Способ увеличения пролиферативного потенциала трехмерных опухолевых клеточных культур
METHOD FOR INCREASING THE PROLIFERATIVE POTENTIAL OF THREE-DIMENSIONAL TUMOR CELL CULTURES

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, ветеринарии, фармакологии, клеточной биологии, более точно к способам улучшения культивирования опухолевых сфероидов для скрининга веществ с потенциальной противоопухолевой активностью in vitro. Изобретение может быть использовано для повышения количества опухолевых сфероидов и улучшения достоверности результатов доклинических исследований различных препаратов и веществ с противоопухолевой активностью.
Далее в целях исключения неоднозначного понимания текста заявителем приведены использованные в заявочном материале термины и их расшифровка.
иМВ - индуцированных цитохалазином В мембранные везикулы
МСК - мезенхимные стромальные (стволовые) клетки
3D клеточные культуры - трехмерные клеточные культуры
МВ - мембранные везикулы
МО - микроокружение опухоли
ФСБ - фосфатно-солевой буфер
ЭМП - эпителиально-мезенхимный переход
ПП - пролиферативный потенциал (увеличение количества сфероидов)
Число новых случаев злокачественных новообразований продолжает расти с каждым годом. В 2019 году в Российской Федерации было выявлено более 640 тыс. случаев злокачественных новообразований, что на 2,5% выше по сравнению с показателями 2018 года [Каприн, А.Д., с соавт., Состояние онкологической помощи населению России в 2019 году. М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2020. - 236 с. ISBN 978-5-85502-255-1]. На дату подачи настоящей заявки тестирование противоопухолевых препаратов проводят с использованием монослойных опухолевых клеток.
Данная модель имеет определенные недостатки. Например, в монослойных клеточных культурах отсутствуют пространственные градиенты кислорода, факторы роста и метаболиты, а также зональность, которая включает наличие некротических, гипоксических, покоящихся и пролиферирующих клеток, характерных для естественной опухоли [Ham et al., Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery. Exp Biol Med, 2016. 241(9): p. 939-954.]. Кроме того, после длительного культивирования опухолевых клеточных линий исключается генетическая гетерогенность исходной опухоли [Zhou et al., Microfluidic device for primary tumor spheroid isolation. Exp Hematol Oncol, 2017. 6 (22): p. 1-7].
Основными наиболее приближенными моделями к естественной опухоли на дату подачи настоящей заявки являются трехмерные (3D) клеточные культуры (в частности, опухолевые сфероиды). Они обладают рядом важных свойств, сближающих их с нативной тканью [Jeppesen et al., Short-term spheroid culture of primary colorectal cancer cells as an in vitro model for personalizing cancer medicine. Plos One, 2017. 12(9): p. 1-19].
Сфероиды, полученные из опухолевой ткани пациента, могут позволить осуществить подбор наиболее эффективного препарата и его необходимую дозу. Например, в [Jeppesen et al., Short-term spheroid culture of primary colorectal cancer cells as an in vitro model for personalizing cancer medicine. Plos One, 2017. 12(9): p. 1-19] описан скрининг химиочувствительности с использованием сфероидов первичных клеток колоректальной аденокарциномы пяти пациентов и получены индивидуальные профили ответа опухоли на терапию. Сфероиды сохраняли различия между пациентами в чувствительности к лекарствам и их комбинациям, наиболее часто используемым для лечения колоректального рака.
В работе [Halfter et al., Testing chemotherapy efficacy in HER2 negative breast cancer using patient-derived spheroids. J Transl Med, 2016. 14(1): p. 1-14] приведено сравнение действия терапевтических препаратов на сфероидах, полученных из ткани и клеточной линии опухоли молочной железы, которое показало различие между данными группами.
Сфероиды могут быть получены из большинства типов опухолей, что предоставляет возможности для создания биобанков с соответствующими материалами пациентов, которые могут быть использованы для проведения скрининга лекарств и облегчения разработки терапевтических средств [Gilazieva et al., Promising Applications of Tumor Spheroids and Organoids for Personalized Medicine. Cancers, 2020. 12(10): p. 2-19].
