НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ РНК SARS-COV-2 МЕТОДОМ ПЕТЛЕВОЙ ИЗОТЕРМИЧЕСКОЙ АМПЛИФИКАЦИИ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ (КОВИГЕН-LAMP)
REAGENT KIT FOR SARS-CoV-2 RNA DETECTION BY REAL-TIME LOOP ISOTHERMAL AMPLIFICATION (COVIGEN-LAMP)

Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и биотехнологии и может быть использовано для специфической клинической лабораторной диагностики коронавирусной инфекции 2019 года (COVID-19), а именно для обнаружения РНК коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) в мазках из носоглотки.
COVID-19 - острое вирусное заболевание с преимущественным поражением верхних дыхательных путей, вызываемое одноцепочечным РНК-содержащим вирусом острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) семейства Coronaviridae, рода Betacoronavirus, подрода Sarbecovirus.
По характеру всемирного распространения согласно решению ВОЗ данная инфекция была признана пандемией [Электронный ресурс] URL: https://www.who.int/ru/director-general/speeches/detail/who-director-general-s-opening-remarks-at-the-media-briefing-on-covid-19-11-march-2020/ (дата обращения 11.01.2022)]. По состоянию на 10 января 2022 года зарегистрировано свыше 300 млн подтвержденных случаев заболевания по всему миру и более 5,0 млн летальных исходов, что делает пандемию COVID-19 одной из самых смертоносных в истории [Электронный ресурс] URL: https:// http://jrhs.umsha.ac.ir/index.php/JRHS/article/view/6368/pdf (дата обращения 17.01.2022)].
Геном SARS-CoV-2 секвенирован, структура генома сходна с другими коронавирусами, гомология с SARS-CoV составляет 79,5%, a MERS-CoV - 50%. [Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding [Электронный ресурс] URL: https:// https://www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140-6736(20)30251-8/fulltext (дата обращения 10.01.2022)].
Молекулярно-генетический анализ коронавируса SARS-CoV-2 имеет решающее значение при создании эффективных средств обнаружения возбудителя РНК SARS-CoV-2 и специфической клинической лабораторной диагностики COVID-19.
При отсутствии эффективных средств этиотропной терапии коронавирусной инфекции COVID-2019, недостаточном уровне достижения коллективного иммунитета с помощью специфической иммунопрофилактики и продолжающимся распространением коронавирусной инфекции в мире, приоритетным направлением совершенствования системы биологической защиты населения Российской Федерации остается разработка экспрессных средств специфической клинической лабораторной диагностики коронавирусной инфекции COVID-19. Метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ-ПЦР РВ) считается «золотым стандартом» диагностики коронавирусной инфекции COVID-19 благодаря высокой чувствительности и специфичности [Электронный ресурс] URL: https://rnajournal.cshlp.org/content/26/7/771 (дата обращения 11.01.2022)]. Разновидностью данного метода является петлевая изотермическая амплификация (Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP), при которой не требуются температурные циклы денатурации-отжига-элонгации. Амплификация нуклеотидных последовательностей происходит при постоянной температуре с использованием полимеразы с геликазной активностью, что позволяет сократить время анализа, повысить специфичность и чувствительность, упростить интерпретацию результатов. [Электронный ресурс] URL: ttps://virusjour.elpub.ru/jour/article/view/473?locale=ru_RU (дата обращения 10.01.2022)].
Целью настоящего изобретения является разработка набора реагентов для обнаружения РНК SARS-CoV-2 методом петлевой изотермической амплификации в реальном времени для клинической лабораторной диагностики COVID-19 без этапа подготовки проб и выделения РНК.
Для достижения поставленной цели были проведены следующие исследования:
- изучена структура генома вируса SARS-CoV-2;
- на основе изученного генома вируса SARS-CoV-2 разработаны уникальные олигонуклеотидные праймеры;
- обоснован состав набора;
- обоснованы параметры проведения реакции петлевой изотермической амплификации в реальном времени;
3
- определена аналитическая чувствительность 1,0⋅10 копий РНК SARS-CoV-2 в 1 мл, специфичность, воспроизводимость набора реагентов.
3
Сущность изобретения заключается в том, что обнаружение РНК SARS-CoV-2 возбудителя COVID-2019, осуществляется методом одностадийной обратной транскрипции, совмещенной с петлевой изотермической амплификацией в реальном времени с использованием разработанных олигонуклеотидных праймеров, что позволяет осуществлять воспроизводимое обнаружение РНК SARS-CoV-2 в клинических образцах с аналитической чувствительностью 1⋅10 копий РНК SARS-CoV-2 в 1 мл без этапа подготовки проб и выделения РНК.
