ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus subtilis, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ К РАСЩЕПЛЕНИЮ САХАРОВ И АНТАГОНИСТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ В ОТНОШЕНИИ ПАТОГЕННЫХ И УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ И ГРИБОВ, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ.
Bacillus subtiliS STRAIN CAPABLE OF SPLITTING SUGARS AND HAVING ANTAGONISTIC EFFECT ON PATHOGENIC AND OPPORTUNISTIC PATHOGENIC BACTERIA AND FUNGI, AND USE THEREOF

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и представляет собой новый штамм из бактерий рода Bacillus, способный к быстрому расщеплению широкого спектра моно- и дисахаров и являющийся антагонистом по отношению к плесневым грибам, патогенным и условно-патогенным бактериям.
В настоящее время препараты-пробиотики из бактерий рода Bacillus, подавляющие развитие патогенных микроорганизмов, находят широкое применение в сельском хозяйстве для подавления фитопатогенных бактерий и грибов (бациспецин-БМ, фитоспорин) (Вялых Л.К., Мелентьев Л.И. Индукция устойчивости к ржавчине у ячменя и пшеницы, вызываемая препаратом Бациспецин БМ / Микробиол. охрана биосферы в регионах Урала и Сев. Прикаспия: Тез. докл. Всес. симп. - Оренбург, 1991. - С. 23-24; RU 2099947, опубл 25.12.97, бюл. №12), в медицине (биоспорин, бактиспорин, споробактерин) (SU 1722502, опубл. 30.03.92; RU 2130316, опубл. 20.05.1999; WO 8909607, опубл. 19.10.1989), ветеринарии для лечения различных заболеваний птиц и сельскохозяйственных животных (БЦЛ - бактоцеллолактин, субалин, споролакт) (RU 2084233, опубл. 20.07.97, Бюл. №20; RU 2035185, опубл. 31.01.92, Бюл. №14; RU 2035186, опубл. 20.05.95, бюл. №14).
Здоровье животных зависит в большой степени от кормовой базы. Основным сочным кормом для скота в зимний период является силос, при заготовке которого еще допускаются большие потери питательных веществ, обусловливающие снижение его качества. Это приводит к существенному недобору животноводческой продукции, поэтому разработка новых эффективных технологий силосования зеленых растений в целях повышения сохранности и качества полученного из них корма по-прежнему остается актуальной (Зафрен С.Я. Как приготовить хороший силос, М., 1970).
Силосование является биологическим способом консервирования кормов, при котором используются процессы превращения растительных веществ, протекающие в природе спонтанно. Консервирующий эффект обусловлен быстрым снижением pH в силосуемом сырье за счет расщепления углеводов и накопления молочной кислоты, что препятствует размножению микроорганизмов, прежде всего патогенных бактерий и плесневых грибов, и потерь питательных веществ в силосе.
Известно большое количество биологических консервантов для силоса, созданных на основе осмотолерантных штаммов молочнокислых бактерий (Головач Т., Коваленко М. Микрофлора силоса амилолитических и молочнокислых бактерий. // Микробиол. ж.1994, Т.56, №2, С.3-7). В то же время указанные препараты имеют и ряд недостатков: они не обладают достаточной антагонистической активностью в отношении плесневых грибов и патогенных бактерий, мало- или совсем не эффективны при силосовании свежескошенных трав, а также кукурузы и других силосных культур с избыточным содержанием сахара, не дают желаемого результата при силосовании провяленных трав, относящихся к группе несилосующихся растений (Мамаев А.А. Эффективность консервирования трав культурой Bacillus subtilis и использование полученного корма в рационах крупного рогатого скота. Автореферат канд. дисс., 2005, 133 с.).
Для гарантированного повышения сохранности и качества силоса практически из любого растительного сырья необходимо использование биологического препарата, обладающего наряду с бактерицидным и хорошо выраженным фунгицидным действием. Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о том, что эта цель может быть достигнута путем создания препарата на основе культуры рода Bacillus.
