Добавочный раствор для хранения отмытых размороженных эритроцитов
ADDITIONAL SOLUTION FOR STORING WASHED DEFROSTED ERYTHROCYTES

Заявляемое изобретение относится к медицине, а именно к растворам для ресуспендирования и хранения компонентов заготовленной донорской крови (добавочным растворам), и, в частности, для ресуспендирования и хранения отмытых размороженных эритроцитов (ОРЭ). Взвесь эритроцитов в добавочном растворе находит применение в гемотрансфузионной терапии анемий и острой кровопотери.
Криоконсервация - это единственная современная технология, которая поддерживает биологическую функцию клеток ex vivo и обеспечивает длительное хранение биопродукта. Существует два способа криоконсервирования эритроцитов: безаппаратный («ручной») и аппаратный, с использованием специально разработанного устройства Haemonetics АСР 215 фирмы Haemonetics Corp., США.
При безаппаратном способе эритроциты смешивают с криоконсервантом на основе глицерина и замораживают в медицинском холодильнике при температурах от -30°С до -80°С или в жидком азоте/его парах при -196°С/-150±10°С (в зависимости от метода) [Инструкция по криоконсервированию клеток крови (Утв. Минздравом РФ 29.05. 1995), действующая]. Эритроциты, замороженные при -40°С, могут храниться до 1 года, при более низкой температуре - до 10 лет и более, не теряя морфофункциональной сохранности. Безаппаратным способом криоконсервирования эритроцитов пользуются в клиниках и региональных центрах крови, не имеющих оборудования для аппаратной криоконсервации и холодильных установок высокой мощности.
В большинстве международных центров крови наиболее распространенным методом криоконсервирования является аппаратный способ с использованием высокой концентрации глицерина (40%) в сочетании с медленным охлаждением (~1°С/мин) и хранением при температуре ниже - 65°С. Закрытая автоматизированная система аппарата, одноразовые комплекты полимерных систем, снабженные барьерными антибактериальными фильтрами, обеспечивают непрерывность процесса деглицеринизации и стерильность подготовленного к переливанию гемокомпонента. Основным и весьма существенным недостатком автоматического метода является высокая стоимость как аппарата Haemonetics АСР-215, так и комплектующего оборудования и расходных материалов.
Для использования в трансфузиях криоконсервированная эритроцитная масса должна быть быстро разморожена оттаиванием на водяной бане [J.P. Acker, D.C. Marks and W.P. Sheffield//J of Blood Transfusion - V. 2016, Article D 4860284, P. 28] или с использованием специального аппарата для размораживания и подогрева компонентов крови, отмыта от криоконсерванта и ресуспендирована (взвешена) в добавочном растворе, разрешенном для трансфузии.
При ручном способе ресуспендирование ОРЭ обычно производят в растворе Ресин, включающем 70 г/л сахарозы, 3 г/л хлористого натрия, 2 г/л гидрофосфата натрия и 1 г/л дигидрофосфата натрия. Ресуспендированные ОРЭ должны быть использованы в течение 1 суток из-за опасности бактериальной контаминации в процессе размораживания и отмывания.
Разработанный недавно способ безаппаратного криоконсервирования, предотвращающий бактериальную контаминацию в процессе обработки за счет модификации контейнеров для вспомогательных растворов и создания «закрытой системы» [Криоконсервирование эритроцитов при умеренно низких температурах и пролонгированное хранение после размораживания в учреждениях службы крови. Методические рекомендации MP ФМБА России 35 - 22019], позволяет увеличить продолжительность хранения ОРЭ в растворе Ресин до 3 суток, однако хранение в растворе Ресин в течение 3 суток сопровождается некоторым снижением морфофункциональной полноценности клеток, т.к. этот раствор не содержит необходимых для них метаболитов (глюкозы и аденина).
При аппаратном способе (на приборе Haemonetics АСР 215) для ресуспендирования ОРЭ используют раствор SAG-M, содержащий 0,877% хлорида натрия, 0,9% глюкозы, 0,016% аденина (6-аминопурина) и 0,525% маннитола (D-маннита) в 100 г раствора [ФЗС 2011/10524]. Производитель предлагает использовать взвесь ОРЭ в SAG-M в течение 7 суток после приготовления, в России разрешенный срок хранения в растворе SAG-M составляет 72 часа.
