НОВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ АМИДА ЭРЕМОМИЦИНА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ
NEW DERIVATIVES OF EREMOMYCIN AMIDE AND APPLICATION THEREOF FOR TREATING BACTERIAL INFECTIONS

Область техники
Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается структуры новых производных гликопептидного антибиотика амида эремомицина, содержащих необязательно замещенный арильный радикал, соединенный алкиламиноалкильным линкером с атомом азота С-концевой амидной группы амида эремомицина, а также их медицинского применения для лечения инфекций, вызванных грамположительными бактериями.
Уровень техники
Ванкомицин (1) - важнейший гликопептидный антибиотик, являющийся основным антибиотиком резерва для лечения тяжелых, устойчивых к антибиотикам бактериальных инфекций, прежде всего, вызванных метициллин-резистентным Staphylococcus aureus (MRSA) [С. Watanakunakorn. J. Antimicrob. Chemother, 1984, 14, 7]. Антибактериальная активность ванкомицина, как и других гликопептидных антибиотиков основана на способности ингибировать стадии транспептидации и трасгликозилирования синтеза муреина бактериальной клеточной стенки [С. Watanakunakorn. J. Antimicrob. Chemother, 1984, 14, 7].
Активное распространение резистентных к гликопептидам энтерококков и стафилококков VRE (Vancomycin-resistant enterococci) и GISA (Glycopeptide-Intermediate S. aureus), вызванное широким применением ванкомицина в последние десятилетия, обуславливает необходимость создания новых гликопетидов, активных в отношении резистентных штаммов бактерий [WHO, Global Priority List of Antibiotic-Resistant Bacteria to Guide Research, Discovery, and Development of New Antibiotics, 2017].
Показано, что химическая модификация гликопептидов позволяет преодолеть перекрестную резистентность, а также снизить значительные побочные эффекты природных антибиотиков [D. Kahne et al. Chem. Rev., 2005, 105, 425; E.N. Olsufyeva, A.N. Tevyashova. Curr. Topics in Med. Chem., 2017, 17, 2166]. Доказано, что повысить активность гликопептидного антибиотика можно за счет введения гидрофобного фрагмента, что, однако, сопровождается снижением растворимости полученного соединения [Т. I. Nicas, et al. Antimicrob. Agents Chemother., 1995, 39, 2585]. Сочетание гидрофобных фрагментов с гидрофильными линкерами позволяет нивелировать эффект снижения растворимости без потери антибактериальной активности [A. Y. Pavlov et al. J. Antibiot. 1998, 51, 73; Т. Yasukata et al. Bioorg. Med. Chem. Lett., 2002, 12, 3033]
Эремомицин (2) - гликопептидный антибиотик, близкий по структуре к ванкомицину, отличительной особенностью которого является дисахарид, присоединенный к D-кольцу и состоящий из β-D-глюкозы и эремозамина, а также эремозамин, присоединенный к 6 аминокислотному остатку [Г.Ф. Гаузе и др. Антибиотики и химиотерапия, 1989, 5, 348].
Эремомицин (2) в экспериментах in vitro и in vivo в 3-5 раз более активен, чем ванкомицин в отношении большинства значимых для клиники грамположительных бактерий, включая MRSA, а также обладает менее выраженными побочными эффектами [I.V. Malkova. Antibiot. Chemother., 1989, 34, 52; Патент РФ 2641912; Патент РФ 2661613]. Полусинтетические производные эремомицина также имеют преимущества в биологических свойствах перед аналогичными производными ванкомицина [K.R. Maples et al. J. Med. Chem., 2007, 50, 3681]. Кроме того, для ряда амидов эремомицина отмечена более низкая аллергенность по сравнению с эремомицином [A.Y. Pavlov et al. J. Antibiotics, 1996, 49, 194; Патент РФ №2641912]. Все вышеперечисленное делает производные амиды эремомицина перспективной основой для создания нового поколения высокоэффективных гликопептидных антибиотиков.
Раскрытие изобретения
Целью настоящего изобретения ставится создание более эффективных антибактериальных средств на основе новых полусинтетических амидов эремомицина, в частности, производных, содержащих необязательно замещенный арильный радикал, соединенный алкиламиноалкильным линкером с атомом азота С-концевой амидной группы амида эремомицина. Найденная новая модификация эремомицина позволяет улучшить его фармакологические свойства и, в особенности, повысить активность в отношении чувствительных и резистентных к гликопептидам штаммов патогенов с сохранением растворимости антибиотика в водных фармацевтически приемлемых средах. Настоящее изобретение включает соединения, соответствующие формуле 3, их фармакологически приемлемые соли, пригодные для лечения тяжелых, устойчивых к антибиотикам бактериальных инфекций, прежде всего, вызванных штаммами MRSA, GISA и VRE.
