СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММАРНОЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
METHOD OF TOTAL ANTIOXIDANT EFFECT DEFINITION FOR BIOACTIVE SUBSTANCES

Изобретение относится к области медицины, фармакологии, аналитической химии и может быть использовано для оценки антиоксидантной активности (АОА) различных лекарственных экстрактов и препаратов, пищевых продуктов, напитков и биологически активных добавок к пище (БАД). АОА лекарственного препарата является одним из важнейших показателей его качества и мерой его биологической активности; она характеризует восстановительные свойства препарата, т.е. его способность вступать в реакцию с активными формами кислорода, которые возникают в организме при неполном восстановлении кислорода до активных кислородсодержащих свободных радикалов, в частности супероксидного анион-радикала, гидропероксидного радикала, пероксида водорода, гидроксил радикала и др. Многие биохимические реакции, обеспечивающие жизнедеятельность клеток, органов и организма в целом, протекают с образованием и участием свободных радикалов. Но увеличение концентрации радикалов выше нормальных значений может привести к возникновению окислительного стресса. Эти радикалы окисляют липиды в клеточных мембранах, белки тканей, энзимы, полисахариды и ДНК при их избытке или при снижении антиоксидантной системы организма человека, что приводит к тяжелым заболеваниям и старению.
Для поддержания необходимой концентрации в организме свободных радикалов используются лекарственные препараты и биологически активные вещества (БАВ) (в т.ч. в виде БАД), обладающие АОА.
В последнее время значительно возросла актуальность определения показателя суммарной антиоксидантной активности препаратов в связи с необходимостью жесткого контроля качества лекарственных препаратов, биологически активных веществ, пищевых продуктов и напитков, а также для повышения качества лечения и профилактики заболеваний.
Известен метод определения АОА по ингибированию реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ) (Владимиров Ю.А., Арчаков A.M. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972, 252 с). При этом интенсивность ПОЛ определяют по цветной реакции тиобарбитуровой кислоты с продуктом окисления - малоновым диальдегидом. Этот метод является очень длительным, трудоемким и дорогостоящим. Кроме того, для его проведения требуются биологические объекты (липиды живых субстанций).
Известен способ определения количества антиоксидантов методом жидкостной хроматографии со спектроскопическим детектированием (Grosset С., Cantin P. Alarys // Analusis, 1989, 17, №7, p.409-412). Недостатками этого метода являются невозможность суммарного определения АОА (определяются только отдельные индивидуальные вещества), сложное приборное исполнение, требующее специалиста для обслуживания, и длительность определения.
Известен способ определения АОА, основанный на изменении интенсивности хемилюминесцентного свечения, пропорциональном количеству свободных радикалов (RU 2033609, 20.04.1995). Основными недостатками этого метода являются образование люминесцирующих веществ из различных индивидуальных соединений (не всегда имеющих отношение к антиоксидантам) и отсутствие избирательности к окислительным веществам в сложных многокомпонентных системах.
4
Известен способ определения суммарной АОА БАВ с помощью катодной вольтамперометрии (Короткова А.Н., Лукина А.Н., Гончаров Л.А и др. Сборник докладов научно-практического семинара «Методы оценки антиоксидантной активности биологически активных веществ лечебного и профилактического назначения». М., 2004, с.182-192). Суть этого способа заключается в том, что в качестве модельной реакции, лежащей в основе методики, используется процесс электровосстановления кислорода, идущий по механизму, подобному восстановлению кислорода в клетках организма человека и животных, а также в тканях растений. Измеряется первая катодная волна восстановления кислорода на ртутно-пленочном электроде в различных фоновых электролитах (фосфатный буфер, для апротонных сред 0.1 М NaClO и для биологических объектов - 0,9% NaCl) в области потенциалов от 0,0 до - 0,6 В. В качестве критерия АОА БАВ предлагается использовать параметр, отражающий количество «обезвреженных» активных кислородных радикалов за минуту времени, мг/л·мин. Недостатком предложенного способа является то, что результат измерения суммарной АОА является косвенным параметром. Кроме того, к существенному недостатку способа следует отнести использование ртутно-пленочного электрода, для получения которого применяют токсичные соли ртути.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ амперометрического определения суммарной АОА БАВ, основанный на измерении электрического тока, возникающего при окислении исследуемого вещества (или смеси веществ) на поверхности рабочего электрода из стеклоуглерода, находящегося при определенном потенциале (патент РФ 2238554, G01N 33/15, 20.10.2004). Электрохимическое окисление анализируемого и стандартного веществ проводят путем непосредственной поочередной подачи их в термостатируемую электрохимическую ячейку амперометрического детектора с получением сигналов в виде импульсов электрического тока, усиления сигналов, регистрации в виде выходных кривых и расчета площадей полученных пиков анализируемого и стандартного веществ, по которым производят расчет показателя АОА.
