Возможности высокотехнологичной идентификации возбудителей острых кишечных инфекций в Санкт-Петербурге

ПЕРЕДОВАЯ СТАТЬЯ

УДК 616.9

ВОЗМОЖНОСТИ ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ОСТРЫХ

КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ В САНКТ-ПЕТЕРБУРГЕ

А.А. Яковлев1, В.Б. Мусатов1, С.И. Котлярова1, В.А. Неверов2, З.Н. Кинго3, И.П. Федуняк3,

Э.Н. Лукашевич3

хКафедра инфекционных болезней и эпидемиологии СПбГУ, 2Клиническая инфекционная больница им. С.П.Боткина, 3Кафедра инфекционных болезней СПбМАПО

© Коллектив авторов, 2010 г.

FEATURES HIGH-TECH IDENTIFICATION OF PATHOGENS ACUTE INTESTINAL INFECTIONS

AT ST. PETERSBURG

Yakovlev, A.A.1, Musatov V.B.1, Kotlyarova S.I.1, Neverov V.A.2, Kingo Z.N.3, Fedunyak I.P.3,

Lukashevich E.N.3

department of Infectious Diseases and Epidemiology, St. Petersburg State University, Russia;

2Botkin Clinical Infectious Diseases Hospital, St. Petersburg, Russia;

3Department of Infectious Diseases St. Petersburg Medical Academy of Postgraduate Studies, Russia

Проблема идентификации возбудителей острых кишечных заболеваний остается актуальной в настоящее время в Санкт-Петербурге. В последние 2-3 года значительно уменьшился рост инфекционных диарей бактериальной природы. Стартовые исследования с помощью новых технологий молекулярной детекции вирусных агентов в фекалиях (ОТ-ПЦР и иммуноферментный анализ) позволили выявить большую долю вирусных агентов. Эти данные свидетельствуют о новых возможностях верификации диарейных заболеваний, в том числе вирусной природы.

Ключевые слова: вирусная диарея, ПЦР-диагностика, ИФА (иммуноферментный анализ), ротавиру-сы, норовирусы, астровирусы, аденовирусы.

Resume. The problem of identification of acute intestinal diseases activators remains actual in St.-Petersburg now. Last 2-3 years number of bacterial infectious diarrheas has considerably decreased. The carried out starting researches with using new technologies molecular detection virus agents in excrements (RT-PCR and ELISA) have allowed to reveal the big percent of virus agents. The data shows the new possibilities of verification diarrheas diseases, including the virus nature.

Keywords: virus diarrheas, RT-PCR, ELISA, rotaviruses, noroviruses, astroviruses, adenoviruses.

Заболеваемость инфекционной диареей в Санкт-Петербурге постоянно регистрируется во все времена года. Этиологическая расшифровка острых кишечных инфекций (ОКИ) в настоящее время сравнительно низка и составляет 18-20%. Этот показатель носит стабильный характер как в инфекционной больнице, так и в лабораториях Роспотребнадзора Санкт-Петербурга.

В 2009 г. у 21450 человек взрослого населения города зарегистрирована инфекционная диарея. Из них практически половина — 49,7% (10659 человек) была госпитализирована в клиническую инфекционную больницу им. С.П.Боткина. После стационарного обследования у 21,7% госпитализированных диагноз направления «острая кишечная инфекция» был отменен, так как были выявлены соматические заболевания, что, в свою очередь свидетельствует о трудностях клинической дифференциальной диагностики диарейного синдрома на догоспитальном этапе. У 28% больных в соотве-

тствии с клинико-лабораторными данными верифицирован диагноз кишечной инфекции. У детей в 2009 г. складывалась аналогичная картина: 21730 случаев регистрации ОКИ выполнено за год, из них госпитализировано больше половины — 56,4% (12250) пациентов. Таким образом, в последнее время число госпитализированных в Санкт-Петербурге больных с установленным диагнозом инфекционной диареи составляло 40-60% от числа больных ОКИ детей и 23-28% от числа взрослых пациентов с ОКИ. С учетом вышесказанного статистические данные инфекционного стационара для взрослых отражали общую ситуацию по заболеваемости кишечными инфекциями в Санкт-Петербурге и представляли репрезентативную выборку для достоверного мониторинга эпидемиологической ситуации по острым кишечным инфекциям.

В инфекционном стационаре для детекции возбудителя проводили тотальное бактериологическое обследование на патогенную группу возбуди-

вддовдсеэгее ок|  нсиризимюемъе ОК1

Рис. 1. Динамика соотношения верифицированных и нерасшифрованных случаев ОКИ в КИБ им. С.П.Боткина

Верифицированные бак. ОКИ  Неверифицированные ОКИ  Вирусные ОКИ

Рис. 2. Удельный вес ротавирусной инфекции среди диарейных заболеваний.

