СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХИТОЗАН-МЕЛАНИНОВОГО КОМПЛЕКСА ИЗ ПОДМОРА ПЧЕЛ
METHOD FOR MAKING CHITOSAN-MELANIN COMPLEX OF DEAD BEES

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области биотехнологии и, в частности, к способам получения хитозан-меланинового комплекса из подмора пчел, который может быть использован в ветеринарии для получения препаратов лечебно-профилактического назначения, в медицине для профилактики и лечения кишечно-инфекционных заболеваний различного происхождения, а также ранозаживляющих мазей и как радиопротектор организма и кожного покрова.
Уровень техники
Сырьем для получения хитозан-меланинового комплекса являются подмор пчел, а также жуки, мухи, которых выращивают искусственно, и другие насекомые, содержащие хитин, являющийся основой кутикулы, и меланин, а также коконы и куколки насекомых.
Известен экстракционный способ получения хитозана, заключающийся в последовательном разрушении структуры сырья в растворах едкого натра NaOH и соляной кислоты НСl концентрацией 4% по следующей схеме.
Подсушенное исходное сырье после автоферментолиза подвергается последовательно следующей обработке:
1 стадия. Деминерализация раствором НСl.
2 стадия. Промывка дистиллированной водой до нейтральной реакции.
3 стадия. Депротеинирование раствором NaOH.
4 стадия. Промывка дистиллированной водой до нейтральной реакции.
5 стадия. Деминерализация раствором НСl.
6 стадия. Промывка дистиллированной водой до нейтральной реакции.
7 стадия. Сушка теплым воздухом t=55…60°С.
Высушенная масса представляет собой хитин, из которого нужно получить хитозан.
8 стадия. Дезацетилирование раствором NaOH.
9 стадия. Сушка теплым воздухом t=55…60°С. Высушенная масса представляет собой хитозан.
На стадиях деминерализации, депротеинирования, дезацетилирования процессы длятся до двух часов. Процесс сушки длится до 48 часов (см. О.Я.Мезенова, А.С.Лысова, Е.В.Григорьева, С.М. Вильт. Технология получения хитина/хитозана из сушеного рачка гаммаруса с применением автоферментолиза. // Известия Калининградского ГТУ. - 2004. - №5).
Вышеприведенный способ является универсальным для получения из хитинсодержащего сырья хитина/хитозана. Применение этой технологии для получения хитина/хтиозана из пчелиного подмора нежелательно по следующим причинам:
во-первых, из-за его двукратной деминерализации (стадии 1 и 5), поскольку пчелиный подмор практически не содержит минеральных веществ и эта обработка не нужна;
во-вторых, из-за лишних стадий промывки (стадии 2 и 6), потому что исключаются стадии деминерализации 1 и 5.
Также нерациональна промывка обрабатываемого сырья дистиллированной водой (стадия 4) после депротеинирования (стадия 3), поскольку водой вымывается растворенный в щелочной среде меланин. К тому же в удаляемом растворе NaOH находится меланин, который по данному способу не используется, а выход хитозана по нашим экспериментальным данным при этом уменьшается до 6% от массы исходного подмора, что недопустимо при получении хитозан-меланинового комплекса из подмора пчел.
Разновидностями базового экстракционного способа являются способы получения хитозана из сырья с высоким содержанием минеральных веществ, например из панциря ракообразных (см. Патенты Российской Федерации №1336291 А1, 6 А23L 1/33; №2000066 С, A23L 1/33; №2116733 С1, 6 А23L 1/33; №2147590 С1, 7 С08В 37/08.), которые также содержат стадии обработки, ухудшающие свойства хитозана даже при получении его из сырья ракообразных, а для получения хитозана и меланина из подмора пчел совершенно не пригодны, поскольку уменьшают содержание этих веществ в конечном продукте - хитозан-меланиновом комплексе.
Результаты проведенной проверочной обработки пчелиного подмора по базовому способу и его вариантам показали, что в конечном продукте содержание хитозана уменьшается более чем вдвое по сравнению с предлагаемым способом, а меланина остаются только следовые количества, не имеющие практического значения.