Однако существуют ограничения, которые не позволяют полноценно использовать опухолевые сфероиды в персонализированной медицине. Одно из таких ограничений обусловлено недостаточным количеством клеточного материала. Первичные культуры клеток, которые в последующем будут использоваться для формирования опухолевых сфероидов, обладают ограниченным пролиферативным потенциалом. Для усиления пролиферации клеток и использования их в дальнейших исследованиях необходимы специальные добавки. В качестве данных добавок могут быть использованы факторы роста, цитокины, гормоны, которые добавляются в культуральную среду для пролиферации и активации клеток.
В качестве новой культуральной добавки, улучшающей выход опухолевых сфероидов, может использоваться заявленное техническое решение, которое основывается на идее того, что индуцированные цитохалазином В мембранные везикулы (иМВ), выделенные из мезенхимных стромальных (стволовых) клеток (МСК), будут доставлять опухолевым клеткам ростовые факторы, тем самым увеличивая пролиферацию опухолевых сфероидов. Заявленное техническое решение позволит увеличить выход опухолевых сфероидов, что может значительно повысить эффективность индивидуального подбора противоопухолевых препаратов и внедрить методы персонализированной медицины в онкологию.
Внеклеточные мембранные везикулы - это сферические микро- и наноструктуры, отделяющиеся от поверхности клетки и участвующие в межклеточной коммуникации путем переноса заключенных внутри них биологически активных молекул и факторов роста в другие клетки и ткани. Внеклеточные везикулы опосредуют взаимодействия между клетками микроокружения опухоли и индуцируют фенотипические модификации в клетках-реципиентах, тем самым выступая ключевыми медиаторами в поддержании и распространении злокачественного новообразования [Whiteside, T.L. Exosome and mesenchymal stem cell cross-talk in the tumor microenvironment. Seminars in Immunology, 2018. 35(C): p. 69-79].
Механизм слияния везикулы с клеткой и передача различных молекул происходит через рецепторное взаимодействие и может осуществляться через клатрин-опосредованный и кавеолин-зависимый эндоцитоз, благодаря лиганд/рецепторным взаимодействиям [Colombo et al., Extracellular Vesicles Enhance Multiple Myeloma Metastatic Dissemination. International Journal of Molecular Sciences, 2019. 20(13): p. 1-15].
МСК представляют собой мультипотентные клетки, способные к самообновлению и дифференцировке в различные типы клеток. МСК могут быть получены из разных тканей, например, из костного мозга, жировой ткани, плаценты или пуповины. МСК являются основным компонентом микроокружения опухоли и играют ключевую роль в ее развитии. В микроокружении опухоли MCК участвуют в ремоделировании внеклеточного матрикса, эпителиально-мезенхимном переходе, способствуют метастазированию, а также ингибируют противоопухолевые иммунные ответы [Ridge et al., Mesenchymal stem cells: key players in cancer progression. Molecular Cancer, 2017. 16(1): p. 1-10].
Везикулы МСК содержат и переносят белки, связанные с ростом опухоли и ремоделированием внеклеточного матрикса (эндогенный или тканевые ингибиторы металлопротеиназ TIMP-1 и TIMP-2, матриксные металлопротеиназы MMP-9 и MMP-2), с ангиогенезом (сосудистый эндотелиальный фактор роста VEGF и тромбоцитарный фактор роста PDGF), пролиферацией (трансформирующий фактор роста TGF-β, фактор роста фибробластов FGF), а также цитокины (интерлейкины IL-6, IL-8 и IL-1β), РНК и микроРНК [Lindoso et al., Extracellular vesicles as regulators of tumor fate: crosstalk among cancer stem cells, tumor cells and mesenchymal stem cells. Stem cell investigation, 2017. 4: p. 1-14]. Показано, что полученные из MCК везикулы, несущие факторы роста и IL-6, способствуют пролиферации клеток множественной миеломы in vitro и in vivo [Roccaro et al., BM mesenchymal stromal cell-derived exosomes facilitate multiple myeloma progression. Journal of Clinical Investigation, 2013. 123(8): p.1542]. Содержимое везикул может активировать транскрипционные факторы, которые играют роль в регуляции роста опухолевых стволовых клеток. К ним относятся такие факторы, как Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и Myc [Yang et al., Targeting cancer stem cell pathways for cancer therapy. Signal Transduction and Targeted Therapy, 2020. 5(1): p. 1-35]. Таким образом происходит повышение уровня стволовости опухолевых клеток, которая играет роль в самообновлении стволовых клеток и генерации дифференцированного потомства. Это свойство позволяет поддерживать популяцию клеток и баланс между покоем, пролиферацией и регенерацией.
