КОМПОЗИЦИЯ АДЪЮВАНТА, СОДЕРЖАЩАЯ ПОЛИ-ГАММА-ГЛУТАМИНОВУЮ КИСЛОТУ
ADJUVANT COMPOSITION CONTAINING POLY-GAMMA-GLUTAMIC ACID

Область техники
Настоящее изобретение относится к композиции для иммуностимулятора (адъюванта), содержащей поли-гамма-глутаминовую кислоту, и к композиции для вакцины, содержащей иммуностимулятор, и, более конкретно, к иммуностимулятору, содержащему поли-гамма-глутаминовую кислоту, который может повышать скорость продуцирования антител при введении животным вместе с антигеном, имеющим низкую иммуногенность, и к композиции для вакцины, содержащей указанный иммуностимулятор и антиген.
Предшествующий уровень техники
До настоящего времени проводится много научных исследований в области субъединичных вакцин, в которых используются антигенные белки или пептиды, ДНК-вакцин, в которых используется антигенная ДНК, и различных рекомбинантных вакцин. Эти вакцинные вещества обладают тем преимуществом, что они проявляют мало побочных эффектов, и в тоже время обладают недостатком, будучи слабо иммуногенными. Таким образом, в данной области безотлагательно требуется разработка иммуностимулятора (адъюванта), который бы эффективно усиливал иммунную реакцию вакцинных веществ (O′Hagan, J.Pharm. Pharmacol. 50:1-10, 1998).
Адъюванты представляют собой вещества, усиливающие антиген-специфичную гуморальную и/или клеточную реакцию. Гуморальная реакция (реакция В-клеток) адъюванта указывает на мощную антительную реакцию на специфический антиген и известно, что эта реакция приводит к образованию депо, которое защищает антиген от метаболистического быстрого разложения, и неспецифически стимулирует иммунную реакцию. Когда образуется депо, антительная реакция протекает более устойчиво, в то время как емкость антигена становится намного меньше, что является причиной продолжительной стимуляции иммунной системы в течение определенного времени, поскольку она сохраняет антиген и высвобождает его с течением времени. Адъювант сам по себе также неспецифически стимулирует клетки иммунной системы, благодаря чему он выполняет роль усилителя реакции, в которой участвует антиген, т.е. он выполняет функцию стимулирования иммунной реакции путем подъема уровня лимфокина.
Поскольку адъюванты проявляют другой характер, становясь причиной мощной опосредованной Т-клетками иммунной реакции, когда их вводят вместе с антигеном, считается, что обладающая антигеном клетка (АРС) активирует иммунную систему, результатом чего является усиление эффекта превентивной вакцинации и лечебной вакцинации. Этот адъювант неспецифически стимулирует функцию организма-хозяина сопротивляться инфекционным болезням и раку и усиливает функцию иммуногенности превентивной вакцины и лечебной вакцины.
Адъювант Фрейнда является типичным адъювантом из множества существующих описанных адъювантов. Адъювант Фрейнда является адъювантом, получаемым добавлением поверхностно-активного вещества Arlacel А к минеральному маслу, которое затем тщательно смешивается с антигеном с образованием суспензии, которую далее вводят в виде инъекции в кровяное русло или подкожно с целью повышения скорости продуцирования антител. Адъювант Фрейнда является наиболее широко применяемым адъювантом при тестировании животных благодаря стимулированной им высокой скорости продуцирования антител, однако он обладает тем недостатком, что не может быть использован в медицине человека, поскольку он очень токсичен. Также различные компоненты, проявляющие иммуностимулирующий эффект, были идентифицированы и использованы в качестве адъювантов, такие как бактериальные продукты (липополисахарид (LPS), мурамил-депептид, В-субъединица токсина холеры), QuilA, представляющего собой вид сапонина, выделяемого из растения, и иммуностимулирующие комплексы (ISCOM), например препараты желчной соли и фосфолипидов и т.д. Однако надежность большей части этих препаратов не гарантирована.
