УЛУЧШЕННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ БОТУЛИНИЧЕСКОГО НЕЙРОТОКСИНА В ЛЕЧЕНИИ СИАЛОРЕИ
IMPROVED USE OF BOTULINUM NEUROTOXIN IN THE TREATMENT OF SIALORRHEA

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[001] Настоящее изобретение относится к улучшенным вариантам применения ботулинических нейротоксинов в лечении заболевания или состояния, ассоциированного с сиалореей или повышенной выработкой слюны. В частности, раскрыты ботулинические нейротоксины, которые вводят в околоушные и подчелюстные железы в соотношении доз от 1,45:1 до 1,7:1.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[002] Слюнотечение обычно представлено широким разнообразием клинических состояний, которые приводят к симптому перетекания слюны через край губ (называемому передним слюнотечением) или самопроизвольного вытекания из глотки глотки с непроизвольным попаданием слюны в голосовую щель и трахею (называемому задним слюнотечением). В то время как переднее слюнотечение в основном представляет собой проблему для пациентов при бытовом общении, заднее слюнотечение также может вызывать кашель и раздражение у субъектов с неповрежденным кашлевым рефлексом или тихую аспирацию у субъектов без сознания.
[003] Термин "слюнотечение" часто используется в быту вместо медицинского термина "сиалорея", "гиперсаливация" или "птиализм", применяемых в зависимости от клинического состояния, страны использования, медицинской специальности. Согласно определению, сиалорея - это "избыточное течение слюны через край губы", гиперсаливация - "чрезмерное образование слюны", птиализм - "гиперсаливация у беременных женщин". Эти термины и определения не всегда используются последовательно ввиду неясной причины и патомеханизма лежащих в их основе состояний и проблем.
[004] Причины сиалореи могут быть различными и, как правило, связаны с перепроизводством слюны или недостаточностью контроля слюны, или утратой некоторых анатомических структур или физиологический функций. Конечно, сочетание этих факторов делает невозможным четкое разграничение причин, поэтому описания, такие как диагнозы симптомов, перечисленные выше, используются вразнобой. В некоторых случаях всего лишь анатомические пороки развития и деформации слюнных желез и протоков, губ, полости рта и зубов (дефекты закрытия губ, неправильный прикус зубов) вызывают появление локальных каналов между полостью рта и внешним миром, что обеспечивает неконтролируемое истечение вырабатываемой слюны.
[005] Пороки развития, стриктуры, шрамы, свищи и шунты могут возникать как необратимые последствия рака полости рта или головы и шеи, травм и как осложнения соответствующего хирургического вмешательства. У пациентов с ограниченными интеллектуальными возможностями может быть постоянно открыт рот, что вызывает тот же эффект, в сочетании с пороками развития или без них. Снижение сенсомоторных способностей, недостаточный нервно-мышечный контроль ротовой полости, снижение защитных рефлексов, гипокинезия глотательных мышц, снижение частоты глотания или неэффективное глотание или дисфагия, по-видимому, являются наиболее частыми характерными причинами сиалореи у пациентов с неврологическими состояниями, выбранными, например, из следующих: болезнь Паркинсона, прогрессирующий надъядерный паралич, кортикобазальная дегенерация, мультисистемная атрофия, боковой амиотрофический склероз (БАС), церебральный паралич, инсульт, черепно-мозговая травма (ЧМТ), гиперсаливация, вызванная клозапином, синдром Ретта, синдром Ангельмана, эпилептическая энцефалопатия и опухоли головного мозга, эпилептическое поражение головного мозга, опухоли головного мозга, тотальная фаринголарингэктомия, супракрикоидная ларингэктомия и супраглоттическая ларингэктомия, деменция или умственная отсталость или любая другая причина сиалореи или гиперсаливации. В отсутствие частого глотания из-за нарушенного контроля глотательных движений, выработанная нестимулированная или стимулированная слюна скапливается в полости рта. Неконтролируемое открывание рта и антероградное положение головы способствуют переливанию скопившейся слюны через край губы пациента.
[006] Слюноотделение также может быть постоянно усилено раздражающими факторами, например, массивным кариесом или одонтолитом, гипертрофией слюнных желез, гастроэзофагеальным рефлюксом или лекарственными препаратами или токсинами, вызывающими гиперсаливацию в качестве побочного эффекта (например, кпозапин, бензодиазепины, антипсихотики), вызывающими постоянную активацию слюнных ядер или нервных окончаний в слюнных железах.
[007] Повышенную выработку слюны можно контролировать у здоровых в остальном людей только до определенной степени. У пациентов с нарушениями контроля слюны верхний порог способности контролировать слюну во рту или глотать чрезмерное количество слюны снижен, что усложняет ситуацию.
[008] Варианты лечения проблем с глотанием сосредоточены на реабилитационных мерах (тренировка глотания, тренировка орального моторного контроля), однако бессознательные механизмы частого глотания с трудом поддаются тренировке и развитию у пациентов с прогрессирующими неврологическими заболеваниями, такими как болезнь Паркинсона или БАС. Поэтому лечение сиалореи часто направлено на снижение выработки слюны. В ранних подходах использовались хорошо известные антихолинергические лекарственные средства (например, атропин, ипратропий бромид, скополамин, гликопирролат, тропикамид), оказывающие ингибирующее действие на мускариновые холинергические нервы, которые контролируют количество слюны, выделяемой слюны слюнными железами в полости рта и вокруг нее. Несколько других производных антихолинергиков также были исследованы и использовались при этом диагнозе вне зарегистрированных показаний. Лишь гликопирролат был недавно одобрен для лечения слюнотечения у детей в США и ЕС.
[009] Другой альтернативой лечения является ботулинический нейротоксин, вводимый пациентам посредством внутримышечных инъекций для снижения мышечного тонуса и спастичности в соответствующих мышцах или гипергидроза. У таких пациентов сухость во рту была выявлена как побочная лекарственная реакция, и это побудило врачей лечить слюнные железы ботулиническим нейротоксином А или В непосредственно, то есть путем внутрижелезистых или внутрипаренхиматозных инъекций ботулинического нейротоксина А или В в крупные слюнные железы, околоушные и подчелюстные железы.
[0010] Clostridium - это род анаэробных грамположительных бактерий, принадлежащих к типу фирмикутов. Род Clostridium состоит из приблизительно 100 видов, которые включают распространенные свободноживущие бактерии, а также важные патогены, такие как Clostridium botulinum и Clostridium tetani. Оба вида вырабатывают нейротоксины, ботулинический нейротоксин и столбнячный токсин соответственно. Эти нейротоксины являются мощными ингибиторами кальций-зависимой секреции нейротрансмиттеров нейрональных клеток и одними из самых сильных токсинов, известных человеку. Смертельная доза для человека составляет от 0,1 нг до 1 нг на килограмм веса тела.
[0011] Пероральное попадание ботулинического нейротоксина в организм через загрязненную пищу или образование ботулинического нейротоксина в ранах может вызвать ботулизм, который характеризуется параличом различных мышц. Паралич дыхательных мышц может привести к смерти пострадавшего.
[0012] Хотя и ботулинический нейротоксин (BoNT), и столбнячный нейротоксин (TeNT) действуют по одинаковому исходному физиологическому механизму, ингибируя высвобождение нейротрансмиттера из аксона пораженного нейрона в синапс, они различаются по клиническому ответу. В то время как ботулинический нейротоксин воздействует на нервно-мышечное соединение и другие холинергические синапсы в периферической нервной системе, ингибируя высвобождение нейротрансмиттера ацетилхолина и тем самым вызывая атонический паралич, столбнячный нейротоксин, который трансцитозируется в центральные нейроны, действует главным образом в центральной нервной системе, предотвращая высвобождение ингибирующих нейротрансмиттеров ГАМК (гамма-аминомасляной кислоты) и глицина путем разложения белка синаптобревина. Последующая гиперактивность двигательных нейронов спинного мозга вызывает генерализованные сокращения мышц-агонистов и мышц-антагонистов, называемые тетаническим спазмом (ригидный паралич).
