СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ГРИППА ТИПА А У ПТИЦ
METHOD FOR DETECTION OF SPECIFIC ANTIBODIES TO TYPE A INFLUENZA VIRUS IN BIRDS

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, эпизоотологии, а именно к способам выявления специфических антител [AT] к вирусу гриппа [ВГ] типа A у птиц.
Известны способы выявления специфических AT к ВГ в сыворотке крови птицы с использованием тестов реакции задержки гемагглютинации [РЗГА] (Kilbourne, E.D. 1987. Influenza. Plenum Press, New York) и иммуноферментного анализа [ИФА] (Snyder, D.B., W.W.Marquardt, F.S.Yancey, P.K.Savage. 1985. An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibody against avian influenza virus. Avian Dis. 29:136-44).
Однако данные тесты не позволяют проводить обнаружение AT к ВГ в желтке яйца.
Наиболее близким в техническом отношении и принятым за прототип является способ обнаружения AT к вирусу Ньюкаслской болезни птиц в желтке яйца с использованием тестов РЗГА и ИФА (Czifra G, М Nilsson, D.J.Alexander, R.Manvell, S.Kecskemeti, B.E.Engstrom. Detection of PMV-1 specific antibodies with a monoclonal antibody blocking enzyme-linked immunosorbent assay. Avian Pathol. 1996 Dec; 25(4): 691-703). Авторами показана устойчивая корреляция титра AT к вирусу Ньюкаслской болезни в желтке яйца с титром AT в сыворотке крови птицы.
Однако данные тесты не позволяют выявлять AT к ВГ птиц.
Задачей заявляемого решения является расширение арсенала диагностических методов для выявления специфических антител к вирусу гриппа у птиц.
Поставленная задача решается тем, что в способе выявления специфических антител к вирусу гриппа типа A у птиц, включающем исследование биоматериала от птицы в РЗГА, в качестве биоматериала используют желток яйца птицы.
Сущность изобретения заключается также в том, что полученный в РЗГА титр AT в желтке яйца пересчитывают в эквивалент титра AT в сыворотке крови с использованием коэффициента пересчета: 1,66 - для кур, 1,55 - для уток, при условии, что для исследования птицы использовали желток яйца 1-2-дневной кладки.
Способ осуществляют следующим образом.
Материал: 1-2-суточные яйца диких уток и гусей, кур. Для исследования использовали желток яиц.
Отбор материала: из гнезда/кладки отбирают 1-2 суточные яйца (с чистой скорлупой).
Подготовка проб желтка: желток яйца смешивают с фосфатно-солевым буфером [ФСБ] 0,01M pH 7,2 в соотношении 1:10.
Для постановки РЗГА реакцию проводят по следующему протоколу:
- в первую колонку лунок на планшете вносят по 0,5 мл смеси испытуемых проб 1:10 с ФСБ;
- в остальные лунки планшета вносят по 0,25 мл ФСБ;
- готовят последовательные двукратные разведения желтка яиц 1:20, 1:40… до 1:2660, путем перенесения 0,25 мл суспензии желтка из предыдущей лунки в последующую с предварительным ресуспендированием, 0,25 мл из последней лунки утилизируют;
- добавляют во все лунки 0,25 мл смеси, содержащей по 4 ГАЕ антигена ВГ. Дозу антигена 4 ГАЕ рассчитывают и контролируют по методике, описанной в «Методических указаниях по лабораторной диагностике болезни Ньюкасла и классической чумы птиц (гриппа птиц) - г.Покров, 1972». По данной же методике проводят контроль спонтанной агглютинации эритроцитов и контроль желтка на агглютинацию;
- встряхивают;
- экспозиция 30 минут при 18-22°C;
- добавляют во все лунки по 0,5 мл 1%-ной взвеси куриных/утиных эритроцитов;
- встряхивают;
- экспозиция при 18-22°C;
- учет реакции через 30,40 и 45 минут;
- за титр AT принимают максимальное разведение желтка яиц, которое обеспечило отсутствие агглютинации.
