Иммунологическая оценка эффективности применения лефлуномида у больных ревматоидным артритом

ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ЛЕФЛУНОМИДА У БОЛЬНЫХ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ

А. И.Савельев, В.И. Черняк, Е.А.Вороненкова, Ю.М.Горшкова Московская медицинская академия им. И. М. Сеченова

Резюме

Цель. Изучить клиническую эффективность лефлуномида (Аравы) и его влияние на показатели клеточного и гуморального иммунитета у больных ревматоидным артритом (РА).

Материал и методы. У 28 больных РА проводили 6-нед. терапию лефлуномидом по стандартной схеме. В программу обследования входили оценка боли и общего состояния пациента по ВАШ, суставных индексов, анализы крови (включая исследование уровня иммуноглобулинов А, М, G, мг%), определение активности РА по DAS28. Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови проводилось с помощью проточного цитофлуориметра с использованием меченых анти-мышиных антител к CD3, CD4, CD8, CD20, CD25, HLA-DR.

Результаты. При применении лефлуномида через 6 нед. было отмечено статистически достоверное снижение уровня CD20+ лимфоцитов (р<0,05) и уровня иммуноглобулина G (р<0,05). Выявлены прямые достоверные корреляционные связи между содержанием CD25+ и HLA-DR+ лимфоцитов периферической крови и основными клиническими проявлениями суставного синдрома при РА (Z>0,31; р<0,05). Индекс DAS28 снизился через 6 нед. с 5,58 ± 1,16 до 3,84 ± 1,23 (р<0,01). Заключение. Лефлуномид у больных РА через 6 нед. применения продемонстрировал как клиническую эффективность, так и влияние на показатели клеточного и гуморального иммунитета.

Ключевые слова: лефлуномид, ревматоидный артрит, лимфоциты периферической крови

Ревматоидный артрит (РА) - хроническое воспалительное заболевание неизвестной этиологии, характеризующееся необратимой деструкцией суставного хряща и кости. Патологический процесс первично локализуется в синовиальной оболочке сустава. Ведущая роль в иммунопатогенезе РА принадлежит ответу СР4+ лимфоцитов и макрофагов на презентируемый антиген с вторичной гиперактивацией В-лимфоцитарного звена. При РА уже на самых ранних стадиях отмечается высокая аккумуляция активированных Т-лимфоцитов в синовиальной оболочке [1-6,10]. Если клеточно-опосредованные механизмы играют ведущую роль в поражении суставов, то гуморальные иммунные нарушения ответственны прежде всего за внесуставные проявления РА [4].

Фундаментальные исследования последних лет, посвященные изучению поведения субпопуляций

Адрес: 119 881, Москва, ул. Б.Пироговская, д.6, Тел.: (495) 248-63-85 8 E-Mail: drgorshkova @ inbox.ru

лимфоцитов и роли цитокинов в иммунном воспалении, позволяют, с одной стороны, глубже понять механизм действия противоревматических препаратов, с другой стороны - открывают перспективу целенаправленного ("точечного") воздействия на иммунное воспаление.

Одним из достижений последнего десятилетия в лечении РА стала разработка базисного препарата

- лефлуномида, зарегистрированного в РФ под коммерческим названием Арава. Его активным метаболитом является А77 1726 [6].

Главными мишенями А77 1726 служат активированные лимфоциты, которым в патогенезе заболевания принадлежит значимая роль - инициация каскада иммуновоспалительных реакций. Анти-пролиферативное действие лефлуномида обусловлено обратимым подавлением активности фермента дигидрооротатдегидрогеназы (ООНЭН), что, в свою очередь, приводит к остановке клеточного цикла активированных Т- и В-лимфоцитов в фазе 01/8 (репликация ДНК). В отличие от большинства других клеток, для активированных лимфоци-

тов путь биосинтеза пиримидинов de novo, в котором DOHDH является ключевым ферментом, признан доминирующим [6,11,13,15]. Этим и объясняется преимущественное воздействие лефлуно-мида на активированные лимфоциты. Кроме ан-типролиферативного действия, лефлуномид обладает широким спектром дополнительных иммуно-регуляторных и противовоспалительных эффектов, среди которых стоит отметить снижение Т-за-висимого синтеза антител В-клетками [17], подавление синтеза провоспалительных цитокинов [9,12], угнетение активности циклооксигеназы -1 и циклооксигеназы-2 [7,8,14].

Несмотря на то, что до сих пор открываются новые свойства и механизмы действия лефлуномида, его клиническая эффективность уже подтверждена в многочисленных контролируемых клинических испытаниях [16].

