СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА ФАКТОРА VIII, ИМЕЮЩЕГО УЛУЧШЕННОЕ СООТНОШЕНИЕ FVIII:C/FVIII:Ag

1. Способ производства продукта Фактора VIII, имеющего соотношение FVIII:C/FVIII:Ag, по меньшей мере, 0,7 в продукте Фактор VIII с помощью хроматографии, в которой, по меньшей мере, одна хроматографическая стадия выполнялась с помощью аффинной хроматографической смолы, обладающей аффинностью к специфическому связыванию Фактора VIII, на которую воздействовал лиганд аффинности, который был иммобилизован на смоле для аффинной хроматографии, упомянутый лиганд аффинности представляет собой 13 кДа Fab-фрагмент антитела дрожжевого происхождения, направленный против молекулы Фактора VIII.
2. Способ увеличения соотношения FVIII:C/FVIII:Ag до, по меньшей мере, 0,7 и получения высокого содержания мономера фактора VIII ≥ 98% и практического отсутствия агрегатов Фактора VIII, в котором, по меньшей мере, одна хроматографическая стадия выполняется путем использования, по меньшей мере, одной хроматографической стадии на анионообменной хроматографической смоле.
3. Способ увеличения соотношения FVIII:C/FVIII:Ag до, по меньшей мере, 0,7 и получения высокого содержания мономера фактора VIII ≥ 99% и практического отсутствия агрегированного Фактора VIII, в котором, по меньшей мере, одна хроматографическая стадия выполняется путем использования стадии эксклюзионной хроматографии.
4. Способ по п. 1, в котором молекула Фактора VIII представляет собой комплекс легкой цепи и тяжелой цепи, и улучшение соотношения FVIII:C/FVIII:Ag является результатом истощения легкой цепи Фактора VIII, тяжелой цепи Фактора VIII и/или диссоциированной от комплекса легкой цепи Фактора VIII/тяжелой цепи Фактора VIII.
5. Способ по п. 1 или 4, в котором хроматографическая стадия выполняется при условиях, когда Фактор VIII связан с аффинной смолой и когда диссоциированная легкая цепь отмывается перед элюцией Фактора VIII, причем
связывание Фактора VIII на аффинной хроматографической смоле происходит при условии низкой солености, эквивалентной концентрации 0,1 - 0,5 моль/кг хлористого натрия,
отмывка аффинной хроматографической смолы при повышенной концентрации соли в диапазоне 0,3 - 4 моль/кг хлористого натрия для устранения легкой цепи, и
если требуется, элюция и сбор Фактора VIII в отдельную фракцию путем использования концентрации соли в диапазоне 0,5 - 4 моль/кг хлористого натрия в комбинации с 40 - 60% этиленгликоля.
ab
6. Способ по п. 1 или 4, в котором аффинная смола основывается на агарозном матриксе с поперечной сшивкой со средним размером частиц 74 мкм и том, что лиганд аффинности 13 кДа фрагмент F антитела дрожжевого происхождения связан с матриксом через гидрофильную спейсерную ножку, чтобы сделать лиганд более доступным для связывания с молекулой Фактора VIII, и лиганд аффинности связывается с легкой цепью Фактора VIII биологически активной молекулы Фактора VIII.
7. Способ по п. 1 или 4, в котором условия аффинной хроматографии содержат, по меньшей мере, два следующих условия:
- смола загружается биологически активным Фактором VIII, по меньшей мере 5000 IU/мл смолы, предпочтительно, по меньшей мере 10000 IU/мл смолы, а наиболее предпочтительно - более чем 20000 IU/мл смолы;
2
- загрузка фактора VIII: 0,1 - 0,5 моль/кг NaCl, 0,01 - 0,05 моль/кг CaCl, 0,01 - 0,05 моль/кг L-гистидина, 0,005 - 0,05% (вес/вес) Polysorbate 80, 0,5 - 2% Triton X-100, 0,1 - 1% TNBP при pH 6,2 - 6,8;
2
- отмывка: 0,5 - 4 моль/кг NaCl, 0,01 - 0,05 моль/кг CaCl, 0,01 - 0,05 моль/кг L-гистидина, 0,005 - 0,05% (вес/вес) Polysorbate 80 при pH 6,2 - 6,8;
2
- элюция фактора VIII: 0,5 - 4 моль/кг NaCl, 40 - 60% этиленгликоля, 0,01 - 0,05 моль/кг CaCl, 0,01 - 0,05 моль/кг L-гистидина, 0,005 - 0,05% (вес/вес) Polysorbate 80 при pH 6,2 - 6,8.