где Ar означает арил, выбранный из фенила, бифенила или нафтила, необязательно замещенный от одного до пяти заместителями, независимо выбранными из С1-6алкила, С1-6алкилтио, С1-6алкокси, галоген, галогенС1-6алкил, галогенС1-6алкилтио, галогенС1-6алкокси группы, m независимо имеет значение от 1 до 2, n имеет независимо значение от 1 до 3.
Соединения формулы 3 могут быть получены конденсацией эремомицина (2) или его солей и соответствующего амина, с использованием методов, хорошо известных из уровня развития техники. Так, для конденсации могут быть использованы конденсирующие агенты (РуВОР, ВОР, TBTU, HBTU, HATU), а также вспомогательные основания или соли, необходимых для поддержания оптимального рН в подходящем инертном апротонном растворителе (Схема 1).
Схема 1
Сравнительное исследование антибактериальных свойств новых производных эремомицина, соответствующих формуле 3, и используемого в клинике ванкомицина (1) на контрольном штамме S. aureus АТСС №29213, а также широкой панели грамположительных бактерий показали, что новая модификация карбоксильной группы эремомицина позволяет повысить его активность в отношении резистентных к гликопептидам штаммов при сохранении активности в отношении чувствительных штаммов. Кроме того, производные формулы 3 существенно превосходит по эффективности ванкомицин (1) на моделях системной бактериальной инфекции in vivo.
Таким образом, изобретение также включает способ лечения бактериальных инфекций, вызванных штаммами грамположительных патогенов, такими как Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Clostridium spp., Bacillus spp., в том числе, нечувствительными или малочувствительных к другим антибиотикам, например MRSA (метициллин-резистентный) и VRSA (ванкомицин-резистентный), предусматривающий введение нуждающемуся субъекту терапевтически эффективного количества производного эремомицина, соответствующего формуле 3.
Если не указано иное, термины, используемые в описании заявки и пунктах формулы изобретения, имеют значения, указанные ниже. Следует отметить, что, если не указано иное, используемые в описании и пунктах формулы формы единственного числа включают также формы множественного числа.
"Алкил" означает, одновалентный насыщенный углеводородный радикал с прямой или разветвленной цепью или циклический радикал, включающий только атомы углерода и водорода и содержащий от 1 до включительно 6 атомов углерода.
"Алкилтио" означает радикал -SR, где R означает указанный выше алкильный радикал.
"Алкокси" означает радикал -OR, где R означает указанный выше алкильный радикал.
"Арил" означает, одновалентный циклический ароматический углеводородный радикал, содержащий один или более конденсированных циклов, из которых, по меньшей мере, один цикл является ароматическим. Примеры арильных радикалов включают фенил, бифенил и нафтил.
"Галоген" означает радикал фтора, брома, хлора, иода.
"Галогеналкил" означает алкильный радикал, имеющий значения, указанные выше, замещенный в любом положении одним или более атомами галогена.
Талогеналкилтио" означает радикал -SR, где R означает указанный выше галогеналкил.
"Галогеналкокси" означает радикал -OR, где R означает указанный выше галогеналкил.
"Инертный органический растворитель" означает растворитель, инертный в условиях описываемой в тексте реакции, включающий, например, бензол, толуол, ацетонитрил, тетрагидрофуран, N,N-диметилформамид, N,N-диметилацетамид, N-метилпирролидон, диметилсульфоксид, сульфолан, хлороформ, дихлорметан, дихлорэтан, этил ацетат, ацетон, метилэтилкетон, метанол, этанол, пропанол, изопропанол, mpem-бутанол, диоксан, пиридин и т.п. Если не указано иное, растворители, использованные в реакциях по настоящему изобретению, являются инертными растворителями.
"Сольваты" означает сольватированные формы, содержащие стехиометрическое или нестехиометрическое количество растворителя. Некоторые соединения способны удерживать в кристаллической решетке фиксированное количество молекул растворителя, образуя сольват. Гидраты образуются в том случае, если в качестве растворителя используется вода, а алкоголяты образуются в том случае, если растворителем является спирт.
"Субъект" означает млекопитающих, т.е. любого члена класса млекопитающих, включая, без ограничения перечисленным, человека, приматов, сельскохозяйственных животных, лабораторных животных и т.п., предпочтительно человека. Термин субъект не означает конкретный возраст или пол пациента.
"Терапевтически эффективное количество" означает количество соединения, которое при введении субъекту (пациенту) для лечения патологического состояния является достаточным для оказания фармакологического действия при лечении патологического состояния субъекта. Терапевтически эффективное количество варьируется в зависимости от типа соединения, патологического состояния подлежащего лечению, тяжести болезни, возраста и относительного состояния здоровья субъекта, от способа и формы введения, от мнения лечащего врача или практикующего ветеринара и других факторов.