Наиболее близким к изобретению является штамм бактерий Bacillus subtilis 111 - основа консерванта для силоса «Биотроф - 111» (Мамаев А.А. Эффективность консервирования трав культурой Bacillus subtilis и использование полученного корма в рационах крупного рогатого скота. Автореф. канд. дисс., 2005, 133 с.). Эти бактерии очень хорошо адаптированы для консервации зеленой массы. Они мало требовательны к влажности сырья, могут консервировать трудносилосуемые растения. В процессе консервации ими выделяются особые вещества - бактероцины, которые непосредственно действуют на вредоносную микрофлору. Штамм В. subtilis 111 обладает выраженной фунгицидной активностью в отношении штаммов грибов: Torula - 5 мм задержки роста, Sacharomyces - 7 мм, Penicillium - 35 мм, Aspergillus -24 мм и Fusarium - 37 мм (Лаптев Г.Ю. Разработка биологических препаратов для повышения питательности и эффективности использования кормов. Автореф. докт. дисс., 2009).
Однако неизвестна способность штамма к расщеплению легкоусвояемых сахаров, чем достигается универсальность его применения в качестве консерванта для силоса и способность к быстрому снижению pH за счет накопления молочной кислоты. Неизвестна также антагонистическая активность штамма в отношении других патогенных бактерий кишечной группы, а также его влияние на микробиоценоз кишечника у животных. Все эти показатели имеют важное значение с точки зрения использования штамма Bacillus subtilis в качестве консерванта при силосовании кормов, поскольку споры штамма остаются в силосе при его хранении и при поедании силоса попадают в организм животных. Поэтому необходимо изучение свойств штамма с точки зрения его пробиотических характеристик.
Задачей настоящего изобретения является получение нового штамма рода Bacillus, обладающего способностью к быстрому расщеплению широкого спектра моно- и дисахаров и обладающего широким спектром антагонистического действия в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов, а также который можно использовать в качестве средства для нормализации микрофлоры кишечника животных или средства для борьбы с заболеваниями растений, и который можно применять в качестве консерванта при силосовании.
Результатом изобретения является новый штамм Bacillus subtilis 1K, выделенный из здорового растения пшеницы (прикорневой зоны) в Уфимском районе. Идентификацию штамма проводили по «Определителю бактерий Берджи».- М.: Мир, 1997.
Штамм Bacillus subtilis 1K депонирован во Всероссиской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП Гос.НИИ.Генетика, г. Москва, под № В-11353. Дата депонирования 23.11.2012 г.
Культура штамма характеризуется следующими свойствами: Bacillus subtilis 1K - грамположительные аэробные спорообразующие палочки, продуцирующие каталазу. На мясо-пептонном агаре (далее - МПА) образует серовато-белые плоские, мелкоморщинистые колонии с ровными краями, вязкой консистенции. Рост в жидкой среде сопровождается образованием пленки серовато-белого цвета и придонного осадка. Через 18 часов роста в мазках культуры обнаруживаются прямые палочковидные клетки, расположенные одиночно, попарно или цепочкой. При спорообразовании клетка не раздувается. Споры овальные, расположены в клетке центрально.
Культура ферментирует моно- и дисахара, в том числе глюкозу, лактозу, сахарозу, манит, мальтозу, арабинозу, галактозу, рамнозу, ксилозу, дульцит, без выделения газа в течение 18-24 часов, что сопровождается накоплением молочной кислоты. Расщепление широкого спектра сахаров создает возможность использования штамма для силосования кормов.
Штамм дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра, гидролизует крахмал, желатину, гидролизует мочевину, не утилизирует цитрат натрия, не расщепляет тирозин. Не растет в анаэробных условиях. Продуцирует каталазу, протеазу, амилазу. Не образует лецитиназу и липазу. Редуцирует нитраты до нитритов, не образует газ на среде с нитратами в анаэробных условиях. Не образует индол.
Культура штамма была проверена на безвредность (вирулентность, токсичность и токсигенность).
