Иммуносупрессорные эффекты т-регуляторных клеток при инфильтративном туберкулезе легких

© коллектив авторов, 2012

УДК 616.24-002.5-003.2-078.33

Е. Г. Чурина, О. И. Уразова, в. в. Новицкий, А. Е. Колосова, Е. в. Сионина, О. в. Филинюк, О. в. воронкова, И. О. Наследникова

иммуносупрессорные эффекты т-регуляторных клеток при инФильтрдтивном туберкулезе легких

Кафедра патофизиологии ГОУ вПО Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства но здравоохранению и социальному развитию, Томск

В работе исследованы особенности субпопуляционного состава Т-регуляторных клеток (Teg) с супрессорной активностью и продукция иммунорегуляторных цитокинов, обладающих свойствами супрессировать иммунный ответ (IL-10, TGFfi) у пациентов с инфильтративным туберкулезом легких. Показано, что ведущую роль в формировании иммуносупрессии и туберкулиновой анергии при инфильтративном туберкулезе легких играют T с фенотипом CD4+CD25+Foxp3+. Продемонстрировано, что иммуносупрессия, опосредованная цитокинопродукцией, связана с увеличением как базальной, так и BCG-индуцированной секреции IL-10, на фоне снижения уровня продукции TGFfi мононуклеарными лейкоцитами in vitro.

Ключевые слова: Т-регуляторные клетки, иммуносупрессия, цитокины, инфильтративный туберкулез легких

Ye.G. Tchurina, O.I. Urazova, V.V. Novitsky, A.Ye. Kolosov, Ye.V. Sionina, O.V. Filinyuk, O.V. Voronkova, I.O. Naslednikova THE IMMUNE STRESSOR EFFECTS OF T-REGULATORY CELLS UNDER INFILTRATIVE TUBERCULOSIS

OF LUNGS

The article deals with the characteristics of sup-population composition of T-regulatory cells with suppressor activity and production of immunoregulatory cytokines suppressing immune response (IL-10, TGF-в) in patients with infiltrative tuberculosis of lungs. It is proved that the leading role in formation of immunodepression and tuberculin anergy under infiltrative tuberculosis of lungs is played by T-regulatory cells with phenotype CD4+CD25+Foxp3+. It is demonstrated that the immunodepression mediated by cytokine production is connected with increasing of both basal and BCG-induced secretion of IL-10 on the background of decrease of level of production of TGF-Pby mononuclear leukocytes in vitro.

Key words: T-regulatory cells, immunosuppression, cytokine, infiltrative tuberculosis of lungs

В последние годы в отечественной и зарубежной литературе появилось много работ, в которых характеризуется иммунный статус и эффективность иммунного ответа у больных туберкулезом легких, так как состояние факторов иммунологической защиты является решающим при инфицировании Mycobacterium tuberculosis, определяет клинико-морфологическое течение туберкулезного процесса и исход заболевания [2, 3]. Контроль за распространением М. tuberculosis в организме осуществляется с вовлечением широкого спектра иммунокомпетентных клеток и продуцируемых ими цитокинов. В последнее десятилетие особое внимание уделяется изучению Т-регуляторных клеток (T,), обладающих су-прессорной активностью. Выделяют как минимум две разновидности T -клеток: естественные T (СБ4+СБ25+Рохр3+) с

re^ reg 4 i

супрессорной активностью и индуцированные на периферии (СВ4+СБ25+Рохр3-, СБ4+СБ25-Рохр3+). При этом супрессорной активностью обладают преимущественно РохрЗ-экспрессирующие клетки, т. е. лимфоциты СБ4+СБ25+Рохр3+ и СБ4+СБ25-Рохр3+. Но механизмы действия Treg, при инфекционных заболеваниях, в том числе при туберкулезе, до сих пор не изучены, хотя предполагают наличие двух основных путей реализации супрессорного эффекта: контактзависи-мым способом и через продукцию иммунорегуляторных цитокинов (IL-10 и TGPß) [1, 4, 8].

Цель исследования - оценить роль T^-клеток и продуцируемых ими иммунорегуляторных цитокинов в супрессии иммунного ответа при инфильтративном туберкулезе легких.