"Фармакологическое действие" означает термин, используемый в описании заявки, включает результаты воздействия на субъект, при которых достигается предполагаемая цель терапии. Например, фармакологическое действие означает такие результаты воздействия, которые приводят к излечению или замедлению развития, предупреждению рецидива заболевания.
"Фармацевтически приемлемый" означает материал, который используют при получении фармацевтической композиции, и который обычно является безопасным, не токсичным, безопасным в биологическом или ином отношении и включает материал, приемлемый как в ветеринарии, так и в фармацевтике.
"Фармацевтически приемлемые соли" соединений означают соли, которые являются фармацевтически приемлемыми и обладают необходимой фармакологической активностью исходного соединения. Такие соли включают кислотно-аддитивные соли неорганических кислот, таких, как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, фосфорная кислота и т.п., или органических кислот, таких, как уксусная кислота, бензойная кислота, лимонная кислота, фумаровая кислота, глутаминовая кислота, гликолевая кислота, молочная кислота, малеиновая кислота, яблочная кислота, метансульфоновая кислота, пропионовая кислота, салициловая кислота, янтарная кислота, винная кислота, толуолсульфоновая кислота и т.п.Подразумевается, что фармацевтически приемлемые соли включают сольваты или кристаллические формы (полиморфные образования) указанной кислотно-аддитивной соли. Предпочтительными фармацевтически приемлемыми солями являются соли соляной кислоты, серной кислоты, метансульфоновой кислоты, уксусной кислоты, адипиновой кислоты, янтарной кислоты, фумаровой кислоты, щавелевой кислоты, фосфорной кислоты.
Исходный эремомицин (2) наработан на опытно-промышленной установке в НИИНА им Г.Ф. Гаузе, РуВОР, диизопропилэтиламин, диметилсульфоксид, растворители и прочие реагенты являются коммерческими химическими соединениями, поставляемыми фирмами, такими, как Aldrich, Merck или Acros. Исходные диамины можно получить методами, известными специалисту в данной области или описанными в литературе [Wang et al., Tetrahedron, 2009, 65, 50, 10377].
Примеры, показывающие возможность получения новых производных эремомицина, соответствующих формуле 3, являющихся предметом настоящего изобретения, а также их физико-химические свойства, антибактериальная активность и терапевтическая эффективность in vivo, описанные ниже, приводятся лишь для иллюстрации настоящего изобретения, а не для ограничения объема притязаний.
Пример 1. Гидрохлорид N-(2-бензиламино)этил)амида эремомицина (3-1)
При слабом нагревании и интенсивном перемешивании растворяют сульфат эремомицина 2 (0.5 г, 0.29 ммоль) и этилдиизопропиламин (0.08 мл, 4.2 ммоль) в безводном диметилсульфоксиде (12.5 мл). К полученному раствору прибавляют (0.20 г, 1.3 ммоль) N-(бензил)этилендиамина и РуВОР (0.19 г, 0.33 ммоль). Через 10 мин к смеси при перемешивании дополнительно N-(бензил)этилендиамин (0.06 г, 0.4 ммоль) и РуВОР (0.06 г, 0.12 ммоль) и выдерживают 30 мин. К перемешиваемому раствору прибавляют изопропанол (8.5 мл), ацетон (25 мл) и диэтиловый эфир (15 мл). Выпавший осадок отфильтровывают, промывают ацетоном (2×10 мл), диэтиловым эфиром (2×10 мл) и высушивают в вакууме. Осадок растворяют в воде (2 мл), при перемешивании прибавляют изопропанол (3-4 мл) до помутнения раствора и повторно осаждают продукт смесью ацетона (25 мл) и диэтилового эфира (15 мл). Вьшавший осадок отфильтровывают, промывают ацетоном (2×10 мл), диэтиловым эфиром (2×10 мл) и высушивают в вакууме. Получают технический N-(2-бензиламино)этил)амид эремомицина с выходом 97% в виде кремового порошка.
4
82
102
12
25
+
Технический продукт растворяют в 3-5 мл воды и очищают методом обращенно-фазовой хроматографии (элюент 0.5% водный раствор уксусной кислоты - ацетонитрил). Фракции, содержащие продукт, объединяют, концентрируют в вакууме до объема ~5 мл. Раствор подкисляют при тщательном перемешивании водным раствором (1%) соляной или другой фармацевтически приемлемой кислоты до рН ~4, упаривают до объема 1-2 мл, после чего осаждают продукт ацетоном (50 мл). Вьшавший осадок отфильтровывают, промывают ацетоном (2×10 мл), диэтиловым эфиром (2×10 мл) и сушат в вакууме. Получают 0.26 г (53%) гидрохлорида N-(2-бензиламино)этил)амида эремомицина (3-1) в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А -HCOONH (0.2%) рН=4.5, В - MeCN; градиент В 10→35% (30 мин): Rt=8.85 мин. HRSM (ESI) вычислено для CHClNO[M+H]: 1689.6762; найдено 1689.6697.
