Микроклональное размножение и некоторые особенности морфогенеза лилейников и хост in vitro

ФАУНА, ФЛОРА

УДК 581:14

МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ И НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ МОРФОГЕНЕЗА ЛИЛЕЙНИКОВ И ХОСТ IN VITRO

О.А. Чурикова

Лилейники и хосты, несомненно, являются одними из самых перспективных многолетних растений с высокими декоративными качествами — большим разнообразием форм и окраски цветков, а также листьев. Интерес к ним появился еще в глубокой древности. Лилейники издавна использовались в пищу, в качестве лекарственных растений и выращивались садоводами. К 1990 г. Американским обществом лилейников, основанном в 1946 г., было зарегистрировано 32 000 сортов, число которых продолжает расти и в настоящее время. Хосты отличаются не меньшим разнообразием сортов. Особую декоративность этим растениям придает различная окраска изящных цветков, собранных в кистевидное соцветие, и листья необычной формы и величины.

Род Hemerocallis Ь., относящийся к семейству ИешегосаШёасеае, насчитывает в своем составе около 15 видов (Жизнь растений, 1982). Родиной большинства лилейников являются страны Юго-Восточной Азии и Японии, встречаются они и в Сибири, на Дальнем Востоке, в Закавказье. В настоящее время лилейники широко распространены в садах и парках Европы и Америки. Роду Нетегоса1Ш Ь. посвящена немногочисленная литература, среди которой имеются монографии Т.Н. Турчинской (1973), Я. Васариетиса (1992) и Н.И. Химиной (2002), содержащие сведения о классификации, географическом распространении отдельных видов, морфологии, сортах и их размножении.

Лилейники — многолетние травянистые растения высотой до 50—100 см с подземным корневищем и мощной корневой системой. От корневища у многих видов отрастают ползучие побеги (столоны) длиной до 30—35 см, заканчивающиеся верхушечной почкой, из которой развиваются розетки листьев и цветочный побег. Замещающие почки могут образовываться по всей длине столона. Для лилейников, также как и для других однодольных (Родионенко, 1961), характерно наличие многолетнего вегетативного побега и однолетнего цветоносного побега, функционально и морфологически различающихся между собой. Цветоносный побег 60—120 см высотой, безлистный, при осно-

вании одетый бурыми остатками листовых влагалищ. Междоузлия его сильно вытянуты, поэтому он приобретает форму цветочной стрелки, которая заканчивается соцветием из 10—12 цветков, а у многоцветковых форм их число доходит до 100.

Согласно результатам исследований М.А. Смо-линской (Смолинская, 1975), лилейник относится к летнецветущим растениям с длительным периодом вегетации, которая заканчивается к моменту полного созревания плодов-коробочек. В первый месяц после прорастания сеянцы развивают 2 пары листьев и небольшой корешок до 5—6 см длиной. В последующие два месяца рост надземной части замедляется по сравнению с корневой системой. В дальнейшем развитие надземных и подземных частей идет равномерно. Сеянцы зацветают на второй-третий год.

Среди немногочисленных работ, посвященных лилейникам, особенно следует отметить, как указывалось выше, монографию Т.Н. Турчинской (1973) и отдельные статьи этого автора (1974, 1979, 1989), в которых подробно освещены не только вопросы классификации, морфологического и анатомического строения вегетативных и репродуктивных органов лилейников, но приводятся и результаты сравнительного анализа вышеуказанных признаков у летне- и вечнозеленых видов. Результаты морфолого-анатомического изучения репродуктивных органов лилейника гибридного (Турчинская, 1989) указывают на возможность пролиферации: в верхней и средней частях цветочной стрелки могут развиваться слабые прицветные листочки зеленого цвета, в пазухе которых находится вегетативная, а возможно, и репродуктивная почка. В процессе развития из нее формируется укороченный побег, несущий 3—4 пары мелких зеленых листьев. Позднее у основания листьев образуется утолщение, из которого появляются бугорки — зачатки корней. К сожалению, автор не приводит в работе фотографий или рисунков, иллюстрирующих эти процессы, представляющие определенный интерес с точки зрения реализации морфогенетических потенций различных органов растения.