Предполагается, что изменение условий культивирования путем добавления иМВ в опухолевые сфероиды позволит увеличить их выход. Предлагаемый способ обеспечивает доставку трофических факторов роста и других биологических молекул, содержащихся в иМВ МСК, которые будут поддерживать рост и пролиферацию опухолевых сфероидов.
Заявителем был проведен анализ существующего уровня техники по научной и патентной информации в области улучшения качества культивирования культур клеток, в результате выявлены следующие аналоги.
Из исследованного уровня техники выявлено изобретение по патенту US20070020760 «Добавка к среде и среда для культивирования клеток животных» (с англ. Medium supplement and animal cell culture medium). Сущностью данного изобретения является добавочная среда, в которой содержится серицин или производное серицина для использования при культивировании клеток животных.
Из исследованного уровня техники выявлено изобретение по патенту EP3719115 «Состав и способ культивирования, размножения, сохранения и/или предварительной обработки клеток» (с англ. Composition and method for the cultivation, expansion, preservation and/or pre-treatment of cells). Сущность способа заключается в том, что композиция, представляющая собой среду, добавку к среде и/или раствор, содержит птеростильбен, использующийся как композиция для культивирования, размножения, сохранения и/или предварительной обработки клеток.
Из исследованного уровня техники выявлено изобретение по патенту RU №2711920 «Добавка для культивирования эпителиальных клеток». Сущностью является добавка для ускорения пролиферации клеточных культур в условиях in vitro, на основе хитозана, отличающаяся тем, что она представляет собой хитозан в солевой форме, полученной при взаимодействии хитозана с органической кислотой, выбранной из аскорбиновой, или аспарагиновой, или аминокапроновой, или гликолевой кислоты при мольном соотношении хитозан: кислота 0,4:1,6.
Из исследованного уровня техники выявлено изобретение по патенту RU №2663794 «Добавление железа для улучшения культивирования клеток». Сущностью изобретения является способ повышения плотности, жизнеспособности и/или титра клеток в среде для культивирования клеток, с помощью железа, в частности, высокой концентрации железа.
Недостатками всех вышеописанных аналогов является то, что все они включают в себя добавление определенных веществ к клеткам, что может сопровождаться нежелательными эффектами. Подбор концентрации и изучение влияния химических веществ на разные типы клеток должен производиться в индивидуальном порядке. Например, использование железа в высоких концентрациях для некоторых клеточных линий, предположительно, может отрицательно воздействовать на молекулярные процессы, происходящие в клетке.
Кроме того, еще одним недостатком использования дополнительных химических веществ может являться их влияние на биологическую активность опухолевых клеток, при моделировании 3D моделей опухоли и использовании их в скрининговых системах. Моделирование противоопухолевых ответов на исследуемое вещество с потенциальной противоопухолевой активностью, было изучено на примере птеростильбена, который сам по себе обладает противоопухолевой активностью [Obrador et al., Pterostilbene in Cancer Therapy. Antioxidants (Basel), 2021. 10(3): p. 1-17]. Хитозан используется для создания каркасов для культивирования клеток в качестве усилителя абсорбции, что также может сказываться на действие противоопухолевых препаратов [Babu and Ramesh, Multifaceted Applications of Chitosan in Cancer Drug Delivery and Therapy. Mar Drugs, 2017. 15(4): p. 1-19].
Также недостатками вышеперечисленных веществ может быть их стоимость, например, серицин-протеин шелка, сотканный из коконов тутового шелкопряда (Bombyx mori), может быть труднодоступным и дорогим, поэтому его использование при культивировании клеток в крупных масштабах, может носить ограниченный характер [Kaewkorn et al., Effects of silk sericin on the proliferation and apoptosis of colon cancer cells. Biol Res, 2012. 45(1): p. 45-50].
