СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ КОБАЛЬТА У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ОТРАВЛЕНИИ
METHOD FOR PREVENTION OF TOXIC ACTION OF COBALT IN EXPERIMENTAL ANIMALS SUFFERING CHRONIC POISONING

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии, экологии, токсикологии и может быть использовано при исследовании методов профилактики хронического токсического действия тяжелых металлов, в частности кобальта, на функциональное состояние почек.
12
Являясь составной частью витамина В, кобальт считается одним из важнейших микроэлементов, участвующих в каталитической ферментативной функции витамина. Однако при чрезмерном поступлении кобальта в организм, в количествах, во много раз превышающих ПДК, приводит к избыточному накоплению ксенобиотика в тканях и к их структурно-функциональным повреждениям [Талакин Ю.Н., Иванова Л.А., Костецкая Н.И., Гриднева Н.В., Савченко М.В., Древняк Н.С. Состояние здоровья рабочих, занятых в производстве солей кобальта. / Врачебное дело. - 1990. - №12. - С.90-93]. Кобальт относится к веществам I класса опасности вследствие наличия высокой сенсибилизирующей активности, что проявляется в полиморфном поражении сердечно-сосудистой, дыхательной, кроветворной систем [Орджоникидзе Э.К., Рощин А.В. Кобальт - токсичность, биологический контроль. / Гигиена труда и профессиональные заболевания. - 1991. - №12. - С.1-4]. Избыточное поступление кобальта в организм приводит к активации процессов перекисного окисления липидов, что вызывает повреждение мембранных структур и биологических макромолекул. Из литературных данных известно, что одним из основных органов кумуляции кобальта при его хроническом поступлении в организм являются почки (Firriolo JM, Ayala-Fierro F, Sipes IG, Carter DE. / J Toxicol Environ Health A. 1999 Nov 26; 58(6):383-95).
Прогрессирующие увеличение концентрации кобальта в окружающей среде приводит к постоянному ухудшению экологической обстановки, что делает актуальной проблему поиска эффективных средств профилактики токсического влияния кобальта на организм человека.
Известно множество детоксикантов, способных снижать токсические эффекты тяжелых металлов при чрезмерном поступлении их в организм. К ним относятся тиоловые соединения - тиосульфат натрия, унитиол, тетацин кальций, различные комплексообразующие соединения - пентацин, динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, дефероксамин и др. (Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2-х томах. Т.2. - Харьков «Торсинг», 1998. С.212-220). Однако длительное применение этих препаратов способно вызвать различные побочные эффекты: расстройства деятельности ЖКТ, аллергические реакции, изменение количества форменных элементов крови, острый некроз проксимальных канальцев нефронов и др. Также наряду с токсинами они повышают экскрецию из организма важных микроэлементов, таких как: железо, кальций, цинк и др., и вызывают тем самым нарушения обменных процессов, что препятствует их длительному профилактическому применению.
В качестве профилактического средства в условиях хронической кобальтовой интоксикации был выбран синтетический аналог гормона эпифиза - Мелаксен. Мелаксен оказывает выраженное адаптогенное действие, снижает стрессовые реакции, оказывает иммуностимулирующее действие, регулирует нейроэндокринные функции. Наличие у Мелаксена выраженного мембранопротекторного свойства обусловлено его мощным антиоксидантным действием [Лилица Г.А., Заславская P.M., Калинина Е.В. Эффективность метаболических препаратов в комплексом лечении пожилых больных постинфарктным кардиосклерозом и недостаточностью кровообращения. / Клиническая медицина. - 2005. - №3. - С.54-57; Попов С.С. «Клиническая эффективность мелатонина и его воздействие на свободнорадикальный гомеостаз при токсическом поражении печени». Автореферат диссертации на соискание ученой степени к.м.н. - Воронеж, 2008].
Наиболее близким к заявляемому является способ профилактики токсического действия и накопления кобальта в тканях у экспериментальных животных при моделировании хронического отравления, взятый за прототип (Патент 2312666 С1, опубликованный 20.12.2007. Бюл.35, заявка 2006113098/13 от 18.04.2006, МКИ A61K 33/00, A61K 35/00, авторы: Бузоева М.Р., Брин В.Б.), заключающийся в том, что животным ежедневно вводят хлорид кобальта в дозировке 0,2 мг/кг через зонд в желудок и через день ирлит-7 в виде 6% взвеси, также через зонд в желудок. Продолжительность эксперимента 2 месяца.
