СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ФИТОПАТОГЕННОГО ГРИБА Cryphonectria parasitica И ДИАГНОСТИКИ КРИФОНЕКРОЗА (ЭНДОТИЕВОГО РАКА) КАШТАНА МЕТОДОМ ПЦР
METHOD FOR PHYTOPATHOGENIC FUNGUS Cryphonectria parasitica IDENTIFICATION AND DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR CHESTNUT BLIGHT BY PCR METHOD

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии, а именно к способам молекулярно-генетической идентификации микроорганизмов, и может быть использовано в микологии, фитопатологии и фитосанитарном контроле для специфического определения и обнаружения в растительных тканях аскомицетового гриба Cryphonectria parasitica - возбудителя так называемого крифонекроза, или эндотиевого рака, коры каштанов (в англоязычной литературе - chestnut blight, chestnut canker) и ряда других древесных растений.
С.parasitica, попав в Северную Америку в конце XIX века, к 1950-м годам фактически уничтожил зубчатый каштан (Castanea dentata) как лесообразующий вид восточной части США [1, 2]. В Европе, где основным хозяином патогена является посевной каштан (Castanea sativa), гриб впервые был обнаружен в 1938 году, после чего в течение нескольких десятилетий охватил почти весь ареал распространения каштана (Италия, Франция, Испания, Греция, Венгрия, Австрия, Бельгия, Швейцария, бывшая Югославия, бывший СССР (побережье Черного моря), Турция) [1, 2]. С.parasitica является карантинным организмом для Европейской и Средиземноморской организации по защите растений и Европейского Союза, а также имеет карантинное значение для Североамериканской организации по защите растений и Межафриканского фитосанитарного совета [1].
В настоящее время фактически единственным способом определения болезней растений, вызываемых микроскопическими грибами, является фитопатологическая экспертиза, основанная на анализе косвенных признаков заболевания [3], и связанные с ней процедуры микологического анализа (выделение микромицетов в чистую культуру и их визуальная идентификация [4]). При этом определение конкретных возбудителей традиционно осложняется такими факторами, как сходство внешних проявлений некоторых заболеваний (так, рак каштана можно спутать с чернильной болезнью [1]), отличия в агрессивности, морфологии и характере действия разных форм и рас одного вида (что характерно в том числе и для С.parasitica [1, 2]), «размывание» симптоматики вследствие одновременного поражения несколькими патогенами, действия сапрофитов и т.д. Микологический анализ является длительной процедурой (время от посева образцов растительных тканей до определения вида гриба может составлять несколько недель) и, кроме того, связан с рядом трудностей методического характера (выделение и культивирование отдельных паразитических грибов, идентификация стерильных мицелиев и др.) [4].
В то же время полимеразная цепная реакция (ПЦР) является на данный момент наиболее совершенным диагностическим методом молекулярной биологии, молекулярной генетики и клинической лабораторной диагностики. Возможности, заложенные в этом методе, позволяют достигать максимальной чувствительности и специфичности анализа, то есть способности надежно и точно детектировать искомые единичные фрагменты генетического материала, в том числе при наличии в пробе ДНК других организмов. Будучи универсальным методом, ПЦР может быть использована для обнаружения ДНК определенных организмов практически в любом биологическом материале и объектах окружающей среды (воде, почве), что обуславливает перспективность применения ПЦР-анализа для выявления различных вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных патогенов.
Задачей заявляемого изобретения является разработка точного и быстрого способа идентификации Cryphonectria parasitica в пробах биологического материала, в том числе растительных тканях, с использованием метода ПЦР. Техническим результатом, достигаемым при использовании способа, является:
- прямое распознавание патогена и 100%-ная специфичность анализа (идентификация С.parasitica независимо от возможного присутствия в исследуемых пробах других грибов);
- оперативность (получение результатов анализа в течение 1 рабочего дня);
- диагностика инвазии С.parasitica на любых стадиях заболевания растений, в том числе самых ранних, еще при отсутствии внешних признаков поражения;
- возможность применения методики для различных целей (мониторинг рака каштанов в природных популяциях и искусственных насаждениях, подтверждение или дополнение результатов фитопатологической экспертизы, контроль заражения посадочного и прививочного материала, молекулярно-генетическая идентификация культур С.parasitica и др.).
