Анализ содержания плазмабластов в крови людей в разные сроки после иммунизации вакциной сибиреязвенной живой сухой

© Коллектив авторов, 2019

Силкина М.В., Карцева А.С., Зенинская Н.А., Марьин М.А., Рябко А.К., Мунтян Я.О., Фирстова В.В., Шемякин И.Г., Дятлов И.А.

Анализ содержания плазмабластов в крови людей в разные сроки после иммунизации вакциной сибиреязвенной живой сухой

ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, 142279, г. Оболенск, Россия

Лечение сибирской язвы успешно проводят с использованием антибиотиков. Однако при легочной/кишечной форме или поздней стадии сибиреязвенной инфекции эффективность антибиоти-котерапии резко падает. Это связано с накоплением в организме большого количества летального токсина, который и обусловливает летальный исход при сибирской язве. Летальный токсин состоит из протективного антигена (ПА) и летального фактора (ЛФ). При активной системной форме инфекции летальный токсин может быть нейтрализован только специфическими антителами к ПА и/или ЛФ. Один из подходов получения человеческих терапетических моноклональных антител подразумевает выделение специфических плазмабластов из крови иммунных доноров. В норме содержание плазмабластов в кровотоке крайне низкое - от 0,2 до 5%. Увеличение плазмабластов в крови кратковременно, в зависимости от типа вакцины и пути ее введения оно наблюдается на 5-13-е сутки после вакцинации.

Цель работы - выявление времени транзиторного увеличения плазмабластов в крови доноров после вакцинации. В работе показано, что у 5 из 12 доноров, многократно иммунизированных вакциной сибиреязвенной живой сухой, на 5-8-е сутки детектировались антитела против протективного антигена и у 2 - антитела против летального фактора. Из 5 серопозитивных сывороток только 2 характеризовались способностью нейтрализовать летальный токсин в экспериментах in vitro. Максимальный транзиторный выброс плазмабластов с фенотипом CD19+CD20"/1oCD27hiCD38hi в кровь регистрировался на 7-е сутки после иммунизации доноров вакциной живой сибиреязвенной сухой. Количество плазмабластов в этот срок увеличивалось до 6,9-14,6%. Предварительный анализ наличия антител в крови к ПА и ЛФ, а также оценка их нейтрализующей активности в отношении сибиреязвенного токсина позволит выбрать наиболее перспективного донора специфических плаз-мабластов для получения человеческих моноклональных антител к ПА или ЛФ.

Ключевые слова: Bacillus anthracis; плазмабласты; антитела; летальный токсин; токсин-нейтрализующая активность

Статья поступила 31.01.2019. Принята в печать 16.02.2019.

Для цитирования: Силкина М.В., Карцева А.С., Зенинская Н.А., Марьин М.А., Рябко А.К., Мунтян Я.О., Фирстова В.В., Шемякин И.Г., Дятлов И.А. Анализ содержания плазмабластов в крови людей в разные сроки после иммунизации вакциной сибиреязвенной живой сухой. Иммунология. 2019; 40 (2): 23-29. doi: 10.24411/0206-49522019-12004.

Финансирование. Работа проведена в рамках работы по Государственному контракту № 13-Д от 28.08.2018 г. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Silkina M.V., Kartseva A.S., Zeninskaya N.A., Marin M.A., Ryabko A.K., Muntyan Ya.O., Firstova V.V., Shemyakin I.G., Dyatlov I.A.

Analysis of plasmoblasts in the human blood at different times after immunization with live anthrax vaccine

Science State research center for Applied Microbiology and Вiotechno1ogy of Rospotrebnadzor, 142279, Obolensk, Russia

Anthrax treatment is successfully carried out with the use of antibiotics. However, in cases of pulmonary, intestinal forms or late stages of anthrax infection, the effectiveness of antibiotic therapy drops sharply. This is due to the accumulation in the body of a large number of lethal toxin, which causes death. The lethal toxin consists of a protective antigen (PA) and a lethal factor (LF). At the active systemic form of anthrax, the concentration of lethal toxin in the body increases and in this case, the toxin can be neutralized with specific antibodies to PA and/or LF. One approach to obtaining human therapeutic monoclonal antibodies involves the isolation of specific plasmablasts from the blood of immune donors. Normally, the content

Для корреспонденции

Силкина Марина Владимировна -младший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии, ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, Оболенск, Россия