Пример 2. Гидрохлорид N-(2-фенэтиламино)этил)амида эремомицина (3-2)
4
83
104
12
25
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N-(фенэтил)эилендиамина. Выход гидрохлорида N(2-фенэтилшино)этил)амида эремомицина (3-2) - 54%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH (0.2%) рН=4.5, В - MeCN; градиент В 10→35% (30 мин): Rt=9.9 мин. HRSM (ESI) вычислено для CHClNO[M+H]: 1703.6919; найдено 1703.6964.
Пример 3. Гидрохлорид N-(2-((4-метилбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-3)
4
83
104
12
25
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N-(4-метилбензил)этилендиамина. Выход гидрохлорида N-(2-((4-метилбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-3) - 0.22 г (45%), в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH (0.2%) рН=4.2, В - MeCN; градиент В 5→60% (30 мин): Rt=13.4 мин. HRSM (ESI) вычислено для CHClNO[M+H]: 1703.6919; найдено 1703.6905.
Пример 4. Гидрохлорид N-(2-((4-метилтиобензил)амино)этил)амида эремомицина (3-4)
4
83
104
12
25
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N-(4-метилтиобензил)этилендиамина. Выход гидрохлорида N-(2-((4-метилтиобензил)амино)этил)амида эремомицина (3-4) - 56%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH (0.2%) рН=4.2, В - MeCN; градиент В 5→60% (30 мин): Rt=12.2 мин. HRSM (ESI) вычислено для CHClNOS[M+H]: 1735.6639; найдено 1735.6578.
Пример 5. Гидрохлорид N(2-((4-метоксибензил)амино)этил)амида эремомицина (3-5)
4
83
104
12
26
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N-(4-метоксибензил)этилендиамина. Выход гидрохлорида N-(2-((4-метоксибензил)амино)этил)амида эремомицина (3-5) - 0.30 г (60%), в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH (0.2%) рН=4.2, В - MeCN; градиент В 5→60% (30 мин): Rt=11.4 мин. HRSM (ESI) вычислено для CHClNO[М+Н]: 1719.6868; найдено 1719.6782.
Пример 6. Гидрохлорид N(2-((2-фторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-6)
4
82
101
12
25
82
100
12
25
2
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N(2-фторбензил)этилендиамина. Выход гидрохлорида N-(2-((2-фторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-6) - 55%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH (0.6%) рН=7.8, В - MeCN; градиент В 10→30% (30 мин): Rt=8.9 мин, чистота 98.2%. HRSM (ESI) вычислено для CHClFNO[M+H]: 1707.6668; найдено 1707.6617. Найдено, %: С 50.19, Н 5.96, N 8.57; вычислено для CHClFNO*4HCl*6HO, %: С 50.34, Н 5.80, N 8.59.
Пример 7. Сульфат N(2-((2-фторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-7)
4
82
12
25
82
100
12
25
2
4
2
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N(2-фторбензил)этилендиамина при использовании серной кислоты. Выход сульфата N-(2-((2-фторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-7) - 58%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH (0.6%) рН=7.8, В - MeCN; градиент В 10→30% (30 мин): Rt=8.62 мин. HRSM (ESI) вычислено для CH101ClFNO[M+H]: 1707.6668; найдено 1707.6617. Найдено, %: С 48.64, Н 5.74, N 8.67; вычислено для CHClFNO*2HSO*7HO, %: С 48.51, Н 5.86, N 8.28.
Пример 8. Фосфат N-(2-((2-фторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-8)
4
82
101
12
25
82
100
12
25
3
4
2
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N-(2-фторбензил)этилендиамина при использовании ортофосфорной кислоты. Выход фосфата N-(2-((2-фторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-8) - 61%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH (0.6%) рН=7.8, В - MeCN; градиент В 10→30% (30 мин): Rt=8.52 мин. HRSM (ESI) вычислено для CHClFNO[M+H]: 1707.6668; найдено 1707.6617. Найдено, %: С 48.53, Н 6.04, N 8.13; вычислено для CHClFNO*2HPO*8HO, %: С 48.08, Н 6.00, N 8.21.
Пример 9. Ацетат N-(2-((2-фторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-9)
4
82
101
12
25
82
100
12
25
3
2
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N-(2-фторбензил)этилендиамина при использовании уксусной кислоты. Выход ацетата N-(2-((2-фторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-9) - 61%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH (0.6%) рН=7.8, В - MeCN; градиент В 10→30% (30 мин): Rt=8.64 мин. HRSM (ESI) вычислено для CHClFNO[M+H]: 1707.6668; найдено 1707.6617. Найдено, %: С 52.37, Н 6.54, N 7.57; вычислено для CHClFNO*4CHCOOH*7HO, %: С 52.11, Н 6.32, N 8.10.
