Видовая идентификация мяса птицы в животноводческой продукции с применением метода полимеразной цепной реакции

рис. 2. Распределение индеек пород ВЮ6 и ВЮ10 в пространстве двух измерений.

число индивидуумов с одинаковым генотипом по восьми локусам микросателлитов у индеек породы ВЮ6 составило 7,3 х 10-6, ВЮ10 - 1,2 х 10-6.

По результатам анализа уровней гетерозиготности отмечено наличие избытка гетерозигот у индеек породы ВЮ6 (Fis= -0,112) и, напротив, их недостаток в породе ВЮ10 (Fis= 0,074).

Расчет генетической принадлежности к собственной популяции, основанный на генотипе каждого животного по микросателлитам, а также на числе и

частотах встречаемости аллелей, общих для каждой из групп, показал высокую консолидированность изучаемых пород: 100 % индеек были генетически отнесены к собственной породе (рис. 2).

О генетической изолированности изучаемых пород так же свидетельствует наличие пяти приватных аллелей у индеек ВЮ6 с частотой встречаемости от 0,025 до

0,125 и тринадцати приватных аллелей у индеек ВЮ10 с частотой встречаемости от 0,026 до 0,263.

Значение индекса фиксации Fst свидетельствует о том, что 95,1 % всей изменчивости обусловлено вну-трипородными различиями и лишь 4,9 % приходится на межпородные различия.

выводы. Результаты проведенных молекулярногенетических исследований двух пород индеек ВЮ6 и ВЮ10 выявили полиморфность семи из восьми изученных локусов микросателлитов G. gallus. В шести локусах установлено наличие трех и более аллелей, что позволило выявить генетическую изолированность изученных пород индеек, их внутри- и межпородные различия. Таким образом, микросателлитные локусы кур G. gallus - информативны для характеристики генофонда индеек М. gallopavo.

Литература.

1. Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А., Брем Г. Характеристика генофонда и установление генеалогических связей между породами овец России с использованием ДНК-микросателлитов //Доклады РАСХН. - 2004. - № 2. - С. 26-29.

2. Зиновьева Н.А., Сизарева Е.И., Гладырь Е.А., Проскурина Н.В., Шавырина К.М. Некоторые аспекты использования микросателлитов в свиноводстве //Достижения науки и техники АПК. - 2010. - № 8. - С. 38-41.

3. Кривцов Н.И., Гладырь Е.А., Волкова В.В., Форнара М.С., Лебедев В.И., Зиновьева Н.А. Характеристика аллелофонда трех пород медоносной пчелы России с использованием микросателлитов // Проблемы биологии продуктивных животных.

- 2011. - № 1. - С. 41-45.

4. Фисинин В.И., Гладырь Е.А., Волкова В.В., Севастьянова А.А., Зиновьева Н.А. Анализ генетической структуры пород домашних кур с использованием микросателлитных маркеров // Проблемы биологии продуктивных животных. - 2011. - № 1. - С. 68-72.

5. БагировВ.А., НасибовШ.Н., КленовицкийП.М., ЛесинС.А., ВоеводинВ.А., ЗиновьеваН.А., ЭрнстЛ.К., В.В. Калашников, В.А. Солошенко Сохранение и рациональное использование генофонда животных// Доклады РАСХН. - 2010. - № 2. - С. 37-40

6. Paetkau D., Slade R., Burdens M., Estoup A. Genetic assignment methods for the direct, real-time estimation of migration rate: a simulationbased exploration of accuracy and power// Molecular Ecology. - 2004. - 13. - 55-65.

study OF the informative OF G. GALLus microsatellites for the CHARACTERiSTiCS OF M. GALLOPAVO ALLELE POOL

i.P. Novgorodova, V.V. Volkova, E.A. Gladyr, M.l. selionova, E.l. Rastovarov, V.l. Fisinin, N.A. Zinovieva

summary. The study of two turkey breeds BIG6 and BIG10 using G. gallus microsatellites was performed. The polymorphism of seven of eight analyzed loci was shown. In six loci the presence of three and more alleles was shown that makes possible to regards they as informative for the characteristics of M. gallopavo gene pool.

Key words: DNA markers, microsatellite, turkey gene pool.

