СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И СОХРАНЕНИЯ EUBACTERIUM HALLII
EUBACTERIUM HALLII CULTIVATION AND PRESERVATION METHOD

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к области пробиотиков и, в частности, имеет отношение к предложению способа культивирования Е. hallii, согласно которому предложена композиция Е. hallii, которая подходит для введения человеку и которая дает высокий выход биомассы и которая идеально подходит для введения человеку, независимо от его религии.
Предшествующий уровень техники
Кишечник человека содержит большое разнообразие микроорганизмов, из которых бактерии являются наиболее преобладающими и многообразными. Полагают, что микробиота состоит из 500-1000 разных видов бактерий, большинство которых являются анаэробными. Кишечная микробиота содействует всему обмену веществ и играет роль в превращении пищи в питательные вещества и энергию. Среди людей обнаружены различия состава микробиоты, и определенные различия могут коррелировать с определенными заболеваниями или состояниями.
В WO 2013/032328 раскрыта причинная роль микробиоты тонкого кишечника в инсулинорезистентности и дислипидемии. 18 субъектов мужского пола с впервые диагностированным метаболическим синдромом подвергались взятию биопсий тонкого кишечника и последующему промыванию кишечника полиэтиленгликолем посредством вставки дуоденального зонда с последующим произвольным назначением либо на аллогенную, либо аутологичную трансплантацию фекального материала. В группе аллогенной трансплантации фекального материала, которая была составлена из 9 субъектов, фекальный материал происходил от здорового и тощего донора. Группа аутологичной трансплантации включала 9 других субъектов, и данные субъекты получали свой собственный фекальный материал. Обнаружили, что субъекты аллогенной группы характеризовались отличной микробиотой сигмовидной кишки, по сравнению с микробиотой сигмовидной кишки аутологичной группы. Уровни TG-богатых липопротеинов (отношение TG/ApoB) натощак были значительно снижены у субъектов в аллогенной группе с отсутствием эффекта после аутологичной инфузии фекального материала. Несмотря на то, что масса субъектов оставалась стабильной, спустя 6 недель после трансплантации фекального материала, обнаруживали улучшение как в периферической (Rd), так и печеночной чувствительности к инсулину (подавление выработки эндогенной глюкозы (EGP, от англ. - endogenous glucose production)) в аллогенной группе, тогда как значимых изменений в аутологичной группе обработки не наблюдалось.
У субъектов, получающих аллогенную или аутологичную трансплантацию фекального материала, идентифицировали изменения в микробиоте тонкого кишечника. Сравнение состава микробиоты тонкого кишечника на исходном уровне и спустя 6 недель в аллогенной группе показало повышенное обилие бутират-продуцирующих Е. halli. Примечательно, численность Е. hallii почти в два раза снижалась после инфузии в аутологичной группе. Бактерии, принадлежащие к Eubacterium hallii и родств., включают относительно быстрорастущих анаэробов. Они обладают метаболической способностью превращать лактат в бутират в процессе, в котором требуется ацетат (Munoz-Tamayo et al 2011 FEMS Microbiol Ecolo 76: 615-624). Лактат и ацетат представляют собой метаболиты, имеющиеся в изобилии в верхней части кишечника, которая колонизирована, среди прочего, стрептококками и лактобациллами, которые могут продуцировать данные соединения (Booijink et al., 2010, см. выше).
В мышах db/db (модель ожирения, диабета и дислипидемии) был обнаружен отчетливый эффект непродолжительного перорального введения L2-7 Е. hallii в тонкий кишечник на нормализацию инсулинорезистентности (как выявлено с помощью расчета НОМА (гомеостатическая модель оценки) и постпрандиального метаболизма глюкозы посредством AUC (площадь под кривой) кривой толерантности к глюкозе при пероральном введении), а также профили липидов натощак у мышей db/db (WO 2013/032328).
Культивирование облигатных анаэробных кишечных микроорганизмов является общеизвестно сложным, и мало когда получают высокие выходы биомассы.
До этого времени Е. halllii культивировали в сложных средах и получали относительно низкие выходы биомассы (WO 2013/032328; Duncan et al. Appl. Environm. Microbiol. 70:5810).
В данной области существует потребность в способе культивирования Е. halllii, облигатного анаэроба, согласно которому была бы предложена композиция, подходящая для введения человеку, и который давал бы высокие выходы биомассы. Предпочтительно, такая композиция должна содержать все источники пищевого уровня качества, не должна содержать животных компонентов и/или должна быть кошерной. Предпочтительно, способ культивирования основан на простой среде.