E-mail: silkina@obolensk.org https://orcid.org/0000-0002-5329-2807

of plasmablasts in the bloodstream is extremely low - from 0.2 to 5%. Depending on the type of vaccine and the route of its administration transient increase of plasmablasts in the blood is briefly observed on the 5-13 day after vaccination. The purpose of the work was to identify the time of the transient increase of plasmablasts in the blood of donors after vaccination. It was shown that in 5 out of 12 donors repeatedly immunized with the live antisera vaccine, antibodies against the protective antigen were detected and in two, antibodies against the lethal factor on 5-8 days after vaccination. The maximum transient release of plasmablasts in the blood with the phenotype CD19+CD20-/loCD27hiCD38hi was found on the 7th day after immunization of donors with a live anthrax vaccine. The number of plasmablasts in this period increased to 6.9-14.6%. Preliminary detection of antibodies to PA and LF, as well as assessment of their neutralizing activity against the lethal toxin, will help select the most potential donors of specific plasma blasts in order to obtain human monoclonal antibodies to PA or LF.

Keywords: Bacillus anthracis; plasma blasts; antibodies; lethal toxin; toxinneutralizing activity

Received 31.01.2019. Accepted 16.02.2019.

For citation: Silkina M.V., Kartseva A.S., Zeninskaya N.A., Marin M.A., Ryabko A.K., Muntyan Ya.O., Firstova V.V., Shemyakin I.G., Dyatlov I.A. Analysis of plasmablasts in the human blood at diffrent times after immunization with live anthrax vaccine

Acknowledgments. The work was carried out within the framework of the state contract № 13-D from 28.08.2018.

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

For correspondence

Silkina Marina V. -Junior Researcher of Laboratory of Molecular Biology, Science State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology of Rospotrebnadzor,142279, Obolensk, Russia E-mail: silkina@obolensk.org https://orcid.org/0000-0002-5329-2807

Антибиотикотерапия сибирской язвы эффективна на ранних стадиях инфекции. На поздней стадии инфекции, а также при легочной и кишечной формах эффективность применения антибиотиков резко снижается [1]. Это связано с накоплением в крови 3-компонентного токсина сибирской язвы, состоящего из А- (летальный и отечный факторы) и В- (протек-тивный антиген) субъединиц. Летальное действие сибиреязвенного токсина обусловлено прежде всего летальным токсином (ЛТ), состоящим из протектив-ного антигена (ПА) и летального фактора (ЛФ) [2]. В связи с этим токсин-нейтрализующее действие при лечении сибирской язвы направлено прежде всего на нейтрализацию ЛТ. Так, ПА участвует в связывании токсина с рецептором, соответственно, при инги-бировании ПА будет наблюдаться антитоксический эффект в отношении ЛФ и отечного фактора (ОФ). С использованием гибридомной технологии получены моноклональные антитела мыши (МкАТ) к ПА и ЛФ. В экспериментах in vitro на мышиных макрофаго-подобных клеточных линиях J774 и RAW 264.7 была показана токсин-нейтрализующая активность МкАТ против ЛТ [3]. Эффективность ингибирования токсина сибирской язвы подтверждена в опытах на мышиных моделях [4]. Это позволило предположить эффективность использования токсин-нейтрализующих антител в терапевтических целях.

Получение МкАТ мыши является рутинным методом и не вызывает трудностей. Однако использование мышиных МкАТ для терапии людей связано с рядом ограничений: высокая иммуногенность, низкая эффективность, быстрое выведение из организма. Одним из подходов к решению данной проблемы является получение гибридомных клеток, синтезирующих МкАТ человека, что предполагает получение плазмабластов и слияние их с перевиваемой миеломной или гетеро-миеломной клеткой. Большая сложность заключается в получении специфических плазмабластов человека

в связи с их низким содержанием 0,2% от всех мо-нонуклеаров) в крови здоровых людей. Известно, что после вакцинации количество плазмабластов в кровотоке увеличивается до 5-6% и выше. Время транзитор-ного выброса плазмабластов в кровоток определяется особенностями вакцинного препарата и наблюдается между 5-13-ми сутками после вакцинациии.

Цель исследования - определить время, оптимальное для получения плазмабластов, у людей после иммунизации вакциной сибиреязвенной живой сухой.

