БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧНЫЕ К АНТИГЕНАМ, АКТИВИРУЮЩИМ Т-КЛЕТКИ, И ОПУХОЛЕВОМУ АНТИГЕНУ, И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
BISPECIFIC ANTIBODIES SPECIFIC FOR T-CELL ACTIVATING ANTIGENS AND A TUMOR ANTIGEN AND METHODS OF USE

Область изобретения
Данное изобретение относится к биспецифическим антителам, которые специфически связываются с антигеном, активирующим Т-клетки, и опухолевым антигеном (ТА, от англ. tumor antigen), включающим первый Fab-фрагмент и второй Fab-фрагмент, где произведен обмен либо вариабельными областями, либо константными областями между тяжелой и легкой цепями второго Fab-фрагмента; и где биспецифическое антитело не содержит Fc-домен; к способам их получения, фармацевтическим композициям, содержащим указанные антитела, и к их применению.
Уровень техники
Селективное разрушение отдельной клетки или конкретного типа клеток часто является желательным в различных клинических условиях. Например, основной целью терапии рака является специфическое уничтожение опухолевых клеток с сохранением здоровых клеток и тканей неповрежденными. Один подход заключается в селективной индукции иммунного ответа против опухоли, который вызывает атаку и последующее разрушение опухолевых клеток иммунными эффекторными клетками, такими как натуральные киллеры (NK-клетки) или цитотоксические Т-лимфоциты (CTL, от англ. cytotoxic Т lymphocytes). CTL являются наиболее мощными эффекторными клетками иммунной системы, однако они не могут быть активированы с помощью эффекторного механизма, опосредованного Fc-доменом обычных терапевтических антител. В связи с этим биспецифические антитела, которые способны связываться с поверхностным антигеном на раковых клетках и активирующим инвариантным компонентом Т-клеточного рецепторного (TCR, от англ. Т cell receptor) комплекса, привлекают интерес в последние годы. Одновременное связывание биспецифического антитела с его обеим мишенями приводит ко временному взаимодействию раковой клетки и Т-клетки, что приводит к активации цитотоксических Т-клеток и последующему лизису опухолевой клетки.
Разработано несколько форматов биспецифических антител и исследована их пригодность для опосредованной Т-клетками иммунотерапии рака. Из них так называемые молекулы BiTE (биспецифические проводники Т-клеток) были очень хорошо охарактеризованы и уже показали многообещающие результаты в клинике (обзор в Nagorsen and Bäuerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)). Молекулы BiTE являются тандемными scFv-молекулами, в которых две scFv-молекулы слиты с помощью гибкого линкера. Другие биспецифические форматы, которые оценивались на взаимодействие с Т-клетками, включают димерные антитела (Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)) и их производные, такие как тандемные димерные антитела (Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-66 (1999)). В последнее время разработаны так называемые молекулы DART (двойной аффинности), которые основаны на формате димерных антител, но обладают С-концевым дисульфидным мостиком для дополнительной стабилизации (Moore et al., Blood 117, 4542-51 (2011)). Так называемые антитела Triomab, которые представляют собой целые гибридные молекулы мышиного/крысиного IgG и в настоящее время оцениваются в клинических испытаниях, представляют большеразмерный формат (обзор в Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)).
Тем не менее, биспецифические антитела, разработанные для опосредованной Т-клетками иммунотерапии рака, как известно, до сих пор имеют серьезные недостатки, связанные с их эффективностью, токсичностью и применимостью. Небольшие конструкции, такие как, например, молекулы BiTE - в то время как они способны эффективно соединять эффекторные клетки и клетки-мишени - имеют очень короткий период полужизни в сыворотке крови, требующий их введения пациентам путем непрерывной инфузии. С другой стороны, IgG-подобные форматы - в то время как они имеют большую пользу из-за длинного периода полужизни - страдают от токсичности, связанной с нативными эффекторными функциями, присущими молекулам IgG. Этот иммуногенный потенциал представляет собой еще один признак IgG-подобных биспецифических антител, неблагоприятный для успешной терапевтической разработки. Наконец, одной из основных задач в общей разработке биспецифических антител остается продукция конструкций биспецифических антител в достаточном для клиники количестве и чистоте. Ошибочное спаривание тяжелых и легких цепей антител с различными специфичностями при совместной экспрессии уменьшает выход правильно собранной конструкции и приводит к образованию ряда нефункциональных побочных продуктов.
Учитывая трудности и недостатки, связанные с имеющимися в настоящее время биспецифическими антителами для опосредованной Т-клетками иммунотерапии рака, остается потребность в новых, усовершенствованных форматах таких молекул. Теперь эти недостатки преодолены посредством новых биспецифических антител изобретения. Новые биспецифические антитела можно легко получить с повышенным выходом благодаря сниженному количеству ошибочно спаренных побочных продуктов, которые демонстрируют меньшую агрегацию, чем фрагменты биспецифических антител, известные в данной области. Применение подхода перехлеста может обеспечить правильную ассоциацию LC без необходимости создавать общую легкую цепь. Кроме того, новые биспецифические антитела имеют более высокую молекулярную массу по сравнению со многими обычными фрагментами биспецифических антител, тем самым предотвращают чрезмерный клиренс почками и приводят к улучшенному времени полужизни in vivo. Новые биспецифические антитела полностью функциональны и имеют сравнимое или улучшенное связывание и активность, как у соответствующих обычных биспецифических антител.
Данное изобретение предусматривает биспецифические антигенсвязывающие молекулы, разработанные для активации и перенаправления Т-клеток, которые сочетают хорошую эффективность и продуктивность с низкой токсичностью и благоприятными фармакокинетическими свойствами.
Краткое описание
Данное изобретение относится к биспецифическим антителам, которые специфически связываются с активирующим Т-клетки антигеном и опухолевым антигеном (ТА), включающим первый Fab-фрагмент и второй Fab-фрагмент, где произведен обмен либо вариабельными областями, либо константными областями между тяжелой и легкой цепями второго Fab-фрагмента; и где биспецифическое антитело не содержит Fc-домен.
Антитела изобретения специфически связываются с опухолевым антигеном на поверхности опухолевой клетки и в то же время связываются с антигеном, активирующим Т-клетки. Поэтому биспецифическое антитело способно вызывать иммунный ответ специфически в месте опухоли, впоследствии приводя к апоптозу клетки-мишени.
В одном аспекте предусмотрено биспецифическое антитело, которое специфически связывает антиген, активирующий Т-клетки, и опухолевый антиген (ТА), содержащее по меньшей мере два Fab-фрагмента, где первый Fab-фрагмент содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, специфичный к опухолевому антигену (ТА); а второй Fab-фрагмент содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, специфичный к антигену, активирующему Т-клетки, где либо вариабельные области, либо константные области тяжелой и легкой цепи второго Fab-фрагмента поменяны; и где биспецифическое антитело лишено Fc-домена.
В частности, данное изобретение относится к биспецифическим антителам, где антиген, активирующий Т-клетки, является антигеном, направленным на CD3 Т-клеточный корецептор (CD3).
В одном аспекте предусмотрено биспецифическое антитело, которое специфически связывается с антигеном CD3 Т-клеточным корецептором (CD3) и опухолевым антигеном (ТА), включающее по меньшей мере два Fab-фрагмента, где первый Fab-фрагмент содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, специфичный к опухолевому антигену (ТА); а второй фрагмент Fab содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, специфичный к CD3 Т-клеточному корецептору (CD3), где либо вариабельные области, либо константные области тяжелой и легкой цепи второго Fab-фрагмента поменяны; и где биспецифическое антитело лишено Fc-домена. В одном воплощении первый и второй Fab-фрагменты соединены через пептидный линкер. Предпочтительно пептидный линкер является (G4S)2-линкером.
В одном воплощении указанное антитело дополнительно содержит третий Fab-фрагмент. В другом воплощении указанный третий Fab-фрагмент содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, специфичный к опухолевому антигену. В одном воплощении третий Fab-фрагмент связан с N- или С-концом легкой цепи или тяжелой цепи первого Fab-фрагмента. В другом воплощении третий Fab-фрагмент связан с N- или С-концом легкой цепи или тяжелой цепи второго Fab-фрагмента. В одном воплощении третий Fab-фрагмент соединен с первым или вторым Fab-фрагментом с помощью пептидного линкера. Предпочтительно указанный пептидный линкер является (G4S)2-линкером.
Биспецифические антитела в соответствии с изобретением являются по меньшей мере двухвалентными и могут быть трехвалентными или поливалентными, например, четырехвалентными или шестивалентными. В одном воплощении указанные биспецифические антитела являются двухвалентными (формат 1+1) с одним сайтом связывания, нацеленным на опухолевый антиген (ТА) и антиген, активирующий Т-клетки, соответственно. В другом воплощении указанные биспецифические антитела являются трехвалентными (формат 2+1) с двумя сайтами связывания, каждый из которых направлен на опухолевый антиген (ТА), и один сайт связывания направлен на антиген, активирующий Т-клетки, как описано в следующем разделе. В предпочтительном воплощении указанный антиген, активирующий Т-клетки, представляет собой CD3.
В соответствии со вторым объектом данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей биспецифическое антитело согласно данному изобретению.
В соответствии с третьим объектом данное изобретение относится к биспецифическому антителу согласно данному изобретению для лечения рака. В другом воплощении предусмотрено применение биспецифического антитела в качестве лекарственного средства. Предпочтительно указанное применение является лечением рака.
В соответствии с другими объектами данное изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую тяжелую цепь биспецифического антитела данного изобретению, к последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую легкую цепь биспецифического антитела данного изобретения, к экспрессионному вектору, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению, и к прокариотической или эукариотической клетке-хозяину, содержащей вектор данного изобретения. Кроме того, предусмотрен способ получения антитела, включающий культивирование клетки-хозяина таким образом, что продуцируется антитело.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1: Схематическое изображение типичных форматов биспецифических антител изобретения. а) С-конец молекулы Fab-Crossfab, b) N-конец молекулы Fab-Crossfab с) С-конец молекулы (Fab)2-Crossfab d) N-конец молекулы (Fab)2-Crossfab e) молекула Fab-Crossfab-Fab.
Фиг. 2: Анализ продукции и очистки hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3): SDS-Page: 4-12% Bis/Tris (NuPage [invitrogen]; окрашенный Кумасси): а) 1 - Mark 12 (invitrogen), 2 - hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) невосстановленные условия; b) 1 - Mark 12 (invitrogen), 2 - hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) восстановленные условия.
Фиг. 3: Анализ продукции и очистки Fab(MCSP)-Crossfab(CD3). Аналитическая эксклюзионная хроматография, хроматограмма А280 (Superdex 200 10/300 GL [GE Healthcare]; 2 мМ MOPS pH 7,3, 150 мМ NaCl, 0,02% (w/v) NaCl; было введено 50 мкг образца).
Фиг. 4: Анализ продукции и очистки hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3): SDS-Page: 4-12% Bis/Tris (NuPage [invitrogen]; окрашенный Кумасси): а) 1 - Mark 12 (invitrogen), 2 - hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) невосстановленные условия; b) 1 - Mark 12 (invitrogen), 2 - hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) восстановленные условия.
Фиг. 5: Анализ продукции и очистки hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3). Аналитическая эксклюзионная хроматография, хроматограмма А280 (Superdex 200 10/300 GL [GE Healthcare]; 2 мМ MOPS pH 7,3, 150 мМ NaCl, 0,02% (w/v) NaCl; 50 мкг образца было введено).
Фиг. 6: Анализ продукции и очистки hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)-Fab(MCSP). SDS-Page: 4-12% Bis/Tris (NuPage [invitrogen]; окрашенный Кумасси): a) 1 - Mark 12 (invitrogen), 2 - hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)-Fab(MCSP) невосстановленные условия; b) 1 - Mark 12 (invitrogen), 2 - hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)-Fab(MCSP) восстановленные условия.
Фиг. 7: Анализ продукции и очистки hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)-Fab(MCSP). Аналитическая эксклюзионная хроматография, хроматограмма А280 (Superdex 200 10/300 GL [GE Healthcare]; 2 мМ MOPS pH 7,3, 150 мМ NaCl, 0,02% (w/v) NaCl; было введено 50 мкг образца).
Фиг. 8: Анализ продукции и очистки мышиный Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP). SDS-Page: 4-12% Bis/Tris (NuPage [invitrogen]; окрашенный Кумасси): a) 1 - Mark 12 (invitrogen), 2 - мышиный Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP) невосстановленные условия; b) 1 - Mark 12 (invitrogen), 2 - мышиный Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP) восстановленные условия.
Фиг. 9: Анализ продукции и очистки мышиный Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP). Аналитическая эксклюзионная хроматография, хроматограмма А280 (Superdex 200 10/300 GL [GE Healthcare]; 2 мМ MOPS pH 7,3, 150 мМ NaCl, 0,02% (w/v) NaCl; было введено 50 мкг образца).
Фиг. 10: Гибель (измеренная по высвобождению LDH) опухолевых клеток MDA-MB-435 при совместном культивировании с человеческими пан-Т-клетками (соотношение Е:Т = 5:1) и активации в течение 20 часов различными концентрациями hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) (="Fab-Crossfab"), hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)-Fab(MCSP) (="Fab-Crossfab-Fab"), hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) (="(Fab)2-Crossfab"), а также биспецифическими молекулами (scFv)2 (антиMCSP/антиhuCD3e) (="(scFv)2"). Конструкции с двухвалентным MCSP-нацеливанием демонстрируют цитотоксическую активность, сравнимую с конструкцией "(scFv)2", в то время как конструкция "Fab-Crossfab" с моновалентным MCSP-связыванием имеет явно меньшую активность.
Фиг. 11: Сравнение конструкций hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) (="(Fab)2-Crossfab") и (scFv)2 (антиMCSP/антиhuCD3e) (="(scFv)2"). Изображено высвобождение LDH из опухолевых клеток MDA-MB-435 при совместном культивировании с человеческими пан-Т-клетками (соотношение Е:Т = 5:1) и активации в течение 21 часа различными концентрациями биспецифических конструкций и соответствующих IgG. "(Fab)2-Crossfab" индуцирует аопотоз в клетках-мишенях по меньшей мере так же хорошо, как молекула (scFv)2.
Фиг. 12: Сравнение конструкций hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) (="(Fab)2-Crossfab") и (scFv)2 (антиMCSP/антиhuCD3e) (="(scFv)2"). Изображено высвобождение LDH из опухолевых клеток человеческой меланомы MV-3 при совместном культивировании с человеческими РВМС (соотношение Е:Т = 10:1) и активации в течение 26 часов различными концентрациями биспецифических конструкций и соответствующих IgG. "(Fab)2-Crossfab" индуцирует аопотоз в клетках-мишенях по меньшей мере так же хорошо, как молекула (scFv)2.
2
Фиг. 13: Высвобождение LDH из опухолевых клеток B16/F10-huMCSP Fluc2 клона 48, индуцированное путем активации первичных мышиных Т-клеток конструкцией мышиный Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP) (=(Fab)2-CrossFab), нацеленной на человеческий MCSP, а также на мышиный CD3. Соотношение эффекторных клеток и клеток-мишеней составляло 5:1. Анализ проводили после инкубации в течение 23,5 ч при 37°С, 5% CO. Конструкция индуцирует зависимый от концентрации опосредованный Т-клетками апоптоз человеческих клеток-мишеней, экспрессирующих MCSP.
2
Фиг. 14: Высвобождение LDH из опухолевых клеток B16/F10-huMCSP Fluc2, клона 48, индуцированное путем активации первичных мышиных Т-клеток 50 нМ конструкции мышиного Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP) (=(Fab)2-CrossFab), нацеленной на человеческий MCSP, а также на мышиный CD3. Соотношение эффекторных клеток и клеток-мишеней составляло 5:1. Анализ проводили после инкубации в течение 23,5 ч при 37°С, 5% CO. Конструкция индуцирует опосредованный Т-клетками апоптоз человеческих клеток-мишеней, экспрессирующих MCSP. Наблюдается только слабая гиперактивация Т-клеток при такой концентрации конструкции.
Фиг. 15: Различные уровни цитокинов, измеренные в супернатанте цельной крови после обработки 1 нМ различных CD3-MCSP-биспецифических конструкций ((hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) (="(Fab)2-Crossfab") и (scFv)2 (антиMCSP/антиhuCD3e) (="(scFv)2")) в присутствии (А, В) или в отсутствие (С, D) опухолевых клеток Colo-38 в течение 24 часов. 280 мкл цельной крови на лунку высевали в 96-луночный планшет и добавляли 30000 клеток Colo-38, как указано. Основным цитокином, который секретировался при активации Т-клеток в присутствии опухолевых клеток Colo-38, является IL-6, и затем IFN-гамма. Кроме того, также уровни гранзима В сильно повышались после активации Т-клеток в присутствии клеток-мишеней. В целом, конструкция "(scFv)2" повышала уровни TNF и IFN-гамма, а также гранзима В в присутствии клеток-мишеней (А и В) немного больше по сравнению с другими биспецифическими конструкциями.
Не наблюдалось никакой существенной секреции цитокинов Th2 (IL-10 и IL-4) после активации Т-клеток биспецифическими конструкциями в присутствии (или в отсутствие) клеток-мишеней. В этом анализе также наблюдалась слабая секреция IFN-гамма, индуцированная конструкцией "(Fab)2-Crossfab" в отсутствие клеток-мишеней.
+
+
Фиг. 16: Уровень поверхностной экспрессии позднего маркера активации CD25 на мышиных пан-Т-клетках, выделенных из селезенки. Мышиные пан-Т-клетки инкубировали с 50 нМ биспецифической конструкции мышиный Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP) (=(Fab)2-CrossFab) (нацеленной на мышиный CD3, а также на человеческий MCSP), в присутствии или в отсутствие опухолевых клеток-мишеней B16/F10-huMCSP Fluc2 клона 48, как указано (соотношение Е:Т = 10:1). Изображен уровень экспрессии позднего маркера активации CD25 на CD8 Т-клетках через 70 часов. Повышающая регуляция CD25 на CD8 Т-клетках с конструкцией (Fab)2-CrossFab наблюдалась только в присутствии клеток-мишеней. Используемые контрольные IgG, доведенные до той же молярности, не смогли вызвать повышающую регуляцию CD25.
Фиг. 17: Анализ продукции и очистки Fab(CD33)-CrossFab(CD3). SDS-Page: a) 3-8% Tris/Acetate (NuPage [invitrogen]; окрашенный Кумасси): а) 1 - HiMark (invitrogen), 2 - Fab(CD33)-CrossFab(CD3). невосстановленные условия; b) 4-12% Bis/Tris (NuPage [invitrogen]: 1 - Mark 12 (invitrogen), 2 - Fab(CD33)-CrossFab(CD3), восстановленные условия.
Фиг. 18: Анализ продукции и очистки Fab(CD33)-CrossFab(CD3). Аналитическая эксклюзионная хроматография, хроматограмма А280 (Superdex 200 10/300 GL [GE Healthcare]; 2 мМ MOPS pH 7,3, 150 мМ NaCl, 0,02% (w/v) NaCl; вводили 50 мкг образца).
Фиг. 19: Гибель (измеренная по высвобождению LDH) опухолевых клеток MV-3 при совместном культивировании с человеческими РВМС (соотношение Е:Т = 10:1) и активации в течение 24 часов различными концентрациями CD3-MCSP-биспецифических конструкций (hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3); обозначена "1+1 без Fc", и (scFv)2 (антиMCSP/антиhuCD3e) (=референсная молекула "(scFv)2")). Конструкция "1+1 без Fc" индуцирует апоптоз в клетках-мишенях MV-3 с расчетной ЕС50 25,4 пМ, в то время как рассчитанная ЕС50 для референсной молекулы "(scFv)2" составляет 57 пМ, показывая немного более высокую силу молекулы "1+1 без Fc" в отношении ЕС50.
+
+
+
+
Фиг. 20: Активация CD4 или CD8 Т-клеток, измеренная по повышающей регуляции CD69 (А), соответствующему повышению числа CD69-положительных клеток (В) в присутствии huMCSP-положительных опухолевых клеток MV-3 при совместном культивировании с РВМС человека (соотношение Е:Т = 10:1), обработанными CD3-MCSP-биспецифическими конструкциями (hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3); обозначена как "1+1 без Fc", и референсной молекулой (scFv)2 (антиМСSР/антиhuCD3e) (="(scFv)2"), соответственно) в течение примерно 24 часов. В целом, медианные значения CD69 выше на CD8 Т-клетках по сравнению с CD4 Т-клетками. Существует четкое зависимое от концентрации увеличение как медианных значений CD69, так и процента CD69-положительных клеток для обеих конструкций.
Фиг. 21: Иллюстрация референсной молекулы (scFv)2.
Фиг. 22: Анализ продукции и очистки (scFv)2 (антиМСSР/антиhuCD3e). SDS-Page: 4-12% Bis/Tris (NuPage [invitrogen]; окрашенный Кумасси): 1 - Mark 12 (invitrogen), 2 - (scFv)2 (антиМСSР/антиhuCD3e) восстановленные условия; 3 - (scFv)2 (антиМСSР/антиhuCD3e), невосстановленные условия.
Figure 23: Анализ продукции и очистки (scFv)2 (антиМСSР/антиhuCD3e) Аналитическая эксклюзионная хроматография, хроматограмма А280 (Superdex 75 10/300 GL [GE Healthcare]; 2 мМ MOPS pH 7,3, 150 мМ NaCl, 0,02% (w/v) NaCl; вводили 50 мкг образца ((scFv)2 (антиМСSР/антиhuCD3e))).
Подробное описание воплощений изобретения
I. Определения
Понятие "каркасного участка", или "FR", относится к остаткам вариабельных доменов, которые отличаются от остатков гипервариабельных областей (HVR). FR вариабельного домена обычно состоит из четырех FR-доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR обычно следуют в VH (или VL) в следующей последовательности: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
"Акцепторная человеческая каркасная область" в контексте данного изобретения является каркасной областью, включающей аминокислотную последовательность каркасной области вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркасной области вариабельного домена тяжелой цепи (VH), полученной из каркасной области человеческого иммуноглобулина или человеческой консенсусной каркасной области, определенной ниже. Акцепторная человеческая каркасная область, "полученная из" каркасной области человеческого иммуноглобулина или консенсусной человеческой каркасной области, может содержать одну и ту же аминокислотную последовательность, или она может содержать аминокислотные замены. В некоторых воплощениях число аминокислотных замен составляет 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее, или 2 или менее. В некоторых воплощениях акцепторная человеческая каркасная область VL по своей последовательности идентична VL каркасной последовательности человеческого иммуноглобулина или консенсусной человеческой каркасной последовательности.
"Человеческая консенсусная каркасная область" является каркасной областью, которая представляет наиболее часто встречающиеся аминокислотные остатки в выборе каркасных областей последовательностей VL или VH человеческого иммуноглобулина. Как правило, выбор VL- или VH-последовательностей человеческого иммуноглобулина осуществляется из подгруппы последовательностей вариабельного домена. Как правило, подгруппа последовательностей является такой подгруппой, как описано в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. В одном воплощении для VL подгруппа является подгруппой каппа I, описанной в Kabat et al., см. выше. В одном воплощении для VH подгруппа является подгруппой III, описанной в Kabat et al., см. выше.
Термины "гипервариабельная область" или "HVR", используемые в данном документе, относятся к областям вариабельного домена антитела, которые являются гипервариабельными в последовательности и/или формируют структурно определенные петли ("гипервариабельные петли"). Как правило, нативные четырехцепочечные антитела состоят из шести HVR, три в VH (Н1, Н2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3). HVR, как правило, содержат аминокислотные остатки из гипервариабельных петель и/или из "областей, определяющих комплементарность" (CDR), причем последние имеют наивысшую изменчивость последовательности и/или участвуют в распознавании антигена. Типичные гипервариабельные петли возникают на аминокислотных остатках 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3). (Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917). Типичные CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 и CDR-Н3) возникают на аминокислотных остатках 24-34 в L1, 50-56 в L2, 89-97 в L3, 31-35 В в Н1, 50-65 в Н2 и 95-102 в Н3 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Термины "гипервариабельные области" (HVR) и "области, определяющие комплементарность" (CDR) используются в данном документе взаимозаменяемо по отношению к участкам вариабельной области, которые образуют антигенсвязывающие области. Данная конкретная область была описана Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) и Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987), где определения включают перекрывание или подгруппы аминокислотных остатков при их сравнении друг с другом. Тем не менее, применение определения к CDR антитела или его вариантов находится в рамках термина, определенного и используемого в данном документе. Соответствующие аминокислотные остатки, которые охватывают CDR, определенные каждой из приведенных выше ссылок, приведены ниже в таблице 1 в качестве сравнения. Точное число аминокислотных остатков, которые охватывают конкретный CDR, будет варьировать в зависимости от последовательности и размера CDR. Специалист в данной области сможет легко определить, какие остатки содержит конкретный CDR с данной аминокислотной последовательностью вариабельной области антитела.
Таблица 1.
Определения CDR<sup>1</sup>
<img file="00000001.tif" he="34" wi="130" img-content="undefined" img-format="tif" />
<sup>1</sup> Нумерация всех определений CDR в таблице 1 проводится в соответствии с правилами нумерации, установленными Kabat et. al. (см. ниже).
<sup>2</sup> "AbM" со строчной "b", используемый в таблице 1, относится к CDR, определенным с помощью программного обеспечения моделирования антитела "AbM" от Oxford Molecular.
Kabat et al. также описали систему нумерации последовательностей вариабельных областей, которая применима к любому антителу. Специалист в данной области сможет однозначно приписать эту систему "нумерации Кабата" к любой последовательности вариабельной области без опоры на какие-либо экспериментальные данные за пределами самой последовательности. Используемое в данном документе понятие "нумерации Кабата" относится к системе нумерации, предложенной в Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). Если не указано иное, то ссылки на нумерацию определенных позиций аминокислотных остатков в вариабельной области антитела даются в соответствии с системой нумерации Кабата.
За исключением CDR1 в VH, CDR, как правило, содержат аминокислотные остатки, которые образуют гипервариабельные петли. CDR также включают "остатки, определяющие специфичность", или "SDR", которые являются остатками, которые контактируют с антигеном. SDR содержатся в областях CDR, называемых сокращенно -CDR, или a-CDR. Типичные a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 и a-CDR-Н3) возникают на аминокислотных остатках 31-34 в L1, 50-55 в L2, 89-96 в L3, 31-35 В в Н1, 50-58 в Н2 и 95-102 в Н3. (см. Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)). Если не указано иное, то HVR-остатки и другие остатки в вариабельном домене (например, FR-остатки) пронумерованы в данном документе в соответствии с Kabat et al., см. выше.
Термин "антитело" используется в данном документе в самом широком смысле и охватывает различные структуры антител, включая (но не ограничиваясь ими) моноклональные антитела, поликлональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), а также фрагменты антител до тех пор, пока они проявляют желаемую антигенсвязывающую активность. В частности, термин "антитело" включает биспецифические антитела изобретения, содержащие по меньшей мере два Fab-фрагмента, но не содержащие Fc-домен.
Термин "биспецифическая" означает, что антигенсвязывающая молекула способна специфически связываться по меньшей мере с двумя различными антигенными детерминантами. В некоторых воплощениях биспецифическая антигенсвязывающая молекула способна одновременно связывать две антигенные детерминанты, в частности, две антигенные детерминанты, экспрессированные на двух различных клетках.
Термин "моновалентное связывание с антигеном" означает, что не более чем один антиген, содержащийся в антителе, специфически связывается с этим антигеном.
"Человеческое антитело" является таким антителом, которое обладает аминокислотной последовательностью, соответствующей антителу, которое продуцируется человеком и/или человеческой клеткой или получено из нечеловеческого источника, который использует репертуар человеческих антител или других человеческих последовательностей, кодирующих антитело. Это определение человеческого антитела, в частности, исключает гуманизированное антитело, содержащее нечеловеческие антигенсвязывающие остатки.
