СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВОИШЕМИЧЕСКОЙ И АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
METHOD FOR PRODUCING AGENT POSSESSING ANTI-ISCHEMIC AND ANTIOXIDANT ACTIVITY

Изобретение относится к области фармации, касается способа получения лекарственного средства из сбора растений (астрагала перепончатого, шлемника байкальского, вздутоплодника сибирского), обладающего противоишемической и антиоксидантной активностью.
Одной из важнейших медико-социальных проблем современного общества являются цереброваскулярные заболевания, характеризующиеся высокими показателями инвалидизации и смертности в развитых странах [14]. В России ежегодно регистрируют около 400-450 тысяч инсультов, из которых 80% имеют ишемический характер [5]. Учитывая гетерогенный характер цереброваскулярных заболеваний, целесообразным подходом в фармакотерапии считается комплексное воздействие на факторы и звенья патогенеза ишемии головного мозга. Данный подход в достаточной мере может быть реализован с применением растительных средств, содержащих, как правило, целый комплекс биологически активных веществ. Известно, что они влияют на многие обменные процессы, оказывают устойчивый лечебный эффект с отсутствием побочных явлений в сравнении с синтетическими препаратами [18, 25, 27, 37, 52, 53].
С учетом сложного патогенеза цереброваскулярного заболевания нами выбраны растения, обладающие нейромодулирующим, нейропротективным, вазоактивным свойствами: астрагал перепончатый, шлемник байкальский, вздутоплодник сибирский. Так, экстракты и действующие вещества из астрагала перепончатого оказывают противоглутаматное, нейропротективное действие при глутаматной нейротоксичности [16, 24], тритерпеновый сапонин - астрагалозид IV, проявляет защитный эффект при ишемии мозга [30, 49]. Доказано также противоишемическое действие каликозина при повреждении эндотелия сосудов [39, 44]. Экстракты из корней шлемника байкальского, его флавоноиды (байкалин, байкалеин, вогонин, ороксилин А) оказывают нейропротективное действие благодаря стимуляции ГАМКл-рецепторов [17, 29, 31, 34, 38, 41, 42, 46, 55]. Флавоноиды, выделенные из этого растения, кроме того, обладают выраженной антиоксидантной активностью [32, 35, 36, 43, 47, 48, 50]. Важной составляющей их нейропротективного эффекта является противовоспалительное действие [33, 54]. Содержание в корнях вздутоплодника сибирского кумаринов (виснадин, дигидросамидин, умбеллиферон) [1,15], аминокислот (фосфоэтаноламин, аспарагиновая кислота, аспарагин, глутаминовая кислота, глютамин, глицин, аланин, γ-аминомасляная кислота) [22] обусловливает спазмолитическое, антиоксидантное, нейромодулирующее и нейропротекторные свойства [11]. Установлено церебропротекторное действие настойки и экстракта из корней вздутоплодника сибирского при ишемии головного мозга [44, 8-10, 12].
Таким образом, нами разработан оптимальный способ получения суммарного экстракта, обладающего широким диапазоном потенцированных противоишемической и антиоксидантной активностей для лечения и профилактики сосудистых расстройств головного мозга.
Известно лекарственное средство - сухой экстракт из листьев гинкго билоба (Танакан), который содержит 22-27% флавонолгликозидов, 5-7% терпен-лактонов (из которых 2,8-3,4% представлены гинкголидами А, В и С, а 2,6-3,2% - билобалидом) и до 5 мкг/г гинколиевой кислоты [13, 21]; относится к ангиопротекторным средствам и является стандартизированным препаратом растительного происхождения, действие которого обусловлено влиянием на процессы обмена веществ в клетках, реологические свойства крови, а также на вазомоторные реакции кровеносных сосудов. Препарат улучшает снабжение мозга кислородом и глюкозой. Нормализует тонус артерий и вен, улучшает микроциркуляцию. Способствует улучшению кровотока, препятствует агрегации эритроцитов. Оказывает тормозящее влияние на фактор активации тромбоцитов. Улучшает метаболические процессы, оказывает антигипоксическое действие на ткани. Препятствует образованию свободных радикалов биомакромолекул и перекисному окислению липидов клеточных мембран. Воздействует на высвобождение, обратный захват и катаболизм нейромедиаторов (норадреналина, ацетилхолина, допамина, серотонина) и на их способность к связыванию с мембранными рецепторами [19, 28, 40].
К недостаткам указанного средства относятся: возможность возникновения кровоточивости при длительном применении из-за снижения свертываемости крови, расстройства со стороны пищеварительной системы, слабее выражены нейромодулирующая активность по сравнению со средством, полученным по предлагаемому способу [26].