Вместе с тем данные по комплексной оценке иммунологической эффективности лефлуномида недостаточны, в связи с чем целью данной работы явилось сопоставление клинической эффективности препарата Арава, производства фармацевтической компании Aventis, Германия, и его влияния на показатели клеточного и гуморального иммунитета у больных РА.

Материал и методы

Под наблюдением находились 28 пациентов (4 муж. и 24 жен.) в возрасте от 22 до 74 лет (средний возраст - 53,43 ± 13,86 лет) с достоверным диагнозом РА по критериям ACR (1987), с длительностью заболевания от 3 мес. до 18 лет (средняя продолжительность 5,17 ± 5,66 лет). Преобладали серопозитивные по ревматоидному фактору (РФ) пациенты

- 18 чел. (64,3%), с суставно-висцеральной формой РА 23 чел. (82%). У 50% больных длительность болезни к моменту исследования была менее 2-х лет, у 29% - 2-10 лет и у 21 % - более 10 лет. У 20 больных

(71,4 %) имелись рентгенологические признаки эрозивного артрита. Степень активности РА с учетом индекса активности DAS28 (Desease Activity Score, оценка 28 суставов) была высокой у 19 пациентов (68%), средней - у 9 (32%). По отечественным критериям активность 3 ст. была установлена у 18 больных (64,3 %), 2 ст. - у 9 (32,1 %). Решающим условием для назначения больным лефлуномида было отсутствие в анамнезе базисной терапии вообще или ее неэффективность; базисные противовоспалительные препараты (БПВП) при этом отменялись за 4 нед. до начала исследования. Все больные до и во время исследования принимали нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП), их доза оставалась стабильной, смены НПВП не проводилось. Лефлуномид назначался по стандартной схеме: первые три дня - насыщающая доза по 100мг/сут, затем - поддерживающая доза по 20 мг/сут (продолжительность лечения 6 нед.).

Обследование пациентов проводили по стандартной программе, включающей оценку боли и общего состояния пациента по ВАШ, длительности скованности в суставах, оценку суставных индексов и функциональных нарушений, клинический, биохимический и иммунологический анализы крови. Уровень СРВ оценивали в реакции кольцепреципи-тации. Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови с использованием меченых антимышиных антител (ООО "Сорбент", Подольск) к CD3, CD4, CD8, CD20, CD25, HLA-DR проводилось в группе больных РА (п=23) и в группе здоровых доноров (п=7). Анализ результатов осуществлялся с помощью проточного цитофлуо-риметра Epics XL ("Beckman Coulter", Швейцария) при длине волны возбуждения 490 нм и длине волны эмиссии 525 нм.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программного пакета Statistika 6.0 (StatSoft, USA). Для описания резуль-

Таблица 1

ДИНАМИКА КЛИНИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ У БОЛЬНЫХ РА ЧЕРЕЗ 6 НЕД. ЛЕЧЕНИЯ ЛЕФЛУНОМИДОМ

Показатели Исходно Через 6 нед. Р

Оценка интенсивности боли, ВАШ (0-10)1 6,54 ± 2,36 2,96 ± 1,83 <0,001

Продолжительность утренней скованности, часы 3,00 ± 2,02 0,64 ± 0,82 <0,001

Опенка общего состояния, ВАШ (0-10)2 5,28 ± 1,69 2,50 ± 1,43 <0,001

Счет3 боли по Ричи, баллы 43,50 ± 25,64 14,21 ± 12,86 <0,001

Счет4 припухших суставов 19,14 ±9,25 5,42 ± 4,79 <0,001

Счет5 болезненных суставов 22,46 ± 14,79 7,89 ±7,18 <0,001

Суставной индекс6 по Ричи, баллы 19,25 ± 12,20 6,43 ±5,11 <0,001

Функциональная недостаточность, баллы 23,81 ± 12,78 10,44 ± 9,68 <0,001

Примечания. I - визуальная аналоговая шкала (0 - нет боли, 10 - максимум), 2 - визуальная аналоговая шкала (0 - хорошо, 10 - плохо), 3 - оценка 76 суставов, 4 - оценка 44 суставов, 5 - оценка 68 суставов, 6 - оценка 53 суставов

татов рассчитывали среднее значение и стандартное отклонение (M±SD). Достоверность различий рассчитывали при помощи методов непараметрического анализа: между независимыми выборками по Mann-Whitney, между зависимыми выборками по Wilcoxon. Анализ корреляционной связи проводили по Spearman. Статистически достоверными считали различия при р < 0,05.

