ЖИВАЯ СТРЕПТОКОККОВАЯ ВАКЦИНА И СПОСОБ ЕЁ ПОЛУЧЕНИЯ
LIVE STREPTOCOCCAL VACCINE AND METHOD FOR OBTAINING

Изобретение относится к микробиологии, производству медицинских и ветеринарных биологических препаратов, а в частности к способам получения из бактерий вида Streptococcus pyogenes препаратов, обладающих онкопротекторной, тромболитической, противовирусной и иммуномодулирующей активностью.
В научной литературе описаны противораковые и иммуномодулирующие свойства бактерий вида Streptococcus pyogenes. Так, известно, что липотейхоевые кислоты, липополисахариды и фрагменты ДНК Streptococcus pyogenes действует на рецепторы дендритных клеток, макрофагов и лимфоцитов, запуская выработку каскада цитокинов, которые приводят в конечном итоге к усилению неспецифического иммунитета в организме и повышению сопротивляемости вирусным инфекциям (Linnebacher М., Maletzki С., Klier U., Klar Е. Bacterial immunotherapy of gastrointestinal tumors [Text] / M. Linnebacher et al. // Langenbecks. Arch. Surg. - 2012. - Vol. 397. - P. 557-568.). Важный противораковый механизм препаратов на основе Streptococcus pyogenes связан с ускорением созревания дендритных клеток. Установлено, что активация дендритных клеток вызывается взаимодействием ТПР-9 с фрагментами ДНК Streptococcus pyogenes. При этом дендроциты начинают активно вырабатывать интерлейкин-12 и гамма-интерферон, увеличивают экспрессию антигенов (CD40, CD80, CD83, CD86), молекул клеточной адгезии (ICAM-1) и индуцируют появление цитотоксических лейкоцитов, в том числе Т-лимфоцитов с противоопухолевой активностью. Таким образом, компоненты клеток Streptococcus pyogenes, активируя дендритные клетки организма человека, стимулируют противораковый иммунитет (Hovden А.-О., Karlsen М., Jonsson R., Aarstad Н.J., Silke Appel Maturation of monocyte derived dendritic cells with OK432 boosts IL-12p70 secretion and conveys strong T-cell responses / A.-O. Hovden et al. // BMC Immunology. - 2011. - Vol. 12. - P. 2-5.).
Установлено прямое противораковое действие протеолитических ферментов Streptococcus pyogenes на 4 типа клеток карцином человека (Eslami-Nejad Z., Nematollahi-Mahani S.N., Saffari F., Mollaii H., Arabzadeh S. A. M. Cell death induction by Streptococcus pyogenes in four types of malignant cell lines / Z. Eslami-Nejad et al. // Med. J. of the Islamic Repub. of Iran. - 2010. - Vol. 23(4). - P. 207-217.).
Бактерии Streptococcus pyogenes вырабатывают гликопротеин SAGP, белок, который действуя на опухоль напрямую, угнетает митотическую активность опухолевых клеток и вызывает их апоптоз, а также оказывает иммуномодулирующее действие (Yoshida J., Takamura S., Nishio M. Characterization of a streptococcal antitumor glycoprotein (SAGP) [Text] / J. Yoshida et al. // Life Sciences. - 1998. - Vol. 62(12). - P. 1043-1053.).
Из патентной литературы известен способ получения иммуностимулирующего препарата Пицибанил (ОК-432), включающий выращивание бактерий Streptococcus pyogenes на питательной среде с последующей инактивацией с помощью процесса пастеризации, затем обработки пенициллином, лиофилизацией, удалением пенициллина и повторной лиофилизацией (US 4328218 А - Method for the treatment of cells of Streptococcus pyogenes).
Недостатком данного метода является вирулентность используемого штамма, которая требует сложного процесса инактивации и, как следствие, невозможность использования живого штамма. В то же время известно, что живые бактерии Streptococcus pyogenes гораздо более эффективно вызывают регрессию различных видов опухолей и предотвращают метастазы, чем убитые термической обработкой (Maletzki С., Linnebacher М., Kreikemeyer В., Emmrich J. Pancreatic cancer regression by intratumoural injection of live Streptococcus pyogenes in a syngeneic mouse model / C. Maletzki // Gut. - 2008. - Vol. 57. - P. 483-491.).
Известен способ получения энзимотерапевтического, противовирусного и иммуномодулирующего препарата из живой слабовирулентной культуры Streptococcus pyogenes штамм «Гуров», в котором штамм бактерий выращивают сначала на жидкой питательной среде, затем пересевают на чашки Петри на твердую питательную среду и после инкубации смывают с чашек Петри физиологическим раствором (патент №2086246).
