Геропротекторная кормовая добавка
GEROPROTECTIVE FEED ADDITIVE

Изобретение относится к пищевым композициям для предотвращения возрасзависимых заболеваний и увеличения здорового периода продолжительности жизни непродуктивных и сельскохозяйственных животных с помощью диетических композиций, содержащих биологически активные вещества, способных эффективно влиять на компоненты ключевых сигнальных путей старения, маркеры-источники оксидативного стресса, маркеры апоптоза и инсулинорезистентности. Геропротекторная кормовая добавка может быть добавлена к основному рациону непродуктивных и сельскохозяйственных животных без его качественных изменений.
Известен способ, включающий кормление животного-компаньона эффективным количеством композиции, содержащей, по меньшей мере, одну омега-3 полиненасыщенную жирную кислоту и различные комбинации аминокислот, минералов и антиоксидантов в количествах, эффективных для усиления активности, повышения жизнеспособности, защиты хрящей, поддержания мышечной массы, усиления усваиваемости и улучшения качества кожи и шерсти в расчете на массу сухого вещества (RU 2 525 617 C2, 2014.08.20)
Известна композиция, представляющая собой питательно полноценный рацион, содержащий источник белка, источник углеводов, овощной источник и фруктовый источник. Источник белка представляет собой комбинацию курятины, яичного белка в количестве, составляющем от 4% до 15% в пересчете на полную массу композиции в сухом состоянии, и кукурузной глютеновой муки. Источник углеводов представляет собой комбинацию проса, пивоваренной рисовой крупки и овсяной крупы. Овощной источник представляет собой комбинацию моркови, шпината и томатных выжимок. Фруктовым источником является цитрусовая пульпа (патент RU 2611160, 21.02.2017).
Известна композиция, представляющая собой белковый гидролизат, полученный путем кислотного гидролиза и последующей нейтрализации пептидосодержащего животного сырья, выбранного из ряда: туши животных или рыб, альбумин, кровь животных или рыб, мясо животных или рыб, протеиносодержащие отходы при производстве продукции из животных или рыб, фильтрации с получением гидролизата и осадка, с последующей сушкой гидролизата, при этом готовый продукт содержит пептиды с молекулярной массой выше 3000 дальтон не более 25 мас. %, оптическая активность α20D готового продукта составляет 5-15, соотношение азота аминного : жирных кислот : углеводов составляет (10-30):(0,2-2): (0,4-5), а также содержит натрий, хром, никель, кобальт, селен, кальций, калий, серу, фосфор, хлор, железо, цинк, медь, марганец. (патент RU 2 221456, 20.01.2004)
Известна кормовая композиция, включающая следующие категории ингредиентов: антиоксиданты; агенты, предотвращающие гликирование; агенты, уменьшающие вес тела или жира; агенты, способствующие высокой чувствительности к инсулину или низким уровням инсулина или глюкозы в крови и противовоспалительные агенты (RU 2449554 C2, 10.05.2012. CN 101298563 A, 05.11.2008.).
Известны геропротекторные кормовые добавки. Например, по заявке US2019350899 - содержащая ресвератрол, генистеин, эллаговую кислоту, куркумин и кверцетин, по заявке CN104543405 - содержащая растительные экстракты артишока, розмарина, тагете, экстракт куркумы, экстракт цитрусовых, предпочтительно грейпфрута, крапивы, чеснока, винограда, расторопши, андрографиса, зеленого чая и помидоров.
Известна геропротекторная кормовая добавка, включающее в себя никотинамида рибозид, экстракт косточек белого грейпфрута, содержащий спермидин, экстракт фукуса пузырчатого, содержащий фукоксантин (по патенту RU 2738644, выбран в качестве прототипа).
Недостатком известных добавок является недостаточная эффективность, связанная с отсутствием комплексного действия, направленного на регуляцию ключевых сигнальных путей долголетия и старения, включая белки сиртуины, а также одновременное влияние на маркеры оксидативного стресса, инсулинорезистентности и апоптоза.
Таким образом, несмотря на существующие изобретения, в данной области техники существует потребность в дополнительных композициях для коррекции сигнальных путей и маркеров, ассоциированных со старением организма животных.
Технической задачей изобретения является создание кормовой композиции, содержащей различные геропротекторы, включающие источники ресвератрола, куркумина и эпигаллокатехина галлата, нарингенина и силимарина, которые в определенных комбинациях способны влиять на компоненты ключевых сигнальных путей старения, маркеры-источники оксидативного стресса, а также маркеры апоптоза и чувствительности к инсулину. Техническим результатом является повышение эффективности геропротекторной кормовой добавки за счет комплексного действия.
