Некоторые показатели иммунной системы при экспериментальной гипергомоцистеинемии

ИММУНОПАТОЛОГИЯ

© коллектив авторов, 2015

удк 616.153.478.6-008.61-092:612.017.1]-078.33-092.9

Фефелова Е.В., Терешков П.П., Дутов А.А., Цыбиков Н.Н.

некоторые показатели иммунной системы при экспериментальной гипергомоцистеинемии

ГБОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия, 672090, Чита, Россия

Изучали влияние гомоцистеина на показатели иммунной системы в эксперименте. Обнаружено, что пороговая гипергомоцистеинемия сопровождается относительным и абсолютным снижением числа лимфоцитов, за счет популяции Т-лимфоцитов. При умеренной гипергомоцистеинемии количество лимфоцитов, наоборот, резко возрастает, что отображает развитие компенсаторных и воспалительных реакций организма. Динамика количества субпопуляций Т-лимфоцитов в разных группах носят разнонаправленный характер. Наблюдалось увеличение концентраций TNFa, INFy, IL 17a во всех опытных группах, максимальные значения достигнуты при четырехкратном введении гомоцистеина в сутки.

Ключевые слова: экспериментальная гипергомоцистеинемия; лимфоциты; субпопуляции лимфоцитов; ци-токины.

Для цитирования: Иммунология. 2015; 36 (5): 280-283.

Fefelova E.V., Tereshkov P.P., Dutov A. A., Tsybikov N.N.

SOME IMMUNE SYSTEM INDICES IN EXPERIMENTAL HYPERHOMOCYSTEINEMIA

Chita State Medical Academy, Chita, Russia

Homocysteine influence on the immune system indices has been studied experimentally. Liminal hyperhomocysteinemia has been detected to be accompanied by absolute and relative decrease of lymphocyte number due to T-lymphocyte population. Moderate hyperhomocysteinemia was on the contrary characterized by sharp increase lymphocyte number which testified to the development of compensatory and inflammatory reactions of the body. The dynamics of the T- lymphocyte subpopulation number in groups under study at the same time proved to be of different character. Increased TNFa, INFy, IL 17a concentrations were registered in all experimental groups, maximal levels being marked in case of homocysteine quadruplicate administration per day.

Keywords: experimental hyperhomocysteinemia; lymphocytes; lymphocytes populations; cytokines.

citation: Immunologiya. 2015; 36 (5): 280-283.

введение. Накапливающиеся в современной литературе данные демонстрируют, что атеросклероз является иммуно-логически опосредованной болезнью [1, 2]. Одним из основных факторов риска развития атеросклероза является повышенный уровень гомоцистеина [3, 4]. Гомоцистеин (ГЦ) - это аминотиол, образующийся в ходе взаимопревращений ме-тионина и цистеина. Он обнаруживается в крови преимущественно в комплексе с цистеином белков, а также в виде продуктов его спонтанного окисления. Содержание общего ГЦ в крови грызунов и человека не превышает 10 мкмоль/л [3]. Влияние же гипергомоцистеинемии на функционирование иммунной системы практически не описано. В предыдущих исследованиях нами показано увеличение уровня аутоанти-тел к альбумину, модифицированному гомоцистеином [5]. В то же время показана способность гомоцистеина связываться с глутаматными рецепторами, имеющимся на мембранах нейронов и ряда других клеток - мегакариоцитах, тромбоцитах, эритроцитах, лимфоцитах, нейтрофилах, миокардио-цитах, вызывая их гиперактивацию и развитие целого ряда токсических эффектов [6-8]. Однако данные исследования проведены только in vitro. Результаты исследований влияния гипергомоцистеинемии на лимфоциты in vivo отсутствуют,

Для корреспонденции: Фефелова Елена викторовна, fefelova . elena@mail. ru

For correspondence: Fefelova Elena Viktorovna, fefelova.el-ena@mail.ru

поэтому целью нашей работы явилось изучение изменений в функционировании иммунной системы при экспериментальной гипергомоцистеинемии.

Материал и методы

Моделирование экзогенной гипергомоцистеинемии

В эксперименте использовали 41 белую беспородную крысу - самцы средней массой 150 г, одного возраста. Всех животных разделили на 4 группы. Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г).