Известен способ получения хитозана непосредственно из сухого подмора пчел. При детальном рассмотрении подмора в нем видны целые не разрушенные пчелы и различные части пчел (голова, грудь, ножки, брюшко, крылья и др.). Для получения хитина применяется одностадийная обработка 10% раствором щелочи NaOH, что позволяет отделить до 80% белка и большое количество меланинов. После удаления жидкой части - щелочного гидролизата, оставшаяся масса - хитин - промывается большим количеством воды до рН 7 и высушивается при температуре 55±5°С. Сухой хитин из подмора пчел имеет вид темно-коричневой массы со специфическим запахом. В нем хорошо просматриваются членики насекомого (голова, грудь, ножки и крылья в виде слипшихся комочков и в виде отдельных раздробленных частей), а также отдельные сегменты брюшка. В кутикуле пчелы хитин связан с меланином, и в процессе депротеинирования некоторая часть меланина теряется с белком. Безусловно, некоторая часть меланина остается с хитином, поэтому полученный продукт можно считать хитин-меланиновым комплексом. Последующая обработка - дезацетилирование хитина пчел - проводится в 50% растворе NaOH при температуре 125±5°С. При этом происходит растворение меланинов, которые окрашивают щелочь в черный цвет. После обработки хитина раствор сливают, а оставшуюся часть промывают до рН 7 промывных вод. Полученный остаток является хитозаном. Его коричневый цвет свидетельствует об остаточном содержании меланинов. Полученный продукт используется для получения препарата «Пчелозан» (см. Немцев С.В., Зуева О.Ю., Хисматуллин Р.Г., Хисматуллин М.Р., Варламов В.П. Пчела как потенциальный источник хитозана. // материалы 6 Междунар. конф. (Щелково, Моск. обл., 22-24 окт.2001 г.), Центр «Биоинженерия» РАН, 398 с.).
Недостатком данной технологии является то, что обработке подвергается подмор пчел без их предварительного измельчения, необходимого для разрушения частей пчел и увеличения активной поверхности контакта частиц с реагентами. В результате отсутствия измельчения на всех стадиях обработки сохраняются части пчелы, а это свидетельствует о неглубокой обработке сырья и неполном отделении белка и других веществ. Поэтому судить о полноте переработки сырья не представляется возможным, что подтверждается данными, приведенными в таблицах 1, 2, 3 (см. ссылку). Судить о количественном выходе хитозана из подмора пчел по данным, приведенным в этих таблицах, также не имеется возможности, поскольку они приведены к разным исходным массам.
2
Другим значительным недостатком является то, что после отделения раствора NaOH из него не выделяется ценный продукт меланин. Кроме того, применение СO экстракции требует дополнительно оборудования, что значительно удорожает процесс, но не дает желаемого результата.
Также известен способ получения хитозана из кутикулярных оболочек насекомых, которые измельчают до частиц размером 0,2…0,3 мм, обрабатывают 40% раствором щелочи при температуре 100…110°С, жидкостном модуле 1:20 в течение 3…3,5 часов при одновременном воздействии ультразвуком с частотой 15…35кГц. Применение ультразвука вызвано тем, что структура хитина из наружного скелета насекомых, не имеющего минеральных солей, отличается плотной упаковкой. При обработке химическими веществами такая структура препятствует проникновению реагентов вглубь частиц хитина (см. Патент Российской Федерации №2067588 С1, 6 С08В 37/08. Способ получения хитозана).
Недостатком данного способа является то, что измельчение исходного сырья, в том числе кутикул насекомых, куколок тутового шелкопряда без предварительной сушки до величины зерен 0,2…0,3 мм практически не выполнимо по следующим причинам:
во-первых, исходное сырье в зависимости от его вида имеет определенную равновесную влажность (у подмора пчел она равна 8-10%), которая не позволяет применять измельчение обычными способами. Исходная масса не измельчается, а размазывается, то есть превращается в некоторую мягкую массу с сохранением частиц скелета пчел, насекомых, а коконы тутового шелкопряда сминаются, но не разделяются на частицы;
во-вторых, плотность исходной массы очень мала, поэтому она не измельчается под воздействием ударных усилий ножей лабораторных мельниц.
