Способ определения показаний к проведению противогерпетической терапии при инфекции ВГЧ-6 у детей с острыми респираторными заболеваниями
METHOD FOR DETERMINATION OF INDICATIONS FOR ANTIHERPETIC THERAPY IN CASE OF HHV-6 INFECTION IN CHILDREN WITH ACUTE RESPIRATORY DISEASES

Изобретение относится к педиатрии и инфекционным заболеваниям и предназначено для определения показаний к проведению противогерпетической терапии у детей с острыми респираторными заболеваниями и инфекцией вируса герпеса человека 6 типа.
Герпесвирусная инфекция является одной из важнейших медико-социальных проблем, что обусловлено ее широким распространением и чрезвычайно большим спектром клинических проявлений и осложнений. Герпесвирусную инфекцию у людей вызывают вирусы простого герпеса I, II, III, IV (Эпштейна-Барр вирус), V (цитомегаловирус), VI, VII и VIII типов. По данным глобального обзора герпесвирусных исследований, инфицированность/заболеваемость герпесом из года в год нарастает. Многообразие клинических проявлений, особенности возбудителей, возможность их распространения практически всеми известными путями передачи позволили Европейскому региональному бюро ВОЗ отнести герпесвирусные инфекции в группу болезней, которые определяют будущее инфекционной патологии в текущем столетии. Важно отметить, что по данным современных эпидемиологических исследований регистрируется не только увеличение количества пациентов с герпетической инфекцией, но также более тяжелых форм течения заболевания с частыми обострениями [Human Herpesviruses HHV-6A, HHV-6B, and HHV-7. Diagnosis and Clinical Management / Edited by L. Flamand [et al.]. - Amsterdam, Elsevier, 2014. 341].
После первичного инфицирования и развития манифестных форм заболевания вирус герпеса находится пожизненно в организме человека в латентном состоянии под контролем иммунной системы в 85-90% случаев. Однако у 10-15% людей при ослаблении иммунитета происходит реактивация инфекции с клиническими проявлениями заболевания.
Как и другие представители подсемейства Betaherpesvirinae, ВГЧ-6 проникает в клетку и реплицируется, он обладает также способностью к персистенции и латенции в организме. Персистенция представляет собой способность герпесвирусов непрерывно циклично размножаться в инфицированных клетках, латенция - пожизненное сохранение вирусов в неявной форме в ганглиях.
В настоящее время считается, что инфицирование происходит преимущественно в раннем детском возрасте. После первичного заражения ребенка возможно несколько вариантов развития болезни: от классической Roseola infantum до недифференцируемого заболевания, сопровождающегося лихорадочным состоянием, раздражительностью, отитом, судорожными приступами, сыпью.
Однако часто активная ВГЧ-6 инфекция протекает бессимптомно, но вирус может быть причиной серьезных заболеваний, особенно у лиц с ослабленным иммунитетом.
Исследования последних лет показали, что ВГЧ6, как и другие герпесвирусные инфекции, может вызывать у детей не только острые, но и хронические формы заболевания. Этот факт играет важную роль в формировании группы часто болеющих детей, приводя к развитию вторичного иммунного дисбаланса с преимущественным повреждением В-клеточного звена. Течение активных герпесвирусных инфекций у детей раннего и старшего возраста утяжеляет клинические проявления ОРЗ (длительная фебрильная лихорадка, фебрильные судороги, поражение нижних отделов органов дыхания). Диагностика герпесвирусной инфекции включает в себя интерпретацию характерной клинической картины, а также вирусологические и иммунологические исследования. Общепринятый способ диагностики - определение титров IgM и IgG к антигенам вирусов, а также их авидности. Однако для определения стадии инфекции основополагающим является исследование различных сред организма больного (слюны, мочи, крови) с целью выделения вируса. Диагноз устанавливается на основании обнаружения повышенного содержания вируса путем определения вирусного генома, разновидность которого - полимеразная цепная реакция (ПЦР). Достоинствами метода являются высокая специфичность (100%), чувствительность (90-97%), быстрота исследования (несколько часов).
Существует целый ряд серологических методов определения маркеров ВГЧ-6-инфекции: иммунофлюоресцентный метод, иммуноферментный анализ (ИФА), иммуноблот, иммунопреципитация. Наиболее часто используется ИФА, хотя метод имеет целый ряд недостатков. Определение титра специфических IgM используют для диагностики острой инфекции или реактивации. Однако не у всех детей, переносящих первичную инфекцию, отмечается продукция антител IgM. а приблизительно 5% здоровых взрослых имеют антитела IgM к ВГЧ-6 (Human Herpesviruses HHV-6A, HHV-6B, and HHV-7. Diagnosis and Clinical Management / Edited by L. Flamand [et al.]. - Amsterdam, Elsevier. 2014. - 341).