Животные содержались в помещении вивария и получали при свободном доступе к воде стандартную диету (экструди-рованный комбикорм ПК-120-1).

Повышенный уровень гомоцистеина в крови экспериментальных животных создавали разными способами:

1) внутрибрюшинным введением гомоцистеина в дозе 0,1 мкмоль на 1 г веса животного, однократно. Забор крови производили через 6 часов после введения гомоцистеина [5];

2) один раз в сутки в той же дозе в течение 7 дней [9];

3) 4 раза в сутки в той же дозе (каждые 6 часов) в течение 7 дней. Предварительно нами проведен эксперимент по определению периода полувыведения гомоцистеина из организма животного. У опытных животных (п = 10) забирали кровь для предварительного определения исходного уровня гомоци-стеина, затем внутрибрюшинно вводили гомоцистеин в дозе

Таблица 1

Содержание гомоцистеина сыворотки крови опытных животных, мкмоль/л,

Исходный Забор крови, мин

уровень 30 60 90 120 150 180

7,9 [6,7; 10,7] 98,5 [74,3; 122,8] 190,0 [188,5; 191,5] 115,5 [100,3; 130,8] 68,0 [61,0; 75,0] 46,0 [42,0; 50,0] 45,0 [41,5; 48,5]

0,1 мкмоль на 1 г веса животного, последующие заборы крови производили каждые 30 мин. Полученные данные приведены в табл. 1.

Затем, используя однокамерную фармакокинетическую модель [10], рассчитывали, что для обеспечения умеренной гипергомоцистеинемии необходимо вводить его каждые 6 ч. Забор крови во всех исследуемых группах осуществляли через 6 ч после последней инъекции. Крысам контрольной группы внутрибрюшинно вводили физиологический раствор. Животных из эксперимента выводили путем передозировки эфирного наркоза.

Определение концентрации гомоцистеина Концентрацию гомоцистеина в сыворотке крови определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовой детекцией при 330 нм (колонка Chromolith 100x4,6 мм, элюент ацетонитрил/0,05 М лимонная кислота в соотношении 10/90) [11].

Определение некоторых параметров иммунной системы Оценку субпопуляционной структуры лимфоцитов осуществляли стандартным методом прямого трехпараметриче-ского иммунофлюоресцентного окрашивания цельной крови с использованием коммерческого лизирующего/фиксирую-щего раствора VERSALYSE/IOTest 3 (Beckman Coulter) и панели моноклональных антител IOTest (Beckman Coulter): 1-я панель - CD3-FITC/CD4-PC7/CD8-APC; 2-я панель - CD3-FITC/CD45RA-PC7/CD161a-APC. Контрольные пробы инкубировали с иммуноглобулинами, меченными флуорохрома-ми (FITC, PC7, APC) соответствующего изотипа,- мышиные IgG1, IgM IOTest (Beckman Coulter). Цитофлуориметрию осуществляли на проточном цитофлуориметре "Cytomics FC-500" (Beckman Coulter, USA), при этом регистрировали суммарно не менее 10 000 событий. Данные анализировали с помощью программы CXP Cytometer (Beckman Coulter).

Для получения мононуклеарной фракции клеток, кровь крысы фракционировали в 63%-ном растворе Перколла (GE Healthcare), центрифугируя при 400g в течение 30 мин. Фракцию собирали и отмывали от Перколла в растворе PBS рН 7,4. Клетки считали на проточном цитофлуориметре "Cytomics FC-500" (Beckman Coulter, USA), используя 1-ю панель моноклональных антител IOTest (Beckman Coulter) для крысы. Чистота мононуклеаров, полученных на градиенте плотности, составляла 96-98%.

Исследование концентрации ци-токинов IFNg, TNFa, IL-17A в плазме крови крыс проводили с помощью системы мультиплексного анализа FlowCytomix 5 plex (BMS826FF) в комбинации с Simplex Kit (BMS8635FF) соответствующих аналитов для крыс компании "Bender Medsystems" (Австрия). Полученные пробы анализировали на проточном цитофлуориметре Cytomics FC 500 ("Beckman Coulter", США). Обработку цитометрических файлов осуществляли в программном обеспечении FlowCytomixPro 3.0 ("Bender Medsystems", Австрия). Статистический анализ Статистический анализ полученных данных проводили с помощью программы Statistica 6.1 (StatSoft). Описательная статистика представлена медианой и межквартильным

интервалом (25-го, 75-го перцентилей); сравнение зависимых выборок проводили с помощью критерия Вилкоксона; сравнение независимых выборок проводили с помощью и-критерия Манна-Уитни. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали р < 0,05.

