Культура дифференцированных нейронов взрослого моллюска альтернативная модель изучения процессов регенерации нервной системы

Культура дифференцированных нейронов взрослого моллюска - альтернативная модель изучения процессов регенерации нервной системы

Н.А. Ивличева1,2, Э.Н. Гахова1

1 Институт биофизики клетки РАН, Пущино, Моск обл.,

2 Пущинский государственный университет, Пущино, Моск. обл.

Культура дифференцированных нейронов in vitro рассматривается как модель для изучения процессов регенерации нервной системы в криомедицине. Кратко описана история развития метода культуры клеток in vitro и возможность его практического применения в нейробиологиии. Дается описание модельного объекта - мозга пресноводного моллюска Lymnaea stagnalis L. - для изучения процессов восстановления нейронов, прошедших криоконсервацию (замораживание при -196°С). Метод культивирования in vitro нейронов беспозвоночных в настоящее время является перспективным для проблем биомедицины.

Ключевые слова: культура клеток in vitro, нейроны моллюска, криоконсервация, регенерация нервной системы

Одно из основных мест в науке о мозге занимают проблемы развития нервной системы и неразрывно связанные с ними проблемы регенерации нервных клеток, в решении которых значение тканевых и клеточных культур трудно переоценить.

Клеточная культура in vitro как модель используется для решения целого ряда задач нейробиологии, поскольку позволяет в течение длительного времени исследовать нервные клетки, сохраняющие свою целостность и высокий уровень физиологической активности. Метод культуры нервных клеток применяется при исследовании синаптогенеза, пластичности и специфичности восстановленных межнейро-нальных функциональных связей и синаптической передачи, и т.д.

В последнее время культура нервных клеток in vitro приобретает существенное значение в области нейромедицины, связанной с задачами трансплантологии и развитием биотехнологии длительного сохранения нервной ткани (и целого мозга) с помощью глубокого замораживания при температуре жидкого азота (-196°С).

История развития исследований на клеточном уровне в культуре in vitro насчитывает уже более 100 лет [11]. Можно считать, что клеточные и тканевые культуры берут свое начало с того времени, когда в 1885 году Ру (Roux) удалось в течение немногих дней поддерживать развитие медуллярной пластинки куриного эмбриона в теплом солевом растворе. В 1887 году Арнольд (Arnold) описал кратковременное переживание и миграцию лейкоцитов вне организма лягушки, в солевом растворе. В 1903 году Жолли (Jolly) впервые наблюдал деление клеток (лейкоцитов) саламандры в висячей капле. В 1906 году Биб и Эвинг (Beebe and Ewing) осуществили попытку получить истинное культивирование ткани на примере инфекционной лимфосаркомы собак. Однако подлинное начало применения метода культуры ткани, началось с того времени, когда Харрисон (Harrison) в 1907 году осуществил воспроизводимые эксперименты по переживанию in vitro медулярной трубки эмбриона лягушки. Ученому удалось получить рост аксонов из клеток, взятых

из кусочков ткани медулярной трубки. С этого момента начинается развитие метода культуры нервной клетки и ткани.

Дальнейшее развитие культуры in vitro шло по пути изолирования клеток диссоциацией, или дезагрегацией живой ткани, и введения полученных клеток в искусственные среды. Так, Роуз и Джонсон (Rous and Jones) в 1916 году впервые применили раствор трипсина для переваривания плазматического сгустка и обнаружили, что ткань эксплантанта распадается на отдельные клетки, которые могут быть использованы для дальнейшего культивирования in vitro. Но лишь спустя 40 лет это наблюдение нашло практическое применение благодаря исследованиям Моско-ны (Moscona) [27], который разработал методику диссоциации эмбриональных тканей с помощью протеолитических ферментов в среде, свободной от двухвалентных ионов кальция и магния. И по сей день эта методика выделения живых изолированных клеток широко применяется для получения монослойных культур диссоциированных клеток, в том числе и развивающейся нервной системы [12].