Технический результат изобретения - расширение ассортимента нейропротективных лекарственных средств растительного происхождения, обладающих более выраженной противоишемической и антиоксидантной активностью, за счет использования широко распространенного растительного сырья, имеющего надежную и обеспеченную сырьевую базу. Использование растительного средства в виде экстракта сухого позволит получать препарат с определенным содержанием действующих веществ.
Технический результат достигается тем, что измельченный растительный материал следующего состава (мас. части): корни астрагала перепончатого - 40, корни шлемника байкальского - 35, корневища и корни вздутоплодника сибирского - 25, экстрагируют трехкратно при отношении 1 мас. ч. сырья: 12 об. ч экстрагента при температуре 60°С. При первом, втором и третьем контактах фаз используется экстрагент 60% этиловый спирт, экстракция выполняется в течение 60 минут. Объединенное спиртовое извлечение после трех экстракций упаривают до 1/5 первоначального объема. Объединенные кубовые остатки от трех извлечений сепарируют. Полученный продукт доупаривают приблизительно до 1/3 и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Выход готового продукта составляет 28,00% от массы растительного материала. Сухой экстракт представляет собой аморфный порошок от светло-коричневого до темно-коричневого цвета со специфическим запахом, потеря в массе при высушивании не превышает 5%.
Предлагаемый способ получения достаточно прост, не требует сложной схемы очистки, позволяет получить продукт постоянного состава. Технология может быть внедрена на предприятиях по выпуску лекарственных препаратов.
На первоначальном этапе исследований проводился подбор типа экстрагента, который, действуя как активный компонент системы, влияет на скорость, полноту и качество экстрагирования биологически активных веществ из растительного материала. В качестве экстрагентов были использованы вода и водно-спиртовые растворы различной концентрации. Результаты приведены в таблице 1.
Эффективность экстракции оценивали по количественному выходу экстрактивных веществ [7] и по выходу флавоноидов, свободных аминокислот.
Количественное определение суммы флавоноидов и суммы свободных аминокислот в сборе нейропротективном проводили методом спектрофотометрии.
Методика количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на байкалин в растительной композиции
Аналитическую пробу растительной композиции измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм.
1
Около 1 г (точная навеска) измельченной растительной смеси помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 100 мл 60% этанола (V), взвешивают с погрешностью ± 0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и экстрагируют на кипящей водяной бане в течение 1 часа. Колбу с содержимым охлаждают, взвешивают, доводят до первоначальной массы 60% этанолом.
2
Извлечение фильтруют через бумажный складчатый фильтр, отбрасывая первые 10 мл фильтрата (раствор А). 0,5 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл (V), доводят объем раствора 60% этанолом до метки и перемешивают (раствор Б).
Измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 279±2 нм. В качестве раствора сравнения используют 60% этанол. Параллельно в тех же условиях измеряют оптическую плотность раствора РСО байкалина (раствор Б).
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на байкалин и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:
где D - оптическая плотность испытуемого раствора;
0
D - оптическая плотность раствора РСО байкалина;
m - масса растительной смеси, г;
0
m - масса РСО байкалина, г;
W - влажность растительной смеси, %;
1
2
3
4
V - объем экстрагента, V, V, V- разведения, мл.
3
4
Приготовление раствора РСО байкалина: Около 0,015 г (точная навеска) байкалина помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл (V), растворяют в 2 мл диметилсульфоксида, доводят объем раствора до метки 60% этанолом и перемешивают (раствор А). 2 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл (V), доводят объем раствора до метки 60% этанолом и перемешивают (раствор Б).
Методика количественного определения суммы свободных аминокислот в пересчете на аргинин в растительной композиции
Аналитическую пробу растительной композиции измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм.
1
Около 1 г (точная навеска) измельченной растительной смеси помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 150 мл воды очищенной (V), взвешивают с погрешностью ± 0,01 г. Содержимое колбы экстрагируют на водяной бане с обратным холодильником при температуре 90°С в течение 1 часа. Затем колбу с содержимым охлаждают, взвешивают, доводят до первоначальной массы водой очищенной.
Извлечение фильтруют через бумажный складчатый фильтр, отбрасывая первые 10 мл фильтрата (раствор А).
2
В пробирку вместимостью 25 мл помещают 1 мл раствора А, прибавляют к нему 2 мл ацетатного буфера 4,5, 2 мл 0,05% водного раствора аскорбиновой кислоты, 1 мл 0,2% водного раствора нингидрина и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 минут. После охлаждения раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл (V), доводят объем раствора водой до метки, перемешивают и через 1 ч после начала реакции определяют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 568±2 нм. В качестве раствора сравнения используют воду.