Результаты и обсуждение

Через 6 нед. лечения лефлуномидом наблюдалась статистически значимая положительная динамика клинических показателей суставного синдрома, представленная в табл. 1. Отмечалось достоверное снижение СОЭ с 37,32 ± 18,2 до 27,46 ± 15,2 мм/час (р<0,01). По уровню СРВ в начале исследования преобладали пациенты с резкоположительной и положительной реакцией - 26 чел., через 6 нед. их количество снизилось до 15 чел.

Оценка активности РА в динамике по индексу БА528 показала, что к концу исследования пациенты "перешли" из категорий с более высокой активностью в категории с меньшей активностью (рис.), а индекс ОА828 снизился с исходного уровня 5,58 ± 1,16 до 3,84 ± 1,23 (р<0,01).

Анализ эффективности проводимой терапии по критериям ЕиЬАЛ (ДОА828) показал, что к 6-ой нед. лечения хороший эффект наблюдался у 7 пациентов (25%), удовлетворительный эффект - у 15 (53,6%). Клиническая эффективность по критериям АСЯ 20%, 50% и 70% через 6 нед. лечения составила 21,4%, 53,6% и 25%.

Таким образом, статистически достоверное уменьшение субъективных и объективных клинических проявлений суставного синдрома у больных РА на фоне 6-нед. приема лефлуномида демонстри-

рует его противовоспалительную активность уже на ранних этапах лечения.

Исследование фенотипических маркеров лимфоцитов периферической крови у больных РА позволило получить сведения об иммунном статусе пациентов и влиянии лефлуномида на показатели клеточного звена иммунитета, результаты которых представлены в табл. 2.

У больных РА до начала базисной терапии наблюдалось достоверное повышение уровня лейкоцитов и процента лимфоцитов, несущих маркеры активации (СБ25, НЬА-ОЯ), при этом процентное содержание СБЗ+, С04+ и С08+ лимфоцитов у больных РА и доноров не отличалось, что указывает на активацию клеточного звена иммунитета при отсутствии дисбаланса субпопуляций Т-лимфоци-тов в периферической крови.

При применении лефлуномида через 6 нед. у больных РА достоверно значимым оказалось снижение уровня лейкоцитов и общего количества лимфоцитов. Можно предположить, что снижение общего количества лимфоцитов произошло из-за достоверного уменьшения процента СЭ20+ лимфоцитов.

На фоне 6-нед. лечения было отмечено статистически недостоверное снижение уровня С025+ и НЬА-011+ лимфоцитов (на 20% и 18% соответственно, р>0,05). Исследования патогенеза воспалительного процесса при РА позволяют считать, что активированные Т-клетки играют ключевую роль как в развитии, так и в дальнейшем прогрессировании заболевания. Активированные Т-лимфо-циты путем прямых межклеточных взаимодействий и выработки цитокинов активируют макрофаги, фибробласты, что, в свою очередь, стимулирует ак-

Таблица 2

ДИНАМИКА КОЛИЧЕСТВА ЛЕЙКОЦИТОВ И ЛИМФОЦИТОВ РАЗНЫХ ТИПОВ В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ

БОЛЬНЫХ РА ЧЕРЕЗ 6 НЕД. ЛЕЧЕНИЯ ЛЕФЛУНОМИДОМ

Показатели Здоровые доноры (п =7 чел.) Больные РА (п = 23чел.) pl-2

1 - исходив 2 - через 6 нед.

Лейкоциты, 10х9/л 6,39 ± 0,53 8,70 ±2,14* 7,49 ± 2,50 0,019

Лимфоциты, 10x9/л 1,76 ±0,25 2,28 ± 0,96 1,96 ±0,76 0,006

CD3, % 68,58 ± 3,54 66,58 ±9,46 68,14 ± 14,21 >0,05

CD4, % 43,64 ± 3,73 39,65 ± 9,74 40,95 ± 13,09 >0,05

CD8, % 23,92 ± 2,47 24,39 ± 9,79 24,81 ±11,32 >0,05

CD4 / CD8 1,84 ±0,28 2,06 ± 1,32 2,11 ± 1,36 >0,05

CD20, % 10,99 ±2.13 13,59 ± 3,90 11,32 ±3,06 0,02

CD25, % 3,47 ± 1,02 10,75 ± 6,67 * 8,60 ± 5,64 >0,05

HLA - DR, % 10,35 ± 1,87 18,31 ±7,68* 15,10 ± 6,59 >0,05

Примечания. * р<0,05 при сравнении исходных показателей больных РА с группой доноров

Таблица 3

ДИНАМИКА УРОВНЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ У БОЛЬНЫХ РА ЧЕРЕЗ 6 НЕД. ЛЕЧЕНИЯ ЛЕФЛУНОМИДОМ

Показатели Здоровые доноры (п =7 чел.) Больные РА (п = 28чел.) р1-2

1 - исходно 2 - через 6 нед.