Технический результат достигается в геропротекторной кормовой добавке, содержащей смесь веществ, взятых при следующем соотношении массовых частей: ресвератрол - от 1 до 20 частей; куркумин - от 4 до 40 частей; эпигаллокатехин галлат - от 10 до 40 частей; силимарин - от 2 до 40 частей; нарингенин - от 2 до 40 частей.
Изобретение поясняется рисунками:
Фиг. 1. Относительное количество белка SIRT1 в камбаловидной мышце крыс, которые получали диету с добавлением различных комбинаций геропротекторов (I - ресвератрол и экстракт куркумы (куркуминоиды 95%); II - экстракт зеленого чая (95% полифенолов, 60% катехинов, 30% эпигалокатехингаллат), экстракт косточек грейпфрута (источник нарингенина) и экстракт расторопши (силимарин 80%)) и их комбинации (III) в сравнении с контрольной группой (Контроль). * - достоверные различия по отношению к контрольной группе (P<0,05).
Фиг. 2. Интенсивность свечения (флуоресценция) маркера-источника оксидативного стресса NOX2 в камбаловидной мышце крыс, которые получали диету с добавлением различных комбинаций геропротекторов (I - ресвератрол и экстракт куркумы (куркуминоиды 95%); II - экстракт зеленого чая (95% полифенолов, 60% катехинов, 30% эпигалокатехингаллат), экстракт косточек грейпфрута (источник нарингенина) и экстракт расторопши (силимарин 80%)) и их комбинации (III) в сравнении с контрольной группой (Контроль). * - достоверные различия по отношению к контрольной группе (P<0,05).
Фиг. 3. Интенсивность свечения (флуоресценция) глюкозного транспортера GLUT4 в камбаловидной мышце крыс, которые получали диету с добавлением различных комбинаций геропротекторов (I - ресвератрол и экстракт куркумы (куркуминоиды 95%); II- экстракт зеленого чая (95% полифенолов, 60% катехинов, 30% эпигалокатехингаллат), экстракт косточек грейпфрута (источник нарингенина) и экстракт расторопши (силимарин 80%)) и их комбинации (III) в сравнении с контрольной группой (Контроль). * - достоверные различия по отношению к контрольной группе (P<0,05).
Фиг. 4. Интенсивность свечения (флуоресценция) проапоптотического фактора Bax в камбаловидной мышце крыс, которые получали диету с добавлением различных комбинаций геропротекторов (I - ресвератрол и экстракт куркумы (куркуминоиды 95%); II- экстракт зеленого чая (95% полифенолов, 60% катехинов, 30% эпигалокатехингаллат), экстракт косточек грейпфрута (источник нарингенина) и экстракт расторопши (силимарин 80%)) и их комбинации (III) в сравнении с контрольной группой (Контроль). * - достоверные различия по отношению к контрольной группе (P<0,05).
Фиг. 5. Интенсивность свечения (флуоресценция) антиапоптотического фактора Bcl-2 в камбаловидной мышце крыс, которые получали диету с добавлением различных комбинаций геропротекторов (I - ресвератрол и экстракт куркумы (куркуминоиды 95%); II- экстракт зеленого чая (95% полифенолов, 60% катехинов, 30% эпигалокатехингаллат), экстракт косточек грейпфрута (источник нарингенина) и экстракт расторопши (силимарин 80%)) и их комбинации (III) в сравнении с контрольной группой (Контроль). * - достоверные различия по отношению к контрольной группе (P<0,05).
Фиг. 6. Соотношение проапоптотического фактора Bax и антиапоптотического фактора Bcl-2 в камбаловидной мышце крыс, которые получали диету с добавлением различных комбинаций геропротекторов (I - ресвератрол и экстракт куркумы (куркуминоиды 95%); II- экстракт зеленого чая (95% полифенолов, 60% катехинов, 30% эпигалокатехингаллат), экстракт косточек грейпфрута (источник нарингенина) и экстракт расторопши (силимарин 80%)) и их комбинации (III) в сравнении с контрольной группой (Контроль). * - достоверные различия по отношению к контрольной группе (P<0,05).
Знаком (*) на рисунках показаны достоверные различия по отношению к контрольной группе (P<0,05). Значения представлены в условных единицах (у.е.).