[0013] В то время как столбнячный нейротоксин представлен в одном иммунологически обособленном типе, ботулинические нейротоксины, как известно, встречаются в семи различных иммуногенных серотипах, называемых BoNT/A - BoNT/H, с дальнейшими подтипами. Большинство штаммов Clostridium botulinum производят один тип нейротоксина, но также описаны штаммы, производящие несколько нейротоксинов.
[0014] Нейротоксины ботулина и столбняка одержат высокогомологичные аминокислотные последовательности и имеют сходную доменную структуру. Их биологически активная форма включает две пептидные цепи, легкую цепь приблизительно 50 кДа и тяжелую цепь приблизительно 100 кДа, связанные дисульфидной связью. Линкерная или петлевая область, длина которой варьирует среди различных клостридийных нейротоксинов, расположена между двумя остатками цистеина, образующими дисульфидную связь. Эта петлевая область протеолитически расщепляется неизвестной клостридийной эндопротеазой с получением биологически активного нейротоксина.
[0015] Молекулярные механизмы интоксикации TeNT и BoNT, по-видимому, также сходны: проникновение в нейрон-мишень опосредуется связыванием С-концевой части тяжелой цепи со специфическим рецептором клеточной поверхности; затем нейротоксин поглощается рецептор-опосредованным эндоцитозом. Низкое значение рН в образованной таким образом эндосоме затем вызывает конформационное изменение в клостридийном нейротоксине, которое позволяет ему встраиваться в эндосомальную мембрану и транслоцироваться через эндосомальную мембрану в цитоплазму, где дисульфидная связь, соединяющая тяжелую и легкую цепь, восстанавливается. Затем легкая цепь может селективно расщеплять так называемые SNARE-белки, которые необходимы для разных этапов высвобождения нейротрансмиттера в синаптическую щель, например, для распознавания, докинга и слияния нейротрансмиттер-содержащих везикул с плазматической мембраной. TeNT, BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F и BoNT/G вызывают протеолитическое расщепление синаптобревина или VAMP (везикуло-ассоциированный мембранный белок), BoNT/A и BoNT/E расщепляют ассоциированный с плазматической мембраной белок SNAP-25 и BoNT/C1 расщепляет интегральный белок плазматической мембраны синтаксин и SNAP-25.
[0016] В бактерии Clostridium botulinum ботулинический нейротоксин образуется в виде белкового комплекса, включающего нейротоксический компонент и нетоксичные белки. Вспомогательные белки окружают нейротоксический компонент, тем самым защищая его от разрушения пищеварительными ферментами в желудочно-кишечном тракте, не добавляя ничего к его токсическому эффекту. Таким образом, ботулинические нейротоксины большинства серотипов токсичны при пероральном введеии. Из культур Clostridium botulinum можно получить комплексы величиной, например, 450 кДа или 900 кДа.
[0017] В последние годы ботулинические нейротоксины использовали в качестве терапевтических агентов, например, в лечении дистоний и спазмов, и дополнительно использовали в косметических применениях, таких как лечение мелких морщин. Препараты, содержащие комплексы ботулинических нейротоксинов, коммерчески доступны, например, от производителей Ipsen Ltd (Диспорт), Solstice Neurosciences LLC/US Worldmeds LLC (Myobloc) или Allergan Inc. (Ботокс). Нейротоксический компонент ботулинического нейротоксина высокой чистоты, не содержащий комплексообразующих белков предлагается, например, производителем Merz Pharmaceuticals GmbH, Франкфурт (Ксеомин, Бокутюр).
[0018] В предшествующем уровне техники имеется несколько сообщений о применении ботулинического нейротоксина А и В у пациентов с сиалореей, вызванной различными основными заболеваниями. Например, Breheret et al. (Annales francaises  et de Pathologie Cervico-faciale, том 128, выпуск 5, 2011, страницы 266-271), Barbero et al. (J Neurol. 2015 Dec; 262 (12): 2662-7), Suskind et al. (Laryngoscope. 2002 Jan; 112 (1): 73-81), Porta et al. (J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2001 Apr; 70 (4): 538-40.), Narayanaswami et al. (Parkinsonism Relat Disord. 2016 Sep; 30: 73-7) и Castelnovo et al. (Movement Disorders 2013, том 28, приложение к реферату) сообщают об использовании различных токсинов в соответствии с несколькими различными протоколами с варьирующимися количествами токсина, вводимого в слюнные железы для лечения сиалореи при различных медицинских состояниях. Несмотря на ряд исследований, в которых представлены данные о безопасности и эффективности использования ботулинических нейротоксинов при сиалорее, продолжаются многочисленные дискуссии без ясных рекомендаций относительно используемых дозировок, мест введения и типа токсина.
ЗАДАЧИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0019] Одной из задач настоящего изобретения является обеспечение ботулинического нейротоксина для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с сиалореей или повышенной выработкой слюны, ограничивающего активность слюнных желез в течение длительного периода времени в такой степени, что у субъекта не наблюдается слюнотечения, но все еще позволяющего вырабатывать пониженное количество слюны, достаточное для нормального физиологического функционирования, например в качестве смазки, в качестве резервуара для ионов, в качестве буфера, в качестве очищающего средства, для противомикробного действия, для агглютинации, для образования пленок, для пищеварения, для вкуса, для выведения и/или для водного баланса. Еще одна задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы избежать побочных эффектов, связанных с лечением ботулиническим токсином, или уменьшить их по меньшей мере по частоте, степени тяжести и/или продолжительности во время лечения. В качестве еще одной задачи настоящего изобретения ботулинические нейротоксины должны обеспечивать полезные результаты лечения в течение длительного периода лечения, чтобы данное лечение не влияло на основное заболевание, и таким образом длительная терапия была эффективной и безопасной, без снижения ее эффективности и ее безопасности при повторных циклах инъекций для длительного лечения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0020] Неожиданно было установлено, что ботулинический нейротоксин может помочь решить одну или более из этих задач, если применять его для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с сиалореей или повышенной выработкой слюны, причем указанный ботулинический нейротоксин вводят путем инъекции в околоушные железы и подчелюстные железы и при этом соотношение между дозами ботулинического нейротоксина, вводимыми в каждую из околоушных желез и каждую из подчелюстных желез, составляет от 1,45:1 до 1,7:1.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0021] Настоящее изобретение может быть более легко понято посредством ссылки на следующее подробное описание изобретения и включенные в него примеры.
[0022] В первом варианте реализации настоящее изобретение относится к ботулиническому нейротоксину для применения в лечении заболевания или состояния, ассоциированного с сиалореей или повышенной выработкой слюны, причем указанный ботулинический нейротоксин вводят путем инъекции в околоушные железы и подчелюстные железы и при этом соотношение между дозами ботулинического нейротоксина, вводимого в каждую из околоушных желез и каждую из подчелюстных желез, составляет от 1,45:1 до 1,7:1. В предпочтительном варианте реализации ботулинический нейротоксин по настоящему изобретению вводят в околоушные железы и подчелюстные железы, причем соотношение между дозами ботулинического нейротоксина, вводимыми в каждую из околоушных желез и каждую из подчелюстных желез, составляет от 1,50:1 до 1,6:1. В частном предпочтительном варианте реализации ботулинический нейротоксин по настоящему изобретению вводят в околоушные железы и подчелюстные железы, причем соотношение между дозами ботулинического нейротоксина, вводимого в каждую околоушную железу и каждую из подчелюстных желез, составляет 1,50:1.
[0023] В другом варианте реализации настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, ассоциированного с сиалореей или повышенной выработкой слюны у пациента, причем этот способ включает введение терапевтически эффективного количества ботулинического нейротоксина путем инъекции в околоушные железы и подчелюстные железы, причем соотношение между дозами ботулинического нейротоксина, вводимого в каждую из околоушных желез и каждую из подчелюстных желез, составляет от 1,45:1 до 1,7:1. В предпочтительном варианте реализации способ по настоящему изобретению включает введение терапевтически эффективного количества ботулинического нейротоксина путем инъекции в околоушные железы и подчелюстные железы, причем соотношение между дозами ботулинического нейротоксина, вводимого в каждую из околоушных желез и каждую из подчелюстных желез, составляет от 1,50:1 до 1,6:1. В частном предпочтительном варианте реализации способ по настоящему изобретению включает введение терапевтически эффективного количества ботулинического нейротоксина путем инъекции в околоушные железы и подчелюстные железы, причем соотношение между дозами ботулинического нейротоксина, вводимого в каждую из околоушных желез и каждую из подчелюстных желез составляет 1,50:1.
