ПРОТИВОВИРУСНОЕ СРЕДСТВО (ВАРИАНТЫ)
ANTIVIRAL MEDICATION (VERSIONS)

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии и касается нового противовирусного средства, обладающего противовирусной активностью, в частности, относительно высокопатогенного вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (A/H5N1).
В связи с широким распространением вирусных заболеваний, вызванных вирусом человека, а также вирусом гриппа птиц (A/H5N1), в настоящее время особую актуальность имеет поиск средств противовирусной защиты, углубленное изучение вирусных инфекций и создание препаратов, направленных на их подавление.
Известно, что бактерии вида Bacillus thuringiensis, способные формировать параспоральные кристаллические включения белковой природы [1], обладают избирательным антагонистическим действием в отношении микроорганизмов [2, 3]. Известна также противовирусная активность штаммов Bt против фитопатогенов, вредителей сельскохозяйственных растений [4].
Известно средство на основе консорциума микроорганизмов, включающий в себя штамм Bacillus licheniformis, штаммы, относящиеся к родам Saccharomycetes, Azotobacteria, штаммы Р. bacteria и Bacillus thuringiensis, который обладает противовирусной активностью (патент Китая №1274702, МПК C12N 1/00, опубл. 29.11.2000).
Известно средство на основе штамма VNPB 17-3 бактерий Bacillus thuringiensis (патент США №6528480, МПК А01N 63/00, опубл. 04.03.2003 г.), содержащий белковый токсин, обладающий противовирусным действием против вируса табачной мозаики.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является средство на основе штаммов Bacillus thuringiensis, имеющих авторское наименование соответственно Gi-47, Gi-535, Dg-992, которое обладает антимикробной и инсектицидной активностью (Андреева И. С. Особенности антимикробной и инсектицидной активности штаммов Bacillus thuringiensis, выделенных из почвы долины гейзеров (Камчатка). Тезисы Международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера», 19-20 Ноября 2007 г. Москва. - 2007, с.5-7).
Однако все выше приведенные аналоги и прототип не обладают ингибирующим действием против высокопатогенного вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (A/H5N1).
Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание 3 вариантов нового противовирусного средства, обладающего ингибирующей активности в отношении вируса гриппа птиц A/H5N1.
Указанный технический результат достигается тем, что противовирусное средство представляет собой суспензию продуктов метаболизма штамма бактерий Bacillus thuringiensis В-1069, обладающую ингибирующей активностью против вируса гриппа птиц A/H5N1.
Указанный технический результат достигается также тем, что противовирусное средство представляет собой суспензию продуктов метаболизма штамма бактерий Bacillus thuringiensis В-1073, обладающую ингибирующей активностью против вируса гриппа птиц A/H5N1.
Указанный технический результат достигается также тем, что противовирусное средство представляет собой суспензию продуктов метаболизма штамма бактерий Bacillus thuringiensis В-1091, обладающую ингибирующей активностью против вируса гриппа птиц A/H5N1.
Штаммы В. thuringiensis, продукты метаболизма которых обладают противовирусными свойствами, депонированы в коллекции микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора) под коллекционными номерами: В. thuringiensis В-1091, Д. thuringiensis В-1069, В. thuringiensis В-1073.
Справки о депонировании штаммов прилагаются.
Свойства продуктов метаболизма штаммов В. thuringiensis В-1091, В. thuringiensis В-1069, В. thuringiensis В-1073, обладающих активностью против вируса птичьего гриппа A/H5N1 обнаружены впервые, в связи с чем можно сделать вывод о соответствии предлагаемых технических решений критериям изобретения «новизны» и «изобретательский уровень».
Характеристика штаммов
Кристаллообразующие, содержащие эндоспоры бактерии В. thuringiensis В-1091, В. thuringiensis В-1069, В. thuringiensis В-1073, были выделены при высеве на полные агаризованные среды различных образцов, взятых в Долине гейзеров (Камчатка). Штаммы имеют некоторые отличия от типовых штаммов В. thuringiensis, заключающиеся в отсутствии или слабо выраженной инсектицидной активности и ряде морфологических характеристик.
