СПОСОБ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ ЛЕЙКОЦИТАРНЫХ БЕЛКОВ
METHOD FOR FRACTIONATION OF LEUKOCYTE PROTEINS

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к способам выделения лейкоцитарных пептидов из сырья животного происхождения, которые могут найти применение в качестве биологически активных веществ при создании фармацевтических композиций.
Известно, что антимикробные пептиды (АМП) являются неспецифическими факторами гуморального иммунитета, обладают эндотоксин-нейтрализующей и иммуномодулирующей активностью, а также обеспечивают защиту против широкого спектра микроорганизмов: грамотрицательных и грамположительных бактерий, грибов, вирусов и простейших. О существовании АМП известно уже несколько десятилетий, но только недавно интерес к этим молекулам перешел из плоскости фундаментальных исследований иммунной системы в клиническую область. На сегодняшний день у человека обнаружено три семейства таких пептидов: дефензины, кателицидины и гистатины. Впервые дефензины млекопитающих были описаны в 1956 году Robert С. Skarnes и Dennis W. Watson как фагоцитины полиморфноядерных лейкоцитов кролика. В серии работ H.I. Zeya и John K. Spitznagel показали, что данные протеины относятся к одному молекулярному семейству, которое они определили как семейство катионных антимикробных протеинов, и только в 1985 году Michael Е. Selste дал им современное название - дефензины. Дефензины - это катионные амфипатические пептиды длиной от 30 до 42 аминокислот с трехнитевой β-пластинчатой структурой. Они синтезируются только нейтрофилами, что позволяет считать их специфическими клеточными маркерами этих клеток [Азимова В.Т. Эндогенные антимикробные пептиды человека. Современные проблемы науки и образования. 2015].
3
Наиболее близким способом того же назначения к заявленному изобретению по совокупности признаков является способ выделения низкомолекулярных пептидов (патент RU 2510398 от 27.03.2014). Способ осуществляют следующим образом. Получают гидролизат ферментативным гидролизом предварительно гемолизированной и вирусинактивированной эритромассы крови доноров с 2% пепсина от исходного объема в течение 144 ч и с коррекцией среды (0,01-0,1)М раствором соляной кислоты до рН=(1,5-2,0), инактивируют фермент, осветляют гидролизат раствором перекиси водорода с конечной концентрацией 0,83% с последующим выдерживанием при 66°С в течение 15 мин и осаждают балластные вещества методом центрифугирования при 1,3*10 об/мин в течение 15 мин. Полученную жидкую фракцию подвергают стерилизующей фильтрации через мелкопористые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. Определение молекулярной массы пептидов в гидролизате проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Данный способ принят в качестве прототипа.
Признаки прототипа, совпадающие с существенными признаками заявляемого способа, - гомогенизация человеческого донорского сырья, центрифугирование с последующей стерилизующей фильтрацией полученной субстанции через мелкопористые фильтры.
Недостатком известного способа, принятого за прототип, является его сложность из-за необходимости использование гидролиза для расщепления белков на составляющие. В настоящее время отсутствуют легко выполняемые способы контроля ферментативного гидролиза белков. Для проведения ферментативного гидролиза необходимо создавать особые условия, которые позволят обеспечить функционирование фермента, тем самым увеличивается риск получения пептидов с ненадлежащими физико-химическими параметрами. Кроме того, полученные известным способом белковые фракции не обладают антибактериальными и противовирусными свойствами.
Задачей изобретения является получение белковых фракций, обладающих антибактериальными и противовирусными свойствами упрощенным способом.
Поставленная задача была решена за счет того, что в известном способе выделения лейкоцитарных пептидов, включающем гомогенизацию человеческого донорского сырья, центрифугирование с последующей стерилизующей фильтрацией полученной субстанции через мелкопористые фильтры, согласно изобретению в качестве человеческого донорского сырья используют лейкоциты в физиологическом растворе, которые подвергают ультразвуковой обработке при амплитуде от 60 до 80% в течение от 60 до 120 секунд.
Признаки изобретения, отличающиеся от прототипа, - использование в качестве человеческого донорского сырья лейкоцитов в физиологическом растворе, которые подвергают ультразвуковой обработке при амплитуде от 60 до 80% в течение от 60 до 120 секунд.
Использование в качестве исходного сырья донорских лейкоцитов, включающих в свой состав широкий спектр фракций биологически активных пептидов, обеспечивает дальнейшую возможность их выделения в технологии. Осуществление операций ультразвуковой обработки, центрифугирования, осветления и сушки позволяет выделить  спектр фракций пептидов в сухом виде и изготовить необходимую композицию на их основе,
Отличительные признаки в совокупности с известными позволяют получить белковые фракции, обладающие антибактериальными и противовирусными свойствами упрощенным способом.
Способ осуществляют следующим образом.
В качестве сырья используют донорские лейкоциты, которые должны пройти вирусологический контроль (HBS - антиген к вирусу гепатита В, антитела к вирусу гепатита С и ВИЧ отсутствуют).
Донорские лейкоциты суспендируют в физиологическом растворе, полученную суспензию подвергают ультразвуковой обработке при амплитуде от 60 до 80%, в течение от 60 до 120 секунд, при этом клетки лейкоцитов подвергаются разрушению, клеточные остатки отделяют центрифугированием при 1300 об/мин в течение 10 минут. Полученную жидкую фракцию подвергают стерилизующей фильтрации через мелкопористые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. с последующим осветлением. Полученный раствор подвергают лиофильному высушиванию. Определение биологической активности проводят методом микротитрования на 96-луночных планшетах (таблица).
Данные таблицы показывают, что использование предлагаемого способа выделения пептидов из лейкоцитарной массы позволяет получить пептиды с антибактериальными и противовирусными свойствами. Изобретение обеспечивает получение белкового раствора и выделение всего спектра белков и пептидов, содержащихся в лейкоцитарной массе, без потерь на фракционирование упрощенным способом.