ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА НА ОСНОВЕ ЛАНТИОНИНСИНТЕТАЗА C-ПОДОБНОГО БЕЛКА 2
MEDICINES BASED ON LANTIONINE SYNTHETASE OF C-LIKE PROTEIN 2

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с 119(e) Раздела 35 Кодекса законов США по предварительной заявке на выдачу патента США №62/068322, поданной 24 октября 2014 г., и предварительной заявке на выдачу патента США №62/101164, поданной 8 января 2015 г., полное содержание которых включено в настоящий документе посредством ссылки.
заявление касательно ИССЛЕДОВАНИЯ, финансируемого из федерального бюджета
Настоящее изобретение было реализовано частично при поддержке правительства США от Национального института здравоохранения США в соответствии с грантом SBIR (изучение рационализаторских предложений от небольших фирм) 1R43DK097940-01A1 и грантом STTR (передача технологии от небольших фирм) 1R41DK099027-01A1, выданных компании BioTherapeutics Inc. Правительство США имеет определенные права на настоящее изобретение.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к области медицинского лечения заболеваний и расстройств. Более конкретно, настоящее изобретение относится к классам биологически активных соединений, которые лечат и предупреждают воспалительные и связанные с иммунной системой заболевания, такие как, помимо прочего, воспалительное заболевание кишечника, ревматоидный артрит, псориаз, рассеянный склероз и диабет 1 типа, а также хронические воспалительные заболевания и расстройства, такие как резистентность к инсулину, нарушение механизма усваивания глюкозы, преддиабет, диабет 2 типа и связанное с ожирением воспаление.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
in vivo
in vitro
Лантионин C-подобный белок 2 (LANCL2) (также называемый «лантионинсинтетаза C-подобный белок 2» или «лантионинсинтетазный компонент C-подобный белок 2») представляет собой белок сигнального пути, который экспрессируется иммуноцитами, желудочно-кишечным трактом, нейронами, яичками и поджелудочной железой [1]. Активация пути LANCL2 повышает чувствительность к инсулину и снижает воспаление, связанное с различными аутоиммунными, воспалительными и метаболическими состояниями. Результаты  и  тестирования на мышах показали, что использование соединений, нацеленных на этот путь, снижает уровни глюкозы в 2 раза в пробах на переносимость глюкозы по сравнению с контролями и вводимыми эквивалентными уровнями прописанного AVANDIA (GlaxoSmithKline plc, Брентфорд, Великобритания) - эффективного лечения, но со значительными побочными эффектами. Нацеливание на путь LANCL2 также снижает воспаление в пищеварительном тракте на 90% с соответствующим 4-кратным снижением числа повреждений. Результаты этого тестирования и другие оценки пути опубликованы в 12 статьях из рецензируемых научных журналов [2-13].
В категории связанных с иммунной системой воспалений находятся ныне мировые пандемии аутоиммунных расстройств, таких как воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), системная волчанка, ревматоидный артрит, диабет 1 типа, псориаз, рассеянный склероз. Существует также пандемия хронических метаболических воспалительных заболеваний, включая метаболический синдром, ожирение, преддиабет, сердечно-сосудистое заболевание и диабет 2 типа. Существующие способы лечения являются относительно эффективными, но дорогостоящими и имеют серьезные побочные эффекты. Путь введения для наиболее эффективного лечения аутоиммунных заболеваний, таких как антитела к анти-TNF, представляет собой внутривенную или подкожную инъекцию, что требует визитов в клинику/приемную врача и частого контроля. Уникальный способ действия LANCL2 обеспечивает перорально вводимые лекарственные средства, которые эффективны в качестве антител к рецептору TNF, но без побочных эффектов и высокой стоимости. С учетом эпидемий воспалительных и аутоиммунных заболеваний в целом путь LANCL2 имеет потенциал для значительного воздействия на миллионы пациентов.
Абсцизовая кислота («ABA») является одним из природных соединений, присутствующих в исходном процессе скрининга, которое связывается с LANCL2.
Существует многочисленное количество соединений, описанных в области синтетической органической химии. Различные соединения представлены следующими ссылками: WO1997/036866 авторов Diana и др., WO 2006/053109 авторов Sun и др., WO 2006/080821 авторов Kim и др., WO 2007/019417 авторов Nunes и др., WO 2009/067600 и WO 2009/067621 авторов Singh и др., WO 2008/079277 авторов Adams и др., JP 2008/056615 авторов Urasoe и др., WO 2011/066898 авторов Stoessel и др., US 2013/0142825 авторов Bassaganya-Riera и др., и патент США №7741367, выданный Bassaganya-Riera и др. Некоторые из соединений, описанных в этих ссылках, как известно, активируют путь LANCL2, а другие - нет.
Существует необходимость в разработке новых лигандов пути LANCL2 для обеспечения лечений, специально приспособленных для отдельных заболеваний, и для потенциальной максимизации их эффективности.
in silico
in vitro
in vivo
Таким образом, в настоящей заявке описан ряд классов соединений, которые были разработаны при помощи новых подходов медицинской химии и проверены при помощи технологий ,  и  в отношении максимизации их связывающей способности касательно белка LANCL2 и, таким образом, воздействия на полезный ответ при различных болезненных состояниях, включая помимо прочего, аутоиммунные, хронические воспалительные, метаболические и инфекционные заболевания.
РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение обеспечивает соединения, включающие формулу Z-Y-Q-Y'-Z', или их фармацевтически приемлемую соль или сложный эфир,
где:
Z представляет собой:
;
Y представляет собой:
или ;
1
4
1
2
1
2
1
2
1
3
1
3
1
3
1
4
6
1
6
1
6
1
6
3
1
6
1
6
1
6
Q представляет собой пиперазин-1,4-диил; 2,5-диазабицикло[2.2.1]гептан-2,5-диил; 2,5-диазабицикло[2.2.2]октан-2,5-диил; 1,4-диазепан-1,4-диил; бензол-1,4-диамин-N,N-диил; этан-1,2-диамин-N,N-диил; N,N-диалкилэтан-1,2-диамин-N,N-диил; пропан-1,3-диамин-N,N-диил; N,N-диалкилпропан-1,3-диамин-N,N-диил; 1,4-диаминоантрацен-9,10-дион-1,4-диил; Cарен-1,4-диамин-N,N-диил, где арен замещен одним-четырьмя заместителями в положениях 2, 3, 5 или 6, и где заместители независимо выбраны из группы, состоящей из -C(O)O(C-C)алкила, OH, O(C-C)алкила, (C-C)алкила, CF, F, Cl и Br; или замещенный пиперазин-1,4-диил, причем пиперазин замещен одним-восьмью заместителями в положениях 2, 3, 5 или 6, и причем заместители независимо выбраны из группы, состоящей из (C-C)алкила, арила, арил(C-C)алкила, C(O)OH и C(O)O(C-C)алкила;
Y' представляет собой:
,  или одинарную связь; и
Z' представляет собой:
5
или R;
где:
5
Y' представляет собой одинарную связь только когда Z' представляет собой R;
1
1
1
6
6
каждый из A и A' независимо представляет собой N, N(C-C)алкил, O, S или CR;
2
2
7
каждый из A и A' независимо представляет собой N или CR;
3
3
8
каждый из A и A' независимо представляет собой NR, O или S;
4
4
9
каждый из A и A' независимо представляет собой N или CR;
5
5
10
каждый из A и A' независимо представляет собой N или CR;
6
6
11
каждый из A и A' независимо представляет собой N или CR;
1
1'
2
2'
3
3'
4
4'
5
6
7
8
9
10
11
2
1
6
1
6
3
каждый из R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R и Rнезависимо выбран из группы, состоящей из водорода; алкила; галогена; трифторметила; диалкиламино, где каждый алкил независимо выбирается; -NH; алкиламино; арилалкила; гетероарилалкила; гетероциклоалкила; замещенного гетероциклоалкила, замещенного 1-2 заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из -C(O)OH, -C(O)O(C-C)алкила, (C-C)алкила, -CF, F, Cl и Br; и замещенного гетероарилалкила;
2
1
6
1
6
2
2
3
3
2
1
6
1
6
2
3
2
12
13
14
15
16
17
16
17
15
причем замещенный гетероарилалкил замещен 1-3 заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из -NH; -NH(C-C)алкила; -N((C-C)алкила),где каждый алкил выбраны независимо; алкила; галогена; арила; замещенного арила, замещенного 1-3 заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из -SOR, -OR, -галогена, -CN, -CF, аминоалкила-,-S(O)R и алкила; гетероциклоалкила; гетероарила; замещенного арила, замещенного 1-3 заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из алкила, -CF, F, Cl и Br; алкиламино-; гетероциклоалкилалкиламино-; алкиламиноалкиламино-; -NHC(O)OR; -NHC(O)NRR; -C(O)NRR; и замещенного гетероарила, замещенного 1-3 заместителями, выбранными из группы, состоящей из алкила, галогена, CN, NH, -NH(C-Cалкила), -N(C-Cалкила),где каждый алкил выбран независимо, -CF и замещенного арила, замещенного 1-3 заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из -S(O)R и -CN;
12
13
14
15
16
17
1
6
1
6
2,
1
6
1
6
причем каждый из R, R, R, R, R и Rнезависимо выбран из группы, состоящей из C-Cалкила, диалкиламино, содержащего независимо выбранный C-Cалкил, -NH алкиламино, гетероциклоалкила и замещенного гетероциклоалкила, замещенного одним-двумя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из -C(O)O(C-Cалкила) и C-Cалкила.
3
3
1
1
2
2
3
4
5
6
2
2
3
3
4
4
5
5
6
6
6
1
6
1
6
1
6
3
1
6
1
6
1
6
1
2
1
2
1
3
1
3
1
4
В некоторых соединениях по меньшей мере один из A и A' представляет собой O или S. В некоторых соединениях один или оба из A и A' представляют собой N. В некоторых соединениях один или оба из A и A' представляют собой CH, A представляет собой NH, A представляет собой N, A представляет собой CH, а A представляет собой CH. В некоторых соединениях один или оба из A и A' представляют собой CH, один или оба из A и A' представляют собой NH, один или оба из A и A' представляют собой N, один или оба из A и A' представляют собой CH, и один или оба из A и A' представляют собой CH. В некоторых соединениях Q представляет собой пиперазин-1,4-диил; 2,5-диазабицикло[2.2.1]гептан-2,5-диил; 2,5-диазабицикло[2.2.2]октан-2,5-диил; 1,4-диазепан-1,4-диил; N,N-диалкилэтан-1,2-диамин-N,N-диил; N,N-диалкилпропан-1,3-диамин-N,N-диил; 1,4-диаминоантрацен-9,10-дион-1,4-диил; Cарен-1,4-диамин-N,N-диил, где арен замещен одним-четырьмя заместителями в положениях 2, 3, 5 или 6, и каждый заместитель независимо выбран из группы, состоящей из -C(O)O(C-C)алкила, OH, O(C-C)алкила, (C-C)алкила, CF, F, Cl и Br; или замещенный пиперазин-1,4-диил, где пиперазин замещен одним-восьмью заместителями в положениях 2, 3, 5 или 6, и каждый заместитель независимо выбран из группы, состоящей из (C-C)алкила, арила, арил(C-C)алкила, C(O)OH и C(O)O(C-C)алкила.
В некоторых соединениях формула Z-Y-Q-Y'-Z' представляет собой:
;
;
или
ее соли.
1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
6
6
1
1
2
2
3
3
4
4
1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
6
6
1
1
2
2
3
3
4
4
1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
6
6
1
1
2
2
3
3
4
4
1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
6
6
1
1
2
2
3
3
4
4
В некоторых соединениях, члены одной или нескольких пар, выбранных из группы, состоящей из A и A', A и A', A и A', A и A', A и A', A и A', R и R', R и R', R и R' и R и R' являются одинаковыми. В некоторых соединениях члены одной или нескольких пар, выбранных из группы, состоящей из A и A', A и A', A и A', A и A', A и A', A и A', R и R', R и R', R и R' и R и R' являются различными. В некоторых соединениях члены каждой пары, выбранной из группы, состоящей из A и A', A и A', A и A', A и A', A и A', A и A', R и R', R и R', R и R' и R и R' являются одинаковыми. В некоторых соединениях члены каждой пары, выбранной из группы, состоящей из A и A', A и A', A и A', A и A', A и A', A и A', R и R', R и R', R и R' и R и R' являются различными.
В некоторых соединениях формула Z-Y-Q-Y'-Z' представляет собой:
;
;
или
ее соли.
Некоторые соединения настоящего изобретения имеют структуру:
;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
или
их соли.
Настоящее изобретение также обеспечивает соединения, включающие формулу A-B-C, или их фармацевтически приемлемую соль или сложный эфир,
где:
A представляет собой:
или ;
B представляет собой:
, , или ; а
C представляет собой:
, , , или ,
где:
7
8
9
10
11
12
13
14
18
каждый из A, A, A, A, A, A, A и A независимо выбран из CH, CR и N;
15
16
17
18
19
20
15
16
17
18
19
20
19
20
20
20
каждый из A, A, A, A, A и A независимо выбран из CH, CR, N, NR, O и S, при условии, что только один из A, A и A может представлять собой N, NR, O или S, и только один из A, A и A может представлять собой N, NR, O или S;
18
19
18
18
19
19
1
6
1
6
1
6
2
1
6
1
6
каждый из R и R независимо выбран из C-Cалкила; C-Cдиалкиламино, причем каждый C-Cалкил выбран независимо; -NH; алкиламино; гетероциклоалкила и замещенного гетероциклоалкила, причем замещенный гетероциклоалкил замещен одним-двумя заместителями, независимо выбранными из группы, состоящей из: -C(O)O(C-Cалкила) и C-Cалкила; причем в соединениях с более чем одним CR каждый R выбран независимо, а в соединениях с более чем одним CR каждый R выбран независимо; и
20
1
6
R представляет собой C-Cалкил.
В некоторых соединениях B представляет собой:
.
Некоторые соединения имеют структуру:
; ;
; ;
; или их соли.