Для корреспонденции:

Чурина Елена Георгиевна, канд. мед. наук, докторант Адрес: 634050, Томск, Московский тракт, 2 Телефон: +7-913-8060-700 E-mail: office@ssmu.tomsk.ru

Материалы и методы. Обследовано 20 пациентов с впервые выявленным инфильтративным туберкулезом легких (15 мужчин и 5 женщин в возрасте от 18 до 55 лет, средний возраст 43 ± 13 лет). Диагноз туберкулеза легких устанавливали на основании клинической картины заболевания, рентгенологического исследования легких, данных микроскопического и бактериологического исследования мокроты. Возбудитель туберкулеза выявляли методом прямой световой микроскопии мазка мокроты, окрашенного по Цилю-Нильсену, а также методом люминесцентной микроскопии с использованием флюорохромов (аурамина). Для видовой идентификации М. tuberculosis проводили посев мокроты на плотные питательные среды Левенштейна-Йенсена и Финн II.

Всем обследованным внутрикожно вводили туберкулин (реакция Манту) в объеме 0,1 мл раствора, содержащего 2 ТЕ. Все больные были разделены на 2 группы в зависимости от реакции на внутрикожное введение туберкулина: 14 с положительной и 6 с отрицательной.

Критериями исключения больных туберкулезом из исследования служили возраст менее 18 или более 55 лет, проведение вакцинации или ревакцинации (в течение менее 3 лет до момента начала исследования) BCG и другими вакцинами, недавно (менее 3 мес назад) перенесенная инфекция, острые и хронические (в стадии обострения) инфекционные и соматические заболевания, отягощенный аллергологический анамнез.

В контрольную группу были включены 15 здоровых доноров (10 мужчин и 5 женщин в возрасте от 18 до 55 лет, средний возраст 41 ± 7 лет), не предъявлявшие на момент обследования жалоб соматического характера.

Материалом исследования являлась периферическая венозная кровь больных туберкулезом легких и здоровых доноров. Кровь брали утром натощак из локтевой вены в количестве 10 мл.

Культивирование мононуклеарных лейкоцитов периферической крови проводили по методу Е. Д. Гольдберга и соавт.

иммунология

(1992). Для определения уровня IL-10 и TGFp в супернатан-тах культуральных суспензий использовали твердофазный иммуноферментный сандвич-метод (ELISA). Иммунофер-ментный анализ проводили по инструкциям, предлагаемым отечественными (ООО "Протеиновый контур", Россия) и зарубежными ("ВСМ Diagnostics", США) производителями тест-систем. Оптическую плотность содержимого ячеек планшета регистрировали на фотометре Multiscan ЕХ (Финляндия) при длине волны 450 нм. Концентрацию цитокинов вычисляли по калибровочной кривой. Результаты выражали в пикограммах на 1 мл.

Для определения сочетанной экспрессии CD4 и CD25 на лимфоцитах периферической крови и внутриклеточного маркера Fохр3 применяли метод проточной лазерной трехцветной цитометрии с использованием специфических моноклональных антител, меченных флюоресцентными метками (FITC, PerCP; "Becton Dickinson", США). Для пер-меабилизации и перфорации мембран лимфоцитов с целью определения внутриклеточного содержания Fохр3 использовали стандартные буферы из набора BD Pharmingen Human Foxp3 Buffer Set (США).

Анализ образцов клеточных суспензий проводили на проточном цитометре FACSCalibur ("Becton-Dickinson", США) с аргоновым лазером на основе определения следующих параметров: малого углового (FSC, характеризующего размер клетки) и бокового (SSQ характеризующего цитоплазмати-

ческие и мембранные особенности клетки) светорассеяния и трех показателей флюоресценции - зеленой (FITC 530 нм), оранжевой (РЕ - 585 нм) и малиновой (РегСР 610 нм) в гейте мононуклеарных клеток, выявляемых на каналах FL1, FL2, FL3.

Использовали автоматическое программное обеспечение и методы сбора и анализа данных с высоким разрешением (1024 канала).