Краткое изложение сущности изобретения
Авторы настоящего изобретения разработали способ получения препарата Е. halllii, который подходит для введения или перорального приема человеком и который дает высокие выходы биомассы, предпочтительно выходы, подходящие для коммерческого производства. В идеале, среда содержит только компоненты пищевого уровня качества, не содержит каких-либо животных источников и/или является кошерной. Способ по изобретению основан на простой среде.
Определения
В контексте настоящего изобретения термин «эффективное количество» относится к количеству, достаточному для достижения желаемого терапевтического и/или профилактического эффекта, например, количеству, которое приводит к лечению и/или профилактике заболеваний и состояний, о которых сообщается в данном документе. В контексте терапевтических или профилактических применений количество бактерий E. halllii, вводимое животному субъекту, предпочтительно субъекту, являющемуся человеком, будет зависеть от типа и тяжести заболевания или состояния и от характеристик субъекта, таких как общее здоровье, возраст, пол, масса тела и толерантность по отношению к лекарственным средствам. Специалист в данной области сможет определять соответствующие дозировки, в зависимости от хорошо известных факторов. Бактерии можно также вводить в комбинации с одним или более чем одним дополнительным терапевтическим соединением.
В данном документе и в его формуле изобретения глагол «содержать» и его спряжения используют в его неограничивающем смысле для обозначения того, что объекты после данного слова включены, а объекты, специально не упомянутые, не исключены. Кроме того, глагол «состоять» может быть заменен фразой «состоять по существу из», означая, что композиция по изобретению может содержать дополнительный(ые) компонент(ы), чем компоненты, конкретно идентифицированные, причем указанный(ые) дополнительный(ые) компонент(ы) не меняет(ют) уникальных характеристик изобретения.
Кроме того, ссылка на элемент посредством единственного числа не исключает возможности, что присутствует больше чем один из данных элементов, если контекстом явно не подразумевается, что существует один и только один из данных элементов. Элемент в единственном числе, таким образом, обычно подразумевает «по меньшей мере один».
Подробное описание изобретения
Способы культивирования и сохранения Е. halllii
Согласно настоящему изобретению предложен способ получения препарата Е. halllii, подходящего для перорального приема человеком, причем указанный способ включает следующие стадии:
а) предоставление среды, содержащей примерно 1-100, например, примерно 2-80, примерно 4-60, предпочтительно примерно 5-40, более предпочтительно примерно 10-30, г/кг сахара, предпочтительно глюкозы; примерно 1-100, например, примерно 2-80, примерно 4-60, предпочтительно 5-40, более предпочтительно 10-30 г/кг источника азота и факторов рота, например, дрожжевого экстракта; примерно 1-20, например, примерно 2-16 или примерно 3-12 г/кг растительного пептона, предпочтительно соевого пептона; например, 0,01-20, например, примерно 0,1-18, примерно 0,2-16, примерно 0,5-14, примерно 0,75-12, примерно 1-10, примерно 1,5-8, примерно 2-6 или примерно 2,5-4 г/кг соли ацетат, например, ацетата натрия; буферную систему, поддерживающую рН перед подкислением Е. hallii на уровне примерно 6-8; возможно цистеин; возможно ионы магния; возможно ионы кальция; возможно ионы калия; возможно витамины;
б) инокуляция указанной среды Е. hallii;
в) обеспечение роста Е. hallii в указанной среде; и
г) сбор препарата указанной Е. hallii из указанной среды.
Указанная среда может содержать примерно 1-100, например, примерно 2-80, примерно 4-60, предпочтительно примерно, 5-40, более предпочтительно примерно 10-30 г/кг сахара. Указанный сахар может быть выбран из группы, состоящей из глюкозы, сахарозы, галактозы, фруктозы, мальтозы и лактозы или любой их комбинации. Среда предпочтительно содержит примерно 1-100, например, примерно 2-80, примерно 4-60, предпочтительно примерно 5-40, более предпочтительно примерно 10-30 г/кг глюкозы, фруктозы или сахарозы в качестве источника углерода.
Среда может дополнительно содержать примерно 1-100, например, примерно 2-80, примерно 4-60, предпочтительно 5-40, более предпочтительно 10-30 г/кг источника азота и факторы роста, например, дрожжевой экстракт.