Результаты и обсуждение

Через 6 ч после однократного введения гомоцистеина уровень этого аминотиола в плазме крови возрос практически в 2 раза (р = 0,0117), у животных 2-й опытной группы его концентрация увеличилась в 2,7 раза (р = 0,0499), а в 3-й опытной группе - в 7,2 раза (р = 0,00001) по сравнению с интактными животными. При этом уровень гомоцистеина внутри клеток не изменялся ни в одной из исследуемых групп (табл. 2).

Общее количество лимфоцитов у животных 1-й опытной группы уменьшилось в 3 раза (р = 0,0117) за счет снижения в большей степени Т-цитотоксических лимфоцитов практически в 6 раз (р = 0,0117) по сравнению с контролем. Количество Т-хелперов также уменьшилось, но лишь в 1,5 раза (р = 0,025). Во 2-й опытной группе общее количество лимфоцитов не изменилось, но при этом наблюдалось увеличение уровня Т-цитотоксических лимфоцитов в 1,2 раза (р = 0,012) и снижение количества натуральных киллеров в 1,4 и 2,6 раза по сравнению с 1-й и 3-й опытными группами (р = 0,012 и 0,003 соответственно). В 3-й опытной группе резко увеличилось абсолютное количество всех лимфоцитов за счет Т-лимфоцитов по сравнению со всеми исследуемыми группами животных. Соотношение Т-хелперы/Т-цитотоксические при этом было в 2 раза меньше, чем в контрольной, и в 6,3 раза по сравнению с 1-й опытной группой, но не отличалось от второй опытной группы.

Процентное содержание В-лимфоцитов и натуральных киллеров во всех группах значительно варьировало, при этом количественные показатели не отличались от таковых у животных контрольной группы (табл. 3).

На следующем этапе исследования нами определены уровни цитокинов, характеризующих функцию Т-лимфоцитов: ТОТа, ЮТу, ГЬ-17А. Максимальные значения всех изучаемых цитокинов наблюдались в 3-й опытной группе. Причем наиболее выраженное повышение концентрации наблюдалось у ТОТа. Так, в 1-й опытной

Таблица 2

Уровень гомоцистеина в плазме и мононуклеарах крови

Группа

Показатель контрольная 1-я опытная 2-я опытная 3-я опытная

n = 9 n = 13 n = 10 n = 9

Гомоцистеин 4,6 [4,25; 5,! в плазме крови, мкмоль/л

8,96 [8,75; 10,64] р1 = 0,0117*

Гомоцистеин в мононуклеарах, нмоль/1 клетку

0,02 [0,00; 0,17] 0,02 [0,00; 0,19] 0,01 [0,00; 0,10]

12,86 [12,56; 20,24] 33,10 [23,88; 35,56]

р1 = 0,00001 р2 = 0,00045 р3 = 0,00591 0,03 [0,00; 0,60]

р1 = 0,0499 р2 = 0,0466

Примечание. Здесь и на рис. 3, 4: р1 - уровень статистической значимости различий по сравнению с контрольной группой, р2 - ур овень статистической значимости различий по сравнению с первой экспериментальной группой, р3 - уровень статистической значимости различий по сравнению со второй экспериментальной группой.

Таблица 3

Изменение в иммунограмме крыс при экспериментальной гипергомоцистеинемии

Показатель Группа

контрольная 1-я опытная 2-я опытная 3-я опытная

п = 9 п = 13 п = 10 п = 9

Лимфоциты, абс. в 1 мкл 8210,0 [4760; 8704] 4342,0 [3166,0; 6370,0] 7679,0 [7024,0; 8606,0] 14884,0 [13 744,0; 20 096,0]

крови р1 = 0,036 р1 = 0,888 р1 = 0,012

р2 = 0,0011 р2 = 0,0002

р3 = 0,0024

Т-лимфоциты (CD3±), абс. 5404,0 [3208,0; 5884,0] 1750,0 [1346,0; 2514,0] 5510,0 [5464,0; 6198,0] 11 944,0 38142,0; 13 977,0]