Сведения по биологии и морфогенезу хост в доступной нам литературе также очень немногочисленны. В современной ботанической литературе род Hosta L. относят к сем. Hostaceae (Цвелев, 2000). Однако, учитывая ряд эмбриологических признаков, одинаковый набор хромосом и данные серологии, некоторые авторы включают этот род в сем. Agavaceae (Жизнь растений, 1982). Род Hosta L. насчитывает около 40 видов, произрастающих в умеренно теплых областях Восточной Азии (Япония, Китай, Корея, о. Сахалин). Хосты — многолетние травянистые растения с поверхностным компактным или слаборазветвленным корневищем и густой розеткой прикорневых листьев на длинных черешках (Турчинская, 1974). Цветочная стрелка у большинства видов высоко поднята над листьями и заканчивается многоцветковой кистью. Во время созревания семян соцветие долго не теряет декоративности. Посев семян лучше производить осенью свежесобранными семенами. После появления всходов в течение первых двух месяцев сеянец развивает 2—3 маленьких листочка и от двух до пяти корешков 7—10 см длиной (Турчинская, 1979). Наиболее красивы и эффектны кусты хосты в возрасте 8—10 лет. В работе С.Р. Гиндиной (1975) приводятся особенности ритма развития, данные по фенологии этого рода. Как отмечает Т.Н. Турчинская (1974), хосту можно размножать и вегетативным путем — делением куста благодаря хорошо развитому корневищу.

Таким образом, можно отметить, что сведения по морфогенезу лилейников и хост in vivo в доступной нам литературе очень немногочисленны и, за исключением трех монографий (Турчинская, 1973; Васариетис, 1992; Химина, 2002) и нескольких коротких публикаций, в литературе отсутствуют.

В течение длительного времени однодольные считались трудными для культивирования in vitro объектами. Р. Готре (Gautheret, 1959), описывая культуру тканей для 100 видов растений, упоминал лишь 10 видов однодольных. Впоследствии число работ, посвященных культуре тканей однодольных увеличивалось и продолжает неуклонно расти в настоящее время (Morel, Wetmore, 1951; Mullin, 1970; Hussey, 1975, 1980). Главным образом это относится к декоративным представителям класса, в частности к лилейникам и хостам. M. Мюллин (Mullin, 1970) первым описал ограниченную индукцию каллуса на корнях у видов лилейника и образование в нем единичных адвентивных корней. Среди работ, посвященных морфогенезу in vitro у лилейника особого внимания заслуживает работа Хезера и Апса, которые показали, что способность к регенерации растений лилейника в культуре ткани зависит от органа, используемого в качестве источника эксплантов и условий культивирования (Chen, Holden, 1972; Heuser, Apps, 1976; Heuser, Harker, 1976 — цит. по: Papachatzi et al., 1980). В экспери-

менте каллус был индуцирован на лепестках, а также на сегментах цветоножки. При помещении корней на питательную среду формирования каллуса не наблюдалось. Изучая гормональную регуляцию морфогенеза, исследователи отмечали, что развитие из каллуса растеньиц тормозилось при наличии в среде цитокинина (2,4-D) и успешно протекало без него, но в присутствии кинетина.

Ранее дифференциацию in vitro растений H. flava L. (H. lilio-asphodelus L.) наблюдали С. Чен и Д. Холден (Chen, Holden, 1972). Они регенерировали растеньица из образующегося на лепестках каллуса, а затем индуцировали развитие адвентивных корней.

Вегетативное размножение хосты традиционно было долгим и дорогим. Подземная почка, или "глазок", может быть использована для размножения хосты культурой ткани, однако, как отмечает М. Мейер (Meyer, 1980), это увеличивает степень контаминации эксплантов, уменьшая тем самым ростовой потенциал.

