КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ ВРЕМЕНИ ПОЛУЖИЗНИ FC-СЛИТЫХ БЕЛКОВ В СЫВОРОТКЕ

1. Способ получения модифицированной нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный Fc-слитый белок, который имеет время полужизни в сыворотке, увеличенное относительно такового исходного Fc-слитого белка, причем каждый из модифицированного и исходного Fc-слитых белков включает Fc-часть и гетерологичную часть, включающий модифицирование нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичную часть исходного Fc-слитого белка, для кодирования одного или более дополнительных сайтов N-связанного гликозилирования, причем (а) модифицированная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный Fc-слитый белок, который, после экспрессии в подходящей культуре клеток, имеет время полужизни в сыворотке, которое на по крайней мере 10% больше времени полужизни в сыворотке исходного Fc-слитого белка, как определено в фармакокинетическом анализе с использованием обезьян, и (b) модифицированный Fc-слитый белок имеет in vivo биологическую активность, по существу одинаковую с таковой немодифицированного Fc-слитого белка, или превышающую ее.
2. Способ по п.1, в котором один или более дополнительных сайтов N-связанного гликозилирования вводят в одну или более аминокислотных последовательностей гетерологичной части, которые являются поверхностно-экспонированными.
3. Способ по п.2, в котором один или более дополнительных сайтов N-связанного гликозилирования вводят в одну или более аминокислотных последовательностей гетерологичной части, которые являются поверхностно-экспонированными и не включены в β-лист или α-спираль.
4. Способ по п.1, в котором гетерологичная часть включает лиганд-связывающий домен.
5. Способ по п.4, в котором лиганд-связывающий домен происходит из экстраклеточного домена трансмембранного рецептора.
6. Способ по п.1, в котором один или более дополнительных сайтов N-связанного гликозилирования вводят в положения в гетерологичной части таким образом, чтобы любые дополнительные сахарные фрагменты не препятствовали лиганд-связывающему домену.
7. Способ по любому из пп.4-6, в котором один или более дополнительных сайтов N-связанного гликозилирования вводят в положения таким образом, чтобы аминокислотная последовательность лиганд-связывающего домена не модифицировалась.
8. Способ по любому из пп.4-6, в котором один или более дополнительных сайтов N-связанного гликозилирования вводят в положения таким образом, чтобы любые сахарные фрагменты, присоединяемые в дополнительных сайтах N-связанного гликозилирования, в соответствии с предсказанием не препятствовали по существу области связывания с лигандом.
50
50
9. Способ по любому из пп.4-6, в котором модифицированный Fc-слитый белок связывается с лигандом с концентрацией полумаксимального ингибирования (IC), которая не более чем в два раза меньше IC исходного Fc-слитого белка.
10. Способ по п.1, в котором исходный Fc-слитый белок модифицирован в результате добавления или делеции по крайней мере одного аминокислотного остатка для введения по крайней мере одного сайта гликозилирования.
11. Способ по п.1, в котором исходный Fc-слитый белок модифицирован в результате замены по крайней мере одного аминокислотного остатка с целью введения по крайней мере одного сайта гликозилирования.
12. Способ по п.1, в котором гетерологичная часть исходного Fc-слитого белка включает по крайней мере два структурно различных домена в виде α-спирали и/или β-листа, соединенных неструктурированным полипептидным участком, который является поверхностно-экспонированным.
13. Способ по п.12, в котором дополнительный сайт N-связанного гликозилирования расположен внутри неструктурированного пептидного участка.
14. Способ по п.1, в котором гетерологичная часть исходного Fc-слитого белка включает менее одного сайта N-связанного гликозилирования на каждые 90 аминокислот.
15. Способ по п.1, в котором гетерологичная часть исходного Fc-слитого белка включает менее одного сайта N-связанного гликозилирования на каждые 125 аминокислот.
16. Способ по п.1, в котором гетерологичная часть модифицированного Fc-слитого белка включает по крайней мере один сайт N-связанного гликозилирования на каждые 90 аминокислот.
17. Способ по п.1, в котором гетерологичная часть модифицированного Fc-слитого белка включает по крайней мере один сайт N-связанного гликозилирования на каждые 65 аминокислот.