Пример 10. Цитрат N(2-((2-фторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-10)
4
82
101
12
25
82
100
12
25
2
2
2
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N-(2-фторбензил)этилендиамина при использовании лимонной кислоты. Выход цитрата N-(2-((2-фторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-10) - 55%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH (0.6%) рН=7.8, В - MeCN; градиент В 10→30% (30 мин): Rt=8.10 мин. HRSM (ESI) вычислено для CHClFNO[M+H]: 1707.6668; найдено 1707.6617. Найдено, %: С 50.32, Н 6.00, N 7.52; вычислено для CHClFNO*2(HOOCCH)C(OH)COOH*8HO, %: С 50.48, Н 5.95, N 7.52.
Пример 11. Мезилат N(2-((2-фторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-11)
4
82
101
12
25
82
100
12
25
3
3
2
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N-(2-фторбензил)этилендиамина при использовании метансульфоновой кислоты. Выход мезилата N-(2-((2-фторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-11) - 57%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH (0.6%) рН=7.8, В - MeCN; градиент В 10→ 30% (30 мин): Rt=8.09 мин. HRSM (ESI) вычислено для CHClFNO[M+H]: 1707.6668; найдено 1707.6617. Найдено, %: С 47.03, Н 5.74, N 7.88; вычислено для CHClFNO*4CHSOH*6HO, %: С 46.94, Н 5.86, N 7.64.
Пример 12. Оксалат N(2-((2-фторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-12)
4
82
101
12
25
82
100
12
25
2
2
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N-(2-фторбензил)этилендиамина при использовании щавелевой кислоты. Выход оксалата N-(2-((2-фторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-12) - 52%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH (0.6%) рН=7.8, В - MeCN; градиент В 10→30% (30 мин): Rt=8.04 мин. HRSM (ESI) вычислено для CHClFNO[M+H]: 1707.6668; найдено 1707.6617. Найдено, %: С 51.42, Н 5.93, N 8.44; вычислено для CHClFNO*2(COOH)*6HO, %: С 51.74, Н 5.86, N 8.42.
Пример 13. Фумарат N-(2-((2-фторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-13)
4
82
101
12
25
82
100
12
25
2
2
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N-(2-фторбензил)этилендиамина при использовании фумаровой кислоты. Выход фумарата N-(2-((2-фторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-13) - 57%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH (0.6%) рН=7.8, В - MeCN; градиент В 10→30% (30 мин): Rt=8.37 мин. HRSM (ESI) вычислено для CHClFNO[M+H]: 1707.6668; найдено 1707.6617. Найдено, %: С 53.03, Н 5.89, N 8.65; вычислено для CHClFNO*2HOOC(CH)COOH*6HO, %: С 52.77, Н 5.90, N8.21.
Пример 14. Сукцинат N(2-((2-фторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-14)
4
82
101
12
25
82
100
12
25
2
2
2
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N-(2-фторбензил)этилендиамина при использовании янтарной кислоты. Выход сукцината N-(2-((2-фторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-14) - 50%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH(0.6%) рН=7.8, В - MeCN; градиент В 10→30% (30 мин): Rt=8.47 мин. HRSM (ESI) вычислено для CHClFNO[M+H]: 1707.6668; найдено 1707.6617. Найдено, %: С 53.03, Н 5.89, N 8.65; вычислено для CHClFNO*2HOOC(CH)COOH*6HO, %: С 52.77, Н 5.90, N8.21.
Пример 15. Адипинат N-(2-((2-фторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-15)
4
82
101
12
25
82
100
12
25
2
4
2
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N-(2-фторбензил)этилендиамина при использовании адипиновой кислоты. Выход адипината N-(2-((2-фторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-15) - 56%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH (0.6%) рН=7.8, В - MeCN; градиент В 10→30% (30 мин): Rt=8.49 мин. HRSM (ESI) вычислено для CHClFNO[M+H]: 1707.6668; найдено 1707.6617. Найдено, %: С 53.21, Н 6.08, N 8.25; вычислено для CHClFNO*2HOOC(CH)COOH*6HO, %: С 53.54, Н 6.31, N7.97.
Пример 16. Гидрохлорид N(3-((2-фторбензил)амино)пропил)амида эремомицина (3-16)
4
83
103
12
25
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N-(2-фторбензил)пропан-1,3-диамина. Выход гидрохлорида N-(3-((2-фторбензил)амино)пропил)амида эремомицина (3-16) - 54%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH (0.2%) рН=4.5, В - MeCN; градиент В 10→35% (30 мин): Rt=9.7 мин. HRSM (ESI) вычислено для CHClFNO[M+H]: 1721.6824; найдено 1721.6798.