Недостатком данного способа является его технологическая непригодность для промышленного производства препарата, так как при производстве препарата высока доля ручного труда и отсутствует возможность автоматизации процесса, так как при помощи смыва с чашки Петри препарат можно получать лишь в небольших количествах.
К дополнительным недостаткам данного способа относится повышенная вероятность контаминации патогенной микрофлорой на этапах пересева и при смыве с чашек Петри физиологическим раствором, а также короткий срок жизнеспособности бактерий в физиологическом растворе (4-5 часов), что не позволяет приготовить живой лиофилизированный препарат. В то же время оптимальным методом сохранения живых бактерий Streptococcus pyogenes является лиофильная сушка. Но проведенные опыты по лиофильной сушке Streptococcus pyogenes в физиологическом растворе, даже в присутствии питательного бульона дают очень плохие результаты.
Полученный вышеописанным способом препарат может быть применен только по месту производства и не может транспортироваться на дальние расстояния.
Кроме того, продукты метаболизма бактерий Streptococcus pyogenes содержат важные для лечения компоненты: липотейхоевые кислоты, липополисахариды и фрагменты ДНК Streptococcus pyogenes, гликопротеин SAGP, фермент Стрептокиназу, гиалуроновую кислоту и другие. При описанном выше способе приготовления препарата эти важные и нужные вещества в организм не поступают. Они начнут продуцироваться только после того, как бактерии Streptococcus pyogenes начнут размножаться в организме. Эксперименты, проведенные на добровольцах, показывают, что при введении интрадермально одного и того же количества бактериальных клеток вместе с продуктами метаболизма вызывает тромболитический эффект в течение 20 минут после введения. А при введении очищенных от продуктов метаболизма бактериальных клеток, такой же эффект проявляется только через 5-6 часов. Таким образом, препарат, содержащий бактериальные клетки вместе с продуктами метаболизма, может использоваться для экстренной медицинской помощи в качестве тромболитика.
Предлагаемый способ получения препарата включает выращивание β-гемолитических стрептококков группы A (Streptococcus pyogenes), выбранных среди слабовирулентных штаммов, например штамм «Гуров», штамм MPK-12, или аналогичных и/или смесь разных штаммов на жидкой питательной среде, затем в полученную биомассу, содержащую смесь живых бактерий и продукты метаболизма, добавляют защитную среду высушивания, разливают в ампулы и/или флаконы и проводят лиофильную сушку с последующей укупоркой.
При таком способе производства возможно применение промышленных технологий автоматизации выращивания культуры и обеспечивается более высокая степень стерильности при производстве препарата, так как уменьшается доля ручного труда, уменьшается количество операций, и соответственно уменьшается вероятность контаминации патогенной микрофлорой. Также обеспечивается возможность продолжительного хранении и транспортировки препарата. Лиофильно высушенная культура бактерий, запаянная в ампулы, сохраняет жизнеспособность в течение длительного времени (до 10 лет). Ампулы с препаратом могут перевозиться любым видом транспорта на любые расстояния.
Пример 1. В бутыль объемом 0,5 литра с 400 мл питательного бульона с 2% глюкозы и 2% экстракта дрожжей добавляют 20 мл лошадиной сыворотки и вносят лиофилизированную культуру β-гемолитических стрептококков группы А штамма MPK-12. Бутыль с культурой помещают в термостат и инкубируют при 37°C в течение 24-36 часов. После образования в бутыли хлопьевидного осадка культуру проверяют на стерильность, добавляют защитную среду высушивания, разливают по ампулам и/или флаконам и проводят лиофильную сушку с последующей укупоркой.
Пример 2. В пробирку объемом 10 мл с 7 мл питательного бульона с 2% глюкозы вносят лиофилизированную культуру β-гемолитических стрептококков группы А штамма MPK-12. Пробирку с культурой помещают в термостат и инкубируют при 37°C 24-36 часов до образования хлопьевидного осадка. Затем проводят пересев культуры из пробирки в бутыль объемом 0,5 литра с 400 мл питательного бульона с 2% глюкозы, добавляют 20 мл крови человека и вносят лиофилизированную культуру β-гемолитических стрептококков группы А штамма MPK-12. Бутыль с культурой помещают в термостат и инкубируют при 37°C в течение 24-36 часов. После образования в бутыли хлопьевидного осадка культуру проверяют на стерильность, добавляют защитную среду высушивания, разливают по ампулам и/или флаконам и проводят лиофильную сушку с последующей укупоркой.