Сурвивин - антиапоптотический протеин как фактор прогноза рака молочной железы

БИОЛОГИСЧЕСКИЕ НАУКИ

СУРВИВИН - АНТИАПОПТОТИЧЕСКИЙ ПРОТЕИН КАК ФАКТОР ПРОГНОЗА РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Шляхтунов Е.А.

Шляхтунов Евгений Александрович - кандидат медицинских наук, доцент, кафедра онкологии с курсами лучевой диагностики и лучевой терапии, ФПК и ПК,

Учреждение образования Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет, г. Витебск, Республика Беларусь

Аннотация: цель исследования - изучить экспрессию антиапоптотического протеина сурвивина, а также экспрессию гена BIRC5 его кодирующего в первичной карциноме молочной железы как потенциального прогностического и предиктивного маркера.

Материалы и методы. При помощи иммуногистохимии (ИГХ), а также полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (real-time PCR) изучено 67 образцов (биоптатов) первичной карциномы молочной железы на предмет наличия экспрессии белка сурвивина и гена его кодирующего BIRC5.

Результаты. Экспрессия сурвивина определялась в 47 образцах карциномы молочной железы, что составило 70,15%. Экспрессия сурвивина определялась наиболее часто в протоковой карциноме средней и высокой степени злокачественности (G2-G3), и сочеталась с лимфовенозной стромальной инвазией (LVSI+). Экспрессия белка сурвивина коррелировала с экспрессией HER2-neu. В 59,6% случаев сурвивин экспрессировался в опухолях с низким показателем Ki 67. Наиболее часто сурвивин экспрессиировался при люминальном А и люминальном Бмолекулярно-биологическом подтипе опухоли. Real-time PCR определила экспрессию гена BIRC5 во всех 67 образцах карциномы. Уровень нормализованной экспрессии гена BIRC5 достоверно умеренно коррелировал с экспрессией собственного продукта белка сурвивина (r=0,704, p<0,01) и слабо отрицательно коррелировал c экспрессией онкопротеина HER2-neu (r= - 0,285, p<0,05).

Медиана наблюдения составляла 40 месяцев. Общая выживаемость в первой группе пациентов без экспрессии сурвивина в первичной опухоли составляла 100%, Общая выживаемость во второй группе пациентов с наличием экспрессии составляла 77,16 (74,6-80,1) (р = 0,041). Безрецидивная выживаемость в первой группе составляла 100%, во второй - 71,9 (70,1-74,2) (p = 0,037). Соотношение рисков прогрессирования в группе экспрессии сурвивина была ОР = 10,6 (ДИ 95% 0,85-132,2) (p = 0,041). Заключение. Экспрессия белка сурвивина и его гена - BIRC5, может рассматриваться как неблагоприятный прогностический фактор и использоваться в качестве предиктивного и прогностического маркера.

Ключевые слова: рак молочной железы, сурвивин, BIRC5, выживаемость, прогноз.

Сурвивин - белок, кодируемый у людей геном BIRC5, получивший название бакуловирусный протеин [1, 2]. Сурвивин - член семейства белков ингибиторов апоптоза (IAP). Основная функция белка сурвивина заключается в том, чтобы запретить каспазную активацию апоптоза. Экспрессия генов BIRC5 высока в период внутриутробного развития и при развитие большинства опухолей, при этом содержание его ничтожно мало в дифференцированной ткани [3]. Экспрессия гена сурвивина четко отрегулирована клеточным циклом. Установлено, что экспрессия гена BIRC5 и синтез сурвивина связано с p53 белком [4]. Экспериментальные исследования показали, что сурвивин ингибирует апоптоз

путем остановки как внешнего так и внутреннего пути путем связывания и ингибирования эффекторных каспаз 3 и 7 [5].

Экспрессия гена сурвивина особенно выражена во время эмбрионального развития, а также в большинстве типов клеток опухоли, и редко присутствует в нормальных, доброкачественных взрослых

Белок сурвивин может быть расценен как онкоген, поскольку его сверхэкспрессия в большинстве раковых клетках способствует их сопротивлению апоптотическим стимулам и химиотерапевтическим методам лечения, таким образом способствуя их продолжающемуся выживанию и прогрессированию.

Цель - изучить экспрессию антиапоптотического протеина сурвивина, а также экспрессию гена BIRC5 его кодирующего в первичной карциноме молочной железы как потенциального прогностического и предиктивного маркера.

Материалы и методы

Исследованию подлежало 67 образцов (биоптатов) первичной карциномы молочной железы, полученные в ходе оперативного вмешательства или трепан-биопсии опухоли у пациенток с верифицированным резектабельным первичным раком молочной железы (РМЖ) pT1-4N3cM0 стадии.

