СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ ТРАНСПОРТЕР ЛИЗИНА/АРГИНИНА/ОРНИТИНА
METHOD OF OBTAINING L-AMINO ACID WITH APPLICATION OF BACTERIUM OF ENTEROBACTERIACEAE FAMILY, WITH WEAKENED EXPRESSION OF GENES, CODING LYSINE/ARGININE/ORNITHINE TRANSPORTER

Область техники
Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, модифицированной таким образом, что экспрессия генов, кодирующих траспортер лизина/аргинина/орнитина, в указанной бактерии ослаблена.
Описание предшествующего уровня техники
Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе могут быть получены методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, полученных из природных источников, или их мутантов. Обычно микроорганизмы модифицируют для того, чтобы увеличить продукцию L-аминокислот.
Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, например путем трансформации микроорганизма рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4,278,765). Другие методы основаны на повышении активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот, и/или уменьшении чувствительности целевого фермента к ингибированию по типу обратной связи продуцируемой L-аминокислотой (см., например, патенты США 4,346,170; 5,661,012 и 6,040,160).
Другими методами увеличения продукции L-аминокислот являются ослабление экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в деградацию целевой L-аминокислоты; генов, экспрессия которых ведет к отвлечению предшественников целевой аминокислоты от пути биосинтеза L-аминокислоты; генов, вовлеченных в перераспределение потоков углерода, азота и фосфора; генов, кодирующих токсины, и т.д.
Гены hisJ и argT Salmonella typhimurium кодируют два периплазматических связывающих белка, J и LAO, вовлеченных в транспорт гистидина и аргинина соответственно и взаимодействующих с общим мембраносвязанным компонентом, белком Р. Определена полная нуклеотидная последовательность этих двух генов. Гены в высокой степени гомологичны (70%) и предположительно возникли в результате тандемной дупликации одного гена. Два кодируемых этими генами белка осуществляют различные функции, но сохраняют степень гомологии, достаточную для осуществления взаимодействия с одним сайтом мембраносвязанного белка Р (Higgins C.F., Ames G.F., Proc Natl Acad Sci USA.; 78(10):6038-42(1981)).
Суперсемейство транспортных АТФаз (АВС транспортеров) включает бактериальные периплазматические транспортные системы (пермеазы) и различные транспортеры эукариот. Гистидиновая пермеаза S. typhimurium и Escherichia coli состоит из растворимого рецептора, включающего мембраносвязанный комплекс, содержащий четыре субъединицы, субстратсвязывающий белок, и получает энергию за счет АТФ. Показано, что транспорт гистидина полностью зависит от АТФ и лиганда HisJ, на него влияют рН, температура и концентрация соли. Транспорт необратим, и аккумуляция выходит на плато при прекращении транспорта. Пермеазу ингибируют АДФ и высокие концентрации гистидина внутри клетки. Ингибирование гистидином, вероятно, свидетельствует о том, что мембраносвязанный комплекс HisQ/M/P включает субстратсвязывающий сайт. Активность реконструированной пермеазы соответствует уровню 40-70% скорости транспорта in vivo (Liu C.E., Ames G.F., J Biol Chem.; 272(2):859-66(1997)).
Мембраносвязанный комплекс периплазматической гистидиновой пермеазы Salmonella typhimurium состоит из двух интегральных мембранных белков, HisQ и HisM, и двух копий АТФ-связывающей субъединицы, HisP. Комплекс гидролизует АТФ при индукции активности растворимого рецептора и периплазматического гистидин-связывающего белка, HisJ. Показано, что нуклеотид-связывающий компонент может быть отделен от интегральных мембранных компонентов, HisQ и HisM. Комплекс может быть реконструирован с использованием мембран с удаленным HisP, содержащих HisQ и HisM, и чистого растворимого HisP. Было показано, что HisP имеет высокую аффинность к комплексу с удаленным HisP, HisQM, и две молекулы HisP присоединяются независимо друг от друга к каждой единице HisQM. Собранный in vitro комплекс имеет полностью нормальные свойства и реагирует на ингибиторы HisJ и АТФазы так же, как и оригинальный комплекс, в противоположность растворимому HisP. Эти результаты показывают абсолютную необходимость HisP для гидролиза АТФ, HisQM гидролизовать АТФ не может, HisP зависит HisQM, с тем чтобы передать сигнал с растворимого рецептора HisJ, и HisQM регулирует АТФазную активность HisP. Также было показано, что конформация HisP меняется при взаимодействии с фосфолипидами (Liu P.Q., Ames G.F., Proc Natl Acad Sci USА.; 95(7):3495-500(1998)).
Белок ArgT E.coli может быть в форме цитоплазматического белка-предшественника с молекулярной массой 28 кДa и в форме зрелого периплазматического белка с молекулярной массой 25.8 кДа. Для изучения роли протеолиза в регуляции адаптации в стационарной фазе роста мутанты по протеазам clpA, clpX и clpP Escherichia coli исследовали с использованием протеомного анализа в процессе роста и голодания по углероду. В мутантах clpA, clpX и clpP периплазматический лизин-аргинин-орнитин-связывающий белок ArgT не показывал индукцию, типичную для клеток дикого типа в поздней стационарной фазе роста (Weichart D. et al., Journal of Bacteriology, vol.185, No.1, p.115-125 (2003)).
В настоящее время нет сообщений, описывающих использование ослабления экспрессии генов, кодирующих траспортер лизина/аргинина/орнитина, для получения L-аминокислот.
Описание изобретения
Целями настоящего изобретения являются повышение продуктивности штаммов-продуцентов L-аминокислот и предоставление способа получения L-аминокислот с использованием этих штаммов.
Обнаружено, что ослабление экспрессии кластера argT-hisJQMP может приводить к увеличению продукции диаминомонокарбоновых килот, таких как L-лизин, L-аргинин, L-орнитин и L-цитруллин.