Термин "рекомбинантное человеческое антитело", используемый в данном документе, включает все человеческие антитела, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантными способами, например, антитела, выделенные из клетки-хозяина, такой как клетка NS0 или СНО, или животного (например, мыши), которая является трансгенной по генам иммуноглобулина человека, или антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного экспрессионного вектора, которым трансфицирована клетка-хозяин. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельные и константные области в перегруппированной форме. Рекомбинантные человеческие антитела в соответствии с изобретением были подвергнуты соматической гипермутации in vivo. Таким образом, аминокислотные последовательности VH- и VL-областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, будучи полученными или родственными человеческим зародышевым последовательностям VH и VL, могут не существовать в природе в репертуаре человеческой зародышевой линии антитела in vivo.
"Гуманизированное" антитело относится к химерному антителу, содержащему аминокислотные остатки из нечеловеческих HVR и аминокислотные остатки из человеческих FR. В некоторых воплощениях гуманизированное антитело будет содержать по существу все из по меньшей мере одного, а обычно двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все HVR (например, CDR) соответствуют таковым в нечеловеческом антителе, и все или по существу все FR соответствуют таковым в человеческом антителе. Гуманизированное антитело, возможно, может содержать по меньшей мере часть константной области антитела, полученной из человеческого антитела. "Гуманизированная форма" антитела, например, нечеловеческого антитела, относится к антителу, которое подверглось гуманизации. Другие формы "гуманизированных антител", охватываемые данным изобретением, являются такими, в которых константная область была дополнительно модифицирована или изменена по сравнению с исходным антителом, чтобы получить свойства в соответствии с изобретением, особенно в отношении C1q-связывания и/или Fc-рецепторного (FcR) связывания.
Термин "химерное антитело" относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи получена из конкретного источника или вида, в то время как оставшаяся часть тяжелой и/или легкой цепи получена из другого источника или вида, особенно к полученному с помощью методик рекомбинантной ДНК. Предпочтительными являются химерные антитела, содержащие мышиную вариабельную область и человеческую константную область. Другими предпочтительными формами "химерных антител", охватываемыми данным изобретением, являются те, в которых константную область модифицировали или изменяли по сравнению с исходным антителом, создавая свойства в соответствии с изобретением, особенно в отношении C1q-связывания и/или Fc-рецепторного (FcR) связывания. Такие химерные антитела также называют "антителами с переключением класса". Химерные антитела являются продуктом экспрессированных иммуноглобулиновых генов, содержащих сегменты ДНК, кодирующие вариабельные области иммуноглобулинов, и сегменты ДНК, кодирующие константные области иммуноглобулинов. Способы получения химерных антител включают обычные методики рекомбинантной ДНК и генной трансфекции, в настоящее время хорошо известные в данной области. См., например, Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; патенты США №№5202238 и 5204244.
Термин "моноклональное антитело", используемый в данном документе, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. из популяции, состоящей из отдельных антител, которые являются идентичными и/или связывают один и тот же эпитоп, за исключением возможных вариантных антител, например, содержащих встречающиеся в природе мутации или образованных во время производства препарата моноклонального антитела, которые могут присутствовать в незначительных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело в препарате моноклонального антитела направлено против одной детерминанты на антигене. Таким образом, указатель "моноклональное" указывает на характер антитела, которое было получено из популяции по существу гомогенных антител, и не должен быть истолкован как требующий получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, используемые в соответствии с данным изобретением, могут быть получены с помощью различных методик, включая, но не ограничиваясь ими, гибридомную методику, рекомбинантную ДНК-методику, методики фагового дисплея, а также методики с использованием трансгенных животных, содержащих все или часть человеческих иммуноглобулиновых локусов, и такие методики и другие иллюстративные методики получения моноклональных антител описаны в данном документе.
2
Понятие "фрагмент антитела" относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, связывающую антиген, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваясь ими, Fv, Fab-, Fab′-, Fab′-SH, F(ab′); димерные антитела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител (например scFv); и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. scFv-антитела описаны, например, в Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96). Кроме того, фрагменты антител включают одноцепочечные полипептиды, имеющие характеристики VH-домена, а именно возможность группироваться с VL-доменом, или VL-домена, а именно возможность группироваться с VH-доменом для образования функционального антигенсвязывающего сайта и тем самым обеспечения антигенсвязывающего свойства полноразмерных антител.
(VLVH)
(CLCH1)
Используемое в данном документе понятие "Fab-фрагмента" относится к фрагменту антитела, содержащему фрагмент легкой цепи с VL-доменом и константным доменом легкой цепи (CL), и VH-домен и первый константный домен (СН1) тяжелой цепи. Биспецифические антитела изобретения содержат по меньшей мере два Fab-фрагмента, где либо вариабельные области, либо константные области тяжелой и легкой цепи второго Fab-фрагмента меняются. В связи с обменом вариабельных областей или константных областей указанный Fab-фрагмент также упоминается как "кросс-Fab-фрагмент" или "xFab-фрагмент" или "перекрестный Fab-фрагмент". Возможны два разных состава цепей перекрестной Fab-молекулы, и они включены в биспецифические антитела изобретения: с одной стороны, вариабельные области тяжелой и легкой Fab-цепи меняются, т.е. перекрестная Fab-молекула содержит пептидную цепь, состоящую из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области тяжелой цепи (СН1), а пептидная цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области легкой цепи (CL). Эта перекрестная Fab-молекула также упоминается как CrossFab. С другой стороны, когда константные области тяжелой и легкой цепи Fab-фрагмента меняются, перекрестная Fab-молекула содержит пептидную цепь, составленную из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области легкой цепи (CL), и пептидную цепь, составленную из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области тяжелой цепи (СН1). Эта перекрестная Fab-молекула также упоминается как CrossFab.
В одном воплощении указанные Fab-фрагменты соединены через пептидный линкер. Под "соединением" понимается, что Fab-фрагменты связаны пептидными связями либо непосредственно, либо через один или более чем один пептидный линкер.
4
2
4
6
3
2
3
4
3
4
2
Термин "пептидный линкер", используемый в изобретении, обозначает пептид с аминокислотными последовательностями, который предпочтительно имеет синтетическое происхождение. Эти пептидные линкеры в соответствии с изобретением используются для соединения одного из Fab-фрагментов с С- или N-концом другого Fab-фрагмента, чтобы сформировать полиспецифическое антитело в соответствии с изобретением. Предпочтительно указанные пептидные линкеры представляют собой пептиды с аминокислотной последовательностью с длиной по меньшей мере 5 аминокислот, предпочтительно с длиной от 5 до 100, более предпочтительно от 10 до 50 аминокислот. В одном воплощении указанный пептид линкер представляет собой (GxS)n или (GxS)nGm, где G = глицин, S = серин, и (х=3, n=3, 4, 5 или 6, и m=0, 1, 2 или 3) или (х=4, n=2, 3, 4 или 5 и m=0, 1, 2 или 3), предпочтительно х=4 и n=2 или 3, более предпочтительно с х=4, n=2. Кроме того, линкеры могут содержать шарнирную область иммуноглобулина (или ее часть). В одном воплощении указанный пептидный линкер представляет собой (GS) (SEQ ID №28). Другими линкерными пептидами, подходящими для соединения Fab-фрагментов, являются, например, (GS)-GG (SEQ ID №147) или (SG)-(SEG)-(SG)-SG (SEQ ID №148), или EPKSC(D)-(GS) (SEQ ID №№145 и 146).
Термин "антигенсвязывающий домен" относится к части антигенсвязывающей молекулы, которая содержит область, которая специфически связывается с частью или целым антигеном и является комплементарной ему. Если антиген является большим, то антигенсвязывающая молекула может связываться только с определенной частью антигена, которую называют эпитопом. Антигенсвязывающий домен может быть образован, например, за счет одного или более чем одного вариабельного домена антитела (также называемого вариабельной областью антитела). Предпочтительно, антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область легкой цепи антитела (VL) и вариабельную область тяжелой цепи антитела (VH).
th
Термин "вариабельная область" или "вариабельный домен" относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL, соответственно) нативного антитела обычно имеют аналогичную структуру, при этом каждый домен содержит четыре консервативные каркасные области (FR, framework region) и три гипервариабельные области (HVR, гипервариабельная область). (См., например, Kindt et al. Kuby Immunology, 6 ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)). Один VH- или VL-домен может быть достаточным для придания антигенсвязывающей специфичности. Кроме того, антитела, которые связывают конкретный антиген, могут быть выделены с помощью VH- или VL-домена из антитела, которое связывается с антигеном, для скрининга библиотеки комплементарных VL- или VH-доменов, соответственно. См., например, Portolano et al., J. Immunol. 150: 880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352: 624-628 (1991).
Термин "антигенсвязывающий сайт антитела", используемый в данном документе, относится к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание антигена. Антигенсвязывающая часть антитела включает аминокислотные остатки из "областей, определяющих комплементарность", или "CDR". "Каркасные области", или "FR", представляют собой такие области вариабельных доменов, которые отличаются от остатков гипервариабельной области, определенной в данном документе. Таким образом, вариабельные домены легкой и тяжелой цепей антитела содержат от N- к С-концу домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Особенно CDR3 тяжелой цепи является областью, которая вносит наибольший вклад в связывание антигена и определяет свойства антитела. CDR- и FR-области определяются в соответствии со стандартным определением Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) и/или таковыми остатками из "гипервариабельной петли".
Термин "эпитоп" включает любую полипептидную детерминанту, способную специфически связываться с антителом. В некоторых воплощениях эпитопная детерминанта включает химически активные поверхностные группировки молекул, такие как аминокислоты, сахарные боковые цепочки, фосфорил или сульфонил, а в некоторых воплощениях может иметь специфические трехмерные структурные характеристики и/или специфические характеристики заряда. Эпитоп является областью антигена, которая связывается антителом.
Н
Термин "Fc-домен" используется в данном документе для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Например, в природных антителах Fc-домен состоит из двух идентичных белковых фрагментов, полученных из второго и третьего константных доменов антитела двух тяжелых цепей в изотипах IgG, IgA и IgD; Fc-домены IgM и IgE содержат три константных домена тяжелой цепи (С-домены 2-4) в каждой полипептидной цепи. Биспецифические антитела изобретения лишены Fc-домена. Понятие "лишенный Fc-домена", используемое в данном документе, означает, что биспецифические антитела изобретения не содержат домены СН2, СН3 или СН4; т.е. константная тяжелая цепь состоит исключительно из одного или более чем одного СН1-домена.
Понятие "аффинность" относится к силе суммарных общих нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антитела) и его партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указано иное, то термин "аффинность связывания", используемый в данном документе, относится к внутренней аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами пары связывания (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы Х в отношении ее партнера Y может в основном выражаться константой диссоциации (KD). Аффинность может быть измерена обычными способами, известными в данной области, включая те, которые описаны в данном документе. Конкретные иллюстративные и примерные воплощения измерения аффинности связывания описаны далее.
D
-8
-8
-13
-9
-13
Используемые в данном документе термины "связывающийся" или "специфически связывающийся" означают, что связывание является селективным в отношении антигена, и его можно отличить от нежелательного или неспецифического взаимодействия. Способность антигенсвязывающей группировки связываться с конкретной антигенной детерминантой может быть измерена либо путем иммуноферментного анализа (ELISA), либо с помощью других методик, известных специалистам в данной области, например, методики поверхностного плазменного резонанса (SPR) (анализированного на приборе BIAcore) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), и традиционных анализов связывания (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). В одном воплощении степень связывания антитела с неродственным белком составляет менее чем примерно 10% от связывания антитела с антигеном, что измерено, например, с помощью SPR. В некоторых воплощениях антигенсвязывающая группировка, которая связывается с антигеном, или антигенсвязывающая молекула, содержащая эту антигенсвязывающую группировку, имеет константу диссоциации (K) ≤ 1 мкМ, ≤ 100 нМ, ≤ 10 нМ, ≤ 1 нМ, ≤ 0,1 нМ, ≤ 0,01 нМ или ≤ 0,001 нМ (например, 10 М или менее, например, от 10 М до 10 M, например, от 10 М до 10 М).
-8
-8
-13
-9
-13
В одном воплощении степень связывания с несвязанным белком биспецифичного антитела, которое специфически связывается с антигеном, активирующим Т-клетки, и опухолевым антигеном (ТА), составляет менее чем примерно 10% от связывания антитела с антигеном, активирующим Т-клетки, или опухолевым антигеном (ТА), что измерено, например, с помощью радиоиммуноанализа (RIA) или проточной цитометрии (FACS). В некоторых воплощениях биспецифическое антитело, которое специфически связывает антиген, активирующий Т-клетки, и опухолевый антиген (ТА), имеет константу диссоциации (KD) ≤ 1 мкМ, ≤ 100 нМ, ≤ 10 нМ, ≤ 1 нМ, ≤ 0,1 нМ, ≤ 0,01 нМ или ≤ 0,001 нМ (например 10 М или менее, например от 10 М до 10 М, например, от 10 М до 10 М). В некоторых воплощениях биспецифическое антитело, которое специфически связывается с антигеном, активирующим Т-клетки, и опухолевым антигеном (ТА), связывается с эпитопом антигена, активирующего Т-клетки, или опухолевого антигена (ТА), который консервативен среди антигенов, активирующих Т-клетки, или опухолевых антигенов (ТА) от различных видов.
Понятие "антитела со зрелой аффинностью" относится к антителу с одним или более чем одним изменением в одной или более чем одной гипервариабельной области (HVR) по сравнению с родительским антителом, которое не обладает такими изменениями, причем такие изменения приводят к повышению аффинности антитела к антигену.
Термин "биспецифическое антитело, которое специфически связывается с антигеном, активирующим Т-клетки, и опухолевым антигеном (ТА)" относится к биспецифическому антителу, способному связывать антиген, активирующий Т-клетки, и опухолевый антиген с достаточной аффинностью, так что антитело используется в опосредовании Т-клеточного иммунного ответа в или рядом с клетками, экспрессирующими опухолевый антиген. В конкретном воплощении антиген, активирующий Т-клетки, представляет собой CD3 Т-клеточный корецепторный (CD3) антиген, особенно человеческий или собачий CD3, наиболее предпочтительно человеческий CD3. В некоторых воплощениях антиген, активирующий Т-клетки, представляет собой эпсилон-субъединицу CD3. В других воплощениях антиген, активирующий Т-клетки, представляет собой альфа- или бета-субъединицу CD3.
В одном воплощении биспецифическое антитело, которое специфически связывается с активирующим Т-клетки антигеном и опухолевым антигеном (ТА), может конкурировать с моноклональным антителом Н2С (описанным в публикации РСТ № WO 2008/119567) в связывании с эпитопом CD3. В другом воплощении биспецифическое антитело, которое специфически связывается с антигеном, активирующим Т-клетки, и опухолевым антигеном (ТА), может конкурировать с моноклональным антителом V9 (описанным в Rodrigues et al., Int J Cancer Suppl 7, 45-50 (1992) и в патенте США №6054297) в связывании с эпитопом CD3. В еще одном воплощении биспецифическое антитело, которое специфически связывается с активирующим Т-клетки антигеном и опухолевым антигеном (ТА), может конкурировать с моноклональным антителом FN18 (описанным в Nooij et al., Eur J Immunol 19, 981-984 (1986)) в связывании с эпитопом CD3.
Понятие "антигена, активирующего Т-клетки", используемое в данном документе, относится к антигенной детерминанте, экспрессированной на поверхности Т-лимфоцитов, в частности цитотоксических Т-лимфоцитов, которая способна индуцировать активацию Т-клеток при взаимодействии с антигенсвязывающей молекулой. В частности, взаимодействие антигенсвязывающей молекулы с антигеном, активирующим Т-клетки, может вызывать активацию Т-клеток путем активации сигнального каскада Т-клеточного рецепторного комплекса. В конкретном воплощении антигеном, активирующим Т-клетки, является CD3.
Понятие "Т-клеточной активации", используемое в данном документе, относится к одному или более чем одному клеточному ответу Т-лимфоцитов, в частности цитотоксических Т-лимфоцитов, выбранному среди: пролиферации, дифференцировки, секреции цитокинов, высвобождения цитотоксических эффекторных молекул, цитотоксической активности и экспрессии маркеров активации. Биспецифические антигенсвязывающие молекулы изобретения, активирующие Т-клетки, способны индуцировать активацию Т-клеток. Подходящие анализы для измерения активации Т-клеток известны в данной области и описаны в данном документе.
Термин "CD3 Т-клеточный корецептор (CD3)", используемый в данном документе, относится к белковому комплексу, который состоит из четырех отдельных цепей. У млекопитающих этот комплекс содержит цепь CD3γ, цепь CD3δ и две цепи CD3ε. Эти цепи ассоциируют с молекулой, известной как Т-клеточный рецептор (TCR), и ζ-цепью, создавая сигнал активации в Т-лимфоцитах. Термин "CD3 Т-клеточный корецептор (CD3)" включает любой нативный CD3 от любого позвоночного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, человека) и грызунов (например, мышей и крыс), если не указано иное, предпочтительно от человека. Термин охватывает непроцессированный "полноразмерный" CD3, а также любую форму CD3, которая является результатом процессинга в клетке. Термин также охватывает варианты CD3 природного происхождения, например, варианты сплайсинга или аллельные варианты. В предпочтительном воплощении термин "CD3 Т-клеточный корецептор (CD3)" относится к человеческому или собачьему CD3, в частности человеческому CD3. В некоторых воплощениях антиген, активирующий Т-клетки, представляет собой эпсилон-субъединицу CD3. В других воплощениях антиген, активирующий Т-клетки, представляет собой альфа- или бета-субъединицу CD3. Пример последовательности человеческого CD3 приведен в SEQ ID №103.
Термин "опухолевый антиген (ТА)", используемый в данном документе, относится к ассоциированным с опухолью антигенам, а также к опухолеспецифическим антигенам, т.е. к любому иммуногенному эпитопу (например, белку), экспрессированному опухолевой клеткой. Белок может быть экспрессирован неопухолевой клеткой, но является иммуногенным только тогда, когда экспрессируется опухолевой клеткой. Альтернативно, белок может быть экспрессирован опухолевыми клетками, но не нормальными клетками. Предпочтительно, анти-ТА-антитело изобретения связывается с внеклеточным доменом ТА. В одном предпочтительном воплощении указанный опухолевый антиген представляет собой человеческий опухолевый антиген. Примеры опухолевых антигенов включают, но не ограничиваясь ими, ассоциированный с меланомой хондроитинсульфатпротеогликан (MCSP, UniProt Q6UVK1, NCBI Accession NP_001888), белок активации фибробластов (FAP, UniProt Q12884, Q86Z29, Q99998; NCBI Accession NP_004451), рецептор эпидермального фактора роста (EGFR, также известный как ErbB1 и Her1, UniProt P00533; NCBI Accession NP_958439, NP_958440), карциноэмбриональный антиген (СЕА, также известный как связанная с раково-эмбриональным антигеном молекула клеточной адгезии 5 или CD66e; UniProt P06731, NCBI Accession NP_004354) и CD33 (также известный как gp76 или связывающий сиаловую кислоту Ig-подобный лектин 3 (Siglec-3), UniProt P20138, NCBI Accession NP_001076087, NP_001171079).
В одном воплощении биспецифическое антитело изобретения содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, который специфичен к ассоциированному с меланомой протеогликанхондроитинсульфату (MCSP).
В одном воплощении биспецифическое антитело изобретения содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, который специфичен к CD33.
Специфичность антитела относится к селективному распознаванию антителом определенного эпитопа антигена. Природные антитела, например, являются моноспецифическими. "Биспецифические антитела" в соответствии с изобретением представляют собой антитела, которые имеют две различные антигенсвязывающие специфичности. Антитела данного изобретения специфичны по меньшей мере к двум антигенам, т.е. к антигену, активирующему Т-клетки, в качестве первого антигена, и к опухолевому антигену в качестве второго антигена.
Термин "моноспецифическое" антитело, используемый в данном документе, обозначает антитело, которое имеет один или более чем один сайт связывания, каждый из которых связывается с одним и тем же эпитопом одного и того же антигена.
Термин "биспецифическое" антитело, используемый в данном документе, обозначает антитело, которое имеет по меньшей мере два сайта связывания, которые связываются с различными эпитопами одного и того же антигена или разных антигенов.
Антитело, предложенное в данном документе, является полиспецифическим антителом, например, биспецифическим антителом. Полиспецифические антитела представляют собой моноклональные антитела, которые обладают специфичностью связывания по меньшей мере с двумя различными сайтами. В данном документе предложено биспецифическое антитело со специфичностью связывания опухолевого антигена (ТА) и антигена, активирующего Т-клетки. В некоторых воплощениях биспецифические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами ТА. Биспецифические антитела также могут быть использованы для направления цитотоксических агентов к клеткам, которые экспрессируют ТА.
Термин "валентность", используемый в данной заявке, означает наличие определенного числа сайтов связывания в молекуле антитела. Таким образом, термины "двухвалентный", "четырехвалентный" и "шестивалентный" обозначают наличие двух сайтов связывания, четырех сайтов связывания и шести сайтов связывания, соответственно, в молекуле антитела. Биспецифические антитела в соответствии с изобретением являются по меньшей мере "двухвалентными" и могут быть "трехвалентными" и "поливалентными" (например, "четырехвалентными" или "шестивалентными").
Антитела данного изобретения имеют два или более двух сайтов связывания и являются биспецифическими. То есть антитела могут быть биспецифическими даже в тех случаях, когда имеют более двух сайтов связывания (т.е. когда антитело трехвалентно или поливалентно).
Понятие "антитела, которое связывается с одним и тем же эпитопом" в отношении референсного антитела относится к антителу, которое блокирует связывание референсного антитела с его антигеном в конкурентном анализе на 50% или более, и, наоборот, референсное антитело блокирует связывание антитела с его антигеном в конкурентном анализе на 50% или более. Пример конкурентного анализа предложен в данном документе.
"Отсутствие существенной перекрестной реактивности" означает, что молекула (например, антитело) не распознает или не связывается специфически с антигеном, отличным от фактического целевого антигена молекулы (например, антигена, близкородственного целевому антигену), особенно по сравнению с таким целевым антигеном. Например, антитело может связываться на менее чем примерно 10% до менее чем примерно 5% с антигеном, который отличается от реального целевого антигена, или может связывать указанный антиген, отличающийся от реального целевого антигена, в количестве, выбранном из группы, состоящей из менее примерно 10%, 9%, 8% 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,2% или 0,1%, предпочтительно менее чем примерно 2%, 1%, или 0,5%, и наиболее предпочтительно менее чем примерно 0,2% или 0,1% антигена, который отличается от реального целевого антигена.
"Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности" по отношению к референсной полипептидной последовательности определяется как процент аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые идентичны аминокислотным остаткам в референсной полипептидной последовательности после выравнивания последовательностей и введения при необходимости пробелов для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и без учета любых консервативных замен как части идентичности последовательности. Выравнивание с целью определения процента идентичности аминокислотных последовательностей может быть достигнуто различными способами, которые известны специалистам в данной области, например, с использованием общедоступного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, в том числе любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Тем не менее, для целей данного изобретения значения % идентичности аминокислотных последовательностей получают с использованием компьютерной программы для сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа для сравнения последовательностей ALIGN-2 была разработана Genentech, Inc., и исходный код был подан с пользовательской документацией в бюро авторских прав США, Вашингтон, округ Колумбия, 20559, где он был зарегистрирован под номером TXU510087. Программа ALIGN-2 находится в открытом доступе от Genentech, Inc., Саут-Сан-Франциско, Калифорния, или может быть составлена из исходного кода. Программа ALIGN-2 должна быть скомпилирована для применения на операционной системе UNIX, включая цифровую UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей установлены программой ALIGN-2 и не меняются.
В ситуациях, когда ALIGN-2 используется для сравнения аминокислотных последовательностей, % идентичности аминокислотной последовательности данной аминокислотной последовательности А с данной аминокислотной последовательностью В (альтернативно можно сказать, что данная аминокислотная последовательность А имеет или содержит определенный % идентичности аминокислотной последовательности с данной аминокислотной последовательностью В) вычисляется следующим образом:
100×доля X/Y,
где Х обозначает число аминокислотных остатков, оцененных как идентичные совпадения с помощью программы для выравнивания последовательностей ALIGN-2 при выравнивании в этой программе А и В, и где Y обозначает общее число аминокислотных остатков в В. Следует иметь в виду, что если длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности В, то % идентичности аминокислотной последовательности А с В не будет равен % идентичности аминокислотной последовательности В с А. Если специально не указано иное, то все значения % идентичности аминокислотной последовательности, используемые в данном описании, получены так, как описано в предыдущем абзаце, с использованием компьютерной программы ALIGN-2.
"Изолированное" ("выделенное") антитело является таким антителом, которое было выделено из компонента его природной среды. В некоторых воплощениях антитело очищают до чистоты более 95% или 99%, определенной, например, с помощью электрофореза (например, SDS-PAGE, изоэлектрофокусировки (IEF), капиллярного электрофореза) или хроматографии (например, ионнообменной или обращено-фазовой HPLC). Обзор методик оценки чистоты антител см., например, в Flatman, S. et al., J. Chromatogr. В 848 (2007) 79-87.
Понятие "изолированной" ("выделенной") нуклеиновой кислоты относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая была выделена из компонента ее природной среды. Изолированная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат эту молекулу нуклеиновой кислоты, но молекула нуклеиновой кислоты находится вне хромосомы или в том месте хромосомы, которое отличается от ее природной хромосомной локализации.
"Изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая биспецифическое антитело, которое специфически связывается с антигеном, активирующим Т-клетки, и опухолевым антигеном (ТА)" относится к одной или более чем одной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую и легкую цепи антитела (или их фрагменты), включая такие молекулы нуклеиновой кислоты в одном векторе или в отдельных векторах, и такие молекулы нуклеиновой кислоты, присутствующие в одном или более чем одном месте в клетке-хозяине.
Термин "аминокислота", используемый в данной заявке, обозначает группу природных α-карбоксильных аминокислот, включающую аланин (трехбуквенный код: ala, однобуквенный код: А), аргинин (arg, R), аспарагин (asn, N), аспарагиновую кислоту (asp, D), цистеин (cys, С), глутамин (gln, Q), глутаминовую кислоту (glu, Е), глицин (gly, G), гистидин (his, Н), изолейцин (ile, I), лейцин (leu, L), лизин (lys, К), метионин (met, М), фенилаланин (phe, F), пролин (pro, Р), серин (ser, S), треонин (thr, Т), триптофан (trp, W), тирозин (tyr, Y) и валин (val, V).
Термин "вектор", используемый в данном документе, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной размножать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Этот термин включает вектор как самореплицирующуюся нуклеиновокислотную структуру, а также как вектор, включенный в геном клетки-хозяина, в которую он был введен. Некоторые векторы способны направлять экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы называют в данном документе "экспрессионными векторами".
Используемые в данном документе выражения "клетка", "клеточная линия" и "клеточная культура" используются как синонимы, и все такие обозначения включают потомство. Таким образом, слова "трансфектанты" и "трансфицированные клетки" включают первичную клетку-объект и культуры, полученные из нее, независимо от числа переносов. Также понятно, что все потомство может не быть точно идентичным по содержанию ДНК из-за преднамеренных или случайных мутаций. Подразумевается вариантное потомство, которое имеет такую же функцию или биологическую активность, как и у исходной трансформированной клетки.