Среда, о которой сообщается в данном документе, может дополнительно содержать от примерно 0,1-50, например, примерно 0,5-40, примерно 1-20, примерно 2-16 или примерно 3-12 г/кг растительного пептона. Растительный пептон представляет собой гидролизат растительного белка. Он может происходить из любого растения. Растительный пептон может, например и без ограничения, быть выбран из группы, состоящей из соевого пептона, пшеничного пептона, хлопкового пептона, горохового пептона, пептона кормовых бобов, люпинового пептона и картофельного пептона. Среда может, например, содержать от примерно 0,1-50, например, примерно 0,5-40, примерно 1-20, примерно 2-16 или примерно 3-12 г/кг соевого пептона.
Среда, о которой сообщается в данном документе, дополнительно содержит примерно 0,01-20, например, примерно 0,1-18, примерно 0,2-16, примерно 0,5-14, примерно 0,75-12, примерно 1-10, примерно 1,5-8, примерно 2-6 или примерно 2,5-4 г/кг соли ацетат. Соль ацетат является важной, так как она образует субстрат для образования бутирата Е. hallii. Кроме того, ацетат является противовспенивающим соединением. Соль ацетат может, без ограничения, быть выбрана из группы, состоящей из ацетата натрия, ацетата алюминия, ацетата аммония и ацетата калия или их любой комбинации. В воплощении среда содержит примерно 0,01-20, например, примерно 0,1-18, примерно 0,2-16, примерно 0,5-14, примерно 0,75-12, примерно 1-10, примерно 1,5-8, примерно 2-6 или примерно 2,5-4 г/кг ацетата натрия.
Среда может дополнительно содержать буферную систему, которая поддерживает рН среды на уровне 6-8 до подкисления Е. hallii. Подходящая буферная система может включать бикарбонат натрия, гидроортофосфат калия и дигидроортофосфат калия, как сообщается в данном документе. Специалист прекрасно может выбрать подходящую пищевую буферную систему для применения в способе по настоящему изобретению.
Среда может дополнительно содержать цистеин для того, чтобы привести среду в восстанавливающее состояние, ионы магния, ионы кальция, ионы калия и/или витамины. Обнаружили, что данное добавление этих компонентов к среде, о которой сообщается в данном документе, еще больше улучшало выход биомассы.
В одном воплощении используемая среда содержит примерно 1-100, например, примерно 2-80, примерно 4-60, предпочтительно примерно 5-40, более предпочтительно примерно 10-30 г/кг глюкозы; примерно 1-100, например, примерно 2-80, примерно 4-60, предпочтительно 5-40, более предпочтительно 10-30 г/кг дрожжевого экстракта; примерно, 1-20, например, примерно 2-16 или примерно 3-12 г/кг соевого пептона; примерно 0,01-20, например, примерно 0,1-18, примерно 0,2-16, примерно 0,5-14, примерно 0,75-12, примерно 1-10, примерно 1,5-8, примерно 2-6 или примерно 2,5-4 г/кг соли ацетат, например, ацетата натрия; буферную систему, поддерживающую рН до подкисления Е. hallii на уровне примерно 6-8; возможно цистеин; возможно ионы магния; возможно ионы кальция; возможно ионы калия; и возможно витамины.
Штамм Е. hallii, используемый в способе, о котором сообщается в данном документе, может представлять собой любой человеческий изолят Е. hallii, например, штамм Е. hallii, обозначаемый L2-7, который был депонирован в DSMZ и получил номер депонирования 17630.
Предпочтительно, среда не содержит каких-либо животных источников, таких как животные продукты или продукты животного происхождения.
2
Способ, о котором сообщается в данном документе, предпочтительно осуществляют в анаэробных условиях. Так как E. hallii представляет собой облигатную анаэробную бактерию, на ее жизнеспособность влияет контакт с воздухом. Анаэробные условия могут поддерживаться с использованием хорошо известных способов, которые включают N-продувку.
Способ, о котором сообщается в данном документе, предпочтительно осуществляют при температуре в диапазоне 30-42°С, предпочтительно в диапазоне 34-40°С.
Препарат Е. hallii можно собирать из указанной среды с использованием любой методики, известной специалисту, в частности методики сбора, которая поддается проведению при анаэробных условиях, такой как фильтрация.
