Штамм Aspergillus terreus в качестве биодеструктора полиэтилена высокого давления
ASPERGILLUS TERREUS STRAIN AS A HIGH PRESSURE POLYETHYLENE DEGRADER

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к средствам защиты окружающей среды от загрязнений, и касается использования штамма микроскопических грибов Aspergillus terreus ВКПМ F-1332 как биодеструктора полимерных материалов. Изобретение может быть использовано при утилизации полимерсодержащих отходов и материалов.
В настоящее время проблема загрязнения окружающей среды отходами полимерной природы является особенно актуальной. Из-за массового производства полимерных материалов и их широким использованием во многих областях человеческой деятельности (промышленности: строительство, агросектор, автопроизводства; бытовой деятельности), происходит интенсивное накопление синтетических полимерных материалов в объектах окружающей среды, что приводит к проблемам, связанным с необходимостью в их утилизации.
Известен штамм микроскопических грибов - биодеструктор полимерных материалов, который встречается на полимерсодержащих материалах практического назначения России и Прибалтики (см. кн. Лугаускас А.Ю. и др. Каталог микромицетов - биодеструкторов полимерных материалов, М.: Наука, 1987 г. С. 82). Представлены краткие данные о культурально-морфологических особенностях биодеструкторов. Однако, штамм обладает меньшей деструкционной способностью в отношении полимерсодержащих материалов, таких как полиэтилен высокого давления.
В качестве ближайшего аналога (прототипа) принят штамм Clonostachyssolanif. Nigrovirens (vanBeyma) Schroers - биодеструктор термопластичных полиуретанов и латексов на основе акриловой кислоты (Патент РФ №2415914, 2011). Однако, при отнесении микроорганизмов к биодеструкторам использовался метод приманки, который менее эффективен, чем метод накопительных культур, используемый при реализации предполагаемого изобретения на протяжении длительного периода экспериментальных исследований.
Техническая задача заявляемого изобретения - выявление нового штамма, характеризующегося высоким уровнем биодеструкционной активности в отношении полимерсодержащих материалов, путем изменения их физико-химических свойствпри иммобилизации исследуемым штаммом микромицетов, а так же интенсивности действия ферментных систем штамма под действием факторов окружающей среды для максимизации деструктивного процесса.
рм
Технический результат - повышение биодеструкции полиэтилена высокого давления штаммом Aspergillus terreus ВКПМ F-1332 в составе консорциума микроорганизмов-деструкторов, путем снижения прочности полиэтилена при растяжении (σ) на 49,2% и относительного процентного удлинения при разрыве (ε) на 80,2% за период экспозиции модельных систем.
Предлагаемый штамм, входящий в состав консорциума биодеструкторов, деформирует аморфную часть полимера, нарушая его кристалличность. Вследствие этого происходит снижение плотности укладки длинной цепи метиленовых групп, составляющих молекулу полиэтилена, что приводит к снижению прочности и увеличению упругости полимерных материалов.
Особенностью предлагаемого штамма является то, что в процессе его культивирования на протяжении 21 суток на минеральной синтетической среде с полимерным материалом при оптимальных условиях культивирования наблюдается максимальная экзооксидоредуктазная активность.
Экзооксидоредуктазы - агенты в окислении химических группировок разнообразных органических соединений, способные повышать устойчивость микроскопических грибов к условиям внешней среды.
Штамм Aspergillus terreus выделен в лабораторных условиях методом накопительных культур из модельных экосистем на основе минеральной синтетической среды (содержание неорганических солей ≤2%) с внесением полимерсодержащего материала на основе полиэтилена высокого давления. Заявляемый штамм стабильно выделялся на протяжении 100 месяцев непрерывного культивирования модельных экосистем.
Таксономическая принадлежность штамма определена при помощи нуклеотидных последовательностей генов 18S рДНК. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов при Федеральном Государственном Бюджетном Учреждении "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" и имеет коллекционный номер F-1332.