Серологическую диагностику затрудняет перекрестная реакция с антителами других ДНК-вирусов, например вирус герпеса человека 7 типа (ВГЧ-7), в силу схожести геномов на 42,5%. Кроме того, гетеротипичная реактивация синтеза IgM, например, происходит при ЦМВ и ВЭБ-инфекциях.
Выделение вируса в клеточных культурах - способ доказать наличие инфекционных вирусных частиц в пробе. Выявление антигенов затруднено из-за снижения количества циркулирующих антител, наличия перекрестной реактивности, распределения антигенных детерминант, неспецифического окрашивания и низкой чувствительности.
Противовирусные препараты являются эффективными в отношении активной ВГЧ-6 инфекции, но показания к применению (как и режимы дозирования) у детей до сих пор но существу не определены.
Ближайшим аналогом предлагаемого способа является способ того же назначения, включающий проведение противогерпетической терапии в зависимости от степени тяжести клинического состояния, то есть только у пациентов с осложненными формами - патологией нервной системы и мультиформной эритемой, причем при обнаружении ДНК вируса в плазме крови качественным методом (Мюкке Н.А. Герпетическая инфекция 6-го типа у детей. Автореф. дисс. к.м.н., 2006). Однако, как было показано в более поздних работах (Вашура Л.В., Савенкова М.С., Заваденко Н.Н., Колтунов И.Е., Каражас Н.В., Рыбалкина Т.Н., Калугина М.Ю., Буллих А.В. Судорожный синдром у детей: роль герпесвирусных инфекций // Детские инфекции. 2014. - №2. с. 48-52. Вашура Л.В. Судорожные приступы у детей с герпесвирусными инфекциями: дифференциальная диагностика и исходы. Автореф. дисс., 2016), после перенесенных неосложненных форм без проведения специфической терапии возможно рецидивирование инфекции с фебрильными судорожными приступами. Кроме того, при качественном исследовании и положительном результате анализа не всегда определяется тяжесть заболевания. Неправильная диагностика стадии заболевания у детей зачастую ведет к назначению противовирусной терапии у пациентов с латентными формами. Противовирусные препараты имеют целый ряд побочных эффектов и не действуют на жизненный цикл вируса в латентной стадии. В связи с этим точное установление показаний к назначению противогерпетической терапии является крайне актуальным в педиатрической практике. В случае ВГЧ-6 первичной инфекции, преимущественно в течение первого года жизни, наличие материнских IgG может повлиять на результаты диагностики. Таким образом, при наличии симптомов, сходных с первичной ВГЧ-6 инфекцией, для установления диагноза требуется использование количественного метода для определения показаний к проведению противогерпетической терапии. Таким методом является высокочувствительный метод ПЦР-диагностики, с помощью которого у клинически здоровых лиц может определяться в том числе минимальное количество ДНК вируса в крови, что не требует назначения терапии.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка лабораторного диагностического способа определения показаний для проведения противогерпетической терапии у детей при инфекции ВГЧ-6 с острыми респираторными заболеваниями.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является возможность коррекции инфекционного процесса путем своевременного проведения противогерпетической терапии, а также исключение необоснованного использования противогерпетических препаратов и предупреждение рецидивирования.
Технический результат достигается за счет определения с помощью с помощью метода ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов анализа в режиме «реального времени» в крови.
8
В основе способа обнаружения и количественной оценки ДНК вируса с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени лежит многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента ДНК, являющегося маркерным для данного вида возбудителя инфекционного заболевания. ПЦР является прямым методом выявления ДНК вируса и имеет высокую степень чувствительности. Метод ПЦР в реальном времени имеет целый ряд преимуществ, таких как быстрота выполнения (2 часа для комбинированной амплификации и считывания), широкий диапазон линейности сигнала (меньше чем 10 к 10 геномных копий), получение всех флуоресцентных сигналов во время амплификации происходит без открывания реакционной пробирки, стабильность флуоресцентного зонда, наличие 96 лунок, что позволяет производить большие серии тестов (Human Herpesviruses HHV-6A, HHV-6B, and HHV-7. Diagnosis and Clinical Management / Edited by L. Flamand [et al.]. - Amsterdam, Elsevier, 2014. - 341).
Было обследовано 236 пациентов старше 1 года до 17 лет: из них 136 детей с острыми респираторными инфекциями, поступившими в детское инфекционное отделение, и 100 клинически здоровых детей в ходе диспансеризации (группа контроля).