Термины "клетка-хозяин", "клеточная линия-хозяин" и "клеточная культура-хозяин" используются взаимозаменяемо и относятся к клеткам, в которые была введена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство таких клеток. Клетки-хозяева включают "трансформанты" и "трансформированные клетки", которые включают первичные трансформированные клетки и потомство, полученное из них, независимо от числа пассажей. Потомство может не быть полностью идентичным родительской клетке по содержанию нуклеиновых кислот, но может содержать мутации. Мутантное потомство, которое имеет такую же функцию или биологическую активность при скрининге или селекции первоначально трансформированной клетки, включено в данный документ.
Понятие "голое антитело" относится к антителу, которое не конъюгировано с гетерологичной группировкой (например, цитотоксической группировкой) или мечено радиоактивной меткой. Голое антитело может присутствовать в фармацевтическом составе.
"Иммуноконъюгат" представляет собой антитело, конъюгированное с одной или более чем одной гетерологичной молекулой(ами), в том числе с цитотоксическим агентом, но не ограничиваясь им.
211
131
125
90
186
188
153
212
32
212
Термин "цитотоксический агент", используемый в данном документе, относится к веществу, которое ингибирует или предотвращает функционирование клеток и/или вызывает гибель или разрушение клеток. Цитотоксические агенты включают, но не ограничиваясь ими, радиоактивные изотопы (например, At, I, I, Y, Re, Re, Sm, Bi, P, Pb и радиоактивные изотопы Lu); химиотерапевтические агенты или лекарственные вещества (например, метотрексат, адриамицин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин С, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркалирующие агенты); агенты-ингибиторы роста; ферменты и их фрагменты, такие как нуклеолитические ферменты; антибиотики; токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, в том числе их фрагменты и/или варианты; а также различные противоопухолевые или противораковые агенты, описанные ниже.
Термин "N-конец" означает последнюю аминокислоту на N-конце, термин "С-конец" означает последнюю аминокислоту на С-конце.
Термин "фармацевтический состав" относится к препарату, который находится в такой форме, чтобы обеспечить биологическую активность активного ингредиента, содержащегося в нем, и который не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому будет осуществляться введение состава.
Понятие "фармацевтически приемлемого носителя" относится к ингредиенту в фармацевтическом составе, помимо активного ингредиента, который является нетоксичным для субъекта. Фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничиваясь ими, буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант.
Используемый в данном документе термин "лечение" (и его грамматические варианты, такие как "лечить") относится к клиническому вмешательству в попытке изменить естественный ход заболевания у индивидуума, которого лечат, и которое может быть выполнено либо для профилактики, либо в ходе клинической патологии. Желательные эффекты лечения включают, но не ограничиваясь ими, предотвращение возникновения или рецидива заболевания, ослабление симптомов, уменьшение любого прямого или косвенного патологического последствия заболевания, предотвращение метастазирования, уменьшение скорости прогрессирования заболевания, улучшение или временное облегчение болезненного состояния, достижение ремиссии или улучшение прогноза. В некоторых воплощениях антитела изобретения используются для задержки развития заболевания или замедления прогрессии заболевания.
"Индивидуум" или "субъект" является млекопитающим. Млекопитающие включают, но не ограничиваясь ими, домашних животных (например, коров, овец, кошек, собак и лошадей), приматов (например, людей и других приматов, таких как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс). В некоторых воплощениях индивидуум или субъект является человеком.
Понятие "эффективное количество" агента, например фармацевтического состава, относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периода времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического или профилактического результата.
Термин "рак", используемый в данном документе, относится к пролиферативным заболеваниям, таким как лимфомы, лимфоцитарные лейкозы, рак легкого, немелкоклеточный рак легкого (NSCL), бронхиолоальвеолярный рак легкого, рак кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы или шеи, кожная или внутриглазная меланома, рак матки, рак яичника, рак прямой кишки, рак анальной области, рак желудка, рак верхней части желудка, рак толстого кишечника, рак молочной железы, рак матки, карцинома фаллопиевых труб, карцинома эндометрия, карцинома шейки матки, карцинома влагалища, карцинома вульвы, болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкого кишечника, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечника, саркома мягких тканей, рак уретры, рак пениса, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак почки или мочеточника, почечно-клеточная карцинома, карцинома почечной лоханки, мезотелиома, гепатоцеллюлярный рак, рак желчных путей, новообразования центральной нервной системы (ЦНС), опухоли позвоночника, глиома ствола головного мозга, мультиформная глиобластома, астроцитомы, шванномы, эпендимомы, медуллобластомы, менингиомы, плоскоклеточные карциномы, аденома гипофиза и саркома Юинга, включая рефракторные варианты любого из вышеперечисленных типов рака или сочетание одного или более чем одного из перечисленных выше типов рака.
Термин "вкладыш в упаковку" используется для обозначения инструкций, обычно включаемых в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предупреждениях, касающихся применения таких терапевтических продуктов.
II Композиции и способы
В одном аспекте изобретение основано, в частности, на биспецифических антителах, содержащих первый антигенсвязывающий сайт, специфичный к антигену, активирующему Т-клетки, и второй антигенсвязывающий сайт, специфичный к опухолевому антигену (ТА). Антитела изобретения используются, например, для лечения рака.
А. Примеры биспецифических антител, которые связываются с антигеном, активирующим Т-клетки, и опухолевым антигеном (ТА)
Данное изобретение относится к биспецифическим антителам, комбинирующим сайт связывания антигена, активирующего Т-клетки, со вторым сайтом связывания антигена, который нацелен на опухолевый антиген (ТА). Антитела изобретения специфически связываются с опухолевым антигеном на поверхности опухолевой клетки и в то же время связываются с антигеном на поверхности цитотоксических Т-лимфоцитов. Предпочтительно указанный антиген представляет собой CD3 Т-клеточный корецепторный (CD3) антиген. Биспецифическое антитело способно вызывать иммунный ответ специфически в месте опухоли, впоследствии вызывая апоптоз клетки-мишени.
В конкретном воплощении в соответствии с изобретением биспецифическое антитело, активирующее Т-клетки, способно к одновременному связыванию с антигеном опухолевой клетки и антигеном, активирующим Т-клетки. В одном воплощении биспецифическое антитело, активирующее Т-клетки, способно соединять Т-клетку и опухолевую клетку путем одновременного связывания с антигеном опухолевой клетки и антигеном, активирующим Т-клетки. В еще более конкретном воплощении такое одновременное связывание приводит к лизису опухолевой клетки. В одном воплощении такое одновременное связывание приводит к активации Т-клетки. В других воплощениях такое одновременное связывание приводит к клеточному ответу Т-лимфоцита, в частности цитотоксического Т-лимфоцита, выбранному из группы: пролиферации, дифференцировки, секреции цитокинов, высвобождения цитотоксических эффекторных молекул, цитотоксической активности и экспрессии маркеров активации. В одном воплощении связывание биспецифического антитела, активирующего Т-клетки, с антигеном, активирующим Т-клетки, без одновременного связывания с антигеном клетки-мишени не приводит к активации Т-клеток.
В одном воплощении биспецифическое антитело, активирующее Т-клетки, способно к перенаправлению цитотоксической активности Т-клетки на клетку-мишень. В конкретном воплощении указанное перенаправление не зависит от МНС-опосредованной презентации пептидного антигена клеткой-мишенью и/или специфичности Т-клетки.
+
+
+
В частности, Т-клетка в соответствии с любым из воплощений изобретения является цитотоксической Т-клеткой. В некоторых воплощениях Т-клетка представляет собой CD4 или CD8 Т-клетку, в частности CD8 Т-клетку.
В одном воплощении предложены биспецифические антитела, которые специфически связывают антиген, активирующий Т-клетки, и опухолевый антиген (ТА), содержащие первый Fab-фрагмент и второй Fab-фрагмент, где либо вариабельные области, либо константные области тяжелой и легкой цепи второго Fab-фрагмента меняются; и где биспецифическое антитело не содержит Fc-домен.
В одном аспекте предложено биспецифическое антитело, которое специфически связывает антиген, активирующий Т-клетки, и опухолевый антиген (ТА), содержащее по меньшей мере два Fab-фрагмента, где первый Fab-фрагмент содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, специфичный к опухолевому антигену (ТА); и второй Fab-фрагмент содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, специфичный к антигену, активирующему Т-клетки, где либо вариабельные области, либо константные области тяжелой и легкой цепей второго Fab-фрагмента меняются; и где биспецифическое антитело лишено Fc-домена.
В конкретном воплощении антиген, активирующий Т-клетки, представляет собой CD3 Т-клеточный корецепторный (CD3) антиген, в частности человеческий или собачий CD3, наиболее конкретно человеческий CD3. В некоторых воплощениях антиген, активирующий Т-клетки, является эпсилон-субъединицей CD3. В других воплощениях антиген, активирующий Т-клетки, является альфа- и бета-субъединицей CD3.
В одном аспекте предложено биспецифическое антитело, которое специфически связывает CD3 Т-клеточный корецепторный (CD3) антиген и опухолевый антиген (ТА), содержащее по меньшей мере два Fab-фрагмента, где первый Fab-фрагмент содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, специфичный к опухолевому антигену (ТА); а второй Fab-фрагмент содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, специфичный к CD3 Т-клеточному корецептору (CD3), где либо вариабельные области, либо константные области тяжелой и легкой цепи второго Fab-фрагмента меняются; и где биспецифическое антитело лишено Fc-домена.
4
2
В одном воплощении первый и второй Fab-фрагменты связаны через пептидный линкер. Предпочтительно указанный пептидный линкер представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью с длиной по меньшей мере 5 аминокислот, предпочтительно с длиной от 5 до 100, более предпочтительно от 10 до 50 аминокислот. В одном воплощении указанный пептидный линкер представляет собой (GxS)n или (GxS)nGm, где G = глицин, S = серин, и (х=3, n=3, 4, 5 или 6, и m=0, 1, 2 или 3) или (х=4, n=2, 3, 4 или 5 и m=0, 1, 2 или 3), предпочтительно х=4 и n=2 или 3, более предпочтительно с х=4, n=2. В одном воплощении указанный пептидный линкер представляет собой (GS). Пептидный линкер используется для соединения первого и второго Fab-фрагмента.
В одном воплощении первый Fab-фрагмент соединен с С- или N-концом второго Fab-фрагмента.
В одном воплощении первый Fab-фрагмент соединен с N-концом второго Fab-фрагмента. В зависимости от того, меняются ли вариабельные или константные домены тяжелой и легкой цепи второго Fab-фрагмента, возможны различные молекулы биспецифического антитела, когда первый Fab-фрагмент соединен с N-концом второго Fab-фрагмента.
(VHVL)
В одном воплощении вариабельные домены второго Fab-фрагмента меняются (т.е. второй Fab-фрагмент представляет собой CrossFab), и С-конец тяжелой или легкой цепи первого Fab-фрагмента соединен с N-концом VLCH1-цепи второго Fab-фрагмента. Предпочтительно, С-конец тяжелой цепи первого Fab-фрагмента соединен с N-концом VLCH1-цепи второго Fab-фрагмента. Таким образом, в одном воплощении биспецифическое антитело содержит три цепи: легкую цепь (VLCL) первого Fab-фрагмента, тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, связанную с VLCH1-цепью второго Fab-фрагмента через пептидный линкер (VHCH1-линкер-VLCH1), и VHCL-цепь второго Fab-фрагмента.
(CLCH1)
В другом воплощении константные домены второго Fab-фрагмента меняются (т.е. второй Fab-фрагмент представляет собой CrossFab), а С-конец тяжелой или легкой цепи первого Fab-фрагмента соединен с N-концом VHCL-цепи второго Fab-фрагмента. Предпочтительно, С-конец тяжелой цепи первого Fab-фрагмента соединен с N-концом VHCL-цепи второго Fab-фрагмента. Таким образом, в одном воплощении биспецифическое антитело содержит три цепи: легкую цепь (VLCL) первого Fab-фрагмента, тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, связанную с VHCL-цепью второго Fab-фрагмента через пептидный линкер (VHCH1-линкер-VHCL), и VLCH1-цепь второго Fab-фрагмента.
В одном воплощении первый Fab-фрагмент соединен с С-концом второго Fab-фрагмента. В зависимости от того, меняются ли вариабельные или константные домены тяжелой и легкой цепей второго Fab-фрагмента, возможны различные молекулы биспецифического антитела, когда первый Fab-фрагмент связан с С-концом второго Fab-фрагмента.
(VHVL)
В одном воплощении меняются вариабельные домены второго Fab-фрагмента (т.е. второй Fab-фрагмент представляет собой CrossFab), а СН1-домен второго Fab-фрагмента соединен с N-концом тяжелой или легкой цепи первого Fab-фрагмента. Предпочтительно, СН1-домен второго Fab-фрагмента соединен с N-концом тяжелой цепи первого Fab-фрагмента. Таким образом, в одном воплощении биспецифическое антитело содержит три цепи: легкую цепь (VLCL) первого Fab-фрагмента, VLCH1-цепь второго Fab-фрагмента, соединенную с тяжелой цепью первого Fab-фрагмента через пептидный линкер (VLCH1-линкер-VHCH1), и VHCL-цепь второго Fab-фрагмента.
(CLCH1)
В другом воплощении меняются константные домены второго Fab-фрагмента (т.е. второй Fab-фрагмент представляет собой CrossFab), a CL-домен второго Fab-фрагмента соединен с N-концом тяжелой или легкой цепи первого Fab-фрагмента. Предпочтительно, CL-домен второго Fab-фрагмента соединен с N-концом тяжелой цепи первого Fab-фрагмента. Таким образом, в одном воплощении биспецифическое антитело содержит три цепи: легкую цепь (VLCL) первого Fab-фрагмента, VHCL-цепь второго Fab-фрагмента, соединенную с тяжелой цепью первого Fab-фрагмента через пептидный линкер (VLCH1-линкер-VHCH1), и VLCH1-цепь второго Fab-фрагмента.
Биспецифические антитела в соответствии с изобретением являются по меньшей мере двухвалентным и могут быть трехвалентными или поливалентными, например четырехвалентными или шестивалентными. В одном воплощении указанные биспецифические антитела являются двухвалентными (формат 1+1) с одним сайтом связывания, направленным на опухолевый антиген (ТА) и антиген, активирующий Т-клетки, соответственно. В другом воплощении указанные биспецифические антитела являются трехвалентными (формат 2+1) с двумя сайтами связывания, каждый из которых направлен на опухолевый антиген (ТА), и одним сайтом связывания, направленным на антиген, активирующий Т-клетки, как описано в следующем разделе.
В одном воплощении указанное антитело дополнительно содержит третий Fab-фрагмент. В одном воплощении указанный третий Fab-фрагмент содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, специфичный к опухолевому антигену. В одном воплощении антигенсвязывающий сайт указанного третьего Fab-фрагмента специфичен к тому же опухолевому антигену, что и антигенсвязывающий сайт первого Fab-фрагмента.
В одном воплощении третий Fab-фрагмент соединен с N- или С-концом первого Fab-фрагмента. В одном воплощении третий Fab-фрагмент соединен с первым Fab-фрагментом через пептидный линкер. Предпочтительно указанный пептидный линкер представляет собой (G4S)2-линкер.
В одном воплощении третий Fab-фрагмент соединен с N- или С-концом легкой цепи или тяжелой цепи первого Fab-фрагмента. В зависимости от того, какой конец первого Fab-фрагмента соединен со вторым Fab-фрагментом (как описано выше), третий Fab-фрагмент соединен с противоположным (свободным) концом первого фрагмента.
В одном воплощении биспецифическое антитело изобретения содержит три Fab-фрагмента, где указанные Fab-фрагменты и указанный линкер соединены в следующем порядке в направлении от N-конца к С-концу: Fab-фрагмент 3 - линкер - Fab-фрагмент 1 - линкер - Fab-фрагмент 2, где либо вариабельные области, либо константные области тяжелой и легкой цепи второго Fab-фрагмента меняются. В этом воплощении С-конец третьего Fab-фрагмента соединен с N-концом первого Fab-фрагмента. Как описывалось выше, Fab-фрагменты могут быть связаны друг с другом через тяжелую или легкую цепи. В одном воплощении С-конец тяжелой цепи третьего Fab-фрагмента соединен с N-концом тяжелой цепи первого Fab-фрагмента через пептидный линкер; и С-конец первого Fab-фрагмента соединен с N-концом второго Fab-фрагмента, где либо вариабельные области, либо константные области тяжелой и легкой цепи второго Fab-фрагмента меняются. В зависимости от того, меняются ли вариабельные или константные домены тяжелой и легкой цепей второго Fab-фрагмента, возможны различные молекулы биспецифического антитела.
(VHVL)
В одном воплощении вариабельные домены второго Fab-фрагмента меняются (т.е. второй Fab-фрагмент представляет собой CrossFab), и цепи трех Fab-фрагментов соединены в следующем порядке в направлении от N-конца к С-концу: VHCH1-линкер-VHCH1-линкер-VLCH1. В одном воплощении биспецифическое антитело содержит четыре цепи: легкую цепь (VLCL) третьего Fab-фрагмента, легкую цепь (VLCL) первого Fab-фрагмента, тяжелую цепь третьего фрагмента, соединенную с тяжелой цепью первого Fab-фрагмента, который сам соединен с VLCH1-цепью второго Fab-фрагмента через пептидный линкер (VHCH1-линкер-VHCH1-линкер-VLCH1), и VHCL-цепь второго Fab-фрагмента.
(CLCH1)
В одном воплощении константные домены второго Fab-фрагмента меняются (т.е. второй Fab-фрагмент представляет собой CrossFab), а цепи трех Fab-фрагментов соединены в следующем порядке в направлении от N-конца к С-концу: VHCH1-линкер-VHCH1-линкер-VHCL. В одном воплощении биспецифическое антитело содержит четыре цепи: легкую цепь (VLCL) третьего Fab-фрагмента, легкую цепь (VLCL) первого Fab-фрагмента, тяжелую цепь третьего фрагмента, соединенную с тяжелой цепью первого Fab-фрагмента, который сам соединен с VHCL-цепью второго Fab-фрагмента через пептидный линкер (VHCH1-линкер-VHCH1-линкер-VHCL), и VLCH1-цепь второго Fab-фрагмента.
В одном воплощении биспецифическое антитело изобретения содержит три Fab-фрагмента, где указанные Fab-фрагменты и указанный линкер соединены в следующем порядке в направлении от N-конца к С-концу: Fab-фрагмент 2 - линкер - Fab-фрагмент 1 - линкер - Fab-фрагмент 3, где либо вариабельные области, либо константные области тяжелой и легкой цепи второго Fab-фрагмента меняются. В этом воплощении N-конец третьего Fab-фрагмента соединен с С-концом первого Fab-фрагмента. Как описывалось выше, Fab-фрагменты могут быть связаны друг с другом через тяжелую или легкую цепи. В одном воплощении N-конец тяжелой цепи третьего Fab-фрагмента соединен с С-концом тяжелой цепи первого Fab-фрагмента через пептидный линкер; а N-конец первого Fab-фрагмента соединен с С-концом второго Fab-фрагмента, где либо вариабельные области, либо константные области тяжелой и легкой цепи второго Fab-фрагмента меняются. В зависимости от того, меняются ли вариабельные или константные домены тяжелой и легкой цепей второго Fab-фрагмента, возможны различные молекулы биспецифического антитела.
(VHVL)
В одном воплощении вариабельные домены второго Fab-фрагмента меняются (т.е. второй Fab-фрагмент представляет собой CrossFab), и цепи трех Fab-фрагментов соединены в следующем порядке в направлении от N-конца к С-концу: VLCH1-линкер-VHCH1-линкер-VHCH1. В одном воплощении биспецифическое антитело содержит четыре цепи: легкую цепь (VLCL) третьего Fab-фрагмента, легкую цепь (VLCL) первого Fab-фрагмента, VLCH1-цепь второго Fab-фрагмента, соединенную с тяжелой цепью первого фрагмента, которая сама соединена с тяжелой цепью первого Fab-фрагмента через пептидный линкер (VLCH1-линкер-VHCH1-линкер-VHCH1), и VHCL-цепь второго Fab-фрагмента.
(CLCH1)
В одном воплощении константные домены второго Fab-фрагмента меняются (т.е. второй Fab-фрагмент представляет собой CrossFab), и цепи трех Fab-фрагментов соединены в следующем порядке в направлении от N-конца к С-концу: VHCL-линкер-VHCH1-линкер-VHCH1. В одном воплощении биспецифическое антитело содержит четыре цепи: легкую цепь (VLCL) третьего Fab-фрагмента, легкую цепь (VLCL) первого Fab-фрагмента, VHCL-цепь второго Fab-фрагмента, соединенную с тяжелой цепью первого фрагмента, которая сама соединена с тяжелой цепью первого Fab-фрагмента через пептидный линкер (VHCL-линкер-VHCH1-линкер-VHCH1), и VLCH1-цепь второго Fab-фрагмента.
В другом воплощении третий Fab-фрагмент соединен с N- или С-концом легкой цепи или тяжелой цепи второго Fab-фрагмента. В одном воплощении третий Fab-фрагмент соединен со вторым Fab-фрагментом через пептидный линкер. Предпочтительно указанный пептидный линкер представляет собой (G4S)2-линкер. Как описывалось выше, Fab-фрагменты могут быть связаны друг с другом через тяжелую или легкую цепи.
В одном воплощении биспецифическое антитело изобретения содержит три Fab-фрагмента, где указанные Fab-фрагменты и указанный линкер соединены в следующем порядке в направлении от N-конца к С-концу: Fab-фрагмент 1 - линкер - Fab-фрагмент 2 - линкер - Fab-фрагмент 3, где либо вариабельные области, либо константные области тяжелой и легкой цепи второго Fab-фрагмента меняются. В одном воплощении N-конец третьего Fab-фрагмента соединен с С-концом второго Fab-фрагмента.
В другом воплощении С-конец тяжелой цепи третьего Fab-фрагмента соединен с N-концом второго Fab-фрагмента через пептидный линкер; и N-конец первого Fab-фрагмента соединен с С-концом второго Fab-фрагмента, где либо вариабельные области, либо константные области тяжелой и легкой цепи второго Fab-фрагмента меняются.
В зависимости от того, меняются ли вариабельные или константные домены тяжелой и легкой цепей второго Fab-фрагмента, возможны различные молекулы биспецифического антитела.
(VHVL)
В одном воплощении вариабельные домены второго Fab-фрагмента меняются (т.е. второй Fab-фрагмент представляет собой CrossFab), и цепи трех Fab-фрагментов соединены в следующем порядке в направлении от N-конца к С-концу: VHCH1-линкер-VLCH1-линкер-VHCH1. В одном воплощении биспецифическое антитело содержит четыре цепи: легкую цепь (VLCL) третьего Fab-фрагмента, легкую цепь (VLCL) первого Fab-фрагмента, тяжелую цепь третьего фрагмента, связанную с N-концом VLCH1-цепи второго Fab-фрагмента, при этом С-конец указанной VLCH1-цепи связан с N-концом тяжелой цепи первого Fab-фрагмента через пептидный линкер (VHCH1-линкер-VLCH1-линкер-VHCH1), и VHCL-цепь второго Fab-фрагмента.
(CLCH1)
В одном воплощении константные домены второго Fab-фрагмента меняются (т.е. второй Fab-фрагмент представляет собой CrossFab), и цепи трех Fab-фрагментов соединены в следующем порядке в направлении от N-конца к С-концу: VHCH1-линкер-VHCL-линкер-VHCH1. В одном воплощении биспецифическое антитело содержит четыре цепи: легкую цепь (VLCL) третьего Fab-фрагмента, легкую цепь (VLCL) первого Fab-фрагмента, тяжелую цепь третьего фрагмента, связанную с N-концом VHCL-цепи второго Fab-фрагмента, при этом С-конец указанной VHCL-цепи связан с N-концом тяжелой цепи первого Fab-фрагмента через пептидный линкер (VHCH1-линкер-VHCL-линкер-VHCH1), и VLCH1-цепь второго Fab-фрагмента.
(ТА)
(ТА)
(Антиген, активирующий Т-клетки)
(ТА)
(Антиген, активирующий Т-клетки)
В одном воплощении антигенсвязывающий сайт указанного третьего Fab-фрагмента специфичен к тому же опухолевому антигену, что и антигенсвязывающий сайт первого Fab-фрагмента, и биспецифическое антитело изобретения содержит три Fab-фрагмента, связанных через пептидный линкер в следующем порядке (либо в направлении от N-конца к С-концу, либо от С-конца к N-концу): Fab-линкер-Fab-линкер-xFab, где Fab обозначает Fab-фрагмент с антигенсвязывающим сайтом, специфичным к опухолевому антигену, а xFab обозначает Fab-фрагмент с антигенсвязывающим сайтом, специфичным у антигену, активирующему Т-клетки, где либо вариабельные области, либо константные области тяжелой и легкой цепи меняются.
(ТА)
(Антиген, активирующий Т-клетки)
(ТА)
(ТА)
(Антиген, активирующий Т-клетки)
В одном воплощении антигенсвязывающий сайт указанного третьего Fab-фрагмента специфичен к тому же опухолевому антигену, что и антигенсвязывающий сайт первого Fab-фрагмента, и биспецифическое антитело изобретения содержит три Fab-фрагмента, связанных через пептидный линкер в следующем порядке (либо в направлении от N-конца к С-концу, либо от С-конца к N-концу): Fab-линкер-xFab-линкер-Fab, где Fab обозначает Fab-фрагмент с антигенсвязывающим сайтом, специфичным к опухолевому антигену, a xFab обозначает Fab-фрагмент с антигенсвязывающим сайтом, специфичным к антигену, активирующему Т-клетки, где либо вариабельные области, либо константные области тяжелой и легкой цепи меняются.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит антигенсвязывающую группировку, которая может конкурировать с моноклональным антителом V9 в связывании эпитопа CD3. См., например, Rodigues et al., Int J Cancer Suppl 7 (1992), 45-50; US 6,054,297, включенный в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит антигенсвязывающую группировку, которая может конкурировать с моноклональным антителом FN18 в связывании эпитопа CD3. См. Nooij et al., Eur J Immunol 19 (1986), 981-984, включенный в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит антигенсвязывающую группировку, которая может конкурировать с моноклональным антителом СН2527 (последовательность ID 157 и 158) или его вариантом со зрелой аффинностью в связывании эпитопа CD3.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит второй Fab-фрагмент, специфически связывающий CD3, где вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR1 из SEQ ID №10 или SEQ ID №32, CDR2 из SEQ ID №11 или SEQ ID №33, и CDR3 из SEQ ID №12 или SEQ ID №34; и где вариабельная область легкой цепи содержит CDR1 из SEQ ID №7 или SEQ ID №29, CDR2 из SEQ ID №8 или SEQ ID №30, и CDR3 из SEQ ID №9 или SEQ ID №31.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит второй Fab-фрагмент, специфически связывающий CD3, где вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR1 из SEQ ID №10, CDR2 из SEQ ID №11 и CDR3 из SEQ ID №12; и где вариабельная область легкой цепи содержит CDR1 из SEQ ID №7, CDR2 из SEQ ID №8 и CDR3 из SEQ ID №9.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит второй Fab-фрагмент, специфически связывающий CD3, где вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR1 SEQ ID №32, CDR2 SEQ ID №33 и CDR3 из SEQ ID №34; и где вариабельная область легкой цепи содержит CDR1 из SEQ ID №29, CDR2 из SEQ ID №30 и CDR3 из SEQ ID №31.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №20 или SEQ ID №36; где последовательность вариабельной области легкой цепи имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №19 или SEQ ID №35, или их варианты, которые сохраняют функциональность. В одном воплощении биспецифическое антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID №20; а вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID №19, или их варианты, которые сохраняют функциональность.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID №36; а вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID №35, или их варианты, которые сохраняют функциональность.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID №158; а вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID №157, или их варианты, которые сохраняют функциональность. В одном воплощении биспецифическое антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №158; где последовательность вариабельной области легкой цепи имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №157, или их варианты, которые сохраняют функциональность. В одном воплощении биспецифическое антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи является вариантом SEQ ID №158 со зрелой аффинностью, и где последовательность вариабельной области легкой цепи является вариантом SEQ ID №157 со зрелой аффинностью. Понятие вариантов со зрелой аффинностью в этом воплощении означает, что независимо 1, 2, 3 или 4 аминокислоты из SEQ ID №158 и/или SEQ ID №157 меняются.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, где указанная тяжелая цепь содержит константную область, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID №22 или SEQ ID №38, или их варианты, которые сохраняют функциональность. В одном воплощении биспецифическое антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, где указанная тяжелая цепь содержит константную область, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID №22 или SEQ ID №38, и легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфичного к опухолевому антигену (ТА), содержащему одну или более чем одну аминокислотную последовательность, определенную в любом из воплощений, описанных в данном документе.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, где указанная тяжелая цепь содержит константную область, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID №22. В одном воплощении биспецифическое антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, где указанная тяжелая цепь содержит константную область, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID №22, и легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфичного к опухолевому антигену (ТА), содержащему одну или более чем одну аминокислотную последовательность, определенную в любом из воплощений, описанных в данном документе.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, где указанная легкая цепь содержит константную область, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID №21 или SEQ ID №37. В одном воплощении биспецифическое антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, где указанная легкая цепь содержит константную область, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID №21 или SEQ ID №37, и легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфичного к опухолевому антигену (ТА), содержащему одну или более чем одну аминокислотную последовательность, определенную в любом из воплощений, описанных в данном документе.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, где указанная легкая цепь содержит константную область, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID №21. В одном воплощении биспецифическое антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепи второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, где указанная легкая цепь содержит константную область, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID №21, и легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфичного к опухолевому антигену (ТА), содержащему одну или более чем одну аминокислотную последовательность, определенную в любом из воплощений, описанных в данном документе.