Результаты исследования обрабатывали с использованием стандартного пакета программ SPSS v. 11.0. Для всех имеющихся выборок данных проверяли гипотезу нормальности распределения по критерию Шапиро-Уилкса. Так как распределение выборок отличалось от нормального, рассчитывали медиану (Ме), 1-й и 3-й квартили (Q Q3). Для оценки достоверности различий выборок, не подчиняющихся нормальному распределению, использовали критерии Манна-Уитни и Вилкоксона. Различия считались достоверными при р < 0,05.

Результаты и обсуждение. При оценке результатов проведенного исследования у больных инфильтративным туберкулезом легких вне зависимости от реакции на туберкулин были зарегистрированы изменения количественных показателей белой крови по сравнению с соответствующими значениями у здоровых доноров, проявляющиеся достоверным увеличением общего количества лейкоцитов (ОКЛ) и лимфо-цитопенией, особенно выраженной в случае отрицательной

Содержание лейкоцитов в периферической крови и продукция цитокинов in vitro у больных инфильтративным туберкулезом легких, Ме

Показатель Здоровые доноры Больные инфильтративным туберкулезом легких

c отрицательной реакцией на туберкулин c положительной реакцией на туберкулин

Общее количество лейкоцитов, • 109/л 5,70 (5,15-6,25) 10,20 (7,85-14,28) р1 = 0,001 8,70 (8,08-10,33) р1 = 0,001

Содержание лимфоцитов: % в числителе абс. • 109/л (в знаменателе) 31,00 (29,0-34,5) 8,0 (5,5-9,75) р1 = 0,001 20,3 (14,25-29,70) р1 = 0,001

1,80

Концентрация IL-10, пг/мл:

базальная секреция 25,29 (15,60-33,50) 48,20 (33,00-54,48) р1 = 0,045 49,29 (22,60-61,97) р1 = 0,045

индуцированная ВСО секреция 24,48 (22,50-158,20) 65,73 (62,09-91,00) р1 = 0,029 р3 = 0,043 54,30 (29,75-62,.09) р1 = 0,006

Концентрация TGFp, пг/мл:

базальная секреция 1108,75 (925,70-1546,90) 907,80 (695,80-1103,05) 856,00 (29,39-972,50) р1 = 0,017

индуцированная ВСО секреция 1087,80 (703,90-1327,60) 756,00 (276,20-897,10) р1 = 0,043 р2 = 0,001 528,80 (46,92-728,00) р1 = 0,045 р^ = 0,031

Индекс стимуляции:

IL-10 1,08

TGFp 0,82

Субпопуляции регулятор-ных Т-лимфоцитов, %:

СD4+СD25+Fохр3+ 2,60 (2,00-3,10) 5,00 (3,50-6,50) р1 = 0,012 4,50 (2,25-6,75) р1 = 0,038

СD4+СD25+Fохр3- 25,00

СD4+СD25-Fохр3+ 5,00 (4,80-8,00) 6,00 (3,50-7,75) р2 = 0,043 4,00 (3,25-5,00) р1 = 0,019

Примечание. р1 - уровень статистической значимости различий по сравнению с соответствующими показателями у здоровых доноров,р2 - по сравнению с больными туберкулезом легких с положительной туберкулиновой реакцией, р3 - но сравнению с базальным уровнем продукции цитокина.

реакции на внутрикожное введение туберкулина (см. таблицу). Увеличение ОКЛ в периферической крови можно рассматривать как защитную реакцию организма на внедрение инфекционного агента, направленную на элиминацию возбудителя. Кроме того, лейкоцитоз служит одним из маркеров, характеризующих остроту инфекционного процесса [2].

Развитие выраженной лимфоцитопении у обследованных больных связано прежде всего со специфической тропно-стью микобактерий к лимфоидной ткани. Лимфоцитопения является признаком иммунодефицита, инициированного М. tuberculosis и формирующегося за счет токсического действия компонентов бактерий (кордфактора, сульфатидов и др.) на лимфоциты, возможно, с последующим запуском программированной гибели иммунокомпетентных клеток [2].

Одной из важнейших особенностей Т-клеток, в том числе Treg- лимфоцитов, является способность синтезировать имму-ноцитокины, осуществляющие регуляцию иммунных процессов в организме. Данные об участии иммунорегулятор-ных цитокинов в реализации иммунного ответа при различных формах туберкулеза малочисленны и противоречивы, но исследования на экспериментальных моделях показали, что наиболее широким спектром супрессорного воздействия обладают TGFß и IL-10 [7].

