Биохимические исследования сыворотки крови и скелетных мышц при удлинении голени аппаратом илизарова с темпом дистракции 3 мм в сутки в автоматическом режиме

Статья

позвонков устанавливает их пространственное положение. Результаты обрабатываются на компьютере. В практической деятельности нашли применение, по данным В.Н. Сарнадского [8], «the rib hump measuring apperatus», «the formulator body tracer», «scoliometr», «flexible curve», «spinal pantograh». Бесконтактные методы основаны на использовании излучения: оптического, ионизирующего (рентгеновское, электронного парамагнитного резонанса, ядерного магнитного резонанса) и ультразвукового.

К оптическим методам относятся стерео- и фотография, видеорегистрация и проекционные методы. Фотография дает недостаточную информацию для получения пространственного представления о патологии и используется лишь для документации. Стереометрия и стереограмметрия дают трехмерное изображение с достаточной точностью, но сложна обработка полученной информации [2]. Видеорегистрация основывается на синхронной записи двумя или более видеокамерами, расположенными по разные стороны от пациента и при перемещении специальных маркеров на его теле. Этот метод имеет невысокую точность измерений. Предпочтительнее стереограмметрия, основанная на цифровой технике. Ранее рентгенография считалась единственным методом диагностики вертеброгенной патологии, но из-за лучевой инвазивности его применение ограничено. Более эффективна стереорентгенография, ее суть аналогична стереограммет-рии с возможностью исследования в статике и в динамике. Современное техническое обеспечение снижает влияние лучевой нагрузки при хорошем качестве изображения. Недостатки метода: высокая стоимость, необходимость помещения и персонала, невозможность проводить исследования беременных женщин.

К проекционным методам диагностики вертеброгенной патологии относятся: теневой муаровый метод, метод пространственного детектирования фазы (компьютерная оптическая топография), электронно-проекционный муаровый метод. Теневой муаровый метод [11-12] заключается в том, что пациент располагается вблизи фотопластинки с линейчатой сеткой. При освещении световым потоком (например, диапроектором) перпендикулярно к фотопластинке, на поверхности спины пациента образуется тень сетки. Под углом к плоскости фотопластины, на фоне спины пациента, можно увидеть картину муаровых полос, образованной наложением сетки фотопластины и ее тени (механическая интерференция). Фотоснимок, полученный любым фотоаппаратом, легко обрабатывается по простой формуле [10] с помощью калькулятора. В результате исследования получают пространственную топограмму дорсальной поверхности туловища человека. Этот способ позволяет получить снимки спины при наклонах туловища вправо и влево. Применение цифрового фотоаппарата или видеокамеры и компьютера позволяют автоматизировать процесс обработки муаровой картины по программе с выходом аксонометрических изображений спины, как в статике, так и в динамике. Чувствительность метода - 0,1 мм. Ограничения к использованию метода: невозможность исследования спины при максимальном сгибании и разгибании туловища, наличие выраженного слоя подкожно-жировой клетчатки, реберного горба и келоидных рубцов. С некоторой погрешностью можно использовать метод муаровой топографии и при выраженной подкожно-жировой клетчатке по методике Л.С. Трофименко с помощью клипера Беста [3], а также у беременных и детей.

Вторым по распространенности проекционным методом является метод пространственного детектирования фазы (компьютерной оптической топографии) [7, 9]. Установка состоит из проектора, видеокамеры, компьютера, монитора, экрана, установочного места, направляющих и юстировочных механизмов. Принцип работы: с помощью проектора на эталонную плоскость экрана проецируется сетка прямолинейных эквидистантных черно-белых линий. Эта сетка сканируется видеокамерой и посылается в компьютер посредством алгоритмов. Затем перед экраном становится пациент, на спину которого проецируется сетка. Сетка деформируется по рельефу спины пациента. Изображение этой стеки сканируется видеокамерой и посылается в компьютер. Обработка двух введенных в компьютер видеосигналов ведется по программе путем определения разности фаз двух видеосигналов. Программа позволяет строить топограмму задней поверхности и здорового туловища, и деформированного [8]. Установка требует 1,8x5,5 м2 площади. Чувствительность метода равна

0,5 мм. Время компьютерной обработки не превышает б с.