Эти причины не позволяют измельчать материал не только до рекомендованных размеров частиц 0,2…0,3 мм, но и больших размеров. В результате получается некоторая сырая не измельченная масса, которая из-за своей вязкости слабо реагирует на применение ультразвука, т.е. масса не разрушается. Для снятия этой проблемы необходимы соответствующая предварительная сушка исходного сырья и соответствующий способ измельчения применительно к пчелиному подмору, что исключит применение ультразвука, повысит выход хитозана. Нужно отметить, что данная технология не предусматривает извлечения меланина, который имеется в подморе пчел.
Наиболее близким к заявленному способу является способ получения хитина и способ получения хитозана из синантропных мух, культивируемых на твердых органических отходах, а также из форм их постадийного развития. Хитинсодержащую фракцию получают путем раздавливания хитинсодержащего сырья с разделением последнего на гидрофильные и гидрофобные жидкие фракции с последующим получением хитинсодержащей массы. Эта подготовительная часть способа получения исходного сырья характерна и необходима для технологии получения хитинсодержащей исходной массы из мух, а при использовании исходной массы из подмора пчел она не требуется.
Общим в данной технологии с предлагаемым способом является то, что исходная масса из мух имеет повышенную влажность и требуется ее высушивание до влажности, позволяющей осуществить тонкий помол. Подмор пчел тоже имеет первоначальную влажность и требуется его сушка.
Далее, по технологии прототипа полученная высушенная масса подвергается тонкому помолу, загружается в колбу, заливается 40-50%-ным раствором NaOH, предварительно нагретым до 85-90°С, до соотношения твердой и жидкой фаз Т:Ж=1:(3-5) по массе и выдерживается 1,5-2 часа при температуре 100-110°С, перемешивании, отсутствии доступа воздуха в колбу к реакционной среде и воздействии ультразвуком частотой 20-30 кГц. Затем раствор отсасывается, а осадок промывается дистиллированной водой до нейтральной реакции. Отмытый осадок повторно обрабатывается таким же образом. После обработки раствор удаляется, а осадок промывается дистиллированной водой до нейтральной реакции. Растворы, полученные при обработке хитинсодержащей массы, подвергаются дальнейшей обработке с целью выделения белка, сырого жира, хлористого натрия (см. Патент Российской Федерации №2139887 C1, 6 С08В 37/08).
Рассмотрение способа, изложенного в патенте, и анализ его недостатков рационально начать со стадии сушки и получения хитозана.
Первой стадией получения хитозана является сушка влажной массы. Как, при каком режиме и до какой влажности она проводилась в прототипе не указано, хотя это важно, поскольку второй стадией обработки указан тонкий помол. Какова величина зерен или что собою представляет молотая масса, снова не сказано. Далее в прототипе указано, что в остатке имеются частицы величиной 0,5 мм и это после многократной обработки щелочью с применением ультразвука. Отсюда следует вывод: в прототипе сушка хитинсодержащей массы проводилась недостаточно, по крайней мере, не до стадии ее крошимости, а в таком случае тонкий помол массы выполнить невозможно, можно только немного ее измельчить, но этого в процессе обработки оказалось недостаточно и потребовалось для проникновения раствора в частицы массы применить ультразвук с его дорогостоящим оборудованием и технологией. Недосушенный материал не будет размалываться, а будет размазываться в виде пасты по рабочим органам измельчителя. А поскольку тонкого помола не происходит, возникают дальнейшие осложнения при воздействии на пастообразную массу реагентами и для интенсификации процесса вынужденно применяют ультразвук с его дорогостоящим оборудованием.
На стадиях обработки хитинсодержащей массы также можно отметить недостатки, а именно: в рассматриваемом способе масса последовательно дважды обрабатывалась щелочным раствором одинаковой (45-50%) концентрации, хотя известно, что сначала реакция идет в поверхностном слое и не требует ни повышения концентрации реагента, ни применения ультразвука. При повторной углубленной обработке повышенная концентрация реагента оправдана, а применение ультразвука вынужденное из-за некачественного тонкого помола.