Известно, что при инфильтративном туберкулезе отмечается наименьшая степень нарушений в показателях иммунитета, что согласуется с меньшей выраженностью клинико-рентгенологических проявлений заболевания по сравнению с другими клиническими формами туберкулеза легких. У таких больных наблюдается адекватное функционирование Т-клеточного ответа, эффективно работают клеточные механизмы защиты. При этом сохранена функциональная активность иммунокомпетентных клеток и преобладает продукция провоспалительных иммунорегуляторных цитокинов (IL-2, IL-12, IFN-y), а ведущую роль в формировании туберкулиновой анергии у больных инфильтративным туберкулезом легких играет IL-10 [7].

В ходе проведенных исследований было зарегистрировано изменение уровня базальной продукции IL-10, который у больных с инфильтративным туберкулезом легких вне зависимости от реакции на туберкулин оказался достоверно выше (в 2 раза), чем у здоровых доноров (см. таблицу).

Действие вакцинного штамма BCG на клеточные культуры вызывало статистически значимое увеличение (по сравнению с группой здоровых доноров) секреции IL-10 у больных инфильтративным туберкулезом легких как с отрицательной, так и с положительной реакцией на туберкулин (в 2,7 и 2,2 раза соответственно, см. таблицу).

При этом добавление в культуру мононуклеарных лейкоцитов вакцинного штамма BCG приводило к значимому усилению (относительно спонтанной) продукции IL-10 только у больных инфильтративным туберкулезом легких с отрицательной пробой Манту - в 1,4 раза (см. таблицу). Индекс стимуляции у этих пациентов был повышенным как по сравнению с нормой, так и по сравнению с таковым у туберку-линположительных пациентов, что свидетельствует о более высоких резервных возможностях IL-10-образующих клеток (в частности, Т^-лимфоцитов периферической крови) у ту-беркулинотрицательных пациентов и как следствие о более выраженной цитокинопосредованной супрессии иммунного ответа у данной группы пациентов (см. таблицу).

При анализе продукции TGFß значимое снижение ее ба-зального уровня относительно группы здоровых доноров было зарегистрировано у туберкулинположительных пациентов с инфильтративным туберкулезом легких (в 1,6 раза; см. таблицу).

Индукция культуры клеток вакцинным штаммом BCG вызывала еще более выраженное снижение продукции TGFß относительно базального уровня секреции цитокина у больных инфильтративным туберкулезом легких как с отрицательной, так и с положительной реакцией на туберкулин - в

1,2 и 1,6 раза соответственно (см. таблицу). Индекс стимуляции у больных инфильтративным туберкулезом легких вне зависимости от реакции на туберкулин также был несколько ниже нормы, но статистически значимых различий выявлено не было (см. таблицу).

Анализ BCG-индуцированной секреции TGFß у пациентов с инфильтративным туберкулезом легких по сравнению с группой здоровых доноров показал, что у туберкулинпо-ложительных больных данный показатель был в 2 раза ниже нормы. У туберкулинотрицательных больных уровень BCG-зависимой секреции данного цитокина оказался ниже по сравнению с таковым у здоровых доноров в 1,4 раза, но статистически значимых различий выявлено не было (см. таблицу).

При оценке количества регуляторных Т-лимфоцитов в крови были зарегистрированы следующие значимые изменения: у больных инфильтративным туберкулезом легких как с отрицательной, так и с положительной реакцией на туберкулин выявлялось увеличение количества С04+СВ25Тохр3+-лимфоцитов (в 1,9 в 1,7 раза соответственно), количество Т^-лимфоцитов СD4+СD25+Fохр3- было сопоставимым с контролем. Количество (T^-лимфоцитов СD4+СD25+Fохр3+ у больных инфильтративным туберкулезом легких с положительной реакцией на туберкулин было ниже в 1,25 раза по сравнению с таковым у здоровых доноров. Кроме того, у туберкулинположительных пациентов количество клеток данной субпопуляции было ниже, чем у туберкулинотрица-тельных в 1,5 раза (см. таблицу).

