Разнообразие Borrelia burgdorferi sensu lato в природных очагах Новосибирской области

Разнообразие Borrelia burgdorferi sensu lato в природных очагах Новосибирской области

Фоменко Н.В.1, Романова Е.В.2, Караваева Ю.Ю.3, Панов В.В.4,

Черноусова Н.Я.3, Ливанова Н.Н.4

Diversity Borrelia burgdorferi sensu lato in natural foci of Novosibirsk region

Fomenko N.V., Romanova Ye.V., Karavaeva Yu. Yu., Panov V. V.,

Chernousova N. Ya., Livanova N.N.

1 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

2 Новосибирская государственная медицинская академия, г. Новосибирск

3 Муниципальная инфекционная клиническая больница №1, г. Новосибирск

4 Институт систематики и экологии животных СО РАН, г. Новосибирск

© Фоменко Н.В., Романова Е.В., Караваева Ю.Ю. и др.

Методом ПЦР исследованы образцы от Ixodes persulcatus, кровь и ткани органов мелких млекопитающих, образцы крови человека, а также изоляты боррелий от голодных имаго. Показано, что на территории Новосибирской области распространены боррелии двух видов — B. garinii и B. afzelii. Образцы, содержащие ДНК B. garinii подгруппы NT29, преобладали среди исследованных.

Ключевые слова: боррелии, ПЦР, мелк^ млекопитающ^, Ixodes persulcatus.

PCR assays were used to test sample from Ixodes persulcatus, blood and tissues of small mammals, human blood after tick bites, as well as isolates from adult ticks. It was demonstrated the presence of two Borrelia species: B. garinii and B. afzelii. Mainly DNA B. garinii NT29 were determined.

Key words: borrelia, PCR, small mammals, Ixodes persulcatus.

УДК 616.98:579.834.114

Иксодовые клещевые боррелиозы (ИКБ) — трансмиссивные природно-очаговые заболевания, возбудителями которых являются спирохеты комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.). В настоящее время в составе комплекса выделяют 13 видов боррелий, однако патогенность доказана для Borrelia burgdorferi sensu stricto (s.s.), Borrelia afzelii, Borrelia garinii [26] и Borrelia spielmani [24]. На территории России в природных очагах с участием клещей Ixodes persulcatus и Ixodes ricinus циркулируют виды B. afzelii, B. garinii, B. burgdorferi s.s. и Borrelia valaisiana, при этом два последних вида боррелий детектированы только в образцах от I. ricinus [3, 19]. В западносибирских природных очагах ИКБ основная роль в циркуляции боррелий принадлежит таежному клещу. В ча-

стности, высокие показатели уровня инфицированно-сти I. persulcatus боррелиями (32,0%) регистрируют в приобских борах, в осиново-березовых лесах (24,0%) и северной лесостепи (27,8%); южнее уровень зараженности клещей снижается и в основном не превышает 18,5% [2, 6]. Видовой состав боррелий, циркулирующих на территории Новосибирской области, установлен в 1997 г. [22]; при идентификации изолятов спирохет из имаго I. persulcatus выявлены виды B. afzelii и B. garini. Несколько позже показано, что вид B. garinii представлен двумя подгруппами — 20047 и NT29, выявляемыми как у клещей-переносчиков, так и у мелких млекопитающих [4, 16].

Организация генома боррелий комплекса B. burgdorferi s.l. отличается не только от геномов других

спирохет, но и всех бактерий. Строение 90% плаз-мид боррелий комплекса Borrelia burgdorferi s.l. не имеет гомологии с охарактеризованными к настоящему времени плазмидами других микроорганизмов [10]. Показано, что плазмиды кодируют гены более 130 различных липопротеинов, часть из которых являются белками поверхностного слоя оболочки боррелий и иммунодоминантными антигенами. Гуморальный иммунный ответ человека на боррелиоз-ную инфекцию может быть представлен антителами к более чем 20 антигенам боррелий. При этом часть иммунодоминантных белков боррелий кодируется генами хромосомы, другие — генами внехромосом-ных плазмид [9, 10]. Состав белков-антигенов и их соотношение значительно отличаются не только у боррелий разных видов (гетерогенность ряда их поверхностных белков достигает 40%), но и в изолятах одного вида [14]. Кроме того, в процессе развития инфекции значительно изменяется уровень экспрессии некоторых иммунодоминантных белков. Поэтому спектр специфичности антител у инфицированных людей может варьировать в зависимости от вида возбудителя и, что не менее важно, у одного больного на разных стадиях инфекции [12, 14]. Ранее неоднократно отмечалось, что при использовании видов и даже штаммов боррелий, не соответствующих штамму, вызвавшему развитие болезни, могут быть получены ложноотрицательные результаты серологических тестов [12]. Получение данных о разнообразии видов боррелий, циркулирующих в природных очагах и принимающих участие в патогенезе на исследованной территории, может помочь при разработке методов диагностики ИКБ.