Для удаления или разведения дополнительных компонентов среды собранные клетки Е. hallii можно промывать физиологически приемлемым раствором, таким как фосфатно-солевой буферный раствор. Специалист может выбрать подходящий физиологически приемлемый раствор, а также способ промывания, достигающий желаемого результата. Например, для промывки клеток Е. hallii можно использовать диафильтрование. В качестве альтернативы, клетки Е. hallii можно центрифугировать и ресуспендировать в промывочном буфере, или они могут непосредственно быть поглощены в буфере, содержащем криопротекторы и утилизаторы кислорода.
Способ, о котором сообщается в данном документе, может дополнительно включать стадию лиофилизации указанной Е. hallii с получением лиофилизированной композиции Е. hallii. В качестве альтернативы или помимо этого, способ может дополнительно включать стадию инкапсуляции указанной Е. hallii с получением композиции инкапсулированной Е. hallii.
Методика инкапсуляции хорошо известна в данной области в отношении сохранения пробиотических бактерий (например, как рассмотрено Serna-Cock and Vallejo-Castillo, 2013. Afr J of Microbiol Res, 7(40): 4743-4753, включенной в данный документ посредством ссылки). В настоящем изобретении можно использовать любые из методик сохранения и систем сохранения, о которых сообщается Serna-Cock и Vallejo-Castillo.
7
Стадию лиофилизации можно проводить, используя любой способ, известный в данной области. Лиофильная сушка или лиофилизация обычно используется для сохранения микроорганизмов. В конечном итоге, лиофилизаты могут храниться десятилетиями. Соответственно, многие микробы хранят в виде лиофилизатов в коллекциях штаммов. Для решения проблемы возможной потери жизнеспособности во время приготовления обычно рекомендуется лиофилизировать концентрированные культуры, например, содержащие по меньшей мере 10 клеток. Это обеспечивает наличие достаточного количества жизнеспособных клеток после лиофилизации, длительного хранения и восстановления. Для композиций пробиотиков, таких как композиции Е. hallii, о которых сообщается в данном документе, важно, чтобы как можно больше бактерий выдерживало лиофилизацию и последующее хранение.
Обнаружили, что Е. hallii чрезвычайно чувствительна к замораживанию и лиофильной сушке. Криопротекторы часто используют для защиты композиций пробиотиков во время лиофилизации и для увеличения длительности хранения. Однако выбор соответствующих и совместимых криопротекторов остается основной проблемой. До сих пор не сообщалось о криопротекторах, подходящих для Е. hallii.
В способе, о котором сообщается в данном документе, можно использовать криопротектор, выбранный из группы, состоящей из сахарозы, мальтозы, мальтодекстрина, трегалозы, маннита, сорбита, инулина, глицерина, ДМСО (диметилсульфоксид), этиленгликоля, пропиленгликоля, 2-метил-2,4-пентандиола, полиэтиленгликоля, поливинилпирролидона, поливинилового спирта, полиглицерина, сухого обезжиренного молока, белка молока, сывороточного белка, UHT (ультрапастеризация)-молока, бетаина, адонита, сахарозы, глюкозы, лактозы или любой их комбинации.
Пребиотики, такие как крахмал и пшеничные отруби, можно дополнительно добавлять перед лиофилизацией для повышения эффективности препарата Е. hallii, о котором сообщается в данном документе. Добавление антиоксидантов, таких как рибофлавин, рибофлавин фосфат или его физиологически приемлемая соль, глутатион, аскорбат, глутатион и цистеин, к смеси лиофилизации может дополнительно усиливать жизнеспособность препарата Е. hallii, о котором сообщается в данном документе, во время хранения.
Способы лиофилизации включают, без ограничения, медленное постепенное замораживание до -40°С перед сушкой, быстрое замораживание посредством помещения при -80°С перед сушкой или сверхбыстрое замораживание посредством капания на клетки криопротектора в жидком азоте перед сушкой.
Для придания Е. hallii большей устойчивости к замораживанию может быть полезным подвергать клетки E. hallii действию легких - умеренных стрессовых условий во время культивирования с получением данных бактерий для неблагоприятных условий. Например, во время культивирования клетки можно подвергать действию легкого окислительного стресса, например, посредством добавления низкой дозы пероксида водорода, посредством ограничения определенного питательного вещества, посредством культивирования при низком значении рН и тому подобное.
