Сравнение различных методов выделения, мечения и трансплантации звёздчатых клеток печени крысы

Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского

федерального университета

147

Сравнение различных методов выделения, мечения и трансплантации звёздчатых клеток печени крысы

А.К. Шафигуллина 1, А.А. Трондин 1, Г.Р. Бурганова 1, А.А. Титова 12, М.О.Мавликеев 2, Э.И. Шарипова 12, А.В. Табанакова 12, И.М. Газизов 12, М.С. Калигин12, М.А. Титова 12, А.А. Ризванов 2, А.А. Гумерова 2, А.П. Киясов 2

1 Казанский государственный медицинский университет, Казань

2 Казанский (Приволжский) Федеральный Университет, Казань

Comparison of different methods of rat hepatic stellate cells isolation, labeling and transplantation

A.K. Shafigullina 1, A.A. Trondin 1, G.R. Burganova 1, A.A. Titova 12, M.O. Mavlikeev2, E.I. Sharipova 12,

A.V. Tabanakova 12,1.M. Gazizov12, MS.Kaligin 12, M.A. Titova 1-2, A.A. Rizvanov2, A.A. Gumerova 2, AP. Kiassov2

1 Kazan State Medical University, Kazan

2 Kazan Federal University, Kazan

На сегодняшний день всё больше исследований посвящено изучению роли звёздчатых клеток печени (ЗКП) в регенерации органа. При этом остаются нерешёнными важные методические вопросы, в частности, технология выделения ЗКП, способы мечения выделенных клеток и их наиболее эффективной трансплантации. В ходе данной работы было проведено сравнение двух методов выделения клеток: метод коллагеназно-проназной перфузии печени с последующим разделением клеток в градиенте плотности гистоденза и ассоциированного выделения ЗКП и гепато-цитов методом Сеглена. Также был проведён анализ эффективности различных методов мечения ЗКП: мембранными флуоресцентными метками РКН26 и геном зелёного флуоресцентного белка (GFP), доставляемого в клетки методом электропорации с помощью химического реагента TurboFect или аденовируса. Далее меченые клетки были трансплантированы здоровым крысам двумя методами: в селезёнку и в систему воротной вены. На основании полученных результатов можно заключить, что для выделения ЗКП оптимальным является метод коллагеназно-проназной перфузии печени с последующим разделением клеток в градиенте плотности гистоденза, для мечения клеток — доставка гена GFP аденовирусом, для трансплантации — введение клеток в систему воротной вены.

Ключевые слова: звёздчатые клетки печени, выделение клеток, мечение клеток, зеленый флуоресцентный белок, аденовирус, РКН26, трансплантация.

В настоящее время звёздчатые клетки печени (ЗКП) привлекают к себе все большее внимание как важный «участник» процесса регенерации печени. Большая часть исследований направлена на изучение роли эндогенных ЗКП в регенерации печени путём иммуногистохимического исследования с использованием специфических маркёров: десмина — маркера ЗПК [1, 2], a-SMA — маркёра портальных миофибробластов и активированных ЗКП [2]. Однако последние годы ЗКП всё чаще рассматриваются как прогениторные клетки печени [3], что определяет необходимость изучения свойств этих клеток (путей миграции, хоуминга, возможностей дифференцировки и т.д.) после трансплантации для выяснения эффективности использования ЗКП в клеточной терапии заболеваний печени. В данном случае возникает ряд технических и методологических вопросов: раз-

e-mail: sh.aygul@gmail.com

Nowadays more and more attention is turned to hepatic stellate cells (HSC) and their role in liver regeneration. Nonetheless there are several methodological questions, for example, methods of HSC isolation, their labeling and ways of transplantation. In this work we compared two different methods of HSC isolation: collagenase-pronase liver perfusion with further Histodenz density gradient centrifugation and method of Seglen for isolation of hepatocytes associated with HSC. We also analyzed diverse methods of cells labeling: membrane fluorescent labels PKH26 and with gene of green fluorescent protein (GFP), that could be get into the cells by electroporation, with chemicals like TurboFect or by adenovirus. Then cells were transplanted into rats in two ways: into lien and into system of portal vein. According to our results, we able to conclude that collagenase-pronase liver perfusion with further cells gradient centrifugation in Histodenz is better for HSC isolation than method of Seglen, the most optimal method for cells labeling is with adenovirus, expressing the GFP gene, for HSC transplantation — transplantation into system of portal vein.