Недостатком данного способа является то, что используемый в качестве профилактического средства ирлит способен приводить к изменению водного гомеостазиса вследствие присущей ему выраженной сорбционной способности. Также одним из основных недостатков описываемого способа является то, что не исследовано функциональное состояние почек, поскольку именно это в условиях хронической кобальтовой интоксикации является одним из основных индикаторов тяжести токсического процесса.
Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа профилактики токсического действия кобальта у экспериментальных животных при хроническом отравлении.
Решение этой задачи обеспечивает значительное снижение токсического действия кобальта при хроническом отравлении у экспериментальных животных путем снижения повреждающего действия кобальта на клетки за счет оптимизации процессов перекисного окисления липидов в клеточных структурах.
Для достижения этого технического результата заявляемое изобретение способ профилактики токсического действия кобальта у экспериментальных животных при хроническом отравлении имеет следующие существенные признаки: одновременное с первого дня эксперимента введение детоксиканта и хлорида кобальта через зонд в желудок, в качестве детоксиканта применяют мелаксен, вводимый животным ежедневно в дозе 10 мг/кг, а хлорид кобальта вводят в дозе 2 мг/кг.
Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что впервые применяется синтетический фармакологический препарат - мелаксен, с целью профилактики хронической токсической нефропатии.
Ежедневное профилактическое введение мелаксена через зонд в желудок в дозе 10 мг/кг одновременно с внутрижелудочным введением раствора хлорида кобальта приводит к снижению проявлений токсической нефропатии, восстановлению функций почек. Заявленный способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.
По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».
По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа профилактики токсического действия кобальта у экспериментальных животных при хроническом отравлении, включающего одновременное с первого дня эксперимента введение детоксиканта и хлорида кобальта через зонд в желудок, в качестве детоксиканта применяют мелаксен, вводимый животным ежедневно в дозе 10 мг/кг, а хлорид кобальта вводят в дозе 2 мг/кг, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».
Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе профилактики токсического действия кобальта, путем снижения токсического действия тяжелого металла при хроническом отравлении, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».
Данный способ осуществляется следующим образом.
Для получения токсического вещества хлорид кобальта растворяют в стерильной дистиллированной воде таким образом, что на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 2 мг кобальта (в пересчете на металл). На каждые 100 г веса крысы вводят 0,1 мл токсического раствора, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм экспериментального животного. Раствор мелаксена приготавливают таким образом, что на каждую единицу раствора, равную 2 мл, приходится 10 мг мелаксена. Раствор мелаксена готовят ежедневно перед внутрижелудочным введением. Раствор хлорида кобальта вводят через атравматичный зонд в желудок в дозировке 2 мг/кг, ежедневно 1 раз в сутки в течение 30 дней двум группам животных (№1 и №2). Одновременно, с первого дня введения хлорида кобальта группе №2 каждый день внутрижелудочно вводят мелаксен в дозировке 10 мг/кг через атравматичный зонд.
По истечении времени эксперимента (30 дней) исследовали функциональное состояние почек, что включало определение диуреза (мл/час/100 г), клубочковой фильтрации (мл/час/100 г), канальцевой реабсорбции воды (%), осмолярности мочи, экскреции натрия, калия, белка. Крысы забивались с использованием тиопентала. Полученные результаты в группе №2 сравнивали с контролем (гр. №1) и фоновыми показателями интактной группы.
Для гистологических исследований образцы тканей (почки) фиксировали в 10% нейтральном формалине, после чего подвергали заливке в парафин с последующим приготовлением срезов толщиной 7-8 микрон. Срезы окрашивались гематоксилином и эозином. Изучение срезов проводилось в проходящем свете при помощи микроскопа Микмед-1 под увеличением 80×200×400.
Сущность способа подтверждается морфологически, где на Фиг.1 в опытной группе выявлены выраженные дистрофические явления в клубочковом и канальцевом аппарате почек, наблюдались выраженные альтеративные, некробиотические изменения в тканях почек, отмечались: отек канальцев (а); белок в просвете канальцев (б); выраженный отек (в) и дистрофические изменения в клубочке (г).
На Фиг.2 при морфологическом исследовании почек в группе №2 гистологическая картина характеризовалась наличием менее выраженных дистрофических изменений в тканях почек, тогда как некробиотические изменения полностью отсутствовали, отмечалась регенерация канальцев (а), на фоне умеренного расширения их протоков (б).