В настоящее время имеются реальные предпосылки к тому, что культура нейронов и нервной ткани in vitro найдет широкое применение в такой перспективной области как криобиотехнология нервной системы. Создание криобанков нервной ткани позволит в течение длительного времени (десятки лет) сохранять резерв трансплантатов при сверхнизких температурах, например в жидком азоте при -196°С.

Первые наблюдения за выживаемостью нейрональной ткани после замораживания относятся к 1953 году, когда Лайет и Гонзалес (Luyet and Gonzales) [26] показали, что ткань мозга цыпленка может переживать замораживание до -196°С. Позднее, в 1980 году, были опубликовано данные по переживанию эмбриональной ткани мозга млекопитающих в течение 18 недель при -90°С,

замороженных с медленной скоростью с использованием 10% ДМСО. [21]. Эмбриональные ткани, в том числе и нервная, отличаются пониженной иммунологической компетентностью и относительно хорошо переносят цикл замораживания-отогрева при удачном подборе криопротекторов и криозащитных сред [18, 25]. Тем не менее, авторы отмечают, что клетки, культивированные после криоконсервации эмбриональной нервной ткани, были чувствительны к механическим и осмотическим воздействиям, а процент приживления трансплантатов после криоконсервирования был довольно низким. Клетки эмбриональной нервной ткани способны к митотическому делению и росту клеток, поэтому поврежденные клетки могут замещаться новыми, а критериями успешной криоконсервации может служить изучение биосинтеза белка и ДНК [1]. Дальнейшие работы показали возможность криоконсервации ткани мозга крыс и приматов, в том числе и человека [23, 30, 31]. Нейроны и глиальные клетки человека и лабораторных животных в различной степени сохраняли жизнеспособность при одних и тех же условиях замораживания-оттаивания [4, 25]. Показано также, что контакты, необходимые для функционирования тканевой системы, оказываются наиболее уязвимыми местами для осмотического стресса и фазовых переходов, сопровождающих процесс криоконсервации [14].

Интерес к криоконсервации нервной ткани возрастает параллельно с развитием методов трансплантации нервной ткани. [17, 19]. В связи с этим особое внимание уделяется изучению криоконсервации не изолированных нейронов, а зрелой нейрональной ткани (коры головного мозга, гиппокампа и др.), которую можно трансплантировать в мозг реципиентам сразу после оттаивания, или через промежуточный этап проведения изолированных клеток через культуру in vitro.

Криоконсервация и восстановление физиологических функций зрелой дифференцированной нервной ткани имеет ряд трудностей, отличных от замораживания эмбриональной ткани. Тем не менее, показана возможность криоконсервации и восстановление жизнеспособности постнатальной нервной ткани практически при тех же условиях замораживания-оттаивания, что и эмбриональной ткани [28]. В работе Брюне (Brunet) с соавт. опубликованы успешные результаты такого исследования. Авторы замораживали небольшие кусочки (1 мм3) коры головного мозга человека в среде DMEM (250 мкл) с добавлением 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 8% ДМСО. Замораживание осуществляли медленно со скоростью 1°С/мин до -196°С и хранили в жидком азоте в течение 2-х лет. После быстрого оттаивания и механической диссоциации размороженных кусочков, выделенные из них клетки были введены в культуру in vitro. Иммуноцитофлуоресцентный анализ показал, что и глиальные клетки, и нейроны криоконсервированной ткани в культуре не отличались от контрольных [17].

Применение метода культуры ткани расширяет возможности в сфере изучения жизнеспособности биоматериала, прошедшего криоконсервацию. Сюда входит тестирование морфо-функциональной сохранности, способности формирования отростков, анализ состояния рецепторов, синтеза медиаторов, восстановления электрической активности, для последующей успешной приживляемости трансплантатов в мозге животных.

Несмотря на определенные успехи, введение в практику нейромедицины методов криоконсервации пока не получило развития в основном из-за недостатка фундаментальных научных знаний о механизмах криоповреждений и путей криозащиты нейронов.