в 1 мкл крови р1 = 0,0117 р1 = 0,674 р1 = 0,012

р2 = 0,000017 р2 = 0,000035

р3 = 0,0059

Т-хелперы ^3±, CD4±), 1801,5 [1095,0; 2223,0] 1171,0 [960,0; 1484,0] 1366,0 [974,0; 2207,0] 2804,0 [2354,0; 3009]

абс. в 1 мкл крови р1 = 0,025 р1 = 0,123 р1 = 0,012

р2 = 0,0016 рг = 0,604

р3 = 0,0091

Т-цитотоксические (CD3+, 3497,0 [1751,0; 3724,0] 590,0[496,0; 1065] 4509,0 [3751,0; 5058,0] 11 526,0 35825,0; 12 573,0]

CD8+), абс. в 1 мкл крови р1 = 0,0117 р1 = 0,012р1 = 0,012

р2 = 0,00002 р2 = 0,000001

р3 = 0,007

Т-хелперы/Т- 0,6 [0,5; 0,65] 1,89 [1,47; 2,21] 0,27 [0,22; 0,59] 0,333[0,24; 0,36]

цитотоксические р1 = 0,012 р1 = 0,011 р1 = 0,012

р2 = 0,012 р2 = 0,012

р3 = 0,944

В-лимфоциты, (CD3-, 532,0 [411,0; 1226,0] 871,0 [683,0; 1190,0]774,0 899,0 [714,0; 981,0]

CD45RA+), абс. в 1 мкл [739,0; 1530,0]

крови р1 = 0,33 р1 = 0,48р1 = 0,78

р2 = 0,46 р2 = 0,56

ръ = 0,82

ПК, ^3-, CD161ax+), абс. 537,5 [230,0; 675,0] 318,0 [198,0; 492,0] 214,0 [129,0; 223,0] 559,0 [3297,0; 788,0]

в 1 мкл крови р1 = 0,67 р = 0,19 р1 = 0,33

р2 = 0,012 р2 = 0,06

р3 = 0,003

Таблица 4

Изменение концентрации цитокинов крыс при экспериментальной гипергомоцистеинемии

Показатели Группа

контрольная 1-я опытная 2-я опытная 3-я опытная

п = 9 п = 13 п = 10 п = 9

ЮТа 30,20 [0,00; 54,30] 137,50 [109,00; 150,74] 297,41 [248,77; 346,27] 1104,01 [866,79; 1350,81]

р1 = 0,00001 р1 = 0,00004 р1 = 0,00001

р2 = 0,003 р2 = 0,000023

р3 = 0,00036

ЮТу 13,42 [0,00; 24,16] 107,26 [101,00; 118,23] 161,69 [150,56; 193,24] 228,12 [191,53; 323,24]

р1 = 0,000001 р1 = 0,000001 р1 = 0,00001

р2 = 0,00007 р2 = 0,001

р3 = 0,0001

IL-17А 15,46 [5,09; 46,81] 179,29 [101,00; 218,09] 399,35 [310,45; 402,17] 728,47 [416,96; 1326,90]

р1 = 0,000001 р1 = 0,000001 р1 = 0,00001

р2 = 0,00008 р2 = 0,001004

р3 = 0,00001

группе он повысился в 4,5 раза (р = 0,00001), во 2-й - в 9, 9 (р = 0,00004), а в 3-й - в 36,6 раза (р = 0,00001) по сравнению с контролем. Уровень ГЬ17а также увеличивался, но менее выраженно: в 1-й опытной группе - в 11 раз

(р = 0,00001), во 2-й - в 26 раз (р = 0,00008), а в 3-й - в 47 раз (р = 0,00001) по сравнению с контрольными животными. Содержание интерферона-гамма возросло в первой опытной группе - в 8,2 раза (р = 0,00001), во второй и тре-

тьей его концентрация увеличилась в 12,4 и 17,5 раз соответственно (табл. 4).

