СПОСОБ ЗАЩИТЫ МАТЕРИАЛОВ ОТ МИКРОБНОГО РАЗРУШЕНИЯ
WAY TO PROTECT MATERIALS FROM MICROBIAL DESTRUCTION

Изобретение относится к способам подавления роста микроорганизмов и может быть использовано для защиты органических и неорганических материалов от биоповреждений, а также в медицине, ветеринарии, микробиологической и медицинской промышленности.
Известен способ защиты материалов, например смазочно-охлаждающей жидкости на водной или неводной основе, когда в нее вводят композицию соединений, подавляющих рост анаэробов, которая содержит α-три-1-(п-нитрофенол)-2-аминопропандиол-1,3 и органический сульфонат (Патент ГДР №266240, кл. С10М 141/08, 1987).
Недостатком указанного способа являются применение антимикробных композиций, подавляющих только микроорганизмы одного типа, например анаэробы, и не активных против других организмов, например аэробов, а также ингибирование развития только вегетативных клеток, но не покоящихся форм, таких как споры.
Известен способ защиты материалов, например технического масла, от воздействия микромицетов, предусматривающий введение в техническое масло эфирного масла цитраль (3,7-диметилоктадиен-2,6-аль-1) в количестве 0,5-1,0% (RU 2074250, 27.02.1992).
Известен способ борьбы с бактериями и загрязняющими (контаминирующими) организмами, включающий нанесение на указанные бактерии и загрязняющие организмы или места их обитания эффективного количества антибактериального активного ингредиента, соответствующего формуле (а):
1
1-12
1-5
1-4
где n=1 или 2; R - водород; R представляет (а) фенил; фенил, замещенный 1 или 2 заместителями, независимо выбранными из галогена, C-алкила, тригалометила, C-алкокси, C-алкилкарбонил или нитро; тиенил, когда n≠2, фуранил; или R представляет собой радикал формулы (b):
1-4
где Х - кислород или сера, Y - азот или СН; R'' - водород или C-алкил (RU 2143805, 10.01.2000).
Недостатком указанного способа является то, что биоциды указанной формулы, применяемые для защиты материалов, обладают токсическим действием и являются экологически опасными веществами.
Известно также использование антимикробных белков и пептидов для защиты объектов от микробного разрушения. Например, известно применение белкового компонента, выделенного из растительного хроматина после разложения последнего, в качестве антимикробного агента. Указанный белковый компонент имеет кажущуюся молекулярную массу в интервале от 10 до 20 кДа (RU 2303357, 27.07.2007). Однако данное вещество может быть разрушено микроорганизмами, что сокращает срок его защитного действия.
К общему недостатку используемых способов защиты материалов от биоповреждений следует отнести развитие процесса автолиза микроорганизмов, ингибированных биоцидами, вследствие чего в среду попадают органические вещества, облегчающие последующее развитие микроорганизмов второй волны контаминации. Тем самым срок защитного действия биоцидов сокращается.
Наиболее близким к предложенному изобретению является способ защиты материалов от микробиологического и окислительного разрушения, согласно которому навеску вещества фенольного ряда вносят в защищаемый материал, при этом используют вещество общей формулы (с):
1
2
21
где R=H; НО или алкил C-C;
2
2
n
R=H; ОН; (CH)OH,
2
4
4
1
20
6
21
2
5
где n=2-6; CHCOOR(R=Н или алкил C-C); алкил С-C или CHCOR
5
2
n
3
2
n
3
[R=СО(СН)CH, где n=0-19 или NН(СНz)CH, где n=0-19]
3
2
21
R=Н или алкил С-С,
1
2
3
причем R, R и R одновременно не могут быть водородами (RU 2086610, 10.08.1993).
Антимикробные вещества в известном способе обладают широким спектром действия и пролонгированным характером защиты.
Однако недостатком известного технического решения, принятого за прототип, является высокая гидрофобность большинства соединений общей формулы, что существенно ограничивает сферу их применения. Кроме того, в патенте описано применение для защиты материалов лишь ограниченного спектра экологически безопасных веществ, не приведены примеры пролонгированного антимикробного действия и предотвращения автолиза клеток ингибированных микроорганизмов.