Старение включает структурные изменения на различных уровнях организации живого организма: системном, органном, тканевом, клеточном и молекулярном. Общие признаки старения в первую очередь проявляются на молекулярном уровне, а также характеризуются изменением внутриклеточной и межклеточной сигнализации. В соответствии с этим при воздействии на возраст-ассоциированные мишени ранние изменения также будут заметны в первую очередь на молекулярном уровне и в регуляции сигнальных путей (Прошкина и соавт., 2020). Одними из ключевых компонентов сигнальных путей, считающихся в настоящее время маркерами долголетия, является семейство НАД-зависимых белков - сиртуинов (SIRT1-7), среди которых наиболее изучен SIRT1 (M. Yu et al., 2021). Роль сиртуина в подавлении клеточного старения может быть опосредована задержкой возрастного укорочения теломер, поддержанием целостности генома, а также участием в репарации повреждений ДНК. Вдобавок SIRT1 может улучшить способность индуцировать остановку клеточного цикла, биогенез митохондрий и устойчивость к окислительному стрессу, ингибируя гибель клеток и пути запрограммированной клеточной смерти - апоптоза. Возрастные особенности также включают изменения соотношения сигнальных молекул, участвующих в активации апоптотических путей, например, Bax, и противодействующих апоптозу - Bcl-2: с возрастом соотношение Bax/Bcl-2 увеличивается (E.Khodapasand et al., 2015; L. Chung et al., 2006). С другой стороны, согласно свободнорадикальной (оксидативной) теории старения с возрастом происходит накопление окисленных макромолекул и усиление оксидативного стресса, вследствие чего клетки теряют возможность нормального функционирования (M.T.Lin etal., 2003). Одним из критических источников оксидативного стресса в клетках при старении являются различные изоформы ферментов НАДФН-оксидаз (NOX), в частности многие исследователи указывают на ведущую роль изоформы NOX2 (L. Park et al., 2007; L.Geng et al., 2020; L.M. Fan et al., 2017; M.J.Sullivan-Gunn et al., 2013). В дополнение, возраст-ассоциированные изменения могут сопровождаться нарушением чувствительности тканей к инсулину, что может привести к развитию сахарного диабета второго типа. Одним из маркеров чувствительности тканей к инсулину является глюкозный транспортер GLUT4, содержание которого может быть снижено в инсулинзависимых тканях организма с увеличением возраста (J.A.Houmard et al., 1995; J.M.dos Santos et al., 2012).
Геропротекторная кормовая добавка по настоящему изобретению содержит смесь веществ, взятых при следующем соотношении массовых частей.
Ресвератрол - от 1 до 20 массовых частей (иначе, 50-1000 мг на кг диеты). В качестве источника ресвератрола может быть использован экстракт горца гребенчатого (Polygonumcuspidatum).
Куркумин - от 4 до 40 массовых частей (иначе, 200-2000 мг на кг диеты). В качестве источника куркумина и куркуминоидов может быть использован экстракт куркумы (Curcumalonga).
Эпигаллокатехин галлат - от 10 до 40 массовых частей (иначе, 500-2000 мг на кг диеты). В качестве источника эпигалокатехина галлата может быть использован экстракт зеленого чая.
Силимарин - от 2 до 40 массовых частей (иначе, 100-2000 мг на кг диеты). В качестве источника силимарина может быть использован экстракт расторопши (Silybummarianum).
Нарингенин - от 2 до 40 массовых частей (иначе, 100-2000 мг на кг диеты). В качестве источника нарингенина может быть использован экстракт семян грейпфрута (Citrusparadissi).
Добавление концентраций ниже указанного минимального предела не обеспечивает геропротекторный эффект на организм животного. Использование концентраций выше указанных максимальных значений снижает вкусовую привлекательность продукта и, как следствие, снижает объемы потребления продукта животными, либо приводит к неблагоприятным последствиям, связанным с отказом от еды. Концентрация может быть подобрана индивидуально для каждого вида животного с использованием формул и коэффициентов межвидового переноса доз.
Далее приведены характеристики каждого компонента геропротекторных добавок.
Ресвератрол - это растительный полифенол, который содержится в различных растениях, включая кожуру винограда, ягоды, птичий горец, арахис и др. Ресвератрол может влиять на различные внутриклеточные мишени, связанные с увеличением продолжительности жизни, главной из которых является гистондеацитилаза SIRT1. Было показано, что ресвератрол продлевает продолжительность жизни за счет значительного повышения активности SIRT1 (M. Lagouge etal., 2006; K.T.Howitz etal., 2003). В то же время многие исследования сообщают о влиянии ресвератрола на несколько видов биологической активности, такие как антиоксидантная, противовоспалительная, противоопухолевое, антидиабетическое, нейропротекторное и антиагрегантное действие, защита сердечно-сосудистой системы (Dan-Dan Zhou etal., 2021).