Таким образом, обобщая полученные в результате исследования данные, можно предположить, что у туберку-линположительных пациентов с инфильтративным туберкулезом легких сниженный уровень как базальной, так и BCG-индуцированной секреции TGFß может быть связан со снижением количества субпопуляции T^-клеток с фенотипом СD4+СD25+Fохр3+. Tre -клетки с указанным фенотипом принято считать индуцированными [5], т. е. генерированными на периферии под воздействием TGFß, так как экспрессии Foxp3+ в большей степени способствует TGFß, чем IL-10, хотя они и сами способны секретировать оба эти цитокина. С одной стороны, снижение базальной и стимулированной секреции TGFß может являться следствием угнетения функциональной активности клеток, продуцирующих данный цитокин (СD4+СD25-Fохр3+), с другой - возможна обратная ситуация, при которой изначально сниженное количество данной субпопуляции T^-клеток могло привести к снижению продукции TGFß, в том числе и другими клетками [6]. Что касается увеличения секреции IL-10, то это, возможно, связано с увеличением количества лимфоцитов СD4+СD25+Fохр3+, которые, как принято считать, являются естественными регуляторными клетками (Trn), образующимися в тимусе, и именно они, как правило, ответственны за гиперпродукцию IL-10 [1].

Достоверное увеличение количества Trn, способных вырабатывать супрессорные цитокины, основные из которых TGFß и IL-10, в группе пациентов с инфильтративным туберкулезом легких вне зависимости от реакции на туберкулин (т. е. с острым процессом) по сравнению со здоровыми донорами, по-видимому, связано с тем, что у этих пациентов формируется супрессия Т-клеточного ответа как фактор ограничения выраженной иммунной реакции и гиперергического воспаления, опосредующего повреждение ткани легких. По всей видимости у данных пациентов преобладает цитокино-продукция в направлении IL-10, являющегося ингибитором клеточного иммунитета, что может привести к активации гуморального иммунитета, а следовательно, к диссеминации инфекции и ухудшению прогноза заболевания [9.

У туберкулинотрицательных пациентов с инфильтра-тивным туберкулезом легких отмечалось более выраженное увеличение количества T^-лимфоцитов с фенотипом СD4+СD25+Fохр3+ в крови, что может быть фактором риска

иммунология

хронизации и затяжного течения заболевания, распространения инфекции. При этом увеличение как базальной, так и ВСО-индуцированной секреции И-10 также является неблагоприятным прогностическим признаком, поскольку его избыток ведет к снижению противоинфекционной защиты, формированию туберкулиновой анергии, недостаточному подавлению туберкулезной инфекции и развитию хронического процесса [3].

Заключение. Полученные нами данные позволяют думать о том, что ведущую роль в формировании иммуносупрессии при инфильтративном туберкулезе легких играют Тге -клетки с фенотипом С04+С025+Рохр3+. При этом отмечается дисбаланс в количестве субпопуляций Тге с супрессорной активностью. При инфильтративном туберкулезе увеличивается количество С04+С025+Рохр3+-клеток с супрессорной активностью, причем данные изменения наиболее выражены у ту-беркулинотрицательных пациентов, что свидетельствует об их непосредственной роли в формировании туберкулиновой анергии.

При инфильтративном туберкулезе легких иммуносу-прессия, опосредованная цитокинопродукцией, связана с увеличением как базальной, так и ВСО-индуцированной секреции И-10, при этом происходит снижение уровня базаль-

ной и BCG-индуцированной продукции TGFp мононуклеар-ными лейкоцитами in vitro.

ЛИТЕРАТУРА

1. Воробьев А. А., Быковская С. Н., Пашков Е. П., Быков А. С. // Вестн. РАМН. - 2006. - № 9-10. - С. 24-29.

2. Мишин В. Ю., Борисов С. Е., Аксенов В. А. // Пробл. туб. - 2005. - № 3. - С. 47-64.

3. Новицкий В. В., Синицына В. А., Воронкова О. В. и др. // Пробл. туб. - 2005. - № 6. - С. 39-42.

