Апоптозиндуцирующее действие рибонуклеазы Bacillus pumilus и экстрактов лекарственных растений Египта на клетки аденокарциномы легких человека

62

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

апоптозиндуцирующее действие рибонуклеазы

BACILLUS PUMILUS И ЭКСТРАКТОВ ЛЕКАРСТВЕННЫх РАСТЕНИЙ ЕГИПТА НА КЛЕТКИ АДЕНОКАРЦИНОМЫ ЛЕГКИх ЧЕЛОВЕКА

Н.С. Карамова 1, П.В. Зеленихин1, Н.Б. Мирошник1, Иссам Абдул-Хафиз12, Я.Н. Закирова 1, О.Н. Ильинская 1

1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия

2 Университет Асьют, Асьют, Египет

Apoptosis-inducing activity of Bacillus pumilus ribonuclease and some egyptian medicinal plants extracts on human alveolar adenocarcinoma cells

N.S. Karamova 1, P.V. Zelenikhin 1, N.B. Miroshnik 1, Essam Abdul-Hafeez12, Ya.N. Zakirova 1, O.N. Ilinskaya 1

1 Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia

2 Assiut University, Assiut, Egypt

Антиканцерогенная активность многих препаратов, используемых для лечения пациентов со злокачественными новообразованиями, обусловлена их способностью индуцировать апоптоз опухолевых клеток . В настоящей работе исследовано индивидуальное и сочетанное апоптозинду-цирующее действие РНКазы Bacillus pumilus (биназы) и водных экстрактов коры восьми лекарственных растений Египта на клетки аденокарциномы легкого человека А549 . Установлено, что биназа в концентрации 300 мкг/мл достоверно повышает процентное содержание апоптических клеток в популяции опухолевых клеток человека А549 через 24 ч . Достоверно значимым дозозависмым апоптогенным эффектом обладали экстракты растений альбиции лебекк (Albizzia lebbeck) и баухинии пестрой (Bauhinia variegate) . Показано, что комбинация биназы и водных экстрактов коры трех растений Albizzia lebbeck, Bauhinia variegate, Kigelia africana усиливает индукцию апоптоза клеток аде-нокарциномы легких человека А549 по сравнению с действием биназы и экстрактов в отдельности Полученные результаты позволяют рассматривать комбинацию биназы и водных экстрактов коры растений Albizzia lebbeck, Bauhinia variegate, Kigelia africana как основу для создания природных щадящих средств, способных индуцировать апоптоз в опухолевых клетках

Ключевые слова: апоптоз, опухолевые клетки, рибону-клеаза, экстракты растений, проточная цитофлуореметрия

Induction of apoptosis is a primary mechanism of anticancer activity of several drugs using for cancer therapy . Apoptosis-inducing activity of Bacillus pumilus ribonuclease (binase) and stem bark aqueous extracts of eight medicinal plants from Egypt in human A549 alveolar adenocarcinoma cells was studied . It was shown that binase (300 ¿ug/ml) significantly increases the portion of apoptic cells in population after 24 h . Extracts of Albizzia lebbeck and Bauhinia variegate demonstrated a clear dose-dependent apoptosis-inducing effect . Combined treatment of A549 cells with binase and stem bark aqueous extracts of Albizzia lebbeck, Bauhinia variegate, Kigelia africana enhances induction of apoptosis in comparison with binase and extracts alone . Results obtained allow to consider combination of binase and stem bark aqueous extracts of Albizzia lebbeck, Bauhinia variegate, Kigelia africana as a source for development of low toxic, natural drugs to induce apoptosis in tumor cells

Keywords: apoptosis, tumor cells, ribonuclease, plant extracts, flow cytometry

Введение

Проблема профилактики и терапии онкологических заболеваний остается актуальной во всех странах мира . По данным Международного агентства по исследованию рака в 2012 г . во всем мире было зарегистрировано 14 млн новых случаев заболеваний злокачественными опухолями и по прогнозам, за ближайшие 20 лет это число возрастет примерно на 70% [1].

