Диагностический набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н9 в реакции торможения гемагглютинации
DIAGNOSTIC SET FOR DETECTING ANTIBODIES TO AVIAN INFLUENZA VIRUS SUBTYPE H9 IN HEMAGGLUTINATION INHIBITION REACTION

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к созданию диагностического набора РТГА для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н9 при разработке и производстве средств диагностики.
Грипп птиц (ГП) - контагиозное вирусное заболевание домашних и диких птиц, характеризующееся, в первую очередь, поражением органов дыхания и пищеварения [6, 8]. Тяжесть заболевания гриппом птиц может варьировать в широких пределах: от бессимптомного носительства до тяжелого генерализованного инфекционного процесса, сопровождающегося высокой смертностью среди птиц. На этом основании, в соответствии с особенностями патогенеза гриппозной инфекции для цыплят и согласно кодексу Всемирной организации здравоохранения животных (OIE), ГП дифференцирован на 2 группы: высокопатогенный грипп птиц (ВПГП) и низкопатогенный грипп птиц (НПГП). Высокопатогенный грипп птиц относится к заболеваниям, подлежащим обязательному уведомлению Всемирной организации здравоохранения животных [OIE, 2018].
Вирус гриппа птиц подтипа Н9, относящийся к низкопатогенным вирусам гриппа, был впервые выделен в 1966 году от птиц в США. С тех пор он не только распространился по всему миру, но и значительно расширил круг хозяев. С середины 90-х годов прошлого века он стал вызывать вспышки заболевания среди домашней птицы. В материковой части Китая вирус гриппа Н9 впервые был выделен в 1994 году [7] и в последнее десятилетие стал наиболее распространенным подтипом вируса гриппа среди домашней птицы.
Возбудитель - РНК содержащий вирус Influenza A virus, относящийся к семейству Orthomyxoviridae. Вирусы данного семейства разделены на 7 родов: Thogotovirus, Quaranjavirus, Isavirus, Alphainfluenzavirus, Betainfluenzavirus, Gammainfluenzavirus и Deltainfluenzavirus. Вирус гриппа птиц (Influenza A virus) принадлежит к роду Alphainfluenzavirus.
На сегодняшний день грипп птиц вызывается только вирусом гриппа А, который подразделяется на подтипы на основе антигенных различий двух поверхностных гликопротеинов: гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). На данный момент известно 18 гемагглютинирующих (Н1-Н18) и 11 нейраминидазных подтипов (N1-N11) вирусов гриппа А [13]. Среди них, Н1-Н16 и N1-N9 подтипы были выделены от водоплавающих птиц, в то время как вирусы подтипов H17N10 и H18N11 были выделены от летучих мышей [13].
Хотя вирусы гриппа А подтипа Н9 классифицируются как низковирулентные вирусы гриппа, широкое распространение этого вируса среди птиц привело к большим экономическим потерям в птицеводстве из-за значительного снижения яйценоскости и высокой смертности, вызванной коинфекцией с другими патогенами. Для вируса подтипа Н9 продемонстрирована совместимость генов с другими подтипами вируса гриппа А и показана возможность формировать реассортанты с другими подтипами вируса, способные заражать млекопитающих [6].
В настоящее время вирусы гриппа А/Н9 широко распространены в Китае, Африке и Юго-Восточной Азии и встречаются у домашней птицы в большом количестве [10, 11].
В Российской Федерации впервые был выявлен вирус гриппа птица А подтипа Н9 в 2012 году в одном из бройлерных хозяйств Дальнего Востока. В 2018 году он был выявлен на Дальнем Востоке РФ на трех птицеводческих предприятиях промышленного типа [1]. Следует отметить, что Приморский край граничит непосредственно с Китаем, являющимся лидером по количеству вспышек гриппа птиц подтипа Н9. В этом же году вирус гриппа А/Н9 был выявлен в Амурской области у двух диких уток. Все эти случаи свидетельствуют о циркуляции вируса гриппа подтипа Н9 в популяциях домашних и диких птиц на Дальнем Востоке.
В связи с возникновением заболевания в Российской Федерации возникла необходимость иметь высокоэффективные диагностические препараты, которые позволили бы идентифицировать возбудителя вируса гриппа птиц подтипа Н9. Это обстоятельство требует постоянных поисков штаммов, пригодных для изготовления современных средств диагностики вируса гриппа птиц подтипа Н9.
Традиционно, для диагностики гриппа птиц применяют реакцию торможения гемагглютинации (РТГА). РТГА обладает высокой чувствительностью и достоверно оценивает уровень специфических антител в сыворотке крови больных или вакцинированных птиц, а также позволяет обнаружить и идентифицировать гемагглютинирующий агент при его выделении. Разработка высокочувствительных и надежных серологических методов идентификации низковирулентных подтипов вируса гриппа птиц, таких, как Н9, необходима для осуществления эпидемиологического контроля и серологического мониторинга распространения вируса гриппа птиц подтипа Н9 в популяциях сельскохозяйственных и диких птиц с целью своевременного выявления постинфекционных и поствакцинальных антител.
