СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ БАКТЕРИЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ
METHOD OF INCREASING BACTERICIDAL ACTIVITY

Изобретение относится к медицине, а именно к аллергологии и иммунологии, хирургии, микробиологии, терапии, фармакологии, клинической фармакологии, ветеринарии и может использоваться как способ антибактериального воздействия в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий.
Несмотря на довольно широкий спектр антибактериальных препаратов, поиск и разработка новых средств, обладающих антибактериальной активностью, остается актуальным по сей день.
На сегодняшний день одним из наиболее перспективных направлений является разработка антибактериальных средств на основе эндогенных нейтрофильных пептидов. Благодаря ярко выраженным антимикробным свойствам и небольшому размеру молекул, эти пептиды рассматриваются как потенциальные агенты для лечения инфекционных заболеваний человека.
В качестве прототипа использовали известные рекомбинантные пептиды, обладающие антибактериальной активностью: HNP 1-3 и LL37.
- LL37 - кателицидин семейства антимикробных пептидов нейтрофилов человека.
- HNP (human neutrophils peptides), содержащее в своем составе 30 аминокислотных остатков. Вторичная структура HNP предаставлена β-складчатой антипараллельной структурой, стабилизированной тремя внутримолекулярными дисульфидными мостиками между остатками цистеина. Будихина А.С., Пинегин Б.В. α-Дефензины - антимикробные пептиды нейтрофилов: свойства и функции. Иммунология. №5. Том 29, с.317-320; 2008 г. Иммунология. №5. Том 29, с.317-320; 2008 г.
Несомненными преимуществами данных пептидов перед антибиотиками являются более широкий спектр антибактериального действия, функциональная активность при малых концентрациях, практически полное отсутствие возможности формирования резистентности возбудителей к антимикробным пептидам, возможность синтеза аналогов природных пептидов с измененными биологическими свойствами.
Однако существенным недостатком указанных пептидов является отсутствие бактерицидной активности при растворении его в физиологическом растворе, что служит значимым препятствием в отношении перспективы их использования в качестве лекарственного средства.
Задачей заявляемого способа является использование синтетического пептидного средства, обладающего высокой бактерицидной активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий и сохраняющего свои антибактериальные свойства как в физиологическом растворе, так и в буферных средах.
Поставленная задача решается тем, что в способе повышения бактерицидной активности, заключающимся в воздействии на грамположительные и грамотрицательные бактерии пептидами, используемыми в лекарственной основе, согласно изобретению в качестве пептидов используют синтетические пептиды, имеющие структуру LYS GLY PRO LEY THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO и THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO, с молекулярной массой соответственно 1794 и 1397 дальтон, в качестве лекарственной основы используют физиологический раствор из расчета 10÷30 мг синтетических пептидов, 1 мл физиологического раствора.
За счет того что в способе повышения бактерицидной активности организма в качестве пептидов используют синтетические пептиды, имеющие структуру LYS GLY PRO LEY THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO и THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO, с молекулярной массой соответственно 1794 и 1397 дальтон, в качестве лекарственной основы используют физиологический раствор из расчета 10÷30 мг синтетических пептидов, 1 мл физиологического раствора, повышается антибактериальная активность в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, которая сохраняет свои свойства и в буферных средах.
Заявляемый способ повышения бактерицидной активности организма обладает новизной в сравнении с прототипом, отличающийся существенными признаками, так как получено новое химическое соединение с известной структурой, имеющее свойства как вещества, обладающего антибактериальной активностью как при растворении в физиологическом растворе, так и в специальных буферных средах, которое ранее у него нигде не описывались, при этом степень выраженности антибактериальной активности в буферных средах по сравнению с известными синтетическими пептидами у данного вещества не меняются, то есть имеются все признаки достижения заданного результата.
Заявителю не неизвестны технические решения, обладающие указанными отличительными признаками, обеспечивающие в совокупности достижение заданного результата, поэтому он считает, что заявляемый способ соответствует критерию «изобретательский уровень».
Заявляемый способ может найти широкое применение в аллергологии и иммунологии, хирургии, микробиологии, терапии, фармакологии, клинической фармакологии.
Оценка бактерицидной активности заявляемого способа осуществляется следующим образом.
Бактерицидная активность фракций супернатантов клеток оценивалась по общепринятой методике «Определение чувствительности микробов к антибиотикам методом диффузии в агар с применением бумажных дисков». В стерильные чашки Петри заливали 20 мл 2% стандартного мясо-пептонного агара. Посев тестовой культуры микроорганизмов производили общепринятым способом. На подсушенную поверхность среды засевали сплошным газоном госпитальный штамм St.aureus 155, Е.Coli 2290 и Canda albicans с использованием стерильного ватного тампона, смоченного в 2-миллиардной взвеси микробной культуры. На поверхность засеянной среды раскладывали диски, пропитанные исследуемыми субстанциями путем погружения дисков в состав до полного пропитывания.
Зоны подавления роста микроорганизмов учитывали через 18 часов, измеряя их диаметр в миллиметрах линейкой.
