Амплификация ДНК in vitro

ки Мордовия. Т. 2. Животные. Саранск: Мордов. кн. изд-во, 2005. С. 125.

22. Губанов И. А., Киселев К. В., Новиков В.С., Тихомиров В. Н. Кирказон обыкновенный - Aristolochia clema-titis L. // Иллюстрированный определитель растений Средней России. Т. 2. Покрытосеменные (Двудольные: Раздельнолепестные). М.: КМК, 2003. С. 44.

23. Маевский П. Ф. Флора средней полосы европейской части России (Изд. 10-е). М.: КМК, 2006. С. 188-189.

24. Сацердотов Б. П. Растительность заповедного участка «Сосновый бор» Куйбышевского государственного заповедника;Флора заповедного участка «Сосновый бор» Куйбышевского государственного заповедника // Труды Куйбышевского государственного заповедника. Вып. 1. М.: Красный пролетарий, 1939. 208 с.

25. Штукенберг А. А. Из древней и новой истории долины р. Суры вблизи г. Пензы // Труды Пензенского общества Любителей Естествознания и краеведения. 1925. Вып. IX. 27 с.

26. Коршиков Л. В., Корнев С. В., Горбунов П. Ю. Заметки к познанию фауны RHOPALOCERA (LEPIDOP-TERA) Оренбургской области // Биоразнообразие и биоресурсы Урала и сопредельных территорий. Мат. межд. науч. конференции. Оренбург: Газпромпечать, 2001. С. 223-227.

27. Чинаев М. И., Цинговатов Л. В. Календарь природы Пензенской области. Пенза: Приволжское книжное изд-во, 1964. 118 с.

28. Агроклиматический справочник по Пензенской области / под ред. Ю. П. Либеровского. Л.: Гидрометеорологическое изд-во, 1958. 100 с.

29. Полтавский А. Н. Некоторые данные о численности парусников (Lepidoptera, Papilionidae) в Ростовской области // Эверсманния. Энтомологические исследо-

вания в России и соседних регионах. 2006. Вып. 7-8. Тула. С. 42-45.

30. Ганжа Е. А., Кириченко Л. М. Поликсена - Zerynthia polyxena ([Den. et Schiff.], 1775) // Красная книга Тамбовской области: Животные. Тамбов: Тамбовполигра-физдат, 2000. С. 99.

31. Блинушов А. Е. Поликсена - Zerynthia polyxena ([Den. et Schiff.], 1775) // Красная книга Рязанской области. Редкие и находящиеся под угрозой исчезновения виды животных. Рязань: Узорочье, 2001. С. 265.

32. Аникин В. В., Роднев Н. В. Поликсена - Zerynthia polyxena ([Den. et Schiff.], 1775) // Красная книга Саратовской области: Грибы. Лишайники. Растения. Животные. Саратов: Изд-во Торгово-промышленной палаты Саратов.обл., 2006. С. 298.

33. Некрутенко Ю., Чиколовец В. Денш метелики Украши. Ки1в: Видавництво Раевського, 2005. 232 с.

34. Ластухин А. А. Экология исчезающей реликтовой бабочки поликсены в Чувашской ССР и вопросы ее охраны // Актуальные экологические проблемы Чув. ССР. Тез. докл. науч.-практ. конф. Чебоксары, 1991. С. 73-75.

35. Гусынин И. А. Ядовитые растения и вызываемые ими отравления сельскохозяйственных животных. М.: Сельхозиздат, 1958. 221 с.

36. Вильнер А. М. Кормовые отравления сельскохозяйственных животных. Л.: Колос, 1966. 448 с.

37. дударь А. К. Ядовитые и вредные растения лугов, сенокосов и пастбищ. М.: Россельхозиздат, 1971. 95 с.

38. Полумордвинов О. А. К вопросу о сохранении биоразнообразия насекомых (Insecta) на территории Пензенской области // Охрана биологического разнообразия и развитие охотничьего хозяйства России. Мат. Всерос. научно-практ. конф. Пенза: ПГСХА, 2005. С. 65-67.

УДК 577.21

АМПЛИФИКАЦИЯ ДНК IN VITRO

Ю. В. ПРОХОРОВА

Пензенский государственный педагогический университет им. В. Г. Белинского

кафедра биохимии

Открытие метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние 20 лет. Полимеразная цепная реакция - это изящный метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить и многократно копировать с помощью термофильной ДНК-полимеразы определенный фрагмент ДНК [10].