Настоящее изобретение также обеспечивает способы лечения состояния у животного при помощи любого одного или нескольких соединений, описанных в настоящем документе. Способы включают введение животному эффективного количества одного или нескольких соединений, описанных в настоящем документе. Состояние может быть выбрано из группы, состоящей из инфекционного заболевания, аутоиммунного заболевания, диабета и хронического воспалительного заболевания. В некоторых способах инфекционное заболевание включает вирусное заболевание, такое как грипп. В некоторых способах аутоиммунное заболевание включает аутоиммунное воспалительное заболевание, такое как воспалительные заболевания кишечника, включая язвенный колит и/или болезнь Крона. В некоторых способах диабет выбран из группы, состоящей из диабета 1 типа и диабета 2 типа. В некоторых способах хроническое воспалительное заболевание включает метаболический синдром. В некоторых способах способы включают введение количества соединения, эффективное для повышения активности LANCL2, снижения воспаления и/или увеличения противовоспалительного действия.
Настоящее изобретение также обеспечивает соединения для применения при лечении состояния у животного при помощи любого одного или нескольких соединений, описанных в настоящем документе. Соединения для такого применения включают любые соединения, описанные в настоящем документе. Применение может включать введение эффективного количества одного или нескольких соединений, описанных в настоящем документе, животному, причем состояние выбрано из группы, состоящей из инфекционного заболевания, аутоиммунного заболевания, диабета и хронического воспалительного заболевания. В некоторых вариантах инфекционное заболевание включает вирусное заболевание, такое как грипп. В некоторых вариантах аутоиммунное заболевание включает аутоиммунное воспалительное заболевание, такое как воспалительные заболевания кишечника, включая язвенный колит и/или болезнь Крона. В некоторых вариантах диабет выбирают из группы, состоящей из диабета 1 типа и диабета 2 типа. В некоторых вариантах хроническое воспалительное заболевание включает метаболический синдром. В некоторых вариантах соединение эффективно для повышения активности LANCL2, снижения воспаления и/или увеличения противовоспалительного действия.
Цели и преимущества настоящего изобретения станут более очевидными из следующего подробного описания предпочтительного варианта осуществления настоящего изобретения, взятого совместно с приложенными графическими материалами.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1A и 1B.
Компьютерное прогнозирование связывания соединений с LANCL2 и биохимическая экспериментальная оценка при помощи ППР (поверхностного плазмонного резонанса).
Фиг. 2
. Кластерная гистограмма для лучших пяти кластеров NSC6160. Сто стыковок проводили при помощи NSC6160, стыкуемого с LANCL2, используя AutoDock Tools. RMSD (среднее квадратичное отклонение) допуска кластера составляло 2 Å. Энергии связывания указаны в кДж/моль.
Фиг. 3
. Кластерная гистограмма для лучших пяти кластеров ABA. Сто стыковок проводили при помощи ABA, стыкуемой к LANCL2, используя AutoDock Tools. RMSD допуск кластера составляло 2 Å. Энергии связывания указаны в кДж/моль.
Фиг. 4
. Кластерная гистограмма для лучших пяти кластеров BT-11. Сто стыковок проводили при помощи BT-11, стыкуемого к LANCL2, используя AutoDock Tools. RMSD допуск кластера составляло 2 Å. Энергии связывания указаны в кДж/моль.
Фиг. 5
. Кластерная гистограмма для лучших пяти кластеров BT-6. Сто стыковок проводили при помощи BT-6, стыкуемого к LANCL2, используя AutoDock Tools. RMSD допуск кластера составляло 2 Å. Энергии связывания указаны в кДж/моль.
Фиг. 6.
Кластерная гистограмма для лучших пяти кластеров BT-15. Сто стыковок проводили при помощи BT-15, стыкуемого с LANCL2, используя AutoDock Tools. RMSD допуск кластера составляло 2 Å. Энергии связывания указаны в кДж/моль.
Фиг. 7.
Кластерная гистограмма для лучших пяти кластеров BT-ABA-5a. Сто стыковок проводили при помощи BT-ABA-5a, стыкуемого с LANCL2, используя AutoDock Tools. RMSD допуск кластера составляло 2 Å. Энергии связывания указаны в кДж/моль.
Фиг. 8.
D
Кинетика связывания лантионинсинтетаза C-подобного белка 2 (LANCL2) с BT-11 и BT-15. Панели A и C показывают сенсорограммы поверхностного плазмонного резонанса (ППР) для связывания различных концентраций BT-11 (A) и BT-15 (C) с иммобилизированным LANCL2. Панели B и D показывают графики максимальной единицы резонанса (RU) относительно концентрации BT-11 (B) и BT-15 (D). Указаны константы диссоциации (K) установившегося режима, используя модель связывания 1:1.
Фиг. 9A и 9B.
фиг. 9A
фиг. 9B
Кинетика связывания лантионинсинтетаза C-подобного белка 2 (LANCL2) с BT-6 () и BT-ABA-5a (). Показаны сенсорограммы поверхностного плазмонного резонанса (ППР) для связывания различных концентраций BT-6 и BT-ABA-5a с иммобилизированным LANCL2.
Фиг. 10.
Влияние перорального введения на активность заболевания и серьезность патологии мышей с колитом, вызванным декстраном сульфатом натрия (DSS). Панель A показывает показатели индекса активности заболевания у мышей, которых лечили или BT-11, или только средой. Панели B-C показывают показатели макропатологии в (B) селезенке, (C) брыжеечных лимфатических узлах (БЛУ) и (D) толстой кишке у мышей, которых лечили или средой, или BT-11. Статистически значимые разницы между группами (P<0,05) отмечены звездочкой (n=10).
Фиг. 11.
.
Влияние перорального введения BT-11 на воспалительные повреждения в толстой кишке у мышей с колитом, вызванным DSS Показаны типичные микроснимки (A, D) контроля (B, E) DSS и (C, F) мышей с DSS, которых лечили при помощи BT-11. Гистопатологические повреждения оценивали на основании (G) лейкоцитарной инфильтрации, (H) эрозии эпителия и (I) утолщения слизистой. Статистически значимые разницы между группами (P<0,05) отмечены звездочкой (n=10).
Фиг. 12.
Эффект доза-ответ перорального введения BT-11 на воспалительные повреждения в толстой кишке у мышей с колитом, вызванным DSS. Гистопатологические повреждения оценивали на основании (A) лейкоцитарной инфильтрации, (B) утолщения слизистой и (C) эрозии эпителия. Статистически значимые разницы между группами (P<0,05) отмечены звездочкой (n=10).
Фиг. 13.
Анализ экспрессии гена в толстой кишке TNFα, интерлейкина 10 (IL-10) и LANCL2. Показана экспрессия гена в толстой кишке для оценки уровней (A) провоспалительного TNFα, (B) IL-10 и (C) LANCL2. Статистически значимые разницы между группами (P<0,05) отмечены звездочкой (n=10).
Фиг. 14.
Эффект доза-ответ перорального введения BT-11 на про- и противовоспалительные субпопуляции иммунноцитов в толстой кишке у мышей с колитом, вызванным DSS. Анализ при помощи проточной цитометрии использовали для измерения (A) TNFa+ клеток, (B) IL-10+ CD4+ T-клеток и (C) FOXP3+ CD4+ T-клеток в слизистой толстой кишки.
Фиг. 15.
Влияние перорального введения BT-11 на макропатологические повреждения ткани у мышей дикого типа LANCL2-/- с колитом, вызванным DSS. Панель A показывает показатели индекса активности заболевания мышей дикого типом относительно LANCL2-/-, которых лечили или BT-11, или только средой. Панели B-D показывают показатели макропатологии в (B) толстой кишке, (C) брыжеечных лимфатических узлах (БЛУ) и (D) селезенке у мышей дикого типа LANCL2-/-, которых лечили или средой, или BT-11. Статистически значимые разницы между группами (P<0,05) отмечены звездочкой (n=10).
Фиг. 16.
Влияние перорального введения BT-11 на воспалительные повреждения в толстой кишке у мышей дикого типа LANCL2-/- с колитом, вызванным DSS. Гистопатологические повреждения оценивали на основании (A) лейкоцитарной инфильтрации, (B) утолщения слизистой и (C) эрозии эпителия. Статистически значимые разницы между группами (P<0,05) отмечены звездочкой.
Фиг. 17.
Влияние перорального введения BT-11 на субпопуляции иммунноцитов, инфильтрующих в собственную пластинку слизистой оболочки толстой кишки, селезенку и брыжеечные лимфатические узлы (БЛУ), мышей с диким типом и LANCL2-/- при хроническом колите. Проточную цитометрию использовали для оценки уровней (A) MCP1+ CD45+ клеток толстой кишки, (B) MCP1+ CD45+ клеток в БЛУ, (C) TNFa+ CD45+ клеток толстой кишки, (D) MHC-II+ CD11c+ гранулоцитов толстой кишки, (E) IL-10+ CD45+ клеток толстой кишки и (F) IL-10+ CD45+ спленоцитов после лечения при помощи BT-11. Статистически значимые разницы между группами (P<0,05) отмечены звездочкой.
Фиг. 18.
Влияние перорального введения BT-11 на показатели индекса активности заболевания (DAI) у IL-10-/- мышей с хроническим колитом. Показатели DAI у мышей с нулевым IL-10, у которых развивался спонтанный колит и которых лечили ежедневно или только средой, или 20, 40 и 80 мг BT-11/кг массы тела (n=10). Статистически значимые разницы между группами (P<0,05) отмечены звездочкой.
Фиг. 19.
Влияние перорального введения BT-11 на макроскопические показатели ткани в хронической модели колита после лечения при помощи BT-11. Макроскопические показатели в (A) селезенке, (B) брыжеечных лимфатических узлах (БЛУ) и (C) толстой кишке мышей, которых лечили или средой, или BT-11 при трех различных концентрациях (20, 40 и 80 мг/кг). Статистически значимые разницы между группами (P<0,05) отмечены звездочкой.
Фиг. 20.
Влияние перорального введения BT-11 на гистопатологические повреждения толстой кишки в модели хронической IL-10-/- ВЗК. Гистопатологические повреждения оценивали на основании (A) лейкоцитарной инфильтрации, (B) эрозии эпителия и (C) утолщения слизистой. Статистически значимые разницы между группами (P<0,05) отмечены звездочкой.
Фиг. 21.
Влияние перорального введения BT-11 на субпопуляции иммунноцитов, инфильтрующих в собственную пластинку слизистой оболочки толстой кишки IL-10-/- с хроническим колитом. Проточную цитометрию использовали для оценки уровней (A) F4/80+ макрофаги, (B) MHC-II+ CD11c+ дендритные клетки (DC), (C) CD4+ FOXP3+ регуляторных T-клеток и (D) Т-клеток-помощников 1 (Th1) в LP толстой кишки после лечения при помощи BT-11. Статистически значимые разницы между группами (P<0,05) отмечены звездочкой.
Фиг. 22.
Влияние перорального введения BT-11 на субпопуляции иммунноцитов, инфильтрующих в селезенку и брыжеечные лимфатические узлы IL-10-/- с хроническим колитом. Проточную цитометрию использовали для оценки уровней (A) CD4+ RORgt+ T-клеток, (B) CD4+ FOXP3+ T-клеток, (C) CD4+ CD45+ FOXP3+ регуляторных T-клеток и (D) Т-клеток-помощников 1 (Th1) после лечения при помощи BT-11. Статистически значимые разницы между группами (P<0,05) отмечены звездочкой.
Фиг. 23.
Влияние перорального лечения при помощи BT-11 на экспрессию в толстой кишке LANCL2 и TNFα. Экспрессию гена в толстой кишке использовали для оценки уровней (A) LANCL2 и (B) TNFα. Статистически значимые разницы между группами (P<0,05) отмечены звездочкой.
Фиг. 24.
Влияние перорального введения BT-11 на показатели индекса активности заболевания у мышей, которым давали среду, относительно мышей, которым давали лечение, в модели адоптивного переноса хронического колита. RAG2-/- мышей лечили средой или BT-11 с последующим внутрибрюшинным переносом 400000 необработанных CD4+ T-клеток. Статистически значимые разницы между группами (P<0,05) отмечены звездочкой.
Фиг. 25.
Влияние перорального введения BT-11 на показатели индекса активности заболевания у мышей, которых лечили средой относительно активного вещества, с переносом дикого типа относительно LANCL2-/-, в модели адоптивного переноса хронического колита. RAG2-/- мышей лечили средой или BT-11 с последующим внутрибрюшинным переносом 400000 необработанных CD4+ T-клеток от доноров или с диким типом, или LANCL2-/-. Статистически значимые разницы между группами (P<0,05) отмечены звездочкой.
Фиг. 26.
Влияние перорального введения BT-11 на потерю массы в модели хронического ВЗК вызванного CD4+ колита. Мышей взвешивали и рассчитывали процент потери массы. Статистически значимые разницы между группами (P<0,05) отмечены звездочкой.
Фиг. 27.
Влияние перорального введения BT-11 на макроскопические показатели тканей в хронической модели вызванного CD4+ T-клетками колита после лечения при помощи BT-11. Показаны макроскопические показатели в (A) селезенке, (B) БЛУ, (C) толстой кишке и (D) подвздошной кишке мышей, которых лечили или средой, или BT-11 с концентрацией 80 мг/кг. Статистически значимые разницы между группами (P<0,05) отмечены звездочкой.
Фиг. 28.
Влияние перорального введения BT-11 на макроскопические показатели тканей в хронической модели вызванного CD4+ T-клетками колита с мышами дикого типа и LANCL2-/- после лечения при помощи BT-11. Показаны макроскопические показатели в (A) толстой кишке, (B) БЛУ и (C) селезенке мышей дикого типа и LANCL2-/-, которых лечили или средой, или BT-11 с концентрацией 80 мг/кг. Статистически значимые разницы между группами (P<0,05) отмечены звездочкой.
Фиг. 29.
Влияние перорального введения BT-11 на гистопатологию толстой кишки и подвзошной кишки у мышей, которых лечили средой или действующим веществом в модели адоптивного переноса хронического колита. Гистопатологические повреждения в толстой кишке (A, C, E) и подвзошной кишке (B, D, F) оценивали на основании (A, B) лейкоцитарной инфильтрации, (C, D) эрозии эпителия и (E, F) утолщения слизистой. Статистически значимые разницы между группами (P<0,05) отмечены звездочкой.
Фиг. 30.
Влияние перорального введения BT-11 на гистопатологию толстой кишки у мышей, которых лечили средой или действующим веществом, которым переносили или дикий тип, или LANCL2-/- CD4+ T клетки в модели адоптивного переноса хронического колита. Гистопатологические повреждения оценивали на основании (A) лейкоцитарной инфильтрации, (B) утолщения слизистой и (C) эрозии эпителия. Статистически значимые разницы между группами (P<0,05) отмечены звездочкой.