Параллельно в аналогичных условиях проводят реакцию свежеприготовленного раствора РСО аргинина (1 мл) с 0,2% водным раствором нингидрина (1 мл) в присутствии ацетатного буфера 4,5 (2 мл), 0,05% водного раствора аскорбиновой кислоты (2 мл) и измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 568±2 нм. В качестве раствора сравнения используют воду.
Содержание суммы свободных аминокислот в пересчете на аргинин и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:
где D - оптическая плотность испытуемого раствора;
0
D - оптическая плотность раствора РСО аргинина;
m - масса растительной смеси, г;
0
m - масса РСО аргинина, г;
W - влажность растительной смеси, %.
1
2
4
3
V - объем экстрагента, V=V, V- разведения, мл.
3
Приготовление раствора РСО аргинина: Около 0,025 г (точная навеска) аргинина помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл (V), растворяют в 40-50 мл воды очищенной, доводят объем раствора до метки водой и перемешивают.
Как видно из таблицы 1, с увеличением концентрации водно-спиртовых растворов повышается содержание суммы флавоноидов, экстрактивных веществ в извлечениях растительной смеси и при 60% этаноле достигает максимальных значений, поэтому в дальнейших исследованиях в качестве экстрагента выбран 60% этанол.
Используя для экстракции 60% этанол в различных соотношениях к количеству сырья 1:5, 1:7, 1:10, 1:12, 1:15, 1:20, получили соответствующие выходы экстрактивных веществ, флавоноидов и свободных аминокислот (табл. 2). Полученные данные свидетельствуют о том, что при соотношении сырья и экстрагента 1:10 и выше количество экстрагируемых веществ примерно одинаково, в этой связи нерационально увеличение объема экстрагента.
Как известно, степень измельчения растительного материала является важным фактором повышения выхода действующих веществ и интенсификации процесса экстрагирования. На основании экспериментальных данных (табл. 3) для сбора нами выбрана степень измельчения 1 мм, которая обеспечивает максимальный выход суммы экстрактивных веществ. Дальнейшее уменьшение размера частиц приводит к затруднению процесса фильтрации, а увеличение размера частиц ведет к уменьшению выхода суммы экстрактивных веществ.
Исследовано влияние температурного режима на выход суммы экстрактивных веществ и действующих веществ (табл. 4). Полученные результаты свидетельствуют о том, что с увеличением температуры повышается выход БАВ и выбрана оптимальная температура 60°С. Использование слишком высоких температур увеличивает энергозатратность производства готового продукта, поэтому для интенсификации процесса экстракции и рационального использования сырья можно дополнительно использовать перемешивание и оптимизировать время и кратность экстракции.
С целью определения продолжительности и кратности числа экстракций изучено время наступления равновесной концентрации в системе «сырье-экстрагент». Для этого проводили 4-кратную 2-часовую экстракцию измельченного сбора 60% этанолом в соотношении 1:12 (с учетом коэффициента водопоглощения = 2) на водяной бане при температуре 60°С. Через заданные промежутки времени (15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120 мин) извлечения фильтровали (1-й контакт фаз), определяя содержание суммы экстрактивных веществ и действующих веществ. Аналогичным образом проводили две последующие экстракции отжатого сырья при том же промежутке времени, подавая каждый раз 60% этанол в количестве, равном объему слитого извлечения (2-й и 3-й контакты фаз), полученные извлечения также анализировали на содержание экстрактивных веществ, флавоноидов, свободных аминокислот. Экспериментальные данные, представленные в таблице 5, свидетельствуют о том, что равновесное состояние во время I контакта фаз наступает через 60 минут, во время II - через 60 минут, во время III - через 60 минут. Как видно из таблицы 5, трехкратная экстракция обеспечивает максимальный выход как действующих, так и экстрактивных веществ.
В результате проведенных исследований установлены оптимальные условия экстрагирования сбора нейропротективного: экстрагент - 60% этанол, его соотношение к количеству сырья - 1:10, температурный режим - 60°С, степень измельчения сбора - 1 мм. Время I экстракции - 1 час, II - 1 час, III - 1 час.
Все подобранные оптимальные параметры процесса экстракции были положены в основу первой серии балансовых загрузок, на основании которой была разработана технологическая схема получения экстракта сухого из сбора нейропротективного.