Технический результат достигается тем, что для проведения ПЦР подбираются олигонуклеотидные праймеры, специфичные к области ДНК, характерной для С.parasitica, а при выделении ДНК из образцов растительных тканей используются лизирующие буферы, содержащие в своем составе антиоксиданты.
В соответствии с поставленной задачей нами был разработан способ идентификации С.parasitica по генам Mf1/1 и Mf2/1 (Vir1), Mf2/2 (Vir2), кодирующим белки-предшественники половых феромонов этого гриба [5], - элементам генома, которые должны, с одной стороны, отличаться генетической консервативностью, с другой стороны, содержать уникальные последовательности, не представленные в ДНК других грибов. Способ предусматривает выделение ДНК из образцов биологического материала, проведение с выделенной ДНК полимеразной цепной реакции с использованием пар праймеров MF1-F, MF1-R (фланкируют фрагмент гена Mf1/1 размером 189 пар нуклеотидов) или MF2-F, MF2-R (фланкируют фрагмент генов Mf1/1,2 размером 66 п.н.) и анализ продуктов ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле; наличие на электрофореграмме целевых ампликонов (189 или 66 п.н. соответственно) свидетельствует о присутствии в исследуемом образце С.parasitica. При этом используемые праймеры имеют следующие нуклеотидные последовательности:
MF1-F: 5'-GAAGCCTGGTGTCTCTTCCAC-3',
MF1-R: 5'-GTGGAAGAGACACCAAGCCTC-3',
MF2-F: 5'-ATGCCTTCCAACACCCAGAC-3',
MF2-R: 5'-GACAACGCAGTAGGAGTAGCC-3',
ПЦР проводится в следующем режиме: 1 цикл - 94°С/3 мин; 35 циклов, включающих 94°С/40 сек, 62°С/30 сек, 72°С/20 сек; 1 цикл - 72°С/3 мин.
Апробация данного способа была проведена на микробиологических культурах 26 штаммов С.parasitica и 27 штаммов ряда других микромицетов (Phomopsis castanea, Phomopsis castaneae, Diplodina castaneae, Phyllosticta castaneae, Pestalotiopsis guepinii, Alternaria alternata, Monochaetia concentrica, Colletotrichum gloeosporioides, Aplosporella obscura, Seimatosporium pestalozzioides, Seimatosporium lichenicola, Truncatella angustata, Penicillium spp. и др.), депонированных во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН. Штамм С.parasitica ВКМ F-123 был предоставлен для исследований ВКМ. Все остальные штаммы С.parasitica (ВКМ F-2986, F-3897, F-3901, F-3904, FW-3131 - FW-3151) и других видов грибов были выделены в 2005-2008 годах с образцов тканей посевного каштана (кора, древесина, листья, плоды, фрагменты побегов и корней), собранных в районах его естественного ареала на севере Турции, и, таким образом, представляют собой встречающуюся на каштане микофауну, включая патогенную (9 видов).
Выделяя ДНК микромицетов с помощью лизирующего буфера на основе гуанидинтиоционата и сорбента «диатомовая земля» и используя ее в качестве матрицы для проведения ПЦР, мы убедились, что амплификация с образованием целевых фрагментов протекает только в присутствии ДНК С.parasitica (что справедливо для всех изученных штаммов этого гриба). При использовании препаратов ДНК других грибов ПЦР-продукты не образуются, что позволяет четко проводить молекулярно-генетическую идентификацию С.parasitica.
