КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ НАПИТКА
BEVERAGE PREPARATION COMPOSITIONS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к композициям для приготовления напитков. Композиции содержат микроорганизм и/или фермент, обладающий способностью гидролизовать хлорогеновые кислоты экстракта кофе в фенольные кислоты. Напитки, приготовленные с композициями настоящего изобретения, обладают улучшенными антиоксидантными и противовоспалительными свойствами.
Уровень техники
Было показано, что кофе и активные соединения кофе, такие как кофеин и дитерпены (например, кафестол, кафеол), стимулируют у грызунов детоксифицирующие ферменты (например, глутатион-8-трансферазы, GST) (Cavin С. и др., 1998. The coffee-specific diterpenes cafestol and kahweol protect against aflatoxin Bl-mduced genotoxicity trough a dual mechanism. Carcinogenesis 19, 1369-1375; Cavin, С. и др., 2003. Coffee diterpenes prevent benz6[a]pyrene genotoxicity in rat and human culture systems. Biochemical Biophysical Research Communication 306, 488-495; Huber, W. и др. 2002а. Enhancement of the chemoprotective enzymes glucuronyl transferase and glutathione transferase in specific organs of:the rat by the coffee components kahweol and cafestol. Archive of Toxicology 76, 209-217). После употребления 800 мл кофе в течение 5 дней продемонстрировано возрастание под действием кофе GST активности (Steinkellner, H. и др. 2005. Coffee consumption induces GSTP in plasma and protects lymphocytes against (+/-)-anti-benzo[a]pyrene-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide induced DNA-damage: results of controlled human intervention trials. Mut. Res. 591 264-275).
Этот вид антиоксидантной активности, как известно, предохраняет против «оксидантного стресса», снижая количество вредоносных свободных радикалов, которые могут быть непосредственно связаны с развитием, например, рака, болезней сердца, дегенеративных мозговых нарушений и процессами старения.
Для увеличения полезности для здоровья пищевых продуктов и напитков является желательным получение продуктов с увеличенной антиоксидантной активностью и другими благоприятными биологически активными качествами.
Сущность изобретения
Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что обработка экстракта кофе микроорганизмами или ферментами, способными гидролизовать хлорогеновые кислоты с образованием фенольных кислот, приводит к улучшению антиоксидантных и/или противовоспалительных свойств экстракта кофе. Кроме того, обнаружено, что такая обработка может происходить in vivo, когда человек или животное принимают внутрь экстракт кофе в комбинации с ферментом или микроорганизмом, способными осуществлять гидролиз хлорогеновых кислот с образованием фенольных кислот.
Соответственно, настоящее изобретение относится к сухому напитку, содержащему: а) сухой экстракт кофе и b) микроорганизм и/или фермент, обладающие способностью гидролизовать кофеоилхинную кислоту и диэфиры с получением кофейной кислоты. В следующий объекте изобретение относится к набору для приготовления напитка, содержащему по меньшей мере две части: а) первую часть, содержащую экстракт кофе, и b) вторую часть, содержащую микроорганизм и/или фермент, обладающие способностью гидролизовать хлорогеновые кислоты с образованием фенольных кислот. В еще одном следующем объекте изобретение относится к применению продуктов настоящего изобретения.
Краткое описание чертежей
Фигура 1. Гели вестерн-блоттинга, демонстрирующие белковую экспрессию субъединиц GST (GST A4, GSTP1) и гем-оксигеназы-1 (НО-1) в первичных гепатоцитах крысы, обработанных 200 и 400 мкг/мл NESCAFE RED CUP (экстракт обжаренных кофейных зерен), не подвергавшимся гидролизу хлорогеновых кислот, и обработанных 200 и 400 мкг/мл NESCAFE PROTECT с Lactobacillus johnsonii, а также контрольные образцы, не подвергавшиеся обработке настоем кофе. Более подробно см. Пример 1.
Фигура 2. Вестерн-блоттинг, демонстрирующий индукцию экспрессии детоксифицирующего фермента (GSTP1, NQO1) в печени самцов крыс, в течение 2 недель получавших диету с 5% CUP RED NESCAFE (экстракт обжаренных кофейных зерен), не подвергавшимся обработке с гидролизом хлорогеновых кислот (RN), NESCAFE PROTECT (совместный экстракт зеленых и обжаренных кофейных зерен), не подвергавшимся гидролизу хлорогеновых кислот (Р), и NESCAFE PROTECT, обработанным Lactobacillus johnsonii (LaI-P). Более подробно см. Пример 1.
Раскрытие изобретения
Композиции, предназначенные для смешивания с экстрактом кофе для приготовления кофейного напитка, широко известны в данной области, это, например, молоко, сливки, осветлители кофе и забеливатели для кофе. Такие композиции используются потребителями для модифицирования, например, аромата, внешнего вида и текстуры кофе. Композиции могут быть в жидкой или в сухой форме, например, в виде порошков, которые растворяются и/или суспендируются в чашке кофе, например, в виде чашки свежезаваренного кофе или чашки кофе, приготовленной растворением чистого быстрорастворимого кофе в воде.
В одном воплощении изобретения предназначаемая для смешивания с экстрактом кофе композиция является забеливателем для кофе или осветлителем кофе. Забеливатель может быть на основе молочного белка и/или молочного жира, или же он может являться немолочным забеливателем на основе растительного белка и/или растительного жира. Композиция может быть в сухой форме, например, в виде порошка, содержание в котором воды составляет, например, менее 5%. Композиция также может быть в жидкой форме.