18. Способ по п.1, в котором каждую аминокислоту гетерологичной части модифицированного Fc-слитого белка, которая связана с N-связанным гликозилированием, отделяют по крайней мере 20 аминокислот от любой другой аминокислоты, модифицированной в результате N-связанного гликозилирования.
19. Способ по п.1, в котором исходный Fc-слитый белок дополнительно включает полипептидный линкер между Fc-частью и гетерологичной частью, который не содержит сайт N-связанного гликозилирования.
20. Способ по п.1, в котором модифицированный Fc-слитый белок включает сайт N-связанного гликозилирования, расположенный внутри линкера.
21. Способ по п.1, в котором гетерологичная часть включает экстраклеточный домен рецептора TNFR2, который включает лиганд-связывающий домен.
22. Способ по п.21, в котором экстраклеточный домен рецептора TNFR2 включает аминокислотную последовательность, которая на по крайней мере 90% идентична SEQ ID NO: 2.
23. Способ получения модифицированного Fc-слитого белка, который имеет время полужизни в сыворотке, увеличенное относительно такового исходного Fc-слитого белка, включающий
(a) экспрессию модифицированной нуклеиновой кислоты, полученной способом по любому из пп.1-22, в культуре клеток, которая обеспечивает гликозилирование, характерное для млекопитающих или подобное таковому; и
(b) выделение модифицированного Fc-слитого белка из культуры клеток.
24. Способ по п.23, дополнительно включающий стадию очистки модифицированного Fc-слитого белка.
25. Способ по п.24, в котором стадия очистки модифицированного Fc-слитого белка включает подвергание модифицированного Fc-слитого белка воздействию белка A и выделения модифицированного Fc-слитого белка, который связан с белком A.
26. Способ по любому из пп.23-25, дополнительно включающий получение в виде состава модифицированного Fc-слитого белка для введения пациенту.
27. Способ по п.23, в котором модифицированную нуклеиновую кислоту экспрессируют посредством линии клеток млекопитающего.
28. Способ по п.27, в котором линию клеток млекопитающего выбирают из группы, состоящей из линии клеток CHO, линии клеток NSO, линии клеток COS и линии клеток HEK236.
29. Способ по любому из пп.23, 27 или 28, в котором модифицированную нуклеиновую кислоту экспрессируют в линии клеток, которая создает N-связанные сахарные фрагменты, которые включают сиаловую кислоту.
30. Способ по п.23, в котором модифицированную нуклеиновую кислоту экспрессирует клетка не млекопитающего, которая была сконструирована для обеспечения гликозилирования, характерного для млекопитающих или подобного таковому.
31. Способ по п.30, в котором линия клеток происходит от клетки гриба, клетки насекомого или клетки растения.
32. Линия клеток, включающая модифицированную нуклеиновую кислоту, полученная способом по любому из пп.1-22.
33. Модифицированный Fc-слитый белок, полученный способом по любому из пп.23-32.
34. Слитый белок, включающий Fc-домен иммуноглобулина и по крайней мере один гетерологичный полипептидный домен, причем слитый белок модифицирован за пределами Fc-домена иммуноглобулина для введения по крайней мере одного неэндогенного сайта N-связанного гликозилирования, и причем гликозилирование в одном или более введенных сайтов гликозилирования увеличивает время полужизни в сыворотке модифицированного слитого белка на по крайней мере 10% относительно времени полужизни в сыворотке слитого белка, в котором отсутствует введенный сайт гликозилирования, как определено в фармакокинетическом анализе с использованием обезьян.
35. Слитый белок по п.34, в котором гетерологичный полипептидный домен включает по крайней мере часть экстраклеточного домена рецептора, которая включает лиганд-связывающий домен.
36. Слитый белок по п.35, в котором сайт гликозилирования введен в экстраклеточный домен за пределами лиганд-связывающего кармана.
37. Слитый белок по п.35 или 36, в котором гликозилирование в одном или более введенных сайтов гликозилирования не уменьшает активность связывания рецептора с лигандом в более чем 3 раза.
38. Слитый белок по п.34, который модифицирован в результате добавления или делеции по крайней мере одного аминокислотного остатка для введения по крайней мере одного сайта гликозилирования.
39. Слитый белок по п.34, который модифицирован в результате замены по крайней мере одного аминокислотного остатка для введения по крайней мере одного сайта гликозилирования.
