Нарушения иммунного и цитокинового статуса у больных хроническим остеомиелитом костей стопы

УДК 612.017.1: 616.718.8-002.2-089.87: 616.15-07 Т06

нарушения иммунного и цитокинового статуса у больных хроническим остеомиелитом костей стопы

Дмитрий Станиславович Тевс12*, Павел Вячеславович Калуцкий1,

Виктор Анатольевич Лазаренко1

1 Курский государственный медицинский университет,

2Курская областная клиническая больница

Реферат

Цель. Изучение состояния клеточного и гуморального звеньев иммунитета и цитокинового статуса при хроническом остеомиелите костей стопы, протекающем на фоне сахарного диабета и атеросклероза.

Методы. Проведён анализ иммунного и цитокинового статуса 20 больных хроническим остеомиелитом костей стопы. Также сформирована контрольная группа из 20 клинически здоровых доноров крови. Проводили клиническое обследование, изучали фенотипы популяций лимфоцитов, состояние фагоцитарного звена, концентрацию иммуноглобулинов и интерлейкинов. Статистическая обработка полученных данных проведена с помощью пакетов прикладных программ «Excel» и «Statisticа 10». Для сравнения иммунологических показателей групп использовали непараметрический вариант критерия Ньюмена-Кейлса.

Результаты. Развитие остеомиелита костей стопы характеризовалось супрессией фагоцитарного звена иммунитета, снижением абсолютного и относительного числа Т-хелперов, NK-клеток, увеличением содержания Т-цитотоксических лимфоцитов, повышением концентрации про- и противовоспалительных цитокинов.

Вывод. У больных хроническим остеомиелитом костей стопы присутствуют снижение показателей клеточного звена врождённого иммунитета и повышение уровня про- и противовоспалительных цитокинов крови; стандартный курс лечения снижает выраженность дисбаланса иммунного и цитокинового статуса, но не приводит к нормализации исследованных показателей.

Ключевые слова: хронический остеомиелит, иммунный статус, цитокиновый статус.

IMMUNE AND CYTOKINE DISORDERS IN PATIENTS WITH CHRONIC FOOT OSTEOMYELITIS D.S. Tevs‘2, P.V. Kalutsk/, V.A Lazarenko1. ‘Kursk State Medical University, Kursk, Russia,2Kursk Regional Clinical Hospital, Kursk, Russia. Aim. To study the cell and humoral immunity and cytokine status in patients with chronic foot osteomyelitis associated with diabetes mellitus and atherosclerosis. Methods. Immune and cytokine status was assessed in 20 patients with chronic foot osteomyelitis. Results were compared to control group of 20 healthy blood donors. Patients underwent clinical examination, lymphocyte populations phenotypes, phagocytes, immunoglobulins and interleukins concentration were studied. Statistical analysis was performed using «Excel» and «Statistica 10» software. To compare immunological parameters, New-man-Keuls test was used. Results. Development of foot osteomyelitis was associated with decreasing of phagocytic activity, absolute and relative number of T-helpers, NK-cells, increasing of T-cytotoxic cells number, pro- and anti-inflammatory cytokines levels. Conclusion. A marked suppression of cell-mediated immunity and increased blood levels of pro- and antiinflammatory cytokines were found in patients with chronic foot osteomyelitis. Standard treatment decreased, but did not normalize the immune and cytokine imbalance. Keywords: chronic osteomyelitis, immune status, cytokine status.

Лечение хронического остеомиелита — одна из актуальных проблем хирургии. На фоне внедрения в практику новых методов оперативного лечения и программ комбинированной антибактериальной терапии процент инвалидизации больных хроническим остеомиелитом остаётся высоким и колеблется от 8 до 13% [1]. Частота рецидивов остеомиелита достигает 20-30%, что приводит к высокой частоте вторичных ампутаций (7,512,1%) и функциональной неполноценности конечности (10,3-57% случаев) [1].

Персистенция возбудителя, некроти-зированные ткани в зоне воспаления и обусловленная этим интоксикация при хроническом остеомиелите не только повышают нагрузку на иммунную систему, но и серьёзно повреждают её, а само хирургическое вмешательство без соответствующей иммунокоррекции несёт риск диссеминации локального инфекционного процесса [2]. В

Адрес для переписки dmitriy.tevs@gmail.com 460

этой связи одним из наиболее перспективных и патогенетически обоснованных направлений в комплексном лечении таких больных становится иммунокорригирующая и дезинтоксикационная терапия [5, 6].

Цель исследования — изучение состояния клеточного и гуморального звеньев иммунитета и цитокинового статуса при хроническом остеомиелите костей стопы, протекающем на фоне сахарного диабета и атеросклероза.