Очень серьезным недостатком является то, что в прототипе, как и в других способах, совершенно не уделено внимание выделению из отработавших растворов меланина, являющегося ценным препаратом.
Также необходимо отметить, что на стадиях получения хитозана из хитинсодержащей массы двукратная обработка 45-50% раствором щелочи не требуется, потому что удаление белка (депротеинирование) было осуществлено в стадии подготовки хитинсодержащего сырья. Применение ультразвука свидетельствует о недостаточной предварительной сушке массы и недостаточном ее измельчении, то есть малой активной контактной поверхности. Кроме этого необходимо отметить, что при подготовке хитинсодержащая масса в рассматриваемом способе обрабатывалась различными органическими растворителями: хлороформом, этиловым спиртом и др., что недопустимо при подготовке препаратов для медицинских и ветеринарных целей, поскольку при использовании этих растворителей препарат приобретает специфический запах и вкус, на которые люди и животные реагируют отрицательно.
Раскрытие изобретения
Технический результат, который может быть получен с помощью предлагаемого изобретения, сводится к увеличению выхода хитозана, получаемого из подмора пчел, в 1,5…2 раза и меланина до 85…92% от его содержания в пчелином подморе, а также упрощению способа получения хитозан-меланинового комплекса за счет более рациональной технологии.
Технический результат достигается с помощью способа получения хитозан-меланинового комплекса, включающего сушку, измельчение хитин-меланинового сырья, обработку измельченной массы водным раствором щелочи при нагревании, промывку до рН 7 промывных вод, отличающийся тем, что хитин-меланиновую массу предварительно высушивают до влажности 4-6%, обеспечивающей ее крошимость, высушенную массу перетирают до порошкообразного состояния, депротеинируют 10% раствором щелочи NaOH при температуре 78-82°С в течение 1,5…2,0 часов, после чего добавляют в реакционную смесь 50% раствор NaOH и доводят таким образом его концентрацию до 30% от исходной, дезацетилируют полученную массу при температуре 90…95°С в течение 1,5…2,0 часов, фильтруют, осаждают из отфильтрованного раствора меланин воздействием концентрированной соляной кислотой до изменения рН среды обрабатываемого раствора в кислую область и выпадения хлопьевидного осадка, представляющего собой меланин, отделяют меланин от жидкой фазы центрифугированием, промывают, отдельно сушат хитозан и меланин при температуре 50…60°С до влажности 8…10% и смешивают их для получения конечного продукта хитозан-меланинового комплекса.
Сущность способа получения хитозан-меланинового комплекса из подмора пчел заключается в следующем.
Технологический процесс состоит из следующих последовательных стадий обработки (см. чертеж):
1 стадия. Предварительная сушка подмора пчел потоком теплого воздуха (60-82°C) до влажности 4-6%, обеспечивающей его крошимость. Степень высушивания подмора пчел определяется органолептическим методом, т.е. путем сжатия подмора в ладони руки. При этом подмор должен крошиться.
2 стадия. Измельчение высушенной массы до размера 0,2-0,3 мм путем перетирания ее до состояния порошкообразной массы с целью увеличения поверхности контакта с реагентом.
3 стадия. Депротеинирование массы 10% раствором NaOH при соотношении 1:10, при постоянном перемешивании, t=78-82°C, без доступа воздуха в течение 1,5-2,0 часов.
4 стадия. Дезацетилирование реакционной массы проводится 30% раствором NaOH, получаемым добавлением 50% раствора NaOH к исходному, при t=90-95°C в течение 1,5-2,0 часов.
5 стадия. Фильтрование прореагировавшей массы с сохранением использованного раствора для последующего осаждения из него меланина.
6 стадия. Промывка полученного хитозана дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод.
7 стадия. Осаждение меланина из сохраненного после стадии 5 раствора концентрированной соляной кислотой до изменения рН среды в кислую область и выпадения хлопьевидного осадка.
8 стадия. Отделение хлопьевидного осадка, представляющего собой меланин, центрифугированием с последующим его промыванием до нейтральной реакции промывных вод.