Наряду со стандартным иммуногистохимическим (ИГХ) исследованием оценки экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона, а также рецептора эпидермального фактора роста была исследована экспрессия антиапоптотического белка сурвивина. Использовалось антитело Susvivin Antibody Bwtin conjugate (Pierce, Франция), а также система для автоматической визуализации BOND Polymer Detection Systems («Leica Microsystems», Германия). Окрашивание проводилось в автоматическом режиме на аппаратуре иммуностейнере фирмы «Leica Microsystems». Дальнейшее изучение микропрепаратов и их оценка осуществлялись на микроскопах фирмы «Leica».

Наряду с ИГХ исследованием экспрессии антиапоптотического протеина сурвивина в ткани карциномы при помощи обратнотранскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени была исследована нормализованная экспрессия гена BIRC5, кодирующего белок сурвивин. Полученный в ходе биопсии или оперативного вмешательства образец опухоли в объеме до 5 мм3 замораживали, затем измельчали, лизировали. Выделение мРНК из лизированных клеток проводилось в соответствии с инструкциями производителя наборов для выделения РНК (ООО СИВитал, Беларусь). Используя технологию обратной транскрипции синтезировали кДНК, которую использовали в последующем для анализа экспрессии гена BIRC5 в режиме реального времени ОТ-ПЦР. Расчет нормализованной экспрессии производили относительно уровня экспрессии референсного гена «домашнего хозяйства» с-ABL.

Статистическая обработка полученных данных проводилась в соответствии с современными требованиями, предъявляемыми к проведению медико-биологических исследований. Качественные показатели представлены абсолютными и относительными величинами. Количественные признаки, не подчиняющиеся нормальному закону распределения, представлены в виде медианы (Ме), интерквартильного диапазона (LQ/UQ), минимального и максимального значений (min, max). В качестве меры связи для количественных признаков, не подчиняющихся нормальному закону распределения, рассчитывался коэффициент корреляции Спирмена. Во всех случаях различия считались статистически значимыми при уровне значимости р<0,05. Все значения р были двухсторонними. Для оценки значимости экспрессии сурвивина как прогностического фактора смерти и прогрессирования заболевания был проведен корреляционный и многофакторный анализ с использованием регрессионной модели пропорциональный рисков Кокса и определением отношения рисков Статистическая обработка результатов произведена с использованием программы SPSS Statistics 10.0.

Результаты и обсуждение

Учитывая тот факт, что в настоящее время отсутствуют иммуногистохимические критерии оценки уровня экспрессии в отношении сурвивина, как, например, для рецептора эпидермального фактора роста Her2-neu, оценка экспрессии таргетного антигена проводилась по принципу да/нет, т.е. имеется экспрессия данного протеина в клетках или нет.

Экспрессия сурвивина определялась в 47 образцах карциномы молочной железы, что составило 70,15%.

Клинико-анатомическая характеристика опухолевого процесса, а также патоморфологическая характеристика образцов первичных карцином, в которых иммуногистохимически определялась экспрессия антиапоптотического протеина сурвивина, представлена в таблицах 1 и 2 соответственно.

Таблица 1. Клинико-анатомическая характеристика первичных карцином молочной железы,

экспрессирующих сурвивин

Клиническая характеристика опухоли

Клинический признак Варианты Значения

абс. %

Сторона Левая 25 53,2

Правая 22 46,8

Центральная 3 6,4

Верхне-внутренний квадрант 8 17,0

Локализация Нижне-внутренний квадрант 3 6,4

Верхне-наружный квадрант 26 55,3

Нижне-наружный квадрант 4 8,5

Мультицентрической рост 3 6,4

1 21 44,7

T 2 24 51,1

3 2 4,3

0 20 42,6

N 1 20 42,6

2 2 4,3

3 5 10,6

I 12 25,5

IIA 16 34,0

Стадия IIB 12 25,5

IIIA 2 4,3

IIIC 5 10,6

При анализе клинико-анатомических характеристик опухоли и экспрессии сурвивина в опухолевой ткани каких-либо статистически значимых зависимостей и корреляций выявлено не было.

Наибольший интерес представляет изучение экспрессии сурвивина в сравнении с известными прогностическими маркерами, определяемыми в опухолевой ткани, главным образом такими, как гистологический тип опухоли, молекулярно-биологический подтип опухоли, степень дифференцировки, лимфо-сосудистая инвазия, индекс пролиферативной активности и др. (таблица 2).