Электронно-проекционный муаровый метод [5-б] имеет установку, состоящую из мультимедийного проектора, цифровой

фото- или видеокамеры, компьютера и монитора. Линейчатая сетка мультимедийным проектором проецируется на спину пациента, затем объектная сетка сканируется цифровым фотоаппаратом и засылается в компьютер. Компьютер по программе, моделирущей теневой муаровый метод, образует муаровую картину, затем строит топограмму спины и выдает характеристики диагностики. В отличие от теневого муарового метода электронно-проекционная установка позволяет исследовать положения при наклонах туловища за счет автоматических изменений резкости, юстировки оптической системы и фрагментарного сканирования исследуемой поверхности. Размеры площади установки составляют 1,8х3,0 м2. Чувствительность - 0,1 мм.

Хорошие перспективы для внедрения в практику имеют ЯМР-томографы, поскольку принцип их действия не основан, в отличие от рентгенографии и компьютерной томографии, на использовании ионизирующего излучения. Одним из недостатков является высокая стоимость оборудования и самого исследования для пациента, не входящего в систему обязательного медицинского страхования. Отметим высокую эффективность проекционных методов, результаты которых сопоставимы с рентгенологическими. По мнению многих авторов, проекционные методы получат дальнейшее развитие и распространение в силу своей неинвазивности, низкой стоимости оборудования и самого исследования. Теневые муаровые установки могут использоваться в периферийных больницах вследствие низкой стоимости; при необходимости фотоснимок с картиной муаровых полос может быть послан в центр по сети «МегпеЬ) для вынесения квалифицированного заключения и выдачи рекомендаций по лечению.

Литература

1. Батышева Т.Т. и др. // Мед. помощь.- 2004.- № 1.- С. 27.

2. Беленький В.Е. и др. // Ортопедия, травматол. и протез.-1969.- № 4.- С. 57-60.

3. Дубровский В.И. Биомеханика.- М.: ВЛАДОС-ПРЕСС,

2003.

4. Зацепин Т.С. и др. // Нов. хир. архив.- 1926 № 10.- С. 500.

5. Лесун З.В. Аппарат для графической записи боковых искривлений позвоночника и методика выявления величины искривления: Дис. ... канд. мед. наук.- Иркутск, 1962.

6. Патент 2065570 ЯИ. Электронно-проекционный способ измерения формы и перемещений поверхности объекта / Куче-рюк В.И., Попов А.М., Колесников А.В 1996.- Бюл. № 23.

7. Садовой М.А. и др. // Травматол. и ортопедия России.-1994.- № 3.- С. 43-51.

8. Сарнадский В.Н. и др. Мониторинг деформаций позвоночника методом компьютерной оптической топографии.- Новосибирск, 2001.

9. Сарнадский В.Н. и др. // Тез. докл. VII съезда травматол.-ортопедов России.- Новосибирск, 2002.- Т. 1.- С. 166.

10. Скрябин Е.Г. и др. Муаровая топография в диагностике вертеброгенных деформаций у беременных.- Тюмень, 1999.

11. Скрябин Е.Г. и др. // Изобретения. Полезные модели.-2000.- № 34.- С. 3.

12. Скрябин Е.Г. и др. // Тез.докл. VII съезда травматол-ортопедов России.- 2002.- Т. 1.- С. 168-169.

13. Чаклин В.Д. и др. Сколиоз и кифозы.- М.: Медицина,

1973.

УДК: 612.398.12:616.748:617.58 - 089

БИОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ СЫВОРОТКИ КРОВИ И СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ ПРИ УДЛИНЕНИИ ГОЛЕНИ АППАРАТОМ ИЛИЗАРОВА С ТЕМПОМ ДИСТРАКЦИИ 3 ММ В СУТКИ В АВТОМАТИЧЕСКОМ РЕЖИМЕ

С.А. ЕРОФЕЕВ, С.Н. ЛУНЕВА, М.В. СТОГОВ, Н.В. ТУШИНА*

Введение. Разработка методов удлинения конечности, основанных на щадящих принципах, является актуальной задачей. Манипуляции со скелетом вызывают существенные изменения во внутренней среде организма, напряжение в системах, ответственных за гомеостаз и адаптацию. Структура и функция костной ткани поддерживается специфическими ферментами, синтезирующими и расщепляющими компоненты внеклеточного матрик-

* ФГУН «Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. Г.А. Илизарова Росздрава», г. Курган

С.А. Ерофеев, С.Н. Лунева, М.В. Стогов и др.

са, и ферментами общих метаболических путей, снабжающих костные клетки энергией и пластическим материалом. При этом значимую роль в процессах регенерации костной ткани в условиях чрескостного дистракционного остеосинтеза играет функциональное состояние скелетных мышц.