Для исследования вирулентности штамм выращивали на МПА в течение 24 часов при температуре 37°C. Выросшую биомассу смывали 0,9%-ным раствором натрия хлорида и готовили бактериальные суспензии с концентрацией клеток от 0,5 до 5,0 млрд/в мл. Полученные суспензии вводили белым беспородным мышам массой (16±1) г двумя способами: однократно внутрибрюшинно и пятикратно перорально (по одной дозе ежедневно в течение 5 дней). Результаты испытаний представлены в табл.1.
Таблица 1
Изучение вирулентности культуры штамма В. subtilis 1K (ВКПМ В-11353)
Кол-во животных в опыте (штук)
Вводимая доза (×10<sup>9</sup> кл.мл)
Способ введения
Кратность введения (раз)
Кол-во заболевших мышей (штук)
Кол-во павших мышей (штук)
Кол-во выживших мышей
Внутрибрюшинно
10
0,5
1
0
0
10
10
1,0
1
0
0
10
Перорально
10
1,0
5
0
0
10
10
3,0
5
0
0
10
10
5,0
5
0
0
10
9
С целью более полного изучения безопасности штамма при пероральном введении были испытаны высокие дозы штамма при разовом пероральном введении мышам (табл.2). Установлено, что разовое введение per os высоких доз штамма - (10-20)×10 кл/мл не приводит к снижению веса животных на первые сутки после введения, и в последующие дни вес животных увеличивается.
Таблица 2
Изучение безопасности штамма В. subtilis 1K (ВКПМ В-11353) при разовом пероральном введении
№
Вводимая доза, млрд. кл/мл
Количество животных, штук
Средняя масса животных, г
Было
выжило
До введения
Через 1 сутки
Через 5 суток
1
1
10
10
17,2±0,3
17,2±0,3
18,7±0,3
2
5
10
10
16,8±0,2
16,8±0,3
17,9±0,2
3
10
10
10
17,0±0,2
17,0±0,2
17,6±0,2
Для исследования токсичности (табл.3) штамм выращивали на МПА в течение 24 часов при 37°C, смывали 0,9%-ным раствором хлорида натрия, готовили суспензию, содержащую от 1,0 до 5,0 млрд клеток в 1 мл, которые затем инактивировали прогреванием при 100°C в течение 1 часа. Суспензии вводили способами, описанными при изучении вирулентности.
Таблица 3
Исследование токсичности штамма В. subtilis 1K (ВКПМ В-11353)
Кол-во животных в опыте, штук
Вводимая доза, млрд кл.мл
Способ введения
Кратность введения, раз
Кол-во заболевших мышей, штук
Кол-во павших мышей, штук
Кол-во выживших мышей, штук
Внутрибрюшинно
10
1,0
1
0
0
10
10
2,0
10
3,0
1
0
0
10
Перорально
10
1,0
5
0
0
10
10
2,0
5
0
0
10
10
5,0
5
0
0
10
Для изучения токсигенности (табл.4) штамм выращивали в течение 10 суток на мясо-пептонном бульоне (далее - МПБ) при температуре 37°C. По истечении срока культуральную жидкость центрифугировали при 8000 об/мин в течение 30 мин. Для введения мышам использовали надосадочную жидкость. Контролем служила группа мышей, получавших стерильный МПБ.
Таблица 4
Исследование токсигенности штамма В. subtilis 1K (ВКПМ В-11353)
Кол-во животных в опыте, штук
Вводимая доза, мл
Способ введения
Кратность введения, раз
Кол-во заболевших мышей, штук
Кол-во павших мышей, штук
Кол-во выживших мышей, штук
1
2
3
4
5
6
7
Внутрибрюшинно
10
0,5
1
0
0
10
10
1,0
1
0
0
10
Перорально
10
1,0
5
0
0
10
10
2,0
5
0
0
10
10
3,0
5
0
0
10
Контроль - внутрибрюшинно
10
1,0
5
0
0
10
Контроль - перорально
10
3,0
5
0
0
10
Наблюдения за животными проводили на протяжении 5 суток после окончания курса инъекций или перорального введения. В этот период все животные оставались активными, хорошо поедали пищевые рационы, прибавляли в весе, физиологические отправления и поведенческие реакции у них не изменялись. Полученные данные свидетельствуют о безопасности штамма.
