МОДУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ REP БЕЛКА ПРИ ПОЛУЧЕНИИ ДНК С ЗАМКНУТЫМИ КОНЦАМИ (ЗКДНК)

1. ДНК-вектор, полученный из векторного полинуклеотида, в котором векторный полинуклеотид кодирует гетерологичную нуклеиновую кислоту, функционально расположенную между первым инвертированным концевым повтором полинуклеотидной последовательности ДНК (ITR) и вторым ITR, причем по меньшей мере один из первого ITR и второго ITR содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности связывания Rep AAV для индуцирования репликации ДНК-вектора в клетке в присутствии единственного вида Rep-белка, причем ДНК-вектор получен способом, включающим стадии:
а. инкубация популяции клеток, несущих векторный полинуклеотид, который лишен кодирующих последовательностей вирусного капсида, в присутствии единственного вида Rep-белка, обладающего, по крайней мере, ДНК-связывающей и ДНК-никирующей функциональностью, в условиях, эффективных и в течение времени, достаточного для индуцирования получения ДНК-вектора внутри клеток, причем клетки не содержат последовательностей, кодирующих вирусный капсид, причем не присутствуют другие виды Rep-белков, и причем клетки не контактируют с нуклеотидной последовательностью, кодирующей второй белок Rep; и
b. сбор и выделение полученного ДНК-вектора из клеток.
2. ДНК-вектор по п. 1, отличающийся тем, что единственный белок Rep дополнительно имеет геликазную, лигазную и АТФазную функциональность.
3. ДНК-вектор по п. 1, отличающийся тем, что единственный вид белка Rep представляет собой белок Rep AAV.
4. ДНК-вектор по п. 3, отличающийся тем, что белок Rep выбран из любого из: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 или белка Rep AAV12.
5. ДНК-вектор по п. 3, отличающийся тем, что белок Rep представляет собой белок Rep 68 AAV2.
6. ДНК-вектор по п. 3, отличающийся тем, что белок Rep представляет собой белок Rep 78 AAV2.
7. ДНК-вектор по п. 6, отличающийся тем, что белок Rep 78 кодируется мутантной нуклеотидной последовательностью Rep78, которая не имеет функционального кодона инициации трансляции для Rep 52.
8. ДНК-вектор по п. 7, отличающийся тем, что мутантная нуклеотидная последовательность Rep 78 кодирует мутантный белок Rep 78, который содержит мутацию в положении 225 аминокислоты SEQ ID NO: 588.
9. ДНК-вектор по п. 8, отличающийся тем, что аминокислота в положении 225 SEQ ID NO: 588 мутирована в глицин (Gly) или треонин (Thr).
10. ДНК-вектор по п. 7, отличающийся тем, что мутантная нуклеотидная последовательность Rep 78 кодирует мутантный белок Rep 78, который содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 588, и имеет по меньшей мере функциональность связывания ДНК и никирования ДНК.
11. ДНК-вектор по п. 1, отличающийся тем, что ITR представляет собой ITR парвовируса.
12. ДНК-вектор по п. 11, отличающийся тем, что парвовирус представляет собой депендовирус.
13. ДНК-вектор по п. 1, отличающийся тем, что ДНК-вектор представляет собой двухцепочечный ДНК-вектор, не содержащий вирусного капсида, с ковалентно замкнутыми концами (вектор зкДНК).
14. ДНК-вектор по п. 13, отличающийся тем, что присутствие зкДНК-вектора, выделенного из клеток, может быть подтверждено путем расщепления ДНК, выделенной из клетки, рестрикционным ферментом, имеющим единственный сайт распознавания на ДНК-векторе, и анализа расщепленного ДНК-материала на неденатурирующем геле для подтверждения присутствия характерных полос линейной и непрерывной ДНК по сравнению с линейной и прерывистой ДНК.