Фиг. 31.
Влияние перорального введения BT-11 на показатели индекса активности заболевания у мышей, которых лечили средой или действующим веществом, в модели адоптивного переноса хронического колита. Проточную цитометрию использовали для оценки уровней (A) F4/80+CD11b+ макрофаги, (B) CD45+ IFNg+ клетки, (C) CD4+ FOXP3+ регуляторные T-клетки и (D) CD4+ IL-10+ противовоспалительные клетки после лечения при помощи BT-11. Статистически значимые разницы между группами (P<0,05) отмечены звездочкой.
Фиг. 32.
Влияние перорального введения BT-11 на показатели индекса активности заболевания у мышей, которых лечили средой или действующим веществом, в модели адоптивного переноса хронического колита. Проточную цитометрию использовали для оценки уровней (A) CD4+ FOXP3+ T-клетки, (B) CD4+ IL-10+ T-клетки, (C) CD45+ IFNg+ клетки в БЛУ и (D) CD4+ FOXP3+ T-клетки, (E) CD4+ IL-10+ T-клетки, (F) CD45+ IFNg+ клетки в селезенке после лечения при помощи BT-11. Статистически значимые разницы между группами (P<0,05) отмечены звездочкой.
Фиг. 33.
Влияние перорального введения BT-11 на показатели индекса активности заболевания у мышей, которых лечили средой или действующим веществом, с диким типом относительно перенесенного PPARγ-/- в модели адоптивного переноса хронического колита. RAG2-/- мышей лечили средой или BT-11 с последующим внутрибрюшинным переносом 400000 необработанных CD4+ T-клеток от доноров или с диким типом, или с PPARγ-/-. (A) Показаны показатели индекса активности заболевания относительно времени после переноса. Гистопатологические повреждения в толстой кишке оценивали на основании (B) лейкоцитарной инфильтрации, (C) утолщения слизистой и (D) эрозии эпителия. Статистически значимые разницы между группами (P<0,05) отмечены звездочкой.
Фиг. 34.
Влияние перорального введения BT-11 на уровни глюкозы в крови натощак и уровни инсулина у NOD мышей с диабетом. (A) Уровни глюкозы в крови натощак определяли на 0, 1, 3, 4, 5, 10 и 11 неделе лечения средой или BT-11 (80 мг/кг/сутки). (B) Уровни инсулина в сыворотке крови натощак определяли на 5 неделе лечения или средой, или BT-11 (80 мг/кг/сутки). Статистически значимые разницы между группами (P<0,05) отмечены звездочкой (n=10).
Фиг. 35.
Влияние перорального введения BT-11 на образование повреждений в поджелудочной железе у мышей с диабетом 1 типа. Гистопатологические повреждения оценивали на основании лейкоцитарной инфильтрации, образования повреждений и эрозии тканей. Статистически значимые разницы между группами (P<0,05) отмечены звездочкой.
Фиг. 36.
Влияние перорального введения BT-11 на (A) уровни глюкозы в крови натощак и (B) пробу на толерантность к глюкозе. (A) Мышам не давали еду в течение 12 часов и уровни глюкозы в крови определяли на 2 и 12 неделе после начала эксперимента. (B) Мышам также давали нагрузку при помощи IP инъекции глюкозы (2 г/кг) и измеряли уровень глюкозы. Статистически значимые разницы между группами (P<0,05) отмечены звездочкой.
Фиг. 37.
high
Влияние перорального введения BT-11 на провоспалительные популяции, инфильтрующие в белую жировую ткань (БЖТ). БЖТ иссекали и обрабатывали и результаты иммунофенотипирования определяли при помощи проточной цитометрии. Показаны уровни (A) инфильтрующих макрофагов и (B) Ly6c GR1+ инфильтрующих клеток. Статистически значимые разницы между группами (P<0,05) отмечены звездочкой.
Фиг. 38.
Влияние перорального введения BT-11 на гомеостаз глюкозы в db/db модели диабета. Показаны (A) концентрации глюкозы в крови натощак (FBG) у дефицитных по рецептору лептина (db/db) мышей, которых лечили или BT-11, или средой, на 1 и 3 неделе после начала эксперимента. Показаны (B) уровни глюкозы в плазме крови после вводимой внутрибрюшинно сахарной нагрузки (1 г/кг массы тела). Кровь отбирали перед (0), затем через 15, 30, 60, 90, 120, 180, 220 и 265 минут после введения сахарной нагрузки. Статистически значимые разницы между группами (P<0,05) отмечены звездочкой.
Фиг. 39.
Влияние перорального введения BT-11 на экспрессию LANCL2, TNFα и MCP-1 в белой жировой ткани (БЖТ) у мышей с алиментарным ожирением. Анализ экспрессии генов LANCL2, TNFα и MCP-1 оценивали по сравнению с мышами, которые не получали лечения. Линия на нуле представляет исходный уровень для мышей, которые получали только среду.
Фиг. 40.
Влияние перорального введения BT-11 на клинические показатели и заболеваемость мышей, инфицированных вирусом гриппа. Мышей инфицировали вирусом гриппа и оценивали клинические показатели посредством эксперимента. Клинические показатели отмечали для (A) активности и (B) внешнего вида. (C) Процент мышей, которые потеряли более 15% массы тела, отмечали на графике, чтобы показать изменения в заболеваемости. Статистически значимые разницы между группами (P<0,05) отмечены звездочкой.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Общие определения
Если не указано иное, следующие определения используются по всему тексту настоящей заявки:
Вариационный анализ (ANOVA): Арифметический процесс разделения полной вариации в наборах данных на конкретные компоненты на основе источников вариации. Его использовали для определения того, является ли численная разница между группами обработки статистически значимой.
Липогенез: Процесс, посредством которого образуются новые адипоциты или клетки жирового депо.
Аллель: Одна из ряда конкурентных ДНК, кодирующих один и тот же ген.
Сопряженный диен: Молекула, содержащая две двойные связи, разделенные одинарной связью.
Мыши db/db: Выражение, используемое для определения типа мышей, у которых нет обеих аллелей длинной изоформы рецептора лептина. Это отсутствие приводит к высокой предрасположенности к развитию диабета 2 типа. См. примеры ниже для дополнительного обсуждения касательно мышей db/db.
Энантиомер: Оптический изомер; химическая классификация молекул на основе их способности вращать плоскость поляризации по часовой стрелке (+) или против часовой стрелки (-).
Гликемия: Концентрация глюкозы в крови.
Гипергликемия: Повышение концентрации глюкозы в крови свыше нормальных диапазонов.
Гиперинсулинемия: Повышение концентрации инсулина в крови свыше нормальных диапазонов.
Инсулинемия: Концентрация инсулина в крови.
Резистентность к инсулину: Неспособность тканей реагировать на инсулин и поглощать глюкозу из крови.
По существу чистый: Имеющий чистоту по меньшей мере 90 масс. %, предпочтительно по меньшей мере 95 масс. %, например, по меньшей мере 98 масс. %, 99 масс. % или приблизительно 100 масс. %.
Диабет 2 типа или инсулиннезависимый сахарный диабет: Выражение, относящееся к общему типу диабета, вызываемому невосприимчивостью клеток к действию инсулина. Если клетки не реагируют на инсулин, они неспособны поглощать глюкозу из крови, что приводит к глюкозотоксичности. Кроме того, клетки лишены энергии, получаемой от окисления глюкозы.
ВЗК: Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) включают хроническое воспаление всего или части желудочно-кишечного тракта. ВЗК главным образом включает язвенный колит и болезнь Крона. Оба обычно включают тяжелые случаи диареи, боль, усталость и потерю веса. ВЗК может истощать и иногда приводит к опасным для жизни осложнениям.
Язвенный колит (ЯК): ЯК представляет собой ВЗК, которое вызывает хроническое воспаление и раны (язвы) в самом глубоком слое выстилки толстой кишки (толстого кишечника) и прямой кишки.
Болезнь Крона: Болезнь Крона представляет собой ВЗК, которое вызывает воспаление выстилки желудочно-кишечного тракта. При болезни Крона воспаление часто распространяется глубоко в поврежденные ткани. Воспаление может включать различные области желудочно-кишечного тракта - толстый кишечник, тонкий кишечник или оба.
IL-10: Интерлейкин-10 (IL-10), также известный как ингибирующий фактор синтеза цитокина человека (CSIF), представляет собой противовоспалительный цитокин. У людей IL-10 кодируется геном IL10.
FOXP3: FOXP3 (forkhead box P3), также известный как скурфин, представляет собой белок, вовлеченный в ответы иммунной системы. Член семейства белков FOX, FOXP3, по-видимому, функционирует как основной регулятор (транскрипционный фактор) при развитии и функционировании регуляторных T-клеток.
TNF-альфа: Фактор некроза опухолей (TNF, кахексин или кахектин, и ранее известный как фактор некроза опухолей альфа или TNFα) представляет собой цитокин, вовлеченный в системное воспаление, и является членом группы цитокинов, которые стимулируют острофазовую реакцию.
MCP1: Моноцитарный хемотаксический белок-1. Более ранний термин для CC-цитокина, который важен для развития атеросклеротических повреждений, присутствующих в эндотелиальных клетках, макрофагах и в сосудистых гладких мышечных клетках пациентов, подвергающихся процедурам аорто-коронарного шунтирования. Официальным предпочтительным термином теперь является хемокиновый (C-C мотив) лиганд 2.
Интерферон-гамма: Интерферон-гамма представляет собой провоспалительный димеризованный растворимый цитокин, который является единственным членом класса типа II интерферонов.
Диабет 1 типа: Диабет 1 типа, в свое время известный как ювенильный диабет или инсулинозависимый диабет, представляет собой хроническое состояние, при котором поджелудочная железа продуцирует мало инсулина или не продуцирует инсулин, гормон, необходимый для обеспечения проникновения сахара (глюкозы) в клетки для получения энергии.
Лейкоцитарная инфильтрация: Лейкоцитарная инфильтрация относится к процессу перемещения или инфильтрации лейкоцитов в поврежденную ткань для начала процесса заживления.
Химические определения
например
1
10
Термин «алкил», само по себе или как часть другого заместителя, означает, если не указано иное, полностью насыщенный, с прямой цепью, с разветвленной цепью или циклический углеводородный радикал или их комбинацию и может включать ди- и поливалентные радикалы, с указанным числом атомов углерода (, C-C означает от одного до десяти атомов углерода, включительно). Примеры алкильных групп включают, помимо прочего, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, трет-бутил, изобутил, втор-бутил, циклогексил, (циклогексил)этил, циклопропилметил, и их гомологи и изомеры, например, н-пентил, н-гексил, н-гептил, н-октил и подобное. Термин «алкил», если не указано иное, также включает те производные алкила, определенные более подробно ниже как «гетероалкил» и «циклоалкил».
Термин «алкенил» означает алкильную группу, как определено выше, за исключением того, что она содержит одну или несколько двойных связей. Примеры алкенильных групп включают винил, 2-пропенил, кротил, 2-изопентенил, 2-(бутадиенил), 2,4-пентадиенил, 3-(1,4-пентадиенил) и пр., и высшие гомологи и изомеры.
Термин «алкинил» означает алкильную или алкенильную группу, как определено выше, за исключением того, что она содержит одну или несколько тройных связей. Примеры алкинильных групп включают этинил, 1- и 3-пропинил, 3-бутинил и подобные, включая высшие гомологи и изомеры.
2
2
2
2
Термины «алкилен», «алкенилен» и «алкинилен», отдельно или как часть другого заместителя, означают двухвалентный радикал, полученный из алкильной, алкенильной или алкинильной группы, соответственно, как представлено в качестве примера при помощи -CHCHCHCH-.
Как правило, алкильные, алкенильные, алкинильные, алкиленильные, алкениленильные и алкиниленильные группы будут иметь от 1 до 24 атомов углерода. Эти группы с 10 или меньшим числом атомов углерода предпочтительны в настоящем изобретении. Термин «низший» при применении к любой из этих групп, как в «низшем алкиле» или «низшем алкилене», означает группу с 10 или меньшим количеством атомов углерода.
3
«Замещенный» относится к химической группе, как описано в настоящем документе, которая дополнительно содержит один или несколько заместителей, таких как низший алкил, арил, ацил, галоген (например, алкилгалоген, такой как CF), гидрокси, амино, алкокси, алкиламино, ациламино, тиоамидо, ацилокси, арилокси, арилоксиалкил, меркапто, тиа, аза, оксо, как насыщенные, так и ненасыщенные циклические углеводороды, гетероциклы и подобное. Эти группы могут присоединяться к любому углероду или заместителю алкильных, алкенильных, алкинильных, алкиленильных, алкениленильных и алкиниленильных фрагментов. Кроме того, эти группы могут присоединяться как боковые группы или быть цельными с самой углеродной цепочкой.
Термин «арил» используется в настоящем документе для ссылки на ароматический заместитель, который может быть одним ароматическим кольцом или множеством ароматических колец, которые сконденсированы вместе, ковалентно связаны или присоединены к общей группе, такой как диазо, метиленовый или этиленовый фрагмент. Общей связующей группой может также быть карбонил как в бензофеноне. Ароматическое кольцо(а) может включать, например, фенил, нафтил, бифенил, дифенилметил и бензофенон, помимо прочего. Термин «арил» охватывает «арилалкил» и «замещенный арил». Для фенильных групп арильное кольцо может быть моно-, ди-, три-, тетра- или пента-замещенным. Большие кольца могут быть незамещенными или содержать один или несколько заместителей.
3
«Замещенный арил» относится к арилу, как уже описано, содержащему одну или несколько функциональных групп, таких как низкий алкил, ацил, галоген, алкилгалоген (например, CF), гидрокси, амино, алкокси, алкиламино, ациламино, ацилокси, фенокси, меркапто и как насыщенные, так и ненасыщенные циклические углеводороды, которые сконденсированы с ароматическим кольцом(ами), ковалентно связаны или присоединены к общей группе, такой как диазо, метиленовый или этиленовый фрагмент. Связующей группой может также быть карбонил, как, например, в циклогексилфенилкетоне. Термин «замещенный арил» охватывает «замещенный арилалкил».
Термин «галоген» или «гало» используют в настоящем документе для ссылки на атомы фтора, брома, хлора и йода.
Термин «гидрокси» используют в настоящем документе для ссылки на группу -OH.