Для определения специфической активности исследовали антагонистическую активность штамма в отношении тест культур патогенных микроорганизмов, вызывающих заболевания растений (табл.5) и животных (табл.6). Исследование осуществляли методом отсроченного антагонизма. Для этого культуру штамма высевали петлей в центре чашки Петри с агаризованной картофельно-глюкозной средой. Посевы инкубировали в термостате при 37°C в течение 72 часов. Затем к выросшей культуре подсевали штрихом тест-микроорганизмы (500-миллионные суспензии суточных культур в физиологическом растворе). Учет результатов проводили через 18 ч инкубирования при 37°C по величине зон отсутствия роста тест-культур. Контролем роста тест-культур служило параллельное выращивание их на чашках с агаризованной картофельно-глюкозной средой без культуры исследуемого штамма. Полученные данные результатов испытания представлены в табл.5 и 6.
Таблица 5
Спектр антагонистической активности штамма В. subtilis 1K (ВКПМ В-11353) в отношении фитопатогенных штаммов, вызывающих заболевания растений
№
Тест-культуры
Зоны торможения роста, мм
1
2
3
Грибов:
1
Fusarium avenaceum
18-20
2
Fusarium sporotrichiella
12-15
3
Fusarium oxysporum
15-17
4
Fusarium culmorum
14-15
5
Alternaria alternata
16-18
6
Alternaria brassicicola
15-17
7
Botrytis cinerea
15-17
8
Botrytis aclada F-81
15-18
9
Penicillium lividum
15-17
10
Emericellopsis glabra F 1312
16-18
Бактерии:
14
Erwinia carotovora
14-15
15
Xanthomonas malvaceae
15-17
Таблица 6
Спектр антагонистической активности штамма В. subtilis 1K (ВКПМ B-11353) в отношении патогенных штаммов, вызывающих заболевания у животных
Тест-штаммы
Зона торможения роста, мм
1
2
Бактерии
Staphylococcus aureus (Никифоров)
22-25
Staphylococcus aureus (Филиппов)
22-25
1
2
St. aureus 66
15-17
St. aureus 67
20-22
St. aureus 81
18-20
Proteus vulgaris 177
15-20
Proteus vulgaris 12
14-16
Proteus vulgaris 48
12-14
Proteus. vulgaris 41
12-15
Proteus mirabilis 40
15-20
Proteus mirabilis 36
15-17
Proteus mirabilis 35
15-18
Candida albicans
28-30
Escherihia coli 177
12-15
Escherihia coli 154
12-15
Escherihia coli 140
12-15
Streptococcus 324
10-15
Streptococcus 362
12-15
Salmonella paratyphi 269
12-15
Salmonella paratyphi 15
15-20
Salmonella группа C infantis 155
15-18
Salmonella группа D enteriditis 25
15-18
Shigella flexneri II 1230
22-25
Shigella sonnei 2290
18-20
Грибы
Trichophyton rubrum
15-17
Microsporum canis
12-14
Из данных табл.5 и 6 следует, что штамм В. subtilis 1K обладает широким спектром антагонистической активности к патогенным бактериям и грибам, вызывающих заболевания растений и животных.
Пример 1.
9
Влияние штамма В. subtilis 1K на микробиоценоз кишечника изучалось на 10 белых опытных крысах, которых в течение 30 дней поили культурой штамма В. subtilis 1K в дозе 1×10 кл/мл. 10 контрольных животных получали адекватный объем физиологического раствора. Перед началом исследований и по окончанию опыта фекалии животных в виде разведений в соответствии с МУ (Методические указания по гигиенической оценке микробных средств защиты растений от насекомых и болезней на основе неспорообразующих микроорганизмов. №2620-82 от 22.09.82 г.) на селективные и дифференциально-диагностические среды для определения основных групп микроорганизмов, обитающих в кишечнике.