Настоящее изобретение предоставляет бактерию, принадлежащую к семейству Enterobacteriaceae, обладающую повышенной способностью к продукции аминокислот, таких как L-лизин, L-аргинин, L-орнитин и L-цитруллин.
Целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, принадлежащей к семейству Enterobacteriaceae, - продуцента L-аминокислоты, модифицированной таким образом, что экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих траспортер лизина/аргинина/орнитина, в указанной бактерии ослаблена.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, отличающейся тем, что кластер argT-hisJQMP включает гены, кодирующие траспортер лизина/аргинина/орнитина.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, отличающейся тем, что указанный кластер argT-hisJQMP инактивирован.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, отличающейся тем, что один или более генов указанного кластера argT-hisJQMP инактивирован/аны.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, отличающейся тем, что указанная бактерия принадлежит к роду Escherichia.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, отличающейся тем, что указанная бактерия принадлежит к роду Pantoea.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, отличающейся тем, что указанная L-аминокислота является диаминомонокарбоновой кислотой.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, отличающейся тем, что указанная диаминомонокарбоновая кислота выбрана из группы, состоящей из L-лизина, L-аргинина, орнитина и цитруллина.
Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения L-аминокислоты, включающего:
- выращивание описанной выше бактерии в питательной среде, вызывающее продукцию и секрецию указанной L-аминокислоты в культуральную жидкость;
и
- выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что указанная L-аминокислота является диаминомонокарбоновой кислотой.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что указанная диаминомонокарбоновая кислота выбрана из группы, состоящей из L-лизина, L-аргинина, орнитина и цитруллина.
Более детально настоящее изобретение описано ниже.
Наилучший способ осуществления изобретения
1. Бактерия согласно настоящему изобретению
Бактерия согласно настоящему изобретению - это бактерия-продуцент L-аминокислоты, принадлежащая к семейству Enterobacteriaceae, способная к продукции L-аминокислоты, такой как диаминомонокарбоновая кислота, отличающаяся тем, что траспортер лизина/аргинина/орнитина в указанной бактерии инактивирован.
Фраза «бактерия-продуцент L-аминокислоты» может означать бактерию, обладающую способностью к продукции и секреции L-аминокислоты в питательную среду, когда бактерия выращивается в указанной питательной среде.
Термин «бактерия-продуцент L-аминокислоты» также может означать бактерию, которая способна к продукции и накоплению L-аминокислоты, такой как диаминомонокарбоновая кислота, в ферментационной среде в больших количествах по сравнению с природным или родительским штаммом Е. coli, таким как штамм Е. coli K-12, и также может означать, что бактерия способна накапливать в среде целевую L-аминокислоту в количестве не менее чем 0.5 г/л или не менее чем 1.0 г/л в другом примере.
Термин «диаминомонокарбоновая кислота» может включать L-лизин, L-аргинин, L-орнитин и L-цитруллин. Данные аминокислоты имеют положительный заряд благодаря присутствию аминогруппы.
Семейство Enterobacteriaceae включает в себя бактерии, принадлежащие к родам Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia и т.д. Более конкретно, могут быть использованы бактерии, классифицируемые как принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae в соответствии с таксономией, используемой в базе данных NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=l&srchmode=l&unlock). Предпочтительна бактерия, принадлежащая к роду Escherichia или Pantoea.
Термин "бактерия, принадлежащая к роду Escherichia" означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е. coli).
Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть включены в число бактерий согласно настоящему изобретению.
Термин «бактерия, принадлежащая к роду Pantoea» означает, что бактерия относится к роду Pantoea в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. Недавно несколько видов Enterobacter agglomerans были классифицированы как Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii или подобные им, на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК и т.д. (Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)).
Термин «бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия кластера argT-hisJQMP ослаблена» означает, что указанная бактерия модифицирована таким образом, что в результате модификации такая бактерия содержит пониженное количество белков ArgT, HisJ, HisQ, HisM и HisP по сравнению с немодифицированной бактерией, или это также может означать, что модифицированная бактерия не способна синтезировать ArgT, HisJ, HisQ, HisM и HisP.
Фраза «инактивация кластера argT-hisJQMP» означает, что модифицированный ген кодирует полностью неактивный белок. Возможно также, что естественная экспрессия модифицированного участка ДНК невозможна из-за делеции части гена, сдвига рамки считывания, введения миссенс/нонсенс мутации(-ий) или модификации примыкающих к гену областей, которые включают последовательности, контролирующие экспрессию гена, такие как промоторы, энхансеры, аттенуаторы и т.д.
Наличие или отсутствие кластера argT-hisJQMP на хромосоме может быть определено хорошо известными методами, включая ПЦР, блоттинг по Саузерну и т.п. Кроме того, уровень экспрессии гена можно оценить определением количества транскрибируемой с гена РНК с использованием различных известных методов, включая блоттинг по Нозерну, количественную ОТ-ПЦР и т.п. Количество и молекулярную массу белков, кодируемых генами, можно определить известными методами, включая электрофорез в SDS-ПААГ с последующим иммуноблоттингом (Вестерн-блоттинг) и т.д.
Ген artT (синонимы: ЕСK2304, b2310) кодирует белок ArtT - субъединицу АВС траспортера лизина/аргинина/орнитина (синоним В2310). Ген artT (нуклеотиды, комплементарные нжуклеотидам с 2,425,031 по 2,425,813 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 16130244) расположен между геном hisJ и геном ubiX, ориентированными в одинаковом с геном artT направлении, на хромосоме штамма Е. coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена artT и аминокислотная последовательность белка ArtT, кодируемого геном artT, приведены в Перечне последовательностей под номерами 1 (SEQ ID NO: 1) и 2 (SEQ ID NO: 2) соответственно.