Таблица 2. Патоморфологическая характеристика первичных карцином молочной железы,

экспрессирующих сурвивин

Патоморфологическая характеристика опухоли

Признак Варианты Значения

абс. %

Морфологическое строение тубулярная карцинома 1 2,1

медулярная карцинома 1 2,1

муцинозная карцинома 2 4,3

неспецифическая карцинома 1 2,1

дольковая карцинома 8 17,0

протоковая карцинома 34 72,3

Степень дифференцировки 01 2 4,3

02 23 48,9

03 22 46,8

Лимфовенозная стромальная инвазия ЬУБ1+ 41 87,2

ЬУБ1- 6 12,8

Молекулярно-биологическии подтип люминальный А 24 51,1

люминальный Б НЕК2- 11 23,4

люминальный Б НЕК2+ 5 10,6

гипер HER2 экспрессирующий 3 6,4

трижды негативный (базальный) 4 8,5

Ю 67 >15% 19 40,4

<15% 28 59,6

Из представленных в таблице 2 данных видно, что экспрессия антиапоптотического белка сурвивина определялась наиболее часто в протоковой карциноме средней и высокой степени злокачественности, главным образом, сочеталась с лимфовенозной стромальной инвазией.

Следует отметить, что экспрессия белка сурвивина коррелировала с экспрессией рецептора эпидермального фактора роста HER2-neu. Наиболее часто сурвивин экспрессировался в опухолях неэкспрессирующих HER2-neu (г=0,113, p>0,05).

Интересной является полученная информация о взаимосвязи экспрессии сувивина и индекса пролиферативной активности Ю67. Так, например, в 59,6% случаев сурвивин экспрессировался в опухолях с низким показателем К 67 - меньше 15%.

Несмотря на то, что данные статистически не достоверны как в отношении экспрессии HER2-neu, так и К 67 (р>0,05), и корреляционная зависимость слабая, данный факт может свидетельствовать о том, что опухоли, экспрессирующие сурвивин, находятся в особом состоянии, в стадии не активной пролиферации, но в состоянии ингибирования апоптоза. Графическое изображение сочетания экспрессии сурвивина и молекулярно-биологического подтипа опухоли представлено на рисунке 1.

Рис. 1. Определяемая ИГХ экспрессия белка сурвивина в зависимости от молекулярно-биологического подтипа карциномы молочной железы

Качественная оценка экспрессии белка сурвивина имеет также определенное значение, с точки зрения понимания функции данного протеина и возможных потенциальных механизмов воздействия на данный сигнальный путь.

Так, при ИГХ установлено, что белок сурвивин экспрессировался преимущественно в цитоплазме опухолевых клеток первичной карциномы молочной железы (рисунок 2).

Рис. 2. Определяемая ИГХ экспрессия белка сурвивина в зависимости от молекулярно-биологического подтипа карциномы молочной железы

Следует обратить внимание, что не вся опухоль экспрессирует данный белок, а экспрессия отмечается в ряде случаев в отдельных участках, что может свидетельствовать о гетерогенности опухолевых клеток в пределах самой опухоли.

Гетерогенность опухолевых клеток в пределах самой опухоли является одним из важных моментов в патогенезе и развитии резистентности опухоли к проводимой терапии. Различный фенотип опухолевых клеток в первичной опухоли и, главным образом, наличие клеток на этапе ЭМП и стволовых клонов определяют прогноз течения опухолевого процесса.

Также при помощи ОТ-ПЦР в режиме реального времени исследована экспрессия гена сурвивина ВГЯС5 в 67 образцах первичной карциномы молочной железы. Во всех без исключения образцах опухолевой ткани определялась экспрессия гена ВГЯС5, однако уровни рассчитанной нормализованной экспрессии относительно уровня экспрессии референсного гена е-ЛВЬ варьировали в широком диапазоне (рисунок 3, таблица 3). Результаты корреляционного анализа приведены в таблице 4.

Рис. 3. Показатели нормализованной экспрессии гена BIRC5 в первичной карциноме молочной

железы

Таблица 3. Показатели нормализованной экспрессии гена BIRC5 в первичной карциноме

молочной железы

Ген Значения

Медиана Мт Мах ьо ио

ВШ.С5 1,49 0,015 30,40 0,662 13,5

Таблица 4. Корреляция нормализованной экспрессии гена Б1ЯС5 и другими молекулярно-биологическими и патологоанатомическими характеристиками первичной карциномы

молочной железы

Молекулярно-биологические и патологоанатомические критерии первичной опухоли Значение коэффициента корреляции Спирмена и статистическая значимость