Детекцию ДНК боррелий проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, соответствующих концам генов 5S и 23S рРНК [4, 8, 16, 23]. Амплификация межгенного спейсера 5S—23S рРНК позволяет избежать перекрестных реакций даже с близкородственными спирохетами, поскольку данный межгенный спейсер присутствует только у представителей комплекса B. burgdorferi s.l. [11, 18, 21, 26]. Результаты анализа нуклеотидных последовательностей и полиморфизма длин фрагментов рестрикции ПЦР-продуктов (ПЦР-ПДРФ) межгенного спейсера позволили определить наличие в исследуемых образцах ДНК двух видов боррелий комплекса B. burgdorferi s.l. Однако

следует учитывать, что с использованием ПЦР без предварительного культивирования возможно проведение лишь косвенной оценки встречаемости различных видов боррелий по наличию ДНК. Филогенетический анализ последовательностей межгенного спейсера 5S—23S РНК, полученных из образцов клещей, мелких млекопитающих и людей, подтвердил, что во всех случаях детектируется ДНК борре-лий видов B.garinii и B.afzelii (рисунок). Сравнение полученных последовательностей ДНК с опубликованными ранее показало, что для относящихся к одному виду последовательностей межгенного спейсера ДНК боррелий уровень гомологии варьирует от 96 до 99% (рисунок).

Выявлено, что помимо B. afzelii подгруппы VS461, широко распространенной на территории Новосибирской области [7], встречается B. afzelii подгруппы NT28, впервые детектированной Т. Masuzawa с соавт. в Японии [17]. Позднее было показано, что подгруппа NT28 вида B. afzelii широко распространена на территории России и сопредельных стран [7]. При определении видовой принадлежности методом ПЦР-ПДРФ разделение на внутривидовые подгруппы для вида B. afzelii невозможно [7], поэтому для внутривидовой дифференцировки необходимо определение нуклеотидных последовательностей исследуемых локусов. На территории Новосибирской области при установлении видовой принадлежности методом определения нуклеотидных последовательностей ДНК B. afzelii подгруппы NT28 определена только в одном образце кожи мелкого млекопитающего, а также в двух изолятах от клещей I. persulcatus одновременно с B. afzelii подгруппы VS461.

Анализ последовательностей межгенного спейсера ДНК вида B. garinii, выявленных в образцах, собранных на территории Новосибирской области, показал, что на обследованной территории устойчиво детектируются боррелии двух генетических подгрупп вида B. garinii: NT29 и 20047. Данные генетические подгруппы широко распространены в природных очагах ИКБ на территории России. B. garinii подгруппы 20047 выявляется и в I. persulcatus, и в I. ricinus, тогда как B. garinii подгруппы NT29 в клещах I. ricinus не обнаружена [17—19]. В ходе исследования выявлены два ранее не встречавшихся варианта последовательности ДНК межгенного спейсера B. garinii подгруппы 20047.

В одном случае наблюдается делеция двух нуклеотидов (ТА) по сравнению с последовательностью типового штамма 20047 вида B. garinii, в другом — инсерция пары нуклеотидов (ТА) [8]. При сравнении последовательности ДНК, содержащей инсерцию, с имеющимися

в GenBank, найдены две аналогичные последовательности межгенного спейсера боррелий (AY772203, AY772202), изолированных от клещей Ixodes pavlovskyi, собранных

H-35

AY862886 Hm-11 AY741544

2 8

7 9

B568

AY741546 _B. garinii NT29

4N . I-29

AY862885 . U15

AY741545

B. garinii 20047

H-82

AY862888

U120

AY741547

1N I-15

AY862887 H-220 AY862889 H3-23 AY741543 _ B. afzelii

U778

_ B. afzelii

NT28

Ip-2994

5 5 9

2 4

_Rut

_ChY13p

_Fi24f

_B. afzelii

(AY573192) . H-117 AY862890 . B. afzelii (L30135) I-58

AY603351

217

Ip-21

VS461T

11N B.

burgdorferi s.s. B31

_ B. japonica HO 14

B. andersonii

0,01

Филогенетическое дерево, построенное на основании нуклеотидных последовательностей межгенного спейсера 5S—23S РНК боррелий комплекса Borrelia burgdorferi s.l. с применением пакета программ Mega 3.0. [15]. В скобках указаны номера GenBank для ранее опубликованных

4

6

4

5

6

6

8

3

последовательностей, без скобок — ванные

на территории Казахстана. Кроме часто определяемых последовательностей межгенного спейсера 5S—23S РНК, детектирован вариант, о котором сообщалось лишь дважды. Последовательность образца Rut 217, детектированная в одном образце крови красной полевки, гомологична последовательностям межгенного спейсера боррелий, изолированных от I. persulcatus и Haemaphysalis flava в Китае и Японии [13]. При сравнении нуклеотидной последовательности Rut 217 (AY643482) с ранее опубликованными установлено, что уровень гомологии между данной последовательностью и последовательностью B. afzelii (L30135) составляет 97%.