В настоящее время в Российской Федерации известны наборы/тест-системы для диагностики гриппа птиц.
Известен набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц, основанный на иммуноферментном анализе (ИФА) [3]. Способ заключается в связывании специфических антител к вирусу гриппа с вирусным антигеном, сорбированным на дне лунок полистиролового планшета, последующим выявлением количества связавшихся антител с использованием конъюгата - антивидовых антител и ферментной метки. К недостаткам способа можно отнести не очень высокую специфичность (обусловленную высокой чувствительностью метода) и невозможность использования ИФА-тест систему для тестирования крови птиц разных видов [2].
Известен набор для диагностики гриппа птиц в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) (подтипы H1-H15), с помощью которого можно исследовать сыворотки крови птиц на 15 подтипов по гемагглютинину. В его состав входят:
- инактивированные референтные штаммы вируса гриппа птиц с подтипами гемагглютинина Н1-Н15;
- моноспецифические гипериммунные сыворотки к 15 серологическим вариантам вируса гриппа птиц (H1-H15);
- нормальная сыворотка, не содержащая антител к вирусу гриппа птиц [4].
Наиболее близким по технической сущности по совокупности существенных признаков к заявляемому и взятым за прототип является набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 в реакции торможения гемагглютинации (организация-производитель: ФГБУ «ВНИИЗЖ»), который содержит иммуноспецифические и неспецифические компоненты. [5]. Недостатком набора - прототипа является возможность выявлять антитела к высокопатогенному вирусу гриппа птиц подтипа Н5.
Недостатком производимых в настоящее время наборов является тот факт, что иммуноспецифические компоненты для РТГА приготовлены из штаммов, полученных в течение последних 20 лет. А учитывая эпизоотические вспышки и антигенную вариабельность изолятов вируса гриппа птиц, необходимо своевременное обновление диагностических штаммов. В связи с распространением низковирулентного вируса гриппа птиц подтипа Н9 в популяциях сельскохозяйственной и дикой птицы необходима разработка диагностического набора с соответствующим актуальным антигеном.
Целью изобретения является разработка диагностического набора для выявления антител к низковирулентному вирусу гриппа птиц подтипа Н9 в реакции торможения гемагглютинации на основе актуального штамма вируса гриппа птиц, позволяющего выявлять и определять количество антител к НА вируса гриппа птиц подтипа Н9.
Поставленная цель достигается тем, что предлагаемый диагностический набор содержит специфический антиген вируса гриппа птиц, полученный из штамма «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2». Принцип РТГА основан на специфическом взаимодействии антител, содержащихся в сыворотке крови птиц с антигеном вируса гриппа птиц подтипа Н9, что приводит к потере его агглютинирующих свойств и визуально проявляется оседанием или склеиванием эритроцитов.
Технический результат от изобретения заключается в разработке современного, высокоспецифичного диагностического набора, предназначенного для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н9 в реакции торможения гемагглютинации с применением штамма «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2» вируса гриппа птиц при получении специфических компонентов для РТГА.
В состав предлагаемого диагностического набора РТГА входят:
3
1. Инактивированный антиген вируса штамма «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2» гриппа птиц подтипа Н9 - 2,0 см;
3
2. Гипериммунная сыворотка крови кур (положительный контроль) - 0,5 см;
3
3. Нормальная сыворотка крови кур (отрицательный контроль), не содержащая антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н9 - 0,5 см;
4. Набор солей для приготовления забуференного физиологического раствора: натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный и калий фосфорнокислый однозамещенный - 22,5 г;
5. Соль натрия лимоннокислого - 3,0 г.
Сущность изобретения поясняется чертежами.
Фиг. 1 - схема РТГА.
Фиг. 2 - схема расположения контрольных и испытуемых проб.
Фиг. 3 - учет реакции РТГА.
Фиг.4 - дендрограмма, видовая принадлежность штамма «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2» методом секвестрования.
Фиг. 5 - препарат очищенного низкопатогенного ВГП представленный методом электронной микроскопии (негативное окрашивание с 2% фосфорно-вольфрамовой кислотой; увеличение х 282, 100).
Разработанный диагностический набор на основе актуального штамма «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2» вируса гриппа птиц, позволяющего выявлять и определять титр антител к НА вируса гриппа птиц подтипа Н9 в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) основан на специфическом взаимодействии антител, содержащихся в исследуемой сыворотке крови птиц, с антигеном вируса гриппа птиц подтипа Н9, что приводит к потере его агглютинирующих свойств и визуально проявляется оседанием или склеиванием эритроцитов. Схема РТГА представлена на Фиг. 1.
РТГА проводят в три этапа:
- определение гемагглютинирующего титра антигена в реакции гемагглютинации (РГА);
- подготовка рабочей дозы антигена;
- выявление специфических антител в пробах сыворотки крови.