Термин «амино» используют для обозначения NRR', где R и R' независимо представляют собой H, алкил, алкенил, алкинил, арил или их замещенные аналоги. «Амино» охватывает «алкиламино», означая вторичные и третичные амины, а «ациламино» описывает группу RC(O)NR'.
Введение
В ходе осуществления способов настоящего изобретения терапевтически эффективное количество соединений настоящего изобретения можно вводить животному, включая млекопитающих и людей, различными путями. Хотя в предпочтительном варианте осуществления соединения настоящего изобретения вводят перорально или парентерально, также предусмотрены и другие формы введения, такие как посредством медицинских составов или аэрозолей.
Для перорального введения эффективное количество соединений можно вводить, например, в твердом, полутвердом, жидком или газообразном состоянии. Конкретные примеры включают таблетки, капсулы, порошки, гранулы, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. Однако соединения не ограничены этими формами.
Для составления соединений настоящего изобретения в таблетки, капсулы, порошки, гранулы, растворы или суспензии соединение предпочтительно смешивают со связующим, дезинтегрирующим средством и/или смазывающим веществом. При необходимости, полученная композиция может быть смешана с разбавителем, буфером, инфильтрующим средством, консервантом и/или ароматизатором, используя известные способы. Примеры связующего включают кристаллическую целлюлозу, производные целлюлозы, кукурузный крахмал, циклодекстрины и желатин. Примеры дезинтегрирующего средства включают кукурузный крахмал, картофельный крахмал и карбоксиметилцеллюлозу натрия. Примеры смазывающего вещества включают тальк и стеарат магния. Кроме того, также могут быть использованы добавки, которые традиционно использовались, такие как лактоза и маннит.
Для парентерального введения соединения настоящего изобретения можно вводить ректально или путем инъекции. Для ректального введения может быть использован суппозиторий. Суппозиторий может быть получен путем смешивания соединений настоящего изобретения с фармацевтически пригодным вспомогательным средством, которое плавится при температуре тела, но остается твердым при комнатной температуре. Примеры включают, помимо прочего, какао-масло, углеродный воск и полиэтиленгликоль. Полученную композицию можно формовать в любую желаемую форму при помощи способов, известных в данной области техники.
Для введения путем инъекции соединения настоящего изобретения можно вводить подкожно, внутрикожно, внутривенно или внутримышечно. Лекарственные средства для такой инъекции могут быть получены путем растворения, суспендирования или эмульгирования соединений настоящего изобретения в водном или неводном растворителе, таком как растительное масло, глицерид синтетической смоляной кислоты, сложный эфир высшей жирной кислоты или пропиленгликоль, при помощи известного способа. При необходимости, добавки, такие как солюбилизирующее средство, осморегулирующее средство, эмульгатор, стабилизатор или консервант, которые обычно использовались, можно также добавлять. Если не требуется, предпочтительно, чтобы композиция была стерильной или стерилизованной.
Для составления соединений настоящего изобретения в суспензии, сиропы или эликсиры может быть использован фармацевтически пригодный растворитель. В качестве неограничивающего примера, включена, помимо прочего, вода.
Соединения настоящего изобретения также могут быть использованы вместе с дополнительным соединением, имеющим другое фармацевтически подходящее действие, для получения лекарственного средства. Лекарственное средство, содержащее соединение настоящего изобретения или в качестве отдельного соединения, или в качестве части композиции, можно использовать для лечения субъектов, нуждающихся в этом.
Соединения настоящего изобретения можно также вводить в виде аэрозоля или лекарственной формы для ингаляции, полученной путем загрузки соединений в виде жидкости или тонкодисперсного порошка, вместе с газообразным или жидким распыляющим средством и, при необходимости, известным вспомогательным средством, таким как порообразующее средство, в негерметичный контейнер, такой как аэрозольный баллончик или небулайзер. В качестве распыляющего средства может быть использован, например, сжатый дихлорфторметан, пропан или азот в газообразной форме.
Соединения настоящего изобретения можно вводить животному, в том числе млекопитающим и людям, которые нуждаются в этом, в виде фармацевтической композиции, такой как таблетки, капсулы, растворы или эмульсии. Введение других форм соединений, описанных в настоящем изобретении, включая, помимо прочего, их сложные эфиры, их фармацевтически приемлемые соли, их метаболиты, их структурно родственные соединения, их аналоги и их комбинации, в однократной дозе или многократной дозе, также предусмотрены в настоящем изобретении.
Соединения настоящего изобретения можно также вводить животному, нуждающемуся в этом, в качестве диетологической добавки, или в качестве пищевой добавки, или нутрицевтика.
Термины «предупреждение», «лечение» или «улучшение состояния» и аналогичные термины, используемые в настоящем документе, включают предупреждение и полное или частичное излечение. Термины могут также включать подавление симптомов, улучшение состояния при симптомах, снижение тяжести симптомов, снижение частоты возникновения заболевания или любое другое изменение в состоянии пациента, которое улучшает терапевтический исход.
Соединения, описанные в настоящем изобретении, предпочтительно используют и/или вводят в виде композиции. Подходящими композициями являются предпочтительно фармацевтическая композиция, пищевой продукт или пищевая добавки. Эти композиции обеспечивают удобную форму, в которой доставляются соединения. Композиции настоящего изобретения могут содержать антиоксидант в количестве, эффективном для повышения стабильности соединений в отношении окисления или растворимости.
Количество соединения, которое вводят в способе настоящего изобретения, или которое предназначено для введения при применении настоящего изобретения, представляет собой любое подходящее количество. Предпочтительно, оно составляет от приблизительно 0,0001 г до приблизительно 20 г (более предпочтительно от 0,01 г до 1 г, например, от 0,05 г до 0,5 г) соединения в сутки. Подходящие композиции можно составлять соответствующим образом. Специалисты в области дозирования биологически активных средств смогут разработать конкретные схемы дозирования для различных субъектов на основании известных и хорошо понятных параметров.
Предпочтительная композиция согласно настоящему изобретению представляет собой фармацевтическую композицию, например, в виде таблеток, пилюль, капсул, каплет, состоящие из множества частиц лекарственные формы (включая гранулы, шарики, пеллеты и микроинкапсулированные частицы), порошков, эликсиров, сиропов, суспензий и растворов. Как правило, фармацевтические композиции будут содержать фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель. Предпочтительно, фармацевтические композиции приспособлены для парентерального или перорального введения. Композиции для перорального введения могут быть в твердой или жидкой форме и могут принимать вид таблеток, порошков, суспензий и сиропов, помимо прочего. При необходимости, композиции содержат один или несколько ароматизаторов и/или красителей. В целом, терапевтические и диетологические композиции могут содержать любое вещество, которое значительно не мешает действию соединений на субъект.
Фармацевтически приемлемые носители, подходящие для использования в таких композициях, хорошо известны в фармацевтической промышленности. Композиции настоящего изобретения могут содержать 0,01-99 масс. % соединений настоящего изобретения. Как правило, композиции настоящего изобретения получают в стандартной лекарственной форме. Предпочтительно однократная доза соединений, описанных в настоящем изобретении, составляет от 1 мг до 1000 мг (более предпочтительно от 50 мг до 500 мг). Вспомогательные вещества, используемые при получении таких композиций, являются вспомогательными веществами, известными в данной области техники.
Дополнительные примеры форм продуктов для композиции представляют собой пищевые добавки, например, в виде мягкой гелеобразной или твердой капсулы, содержащей инкапсулирующий материал, выбранный из группы, состоящей из желатина, крахмала, модифицированного крахмала, производных крахмала, таких как глюкоза, сахароза, лактоза и фруктоза. При необходимости, инкапсулирующий материал может содержать сшивающие или полимеризующие средства, стабилизаторы, антиоксиданты, светопоглощающие средства для защиты светочувствительных наполнителей, консервантов и подобного. Предпочтительно, однократная доза соединений в пищевых добавках составляет от 1 мг до 1000 мг (более предпочтительно от 50 мг до 500 мг).
В целом, термин «носитель» может быть использован во всей данной заявке для представления композиции, с которой описанные соединения можно смешивать, это может быть фармацевтический носитель, пищевой продукт, пищевая добавка или диетическая добавка. Материалы, описанные выше, могут быть рассматриваемыми носителями для целей настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения носитель имеет от небольшого биологического действия на соединения настоящего изобретения до отсутствия такового.
Доза: Способы настоящего изобретения могут включать введение терапевтически эффективного количества соединения животному, нуждающемуся в этом. Эффективное количество соединения зависит от формы вводимого соединения, длительности введения, пути введения (например, перорально или парентерально), возраста животного и состояния животного, в том числе млекопитающих и людей.
Например, количество соединения, эффективное для лечения или предупреждения диабета 2 типа, преддиабета, диабета 1 типа, нарушения механизма усваивания глюкозы, резистентности к инсулину, язвенного колита или болезни Крона, или любого другого состояния, описанного в настоящем документе, у животного, может находиться в диапазоне 0,1-10000 мг/кг/сутки. Предпочтительное эффективное количество соединения составляет 1-5000 мг/кг/сутки, причем более предпочтительная доза составляет 2-100 мг/кг/сутки. Верхний предел эффективного вводимого количества не важен, поскольку соединения относительно нетоксичны, как показывают представленные токсикологические данные. Эффективное количество соединения является наиболее эффективным при лечении или предупреждении язвенного колита, болезни Крона, диабета 2 типа, диабета 1 типа, преддиабета, метаболического синдрома, нарушения механизма усваивания глюкозы и резистентности к инсулину животного при введении животному в течение периодов в диапазоне от приблизительно 7 до 100 дней, причем предпочтительный период составляет от 15 до 50 дней, а наиболее предпочтительный период составляет от 30 до 42 дней.
Количество соединения, наиболее предпочтительное для предупреждения сверхактивации иммунной системы, может находиться в диапазоне от 0,1 до 500 мг/кг/сутки, причем предпочтительная доза составляет 1-150 мг/кг/сутки.
Когда эффективное количество соединения настоящего изобретения вводят в диетологическую, терапевтическую, лекарственную или ветеринарную композицию, предпочтительные диапазоны доз составляют от приблизительно 0,01 до 2,0 масс./масс. % для пищевого или or диетологического продукта.
В некоторых других вариантах осуществления, настоящее изобретение обеспечивает применение связывающих LANCL2 соединений, а также структурно связанных соединений, таких как соединение, выбранное из группы, состоящей из соединения, его сложных эфиров, его фармацевтически подходящих солей, его метаболитов, его структурно связанных соединений, или их комбинаций при лечении и предупреждении ВЗК и воспаления ЖКТ.
Кроме того, в целом, настоящее изобретение относится к ингибированию воспаления в ЖКТ, причем соответствующие компоненты включают желудок, тонкий кишечник, толстый кишечник и прямую кишку. Эффект обусловлен воздействием соединения на различные типы клеток в организме, который провоцирует биологическое действие. Клетки могут включать клетки из тканей ЖКТ, иммуноциты (т.е. макрофаги, моноциты, лимфоциты) или эпителиальные клетки. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение обеспечивает лечение субъектов соединением настоящего изобретения, например, в качестве диетической добавки, для снижения или предупреждения воспаления, связанного с воспалительными заболеваниями кишечника, или болезнью Крона, или язвенным колитом. Настоящее изобретение также предполагает введение соединений настоящего изобретения в ЖКТ для подавления экспрессии молекул клеточной адгезии в пищеварительном тракте.
При осуществлении на практике, способы настоящего изобретения могут быть реализованы путем введения соединений субъекту посредством любого пригодного пути введения, используя любую подходящую форму, как описано выше, и обеспечение распределения соединений телом субъекта в целевую клетку за счет природных процессов. Как описано выше, введение может аналогично происходить путем прямой инъекции в сайт (например, орган, ткань), содержащий целевую клетку (т.е. клетку, подлежащую лечению).
Кроме того, введение может происходить в соответствии с рядом режимов. Таким образом, оно может содержать однократную дозу или дозирование экспериментального соединения, или многократную дозу или дозы в течение периода времени. Следовательно, лечение может включать повторение стадии введения один или несколько раз до тех пор, пока не будет достигнут желаемый результат. В некоторых вариантах осуществления, лечение может продолжаться в течение длительных периодов времени, например, недель, месяцев или лет. Специалисты в данной области техники вполне могут легко разработать подходящие режимы дозирования для отдельных пациентов на основании известных в данной области параметров. Количества доз для соединений настоящего изобретения могут быть использованы в способах данных вариантов осуществления настоящего изобретения. Для лечения ВЗК, воспаления ЖКТ или подавления экспрессии молекул клеточной адгезии в пищеварительном тракте предпочтительно, чтобы соединения вводились в количествах от приблизительно 1 мг/сутки до 9000 мг/сутки.
Количество, подлежащее введению, будет изменяться в зависимости от субъекта, стадии заболевания или расстройства, возраста субъекта, общего состояния здоровья субъекта и других различных параметров, известных и обычно принимаемых во внимание специалистами в области медицины. В общем случае достаточное количество соединения будут вводить для получения заметного изменения в величине воспаления в ЖКТ, что в случае ВЗК часто связано со степенью испытываемых болевых ощущений человека. У пациентов, не испытывающих на данный момент симптомов ВЗК, изменение, которое следует искать, может включать параметры иммуноцитов, такие как экспрессия TNFα на иммуноциы или процент регуляторных T-клеток в крови. Подходящие количества раскрыты в настоящем документе, и дополнительные подходящие количества могут быть определены специалистами в данной области без чрезмерного или избыточного проведения экспериментов, на основании количеств, раскрытых в настоящем документе.
В одном аспекте, настоящее изобретение обеспечивает способ лечения или профилактики субъекта, страдающего от ВЗК, или в ином случае здоровых людей, возможно с генетической предрасположенностью к болезни Крона или язвенному колиту, от развития ВЗК. Способ может также включать лечение пациентов с ослабленной формой ВЗК. Согласно настоящему изобретению, термин «субъект, страдающий от ВЗК» используют для обозначения субъекта (например, животного, человека) с заболеванием или расстройством, проявляющего один или несколько клинических признаков, которые типичны для ВЗК. В целом, способ лечения или предупреждения, согласно данному аспекту настоящего изобретения, включает введение субъекту количества лечебного соединения, эффективного для лечения или предупреждения одного или нескольких симптомов или клинических проявлений ВЗК, или для предупреждения развития такого симптома(ов) или проявления(й).
