Способ определения концентрации глюкозы
METHOD FOR DETERMINING THE CONCENTRATION OF GLUCOSE

Изобретение относится к аналитической химии и касается способов определения концентрации глюкозы в водных растворах с использованием соединений меди(II). Глюкоза является самым распространенным органическим веществом, которое встречается в природе в виде простого сахара, а также она входит в состав сложных сахаров от дисахаридов до полисахаридов [1],  [2].
Глюкоза находит применение в различных отраслях:
– в медицине используют как универсальное антитоксическое средство, как источник углеводов при парентеральном питании, при тестировании на диабет;
– в пищевой промышленности при выпечке хлеба, в кондитерском деле, при производстве сгущённого молока, мороженого, простокваши, кефира, для производства спирта, вин, пива;
– в сельском хозяйстве для подкормки пчёл;
– в химической промышленности для получения витамина C (аскорбиновая кислота), сорбита и биополимеров;
– в фармацевтической промышленности при производстве лекарств и в качестве консерванта;
– в микробиологической промышленности при выращивании различных микроорганизмов;
– в кожевенном производстве в качестве восстановителя;
– в текстильном производстве при изготовлении вискозы.
Большое значение глюкозы в различных сферах, значимость ее для решения задач, указанных выше, определяет интерес к разработке методов определения глюкозы, среди которых полярографические [3], хроматографические [4], электрохимические [5], спектральные [6], [7], [8], фотометрические [9], [10],  биосенсорные [11] и др.
Известным и применяемым методом определения восстанавливающих сахаров, в том числе и глюкозы, является метод Шомоди-Нельсона, который базируется на работах Шомоди [12], [13].
Раствор Шомоди готовят следующим образом.
3
- раствор А готовят, растворяя 10 г сернокислой меди в 90 см дистиллированной воды;
3
3
- раствор Б готовят из 24 г натрия углекислого безводного и 12 г калия-натрия виннокислого, которые растворяют в 250 см дистиллированной воды, затем при перемешивании последовательно вносят 40 см раствора А и 16 г кислого углекислого натрия.
3
- раствор В готовят из навески (18 г) сернокислого безводного натрия, которую растворяют в 500 см горячей дистиллированной воды и кипятят в течение 40 мин на электроплитке. Раствор охлаждают до комнатной температуры.
3
Далее растворы Б и В объединяют и доводят объем дистиллированной водой до 1000 см. Если образуется осадок, его отфильтровывают.
Нельсон разработал [14] адаптацию метода Шомоди для фотометрического определения глюкозы, для этого был предложен раствор Нельсона, который готовят из двух растворов:
3
- раствор Г готовят, растворяя 3 г мышьяковокислого натрия в 25 см дистиллированной воды.
3
3
- раствор Д готовят, растворяя 25 г молибденовокислого аммония в 450 см дистиллированной воды, затем добавляют 21 см концентрированной серной кислоты и раствор Г. Полученный раствор выдерживают в термостате при температуре 55 °С в течение (25±1) мин.
3
3
3
3
Процедура выполнения анализа заключается в следующем. К 1 см анализируемого раствора приливают 1 см раствора Шомоди и кипятят 15 мин на водяной бане. Затем смесь быстро охлаждают на ледяной бане, добавляют к ней 1 см раствора Нельсона и доводят объем дистиллированной водой до 10 см. Раствор тщательно перемешивают и измеряют оптическую плотность при 508 нм. Если оптическая плотность раствора больше 0,5, то определение повторяют с большим разведением. В контрольном опыте вместо анализируемого раствора используют дистиллированную воду. Концентрацию глюкозы определяют по градуировочной зависимости, построенной по растворам глюкозы с известными концентрациями.
Известен модифицированный метод Шомоди-Нельсона [15] , который осуществляется следующим образом. Первоначально готовят растворы Шомоди и Нельсона. Затем к 0,5 мл анализируемого раствора глюкозы добавляют 0,5 мл раствора Шомоди. Реакционную смесь нагревают в течение 20 минут. После охлаждения добавляют 0,5 мл раствора Нельсона. Затем измеряют оптическую плотность и по градуировочной зависимости определяют концентрацию глюкозы в анализируемом растворе. Недостатком является двухстадийность проведения фотометрической реакции.
Известен минимизированный метод Шомоди-Нельсона [16], который осуществляется следующим образом. Первоначально готовят растворы Шомоди и Нельсона. Затем 0,45 мкл анализируемого раствора помещают на микроплату из полипропилена, затем добавляют 0,45 мкл раствора Шомоди. Реакционную смесь перемешивают в течение 10 с, после чего нагревают на кипящей водяной бане в течение 20 мин. После нагревания микроплату охлаждают холодной водой в течение 5 мин. Затем в лунку пипеткой вносят 0,45 мкл раствора Нельсона. Планшет выдерживают не менее чем 15 минут для завершения фотометрической реакции. После чего реакционную смесь разбавляют и измеряют оптическую плотность при 600 нм и по величине оптической плотности определяют концентрацию глюкозы в растворе. Недостатками указанного метода являются многостадийность и большая продолжительность (прототип).