Пример 17. Гидрохлорид N(2-((3-фторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-17)
4
82
101
12
25
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N-(3-фторбензил)этилендиамина. Выход гидрохлорида N-(2-((3-фторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-17) - 57%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH (0.2%) рН=4.2, В - MeCN; градиент В 5→60% (30 мин): Rt=11.2 мин, чистота 95.5%. HRSM (ESI) вычислено для CHClFNO[M+H]: 1707.6668; найдено 1707.6645.
Пример 18. Гидрохлорид N-(2-((4-фторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-18)
4
82
101
12
25
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N-(4-фторбензил)этилендиамина. Выход гидрохлорида N-(2-((4-фторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-18) - 57%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×150 мм, LW=270 нм, элюент: А - HCOONH (0.2%) рН=4.2, В - MeCN; градиент В, 6→60% (30 мин): Rt=13.4 мин. HRMS (ESI) вычислено для CHClFNO[M+H]: 1707.6668; найдено 1707.6623.
Пример 19. Гидрохлорид N-(2-((4-хлорбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-19)
4
82
101
2
12
25
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N-(4-хлорбензил)зтилендиамина. Выход гидрохлорида N-(2-((4-хлорбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-19) - 50%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH (0.2%) рН=4.2, В - MeCN; градиент В 5→60% (30 мин): Rt=14.2 мин. HRSM (ESI) вычислено для CHClNO[M+H]: 1723.6372; найдено 1723.6344.
Пример 20. Гидрохлорид N-(2-((2,6-дифтор)бензил)амино)этил)амида эремомицина (3-20)
4
82
100
2
12
25
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N-(2,6-дифторбензил)этилендиамина. Выход гидрохлорида N-(2-((2,6-дифторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-20) - 48%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH(0.2%) рН=4.5, В - MeCN; градиент В 10→60% (30 мин): Rt=7.6 мин. HRSM (ESI) вычислено для CHClFNO[М+Н]: 1725.6574; найдено 1725.7134.
Пример 21. Гидрохлорид N-(2-((3,5-дифторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-21)
4
82
100
2
12
25
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N-(3,5-дифторбензил)этилендиамина. Выход гидрохлорида N-(2-((3,5-дифторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-21) - 49%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH (0.2%) рН=4.5, В - MeCN; градиент В 10→35% (30 мин): Rt=11.9 мин. HRSM (ESI) вычислено для CHClFNO[M+H]: 1725.6574; найдено 1725.6346.
Пример 22. Гидрохлорид N-(2-((4-фтор-2-хлорбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-22)
4
82
100
2
12
25
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N-(4-фтор-2-хлорбензил)этилендиамина. Выход гидрохлорида N-(2-((4-фтор-2-хлорбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-22) - 45%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH (0.2%) рН=4.5, В - MeCN; градиент В 10→60% (30 мин): Rt=10.4 мин. HRSM (ESI) вычислено для CHClFNO [М+Н]: 1741.6278; найдено 1741.6260.
Пример 23. Гидрохлорид N-(2-((6-фтор-2-хлорбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-23)
4
82
100
2
12
25
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N-(6-фтор-2-хлорбензил)этилендиамина. Выход гидрохлорида N-(2-((6-фтор-2-хлорбензил)этил)амида эремомицина (3-23) - 46%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH (0.2%) рН=4.5, В - MeCN; градиент В 10→35% (30 мин): Rt=10.7 мин. HRSM (ESI) вычислено для CHClFNO [М+Н]: 1741.6278; найдено 1741.6243.
Пример 24. Гидрохлорид N-(2-((2,4-дихлорбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-24)
4
82
100
3
12
25
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N-(2,4-дихлорбензил)этилендиамина. Выход гидрохлорида N-(2-((2,4-дихлорбензил)амино)этил)амид эремомицина (3-24) - 61%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH (0.2%) рН=4.2, В - MeCN; градиент В 5→60% (30 мин): Rt=15.2 мин. HRSM (ESI) вычислено для CHClNO[M+H]: 1757.5983; найдено 1757.5883.
Пример 25. Гидрохлорид N-(2-((3,4-дихлорбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-25)
4
82
100
3
12
25
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N-(3,4-дихлорбензил)этилендиамина. Выход гидрохлорида N-(2-((3,4-дихлорбензил)амино)этил)амид эремомицина (3-25) - 48%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH (0.2%) рН=4.2, В - MeCN; градиент В 5→60% (30 мин): Rt=15.2 мин. HRSM (ESI) вычислено для CHClNO[M+H]: 1757.5983; найдено 1757.6009.
Пример 26. Гидрохлорид N-(2-((2,3,4,5,6-пентафторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-26)
4
82
97
5
12
25
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N-(2,3,4,5,6-пентафторбензил)этилендиамина. Выход гидрохлорида N-(2-((2,3,4,5,6-пентафторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-26) - 63%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH (0.2%) рН=4.5, В - MeCN; градиент В 10→35% (30 мин): Rt=16.7 мин. HRSM (ESI) вычислено для CHClFNO[M+H]: 1779.6291; найдено 1779.6256.