Были проанализированы уровни вирусной нагрузки в крови методом ПЦР в реальном времени (Таблица 1. Результаты ПЦР-исследования крови).
5
5
5
5
5
5
Было изучено 136 образцов крови пациентов основной группы (у детей старше 1 года до 17 лет с острыми респираторными инфекциями), у 25% обнаружено 5-9 копий / 10 клеток, у 43% - от 10 до 99 копий / 10 клеток, у 19% - 100-999 копий / 10 клеток, у 11% - 1000-9999 копий / 10 клеток, у 2% детей более 10000 копий / 10 клеток. У всех 100 пациентов группы контроля нагрузка составила не более 99 копий / 10 клеток (Фиг. 1. Вирусная нагрузка в крови (ПЦР)).
5
5
Выявление в крови пациента ДНК ВГЧ-6 в количестве более 100 копий/10 клеток коррелировало с тяжестью клинического состояния. У детей, имевших высокий уровень ДНК ВГЧ-6 в крови - более 100 копий/10 клеток, в клинической картине преобладали классические формы, характерные для моноинфекции ВГЧ-6, такие как внезапная экзантема и фебрильные судорожные приступы. Все это подтверждает наличие у пациента активной формы инфекции ВГЧ-6 и должно определять дальнейшую тактику ведения пациента.
5
У детей, имевших низкий уровень ДНК ВГЧ-6 в крови - менее 100 копий/10 клеток, в клинической картине преобладали неспецифические симптомы острого респираторного заболевания, сочетающегося с микст-инфекциями ВГЧ-6 и респираторных вирусов.
5
5
Детям с ОРИ (16 пациентов), имевшим высокие уровни ДНК ВГЧ-6 более 100 копий/10 клеток, проводили противогерпетическую терапию. Группу сравнения составили дети с ОРИ, имевшие высокие уровни ДНК ВГЧ-6 более 100 копий/10 клеток, которым не проводили противогерпетическую терапию. Контрольное обследование пациентов производилось двукратно: на 5 сутки терапии, а также через 1 месяц после начала противогерпетического лечения. Исследование включало ПЦР крови. На 5-е сутки терапии 61% детей на фоне противогерпетического лечения не имели ДНК ВГЧ-6 в крови. В группе детей без противогерпетической терапии ДНК ВГЧ-6 обнаруживалось в крови у 69% пациентов, т.е. чаще, чем в группах детей, получавших противогерпетическое лечение, которое было продолжено. Дети были обследованы повторно через 1 месяц от начала лечения. У 82% детей на фоне противогерпетического лечения через 1 месяц от начала терапии не выявлено признаков активной ВГЧ-6 инфекции. В группе детей без противогерпетической терапии доля пациентов с активными формами инфекции составила 56%, что выше, чем в группах детей, получавших противовирусное лечение.
5
5
Таким образом, минимальное количество копий (менее 100 копий / 10 клеток) или отсутствие их в крови достоверно чаще определяется у клинически здоровых детей (р<0,05, точный критерий Фишера, критерий Хи-квадрат). Уровень вируса в крови более 100 копий/10 клеток характеризует такое течение заболевания, которое требует проведения противогерпетической терапии (Табл. 1).
5
Способ осуществляют следующим образом. У ребенка с острым респираторным заболеванием забирают кровь и с помощью метода ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов анализа в режиме «реального времени» определяют количество копий ДНК ВГЧ-6. При наличии более 100 копий/10 клеток в крови определяют показания к проведению противогерпетической терапии.
Примеры
Клинический пример 1
Дарима М., 1 год 4 мес,
поступила в инфекционное отделение с жалобами на повышение температуры до фебрильных цифр. Ребенок болен в течение 2 суток - подъем температуры до 38.8, явления ринита. В первый день болезни осмотрена врачом скорой помощи, введен Анальгин, с незначительным эффектом. На второй день заболевания - подъем температуры до 39, вялая, после приема Ибупрофена в возрастной дозе в течение 2 часов температура сохраняется до 39,5. Ребенок доставлен в стационар. На фоне беспокойства впервые возникли тонико-клонические судороги без потери сознания. Купировались самостоятельно. При осмотре состояние ребенка средней тяжести, капризна. Кожные покровы бледно-розовые, чистые. Видимые слизистые чистые, влажные, зев умеренно гиперемирован, налетов нет. Задняя стенка зерниста, миндалины увеличены 1 ст. Носовое дыхание незначительно затруднено, отделяемое слизистое. Лимфатические узлы шейных групп более 3 в группе, увеличены до 10-12 мм, подмышечные - до 10 мм, все они мягко-эластичные на ощупь, подвижные, безболезненные, кожа над ними не изменена. В легких дыхание пуэрильное, проводится равномерно, хрипов нет. Менингеальной симптоматики нет.
