Динамика ответных реакций проростков тритикале на стресс, индуцируемый сульфатным и карбонатным засолением

Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2015. Вып. 4. С. 273-282

Биология =

УДК 581.1

Динамика ответных реакций проростков

тритикале на стресс, индуцируемый сульфатным и карбонатным засолением

Т. Н. Лобанова, Н. Н. Жуков, О. И. Бойкова, В. В. Иванищев

Аннотация. Изучены начальные этапы развития стресса в проростках тритикале под действием сульфатного (120 мМ) и карбонатного (120 мМ) засоления. Показано, что в обоих случаях в течение 96 ч эксперимента содержание пероксида водорода как одного из показателей стресса менялось в проростках тритикале не более чем на 20 % от исходной величины. Наблюдали значительное снижение содержания пролина и аскорбиновой кислоты в побегах в первые 12 ч эксперимента при меньших изменениях этих показателей в корнях тритикале. Сульфатное засоление вызывало в побегах более значительные изменения в активности аскорбатпероксидазы в сравнении с карбонатным засолением. В обоих случаях наблюдали рост активности каталазы в побегах тритикале. Сделан вывод о том, что изученные показатели отражают стрессовое состояние растений в условиях сульфатного и карбонатного засолений.

Ключевые слова: тритикале (х Triticosecale), пероксид водорода, пролин, аскорбиновая кислота, аскорбатпероксидаза, каталаза.

Введение

Засоленные почвы широко распространены во многих странах мира. Они занимают около 25 % поверхности суши, включая половину всех орошаемых земель, причем площади засоленных территорий постепенно увеличиваются [8]. Некоторые авторы считают, что особенно сильное воздействие на растения оказывает хлоридное засоление, в то время как сульфатное и карбонатное рассматривают как менее вредные. Меньшую токсичность сульфатного засоления, отчасти, связывают с потребностями растений в сере как элементе минерального питания для нормального роста и развития [10], хотя присутствие хлора в небольших количествах также необходимо в качестве элемента питания [21]. К особенностям присутствия карбонат-ионов в среде можно отнести появление дополнительного фактора - повышенного рН среды, в результате чего солевой стресс дополняется щелочным стрессом для растений [20].

Избыточная концентрация солей оказывает как осмотическое действие, нарушающее нормальное водоснабжение растений, так и токсическое. В то же время любое негативное воздействие на организм приводит к стрессу, который проявляется, в частности, в появлении избыточного количества активных форм кислорода, накоплении пролина, изменении содержания аскорбиновой кислоты, активности ряда ферментов [3, 14].

С другой стороны, виды и сорта растений могут значительно различаться по таким показателям. Внедрение новых гибридов и сортов в практику сельского хозяйства делает необходимым исследование их устойчивости к негативным факторам. Особый интерес представляет изучение тритикале, как межродового гибрида с высоким хозяйственным потенциалом, пока еще не нашедшим широкого распространения в хозяйствах Тульской области. При этом особенности начальных этапов развития окислительного стресса и индукции защитных реакций остаются мало изученными [5], что не позволяет выработать стратегию защиты растений от солевого стресса на начальных этапах его проявления. Особенно слабо с этой стороны изучен стресс, создаваемый сульфатным и карбонатным засолением.

Исходя из изложенного, целью работы стало изучение биохимических показателей стресса у растений тритикале на ранних этапах онтогенеза при карбонатном и сульфатном засолении среды.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования являлись проростки тритикале озимого ( TrШcale) сорта Трибун. Семена были получены в ГНУ «Тульский НИИСХ» РАСХН.

Семена стерилизовали в 2,5% растворе перманганата калия, промывали проточной и трижды - дистиллированной водой. Растения выращивали на питательной среде Кнопа с добавлением микроэлементов по Хогланду при 12-часовом световом дне и температуре воздуха 23/15 °С (день/ночь). По достижении фазы кущения питательная среда заменялась на аналогичную с добавлением сульфат-(120 мМ) или карбонат-(120 мМ) ионов. Пробы отбирали для анализа через 12, 24, 48, 72 и 96 ч экспозиции.