На всех этапах работы качество выделения ДНК из образцов контролировалось нами с помощью ПЦР, направленной на выявление кодирующей 18S-рибосомальную РНК последовательности (универсальный ДНК-маркер для идентификации генома эукариот). Оказалось, что с использованием лизирующего буфера на основе гуанидинтиоционата удается получать препараты ДНК качества, необходимого для проведения ПЦР, из микробиологических культур грибов и здоровых растительных тканей, но не удается из пораженных (некротических) тканей каштана. Очевидно, что трудности выделения ДНК из некротических тканей связаны со спецификой биологического материала: либо качественному выделению ДНК препятствуют какие-либо органические соединения (смолы и т.д.), образующиеся в тканях растения вследствие взаимодействия паразит-хозяин, либо по тем же причинам в получаемых препаратах ДНК присутствуют ингибиторы ПЦР. Используемая методика была оптимизирована за счет применения в процедурах пробоподготовки лизирующих буферов, включающих в свой состав композиции антиоксидантов, которые препятствуют образованию смол в лизируемой пробе, что позволяет получать препараты ДНК удовлетворительного качества из любых образцов растительных тканей. Полностью сущность технического решения раскрыта в примерах конкретного осуществления способа.
Пример 1. Идентификация Cryphonectria parasitica в микробиологической культуре
1. Отбор проб. С поверхности чашки Петри одноразовьм шпателем отбирали фрагмент питательной среды с мицелием и вносили в пробирку типа Эппендорф (до 1,5 мл) в количестве 100-150 мкл по насыпному объему (5-7 мм от дна пробирки).
2. Выделение ДНК. Пробоподготовку (получение препарата ДНК из анализируемого материала) проводили с использованием набора реагентов для пробоподготовки «SILICA M» (ООО «Компания «Биоком», Москва, РФ), включающего лизирующий буфер ЛБ, суспензию сорбента, отмывочные буферы ОБ1 и ОБ2, буфер ТЕ. В пробирку с исследуемой пробой добавляли 500 мкл ЛБ, гомогенизировали пробу с помощью пестика-гомогенизатора до однородного состояния и инкубировали в течение 40 мин при 65°С на твердотельном термостате ТЕРМО 48 (ООО «Компания «Биоком»). После инкубации пробирку встряхивали на вортексе ТЭТА 2 (ООО «Компания «Биоком») и центрифугировали 10 мин при 10000 об/мин на микроцентрифуге СМ-50 («ELMI», Латвия). Надосадочную жидкость отбирали с помощью автоматической пипетки и переносили в чистую пробирку, добавляли 40 мкл суспензии сорбента, встряхивали на вортексе и оставляли в штативе на 5 мин, в течение которых 2-3 раза осторожно перемешивали содержимое. Пробу центрифугировали 15 сек при 10000 об/мин, после чего удаляли надосадочную жидкость при помощи автоматической пипетки, а к осадку добавляли 500 мкл буфера ОБ1. Пробу встряхивали на вортексе до полного суспендирования осадка, после чего центрифугировали 20 сек при 2000 об/мин, надосадочную жидкость удаляли, а с осадком еще дважды повторяли описанную процедуру отмывки, но используя буфер ОБ2. Пробирку открывали и, поместив в твердотельный термостат, сушили осадок при 65°С примерно 5-7 мин. К высушенному осадку добавляли 75 мкл буфера ТЕ, закрывали пробирку и встряхивали ее на вортексе до полного суспендирования осадка, затем термостатировали при 65°С в течение 10 мин и еще раз встряхивали на вортексе. Пробу центрифугировали 1 мин при 10000 об/мин, надосадочную жидкость переносили в чистую пробирку и использовали затем в качестве пробы ДНК для проведения ПЦР.
3. Амплификация. Для постановки ПЦР использовали «сухой» набор реагентов «PCR-Core» (ООО «Компания «Биоком»). В пробирку «ПЦР-ядро» с сухой смесью реагентов вносили 10 мкл ПЦР-растворителя, 5 мкл водного раствора праймеров, содержащего по 10 пикомоль праймеров MF1-F и MF1-R либо MF2-F и MF2-R, и 5 мкл пробы ДНК. Содержимое пробирки аккуратно перемешивали на вортексе до полного растворения компонентов сухой смеси и наслаивали сверху 30 мкл вазелинового масла. Амплификацию проводили на программируемом термостате (амплификаторе) «Терцик» МС2 (ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Москва, РФ) в следующем режиме: 1 цикл - 94°С/3 мин; 35 циклов, включающих 94°С/40 сек, 62°С/30 сек, 72°С/20 сек; 1 цикл - 72°С/3 мин.