Пример 27. Гидрохлорид N-(2-((3-трифторметилбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-27)
4
83
101
3
12
25
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N-(3-трифторметилбензил)этилендиамина. Выход гидрохлорида N-(2-((3-трифторметилбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-27) - 56%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH (0.2%) рН=4.5, В - MeCN; градиент В 10→60% (30 мин): Rt=12.7 мин. HRSM (ESI) вычислено для CHClFNO[М+Н]: 1757.6636; найдено 1757.6768.
Пример 28. Гидрохлорид N-(2-((4-трифторметилбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-28)
4
83
101
3
12
25
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N-(4-трифторметилбензил)этилендиамина. Выход гидрохлорида N-(2-((4-трифторметилбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-28) - 52%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH (0.2%) рН=4.5, В - MeCN; градиент В 10→60% (30 мин): Rt=13.3 мин, чистота 95.2%. HRSM (ESI) вычислено для CHClFNO[M+H]: 1757.6636; найдено 1757.6802.
Пример 29. Гидрохлорид N-(2-((2-фтор-5-трифторметилбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-29)
4
83
100
4
12
25
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N-(2-фтор-5-трифторметилбензил)этилендиамина. Выход гидрохлорида N-(2-((2-фтор-5-трифторметилбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-29) - 52%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH (0.2%) рН=4.5, В - MeCN; градиент В 10→60% (30 мин): Rt=12.3 мин. HRSM (ESI) вычислено для CHClFNO[M+H]: 1775.6542; найдено 1775.6362.
Пример 30. Гидрохлорид N-(2-((4-трифторметилтиобензил)амино)этил)амида эремомицина (3-30)
4
83
101
3
12
25
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N-(4-трифторметилтиобензил)этилендиамина. Выход гидрохлорида (2-((4-трифторметилтиобензил)амино)этил)амида эремомицина (3-30) - 60%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH (0.2%) рН=4.5, В - MeCN; градиент В 10→60% (30 мин): Rt=15.4 мин. HRSM (ESI) вычислено для CHClFNOS[M+H]. 1789.6357; найдено 1789.6344.
Пример 31. Гидрохлорид N-(2-((4-трифторметоксибензил)амино)этил)амида эремомицина (3-31)
4
83
101
3
12
26
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N-(4-Трифторметоксибензил)эталендиамина. Выход гидрохлорида N-(2-((4-Трифторметоксибензил)амино)этил)амида эремомицина (3-31) - 53%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH (0.2%) рН=4.5, В - MeCN; градиент В 10→60% (30 мин): Rt=14.2 мин, чистота 95.8%. HRSM (ESI) вычислено для CHClFNO[M+H]: 1773.6585; найдено 1773.6512..
Пример 32. Гидрохлорид N-(2-((4-(4-хлорфенил)бензил)амино)этил)амида эремомицина (3-32)
4
88
105
2
12
25
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N-(4-(4-хлорфенил)бензил)этилендиамина. Выход гидрохлорида N-(2-((4-(4-хлорфенил)бензил)амино)этил)амида эремомицина (3-32) - 58%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH (0.2%) рН=6.4, В - MeCN; градиент В 20→70% (30 мин): Rt=14.4 мин, чистота 98.7%. HRSM (ESI) вычислено для CHClNO[M+H]: 1799.6685; найдено 1799.6486.
Пример 33. Гидрохлорид N-(2-(1-нафтилметиламино)этил)амида эремомицина (3-33)
4
86
104
12
25
+
Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и N-(1-нафтил)этилендиамина. Выход гидрохлорида N-(2-(1-нафтилметиламино)этил)амида эремомицина (3-33) - 52%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH (0.2%) рН=4.5, В - MeCN; градиент В 20→70% (30 мин): Rt=12.5 мин. HRSM (ESI) вычислено для CHClNO[M+H]: 1739.6919; найдено 1739.6943.
Пример 34. Антибактериальная активность новых производных в отношении чувствительных штаммов грамположительных бактерий
Антимикробная активность полусинтетических производных амида эремомицина, являющихся предметом настоящего изобретения, изучена в сравнении с ванкомицином (1) на широкой панели чувствительных к ванкомицину грамположительных бактерий: Staphylococcus aureus АТСС 29213, S. aureus R-2, S. epidermidis 04T1, S. haemoliticus 602, S. pneumoniae ATCC 6305, Clostridium sporogenes ATCC 19404, Bacillus cereus ATCC 10702, Enteroccus faecium 4, E. faecalis 559, полученных из музея лаборатории медицинской микробиологии Государственного научного центра по антибиотикам (ГНЦА). Минимальную подавляющую рост микроорганизмов концентрацию (МПК) для тестируемых соединений определяли микрометодом серийных разведений в бульоне, в соответствии с рекомендациями CLSI.