Экспериментальная часть

Доноры. У людей, ежегодно иммунизированных вакциной сибиреязвенной живой сухой для подкожного и скарификационного применения (серия 265, Киров), на 0-е и 5, 6, 7, 8-е сутки после вакцинации брали цельную кровь в вакуумные пробирки Vacuette (Greiner-Bio-One, Австрия) с лития гепарином и активатором свертывания крови для получения сыворотки. Контролем при анализе содержания плазмабластов служили данные, полученные у этого же донора до вакцинации. Доноры, включенные в исследование, были иммунизированы не менее 2 раз. Интервал между крайней вакцинацией, предшествующей исследованию, и включением донора в данное исследование составлял 1 год. Группа сравнения при анализе титров антител к ПА и ЛФ состояла из 15 доноров, не иммунизированных и ранее не болевших сибирской язвой.

Выделение В-лимфоцитов. Гепаринизированную кровь инкубировали в пробирках в течение 20 мин с RosseteSepTM Human B Cell Enrichment Cocktail (Stemcell technologies, Канада) из расчета 50 мкл реактива на 1 мл цельной крови. Затем кровь разводили в 2 раза средой RPMI 1640 («Пан Эко», Россия), наслаивали на градиент плотности RosseteSepTM DM-L Density (Stemcell technologies, Канада) в соотношении 1 : 1 и центрифугировали в течение 20 мин при 1200 g с выключенным тормозом при комнатной температуре.

Полученное опалесцирующее кольцо на границе раздела двух сред собирали и дважды отмывали в среде RPMI 1640 при 300g в течение 10 мин, а затем ресу-спендировали в полной питательной среде RPMI 1640, содержащей 2 мМ глутамина («ПанЭко», Россия), 10 мМ HEPES (Sigma, США), 25 мкМ 2-меркаптоэтанола (Sigma, США) и 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS, Termo Fisher Scientific, США). Жизнеспособные клетки подсчитывали на автоматическом счетчике «ТС-20» (Bio-Rad, США) после окрашивания клеток трипано-вым синим (Invitrogen, США).

Фенотипирование лимфоцитов. Выделенные В-лимфоциты

в соответствии с инструкцией производителя. Вкратце, образец клеток окрашивали в течение 20 мин в темноте при температуре 20 °С. Затем клетки отмывали в фосфатно-солевом буфере (PBS) и фиксировали 1% раствором формалина. Цитометрический анализ проводили на проточном цитофлюориметре «FACS Aria III» (Becton Dickinson, США) с использованием программного обеспечения BD FACS Diva (версия 8.0). В каждом образце анализировали 10 000 клеток.

Получение рекомбинантных антигенов. Рекомби-нантные белки, ПА и ЛФ Bacillus anthracis получили в системе экспрессии E. coli. Клетки E. coli штамма BL21(DE3), трансформированные экспрессионной плазмидой pET22b(+)-ПА и pET22b(+)-ЛФ, наращивали в среде 2xYT, содержащей 0,1% глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина. Экспрессию белка проводили при 25 °С в течение 6 ч под воздействием индуктора IPTG. Для очистки бактериальную биомассу собирали центрифугированием. Осветленный лизат очищали на колонке с Ni-сефарозой с последующей доочисткой на гель-фильтрационной хроматографии. Чистоту полученных рекомбинантных белков проверяли в электрофорезе в ПААГ в денатурирующих условиях по методу Лэммли. Гель окрашивали кумасси бриллиантовым синим (R-250), молекулярную массу полученных полос сравнивали с коммерческим маркером молекулярных масс. Концентрацию определяли на спектрофотометре Smart Spec Plus (BIO-RAD, США) при длине волны 280 нм.

Определение антител к протективному антигену и летальному фактору в сыворотке крови. На поверхности лунок поликарбонатного планшета иммобилизи-ровали рекомбинантный белок ЛФ или ПА B. anthracis. Для этого в лунки планшета вносили по 100 мкл раствора рекомбинантных белков в концентрации 0,01 мг/мл, инкубировали в течение 2 ч при температуре 37 °С и перемешивании на орбитальном шейкере при скорости 300 об/мин. По окончании инкубации проводили 3-кратную отмывку лунок планшета PBS с добавлением 0,05% Tween-20 (PBS-Tween). Свободные валентности пластика блокировали обезжиренным молоком, внося его в объеме 200 мкл на лунку. Блокировку проводили в течение 1 ч при температуре 37 °С и перемешивании, после чего 3-кратно отмывали с использованием