В основу настоящего исследования положены результаты обследования и лечения 20 больных хроническим остеомиелитом костей стопы в возрасте от 30 до 59 лет, поступивших в отделения гнойной хирургической инфекции ГМУ «Курская областная больница» и ОБУЗ «Курская городская клиническая больница скорой медицинской помощи» в период с 2011 по 2012 гг. Критериями включения в исследование были клинически и рентгенологически подтверждённый диагноз, согласие пациентов на участие в

Таблищ 1

Показатели клеточного звена врождённого иммунитета у больных хроническим остеомиелитом костей стопы до

и после лечения

Показатель Группа контроля (n=20), М±о Основная группа (n=20) до лечения, М±о Основная группа (n=20) после лечения, М±о

1 2 3

Фагоцитарный показатель, % 75,1±3,32 56,6±12,91 59,2±13,4

Фагоцитарное число 5,8±0,7323 1,7±0,161'3 2,02±0,1912

Индекс завершённости фагоцитоза 70,7±7,72'3 46,65±10,413 53,3±1212

Индекс активности фагоцитов 4,4±0,623 0,94±0,181 1,18±0,221

Спонтанный НСТ-тест 0,1±0,04 0,2±0,07 0,1б±0,06

Стимулированный НСТ-тест 0,4±0,0623 0,24±0,07‘ 0,23±0,071

Индекс стимуляции нейтрофилов 3,1±0,723 1,27±0,281 1,52±0,331

CD3+-лимфоциты, х109/л 1,3±0,2 1,2±0,43 1,22±0,4

CD3+-лимфоциты, % 64,5±4,223 47,3±12,01 48,2±11,б1

CD4+-лимфоциты, х109/л 0,9±0,223 0,47±0,171 0,5±0,171

CD4+-лимфоциты, % 40,1±2,823 28,6±4,61 28,5±5,51

CD8+-лимфоциты, х109/л 0,4±0,0923 0,72±0,181 0,71±0,181

CD8+-лимфоциты, % 25,5±4,32'3 44,4±4,4‘ 44,7±2,71

CD16+-лимфоциты, х109/л 0,2±0,062 0,1±0,031 0,12±0,03

CD16+-лимфоциты, % 10,4±2,423 6,4±0,761 7,1±0,81

Индекс CD4+/CD8+ 2,09±0,5223 0,65±0,111 0,68±0,121

Примечание: цифрами надстрочного индекса указаны группы, по отношению к которым выявлено статистически значимое различие показателей (р <0,05); НСТ-тест — тест восстановления нитросинего тетразолия.

исследовании, возраст от 30 до 59 лет. Критериями исключения считали декомпенсиро-ванную сердечно-лёгочную недостаточность, гематологические заболевания, беременность, кормление грудью. В числе пациентов были 10 (50%) мужчин и 10 (50%) женщин, средний возраст 50,7±7,8 года. Все больные получали стандартное лечение, включавшее антибактериальные, противовоспалительные препараты, физиотерапию, перевязки. У всех больных до начала лечения и перед выпиской из стационара производили забор 10 мл венозной крови для исследования иммунного и цитокинового статуса.

В группу контроля вошли 20 клинически здоровых доноров крови в возрасте от 30 до 59 лет. По полу и возрасту исследуемые группы были сопоставимы.

Для оценки иммунного статуса исследовали показатели клеточного и гуморального иммунитета. О состоянии функциональнометаболической активности нейтрофилов крови судили по фагоцитарному числу и фагоцитарному показателю, на основе которых вычисляли индекс активности фагоцитов и завершённость фагоцитоза [4]. Кислород-за-висимую активность бактерицидных систем нейтрофилов изучали в тесте восстановления нитросинего тетразолия с расчётом индекса стимуляции нейтрофилов [4].

Фенотипы популяций лимфоцитов крови (CD3+, CD4+, CD8+, CD16+) определяли с помощью набора реагентов «МКА Клоноспектр» («Клоноспектр», Москва) методом иммунофлюоресценции.

Концентрацию иммуноглобулинов А, М и G, интерлейкина-1р (ИЛ-1Р), рецепторного антагониста ИЛ-1, фактора некроза опухоли альфа, интерферона у, ИЛ-2, -4, -6 и -10 определяли методом твердофазного иммунофер-ментного анализа с использованием коммерческих наборов ЗАО «Вектор-Бест» (Россия).

Статистическая обработка полученных данных проведена с помощью пакетов прикладных программ «Excel» и «Statists 10». Для сравнения иммунологических показателей групп использовали непараметрический вариант критерия Ньюмена-Кейлса [3].