В ряде работ обсуждается вопрос о том, какие экспланты предпочтительнее для введения в культуру in vitro (Hammer, 1976; Meyer, 1976; 1980; Papachatzi et al., 1980; Hill et al., 1989). Так, М. Мейер (Meyer, 1980) отмечает, что молодые соцветия являются хорошим источником эксплантов только в том случае, если цветки отделены от соцветия и культивируются вместе с частью цветоножки размером 0,5—1,0 см. При этом 50—75% эксплантов дают начало регенерантам. Другими авторами (Zi-lis, Zwagerman, Gardens, 1979) было показано, что из незрелых тканей цветоноса H. lancefolia и H. sub-cordata grandiflora могут быть регенерированы побеги с последующим их укоренением на специальной среде. Как отмечается в литературе, побеговый апекс также может быть успешно культивирован in vitro (Hammer, 1976; Papachatzi et al., 1980, 1981), однако число образовавшихся растеньиц при этом ограниченно и регенерационный потенциал значительно меньше по сравнению с таковым при использовании в качестве эксплантов цветков. Кроме того, в данном случае наносится больший ущерб материнскому растению. Р. Хилл с сотрудниками (Hill et al., 1989) использовали для размножения in vitro H. sieboldiana завязи бутонов. В ходе эксперимента было показано, что 19 из 20 выделенных завязей продуцировали каллус и/или дифференцировались в побеги, и только на 2 из 20 эксплантов с брактеями образовывался каллус. Сегменты листьев также были культивированы, но лишь на 20% из них впоследствии формировались зачатки побегов.

Другие исследователи (Zilis, Zwagerman, 1980) наблюдали формирование нуцеллярных и адвентивных зародышей у проростков 5 видов хост in vitro. В ряде экспериментов (Meyer, 1980; Papachatzi et al., 1981) анализировалось влияние условий культиви-

рования на сохранение пестролистности и рассматривалась ультраструктура пигмент-протеиновых комплексов у некоторых пестролистных форм хост.

Таким образом, несмотря на большое количество работ, посвященных культуре клеток, тканей и органов однодольных, в частности лилейников и хост in vitro, в которых подробно обсуждаются состав питательных сред, концентрации гормональных регуляторов роста, подбор условий, приводящих к оптимальному выходу искомых морфологических структур, возможность использования в качестве эксплантов различных тканей и органов растений, в них практически отсутствуют сведения о последовательном ходе морфогенеза, сопровождаемые рисунками или фотографиями. Отдельные иллюстрации, приводимые в работах, также не отражают всю сложность и многообразие морфогене-тических процессов, происходящих in vitro.

В связи с вышеизложенным цель нашей работы заключалась в выявлении и анализе особенностей морфогенетических процессов in vitro, происходящих при микроклональном размножении двух видов лилейника и одного вида хосты с целью выявления черт сходства и различия.

Материалы и методика исследований

Обьектами исследований послужили лилейник, или красоднев (виды Hemerocallis fulva L. и H. li-lio-asphodelus L. syn. H. flava L.), и хоста (Hosta sie-boldiana (Hook.) Engl. (Пор. Liliales). Цветоносные побеги с еще не раскрывшимися бутонами (1—2 см длиной) срезали в мае. Для закладки использовали неповрежденный и непораженный болезнями и насекомыми растительный материал, который подвергали предстерилизационной обработке фундазо-лом и последующей стерилизации. Подробно методика описана ранее (Чурикова и др., 1991). После стерилизации у каждого бутона отсекали апикальную часть, оставляя небольшой участок цветоножки.

Для индукции морфогенеза использовали основную среду MS по прописи Мурасиге и Скуга (Mu-rashige, Skoog, 1962), усовершенствованную в ходе эксперимента (добавление 1,5 мг/л БАП; 0,1 мг/л НУК; 30 г/л сахарозы). Экспланты размером 3—7 мм высаживали по 5—6 штук на среду в каждую банку и содержали в климатической камере при температуре 20—22° и круглосуточном освещении интенсивностью 2000 лк. Сформировавшиеся на стадии индукции культуры зачатки побегов отделяли от первичных эксплантов и помещали на среду для размножения (MS; 6 мг/л БАП; 0,1 мг/л НУК; 20 г/л сахарозы). Образующиеся на этой среде многочисленные зачатки побегов разделяли и помещали на среды: а) для последующего размножения; б) и укоренения (1/2 MS; 1,5 мг/л ИУК; 20 г/л сахарозы). При этом на всех вариантах питательных сред процесс регенерации происходил посред-

ством прямого органогенеза, минуя стадию каллу-сообразования, в соответствии с подобранным соотношением компонентов среды. Более подробный анатомический анализ был проведен по общепринятой методике (Барыкина и др., 2000) у вторичных эксплантов, взятых со стадии размножения. Фотографирование срезов проводили на микроскопе МБИ-1 с использованием цифровой камеры "Olympus".