Цель работы - изучение динамики показателей сыворотки крови, характеризующих костный метаболизм, и обменных процессов в скелетных мышцах удлиняемой конечности собак при темпе дистракции 3 мм в сутки в автоматическом режиме.

Материалы и методы. Биохимические исследования проведены на 20 беспородных взрослых собаках, которым удлиняли голень аппаратом Илизарова. В основной группе (ОГ - 8 собак) -удлинение проводили с темпом дистракции 3 мм в сутки за 180 приемов в автоматическом режиме в течение 10 дней. В контрольной группе (КГ - 12 собак) удлинение вели в ручном режиме с темпом 1 мм в сутки за 4 приема в течение 28 дней. Величина удлинения сегмента в обеих группах составила 28-30 мм.

Переднюю большеберцовую мышцу брали сразу же после эвтаназии в конце дистракции, через 30 суток фиксации конечности в аппарате и через месяц после снятия аппарата. Взвешенную ткань растирали с кварцевым песком в 0,15 М растворе КС1 при 5°С. Экстрагировали в течение 2-х часов при 50С.

Затем гомогенат центрифугировали 10 мин при 14000g на ультрацентрифуге «Beckman» (США). Полученный супернатант исследовали, сравнивая с передней большеберцовой мышцей интактных собак.

Углеводно-энергетический метаболизм скелетной мышечной ткани оценивали по активности ферментов - лактатдегидро-геназы (ЛДГ), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), креа-тинфосфокиназы (КК), а также по содержанию в супернатанте конечных продуктов гликолиза - молочной (МК) и пировино-градных кислот (ПВК). Интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по содержанию диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА). Антиоксидантную систему - по активности ключевого антиоксидантного фермента -супероксиддисмутазы (СОД). В сыворотке крови определяли уровень общего кальция, фосфата и магния, активность щелочной (ЩФ) и тартратрезистентной кислой (ТрКФ) фосфатаз.

Активность КК, ЛДГ, ЩФ, ТрКФ, а также концентрацию МК, кальция, фосфата и магния определяли на анализаторе Stat Fax 1904 Plus (США), используя наборы фирмы Vital Diagnostic (Санкт-Петербург). СОД в ткани определяли спектрофотометрически. За единицу активности СОД принимали количество фермента, необходимого для 50% ингибирования реакции восстановления нит-росинего тетразолия. Ферментативную активность Г6ФГД определяли по методу Ф.Е. Путилиной [3]. Активность тканевых энзимов рассчитывали на белок, определявшийся по Лоури. Содержание МДА изучали по реакции с тиобарбитуровой кислотой [4]. Уровень диеновых конъюгатов определяли в гептановой фазе гептан-изопропаноловой (1:1) смеси при длине волны 232 нм [4]. Концентрацию ПВК - по методу Umbright в модификации Бабаскина [1]. Концентрацию продуктов обмена выражали в моль/г сырой ткани. Для анализа соотношения объемов остеогенеза и резорбции считали индекс фосфатаз (ИФ=ЩФ/ТрКФ).

Для оценки достоверности различий применяли непараметрический U-критерий Вилкоксона - Манна - Уитни. Данные в табл. представлены в виде медианы, 25-го и 75-го процентиля, на графиках - в виде медианы, нулевого и сотого процентиля.

Результаты исследования. Результаты биохимического исследования сыворотки крови собак представлены в табл. 1-2.

Из табл. 1 видно, что содержание электролитов в сыворотке крови животных группы ОГ на всех сроках эксперимента достоверно от дооперационных значений не отличалось, а у животных с темпом удлинения 1 мм в сутки (КГ) отмечалось снижение концентрации кальция к концу этапа дистракции. На этом же сроке в обеих группах статистически значимо возрастала активность щелочной и кислой фосфатазы (табл. 2). При этом рост индекса ЩФ/ТрКФ относительно дооперационного уровня на этом сроке у животных ОГ было недостоверным. Отсутствие значимого роста ИФ к концу дистракции у животных с темпом удлинения 3 мм/сут, при увеличении активности фосфатаз, свидетельствовало об одновременной интенсификации остеосинте-тических и остеолитических процессов в ткани при сохранении соотношения их объемов, характерных для интактных животных.