R Р

Экспрессия Ki67 (ИГХ) Экспрессия HER2-neu (ИГХ) -0,038913 -0,285245 0,754 0,019

Экспрессия survivin (ИГХ) Экспрессия ER (ИГХ) 0,704108 -0,149550 0,000 0,227

Экспрессия PgR (ИГХ) -0,031379 0,800

BIRC5 и HER2-neu (ПЦР) -0,153308 0,215

T (tumor size) 0,129916 0,294

N (nodules number) 0,218674 0,075

G(greid) 0,004557 0,970

LVSI 0,018127 0,884

При анализе представленных данных установлено, что уровень нормализованной экспрессии гена BIRC5 достоверно умеренно коррелирует с экспрессией собственного продукта белка сурвивина (г=0,704, p<0,01) и слабо отрицательно коррелирует c экспрессией онкопротеина HER2-neu (г= - 0,285, p<0,05).

Важной составляющей данного исследования является определение значения экспрессии антиапоптотического протеина сурвивина как прогностического и предиктивного фактора при терапии первичного неметастатического рака молочной железы. Проведен анализ ОВ и БРВ в зависимости от наличия экспрессии определяемой ИГХ в первичной опухоли и ее отсутствии. Несмотря на малую выборку, были получены интересные данные. Так, например ни одна пациентка с отсутствием экспрессии сурвивина не умерла и не спрогрессировала за анализируемый промежуток времени. Напротив, наличие экспрессии антиапоптотического сурвивина негативно сказывалось на показателях ОВ и БРВ. Показатели различия ОВ и БРВ статистически достоверные ф=0,041 и p=0,037 соответственно) (таблицы 5-6, рисунок 4).

Таблица 5. Общая выживаемость пациенток 1 группы в зависимости от наличия или отсутствия экспрессии сурвивина в первичной опухоли

Категория Показатель выживаемости, % 95% ДИ

1-летняя 2-летняя 3-летняя

Наличие экспрессии 93,61

Отсутствие экспрессии 100 100 100

Таблица 6. Безрецидивная выживаемость пациенток 1 группы в зависимости от наличия или отсутствия экспрессии сурвивина в первичной опухоли

Категория Показатель выживаемости, %, 95% ДИ

1-летняя 2-летняя 3-летняя

Наличие экспрессии 90,49

Отсутствие экспрессии 100 100 100

1 1

РЬоя-Е.ап1?=0,041

: —

Ла лнчие экспрессии

15 20 25 30 В ре ил нас люд» «а нее

А

РЬой-Е.апЬ=0,037

Огс ут стане экспр ессин

-

1

ц

Наличие экспрессии

а 5 10 15 10 25 за 35 ча 45 Врет наблюдення. 1*с.

Б

Рис. 4. Сравнение ОВ (А) и БРВ (Б) пациенток с наличием и отсутствием экспрессии сурвивина

в первичной опухоли

В результате проведенного многофакторного анализа было установлено, что на БРВ на ряду с общеизвестными факторами риска (метастатическое поражение регионарных лимфатических узлов и их количество, наличие экспрессии ИБЯ2-пеи и др.) оказывает влияние такой фактор как наличие экспрессии антиапоптотического протеина сурвивина в опухолевой ткани. Неблагоприятными независимыми факторами риска развития прогрессирования является наличие экспрессии сурвивина в опухолевой ткани первичной карциномы молочной железы. А сочетание данного факторов с другими факторами риска приводит к повышению риска возврата болезни более чем в 10 раз. Результаты представлены в таблице 7.

Статистические данные

Показатель ß SE е (ß) Wald- Р ОР ДИ

стат. LL LU

Экспрессия сурвивина в первичной опухоли ИГХ 2,364 1,285 4,884 3,380 0,041 10,634 0,8 5 132,2

Tamm I. et al. показали, что уровень сурвивина был повышен во всех 60 различных человеческих линиях опухоли [5]. В литературе имеются сведения, что инактивация сурвивина в раковых клетках позволяет остановить формирование микроканальцев, что приводит к полиплоидии, а также к крупному апоптозу [6]. Еще одной из важных функций сурвивина является регулирование уровня p53. Известно, что особенностью большинства опухолей со сверхэкспрессией сурвивина имеет является полная потеря дикого типа p53 [7]. В то же время исследования Mirza A. et al. доказывают, что существует связь между уровнями сурвивина и p53. Дикий тип p53 подавлял экспрессию сурвивина на мРНК уровне [7] как в клетках рака легкого, так и в клетках РМЖ.