^ А, мг % 157,43 + 27,09 344,77 ± 159,75 * 312,95 ± 142,34 >0,05

1% М, мг % 93,28 ± 7,76 151,90 ± 50,85* 130,54 ±38,19 >0,05

їй Є, мг % 1037,14 ± 147,27 1408,63 ±319,60* 1221,81 ± 303,07 0,049

Примечания. * р<0,01 при сравнении исходных показателей больных РА с группой доноров

Рисунок

КОЛИЧЕСТВО БОЛЬНЫХ (%) С РАЗЛИЧНЫМИ ЗНАЧЕНИЯМИ АКТИВНОСТИ РА ПО ИНДЕКСУ ЭА828 ДО И ЧЕРЕЗ 6 НЕЦ. ЛЕЧЕНИЯ ЛЕФЛУНОМИДОМ.

низкая ст. акт.

средняя ст.акт.

высокая ст.акт.

0 6 нед.

тивацию и пролиферацию тех же Т-лимфоцитов и ряда других клеток, участвующих в разрушении суставного хряща и кости, а также стимулируют пролиферацию В-лимфоцитов и их дифференци-ровку в плазматические клетки. Было показано [6,11], что лефлуномид, помимо антипролифера-тивного действия, ингибирует экспрессию рецепторов к интерлейкину-2 (ИЛ-2) (С025-антиген идентифицирован как низкоаффинный рецептор к ИЛ-2), которые появляются почти исключительно на поверхности активированных Т-лимфоцитов, тем самым отражая их готовность к пролиферации. Однако диапазон концентрации лефлуномида, в пределах которого происходит ингибирование пролиферации лимфоцитов, оказывается недостаточным для уменьшения экспрессии рецептора к ИЛ-

2, что свидетельствует о том, что в терапевтических дозах лефлуномид блокирует пролиферацию лимфоцитов, а не предшествующую ей активацию. Таким образом, можно предположить, что снижение общего процента клеток в периферической крови, несущих маркеры активации, на фоне лечения леф-луномидом происходит опосредованно (прерыва-

ется цепь реакций, когда в условиях иммунного воспаления за пролиферацией клеток следует их активация).

Анализ исходных показателей гуморального иммунитета у больных РА выявил достоверно высокое (в сравнении с донорами) содержание основных классов иммуноглобулинов (А, М, в). Через 6 нед. было отмечено иммунокорригирующее влияние лефлуномида в виде снижения всех классов иммуноглобулинов (достоверным было снижение уровня иммуноглобулина в) (табл. 3).

Изучение корреляционных связей между показателями иммунного статуса и клиническими проявлениями РА выявило наличие следующих достоверных связей: между содержанием СЭ25+ лимфоцитов и интенсивностью боли, ВАШ (г=0,34, р=0,02), длительностью утренней скованности (г=0,31, р=0,04), общим состоянием, ВАШ (г=0,32, р=0,03); между содержанием Н1_А-ОИ+ и интенсивностью боли, ВАШ (г=0,46, р=0,02), общим состоянием, ВАШ (г=0,43, р=0,03); между уровнем иммуноглобулина А и счетом боли по Ричи (г=0,35, р=0,01), функциональными нарушениями (г=0,38, р=0,008); между уровнем иммуноглобулина М и длительностью скованности (г=0,31, р=0,03); между уровнем иммуноглобулина в и интенсивностью боли, ВАШ (г=0,34, р=0,017), общим состоянием, ВАШ (г=0,37, р=0,01), счетом боли по Ричи (г=0,42, р=0,003), счетом болезненных суставов (г=0,33, р=0,02), функциональными нарушениями (г=0,35, р=0,02).

Заключение

Полученные данные могут свидетельствовать о наличии у лефлуномида системных эффектов как на уровне клеточного, так и на уровне гуморального иммунитета, что коррелирует со статистически значимым уменьшением суставного воспаления у больных РА уже через 6 нед. лечения.