Техническим результатом заявленного технического решения является разработка способа, направленного на увеличение количества трехмерных опухолевых клеточных культур in vitro путем добавления индуцированных цитохалазином В мембранных везикул.
Сущностью заявленного решения является способ увеличения пролиферативного потенциала трехмерных опухолевых клеточных культур, заключающийся в том, что к культуре опухолевых клеток - сфероидов, индуцированных цитохалазином В, добавляют мембранные везикулы мезенхимных стромальных клеток жировой ткани человека. Способ по п.1, отличающийся тем, что мембранные везикулы мезенхимных стромальных клеток жировой ткани человека добавляют к культуре опухолевых клеток - сфероидов, полученных из коммерческих перевиваемых опухолевых клеточных линий. Способ по п.1, отличающийся тем, что мембранные везикулы мезенхимных стромальных клеток жировой ткани человека добавляют к культуре опухолевых клеток - сфероидов, полученных из первичных клеток биоптатов опухоли.
Заявленное техническое решение поясняется Фиг. 1 - Фиг.6.
На Фиг. 1 показаны иМВ МСК различного размера, выделенные с использованием цитохалазина B. Данные получены с помощью сканирующей электронной микроскопии (шкала 1 мкм, увеличение 10.00к х.).
На Фиг. 2 приведена Таблица, в которой показаны результаты мультиплексного анализа лизата иМВ МСК. Значения указаны в пкг на 1 мл.
На Фиг. 3 показаны сфероиды, культивированные в суспензии из опухолевых клеток аденокарциномы протоков молочной железы человека (MCF7). Фазово-контрастная микроскопия (шкала: 200 μm). А-Контрольная группа - сфероиды MCF7 без добавления иМВ МСК. Б-Опытная группа - сфероиды с добавлением иМВ МСК в концентрации 10 мкг.
На Фиг. 4 представлен график, показывающий количество сфероидов из клеток MCF7 после добавления иМВ МСК в концентрации 10 мкг. По оси X указан размер, образовавшихся сфероидов. По оси Y указано количество образовавшихся сфероидов. В качестве контроля использовались сфероиды без добавления иМВ МСК.
На Фиг.5 представлены графики, показывающие уровень экспрессии мРНК генов апоптоза: BAX, BCL-2, Caspase 3. Количество мРНК нормализовано по 18S-РНК. * - p <0.05.
На Фиг.6 представлены графики, показывающие уровень экспрессии мРНК генов стволовости и эпителиально-мезенхимного перехода: Ncad, Ecad, Sox2, Oct4. Количество мРНК нормализовано по 18S-РНК. * - p <0.05.
Далее заявителем приведено описание заявленного технического решения.
Поставленная цель и заявленный технический результат достигается путем добавления мембранных везикул к опухолевым клеткам при формировании сфероидов, что приводит к временному перепрограммированию клеток, устраняя тем самым ограничения в пролиферации клеток. Сливаясь с клетками-реципиентами, мембранные везикулы способны доставлять трофические факторы роста и нуклеиновые кислоты, которые поддерживают рост и пролиферацию опухолевых сфероидов.
Заявленное изобретение осуществляется в 3 этапа в нижеприведенной последовательности, а именно:
1 этап: Получение иМВ МСК человека с помощью цитохалазина В и оценка полученных иМВ (измерение концентрации, мультиплексный анализ, сканирующая электронная микроскопия);
2 этап: Получение опухолевых сфероидов и культивирование с иМВ МСК;
3 этап: Анализ эффективности влияния иМВ МСК на опухолевые сфероиды при стандартных условиях культивирования (ПЦР-РВ, количественный подсчет сфероидов).
Далее заявителем приведено подробное описание этапов осуществления заявленного технического решения.
1 этап: Получение иМВ МСК человека с помощью цитохалазина В.
Индуцированные микровезикулы из МСК жировой ткани человека получают путем обработки клеток раствором цитохалазина B и активному перемешиванию на вортексе 60 секунд. Мембранные везикулы отделяют от клеточного дебриса и ядер последовательным центрифугированием при 700 об/мин, 1400 об/мин и 12000 об/мин и фильтрованием (фильтр на 1 мкм).