Таблица 1

Исследование мышечной ткани выявило ряд особенностей метаболизма передней большеберцовой мышцы собак с удлинением костей голени темпом 3 мм в сутки (рис. 1). Из полученных данных значительный интерес представляет динамика активности ферментов ответственных за энергообеспечение ткани - ЛДГ (рис. 1а) и КК (рис. 1б). Если при удлинении 1 мм в сутки за 4 приема активность данных энзимов на этапе дистракции возрастала, а в период фиксации снижалась, то при удлинении 3 мм в сутки уровень ЛДГ и КК относительно нормы практически не менялся при дистракции и значительно возрастал на фиксации. Если активность СОД у собак КГ на этапах эксперимента увеличивалась, то в ОГ она имела обратную тенденцию (рис.1в).

Из этих данных обратим внимание на низкую активность ЛДГ и КК в период дистракции у собак ОГ. Стоило ожидать, что с ростом темпа удлинения активность этих ферментов в ответ на растяжение должна была компенсаторно расти, но этого не было. Реактивные изменения процессов энергетического метаболизма в ткани развивались только после снятия дистракционных усилий, на этапе фиксации, когда в удлиняемой мышце животных этой группы шлоскачкообразное повышение активности ЛДГ и КК.

Отметим изменение активности Г6ФДГ. В ткани животных ОГ в течение всего опыта (рис. 1г) она значимо превышала значения собак КГ. Это аномальное увеличение Г6ФДГ говорило об активации пентозофосфатного пути (ПФП) окисления углеводов

Динамика концентрации электролитов в сыворотке крови собак в условиях удлинения голени при

различных темпах дистракции

До операции Общий кальций, ммоль/л Фосфор, ммоль/л Магний, ммоль/л

1 группа 2 группа 1 группа 2 группа 1 группа 2 группа

2,45 (2,30-2,62) n=7 2,51 (2,39-2,68) n=34 1,52 (1,28-1,73) n=7 1,46 (1,24-1,66) n=30 0,82 (0,60-1,02) n=7 0,92 (0,81-1,12) n=25

ц - раи 2,30 (2,23-2,39) n=8 2,37 (2,33-2,46) n= 11 1,58 (1,40-1,72) n=8 1,30 (1,11-1,66) n=11 0,96 (0,90-1,08) n=8 0,87 (0,80-1,02) n=11

1 s« 1 2,39 (2,37-2,60) n=4 2,43 (2,29-2,60) n=4 1,53 (1,45-1,75) n=4 1,38 (1,17-1,62) n=4 1,18 (1,04-1,22) n=4 0,80 (0,80-0,85) n=4

Здесь и в табл.2. подчеркнуты результаты, достоверно отличающиеся от дооперационных значений при

уровне значимости р<0,05.

Таблица 2

Динамика фосфатазной активности сыворотки крови собак в условиях удлинения голени при различных темпах дистракции

ЩФ, Е/л ТрКФ, Е/л ИФ = ЩФ/ТрКФ

1 группа 2 группа 1 группа 2 группа 1 группа 2 группа

До операции 53,7 (53,7-77,0) n=6 58,2 (51,6-77,5) n=27 ,2) (2, 4,9 (3,9-5,7) n=27 12,8 (12,4-26,6) n=6 13,1 (9,7-14,3) n=27

Конец дистракции 86,1 (72.0-153.8) n=7 130,2 (118-2-163-7) n=10 50 (З^-^) n=7 67 (6.1-7.2) n=10 17,3 (12,5-46,4) n=7 21,3 (\1.Ъ-25.<8'\ n=10

30 суток фиксации 61,7 (57,0-88,6) n=4 87,0 (69,8-110,3) n=4 4,4 (4,2-4,5) n=4 72 (7,6-8,0) n=4 13,4 (12,7-20,5) n=4 10,9 (8,8-14,5) n=4

С.А. Ерофеев, С.Н. Лунева, М.В. Стогов и др.

в мышечной ткани собак ОГ, что, по А. Лабори, можно расценивать как проявление активных пролиферативных процессов происходящих в ткани [2], а с другой - рост активности пентозо-фосфатного пути окисления углеводов при удлинении 3 мм в сутки мог носить компенсаторный характер, возникавший в ответ на снижение роли гликолитического пути окисления углеводов.

вопрос об обратимости биохимических изменений на этапах дистракции и фиксации. Отмечено, что через 30 суток после снятия аппарата в мышечной ткани животных ОГ сохранялась повышенной активность Г6ФДГ (рис. 2). В обеих группах на данном сроке отмечался высокий уровень КК. Суммарное содержание продуктов гликолиза и ПОЛ в интактной мышце и в мышце после удлинения темпом 3 мм в сутки отличалось мало.