Для хранения нативных эритроцитов разработан целый ряд добавочных растворов (AS - additives solutions). Были сделаны многочисленные попытки приспособить известные AS, предназначенные для хранения нативных эритроцитов, для хранения ОРЭ [см., например, Strauss D., Stark Е., Seidel В. // Z. Ges. Inn. Med. -1981. - Vol. 36, No. 13. - P. 443-448; Silbert J.A. // Transfusion - 1983. - Vol.23, No. 1. - P. 8-10; Mazor D., Dvilansky A., Meyerstein N. // Transfusion. - 1990. - Vol. 30, No. 2. - P. 150-153; C.R. Valeri, L.E. Pivacek, G.P. Cassidy et al. // Transfusion - 2000. - Vol.40, No. 11. - P. 1337-1340; J.D. Roback, CD. Josephson, E.K. Waller et al. // Transfus. Med. Rev. - 2014. - V. 28, No. 2. - P. 41-55; A. D'Alessandro, K.C. Hansen, C.C. Silliman et al. // Vox Sang. - 2015. - Vol. 108, No. 2. - P. 131-140]. Однако растворы для нативных эритроцитов не учитывают особенностей жизнедеятельности размороженных, деглицеринизированных, полностью лишенных плазмы, гиперосмолярных красных клеток.
Добавочный раствор для хранения нативных эритроцитов AS-3, включающий 11 г/л декстрозы, 0,3 г/л аденина, 2,76 г/л однозамещенного фосфата натрия, 4,1 г/л хлористого натрия, 5,88 г/л цитрата натрия и 0,42 г/л лимонной кислоты, был исследован при хранении ОРЭ, и он оказался не менее пригодным, чем раствор SAG-M, применяющийся для хранения ОРЭ, полученных аппаратным способом с использованием устройства Haemonetics АСР 215 [M.J. de Grandmont, Е. Ducas, М. Girard et al. // Vox Sang. - 2014. - Vol. 107, No. 3. - P. 239-246; A. D'Alessandro, T. Nemkov, M. Kelher et al. // Transfusion. - 2015. - Vol. 55, No. 6. - P. 1155-68.].
Для успешного применения взвесь эритроцитов должна соответствовать определенным показателям, характеризующим морфофункциональную сохранность эритроцитов, таким как уровень свободного гемоглобина, процент гемолиза (количество разрушенных клеток), процент осмотически неустойчивых эритроцитов, их морфология, содержание аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) и др.
При хранении нативных эритроцитов в виде взвеси в добавочном растворе ставится задача сохранения морфофункциональной активности эритроцитов на срок не менее 21 суток. Криоконсервирование позволяет сохранять морфофункциональную активность эритроцитов достаточно продолжительное время, а после размораживания и отмывания ОРЭ необходимо хранить только то время, которое требуется для доставки взвеси ОРЭ больному, особенно при значительной удаленности медицинских организаций от станций переливания крови (центров крови). Поэтому 6-7 суток хранения взвеси ОРЭ в добавочном растворе считается достаточным сроком, и возникает вопрос о наилучших показателях их морфофункциональной сохранности.
Наиболее близким по достигаемому результату к заявляемому раствору является раствор SAG-M фирмы Haemonetics Corp., США, разрешенный для трансфузии [ФЗС 2011/10524], который содержит соль натрия (хлористый натрий), глюкозу, аденин и шестиатомный углеводородный спирт из группы сахаров -маннитол. SAG-M обеспечивает сохранность размороженных отмытых эритроцитов при 4°С до 3-7 дней.
Однако, по мере хранения эритроцитов в этом растворе происходит нарастающее ухудшение их морфофункциональных свойств, так называемые «метаболические нарушения хранения», а именно нарастание гемолиза, снижение осмотической резистентности эритроцитов, снижение уровня АТФ и 2,3-дифосфатглицерата (2,3-ДФГ), накопление продуктов деградации: молочной кислоты, ионов водорода, оксида азота, энзимов, продуктов разрушения липидов и др. Эти нарушения не могут не влиять на качество и жизнеспособность переливаемых эритроцитов.
Результат, на достижение которого направлено заявляемое изобретение, заключается в сохранении количества и функциональной активности размороженных отмытых эритроцитов в период их хранения в добавочном растворе.
Указанный результат достигается тем, что добавочный раствор для хранения отмытых размороженных эритроцитов, включающий соль натрия, глюкозу и аденин, в качестве соли натрия содержит фумарат натрия и смесь одно- и двузамещенных фосфатов натрия, а для повышения осмолярности раствора - сахарозу (дисахарид из группы олигосахаридов) при следующем соотношении компонентов в миллимолях (мМоль) на 1 литр раствора:
фумарат натрия
46,3±6,9
однозамещенный фосфат натрия
12,2±4,5
двузамещенный фосфат натрия
10,5±3,6
глюкоза
40,4±0,1
аденин
1,47±0,01
сахароза
88,8±1,7
Раствор может включать 4,3±0,5 мМоль/л цитрата натрия. Заявляемый раствор получен растворением компонентов раствора (кроме глюкозы) в 1000 мл бидистиллированной воды; раствор был профильтрован через фильтр миллипор, разлит во флаконы и стерилизован автоклавированием. Для предотвращения карамелизации раствора при автоклавировании глюкоза была введена в стерилизованный раствор добавлением расчетного количества стерильного 40%-ного водного раствора.