Результаты и обсуждение

Исследованные нами виды лилейников и хосты успешно вводятся в культуру in vitro, образуя при этом множественные зачатки побегов (рис.1, А). Анализ результатов исследования морфогенетиче-ских процессов в тканях вторичных эксплантов лилейников и хосты показал, что в целом они протекают сходным образом (Чурикова, Молкано-ва, 2003).

Рис. 1. Внешний вид экспланта лилейника с несколькими зачатками побегов

При помещении зачатков побегов на среду для размножения за счет продолжающейся деятельности апикальной меристемы наблюдался их верхушечный рост, который проявлялся в акропеталь-ном заложении новых метамеров побега с последующим их растяжением. Наряду с этим происходило заложение почек второго порядка сначала в пазухах самых первых, а впоследствии и более молодых листовых зачатков (внутрипочечное ветвление) (рис. 2, А).

Рис. 2. Заложение почек второго порядка в пазухах нижних и более молодых листовых зачатков

В большинстве случаев параллельно с этими процессами наблюдалось разрастание базальной части зачатков побегов и образование выростов неправильной формы (рис. 2, Б). В дальнейшем в них дифференцировались один или несколько зачатков адвентивных побегов. При анатомическом анализе срезов именно в этой области были отмечены очаги меристематически активных клеток с крупными ядрами и густым цитоплазматическим содержимым. Формированию их предшествовали изоляция инициальной клетки посредством утолщения клеточной стенки и несколько последовательных делений, что приводило к образованию полиады, как правило, сферической, реже грушевидной формы (рис. 3, А). В результате лизиса общих оболо-

Рис. 3. Формирование полиады (А) и элементов гидроцитной системы (Б) в эксплантах хосты

чек одной или нескольких рядом расположенных полиад и продолжающихся неупорядоченных делений в экспланте формировался массив мелких ме-ристематических клеток. В пределах его в дальнейшем дифференцировались элементы васкулярной системы (гидроцитные узлы и тяжи) (рис. 3, Б). Начало дифференциации гидроцитов можно было наблюдать уже при первых делениях инициальных клеток, что обусловливало более быстрое развитие образующихся de novo зачатков адвентивных побегов, а впоследствии и корней. Результаты более подробного структурно-функционального анализа гидроцитной системы растений разных таксономических групп были приведены ранее (Барыкина, Чурикова, 2004; Churikova, Barykina, 2005).

В ходе анализа морфогенетических процессов у лилейников и хосты in vitro в ряде случаев наряду с пленкой из остатков разрушенных клеток и клеточного сока наблюдалось образование раневой пробки, представляющей собой защитную ткань особого типа — ярусную пробку, характерную и для других однодольных (Эсау, 1980). Однако нам не удалось выявить корреляции между ее наличием и степенью интенсивности морфогенетических процессов, происходящих в эксплантах.

При помещении образовавшихся на стадии размножения зачатков побегов на среду для укоренения по прошествии двух недель становились хорошо заметными зачатки придаточных корней, закладывающихся эндогенно на их осях (рис. 1, Б). Проведенный морфолого-анатомический анализ вторичных эксплантов позволил выявить и отличие в ходе морфогенеза в культуре in vitro хост по сравнению с лилейниками. Нами было обнаружено множественное заложение почек (до трех) в пазухе одного листа эксплантов хосты за счет расширенного участка меристемы (рис. 2, В), образующих аксиллярный комплекс. У покрытосеменных, как указывал еще Гофмейстер (Гофмейстер, 1868 —

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Барыкина Р.П., Веселова Т.Д., Д е в я -т о в А . Г . и др. 2000. Основы микротехнических исследований в ботанике. М.

Барыкина Р.П., Чурикова О.А. 2004. Развитие, структура и функции гидроцитной системы у растений // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 2. 23—31.