Композиция, предназначенная для смешивания с кофейным экстрактом согласно изобретению, содержит микроорганизм и/или фермент, обладающий способностью гидролизовать хлорогеновые кислоты с образованием фенольных кислот. Хлорогеновые кислоты представляют собой семейство сложных эфиров, образованных кислотами в ряду между транс-коричными кислотами и хинной кислотой. Хлорогеновые кислоты естественным образом присутствуют в кофе, главным образом в виде моно- и диэфиров хинной кислоты и ее производных с фенольными группами, находящимися в различных положениях (например, кофейная, феруловая, кумаровая, метоксикоричная кислоты). В одном воплощении изобретения микроорганизм и/или фермент являются способными осуществлять гидролиз кофеоилхинной кислоты и диэфиров (например, 3-, 4- или 5-кофеоилхинной кислоты и диэфиров), и/или ферулоилхинной кислоты и диэфиров (например, 3-, 4-, или 5-ферулоилхинной кислоты и диэфиров) с образованием кофейной кислоты и феруловой кислоты, соответственно.
Рецептура композиции согласно изобретению должна быть такой, чтобы микроорганизм и/или фермент не вызывали бы брожения или не вступали бы во взаимодействие с композиций во время хранения. Это может быть достигнуто, например, с рецептурой композиции в виде сухого порошка и/или посредством инкапсулирования микроорганизма и/или фермента таким образом, чтобы микроорганизмы и/или фермент высвобождались бы только тогда, когда композиция смешивается с экстрактом кофе, или в процессе переваривания.
Композиция согласно изобретению может, кроме того, содержать любой ингредиент, подходящий для включения в предназначаемую для смешивания с экстрактом кофе композицию для приготовления напитка. Обычные ингредиенты могут быть, например, сахаром, искусственными подслащивающими веществами, эмульгаторами, стабилизаторами, загустителями, антислеживающими агентами, красителями, усилителями вкуса, ароматизаторами и другими подобными. Подходящие искусственные подслащивающие вещества включают сахарин, цикламаты, ацесульфам, подслащивающие вещества на основе L-аспартила, такие как аспартам, и их смеси. Подходящие эмульгаторы включают моноглицериды, диглицериды, лецитин, эфиры диацетилвинной кислоты и монодиглицеридов, эмульгирующие крахмалы и их смеси. Подходящие стабилизаторы включают двузамещенный фосфат калия и цитрат натрия. Подходящим антислеживающим агентом является алюмосиликат натрия. В одном воплощении композиция содержит молочный белок и/или растительный белок. В одном следующем воплощении композиция содержит молочный жир и/или растительный жир.
Экстракт кофе
Кофейный экстракт в соответствии с изобретением является экстрактом, полученным из необжаренных зерен кофе и/или обжаренных кофейных зерен с помощью воды или пара. В данной области известны многочисленные способы получения экстрактов кофе, например, из ЕР 0916267. Экстракт кофе может быть, например, чистым быстрорастворимым кофе. Продукты в виде чистого быстрорастворимого кофе являются легко доступными и в данной области известны многочисленные способы получения продуктов в виде чистого быстрорастворимого кофе, например, из ЕР 106930.
Микроорганизмы
Способные выполнять гидролиз хлорогеновой кислоты микроорганизмы могут быть определены как, например, раскрываемые в примерах настоящей заявки. Подходящие микроорганизмы могут быть выбраны из дрожжей, грибов или бактерий. Подходящими микроорганизмами могут быть принадлежащие, например, к роду Aspergillus, такие как Aspergillus oryzae, к роду Lactobacillus, такие как, например, L.johnsonii (CNCM 1-1225), к роду Bifidobacterium, такие как, например, В. lactis (CNCM I-3446), или дрожжи, такие как, например, Saccharomyces cerevisiae.
Ферменты
Подходящими ферментами являются, например, эстераза, например, расщепляющая хлорогеновые кислоты эстераза, полученная из Aspergillus japonicus, (предлагается в продаже компанией Kikkoman, Япония), танназа из Aspergillus oryzae (EC 3.1.1.20) (предлагается в продаже компанией Kikkoman, Япония) и палатаза 20000L (ЕС 3.1.1.3) (предлагается в продаже компанией Novozymes A/S, Дания). Фермент может присутствовать в виде очищенного фермента или, например, в форме лизата клеток микроорганизма. Подходящие клетки могут быть, например, клетками микроорганизмов, упоминаемых выше. В данной области известны подходящие способы получения клеточных лизатов.
Микроорганизм и/или фермент должен присутствовать в количестве, достаточном для гидролиза существенного количества присутствующих в экстракте кофе хлорогеновых кислот в фенольные кислоты в процессе ферментативного гидролиза. Необходимые количества микроорганизма и/или фермента могут быть определены, например, с помощью описанной здесь в Примере 3 модели пищеварения TIM посредством определения количества хлорогеновых кислот, гидролизованных в процессе проведения эксперимента по ферментативному гидролизу. Предпочтительно гидролизуется по меньшей мере 20%, например, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 50% или по меньшей мере 75% кофеоилхинных кислот (CQA) и/или ферулоилхинных кислот (FQA), присутствующих в экстракте кофе.
Набор частей
В одном воплощении изобретение относится к набору для приготовления напитка, содержащему по меньшей мере две части: а) первую часть, содержащую экстракт кофе, и b) вторую часть, содержащую микроорганизм и/или фермент, обладающие способностью гидролизовать хлорогеновые кислоты с образованием фенольных кислот. Эти две предназначаемые для приготовления напитка части продаются вместе, но в упаковке продукта физически отделены друг от друга. Предназначенный для потребления конечный напиток готовится смешиванием этих двух части незадолго до потребления. Если одна или обе части находятся в жидком виде, они могут смешиваться непосредственно, возможно может быть добавлена дополнительная жидкость, например, вода или молоко. Эти две части также могут быть смешаны посредством растворения или суспендирования их в жидкости, например, в воде или молоке. В случае использования жидкости она может быть горячей или холодной в зависимости от того, является ли желательным горячий или же холодный напиток. Если используется горячая жидкость, предпочтительно она может иметь температуру, которая не настолько высока, чтобы приводить к инактивации микроорганизма и/или фермента перед употреблением напитка.
