ПРОТИВОРАКОВЫЕ ВАКЦИНЫ, НАПРАВЛЕННЫЕ НА LEMD1, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
ANTI-CANCER VACCINES AIMED AT LEMD1 AND THEIR USE

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Данная заявка претендует на приоритет и преимущество относительно предварительной заявки на патент США № 62/598329, поданной 13 декабря 2017 года, предварительной заявки на патент США № 62/598612, поданной 14 декабря 2017 года, полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0002] Данная заявка содержит Перечень последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и настоящим полностью включен посредством ссылки. Указанная ASCII-копия, созданная 12 декабря 2018 года, называется l04409_000449_sequence_listing.txt и имеет размер 25 040 байт.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0003] Настоящее изобретение относится к антигенам LEMD1 и молекулам нуклеиновых кислот, которые их кодируют. Настоящее изобретение также относится к вакцинам, включающим такие иммуногены LEMD1 и/или молекулы нуклеиновых кислот. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам использования вакцин для индукции иммунных ответов и предотвращения и/или лечения субъектов, имеющих раковые клетки или опухоли, которые экспрессируют LEMD1.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0004] Рак остается основной причиной смерти в США и во всем мире. Рынок противораковых вакцин быстро растет. Эффективные противоопухолевые вакцины могут быть полезны для предотвращения роста опухоли и/или могут быть полезны в качестве более эффективной, менее токсичной альтернативы стандартному лечению пациентов с запущенными формами рака. Антигеном, связанным с раком и, следовательно, мишенью для противоопухолевых вакцин является LEMD1.
[0005] LEMD1 представляет собой белок 20 кДа, который локализуется на внутренней ядерной мембране (INM). Там он ассоциируется с ядерной ламиной, которая участвует в механических функциях ядра и организации гетерохроматина. LEMD1 характеризуется своим доменом LAP2-Emerin-MAN1 (LEM), первоначально описанным как консервативный глобулярный модуль, состоящий приблизительно из 40 аминокислот, который обеспечивает связывание с фактором, препятствующим аутоинтеграции (BAF), белком, образующим мостиковые связи с ДНК.
[0006] Нуклеопротеиновые комплексы BAF-ДНК играют важную роль в повторной сборке ядра в сочетании с ламинами и усиливают деконденсацию хроматина в конце митоза. Повышенная экспрессия LEMD1 может быть связана с митозом быстрорастущих раковых клеток. Yuki, D. et al. Yuki, D. et al, Isolation of LEM Domain-Containing 1, a Novel Testis-specific Gene Expressed in Colorectal Cancers. Oncology reports 12, 275-280 (2004). Были идентифицированы шесть изоформ LEMD1, от LEMD1A до LEMD1F.
[0007] Представляют интерес вакцины для лечения и профилактики рака. Однако существующие вакцины, нацеленные на антигены опухолевых клеток, ограничены из-за слабой экспрессии антигена in vivo. Соответственно, в данной области техники остается потребность в безопасных и эффективных вакцинах и способах их применения для предотвращения и/или лечения рака и снижения смертности у субъектов, страдающих от рака.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0008] В данном документе раскрыты молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из (a) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотные остатки от 19 до 198 SEQ ID NO: 2; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотные остатки от 19 до 84 SEQ ID NO: 4; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотные остатки от 19 до 198 и от 206 до 271 SEQ ID NO: 6; (г) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент, включающий по меньшей мере 90% полной длины белка, содержащего аминокислотные остатки от 19 до 198 SEQ ID NO: 2; (д) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент, включающий по меньшей мере 90% полной длины белка, содержащего аминокислотные остатки от 19 до 84 SEQ ID NO: 4; (е) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент, включающий по меньшей мере 90% полной длины белка, содержащего аминокислотные остатки от 19 до 198 и от 206 до 271 SEQ ID NO: 6; (ж) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок, который на более чем 95,6% идентичный аминокислотным остаткам от 19 до 198 SEQ ID NO: 2; (з) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок, который на более чем 95,5% идентичный аминокислотным остаткам от 19 до 84 SEQ ID NO: 4; (и) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок, который по меньшей мере, на 95% идентичный аминокислотным остаткам от 19 до 198 и от 206 до 271 SEQ ID NO: 6; (к) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент, включающий по меньшей мере 90% полной длины белка, который на более чем 95,6% идентичный аминокислотным остаткам от 19 до 198 SEQ ID NO: 2; (л) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент, включающий по меньшей мере 90% полной длины белка, который на более чем 95,5% идентичный аминокислотным остаткам от 19 до 84 SEQ ID NO: 4; и (1) последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент, включающий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере, 95% идентичный аминокислотным остаткам от 19 до 198 и от 206 до 271 SEQ ID NO: 6.
[0009] Предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, которые содержат одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из (a) нуклеотидов от 55 до 600 SEQ ID NO: 1; (б) нуклеотидов от 55 до 258 SEQ ID NO: 3; (в) нуклеотидов от 55 до 594 и от 616 до 819 SEQ ID NO: 5; (г) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотиды от 55 до 600 SEQ ID NO: 1; (д) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотиды от 55 до 258 SEQ ID NO: 3; (е) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотиды от 55 до 594 и от 616 до 819 SEQ ID NO: 5; (ж) фрагмента по меньшей мере на 95% идентичного нуклеотидам от 55 до 600 SEQ ID NO: 1; (з) фрагмента по меньшей мере на 95% идентичного нуклеотидам от 55 до 258 SEQ ID NO: 3; (и) фрагмента по меньшей мере на 95% идентичного нуклеотидам от 55 до 594 и от 616 до 819 SEQ ID NO: 5; (к) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере, на 95% идентична нуклеотидам от 55 до 600 SEQ ID NO: 1; (л) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере, на 95% идентична нуклеотидам от 55 до 258 SEQ ID NO: 3; и (1) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична нуклеотидам от 55 до 594 и от 616 до 819 SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, изложенную в SEQ ID NO: 1, 3 или 5.
[0010] Также предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, согласно настоящему описанию, при этом молекула нуклеиновой кислоты включена в плазмиду или вектор. В некоторых вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты может быть функционально связана с регуляторным элементом, выбранным из промотора и сигнала полиаденилирования. В некоторых вариантах воплощения промотор представляет собой немедленный ранний промотор цитомегаловируса человека (промотор hCMV). В других вариантах воплощения сигнал полиаденилирования может представлять собой сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (bGH poly A). В других вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты может быть включена в вирусный вектор.
[0011] Также предлагаются композиции, которые содержат одну или более молекул нуклеиновой кислоты, как изложено в данном документе. В некоторых аспектах эти композиции дополнительно содержат фармацевтически приемлемый носитель.
[0012] Также в данном документе предлагаются белки и пептиды, включающие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (a) аминокислотных остатков от 19 до 198 SEQ ID NO: 2; (б) аминокислотных остатков от 19 до 84 SEQ ID NO: 4; (в) аминокислотных остатков от 19 до 198 и от 206 до 271 SEQ ID NO: 6; (г) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотных остатков от 19 до 198 SEQ ID NO: 2; (д) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотных остатков от 19 до 84 SEQ ID NO: 4; (е) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотных остатков от 19 до 198 и от 206 до 271 SEQ ID NO: 6; (ж) аминокислотной последовательности, более чем на 95,6% идентичной аминокислотным остаткам от 19 до 198 SEQ ID NO: 2; (з) аминокислотной последовательности, более чем на 95,5% идентичной аминокислотным остаткам от 19 до 84 SEQ ID NO: 4; и) аминокислотной последовательности по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотным остаткам от 19 до 198 и от 206 до 271 SEQ ID NO: 6; (к) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотной последовательности, более чем на 95,6% идентичной аминокислотным последовательностям от 19 до 198 SEQ ID NO: 2; (л) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотной последовательности, более чем на 95,5% идентичной аминокислотным последовательностям от 19 до 84 SEQ ID NO: 4; и (1) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотной последовательности по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотным последовательностям от 19 до 198 и от 206 до 271 SEQ ID NO: 6.
[0013] Также в данном документе предлагаются вакцины, содержащие антиген, который включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (a) аминокислотных остатков от 19 до 198 SEQ ID NO: 2; (б) аминокислотных остатков от 19 до 84 SEQ ID NO: 4; (в) аминокислотных остатков от 19 до 198 и от 206 до 271 SEQ ID NO: 6; (г) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотных остатков от 19 до 198 SEQ ID NO: 2; (г) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотных остатков от 19 до 84 SEQ ID NO: 4; (е) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотных остатков от 19 до 198 и от 206 до 271 SEQ ID NO: 6; (ж) аминокислотной последовательности, более чем на 95,6% идентичной аминокислотным остаткам от 19 до 198 SEQ ID NO: 2; (з)аминокислотной последовательности, более чем на 95,5% идентичной аминокислотным остаткам от 19 до 84 SEQ ID NO: 4; (и) аминокислотной последовательности по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотным остаткам от 19 до 198 и от 206 до 271 SEQ ID NO: 6; (к) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотной последовательности, более чем на 95,6% идентичной аминокислотным последовательностям от 19 до 198 SEQ ID NO: 2; (л) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотной последовательности, более чем на 95,5% идентичной аминокислотным последовательностям от 19 до 84 SEQ ID NO: 4; и (1) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотной последовательности по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотным последовательностям от 19 до 198 и от 206 до 271 SEQ ID NO: 6.
[0014] В некоторых вариантах воплощения антиген вакцины кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из (a) нуклеотидов от 55 до 600 SEQ ID NO: 1; (б) нуклеотидов от 55 до 258 SEQ ID NO: 3;(c) нуклеотидов от 55 до 594 и от 616 до 819 SEQ ID NO: 5; (г) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотиды от 55 до 600 SEQ ID NO: 1; (г) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотиды от 55 до 258 SEQ ID NO: 3; (е) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотиды от 55 до 594 и от 616 до 819 SEQ ID NO: 5; (ж) фрагмента по меньшей мере на 95% идентичного нуклеотидам от 55 до 600 SEQ ID NO: 1; (з)фрагмента по меньшей мере на 95% идентичного нуклеотидам от 55 до 258 SEQ ID NO: 3; (и) фрагмента по меньшей мере на 95% идентичного нуклеотидам от 55 до 594 и от 616 до 819 SEQ ID NO: 5; (к) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична нуклеотидам от 55 до 600 SEQ ID NO: 1; (л) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична нуклеотидам от 55 до 258 SEQ ID NO: 3; и (м) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична нуклеотидам от 55 до 594 и от 616 до 819 SEQ ID NO: 1.
[0015] Предлагаются дополнительные вакцины, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, при этом молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую идентичность по меньшей мере приблизительно 95% по всей длине последовательности нуклеиновой кислоты, указанной в SEQ ID NO: 1, 3 или 5.
[0016] Также в настоящем документе раскрыты вакцины, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, при этом молекула нуклеиновой кислоты кодирует пептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую идентичность по меньшей мере приблизительно 95% по всей длине аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2, 4, или 6. В некоторых вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой вектор экспрессии. В некоторых вариантах воплощения вакцина дополнительно содержит фармацевтически приемлемый наполнитель или адъювант.
[0017] Также раскрыты вакцины, которые содержат пептид, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую идентичность по меньшей мере приблизительно на 90% по всей длине аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 4 или 6.
[0018] В данном документе также предложены способы лечения субъекта с использованием раковой клетки, экспрессирующей LEMD1, включающие введение терапевтически эффективного количества вакцины, представленной в настоящем документе.
[0019] Способы вакцинации субъекта против раковой клетки, экспрессирующей LEMD1, включающие введение количества вакцины, согласно настоящему описанию, эффективного для индукции гуморального иммунного ответа.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
ФИГ. 1A
1B
[0020]  является выравниванием последовательности аминокислот 19-198 синтетического консенсусного LEMD1A (SEQ ID NO: 1) с нативным человеческим LEMD1A (SEQ ID NO: 11). ФИГ. представляет идентичность последовательности и расхождение между нативным и синтетическим консенсусным LEMD1A.
ФИГ. 2
[0021]  является схематическим представлением синтетического консенсусного LEMD1A.
ФИГ. 3
[0022]  иллюстрирует стратегию клонирования, используемую для генерации pGXl43l.
ФИГ. 4A
ФИГ. 4B
[0023]  является выравниванием последовательности аминокислот 19-84 синтетического консенсусного LEMD1F (SEQ ID NO: 4) с нативным человеческим LEMD1F (SEQ ID NO: 12).  представляет идентичность последовательности и расхождение между нативным и синтетическим консенсусным LEMD1F.
ФИГ. 5
[0024]  является схематическим представлением синтетического консенсусного LEMD1F.
ФИГ. 6
[0025]  иллюстрирует стратегию клонирования, используемую для генерации GXl432.
ФИГ. 7
[0026]  является схематическим представлением синтетического консенсусного LEMD1AF.
ФИГ. 8
[0027]  иллюстрирует стратегию клонирования, используемую для генерации pGXl433.
ФИГ. 9
[0028]  показывает вестерн-блоттинг для определения экспрессии синтетического консенсусного LEMD1A, LEMD1F и LEMD1AF, сгенерированного, соответственно, из конструкций pGXl43l, pGXl432 и pGXl433, в клетках рабдомиосаркомы.
ФИГ. 10
[0029]  изображает стратегию гейтирования при помощи проточной цитометрии для характеристики клеточных иммунных ответов.
ФИГ. 11A, ФИГ. 11B и ФИГ. 11C
[0030]  графически иллюстрируют, соответственно, иммуногенность синтетического консенсусного LEMD1A, синтетического консенсусного LEMD1F и синтетического консенсусного LEMD1AF.
ФИГ. 12A, ФИГ. 12B и ФИГ.
12C
ФИГ. 12D
ФИГ. 12E
[0031]  графически иллюстрируют относительную частоту Т-клеток CD4 +, индуцированных, соответственно, синтетическим консенсусным LEMD1A, синтетическим консенсусным LEMD1F и синтетическим консенсусным LEMD1AF.  сравнивает относительную частоту Т-клеток CD4 +, индуцированных синтетическим консенсусным LEMD1A и синтетическим консенсусным LEMD1F.  иллюстрирует профиль цитокинов, индуцированный синтетическими консенсусными LEMD1A, LEMD1F и LEMD1AF в компартменте Т-клеток CD4 +.
ФИГ. 13A, ФИГ. 13B и ФИГ. 13C
ФИГ. 13D
ФИГ. 13E
[0032]  графически иллюстрируют цитолитический потенциал антигенспецифических T-клеток CD4+CDl07a +, индуцированных, соответственно, синтетическим консенсусным LEMD1A, синтетическим консенсусным LEMD1F и синтетическим консенсусным LEMD1AF.  сравнивает относительную частоту Т-клеток CD4+ CDl07a+, индуцированных синтетическим консенсусным LEMD1A и синтетическим консенсусным LEMD1F.  иллюстрирует профиль цитокинов, индуцированных в CD4+ CDl07a+ при помощи pGXl43l, pGXl432 и pGXl433.
ФИГ. 14A, ФИГ. 14B и ФИГ. 14C
ФИГ. 14D
ФИГ. 14E
[0033]  графически иллюстрируют относительные частоты Т-клеток CD8 +, индуцированных LEMD1A (синтетический консенсусный pGXl43l), LEMD1F (синтетический консенсусный pGXl432) и LEMD1AF (синтетический консенсусный pGXl433). сравнивает относительную частоту Т-клеток CD8 +, индуцированных синтетическим консенсусным LEMD1A и синтетическим консенсусным LEMD1F.  иллюстрирует профиль цитокинов, индуцированный синтетическими консенсусными LEMD1A, LEMD1F и LEMD1AF в компартменте CD8+Т-клеток.
ФИГ. 15A, ФИГ. 15B и ФИГ. 15C
ФИГ. 15D
ФИГ. 15E
[0034]  графически иллюстрируют цитолитический потенциал антигенспецифических T-клеток CD8+CDl07a +, индуцированных, соответственно, синтетическим консенсусным LEMD1A, синтетическим консенсусным LEMD1F и синтетическим консенсусным LEMD1AF.  сравнивает относительную частоту T-клеток CD8+CDl07a +, индуцированных синтетическим консенсусным LEMD1A и синтетическим консенсусным LEMD1F.  иллюстрирует профиль цитокинов, индуцированный у CD8+CDl07a+при помощи LEMD1A (синтетический консенсусный pGXl43l), LEMD1F (синтетический консенсусный pGXl432) и LEMD1AF (синтетический консенсусный pGXl433).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0035] Настоящее изобретение относится к вакцине, содержащей антиген LEMD1. LEMD1 экспрессируется во многих опухолях. Соответственно, вакцина предлагает лечение рака или опухоли на основе рака, экспрессирующей LEMD1. Вакцина по изобретению может обеспечить любую комбинацию конкретных раковых антигенов для конкретной профилактики или лечения рака у субъекта, который нуждается в лечении.
[0036] Одним из способов конструирования нуклеиновой кислоты и ее кодируемой аминокислотной последовательности рекомбинантного ракового антигена является введение мутаций, которые изменяют конкретные аминокислоты в общей аминокислотной последовательности нативного ракового антигена. Введение мутаций не настолько сильно изменяет раковый антиген, что его нельзя универсально применять у субъекта-млекопитающего и предпочтительно у субъекта-человека или собаки, но изменяет его настолько, что полученная аминокислотная последовательность нарушает толерантность или считается чужеродным антигеном в организме, для того чтобы вызывать иммунный ответ. Другим способом может быть создание консенсусного рекомбинантного ракового антигена, который имеет по меньшей мере от 85% и до 99% идентичности аминокислотной последовательности соответствующего нативного ракового антигена; предпочтительно по меньшей мере от 90% и до 98% идентичности последовательности; более предпочтительно по меньшей мере от 93% и до 98% идентичности последовательности; или даже более предпочтительно по меньшей мере от 95% и до 98% идентичности последовательности. В некоторых случаях рекомбинантный раковый антиген имеет идентичность аминокислотной последовательности 95, 96, 97, 98% или 99% по отношению к соответствующему нативному раковому антигену. Нативный антиген рака является антигеном, обычно ассоциированным с конкретным раком или раковой опухолью. В зависимости от ракового антигена консенсусная последовательность ракового антигена может встречаться у разных видов млекопитающих или в пределах подтипов вида, или среди вирусных штаммов или серотипов. Некоторые раковые антигены не сильно отличаются от аминокислотной последовательности дикого типа ракового антигена. Некоторые раковые антигены имеют последовательности нуклеиновых кислот/аминокислот, которые настолько различаются между видами, что консенсусная последовательность не может быть получена. В этих случаях генерируется рекомбинантный раковый антиген, который нарушает толерантность и генерирует иммунный ответ, который имеет идентичность аминокислотной последовательности по меньшей мере от 85% до 99% с соответствующим нативным антигеном рака; предпочтительно по меньшей мере от 90% и до 98% идентичности последовательности; более предпочтительно по меньшей мере от 93% и до 98% идентичности последовательности; или даже более предпочтительно по меньшей мере от 95% и до 98% идентичности последовательности. В некоторых случаях рекомбинантный раковый антиген имеет идентичность аминокислотной последовательности 95, 96, 97, 98% или 99% по отношению к соответствующему нативному антигену рака. Вышеупомянутые подходы могут быть объединены так, что конечный рекомбинантный раковый антиген имеет процентное сходство с аминокислотной последовательностью нативного ракового антигена, как обсуждалось выше.
[0037] Антиген LEMD1 может быть консенсусным антигеном LEMD1, полученным из последовательностей LEMD1 из разных видов или из разных изоформ в пределах вида, и, следовательно, консенсусный антиген LEMD1 не является нативным. Рекомбинантный LEMD1 может индуцировать антигенспецифические ответы Т-клеток и/или антител с высоким титром, тем самым индуцируя или вызывая иммунный ответ, который направлен против рака или опухоли или реагирует на рак или опухоль, экспрессирующую антиген. В некоторых вариантах воплощения индуцированный или вызванный иммунный ответ может представлять собой клеточный, гуморальный или оба, клеточный и гуморальный иммунные ответы. В некоторых вариантах воплощения индуцированный или вызванный клеточный иммунный ответ может включать индукцию или секрецию интерферона-гамма (IFN-γ) и/или фактора некроза опухолей-альфа (TNF-α). В других вариантах воплощения индуцированный или вызванный иммунный ответ может уменьшать или ингибировать один или более факторов иммуносупрессии, которые способствуют росту опухоли или рака, экспрессирующего антиген, например, но без ограничений, факторы, которые подавляют презентацию МНС, факторы, которые стимулируют антигенспецифичные регуляторные T-клетки (Tregs), PD-L1, FasL, цитокины, такие как IL-10 и TFG-b, связанные с опухолью макрофаги, связанные с опухолью фибробласты, растворимые факторы, продуцируемые иммуносупрессорными клетками, CTLA-4, PD- l, MDSCs, MCP-1 и молекула иммунной контрольной точки.
[0038] Вакцина может дополнительно комбинироваться с антителами к ингибиторам контрольной точки, такими как PD-1 и PDL-1, для усиления стимуляции как клеточного, так и гуморального иммунного ответа. Использование антител против PD-1 или против PDL-1 предотвращает подавление PD-1 или PDL-1 Т-клеточными и/или В-клеточными реакциями. В целом, проектирование антигенов рака, распознаваемых иммунной системой, помогает преодолеть другие формы иммуносупрессии опухолевыми клетками, и эти вакцины можно использовать в сочетании с терапией подавления или ингибирования (например, терапиями антител к PD-1 и антител к PDL-1) для дальнейшего увеличения Т-клеточных и/или В-клеточных ответов.
Определения
[0039] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимают специалисты в данной области техники. В случае конфликта, регулирование будет осуществляться настоящим документом, включая определения. Предпочтительные способы и материалы описаны ниже, хотя на практике или при тестировании настоящего изобретения могут использоваться способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в данном документе. Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие ссылки, упомянутые в данном документе, включены посредством ссылки во всей их полноте. Материалы, способы и примеры, раскрытые в данном документе, являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения. Используемая в документе терминология предназначена только для описания конкретных вариантов воплощения и не предназначена для ограничения.
[0040] Термины «включают(ет)», «содержат(ит)», «имеющий», «имеет», «может», «заключают(ет) в себе» и их варианты, в контексте данного документа, предназначены служить переходными фразами с открытым концом, терминами или словами, которые не исключают возможности дополнительных действий или структур. Формы единственного числа охватывают множественные ссылки, если контекст явно не предписывает иное. В настоящем описании также рассматриваются другие варианты воплощения, «содержащие», «состоящие из» и «состоящие по существу из» вариантов воплощения или элементов, представленных в данном документе, независимо от того, изложены они явно или нет.
[0041] Для перечисления числовых диапазонов в настоящем документе явным образом предусмотрено каждое промежуточное значение, имеющее ту же степень точности, что и минимум и максимум приведенного диапазона. Например, для диапазона 6-9 числа 7 и 8 рассматриваются в дополнение к 6 и 9, а для диапазона 6,0-7,0 числа 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 и 7,0 предусмотрены явным образом.
[0042] Термин «адъювант», используемый в настоящем документе, означает любую молекулу, добавленную к ДНК-плазмидным вакцинам, описанным в настоящем документе, для усиления иммуногенности антигенов, кодируемых ДНК-плазмидами, и кодирующих последовательностей нуклеиновых кислот, описанных в настоящем документе.
[0043] Термин «антитело» в данном описании означает антитело классов IgG, IgM, IgA, IgD или IgE или их фрагменты или производные, включая Fab, F(ab')2, Fd и одноцепочечные антитела, диатела, биспецифичные антитела, бифункциональные антитела и их производные. Антитело может представлять собой антитело, выделенное из образца сыворотки млекопитающего, поликлональное антитело, аффинное антитело или любую их смесь, которое проявляет достаточную специфичность связывания с желаемым эпитопом или полученной из него последовательностью.
[0044] Термин «антиген» относится к белкам, имеющим мутированные аминокислотные последовательности LEMD1, включая SEQ ID NO: 2, и их фрагменты с длинами, указанными в данном документе, такими как аминокислотные остатки от 19 до 198 SEQ ID NO: 2; варианты, то есть белки с последовательностями, идентичными SEQ ID NO: 2, как указано в настоящем документе, и фрагменты вариантов, имеющие указанные длины, и их комбинации. «Антиген» также относится к белкам, имеющим мутированные аминокислотные последовательности LEMD1, включая SEQ ID NO: 4, и их фрагменты с длинами, указанными в данном документе, такими как аминокислотные остатки от 19 до 84 SEQ ID NO: 4; варианты, то есть белки с последовательностями, идентичными SEQ ID NO: 4, как указано в данном документе, и фрагменты вариантов, имеющие длины, указанные в данном документе, и их комбинации. «Антиген» также относится к белкам, имеющим мутированные аминокислотные последовательности LEMD1, включая SEQ ID NO: 6, и их фрагменты с длинами, указанными в данном документе, такими как аминокислотные остатки от 19 до 198 и от 206 до 271 SEQ ID NO: 6; варианты, то есть белки с последовательностями, идентичными SEQ ID NO: 6, как указано в настоящем документе, и фрагменты вариантов, имеющих длины, указанные в настоящем документе, SEQ ID NO: 6, и их комбинации. Антигены могут необязательно включать сигнальные пептиды, такие как пептиды из других белков.
[0045] Термины «кодирующая последовательность» или «кодирующая нуклеиновая кислота», в контексте данного документа, означают нуклеиновые кислоты (молекулы РНК или ДНК), которые содержат нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок. Кодирующая последовательность может дополнительно включать сигналы инициации и терминации, функционально связанные с регуляторными элементами, включая промотор и сигнал полиаденилирования, способный направлять экспрессию в клетках субъекта или млекопитающего, которым вводят нуклеиновую кислоту.
[0046] Термины «комплементарность» или «комплементарный», используемые в данном документе, означают, что нуклеиновая кислота может означать спаривание оснований по Уотсону-Крику (например, A-T/U и C-G) или по Хугстину между нуклеотидами или нуклеотидными аналогами молекул нуклеиновой кислоты.
[0047] Термины «консенсусный» или «консенсусная последовательность», в контексте данного документа, означают полипептидную последовательность, основанную на анализе выравнивания множества последовательностей для одного и того же гена из разных организмов. Могут быть приготовлены последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют консенсусную полипептидную последовательность. Вакцины, содержащие белки, которые содержат консенсусные последовательности, и/или молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют такие белки, могут быть использованы для индукции широкого иммунитета против антигена.