Васариетис Я. 1992. Лилейники. Рига.

Власова Н.В., Говорина Т.П., Яри-на О.А., Данилова Н.С. 1986. Красоднев малый — Hemerocallis minor Mill. // Биологические особенности растений Сибири, нуждающихся в охране. Новосибирск. С. 92—97.

Гиндина С.Р. 1975. Особенности ритма развития рода хоста в условиях юго-востока степной зоны Украины // Сезонное развитие природы: Мат-лы конф. "Фенология травянистых растений" 11—12 дек. 1975 г. М. С. 63—65.

цит. по: Серебряков, 1952), аксиллярные почки могут развиваться всюду, кроме листьев околоцветника. У однодольных в пазухах листьев с широким основанием могут развиваться несколько коллате-рально расположенных почек. При этом наблюдается определенная закономерность во времени их появления, степени сформированности и величине. Так, у Crocus speciosus меняется характер побегов, формирующихся из разных почек — из центральной развивается цветоносный побег, а из боковых — вегетативный ассимилирующий побег (Серебряков, 1952). У луковичных и клубнелуковичных однодольных могут закладываться метаморфизиро-ванные коллатеральные почки, что было отмечено рядом авторов у различных представителей этих групп. У гладиолусов пазушные почки нижних чешуевидных листьев метаморфизируются в клубне-луковички и, по данным Н. Сысиной (1952), дифференцируются по одной или в числе нескольких, образуя "клубнепочечный мешочек". В действительности он представляет собой метаморфизиро-ванные коллатеральные почки (Чурикова, 1993), возникающие независимо друг от друга в результате активизации клеток протяженной зоны пазушной меристемы. Множественное заложение луковиц в пазухе одной чешуи наблюдалось ранее и у тюльпанов (Силина, Данилова, 1961).

Таким образом, результаты проведенного мор-фолого-анатомического анализа вторичных эксплан-тов лилейников и хосты позволили выделить два основных варианта развития in vitro: а) рост исходной почки и ее ветвление; б) множественное заложение адвентивных почек. Нами была отмечена более высокая регенерационная активность хосты по сравнению с лилейником, которая, очевидно, обусловлена образованием множественных коллатеральных почек в пределах одного аксиллярного комплекса.

Данилина А.Н. 1972. Цитохимическая и морфологическая характеристика разных штаммов культуры ткани моркови: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. М.

Жизнь растений. Т. 6. 1982. М.

Прозина М.Н. 1960. Ботаническая микротехника. М.

Родионенко Г.И. 1961. Род Ирис — Iris L. (Вопросы морфологии, биологии,эволюции и систематики). М.; Л.

Серебряков И.Г. 1952. Экологическая морфология растений. М.

Силина З.М., Данилова М.Ф. 1961. Формообразование у тюльпана (Tulipa sp.) в связи с активизацией пазушных меристем // Морфогенез растений. Т. 3. М. С. 180—187.

Смолинская М.А. 1975. Фенологическое развитие некоторых видов лилейных на Буковине // Се-

зонное развитие природы: Мат-лы конф. "Фенология травянистых растений". Москва, 11—12 дек. 1975 г. М. С. 65—66.

Сысина Н.Я. 1952. Морфогенез гладиолуса: Ав-тореф. дис. ... канд. биол. наук. М.

Турчинская Т.Н. 1979. Анатомическое исследование строения вегетативных органов летне-зеленого и вечнозеленого лилейника гибридного // Тр. Сухум. бот. сада. Вып. 25. 88—114.

Турчинская Т.Н. 1974. Культура хосты на Черноморском побережье Кавказа // Тр. Сухум. бот. сада. Вып. 20. 85—96.

Турчинская Т.Н. 1973. Лилейники гибридные. Тбилиси.

Турчинская Т.Н. 1989. Морфологическая и анатомическая характеристика репродуктивных органов лилейника гибридного // Тр. Сухум. бот. сада. Вып. 33. 91—108.

Цвелев Н.Н. 2000. Определитель сосудистых растений Северо-Западной России / Под ред. А.Л. Тах-таджана. М.; СПб.

Химина Н.И. 2002. Лилейники. М.

