МУТАЦИИ ФЕРМЕНТА CRISPR, УМЕНЬШАЮЩИЕ НЕЦЕЛЕВЫЕ ЭФФЕКТЫ

1. Сконструированный белок Cas9, содержащий по меньшей мере одну модификацию по сравнению с белком Cas9 дикого типа, где указанная модификация включает аминокислотную замену в положении 13, 63, 415, 610, 775, 779, 780, 810, 832, 848, 855, 861, 862, 866, 961, 968, 974, 976, 1000, 1003, 1014, 1047, 1060, 1107, 1108, 1109, 1114, 1129, 1240, 1289, 1296, 1297, 1300, 1311 или 1325 согласно нумерации аминокислотных положений в Cas9 из Streptococcus pyogenes (SpCas9).
2. Сконструированный белок Cas9 по п.1, в котором модификация включает замену Lys, His, Arg, Glu, Asp, Ser, Gly или Thr.
3. Сконструированный белок Cas9 по п.1, в котором модификация включает замену на Gly, Ala, Ile, Glu или Asp.
4. Сконструированный белок Cas9 по п.1, в котором модификация включает аминокислотную замену в связывающей бороздке между доменами RuvC и HNH.
5. Сконструированный белок Cas9 по п.1, в котором модификация включает мутацию в домене RuvCI, RuvCIII, RuvCIII или HNH.
6. Сконструированный белок Cas9 по п.1, в котором модификация в положении 63, 415, 775, 779, 780, 810, 832, 848, 855, 861, 862, 866, 961, 968, 974, 976, 1000, 1003, 1014, 1047, 1060, 1107, 1108, 1109, 1114, 1129, 1240, 1289, 1296, 1297, 1300, 1311 или 1325 включает замещение аланина.
7. Сконструированный белок Cas9 по п.1, в котором модификация в положении 13 включает изолейциновую замену, модификация в положении 610 включает глициновую замену, модификация в положении 799 включает лейциновую замену и/или где модификация в положении 1129 включает глутаминовокислотную замену.
8. Сконструированный белок Cas9 по п.1, отличающийся тем, что модификация включает K775A, E779L, Q807A, R780A, K810A, R832A, K848A, K855A, K862A, K961A, K968A, K974A, R976A, H983A, K1000A, K1014A, K1047A, R1060A, K1003A, S1109A, H1240A, K1289A, K1296A, H1297A, K1300A, H1311A или K1325A.
9. Сконструированный белок Cas9 по п.1, в котором модификация включает R783A и A1322T, или R780A и K810A, или R780A и K855A, или R780A и R976A, или K848A и R976A, или K855A и R976A, или R780A и K848A, или K810A и K848A, или K848A и K855A, или K810A и K855A, или H982A и R1060A, или H982A и R1003A, или K1003A и R1060A, или R780A и H982A, или K810A и H982A, или K848A и H982A, или K855A и H982A, или R780A и K1003A, или K810A и R1003A, или K848A и K1003A, или K848A и K1007A, или R780A и R1060A, или K810A и R1060A, или K848A и R1060A, или R780A и R1114A, или K848A и R1114A, или R63A и K855A, или R63A и H982A, или H415A и R780A, или H415A и K848A, или K848A и E1108A, или K810A и K1003A, или R780A и R1060A, или K810A и R1060A, или K848A и R1060A.
10. Сконструированный белок Cas9 по п.1, в котором модификация включает H982A, K1003A, и K1129E, или R780A, K1003A, и R1060A, или K810A, K1003A, и R1060A, или K848A, K1003A, и R1060A, или K855A, K1003A, и R1060A, или H982A, K1003A, и R1060A, или R63A, K848A, и R1060A, или T13I, R63A, и K810A, или G12D, R63A, и R1060A.
11. Сконструированный белок Cas9 по п.1, в котором модификация включает R63A, E610G, K855A и R1060A; или R63A, K855A, R1060A и E610G.
12. Сконструированный белок Cas9 по п.1, где сконструированный белок Cas9 является мутантом белка Cas9 из рода, включающего Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium или Corynebacter.
13. Сконструированный белок Cas9 по п.1, где сконструированный белок Cas9 содержит один или несколько доменов сигнала ядерной локализации (NLS).
14. Сконструированный белок Cas9 по п.1, где сконструированный белок Cas9 содержит по меньшей мере два или более NLS.
15. Сконструированный белок Cas9 по п.1, где сконструированный белок Cas9 содержит один или несколько гетерологичных функциональных доменов.
16. Сконструированный белок Cas9 по п.15, в котором один или несколько гетерологичных функциональных доменов содержат один или несколько доменов активации транскрипции.
17. Сконструированный белок Cas9 по п.16, в котором домен активации транскрипции содержит VP64.
18. Сконструированный белок Cas9 по п.15, в котором один или несколько гетерологичных функциональных доменов содержат один или несколько доменов репрессии транскрипции.
19. Сконструированный белок Cas9 по п.18, в котором домен репрессии транскрипции включает домен KRAB или домен SD.
20. Сконструированный белок Cas9 по п.15, в котором один или несколько гетерологичных функциональных доменов содержат один или несколько нуклеазных доменов.
21. Сконструированный белок Cas9 по п.20, в котором нуклеазный домен включает Fok1.
22. Сконструированный белок Cas9 по п.15, в котором один или несколько гетерологичных функциональных доменов обладают одной или несколькими из следующих активностей: активность метилазы, активность деметилазы, активность активации транскрипции, активность репрессии транскрипции, активность фактора высвобождения транскрипции, активность модификации гистонов, нуклеазная активность, активность расщепления одноцепочечной РНК, активность расщепления двухцепочечной РНК, активность расщепления одноцепочечной ДНК, активность расщепления двухцепочечной ДНК и активность связывания нуклеиновых кислот.
23. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую сконструированный белок Cas9 по п.1, где нуклеотидная последовательность является оптимизированной по кодонам для экспрессии в эукариоте.
24. Композиция, содержащая сконструированный белок Cas9 по п.1 и один или несколько направляющих полинуклеотидов, содержащих направляющую последовательность, парную tracr-последовательность и tracr-последовательность.
25. Система CRISPR-Cas9, содержащая сконструированный белок Cas9 по п.1 в комплексе с направляющим полинуклеотидом, содержащим направляющую последовательность, парную tracr-последовательность и tracr-последовательность.
26. Векторная система, содержащая один или несколько векторов, причем один или несколько векторов содержат:
а) первый регуляторный элемент, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей сконструированный белок Cas9 по п.1; а также
b) второй регуляторный элемент, функционально связанный с одной или несколькими нуклеотидными последовательностями, кодирующими одну или несколько молекул нуклеиновых кислот, содержащих направляющий полинуклеотид, содержащий направляющую последовательность, tracr-последовательность и парную tracr-последовательность, где компоненты (a) и (b) расположены на одном или разных векторах.
27. Выделенная эукариотическая клетка, содержащая векторную систему по п. 26.
28. Способ модификации представляющего интерес целевого локуса, включающий доставку в указанный локус сконструированного белка Cas9 по п.1 и одного или нескольких направляющих полинуклеотидов, при этом сконструированный белок Cas9 образует комплекс с одним или несколькими направляющими полинуклеотидами и после связывания комплекса с представляющим интерес целевым локусом белок Cas9 индуцирует модификацию интересующего целевого локуса.
29. Выделенная клетка-хозяин или линия клеток, содержащая сконструированный белок Cas9 по п.1.