Изучение действия наночастиц сплава металлов на клинические штаммы Pseudomonas aeruginosa

Бабушкина И.В., Коршунов Г.В., Пучиньян Д.М., Бородулин В.Б. Изучение действия наночастиц.

ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ НАНОЧАСТИЦ СПЛАВА МЕТАЛЛОВ НА КЛИНИЧЕСКИЕ ШТАММЫ PSEUDOMONAS AERUGINOSA

И.В. Бабушкина, Г.В. Коршунов, Д.М. Пучиньян

ФГУ «СарНИИТО Росмедтехнологий» ул. Чернышевского, 148, Саратов, Россия, 410002

В.Б. Бородулин

Кафедра биологической химии ГОУ ВПО «СГМУ Росздрава» ул. Б. Казачья, 112, Саратов, Россия, 410012

В работе изучалось действие наночастиц сплава меди, цинка и железа на 10 полиантибиоти-корезистентных штаммов Pseudomonas aeruginosa, выделенных от больных с гнойными осложнениями травматолого-ортопедического стационара. Выявлено, что концентрация наночастиц 10 мг/мл подавляет рост бактерий на 91—97% в зависимости от времени воздействия, 1 мг/мл — от 54 до 61% и 0,1 мг/мл — от 30 до 63% по сравнению с контролем. Отмечены изменения в биохимической активности после воздействия нанопорошков (80—100% штаммов дают отрицательную реакцию на эскулин, орнитин, лизин, 60—100% штаммов перестают ферментировать маннит и сорбит).

Ключевые слова: наночастицы, железо, цинк, медь, Pseudomonas aeruginosa.

Создание высокоэффективных антибактериальных препаратов является актуальной проблемой современной медицины в связи с постоянно возрастающим числом гнойных осложнений. В этом отношении металлы в виде наночастиц являются одними из перспективных претендентов на создание нового класса антибактериальных средств. Наночастицы металлов обладают низкой токсичностью (в 7—10 раз меньшей, чем металлы в ионной форме), ранозаживляющим действием [1], в биотических дозах стимулируют функциональную активность регуля-торных систем, участвующих в поддержании оптимальных уровней природных антиоксидантов и микроэлементов, циклических нуклеотидов, синтезе нуклеиновых кислот и белка [2, 3].

Наночастицы и их сплавы могут выступать в качестве антибактериальных и противоопухолевых препаратов, так как могут участвовать в реакциях Фенто-на и Хабера-Вейса и генерировать свободные радикалы, разрушающие клеточные элементы [4].

Целью настоящей работы является изучение антибактериальной активности наночастиц сплава меди, цинка, железа на штаммах Pseudomonas aeruginosa, выделенных от больных с гнойными осложнениями, и исследование изменений биохимических показателей жизнедеятельности микроорганизмов после воздействия суспензии наночастиц сплава.

Материалы и методы. Нанопорошки синтезированы на Саратовском плазмохимическом комплексе ФГУП РФ ГНЦ ГНИИ химической технологии элементоорганического синтеза (г. Москва). Cерию разведений ультрадисперсных порошков металлов готовили непосредственно перед экспериментом в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл, 10 мг/мл в физиологическом растворе. В качестве контроля использовали физиологический раствор той же серии.

Исследования проводились на штаммах Pseudomonas aeruginosa, выделенных от больных с гнойными осложнениями, находящимися на лечении в травма-толого-ортопедическом стационаре, и обладающих резистентностью к пяти и более профильным антибиотикам. Суспезию бактерий готовили по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича на 10 ЕД, что соответствует 1 млрд микробных тел в 1 мл, затем рядом последовательных разведений получали конечную концентрацию бактерий в 50 000 клеток в 1 мл.

В пробирки с разведениями нанопорошков добавляли по 100 мкл конечной суспензии микроорганизмов, встряхивали и оставляли на 30 мин. В качестве контроля использовали те же количества бактериальной взвеси, разведенные в аналогичных пропорциях с физиологическим раствором и так же выдержанные в течение 30 мин. После этого с каждого из разведений производили высев на твердые питательные среды (мясопептонный агар) по 100 мкл на каждую чашку Петри. Все чашки помещали в термостат на 24 часа при 37 °С. Подсчет колоний производили на следующий день. Тогда же исследовали биохимические свойства микроорганизмов в опытной и контрольной культурах. Для биохимических тестов использовали дифференциально-диагностические системы NEFERMtest 16 (La Chema).

Производили статистическую обработку материала с подсчетом средних значений (М), их среднеквадратичных ошибок (m) и уровня достоверности (p).

Результаты и обсуждение. Результаты подсчета количества колоний, выросших на твердых питательных средах после воздействия различных концентраций наночастиц сплава в течение 30—180 мин., и в контрольной группе, не подвергавшейся влиянию ультрадисперсных порошков, представлены в табл. 1.