Так как нами не зарегистрировано увеличение концентрации гомоцистеина в мононуклеарах при экзогенной гиперго-моцистеинемии, то полученные сдвиги как в общем количестве лимфоцитов, так и в субпопуляциях, вероятно, можно объяснить взаимодействием гомоцистеина с ионотропными рецепторами глутамата, активируемыми NMDA. Активация этих рецепторов в экспериментах in vitro приводила к усиленному входу ионов кальция и возрастанию уровня активных форм кислорода, активации процессов перекисного окисления липидов и апоптозу лимфоцитов [6-8]. Кроме этого, установлено, что блокада NMDA-рецепторов Т-клеток у здоровых доноров и больных рассеянным склерозом приводит к выраженному ингибированию синтеза мРНК и секреции INFy, TNFa, и IL-10, при этом секреция IL-6 подавляется в незначительной степени [12].

Таким образом, однократное введение гомоцистеина сопровождается выраженным снижением числа Т-лимфоцитов и их субпопуляций. На наш взгляд, это может быть обусловлено по крайне мере двумя механизмами: повышенной экспрессией молекул адгезии как эндотелиоцитами, так и лимфоцитами [3, 13], что обеспечивает адгезию лимфоцитов к сосудистой стенке и, тем самым, сокращение пула циркулирующих лимфоцитов. Не исключено, что часть лимфоцитов элиминирует вследствие активации NMDA-рецепторов с последующим развитием апоптоза. Однако совершенно иная картина зарегистрирована нами у животных третьей опытной группы, имевших постоянную гипергомоцистеине-мию на протяжении 7 суток. У этих животных общее число лимфоцитов возрастало, особенно за счет субпопуляции Т-цитотоксических лимфоцитов.

При введении гомоцистеина один раз в сутки в течение недели у опытных животных, очевидно, включались механизмы адаптации, позволяющие животному инактивировать этот аминотиол как ксенобиотик, вследствие чего зафиксированный нами уровень гомоцистеина уровень достигал лишь пограничных значений. Вероятно, этим можно объяснить и то, что в этой группе не было зафиксировано изменений ни общего количества лимфоцитов, ни содержания Т-лимфоцитов.

Сказанное позволяет заключить, что высокие дозы гомоци-стеина повреждают тканевые структуры, что сопровождается развитием аутоиммунных реакций и усилением лимфопоэза. Прямым свидетельством сказанного является резкое увеличение концентрации всех цитокинов и особенно IL-17A, указывающее на развитие аутоиммунного конфликта [14].

ЛИТЕРАТУРА

1. Hansson G.K. Immune mechanisms in atherosclerosis. Arterio-scler. Thromb. Vasc. Boil. 2001; 21 (12): 1876-90.

2. Hansson G.K. Inflammation, athtrosclerosis, and coronary artery disease. N. Engl. J. Med. 2005; 352 (16): 1685-95.

3. Цыбиков Н.Н., Цыбикова Н.М. Роль гомоцистеина в патологии человека. Успехи современной биологии. 2007; 127 (5): 471-82.

4. Boldyrev A.A. Molecular mechanisms of homocysteine toxicity. Biochemistry (Moscow). 2009; 74: 725-36.

5. Изместьев С.В., Фефелова Е.В., Терешков П.П., Дутов А.А., Цыбиков Н.Н. Аутоантитела к альбумину, модифицированному гомоцистеином, в эксперименте. ЭНИ Забайкальский медицинский вестник. 2013; 1: 136-40. Режим доступа htto:// medacadem.chita.ru/zmv.

6. Болдырев А.А., Брюшкова Е.А., Владыченская Е.А. NMDA-рецепторы в клетках иммунной системы. Биохимия 2012; 77 (2): 160-8.

7. Владыченская Е.А., Тюлина О.В., Болдырев А.А.. Влияние гомоцистеина и гомоцистиновой кислоты на глутаматные рецепторы лимфоцитов крысы. Бюллетень экспериментальной биологической медицины . 2006; 142 (1): 47-50.

8. Gill S., Veinot J., Kavanagh M., Pulido O. Human Heart Gluta-

mate Receptors - Implications for Toxicology, Food Safety, and Drug Discovery. Toxicol. Pathol. 2007; 35: 411-7.

9. Иванов А.В., Московцев А.А., Мартынова Е.А. и др. Общие аминотиолы плазмы крови крыс при внутрибрюшинном и подкожном введении гомоцистеина. Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2013; 4: 41-5.