В этом плане простые нервные системы беспозвоночных, в частности модель

дифференцированых нейронов взрослого моллюска в культуре клеток in vitro, является наиболее удобной для изучения механизмов регенерации нервной системы и роста отростков [16, 32, 33] при (крио-) повреждениях в процессе криоконсервации нервной ткани.

Известно, что основные принципы функционирования и строения нервной системы всех изученных в этом отношении представителей животного мира идентичны. Возможно, что механизмы регенерации нейронов также не имеют существенных видовых отличий, и закономерности, обнаруженные на нейронах беспозвоночных, могут быть использованы для понимания аналогичных процессов в нейронах высших животных и человека. Более существенен вопрос, который до сих пор остается открытым, в какой мере закономерности, обнаруженные в модельных условиях in vitro, могут быть использованы для понимания механизмов, регулирующих тот же процесс in vivo [10, 24].

Несмотря на то, что беспозвоночные относятся к пойкилотермным животным и, вероятно, более устойчивы к низким температурам по сравнению с млекопитающими, их клетки, как и нейроны млекопитающих, могут быть заморожены до сверхнизких температур только с использованием определенных режимов охлаждения и криозащитных агентов.

В наших исследованиях по культивированию нейронов и криоконсервации нервной ткани модельным объектом являются дифференцированные нейроны изолированного мозга взрослого пресноводного моллюска Lymnaea stagnalis L. (большой прудовик) [2, 3, 5, 6, 8, 9, 12, 13, 20, 24]. По систематическому положению Lymnaea stagnalis относится к подтипу Conchífera (раковинные), к классу Gastropoda (брюхоногие), подклассу Pulmonata (легочные), надотряду Basommatophora (сидячеглазых).

Мозг моллюска состоит из нескольких пар ганглиев, соединенных между собой комиссурами и коннективами. Все ганглии и отходящие от них нервы заключены в соединительнотканную оболочку. В ганглиях моллюсков нервные клетки лежат по наружной поверхности ганглия, а середина ганглия занята отростками нейронов, нейропилем. Каждый из ганглиев содержит до 2000 нейронов разного размера, от 10 до 250 мкм. Тела нейронов пигментированы и хорошо видны под микроскопом. Гигантских нейронов, как правило легко идентифицируемых, в мозге моллюска не более 20 [7, 9]. Нейроны моллюсков относятся к распространенной среди беспозвоночных категории униполярных клеток, у которых функции различных отростков мультиполярных нейронов (рецептивные и эфферентные) сочетаются в одном отростке. Нейроны посылают свои аксоны в нейропиль, где находятся синаптические контакты между отростками нейронов.

Изолированный мозг моллюска Lymnaea stagnalis L. был использован нами для изучения механизмов действия криопротекторов и замораживания (жидкий азот, -196°С) с применением методов фиксации мембранного потенциала и регистрации трансмембранных ионных токов на диализированных нейронах [3, 12, 13, 20]. Основные результаты показали, что независимо от используемого вида криопротектора (диметилсульфоксид, этилен-гликоль, формамид, маннитол) происходило увеличение порога активации ионных каналов, уменьшение пика входящих и выходящих токов (К+. Na+, Ca++, Cl-), уменьшение проводимости мембраны для К+, Na+, Ca++. Эффекты криопротекторов на ионные каналы имели обратимый характер. После оттаивания ганглиев, замороженных в жидком азоте, нейроны восстанавливали характерные для них электрические параметры через 1,5-2 ча-

са. Несмотря на различия в деталях, нейроны беспозвоночных и позвоночных имеют ряд общих структурных особенностей, поэтому результаты по изучению влияния криопротекторов и ультранизких температур могут быть в значительной степени экстраполированы на нейроны позвоночных.