Источник выделения и морфология штаммов
Штамм В. thuringiensis B-1091 выделен из образца почвы при его высеве на полную агаризованную среду рыбно-пептонный агар (РПА, рН 7.0, ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ) и инкубировании высева при температуре 28-30°С. Штамм на плотной среде формирует влажные, ослизненные, белесые, высокие, непрозрачные, блестящие колонии. Клетки штамма палочковидные, размером 1×2-4 мкм, расположены по 1-2 или в цепочках; параспоральные включения имеют округлую форму, плотно прилегают к эллиптической споре, диаметр споры и кристалла имеют близкие размеры.
Штамм В. thuringiensis B-1069 выделен из образца воды горячего источника Долины гейзеров при его высеве на полную агаризованную среду РПА (рН 9.0). На агаризованной среде штамм образует матовые, мелкозернистые, непрозрачные, белесые, влажноватые колонии. Клетки штамма палочковидные, размером 1×2-8 мкм, прямые или слабо изогнутые, расположены по 1-2 или в цепочках, формируют параспоральные включения округлой или чуть угловатой формы, плотно прилегающие к эллиптической споре в виде шляпки гриба, значительно превышая ее диаметр, центральные оси споры и кристалла совпадают.
Штамм В. thuringiensis B-1073 выделен из образца ила горячего источника Долины гейзеров при его высеве на агаризованную среду РПА (1:10, рН 5.0). На агаризованной среде штамм формирует влажные, ослизненные, белесые, высокие, непрозрачные, блестящие колонии. Клетки штамма палочковидные, размером 1-1.2×2-8 мкм, прямые или слабо изогнутые, расположены по 1-2 или в цепочках, параспоральные включения округлой формы плотно прилегают к эллиптической споре, расположение кристалла на споре свободное, размер кристалла, как правило, превышет диаметр споры.
Биохимические признаки штаммов
Выяснено, что все исследуемые штаммы способны к анаэробному росту, образуют кислоту из глюкозы и мальтозы, но, не из арабинозы, ксилозы, маннита и лактозы, не образуют индол, не дезаминируют фенилаланин, не обладают аргининдекарбоксилазой, не утилизируют цитрат. Штаммы продуцируют каталазу, лецитиназу, обладают липазной, желатиназной активностями, растут в присутствии 0,001% лизоцима. Штамм В. thuringiensis B-1069 отрицателен по амилазе, штаммы В. thuringiensis В-1091 и B-1073 обладают амилолитической активностью. Важно отметить, что исследуемые штаммы В. thuringiensis Долины гейзеров В-1091, B-1069, B-1073 согласно результатам косвенных тестов на патогенность не имели гемолитической, фибринолитической и плазмокоагулазной активностей.
Хранение штаммов
Субкультуры штаммов хранят периодическими пересевами на агаризованную среду А (0,7% пептона "Difco", 0,4% рыбного гидролизата, 0,5% NaCl, 1,7% агара, рН 7,0-7,2) и в 15% растворе глицерина при низкотемпературном замораживании при минус 65°С [5].
Посевной материал получают при выращивании штаммов на жидких или агаризованных средах: LB (0,25% LB "Difco"), LB с добавлением агара до 1,7%, среде А; значение рН всех сред составляет 7,0-7,2.
Ниже приведены примеры 1 и 2 исследования токсичности и противовирусной активности штаммов В. thuringiensis B-1091, В. thuringiensis В-1069, В. thuringiensis В-1073 относительно вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005(A/H5N1).
Пример 1. Подготовка препаратов на основе водорастворимых метаболитов штаммов Bt и их испытание на противовирусную активность.
Получение препарата на основе культуральной жидкости.
7
С использованием культур исследуемых штаммов, выращенных на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°С, готовят суспензии клеток с концентрацией 1-5×10 кл/мл. Приготовленные суспензии вносят в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивируют в течение 18 часов с применением термостатированной качалки (КТ 104, Россия). Для приготовления препаратов используют клеточные культуры бацилл, находящиеся в вегетативной стадии развития. Отсутствие процесса споруляции и формирования параспоральных включений контролируют при микроскопировании клеток культур методом фазового контраста (микроскоп Axioskop 40, "Карл Цейсс", Германия).