Способ получения иллюстрируется следующим примером. 1 кг растительной композиции следующего состава (мас. части): корни астрагала перепончатого - 40, корни шлемника байкальского - 35, корневища и корни вздутоплодника сибирского - 25, измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 1 мм. Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливают 12 л 60% этанола в соотношении сырье-экстрагент 1:12 с учетом коэффициента водопоглощения. Экстрагируют при 60°С и постоянном перемешивании. Первый контакт фаз в течение 60 мин. Извлечение фильтруют через серошинельное сукно в сборник. Проводят еще две экстракции в течение 60 мин каждая, подавая в экстрактор 60% этанол в количестве, равном объему слитого. 1-й слив - 10 л; 2-й слив - 9 л; 3-й слив - 8,9 л. Водно-спиртовое извлечение после трех контактов фаз последовательно порциями упаривают примерно до 1/5 первоначального объема. Объединенные кубовые остатки от трех извлечений подвергают очистке сепарированием. Очищенный экстракт доупаривают до 1/3 первоначального объема и сушат на нержавеющих противнях в вакуумной сушилке при 65-70°С 8 ч. Получают 280,0 г готового продукта, что составляет 28,00% сухого экстракта от массы исходной растительной композиции. Сухой экстракт представляет собой аморфный порошок от светло-коричневого до темно-коричневого цвета и со специфическим запахом, комкуется, потеря в массе при высушивании - 4,05%. Содержание суммы флавоноидов - 30,28%, суммы свободных аминокислот - 9,26%.
Сравнительная характеристика заявляемого способа с выбранным прототипом представлена в табл. 7, 8, 9, 10.
Определение антиоксидантной активности средства, обладающего противоишемической и антиоксидантной активностью
Известно, что свободные радикалы биомакромолекул и реакции с их участием являются одним из основных механизмов развития и прогрессирования ишемии головного мозга. В этой связи значительный интерес представляет определение антиоксидантной активности полученного экстракта. Для определения антиоксидантной активности испытуемого экстракта использовали метод, основанный на взаимодействии антиоксидантов со стабильным хромоген-радикалом 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилом (ДФПГ) [51]. Метод отличается высокой чувствительностью к антирадикальным антиоксидантам.
Этанольные растворы образцов средства, обладающего противоишемической и антиоксидантной активностью, (0,1 мл) в различных концентрациях (80, 160, 240, 320, 400 мкг/мл) были смешаны с 1 мл 0,2 мМ ДФПГ, растворенного в 60% этаноле. Смесь инкубировали 20 мин при 25°С в темноте. Контроль содержал все реагенты без образцов. ДФПГ радикалсвязывающую активность экстракта определяли измерением абсорбции при λ=517 nm спектрофотометрически. Радикалсвязывающую активность (%) образцов высчитывали по формуле:
% ингибирования = АБ-АА/АБ×100,
где АБ - абсорбция контроля, АА - абсорбция тестируемого экстракта.
Антирадикальную активность тестируемого экстракта определяли по снижению абсорбции при λ=517 nm. Результаты теста свидетельствуют о выраженной антирадикальной активности испытуемого экстракта. ДФПГ радикалсвязывающая активность экстракта повышается с увеличением концентрации: наибольшая активность экстракта отмечается в концентрации 400 мкг/мл.
Таким образом, установлено, что испытуемый экстракт обладает выраженной антирадикальной - антиоксидантной активностью, способной влиять на течение ишемии головного мозга. Антиоксидантная активность экстракта обусловлена преимущественно наличием флавоноидов, аминокислот.
Определение противоишемической активности средства, обладающего противоишемической и антиоксидантной активностью
Опыты проводили на крысах обоего пола линии Wistar с массой 160-180 г. Исследования выполнялись согласно «Правилам лабораторной практики» (Приложение Приказа Минздравсоцразвития России от 23.08.2010 г. №708н «Об утверждении Правил лабораторной практики»).
Эксперименты проводили в двух последовательных сериях. В первой серии ишемию головного мозга у крыс воспроизводили путем окклюзии левой общей сонной артерии под легким эфирным наркозом. Животные были распределены на четыре группы. Первую контрольную группу составили оперированные животные, получавшие per os дистиллированную воду 1 раз в день в течение 7 суток до и после операции. Вторую группу составили ложнооперированнные крысы, им вводили дистиллированную воду. Крысы третьей и четвертой групп получали соответственно средство, обладающее противоишемической и антиоксидантной активностью, и Танакан в дозах по 100 мг/кг до и после операции по аналогичной схеме. Через 7 суток после операции проводили тестирование поведения животных в установке «Открытое поле», крестообразный приподнятый лабиринт (КПЛ) [3]. По окончании опыта крыс декапитировали, извлекали головной мозг, готовили гомогенат ткани для определения конечного продукта перекисного окисления липидов - малонового диальдегида (МДА) по стандартному методу [20].