В еще одном конкретном воплощении биспецифическое антитело изобретения содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, при этом указанная тяжелая цепь содержит константную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из SEQ ID №22 или SEQ ID №38; а указанная легкая цепь содержит константную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью из SEQ ID №21 или SEQ ID №37.
В еще одном конкретном воплощении биспецифическое антитело изобретения содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, при этом указанная тяжелая цепь содержит константную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из SEQ ID №22; а указанная легкая цепь содержит константную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью из SEQ ID №21.
В еще одном конкретном воплощении биспецифическое антитело изобретения содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, при этом указанная тяжелая цепь содержит константную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из SEQ ID №22; а указанная легкая цепь содержит константную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью из SEQ ID №21, и легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфичного к опухолевому антигену (ТА), содержащему одну или более чем одну аминокислотную последовательность, определенную в любом из воплощений, описанных в данном документе.
В одном воплощении биспецифическое антитело изобретения содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №19 и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №20, константную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из SEQ ID №22 и константную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью из SEQ ID №21.
В одном воплощении биспецифическое антитело изобретения содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №19 и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №20, константную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из SEQ ID №22 и константную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью из SEQ ID №21, и легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфичного к опухолевому антигену (ТА), содержащему одну или более чем одну аминокислотную последовательность, определенную в любом из воплощений, описанных в данном документе.
В одном воплощении биспецифическое антитело изобретения содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №35 и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №36, и константную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из SEQ ID №38, и константную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью из SEQ ID №37.
В одном воплощении биспецифическое антитело изобретения содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №35 и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №36, и константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID №38, и константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID №37, и легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфичного к опухолевому антигену (ТА), содержащему одну или более чем одну аминокислотную последовательность, определенную в любом из воплощений, описанных в данном документе.
В одном воплощении биспецифическое антитело изобретения содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №157 и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №158, и константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID №22, и константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID №21.
В одном воплощении биспецифическое антитело изобретения содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №157 или ее вариант со зрелой аффинностью, и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №158 или ее вариант со зрелой аффинностью, и константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID №22, и константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID №21. Понятие вариантов со зрелой аффинностью в этом воплощении означает, что независимо 1, 2, 3 или 4 аминокислоты из SEQ ID №158 и/или SEQ ID №157 меняются.
В одном воплощении биспецифическое антитело изобретения содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №157 и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №158, и константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID №22, и константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID №21, и легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфичного к опухолевому антигену (ТА), содержащему одну или более чем одну аминокислотную последовательность, определенную в любом из воплощений, описанных в данном документе.
В одном воплощении биспецифическое антитело изобретения содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №157 или ее вариант со зрелой аффинностью и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №158 или ее вариант со зрелой аффинностью, и константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID №22, и константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID №21, и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфичного к опухолевому антигену (ТА), содержащему одну или более чем одну аминокислотную последовательность, определенную в любом из воплощений, описанных в данном документе. Понятие вариантов со зрелой аффинностью в этом воплощении означает, что независимо 1, 2, 3 или 4 аминокислоты из SEQ ID №158 и/или SEQ ID №157 меняются.
В одном воплощении опухолевый антиген выбран из группы ассоциированного с меланомой хондроитинсульфатпротеогликана (MCSP), рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), карциноэмбрионального антигена (СЕА), белка активации фибробластов (FAP) и CD33. В одном предпочтительном воплощении опухолевый антиген представляет собой MCSP.
В одном воплощении биспецифическое антитело, активирующее Т-клетки, содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, который специфичен к ассоциированному с меланомой хондроитинсульфатпротеогликану (MCSP). В другом воплощении биспецифическое антитело, активирующее Т-клетки, содержит по меньшей мере один, обычно две или более двух антигенсвязывающих группировок, которые могут конкурировать с моноклональным антителом М4-3 ML2 (последовательность ID 161 и 162) или его вариантом со зрелой аффинностью за связывание с эпитопом MCSP.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфически связывающегося с MCSP, где вариабельная тяжелая цепь содержит CDR1 из SEQ ID №4, CDR2 из SEQ ID №5, CDR3 из SEQ ID №6; а вариабельная легкая цепь содержит CDR1 из SEQ ID №1, CDR2 из SEQ ID №2, и CDR3 из SEQ ID №3.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфически связывающегося с MCSP, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №14; а вариабельная область легкой цепи имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №13.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфически связывающегося с MCSP, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №161; а вариабельная область легкой цепи имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №162.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфически связывающегося с MCSP, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи является вариантом SEQ ID №161 со зрелой аффинностью, и где последовательность вариабельной области легкой цепи является вариантом SEQ ID №162 со зрелой аффинностью. Понятие вариантов со зрелой аффинностью в этом воплощении означает, что независимо меняются 1, 2, 3 или 4 аминокислоты из SEQ ID №161 и/или SEQ ID №162.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфически связывающегося с MCSP, где указанная тяжелая цепь содержит константную область с аминокислотной последовательностью из SEQ ID №16. В одном воплощении биспецифическое антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфически связывающегося с MCSP, где указанная тяжелая цепь содержит константную область с аминокислотной последовательностью из SEQ ID №16, и легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфичного к CD3, содержащего одну или более чем одну аминокислотную последовательность, определенную в любом из воплощений, описанных в данном документе.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфически связывающегося с MCSP, где указанная легкая цепь содержит константную область с аминокислотной последовательностью из SEQ ID №15. В одном воплощении биспецифическое антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго антитела, специфически связывающегося с MCSP, где указанная легкая цепь содержит константную область с аминокислотной последовательностью из SEQ ID №15, и легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфичного к CD3, содержащего одну или более чем одну аминокислотную последовательность, определенную в любом из воплощений, описанных в данном документе.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфически связывающегося с MCSP, где константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID №16; и константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID №15.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфически связывающегося с MCSP, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID №14; и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью из SEQ ID №13, и где константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID №16; и константную область легкой цепи с аминокислотную последовательность из SEQ ID №15.
В другом воплощении биспецифическое антитело изобретения содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №19 и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №20; и легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфичного к MCSP, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №13 и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №14.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфически связывающегося с MCSP, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID №161; и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID №162, и где константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID №16; и константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID №15.
В другом воплощении биспецифическое антитело изобретения содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №19 и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №20; и легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфичного к MCSP, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №161 и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №162.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфически связывающегося с MCSP, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID №161 или ее вариант со зрелой аффинностью; и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью из SEQ ID №162 или ее вариант со зрелой аффинностью, и где константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID №16; и константную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью из SEQ ID №15. Понятие вариантов со зрелой аффинностью в этом воплощении означает, что независимо 1, 2, 3 или 4 аминокислоты из SEQ ID №161 и/или SEQ ID №162 меняются.
В другом воплощении биспецифическое антитело изобретения содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №19 и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №20; и легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфичного к MCSP, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №161 или ее вариант со зрелой аффинностью и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №162 или ее вариант со зрелой аффинностью. Понятие вариантов со зрелой аффинностью в этом воплощении означает, что независимо 1, 2, 3 или 4 аминокислоты из SEQ ID №161 и/или SEQ ID №162 меняются.
В другом воплощении биспецифическое антитело изобретения содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №158 и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №157; и легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфичного к MCSP, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №161 и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №162.
В другом воплощении биспецифическое антитело изобретения содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №158 или ее вариант со зрелой аффинностью и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №157 или ее вариант со зрелой аффинностью; и легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфичного к MCSP, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №161 или ее вариант со зрелой аффинностью и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №162 или ее вариант со зрелой аффинностью. Понятие вариантов со зрелой аффинностью в этом воплощении означает, что независимо 1, 2, 3 или 4 аминокислоты одной или более чем одной SEQ ID №157, SEQ ID №158, SEQ ID №161 и/или SEQ ID №162 меняются.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит третий Fab-фрагмент, содержащий легкую цепь и тяжелую цепь, специфически связывающийся с MCSP, где вариабельная тяжелая цепь содержит CDR1 из SEQ ID №4, CDR2 из SEQ ID №5, CDR3 из SEQ ID №6; а вариабельная легкая цепь содержит CDR1 из SEQ ID №1, CDR2 из SEQ ID №2, и CDR3 из SEQ ID №3.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит третий Fab-фрагмент, содержащий легкую цепь и тяжелую цепь, специфически связывающийся с MCSP, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №14; и вариабельная область легкой цепи имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №13.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит третий Fab-фрагмент, содержащий легкую цепь и тяжелую цепь, специфически связывающийся с MCSP, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №161; а вариабельная область легкой цепи имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №162.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит третий Fab-фрагмент, содержащий легкую цепь и тяжелую цепь, специфически связывающийся с MCSP, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи является вариантом SEQ ID №161 со зрелой аффинностью, и где последовательность вариабельной области легкой цепи является вариантом SEQ ID №162 со зрелой аффинностью. Понятие вариантов со зрелой аффинностью в этом воплощении означает, что независимо 1, 2, 3 или 4 аминокислоты из SEQ ID №161 и/или SEQ ID №162 меняются.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит третий Fab-фрагмент, содержащий легкую цепь и тяжелую цепь, специфически связывающийся с MCSP, где указанная тяжелая цепь содержит константную область с аминокислотной последовательностью из SEQ ID №16. В одном воплощении биспецифическое антитело содержит третий Fab-фрагмент, содержащий легкую цепь и тяжелую цепь, специфически связывающийся с MCSP, где указанная тяжелая цепь содержит константную область с аминокислотной последовательностью из SEQ ID №16, и легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфичного к CD3, содержащего одну или более чем одну аминокислотную последовательность, определенную в любом из воплощений, описанных в данном документе, и легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфичного к MCSP, содержащего одну или более чем одну аминокислотную последовательность, определенную в любом из воплощений, описанных в данном документе.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит третий Fab-фрагмент, содержащий легкую цепь и тяжелую цепь, специфически связывающийся с MCSP, где указанная легкая цепь содержит константную область, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID №15. В одном воплощении биспецифическое антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго антитела, специфически связывающегося с MCSP, где указанная легкая цепь содержит константную область с аминокислотной последовательностью из SEQ ID №15, и легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфичного к CD3, и легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфичного к MCSP, содержащего одну или более чем одну аминокислотную последовательность, определенную в любом из воплощений, описанных в данном документе.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит третий Fab-фрагмент, содержащий легкую цепь и тяжелую цепь, специфически связывающийся с MCSP, где константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID №16; и константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID №15.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит третий Fab-фрагмент, содержащий легкую цепь и тяжелую цепь, специфически связывающийся с MCSP, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID №14; и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью из SEQ ID №13, и где константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID №16; и константную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью из SEQ ID №15.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит третий Fab-фрагмент, содержащий легкую цепь и тяжелую цепь, специфически связывающиеся с MCSP, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID №161; и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью из SEQ ID №162, и где константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID №16; и константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID №15.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит третий Fab-фрагмент, содержащий легкую цепь и тяжелую цепь, специфически связывающийся с MCSP, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи является вариантом SEQ ID №161 со зрелой аффинностью, и где последовательность вариабельной области легкой цепи является вариантом SEQ ID №162 со зрелой аффинностью, и где константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID №16; и константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID №15. Понятие вариантов со зрелой аффинностью в этом воплощении означает, что независимо 1, 2, 3 или 4 аминокислоты из SEQ ID №161 и/или SEQ ID №162 меняются.
В другом воплощении биспецифическое антитело изобретения содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №19 и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №20; и легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфичного к MCSP, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №13 и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №14, и легкую цепь и тяжелую цепь третьего Fab-фрагмента, специфичного к MCSP, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №13 и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №14.
В другом воплощении биспецифическое антитело изобретения содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №19 и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №20; и легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфичного к MCSP, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №162 и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №161, и легкую цепь и тяжелую цепь третьего Fab-фрагмента, специфичного к MCSP, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №162 и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №161.
В другом воплощении биспецифическое антитело изобретения содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №19 и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №20; и легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфичного к MCSP, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №162 или ее вариант со зрелой аффинностью и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №161 или ее вариант со зрелой аффинностью, и легкую цепь и тяжелую цепь третьего Fab-фрагмента, специфичного к MCSP, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №162 или ее вариант со зрелой аффинностью и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №161 или ее вариант со зрелой аффинностью. Понятие вариантов со зрелой аффинностью в этом воплощении означает, что независимо 1, 2, 3 или 4 аминокислоты из SEQ ID №161 и/или SEQ ID №162 меняются.
В другом воплощении биспецифическое антитело изобретения содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №157 и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №158; и легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфичного к MCSP, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №162 и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №161, и легкую цепь и тяжелую цепь третьего Fab-фрагмента, специфичного к MCSP, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №162 и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №161.
В другом воплощении биспецифическое антитело изобретения содержит легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфически связывающего CD3, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №157 и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №158; и легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфичного к MCSP, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №162 или ее вариант со зрелой аффинностью и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №161 или ее вариант со зрелой аффинностью, и легкую цепь и тяжелую цепь третьего Fab-фрагмента, специфичного к MCSP, содержащего вариабельную легкую цепь из SEQ ID №162 или ее вариант со зрелой аффинностью и вариабельную тяжелую цепь из SEQ ID №161 или ее вариант со зрелой аффинностью. Понятие вариантов со зрелой аффинностью в этом воплощении означает, что независимо 1, 2, 3 или 4 аминокислоты из SEQ ID №161 и/или SEQ ID №162 меняются.
В еще одном воплощении указанное биспецифическое антитело содержит одну или более чем одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ ID №25, SEQ ID №26, SEQ ID №27, SEQ ID №41 и SEQ ID №43.
В одном воплощении указанное биспецифическое антитело содержит SEQ ID №23, SEQ ID №25, SEQ ID №26, SEQ ID №27.
В одном воплощении биспецифическое антитело, активирующее Т-клетки, содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, который специфичен к рецептору эпидермального фактора роста (EGFR). В другом воплощении биспецифическое антитело, активирующее Т-клетки, содержит по меньшей мере одну, как правило, две или более двух антигенсвязывающих группировок, которые могут конкурировать с моноклональным антителом GA201 за связывание с эпитопом EGFR. См. публикацию РСТ WO 2006/082515, включенную в данный документ посредством ссылки в полном объеме. В одном воплощении антигенсвязывающий сайт, который специфичен к EGFR, содержит тяжелую цепь CDR1 из SEQ ID №68, тяжелую цепь CDR2 из SEQ ID №69, тяжелую цепь CDR3 из SEQ ID №70, легкую цепь CDR1 из SEQ ID №71, легкую цепь CDR2 из SEQ ID №72 и легкую цепь CDR3 из SEQ ID №73. В другом воплощении антигенсвязывающий сайт, который специфичен к EGFR, содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №74, и последовательность вариабельной области легкой цепи, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №75, или их варианты, которые сохраняют функциональность.
В другом воплощении биспецифическое антитело содержит первый Fab-фрагмент, содержащий антигенсвязывающий сайт, который специфичен к EGFR, содержащий последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №74, и последовательность вариабельной области легкой цепи, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №75, или их варианты, которые сохраняют функциональность, и легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфичного к CD3, содержащего одну или более чем одну аминокислотную последовательность, определенную в любом из воплощений, описанных в данном документе.
В другом воплощении биспецифическое антитело содержит первый и третий Fab-фрагмент, содержащий антигенсвязывающий сайт, специфичный к EGFR, содержащий последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №74, и последовательность вариабельной области легкой цепи, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №75, или их варианты, которые сохраняют функциональность, и легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфичного к CD3, содержащего одну или более чем одну аминокислотную последовательность, определенную в любом из воплощений, описанных в данном документе.
В одном воплощении биспецифическое антитело, активирующее Т-клетки, содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, который специфичен к белку активации фибробластов (FAP). В другом воплощении биспецифическое антитело, активирующее Т-клетки, содержит по меньшей мере одну, как правило, две или более двух антигенсвязывающих группировок, которые могут конкурировать с моноклональным антителом 3F2 за связывание с эпитопом FAP. См. заявку на европейский патент № ЕР 10172842.6, включенную в данный документ в полном объеме посредством ссылки. В одном воплощении антигенсвязывающий сайт, который специфичен к FAP, содержит тяжелую цепь CDR1 из SEQ ID №76, тяжелую цепь CDR2 из SEQ ID №77, тяжелую цепь CDR3 из SEQ ID №78, легкую цепь CDR1 из SEQ ID №79, легкую цепь CDR2 из SEQ ID №80 и легкую цепь CDR3 из SEQ ID №81. В другом воплощении антигенсвязывающий сайт, который специфичен к FAP, содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №82, последовательность вариабельной области легкой цепи, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №83, или их варианты, которые сохраняют функциональность.
В другом воплощении биспецифическое антитело содержит первый Fab-фрагмент, содержащий антигенсвязывающий сайт, специфичный к FAP, содержащий последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №82, и последовательность вариабельной области легкой цепи, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №83, или их варианты, которые сохраняют функциональность, и легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфичного к CD3, содержащего одну или более чем одну аминокислотную последовательность, определенную в любом из воплощений, описанных в данном документе.
В другом воплощении биспецифическое антитело содержит первый и третий Fab-фрагмент, содержащий антигенсвязывающий сайт, специфичный к FAP, содержащий последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №82, и последовательность вариабельной области легкой цепи, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №83, или их варианты, которые сохраняют функциональность, и легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфичного к CD3, содержащего одну или более чем одну аминокислотную последовательность, определенную в любом из воплощений, описанных в данном документе.
(98/99)
В одном воплощении биспецифическое антитело, активирующее Т-клетки, содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, который специфичен к карциноэмбриональному антигену (СЕА). В другом воплощении биспецифическое антитело, активирующее Т-клетки, содержит по меньшей мере одну, как правило, две или более двух антигенсвязывающих группировок, которые могут конкурировать с моноклональным антителом СН1А1А за связывание с эпитопом СЕА. В одном воплощении биспецифическое антитело, активирующее Т-клетки, содержит по меньшей мере одну, как правило, две или более двух антигенсвязывающих группировок, которые могут конкурировать с моноклональным антителом СН1А1А клона 98/99 (СН1А1) за связывание с эпитопом СЕА. См. заявку на патент РСТ № РСТ/ЕР 2010/062527, включенную в данный документ посредством ссылки в полном объеме. В одном воплощении антигенсвязывающий сайт, который специфичен к СЕА, содержит тяжелую цепь CDR1 из SEQ ID №84, тяжелую цепь CDR2 из SEQ ID №85, тяжелую цепь CDR3 из SEQ ID №86, легкую цепь CDR1 из SEQ ID №87, легкую цепь CDR2 из SEQ ID №88 и легкую цепь CDR3 из SEQ ID №89. В другом воплощении антигенсвязывающий сайт, который специфичен к СЕА, содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №90 или SEQ ID №159, и последовательность вариабельной области легкой цепи, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №91 или SEQ ID №160, или их варианты, которые сохраняют функциональность.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфически связывающегося с СЕА, где вариабельная область тяжелой цепи содержит вариант SEQ ID №159 со зрелой аффинностью, и вариабельная область легкой цепи содержит вариант со зрелой аффинностью из SEQ ID №160. Понятие вариантов со зрелой аффинностью в этом воплощении означает, что независимо 1, 2, 3 или 4 аминокислоты из SEQ ID №159 и/или SEQ ID №160 меняются.
В другом воплощении биспецифическое антитело содержит первый Fab-фрагмент, содержащий антигенсвязывающий сайт, специфичный к СЕА, содержащий последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №90, и последовательность вариабельной области легкой цепи, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №91, или их варианты, которые сохраняют функциональность, и легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфичного к CD3, содержащего одну или более чем одну аминокислотную последовательность, определенную в любом из воплощений, описанных в данном документе.
В другом воплощении биспецифическое антитело содержит первый Fab-фрагмент, содержащий антигенсвязывающий сайт, специфичный к СЕА, содержащий последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №159, и последовательность вариабельной области легкой цепи, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №160, или их варианты, которые сохраняют функциональность, и легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфичного к CD3, содержащего одну или более чем одну аминокислотную последовательность, определенную в любом из воплощений, описанных в данном документе.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь первого Fab-фрагмента, специфически связывающегося с СЕА, где вариабельная область тяжелой цепи содержит вариант SEQ ID №159 со зрелой аффинностью; и вариабельную область легкой цепи, содержащую вариант SEQ ID №160 со зрелой аффинностью, и легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфичного к CD3, содержащего одну или более чем одну аминокислотную последовательность, определенную в любом из воплощений, описанных в данном документе. Понятие вариантов со зрелой аффинностью в этом воплощении означает, что независимо 1, 2, 3 или 4 аминокислоты из SEQ ID №159 и/или SEQ ID №160 меняются.
В другом воплощении биспецифическое антитело содержит первый и третий Fab-фрагмент, содержащий антигенсвязывающий сайт, специфичный к СЕА, содержащий последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №90 или SEQ ID №159, и последовательность вариабельной области легкой цепи, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №91 или SEQ ID №160, или их варианты, которые сохраняют функциональность, и легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфичного к CD3, содержащего одну или более чем одну аминокислотную последовательность, определенную в любом из воплощений, описанных в данном документе. Понятие вариантов со зрелой аффинностью в этом воплощении означает, что независимо 1, 2, 3 или 4 аминокислоты из SEQ ID №159 и/или SEQ ID №160 меняются.
В другом воплощении биспецифическое антитело содержит первый и третий Fab-фрагмент, содержащий антигенсвязывающий сайт, который специфичен к СЕА, где вариабельная область тяжелой цепи содержит вариант SEQ ID №159 со зрелой аффинностью; и вариабельную область легкой цепи, содержащую вариант SEQ ID №160 со зрелой аффинностью. Понятие вариантов со зрелой аффинностью в этом воплощении означает, что независимо 1, 2, 3 или 4 аминокислоты из SEQ ID №159 и/или SEQ ID №160 меняются.
В одном воплощении биспецифическое антитело, активирующее Т-клетки, содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, который специфичен к CD33. В одном воплощении антигенсвязывающий сайт, который специфичен к CD33, содержит тяжелую цепь CDR1 из SEQ ID №92, тяжелую цепь CDR2 из SEQ ID №93, тяжелую цепь CDR3 из SEQ ID №94, легкую цепь CDR1 из SEQ ID №95, легкую цепь CDR2 из SEQ ID №96, и легкую цепь CDR3 из SEQ ID №97. В другом воплощении антигенсвязывающий сайт, который специфичен к CD33, содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №98, и последовательность вариабельной области легкой цепи, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №99, или их варианты, которые сохраняют функциональность.
В другом воплощении биспецифическое антитело содержит первый Fab-фрагмент, содержащий антигенсвязывающий сайт, специфичный к CD33, содержащий последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №98, и последовательность вариабельной области легкой цепи, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID №99, или их варианты, которые сохраняют функциональность, и легкую цепь и тяжелую цепь второго Fab-фрагмента, специфичного к CD3, содержащего одну или более чем одну аминокислотную последовательность, определенную в любом из воплощений, описанных в данном документе.
В конкретном воплощении биспецифическое антитело, активирующее Т-клетки, содержит полипептидную последовательность, закодированную полинуклеотидной последовательностью, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с последовательностью, выбранной из группы SEQ ID №100, SEQ ID №101 и SEQ ID №102.
В одном воплощении биспецифическое антитело, активирующее Т-клетки, содержит полипептидную последовательность, закодированную полинуклеотидной последовательностью, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с последовательностью, выбранной из группы из SEQ ID №151, SEQ ID №152 и SEQ ID №153.
В еще одном воплощении указанное биспецифическое антитело содержит одну или более чем одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы из SEQ ID №100, SEQ ID №101, SEQ ID №151, SEQ ID №152 и SEQ ID №153.
В одном воплощении изобретения биспецифическое антитело представляет собой гуманизированное антитело, как подробно описано ниже.
В другом воплощении изобретения биспецифическое антитело представляет собой человеческое антитело, как подробно описано ниже.
В соответствии со вторым объектом данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей биспецифическое антитело данного изобретения.
В соответствии с третьим объектом данное изобретение относится к биспецифическому антителу данного изобретения для лечения рака. В другом воплощении предложено применение биспецифического антитела в качестве лекарственного препарата. Предпочтительно указанное применение представляет собой лечение рака.
В соответствии с другими объектами данное изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую тяжелую цепь биспецифического антитела данного изобретения, к последовательности нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность, кодирующую легкую цепь биспецифического антитела данного изобретения, к экспрессионному вектору, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению, и к прокариотической или эукариотической клетке-хозяину, содержащей вектор данного изобретения. Кроме того, предложен способ получения антитела, включающий культивирование клетки-хозяина, так что продуцируется антитело.
В конкретном воплощении биспецифическое антитело, активирующее Т-клетки, содержит полипептидную последовательность, закодированную полинуклеотидной последовательностью, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с последовательностью, выбранной из группы из SEQ ID №44, SEQ ID №45, SEQ ID №46, SEQ ID №47, SEQ ID №48, SEQ ID №49, SEQ ID №50, SEQ ID №51, SEQ ID №52, SEQ ID №53, SEQ ID №54, SEQ ID №55, SEQ ID №56, SEQ ID №57, SEQ ID №58, SEQ ID №59, SEQ ID №60, SEQ ID №61, SEQ ID №62, SEQ ID №63, SEQ ID №64, SEQ ID №65, SEQ ID №66 и SEQ ID №67.
В конкретном воплощении биспецифическое антитело, активирующее Т-клетки, содержит полипептидную последовательность, закодированную полинуклеотидной последовательностью, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с последовательностью, выбранной из группы из SEQ ID №107, SEQ ID №108, SEQ ID №109, SEQ ID №110, SEQ ID №111 и SEQ ID №112.