Пример. Двум группам крыс-самцов линии Вистар массой 200-300 г вводили через атравматичный зонд в желудок раствор хлорида кобальта в дозе 2 мг/кг каждый день в течение 30 дней. Одновременно, с первого дня введения хлорида кобальта, группе №2 каждый день внутрижелудочно вводился мелаксен в дозировке 10 мг/кг. Через 30 дней исследовали функциональное состояние почек в условиях 6-часового спонтанного диуреза, что включало в себя определение: объема диуреза, скорости клубочковой фильтрации по клиренсу эндогенного креатинина, канальцевой реабсорбции воды, экскреции с мочой ионов натрия, калия и кальция, экскреции белка с мочой, осмолярность мочи.
Содержание натрия, калия в плазме крови и моче определяли методом пламенной фотометрии, с помощью пламенного анализатора жидкостей ПАЖ-1, концентрацию кальция и креатинина определяли спектрофотометрически (СФ-26) с помощью наборов «Кальций-Арсеназо-Агат», «Креатинин-Агат», «ООО» «Агат-Мед» (г.Москва, Россия). Концентрацию белка определяли спектрофотометрически (СФ-26) по методу Лоури. Для определения осмотической концентрации мочи использовали метод криоскопии, измерения выполняли на миллиосмометре «OSMOMAT-2». Результаты всех серий опытов обработаны статистически с применением критерия «t» Стьюдента на ПЭВМ Pentium-4 с использованием программы Prizma 4.0.
Результаты исследования показали, что у крыс при хронической интоксикации хлоридом кобальта (1 группа) происходило достоверное снижение объема 6-часового спонтанного диуреза, относительно значений интактной группы животных спустя 30 дней эксперимента, что было обусловлено значительными изменениями скорости клубочковой фильтрации и канальцевой реабсорбции воды. У животных, получавших внутрижелудочное введение хлорида кобальта (1 группа), определялось достоверное повышение содержания белка в моче по сравнению с показателями интактной группы животных (табл.1).
Изолированное внутрижелудочное введение хлорида кобальта экспериментальным животным (1 группа) приводило к достоверному снижению уровня осмолярности мочи, относительно показателей интактной группы животных, что говорит о нарушении концентрирующей функции почек (табл.5).
Хроническая интоксикация хлоридом кобальта (1 группа) приводила к достоверному снижению экскреции натрия вследствие уменьшения фильтрационного заряда катиона, относительно фоновых значений, тогда как канальцевая реабсорбция натрия не отличалась от значений интактной группы животных (табл.2).
Таблица 2
Влияние внутрижелудочного (в/ж) введения мелаксена на почечную обработку натрия у крыс на фоне внутрижелудочного введения хлорида кобальта (М±m)
Условия опыта
Стат. показатель
Процессы почечной обработки натрия
E<sub>Na</sub>
F<sub>Na</sub>
R<sub>Na</sub>
мкмоль/час/100 г
%
I
II
III
IV
V
Фон
М±m
12,34±0,163
2526±67,32
99,51±0,016
CoCl<sub>2</sub> в/ж (30 дней)
М±m
9,69±0,23
2080±45,28
99,52±0,012
p
*)
*)
-
CoCl<sub>2</sub> в/ж (30 дней) +
М±m
10,54±0,22
2175±23,21
99,51±0,011
Мелаксен в/ж (30 дней)
p
*)##)
*)
-
Примечание: (*) - достоверное (р≤0,001) изменение по сравнению с фоном;
(##) - достоверное (р≤0,05) изменение относительно месяца введения CoCl<sub>2</sub>;
E<sub>Na</sub> - экскреция Na, F<sub>Na</sub> - фильтрационный заряд Na, R<sub>Na</sub> - относительная канальцевая реабсорбция Na.
Отмечалось снижение экскреции калия с мочой у животных, изолированно получавших внутрижелудочное введение хлорида кобальта (1 группа), что было обусловлено уменьшением его фильтрационного заряда относительно значений интактной группы животных (табл.3). Хроническая интоксикация хлоридом кобальта приводила к достоверному снижению экскреции кальция с мочой, относительно фоновых значений, что было обусловлено повышением канальцевой реабсорбции катиона и одновременным снижением его фильтрационного заряда (табл.4).
Профилактическое применение мелаксена в группе животных внутрижелудочно получавших хлорид кобальта (группа №2), способствовало некоторому восстановлению объема 6-часового спонтанного диуреза, относительно животных, изолированно получавших внутрижелудочное введение хлорида кобальта (группа №1), что было обусловлено повышением скорости клубочковой фильтрации (табл.1).