РГА оценивают положительно при оседании эритроцитов в виде «зонтика», отрицательно - в виде «пуговки» при отсутствии спонтанной агглютинации в контроле. За титр антигена принимают его наибольшее разведение, дающее четко выраженную агглютинацию эритроцитов в виде «зонтика», что соответствует 1 гемагглютинирующей единице (1 ГАЕ). Гемагглютинирующая активность антигена должна быть не ниже 1:64.
Для постановки РТГА готовят рабочую дозу антигена (4 ГАЕ), исходя из его титра, установленного в РГА. Учет реакции проводят после оседания эритроцитов в контроле. При правильном определении рабочей дозы в первой и второй лунках должна быть полная агглютинация («зонтик»), в третьей лунке, содержащей  ГАЕ - частичная, в четвертой - отсутствие агглютинации («пуговка»).
3
3
Для выявления специфических антител в пробах сыворотки крови от птиц во все лунки планшета вносят забуференный физиологический раствор в объеме 0,050 см (0,025 см). Затем в первую лунку вертикального ряда добавляют равный объем испытуемой сыворотки, трижды пипетируют и готовят ряд последовательных двукратных разведений (с 1:2 до 1:4096). Схема расположения контрольных и испытуемых проб представлена на Фиг. 2.
3
3
3
После этого, во все лунки вносят рабочее разведение антигена в объеме 0,05 см3 (0,025 см), осторожно встряхивают и после 30 минут контакта при комнатной температуре (18-26)°С в каждую лунку добавляют 0,05 см (0,025 см) 1% суспензии эритроцитов. Планшеты аккуратно встряхивают и оставляют при комнатной температуре (18-26)°С на (30-40) мин.
Одновременно ставят контроли реакции:
- на отсутствие изоагглютинации сывороток (агглютинация эритроцитов должна отсутствовать);
- на спонтанную агглютинацию эритроцитов (должна отсутствовать);
- контроль активности положительной и отрицательной сыворотки крови.
2
Учет результатов реакции проводят визуально после полного оседания эритроцитов в контрольных лунках (в виде «пуговки»). Титром сыворотки считают наибольшее ее разведение, в котором полностью отсутствует агглютинация эритроцитов антигеном вируса ГП. Исследуемая сыворотка оценивается положительно, если она содержит специфические к вирусу гриппа птиц типа А подтипа Н9 антитела в титре 1:16 (4,0 log) и выше.
Результат тестирования контрольных и испытуемых проб в РТГА представлен на Фиг. 3.
С использованием разработанного диагностического набора проведены исследования референтных и испытуемых полевых сывороток крови, отобранных от сельскохозяйственных, синантропных и диких птиц.
При исследовании активности и специфичности компонентов набора с нормальными (не содержащими антител к вирусу гриппа птиц) и гетерологичными сыворотками были получены отрицательные результаты, положительные сыворотки крови кур (содержащие антитела к вирусу гриппа птиц) к вирусу гриппа птиц типа А подтипа Н9 показали положительный результат.
Проверка стабильности компонентов набора (по воспроизводимости результатов исследований, проведенных в двух повторностях) показала воспроизводимость полученных результатов.
Набор рассчитан на проведение 300 исследований сывороток. Срок годности набора 12 месяцев от даты изготовления при хранении в защищенном от света месте и температуре от 2°С до 8°С.
Контроль штамма «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2» вируса гриппа птиц на специфичность.
Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2» вируса гриппа птиц, был выделен от кур из промышленного хозяйства Приморского края. Депонирован 10 апреля 2019 г. в Коллекцию штаммов микроорганизмов федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») под регистрационным номером №113-деп/19-3-КШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».
Генотаксономическая характеристика штамма
«A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2» вируса гриппа птиц подтипа Н9.
Возбудителем болезни является вирус гриппа птиц Influenza A virus, относящийся к роду Alphainfluenzavirus, семейству Orthomyxoviridae. Принадлежность штамма вируса гриппа к роду определяется консервативными элементами генома, задающими антигенные характеристики нуклеокапсидов.
Вирионы вируса гриппа имеют наружную липопротеиновую оболочку, чаще сферической формы. Диаметр сферических форм 60-180 нм. Встречаются нитевидные формы вирионов до 200-350 нм. Вирусные частицы содержат РНК - 1%, белки - 70%, жиры - 20%, углеводы - до 8% [14].
Геном вируса сформирован одноцепочечной сегментированной (-) РНК, которая состоит из 8 сегментов и кодирует 11 белков вируса. Вирусная РНК упакована белком нуклеопротеином (NP) в нуклеокапсид.
Антигенная вариабельность и таксономическая классификация вируса основана на идентификации двух основных поверхностных белков - гемагглютинина и нейраминидазы.
Видовая принадлежность штамма «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2» к вирусу гриппа птиц подтипа H9N2 была подтверждена методами серологической (РТГА и реакция ингибиции нейраминидазной активности (РИНА)) и молекулярно-биологической диагностики (ОТ-ПЦР-РВ, ОТ-ПЦР и секвенирование).