УДК 577.29

ВИДОВАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ МЯСА ПТИЦЫ В ЖИВОТНОВОДЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ МЕТОДА ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

Е.Н. КОНОВАЛОВА, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник

Е.А. ГЛАДЫРЬ, кандидат биологических наук, зав. лабораторией

Н.А. ЗИНОВЬЕВА, член-корреспондент РАСХН, зам. директора

ВНИИ животноводства Россельхозакадемии E-mail: n_zinovieva@mail.ru

Резюме. Разработана методика, позволяющая проводить одновременную идентификации в мясном сырье ДНК птицы трех видов (Gallus gallus, Anas platyrhynchos, Meleagris gallopavo) на основе ПЦР, что существенно сокращает за-

траты времени и реактивов, по сравнению с симплексными системами анализа.

Методика предусматривает мультиплексную амплификацию консервативного участка митохондриального гена цитохрома B с использованием трех пар видоспецифических праймеров с последующей детекцией ПцР-продуктов посредством гель-электрофореза в агарозном геле. Для выявления ДНК индейки в образце фарша предложены праймеры Mel 1,2, в результате ПЦР с которыми нарабатывается ампликон длиной 320 п.о., для выявлнения ДНК утки - праймеры Plat 1,2 (нарабатывается ампликон длиной 270 п.о.), для идентификации ДНК курицы при использовании праймеров Gal 1,2 получали ампликон длиной 150 п.о. То есть при визуализации в агарозном геле дифференциация ДНК птиц трех указанных видов в образце смешанного фарша не затруднительна.

Одновременная амплификация участков цитохрома В изучаемых видов птиц возможна при температуре отжига 70 °С уже после 35 циклов ПЦР. Разработанную методику можно использовать для анализа состава различных видов фарша, приготовленных на основе моносырья (курятина, индюшатина, утятина) или их смеси.

Ключевые слова: идентификация видового состава, молекулярные методы, мультиплексная ПЦР.

Один из наиболее часто встречающихся типов фальсификации продуктов животного происхождения - подмена сырья более ценных видов менее

ценными, в том числе и мяса птицы. Традиционно видовую идентификацию мяса птицы проводят морфологическим методом [1], однако он практически неприемлем для оценки переработанных продуктов, когда морфологические признаки вида абсолютно утерянны (фарш, паштет и др.). Использование гистологических методов не находит широкого применения вследствие их трудоемкости, а также невозможности использования в механически и термически переработанных продуктах. Указанную проблему можно решить с помощью методов ДНК-анализа. ДНК достаточно стабильная структура, которая практически не разрушается при термической обработке и соответственно не утрачивает информативной функции. Известны успешные попытки видовой идентификации ДНК с помощью ПЦР [2, 3, 4]. В качестве целевого гена был предложен цитохром В, как наиболее консервативный участок митохондриального генома [5].

Относительно недавно появились сведения, демонстрирующие возможность использования мультиплексной ПЦР для идентификации нескольких видов животных одновременно [6, 7], что обеспечивает снижение трудоемкости и себестоимости анализа.

Исходя из изложенного, цель наших исследований - разработка тест-системы на основе мультиплексной ПЦР для одновременного обнаружения ДНК трех видов птицы (курицы, индейки и утки).

Условия, материалы и методы. Материалом для исследований служили пробы фарша курицы, утки, индейки, как в виде моносырья, так и в различных сочетаниях. Выделение ДНК проводили с помощью набора реагентов DIAtom DNA Prep. Для идентификации видовой принадлежности был выбран ген цитохрома В (cyt b) митохондриальной ДНК. Подбор праймеров осуществляли с помощью интернет-ресурса www.ncbi. nih.gov. При выборе праймеров проверяли их специфичность не только по отношению к исследуемым видам (курица, утка, индейка), но и к другим видам сельскохозяйственных животных, которые могут быть источниками мясного сырья (крупный рогатый скот, свиньи). Анализ продуктов амплификации проводили с помощью электрофореза в агарозном геле по стандартной методике [8].

результаты и обсуждение. В результате исследований были подобраны праймеры для идентификации изучаемых видов птицы (см. табл.), оптимизированы состав реакционной смеси, температурные и временные условия мультиплексной ПЦР

Общий объем реакционной смеси составил 10 мкл. Смесь содержала 1х ПЦР-буфер (16,6 мМ (NH4)2SO4; 67,0 мМ Tris-HCl pH = 8,8; 1,5 мМ MgCl2, 0,01 % Tween20), смесь дНТФ 20 мкМ, праймеры Mel1, 2 - по 9 пкмоль, Plat 1, 2 - по 2 пкмоль, Gal 1, 2 - по 1,5 пкмоль, Taq-полимеразу - 1 ед. акт.