В настоящее время единственным допущенным к применению для человека адъювантом являются соединения алюминия, но недостаток их состоит в относительно низком иммуностимулирующем эффекте по сравнению с другими адъювантами. К тому же соединения алюминия в основном усиливают гуморальный иммунитет путем стимулирования Th2 иммунной реакции (Audiber and Lise, Immunol. Today, 14:281-284, 1993), в результате чего они ограничены для применения в качестве адъюванта для вакцин, требующих усиления иммунного ответа цитотоксических Т-клеток. Кроме того, вакцины, содержащие алюминиевые адъюванты, имеют тот недостаток, что они трудно разлагаются in vivo и их трудно хранить в лиофилизированном виде из-за их склонности образовывать осадок при замораживании алюминия. При этом соединения алюминия (сульфат алюминия, гидроксид алюминия, фосфат алюминия и т.д.) могут использоваться в качестве вакцин для организма человека, но недостатком их является то, что их качество может меняться в процессе производства и они непригодны для массового производства из-за трудности операции очистки.
Кроме этих адъювантов разрабатываются более безопасные и эффективные адъюванты и способы, например, такие адъюванты, как цитокин, вводимые вместе с вакцинным антигеном. Однако эти цитокины также нуждаются в усовершенствовании в отношении безопасности.
Большая часть путей проникновения вирусов проходит через слизистую оболочку, в связи с чем многие инфекции возникают, прежде всего, в слизистых оболочках и в подслизистых тканях. Поскольку обычные парентеральные вакцины очень неэффективны в отношении индуцирования иммунного ответа в слизистых тканях, значительные усилия были направлены на разработку системы для оптимальной иммунизации слизистых тканей. Например, предпринята разработка адъювантов (липосом, иммуностимулирующих комплексов и микросфер) для улучшения введения антигена для иммуноцитов подслизистой ткани (Sjolander et al., J.Leucocyte Biol. 64:713-723, 1998). Но даже хотя во многих ситуациях мукозная иммунизация может оказаться эффективной, для того, чтобы получить в случае многих инфекций эффективный иммунный ответ, необходимо сочетание мукозной и немукозной иммунизации.
С учетом сказанного выше, для разработки коммерчески выгодной и доступной вакцины необходим экономически выгодный адъювант, который максимизировал бы эффект вакцины и был бы способен обеспечить ее безопасную доставку, а также массовое производство выбранного антигенного вещества. Кроме того, необходим адъювант, который мог бы применяться через кожу, через слизистую оболочку и на уровне целого организма.
Краткое описание изобретения
Авторы настоящего изобретения предприняли обширные усилия с целью разработки более эффективного и безопасного адъюванта, в результате чего обнаружили, что в качестве адъюванта эффективна поли-гамма-глутаминовая кислота, доказав при этом, что поли-гамма-глутаминовая кислота, продуцируемая Bacillus sp., усиливает эффект различных антигенных и вакцинных веществ, что и составило предмет настоящего изобретения.
Таким образом, основной целью настоящего изобретения является создание композиции для иммуностимулятора (адъюванта), включающего эффективную дозу поли-гамма-глутаминовой кислоты.
Другой целью настоящего изобретения является создание композиции для вакцины, включающей указанный адъювант и антиген.
Другие признаки и варианты осуществления настоящего изобретения станут более очевидными из следующего детального описания и формулы изобретения.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 - график, показывающий титр специфичных к нуклеопротеиновому антигену IgG-антител в сыворотке через определенный промежуток времени после инъекции поли-гамма-глутаминовой кислоты и нуклеопротеинового (N) антиген свиного инфекционного вируса Transmissible gastroenteritis virus под кожу крыс.
Фиг.2 - график, показывающий титр специфичных к HBs-антигену IgG-антител в сыворотке через определенный промежуток времени после инъекции поли-гамма-глутаминовой кислоты и поверхностного антигена (L-частицы) вируса гепатита В (HBV) в брюшинную полость мышей.