ЛИТЕРАТУРА

1, Гнилорыбов А.М. Патогенез ревматоидного раін. ревматолог, жур., 2000, 1, 23-28

артрита. Механизмы активации клеток синови- 2. Насонов Е.Л. Новые направления в исследова-альной оболочки и продукции цитокинов. Ук нии воспаления при ревматических заболева-

ниях. В кн.: Избранные лекции по клинической ревматологии. Под ред. Насоновой В.А., Бунчука Н.В. М., Медицина, 2001, 29-45

3. Насонов E.JI. Фармакотерапия ревматоидного артрита с позиций доказательной медицины: новые рекомендации. Русс. мед. жур., 2002, 10, 6, 294-301

4. Яременко О.Б. Современная стратегия базисной терапии ревматоидного артрита. Украин. ревматолог, жур., 2002, 3, 45-51

5. Ярилина А.А., Никонова М.Ф., Литвина М.М. и соавт. Влияние а2Ь-интерферона in vivo и in vitro на функциональную активность Т-лимфо-цитов больных ревматоидным артритом. Тер. архив, 2000, 5, 9-17

6. Breedveld F.C., Dayer J-M. Leflunomide: mode of action in the treatment of rheumatoid arthritis. Ann. Rheum. Dis., 2000, 59, 11, 841-849

7. Burger D., Begue-Pastor N., Benavent S. et.al. The active metabolite of leflunomide, A77 1726, inhibits the production of prostaglandin E2, matrix metallo-proteinase 1 and interleukin 6 in human fibroblastlike synoviocytes. Rheumatology, 2003, 42, 1, 89 -96

8. Curnock A.P., Robson P.A., Yea C.M. Potencies of leflunomide and HR325 as inhibitors of prostaglandin endoperoxide H synthase-1 and -2: comparison with nonsteroidal anti-inflammatory drugs. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1997,282, 339-347

9. Cutolo М., Sulli A., Ghorzo P. et.al. Anti-inflammatory effects of leflunomide on cultured synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis. Ann. Rheum. Dis., 2003, 62, 4, 297 - 302

10. David E.Yocum. T-cells and therapeutic targets in rheumatoid arthritis (RA). Sem. Arthr. Rheum., 1999, 1, 27-35

11. Elder R.T., Xu X., Williams J. W. et al. The immunosuppressive metabolite of leflunomide, A77 1726, affects murine T cells through two biochemical mechanisms. J. Immunol., 1997, 159, 22-27

12. Elkayam O., Yaron I., Shirazi I. et al. Active leflunomide metabolite inhibits interleukin 1(5, tumour necrosis factor- a , nitric oxide, and metal-loproteinase-3 production in activated human synovial tissue cultures. Ann. Rheum. Dis., 2003, 62, 5, 440 - 443

13. Fox R.I. Mechanism of action of leflunomide in rheumatoid arthritis. J.Rheumatol., 1998, 25, 53, 20-26

14. Halminton L.C., Vojnovic I., WarnerT.D. A771726, the active metabolite of leflunomide, directly inhibits activity of cyclo-oxygenase-2 in vitro and in vivo in a substrate-sensitive manner. Br. J. Pharmacol., 1999, 127, 1589-1596

15. R?ckemann K, Fairbanks L.D., Carrey E.A. et al. Leflunomide inhibits pyrimidine de novo synthesis in mitogen-stimulated T-lymphocytes from healthy humans. J. Biol. Chem., 1998, 273, 21682-21691

16. Sciff M.N., Strand V. et al. Leflunomide: efficacy and safety in clinical trials for the treatment of RA. Drugs Today, 2000, 36, 383-394

17. Siemasko K.F., Chong A.S.F., Williams J.W. et al. Regulation of В cell function by the immunosuppressive agent leflunomide. Transplantation, 1996, 61,635-642

Поступила 8.07.05.

Abstract

A.I. Savelyev, V.I. Chernyak, E.A. Yoronenkova, Y.M. Gorshkova

Immunological assessment of leflunomide efficacy in patients with rheumatoid arthritis

Objective. To assess leflunomide (Arava) clinical efficacy and influence on cell and humoral immunity indices in pts with rheumatoid arthritis (RA).

Materials and methods. 28 pts with RA received leflunomide during 6 weeks according to the standard scheme. Pain, patients general health (GH) measured on a Visual Analogue Scale (VAS), the number of swollen joints and tender joints were assessed as well as IgA, IgG, IgM levels. RA activity was assessed with DAS 28. CD3, CD4, CD8, CD20, CD25, HLA-DR expression was evaluated on peripheral blood lymphocytes by flow cytometry. Results. Significant decrease of CD20+ lymphocytes (p<0,05) and IgG level (p<0,05) was revealed after 6 weeks of treatment with leflunomide. The main joint changes significantly correlated with CD25 and HLA-DR expression (p,0,05). DAS 28 decreased after 6 weeks from 5,58± 1,16 to 3,84+1,23 (p<0,01).

Conclusion. Treatment with leflunomide during 6 weeks decreased RA activity and exerted influence on cell and humoral immunity.

Key words: leflunomide, rheumatoid arthritis, peripheral blood lymphocytes