Впервые состав ингредиентов, входящих в реакционную смесь для постановки полимеразной цепной реакции, и основные принципы использования прай-меров (коротких искусственно синтезированных молекул ДНК) для получения копий ДНК были описаны К1ерре с соавторами в 1971 году. Однако тогда еще не была продемонстрирована основная черта ПцР -экспоненциальное увеличение количества копий фрагмента исходной ДНК, как результат реакции [3]. Первое сообщение о современной ПцР было опубликовано сотрудником корпорации «СеШв» Кагу МиШв

и соавторами в 1985 году в журнале «Science» [8]. Усовершенствованию метода ПЦР и широкому ее использованию способствовало развитие некоторых технологий. В частности, появление приборов, позволяющих автоматически синтезировать одноцепочечные фрагменты ДНК (олигонуклеотиды-праймеры). В тот же период были обнаружены уникальные микроорганизмы, живущие в гейзерах. Их ферментные системы, в том числе и ДНК-полимераза, выдерживают высокие температуры горячих источников (до 95°С) и при этом сохраняют свою биологическую активность. Журнал «Science» в 1989 году назвал открытую термостабильную ДНК-полимеразу, дающую возможность автоматизировать ПЦР, молекулой года [4].

В 1987 году P. Chomezynski и N. Sacchi предложили одноэтапный метод выделения ДНК с помощью гуанидинтиоцианат-фенолхлороформной экстракции, а К. В. Mullis и F. A. Faloona ввели в практическую медицину метод синтеза ДНК in vitro. Особенно бурное

ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ

развитие метод ПЦР получил благодаря международной программе «Геном человека» [13].

Метод амплификации ДНК сразу же был внедрен в практику, что позволило поднять медицинскую диагностику на качественно новый уровень. Универсальность, высокая чувствительность и относительная простота исполнения сделали метод ПцР незаменимым для решения различных задач клинической диагностики, таких как прямое обнаружение и идентификация возбудителей заболеваний, молекулярное типи-рование и исследование свойств патогенных микроорганизмов, анализ мутаций, связанных с генетическими заболеваниями у человека и т.д. [6] В настоящее время предложены всевозможные модификации ПцР, в том числе «лонг-ПЦР», ПЦР с использованием «горячего старта», обратно-транскрипционная ПЦР, «гнездовая» ПЦР, лигазная цепная реакция, мультиплексная ПЦР и некоторые другие. [2] За открытие ПЦР К. В. Mullís в 1993 году был удостоен Нобелевской премии в области химии.

Сущность метода ПЦР

Метод ПЦР обеспечивает многократное приумножение (амплификацию, amplification - усиление, увеличение) в условиях in vitro фрагментов генома и быстрое накопление практически в любых количествах определенной, интересующей исследователя последовательности ДНК, которая первоначально может быть представлена всего лишь одной молекулой. В результате получают количество материала, достаточное для проведения анализа обычными методами.

Сущность метода ПЦР состоит в многократном циклическом процессе, включающим в себя три последовательно сменяющихся стадии. Первая стадия представляет собой плавление (денатурацию) ДНК при температуре 90-97°С, т. е. расплетения двойной спирали ДНК, расхождение нитей нуклеиновых кислот. На второй стадии происходит гибридизация или отжиг ДНК с праймером (затравкой) при температуре 50-60°С, в результате которого происходит комплиментарное связывание специфической олигонуклео-тидной последовательности праймера с определенным участком матричной ДНК. На третьей заключительной стадии осуществляется процесс элонгации (удлинения) нитей ДНК, катализируемый термостабильной Taq-полимеразой в направлении от 5'-конца к З'-кон-цу при оптимальной для работы фермента температуре 72°С. Один цикл ПЦР длится от 2 до 5 минут. Во втором и последующих циклах праймеры гибридизи-руются с исходной ДНК и с вновь синтезированными олигонуклеотидными молекулами, следовательно, количество копий определенного фрагмента ДНК увеличивается в геометрической прогрессии [3].