Для определения морфологии и размера иМВ, выделенных из МСК, используют сканирующую электронную микроскопию. Пробоподготовка иМВ к сканирующей электронной микроскопии осуществляется по следующему протоколу.
Осадок иМВ растворяют в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и переносят и лунки 24х луночного культурального планшета, предварительно, положив на дно лунок культуральные стекла. Далее центрифугируют планшет при 3000 об/мин в течение 25 минут для осаждения иМВ МСК на культуральные стекла. Фиксация везикул происходит при комнатной температуре в течение 15 минут, с добавлением 10% формалина. Далее образец иМВ МСК дегидрируют в возрастающих концентрациях этилового спирта. Культуральные стекла высушивают и производят напыление проводящего слоя золото/палладий в вакуумной напылительной установке Quorum T150ES (Quorum Technologies, UK). После процедуры напыления пробы помещаются в автоэмиссионный сканирующий электронный микроскоп Merlin (Carl Zeiss, Германия) и проводят анализ.
4
2
Метод определения концентрации везикул происходит по белку и заключается в добавлении лизирующего раствора (50мМ Tris-HCl pH 7.4, 1% NP 40, 0,5% дезоксихалата натрия, 0,1% ДСН, 150 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА) и ингибитор протеаз - PMSF (фенилметилсульфонилфторид) к осадку иМВ МСК до конечной концентрации 1мМ. Далее перемешивают везикулы в лизирующем растворе и инкубируют на льду 20 минут. Для измерения концентрации тотального белка, используют коммерческий набор Pierce™ BCA Protein Assay Kit (ThermoScientific, США). Для приготовления рабочего раствора, смешивают Реагент А (раствор, содержащий бицинхониновую кислоту, карбонат натрия, тартрат натрия, бикарбонат натрия в 0,1н NaOH pH 11,25) и Реагент Б (4% CuSOx 5HO) в соотношении 50:1. Смешивание образца и рабочего раствора происходит в соотношении 25 к 200 мкл. Смесь инкубируют при 37°С в течение 30 минут. Уровень абсорбции измеряется при длине волны 562 нм.
Концентрации белка в исследуемых образцах определяется с помощью построения калибровочной кривой на основании разведения белка бычьего сывороточного альбумина с известной концентрацией белка.
Для определения цитокинового профиля лизатов, полученных из иМВ, используют мультиплексный анализ цитокинов/хемокинов и факторов роста. Используется набор Bio-Plex Pro Human Chemokine 40-plex Panel (Cat. #171AK99MR2, Bio-Rad), который позволяет одновременно детектировать 40 аналитов: 6Ckine/CCL21, BCA-1/CXCL13, CTACK/CCL27, ENA-78/CXCL5, Eotaxin/CCL11, Eotaxin-2/CCL24, Eotaxin-3/CCL26, Fractalkine/CX3CL1, GCP-2/CXCL6, GMCSF, Gro-alpha/CXCL1, Gro-beta/CXCL2, I-309/CCL1, IFN-gamma, IL-1beta, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8/CXCL8, IL-10, IL-16, IP10/CXCL10, I-TAC/CXCL11, MCP-1/CCL2, MCP-2/CCL8, MCP-3/CCL7, MCP-4/CCL13, MDC/CCL22, MIF, MIG/CXCL9, MIP1alpha/CCL3, MIP-1delta/CCL15, MIP-3alpha/CCL20, MIP-3beta/CCL19, MPIF-1/CCL23, SCYB16/CXCL16, SDF1alpha+beta/CXCL12, TARC/CCL17, TECK/CCL25, TNF-alpha.
2 этап: Получение опухолевых сфероидов.