По своим антигенным свойствам штамм «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2» вируса гриппа птиц относится к семейству Orthomyxoviridae, роду Alphainfluenzavirus, виду Influenza A virus, типу А, подтипу H9N2.
Гемагглютинирующая активность штамма «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2» подавляется специфической сывороткой к вирусу гриппа птиц подтипа H9N2 («IZSVe», Италия), что подтверждает принадлежность штамма «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2» вируса гриппа птиц к подтипу Н9. Нейраминидазная активность штамма подавляется специфической сывороткой к вирусу гриппа птиц (ВГП) подтипа H5N2 («IZSVe», Италия), что подтверждает принадлежность штамма «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2» вируса гриппа птиц к подтипу H9N2.
С целью генетической характеристики было проведено определение первичной структуры фрагмента гена НА испытуемого образца штамма вируса гриппа птиц с последующим анализом филогенетического родства с другими штаммами и изолятами ВГП подтипа H9N2.
Филогенетический анализ полученной нуклеотидной последовательности (1414-1572 п.н.) фрагмента гена НА, методом секвестрования, показал, что исследуемый штамм «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2» вируса гриппа птиц принадлежит к генетической линии Y-280/G9-like, широко распространенной на территории КНР и сопредельных государств Юго-Восточной Азии (Фиг. 4).
Отсутствие контаминации исследуемого образца штамма вируса гриппа птиц посторонними вирусами ньюкаслской болезни (НБ), инфекционного бронхита кур (ИБК), инфекционного ларинготрахеита птиц (ИЛТ), инфекционной бурсальной болезни (ИББ), реовирусом птиц было подтверждено методами ПЦР-РВ и ОТ-ПЦР-РВ. Подтверждение отсутствия контаминации микоплазмами проводили в соответствии с требованиями ГФ XIV, том 1, с. 1201-1222.
В результате контроля было установлено, что штамм «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2» не контаминирован указанными посторонними вирусами и микоплазмами.
Биологические характеристики.
50
3
Штамм «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2» вируса гриппа птиц способен к размножению в куриных эмбрионах (КЭ) без предварительной адаптации и показывает высокую гемагглютинирующую (титр в РГА составил 1:512 (9,0 Log2)) и инфекционную активность при двукратном титровании в СПФ-КЭ (свободные от патогенной микрофлоры куриные эмбрионы) (инфекционный титр более 10,13 lg ЭИД/см).
50
3
Штамм «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2» вируса гриппа птиц сохраняет инфекционную и антигенную активность в лиофилизированном виде, предназначен для изготовления диагностических препаратов, репродуцируется в СПФ-КЭ в течение 4-5 суток инкубирования и накапливается в титре 10,13 lg ЭИД/см. Данные титрования представлены в таблице 1.
Подтверждение отсутствия контаминации бактериями и грибами исследуемого штамма вируса гриппа птиц проводили в соответствии с ГОСТ 28085 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Метод бактериологического контроля стерильности».
Установлено, что штамм «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2» не контаминирован бактериями, грибами и микоплазмами.
Биотехнологические свойства.
Инактивированный вирус индуцирует антитела, выявляемые методами реакции торможения гемагглютинирующей активности (РТГА) и иммуноферментным анализом (ИФА).
Устойчивость к внешним факторам.
Штамм «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2» вируса ГП чувствителен к детергентам, формальдегиду, бета-пропиолактону, производным азиридина, быстро инактивируется при прогревании 56°С, ультрафиолетовом облучении и при рН ниже 5,0.
В результате проведения последовательных пассажей в 11 суточных СПФ-КЭ был получен штамм «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2» вируса гриппа птиц, имеющий стабильные биотехнологические и антигенные свойства и пригодный для изготовления и получения антигенов и сывороток для диагностики вируса гриппа птиц подтипа Н9.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1. Получение антигена вируса гриппа птиц подтипа Н9.
3
Для изготовления антигена вируса гриппа птиц подтипа Н9 использовали штамм «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2», полученный из Коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ», и 11 суточные СПФ-КЭ. Перед проведением работ куриные эмбрионы овоскопировали, отбирали жизнеспособные, подвижные эмбрионы с хорошо развитой сосудистой системой. Посевной вирус разводили стерильным фосфатно-буферным раствором рН (7,2-7,4) в объеме, необходимым для заражения партии 11-суточных куриных эмбрионов, из расчета 0,2 см на эмбрион. К рабочему разведению вируса добавляли антибиотики. Инокулированные куриные эмбрионы инкубировали при температуре (37±1)°C и относительной влажности (60-70)% в течение 72 часов. Ежесуточно эмбрионы овоскопировали и проверяли их состояние. Все эмбрионы, погибшие в течение 24 ч после инокуляции браковали и утилизировали. Эмбрионы, погибшие через (48-72) ч, и оставшиеся живые эмбрионы выдерживали в течение (12-24) ч при температуре (4±2)°С. Экстраэмбриональную жидкость из полости эмбриона отсасывали в стерильный флакон с помощью стерильной пипетки с резиновой грушей.