[0024] В другом аспекте настоящее изобретение относится в целом к ботулиническим нейротоксинам для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с сиалореей или повышенной выработкой слюны. В частных вариантах реализации настоящего изобретения заболевание или состояние, ассоциированное с сиалореей или повышенной выработкой слюны, ассоциировано, например, с болезнью Паркинсона, прогрессирующим надъядерным параличом, кортикобазальной дегенерацией, мультисистемной атрофией, боковым амиотрофическим склерозом (БАС), церебральным параличом, инсультом, черепно-мозговой травмой (ЧМТ), гиперсаливацией, вызванной клозапином, синдромом Ретта, синдромом Ангельмана, эпилептической энцефалопатией, опухолями головного мозга, тотальной фаринголарингэктомией, супракрикоидной ларингэктомией и супраглоттической ларингэктомией, деменцией или умственной отсталостью (задержкой в виде неспособности к обучению (например, общей задержкой в развитии, задержкой в способности к обучению) или любой другой причиной сиалореи или гиперсаливации. Заболеванием или состоянием, ассоциированным с сиалореей или повышенной выработкой слюны в соответствии с настоящим изобретением, также может быть синдром Дауна, синдром Смита-Лемли-Опитца, синдром Мебиуса, синдром MEGDEL, синдром Беквита-Видемана, лимфатическая мальформация языка, синдром Фуа-Шавани-Мари, хромосомные аномалии и генетические заболевания, такие как делеция 17q21, семейная дисавтономия, частичная трисомия 22, синдром Айкарди, SMA типа 1, GM1-ганглиозидоз или синдром Аперта, болезнь Вильсона, врожденный порок развития головного мозга, такой как гидроцефалия, микроцефалия, мостомозжечковая гипоплазия, опухоль задней черепной ямки, нейрональный цероидный липофусциноз, болезнь Баттена, метахроматическая лейкодистрофия, множественный артрогрипоз, энцефалопатия, лиссэнцефалия или пахигирия, мозговые травмы, такие как травмы спинного мозга, гипоксической гипоксическая ишемическая энцефалопатия, врожденный токсоплазмоз, врожденная цитомегаловирусная инфекция, состояние после менингоэнцефалита или после герпетической энцефалита, нейромоторные расстройства, такие как оральная диспраксия, надбульбарный паралич, оперкулярный синдром, миопатия, младенческие судороги, миотоническая дистрофия, мышечная дистрофия Дюшенна, нейрофиброматоз типа I или митохондриопатия, алкогольный синдром плода, аутизм или ювенильный синдром Гийена-Барре.
[0025] В частных вариантах реализации настоящего изобретения заболевание или состояние, ассоциированное с сиалореей или повышенной выработкой слюны, ассоциировано с инсультом, в частности заболевание или состояние, ассоциированное с сиалореей или повышенной выработкой слюны, возникающее после инсульта (постинсультное).
[0026] В предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения заболевание или состояние, ассоциированное с сиалореей или повышенной выработкой слюны, ассоциировано, например, с черепно-мозговой травмой (ЧМТ), постинсультным состоянием, болезнью Паркинсона или атипичным паркинсонизмом (прогрессирующий надъядерный паралич [PSP], мультисистемная атрофия [MSA], кортикобазальная дегенерация [CBD]). В другом предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения заболевание или состояние, ассоциированное с сиалореей или повышенной выработкой слюны, представляет собой черепно-мозговую травму (ЧМТ), постинсультное состояние, болезнь Паркинсона или атипичный паркинсонизм (прогрессирующий надъядерный паралич [PSP], мультисистемная атрофия [MSA], кортикобазальная дегенерация [CBD]) с хронической сиалореей в течение не менее 3 месяцев и тяжестью сиалореи не менее 2 баллов по суб-шкале тяжести слюнотечения и частотой не менее 2 баллов по суб-шкале частоты слюнотечения и не менее 6 баллов по сумме баллов по шкалам тяжести и частоты слюнотечения. В другом предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения заболевание или состояние, ассоциированное с сиалореей или повышенным выделением слюны, представляет собой черепно-мозговую травму (ЧМТ), постинсультное состояние, болезнь Паркинсона или атипичный паркинсонизм (прогрессирующий надъядерный паралич [PSP], мультисистемная атрофия [MSA], кортикобазальная дегенерация [CBD]) с хронической сиалореей, имеющей скорость нестимулированного слюноотделения по меньшей мере 0,3 г/мин.
[0027] Настоящее изобретение в дополнительном варианте реализации относится к фармацевтической композиции, содержащей ботулинический нейротоксин для применения в лечении заболевания или состояния, ассоциированного с сиалореей или повышенной выработкой слюны, и фармацевтически приемлемый носитель, причем указанный ботулинический нейротоксин вводят инъекцией в околоушные железы и подчелюстные железы и причем соотношение между дозами ботулинического нейротоксина, вводимого в каждую из околоушных желез и каждую из подчелюстных желез, составляет от 1,45:1 до 1,7:1.
[0028] В соответствии с одним вариантом реализации настоящего изобретения ботулинический нейротоксин вводят в околоушные железы и подчелюстные железы в общей дозе от 70 до 110 Ед. В предпочтительном варианте реализации общая доза ботулинического нейротоксина, вводимого в околоушные и подчелюстные железы, составляет от 75 Ед до 100 Ед.
[0029] В соответствии с одним вариантом реализации настоящего изобретения ботулинический нейротоксин вводят в околоушные железы и подчелюстные железы в общей дозе 75 Ед. В альтернативном варианте реализации общая доза ботулинического нейротоксина, вводимого в околоушные и подчелюстные железы, составляет 100 Ед.
[0030] Как правило, ботулинический нейротоксин в соответствии с настоящим изобретением можно вводить в околоушные железы и подчелюстные железы в общей дозе от 0,5 до 2,35 Ед/кг массы тела. В частном предпочтительном варианте реализации ботулинический нейротоксин вводят в околоушные железы и подчелюстные железы в общей дозе от 1 до 1,25 Ед/кг массы тела. Детям из-за низкой массы тела ботулинический нейротоксин обычно вводят, как показано в таблице дозирования 8. В другом варианте реализации у детей в околоушную железу и подчелюстную железу вводят общую дозу до 2,5 Ед/кг.
[0031] В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения ботулинический нейротоксин вводят в водной композиции с концентрацией ботулинического нейротоксина в диапазоне от 45 до 55 Ед/мл. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения ботулинический нейротоксин вводят в виде водной композиции с концентрацией ботулинического нейротоксина 50 Ед/мл. В частном предпочтительном варианте реализации содержимое флакона на 100 Ед восстанавливают в общей сложности 2,0 мл физиологического раствора, а объемы, вводимые в околоушные и подчелюстные железы, составляют:
- Околоушная железа: 0,6 мл с каждой стороны,
- Подчелюстная железа: 0,4 мл с каждой стороны.
Если предусмотрено несколько последовательных циклов лечения, объемы инъекций могут быть снижены при возникновении сухости во рту или дисфагии в предыдущих циклах лечения. Это снижение рекомендуется на усмотрение выполняющего инъекции лица, чтобы избежать дальнейшего возникновения таких побочных эффектов. Если предусмотрено введение сниженного количества ботулинического нейротоксина, объемы инъекций, вводимые в околоушные и подчелюстные железы, составляют:
- Околоушная железа: 0,45 мл с каждой стороны,
- Подчелюстная железа: 0,3 мл с каждой стороны.