[0048] Используемый в данном документе термин «постоянный ток» описывает ток, который воспринимается или испытывается тканью или клетками, определяющими указанную ткань, в течение воздействия электрического импульса, доставляемого в ту же ткань. Электрический импульс подается от устройств электропорации, описанных в данном документе. Плотность тока остается постоянной в указанной ткани в течение времени воздействия электрического импульса, поскольку устройство электропорации, предложенное в настоящем документе, имеет элемент обратной связи, предпочтительно обладающий мгновенной обратной связью. Элемент обратной связи позволяет измерять сопротивление ткани (или клеток) на протяжении всего времени воздействия импульса и заставлять устройство электропорации изменять выходную электрическую мощность (например, увеличивать напряжение) таким образом, чтобы плотность тока в одной и той же ткани оставалась постоянной в течение всего времени воздействия электрического импульса (порядка микросекунд) и от импульса к импульсу. В некоторых вариантах воплощения элемент обратной связи содержит контроллер.
[0049] Термины «обратная связь по току» или «обратная связь», в контексте данного документа, могут использоваться взаимозаменяемо и могут означать активную реакцию предоставленных устройств электропорации, которая включает измерение тока в ткани между электродами и соответствующее изменение выходной мощности, доставляемой устройством ЭП, для поддержания плотности тока на постоянном уровне. Этот постоянный уровень задается пользователем перед инициацией воздействия последовательности импульсов или электротерапии. Обратная связь может обеспечиваться компонентом электропорации, например, контроллером устройства электропорации, поскольку электрическая цепь в нем способна непрерывно контролировать ток в ткани между электродами и сравнивать этот контролируемый ток (или ток в ткани) с заданным током и непрерывно производить регулировку выходной энергии для поддержания контролируемого тока на заданных уровнях. Цикл обратной связи может быть мгновенным, поскольку он является аналоговой замкнутой обратной связью.
[0050] Термин «децентрализованный ток», используемый в данном документе, может означать схему электрических токов, подаваемых из различных наборов игольчатых электродов устройств электропорации, описанных в данном документе, при этом схемы минимизируют или предпочтительно устраняют возникновение теплового напряжения, связанного с электропорацией, в любой области ткани, подвергающейся электропорации.
[0051] «Электропорация», «электропермеабилизация» или «электрокинетическое усиление» («ЭП»), используемые в данном документе взаимозаменяемо, означают импульсное воздействие трансмембранного электрического поля для индукции микроскопических путей (пор) в биомембране; их присутствие позволяет биомолекулам, таким как плазмиды, олигонуклеотиды, миРНК, лекарственные средства, ионы и вода, проходить с одной стороны клеточной мембраны на другую.
[0052] Используемый в данном документе термин «фрагмент», в отношении последовательностей нуклеиновой кислоты, означает последовательность нуклеиновой кислоты или ее части, которая кодирует полипептид, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего, который перекрестно реагирует с антигеном, раскрытым в данном документе. Фрагменты могут представлять собой фрагменты ДНК, выбранные по меньшей мере из одной из различных нуклеотидных последовательностей, которые кодируют фрагменты белка, указанные ниже. Фрагменты могут содержать по меньшей мере 10% по меньшей мере 20% по меньшей мере 30% по меньшей мере 40% по меньшей мере 50% по меньшей мере 60% по меньшей мере 70% по меньшей мере 80% по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95% одной или более последовательностей нуклеиновых кислот, указанных ниже, за исключением добавления гетерологичного сигнального пептида. Фрагмент может содержать по меньшей мере 95% по меньшей мере 96% по меньшей мере 97% по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% одной или более последовательностей нуклеиновых кислот, указанных ниже, и дополнительно необязательно включать последовательность, кодирующую гетерологичный сигнальный пептид, который не учитывается при расчете процента идентичности. Фрагменты могут дополнительно содержать кодирующие последовательности для сигнального пептида, такого как сигнальный пептид иммуноглобулина, например сигнальный пептид IgE или IgG. Кодирующая последовательность, кодирующая N-концевой метионин и/или сигнальный пептид, может быть связана с фрагментом кодирующей последовательности.
[0053] В некоторых вариантах воплощения фрагменты могут содержать по меньшей мере, 20 нуклеотидов или более по меньшей мере 30 нуклеотидов или более по меньшей мере 40 нуклеотидов или более по меньшей мере 50 нуклеотидов или более по меньшей мере 60 нуклеотидов или более по меньшей мере 70 нуклеотидов или более по меньшей мере 80 нуклеотидов или более по меньшей мере 90 нуклеотидов или более по меньшей мере 100 нуклеотидов или более по меньшей мере 150 нуклеотидов или более по меньшей мере 200 нуклеотидов или более по меньшей мере 250 нуклеотидов или более по меньшей мере 300 нуклеотидов или более по меньшей мере 350 нуклеотидов или более по меньшей мере 400 нуклеотидов или более по меньшей мере 450 нуклеотидов или более по меньшей мере 500 нуклеотидов или более по меньшей мере 550 нуклеотидов или более по меньшей мере 600 нуклеотидов или более по меньшей мере 650 нуклеотидов или более по меньшей мере 700 нуклеотидов или более по меньшей мере 750 нуклеотидов или более по меньшей мере из одной из последовательностей нуклеиновых кислот, указанных ниже.
[0054] Термины «фрагмент» или «иммуногенный фрагмент», в отношении полипептидных последовательностей, означают полипептид, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего, который перекрестно реагирует с антигеном, раскрытым в данном документе. Фрагменты могут быть полипептидными фрагментами, выбранными из по меньшей мере одной из различных аминокислотных последовательностей, приведенных ниже. Фрагменты консенсусных белков могут содержать по меньшей мере 10% по меньшей мере 20% по меньшей мере 30% по меньшей мере 40% по меньшей мере 50% по меньшей мере 60% по меньшей мере 70% по меньшей мере 80% по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% консенсусного белка, исключая добавление любого гетерологичного сигнального пептида. Фрагмент может содержать по меньшей мере 95% по меньшей мере 96% по меньшей мере 97% по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% одной или более аминокислотных последовательностей, указанных ниже, и дополнительно необязательно содержать гетерологичный сигнальный пептид, который не учитывается при расчете процента идентичности. Фрагменты могут дополнительно содержать сигнальный пептид, такой как сигнальный пептид иммуноглобулина, например, сигнальный пептид IgE или IgG.
[0055] В некоторых вариантах воплощения фрагменты консенсусных белков могут содержать по меньшей мере 20 аминокислот или более по меньшей мере 30 аминокислот или более по меньшей мере 40 аминокислот или более по меньшей мере 50 аминокислот или более по меньшей мере 60 аминокислот или более по меньшей мере 70 аминокислот или более по меньшей мере 80 аминокислот или более по меньшей мере 90 аминокислот или более по меньшей мере 100 аминокислот или более по меньшей мере 110 аминокислот или более по меньшей мере 120 аминокислот или более по меньшей мере 130 аминокислот или более по меньшей мере 140 аминокислот или более по меньшей мере 150 аминокислот или более по меньшей мере 160 аминокислот или более по меньшей мере 170 аминокислот или более по меньшей мере 180 аминокислот или более по меньшей мере 190 аминокислот кислоты или более по меньшей мере 200 аминокислот или более по меньшей мере 210 аминокислот или более по меньшей мере 220 аминокислот или более по меньшей мере 230 аминокислот или более по меньшей мере 240 аминокислот или более по меньшей мере 250 аминокислот или более или по меньшей мере 260 аминокислот или более белковой последовательности, раскрытой в данном документе.
[0056] Используемый в данном документе термин «генетическая конструкция» относится к молекулам ДНК или РНК, которые содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую белок. Кодирующая последовательность включает сигналы инициации и терминации, функционально связанные с регуляторными элементами, включая сигнал промотора и полиаденилирования, способный направлять экспрессию в клетках субъекта, которому вводят молекулу нуклеиновой кислоты. Используемый в данном документе термин «экспрессируемая форма» относится к генной конструкции, которая содержит необходимые регуляторные элементы, функционально связанные с кодирующей последовательностью, кодирующей белок, при наличии которых в клетке субъекта, кодирующая последовательность будет экспрессироваться.
[0057] Используемый в данном документе термин «гомология» относится к степени комплементарности. Может существовать частичная гомология или полная гомология (то есть идентичность). Частично комплементарная последовательность, которая по меньшей мере частично ингибирует гибридизацию полностью комплементарной последовательности с нуклеиновой кислотой-мишенью, относится к использованию функционального термина «по существу гомологичный». При использовании в отношении последовательности двухцепочечной нуклеиновой кислоты, такой как кДНК или геномный клон термин «по существу гомологичный», используемый в данном документе, относится к зонду, который может гибридизироваться с цепью двухцепочечной последовательности нуклеиновой кислоты в условиях низкой жесткости. При использовании в отношении последовательности одноцепочечной нуклеиновой кислоты термин «по существу гомологичный», в контексте данного документа, относится к зонду, который может гибридизироваться (то есть является комплементарным последовательности) с одноцепочечной матричной последовательностью нуклеиновой кислоты в условиях низкой жесткости.
[0058] Термины «идентичный» или «идентичность», используемые в данном документе, относительно двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов, означают, что последовательности имеют определенный процент остатков, которые являются одинаковыми в указанной области. Процент может быть рассчитан путем оптимального выравнивания двух последовательностей, сравнения двух последовательностей в указанной области, определения количества позиций, в которых одинаковый остаток встречается в обеих последовательностях, для получения количества совпадающих позиций, деления количества совпавших позиций на общее количество позиций в указанной области и умножение результата на 100, чтобы получить процент идентичности последовательности. В тех случаях, когда две последовательности имеют разную длину или выравнивание приводит к одному или более ступенчатым концам и указанная область сравнения включает в себя только одну последовательность, остатки одной последовательности включаются в знаменатель, но не в числитель вычисления. При сравнении ДНК и РНК тимин (T) и урацил (U) можно считать эквивалентными. Идентификация может быть выполнена вручную или с помощью компьютерного алгоритма последовательности, такого как BLAST или BLAST 2.0.
[0059] Термин «импеданс», в контексте данного документа, может использоваться при рассмотрении в деталях механизма обратной связи и может быть преобразован в текущее значение в соответствии с законом Ома, что позволяет проводить сравнение с заданным током.
[0060] Термин «иммунный ответ», в контексте данного документа, означает активацию иммунной системы хозяина, например, млекопитающего, в ответ на введение антигена. Иммунный ответ может быть в форме клеточного или гуморального ответа, или обоих.
[0061] Термины «нуклеиновая кислота», или «олигонуклеотид», или «полинуклеотид», в контексте данного документа, означают, что по меньшей мере два нуклеотида, ковалентно связаны друг с другом. Описание одной цепи также определяет последовательность дополнительной цепи. Таким образом, нуклеиновая кислота также охватывает комплементарную цепь описанной единственной цепи. Многие варианты нуклеиновой кислоты могут быть использованы для той же цели, что и данная нуклеиновая кислота. Таким образом, нуклеиновая кислота также включает по существу идентичные нуклеиновые кислоты и их дополнения. Одна цепь обеспечивает зонд, который может гибридизироваться с последовательностью-мишенью в жестких условиях гибридизации. Таким образом, нуклеиновая кислота также включает зонд, который гибридизируется в жестких условиях гибридизации.
[0062] Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными или могут содержать части как двухцепочечной, так и одноцепочечной последовательности. Нуклеиновая кислота может быть ДНК, как геномной, так и кДНК, РНК или гибридной нуклеиновой кислотой, при этом нуклеиновая кислота может содержать комбинации дезоксирибо- и рибонуклеотидов и комбинации оснований, включая урацил, аденин, тимин, цитозин, гуанин, инозин, ксантин, гипоксантин, изоцитозин и изогуанин. Нуклеиновые кислоты могут быть получены с помощью способов химического синтеза или посредством рекомбинантных способов.
[0063] Термин «функционально связанный», в контексте данного документа, означает, что экспрессия гена находится под контролем промотора, с которым он пространственно связан. Промотор может быть расположен 5 '(слева) или 3' (справа) от гена, находящегося под его контролем. Расстояние между промотором и геном может быть приблизительно таким же, как расстояние между этим промотором и геном, который он контролирует в гене, из которого происходит промотор. Как известно в данной области техники, изменение этого расстояния может быть адаптировано без утраты функции промотора.
[0064] Используемые в данном документе термины «пептид», «белок» или «полипептид» могут означать связанную последовательность аминокислот и могут быть природным, синтетическим или быть модификацией или комбинацией природного и синтетического.
[0065] Термин «промотор», в контексте данного документа, означает синтетическую молекулу или молекулу природного происхождения, которая способна придавать, активировать или усиливать экспрессию нуклеиновой кислоты в клетке. Промотор может содержать одну или более специфических регуляторных транскрипционных последовательностей для дополнительного усиления экспрессии и/или изменения пространственной экспрессии и/или временной экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке. Промотор также может содержать дистальные энхансерные или репрессорные элементы, которые могут находиться на расстоянии до нескольких тысяч пар оснований от сайта начала транскрипции. Промотор может быть получен из источников, включая вирусные, бактериальные, грибковые, растительные, насекомые и животные. Промотор может регулировать экспрессию генного компонента конститутивно или дифференциально по отношению к клетке, ткани или органу, в котором происходит экспрессия, или относительно стадии развития, на которой происходит экспрессия, или в ответ на внешние раздражители, такие как физиологические стрессы, патогены, ионы металлов или индуцирующие агенты. Репрезентативные примеры промоторов включают промотор бактериофага Т7, промотор бактериофага Т3, промотор SP6, оператор-промотор lac, промотор tac, поздний промотор SV40, ранний промотор SV40, промотор RSV-LTR, промотор CMV IE, ранний промотор SV40 или поздний промотор SV40 и промотор CMV IE.
[0066] Термины «сигнальный пептид» и «лидерная последовательность» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к аминокислотной последовательности, которая может быть связана на амино-конце белка, предложенного в данном документе. Сигнальные пептиды/лидерные последовательности обычно направляют локализацию белка. Используемые в данном документе сигнальные пептиды/лидерные последовательности предпочтительно облегчают секрецию белка из клетки, в которой он продуцируется. Сигнальные пептиды/лидерные последовательности часто отщепляются от остатка белка, часто называемого зрелым белком, при секреции из клетки. Сигнальные пептиды/лидерные последовательности связаны на амино-конце (то есть на N-конце) белка.
[0067] Термин «жесткие условия гибридизации», в контексте данного документа, означает условия, при которых первая последовательность нуклеиновой кислоты (например, зонд) будет гибридизироваться со второй последовательностью нуклеиновой кислоты (например, мишенью), такой как сложная смесь нуклеиновых кислот. Жесткие условия зависят от последовательности и будут различными в разных обстоятельствах. Жесткие условия могут быть выбраны так, чтобы они были приблизительно на 5-10°С ниже, чем температура плавления (Tm) для конкретной последовательности при определенном рН и ионной силе. Tm может быть температурой (при определенной ионной силе, pH и концентрации нуклеиновых кислот), при которой 50% зондов, комплементарных мишени, гибридизируются с последовательностью-мишенью в равновесии (так как последовательности мишени присутствуют в избытке, при Tm, 50% зондов заняты в равновесном состоянии). Жесткие условия могут быть такими, при которых концентрация соли составляет менее чем приблизительно 1,0 М иона натрия, например, концентрация приблизительно 0,01-1,0 М иона натрия (или других солей) при рН 7,0-8,3, и температура составляет по меньшей мере приблизительно 30°С для коротких зондов (например, приблизительно 10-50 нуклеотидов) и по меньшей мере приблизительно 60°С для длинных зондов (например, больше, чем приблизительно 50 нуклеотидов). Жесткие условия также могут быть достигнуты путем добавления дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Для селективной или специфической гибридизации положительный сигнал может по меньшей мере в 2-10 раз превышать фоновую гибридизацию. Примерные жесткие условия гибридизации включают следующие: 50% формамид, 5x SSC и 1% SDS, инкубирование при 42°C или 5x SSC, 1% SDS, инкубирование при 65°C, с промыванием в 0,2x SSC и 0,1% SDS при 65°С.
[0068] Термин «субъект» в данном описании может означать млекопитающее, которое требует или нуждается в иммунизации описанными в данном документе вакцинами. Млекопитающее может быть человеком, шимпанзе, собакой, кошкой, лошадью, коровой, мышью или крысой.
[0069] Термин «практически комплементарный», в контексте данного документа, означает, что первая последовательность по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 , 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% идентична комплементу цепи второй последовательности в области 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540 или более нуклеотидов или аминокислот, или что две последовательности гибридизируются в жестких условиях гибридизации.
[0070] «По существу идентичный», как используется в данном документе, означает, что первая и вторая последовательности по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% идентичны в области 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540 или более нуклеотидов или аминокислот или по отношению к нуклеиновым кислотам, если первая последовательность по существу комплементарна комплементу второй последовательности.
[0071] Термины «лечить», «лечение» или «лечащийся», используемые в данном документе, могут означать защиту животного от заболевания посредством предотвращения, подавления, сдерживания или полного устранения заболевания. Предотвращение заболевания включает введение вакцины по настоящему изобретению животному до начала заболевания. Подавление заболевания включает введение вакцины по настоящему изобретению животному после индукции заболевания, но до его клинического проявления. Сдерживание заболевания включает введение вакцины по настоящему изобретению животному после клинического проявления заболевания.
[0072] Термин «вариант», используемый в данном документе в отношении нуклеиновой кислоты, означает (и) часть или фрагмент указанной нуклеотидной последовательности; (ii) комплемент эталонной нуклеотидной последовательности или ее части; (iii) нуклеиновую кислоту, которая по существу идентична указанной нуклеиновой кислоте или ее комплементу; или (iv) нуклеиновую кислоту, которая гибридизируется в жестких условиях с указанной нуклеиновой кислотой, ее комплементом или последовательностью, по существу идентичной ей.
[0073] «Вариант» в контексте настоящего описания в отношении пептида или полипептида означает пептид или полипептид, который отличается по аминокислотной последовательности вставкой, делецией или консервативным замещением аминокислот, но сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность. Вариант также может означать белок с аминокислотной последовательностью, которая по существу идентична референтному белку с аминокислотной последовательностью, которая сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность. Консервативное замещение аминокислоты, то есть замена аминокислоты другой аминокислотой со схожими свойствами (например, гидрофильностью, степенью и распределением заряженных областей), в данной области техники обычно признается незначительным изменением. Эти незначительные изменения могут быть идентифицированы, частично, с учетом индекса гидрофобности аминокислот, как понятно в данной области техники. Kyte et al, J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982). Индекс гидрофобности аминокислоты основан на учете ее гидрофобности и заряда. В данной области техники известно, что аминокислоты с подобными индексами гидрофобности могут быть замещены и при этом сохранять функцию белка. В одном аспекте аминокислоты, имеющие индексы гидрофобности ± 2, являются замещенными. Гидрофильность аминокислот также может быть использована для выявления замен, которые приводят к тому, что белки сохраняют биологическую функцию. Рассмотрение гидрофильности аминокислот в контексте пептида позволяет рассчитать наибольшую локальную среднюю гидрофильность этого пептида, что является полезной мерой, которая, как сообщалось, хорошо коррелирует с антигенностью и иммуногенностью. Патент США № 4554101 включен в данный документ полностью посредством ссылки. Замена аминокислот, имеющих сходные значения гидрофильности, может привести к тому, что пептиды сохраняют биологическую активность, например иммуногенность, как понятно в данной области техники. Замены могут быть выполнены аминокислотами, имеющими значения гидрофильности в разницей в ± 2. И индекс гидрофобности, и значение гидрофильности аминокислот зависят от конкретной боковой цепи этой аминокислоты. В соответствии с этим наблюдением считается, что аминокислотные замены, которые совместимы с биологической функцией, зависят от относительного сходства аминокислот и, в частности, от боковых цепей этих аминокислот, что проявляется в гидрофобности, гидрофильности, заряде, размере и других свойствах.
[0074] Вариант может представлять собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая по существу идентична по всей длине полной последовательности гена или ее фрагмента. Последовательность нуклеиновой кислоты может составлять 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичности по всей длине генной последовательности или ее фрагмента. Вариант может представлять собой аминокислотную последовательность, которая по существу идентична по всей длине аминокислотной последовательности или ее фрагмента. Аминокислотная последовательность может составлять 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности или ее фрагмента.
[0075] Термин «вектор», в контексте данного документа, означает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую источник репликации. Вектор может представлять собой вирусный вектор, бактериофаг, бактериальную искусственную хромосому или дрожжевую искусственную хромосому. Вектор может быть вектором ДНК или РНК. Вектор может быть самореплицирующимся внехромосомным вектором и предпочтительно представляет собой плазмиду ДНК. Вектор может содержать или включать одну или более гетерологичных последовательностей нуклеиновых кислот.
Вакцина
[0076] В данном документе предложены вакцины, содержащие антиген LEMD1 или нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген LEMD1, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах воплощения вакцины содержат одну или более молекул нуклеиновой кислоты, которые кодируют антиген LEMD1, как описано в данном документе. В некоторых вариантах воплощения вакцины содержат одну или более молекул нуклеиновых кислот, которые включают последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислоты. В некоторых вариантах воплощения одна или более молекул нуклеиновой кислоты кодируют антиген. В некоторых вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты содержит одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из (a) нуклеотидов от 55 до 600 SEQ ID NO: 1; (б) нуклеотидов от 55 до 258 SEQ ID NO: 3; (в) нуклеотидов от 55 до 594 и от 616 до 819 SEQ ID NO: 5; (г) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотиды от 55 до 600 SEQ ID NO: 1; (г) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотиды от 55 до 258 SEQ ID NO: 3; (е) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотиды от 55 до 594 и от 616 до 819 SEQ ID NO: 5; (ж) фрагмента по меньшей мере на 95% идентичного нуклеотидам от 55 до 600 SEQ ID NO: 1; (з)фрагмента по меньшей мере на 95% идентичного нуклеотидам от 55 до 258 SEQ ID NO: 3; (и) фрагмента по меньшей мере на 95% идентичного нуклеотидам от 55 до 594 и от 616 до 819 SEQ ID NO: 5; (к) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична нуклеотидам от 55 до 600 SEQ ID NO: 1; (л) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична нуклеотидам от 55 до 258 SEQ ID NO: 3; и (1) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична нуклеотидам от 55 до 594 и от 616 до 819 SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты кодирует белки и пептиды, включающие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (a) аминокислотных остатков от 19 до 198 SEQ ID NO: 2; (б) аминокислотных остатков от 19 до 84 SEQ ID NO: 4; (в) аминокислотных остатков от 19 до 198 и от 206 до 271 SEQ ID NO: 6; (г) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотных остатков от 19 до 198 SEQ ID NO: 2; (г) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотных остатков от 19 до 84 SEQ ID NO: 4; (е) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотных остатков от 19 до 198 и от 206 до 271 SEQ ID NO: 6; (ж) аминокислотной последовательности, более чем на 95,6% идентичной аминокислотным остаткам от 19 до 198 SEQ ID NO: 2; (з)аминокислотной последовательности, более чем на 95,5% идентичной аминокислотным остаткам от 19 до 84 SEQ ID NO: 4; (и) аминокислотной последовательности по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотным остаткам от 19 до 198 и от 206 до 271 SEQ ID NO: 6; (к) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотной последовательности, более чем на 95,6% идентичной аминокислотным последовательностям от 19 до 198 SEQ ID NO: 2; (л) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотной последовательности, более чем на 95,5% идентичной аминокислотным последовательностям от 19 до 84 SEQ ID NO: 4; и (1) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотной последовательности по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотным последовательностям от 19 до 198 и от 206 до 271 SEQ ID NO: 6.
[0077] В некоторых аспектах настоящего изобретения вакцина содержит антиген, который включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (a) аминокислотных остатков от 19 до 198 SEQ ID NO: 2; (б) аминокислотных остатков от 19 до 84 SEQ ID NO: 4; (в) аминокислотных остатков от 19 до 198 и от 206 до 271 SEQ ID NO: 6; (г) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотных остатков от 19 до 198 SEQ ID NO: 2; (г) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотных остатков от 19 до 84 SEQ ID NO: 4; (е) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотных остатков от 19 до 198 и от 206 до 271 SEQ ID NO: 6; (ж) аминокислотной последовательности, более чем на 95,6% идентичной аминокислотным остаткам от 19 до 198 SEQ ID NO: 2; (з)аминокислотной последовательности, более чем на 95,5% идентичной аминокислотным остаткам от 19 до 84 SEQ ID NO: 4; (и) аминокислотной последовательности по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотным остаткам от 19 до 198 и от 206 до 271 SEQ ID NO: 6; (к) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотной последовательности, более чем на 95,6% идентичной аминокислотным последовательностям от 19 до 198 SEQ ID NO: 2; (л) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотной последовательности, более чем на 95,5% идентичной аминокислотным последовательностям от 19 до 84 SEQ ID NO: 4; и (1) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотной последовательности по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотным последовательностям от 19 до 198 и от 206 до 271 SEQ ID NO: 6.
[0078] В некоторых аспектах настоящего изобретения вакцина содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая представляет собой, в частности, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую идентичность по меньшей мере приблизительно 95% по всей длине последовательности нуклеиновой кислоты, указанной в SEQ ID NO: 1, 3 или 5. В некоторых аспектах вакцина содержит молекулу нуклеиновой кислоты, при этом молекула нуклеиновой кислоты кодирует пептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую идентичность по меньшей мере приблизительно 95,6%, 95,5% или 95% по всей длине аминокислотной последовательности указанной, соответственно в SEQ ID NO: 2, 4 или 6.
[0079] В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты, присутствующая в вакцине, содержит вектор экспрессии. В некоторых вариантах воплощения вакцина дополнительно содержит фармацевтически приемлемый наполнитель, а в некоторых вариантах воплощения вакцина дополнительно содержит адъювант, который в некоторых аспектах варианта воплощения может представлять собой IL-12, IL-15, IL-28 или RANTES.
[0080] В некоторых вариантах воплощения вакцина содержит пептид, при этом пептид содержит аминокислотную последовательность, имеющую идентичность по меньшей мере приблизительно 95,6%, 95,5% или 95% по всей длине аминокислотной последовательности, указанной, соответственно, в SEQ ID NO: 2, 4 или 6. В других вариантах воплощения вакцина содержит пептид, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 4 или 6.