8. Способ по п. 1 или 4, в котором аффинная хроматографическая смола представляет собой основной агарозный матрикс с поперечной сшивкой.
9. Способ по п. 8, в котором упомянутый лиганд аффинности связывается с частью легкой цепи FVIII и устраняет ее специфическим образом.
10. Способ по п. 2, в котором анионообменная хроматография выполняется при условиях, что Фактор VIII связан с анионообменной хроматографической смолой и что биологически неактивные формы устранены с анионообменной хроматографической смолы либо до, либо после элюции биологически активного Фактора VIII, причем
Фактор VIII загружен при условиях низкой солености, эквивалентной концентрации 0,01 - 0,15 моль/кг хлористого натрия для связывания Фактора VIII и устранения неактивных форм Фактора VIII, и отмывка анионообменной хроматографической смолы [проводится] при условиях умеренной солености, эквивалентной концентрации 0,15 - 0,3 моль/кг хлористого натрия для устранения неактивных форм Фактора VIII, и элюции и сбора интактного мономерного Фактора VIII с анионообменной хроматографической смолы в отдельную фракцию путем использования условий высокой солености, эквивалентной концентрации 0,3 - 1 моль/кг хлористого натрия.
11. Способ по п. 2 или 10, в котором биологически неактивный Фактор VIII устранен с помощью анионообменной хроматографической стадии и получившаяся фракция мономерного продукта отвечает, по меньшей мере, двум из нижеследующих хроматографических условий:
- смола загружена биологически активным Фактором VIII, по меньшей мере, 10000 IU/мл смолы, предпочтительно, по меньшей мере, 15000 IU/мл смолы, а наиболее предпочтительно - более чем 20000 IU/мл смолы;
2
- условия загрузки фактора VIII: 0,05 - 0,15 моль/кг NaCl, 0,01-0,05 моль/кг CaCl, 0,01 - 0,05 моль/кг L-гистидина, 0,005 - 0,05% (вес/вес) Polysorbate 80 при pH 6,0 - 7,5;
2
- условия отмывки: 0,15 - 0,3моль/кг NaCl, 0,01 - 0,05 моль/кг CaCl, 0,01 -0,05 моль/кг L-гистидина, 0,005 - 0,05% (вес/вес) Polysorbate 80 при pH 6,0 - 7,5;
2
- условия элюции Фактора VIII: 0,3 - 0,5 моль/кг NaCl, 0,01 - 0,05 моль/кг CaCl, 0,01 - 0,05 моль/кг L-гистидина, 0,005 - 0,05% (вес/вес) Polysorbate 80 при pH 6,0 - 7,5.
12. Способ по п. 2 или 10, в котором анионообменная смола является сильным анионообменником с четвертичным ионом амина в качестве лиганда, связанного с поперечно сшитым 6% матриксом со сферическим диаметром 45 - 165 мкм, с общей емкостью связывания ионов 0,18 - 0,25 ммоль/мл.
