СПОСОБ КОСМЕТИЧЕСКОЙ ОБРАБОТКИ ПОВЕРХНОСТНОЙ ОБЛАСТИ КОЖИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
METHOD OF COSMETIC PROCESSING OF SKIN SURFACE AREA IN MAMMALS

Область техники
Настоящее изобретение имеет отношение к косметическому использованию электромагнитного излучения. Косметическая обработка предусматривает уменьшение или смягчение, удаление или убавление морщин или тонких линий, в особенности (но не исключительно) морщин лица или шеи, и других признаков старения. Настоящее изобретение также предусматривает использование электромагнитного излучения для общего омоложения кожи, замедления признаков старения и улучшения упругости кожи, оттенка и внешнего вида кожи. В соответствии с настоящим изобретением предлагается также способ обработки кожи, позволяющий обеспечить уменьшение или смягчение, замедление или реверсирование видимых признаков старения и улучшение красоты кожи, и устройство, позволяющее осуществлять такую косметическую обработку.
Предпосылки к созданию изобретения
В молодой коже коллаген, который находится непосредственно под поверхностью кожи, образует организованную решетку с хорошей упругостью и гибкостью. Когда женщины проходят через менопаузу, а мужчины стареют, те и другие сталкиваются с увеличением морщинистости кожи и снижением толщины кожи. В ходе старения коллаген изменяет свою структуру, что отрицательно влияет на косметический внешний вид кожи. Изменения в коллагене могут быть также ускорены продолжительным воздействием УФ-лучей солнца. Громадные средства тратятся ежегодно англичане на покупку косметической продукции. Так, например, можно полагать, что средняя английская женщина тратит около £800 в год на покупку косметики и средств ухода за кожей.
Уже известно использование химического пилинга (отшелушивания) или косметических препаратов, обычно в виде кремов, для предотвращения или смягчения морщин и в качестве средств против старения кожи. Такие препараты могут содержать синтетические вещества или продукты растительного и/или животного происхождения. Композиции наносят локально и обычно на регулярной основе, чтобы максимально повысить их эффективность. Однако имеются ограниченные свидетельства того, что даже постоянное использование таких композиций приводит к смягчению видимых признаков старения.
В качестве альтернативы использованию косметических препаратов и хирургических подтяжек уже известно использование источника электромагнитного излучения низкого уровня, позволяющего достичь фотохимических реакций в коже, что обычно называют биостимуляцией. Биостимуляция основана на концепции усиления репликации и синтеза, что приводит к повышению производства коллагена, улучшению стимуляции фибробласта или к повышению синтеза ДНК. Световая энергия поглощается в цитохромах (гистогематине) и порфирине внутри клеточной митохондрии, и клеточные мембраны производят небольшое количество синглетного кислорода. Обычно пациентам требуется от 4 до 6 сеансов лечения в случае острых состояний и от 6 до 8 сеансов в случае хронических состояний. Этот тип лечения является длительным и дорогостоящим.
2
Начиная с девяностых годов начали использовать лазеры для очистки поверхности кожи и удаления морщин. Удаление морщин представляет собой агрессивную технологию, при которой слой за слоем удаляют ткань, проникают в дерму и эффективно индуцируют ожог второй степени. Теплота, вводимая в дерму, сокращает коллаген и стягивает кожу. Лазер индуцирует денатурацию коллагена в дерме и образование поперечных связей, что приводит к возникновению эффекта стягивания кожи, в результате чего уменьшаются или удаляются морщины. Этот способ именуется термолизом и тепловой нагрев тканей является необходимым условием терапии, причем можно полагать, что термический порог для термолиза составляет около 70°С. Однако при традиционной обработке лазером возникает проблема, связанная с тем, что пациент может получить ожоги и поэтому иметь в течение нескольких недель после лечения мокнущую кожу, струпья и покраснение кожи. Кроме того, имеются сообщения о высокой степени гиперпигментации после удаления морщин при помощи CO лазера.
В связи с изложенным, имеется необходимость в альтернативном, эффективном и безопасном способе, позволяющем обеспечить уменьшение или смягчение, удаление или убавление морщин или тонких линий, омоложение кожи, замедление признаков старения и улучшение упругости кожи, оттенка и внешнего вида кожи и, в целом, улучшение красоты кожи.
Сущность изобретения
В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения предлагается способ косметической обработки поверхностной области кожи млекопитающих, который предусматривает облучение кожи при помощи источника расходящегося электромагнитного излучения с длиной волны от 900 нм до 1500 нм.
Использованный здесь термин "косметическая обработка " включает в себя уменьшение или смягчение, удаление или убавление морщин или тонких линий, омоложение кожи, замедление или реверсирование видимых признаков старения, улучшение упругости кожи, оттенка, текстуры и внешнего вида кожи, и, в целом, улучшение красоты кожи.
Использованный здесь термин "кожа" включает в себя самый верхний эпидермис, базальный слой и дерму лица, груди, рук, ягодиц, бедер, живота или шеи.
Во всем тексте описания изобретения и формулы изобретения слова "включает в себя" и "содержит" и производные от них, такие как, например "содержащий", означают "включает в себя, но без ограничения", и не предназначены для того, чтобы исключать (и не исключают) использование долей, добавок, компонентов, целых чисел или операций.