На сегодняшний день показано, что нейроны, выделенные из замороженного в жидком азоте мозга моллюска, оживают [2, 20] и формируют отростки в клеточной культуре in vitro после двухлетнего хранения при -196°С (рис.) [8]. На рисунке изображен мозг моллюска, замораживание-оттаивание осуществляли со скоростью 400-500°С/мин., в качестве криопротектора использовали 2М ДМСО [5, 7]. Культивирование проводили при 22°С. Состав питательной среды с антибиотиком (генто-мицин): NaCl - 90mM, KCl - 5, CaCl2 - 2, MgCl2 — 1,5, tris HCl — 0,25, без добавления сыворотки, но содержащий 10% RPMI , рН 7,9 (по Костенко, 1985). Для морфологической дифференцировки изолированных нейронов моллюска Lymnaea stagnalis L. необходимо, чтобы после эксплантации в культуру нейроны прикрепились к стеклу и втянули аксоны, оставшиеся в процессе изоляции клеток из мозга. Затем у клеток образуются наплывы цитоплазмы - ламел-лы, указывающие на начало роста новых отростков. Отростки опытных нейронов не отличались от отростков контрольных нейронов, мозг которых не подвергался криоконсервации [10].

Однако, как показали электрофизио-логические и электронномикроскопические исследования [3, 8] для проявления функций формирования отростков в клеточной культуре in vitro после двухлетнего хранения при -196бС требуется длительный восстановительный период (до 18 часов). Это свидетельствует о наличии криоповреждений, отдаленные последствия которых могут проявиться в дальнейшем

функционировании нейронов. В этой связи представляет большой интерес изучение механизма индукции и ингибирования роста нейритов путем воздействия различными биологическими, в том числе и фармакологическими, агентами.

Рис. Культура дифференцированных нейронов in vitro мозга взрослого моллюска Lymnaea stagnalis L. (3-и сутки культивирования):

а) контроль - нейроны из мозга моллюска,

не подвергнутого замораживанию;

б) нейроны из оттаянного мозга моллюска

после его хранения в жидком азоте в течение 2-х лет.

По данным литературы в настоящее время на идентифицированных нейронах моллюска Lymnaea stagnalis L. широко изучаются механизмы взаимодействия между пресинаптическими кальциевыми каналами в процессе синаптической передачи информации, механизмы формирования конусов роста нейронов [32, 33, 35], роль хемотропизма и аутокринной регуляции в образовании межнейронных

связей [10, 24], влияние нейротрофиче-ских (серотонин, дофамин) и эпидермальных ростовых факторов на регенерацию и формирование нейрональных отростков [22, 34]; вопросы ассоциативного обучения и проблемы долговременной памяти на клеточном уровне [15]. Наиболее актуальной проблемой сейчас является проблема трансплантации криоконсер-вированных нейронов взрослого человека [23]. Поняв механизмы регенеративных процессов нейронов на примере таких простых нервных систем, как мозг моллюска, можно будет приблизиться к управлению процессами восстановления нервных клеток и развития нервной системы в целом.

Резюмируя вышесказанное, можно полагать, что изолированные и развивающиеся in vitro нервные и глиальные клетки являются почти идеальной экспериментальной моделью для решения многих задач нейробиологии, криомедицины, нейрофармакологии и нейроцитотоксикологии.

Таким образом, метод культивирования in vitro нейронов беспозвоночных, давно ставший классическим для элект-рофизиологических, фармакологических и функционально-метаболических исследований, в настоящее время является перспективным для проблем биомедицины.

Литература

1. Бабийчук ГА. Ломако В.В., Шуляк Л.И., Шило А.В. Ломакин И.И. Функциональное состояние фрагментов эмбриональной нервной ткани после гипотер-мического хранения и трансплантации реципиенту. // Проблемы криобиологии. № 2, с.40-48. 2000.

2. Гахова Э.Н., Дмитриева Е.В. Криоконсервация нервной ткани // Биофизика живой клетки, Т.7, с.65-68 (http:// cam.iteb.psn.ru/). 2003.

3. Гахова Э.Н., Чекурова Н.Р., Кислое А.Н., Вепринцев Б.Н. Гигантские нейроны сохраняют жизнеспособность после глубокого замораживания мозга пресноводного моллюска Lymnaea stagnalis L. // Криобиология. № 1, с. 19-21. 1989.