телей, куда входили различные типы шигелл, сальмонелл, эшерихий. В соответствии с клиническими, эпидемиологическими показаниями и по назначению врача выполнялись исследования на иерси-ниозы, кампилобактериоз, холеру, ботулизм, а также на широкий спектр условно-патогенных микроорганизмов при пищевых токсикоинфекциях.

Бактериологическая лаборатория клинической инфекционной больницы с 2006 года участвует в международной программе «Микробиологический мониторинг и эпидемиологический анализ ан-тибиотикорезистентности микроорганизмов с использованием компьютерной программы WHONET», принимает участие в системе федерального контроля качества микробиологических исследований. В настоящее время в клинической инфекционной

больнице им. С.П.Боткина используются заводские стандартные высококачественные среды, современные автоматические бактериологические анализаторы. Однако несмотря на хорошую оснащенность, верификация инфекционной диареи остается весьма низкой и тенденция к увеличению нерасшифрованной этиологии диареи ежегодно растет (рис. 1). Этот парадокс требовал изучения.

При анализе нозологической структуры ОКИ в клинической инфекционной больнице им. С.П.Боткина установлено, что в 2009 г. выявляе-мость патогенной флоры (шигеллезы, сальмонел-лезы) была крайне мала и достигала всего 4—6%. Условно-патогенная флора составляла всего 15-16% среди общего числа диарейных заболеваний. В целом в 2003-2009 гг. преобладающее боль-

Н евериф иц. v-s. Бактериальные ОКИ

Неверифиц. vs. Вирусные ОКИ

BdpyGH. ОКИ

Рис. 3. Корреляция между верифицированными и неверифицированными ОКИ

шинство случаев ОКИ (50-75%) оставалось не уточненным, как показано на рисунках 1 и 2. При этом отчетливо видно, что в годы эпидемического подъема острой дизентерии (1993 и 1994 гг.) число бактериологически подтвержденных случаев заболевания достигало 48,0-60,5%, что позволяет считать систему бактериологического контроля вполне полноценной. Но с тех пор (1994 г.) появились изменения в этиологической структуре заболеваемости ОКИ. Бактериальные возбудители постепенно уступают лидирующие позиции вирусным агентам. Этот феномен также наблюдается во многих странах Европы, Северной Америки, Азии [2, 3, 5, 6].

Внедренная в 1999 г. методика определения ро-тавирусной инфекции позволила несколько улучшить расшифровку диарейных заболеваний. В 2007 г. верифицировано 505 случаев ротавирус-ной инфекции, в 2008 — 327 и в 2009 году 441 случай, что составило 6,1%, 4,4% и 5,2% соответственно (рис. 2).

Однако по сравнению с ежегодным общим числом поступающих пациентов эта цифра крайне мала. Важно отметить, что при анализе случаев ОКИ в 2009 г. (рис. 3) наблюдалась отчетливая прямая корреляционная связь (р=0,001) между неверифицированными ОКИ и вирусными диарейны-ми заболеваниями и отсутствие таковой между неверифицированными и бактериальными кишечными инфекциями [7]. Указанные данные свидетельствовали о том, что доминирующее число больных с диагнозом ОКИ неустановленной этиологии, на самом деле, составляли пациенты с вирусными диареями.

В 2008 г. в рамках дополнительного оснащения на основании распоряжения Губернатора Санкт-Петербурга было дополнительно закуплено оборудование, и с внедрением в октябре 2009 г. новых технологий молекулярной детекции вирусных

агентов в фекалиях (ОТ-ПЦР и иммунофермен-тный анализ) открылась новая картина заболеваемости диарейными инфекциями. Вирусные диареи, длительное время остававшиеся «теневыми», не расшифрованными и даже не диагностированными как «вирусные заболевания», стали выявляться, благодаря чему мы получили данные, соответствующие мировым трендам в экономически развитых странах с умеренным климатом [1, 4, 5].

В 2010 г. было обследовано 430 пациентов с использованием бактериологического и молеку-лярно-биологического видов исследования. Методом ОТ-ПЦР в реальном времени обследовано 294 пациента. У 171 из 294 установлена этиологическая причина заболеваний, что составило 58,2% расшифрованных случаев (рис. 4). Среди них у 115 человек выявлены норовирусы, у 18 — ротавиру-сы, у 7 — аденовирусы.

Бактериальная этиология ОКИ установлена у немногих пациентов: кампилобактериоз у 13 человек, шигеллез — у 10 и сальмонеллез — у 3. Данные в таблице представлены в процентном отношении.

Метод иммуноферментного анализа был использован у 136 пациентов. Из них в 33% случаев зарегистрированы аденовирусы, у 16% пациентов обнаружены астровирусы и у 11% — ротавирусы (рис. 6).

В ряде случаев удалось идентифицировать кишечную микст-флору, что открывает новую главу для последующего изучения условий и взаимодействия двух патогенных агентов одновременно. Особенно большой научный и практический интерес представляет микст-вирусно-бактериальные кишечные инфекции. В нашем наблюдении эти случаи составили 4,7%, а именно: у 4 пациентов выявлены шигеллы и норовирусы, у 3 больных -кампилобактер и норовирусы и у 1 — шигелла и норовирус.