13. Способ по п. 3, в котором стадия эксклюзионной хроматографии содержит, по меньшей мере, два из нижеследующих хроматографических условий:
- загрузка образца составляет 4 - 8% объема колонки,
- высота колонки 60 - 90 см,
- концентрация биологическим активного Фактора VIII в загруженном образце составляет, по меньшей мере, 10000 IU/мл, предпочтительно, по меньшей мере, 15000 IU/мл, а наиболее предпочтительно более чем 20000 IU/мл,
2
- буфер уравновешивания колонки для оптимальной агрегации неактивных форм Фактора VIII: 0,2 - 0,7 моль/кг NaCl, 0,01 - 0,05 моль/кг CaCl, 0,01 - 0,05 моль/кг цитрата натрия, 0,5 - 2% (вес/вес) сахарозы, 0,5 - 2% (вес/вес) L-аргинина, 0,1 - 1% (вес/вес) Poloxamer 188 при pH 6,0 - 7,5,
в которой биологически активный Фактор VIII собирали в фракцию мономерной формы, тогда как неактивный Фактор VIII обнаруживался либо в пике агрегатов и/или в фракции пика фрагментов стадии эксклюзионной хроматографии и
- сбор мономера Фактора VIII начинается, когда пик поглощения 30 - 40 mAU регистрируется после колонки, и заканчивается, когда пик поглощения возвращается к 1 - 40 mAU, что соответствует 2-3-кратному количеству к апплицированному образцу.
14. Способ по п. 3 или 13, в котором эксклюзионная хроматографическая смола представляет собой сферическую среду агароза/декстран с поперечной сшивкой со средним диаметром 34 мкм и оптимальным диапазоном разделения между 10000 - 600000 дальтон.
15. Продукт Фактора VIII, который можно получить по способу по любому из пп. 1-14 для лечения гемофилии и устранения формирования ингибиторов, продукт, который стабилен в замороженном и лиофилизированном состоянии в течение, по меньшей мере, 6 месяцев, предпочтительно, в течение по меньшей мере, 12 месяцев, более предпочтительно - в течение, по меньшей мере, 24 месяцев, а наиболее предпочтительно - до 36 месяцев.
16. Фактор VIII по п. 15, характеризующийся тем, что часть биологически активного Фактора VIII (FVIII:C) относительно общего количества Фактора VIII (FVIII:Ag) составляет ≥ 0,7, предпочтительно ≥ 0,8, более предпочтительно ≥ 0,9, а наиболее предпочтительно 1, и содержание мономера фактора VIII составляет ≥ 98%, предпочтительно, ≥ 99%, а наиболее предпочтительно 100% после последней стадии и что практически не может быть обнаружено агрегированного Фактора VIII.
17. Продукт по п. 15 или 16, характеризующийся тем, что сохраняет биологическую активность, высокое содержание мономерного Фактора VIII и низкое содержание агрегатов Фактора VIII.
18. Продукт по п. 15 или 16, характеризующийся тем, что молекула Фактора VIII происходит из плазмы, рекомбинантного происхождения и/или является производным делеции или усеченной формой Фактора VIII, обладающей биологической активностью, в частности, FVIII с делецией B-домена.
19. Продукт по п. 18, характеризующийся тем, что в случае рекомбинантного происхождения и/или происхождения в результате делеции, он продуцируется в клетках человека.
20. Продукт по п. 19, характеризующийся тем, что количество ингибиторов у ранее леченных или не леченных от гемофилии A пациентов, получивших лечение продуктом, составляет < 25%, предпочтительно < 20%, более предпочтительно < 10%, а наиболее предпочтительно 0%.
21. Продукт по п. 20 в глубокозамороженной форме, в частности при -50°С до -80°С, или в лиофилизированной форме.
22. Продукт по п. 21, в котором присутствует, по меньшей мере, один крио-/лиопротектор, по меньшей мере один наполнитель и/или буферный агент.
23. Способ по п. 1 или 4, в котором упомянутый лиганд аффинности связывается с частью легкой цепи FVIII и устраняет ее специфическим образом.
24. Продукт по п. 17, характеризующийся тем, что молекула Фактора VIII происходит из плазмы, рекомбинантного происхождения и/или является производным делеции или усеченной формой Фактора VIII, обладающей биологической активностью, в частности, FVIII с делецией B-домена.