Первая часть набора содержит экстракт кофе. В одном предпочтительном воплощении первая часть находится в сухом виде, например, в форме порошка. Экстракт кофе может быть, например, обычным чистым быстрорастворимым кофе, например, экстрактом кофе, высушенным распылением или подвергнутым сублимационной сушке. Порошки чистого быстрорастворимого кофе легко доступны и широко описаны в данной области. Первая часть также может быть и в жидкой форме. Жидкие экстракты кофе являются легко доступными, например, в виде готовых к употреблению кофейных напитков. Первая часть может дополнительно содержать любой другой подходящий ингредиент, например, экстракт цикория, ароматизирующие добавки, стабилизаторы, соли и/или подслащивающие вещества. Первая часть может быть упакована любым подходящим образом, например, в пакетике-саше, в бутылке или банке.
Вторая часть содержат микроорганизм и/или фермент, обладающие способностью гидролизовать хлорогеновые кислоты с образованием фенольных кислот. Эта часть предпочтительно может быть в форме описываемой здесь композиции, предназначаемой для смешивания с экстрактом кофе, предпочтительно в форме забеливателя для кофе или образующего сливки компонента для кофе. Она может содержать любые другие подходящие компоненты, например компоненты, обычно обеспечиваемые в забеливателях для кофе или в осветлителях кофе, такие как компоненты, упоминаемые здесь в качестве ингредиентов предназначаемой для смешивания с экстрактом кофе в композиции. Она может находиться в сухой форме, например, в виде порошка, или в жидкой форме, и может упаковываться любым подходящим образом, например, в пакетике-саше, в бутылке или банке. Ее рецептура должна быть такой, чтобы микроорганизм и/или фермент не вызывали бы брожения или не вступали бы во взаимодействие с другими ингредиентами во время хранения. Это может быть достигнуто, например, с рецептурой композиции в виде сухого порошка и/или посредством инкапсулирования микроорганизма и/или фермента таким образом, чтобы микроорганизмы и/или фермент высвобождались бы только тогда, когда композиция смешивается с экстрактом кофе или в процессе переваривания.
Эти по меньшей мере две части могут упаковываться вместе любым подходящим для этого образом. Например, они могут быть упакованы в общем контейнере, в котором части при хранении содержатся физически изолированным друг от друга образом и смешиваются, когда контейнер вскрывается, или же они могут упаковываться в отдельных контейнерах, которые для приготовления напитка поступают в продажу вместе.
Сухой напиток
В одном воплощении изобретение относится к сухому напитку, содержащему: а) сухой экстракт кофе и b) микроорганизм и/или фермент, обладающие способностью гидролизовать хлорогеновые кислоты с получением фенольных кислот.
Сухой напиток согласно изобретению является порошком, который применяется для приготовления напитка посредством растворения или суспендирования порошка в жидкости, например, в воде или молоке. Предназначенный для получения из порошка напиток может быть, например, черным кофе, кофе-латте, кофе с молоком, капучино или любым другим напитком на основе кофе.
Сухой экстракт кофе может быть, например, обычным чистым быстрорастворимым кофе, например, экстрактом кофе, высушенным распылением или подвергнутым сублимационной сушке. Порошки чистого быстрорастворимого кофе легко доступны и широко описаны в данной области.
Микроорганизм и/или фермент присутствуют в сухой порошкообразной форме, например, в виде порошка: полученного сублимационной сушкой. Микроорганизм и/или фермент могут находиться в инкапсулированном состоянии.
Рецептура сухого напитка должна быть такой, чтобы микроорганизм и/или фермент не вызывали бы брожения или не вступали бы во взаимодействие с кофейным экстрактом и/или другими ингредиентами во время хранения.
В одном предпочтительном воплощении изобретения сухой напиток содержит описанную здесь предназначенную для смешивания с экстрактом кофе композицию в сухой форме. В более предпочтительном воплощении изобретения сухой напиток содержит забеливатель.
:
Сухой напиток может содержать любой другой ингредиент, подходящий для приготовления желательного напитка. Подходящие ингредиенты известны в данной области и могут быть, например, сахаром, искусственными подслащивающими веществами, эмульгаторами, стабилизаторами, загустителями, антислеживающими агентами, красителями, усилителями вкуса, ароматизаторами и другими подобными. Подходящие искусственные подслащивающие вещества включают сахарин, цикламаты, подслащивающие вещества на основе L-аспартила, такие как аспартам, и их смеси. Подходящие эмульгаторы включают моноглицериды, диглицериды, лецитин, эфиры диацетилвинной кислоты и монодиглицеридов (DATA-эфиры), эмульгирующие крахмалы и их смеси. Подходящие стабилизаторы включают двузамещенный фосфат калия и цитрат натрия. Подходящим антислеживающим агентом является алюмосиликат натрия. В одном воплощении сухой напиток содержит молочный белок и/или растительный белок. В еще одном воплощении сухой напиток содержит молочный жир и/или растительный жир. В одном следующем воплощении сухой напиток дополнительно содержит подслащивающее вещество.
Применение продуктов согласно изобретению
Продукты согласно изобретению могут применяться для усиления антиоксйдантной способности in vivo у человека или животного, потребляющего приготавливаемый из продуктов согласно изобретению напиток, например, стимулируя детоксифицирующие ферменты, такие как глутатион-8-трансфераза (GST), и усиливая Hrf2-опосредованную экспрессию генов. Сообщается, что ассоциированные с увеличенной Hrf2-активностью гены усиливали детоксикацию и стимулировали эндогенную защиту против оксидантного стресса.
Продукты согласно изобретению могут применяться для ослабления воспалений, например, снижая уровень простагландина Е2.