Ген hisJ (синонимы: ЕСK2303, b2209) кодирует белок HisJ - субъединицу АВС траспортера гистидина (синоним B2309). Ген hisJ (нуклеотиды, комплементарные нжуклеотидам с 2,424,028 по 2,424,810 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 16130244) расположен между геном argT и геном hisQ, ориентированными в одинаковом с геном hisJ направлении, на хромосоме штамма Е. coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена hisJ и аминокислотная последовательность белка HisJ, кодируемого геном hisJ, приведены в Перечне последовательностей под номерами 3 (SEQ ID NO: 3) и 4 (SEQ ID NO: 4) соответственно.
Ген hisQ (синонимы: ЕСK2302, b2208) кодирует белок HisQ - субъединицу АВС траспортера лизина/ аргинина/ орнитина (синоним В2308). Ген hisQ (нуклеотиды, комплементарные нжуклеотидам с 2,423,252 по 2,423,938 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 16130243) расположен между геном hisJ и геном hisM, ориентированными в одинаковом с геном hisQ направлении, на хромосоме штамма Е. coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена hisQ и аминокислотная последовательность белка HisQ, кодируемого геном hisQ, приведены в Перечне последовательностей под номерами 5 (SEQ ID NO: 5) и 6 (SEQ ID NO: 6) соответственно.
Ген hisM (синонимы: HisM) кодирует белок HisM - субъединицу АВС траспортера лизина/ аргинина/ орнитина (синоним В2307). Ген hisM (нуклеотиды, комплементарные нжуклеотидам с 2,422,539 по 2,423,255 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 16130242) расположен между геном hisQ и геном hisP, ориентированными в одинаковом с геном hisM направлении, на хромосоме штамма Е. coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена hisM и аминокислотная последовательность белка HisM, кодируемого геном hisM, приведены в Перечне последовательностей под номерами 7 (SEQ ID NO: 7) и 8 (SEQ ID NO: 8) соответственно.
Ген hisP (синонимы: ЕСK2300, b2306) кодирует белок HisP - субъединицу АВС траспортера лизина/ аргинина/ орнитина (синоним В2308). Ген hisP (нуклеотиды, комплементарные нжуклеотидам с 2,421,758 по 2,422,531 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 16130241) расположен между геном hisM и открытой рамкой считывания yfcI, ориентированными в одинаковом с геном hisP направлении, на хромосоме штамма Е. coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена hisP и аминокислотная последовательность белка HisP, кодируемого геном hisP, приведены в Перечне последовательностей под номерами 9 (SEQ ID NO: 9) и 10 (SEQ ID NO: 10) соответственно.
Поскольку у представителей различных родов и штаммов семейства Enterobacteriaceae возможны некоторые вариации в нуклеотидных последовательностях, понятие кластера argT-hisJQMP не ограничивается генами, последовательности которых приведены в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 9, но также может включать и гены, гомологичные SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 9, кодирующие варианты белков ArgT, HisJ, HisQ, HisM и HisP. Термин "вариант белка" может означать белок с изменениями в последовательности, будь то делеции, вставки, добавления или замены аминокислот, в котором сохраняется функциональная активность белка. Число изменений в варианте белка зависит от положения или типа аминокислотного остатка в третичной структуре белка. Оно может быть от 1 до 30, или в другом примере от 1 до 15, или в другом примере от 1 до 5 в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 10. Данные изменения в вариантах могут иметь место в областях, не критичных для функции белка. Данные изменения возможны потому, что некоторые аминокислоты имеют высокую гомологию друг другу, поэтому такие изменения не влияют на третичную структуру или активность. Следовательно, вариант белка, кодируемого геном кластера argT-hisJQMP, может быть представлен белками с гомологией не менее 80%, или в другом примере не менее 90%, или в другом примере не менее 95%, по отношению к полной аминокислотной последовательности, приведенной в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 10, при условии сохранения функциональности белка.
Гомология между двумя аминокислотыми последовательностями может быть определена с использованием известных методов, например компьютерной программы BLAST 2.0, которая считает три параметра: число аминокислот, идентичность и сходство.
+
Кроме того, гены кластера argT-hisJQMP могут быть вариантами, если они гибридизуются в жестких условиях с нуклеотидными последовательностями, комплементарными нуклеотидным последовательностям, приведенным в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 9, или с зондом, который может быть синтезирован на основе указанной нуклеотидной последовательности, при условии, что он кодирует функциональный белок. «Жесткие условия» включают такие условия, при которых специфические гибриды, например гибриды с гомологией не менее 60%, или в другом примере не менее 70%, или в другом примере не менее 80%, или в другом примере не менее 90%, или в другом примере не менее 95%, образуются, а неспецифические гибриды, например гибриды с меньшей гомологией, чем указано выше, не образуются. Практическим примером жестких условий является однократная отмывка, предпочтительно двух- или трехкратная, при концентрации солей 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS, при 60°С. Продолжительность отмывки зависит от типа используемой для блоттинга мембраны и, как правило, такова, как рекомендовано производителем. Например, рекомендуемая продолжительность отмывки для нейлоновой мембраны Hybond™ N (Amersham) в жестких условиях - 15 минут. Предпочтительна двух-трехкратная отмывка. Длина зонда может быть выбрана в зависимости от условий гибридизации и обычно составляет около 100-1000 п.н.
Экспрессия кластера argT-hisJQMP может быть ослаблена введением в ген такой мутации, что внутриклеточная активность кодируемого геном белка снижается по сравнению с немодифицированным штаммом. Мутации, результатом которых является ослабление экспрессии гена, включают замену одного или более оснований для аминокислотной замены в кодируемом геном белке («миссенс»-мутация), введение стоп-кодона («нонсенс»-мутация), делецию одного или более оснований для сдвига рамки считывания, вставку гена устойчивости к антибиотику или делецию гена или его части (Qiu, Z. and Goodman, M.F., J. Biol. Chem., 272, 8611-8617 (1997); Kwon, D.H. et al., J. Antimicrob. Chemother., 46, 793-796 (2000)). Экспрессия гена artI также может быть ослаблена модификацией экспрессии регуляторных последовательностей, таких как промотор, последовательность Shine-Dalgarno (SD) и т.д. (заявка РСТ WO 95/34672; Carrier, T.A. and Keasling, J.D., Biotechnol Prog 15, 58-64 (1999)).