PBS-Tween. Сыворотки доноров разводили в PBS в соотношениях от 1 : 25 до 1 : 3200 с 2-кратным шагом разведения и инкубировали в течение 1 ч на шейкере при температуре 37 °C, затем 3-кратно промывали PBS-Tween. В лунки планшета добавляли по 100 мкл конъюгата кроличьих антител против IgG человека с пе-роксидазой хрена (Sigma, США) в разведении 1 : 5000 в PBS. После часовой инкубации и 6-кратной отмывки планшета во все лунки вносили по 100 мкл субстрат-индикаторной смеси. Реакцию останавливали 2 М серной кислотой (50 мкл/лунку). Результаты учитывали на спектрофотометре «Smart Spec Plus» (BIO-RAD, США) при длине волны 492 нм.

Оценка токсин-нейтрализующей активности антител. Токсическая доза (ED100) ПА и ЛФ для клеточной линии J774A.1 была определена в предыдущих экспериментах и составила 100 нг/мл ЛФ и 500 нг/мл ПА.

В лунки 96-луночного планшета, содержащие адгезированные клетки макрофагоподобной линии J774A.1 в 85 мкл полной питательной среды DMEM (Termo Fisher Scientific, США), вносили рекомбинант-ные ПА и ЛФ, предварительно инкубировавшиеся в течение 1 ч при 37 °С разными разведениями сывороток доноров. Сыворотки доноров титровали двойным шагом, начиная с разведения 1 : 25 до 1 : 200. В качестве положительного контроля использовали лунки без добавления токсина и антител, в качестве отрицательного - с добавлением 0,024% мер-тиолята натрия (Oskar Tropitzsch, Германия). Все исследуемые точки дублировали в 4 повторах. После внесения всех ингредиентов планшеты инкубировали 4 ч при 37 °С в С02-инкубаторе, а затем добавляли по 10 мкл 3-[4,5-диметилтиазолил-2-ел]-2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ) и инкубировали еще 4 ч. Клеточный слой лизировали добавлением 175 мкл диметилсульфоксида (DMSO, Sigma-Aldrich, США). Оптическую плотность клеточного лизата измеряли на планшетном спектрофотометре xMark (Bio-Rad, США) при длине волны 540 нм.

Токсин-нейтрализующую активность сывороток определяли по жизнеспособности клеток, выражали в процентах и рассчитывали по формуле:

Жизнеспособность клеток = °Р(пРобы) OD(K ),

0D

где K- - лунки с добавлением 0,024% мертиолята натрия, а K+- лунки без добавления токсина и антител; OD - оптическая плотность.

Показатель жизнеспособности клеток, составляющий 50%, считался пороговым для разграничения положительных и отрицательных результатов.

Статистическую обработку результатов выполняли с использованием пакета программ Exel. Достоверность различия сравниваемых величин оценивали по критерию Стьюдента (t) и уровню вероятности безошибочного прогноза (p). Статистический анализ цито-метрических данных проводили в программе BD FACS Diva (версия 8.0).

экспрессируют СБ27- и СБ38-молекулы. В процессе дальнейшей дифференцировки плазмабласты могут полностью терять экспрессию СБ19- и СБ20-молекул. Таким образом, плазмабласты могут иметь фенотипы: СВ19+СВ201оСВ27ыСБ38ы, СБ 19+СБ20-СВ27ыСБ38ы, СВ19-СВ20-СВ27ЫСБ38Ы

Для определения содержания субпопуляции плазма-бластов мы гейтировали субпопуляции В-лимфоцитов по наличию/отсутствию СБ19- и СБ20-молекул и анализировали экспрессию на их поверхности СБ27ЫСБ38Ы (см. рисунок). Обнаружено, что только в субпопуляциях СБ19+СБ20- и СВ19+СБ2010 выявлены клетки с высокой экспрессией СБ27ЫСБ38Ы. Данные подтверждены методом обратного гейтирования. Таким образом, основной фенотип плазмабластов, циркулирующих в крови людей в ранние сроки после иммунизации вакциной сибиреязвенной живой сухой, имели субпопуляции СВ19+СВ201оСВ27ыСБ38ы и СВ19+СВ20-СВ27ЫСБ38Ы

Анализ процентного содержания плазмабластов с фенотипом СВ19+СВ20-ЛоСВ27ыСБ38ы проводили в крови у людей на 5, 6, 7, 8-е сутки после вакцинации. Результаты исследований показали, что содержание плазмабла-стов увеличивалось на 6, 7, 8-е сутки после вакцинации по сравнению с их содержанием до вакцинации (табл. 2).