Задачей настоящего изобретения являются расширение ассортимента экологически безопасных веществ, которые могут быть использованы для антимикробной защиты материалов разной природы и обладают пролонгированным действием, а также повышение надежности защиты.
Поставленная задача решается описываемым способом защиты материалов от микробного разрушения путем обработки защищаемого материала веществом с антимикробной активностью, при этом в качестве вещества с антимикробной активностью используют алкилоксифенильное производное метана общей формулы:
1
1
21
2
3
2
20
где R выбран из водорода, алкила C-C, алкилоксифенила, R выбран из водорода, оксифенила, алкилоксифенила, диалкилоксифенила, R выбран из алкилоксифенила, диоксифенила, диалкилоксифенила, при этом в алкилоксифениле и диалкилоксифениле алкил выбран из С-С, при этом концентрации вещества с антимикробной активностью составляют 0.002-0.5% мас.
Нами установлено, что указанные выше вещества обладают антимикробной активностью против вегетативных и покоящихся клеток широкого спектра микроорганизмов: бактерий, архей, грибов, дрожжей. Они предотвращают их автолиз и вторичную волну контаминации, что обеспечивает пролонгированный эффект и отсутствие привыкания. Основная биологическая активность соединений заключается в индукции перехода вегетативных клеток микроорганизмов в состояние анабиоза и поддержании этого состояния, что выражается в ингибировании прорастания покоящихся форм и роста микроорганизмов. Кроме того, заявленные производные метана являются низкотоксичными соединениями. По молекулярному механизму действия используемые производные метана являются модификаторами мембран и биополимеров клетки, что обусловливает потерю клеткой метаболитической активности, способности к пролиферации и ее гибель без последующего автолиза. Используемые производные метана можно получить известными методами синтеза, или выделить из природных источников.
Максимальный эффект защиты материалов от микробного разрушения достигается путем введения заявленных веществ в концентрации от 20 до 5000 мг/л в зависимости от таксономической группы микроорганизмов (эубактерии, археи, грибы) и физиологической группы (гетеротрофы, автотрофы, углеводородокисляющие, сульфатредуцирующие и др.). Заявленные вещества при разбавлении до концентраций ниже 10 мг/л не оказывают угнетающего действия на развитие микроорганизмов.
Антимикробную активность веществ изучают методами турбидиметрического определения роста микроорганизмов в селективных питательных жидких средах при измерении оптической плотности (ОП) микробной суспензии на фотоэлектроколориметре ФЭК-56, фильтр №8, толщина слоя в кювете 0,5 см, или спектрофотометре, длина волны 660 нм, толщина слоя в кювете 1 см, или методом определения концентрации жизнеспособных клеток (КОЕ) высевом десятикратных разведений жидких культур на плотные питательные среды. Инокулят вносят в количестве, дающем количество клеток в среде 20,0-25,0 млн/мл, что составляет начальное значение ОП=0,2. Продолжительность культивирования 1-360 дней. Температуры культивирования - оптимальные для роста культур микроорганизмов (20-37°С). Аэрация обеспечивается качалкой со 140-160 об/мин, анаэробные и микроаэрофильные микроорганизмы выращивают без перемешивания и без слоя воздуха над средой.
Испытуемые вещества вносят в виде раствора в воде, или в этиловом спирте (96%-ный ректификат), или в специальном растворителе, состоящем из ацетона, содержащего 10% детергента Твин-80, в количестве 0,5-1% об/об. В контрольные варианты вносят равные количества компонентов растворителей. Концентрации вносимых веществ в среде роста от максимальной - 5000 мг/л (0.5% мас.), уменьшаются дробно до минимальной концентрации 1,0 мг/л (0.0001% мас.).
Антимикробную активность оценивают по величине минимальных рост-ингибирующих концентраций (МИК), выраженных в мг/л.