Для приготовления препарата на основе культуральной жидкости (КЖ) полученную КЖ штаммов центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). Надосадочную жидкость стерилизуют ультрафильтрацией через Whatman фильтр с размерами пор 0,2 мкм и хранят до использования при температуре минус 20°С.
Получение препарата на основе лизатов клеток.
2
После центрифугирования и использования надосадочной жидкости осадки клеток ресуспендируют в 4 мл дистиллированной НО и обрабатывают на УЗ-дезинтеграторе до 15 раз (с амплитудой 18) в течение 30", с интервалом 30", добиваясь максимально возможного разрушения клеток. Отсутствие спор и параспоральных кристаллов, степень разрушения клеток в суспензии после обработки УЗ контролировали с помощью фазово-контрастной микроскопии (микроскоп Axioskop 40, "Карл Цейсс", Германия). После УЗ обработки суспензию освобождают от остатков клеток центрифугированием при 8000 об/мин на микроцентрифуге (Eppendorf, Centrifuge 5415C), супернатант отбирают и стерилизуют ультрафильтрацией. Полученный препарат хранят до использования при температуре минус 20°С.
Подготовка к тестированию штамма вируса и культуры клеток.
50
Для оценки противовирусной эффективности полученных препаратов Bt использовали высокопатогенный вирус гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (A/H5N1) из коллекции ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, наработанный на 10-суточных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). Концентрация вируса в вирусаллантоисной жидкости (ВАЖ) составляла 9,5 lgЭИД/мл (50% эмбриональных инфицирующих доз в мл).
5
2
Для тестирования токсичности и противовирусной активности препаратов Bt использовали перевиваемую культуру клеток MDCK, полученную из коллекции культур клеток ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. В асептических условиях суспензию с известной концентрацией клеток разводили предварительно подогретой до температуры 37°С средой Axcevir-MDCK, фирмы Stem Alpha (Франция) до концентрации 1×10 кл/мл и по 100 мкл вносили в лунки 96-луночных планшетов. Планшеты с клетками помещали в термостат при температуре 37°С, 5% CO и 100% влажности на 2-3 суток до образования монослоя.
Определение токсичности препаратов.
2
Для определения токсических доз препараты разводили в 2, 10, 100, 1000, 10000, 100000, 1000000 раз средой Axcevir-MDCK, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета с клетками MDCK и инкубировали в термостате при температуре 37°С, 5% СО и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов. Для определения противовирусной активности препаратов использовали максимально переносимые концентрации (МПК).
Определение противовирусной активности препаратов.
2
Для определения противовирусной активности препаратов готовили десятикратные разведения ВАЖ от 1 до 8 с использованием среды Axcevir-MDCK, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Далее в монослой культуры клеток MDCK вносили по 50 мкл выбранного разведения препарата и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре 37°С в атмосфере 5% CO в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.
Ниже приведены примеры 2, 3, 4, 5, 6 и 7 конкретного применения заявляемых штаммов.
Пример 2. Испытание противовирусного действия препарата №11, приготовленного на основе культуральной жидкости штамма Bacillus thuringiensis B-1091.
Приготовление бактериального препарата №11.
7
С использованием культуры штамма Bacillus thuringiensis B-1091, наработанной на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°С, готовили суспензию клеток с концентрацией 1-5×10 кл/мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки при температуре 28-30°С и скорости 190 об/мин. Для приготовления препаратов использовали КЖ бацилл, находящихся в вегетативной стадии развития. Отсутствие процесса споруляции и формирования параспоральных включений контролировали при микроскопировании культуры методом фазового контраста. Для приготовления препарата №11 на основе культуральной жидкости штамма В. thuringiensis B-1091 полученную КЖ штамма центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). Надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр с размерами пор 0,2 мкм. Полученный препарат хранили до использования при температуре минус 20°С.
Определение токсических доз препарата №11.
2
Препарат №11 разводили в 2, 10, 100, 1000, 10000, 100000, 1000000 раз средой Axcevir-MDCK, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета и инкубировали в термостате при температуре 37°С, 5% СО, и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов. Препарат №11 был нетоксичен на клеточной культуре MDCK при всех используемых разведениях. Для оценки противовирусной активности препарата №11 использовали разведение в 2 раза.