Например, для введения мутаций путем генной рекомбинации могут применяться следующие методы. Конструируется мутантный ген, кодирующий мутантный белок со сниженной активностью, и бактерия для ее модификации трансформируется фрагментом ДНК, содержащим мутантный ген. Затем нативный ген на хромосоме замещается путем гомологичной рекомбинации мутантным геном, отбирается полученный штамм. Замещение гена с использованием гомологичной рекомбинации может быть проведено методом с использованием линейной ДНК, известным как "Red-зависимая интеграция" или "интеграция посредством Red-системы" (Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 97, 12, 6640-6645 (2000)), или методом с использованием плазмиды, репликация которой чувствительна к температуре (патент США 6,303,383 или патентная заявка Японии JP 05-007491 А). Кроме того, введение сайт-специфической мутации путем замещения гена с использованием вышеупомянутой гомологичной рекомбинации может также быть осуществлено с использованием плазмиды с пониженной способностью к репликации в клетке хозяина.
Экспрессия гена также может быть ослаблена вставкой транспозона или IS фактора в кодирующую область гена (патент США 5,175,107) или традиционными методами, такими как мутагенез с использованием УФ-излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N′-нитро-N-нитрозогуанидин).
Инактивация гена также может быть осуществлена такими традиционными методами, как мутагенез с использованием УФ-излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N′-нитро-N-нитрозогуанидин), сайт-специфический мутагенез, разрушение гена с использованием гомологичной рекомбинации или/и мутагенеза за счет вставки-делеции (Yu, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:5978-83, и Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45), также называемого "Red-зависимая интеграция".
Методы приготовления плазмидной ДНК, рестрикции и лигирования ДНК, трансформации, выбора нуклеотидов в качестве праймера и т.п. могут быть обычными методами, известными специалисту в этой области. Эти методы описаны, например, в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
Бактерия-продуцент L-аминокислоты
В способе в соответствии с настоящим описанием изобретения может быть использована бактерия, модифицированная таким образом, что экспрессия гена/ов кластера argT-hisJQMP в указанной бактерии ослаблена, и способная к продукции L-аминокислоты, такой как диаминомонокарбоксиловая кислота.
Указанная бактерия может быть получена путем ослабления экспрессия гена/ов кластера argT-hisJQMP в бактерии, уже обладающей способностью к продукции L-аминокислоты, такой как диаминомонокарбоксиловая кислота. С другой стороны, указанная бактерия может быть получена путем придания способности к продукции L-аминокислоты, такой как диаминомонокарбоксиловая кислота, бактерии, в которой экспрессия гена/ов кластера argT-hisJQMP уже ослаблена.
Бактерия-продуцент L-лизина
Примеры бактерий-продуцентов L-лизина, принадлежащих к роду Escherichia, включают мутанты, обладающие устойчивостью к аналогу L-лизина. Аналог L-лизина ингибирует рост бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, но это ингибирование полностью или частично снимается, когда в среде также присутствует L-лизин. Примеры аналога L-лизина включают, но не ограничиваются оксализином, лизингидроксаматом, S-(2-аминоэтил)-L-цистеином (АЕС), γ-метиллизином, α-хлорокапролактамом и так далее. Мутанты, обладающие устойчивостью к указанным аналогам лизина, могут быть получены путем обработки бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, традиционными мутагенами. Конкретные примеры бактериальных штаммов, используемых для получения L-лизина, включают штамм Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL В-12185; см. патент США 4346170) и штамм Escherichia coli VL611. В этих микроорганизмах аспартокиназа устойчива к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи.
Штамм WC196 может быть использован в качестве бактерии-продуцента L-лизина Escherichia coli. Данный бактериальный штамм был получен путем селекции фенотипа устойчивости к АЕС у штамма W3110, производного от штамма Escherichia coli K-12. Полученный штамм был назван Escherichia coli AJ13069 и был депонирован в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агенство Промышленной Науки и Технологии, Министерство Международной Торговли и Промышленности (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry), в настоящее время называющемся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan), 6 декабря 1994 года и получил инвентарный номер FERM Р-14690. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора 29 сентября 1995 года, и штамм получил инвентарный номер FERM BP-5252 (патент США 5827698).
Примеры родительских штаммов для получения бактерий, продуцирующих L-лизин, согласно настоящему изобретению, также включают штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-лизина. Примеры ферментов, вовлеченных в биосинтез L-лизина, включают, но не ограничиваются ими, дигидродипиколинатсинтазу (dapA), аспартокиназу (lysC), дигидродипиколинатредуктазу (dapB), диаминопимелатдекарбоксилазу (lysA), диаминопимелатдегидрогеназу (ddh) (патент США. 6,040,160), фосфоенолпируваткарбоксилазу (ррс), аспартатсемиальдегиддегидрогеназу (asd), никотинамидадениндинуклеотидтрансгидрогеназу (pntAB) и аспартазу (aspA) (европейская заявка ЕР 1253195 А). Кроме того, родительские штаммы могут иметь повышенный уровень экспрессии гена, вовлеченного в процесс дыхания (суо) (европейская заявка ЕР 1170376 А), гена, кодирующего никотинамиднуклеотидтрансгидрогеназу (pntAB) (патент США 5,830,716), гена ybjE (заявка РСТ WO 2005/073390) или комбинации этих генов.