В таблице 1 приведены конкретные вещества, соответствующие общей формуле, указанной выше, которые опробованы нами для защиты материалов от микроорганизмов, указанных в таблице 2.
Таблица 1. Вещества, обладающие антимикробной активностью.
№
Вещества, спецификация радикалов R<sub>1</sub>, R<sub>2</sub>, R<sub>3</sub>.
1
Алкил, алкилоксифенилметаны, где R<sub>1</sub>-Н или алкил С<sub>2</sub>-С<sub>21</sub>, R<sub>2</sub>-H; R<sub>3</sub> - алкилоксифенил с длиной алкильного радикала С<sub>2</sub>-С<sub>21</sub>.
2
Триалкилоксифенилметаны, где R<sub>1</sub>, R<sub>2</sub> и R<sub>3</sub> - алкилоксифенилы с длиной алкильного радикала C<sub>2</sub>-C<sub>21</sub>.
3
Алкилоксифенилметан, где R<sub>1</sub>-С<sub>5</sub>Н<sub>11</sub>, R<sub>2</sub> - Н; R<sub>3</sub> - диоксифенил.
4
Алкилоксифенилметан, где R<sub>1</sub>, R<sub>2</sub> - Н, R<sub>3</sub> - диалкилоксифенил.
5
Диалкилоксифенилметан, где R<sub>1</sub> - Н, R<sub>2</sub>, R<sub>3</sub> - диалкилоксифенил.
Сущность изобретения поясняется примерами.
Пример 1. В ряд пробирок, содержащих специальные питательные среды для роста культур микроорганизмов (табл.2), вносят вещество №3 (табл.1) в концентрациях 1-1000 мг/л, после чего вносят инокулят микроорганизмов в количестве, дающем величину концентрации клеток по КОЕ 20.0-25.0 млн/мл. В контрольные пробирки биоцид не добавляют. Через 3 и 7 дней в контрольном и опытных вариантах определяют концентрацию жизнеспособных клеток (КОЕ) методом высева десятичных разведений на плотные среды. Значения концентраций веществ, при которых величина КОЕ остается на уровне инокулята, считают за МИК. Для разных культур получают разные значения МИК (табл.2).
Таблица 2
Тест-организмы разных таксономических и физиологических групп и значения минимальных рост-ингибирующих концентраций (МИК) для вещества №3 (табл.1) для этих культур
Штамм микроорганизма
МИК, мг/л
Methanosarcina acetovorans
20
Bacillus subtilis
20
Micrococius luteus
20
Staphylococcus aureus
20
Streptococcus faecalis
20
Lactococcus lactis
20
Staphylococcus aureus
25
Streptomyces coelicolor
30
Halobacterium halobium
30
Lactobacillus acidophilus
50
Salmonella minnesota
65
Pseudomonas
65
Mycobacterium smegmatis
70
Saccharomyces cerevisiae
300
Candida utilis
300
Aspergillus niger
300
Penicillium brevi-
300
Приведенный пример показывает, что алкилоксифенилметан (вещество №3, табл.1) подавляет рост микроорганизмов разных таксономических и физиологических групп при концентрациях 20 мг/л (0.002%) и свыше и что при разбавлении ниже этой концентрации вещества общей формулы не оказывают угнетающего действия на развитие микроорганизмов и не представляют экологической опасности. Аналогичные результаты по подавлению роста широкого спектра микроорганизмов получены и для других веществ, перечисленных в таблице 1.
Пример 2. Питательную среду инокулируют смесью микроорганизмов, В. subtilis, P. fluorescens S. cerevisiae. Затем по методу, описанному в примере 1, в питательную среду вносят препарат №1 в концентрации 1000 мг/л. Определяют титр КОЕ сразу после засева и через 3 и 7 дней, а также через 1, 3, 6 и 12 месяцев. Роста микроорганизмов не наблюдают в течение 12 месяцев. Аналогичный результат получен для остальных веществ, представленных в табл.1.