[0081] Вакцины могут быть способны вызывать у субъекта иммунный ответ против антигена. Иммунный ответ может представлять собой терапевтический или профилактический иммунный ответ.
[0082] Вакцины могут быть использованы для защиты от рака, например, рака или опухоли, экспрессирующей LEMD1. Вакцины могут быть использованы для профилактики и/или лечения опухоли, экспрессирующей LEMD1, у субъекта, нуждающегося в этом. Вакцины могут вызывать клеточные ответы и/или ответы антителами против LEMD1 и против опухолей, экспрессирующих LEMD1.
[0083] Разработка противораковой вакцины, как описано в данном документе, включает идентификацию ракового антигена, например, LEMD1, который не распознается иммунной системой и является аутоантигеном. Идентифицированный раковый антиген изменяется в направлении от аутоантигена к чужеродному антигену для распознавания иммунной системой. Изменение структуры нуклеиновой кислоты и аминокислотной последовательности рекомбинантного ракового антигена индивидуума в направлении от своей структуры к чужеродному антигену нарушает толерантность иммунной системы в отношении антигена. Для нарушения толерантности к антигену рака могут быть применены более мероприятий по изменению структуры, как описано ниже.
[0084] Рекомбинантный раковый антиген вакцины не распознается как собственный, тем самым нарушается толерантность. Нарушение толерантности может индуцировать антигенспецифические ответы Т-клеток и/или антител с высоким титром, тем самым индуцируя или вызывая иммунный ответ, который направлен против рака или опухоли или реагирует на рак или опухоль, экспрессирующую антиген. В некоторых вариантах воплощения индуцированный или вызванный иммунный ответ может представлять собой клеточный, гуморальный или оба, клеточный и гуморальный иммунные ответы. В некоторых вариантах воплощения индуцированный или вызванный клеточный иммунный ответ может включать индукцию или секрецию интерферона-гамма (IFN-γ) и/или фактора некроза опухолей-альфа (TNF-α). В других вариантах воплощения индуцированный или вызванный иммунный ответ может уменьшать или ингибировать один или более факторов иммуносупрессии, которые способствуют росту опухоли или рака, экспрессирующего антиген, например, но без ограничений, факторы, которые подавляют презентацию МНС, факторы, которые стимулируют антигенспецифичные регуляторные T-клетки (Tregs), PD-L1, FasL, цитокины, такие как IL-10 и TFG-b, связанные с опухолью макрофаги, связанные с опухолью фибробласты, растворимые факторы, продуцируемые иммуносупрессорными клетками, CTLA-4, PD- l, MDSCs, MCP-1 и молекула иммунной контрольной точки.
[0085] Вакцина может увеличивать безопухолевую выживаемость на 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44% и 45%. Вакцина может снижать массу опухоли на 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59% и 60% после иммунизации. Вакцина может предотвращать и блокировать увеличение белка 1 хемоаттрактанта моноцитов (МСР-1), цитокина, секретируемого клетками-супрессорами миелоидного происхождения. Вакцина может увеличить выживаемость с опухолью на 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59% и 60%.
[0086] Вакцина может усиливать клеточный иммунный ответ у субъекта, которому вводят вакцину, от приблизительно в 50 раз до приблизительно в 6000 раз, от приблизительно в 50 раз до приблизительно в5500 раз, от приблизительно в 50 раз до приблизительно в 5000 раз, от приблизительно в 50 раз до приблизительно в 4500 раз, от приблизительно в 100 раз до приблизительно в 6000 раз, от приблизительно в 150 раз до приблизительно в 6000 раз, от приблизительно в 200 раз до приблизительно в 6000 раз, от приблизительно в 250 раз до приблизительно в 6000 раз или от приблизительно в 300 раз до приблизительно в 6000 раз по сравнению с клеточным иммунным ответом у субъекта, которому не вводили вакцину. В некоторых вариантах воплощения вакцина может усиливать клеточный иммунный ответ у субъекта, которому вводят вакцину, приблизительно в 50, 100, l50, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, l200, l300, l400, l500, l600, l700, 1800, 1900, 2000, 2l00, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5 l00, 5200, 5300, 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900 раз или в 6000 раз по сравнению с клеточным иммунным ответом у субъекта, которому не вводили вакцину.
[0087] Вакцина может увеличивать уровни интерферона гамма (IFN-γ) у субъекта, которому вводится вакцина от приблизительно в 50 раз до приблизительно в 6000 раз, от приблизительно в 50 раз до приблизительно в 5500 раз, от приблизительно в 50 раз до приблизительно в 5000 раз, от приблизительно в 50 раз до приблизительно в 4500 раз, от приблизительно в l00 раз до приблизительно в 6000 раз, от приблизительно в 150 раз до приблизительно в 6000 раз, от приблизительно в 200 раз до приблизительно в 6000 раз, от приблизительно в 250 раз до приблизительно в 6000 раз или от приблизительно в 300 раз до приблизительно в 6000 раз по сравнению с уровнями IFN-γ у субъекта, которому не вводили вакцину. В некоторых вариантах воплощения вакцина может увеличивать уровни IFN- γ у субъекта, которому вводили вакцину, приблизительно в 50, l00, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, l000, 1 l00, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2l00, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3l00, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4l00, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900 раз или в 6000 раз по сравнению с уровнями IFN-γ у субъекта, которому не вводили вакцину.
[0088] Вакцина может представлять собой ДНК-вакцину. ДНК-вакцины раскрыты в патентах США №№ 5593972, 5739118, 5817637, 5830876, 5962428, 5981505, 5580859, 5703055 и 5676594, которые полностью включены в данный документ посредством ссылки. ДНК-вакцина может дополнительно содержать элементы или реагенты, которые препятствуют ее интеграции в хромосому.
[0089] Вакцина может представлять собой РНК одного или более раковых антигенов. РНК-вакцина может быть введена в клетку.
[0090] Вакцина может представлять собой живую вакцину с ослабленным действием, вакцину, использующую рекомбинантные векторы для доставки антигена, субъединичные вакцины и гликопротеиновые вакцины, например, но без ограничения, вакцины, описанные в патентах США №№.: 4510245; 4797368; 4722848;4790987; 4920209; 5017487; 5077044; 5110587; 5112749; 5174993; 5223424; 5225336; 5240703; 5242829; 5294441; 5294548; 5310668; 5387744; 5389368; 5424065; 5451499; 5453364; 5462734; 5470734; 5474935; 5482713; 5591439; 5643579; 5650309; 5698202; 5955088; 6034298; 6042836; 6156319 и 6589529, которые полностью включены в данный документ посредством ссылки.
[0091] В некоторых вариантах воплощения вакцина может дополнительно содержать молекулярный адъювант, в некоторых случаях молекулярный адъювант может представлять собой IL-12, IL-15, IL-28, IL-31, IL-33 и/или RANTES, а в некоторых случаях молекулярный адъювант является ингибитором контрольной точки, включая направленный против антигена 4 типа, ассоциированного с антицитотоксическим действием Т-лимфоцитов (CTLA-4), против рецептора программируемой смерти-1 (PD-1) и против гена активации лимфоцитов (LAG-3). В некоторых вариантах воплощения вакцина нуклеиновой кислоты может дополнительно содержать кодирующую последовательность для молекулярного адъюванта, в некоторых случаях молекулярным адъювантом может быть IL-12, IL-15, IL-28, IL-31, IL-33 и/или RANTES, и в некоторых случаях молекулярный адъювант является ингибитором контрольной точки, включая направленный против антигена 4 типа, ассоциированного с антицитотоксическим действием Т-лимфоцитов (CTLA-4), против рецептора программируемой смерти-1 (PD-1) и против гена активации лимфоцитов (LAG-3). Кодирующая последовательность для IL-12, IL-15, IL-28, IL-31, IL-33 и/или RANTES может быть включена в одну или более молекул нуклеиновой кислоты, которые содержат кодирующую последовательность для одного или более антигенов. Кодирующая последовательность для IL-12, IL-15, IL-28, IL-31, IL-33 и/или RANTES может быть включена в отдельные молекулы нуклеиновой кислоты, такие как отдельная плазмида.
[0092] Вакцина по настоящему изобретению может обладать свойствами, необходимыми для эффективных вакцин, такими как безопасность, при которых сама вакцина не вызывает заболевания или смерти; защищать от болезней; индуцировать нейтрализующие антитела; индуцировать защитные ответы Т-клеток; и обеспечивать простоту введения, обладать небольшим количеством побочных эффектов, биологической стабильностью и низкой стоимости на дозу. Вакцина может достигать некоторых или всех из этих характеристик путем содержания антиген рака, как обсуждается ниже.
[0093] Вакцина может дополнительно содержать один или более ингибиторов одной или более молекул иммунной контрольной точки (то есть ингибитора иммунной контрольной точки). Молекулы иммунной контрольной точки описаны ниже более подробно. Ингибитором иммунной контрольной точки является любая нуклеиновая кислота или белок, которые предотвращают подавление любого компонента в иммунной системе, такого как презентация классами MHC, презентация и/или дифференцировка Т-клеток, презентация и/или дифференцировка В-клеток, любого цитокина, хемокина или передачи сигналов для пролиферации и/или дифференцировки иммунных клеток. Как также более подробно описывается ниже, вакцина может дополнительно комбинироваться с антителами к ингибиторам контрольной точки, таким как PD-1 и PDL-1, для усиления стимуляции как клеточного, так и гуморального иммунного ответа. Использование антител против PD-1 или против PDL-1 предотвращает подавление Т-клеточными и/или В-клеточными реакциями PD-1 или PDL-1.
Антиген
[0094] Как описано выше, вакцина может содержать антиген LEMD1 или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антиген LEMD1. Антигеном может быть LEMD1, его фрагмент, его вариант или их комбинация.
[0095] Вакцина может быть использована для лечения субъектов, страдающих от рака, экспрессирующего LEMD1. Вакцина также может быть использована для лечения субъектов с раком или опухолями, которые экспрессируют LEMD1, или для предотвращения развития таких опухолей у субъектов. Антиген LEMD1 может отличаться от нативного «нормального» гена LEMD1 и, таким образом, обеспечивать терапию или профилактику в отношении опухоли, экспрессирующей антиген LEMD1. Соответственно, в данном документе предложены последовательности антигена LEMD1, которые отличаются от нативного гена LEMD1 (то есть мутированные гены или последовательности LEMD1). Например, в некоторых аспектах настоящего изобретения предлагается вакцина, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты, включающую последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 1, 3 или 5, и некоторые аспекты предлагают вакцину, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты, включающую последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 4 или 6. В некоторых аспектах вакцины, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, молекула нуклеиновой кислоты включает одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из (a) нуклеотидов от 55 до 600 SEQ ID NO: 1; (б) нуклеотидов от 55 до 258 SEQ ID NO: 3; (в) нуклеотидов от 55 до 594 и от 616 до 819 SEQ ID NO: 5; (г) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотиды от 55 до 600 SEQ ID NO: 1; (г) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотиды от 55 до 258 SEQ ID NO: 3; (е) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотиды от 55 до 594 и от 616 до 819 SEQ ID NO: 5; (ж) фрагмента по меньшей мере на 95% идентичного нуклеотидам от 55 до 600 SEQ ID NO: 1; (з)фрагмента по меньшей мере на 95% идентичного нуклеотидам от 55 до 258 SEQ ID NO: 3; (и) фрагмента по меньшей мере на 95% идентичного нуклеотидам от 55 до 594 и от 616 до 819 SEQ ID NO: 5; (к) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична нуклеотидам от 55 до 600 SEQ ID NO: 1; (л) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична нуклеотидам от 55 до 258 SEQ ID NO: 3; и (1) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична нуклеотидам от 55 до 594 и от 616 до 819 SEQ ID NO: 1.
[0096] Предлагаются изолированные молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие описанные выше гетерологичные последовательности. Предлагаются изолированные молекулы нуклеиновой кислоты, состоящие из описанных выше гетерологичных последовательностей. Изолированные молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие вышеописанные гетерологичные последовательности, могут быть включены в векторы, такие как плазмиды, вирусные векторы и другие формы молекул нуклеиновой кислоты, как описано ниже. В данном документе предложены последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют антигены LEMD1. Кодирующие последовательности, кодирующие антигены LEMD1, имеют последовательности, описанные выше.
[0097] Предлагаются молекулы белка, содержащие описанные выше гетерологичные аминокислотные последовательности. Предлагаются молекулы белка, состоящие из описанных выше гетерологичных аминокислотных последовательностей. В данном документе предлагаются белки и полипептиды, имеющие вышеописанные последовательности. Некоторые варианты воплощения настоящего изобретения предлагают белок, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (a) аминокислотных остатков от 19 до 198 SEQ ID NO: 2; (б) аминокислотных остатков от 19 до 84 SEQ ID NO: 4; (в) аминокислотных остатков от 19 до 198 и от 206 до 271 SEQ ID NO: 6; (г) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотных остатков от 19 до 198 SEQ ID NO: 2; (г) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотных остатков от 19 до 84 SEQ ID NO: 4; (е) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотных остатков от 19 до 198 и от 206 до 271 SEQ ID NO: 6; (ж) аминокислотной последовательности, более чем на 95,6% идентичной аминокислотным остаткам от 19 до 198 SEQ ID NO: 2; (з)аминокислотной последовательности, более чем на 95,5% идентичной аминокислотным остаткам от 19 до 84 SEQ ID NO: 4; (и) аминокислотной последовательности по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотным остаткам от 19 до 198 и от 206 до 271 SEQ ID NO: 6; (к) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотной последовательности, более чем на 95,6% идентичной аминокислотным последовательностям от 19 до 198 SEQ ID NO: 2; (л) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотной последовательности, более чем на 95,5% идентичной аминокислотным последовательностям от 19 до 84 SEQ ID NO: 4; и (1) фрагмента, включающего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотной последовательности по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотным последовательностям от 19 до 198 и от 206 до 271 SEQ ID NO: 6.
[0098] Белки и полипептиды могут относиться к антигенам LEMD1 и иммуногенам LEMD1. Антигены LEMD1 способны вызывать иммунный ответ против раковых клеток и опухолей, экспрессирующих антиген LEMD1.
[0099] В одном аспекте изобретения желательно, чтобы консенсусный антиген обеспечивал улучшенную транскрипцию и трансляцию, включая наличие одного или более из следующего: лидерная последовательность с низким содержанием GC для увеличения транскрипции; стабильность мРНК и оптимизация кодонов и устранение, насколько это возможно, мотивов цис-действующих последовательностей (т.е. внутренних TATA-боксов).
[0100] В некоторых аспектах изобретения желательно генерировать консенсусный антиген, который генерирует широкий иммунный ответ для нескольких штаммов, включая одно или более из следующего: включение всех доступных последовательностей полной длины; генерирование компьютером последовательностей, которые используют наиболее часто встречающуюся аминокислоту в каждой позиции; и увеличение перекрестной реактивности между штаммами.
[0101] Антиген LEMD1 может представлять собой консенсусную последовательность антигена (или иммуногена), полученную из двух или более видов. Антиген LEMD1 может содержать консенсусную последовательность и/или модификацию(и) для улучшения экспрессии. Модификация может включать оптимизацию кодонов, оптимизацию РНК, добавление последовательности Козак (например, GCC ACC) для увеличения инициации трансляции и/или добавление лидерной последовательности иммуноглобулина для увеличения иммуногенности антигена LEMD1. Антиген LEMD1 может содержать сигнальный пептид, такой как сигнальный пептид иммуноглобулина, например, без ограничений, сигнальный пептид иммуноглобулина E (IgE) или иммуноглобулина G (IgG). В некоторых вариантах воплощения консенсусный антиген LEMD1 может содержать метку гемагглютинина (HA). Консенсусный антиген LEMD1 может быть сконструирован так, чтобы вызывать более сильные и более широкие клеточные и/или гуморальные иммунные ответы, чем соответствующий оптимизированный по кодону антиген LEMD1.
[0102] Консенсусный антиген LEMD1 может содержать одну или более мутаций, вызывая тем самым более сильные и более широкие клеточные и/или гуморальные иммунные ответы, чем соответствующий оптимизированный по кодонам антиген LEMD1.
[0103] Консенсусный антиген LEMD1 может представлять собой нуклеотиды от 55 до 600 нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1, которая кодирует аминокислотные остатки от 19 до 198 SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах воплощения консенсусный антиген LEMD1 может представлять собой последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере приблизительно 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% идентичности по всей длине последовательности нуклеиновой кислоты, указанной в SEQ ID NO: 1. В других вариантах воплощения консенсусный антиген LEMD1 может представлять собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% идентичности по всей длине последовательности нуклеиновой кислоты, указанной в SEQ ID NO: 2.
[0104] Консенсусный антиген LEMD1 может представлять собой нуклеотиды от 55 до 258 нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 3, которая кодирует аминокислотные остатки от 19 до 84 SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах воплощения консенсусный антиген LEMD1 может представлять собой последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере приблизительно 80, 81, 82, 83, 84, 85 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% идентичности по всей длине последовательности нуклеиновой кислоты, указанной в SEQ ID NO: 3. В других вариантах воплощения консенсусный антиген LEMD1 может представлять собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% идентичности по всей длине последовательности нуклеиновой кислоты, указанной в SEQ ID NO: 4.
[0105] Консенсусный антиген LEMD1 может представлять собой нуклеотиды от 55 до 594 и от 616 до 819 нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 5, которая кодирует аминокислотные остатки от 19 до 198 и от 206 до 271 SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах воплощения консенсусный антиген LEMD1 может представлять собой последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере приблизительно 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98%, или 99% идентичности по всей длине последовательности нуклеиновой кислоты, указанной в SEQ ID NO: 5. В других вариантах воплощения консенсусный антиген LEMD1 может представлять собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% идентичности по всей длине последовательности нуклеиновой кислоты, указанной в SEQ ID NO: 6.
[0106] Антиген LEMD1 может содержать модификации для улучшения экспрессии. Модификация может включать оптимизацию кодонов, оптимизацию РНК, добавление последовательности Козак (например, GCC ACC) для увеличения инициации трансляции и/или добавление лидерной последовательности иммуноглобулина для повышения иммуногенности антигена. Антиген LEMD1 может содержать сигнальный пептид, такой как сигнальный пептид иммуноглобулина, например, без ограничений, сигнальный пептид иммуноглобулина E (IgE) или иммуноглобулина G (IgG).
[0107] Антиген LEMD1 может содержать модификации для оптимизации эпитопа. В некоторых вариантах воплощения такой сайт расщепления может быть вставлен между несколькими последовательностями антигена LEMD1. Сайт расщепления может быть сайтом расщепления фурином.
Вакцина в комбинации с ингибитором иммунной контрольной точки
[0108] Вакцина может дополнительно содержать один или более ингибиторов одной или более молекул иммунной контрольной точки (то есть ингибитора иммунной контрольной точки). Молекулы иммунной контрольной точки описаны ниже более подробно. Ингибитором иммунной контрольной точки является любая нуклеиновая кислота или белок, которые предотвращают подавление любого компонента в иммунной системе, такого как презентация классами MHC, презентация и/или дифференцировка Т-клеток, презентация и/или дифференцировка В-клеток, любого цитокина, хемокина или передачи сигналов для пролиферации и/или дифференцировки иммунной клетки.
[0109] Такой ингибитор может быть последовательностью нуклеиновой кислоты, аминокислотной последовательностью, небольшой молекулой или их комбинацией. Последовательность нуклеиновой кислоты может представлять собой ДНК, РНК, кДНК, их вариант, их фрагмент или их комбинацию. Нуклеиновая кислота может также включать дополнительные последовательности, которые кодируют последовательности линкера или метки, которые связаны с ингибитором иммунной контрольной точки пептидной связью. Малой молекулой может быть низкомолекулярное, например, менее 800 дальтон, органическое или неорганическое соединение, которое может служить субстратом фермента, лиганд (или его аналог), связанный с белком или нуклеиновой кислотой, или регулятор биологического процесса. Аминокислотная последовательность может быть белком, пептидом, его вариантом, его фрагментом или их комбинацией.
[0110] В некоторых вариантах воплощения ингибитор иммунной контрольной точки может представлять собой одну или более последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих антитело, его вариант, его фрагмент или их комбинацию. В других вариантах воплощения ингибитор иммунной контрольной точки может представлять собой антитело, его вариант, его фрагмент или их комбинацию.
1. Молекула иммунной контрольной точки
[0111] Молекула иммунной контрольной точки может быть последовательностью нуклеиновой кислоты, аминокислотной последовательностью, небольшой молекулой или их комбинацией. Последовательность нуклеиновой кислоты может представлять собой ДНК, РНК, кДНК, их вариант, их фрагмент или их комбинацию. Нуклеиновая кислота также может включать дополнительные последовательности, которые кодируют последовательности линкера или метки, которые связаны с ингибитором иммунной контрольной точки пептидной связью. Малой молекулой может быть низкомолекулярное, например, менее 800 дальтон, органическое или неорганическое соединение, которое может служить субстратом фермента, лиганд (или его аналог), связанный с белком или нуклеиновой кислотой, или регулятор биологического процесса. Аминокислотная последовательность может быть белком, пептидом, его вариантом, его фрагментом или их комбинацией.
a. PD-l и PD-Ll
[0112] Молекула иммунной контрольной точки может быть программированным белком 1 клеточной гибели (PD-1), лиганд 1 программированной клеточной гибели (PD-L1), его фрагмент, его вариант или их комбинацию. PD-1 представляет собой белок клеточной поверхности, кодируемый геном PDCD1. PD-1 является членом суперсемейства иммуноглобулинов и экспрессируется на Т-клетках и про-В-клетках и, таким образом, способствует участию и/или дифференцировке этих клеток. В частности, PD-1 является мембранным белком типа 1 семейства регуляторов Т-клеток CD28/CTLA-4 и отрицательно регулирует сигналы рецептора Т-клеток (TCR), тем самым отрицательно регулируя иммунные ответы. PD-1 может отрицательно регулировать ответы CD8+T-клеток и, таким образом, ингибировать цитотоксичность, опосредованную CD8, и усиливать рост опухоли.
[0113] PD-1 имеет два лиганда, PD-L1 и PD-L2, которые являются членами семейства B7. PD-L1 активируется на макрофагах и дендритных клетках (DC) в ответ на обработку LPS и GM-CSF, а также на T-клетках и B-клетках при передаче сигналов TCR и рецепторами B-клеток. PD-L1 экспрессируется многими опухолевыми клеточными линиями, включая миеломы, мастоцитомы и меланомы.
2. Антитело против молекулы иммунной контрольной точки
[0114] Как описано выше, ингибитор иммунной контрольной точки может представлять собой антитело. Антитело может связываться или реагировать с антигеном (то есть молекулой иммунной контрольной точки, описанной выше). Соответственно, антитело может рассматриваться как антитело против иммунной контрольной молекулы или антитело против молекулы иммунной контрольной точки. Антитело может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащейся в данном документе.
[0115] Антитело может включать полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи. Полипептид тяжелой цепи может включать вариабельную область тяжелой цепи (VH) и/или по меньшей мере одну константную область тяжелой цепи (CH). По меньшей мере, одна константная область тяжелой цепи может включать в себя константную область 1 тяжелой цепи (СН1), константную область 2 тяжелой цепи (СН2) и константную область 3 тяжелой цепи (СН3) и/или шарнирную область.
[0116] В некоторых вариантах воплощения полипептид тяжелой цепи может включать область VH и область CH1. В других вариантах воплощения полипептид тяжелой цепи может включать область VH, область CH1, шарнирную область, область CH2 и область CH3.
[0117] Полипептид тяжелой цепи может включать набор областей, определяющих комплементарность («CDR»). Набор CDR может содержать три гипервариабельные области VH. Исходя из N-конца полипептида тяжелой цепи, эти CDR обозначены, соответственно, как «CDR1», «CDR2» и «CDR3». CDR1, CDR2 и CDR3 полипептида тяжелой цепи могут способствовать связыванию или распознаванию антигена.
[0118] Полипептид легкой цепи может включать область вариабельной легкой цепи (VL) и /или область константной легкой цепи (CL). Полипептид легкой цепи может включать набор областей, определяющих комплементарность («CDR»). Набор CDR может содержать три гипервариабельные области VL. Исходя из N-конца полипептида легкой цепи, эти CDR обозначены, соответственно, как «CDR1», «CDR2» и «CDR3». CDR1, CDR2 и CDR3 полипептида легкой цепи могут способствовать связыванию или распознаванию антигена.
[0119] Антитело может содержать набор областей, определяющих комплементарность («CDR») легкой цепи и тяжелой цепи, и, соответственно, помещаться между набором каркасной области тяжелой цепи и легкой цепи («FR»), которые обеспечивают поддержку CDR и определяют пространственную взаимосвязь разных CDR относительно друг друга. Набор CDR может содержать три гипервариабельных участка V-области тяжелой или легкой цепи. Исходя из N-конца тяжелой или легкой цепи, эти области обозначены как, соответственно, «CDR1», «CDR2» и «CDR3». Следовательно, антигенсвязывающий сайт может включать шесть CDR, включающих набор CDR из каждой V-области тяжелой и легкой цепи.
[0120] Антитело может представлять собой иммуноглобулин (Ig). Ig может быть, например, IgA, IgM, IgD, IgE и IgG. Иммуноглобулин может включать полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи. Полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина может включать область VH, область CH1, шарнирную область, область CH2 и область CH3. Полипептид легкой цепи иммуноглобулина может включать область VL и область CL.
[0121] Кроме того, протеолитический фермент папаин предпочтительно расщепляет молекулы IgG с образованием нескольких фрагментов, два из которых (фрагменты F (ab)), каждый, содержит ковалентный гетеродимер, который включает интактный антигенсвязывающий сайт. Фермент пепсин способен расщеплять молекулы IgG с образованием нескольких фрагментов, включая фрагмент F(ab')2, который содержит оба антигенсвязывающих сайта. Соответственно, антитело может представлять собой Fab или F(ab')2. Fab может включать полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи. Полипептид тяжелой цепи Fab может включать область VH и область CH1. Легкая цепь Fab может включать область VL и область CL.