Примеры родительских штаммов для получения бактерий, продуцирующих L-лизин, согласно настоящему изобретению, также включают штаммы, в которых снижена или отсутствует активность ферментов, которые катализируют реакции образования отличных от L-лизина соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-лизина. Примеры ферментов, которые катализируют реакции образования отличных от L-лизина соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-лизина, включают гомосериндегидрогеназу, лизиндекарбоксилазу (патент США 5,827,698) и малатдегидрогеназу (заявка РСТ WO 2005/010175).
Бактерия-продуцент L-аргинина
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-аргинина, согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е. coli 237 (ВКПМ В-7925) (патентная заявка США 2002/058315 А1) и его производные, содержащие мутантную N-ацетилглутаматсинтазу (патентная заявка РФ 2001112869), штамм Е. coli 382 (ВКПМ В-7926) (Европейская патентная заявка ЕР 1170358 А1 ), штамм-продуцент аргинина, в который введен ген argA, кодирующий N-ацетилглутаматсинтетазу (Европейская патентная заявка ЕР 1170361 А1), и подобные им.
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-аргинина, согласно настоящему изобретению, также включают в себя штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-аргинина. Примеры ферментов биосинтеза L-аргинина включают N-ацетилглутамилфосфатредуктазу (argC), орнитинацетилтрансферазу (argJ), N-ацетилглутаматкиназу (argB), ацетилорнитинтрансаминазу (argD), орнитинкарбамоилтрансферазу (argF), синтетазу аргининсукциниловой кислоты (argG), лиазу аргининсукциниловой кислоты (argH) и карбамоилфосфатсинтетазу(carAB).
Бактерия-продуцент L-цитруллина
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента цитруллина, согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются ими, штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как мутантные по N-ацетилглутаматсинтазе штаммы Е. coli 237/pMADS11, 237/pMADS12 и 237/pMADS13 (RU 2215783, EP 1170361 B1, US 6790647 B2).
Также бактерию-продуцент цитруллина можно легко получить из любой бактерии-продуцента аргинина, например из штамма Е. coli 382 (ВКПМ В-7926), путем инактивации аргининсукцинатсинтазы, кодируемой геном argG.
Фраза "инактивация аргининсукцинатсинтазы" означает, что бактерия модифицирована таким образом, что модифицированная бактерия содержит неактивную аргининсукцинатсинтазу, или также она может означать, что бактерия не способна синтезировать аргининсукцинатсинтазу. Инактивация аргининсукцинатсинтазы может быть осуществлена путем инактивации гена argG.
Фраза "инактивация гена argG" означает, что модифицированный ген кодирует полностью нефункциональный белок. Также возможно, что область модифицированной ДНК не способна к естественной экспрессии гена из-за делеции части гена или всего гена, сдвига рамки считывания гена, введения миссенс/нонсенс мутации(ий) или модификации прилегающих к гену областей, включая последовательности, контролирующие экспрессию гена, такие как промотор, энхансер, аттенюатор, сайт связывания рибосомы и т.д.
Наличие или отсутствие гена argG на хромосоме бактерии может быть определено хорошо известными методами, включая ПЦР, блоттинг по Саузерну и т.п. Кроме того, уровень экспрессии гена можно оценить определением количества транскрибируемой с гена РНК с использованием различных известных методов, включая блоттинг по Нозерну, количественную ОТ-ПЦР и т.п. Количество белка, кодируемого геном argG, можно определить известными методами, включая электрофорез в SDS-ПААГ с последующим иммуноблоттингом (Вестерн-блоттинг), и т.д.
Экспрессия гена argG может быть ослаблена введением в ген на хромосоме такой мутации, что внутриклеточная активность кодируемого геном белка уменьшена по сравнению с таковой в немодифицированном штамме. Такой мутацией гена может быть замена одного или более оснований для аминокислотной замены в кодируемом геном белке («миссенс»-мутация), введение стоп-кодона («нонсенс»-мутация), делеция одного или более оснований для сдвига рамки считывания, вставка гена устойчивости к антибиотику или делеция гена или его части (Qiu, Z. and Goodman, M.F., J. Biol. Chem., 272, 8611-8617 (1997); Kwon, D.H. et al., J. Antimicrob. Chemother., 46, 793-796 (2000)). Экспрессия гена argG также может быть ослаблена путем модификации экспрессии регуляторных последовательностей, таких как промотор, последовательность Shine-Dalgamo (SD) и т.д. (заявка РСТ WO 95/34672; Carrier, T.A. and Keasling, J.D., Biotechnol Prog 15, 58-64 (1999)).
Например, следующие методы могут применяться для введения мутаций путем генной рекомбинации. Конструируется мутантный ген, кодирующий мутантный белок со сниженной активностью, и бактерия для ее модификации трансформируется фрагментом ДНК, содержащим мутантный ген. Затем нативный ген на хромосоме замещается гомологичной рекомбинацией мутантным геном, отбирается полученный штамм. Такое замещение гена с использованием гомологичной рекомбинации может быть проведено методом с использованием линейной ДНК, известным как "Red-зависимая интеграция" или "интеграция посредством Red-системы" (Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 97, 12, 6640-6645 (2000), заявка РСТ WO 2005/010175), или методом с использованием плазмиды, репликация которой чувствительна к температуре (патент США 6,303,383 или патентная заявка Японии JP 05-007491 А). Далее, введение сайт-специфической мутации путем замещения гена с использованием вышеупомянутой гомологичной рекомбинации может также быть осуществлено с использованием плазмиды с пониженной способностью к репликации в клетке хозяина.
Экспрессия гена также может быть ослаблена вставкой транспозона или IS фактора в кодирующую область гена (патент США 5,175,107) или традиционными методами, такими как мутагенез с использованием УФ излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N′-нитро-N-нитрозогуанидин).