Key words: hepatic stellate cells, cells isolation, cells labeling, green fluorescent protein, adenovirus, PKH26, transplantation.

работка и выбор оптимальных методов выделения ЗКП, мечения выделенных клеток и способов трансплантации.

На сегодняшний день ЗКП печени крыс могут быть выделены двумя методами: 1) методом колла-геназно-проназной перфузии печени с последующим разделением клеток в градиенте плотности гисто-денза [4]; 2) методом ассоциированного получения гепатоцитов и ЗКП (по Сеглену) [5]. В литературе данных по сравнению эффективности данных методов нет, что и стало одной из задач данной работы.

Следующий вопрос — метод мечения клеток. Для мечения клеток необходим метод простой и информативный, стабильный и позволяющий детектировать трансплантированные клетки на протяжении длительного периода времени, в том числе после их деления. Известно множество различных методов

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013

148

Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского

федерального университета

получения меченых клеток: методы генетической модификации, молекулярно-биологические методы введения плазмиды, несущей ген зелёного флуоресцентного белка (GFP), а также химические методы с применением мембранных красителей. Бесспорно, самым эффективным методом является выделение клеток из ткани трансгенных зелёных мышей. Сопоставимым по эффективности является метод выявления трансплантированных клеток по Y-хромосоме — для этого в качестве донора клеток выступает мужская особь, а в качестве реципиента — женская. Определение клеток по Y-хромосоме может быть проведено методом ПЦР в режиме реального времени [6] или методом гибридизации in situ [7]. Главное преимущество данных методов заключается в том, что нет необходимости проводить дополнительные процедуры по мечению клеток, а благодаря наследованию признака выявить GFP или Y-хромосому можно и в дочерних клетках. Ограничивают широкое применение данных методов высокая стоимость и необходимость специального оборудования и навыков. Также общепринятым является проведение лабораторных экспериментов на самцах животных, тогда как при трансплантации клеток самкам при интерпретации результатов необходимо учитывать их физиологические особенности. Некоторыми исследователями проведены эксперименты по ксенотрансплантации, однако в данном случае большую роль в приживлении клеток играет иммунная система [8], поэтому данный метод не может быть применён в клинических исследованиях.

Альтернативный метод, позволяющий метить клетки, — использование флуоресцентных мембранных меток PKH (Sigma) [9]. Данный метод прост в проведении и позволяет получить высокий процент меченых клеток.

Наиболее распространённым и изученным является метод мечения клеток с помощью гена GFP. Методы доставки гена GFP в клетки очень разнообразны — метод электропорации, химический метод с помощью липосом или специальных реагентов (например, TurboFect), а также с помощью вирусных векторов. При работе с белком GFP необходимо помнить, что он обладает повышенной иммуногенностью, в связи с этим клетки, экспрессирующие ген белка GFP, элиминируются иммунной системой [10]. Тем не менее, метод выявления трансплантированных клеток по GFP прост и информативен, широко применяется и поэтому необходимо определить наиболее оптимальный метод мечения ЗКП с помощью гена GFP. Поэтому задачей данной работы стало сравнение различных методов доставки в ЗКП гена GFP и мечения ЗКП с помощью флуоресцентной мембранной метки РКН, как наиболее перспективных.

