Способ прогнозирования риска развития генитального эндометриоза
METHOD FOR PREDICTION OF RISK OF GENITAL ENDOMETRIOSIS

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития генитального эндометриоза.
Эндометриоз – это гинекологическое заболевание, которое характеризуется разрастанием ткани, подобной эндометрию, по морфологическим и функциональным свойствам за пределами полости матки. Данное заболевание является одной из основных причин бесплодия, дисменореи, диспареунии, а также хронических тазовых болей, спаечного процесса органов малого таза, что в совокупности приводит к общему ухудшению качества жизни женщин.
Генитальному эндометриозу подвержены 6-10% женщин репродуктивного возраста, однако он диагностируется у 35-50% женщин, страдающих бесплодием и у 80% женщин с выраженными тазовыми болями. Данное заболевание является показателем к гистерэктомии, а также накладывает значительные финансовые трудности на систему здравоохранения. Несмотря на то что у большинства пациенток отмечается облегчение симптомов после применения медикаментозного или малоинвазивного хирургического лечения, частота рецидивирования превышает 50% после прекращения медикаментозной терапии и спустя 5 лет после малоинвазивного хирургического вмешательства [Lindsаy S.F., Luciаnо D.Е., Luciаnо А.А. Еmеrging thеrаpу fоr еndometriosis // Expert Оpin. Еmеrging Drugs. 2015. Vоl. 20, №3. P. 19-28].
С практической точки зрения представляется крайне необходимым выделение критериев индивидуального прогнозирования у женщин риска развития генитального эндометриоза на основании исследования генов-кандидатов с целью выявления женщин, предрасположенных к генитальному эндометриозу.
В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития генитального эндометриоза на основе данных о сочетании генетических полиморфизмов  rs713586, rs10441737, rs887912.
Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2016 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования риска развития генитального эндометриоза на основе молекулярно-генетических данных в зависимости от полиморфных маркеров генов rs7538038, rs1782507 и rs7589318.
В патенте РФ № 2247391 (дата публикации 27.02.2005), где предложен «Способ ранней диагностики наружного генитального эндометриоза у женщин», заключающийся в определении активности катепсина в биоптате эндометрия. При ее значении 0,1 Ед.ферм.акт/час и менее диагностируют наружный генитальный эндометриоз.
Выявлен патент РФ № 2526823 (дата публикации 27.08.2014), где предложен «Способ диагностики наружного генитального эндометриоза», включающий исследование сыворотки крови, отличающийся тем, что в сыворотке крови определяют уровень липопротеинов высокой плотности и при величине 0,77 ммоль/л и выше диагностируют наружный генитальный эндометриоз.
Общий недостаток указанных способов заключается в том, что не рассматриваются генетические полиморфизмы и их сочетания с риском развития генитального эндометриоза.
В патенте РФ № 2592240 (дата публикации 20.07.2016) «Способ диагностики ранних стадий наружного генитального эндометриоза», сущность которого заключается в определении содержания 6-сульфатоксимелатонина в утренней порции мочи женщин и при его концентрации, равной 41 нг/мл и ниже, диагностируют наружный генитальный эндометриоз I-II стадии.
Недостаток метода заключается в том, что он позволяет диагностировать наружный генитальный эндометриоз I-II стадии, но не дает возможности прогноза риска развития эндометриоза у женщин.
За аналог выбран патент РФ № 2558854 (дата публикации 10.08.2015) «Способ прогнозирования риска развития эндометриоза», который заключается в выделении ДНК из периферической венозной крови, типировании генетических полиморфизмов генов интерлейкинов и анализе сочетаний полиморфизмов гена интерлейкина 6 (-174 G/C IL-6), интерлейкина 1B (-511 С/Т IL-1B), интерлейкина 10 (-592 С/А IL-10), генов хемокинов фактора стромальных клеток (-801 G/A SDF1), макрофагального воспалительного протеина -1β (+1931 А/Т MIP 1β), регулятора активности нормальной экспрессии и секреции Т-клеток (-403 G/A RANTES), интерферона индуцебельного хемоаттрактанта Т-клеток (A/G I-TAC). Повышенный риск развития изолированного эндометриоза прогнозируют при выявлении комбинаций сочетания аллелей -174 С IL-6, -801 A SDF1, +1931 A MIP1β, -592 С IL-10, аллелей -801 A SDF1, -403 G RANTES, +1931 A MIP1β, -592 С IL-10, аллелей -801 A SDF1, -403 G RANTES, -511 С IL-1B, -592 С IL-10, аллелей -801 A SDF1, +1931 A MIP1β, -592 С IL-10, аллелей -174 С IL-6, -801 A SDF1, -403 G RANTES, -592 С IL-10, аллелей -801 A SDF1, А I-TAC, -511 СС IL-1B.
Недостаток метода заключается в его дороговизне, т.к. необходимо исследовать 7 различных генов.
Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования развития генитального эндометриоза на основе данных о сочетании однонуклеотидных полиморфизмов – rs713586, rs10441737 и rs887912.
Технический результат использования изобретения – получение критериев оценки риска развития генитального эндометриоза у женщин русской национальности, уроженок Центрального Черноземья на основе данных о сочетаниях генетических вариантов локусов rs713586, rs10441737 и rs887912.
В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования риска развития генитального эндометриоза, включающий:
- выделение ДНК из периферической венозной крови;
- анализ полиморфизмов генов rs713586, rs10441737 и rs887912;
- прогнозирование повышенного риска развития генитального эндометриоза у женщин русской национальности, уроженок Центрального Черноземья в случае выявления сочетания аллеля Т rs713586 с аллелем Т rs10441737 с генотипом GG rs887912.
Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза риска развития генитального эндометриоза по данным о сочетании генетических вариантов локусов rs713586, rs10441737 и rs887912.
Способ осуществляют следующим образом:
ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови  индивидуумов в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MgCl2, 10мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°С, 4000 об./мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМNaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10мг/мл) и инкубируют образец при 37°С в течение 16 часов.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об./мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -200°С. Выделенную ДНК использовали для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.
Анализ всех локусов (rs713586, rs10441737 и rs887912) осуществляют методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК. ПЦР проводилась на аппарате IQ5 (Bio-Rad) в режиме real time с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus производства фирмы «Силекс-М» и стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов, синтезированных фирмой «Синтол» с последующим анализом полиморфизмов методом дискриминации аллелей. Для дискриминации аллелей использовалась программа Bio-Rad «IQ5-Standart Edition».
Возможность использования предложенного способа для оценки риска развития генитального эндометриоза подтверждает анализ результатов наблюдений 395 женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья РФ, больных генитальным эндометриозом, и 981 человек контрольной группы. Обследование пациенток проводилось врачами гинекологического отделения и отделения вспомогательных репродуктивных технологий перинатального центра Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа. В контрольную группу включались женщины, не имеющие пролиферативных заболеваний органов малого таза и доброкачественных заболеваний молочных желез. Формирование контрольной выборки осуществлялось при профилактических осмотрах (диспансеризации). Обследование женщин проводилось врачами консультативно-диагностического отделения перинатального центра Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа.
Критерии включения в исследуемые выборки:
1. Женщины русской национальности, родившиеся в Центральном Черноземье России и не имеющие между собой родства;
2. Добровольное согласие пациенток на проведение исследования.
3. В группу больных включались индивидуумы только после установления диагноза генитального эндометриоза, подтвержденного с помощью клинических, клинико-инструментальных и клинико-лабораторных методов исследования.
Критерии исключения из исследуемых выборок:
1. Пациентки со злокачественными заболеваниями  органов малого таза и молочных желез;
2. Женщины с нерусской национальностью, родившиеся вне Центрального Черноземья;
3. Индивидуумы, отказавшиеся от участия в исследования..
Типирование молекулярно-генетических маркеров осуществлялось в лаборатории «Молекулярной генетики человека» медицинского института Белгородского государственного национального исследовательского университета.
Изучение роли комбинаций генетических вариантов rs713586, rs10441737 и rs887912 в формировании генитального эндометриоза проводилось с помощью программного обеспечения АРSampler [http://sources.redhat.com/cygwin/], использующего метод Монте-Карло марковскими цепями и байесовскую непараметрическую статистику [A Gibbs sampler for identiﬁcation of symmetrically structured, spaced DNA motifs with improved estimation of the signal length [Text] / A. V.Favorov, M. S. Gelfand, A. V. Gerasimova [et al.] // Bioinformatics. – 2005. – Vol. 21, № 10. – P. 2240-2245].
Выявлены различия в концентрациях комбинации генетических вариантов Т rs713586 с Т rs10441737 с GG rs887912 между больными с генитальным эндометриозом (51,99%) и контрольной группой (40,33%). Данное сочетание является фактором риска формирования генитального эндометриоза у женщин (p=0,000001, ОR=1,60, 95% CI 1,25-2,04).
Таким образом, результаты, полученные с помощью биоинформатического анализа, свидетельствуют о вовлеченности комбинации полиморфных вариантов генов rs713586, rs10441737 и rs887912 в формирование генитального эндометриоза. Фактором риска развития генитального эндометриоза у женщин является сочетание аллеля Т rs713586 с аллелем Т rs10441737 с генотипом GG rs887912.
В качестве примеров конкретного выполнения разработанного способа приведено генетическое обследование по локусам rs713586, rs10441737 и rs887912 трех женщин (добровольцев) русской национальности, являющихся жителями Центрального Черноземья, не имеющих среди родственников 1-й степени родства больных эндометриозом.
Пример 1. У женщины А. было выявлено сочетание аллеля  Т rs713586 с аллелем Т rs10441737 с генотипом GG rs887912. На основании этого женщина включена в группу риска по развитию генитального эндометриоза. Повторное обследование через 1 год подтвердило обоснованность прогноза. Назначен комплекс лечебных мероприятий, регулярный профилактический осмотр (посещение гинеколога раз в 6 месяцев).
Пример 2. У женщины В. было выявлено сочетание аллеля Т rs713586 с аллелем Т rs10441737 с генотипом GG rs887912. На основании этого женщина включена в группу риска по развитию генитального эндометриоза и ей назначен комплекс профилактических мероприятий по предупреждению развития данного заболевания (лечение хронических гинекологических заболеваний, рациональное питание, физическая активность, нормализация веса и психо-эмоционального состояния, регулярный профилактический осмотр (посещение гинеколога раз в 6 месяцев и др.). Повторные осмотры подтвердили эффективность проведенного комплекса профилактических мероприятий.
Пример 3. У женщины C. было выявлено сочетание аллеля C rs713586 с аллелем C rs10441737 с генотипом AA rs887912. На основании этих результатов у данной пациентки  прогнозируют низкий риск развития генитального эндометриоза, что подтверждено дальнейшим наблюдением.
Применение данного способа позволит формировать среди женщин на доклиническом этапе группы риска по развитию генитального эндометриоза и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития генитального эндометриоза.