Определение содержания пероксида водорода проводили по методу, основанному на образовании комплекса пероксида титана [16]. Спектрофо-тометрические измерения проводили при 415 нм. Содержание пероксида рассчитывали по калибровочной зависимости, построенной для стандартных концентраций этого вещества.

Определение содержания свободного пролина проводили по методу Бейтса и др. [12]. Оптическую плотность толуольного раствора измеряли при 520 нм. Содержание аминокислоты проводили по калибровочной зависимости.

Определение содержания аскорбиновой кислоты проводили по методу, описанному в работе [7].

Активность аскорбатпероксидазы определяли как описано ранее [6].

Активность каталазы определяли по модифицированному методу [13]. Эксперименты проведены в трех биологических повторностях. Результаты экспериментов обработаны статистически с использованием программы MS Excel 2013. На рисунках представлены средние арифметические значения величин.

Результаты и их обсуждение

Содержание пероксида водорода

В ходе исследования было выявлено, что содержание пероксида водорода в побегах при сульфатном засолении достигало максимальных в эксперименте величин после 24 ч экспозиции проростков тритикале в растворе (рис. 1, а). В дальнейшем наблюдали незначительное снижение этого показателя, который, однако, оставался выше исходной величины. В корнях наблюдали наибольшие величины уже через 12 ч. экспозиции с последующим снижением до величин ниже первоначальных к 96 ч эксперимента.

Рис. 1. Содержание пероксида водорода в побегах и корнях тритикале сорта «Трибун» в присутствии в среде 120 мМ Ма2804

В условиях карбонатного засоления (рис. 1, б) для побегов наблюдали небольшие колебания этого показателя, но картина в целом была похожа на результаты сульфатного засоления. В корнях, напротив, за повышением показателя через 12 ч экспозиции наблюдали стабилизацию содержания пе-роксида водорода с максимальным возрастанием к 96 ч эксперимента.

Содержание пролина

В экспериментах в ходе увеличения продолжительности сульфатного засоления общее содержание пролина уменьшалось (рис. 2, а). При этом картина изменений в побегах и корнях существенно различалась. В побегах после трехкратного снижения через 12 ч экспозиции наблюдали дальнейшее уменьшение показателя до минимальных значений к 96 ч эксперимента.

Для корней наблюдали почти троекратное повышение показателя к 48 ч экспозиции с последующим снижением до величин, близких к исходной.

Рис. 2. Содержание пролина в побегах и корнях тритикале сорта «Трибун» в присутствии в среде 120 мМ Ма2804

При карбонатном засолении (рис. 2, б) картина принципиально не менялась. Однако снижение содержания пролина в побегах достигало более значительных (восьмикратных) величин к 24 ч эксперимента с последующим двукратным от достигнутого увеличением к концу эксперимента. В корнях повышение содержания аминокислоты наблюдали к 24 ч экспозиции проростков с дальнейшим снижением до минимальных значений к концу эксперимента.

Содержание аскорбиновой кислоты

Перенос проростков тритикале в среду, содержавшую 120 мМ сульфата натрия, приводил почти к 7-кратному снижению аскорбиновой кислоты в побегах тритикале уже через 12 ч эксперимента с сохранением тенденции к 96 ч (рис. 3, а). В корнях некоторое увеличение показателя к 12 ч экспозиции растений сменялось его возвращением к первоначальным величинам.

Картина изменений содержания аскорбиновой кислоты в условиях карбонатного засоления (рис. 3, б) имела практически аналогичный вид. В корнях также наблюдали картину, очень похожую на ту, которая была получена в условиях сульфатного засоления.

Активность аскорбатпероксидазы

Исследование активности аскорбатпероксидазы показало различную динамику изменений в условиях сульфатного и карбонатного засолений (рис. 4). При сульфатном засолении более чем двукратное возрастание активности фермента в побегах и поддержание этой величины в течение первых суток эксперимента сменялось снижением до исходного уровня к 48 ч эксперимента и новым возрастанием к концу опыта. В корнях наблюдали последовательное увеличение активности фермента к 48 часам с дальнейшей стабилизацией.