В конкретном воплощении биспецифическое антитело, активирующее Т-клетки, содержит полипептидную последовательность, закодированную полинуклеотидной последовательностью, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с последовательностью, выбранной из группы SEQ ID №113, SEQ ID №114, SEQ ID №115, SEQ ID №116, SEQ ID №117, SEQ ID №118, SEQ ID №119 и SEQ ID №120.
В конкретном воплощении биспецифическое антитело, активирующее Т-клетки, содержит полипептидную последовательность, закодированную полинуклеотидной последовательностью, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с последовательностью, выбранной из группы из SEQ ID №121, SEQ ID №122, SEQ ID №123, SEQ ID №124, SEQ ID №125, SEQ ID №126, SEQ ID №127 и SEQ ID №128.
В конкретном воплощении биспецифическое антитело, активирующее Т-клетки, содержит полипептидную последовательность, закодированную полинуклеотидной последовательностью, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с последовательностью, выбранной из группы из SEQ ID №129, SEQ ID №130, SEQ ID №131, SEQ ID №132, SEQ ID №133, SEQ ID №134, SEQ ID №135 и SEQ ID №136.
В конкретном воплощении биспецифическое антитело, активирующее Т-клетки, содержит полипептидную последовательность, закодированную полинуклеотидной последовательностью, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с последовательностью, выбранной из группы из SEQ ID №105, SEQ ID №106, SEQ ID №137, SEQ ID №138, SEQ ID №139, SEQ ID №140, SEQ ID №141, SEQ ID №142, SEQ ID №143, SEQ ID №144, SEQ ID №154, SEQ ID №155 и SEQ ID №156.
В другом аспекте биспецифические антитела по любому из вышеописанных воплощений может включать любой из признаков, по отдельности или в комбинации, как описано в разделах 1-5 ниже:
1. Аффинность антитела
Аффинность биспецифического антитела, активирующего Т-клетки, к антигену-мишени может быть определена в соответствии со способами, изложенными в примерах, с помощью поверхностного плазменного резонанса (SPR), с использованием стандартных измерительных приборов, таких как инструмент BIAcore (GE Healthcare), и рецепторов или белков-мишеней, таких, которые могут быть получены путем рекомбинантной экспрессии. Альтернативно, связывание биспецифических антител, активирующих Т-клетки, с различными рецепторами или антигенами-мишенями может быть оценено с использованием клеточных линий, экспрессирующих конкретный рецептор или антиген-мишень, например, путем проточной цитометрии (FACS).
-8
-8
-13
-9
-13
В некоторых воплощениях биспецифическое антитело, предложенное в данном документе, имеет константу диссоциации (KD) из ≤ 1 нМ, ≤ 100 нМ, ≤ 10 нМ, ≤ 1 нМ, ≤ 0,1 нМ, ≤ 0,01 нМ, или ≤ 0,001 нМ (например, 10 М или менее, например, от 10 М до 10 М, например, от 10 М до 10 М).

6
-1
-1
on
off
off
on
В соответствии с одним воплощением KD измеряли с помощью поверхностного плазмонного резонанса с использованием BIACORE-2000 или BIACORE-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°С с СМ5-чипами с иммобилизованным антигеном примерно 10 единиц ответа (RU). Вкратце, биосенсорный чип с карбоксиметилированным декстраном (СМ5, BIACORE, Inc.) активировали N-этил-N′-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлоридом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями поставщика. Антиген разводили в 10 мМ растворе ацетата натрия, рН 4,8, до концентрации 5 мкг/мл (примерно 0,2 мкМ) и вводили со скоростью потока 5 мкл/мин до достижения примерно 10 единиц ответа (RU) связанного белка. После введения антигена вводили 1 М этаноламина для блокировки непрореагировавших групп. Для измерения кинетики двукратные серийные разведения Fab (от 0,78 нМ до 500 нМ) вводили в PBS с 0,05% поверхностно-активного вещества полисорбата 20 (TWEEN-20™) (PBST) при 25°С со скоростью потока примерно 25 мкл/мин. Скорости ассоциации (ka или k) и скорости диссоциации (kd или k) рассчитывали с помощью простой модели связывания Ленгмюра 1:1 (программное обеспечение BIACORE Evaluation Software версии 3.2), одновременно соединяя сенсограммы ассоциации и диссоциации. Константу равновесия диссоциации (KD) рассчитывали как отношение k/k (см., например, Chen et al., J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999). Если в анализе поверхностного плазмонного резонанса, описанном выше, on-скорость превышает 10 М с, то она может быть определена с помощью методики тушения флуоресценции, которая измеряет увеличение или уменьшение интенсивности флуоресцентного излучения (возбуждение = 295 нм; излучение = 340 нм; 16 нм полосовой фильтр) при 25°С с 20 нМ антитела против антигена (Fab-форма) в PBS, рН 7,2, в присутствии возрастающих концентраций антигена, измеряемых спектрометром, таким как спектрофотометр, оборудованный системой быстрого смешивания с последующей остановкой (stop-flow) (Aviv Instruments) или спектрофотометр SLM-AMINCO™ серии 8000 (ThermoSpectronic) со встряхивающейся кюветой.
2. Химерные и гуманизированные антитела
В некоторых воплощениях биспецифическое антитело, предложенное в данном документе, является химерным антителом. Некоторые химерные антитела описаны, например, в патенте США №4816567 и в Morrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855). В одном примере химерное антитело содержит вариабельную нечеловеческую область (например, вариабельную область, полученную от мыши, крысы, хомяка, кролика или примата, например обезьяны) и константную человеческую область. В другом примере химерное антитело представляет собой антитело "с переключением класса", в котором класс или подкласс был изменен по сравнению с родительским антителом. Химерные антитела включают их антигенсвязывающие фрагменты.
В некоторых воплощениях химерное антитело представляет собой гуманизированное антитело. Как правило, нечеловеческое антитело гуманизируют, чтобы уменьшить иммуногенность для людей, сохраняя при этом специфичность и аффинность родительского нечеловеческого антитела. Как правило, гуманизированное антитело содержит один или более чем один вариабельный домен, в котором HVR, например, CDR (или их части) получены из нечеловеческого антитела, a FR (или их части) получены из последовательностей человеческого антитела. Гуманизированное антитело, возможно, также будет содержать по меньшей мере часть человеческой константной области. В некоторых воплощениях некоторые FR-остатки в гуманизированном антителе замещают соответствующими остатками из нечеловеческого антитела (например, антитела, из которого получены HVR-остатки), например, для восстановления или повышения специфичности или аффинности антитела.
Гуманизированные антитела и способы их получения приведены, например, в Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008), а также описаны, например, в Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat′l Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989); патентах США №№5821337, 7527791, 6982321 и 7087409; Kashmiri et al., Methods 36: 25-34 (2005) (описывает прививание SDR (a-CDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28: 489-498 (1991) (описывает "перекладку"); Dall′Acqua et al., Methods 36: 43-60 (2005) (описывает "перетасовку FR"); и Osbourn et al., Methods 36: 61-68 (2005) and Klimka et al., Br. J. Cancer, 83: 252-260 (2000) (описывают подход "направляемой селекции" к перетасовке FR).
Человеческие каркасные области, которые могут быть использованы для гуманизации, включают, но не ограничиваясь ими: каркасные области, выбранные с помощью методики "наилучшего соответствия" (см., например, Sims et al. J. Immunol. 151: 2296 (1993)); каркасные области, полученные из консенсусной последовательности человеческих антител конкретной подгруппы вариабельных областей легкой или тяжелой цепей (см., например, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); и Presta et al. J. Immunol., 151: 2623 (1993)); человеческие зрелые (соматически мутантные) каркасные области или человеческие зародышевые каркасные области (см., например, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)); и каркасные области, полученные при скрининге FR-библиотеки (см., например, Васа et al., J. Biol. Chem. 272: 10678-10684 (1997) и Rosok et al., J. Biol. Chem. 271: 22611-22618 (1996)).
3. Человеческие антитела
В некоторых воплощениях биспецифическое антитело, предложенное в данном документе, является человеческим антителом. Человеческие антитела могут быть получены с помощью различных методик, известных в данной области. Человеческие антитела в общем описаны в van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) and Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20: 450-459 (2008).

Человеческие антитела могут быть получены путем введения иммуногена трансгенному животному, которое было модифицировано таким образом, чтобы производить интактные человеческие антитела или интактные антитела с человеческими вариабельными областями в ответ на антигенную стимуляцию. Такие животные, как правило, содержат все или часть локусов человеческого иммуноглобулина, которые заменяют локусы эндогенного иммуноглобулина или которые присутствуют вне хромосом или интегрированы случайным образом в хромосомы животного. У таких трансгенных мышей эндогенные локусы иммуноглобулина, как правило, инактивированы. Обзор способов получения человеческих антител с помощью трансгенных животных см. в Lonberg, Nat. Biotech. 23: 1117-1125 (2005). См. также, например, патенты США №№6075181 и 6150584, описывающие методику XENOMOUSE™; патент США №5770429, описывающий методику HUMAB; патент США №7041870, описывающий методику К-М MOUSE, и публикацию патентной заявки США №2007/0061900, описывающую методику VELOCIMOUSE). Человеческие вариабельные области из интактных антител, полученные с помощью таких животных, могут быть дополнительно модифицированы, например, путем объединения с другой человеческой константной областью.
Человеческие антитела также могут быть получены с помощью методик на основании гибридом. Были описаны линии клеток человеческой миеломы и мышиной-человеческой гетеромиеломы для получения человеческих моноклональных антител (см., например, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); и Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Человеческие антитела, полученные с помощью человеческой В-клеточной гибридомной методики, также описаны в Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 3557-3562 (2006). Дополнительные методики включают те, которые описаны, например, в патенте США №7189826 (описывает производство моноклональных человеческих антител IgM с помощью гибридомных клеточных линий) и Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4): 265-268 (2006) (описывает человек-человеческие гибридомы). Методика человеческих гибридом (методика триомы) также описана в Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3): 927-937 (2005) и Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).
Человеческие антитела также могут быть получены путем выделения последовательностей вариабельных областей Fv-клонов, выбранных из библиотек фагового дисплея человеческого происхождения. Такие последовательности вариабельного домена затем могут быть объединены с нужным человеческим константным доменом. Методики отбора человеческих антител из библиотек антител описаны ниже.
4. Антитела, полученные из библиотек
Биспецифические антитела изобретения могут быть выделены путем скрининга комбинаторных библиотек на антитела с нужной активностью или активностями. Например, в данной области известны различные способы для создания библиотек фагового дисплея и скрининга таких библиотек антител, обладающих для желаемых характеристик связывания. Такие методики см., например, в Hoogenboom et al. Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O′Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001), а также описаны, например, в McCafferty et al., Nature 348: 552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, Methods in Molecular Biology 248: 161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); и Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004).
В некоторых методиках фагового дисплея репертуар VH- и VL-генов отдельно клонировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и рекомбинировали в случайном порядке в фаговые библиотеки, которые затем могут быть подвергнуты скринингу на антигенсвязывающий фаг, как описано в Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Фаг, как правило, выставляет фрагменты антитела либо как одноцепочечные Fv-фрагменты (scFv), либо как Fab-фрагменты. Библиотеки из иммунизированных источников предлагают высокоаффинные антитела к иммуногену без необходимости построения гибридом. Альтернативно, может быть клонирован наивный репертуар (например, от человека), чтобы обеспечить единый источник антител к широкому спектру чужих, а также собственных антигенов без какой-либо иммунизации, как описано в Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Наконец, наивные библиотеки также могут быть получены синтетически путем клонирования неперестроенных сегментов V-гена из стволовых клеток и с использованием ПЦР-праймеров, содержащих случайную последовательность для кодирования высоко вариабельных CDR3-областей и для выполнения перестройки in vitro, как описано в Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Патентные публикации, описывающие фаговые библиотеки человеческого антитела, включают, например: патент США №5750373 и патентные публикации США №№2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 и 2009/0002360.
Антитела или фрагменты антител, выделенные из библиотек человеческих антител, считаются человеческими антителами или фрагментами человеческих антител в данном документе.
5. Варианты антител
В некоторых воплощениях рассматриваются варианты аминокислотных последовательностей биспецифических антител, представленных в данном документе. Например, может быть желательным улучшение аффинности связывания и/или других биологических свойств биспецифического антитела. Варианты аминокислотной последовательности биспецифического антитела могут быть получены путем внесения соответствующих изменений в нуклеотидную последовательность, кодирующую биспецифическое антитело, или путем пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции и/или вставки и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Может быть сделана любая комбинация делеции, инсерции и замены, чтобы получить конечную конструкцию, при условии, что конечная конструкция обладает желаемыми характеристиками, например, связыванием антигена.
а) Варианты с заменой, вставкой и делецией
В некоторых воплощениях предложены варианты антител, имеющие одну или более чем одну аминокислотную замену. Сайты для мутагенеза путем замен, представляющие интерес, включают HVR и FR. Консервативные замены приведены в таблице 1 под заголовком "консервативные замены". Более существенные изменения приведены в таблице 1 под заголовком "примеры замен" и дополнительно описаны ниже со ссылкой на классы аминокислот по боковой цепи. Аминокислотные замены могут быть введены в антитело, представляющее интерес, и продукты могут быть проверены на желаемую активность, например, сохранившееся/улучшенное связывание антигена или снижение иммуногенности.
Таблица 1
<img file="00000002.tif" he="136" wi="157" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000003.tif" he="33" wi="157" img-content="undefined" img-format="tif" />
Аминокислоты могут быть сгруппированы в соответствии с общими свойствами боковой цепи:
(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) нейтральный гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) кислые: Asp, Glu;
(4) основные: His, Lys, Arg;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;
(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.
Неконсервативные замены влекут за собой замену члена одного из этих классов на член другого класса.
Один тип варианта с заменой предполагает замену одного или более чем одного остатка гипервариабельной области родительского антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). Как правило, полученный вариант(ы) для дальнейшего изучения будет иметь модификации (например, улучшений) в определенных биологических свойствах (например, повышенную аффинность, сниженную иммуногенность) относительно родительского антитела и/или будет иметь по существу сохранившиеся определенные биологические свойства родительского антитела. Примером варианта с замещением является антитело со зрелой аффинностью, которое можно легко получить, например, с помощью методик созревания аффинности на основе фагового дисплея, таких как описанные в данном документе. Вкратце, один или более чем один остаток HVR подвергается мутированию, и вариантные антитела выставляют на фаге и проверяют на конкретную биологическую активность (например, аффинность связывания).
Изменения (например, замены) могут быть сделаны в HVR, например, для улучшения аффинности антитела. Такие изменения могут быть сделаны в "горячих точках" HVR, т.е. остатках, кодируемых кодонами, которые подвергаются мутации с высокой частотой в ходе процесса соматического созревания (см., например, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207: 179-196 (2008)), и/или в SDR (a-CDR) с получением вариантного VH или VL, исследуемого на аффинность связывания. Созревание аффинности путем конструирования и повторного выбора из вторичных библиотек было описано, например, в Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O′Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). В некоторых воплощениях созревания аффинности разнообразие вводится в вариабельные гены, выбранные для созревания с помощью любой из разнообразных методик (например, ПЦР с внесением ошибок, перестановка цепей, или олигонуклеотид-направленный мутагенез). Затем создается вторичная библиотека. Затем эту библиотеку скринируют для выявления любых вариантов антител с нужной аффинностью. Другой способ внесения разнообразия включает HVR-направленные подходы, в которых несколько остатков HVR (например, 4-6 остатков за один раз) рандомизируют. HVR остатки, участвующие в связывании антигена, могут быть конкретно выявлены, например, с помощью сканирующего аланином мутагенеза или моделирования. CDR-H3 и CDR-L3, в частности, часто становятся мишенями.
В некоторых воплощениях замены, вставки или делеции могут возникать в одном или более чем одном HVR до тех пор, пока такие изменения не вызывают существенного снижения способности антитела связывать антиген. Например, консервативные изменения (например, консервативные замены, предложенные в данном документе), которые существенно не снижают аффинность связывания, могут быть сделаны в HVR. Такие изменения могут быть вне "горячих точек" HVR или SDR. В некоторых воплощениях вариантных VH- и VL-последовательностей, приведенных выше, каждый HVR либо не меняется, либо содержит не более чем одну, две или три аминокислотные замены.
Полезный способ выявления остатков или областей антитела, которые могут быть мишенями мутагенеза, называется "сканирющим аланином мутагенезом", который описан Cunningham and Wells (1989) Science, 244: 1081-1085. В этом способе остаток или группа остатков-мишеней (например, заряженные остатки, такие как Arg, Asp, Lys, His и Glu) определяют и заменяют нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (например, аланином или полиаланином), чтобы определить, влияют ли они на взаимодействие антитела с антигеном. Дальнейшие замены могут быть введены в местах аминокислот, демонстрирующих функциональную чувствительность к первоначальным заменам. Альтернативно или дополнительно определяют кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело для выявления точек контакта между антителом и антигеном. Такие контактные остатки и соседние остатки могут стать целевыми или могут быть устранены в качестве кандидатов на замену. Варианты можно подвергнуть скринингу, чтобы определить, содержат ли они нужные свойства.
Вставки в аминокислотную последовательность включают амино- и/или карбоксиконцевые слияния длиной от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также вставки внутри последовательности одного или нескольких аминокислотных остатков. Примеры концевых вставок включают антитела с N-концевым остатком метионина. Другие варианты молекулы антитела со вставками включают слияние N- или С-конца антитела с ферментом (например, ADEPT) или полипептидом, который увеличивает время полужизни антитела в сыворотке.
б) Цистеин-инженерные варианты антител
В некоторых воплощениях может быть желательным создание цистеин-инженерных биспецифических антител, например, "тиоМКА" ("thioMAbs"), в которой один или более чем один остатков биспецифического антитела замещен на остаток цистеина. В конкретных воплощениях замещенные остатки находятся в доступных сайтах биспецифического антитела. При замещении этих остатков цистеином реактивные тиольные группы, таким образом, располагаются в доступных участках антитела и могут быть использованы для конъюгирования антитела с другими группировками, такими как лекарственные группировки или линкер-лекарственные группировки, для образования иммуноконъюгата, как описано далее. В некоторых воплощениях один или более чем один из следующих остатков может быть замещен цистеином: V205 (нумерация Кабата) легкой цепи и А118 (нумерации ЕС) тяжелой цепи. Цистеин-инженерные антитела могут быть получены, как описано, например, в патенте США №7521541.
в) Производные антител
В некоторых воплощениях биспецифическое антитело, представленное в данном документе, может быть дополнительно модифицировано так, чтобы содержать дополнительные небелковые группировки, которые известны в данной области и легко доступны. Группировки, пригодные для получения производных биспецифического антитела, включают, но не ограничиваясь ими, водорастворимые полимеры. Неограничивающие примеры водорастворимых полимеров включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимеры этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (гомополимеры или рандомные сополимеры), и декстран или поли(n-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры оксида полипропиленгликоля/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Полиэтиленгликоля пропиональдегид может давать преимущества в производстве благодаря его стабильности в воде. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Число полимеров, присоединенных к антителу, может варьировать, и если присоединено больше одного полимера, то они могут быть одинаковыми или различными молекулами. Как правило, число и/или тип полимеров, используемых для получения производных, может быть определен на основании соображений, включая, но не ограничиваясь ими, конкретные свойства или функции антитела, которые будут улучшены, будет ли использоваться производное антитела в терапии в определенных условиях и т.д.
В другом воплощении предложены конъюгаты биспецифического антитела и небелковой группировки, которая может селективно нагреваться при воздействии радиации. В одном воплощении небелковая группировка представляет собой углеродную нанотрубку (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). Излучение может быть любой длины волны, включая, но не ограничиваясь ими, длины волн, которые не повреждают обычные клетки, но нагревают небелковую группировку до температуры, при которой клетки, ближайшие к небелковой группировке антитела, погибают.
В. Рекомбинантные способы и композиции
Биспецифические антитела изобретения, активирующие Т-клетки, могут быть получены, например, путем твердофазного синтеза (например, твердофазного синтеза Merrifield) или рекомбинантной продукции. Для рекомбинантной продукции один или более чем один полинуклеотид, кодирующий активирующее Т-клетки биспецифическое антитело (фрагмент) изобретения, например, описанный выше, выделяют и встраивают в один или более чем один вектор для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Такой полинуклеотид может быть легко выделен и секвенирован с помощью обычных процедур. В одном воплощении предложен вектор, предпочтительно экспрессионный вектор, содержащий один или более чем один полинуклеотид изобретения. Способы, которые хорошо известны специалистам в данной области, могут быть использованы для построения экспрессионных векторов, содержащих кодирующую последовательность биспецифического антитела (фрагмента), активирующего Т-клетки, вместе с соответствующими сигналами контроля транскрипции/трансляции. Эти способы включают in vitro методики рекомбинантной ДНК, синтетические методики и in vivo рекомбинацию/генетическую рекомбинацию. См., например, методики, описанные в Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); и Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989). Экспрессионный вектор может быть частью плазмиды, вируса или может быть фрагментом нуклеиновой кислоты. Экспрессионный вектор содержит экспрессионную кассету, в которой полинуклеотид, кодирующий активирующее Т-клетки биспецифическое антитело (фрагмент) (т.е. кодирующую область), клонирован в функциональной связи с промотором и/или другим элементом контроля транскрипции или трансляции. Используемый в данном документе термин "кодирующая область" представляет собой часть нуклеиновой кислоты, которая состоит из кодонов, транслируемых в аминокислоты. Хотя "стоп-кодон" (TAG, TGA, или ТАА) не транслируется в аминокислоту, он может рассматриваться как часть кодирующей области, если он присутствует, но любые фланкирующие последовательности, например, промоторы, сайты связывания рибосом, терминаторы транскрипции, интроны, 5′- и 3′-нетранслируемые области и т.п. не являются частью кодирующей области. Две или более чем две кодирующие области могут находиться в одной полинуклеотидной конструкции, например, в одном векторе, или в отдельных полинуклеотидных конструкциях, например, в отдельных (различных) векторах. Кроме того, любой вектор может содержать одну кодирующую область или может содержать две или более двух кодирующих областей, например, вектор данного изобретения может кодировать один или более чем один полипептид, который пост- или котрансляционно разделяется на окончательные белки путем протеолитического расщепления. Кроме того, вектор, полинуклеотид или нуклеиновая кислота изобретения может кодировать гетерологичные кодирующие области, слитые или не слитые с полинуклеотидом, кодирующим активирующее Т-клетки биспецифическое антитело (фрагмент) изобретения или его вариант или производное. Гетерологичные кодирующие области включают, но не ограничиваясь ими, специализированные элементы или мотивы, такие как секреторный сигнальный пептид или гетерологичный функциональный домен. Функциональная связь имеет место, когда кодирующая область генного продукта, например, полипептида, связана с одной или более чем одной регуляторной последовательностью таким образом, что экспрессия генного продукта находится под воздействием или под контролем регуляторной последовательности(ей). Два фрагмента ДНК (например, область, кодирующая полипептид, и промотор, связанный с ней) являются "функционально связанными", если индукция функции промотора приводит к транскрипции мРНК, кодирующей нужный генный продукт, и если природа связи между двумя фрагментами ДНК не мешает способности регуляторных экспрессионных последовательностей направлять экспрессию генного продукта или не мешает способности ДНК-матрицы быть транскрибированной. Таким образом, промоторная область функционально связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, если промотор способен осуществлять транскрипцию этой нуклеиновой кислоты. Промотор может быть специфичным для клетки промотором, который вызывает значительную транскрипцию ДНК только в заданных клетках. Другие элементы контроля транскрипции, за исключением промотора, например энхансеры, операторы, репрессоры и сигналы терминации транскрипции, могут быть функционально связаны с полинуклеотидом для направления специфичной для клетки транскрипции. Подходящие промоторы и другие области контроля транскрипции раскрыты в данном описании. Разнообразные области контроля транскрипции известны специалистам в данной области. Они включают, но не ограничиваясь ими, области контроля транскрипции, которые функционируют в клетках позвоночных, таких как, но не ограничиваясь ими, промоторные и энхансерные сегменты из цитомегаловирусов (например, немедленный ранний промотор в сочетании с интроном-А), вируса обезьян 40 (например, ранний промотор) и ретровирусов (таких как, например, вирус саркомы Рауса). Другие области контроля транскрипции включают те, которые получены из генов позвоночных, такие как актин, белкок теплового шока, бычий гормона роста и кроличий а-глобин, а также другие последовательности, способные контролировать экспрессию генов в эукариотических клетках. Дополнительные подходящие области контроля транскрипции включают тканеспецифические промоторы и энхансеры, а также индуцируемые промоторы (например, промотор, индуцируемый тетрациклинами). Аналогичным образом, специалистам в данной области известно множество элементов контроля трансляции. Они включают, но не ограничиваются ими, сайты связывания рибосом, кодоны инициации и терминации трансляции и элементы, полученные из вирусных систем (в частности, сайт внутренней посадки рибосомы, или IRES, также известный как CITE-последовательность). Экспрессионная кассета также может включать другие детали, такие как сайт инициации репликации, и/или элементы интеграции в хромосому, такие как ретровирусные длинные концевые повторы (LTR) или инвертированные концевые повторы (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV)
Полинуклеотидные и нуклеиновокислотные кодирующие области данного изобретения могут быть связаны с дополнительными кодирующими областями, которые кодируют секреторные или сигнальные пептиды, которые направляют секрецию полипептида, кодируемого полинуклеотидом данного изобретения. Например, если желательна секреция активирующей Т-клетки биспецифической антигенсвязывающей молекулы, то ДНК, кодирующая сигнальную последовательность, может быть помещена выше нуклеиновой кислотой, кодирующей активирующее Т-клетки биспецифическое антитело изобретения или его фрагмент. Согласно сигнальной гипотезе белки, секретируемые клетками млекопитающих, имеют сигнальный пептид или секреторную лидерную последовательность, которая отщепляется от зрелого белка, когда начинается экспорт растущей цепи белка через шероховатый эндоплазматический ретикулум. Специалистам в данной области известно, что полипептиды, секретируемые клетками позвоночных, как правило, имеют сигнальный пептид, слитый с N-концом полипептида, который отщепляется от транслируемого полипептида с получением секретируемой или "зрелой" формы полипептида. В некоторых воплощениях используется нативный сигнальный пептид, например, сигнальный пептид тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина или функциональное производное этой последовательности, которое сохраняет способность направлять секрецию полипептида, функционально связанного с ним. Альтернативно может быть использован гетерологичный сигнальный пептид млекопитающего или его функциональное производное. Например, лидерная последовательность дикого типа может быть замещена лидерной последовательностью человеческого тканевого активатора плазминогена (ТРА) или мышиной β-глюкуронидазы.
ДНК, кодирующая короткую последовательность белка, который может быть использован для облегчения дальнейшей очистки (например, гистидиновую метку) или помощи в мечении активирующего Т-клетки биспецифического антитела, могут быть включены в полинуклеотид (или на его концы), кодирующий биспецифическое антитело (фрагмент), активирующее Т-клетки.