Во всем тексте описания изобретения и формулы изобретения единственное число заключает в себе множественное число, если только иное специально не указано в контексте. В частности, использованное в описании изобретения единственное число следует понимать как и возможное множественное число, если только иное не требуется в контексте.
Следует понимать, что любые признаки, целые числа, характеристики, соединения, химические компоненты или группы, описанные применительно к конкретному аспекту, варианту или примеру изобретения, применимы к любому другому описанному здесь аспекту, варианту или примеру изобретения, если только нет несовместимости с ним.
Преимущественно угол расхождения света составляет от 10° до 50°. Под расхождением света понимают, что электромагнитное излучение, испускаемое электромагнитным источником, имеет половинный угол расхождения, составляющий по меньшей мере 5°. Преимущественно имеющее расхождение электромагнитное излучение имеет половинный угол расхождения в диапазоне от 15° до 25°.
Таким образом, следует иметь в виду, что способ в соответствии с настоящим изобретением не предусматривает использование лазеров в качестве источника электромагнитного излучения.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что электромагнитное излучение с низкой интенсивностью и с узкой шириной полосы пропускания (преимущественно, ориентировочно от 10 нм до 120 нм, предпочтительнее около 50 нм) является эффективным при косметической обработке кожи. Можно предполагать, что электромагнитное излучение воздействует на кожу за счет прохождения энергии через клеточные компоненты/ органеллы и ферменты, вызывая (но без ограничения) индуцированный синтез оксида азота (iNOS). Молекула воды, которая имеет определенный диапазон пропускания длин волн электромагнитного излучения, образует множество пиков пропускания. Эти пики пропускания связаны с предпочтительным диапазоном длин волн терапевтического электромагнитного излучения в соответствии с настоящим изобретением и, следовательно, усиливают роль молекулы воды в общем механизме действия.
Преимущественно длина волны электромагнитного излучения концентрирована вокруг одной или нескольких специфических длин волн, выбранных из группы, в которую входят 940 нм, 950 нм, 1040 нм, 1060 нм, 1072 нм и 1267 нм.
Проведенное авторами исследование показало, что длины волн, концентрированные вокруг указанных выше длин волн, а особенно вокруг единственной ограниченной ширины полосы пропускания света, концентрированной на длине волны 1072 нм или 1267 нм, являются особенно эффективными для уменьшения длины и площади морщины. Следует иметь в виду, что эти две длины волны соответствуют длинам волн пикового излучения профиля пропускания света молекулой воды, так что можно полагать, что механизм действия связан с водой и, возможно, с клеточными мембранами.
Проведенное авторами исследование также показало, что длины волн 1072 нм и 880 нм оказывают противоположное действие на жизнеспособность лимфоцитов ех vivo (в живом организме), причем первая длина волны является защитной, а последняя длина волны является питотоксичной. Более того, имеются свидетельства того, что 1072 нм защищает от УФ-опосредованной лимфотоксичности.
Преимущественно электромагнитное излучение является непрерывным или пульсирующим (импульсным).
2
2
Преимущественно когда электромагнитное излучение является непрерывным, а его интенсивность составляет по меньшей мере от 500 мкВт/см и до 500 мВт/см.
2
2
2
2
Преимущественно, когда электромагнитное излучение является пульсирующим, его интенсивность (мощность) составляет по меньшей мере 500 мкВт/см в пике, а средняя интенсивность составляет до 500 мВт/см. Средняя интенсивность равна пиковой интенсивности, умноженной на пропорцию полного времени, в течение которого действует излучение. Например, если пиковая интенсивность равна 500 мкВт/см и длительность импульса составляет 10 мкс при частоте следования импульсов 600 Гц, то тогда средняя интенсивность равна 30 мкВт/см.
2
Известные ранее методики, которые основаны на термическом нагреве, указывают в качестве нижнего предела мощность 0.5 Вт/см, в то время как в соответствии с настоящим изобретением предлагается избегать любых тепловых эффектов и работать ниже этого уровня.
2
Преимущественно, когда электромагнитное излучение является пульсирующим, его средняя интенсивность лежит в диапазоне 50-100 мкВт/см.
2
2
2
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что подходящий диапазон мощностей, приложенных к коже, составляет от 500 мкВт/см в пике до 500 мВт/см в непрерывном режиме. Обычно используют 20 мВт/см, приложенных к коже, однако следует иметь в виду, что это значение зависит от того, насколько жирным или мускулистым является пациент и насколько глубокой является морщина.
Преимущественно, когда электромагнитное излучение является пульсирующим, его прикладывают в течение периодов (длительности импульсов), составляющих по меньшей мере 10-15 мкс, а преимущественно прикладывают с частотой следования импульсов в диапазоне 300-900 Гц, а предпочтительнее с частотой следования импульсов около 600 Гц.
Проведенное авторами исследование показало, что электромагнитное излучение может быть как когерентным, так и не когерентным, так как клинические результаты не зависят от этого параметра.
Преимущественно электромагнитное излучение прикладывают к пораженной области по меньшей мере на 30 секунд и до нескольких минут. Обычное время экспонирования составляет около 3 минут, однако для более глубоких морщин это время увеличивают в соответствии с индивидуальной толщиной слоя жира, при этом время экспонирования может достигать 10 минут.
Следует иметь в виду, что источник питания для устройства электромагнитного излучения должен иметь мощность, превышающую требуемую интенсивность, создающую клинический эффект, так как нами было обнаружено, что ориентировочно 99% приложенного терапевтического количества света теряется при прохождении через поверхность кожи в ходе лечения. Таким образом, интенсивность приложенного излучения необходимо регулировать при проведении лечения.