Рис. 3. Содержание аскорбиновой кислоты в побегах и корнях тритикале сорта «Трибун» в присутствии в среде 120 мМ Ма2Б04

Рис. 4. Активность аскорбатпероксидазы в побегах и корнях тритикале сорта «Трибун» в присутствии в среде 120 мМ Ма2Б04

В условиях карбонатного засоления (рис. 4, б) изменение активности аскорбатпероксидазы было похожим, но менее значительным по величине. Достижение максимальных величин к 12 ч экспозиции проростков в среде сменялось снижением показателя с последующим возрастанием до примерно исходных величин к концу эксперимента.

Активность каталазы

Активность каталазы в условиях обоих видов засолений менялась очень похожим образом (рис. 5). В побегах после достижения максимальных величин активности фермента к 12 ч эксперимента наблюдали снижение активности. При этом к 72 ч эксперимента наблюдали минимальную величину, после чего активность каталазы вновь возрастала.

В корнях активность менялась с увеличением в 1,5-2 раза к 24 ч (сульфатное засоление) и 48 ч (карбонатное засоление) эксперимента с дальнейшим снижением показателя до величин ниже исходных.

Рис. 5. Активность каталазы в побегах и корнях тритикале сорта «Трибун» в присутствии в среде 120 мМ Ма2Б04

Обсуждение результатов

Исследование проявлений окислительного стресса при воздействии различных видов засоления показало, что изменение одного из главных показателей - содержания пероксида водорода менялось в пределах менее 20 % (см. рис. 1). При этом вполне ожидаемым оказалось первоначальное возрастание показателя в корневой системе как первой ответной реакции для запуска антиоксидантных реакций в организме тритикале. В то же время реакция растений на сульфатное и карбонатное засоления была явно более слабой в сравнении с хлоридным засолением [5]. Такой вывод можно считать достаточно неожиданным, поскольку по данным других авторов карбонатное засоление оказывает более значительный эффект чем сульфатное и даже хлоридное [2, 18]. Возможно, это связано с более длительным воздействием исследуемого фактора в указанных работах.

Несмотря на несущественные изменения содержания пероксида водорода весьма значительным оказалось снижение аминокислоты пролина - едва ли не главного осморегулятора растительной клетки (см. рис. 2). Особенно непонятным выглядит резкое снижение аминокислоты в побегах, что вряд ли могло быть связано с поступлением соли в побеги к этому времени экспозиции проростков [4]. При этом известно, что уровень аминокислоты пролина - динамичный фактор, изменяющийся даже при нормальных для растений условиях [9].

Содержание аскорбиновой кислоты в растениях определяется многими одновременно идущими процессами, и регуляция ее накопления на свету требует согласованной их работы. Это имеет место не только при нормальном функционировании растений, но и в стрессовых условиях, которые обычно сопровождаются усилением биосинтеза и использования аскорбиновой кислоты в качестве антиоксиданта [11, 1].

Резкое снижение содержания аскорбиновой кислоты вполне можно объяснить ее использованием для активации защитных механизмов проростков тритикале и/или нейтрализацией негативных изменений в клетках растений (см. рис. 3). На этом фоне двукратное повышение активности аскор-батпероксидазы в условиях сульфатного засоления (см. рис. 4, а) вполне коррелирует со снижением содержания этого субстрата в побегах. Отчасти, возможно, поэтому увеличение содержания пероксида водорода после 12 ч эксперимента возросло менее чем на 20% (см. рис. 1, а). Однако подобная картина значительного (более чем в 7 раз) снижения аскорбиновой кислоты при карбонатном засолении хуже согласуется с менее чем 30 %-ным увеличением активности фермента в побегах (см. рис. 4, б). При этом содержание пероксида водорода в побегах уменьшалось на величину менее 10 %.

Возрастание активности каталазы как одной из первых ответных реакций живых организмов на любой стресс было вполне ожидаемым, так же как и сохранение повышенной ее активности в течение всего эксперимента (см. рис. 5). Это вполне согласуется с действием других видов стресса на растения, напр., тяжелых металлов [14]. При этом солевой NaCl-стресс у растений риса вызывал снижение активности этого фермента и аскорбиновой кислоты на фоне увеличения содержания пероксида водорода и активности аскорбатпе-роксидазы [17]. В корешках нута исследователи также наблюдали снижение активности аскорбатпероксидазы и каталазы при NaCl-засолении [15].