Известен коммерческий «Набор для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 в биологическом материале методом изотермической амплификации в режиме реального времени», разработанный ООО «Эвотек-Мирай Геномикс», зарегистрированный Росздравнадзором (19.06.2020 г., № РЗН 2020/10088) имеет аналогичное предназначение и может считаться аналогом представляемого изобретения [Электронный ресурс] URL: https://evotech-mg.com/products/nabor-dlia-vyiavleniia-rnk-koronavirusa-SARS (дата обращения 17.01.2022)].
К признаку представляемого изобретения, отличающим его от аналога, следует отнести:
- набор-аналог имеет в составе жидкие компоненты, что требует специальных условий хранения и транспортировки при температуре Цельсия от минус 80 до минус 20°С, заявляемый набор хранят при температуре от плюс 2 до плюс 8°С. Суммарный срок хранения при температуре от плюс 9 до плюс 20°С не может превышать 14 суток в течение срока годности набора реагентов.
На отечественном рынке реализуется «Набор реагентов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 тяжелого острого респираторного синдрома (COVID-19) методом изотермической амплификации (АмплиТест SARS-CoV-2 LAMP)», разработанный ФГБУ «ЦСП» ФМБА России, зарегистрированный Росздравнадзором (06.04.2021 г., № РЗН 2021/13956) имеет аналогичное предназначение и может считаться аналогом представляемого изобретения [Электронный ресурс] URL: https://https://amplitest.ru/ (дата обращения 17.01.2022)].
К признакам представляемого изобретения, отличающимся от аналога, следует отнести:
- в заявляемом наборе реагентов в качестве фермента используется SD-полимераза, которая сохраняет стабильность при температуре 94°С, что позволяет проводить изотермическую амплификацию с предварительным прогревом для увеличения специфичности реакции, Bst-полимераза в наборе-аналоге активна при температуре ниже 68°С;
3
3
3
- чувствительность заявляемого набора составляет 1⋅10 Г-Э⋅см. Согласно паспортным данным, чувствительность набора-аналога составляет 5⋅10 ГЭ⋅/мл. Меньшая чувствительность набора-аналога может привести к получению ложноотрицательных результатов.
Известен «Набор реагентов для выявления РНК SARS-CoV-2 методом изотермической амплификации «Изотерм SARS-CoV-2 РНК-скрин», разработанный АО «Генериум», зарегистрированный Росздравнадзором (26.11.2020 г., № РЗН 2020/9957), имеет аналогичное предназначение и может считаться аналогом представляемого изобретения [Электронный ресурс] URL: https:// https://www.generium.ru/products/izoterm-sars-cov-2-rnk-skrin/ (дата обращения 17.01.2022)].
К признакам представляемого изобретения, отличающимся от аналога, следует отнести:
- в заявляемом наборе реагентов в качестве фермента используется SD-полимераза, которая сохраняет стабильность при температуре 94°С, что позволяет проводить изотермическую амплификацию с предварительным прогревом для увеличения специфичности реакции, Bst-полимераза в наборе-аналоге активна при температуре ниже 68°С;
- заявляемый набор реагентов возможно транспортировать при температуре от 9 до 20°С не более 14 суток, транспортирование набора-аналога производят в соответствии при температуре от 2 до 8°С.
3
Технический результат изобретения заключается в том, что обнаружение РНК коронавируса SARS-CoV-2 осуществляется методом одностадийной реакции обратной транскрипции, совмещенной с петлевой изотермической амплификацией в реальном времени с использованием разработанных уникальных олигонуклеотидных праймеров, находящихся в лиофильно высушенном состоянии, с аналитической чувствительностью 1⋅10 копий РНК SARS-CoV-2 в 1 мл, без этапов подготовки проб и выделения РНК.