Для инактивации инфекционных свойств вируса использовали рабочее разведение бета-пропиолактона с конечной концентрации 0,1%. Инактивированную вируссодержащую суспензию центрифугировали при 5000 об/мин (4000 g) в течение 25 мин при температуре +4°С. Надосадочную жидкость, содержащую очищенный антиген, хранили при температуре +4°С до лиофилизации.
2
Гемагглютинирующую активность вирусного препарата определяли в реакции гемагглютинации. Титр гемагглютинирующей активности вируса должен быть не ниже 1:128 (7,0 log).
3
2
2
Очищенную инактивированную вируссодержащую суспензию, после добавления стабилизаторов и антибиотиков, разливали по 2 см в стеклянные флаконы и замораживали при температуре минус (55-60)°С (не менее шести часов). Высушивание проводили в вакуумных аппаратах фирмы Usifroid, Франция. По окончании лиофилизации титр антигена вируса гриппа птиц подтипа Н9 в РГА должен быть не менее 1:64 (6,0 log). Гемагглютинирующая активность антигена для серии набора составила 1:512 (9,0 log). Специфичность препарата антигена штамма «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2» после лиофилизации проверяли в РТГА с гомо- и гетерологичными сыворотками крови птиц. Результаты представлены в таблице 2. Полученный лиофилизированный препарат антигена штамма «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2» вируса гриппа птиц подтипа Н9 реагировал только со специфической сывороткой крови, содержащей антитела к вирусу гриппа птиц подтипа Н9 (IZSVe, Италия), что говорит о специфичности приготовленного антигена.
Пример 2. Получение положительной и отрицательной контрольных сывороток крови.
Для получения гипериммунных положительных и нормальных отрицательных сывороток крови кур отбирают клинически здоровых кур 40-60 суточного возраста.
2
Для иммунизации 40-суточных кур использовали очищенную инактивированную бета-пропиолактоном экстраэмбриональную жидкость (ЭЭЖ), полученную от 11-суточных эмбрионов, зараженных штаммом «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2», эмульгированную с равным объемом адъюванта ISA-70, SEPPIC, Франция. Иммунизацию кур проводили двукратно с интервалом 14 суток, внутримышечно в объеме 1,0 см3 в область бедренной или грудных мышц. Через 10 суток после второй иммунизации проводили пробное взятие крови из подкрыльцовой вены для определения специфической активности в РТГА. В том случае, если активность сыворотки была ниже 1:128 (7,0 log), проводили дополнительную иммунизацию.
2
Пробы крови выдерживали сначала при температуре (37±1)°С в течение (30-60) мин, а затем при (4±2)°С в течение суток. Отстоявшуюся сыворотку отбирали в стерильные пробирки, не допуская попадания эритроцитов и других форменных элементов крови. Сыворотку инактивировали при температуре (57±1)°С в течение 30 мин на водяной бане. Активность полученной сыворотки в РТГА со специфическим антигеном вируса гриппа птиц подтипа Н9 «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2» должна быть не ниже 1:128 (7,0 log ).
Нормальную отрицательную сыворотку кур получали путем обескровливания здоровой птицы, не имеющей антител к вирусу гриппа птиц. Проверку отрицательной сыворотки крови на активность и специфичность проводили в РТГА с использованием специфических антигенов и сывороток к вирусу гриппа птиц подтипа H1-H16; к вирусам ньюкаслской болезни, синдрома снижения яйценоскости-76 и микоплазме галлисептикум. Для составления серийного препарата использовали пробы сыворотки крови, активность которых с гетерологичными антигенами не превышала фоновый уровень - титр 1:4 (реакция с неиммунной сывороткой).
2
Лиофилизацию сывороток крови после добавления к ним стабилизаторов проводили в вакуумных аппаратах фирмы Usifroid, Франция. Активность полученной лиофилизированной гипериммунной сыворотки (положительный контроль) должна быть не менее 1:64 (6,0 log). Активность отрицательной контрольной сыворотки не должна быть больше 1:4.
В таблице 3 представлены результаты тестирования контрольных сывороток для серии диагностического набора.
Пример 3. Применение диагностического набора для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н9 в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).