-
В другом воплощении предложена клетка-хозяин, содержащая один или более чем один полинуклеотид изобретения. В некоторых воплощениях предложена клетка-хозяин, содержащая один или более чем один вектор изобретения. Полинуклеотиды и векторы могут включать любую из деталей, по отдельности или в комбинации, описанных здесь в отношении полинуклеотидов и векторов, соответственно. В одном таком воплощении клетка-хозяин содержит (например, была трансформирована или трансфицирована) вектор, содержащий полинуклеотид, который кодирует активирующее Т-клетку биспецифическое антитело изобретения (его часть). Используемый здесь термин "клетка-хозяин" относится к любому виду клеточной системы, которая может быть разработана для создания активирующих Т-клетки биспецифических антител изобретения или их фрагментов. Клетки-хозяева, пригодные для репликации и поддержки экспрессии биспецифических антител, активирующих Т-клетки, хорошо известны в данной области. Такие клетки при необходимости могут быть трансфицированы или трансдуцированы конкретным экспрессионным вектором, и может быть выращено большое число клеток, содержащих вектор, для посева в больших ферментерах для получения достаточного количества активирующего Т-клетки биспецифического антитела для клинического применения. Подходящие клетки-хозяева включают прокариотические микроорганизмы, такие как Е. coli, или различные эукариотические клетки, такие как клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки насекомых и т.п. Например, полипептиды могут быть получены в бактериях, в частности, когда не нужно гликозилирование. После экспрессии полипептид может быть выделен из бактериальной клеточной массы в растворимой фракции и может быть дополнительно очищен. Помимо прокариотов, эукариотические микроорганизмы, такие как нитчатые грибы или дрожжи, являются подходящими клонирующими или экспрессирующими хозяевами для кодирующих полипептид векторов, в том числе грибы и дрожжевые штаммы, чьи пути гликозилирования были "гуманизированы", что привело к продукции полипептида с частично или полностью человеческим характером гликозилирования. См. Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), и Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006). Подходящие клетки-хозяева для экспрессии (гликозилированных) полипептидов также получают из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Были идентифицированы многочисленные бакуловирусные штаммы, которые могут быть использованы в сочетании с клетками насекомых, в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda. Культуры растительных клеток также можно использовать в качестве хозяев. См., например, патенты US №№5959177; 6040498, 6420548, 7125978 и 6417429 (описывающие технологию получения антител в трансгенных растениях PLANTIBODIES™). Клетки позвоночных также могут быть использованы в качестве хозяев. Например, могут быть использованы линии клеток млекопитающих, которые приспособлены для роста в суспензии. Другими примерами используемых клеточных линий млекопитающих являются линия почки обезьяны CV1, трансформированная SV40 (COS-7); линия почки эмбриона человека (клетки 293 или 293Т, описанные, например, в Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), клетки почки детеныша хомяка (ВНК), мышиные клетки Сертоли (ТМ4-клетки, описанные, например, в Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), клетки почки обезьяны (CV1), клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76), клетки карциномы шейки матки человека (HELA), клетки почки собаки (MDCK), клетки печени крысы линии buffalo (BRL 3А), клетки легких человека (W138), клетки печени человека (Нер G2), мышиные клетки опухоли молочной железы (ММТ 060562), TRI-клетки (описанные, например, в Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)), клетки MRC 5 и клетки FS4. Другие используемые клеточные линии млекопитающих включают клетки яичника китайского хомячка (СНО), в том числе dhfr СНО клетки (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); и клеточные линии миеломы, такие как YO, NS0, Р3Х63 и Sp2/0. Обзор некоторых клеточных линий млекопитающих для продукции белка, см., например, в Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003). Клетки-хозяева включают культивируемые клетки, например, культивируемые клетки млекопитающих, клетки дрожжей, клетки насекомых, клетки бактерий и клетки растений (названо лишь несколько), а также клетки, находящиеся в трансгенном животном, трансгенном растении или культивированной растительной или животной ткани. В одном воплощении клетка-хозяин является эукариотической клеткой, в частности клеткой млекопитающего, например, клеткой яичника китайского хомячка (СНО), клеткой почки эмбриона человека (НЕК) или лимфоидной клеткой (например, клеткой Y0, NS0, Sp20).
В данной области известны стандартные методики экспрессии чужеродных генов в этих системах. Клетки, экспрессирующие полипептид, включающий тяжелую или легкую цепь антигенсвязывающего домена, такой как антитело, могут быть сконструированы таким образом, чтобы также экспрессировать другие цепи антитела таким образом, что экспрессируемый продукт является антителом, которое имеет и тяжелую, и легкую цепи.
В одном воплощении предложен способ получения активирующего Т-клетки биспецифического антитела в соответствии с изобретением, который включает культивирование клетки-хозяина, содержащей полинуклеотид, кодирующий активирующее Т-клетки биспецифическое антитело, предложенное в данном документе, в условиях, подходящих для экспрессии активирующего Т-клетки биспецифического антитела, и выделение активирующего Т-клетки биспецифического антитела из клетки-хозяина (или культуральной среды клетки-хозяина).
Компоненты активирующего Т-клетки биспецифического антитела генетически слиты друг с другом. Активирующее Т-клетки биспецифическое антитело может быть сконструировано таким образом, чтобы его компоненты были слиты друг с другом напрямую или косвенно, через линкерную последовательность. Состав и длина линкера могут быть определены в соответствии со способами, хорошо известными в данной области, и испытаны на эффективность. Примеры линкерных последовательностей между различными компонентами активирующих Т-клетки биспецифических антител находятся в последовательностях, представленных в данном документе. Также могут быть включены дополнительные последовательности, чтобы вставить сайт расщепления для разделения отдельных компонентов слияния, если это необходимо, например, последовательность распознавания эндопептидазы.
В некоторых воплощениях одна или более чем одна антигенсвязывающая группировка активирующих Т-клетки биспецифических антител включает по меньшей мере вариабельную область антитела, способную связывать антигенную детерминанту. Вариабельные области могут образовывать часть природных или неприродных антител и их фрагментов и могут быть получены из них. Способы получения поликлональных антител и моноклональных антител хорошо известны в данной области (см., например, Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Неприродные антитела могут быть построены с использованием твердофазного пептидного синтеза, могут быть получены рекомбинантным способом (например, как описано в патенте США №4816567), либо могут быть получены, например, путем скрининга комбинаторных библиотек, содержащих вариабельные тяжелые цепи и вариабельные легкие цепи (см., например, патент США №5969108 McCafferty).
Антитела, фрагменты антител, антигенсвязывающие домены или вариабельные области от любых видов животных могут быть использованы в активирующих Т-клетки биспецифических антителах изобретения. Неограничивающие антитела, фрагменты антител, антигенсвязывающие домены или вариабельные области, используемые в данном изобретении, могут быть получены от мышей, приматов или человека. Если активирующее Т-клетки биспецифическое антитело предназначено для применения у человека, то может быть использована химерная форма антитела, в которой константные области антитела являются человеческими. Гуманизированная или полностью человеческая форма антитела также может быть получена в соответствии со способами, хорошо известными в данной области (см., например, патент США №5565332 Winter). Гуманизация может быть достигнута с помощью различных способов, включая, но не ограничиваясь ими, (а) прививание нечеловеческих CDR (например, от донорного антитела) в человеческие каркасные и константные области (например, реципиентного антитела) с сохранением или без сохранения критических остатков каркасной области (например, тех, которые важны для сохранения хорошей аффинности связывания антигена или функций антитела), (б) прививание только нечеловеческих определяющих специфичность областей (SDR или a-CDR; остатков, критичных для взаимодействия антитело-антиген) в человеческие каркасные и константные области; или (в) трансплантацию целых нечеловеческих вариабельных доменов, но "маскировку" их под человекоподобный сегмент путем замены поверхностных остатков. Гуманизированные антитела и способы их получения приведены, например, в Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008), а также описаны, например, в Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); патентах США №№5821337, 7527791, 6982321 и 7087409; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (описывает прививание SDR (a-CDR)); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (описывает "перекладку"); Dall′Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) (описывает "перетасовку FR"); и Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) и Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (описывает подход "направляемой селекции" к перетасовке FR). Человеческие антитела и человеческие вариабельные области могут быть получены с использованием различных методик, известных в данной области. Человеческие антитела описаны в целом в van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001), и в Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). Человеческие вариабельные области могут быть частью и могут быть получены из человеческих моноклональных антител, произведенных гибридомным способом (см., например, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). Человеческие антитела и человеческие вариабельные области также могут быть получены путем введения иммуногена трансгенным животным, которые были модифицированы таким образом, чтобы производить интактные человеческие антитела или интактные антитела с человеческими вариабельными областями в ответ на антигенную стимуляцию (см., например, Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005). Человеческие антитела и человеческие вариабельные области также могут быть получены путем выделения Fv-клональных последовательностей вариабельной области, выбранных из библиотек фагового дисплея человеческого происхождения (см., например, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O′Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001); и McCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)). Фаг, как правило, выставляет фрагменты антител либо в виде одноцепочечных Fv (scFv)-фрагментов, либо в виде Fab-фрагментов.
В некоторых воплощениях биспецифические антитела данного изобретения разработаны таким образом, чтобы они имели повышенную аффинность связывания в соответствии, например, со способами, описанными в публикации патентной заявки US №2004/0132066, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки. Способность активирующего Т-клетки биспецифического антитела изобретения связываться со специфической антигенной детерминантой может быть измерена либо с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), либо с помощью других методик, хорошо известных специалистам в данной области, например, методики поверхностного плазменного резонанса (анализируемого на системе BIACORE Т100) (Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), и традиционных анализов связывания (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Конкурентные анализы могут быть использованы для идентификации антитела, фрагмента антитела, антигенсвязывающего домена или вариабельного домена, который конкурирует с референсным антителом в связывании с конкретным антигеном, например, антителом, которое конкурирует с антителом V9 в связывании с CD3. В некоторых воплощениях такое конкурирующее антитело связывается с тем же эпитопом (например, линейным или конформационным эпитопом), который связывается референсным антителом. Подробные примеры способов для картирования эпитопа, с которым связывается антитело, приведены в Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). В примерном конкурентном анализе иммобилизованный антиген (например, CD3) инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, которое связывается с антигеном (например, антителом V9) и вторым немеченым антителом, которое тестируют на его способность конкурировать с первым антителом за связывание с антигеном. Второе антитело может присутствовать в супернатанте гибридомы. В качестве контроля иммобилизованный антиген инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, но не второе немеченое антитело. После инкубации в условиях, разрешающих связывание первого антитела с антигеном, избыток несвязанного антитела удаляют и измеряют количество метки, связанной с иммобилизованным антигеном. Если количество метки, связанной с иммобилизованным антигеном, существенно снижается в анализируемом образце по сравнению с контрольным образцом, то это указывает, что второе антитело конкурирует с первым антителом в связывании с антигеном. См. Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Активирующие Т-клетки биспецифические антитела, полученные, как описано в данном документе, могут быть очищены с помощью известных методик, таких как высокоэффективная жидкостная хроматография, ионообменная хроматография, гель-электрофорез, аффинная хроматография, эксклюзионная хроматография и т.п. Реальные условия, используемые для очистки конкретного белка, будут зависеть, в частности, от таких факторов, как суммарный заряд, гидрофобность, гидрофильность и т.д., и будут очевидны специалистам в данной области. Для очистки путем аффинной хроматографии может быть использовано антитело, лиганд, рецептор или антиген, с которым связывается биспецифическое антитело, активирующее Т-клетки. Например, для аффиннохроматографической очистки активирующего Т-клетки биспецифического антитела изобретения может быть использована матрица с белком А или белком G. Может быть использована последовательная аффинная хроматография с белком А или G и эксклюзионная хроматография для выделения по существу активирующего Т-клетки биспецифического антитела, как описано в примерах. Чистоту биспецифических антител, активирующих Т-клетки, можно определить с помощью любого из множества хорошо известных аналитических способов, включая гель-электрофорез, жидкостную хроматографию высокого давления и т.п.
С. Анализы
Биспецифические антитела, представленные в данном документе, могут быть выявлены, подвергнуты скринингу или охарактеризованы по их физическим/химическим свойствам и/или биологической активности с помощью различных анализов, известных в данной области.
1. Анализы связывания и другие анализы
В одном аспекте биспецифическое антитело изобретения исследуют на антигенсвязывающую активность, например, с помощью известных способов, таких как ELISA, вестерн-блот и т.д.
В другом аспекте могут быть использованы конкурентные анализы для идентификации антитела, которое конкурирует с конкретным анти-ТА-антителом или антителом, специфичным к активирующему Т-клетки антигену, за связывание с опухолевым антигеном (ТА) или активирующим Т-клетки антигеном, соответственно. В некоторых воплощениях такое конкурирующее антитело связывается с тем же эпитопом (например, линейным или конформационным эпитопом), который связывается конкретным анти-ТА-антителом или антителом, специфичным к активирующему Т-клетки антигену. Подробные примеры способов картирования эпитопа, с которым связывается антитело, приведены в Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)
2. Анализы активности
В одном аспекте предложены анализы для выявления биспецифических антител, которые связываются с активирующим Т-клетки антигеном и опухолевым антигеном (ТА), обладающих биологической активностью. Биологическая активность может включать, например, лизис клеток-мишеней или индукцию апоптоза. Также предложены антитела, обладающие такой биологической активностью in vivo и/или in vitro.
В некоторых воплощениях биспецифическое антитело изобретения анализируют на наличие такой биологической активности. Анализы для обнаружения лизиса клеток (например, путем измерения высвобождения LDH) или апоптоза (например, с использованием анализа TUNEL) хорошо известны в данной области.
D. Иммуноконъюгаты
Изобретение также предусматривает иммуноконъюгаты, содержащие биспецифическое антитело, которое связывается с активирующим Т-клетки антигеном и опухолевым антигеном (ТА), конъюгированным с одним или более чем одним цитотоксическим агентом, таким как химиотерапевтические агенты или лекарства, ингибирующие рост агенты, токсины (например, белковые токсины, ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или их фрагменты) или радиоактивные изотопы.
В одном воплощении иммуноконъюгат является конъюгатом антитело-лекарственное средство (ADC), в котором антитело конъюгировано с одним или более чем одним лекарственным средством, включая, но не ограничиваясь ими, мейтансиноид (см. патенты США NN 5208020, 5416064 и Европейский патент ЕР 0425235 В1); ауристатин, такой как монометилауристатиновые лекарственные группировки DE и DF (ММАЕ и MMAF) (см. патенты США №5635483, 5780588 и 7498298); доластатин; калихеамицин или его производное (см. патенты США №№5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001 и 5877296; Hinman et al., Cancer Res. 53: 3336-3342 (1993); и Lode et al., Cancer Res. 58: 2925-2928 (1998)); антрациклины, такие как дауномицин или доксорубицин (см. Kratz et al., Current Med. Chem. 13: 477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16: 358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16: 717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12: 1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45: 4336-4343 (2002); и патент США №6630579); метотрексат; виндезин; таксаны, такие как доцетаксел, паклитаксел, ларотаксел, тезетаксел и ортатаксел; трихотецен; и СС1065.
В другом воплощении иммуноконъюгат включает биспецифическое антитело, описанное в данном документе, конъюгированное с ферментативно активным токсином или его фрагментом, включая, но не ограничиваясь ими, дифтерийную А-цепь, связывающиеся активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модецина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантина, белки Phytoiacca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Saponaria officinalis, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трихотецены.
211
131
125
90
186
188
153
212
32
212
В другом воплощении иммуноконъюгат включает биспецифическое антитело, описанное в данном документе, конъюгированное с радиоактивным атомом с образованием радиоконъюгата. Множество радиоактивных изотопов доступно для получения радиоконъюгатов. Примеры включают At, I, I, Y, Re, Re, Sm, Bi, P, Pb и радиоактивные изотопы Lu. Когда радиоконъюгат используется для обнаружения, он может содержать радиоактивный атом для сцинтиграфических исследований, например, Tc99m или I123, или спиновую метку для визуализации путем ядерного магнитного резонанса (NMR) (также известного как магнитно-резонансная томография, MRI), такую как снова йод-123, йод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.
Конъюгаты биспецифического антитела и цитотоксического агента могут быть получены с использованием множества бифункциональных связывающих белки агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис(параазидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицин может быть получен, как описано в Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). Меченная углеродом-14 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилен-триамин-пентауксксная кислота (MX-DTPA) является примером хелатирующего агента для конъюгации радионуклида с антителом. См. WO 94/11026. Линкер может представлять собой "расщепляемый линкер", облегчающий высвобождение цитотоксического лекарственного агента в клетке. Например, может быть использован кислотно-лабильный линкер, чувствительный к пептидазе линкер, фотолабильный линкер, линкер, содержащий диметил или дисульфид (Chari et al., Cancer Res. 52: 127-131 (1992); патент США №5208020).
Иммуноконъюгаты или ADC в данном документе специально рассмотрены, но не ограничиваются такими конъюгатами, полученными с помощью сшивающих реагентов, включая, но не ограничиваясь ими, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, МРВН, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат), которые коммерчески доступны (например, Pierce Biotechnology, Inc., Рокфорд, Иллинойс, США).
Е. Способы и композиции для диагностики и обнаружения
В некоторых воплощениях любые биспецифические антитела, которые связывают активирующий Т-клетки антиген и опухолевый антиген (ТА), представленные в данном документе, используются для обнаружения активирующего Т-клетки антигена и/или опухолевого антигена (ТА) в биологическом образце. Термин "обнаружение", используемый в данном документе, включает количественное или качественное обнаружение. В некоторых воплощениях биологический образец содержит клетку или ткань.
В одном воплощении предложено биспецифическое антитело, которое связывает активирующий Т-клетки антиген и опухолевый антиген (ТА), для применения в способе диагностики или обнаружения. В другом аспекте предложен способ обнаружения присутствия активирующего Т-клетки антигена 3 и/или опухолевого антигена (ТА) в биологическом образце. В некоторых воплощениях способ включает контактирование биологического образца с биспецифическим антителом, которое связывает активирующий Т-клетки антиген и опухолевый антиген (ТА), описанным в данном документе, в условиях, разрешающих связывание биспецифического антитела, которое связывает активирующий Т-клетки антиген и опухолевый антиген (ТА), с активирующим Т-клетки антигеном и/или опухолевым антигеном (ТА), и определение того, образуется ли комплекс между биспецифическим антителом, которое связывает активирующий Т-клетки антиген и опухолевый антиген (ТА), и активирующим Т-клетки антигеном и/или опухолевым антигеном (ТА). Такой способ может быть способом in vitro или in vivo. В одном воплощении биспецифическое антитело, которые связывает активирующий Т-клетки антиген и опухолевый антиген (ТА), используется для выбора субъектов, имеющих право на терапию биспецифическим антителом, которое связывает активирующий Т-клетки антиген и опухолевый антиген (ТА), например, когда опухолевый антиген (ТА) является биомаркером для выбора пациентов.
Примеры нарушений, которые могут быть диагностированы с использованием антитела изобретения, включают рак.
32
14
125
3
131
В некоторых воплощениях предложены меченые биспецифические антитела, которые связывают активирующий Т-клетки антиген и опухолевый антиген (ТА). Метки включают, но не ограничиваясь ими, метки или группировки, которые обнаруживаются непосредственно (такие как флуоресцентные, хромофорные, электронно-плотные, хемилюминесцентные и радиоактивные метки), а также группировки, такие как ферменты или лиганды, которые обнаруживаются косвенно, например через ферментативную реакцию или молекулярное взаимодействие. Примеры меток включают, но не ограничиваясь ими, радиоизотопы P, С, I, H и I, флуорофоры, такие как хелаты редкоземельных элементов или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон, люциферазы, например люциферазу светлячка и бактериальную люциферазу (патент США №4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидазу хрена (HRP), щелочную фосфатазу, β-галактозидазу, глюкоамилазу, лизоцим, оксидазы сахаридов, например, глюкозооксидазу, галактозооксидазу и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, гетероциклические оксидазы, такие как уриказа и ксантиноксидаза, в сочетании с ферментом, который использует пероксид водорода для окисления предшественника метки, таким как HRP, лактопероксидазу или микропероксидазу, биотин/авидин, спиновые метки, бактериофаговые метки, стабильные свободные радикалы и т.п.
F. Фармацевтические составы

Фармацевтические составы биспецифического антитела, которое связывает активирующий Т-клетки антиген и опухолевый антиген (ТА), описанного в данном документе, получают путем смешивания такого биспецифического антитела, имеющего требуемую степень чистоты, с одним или более чем одним возможным фармацевтически приемлемым носителем (Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в виде лиофилизированных составов или водных растворов. Фармацевтически приемлемые носители, как правило, нетоксичны для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и включают, но не ограничиваясь ими: буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмония хлорид; гексаметония хлорид; бензалкония хлорид; бензетониума хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол, 3-пентанол и m-крезол); низкомолекулярные (менее чем примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, Zn-белковые комплексы); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Типичные фармацевтически приемлемые носители в данном документе также включают дисперсные агенты промежуточных лекарственных средств, такие как растворимые нейтрально-активные гликопротеины гиалуронидазы (sHASEGP), например, человеческие растворимые РН-20 гликопротеины гиалуронидазы, такие как rhuPH20 (HYLENEX, Baxter International, Inc.). Некоторые типичные sHASEGP и способы применения, в том числе rhuPH20, описаны в патентных публикациях США №№2005/0260186 и 2006/0104968. В одном аспекте sHASEGP комбинирован с одной или более чем одной дополнительной гликозамингликаназой, такой как хондроитиназа.
Типичные лиофилизированные составы антител описаны в патенте США №6267958. Водные составы антител включают те, которые описаны в патенте США №6171586 и WO 2006/044908, последние составы включают гистидин-ацетатный буфер.
Состав в данном документе может также содержать более одного активного ингредиента, что нужно при лечении по конкретным показаниям, предпочтительно с дополняющими активностями, которые не влияют друг на друга. Такие активные ингредиенты предпочтительно присутствуют в комбинации в количествах, которые эффективны для данной цели.
Активные ингредиенты могут быть заключены в микрокапсулы, полученные, например, с помощью методик коацервации или путем межфазной полимеризации, например, в гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли-(метилметакрилатные) микрокапсулы, соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсиях. Такие методики раскрыты в Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
Могут быть изготовлены препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, при этом матрицы находятся в виде формованных изделий, например пленок или микрокапсул.
Составы, используемые для введения in vivo, обычно являются стерильными. Стерильность может быть легко достигнута, например, путем фильтрации через стерилизующие фильтрационные мембраны.
G. Терапевтические способы и композиции
Любое из биспецифических антител, которые связывают активирующий Т-клетки антиген и опухолевый антиген (ТА), представленных в данном документе, могут быть использованы в терапевтических способах.
В одном аспекте предложено биспецифическое антитело, которое связывает активирующий Т-клетки антиген и опухолевый антиген (ТА), для применения в качестве лекарственного средства. В другом аспекте предложено биспецифическое антитело, которое связывает активирующий Т-клетки антиген и опухолевый антиген (ТА), для применения в лечении рака. В некоторых воплощениях предложено биспецифическое антитело, которое связывает активирующий Т-клетки антиген и опухолевый антиген (ТА), для применения в способе лечения. В некоторых воплощениях данное изобретение предусматривает биспецифическое антитело, которое связывает активирующий Т-клетки антиген и опухолевый антиген (ТА), для применения в способе лечения индивидуума с раком, включающем введение индивидууму эффективного количества биспецифического антитела, которое связывает активирующий Т-клетки антиген и опухолевый антиген (ТА). В одном таком воплощении изобретения способ дополнительно включает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, например, как описано ниже. "Индивидуум" в соответствии с любым из вышеописанных воплощений предпочтительно представляет собой человека.
В другом аспекте изобретение предусматривает применение биспецифического антитела, которое связывает активирующий Т-клетки антиген и опухолевый антиген (ТА), в производстве или изготовлении лекарственного средства. В одном воплощении лекарственное средство предназначено для лечения рака. В еще одном воплощении лекарственное средство предназначено для применения в способе лечения рака, включающем введение индивидууму с раком эффективного количества лекарственного средства. В одном таком воплощении изобретения способ также включает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, например, как описано ниже. "Индивидуум" в соответствии с любым из вышеописанных воплощений может быть человеком.
В другом аспекте данное изобретение предусматривает способ лечения рака. В одном воплощении способ включает введение индивидууму с раком эффективного количества биспецифического антитела, которое связывает активирующий Т-клетки антиген и опухолевый антиген (ТА). В одном таком воплощении изобретения способ также включает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, как описано ниже. "Индивидуум" в соответствии с любым из вышеописанных воплощений может быть человеком.
В другом аспекте изобретение предусматривает фармацевтические составы, содержащие любое из биспецифических антител, которые связывают активирующий Т-клетки антиген и опухолевый антиген (ТА), предложенных в данном документе, например, для применения в любом из указанных выше терапевтических способов. В одном воплощении фармацевтический состав содержит любое из биспецифических антител, которые связывают активирующий Т-клетки антиген и опухолевый антиген (ТА), предложенных в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель. В другом воплощении фармацевтический состав содержит любое из биспецифических антител, которые связывают активирующий Т-клетки антиген и опухолевый антиген (ТА), предложенных в данном документе, и по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент, например, как описано ниже.
Биспецифические антитела изобретения могут быть использованы в терапии по отдельности или в комбинации с другими агентами. Например, биспецифическое антитело изобретения может быть введено совместно по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим агентом.
Такие комбинированные терапии, отмеченные выше, охватывают комбинированное введение (где два или более двух терапевтических агентов включены в одни и те же или отдельные составы), а также раздельное введение, и в этом случае введение антитела изобретения может происходить до, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического агента и/или адъюванта. Биспецифические антитела изобретения также могут быть использованы в сочетании с лучевой терапией.
Биспецифическое антитело изобретения (и любой дополнительный терапевтический агент) может быть введено с помощью любых подходящих средств, в том числе путем парентерального, внутрилегочного и интраназального, и, если желательно местное лечение, внутриочагового введения. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Дозирование может быть осуществлено любым подходящим способом, например с помощью инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, частично в зависимости от того, является ли введение кратковременным или хроническим. В данном описании рассматриваются различные схемы дозировки, включая, но не ограничиваясь ими, одно или множество введений в различные временные точки, болюсное введение и импульсную инфузию.
Биспецифические антитела изобретения будут собраны в состав, дозированы и введены в соответствии с надлежащей медицинской практикой. Факторы, подлежащие рассмотрению в этом контексте, включают конкретное нарушение, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, подлежащее лечению, клиническое состояние отдельного пациента, причину нарушения, место доставки агента, способ введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим врачам. Биспецифическое антитело не обязательно, но может быть собрано в состав с одним или более чем одним агентом, используемым в настоящее время для профилактики или лечения рассматриваемого нарушения. Эффективное количество таких других агентов зависит от количества антитела, присутствующего в составе, от типа заболевания или лечения и от других факторов, описанных выше. Как правило, они используются в тех же дозах и с теми же путями введения, как описано в данном документе, или в дозировках от 1 до 99% от описанных в данном документе, или в любой дозировке и любым путем, который является эмпирически/клинически подходящим.
Для профилактики или лечения заболевания подходящая доза биспецифического антитела изобретения (при использовании его отдельно или в сочетании с одним или более чем одним другим дополнительным терапевтическим агентом) будет зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, от типа антитела, тяжести и течения заболевания, от того, вводят ли антитело с профилактической или терапевтической целью, от предыдущей терапии, истории болезни пациента и ответа на антитела и по усмотрению лечащего врача. Антитело вводят пациенту подходящим образом одномоментно или серийно. В зависимости от типа и тяжести заболевания изначальной кандидатной дозировкой биспецифического антитела для введения пациенту может быть дозировка от примерно 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, от 0,1 мг/кг до 10 мг/кг) независимо от того, например, вводится ли оно в ходе одного или нескольких отдельных введений или путем непрерывной инфузии. Одна из типичных суточных доз может варьировать от примерно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более в зависимости от указанных выше факторов. В случае повторных введений в течение нескольких дней или дольше в зависимости от состояния лечение, как правило, может быть продолжительным до требуемого подавления симптомов заболевания. Один из примеров дозировки биспецифического антитела будет находиться в диапазоне от примерно 0,05 мг/кг до примерно 10 мг/кг. Таким образом, пациенту может быть введена одна или более чем одна доза примерно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг или 10 мг/кг (или любая их комбинация). Такие дозы можно вводить периодически, например, каждую неделю или каждые три недели (например, так, чтобы пациент получал от примерно двух до примерно двадцати или, например, примерно шесть доз биспецифического антитела). Может быть введена первоначальная более высокая нагрузочная доза с последующей одной или более чем одной более низкой дозой. Тем не менее, могут использоваться и другие режимы дозирования. Прогресс этой терапии легко контролировать с помощью обычных методик и анализов.