Бактерия-продуцент L-орнитина
Бактерия-продуцент орнитина может быть легко получена из любой бактерии-продуцента аргинина, например штамма Е. coli 382 (ВКПМ В-7926), путем инактивации орнитинкарбамоилтрансферазы, кодируемой генами argF и argI. Методы для инактивации орнитинкарбамоилтрансферазы описаны выше.
2. Способ согласно настоящему изобретению
Способом согласно настоящему изобретению является способ получения L-аминокислоты, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-аминокислоты в питательной среде и выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости.
Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка L-аминокислоты из культуральной или подобной ей жидкости могут быть осуществлены способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием бактерии.
Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. В качестве источника углерода используют этанол. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин, дрожжевой экстракт и т.п.
Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание культуральной жидкости на качалке, взбалтывание с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30 до 38°С. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно, выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.
После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем L-аминокислота может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и/или кристаллизации.
Примеры
Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение примеры.
Пример 1. Конструирование штамма с инактивированным кластером argT-hisJQMP
1. Деления кластера argT-hisJQMP
R
Штамм, содержащий делецию кластера argT-hisJQMP, был сконструирован с использованием методики, разработанной Datsenko, K.А. и Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645), известной как "Red-зависимая интеграция". Фрагмент ДНК, содержащий маркер Cm, кодируемый геном cat, был получен в ПЦР с использованием праймеров PI (SEQ ID NO: 11) и Р2 (SEQ ID NO: 12) и плазмиды pMW118-attL-Cm-attR (WO 05/010175) в качестве матрицы. Праймер Р1 содержит область, комплементарную области, локализованной на 5′ конце гена argT, и область, комплементарную области attR. Праймер Р2 содержит область, комплементарную области, локализованной на 3′ конце гена hisP, и область, комплементарную области attL. Использовали следующий температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 3 мин; два первых цикла: 1 мин при 95°С, 30 сек при 50°С, 40 сек при 72°С; последующие 25 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 54°С, 40 сек при 72°С; и заключительная полимеризация: 5 мин при 72°С.
araB
Полученный ПЦР-продукт длиной 1699 п.н. очищали в агарозном геле и использовали для электропорации в штамм Е. coli MG1655 (АТСС 700926), содержащий плазмиду pKD46 с термочувствительным репликоном. Плазмида pKD46 (Datsenko, K.А. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645) содержит ДНК-фрагмент фага λ длиной 2154 п.н. (позиции с 31088 по 33241 нуклеотидной последовательности с инвентарным номером J02459 в базе данных GenBank), а также содержит гены λ Red-гомологичной системы рекомбинации (гены γ, β, ехо) под контролем промотора P, индуцируемого арабинозой. Плазмида pKD46 необходима для интеграции продукта ПЦР в хромосому штамма MG1655.
600
2
R
Электрокомпетентные клетки были получены следующим образом: ночную культуру штамма Е. coli MG1655 выращивали при 30°С в среде LB с добавкой ампициллина (100 мг/л), разводили в 100 раз, добавив 5 мл среды SOB (Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), содержащей ампициллин и L-арабинозу (1 мМ). Полученную культуру растили с перемешиванием при 30°С до достижения OD≈0.6, после чего делали клетки электрокомпетентными путем концентрирования в 100 раз и трехкратного отмывания ледяной деионизированной НO. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл клеток и ≈100 нг ПЦР-продукта. После электропорации клетки инкубировали в 1 мл среды SOC (Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) при 37°C в течение 2.5 часов, после чего высевали на чашки с L-агаром, содержащим 30 мкг/мл хлорамфеникола, и выращивали при 37°C для отбора Cm-рекомбинантов. Затем для удаления плазмиды pKD46 проводили 2 пассажа на L-агаре с Cm при 42°C и полученные колонии проверяли на чувствительность к ампициллину.
2. Подтверждение делеции кластера argT-hisJQMP с помощью ПЦР
Мутанты с делегированным геном chaC, содержащие ген устойчивости Cm, были проверены с помощью ПЦР. Локус-специфичные праймеры Р3 (SEQ ID NO: 13) и Р4 (SEQ ID NO: 14) были использованы для проверки делеции с помощью ПЦР. Использовался следующий температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 94°C в течение 3 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 94°C, 30 сек при 54°C, 1 мин при 72°C; заключительный шаг: 7 мин при 72°C. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток мутантного штамма, составляет 1650 п.н. Мутантный штамм был назван MG1655 ΔargT-hisJQMP::cat.
Пример 2. Продукция L-аргинина штаммом Е. coli 382ΔargT-hisP
ый
Для оценки влияния инактивации кластера argT-hisJQMP на продукцию L-аргинина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е. coli MG1655 ΔargT-hisP::cat были перенесены в штамм-продуцент L-аргинина Е. coli 382 с помощью Р1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) для получения штамма 382-ΔargT-hisP. Штамм 382 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1 Дорожный проезд, 1) 10 апреля 2000 года с инвентарным номером ВКПМ В-7926, затем 18 мая 2001 г. было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора.
Оба штамма, 382 и 382-ΔargT-hisP, выращивали с перемешиванием при 37°C в течение 18 часов в 3 мл питательного бульона, по 0.3 мл полученных культур вносили в 3 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм и культуры выращивали при 32°C в течение 48 часов на роторной качалке.
2
После выращивания количество накопленного в среде L-аргинина определяли с помощью бумажной хроматографии, при этом использовали следующий состав подвижной фазы: бутанол:уксусная кислота:вода=4:1:1 (v/v). Раствор нингидрина (2%) в ацетоне использовали для визуализации. Пятно, содержащее L-аргинин, вырезали; L-аргинин элюировали 0.5% водным раствором CdCl, после чего количество L-аргинина определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм. Результаты десяти независимых пробирочных ферментаций представлены в таблице 1. Как следует из таблицы 1, штамм 382ΔargT-hisP накапливал большее количество L-аргинина, чем штамм 382.