10. Сергиенко В.М., Джелифф Р., Бондарева И.Б. Прикладная фармакокинетика: основные положения и клиническое применение. М.: Издательство РАМН; 2003.

11. Дутов А.А., Никитин Д.А., Федотова А.А. Определение гомоцистеина и цистеина в плазме/сыворотке крови ВЭЖХ методом с УФ детекцией и твердофазной экстракцией на полимерном сорбенте. Биомедицинская химия. 2010; 56 (5): 609-15.

12. Фаткулина У.Ш., Зайнулина Л.Ф., Бахтиярова К.З., Вахитова Ю.В. NMDA-рецепторы Т-лимфоцитов регулируют синтез цитокинов у больных рассеянным склерозом. Иммунология. 2013; 34 (6): 339-43.

13. Фефелова Е.В. Изменение адгезивных свойств лейкоцитов под воздействием гипергомоцистеинемии. Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 201073 (3): 267-9.

14. Eisenstein E.M., Williams C.B. The Treg/Th17 Cell Balance: A New Paradigm for Autoimmunity. Pediatric Research. 2009; 65: 26R-31R.

Поступила 17.03.15

REFERENCES

1. Hansson G.K. Immune mechanisms in atherosclerosis. Arterio-scler. Thromb. Vasc. Boil. 2001; 21 (12): 1876-90.

2. Hansson G.K. Inflammation, athtrosclerosis, and coronary artery disease. N. Engl. J. Med. 2005; 352 (16): 1685-95.

3. Tsybikov N.N., Tsybikova N.M. The role of homocysteine in human pathology. Uspekhi sovremennoy biologii. 2007; 127

4 Boldyrev A.A. Molecular mechanisms of homocysteine toxicity. Biochemistry (Moscow). 2009; 74: 725-36.

5 Izmest'ev S.V., Fefelova E.V, Tereshkov P.P., Dutov A.A., Tsybikov N.N. Antibodies to albumin, the modified homocysteine in experiment. ENIZabaykal'skiy meditsinskiy vestnik. 2013; 1: 13640. Available at: htto://medacadem.chita.ru/zmv.

6. Boldyrev A.A., Bryushkova E.A., Vladychenskaya E.A. NMDA-receptors in cells of the immune system. Biokhimiya. 2012; 77

7. Vladychenskaya E.A., Tyulina O.V., Boldyrev A.A.. Effect of homocysteine and gomotsistinovoy acid glutamate receptors on rat lymphocytes. Byulleten' ekspimental'noy biologicheskoy meditsiny. 2006; 142

8. Gill S., Veinot J., Kavanagh M., Pulido O. Human Heart Glutamate Receptors - Implications for Toxicology, Food Safety, and Drug Discovery. Toxicol. Pathol. 2007; 35: 411-7.

9. Ivanov A.V., Moskovtsev A.A., Martynova E.A. et al. General aminothiols rat plasma after intraperitoneal and subcutaneous administration of homocysteine. Patologicheskaya fiziologiya i eksperimental'naya terapiya. 2013; 4: 41-5.

10. Sergienko V.M., Jelliffe R., Bondarev I.B. Applied Pharmacoki-netics: fundamentals and clinical application. Moscow: Publishing House of Medical Sciences; 2003.

11. Dutov A.A., Nikitin D.A., Fedotova A.A. Determination of homocysteine and cysteine in plasma/serum HPLC method with UV detection and on the polymeric solid phase extraction sorbent. Bio-meditsinskaya khimiya. 2010; 56

12. Fatkulina U.Sh., Zaynulina L.F., Bakhtiyarova K.Z., Vakhitova Yu.V. NMDA-receptors of T lymphocytes regulate the synthesis of cytokines in patients with multiple sclerosis. Immunologiya. 2013; 34

13. Fefelova E.V. changes in leukocyte adhesion properties under the influence of hyperhomocysteinemia. Newsletter ESSC SB RAMS. 2010; 73 (3): 267-9.

14. Eisenstein E.M., Williams C.B. The Treg/Th17 Cell Balance: A New Paradigm for Autoimmunity. Pediatric Research. 2009; 65: 26R-31R.

Received 17.03.15