-9
-12
В условиях амперометрического детектирования хорошо окисляются соединения, содержащие гидроксильные группы, предел их обнаружения составляет 10-10 г. Поскольку основные и наиболее активные природные антиоксиданты (природные полифенолы, разные типы флавоноидов, фенольные оксикислоты, витамины и другие продукты) имеют фенольную природу, амперометрический метод наиболее пригоден для оценки их суммарной антиоксидантной активности.
Недостатком известного способа является дорогостоящая и громоздкая установка, включающая в себя: емкость для растворителя, насос, кран-дозатор, выполненный в виде многоходового крана, амперометрический детектор, состоящий из термостатируемой электрохимической ячейки со сменными рабочими электродами, усилитель тока, аналого-цифровой преобразователь, устройство регистрации выходного сигнала (компьютер с принтером) и устройство ввода анализируемого и стандартного веществ. Кроме того, этот способ требует большого расхода реагентов, в том числе, растворителя и стандартов.
Задачей предлагаемого изобретения является создание более простого в осуществлении вольтамперометрического способа измерения суммарной антиоксидантной активности фармацевтических препаратов, лекарственных растений, биологически активных добавок и пищевых продуктов (чай, вино, соки).
Для решения этой задачи предложен способ вольтамперометрического определения антиоксидантной активности биологически активных веществ на стационарном стеклоуглеродном электроде в аммиачных буферных растворах, а регистрацию вольтамперограмм осуществляют в классическом или постояннотоковом дифференциальном режиме с последующим использованием высоты регистрируемой волны (пика) для расчета антиоксидантной активности.
Предлагаемый способ осуществляют в обычной стеклянной термостатируемой трехэлектродной электрохимической ячейке с использованием серийных приборов: электронного полярографа и двухкоординатного самописца. В качестве рабочего электрода используют стационарный стеклоуглеродный электрод, а электродом сравнения и вспомогательным служат насыщенные каломельные электроды.
Для определения суммарной антиоксидантной активности различных биологически активных веществ в аммиачных буферных растворах в классическом или в постояннотоковом дифференциальном режиме в анодной области потенциалов наблюдаются четко выраженные волны (пики) окисления антиоксидантов, содержащиеся в исследуемых растворах. Использование аммиачных буферных растворов в качестве фонового электролита исключает искажение анодных волн (пиков) и увеличивает их высоту по сравнению с другими электролитами вследствие более высокой протонодонорной активности ионов аммония.
В качестве стандартных растворов используют следующие растворы общеизвестных антиоксидантов: аскорбиновой кислоты, кверцетина, дигидрокверцетина и рутина, окисляющихся в аммиачных буферных растворах при
1/2
1/2
E -0,29 В, -0,28 В, -0,15 В и -0,1 В (н.к.э.) соответственно. В зависимости от Е регистрируемых анодных пиков (волн) на вольтамперограммах исследуемых биологически активных веществ выбирают соответствующий стандартный раствор. Расчет показателя антиоксидантной активности (АОА) осуществляют по следующей формуле:
x
где I - высота пика (волны) анализируемого препарата, мм;
c
I - высота пика (волны) стандарта, мм;
x
V - объем анализируемого препарата, мл;
с
С - концентрация стандарта, г/л;
c
V - объем стандарта, мл;
ф
V - объем фонового раствора, мл;
p
V - разбавление анализируемого препарата, мл;
m - навеска анализируемого препарата, г.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Китайский зеленый чай.