15. ДНК-вектор, полученный из векторного полинуклеотида, причем векторный полинуклеотид кодирует гетерологичную нуклеиновую кислоту, функционально расположенную между двумя разными инвертированными концевыми повторами полинуклеотидной последовательности (ITR), причем по крайней мере один из ITR представляет собой функциональный ITR, содержащий функциональный концевой сайт разрешения и Rep-связывающий сайт; присутствие единственного вида Rep-белка, индуцирующего репликацию векторного полинуклеотида и получение ДНК-вектора в клетке, причем ДНК-вектор получен способом, включающим стадии:
а. инкубация популяции клеток, несущих векторный полинуклеотид, который лишен кодирующих последовательностей вирусного капсида, в присутствии единственного вида Rep-белка, обладающего, по крайней мере, ДНК-связывающей и ДНК-никирующей функциональностью, в условиях, эффективных и в течение времени, достаточного для индуцирования получения ДНК-вектора внутри клеток, причем клетки не содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую Rep52 или Rep40 в клетках, при этом другие виды Rep не присутствуют в клетке, и причем клетки не контактируют с нуклеотидной последовательностью, кодирующей второй белок Rep; и
b. сбор и выделение вектора ДНК из клеток.
16. Полинуклеотид для создания ДНК-вектора, включающего нуклеотидную последовательность, кодирующую единственный вид аминокислотной последовательности Rep белка, которая имеет, по меньшей мере, ДНК-связующую и ДНК-никирующую функциональность, функционально связанную, по меньшей мере, с одной последовательностью контроля экспрессии.
17. Полинуклеотид по п. 16, отличающийся тем, что белок Rep имеет геликазную, лигазную и АТФазную функциональность.
18. Полинуклеотид по п. 16, отличающийся тем, что белок Rep представляет собой белок Rep AAV.
19. Полинуклеотид по п. 18, отличающийся тем, что белок Rep AAV выбран из любого из: белка AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 или белка AAV12 Rep.
20. Полинуклеотид по п. 18, отличающийся тем, что белок Rep AAV представляет собой белок Rep AAV2.
21. Полинуклеотид по п. 18, отличающийся тем, что белок Rep AAV представляет собой белок Rep 78 AAV2.
22. Полинуклеотид по п. 21, отличающийся тем, что белок Rep 78 кодируется мутантной нуклеотидной последовательностью Rep78, которая не имеет функционального кодона инициации для Rep 52.
23. Полинуклеотид по п. 22, отличающийся тем, что белок Rep78 содержит мутацию в положении 225 аминокислоты SEQ ID NO: 588.
24. Полинуклеотид по п. 23, отличающийся тем, что аминокислота 225 из SEQ ID NO: 588 мутирована в глицин (Gly) или треонин (Thr).
25. Полинуклеотид по п. 22, отличающийся тем, что мутантная нуклеотидная последовательность Rep 78 кодирует мутантный белок Rep78, который содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 588 и имеющий по меньшей мере ДНК-связующую и ДНК-никирующую функциональность.
26. Полинуклеотид по п. 16, отличающийся тем, что по меньшей мере одна последовательность контроля экспрессии кодирует промотор IE, промотор ΔIE или промотор CMV.
27. Полинуклеотид по п. 16, отличающийся тем, что ДНК-вектор представляет собой двухцепочечный ДНК-вектор, не содержащий вирусного капсида, с ковалентно замкнутыми концами (вектор зкДНК).
28. Полинуклеотид по п. 27, отличающийся тем, что присутствие зкДНК-вектора, выделенного из клеток, может быть подтверждено путем расщепления ДНК, выделенной из клетки, рестрикционным ферментом, имеющим единственный сайт распознавания на ДНК-векторе, и анализа расщепленного ДНК-материала на неденатурирующем геле для подтверждения присутствия характерных полос линейной и непрерывной ДНК по сравнению с линейной и прерывистой ДНК.
29. Способ получения ДНК-вектора, включающий контактирование клетки с:
(1) нуклеотидной последовательностью, кодирующей единственный вид белка Rep AAV (Rep78 и/или Rep68), имеющую по меньшей мере ДНК-связующую и ДНК-никирующую функциональность, связанную по меньшей мере с одной последовательностью контроля экспрессии, причем клетка не экспрессирует какие-либо другие виды белка Rep и не контактирует с другими видами белка Rep;
(2) двухцепочечным ДНК-конструктом, содержащим:
экспрессионную кассету;
первый ITR перед (на 5'-конце) кассетой экспрессии; и
второй ITR после (на 3'-конце) кассеты экспрессии; и
(3) сбор ДНК-вектора.
30. Способ по п. 29, отличающийся тем, что белок Rep представляет собой белок Rep AAV.
31. Способ по п. 30, отличающийся тем, что белок Rep AAV выбран из любого из: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 или белка AAV12 Rep.