Препарат Е. hallii
Настоящее изобретение также относится к препарату E. hallii, получаемому способом, о котором сообщается в данном документе. Указанный препарат характеризуется тем, что подходит для перорального приема человеком.
Препарат E. hallii, о котором сообщается в данном документе, предпочтительно содержит эффективное количество E. hallii совместно с физиологически приемлемым носителем.
6
12
8
12
Предпочтительно, препарат E. hallii содержит от примерно 10 до примерно 10, предпочтительно от примерно 10 до примерно 10 жизнеспособных бактерий E. hallii. Предпочтительно, указанные бактерии содержатся в суточной дозе.
Предпочтительно, препарат E. hallii, о котором сообщается в данном документе, предназначен для энтерального или перорального введения. Композиция для энтерального или перорального введения может представлять собой либо пищевую композицию, либо кормовую композицию, либо фармацевтическую композицию.
Препарат E. hallii, о котором сообщается в данном документе, обычно будет содержать носитель, такой как фармацевтический носитель, предпочтительно инертный носитель. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и (терапевтического) применения. Фармацевтический носитель может представлять собой любое совместимое нетоксичное вещество, подходящее для доставки бактерий E. hallii в желудочно-кишечный тракт субъекта. Например, стерильную воду или инертную твердую фазу можно использовать в качестве носителя, обычно дополняемого фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом, буферным средством, диспергирующим средством и тому подобное. Композиция будет представлена либо в жидкой форме, например, стабилизированной суспензии бактерий Е. hallii, либо в твердой форме, например, порошке лиофилизированных бактерий Е. hallii. Для перорального введения бактерии Е. hallii можно вводить в твердых лекарственных формах, таких как капсулы, таблетки и порошки, или в жидких лекарственных формах, таких как эликсиры, сиропы и суспензии. Бактерии Е. hallii могут, например, быть инкапсулированы в капсулах, таких как желатиновые капсулы, вместе с неактивными ингредиентами и измельченными в порошок носителями, такими как, например, глюкоза, лактоза, сахароза, маннит, крахмал, целлюлоза или производные целлюлозы, стеарат магния, стеариновая кислота, сахаринат натрия, тальк, карбонат магния и тому подобное.
Препарат Е. hallii, о котором сообщается в данном документе, может находиться в форме биоактивной пищевой добавки или пищевого продукта или пищевой композиции (в данном документе в совокупности называемой «пищевой композицией»), которая может помимо бактерий Е. hallii также содержать подходящую пищевую основу. В качестве альтернативы, такой препарат может находиться в форме кормовой добавки или корма или кормовой композиции (в данном документе в совокупности называемой «кормовой композицией»). В данном документе подразумевается, что пищевой продукт или пищевая композиция или кормовая композиция включают жидкость для потребления человеком или животным, не являющимся человеком, то есть питье или напиток. Пищевой продукт или пищевая композиция или кормовая композиция может представлять собой твердый, полутвердый и/или жидкий пищевой продукт или пищевую композицию и в частности может представлять собой молочный продукт, такой как ферментированный молочный продукт, включая йогурт, напиток на основе йогурта или пахту, но, не ограничиваясь ими. Такой пищевой продукт или пищевую композицию или кормовую композицию можно получать способом, известным по существу, например, посредством добавления бактерий Е. hallii в подходящую пищу, пищевую основу или кормовую основу в подходящем количестве. Аналогично, данный способ может включать применение данных бактерий в капсулированной форме, как описано выше, так как они должны проходить через низкий рН желудка. Также это может являться предпочтительным путем в отношении уменьшения следов бутирата, которые связаны с ростом бактерий E. hallii и могут продуцировать привкус в пищевом продукте или пищевой композиции. В другом воплощении бактерии Е. hallii можно использовать в или для получения пищевого продукта или пищевой композиции или кормовой композиции, например, посредством ферментации. При этом бактерии Е. hallii можно использовать способом, известным по существу для получения таких ферментированных продуктов или пищевых композиций или ферментированных кормовых композиций, например, способом, известным по существу для получения ферментированных молочных продуктов с использованием молочнокислых бактерий. В таких способах бактерии Е. hallii могут быть использованы в дополнение к обычно используемому микроорганизму и/или могут замещать одну или более чем одну часть обычно используемого микроорганизма.
Предпочтительно, препарат Е. hallii, о котором сообщается в данном документе, может содержать бактерии Е. hallii в количествах, которые делают возможным удобное (пероральное) введение, как указано выше, например, в виде или в одной или более чем одной дозе в сутки или в неделю. В частности, препарат может содержать единичную дозу E. hallii.