Подводя итоги исследованию можно отметить, что действие сульфатного и карбонатного засолений на проростки тритикале в целом соответствует общим представлениям об активации защитных механизмов проростков. Особенно интересно, что ответные реакции в значительно большей степени происходят в надземной части растений, что, однако, нельзя объяснить проникновением ионов в побеги в первые сутки эксперимента. С другой стороны, необходимо отметить, что влияние сульфатного и, особенно, карбонатного засоления на развитие стресса и формирование антиоксидантных механизмов защиты практически не изучено. Это позволяет продолжить работу в избранном направлении в попытке обнаружить разнообразие ответных реакций растений на разные виды солевого стресса.

Список литературы

1. Абрамова Э.А, Иванищев В.В. Содержание фотосинтетических пигментов и аскорбиновой кислоты в проростках вики в присутствии хлорида никеля // Науч. ведомости Белгородского гос. ун-та. Сер. Естественные науки. 2012. № 9 (128). Вып. 19. С. 152-155.

2. Белозерова А.А., Боме Н.А. Изучение реакции яровой пшеницы на завсоление по изменчивости морфометрических параметров проростков // Фундаментал. исслед. 2014. № 12. С. 300-306.

3. Гарифзянов А.Р., Жуков Н.Н., Иванищев В.В. Образование и физиологические реакции активных форм кислорода в клетках растений // Современные пробл. науки и образования. 2011. № 2. 21 с.

4. Регуляция водного обмена у тритикале озимого в условиях NaCl-засоления / А.Р. Гарифзянов, Н.Н. Жуков, В.В. Иванищев, А.А. Кособрюхов // В1сник Харьшвского нацюнального аграрного ушверситету. Сер1я бюлопя. 2013. Вып. 1 (28). С. 34-43.

5. Жуков Н.Н. Исследование физиолого-биохимических механизмов солевого стресса у тритикале на ранних этапах онтогенеза: автореф. дис. ... канд. биол. наук. Пущино, 2013. 22 с.

6. Жуков Н.Н., Гарифзянов А.Р., Иванищев В.В. Динамика активности антиокси-дантных ферментов в органах Triticosecale на фоне NaCl-засоления // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. 2012. Вып. 2. С. 285-291.

7. Иванищев В.В. Биохимический эксперимент. Проведение; обработка и интерпретация результатов. Тула: Изд-во ТГПУ им. Л.Н. Толстого, 2002. 75 с.

8. Кошкин Е.И. Физиология устойчивости сельскохозяйственных культур. М.: Дрофа, 2010. С. 328-335.

9. Сергеева Л.Е., Бронникова Л.И., Тищенко Е.Н. Содержание свободного проли-на как показатель жизнедеятельности клеточной культуры Nicotiana tabacum L. при стрессе // Бютехнолопя. 2011. Т. 4. № 4. С. 87-93.

10. Физиология и биохимия сельскохозяйственных растений / Н.Н. Третьяков [и др.]. М.: КолосС, 2005. 656 с.

11. Чупахина Г.Н. Абиотические факторы, определяющие пул антиоксидантов растений // Вестник Рос. го. ун-та им. И. Канта. 2009. Вып. 7. С. 55-63.

12. Bates L.S., Waldren R.P., Teare I.D. Rapid determination of free proline for water stress studies // Plant Soil. 1973. V. 39. P. 205-207.

13. Goth L. A simple method for determination of serum catalase activity and revision of reference range // Clinica Chimica Acta. 1991. V. 196. P. 143-152.

14. Ivanishchev V.V., Abramova E.A. Accumulation of nickel ions in seedlings of Vicia sativa L. and manifestations of oxidative stress // Environ Sci Pollut Res. 2015. V. 22 (10). P. 7897-7905.

15. Physiological and Antioxidant Responses of Germinating Cicer arietinum Seeds to Salt Stress / S. Keshavkant, J. Padhan, S. Parkhey, S.C. Naithani // Физиология растений. 2012. Т. 59 (2). С. 232-237.