Таблица 1

Количество колоний Pseudomonas aeruginosa, выросших на твердых питательных средах, после воздействия наночастиц сплава железа, меди и цинка

Время воздействия, мин Контроль, количество колоний, М ± m Опытная группа 1 (10 мг/мл), количество колоний, М ± m Опытная группа 2 (1 мг/мл), количество колоний, М ± m Опытная группа 3 (0,1 мг/мл), количество колоний, М ± m

30 458,5 ± 38,4 55,4 ± 12,1*** 267,6 ± 49,3*** 341, 2 ± 87,8

60 441,1 ± 42,4 28,6 ± 11,1*** 206,6 ± 35,7*** 329,3 ± 73,9

120 469,2 ± 56,8 31,1 ± 13,3*** 181,4 ± 27,8*** 260,7 ± 43,9**

180 407,3 ± 37,8 13,3 ± 6,1*** 170,7 ± 37,8*** 254,0 ± 53,7*

Примечание: * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001

Бабушкина И.В., Коршунов Г.В., Пучиньян Д.М., Бородулин В.Б. Изучение действия наночастиц...

При изучении 10 штаммов Pseudomonas aeruginosa, выделенных у больных с гнойными осложнениями и обладающими полиантибиотикорезистентностью, было установлено, что активность наночастиц сплава железа, цинка, меди колеблется в широком диапазоне концентраций от 0,1 мг/мл до 10 мг/мл, при этом концентрация 10 мг/мл даже при кратковременном воздействии (30 мин.) вызывает снижение количества колоний, выросших на мясо-пептонном агаре, на 91% по сравнению с контролем (p < 0,001). Дальнейшее увеличение времени воздействия повышает эффективность воздействия незначительно: в течение 60 мин. — до 93%, 120 мин. — до 94%, 180 мин. — до 97% (p < 0,001). В концентрациях до 5 мг/мл антибактериальная активность сплава наночастиц выражена в меньшей степени, но количество колоний по сравнению с контролем было достоверно ниже. Концентрация 1 мг/мл при 30-минутном воздействии уменьшает количество колоний на 54%, увеличение времени воздействия до 60 мин приводит к уменьшению числа колоний на 58%, до 120 мин. — на 61%, до 180 мин. — на 61% по сравнению с контролем (p < 0,001). Воздействие концентрации 0,1 мг/мл вызывает ингибирование роста микроорганизмов в меньшей степени (от 30 до 63%) по сравнению с контролем (p < 0,01 и p < 0,05 при воздействии 120—180 мин.).

Результаты изучения влияния различных концентраций сплава наночастиц на клинические штаммы Ps. aeruginosa в течение 30—180 мин. представлены на рис. 1.

120 180 Время воздействия, мин

Рис. 1. Зависимость количества колоний микроорганизмов, выросших на твердой питательной среде, от концентрации наночастиц и времени воздействия на суспензию бактериальных клеток

При изучении биохимической активности штаммов Pseudomonas aeruginosa установлено, что после воздействия сплава наночастиц в концентрации 10 мг/мл наблюдаются обратимые изменения ферментативной активности микроорганиз-

мов. Отрицательную реакцию на эскулин дают80% изучаемых штаммов, 100% — на орнитин, 100% — на лизин, 60% штаммов перестают ферментировать маннит, 100% — сорбит (p < 0,05). В контрольной группе биохимические свойства оставались неизменными.

Заключение. В результате проведенных экспериментов было выявлено выраженное антибактериальное действие наночастиц сплава ультрадисперсных порошков металлов на клинические штаммы Pseudomonas aeruginosa. Значительно уменьшалось число колоний на твердых питательных средах, изменялись показатели биохимической активности. Полученные данные позволяют предполагать использование нанопорошков металлов при лечении гнойных осложнений.

ЛИТЕРАТУРА

[1] Байтукалов Т.А. Физико-химические особенности ранозаживляющих свойств наночастиц железа и магния в составе различных полимеров: Автореф. дис. ... канд. хим. наук. — Москва, 2006. — 20 с.

[2] Глущенко Н.Н., Богословская О.А., Ольховская И.П. и др. Физико-химические закономерности биологического действия высокодисперсного порошка железа // Применение биомагнитных носителей в медицине: Материалы симпозиума. — М., 2002. — С. 86—94.

[3] Глущенко Н.Н. Физико-химические закономерности биологического действия высокодисперсных порошков металлов: Дисс. докт. биол. наук. — М., 1987. — 464 с.

[4] Сергеев Г.Б. Нанохимия. — М.: КДУ, 2007. — 336 с.

THE STUDY OF ACTION OF A NANOPARTICLE ALLOY OF METALS ON CLINICAL STRAINS OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA

I.V. Babushkina, G.V. Korshunov, D.M. Puchinyan

FSI «SarNIITO Rosmedtechnologies» Chernishevskiy str., 148, Saratov, Russia, 410002

V.B. Borodulin

Biological Chemistry Department GOU VPO «SGMY Roszdrava» Bolshaya Kazachya str., 112, Saratov, Russia, 410012

The research is concerned with the action of a nanoparticle alloy of copper, zinc and iron on 10 strains of Pseudomonas aeruginosa, exuded from patients with suppurative complications of a trauma-tologic-orthopedic hospital. It has been revealed that the nanoparticle concentration 10 mg/ml suppresses the bacteria growth within 91—97% according to the activity time, 1 mg/ml — within 54—61% and 0,1 mg/ml — within 30—63% against the control. Some changes in biochemical activity under the nanopowder influence (80—100% of strains give negative reaction on esculin, ornithine, lysine, 60— 100% of strains cease fermenting mannitol and sorbitol) has been observed.

Key words: nanoparticle, copper, zinc, iron, Pseudomonas aeruginosa.