Следующим важным вопросом является поиск наиболее эффективного метода трансплантации клеток. В целом все методы введения гемопоэтических стволовых и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток могут быть разделены на 3 группы: прямое или адресное введение в определенный орган, «полупрямое» и системное введение [11]. Примером прямого введения могут быть исследования Y. Sato с соавт. (2005), когда клетки были введены непосредственно в поражённую печень [12]; примеры полупрямого введения — внутриселезёночное [13] и интраперитонеальное [14]; пример системного введения — введение в хвостовую вену [15, 16]. Также

клетки могут быть введены в воротную вену [10] или в печеночную артерию [17], что, несомненно, повышает количество клеток, поступающих с током крови в печень [18]. Пути введения ЗКП малоизучены, поэтому нами были выбраны два пути введения: в систему воротной вены и в селезёнку, из которой с током венозной крови клетки теоретически должны достичь системы воротной вены и далее — печени.

Материал и методы

Исследование было проведено на белых беспородных крысах-самцах рода Вистар весом 250— 300 г, находящихся на стандартном рационе вивария и имеющих свободный доступ к воде. Проведение исследований одобрено Республиканским комитетом по Этике при Министерстве здравоохранения Республики Татарстан (протокол № 3 от 21.03.2011).

Выделение ЗКП было проведено двумя методами: 1) методом коллагеназно-проназной перфузии печени с последующим разделением клеток в градиенте плотности гистоденза [4] и 2) методом Сеглена для ассоциированного выделения гепатоцитов и ЗКП [5]. Сравниваемые параметры: чистота культуры, выживаемость клеток, техническая простота метода выделения.

В основе обоих методов выделения ЗКП лежит перфузия печени через систему воротной вены, различия заключаются в растворах для перфузии. В первом методе перфузия печени была проведена следующими растворами: 1) буферным сбалансированным солевым раствором Гейса (Gey's Balanced Salt Solution, GBSS, Sigma) объёмом 80 мл, скорость перфузии 10 мл/мин; 2) GBSS в комбинации с проназой (Pronase E, Sigma) для лизиса гепатоцитов объёмом 80 мл (0,264 г — про-наза), скорость перфузии 10 мл/мин; 3) GBSS в комбинации с проназой (0,08 г) и коллагеназой для лизиса соединительнотканной стромы печени (0,16 г, Collagenase Type I, Sigma) объёмом 100 мл, скорость перфузии 3,33 мл/мин). Для лучшей работы ферментов температура растворов поддерживалась на уровне 37°С в условиях водяной бани. После окончания перфузии печень извлекали из брюшинной полости и измельчали в стерильных условиях ламинара, полученную суспензию клеток инкубировали в растворе GBSS в комбинации с 0,04 г проназы Е, 0,048 г коллагеназы I и 0,08 г ДНК-азы в течение 30 мин в водяной бане при температуре 37°С. Полученную суспензию клеток переносили в чистую пробирку и отмывали от ферментов путём центрифугирования в течение 5 мин при 500 g и ресуспендирования в растворе GBSS. Разделение фракций непаренхиматозных клеток было проведено в градиенте плотности гистоденза (Histodenz, Sigma), при этом клетки были ресуспен-дированы в 28,7% растворе гистоденза с последующим подслаиванием полученной суспензии к 7% раствору гистоденза. В результате центрифугирования в течение 17 мин при 3000 rpm витамин А-содержащие ЗКП были в верхнем слое (рис. 1). Выделенные ЗКП переносили в чистую пробирку и для отмывки от гистоденза общий объём клеточной суспензии доводили до 15 мл раствором GBSS и центрифугировали клетки в течение 15 мин при 800 g, удаляли супернатант, клеточный осадок ре-суспендировали в небольшом объёме питательной среды и рассевали на культуральные чашки.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013

Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского

федерального университета

149

Рис. 1. Распределение непаренхиматозных клеток печени в результате центрифугирования в градиенте плотности гистоденза после проназно-коллагеназной перфузиии печени

По методу Сеглена перфузия печени была проведена растворами: 1) этиленгликольтетраацета-та (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid, EGTA) объёмом 50 мл, скорость перфузии 10 мл/мин; 2) буферного сбалансированного солевого раствора Гейса (GBSS, Sigma) объёмом 30 мл при скорости перфузии 10 мл/мин и 3) раствором 0,5% коллагеназы (Био-лот) объёмом 50 мл в течение 5 мин, скорость перфузии 10 мл/мин. После окончания перфузии печень, как и в предыдущем методе, извлекали из брюшинной полости и измельчали, клеточную суспензию сразу центрифугировали в течение 10 мин при скорости вращения 450 g.