Культура заявляемого штамма имеет следующие признаки:
Макроморфологические признаки: быстрорастущие колонии, низкие бархатистые с тонким краем; размер колонии D=3,5-5,0 см за 10 суток культивирования; обильное песочное спороношение; цвет обратной стороны колонии белый, слегка желтоватый; не образует пигмент; экссудат янтарного цвета; по мере старения колонии приобретают более темную окраску;
Микроморфологические признаки: конидиальные головки компактные, 30-50 мкм в диаметре, длиной от 200 до 500 мкм, везикулы полушаровидные, куполовидные (10-20 мкм). Конидиеносцы 100-250*5-6 мкм, гладкие. Конидии шаровидные, гладкие 1,9-2,4 мкм в диаметре, Стеригмы двуярусные: первого яруса - однообразные разных размеров, второго яруса - однообразные.
2
4
2
4
4
2
4
2
4
2
3
4
2
4
2
4
2
4
2
3
3
4
2
Условия культивирования: для получения препаративной формы штамма Aspergillus terreus ВКПМ F-1332 в качестве питательной среды используют недорогостоящую среду - минеральный синтетический агар следующего состава (г/л) KНРO - 7,0; KНРO - 0,3; MgSO⋅7HO - 0,1; (NH)SO - 1,0; Na-цитрат⋅3НO - 0,5; микроэлементы: MgO - 0,1; FeCl - 0,054; ZnSO⋅7HO - 0,014; MnSO⋅4HO - 0,011; CuSO⋅5HO - 0,0025; CoSO⋅7HO - 0,0028; HBO - 0,006; NaMoO⋅2HO - 0,0049; дистиллированная вода - 1,0). Для получения посевного материала используют стандартную методику: культуру рассевают на скошенный синтетический агар, инкубируют в условиях термостата при 25-28°С в течение 5-7 суток. При культивировании штамм Aspergillus terreus ВКПМ F-1332 не нуждается в дополнительных факторах роста.
Для хранения штамма штамма Aspergillus terreus ВКПМ F-1332 используют метод периодических пересевов на поверхность скошенного синтетического агара (3-4 раза в год). После пересева штамма производится культивирование при температуре 25-28°С в течение 5-7 суток, после чего культуры хранят при температуре 4±1°С.
Заявляемый штамм, являющийся биодеструктором полимерсодержащих материалов, хранится в коллекции кафедры «Прикладная биология и микробиология» ФГБОУ ВО «Астраханский государственный технический университет» и во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика» (г. Москва).
Получение и применение заявляемого штамма поясняется нижеприведенными примерами.
Пример 1 демонстрирует условия культивирования заявляемого штамма Aspergillus terreus ВКПМ F-1332. В ходе экспериментальных исследований производили определение оптимальных для роста и развития заявляемого штамма значений следующих факторов среды: температура, влажность, освещенность, кислотность, соленость. По истечении определенного срока культивирования определяли ростовые параметры и ростовой коэффициент заявляемого штамма (см. монографию А.С. Бухало «Высшие съедобные базидиальные грибы в чистой культуре». - Киев: изд-во «Наукова думка», 1988. - 144 с.)
Изучение температуры культивирования производилось при 3-х температурных режимах: 36±0,9°С, 25±0,5°С, 4±0,6°С. По истечении 14 суток культивирования изучали параметры развития микромицета, представленные в таблице 1.
Из таблицы 1 видно, что оптимальной температурой для развития заявляемого штамма является температурный режим 25±0,5°С.
Изучение содержания влаги в среде проводилось при 2-х уровнях увлажненности: на высушенном и влажном субстрате, инокулированном суспензией спор микромицета. По истечении 14 суток культивирования изучали параметры развития микромицета. В ходе эксперимента установили, что на сухом субстрате колонии не развивались, в то время как на влажном диаметр колоний был равен 23±2 мм. Заявленному штамму для роста, развития и поддержания жизненных процессов необходимо значительное содержание влаги.
Изучение влияния света на рост и развитие заявляемого штамма производили при постоянном освещении (люминесцентная лампа) и при полном его отсутствии. Исследование проводили в течение 10 суток культивирования, после которого изучали параметры развития штамма, представленные в таблице 2.
Таблица 2 демонстрирует, что постоянное освещения более благоприятно сказывается на ростовых факторах заявляемого штамма.