Для проведения ПЦР необходимы следующие материалы: 1) два синтетических олигонуклеотид-ных праймера (длиной примерно по 20 нуклеотидов), комплементарные определенным участкам ДНК из противоположных цепей, их З'-гидроксильные концы после отжига с ДНК должны быть ориентированы навстречу друг другу; 2) днк-мишень длиной от 100 до

35 000 пар нуклеотидов; 3) термостабильная ДНК-по-лимераза (Taq-полимераза, ТШ-полимераза или лига-за), которая не теряет своей активности при температуре 95° и выше; 4) смесь четырех дезоксирибонуклео-тидов определенной концентрации.

5) Буферный раствор для обеспечения оптимальных условий работы и ионы магния (Mg2+) — катализатор фермента Taq-ДHK-полимеразы. [1]

подбор праймеров

Праймеры - синтетические олигонуклеотиды, состоящие из 15-30 нуклеотидов, комплементарных сайтам (участкам) на идентифицируемой матричной ДНК. Синтез праймеров - довольно трудоемкий процесс. В настоящее время подбор последовательности обеспечивается автоматически с использованием соответствующих программ. От правильности подбора праймеров зависит уровень амплификации ДНК [3]. Особенно важно наличие комплементарности З'-кон-цевых нуклеотидов праймеров в выявляемой генетической структуре, так как отсутствие данного условия приводит к резкому снижению (в десятки раз) эффективности присоединения к З'-концу новых нуклеоти-дов, что, естественно, затрудняет последующий рост полинуклеотидной цепи. Часто в 5'-концевой участок праймеров для упрощения клонирования ПЦР-амп-лифицированной ДНК вводят сайты узнавания для рестриктирующих эндонуклеаз.

Конструирование праймеров проводится после определения нуклеотидных последовательностей в исследуемой ДНК методом секвенирования. Для подбора оптимальных условий ПцР с выбранными прайме-рами применяют различные компьютерные программы, например, OLIGO [14].

Из всего выше сказанного можно сформировать следующие требования к праймером:

1. Праймеры должны быть специфичны. Особое внимание уделяют З'-концам праймеров, т. к. именно с них начинает достраивать комплиментарную цепь ДНК Taq-полимераза. Если их специфичность недостаточна, то, вероятно, что в пробирке с реакционной смесью будут происходить нежелательные процессы, а именно, синтез неспецифической ДНК (коротких или длинных фрагментов). Часть праймеров и дНТФ расходуется на синтез неспецифической ДНК, что приводит к значительной потере чувствительности.

2. Праймеры не должны образовывать димеры и петли, т. е. не должно образовываться устойчивых двойных цепей в результате отжига праймеров самих на себя или друг с другом.

3. Область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций, делеций или инсерций в пределах видовой или иной, взятой в качестве критерия при выборе праймеров, специфичности. При попадании на такую зону, отжига праймеров происходить не будет, и как следствие - ложноотрицательный результат [4].

Tag-полимераза

В 1980 году полимеразная активность была открытая у некоторых форм термофильных бактерий. Taq-полимераза была выделена из бактерий вида ТЪегтт

aquaticus, способных расти при температуре 70-75°С. Молекулярный вес очищенного протеина 94 кД и оптимальная температура полимеразной активности 70-80°С. Активность фермента уменьшается, но по-лимераза не денатурируется при 90°С, при снижении температуры до 70-80°С уровень активности восстанавливается [13].

Tag-полимераза имеет очень высокую скорость синтеза. При оптимальных условиях фермент может достраивать до 150 оснований на секунду. При низкой температуре активность падает до 2 оснований на секунду. Время полужизни Taq-полимерази при 95° С составляет 40 минут [4]. Несколько лет назад удалось получить из бактерий ТЪегтт ТЬегторЫШ ТШ-ДНК-полимеразу, которая выполняет целый ряд функций, в том числе обеспечивает репарацию и репликацию ДНК, и обладает обратнотранскриптазной активностью, позволяя получать из РНК комплементарную ДНК. Она способна удлинять короткие олигонуклео-тидные последовательности (праймеры), присоединяя к их З'-концу дополнительный нуклеотид при условии, что праймер комплементарен сайту цепи ДНК (матрице). Наращивание длины праймера с помощью полимеразы происходит до тех пор, пока не будет достигнут 5'-конец матрицы [12].