[0122] Антитело может представлять собой поликлональное или моноклональное антитело. Антитело может быть химерным антителом, одноцепочечным антителом, антителом со зрелой аффинностью, человеческим антителом, гуманизированным антителом или полностью человеческим антителом. Гуманизированное антитело может быть антителом нечеловеческого вида, которое связывает желаемый антиген, имеющий одну или более областей, определяющих комплементарность (CDR) из нечеловеческого вида, и каркасных областей молекулы человеческого иммуноглобулина.
a. Антитело PD-l
[0123] Антитело против иммунной контрольной точки может представлять собой антитело против PD-1 (также называемое в настоящем документе «антитело против PD-1»), его вариант, его фрагмент или их комбинацию. Антитело к PD-1 может представлять собой ниволумаб. Антитело против PD-1 может ингибировать активность PD-1, таким образом индуцируя, вызывая или усиливая иммунный ответ против опухоли или рака и уменьшая рост опухоли.
b. Антитело PD-L1
[0124] Антитело против иммунной контрольной точки может представлять собой антитело против PD- L1 (также называемое в настоящем документе «антитело против PD- L1»), его вариант, его фрагмент или их комбинацию. Антитело против PD- L1 может ингибировать активность PD- L1, таким образом индуцируя, вызывая или усиливая иммунный ответ против опухоли или рака и уменьшая рост опухоли.
Вектор
[0125] Вакцина может содержать один или более векторов, которые включают гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген LEMD1. Один или более векторов могут быть способны экспрессировать антиген в количестве, эффективном для вызывания иммунного ответа у млекопитающего. Вектор может содержать гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген. Вектор может иметь последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую источник репликации. Вектор может представлять собой плазмиду, бактериофаг, бактериальную искусственную хромосому или дрожжевую искусственную хромосому. Вектор может быть либо самовоспроизводящимся внехромосомным вектором, либо вектором, который интегрируется в геном хозяина.
[0126] Один или более векторов могут быть экспрессионной конструкцией, которая обычно представляет собой плазмиду, которая используется для введения специфического гена в клетку-мишень. Как только экспрессирующий вектор находится внутри клетки, белок, который кодируется геном, продуцируется рибосомными комплексами механизмов клеточной транскрипции и трансляции. Плазмиду часто конструируют так, чтобы она содержала регуляторные последовательности, которые действуют в области энхансера и промотора и приводят к эффективной транскрипции гена, переносимого на вектор экспрессии. Векторы по настоящему изобретению экспрессируют большие количества стабильной матричной РНК и, следовательно, белков.
[0127] Векторы могут иметь сигналы экспрессии, такие как сильный промотор, сильный кодон терминации, регулирование расстояния между промотором и клонированным геном и вставка последовательности терминации транскрипции и PTIS (портативная последовательность инициации трансляции).
[0128] Векторы могут содержать последовательности нуклеиновых кислот, функционально связанные с регуляторным элементом, выбранным из промотора и сигнала полиаденилирования. В некоторых вариантах воплощения промотор представляет собой немедленный ранний промотор цитомегаловируса человека (промотор hCMV). В некоторых вариантах воплощения сигнал полиаденилирования представляет собой сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (bGH poly A).
[0129] Вектор может представлять собой кольцевую плазмиду или линейную нуклеиновую кислоту. Кольцевая плазмида и линейная нуклеиновая кислота способны направлять экспрессию конкретной нуклеотидной последовательности в соответствующей клетке субъекта. Вектор может иметь промотор, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей антиген, который может быть функционально связан с сигналами терминации. Вектор также может содержать последовательности, необходимые для правильной трансляции нуклеотидной последовательности. Вектор, содержащий искомую нуклеотидную последовательность, может быть химерным, что означает, что по меньшей мере один из его компонентов является гетерологичным по отношению по меньшей мере к одному из его других компонентов. Экспрессия нуклеотидной последовательности в кассете экспрессии может находиться под контролем конститутивного промотора или индуцибельного промотора, который инициирует транскрипцию только тогда, когда на клетку-хозяина воздействует какой-то конкретный внешний стимул. В случае многоклеточного организма промотор также может быть специфичным для конкретной ткани или органа или стадии развития. Вектор может представлять собой плазмиду. Плазмида может быть полезна для трансфекции клеток нуклеиновой кислотой, кодирующей антиген, которую трансформированные клетки-хозяева культивируют и поддерживают в условиях, при которых происходит экспрессия антигена.
[0130] Плазмида может включать нуклеиновую кислоту, которая кодирует один или более различных антигенов, описанных выше, включая кодирующие последовательности, которые кодируют синтетический консенсусный антиген, способный вызывать иммунный ответ против антигена, фрагменты таких белков, варианты таких белков, фрагменты вариантов или слитые белки, которые состоят из комбинаций консенсусных белков и/или фрагментов консенсусного белка и/или вариантов консенсусного белка и/или фрагментов вариантов консенсусных белков.
[0131] Единичная плазмида может содержать кодирующую последовательность для одного антигена, кодирующую последовательность для двух антигенов, кодирующую последовательность для трех антигенов или кодирующую последовательность для четырех антигенов. В некоторых вариантах воплощения плазмида может дополнительно содержать кодирующую последовательность, которая кодирует CCR20 отдельно или как часть одной из этих плазмид. Аналогичным образом, плазмиды могут дополнительно содержать кодирующие последовательности для IL-12, IL-15 и/или IL-28.
[0132] Плазмида может дополнительно содержать инициирующий кодон, который может располагаться против хода транскрипции по отношению к кодирующей последовательности, и стоп-кодон, который может располагаться по ходу транскрипции по отношению к кодирующей последовательности. Кодон инициирования и терминации может находиться в рамке считывания с кодирующей последовательностью.
[0133] Плазмида также может содержать промотор, который функционально связан с кодирующей последовательностью. Промотор, функционально связанный с кодирующей последовательностью, может представлять собой промотор обезьяньего вируса 40 (SV40), промотор вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV), промотор вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), такой как промотор длинного терминального повтора (LTR) вируса иммунодефицита крупного рогатого скота (BIV), промотор вируса Молони, промотор вируса птичьего лейкоза (ALV), промотор цитомегаловируса (CMV), такой как немедленный ранний промотор CMV, промотор вируса Эпштейна-Барр (EBV) или промотор вируса саркомы Рауса (RSV). Промотор также может быть промотором человеческого гена, такого как человеческий актин, человеческий миозин, человеческий гемоглобин, человеческий мышечный креатин или человеческий металлотионеин. Промотор также может представлять собой тканеспецифичный промотор, такой как мышечный или кожный специфический промотор, природный или синтетический. Примеры таких промоторов описаны в публикации заявки на патент США № US 20040175727, содержание которой полностью включено в настоящий документ.
[0134] Плазмида также может содержать сигнал полиаденилирования, который может располагаться после кодирующей последовательности. Сигнал полиаденилирования может представлять собой сигнал полиаденилирования SV40, сигнал полиаденилирования LTR, сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (bGH), сигнал полиаденилирования человеческого гормона роста (hGH) или сигнал полиаденилирования β-глобина человека. Сигнал полиаденилирования SV40 может быть сигналом полиаденилирования от плазмиды pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA).
[0135] Плазмида также может содержать энхансер перед кодирующей последовательностью. Энхансером может быть человеческий актин, человеческий миозин, человеческий гемоглобин, человеческий мышечный креатин или вирусный усилитель, такой как усилитель CMV, FMDV, RSV или EBV. Усиления полинуклеотидной функции описаны в патентах США №№ 5593972, 5962428 и W094/016737, содержание каждого из которых полностью включено посредством ссылки.
[0136] Плазмида также может содержать источник репликации млекопитающего для поддержания внехромосомной плазмиды и получения множества копий плазмиды в клетке. Плазмида может представлять собой p V AXI, pCEP4 или pREP4 от Invitrogen (San Diego, CA), которая может включать источник репликации вируса Эпштейна-Барр и кодирующую область ядерного антигена EBNA-1, которая может продуцировать эписомальную репликацию большого количества копий без интеграции. Основой плазмиды может быть pA V0242. Плазмида может быть дефектной по репликации плазмидой аденовируса типа 5 (Ad5).
[0137] Плазмида также может содержать регуляторную последовательность, которая может хорошо подходить для экспрессии генов в клетке, в которую вводится плазмида. Кодирующая последовательность может содержать кодон, который может обеспечивать более эффективную транскрипцию кодирующей последовательности в клетке хозяина.
[0138] Кодирующая последовательность также может содержать лидерную последовательность Ig. Лидерная последовательность может быть последовательностью, кодирующей 5”. Консенсусные антигены, кодируемые этой последовательностью, могут содержать N-концевой лидерный Ig, за которым следует консенсусный антигенный белок. N-концевым лидерным Ig может быть IgE или IgG.
[0139] Плазмида может быть pSE420 (Invitrogen, San Diego, Калифорния), которая может использоваться для продуцирования белка в Escherichia coli (E.coli). Плазмида также может быть p YES2 (Invitrogen, San Diego, CA), которая может быть использована для продуцирования белка в штаммах дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Плазмида также может иметь полную систему экспрессии бакуловируса MAXBAC ™ (Invitrogen, San Diego, Калифорния), которая может быть использована для продуцирования белка в клетках насекомых. Плазмида также может представлять собой pcDNA I или pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Калифорния), которые могут быть использованы для продуцирования белка в клетках млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомячка (CHO). Вектор может представлять собой кольцевую плазмиду, которая может трансформировать клетку-мишень путем интеграции в клеточный геном или существовать внехромосомно (например, автономная реплицирующаяся плазмида с точкой начала репликации).
[0140] Вектором может быть pVAX, pcDNA3.0 или provax или любой другой вектор экспрессии, способный экспрессировать ДНК, кодирующую антиген, и позволяющий клетке транслировать последовательность в антиген, который распознается иммунной системой.
[0141] Также в данном документе предоставлена линейная вакцина на основе нуклеиновых кислот или кассета с линейной экспрессией («LEC»), которая способна эффективно доставляться субъекту посредством электропорации и экспрессии одного или более желаемых антигенов. LEC может представлять собой любую линейную ДНК, лишенную какого-либо фосфатного остова. ДНК может кодировать один или более антигенов. LEC может содержать промотор, интрон, стоп-кодон и/или сигнал полиаденилирования. Экспрессия антигена может контролироваться промотором. LEC может не содержать генов устойчивости к антибиотикам и/или фосфатного остова. LEC может не содержать других последовательностей нуклеиновых кислот, не связанных с желаемой экспрессией гена антигена. LEC может быть получен из любой плазмиды, способной к линеаризации. Плазмида может быть способной экспрессировать антиген. Плазмида может быть pNP (Puerto Rico/34) или pM2 (New Caledonia/99). Плазмида может быть WLV009, pVAX, pcDNA3.0 или provax или любым другим вектором экспрессии, способным экспрессировать ДНК, кодирующую антиген и позволяющую клетке транслировать последовательность в антиген, который распознается иммунной системой. LEC может быть pcrM2. LEC может быть pcrNP. pcrNP и pcrMR могут быть получены из, соответственно, pNP (Puerto Rico/34) и pM2 (New Caledonia/99).
[0142] Вектор может иметь промотор. Промотор может быть любым промотором, который способен управлять экспрессией гена и регулировать экспрессию выделенной нуклеиновой кислоты. Такой промотор представляет собой цис-действующий элемент последовательности, необходимый для транскрипции через ДНК-зависимую РНК-полимеразу, которая транскрибирует последовательность антигена, описанную в настоящем документе. Выбор промотора, используемого для прямой экспрессии гетерологичной нуклеиновой кислоты, зависит от конкретного применения. Промотор может быть расположен приблизительно на том же расстоянии от начала транскрипции в векторе, что и от начального сайта транскрипции в его естественной обстановке. Тем не менее, изменение этого расстояния может быть принято без потери функции промотора.
[0143] Промотор может быть функционально связан с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген и сигналы, необходимые для эффективного полиаденилирования транскрипта, сайтов связывания рибосом и терминации трансляции.
[0144] Промотор может представлять собой промотор CMV, ранний промотор SV40, поздний промотор SV40, металлотионеиновый промотор, промотор вируса опухоли молочной железы мыши, промотор вируса саркомы Рауса, промотор полиэдрина или другой промотор, продемонстрировавший эффективность для экспрессии в эукариотических клетках.
[0145] Вектор может включать энхансер и интрон с функциональными донорными и акцепторными сайтами сплайсинга. Вектор может содержать область терминации транскрипции, расположенную против хода транскрипции структурного гена для обеспечения эффективной терминации. Терминальная область может быть получена из того же гена, что и последовательность промотора, или может быть получена из разных генов.
Способы получения вектора
[0146] В настоящем документе представляются способы получения вектора, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антиген LEMD1, обсуждаемый в данном документе. Вектор, после заключительной стадии субклонирования в плазмиду экспрессии млекопитающего, может быть использован для инокуляции в культуры клеток в крупномасштабном ферментационном резервуаре с использованием известных в данной области способов.
[0147] Вектор для использования с устройствами ЭП, которые описаны ниже более подробно, может быть составлен или изготовлен с использованием комбинации известных устройств и технологий, но предпочтительно, чтобы они были изготовлены с использованием оптимизированной технологии изготовления плазмиды, которая описана в лицензированном документе - в одновременно находящейся на рассмотрении предварительной заявке США, серийный номер 60/939792, поданной 23 мая 2007 года. В некоторых примерах плазмиды ДНК, используемые в этих исследованиях, могут быть приготовлены в концентрациях, превышающих или равных 10 мг/мл. Технологии производства также включают или охватывают различные устройства и протоколы, которые широко известны специалистам в данной области техники, в дополнение к тем, которые описаны в заявке США, серийный номер 60/939792, включая те, которые описаны в лицензированном патенте США № 7238522, выданном 3 июля 2007 года. Вышеупомянутая заявка и патент, соответственно, серийный номер США 60/939792 и патент США № 7238,522 полностью включены в настоящий документ.
Вспомогательные вещества и другие компоненты вакцины
[0148] Вакцина может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый наполнитель. Фармацевтически приемлемый наполнитель может представлять собой функциональные молекулы, такие как наполнители, носители или разбавители. Фармацевтически приемлемый наполнитель может представлять собой агент, облегчающий трансфекцию, который может включать поверхностно-активные агенты, такие как иммуностимулирующие комплексы (ISCOMS), неполный адъювант Фрейнда, аналог LPS, включая монофосфориллипид A, мурамилпептиды, аналоги хинона, везикулы, такие как сквален и сквален, гиалуроновая кислота, липиды, липосомы, ионы кальция, вирусные белки, полианионы, поликатионы или наночастицы или другие известные агенты, облегчающие трансфекцию.
[0149] Агент, облегчающий трансфекцию, представляет собой полианион, поликатион, включая поли-L-глутамат (LGS), или липид. Средство, облегчающее трансфекцию, представляет собой поли-L-глутамат, и поли-L-глутамат может присутствовать в вакцине в концентрации менее 6 мг/мл. Агент, облегчающий трансфекцию, может также включать поверхностно-активные агенты, такие как иммуностимулирующие комплексы (ISCOMS), неполный адъювант Фрейнда, аналог LPS, включая монофосфориллипид А, мурамилпептиды, аналоги хинона и везикулы, такие как сквален и сквален, и гиалуроновая кислота также могут быть использованы в сочетании с генетической конструкцией. ДНК-плазмидные вакцины могут также включать агент, облегчающий трансфекцию, такой как липиды, липосомы, включая лецитиновые липосомы или другие липосомы, известные в данной области техники, в виде смеси ДНК-липосомы (см., например, W09324640), ионы кальция, вирусные белки, полианионы, поликатионы или наночастицы или другие известные агенты, облегчающие трансфекцию. Агент, облегчающий трансфекцию, представляет собой полианион, поликатион, включая поли-L-глутамат (LGS), или липид. Концентрация агента трансфекции в вакцине составляет менее 4 мг/мл, менее 2 мг/мл, менее 1 мг/мл, менее 0,750 мг/мл, менее 0,500 мг/мл, менее 0,250 мг/мл, менее 0,100 мг/мл, менее 0,050 мг/мл или менее 0,010 мг/мл.
[0150] Фармацевтически приемлемый наполнитель может представлять собой один или более адъювантов. Адъювант может представлять собой другие гены, которые экспрессируются в альтернативной плазмиде или доставляются в виде белков в комбинации с указанной выше плазмидой в вакцине. Один ибо более адъювантов могут быть выбраны из группы, состоящей из следующего: CCL20, α-интерферон (IFN-α), β-интерферон (IFN-β), γ-интерферон, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, эпидермальный фактор роста (EGF), кожный Т-клеточный хемокин (CTACK), эпителиальный тимус-экспрессированный хемокин (TECK), связанный с слизистой оболочкой эпителиальный хемокин (MEC), IL-12, IL-15, IL-28, MHC, CD80, CD86, IL-l, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, MCP-l, MIP-la, MIP-1~, IL-8, L-селектин, P-селектин, E-селектин, CD34, GlyCAM-l, MadCAM-l, LFA-l, VLA-l, Mac-l, pl50.95, PECAM, ICAM-l, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, мутантные формы IL-l 8, CD40, CD40L, фактор роста сосудов, фактор роста фибробластов, IL-7, фактор роста нервов, фактор роста эндотелия сосудов, Fas, рецептор TNF, Flt, Apo-l, p55, WSL-l, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DRS, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Каспазу ICE, Fos, c-jun, Sp-l, Ap-l, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, Неактивный NIK, SAP K, SAP-I, JNK, гены ответа на интерферон, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Оx40, Оx40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAPI, TAP2, IL-l5, имеющие сигнальную последовательность или кодирующую последовательность, которая кодирует удаленную сигнальную последовательность, и необязательно включающую в себя другой сигнальный пептид, такой как из IgE, или кодирующую последовательность, которая кодирует другой сигнальный пептид, такой как из IgE, и их функциональные фрагменты или их комбинацию. Адъювант может представляет собой IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, эпидермальный фактор роста (EGF), IL-l, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-l8 или их комбинацию.
[0151] В некоторых вариантах воплощения адъювант может представлять собой один или более белков и/или молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют белки, выбранных из группы, состоящей из: CCL-20, IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, MEC или RANTES. Примеры конструкций и последовательностей IL-12 раскрыты в заявке PCT №. PCT/US1997/019502 и соответствующей заявке США, серийный номер 08/956865, и в предварительной заявке США, серийный номер 61/569600, поданной 12 декабря 2011 г., каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки. Примеры конструкций и последовательностей IL-15 раскрыты в заявке PCT № PCT/US04/18962 и соответствующей заявке США серийный номер 10/560650, и в заявке PCT № PCT/US07/00886 и соответствующей заявке США, серийный № 12/160766, и в заявке PCT № PCT/USI0/048827, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки. Примеры конструкций и последовательностей IL-28 раскрыты в заявке PCT № PCT/US09/039648 и соответствующей заявке США, серийный номер 12/936192, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки. Примеры RANTES и других конструкций и последовательностей раскрыты в заявке PCT № PCT/US 1999/004332 и соответствующей заявке США, серийный номер 09/622452, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки. Другие примеры конструкций и последовательностей RANTES раскрыты в заявке PCT № PCT/US 11/024098, которая включена сюда посредством ссылки. Примеры RANTES и других конструкций и последовательностей раскрыты в заявке PCT № PCT/US1999/004332 и соответствующей заявке США, серийный номер 09/622452, каждая из которых включена сюда посредством ссылки. Другие примеры конструкций и последовательностей RANTES раскрыты в заявке PCT № PCT/US11/024098, которая включена сюда посредством ссылки. Примеры хемокинов, конструкций и последовательностей CTACK, TECK и MEC раскрыты в заявке PCT № PCT/US 2005/042231 и соответствующей заявке США, серийный № 11/719646, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки. Примеры ОX40 и других иммуномодуляторов раскрыты в заявке США № 10/560653, которая включена в настоящее описание посредством ссылки. Примеры DR5 и других иммуномодуляторов раскрыты в заявке США № 09/622452, которая включена в настоящее описание посредством ссылки.
[0152] Другие гены, которые могут быть полезны в качестве адъювантов, включают гены, кодирующие: MCP-l, MIP-la, MIP-lp, IL-8, RANTES, L-селектин, P-селектин, E-селектин, CD34, GlyCAM-l, MadCAM-l, LFA-l, VLA-l, Mac-l, pl50.95, PECAM, ICAM-l, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, мутантные формы IL-18, CD40, CD40L, фактор роста сосудов, фактор роста фибробластов, IL-7, IL-22, фактор роста нервов, фактор роста эндотелия сосудов, Fas, рецепор TNF, Flt, Apo-l, p55, WSL-l, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Каспазу ICE, Fos, c-jun, Sp-l, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, Неактивный NIK, SAP K, SAP-l, JNK, гены ответа на интерферон, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Оx40, Оx40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 и их функциональные фрагменты.
[0153] Вакцина может дополнительно включать агент, стимулирующий генетическую вакцину, как описано в заявке США, серийный номер 021579, поданной 1 апреля 1994 г., которая полностью включена посредством ссылки.
[0154] Вакцина может содержать антиген и плазмиды в количестве от приблизительно 1 нанограмма до 100 миллиграммов; от приблизительно 1 микрограмма до приблизительно 10 миллиграммов; или предпочтительно приблизительно от 0,1 микрограмма до приблизительно 10 миллиграммов; или более предпочтительно от приблизительно 1 миллиграмма до приблизительно 2 миллиграммов. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения вакцина согласно настоящему изобретению содержит от приблизительно 5 нанограммов до приблизительно 1000 микрограммов ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения вакцина может содержать от приблизительно 10 нанограммов до приблизительно 800 микрограммов ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения вакцина может содержать приблизительно от 0,1 до приблизительно 500 микрограммов ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения вакцина может содержать от приблизительно 1 до приблизительно 350 микрограммов ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения вакцина может содержать от приблизительно 25 до приблизительно 250 микрограммов, от приблизительно 100 до приблизительно 200 микрограммов, от приблизительно 1 нанограмма до 100 миллиграммов; от приблизительно 1 микрограмма до приблизительно 10 миллиграммов; от приблизительно 0,1 микрограмма до приблизительно 10 миллиграммов; от приблизительно 1 миллиграмма до приблизительно 2 миллиграммов, от приблизительно 5 нанограммов до приблизительно 1000 микрограммов, от приблизительно 10 нанограммов до приблизительно 800 микрограммов, от приблизительно 0,1 до приблизительно 500 микрограммов, от приблизительно 1 до приблизительно 350 микрограммов, от приблизительно 25 до приблизительно 250 микрограммов, от приблизительно 100 до приблизительно 200 микрограммов антигена или его плазмиды.
[0155] Вакцина может быть составлена в соответствии с применяемым способом введения. Фармацевтическая композиция для инъекционных вакцин может быть стерильной, апирогенной и не содержащей частиц. Можно использовать изотонический состав или раствор. Добавки для изотоничности могут включать хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Вакцина может содержать вазоконстриктор. Изотонические растворы могут включать забуференный фосфатом физиологический раствор. Вакцина может дополнительно содержать стабилизаторы, включая желатин и альбумин. Стабилизаторы могут обеспечивать стабильность состава при комнатной температуре или температуре окружающей среды в течение продолжительных периодов времени, включая LGS или поликатионы или полианионы.
Фармацевтические композиции вакцины
[0156] Вакцина может быть в форме фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция может содержать вакцину. Фармацевтические композиции могут содержать приблизительно от 5 нанограммов (нг) до приблизительно 10 миллиграммов (мг) ДНК вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержат приблизительно от 25 нг до приблизительно 5 мг ДНК вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 50 нг до приблизительно 1 мг ДНК вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 0,1 до приблизительно 500 микрограммов ДНК вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 1 до приблизительно 350 микрограммов ДНК вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 5 до приблизительно 250 микрограммов ДНК вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 10 до приблизительно 200 микрограммов ДНК вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 15 до приблизительно 150 микрограммов ДНК вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 20 до приблизительно 100 микрограммов ДНК вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 25 до приблизительно 75 микрограммов ДНК вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 30 до приблизительно 50 микрограммов ДНК вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 35 до приблизительно 40 микрограммов ДНК вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 100 до приблизительно 200 микрограммов ДНК вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 10 микрограммов до приблизительно 100 микрограммов ДНК вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 20 микрограммов до приблизительно 80 микрограммов ДНК вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 25 микрограммов до приблизительно 60 микрограммов ДНК вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 30 нг до приблизительно 50 микрограммов ДНК вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 35 нг до приблизительно 45 микрограммов ДНК вакцины. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 0,1 до приблизительно 500 микрограммов ДНК вакцины. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 1 до приблизительно 350 микрограммов ДНК вакцины. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 25 до приблизительно 250 микрограммов ДНК вакцины. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 100 до приблизительно 200 микрограммов ДНК вакцины.
[0157] В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению содержат по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 нг ДНК вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции могут содержать по меньшей мере 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895, 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 или 1000 микрограммов ДНК вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтическая композиция может содержать по меньшей мере 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 или 10 мг или более ДНК вакцины.
[0158] В других вариантах воплощения фармацевтическая композиция может включать до и включая 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 нг ДНК вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтическая композиция может включать до и включая 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895. 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 или 1000 микрограммов ДНК вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтическая композиция может включать до и включая 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 или 10 микрограммов ДНК вакцины.
[0159] Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать другие агенты для целей включения в состав в соответствии с используемым способом введения. В тех случаях, когда фармацевтические композиции представляют собой фармацевтические композиции для инъекций, они являются стерильными, апирогенными и не содержат твердых частиц. Предпочтительно использовать изотонический состав. Как правило, добавки для изотоничности могут включать хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. В некоторых случаях предпочтительными являются изотонические растворы, такие как забуференный фосфатом физиологический раствор. Стабилизаторы включают желатин и альбумин. В некоторых вариантах воплощения к препарату добавляют вазоконстриктор.
[0160] Вакцина может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый наполнитель. Фармацевтически приемлемый наполнитель может представлять собой функциональные молекулы, такие как наполнители, адъюванты, носители или разбавители. Фармацевтически приемлемый наполнитель может быть средством, облегчающим трансфекцию.
[0161] В некоторых вариантах воплощения агент, облегчающий трансфекцию, представляет собой полианион, поликатион, включая поли-L-глутамат (LGS), или липид. В одном варианте воплощения агент, облегчающий трансфекцию, представляет собой поли-L-глутамат, и более предпочтительно, поли-L-глутамат присутствует в вакцине в концентрации менее 6 мг/ мл. Агент, облегчающий трансфекцию, может также включать поверхностно-активные агенты, такие как иммуностимулирующие комплексы (ISCOMS), неполный адъювант Фрейнда, аналог LPS, включая монофосфориллипид А, мурамилпептиды, и аналоги хинона и везикулы, такие как сквален и сквален, и гиалуроновая кислота также могут быть использованы в сочетании с генетической конструкцией. В некоторых вариантах воплощения агент, облегчающий трансфекцию, может включать липиды, липосомы, в том числе лецитиновые липосомы или другие липосомы, известные в данной области техники, в виде смеси ДНК-липосомы (см., например, W09324640), ионы кальция, вирусные белки, полианионы, поликатионы или наночастицы или другие известные агенты, облегчающие трансфекцию. Концентрация трансфекционного агента в вакцине может составлять менее 4 мг /мл, менее 2 мг/мл, менее 1 мг/мл, менее 0,750 мг/мл, менее 0,500 мг/мл, менее 0,250 мг/мл, менее 0,100 мг/мл, менее 0,050 мг/мл или менее 0,010 мг/мл.
