Фосфатазный метод контроля пастеризации в применении к простокваше и кефиру

Фосфатазный метод контроля пастеризации в применении к простокваше и кефиру

Из кафедры гигиены питания Центрального института усовершенствования врачей

Стандартные методы, позволяющие на основании действия фермента пероксидазы судить о пастеризации молока, мало точны. Опыты, проведенные нами, показали, что молоко, подвергнутое пастеризации при 63° в течение 30 минут, дает реакцию на пероксидазу, как сырое молоко. С. Я. Михлин и Г. К. Шлыгин указывают, что при нагревании молока при 69° в течение часа разрушается только половина имеющегося количества пероксидазы '. ,

Более чувствителен фосфатазный метод. Работы, проведенные •С. Я. Михлиным и Г. К. Шлыгиным и рядом иностранных ученых, показали, что фермент фосфатаза полностью разрушается при нагревании молока при 63° в течение 30 минут. Нарушение условий пастеризации в сторону понижения температуры (нагревание при 59° в течение 30 минут) или времени пастеризации обнаруживается положительной реакцией на фосфатазу.

Согласно действующим стандартам, простокваша и кефир должны приготовляться из пастеризованного молока. Это требование имеет важное противоэпидемическое значение.

Существует несколько методов определения фосфатазы в молоке, которые основаны на том, что этот фермент расщепляет эфиры фосфорной кислоты. Определяя компоненты, образовавшиеся при расщеплении эфира, можно судить об активности фосфатазы.

Мы в своей работе применили для определения фосфатазы натриевую соль фенолфталеинфосфата.

Литературные данные указывают, что в молоке содержится главным образом щелочная монофосфатаза, максимум действия которой проявляется при рН = 8,1. При рН = 4,7 фермент инактивизируется.

Ряд микроорганизмов, например, стрептококк, дрожжи вида БассЬа-гашусеБ cerewisiae и др., содержит фосфатазу, как показали данные Кинга. Следовательно, с одной стороны, надо считаться с возможностью обнаружить отсутствие фосфатазы в молочнокислых продуктах, приготовленных из сырого молока (при высокой кислотности продукта), и, с другой стороны, молочные продукты, приготовленные из пастеризованного молока, могут содержать фосфатазу за счет микроорганизмов, размножившихся при приготовлении продукта.

Учитывая все эти обстоятельства, мы в своей работе исследовали исходное молоко как сырое, так и после пастеризации. Пастеризация молока проводилась как медленная при температуре 63° в течение 30 минут, так и быстрая в заводских условиях в пастеризаторе «Астра». Из молока, далее, приготовлялись молочные продукты: 1) путем само-сквашива>ния (т. е. под действием случайных микробов); 2) под дей-ствиет чистых культур молочнокислых микробов: стрептококка, болгарской палочки, ацидофильной палочки и кефирной закваски; 3) применением заводских заквасок в лаборатории комбината имени М. Горького. В полученных молочнокислых продуктах проверялась кислотность и содержание фосфатазы сразу после приготовления и после продолжительного хранения. Проверялись также свежие продажные молочные продукты и эти же продукты после продолжительного хранения при комнатной температуре.

1 Гигиена и санитария, № 1, 1950.

Активность фосфатазы в простокваше, приготовленной из сырого и пастеризованного молока

Наименование продукта

Г О.

О) ib-

Температура 20°

со к

О X

= - *

ОС и

ы х га

О X с.

а. <и -л

о с: о

н и о. х о и

X X О

Температура 45°

ее

о я

с м

к <->

M X га

О ж о-

а. си и

и ч о

х s

и м х л " OhS Н О CL X о * X X о

I Молоко сырое......... 22° 7 минут ++ 2 минуты ++

Простакваша самоквас из этого молока .............. 104° 8 минут + 2 минуты ++

2 Молоко, пастеризованное при температуре bó° в течение 30 минут 22° — — — —

Простокваша самоквас из этого молока.............. 63° _ _ _ _

3 Молоко, пастеризованное при температуре 63° в течение ¿0 минут 21° ;— — _ —

Простокваша из этого молока, заквашенная простоквашей из опыта 2 101° - — — —

4 Молоко, пастеризованное при температуре 59° в течение 30 минут 22° 24 часа + 24 часа ++