На сегодняшний день сочетание хирургических методов лечения, лучевой и химиотерапии остается золотым стандартом лечения онкологических больных, что позволило повысить выживаемость пациентов за последние 30 лет до 8 раз [2, 3]. Тем не менее, в силу негативных побочных эффектов химиотерапии с использованием синтетических препаратов (системная токсичность, появление лекарственно-устойчивых клонов опухолевых клеток и т . д . ) весьма оправдан возрастающий интерес к разработке новых стратегий лечения на основе природных материалов с низкой токсичностью .

Скрининг лекарственных растений в качестве источников противораковых агентов начался в 50-х годах прошлого века с открытия алкалоидов барвин-

е-таП: nskaramova@mail . ги

ка Vinca rosea L., винбластина и винкристина, и выделения цитотоксических подофиллотоксинов [4]. Препараты на основе этих веществ сейчас успешно применяют для лечения детской лейкемии, лимфо-гранулломатоза, острого лейкоза, опухолей мягких тканей . Алкалоид паклитаксел (таксол), выделенный из тиса ягодного (Taxus baccata), — один из самых эффективных противоопухолевых препаратов в лечении рака молочной железы, яичников [5].

В настоящее время противоопухолевое действие показано для рибонуклеаз (РНКаз) — важнейших ферментов метаболизма РНК [6-10]. Особый интерес представляют собой РНКазы микробного происхождения, т . к у них нет сродства к ингибитору каталитической активности РНКаз (RI), который присутствует практически во всех тканях млекопитающих, а также в силу широких возможностей для биоинженерии данных ферментов

Прогрессивным направлением в терапии онкологических заболеваний является комбинирование препаратов, отличающихся по структуре и механизмам действия, что приводит к повышению уровня эффективности лечения злокачественных новообразований

Целью данного исследования явилась оценка индивидуального и сочетанного действия РНКазы Bacillus pumilus и водных экстрактов коры восьми лекарственных растений Египта на индукцию апопто-за в культивируемых опухолевых клетках человека в условиях in vitro .

Материал и методы

Растительный материал

Растительный материал — кора лекарственных растений брахихитона разнолистного (Brachychiton populneus Schott & Endl.), хлопкового дерева (Ceiba pentandra L . ), хлопка малабарского (Bombax malabaricum DC), хоризии великолепной (Chorisia speciosa A . St . -Hil.), альбиции лебекк (Albizzia lebbeck (L . ) Benth . ), баухинии пестрой (Bauhinia variegate L . ), кигелии африканской (Kigelia africana (Lam . ) Benth . ), сосны аллепской (Pinus halepensis Miller), был собран в ботаническом саду университета г . Асьют, Египет . Высушенный и измельченный до порошкообразного состояния растительный материал хранили в темном, хорошо проветриваемом помещении .

Приготовление водных экстрактов растений. Водные экстракты растений были получены методом холодной экстракции . Растительный материал (2 г), заливали дистиллированной водой (20 мл) . Экстракцию проводили в течение 48 ч . при комнатной температуре и постоянном перемешивании . Полученную смесь заворачивали в 4—6 слоев марли, отжимали . Экстракт пропускали через фильтровальную бумагу, затем через мембранный фильтр Synpor с диаметром пор 0,2 мкм . Стерильный растительный экстракт разливали в пробирки эппендорф и хранили при температуре -20°C .

Ферментный препарат. В настоящей работе была использована биназа — гуанил-специфич-ная РНКаза Bacillus pumilus. Молекулярная масса 12,3 кДа, 109 аминокислотных остатков, pI = 9,5 .