Заключение. Полученные результаты показывают, что метаболические процессы, происходившие в скелетной мышце при удлинении голени с темпами 3 и 1 мм в сутки, имели ряд различий: 1) у животных с удлинением голени темпом 3 мм/сутки активизировались резервные пути обмена ткани, и в частности пентозофосфатный путь окисления углеводов; 2) активация центральных метаболических путей скелетных мышц (гликолиз, креатинкиназная система) при удлинении 3 мм/сут наблюдалась на этапе фиксации, тогда как в условиях дистракции темпом 1 мм/сутки она приходилась на период дистракции.

д

- 1 группа;  - 2 группа.

Рис. 1. Изменение активности ЛДГ, мккат/мг белка (1а); КК, мккат/мг белка (1б); СОД, от.ед./мг белка (1в) и Г6ФДГ, мккат/мг белка (1г) в передней большеберцовой мышце собак опытных групп. По оси абсцисс: 1 - интактные животные; 2 - конец дистракции; 3 - 30-е сутки фиксации

Анализ содержания продуктов гликолиза и ПОЛ в ткани собак показал, что средние значения суммарной концентрации продуктов ПОЛ и гликолиза в динамике опыта между группами отличались мало. Но индивидуальный анализ у двух собак ОГ, эвтаназированных в конце дистракции, показал, что у одной собаки (№ 2630) в ткани к концу дистракции увеличивалось содержание продуктов ПОЛ при снижении концентрации продуктов гликолиза, а у другой (№ 2570), наоборот, возрастало содержание продуктов гликолиза при снижении метаболитов ПОЛ. Наглядно это можно показать, если рассчитать отношение суммарных концентраций продуктов гликолиза к сумме продуктов ПОЛ: ([МК+ПВК]/[ДК+МДА]). У особей с удлинением 1 мм в сутки к концу дистракции оно в среднем составляло 0,16, а у собаки № 2630 оно было равно 0,08, а у №2570 - 0,48.

Для характеристики обменных реакций, возникающих в мышцах при удлинении голени темпом 3 мм в сутки, важен

Г6ФДГ

ЛДГ

(ДК+МДА)/10 МК+ПВК

интактная ткань  1 мм в сутки  3 мм в сутки

Рис. 2. Активность Г6ФДГ, ЛДГ, КК (в мккат/мг белка) и суммарное содержание продуктов ПОЛ (ДК+МДА, нмоль/г ткани) и гликолиза (МК+ПВК, ммоль/г ткани) в передней большеберцовой мышце интактных животных и собак 1, 2 групп на 30 сутки после снятия аппарата.

* - достоверность различий с интактными животными при р<0,05

При повышении дистракционых усилий в скелетных мышцах удлиняемой конечности возрастает роль универсальных путей обмена, к которым, можно отнести пентозофосфатный путь. Универсальность последнего связана, во-первых, с его высокой энергетической эффективностью, и, во-вторых, с его существенной ролью в синтетических процессах (промежуточные метаболиты пентозофосфатного шунта - пентозы - используются для синтеза нуклеиновых кислот). Это позволяет предположить, что ПФП окисления является одним из основных молекулярных механизмов, обеспечивающим репаративные процессы в ткани при удлинения темпом 3 мм в сутки. После снятия дистракцион-ных нагрузок на этапе фиксации значение ПФП ограничивается пластической функцией, т.к. роль основного энергетического пути переходит к реакциям гликолиза.

Перестройка тканевого обмена скелетных мышц, происходящая в ответ на удлинение темпом 3 мм в сутки, говорит о гибкости молекулярных механизмов в ткани, что обеспечивает ее устойчивость к растяжению при повышенном темпе дистракции.

Литература

1. Бабаскин Б.С. // Лаб. дело.- 1976.- № 3.- С. 76-79.

2. Лабори А. Регуляция обменных процессов.- М.: Медицина, 1970.- 384 с.

3. Методы биохимических исследований/ Под ред. М.И. Прохоровой.- Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1982.- 272 с.

4. Современные методы в биохимии / Под ред. В.Н. Орехо-вича.- М.: Медицина, 1977.- С. 62-68.

BIOCHEMICAL STUDY OF BLOOD SERUM AND SKELETAL MUSCLES DURING TIBIAL LENGTHENING WITH THE RATE OF 3 MM PER DAY IN AUTOMATIC MODE

S.A. EROFEEV, S.N. LUNYOVA, M.V. STOGOV, N.V. TUSHINA

Summary

The study presents a comparative analysis of several indices of the blood serum that characterize bone metabolism, as well as a biochemical study of the anterior tibial muscle in dogs during length-

а

в

*

*

о

б

г