При исследовании образцов крови от пациентов, страдающих раком, ученые нашли антитела, которые являются специфическими для сурвивина и отсутствуют у здоровых людей. Измерение уровня сурвивин-определенных антител в крови пациента является мониторингом развития опухоли, а определение экспрессии сурвивина при всех наиболее распространенных злокачественных опухолях (рак легкого, толстой кишки, поджелудочной железы, простаты, молочной железы, сарком мягких тканей, Т-клеточного лейкоза) позволяет прогнозировать риск смерти [8]. Кроме того, исследования показали, что клетки рака молочной железы гиперэкспрессирующие ген эпидермального фактора роста HER2-neu имели более высокие уровни сурвивина, которые коррелировали с увеличенным сопротивлением Таксан-вызванному апоптозу. В то же время, комбинация Таксанов с ингибитором сурвивина привела к увеличенному апоптозу в HER2-гиперэкспрессирующих клетках РМЖ, по сравнению с монотерапией [9, 10]. Заключение

Полученные данные по исследованию экспрессии гена BIRC5 и его белкового продукта семейства ингибиторов апоптоза протеина сурвивина позволяют рассматривать данный ген и его продукт как один из опухолеспецифических маркеров опухолевой ткани карциномы молочной железы. Его положительная корреляционная связь с известным прогностическим фактором, таким как экспрессия онкопротеина рецептора эпидермального фактора роста HER2-neu (r= - 0,285, p<0,05), и активная транскрипция кодирующего гена (r=0,704, p<0,01) позволяют рассматривать белок сурвивин и ген, его кодирующий - BIRC5, как неблагоприятный прогностический фактор и использовать его в качестве предиктивного маркер ответа на химотерапию, в том числе и таргетную.

Список литературы

1. Stoecklein N.H., Klein C.A. Genetic disparity between primary tumours, disseminated tumour cells, and manifest metastasis // Int J Cancer 2010; 126 (3):589-98. https://doi: 10.1002/ijc.24916.

2. Ambrosini G., Adida C., Altieri D.C., Ambrosini G. A novel anti-apoptotic gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma // Nat. Med. 1997;3 (8):917-21. https://PMID: 9256286.

3. Sah N.K., Khan Z., Khan G.J., Bisen P.S. Structural, functional and therapeutic biology of surviving // Cancer Lett., 2006; 244(2):164-71. https://doi: 10.1016/j.canlet.2006.03.007.

4. Olie R.A., Simoes-Wust A.P., Baumann B., Leech S.H., Fabbro D., Stahel R.A., Zangemeister-Wittke U. A novel antisense oligonucleotide targeting survivin expression induces apoptosis and sensitizes lung cancer cells to chemotherapy // Cancer Res., 2000;60(11):2805-9. https:// PMID 10850418.

5. Tamm I., Wang Y., Sausville E., Scudiero D.A., Vigna N., Oltersdorf T., Reed J.C. IAP-family protein survivin inhibits caspase activity and apoptosis induced by Fas (CD95), Bax, caspases, and anticancer drugs // Cancer Res., 1998; 58 (23):5315-20. https://PMID: 9850056.

6. Castedo M., Perfettini J.L., Roumier T., Andreau K., Medema R., Kroemer G. Cell death by mitotic catastrophe: a molecular definition // Oncogene, 2004; 23 (16):2825-37. https://doi:10.1038/sj .onc. 1207528.

7. Bonora M., Wieckowsk M.R., Chinopoulos C., Kepp O., Kroemer G., Galluzzi L., Pinton P. Molecular mechanisms of cell death: central implication of ATP synthase in mitochondrial permeability transition // Oncogene, 2015; 34(12):1608. https://doi:10.1038/onc.2014.462.doi:10.1038/sj.onc.1205353.

8. Friedrichs B., Siegel S., Andersen M.H., Schmitz N., Zeis M. Survivin-derived peptide epitopes and their role for induction of antitumor immunity in hematological malignancies // Leuk Lymphoma, 2006; 47(6):978-85. https://doi:10.1080/10428190500464062.

9. Lu J., Tan M., Huang W.C., Li P., Guo H., Tseng L.M., Su X.H., Yang W.T., Treekitkarnmongkol W., Andreeff M., Symmans F., Yu D. Mitotic deregulation by survivin in ErbB2-overexpressing breast cancer cells contributes to Taxol resistance // Clin Cancer Res., 2009; 15 (4):1326-34. https://doi: 10.1158/1078-0432.CCR-08-0954.

10. Jolly M.K., Tripathi S.C., Jia D., Mooney S.M., Celiktas M., Hanash S.M., Mani S.A., Pienta K.J., Ben-Jacob E., Levine H. Stability of the hybrid epithelial/mesenchymal phenotype // Oncotarget., 2016; 7 (19):27067-84. https://doi: 10.18632/oncotarget.8166.