В эксперименте на животных (крысы, кролики) выяснено, что заявляемый раствор не токсичен и апирогенен.
Замораживанию подвергалась эритроцитная масса (ЭМ), полученная из консервированной донорской крови и хранившаяся не более 3-х суток. Трубка контейнера с ЭМ стерильно соединялась с трубкой контейнера с криозащитным раствором «Криосин», содержащим 40% глицерина, с помощью устройства для стерильного соединения магистралей. В процессе глицеринизации к эритроцитам медленно, при тщательном перемешивании добавлялся раствор «Криосин» до соотношения 1:1 (с экспозициями в течение 8-10 минут после добавления 1/5, 1/3 и оставшейся части криозащитного раствора). Конец трубки запаивался на расстоянии 10 см. Эквилибриционный период перед помещением контейнера в холодильник составлял 40-60 минут.
Подготовленную к замораживанию эритроцитную взвесь в контейнере объемом 750 мл в горизонтальном положении помещали в медицинский холодильник (-40°С), где осуществлялось ее нерегулируемое медленное замораживание и последующее хранение в течение не более 1 года.
Оттаивание эритроцитов осуществляли на аппарате для размораживания и подогрева крови и ее компонентов. Размораживание проводилось в течение различного времени (в зависимости от объема взвеси) до комнатной температуры. В процессе размораживания каждые 5 минут взвесь в контейнере перемешивали.
На этапе деглицеринизации (отмывания) эритроцитов размороженную эритроцитную взвесь стерильно (с помощью аппарата для стерильного соединения полимерных трубок) переводили в контейнер для отмывания эритроцитов. Одну из магистралей контейнера для отмывания соединяли с емкостью, содержащей отмывающий раствор Маннисин №1 (160 г маннита и 7 г хлористого натрия в 1000 мл воды), с помощью аппарата для стерильного соединения полимерных трубок, и медленно, постоянно перемешивая, добавляли весь его объем к взвеси эритроцитов (в соотношении не менее чем 1:1). Не разъединяя (используя зажим), контейнеры центрифугировали при 1250g, 4°С в течение 10 минут. Надосадочную жидкость переводили в контейнер из-под раствора Маннисин №1. Использованную трубку контейнера для отмывания герметизировали.
Вторую магистраль контейнера для отмывания с помощью аппарата для стерильного соединения подсоединяли к емкости, содержащей отмывающий раствор Маннисин №2 (50 г маннита и 7 г хлористого натрия в 1000 мл воды), и медленно, постоянно перемешивая, добавляли весь его объем к эритроцитам. Не разъединяя, контейнеры центрифугировали в том же режиме. Надосадочную жидкость переводили в контейнер из-под раствора Маннисин №2. Использованную трубку контейнера для отмывания герметизировали. Третий этап деглицеринизации проводили аналогично второму, с использованием отмывающего раствора Маннисин №3 (25 г маннита и 7 г хлористого натрия в 1000 мл воды), центрифугирования и перевода надосадочной жидкости в пустой контейнер.
Таким образом, в результате проведения вышеописанных манипуляций получали дозу отмытых размороженных эритроцитов.
Криоконсервирование эритроцитов безаппаратным (ручным) методом при -80°С проводили аналогичным образом. При замораживании эритроцитов при -80°С срок хранения может быть увеличен до 10 лет.
Дозу ОРЭ также заготовляли с использованием технологии глицеринизации -деглицеринизации эритроцитов на аппарате Haemonetics АСР 215 (США).
Изучение эффективности заявляемого добавочного раствора осуществлялось в параллельных экспериментах на ОРЭ одного донора. Сравнение между собой ОРЭ разных доноров некорректно из-за многоступенчатости процесса криоконсервирования и индивидуальных различий в устойчивости эритроцитов разных доноров ко всем его этапам.
В рамках экспериментов размороженные после криоконсервирования и отмытые эритроциты в объеме стандартной дозы были разделены на 2-3 равные части и суспендированы в заявляемом растворе (примеры 1 и 2) и растворе SAG-M (пример 3 контрольный), в соотношении 1:1. Полученные взвеси исследовались в день отмывания, через 1 и 2 недели хранения при 4°С. Аликвоты отбирались с соблюдением условий стерильности.
