СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КЛИНИЧЕСКИ ВАЖНЫХ СТЕРОИДОВ В БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ ЧЕЛОВЕКА
METHOD FOR SIMULTANEOUS DETECTION OF CLINICALLY SIGNIFICANT STEROIDS IN HUMAN BIOLOGICAL FLUID

Предлагаемое изобретение относится к области биохимии и медицины, а именно к способу одновременного определения клинически важных стероидов в биологической жидкости человека, используемого для выявления целого ряда гинекологических и онкологических заболеваний, связанных с нарушением синтеза и метаболизма стероидных гормонов, причем многие из них могут быть диагностированы только по стероидному профилю (СП). Кроме того, СП дает информацию о ряде стероидов одновременно, что особенно важно для диагностических целей.
Исследования гормонов в крови иммунными методами можно использовать только для приблизительных оценок, так как результаты зависят от сиюминутного состояния организма человека и, как следствие, колеблются от 200 до 500%. Исследования мочи представляют собой более точный, а, главное, неинвазивный метод диагностики, предотвращающий опасность заражения пациента СПИДом, гепатитом В и т.д.
Суточная моча, как объект исследования, имеет существенные преимущества перед иммунными методами определения гормонов в крови, распространенными в настоящее время в клинической медицине, так как позволяет исключить влияние на результаты циркадных ритмов и мгновенных колебаний гормонов в крови, которые часто бывают значительными.
Известен способ определения СП в суточной моче, который описан в статье Leunissen W.J.J., Thijssen J.H.H., J. Chromat, Biomed Appl., 1978, v.146, p.365.
Недостатком этого способа является ферментативный гидролиз, с использованием дорогостоящих ферментов, активность которых меняется со временем; присутствие дополнительной стадии очистки образца перед вводом в испаритель хроматографа с использованием колонки Lipidex-5000, с последующим элюированием дериватов смесью дериватов, что значительно усложняет процесс и делает его крайне громоздким. Для реализации способа применяют смеси легкокипящих растворителей, что повышает опасность возгорания.
Наиболее близкий способ определения стероидного профиля мочи (СПМ) (прототип) изложен в обзоре «Profiling steroid hormones and urinary steroids» журнала "Journal of chromatography biomedical applications", vol.379, June 20, 1986 г. крупным исследователем в данной области C.H.L. Shakelton, стр.91-156.
В этом способе для извлечения конъюгатов стероидов используют различные вариации твердофазной экстракции, например с использованием С24-картриджей, стоимость которых относительно велика, вследствие чего для исследования в России они неприемлемы, кроме того, для работы с ними необходим высокотоксичный метанол (на работу с которым требуется специальное разрешение).
С другой стороны, в прототипе для гидролиза конъюгатов стероидов используют очень дорогостоящий фермент, полученный извлечением из виноградной улитки, активность которого меняется со временем, что сказывается на качестве гидролиза и требует дополнительного тестирования указанного фермента. Кроме того, при помощи этого фермента не удается достигнуть количественного гидролиза, для чего вводится еще одна дополнительная стадия - сольволиз, что увеличивает трудоемкость процедуры и занимает много дополнительного времени.
Недостатком способа также является двухступенчатая защита функциональных групп: силирование и получение метокси - производных, что еще более усложняет и без того сложный и многоступенчатый процесс.
Задачей предлагаемого изобретения является определение СП по суточной моче человека более простым и дешевым способом.
Решение поставленной задачи заключается в том, что в способе одновременного определения клинически важных стероидов в биологической жидкости человека, включающем экстракцию конъюгатов стероидов, выделение сухого остатка конъюгатов стероидов и их последующее расщепление с одновременной защитой функциональных групп, используют экстракцию конъюгатов стероидов по типу «жидкость-жидкость» в среде этилацетата, расщепление конъюгатов стероидов проводят комбинированным кислотным гидролизом при температуре 80°С путем взаимодействия бензола, конъюгатов стероидов и соляной кислоты, разбавленной до соотношения 1:2, в присутствии металлического шарика, причем используют металлический шарик из стали ШХ15 диаметром 3,175 мм.