Указанный препарат E. hallii подходит для применения в качестве лекарственного средства, в частности, для применения в профилактике и/или лечении инсулинорезистентности и/или осложнений, связанных с инсулинорезистентностью, таких как метаболический синдром, дислипидемия, сахарный диабет 2 типа, неалкогольная жировая болезнь печени (NAFLD) или неалкогольный стеатоз печени (NASH), и инсулинорезистентности в эндокринных заболеваниях (например, субъекты с ожирением с сахарным диабетом 1 типа, болезнью Кушинга и синдромами липодистрофии), для профилактики и/или лечения лактатацидоза, синдрома короткой кишки и воспалительного заболевания кишечника, для профилактики, снижения частоты возникновения или уменьшения тяжести колоректального рака или колита.
В настоящем изобретении также сообщается о способе стимулирования образования масляной кислоты в кишечнике млекопитающего, причем указанный способ включает стадию введения препарата E. hallii, о котором сообщается в данном документе, нуждающемуся в этом субъекту.
Все патентные и литературные ссылки, приводимые в настоящем описании, таким образом, включены в данный документ во всей полноте посредством ссылки.
Станет ясно, что приведенное выше описание включено для иллюстрации некоторых воплощений изобретения и не должно ограничивать объем охраны. Исходя из данного раскрытия, еще многие воплощения, которые находятся в пределах объема охраны и сущности изобретения и которые представляют собой очевидные комбинации методик предшествующего уровня техники и раскрытия данного патента, станут очевидными специалисту.
Примеры
Культивирование Е. hallii
Среду готовили с использованием следующих компонентов и концентраций:
2
Среду подвергали автоклавированию в течение 20 минут при 121°С с последующей продувкой N. рН доводили до 6,9 плюс/минус 0,1.
2
Примерно 20 мл лабораторной культуры Е. hallii добавляли к примерно 1 л среды и культивировали в течение 18 часов при 37°С. Затем 500 мл данной культуры добавляли к 20 л сред и культивировали в течение 14-18 часов при 37°С. Все стадии проводили в стерильных условиях и в атмосфере N (продувка).
600
Клетки росли до оптической плотности (OD) 8,5 при подкислении среды с 6,9 до рН 5,0.
К среде 2 добавляли следующие стерилизованные посредством фильтрации анаэробные растворы:
Раствор витаминов I (1000х концентрированный)
2
Среду подвергали автоклавированию в течение 20 минут при 121°С с последующей продувкой N. рН додводили до 6,9 плюс/минус 0,1.
2
Примерно 20 мл лабораторной культуры Е. hallii добавляли к примерно 1 л среды и культивировали в течение 18 часов при 37°С. Затем 500 мл данной культуры добавляли к 20 мл среды и культивировали в течение 14-18 часов при 37°С. 10 л указанной культуры добавляли к 320 л среды и культивировали в течение 14-16 часов при 37°С. Все стадии проводили в стерильных условиях и в атмосфере N (продувка).
600
9
Клетки росли до оптической плотности (OD) 9,4 (1,4×10 клеток/мл) при подкислении среды с рН 6,9 до рН 5,0.
Клетки собирали, используя концентрирование с помощью половолоконных мембран (Koch membrane systems; HF3043-25-43-PM500; HF3043-16-106-PM500) и диафильтрации с использованием PBS (фосфатно-солевой буферный раствор). Диафильтрация продолжалась до тех пор, пока уровень компонентов среды и продуктов ферментации не достигал примерно 2% их исходной концентрации. Образец концентрировали примерно в 20 раз с получением примерно 15 л концентрированных клеток Е. hallii в PBS. Примерно 99,8% соединений среды удаляли.
2
Образцы закладывали в продезинфицированный ламинар-бокс или в глицерине или в глицерине и PBS (предварительно проавтоклавированный, предварительно охлажденный и с предварительной продувкой N).
Лиофильная сушка клеток
Центрифужные пробирки, содержащие 800 мл итоговой культуры, центрифугировали при 4000 об/мин в течение 30 минут. Супернатант удаляли в анаэробной камере.