2
Определение противовирусной активности препарата №11. Готовили десятикратные разведения ВАЖ от 1 до 8 с использованием среды Axcevir-MDCK, содержащей 2 мкг/мл трипсина. В монослой культуры клеток MDCK вносили по 50 мкл/лунку препарата №11, разведенного в 2 раза средой Axcevir-MDCK, и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре 37°С в атмосфере 5% СО, в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.
При высокой инфекционности вируса на клетках MDCK (титр в lgТЦД50/мл составил 9,5) ее нейтрализация под влиянием препарата №11 составляла 8 lg.
Пример 3. Испытание противовирусного действия препарата №61, приготовленного на основе лизатов клеток штамма Bacillus thuringiensis B-1091.
Приготовление бактериального препарата №61.
7
С использованием культуры штамма Bacillus thuringiensis В-1091, выращенной на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°С, готовили суспензию клеток с концентрацией 1-5×10 кл/мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки при температуре 28-30°С и скорости 190 об/мин. Для приготовления препарата №61 использовали клеточные культуры бацилл, находящихся в вегетативной стадии развития. Полученную КЖ центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). После центрифугирования надосадочную жидкость убирали, а осадок клеток ресуспендировали в 4 мл дистиллированной воды и обрабатывали 10 раз на УЗ-дезинтеграторе (амплитуда 18) в течение 30" с интервалом 30". При этом степень разрушения клеток штамма Bacillus thuringiensis В-1091 составила 50%. Отсутствие спор и параспоральных кристаллов, степень разрушения клеток в суспензии после обработки УЗ контролировали с помощью фазово-контрастной микроскопии. После УЗ обработки суспензию освобождали от остатков клеток центрифугированием при 8000 об/мин на микроцентрифуге (Eppendorf, Centrifuge 5415C), супернатант отбирали, стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр с размерами пор 0,2 мкм. Полученный препарат №61 хранили до использования при температуре минус 20°С.
Определения токсических доз препарата №61.
2
Препарат №61 разводили в 2, 10, 100, 1000, 10000, 100000, 1000000 раз средой Axcevir-MDCK, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета и инкубировали в термостате при температуре 37°С, 5% CO и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK с разными концентрациями препаратов. Препарат №61 был нетоксичен на клеточной культуре MDCK при всех используемых разведениях. Для оценки противовирусной активности препарата № 61 использовали его разведение в 2 раза.
Определение противовирусной активности препарата №61.
2
Готовили десятикратные разведения ВАЖ от 1 до 8 с использованием среды Axcevir-MDCK, содержащей 2 мкг/мл трипсина. В монослой культуры клеток MDCK вносили по 50 мкл/лунку препарата, разведенного в 2 раза средой Axcevir-MDCK, и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре 37°С в атмосфере 5% СO, в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.
При высокой инфекционности вируса на клетках MDCK (титр в lgТЦД50/мл составил 9,5) ее нейтрализация под влиянием препарата №61 составляла 7 lg.
Пример 4. Испытание противовирусного действия препарата №48, приготовленного на основе культуральной жидкости штамма Bacillus thuringiensis B-1069.
Приготовление бактериального препарата №48.
7
С использованием культуры штамма Bacillus thuringiensis B-1069, выращенной на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°С, готовили суспензию клеток с концентрацией 1-5×10 кл/мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки при температуре 28-30°С и скорости 190 об/мин. Для приготовления препарата использовали КЖ бацилл, находящихся в вегетативной стадии развития. Отсутствие процесса споруляции и формирования параспоральных включений контролировали при микроскопировании культуры методом фазового контраста.
Для приготовления препарата №48 полученную КЖ штамма В. thuringiensis B-1069 центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). Надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр с размерами пор 0,2 мкм. Полученный препарат №48 хранили до использования при температуре минус 20°С.
Определение токсичности препарата №48.
Для определения токсических доз препарат №48 разводили в 2, 10, 100, 1000, 10000, 100000, 1000000 раз средой Axcevir-MDCK, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета и инкубировали в термостате при температуре 37°С, 5% С02 и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK с разными концентрациями препарата. Препарат №48 был токсичен на клеточной культуре MDCK при разведении в 2 раза и нетоксичен при всех других используемых разведениях. Для оценки противовирусной активности препарата №48 использовали его разведение в 10 раз.