Из приведенного выше становится понятно, что электромагнитное излучение может быть направлено на заданное место непрерывно или в виде импульсов. Основное преимущество импульсного режима состоит в эффективном использовании мощности, при этом можно прикладывать намного большую мощность в пике, что улучшает косметический эффект.
Преимущественно терапевтический источник электромагнитного излучения содержит средство уменьшения количества окружающего излучения, которое могло бы воздействовать на участок лечения.
Преимущественно источник электромагнитного излучения представляет собой светоизлучающий диод. Излучением от такого источника можно управлять электрически или же излучение можно подводить к аппликатору при помощи волоконно-оптической системы.
Преимущественно источник излучения представляет собой р-n переход, позволяющий испускать излучение с длиной волны, концентрированной на или около одной или нескольких указанных выше длинах волн. Единственный светодиодный узел может иметь множество ориентированных р-n переходов. Диоды инфракрасного излучения могут быть использованы так, чтобы не только испускать излучение на специфической частоте, но и создавать расходящийся пучок с высокой интенсивностью. Расходящийся пучок света также может быть получен от излучающих свет полимеров.
В соответствии с настоящим изобретением предлагается способ косметической обработки кожи с использованием расходящегося электромагнитного излучения, имеющего длину волны в диапазоне от видимого излучения до инфракрасного излучения, и концентрированного вокруг длин волн 940 нм, 950 нм, 1040 нм, 1060 нм, 1072 нм или 1267 нм. Электромагнитное излучение прикладывают с низкой интенсивностью, так что не создается никакое термическое повреждение или нагревание кожи, или любой другой ткани или органа, расположенного вблизи от зоны обработки. Таким образом, способ в соответствии с настоящим изобретением отличается от известных ранее способов, так как он не является тепловым и исключает термолиз. Кроме того, настоящее изобретение не имеет отношения к биостимуляции, так как концепция усиленной репликации и синтеза исключается. В самом деле, авторы настоящего изобретения обнаружили, что длины волн, использованные в соответствии с настоящим изобретением, специфически тормозят синтез ДНК, тормозят производство коллагена и тормозят репликацию фибробласта. Полученные авторами настоящего изобретения результаты показывают, что желательный эффект достигается за счет того, что качество соединительной ткани между клетками удивительным образом улучшается, скорее за счет торможения производства коллагена, чем за счет повышения плотности коллагена, как в известных ранее способах.
В соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения предлагается способ улучшения упругих свойств поверхностной области кожи млекопитающих, который предусматривает облучение кожи при помощи источника расходящегося электромагнитного излучения с длиной волны от 900 нм до 1500 нм.
При использовании способа в соответствии с настоящим изобретением авторы обнаружили, что волокна эластина становятся менее фрагментированными и более однородными, в результате чего улучшаются упругие свойства кожи. Например, при проведении обработки кожи груди авторы обнаружили, что не только улучшается упругость кожи, но улучшается также и оттенок кожи. Авторы настоящего изобретения обнаружили также, что способ в соответствии с настоящим изобретением улучшает способность к воспроизведению клеток.
В соответствии с третьим аспектом настоящего изобретения предлагается способ уменьшения площади поверхности и объема ткани поверхностной области кожи млекопитающих, который предусматривает облучение кожи при помощи источника расходящегося электромагнитного излучения с длиной волны от 900 нм до 1500 нм.
Результаты, полученные при помощи способа в соответствии с настоящим изобретением, показывают, что за счет уменьшения объема кожи над глазами и под глазами можно уменьшить обвислость по сторонам лица. Таким образом, было показано, что уменьшение площади поверхности кожи и объема ткани, вместе с улучшением упругих свойств, обеспечивает желательные косметические эффекты.
Следует иметь в виду, что в соответствии с четвертым аспектом способ в соответствии с настоящим изобретением может быть также использован для предотвращения, снижения или реверсирования повреждения кожи, вызванного УФ-излучением или фотохимическим старением.
В соответствии с пятым аспектом настоящего изобретения предлагается использование расходящегося электромагнитного излучения с длиной волны от 900 нм до 1500 нм для косметической обработки области поверхностной кожи.
Было показано, что световая терапия, как с использованием лазера, так и СИД, имеет клинический эффект в различных терапевтических областях. Была проведена оценка воздействий света, концентрированного вокруг длин волн 1072 нм и 880 нм, с использованием диапазона протоколов единственного и множественного облучений, на свежеприготовленные лимфоциты человека, стимулированные при помощи фитогемагглютинина (РНА). Число жизнеспособных клеток существенно повышается после облучения длиной волны 1072 нм и существенно снижается после облучения длиной волны 880 нм, по сравнению с контрольными пробами без обработки, после ежедневного единичного облучения в течение пяти дней. Кроме того, число клеток существенно повышается после предварительной обработки длиной волны 1072 нм и воздействия УФА, по сравнению с числом клеток после воздействия УФА, без указанной предварительной обработки. Клетки, облученные дважды, на третий день после сбора клеток, при различных диапазонах волн, с подтверждением на пятый день, показывают повышение процента жизнеспособных клеток после воздействия длины волны 1072 нм, и облучения с чередованием длин волн 1072 нм и 1268 нм, и снижение процента жизнеспособных клеток после воздействия только облучения 880 нм. Эти наблюдения привели авторов настоящего изобретения к предположению о том, что свет, концентрированный вокруг длины волны 1072 нм, может быть полезен в ex vivo способе улучшения способности к воспроизведению иммунных клеток.