4. Гольцев А.Н., Гурина Т.М., Бабенко Н.Н., Останков М.В. Влияние различных режимов криоконсервирования на некоторые характеристики эмбриональных нервных клеток // Проблемы криобиологии, № 1, с.46-50. 2003.

5. Дмитриева Е.В. Структурно-функциональные изменения нейронов моллюска Lymnaea stagnalis L. после криоконсервации. — Автореф. дис ... канд. биол. наук. — Пущино, 22с. 2004.

6. Дмитриева Е.В., Мошков Д.А., Гахова Е.Н. Ультраструктурные изменения нейрона МП3 моллюска Lymnaea stagnalis L. после криоконсервации изолированного мозга // Цитология, Т. 48. № 6, с. 2006.

7. Дьяконова Т.Л., Вепринцев Б.Н. Особенности структурной и функциональной организации и метаболической активности нейронов прудовика // ВИНИТИ. № 816-69. 1969.

8. Ивличева Н.А., Дмитриева Е.В., Костенко М.А., Гахова Э.Н. Криоконсер-вированные нейроны моллюска способны к морфологической дифферен-цировке в культуре in vitro // Биофизика, Т.49, вып. 4, с.710-714. 2004.

9. Костенко М.А Внутриклеточная регуляция дифференцировки и регенерации нейронов в культуре. — Автореф. дис ... докт. биол. наук. — Пущино, 360с. 1985.

10. Мякишева С.Н., Костенко М.А Роль хемотропизма и аутокринной регуляции в образовании межнейронных связей. // Цитология. Т.43, № 4, с.370. 2001.

11. Пол Д. Культура клеток и тканей. — Медгиз, 1963.

12. Сотников О.С., БогутаК.К., Голубев А.И., Миничев Ю.С. Механизмы структурной

пластичности нейронов и филогенез нервной системы. — С.-Пб.: Наука, 1994.

13. Чекурова Н.Р. Использование элект-рофизиологического метода для изучения механизмов криоповреждений и способов криозащиты. // Биофизика живой клетки, Т. 6, с.121-126. 1994.

14. Armitage W.J., Juss B.K., Easty D.L. Differing effects of various cryoprotecants on intercellular junctions of epithelial cells // Cryobiology. V.32, p.52-59. 1995.

15. Benjamin P.R., Staras K., and Kemenes G A Systems Approach to the Cellular Analysis of Associative Learning in the Pond Snail Lymnaea. // J. Neurophysiol., May/June. V.7, № 3, p.124-131. 2000.

16. Bray D. Membrane biophysics: the dynamics of growing axons. // Current biology, V.6, № 3. p.241-243. 1996.

17. Brunet J-F., Pellerin L., Magostretti P., Villemure J-G. Cryopreservation of human brain tissue allowing timely production of viable human brain cells for autologous transplantation // Cryobiology. V.47, № 2, p.179-183. 2003.

18. Collier T.J., Gallagher M.J., Sladek C.D. Cryopreservation and storage of embryonic rat mesencephalic dopamine neurons for one year: comparison to fresh tissue in culture and neural grafts // Brain Res.; 623(2):249-56. 1993.

19. Frodl E., Duan W.M., Sauer H., Kupsch A., Brundin P. Human embryonic dopamine neurons xenografted to the rat: effects of cryopreservation and varying regional souce of donor cells on transplant survival, morphology and function.// Brain.Res. V.647, p.286-298. 1994.

20. Gakhova E.N., Kislov A.N., Chekurova N.R Study of membrane properties of mollusc neuron after freeze-storage at liquid nitrogen temperature for 8 years.// Cryopreservation of testis of frog Rana temporaria. Infusionsther.Trasfusiosmed. V.24, № 5. p.378-379. 1997.

21. Houle J.D., Das G.D. Freezing of embryonic neural tissue and its transplantation in the rat brain // Brain Res. V. 192, p.5?G-5?4. 1980.

22. Koert C.E., Spencer G.E., Minnen J. et al. Functional Implications of Neurotransmitter Expression during Axonal Regeneration: Serotonin, But Not Peptides, Auto-Regulate Axon Growth of an Identified Central Neuron. // J. Neurosc., August 1, 21(15): 5597-5606. 2001.