Была использована ферментационная среда следующего состава (г/л):
Глюкоза
48.0
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
35.0
KН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>
2.0
MgSO<sub>4</sub>7H<sub>2</sub>O
1.0
ТиаминНСl
0.0002
Дрожжевой экстракт
1.0
L-изолейцин
0.1
СаСО<sub>3</sub>
5.0
3
Глюкозу и сульфат магния стерилизовали раздельно. СаСО стерилизовали сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводили до 7.0.
Пример 3. Продукция L-лизина штаммом Е. coli AJ11442-ΔargT-hisJQMP
Для оценки влияния инактивации кластера argT-hisJQMP на продукцию лизина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е. coli MG1655 ΔargT-hisP::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-лизина Е. coli АJ1442 с помощью Р1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) с целью получения штамма AJ 11442-382-ΔargT-hisP. В составе плазмиды pCABD2 имеются ген dapA, кодирующий дигидродипиколинатсинтазу с мутацией, снимающей ингибирование L-лизином по типу обратной связи, ген lysC, кодирующий аспартокиназу III с мутацией, снимающей ингибирование L-лизином по типу обратной связи, ген dapB, кодирующий дигидродипиколинатредуктазу, и ген ddh, кодирующий диаминопимелатдегидрогеназу (US Patent 6,040,160).
Оба штамма Е. coli, AJ1442 и AJ11442-382-ΔargT-hisP, могут быть выращены в L-среде, содержащей 20 мг/л стрептомицина, при 37°С; и 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 20 мл ферментационной среды, содержащей необходимые антибиотики, в колбы объемом 500 мл. Культивирование может проводиться при 37°С в течение 16 часов с использованием возвратно-поступательной качалки со скоростью перемешивания 115 об/мин. После выращивания количество L-лизина и остаточной глюкозы в среде может быть измерено известным способом (Biotech-analyzer AS210, производитель Sakura Seiki Co.). Затем, для каждого из штаммов может быть рассчитан выход L-лизина в пересчете на потребленную глюкозу.
Может быть использована ферментационная среда следующего состава (г/л):
Глюкоза
40
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
24
K<sub>2</sub>НРO<sub>4</sub>
1.0
MgSO<sub>4</sub>·7Н<sub>2</sub>О
1.0
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
0.01
MnSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O
0.01
Дрожжевой экстракт
2.0
4
2
3
рН доводят до 7.0 с помощью KОН и среду автоклавируют при 115°С в течение 10 мин. Глюкозу и MgSO 7HO стерилизуют отдельно. Также добавляют СаСО до концентрации 30 г/л, предварительно простерилизованного сухим жаром при 180°С в течение 2 часов.
+
Пример 4. Продукция цитруллина штаммом Е. coli 382 ilvA ΔargG ΔargT-hisP
+
+
+
+
+
Для оценки влияния инактивации кластера argT-hisJQMP на продукцию цитруллина был сконструирован штамм-продуцент цитруллина 382 ilvA ΔargG. Для этого из штамма-продуцента аргинина 382 (ВКПМ В-7926) был получен штамм 382 ilvA методом P1-трансдукции гена ilvA из дикого штамма Е. coli K12. Были отобраны клоны 382 ilvA, хорошо растущие на чашках с минимальным агаром. Затем был получен штамм-продуцент цитруллина 382 ilvA ΔargG путем удаления гена argG на хромосоме штамма 382 ilvA с использованием метода, предложенного Datsenko, K.A. и Warmer, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645), называемого "Red-зависимая интеграция".
R
Фрагмент ДНК, содержащий маркер устойчивости к хлорамфениколу (Cm), кодируемый геном cat, был получен с помощью ПЦР с использованием праймеров Р5 (SEQ ID NO: 15) и Р6 (SEQ ID NO: 16) и плазмиды pMW118-attL-Cm-attR (WO 05/010175) в качестве матрицы. Праймер Р5 содержит область, комплементарную области, локализованной на 5′ конце гена argG, и область, комплементарную области attR. Праймер Р6 содержит область, комплементарную области, локализованной на 3′ конце гена argG, и область, комплементарную области attL. Использовали следующий температурный профиль для ПЦР: денатурация в течение 3 мин при 95°С; два первых цикла: 1 мин при 95°С, 30 сек при 50°С, 40 сек при 72°С; последующие 25 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 54°С, 40 сек при 72°С; и заключительная полимеризация: 5 мин при 72°С.
+
Полученный ПЦР-продукт длиной 1,85 т.п.н. очищали в агарозном геле и использовали для электропорации в штамм Е. coli 382 ilvA, который был предварительно трансформирован плазмидой pKD46, необходимой для интеграции ПЦР-продукта в бактериальную хромосому. Электрокомпетентные клетки были получены, как описано в Примере 1. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл клеток и ≈100 нг ПЦР-продукта. После электропорации клетки инкубировали и плазмиду pKD46 удаляли, как описано в Примере 1.
+
Мутанты, не содержащие ген argG и маркированные геном устойчивости к хлорамфениколу, проверяли с помощью ПЦР. Для проверки использовали локус-специфичные праймеры Р7 (SEQ ID NO: 17) и Р8 (SEQ ID NO: 18) и клетки мутантного штамма в качестве матрицы. Использовали следующий температурный профиль для ПЦР: денатурация в течение 3 мин при 94°С; 30 циклов: 30 сек при 94°С, 30 сек при 54°С, 1 мин при 72°С; и заключительная полимеризация: 7 мин при 72°С. Был получен продукт ПЦР длиной 1,35 т.п.н. Полученный мутантный штамм был назван 382 ilvA ΔargG::cat.