Escherichia coli, Shigella, Salmonella
Vibrios
Campylobacter jejuni, Yersina enterocolitica, Toxoplasma gondii, Entamoeba histolytica
Giardia lamblia
Таким образом, согласно способам настоящего изобретения, настоящее изобретение может обеспечивать способы лечения ВЗК, воспаления, связанного с кишечной инфекцией, и воспаления, связанного с аутоиммунными заболеваниями. Способы лечения могут быть профилактическими способами. В некоторых вариантах осуществления, способ представляет собой способ лечения ВЗК, воспаления, связанного с кишечной инфекцией, и воспаления, связанного с аутоиммунными заболеваниями. В других вариантах осуществления, способ представляет собой способ предупреждения ВЗК. В вариантах осуществления, способ представляет собой способ предупреждения перехода ослабленной формы ВЗК в активную. В еще одних вариантах осуществления, способ представляет собой способ улучшения состояния здоровья субъекта, страдающего от ВЗК, воспаления, связанного с кишечной инфекцией, и воспаления, связанного с аутоиммунными заболеваниями. Организмы, вызывающие желудочно-кишечные инфекции включают, помимо прочего: , pathogenic , и . Следовательно, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ защиты здоровья, органов и/или тканей субъекта, страдающего от ВЗК, воспаления, связанного с кишечной инфекцией, и воспаления, связанного с аутоиммунными заболеваниями, или при риске развития ВЗК, воспаления, связанного с кишечной инфекцией, и воспаления, связанного с аутоиммунными заболеваниями.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, способ лечения ВЗК включает лечение ВЗК без видимых побочных эффектов, таких как значительный набор веса, системная иммуносупрессия, появление признаков кушингоида, остеопения/остеопороз или панкреатит, которые обычны для доступных на данный момент способов лечения ВЗК (т.е. кортикостероиды, ингибиторы фактора некроза опухолей альфа). То есть было обнаружено, что способ лечения согласно настоящему изобретению, который обеспечивает лечебный эффект, по меньшей мере частично, путем влияния на экспрессию и/или активацию LANCL2 в некоторых клетках, обеспечивает положительный результат без значительного набора веса, например, путем удержания жидкости, у субъекта, которого лечат, по сравнению с другими аналогичными субъектами, которые не получали лечения.
+
+
+
В результате, способы настоящего изобретения могут обеспечивать способы уменьшения воспаления. Способы могут уменьшать воспаление системно (т.е. во всем теле субъекта) или местно (например, в месте введения или месте клеток зоны воспаления, включая, помимо прочего, T-клетки и макрофаги). При лечении или предупреждении воспаления, согласно способам настоящего изобретения, один наблюдаемый эффект представляет собой снижение числа моноцитов или макрофагов и лимфоцитов крови, инфильтрующих в кишечный тракт. Другим может быть увеличение популяций регуляторных иммуноцитов, таких как регуляторные T-клетки CD4CD25FoxP3, или увеличение регуляторных свойств лимфоцитов или макрофагов (например, повышение интерлейкина 4 (IL-4) или IL-10 или снижение TNF-α и IL-6). Другим может быть уменьшение присутствия воспалительных генов и/или молекул адгезии. Таким образом, способы также могут быть рассмотрены в качестве способов воздействия или изменения иммунного ответа субъекта, которому вводят терапию соединением. Субъект может иметь воспалительные заболевания кишечника или другое состояние, при котором иммуномодуляция T-клеток или снижение количества молекул клеточной адгезии является желательным результатом.
Настоящее изобретение также обеспечивает способы лечения инфекционного заболевания соединениями, описанными в настоящем документе. Неограничивающие примеры таких инфекционных заболеваний включают вирусные инфекции, бактериальные инфекции и грибковые инфекции.
Неограничивающие примеры вирусных инфекций включают инфекции от вирусов семейства adenoviridae, такими как аденовирус; вирусов семейства herpesviridae, такими как простой герпес, типа 1, простой герпес, типа 2, вирус ветряной оспы, вирус Эпштейна-Барра, цитомегаловирус человека, вирус герпеса человека и типа 8; вирусов семейства papillomaviridae, такими как вирус папилломы человека; вирусов семейства polyomaviridae, такими как вирус BK и вирус JC; вирусов семейства poxviridae, такими как оспы; вирусов семейства hepadnaviridae, такими как вирус гепатита B; вирусов семейства parvoviridae, такими как бокавирус человека и парвовирус B19; вирусов семейства astroviridae, такими как астровирус человека; вирусов семейства caliciviridae, такими как вирус Норфолк; вирусов семейства picornaviridae, такими как вирус Коксаки, вирус гепатита A, полиовирус и риновирус; вирусов семейства coronaviridae, такими как вирус острого респираторного синдрома; вирусов семейства flaviviridae, такими как вирус гепатита C, вирус желтой лихорадки, вирус денге и вирус Западного Нила, вирусов семейства togaviridae, такими как вирус краснухи; вирусов семейства hepeviridae, такими как вирус гепатита E; вирусов семейства retroviridae, такими как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ); вирусов семейства orthomyxoviridae, такими как вирус гриппа; вирусов семейства arenaviridae, такими как вирус гуанарито, вирус Хунин, вирус ласса, вирус Мачупо и вирус Сэбия; вирусов семейства bunyaviridae, такими как вирус конго-крымской геморрагической лихорадки; вирусов семейства filoviridae, такими как вирус Эбола и вирус, вызывающий «марбургскую болезнь»; вирусов семейства paramyxoviridae, такими как вирус кори, вирус свинки, вирус парагриппа, респираторно-синцитиальный вирус, метапневмовирус человека, вирус Хендра и нипавирус; вирусов семейства rhabdoviridae, такими как вирус бешенства; неопределенные вирусы, такие как вирус гепатита D; и вирусов семейства reoviridae, такими как ротавирус, орбивирус, колтивирус и вирус Банна, помимо прочего.
Bacillus anthracis
Bacillus cereus
Bordetella pertussis
Borrelia burgdorferi
Brucella abortus
Brucella canis
Brucella melitensis
Brucella suis Campylobacter jejuni Chlamydia pneumoniae
Chlamydia trachomatis
Chlamydophila psittaci
Clostridium botulinum
Clostridium difficile
Clostridium perfringens
Clostridium tetani
Corynebacterium diphtheriae
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Escherichia coli
Francisella tularensis
Haemophilus influenzae
Helicobacter pylori
Legionella pneumophila
Leptospira interrogans
Listeria monocytogenes
Mycobacterium leprae
Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium ulcerans
Mycoplasma pneumoniae
Neisseria gonorrhoeae
Neisseria meningitidis
Pseudomonas aeruginosa
Rickettsia rickettsii
Salmonella typhi
Salmonella typhimurium
Shigella sonnei
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus saprophyticus
Streptococcus agalactiae
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pyogenes
Treponema pallidum
Vibrio cholerae
Yersinia pestis
Yersinia enterocolitica
Yersinia pseudotuberculosis
Неограничивающие примеры бактериальных инфекций включают инфекции с бактериями, описанными выше, в дополнение к , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , и другим видам из рода вышеуказанных организмов.
Aspergillus
Aspergillus fumigatus
Blastomyces
Blastomyces dermatitidis
Candida
Candida albicans
Coccidioides
Cryptococcus
Cryptococcus neoformans
Cryptococcus gattii
Fusarium
Aspergillus
Candida
Histoplasma
Histoplasma capsulatum
Saccharomyces
Saccharomyces cerevisiae
Pneumocystis
Pneumocystis jirovecii
Sporothrix
Sporothrix schenckii
Неограничивающие примеры грибковых инфекций включают инфекции с грибками рода , такими как , которые вызывают аспергиллез; грибками рода , такими как , которые вызывают бластомикоз; грибками рода , такими как , которые вызывают кандидоз; грибками рода , которые вызывают кокцидиоидомикоз (калифорнийскую лихорадку); грибками рода , такими как и , которые вызывают криптококкоз; грибки-дерматофиты, которые вызывают дерматофитию; грибки, которые вызывают грибковый кератит, такие как вида , вида и вида ; грибками рода , такими как , которые вызывают гистоплазмоз; грибками порядка Mucorales, которые вызывают мукороз; грибками рода , такими как ; грибками рода , такими как , которые вызывают плазмоклеточную пневмонию; и грибками рода , такими как , которые вызывают споротрихоз.
Настоящее изобретение также обеспечивает способы лечения аутоиммунного воспалительного заболевания соединениями, описанными в настоящем документе. Неограничивающие примеры аутоиммунных воспалительных заболеваний включают воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), системную волчанку, ревматоидный артрит, диабет 1 типа, псориаз и рассеянный склероз, помимо прочего.
Настоящее изобретение также обеспечивает способы лечения хронических воспалительных заболеваний соединениями, описанными в настоящем документе. Неограничивающие примеры хронических воспалительных заболеваний включают метаболический синдром, ожирение, преддиабет, сердечно-сосудистое заболевание и диабет 2 типа, помимо прочего.
Настоящее изобретение также обеспечивает способы лечения диабета соединениями, описанными в настоящем документе, включая диабет 1 типа, диабет 2 типа и другие типы диабета. Термин «диабет» или «сахарный диабет» используют для включения нарушений обмена веществ, при которых субъект имеет высокое содержание сахара в крови (т.е. гипергликемию). Гипергликемические состояния имеют различные этиологии, например, поджелудочная железа не вырабатывает достаточное количество инсулина, или клетки не отвечают на инсулин, который получается. Существует несколько определенных подтипов диабета. Диабет 1 типа отличается полным отсутствием продуцирования организмом инсулина или отсутствием продуцирования организмом достаточного количества инсулина. Диабет 2 типа обычно является результатом резистентности к инсулину, состояния, при котором клетки не используют инсулин надлежащим образом. Диабет 2 типа иногда присутствует совместно с дефицитом инсулина. Гестациозный диабет происходит, когда у беременной женщины без предварительного диагноза диабет развивается гипергликемия. Менее встречающиеся формы диабета включают наследственный диабет (ввиду генетически обусловленной недостаточности, связанной с секрецией инсулина), связанный с кистозным фиброзом диабет, сахарный стероидный диабет, возбуждаемый высокими дозами глюкокортикоидов, и некоторые формы моногенного диабета (включая диабет зрелого возраста у молодых людей). Моногенный диабет включает некоторые наследственные формы диабета, вызываемые мутациями в одном, аутосомном доминантном гене (в противоположность более сложным, полигенным этиологиям, приводящим к гипергликемии).
Ввиду вышеуказанных способов будет очевидно, что настоящее изобретение обеспечивает терапию связывающим LANCL2 соединением для применения в контактирующих клетках, например, при лечении клеток субъекта. Вышеуказанное обсуждение сосредоточено на применении соединений настоящего изобретения в виде части композиции для применения в том, что можно, в общем, рассматривать фармацевтической или медицинской установкой.
Соединения, описанные в настоящем изобретении для лечения ВЗК, воспаления ЖКТ и других описанных состояний, могут быть составлены в виде фармацевтической, диетологической композиции, композиции продуктов здорового питания или диетической добавки, как описано более подробно выше.
Элементы и стадии способа, описанные в настоящем документе, могут быть использованы в любой комбинации, описано ли это явным образом или нет.
Все комбинации стадий способа при использовании в настоящем документе можно проводить в любом порядке, если иное не определено или явным образом не следует из контекста, в котором указана упоминаемая комбинация.
При использовании в настоящем документе формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если в контексте явным образом не указано иное.
Численные диапазоны, используемые в настоящем документе, предназначены для включения любого числа и подгрупп чисел, содержащихся в этом диапазоне, раскрыты ли они явным образом или нет. Кроме того, эти численные диапазоны следует рассматривать как обеспечивающие основание для пункта формулы, направленного на любое число или подгруппу чисел в этом диапазоне. Например, раскрытие от 1 до 10 следует рассматривать как основание для диапазона от 2 до 8, от 3 до 7, от 5 до 6, от 1 до 9, от 3,6 до 4,6, от 3,5 до 9,9 и т.д.
Все патенты, публикации патентов и рецензируемые публикации (т.е. «ссылки»), цитируемые в настоящем документе, специально включены ссылкой в таком же объеме, как если бы каждая отдельная ссылка была конкретно и отдельно указана как включенная посредством ссылки. В случае конфликта между настоящим раскрытием и включенными ссылками, настоящее раскрытие имеет преимущество.
Следует понимать, что изобретение не ограничено конкретной описанной и показанной конструкцией и расположением частей в ней, но охватывает такие его модифицированные формы, находящиеся в пределах объема формулы изобретения.
ПРИМЕРЫ МОЛЕКУЛЯРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ
Пример 1: Молекулярное моделирование связывания лиганда LANCL2
Введение
Известные агонисты LANCL2, такие как абсцизовая кислота (ABA) и NSC61610, проявляют противовоспалительная активность в широком диапазоне моделей заболеваний в ряду от ВЗК до диабета и гриппа. Значение LANCL2 в качестве нового терапевтического средства заслуживает внимания в отношении обнаружения и разработки нового класса перорально активных лекарственных средств для лечения хронических метаболических, связанных с иммунной системой и инфекционных заболеваний. Как обсуждается в данном примере, дополнительные агонисты LANCL2 были разработаны посредством рациональной структуры лекарственных средств, которые итеративно объединяют компьютерное моделирование и экспериментальную оценку. В данном примере показаны подходы к увеличению усилий в отношении рациональной структуры лекарственных средств и медицинской химии для повышения растворимости, повышения связывания с LANCL2, снижения стоимости и понимания самого белка LANCL2.
Способы
Структура LANCL2.
Для LANCL2 не существует кристаллической структуры. Таким образом, для понимания структуры и функции LANCL2, моделирование гомологии LANCL2 человека проводили при помощи кристаллической структуры LANCL1 в качестве шаблона. Качество модели оценивали и уточнения делали посредством процедур минимизации энергии. Моделирование гомологии предлагает 3D-структуру белка посредством идентификации его гомологичных белков из других членов семейства белков, чьи структуры были экспериментально найдены [52]. Когда белки имеют идентичность последовательности более 35%, они, вероятно, являются гомологичными. LANCL1 имеет идентичность последовательности 54% с LANCL2 [15].
Генерирование соединения и структура лиганда
. Получали структуры агонистов LANCL2 (фиг. 1A и 1B). SMILES этих агонистов генерировали при помощи онлайн транслятора и конвертера SMILES NIH [53]. Параллельно, получали и загружали отдельные структурные.pdb файлы. AutoDock Tools использовали для конвертирования pdb файлов в.pdbqt, необходимые для виртуального скрининга.