Определение противовирусной активности препарата №48.
2
Для определения противовирусной активности препарата готовили десятикратные разведения ВАЖ от 1 до 8 с использованием среды Axcevir-MDCK, содержащей 2 мкг/мл трипсина. В монослой культуры клеток MDCK вносили по 50 мкл/лунку препарата, разведенного в 10 раз средой Axcevir-MDCK, и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре 37°С в атмосфере 5% СО, в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.
При высокой инфекционности вируса на клетках MDCK (титр в lgТЦД50/мл составил 9,5) ее нейтрализация под влиянием препарата №48 составляла 7 lg.
Пример 5. Испытание противовирусного действия препарата №57, приготовленного на основе лизатов клеток штамма Bacillus thuringiensis B-1069.
Приготовление бактериального препарата №57.
7
С использованием культуры штамма Bacillus thuringiensis В-1069, наработанной на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°С, готовили суспензию клеток с концентрацией 1×10 кл/мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки. Для приготовления препарата №57 использовали клеточные культуры бацилл, находящиеся в вегетативной стадии развития. Полученную культуральную жидкость центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). После центрифугирования надосадочную жидкость убирали, а осадок клеток ресуспендировали в 4 мл дистиллированной воды и обрабатывали 10 раз на УЗ-дезинтеграторе (амплитуда 18), в течение 30", с интервалом 30". При этом степень разрушения клеток штамма Bacillus thuringiensis В-1069 составила 90%.
Отсутствие спор и параспоральных кристаллов, степень разрушения клеток в суспензии после обработки УЗ контролировали с помощью фазово-контрастной микроскопии. После УЗ обработки, суспензию разрушенных клеток центрифугировали при 8000 об/мин на микроцентрифуге, супернатант отбирали, стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр с размерами пор 0,2 мкм. Полученный препарат № 57 хранили до использования при температуре минус 20°С.
Определение токсичности препарата №57.
2
Для определения токсических доз препарат №57 разводили в 2, 10, 100, 1000, 10000, 100000, 1000000 раз средой Axcevir-MDCK, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета и ставили в термостат при температуре 37°С, 5% СО и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препарата. Препарат №57 был токсичен на клеточной культуре MDCK при разведении в 2 раза и нетоксичен при всех других используемых разведениях. Для оценки противовирусной активности препарата №57 использовали его разведение в 10 раз.
Определение противовирусной активности препарата №57.
2
Для определения противовирусной активности препарата готовили десятикратные разведения ВАЖ от 1 до 8 с использованием среды Axcevir-MDCK, содержащей 2 мкг/мл трипсина. В монослой культуры клеток MDCK вносили по 50 мкл/лунку препарата, разведенного в 10 раз средой Axcevir-MDCK, и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре 37°С в атмосфере 5% СO в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.
При высокой инфекционности вируса на клетках MDCK (титр в lgТЦД50/мл составил 9,5) ее нейтрализация под влиянием препарата №57 составляла 7 lg.
Пример 6. Испытание противовирусного действия препарата №43, приготовленного на основе культуральной жидкости штамма Bacillus thuringiensis B-1073.
Приготовление бактериального препарата №43.
7
С использованием культуры штамма Bacillus thuringiensis B-1073, наработанной на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°С, готовили суспензию клеток с концентрацией 1х10 кл/мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки. Для приготовления препаратов использовали клеточные культуры бацилл, находящиеся в вегетативной стадии развития. Отсутствие процесса споруляции и формирования параспоральных включений контролировали при микроскопировании культуры методом фазового контраста. Для приготовления препарата №43 на основе культуральной жидкости полученную КЖ штамма центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). Надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр с размерами пор 0,2 мкм. Полученный препарат №43 хранили до использования при температуре минус 20°С.
Определение токсичности препарата №43.