С оксидантным стрессом и воспалением соотносится множество связанных со здоровьем неблагополучий и нарушений. Продукты согласно изобретению могут применяться для профилактики или терапии таких неблагополучий или нарушений у человека или животного, употребляющих приготавливаемый из продуктов согласно изобретению напиток. К соответствующим неблагополучиям и нарушениям относятся, например, повреждения кожи, например, фотоповреждения, вызываемые ультрафиолетовым излучением, атонический дерматит, экзема, шелушение кожи, зуд, аллергические симптомы, мозговые нарушения, воспаления, ожирение и рак, например, рак кожи и рак легкого.
Продукты согласно изобретению могут, кроме того, применяться в качестве антидиабетического средства, например, снижающего уровни глюкозы в крови и/или увеличивающего уровни содержания в крови лептина, инсулина и/или С-пептида, в качестве средства, воздействующего на ремоделирование кости, например, увеличивающего минеральную плотность костной ткани посредством, например, увеличения серологических уровней эстрогена и/или прогестерона и/или повышения активности щелочной фосфатазы, в качестве антиметастатического средства, например, с антиангиогенным действием.
Примеры
Пример 1. Обработка NESCAFE PROTECT свежими клетками Lactobacillus fohnsonii
Были выращены клетки L. johnsonii (CNCM 1-1225) (7,0Е08 КОЕ/мл) и подвергнуты центрифугированию (5000 g, 10 мин), осадок ресуспендировался в фосфатном буфере (50 ммоль, рН 7,0) при концентрации 0,61 г/мл. Было добавлено 30 мг/мл NESCAFE PROTECT (высушенный совместный экстракт зеленых и обжаренных кофейных зерен) и смесь инкубировалась при 37°С. Образцы отбирались через различные промежутки времени протекания реакции, центрифугировались (3000 g, 5 мин), фильтровались через шприцевой фильтр с размером пор 0,45 мкм (Millipore SLHA 025 BS) и анализировались с помощью ВЭЖХ.
Параллельно осуществлялась контрольная реакция, проводившаяся при тех же реакционных условиях, но без использования бактерий.
Обработка NESCAFE PROTECT лизированными клетками Lactobacillus fohnsonii
Были выращены клетки L. johnsonii (CNCM 1-1225) (7,0Е08 КОЕ/мл) и подвергнуты центрифугированию (5000 g, 10 мин), осадок ресуспендировался в фосфатном буфере (50 ммоль, рН 7,0) при концентрации 0,61 г/мл. Затем клетки были лизированы с применением способа стеклянных бус. 600 мкл приготовленных клеток помещалось в пробирки с завинчивающейся пробкой и при 0°С к ним добавлялось 600 мкл стеклянных шариков. Затем пробирки помещались на 1 минуту в гомогенизатор Mini-Beadbeater для интенсивного встряхивания, охлаждались на льду и помещались в Mini-Beadbeater еще на 1 минуту. Сырой клеточный экстракт затем добавлялся к 900 мкл раствора NESCAFE PROTECT (30 мг/мл, фосфатный буфер рН 7,0) и смесь инкубировалась при 37°С. Образцы отбирались через различные промежутки времени протекания реакции,: центрифугировались (3000 g, 5 мин), фильтровались через шприцевой фильтр с размером пор 0,45 мкм (Millipore SLHA 025 BS) и анализировались с помощью ВЭЖХ.
Обработка NESCAFE PROTECT препаратом клеток Lactobacillus johnsonii, подвергнутых распылительной сушке
30 мг NESCAFE PROTECT растворялось в 1 мл фосфатного буфера (50 ммоль, рН 7,0) или в 1 мл воды. К этому раствору добавлялось 10 мг высушенного распылением препарата Lactobacillus johnsonii (CNCM 1-1225) (3,3Е9 КОЕ/г). Затем смесь инкубировалась при 37°С и через различные промежутки времени протекания реакции отбирались образцы. После центрифугирования (3000 g, 5 мин) и фильтрации (шприцевой фильтр с размером пор 0,45 мкм Millipore SLHA 025 BS) образцы анализировались с помощью ВЭЖХ.
Обработка экстракта зеленого кофе препаратом высушенных распылением Lactobacillus fohnsonii (CNCM 1-1225)
30 мг высушенного экстракта зеленого кофе растворялось в 1 мл фосфатного буфера (50 ммоль, рН 7,0); или в 1 мл воды. К этому раствору добавлялось 10 мг высушенного распылением препарата Lactobacillus johnsonii (3,3E9 КОЕ/г). Затем смесь инкубировалась при 37°С и через различные промежутки времени протекания реакции отбирались образцы. После центрифугирования (3000 g, 5 мин) и фильтрации (шприцевой фильтр с размером пор 0,45 мкм Millipore SLHA 025 BS) образцы анализировались с помощью ВЭЖХ.
Обработка NESCAFE концентрированным препаратом Lactobacillus johnsonii (CNCM 1-1225)
400 мг NESCAFE SPECIAL FILTRE (высушенный экстракт обжаренных кофейных зерен) растворялось в 1 мл кипящей воды и раствор при комнатной температуре охлаждался до 37°С. К 250 мкл этого кофейного раствора добавлялись различные количества концентрированного препарата Lactobacillus johnsonii (50 мкл, 100 мкл, 350 мкл, 750 мкл) и объем доводился водой до 1 мл. Смеси инкубировались при 37°С в течение 2 часов и 4 часов. После центрифугирования (3000 g, 5 мин) и фильтрации образцы анализировались с помощью ВЭЖХ.