При изучении морфофункционального состояния размороженных отмытых эритроцитов использовали следующие методики:
1) изучение морфологии эритроцитов (подсчет процентного содержания дискоцитов, эхиноцитов, сфероцитов) с помощью светового микроскопа МБИ-6 методом микроскопии в нативной капле (в плазме IV группы);
2) морфологический индекс рассчитывали как сумму произведений процентного содержания отдельных форм эритроцитов и соответствующих коэффициентов
3) (оценивалось 300 клеток). Для дискоцитов использовался коэффициент 1,0; для эхиноцитов - 0,6 и для сфероцитов - 0,0 (модификация метода Usry R.T.);
4) концентрацию свободного гемоглобина (г/л) во взвесях размороженных отмытых эритроцитов определяли спектрофотометрически аммиачным методом при длине волны 540 нм на спектрофотометре СФ-46;
5) количество эритроцитов, остаточных тромбоцитов и лейкоцитов, уровень общего гемоглобина, гематокрит, средний объем эритроцита (MCV), среднее содержание гемоглобина в одном эритроците (МСН) и среднюю концентрацию гемоглобина в одном эритроците (МСНС) определяли на гематологическом анализаторе М10 Medonic M-Series (Bouble Medical AB, Швеция);
6) количество разрушенных клеток (гемолиз) рассчитывали по формуле:
где Hb св. - содержание свободного гемоглобина в надетое;
Ht - гематокритное число;
Hb общ. - содержание общего гемоглобина;
7) содержание осмотически неустойчивых эритроцитов (ОНЭ, %) оценивали по процентному отношению содержания свободного гемоглобина во взвеси 0,05 мл эритроцитов, помещенных в 10 мл гипотонического (0,6%) раствора натрия хлорида к содержанию общего гемоглобина такого же объема красных клеток, полностью гемолизированных в 10 мл раствора аммиака (1:250). Содержание свободного гемоглобина определяли на СФ-46 в надосадочной жидкости, полученной путем центрифугирования взвесей в гипотоническом растворе при 2000 об/мин в течение 10 минут, после 15 мин экспозиции при комнатной температуре;
8) содержание остаточных лейкоцитов в ОРЭ определяли с помощью автоматического анализатора ADAM-rWBC;
9) содержание электролитов (К+, Na+, Cl-), метаболитов (глюкозы, лактата), рН и р50 (показатель, отражающий сродство гемоглобина к кислороду) исследовали на газоанализаторе крови RADIOMETER ABL800 FLEX;
10) осмолярность взвесей определяли на осмометре Vapro 5600 (США);
11) уровень АТФ в отмытых размороженных эритроцитах определяли хемилюминесцентным методом на аппарате Bio Тек Flx800 с использованием биолюминесцентного набора (Adenosine 5-triphosphate Bioluminescent Assay Kit, SIGMA-ALDRICH).
Далее изобретение иллюстрируется примерами, но не ограничено ими.
Пример 1.
8,5 г фумарата натрия, 1,0 г однозамещенного фосфата натрия, 2 г двузамещенного фосфата натрия, 0,2 г аденина и 31,0 г сахарозы были растворены в 1000 мл бидистиллированной воды. После фильтрования и стерилизации автоклавированием в раствор ввели 7,27 г глюкозы добавлением в стерильных условиях стерильного аптекарского 40%-ного раствора (для инъекций).
Концентрация раствора (мМоль/л):
фумарат натрия
53,2
однозамещенный фосфат натрия
8,3
двузамещенный фосфат натрия
14,1
глюкоза
40,4
аденин
1,5
сахароза
90,5
Общая концентрация ионов натрия в растворе 143 мМоль/л, рН раствора 7,06, его осмолярность 351 мосм/л.
Пример 2.
Раствор, включающий 6,3 г фумарата натрия, 2,0 г однозамещенного фосфата, 1,0 г двузамещенного фосфата натрия, 7,27 г глюкозы, 0,2 г аденина, 29,9 г сахарозы и 1,1 г цитрата натрия в 1000 мл воды, был приготовлен так, как описано в примере 1.
Концентрация раствора (мМоль/л):
фумарат натрия
39,4
однозамещенный фосфат натрия
16,7
двузамещенный фосфат натрия
7,0
глюкоза
40,4
аденин
1,5
сахароза
87,1
цитрат натрия
4,3
Общая концентрация ионов натрия 148 мМоль/л, рН раствора 6,90, его осмолярность 350 мОсм/л.
Полученные растворы использовали в опытах по хранению ОРЭ; раствором сравнения служил раствор SAG-M фирмы Haemonetics.