Для создания сфероидов используются клетки MCF7, полученные из Американской коллекции типовых клеточных культур (ATCC HTB-22). Данные клетки из расчета 1000 клеток на лунку культивируют на 24х луночном планшете предварительно покрытым 1% агарозой. Сфероиды культивируются в питательной среде, например DMEM/F12 (производства фирмы ПанЭко, Россия), L-глутамин (ПанЭко, Россия) смесь антибиотиков пенициллин-стрептомицин (производства фирмы Биолот, Россия), добавка B27 (Sigma, США), фактор роста фибробластов 20 нг/мл (Sigma, США), эпидермальный фактор роста 20 нг/мл (Sigma, США) при температуре 37°С, во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2.
Добавление иМВ МСК происходит после 4-х часов культивирования клеток в планшете. В исследовании используется концентрации 10 мкг иМВ МСК на 500 мкл среды. Клетки с иМВ МСК культивируются 96 часов, после чего проводится оценка влияния иМВ МСК на формирование сфероидов.
3 этап: Анализ эффективности влияния иМВ МСК на опухолевые сфероиды.
Влияние иМВ МСК на экспрессию генов опухолевых сфероидов оценивается с помощью полимеразной цепной реакции реального времени (ПЦР-РВ) на приборе CFX 96 Real-Time System (Bio-Rad, США) c использованием программного обеспечения BioRad CFX Manager и GraphPad Prism 7 (GraphPad Software). В образцах опухолевых сфероидов после культивирования их с иМВ МСК исследуется экспрессия генов, участвующих в индукции апоптоза (BAX, BCL-2, Caspase 3), придании клеткам свойств стволовости (Sox2, Oct4) и ЭМП (E-cadherin, N-cadherin).
ПЦР-РВ проводят по методике, включающей праймеры и геноспецифический ДНК-зонд (FAM). Реакционная смесь для ПЦР-РВ включает: ДНК-матрица, 2.5Х реакционная смесь, прямой и обратный праймеры и проба. Амплификацию проводят при режиме: 95 °С - 3 мин, 39 циклов; 95 °C - 10 сек, 44 цикла; 55 °C - 30 сек, 44 цикла. Количество мРНК нормализуют по гену 18S.
Для изучения влияния иМВ МСК на изменения количества опухолевых сфероидов в суспензии проводят их подсчет на 4 сутки культивирования с помощью инвертированного микроскопа AxyObserver.Z1 (Carl Zeiss, Германия). Для подсчета сфероидов, их собирают и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 минут. Супернатант удаляют, а к осадку добавляли 100 мкл ФСБ. После аккуратного перемешивания, сфероиды переносят в 96ти луночный планшет и проводят подсчет.
Результаты, описанные на Этапах 1 - 3, приведены на Фиг. 1 - Фиг.6.
Из данных, приведенных на Фиг. 1, видно, что метод выделения иМВ МСК позволяет получать стабильную по размерам фракцию, состоящую из округлых клеточных компонентов, окруженных мембранной. Кроме того, полученная фракция не содержит клеточных остатков.
Из данных, приведенных в Таблице на Фиг.2, видно наличие выраженных цитокинов и хемокинов в иМВ МСК. Наибольшая концентрация была отмечена для следующих цитокинов: MCP-1, TARC, IFNg, IL-2, IL4, CTACK, MDC, MIP-1b, MIP-3a, MIP-3b.
Из данных, приведенных на Фиг. 3 и Фиг. 4, видно, что культивирование клеток MCF7 с иМВ МСК приводит к увеличению количества опухолевых сфероидов при добавлении иМВ МСК. По графику видно, что при 10 мкг иМВ МСК происходит наибольшее увеличение количества сфероидов размером от 50 до 100 мкм. Кроме того, на дату подачи настоящей заявки влияние иМВ МСК на опухолевые сфероиды находится на стадии дальнейших испытаний, однако уже на данной стадии исследований возможно констатировать факт того, что иМВ МСК влияют на пролиферативный потенциал опухолевых клеток и изменяют количественный показатель сфероидов in vitro.
Из данных, приведенных на Фиг. 5, видно, что при культивировании сфероидов MCF7 в суспензии можно говорить о снижении экспрессии таких апоптозных генов, как BAX и BCL-2 при культивировании сфероидов с 10 мкг иМВ МСК. Было выявлено, что экспрессия каспазы 3 значительно снижена при добавлении 10 мкг иМВ МСК по сравнению с контролем.