Концентрацию ионов водорода в среде изучали при 3-х реакциях среды: кислая, нейтральная, щелочная. Исследование проводили в течение 14 суток культивирования, по истечении которого изучали параметры развития штамма (таблица 3).
В таблице 3 показано, что нейтральная реакция среды является оптимальной для развития заявляемого штамма.
Определение солености среды для заявляемого штамма производилось при 3-х различных концентраций NaCl (3%; 5%; 10%). По истечении 20 суток культивирования изучали параметры развития объектов исследования (таблица 4).
Из таблицы 4 видно, что повышение концентрации соли в питательной среде, оказывает влияние на величину осмотического давления внутри клеток заявляемого штамма, вызывая их обезвоживание. При повышении концентрации соли более 4% рост и размножение замедляются, при концентрации более 7% - прекращается.
Пример 2 демонстрирует деструкционное действие заявляемого штамма Aspergillus terreus ВКПМ F-1332 на полимерсодержащий материал и его грибостойкость. Культуру штамма получали описанным способом.- методом периодических пересевов на поверхность интетичского агара. Грибостойкость определяли по ГОСТ 9.049-91. Инкубируемый материал - полиэтилен высокого давления (производитель ООО «Спринт-пласт») помещали в чашки Петри и инокулировали суспензией спор заявляемого штамма и выдерживали в течение 28 суток при t=25±2°С и влажности >95%. Грибостойкость определяли на основании визуального обрастания инокулируемого полимерсодержащего материала по 5-ти балльной шкале.
По истечении заявленного срока культивирования произвели микроскопирование нескольких образцов полимерсодержащего материала, в результате чего интенсивность роста заявленного штамма на поверхности ПСМ оценена в 4 (невооруженным глазом отчетливо виден рост микромицета, покрывающего менее 25% образца) и 5 баллов (невооруженным глазом отчетливо виден рост микромицета, покрывающего менее 25% образца).
Пример 3 демонстрирует проявление экзооксидоредуктазной активности заявляемого штамма Aspergillus terreus ВКПМ F-1332, а так же условия среды для максимального проявления экзокаталазной и экзопероксидазной активностей.
Изучение динамики накопления экзооксидоредуктаз проводили на примере таких ферментов как каталаза и пероксидаза, которые играют главную роль в биодеструктивных процессах.
Заявленный штамм выращивался на качалке, обеспечивающей встряхивание колб со скорость 200 об/мин. В стерильные колбы Эрленмейера на 250 мл, содержащих жидкую питательную синтетическую среду, помещали при помощи бактериологической петли споры исследуемого гриба, а также измельченный полиэтиленной пакет (производитель ООО «Спринт-пласт»). Данные манипуляции проводили для подтверждения биодеструктивного потенциала заявляемого штамма. Полученные результаты сравнивали с контрольными. Контролем являлись колбы с синтетической средой без внесения полимерсодержащего материала. Затем колбы помещали на качалку, температура культивирования +27±2°С. После окончания культивирования на протяжении 21 суток культуральную жидкость отделяли от мицелия путем фильтрования. Для дальнейших исследований использовалась культуральная жидкость (КЖ).
Определение активности пероксидазы проводилось спектрофотометрически (СФ-2000) по модифицированому методу  (см. Aurand et all, 1956). В качестве субстрата использовали пероксид водорода (0,03%) и парафенилендиамин (0,1 М). Измерения проводили при
2
2
2
2
В кювету спекрофотометра толщиной 1 см помещали: 1,5 мл буферного раствора рН=7,2; 0,5 мл ферментативного препарата (КЖ); 0,5 мл раствора n-фенилендиамина; 0,5 мл 0,03% НО. В контрольной кювете НО заменяли водой. Измерения проводили в течение 1 минуты.
Определение активности каталазы проводилось спектрофотометрически (СФ-2000) по методу  (см. Patterson et all, 1984). В качестве субстрата использовали пероксид водорода (30 мМ). Измерения проводили при
2
2
2
2
В кювету спекрофотометра толщиной 1 см помещалось: 1 мл буферного раствора рН=7,8; 1 мл ферментативного препарата (КЖ); 1 мл 30 мМ НО. В контрольной кювете НО заменяли водой. Измерения проводили в течение 1 минуты.