Таблица. Краткая характеристика праймеров для амплификации фраг-

Вид животного Праймер Длина ампли-фицированного фрагмента п.о.

название последовательность 5’-3’

Индейка (Melea- Mel1 AACCTCCATGCGAATGGCGCC 320

gris gallopavo) Mel2 AAGGGGAGGAGGAAGTGGAGG

Утка (Anas platy- Platl AGGAGGCGTCCTAGCACTAGC 256

rhynchos) Plat2 TTCTAGGGCGCTTACGGCAGG

Курица (Gallus Gall ATAGCCACCGCCTTTGTGGGC 151

gallus) Gal2 TTGGGTTGTCGACTGAAAATCCC

Начальную денатурацию проводили при 94 оС -

3 мин; последующие 35 циклов: 94 оС - 40 с, 70 оС -30 с, 72 оС - 40 с; заключительную элонгацию при 72 оС - 4 мин.

В фарше из моносырья (индюшатина, курятина или утятина) были амплифицированы фрагменты длиной 320, 151, 270 п.о. (см. рисунок). Как и предполагалось, в смешанном фарше обнаруживали в зависимости от числа компонентов два или три фрагмента.

рисунок. Электрофореграмма ПЦР фарша птица различного состава: образцы 1, 2 - отрицательный контроль; 3,

4 - индюшатина; 5, 6 -курятина; 7, 8 - утятина; 9, 10 - курятина + утятина; 11, 12 - курятина + индюшатина; 13, 14 - индюшатина + утятина; 15, 16 - курятина + утятина + индюшатина; 17 - положительный контроль ПЦР

Так, продукты ПЦР-анализа фарша из утятины и курятины включали фрагменты длиной 320 и 151 п.о., из курятины и индюшатины - 270 и 151 п.о., индюшатины и утятины - 320 и 270 п.о.. В фарше из трех видов птицы одновременно амплифицировали фрагменты длиной 320, 270, 151 п.о.

выводы. Таким образом, разработанный метод пригоден для анализа проб, лишенных морфологических и анатомических видовых особенностей (измельченное сырье). Кроме того, проведение идентификации трех видов птицы в одной реакции позволит сократить затраты времени и реактивов, по сравнению с симплексными методами анализа, что делает предложенный метод полезным инструментом для видовой идентификации птицесырья.

Литература.

1. Николаева М.А., Лычников Д.С., Неверов А.Н. Идентификация и фальсификация пищевых продуктов — М., Экономика, 1996.

2. Parson W., Pegoraro K., Niederstatter H., Foger M. and Steinlechner M. Species identification by means of the cytochrome b gene.// International Journal of Legal Medicine. - 2004. - Volume 114. - Numbers 1-2. - 23-28.

3. Pfenninger M., Schwenk K. Cryptic animal species are homogeneously distributed among taxa and biogeographical regions. // BMC Evol Biol. - 2007. - 7. - 121.

4. Rogers N.L., Cole S.A., Lan H.C., Crossa A., Demerath E.W. New saliva DNA collection method compared to buccal cell collection techniques for epidemiological studies.//Am J Hum Biol 2007. - 19. - 319-326.

5. Малярчук Б.Я. Мт-ДНКподобные последовательности и координация функционирования ядерного и митохондриального геномов млекопитающих. // Цитология и генетика. 1997. - Т.31. - №2. - С.53-55.

6. Kazumi Ono, Motonobu Satoh, Touho Yoshida, Yutaka Ozawa, Arihiro Kohara, Masao Takeuch, Hiroshi Mizusawa, Hidekazu Sawada. Species identification of animal cells by nested PCR targeted to mitochondrial DNA In Vitro Cell.Dev.Biol.—Animal. - 2007.

- 43. - 168-175.

7. Коновалова Е.Н., Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А. Мультиплексная ДНК-идентификация видового происхождения мясной продукции (в печати).

8. Nsubuga A.M., Robbins M.M., Roeder A.D. et al. Factors affecting the amount of genomic DNA extracted from ape faeces and the identification of an improved sample storage method. // Mol. Ecol. - 2004. - 13. - 2089-2104.

species identification of poultry in livestock products by using of polymerase

chain reaction method

E.N. Konovalova, E.A. Gladyr, N.A. Zinovieva

summary. The test-system on PCR-base allowed to carry out simultaneous identification of three avian species (Gallus gallus, Anas platyrhynchos, Meleagris gallopavo) in poultry raw was developed significantly reducing the time and reagents costs. The test-system is based on multiplex amplification of conserved region of mitochondrial gene cytochrome B by using of three species-specific primer pairs with consequent detection of PCR-products by electrophoresis method in agarose gel. It was shown the ability of using the test-system to analyze of composition of mince different species.