Из данных, приведенных на Фиг. 6, видно, что при культивировании сфероидов с иМВ МСК отсутствует значительное расхождение между экспрессией генов Е-кадгерин и N-кадгерин, что может свидетельствовать об отсутствие ЭМП. Кроме того, отсутствует достоверное отличие в экспрессии гена стволовости SOX2 между группами, тогда как экспрессия гена стволовости OCT4 значительно возрастает при добавлении 10 мкг иМВ МСК.
Таким образом, графические материалы, иллюстрирующие примеры конкретного выполнения заявленного технического решения, доказывают возможность достижения заявленных технических результатов, а именно:
- добавление цитохалазина B, последовательное центрифугирование и фильтрация способствуют выделению иМВ МСК, обладающих округлой формой без включения клеточных остатков.
- мультиплексный анализ показывает наличие в иМВ МСК цитокинов/хемокинов и факторов роста.
- добавление иМВ МСК к опухолевым клеткам увеличивает количество образующихся сфероидов в суспензионной культуре, что, предположительно, доказывает, роль иМВ МСК в пролиферации опухолевых клеток.
- иМВ МСК не влияют на жизнеспособность опухолевых клеток в концентрации 10 мкг.
- иМВ МСК не влияют на процесс эпителиально-мезенхимного перехода (ЭМП), но, предположительно, запускают экспрессию гена OCT4, который является транскрипционным фактором, играющим роль в регуляции роста опухолевых стволовых клеток.
Таким образом, из вышеизложенного можно сделать общий вывод, что заявителем достигнут заявленный технический результат, а именно - разработан способ увеличения количества трехмерных опухолевых клеточных культур in vitro путем добавления индуцированных цитохалазином В мембранных везикул.
Заявленное техническое решение изобретение удовлетворяет условию патентоспособности «новизна», так как впервые для повышения количества опухолевых сфероидов будут использоваться индуцированные цитохалазином В мембранные везикулы, выделенные из МСК жировой ткани человека.
Заявленное техническое решение изобретение удовлетворяет условию патентоспособности «изобретательский уровень», так как конкурентным преимуществом использования иМВ МСК по сравнению с описанными по тексту аналогами являются их особенности. иМВ МСК способны переносить различные факторы роста. Кроме того, мембрана иМВ МСК включает в себя такие компоненты как холестерин, сфингомиелин, гликосфинголипиды и фосфатидилсерины. Эти компоненты поддерживают стабильность этих структур, защищая содержимое везикул от деградации [Choi et al., Proteomics of extracellular vesicles: Exosomes and ectosomes. Mass Spectrom Rev, 2015. 34(4): p. 474-490]. Таким образом, иМВ МСК являются стабильными, устойчивыми структурами, которые имеют естественный барьер, предотвращающий их разрушение, что способствует доставке биологически активных молекул в реципиентные клетки.
Кроме того, мембрана иМВ МСК также включает в себя рецепторные белки, которые будут способствовать слиянию иМВ МСК и клеток [Mulcahy et al., Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. J Extracell Vesicles, 2014. 3: p. 1-14]. Таким образом, преимуществом использования иМВ МСК является возможность их естественного слияния с клетками, без необходимости дополнительного стимулирования слияния, например, электропарация (создание пор в мембране под действием электрического поля), при использовании которой происходит повреждение клеток.
Заявленное техническое решение изобретение удовлетворяет условию патентоспособности «промышленная применимость», так как иМВ отличаются от естественных везикул только методом получения. Поскольку клетки выделяют естественные везикулы в ограниченном количестве, применение специальных веществ (цитохалазин B) будет способствовать увеличению выхода иМВ. Характеристики же иМВ, включая размер, иммунофенотип, молекулярный состав и, главное, способность переносить необходимые молекулярные компоненты, не отличаются от естественных везикул [Gomzikova et al., Evaluation of Cytochalasin B-Induced Membrane Vesicles Fusion Specificity with Target Cells. Biomed Res Int, 2018. p. 1-6]. Кроме того, иМВ подлежат лиофилизации и хранению. Таким образом, препарат иМВ отвечает критерию «промышленная применимость», предъявляемого к изобретениям.