Активность пероксидазы и каталазы рассчитывали по формуле:
а
где А - активность фермента, Д - приращение оптической плотности, d-толщина слоя жидкости в кювете (1 см), t - время измерения, мин.; ×β×x - факторы разведения (равны 1).
Результаты измерений выражались в условных единицах (у.е.). За единицу активности принималось приращение оптической плотности в 1 мл реакционной смеси за 1 час, в пересчете на 1 мг вносимого белка.
Эксперименты проводили в течение 21-х суток. Контрольные показатели измеряли на 7, 14 и 21 сутки инокулирования.
Установили, что максимальное продуцирование каталазы и пероксидазы у заявляемого штамма наблюдалось на 14 сутки культивирования, причем показатели опытных колб (с субстратом) превышали контрольные (без субстрата) на 40,4% (0,52±0,01 у.е.) и 43,8% (0,08±0,016 у.е.) соответственно. Экзооксидоредуктазная активность заявляемого штамма Aspergillus terreus ВКПМ F-1332 на 14 сутки культивирования представлена на фигуре 1.
Вышеприведенные денные свидетельствуют о высокой эксзооксидоредуктазной активности заявляемого штамма Aspergillus terreus ВКПМ F-1332 в отношении полиэтилена высоко давления, который был использован в эксперименте в качестве субстрата.
Определили оптимальные значения рН и температуры среды для проявления экзооксидоредуктазной активности заявляемого штамма.
Полученные экспериментальные данные представлены в %, произведен перерасчет при помощи дисперсионного анализа, построен график. Значения сравнивали с контрольными (100%). Данные по определению рН - оптимума для проявления экзопероксдазной и экзокаталазной активностей показаны на фигурах 2 и 3, данные по температурному оптимуму - на фигурах 4 и 5.
Изменение уровня активности пероксидазы при культивировании заявленного штамма Aspergillus terreus ВКПМ F-1332 на среде с различными значениями рН показало, что количество фермента по отношению к контролю увеличивается при рН=5 и рН=9 на 68% и 12% соответственно, остальные показатели ниже контроля. Оптимальное значение рН=5.
Полученные данные показывают изменение уровня активности экзокаталазы при культивировании заявленного штамма Aspergillus terreus ВКПМ F-1332 на среде с различными значениями рН по отношению к контролю. Оптимальное значение рН находится в пределах рН=9, где количество фермента по отношению к контролю увеличивается на 186%.
Экспериментальные данные показывают, что изменение пероксидазной активности при культивировании Aspergillus terreus ВКПМ F-1332 происходит при температуре равной 30°С на 86%,
Изменение каталазной активности при культивировании Aspergillus terreus при различных температурных режимах увеличивается при всех исследуемых режимах культивирования, но максимальной точки достигает в диапазоне от 10 до 20°С: от 55% до 81%. Температурный оптимум проявления экзокаталазной активности - в диапазоне от 10°С до 20°С.
Заявляемый штамм Aspergillus terreus ВКПМ F-1332 является стабильно выделяемым среди штаммов в составе сообщества микромицетов - деструкторов полимеродержащих материалов на протяжении 100 месяцев культивирования модельных лабораторных экспериментов. Установлено, что для достижения максимальных ростовых параметров культуры биодеструктора необходим температурный режим в 25±0,5°С, высокое содержание влаги в среде (>60%), культивирование при постоянном освещении и нейтральная реакция среды. За 28 суток культивирования штамма на поверхности полимерсодержащего материала в вышеуказанных условиях культивирования происходит обрастание полиэтилена штаммом микромицета, образование микротрещин. Заявляемый штамм обладает высокой экзооксидоредуктазной активностью, что характеризуется наличием каталазы и пероксидазы, способствующим разрушению полиэтилена. Максимальное выделение ферментов и проявление деструктивной активности происходит на 14 сутки экспонирования.
Положительный эффект заявляемого штамма Aspergillus terreus ВКПМ F-1332 заключается в эффективном действии экзооксидоредуктаз микромицета, входящего в состав сообщества биодеструкторов; высокой степени обрастания полимерсодержащего материала за счет чего происходит снижение физических параметров полимеродержащих материалов.