2.3-

4 4 3,4 1

6,1-

\41,8

39,1

отрицательный норовирусы

ротавирусы

аденовирусы

кампилобактер

ш и геллы

сальмонеллы

Рис. 4. Выявляемость возбудителей (в %) из кишечника у больных ОКИ методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени

11,20%

16%

39ßÜ%

Отриц. Результат  аденовирусы

астровирусы

ротавирусы

33%

Рис. 5. Определение возбудителей методом ИФА

Микст-вирусные случаи имели несколько больший удельный вес (7,3%), чем микст-вирусно-бакте-риальные (4,7%) заболевания. У 9 человек одновременно определено 2 вируса (аденовирусы + ротавирусы), у 3 пациентов — аденовирусы и астровирусы.

Таким образом, среди возбудителей вирусных диарей первое место занимают норовирусы — 46,9% (115 случаев заболеваний), второе — аденовирусы 21,2% (52 пациента), третье — ротавирусы 13% (32 случая) и четвертое — астровирусы 6% (15 пациентов).

Проведенное в этот же период (январь-февраль 2010 г.) «классическое» бактериологическое исследование у 456 человек потребовало выполнения 1197 посевов на различные среды. Бактериальные возбудители выявлены в 4,6% случаев, условно-патогенная флора — в 15,8%. В конечном итоге, удалось идентифицировать возбудителей только в 20,4% посевов.

При сравнении двух подходов биологической индикации возбудителей кишечных инфекций было обнаружено, что при «классическом» бактериологическом исследовании было верифицировано 20,4% случаев ОКИ, в то время как при использовании ПЦР-диагностики возбудители ОКИ обнаружены в 58,2% случаев, при применении ИФА — в 60,2% случаев. Полученные данные подтверждают высокую эффективность новых технологий, позволяющих увеличить расшифровку диарейных заболеваний более чем в 2,5 раза.

Мы получили стартовые данные о том, что комплексное бактериологическое, молекулярно-

биологическое и иммуноферментное обследование пациентов на госпитальном этапе может дать более четкое представление о структуре ОКИ в Санкт-Петербурге.

выводы

1. Внедрение новых технологий: ПЦР-диагностики и метода ИФА в кале обеспечивает значительное увеличение верификации диарейных заболеваний;

2. Использование молекулярно-биологических технологий и ИФА для детекции агентов ОКИ даст возможность своевременно корректировать этиот-ропную терапию, отменять антибактериальные препараты при исключении бактериальных возбудителей;

3. Терапия, максимально адекватная этиологии диарейных заболеваний, позволит избежать частого формирования дисбактериоза у пациентов и замедлит развитие быстро распространяющейся резистентности к антибиотикам в микробных популяциях у людей.

ЛИТЕРАТУРА

1. Fischer Т.К., Eugen-Olsen J., Pedersen A.G., Molbak К., Bottiger В., Rostgaard К., Nielsen N.M.: Characterization of rotavirus strains in a Danish population: high frequency of mixed infections and diversity within the VP4 gene of P[8] strains.//! Clin. Microbiol. 2005, 3 (3)1099-104. Plumbed Abstract.

2. Mitchell D.K. (November 2002). "Astrovirus gastroente-ritis"//The Pediatric Infectious Disease Journal 21 (11): 1067-9. doi: 10.1097/01.inf.0000036683.11146x7 (inactive 2009-12-18). PMID 12442031.

3. Patel M.M., Hall A.J., Vinjñ J., Parashar U.D. (January 2009). "Noroviruses: a comprehensive review'V/Journal of Clinical Virology : the Official Publication of the Pan-American Society for Clinical Virology 44 (1): 1-8. doi: 10.1016/j.jcv.2008.10.009. PMID 19084472.

4. Enriqueta R., Isabelll W., Javier C., Joaquin V et al. Acute viral gastroenteritis: proportion and clinical relevance of multiple infections in Spanish children.//J. Med. Microbiol. 2003, 52:435-440. PubMed Abstract

5. Ruuska Т., Vesikari T. (1990). "Rotavirus disease in Finnish children: use of numerical scores for clinical severity of diarrhoeal episodes"// Scand. J. Infect. Dis. 22 (3): 259-67. doi: 10.3109/00365549009027046. PMID 2371542.

6. Speelman P. Acute diarrhoeal illness — a global perspective // The management of acute diarrhoea: current controversies — and best practice. Materials of satellite symposium. 9 United European Gastroenterology Week. - Amsterdam, 2001.

7. Yakovlev A.A. VIII Nordic-Baltic congress on infection diseases, "Well-known infections - the hottest features of diagnostics and treatment".- Saint-Petersburg, Russia-September 23-26, 2009.