Key words: identification of species composition, molecular tools, multiplex PCR.

УДК 619:615+339:636.5

ПРИМЕНЕНИЕ ВЕТОМА 1.23 ПРИ ВЫРАЩИВАНИИ ЦЫПЛЯТ-БРОЙЛЕРОВ КРОССА ISA F-15

М.Г. ПЕТРАШ, генеральный директор А.Н. ЛУКЬЯНОВ, директор по технологии ЗАО «Алтайский бройлер»

Г.А. НОЗДРИН, доктор ветеринарных наук, зав. кафедрой

А.И. ВОРОНЦОВА, аспирант Н.В. РЕВКОВ, аспирант Новосибирский ГАУ А.И. ЛЕЛЯК, директор

А.А. ЛЕЛЯК, кандидат биологических наук, зав. лабораторией

НПФ «Исследовательский центр»

E-mail: lelaik2@yandex.ru

Резюме. Определение эффективности применения пробиотического препарата ветом 1.23 (на основе бактерий Bacillus subtilis штамм ВКПМ В10641 не менее 1 х 110 КОЕ/мл) в процессе промышленного выращивания цыплятбройлеров с ограниченным использованием антибиотиков (в первые

5 дней жизни) проводили в ЗАО «Алтайбройлер» на птице кросса ISA F15 при напольном содержании в период с мая 2010 г. по май 2010 г. В ходе исследований выполнены 2 серии опытов. В первой из них определяли оптимальную кратность дачи препарата ветом 1.23 (ежедневно, 1 раз в 2-е суток, 1 раз в 3-е суток, 1 раз в 4-о суток до 34-х суточного возраста включительно), во второй - дозу (3 мкл/кг, 0,5 мкл/кг и 1 мкл/ кг живой массы цыплят с кратностью - один раз в 3-е суток). Наибольшая сохранность цыплят (97,24 %) и самый высокий фрактал эффективности применения препарата (2,93) отмечены в группе, птица которой получала пробиотик один раз в 3 дня.

Во второй серии опытов наименьший расход корма на 1 кг прироста живой массы (1,83) отмечен в вариантах с 3 и 0,5 мкл/кг, а самая высокая величина фрактала эффективности (3,05) - в группе, получавшей ветом 1.23 в дозе 0,5 мкл/кг живой массы.

Таким образом, выращивание цыплятбройлеров кросса ISA F15 с применением антибиотиков только в первые 5 дней жизни возможно при использовании пробиотика Ветом 1.23 в количестве 0,5 мкл/кг 1 раз в 3 дня.

Ключевые слова: бройлеры, пробиотики, бактериальные штаммы, сохранность, живая масса, конверсия корма.

В последние годы во многих странах сократилось использование антибиотиков в процессе промышленного выращивания птицы. Причиной этого стало обнаружение резистентности в популяциях патогенных и условно патогенных микроорганизмов, персистирующих в экосистемах птицеводческих комплексов, к большинству используемых препаратов. Кроме того, установлено, что остаточные количества антибиотиков, присутствующие в готовой продукции, оказывают негативное влияние на нормофлору желудочно-кишечного тракта человека [1]. Поэтому становится актуальным вопрос поиска технологий и препаратов, способных заменить антибиотики в промышленном птицеводстве.

В основу одной из таких технологий может лечь подавление роста и развития патогенной, условно патогенной и гнилостной микрофлоры микробными препаратами на основе бактерий рода Bacillus [2-6].

Цель наших исследований - определить эффективность применения пробиотического препарата ветом 1.23 в процессе промышленного выращивания цыплят-бройлеров с ограниченным использованием антибиотиков.

Условия, материалы и методы. Производственный эксперимент проводили в ЗАО «Алтайбройлер» на цыплятах-бройлерах кросса ISA F-15 при напольном содержании в период с мая 2010 г. по май 2010 г. Птица получала полнорационный комбикорм, сбалансированный по всем питательным и биологически активным веществам. Воду и корм давали по технологической схеме предприятия.

В ходе исследований выполнены 2 серии опытов. В первой из них определяли оптимальную кратность дачи препарата ветом 1.23, во второй - дозу.

Ветом 1.23 - жидкий пробиотический препарат на основе бактерий Bacillus subtilis штамм ВКПМ В-10641 с содержанием не менее 1x11° КОЕ/мл.