+
+
S
R
+
Ген устойчивости к хлорамфениколу (ген cat) был удален из хромосомы штамма Е. coli 382 ilvA ΔargG::cat с использованием системы int-xis. С этой целью штамм Е. coli 382 ilvA ΔargG::cat был трансформирован плазмидой pMWts-Int/Xis (WO 05/010175). Трансформированные клоны были отобраны на среде LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Чашки инкубировали при 30°С в течение ночи. Ген cat и плазмиду pMWts-Int/Xis удаляли из трансформантов, высевая отдельные колонии при 37°С (при этой температуре репрессор Cits частично инактивирован и транскрипция генов int/xis дерепрессирована) и отбирая варианты CmАр. Удаление гена cat из хромосомы проверяли с помощью ПЦР. Для проверки использовали локус-специфичные праймеры Р7 (SEQ ID NO: 17) и Р8 (SEQ ID NO: 18) и в качестве матрицы клетки, не содержащие ген cat. Условия проведения ПЦР были такие же, как описано выше. Был получен продукт ПЦР длиной ~0.44 т.п.н. Таким образом, был получен штамм-продуцент цитруллина 382 ilvA ΔargG.
+
+
Для оценки влияния инактивации кластера argT-hisJQMP на продукцию цитруллина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е. coli MG1655 ΔargT-hisP::cat были перенесены в штамм-продуцент цитруллина Е. coli 382 ilvA ΔargG с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) с целью получения штамма 382 ilvA ΔargG ΔargT-hisP.
+
+
Оба штамма Е. coli, 382 ilvA ΔargG и 382 ilvA ΔargG ΔargT-hisP, были выращены с перемешиванием при 37°С в течение 18 часов в 3 мл питательной среды и 0.3 мл полученных культур были перенесены в 2 мл ферментационной среды в пробирках 20×200 мм и культивированы при 32°С в течение 48 часов на роторной качалке.
2
После выращивания количество полученного цитруллина определяли с помощью бумажной хроматографии, используя в качестве подвижной фазы систему бутанол:уксусная кислота:вода=4:1:1 (по об.). Последующее окрашивание выполняли нингидрином (2% раствор в ацетоне). Содержащее цитруллин пятно вырезали и цитруллин элюировали с использованием 0,5% водного раствора CdCl. Количество цитруллина определяли спектрофотометрически при длине волны 540 нм.
+
+
Результаты восьми независимых пробирочных ферментаций приведены в таблице 2. Как видно из таблицы 2, штамм 382 ilvA ΔargG ΔargT-hisP продуцировал L-цитруллин в большем количестве, чем штамм 382 ilvA ΔargG.
Была использована ферментационная среда следующего состава (г/л):
Глюкоза
48.0
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
35.0
KН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>
2.0
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
1.0
Тиамин·HCl
0.0002
Дрожжевой экстракт
1.0
L-аргинин
0.1
СаСО<sub>3</sub>
5.0
3
Глюкозу и сульфат магния стерилизуют отдельно. СаСО стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. Значение рН доводят до 7.0.
Пример 5. Продукция орнитина штаммом Е. coli 382 ΔargFΔargI ΔargT-hisP
Для оценки влияния инактивации кластера argT-hisJQMP на продукцию орнитина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е. coli MG1655 ΔargT-hisP::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент орнитина Е. coli 382ΔargFΔargI с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) с целью получения штамма 382 ΔargFΔargIΔargT-hisP. Штамм 382ΔargFΔargI может быть получен в результате последовательных делеций генов argF и argI на хромосоме штамма 382 (ВКПМ В-7926) с использованием метода, предложенного Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645), называемого "Red-зависимая интеграция". В соответствии с этой процедурой могут быть сконструированы две пары ПЦР-праймеров, гомологичных как областям, прилегающим к генам argF и argI, так и гену, отвечающему за устойчивость к антибиотику. В качестве матрицы в ПЦР может быть использована плазмида pMW118-attL-Cm-attR (WO 05/010175).
Оба штамма Е. coli, 382ΔargFΔargI и 382ΔargFΔargIΔargT-hisP, могут быть выращены с перемешиванием при 37°С в течение 18 часов в 3 мл питательной среды, и 0.3 мл полученных культур могут быть перенесены в 2 мл ферментационной среды в пробирках 20×200 мм и могут быть культивированы при 32°С в течение 48 часов на роторной качалке.
2
После выращивания количество полученного орнитина может быть определено с помощью бумажной хроматографии с использованием подвижной фазы следующего состава: бутанол-уксусная кислота-вода=4:1:1. Последующее окрашивание может быть выполнено нингидрином (2% раствор в ацетоне). Содержащее цитруллин пятно может быть вырезано, цитруллин может быть элюирован с использованием 0.5% водного раствора CdCl, и количество цитруллина может быть определено спектрофотометрически при длине волны 540 нм.
Возможный состав ферментационной среды (г/л):
Глюкоза
48.0
(NH<sub>4</sub>)OSO<sub>4</sub>
35.0
KН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>
2.0
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
1.0
Тиамин·НСl
0.0002
Дрожжевой экстракт
1.0
L-изолейцин
0.1
L-аргинин
0.1
СаСО<sub>3</sub>
5.0
3
Глюкозу и сульфат магния стерилизуют отдельно. СаСО стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. Значение рН доводят до 7.0.
Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на наилучший способ осуществления изобретения, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.
Каждому из упомянутых выше документов соответствует ссылка, и все цитируемые документы являются частью описания настоящего изобретения.
Таблица 1
Штамм
OD<sub>540</sub>
L-аргинин, г/л
382
11.3±1.9
10.7±1.0
382ΔargT-hisP
13.2±1.0
11.6±0.7
Таблица 2
Штамм
OD<sub>540</sub>
L-цитруллин, г/л
382 ilvA<sup>+</sup> ΔargG382 ilvA<sup>+</sup> ΔargG ΔargT-hisP
12.1±0.310.4±0.7
4.0±0.34.3±0.2