Длительность стационарного лечения пациентов основной группы составила 21,8±9,6 дня. У всех больных диагностирован экзогенный контактный хронический остеомиелит. У 13 (65%) больных остеомиелит развился на фоне сахарного диабета 2-го типа. У 7 (35%) пациентов остеомиелит сочетался с облитерирующим атеросклерозом сосудов нижних конечностей. У 13 (65%) больных течение остеомиелита осложнилось появлением свищей, у 5 (25%) пациентов диагностирована флегмона стопы, в 2 (10%) случа-

Таблица 2

Содержание иммуноглобулинов и цитокинов у больных до и после стандартного лечения

Показатель Группа контроля (п=20), М±ст Основная группа (п=20) до лечения, М±о Основная группа (п=20) после лечения, М±о

1 2 3

Интерлейкин-1р, пг/мл 3,2±1,82'3 143,3±31,313 26,2±6,812

Фактор некроза опухоли альфа, пг/мл 1,9±0,923 70,3±12,913 21,9±4,81-2

Интерлейкин-6, пг/мл 3,1±2,12'3 109,3±23,713 14,9±3,31д

Интерферон у, пг/мл 3,5±2,332'3 95,8±22,113 30,2±8,512

Рецепторный антагонист интерлейкина-1, пг/мл 236,3±84,323 1258,5±224,013 828±44,612

Интерлейкин-2, пг/мл 1,1±0,923 45,3±13,613 10,4±3,21'2

Интерлейкин-4, пг/мл 2,4±1,52'3 33,3±10,71 24,1±41

Интерлейкин-10, пг/мл 11,0±5,423 100,8±14,513 42,8±7,11'2

Иммуноглобулин А, г/л 2,0±0,5 1,2±0,3 1,2±0,5

Иммуноглобулин М, г/л 1,7±0,7 1,2±0,33 2,4±0,52

Иммуноглобулин С г/л 10,7±2,9 8,0±1,6 9,7±2,3

Примечание: цифрами надстрочного индекса указаны группы, по отношению к которым выявлено статистически значимое различие показателей (р <0,05).

ях отмечен абсцесс пальца стопы, у 5 (25%) больных развилась трофическая язва, у 1 (5%) пациента выявлен патологический перелом фаланги пальца стопы.

Оценка клеточного звена врождённого иммунитета у больных остеомиелитом до начала лечения выявила существенные отличия исследуемых показателей от данных группы контроля (табл. 1). Развитие заболевания характеризовалось статистически значимо более низкими фагоцитарными показателем и числом, завершённостью фагоцитоза, индексом активности фагоцитов, значением стимулированного теста восстановления нит-росинего тетразолия и индекса стимуляции нейтрофилов. Абсолютное количество СБ3+-лимфоцитов не отличалось от показателей контроля, тогда как процентное содержание СБ3+-клеток было ниже нормы. На фоне снижения абсолютного и относительного содержания СБ4+- и СБ16+-клеток у больных остеомиелитом количество СБ8+-лимфоцитов было статистически значимо выше значений здоровых людей. Это привело к тому, что соотношение СВ4+/СБ8+ было в 3,2 раза меньше показателей контроля. Всё это свидетельствует о напряжённости иммунного ответа, истощении функционального резерва нейтрофилов и развитии иммунодефицита со стороны клеточного звена врождённого иммунитета у пациентов с остеомиелитом.

Исследование сыворотки крови у больных хроническим остеомиелитом выявило достоверное повышение уровня всех исследуемых цитокинов по сравнению с нормой 462

(табл. 2). Среди провоспалительных цитоки-нов наиболее высокие значения показателей по сравнению с группой контроля отмечены для ИЛ-1Р (в 44,8 раза) и ИЛ-2 (в 41,1 раза). С учётом выявленной у больных реакции клеточного звена врождённого иммунитета и данных литературы об источниках секреции этих цитокинов их чрезмерный синтез может быть обусловлен повышенной активностью Т-лимфоцитов как компенсаторной реакцией на снижение их содержания в крови. Концентрация противовоспалительных цитокинов также была повышена (в основном это касалось ИЛ-4), однако степень увеличения была меньшей, чем у провоспа-лительных. Причём необходимо обратить внимание на тот факт, что концентрация рецепторного антагониста ИЛ-1, являющегося регулятором активности ИЛ-1 — мощного ци-токина воспаления, была повышена всего в 5,3 раза по сравнению с нормой. Такой дисбаланс соотношения рецепторного антагониста ИЛ-1 и ИЛ-1Р свидетельствует о нарушении функционирования как цитокиновой сети организма, так и иммунной системы в целом. Кроме того, повышение по сравнению с контролем концентрации ИЛ-2 (в 41,1 раза) и интерферона у (в 27,4 раза) свидетельствует об активности Т-хелперов 1-го типа. Среди цитокинов, синтезируемых Т-хелперами 2-го типа, наиболее высокая концентрация зарегистрирована у ИЛ-6 (в 35,3 раза выше нормы). Содержание же ИЛ-4 было в 13,9 раза, а ИЛ-10 — в 9,2 раза выше контроля. Учитывая это, а также высокое содержание в сыво-