12
9
9
Клинический анализ крови при поступлении в стационар: Hb - 125 г/л, Эритр. - 4,54×10/л, Лейкоц. - 3,98×10/л, Тромбоц. - 277×10/л, n/я - 6, с/я - 17, мон. - 12, лимфоц. - 65, СОЭ - 19 мм/час. Биохимический анализ крови без особенностей, СРБ в норме.
Данные вирусологического обследования.
5
ПЦР крови: обнаружена ДНК ВГЧ-6 16122 копий ДНК/10 клеток, что указывает на активную форму инфекции ВГЧ-6 у ребенка, требующую использования противогерпетической терапии.
На 4-е сутки заболевания температура снизилась до нормальных значений и появилась пятнисто-папулезная сыпь на животе и разгибательных поверхностях верхних конечностей, что подтвердило лабораторный диагноз инфекции ВГЧ-6 развитием классической формы инфекции у детей - детской розеолы (внезапной экзантемы).
12
9
9
Клинический анализ крови на 7 день болезни: Hb - 127 г/л, Эритр. - 4,7×10/л, Лейкоц. - 6,3×10/л, Тромбоц. - 311×10/л, n/я - 2, с/я - 19, мон. - 10, лимфоц. - 68, СОЭ - 16 мм/час.
Таким образом, у ребенка имеет место первичная активная инфекция ВГЧ 6 типа. Фебрильный судорожный приступ. Внезапная экзантема.
В связи со своевременно поставленным диагнозом сразу была начата противогерпетическая (Ацикловир 200 мг × 4 р/д в сочетании с рекомбинантным интерфероном-α2β с таурином в дозе 125000 ME 2 раза в день) и сопутствующая терапия.
12
9
9
Через 2 месяца после перенесенного заболевания ребенок был консультирован амбулаторно. ОРВИ однократно, температура 37,8 фебрильного приступа не было. Жалоб на момент осмотра нет. Имел место гранулярный фарингит, гипертрофия миндалин 1 ст., микролимфаденопатия (лимфоузлы шейных групп более 3 в группе, до 10 мм, подмышечные до 10 мм). Клинический анализ крови: Hb - 130 г/л, Эритр. - 5,01×10/л, Лейкоц. - 11,0×10/л, Тромбоц. - 350×10/л, n/я - 1, с/я - 30, мон. - 7, лимфоц. - 61, СОЭ - 8 мм/час.
Исследование ПЦР-крови показало отрицательный результат. Лечение закончено. Дополнительная терапия не проводилась.
При осмотре через 4 месяца ребенок клинически здоров, при осмотре - без особенностей. При серологическом исследовании выявлены Ig G к ВГЧ-6 в диагностическом титре 1:540. Убедительных данных за активность ВГЧ-6 не было. Рекомендовано повторное обследование через 1 год.
5
Таким образом, данный клинический пример наглядно демонстрирует типичное развитие острой первичной инфекции ВГЧ-6, начало которой протекало под маской ОРВИ. Ранняя диагностика инфекции путем определения уровня ДНК ВГЧ-6 в крови с помощью метода ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов анализа в режиме «реального времени» более 100 копий/10 клеток позволило назначить противогерпетическую терапию до появления классических клинических проявлений ВГЧ-6 инфекции в виде сыпи. Это способствовало быстрому переходу инфекции в латентную форму и позволило предотвратить рецидивирование фебрильных судорожных приступов, как проявления обострения инфекции ВГЧ-6, у ребенка на фоне последующих ОРВИ.
Клинический пример 2
Ваня П., 3 года. Осмотрен в рамках диспансеризации в детском саду. Жалоб на момент осмотра мама не предъявляет. Объективно здоров.
Перед обследованием последнее острое респираторное заболевание 6 мес. назад.
С 1 г 7 мес Аденоидит. ОРВИ перенес 3 раза.
12
9
9
Клинический анализ крови: Hb - 131 г/л, Эритр. - 4,84×10/л, Лейкоц. - 8,83×10/л, Тромбоц. - 276×10/л, n/я - 1, с/я - 23, мон. - 7, лимфоц. - 68, эозинофиды - 1, СОЭ - 3 мм/час.
5
В крови выделено ДНК ВГЧ-6 17 копий/10 клеток.
При серологическом исследовании специфические IgM и IgG к ВГЧ-6 не обнаружены.