Во второй серии экспериментов ишемию головного мозга у крыс воспроизводили путем окклюзии обеих общих сонных артерий под легким эфирным наркозом. Крысам опытных групп вводили испытуемые экстракты внутрибрюшинно в дозах по 100 мг/кг массы за 30 мин до перевязки сонных артерий и через 4 часа после операции. Животным контрольной группы вводили внутрибрюшинно физиологический раствор по аналогичной схеме. Неврологический дефицит у животных оценивали по модифицированной шкале Мс Grow через 24 часа: регистрировали неврологические симптомы, а соответствующие им баллы (Stroke index) суммировались [6, 45].
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента [7].
Недостаточность мозгового кровообращения, вызванная односторонней окклюзией левой общей сонной артерии, приводила к изменению поведенческих реакций у животных контрольной группы в тесте «Открытое поле» и КПЛ (табл. 7, 8). В первом эксперименте у крыс, получавших средство, обладающее противоишемической и антиоксидантной активностью, показатели горизонтальной и вертикальной активности в тесте "Открытое поле" были в 2,3 (р≤0,05) и 1,5 (р≤0,05) раз выше таковых контрольных показателей, а количество дефекационных болюсов в 1,7 раз меньше контроля, что были сопоставимы с таковыми показателями ложнооперированных животных. Показатели крыс, получавших Танакан, незначительно отличались от контрольных значений. Введение средства, обладающего противоишемической и антиоксидантной активностью, предупреждало развитие поведенческих изменений в КПЛ: количество выходов открытые рукава лабиринта и время, проведенное в них, также были выше контроля соответственно в 2,5 и 3 раза (р≤0,05). Введение Танакана незначительно влияло на поведенческие реакции крыс при ишемии мозга.
Причиной указанных расстройств у крыс контрольной группы, вероятно, является развитие нейромедиаторного дисбаланса в ответ на ишемическое воздействие. Известно, что чрезмерное повышение уровня глутамата при ишемии головного мозга вызывает продукцию свободных радикалов, окислительный стресс и интенсификацию перекисного окисления липидов. Так, содержание конечного продукта перекисного окисления липидов - МДА в головном мозге крыс контрольной группы увеличилось в два раза по сравнению с показателем 2 группы. В головном мозге крыс, получавших средство, обладающее противоишемической и антиоксидантной активностью, его содержание было меньше показателя крыс контрольной группы на 42% (р≤0,05). Содержание МДА в мозге крыс, получавших Танакан, было ниже контроля на 24%, но на 32% выше в сравнении с показателем крыс 3 группы (табл. 9). Можно предположить, что эффект средства, обладающего противоишемической и антиоксидантной активностью, обусловлен комплексной нейромодулирующей противоглутаматной, ГАМК-ергической активностью. Введение Танакана не оказывало заметного нейромодулирующего эффекта в условиях односторонней окклюзии сонной артерии.
Во втором эксперименте через 3 часа после операции у 20% крыс контрольной группы наблюдали развитие тонико-клонических судорог с последующим развитием комы. У остальных животных, в первые 4 часа наблюдений, отмечали быстрое нарастание очаговой (птоз, парез конечностей) и общей неврологической симптоматики (снижение двигательной активности, тонуса мышц, реакций на тактильные и болевые раздражители). К концу эксперимента показатель неврологического дефицита в контрольной группе составил 8,6, а выживаемости - 20% (табл.10). Введение средства, обладающего противоишемической и антиоксидантной активностью, оказывало противоишемическое действие: неврологический дефицит был меньше контроля на 36%. Неврологические нарушения у животных были менее выражены и заключались в замедленной реакции на внешние, болевые раздражители, малоподвижности. При этом неврологические расстройства в виде птоза, гемипарезов и комы отмечали реже по сравнению с контролем. Выживаемость животных через 24 часа составила 55%. Введение животным Танакана оказывало также церебропротекторное действие: неврологический дефицит был меньше на 23% по сравнению с контролем, выживаемость составила 50%. Церебропротекторный эффект Танакана был менее выражен по сравнению с таковыми показателями крыс, получавших средство, обладающее противоишемической и антиоксидантной активностью.
При окклюзии обеих общих сонных артерий у крыс введение средства, обладающего противоишемической и антиоксидантной активностью, оказывает противоишемическое действие. Защитный эффект испытуемого средства обусловлен ингибированием развития глутаматной эксайтотоксичности, окислительного повреждения нервной ткани, ГАМКергической активностью, о чем свидетельствует менее выраженный неврологический дефицит, высокий уровень выживаемости у крыс опытных групп по сравнению с контролем. Противоишемическое действие средства, обладающего противоишемической и антиоксидантной активностью, определяется вазоактивным, антиоксидантным, нейропротективным, нейромодулирующим свойствами содержащихся веществ, синергизм которых обеспечивает более выраженный эффект в сравнении с таковым Танакана. Фармакологические свойства испытуемого экстракта обусловлены наличием целого комплекса биологически активных веществ - флавоноидов, аминокислот, сапонинов, кумаринов в растениях [2, 23].