Простокваша самоквас из этого молока .............. 64° 24 часа + 24 часа +

5 Молоко (800 мл), доведенное в кипящей водяной бане до температуры 90° за 5 минут...... . 21°

Простокваша из этого молока, заквашенная простоквашей из 123°

6 Молоко, пастеризованное при температуре 59° в течение 30 минут 21° 1 час + 10 минут +

Простокваша из этого молока, заквашенная простоквашей из опыта 3 ............. 95° 2 часа + 28 минут +

7 Простокваша из молока, пастеризованного при температуре 63° в течение 10 минут ....... 116° 24 часа + 24 часа +

8 Простокваша из молока, пастеризованного при температуре 63° в течение 20 минут ........ 152° 24 часа + 24 часа +

9 Простокваша из сырого молока 144° 27 минут + 6 минут +

10 Простокваша из пастеризованного молока, к которому было прибавлено 5и/0 сырого молока . . 102° 2»/а часа + 1 час +

11 Простокваша из пастеризованного молока, к которому был прибавлен 1% сырого молока........ 128° _ _ _ _

12 Простокваша из пастеризованного молока, заквашенная 2°/0 сметаны (из сырых сливок)...... 132° 4>/г часа + 4>/5 часа +

13 Ацидофилин продажный..... 137° — — — —

14 Молоко сырое......... 20° 4 минуты + 1 минута +

Ацидофилин из этого молока . . 136° 9 минут + 9 минут ++

15 Ацидофилин из молока, пастеризованного при температуре 63° в течение 30 минут ......... ! 120° — — - —

Продолжение таблицы 1

| >* опыта Наименование продукта Кислотность в градусах Тернера Температура 20° Температура 45°

срок появления окраски интенсивность окраски срок появления окраски интенсивность окраски

16 Молоко, пастеризованное при ++

температуре 63° в течение К) минут 20° 24 часа ++ 24 часа

Ацидофилин из этого молока . . 126° 24 часа — 24 часа "I-

17 Ацидофилин из пастеризованного

молока, к которому прибавлен 1% 24 часа

сырого молока.......... 120° 24 часа — 1 V

18 Ацидофилин из пастеризованного

молока, к которому прибавлено +++

2°/0 сырого молока........ 140° 24 часа ++ 24 часа

19 Ацидофилин из опыта 14 после ++

стояния .............. 162° 37 минут + 10 минут

20 Простокваша из пастеризованного

молока, заквашенная чистой куль-

турой стрептококка ........ 86° — — — —

21 Простокваша из пастеризован-

ного молока, заквашенная чистой

культурой болгарской палочки . . 94° — — • — —

22 Простокваша из пастеризован-

ного молока, заквашенная чистой

культурой ацидофилина ...... 112° — — — —

23 Простокваша из кратковременно

пастеризованного молока в при-

боре „Астра" на заводской за-

кваске .............. 78° —  — —г —

24 То же............. 91° — — — '

25 180° — — — —

Определение фосфатазы проводилось в молочных продуктах без предварительной нейтрализации и после нейтрализации. Молоко и молочные продукты смешивались с реактивом на фосфатазу — натриевой солью фенолфталеинфосфата в растворе аммиачного буфера с рН=10,1. В одних случаях смесь выдерживалась при комнатной температуре до 24 часов; в других — предварительно помещалась в водяную баню при температуре 45° на 10 минут, после чего оставлялась при комнатной температуре. Действие фосфатазы сказывалось появлением розового окрашивания в смеси. Отмечалось время появления, а также интенсивность окрашивания. Едва заметное окрашивание отмечалось знаком +, ясное розовое окрашивание знаками ++, сильное — знаками +++. Отрицательная реакция отмечалась знаком —. Наблюдение проводилось в течение 24 часов.

В табл. 1 и 2 приведены данные по исследованию на фосфатазу образцов простокваши и кефира.