Было проведено 7 серий экспериментов с раствором по примеру 1: на эритроцитах, криоконсервированных при -40°С безаппаратным методом (5 серий), на эритроцитах, криоконсервированных при -80°С безаппаратным методом и при -80°С с использованием аппарата Haemonetics АСР 215.
С использованием раствора по примеру 2 проведено 3 серии экспериментов: на эритроцитах, криоконсервированных при -80°С безаппаратным методом, при -80°С с использованием аппарата Haemonetics АСР 215 (в сравнении с раствором SAG-M) и при -40°С безаппаратным методом.
Взвеси исследовались в день отмывания, через 1 и 2 недели хранения. Результаты отражены в таблицах 1-3.
Данные, полученные при криоконсервировании эритроцитов при -40°С безаппаратным методом, свидетельствуют о том, что взвесь отмытых размороженных эритроцитов в растворе по примеру 1, при сопоставимости по гематокриту и общему гемоглобину со взвесями эритроцитов тех же доноров в растворе SAG-M, содержит статистически достоверно меньшее содержание разрушенных клеток (0,19±0,023 против 0,28±0,025) и осмотически неустойчивых к действию гипотонического раствора клеток (1,3±0,12% против 2,7±0,36%) уже через 1 час после ресуспендирования. На сроках хранения 1 и 2 недели указанные различия сохраняются: процент гемолиза во взвесях в растворе по примеру 1 в 2 раза, а содержание ОНЭ в 3-5 раз ниже, чем в растворе SAG-M.
Статистически значимые различия в MCV (средний объем эритроцитов), особенно на сроках хранения в 1 и 2 недели, указывают на относительный свеллинг красных клеток крови в растворе SAG-M.
После хранения взвесей ОРЭ (криоконсервированных при -80°С безаппаратным методом) в течение 1 недели при 4°С (таблица 2) отмечено статистически значимое различие в уровне гемолиза и осмотически неустойчивых клеток между экспериментальными растворами и SAG-M (р<0,05) в пользу первых. Так, процент гемолиза равнялся 1,51±0,208 и 1,51±0,267 в растворах по примеру 1 и 2 соответственно и в 2 раза выше - в SAG-M (3,56±0,324).
Отмечено более интенсивное закисление среды в растворе SAG-M (с 7,12±0,009 до 6,96±0,014). В экспериментальных растворах за счет эффективного буфера снижение рН через 1 неделю было незначительным. Нарастание уровня внеклеточного калия и лактата было приблизительно одинаковым во всех растворах.
Для сравнения эффективности добавочных растворов по примеру 1 и по примеру 2 была поставлена серия из 4-х экспериментов на ОРЭ, криоконсервированных при температуре -40°С, в процессе их гипотермического хранения (таблица 3).
Анализируя данные, представленные в таблице 3, следует отметить, что через 1 час после соединения ОРЭ с добавочными растворами взвеси эритроцитов в исследуемых растворах практически не различаются по основным показателям морфофункциональной полноценности.
Через 1 неделю хранения оба раствора демонстрируют свою эффективность: допустимый процент гемолиза (0,37±0,025 в растворе по примеру 1 и 0,32±0,039 в растворе по примеру 2) и умеренное нарастание ОНЭ - 4,7±0,90% и 3,9±0,75% соответственно.
По этим показателям, как через 1, так и через 2 недели хранения раствор по примеру 2, возможно, является более адекватным для данной среды. В данной серии экспериментов не отмечено и существенного нарастания внеклеточного калия и лактата (их уровень через 1 неделю хранения ниже, чем в нативной эритроцитной массе 2-х суток хранения).
Гематологические показатели ОРЭ в обоих исследуемых растворах как через 1 час после их соединения, так и через одну и две недели гипотермического хранения не имели значимых различий и укладывались в норму (таблица 3). Отмечено незначительное снижение морфологического индекса в процессе хранения взвесей (с 94,9±1,28 до 83,5±3,13 в растворе по примеру 1), которое происходило за счет увеличения обратимо измененных форм эритроцитов (эхиноцитов).
Из представленных результатов видно, что морфофункциональная сохранность ОРЭ в заявляемом растворе выше, чем в растворе SAG-M по уровням свободного гемоглобина и гемолиза, содержанию АТФ и осмотически неустойчивых эритроцитов, их морфологии, поддержанию рН взвесей.
Таким образом, заявляемый добавочный раствор по изученным показателям эффективен при гипотермическом хранении в нем отмытых размороженных эритроцитов. Отмечено сохранение количества и функциональной активности размороженных отмытых эритроцитов в период их хранения в заявляемом добавочном растворе.