Сравнительный анализ изменения количества плаз-мабластов в крови доноров показал плавное нарастание количества плазмабластов к 7-м суткам вакцинального процесса с последующим снижением их содержания на 8-е сутки после вакцинации (см. табл. 2). Таким образом, транзиторное увеличение содержания субпопуляции СВ19+СВ20-ЛоСВ27ыСБ38ы в крови доноров выявлено на 7-е сутки после их иммунизации вакциной сибиреязвенной живой сухой.

Таблица 1. Титры антител ^О к протективному антигену (ПА), летальному фактору (ЛФ) в сыворотке крови доноров и ее токсин-нейтрализующая активность на 5-8-е сутки после иммунизации вакциной живой сибиреязвенной сухой

№ донора (срок, сутки) Токсин-нейтрализующая активность (% жизнеспособности клеток*) Титры антител к Кратность вакцинации

ПА ЛФ

1 (5-е) 92 1600 Не обнаружено > 10

2 (5-е) 14 Не обнаружено Не обнаружено 2

3 (6-е) 15 200 Не обнаружено > 20

4 (6-е) 21 Не обнаружено Не обнаружено 3

5 (7-е) 11 400 800 > 20

6 (7-е) 13 50 Не обнаружено > 20

7 (7-е) 13 Не обнаружено Не обнаружено 2

8 (7-е) 22 Не обнаружено 100 9

9 (7-е) 51 50 Не обнаружено > 10

10 (7-е) 25 Не обнаружено Не обнаружено > 10

11 (8-е) 19 Не обнаружено Не обнаружено 2

12 (8-е) 17 Не обнаружено Не обнаружено > 10

Контроль (среднее значение от 15 доноров) 19 ± 10 Не обнаружено Не обнаружено

Примечание. * - значения жизнеспособности клеток получены при разведении сывороток 1 : 25.

Результаты

Определение антител к протективному антигену и летальному фактору. Антитела к ПА и ЛФ и токсиннейтра-лизующую активность сывороток у доноров до иммунизации не выявляли. Анализ сывороток вакцинированных доноров показал, что у 5 из 12 вакцинированных доноров на 5-8-е сутки после иммунизации вакциной сибиреязвенной живой сухой появлялись антитела к ПА (табл. 1). Уровень антител к ПА варьировал от 1 : 50 до 1 : 1600. Наличие антител к ПА не зависело от сроков забора крови после вакцинации и ее кратности. Антитела к ЛФ выявлены только у 2 многократно вакцинированных доноров, кровь которых взяли на исследование на 7-е сутки после иммунизации вакциной сибиреязвенной живой сухой.

Определение токсин-нейтрализующей активности сывороток крови. Из 5 сывороток, в которых обнаружены специфические антитела к ПА, только 2 сыворотки характеризовались способностью нейтрализовать ЛТ B. anthracis в тесте in vitro, что проявлялось в защите от гибели 50% и более клеток линии J774 А.1 в присутствии ЛТ. Токсин-нейтрализующая активность сывороток проявлялась в разведениях от 1 : 25 до 1 : 100. Сыворотки контрольных доноров не обладали способностью нейтрализовать ЛТ, как и сыворотки, полученные от доноров, вакцинированных против сибирской язвы, у которых не выявлены антитела к ПА и ЛФ.

Анализ содержания плазмабластов в разные сроки после вакцинации. В процессе дифференцировки В-лимфоцитов происходит изменение их фенотипа, по которому можно определить стадию созревания клеток, выделить субпопуляции плазмабластов и В-клеток памяти. Плазмабласты экспрессируют СБ19-молекулу и незначительное количество CD20, а также усиленно

Примеры двухпараметрических цитофлюорограмм, отражающих последовательное гейтирование субпопуляций CD19+CD20"'10 и CD19+CD20"/1oCD27hiCD38hi.