Данный пример показывает, что у микроорганизмов не происходит развития адаптационных реакций в отношении биоцидных веществ общей формулы и поэтому ростподавляющее действие испытанных веществ сохраняется в течение не менее 12 месяцев.
Пример 3. В пробирки с питательными средами вносят культуры микроорганизмов (Saccharomyces cerevisiae, Micrococcus luteus, Thioalkalivibrio versutus, Staphylococcus aureus, Mycobacterium smegmatis) и инкубируют в течение 1-3 сут до достижения стационарной фазы, после чего добавляют вещество №3 (табл.1) до конечной концентрации 150-800 мг/л. В течение 30-60 мин наблюдают гибель всех клеток, причем лизиса клеток не происходит, наблюдаются высокая рефрактерность клеток и специфические морфологические изменения (появление разрывов цитоплазматической мембраны с ее последующей дезинтеграцией, выход фосфолипидов в среду, при сохранении целостности клеточной стенки, конгломерация рибосом, витрификация цитоплазмы), характерные для нового типа биоцидного действия - образования микромумий. Вещества №2 и 4 (табл.1) действуют аналогично.
Данный пример доказывает, что применение веществ №2-4 (табл.1) в дополнение к элиминации всех жизнеспособных бактерий препятствует их лизису и сопутствующему ему выходу питательных веществ (содержимого убитых микроорганизмов) в окружающую среду. В результате для микроорганизмов, попадающих в данную (защищаемую) среду, не будет питательных веществ и их развития не произойдет, что повышает надежность антимикробного действия предлагаемых биоцидов.
Пример 4. Растения ячменя в стадии кущения были обработаны веществом 1 (табл.1) в концентрации 230-350 мг/л. На опытных и контрольных участках применялась одинаковая технология обработки почвы и внесения удобрений. На опытном участке растения, обработанные веществом 1, не поражались фитопатогенными грибами и бактериями, в отличие от необработанных растений контрольного участка. При этом зерно было лучшего качества за счет отсутствия поражения фитопатогенными грибами. Для яблонь при обработке на стадии образования завязей был получен аналогичный результат (яблоки не поражались паршой).
Данный пример показывает, что препараты на основе вещества 1 являются не только эффективными, но и экологически безопасными. Они могут эффективно применяться для защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенных микроорганизмов.
8
Пример 5. Культуры углеводородокисляющих бактерий Rhodococcus erytropolis и R. maris вносили в пробирки с 10 мл среды Раймонда с 2% нефти до концентрации 3×10 кл/мл. В пробирки вносили вещество 1 (табл.1) до концентрации 0.005-0.5%. В контрольном варианте биоцид не был добавлен. Пробирки культивировали при 27°С в течение 14 суток. Выводы о наличии роста и развития культур делали на основании помутнения среды роста, образования эмульсии вода-нефть и микроскопического исследования образцов. Культуры углеводородородокисляющих бактерий выращивали, как описано выше, и добавляли (в количестве 10%) к культурам сульфатвосстанавливающих бактерий, которые затем выращивали на среде Видделя с лактатом в пробирках Балча в течение 2 недель. При засеве вносили вещество №1 в вышеуказанных концентрациях. Об активности сульфатвосстанавливающих бактерий судили по появлению в среде сероводорода, определяемого по Пахмайеру.
Результаты анализа развития культур углеводородокисляющих и сульфатвосстанавливающих бактерий в присутствии нефти представлены в табл.4.
Данный пример показывает, что биоциды общей формулы эффективно подавляют развитие углеводородокисляющих и сульфатредуцирующих бактерий, участвующих в разложении нефти и нефтепродуктов, и могут быть использованы для предотвращения их биокоррозии в концентрациях 0.1-0.5%.
Таблица 4
Влияние различных концентраций вещества 1 на рост и развитие углеводородокисляюших бактерий R. erytropolis и R. maris.