В соответствии с шестым аспектом настоящего изобретения предлагается ех vivo способ улучшения способности к воспроизведению иммунных клеток, который предусматривает осуществление воздействия на периферические кровяные мононуклеарные клетки при помощи расходящегося электромагнитного излучения с узкой шириной полосы пропускания, концентрированного вокруг длины волны 1072 нм.
Преимущественно периферические кровяные мононуклеарные клетки представляют собой лимфоциты.
Преимущественно периферические кровяные мононуклеарные клетки стимулируют фитогемагглютинином (РНА).
Следует иметь в виду, что клетки могут быть затем повторно введены индивиду, от которого они были получены, так чтобы укрепить его иммунную систему.
В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предлагается портативное излучающее свет (светоизлучающее) устройство для косметической обработки кожи, причем устройство содержит питающее средство для подачи мощности на излучающее свет средство, которое создает расходящееся электромагнитное излучение с длиной волны от 900 им до 1500 нм, гибкую или фасонную панель, через которую проходит свет, и корпус, к которому прикреплена гибкая или фасонная панель, так что устройство может охватывать часть тела, требующую косметической обработки.
Преимущественно питающее средство представляет собой батарею или электрическую сеть.
Преимущественно излучающее свет устройство представляет собой светодиод (СИД) или, предпочтительнее, множество светодиодов. Следует иметь в виду, что устройство в соответствии с настоящим изобретением не является лазерным устройством.
Преимущественно устройство может также содержать по меньшей мере один или несколько р-n переходов, создающих излучение с длиной волны, концентрированной на или вокруг одной или нескольких специфических длин волн, выбранных из группы, в которую входят 940 нм, 950 нм, 1040 нм, 1060 нм, 1072 нм и 1267 нм.
Краткое описание чертежей
Далее изобретение будет описано со ссылкой на чертежи.
На фиг.1 показан вид сверху (1А), сбоку (1В) и поперечное сечение (1C и 1D) одного из устройств для практического осуществления способа в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг.2 показан вид сбоку альтернативного устройства для практического осуществления способа в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг.3 показан вид спереди, на фиг.4 показан вид сбоку и на фиг.5 показан вид сзади еще одного альтернативного устройства для практического осуществления способа в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг.6, в колонках 1 и 2, показаны % жизнеспособности клеток РНА бластов после единичной 3-минутной обработки IR1072 на третий день и пятый день, ранее проверки апоптоза на пятый день. Было произведено сравнение данных с соответствующими контрольными пробами, причем анализ был проведен с использованием анализа вариантов ANOVA, в котором *р<0.05.
В колонках 3, 4 и 5 показаны % жизнеспособности клеток РНА бластов после множества 5×3 мин обработок IR1072 & IR880 на третий день и пятый день, ранее проверки жизнеспособности клеток на пятый день. Было произведено сравнение данных с соответствующими контрольными пробами на пятый день, причем анализ был проведен с использованием анализа вариантов ANOVA, в котором **р<0.01.
На фиг.7 показан % жизнеспособности клеток РНА бластов после ежедневной единичной 3-минутной обработки (облучения) при помощи IR1072 или IR880. Жизнеспособность клеток была определена с использованием набора Annexin V для определения апоптоза. Был проведен анализ данных для IR1072 и их сравнение с соответствующими данными для IR880, с использованием анализа вариантов ANOVA, причем существенные различия были обнаружены на 1, 3, 4 и 5 дни, *р<0,01, при этом тренд является значимым на второй день.
На фиг.8 показаны РНА бласты, которые были предварительно обработаны при помощи облучения 4×3 мин на третий день, и 1×3 мин на четвертый день, при помощи IR1072, после чего клетки были инкубированы на 4 часа, ранее УФА воздействия в течение 40 мин. Затем был проведен анализ проб на жизнеспособность клеток. Было проведено сравнение полученных данных с пробами только УФА воздействия, без предварительной обработки, с использованием анализа вариантов ANOVA, где **р<0.01.
На фиг.9 показан эффект воздействия различных диапазонов волн на РНА бласты, с обработкой на третий день 2х3 минуты и анализом. Было проведено сравнение полученных данных с контрольными пробами, с использованием множественного анализа вариантов ANOVA, где **р<0.01.
На фиг.10 показан Western Blot (вестерн-блоттинг), где можно видеть воздействие ИК обработки на уровни экспрессии протеина iNOS РНА бластов, при ежедневном воздействии 1×3 мин ИК-излучения IR1072 или IR880, причем на третий и пятый день был проведен анализ экспрессии протеина iNOS с использованием количественного иммунноблотирования селективным анти-iNOS антителом (Autogen Bioclear, Великобритания) (иммунноблоты были вновь отправлены в пробу и стандартизованы при помощи антитела бета-актин (Sigma, Великобритания). Линия 1, контрольные клетки (пятый день); линия 2, обработанные IR1072 клетки (пятый день); линия 3, обработанные IR880 клетки (пятый день). Было проведено сравнение полученных данных с контрольными пробами, с использованием множественного анализа вариантов ANOVA, с уровнем значимости, установленным на р<0.01.