Перед постановкой реакции готовят рабочие растворы:
3
- Забуференный физиологический раствор, рН (7,2-7,4), предназначенный для растворения лиофилизированных антигена и сывороток, соли натрия лимоннокислого, разведения исследуемых проб сывороток крови в лунке планшета. Содержимое флакона с набором солей натрия хлористого - 17,0 г, натрия фосфорнокислого двузамещенного - 4,8 г, калия фосфорнокислого однозамещенного - 0,7 г, растворить в 2000 см дистиллированной воды. Раствор рекомендуется хранить при температуре (2-8)°С не более одного месяца;
3
- 3% раствор натрия лимоннокислого, предназначенный для приготовления взвеси эритроцитов. Содержимое флакона с солью натрия лимоннокислого растворить в 100 см забуференного физиологического раствора. Раствор рекомендуется хранить при температуре (2-8)°С не более одного месяца;
- 1%-ю суспензию эритроцитов. Для получения эритроцитов кровь берут из подкрыльцовой вены от цыплят, кур или петухов-доноров, не имеющих антител к вирусу гриппа птиц. Кровь отбирают во флаконы с 3% раствором натрия лимоннокислого в соотношении 1:2, трижды отмывают забуференным физиологическим раствором путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 минут. Из осадка эритроцитов на забуференном физиологическом растворе готовят 1%-ю суспензию эритроцитов. Хранят суспензию при температуре (2-8)°С до появления признаков гемолиза эритроцитов;
- Воду для приготовления растворов используют дистиллированную с рН 6,0.
3
Для получения сывороток крови от птиц кровь берут из подкрыльцовой вены или путем скарификации гребня в объеме (1,0-2,0) см в пробирки, предварительно увлажненные забуференным физиологическим раствором. Образовавшийся сгусток отделяют от стенок тонким металлическим стержнем или пастеровской пипеткой и выдерживают при температуре (18-26)°С в течение (12-18) часов или при температуре 37°С в термостате в течение 60 минут, а затем (8-10) часов при температуре от 2°С до 8°С. Отстоявшуюся сыворотку сливают в чистые пробирки. Для удаления термолабильных ингибиторов сыворотку прогревают на водяной бане при температуре 56°С в течение 30 минут. Подготовленные сыворотки используют для постановки РТГА. При необходимости хранения сывороток более трех суток до начала исследований их замораживают при температуре не выше минус 15°С.
1. Определение гемагглютинирующего титра антигена.
Постановка реакции гемагглютинации (РГА).
3
3
3
3
3
3
Для постановки РГА готовят двукратные разведения антигена, полученного из штамма «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2», от 1:2 до 1:4096. С этой целью во все лунки полимерного круглодонного планшета для иммунологических реакций вносят забуференный физиологический раствор в объеме 0,050 см или 0,025 см. В первую лунку горизонтального ряда добавляют равный объем подготовленного антигена вируса гриппа птиц, полученного из штамма «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2», трехкратно пипетируют и переносят по 0,050 см или 0,025 см во вторую лунку и т.д. Из последней лунки удаляют по 0,050 см или 0,025 см испытуемого материала.
После разведения антигена во все лунки вносят 1%-ю суспензию эритроцитов в объеме, равном исходному внесенному объему забуференного физиологического раствора. Планшеты аккуратно встряхивают и оставляют при температуре (18-26)°С на (30-40) минут.
3
3
3
3
Для контроля эритроцитов на отсутствие спонтанной агглютинации и определения времени учета реакции в две-три лунки планшета с двойным объемом забуференного физиологического раствора (0,10 см или 0,05 см) добавляют по 0,050 см или 0,025 см 1% суспензии эритроцитов. Учет реакции проводят после оседания эритроцитов в виде «пуговицы» в контрольных лунках.
РГА оценивают положительно при оседании эритроцитов в виде хорошо выраженного «зонтика», отрицательно - в виде «пуговки» при отсутствии спонтанной агглютинации в контроле.
За титр антигена принимают его наибольшее разведение, дающее четко выраженную агглютинацию эритроцитов в виде «зонтика», что соответствует 1 гемагглютинирующей единице (1 ГАЕ). Титр антигена должен соответствовать значению, указанному на этикетке флакона с антигеном плюс или минус одно разведение.
2. Подготовка рабочей дозы инактивированного антигена штамма «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2»
Для постановки РТГА готовят рабочую дозу антигена (4 ГАЕ), исходя из его титра, установленного в РГА. Объем рабочей дозы антигена определяют, исходя из количества подлежащих исследованию сывороток. Рабочую дозу антигена готовят непосредственно в день постановки реакции с обязательным контролем 4 ГАЕ.
Для этого в 4 лунки разливают забуференный физиологический раствор в объеме, выбранном для постановки реакции. В первую добавляют равный объем рабочей дозы антигена и титруют.
3
3
3
3
Для определения времени учета реакции в две-три лунки планшета с двойным объемом забуференного физиологического раствора (0,100 см или 0,050 см) добавляют по 0,050 см или 0,025 см 1% суспензии эритроцитов.
Учет реакции проводят после оседания эритроцитов в контроле. При правильном определении рабочей дозы в первой и второй лунках должна быть полная агглютинация («зонтик»), в третьей лунке, содержащей  ГАЕ - частичная, в четвертой - отсутствие агглютинации («пуговка»). Корректирование рабочей дозы (увеличение или уменьшение) проводят путем добавления антигена или забуференного физиологического раствора с обязательным повторным контролем 4 ГАЕ.