9 стадия. Раздельное высушивание хитозана и меланина при t=50-60°C до влажности 8-10%.
10 стадия. Смешивание полученных хитозана и меланина для получения конечного продукта хитозан-меланинового комплекса.
Таким образом, указанные недостатки, имеющие место в вышерассмотренных способах получения хитозана из сушеного рачка гаммаруса, мух, жуков и другого хитинсодержащего сырья, учтены при разработке способа получения хитозан-меланинового комплекса из подмора пчел, а именно учтено что:
1. При получении хитозан-меланинового комплекса исходное сырье - подмор пчел - практически не содержит минеральных веществ. Поэтому нет необходимости обрабатывать его раствором соляной кислоты НСl.
2. Сушка подмора пчел должна осуществляться до стадии его крошимости, которая устанавливается известным органолептическим способом. Недосушенная масса не перемалывается. Она размазывается по стенке измельчающих устройств. Поэтому измельчение до стадии крошимости трупиков пчел и их частей необходимо и обязательно.
3. Подмор пчел легкий, имеет малую объемную плотность. Поэтому ударным способом, то есть в измельчителях с ножами, измельчению не поддается. В результате в измельченной массе остаются в большом количестве части трупов пчел. Поэтому высушенный до стадии крошимости подмор пчел необходимо измельчать в вальцевом или барабанном измельчителях до порошкообразного состояния. При этом измельченная таким способом порошкообразная масса не содержит различимых частей трупиков пчел и имеет большую активную поверхность контакта с реагентами и не требует применения ультразвука.
Таким образом, технология подготовки пчелиного подмора к воздействию на него химическими реагентами значительно упрощается, а качество проведения последующих стадий обработки улучшается, что способствует более высокому выходу из исходного сырья как хитозана, так и меланина.
4. Пчелиный подмор, высушенный до возможности его измельчения и измельченный до порошкообразного состояния, позволяет ограничиться только одной обработкой раствором 10% щелочи NaOH, что также упрощает технологический процесс.
5. В заявленном способе в отличие от прототипа и других способов раствор NaOH из обрабатываемой массы не удаляется, а оставшаяся масса не промывается дистиллированной водой, поскольку следующая обработка (дезацетилирование) проводится так же щелочью, только с ее концентрацией 30% для получения хитозана, что упрощает технологию.
6. В заявленном способе при окончании проведения дезацетилирования отфильтрованный раствор NaOH сохраняется, поскольку в нем содержится меланин.
7. В заявленном способе из сохраненного раствора осаждается меланин при добавлении концентрированной соляной кислоты НСl и последующем выделении образовавшегося осадка центрифугированием.
Таким образом, последовательное выполнение в указанном порядке вышеперечисленных операций не только упрощает процесс получения хитозан-меланинового комплекса, но и позволяет повысить выход его из исходной массы с 12% хитозана до 21…24%, а меланина до 85…92%, а также осуществить более рациональную технологию его промышленного получения.
Осуществление изобретения
Примеры конкретного выполнения способа получения хитозан-меланинового комплекса из подмора пчел
Пример 1
Получение хитозан-меланинового комплекса из сырья, не высушенного до степени крошимости с разделением стадий депротеинирования и дезацетилирования
1 стадия. Берется пчелиный подмор, состоящий из целых пчел и их частей, туловища, крылышек, отдельных частей, при его отборе из ульев и последующем хранении имеющий влажность 12…18%, и измельчается.
2 стадия. Для проведения депротеинирования берется навеска измельченной массы 5 г и насыпается в колбу с притертой пробкой, заливается 10% раствором щелочи NaOH соотношением по массе 1:10 и нагревается до t=78…82°C при постоянном перемешивании магнитной мешалкой в течение 1,5…2,0 часов.
3 стадия. Полученная масса фильтруется на воронке Бюхнера, отфильтрованный раствор сохраняется для дальнейшего выделения из него меланина. Отфильтрованная масса является хитином с некоторым содержанием в нем меланина, о чем свидетельствует ее темно-коричневый цвет.
4 стадия. Полученный хитин промывается дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод рН 7.