Таблица 2. Содержание субпопуляции СВ19+СВ20-/1оСВ27111СВ38111 в крови доноров на 5-8-е сутки после иммунизации вакциной сибиреязвенной живой сухой

Содержание CD19+CD20-/loCD38hiCD27hi до вакцинации

Номер донора 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Содержание, % 0,6 2,8 1,5 2,1 2,5 3 3,2 1,9 2,8 2,7 1,2 0,9

Количество на 10 000 подсчитанных клеток 6 16 5 20 35 15 28 17 22 25 9 10

Содержание CD19+CD20-/loCD38hiCD27hl после вакцинации

Время после вакцинации, сут 5-е 6-е 7-е 8-е

Номер донора 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Содержание, % 0,5 2,8 3,4 3,8 14,6 10,5 8,9 5,8 8,1 6,9 5,8 1,2

Количество на 10 000 подсчитанных клеток 5 20 7 80 90 34 62 42 52 36 16 61

Обсуждение

В-лимфоциты играют важную роль в формировании адаптивного иммунного ответа против патогенов, главным образом за счет способности синтезировать специфические антитела. Иммунизация вакциной живой сибиреязвенной сухой индуцирует синтез антител, специфических к антигенам B. anthracis [5]. Результаты наших исследований показали, что на 5-8-е сутки после иммунизации вакциной живой сибиреязвенной сухой у 5 из 12 доноров были выявлены антитела к ПА и у 2 из всех вакцинированных - к ЛФ. Все серопозитивные доноры были иммунизированы против сибирской язвы свыше 10 раз, что позволяет выдвинуть гипотезу о сохранении у них клеток памяти, способствующих быстрому синтезу специфических антител.

Основная роль антител к ПА и ЛФ заключается в нейтрализации ЛТ. Однако, как показали предыдущие исследования, не все антитела к ПА и ЛФ характеризуются токсин-нейтрализующей активностью [6]. В связи с этим сыворотку доноров проанализировали на способность нейтрализовать цитотоксическое действие ЛТ in vitro на клеточной линии J774.1. Сыворотка только 2 из 5 доноров ингибировала цитотокси-ческое действие ЛТ.

Появление антител в крови свидетельствует о том, что после первичного контакта с антигенами ПА и ЛФ в лимфатических узлах произошла диффренцировка лимфоцитов сначала в плазмабласты, а затем в плазматические клетки, синтезирующие специфические антитела. Короткоживущие плазматические клетки мигрируют из вторичных лимфоидных органов в костный мозг, где превращаются в долгоживущие плазматические клетки. В момент миграции плазмабластов в ниши иммунной системы, располагающихся в лимфатических узлах, костном мозге, селезенке или слизистых, ассоциированных с лимфатической тканью, их количество в кровяном русле увеличивается на короткий промежуток времени [7], что делает возможным выделение специфических плазмабластов из крови.

Фенотип плазмабластов определяется как CD19+CD201oCD27hiCD38hi, CD 19+CD20-CD27hlCD38hl или CD19-CD20-CD27hiCD38hi. Так, CD38 и CD27 экс-прессируются на большинстве плазмабластов в ярко выраженном количестве [8]. Молекула CD38 катализирует образование циклической АДФ-рибозы и НАДФ и регулирует Ca2+ в лимфоидной клетке [9]. Молекула CD27- - член семейства рецепторов факторов некроза опухоли, она индуцирует дифференцировку и способствует выживанию клетки [10] и экспрессируется на

большинстве B-клеток памяти [11]. В процессе диффе-ренцировки B-лимфоцитов в плазмабласты снижается экспрессия CD20-молекулы на поверхности клетки [12]. В исследованиях мы выявили, что плазмабласты, циркулирующие в крови людей в ранние сроки после иммунизации вакциной сибиреязвенной живой сухой, характеризовались фенотипами CD19+CD20loCD27luCD38lu и CD19+CD20-CD27hiCD38hi.

Время максимального выброса плазмабластов в кровоток после иммунизации или инфекции колеблется в зависимости от пути проникновения антигенов и кратности вакцинации/инфекции и характера инфекционного агента. При острых инфекционных заболеваниях, например, после заражения вирусами гриппа, количество плазмабластов после выхода их в кровь снижается до базового уровня медленно в течение 2-3 нед [13]. После вакцинации волонтеров против вируса Денге максимальный выброс плазмабластов в кровь наблюдали на 13-е сутки [14]. После вакцинации аттенуированным штаммом YF-17D, вызывающим желтую лихорадку [15], инактивированной противогрип-

Литература

1. Zasada А.А. Injectional anthrax in human: а new face of the old disease. Adv. Clin. Exp. Med. 2018; 27 (4): 553-8.

2. Krantz B.A. Anthrax lethal toxin co-complexes are stabilized by contacts between adjacent lethal factors. J. Gen. Physiol. 2016; 148 (4): 273-5.