Фиг.3 - график, показывающий титр специфичных к VP2-антигену IgG-антител в сыворотке через определенный промежуток времени после введения поли-гамма-глутаминовой кислоты и Lactobacillus, поверхностно-экспрессирующей капсидный антигенный белок VP2 парвовируса собаки, в ротовую и носовую полости мышей.
Фиг.4 - график, показывающий титр IgA-антител против VР2-антигена в кишечной и бронхоальвеолярной промывных жидкостях мышей через определенный промежуток времени после введения поли-гамма-глутаминовой кислоты и Lactobacillus, поверхностно-экспрессирующей VP2, который является капсидным антигенным белком парвовируса собаки, в ротовую и носовую полости мышей.
Фиг.5 - график, показывающий титр специфичных к нуклеопротеидному антигену IgG-антитела в сыворотке через определенный промежуток времени после введения поли-гамма-глутаминовой кислоты и Lactobacillus, поверхностно-экспрессирующей нуклеопротеидный (N) антиген свиного инфекционного вируса Transmissible gastroenteritis virus в рот свиньи вместе с кормом.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение предлагает композицию для иммуностимулятора (адъюванта), содержащую эффективную дозу поли-гамма-глутаминовой кислоты и фармацевтически приемлемый носитель. В настоящем изобретении предпочтительный молекулярный вес поли-гамма-глутаминовой кислоты составляет от 10 до 10000 кДа.
Настоящее изобретение предлагает также композицию для вакцины, включающую композицию для указанного иммуностимулятора и антигенное вещество. В настоящем изобретении указанное антигенное вещество является преимущественно каким-либо из веществ, выбираемых из группы, состоящей из пептида, полипептида, Lactobacillus, экспрессирующей полипептид, белка, Lactobacillus, экспрессирующей белок, олигонуклеотида, полинуклеотида, рекомбинантной бактерии и рекомбинантного вируса. Кроме того, указанное антигенное вещество является преимущественно нуклеопротеидом (N) свиного инфекционного вируса Transmissible Gastroenteritis virus, антигенным белком VP2 парвовируса собаки или поверхностным антигеном (L-частицей) вируса гепатита В, указанное нуклеопротеидное (N) антигенное вещество является продуцирующим молочную кислоту микроорганизмом, экспрессирующим нуклеопротеид (N), а указанное УР2-антигенное вещество является продуцирующим молочную кислоту микроорганизмом, экспрессирующим VP2.
Композиция для вакцины согласно настоящему изобретению дополнительно включает, по меньшей мере, одну вторую добавку, выбираемую из группы, которую составляют стабилизатор, эмульгатор, гидроксид алюминия, фосфат алюминия, рН-регулятор, поверхностно-активное вещество, липосома, добавка типа иммуностимулирующего комплекса, синтетический гликопептид, наполнитель, карбоксиполиметилен, стенка бактериальной клетки, производные стенки бактериальной клетки, бактериальная вакцина, белок животного поксвируса, добавка субвирусной частицы, холерный токсин, N,N-диоктадецил-N',N'-бис(2-гидроксиэтил)пропандиамин, монофосфорильный липид А, бромид диметилдиоктадециламмония и их смеси. При этом композиция для вакцины согласно настоящему изобретению предназначена в основном для профилактики или лечения, по меньшей мере, одной болезни, входящей в группу, которую составляют карцинома простаты, карцинома толстой кишки, рак легких, рак груди, рак яичников, рак головы и шеи, рак наружных женских половых органов, рак мочевого пузыря, рак мозга и глиома.
Настоящее изобретение предлагает также способ повышения скорости продуцирования антител против антигена путем введения указанной композиции в виде вакцины для животных, исключая человека. В настоящем изобретении животными являются преимущественно млекопитающие или птицы, а введение осуществляется преимущественно путем гиподермической инъекции, внутримышечной инъекции, подкожной инъекции, внутрибрющинной инъекции, перназального введения, чрезкожного введения и перорального введения.