5 стадия. Для проведения дезацетилирования масса полученного хитина заливается 30% раствором NaOH в соотношении 1:10. Полученная масса нагревается до t=90…95°C без доступа воздуха с перемешиванием в течение 1,5…2,0 часов.
6 стадия. Охлажденная после дезацетилирования масса фильтруется на воронке Бюхнера, отфильтрованный раствор сохраняется.
7 стадия. Полученный хитозан с некоторым содержанием в нем меланина промывается дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод рН 7.
8 стадия. Осаждение меланина из сохраненного раствора (п.3 и п.6) проводится концентрированной соляной кислотой до изменения рН среды в кислую область и выпадения темного хлопьевидного осадка.
9 стадия. Отделение осажденного меланина из раствора проводится центрифугированием с последующей его промывкой до нейтральной реакции промывных вод рН 7.
10 стадия. Высушивание хитозана и меланина проводится одновременно без их смешивания при t=50…60°C до влажности 8…10%, являющейся равновесной.
11 стадия. Для получения конечного продукта хитозан-меланинового комплекса проводится смешивание хитозана и меланина.
Выход хитозана в этом случае составляет 6…8% от исходной массы подмора, а меланина - 62…69% от содержания его в подморе.
Выход хитозана можно увеличить, применив сушку исходной массы до степени крошимости с последующим ее более тонким измельчением.
Пример 2
Получение хитозан-меланинового комплекса из сырья, предварительно высушенного до степени крошимости с последующим более тонким измельчением и разделением стадий депротеинирования и дезацетилирования
Пчелиный подмор, состоящий из целых пчел и их частей, туловища, крылышек, отдельных частей, при его отборе из ульев и последующем хранении имеет влажность 12…18%.
При такой влажности пчелиный подмор плохо измельчается и требует подсушки до 4-6% влажности, при которой он приобретает хрупкость и легко измельчается. Сушка осуществляется одним из способов.
1 стадия. 1-й способ заключается в высушивании исходной массы, распределенной слоем 5…10 мм по противню в сушильном шкафу при t=60…82°С. Продолжительность сушки составляет 2,0…2,5 часа.
По 2-му способу исходная масса помещается в мешочек из хлопчатобумажной ткани, укладывается на сетку и распределяется в мешочке слоем толщиной 2-4 см и продувается потоком воздуха при t=60…82°C. При этом процесс сушки заканчивается через 15…20 мин. Степень высушивания массы определяется органолептическим методом, то есть путем сжатия подмора в ладони руки. При этом подмор должен крошиться.
Имея малую плотность, пчелиный подмор плохо измельчается в мельницах с ножами. Поэтому в лабораторных условиях при малой его массе необходимо проводить измельчение способом перетирания в лабораторной ступке, а при большой массе - в барабанной или конусной мельнице до порошкообразного состояния с величиной зерен 0,2…0,3 мм. Измельченная масса имеет очень большую активную поверхность контакта с реагентами, что значительно ускоряет протекание химических реакций и увеличивает полноту обработки.
2 стадия. Для проведения депротеинирования берется порошкообразная навеска массой 5 г и насыпается в колбу с притертой пробкой, заливается 10% раствором щелочи NaOH соотношением 1:10 по массе и нагревается до t=78-82°С при постоянном перемешивании магнитной мешалкой в течение 1,5…2,0 часов.
3-я и последующие стадии выполняются аналогично соответствующим стадиям из примера 1.
В примере 2 по сравнению с примером 1 выход хитозана увеличился с 6…8% до 13…15% от исходной массы подмора, а выход меланина остался в пределах 62…69%. Увеличение выхода хитозана во 2-м примере объясняется более полным его извлечением из массы подмора, что свидетельствует о необходимости сушки подмора до стадии крошимости, обеспечивающей его тонкое измельчение, которое увеличивает активную поверхность массы, вступающей в контакт с реагентами.
Имеется возможность увеличения выхода хитозана и меланина за счет исключения промежуточной стадии 3 промывки и объединения (в примерах 1 и 2) стадий 2 и 4.