3. Маринин Л.И., Дятлов И.А., Мокриевич А.Н., Бахтеева И.В. и др. Методы изучения биологических свойств возбудителя сибирской язвы. М. : ГИГИЕНА, 2009.

4. Smith K., Crowe S.R., Garman L., Guthridge C.J. et al. Human monoclonal antibodies generated following vaccination with AVA provide neutralization by blocking furin cleavage but not by preventing oligomerization. Vaccine. 2012; 30 (28): 4276-83.

5. Chi X., Li J., Liu W., Wang X. et al. Generation and characterization of human monoclonal antibodies targeting anthrax protective antigen following vaccination with a recombinant protective antigen vaccine. Clin. Vaccine Immunol. 2015; 22 (5): 553-60.

6. Kelly-Cirino C.D., Mantis N.J. Neutralizing monoclonal antibodies directed against defined linear epitopes on domain 4 of anthrax protective antigen. Infect. Immun. 2009; 77 (11): 4859-67.

7. Caraux A., Klein B., Paiva B., Bret C. et al. Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells. Haematologica. 2010; 95 (6): 1016-20.

8. Qian Y., Wei C., Eun-Hyung Lee F., Campbell J. et al. Elucidation of seventeen human peripheral blood B-cell subsets and quantification of the tetanus response using a density-based method for the automated identification of cell populations in multidimensional flow cytometry data. Cytometry B Clin. Cytometry. 2010; 78 (Suppl 1): 69-82.

References

1. Zasada AA. Injectional anthrax in human: а new face of the old disease. Adv. Clin. Exp. Med. 2018; 27 (4): 553-8.

2. Krantz B.A. Anthrax lethal toxin co-complexes are stabilized by contacts between adjacent lethal factors. J. Gen. Physiol. 2016; 148 (4): 273-5.

3. Marinin L.I., Dyatlov I.A., Mokrievich A.N., Bakhteeva I.V., et al. Methods of studying the biological properties of the causative agent of anthrax. Moscow: GIGIENA; 2009.

позной вакциной [16, 17], столбнячной вакциной [8] наибольшее количество плазмабластов у людей регистрировали на 6-е или 7-е сутки. Результаты наших исследований показали, что максимальное количество СВ19+СВ20-ЛоСВ27ыСБ38ы-субпопуляции в крови после иммунизации людей вакциной живой сибиреязвенной сухой выявляли на 7-е сутки. На 8-е сутки исследований у вакцинированных доноров количество плазмабластов падало и достигало значений контроля.

Заключение

Таким образом, время максимального выброса плазма-бластов в кровоток доноров соответствовало 7-му дню после иммунизации вакциной живой сибиреязвенной сухой.

Предварительный анализ наличия антител в крови к ПА и ЛФ, а также оценка их нейтрализующей активности в отношении сибиреязвенного токсина позволит выбрать наиболее перспективного донора для получения специфических плазмабластов с целью получения человеческих МкАТ к ПА или ЛФ, способных нейтрализовать ЛТ.

9. Partida-Sanchez S., Cockayne D.A., Monard S., Jacobson E.L. et al. Cyclic ADP-ribose production by CD38 regulates intracellular calcium release, extracellular calcium influx and chemotaxis in neutrophils and is required for bacterial clearance in vivo. Nat. Med. 2001; 7 (11): 1209-16.

10. Borst J., Hendriks J., Xiao Y. CD27 and CD70 in T cell and B cell activation. Curr. Opin. Immunol. 2005; 17 (3): 275-81.

11. Wu Y.C., Kipling D., Dunn-Walters D.K. The relationship between CD27 negative and positive B cell populations in human peripheral blood. Front. Immunol. 2011; 2 (81): 1-12.

12. Jego G., Bataille R., Pellat-Deceunynck C. Interleukin-6 is a growth factor for nonmalignant human plasmablasts. Blood. 2001; 97 (6): 1817-22.

13. Wrammert J., Onlamoon N., Akondy R.S., Perng G.C. et al. Rapid and massive virus-specific plasmablast responses during acute dengue virus infection in humans. J. Virol. 2012; 86 (6): 2911-8.