1,80 г зеленого чая заливают 100 мл нагретой до кипения дистиллированной водой, накрывают часовым стеклом и настаивают в течение 5 мин, затем полученный водный экстракт фильтруют через бумажный фильтр «белая лента», охлаждают и доводят объем до 100 мл водой.
В электрохимическую ячейку заливают 4 мл аммиачного буферного раствора (фоновый раствор), продувают его азотом 5 минут и записывают классическую и дифференциальную вольтамперограммы фонового раствора при скорости развертки потенциала 20 мВ/с от -0,6 до +0,5 В в анодном направлении с использованием электронного полярографа ПУ-1М и двухкоординатного самописца ПДС-021. К фоновому раствору прибавляют 0,1 мл приготовленного водного экстракта чая, полученный раствор продувают азотом в течение 5 минут и записывают классическую и дифференциальную вольтамперограммы в области потенциалов от - 0,6 до +0,5 В. В анодной области наблюдают общий пик (волну), отвечающий процессам окисления содержащихся в анализируемой пробе антиоксидантов. Затем в этот же раствор добавляют 0,1 мл предварительно приготовленного стандартного раствора антиоксиданта - рутина с концентрацией 2,0 г/л, продувают азотом 5 минут и записывают его вольтамперограммы. Измеряют высоту пиков (волн) анализируемой пробы и стандартного раствора, а количественную оценку антиоксидантной активности анализируемого сорта чая проводят по формуле, приведенной выше. Найдено экспериментально: высота пика исследуемого чая - 67 мм, а высота пика стандарта рутина - 102 мм. Для анализируемого сорта зеленого чая АОА составляет 70,9 мг/г в расчете на сухой продукт.
Пример 2. Экстракт герани.
0,2030 г экстракта герани вносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в дистиллированной воде и доводят объем колбы дистиллированной водой до метки, а затем перемешивают.
Запись вольтамперограмм и определение высоты пиков анализируемого раствора и стандарта рутина, а также количественный расчет АОА проводился аналогично примеру 1. Для анализируемого экстракта герани АОА составляет 206,7 мг/г в расчете на сухой продукт.
Пример 3. Биологически активная добавка «Экстралайф».
0,2005 г препарата вносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в дистиллированной воде и доводят объем колбы дистиллированной водой до метки, а затем перемешивают.
Запись вольтамперограмм и определение высоты пиков анализируемого раствора препарата и стандарта рутина, а также количественный расчет АОА проводят аналогично примеру 1. Для анализируемого препарата АОА составляет 190 мг/г в расчете на сухой продукт.
Пример 4. Чай «Maitre» зеленый.
2,00 г зеленого чая заливают 100 мл нагретой до кипения дистиллированной водой, накрывают часовым стеклом и настаивают в течение 5 мин, затем полученный водный экстракт фильтруют через бумажный фильтр «белая лента», охлаждают и доводят объем до 100 мл водой.
Запись вольтамперограмм и определение высоты пиков анализируемого раствора препарата и стандарта рутина, а также количественный расчет АОА проводят аналогично примеру 1. Для анализируемого сорта чая АОА составляет 76 мг/г в расчете на сухой продукт.
Пример 5. Продукт пчеловодства - прополис.
0,2300 г прополиса вносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, заливают в нее 20 мл этилового спирта, тщательно перемешивают и оставляют полученную суспензию на 7 суток для экстракции, затем полученный спиртовый экстракт фильтруют и получают раствор для анализа.
Запись вольтамперограмм анализируемого раствора и стандарта рутина проводят на фоне смешанного аммиачного буферного раствора с этиловым спиртом (1:1), а определение высоты пиков анализируемого раствора препарата и стандарта рутина, а также количественный расчет АОА проводят аналогично примеру 1. Для прополиса АОА составляет 130 мг/г в расчете на сухой продукт.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет эффективно определять суммарную АОА БАВ с одновременным упрощением его реализации за счет использования серийного приборного оформления.