Чурикова О.А. 1993. Морфогенетические процессы при масс-клональном размножении некоторых декоративных луковичных и клубнелуковичных растений: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. М.

Чурикова О.А., Молканова О.И. 2003. Некоторые особенности морфогенеза лилейников и хосты in vitro // Мат-лы 3-й Междунар. науч. конф. "Биологическое разнообразие. Интродукция растений" 23—25 сент. 2003 г. СПб. С. 288—289.

Чурикова О.А., Румынии В.А., Барыкина Р.П., Слюсаренко А.Г. 1991. Некоторые особенности морфогенеза in vitro при масс-клональном размножении лилий // Бюл. ГБС АН СССР. Вып. 159. 43—49.

Эсау К. 1980. Анатомия семенных растений. М.

Arisumi T., Frazier L.C. 1969 The initial and early developmental stages of the floral scape in Hemero-callis // Am. Soc. for Horticultural Sci. 93. 604—609.

Chen C.H., Holden D.J. 1972. Organogenesis in daylily callus // Pros. S.D. Acad. Sci. 51. 146—149.

Churikova O.A., Barykina R.P. 2005. The hydrocyte system in seed plants. Wulfenia. 12. 25—33.

Gautheret R. 1959. La culture des tissus vegetaux. Paris.

Haccius B. 1978. Question of unicellular origin of non-zigotic embrios in callus cultures // Phytomorphology. 28. N 1. 78—81.

Halperin W. 1973. The use of cultured tissue in studying developmental problems // Can. J. Bot. 51. N 10. 1801—1806.

Hammer P.A. 1976. Tissue culture propagation of Hosta decorata Baily // HortScience (Abstr.) 11. 309.

Hill R.A., Tuscan G.A., Boe A.A. 1989. In vitro propagation using excised ovaries from immature florets // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 17. 71—75.

Hussey G. 1975. Totipotency in tissue explants and callus of some members of the Liliaceae, Iridaceae and Ama-ryllidaceae // J. Exp. Bot. 26. 253—262.

Hussey G. 1980. Propagation of some members of the Liliaceae, Iridaceae and Amaryllidaceae by tissue culture. Petaloid Monocotyledons: Horticultural and Botanical Research. London. Р. 33—42.

Meyer M . M . 1976. Propagation of daylilies by tissue culture // HortScience. 11. N 5. 485—487.

Meyer M.M. 1980. In vitro propagation of Hosta sieboldiana // HortSience. 15. N 6. 737—738.

Morel G. M., Wetmore R.M. 1951. Tissue cultures of monocotyledons // Am. J. Bot. 38. N 2. 138—140.

Mullin M. 1970. Tissue culture of some monocotyledons plants // Aust. J. Biol. Sci. 23. N 2. 473—477.

Murashige T., Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 15. 473—497.

Papachatzi M., Hammer P.A., Hasega-v a P.M. 1980. In vitro propagation of Hosta plantaginea // HortScience. 15. N 506—507.

Papachatzi M., Hammer P.A., Hasega-va P.M. 1981. In vitro propagation of Hosta decorata "Thomas Hogg" using cultured shoot tips // J. Am. Soc. Hort. Sci. 106. N 2. 232—236.

Zilis M., Zwagerman D., Gardens W. 1979. Clonal propagation of Hostas by scape section culture in vitro // HortScience (Abstr.). 14. N 3. 456

Zilis M., Zwagerman D. 1980. In vitro characteristics of nucellear and adventitious embryos in the genus Hosta // HortScience (Abstr.). 15. N 3. 417

Поступила в редакцию 19.05.06

MICROCLONAL PROPAGATION AND SOME REGULARITIES

OF DAYLILY AND HOSTA MORPHOGENESIS IN VITRO

O.A. Churikova

Rapid in vitro propagation technology of daylilies and hosta species is improved. The results of comparative morpho-anatomical study of regeneration in florets explants of daylily and hosta species are given, with particular emphasis on their similarity and differences. The possibility of obtaining the regenerants via direct organogenesis is showed. The morphogenesis in two daylily species is going by similar type. The distinctive peculiarity of hosta morphogenesis in vitro is it's high regeneration activity which due to the formation of several collateral buds in axillar complex.