Клеточные линии и условия культивирования

Исследования проводили на перевиваемых линиях культуры клеток аденокарциномы легкого человека — А549 (ATCC, Роквилль, Мэриленд, США) в условиях in vitro . Клетки культивировали в среде RPMI-1640, с добавлением 10% FBS, 2 мкМ глутамина, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина при 37°С в атмосфере 5% СО2 . По истечении 24 ч . инкубирования клетки A549 высевали в 12-луночные планшеты . Снятие клеток с культуральных сосудов производили согласно описанной ранее методике [11]. Подсчет количества клеток производили в камере Горяева . В каждую лунку вносили 150 тыс . клеток А549 в суспензии По достижении клетками монослоя (~60%) заменяли среду в лунках на свежую и добавляли исследуемые агенты: биназу в концентрации 300 мкг/мл, водные экстракты растений в концентрациях 150, 300 мкг/мл . Далее клетки культивировали в течение 24 ч. В качестве позитивного контроля использовали классический индуктор апоп-тоза камптотецин в концентрации 50 мМ [12].

Проточная цитометрия. Апоптические изменения клеток фиксировали с помощью проточного цитофлу-ориметра FAcScanto II (BD, США) с использованием катионного красителя мероцианина-540, 1 мкг/мл, который связывается с отрицательно заряженным фосфатидилсерином, появляющимся на внешней стороне клеточной мембраны при апоптозе [13].

Для цитометрической оценки апоптических изменений опухолевых клеток под действием исследуемого агента отбирали среду из лунок и помещали в пробирки; трипсинизировали монослой в лунках и переносили клетки в ранее отобранную среду . Клетки осаждали центрифугированием при 1000 об ./мин . 5 мин . при 23°С. Клетки ресуспендировали в 1 мл питательной среды RPMI 1640 . Каждый образец окрашивали 5 мкл красителя мероцианина-540 при комнатной температуре, в темноте в течение 20 мин . , далее проводили цитометрический анализ. Обработку результатов проводили с помощью программы FACSDiva Software (BD) .

Апоптозиндуцирующий эффект рассчитывали по формуле:

АЭ,% = Кол -во апоптических клет°к х 100 .

Общее кол-во клеток

Статистический анализ результатов. Статистическую обработку результатов проводили, используя программу «Microsoft Excel 2003» . Анализ цитоме-трических данных приведен для 100 000 событий. Достоверность различий между группами данных определяли, используя непараметрический критерий Крамора-Уэлча . Различия считались достоверными при р<0,05.

Результаты

Апоптозиндуцирующий эффект РНКазы

Bacillus pumilus на клетки аденокарциномы

легких человека А549

Цитометрическое исследование культуры клеток аденокарциномы легких человека А549 после воздействия биназы в концентрации 300 мкг/мл в течении 24 ч показало увеличение интенсивности флуоресценции клеточной суспензии по сравнению с контролем, что свидетельствует о связывании кати-онного флуоресцентного красителя мероцианина-540 с отрицательно заряженным фосфатидилсерином, появляющегося на поверхности клеток при раннем апоптозе [13]. Согласно полученным данным, обработка биназой клеток А549 приводила к увеличению доли клеток в состоянии апоптоза до 6,075 %, в то время как в контрольном варианте значение данного показателя составило 1,98% (рис . ).

Контроль 300

РНКаза, мкг/мл

Рис. Индукция апоптоза РНКазой Bacillus pumilus (300 мкг/мл) в клетках аденокарциномы легких человека А549.

* — отличия от контроля статистически значимы при р<0,05

Влияние экстрактов растений на апоптоз клеток аденокарциномы легких человека А549

Инкубация in vitro культуры опухолевых клеток A549 с водными экстрактами коры восьми лекарственных растений в течение 24 ч . приводила к апоп-тическим изменениям разной интенсивности . Как следует из результатов, представленных в табл . 1, самый высокий апоптозиндуцирующий эффект проявляет водный экстракт коры альбиции лебекк (A. lebbeck) в обеих исследуемых концентрациях: процент апоп-тических клеток при действии экстракта увеличился соответственно в 4,2 и 4,6 раза по сравнению с контролем, представленным нативными клетками

А549 . Заметное повышение процентной доли апоп-тических клеток также наблюдалочь при действии водного экстракта баухинии пестрой (B. variegate): в 3,8 раза при концентрации 300 мкг/мл (табл . 2) .