Понятно, что любой из вышеуказанных составов или терапевтических способов может быть осуществлен с использованием иммуноконъюгата изобретения вместо или в дополнение к биспецифическому антителу, которое связывает активирующий Т-клетки антиген и опухолевый антиген (ТА).
Н. Продукт производства
В другом аспекте данного изобретения предусматривается продукт производства, содержащий материалы, используемые для лечения, профилактики и/или диагностики нарушений, описанных выше. Продукт производства содержит контейнер и этикетку или листок-вкладыш, прикрепленный или связанный с контейнером. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы, пакеты для внутривенно вводимых растворов и т.д. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию саму по себе или в сочетании с другой композицией, эффективной для лечения, профилактики и/или диагностики состояния, и может иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенно вводимого раствора или флакон с пробкой, прокалываемой иглой для подкожной инъекции). По меньшей мере один активный агент в композиции представляет собой биспецифическое антитело изобретения. На этикетке или вкладыше в упаковку указывается, что композиция используется для лечения выбранного состояния. Кроме того, изделие может включать: (а) первый контейнер с композицией, содержащейся в нем, где композиция содержит биспецифическое антитело изобретения; и (б) второй контейнер с композицией, содержащейся в нем, где композиция также содержит цитотоксический или другой терапевтический агент. Продукт производства в этом воплощении изобретения может также содержать вкладыш в упаковку, указывающий, что композиции могут быть использованы для лечения конкретного состояния. Альтернативно или дополнительно изделие может также включать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, например, бактериостатическую воду для инъекций (BWFI), забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Он может также включать другие материалы, желательные с коммерческой и потребительской точки зрения, в том числе другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
Понятно, что любой из указанных выше продуктов производства может включать иммуноконъюгат изобретения вместо или в дополнение к биспецифическому антителу, которое связывает активирующий Т-клетки антиген и опухолевый антиген (ТА).
III. Примеры
Ниже приведены примеры способов и композиций изобретения. Понятно, что различные другие воплощения могут применяться на практике, учитывая общее описание, данное выше.
Хотя данное изобретение было описано в некоторых деталях в качестве иллюстрации и примера с целью ясности понимания, описания и примеры не следует рассматривать как ограничивающие объем изобретения. Раскрытие всей патентной и научной литературы, приведенной в данном документе, включено во всей полноте посредством ссылки.
Пример 1: Получение Fab(MCSP)-CrossFab(CD3)
Полученную вариабельную область тяжелой и легкой цепи ДНК-последовательностей субклонировали в рамке либо с константной тяжелой цепью, либо с константной легкой цепью, предварительно вставленной в соответствующий реципиентый вектор для экспрессии у млекопитающих. Экспрессия антитела управляется MPSV-промотором и несет синтетическую сигнальную полиА-последовательность на 3′-конце CDS. Кроме того, каждый вектор содержит последовательность EBV OriP.
Молекулу получали путем котрансфекции клеток HEK293-EBNA векторами для экспрессии у млекопитающих с использованием фосфата кальция. Экспоненциально растущие клетки HEK293-EBNA трансфицировали с помощью фосфата кальция. Альтерантивно, клетки HEK293-EBNA, растущие в суспензии, трансфицировали с помощью полиэтиленимина. Клетки трансфицировали соответствующими экспрессионными векторами в соотношении 1:1:1 ("вектор CH1-VH-CK-VH" : "вектор с легкой цепью" : "вектор с легкой цепью CH1-VL").
2
2
2
2
4
2
Для трансфекции с помощью фосфата кальция клетки выращивали в виде монослойной прикрепленной культуры в Т-колбах с использованием культуральной среды Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), содержащей 10% (объем/объем) эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), и трансфицировали, когда они находились между 50 и 80% конфлюэнтности. Для трансфекции в колбу Т150 высевали 15 млн клеток за 24 часа до трансфекции в 25 мл культуральной среды DMEM, содержащей FCS (финальная концентрация 10% объем/объем), и клетки помещали в инкубатор с температурой 37°С и атмосферой 5% CO на ночь. Для каждой колбы Т150 для трансфекции готовили раствор ДНК, CaCl и воды, смешивая 94 мкг тотальной плазмидной векторной ДНК, разделенной в соответствующем соотношении, воду до конечного объема 469 мкл и 469 мкл 1 М раствора CaCl. К этому раствору добавляли 938 мкл 50 мМ HEPES, 280 мМ NaCl, 1,5 мМ раствор NaHPO при рН 7,05, немедленно перемешивали в течение 10 с и оставляли при комнатной температуре на 20 с. Суспензию разбавляли 10 мл DMEM с добавлением 2% (объем/объем) FCS, и вносили в Т150 вместо находящейся там среды. Затем добавляли еще 13 мл среды для трансфекции. Клетки инкубировали при 37°С и 5% CO, в течение примерно 17-20 часов, а затем среду заменяли на 25 мл DMEM, 10% FCS. Кондиционированную культуральную среду собирали примерно через 7 дней после замены среды путем центрифугирования в течение 15 мин при 210 g, раствор стерилизовали фильтрацией (через фильтр с размером пор 0,22 мкм), добавляли азид натрия до конечной концентрации 0,01% (вес/объем) и хранили при 4°С.
2
Для трансфекции с помощью полиэтиленимина клетки HEK293-EBNA культивировали в бессывороточной суспензии в культуральной среде CD CHO. Для продукции в 500 мл встряхивающийся флакон высевали 400 млн клеток HEK293-EBNA за 24 часа до трансфекции. Для трансфекции клетки центрифугировали в течение 5 мин при 210 g, супернатант заменяли 20 мл подогретой среды CD CHO. Экспрессионные векторы смешивали в 20 мл среды CD CHO до конечного количества 200 мкг ДНК. После добавления 540 мкл PEI раствор перемешивали на вортексе в течение 15 с, а затем инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем клетки смешивали с раствором ДНК/PEI, переносили в 500 мл встряхивающийся флакон и инкубировали в течение 3 часов при 37°С в инкубаторе с атмосферой 5% CO. После периода инкубации добавляли 160 мл среды F17 и культивировали клетки в течение 24 часов. На следующий день после трансфекции добавляли 1 мМ вальпроевую кислоту и 7% Feed 1 (Lonza). Через 7 дней культивирования супернатант собирали и очищали путем центрифугирования в течение 15 мин при 210 g, раствор стерилизовали фильтрацией (через фильтр с размером пор 0,22 мкм), добавляли азид натрия до конечной концентрации 0,01% (вес/объем) и хранили при 4°С.
Секретируемый белок очищали из клеточного культурального супернатанта с помощью аффинной хроматографии с использованием белка А и белка G, с последующим этапом эксклюзионной хроматографии. Для аффинной хроматографии супернатант загружали в колонку HiTrap Protein A HP (CV=5 мл, GE Healthcare), соединенную с колонкой HiTrap Protein G HP (CV=5 мл, GE Healthcare), каждая из которых была уравновешена 30 мл раствора 20 мМ фосфата натрия, 20 мМ цитрата натрия, рН 7,5. Несвязанный белок удаляли промыванием обеих колонок шестью объемами колонки раствора 20 мМ фосфата натрия, 20 мМ цитрата натрия, рН 7,5. Затем был необходим дополнительный этап промывания только колонки HiTrap Protein G HP с использованием по меньшей мере восьми объемов колонки раствора 20 мМ фосфата натрия, 20 мМ цитрата натрия, рН 7,5. Целевой белок элюировали из колонки HiTrap Protein G HP с использованием ступенчатого градиента семью объемами колонки 8,8 мМ муравьиной кислоты, рН 3,0. Раствор белка нейтрализовали добавлением 1/10 0,5 М фосфата натрия, рН 8,0. Целевой белок концентрировали и фильтровали перед загрузкой в колонку HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare), уравновешенную раствором 25 мМ фосфата калия, 125 мМ хлорида натрия, 100 мМ глицина с рН 6,7.

3
Концентрацию белка в очищенных образцах белка определяли путем измерения оптической плотности (OD) при 280 нм с использованием молярного коэффициента экстинкции, рассчитанного на основе аминокислотной последовательности. Чистоту и молекулярный вес антител анализировали с помощью SDS-PAGE в присутствии и в отсутствие восстанавливающего агента (5 мМ 1,4-дитиотреитол) и окрашивания Кумасси (SimpleBlue™ SafeStain от Invitrogen). Систему NuPAGE Pre-Cast gel system использовали в соответствии с инструкцией изготовителя (4-12% трис-ацетатные гели или 4-12% бис-трис-гели). Содержание агрегатов в образцах антител анализировали с помощью аналитической эксклюзионной колонки Superdex 200 10/300GL (GE Healthcare, Швеция) в рабочем буфере 2 мМ MOPS, 150 мМ NaCl, 0,02% (вес/объем) NaN, рН 7,3 при 25°С.
V9
V9
Анализ продукции и очистки примерной молекулы Fab-Crossfab (состоящей из трех цепей: VHCH1(MCSP)-VLCH1(CD3) = SEQ ID №25, VLCL(MCSP) = SEQ ID №17 и VHCL(CD3) = SEQ ID №23; с ориентацией, как показано на фиг. 1а) показан на фиг. 2 и 3. Эта молекула далее упоминается как Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) или hu Fab(MCSP)-Crossfab(CD3).
Пример 2: Получение Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-CrossFab(CD3) и Fab(MCSP)-CrossFab(CD3)-Fab(MCSP)
Полученную вариабельную область тяжелой и легкой цепи ДНК-последовательностей субклонировали в рамке либо с константной тяжелой цепью, либо с константной легкой цепью, предварительно вставленной в соответствующий реципиентый вектор для экспрессии у млекопитающих. Экспрессия антитела управляется MPSV-промотором и несет синтетическую сигнальную полиА-последовательность на 3′-конце CDS. Кроме того, каждый вектор содержит последовательность EBV OriP.
Молекулу получали путем котрансфекции клеток HEK293-EBNA векторами для экспрессии у млекопитающих с использованием фосфата кальция. Экспоненциально растущие клетки HEK293-EBNA трансфицировали с помощью фосфата кальция. Альтерантивно клетки HEK293-EBNA, растущие в суспензии, трансфицировали с помощью полиэтиленимина. Клетки трансфицировали соответствующими экспрессионными векторами в соотношении 1:2:1 ("вектор CH1-VH-CH1-VH-CK-VH" : "вектор с легкой цепью" : "вектор с легкой цепью CH1-VL").
2
2
2
2
4
2
2
Для трансфекции с помощью фосфата кальция клетки выращивали в виде монослойной прикрепленной культуры в Т-колбах с использованием культуральной среды DMEM, содержащей 10% (объем/объем) FCS, и трансфицировали, когда они находились между 50 и 80% конфлюэнтности. Для трансфекции в колбу Т150 высевали 15 млн клеток за 24 часа до трансфекции в 25 мл культуральной среды DMEM, содержащей FCS (финальная концентрация 10% объем/объем), и клетки помещали на ночь в инкубатор с температурой 37°С и атмосферой 5% СО. Для каждой колбы Т150 для трансфекции готовили раствор ДНК, CaCl и воды, смешивая 94 мкг тотальной плазмидной векторной ДНК, разделенной в соответствующем соотношении, воду до конечного объема 469 мкл и 469 мкл 1 М раствора CaCl. К этому раствору добавляли 938 мкл 50 мМ HEPES, 280 мМ NaCl, 1,5 мМ раствора NaHPO при рН 7,05, немедленно перемешивали в течение 10 с и оставляли при комнатной температуре на 20 с. Суспензию разбавляли 10 мл DMEM с добавлением 2% (объем/объем) FCS, и вносили в Т150 вместо находящейся там среды. Затем добавляли еще 13 мл среды для трансфекции. Клетки инкубировали при 37°С и 5% CO, в течение примерно 17-20 часов, а затем среду заменяли 25 мл DMEM, 10% FCS. Кондиционированную культуральную среду собирали примерно через 7 дней после замены среды путем центрифугирования в течение 15 мин при 210 g, раствор стерилизовали фильтрацией (через фильтр с размером пор 0,22 мкм), добавляли азид натрия до конечной концентрации 0,01% (вес/объем) и хранили при 4°С. Для трансфекции с помощью полиэтиленимина клетки HEK293-EBNA культивировали в бессывороточной суспензии в культуральной среде CD CHO. Для продукции в 500 мл встряхивающийся флакон высевали 400 млн клеток HEK293-EBNA за 24 часа до трансфекции. Для трансфекции клетки центрифугировали в течение 5 мин при 210 g, супернатант заменяли 20 мл подогретой среды CD CHO. Экспрессионные векторы смешивали в 20 мл среды CD CHO до конечного количества 200 мкг ДНК. После добавления 540 мкл PEI раствор перемешивали на вортексе в течение 15 с, а затем инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем клетки смешивали с раствором ДНК/PEI, переносили в 500 мл встряхивающийся флакон и инкубировали в течение 3 часов при 37°С в инкубаторе с атмосферой 5% CO. После периода инкубации добавляли 160 мл среды F17 и культивировали клетки в течение 24 часов. На следующий день после трансфекции добавляли 1 мМ вальпроевую кислоту и 7% Feed 1 (Lonza). Через 7 дней культивирования супернатант собирали и очищали путем центрифугирования в течение 15 мин при 210 g, раствор стерилизовали фильтрацией (через фильтр с размером пор 0,22 мкм), добавляли азид натрия до конечной концентрации 0,01% (вес/объем) и хранили при 4°С.
Секретируемый белок очищали из клеточного культурального супернатанта с помощью аффинной хроматографии с использованием белка А и белка G, с последующим этапом эксклюзионной хроматографии.
Для аффинной хроматографии супернатант загружали в колонку HiTrap Protein A HP (CV=5 мл, GE Healthcare), соединенную с колонкой HiTrap Protein G HP (CV=5 мл, GE Healthcare), каждая из которых была уравновешена 30 мл раствора 20 мМ фосфата натрия, 20 мМ цитрата натрия, рН 7,5. Несвязанный белок удаляли промыванием обеих колонок шестью объемами колонки раствора 20 мМ фосфата натрия, 20 мМ цитрата натрия, рН 7,5. Затем был необходим дополнительный этап промывания только колонки HiTrap Protein G HP с использованием по меньшей мере восьми объемов колонки раствора 20 мМ фосфата натрия, 20 мМ цитрата натрия, рН 7,5. Целевой белок элюировали из колонки HiTrap Protein G HP с использованием ступенчатого градиента семью объемами колонки 8,8 мМ муравьиной кислоты, рН 3,0. Раствор белка нейтрализовали добавлением 1/10 0,5 М фосфата натрия, рН 8,0. Целевой белок концентрировали и фильтровали перед загрузкой в колонку HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare), уравновешенную раствором 25 мМ фосфата калия, 125 мМ хлорида натрия, 100 мМ глицина с рН 6,7.

3
Концентрацию белка в очищенных образцах белка определяли путем измерения оптической плотности (OD) при 280 нм с использованием молярного коэффициента экстинкции, рассчитанного на основе аминокислотной последовательности. Чистоту и молекулярный вес антител анализировали с помощью SDS-PAGE в присутствии и в отсутствие восстанавливающего агента (5 мМ 1,4-дитиотреитол) и окрашивания Кумасси (SimpleBlue™ SafeStain от Invitrogen). Систему NuPAGE Pre-Cast gel system использовали в соответствии с инструкцией изготовителя (4-12% трис-ацетатные гели или 4-12% бис-трис-гели). Содержание агрегатов в образцах антител анализировали с помощью аналитической эксклюзионной колонки Superdex 200 10/300GL (GE Healthcare, Швеция) в рабочем буфере 2 мМ MOPS, 150 мМ NaCl, 0,02% (вес/объем) NaN, рН 7,3 при 25°С.
<img file="00000004.tif" he="42" wi="156" img-content="undefined" img-format="tif" />
HMW = высокомолекулярные; LMW = низкомолекулярные
V9
V9
Анализ продукции и очистки примерной молекулы Fab-Fab-Crossfab (состоящей из четырех цепей: VHCH1(MCSP)-VHCH1(MCSP)-VLCH1(CD3) = SEQ ID №26, две VLCL(MCSP)-цепи = SEQ ID №17 и одна VHCL(CD3)-цепь = SEQ ID №23; с ориентацией, как показано на фиг. 1с) показан на фиг. 4 и 5. Эта молекула далее упоминается как Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) или hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3).
V9
V9
Анализ продукции и очистки примерной молекулы Fab-Crossfab-Fab (состоящей из четырех цепей: VHCH1(MCSP)-VLCH1(CD3)-VHCH1(MCSP) = SEQ ID №27, две VLCL(MCSP)-цепи = SEQ ID №17 и одна VHCL(CD3)-цепь = SEQ ID №23; с ориентацией, как показано на фиг. 1е)) показан на фиг. 6 и 7. Эта молекула далее упоминается как Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) или hu Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3).
2C11
2C11
Анализ продукции и очистки примерной молекулы Crossfab-Fab-Fab (состоящей из четырех цепей: VLCH1(CD3)-VHCH1(MCSP)-VHCH1(MCSP) = SEQ ID №42, 2 VLCL(MCSP) цепи = SEQ ID №17 и одна VHCL(CD3)-цепь = SEQ ID №43; с ориентацией, как показано на фиг. 1d)) показан на фиг. 8 и 9. Эта молекула далее упоминается как мышиный Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP).
Пример 3: Получение Fab(CD33)-CrossFab(CD3)
Полученную вариабельную область тяжелой и легкой цепи ДНК-последовательностей субклонировали в рамке либо с константной тяжелой цепью, либо с константной легкой цепью, предварительно вставленной в соответствующий реципиентый вектор для экспрессии у млекопитающих. Экспрессия антитела управляется MPSV-промотором и несет синтетическую сигнальную полиА-последовательность на 3′-конце CDS. Кроме того, каждый вектор содержит последовательность EBV OriP.
Молекулу получали путем котрансфекции клеток HEK293-EBNA векторами для экспрессии у млекопитающих с использованием фосфата кальция. Экспоненциально растущие клетки HEK293-EBNA трансфицировали с помощью фосфата кальция. Альтерантивно клетки HEK293-EBNA, растущие в суспензии, трансфицировали с помощью полиэтиленимина. Клетки трансфицировали соответствующими экспрессионными векторами в соотношении 1:1:1 ("вектор CH1-VH-CH1-VH-CK-VH" : "вектор с легкой цепью" : "вектор с легкой цепью CH1-VL").
2
2
2
2
4
2
Для трансфекции с помощью фосфата кальция клетки выращивали в виде монослойной прикрепленной культуры в Т-колбах с использованием культуральной среды DMEM, содержащей 10% (объем/объем) FCS, и трансфицировали, когда они находились между 50 и 80% конфлюэнтности. Для трансфекции в колбу Т150 высевали 15 млн клеток за 24 часа до трансфекции в 25 мл культуральной среды DMEM, содержащей FCS (финальная концентрация 10% объем/объем), и клетки помещали на ночь в инкубатор с температурой 37°С и атмосферой 5% CO. Для каждой колбы Т150 для трансфекции готовили раствор ДНК, CaCl и воды, смешивая 94 мкг тотальной плазмидной векторной ДНК, разделенной в соответствующем соотношении, воду до конечного объема 469 мкл и 469 мкл 1 М раствора CaCl. К этому раствору добавляли 938 мкл 50 мМ HEPES, 280 мМ NaCl, 1,5 мМ раствора NaHPO при рН 7,05, немедленно перемешивали в течение 10 с и оставляли при комнатной температуре на 20 с. Суспензию разбавляли 10 мл DMEM с добавлением 2% (объем/объем) FCS, и вносили в Т150 вместо находящейся там среды. Затем добавляли еще 13 мл среды для трансфекции. Клетки инкубировали при 37°С и 5% CO, в течение примерно 17-20 часов, а затем среду заменяли 25 мл DMEM, 10% FCS. Кондиционированную культуральную среду собирали примерно через 7 дней после замены среды путем центрифугирования в течение 15 мин при 210 g, раствор стерилизовали фильтрацией (через фильтр с размером пор 0,22 мкм), добавляли азид натрия до конечной концентрации 0,01% (вес/объем) и хранили при 4°С.
2
Для трансфекции с помощью полиэтиленимина клетки HEK293-EBNA культивировали в бессывороточной суспензии в культуральной среде CD CHO. Для продукции в 500 мл встряхивающийся флакон высевали 400 млн клеток HEK293-EBNA за 24 часа до трансфекции. Для трансфекции клетки центрифугировали в течение 5 мин при 210 g, супернатант заменяли 20 мл подогретой среды CD CHO. Экспрессионные векторы смешивали в 20 мл среды CD CHO до конечного количества 200 мкг ДНК. После добавления 540 мкл PEI раствор перемешивали на вортексе в течение 15 с, а затем инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем клетки смешивали с раствором ДНК/PEI, переносили в 500 мл встряхивающийся флакон и инкубировали в течение 3 часов при 37°С в инкубаторе с атмосферой 5% CO. После периода инкубации добавляли 160 мл среды F17 и культивировали клетки в течение 24 часов. На следующий день после трансфекции добавляли 1 мМ вальпроевую кислоту и 7% Feed 1 (Lonza). Через 7 дней культивирования супернатант собирали и очищали путем центрифугирования в течение 15 мин при 210 g, раствор стерилизовали фильтрацией (через фильтр с размером пор 0,22 мкм), добавляли азид натрия до конечной концентрации 0,01% (вес/объем) и хранили при 4°С.
Секретируемый белок очищали из клеточного культурального супернатанта с помощью аффинной хроматографии с использованием белка А и белка G, с последующим этапом эксклюзионной хроматографии.
Для аффинной хроматографии супернатант загружали в колонку HiTrap Protein A HP (CV=5 мл, GE Healthcare), соединенную с колонкой HiTrap Protein G HP (CV=5 мл, GE Healthcare), каждая из которых была уравновешена 30 мл раствора 20 мМ фосфата натрия, 20 мМ цитрата натрия, рН 7,5. Несвязанный белок удаляли промыванием обеих колонок шестью объемами колонки раствора 20 мМ фосфата натрия, 20 мМ цитрата натрия, рН 7,5. Затем был необходим дополнительный этап промывания только колонки HiTrap Protein G HP с использованием по меньшей мере восьми объемов колонки раствора 20 мМ фосфата натрия, 20 мМ цитрата натрия, рН 7,5. Целевой белок элюировали из колонки HiTrap Protein G HP с использованием ступенчатого градиента семью объемами колонки 8,8 мМ муравьиной кислоты, рН 3,0. Раствор белка нейтрализовали добавлением 1/10 0,5 М фосфата натрия, рН 8,0. Целевой белок концентрировали и фильтровали перед загрузкой в колонку HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare), уравновешенную раствором 25 мМ фосфата калия, 125 мМ хлорида натрия, 100 мМ глицина с рН 6,7.

3
Концентрацию белка в очищенных образцах белка определяли путем измерения оптической плотности (OD) при 280 нм с использованием молярного коэффициента экстинкции, рассчитанного на основе аминокислотной последовательности. Чистоту и молекулярный вес антител анализировали с помощью SDS-PAGE в присутствии и в отсутствие восстанавливающего агента (5 мМ 1,4-дитиотреитол) и окрашивания Кумасси (SimpleBlue™ SafeStain от Invitrogen). Систему NuPAGE Pre-Cast gel system использовали в соответствии с инструкцией изготовителя (4-12% трис-ацетатные гели или 4-12% бис-трис-гели). Содержание агрегатов в образцах антител анализировали с помощью аналитической эксклюзионной колонки Superdex 200 10/300GL (GE Healthcare, Швеция) в рабочем буфере 2 мМ MOPS, 150 мМ NaCl, 0,02% (вес/объем) NaN, рН 7,3 при 25°С.
V9
V9
Анализ продукции и очистки примерной молекулы Fab-Crossfab (состоящей из трех цепей: VHCH1(CD33)-VLCH1(CD3) = SEQ ID №102, VLCL(CD33) = SEQ ID №100 и VHCL(CD3) = SEQ ID №23 или SEQ ID №101; с ориентацией, как показано на фиг. 1а) показан на фиг. 17 и 18. Эта молекула далее упоминается как Fab(CD33)-CrossFab(CD3) или hu Fab(CD33)-CrossFab(CD3).
Пример 4: Получение референсной молекулы (scFv)2
Клонирование и продукция
Полученную вариабельную область тяжелой и легкой цепи ДНК-последовательностей субклонировали в рамке в соответствующий реципиентый вектор для экспрессии у млекопитающих. Экспрессия антитела управляется MPSV-промотором и несет синтетическую сигнальную полиА-последовательность на 3′-конце CDS. Кроме того, каждый вектор содержит последовательность EBV OriP.
2
Молекулу получали путем трансфекции клеток HEK293-EBNA вектором для экспрессии у млекопитающих при помощи полиэтиленимина. Клетки HEK293-EBNA культивировали в бессывороточной суспензии в культуральной среде CD СНО. Для продукции в 500 мл встряхивающийся флакон высевали 400 млн клеток HEK293-EBNA за 24 часа до трансфекции. Для трансфекции клетки центрифугировали в течение 5 мин при 210 g, супернатант заменяли 20 мл подогретой среды CD СНО. Экспрессионные векторы смешивали в 20 мл среды CD СНО до конечного количества 200 мкг ДНК. После добавления 540 мкл PEI раствор перемешивали на вортексе в течение 15 с, а затем инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем клетки смешивали с раствором ДНК/PEI, переносили в 500 мл встряхивающийся флакон и инкубировали в течение 3 часов при 37°С в инкубаторе с атмосферой 5% CO. После периода инкубации добавляли 160 мл среды F17 и клетки культивировали в течение 24 часов. На следующий день после трансфекции добавляли 1 мМ вальпроевую кислоту и 7% Feed 1 (Lonza). Через 7 дней культивирования супернатант собирали и очищали путем центрифугирования в течение 15 мин при 210 g, раствор стерилизовали фильтрацией (через фильтр с размером пор 0,22 мкм), добавляли азид натрия до конечной концентрации 0,01% (вес/объем) и хранили при 4°С.
Очистка (scFv)2 (анти-MCSP/антиhuСD3)
Секретируемый белок очищали из клеточного культурального супернатанта путем аффинной хроматографии с помощью металло-хелат-аффинной хроматографии (IMAC) с последующим этапом эксклюзионной хроматографии.
Перед первым этап очистки разрушенные компоненты удаляли из супернатанта путем диафильтрации с помощью системы тангенциальной поточной фильтрации Sarcojet (Sartorius), оснащенной мембраной 5,000 MWCO (Sartocon Slice Cassette, Hydrosart; Sartorius). Супернатант концентрировали до 210 мл, а затем разводили в 1 л 20 мМ фосфата натрия, 500 мМ хлорида натрия, рН 6,5. Белковый раствор снова концентрировали до 210 мл. Этот процесс повторяли дважды, чтобы обеспечить полную замену буфера.
Для аффинной хроматографии ретентат диафильтрационного процесса загружали в картридж NiNTA Superflow Cartridge (CV=5 мл, Qiagen), уравновешенный 25 мл 20 мМ фосфата натрия, 500 мМ хлорида натрия, 15 мМ имидазола, рН 6,5. Несвязанный белок удаляли промыванием по меньшей мере двумя объемами колонки раствора 20 мМ фосфата натрия, 500 мМ хлорида натрия, 15 мМ имидазола, рН 6,5 с последующим дополнительным этапом промывания по меньшей мере тремя объемами колонки раствора 20 мМ фосфата натрия, 500 мМ хлорида натрия, 62,5 мМ имидазола, рН 6,5. Целевой белок элюировали двумя объемами колонки раствора 20 мМ фосфата натрия, 500 мМ хлорида натрия, 125 мМ имидазола, рН 6,5. Колонку промывали последовательно раствором 20 мМ фосфата натрия, 500 мМ хлорида натрия, 250 мМ имидазола, рН 6,5.