На фиг.11А показаны результаты воздействия после 2 месяцев ежедневной обработки 1072 нм, причем на фиг.11В показан тот же самый пациент до начала обработки, а на фиг.11С показано наложение картин до обработки и после одного месяца обработки одного и того же пациента, с использованием 1072 нм.
На фиг.12 схематично показан протокол анализа людей.
На фиг.13А показано состояние до обработки, а на фиг.13В показан результат множества обработок и уменьшение мешков под глазами.
На фиг.14А, В и С показаны различные индивиды, прошедшие обработку в соответствии с протоколом фиг.12.
Подробное описание изобретения
Существует несколько продуктов, которые считают эффективными при обработке линий и морщин с использованием не теплового света в диапазоне синей, желтой или красной длин волн. Авторы настоящего изобретения сделали попытку идентифицировать любые физиологические отклики, которые зависят от длины волны. Использованные длины волн лежат в диапазоне от 660 нм до 1268 нм, причем были исследованы различные ограниченные полосы пропускания как изолированно, так и в комбинации. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что единичная ограниченная полоса пропускания света, концентрированная на 1072 нм, оказывает положительное влияние на лимфоциты человека. Было показано, что эта длина волны света защищает лимфоциты человека от вредного воздействия УФ-излучения, вызывающего фотохимическое старение.
Предпочтительным устройством для практической реализации способа в соответствии с настоящим изобретением является портативное излучающее свет устройство 1, которое может получать питание от батареи или от сети. Устройство соответствует контурам 2 подлежащих обработке областей лица, глаз, рук, бедер или груди.
На фиг.1 показан вид сверху (1А), сбоку (1В) и поперечное сечение (1C и 1D) портативного ручного излучающего свет устройства, которое имеет обычную форму глаза. Инфракрасное излучение проходит через прозрачную панель 3 на подлежащую обработке кожу. Источник питания соединен с устройством в области 4 и устройство удерживается на месте при помощи корпуса 5. Панель 3 является слегка вогнутой, чтобы соответствовать контурам подлежащей обработке области и избежать излишнего давления на глаз, когда панель входит в контакт с орбитой глаза. Пространство 6 содержит управляющую электронику, которая управляет интенсивностью и длительностью цикла обработки. Здесь содержатся также СИД 7. На фиг.2 показан альтернативный вариант устройства, предназначенного для установки на более широкий участок кожи.
Со ссылкой на фиг.3-5 далее будет описан второй вариант источника излучения в соответствии с настоящим изобретением, имеющего множество панелей для излучения узких полос длин волн. В этом случае, множество панелей 7 установлены рядом друг с другом на петлях 8, которые, в свою очередь, соединены с кронштейном 9 при помощи рычагов 10 и 11. Устройство выполнено так, что панели могут двигаться относительно друг друга, а кронштейн можно регулировать для изменения направления облучения. Кронштейн может стоять на полу или может быть прикреплен к креслу или кровати.
Передняя стенка каждой панели 7 является прозрачной, а за ней установлена матрица излучающих устройств 12.
Как и в описанных здесь ранее вариантах устройства, этот вариант содержит управляющую электронику, ограничивающую время приложения излучения, контролирующую окружающее излучение и подающую сигнал тревоги, когда превышен пороговый уровень окружающего излучения.
Устройства в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы для косметического снижения целлюлита, поражающего ягодицы и ноги, и для улучшения оттенка кожи груди, а также для обработки всего лица.
Методики и материалы
Приготовление клеток
6
2
Гепаринированная цельная кровь была получена от здоровых добровольцев и периферические кровяные одноядерные клетки (РВМС) были выделены из нее с использованием прибора Lymphoprep (фирма Axis-Shield Рос AS, Осло, Норвегия) и центрифугированы при 400 Х g в течение 25 мин. От клеток РВМС был отделен межфазный (граничный) слой и они были промыты дважды в RPMI без L-глутамина (Gibco™) и вновь переведены в суспензию в RPMIcm (промывка RMPI+10% по объему сыворотки Fetal Calf Serum+1% пенициллина/ стрептомицина+1% L-глутамина). Затем плотность клеток была отрегулирована на уровне 1×10 клеток на миллилитр при помощи RPMIcm. После этого 100 мкл PHA ('Lectin', фирма Sigma) добавили к клеткам, чтобы получить PHA бласты (фитобласты). Клетки были инкубированы при 37°С в 5% CO.
Схема эксперимента
Были использованы 5 следующих протоколов эксперимента:
1. PHA бласты были подвергнуты воздействию инфракрасного излучения IR1072 на третий, четвертый и пятый день после сбора клеток. С использованием 35 мм чашек Петри, все клетки подвергались единичной 3-минутной обработке инфракрасным излучением. После ежедневных обработок индивидуальные реплицированные пробы клеток на пятый день были проанализированы на % жизнеспособных клеток.
2. РНА бласты были подвергнуты воздействию IR1072 & IR880 на третий и пятый день при обработках 5×3 минуты, и были проанализированы на пятый день. Жизнеспособность клеток и iNOS экспрессия были определены после обработки на пятый день.
3. РНА бласты были подвергнуты ежедневному воздействию единичной трехминутной дозы IR1072 и IR880, начиная с первого дня. После ежедневного облучения клетки были проанализированы на % жизнеспособных клеток.