Анализ ВЭЖХ
Образцы кофе разбавлялись до концентрации 1 масс.% и подвергались анализу с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ-хроматографии на колонке СС 250/4 Nucleosil 100-5-С18 (Macherey-Nagel). Элюирующая система была представлена обработанной ультратонкой фильтрацией (Millipore) водой с 0,1% трифторуксусной кислоты (TFA) и CH3CN при скорости потока 1 мл/минута. Способ позволял одновременно определять кофеоилхинные кислоты (CQA), ферулоилхинные кислоты (FQA), дикофеоилхинные кислоты (diCQA), лактоны ферулоилхинных кислот, кофейную кислоту (СА) и феруловую кислоту (FA) (поглощение на 325 нм) при использовании калибровочных кривых, полученных по внешним стандартам. Результаты были выражены в отнесении к стандарту в момент времени 0 (t0) или к стандарту в тот же самый момент времени, но без использования бактерий.
Антиоксидант-чувствительный элемент (ARE) - люциферазный тест
pGL-8xARE, который содержит восемь копий ARE, присутствующего в глутатион-S-трансферазе крысы А2 (GSTA2) наряду с плазмидой pcDNA3.1, содержащей неомицин-селективный маркер, был устойчиво трансфецирован в клетки человека MCF7 (Wang и др., Cancer Res. 66, 10983-10994, 2006). ARE (антиоксидант-чувствительный элемент) является центром связывания транскрипционного фактора Nrf2, регулирующего гены, вовлекаемые в детоксикацию и эндогенную защиту против оксидантного стресса. Плазмида pGL-8xARE вслед за восемью центрами связывания Nrf2 содержит ген люциферазы, что позволяет отслеживать активность Nrf2.
Для обработки с кофе в 96-луночном планшетном микротитраторе в среде для выращивания DMEM высевались клетки AREc32. После обработки в течение 24 часов с различным кофе определялась активность люциферазы светляка.
Экспрессия белка
5
2
Первичные гепатоциты были получены перфузией печени крыс линии Спраг-Доули с раствором коллагеназы (Sidhu и др., Arch. Biochem. Biophys. 301, 103-113, 1993). Жизнеспособность клеток, оцененная методом исключения красителя трипанового синего, была определена в пределах между 90 и 95%. Посев клеток осуществлялся с плотностью 1,5×10 клеток/см в 60 мм пластмассовых чашках Петри с 3 мл питательной среды Уильяма, дополненной 2 ммоль L-глютамина, 10 ммоль Hepes pH 7,4, ITS+, 15000 ед. пенициллина/стрептомицина, 100 нмоль дексаметазона и 5% эмбриональной бычьей сыворотки (Hi-clone). Гепатоциты оставлялись на два часа для присоединения, а затем промывались EBSS для удаления осадков и неприсоединившихся клеток. Добавлялась свежая, не содержащая сыворотки, питательная среда, содержащая 25 нмоль дексаметазона, и затем применялось наложение матригеля (233 г/мл). Свежий матригель добавлялся к культурам каждые два дня после изменения питательной среды. Для изучения действия кофе на детоксифицирующие ферменты и экспрессию белка антиоксиданта исследуемый материал добавлялся к питательным средам спустя 24 часа после посева клеток за 48 часов до экстракции белков и выполнения вестерн-блоттинга (Cavin и др., Food Chem Tox. 46, 1239-48, 2008).
Проверка образования простагландина Е2
Клетки НТ-29 толстого кишечника человека в течение 15 часов обрабатывались различным кофе с последующей совместной инкубацией в течение 6 часов с провоспалительным агентом TNF-a (10 нг/мл). Был выполнен анализ продуцирования PGE2 в клетках НТ-29 с помощью конкурентного иммуноферментного анализа (EIA) (Cavin и др., BBRC 327, 742-49, 2005).
Результаты
Гидролиз хлорогеновых кислот с образованием фенольных кислот
Эксперимент 1. Обработка NESCAFE PROTECT свежими клетками L. johnsonii при варьирующих продолжительности времени реакции и количестве клеточного препарата. Результаты представлены в Таблице 1.
Таблица 1.
Результаты эксперимента 1.
Время (час)
6
24
6
24
6
24
Клеточный препарат (мкл)
750
750
350
350
100
100
Концентрация в % по отношению к не подвергавшемуся обработке эталону в момент t=0
CQA
3
0
14
3
39
15
FQA
8
0
17
4
42
17
diCQA
0
0
0
0
23
2
CA
13215
13238
14282
15981
10111
13661
FA
7776
8845
7234
8861
4594
6691
Материальный баланс (ммоль/г сухого вещества)
Израсходованные хлорогеновые кислоты
0,20
0,21
0,18
0,20
0,13
0,17
Образовавшиеся СА и FA
0,20
0,20
0,21
0,24
0,14
0,20
Эксперимент 2. Обработка NESCAFE PROTECT экстрактом L. johnsonii (лизированные клетки) при варьирующих продолжительности времени реакции и количестве клеточного препарата. Результаты представлены в Таблице 2.
Таблица 2.
Результаты эксперимента 2.
Время (час)
2
2
6
6
Клеточный препарат (мкл)
350,0
100,0
350,0
100,0
Концентрация в % по отношению к не подвергавшемуся обработке эталону в момент t=0
CQA
10
32
6
14
FQA
15
36
11
18
diCQA
1
8
1
1
CA
13901
10729
16300
12581
FA
7771
5581
9720
6960
Эксперимент 3. Обработка NESCAFE PROTECT клетками Lactobacillus johnsonii, подвергнутыми распылительной сушке. Результаты представлены в Таблице 3.
Таблица 3.
Результаты эксперимента 3. CQA, FQA, CA и FA представлены в виде процентных долей по отношению к не подвергавшимся обработке контрольным образцам в момент t=0.
Время (час)
2
6
4
CQA
73
67
32
FQA
82
60
34
CA
3598
6140
7879
FA
1109
2183
3686
Эксперимент 4. Обработка экстракта зеленого кофе препаратом Lactobacillus johnsonii, подвергнутым распылительной сушке. Результаты представлены в Таблице 4.
Таблица 4.
Результаты эксперимента 4. CQA, FQA, CA и FA представлены в виде процентных долей по отношению к не подвергавшемся обработке контрольным образцам в момент t=0.