Указанный технический результат изобретения достигается за счет включения в состав набора реагентов лиофилизированных олигонуклеотидных праймеров, в том числе флуоресцентно-меченых, позволяющих в реакции петлевой изотермической амплификации в реальном времени достоверно обнаруживать специфические нуклеотидные последовательности РНК SARS-CoV-2 возбудителя COVID-2019, имеющих структуру нуклеотидных последовательностей, которые входят в состав реакционной смеси аналитической в стрипованных микропробирках вместе с обратной транскриптазой MMLV-ревертазой, SD-полимеразой и эквимолярной смесью дезоксинуклеозидтрифосфатов:
стрипованные микропробирки с лиофильно высушенной реакционной смесью контрольной, состоящей из эквимолярной смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов, обратной транскриптазы MMLV, SD-полимеразы, искусственной контрольной РНК, праймеров, фланкирующих последовательность искусственной контрольной кДНК:
а также в отдельных микропробирках: разбавитель, положительный контрольный образец, представляющий лиофильно высушенную искусственно синтезированную последовательность фрагмента гена 7V, кодирующего нуклеокапсидный белок SARS-CoV-2, отрицательный контрольный образец, буфер для экстрагирования биологического образца, зонд медицинский одноразовый стерильный по ТУ 32.50.13-002-28731857-2020 РЗН №2021/13989 от 12.04.2021 г.
Примечание: BHQ2, BHQ1 - присоединенные к 3'-концевому нуклеотиду темновые гасители флуоресценции; FAM, ROX - флуоресцентные красители, присоединенные к 5'-концевому нуклеотиду соответствующего праймера.
Структура олигонуклеотидных праймеров, специфичных по отношению к геному вируса SARS-CoV-2, представленная в данном наборе, в мире аналогов не имеет.
Разработанные праймеры являются видоспецифичными в отношении коронавируса SARS-CoV-2. Праймеры синтезированы путем твердофазного химического синтеза с последующей очисткой методами электрофореза в полиакриламидном геле и высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Предлагаемые к патентованию в составе набора реагентов олигонуклеотидные праймеры фланкируют уникальные участки фрагмента гена N, кодирующего нуклеокапсидный белок SARS-CoV-2. Использование в комплекте с праймерами соответствующих флуоресцентно-меченных праймеров позволяет производить детекцию продуктов петлевой изотермической амплификации в режиме реального времени.
Состав заявляемого набора реагентов приведен в таблице 1
Реакционная смесь аналитическая в стрипованных микропробирках расфасована в микропробирки в стрипах объемом 0,2 мл, в составе: эквимолярная смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих фрагмент гена N, кодирующего нуклеокапсидный белок SARS-CoV-2, включая два праймера, меченных флуоресцентным красителем ROX, обратная транскриптаза MMLV, SD-полимераза.
Реакционная смесь контрольная в стрипованных микропробирках, расфасована в микропробирки в стрипах объемом 0,2 мл, в составе: эквимолярная смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов, искусственная контрольная РНК, олигонуклеотидные праймеры, фланкирующие последовательность кДНК, включая два праймера, меченных флуоресцентным красителем FAM, обратная транскриптаза MMLV, SD-полимераза.
Положительный контрольный образец представляет искусственно синтезированную последовательность гена N, кодирующего нуклеокапсидный белок SARS-CoV-2.
Контрольная РНК в реакционной смеси контрольной представляет собой искусственно синтезированную последовательность следующего нуклеотидного состава:
Буфер для экстрагирования биологического образца предназначен для инактивации и экстракции РНК SARS-CoV-2 в анализируемых пробах, благодаря чему этапы подготовки проб и выделения РНК не требуются.
макс.возб.
макс.эм.
Постановка обратной транскрипции, совмещенной с петлевой изотермической амплификации в реальном времени проводится в соответствии с разработанной инструкцией по применению набора реагентов на детектирующих амплификаторах, имеющих каналы детекции, соответствующие красителям FAM и ROX либо их спектральным аналогам с характеристиками λ/λ равными 490 нм/520 нм и 580 нм/605 нм:
- устройство компьютеризированное четырехканальное для обнаружения в режиме реального времени флюоресцентной детекцией специфической последовательности нуклеиновых кислот методом полимеразной цепной реакции «АНК» по ТУ 9443-003-04699534-2005 (РУ на МИ от 21.08.2015 г. № ФСР 2010/08892);
- амплификатор детектирующий «ДТпрайм» по ТУ 9443-004-96301278-2010 в следующих модификациях: 4М1, 4М3, 4М6, 5М3, 5М6, 6М1, 6М3, 6М6, 4X1, 5X1, 6X1 (РУ на МИ от 03.03.2011 г. № ФСР 2011/10229);
- термоцикл ер для амплификации нуклеиновых кислот 1000 с принадлежностями (РУ на МИ от 21.06.2016 г. № ФСЗ 2008/03399).
Подготовка проб к анализу и выделение РНК SARS-CoV-2 не требуется.
Интерпретация результатов проводится с использованием специализированного программного обеспечения используемого детектирующего амплификатора согласно руководству по эксплуатации.