23. Kohama I., Lankford K.L., Preiningerova J. et al. Transplantation of Cryopreserved Adult Human Schwann Cells Enhances Axonal Conduction in Demyelinated Spinal Cord. // J. Neurosc., February 1, 21(3):944-950. 2001.

24. Kostenko M.A., Myakisheva S.N. The Role of Chemotaxis in Morphological Differentiation of Mollusc Neurons. Comp. // Biochem. Physiol., V.115A, M 3, p.265-268. 1996.

25. Koopmans J., Hogen E.I., Copray S. et al. Cryopreservation of porcine fetal ventral mesencephalic tissue for intrastriatal transplantation in Parkinson's disease // Cell Transplant.;10(?):5?3-81. 2001.

26. Luyet B., Gonzales F. Growth of nerve tissue after freezing in liquid nitrogen // Biodynamica. V. ?, p.1?1-1?3. 1953.

27. Moscona A.A., Moscona H. The dissociation and aggregation of cells from organ rudiments of the ear ly chick embryo. // J. Anat. Lond., V. 86, p.28?. 1952.

28. Negishi T., Ishii Y., Kawamura S. et al. Cryopreservation of brain tissue for primary culture // Exp.Anim., Jul;51(4):383-90. 2002

29. Pasic M., De sa Faria L.J. Effects and freezing on abdominal ganglia of Aplysia // Cryobiology. V 16, p.390-400. 19?9.

30. Pichugin Yu., Fahy G.M., Morin R. Cryopreservation of rat hippocampal slices by vitrification // Cryobiology. V.52, p.228-240. 2006.

31. Silani V., Pizzuti A., Strada O. et al. Human neuronal cell viability demonstrated in culture after cryopreservation // Brain Res. V 4?3, M 1, p.169-1?4. 1988.

32. Spafford J.D., Munno D.W., Nierop P. et al. Calcium Channel Structural Determinants of Synaptic Transmission between Identified Invertebrate Neurons. // J. Biol. Chem., Feb. ?, Vol. 2?8, Issue 6, 4258-426?. 2003.

33. Spencer G.E., Lukowiak K., Syed N. I. Transmitter-receptor interactions between growth cones of identified Lymnaea neurons determine target cell selection in vitro // J. of Neurosc, Nov.1, 20(21):80??-8086. 2000.

34. Syed N., Richardson P., Bulloch A. Ciliary neurotrophic factor, unlike nerve growth factor, supports neurite outgrowth but synapse formation by adult Lymnaea neurons // J.Neurobiol., V 29, M 3, p.293-303. 1996.

35. Wildering W. C., Hermann P. M., Bulloch A.G.M. Lymnaea Epidermal Growth Factor Promotes Axonal Regeneration in CNS Organ Culture // J. of Neurosc., Dec.

1, 21(23):9345-9354. 2001.

THE IN VITRO CULTURE OF THE DIFFERENTIATED NEURONS FROM ADULT MOLLUSCS IS THE MODEL FOR STUDY OF REGENERATIVE PROCESSES OF NERVOUS SYSTEM IN CRYOMEDICINE N.A. Ivlicheva12, E.N. Gakhova1

1 Institute of Cell Biophysics, RAS, Pushchino, Moscow region

2 Pushchino State University, Pushchino, Moscow region

Key words: in vitro culture of cells, mollusc's neurons, cryopreservation, regeneration of neurons.

The in vitro culture of differentiated neurons is considered as a model for study of regenerative processes of nervous system in cryomedicine. It has been shortly described a history of development of the method of the in virto cellular culture and the possibility to its practical application in neurobiology. It has been given the description of the model object, — a brain of fresh-water mollusc Lymnaea stagnalis L., — for study of regenerative processes of neural cells after cryopreservation of isolated brain (freezing at -196°С).

Currently the method for in vitro cultivation of the invertebrate's neurons is promise for biomedicine problems.