Время (час)
4
6
16
24
CQA
77
69
58
50
FQA
79
71
48
52
diCQA
67
53
32
20
СА
2673
3762
5182
6145
FA
961
1429
1963
2432
Эксперимент 5. Обработка NESCAFE концентрированным препаратом Lactobacillus johnsonii. Результаты представлены в Таблице 5.
Таблица 5.
Результаты эксперимента 5. CQA, FQA, СА и FA представлены в виде процентных долей по отношению к не подвергавшимся обработке контрольным образцам в момент t=0.
Количество клеток
50 мкл/1 мл
100 мкл/1 мл
350 мкл/1 мл
750 мкл/1 мл
50 мкл/1 мл
100 мкл/1 мл
350 мкл/1 мл
750 мкл/1 мл
Время (час)
2
2
2
2
4
4
4
4
CQA
92
80
46
25
76
60
33
17
FQA
90
82
61
41
89
74
53
37
diCQA
86
68
23
6
75
56
15
6
СА
1737
2885
5752
7292
1763
2803
4491
5514
FA
1509
2468
5327
7586
786
1266
2408
3281
Таблица 6 показывает абсолютную концентрацию ряда соединений в двух различных образцах экстрактов необжаренных зерен кофе, которые не подвергались обработке гидролизом хлорогеновых кислот (контрольные образцы).
Таблица 6.
Композиции экстрактов, не подвергавшихся обработке необжаренных зерен кофе (контрольные образцы). Концентрация представляется в миллиграммах на грамм сухого вещества.
А
В
3-кофеоилхинная кислота
13,88
15,57
4-кофеоилхинная кислота
17,58
20,08
5-кофеоилхинная кислота
81,16
85,45
Сумма CQA
112,62
121,10
3-ферулоилхинная кислота
0,00
0,00
4-ферулоилхинная кислота
3,29
4,41
5-ферулоилхинная кислота
17,70
19,77
Сумма FQA
20,99
24,18
СА
0,39
0,47
FA
0,25
0,23
Лактон 3-кофеоилхинной кислоты
0,00
0,00
Лактон 4-кофеоилхинной кислоты
0,00
0,00
Сумма лактонов
0,00
0,00
3,4-дикофеоилхинная кислота
6,80
4,34
3,5-дикофеоилхинная кислота
5,53
8,35
4,5-дикофеоилхинная кислота
0,12
8,85
Общее количество дикофеоилхинных кислот
12,45
21,55
Экспрессия белка
В первичных гепатоцитах крысы примененный в количестве 200 мкг/мл NESCAFE RED CUP (экстракт обжаренных кофейных зерен), полученный после 48 часов обработки, никакого увеличения белковой экспрессии субъединиц GST (GSTA4, GSTP1) и гемм-оксигеназы-1 (НО-1) по данным вестерн-блоттинга не показал, а в количестве 400 мкг/мл продемонстрировал слабую индукцию GSTP1 и экспрессию НО-1. Напротив, с NESCAFE PROTECT, обработанным Ljohnsonii, как в количестве 200 мкг/мл, так и 400 мкг/мл наблюдалась сильная индукция различных типов экспрессии белков на GSTA4, GSTP1 и НО-1. Результаты в виде гелей вестерн-блоттинга представлены на Фиг.1.
Данные, полученные на печени самцов крыс, получавших в течение 2 недель диету с 5% NESCAFE RED CUP, в сравнении с NESCAFE PROTECT и NESCAFE PROTECT, обработанным L. johnsonii, подтвердили эффекты, отмеченные в первичных гепатоцитах крыс. Наиболее сильная в сравнении с не подвергавшимся обработке NESCAFE PROTECT (GSTP1, NQO1) и не подвергавшимся обработке NESCAFE RED CUP (GSTP1, NQO1) индукция экспрессии детоксифицирующего фермента (GSTP1, NQO1) была отмечена с NESCAFE PROTECT, обработанным с L. johnsonii. Результаты в виде гелей вестерн-блоттинга представлены на Фиг.2.
Антиоксидант - чувствительный элемент (ARE) - люциферазный тест
Для демонстрации путей активации с помощью кофе Nrf2-ARE использовалась клетки рака молочной железы человека (AREc32), стабильно трансфецированные несколькими копиями репортерной конструкции крысиного GSTA2-ARE. Экстракт зеленого кофе, не подвергавшийся обработке гидролизом хлорогеновых кислот, и другой экстракт зеленого кофе, подвергнутый обработке в течение 24 часов с L.johnsonii, продемонстрировали дозозависимое увеличение активности репортера Hrf2-люциферазы (см. Таблицу 7).
Таблица 7.
Индукция активности Nrf2 (активность люциферазы светляка, относительные единицы) с помощью кофе.
Экстракт кофе, мкг/мл
Экстракт зеленого кофе, необработанный
Экстракт 1 зеленого кофе, подвергнутый обработке
Экстракт 2 зеленого кофе, подвергнутый обработке
Экстракт 3 зеленого кофе, подвергнутый обработке
0
0
0
0
0
200
0,3+/-0,1
15,2+/-1,5
22,1+/-1,6
22,6+/-2,4
300
0,8+/-0,1
29,0+/-3,0
40,5+/-1,6
32,1+/-6,0
400
1,0+/-0,1
40,4+/-6,6
59,3+/-1,9
47,3+/-3,4
600
2,0+/-0,2
77,7+/-10,5
90,4+/-0,7
80,4+/-8,2
800
2,8+/-0,1
77,3+/-4,9
80,7+/-7,3
96,2+/-4,1
Проверка образования простагландина Е2
Потенциальное противовоспалительное действие экстракта зеленого кофе, обработанного с L.johnsonii, оценивалось в клетках НТ-29 толстого кишечника человека. После обработки противовоспалительным агентом TNF-α в клетках толстого кишечника происходила индукция уровня простагландина Е2 (PGE2). В этом исследовании клетки предварительно в течение 24 часов обрабатывались различными экстрактами кофе (экстракт зеленого кофе, не подвергавшийся обработке гидролизом хлорогеновых кислот, и другой экстракт зеленого кофе, обработанный в течение 24 часов с L.johnsonii). На последних 6 часах эксперимента добавлялся TNF-α (10 нг/мл). Данные (см. Таблицу 8) продемонстрировали явное дозозависимое уменьшение под действием кофе образования PGE2 по сравнению с контрольными клетками, обработанными TNF-α.