Исследованы 462 образца крови больных, госпитализированных в муниципальную инфекционную Клиническую больницу № 1 г. Новосибирска и инфекционное отделение центральной клинической больницы СО РАН. ДНК-фрагменты, соответствующие вариабельному межгенному спейсеру боррелий, обнаружены в 63 образцах (таблица). ДНК боррелий детектирована в первый месяц после присасывания клещей как у больных с эритемной формой ИКБ, так и у больных с подтвержденным диагнозом клещевого энцефалита (КЭ). У 129 больных с эритемной формой ИКБ была зафиксирована первая из трех условно выделяемых стадий ИКБ [9], в этой группе ДНК боррелий детектирована в 40 случаях, что составило 31,0%. Определе-

номера ОепБапк последовательностей, полученных в данной работе. Без номеров приведены недепониро-последовательности. Шкала представляет 1% дивергенции

ние видовой принадлежности показало, что в пробах крови присутствовали ДНК видов B. garinii и B. afzeШ. В 13 образцах ДНК выявлена B. qfZeШ, в 47 — B. gari-пИ (таблица). Одновременное присутствие ДНК В. gqrinii подгруппы МТ29 и В. qfzeШ обнаружено в 3 образцах крови. В пробах крови 70 пациентов с диагнозом КЭ ДНК боррелий детектирована в 15,7% случаев. У больных, госпитализированных с подозрением на КЭ

(в дальнейшем диагноз не подтвержден), ДНК боррелий обнаружена в 11,3% случаев. В целом в образцах крови всех исследованных больных преимущественно детектирована ДНК В. gqrinii. По литературным данным, этот вид боррелий изолирован при посевах био-птатов из эритем больных ИКБ в Хабаровском крае [20]. Анализ клиники ИКБ в различных регионах России указывает на преобладание неврологической симптоматики [1, 6]. Принято считать, что с неврологическими проявлениями ИКБ связывают вид В. gqrinii, однако в последнее время неоднократно сообщалось об отсутствии четкой взаимосвязи между видовой принадлежнстью и клиническими симтомами. В приведенных исследованиях в крови больных с проявлениями поражения центральной нервной системы (ЦНС) была обнаружена ДНК В. gqrinii подгруппы МТ29, как в случае моноинфекции ИКБ, так и в случае одновременного заболевания ИКБ и КЭ.

Абсолютное число образцов, в которых детектирована ДНК боррелий (% ± mp от числа типированных) по видам и генетическим подгруппам B. burgdorferi s.l., выявленным в Новосибирской области с 1999 по 2005 гг.

Источник выделения Число образцов B. garinii подгруппы NT29 B. garinii подгруппы 20047 B. afzelii B. garinii подгруппы NT29 + 20047 B. afzelii подгруппы NT28 + VS461 B. afzelii + + B. garinii подгруппы NT29

Люди

Кровь 462

Мелкие млекопитающие

Кожные биоптаты, 740 32 12 13 3

кровь, мочевой пузырь

Ixodes persulcatus

Голодные имаго,

частично напитав- 945 33 23 18 8

шиеся личинки, ним-

фы

Изоляты B. burgdorferi s.l.

Имаго 9 2 2 2 1 2

I. persulcatus

Всего 2156 107 44 46 1 2 14

Примечание . mp — ошибка доли, %.

Ранее изоляцией боррелий из тканей мелких млекопитающих показано, что последние являются резер-вуарными хозяевами как боррелий вида B. afzeШ, так и вида B. garinii [3]. Исследования, направленные на выявление видового разнообразия боррелий, циркулирующих в природных очагах ИКБ Новосибирской области, позволили установить следующее. У мелких млекопитающих, являющихся основными прокорми-телями преимагинальных фаз развития таежного клеща, ДНК B. garinii подгруппы МТ29 детектируется достоверно чаще, чем ДНК B. garinii подгруппы 20047 (р < 0,01) и B. afzelii (р < 0,05). При этом ДНК B. garinii подгруппы МТ29 выявлена в образцах крови и тканей органов (мочевой пузырь), что свидетельствует о развитии генерализованной инфекции в организме зверьков. Известно, что именно на стадии дессиминации такие млекопитающие передают возбудителей практически всем переносчикам [5, 25]. В процентном соотношении число животных, у которых одновременно диагностированы два вида боррелий, достоверно не отличалось от такового для имаго I. persulcatus, а частота одновременного заражения B. afzeШ и B. garinii подгруппы 20047 почти одинакова [4, 16].