32. Способ по п. 30, отличающийся тем, что белок Rep AAV представляет собой белок Rep 68 AAV2.
33. Способ по п. 30, отличающийся тем, что белок Rep AAV представляет собой белок Rep 78 AAV2.
34. Способ по п. 33, отличающийся тем, что белок Rep 78 кодируется мутантной нуклеотидной последовательностью Rep78, которая не имеет функционального инициирующего кодона для Rep 52.
35. Способ по п. 34, отличающийся тем, что мутантная нуклеотидная последовательность Rep 78 кодирует мутантный белок Rep 78, который содержит мутацию в положении 225 аминокислоты SEQ ID NO: 588.
36. Способ по п. 35, отличающийся тем, что аминокислота 225 из SEQ ID NO: 588 мутирована в глицин (Gly) или треонин (Thr).
37. Способ по п. 34, отличающийся тем, что мутантная нуклеотидная последовательность Rep 78 кодирует мутантный белок Rep78, который содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 588.
38. Способ по п. 29, отличающийся тем, что по меньшей мере одна последовательность контроля экспрессии кодирует промотор IE, промотор ΔIE или промотор CMV.
39. Способ по п. 29, отличающийся тем, что указанный двухцепочечный конструкт ДНК представляет собой бакмиду, плазмиду, мини-кольцо или линейную двухцепочечную молекулу ДНК.
40. Способ по п. 29, отличающийся тем, что первый ITR перед кассетой экспрессии представляет собой ITR дикого типа.
41. Способ по п. 29, отличающийся тем, что первый ITR перед кассетой экспрессии и второй ITR после кассеты экспрессии являются симметричными или по существу симметричными или асимметричными относительно друг друга.
42. Способ по п. 29, отличающийся тем, что последовательности ITR выбраны из любой из последовательностей, перечисленных в таблицах 2, 4A, 4B и 5 международной патентной заявки PCT/US18/65242.
43. Способ по п. 40, отличающийся тем, что ITR дикого типа содержит полинуклеотид SEQ ID NO: 51.
44. Способ по п. 29, отличающийся тем, что второй ITR после кассеты экспрессии представляет собой модифицированный ITR.
45. Способ по п. 44, отличающийся тем, что модифицированный ITR содержит полинуклеотид SEQ ID NO: 2.
46. Способ по п. 29, отличающийся тем, что первый ITR перед кассетой экспрессии представляет собой модифицированный ITR.
47. Способ по п. 46, отличающийся тем, что модифицированный ITR содержит полинуклеотид SEQ ID NO: 52.
48. Способ по п. 46, отличающийся тем, что второй ITR ниже экспрессионной кассеты представляет собой ITR дикого типа.
49. Способ по п. 48, отличающийся тем, что ITR дикого типа содержит полинуклеотид SEQ ID NO: 1.
50. Способ по п. 29, отличающийся тем, что ITR является репликационно-компетентным.
51. Способ по п. 29, отличающийся тем, что ITR представляет собой ITR AAV.
52. Способ по п. 29, отличающийся тем, что экспрессионная кассета содержит цис-регуляторный элемент.
53. Способ по п. 52, отличающийся тем, что цис-регуляторный элемент выбирают из группы, состоящей из посттранскрипционного регуляторного элемента и поли(А)-сигнала BGH.
54. Способ по п. 53, отличающийся тем, что указанный посттранскрипционный регуляторный элемент содержит посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита североамериканского лесного сурка (WPRE).
55. Способ по п. 29, отличающийся тем, что экспрессионная кассета дополнительно содержит промотор, выбранный из группы, состоящей из промотора CAG, промотора AAT, промотора LP1 и промотора EF1a.
56. Способ по п. 29, отличающийся тем, что указанная экспрессионная кассета содержит полинуклеотиды SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9.
57. Способ по п. 29, отличающийся тем, что указанная экспрессионная кассета дополнительно содержит экзогенную последовательность.
58. Способ по п. 57, отличающийся тем, что экзогенная последовательность содержит по меньшей мере 2000 нуклеотидов.
59. Способ по п. 57, отличающийся тем, что указанная экзогенная последовательность кодирует белок.
60. Способ по п. 57, отличающийся тем, что экзогенная последовательность кодирует репортерный белок, терапевтический белок, антиген, ген-редактирующий белок или цитотоксический белок.