Последовательности-мишени ДНК

В качестве матрицы для синтеза продуктов ПЦР используют любой тип ДНК: геномную ДНК человека, различных видов прокариотов и эукариотов, вирусов, ДНК, выделенную из культур клеток, «библиотек» генов и других источников. Метод не требует больших количеств исследуемой ДНК, в принципе, достаточно даже молекулы, содержащейся в одном волосе головы, одной капле крови или спермы.

ДНК может быть выделена из любого типа тканей и клеток, содержащих ядра. Этапы выделения ДНК включают быстрый лизис клеток, удаление фрагментов клеточных органелл и мембран с помощью центрифугирования, ферментативное разрушение белков протеиназами и экстрагирование ДНК из раствора с помощью фенола и хлороформа. Затем ДНК осаждают, как правило, этанолом и после удаления надосадочной жидкости растворяют в буферном растворе [8].

Молекула ДНК одной хромосомы среднего размера содержит 150х106 пар нуклеотидов и имеет длину около 4 см. Молекулы такого размера чувствительны к механическим воздействиям, возникающим в растворе в процессе выделения, и часто фрагментируются. В ходе выделения получают молекулы ДНК значительно меньше исходных, но всё равно очень большие — тысячи или десятки тысяч пар нуклеотидов. Такие молекулы неудобны для исследований, и их приходится дополнительно фрагментировать. обычно небольшие фрагменты детектировать проще. Лучше, чтобы их размер не превышал 200 пар нуклеотидов, а оптимальной является длина менее 100 пар нуклеотидов, в этом случае амплификация практически всегда проходит успешно [3].

Консервативные последовательности-мишени

Чтобы ПЦР прошла успешно, должна произойти гибридизация амплимера с нужной последовательностью-мишенью. Если эта последовательность слегка различается у разных индивидуумов или у микроорганизмов из разных изолятов (т. е. имеет место полиморфизм), может произойти ее неполное спаривание с амплимером и нарушение нормальной амплификации, что приведет к получению ложноотрицательного результата. К счастью, у человека большая часть геномных последовательностей консервативна и не различается у разных индивидуумов, так что обычно для них можно использовать один набор «консервативных» амплимеров.

Полиморфные последовательности-мишени

В случае полиморфных мишеней, не полностью гомологичных выбранным праймерам, гибридизация и удлинение праймеров могут вообще не произойти. Наиболее критичным при этом является неправильное соответствие матрице 3'-концевых нуклеотидов амплимера. Показано, что небольшое нарушение гомологии между 3'-концом праймера и матрицей не сказывается на ходе реакции, если концентрация нуклеозид-трифосфатов находится на уровне, обычном для ПцР. При низкой же концентрации нуклеозидтрифосфатов такое нарушение блокирует амплификацию. Таким образом, с помощью ПцР можно различить аллели, различающиеся всего одним нуклеотидом.

Полиморфные локусы ДНК человека хорошо изучены и охарактеризованы. Во многих случаях полиморфизм возникает в результате функционально значимых мутаций в половых или соматических клетках, и для выявления таких мутаций можно создать специальные праймеры и гибридизационные зонды [7]. Кроме того, в геноме человека идентифицировано большое число повторяющихся последовательностей, число которых сильно варьирует у разных индивидуумов. Амплификация таких участков и последующий анализ фрагментов ДНК с помощью электрофореза позволяет получить картину полос, характерную (специфическую) для каждого индивидуума. Анализ полиморфизма и повторяющихся последовательностей может использоваться также для идентификации личности (ПЦР-отпечаток пальцев), на пример VNTR, STR полиморфизм [10].

Что касается микроорганизмов, то данных об их полиморфизме гораздо меньше, и результаты ПцР-тестов могут оказаться ложноотрицательными. В этом случае полиморфизм может отражать аллельные различия между изолятами или возникать в результате нестабильности генома (например, у ретровирусов). В связи с ограниченностью данных о структуре генома микроорганизмов приходится определять специфичность набора праймеров и зондов экспериментально. Идеальный набор праймеров должен выявлять все изоляты исследуемого вида, но не близкородственные и различающиеся с медицинской точки зрения виды. Поскольку даже у изолятов последовательности-мишени могут слегка различаться, для их идентифика-