По данным микроскопии, встречаемость боррелий в таежных клещах на территории Новосибирской области составляет от 12,4 до 25,0% [6]. При микроскопическом исследовании фиксированных и витальных препаратов боррелии были выявлены как у голодных имаго, собранных с растительности, так и у частично или полностью напитавшихся преимагинальных фаз таежного клеща. Распределение боррелий в индивидуальных зараженных клещах всех фаз крайне неравномерно и варьирует в очень широких пределах. У зараженных личинок и нимф большинство составляли особи со средним и высоким содержанием боррелий [6].

В образцах голодных имаго таежного клеща, собранных с растительности, так же как в образцах личинок и нимф, снятых при осмотрах с мелких млекопитающих, выявлены ДНК двух видов боррелий — B. garinii и B. afzeШ. ДНК B. garinii детектирована в 68,3% образцов. В 21,9% образцов определена ДНК вида B. afzeШ, что сопоставимо с долей (21,6%) обнаружения ДНК вида B. afzeШ в образцах от мелких млекопи-

тающих. Соотношение образцов, в которых выявлены ДНК генетических групп B. garinii ЭТ29 и 20047, приблизительно составляет 1:1. Следует отметить, что в исследованных образцах мелких млекопитающих и клещей ДНК B. afzeШ выявлена только в сочетании с ДНК B. garinii подгруппы МТ29. Помимо выявления ДНК боррелий методом ПЦР, в 2005 г. была проведена изоляция боррелий от голодных имаго таежных клещей на среде В8К-И. При посеве образцов от 50 клещей I. рersulcatus получено девять изолятов, результаты по определению видовой принадлежности боррелий приведены в таблице. Как при определении видовой принадлежности боррелий, изолированных от клещей на питательную среду, так и при прямой детекции методом ПЦР детектировано два вида боррелий — B. afzeШ и B. garinii (см. рисунок, образцы Ш, 4М, 1Ш).

Таким образом, в природных очагах ИКБ, расположенных на территории Новосибирской области, зафиксированы два вида боррелий B. garinii и B. afzeШ. Генетические варианты этих видов представлены не только дальневосточными B. garinii подгруппы МТ29 и B. afzeШ подгруппы МТ28, но и европейскими B. garinii подгруппы 20047 и B. afzeШ подгруппы У8461. На репрезентативной выборке показано, что ДНК вида В. garinii подгруппы МТ29 достоверно чаще выявляется в образцах клещей, мелких млекопитающих и, что немаловажно, в крови людей, подвергшихся нападению таежных клещей.

Литература

1. Воробьева Н.Н. Клиника, лечение и профилактика иксо-довых клещевых боррелиозов. П., 1998.

2. Коренберг Э.И. Проблемы клещевых боррелиозов. М., 1993.

3. Коренберг Э.И., Горелова Н.Б., Ковалевский Ю.В. Основные черты природной очаговости иксодовых клещевых боррелиозов России // Паразитология. 2002. № 3. С. 177—191.

4. Ливанова Н.Н., Фоменко Н.В., Добротворский А.К. и др. Участие фоновых видов мелких млекопитающих в циркуляции боррелий в лесостепном Приобье // Сиб. экол. журн. 2004. № 11. С. 567—570.

5. Наумов Р.Л., ВасильеваИ.С., Гутова В.П. и др. Лабораторная модель паразитарной системы болезни Лайма // Мед. паразитология и паразитар. болезни. 2002. № 1. С. 40—43.

6. Оберт А.С., ДроздовВ.Н., Рудакова С.А. Иксодовые кле-

щевые боррелиозы. Нозогеографические и медико-экологические аспекты. Новосибирск: Наука, 2001. 110 с.

7. Фадеева И.А., Нефедова В.В., Коренберг Э.И., Горелова Н.Б. Генетические варианты Borrelia afzelii — одного из возбудителей иксодовых клещевых боррелиозов // Молекуляр. генетика, микробиология и вирусология. 2005. № 3. С. 18—22.

8. ФоменкоН.В., РарВ.А., РомановаЕ.В. и др. Молекулярно-генетический анализ инфекций, переносимых клещами, у больных Новосибирской области // Молекуляр. медицина. 2005. № 4. С. 48—52.