3. Выявление специфических антител в исследуемых и контрольных пробах сыворотки крови от птиц
3
3
Во все лунки планшета полимерного для иммунологических реакций (круглодонного) вносят забуференный физиологический раствор в объеме 0,050 см (0,025 см). Затем в первую лунку горизонтального ряда добавляют равный объем испытуемой сыворотки, трижды пипетируют и готовят ряд последовательных двукратных разведений с 1:2 до 1:409б.
3
3
3
3
После этого, во все лунки вносят рабочее разведение антигена (приготовленного по прописи выше), в объеме 0,05 см (0,025 см), осторожно встряхивают и после 30 минут контакта при температуре (18-26)°С в каждую лунку добавляют 0,05 см (0,025 см) 1% суспензии эритроцитов. Планшеты аккуратно встряхивают и оставляют при комнатной температуре (18-26)°С на (30-40) минут.
Одновременно ставят контроли реакции:
3
3
- На отсутствие изоагглютинации сывороток - в одну лунку планшета вносят 0,050 см (0,025 см) забуференного физиологического раствора, добавляют равный объем испытуемой сыворотки и 1%-ой суспензии эритроцитов. Агглютинация эритроцитов должна отсутствовать.
3
3
- На спонтанную агглютинацию эритроцитов - к двойному объему забуференного физиологического раствора добавляют 0,050 см (0,025 см) 1%-ю суспензию эритроцитов. Спонтанная агглютинация эритроцитов должна отсутствовать.
3
3
3
3
- Контроль активности положительной и отрицательной сывороток крови. В лунки одного ряда планшета вносят по 0,025 см или 0,050 см забуференного физиологического раствора. Затем в первые лунки добавляют равные объемы специфической (положительной) и отрицательной сыворотки, трижды пипетируют и готовят последовательные двукратные разведения с 1:2 до 1:4096. После этого в лунки вносят рабочую дозу антигена в выбранном объеме для постановки реакции, осторожно встряхивают и оставляют для контакта в течение 30 мин при комнатной температуре (18-26)°С, после чего в каждую лунку добавляют по 0,025 см или 0,050 см 1% суспензии эритроцитов. Контрольная гипериммунная положительная сыворотка должна тормозить гемагглютинирующую активность 4 ГАЕ антигена в титре, указанном на этикетке флакона с положительной сывороткой плюс или минус одно разведение. Отрицательная сыворотка должна тормозить гемагглютинирующую активность 4 ГАЕ антигена в титре, меньшем, чем 1:4.
Учет результатов реакции проводят визуально после полного оседания эритроцитов в контрольных лунках (в виде «пуговки»). Титром сыворотки считают наибольшее ее разведение, в котором полностью отсутствует агглютинация эритроцитов антигеном вируса гриппа птиц.
2
Исследуемая сыворотка оценивается положительно, если она содержит специфические к вирусу гриппа птиц подтипа Н9 антитела в титре 1:16 (4,0 log) и выше.
Пример 4. Определение специфичности набора
Для определения специфичности «диагностического набора для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н9 в РТГА» исследовали сыворотки крови от группы СПФ-цыплят 3-х недельного возраста в РТГА, предварительно тестированные методом РТГА с использованием антигенов фирмы «GD» (Нидерланды) и IZSVe (Италия). Результаты представлены в таблице 4.
Диагностический набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н9 в РТГА со всеми испытуемыми антигенами показал 100% специфичность.
Для подтверждения специфичности набора Н9 в РТГА были использованы также специфические сыворотки крови кур к гемагглютинирующим вирусам ньюкаслской болезни, гриппа птиц подтипов Н1-Н8 и Н10-Н16, и микоплазмам «GD» (Нидерланды) и IZISVe (Италия). Результаты представлены в таблице 5.
Было показано, что активность антигена штамма «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2» вируса ГП подтипа Н9, из разработанного набора, с гетерологичными сыворотками (пробы 3-7) не превышала фоновый уровень (реакция с неиммунной сывороткой, титр антител не более 1:4). Гомологичные сыворотки крови кур к вирусу ГП подтипа Н9 различных производителей (пробы 1 и 2) показали положительный результат, титр сыворотки составил 1:256. Все полученные данные подтверждают 100% специфичность набора.
Пример 5. Определение диагностической чувствительности
Для сравнения результатов для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н9 в РТГА производства ФГБУ «ВНИИЗЖ» (разработанный набор) и РТГА с применением различных антигенов вируса ГП подтипа Н9 других производителей было исследовано 75 сывороток крови от цыплят одного из птицехозяйств РФ, привитых вакцинами против гриппа птиц подтипа Н9, 25 сывороток крови были исследованы от контрольных (не вакцинированных) птиц. Птицы были привиты в суточном возрасте, отбор проб для исследования проведен через (30-35) суток после вакцинации. Все пробы предварительно были исследованы в ИФА с использованием набора ФГБУ «ВНИИЗЖ» для выявления антител к вирусу гриппа птиц при тестировании сывороток крови в одном разведении. Результаты параллельного исследования сывороток крови на наличие антител к вирусу ГП представлены в таблицах 6 и 7.