Умеренный апоптозиндуцирующий эффект по отношению к опухолевым клеткам обнаружен для экстрактов коры растений сосны аллепской (P. halepensis), кигелии африканской (K. africana), хоризии великолепной (Ch. speciosa) и брахихитона разнолистного (B. populneus) (табл . 2).

Водные экстракты коры хлопкового дерева (Ceiba pentandra) и хлопка малабарского (Bombax malabaricum) не проявили апоптогенной активности в отношении клеток аденокарциномы легких человека А549 .

Таблица 1. Апоптозиндуцирующий эффект водных экстрактов коры растений на клетки аденокарциномы легких человека А549

№ Экстракты растений Доля апоптических клеток в популяции,%

контроль 150 мкг/мл 300 мкг/мл

1 Brachychiton populneus 2,2±0,45 2,4±0,4 4,7±0,2*

2 Ceiba pentandra 2,2±0,5 1,83±0,23 1,83±0,39

3 Bombax malabaricum 1,6±0,63 1,9±0,3 1,8±0,4

4 Chorisia speciosa 1,6±0,63 4,3±0,8* 4,7±0,3*

5 Albizzia lebbeck 1,67±0,63 7,0±1,9* 7,7±1,1*

6 Bauhinia variegate 2,1±0,45 6,3±1,17* 7,9±1,3*

7 Kigelia africana 1,7±0,4 5,6±1,9* 5,2±1,6*

8 Pinus halepensis 1,7±0,4 2,7±1,09* 3,5±0,47*

* — статистически значимо отличается от контроля, р<0,05 .

Таблица 2. Сочетанный апоптозиндуцирующий эффект РНКазы Bacillus pumilus и водных экстрактов коры растений (ВЭ) на клетки аденокарциномы легких человека А549

Доля апоптических клеток в популяции, %

Растения контроль РНказа, 300 мкг/мл ВЭ 150мкг/мл ВЭ 300мкг/мл РНказа + ВЭ 150 мкг/мл РНказа + ВЭ 300мкг/мл

Brachychiton populneus 2,7±0,45 6,7±1,07* 5,5±1,58* 5,3±1,24* 4,8±0,8 5,9±1,9

Chorisia speciosa 2,8±0,05 8,4±1,07* 3,8±0,52* 4,4±0,47* 6,7±1,63 7,03±1,25

Albizzia lebbeck 2,7±0,45 6,7±1,07* 10,3±1,5* 16,8±1,2* 17,7±0,8** 18,3±1,9**

Bauhinia variegate 1,9±0,2 5,4±0,8* 7,1±0,07* 12,3±0,32* 10,03±1,18** 20,13±4,0**

Kigelia africana 1,9±0,2 4,2±0,2* 3,3±0,46* 4,1±0,5* 4,7±1,4** 5,6±1,1**

Pinus halepensis 2,7±0,6 6,7±0,8* 3,03±0,56 3,9±1,3 6,5±1,65 4,06±1,8

* - статистически значимо отличается от контроля, р<0,05; ** — статистически значимо отличается от варианта РНКаза 300 мкг/мл, р<0 . 05 .

Сочетанный апоптозиндуцирующий эффект

РНКазы Bacillus pumilus и водных экстрактов

коры растений на клетки аденокарциномы

легких человека А549

В результате исследования установлено, что комбинация биназы и водных экстрактов коры трех растений A. lebbeck, B. variegate и K. africana усиливает индукцию апоптоза у клеток аденокарциномы легких человека А549 . Сочетанное действие биназы

Совместная обработка клеток аденокарциномы легких человека А549 водными эстрактами коры B. populneus или P. halepensis с биназой не вызывала значимого повышения процентного содержания апоп-тических клеток, индуцированных ферментным препаратом или экстрактами в отдельности (табл . 2) .