[0032] Биологическую активность обычно выражают в мышиных единицах (Ед). Используемая в настоящем документе 1 Ед представляет собой количество нейротоксического компонента ботулинического нейротоксина, который убивает 50% заданной популяции мышей после внутрибрюшинной инъекции, то есть соответствует величине внутрибрюшинной LD50 мыши. Другим конкретным полезным методом для определения биологической активности ботулинического нейротоксина является клеточный анализ, описанный, например, в WO 2009/114748, WO 2013/049508 или WO 2014/207109. Результаты активности, полученные с помощью таких клеточных анализов, соответствуют значениям активности, полученным в анализе внутрибрюшинной LD50 мыши. Результаты активности, полученные для композиций ботулинического серотипа А, таких как коммерчески доступный Инкоботулинический нейротоксин А (ботулинический нейротоксин серотипа А, без комплексообразующих белков, Ксеомин, Merz Pharmaceuticals GmbH)) или Онаботулинический нейротоксин А (ботулинический токсин серотипа А, с комплексообразующими белками, Ботокс, Allergan Inc.) могут быть преобразованы в значения для других токсинов с использованием коэффициентов пересчета, известных специалисту в данной области. Например, необходимую дозу Абоботулинического нейротоксина А (ботулинотоксин серотипа А, с комплексообразующими белками, Диспорт, Ipsen Biopharm Limited) можно определить путем умножения дозы Инкоботулинического нейротоксина А или Онаботултоксина А на коэффициент от 2,5 до 5. Доза для Римаботулинического нейротоксина В (Botulinumtoxin серотипа В, Миоблок, Solstice Neurosciences/US WorldMeds LLC) можно рассчитать путем умножения дозы Инкоботулинического нейротоксина А или Онаботултоксина А на коэффициент от 20 до 40.
[0033] В другом варианте реализации настоящего изобретения ботулинический нейротоксин вводят в объеме от 0,3 до 0,5 мл на каждый участок инъекции в подчелюстные железы и в объеме от 0,5 до 0,7 мл на каждый участок инъекции в околоушные железы. В особенно предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения ботулинический нейротоксин вводят в объеме 0,4 мл на каждый участок инъекции в подчелюстные железы и в объеме 0,6 мл на каждый участок инъекции в околоушные железы.
[0034] В другом варианте реализации настоящего изобретения ботулинический нейротоксин вводят путем инъекции в один участок каждой подчелюстной железы с обеих сторон пациента. Инъекции делать в геометрический центр желез, в зависимости от анатомической протяженности железы.
[0035] В другом варианте реализации настоящего изобретения ботулинический нейротоксин вводят путем инъекции в один участок каждой околоушной железы с обеих сторон пациента. Инъекции вводят в геометрический центр желез, в зависимости от анатомической протяженности железы.
[0036] В предпочтительном варианте реализации общую дозу ботулинического нейротоксина вводят путем инъекции в один участок каждой подчелюстной железы и в один участок каждой околоушной железы.
[0037] Один вариант реализации настоящего изобретения относится к ботулиническому нейротоксину для применения в лечении заболевания или состояния, ассоциированного с сиалореей или повышенной выработкой слюны, причем указанный ботулинический нейротоксин вводят инъекцией в околоушные железы и подчелюстные железы и при этом соотношение между дозами ботулинического нейротоксина, вводимого в каждую из околоушных желез и каждую из подчелюстных желез, составляет от 1,45:1 до 1,7:1, и при этом заболевание или состояние, ассоциированное с сиалореей или повышенной выработкой слюны, ассоциировано с инсультом и при этом общую дозу 100 Ед ботулинического нейротоксина вводят путем инъекции в один участок каждой подчелюстной железы и в один участок каждой околоушной железы.
[0038] Один вариант реализации настоящего изобретения относится к ботулиническому нейротоксину для применения в лечении заболевания или состояния, ассоциированного с сиалореей или повышенной выработкой слюны, причем указанный ботулинический нейротоксин вводят инъекцией в околоушные железы и подчелюстные железы и при этом соотношение между дозами ботулинического нейротоксина, вводимого в каждую из околоушных желез и каждую из подчелюстных желез, составляет 1,5:1, причем заболевание или состояние, ассоциированное с сиалореей или повышенной выработкой слюны, ассоциировано с инсультом, и при этом общую дозу 100 Ед ботулинического нейротоксина вводят путем инъекции в один участок каждой подчелюстной железы и в один участок каждой околоушной железы, в частности, в геометрический центр железы, соответственно.
[0039] В частных вариантах реализации настоящего изобретения ботулинический нейротоксин вводят путем инъекции в околоушные железы и подчелюстные железы без использования ультразвукового контроля. В этом случае целевой участок в железе определяют с использованием анатомического ориентира, как это хорошо известно специалисту в данной области. Околоушная железа расположена ниже и впереди от наружного слухового прохода и располагается сзади от нижней челюсти и впереди от сосцевидного отростка височной кости. При осмотре с поверхности железа имеет примерно форму клина, и имеет клиновидную форму в горизонтальных сечениях также. Околоушная железа легко пальпируется. Чтобы найти пальпируемые ориентиры для околоушной железы, следует выполнить пальпацию между передней частью ветви нижней челюсти и грудино-ключично-сосцевидной мышцей. Начинают пальпировать спереди от каждого уха, двигаясь к области щеки, а затем низ к углу нижней челюсти. Используя эти анатомические ориентиры, пальпируют поверхностные границы околоушной железы, и вводят ботулинический нейротоксин путем инъекции в середину околоушной железы. Инъекцию можно вводить в верхнюю или нижнюю половину основного тела железы. Необходимо выбрать одну точку инъекции. Та же процедура применима к другой стороне пациента. Подчелюстная железа расположена под дном ротовой полости ниже нижнечелюстной дуги рядом со следующими анатомическими структурами. Находясь над двубрюшными мышцами, каждая подчелюстная железа разделена на поверхностные и глубокие доли, которые разделены миохиоидной мышцей. Поверхностная доля составляет большую часть железы, под ней проходит миогиоидная мышца. Глубокая доля составляет меньшую часть. Хотя подчелюстная железа не всегда легко пальпируется, ее анатомическое положение четко определено. Инъекцию проводят, хотя и очень редко, параллельно выводному протоку. Инъекцию в подчелюстную железу вводят при фиксации железы двумя пальцами в положении ниже нижней челюсти. Иглу вводят сверху вперед в направлении дна ротовой полости под углом 70-90 градусов к нижней челюсти (Holsinger 2005, Anatomy, Function, and Evaluation of the Salivary Glands).
[0032] В других вариантах реализации ботулинический нейротоксин вводят путем инъекции в околоушные железы и подчелюстные железы с применением ультразвукового контроля. Специалист в данной области хорошо осведомлен о применении методик ультразвуковой визуализации для полного определения размера и локализации целевой области в теле железы. Для обнаружения и визуализации железы можно использовать например, высокочастотный линейный датчик >7,5 МГц [Howlett, High resolution ultrasound assessment of the parotid gland (2003) British Journal of Radiology 76, 271-277].
[0040] В общем случае предполагается, что ботулинический нейротоксин вводят путем инъекции в околоушные железы и подчелюстные железы более одного раза. В частных вариантах реализации ботулинический нейротоксин по настоящему изобретению вводят в последовательных циклах лечения. В соответствии с настоящим изобретением цикл лечения представляет собой временной интервал между двумя введениями ботулинического нейротоксина, то есть цикл лечения состоит из одного введения ботулинического нейротоксина и периода наблюдения до следующего введения ботулинического нейротоксина. Ботулинический нейротоксин предпочтительно вводят по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7 или по меньшей мере 8 циклами лечения. В одном варианте реализации ботулинический нейротоксин вводят в 2-6 циклах лечения, в частности в 4 циклах лечения.
[0041] Временной интервал между двумя последовательными введениями ботулинического нейротоксина в околоушные железы и подчелюстные железы может варьироваться от 10 до 20 недель или от 12 до 20 недель. В другом варианте реализации временной интервал между двумя последовательными введениями ботулинического нейротоксина в околоушные железы и подчелюстные железы может варьировать от 6 до 10 недель. В предпочтительном варианте реализации временной интервал между двумя последовательными введениями ботулинического нейротоксина в околоушные железы и подчелюстные железы варьирует от 12 до 18 недель или от 14 до 18 недель. В наиболее предпочтительном варианте реализации этот временной интервал составляет 15, 16 или 17 недель, в частности, 16 недель.
[0042] В одном варианте реализации изобретения этот временной интервал остается одинаковым между всеми последовательными введениями ботулинического нейротоксина в околоушные железы и подчелюстные железы.