[0162] Фармацевтически приемлемый наполнитель может быть адъювантом. Адъювант может представлять собой другие гены, которые экспрессируются в одной или более альтернативных плазмид или доставляются в виде белков в комбинации с указанной выше плазмидой в вакцине. Адъювант может быть выбран из группы, состоящей из следующего: α-интерферон (IFN-α), β-интерферон (IFN-β), γ-интерферон, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, эпидермальный фактор роста (EGF), кожный Т-клеточный хемокин (CTACK), эпителиальный тимус-экспрессированный хемокин (TECK), связанный с слизистой оболочкой эпителиальный хемокин (MEC), IL-12, IL-15, MHC, CD80, CD86 включая IL-15 с удаленной сигнальной последовательностью и необязательно включающий сигнальный пептид из IgE. Адъювант может представлять собой IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, эпидермальный фактор роста (EGF), IL-l, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18 или их комбинацию. В примерном варианте воплощения адъювантом является IL-l 2.
[0163] Другие гены, которые могут быть полезными адъювантами, включают гены, кодирующие: MCP-l, MIP-la, MIP-lp, IL-8, RANTES, L-селектин, P-селектин, E-селектин, CD34, GlyCAM-l, MadCAM-l, LFA-l, VLA-l, Mac-l, pl50.95, PECAM, ICAM-l, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, мутантные формы IL-18, CD40, CD40L, фактор роста сосудов, фактор роста фибробластов, IL-7, фактор роста нервов, фактор роста эндотелия сосудов, Fas, рецептор TNF, Flt, Apo-l, p55, WSL-l, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Каспазу ICE, Fos, c-jun, Sp-l, Ap-l, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, Неактивный NIK, SAP K, SAP-l, JNK, гены ответа на интерферон, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Оx40, Оx40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 и их функциональные фрагменты.
Способы вакцинации
[0164] В настоящем документе предложены способы лечения и/или профилактики рака, экспрессирующего LEMD1, с использованием фармацевтических составов, описанных выше. Также в данном документе описаны способы применения фармацевтических составов, описанных выше, для лечения и/или профилактики рака у субъекта. В данном документе также описаны способы вакцинации субъекта. Также в данном документе описаны способы введения фармацевтических составов, описанных в данном документе, субъекту, нуждающемуся в этом. Описанные в данном документе способы, в совокупности называемые способами лечения с использованием фармацевтических составов, описанных в данном документе, могут включать введение одной или более вакцин, как описано в данном документе, субъекту, нуждающемуся в этом, для индукции терапевтического и/или профилактического иммунного ответа. Вакцина может быть введена субъекту для модуляции активности иммунной системы субъекта и усиления иммунного ответа. Введение вакцины может быть трансфекцией раковых антигенов, как описано в данном документе, в виде молекулы нуклеиновой кислоты, которая экспрессируется в клетке и доставляется на поверхность клетки, после чего иммунная система распознает их и индуцирует клеточный, гуморальный или клеточный и гуморальный ответ. Введение вакцины может быть использовано для того, чтобы индуцировать или вызывать иммунный ответ у субъектов против одного или более раковых антигенов, как описано в настоящем документе, путем введения субъекту вакцины, как указано выше в данном документе.
[0165] Вакцина может быть введена субъекту для модуляции активности иммунной системы субъекта, тем самым усиливая иммунный ответ. В некоторых вариантах воплощения субъектом является млекопитающее. При введении вакцины млекопитающему и тем самым введении вектора в клетки млекопитающего трансфицированные клетки будут экспрессировать и секретировать один или более раковых антигенов, как описано в данном документе. Эти секретируемые белки или синтетические антигены будут распознаваться иммунной системой как чужеродные, что приведет к возникновению иммунного ответа, который может включать: антитела, выработанные против одного или более раковых антигенов, и специфический ответ Т-клеток против одного или более раковых антигенов. В некоторых примерах млекопитающее, вакцинированное вакцинами, обсуждаемыми в данном документе, будет иметь примированную иммунную систему, и при заражении одним или более антигенов рака, как описано в настоящем документе, примированная иммунная система позволит быстро освободиться от последующих раковых антигенов, как описано в настоящем документе, независимо от того, будет ли это произведено через гуморальный, клеточный или через как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ.
[0166] Способы введения ДНК вакцины описаны в патентах США №№ 4945050 и 5036006, оба из которых полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.
[0167] Вакцина может быть введена млекопитающему, чтобы вызвать иммунный ответ у млекопитающего. Млекопитающее может быть человеком, приматом, не являющимся человеком, коровой, свиньей, овцой, козой, антилопой, бизоном, водяным буйволом, быком, оленем, ежом, слоном, ламой, альпакой, мышью, крысой и предпочтительно человеком, коровой или свиньей. Чтобы вызвать иммунный ответ вакцину также можно вводить субъекту, не являющемуся млекопитающим, например курице.
[0168] Доза вакцины может составлять от 1 мкг до 10 мг активного компонента на килограмм (кг) веса тела во времени (компонент/кг веса тела/время) и может составлять от 20 микрограммов до 10 мг компонента/кг веса тела/время. Вакцину можно вводить каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 дней или 31 день. Количество доз вакцины для эффективного лечения может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более доз.
Способы генерирования иммунного ответа при помощи вакцины
[0169] Вакцина может быть использована для генерирования иммунного ответа у субъекта млекопитающего или субъекта, не являющегося млекопитающим, включая терапевтический или профилактический иммунный ответ. Иммунный ответ может генерировать антитела и/или Т-клетки-киллеры, которые направлены на один или более раковых антигенов, как описано в данном документе. Такие антитела и Т-клетки могут быть изолированы.
[0170] Некоторые варианты воплощения предлагают способы генерирования иммунных ответов против одного или более раковых антигенов, как описано в данном документе, причем эти варианты воплощения включают введение вакцины субъекту. Некоторые варианты воплощения предлагают способы профилактической вакцинации субъекта против рака или опухоли, экспрессирующих один или более раковых антигенов, как описано выше, причем эти варианты воплощения включают введение вакцины. Некоторые варианты воплощения предлагают способы терапевтической вакцинации субъекта, который страдает от рака или опухоли, экспрессирующей один или более раковых антигенов, причем эти варианты воплощения включают введение вакцины. Диагностика рака или опухоли, экспрессирующих один или более раковых антигенов, как описано в данном документе, до введения вакцины может проводиться обычным способом.
Способы лечения рака при помощи вакцины
[0171] Вакцина может быть использована для генерирования или индукции иммунного ответа у млекопитающего, который реагирует или направлен на рак или опухоль (например, рак, опосредованный ВПЧ, эпителиальный рак яичников, меланома, рак головы и шеи, рак шейки матки, рак печени, рак простаты, раки крови, плоскоклеточный рак пищевода, рак желудка) млекопитающего или нуждающегося в этом субъекта. Вызванный иммунный ответ может предотвратить рак или рост опухоли.
[0172] Вызванный иммунный ответ может предотвращать и/или уменьшать метастазирование раковых или опухолевых клеток. Соответственно, вакцина может быть использована в способе, который лечит и/или предотвращает рак или опухоли у млекопитающего или субъекта, которому вводят вакцину. Обработанный рак или рост на основе опухоли может представлять собой любой тип рака, такой как, без ограничений, колоректальный рак.
[0173] В некоторых вариантах воплощения вводимая вакцина может опосредовать клиренс или предотвращать рост опухолевых клеток путем индуцирования (1) гуморального иммунитета посредством В-клеточных ответов для генерации антител, которые блокируют продукцию моноцитарного хемоаттрактантного белка-1 (МСР-1), тем самым задерживая клетки-супрессоры (MDSC), происходящие из миелоидных клеток, и вызывая подавление роста опухоли; (2) путем увеличения цитотоксических Т-лимфоцитов, таких как CD8 + (CTL), для атаки и уничтожения опухолевых клеток; (3) через увеличение ответов Т-хелперов; (4) и усиливая воспалительные реакции посредством IFN-γ и TFN-α или предпочтительно через все вышеупомянутое.
[0174] В некоторых вариантах воплощения иммунный ответ может генерировать гуморальный иммунный ответ и/или ответ антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), который не вызывает повреждения или воспаления различных тканей или систем (например, мозга или неврологической системы и т. д.) у субъекта, которому вводили вакцину.
[0175] В некоторых вариантах воплощения вводимая вакцина может увеличить выживаемость, уменьшить массу опухоли, или вызвать их комбинацию у субъекта. Вводимая вакцина может увеличить выживаемость без опухоли у субъекта на 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59% и 60%. Вводимая вакцина после иммунизации может уменьшить массу опухоли на 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69% и 70% у субъекта. Вводимая вакцина может предотвращать и блокировать опосредованный LEMD1 онкогенез и/или прогрессирование опухоли по сравнению с клеточным иммунным ответом у субъекта, которому не вводили вакцину. Вакцина может предотвращать и блокировать увеличение белка 1 хемоаттрактанта моноцитов (МСР-1), цитокина, секретируемого клетками-супрессорами миелоидного происхождения. Вакцина может повышать выживаемость с опухолью на 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59% и 60%.
[0176] В некоторых вариантах воплощения вакцину можно вводить на периферию (как описано более подробно ниже) для установления антигенспецифического иммунного ответа, направленного на раковые или опухолевые клетки или ткань, чтобы освободиться от рака или опухоли или устранить рак или опухоль, экспрессирующую один или более видов раковых антигенов, не повреждая и не вызывая заболевание или смерть у субъекта, которому вводят вакцину.
[0177] Вводимая вакцина может усиливать клеточный иммунный ответ у субъекта от приблизительно в 50 раз до приблизительно в 6000 раз, от приблизительно в 50 раз до приблизительно в 5500 раз, от приблизительно в 50 раз до приблизительно в 5000 раз, от приблизительно в 50 раз до приблизительно в 4500 раз, от приблизительно в 100 раз до приблизительно 6000 раз, от приблизительно в 150 раз до приблизительно в 6000 раз, от приблизительно в 200 раз до приблизительно в 6000 раз, от приблизительно в 250 до приблизительно в 6000 раз или от приблизительно в 300 раз до приблизительно в 6000 раз по сравнению с клеточным иммунным ответом у субъекта, которому не вводили вакцину. В некоторых вариантах воплощения вводимая вакцина может усиливать клеточный иммунный ответ у субъекта приблизительно в 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4l00, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900 раз или в 6000 раз по сравнению с клеточным иммунным ответом у субъекта, которому не вводили вакцину.
[0178] Вводимая вакцина может повышать уровни интерферона гамма (IFN-γ) у субъекта приблизительно от в 50 раз до приблизительно в 6000 раз, приблизительно от в 50 раз до приблизительно 5500 раз, от приблизительно в 50 раз до приблизительно в 5000 раз, от приблизительно в 50 раз до приблизительно в 4500 раз, от приблизительно в 100 раз до приблизительно в 6000 раз, от приблизительно в 150 раз до приблизительно в 6000 раз, от приблизительно в 200 раз до приблизительно в 6000 раз, от приблизительно в 250 раз до приблизительно в 6000 раз или от приблизительно в 300 раз до приблизительно в 6000 раз по сравнению на клеточным иммунным ответом у субъекта, которому не вводили вакцину. В некоторых вариантах воплощения вводимая вакцина может повышать уровни IFN-γ у субъекта приблизительно в 50, 100, l50, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, l200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900 раз или в 6000 раз по сравнению с клеточным иммунным ответом у субъекта, которому не вводили вакцину.
[0179] Доза вакцины может составлять от 1 мкг до 10 мг активного компонента на килограмм (кг) веса тела в период времени (компонент/кг веса тела/время) и может составлять от 20 микрограммов до 10 мг компонента/кг веса тела/время. Вакцина может быть введена каждый 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или 31 день. Количество доз вакцины для эффективного лечения может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более доз.
Пути введения
[0180] Вакцина или фармацевтическая композиция может вводиться различными путями, включая пероральный, парентеральный, сублингвальный, трансдермальный, ректальный, трансмукозальный, местный, посредством ингаляции, посредством буккального введения, внутриплевральный, внутривенный, внутриартериальный, внутрибрюшинный, подкожный, внутримышечный, интраназальный, интратекальный и/или внутрисуставной, или их комбинации. Для ветеринарного применения композицию можно вводить в виде удобной приемлемой композиции в соответствии с обычной ветеринарной практикой. Ветеринар может легко определить режим дозирования и путь введения, который наиболее подходит для конкретного животного. Вакцину можно вводить с помощью традиционных шприцев, безыгольных инъекционных устройств, «генных пушек с бомбардировкой микрочастицами» или других физических способов, таких как электропорация («ЭП»), «гидродинамический способ» или ультразвук.
[0181] Вектор вакцины может быть введен млекопитающему с помощью нескольких хорошо известных технологий, включая инъекцию ДНК (также называемую ДНК-вакцинацией) с электропорацией и без нее in vivo, трансфекцию, опосредованную липосомами, трансфекцию, стимулированную наночастицами, и использование рекомбинантных векторов, таких как рекомбинантный аденовирус, рекомбинантный аденовирус-ассоциированный вирус и рекомбинантная вакцинация. Один или более раковых антигенов вакцины можно вводить путем инъекции ДНК вместе с электропорацией in vivo.
Электропорация
[0182] Вакцина или фармацевтическая композиция могут вводиться путем электропорации. Введение вакцины посредством электропорации может быть выполнено с использованием устройств электропорации, которые могут быть сконфигурированы для доставки в желаемую ткань млекопитающего импульса энергии, эффективного для образования обратимых пор в клеточных мембранах, и предпочтительно импульс энергии представляет собой постоянный ток, соответствующий входящему току, заданному пользователем. Устройство электропорации может содержать компонент электропорации и электродный узел или узел ручного управления. Компонент электропорации может включать и охватывать один или более различных элементов устройств электропорации, в том числе: контроллер, генератор сигналов тока, тестер импеданса, регистратор сигналов, элемент ввода, элемент сообщения о состоянии, порт связи, компонент памяти, источник питания и выключатель. Электропорацию для облегчения трансфекции клеток плазмидой можно проводить с использованием устройства электропорации in vivo, например, системы CELLECTRA EP (Inovio Pharmaceuticals, Inc., Blue Bell, PA) или электропоратора Elgen (Inovio Pharmaceuticals, Inc.).
[0183] Примеры устройств электропорации и способов электропорации, которые могут облегчать введение ДНК-вакцин по настоящему изобретению, включают те, которые описаны в Патенте США № 7245963 авторов Draghia-Akli, et al, Патенте США публикация 2005/0052630, поданная Smith, et al, содержание которых полностью включено в данный документ посредством ссылки. Другие устройства электропорации и способы электропорации, которые можно использовать для облегчения введения ДНК-вакцин, включают в себя устройства, представленные в одновременно находящейся на рассмотрении и находящейся в совместном владении заявке на патент США, серийный № 11/874072, поданной 17 октября 2007 г., в которой заявлено преимущество согласно 35 USC 119(e) к предварительным заявкам США серийный № 60/852149, поданной 17 октября 2006 года, и серийный № 60/978982, поданной 10 октября 2007 года, и все они включены в настоящий документ в полном объеме.
[0184] Патент США № 7245963 авторов Draghia-Akli, et al. описывает модульные электродные системы и их использование для облегчения введения биомолекулы в клетки выбранной ткани организма или растения. Модульные электродные системы могут содержать множество игольчатых электродов; иглу для подкожных инъекций; электрический разъем, который обеспечивает проводящую связь от программируемого импульсного контроллера постоянного тока к множеству игольчатых электродов; и источник питания. Оператор может захватить множество игольчатых электродов, которые установлены на опорной конструкции, и плотно ввести их в выбранную ткань в теле или в растении. Затем биомолекулы вводят через подкожную иглу в выбранную ткань. Программируемый контроллер импульсов постоянного тока активируется, и электрический импульс постоянного тока подается на множество игольчатых электродов. Прилагаемый электрический импульс постоянного тока облегчает введение биомолекулы в ячейку между совокупностью электродов. Все содержание патента США № 7245963 полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.
[0185] Патентная публикация США 2005/0052630, поданная Smith, et al., описывает устройство электропорации, которое можно использовать для эффективного облегчения введения биомолекулы в клетки выбранной ткани организма или растения. Устройство электропорации содержит электрокинетическое устройство («устройство EKD»), работа которого задается внешним программным обеспечением или встроенным программным обеспечением. Устройство EKD создает серию программируемых последовательностей импульсов постоянного тока между электродами в матрице на основе пользовательского управления и ввода параметров импульсов и позволяет хранить и получать данные о форме сигнала тока. Устройство электропорации также содержит сменный электродный диск, имеющий ряд игольчатых электродов, центральный канал для инъекционной иглы и съемный направляющий диск. Все содержание патентной публикации США 2005/0052630 полностью включено посредством ссылки.
[0186] Матрицы электродов и способы, описанные в патенте США № 7245963 и в патентной публикации США 2005/0052630, можно адаптировать для глубокого проникновения не только в такие ткани, как мышцы, но и в другие ткани или органы. Из-за конфигурации матрицы электродов инъекционная игла (для деневрологической системы - выбранная биомолекула) также полностью вводится в орган-мишень, и инъекция вводится перпендикулярно целевой проблеме, в места, которые изначально заданы электродами. Электроды, описанные в патенте США № 7245963 и в патентной публикации США 2005/005263, предпочтительно 20 мм длиной и 21 калибра.
[0187] Кроме того, в некоторых вариантах воплощения, которые включают устройства электропорации и их использование, существуют устройства электропорации, которые описаны в следующих патентах: патент США 5273525, выданный 28 декабря 1993 г., патенты США 6 110 161, выданный 29 августа 2000 г., 6 261 281, выданный 17 июля, 2001 г., и 6 958 060, выданный 25 октября 2005 г., и в патенте США 6 939 862, выданном 6 сентября 2005 г. Кроме того, в настоящем документе рассматриваются патенты, охватывающие предмет, предоставленный в патенте США 6 697 669, выданном 24 февраля 2004 г., который касается введения ДНК с использованием любого из множества устройств, и патенте США 7 328 064, выданном 5 февраля 2008 г., который относится к способу введения ДНК. Вышеуказанные патенты включены посредством ссылки во всей их полноте.
Способы получения вакцины
[0188] В настоящем документе предложены способы получения плазмид ДНК, которые включают вакцины, обсуждаемые в данном документе. ДНК-плазмиды после заключительной стадии субклонирования в плазмиду экспрессии млекопитающих могут быть использованы для инокуляции культуры клеток в крупномасштабном ферментационном резервуаре, используя известные в данной области техники способы.
[0189] ДНК-плазмиды для использования с ЭП-устройствами по настоящему изобретению могут быть составлены или изготовлены с использованием комбинации известных устройств и технологий, но предпочтительно они изготавливаются с использованием оптимизированной технологии получения плазмиды, которая описана в опубликованной заявке США № 20090004716, поданной 23 мая 2007 г. В некоторых примерах плазмиды ДНК, используемые в этих исследованиях, могут быть приготовлены в концентрациях, превышающих или равных 10 мг/мл. Технологии производства также включают или охватывают различные устройства и протоколы, которые широко известны специалистам в данной области техники, в дополнение к тем, которые описаны в заявке на патент США серийный № 60/939792, включая те, которые описаны в лицензированном патенте США № 7238522, выданном 3 июля 2007 года. Вышеупомянутая заявка и патент США, соответственно, серийный номер 60/939792 и патент США № 7238522 полностью включены в настоящий документ.
[0190] Настоящее изобретение имеет множество аспектов, иллюстрируемых следующими неограничивающими примерами.
Примеры
[0191] Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано в следующих примерах. Следует понимать, что эти примеры, хотя и указывают предпочтительные варианты воплощения изобретения, приведены только в качестве иллюстрации. Из приведенного выше обсуждения и этих примеров специалист в данной области техники может определить основные характеристики этого изобретения и, не отступая от его сущности и объема, может внести различные изменения и модификации изобретения, чтобы адаптировать его к различным применениям и условиям. Таким образом, различные модификации изобретения в дополнение к тем, которые показаны и описаны в данном документе, будут очевидны для специалистов в данной области техники из предшествующего описания. Такие модификации также предназначены для попадания в объем прилагаемой формулы изобретения.
Пример 1
Консенсусный LEMD1
Консенсусный LEMD1A
[0192] С целью генерирования консенсусного LEMD1A человека из GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) были отобраны восемь последовательностей LEMD1A. Номера доступа GenBank для отобранных последовательностей: NP_00l185979.1; XP_003938379.l; XP_012314760.1; XP_002760754.2; XP _012513307.1; XP _011371293.1; XP_0l1221935.1 и XP_007086602.1.
[0193] Консенсусная последовательность была получена с помощью программного пакета DNASTAR Lasergene (версия 13.0.0.357). Восемь последовательностей, перечисленных выше, были импортированы в MegAlign и выровнены с использованием программы выравнивания множественных последовательностей ClustalW. Полученная последовательность LEMD1A имеет идентичность 97,2% с нативным LEMD1A человека.
Консенсусный LEMD1F
[0194] С целью генерирования консенсусного LEMD1F человека из GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) были отобраны шесть последовательностей LEMD1F. Номера доступа GenBank для отобранных последовательностей: NP_00l l8598l. l; XP_0l 1845800.1; XP _011813129.1; XP _010347273.1; XP_0l2314764.1 и XP _012513311.1.
[0195] Консенсусная последовательность была получена с помощью программного пакета DNASTAR Lasergene (версия 13.0.0.357). Шесть последовательностей, перечисленных выше, были импортированы в MegAlign и выровнены с использованием программы выравнивания множественных последовательностей ClustalW. Полученная последовательность LEMD1F имеет 98,5% идентичность с нативным LEMD1F человека.
Пример 2
Синтетический консенсусный LEMD1A
Устранение биологической функции LEMD1A
[0196] Чтобы устранить потенциальную биологическую функцию получаемого консенсусного LEMD1A для нарушения связывания BAF были введены три мутации в домене LEM (G20A, P25A и Y34A). В результате синтетический консенсусный белок LEMD1A имеет 95,6% идентичность с нативным человеческим белком LEMD1A, как показано на ФИГ. 1А и 1В.
Оптимизация экспрессии
[0197] После получения синтетической консенсусной последовательности ДНК LEMD1A, для того чтобы иметь более высокий уровень экспрессии, был удален N-концевой метионин синтетического консенсусного LEMD1A, и к N-концу были добавлены предшествующая по расположению последовательность Козак и лидер IgE. Далее использование кодонов этого гена было адаптировано к смещению кодонов генов Homo sapiens, и была также выполнена оптимизация РНК с областями с очень высоким (> 80%) или очень низким (<30%) содержанием GC, при этом избегая мотивов цис-действующей последовательности, таких как внутренние боксы TATA, chi-сайты и сайты связывания рибосом. Схематическое представление синтетического консенсусного LEMD1A представлено на ФИГ. 2. Характеристики синтетического консенсусного LEMD1A приведены в Таблице 1.
Таблица 1: Характеристика синтетического консенсусного LEMD1A
Характеристики
Синтетический консенсусный LEMD1A
Идентичность с нативным LEMD1A человека
95,6%
Идентичность с нативным LEMD1A
56,2-92,8%
Идентичность с нативным LEMD1A
32,2-60,6%
Количество аминокислотных мутаций (по сравнению c нативным человека)
8
Количество вставочных мутаций(не производных от консенсусного)
3
Молекулярный вес
200 аминокислот (22 кДа)
Длина кодирующей последовательности (п.о.)
600
[0198] Ссылаясь на ФИГ. 3, синтезированный синтетический консенсусный LEMD1A расщепляли при помощи BamHI и XhoI и клонировали в вектор экспрессии pGX0001 (Inovio Pharmaceuticals). Остов pGX0001 представляет собой модифицированный вектор экспрессии pVAXl под контролем немедленного раннего промотора цитомегаловируса человека (промотор hCMV). В pVAXl были введены модификации для создания pGX0001 и были идентифицированы на основе описанной последовательности pVAXl, доступной от ThermoFisher Scientific. Эти модификации перечислены в Таблице 2.
Tаблица 2
Вариант
Нуклеотид
Описание
ACT>CTG
2, 3, 4
выше промотора CMV
C>G
241
в промоторе CMV
C>T
1158
остов, ниже сигнала полиаденилирования бычьего гормона роста (bGH polyA)
A>-
2092
остов, ниже гена резистентности к канамицину
C>T
2493
в источнике репликации pUC (pUC ori)
G>C
2969
в самом конце pUC ori выше участка RNASeH
[0199] Остов pGX0001 включает ген устойчивости к канамицину (KanR) и плазмидный источник репликации (pUC ori) для целей продукции. Эти элементы не функционируют в эукариотических клетках. Элементы, присутствующие в паре оснований 2998 pGX0001, включают следующие:
промотор CMV: основания 137-724
сайт промотора/примирования T7: основания 664-683
сайт множественного клонирования: основания 696-811
сигнал полиаденилирования бычьего ГР: основания 829-1053
ген резистентности к канамицину: основания 1226-2020
источник pUC: основания 2319-2992
[0200] Плазмида, полученная в результате клонирования LEMD1A в остов pGX0001, была обозначена как pGXl43l, и полная длина последовательности была подтверждена как правильная. pGXl43l представляет собой ДНК-плазмиду, кодирующую синтетический консенсусный белок LEMD1A. Связанная с этим выработка мРНК управляется человеческим промотором CMV (промотором hCMV) и прекращается сигналом полиаденилирования 3'-конца бычьего гормона роста (bGH poly A). Особенности pGXl43l представлены в Таблице 3.