Таким образом, результаты исследований свидетельствуют о более выраженной противоишемической активности испытуемого экстракта при ишемии головного мозга в сравнении с Танаканом.
Список литературы
1. Антонова О.К. Кумарины корней Phlojodicarpus sibiricus / O.K. Антонова, Б.В. Шемерянкин // Химия природных соединений. - 1981. - №6. - С. 797-798.
2. Биологически активные вещества растительного происхождения / Б.Н. Головкин, Р.Н. Руденская, И.А. Трофимова и др. - М.: Наука, 2002. - 1014 с.
3. Буреш, Я. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения / Я. Буреш, О. Бурешова, Д.П. Хьюстон. - М.: Высшая школа, 1991. - 399 с.
4. Влияние на нейритный рост спинальных ганглиев эмбрионов цыплят этанольного экстракта вздутоплодника сибирского Phlojodicarpus sibiricus / А.Я. Шурыгин, Т.A. Асеева, Н.С. Скороход и др. // Успехи современного естествознания. - 2005. - №10. - С. 90-91.
5. Вторичная профилактика инсульта: взгдяд невролога / В.И. Скворцова, Л.В. Стаховская, Н.А. Пряникова и др. // Болезни сердца и сосудов. - 2006. - №3. - С. 17-20.
6. Ганнушкина И.В. Патофизиологические механизмы нарушений мозгового кровообращения и новые направления в их профилактике и лечении / И.В. Ганнушкина // Журн. невропатол. и психиатр. - 1996. - №1. С. 14-18.
7. Государственная фармакопея СССР XI издание. Т. 1. - Москва, 1987. - 336 с.
8. Гуляев С.М. Анксиолитическое действие экстракта и настойки вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus) / С.М. Гуляев, С.М. Николаев // Дальневосточный медицинский журнал. - 2010. - №1. - С. 100-102.
9. Гуляев, С.М. Влияние настойки вздутоплодника сибирского на когнитивные функции и нейропсихологический статус у больных с недостаточностью мозгового кровообращения / С.М. Гуляев, Т.М. Санданов // Вестник СПбГУ. Серия 11. Медицина. - 2008. - №3. - С. 44-49.
10. Гуляев С.М. Защитное действие Phlojodicarpus sibiricus при ишемии головного мозга у крыс / С.М. Гуляев // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2009. - №3 (67). - С. 172-174.
11. Гуляев С.М. Противотревожное действие Phlojodicarpus sibiricus / С.М. Гуляев // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2009. - №3 (67). - С. 175-177.
12. Гуляев С.М. Церебропротекторное действие настойки вздутоплодника сибирского при экспериментальной ишемии головного мозга / С.М. Гуляев, С.М. Николаев // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2008. - №3 (61). - С. 71-72.

13. Дамулин И.В. Применение Танакана (EGb 761) в неврологической практике / И.B. Дамулин. - РМЖ (Русский медицинский журнал). - 2009. - №17(5). - С. 335-340.
14. Живолупов С.А. Современный клинический анализ цереброваскулярных заболеваний: узловые вопросы дифференциальной диагностики и патогенетического лечения / С.А. Живолупов, И.Н. Самарцев // Фарматека. - 2012. - №7. - С. 87-94.
15. Кабанов В.С. Газохроматографический метод количественного определения суммы виснадина и дигидросамидина в корнях вздутоплодника сибирского / В.С. Кабанов, А.И. Громакова, M.Е. Перельсон // Хим. - фарм. журнал. - 1982. - Т. 16, №12. - С. 1487-1490.
16. Нейропротекторный эффект экстрактов из надземной части Astragalus membranaceus и A. mongolicus (Fabaceae) в условиях токсического действия глутамата / А.Я. Шурыгин, С.М. Николаев, А.А. Кравцов и др. // Растительные ресурсы. - 2012. - Т. 48, Вып. 2. - С. 273-277.
17. Некоторые фармакологические свойства препаратов из надземной части Scutellaria baicalensis GEORGI / О.В. Першина, Н.И. Суслов, В.Г. Пашинский и др. // Растительные ресурсы. - 1998. - Т. 34, Вып. 3. - С. 83-87.
18. Никифоров Ю. В. Алтайские травы-целители / Ю. В. Никифоров. - Бийск, 2002. -190 с.
19. Онбыш Т.Е. Механизмы реализации фармакологической активности экстракта гинкго билоба / Т.Е. Онбыш, Л.М. Макарова, В.Е. Погорелый // Современные наукоемкие технологии. - 2005. - №5. - С. 22-25.
20. Орехович В.Н. Современные методы в биохимии / под ред. В.Н. Ореховича. - М.: Медицина, 1977. - 392 с.