Данные по исследованию микробиоценоза кишечника представлены в табл.7.
Таблица 7
Оценка влияния культуры штамма В. subtilis 1K (ВКПМ В-11353) на состав кишечной микрофлоры крыс
Микрорганизмы
Фоновые данные
1 месяц опыта
опыт
контроль
Опыт
контроль
% случаев
Lg КОЕ/г
% случаев
Lg КОЕ/г
% случаев
Lg КОЕ/г
% случаев
Lg КОЕ/г
Бифидобактерии
100
6,0±0,3
100
6,2±0,1
100
7,0±0,1
100
6,0±0,1
Лактобациллы
100
5,0±0,2
100
5,8±0,2
100
6,0±0,2
100
5,0±0,2
Клостридии
40
5,0±0,2
40
5,0±0,2
80
3,0±0,2
100
3,0±0,2
Кишечная палочка
100
6,2±0,5
100
6,3±0,5
80
6,1±0,3
100
6,3±0,5
Условно-патогенные энтеробактерии
70
3,8±0,5
75
3,6±0,2
70
2,4±0,5
75
3,5±0,5
Стафилококки:
Эпидермальный
100
3,8±0,2
75
3,4±0,3
100
2,8±0,2
100
3,0±0,1
золотистый
0
0
0
0
0
0
0
0
Протей
90
3,0±0,2
90
3,0±0,2
90
3,0±0,2
90
4,0±0,2
Энтерококки
80
3,8±0,2
80
3,6±0,2
100
2,0±0,2
80
4,0±0,2
Дрожжеподобные грибы
100
4,0±0,2
100
3,0±0,2
75
2,0±0,2
75
4,0±0,2
Из данных табл.7 следует, что применение культуры штамма В. subtilis 1K (ВКПМ В-11353) у животных вызывает нормализацию кишечной микрофлоры - у крыс опытной группы увеличивается на порядок содержание бифидо- и лактобактерий, снижается количество условно-патогенной микрофлоры, в том числе стафилококков, энтерококков и дрожжеподобных грибов.
Таким образом, можно заключить, что штамм В. subtilis 1K проявляет пробиотические свойства и на его основе можно создать как препараты для защиты растений от фитопатогенов, так и препараты-пробиотики ветеринарного назначения, способны лечить широкий круг заболеваний и быть использованными в ветеринарной и сельскохозяйственной практике. Широкий спектр расщепления сахаров, антагонистическая активность в отношении фитопатогенных грибов и бактерий позволяет использовать штамм в составе консерванта для силоса.
Пример 2
Использование штамма В. subtilis 1K (ВКПМ В-11353) в качестве консерванта для силоса.
Для изучения способности культуры штамма В. subtilis 1K к силосованию были поставлены модельные опыты по силосованию измельченной кукурузы в банках в сравнении с известным консервантом для силоса - Биотроф 111.
Исходное сырье для силосования сырье получено в Чишминском районе Башкирии. Зеленая масса была измельчена, разложена тонким слоем на бумаге. По технологии применения Биотрофа 111 производили предварительное разведение консервантов в 600 раз (0,1 мл+60 мл воды). Из раствора брали 5 мл разведенного консерванта и вносим в 45 мл воды. В распылитель наливали изучаемый консервант и опрыскивали из распылителя в дозе 0,1 мл на 1 кг зеленой массы (по технологии).
Зеленую массу закладывали в трехлитровые банки. Каждый вариант закладки опыта с препаратом проводили в 3-х повторностях. Банки закрывали полиэтиленовыми крышками и помещали в темное место без прямого солнечного света.
Через 1 месяц определяли основные показатели качества силоса из заложенных вариантов согласно ГОСТ 23638-90 «Силос из зеленых растений».
8
Как следует из полученных результатов, применение суспензии штамма В. subtilis 1 К в качестве консерванта для силоса не уступает по эффективности Биотрофу 111 и даже несколько превосходит его по показателям качества при использовании суспензии штамма В. subtilis 1 К с концентрацией микробных клеток 1×10 кл/мл.