40. Слитый белок по п.34, в котором молекулярная масса гетерологичного полипептидного домена составляет по крайней мере 25 кДа.
41. Слитый белок по п.34, в котором гликозирование в одном или более введенных сайтов гликозирования увеличивает время полужизни в сыворотке слитого белка на по крайней мере 25% относительно времени полужизни в сыворотке слитого полипептида, в котором отсутствует введенный сайт гликозилирования.
42. Слитый белок по п.34, в котором немодифицированный гетерологичный полипептидный домен включает менее одного сайта N-связанного гликозилирования на каждые 90 аминокислот.
43. Слитый белок по п.34, в котором немодифицированный гетерологичный полипептидный домен включает менее одного сайта N-связанного гликозилирования на каждые 125 аминокислот.
44. Слитый белок по п.34, в котором модифицированный гетерологичный полипептидный домен включает по крайней мере один сайт N-связанного гликозилирования на каждые 90 аминокислот.
45. Слитый белок по п.34, в котором модифицированный гетерологичный полипептидный домен включает по крайней мере один сайт N-связанного гликозилирования на каждые 65 аминокислот.
46. Слитый белок по п.34, в котором каждую аминокислоту, модифицированную в результате N-связанного гликозилирования, отделяют по крайней мере 20 аминокислот от любой другой аминокислоты, модифицированной в результате N-связанного гликозилирования.
47. Слитый белок по п.34, дополнительно включающий полипептидный линкер между Fc-доменом и гетерологичным полипептидным доменом.
48. Слитый белок по п.47, в котором по крайней мере один из введенных сайтов гликозилирования располагается в линкере.
49. Слитый белок по п.34, в котором гетерологичная часть Fc-слитого белка включает по крайней мере два структурно различных домена в виде α-спирали и/или β-листа, соединенных неструктурированным пептидным участком, который является поверхностно-экспонированным.
50. Слитый белок по п.49, в котором введенный сайт гликозилирования расположен внутри неструктурированного пептидного участка.
51. Слитый белок по п.35, в котором рецептором является член семейства рецепторов факторов роста нервов/факторов некроза опухолей.
52. Слитый белок по п.51, в котором рецептором является рецептор TNFR2.
53. Слитый белок по п.52, в котором экстраклеточный домен рецептора TNFR2 включает аминокислотную замену в одном или более положений аминокислотных остатков, выбираемых из Q26, D25, A28, E133 или G231 SEQ ID NO: 2.
54. Слитый белок по п.53, в котором экстраклеточный домен рецептора TNFR2 включает замену Q на N в аминокислотном положении 26 SEQ ID NO: 2 и замену A на S в аминокислотном положении 28 SEQ ID NO: 2.
55. Слитый белок по п.53, в котором экстраклеточный домен рецептора TNFR2 включает замену D на N в аминокислотном положении 25 SEQ ID NO: 2 и замену E на N в аминокислотном положении 133 SEQ ID NO: 2.
56. Слитый белок по п.53, в котором экстраклеточный домен рецептора TNFR2 включает замену D на N в аминокислотном положении 25 SEQ ID NO: 2 и замену G на N в аминокислотном положении 231 SEQ ID NO: 2.
57. Слитый белок по любому из пп.53-56, в котором экстраклеточный домен рецептора TNFR2 на по крайней мере 90% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.
58. Слитый белок по п.57, в котором экстраклеточный домен рецептора TNFR2 на по крайней мере 95% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.
59. Слитый белок по п.58, в котором экстраклеточный домен рецептора TNFR2 на по крайней мере 99% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.
60. Слитый белок по п.53, включающий гетерологичный домен, выбираемый из
а) полипептида, включающего аминокислоты 13-257 SEQ ID NO: 5,
b) полипептида, включающего аминокислоты 13-257 SEQ ID NO: 6,
c) полипептида, включающего аминокислоты 13-257 SEQ ID NO: 7, и
d) полипептида, включающего аминокислоты 13-257 SEQ ID NO: 8.
61. Слитый белок по п.60, включающий линкер и Fc-часть, имеющие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.
62. Фармацевтический препарат, включающий слитый белок по любому из пп.34-61 и фармацевтически приемлемый носитель, причем препарат по существу не содержит пирогенные вещества, чтобы быть подходящим для введения млекопитающему.