Задачей изобретения является упрощение процедуры выполнения фотометрического метода Шомоди-Нельсона для определения концентрации глюкозы.
Поставленная задача достигается тем, что фотометрическую реакцию проводят в одну стадию в присутствии нитрованных гуминовых кислот в качестве полимерного стабилизатора, в качестве окислителя  используют этилендиаминовый комплекс меди(II), который образуется в результате взаимодействия катиона меди(II) с этилендиамином (щелочной реагент). Фотометрическую реакцию проводят следующим образом.
При выполнении фотометрической реакции использовали растворы, характеристика которых представлена в таблице 1. Растворы сульфата меди(II) и нитрованных гуминовых кислот готовили с использованием раствора этилендиамина с концентрацией последнего 4,9 мг/мл.
В предварительных экспериментах были определены расходы реагентов и продолжительность фотометрической реакции. Длина волны была установлена на основе изучения электронных спектров. Для этого была проведена фотометрическая реакция и записан электронный спектр в области 250…400 нм (фигура 1). Как видно, максимум полосы поглощения находится при 323 нм. Поэтому в качестве аналитической полосы использовали данную длину волны УФ излучения.
Таблица 1 – Характеристика растворов
№
Раствор
вещество
размерность
значение
1
Нитрогуминовые кислоты (НГК)
мг/мл
8,5
2
Этилендиамин (ЭДА)
мг/мл
4,9
3
Сульфат меди(II)
мг Cu/мл
2,3
Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Первоначально готовят раствор, смешивая заданные объемы растворов сульфата меди(II) в ЭДА и НГК. К этому раствору добавляют известный объем  раствора глюкозы. Реакционную смесь нагревают на кипящей водяной бане (КВБ) в течение 20 минут. После завершения реакции, реакционную смесь охлаждают, объем раствора доводят до 25 мл дистиллированной водой и измеряют оптическую плотность при 323 нм. После чего по градуировочной зависимости вычисляют концентрацию глюкозы в анализируемом растворе.
Пример 1. В мерной пробирке на 25 мл смешивали 1 мл раствора сульфата меди(II) в ЭДА, 0,1 мл раствора НГК и 1 мл раствора глюкозы с концентрацией 1,5 мг/мл и нагревали на  КВБ в течение 20 мин. После чего реакционную смесь охлаждали, объём раствора доводили до 25 мл дистиллированной водой и измеряли его оптическую плотность при 323 нм на спектрометре, в кювете с длиной рабочего слоя 1 мм. Измеренная величина оптической плотности при 323 нм составила 0,544.
Пример 2. Способ определения глюкозы в условиях примера 1, отличающийся тем, что концентрация глюкозы в анализируемом растворе составила 3,0 мг/мл. Измеренная величина оптической плотности при 323 нм составила 1,007.
Пример 3. Способ определения глюкозы в условиях примера 2, отличающийся тем, что концентрация глюкозы в анализируемом растворе составила 4,0 мг/мл. Измеренная величина оптической плотности при 323 нм составила 1,339.
Пример 4. Способ определения глюкозы в условиях примера 3, отличающийся тем, что концентрация глюкозы в анализируемом растворе составила 4,5 мг/мл. Измеренная величина оптической плотности при 323 нм составила 1,488.
Пример 5. Способ определения глюкозы в условиях примера 1, отличающийся тем, что реакцию проводили без раствора глюкозы (холостой опыт), добавив вместо нее 1 мл дистиллированной воды. Измеренная величина оптической плотности при 323 нм составила 0,068.
323
гл
По результатам примеров 1…5 была построена градуировочная зависимость, которая представляет собой полином первого порядка A = 0,3161∙C + 0,0674. Коэффициент парной корреляции для этой зависимости составляет R² = 0,9999.
Пример 6. Способ определения глюкозы в условиях примера 1, отличающийся тем, что концентрация раствора глюкозы составляла 2,0 мг/мл. Измеренная величина оптической плотности при 323 нм составила 0,723. Рассчитанная по градуировочной зависимости концентрация глюкозы составляет 2,07 мг/мл (103,5 % от заданного значения).
Пример 7. Способ определения в условиях примера 6, отличающийся тем, что концентрация раствора глюкозы составляла 2,5 мг/мл. Измеренная величина оптической плотности при 323 нм составила 0,897. Рассчитанная по градуировочной зависимости концентрация глюкозы составляет 2,62 мг/мл (104,9 % от заданного значения).
Пример 8. Способ определения глюкозы в условиях примера 7, отличающийся тем, что концентрация  раствора глюкозы составляла 3,5 мг/мл. Измеренная величина оптической плотности при 323 нм составила 1,142. Рассчитанная по градуировочной зависимости концентрация глюкозы составляет 3,4 мг/мл (97,1% от заданного значения).
Результаты определения концентрации глюкозы сведены в таблице 2.
Таблица 2.