2
Для определения токсических доз препарат №43 разводили в 2, 10, 100, 1000, 10000, 100000, 1000000 раз средой Axcevir-MDCK, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета и ставили в термостат при температуре 37°С, 5% СО и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов. Препарат №43 был нетоксичен на клеточной культуре MDCK при всех используемых разведениях. Для оценки противовирусной активности препарата использовали разведение в 2 раза.
Определение противовирусной активности препарата №43.
2
Для определения противовирусной активности препарата №43 готовили десятикратные разведения ВАЖ от 1 до 8 с использованием среды Axcevir-MDCK, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Далее в монослой культуры клеток MDCK вносили по 50 мкл/лунку препарата, разведенного в 2 раза средой Axcevir-MDCK, и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре 37°С в атмосфере 5% CO в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.
При высокой инфекционности вируса на клетках MDCK (титр в lgТЦД50/мл составил 9,5) ее нейтрализация под влиянием препарата №43 составляла 8 lg.
Пример 7. Испытание противовирусного действия препарата №58, приготовленного на основе лизатов клеток штамма Bacillus thuringiensis B-1073.
Приготовление бактериального препарата №58.
7
С использованием культуры штамма Bacillus thuringiensis В-1073, наработанной на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°С, готовили суспензию клеток с концентрацией 1×10 кл/мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки. Для приготовления препарата №58 использовали клеточные культуры бацилл, находящиеся в вегетативной стадии развития. Полученную культуральную жидкость центрифугировали - при 6000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). После центрифугирования надосадочную жидкость убирали, а осадок клеток ресуспендировали в 4 мл дистиллированной воды и обрабатывали 10 раз на УЗ-дезинтеграторе (амплитуда 18), в течение 30", с интервалом 30". При этом степень разрушения клеток штамма Bacillus thuringiensis В-1073 составила 90%. С помощью фазово-контрастной микроскопии в суспензии после обработки УЗ контролировали отсутствие спор и параспоральных кристаллов, степень разрушения клеток. После УЗ-обработки суспензию разрушенных клеток центрифугировали при 8000 об/мин на микроцентрифуге, супернатант отбирали, стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр с размерами пор 0,2 мкм. Полученный препарат №58 хранили до использования при температуре минус 20.
Определение токсичности препарата №58.
2
Для определения токсических доз препарат №58 разводили в 2, 10, 100, 1000, 10000, 100000, 1000000 раз средой Axcevir-MDCK, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета и ставили в термостат при температуре 37°С, 5% СО и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов. Препарат №58 был нетоксичен на клеточной культуре MDCK при всех используемых разведениях. Для оценки противовирусной активности препарата №58 использовали разведение в 2 раза.
Определение противовирусной активности №58.
2
Для определения противовирусной активности препарата готовили десятикратные разведения ВАЖ от 1 до 8 с использованием среды Axcevir-MDCK, содержащей 2 мкг/мл трипсина. В монослой культуры клеток MDCK вносили по 50 мкл/лунку препарата, разведенного в 2 раза средой Axcevir-MDCK, и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре 37°С в атмосфере 5% СО в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.
При высокой инфекционности вируса на клетках MDCK (титр в lgТЦД50/мл составил 9,5) ее нейтрализация под влиянием препарата №58 составляла 7 lg.
Таким образом, впервые было показано, что препараты, приготовленные как на основе культуральной жидкости штаммов Bacillus thuringiensis В-1091, Bacillus thuringiensis В-1069 и Bacillus thuringiensis В-1073 Долины гейзеров, так и препараты, приготовленные на основе лизатов клеток этих же штаммов, проявили высокую противовирусную активность относительно высокопатогенного вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (A/H5N1).
Источники научно-технической информации
1. Feitelson J.S., Payne J., Kim I. // Biotechnology. - 1992. - V.10. - P.271-275.
2. Юдина Т.Г., Бурцева Л.И. // Микробиология. - 1997. - Т.66. - №1.- С.25-31.
3. Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты / Под ред. Глупова В.В. - М.: Круглый год, 2001. - 716 с.
4. Ahem М., Verschueren S., van Sinderen D. // FEMS Microbiol.Letters. - 2003. - V.220. - P.127-131.
5. Методы общей бактериологии / под ред. Ф.Герхарда и др. - М.: Мир, 1983. - С.528