21. Пат. РФ 2493865 С2, МПК А61К. Применение экстракта листьев гинкго билоба [Текст] / Херрманн Иоахим, Херр Роберт; заявитель и патентообладатель Др. Вилльмар Швабе Гмбх Унд Ко. Кг (DE). - №2010129982/15; заявл. 27.01.2012; опубл. 27.09.2013, Бюл. №27. - 14 с.
22. Содержание аминокислот в корнях Phlojodicarpus sibiricus I Ε.З. Урбанова, С.M. Гуляев, Т.А. Туртуева // Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и Дальнего Востока: материалы II Всероссийской научно-практической конференции (с международным участием). - Улан-Удэ, 2012. - С. 56-58.
23. Соколов М.Я. Справочник по лекарственным растениям / М.Я. Соколов, И.П. Замотаев. - М.: Медицина, 1988. - 464 с.
24. Сравнительное изучение защитного действия экстрактов корней Astragalus mongolicus Bunge и Astragalus membranaceus (Fischer) Bunge на зернистые нейроны мозжечка крыс в условиях глутаматной интоксикации / А.Я. Шурыгин, А.А. Кравцов, Д. Батсурен и др. // Наука Кубани. - 2009. - №3. - С. 46-49.
25. Сур С.В. Проблемы и перспективы разработки и внедрения современных лекарственных средств растительного происхождения / С.В. Сур, Э.Н. Гриценко // Фарматека. - 2001. - №9. - С. 10-14.
26. Танакан в лечении начальных проявлений недостаточности кровоснабжения мозга: эффективность, переносимость и отдаленные результаты / С.Л. Тимербаева, З.А. Суслина, Э.А. Бодарева и др. / Ж. Неврологии и Психиатрии им. С.С. Корсакова. - 1999. - С. 54-61.
27. Ушкалова А.В. Эффективность и безопасность антидепрессивных и седативных средств растительного происхождения / А.В. Ушкалова. Т.С. Илларионова // Фармация. - 2008. - №20 (154). - С. 10-14.
28. Филатова Ε.Г. Терапия нарушений памяти и внимания у молодых пациентов / Е.Г. Филатова, М.В. Наприенко // Неврология, нейропсихиатрия, психосоматика. - 2013. - №3. - С. 18-23.
29. Экстракт Шлемника байкальского стимулирует рост нейритов в культуре спинномозговых ганглиев крысы / А.Я. Шурыгин, Н.В. Беззубов, Е.А. Игнатова и др. // БЭБиМ. - 2002. - Т. 134, №7. - С. 56-57.
30. Astragaloside IV attenuates cerebral ischemia-reperfusion-induced increase in permeability of the blood-brain barrier in rats / Y.Z. Qu, M. Li, Y.L. Zhao et al. // Eur. J. Pharmacol. - 2009. - Vol. 606, №1-3. - P. 137-141.
31. Baicalein exerts neuroprotective effects in 6-hydroxydopamine-induced experimental parkinsonism in vivo and in vitro IX. Mu, G. He, Y. Cheng et al. // Pharmacol. Biochem. Behav. - 2009. - Vol. 92, №4. - P. 642-648.
32. Baicalein improves cognitive deficits induced by chronic cerebral hypoperfusion in rats / Ch. Liu, J. Wu, J. Gu et al. // Pharmacol. Biochem. Behav. - 2007. - Vol. 86, №3. - P. 423-430.
33. Baicalin attenuates focal cerebral ischemic reperfusion injury through inhibition of nuclear factor kB p65 activation / X. Xue, X.-J. Qu, Y. Yang et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2010. - Vol. 403, №3-4. - P. 398-404.
34. Baicalin attenuates global cerebral ischemia/reperfusion injury in gerbils via anti-oxidative and anti-apoptotic pathways / Y. Cao, X. Мао, C. Sun et al. // Brain Res. Bull. - 2011. - Vol. 85, №6. - P. 396-402.
35. Baicalin prevents the production of hydrogen peroxide and oxidative stress induced by Αβ aggregation in SH-SY5Y cells / F. Yin, J. Liu, X. Ji et al. // Neurosci. Lett. - 2011. - Vol. 492, №2. - P. 76-79.
36. Cho, J. Wogonin inhibits excitotoxic and oxidative neuronal damage in primary cultured rat cortical cells / J. Cho, H.-K. Lee // Eur. J. Pharmacol. - 2004. - Vol. 485, №1-3. - P. 105-110.
37. Clinician′s manual on mild cognitive impairment / J. Golomb, A. Kluger, P. Garrard, S. Ferris // London: Science Press Ltd., 2001. - 56 p.