9. Brouqui P., Bacellar F., Baranton G. et al. Guidnelines for the diagnosis of tick-borne bacterial diseases in Europe // Clin. Microbiol. Infect. 2004. V. 10. P. 1108—1132.

10. Casjens S., Palmer N., van Vugt R. et al. A bacterial genome in flux: the twelve linear and nine circular extrachromosomal DNAs in an infectious isolate of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi // Mol. Microbiol. 2000. V. 35. P. 490—516.

11. Derdakova M., Beati L., Petko B. et al. Genetic variability within Borrelia burgdorferi sensu lato genospecies established by PCR-strand conformation polymorphism analysis of the rrlA-rrlB intergenic spacer in Ixodes ricinus ticks from the Czech republic // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 509—516.

12. Dressler F., Ackermann R., Steere A.S. Antibody responses to the three genomic groups of Borrelia burgdorferi in European Lyme borreliosis // J. Infect. Dis. 1994. V. 169. P. 313—318.

13. Hauser U., Krahl H., Peters H. et al. Impact of strain heterogeneity on Lyme disease serology in Europe: comparison of enzyme-linked immunosorbent assays using different species of Borrelia burgdorferi sensu lato // J. Clin. Microbiol. 1998. V. 36. P. 427—436.

14. Ishiguro F., Takada N., Masuzawa T. Molecular evidence of the dispersal of Lyme disease Borrelia from the Asian continent to Japan via migratory birds // Jpn. J. Infect. Dis. 2005. V. 58. P. 184—186.

15. Kumar S., Tamura K., NeiM. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment // Br. Bioin. 2004. V. 5. P. 150—163.

16. Livanova N.N., Morozova O.V., Morozov I.V. et al. Characterization of Borrelia burgdorferi sensu lato from Novosibirsk region (West Siberia, Russia) based on direct PCR // J. Med. Epidemiol. 2003. V. 18. P. 1155—1158.

17.Masuzawa T., Komikado T., Iwaki A. et al. Characterization of Borrelia sp. isolated from Ixodes tanuki, I. turdus, and I. columnae in Japan by restriction fragment length polymorphism of rrf (5S)-rrl (23S) intergenic spacer amplicons // FENS Microbiol. Letter. 1996. V. 142. P. 77—83.

18.Masuzawa T. Terrestrial distribution of the Lyme borreliosis agent Borrelia burgdorferi sensu lato in East Asia // Jpn. J. Infect. Dis. 2004. V. 57. P. 229—235.

19.Masuzawa T., Kharitonenkov I.G., Kadosaka T. Characterization of Borrelia burgdorferi sensu lato isolated in Moscow province-a sympatric region for Ixodes ricinus and Ixodes persulcatus // Int. J. Med. Microbiol. 2005. V. 294. P. 455— 64.

20.Medianikov O.Y., Ivanov L., Zdanovskaya N. et al. Diversity of Borrelia burgdorferi sensu lato in Russian Far East // Microbiol. Immunol. 2005. V. 49. № 3P. 191—197.

21. Postic D., Assous M., Grimont P. et al. Diversity of Borrelia burgdorferi sensu lato evidenced by restriction fragment length polymorphism of rrf(5S)-rrl(23S) intergenic spacer amplicons // Int. J. Syst. Bacteriol. 1994. V. 44. P. 743—752.

22. Postic D., Korenberg E., Gorelova N. et al. Borrelia burgdorferi sensu lato in Russia and neighbouring countris: high incidence of mixed isolates. // Res. Microbiol. 1997. V. 148. P. 691—702.

23. Rar V.A., Fomenko N.V., Dobrotvorsky A.K. et al. Tickborne Pathogen Detection, Western Siberia, Russia. // Emerg. Inf. Dis. 2005. V. 11. P. 1708—1715.

24. Richter D., Schlee D., Allgower R. et al. Relationship of a novel Lyme disease spirochete Borrelia spielmani sp.nov., with its hosts in Central Europe // Appl. environmen.l mi-crobiol. 2004. V. 70. P. 6414—6419

25. Shih C., Pollack R., Telford S. et al. Delayed dissemination of Lyme disease spirochetes from the site of deposition in the skin of mice // J. Infect. Dis. 1992. V. 166. P. 827—831.

26. Wang G., van Dam A., Schwartz I. et al. Molecular typing of Borrelia burgdorferi sensu lato: taxonomic, epidemiological, and clinical implications // Clinical Microbiology Reviews. 1999. V. 12. P. 633—653.

Поступила в редакцию 06.01.2006 г.