Таблица 3
Элементы:
Пары оснований:
Промотор hCMV:
137-724
Кодирующая последовательность синтетического консенсусного LEMD1A:
742-1341
bGH Poly A:
1385-1609
Резистентность к канамицину: (KanR):
1782-2576
pUC Ori:
2875-3548
[0201] Вставочная аминокислотная последовательность pGXl43l (SEQ ID NO: 2)
1 MDWTWILFLV AAATRVHSVD VKCLSDCKLQ NQLEKLAFSP GAILPSTRKL
51 AEKKLVQLLV SPPCAPPVMN GPRELDGAQD SDDSEELNII LQGNIILSTE
101 KSKKLKKRPE ASTTKPKAVD TYCLDYKPSK GRRWAARAPS TRITYGTITK
151 ERDYCTEDQT AESWREEGFP VGLKLAVLGI FIIVVFVYLT VENKPLFG
[0202] N-концевая лидерная последовательность состоит из аминокислотных остатков от 1 до 18 вставочной последовательности, а аминокислотные остатки от 19 до 198 являются синтетическим консенсусным антигеном LEMD1A.
[0203] Последовательность одноцепочечной ДНК pGXl43l (SEQ ID NO: 7):
1 GCTGCTTCGC GATGTACGGG CCAGATATAC GCGTTGACAT TGATTATTGA
51 CTAGTTATTA ATAGTAATCA ATTACGGGGT CATTAGTTCA TAGCCCATAT
101 ATGGAGTTCC GCGTTACATA ACTTACGGTA AATGGCCCGC CTGGCTGACC
151 GCCCAACGAC CCCCGCCCAT TGACGTCAAT AATGACGTAT GTTCCCATAG
201 TAACGCCAAT AGGGACTTTC CATTGACGTC AATGGGTGGA GTATTTACGG
251 TAAACTGCCC ACTTGGCAGT ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACGCC
301 CCCTATTGAC GTCAATGACG GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT
351 ACATGACCTT ATGGGACTTT CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC
401 ATCGCTATTA CCATGGTGAT GCGGTTTTGG CAGTACATCA ATGGGCGTGG
451 ATAGCGGTTT GACTCACGGG GATTTCCAAG TCTCCACCCC ATTGACGTCA
501 ATGGGAGTTT GTTTTGGCAC CAAAATCAAC GGGACTTTCC AAAATGTCGT
551 AACAACTCCG CCCCATTGAC GCAAATGGGC GGTAGGCGTG TACGGTGGGA
601 GGTCTATATA AGCAGAGCTC TCTGGCTAAC TAGAGAACCC ACTGCTTACT
651 GGCTTATCGA AATTAATACG ACTCACTATA GGGAGACCCA AGCTGGCTAG
701 CGTTTAAACT TAAGCTTGGT ACCGAGCTCG GATCCGCCAC CATGGACTGG
751 ACCTGGATTC TGTTCCTGGT GGCAGCAGCA ACACGGGTGC ACTCCGTGGA
801 CGTGAAGTGC CTGTCTGATT GTAAGCTGCA GAACCAGCTG GAGAAGCTGG
851 CCTTTAGCCC TGGCGCCATC CTGCCATCCA CCAGGAAGCT GGCCGAGAAG
901 AAGCTGGTGC AGCTGCTGGT GTCCCCACCT TGCGCACCAC CCGTGATGAA
951 TGGACCCCGC GAGCTGGACG GAGCACAGGA TAGCGACGAT TCCGAGGAGC
1001 TGAACATCAT CCTGCAGGGC AATATCATCC TGTCTACCGA GAAGAGCAAG
1051 AAGCTGAAGA AGCGGCCCGA GGCCTCTACC ACAAAGCCTA AGGCCGTGGA
1101 CACATACTGC CTGGATTATA AGCCATCTAA GGGCCGGAGA TGGGCAGCCA
1151 GGGCCCCAAG CACCCGCATC ACATACGGCA CCATCACAAA GGAGCGGGAC
1201 TATTGTACCG AGGATCAGAC AGCCGAGAGC TGGAGAGAGG AGGGCTTCCC
1251 TGTGGGCCTG AAGCTGGCCG TGCTGGGCAT CTTCATCATC GTGGTGTTCG
1301 TGTACCTGAC AGTGGAGAAC AAGCCACTGT TTGGCTGATA ACTCGAGTCT
1351 AGAGGGCCCG TTTAAACCCG CTGATCAGCC TCGACTGTGC CTTCTAGTTG
1401 CCAGCCATCT GTTGTTTGCC CCTCCCCCGT GCCTTCCTTG ACCCTGGAAG
1451 GTGCCACTCC CACTGTCCTT TCCTAATAAA ATGAGGAAAT TGCATCGCAT
1501 TGTCTGAGTA GGTGTCATTC TATTCTGGGG GGTGGGGTGG GGCAGGACAG
1551 CAAGGGGGAG GATTGGGAAG ACAATAGCAG GCATGCTGGG GATGCGGTGG
1601 GCTCTATGGC TTCTACTGGG CGGTTTTATG GACAGCAAGC GAACCGGAAT
1651 TGCCAGCTGG GGCGCCCTCT GGTAAGGTTG GGAAGCCCTG CAAAGTAAAC
1701 TGGATGGCTT TCTTGCCGCC AAGGATCTGA TGGCGCAGGG GATCAAGCTC
1751 TGATCAAGAG ACAGGATGAG GATCGTTTCG CATGATTGAA CAAGATGGAT
1801 TGCACGCAGG TTCTCCGGCC GCTTGGGTGG AGAGGCTATT CGGCTATGAC
1851 TGGGCACAAC AGACAATCGG CTGCTCTGAT GCCGCCGTGT TCCGGCTGTC
1901 AGCGCAGGGG CGCCCGGTTC TTTTTGTCAA GACCGACCTG TCCGGTGCCC
1951 TGAATGAACT GCAAGACGAG GCAGCGCGGC TATCGTGGCT GGCCACGACG
2001 GGCGTTCCTT GCGCAGCTGT GCTCGACGTT GTCACTGAAG CGGGAAGGGA
2051 CTGGCTGCTA TTGGGCGAAG TGCCGGGGCA GGATCTCCTG TCATCTCACC
2101 TTGCTCCTGC CGAGAAAGTA TCCATCATGG CTGATGCAAT GCGGCGGCTG 2151 CATACGCTTG ATCCGGCTAC CTGCCCATTC GACCACCAAG CGAAACATCG
2201 CATCGAGCGA GCACGTACTC GGATGGAAGC CGGTCTTGTC GATCAGGATG
2251 ATCTGGACGA AGAGCATCAG GGGCTCGCGC CAGCCGAACT GTTCGCCAGG
2301 CTCAAGGCGA GCATGCCCGA CGGCGAGGAT CTCGTCGTGA CCCATGGCGA
2351 TGCCTGCTTG CCGAATATCA TGGTGGAAAA TGGCCGCTTT TCT GGATTCA
2401 TCGACTGTGG CCGGCTGGGT GT GGCGGACC GCTATCAGGA CATAGCGTTG
2451 GCTACCCGT G ATATTGCTGA AGAGCTTGGC GGCGAATGGG CTGACCGCTT
2501 CCTCGTGCTT TACGGTATCG CCGCTCCCGA TTCGCAGCGC ATCGCCTTCT
2551 ATCGCCTTCT TGACGAGTTC TTCTGAATTA TTAACGCTTA CAATTTCCTG
2601 ATGCGGTATT TTCTCCTTAC GCATCTGTGC GGTATTTCAC ACCGCATCAG
2651 GTGGCACTTT TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA CCCCTATTTG TTTATTTTTC
2701 TAAATACATT CAAATATGTA TCCGCTCATG AGACAATAAC CCTGATAAAT
2751 GCTTCAATAA TAGCACGTGC TAAAACTTCA TTTTTAATTT AAAAGGATCT
2801 AGGTGAAGAT CCTTTTTGAT AATCTCATGA CCAAAATCCC TTAACGTGAG
2851 TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC AGACCCCGTA GAAAAGATCA AAGGATCTTC
2901 TTGAGATCCT TTTTTTCT GCGCGTAATCTG CTGCTTGCAA ACAAAAAAAC
2951 CACCGCTACC AGCGGTGGTT TGTTTGCCGG ATCAAGAGCT ACCAACTCTT
3001 TTTCCGAAGG TAACTGGCTT CAGCAGAGCG CAGATACCAA ATACTGTTCT
3051 TCTAGTGTAG CCGTAGTTAG GCCACCACTT CAAGAACTCT GTAGCACCGC
3101 CTACATACCT CGCTCTGCTA ATCCTGTTAC CAGTGGCTGC TGCCAGTGGC
3151 GATAAGTCGT GTCTTACCGG GTTGGACTCA AGACGATAGT TACCGGATAA
3201 GGCGCAGCGG TCGGGCTGAA CGGGGGGTTC GTGCACACAG CCCAGCTTGG
3251 AGCGAACGAC CTACACCGAA CTGAGATACC TACAGCGTGA GCTATGAGAA
3301 AGCGCCACGC TTCCCGAAGG GAGAAAGGCG GACAGGTATC CGGTAAGCGG
3351 CAGGGTCGGA ACAGGAGAGC GCACGAGGGA GCTTCCAGGG GGAAACGCCT
3401 GGTATCTTTA TAGTCCTGTC GGGTTTCGCC ACCTCTGACT TGAGCGTCGA
3451 TTTTTGTGAT GCTCGTCAGG GGGGCGGAGC CTATGGAAAA ACGCCAGCAA
3501 CGCGGCCTTT TTACGGTTCC TGGCCTTTTG CTGGCCTTTT GCTCACATGT
3551 TCTT
[0204] N-концевая лидерная последовательность состоит из нуклеотидов с 1 по 54 вышеуказанной последовательности, а остальные нуклеотиды кодируют антиген LEMD1A.
Пример 3
Синтетический консенсуcный LEMD1F
[0205] Чтобы устранить потенциальную биологическую функцию получаемого консенсусного LEMD1F для нарушения связывания BAF были введены две мутации в домене LEM (G20A и P25A). В результате синтетический консенсусный белок LEMD1F имеет 95,5% идентичность с нативным человеческим белком LEMD1F, как показано на ФИГ. 4А и 4В.
[0206] После получения синтетической консенсусной последовательности ДНК LEMD1F, для того чтобы иметь более высокий уровень экспрессии, был удален N-концевой метионин синтетического консенсусного LEMD1F, и к N-концу были добавлены предшествующая по расположению последовательность Козак и лидер IgE. Далее использование кодонов этого гена было адаптировано к смещению кодонов генов Homo sapiens. Была также выполнена оптимизация РНК с областями с очень высоким (> 80%) или очень низким (<30%) содержанием GC, при этом избегая мотивов цис-действующей последовательности, таких как внутренние боксы TATA, chi-сайты и сайты связывания рибосом. Схематическое представление синтетического консенсусного белка представлено на ФИГ. 5. Некоторые характеристики синтетического консенсусного LEMD1F приведены в Таблице 4.
Таблица 4: Характеристики
LEMD1F
Характеристики
Синтетический консенсусный LEMD1F
Идентичность с нативным LEMD1F человека
95,5%
Идентичность с нативным резусным LEMD1F
55,2-61,2%
Идентичность с нативным мышиным LEMD1F
11,9-43,3%
Количество аминокислотных мутаций (по сравнению в нативным человека)
3
Количество вставочных мутаций(не производных от консенсусного)
2
Молекулярный вес
86 аминокислот (9,5 кДа)
Длина кодирующей последовательности (п.о.)
258
[0207] Вектор экспрессии, pGXl432, был сконструирован с использованием того же остова pGX0001, который использовался для конструирования pGXl43l. Ссылаясь на ФИГ. 6, синтезированный синтетический консенсусный LEMD1F был расщеплен BamHI и Xhol и клонирован в вектор экспрессии pGX0001 (Inovio Pharmaceuticals) с кассетой экспрессии, помещенной под контроль транскрипции немедленного раннего промотора цитомегаловируса. Полученная плазмида была обозначена pGXl432, и была подтверждена полная длина последовательности. Характеристики pGXl432 представлены в Таблице 5.
Таблица 5
Элементы:
Пары оснований:
Промотор hCMV:
137-724
Кодирующая последовательность синтетического консенсусного LEMD1F:
742-999
bGH Poly A:
1043-1267
Резистентность к канамицину: (KanR):
1440-2234
pUC Ori:
2533-3206
[0208] Вставочная аминокислотная последовательность pGXl432 (SEQ ID NO: 4):
1 MDWTWILFLV AAATRVHSVD VKCLSDCKLQ NQLEKLAFSP GAILRGLQEH
51 QAPESHMGLS PKRETTARKT RLLRAGEKKV SQWA
[0209] N-концевая лидерная последовательность состоит из аминокислотных остатков от 1 до 18 вставочной последовательности, а аминокислотные остатки от 19 до 84 являются синтетическим консенсусным антигеном LEMD1F.
[0210] Последовательность одноцепочечной ДНК pGXl432 (SEQ ID NO: 8):
1 GCTGCTTCGC GATGTACGGG CCAGATATAC GCGTTGACAT TGATTATTGA
51 CTAGTTATTA ATAGTAATCA ATTACGGGGT CATTAGTTCA TAGCCCATAT
101 ATGGAGTTCC GCGTTACATA ACTTACGGTA AATGGCCCGC CTGGCTGACC
151 GCCCAACGAC CCCCGCCCAT TGACGTCAAT AATGACGTAT GTTCCCATAG
201 TAACGCCAAT AGGGACTTTC CATTGACGTC AATGGGTGGA GTATTTACGG
251 TAAACTGCCC ACTTGGCAGT ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACGCC
301 CCCTATTGAC GTCAATGACG GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT
351 ACATGACCTT ATGGGACTTT CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC
401 ATCGCTATTA CCATGGTGAT GCGGTTTTGG CAGTACATCA ATGGGCGTGG
451 ATAGCGGTTT GACTCACGGG GATTTCCAAG TCTCCACCCC ATTGACGTCA
501 ATGGGAGTTT GTTTTGGCAC CAAAATCAAC GGGACTTTCC AAAATGTCGT
551 AACAACTCCG CCCCATTGAC GCAAATGGGC GGTAGGCGTG TACGGTGGGA
601 GGTCTATATA AGCAGAGCTC TCTGGCTAAC TAGAGAACCC ACTGCTTACT
651 GGCTTATCGA AATTAATACG ACTCACTATA GGGAGACCCA AGCTGGCTAG
701 CGTTTAAACT TAAGCTTGGT ACCGAGCTCG GATCCGCCAC CATGGACTGG
751 ACCTGGATTC TGTTCCTGGT GGCAGCAGCA ACAAGGGTGC ACTCTGTGGA
801 CGTGAAGTGC CTGAGCGATT GTAAGCTGCA GAACCAGCTG GAGAAGCTGG
851 CCTTTTCCCC AGGAGCAATC CTGAGGGGAC TGCAGGAGCA CCAGGCACCA
901 GAGAGCCACA TGGGACTGTC CCCTAAGCGG GAGACCACAG CAAGGAAGAC
951 CAGACTGCTG AGGGCAGGAG AGAAGAAGGT GTCTCAGTGG GCCTGATAAC
1001 TCGAGTCTAG AGGGCCCGTT TAAACCCGCT GATCAGCCTC GACTGTGCCT
1051 TCTAGTTGCC AGCCATCTGT TGTTTGCCCC TCCCCCGTGC CTTCCTTGAC
1101 CCTGGAAGGT GCCACTCCCA CTGTCCTTTC CTAATAAAAT GAGGAAATTG
1151 CATCGCATTG TCTGAGTAGG TGTCATTCTA TTCTGGGGGG TGGGGTGGGG
1201 CAGGACAGCA AGGGGGAGGA TTGGGAAGAC AATAGCAGGC ATGCTGGGGA
1251 TGCGGTGGGC TCTATGGCTT CTACTGGGCG GTTTTATGGA CAGCAAGCGA
1301 ACCGGAATTG CCAGCTGGGG CGCCCTCTGG TAAGGTTGGG AAGCCCTGCA
1351 AAGTAAACTG GATGGCTTTC TTGCCGCCAA GGATCTGATG GCGCAGGGGA
1401 TCAAGCTCTG ATCAAGAGAC AGGATGAGGA TCGTTTCGCA TGATTGAACA
1451 AGATGGATTG CACGCAGGTT CTCCGGCCGC TTGGGTGGAG AGGCTATTCG
1501 GCTATGACTG GGCACAACAG ACAATCGGCT GCTCTGATGC CGCCGTGTTC
1551 CGGCTGTCAG CGCAGGGGCG CCCGGTTCTT TTTGTCAAGA CCGACCTGTC
1601 CGGTGCCCTG AATGAACTGC AAGACGAGGC AGCGCGGCTA TCGTGGCTGG
1651 CCACGACGGG CGTTCCTTGC GCAGCTGTGC TCGACGTTGT CACTGAAGCG
1701 GGAAGGGACT GGCTGCTATT GGGCGAAGTG CCGGGGCAGG ATCTCCTGTC
1751 ATCTCACCTT GCTCCTGCCG AGAAAGTATC CATCATGGCT GATGCAATGC
1801 GGCGGCTGCA TACGCTTGAT CCGGCTACCT GCCCATTCGA CCACCAAGCG
1851 AAACATCGCA TCGAGCGAGC ACGTACTCGG ATGGAAGCCG GTCTTGTCGA
1901 TCAGGATGAT CTGGACGAAG AGCATCAGGG GCTCGCGCCA GCCGAACTGT
1951 TCGCCAGGCT CAAGGCGAGC ATGCCCGACG GCGAGGATCT CGTCGTGACC
2001 CATGGCGATG CCTGCTTGCC GAATATCATG GTGGAAAATG GCCGCTTTTC
2051 TGGATTCATC GACTGTGGCC GGCTGGGTGT GGCGGACCGC TATCAGGACA
2101 TAGCGTTGGC TACCCGTGAT ATTGCTGAAG AGCTTGGCGG CGAATGGGCT
2151 GACCGCTTCC TCGTGCTTTA CGGTATCGCC GCTCCCGATT CGCAGCGCAT
2201 CGCCTTCTAT CGCCTTCTTG ACGAGTTCTT CTGAATTATT AACGCTTACA
2251 ATTTCCTGAT GCGGTATTTT CTCCTTACGC ATCTGTGCGG TATTTCACAC
2301 CGCATCAGGT GGCACTTTTC GGGGAAATGT GCGCGGAACC CCTATTTGTT
2351 TATTTTTCTA AATACATTCA AATATGTATC CGCTCATGAG ACAATAACCC
2401 TGATAAATGC TTCAATAATA GCACGTGCTA AAACTTCATT TTTAATTTAA
2451 AAGGATCTAG GTGAAGATCC TTTTTGATAA TCTCATGACC AAAATCCCTT
2501 AACGTGAGTT TTCGTTCCAC TGAGCGTCAG ACCCCGTAGA AAAGATCAAA
2551 GGATCTTCTT GAGATCCTTT TTTTCTGCGC GTAATCTGCT GCTTGCAAAC
2601 AAAAAAACCA CCGCTACCAG CGGTGGTTTG TTTGCCGGAT CAAGAGCTAC
2651 CAACTCTTTT TCCGAAGGTA ACTGGCTTCA GCAGAGCGCA GATACCAAAT
2701 ACTGTTCTTC TAGTGTAGCC GTAGTTAGGC CACCACTTCA AGAACTCTGT
2751 AGCACCGCCT ACATACCTCG CTCTGCTAAT CCTGTTACCA GTGGCTGCTG
2801 CCAGTGGCGA TAAGTCGTGT CTTACCGGGT TGGACTCAAG ACGATAGTTA
2851 CCGGATAAGG CGCAGCGGTC GGGCTGAACG GGGGGTTCGT GCACACAGCC
2901 CAGCTTGGAG CGAACGACCT ACACCGAACT GAGATACCTA CAGCGTGAGC
2951 TATGAGAAAG CGCCACGCTT CCCGAAGGGA GAAAGGCGGA CAGGTATCCG
3001 GTAAGCGGCA GGGTCGGAAC AGGAGAGCGC ACGAGGGAGC TTCCAGGGGG
3051 AAACGCCTGG TATCTTTATA GTCCTGTCGG GTTTCGCCAC CTCTGACTTG
3101 AGCGTCGATT TTTGTGATGC TCGTCAGGGG GGCGGAGCCT ATGGAAAAAC
3151 GCCAGCAACG CGGCCTTTTT ACGGTTCCTG GCCTTTTGCT GGCCTTTTGC
3201 TCACATGTTC TT
[0211] N-концевая лидерная последовательность состоит из нуклеотидов с 1 по 54 вышеуказанной последовательности, а остальные нуклеотиды кодируют антиген LEMD1F.
Пример 3
Синтетический консенсусный LEMD1AF
[0212] Мультиантигенная конструкция синтетического консенсусного LEMD1AF была создана путем вставки сайта расщепления фурином (RGRKRRS, SEQ ID NO: 10) между аминокислотными последовательностями синтетического консенсусного LEMD1A и синтетического консенсусного LEMD1F. После получения синтетической консенсусной последовательности ДНК LEMD1AF с целью более высокого уровня экспрессии был удален N-концевой метионин синтетического консенсусного LEMD1AF, и к N-концу были добавлены предшествующая по расположению последовательность Козак и лидер IgE. Далее использование кодонов этого гена было адаптировано к смещению кодонов генов Homo sapiens, и была также выполнена оптимизация РНК с областями с очень высоким (> 80%) или очень низким (<30%) содержанием GC, при этом избегая мотивов цис-действующей последовательности, таких как внутренние боксы TATA, chi-сайты и сайты связывания рибосом. Поскольку N-концевые домены (аминокислоты 2-27) в обоих консенсусных белках LEMD1A и LEMD1F идентичны, последовательности ДНК, кодирующие область аминокислоты 2-27 синтетического консенсусного LEMD1A и область аминокислоты 2-27 синтетического консенсусного LEMD1F были оптимизированы по-разному (идентичность последовательности 64,1%) для увеличения стабильности плазмиды. Схематическое представление синтетической консенсусной конструкции LEMD1AF показано на ФИГ. 7.
[0213] Ссылаясь на ФИГ. 8, синтезированный синтетический консенсусный LEMD1AF был расщеплен BamHI и XhoI и клонирован в вектор экспрессии pGX0001 (Inovio Pharmaceuticals), как описано в предыдущих примерах. Экспрессионная кассета была помещена под транскрипционный контроль немедленного раннего промотора цитомегаловируса. Полученная плазмида была обозначена pGXl433, и была подтверждена полная длина последовательности.
[0214] pGXl433 представляет собой ДНК-плазмиду, кодирующую синтетический консенсусный белок LEMD1AF. Связанное производство мРНК управляется человеческим промотором CMV (промотором hCMV) и прекращается сигналом полиаденилирования 3'-конца бычьего гормона роста (bGH poly A). Основная цепь pGX0001 включает ген устойчивости к канамицину (KanR) и плазмидный источник репликации (pUC ori) для целей продукции. Эти элементы не функционируют в эукариотических клетках. Таблица 6 предоставляет дополнительную информацию, относящуюся к pGXl433.
Таблица 6
Элементы:
Пары оснований:
Промотор hCMV:
137-724
Кодирующая последовательность синтетического консенсусного LEMD1AF:
742-1560
bGH Poly A
1604-1828
Резистентность к канамицину: (KanR):
2001-2795
pUC Ori:
3094-3767
[0215] Вставочная аминокислотная последовательность pGXl433 (SEQ ID NO: 6)
1 MDWTWILFLV AAATRVHSVD VKCLSDCKLQ NQLEKLAFSP GAILPSTRKL
51 AEKKLVQLLV SPPCAPPVMN GPRELDGAQD SDDSEELNII LQGNIILSTE
101 KSKKLKKRPE ASTTKPKAVD TYCLDYKPSK GRRWAARAPS TRITYGTITK
151 ERDYCTEDQT AESWREEGFP VGLKLAVLGI FIIVVFVYLT VENKPLFGRG
201 RKRRSVDVKC LSDCKLQNQL EKLAFS PGAI LRGLQEHQAP ESHMGLSPKR
251 ETTARKTRLL RAGEKKVSQW A
[0216] N-концевая лидерная последовательность состоит из аминокислотных остатков от 1 до 18 последовательности вставки, а аминокислотные остатки от 19 до 198 и 206-271 являются синтетическими консенсусными антигенами LEMD1A и F. Сайт расщепления фурина, аминокислотные остатки от 199 до 205, находится между последовательностями LEMD1.