Иммуностимулятор (адъювант), содержащий поли-гамма-глутаминовую кислоту настоящего изобретения, может дополнительно содержать подходящие добавки и разбавители, обычно используемые при получении фармакологических композиций. Кроме того, иммуностимулятор (адъювант), содержащий поли-гамма-глутаминовую кислоту, согласно настоящему изобретению может быть использован при приготовлении составов для перорального применения и стерилизующего инъекционного раствора, таких как соответственно порошки, гранулы, таблетки, капсулы, суспензии, эмульсии, сироп, аэрозоли и т.д., с привлечением для этого обычных методов.
В адъювантную композицию, содержащую поли-гамма-глутаминовую кислоту, могут вводиться в качестве носителей, добавок и разбавителей лактоза, декстроза, сахароза, сорбит, маннит, ксилит, мальтит, крахмал, глицерин, аравийская камедь, альгинат, желатина, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлоза, метилцеллюлоза, микрокристаллическая целлюлоза, поливинилпирролидон, вода, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния.
В случае лекарственных препаратов последние могут быть приготовлены с использованием обычно применяемых разбавителей или добавок, таких как наполнитель, связующее, увлажняющий агент, разлагающие реагенты, ПАВ и т.д. Твердые препараты для перорального применения включают в себя порошки, пилюли, таблетки, гранулы, капсулы и т.п., причем эти твердые препараты могут быть приготовлены смещением с упомянутой поли-гамма-глутаминовой кислоты, по меньшей мере, одной добавки, например крахмала, карбоната кальция, сахарозы или лактозы, желатины и т.д. Кроме того, могут быть использованы простые добавки и смазочные средства, такие как стеарат магния и тальк. Суспензии, лекарства для внутренних болезней, эмульсии, сиропы и т.д. могут использоваться в виде жидких препаратов для перорального применения и в дополнение к воде и жидкому парафину, которые обычно используют в качестве простых разбавителей, могут включаться различные добавки, например увлажняющий агент, подсластитель, ароматические агенты, консерваторы и т.д. Препараты для парентерального применения включают в себя стерилизованный раствор, нерастворимый агент, суспензию, эмульсию и агент для сублимационной сушки. В качестве нерастворимого агента и суспензии могут использоваться растительное масло, такое как пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, оливковое масло, и инъецируемые сложные эфиры, такие как этилолеат и т.п.
Доза применения настоящего изобретения, содержащего поли-гамма-глутаминовую кислоту адъюванта, может варьировать в зависимости от возраста, пола и веса субъекта и доза вводимой вакцины может меняться в зависимости от способа введения, тяжести заболевания, пола, веса, возраста и т.д.
Используемая в настоящем изобретении поли-гамма-глутаминовая кислота сама по себе является адъювантом, который можно безопасно использовать с профилактическими целями, поскольку кислота почти не проявляет токсичности и побочных эффектов. Антигенные вещества, которые можно было бы приготовить с использованием поли-гамма-глутаминовой кислоты настоящего изобретения в качестве адъюванта для вакцины, могут выбираться из группы, состоящей из антигенов с низкой иммуногенностью или пептидов, полипептидов, белков или соответствующим их последовательностям ДНК, или клеток объекта, который является объектом вакцины или ее смеси и может выбираться из рекомбинантных бактерий или вируса, которые могут быть использованы в качестве вакцины.
Иммуностимулятор (адъювант) для вакцины настоящего изобретения может использоваться совместно при введении вакцины парентеральным, мукозным (через рот, нос и т.д.) и чрезкожным способами. При использовании в качестве вакцины микроорганизма, экспрессирующего антигенный белок, предпочтительно использовать в качестве иммуностимулятора (адъюванта) поли-гамма-глутаминовую кислоту настоящего изобретения. В частности, при использовании в качестве пероральной вакцины Lactobacillus, экспрессирующую упомянутый антигенный белок, предпочтительно одновременно использовать в качестве иммуностимулятора (адъюванта) поли-гамма-глутаминовую кислоту настоящего изобретения.