Для иллюстрации способа и обоснования расчета коэффициента пересчета титра AT в желтке яйца в титр AT в сыворотке крови приведены примеры:
Пример 1
Для оценки уровня корреляции титров антител в сыворотке крови и желтке яйца был проведен опыт. Для этого коммерческой вакциной против гриппа птиц типа A было однократно привито 20 домашних уток 2-3-летнего возраста и 20 кур-несушек. Через 25 дней после вакцинации от птиц, содержащихся изолированно, отобрали по одному 1-2-дневному яйцу (известно, что с возрастом яйца титр AT в его желтке снижается). Полученные пробы исследовали в РЗГА. Результаты исследований приведены в таблице 1.
Расчеты статистических величин проводили с использованием программы Microsoft Excel 2002.
2
Из данных, представленных в таблице 1, можно заключить, что AT к ВГ в желтке яйца обнаруживали во всех случаях их обнаружения в сыворотке крови, кроме тех случаев, когда титр AT в сыворотке крови был 2log и ниже. Данная закономерность подтверждена расчетом показателей коэффициентов корреляции содержания AT к ВГ в сыворотке крови и желтке яйца для кур и уток, равных 0,92 и 0,94 соответственно. Для определения коэффициентов пересчета содержания AT в желтке яйца в титр AT в сыворотке крови рассчитаны средние арифметические величины и определена достоверность их разницы на основании критерия Стьюдента. Коэффициентом пересчета принято частное титра AT в сыворотке крови и титра AT в желтке яйца: 1,66 - для кур и 1,55 - для уток.
Приведенные результаты исследований показывают, что использование желтка яйца в качестве биоматериала для выявления содержания у домашних кур и уток AT, специфических к ВГ, воспроизводит результаты серологического исследования птиц с использованием в качестве материала сыворотки крови.
Пример 2
Для проведения исследований в Чановской озерной системе НСО было отловлено 100 особей птиц рода (Anas) речные утки: 35 - вида Кряква, 25 - Шилохвость, 20 - Чирок-свистунок, 15 - Серый гусь, 5 - Свиязь. Отлов проводили при взлете с гнездовья, с последующим отбором у птиц проб крови и 1-2-дневного яйца из кладки. Сыворотку крови и желток яиц исследовали в РЗГА на наличие антител к ВГ типа А. Из 100 исследованных в РЗГА птиц антитела к гриппу в сыворотке крови выделили у 9 особей, желтки 8 яиц, добытых из кладки, этих птиц содержали антигемагглютинины [аГА]. Результаты исследований приведены в таблице 2.
Данные, представленные в таблице 2, подтверждают полученный ранее коэффициент корреляции титров AT к ВГ в сыворотке крови и желтке яйца - 0,94, а также коэффициент пересчета титра AT к ВГ типа A в желтке яйца в титр AT в сыворотке крови - 1,54; следовательно, и то, что использование желтка яйца в качестве биоматериала для выявления содержания у птиц AT, специфических к ВГ, воспроизводит результаты серологического исследования диких уток с использованием в качестве материала сыворотки крови.
Таблица 2
Корреляция титра специфических AT к вирусу гриппа типа A в желтке яиц и сыворотке крови птиц рода (Anas) речные утки
вид материала
номер птицы
среднее арифметическое, M±m*
коэффициент корреляции титра AT в сыворотке крови и желтке яйца, r
коэффициент пересчета титра AT в желтке в титр AT в сыворотке крови
1
2
3
4
5
6
7
8
9
титр антител log<sub>2</sub>
сыворотка крови
5
2
3
5
7
6
5
4
3
4,44±0,53
0,94
1,54
желток яиц
4
-
2
3
5
4
3
3
2
2,89±0,48
Примечание: (-) - антигемагглютинины в исследованном материале не выявлены;
* - разница средних величин достоверна (Р<0,05).