Оценка бактерицидной активности тестируемых субстанций в отношении госпитальных штаммов St.aureus 155, Е.Coli 2290 и Canda albicans представлены в таблице 1. Полученные результаты демонстрируют наличие бактерицидной активности следующих образцов: 1 пик МНК, интерцид, пептид Zp-1 (LYS GLY PRO LEY THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO), пептид Zp-2 (THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO), LL37 (прототип), HNP (прототип).
Установлено, что выраженной бактерицидной активностью в отношении St.Aureus 155 обладают коммерческие бактерицидные эндогенные пептиды (БЭП) LL37 (прототип) и HNP (прототип), растворенные в буферном растворе в дозе 10 мг/мл (20,1±1,9 и 22,2±2,15 мм диаметр зоны подавления роста микроорганизма соответственно). У них же в той же дозе проявляется самая высокая бактерицидная активность в отношении Е.Coli 2290 (23,2±1,7 и 24,7±2,15 мм диаметр зоны подавления роста микроорганизма соответственно). Подобной же активностью обладает полученный нами пептид ZP-2, состоящий из 12 аминокислот. У него бактерицидная активность в отношении St.Aureus 155 и Е.Coli 2290 достоверно не отличалась от известных коммерческих БЭП и составила соответственно 22,3±2,16 и 19,6±1,6 мм диаметр зоны подавления роста микроорганизмов. Отличие было лишь в том, что подобная бактерицидная активность проявилась не только в буферном растворе, но и при растворении в физиологическом растворе. При растворении бактерицидных эндогенных пептидов (БЭП) LL37 и HNP в физиологическом растворе последние не проявляют бактерицидной активности, что тоже видно из таблицы 1.
Таблица 1
Характеристика бактерицидной активности исследуемых субстанций
№
Исследуемые средства
Концентрация [мг/мл]
n
Диаметр зоны подавления, мм
St.aureus 155
Е.coli 2290
Canda albicans
8
Пептид ZP-1 в физиологическом растворе
3
10
0
0
0
10
10
10,5±1,24
0
0
30
10
10,6±0,6
0
0
9
Пептид ZP-2 в физиологическом растворе
3
10
0
0
0
10
10
12,2±1,1
7,9±0,46
0
30
10
22,6±2,23
20,1±1,8
0
10
Пептид ZP-1 в буферном растворе
3
10
0
0
0
10
10
11,5±1,09
0
0
30
10
9,6±0,8
0
0
12
Пептид ZP-2 в буферном растворе
3
10
0
0
0
10
10
11,7±1,2
7,3±0,5
0
30
10
22,3±2,16
19,6±1,6
0
13
LL37 (прототип) в физиологическом растворе
3
10
0
0
0
10
10
0
0
0
30
10
0
0
0
14
HNP (прототип) в физиологическом растворе
3
10
0
0
0
10
10
0
0
0
30
10
0
0
0
15
LL37 (прототип) в буферном растворе
3
10
0
0
0
10
10
20,1±1,9
23,2±1,7
0
30
10
19,4±2,16
19,4±1,7
0
16
HNP (прототип) в буферном растворе
3
10
17,3±1,2
13,3±1,1
0
10
10
22,2±2,15
24,7±2,15
0
30
10
20,4±1,8
20,4±1,8
0
В отношении Canda albicans ни один изучаемый пептид не проявил бактерицидную активность, в том числе и коммерческие БЭП (LL37 и HNP).
Наибольшая бактерицидная активность выявлена у пептида ZP-2 (THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO), при этом его активность выявлялась не только в фосфатно-солевом буфере, но и в физиологическом растворе в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий.
Наличие противогрибковой активности не было установлено ни у одного исследуемого образца.
Таким образом, заявляемые в изобретении пептид ZP-1 (LYS GLY PRO LEY THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO), пептид Zp-2 (THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO) в разной мере, но в достаточной для бактерицидной активности мере способствуют ее повышению при растворении их в физиологическом растворе.
Известно, что физиологический раствор в сравнении с буферным раствором нейтрален по отношению к живому организму, поэтому использование пептидов ZP-1 (LYS GLY PRO LEY THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO) и ZP-2 (THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO), в растворе с физиологическим раствором, оказывая бактерицидную активность, не проявляет возможных отрицательных воздействий буферного раствора.
Пример 1. Проводили сравнительную оценку бактерицидной активности в отношении St.Aureus 155 пептида ZP-1 в концентрации 10 мг/мл в буферном растворе, в сравнении с LL37 (прототип) в концентрации 10 мг/мл в буферном растворе. Диаметр зоны подавления роста микроорганизмов составил 10.0 и 19.0 мм соответственно.
Пример 2. Проводили сравнительную оценку бактерицидной активности в отношении Е.coli 2290 пептида ZP-2 в концентрации 30 мг/мл в буферном растворе, в сравнении с HNP (прототип) в концентрации 30 мг/мл в буферном растворе. Диаметр зоны подавления роста микроорганизмов составил 18.0 и 19.0 мм соответственно.
Заявляемый способ повышает бактерицидную активность в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий в физиологическом растворе, которая сохраняется и в буферных средах, в котором в качестве пептидов используют синтетические пептиды, имеющие структуру LYS GLY PRO LEY THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO и THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO, с молекулярной массой соответственно 1794 и 1397 дальтон, в качестве лекарственной основы используют физиологический раствор из расчета 10÷30 мг синтетических пептидов, 1 мл физиологического раствора.