ротке крови интерферона у, можно прийти к заключению о преимущественной диффе-ренцировке Т-хелперов 1-го типа. При этом достоверных изменений содержания иммуноглобулинов не отмечено.

На фоне стандартного курса лечения из-за прогрессирования гнойного процесса у 3 (15%) больных была выполнена резекция фаланги пальца, у 3 (15%) пациентов — экзар-тикуляция I и II пальцев с резекцией плюсневой кости. Последние операции существенно снижали опороспособность стопы и активность пациентов в послеоперационном периоде. Частичная хирургическая обработка гнойного очага по поводу абсцесса и флегмоны произведена у 7 (35%) человек.

После проведённого стандартного курса лечения реакция клеточного звена врождённого иммунитета включала только фагоцитарное число и завершённость фагоцитоза, которые увеличились, оставаясь по-прежнему ниже значений здоровых людей (см. табл. 1).

Значительно более выраженной была реакция со стороны исследованных цитокинов. Стандартное лечение привело к достоверному снижению уровня как провоспалитель-ных, так и противовоспалительных цитоки-нов, который, однако, не достиг значений контроля (см. табл. 2). Наиболее выраженная реакция зафиксирована со стороны ИЛ-1р, -2 и -6. Среди провоспалительных цитокинов наибольшее отклонение от нормы отмечено в случае фактора некроза опухоли альфа и ИЛ-2. Среди противовоспалительных цито-кинов на фоне снижения уровня рецепторного антагониста ИЛ-1 и ИЛ-10 концентрация ИЛ-4 осталась по-прежнему высокой (в 10 раз больше нормы). Высокое содержание ИЛ-4 на фоне снижения уровня провоспалитель-ных цитокинов свидетельствует о дифферен-цировке Т-хелперов 2-го типа и активации гуморального звена иммунитета на фоне проводимой терапии, что подтверждается увеличением в 2 раза концентрации иммуноглобулина М. Дисбаланс между уровнями ИЛ-1Р и рецепторного антагониста ИЛ-1, хотя и уменьшился, но продолжал сохраняться.

ВЫВОДЫ

1. Развитие хронического остеомиелита костей стопы характеризуется формированием супрессии фагоцитарного звена иммунитета, снижением абсолютного и относительного числа NK-клеток, Т-хелперов и увеличением содержания Т-цитотоксических лимфоцитов. Это сопровождается выраженным повышением концентрации про- и противовоспалительных цитокинов с нарушением функционирования как цитокиновой сети организма, так и иммунной системы в целом.

2. Проведение больным стандартного курса лечения позволяет снизить выраженность дисбаланса цитокинового звена, фагоцитарного числа и завершённости фагоцитоза, но не приводит к нормализации исследованных показателей иммунного и цитокинового статуса.

3. Всё это свидетельствует о необходимости включения в схему лечения хронического остеомиелита костей стопы иммуномодулирующих препаратов, воздействующих на клеточное звено врождённого иммунитета и цитокиновый статус.

ЛИТЕРАТУРА

1. Амирасланов Ю.А. Современные принципы хирургического лечения хронического остеомиелита // Инфекц. в хир. - 2004. - Т. 2, №1. - С. 8-13.

2. Белохвостикова Ю.С., Леонова С.Н., Винник Ю.С. Иммунокоррекция хронических форм раневой инфекции // Мед. иммунол. - 2006. - №8. - С. 429-430.

3. Гланц С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. - М.: Практика, 1998. - 459 с.

4. Караулов А.В., Ликов В.Ф., Евсегнеева И.В., Кокуш-ков Д.В. Оценка различных методов иммуномониторинга при проведении иммунокоррекции // Аллергол. и иммунол. - 2005. - Т. 6, №2. - С. 136-137.

5. Корженевский А.А. Обоснование выбора препарата для иммунотерапии хронического остеомиелита // Аллергол. и иммунол. - 2008. - Т. 9, №2. - С. 227-230.

6. Сепиашвили Р.И. Дифференцированная иммунотерапия при хирургических гнойно-воспалительных заболеваниях // Аллергол. и иммунол. - 2009. - Т. 10, №1. - С. 5-16.