Пример 3
Получение хитозан-меланинового комплекса из сырья, предварительно высушенного до степени крошимости с последующим более тонким измельчением и без разделения стадий депротеинирования и дезацетилирования
1 стадия. Высушивание и измельчение исходной массы выполняется аналогично стадии 1 из примера 2.
2 стадия. Депротеинирование выполняется аналогично стадии 2 примера 2.
В отличие от примеров 1 и 2 дезацетилирование массы проводится без фильтрования и отделения раствора, содержащего меланин в стадии 3, следующим образом.
3 стадия. Для проведения дезацетилирования в полученную массу в ту же колбу приливается 50 мл 50% раствора NaOH и таким образом доводится его концентрация в реакционной смеси до 30% от исходного. Полученная масса нагревается до t=90…95°C без доступа воздуха с перемешиванием в течение 1,5…2,0 часов.
4 стадия. Полученная масса фильтруется на воронке Бюхнера, отфильтрованный раствор сохраняется для дальнейшего выделения из него меланина. Отфильтрованная масса является хитозаном с некоторым содержанием в нем меланина, о чем свидетельствует ее темно-коричневый цвет.
5 стадия. Полученный хитозан промывается дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод рН 7.
6 стадия. Осаждение меланина из сохраненного раствора проводится концентрированной соляной кислотой до изменения рН среды в кислую область и выпадения темного хлопьевидного осадка.
7 стадия. Отделение осажденного меланина из раствора проводится центрифугированием с последующей его промывкой до нейтральной реакции промывных вод рН 7.
8 стадия. Высушивание хитозана и меланина проводится одновременно без их смешивания при t=50…60°C до влажности 8…10%, являющейся равновесной.
9 стадия. Для получения конечного продукта хитозан-меланинового комплекса проводится смешивание хитозана и меланина.
Последующая обработка хитина для получения хитозана проводится согласно п.п.2-8 из примера 1. Соотношение хитин: раствор NaOH составляет 1:10. Осаждение меланина проводится из щелочного гидролизата, оставленного после получения хитина и из раствора, отделенного после дезацетилирования, согласно п.3.
В результате получения по этому способу выход хитозана составляет 21-24% от исходной массы взятого подмора, а меланина - 85-92% от его первоначального количества в пчелином подморе.
Увеличение выхода хитозана в 3-м примере с 13…15% до 21…24% и меланина с 62…69% до 85…92% произошло за счет исключения их потери при промывке отфильтрованной массы хитина, применяемой в примерах 1 и 2 стадии 3. Таким образом, заявленная технология получения хитозан-меланинового комплекса, приведенная в примере 3, может считаться наиболее оптимальной.
Пример 4
Испытание хитозан-меланинового комплекса на новоржденных телятах
Выпойка новорожденным телятам в первые семь дней жизни хитозан-меланинового комплекса в количестве 10 (I группа) - 15 (II группа) мг на 1 кг живой массы способствовала снижению на 28,6% заболеваемости от желудочно-кишечных инфекций с диарейным синдромом, повышению показателей неспецифической резистентности - уровня гемоглобина, гамма-глобулинов, лизоцимной и бактерицидной активности, в среднем на 16,4% (р<0,01). Анализ роста и развития телят выявил, что выпаивание препарата оказывало положительное влияние на увеличение живой массы и среднесуточных привесов. Животные опытных групп уже после 29-дневного периода имели больше живую массу по отношению к животным контрольной группы на 3,05 кг (5,6%). В период с 29 до 61 и с 61 до 120 дней разница соответственно составила 3,0 кг (4,6%), 5,85 кг (7,6%, р<0,05). При этом среднесуточные привесы в первый и третий периоды был достоверно выше (на 24,1 и 21,4%, р<0,01 соответственно) у животных II опытной группы в сравнении с контролем.
Применение комплекса приводило к значительному по сравнению с контролем снижению количества микроорганизмов рода E.Coli, Proteus, Citrobacter соответственно на 48.0, 12.1 и 8.3 абс. процентов. Результаты проведенных испытаний действия хитозан-меланинового комплекса на биохимические показатели крови и микрофлору кишечника телят представлены в таблицах 1 и 2.