4. РНА бласты на третий день были подвергнуты обработке 4×3 минуты при помощи IR1072 и на четвертый день были подвергнуты единичной трехминутной обработке. Затем клетки оставили на 4 часа, после чего их подвергли воздействию УФА в течение 40 минут, после чего была определена жизнеспособность клеток.
5. Клетки были инкубированы до третьего дня в пробирках для культуры клеток тканей и затем были подвергнуты воздействию различных диапазонов волн при обработке 2×3 минуты на третий день. Использовали длины волн IR660 нм, IR880 нм, IR950 нм, IR1267 нм, IR1072 нм, чередующиеся с IR1268 нм, IR1072 и IR1267 нм, при длительности импульсов 1 мкс для IR1072 нм и 7 мкс для IR1072 нм. Сразу после облучения клетки были проанализированы на % жизнеспособных клеток.
При осуществлении всех протоколов важно, чтобы во всех чашках поддерживалась комнатная температура в течение всех ИК и контрольных обработок.
Набор Annexin V для определения апоптоза
5
6
Жизнеспособность клеток была определена с использованием набора для определения апоптоза Annexin V Apoptosis Detection kit (фирма Autogen Bioclear, Великобритания). Апоптоз может быть обнаружен по изменению положения фосфатидил серина (PS) в клеточной мембране. В не апоптозных клетках большинство PS молекул локализованы во внутреннем слое плазматической мембраны, однако вскоре после индуцирования апоптоза PS перераспределяется в наружный слой мембраны. Открытый PS легко может быть обнаружен при помощи набора Annexin V. Клетки, имеющие связь с Annexin V, приобретают зеленую окраску в плазматической мембране. Клетки, которые потеряли целостность мембраны, приобретают красную окраску (PI) во всей цитоплазме и ореол зеленой окраски на поверхности клеток (в плазматической мембране). Клетки в количестве 1×10-1×10 на чашку промывали и вновь вводили в суспензию в буферном растворе Assay Binding Buffer. 5 мкл Annexin V и 10 мкл Propidium Iodide (PI) добавляли к клеткам до инкубирования при комнатной температуре в темноте, в течение 15-30 мин. Клетки наблюдали через двойной фильтр для FITC & родамина, с использованием флуоресцентной микроскопии и бленды для подсчета, при помощи по меньшей мере двух лаборантов.
Вестерн-блоттинг
Оттаявшие суспензии гранул клеток были гомогенизированы на льду при помощи гомогенизатора Dounce. Уровни протеина в клеточной суспензии были определены при помощи анализа Lowry Assay, с использованием альбумина коровьей сыворотки в качестве стандарта. Уровни протеина регулировали так, чтобы 10 мкг протеина загружалось в каждый канал. Был осуществлен стандартный электрофорез с использованием 6% полиакриламидного геля. После проведения электрофореза протеин переносили на мембрану из нитроцеллюлозы (NC) на 2.5 часа, при 50V. NC мембрана была блокирована 5% не жирным порошковым молоком в солевом буферном растворе 1×Tris (IBS), который содержит 0.2% Tween 20 (фирма Sigma, Великобритания), на 1 час при комнатной температуре. После этого NC мембрана была инкубирована первичным антителом iNOS (раствор 1:2500) в течение ночи при 4°С. Затем NC мембрана была промыта 4×10 минут при помощи промывочного буфера (2.5% не жирное порошковое молоко и 0.2% Tween 20 в TBS) и инкубирована anti-rabbit связанным пероксидазой хрена вторичным антителом (раствор 1:2000) в течение 1 часа. После этого NC мембрана была промыта 4×10 минут при помощи промывочного буфера. Полосы протеина из NC были визуализированы с использованием субстрата 68 mM люминола, 1.25 тМ р-курамовой кислоты и 30% пероксида водорода. Иммуноблот был экспонирован в Hyperfilm™ в течение 3 минут в кассете для пленки, и затем проявлен и фиксирован при комнатной температуре. Полосы протеина были количественно проанализированы с использованием денситометра ImageQuant в линейном диапазоне пленки, чтобы определить относительную экспрессию iNOS. Было проведено сравнение значений оптической плотности (стандартизованных бета-актином) с использованием множественного анализа вариантов ANOVA, с уровнем значимости р<0.05. Данные были получены для n=3 индивидуальных повторных экспериментов.
Статистика
Апоптоз измеряли с использованием % жизнеспособных клеток, то есть
% жизнеспособных клеток = [(число жизнеспособных клеток)/(число всех клеток)]·100.
Данные выражены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD).
Сравнение между контрольными и обработанными клетками было проведено с использованием множественного анализа вариантов ANOVA и выражено как среднее значение ±SD, с доверительным интервалом 95%. Статистический анализ был проведен с использованием Prism 3.2.
Источники света
2
Оба источника излучения 880 нм и 1072 нм имеют многомодовое излучение с шириной полосы пропускания меньше, чем 50 нм, в непрерывном режиме с мощностью оптического излучения 5 мВт/см.
Опыты на людях
Использовали длины волн в диапазоне от 660 нм до 1268 нм, причем исследовали различные ограниченные полосы пропускания как изолированно, так и в комбинации.
40 добровольцев набирали из людей в возрасте от 45 до 65 лет, всего 38 женщин, 2 мужчин. Каждого индивида фотографировали с использованием фиксированного освещения и на фиксированном расстоянии. Делали следующие снимки: слева от центра лица; справа от центра лица; левый профиль лица; и правый профиль лица. Использование постоянного расстояния и освещения облегчает проведение сравнения между снимками до и после облучения.