Обсуждение

Апоптоз — феномен программируемой смерти клеток, необходимый для поддержания гомеостаза организма [14-16]. Нарушение процесса апопто-за характерно для ряда патологических процессов: нейродегенеративные заболевания, ишемические повреждения, аутоиммунные заболевания и канцерогенез [17, 18]. Механизмы регуляция программируемой смерти клеток представляют значительный интерес для создания эффективных и безопасных противоопухолевых препаратов [19, 20]. Существующие в настоящее время неинвазивные, чувствительные методы исследования процесса апоптоза позволяют сравнительно быстро проводить первичную оценку антиканцерогенных веществ [21, 16]. В настоящей работе представлены результаты исследования индивидуального и сочетанного апопто-зиндуцирующего действия ферментного препарата РНКазы B. pumilius и водных экстрактов коры восьми лекарственных растений Египта в отношении клеток аденокарциномы легких человека А549 .

Установлено, что биназа в концентрации 300 мкг/ мл достоверно повышает процентное содержание апоптических клеток в популяции опухолевых клеток человека линии А549 по сравнению с контролем . Полученные нами результаты подтверждают представленные ранее в литературе данные о селективном апоптозиндуцирующем и антипролиферативном действии РНКазы B. intermedius, или B. pumilius в соответствии с международной классификацией [22], на различные линии опухолевых клеток: миеломных

клеток человека К562, мононуклеарных клеток периферической крови, трансгенных миелоидных клеток FDC-P1iR117 c экспрессирующимся kit-онкогеном, фибробластов NIH3T3 c экспрессирующимся ras-онкогеном [8, 23-26], клеток карциномы легкого человека А549 [27, 28]. Цитотоксическое действие на опухолевые клетки посредством индукции различными путями программируемой смерти клеток — один из существенных аргументов, свидетельствующих о перспективности использования РНКаз для элиминации опухолей Механизмы клеточной гибели при действии биназы могут быть обусловлены каспазо-зависимыми процессами, изменениями определенных белков и низкомолекулярных соединений [10]. Показано в частности, что гибель клеток Касуми-1, полученных из периферической крови больного ми-елоидным лейкозом, и клеток экспериментальной модели меланомы В-16 под действием биназы может происходить по пути как митохондриального, так и лигандного апоптоза [29, 30].

Среди восьми исследованных водных экстрактов коры лекарственных растений Египта достоверно значимым дозозависмым апоптогенным эффектом в отношении клеток аденокарциномы легких человека А549 обладали экстракты растений альбиции ле-бекк (A. lebbeck) и баухинии пестрой (B. variegate) . Для экстрактов коры еще трех растений: сосны аллепской (P. halepensis), кигелии африканской (K. africana), хоризии великолепной (Ch. speciosa) и брахихитона разнолистного (B. populneus) показан умеренный апоптозиндуцирующий эффект

Ранее сообщалось, что органические экстракты альбиции лебекк (A. lebbeck] оказывают цитоток-сическое действие в отношении клеточных линий рака молочной железы MCF-7 и аденокарционо-мы толстой кишки человека HT-29, подавляя рост опухолевых клеток на 62,94% и 44,29% соответственно [31].

Противоопухолевый эффект органического экстракта B. variegate показан в отношении лимфомы Дальтона у мышей Swiss albino, индуцированной N-нитрозодиэтиламином модельной опухоли печени крыс [32], и линии опухолевых клеток человека: рака эпителия гортани Hep2 и рака молочной железы HBL-100 [33]. Сведения о способности экстракта баухинии пестрой ингибировать кластогенный эффект циклофосфамида в клетках костного мозга мышей [34] и препятствовать возникновению повреждений ДНК в присутствии перекиси водорода [35] также свидетельствует об антиканцерогенном потенциале данного растения

Ранее нами было показано, что водные экстракты коры растений A. lebbeck, B. variegate, K. africana, P. halepensis обладают высокой антиоксидантной активностью и это свойство коррелирует с содержанием полифенольных соединений [36].