Количество выделенных клеток и их выживаемость определяли путём подсчёта клеток в камере Горяева при разведении клеточной суспензии в три-пановом синем в соотношении 1:10. ЗКП культивировали в питательной среде ДМЕМ (Sigma) с 10% содержанием фетальной бычьей сыворотки (FBS, Sigma), 146 мг/мл L-глутамина и 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma) в инкубаторе при 37°C и 5% содержании СО2 во влажной атмосфере.

В следующем экспериментальном блоке было проведено сравнение эффективности 4-х разных методов мечения клеток: 1) метод генетической модификации путём электропорации плазмидой pEGFР-N2, отвечающей за экспрессию GFP [21];

2) метод введения плазмиды pEGFР-N2 с помощью специального реагента TurboFect (Fermentas);

3) метод трансфекции клеток аденовирусом со встро-

енным геном GFP [22]; 4) применение мембранного красного флуоресцентного красителя PKH26 (Sigma) [23]. Сравниваемые параметры: эффективность

трансфекции (количество меченых клеток), выживаемость клеток, длительность сохранения флуоресценции, а также возможность введения клеток сразу

после мечения или необходимость культивирования клеток с целью их восстановления после мечения.

Для трансплантации меченых ЗКП были выбраны 2 метода введения: 1) в селезёнку; 2) в систему воротной вены. Анализ результатов трансплантации ЗКП был проведён иммуногистохимическим методом с антителами к EGFP.

Результаты и обсуждение

Сравнение методов выделения ЗКП крысы. Обоими методами нами были получены ЗКП крысы. Поскольку метод Сеглена направлен на ассоциированное получение ЗКП и гепатоцитов, то для получения чистой культуры ЗКП требовалось от 7 до 10 сут. для элиминации гепатоцитов. Также необходимо отметить, что в присутствии гепатоцитов ЗКП росли медленнее.

Метод Сеглена является менее затратным в финансовом плане, более простым в исполнении, однако более высокие показатели жизнеспособности ЗКП (90%) и чистоты культуры (99,5%) были получены при выделении клеток методом коллагеназно-прона-зной перфузии печени с последующим разделением клеток в градиенте плотности гистоденза. Данный метод мы рекомендуем для получения чистой культуры ЗКП.

Сравнение методов мечения ЗКП. При сравнении различных методов мечения клеток были получены следующие результаты. Наименее эффективным по количеству меченых клеток (около 50%), их выживаемости (30%) стал метод электропорации. Длительность сохранения свечения составила всего 7 сут., а необходимость последующего культивирования клеток в течение 12 ч. для их восстановления увеличивает потери клеток (при снятии клеток с чашки перед трансплантацией). Метод введения плазмидной конструкции pEGFР-N2 с помощью специального реагента TurboFect позволил получить около 60% меченых клеток при хорошем уровне их выживаемости (рис. 2), однако длительность свечения составила всего около 10 сут., то есть клетки, меченные данным методом, могут применяться только в краткосрочных экспериментах.

Рис. 2. Культура звездчатых клеток печени на 3 сут. после мечения их плазмидой pEGFP-N2 с помощью реагента TurboFect. Флуоресцентная микроскопия. Ув.: х10

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013

150

Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского

федерального университета

Метод вирусной трансфекции обладает рядом преимуществ: простота (культивирование в течение 1 ч в условиях инкубатора [19]), высокая эффективность (90%) и высокий уровень выживаемости клеток (порядка 90%). Важно отметить, что после вирусной

трансфекции нет необходимости в дополнительном восстановлении клеток перед трансплантацией. Максимальное количество меченых клеток (100%) было достигнуто при витальном мечении их мембранным флуоресцентным красителем РКН26 (табл.).