[0043] В одном варианте реализации настоящего изобретения ботулинический нейротоксин вводят путем инъекции в околоушные железы и подчелюстные железы в по меньшей мере 4 последовательных циклах лечения, причем интервал времени между последовательными введениями ботулинического нейротоксина составляет 16 недель.
[0044] В целом, специалистам в данной области известно несколько способов определения эффективности ботулинического нейротоксина для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с сиалореей или повышенной выработкой слюны. Оценки и шкалы для определения эффективности ботулинического нейротоксина для лечения сиалореи или заболевания или состояния, ассоциированного с повышенной выработкой слюны, могут быть выбраны, например, из определения Скорости нестимулированного слюноотделения (uSFR), Шкалы средней обшей оценки изменений (GICS), Шкалы тяжести и частоты слюнотечения (DSFS), модифицированного Опросника оценки речевой моторики университета Radboud для паркинсонизма (mROMP), модифицированной Шкалы слюнотечения Тичера (mTDS), Шкалы влияния последствий слюнотечения (DIS), Коэффициента слюнотечения (DQ), Шкалы балльной оценки слюнотечения (DRS) и/или Шкалы оценки слюнотечения UPDRS.
[0045] В частных вариантах реализации по меньшей мере две из этих оценок и шкал могут быть объединены для определения эффективности ботулинического нейротоксина для лечения сиалореи или заболевания или состояния, ассоциированного с повышенной выработкой слюны.
[0046] В одном варианте реализации настоящего изобретения ботулинический нейротоксин для лечения сиалореи или заболевания или состояния, ассоциированного с повышенной выработкой слюны, используют у пациента, имеющего исходную выработку слюны, то есть скорость нестимулированного слюноотделения (uSFR) 0,1-1,6 г/мин. В предпочтительном варианте реализации ботулинический нейротоксин для лечения сиалореи или заболевания или состояния, ассоциированного с повышенной выработкой слюны, используют у пациента, имеющего исходную выработку слюны, то есть скорость нестимулированного слюноотделения (uSFR) более 0,3 г/мин. В другом варианте реализации ботулинический нейротоксин для лечения сиалореи или заболевания или состояния, ассоциированного с повышенной выработкой слюны, используют у пациента, имеющего исходный суммарный балл по шкале тяжести и частоты (DSFS) ≥6 и подуровень тяжести ≥2 и подуровень частоты ≥2. Как правило, определение баллов uSFR и DSFS хорошо известно специалисту в данной области. Согласно настоящему изобретению uSFR определяют по весу собранной в течение 5 минут слюны с использованием для сбора четырех впитывающих тампонов. Сбор слюны осуществляют путем помещения впитывающего материала в полость рта (например, четырех зубных валиков, систем Salivette или тампонов Salimetrics Oral Swabs) на 5 минут. Впитывающий материал впитывает слюну из закрытой полости рта, и прирост массы впитывающего материала за счет собранного количества слюны может быть определен путем измерения веса впитывающего материала до и после помещения его в полость рта. Повторение сбора и измерение количества выделенной в течение 5 минут слюны после 30-минутной паузы дает второе значение. Среднее обоих значений обеспечивает достоверность результатов измерений (за счет снижения внутрииндивидуальной вариабельности измерений) (Jongerius РН, van Limbeek J, Rotteveel JJ. Assessment of salivary flow rate: biologic variation and measure error. Laryngoscope. 2004; 114(10):1801-4).
[0047] В другом варианте реализации настоящего изобретения введение 100 Ед ботулинического нейротоксина снижает uSFR по меньшей мере на 25% по сравнению с исходным уровнем в течение 4 недель после введения. В предпочтительном воплощении введение 100 Ед ботулинического нейротоксина снижает uSFR по меньшей мере на 30% (в среднем) по сравнению с исходным уровнем в течение 4 недель после инъекции. В другом варианте реализации настоящего изобретения введение 100 Ед ботулинического нейротоксина снижает uSFR по меньшей мере на 22% (в среднем) по сравнению с исходным уровнем в течение 8 недель после введения. В предпочтительном воплощении введение 100 Ед ботулинического нейротоксина снижает uSFR по меньшей мере на 28% (медиана) по сравнению с исходным уровнем в течение 8 недель после инъекции.
[0048] В дополнительном варианте реализации настоящего изобретения введение 100 Ед ботулинического нейротоксина улучшает балл по Шкале средней обшей оценки изменений (GICS) для слюнотечения, оцениваемый пациентом, по меньшей мере на +0,90 баллов по 7-балльной шкале лайкертовского типа по сравнению с исходным слюнотечением в течение 4 недель после введения. В предпочтительном варианте реализации введение 100 Ед ботулинического нейротоксина демонстрирует улучшение по Шкале средней обшей оценки изменений (GICS), по меньшей мере на +1,00 балл по сравнению с исходным слюнотечением в течение 4 недель после инъекции. В другом варианте реализации настоящего изобретения введение 100 Ед ботулинического нейротоксина улучшает слюнотечение, измеренное по Шкале средней обшей оценки изменений (GICS), по меньшей мере на +1,00 балл по сравнению с исходным слюнотечением в течение 8 недель после введения. В предпочтительном воплощении введение 100 Ед ботулинического нейротоксина улучшает слюнотечение, измеренное по Шкале средней обшей оценки изменений (GICS), по меньшей мере на +0,90 балла по сравнению с исходным уровнем в течение 12 недель после инъекции. Балл Шкалы средней обшей оценки изменений (GICS) определяют по шкале лайкертовского типа, на основании ответа на вопрос "По сравнению с вашим состоянием непосредственно перед последней инъекцией в слюнную железу, каково ваше общее впечатление о вашем состоянии сейчас в результате этого лечения?" со шкалой ответов от "-3, очень сильное ухудшение" до "+3, очень сильное улучшение" (Likert, Rensis (1932). "A Technique for the Measurement of Attitudes". Archives of Psychology. 140: 1-55)).
[0049] В дополнительном варианте реализации настоящего изобретения введение 100 Ед ботулинического нейротоксина уменьшает средний суммарный балл по Шкале тяжести и частоты слюнотечения (DSFS) по меньшей мере на 0,90 балла по сравнению с исходным уровнем в течение 4 недель после введения. В предпочтительном варианте реализации введение 100 Ед ботулинического нейротоксина уменьшает средний суммарный балл по шкале тяжести и частоты (DSFS) по меньшей мере на 1,20 балла по сравнению с исходным уровнем в течение 4 недель после инъекции. В другом варианте реализации настоящего изобретения введение 100 Ед ботулинического нейротоксина уменьшает средний суммарный балл по Шкале тяжести и частоты слюнотечения (DSFS) по меньшей мере на 1,50 балла по сравнению с исходным уровнем в течение 8 недель после введения. Балл Шкалы тяжести и частоты слюнотечения (DSFS) определяется двумя суб-шкалами: 4-балльной шкалой Лайкерта для "частоты слюнотечения" и 5-балльной шкалой Лайкерта для "тяжести слюнотечения". DSFS является суммой двух этих суб-шкал. Оценка относится к периоду времени "за последнюю неделю". Максимально возможный балл - 9 (Thomas-Stonell N, Greenberg J. Three treatment approaches and clinical factors in the reduction of слюнотечение. Dysphagia. 1988; 3(2):73-8.).