4. Beissert S., Schwarz A., Schwarz T. // J. Invest. Dermatol. - 2006. -Vol. 126. - P. 15-24.

5. Cassetti R., Martino A. // Cell Mol. Immunol. - 2008. - Vol. 5. - P. 161-170.

6. Jameson J., Havran W. // Immunol. Rev. - 2007. - Vol. 15. - P. 114122.

7. Kapp J., KappL., McKennaK. // Immunol. Res. - 2004. - Vol. 9. - P. 93-102.

8. Minz C, Steinman R., Fujii S. // J. Exp. Med. - 2005. - Vol. 202. - P 203-207.

9. Wands J., Roark C, Aydintung M. // J. Leukocyte Biol. - 2005. - Vol. 78. - P. 1086-1096.

Поступила 08.10.10

© КОЛЛЕКТИв АвТОРОв, 2012

УДК 612.118.221.2:612.6.02.017.1].083

м. А. Логинова12, Н. П. Трофимова1, И. в. Парамонов1

АНАЛИЗ ЧАСТОТЫ ВЫЯВЛЕНИЯ НЕОДНОЗНАЧНОСТЕЙ ЛОКУСОВ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ НЬА-ТИПИРОВАНИЯ ПО ТЕХНОЛОГИИ SSO

Лаборатория Н^А-типирования ФГУ Приволжский окружной медицинский центр экспертизы качества препаратов крови и исследования фракционирования донорской плазмы Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития, 2вятский государственный университет , г. Киров

Проведено HLA-типирование 1829 человек по локусам HLA-A, HLA-В, HLA-DRB1 с использованием наборов реагентов LABType SSO (One Lambda, США). Определены показатели неоднозначности каждого локуса: 4,43% для локуса HLA-A, 4,43% для локуса HLA-В, 0,16% для локуса HLA-DRB1. Используя лист "редких" аллелей, проанализировали 13 типов выявленных неоднозначностей по локусу HLA-A, 27 типов - по локусу HLA-В и 3 типа - по локусу HLA-DRB1.

Ключевые слова: локусы, HLA-типирование

M.A. Loginova, N.P. Trofimova, I.V. Paramonov

THE ANALYSIS OF DETECTION RATE OF AMBIGUITY OF LOCI UNDER HLA-TYPING BY SSO TECHNOLOGY

The article deals with the results of HLA-typing of 1829 patients on loci HLA-A, HLA-B, HLA-DRB1 using kits of LABType SSO reagents (One Lambada, USA). The indicators of each locus ambiguity are determined: locus HLA-A - 4.43%%, locus HLA-B - 4.43%%, locus HLA-DRB1 - 0.16%%. The list of "rare" alleles was applied to analyze 13 types of determined ambiguities on locus HLA-A, 27 types on locus HLA-B, 3 types on locus HLA-DRB1.

Key words: locus, HLA-typing

За годы, прошедшие с момента открытия Жаном Доссе системы HLA (human leukocyte antigen), представления о ее биологической роли расширились [3, 11]. В настоящее время HLA-типирование проводят для решения следующих задач: подбор доноров для трансплантации органов и тканей [12, 14], определение предрасположенности к различным заболеваниям [11], биологическая идентификация (HLA-

Для корреспонденции:

Логинова Мария Александровна, канд. биол. наук, биолог лаб. HLA-типирования

Адрес: 610002, Киров, ул. Ленина, 104 Телефон: 8-8332-36-80-77 E-mail: mlogin2010@gmail.com

генотип наследуется вместе с родительскими генами), диагностика случаев бесплодия [11] и др. Выбор технологии проведения HLA-типирования во многом зависит от поставленной задачи.

В настоящее время HLA-типирование проводят серологическими и молекулярно-генетическими методами. Последние более предпочтительны, так как позволяют выявлять и изучать непосредственно гены HLA. Молекулярно-генетические методы представлены тремя основными технологиями - SSP (sequence specific primers), SBT (sequence-based typing) и SSO (sequence specific oligonucleotides).

При проведении HLA-типирования по технологии SSP искомые HLA-участки ДНК "улавливаются" специфическими праймерами в процессе амплификации. Основными достоинствами технологии SSP являются возможность осуществлять