Таблица. Сравнение различных методов мечения клеток

Метод мечения Эффективность мечения Выживаемость клеток Длительность сохранения флуоресценции Необходимость восстановления клеток

Электропорация плазмиды pEGFP-N2 50% 30% 7 сут. 12 ч. культивирования

Мечение с помощью реагента TurboFect 90% 70% 10 сут. 24 ч. культивирования

Вирусная трансфекция (аденовирус) 90% 70% 14 сут. нет

Флуоресцентный мембранный краситель PKH26 100% 50% (потери при промывании) 14 сут. in vivo 1 мес. in vitro нет

Так же, как и при вирусной трансфекции, клетки, меченные мембранными метками РКН26, могут быть трансплантированы сразу после процедуры мечения. Главным недостатком красителя РКН26 является то, что мембранная метка неустойчива к действию различных химических веществ, применяемых при фиксации и заливке тканей в парафин и иммуногистохимическом окрашивании, поэтому последующую визуализацию клеток лучше проводить лишь на гистологических срезах, выполненных на криостате. Ещё одним недостатком является размывание красителя при делении клеток, поэтому данный метод не подходит для длительных экспериментов и экспериментов, предполагающих пролиферацию трансплантированных клеток [20]. Таким образом, передача метки дочерним клеткам без ослабления флуоресценции возможна лишь при мечении клеток аденовирусом или ретровирусом, несущим ген GFP. На основании полученных результатов наиболее оптимальным методом мече-ния клеток мы считаем использование аденовируса, несущего ген EGFP.

Сравнение методов трансплантации ЗКП. Меченые ЗКП были трансплантированы здоровым крысам. Нами было проведено сравнение двух методов введения: в селезёнку и в систему воротной вены.

При трансплантации ЗКП в селезёнку крыс GFP+-клетки были обнаружены только в самой селезёнке, в печени введённых клеток не было. Вероятно, это связано с тем, что ЗКП обладают высокой адгезией и поэтому остались в месте введения, в самой селезёнке, и кровеносного русла не достигли.

Напротив, при введении ЗКП в систему воротной вены в печени крыс были обнаружены GFP+-клетки, напоминающие по форме гепатоциты (рис. 3). Таким образом, при введении ЗКП в систему воротной вены клетки успешно достигали печени и встраивались в паренхиму органа. Серьёзной проблемой при внутривенном введении клеток стала высокая частота осложнений в виде кровотечения, которую удалось решить путём применения коллагеновой гемостатической губки — место вкола перед извле-

чением иглы инсулинового шприца, которым вводили клетки, прижимали губкой размером 5x5 мм. Удостоверившись в отсутствии кровотечения, накладывали швы. Частота кровотечений и летальных исходов прооперированных животных была сведена к минимуму. Таким образом, для трансплантации ЗКП предпочтительным является метод введения в систему воротной вены, а для исключения кровотечения при введении клеток рекомендуется применение гемостатических средств.

Рис. 3. Печень крысы, 2 сут. после трансплантации GFR-звездчатых клеток печени в систему воротной вены. Иммуногистохимическая реакция с антителами к GFP. Ув.:х40

Подводя итог можно заключить, что наиболее эффективным для выделения ЗКП является метод коллагеназно-проназной перфузии печени крысы с последующим разделением клеток в градиенте плотности гистоденза, оптимальным методом мечения клеток — вирусная трансфекция с помощью аденовируса, несущего ген GFP, а наилучшим методом трансплантации клеток — введение в воротную вену печени.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013

Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского

федерального университета

151

Благодарности

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ 09-04-97013-р_поволжье_а и 12-04-97088-р_поволжье_а.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Yokoi Y., Namihisa T., Kuroda H. et al. Immunocytochemical detection of desmin in fat-storing cells (Ito cells). Hepatology 1984; 4: 709-14.

2. Friedman S.L. Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver. Physiol. Rev. 2008; 88: 125-72.

3. Kordes C., Sawitza I., Haussinger D. Hepatic and pancreatic stellate cells in focus. Biol Chem. 2009; 390(10): 1003-12.