Таблица 8.
Уменьшение образования PGE2 в результате обработки экстрактом кофе в сравнении с контрольными клетками, обработанными TNF-α (относительные единицы).
Экстракт кофе, мкг/мл
Экстракт зеленого кофе, необработанный
Экстракт 1 зеленого кофе, подвергнутый обработке
Экстракт 2 зеленого кофе, подвергнутый обработке
0
100+/-9
100+/-9
100+/-9
50
110+/-10
18+/-2
43+/-5
100
85+/-9
6+/-0,9
10+/-1,1
200
80+/-8
1+/-0,1
1+/-0,2
Пример 2
Образцы кофе
Экстракт зеленого кофе из 100% необжаренных зерен кофе сорта робуста
NESCAFE PROTECT, высушенный совместный экстракт зеленых и обжаренных кофейных зерен
Ферменты и клетки
Микроорганизмы
Питательная среда
Lactobacillus johnsonii (CNCM I-1225)
MRS
Bifidobacterium lactis BB 12 (CNCM 1-3446)
MRS+ цистеин
Bifidobacterium longum BB536 (ATCC BAA-999)
MRS+ цистеин
Эстераза хлорогеновых кислот (24 ед./г), полученная из Aspergillus japonicus (Kikkoman, Япония).
Танназа из Aspergillus oryzae (Kikkoman, Япония)
Приготовление бактериальных клеток
Исследуемые штаммы отбирались (центрифугирование при 5000 g в течение 10 минут) после достижения стационарной фазы, соответствующей 16 часам инкубации в питательной среде при 37°С в анаэробной атмосфере без перемешивания. Для первой активации штаммов замороженная маточная культура была высеяна на свежие питательные среды и выращивалась в течение ночи. Эта предварительная культура использовалось для посева основной культуры.
Обработка экстрактов кофе клетками бактерий
После выращивания бактерий и центрифугирования осадок ресуспендировался в фосфатном буфере (рН 7,0) при концентрации 0,61 г/мл. К 200 мкл этого препарата клеток добавлялось 800 мкл кофейного раствора (3%) и смесь выдерживалась при 37°С в течение 4 часов, 16 часов и 24 часов.
Инкубация экстрактов кофе с эстеразой хлорогеновых кислот
Раствор эстеразы хлорогеновых кислот (25 мг) в 200 мкл фосфатного буфера (рН 7,0) был добавлен к 800 мкл кофейного раствора (3%). Смесь инкубировалась при 37°С в течение 4 часов, 16 часов и 24 часов. По истечении времени реакции ферментативная активность прекращалась тепловой обработкой (3 минуты, 90°С) и смесь перед анализом фильтровалась.
Люциферазный тест ARE
Так же, как и в Примере 1.
Результаты
Д:1я демонстрации активации с помощью кофе антиоксиданта Nrf2-ARE использовалась клетки рака молочной железы человека (AREc32), стабильно трансфецированные несколькими копиями репортерной конструкции крысиного GSTA2-ARE. Экстракт зеленого кофе, не подвергавшийся обработке гидролизом хлорогеновых кислот (необработанный), экстракт зеленого кофе, подвергнутый обработке в течение 24 часов с L. johnsonii, экстракт зеленого кофе, подвергнутый обработке в течение 24 часов с Bifidobacterium lactis (B1), и экстракт зеленого кофе, подвергнутый обработке в течение 4 часов с эстеразой хлорогеновых кислот, все продемонстрировали дозозависимое увеличение активности репортера Nrf2-люциферазы (см. Таблицу 9).
Таблица 9.
Активность репортера Nrf2-люциферазы необработанных и подвергнутых обработке экстрактов кофе (относительные единицы).
Кофе, мг/мл
Зеленый кофе, необработанный
Зеленый кофе, обработанный с LJ
Зеленый кофе, обработанный с BI
Зеленый кофе, обработанный с СЕ
0.
0
0
0
0
100
0,3+/-0,1
0.5+/-0,1
0,3+/-0,1
1,0+/-0,1
200
0,8+/-0,1
1,0+/-0,1
1,1+/-0,1
2,1+/-0,2
400
1,0+/-0,1
5,2+/-0,4
3,1+/-0,3
8,2+/-1,4
600
2,0+/-0,2
11,1+/-0,5
7,2+/-1
11,3+/-1,4
Экстракты зеленого кофе обрабатывались различными микроорганизмами и эстеразой хлорогеновых кислот для гидролиза хлорогеновых кислот. Результаты представлены в Таблице 10.
Таблица 10.
Композиции экстрактов необжаренных зерен кофе, подвергнутых обработке. CQA, FQA, СА и FA представлены в виде процентных долей по отношению к не подвергавшимся обработке контрольным образцам в момент t=0.
Lactobacillus Johnsonii
Bifidobacterium lactis
Эстераза хлорогеновых кислот
Время (час)
4
16
24
4
16
24
4
16
24
CQA
42
15
12
96
79
74
3
2
2
FQA
49
15
15
33
12
6
73
24
23
diCQA
35
6
3
85
70
64
0
0
0
CA
12505
17148
18107
1521
4182
5283
18917
17275
18318
FA
4607
7192
7597
5020
6970
7105
2620
5685
6293
NESCAFE PROTECT обрабатывался различными микроорганизмами и эстеразой хлорогеновых кислот для гидролиза хлорогеновых кислот. Результаты представлены в Таблице 11.