Концентрация вещества 1, %
Титр клеток углеводородокисляющих бактерий
Активность сульфатредуцирующих бактерий
0
10<sup>9</sup>
100
0.005
10<sup>9</sup>
100
0.01
10<sup>7</sup>
40
0.05
10<sup>6</sup>
10
0.1
Менее 10<sup>5</sup>
0
0.5
Менее 10<sup>5</sup>
0
Пример 6. Влияние препарата вещества 1 на коррозию стали оценивали по методу определения защитной способности ингибиторов коррозии металлов в водонефтяных средах (ГОСТ 9.506-87) с использованием образцов стали Ст3. Содержание вещества 1 составляло 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5% (мас.). Эффективными оказались концентрации от 0.05% и выше. При содержании вещества 1 от 0.1% до 0.5% (мас.) снижение скорости коррозии составило 65-75%.
Аналогичные результаты получены для веществ №№2 и 3 (табл.1).
Полученные данные свидетельствуют, что вещества общей формулы в концентрациях 0.05-0.5% (мас.) являются ингибиторами коррозии металлов в условиях работы нефтеперерабатывающего оборудования.
Пример 7. Определение силы биоцидного действия. Культуры бактерий Staphylococcus aureus и Mycobacterium smegmatis выращивали на среде LB состава (г/л): пептон 10, дрожжевой экстракт - 5, NaCl - 5, рН 7.0-7.5, при температуре 30°С. Для выращивания М. smegmatis в среду добавляли детергент Твин-80 (0.01%) для диспергирования агрегатов клеток до единичных клеток. Для определения силы антимикробной активности испытуемых веществ в пробирки объемом 20 мл вносили по 5 мл среды, внося испытуемый препарат вместе с инокулятом (2% культуры стационарной фазы роста). Начальная концентрация клеток - 50-100 млн/мл. В качестве антимикробного агента вносили препарат №3 в концентрации 1, 5, 25, 100, 300, 500 и 750 мг/л. Пробирки инкубировали в течение 4 часов, определяя каждые 15 минут концентрацию жизнеспособных клеток (КОЕ) высевом аликвот десятичных разведений на плотные среды. Силу биоцидного действия выражали в единицах lg/час, соответствующих количеству порядков, на которое произошло снижение численности за 1 час. Результаты представлены в таблице 5. Видно, что полная гибель клеток S. aureus произошла после 45 минут контакта с веществом №3 при концентрации 100 мг/л, а М. smegmatis - через 60 минут при концентрации 300 мг/л и выше.
Таблица 5
Скорость гибели (lg/час) S. aureus и М. smegmatis при разных концентрациях (мг/л) вещества 3
Концентрация, мг/л
1
5
25
50
100
300
500
750
S. aureus
0
0
0.5
2
9
9
>9
>9
M. smegmatis
0
0
0
0
0.5
6
6
6
Данный пример показывает, что растворы вещества №3 в концентрации 300-750 мг/л могут быть применены для холодной стерилизации медицинского оборудования и инструментов при их выдерживании в растворе данного вещества в течение 1 часа и более.
2
7
8
Пример 8. Водные растворы вещества №1 (0.1, 0.2, 0,5, 1, 2, 5 и 10%) нанесены на поверхность деревянных брусков из расчета 0.01-1 мг/см при глубине пропитки не менее 1 мм, бруски высушены и обработаны суспензией спор целлюлолитических грибов родов Trichoderma lignorum (концентрация 10-10 КОЕ/мл). Бруски оставлены во влажных камерах при 30°С. Через 30 суток определено грибное поражение древесины - визуально и путем аппликации брусков на плотную среду Гетчинсона с добавлением фильтровальной бумаги. При использовании концентраций 0.1-0.5% наблюдали рост грибов, как и в контроле - на необработанной древесине. При обработке раствором с концентрацией 1-2% рост сильно подавлен, при использовании 5 и 10% роста грибов не наблюдали в течение 6 месяцев.
Аналогичные данные по подавлению активности протеолитических грибов с применением вещества №1 получены для защиты кож и кожевенных полуфабрикатов.
Данный пример показывает, что вещество №4 может быть использовано для защиты материалов разной природы, углеводов и белков, от микробной деструкции путем нанесения на их поверхность.