Тяжесть слюнотечения
1 Сухость (полное отсутствие слюнотечения)
2 Легкое (мокрые только губы)
3 Умеренное (мокрые губы и подбородок)
4 Тяжелое (вытекающая слюна увлажняет одежду)
5 Массивное (мокрые руки, поднос и предметы)
Частота слюнотечения
1 Никогда
2 Изредка (не каждый день)
3 Часто (часть каждого дня)
4 Постоянно
[0050] В дополнительном варианте реализации настоящего изобретения введение 100 Ед ботулинического нейротоксина снижает средний суммарный балл домена контроля слюнотечения модифицированного Опросника оценки речевой моторики университета Radboud для паркинсонизма (mROMP) по меньшей мере на 3,50 балла по сравнению с исходным уровнем в течение 4 недель после введения. В предпочтительном варианте реализации введение 100 Ед ботулинического нейротоксина снижает средний суммарный балл домена контроля слюнотечения модифицированного Опросника оценки речевой моторики университета Radboud для паркинсонизма (mROMP) по меньшей мере на 4,60 балла по сравнению с исходным уровнем в течение 4 недель после инъекции. В другом варианте реализации настоящего изобретения введение 100 Ед ботулинического нейротоксина снижает средний суммарный балл домена контроля слюнотечения модифицированного Опросника оценки речевой моторики университета Radboud для паркинсонизма (mROMP) по меньшей мере на 5,5 баллов по сравнению с исходным уровнем в течение 8 недель после введения. В предпочтительном варианте реализации введение 100 Ед ботулинического нейротоксина средний суммарный балл домена контроля слюнотечения модифицированного Опросника оценки речевой моторики университета Radboud для паркинсонизма (mROMP) по меньшей мере на 6,50 балла по сравнению с исходным уровнем в течение 8 недель после инъекции. Модифицированный Опросник оценки речевой моторики университета Radboud для паркинсонизма (mROMP) определен согласно оригинальному Опроснику ROMP [Kalf 2011, Arch. Phys. Med. Rehabil.], который представляет собой голландский опросник из 23 пунктов, состоящий из 5-балльных шкал Лайкерта в доменах речи, глотания и контроля слюнотечения. ROMP был модифицирован (mROMP) для внесения небольших изменений в формулировку, полученных в результате бесед с пациентами во время лингвистической валидации для английского языка США. Опросник mROMP теперь включает 24 пункта с четко различимыми вариантами ответа и периодом оценки в течение последних 7 дней.
[0051] В одном аспекте настоящего изобретения ботулинический нейротоксин представляет собой комплекс ботулинического нейротоксина. Из культур Clostridium botulinum можно получить комплексы массой, например, 450 кДа или 900 кДа. Комплекс клостридийного ботулинического нейротоксина по настоящему изобретению содержит нейротоксический компонент и нетоксичные белки. Вспомогательные белки окружают нейротоксический компонент, тем самым защищая его от разложения пищеварительными ферментами в желудочно-кишечном тракте, не добавляя ничего к токсическому эффекту.
[0052] В другом аспекте настоящего изобретения ботулинический нейротоксин является нейротоксическим компонентом комплекса ботулинического нейротоксина. Как правило, нейротоксический компонент имеет молекулярную массу 150 кДа. Нейротоксический компонент не содержит никаких других белковых компонентов комплекса клостридийного ботулинического нейротоксина.
[0053] Ботулинический нейротоксин по настоящему изобретению выбран из группы различных серотипов, включая ботулинический нейротоксин серотипа A (BoNT/A), ботулинический нейротоксин серотипа В (BoNT/B), ботулинический нейротоксин серотипа С1 (BoNT/C1), ботулинический нейротоксин серотипа D (BoNT/D), ботулинический нейротоксин серотипа Е (BoNT/E), ботулинический нейротоксин серотипа F (BoNT/F) или ботулинический нейротоксин серотипа G (BoNT/G). Ботулинический нейротоксин и, в частности, его легкую цепь и тяжелую цепь получают из одного из различных по антигенным свойствам серотипов ботулинических нейротоксинов, указанных выше. В одном аспекте указанная легкая и тяжелая цепь ботулинического нейротоксина представляет собой легкую и тяжелую цепь ботулинического нейротоксина, выбранного из группы, состоящей из: BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F или BoNT/G. В другом аспекте полинуклеотид, кодирующий указанный ботулинический нейротоксин по настоящему изобретению, содержит нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1 (BoNT/A), SEQ ID NO: 3 (BoNT/B), SEQ ID NO: 5 (BoNT/C1), SEQ ID NO: 7 (BoNT/D), SEQ ID NO: 9 (BoNT/E), SEQ ID NO: 11 (BoNT/F) или SEQ ID NO: 13 (BoNT/G). Кроме того, в одном аспекте представлен полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 2 (BoNT/A), SEQ ID NO: 4 (BoNT/B), SEQ ID NO: 6 (BoNT/C1), SEQ ID NO: 8 (BoNT/D), SEQ ID NO: 10 (BoNT/E), SEQ ID NO: 12 (BoNT/F) или SEQ ID NO: 14 (BoNT/G). Кроме того, один аспект средств и способов по настоящему изобретению охватывает ботулинический нейротоксин, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 2 (BoNT/A), SEQ ID NO: 4 (BoNT/B), SEQ ID NO: 6 (BoNT/C1), SEQ ID NO: 8 (BoNT/D), SEQ ID NO: 10 (BoNT/E), SEQ ID NO: 12 (BoNT/F) и SEQ ID NO: 14 (BoNT/G).
[0054] В другом аспекте указанный полинуклеотид, кодирующий ботулинический нейротоксин по настоящему изобретению, представляет собой вариант вышеупомянутых полинукпеотидов, содержащий одну или более нуклеотидных замен, делеций и/или добавлений, которые в еще одном аспекте могут приводить к получению полипептида, имеющего одну или более аминокислотных замен, делеций и/или добавлений. Кроме того, вариант полинуклеотид а по изобретению в другом аспекте содержит вариант нуклеотидной последовательности, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичный нуклеотидной последовательности, приведенной в любой из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 или 13 или вариант нуклеотидной последовательности, который кодирует аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или, по меньшей мере на 99% аминокислотной последовательности, приведенной в любой из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 или 14. Используемый в настоящем документе термин "идентичный" относится к идентичности последовательности, характеризующейся определением количества идентичных аминокислот между двумя нуклеотидными последовательностями или двумя аминокислотными последовательностями, когда последовательности выровнены так, чтобы получить соответствие наивысшего порядка. Он может быть рассчитан с использованием опубликованных методов или методов, кодифицированных в компьютерных программах, таких как, например, BLASTP, BLASTN или FASTA (Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403). Значения идентичности в процентах, в одном аспекте, рассчитывают по всей аминокислотной последовательности. Для сравнения различных последовательностей квалифицированному специалисту доступен ряд программ, основанных на различных алгоритмах. В этом контексте алгоритмы Нидлмана и Вунша или Смита и Уотермана дают особенно надежные результаты. Для осуществления выравнивания последовательностей могут использоваться программа PileUp (Higgins 1989, CABIOS 5, 151) или программы Gap и BestFit (Needleman 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith 1981, Adv Appl Math 2, 482), которые являются частью пакета программного обеспечения GCG (Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Мэдисон, Висконсин, США, 53711). Значения идентичности последовательности, указанные выше в процентах (%), должны быть определены, в другом аспекте изобретения, с использованием программы GAP по всей области последовательности со следующими настройками: штраф за открытие гэпа: 50, штраф за продолжение гэпа: 3, среднее совпадение: 10,000 и среднее несовпадение: 0,000, которые, если не указано иное, всегда должны использоваться в качестве стандартных настроек для выравнивания последовательностей. В одном аспекте каждый из вышеупомянутых вариантов полинуклеотидов кодирует полипептид, сохраняющий один или несколько и, в другом аспекте, все биологические свойства соответствующего ботулинического нейротоксина, то есть BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F или BoNT/G. Специалистам в данной области понятно, что полная биологическая активность сохраняется только после протеолитической активации, даже если непроцессированный предшественник теоретически может выполнять некоторые биологические функции или быть частично активным. Термин "биологические свойства" в контексте настоящего описания относится к (а) связыванию рецептора, (b) интернализации, (с) транслокации через эндосомальную мембрану в цитозоль и/или (d) эндопротеолитическому расщеплению белков, участвующих в слиянии синаптической везикулярной мембраны. Анализы in vivo для оценки биологической активности включают анализ LD50 мыши и анализ гемидиафрагмы мыши ex vivo, как описано Pearce et al. (Pearce 1994, Toxicol. Appl. Pharmacol. 128: 69-77) и Dressler et al. (Dressler 2005, Mov. Disord. 20: 1617-1619, Keller 2006, Neuroscience 139: 629-637) или клеточный анализ, как описано в WO 2009/114748, WO 2014/207109 или WO 2013/049508. Биологическую активность обычно выражают в мышиных единицах (Ед). Используемая в настоящем документе 1 Ед. представляет собой количество нейротоксического компонента ботулинического нейротоксина, которое убивает 50% заранее определенной популяции мышей после внутрибрюшинной инъекции, то есть, т.е. внутрибрюшинную LD50 мыши. В дополнительном аспекте варианты полинуклеотидов могут кодировать ботулинические нейротоксины, имеющие улучшенные или измененные биологические свойства, например, они могут содержать сайты расщепления, которые улучшены для распознавания фермента или могут быть улучшены для связывания рецептора или любого другого свойства, указанного выше. Конкретным полезным способом определения биологической активности ботулинического нейротоксина является клеточный анализ, раскрытый, например, в WO 2009/114748, WO 2013/049508 или WO 2014/207109.