Защиту функциональных ОН-групп проводят в одну стадию путем силилирования.
По сравнению с другими полярными растворителями, этилацетат имеет следующие преимущества: является хорошим растворителем как для сульфатов, так и для глюкуронидов стероидов; имеет относительно невысокую температуру кипения при нормальных условиях (77,1°С); обладает незначительной токсичностью, а также низкую стоимость.
Задача комбинированного кислотного гидролиза (ККГ) коньюгатов состоит в том, чтобы как можно быстрее осуществить переход образующихся в процессе гидролиза в водной среде свободных стероидов в органическую гидрофобную фазу и тем самым защитить стероиды от деструктивного влияния сильной ионизирующей протонной среды.
Сравнительный анализ соответствующих характеристик ряда растворителей, апробированных в работе, позволяет остановиться на таком недорогом и доступном растворителе, как бензол, обладающий температурой кипения 80°, высокой способностью растворять необходимые стероиды, менее токсичным по сравнению, например, с галогенпроизводными углеводородами, а главное, из-за отсутствия ионов бензола вообще не разрушает стероиды. Именно поэтому сразу же после гидролиза гидрофильной молекулы конъюгата образовавшаяся гидрофобная молекула стероида быстро переходит в объем растворителя и, тем самым, надежно защищается в дальнейшем от деструктивного влияния кислой среды.
Главными критериями, по которым осуществляют выбор кислоты для проведения ККГ, являются следующие: во-первых, способность не растворяться в органическом растворителе, во-вторых - образовывать плохо разделяемые взвеси и эмульсии с растворителем, в-третьих, химическая инертность реагента по отношению к растворителю, а также доступность в России и низкая стоимость реактива. С учетом всего нами была выбрана соляная кислота. Сравнительная экспериментальная проверка ряда реагентов показала, что в случае использования соляной кислоты после выдувания органического растворителя током азота в осадке не обнаруживалось даже следов хлористого водорода. Изучение кинетики и механизма реакции гидролиза с использованием соляной кислоты проводят на примере расщепления PdGl.
После процедуры экстракции и удаления растворителя стероиды находятся на дне конусообразной колбы в виде сульфатов и глюкуронидов, что удобно при проведении последующих стадий анализа.
Как правило, в процессе проводимого гидролиза образуется система, состоящая из двух фаз: нижняя - это разбавленная соляная кислота, верхняя - бензол, причем при температуре проведения реакции 80°С нижняя фаза является неподвижной, тогда как верхняя - интенсивно кипит. Существование неподвижной нижней фазы является отрицательным фактором, поскольку гидролизующиеся стероиды длительное время находятся в агрессивной среде и поэтому подвержены относительно большему разрушению.
Для устранения данного недостатка комбинированный кислотный гидролиз проводят в присутствии металлического шарика, изготовленный из стали ШХ15
(03,175 мм). Металл взаимодействует с разбавленной соляной кислотой (при температуре 80°С), в результате чего в системе образуются мельчайшие пузыри водорода, являющиеся в то же время центрами кипения.
В этом случае вся смесь интенсивно кипит, хорошо перемешиваясь, что в свою очередь приводит к увеличению числа переноса стероидов в процессе гидролиза. Таким образом, образующиеся свободные стероиды гораздо быстрее переносятся в углеводородную фазу, где они надежно защищены от разрушительно влияния соляной кислоты.
В серии контрольных опытов показано, что присутствие металла не сказывается на качестве проводимого гидролиза.
Пример
Определяют клинически важные стероиды в биологической жидкости человека (беременной женщины).