Данные табл. 1 и 2 показывают, что, когда простокваша и кефир приготовлены на пастеризованном молоке, реакция на фосфатазу была отрицательной вне зависимости от способа их приготовлений^ Простокваша и кефир, приготовленные на сыром молоке, давали положительную реакцию на фосфатазу. Скорость реакции несколько замедлена у простокваши и кефира по сравнению с молоком, из которого они приготовлялись, но все же достаточно высока. Простокваша и кефир, прдаотовлен-ные «а сыром молоке, давали реакцию в течение первого часа.

Активность фосфатазы в кефире

Температура 20° Температура 45°

№ опыта Наименование продукта КиСЛОТНОСТ! в градусах Тернера срок появления окраски интенсивность окраски срок появления окраски _____ интенсивность | окраски

1 Кефир продажный....... 114° — — — —

2 Кефир из молока, пастеризованного при температуре 03° в течение 30 минут ........... 128° ___ _ _ _

3 Молоко, пастеризованное фляжное ............... 23° _ — — _

Кефир из этого молока ..... 121° — — — —

4 Кефир из пастеризованного молока, к которому было прибавлено 1и/о сырого молока........ 124° 24 часа + 24 часа +

5 Кефир из пастеризованного молока, к которому было прибавлено 23/0 сырого молока........ 134° 24 часа ++ 24 часа ++

6 Молоко сырое ......... 24° 5 минут + 2 минуты +

Кефир из этого молока..... 110° 3 минуты + 7 минут ++

7 Кефир из опыта 6 после стояния 140° 24 минуты + 6 минут +

8 Кефир из сырого молока .... 147° 26 минут + 10 минут +

9 Кефир из кратковременно пастеризованного молока в приборе .Астра", заквашенный заводской закваской ............ 85° — —

Простокваша и кефир, приготовленные из молока, пастеризованного при температуре 59° в течение 30 минут, и из молока, пастеризованного при температуре 63° в течение 10 минут, давали реакцию на фосфатазу через 24 часа. Простокваша и кефир, приготовленные на пастеризованном молоке с примесью сырого молока от 2% и выше, давали ясную реакцию. Прибавление 1% сырого молока к пастеризованному не всегда обнаруживалось в простокваше и кефире, приготовленных из такого •молока.

Хранение этих продуктов при комнатной температуре и увеличение в связи с этим их кислотности замедляет действие фосфатазы, но при кислотности 162° у ацидофилина, 114" — у простокваши и 140° — у кефира активность фосфатазы была все же высокой.

Опыты, результаты которых приведены в табл. 1 и 2, были проделаны с образцами простокваши и кефира после их предварительной нейтрализации до слабо щелочной реакции на фенолфталеин. Реакция на фенолфталеин проверялась капельным методом на часовом стекле. В дальнейших опытах мы решили проверить, как будет протекать реакция без предварительной нейтрализации и с прибавлением увеличенного количества реактива на фосфатазу. Данные этих опытов приведены в табл. 3.

Активность фосфатазы в простокваше и кефире без нейтрализации с увеличенным количеством реактива

4 Температура 2<>° 1 Температура 45°

«о н 2 с о Наименование продукта Кислотност! в градусах Тернера срок появления окраски интенсивность окраски срок появления окраски интенсивность окраски

1 Простокваша из сырого молока без нейтрализации с I мл реактива ............... 9и° 2 часа -н- 2 часа ++

То же, с 2 мл реактива..... 2 часа + 2 часа +

То же, нейтрализованная с 1 мл 2 часа ++ 2 часа +++

То же, с 2 мл реактива..... 2 часа + 2 часа ++

2 Простокваша из сырого молока, заквашенная стрептококком и болгарской палочкой без нейтрализации с 1 мл реактива ....... 110" 1 час ++ 8 минут +

То же, с 2 мл реактива..... 1 час ++ 10 минут +

То же, нейтрализованная с 1 мл 1 час -1—1-4- 5 минут +

То же, с 2 мл реактива..... 1 час ++ 7 минут -1-

3 Простокваша из сырого молока без нейтрализации с 1 мл реактива ............... 161° _ _ _ _