[0055] Кроме того, без привязки к конкретной теории, предполагается, что, в частности, композиция ботулинического нейротоксина, не содержащего комплексообразующих белков (Инкоботулинический нейротоксин А, Ксеомин), то есть нейротоксического компонента ботулинического нейротоксина, свободного от каких-либо других белковых компонентов комплекса клостридийного ботулинического нейротоксина, по сравнению с другими ботулиническими нейротоксинами с комплексообразующими белками (Онаботулинический нейротоксин А, Ботокс, Абоботулинический нейротоксин А, Диспорт, Римаботулинический нейротоксин В, Миоблок или другие с комплексообразующими белками), позволяет выполнить клинически обратимую, функциональную инактивацию холинергической передачи нервного импульса без нарушения внутриклеточной структуры слюнных желез и слюнных протоков. Применение нейротоксического компонента ботулинического нейротоксина, свободного от каких-либо других белковых компонентов комплекса клостридийного ботулинического нейротоксина, также не вызывает какого-либо физического повреждения ацинарных клеток, описанного при резекции подчелюстных слюнных желез у детей после инъекций ботулинического нейротоксина [Mosseri 2016, Otolaryngology-Head and Neck Surgery].
[0056] Обычно, блокада нервных окончаний ботулиническими нейротоксинами необратима; клинические эффекты, однако, носят временный характер, поскольку прорастают новые нервные окончания, вызывая образование новых связей. Комплексообразующие белки рассматривают в качестве биологически не активных для лечения соединений, и полагают, что они не играют никакой роли в эффективности ботулинических нейротоксинов, используемых во внутримышечных инъекциях для лечения спастичности, дистонии, гипергидроза, головной боли, депрессии, спазма мочевого детрузора или при эстетических показаниях, таких как межбровные складки или морщины.
[0057] Комплексообразующие белки представляют собой остатки клостридийных белков, которые происходят из бактерий Clostridium botulinum. Эти белки вырабатываются вместе с нейротоксическим компонентом ботулинических нейротоксинового белкового комплекса, и они играют фундаментальную роль в защите токсина в агрессивных средах (например, в кислой среде желудка), и помогают интернализации токсина через эпителиальный барьер кишечника. Комплексообразующие белки состоят из гемагглютининов и негемагглютининов и рассматриваются в качестве нетоксичных белков ботулинических нейротоксинового белкового комплекса. Сообщалось, что гемагглютинины (ГА) разрушают межклеточный эпителиальный барьер в кишечнике посредством непосредственного связывания Е-кадгерина [Fujinaga 2009, Toxicon  [Sugawara et al. 2010 J. Cell Biol. [], [Ли 2014, Science . В слюнных железах секреторный эпителий, интеркалированный протоковый эпителий и поперечно-полосатый эпителий протоков развиваются из эктодермальных зародышевых линий, аналогично кишечному эпителии. Особый интерес в плотных контактах слюнных желез представляют члены семейства кадгеринов, которые играют роль в развитии слюнных желез, организации тканей и дифференцировке клеток. Эпителиальный (Е)-кадгерин является основной молекулой межклеточной адгезии в эпителиальных тканях и рассматривается как главный организатор эпителиального фенотипа. [Davies 2006, Developmental Cell]. В раннем морфогенезе Е-кадгерин и β-катенин, вероятно, участвуют в ремоделировании слюнных желез, тогда как во время дифференцировки клеток они образуют стабильные межклеточные контакты и могут сотрудничать с Rho ГТФазами в установлении и поддержании полярности слюнных клеток [(Baker 2010, Journal of Biomedicine and Biotechnology). Уникальные межклеточные структуры, такие как Е-кадгерины, также играют фундаментальную роль в поляризации эпителиальных клеток в кишечнике и слюнных железах. Таким образом, взаимодействие Е-кадгеринов с комплексообразующими белками ботулинических нейротоксинов мешает нормальной биологической активности слюнных желез. Исследователи Xu и Shan, например, продемонстрировали, что после введения BoNT/A Prosigne Hengli (Lanzhou Biochemical Co., Ганьсу, Китай) (т.е. ботулинического нейротоксина с комплексообразующими белками) в подчелюстные железы крыс, наблюдается отрицательная регуляция аквапорина (AQP5) на мембране железистых клеток, что может быть вторичным эффектом денервации (Xu et al. 2015 Journal of Dental Research, Shan et al. 2013 International Journal of Oral Science).
[0058] Для приготовления фармацевтического препарата, содержащего ботулинический нейротоксин, композиция нейротоксина может быть составлена различными способами в зависимости от желаемых целей применения, которые известны в данной области. Например, (биологически активный) ботулинический нейротоксин можно использовать в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями в виде фармацевтической композиции. Фармацевтически приемлемый носитель(-и) должен быть приемлемым в том смысле, что он совместим с другими ингредиентами препарата и не является вредным для реципиента. Используемый фармацевтический носитель может включать твердое вещество, гель или жидкость. Примерами твердых носителей являются лактоза, каолин, сахароза, тальк, желатин, агар, пектин, камедь, стеарат магния, стеариновая кислота и тому подобное. Примерами жидких носителей являются глицерин, забуференный фосфатом физиологический раствор, вода, эмульсии, различные типы смачивающих агентов и тому подобное. Подходящие носители включают упомянутые выше и другие, хорошо известные в данной области, см., например, справочник Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Истон, Пенсильвания. В одном аспекте фармацевтическая композиция может быть растворена перед введением в разбавителе. Разбавитель также выбирают таким образом, чтобы он не влиял на биологическую активность продукта ботулинического нейротоксина. Примерами таких разбавителей являются дистиллированная вода или физиологический раствор. Кроме того, фармацевтическая композиция или состав может также включать другие носители или нетоксичные, нетерапевтические, неиммуногенные стабилизаторы и тому подобное. Таким образом, лекарственная форма ботулинического нейротоксина может быть, в одном аспекте, в жидком или лиофилизированном виде. В одном аспекте она может быть представлена с глицерином, белковыми стабилизаторами (HSA) или небелковыми стабилизаторами, такими как поливинилпирролидон (PVP), гиалуроновая кислота или свободные аминокислоты. В одном аспекте подходящие небелковые стабилизаторы раскрыты в WO 2005/007185 или WO 2006/020208. Подходящий состав для стабилизированного HSA состава, включающего ботулинический нейротоксин согласно настоящему изобретению, раскрыт, например, в патенте США 8398998 В2. Лекарственная форма ботулинического нейротоксина может быть использована для лечения различных заболеваний или расстройств у людей или животных в терапевтически эффективной дозе или в косметических целях.