Результаты сравнения чувствительности и специфичности РТГА для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н9 в сыворотках крови кур при использовании антигенов разных производителей представлены в таблице 8.
По полученным результатам можно сделать вывод о близком антигенном родстве между антигенами:
- антиген штамма «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2» вируса ГП подтипа Н9 из разработанного набора производства ФГБУ «ВНИИЗЖ»;
- GD (Нидерланды).
В результате проведенной оценки разработанный диагностический набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н9 в реакции торможения гемагглютинации, производства ФГБУ «ВНИИЗЖ», показал высокую специфичность и чувствительность (100% и 98%, соответственно), воспроизводимость (коэффициент вариации не выше 10% между разными сериями анализа) и правильность. Высокая точность выявления антител (98%) позволяет использовать его как эффективный инструмент для проведения диагностических исследований, оценки иммунного статуса птицы и контроля поствакцинального иммунитета.
Диагностическая чувствительность реакции составила 100%.
Таким образом, предлагаемый «Диагностический набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н9 в реакции торможения гемагглютинации» на основе актуального штамма «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2» вируса гриппа птиц, является чувствительной и специфичной диагностической системой. Набор позволяет быстро в течение рабочего дня провести диагностику вируса гриппа птиц подтипа Н9, отвечает современным требованиям и может быть внедрен в практику ветеринарных лабораторий для контроля эпизоотической ситуации по гриппу птиц типа А подтипа Н9 на территории РФ.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Диагностический набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н9 в реакции торможения гемагглютинации»:
1. Волков, М.С. О распространении вируса низкопатогенного гриппа A/H9N2 в мире и на территории Российской Федерации. Проблемы искоренения болезни / М.С. Волков, А.В. Варкентин, В.Н. Ирза // ВетС. - 2019. - С. 51-55.
2. Биологические ветеринарные препараты в России: вакцины, сыворотки, диагностикумы: Справочник. / Е.А. Романов. - Казань: Рутен, 2005. - С. 486-489.
3. Инструкция к «Набору для выявления антител к вирусу гриппа птиц (ВГП) методом иммуноферментного анализа». ООО «НИИ Авивак».
4. Инструкция к «Набору антигенов и сывороток для диагностики гриппа птиц в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)». ОАО «Покровский завод биопрепаратов». http://www.pokrovbio.ru/view_content.php?id=84
5. Инструкция к «Набору для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 в реакции торможения гемагглютинации». ФГБУ «ВНИИЗЖ». http://www.arriah.ru/main/production/price-diagnosticums/119/nabor-dlya-vyyavleniya-antitel-k-virusu-grippa-ptits-podtipa
6. Alexander, D.J. Characterization of influenza viruses isolated from turkeys in Great Britain during 1963-1977 / D.J. Alexander, W.H. Allan, G. Parsons // Research in Veterinary Science. - 1979. - Vol. 26. - P. 17-20.
7. Alexander D.J. Summary of avian influenza activity in Europe, Asia, Africa, and Australasia, 2002-2006 / D.J. Alexander - Avian Diseases. - 2007. - Vol. 51. - P. 161-166.
8. A Global Perspective on H9N2 Avian Influenza Virus. Review / T.P. Peacock, Joe James, Joshua E. Sealy and Munir Iqbal // Viruses. - 2019, 11, 620; doi:10.3390/v11070620
9. Evolution of the H9N2 influenza genotype that facilitated the genesis of the novel H7N9 virus/ Pu J., Wang S., Yin Y. [et al] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2015. - Vol. 112. - P. 548-553.
10. Epidemiological survey and genetic evolution of H9 subtype influenza viruses in Shanghai, China, from 2006 to 2010 / J.P. Zhou, F.F. Ge, J. Liu [et al.] // Arch. Virology. - 2012. - Vol. 157. - P. 1193-1198.
11. Phylogenetic analysis of influenza A viruses (H6N8, H1N8, H4N2, H9N2, H10N7) isolated from wild birds, duck and ostriches in South Africa from 2007 to 2009 / C. Abolnik, G.H. Gerdes, M. Sinclair [et al.] // Avian Diseases. - 2010. - Vol. 54. - P. 313-323.
th
12. Swayne, D.E. Influenza / D.E. Swayne, D.A. Halvorson // Diseases of Poultry / ed. Y.M. Saif [et al.]. - 12 ed. - Ames, IA, 2008. - Chap. 6. - P. 153-184.
13. Tong, S. New world bats harbor diverse influenza A viruses / Tong S., Zhu X., Li Y. [et al.] // PLoS Pathogens. - 2013. - Vol. 9(10). - P. e1003657
14. The characterization of influenza A viruses by carbohydrate analysis / H.D. Klenk, W. Keil, H. Niemann [et al.] // Curr. Top.Microbiol. Immunol. - 1983. - Vol. 104. - P. 247-257.