4. Детекция продуктов амплификации. Полученные в ПЦР ампликоны подвергали электрофорезу в 2%-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Электрофорез проводили при 120 В в течение 40 мин. Визуализировали и регистрировали изображение в ультрафиолетовом свете с помощью гель-документирующей видеосистемы Gel Doc 1000 («Bio-Rad», США). В работе использовали маркер молекулярных масс Gene Ruler 100 bp DNA Ladder («Pharmacia», США). Обнаружение в качестве продуктов ПЦР фрагментов, соответствующих 189 или 66 п.н. (при использовании праймеров MF1-F+MF1-R или MF2-F+MF2-R соответственно), свидетельствует о положительном результате анализа (идентификации С.parasitica).
Пример 2. Диагностика крифонекроза каштана
3
Для анализа использовали фрагменты коры с ветвей и стволов больных крифонекрозом каштанов: образцы, взятые по периферии некротических областей с захватом живых тканей, незасохшие ткани луба под слоем отмерших тканей из области «язв», кора по внешней границе раковых поражений. Материал измельчали с помощью пинцета, скальпеля, ножниц и вносили одноразовьми шпателями в пробирки типа Эппендорф (до 1,5 мл) в количестве 100-150 мкл по насыпному объему (5-7 мм от дна пробирки). Инструменты для измельчения растительных тканей использовали однократно либо тщательно мыли при переходе от пробы к пробе для исключения возможности перекрестной контаминации. В пробирку с исследуемой пробой добавляли 300 мкл одного из следующих буферов: 1) 2,7% СТАВ, 18 mM EDTA, 1,3 М NaCl, 0,9% PVP, 0,9% Tween-20, 182 mM sorbitol; 2) 2,7% СТАВ, 18 mM EDTA, 1,3 М NaCl, 0,9% PVP, 0,9% Tween-20, 1,4% PEG; 3) 2,7% СТАВ, 18 mM EDTA, 1,3 М NaCl, 0,9% PVP, 0,9% Tween-20, 273 мМ sucrose, 182 мМ mannose; 4) 2% СТАВ, 20 mM EDTA, 1,4 М NaCl, 0,1% NaHSO, 10 mM Tris-HCl, pH 8. Пробу гомогенизировали с помощью пестика-гомогенизатора до однородного состояния, после чего добавляли к ней 300 мкл ЛБ, тщательно перемешивали с помощью пестика-гомогенизатора и инкубировали в течение 40 мин при 65°С. Все последующие процедуры выделения ДНК, постановки ПЦР и детекции продуктов амплификации аналогичны приведенным в Примере 1. Наличие в пробе ПЦР-фрагментов, соответствующих 189 или 66 п.н. (при использовании праймеров MF1-F+MF1-R или MF2-F+MF2-R соответственно), свидетельствует о присутствии в исследуемом образце растительных тканей С.parasitica. При этом в качестве положительного контроля при постановке ПЦР и последующем электрофоретическом анализе ее продуктов можно использовать препарат ДНК, полученный из микробиологической культуры С.parasitica.
Литература
1. Diagnostic protocol of Cryphonectria parasitica // Bull. of European and Mediterranean Plant Protection Organization. 2004 (5). P.295-298.
2. Рекомендации по сохранению и восстановлению каштановых лесов / Чернышев М.П., Придня М.В. // Сочи: ФГУ «НИИгорлесэкол», 2004. 46 с.
3. Хохряков М.К., Доброзракова Т.Л., Степанов К.М., Летова М.Ф. Определитель болезней растений. СПб.: Лань, 2003.
4. Методы экспериментальной микологии /под ред. Билай В.И. // Киев: Наукова думка, 1982. 550 с.
5. Zhang L, Baasiri RA, van Alfen NK // Mol. Cell. Biol. 1998. Vol 18. №2. P.953-958.