Виртуальный скрининг.
Установку сгенерированных производных файлов проводили при помощи AutoDock Tools. Область поиска определяли, включая центр квадрата сетки и размеры по осям x, y и z. Стыковку применяли для всего целевого белка, причем сетка покрывала всю поверхность белка. Сетка представляла собой правильный куб (77,8 Å x 77,8 Å x 77,8 Å) с узловыми точками, разнесенными на 0,608 Å. Эту решетку отцентровывали в середине белка. Эти размеры и расстояния позволяли решетке охватить всю поверхность LANCL2. Генетический алгоритм использовали при вероятностной глобальной оптимизации. Сто форм связи генерировались AutoDock Tools для каждого соединения. 100 полученных положений для каждого производного кластеризуются с RMSD допуском кластера 2,0 Å.
Анализ результатов виртуального скрининга
.
Поиск наилучшего пути для совпадения каждого соединения в LANCL2, используя AutoDock Vina, давал файлы протокола стыковки, которые содержали факты стыковки, включая энергию связывания каждого предполагаемого типа связывания для всех соединений. Энергии связывания представляют сумму всей энергии межмолекулярного взаимодействия, всей внутренней энергии и торсионной свободной энергии минус энергия несвязанной системы. Соединения классифицировали по наибольшему значению отрицательной энергии. Наименьшая энергия связывания, находящаяся в первом кластере, рассматривалась как наиболее желательное положение стыковки. Более низкая свободная энергия связывания указывает на более устойчивую систему белок-лиганд и более высокую аффинность между белком и лигандом. Типичные соединения дополнительно проверяли при помощи in vitro тестирования и доклинических исследований при помощи мышиных моделей человеческих заболеваний.
Результаты
Итоги стыковки NSC61610.
Гистограмма наилучших пяти кластеров NSC61610 с энергией самого низшего по энергии положения дана на фиг. 2. NSC61610 имеет очень сильную аффинность к 'центральной трещине'. Каждый из двух наилучших кластеров, представляющих 7% всех стыковок, направлен на этот участок. Ввиду допуска в два ангстрема, вероятно, что другие кластеры направлены на этот участок. Следующие два кластера направлены на 'аллостерический участок' вблизи синего статистического клубка.
Итоги стыковки ABA
. Гистограмма наилучших пяти кластеров ABA с энергией самого низшего по энергии положения представлена на фиг. 3. ABA имеет среднюю аффинность, но очень высокую специфичность к 'аллостерическому' участку между светло-зеленым витком спирали и светло-зеленым статистическим клубком. 29% всех стыковок направлены на этот наилучший кластер. Второй кластер также направлен на этот участок. Ввиду допуска в два ангстрема, вероятно, что другие кластеры направлены на этот участок. Четвертый кластер, по-видимому, находится в 'центральной трещине'. Это оставляет открытым вопрос истинного терапевтического участка ABA.
Итоги стыковки BT-11
.
Гистограмма наилучших пяти кластеров BT-11 с энергией самого низшего по энергии положения представлена на фиг. 4. Два наилучших кластера BT-11 направлены на 'центральную трещину', но представляют только 2% всех стыковок. Однако ввиду допуска в два ангстрема, вероятно, что другие кластеры направлены на этот участок. BT-11 имеет значительно меньшую аффинность к этому участку, чем NSC61610, но большую, чем ABA. BT-11 продемонстрировал терапевтическую эффективность (см. примеры ниже).
Итоги стыковки BT-6.
Гистограмма наилучших пяти кластеров BT-6 с энергией самого низшего по энергии положения дана на фиг. 5. BT-6 имеет наивысшую аффинность к любому стыкуемому соединению. Два наилучших, возможно три, кластера направлены на 'центральную трещину'. Ввиду допуска в два ангстрема, вероятно, другие кластеры направлены на этот участок. Кластер 4 направлен на 'аллостерический' участок синего статистического клубка.
Итоги стыковки BT-15.
Гистограмма наилучших пяти кластеров BT-15 с энергией самого низшего по энергии положения дана на фиг. 6. BT-15 не имеет аффинности связывания ни с NSC61610, ни с BT-11. Хотя, вероятно, он направлен на 'центральную трещину', этот эффект не кажется явно выраженным как у NSC61610 или BT-11.
Итоги стыковки BT-ABA-5a
.Гистограмма наилучших пяти кластеров BT-ABA-5a с энергией самого низшего по энергии положения представлена на фиг. 7. Наивысшая аффинность BT-ABA-5a находится в участке, не видимом ни в одной из ранее изучаемых стыковок. Однако кластеры 2 и 3 представляют подавляющее большинство всех стыковок, на уровне 32%. Кластер 2 направлен на аллостерический участок сзади справа. Кластер 3 направлен на 'аллостерический участок' ABA. Кластер 4 также направлен на этот участок. Ввиду допуска в два ангстрема, вероятно, другие кластеры направлены на этот участок.
Обсуждение
Как ABA, так и NSC61610 вызывают зависящие от LANCL2 иммунномодулирующие, противовоспалительные и противодиабетические эффекты, однако прогнозы на основании вычислений показывают, что они связываются с различными сайтами LANCL2. Как ожидалось, рационально разработанные лиганды направлены главным образом на первичные сайты связывания ABA и NSC61610. Соединения BT-ABA имеют меньший размер и -COOH функциональные группы; интуитивно понятно, что они будут направлены на гидрофильный поверхностный «карман». BT-соединения намного более гидрофобны; таким образом, интуитивно понятно, что они будут направлены на более гидрофобную центральную трещину, окруженную альфа-спиралями.
D
Аффинности связывания имеют умеренную корреляцию с данными ППР (фиг. 1A и 1B; смотрите примеры ниже). Данные ППР (со значением K) предполагают порядок силы связывания NSC61610 (2.3 и 6.3), BT-11 (6.3 и 7.7), BT-15 (11.4 и 21.4), BT-6 (18.2). Данные моделирования (с самой низкой BE) предполагают порядок силы связывания BT-6 (-10,47), NSC61610 (-10,27), BT-11 (-9,39), BT-15 (-8,87). Помимо обратного порядка в BT-6 от наихудшего до первого, данные ППР и данные моделирования предполагают такой же порядок силы связывания. Данные молекулярного моделирования вместе с рациональным составом лекарственного средства, вероятно, дают лучшее понимание белка LANCL2, что будет обеспечивать дальнейшую разработку аналогов, которые нацелены на путь LANCL2 и активируют его для использования его сильных противодиабетических и противовоспалительных свойств.
ПРИМЕРЫ, ОТНОСЯЩИЕСЯ К МЕДИЦИНСКОЙ ХИМИИ
Пример 2: BT-11 и соль
схеме 2-1
H
d
1
+
++
6
Как показано на , раствор 6-(1-бензимидазол-2-ил)пиридин-2-карбоновой кислоты (12 г) в DMF (100 мл) охлаждали до 0°C, а затем последовательно добавляли EDC•HCl (1,5 экв.), HOBt (1,5 экв.) и DIPEA (1,2 экв., взятые в объемах с предполагаемой плотностью). Смесь перемешивали в течение 10 минут при 0°C. Пиперазин (0,5 экв.) добавляли и реакционной смеси дали постепенно нагреться до к.т. и перемешивали в течение 16 ч. После завершения реакции (которую контролировали при помощи TLC, элюент: 10% MeOH в DCM) реакционную смесь выливали в ледяную воду (~300 мл), осадившееся твердое вещество отфильтровывали, промывали ледяной водой и сушили с получением BT-11 (10 г, 75%) в виде бледно-коричневого твердого вещества. H-ЯМР (400 МГц, DMSO-), δ 13,0 (s, 1H), 12,8 (s, 1H), 8,38 (dd, 2H), 8,13 (dt, 2H), 7,73 (dd, 2H), 7,67 (d, 2H), 7,57 (dd, 2H), 7,25 (m, 4H), 3,90 (bs, 2H), 3,80 (bdd, 2H), 3,65 (bdd, 2H), 3,56 (bs, 2H). LCMS-ES 529,44 [M+H], 265,46 [(M+2H)/2].
Схема 2-1
схеме 2-2
2
2
2
2
6
1
+
d
Как показано на , суспензию BT-11 (1,0 экв.) в минимальном количестве MeOH (5 мл) охлаждали до 0°C, добавляли по каплям 4M HCl в метаноле (избыток, 15 мл/1 г) в течение периода 15-20 мин. Смеси позволяли постепенно нагреться до к.т. в течение 3 ч. После завершения реакции (что контролировали при помощи TLC, элюент: 10% MeOH в CHCl) летучие вещества выпаривали при пониженном давлении. Неочищенный материал промывали 10% MeOH в CHCl и лиофилизировали с получением почти белого твердого вещества (850 мг, 75%). H-ЯМР (400 МГц, DMSO-), δ 8,58 (dd, 2H), 8,29 (dt, 2H), 7,83 (m, 6H), 7,44 (bd, 4H), 3,91 (bs, 2H), 3,81 (bm, 2H), 3,64 (bm, 2H), 3,55 (bs, 2H). LCMS-ES 529,56 [M+H].
Схема 2-2
Пример 3: BT-12
схеме 3-1
2
2
3
1
Как показано на , раствор 6-(бензоксазол-2-ил)пиридин-2-карбоновой кислоты (4,05 г) в 10% DMF в CHCl обрабатывали EDC•HCl (1,5 экв.), HOBt (1,5 экв.) и DIPEA (1,2 экв., взятые в объемах с предполагаемой плотностью) и 0,5 экв. пиперазина при 0°C. Смеси позволяли нагреться до к.т. в течение 16 ч. Светло-коричневое твердое вещество образовывалось, и его отфильтровывали в воронке из спеченного стекла, промывали водой и лиофилизировали с получением светло-коричневого твердого вещества (3,2 г). H-ЯМР (300 МГц, CDCl), δ 8,45 (dd, 2H), 8,05 (m, 2H), 7,9 (d, 2H), 7,8 (dd, 2H), 7,6 (dd, 2H), 7,4 (m, 2H), 7,35 (m, 2H), 4,0 (bm, 8H).
Схема 3-1
Пример 4: BT-14 и соль
схеме 4-1
1
+
+
+
d
6
Как показано на , раствор 6-(бензоксазол-2-ил)пиридин-2-карбоновой кислоты (500 мг) в DMF (10 мл) обрабатывали EDC•HCl (1,5 экв.), HOBt (1,5 экв.), DIPEA (3 экв.) и трет-бутилпиперазин-1-карбоксилатом (1,1 экв.) при 0°C. Смеси позволяли нагреться до к.т. в течение 16 ч. После испарения растворителя остаток экстрагировали в EtOAc и промывали водой. Органический слой испаряли под вакуумом, неочищенный остаток промывали пентаном с получением светло-коричневого твердого вещества (120 мг, 48%). H-ЯМР (400 МГц, DMSO-), δ 8,4 (d, 1H), 8,2 (t, 1H), 7,9 (t, 2H), 7,8 (d, 1H), 7,5 (dt, 2H), 3,7 (bm, 2H), 3,5 (bm, 4H), 3,4 (bm, 2H), 1,4 (s, 9H). LCMS-ES 409,49 [M+H], 431,37 [M+Na], 447,36 [M+K].
Схема 4-1
схеме 4-2
схемы 4-1
1
+
d
6
Как показано на , полученное соединение со  (200 мг) обрабатывали метанольным HCl (6 мл) при 0°C. Смеси позволяли нагреться до к.т. в течение 3 ч. Испарение растворителя и промывки пентаном и эфиром давали светло-коричневое твердое вещество (160 мг, колич.). H-ЯМР (300 МГц, DMSO-), δ 9,30 (bs, 2H), 8,45 (d, 1H), 8,25 (t, 1H), 7,9 (m, 3H), 7,5 (quin, 2H), 3,7 (bm, 2H), 3,5 (bm, 2H), 3,3 (bm, 4H), 1,4 (s, 9H). LCMS-ES 309,26 [M+H].
Схема 4-2
схеме 4-3
схемы 4-2
3
6
1
+
d
Как показано на , полученную соль (25 мг) из  нейтрализовали насыщ. водн. NaHCO с последующей сушкой в лиофилизаторе с получением 20 мг/96% рассматриваемого BT-14. Выход составлял 90%. H-ЯМР (300 МГц, DMSO-), δ 8,4 (d, 1H), 8,2 (t, 1H), 7,90 (t, 2H), 7,75 (d, 1H), 7.5 (quin, 2H), 3,95 (bm, 2H), 3,8 (bm, 2H), 3,3 (bm, 2H), 3,2 (bm, 2H); 309,37 LCMS-ES [M+H].
Схема 4-3
Пример 5: BT-15
схеме 5-1
H
d
1
6
+
++
Как показано на , 6-(1-бензимидазол-2-ил)пиридин-2-карбоновую кислоту (50 мг) в DMF (5 мл) обрабатывали EDC•HCl (1,5 экв.), HOBt (1,5 экв.), DIPEA (3 экв.) и 0,9 экв. соли BT-14 и HCl при 0°C. Смеси позволяли нагреться до к.т. в течение 16 ч. Фильтрование через воронку из спеченного стекла с последующей промывкой водой и лиофилизацией для удаления влаги давало 20 мг BT-15. H-ЯМР (400 МГц, DMSO-), δ 12,93 (d, 1H), 8,44 (dd, 1H), 8,36 (t, 1H) 8,25 (t, 1H), 8,17 (m, 2H), 7,87 (m, 3H), 7,72 (m, 2H), 7,54 (m, 2H), 7,31 (m, 3H), 3,90 (s, 2H), 3,82 (bm, 2H), 3,67 (bm, 2H), 3,58 (bm, 2H). LCMS-ES 530,48 [M+H], 265,94 [(M+2H)/2].
Схема 5-1
фиг. 1A
BT-15 показал связывание LANCL2 (). Его предполагаемая аффинность связывания с LANCL2 составляет -9,9, и аффинность, подтвержденная ППР, имела значение Kd 21,4.