Таблица 2Влияние применения хитозан-меланинового комплекса на микрофлору кишечника телят
Микроорганизмы рода, 10<sup>5</sup>кое*/г
Контрольная
Опытные группы
на начало опыта
через 29 дней
I
II
на начало опыта
через 29 дней
на начало опыта
через 29 дней
E.Coli
9,8
7,8
8,7
2,7
10,4
5,9
Proteus
5,2
3,8
5,9
3,6
4,8
2,7
Citrobacter
2,7
1,9
2,9
1,8
2,1
1,6
Пример 5
Испытание хитозан-меланинового комплекса на поросятах в период их отъема
С целью стимуляции иммунных процессов и профилактики дисбактериоза у поросят в период отъема, выпаивали хитозан-меланиновый комплекс в дозе 10 и 15 мг на 1 кг живой массы (соответственно I и II и опытные группы). Анализ полученных данных выявил, что использование комплекса снижало заболеваемость поросят от желудочно-кишечных инфекций. Так, если в опытных группах регистрировали 31,2 и 25,0% животных с признаками дисфункции желудочно-кишечного тракта, то среди поросят контрольной группы таких было 37,5%. При этом в опытных группах отмечена лучшая на 6,3 и 12,5% сохранность поросят (таблица 3).
Кроме того, установлено, что применение комплекса способствовало повышению защитных функций организма. У особей опытных групп был выше уровень общего белка, гамма-глобулинов, бактерицидной и лизоцимной активности в среднем на 21,8% (р<0,01); 26,3% (р<0,01); 18,2% (р<0,05) и 12,9% (р<0,05) (таблица 4).
Использование хитозан-меланинового комплекса оказывало также положительное влияние на динамику живой массы и среднесуточных привесов поросят. Молодняк опытных групп на 30-й день после стимуляции по сравнению с аналогами из контрольной группы имел больше живую массу на 3,1% (р<0,05). Тенденция сохранилась и в последующие периоды онтогенеза: разница в их пользу в 2-х и 3-х месячном возрасте в среднем составляла 2,3 и 4,0% (р<0,05), что, по-видимому, обусловлено большими среднесуточными привесами на 8,0 и 3,3% (р<0,05). Результаты этого влияния отражены в таблице 5.
Положительное действие хитозана при профилактике желудочно-кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных, по-видимому, обусловлено его структурной особенностью, позволяющей создавать своеобразную защитную пленку-подложку на слизистой оболочке кишечника, которая препятствует прикреплению патогенов к ворсинкам кишечника, абсорбирует монополисахариды, тем самым останавливает рост патогенных микроорганизмов, проявляя при этом бактерицидные свойства.
Таблица 3Эффективность применения хитозана для профилактики диареи у поросят
Показатели
Группы
контрольная
I опытная
II опытная
Заболело, гол.
6
5
4
%
37,5
31,2
25,0
из них пало, гол.
3
2
2
Сохранность, %
81,2
87,5
93,7
Профилактическая эффективность, абс.проц.
-
6,3
12,5
Таблица 5Динамика живой массы и среднесуточных привесов поросят при применении хитозан-меланинового комплекса
Группа
Живая масса, кг/ Среднесуточный прирост, г
30 сут.
60 сут.
90 сут.
контрольная
6,37±0,048401,0±2,16
18,4±0,067349,5±5,21
28,89±0,17371,5±4,71
I опытная
6,57±0,056**401,1±4,28
18,61±0,13380,6±8,40**
30,17±0,33**393,2±5,22*
II опытная
6,56±0,065*407,2±2,74
18,69±0,073**374,5±6,81**
29,92±0,24**374,5±5,81
* Р<0,05; ** Р≤0,01 по отношению к контролю
Таким образом, обобщая данные проведенных исследований можно сделать заключение о том, что использование хитозан-меланинового комплекса в дозе 10-15 мг на 1 кг живой массы способствует нормализации желудочно-кишечной микрофлоры, активизации иммунных реакций, повышению защитных свойств организма, что, в свою очередь, оказывает благоприятное влияние на рост и развитие молодняка.