С этой целью 4 мл, взятые из суточной мочи беременной женщины, помещают в конусообразную колбу, приливают этилацетат в количестве 10 мл и проводят экстракцию конъюгатов стероидов по типу «жидкость-жидкость» при постоянном встряхивании в течении 5-10 мин, после чего этилацетат упаривают и на дне конусообразной колбы остаются конъюгаты стероидов в виде сухого налета (фиг.1).
Затем для расщепления конъюгатов стероидов проводят комбинированный с экстракцией кислотный гидролиз, для чего добавляют 10 мл бензола и 2 мл хлористоводородной кислоты, разбавленной в соотношении 1:2.
Кроме того, на дно помещают металлический шарик (сталь марки ШХ15, диаметр 3,175 мм) для обеспечения равномерного кипения.
Колбу, снабженную обратным холодильником, помещают в водяную баню с температурой 80-83°С. Гидролиз длится 20 мин, начиная с момента начала кипения. Затем смесь быстро охлаждают, переливают в делительную воронку и отбрасывают нижний слой.
Оставшийся экстракт последовательно промывают 2 мл 0,5 N раствора щелочи, 4 мл дистиллированной воды и центрифугируют. Остаток после центрифугирования (супернатант) переносят в коническую колбу и выпаривают досуха.
После проведения кислотного гидролиза, полученные в результате подобной процедуры свободные стероиды нельзя сразу вводить в хроматограф, так как экстракт содержит массу примесей. В предлагаемом изобретении в качестве основного метода очистки выбран способ промывки гидролизата раствором щелочи с целью удаления кислотных и других остатков. После щелочной обработки экстракт промывают дистиллированной водой, при этом удаляется остаток щелочи. С целью достижения наименьших потерь стероидов стадию очистки гидролизата также оптимизируют.
Для проведения анализа клинически важных стероидов проводят газохроматографический анализ.
Полученные количественные характеристики клинически важных стероидов и профиль концентрации клинически важных стероидов в суточной моче представлены в таблице и на фиг.2 соответственно.
При газохроматографическом анализе используют два вида колонок - традиционные насадочные и высокоэффективные капиллярные. Поскольку преимуществами капиллярных колонок являются высокая селективность и долговечность, именно их рекомендуется применять при анализе СП. Оптимальными условиями хроматографирования являются следующие: температура термостата 150°-300°С, испарителя 250°-300°С, детектора 250°-300°С.
Таблица.
Количественное определение стероидов в суточной моче беременной женщины
Нормы (мкМоль/24 часа)
Названия и аббревиатура стероидов
Результаты опред.
Абс. знач.
%
3.8-15.1
Андростерон (An)
15,4
43,7
3.0-14.8
Этиохоланолон (Et)
12,2
34,8
0-2.8
Дегидроэпиандростерон (DHEA)
2,4
7,0
0.3-2.7
11-Кетоандростерон (11-Keto-An)
1,0
2,7
0.4 -2.5
11-Кетоэтиохоланолон (11-Keto-Et)
1,3
3,6
2.0-7.5
11в-Гидроксиандростерон (11-OH-An)
2,2
6,4
0.5-3.1
11в-Гидроксиэтиохоланолон (11-OH-Et)
0,6
1,8
9.9-35.5
Сумма 17-КС
35,2
100,0
<3.0
Дискриминанта ван де Калсейде
2,8
32.2 - 220
Прегнандиол (Pd)
101,1
2.2-8.0
алло-Прегнандиол (allo-Pd)
17,4
1.3-21.7
Прегнанолон
32,1
дельта5-Прегнандиол (дельта5-Pd)
0,9
Прегнантриол (Pt)
0,5
16альфа-Гидрокси-Et
0,0
4.3-39.5
16альфа-Гидрокси-An
0,0
16альфа-Гидрокси-DHEA
0,0
Только для беременных
Эстрадиол
37,0
Только для беременных
Эстрон
13,6
5.6-9.8
Холестерин (Ch)
8,5
0,5-1,8
Суточное количество мочи (литры)
2,05