ/П - 0,59±0,07
При УЗИ брюшной полости и забрюшинного пространства в динамике незначительное уменьшение размеров опухоли, внутриопухолевый кровоток не регистрируется. В проекции среднего сегмента и верхнего полюса правой почки определяется объемное узловое солидное новообразование размерами 15,1×11,5 см, структура опухоли гипоэхогенная с гиперэхогенными включениями, контуры ровные, четкие. При ДГ внутриопухолевый кровоток не регистрируется.
После 5 курса лекарственной терапии при определении в сыворотке крови показателей фибринолитической системы имели:
Уровень активности плазмина - 2,15 КЕ
Уровень активности плазминогена - 1,47 КЕ
Соотношение К=ПГ/П - 0,68±0,08
При УЗИ брюшной полости и забрюшинного пространства без динамики.
Больной выполнена остеосцинтиграфия, на которой выявлено поражение костей скелета. При пункционной биопсии костного мозга - метастаз нейробластомы.
В настоящее время ребенок получает паллиативную XT по месту жительства.
Это наблюдение забрюшинной нейробластомы, которая оказалась резистентной к лекарственной терапии. Проведенное после 5-го курса химиотерапии исследование в сыворотке крови показателей активности плазмина и плазминогена указывает на отсутствие эффективности проводимого лекарственного лечения и резистентность опухоли, а при ультрасонографическом исследовании вследствие отсутствия кровотока в новообразовании осуществить контроль эффективности проводимого лечения является затруднительным.
По лабораторно-клинической динамике данную пациентку можно отнести к группе больных с неблагоприятным прогнозом.
Предлагаемым способом было проведено исследование 15 детей с нейробластомами. Результаты представлены в таблице.
Таблица
Уровни активности плазмина и плазминогена и их соотношения (К) в крови детей с нейробластомами
Группы обследованных больных
Активность плазмина (КЕ)
Активность плазминогена (КЕ)
Соотношение К=ПГ/П
Больные до начала химиотерапии
2,4±1,2
2,5±0,4
0,9±0,1
Больные с клиническим эффектом (n=9)
3,5±0,6<sup>1</sup>
0,2±0,02<sup>1</sup>
17,4±0,2<sup>1</sup>
Больные без клинического эффекта
1,35±0,3<sup>1,2</sup>
1,7±0,1<sup>1,2</sup>
0,8±0,09<sup>2</sup>
Здоровые дети (n=15)
4,6
0,38
12,1
Примечание: 1 - показатели достоверны по отношению к значениям в группе больных до начала химиотерапии (Р≤0,05).
2 - показатели достоверны по отношению к значениям в группе больных с клиническим эффектом (Р≤0,05).
Как видно из представленных данных, показатель К при эффективном лечении увеличивался относительно фоновых величин, тогда как при отсутствии клинического эффекта он либо не изменялся, либо снижался по сравнению с исходными данными, что подтверждено состоянием больных.
Техническо-экономическая эффективность предлагаемого «Способа оценки эффективности противоопухолевой терапии при нейробластомах у детей» заключается в том, что:
- дает возможность индивидуально оценить клинически еще не распознанную биологическую агрессивность опухоли, ее инвазивный и метастатический потенциал;
- выявить больных детей с ожидаемым эффектом от лечения и, следовательно, хорошим прогнозом, для которых возможные осложнения и стоимость агрессивного лечения будут оправданы;
- удается выявить больных без эффекта, а значит, с плохим прогнозом, которым требуется своевременная коррекция проводимой противоопухолевой терапии;
- позволяет определить индивидуальную чувствительность или резистентность злокачественной опухоли больных к конкретным схемам химиотерапии;
- дает возможность объективизировать результаты специфической терапии.
- увеличивается продолжительность и улучшается качество жизни больных детей.