Многочисленные данные о биологических свойствах полифенолов, представленные в научной литературе, позволяют рассматривать эти соединения в качестве перспективных потенциальных агентов для профилактики и терапии онкологических заболеваний [37—39]. Показано, что полифенолы могут участвовать в регуляции генов, участвующих в контроле жизнеспособности пролиферации и клеток [40], индуцировать разные пути апоптоза [41], ингибировать фактор роста эндотелия сосудов [42], препятствуя тем самым развитию процесса ангиогенеза и метастаз . Например, ресвератрол, -(-)эпигалокатехин-

3-галлат, куркумин и птеростилбен могут влиять на важнейшие сигнальные пути апоптоза в клетках разных видов опухолей посредством регуляции активности проапоптических и антиапоптических белков, индукции ядерного фактора транскрипции NF-kB, активация белка р53 [39].

Экспериментальные данные, полученные в настоящей работе, свидетельствуют о том, что комбинация РНКазы B. pumilus c водными экстрактами коры трех растений A. lebbeck, B. variegate и K. africana повышает эффективность индукции апоптоза у клеток аденокарциномы легких человека А549 по сравнению с индивидуальным действием биназы и экстрактов Результаты исследования коррелируют с данными других авторов, демонстрирующими возможность повышения активности апоптоза опухолевых клеток при сочетанном действии вторичных метаболитов растений с другими препаратами. Например, комбинированное действие полифенолов чая с аторвастатином ингибировало онкогенез легких мышей и рост опухолевых клеток Н1299 и Р460, вероятнее всего усиливая их апоптоз [43]. Преклинические эксперименты с использованием

ксенографтов показали, что комбинированное применение полифенолов птеростилбена, кверцетина и FOLFOX6 (оксалиплатин, лейковорин и 5-флюороу-рацил) и радиотерапии приводит к элиминации опухоли in vivo и длительной выживаемости [44].

Таким образом, результаты о сочетанном апоп-тозиндуцирующем действие биназы и водных экстрактов коры растений A. lebbeck, B. variegate и K. africana на клетки аденокарциномы легких человека А549 позволяют рассматривать комбинацию данных препаратов как основу для создания природных щадящих средств, способных индуцировать апоптоз в опухолевых клетках и обусловливают необходимость исследований по определению клеточных мишеней и механизмов действия .

Благодарности

Работа выполнена в рамках Программы повышения конкурентоспособности Казанского федерального университета, поддержана грантом РНФ № 14-14-00522 и частично грантом РФФИ № 15-54-61024.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Stewart B . W ., Wild С . P . World Cancer Report 2014 . IARC Nonserial Publication . WHO Press; 2014 .

2 . Паутина О .А ., Миронова Н .Л ., Власов В . В . и др . Новейшие подходы к лечению онкологических заболеваний: противоопухолевые препараты на основе ген-направленных нуклеиновых кислот. Acta Naturae 2009; 2: 47-66 .

3 . Mitsiades С . S ., Davies F . E ., Laubach J . P . et al . Future directions of next-generation novel therapies, combination approaches, and development of personalized medicine in myeloma . J . Clin . Oncol . 2011; 29 (14): 1916-23 .

4 . Cragg G . M ., Paul G ., Grothaus P . G . et al . Impact on natural products on developing new anticancer agents . Chem . Rev . 2009; 109 (7): 3012-43 .

5 . Khani S . , Barar J . , Movafeghi A . et al . Production of anticancer secondary metabolites: impacts of bioprocess engineering In: Orhan I E , editor Biotechnological Production of Plant Secondary Metabolites . Bentham Science Publishers; 2012: 215-41.

6 . Leland P . A. , Raines R . T . Cancer chemotherapy — ribonucleases to the rescue . Chem . Biol . 2001; 8 (5): 405-13 .