Куркумин - основной куркуминоид, входящий в состав корня растения куркумы (Curcumalonga). Роль куркумина в замедлении старения также была рассмотрена во множестве исследований (A. Bielak-Zmijewskaetal., 2019; E. Sikoraetal., 2010). В корне куркумы содержание куркумина составляет не более 3,14% (R.F. Tayyem 2006), поэтому для достижения целевого эффекта желательно использовать экстракты куркумы, где общее содержание куркуминоидов может составлять более 90%. Добавление куркумина в рацион увеличивало продолжительность жизни модельных животных (V.H. Liao etal., 2011; K.S. Lee etal., 2011; L.R.Shen etal., 2013). Куркумин имеет множетство молекулярных мишеней в клетке, включая регуляцию ключевых путей старения (сиртуины, АМФ-активируемая протеинкиназа (AMPK)), противоопухолевой активности (A.Bielak-Zmijewska etal., 2010), противовоспалительных и проапоптотических механизмов (Y. Heetal., 2015; S.Aggarwaletal., 2006), оказывать актиоксидантное действие (V.P. Menonetal., 2007) и другие эффекты.
Эпигаллокатекхин галлат (EGCG) - это катехин, который в большом количестве содержится в зеленом чае. EGCG показал геропротекторное действие на ряде модельных организмов, включая млекопитающих (S. Abbasetal., 2009; M.K. Brownetal., 2006; A.E. Wagneretal., 2015). Так, показано, что EGCG увеличивал продолжительность жизни крыс на 8-12 недель (Y. Niuetal., 2013). EGCG способен оказывать антиоксидатное действие (S. Beyazetal., 2021), участвует в регуляции сигнальных путей AMPK, SIRT1 и Foxo (S. Pournourmohammadi etal., 2017; Li-Gui Xiong etal., 2017), связанных с увеличением продолжительности жизни и резистентностью к стрессу. Добавка EGCG способствовала транслокации глюкозного транспортера GLUT4 в скелетных мышцах, улучшая транспорт глюкозы (M.Ueda etal., 2008). Также было показано, что EGCG улучшает течение и прогноз заболеваний на животных моделях рака (Kyoung-jinMinetal., 2014), нейродегенерации (N.A. Singhetal., 2016) и метаболического синдрома (Li-GuiXiongetal., 2018).
Нарингенин - природный флавоноид, содержащийся в цитрусовых, в особенности в грейпфруте, и в томатах. Наиболее высокие уровни нарингенина были найдены в молодых тканях грейпфрута, включая его косточки (P.S.Jourdan etal., 1985). Нарингенин также является потенциальным геропротектором, определенные концентрации нарингенина способны увеличивать продолжительность жизни модельных животных (D. Chattopadhyay etal., 2016). Нарингенин способен оказывать протекторный эффект на функцию сердца у мышей за счет активации SIRT1, а также снижения провоспалительных цитокинов (L.Testaietal., 2020). В исследовании на модели стареющих мышей нарингенин улучшал поведенческую функцию и снижал неврологический дефицит, повышая уровень антиоксидантных ферментов и препятствуя окислительному стрессу (Y.Zhangetal., 2017). В другом исследовании нарингенин снижал уровень воспалительных цитокинов и маркеры окислительного стресса в коже мышей после ультрафиолетового облучения (R.M. Martinez etal., 2015).
Силимарин - это производное флаванона, получаемое из семян расторопши (Silybummarianum). Он широко применяется для лечения заболеваний печени в клинической практике ( 2014). Силимарин в исследованиях на модельных животных увеличивал среднюю продолжительность жизни до 24,8% по сравнению с контролем (J. Kumar etal., 2015). Силимарин может увеличивать SIRT1, а также демонстрирует антиапоптотическое действие (L-H Li etal., 2007). Также было показано, что силимарин может активировать фермент теломеразу, тем самым способствуя задержке укорочения теломер в нормальных тканях (A. Parzonkoetal., 2010). В опухолевых клетках силимарин, напротив, снижал активность теломеразы (Z. Faezizadeh etal., 2012; E. Yurtcu etal., 2015). Кроме гепатопротекторного действия силимарин обладает нейропротекторным потенциалом (A.Borahetal., 2013), антиканцерогенным действием (Sung-HyunKimetal., 2019), способен влиять на углеводный обмен и предотвращать нарушение толерантности глюкозы (C.Sotoetal., 2010).
Используемые в композициях биоактивные соединения широко изучены по отдельности и подробно описаны в книге «Потенциальные геропротекторы» (Москалев А.А. и др., 2016). Однако попытки комбинировать более трех веществ из перечисленного списка на данный момент не предпринималось. Данные вещества в комбинации обладают синергическим эффектом, влияя на различные маркеры, ассоциированные со старением.