При этом поли-гамма-глутаминовую кислоту настоящего изобретения можно использовать, добавляя ее к лекарственной композиции, включающей профилактическую или лечебную вакцину, применяемую для профилактики или лечения незаразных хронических заболеваний таких как рак, в частности карцинома простаты, карцинома толстой кишки, рак легких, рак груди, рак яичников, рак головы и шеи, рак наружных женских половых органов, рак мочевого пузыря, рак мозга и глиома.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Далее настоящее изобретение описывается более детально на конкретных примерах. Однако настоящее изобретение не ограничивается этими примерами и специалисту в данной области является очевидным, что в рамках сути и объема настоящего изобретения возможны многочисленные варианты и модификации.
Пример 1. Получение поли-гамма-глутаминовой кислоты
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
-1
В 5-литровый ферментер с 3 л минимальной среды для продуцирования поли-гамма-глутаминовой кислоты (среда GS, содержащая 5% L-глутамата, 5% глюкозы, 1% (NH)SО, 0,27% КНРО, 0,42% NaHPО·12HО, 0,05% NaCl, 0,3% MgSО·7HО, 1 мл/л витаминного раствора, рН 6,8) инокулируют 1% культуральной жидкостью Bacillus subtilis var. Chungkookjang (KCTC 0697BP) и культивируют в течение 72 ч при скорости перемешивания 150 об/мин, скорости аэрации 1 мин и 37°С, после чего доводят рН до 3,0 добавлением 2 н. раствора серной кислоты, получая в результате раствор, содержащий поли-гамма-глутаминовую кислоту.
Этот раствор оставляют на 10 ч при 4°С для удаления содержащихся в ферментированном растворе полисахаридов и добавляют этанол в объеме, вдвое большем объема ферментированного раствора, после чего тщательно перемешивают. Перемешанный раствор оставляют на 10 ч при 4°С, после чего центрифугируют, получая в осадке поли-гамма-глутаминовую кислоту. Осадок растворяют добавлением дистиллированной воды, добавляют 100 мг/мл протеазы и инкубируют 6 ч при 37°С, в процессе чего происходит разрушение содержащегося в образце межклеточного белка. Раствор, содержащий поли-гамма-глутаминовую кислоту, диализуют против достаточного количества дистиллированной воды для удаления свободного глутамата, после чего упаривают, получая чистую поли-гамма-глутаминовую кислоту. В случае необходимости, в соответствии с ее применением, кислота может использоваться после приведения ее к определенному молекулярному весу путем расщепления указанной продуцированной поли-гамма-глутаминовой кислоты каким-либо подходящим способом, либо же для ее использования может быть привлечено выделение в соответствии с каким-либо данным молекулярным весом с помощью какого-либо подходящего способа разделения. В приведенных далее примерах используется поли-гамма-глутаминовая кислота с молекулярными весами 5 кДа, 10 кДа, 20 кДа, 20 кДа, 50 кДа, 1000 кДа и 2000 кДа.
Пример 2. Продуцирование антитела против антигена TGE-вируса с помощью поли-гамма-глутаминовой кислоты
В этом примере с целью изучения того, проявляет ли поли-гамма-глутаминовая кислота изобретения иммуностимулирующий эффект, специфичный по отношению к растворимому антигену, из специфичных к антителу иммунных ответов было, в частности, изучено влияние на гуморальный иммунный В-клеток, участвующих в продукции антител. В качестве антигена был использован нуклеопротеид (N) инфекционного вируса Transmissible Gastroenteritis virus (TGE), который индуцирует инфекционные заболевания пищеварительных органов свиньи, а в качестве подопытных животных были использованы кролики.
В качестве контрольной группы использовали кроликов, которым подкожно вводили только антиген TGEN (400 мкг/PBS мл), а в качестве испытуемой группы кроликов, которым подкожно вводили смеси антигена TGEN (400 мкг/PBS мл) с поли-гамма-глутаминовыми кислотами с молекулярными весами 5 кДа, 10 кДа, 20 кДа и 50 кДа соответственно.
Через две недели после первой подкожной инъекции вводили то же количество антигена и поли-гамма-глутаминовой кислоты с соответствующим молекулярным весом. После первой подкожной инъекции один раз в 2 недели у кроликов отбирали сыворотку крови и измеряли в сыворотке титр антитела против антигена TGEN методом ELISA (ферментный иммуносорбентный анализ).