7 . Matousek J . Ribonucleases and their antitumor activity . Comp . Biochem . Physiol . C . Toxicol . Pharmacol . 2001; 129 (3): 175-91.

8 . Saxena S . K ., Shogen К ., Ardelt W . Onconase and its therapeutic potential Lab Med 2003; 34: 380-6

9 . Makarov A .A ., Kolchinsky A ., Ilinskaya O . N . Binase and other microbial RNases as potential anticancer agents Bioessays 2008; 30 (8): 781-90 .

10 . Митькевич В .А ., Макаров А .А ., Ильинская О . Н . Клеточные мишени противоопухолевых рибонуклеаз . Молекулярная биология 2014; 48 (2): 214-22 .

11 Freshney R J Culture of animal cells A manual of basic technique . 3rd ed . New York: Willey; 1993 .

12 . Smolewski P ., Grabarek J ., Lee B .W . et al . Kinetics of HL-60 cell entry to apoptosis during treatment with TNF-alpha or camptothecin assayed by the stathmo-apoptosis method Cytometry 2002; 47 (3): 143-9 .

13 . Laakko T ., King L ., Fraker P . Versatility of merocyanine 540 for the flow cytometric detection of apoptosis in human and murine cells . J . Immunol . Methods . 2002; 261 (1-2): 129-39 .

14 Pereire W O , Amarante-Mendes G P Apoptosis: a programme of cell death or cell disposal? Scand . J . Immunol . 2011; 73 (5): 401-07 .

15 . Ulukaya E ., Acilan C ., Yilmaz Y . Apoptosis: why and how does it occur in biology? Cell . Biochem . Funct . 2011; 29 (6): 468-80 .

16 Demchenko A P Beyond annexin V: fluorescence response of cellular membranes to apoptosis . Cytotechnology . 2013; 65 (2): 157-72 .

17 Alberts B , Johnson A , Lewis J et al Molecular biology of the cell 5th ed New York: Garland Science; 2007

18 Elmore S Apoptosis: a review of programmed cell death Toxicol . Pathol . 2007; 35(4): 495-516 .

19 Wong R S Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment . J . Exp . Clin . Cancer Res . 2011; 30 (1): 87-100 .

20 Bai L , Wang S Targeting apoptosis pathways for new cancer therapeutics . Annu . Rev . Med . 2014; 65: 139-55 .

21. Martinez M . M ., Reif R . D . , Pappas D . Detection of apoptosis: a review of conventional and novel techniques . Anal . Methods 2^Ю; 2 (В): 996-1004 .

22 . Шарипова М . Р ., Тойменцова А. А. Сабирова А . Р . и др . Hовое филогенетическое положение штамма Bacillus intermedius 3-119 . Микробиология 2Ш1; В^ (3): 424-B .

23 Ilinskaya O N , Decker K , Koschinski A et al Bacillus intermedius ribonuclease as inhibitor of cell proliferation and membrane current . Toxicology 2Ш1; 15B (2-3): Ю1-7 .

24 Ilinskaya O N , Zelenikhin P V , Petrushanko I Y et al Binase induces apoptosis of transformed myeloid cells and does not induce T-cell immune response . Biochem . Biophys . Res . Commun . 2ВД7; 3B1(4): ЮШ-5 .

25 . Ilinskaya O . N ., Koschinski A. , Repp H . et al . RNase-induced apoptosis: fate of calcium-activated potassium channels . Biochimie 2ШВ; 9Ш5): 717-25 .

2B Mitkevich V A , Petrushanko I Y , Kretova O V et al Oncogenic c-kit transcript is a target for binase . Cell Cycle 2^Ю; 9(13): 2B74^ .

27 . Зеленихин П . В ., Колпаков А . И ., Черепнев Г . В . и др . Индукция апоптоза опухолевых клеток биназой Молекулярная биология 2Ш5; 39(3): 457-B3 .