38. Cytoprotective effect of Scutellaria baicalensis in CAI hippocampal neurons of rats after global cerebral ischemia / Y.O. Kim, K. Leem, J. Park et al. // J. Ethnopharmacol. - 2001. - Vol. 77, №2-3. - P. 183-188.
39. Effects of calycosin on the impairment of barrier function induced by hypoxia in human umbilical vein endothelial cells / Y. Fan, D.-Z. Wu, Y. Gong et al. // Eur. J. Pharmacol. - 2003. - Vol. 481, №1. - P. 33-40.
40. Effects of Ginkgo biloba extract (EGb 761) on learning and possible actions on aging / C. Cohen-Salmon, P. Venault, B. Martin et al // J. Physiol. Paris. - 1997. - Vol. 91, №6 - P. 291-00.
41. Effects of Scutellaria baicalensis on chronic cerebral hypoperfusion-induced memory impairments and chronic lipopolysaccharide infusion-induced memory impairments / Y.K. Hwang, M. Jinhua, B.-R. Choi et al. // J. Ethnopharmacol. - 2011. - Vol. 137, №1. - P. 681-689.
42. Flavonoids from Radix Scutellariae as potential stroke therapeutic agents by targeting the second postsynaptic density 95 (PSD-95)/disc large/zonula occludens-1 (PDZ) domain of PSD-95 / W. Tang, X. Sun, J.-S. Fang et al. // Phytomedicine. - 2004. - Vol. 11, №4. - P. 277-284.
43. Gao, Ζ. Protective effects of flavonoids in the roots of Scutellaria baicalensis Georgi against hydrogen peroxide-induced oxidative stress in HS-SY5Y cells / Z. Gao, К. Huang, H. Xu // Pharmacol. Res. - 2001. - Vol. 43, №2. - P. 173-178.
44. Inhibitory Effects of Calycosin Isolated from the Root of Astragalus membranaceus on Melanin Biosynthesis / J.H. Kim, M.R. Kim, E.S. Lee et al. // Biol. Pharm. Bull. - 2009. - Vol. 32, №2. - P. 264-268.
45. Mc Graw, C. P. Experimental Cerebral infarction Effects of Pentobarbital in mongolian Gerbils / C.P. Mc Graw // Arch. Neurol. - 1977. - Vol. 34, №6. - P. 334-336.
46. Memory improvement in ibotenic acid induced model rats by extracts of Scutellaria baicalensis / H. Heo, Y. Shin, W. Cho et al // J. Ethnopharmacol. - 2009. - Vol. 122, №1. - P. 20-27.
47. Mitochondria protection of baicalein against oxidative damage via induction of manganese superoxide dismutase / I.K. Lee, K.A. Kang, R. Zhang et al // Environ. Toxicol. Pharmacol. - 2011. - Vol. 31, №1. - P. 233-241.
48. Neuroprotective effect of wogonin in hippocampal slice culture exposed to oxygen and glucose deprivation / D. Son, P. Lee, J. Lee et al. // Eur. J. Pharmacol. - 2004. - Vol. 493, №1-3. - P. 99-102.
49. Neuroprotective effects of Astragaloside IV in 6-hydroxydopamine-treated primary nigral cell culture / W.S. Chan, S.S. Durairajan, J.H. Lu et al. // Neurochem. Int. - 2009. - Vol. 55, №6. - P. 414-422.
50. Perez, C.A. Iron-binding and anti-Fenton properties of baicalein and baicalin / C.A. Perez, Y. Wei, M. Guo // J. Inorg. Biochem. - 2009. - Vol. 103, №3. - P. 326-332.
51. Phenolic antioxidants from the heartwood of Acacia confuse / J.H. Wu, Y.T. Tung, S.Y. Wang et al. // J. Agrie. Food Chem. - 2005. - Vol. 53, №15. - P. 5917-5921.
52. Sasakia, K. Chemistry and biological activities of Ginkgo biloba / K. Sasakia. - Hokkaido, 2007. - 177 p.
53. Seyoum, A. Structure-radical scavenging relationships of flavonoids / A. Seyoum, K. Asres, F.K. El-Fiky // Phytochemistry. - 2006. - Vol. 67, №18. - P. 2058-2070.
54. The flavonoid baicalin protects against cerebrovascular dysfunction and brain inflammation in experimental heatstroke / C.-P. Chang, W.-T. Huang, B.-C. Cheng et al. // Neuropharmacology. - 2007. - Vol. 52, №3. - P. 1024-1033.
55. Wang, H.-H. Anticonvulsant effect of water extract of Scutellariae radix in mice / H.-H. Wang, J -F. Liao, C.-F. Chen // J. Ethnopharmacol. - 2000. - Vol. 73, №1-2. - P. 185-190.