ПРИМЕРЫ
[0059] Общая методика: Было проведено клиническое испытание, в котором за каждой из 4 последовательных инъекций следовал 16-недельный период наблюдения, то есть всего 4 последовательных цикла лечения. В конце каждого цикла лечения субъектов обследовали на пригодность для участия в следующем цикле. Первый цикл лечения (основной период [ОП]) проводили при двух разных дозах NT 201 (то есть ботулинического нейротоксина серотипа А без комплексообразующих белков, Инкоботулинотоксина А) (75 Ед. и 100 Ед.) в сравнении с плацебо. Субъекты были рандомизированы на соответствующее лечение в соотношении 2:2:1 (75 Е : 100 Е : плацебо). Инкоботулинотоксин А восстанавливали в физиологическом солевом растворе в концентрации 50 Ед/мл, и пациенты получали 30 Ед токсина в каждую околоушную железу и 20 Ед в каждую подчелюстную железу в группе, получавшей 100 Ед, и 22,5 Ед токсина в каждую околоушную железу и 15 Ед. в каждую подчелюстную железу в группе дозы 75 Ед. соответственно. В обеих дозовых группах общую дозу, предназначенную для каждой околоушной и подчелюстной железам, вводили путем инъекции в один участок соответствующей железы. За ОП следовали 3 последовательных цикла лечения дополнительного периода со слепым дозированием, где субъекты получали либо 75 Ед, либо 100 Ед NT 201 таким же образом, как и в MP. Субъектов, которые получали плацебо во время ОП, рандомизировали в соотношении 1:1 для получения 75 Ед. или 100 Ед NT 201 в течение дополнительного периода, так что общее соотношение рандомизации доз было 1:1. Результаты из ОП проведенного исследования показывают, что дозы как 75 Ед, так и 100 Ед достигают лечебных эффектов, имеющих клиническую значимость. Они обобщены ниже.
[0060] Пример 1: Результаты плацебо-контролируемого основного периода (uSFR)
В целом, 184 пациента с хронической причиняющий пациентам беспокойство сиалореей получили лечение в течение ОП исследования. Исследование имело две сопервичные конечные точки эффективности. Одной из сопервичных конечных точек эффективности было изменение Скорости нестимулированного слюноотделения (uSFR) от исходного уровня до недели 4 (см. в таблице 1 средние изменения во времени). Во все моменты времени uSFR значимо снижалась в обеих группах лечения NT 201, причем эффект был более выраженным в группе, получавшей дозу 100 Ед NT 201, как показано на Фигуре 1. На 4-й неделе статистически значимое превосходство над плацебо было показано для группы 100 Ед NT 201 (р=0,004). Средние значения uSFR в группе 75 Ед NT 201 с р-значениями менее 0,05 (таблица 1) были достигнуты через 8 и 12 недель (р-значения: 0,022 и 0,019 соответственно). Эффекты лечения, наблюдаемые в группах 100 Ед NT 201 и 75 Ед NT 201, можно считать клинически значимыми.
[0061]
[0062] Пример 2. Результаты плацебо-контролируемого основного периода (GICS)
Другой сопервичной конечной точкой эффективности было улучшение общей функциональной оценки субъектов, измеренной по Шкале средней обшей оценки изменений (GICS) на 4-й неделе. GICS - это 7-балльная шкала Лайкерта, заполняемая субъектами, отвечающими на вопрос "По сравнению с вашим состоянием непосредственно перед последней инъекцией в слюнную железу, каково ваше общее впечатление о вашем состоянии сейчас в результате этого лечения?". Группы обеих доз достигли улучшения. Статистически значимое различие в пользу группы, получавшей 100 Ед, по сравнению с плацебо наблюдалось на 4 неделе (р=0,002, таблица 2, Фиг. 2). Группа 75 Ед показала численно лучшие результаты по сравнению с плацебо на 4-й неделе, но разница немного не достигла статистической значимости (р=0,055). Тем не менее, значения р менее 0,05 были достигнуты в обеих группах доз на неделе 8 и неделе 12, а также на неделе 16 в группе 100 Ед, как показано на фигуре 2.
[0063]
[0064] Пример 3: Результаты плацебо-контролируемого основного периода (GICS)
Заранее определенный критерий ответа для конечной точки GICS, который следует рассматривать как клинически значимое улучшение слюнотечение, заключался в улучшении по крайней мере на один балл по шкале (минимальное улучшение). Результаты анализа респондеров для всех групп лечения представлены в Таблице 3 и на Фигуре 3.
[0065]
Частота ответов в группе плацебо была ниже, чем в обеих группах лечения NT 201 в течение основного периода. Она варьировалась от 28,6% (на неделе 8) до 48,6% на неделе 2. В двух группах, получавших NT 201, максимальная частота ответов GICS субъекта достигается на неделе 8: 68,1% в группе 75 Ед NT 201 и 76,4% в группе 100 Ед NT 201. Авторы настоящего изобретения считают эти показатели свидетельством клинической значимости для групп дозирования 75 Ед и 100 Ед NT 201.
[0066] Пример 4: Результаты плацебо-контролируемого основного периода (DSFS)
Была также оценена субъективная конечная точка Шкалы тяжести и частоты слюнотечения (DSFS). DSFS состоит из двух суб-шкал, 4-балльной шкалы Лайкерта для "частоты слюнотечения" и 5-балльной шкалы Лайкерта для "степени тяжести слюнотечения". Описательный анализ DSFS показал клинически значимое улучшение сиалореи в обеих группах лечения NT 201 по сравнению с отсутствием соответствующего улучшения в группе плацебо. Изменения среднего суммарного балла по сравнению с исходным уровнем с течением времени являются максимальными с улучшением величиной -1,89 в группе лечения 100 Ед на неделе 8, а затем -1,76 в группе лечения 75 Ед на неделе 12, как показано в таблице 4 и на Фигуре 4. Сравнение лечения с помощью модели со смешанными эффектами для повторных измерений (MMRM) показывает значения р<0,05 для обеих групп NT 201 по сравнению с плацебо на неделе 4, 8 и 12.
[0067] Пример 5. Результаты плацебо-контролируемого основного периода (mROMP)
Наконец, оценивали балл модифицированного Опросника оценки речевой моторики университета Radboud для паркинсонизма (mROMP) с использованием суб-шкалы слюнотечения, которая включает в себя опросник из 9 пунктов 5-балльной шкалы Лайкерта. Обе группы лечения NT 201 показали лучшие результаты по эффективности по суб-шкале слюнотечения mROMP по сравнению с группой плацебо, как показано в Таблице 5 и на Фигуре 5. Средние изменения от исходного уровня достигают максимального улучшения величиной -6,58 в группе лечения 100 Ед на неделе 8 и -6,77 в группе лечения 75 Ед на неделе 12. Авторы изобретения пришли к выводу, что эффекты лечения, наблюдаемые в группах обеих доз, были выше, чем эффект плацебо, и эффекты NT 201 были достаточно последовательными по всем измерениям и робастными в течение всего наблюдения, чтобы подтвердить соответствующую клиническую значимость обеих доз.
[0068] Пример 6: Анализ по подгруппам результатов плацебо-контролируемого основного периода (mROMP)
Анализ подгрупп по этиологии показал, что у субъектов с сиалореей после инсульта в группе 100 Ед NT 201 наблюдалось более высокое среднее снижение uSFR, чем у субъектов с сиалореей, ассоциированной с болезнью Паркинсона или атипичным паркинсонизмом (Таблица 6).
[0069] Пример 7: Эффективность в 3 последовательных циклах лечения с 16-недельными интервалами
Результаты эффективности в 3 последовательных циклах лечения с 16-недельными интервалами дали доказательства дальнейшего улучшения сиалореи. Также оценивали изменение uSFR от исходного уровня исследования до всех моментов времени наблюдения после второй инъекции, и изменение от каждой инъекции (16, 32 и 48 недель после первой инъекции) до соответствующих моментов времени оценки (20, 36 и 52 недели после первой инъекции), а также до визитов окончания цикла/окончания исследования (32, 48 и 64 недели после первой инъекции) в каждом цикле.
Сводная статистика для uSFR в начальные моменты цикла дополнительного периода (ЕР) без контрольной группы плацебо показана в таблице 7. (Субъекты, рандомизированные в группу плацебо в ОП, были рандомизированы на тех же условиях в группу дозы 75 Ед или 100 Ед в соотношении рандомизации 1:1 на протяжении периода ЕР. Субъекты в группе дозы 75 Ед или 100 Ед в ОП сохраняли свою дозу в ЕР). Среднее значение uSFR в ЕР в обеих группах лечения NT 201 было самым высоким в исходный момент цикла 2 и самым низким в исходный момент цикла 4. Кроме того, среднее значение uSFR в исходный момент каждого цикла было немного выше в группе NT 201 75 Ед, чем в группе NT 201 100 Ед. Аналогичное улучшение сиалореи наблюдалось, когда показатели GICS, DSFS и mROMP были проанализированы для групп 100 Ед NT201 и 75 Ед NT201 в течение дополнительного периода.