Пример
Оптическая плотность при 323 нм
Концентрация глюкозы, мг/мл
Процент от заданной концентрации, %
заданная
определенная
6
0,723
2,0
2,07
103,5
7
0,897
2,5
2,62
104,9
8
1,142
3,5
3,40
97,1
Таким образом, изобретение позволяет упростить определение глюкозы по методу Шомоди-Нельсона, определять концентрацию глюкозы с хорошей точностью и избегать использования значительно более токсичных по сравнению с ионами меди (ПДК = 1,0 мг/л) соединения мышьяка и молибдена (ПДК = 0,05 и 0,25 мг/л соответственно).
СПИСОК ИСТОЧНИКОВ
[1]
Stick, R., Williams, S.J. Carbohydrates: The Essential Molecules of Life. – 2nd Edition. – Amsterdam [etc.]: Elsevier Science, 2009. – 496 p.
[2]
Кочетков Н.К., Бочков А.Ф., Дмитриев Б.А., Усов А.И., Чижов О.С., Шибаев В.Н. Химия углеводов. – М.: Химия, 1967. – 626 с.
[3]
Fischl J., Federman D., Talmor N. Preparation of a Modified Glucose Oxidase Reagent for the Polarographic Determination of Glucose with the Beckman" Glucose Analyzer" // Clinical Chemistry. – 1975. – Vol. 21, N 6. – P. 760-761.
[4]
Murillo M.M.S., Granados-Chinchilla F. Total starch in animal feeds and silages based on the chromatographic determination of glucose // MethodsX. – 2018. – Vol. 5. – P. 83-89.
[5]
Gvozdenović M.M., Jugović B.Z., Bezbradica D.I., Antov M.G., Knežević-Jugović Z.D., Grgur B.N. Electrochemical determination of glucose using polyaniline electrode modified by glucose oxidase // Food Chem. – 2011. – Vol. 124, N 1. – P. 396-400., "DOI: 10.1016/j.foodchem.2010.06.046".
[6]
Cao R., Komura F., Nonaka A., Kato T., Fukumashi J., Matsui, T. (2014) Quantitative analysis of D-(+)-glucose in fruit juices using diffusion ordered-1H nuclear magnetic resonance spectroscopy // Analytical Sciences. – 2014. – Vol. 30. – P. 383-388.
[7]
Petibois C., Rigalleau V., Melin A.M., Perromat A., Cazorla G., Gin H., Déléris G. Determination of glucose in dried serum samples by Fourier-transform infrared spectroscopy // Clinical chem. – 1999. – Vol. 45, N 9. – P. 1530-1535., "DOI: 10.1093/clinchem/45.9.1530".
[8]
Baca J.T., Taormina C.R., Feingold E., Finegold D.N., Grabowski J.J., Asher S.A. Mass spectral determination of fasting tear glucose concentrations in nondiabetic volunteers // Clinical chem. – 2007. – Vol. 53, N 7. – P. 1370-1372., "DOI: 10.1373/clinchem.2006.078543".
[9]
Stitt F., Friedlander S., Lewis H.J., Young F.E. Photometric determina-tion of glucose in presence of fructose // Analytical Chemistry. – 1954. – Vol. 26, N 9. – P. 1478-1484.
[10]
Метод фотометрического определения глюкозы и сахарозы / Хабаров Ю. Г., Камакина Н. Д., Гусаков Л. В. // Изв. вузов. Химия и хим. технол. - 2004. - 47, № 2. - С. 20-22.
[11]
Wu B., Zhang G., Shuang S., Choi M.M.F. Biosensors for determination of glucose with glucose oxidase immobilized on an eggshell membrane // Talanta. – 2004. – Vol. 64, N 2. – P. 546-553.
[12]
Somogyi M. Sugar determination // J. Biol. Chem. – 1926. – Vol. 70. – P. 599-612.
[13]
Somogyi M. A reagent for the copper-iodometric determination of very small amounts of sugar // J. Biol. Chem. – 1937. – Vol. 117, N 2. – P. 771-776.
[14]
Nelson N. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose // J. Biol. Chem. – 1944. – Vol. 153, N 2. – P. 375-380.
[15]
Hatanaka C., Kobara Y. Determination of glucose by a modification of So-mogyi-Nelson method // Agricultural and Biological Chemistry. – 1980. – Vol. 44, N 12. – P. 2943-2949. DOI: 10.1271/bbb1961.44.2943.
[16]
Shao Y., Lin A.H.-M. Improvement in the quantification of reducing sugars by miniaturizing the Somogyi-Nelson assay using a microtiter plate // Food Chem. – 2018. – Vol. 240. – P. 898-903. DOI: 10.1016/j.foodchem.2017.07.083.
[17]
Xue Y., Qiu X., Liu Z., Li Y. Facile and Efficient Synthesis of Silver Nano-particles Based on Biorefinery Wood Lignin and Its Application as the Optical Sensor // ACS Sustainable Chemistry & Engineering. – 2018. – Vol. 6, N 6. – P. 7695–7703. DOI:10.1021, /acssuschemeng.8b00578.