Пример 6: Соль BT-13
схеме 6-1
H
d
1
+
6
Как показано на , 6-(1-бензимидазол-2-yl)пиридин-2-карбоновую кислоту (500 мг) в DMF (10 мл) обрабатывали EDC•HCl (1,5 экв.), HOBt (1,5 экв.), DIPEA (3 экв.) и трет-бутилпиперазин-1-карбоксилатом (1,1 экв.) при 0°C. Смеси позволяли нагреться до к.т. в течение 16 ч. После выливания реакционной смеси в ледяную воду, осадок отфильтровывали и сушили с получением бледно-коричневого твердого вещества (600 мг, 70%). TLC (100% этилацетат). H-ЯМР и LCMS согласуются. (Выход: 70%). H-ЯМР (300 МГц, DMSO-), δ 12,90 (s, 1H), 8,4 (d, 1H), 8,15 (t, 1H), 7,65 (td, 3H), 7,25 (quin, 2H), 3,7 (bm, 2H), 3,5 (bm, 2H), 3,3 (bm, 4H), 1,4 (s, 9H). LCMS-ES 408,35 [M+H].
Схема 6-1
схеме 6-2
схемы 6-1
Как показано на , полученное соединение из (600 мг) обрабатывали метанольной HCl (6 мл) в течение 3 ч при 0°C. Смеси позволяли постепенно нагреться до к.т. в течение 3 часов. Испарение избытка метанольной HCl дало BT-13 HCl (500 мг) в виде светло-коричневого твердого вещества.
Схема 6-2
Пример 7: BT-4 и соль
схеме 7-1
1
+
++
d
6
Как показано на , 3-(1H-бензимидазол-2-ил)бензойную кислоту (100 мг) в DMF (6 мл) обрабатывали EDC•HCl (1,5 экв.), HOBt (1,5 экв.), DIPEA (1 экв.) и 0,5 экв. пиперазина при 0°C. Смеси позволяли нагреться до к.т. в течение 16 ч. TLC (10% метанол: DCM) показала образование неполярного участка и отсутствие исходного материала. После обработки и промывок эфиром выделяли 30 мг/95% BT-4. H-ЯМР (400 МГц, DMSO-), δ 13,0 (s, 2H), 8,3 (bm, 4H), 7,75 (bm, 4H), 7,60 (bm, 4H), 7,2 (bm, 4H), 3,65 (bm, 8H). LCMS-ES 527,36 [M+H], 264,50 [(M+2H)/2].
Схема 7-1
схеме 7-2
1
+
++
d
6
Как показано на , 30 мг/95% BT-4 обрабатывали 4M HCl в диоксане в течение 3 ч. Испарение растворителя и промывка эфиром давали 10 мг/97% соли BT-4 и HCl. H-ЯМР (400 МГц, DMSO-), δ 8,45 (bm, 4H), 7,80 (bm, 8H), 7,50 (bm, 4H), 3,65 (bm, 8H). LCMS-ES 527,44 [M+H], 264,50 [(M+2H)/2].
Схема 7-2
Пример 8: BT-6 и соль
схеме 8-1
H
d
1
+
++
6
Как показано на , 3-(1-бензимидазол-2-ил)бензойную кислоту (100 мг) в DMF (6 мл) обрабатывали EDC•HCl (1,5 экв.), HOBt (1,5 экв.), DIPEA (1 экв.) и бензол-1,4-диамином (0,5 экв.) при 0°C. Смеси позволяли нагреться до к.т. в течение 16 ч. TLC (10% метанол: DCM) показала образование неполярного участка и отсутствие исходного материала. После обработки и промывок эфиром выделяли светло-коричневое твердое вещество (60 мг). H-ЯМР (300 МГц, DMSO-), δ 13,1 (s, 2H), 10,45 (s, 2H), 8,75 (s, 2H), 8,40 (d, 2H), 8,05 (d, 2H), 7,85 (s, 4H), 7,70 (t, 4H), 7,55 (d, 2H) 7,25 (quin, 4H). LCMS-ES 549,0 [M+H] 275,1 [(M+2H)/2].
Схема 8-1
схеме 8-2
1
+
++
d
6
Как показано на , 60 мг/98% BT-6 обрабатывали 4M HCl в диоксане в течение 3 ч. После испарения растворителя и промывки эфиром получали 50 мг/96% соли BT-6 и HCl. H-ЯМР (300 МГц, DMSO-), δ 10,60 (s, 2H), 9,00 (s, 2H), 8,55 (d, 2H), 8,30 (d, 2H), 7,90 (s, 4H), 7,85 m, 6H), 7,50 (m, 4H). LCMS-ES 549,3 [M+H] 275,3 [(M+2H)/2].
Схема 8-2
Пример 9: BT-16 и соль
схеме 9-1
Как показано на , 6-(1H-бензимидазол-2-ил)пиридин-2-карбоновую кислоту (100 мг) в DMF (10 мл) обрабатывали EDC•HCl (1,5 экв.), HOBt (1,5 экв.), DIPEA (3 экв.) и бензол-1,4-диамином (0,5 экв.) при 0°C. Смеси позволяли нагреться до к.т. в течение 16 ч. После выливания реакционной смеси в ледяную воду осадок отфильтровывали и сушили с получением бледно-коричневого твердого вещества (60 мг).
Схема 9-1
схеме 9-2
1
+
d
6
Как показано на , соединение BT-16 (50 мг) обрабатывали HCl в диоксане (3 мл) при 0°C. Смеси позволяли нагреться до к.т. в течение 4 ч. Испарение избытка HCl в диоксане давало 30 мг коричневого твердого вещества (30 мг). H-ЯМР (300 МГц, DMSO-), δ 11,00 (s, 2H), 8,6 (bm, 2H), 8,35 (bm, 4H), 8,05 (s, 4H), 7,85 (bm, 4H), 7,40 (bm, 4H). LCMS-ES 551,84 [M+H].
Схема 9-2
Пример 10: BT-3 и соль
схеме 10-1
1
+
d
6
Как показано на , 3-(2-бензоксазолил)бензойную кислоту (50 мг) в DMF (10 мл) обрабатывали EDC•HCl (1,25 экв.), HOBt (1,25 экв.), DIPEA (1 экв.) и пиперазином (1 экв.) при 0°C. Смеси позволяли нагреться до к.т. в течение 16 ч. После разбавления реакционной смеси ледяной водой полученное твердое вещество извлекали, фильтрование с последующей сушкой давало 30 мг BT-3. H-ЯМР (300 МГц, DMSO-), δ 8,2 (bm, 4H), 7,8 (bm, 4H), 7,7 (bm, 4H), 7,45 (bm, 4H), 3,6 (bm, 8H). LCMS-ES 529,32 [M+H].
Схема 10-1
схеме 10-2
Как показано на , BT-3 (30 мг) обрабатывали метанольным HCl (5 мл) при 0°C. Смеси позволяли нагреться до к.т. в течение 4 ч. После испарения избытка метанольного HCl в вакууме образовывалось коричневое твердое вещество (15 мг).
Схема 10-2
Пример 11: BT-5 и соль
схеме 11-1
1
Как показано на , 3-(2-бензоксазолил)бензойную кислоту (50 мг) в DMF (10 mL) обрабатывали EDC•HCl (1,25 экв.), HOBt (1,25 экв.), DIPEA (1 экв.) и бензол-1,4-диамином (0,5 экв.) при 0°C. Смеси позволяли нагреться до к.т. в течение 16 ч. Разбавление реакционной смеси ледяной водой, извлечение твердых веществ, фильтрование с последующей сушкой давали светло-коричневое твердое вещество (30 мг). H-ЯМР (300 МГц, TFA), δ 9,2 (bs, 2H), 8,8 (bm, 2H), 8,6 (bm, 2H), 7,9 (bm, 14H).
Схема 11-1
схеме 11-2
1
Как показано на , 35 мг BT-5 обрабатывали в HCl в диоксане (5 мл) при 0°C. Смеси позволяли нагреться до к.т. в течение 4 ч. После испарения избытка диоксана под вакуумом образовывалось светло-коричневое твердое вещество (15 мг). H-ЯМР (300 МГц, TFA), δ 9,3 (bs, 2H), 8,8 (bm, 2H), 8,6 (bm, 2H), 7,9 (bm, 14H).
Схема 11-2
Пример 12: BT-17 и соль
схеме 12-1
1
+
Как показано на , 6-(бензоксазол-2-ил)пиридин-2-карбоновую кислоту (100 мг) в DMF (10 мл) обрабатывали EDC•HCl (1,5 экв.), HOBt (1,5 экв.), DIPEA (1,2 экв.) и бензол-1,4-диамином (0,5 экв.) при 0°C. Смеси позволяли нагреться до к.т. в течение 16 ч. Разбавление реакционной смеси ледяной водой, извлечение твердых веществ, фильтрование с последующей сушкой давали светло-коричневое твердое вещество (70 мг). H-ЯМР (400 МГц, TFA), δ 8,85 (dd, 4H), 8,55 (t, 2H), 8,1 (bm, 4H), 7,95 (m, 4H), 7,85 (s, 4H). LCMS-ES 553,28 [M+H].
Схема 12-1
схеме 12-2
1
Как показано на , BT-17 (60 мг) обрабатывали в HCl в диоксане (10 мл) при температуре от 0°C до к.т. в течение 4 ч. После испарения растворителя при помощи лиофилизатора образовывалось светло-коричневое твердое вещество (45 мг). H-ЯМР (400 МГц, TFA), δ 8,90 (bm, 4H), 8,6 (bm, 2H), 8,0 (bm, 10H).
Схема 12-2
Пример 13: BT-ABA-25
схеме 13-1
фиг. 1B
Структура BT-ABA-25 показана на . BT-ABA-25 представляет лиганд LANCL2 (). Его предполагаемая аффинность связывания с LANCL2 составляет -7,5, а аффинность, подтвержденная ППР, имела значение Kd 1,77e-04.
Схема 13-1
Пример 14: BT-ABA-5a
схеме 14-1
3
2
6
1
+
d
Как показано на , раствор 8-винил-1,4-диоксаспиро[4.5]декан-8-ола (200 мг, 1 экв.) и метил-5-бромфуран-2-карбоксилата (1,5 экв.) в EtN (2 мл) дегазировали аргоном в течение 10 мин. Затем Pd(OAc) (0,025 экв.), DPPF (0,05 экв.) добавляли и снова дегазировали в течение 10 мин. Полученную реакционную смесь нагревали при 100°C в течение 16 ч. Светло-коричневое твердое вещество (130 мг) выделяли колоночной хроматографией (EtOAx/гексан 3:7). H-ЯМР (400 МГц, DMSO-), δ 7,30 (d 1H), 6,60 (d 1H), 6,45 (dd, 2H), 4,75 (s, 1H), 3,85 (s, 4H), 3,80 (s, 3H), 1,85 (m, 2H), 1,65 (m, 2H), 1,50 (m, 4H), LCMS-ES 291,34 [M+H].
Схема 14-1
схеме 14-2
схеме 14-1
схема 14-3
2
6
1
+
d
Как показано на , LiOH (3 экв.) добавляли в раствор 100 мг полученного соединения на  (соединение 4) в THF: HO: MeOH (2:1:0,5 мл), и смесь перемешивали при к.т. в течение 16 ч. Смесь затем концентрировали под пониженным давлением, и неочищенный материал растворяли в минимальном количестве воды и подкисляли при помощи 2н HCl до pH 4. Соединения экстрагировали при помощи EtOAc и концентрировали с получением светло-коричневого твердого вещества (54 мг), которое использовали для следующей реакции () без дополнительной очистки. H-ЯМР (400 МГц, DMSO-), δ 7,50 (d 1H), 6,60 (d 1H), 6,45 (dd, 2H), 4,75 (s, 1H), 3,85 (s, 4H), 3,80 (s, 3H), 1,85 (m, 2H), 1,65 (m, 2H), 1,50 (m, 4H). LCMS-ES 277,26 [M+H].
Схема 14-2
схеме 14-3
1
+
-
-
d
6
Как показано на , 3н HCl, 0,1 мл добавляли в соединение 5 (50 мг) в THF при 0°C при перемешивании. Смеси позволяли нагреться до к.т. в течение 6 ч. TLC показала отсутствие SM и неполярный участок. Смесь концентрировали под пониженным давлением, разбавляли водой, экстрагировали при помощи EtOAc и повторно концентрировали с получением коричневого твердого вещества (20 мг). H-ЯМР (400 МГц, DMSO-), δ 13,00 (bs 1H), 7,20 (d 1H), 6,95 (d 1H), 6,60 (d 1H), 6,45 (d, 1H), 6,10 (t, 1H), 3,05 (m, 2H), 2,65 (t, 2H), 2,5,(2H). LCMS-ES 233,21 [M+H] LCMS-ES 231,27 [M-H] 463,15 [2M-H].
Схема 14-3
Пример 15: BT-ABA-6
схеме 15-1
3
3
2
6
1
+
d
Как показано на , раствор 8-винил-1,4-диоксаспиро[4.5]декан-8-ола (500 мг, 1 экв.), этил-3-йодбензоата (0,8 экв.) и PPh (0,02 экв.) в EtN (8 мл) дегазировали аргоном в течение 10 мин. Затем Pd(OAc) (0,02 экв.) добавляли и снова дегазировали в течение 10 мин. Полученную реакционную смесь нагревали при 95°C в течение 16 ч. После обработки бледно-коричневое твердое вещество (500 мг) выделяли колоночной хроматографией (EtOAc/гексан 3:7). H-ЯМР (400 МГц, DMSO-), δ 7,95 (s 1H), 7,80 (d 1H), 7,71 (d 1H), 7,47 (t 1H), 6,65 (d 1H), 6,49 (d, 1H), 4,65 (bs 1H), 4,32 (q, 2H), 3,68 (s, 4H), 1,99-1,68 (m, 4H), 1,55-1,50 (m, 4H), 1,33 (t 3H). LCMS-ES 315,38 [M-17].
Схема 15-1
схеме 15-2
2
6
1
+
d
Как показано на , раствор соединения 4 (500 мг) в THF/HO/EtOH (4:2:1, 17,5 мл) охлаждали до 0°C; LiOH (2,5 экв.) добавляли, и смесь перемешивали в то же время повышая температуру до к.т. в течение 16 ч. Смесь концентрировали под пониженным давлением, и неочищенный продукт растворяли в минимальном количестве воды и подкисляли при помощи 1н HCl до pH 3-4. Очистка колоночной хроматографией (EtOAc/гексан 1:1) давала бледно-желтое твердое вещество (220 мг). H-ЯМР (400 МГц, DMSO-), δ 13,00 (bs 1H), 7,95 (s 1H), 7,78 (d 1H), 7,67 (d 1H), 7,44 (t 1H), 6,64 (d 1H), 6,48 (d, 1H), 4,65 (s 1H), 3,86 (s, 4H), 1,87-1,61 (m, 4H), 1,55-1,50 (m, 4H). LCMS-ES 287,34 [M-17].