Когда делали снимки после облучения, старались обеспечить, чтобы глаза были открыты так же широко, как и на снимке до облучения. Это позволяет производить сравнение складок кожи над глазами и мешков под глазами. Участников эксперимента специально просили не улыбаться и удерживать нейтральное выражение лица при проведении съемок. Каждому участнику выдавали активное устройство и просили производить обработку области кожи вокруг глаз в течение времени около 30 минут ежедневно (15 минут на каждый глаз). Кожу вокруг глаз выбрали потому, что она является более мобильной и легче демонстрирует улучшение упругости кожи.
Пример 1
В диапазоне протоколов обработка при помощи IR1072 создает стойкий защитный эффект, повышающий жизнеспособность РНА бласта. В отличие от этого IR880 является стойко цитотоксичным по сравнению с контрольными клетками и клетками, обработанными IR1072.
После облучения IR1072 % жизнеспособных клеток существенно увеличивается на пятый день (р<0.05), по сравнению с контрольными данными, как при единичной обработке, так и при множественной 5×3 минуты обработке на третий и пятый день (фиг.6). В следующем протоколе клетки облучали 5×3 минуты при помощи IR1072 и IR880, причем % жизнеспособных клеток существенно уменьшился на пятый день (р<0.01) после обработки при помощи IR880, по сравнению с клетками, обработанными при помощи IR1072 (фиг.6). Протокол ежедневной обработки вызывает существенное уменьшение % жизнеспособных клеток, в случае обработки клеток при помощи IR880 в течение восьми дней [первый день (р<0.01), третий день (р<0.01), четвертый день (р<0.05), пятый день (р<0.05) и восьмой день (р<0.05)], по сравнению с клетками, облученными при помощи IR1072 (фиг.7), в параллельных экспериментах. После предварительной обработки при помощи IR1072 и последующего воздействия УФА % оставшихся жизнеспособных клеток будет существенно выше (р<0.01) по сравнению с клетками, обработанными только при помощи УФА (фиг.8). После облучения различными длинами волн клетки после воздействия IR880 вновь показывают существенное снижение % жизнеспособных клеток (р<0.01), в то время как % жизнеспособных клеток будет существенно выше после обработки при помощи IR1072 (р<0.01) и после обработки с чередованием IR1072/IR1268 (р<0.01), при сравнении с не обработанными контрольными клетками (фиг.9). Все другие проверенные длины волн и условия эксперимента не оказывают существенного влияния на жизнеспособность клеток.
Несмотря на то что длины волн в диапазоне 855-905 нм могут стимулировать пролиферацию фибробласта, авторы настоящего изобретения обнаружили, что излучение в этом диапазоне является лимфотоксичным. Цитоксичные и защитные воздействия на клетки являются быстрыми, так как анализ проводили при воздействии ИК излучением в течение 2 часов, и оба эти действия являются длительными и наблюдаются по меньшей мере через 2 дня после проведенных обработок. Проведенные авторами настоящего изобретения исследования четко показывают, что излучение в диапазоне 1050-1100 нм улучшает жизнеспособность клеток как после единичного, так и после множественного протоколов обработки. Поддержание жизнеспособности лимфоцитов в присутствии неблагоприятных факторов имеет важное значение, так как бактериальные эндо- и экзотоксины представляют собой лейкотоксичные факторы, действие которых может быть снижено за счет облучения воспаленных клеток излучением 1072 нм ±25 нм. Давно известно, что инфракрасное излучение оказывает защитное действие против УФА, однако точный диапазон длин волн был неизвестен. Полученные результаты показывают, что длина волны 1072 нм ±25 нм оказывает защиту от вредного воздействия УФА.
Пример 2
Было показано, что оксид азота является потенциальным ингибитором апоптоза для клеток различных типов. NO диффундирует очень быстро как через воду, так и через клеточные мембраны, и iNOS производится более быстро и эффективно, чем eNOS и nNOS. iNOS может функционировать без повышения уровней внутриклеточного кальция и его активность быстро воздействует на иммунные клетки, например на первично активированные моноциты и макрофаги, после воздействия цитокинов и микробных продуктов.
Для выявления потенциального механизма, объясняющего длительную цитопротекцию, вызванную воздействием IR1072, было осуществлено количественное иммуноблотирование для исследования экспрессии iNOS, при сравнении с контрольными клетками и воздействием IR880 нм. После предварительной обработки при помощи IR1072 существенное повышение в 4.9±2.1 раза (р<0.05) иммуноактивности iNOS было обнаружено на пятый день, по сравнению с контрольными клетками. В отличие от этого, не наблюдается существенное повышение иммуноактивности iNOS после воздействия IR880 (всего в 2.1±2.2 раза) на пятый день (р>0.05), при проведении параллельных исследований (фиг.10).
Биохимически полученные результаты показывают, что iNOS был перерегулирован зависимым от длины волны образом, по сравнению с контрольными пробами без обработки. Можно полагать, что NO действует как ингибитор апоптоза, при помощи двух отдельных механизмов: прежде всего, за счет cGMP-зависимого механизма, в котором N0 действует на уровне активирования протеазы вида caspase-3 или выше по ходу от этого события, чтобы предотвратить активирование протеазы; во-вторых, NO также тормозит активность протеазы вида caspase-3 за счет S-нитросиляции фермента. Подавление активности протеазы вида caspase-3 позволяет спасти клетки от программируемой смерти.