[0217] Последовательность одноцепочечной ДНК pGXl433 (SEQ ID NO: 9):
1 GCTGCTTCGC GATGTACGGG CCAGATATAC GCGTTGACAT TGATTATTGA
51 CTAGTTATTA ATAGTAATCA ATTACGGGGT CATTAGTTCA TAGCCCATAT
101 ATGGAGTTCC GCGTTACATA ACTTACGGTA AATGGCCCGC CTGGCTGACC
151 GCCCAACGAC CCCCGCCCAT TGACGTCAAT AATGACGTAT GTTCCCATAG
201 TAACGCCAAT AGGGACTTTC CATTGACGTC AATGGGTGGA GTATTTACGG
251 TAAACTGCCC ACTTGGCAGT ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACGCC
301 CCCTATTGAC GTCAATGACG GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT
351 ACATGACCTT ATGGGACTTT CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC
401 ATCGCTATTA CCATGGTGAT GCGGTTTTGG CAGTACATCA ATGGGCGTGG
451 ATAGCGGTTT GACTCACGGG GATTTCCAAG TCTCCACCCC ATTGACGTCA
501 ATGGGAGTTT GTTTTGGCAC CAAAATCAAC GGGACTTTCC AAAATGTCGT
551 AACAACTCCG CCCCATTGAC GCAAATGGGC GGTAGGCGTG TACGGTGGGA
601 GGTCTATATA AGCAGAGCTC TCTGGCTAAC TAGAGAACCC ACTGCTTACT
651 GGCTTATCGA AATTAATACG ACTCACTATA GGGAGACCCA AGCTGGCTAG
701 CGTTTAAACT TAAGCTTGGT ACCGAGCTCG GATCCGCCAC CATGGACTGG
751 ACCTGGATTC TGTTCCTGGT GGCAGCAGCA ACCCGCGTGC ATTCCGTCGA
801 TGTGAAGTGT CTGAGTGATT GTAAACTGCA GAACCAGCTG GAGAAGCTGG
851 CCTTTAGCCC TGGAGCAATC CTGCCATCCA CCAGGAAGCT GGCCGAGAAG
901 AAGCTGGTGC AGCTGCTGGT GAGCCCACCT TGCGCACCAC CCGTGATGAA
951 TGGCCCAAGA GAGCTGGACG GCGCCCAGGA TAGCGACGAT TCCGAGGAGC
1001 TGAACATCAT CCTGCAGGGC AATATCATCC TGTCTACCGA GAAGAGCAAG
1051 AAGCTGAAGA AGCGGCCCGA GGCCTCCACC ACAAAGCCTA AGGCCGTGGA
1101 CACATACTGC CTGGATTATA AGCCTTCCAA GGGCCGGAGA TGGGCAGCCA
1151 GGGCCCCATC TACCAGGATC ACATACGGCA CCATCACAAA GGAGCGGGAC
1201 TATTGTACCG AGGATCAGAC AGCCGAGTCT TGGAGAGAGG AGGGATTCCC
1251 AGTGGGCCTG AAGCTGGCCG TGCTGGGCAT CTTCATCATC GTGGTGTTCG
1301 TGTACCTGAC AGTGGAGAAC AAGCCTCTGT TTGGCCGGGG CAGAAAGAGG
1351 CGCTCTGTGG ATGTAAAATG CCTATCGGAC TGCAAGTTGC AAAATCAATT
1401 AGAAAAATTG GCCTTCTCCC CAGGGGCGAT ATTGAGGGGC CTGCAGGAGC
1451 ACCAGGCACC AGAGTCCCAC ATGGGCCTGT CTCCCAAGCG CGAGACAACC
1501 GCAAGAAAAA CAAGGCTGCT GAGGGCTGGG GAAAAGAAAG TGTCACAGTG
1551 GGCATGATAA CTCGAGTCTA GAGGGCCCGT TTAAACCCGC TGATCAGCCT
1601 CGACTGTGCC TTCTAGTTGC CAGCCATCTG TTGTTTGCCC CTCCCCCGTG
1651 CCTTCCTTGA CCCTGGAAGG TGCCACTCCC ACTGTCCTTT CCTAATAAAA
1701 TGAGGAAATT GCATCGCATT GTCTGAGTAG GTGTCATTCT ATTCTGGGGG
1751 GTGGGGTGGG GCAGGACAGC AAGGGGGAGG ATTGGGAAGA CAATAGCAGG
1801 CATGCTGGGG ATGCGGTGGG CTCTATGGCT TCTACTGGGC GGTTTTATGG
1851 ACAGCAAGCG AACCGGAATT GCCAGCTGGG GCGCCCTCTG GTAAGGTTGG
1901 GAAGCCCTGC AAAGTAAACT GGATGGCTTT CTTGCCGCCA AGGATCTGAT
1951 GGCGCAGGGG ATCAAGCTCT GATCAAGAGA CAGGATGAGG ATCGTTTCGC
2001 ATGATTGAAC AAGATGGATT GCACGCAGGT TCTCCGGCCG CTTGGGTGGA
2051 GAGGCTATTC GGCTATGACT GGGCACAACA GACAATCGGC TGCTCTGATG
2101 CCGCCGTGTT CCGGCTGTCA GCGCAGGGGC GCCCGGTTCT TTTTGTCAAG
2151 ACCGACCTGT CCGGTGCCCT GAATGAACTG CAAGACGAGG CAGCGCGGCT
2201 ATCGTGGCTG GCCACGACGG GCGTTCCTTG CGCAGCTGTG CTCGACGTTG
2251 TCACTGAAGC GGGAAGGGAC TGGCTGCTAT TGGGCGAAGT GCCGGGGCAG
2301 GATCTCCTGT CATCTCACCT TGCTCCTGCC GAGAAAGTAT CCATCATGGC
2351 TGATGCAATG CGGCGGCTGC ATACGCTTGA TCCGGCTACC TGCCCATTCG
2401 ACCACCAAGC GAAACATCGC ATCGAGCGAG CACGTACTCG GATGGAAGCC
2451 GGTCTTGTCG ATCAGGATGA TCTGGACGAA GAGCATCAGG GGCTCGCGCC
2501 AGCCGAACTG TTCGCCAGGC TCAAGGCGAG CATGCCCGAC GGCGAGGATC
2551 TCGTCGTGAC CCATGGCGAT GCCTGCTTGC CGAATATCAT GGTGGAAAAT
2601 GGCCGCTTTT CTGGATTCAT CGACTGTGGC CGGCTGGGTG TGGCGGACCG
2651 CTATCAGGAC ATAGCGTTGG CTACCCGTGA TATTGCTGAA GAGCTTGGCG
2701 GCGAATGGGC TGACCGCTTC CTCGTGCTTT ACGGTATCGC CGCTCCCGAT
2751 TCGCAGCGCA TCGCCTTCTA TCGCCTTCTT GACGAGTTCT TCTGAATTAT
2801 TAACGCTTAC AATTTCCTGA TGCGGTATTT TCTCCTTACG CATCTGTGCG
2851 GTATTTCACA CCGCATCAGG TGGCACTTTT CGGGGAAATG TGCGCGGAAC
2901 CCCTATTTGT TTATTTTTCT AAATACATTC AAATATGTAT CCGCTCATGA
2951 GACAATAACC CTGATAAATG CTTCAATAAT AGCACGTGCT AAAACTTCAT
3001 TTTTAATTTA AAAGGATCTA GGTGAAGATC CTTTTTGATA ATCTCATGAC
3051 CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG
3101 AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG CGTAATCTGC
3151 TGCTTGCAAA CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA
3201 TCAAGAGCTA CCAACTCTTT TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC
3251 AGATACCAAA TACTGTTCTT CTAGTGTAGC CGTAGTTAGG CCACCACTTC
3301 AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA TCCTGTTACC 3351 AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG TTGGACTCAA 3401 GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG 3451 TGCACACAGC CCAGCTTGGA GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT 3501 ACAGCGTGAG CTATGAGAAA GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG 3551 ACAGGTATCC GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA CAGGAGAGCG CACGAGGGAG 3601 CTTCCAGGGG GAAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCG GGTTTCGCCA 3651 CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC 3701 TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT GGCCTTTTGC 3751 TGGCCTTTTG CTCACATGTT CTT
[0218] N-концевая лидерная последовательность состоит из нуклеотидов с 1 по 54 из вышеуказанной последовательности, а нуклеотиды от 55 до 594 и от 616 до 819 кодируют антигенную конструкцию LEMD1AF. Нуклеотиды от 595 до 615 кодируют сайт связывания фурина.
Пример 4
Экспрессия антигена in vitro
2
[0219] Экспрессия белка антигена pGXl431, pGXl432 и pGXl433 была подтверждена вестерн-блоттингом. Клетки человеческой рабдомиосаркомы (RD) (ATCC, CCL-136), которые поддерживали в среде DMEM с 10% FBS (ThermoFisher), трансфицировали pGXl43l, pGXl432, pGXl433 или pGX0001 (6 мкг/10 см/чашку) с использованием Turbofectin 8 (Origene). Через сорок восемь часов после трансфекции клетки лизировали с использованием буфера для лизиса клеток RIPA (ThermoFisher) и собирали лизат клеток. После анализа BCA (ThermoFisher) для определения концентрации общего белка 15 мкг клеточного лизата подвергали электрофорезу в 4-12% геле SDS-PAGE и проводили детекцию с использованием моноклонального антитела против LEMD1 (Abcam, клон ab20l206), затем визуализировали с помощью анти-кроличьего IgG, конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP) (Santa Cruz Biotech, SC-2004), с использованием системы вестерн-блот анализа ECL (GE Amersham). В качестве контроля нагрузки блоты повторно исследовали на экспрессию актина с использованием моноклонального антитела против β-актина (Santa Cruz Biotech, клон, C4).
[0220] Были обнаружены белковые полосы ожидаемой молекулярной массы для конструкций синтетического консенсусного LEMD1A (pGXl43l) и синтетического консенсусного LEMD1AF (pGXl433), но не была обнаружена полоса для конструкции синтетического консенсусного LEMD1F (pGXl432) (ФИГ. 9). Можно сделать вывод, что этот антиген LEMD1F был экспрессирован как часть антигена LEMD1AF, поскольку он был обнаружен при ожидаемой молекулярной массе антигена AF. В полосе pGX0001 полос белка не обнаружено. Анти-β-актиновые полосы были обнаружены с одинаковой интенсивностью, что указывает на то, что в каждой дорожке были загружены равные количества белка. В итоге было обнаружено, что pGXl43l и pGXl433 экспрессируют соответствующие антигенные белки.
Пример 5
Иммуногенность вакцинных конструкций синтетического консенсусного LEMD1
Материалы и способы
Животные и иммунизации
[0221] Самки 8-недельных мышей CB6F1 были приобретены в Jackson Laboratories. Все животные содержались в помещении с регулируемой температурой и световой цикличностью в BTS Research (San Diego, CA). Уход за животными осуществлялся в соответствии с руководящими принципами Национального института здравоохранения и предложением по уходу и использованию животных (ACUP) (BTS ACUP # 15-091). Мыши были разделены на десять групп, как показано в Таблице 7.
Таблица 7
Группа
n
Конструкция
Доза конструкции (мкг)
Объем инъекции (мкл)
1
4
pGX0001
30
30
2
8
pGX1431
10
30
3
8
pGX1431
30
30
4
8
pGX1431
50
30
5
8
pGX1432
10
30
6
8
pGX1432
30
30
7
8
pGX1432
50
30
8
8
pGX1433
10
30
9
8
pGX1433
30
30
10
8
pGX1433
50
30
[0222] Мышей в группах иммунизации вакцинировали указанными дозами pGX0001, pGXl43l, pGXl432 или pGXl433. Вкратце, плазмиды готовили в стерильной воде для инъекций (VetOne) так, чтобы указанная доза доставлялась путем внутримышечной инъекции в переднюю мышцу большеберцовой кости в объеме инъекции 30 мкл. За каждой внутримышечной инъекцией немедленно следовала электропорация (ЭП) с использованием адаптивного устройства электропорации постоянного тока CELLECTRA 2000 с матрицей 3P (Inovio Pharmaceuticals). Устройство было настроено на подачу двух импульсов по 0,1 А с шириной импульса 52 мс, разнесенных на 1 секунду. Мыши получили 3 иммунизации с интервалом 3 недели. Мышей умерщвляли через неделю после последней иммунизации, а селезенки собирали для получения показаний клеточного иммунитета. Другие ткани не собирались.
Выделение лимфоцитов селезенки
[0223] Спленоциты выделяли асептически и помещали в 5 мл среды R10 (среда 1640 Rosewell Park Memorial Institute, дополненная 10% эмбриональной бычьей сывороткой и 1% антибиотиком - антимикотическим средством). Спленоциты выделяли путем механического разрушения селезенки с использованием аппарата Stomacher (Seward Laboratory Systems Inc.), полученный продукт фильтровали с использованием сита для клеток на 40 мкм (BD Falcon). Полученный продукт центрифугировали, и осадок обрабатывали в течение 5 минут лизирующим буфером ACK (Lonza) для лизиса эритроцитов. Спленоциты затем центрифугировали, промывали в PBS, а затем ресуспендировали в среде R10 и сразу же использовали для дальнейшего анализа.
Определение IFNγ методом иммуноферментных пятен (ELISpot)
5
6
2
[0224] Проводили определение мышиного IFNγ методом иммуноферментных пятен (ELISpot)(MabTech) для оценки антигенспецифических клеточных ответов. Вкратце, 96-луночные планшеты, предварительно покрытые антителами против мышиного IFNγ, промывали в PBS и блокировали в течение 2 часов при комнатной температуре с помощью полной питательной среды (RPMI 1640 с добавлением 10% FBS и антибиотиков). Лимфоциты селезенки ресуспендировали в среде R10 (а затем добавляли в трех повторах при количестве клеток на входе 2 х 10 клеток на лунку. Синтезировали набор пептидов (GenScript), каждый из которых содержал 15 аминокислотных остатков с перекрыванием 9 аминокислот, представляющих полную синтетическую консенсусную белковую последовательность LEMD1. Эти наборы пептидов ресуспендировали в DMSO (Sigma) и объединяли при концентрации пептида ~ 2 мкг/мл в два пептидных пула. Один пептидный пул содержал пептиды, соответствующие синтетическому консенсусному антигенному белку LEMD1A, и второй пептидный пул содержал пептиды, соответствующие синтетическому консенсусному антигенному белку LEMD1F. Конкавалин А (Sigma) в концентрации 5 мкг/мл использовали в качестве положительного контроля, а полную культуральную среду использовали в качестве отрицательного контроля. Планшеты инкубировали в течение 18 часов при 37°С в инкубаторе в атмосфере с 5% СО. Затем добавляли биотинилированное антитело против IFNγ мыши (MabTech), и планшеты инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Планшеты промывали и добавляли антитело к стрептавидину-ALP (MabTech), и планшеты инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Обнаружение пятна проводили в соответствии с инструкциями производителя набора (MabTech). Пятна на планшетах подсчитывали с использованием автоматического ридера ELISPOT (Cellular Technology). Для отображения данных среднее количество единиц, формирующих пятно (SFU) было приведено к 1×10 спленоцитов.
6
[0225] Антигенспецифические ответы в ELISpot по IFNγ, представленные как число единиц, формирующих пятно IFNγ (SFU) на 1 × 10 спленоцитов, превышают число SFU в контроле при инкубации с одной только средой.
Проточная цитометрия
6
[0226] Клеточные иммунные ответы, индуцированные синтетическим консенсусным LEMD1, были дополнительно охарактеризованы методом проточной цитометрии. Вкратце, 2 × 10 спленоцитов от вакцинированных и не получавших вакцину мышей непосредственно после выделения стимулировали синтетическим консенсусным пептидом LEMD1, в соответствии с каждой группой, в течение 6 часов в присутствии брефелдина A (BD Biosciences), монензина (BD Biosciences) и меченного FITC мышиного антитела против CDl07a (BD Biosciences). После стимуляции пептидами спленоциты центрифугировали и ресуспендировали в 20 мкл на лунку с блокирующим раствором против Fc мыши BD Fc Block (BD Biosciences) мыши. Раствор Fc Block использовали при начальном разведении 1:40 в PBS и инкубации при 4°С в течение 5 минут. После инкубации оставшиеся внеклеточные антитела (в PBS) добавляли в количестве 30 мкл на лунку и инкубировали при 4°С в течение 30 минут. После добавления внеклеточного красителя конечный объем в каждой лунке составляет 50 мкл, включая раствор Fc Block в конечном разведении 1: 100 и внеклеточные антитела в соответствующих рабочих разведениях. Затем клетки окрашивали красителем для оценки жизнеспособности (Vivid V450, Thermo-Fisher) и следующими внеклеточными антителами: PerCP-Cy5.5 против CD4 мыши (BD Biosciences, клон RM4-5) и APC против CD8a мыши (BD Biosciences, клон 63-6,7). Клетки фиксировали и пермеабилизировали (BD Biosciences, # 554714) в течение 20 минут при 4°C. Внутриклеточное окрашивание затем останавливали следующими антителами: APC-Cy7 против мышиного CD3e (BD Biosciences, клон 145-2C11), BV605 против мышиного IFNγ (BD Biosciences, клон XMG1.2), APC-R700 против мышиного IL-2 (BD Biosciences, клон JEs6-5H4) и PE против мышиного TNF-α (BD Biosciences, клон MP6-XT22). Данные внутриклеточного окрашивания получали на 10-цветном FACS CANTO (BD Biosciences), и анализ завершали с использованием программного обеспечения FlowJo. Стратегия гейтирования проточной цитометрии показана ниже на ФИГ. 10.
[0227] Для того, чтобы клетку можно было назвать антигенспецифичной с помощью проточной цитометрии, частота сообщаемого параметра должна превышать частоту контроля для одной только среды. Для того чтобы клетка была идентифицирована как продуцирующая антигенспецифичная CDl07a, клетка также должна быть идентифицирована как позитивная по антигенспецифической продукции IFNγ, и/или IL-2, и/или TNFα согласно данным идентификации с булевским гейтированием.
Статистический анализ
[0228] Статистический анализ был выполнен с использованием IBM SPSS Statistics 22 (IBM Corporation). Анализ различий между группами был выполнен с использованием ANOVA с использованием апостериорного теста Тьюки Honest Significant Difference (HSD) для того, чтобы скорректировать множественные сравнения. Однородность дисперсии была подтверждена с использованием F-статистики перед множественными сравнениями. Для всего статистического анализа значение р 0,050 считалось значимым.
Результаты
Определение IFNγ методом ELISpot
[0229] Иммуногенность трех синтетических консенсусных конструкций LEMD1 оценивали при трех дозах (10 мкг, 30 мкг и 50 мкг) с помощью определения IFNγ методом ELISpot и проточной цитометрии (n=8/группу). Мышей иммунизировали пустой плазмидной основой (pGX0001) в качестве отрицательного контроля (n=4/группу). Вакцинация синтетическим консенсусным LEMD1A приводила к значительным ответам IFNγ по сравнению с вакцинированными мышами с отрицательным контролем. Были получены доказательства дозозависимого увеличения продукции IFNγ, индуцированного синтетическим консенсусным LEMD1A (ФИГ. 11 A), с максимальным средним ответом, достигнутым при дозе 30 мкг. В частности, показатель SFU для IFNγ при введении синтетического консенсусного LEMD1A составил 646 ± 373, 1683 ± 1248 и 1645 ± 1002 при, соответственно, 10, 30 и 50 мкг. Ответы IFNγ при введении синтетического консенсусного LEMD1A были значительно выше по сравнению с неиммунизированными животными (3 ± 4) при введении дозы pGXl43l в количестве 30 мкг (p=0,024) и 50 мкг (p=0,028) но не при введении дозы в количестве 10 мкг (p=0,642). Вакцинация синтетическим консенсусным LEMD1F привела к минимальным ответам IFNγ без каких-либо доказательств дозозависимого увеличения с увеличением количества дозы (ФИГ. 11B). Показатели SFU для IFNγ при введении синтетического консенсусного LEMD1F составили 163 ± 382, 88 ± 109 и 140 ± 246 при введении , соответственно, 10 мкг, 30 мкг и 50 мкг. Ответы IFNγ при введении синтетического консенсусного LEMD1F не были значительно выше по сравнению с неиммунизированными животными (3 ± 4) при любом количестве дозы pGXl432. Вакцинация синтетическим консенсусным LEMD1AF привела к значительным ответам IFNγ по сравнению с вакцинированными мышами негативного контроля. Были получены данные о дозозависимом увеличении продукции IFNγ, индуцированного синтетическим консенсусным LEMD1 AF (ФИГ. 11C) с максимальным средним ответом, достигнутым при дозе 50 мкг. В частности, SFU для IFNγ при введении синтетического консенсусного LEMD1AF составил 478 ± 269, 779 ± 392 и 879 ± 552 при, соответственно, 10 мкг, 30 мкг и 50 мкг. Ответ на IFNγ при введении синтетического консенсусного LEMD1AF был значительно выше, чем у неиммунизированных мышей (3 ± 4) при дозах pGXl433 30 мкг (p=0,018) и 50 мкг (p=0,007), но не при дозе 10 мкг (p=0,227). Ответы IFNγ приведены в Таблице 8.
Таблица 8: Ответы IFN
, индуцированные pGX1431, pGX1432 и pGX1433
γ
Синтетический консенсусный LEMD1A(pGX1431)
Синтетический консенсусный LEMD1AF(pGX1433)
Конструкция
Доза
Среднее кол-во SFU ± ст.откл.
Значение р
Конструк-ция
Доза
Среднее кол-во SFU ± ст.откл.
Значение р
pGX0001
30 мкг
3 ± 4
н/д
pGX0001
30 мкг
3 ± 4
н/д
pGX1431
10 мкг
646 ± 373
0,642
pGX1433
10 мкг
478 ± 269
0,227
30 мкг
1683 ± 1248
0,024
30 мкг
779 ± 392
0,018
50 мкг
1645 ± 1002
0,028
50 мкг
879 ± 552
0,007
Синтетический консенсусный LEMD1F(pGX1431)
Конструкция
Доза
Среднее кол-во SFU ± ст.откл.
Значение р
pGX0001
30 мкг
3 ± 4
н/д
pGX1432
10 мкг
163 ± 382
н/д
30 мкг
88 ± 109
н/д
50 мкг
140 ± 246
н/д
Указанные значения р относятся к не подвергавшимся воздействию мышам (иммунизированным при помощи pGX0001). Значимым считается значение р≤0,05.
[0230] Синтетический консенсусный LEMD1A индуцировал частоты антигенспецифических ответов T-клеток CD4 +, которые были значимо более эффективными, чем у неиммунизированных мышей (0,04% ± 0,03%) в группах, получавших дозы 50 мкг (1,34% ± 0,58%) (р <0,005), но не 10 мкг (0,50% ± 0,170%) (р <0,004) или 30 мкг (1,02% ± 0,57%) (p <0,122) (ФИГ. 12А). Специфические Т-клеточные ответы CD4+при введении синтетического консенсусного LEMD1A были зависимы от дозы и состояли в основном из Т-клеток CD4+, продуцирующих IFNγ+IL-2+TNFα+ IFNγ+IL-2-TNFα+ или IFNγ+IL-2-TNFα- (ФИГ. 12E).
[0231] Синтетический консенсусный LEMD1F индуцировал частоты антигенспецифических ответов T-клеток CD4 +, которые минимально превышали ответы у неиммунизированных мышей (0,06% ± 0,02%). В частности, pGXl432 индуцировал незначимые ответы при величине дозы в группах, получавших 10 мкг (0,27% ± 0,34%), 30 мкг (0,24% ± 0,10%) и 50 мкг (0,20% ± 0,20%) (ФИГ. 12B). Специфические Т-клеточные ответы CD4+при введении синтетического консенсусного LEMD1F были зависимы от дозы и состояли в основном из Т-клеток CD4+, продуцирующих IFNγ+IL-2+TNFα+, IFNγ+IL-2+TNFα-, IFNγ+IL-2-TNFα+, IFNγ-IL-2-TNFα+ или IFNγ+IL-2-TNFα- (ФИГ. 12E).
[0232] Синтетический консенсусный LEMD1AF индуцировал частоты антигенспецифических ответов T-клеток CD4+, которые были значимо более эффективными, чем у неиммунизированных мышей (0,09% ± 0,03%) в группах, получавших дозу 50 мкг (0,80% ± 0,51%) (p<0,006), но не 10 мкг (0,53% ± 0,19%) (p<0,135) или 30 мкг (0,50% ± 0,20%) (p<0,176) (ФИГ. 12C). Специфические Т-клеточные ответы CD4+при введении синтетического консенсусного LEMD1АF были независимы от дозы и состояли в основном из Т-клеток CD4+, продуцирующих IFNγ+IL-2+TNFα+ IFNγ+IL-2-TNFα+, IFNγ+IL-2-TNFα- или IFNγ-IL-2-TNFα+ (ФИГ. 12E).
[0233] Частота антигенспецифических Т-клеток CD4+ представлена далее в деталях в Таблице 9.
[0234] Все количества доз синтетических консенсусных конструкций LEMD1 индуцировали частоту T-клеток CD4+CDl07a +, которая была немного больше, чем у неиммунизированных животных, но только конструкция pGXl43l при самой высокой дозе была значимо более эффективной.
[0235] В частности, частота антигенспецифических pGX1431 Т-клеток CD4+CD107a+ составила 0,17% ± 0,09%, 0,34% ± 0,19% и 0,50% ± 0,30% при количестве дозы в группах, соответственно, 10 мкг (p=0,532), 30 мкг (p=0,314) и 50 мкг (р=0,002) (Фигура 13А). Профиль цитокинов pGX1431-специфичных T-клеток CD4+CDl07a+ был одинаковым в разных группах доз и состоял в основном из клеток IFNγ+IL-2+TNFα+, IFNγ+IL-2-TNFα+ и IFNγ+IL-2-TNFα- (Фигура 13E).
[0236] Частота антигенспецифических pGX1432 Т-клеток CD4+CD107a+ составила 0,10% ± 0,14%, 0,11% ± 0,08% и 0,04% ± 0,03% при количестве дозы в группах, соответственно, 10 мкг, 30 мкг и 50 мкг (Фигура 13B). Профиль цитокинов pGX1432-специфичных T-клеток CD4+CDl07a+ был одинаковым в группах с количеством дозы 10 мкг и 30 мкг и состоял, в основном, из клеток IFNγ+IL-2+TNFα+, IFNγ+IL-2+TNFα- и IFNγ+IL-2-TNFα- , в то время, как при количестве дозы 50 мкг профиль цитокинов, в основном, состоял из клеток IFNγ+IL-2+TNFα+, IFNγ+IL-2- TNFα+ и IFNγ+IL-2+TNFα- (Фигура 13E).
[0237] Частота антигенспецифических pGX1433 Т-клеток CD4+CD107a+ составила 0,20% ± 0,10%, 0,17% ± 0,10% и 0,39% ± 0,31% в группах с количеством дозы, соответственно, 10 мкг (p=0,365), 30 мкг (p=0,992) и 50 мкг (p=0, l09) (Фигура 13C). Профиль цитокинов pGX1433-специфичных T-клеток CD4+CDl07a+ был одинаковым в группах с количеством дозы 10 мкг и 30 мкг и состоял, в основном, из клеток IFNγ+IL-2+TNFα+, с некоторым количеством клеток IFNγ+IL-2-TNFα+ и IFNγ+IL-2-TNFα-, в то время, как в группе с количеством дозы 50 мкг профиль цитокинов состоял, в основном, из клеток IFNγ+IL-2-TNFα- с некоторым количеством клеток IFNγ+IL-2+TNFα+, IFNγ+IL-2+TNFα- и IFNγ+IL-2-TNFα+ (Фигура 13E).
[0238] Частота антигенспецифических Т-клеток CD4+CD107+ далее представлена в деталях в Таблице 9.
Таблица 9
:
Синтетический консенсусный LEMD1A (pGX1431)
Конструкция
Доза
%CD4+ ± ст.откл.
Значение р
%CD4+CD107a+ ± ст.откл.
Значение р
pGX0001
30 мкг
0,04 ± 0,03
н/д
0,00 ± 0,00
н/д
pGX1431
10 мкг
0,50 ± 0,17
0,346
0,17 ± 0,09
0,532
30 мкг
1,02 ± 0,57
0,122
0,34 ± 0,19
0,314
50 мкг
1,34 ± 0,58
0,005
0,50 ± 0,30
0,002
Синтетический консенсусный LEMD1F (pGX1432)
Конструкция
Доза
%CD4+ ± ст.откл.
Значение р
%CD4+CD107a+ ± ст.откл.