При анализе сывороток методом ELISA сыворотки кроликов контрольной группы и испытуемой группы инкубировали (сериями с разными степенями разведения) с планшетами, сенсибилизированными антигеном TGEN (0,1 мкг/мл), которые предварительно блокировали PBS, содержащим 5% фетальной сыворотки быка. После этого добавляли конъюгированное с пероксидазой хрена анти-IgG антитела кролика (специфичное к Fc). Каждую инкубацию проводили в течение 1 часа при 37°С и после чего планшеты трижды промывали PBS/0,05% Tween 20. В качестве субстрата использовали 1 мг/мл ABTS (2,2-азино-бис(3-этилбензотиазолинсульфокислота) через 30 мин после добавления субстрата с помощью мультиканального спектрофотометра (ридера) измеряли поглощение при 450 нм.
Результаты, приведенные на фиг.1, показывают, что в случае совместного введения с помощью подкожных инъекций поли-гамма-глутаминовых кислот различной молекулярной массы и антигена TGEN титр антитела против антигена TGEN у кроликов был выше по сравнению с тем же титром у кроликов, которым с помощью подкожных инъекций вводили только антиген TGEN. В частности, наивысший титр был в случае введения антигена TGEN с поли-гамма-глутаминовой кислотой с молекулярной массой 50 кДа. Кроме того, было показано, что титр антител значительно повышается, по крайней мере, до 6 недель, по сравнению с контрольной группой после первой инъекции.
Пример 3. Продуцирование антитела против антигена вируса HBV с использованием поли-гамма-глутаминовой кислоты
В этом примере специфичный иммуностимулирующий эффект (гуморальный иммунный ответ) на другой растворимый антиген при внутрибрюшинном введении поли-гамма-глутаминовой кислоты (поверхностный антиген (L-частица) вируса гепатита В (HBV), полученный из дрожжей) проводили с использованием в качестве подопытных животных мышей Balb/c.
В качестве контрольной группы использовали шестинедельных мышей-самок Balb/c, которым внутрибрюшинно вводили очищенный антиген L-частицы HbsAg (поверхностный антиген вируса гепатита В), (1 мкг/мл PBS), а для испытуемой группы антиген L-частицы HbsAg (1 мкг/мл PBS) смешивали с поли-гамма-глутаминовыми кислотами (γ-PGA), имеющими молекулярные веса 10 кДа, 50 кДа и 1000 кДа соответственно и вводили внутрибрюшинно. Наряду с этим для эксперимента использовали также (с другими концентрациями антигена) контрольную группу, в которой мышам вводили внутрибрюшинно только очищенный антиген L-частицы HbsAg (0,5 мкл/мл PBS), а испытуемой группе вводили интраперитонеально смеси антигена L-частицы HbsAg (0,5 мкл/мл PBS) с поли-гамма-глутаминовыми кислотами (γ-PGA), имеющими молекулярные веса 10 кДа, 50 кДа и 1000 кДа соответственно. Через 5 недель после внутрибрюшинной инъекции у испытуемой группы и контрольной группы отбирали кровь и измеряли методом ELISA (иммуноферментный анализ) скорость сероконверсии анти-HbsAg L-частицы в сыворотке и титр антитела. ELISA выполняли так же как в примере 2 с использованием планшет, сенсибилизированных антигеном L-частицы HbsAg (1 мг/мл).
Результаты, приведенные на фиг.2, показывают, что в случае совместного введения с помощью внутрибрюшинных инъекций предлагаемых изобретением поли-гамма-глутаминовых кислот каждого молекулярного веса с антигеном L-частицы HbsAg скорость сероконверсии антитела против антигена L-частицы HbsAg и титр у мышей были пропорциональны количеству антигена L-частицы HbsAg и выше тех же характеристик в случае, когда подкожно вводили только антиген. В частности, скорость сероконверсии антитела и титр оказались наибольшими при совместном использовании с поли-гамма-глутаминовой кислотой с молекулярной массой 1000 кДа.