Пример 3
После обработки кожи лица и кожи вокруг глаз источником изучения наблюдается снижение глубины, длины и площади морщин, а также уменьшение площади поверхности кожи над глазами и уменьшение мешков под глазами. Для снижения до минимума артефакта была использована постоянная световая коробка. Это облегчает поддержание постоянного расстояния объектива фотоаппарата от пациента и постоянной экспозиции. Пациентов просили смотреть на одну точку и удерживать подбородок в фиксированном положении, когда нос касается струны, чтобы обеспечить минимальное расхождение между снимками. Затем пациентам вручали источник излучения для самостоятельного проведения облучения по меньшей мере раз в день, а преимущественно два раза в день. По истечении месяца еще раз делали снимки, а затем еще раз через 2 месяца. При проведении съемки важно, чтобы на лице сохранялось одно и то же нейтральное выражение, а глаза были открыты на одну и ту же величину (ширину), причем взгляд должен быть направлен в одну и ту же точку внутри световой коробки; это позволяет производить прямое сравнение состояния кожи над глазами. Всего делали 4 снимка, а именно слева от центра лица; справа от центра лица; левый профиль лица; и правый профиль лица. Это облегчает проведение прямого сравнения мешков под глазами, длины и глубины морщин. Морщины, которые расположены не в вертикальной или в горизонтальной плоскостях, не анализировали, так как небольшой поворот может создавать искусственное различие. Наблюдали также улучшение тонуса тканей и мышечного тонуса в различных частях тела после проведения электромагнитной косметической обработки. Результаты свидетельствуют о качественном улучшении и снижении видимых признаков старения, об уменьшении избыточной кожи век глаз, о поддержании тонуса лицевой ткани и, следовательно, о поддержании сохраняющих молодость носогубных складок и контуров лица.
Способ в соответствии с настоящим изобретением позволяет улучшать текстуру и контуры кожи, в результате чего кожа выглядит более гладкой. Эти эффекты могут сохраняться на период от одного до трех месяцев после прекращения обработки, и позволяют осуществлять реверсирование видимых признаков старения, в некоторых случаях до 10 лет.
Когда излучение воздействует на бедра и ягодицы, наблюдается существенное снижение признаков целлюлита и уменьшение степени обвислости ягодиц под действием силы тяжести.
Со ссылкой на фиг.11А показан результат после 2 месяцев ежедневной обработки с использованием IR 1072 нм, по сравнению с состоянием до обработки, показанным на фиг.11В, для одного и того же пациента. На фиг.11С показано наложение снимков до обработки и через 1 месяц после ежедневной обработки с использованием IR 1072 нм, для одного и того же пациента. Можно производить непосредственное сравнение складок кожи над веками глаз через 1 месяц после обработки, так как верхнее веко пересекает роговицу в том же самом месте и отражения света от роговицы идентичны в контрольном и рабочем тестах (фиг.11С). Можно видеть, что провисание верхнего века уменьшается после обработки. Провисание дополнительно снижается после 2 месяцев обработки (фиг.11).
Пример 4
На фиг.13А показан профиль с одной стороны лица пациента до обработки, а на фиг.13В показан профиль лица этого же пациента после обработки. Этот пациент имел легко идентифицируемое пигментированное поражение ниже корнеальной каймы. Была проведена линия перпендикулярно к черной маркерной линии и были проведены следующие измерения:
фиг.13А
фиг.13В
1. Кончик носа
34.2 мм
38.3 мм
2. От линии до пигментированного поражения
20.3 мм
28.6 мм
3. От линии до мешка (7 мм ниже века)
18 мм
23.2 мм
Была сделана подстройка, вызванная вариацией шкалы (расстоянием до носа), для расстояния от линии до пигментированного поражения: (38.3/34.2)×20.3=22.7 мм и для расстояния от линии до мешка: (38.3/34.2)×18=20.2 мм.
Скорректированные результаты
До
После
От линии до пигментированного поражения
22.7 мм
28.6 мм
От линии до мешка
20.2 мм
23.2 мм
С использованием описанной методики было проведено измерение уменьшения мешков под глазами для 8 добровольцев. У 7 было обнаружено уменьшение размеров мешков под глазами.
Пример 5
При обеспечении одинакового раскрытия глаз часть изображения глаза на снимке до обработки (фиг.14А) была вырезана и совмещена (фиг.14С) с изображением глаза на снимке после обработки (фиг.14В). Легко можно видеть улучшение качества кожи.
Проведенные изменения размера мешков и измерения старческой дряблой кожи исключают вариабельность, присущую простой оценке морщин вокруг глаз.
Морщины
Мешки под глазами
Дряблая кожа над глазами
Улучшение
n=18
n=6
n=14
Без улучшения
n=2
n=1
n=2
р=0.0004
р=0.1
р=0.004
19 из 20 участников эксперимента считают, что терапия с использованием излучения 1072 нм была эффективной, р=0.00004.
Базовые снимки, которые могут быть использованы в качестве средства контроля данных приведенного косметического испытания, демонстрируют эффективность способа и устройства в соответствии с настоящим изобретением. Ежедневная обработка привела к тому, что большинство участников эксперимента приобрели более молодой внешний вид.