61. Способ по п. 29, отличающийся тем, что ДНК-вектор имеет линейную и непрерывную структуру.
62. ДНК-вектор, получаемый способом по п. 29.
63. Фармацевтическая композиция, содержащая ДНК-вектор по п. 62 и, необязательно, эксципиент.
64. Набор для получения ДНК-вектора, содержащий:
экспрессионный конструкт, содержащий по меньшей мере один сайт рестрикции для вставки по меньшей мере одной гетерологичной нуклеотидной последовательности или регуляторного переключателя, или обоих, по меньшей мере один сайт рестрикции, функционально расположенный между последовательностями асимметричных инвертированных концевых повторов (асимметричные ITR), в которых по меньшей мере один из асимметричных ITR содержит функциональный концевой сайт разрешения и Rep-связывающий сайт; а также
вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность, кодирующую единственный вид Rep-белка, при этом вектор подходит для экспрессии одного вида Rep-белка в клетке насекомого.
65. Набор по п. 64, дополнительно содержащий популяцию клеток насекомых, которая не содержит последовательностей, кодирующих вирусный капсид, которые в присутствии белка Rep могут индуцировать продуцирование ДНК-вектора.
66. Клетка, содержащая: нуклеотидную последовательность, кодирующую единственный вид белка Rep AAV (Rep78 и/или Rep68), имеющую по меньшей мере ДНК-связующую и ДНК-никирующую функциональность, функционально связанную по меньшей мере с одной последовательностью контроля экспрессии, причем клетка не экспрессирует какие-либо виды белка Rep парвовируса (Rep52 or Rep40) и не контактирует с другими видами белка Rep; и, необязательно, конструкт двухцепочечной ДНК, содержащий экспрессионную кассету; первый ITR перед (на 5'-конце) экспрессионной кассеты; и второй ITR после (на 3'-конце) экспрессионной кассеты.
67. Клетка по п. 66, отличающаяся тем, что клетка представляет собой клетку насекомого.
68. Клетка по п. 67, отличающаяся тем, что клетка насекомого выбрана из группы, состоящей из Sf9, Sf21, клетки Trichoplusia ni и клетки High Five.
69. Клетка-хозяин по п. 68, отличающаяся тем, что указанная клетка насекомого представляет собой клетку Sf9.
70. Клетка по п. 68, отличающаяся тем, что клетка насекомого представляет собой клетку High Five.
71. Клетка по п. 66, отличающаяся тем, что клетка представляет собой клетку млекопитающего.
72. Клетка по п. 71, отличающаяся тем, что клетка млекопитающего выбрана из группы, состоящей из HEK293, Huh-7, HeLa, HepG2, HeplA, 911, CHO, COS, MeWo, NIH3T3, A549, HT1080, моноцитов и зрелых и незрелых дендритных клеток.
73. Клетка по п. 72, отличающаяся тем, что клетка млекопитающего представляет собой HEK293.
74. Клетка по п. 66, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая единственный вид белка Rep AAV, кодирует Rep78 и/или Rep68.
75. Клетка по п. 74, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность не имеет функционального инициирующего кодона для Rep52 или Rep40.
76. Клетка по п. 75, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность кодирует белок Rep78.
77. Клетка по п. 75, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность кодирует белок Rep68.
78. Клетка по п. 75, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность кодирует мутантный белок Rep78, который содержит мутацию в положении 225 аминокислоты SEQ ID NO: 588.
79. Способ по п. 78, отличающийся тем, что аминокислота 225 (метионин) из SEQ ID NO: 588 мутирована в глицин (Gly) или треонин (Thr).
80. Способ по п. 78, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность дополнительно включает одну или более модификаций в альтернативных сайтах сплайсинга на карбокси-конце, предотвращая событие сплайсинга, ведущее к получению Rep68, тем самым обеспечивая продукцию только Rep78.
81. Клетка по п. 75, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность является полноразмерной и содержит интактные альтернативные сайты сплайсинга на карбокси-конце, что приводит к продукции Rep78 и Rep68.
82. Клетка по п. 75, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность содержит делецию карбоксиконцевой интронной последовательности, приводящую к получению только Rep68.
83. Клетка по п. 75, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность кодирует белок Rep78, который содержит последовательность, имеющую, по меньшей мере, 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 588, и имеющую по меньшей мере ДНК-связующую и ДНК-никирующую функциональность.