2В Cabrera-Fuentes H A , Aslam M , Saffarzadeh M et al Internalization of Bacillus intermedius ribonuclease (BINASE) induces human alveolar adenocarcinoma cell death . Toxicon 2Ш3; B9: 219-2B .

29 Mitkevich V A , Kretova O V , Petrushanko I Y et al Ribonuclease binase apoptotic signature in leukemic Kasumi-1 cells Biochimie 2m3; 95(B): 1344-9 .

3^ . Mironova N . L. , Petrushanko I .Y ., Patutina O .A. et al . Ribonuclease binase inhibits primary tumor growth and metastases via apoptosis induction in tumor cells . Cell Cycle . 2Ш3; 12(13): 212^31.

31 Sankara A J , Naresh A , Mokkapati K L Evaluation of in vitro cytotoxicity of Andrographis paniculata, Duranta serratifolia and Albizzia lebbeck whole plant extracts by MTT assay against MCF-7 and HT-29 cell lines Curr Res Microbiol Biotechnol 2m4; 2: 351-3 .

32 Rajkapoor B , Jayakar B , Murugesh N Antitumour activity of Bauhinia variegate on Dalton's ascetic lymphoma . J . Ethnopharmacol . 2Ш3; В9 (1): Ю7-9.

33 Rajkapoor B , Jayakar B , Murugesh N et al Chemoprevention and cytotoxic effect of Bauhinia variegate against N-nitrosodiethylamine induce liver tumors and human cancer cell lines J Ethnopharmacol 2MB; Ю4 (3): 4^-9 .

34 Pandey S , Agrawal R C Clastogenic analysis of Bauhinia variegata bark extract using micronucleus assay in mouse bone marrow cells . American-Eurasian J . Toxicol . Sci . 2^Ю; 2 (2): 112-4 .

35 . Sharma N . , Bhardwaj R . , Kumar S . et al . Evaluation of Bauhinia variegate L bark fractions for in vitro antioxidant potential and protective effect against H2O2 — induced oxidative damage to pBR322 DNA . Afr . J . Pharm . Pharmacol . 2^1; 5 (12): 1494-5Ш .

36 . Abdul-Hafeez E .A ., Karamova N . S ., Ilinskaya O . N . Antioxidant activity and total phenolic compounds content of certain medicinal plants . Int . J . Biosci . 2014; 5(9): 213-22 .

37 . Stoner G . D ., Mukhtar H . Polyphenols as anticancer chemopreventive agents . J . Cell Biochem . Suppl . 1995; 22: 169-80 .

38 . Han D . H ., Lee M . J ., Kim J . H . Antioxidant and apoptosis-inducing effect of ellagic acid . Anticancer Res . 2006; 26 (5A): 3601-6 .

39 Rodriguez M , Estrela J M , Ortega A Natural polyphenols and apoptosis induction in cancer therapy J carcinog Mutagen 2013; S6: 004 .

40 Kang N J , Shin S H , Lee H J et al Polyphenols as small molecular inhibitors of signaling cascades in carcinogenesis Pharmacol Ther. 2011; 130 (3): 310-24 .

41. Giovannini C ., Masella R . Role of polyphelos in cell death control . Nutr. Neurosci . 2012; 15 (3): 134-49 .

42 . Oak M . H ., El Bedoui J ., Schini-Kerth V. B . Antiangiogenic properties of natural polyphenols from red wine and green tea . J . Nutr . Biochem . 2005; 16(1): 1-8 .

43 . Lu G . , Xiao H ., You H . et al . Synergistic inhibition of lung tumorigenesis by a combination of green tea polyphenols and atorvastatin . Clin . Cancer Res . 2008; 14(15): 4981-8 .

44 . Priego S . , Feddi F . , Ferrer P . et al . Natural polyphenols facilitate elimination of HT-29 colorectal cancer xenografts by chemoradiotherapy: a Bcl-2- and superoxide dismutase 2-dependent mechanism . Mol . Cnacer . Ther. 2008; 7(10): 3330-42

Поступила: 12.09.2015