Значение р
pGX0001
30 мкг
0,06 ± 0,02
н/д
0,01 ± 0,00
н/д
pGX1432
10 мкг
0,27 ± 0,34
н/д
0,10 ± 0,14
н/д
30 мкг
0,24 ± 0,10
н/д
0,11 ± 0,08
н/д
50 мкг
0,20 ± 0,20
н/д
0,04 ± 0,03
н/д
Синтетический консенсусный LEMD1AF (pGX1433)
Конструкция
Доза
%CD4+ ± ст.откл.
Значение р
%CD4+CD107a+ ± ст.откл.
Значение р
pGX0001
30 мкг
0,09 ± 0,03
н/д
0,01 ± 0,01
н/д
pGX1433
10 мкг
0,53 ± 0,19
0,135
0,20 ± 0,10
0,365
30 мкг
0,50 ± 0,20
0,176
0,17 ± 0,10
0,992
50 мкг
0,80 ± 0,51
0,006
0,39 ± 0,31
0,109
Указанные значения р относятся к не подвергавшимся воздействию мышам (иммунизированным при помощи pGX0001). Значимым считается значение р≤0,05.
[0239] Синтетический консенсусный LEMD1A индуцировал частоты антигенспецифических ответов T-клеток CD8+, которые были более эффективными, чем у неиммунизированных мышей (0,08% ± 0,01%), но не значимыми в группах количества дозы 10 мкг (1,46% ± 0,79%), 30 мкг (2,34% ± 1,47%) и 50 мкг (2,12% ± 1,897%) (ФИГ. 14А). Специфические ответы Т-клеток CD8+ на синтетический консенсусный LEMD1A были дозонезависимыми и состояли, в основном, из IFNγ±IL-2-TNFα- и некоторого количества T-клеток CD8+, продуцирующих IFNγ±IL-2-TNFα+ (ФИГ. 14E).
[0240] Синтетический консенсусный LEMD1F индуцировал частоты антигенспецифических ответов T-клеток CD8+, которые не превышали ответы у неиммунизированных мышей (0,09% ± 0,05%). В частности, pGXl432 индуцировал незначимые ответы в группах количества дозы 10 мкг (0,09% ± 0,04%), 30 мкг (0,07% ± 0,05%) и 50 мкг (0,17% ± 0,07%) (ФИГ. 14B). Специфические клеточные ответы Т-клеток CD8+ на синтетический консенсусный LEMD1F были дозонезависимыми и состояли, в основном, из T-клеток CD8+, продуцирующих IFNγ+IL-2+TNFα-, IFNγ-IL-2-TNFα+ и IFNγ+IL-2-TNFα- (ФИГ. 14E).
[0241] Синтетический консенсусный LEMD1AF индуцировал частоты антигенспецифических ответов T-клеток CD8 +, которые были значимо более эффективными, чем у неиммунизированных мышей (0,17% ± 0,043%) при количестве дозы 50 мкг (1,73% ± 1,40%) (p=0,046), но не в группах количества дозы 10 мкг (0,72% ± 0,36%) (p=0,061) или 30 мкг (1,65% ± 0,86%) (p=0,061) (ФИГ. 14C). Специфические клеточные ответы Т-клеток CD8+ на синтетический консенсусный LEMD1АF были дозозависимыми и состояли, в основном, из T-клеток CD8+, продуцирующих IFNγ+IL-2-TNFα- и некоторого количества IFNγ+IL-2-TNFα+ и IFNγ-IL-2+-TNFα- (ФИГ. 14E).
[0242] Частота антигенспецифических Т-клеток CD8+ далее представлена подробно в Таблице 10.
Таблица 10
Синтетический консенсусный LEMD1A (pGX1431)
Конструкция
Доза
%CD8+ ± ст.откл.
Значение р
%CD8+CD107a+ ± ст.откл.
Значение р
pGX0001
30 мкг
0,08 ± 0,01
н/д
0,03 ± 0,03
н/д
pGX1431
10 мкг
1,46 ± 0,79
н/д
1,37 ± 0,78
н/д
30 мкг
2,34 ± 1,47
н/д
2,23 ± 1,45
н/д
50 мкг
2,12 ± 1,89
н/д
1,97 ± 1,84
н/д
Синтетический консенсусный LEMD1F (pGX1432)
Конструкция
Доза
%CD8+ ± ст.откл.
Значение р
%CD8+CD107a+ ± ст.откл.
Значение р
pGX0001
30 мкг
0,09 ± 0,05
н/д
0,04 ± 0,02
н/д
pGX1432
10 мкг
0,09 ± 0,04
н/д
0,02 ± 0,02
н/д
30 мкг
0,07 ± 0,05
н/д
0,05 ± 0,04
н/д
50 мкг
0,17 ± 0,07
н/д
0,04 ± 0,03
н/д
Синтетический консенсусный LEMD1AF (pGX1433)
Конструкция
Доза
%CD8+ ± ст.откл.
Значение р
%CD8+CD107a+ ± ст.откл.
Значение р
pGX0001
30 мкг
0,17 ± 0,04
н/д
0,07 ± 0,01
н/д
pGX1433
10 мкг
0,72 ± 0,36
0,760
0,54 ± 0,39
0,897
30 мкг
1,65 ± 0,86
0,061
1,43 ± 1,39
0,089
50 мкг
1,73 ± 1,40
0,046
1,57 ± 1,39
0,053
Указанные значения р относятся к не подвергавшимся воздействию мышам (иммунизированным при помощи pGX0001). Значимым считается значение р≤0,05.
[0243] Конструкции pGXl43l и pGXl433 синтетического консенсусного LEMD1, но не pGXl432, индуцировали частоту T-клеток CD8+CDl07a+, которая была выше, чем у неиммунизированных мышей, но не была значимой при любом количестве дозы.
[0244] В частности, частота Т-клеток CD8+CDl07a+, специфичных в отношении антигена pGXl43l, составляла 1,37% ± 0,78%, 2,23% ± 1,45% и 1,97% ± 1,84%, соответственно, в группах количества дозы 10 мкг, 30 мкг и 50 мкг (ФИГ. 15A). Профиль цитокинов Т-клеток CD8+CDl07a+, специфичных в отношении pGX1431, был схожим в группах количеств дозы и состоял, в основном, из клеток IFNγ+IL-2-TNFα- и некоторого количества IFNγ+IL-2-TNFα+ (ФИГ. 15E).
[0245] Частота Т-клеток CD8+CDl07a+, специфичных в отношении антигена pGXl432, составляла 0,02% ± 0,02%, 0,05% ± 0,04% и 0,04% ± 0, 03%, соответственно, в группах количества дозы 10 мкг, 30 мкг и 50 мкг (ФИГ.15B). Профиль цитокинов Т-клеток CD8+CDl07a+, специфичных в отношении pGX1432 состоял, в основном, из клеток IFNγ+IL-2-TNFα-, IFNγ-IL-2+TNFα- и IFNγ+IL-2+TNFα- (ФИГ.15E).
[0246] Частота Т-клеток CD8+CDl07a+, специфичных в отношении антигена pGX1433, составляла 0,54% ± 0,39%, 1,43% ± 1,39% и 1,57% ± 1,39%, соответственно, в группах количества дозы 10 мкг (p=0,897), 30 мкг (p=0,089) и 50 мкг (p=0,053) (ФИГ.15C). Профиль цитокинов Т-клеток CD8+CDl07a+, специфичных в отношении pGX1433 состоял, в основном, из клеток IFNγ+IL-2-TNFα- и некоторого количества IFNγ+IL-2-TNFα+ (ФИГ.15E).
[0247] Понятно, что вышеприведенное подробное описание и сопровождающие примеры являются просто иллюстративными и не должны рассматриваться как ограничения объема изобретения, который определяется исключительно прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.
[0248] Различные изменения и модификации раскрытых вариантов воплощения будут очевидны для специалистов в данной области техники. Такие изменения и модификации к раскрытым вариантам воплощения, включая без ограничения изменения, относящиеся к химическим структурам, заместителям, производным, промежуточным соединениям, синтезам, композициям, составам или способам применения изобретения, могут быть сделаны без отклонения от его сущности и объема.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  INOVIO PHARMACEUTICALS, INC
<120>  ПРОТИВОРАКОВЫЕ ВАКЦИНЫ, НАПРАВЛЕННЫЕ НА LEMD1, И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130>  104409.000449 / INO-1006 WO
<150>  62/598,329
<151>  2017-12-13
<150>  62/598,612
<151>  2017-12-14
<160>  12
<170>  Патентная версия 3.5
<210>  1
<211>  600
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая консенсусная последовательность ДНК LEMD1A
<400>  1
atggactgga cctggattct gttcctggtg gcagcagcaa cacgggtgca ctccgtggac       60
gtgaagtgcc tgtctgattg taagctgcag aaccagctgg agaagctggc ctttagccct      120
ggcgccatcc tgccatccac caggaagctg gccgagaaga agctggtgca gctgctggtg      180
tccccacctt gcgcaccacc cgtgatgaat ggaccccgcg agctggacgg agcacaggat      240
agcgacgatt ccgaggagct gaacatcatc ctgcagggca atatcatcct gtctaccgag      300
aagagcaaga agctgaagaa gcggcccgag gcctctacca caaagcctaa ggccgtggac      360
acatactgcc tggattataa gccatctaag ggccggagat gggcagccag ggccccaagc      420
acccgcatca catacggcac catcacaaag gagcgggact attgtaccga ggatcagaca      480
gccgagagct ggagagagga gggcttccct gtgggcctga agctggccgt gctgggcatc      540
ttcatcatcg tggtgttcgt gtacctgaca gtggagaaca agccactgtt tggctgataa      600
<210>  2
<211>  198
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая консенсусная  последовательность белка LEMD1A
<400>  2
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1. 5                   10                  15
His Ser Val Asp Val Lys Cys Leu Ser Asp Cys Lys Leu Gln Asn Gln
20                  25                  30
Leu Glu Lys Leu Ala Phe Ser Pro Gly Ala Ile Leu Pro Ser Thr Arg
35                  40                  45
Lys Leu Ala Glu Lys Lys Leu Val Gln Leu Leu Val Ser Pro Pro Cys
50                  55                  60
Ala Pro Pro Val Met Asn Gly Pro Arg Glu Leu Asp Gly Ala Gln Asp
65                  70                  75                  80
Ser Asp Asp Ser Glu Glu Leu Asn Ile Ile Leu Gln Gly Asn Ile Ile
85                  90                  95
Leu Ser Thr Glu Lys Ser Lys Lys Leu Lys Lys Arg Pro Glu Ala Ser
100                 105                 110
Thr Thr Lys Pro Lys Ala Val Asp Thr Tyr Cys Leu Asp Tyr Lys Pro
115                 120                 125
Ser Lys Gly Arg Arg Trp Ala Ala Arg Ala Pro Ser Thr Arg Ile Thr
130                 135                 140
Tyr Gly Thr Ile Thr Lys Glu Arg Asp Tyr Cys Thr Glu Asp Gln Thr
145                 150                 155                 160
Ala Glu Ser Trp Arg Glu Glu Gly Phe Pro Val Gly Leu Lys Leu Ala
165                 170                 175
Val Leu Gly Ile Phe Ile Ile Val Val Phe Val Tyr Leu Thr Val Glu
180                 185                 190
Asn Lys Pro Leu Phe Gly
195
<210>  3
<211>  258
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>   Синтетическая консенсусная  последовательность ДНК LEMD1A
<400>  3
atggactgga cctggattct gttcctggtg gcagcagcaa caagggtgca ctctgtggac       60
gtgaagtgcc tgagcgattg taagctgcag aaccagctgg agaagctggc cttttcccca      120
ggagcaatcc tgaggggact gcaggagcac caggcaccag agagccacat gggactgtcc      180
cctaagcggg agaccacagc aaggaagacc agactgctga gggcaggaga gaagaaggtg      240
tctcagtggg cctgataa                                                    258
<210>  4
<211>  84
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая консенсусная  последовательность белка LEMD1A
<400>  4
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1. 5                   10                  15
His Ser Val Asp Val Lys Cys Leu Ser Asp Cys Lys Leu Gln Asn Gln
20                  25                  30
Leu Glu Lys Leu Ala Phe Ser Pro Gly Ala Ile Leu Arg Gly Leu Gln
35                  40                  45
Glu His Gln Ala Pro Glu Ser His Met Gly Leu Ser Pro Lys Arg Glu
50                  55                  60
Thr Thr Ala Arg Lys Thr Arg Leu Leu Arg Ala Gly Glu Lys Lys Val
65                  70                  75                  80
Ser Gln Trp Ala
<210>  5
<211>  819
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая консенсусная  последовательность ДНК LEMD1A
<400>  5
atggactgga cctggattct gttcctggtg gcagcagcaa cccgcgtgca ttccgtcgat       60
gtgaagtgtc tgagtgattg taaactgcag aaccagctgg agaagctggc ctttagccct      120
ggagcaatcc tgccatccac caggaagctg gccgagaaga agctggtgca gctgctggtg      180
agcccacctt gcgcaccacc cgtgatgaat ggcccaagag agctggacgg cgcccaggat      240
agcgacgatt ccgaggagct gaacatcatc ctgcagggca atatcatcct gtctaccgag      300
aagagcaaga agctgaagaa gcggcccgag gcctccacca caaagcctaa ggccgtggac      360
acatactgcc tggattataa gccttccaag ggccggagat gggcagccag ggccccatct      420
accaggatca catacggcac catcacaaag gagcgggact attgtaccga ggatcagaca      480
gccgagtctt ggagagagga gggattccca gtgggcctga agctggccgt gctgggcatc      540
ttcatcatcg tggtgttcgt gtacctgaca gtggagaaca agcctctgtt tggccggggc      600
agaaagaggc gctctgtgga tgtaaaatgc ctatcggact gcaagttgca aaatcaatta      660
gaaaaattgg ccttctcccc aggggcgata ttgaggggcc tgcaggagca ccaggcacca      720
gagtcccaca tgggcctgtc tcccaagcgc gagacaaccg caagaaaaac aaggctgctg      780
agggctgggg aaaagaaagt gtcacagtgg gcatgataa                             819
<210>  6
<211>  271
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая консенсусная  последовательность белка LEMD1A
<400>  6
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1. 5                   10                  15
His Ser Val Asp Val Lys Cys Leu Ser Asp Cys Lys Leu Gln Asn Gln
20                  25                  30
Leu Glu Lys Leu Ala Phe Ser Pro Gly Ala Ile Leu Pro Ser Thr Arg
35                  40                  45
Lys Leu Ala Glu Lys Lys Leu Val Gln Leu Leu Val Ser Pro Pro Cys
50                  55                  60
Ala Pro Pro Val Met Asn Gly Pro Arg Glu Leu Asp Gly Ala Gln Asp
65                  70                  75                  80
Ser Asp Asp Ser Glu Glu Leu Asn Ile Ile Leu Gln Gly Asn Ile Ile
85                  90                  95
Leu Ser Thr Glu Lys Ser Lys Lys Leu Lys Lys Arg Pro Glu Ala Ser
100                 105                 110
Thr Thr Lys Pro Lys Ala Val Asp Thr Tyr Cys Leu Asp Tyr Lys Pro
115                 120                 125
Ser Lys Gly Arg Arg Trp Ala Ala Arg Ala Pro Ser Thr Arg Ile Thr
130                 135                 140
Tyr Gly Thr Ile Thr Lys Glu Arg Asp Tyr Cys Thr Glu Asp Gln Thr
145                 150                 155                 160
Ala Glu Ser Trp Arg Glu Glu Gly Phe Pro Val Gly Leu Lys Leu Ala
165                 170                 175
Val Leu Gly Ile Phe Ile Ile Val Val Phe Val Tyr Leu Thr Val Glu
180                 185                 190
Asn Lys Pro Leu Phe Gly Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Val Asp Val
195                 200                 205
Lys Cys Leu Ser Asp Cys Lys Leu Gln Asn Gln Leu Glu Lys Leu Ala
210                 215                 220
Phe Ser Pro Gly Ala Ile Leu Arg Gly Leu Gln Glu His Gln Ala Pro
225                 230                 235                 240
Glu Ser His Met Gly Leu Ser Pro Lys Arg Glu Thr Thr Ala Arg Lys
245                 250                 255
Thr Arg Leu Leu Arg Ala Gly Glu Lys Lys Val Ser Gln Trp Ala
260                 265                 270
<210>  7
<211>  3554
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  pGX1431
<400>  7
gctgcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta       60
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata      120
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat      180
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga      240
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc      300
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt      360
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat      420
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag      480
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc      540
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga      600
ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga      660
aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt      720
accgagctcg gatccgccac catggactgg acctggattc tgttcctggt ggcagcagca      780
acacgggtgc actccgtgga cgtgaagtgc ctgtctgatt gtaagctgca gaaccagctg      840
gagaagctgg cctttagccc tggcgccatc ctgccatcca ccaggaagct ggccgagaag      900
aagctggtgc agctgctggt gtccccacct tgcgcaccac ccgtgatgaa tggaccccgc      960
gagctggacg gagcacagga tagcgacgat tccgaggagc tgaacatcat cctgcagggc     1020
aatatcatcc tgtctaccga gaagagcaag aagctgaaga agcggcccga ggcctctacc     1080
acaaagccta aggccgtgga cacatactgc ctggattata agccatctaa gggccggaga     1140
tgggcagcca gggccccaag cacccgcatc acatacggca ccatcacaaa ggagcgggac     1200
tattgtaccg aggatcagac agccgagagc tggagagagg agggcttccc tgtgggcctg     1260
aagctggccg tgctgggcat cttcatcatc gtggtgttcg tgtacctgac agtggagaac     1320
aagccactgt ttggctgata actcgagtct agagggcccg tttaaacccg ctgatcagcc     1380
tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg     1440
accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat     1500
tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag     1560
gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc ttctactggg     1620
cggttttatg gacagcaagc gaaccggaat tgccagctgg ggcgccctct ggtaaggttg     1680
ggaagccctg caaagtaaac tggatggctt tcttgccgcc aaggatctga tggcgcaggg     1740
gatcaagctc tgatcaagag acaggatgag gatcgtttcg catgattgaa caagatggat     1800
tgcacgcagg ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac tgggcacaac     1860
agacaatcgg ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc     1920
tttttgtcaa gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact gcaagacgag gcagcgcggc     1980
tatcgtggct ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag     2040
cgggaaggga ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc     2100
ttgctcctgc cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg     2160
atccggctac ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc     2220
ggatggaagc cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga agagcatcag gggctcgcgc     2280
cagccgaact gttcgccagg ctcaaggcga gcatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtga     2340
cccatggcga tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca     2400
tcgactgtgg ccggctgggt gtggcggacc gctatcagga catagcgttg gctacccgtg     2460
atattgctga agagcttggc ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg     2520
ccgctcccga ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct tgacgagttc ttctgaatta     2580
ttaacgctta caatttcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac     2640
accgcatcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc     2700
taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa     2760
tagcacgtgc taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat     2820
aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta     2880
gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa     2940
acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt     3000
tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag     3060
ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta     3120
atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca     3180
agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag     3240
cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa     3300
agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga     3360
acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc     3420
gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc     3480
ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt     3540
gctcacatgt tctt                                                       3554
<210>  8
<211>  3212
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  pGX1432
<400>  8
gctgcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta       60
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata      120
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat      180
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga      240
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc      300
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt      360
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat      420
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag      480
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc      540
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga      600
ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga      660
aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt      720
accgagctcg gatccgccac catggactgg acctggattc tgttcctggt ggcagcagca      780
acaagggtgc actctgtgga cgtgaagtgc ctgagcgatt gtaagctgca gaaccagctg      840
gagaagctgg ccttttcccc aggagcaatc ctgaggggac tgcaggagca ccaggcacca      900
gagagccaca tgggactgtc ccctaagcgg gagaccacag caaggaagac cagactgctg      960
agggcaggag agaagaaggt gtctcagtgg gcctgataac tcgagtctag agggcccgtt     1020
taaacccgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc     1080
tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat     1140
gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg     1200
caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc     1260
tctatggctt ctactgggcg gttttatgga cagcaagcga accggaattg ccagctgggg     1320
cgccctctgg taaggttggg aagccctgca aagtaaactg gatggctttc ttgccgccaa     1380
ggatctgatg gcgcagggga tcaagctctg atcaagagac aggatgagga tcgtttcgca     1440
tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg     1500
gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag     1560
cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc     1620
aagacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc     1680
tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg     1740
atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc     1800
ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca     1860
tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag     1920
agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgagc atgcccgacg     1980
gcgaggatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg     2040
gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca     2100
tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc     2160
tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg     2220
acgagttctt ctgaattatt aacgcttaca atttcctgat gcggtatttt ctccttacgc     2280
atctgtgcgg tatttcacac cgcatcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc     2340
cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc     2400
tgataaatgc ttcaataata gcacgtgcta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag     2460
gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac     2520
tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc     2580
gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat     2640
caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat     2700
actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct     2760
acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt     2820
cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg     2880
gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta     2940
cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg     3000
gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg     3060
tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc     3120
tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg     3180
gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tt                                   3212
<210>  9
<211>  3773
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  pGX1433
<400>  9
gctgcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta       60
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata      120
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat      180
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga      240
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc      300
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt      360
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat      420
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag      480
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc      540
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga      600
ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga      660
aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt      720
accgagctcg gatccgccac catggactgg acctggattc tgttcctggt ggcagcagca      780
acccgcgtgc attccgtcga tgtgaagtgt ctgagtgatt gtaaactgca gaaccagctg      840
gagaagctgg cctttagccc tggagcaatc ctgccatcca ccaggaagct ggccgagaag      900
aagctggtgc agctgctggt gagcccacct tgcgcaccac ccgtgatgaa tggcccaaga      960
gagctggacg gcgcccagga tagcgacgat tccgaggagc tgaacatcat cctgcagggc     1020
aatatcatcc tgtctaccga gaagagcaag aagctgaaga agcggcccga ggcctccacc     1080
acaaagccta aggccgtgga cacatactgc ctggattata agccttccaa gggccggaga     1140
tgggcagcca gggccccatc taccaggatc acatacggca ccatcacaaa ggagcgggac     1200
tattgtaccg aggatcagac agccgagtct tggagagagg agggattccc agtgggcctg     1260
aagctggccg tgctgggcat cttcatcatc gtggtgttcg tgtacctgac agtggagaac     1320
aagcctctgt ttggccgggg cagaaagagg cgctctgtgg atgtaaaatg cctatcggac     1380
tgcaagttgc aaaatcaatt agaaaaattg gccttctccc caggggcgat attgaggggc     1440
ctgcaggagc accaggcacc agagtcccac atgggcctgt ctcccaagcg cgagacaacc     1500
gcaagaaaaa caaggctgct gagggctggg gaaaagaaag tgtcacagtg ggcatgataa     1560
ctcgagtcta gagggcccgt ttaaacccgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc     1620
cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc     1680
actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct     1740
attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg     1800
catgctgggg atgcggtggg ctctatggct tctactgggc ggttttatgg acagcaagcg     1860
aaccggaatt gccagctggg gcgccctctg gtaaggttgg gaagccctgc aaagtaaact     1920
ggatggcttt cttgccgcca aggatctgat ggcgcagggg atcaagctct gatcaagaga     1980
caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg     2040
cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg     2100
ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt     2160
ccggtgccct gaatgaactg caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg     2220
gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat     2280
tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat     2340
ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg     2400
accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg     2460
atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc     2520
tcaaggcgag catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc     2580
cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg     2640
tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg     2700
gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca     2760
tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgaattat taacgcttac aatttcctga     2820
tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatcagg tggcactttt     2880
cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat     2940
ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat agcacgtgct aaaacttcat     3000
ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct     3060
taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct     3120
tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca     3180
gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc     3240
agcagagcgc agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc     3300
aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct     3360
gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag     3420
gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc     3480
tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg     3540
agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag     3600
cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt     3660
gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac     3720
gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctt            3773
<210>  10
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Сайт расщепления фурином
<400>  10
Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser
1. 5
<210>  11
<211>  198
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<220>
<223>  Последовательность нативного человеческого белка LEMD1A
<400>  11
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1. 5                   10                  15
His Ser Val Asp Val Lys Cys Leu Ser Asp Cys Lys Leu Gln Asn Gln
20                  25                  30
Leu Glu Lys Leu Gly Phe Ser Pro Gly Pro Ile Leu Pro Ser Thr Arg
35                  40                  45
Lys Leu Tyr Glu Lys Lys Leu Val Gln Leu Leu Val Ser Pro Pro Cys
50                  55                  60
Ala Pro Pro Val Met Asn Gly Pro Arg Glu Leu Asp Gly Ala Gln Asp
65                  70                  75                  80
Ser Asp Asp Ser Glu Glu Leu Asn Ile Ile Leu Gln Gly Asn Ile Ile
85                  90                  95
Leu Ser Thr Glu Lys Ser Lys Lys Leu Lys Lys Trp Pro Glu Ala Ser
100                 105                 110
Thr Thr Lys Arg Lys Ala Val Asp Thr Tyr Cys Leu Asp Tyr Lys Pro
115                 120                 125
Ser Lys Gly Arg Arg Trp Ala Ala Arg Ala Pro Ser Thr Arg Ile Thr
130                 135                 140
Tyr Gly Thr Ile Thr Lys Glu Arg Asp Tyr Cys Ala Glu Asp Gln Thr
145                 150                 155                 160
Ile Glu Ser Trp Arg Glu Glu Gly Phe Pro Val Gly Leu Lys Leu Ala
165                 170                 175
Val Leu Gly Ile Phe Ile Ile Val Val Phe Val Tyr Leu Thr Val Glu
180                 185                 190
Asn Lys Ser Leu Phe Gly
195
<210>  12
<211>  84
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<220>
<223>  Последовательность нативного человеческого белка LEMD1F
<400>  12
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1. 5                   10                  15
His Ser Val Asp Val Lys Cys Leu Ser Asp Cys Lys Leu Gln Asn Gln
20                  25                  30
Leu Glu Lys Leu Gly Phe Ser Pro Gly Pro Ile Leu Arg Gly Leu Gln
35                  40                  45
Glu His Gln Ala Pro Glu Ser His Met Gly Leu Ser Pro Lys Arg Glu
50                  55                  60
Thr Thr Ala Arg Lys Thr Arg Leu Ser Arg Ala Gly Glu Lys Lys Val
65                  70                  75                  80
Ser Gln Trp Ala
<---