То же, нейтрализованная с 1 мл реактива ............. 24 часа + 2-1 часа +++

4 Простокваша из сырого молока без нейтрализации с 1 мл реактива .............. 70е 10 минут + 6 минут +

То же, нейтрализованная с 1 мл реактива ............. 7 минут + 3 минуты +

5 Простокваша из сырого молока без нейтрализации с 1 мл реактива ...... ....... 118° 1 час + 30 минут ++

То же, нейтрализованная с 1 мл реактива ............. 30 минут + 10 минут ++

6 Кефир нз сырого молока без нейтрализации с 1 мл реактива . . 107° 70 минут + 70 минут ++

То же, с 2 мл реактива ..... 70 минут — 70 минут ++

То же, нейтрализованная с 1 мл реактива ............. 70 минут ++ 70 минут +++

То же, с 2 мл реактива..... 70 минут + 70 минут ++

7 Кефир из сырого молока без нейтрализации с 1 мл реактива . . 172° 24 часа + 21 часа +

То же, нейтрализованная с 1 мл реактива ............. 24 часа ++ 24 часа ++

Данные табл. 3 показывают, что после предварительной нейтрализации активность фосфатазы в простокваше и кефире проявляется несколько быстрее, особенно у более кислых продуктов. Увеличение прибавляемого реактива не сказывается на активности фосфатазы. Реакция на фосфатазу происходит быстрее три 10-минутном нагревании смеси в водяной бане, нагретой до температуры 45°, и дальнейшем хранении при комнатной температуре. Нагревание до температуры 37° и дальнейшее хранение при комнатной температуре дает несколько худшие результаты.

На основании проделанных опытов предлагается следующая методика определения пастеризации простокваши и кефира фосфатазным методом.

Определяют кислотность продукта в градусах Тернера. Отмеряют пипеткой 10 мл простокваши или кефира и прибавляют 1 N раствор щелочи в количестве, соответствующем 0,01 величины кислотности по Тернеру. Например, если кислотность выражается 120° по Тернеру, то к 10 мл простокваши или кефира прибавляют 1,2 мл 1 N раствора щелочи, если кислотность 90°, то—0,9 мл и т. д. 2 мл нейтрализованного продукта отмеряют в пробирку, прибавляют 1 мл реактива на фосфатазу и 3 капли хлороформа. Пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают на 10 минут в водяную баню, нагретую до температуры 45—47°. Через 10 минут вынимают пробирку и оставляют стоять при комнатной температуре. Бели розовое окрашивание не появится через 24 часа, то,значит, простокваша и кефир приготовлены на пастеризованном молоке. В свежеприготовленных простокваше и кефире без повышенной кислотности возможно проводить определение фосфатазы без предварительной нейтрализации.

Приготовление реактива на фосфатазу:

0.1.г натриевой соли фенолфталеинфосфата растворяют в 100 мл аммиачного буфера, состоящего из 1 части 1 N раствора хлористого аммония и 4 частей 1 N раствора аммиака. Раствор реактива сохраняют в темной склянке в прохладном месте.

Выводы

1. Различные культуры молочнокислых микробов, применяемые для получения простокваши и кефира, не дают реакции на фосфатазу. Простокваша и кефир, приготовленные из пастеризованного молока путем самокваса, прибавления чистых культур стрептококка, болгарской палочки, ацидофильной палочки, кефирной закваски, а также заводских заквасок, реакции на фосфатазу не дают.

2. При определении фосфатазы в простокваше и кефире с высокой кислотностью необходима предварительная нейтрализация продукта до слабо щелочной реакции по фенолфталеину.

3. Лучшие результаты получаются при нагревании продукта с реактивом на фосфатазу в водяной бане в течение 10 минут при температуре 45° и последующем выдерживании при комнатной температуре.

4. Исследования, проведенные на 80 образцах простокваши и 30 образцах кефира, дают возможность надеяться, что после массового испытания на практике, особенно в заводских лабораториях, метод можно будет рекомендовать для стандартизации.

V V *

>