Предлагаемая геропротекторная композиция может применяться как пищевая добавка к ежедневному рациону, лакомству, угощению, в составе питьевой воды или отдельно в виде таблетированных или инкапсулированных форм, как для непродуктивных животных (например, кошки, собаки, грызуны, декоративные птицы), так и для сельскохозяйственных животных (например, овцы, коровы, свиньи, козы, птицы). Геропротекторная кормовая добавка может быть использована с у животных, достигших половой зрелости, включая как молодых, так и пожилых животных. Ее изготовление заключается в простом смешивании компонентов.
Пример осуществления изобретения.
Эксперименты проведены на пожилых крысах Вистар в возрасте (25-30 мес.). Исследования осуществляли с соблюдением требований, предъявляемых к работе с экспериментальными животными, изложенными в Приказе Минздравсоцразвития от 23.08.2010 № 708 «Об утверждении Правил лабораторной практики». Животные были случайным образом поделены на 4 группы (n=6 в каждой группе). Контрольная группа (Контроль) получала стандартный ежедневный рацион. Группа I и группа II получала стандартный ежедневный рацион с добавлением следующих концентраций потенциальных геропротекторов:
Группа
Потенциальный геропротектор
Количество, мг/кг диеты
I
Ресвератрол
120
Экстракт куркумы (куркуминоиды 95%)
250
II
Экстракт зеленого чая (полифенолы 95%, катехины 60%, эпигалокатехин галлат 30%)
1000
Экстракт косточек грейпфрута
500
Экстракт расторопши (силимарин 80%)
500
Группа III получала стандартный ежедневный рацион, дополненный комбинацией добавок, которые получали группы I и II. По истечение 30 суток кормления животных выводили из эксперимента и изучали количественное содержание маркеров SIRT1, NOX2, GLUT4 Bax, Bcl-2 в скелетных мышцах крыс с помощью методов иммуногистохимии и Вестерн-блоттинга с антителами против соответствующих белков. Скелетные мышцы были выбраны в качестве экспериментальной модели как вид ткани, который является одним из наиболее чувствительных к старению и характеризуется развитием возрастной саркопении (J.Etienne etal., 2020). Статистическая обработка была проведена с помощью метода Краскела-Уоллиса, статистические различия считались достоверными при уровне значимости P<0,05.
На фиг.1 показаны различия в уровне белка SIRT1 в контрольной и экспериментальной группах. Композиции I и II демонстрируют тенденцию к увеличению уровня SIRT1, однако достоверные различия были найдены только в группе III по отношению к животным контрольной группы, что отражает аддитивный (синергический) эффект компонентов данной композиции. Учитывая вышеописанную роль SIRT1 как ключевого компонента сигнальных путей старения и долголетия, можно заключить, что комбинация RCGGS обладает наибольшим геропротекторным эффектом.
Фиг. 2 показывает влияние диетических комбинаций на маркер оксидативного стресса NOX2. Обнаружено, что комбинация III показывает наибольший эффект отрицательной регуляции экспрессии NOX2 по сравнению с контрольной группой возрастных крыс, имеющих более высокий уровень данного прооксидантного белка. Полученные изменения могут свидетельствовать о протекторном эффекте комбинации RCGGS в отношении оксидативного стресса. Отдельные композиции I и II не показали достоверного эффекта.
На фиг. 3 продемонстрированы уровни маркера чувствительности к инсулину - глюкозного транспортера GLUT4 в контрольной группе и группах с разными наборами геропротекторных добавок. Наиболее низкие уровни флуоресценции GLUT4 на поперечных срезах мышц были найдены в контрольной группе животных. В группах с геропротекторными композициями (I, II и III) отмечено повышение интенсивности флуоресценции GLUT4, что может говорить о положительном влиянии диетических добавок на чувствительность ткани к инсулину. Достоверных различий в группах с добавлением геропротекторных композиций найдено не было.
Фиг. 4, 5 и 6 показывают влияние геропротекторных комбинаций на факторы регуляции апоптоза: проапоптотический фактор Bax, антиапоптотический фактор Bcl-2. Все комбинации демонстрируют влияние на исследуемые регуляторы, наиболее значимым в данном случае является влияние на соотношение Bax/Bcl-2. Эффект значимого уменьшения соотношения Bax/Bcl-2 по сравнению с контрольной группой был найден во всех группах с геропротекторными композициями, что может свидетельствовать о протекторном эффекте на апоптоз и увеличении жизнеспособности тканей в целом.