Таблица 3
Влияние внутрижелудочного (в/ж) введения мелаксена на почечную обработку калия у крыс на фоне внутрижелудочного введения хлорида кобальта (М±m)
Условия опыта
Стат. показатель
Процессы почечной обработки натрия
E<sub>K</sub>
F<sub>K</sub>
мкмоль/час/100 г
I
II
III
IV
Фон
М±m
6,26±0,158
78,16±0,9
CoCl<sub>2</sub> в/ж (месяц)
М±m
4,62±0,12
61,38±1
p
*)
*)
CoCl<sub>2</sub> в/ж (месяц) +
М±m
5,04±0,1
66,05±0,68
Мелаксен в/ж (месяц)
p
*)###)
*)##)
Примечание: (*) - достоверное (р≤0,001) изменение по сравнению с фоном;
(##) - достоверное (р≤0,001) изменение относительно месяца введения CoCl<sub>2</sub>;
(###) - достоверное (р≤0,05) изменение относительно месяца введения CoCl<sub>2</sub>.
F<sub>K</sub> - фильтрационный заряд калия, E<sub>K</sub> - экскреция калия.
В группе животных, профилактически получавших мелаксен в условиях хронической кобальтовой интоксикации (группа №2), отмечалось достоверное уменьшение степени протеинурии (табл.1) по сравнению с показателями группы животных, изолированно получавших внутрижелудочное введение хлорида кобальта (группа №1). Профилактическое введение мелаксена в условиях хронической кобальтовой интоксикации (группа №2) способствовало восстановлению уровня осмолярности мочи (табл.5), относительно значений группы животных, получавших хлорид кобальта (группа №1). Применение мелаксена в качестве профилактического средства в условиях хронической кобальтовой интоксикации способствовало достоверному повышению уровня экскреции натрия, относительно значений группы животных, изолированно получавших хлорид кобальта, что было обусловлено наличием менее выраженных изменений в фильтрационном заряде натрия и его канальцевой реабсорбции (табл.2).
Таблица 4
Влияние внутрижелудочного (в/ж) введения мелаксена на почечную обработку кальция у крыс на фоне внутрижелудочного введения хлорида кобальта (М±m)
Условия опыта
Стат. показатель
Процессы почечной обработки кальция
E<sub>Ca</sub>
F<sub>Ca</sub>
R<sub>Ca</sub>
ммоль/час/100 г
%
I
II
III
IV
V
Фон
М±m
0,225±0,005
24,89±0,46
99,1±0,025
CoCl<sub>2</sub> в/ж (месяц)
М±m
0,16±0,006
20,70±0,4
99,21±0,036
p
*)
*)
**)
CoCl<sub>2</sub> в/ж (месяц) +
М±m
0,192±0,006
22,48±0,24
99,14±0,028
Мелаксен в/ж (месяц)
p
*)##)
*)#)
-
Примечание: (*) - достоверное (р≤0,001) изменение по сравнению с фоном;
(**) - достоверное (р≤0,05) изменение относительно с фоном;
(#) - достоверное (р≤0,001) изменение относительно месяца введения CoCl<sub>2</sub>;
(##) - достоверное (р≤0,05) изменение относительно месяца введения CoCl<sub>2</sub>.
F<sub>Ca</sub> - фильтрационный заряд кальция, E<sub>Ca</sub> - экскреция кальция, R<sub>Ca</sub> - канальцевая реабсорбция кальция.
Восстанавливая уровень фильтрационного заряда калия (табл.3), мелаксен способствовал повышению уровня экскреции катиона с мочой, относительно значений животных, получивших изолированное внутрижелудочное введение хлорида кобальта (1 группа). Профилактическое введение мелаксена (группа №2) способствовало восстановлению уровня экскреции кальция с мочой, относительно значений животных, изолированно получавших хлорид кобальта (группа №1), что было обусловлено отсутствием изменений в канальцевой реабсорбции кальция и повышением его фильтрационного заряда (табл.4).
Таблица 5
Влияние внутрижелудочного (в/ж) введения мелаксена на показатели осмолярности мочи на фоне внутрижелудочного введения хлорида кобальта (М±m)
Условия опыта
Стат. показатель
Osm
осм/л
I
II
III
Фон
М±m
2,406±0,08
CoCl<sub>2</sub> в/ж (месяц)
М±m
1,545±0,098
p
*)
CoCl<sub>2</sub> в/ж (месяц) +
М±m
1,93±0,09
Мелаксен в/ж (месяц)
p
*)##)
Примечание: (*) - достоверное (р≤0,001) изменение по сравнению с фоном;
(##) - достоверное (р≤0,05) изменение относительно месяца введения CoCl<sub>2</sub>;
Osm - осмолярность мочи.
Таким образом, из вышеизложенного следует, что профилактическое применение мелаксена в условиях хронической кобальтовой интоксикации является эффективным способом профилактики токсического действия кобальта при хроническом отравлении.