Регистрация сигнала флуоресценции в каждой микропробирке осуществляется после каждого «цикла» амплификации. Накопление продуктов амплификации в микропробирке реакционной смеси аналитической сопровождается ростом сигнала по каналу ROX, в микропробирке реакционной смеси контрольной - по каналу FAM.
Результаты анализа не подлежат учету в случае регистрации:
- роста сигнала в пробирке с отрицательным контрольным образцом (ложноположительный результат всего эксперимента);
- отсутствия роста сигнала в пробирке с положительным контрольным образцом (ложноотрицательный результат всего эксперимента);
- отсутствия роста сигнала для анализируемого образца в контрольной пробирке реакционной смеси контрольной при отсутствии роста сигнала для этого же образца в пробирке реакционной смеси аналитической (ложноотрицательный результат отдельной пробы);
Результаты анализа подлежат учету в случае регистрации:
- отсутствия роста сигнала в пробирке с отрицательным контрольным образцом;
- роста сигнала в пробирке с положительным контрольным образцом;
- роста сигнала в пробирках реакционной смеси контрольной и реакционной смеси аналитической.
- роста сигнала в пробирке реакционной смеси аналитической и отсутствия роста сигнала в пробирке реакционной смеси контрольной.
- роста сигнала в пробирках реакционной смеси контрольной и отсутствия роста сигнала в пробирке реакционной смеси аналитической.
Интерпретация результатов анализа проводится согласно таблице 2.
3
Предлагаемое техническое решение является новым, поскольку в общедоступных источниках в Российской Федерации неизвестен набор реагентов, включающий все необходимые компоненты, обеспечивающие обнаружение РНК SARS-CoV-2 методом одностадийной реакции обратной транскрипции, совмещенной с петлевой изотермической амплификацией, с аналитической чувствительностью 1⋅10 копий РНК SARS-CoV-2 в 1 мл без этапов подготовки проб и выделения РНК.
3
Предлагаемое техническое решение имеет изобретательский уровень, поскольку разработанные уникальные олигонуклеотидные праймеры для обнаружения РНК SARS-CoV-2 были разработаны в результате выбора и синтеза праймеров, фланкирующих фрагмент гена N, кодирующего нуклеокапсидный белок SARS-CoV-2, что обеспечивает обнаружение РНК указанного вируса методом петлевой изотермической амплификации с получением воспроизводимых результатов в образцах с аналитической чувствительностью 1⋅10 копий РНК SARS-CoV-2 в 1 мл без этапов подготовки проб и выделения РНК, буфер для экстрагирования позволяет избежать этапов подготовки проб и выделения РНК.
3
Определение аналитической чувствительности набора реагентов определяли с использованием специализированного контрольного образца предприятия-производителя. Аналитическая чувствительность составила 1,0⋅10 копий РНК SARS-CoV-2 в 1 мл анализируемой пробы.
Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующим примером.
Пример 1. Клинико-лабораторные испытания аналитической специфичности и воспроизводимости при использовании разработанного набора реагентов
5
Для определения аналитической специфичности и воспроизводимости набора реагентов в клинико-лабораторных испытаниях использовали 25 положительных образцов от больных коронавирусной инфекцией COVID-19 (носоглоточные мазки, содержащие РНК SARS-CoV-2) и 25 отрицательных образцов (пробы не содержащие РНК SARS-CoV-2, включая образцы, в которых было подтверждено наличие возбудителей респираторных инфекций: вируса гриппа А, вируса гриппа В, аденовируса, метапневмовируса, вируса парагриппа, риновируса, сезонного коронавируса (не SARS-CoV-2), Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae type В, а также образцы от людей без признаков ОРВИ, часть из которых была нагружена возбудителями респираторных инфекций из состава панели инактивированных возбудителей респираторных инфекций (суррогатные образцы с охарактеризованными музейными штаммами из Государственной коллекции вирусов ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России на основе представленных паспортов штаммов (с биологической активностью не менее 1,0×1 БОЕ на мл).
Результаты клинико-лабораторных испытаний представлены в таблице 3.
3
Данные, представленные в таблице 3, показывают, что суммарное количество положительных определений для концентрации 1⋅10 копий РНК SARS-CoV-2 в 1 мл составляет 25 из 25 положительных образов, что соответствует воспроизводимости не менее 95%, и подтверждает специфичность испытываемого набора реагентов в отношении вируса SARS-CoV-2 [Генес B.C. Некоторые простые методы кибернетической обработки данных диагностических и физиологических исследований. - М.: Наука, 1967. - 208 с.].