14. Magnani D.M., Silveira C.G.T., Ricciardi M.J., Gonzalez-Nieto L. et al. Potent plasmablast-derived antibodies elicited by the National Institutes of Health Dengue Vaccine. J. Virol. 2017; 91 (22).

15. Querec T.D., Akondy R.S., Lee E.K., Cao W. et al. Systems biology approach predicts immunogenicity of the yellow fever vaccine in humans. Nat. Immunol. 2009; 10 (1): 116-25.

16. Cox R.J., Brokstad K.A., Zuckerman M.A., Wood J.M. et al. An early humoral immune response in peripheral blood following parenteral inactivated influenza vaccination. Vaccine. 1994; 12 (11): 993-9.

17. Halliley J.L., Kyu S., Kobie J.J., Walsh E.E. et al. Peak frequencies of circulating human influenza-specific antibody secreting cells correlate with serum antibody response after immunization. Vaccine. 2010; 28 (20): 3582-7.

4. Smith K., Crowe S.R., Garman L., Guthridge C.J., et al. Human monoclonal antibodies generated following vaccination with AVA provide neutralization by blocking furin cleavage but not by preventing oligomerization. Vaccine. 2012; 30 (28): 4276-83.

5. Chi X., Li J., Liu W., Wang X., et al. Generation and characterization of human monoclonal antibodies targeting anthrax protective antigen following vaccination with a recombinant protective antigen vaccine. Clin. Vaccine Immunol. 2015; 22 (5): 553-60.

6. Kelly-Cirino C.D., Mantis N.J. Neutralizing monoclonal antibodies directed against defined linear epitopes on domain 4 of anthrax protective antigen. Infect. Immun. 2009; 77 (11): 4859-67.

7. Caraux A., Klein B., Paiva B., Bret C., et al. Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells. Haematologica. 2010; 95 (6): 1016-20.

8. Qian Y., Wei C., Eun-Hyung Lee F., Campbell J., et al. Elucidation of seventeen human peripheral blood B-cell subsets and quantification of the tetanus response using a density-based method for the automated identification of cell populations in multidimensional flow cytometry data. Cytometry B Clin. Cytometry. 2010; 78 (Suppl 1): 69-82.

9. Partida-Sanchez S., Cockayne D.A., Monard S., Jacobson E.L., et al. Cyclic ADP-ribose production by CD38 regulates intracellular calcium release, extracellular calcium influx and chemotaxis in neutrophils and is required for bacterial clearance in vivo. Nat. Med. 2001; 7 (11): 1209-16.

10. Borst J., Hendriks J., Xiao Y. CD27 and CD70 in T cell and B cell activation. Curr. Opin. Immunol. 2005; 17 (3): 275-81.

11. Wu Y.C., Kipling D., Dunn-Walters D.K. The relationship between CD27 negative and positive B cell populations in human peripheral blood. Front. Immunol. 2011; 2 (81): 1-12.

12. Jego G., Bataille R., Pellat-Deceunynck C. Interleukin-6 is a growth factor for nonmalignant human plasmablasts. Blood. 2001; 97 (6): 1817-22.

13. Wrammert J., Onlamoon N., Akondy R.S., Perng G.C., et al. Rapid and massive virus-specific plasmablast responses during acute dengue virus infection in humans. J. Virol. 2012; 86 (6): 2911-8.

14. Magnani D.M., Silveira C.G.T., Ricciardi M.J., Gonzalez-Nieto L., et al. Potent plasmablast-derived antibodies elicited by the National Institutes of Health Dengue Vaccine. J. Virol. 2017; 91 (22):

15. Querec T.D., Akondy R.S., Lee E.K., Cao W., et al. Systems biology approach predicts immunogenicity of the yellow fever vaccine in humans. Nat. Immunol. 2009; 10 (1): 116-25.

16. Cox R.J., Brokstad K.A., Zuckerman M.A., Wood J.M., et al. An early humoral immune response in peripheral blood following parenteral inactivated influenza vaccination. Vaccine. 1994; 12 (11): 993-9.

17. Halliley J.L., Kyu S., Kobie J.J., Walsh E.E., et al. Peak frequencies of circulating human influenza-specific antibody secreting cells correlate with serum antibody response after immunization. Vaccine. 2010; 28 (20): 3582-7.