Пример 3
Использование штамма В. subtilis 1 К (ВКПМ В-11353) в качестве средства для нормализации микрофлоры кишечника поросят.
Поскольку штамм В. subtilis 1 К проявляет пробиотические свойства (улучшает состояние микробиоценоза кишечника у крыс), проведены испытания бактериальной суспензии штамма В. subtilis 1 К на поросятах с желудочно-кишечными заболеваниями с целью изучения лечебной эффективности в условиях свиноводческого комплекса Рощинского совхоза Стерлитамакского района.
Поросята были разделены на опытные и контрольные группы. Животные опытных и контрольных групп в каждой серии опытов находились в одинаковых условиях кормления и содержания. За ними постоянно вели наблюдение, учитывали падеж, вынужденный убой и изменение массы тела.
Массу тела животных во всех сериях определяли взвешиванием в начале и конце опыта.
С целью изучения лечебной эффективности суспензии штамма В. subtilis 1 К (ВКПМ В-11353) проведены испытания на поросятах, больных инфекционными и не инфекционными желудочно-кишечными заболеваниями. Желудочно-кишечные заболевания поросят развиваются в первые часы жизни животного, сопровождаются тяжелыми токсическими явлениями, характеризуются высоким падежом. Больным поросятам проводилось традиционное лечение, включающее антибиотикотерапию, коррекцию водно-солевого обмена, симптоматические средства. Опытной группе дополнительно применяли суспензию штамма В. subtilis 1 К (ВКПМ В-11353) в количестве 1 мл на 10 кг веса 2 раза в день до снятия клинических симптомов заболевания. Результаты представлены в табл.8.
Как следует из полученных данных, введение суспензии штамма В. subtilis 1 К (ВКПМ В-11353) в терапию желудочно-кишечных заболеваний у поросят повышает эффективность лечения и повышает сохранность поросят на 11%.
Поэтому можно рекомендовать использование суспензии штамма В. subtilis 1 К (ВКПМ В-11353) в качестве ветеринарного препарата-пробиотика.
Пример 4
Использование штамма В. subtilis 1 К (ВКПМ В-11353) против патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, вызывающих заболевания растений.
Для изучения эффективности использования суспензии штамма В. subtilis 1 К в качестве биофунгицида и биобактерицида использовали обработку семян пшеницы, зараженных комплексом фитопатогенов.
100 г семян помещали в чашку Петри и приливали 1 мл суспензии штамма В. subtilis 1 К в физиологическом растворе. Обработанные опытные семена хорошо встряхивали в течение 3-х минут. К контрольным семенам приливали 1 мл физиологического раствора и также встряхивали.
Через 16 ч проводили выращивание семян рулонным методом на увлажненной фильтровальной бумаге (ГОСТ 12038-84 «Семена сельскохозяйственых культур», с. 4-6).
Через 7 дней оценивали зараженность семян фитопатогенами. Эффективность суспензии штамма В. subtilis 1 К (ВКПМ В-11353) в опытах с семенами составила:
1) против гельминтоспориоза
По биологической эффективности против гельминтоспориоза (при уровне распространенности в контроле 10%) биологическая эффективность штамма В. subtilis 1 К составила 93,3%;
2) против фузариоза
По биологической эффективности против фузариоза (при уровне распространенности в контроле 4%) биологическая эффективность составила 94,4%;
3) против альтернариоза
По биологической эффективности против альтернариоза (при уровне распространенности в контроле 25,3%) биологическая эффективность составила 100%;
4) против бактериозов
По биологической эффективности против бактериозов (при уровне распространенности в контроле 28%) биологическая эффективность составила 52,1%;
5) против смешанной инфекции
По биологической эффективности против смешанной инфекции (при уровне распространенности в контроле 69%) биологическая эффективность составила - 69,3%.
Исходя из полученных данных можно использовать штамм В. subtilis 1 К (ВКПМ В-11353) в качестве биофунгицида и биобактерицида для защиты растений от грибных и бактериальных болезней.