СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АНОМАЛИЙ УПАКОВКИ ХРОМАТИНА СПЕРМАТОЗОИДОВ ПРИ МУЖСКОМ БЕСПЛОДИИ

1. Способ диагностики аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии, характеризуемый тем, что образец спермы очищают от сопутствующих соматических и не дифференцированных клеток, очищенные сперматозоиды осаждают центрифугированием, промывают в буферном растворе с pH 7,6÷8,0, осадок ресуспендируют в буферном растворе с pH 7,8÷8,2 в присутствии 10÷15 мМ Трис-HCl, инкубируют при охлаждении, клетки осаждают центрифугированием с последующим промыванием осадка, промытый осадок ресуспендируют в растворе с pH 7,8÷8,2 в присутствии 8,0÷12 мМ Трис-HCl, к полученной суспензии добавляют микрококковую нуклеазу, образцы инкубируют при температуре от 10 до 40°С, останавливают гидролиз с последующей гомогенизацией и повторным центрифугированием образцов с получением осадка, содержащего нерастворимый хроматин, и супернатанта, содержащего растворимый хроматин, в полученных осадке и супернатанте раздельно определяют содержание ДНК, и по процентному содержанию ДНК в осадке диагностируют наличие аномалии упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что образец спермы очищают по стандартному методу.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что сперматозоиды осаждают при скорости центрифугирования 4000÷6000 об/мин.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что при ресуспендировании используют 1% раствор Тритон Х-100.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что инкубирование осуществляют в течение 5-10 мин на льду.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что осадок промывают, по меньшей мере, один раз буферным раствором с pH.
2
2
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что осадок ресуспендируют в растворе, содержащем 20 мМ Трис-HCl (pH 8), 2 мМ Ca Cl, 2 мМ MgCl.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что микрококковую нуклеазу добавляют в диапазоне концентраций от 10 до 50 ед/мг.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что останавливают гидролиз добавлением ЭДТА до 10 мМ во льду.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что образцы гомогенизируют энергичным встряхиванием или в приборе «Вортекс».
11. Способ по п.1, отличающийся тем, что образцы повторно центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5-10 мин.
4
4
12. Способ по п.1, отличающийся тем, что для пределения количества ДНК в осадке к осадку добавляют 0,5 мл 0,5 н NaOH, суспензию инкубируют 20 мин при 60°С, образцы переносят на лед, после чего добавляют HClO до 5%, образцы центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 мин для отделения РНК, к осадку добавляют 5% HClO, суспензию кипятят 15 мин, центрифугируют при 5000-8000 об/мин в течение 5-7 мин, после центрифугирования концентрацию ДНК определяют на спектрофотометре.
4
4
13. Способ по п.1, отличающийся тем, что для определения количества ДНК во фракции растворимого хроматина к супернатанту добавляют 57% HClO до конечной концентрации 5%, инкубируют на льду в течение 10 мин и центрифугируют суспензию, отделяют осадок, к осадку, содержащему растворимый хроматин, добавляют 5% НСlО, суспензию кипятят 15 мин с последующим центрифугированием, после центрифугирования концентрацию ДНК определяют на спектрофотометре.