Пример 4. Анализ вакцинного эффекта bactobacillus, экспрессирующий на поверхности клеток, антигенный белок парвовируса собаки в присутствии поли-гамма-глутаминовой кислоты
В этом примере изучено, проявляет ли при использовании в качестве адъюванта предлагаемая изобретением поли-гамма-глутаминовая кислота специфический по отношению к антигенам иммуностимулирующий эффект (гуморальный иммунный ответ и мукозный иммунный ответ), когда в качестве вакцины используют микроорганизм, экспрессирующий наряду с растворимыми антигенами антигенный белок.
В качестве антигена использовали капсидный антигенный белок VP2 парвовируса собаки. Авторы настоящего изобретения разработали Lactobacillus, экспрессирующий на поверхности клеток указанный капсидный белок, с целью использования его в качестве новой пероральной вакцины (корейская патентная заявка №2004-007321). В данном примере скорость продуцирования антител в присутствии поли-гамма-глутаминовой кислоты изучали с использованием Lactobacillus, на поверхности которой экспрессируется указанный выше капсидный антигенный белок VP2 парвовируса собаки.
9
9
Более конкретно, в настоящем изобретении Lactobacillus, экспрессирующая на своей поверхности капсидный антигенный белок VP2 парвовируса собаки, собирают до определенной концентрации бактерий и, после промывки клеток PBS-буфером, 5×10клеток Lactobacillus, экспрессирующих на своей поверхности антиген, вводят 4-6-недельным мышам C57BL/6 перорально пять раз с интервалом в один день, спустя одну неделю - пять раз с интервалом в один день и спустя 2 недели - пять раз с интервалом в один день. Кроме этого 1×10 клеток Lactobacillus, экспрессирующих на своей поверхности антиген, вводят мышам через нос три раза с интервалом в один день, спустя одну неделю - три раза с интервалом в один день и спустя 2 недели - три раза с интервалом в один день. Эту группу мышей используют в качестве контрольной группы. Далее готовят группу, аналогичную указанной контрольной группе, давая мышам этой группы по 100 мкг поли-гамма-глутаминовой кислоты 2000 кДа, смешанных с каждой из доз Lactobacillus, и измеряют скорость продуцирования антитела, вызываемого капсидным антигенным белком VP2 у мышей группы, которой не вводили поли-гамма-глутаминовую кислоту, и группы, которой вводили смесь Lactobacillus и PGA.
После перорального введения и введения через нос отбирают мышиную сыворотку и измеряют титр антитела IgG против капсидного антигенного белка в сыворотке. Собирают также кишечники мышей и измеряют титры антитела IgG против капсидного антигенного белка в кишечной промывной жидкости и бронхоальвеолярной промывной жидкости с интервалами в две недели, используя метод ELISA.
На фиг.3 показан титр антитела IgG против антигена капсидного антигенного белка VP2 парвовируса собаки в мышиной сыворотке. А: титр антитела группы, которой перорально и интраназально вводили только Lactobacillus, на поверхности которого экспрессируется антиген капсидного антигенного белка VP2. В: титр антитела группы, которой перорально и интраназально вводили Lactobacillus, на поверхности которой экспрессируется антиген капсидного антигенного белка VP2, смешанную с поли-гамма-глутаминовой кислотой.
На фиг.4 показан определенный с помощью ELISA титр антитела IgA против антигена капсидного антигенного белка VP2 в кишечной промывной жидкости и бронхоальвеолярной промывной жидкости. А и С: титр антитела IgA группы, которой перорально и интраназально вводили только Lactobacillus, на поверхности которого экспрессируется антиген капсидного антигенного белка VP2. В и D: титр антитела IgA группы, которой перорально и интраназально вводили Lactobacillus, на поверхности которой экспрессируется антиген капсидного антигенного белка VP2, смешанную с поли-гамма-глутаминовой кислотой.