При динамическом наблюдении за ребенком в течение 1 месяца катаральных явлений у ребенка не наблюдалось.
При повторном обследовании через 30 дней ДНК ВГЧ-6 в мазке и крови не определялось. При серологическом исследовании специфические IgM и IgG к ВГЧ-6 не обнаружены.
5
Данный клинический пример демонстрирует выявление минимального количества (менее 100 копий/10 клеток) ДНК ВГЧ-6 в крови у клинически здорового ребенка, которое может выявляться высокочувствительным методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов анализа в режиме «реального времени». Подобная находка без клинических проявлений инфекции ВГЧ-6 в момент обследования и на протяжении 5 месяцев наблюдения может свидетельствовать о латентной форме инфекции, не требующей назначения терапии.
Клинический пример 3
Родион А., 3 лет,
поступил в инфекционное отделение с жалобами на повышение температуры до фебрильных цифр, приступ тонико-клонических судорог. В течение 2 дней переносил ОРВИ, ринит, лечение не получал, посещал детский сад. На фоне повышения Т до 38,8 тонико-клонические судороги с потерей сознания, длительностью 2-3 минуты, купировались самостоятельно. Ребенок был госпитализирован.
5
Ребенок до 2 лет ОРВИ с температурой до 39°C, эпизодов судорог не было. В возрасте 2 лет поступал в инфекционное отделение с диагнозом ОРВИ с фебрильным судорожным приступом. На 2 день госпитализации на фоне нормализации температуры на коже появилась пятнисто-папулезная сыпь. В связи с этим была заподозрена инфекция ВГЧ-6 и проведен забор крови для анализа на выделение ДНК вируса в крови. В крови было обнаружена ДНК ВГЧ-6 в количестве 120000 копий/10 клеток, что являлось показанием для проведения противогерпетической терапии. Однако по настоянию матери ребенок выписан. Назначенную противогерпегическую терапию мальчик не получал.
Позже имел место повторный эпизод фебрильного судорожного приступа на фоне повышения температуры при ОРВИ. При поступлении в стационар состояние средней тяжести.
12
9
9
Кожные покровы бледно-розовые, чистые от сыпи. Видимые слизистые розовые, чистые, влажные, зев гиперемирован, задняя стенка глотки зерниста, налетов нет. Подкожно-жировая клетчатка развита умеренно, распределена равномерно. Отеков, пастозности нет. Лимфатические узлы шейных групп единичные, до 1,0 см, мягко-эластичные, б/б. Носовое дыхание свободно. Одышки нет. Перкуторно - звук ясный легочный, симметричный по всем легочным полям. В легких дыхание пуэрильное, проводится во все отделы равномерно, хрипов нет. Клинический анализ крови: Hb - 117 г/л, Эритр. - 4,2×10/л, Лейкоц. - 16,9×10/л, Тромбоц. - 199×10/л, n/я - 4, с/я - 28, мон. - 8, лимфоц. - 60, СОЭ - 12 мм/час.
5
При серологическом исследовании крови обнаружены иммуноглобулины G к ВГЧ 6 в титре 1:350 (методом ИФА, тест системы Вектор-бест). ДНК вируса герпеса человека обнаружено в крови в количестве 2300 копий/10 клеток методом ПЦР.
На основании данных анамнеза (частые ОРЗ, фебрильные судорожные приступы), клинической картины (судороги с потерей сознания), данных лабораторных исследований (ДНК и антигены ВГЧ-6 в крови и мазке из ротоглотки, антитела к вирусу) была диагностирована Хроническая персистирующая инфекция ВГЧ 6 типа в стадии реактивации. Имеются показания для противогерпетической терапии.
За время пребывания ребенка в стационаре на фоне проводимой терапии состояние ребенка с положительной динамикой, не лихорадит, судороги не повторялись, самочувствие хорошее.
Контроль клинического анализа крови, исследование крови методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов анализа в режиме «реального времени» для количественного определения ДНК ВГЧ-6, ИФА к ВГЧ6, после окончания курса терапии выявил отсутствие ДНК ВГЧ-6 в крови.
Данный клинический пример демонстрирует формирование хронической персистирующей инфекции ВГЧ-6 (проявляющейся повторными фебрильными судорожными приступами на фоне ОРВИ) в результате отсутствия своевременной противогерпетической терапии в момент установления диагноза.
Таким образом, предложенный способ позволяет своевременно проводить противогерпетическую терапию для предотвращения формирования хронических форм инфекции, а также исключить необоснованное использование противогерпетических препаратов и предупреждать рецидивирование.