2
4
Целевой белок концентрировали перед загрузкой в колонку HiLoad Superdex 75 (GE Healthcare), уравновешенную раствором 25 мМ KHPO, 125 мМ NaCl, 200 мМ аргинина, рН 6,7.
Выход, содержание агрегатов после первого этапа очистки и конечное содержание мономера показано в таблице выше. Сравнение содержания агрегатов после первого этапа очистки указывает на превосходную стабильность конструкции Fab-Crossfab в отличие от (scFv)2.
Характеризация (scFv)2

3
Концентрацию белка в очищенных образцах белка определяли путем измерения оптической плотности (OD) при 280 нм с использованием молярного коэффициента экстинкции, рассчитанного на основе аминокислотной последовательности. Чистоту и молекулярный вес антител анализировали с помощью SDS-PAGE в присутствии и в отсутствие восстанавливающего агента (5 мМ 1,4-дитиотреитол) и окрашивания Кумасси (SimpleBlue™ SafeStain от Invitrogen). Систему NuPAGE Pre-Cast gel system (Invitrogen, США) использовали в соответствии с инструкцией изготовителя (4-12% трис-ацетатные гели или 4-12% бис-трис-гели). Содержание агрегатов в образцах антител анализировали с помощью аналитической эксклюзионной колонки Superdex 75 10/300GL (GE Healthcare, Швеция) в рабочем буфере 2 мМ MOPS, 150 мМ NaCl, 0,02% (вес/объем) NaN, pH 7,3 при 25°С.
Схематическое изображение молекулы (scFv)2 приведено на фиг. 21.
V9
Анализ продукции и очистки примерной молекулы (scFv)2 (антиМСSР/антиhuCD3), содержащей две Fv-цепи: VL-VH (MCSP) и VH-VL (CD3) = SEQ ID №149, показан на фиг. 22 и 23. Эта молекула далее упоминается как (scFv)2 (антиМСSР/антиhuCD3e).
Пример 5: Выделение первичных человеческих пан-Т-клеток из РВМС
Периферические мононуклеарные клетки крови (РВМС) получали путем центрифугирования в градиенте плотности Histopaque из обогащенных лимфоцитами препаратов (лейкоцитарных пленок), полученных из местных банков крови или из свежей крови от здоровых доноров.
Обогащение Т-клеток из РВМС проводили с использованием набора Pan Т Cell Isolation Kit II (Miltenyi Biotec №130-091-156) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, клеточные осадки разводили в 40 мкл холодного буфера на 10 млн клеток (PBS с 0,5% BSA, 2 мМ EDTA - стерильно профильтрован) и инкубировали с 10 мкл реагента Biotin-Antibody Cocktail на 10 млн клеток в течение 10 мин при 4°С.
30 мкл холодного буфера и 20 мкл антибиотиновых магнитных шариков добавляли к 10 млн клеток и инкубировали смесь еще в течение 15 мин при 4°С.
Клетки промывали путем добавления 10-20-кратного объема и последующего центрифугирования при 300 g в течение 10 мин. До 100 млн клеток ресуспендировали в 500 мкл буфера.
2
Магнитное отделение немеченых человеческих пан-Т-клеток проводили с использованием LS-колонки (Miltenyi Biotec №130-042-401) в соответствии с инструкциями производителя. Полученную Т-клеточную популяцию подсчитывали автоматически (ViCell) и хранили в среде AIM-V при 37°С и 5% CO, в инкубаторе до начала анализа (не более 24 ч).
Пример 6. Выделение мышиных пан-Т-клеток из спленоцитов
Селезенки выделяли у мышей C57BL/6, переносили в С-пробирку GentleMACS (Miltenyi Biotech №130-093-237), содержащую буфер MACS (PBS + 0,5% BSA + 2 мМ EDTA), и подвергали диссоциации с помощью GentleMACS Dissociator для получения суспензий с отдельными клетками в соответствии с инструкциями производителя.
Клеточную суспензию пропускали через фильтр предварительной очистки, чтобы избавиться от оставшихся частиц недиссоциированной ткани. После центрифугирования при 400 g в течение 4 минут при 4°С добавляли буфер АСК Lysis Buffer для лизиса эритроцитов (инкубации в течение 5 минут при комнатной температуре). Остальные клетки промывали дважды буфером MACS, подсчитывали и использовали для выделения мышиных пан-Т-клеток. Отрицательную (магнитную) селекцию проводили с помощью набора Pan T Cell Isolation Kit from Miltenyi Biotec (№130-090-861) в соответствии с инструкциями производителя. Полученную популяцию Т-клеток автоматически подсчитывали (ViCell) и немедленно использовали для дальнейших анализов.
Пример 7: Перенаправленная Т-клеточная цитотоксичность, опосредованная перекрестными биспецифическими конструкциями, нацеленными на CD3 на Т-клетках и MCSP на опухолевых клетках (анализ высвобождения LDH)
Биспецифические конструкции, нацеленные на CD3 на человеческих или мышиных Т-клетках и человеческих опухолевых клетках, анализировали в анализе высвобождения LDH в отношении их способности индуцировать опосредованный Т-клетками апоптоз клеток-мишеней.
Вкратце, клетки-мишени (человеческие Colo-38, человеческие MDA-MB-435, клетки меланомы человека MV-3 или мышиные клетки B16/F10-huMCSP Fluc 2 клона 48, экспрессирующие человеческий MCSP) собирали с помощью буфера для диссоциации клеток Cell Dissociation Buffer (MCSP чувствителен к трипсину) или трипсина (и помещали в платы накануне), промывали и ресуспендировали в соответствующей клеточной культуральной среде (см. подробное описание различных фигур). 20000-30000 клеток на лунку высевали в круглодонный 96-луночный планшет и добавляли соответствующее разведение антитела, как указано (в трех повторах). Эффекторные клетки добавляли так, чтобы получить конечное соотношение Е:Т = 5:1 (для человеческих пан-Т-клеток), 10:1 (для человеческих РВМС).
Кроме того, 1-10 мкг/мл PHA-M (Sigma № L8902), смесь изолектицов, выделенных из Phaseolus vulgaris, использовали в качестве митогенного стимула, чтобы вызвать активацию человеческих или собачьих Т-клеток. Для мышиных Т-клеток в качестве положительного контроля активации использовали 5% раствор "rat T-Stim with ConA" (BD №54115).
Для нормализации: максимальный лизис клеток-мишеней (=100%) был достигнут при инкубации клеток-мишеней с конечной концентрацией 1% Triton-X-100. Минимальный лизис (=0%) относится к клеткам-мишеням, совместно инкубированным с эффекторными клетками, но без конструкции или антитела.
2
После ночной инкубации в течение по меньшей мере 18 ч при 37°С и 5% CO измеряли высвобождение LDH в супернатант из апоптотических/некротических клеток-мишеней с помощью набора для обнаружения LDH (Roche Applied Science, №11644793001) в соответствии с инструкциями производителя.
Анализ высвобождения LDH с биспецифическими конструкциями Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) и Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3)
Очищенный Fab(MCSP)-Crossfab(CD3), Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) и референсную молекулу (scFv)2 (антиMCSP/антиhuCD3e) анализировали на их способность индуцировать опосредованный Т-клетками апоптоз в опухолевых клетках-мишенях при сшивании конструкции посредством связывания обеих группировок, направленных на соответствующие антигены на клетках. Вкратце, клетки-мишени человеческой меланомы MDA-MB-435, экспрессирующие huMCSP, собирали с помощью буфера Cell Dissociation Buffer, промывали и ресуспендировали в среде AIM-V (Invitrogen №12055-091). 30000 клеток на лунку высевали в круглодонный 96-луночный планшет и добавляли соответствующее разведение антитела в указанных концентрациях. Все конструкции и контроли доводили до одной и той же молярности.
Эффекторные пан-Т-клетки человека добавляли так, чтобы получить конечное соотношение Е:Т = 5:1. В качестве положительного контроля активации человеческих пан-Т-клеток использовали 1 мкг/мл PHA-M (Sigma № L8902). Для нормализации: максимальный лизис клеток-мишеней (=100%) был достигнут при инкубации клеток-мишеней с конечной концентрацией 1% Triton-X-100. Минимальный лизис (=0%) относится к клеткам-мишеням, совместно инкубированным с эффекторными клетками, но без конструкции или антитела.
2
После ночной инкубации в течение 20 ч при 37°С и 5% CO измеряли высвобождение LDH в супернатант из апоптотических/некротических клеток-мишеней с помощью набора для обнаружения LDH (Roche Applied Science, №11644793001) в соответствии с инструкциями производителя.
Как показано на фиг. 10, конструкции с бивалентным MCSP-нацеливанием демонстрируют цитотоксическую активность, сравнимую с конструкцией (scFv)2 (антиМСSР/антиhuCD3e), в то время как конструкция Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) с моновалентным MCSP-связыванием явно обладает меньшей силой.
Анализ высвобождения LDH с биспецифической конструкцией Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) с клетками-мишенями человеческой меланомы MDA-MB-435
Очищенный Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) и референсную молекулу (scFv)2 (антиМСSР/антиhuCD3e) анализировали на их способность индуцировать опосредованный Т-клетками апоптоз в опухолевых клетках-мишенях при сшивании конструкции посредством связывания обеих группировок, направленных на соответствующие антигены на клетках.
Вкратце, клетки-мишени человеческой меланомы MDA-MB-435, экспрессирующие huMCSP, собирали с помощью буфера Cell Dissociation Buffer, промывали и ресуспендировали в среде AIM-V (Invitrogen №12055-091). 30000 клеток на лунку высевали в круглодонный 96-луночный планшет и добавляли соответствующее разведение антитела в указанных концентрациях. Все конструкции и контроли доводили до одной и той же молярности.
Эффекторные пан-Т-клетки человека добавляли так, чтобы получить конечное соотношение Е:Т = 5:1. В качестве положительного контроля активации человеческих пан-Т-клеток использовали 5 мкг/мл РНА-М (Sigma № L8902). Для нормализации: максимальный лизис клеток-мишеней (=100%) был достигнут при инкубации клеток-мишеней с конечной концентрацией 1% Triton-X-100. Минимальный лизис (=0%) относится к клеткам-мишеням, совместно инкубированным с эффекторными клетками, но без конструкции или антитела.
2
После ночной инкубации в течение 21 ч при 37°С и 5% СО измеряли высвобождение LDH в супернатант из апоптотических/некротических клеток-мишеней с помощью набора для обнаружения LDH (Roche Applied Science, №11644793001) в соответствии с инструкциями производителя.
Как показано на фиг. 11, Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) индуцирует апоптоз в клетках-мишенях по меньшей мере так же хорошо, как молекула (scFv)2 (антиMCSP/антиhuCD3e).
Анализ высвобождения LDH с биспецифической конструкцией Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) с клетками-мишенями человеческой меланомы MV-3
Очищенный Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) и референсную молекулу (scFv)2 (антиМСSР/антиhuCD3e) анализировали на их способность индуцировать опосредованный Т-клетками апоптоз в опухолевых клетках-мишенях при сшивании конструкции посредством связывания обеих группировок, направленных на соответствующие антигены на клетках.
Вкратце, клетки-мишени человеческой меланомы MV-3, экспрессирующие huMCSP, собирали с помощью трипсина за день до анализа высвобождения LDH. Клетки промывали и ресуспендировали в соответствующей клеточной культуральной среде. 30000 клеток на лунку высевали в круглодонный 96-луночный планшет. На следующий день супернатант удаляли и вносили 100 мкл/лунку среды AIM-V (Invitrogen №12055-091), а также соответствующее разведение антитела в указанных концентрациях. Все конструкции и контроли доводили до одной и той же молярности.
Человеческие эффекторные клетки РВМС добавляли так, чтобы получить конечное соотношение Е:Т = 10:1. В качестве положительного контроля активации человеческих пан-Т-клеток использовали 5 мкг/мл PHA-M (Sigma № L8902). Для нормализации: максимальный лизис клеток-мишеней (=100%) был достигнут при инкубации клеток-мишеней с конечной концентрацией 1% Triton-X-100. Минимальный лизис (=0%) относится к клеткам-мишеням, совместно инкубированным с эффекторными клетками, но без конструкции или антитела.
2
После ночной инкубации в течение 26 ч при 37°С и 5% СО измеряли высвобождение LDH в супернатант из апоптотических/некротических клеток-мишеней с помощью набора для обнаружения LDH (Roche Applied Science, №11644793001) в соответствии с инструкциями производителя.
Как показано на фиг. 12, Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) индуцирует апоптоз в клетках-мишенях по меньшей мере так же хорошо, как молекула (scFv)2 (антиMCSP/антиhuCD3e).
Анализ высвобождения LDH с биспецифической конструкцией Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) с клетками-мишенями человеческой меланомы MV-3
Анализ высвобождения LDH проводили так, как описано выше. На фиг. 19 показана гибель huMCSP-положительных опухолевых клеток MV-3 при совместном культивировании с человеческими РВМС (отношение Е:Т = 10:1), обработанными Fab(MCSP)-Crossfab(CD3), относительно референсной молекулы (scFv)2 (антиМСSР/антиhuCD3e) в течение примерно 24 часов.
Анализ высвобождения LDH с биспецифической конструкцией мышиный Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)
Очищенную конструкцию мышиный Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP), нацеленную на мышиный CD3, а также на человеческий MCSP, анализировали на ее способность индуцировать опосредованный Т-клетками апоптоз в опухолевых клетках-мишеях при сшивании конструкции посредством связывания обеих группировок, направленных на соответствующие антигены на клетках.
Вкратце, опухолевые клетки-мишени B16/F10-huMCSP Fluc 2 клона 48, экспрессирующие huMCSP, собирали с помощью буфера для диссоциации клеток Cell Dissociation Buffer, промывали и ресуспендировали в среде RPMI1640, содержащей 1х NEAA, 10 мМ Hepes, 50 мМ 2-b-ME и 1 мМ пируват натрия.
20000 клеток на лунку высевали в круглодонный 96-луночный планшет и добавляли соответствующее разведение антитела в указанных концентрациях. Биспецифическую конструкцию и различные IgG-контроли доводили до одной и той же молярности. В качестве дополнительного контроля активации мышиных Т-клеток использовали "rat T-Stim with ConA" (BD №54115), разведенный в среде для анализа в соотношении 1:160.
Эффекторные пан-Т-клетки мыши, выделенные из спленоцитов (мыши C57BL/6), добавляли так, чтобы получить конечное соотношение Е:Т = 10:1. Для нормализации: максимальный лизис клеток-мишеней (=100%) был достигнут при инкубации клеток-мишеней с конечной концентрацией 1% Triton-X-100. Минимальный лизис (=0%) относится к клеткам-мишеням, совместно инкубированным с эффекторными клетками, но без конструкции или антитела.
2
После инкубации в течение 70 ч при 37°С и 5% CO измеряли высвобождение LDH в супернатант из апоптотических/некротических клеток-мишеней с помощью набора для обнаружения LDH (Roche Applied Science, №11644793001) в соответствии с инструкциями производителя.
Как показано на фиг. 13, биспецифическая конструкция индуцирует зависимое от концентрации высвобождение LDH из клеток-мишеней, сравнимое с положительным контролем с "Т Cell Stim with ConA".
Анализ высвобождения LDH с биспецифической конструкцией мышиный Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP)
Очищенную конструкцию мышиный Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP), нацеленную на мышиный CD3, а также на человеческий MCSP, анализировали на ее способность индуцировать опосредованный Т-клетками апоптоз в опухолевых клетках-мишеях при сшивании конструкции посредством связывания обеих группировок, направленных на соответствующие антигены на клетках.
Вкратце, опухолевые клетки-мишени B16/F10-huMCSP Fluc 2 клона 48, экспрессирующие huMCSP, собирали с помощью буфера Cell Dissociation Buffer, промывали и ресуспендировали в среде RPMI1640, содержащей 1х NEAA, 10 мМ Hepes, 50 мМ 2-b-ME и 1 мМ пируват натрия.
20000 клеток на лунку высевали в круглодонный 96-луночный планшет и добавляли соответствующее разведение антитела, чтобы получить конечную концентрацию 50 нМ. Биспецифическую конструкцию и различные IgG-контроли доводили до одной и той же молярности.
Эффекторные пан-Т-клетки мыши, выделенные из спленоцитов (мыши C57BL/6), добавляли так, чтобы получить конечное соотношение Е:Т = 10:1. Чтобы оценить уровень гиперактивации мышиных Т-клеток в отсутствие клеток-мишеней, соответственно засевали контрольные лунки с 50 нМ биспецифической конструкции и Т-клетками.
Для нормализации: максимальный лизис клеток-мишеней (=100%) был достигнут при инкубации клеток-мишеней с конечной концентрацией 1% Triton-X-100. Минимальный лизис (=0%) относится к клеткам-мишеням, совместно инкубированным с эффекторными клетками, но без конструкции или антитела.
2
После инкубации в течение 70 ч при 37°С и 5% CO измеряли высвобождение LDH в супернатант из апоптотических/некротических клеток-мишеней с помощью набора для обнаружения LDH (Roche Applied Science, №11644793001) в соответствии с инструкциями производителя.
Как показано на фиг. 14, биспецифическая конструкция индуцирует значительное высвобождение LDH из клеток-мишеней. В отсутствие клеток-мишеней наблюдается только небольшое повышение LDH (отражающее гиперактивацию Т-клеток) по сравнению с необработанными мышиными Т-клетками, совместно инкубированными с клетками-мишенями. Ни один из контрольных IgG не индуцирует высвобождение LDH из клеток-мишеней.
Пример 8: Анализ высвобождения цитокинов (анализ СВА)
Чтобы оценить секрецию de novo различных цитокинов при активации Т-клеток CD3-биспецифическими конструкциями в присутствии или в отсутствие клеток-мишеней, человеческие РВМС выделяли из лейкоцитарных пленок и высевали 0,3 млн клеток на лунку в круглодонный 96-луночный планшет. Альтернативно 280 мкл цельной крови от здорового донора помещали в лунку 96-луночного планшета с глубокими лунками.
2
Опухолевые клетки-мишени (например, клетки MDA-MB-435 для CD3-MCSP-биспецифических конструкций) добавляли так, чтобы получить конечное соотношение Е:Т = 10:1. Биспецифические конструкции и контроли добавляли, как указано. После инкубации в течение периода до 24 ч при 37°С и 5% CO анализируемый планшет центрифугировали в течение 5 мин при 350 g, и супернатант переносили в новый 96-луночный планшет с глубокими лунками для последующего анализа.
Анализ СВА проводили в соответствии с инструкциями производителя для FACS Cantoll, используя комбинацию из следующих наборов СВА Flex Set: человеческий гранзим В (BD 560304), человеческий IFN-γ Flex Set (BD 558269), человеческий TNF Flex Set (BD 558273), человеческий IL-10 Flex Set (BD 558274), человеческий IL-6 Flex Set (BD 558276), человеческий IL-4 Flex Set (BD 558272).
Анализ высвобождения цитокинов с MCSP-CD3-биспецифическими конструкциями
Следующие очищенные биспецифические конструкции, нацеленные на человеческий MCSP и человеческий CD3, анализировали на их способность индуцировать опосредованную Т-клетками секрецию de novo цитокинов в присутствии (А, В) по сравнению с отсутствием (С, D) опухолевых клеток-мишеней: Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) и референсную молекулу (scFv)2 (антиMCSP/антиhuCD3e).
2
Вкратце, 280 мкл цельной крови от здорового донора помещали в лунку 96-луночного планшета с глубокими лунками. 30000 опухолевых клеток-мишеней Colo-38, экспрессирующих человеческий MCSP, а также различные биспецифические конструкции и контроли IgG добавляли до конечной концентрации 1 нМ. Клетки инкубировали в течение 24 ч при 37°С и 5% СО и затем центрифугировали в течение 5 мин при 350 g. Супернатант переносили в новый 96-луночный планшет с глубокими лунками для последующего анализа.
Анализ СВА проводили в соответствии с инструкциями производителя для FACS Cantoll, используя комбинацию из следующих наборов СВА Flex Set: человеческий гранзим В (BD 560304), человеческий IFN-γ Flex Set (BD 558269), человеческий TNF Flex Set (BD 558273), человеческий IL-10 Flex Set (BD 558274), человеческий IL-6 Flex Set (BD 558276), человеческий IL-4 Flex Set (BD 558272)
Фиг. 15 изображает различные уровни цитокинов, которые были измерены в супернатанте цельной крови после обработки 1 нМ различных CD3-MCSP-биспецифических конструкций (Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) и (scFv)2 (антиМСSР/антиhuCD3e)) в присутствии (А, В) или в отсутствие (С, D) опухолевых клеток Colo-38 в течение 24 часов. 280 мкл цельной крови на лунку высевали в 96-луночный планшет и добавляли 30000 клеток Colo-3800, как указано.
Основным цитокином, который секретируется при активации Т-клеток в присутствии опухолевых клеток Colo-38, является IL-6, и затем IFN-γ. Кроме того, также уровни гранзима В сильно повышаются после активации Т-клеток в присутствии клеток-мишеней. В целом, конструкция (scFv)2 (антиМСSР/антиhuCD3e) повышает уровни TNF и IFN-γ, а также гранзима В в присутствии клеток-мишеней (А и В) немного больше по сравнению с другими биспецифическими конструкциями.
Не наблюдалось никакой существенной секреции цитокинов Th2 (IL-10 и IL-4) после активации Т-клеток биспецифическими конструкциями в присутствии (или в отсутствие) клеток-мишеней.
В этом анализе также наблюдалась слабая секреция IFN-γ, индуцированная конструкцией Fab(MCSP)-Fab(MCSP)-Crossfab(CD3) в отсутствие клеток-мишеней.
Анализ высвобождения цитокинов с MCSP-мышиный CD3-биспецифическими конструкциями
+
Очищенную биспецифическую молекулу, нацеленную на huMCSP-muCD3, такую как мышиный Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP), анализировали путем проточной цитометрии на ее способность повышать регуляцию позднего маркера активации CD25 на CD8 T-клетках в присутствии опухолевых клеток, экспрессирующих MCSP человека.
6
6
Вкратце, MCSP-положительные опухолевые клетки B16/F10-huMCSP Fluc 2 клона 48 собирали с помощью буфера Cell Dissociation Buffer, подсчитывали и проверяли на жизнеспособность. Клетки доводили до 0,3×10 (жизнеспособных) клеток на мл в среде RPMI1640 (содержащей 1х NEAA, 10 мМ Hepes, 50 мкм 2-b-МЕ, 1 мМ пирувата натрия), по 100 мкл этой клеточной суспензии вносили пипеткой в каждую лунку в круглодонный 96-луночный планшет (как указано). 50 мкл (разбавленной) биспецифической конструкции добавляли в лунки, содержащие клетки, получая конечную концентрацию 50 нМ. Мышиные Т-эффекторные клетки выделяли из спленоцитов (мыши C57BL/6) и доводили до 3×10 (жизнеспособных) клеток на мл в среды AIM-V. 50 мкл этой клеточной суспензии вносили в лунки аналитического планшета (см. выше), получая конечное соотношение Е:Т = 10:1. Для анализа того, способна ли биспецифическая конструкция активировать Т-клетки только в присутствии клеток-мишеней, экспрессирующих huMCSP, были включены лунки, которые содержали 50 нМ соответствующей биспецифической молекулы, а также Т-эффекторы, но без клеток-мишеней.
2
После инкубации в течение 70 часов при 37°С и 5% CO клетки центрифугировали (5 мин, 350 g) и дважды промывали PBS (150 мкл/лунка), содержащим 0,1% BSA.
Поверхностное окрашивание на CD8a (крысиный IgG2a; клон 53-6.7; BioLegend №100712) и CD25 (крысиный IgG2b; клон 3С7; BD №553075) проводили в соответствии с предложениями поставщиков. Клетки дважды промывали PBS (150 мкл/лунка), содержащим 0,1% BSA, и фиксировали в течение 15 мин при 4°С с помощью буфера для фиксации (BD №554655) (100 мкл/лунка).
После центрифугирования образцы ресуспендировали в PBS (200 мкл/лунка) с 0,1% BSA и анализировали с помощью машины FACS Cantoll (программное обеспечение FACS Diva).
Фиг. 16 показывает, что конструкция мышиный Crossfab(CD3)-Fab(MCSP)-Fab(MCSP) вызывает повышающую регуляцию CD25 только в присутствии клеток-мишеней.
Пример 9: Экспрессия поверхностных маркеров активации на первичных Т-клетках человека при соединении биспецифических конструкций
Чтобы проверить наличие специфической активации Т-клеток при связывании CD3-биспецифических конструкций исключительно в присутствии клеток-мишеней опухоли, первичные человеческие РВМС (выделенные, как описано выше) инкубировали с указанными концентрациями биспецифических конструкций по меньшей мере в течение 24 ч в присутствии или в отсутствие антиген-положительных опухолевых клеток-мишеней.
2
Вкратце, 0,3 млн на лунку первичных человеческих РВМС помещали в плоскодонный 96-луночный планшет, содержащий huMCSP-положительные клетки-мишени (опухолевые клетки MV-3) или среду. Окончательное соотношение эффекторных клеток и клеток-мишеней (Е:Т) составляло 10:1. Клетки инкубировали с указанной концентрацией CD3-MCSP-биспецифических конструкций (Fab(MCSP)-Crossfab(CD3); обозначена как "1+1 без Fc", и референсной молекулой (scFv)2 (антиМСSР/антиhuCD3e) (обозначена как "(scFv)2") в течение указанных периодов инкубации при 37°С и 5% CO. Эффекторные клетки окрашивали на CD8, маркер ранней активации CD69 или маркер поздней активации CD25 и анализировали с помощью FACS Cantoll.
На фиг. 20 показан результат этого эксперимента.
В то время как показаны и описаны предпочтительные в настоящее время воплощения изобретения, нужно четко понимать, что изобретение не ограничивается ими, но может быть по-разному воплощено и применено на практике в объеме прилагаемой формулы изобретения.
Последовательности
В то время как показаны и описаны предпочтительные в настоящее время воплощения изобретения, нужно четко понимать, что изобретение не ограничивается ими, но может быть по-разному воплощено и применено на практике в объеме прилагаемой формулы изобретения.
Легенда: GA201 = связывающий EGFR, 3F2 = связывающий FAP, CH1A1A = связывающий СЕА.
Белковые последовательности
<img file="00000005.tif" he="113" wi="156" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000006.tif" he="234" wi="155" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000007.tif" he="233" wi="154" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000008.tif" he="233" wi="154" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000009.tif" he="236" wi="155" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000010.tif" he="233" wi="156" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000011.tif" he="150" wi="153" img-content="undefined" img-format="tif" />
Последовательности ДНК
<img file="00000012.tif" he="66" wi="156" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000013.tif" he="195" wi="155" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000014.tif" he="236" wi="155" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000015.tif" he="236" wi="156" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000016.tif" he="236" wi="156" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000017.tif" he="236" wi="155" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000018.tif" he="236" wi="154" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000019.tif" he="236" wi="156" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000020.tif" he="236" wi="155" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000021.tif" he="236" wi="155" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000022.tif" he="236" wi="155" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000023.tif" he="232" wi="153" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000024.tif" he="231" wi="153" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000025.tif" he="230" wi="153" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000026.tif" he="232" wi="154" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000027.tif" he="237" wi="155" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000028.tif" he="157" wi="153" img-content="undefined" img-format="tif" />
В то время как показаны и описаны предпочтительные в настоящее время воплощения изобретения, нужно четко понимать, что изобретение не ограничивается ими, но может быть по-разному воплощено и применено на практике в объеме прилагаемой формулы изобретения.