Полученные результаты, представленные в таблице 1, свидетельствуют, что в отношении чувствительных к ванкомицину штаммов в большинстве случаев, по активности in vitro, новые амиды эремомицина, являющиеся предметом настоящего изобретения, превосходят препарат сравнения - ванкомицин (1), обладая в 2-25 раз большей активностью, чем препарат сравнения. Наибольшую активность в отношении чувствительных к гликопептидам штаммам показали фторсодержащие производные 3-6 (гидрохлорид N-(2-((2-фторбензил)амино)этил)амида эремомицина), 3-17 (гидрохлорид N-(2-((3-фторбензил)амино)этил)амида эремомицина), 3-18 (гидрохлорид N-(2-((4-фторбензил)амино)этил)амида эремомицина), 3-20 (гидрохлорид N-(2-((2,6-дифторбензил)амино)этил)амида эремомицина), 3-21 (гидрохлорид N-(2-((3,5-дифторбензил)амино)этил)амида эремомицина).
Пример 35. Антабактериальная активность новых производных в отношении резистентных штаммов грамположительных бактерий
Антимикробная активность полусинтетических производных эремомицина, являющихся предметом настоящего изобретения, изучена в сравнении с ванкомицином (1) на широкой панели резистентных к ванкомицину грамположительных бактерий S. aureus 3797, S. aureus 3795, E. faecium 2, E. faecium 3576, E. faecalis 9, E. faecalis 583, E. gallinarum 5, E. gallinarum ВП 4147 полученных из музея лаборатории медицинской микробиологии Государственного научного центра по антибиотикам (ГНЦА). Минимальную подавляющую рост микроорганизмов концентрацию (МПК) для тестируемых соединений определяли микрометодом серийных разведений в бульоне, в соответствии с рекомендациями CLSI.
В отношении резистентных к ванкомицину штаммов в большинстве случаев, по активности in vitro, новые амиды эремомицина, являющиеся предметом настоящего изобретения, превосходят препарат сравнения - ванкомицин (1), обладая в 8-266 раз более высокой активностью, чем препарат сравнения. Наибольшую активность вотношении резистентных к гликопептидам штаммам показали производные 3-6 (N-(2-((2-фторбензил)амино)этил)амид эремомицина) и 3-18 (N-(2-((4-фторбензил)амино)этил)амид эремомицина).
Пример 36. Антибактериальная эффективность in vivo
100
100
50
50
8
Сравнительное исследование эффективности гидрохлорида N-(2-((2-фторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-6, пример 6) и ванкомицина (1) проведено на модели стафилококкового сепсиса мышей. В опыте использовали самок мышей колонии SHK, весом 20-22 г. В качестве инфекционного агента использовали Staphylococcus aureus (штамм 10, клинический изолят), адаптированный к росту в in vivo, путем пятикратного пассирования в организме мышей. Первоначально определялась летальная доза (LD) стафилококка для данной линии мышей при внутривенном пути заражения. Учет за гибелью мышей проводился ежедневно в течение 10 дней. Летальная доза (LD) составляла 8×10КОЕ/мышь. Мышей рассаживали в клетки по 10 голов, заражали внутривенно Staphylococcus aureus в летальной дозе и определяли эффективность испытуемых препаратов по величине ED (т.е. дозы, при которых выживает 50% подопытных животных) Через 30 мин после заражения мышам внутривенно вводили гидрохлорид N-(2-((2-фторбензил)амино)этил)амида эремомицина (3-6) в дозах от 0.1 до 2.5 мг/кг или гидрохлорид ванкомицина (1) в дозах от 2.5 до 7.5 мг/кг. В качестве контроля дозы в опыте присутствовала группа нелеченых животных, зараженных летальной дозой Staphylococcus aureus. Определение ED испытуемых препаратов производили в одном опыте при едином контроле, используя метод Баренса (накопления частот). За животными наблюдали в течение 14 дней, ежедневно учитывали гибель. Результаты эксперимента представлены в таблице 3.
На основании экспериментальных данных о выживаемости мышей (таблица 3) были рассчитаны значения показателей эффективности испытуемых препаратов (ED50):
50
• N-(2-((2-фторбензил)амино)этил)амид эремомицина ED=0.55 мг/кг;
50
• ванкомицин ED=4.1 мг/кг.
50
50
Полученные результаты, представленные в таблице 3, и величина ED свидетельствуют, что по эффективности in vivo N-(2-((2-фторбензил)амино)этил)амид эремомицина (3-6), являющийся предметом настоящего изобретения, в 7.5 раз превосходит по эффективности (ED) препарат сравнения - ванкомицин (1).