Таблица 11
Композиция NESCAFE PROTECT, подвергнутого обработке. CQA, FQA, CA и FA представлены в виде процентных долей по отношению к не подвергавшимся обработке контрольным образцам в момент t=0.
Lactobacillus Johnsonii
Bifidobacterium lactis
Эстераза хлорогеновых кислот
Время (час)
4
16
24
4
16
24
4
16
24
CQA
33
13
13
97
81
80
5
3
3
FQA
42
21
20
54
23
20
54
15
14
diCQA
18
2
2
91
72
67
0
0
1
CA
7942
9429
9933
968
2258
2840
10879
10198
10750
FA
4051
5226
5504
3065
4518
5144
2794
5140
5518
Пример 3
Функциональная модель желудок/тонкий кишечник (TIM)
TIM-1, модель, имитирующая работу желудка и тонкого кишечника, содержит четыре связанных отделения, которые представляют желудок, двенадцатиперстную кишку, тощую кишку и подвздошную кишку, соответственно. Каждое отделение состоит из стеклянной наружной стенки с гибкой внутренней стенкой. Гибкая стенка окружается водой при 37°С для сжатия стенок, что обеспечивает смешивание пищевого продукта с секретированными ферментами посредством перистальтических движений в желудочно-кишечном тракте.
Эксперименты на модели выполнялись в усредненных физиологических условиях желудочно-кишечного тракта. Во время экспериментов температура поддерживалась на уровне 37°С и моделировались деятельность слюнной, желудочной, желчной и панкреатической секреции. Процесс переваривания отслеживался в модели в течение 6 часов. В первые 3,5 часа желудочное содержимое постепенно поступало в «пилорический клапан» тонкого кишечника. В конце эксперимента приблизительно 80% содержимого тонкой кишки постепенно переходило через илеоцекальный клапан в «толстую кишку». Показатель рН в желудке постепенно, на протяжении приблизительно 5 часов, снижался от 6,5 до 2,0 секрецией 1М HCl; величина рН содержимого тонкого кишечника поддерживалась на уровне 6,5 в двенадцатиперстной кишке, 6,8 в тощей кишке и 7,2 в подвздошной кишке. Продукты переваривания и вода всасывались из отделений тощей кишки и подвздошной кишки посредством перекачивания диализной жидкости через мембраны из пористого волокна с отсечением по молекулярной массе приблизительно в 5000 Да.
Моделирование процесса переваривания экстракта кофе
4,5 г NESCAFE PROTECT (совместный экстракт зеленых и обжаренных кофейных зерен) было растворено в 310 мл ацетатного буфера (20 ммоль, рН 6,5). После добавления 10 мл инициирующего остатка (5 г пепсина и 5 г растворов фермента липазы) раствор был введен в желудочное отделение TIM. В процессе переваривания отбирался общий диализат для периодов времени 0-2, 2-4 и 4-6 часов. После прохождения 6 часов эксперимента остатки из отделений желудка, двенадцатиперстной кишки, тощей кишки и подвздошной кишки были подвергнуты анализу для расчета материального баланса по хлорогеновым кислотам. Образцы пропускались через шприцевые фильтры с размером пор 0,45 мкм (Millipore SLHA 025 BS) и анализировались с помощью ВЭЖХ, как описано в Примере 1. Для эксперимента с Lactobacillus johnsonii (CNCM 1-1225) в желудочное отделение после добавления 10 мл инициирующего остатка помещалось 310 мл раствора ацетатного буфера (20 ммоль, рН 6,5), содержащего в общей сложности 3,3Е9 КОЕ высушенного распылением препарата Ljohnsonii. Затем спустя 15 минут после запуска моделирующего переваривание процесса в желудочное отделение с помощью шприца было введено 10 мл ацетатного буфера, содержащего 4,5 г Nescafe Protect. В процессе переваривания отбирался общий диализат для периодов времени 0-2, 2-4 и 4-6 часов после прохождения через полупроницаемые мембраны из пористого волокна, присоединенные к отделениям тощей и подвздошной кишок. Общее поступление в отдел подвздошной кишки отбиралось для периодов времени 0-2, 2-4 и 4-6 часов. Из желудочного отделения отбирались аликвоты (1 мл) непосредственно после добавления NESCAFE PROTECT и в момент времени, соответствующий 1 часу. По истечении 6 часов остатки из отделений желудка, двенадцатиперстной кишки, тощей кишки и подвздошной кишки были. подвергнуты анализу с помощью ВЭЖХ для расчета материального баланса по 5-кофеоилхинной кислоте. Аналогичные испытания были выполнены с NESCAFE COOL (экстракт обжаренных зерен кофе с забеливателем и подслащивающим веществом), с обычным кофе, сваренным из молотого обжаренного кофе фильтровальным способом с добавлением забеливателя; и с коммерчески доступной 5-кофеоилхинной (5-CQA) кислотой.
Результаты
Данные по процентным долям 5-кофеоилхинной кислоты (5-CQA), гидролизованной во время экспериментов с добавлением L.johnsomi, представлены в Таблице 12. В контрольных экспериментах без добавления L.johnsonii никакого гидролиза 5-кофеоилхинной кислоты (5-CQA) не наблюдалось.
Таблица 12.
Гидролиз 5-CQA в экстрактах кофе и чистой 5-CQA по данным, полученным в модели TIM (процентная доля гидролизовавшейся 5-CQA от ее общего содержания в образцах).
Продукт
% гидролизованной 5-CQA
5-CQA
48
NESCAFE PROTECT
34
NESCAFE COOL
79
Кофе, сваренный фильтровальным способом из молотых обжаренных зерен с добавлением забеливателя
53