Затем клетки Е. hallii лиофилизировали. Тестировали пять растворов разных криопротекторов:
Раствор криопротектора 1:
Раствор криопротектора 2:
Раствор криопротектора 3:
Раствор криопротектора 4:
Раствор криопротектора 5:
80 мл раствора криопротектора добавляли в центрифужную пробирку, содержащую клеточный осадок. Пробирки встряхивали для гомогенизации биомассы и раствора криопротектора. Полученный раствор распределяли по 2 чашкам, содержащим 50 мл в анаэробной камере. Данные тарелки помещали в герметично закрытый бокс и подвергали глубокой заморозке при -40°С. Чашки оставляли в сублиматоре на 1-2 суток. После сбора лиофилизаты измельчали вручную и упаковывали в пакеты в анаэробных условиях. Затем их хранили при -4°С.
Е. hallii могли повторно наращивать после лиофилизации, демонстрируя, что бактерии оставались жизнеспособными после лиофилизации. В данном примере самую высокую жизнеспособность после лиофилизации обнаруживали для раствора криопротектора 1. Обнаружили, что жизнеспособность лиофилизатов была лучше, когда весь процесс проводили в анаэробных условиях, насколько это возможно.
Пример 3 - Сравнительный пример
600
600
Выходы биомассы на кошерных средах, описанных в примерах 1 и 2, были гораздо больше, чем выходы биомассы, описанные для роста Е. hallii на традиционных средах, которые содержали компоненты из животных источников. Типичный пример представляет собой среду YCFA, как описано Duncan et al., 2003 (Appl Environ Microbiol 69: 1136-42) с добавленной глюкозой или лактатом. Данная среда YCFA широко используется для поддержания роста анаэробных и кишечных бактерий (см. Browne et al., 2016, Nature 533: 543-46). Однако рост L2-7 Е. hallii, как описывали, достигает только OD 0,8-1,0 на YCFA с добавленной глюкозой или другими компонентами (Duncan et al., 2004, Appl Environ Microbiol 70: 5810-17). Когда к YCFA с глюкозой добавляли продукты животного происхождения гемин и казитон, рост был только немного лучше, и достигалась максимальная OD 1,8 (Engels et al., 2016, Front Microbiol 7:713).
600
600
Также следует отметить, что описанный выше выход биомассы OD для среды 2, равный 9,4, получали для еще не полностью выросших культур. Для того, чтобы показать, что разработанные кошерные среды превосходят другие описанные до настоящего времени среды, штамм Е. hallii L2-7 культивировали в течение 35-40 часов в 200 мл объеме среды 2 в анаэробных камерах (Эксп.№1 и Эксп. №2; см. Таблицу ниже). Кроме того, L2-7 Е. hallii также масштабно выращивали в 2,5 литровом ферментере на среде 2 (Эксп. 2,5 литра; см. Таблицу ниже). Результаты показывают, что в малом и большом масштабе можно получать большие выходы ферментации OD, близкие к 20.
600
600
600
600
8
8
Пересчет OD на удельное количество клеток зависит от нескольких факторов. Авторы изобретения определяли количество клеток посредством проточной цитометрии и обнаружили, что OD 1 соответствует приблизительно 1×10 - 1,3×10 клеток на мл. Однако не только количество клеток определяет выход, но также размер клеток. Известно, что размеры E. hallii могут значительно варьировать, и было описано, что размеры клеток составляют 0,8-2,4 микрометра в диаметре и 4,7-25,0 микрометров в длину (De Vos Р et al., Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Volume 3 Sec Ed p. 881). Фазово-контрастная микроскопия показала, что клетки, выросшие в среде 2, являются длинноватыми, что приводит к относительно низкому количеству клеток на единицу OD. Следовательно, в сравнительных экспериментах использовали значения OD.
Рост L2-7 Е. hallii
Полезность сред, о которых сообщается в данном документе, в поддержании роста Е. hallii также проиллюстрирована посредством наблюдения того, что эффективный рост единичных клеток получали на среде 2 с добавлением 1% агара с высокой эффективностью посева (выше 10%). Общеизвестно сложно подсчитывать анаэробы, и обычно для оценки количества жизнеспособных клеток используют подходы на основе наиболее вероятного числа (MPN), что является утомительным способом. Кроме того, полезность среды, которая поддерживала высокую эффективность посева Е. hallii, также использовали для отбора производных или мутантов штамма L2-7 Е. hallii.
Все это демонстрирует полезность сред, о которых сообщается в данном документе, которые делают возможным эффективный рост до высокой плотности Е. hallii.