Воспроизводимость оценивали на трех положительных на РНК SARS-CoV-2 образцах и одном отрицательном в 5 пяти повторениях каждый.
3
Таким образом, разработанный набор реагентов позволяет в одностадийной реакции обратной транскрипции, совмещенной с петлевой изотермической амплификацией в реальном времени с использованием разработанных уникальных олигонуклеотидных праймеров, находящихся в лиофильно высушенном состоянии, обнаруживать РНК SARS-CoV-2 с аналитической чувствительностью 1⋅10 копий РНК SARS-CoV-2 в 1 мл, без этапов подготовки проб и выделения РНК.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Олигонуклеотидные праймеры, в том числе и флуоресцентно-меченые, предназначенные для обнаружения РНК SARS-CoV-2 методом методом петлевой изотермической амплификации в реальном времени, имеют представленную ниже структуру нуклеотидных последовательностей:
в аналитической реакционной смеси:
SEQ ID NO 1 прямой внешний праймер SARS-CoV-2_F3:
5'-ACCAGGAACTAATCAGACAAGGA-3';
SEQ ID NO 2 обратный внешний праймер SARS-CoV-2_В3:
5'-GACTTGATCTTTGAAATTTGGATCTTT-3';
SEQ ID NO 3 прямой внутренний праймер SARS-CoV-2_LB:
5'-ACCTTCGGGAACGTGGTTGA-3';
SEQ ID NO 4 обратный внутренний праймер SARS-CoV-2_LF:
5'-CTGGGGGCAAATTGTGCAATT-3';
SEQ ID NO 5 меченный флуоресцентным красителем ROX прямой праймер:
5'-(5ROX-C8-N3 PR)-CGCGCATTGGCATGGAAGTCACAATTTGATGGCACCTG(dT-BHQ2)GTA-3';
SEQ ID NO 6 меченный флуоресцентным красителем ROX обратный праймер:
5'-(5ROX-C8-N3 PR)-CATTCCGAAGAACGCTGAAGCGGAACTGATTACAAACA(dT-BHQ2)TGGCC-3';
SEQ ID NO 7 прямой внутренний праймер SARS-CoV-2_BIP:
5'-CGCGCATTGGCATGGAAGTCACAATTTGATGGCACCTGTGTA-3';
SEQ ID NO 8 обратный внутренний праймер SARS-CoV-2_FIP:
5'-CATTCCGAAGAACGCTGAAGCGGAACTGATTACAAACATTGGCC-3'.
в контрольной реакционной смеси:
SEQ ID NO 9 прямой внешний праймер F3:
5'-TGAGTGAGTGAAGTTTGCGT-3';
SEQ ID NO 10 обратный внешний праймер В3:
5'-TCAGTTTCCAAAGCCTCCAA-3';
SEQ ID NO 11 прямой внутренний праймер LB:
5'-GTTGAATTCGATGAAGCTTCGAAAG-3';
SEQ ID NO 12 меченный флуоресцентным красителем FAM прямой праймер:
5'-(FAM)GGCCAATTGTCGCCGTAATGCCGTTTGCGT(T-BHQ1)TGCGAAGG-3';
SEQ ID NO 13 меченный флуоресцентным красителем FAM обратный праймер:
5'-(FAM)TGCAACACACACGACCAGGTAAGCGAATCAAATGC(T-BHQ1)GCTG-3';
SEQ ID NO 14 внутренний обратный праймер FIP:
5'-GGCCAATTGTCGCCGTAATGCCGTTTGCGTTTGCGAAGG-3';
SEQ ID NO 15 внутренний прямой праймер BIP:
5'-TGCAACACACACGACCAGGTAAGCGAATCAAATGCTGCTG-3';
SEQ ID NO 16 искусственная контрольная РНК:
TAATACGACTCACTATAGGGAGAGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGCAC
CAACCAACCAACCAACCAACCAACCAACTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTT
CAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTGAGTGAGTGAGTGAGTGAGTGAT
GAGTGAAGTTTGCGTTTGCGTTTGCGTTTGCGAAGGCTCTTGGCAATCAGCTGTTAT
AGCATTACGGCGACAATTGGCCAGCTCTAGTTTGCAACACACACGACCAGGTTGA
GTTGAATTCGATGAAGCTTCGAAAGCAGCAGCATTTGATTCGCTTTATAGTTATGC
AATTATAATTGGAGGCTTTGGAAACTGATTAATTCCACTTATAATCGGAGCACCT.
Примечание - BHQ1, BHQ2 - темновые гасители флуоресценции; FAM, ROX - флуоресцентные красители.