Как видно на фиг.3 и фиг.4, когда Lactobacillus, на поверхности которой экспрессируется антиген капсидного антигенного белка VP2, вводят вместе с поли-гамма-глутаминовой кислотой, подтверждается, что в сыворотке, кишечной промывной жидкости и бронхоальвеолярной промывной жидкости титры антител IgG и IgA против антигена VP2, который является капсидным антигенным белком парвовируса собаки, титры антител IgG и IgA значительно выше титров антител в контрольных группах. Из этих результатов можно заключить, что поли-гамма-глутаминовая кислота в смеси с предлагаемой изобретением Lactobacillus, на поверхности которой экспрессируется антиген капсидного антигенного белка VP2, является адъювантом, который может максимизировать эффект мукозных вакцин для перорального применения.
Пример 5. Анализ вакцинного эффекта Lactobacillus, экспрессирующей на поверхности клеток антигенный белок инфекционного вируса Transmissible gastroenteritis virus, в присутствии поли-гамма-глутаминовой кислоты
В этом примере изучен эффект адъюванта при пероральном введении свинье Lactobacillus, экспрессирующей на поверхности клеток нуклеопротеидный (N) антиген инфекционного вируса Transmissible gastroenteritis virus (TGE), который индуцирует инфекционные заболевания пищеварительных органов свиньи, в присутствии с поли-гамма-глутаминовой кислотой.
Более конкретно, в настоящем изобретении Lactobacillus, экспрессирующая на поверхности клеток нуклеокаптидный антигенный белок N инфекционного вируса Transmissibre gastroenterifis virus, coбиpaют дo определенной концентрации бактерий и, после промывки клеток PBS-буфером, рН 7,4, Lactobacillus с экспрессируемым на поверхности антигеном измельчают. Измельченную Lactobacillus смешивают с кормом для свиньи в количестве 0,3% от корма для свиньи и скармливают троим трехмесячным поросятам по 2 кг/день смешанного корма в течение 4 недель, принимая их как контрольную группу. Поли-гамма-глутаминовую кислоту 2000 кДа смешивают с Lactobacillus в количестве 3% от измельченной Lactobacillus и смешивают полученный порошок с кормом для свиньи в количестве 0,3% от корма для свиньи и затем скармливают троим трехмесячным поросятам по 2 кг/день смешанного корма в течение 4 недель, принимая их как испытуемую группу. После кормления с интервалами в 2 недели отбирают сыворотку и измеряют титр антитела IgG против антигенного N-белка в сыворотке с помощью ELISA.
Результаты, приведенные на фиг.5, показывают, что в случае скармливания смеси Lactobacillus, на поверхности которой экспрессируется антиген N-белка, и поли-гамма-глутаминовой кислоты, титр антитела IgG в сыворотке является высоким в сравнении с титром в случае, когда скармливался один антиген нуклеокапсидного антигенного N-белка. Эти результаты подтверждают то, что предлагаемая изобретением поли-гамма-глутаминовая кислота является адъювантом, который может максимизировать эффект мукозных вакцин для перорального применения.
Хотя изобретение было описано в деталях со ссылками на конкретные признаки, специалисту в данной области должно быть очевидно, что это описание относится лишь к одному из предпочтительных вариантов осуществления и не ограничивает объема настоящего изобретения. Таким образом, значительный объем настоящего изобретения ограничивается прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.
Промышленная применимость
Настоящее изобретение способно предложить композицию для иммуностимулятора (адъюванта), включающую в себя эффективную дозу поли-гамма-глутаминовой кислоты. Настоящее изобретение способно также предложить композицию для вакцины, включающую указанный иммуностимулятор и антиген. Предлагаемый изобретением адъювант не токсичен, не имеет побочных эффектов и стимулирует образование антител с высоким титром даже при его применении с антигеном, обладающим низкой иммуногенностью, благодаря чему он может применяться путем добавления его к лекарственным составам, включающим профилактические или лечебные вакцины для незаразных хронических заболеваний, а также рака, в частности карциномы простаты, карциномы толстой кишки, рака легких, рака груди, рака яичников, рака головы и шеи, рака наружных женских половых органов, рака мочевого пузыря, рака мозга и глиомы.