4. Knook D.L., Seffelaar A.M., de Leeuw A.M. Fat-storing cells of the rat liver. Exp. Cell Res. 1982; 132: 468-71.

5. Neufeld D.S. Isolation of rat liver hepatocytes. Methods Mol Biol. 1997; 75: 145-51.

6. Ling-Jid Wung et al. Engraftment assessment in human and mouse liver tissue after sex-mismatched liver cell transplantation by Real-Time Quantitative PCR for Y chromosome sequences. Liver Transpl. 2002; 8: 822-82.

7. Nagwaelkharif B.V. et al. Homing of transplanted bone marrow cells in livers of Schistosoma mansoni-infected mice. APMIS 2010; 118: 277-87.

8. Chamberlain J. et al. Efficient generation of human hepatocytes by the intrahepatic delivery of clonal human mesenchymal stem cells in fetal sheep. Hepatology 2007; 46: 1935-45.

9. Jin S.Z. et al. Granulocyte colony-stimulating factor enhances bone marrow mononuclear cell homing to the liver in a mouse model of acute hepatic injury. Dig. Dis. Sci. 2010; 55(10): 2805-13.

10. Popp F.C. et al. No contribution of multipotent mesenchymal stromal cells to liver regeneration in a rat model of prolonged hepatic injury. Stem Cells 2007; 25: 639-45.

11. Zhang Z.X. et al. A combined procedure to deliver autologous mesenchymal stromal cells to patients with traumatic brain injury. Cytotherapy 2008; 10: 134-9.

12. Sato Y. et al. Human mesenchymal stem cells xenografted directly to rat liver are differentiated into human hepatocytes without fusion. Blood 2005; 106: 756-63.

13. Aurich I. et al. Functional integration of hepatocyrtes derived from human mesenchymal stem cells into mouse livers. Gut. 2007; 56: 405-15.

14. Liu Z. C., Chang T.M.S. Transdifferentiation of bioencapsulated bone marrow cells into hepatocyte-like cells in the 90% hepatectomized rat model. Liver Transplantation 2006; 12: 566-72.

15. Fang B. et al. Systemic infusion of FLK1+ mesenchymal stem cells ameliorate carbon tetrachloride-induced liver fibrosis in mice. Transplant. 2004; 78: 83-8.

16. Terai S. et al. An in vivo model for monitoring transdifferentiation of bone marrow cells into functional hepatocytes. J. Biochem. 2003; 134(4): 551-58.

17. Mohamadnejad M., Alimoghaddam K., Mohyeddin-Bonab M. et al. Phase I trial of autologous bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in patients with decompensated cirrhosis. Arch. Iran Med. 2007; 10: 459-66.

18. Long-Jun Dai et al. The therapeutic potential of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on hepatic cirrhosis. Stem Cell Res. 2009; 2: 16-25.

19. Ризванов А.А., Измайлов А.А., Сафиуллов З.З. и др. Генно-клеточная терапия бокового амиотрофического склероза моно-нуклеарными клетками пуповинной крови человека, генетически модифицированными рекомбинантными аденовирусами. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2012;VII (2): 44.

20. Rand M.L., Wang H., Mody M. et al. Concurrent measurement of the survival of two populations of rabbit platelets labeled with either two PKH lipophilic dyes or two concentrations of biotin. Cytometry 2002; 47: 111-7.

21. Yalvac M.E., Ramazanoglu M., Gumru Z.O. et. al. Comparison and optimisation of transfection of human dental follicle stem cells with different chemical methods and electro-poration. Neurochem. Res. 2009; 34: 1272-7.

22. Мухамедьяров М.А., Ризванов А.А., Сафиуллов З.З. и др. Анализ эффективности генно-клеточной терапии у трансгенных мышей с фенотипом бокового амиотрофического склероза. Клеточные технологии в биологии и медицине 2012; 4: 215-9.

23. Rizvanov A.A., Yalvag M.E., Shafigullina A.K. Interaction and self-organization of human mesenchymal stem cells and neuroblastoma SH-SY5Y cells under co-culture conditions: a novel system for modeling cancer cell micro-environment. Euro. J. Pharm. Biopharm. 2010; 76, №2: 253-9.

Поступила 27.08.2013

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013