16. Kumar G.N., Knowles N.R. Changes in Lipid Peroxidation and Lipolytic and Free-Radical Scavenging Enzyme during Aging and Sprouting of Potato (Solanum tuberosum L.) Seed-Tubers // Plant Physiol. 1993. V. 102. P. 115-124.

17. Lee D.H., Kim Y.S., Lee C.B . The inductive responses of the antioxidant enzymes by salt stress in the rice (Oryza sativa) // J. Plant Physiol. 2001. V. 158. P. 737-745.

18. Physiological adaptive mechanisms of Leymus chinensis during germination and early seedling stages under saline and alkaline conditions / J. Lin, C. Mu, Y. Wang, Z. Li, X. Li // J. Animal & Plant Sciences. 2014. V. 24 (3). P. 904-912.

19. Comparative Study of Alkaline, Saline, and Mixed Saline-Alkaline Stresses with Regard to Their Effects on Growth, Nutrient Accumulation, and Root Morphology of Lotus tenuis / R.C. Paz, R.A. Rocco, Y. Reinoso, A.B. Mene'ndez, F.L. Pieckenstain, O.A. Ruiz // J Plant Growth Regul. 2012.

20. Shi D, Yin L . Difference between salt (NaCl) and alkaline (Na2CO3) stresses on Puccinellia tenuiflora (Griseb.) Scribn.et Merr. Plants // Acta Bot. Sin. 1993. V. 35. P. 144-149.

21. Advances in Chloride nutrition of plants. / G. Xu, H. Magen, J. Narchitzky, U. Kafkafi. 2000.

Лобанова Татьяна Николаевна (tatyanale9339@gmail.com), аспирант, Тульский государственный педагогический университет им. Л.Н. Толстого.

Жуков Николай Николаевич (z.nikolay87@mail.ru), к.б.н, доцент, кафедра биологии и технологий живых систем, Тульский государственный педагогический университет им. Л.Н. Толстого.

Бойкова Ольга Ивановна (benosi@mail.ru), к.х.н., доцент, кафедра химии, Тульский государственный педагогический университет им. Л.Н. Толстого.

Иванищев Виктор Васильевич (avdey_VV@mail.ru), д.б.н., старший научный сотрудник, зав. кафедрой биологии и технологий живых систем, Тульский государственный педагогический университет им. Л.Н. Толстого.

The dynamics of triticale seedlings responses to stress with sulfate and carbonate salinization

T.N. Lobanova, N.N. Zhukov, O.I. Bojkova, V.V. Ivanishchev

Abstract. We investigated the initial stages of development of stress in seedlings of triticale under the influence of sulfate (120 mM) and carbonate (120 mM) of salinity. It is shown that in both cases, within 96 hours of the experiment the content of hydrogen peroxide as an indicator of stress in triticale seedlings varied by no more than 20% of the initial value. We observed a significant reduction of proline and ascorbic acid in the shoots in the first 12 hours of the experiment with smaller changes in these indicators in the roots of triticale. In shoots the sulfate salinity results in a significant alteration in the activity of ascorbate peroxidase in comparison with carbonate salinization. In both cases, we observed the increase in catalase activity in shoots of triticale. It is concluded that the study of stress indicators reflected the state of plants in the conditions of sulfate and carbonate salinization.

Keywords: triticale (Triticosecale x), sulfate and carbonate salinization, hydrogen peroxide, proline, ascorbic acid, ascorbate peroxidase, catalase.

Lobanova Tatjana (tatyanale9339@gmail.com), postgraduate student, Leo Tolstoy Tula State Pedagogical University.

Zhukov Nikolay (z.nikolay87@mail.ru), candidate of biological sciences, associated professor, department of biology and technologies of living systems, Leo Tolstoy Tula State Pedagogical University.

Boikova Olga (benosi@mail.ru), candidate of chemical sciences, associated professor, department of chemistry, Leo Tolstoy Tula State Pedagogical University.

Ivanishchev Viktor (avdey_VV@mail.ru), doctor of biological sciences, senior researcher, head of department, department of biology and technologies of living systems, Leo Tolstoy Tula State Pedagogical University.

Поступила 10.09.2015