Схема 15-2
схеме 15-3
1
-
-
d
6
Как показано на , 2н HCl (1,5 мл) добавляли в смесь 100 мг соединения 5 (100 мг) в THF при 0°C при перемешивании. Смеси позволяли нагреться до к.т. в течение 6 ч. Раствор затем концентрировали под пониженным давлением, разбавляли водой, экстрагировали при помощи EtOAc и повторно концентрировали с получением бледно-желтого твердого вещества (20 мг). H-ЯМР (400 МГц, DMSO-), δ 13,00 (bs 1H), 8,00 (s, 1H), 7,80 (d 1H), 7,65 (d 1H), 7,45 (t 1H), 6,75 (d 1H), 6,45 (d, 1H), 6,10 (t, 1H), 5,15 (s 1H), 2,65 (m, 2H), 2,15 (m, 2H), 1,90 (m, 4H), LCMS-ES 259,37 [M-H] 519,48 [2M-H].
Схема 15-3
Пример 16: BT-ABA-13
схеме 16-1
2
2
Как показано на , дигидропиран (1,3 экв.) и TsOH (0,1 экв.) добавляли в раствор соединения 2 (2,5 г, 1 экв.) в CHCl (50 мл) при 0°C при перемешивании. Полученному раствору позволяли постепенно нагреться до к.т. в течение 14 ч. Бледно-желтую жидкость выделяли колоночной хроматографией (EtOAc/гексан 1:9). Соединение использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
Схема 16-1
схеме 16-2
3
1
Как показано на , соединение 3 (2,5 г, 1,0 экв.), 4,4,5,5-тетраметил-[1,3,2]диоксаборолан (1,2 экв.) и бис(циклопентадиенил)циркония хлорида гидрид (0,15 экв.) добавляли в EtN. Полученную реакционную смесь нагревали при 60-70°C в течение 16 ч. Реакционную смесь разбавляли гексанами. Осадок удаляли фильтрованием через короткую набивку силикагеля и промывали гексанами. При концентрировании растворов гексанов получали бесцветную маслянистую жидкость (1,3 г). H-ЯМР (400 МГц, CDCl3), δ 6,60 (d 1H), 5,60 (d 1H), 6,35 (d, 1H), 4,75 (s, 1H), 3,85 (s, 3H), 2,80 (m, 2H), 2,35 (m, 2H), 2,05 (m, 4H).
Схема 16-2
схеме 16-3
2
3
2
3
4
+
+
Как показано на , раствор соединения 4 (550 мг, 1,1 экв.), метил-6-бромпиколината (1,0 экв.), KCO (2,0 экв.) в смеси DME/HO 9:1 (8 мл) дегазировали аргоном в течение 10 мин. Затем добавляли Pd[(P(Ph)] (0,04 экв.). Полученную реакционную смесь нагревали при 100°C в течение 16 ч. Концентрирование реакционной смеси с последующей колоночной хроматографией (EtOAc/гексан 1:3) давало бледно-желтое твердое вещество (230 мг). LCMS-ES 404,39 [M+H], 302,26 [M-101].
Схема 16-4
схеме 16-5
2
3
1
+
Как показано на , TsOH (0,1 экв.) добавляли в раствор соединения 5 (230 мг, 1,0 экв.) в ацетоне/HO 1:1 (6 мл). Полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Концентрирование реакционной смеси с последующей колоночной хроматографией (EtOAc/гексан 7:3) давало бледно-желтое твердое вещество (110 мг). H-ЯМР (400 МГц, CDCl), δ 8,00 (d 1H), 7,80 (t, 1H), 7,50 (d, 1H), 6,90 (m 2H), 4,00 (s, 3H), 2,80 (m, 2H), 2,35 (m, 2H), 2,10 (m, 4H), LCMS-ES 276,38 [M+H].
Схема 16-5
схеме 16-6
2
6
1
+
d
Как показано на , LiOH (2,5 экв.) добавляли в раствор соединения 6 (75 мг) в THF/HO 3:1 (3 мл) при 0°C при перемешивании. Смеси позволяли нагреться до к.т. в течение 6 ч. Реакционную смесь подкисляли лимонной кислотой и экстрагировали смесью THF и EtOAc. Концентрирование органического раствора давало не совсем белое твердое вещество (10 мг). H-ЯМР (300 МГц, DMSO-), δ 13,05 (bs, 1H), 7,90 (m, 2H), 7,65 (d, 1H), 7,05 (d, 1H), 6,80 (d, 1H), 5,20 (s, 1H), 2,65 (m, 2H), 2,20 (bd 2H), 2,10-1,90 (m, 4H), LCMS-ES 262,27 [M+H].
Схема 16-6
Пример 17: BT-ABA-16
схеме 17-1
2
3
2
3
4
3
1
+
+
Как показано на , раствор соединения 4 (437 мг, 1,2 экв.), метил-2-бромизоникотината (1,0 экв.), KCO (2,0 экв.) в смеси DME/HO 9:1 (8 мл) дегазировали аргоном в течение 10 мин. Затем добавляли Pd[(P(Ph)] (0,04 экв.). Полученную реакционную смесь нагревали при 90°C в течение 12 ч. Концентрирование реакционного раствора с последующей колоночной хроматографией (EtOAc/гексан 1:3) давало бледно-желтую жидкость (300 мг). H-ЯМР (300 МГц, CDCl), δ 8,70 (d, 1H), 7,85 (s, 1H), 7,65 (d, 1H), 6,85 (d, 1H), 6,65 (d, 1H), 4,70 (m, 1H), 3,95 (m, 4H), 2,20-1,40 (m, 16H), LCMS-ES 404,54 [M+H], 302,53 [M-101].
Схема 17-1
схеме 17-2
2
1
+
Как показано на , TsOH (0,1 экв.) добавляли в раствор 5 (300 мг, 1,0 экв.) в ацетоне/HO 1:1 (6 мл). Полученную реакционную смесь перемешивали при к.т. в течение 48 ч. Концентрирование реакционной смеси с последующей колоночной хроматографией (EtOAc/гексан 7:3) давало почти белое твердое вещество (160 мг). H-ЯМР (300 МГц, DMSO-d6), δ 8,70 (d, 1H), 7,85 (s, 1H), 7,65 (d, 1H), 7,05 (d, 1H), 6,85 (d, 1H), 5,20 (s, 1H), 3,90 (s, 3H), 2,65 (td, 2H), 2,15 (bd, 2H), 2,00 (m, 2H), 1,85 (m, 2H), LCMS-ES 276,22 [M+H].
Схема 17-2
схеме 17-3
2
1
+
Как показано на , LiOH (2,5 экв.) добавляли в раствор соединения 6 (100 мг) в THF/HO 3:1 (3 мл) при 0°C при перемешивании. Смеси позволяли нагреться до к.т. в течение 16 ч. Реакционную смесь подкисляли лимонной кислотой и экстрагировали смесью THF и EtOAc. Концентрирование под пониженным давлением давало почти белое твердое вещество (20 мг). H-ЯМР (300 МГц, DMSO-d6), δ 13,60 (bs, 1H), 8,70 (d, 1H), 7,85 (s, 1H), 7,60 (d, 1H), 7,00 (d, 1H), 6,85 (d, 1H), 5,20 (s, 1H), 2,65 (m, 2H), 2,20-1,80 (m, 6H), LCMS-ES 262,28 [M+H].
Схема 17-3
Пример 18: BT-ABA-14
схеме 18-1
2
3
2
3
4
3
1
+
Как показано на , раствор соединения 4 (300 мг, 1,2 экв.), метил-4-бромпиколината (1,0 экв.), KCO (2,0 экв.) в смеси DME/HO 9:1 (8 мл) дегазировали аргоном в течение 10 мин. Затем добавляли Pd[(P(Ph)] (0,04 экв.). Полученную реакционную смесь нагревали при 90°C в течение 12 ч. Концентрирование реакционного раствора с последующей колоночной хроматографией (EtOAc/гексан 1:3) давало бледно-желтую жидкость (200 мг). H-ЯМР (300 МГц, CDCl), δ 8,50 (d, 1H), 8,20 (bs, 1H), 7,45 (d, 1H), 6,70 (d, 1H), 6,50 (d, 1H), 4,60 (m, 1H), 3,95 (m, 4H), 2,20-1,40 (m, 16H), LCMS-ES 390,35 [M+H].
Схема 18-1
схеме 18-2
2
6
1
+
d
Как показано на , TsOH (0,1 экв.) добавляли в раствор 5 (200 мг, 1,0 экв.) в ацетоне/HO 1:1 (6 мл). Полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 48 ч. Реакционную смесь подкисляли лимонной кислотой и экстрагировали смесью THF и EtOAc. Раствор концентрировали для получения почти белого твердого вещества (18 мг). H-ЯМР (300 МГц, DMSO-), δ 8,60 (d, 1H), 8,05 (s, 1H), 7,60 (d, 1H), 6,90 (d, 1H), 6,70 (d, 1H), 5,20 (bs, 1H), 2,65 (m, 2H), 2,15 (bd, 2H), 2,05-1,80 (m, 4H), LCMS-ES 262,27 [M+H].
ПРИМЕРЫ СВЯЗЫВАНИЯ С РЕЦЕПТОРОМ
Пример 19: Пример связывания LANCL2
in vitro
Компьютерное моделирование и биохимическую оценку объединяли для обеспечения выбора соединений, которые связываются с LANCL2. Последние итерации технологии поверхностного плазмонного резонанса (ППР) обеспечивают  количественные значения с высоким выходом для определения молекулярного взаимодействия между белками без меток и небольшими молекулами (>25 Да) в режиме реального времени. Технология BIACORE™ T200 (GE Healthcare, Пискатавэй, Нью-Джерси) дополнительно обеспечивает дополнительное преимущество соответствия GMP/GLP и независимого промышленного сбора данных или скринингов или точных титрований в менее чем 24-часовой период. Интересующие молекулярные взаимодействия обычно подтверждают технологией ППР BIACORE™ T200.
Способы
Скрининг с высоким выходом посредством молекулярного моделирования взаимодействий LANCL2-соединение.
Auto-Doc Vina [14] является программным обеспечением уровня техники, способным выполнять параллельные вычисления с высоким выходом для определенного связывания LANCL2-растительных соединений. Программное обеспечение сначала рассчитывает (i) силы свободной энергии, связанные с комплексом связывания, а затем (ii) конформационное пространство, доступное для комплексообразования между мишенью и лигандом. Эти способы являются стохастическими по природе, таким образом, требуют повторяющиеся независимые скрининги для тщательного изучения всей области параметров и обеспечения уверенности в предположениях. Сейчас модель LANCL2 доступна посредством моделирования гомологии LANCL1 [15]. AutoDockTools, графический интерфейс для AutoDock и AutoGrid, использовали для определения области поиска, включая центр квадрата сетки и размеров по x,y,z [16]. AutoDock Vina генерировал пять структур связывания для каждого соединения. Стыковку применяют для всего белка-мишени, причем сетка покрывает всю поверхность белка. Файлы протокола стыковок генерировали, состоящие из энергий связывания для каждого предполагаемого режима связывания для всех соединений для всех поверхностей.
Определение кинетики взаимодействия LANCL2-небольшие молекулы.
BIACORE™ T200 использовали для определения параметров кинетики для связывания небольших молекул BT-11, BT-ABA-5a, BT-6 и BT-15 (аналиты) с LANCL2 (лиганд). Данные генерировали дозозависимым (5-8 точек титрования) образом с трехкратным повторением и анализировали для определения модели связывания (по Ленгмюру, конформационный сдвиг и пр.), констант ассоциации и диссоциации в режиме реального времени и равновесной константы диссоциации. Технология ППР обеспечивала подтверждение специфичных взаимодействий LANCL2-фитохимические вещества, а также достижение золотой стандарт понимания механизма и скорости связывания. Эксперименты проводили на карбоксиметилдекстрановых (CM5) сенсорных чипах путем ковалентного присоединения LANCL2 путем аминного связывания. Проточные кюветы 1 и 2 сенсорного чипа активировали на 720 секунд при 10 мкл/минуту при помощи смеси 1:1 0,1 M N-гидроксисукцинимида (NHS) и 0,5 M 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида гидрохлорида (EDC). Исходный раствор LANCL2 (0,41 мг/мл) разводили до 8,2 мкг/мл (разбавление 1:50) в 10 мM ацетате натрия, pH 5,0 и вводили через активированную поверхность проточной кюветы 2 в течение 1000 секунд при расходе 10 мкл/мин. После захвата LANCL2 на проточной кювете 2 (11000 RU), поверхности проточных кювет 1 и 2 дезактивировали путем введения 1M этаноламина в течение 720 секунд при 10 мкл/мин. Проточный буфер представлял собой 25 мM MOPS, содержащий 0,05% T-20 и 0,15 M NaCl, pH 6,5. Исследования кинетики проводили путем введения тройных повторений различных концентраций BT-11 (25 мкМ, 12,5 мкМ, 6,25 мкМ, 3,13 мкМ, 1,56 мкМ и 0,76 мкM), BT-ABA-5a (40 мкM, 20 мкM, 10 мкM, 5 мкM, 2,5 мкM и 1,25 мкM) и BT-15/BT-6 (20 мкM, 10 мкM, 5 мкM, 2,5 мкM, 1,25 мкM, 0,625 мкM и 0,313 мкM). Каждый образец вводили в течение 60 секунд (время контакта) с последующим временем диссоциации 60 секунд с расходом 100 мкл/мин. Время стабилизации 180 секунд использовали перед следующим введением. Данные анализировали при помощи программного обеспечения BIACORE™ T200 Evaluation Software (версия 1) для определения константы аффинности связывания (KD) при помощи модели связывания 1:1.
Результаты
Как BT-11, так и BT-15 сильно связываются с LANCL2
k
k
K
K
фиг. 8, панели A и C
фиг. 8, панели B и D
a
d
D
D
. Для подтверждения связывания BT-11 и BT-15 с белком LANCL2 мы проводили анализы ППР на устройстве BIACORE™ T-200. ППР, оптическую технику, используемую для обнаружения молекулярных взаимодействий, использовали для измерения аффинности связывания между LANCL2 и его лигандами (т.е. BT-11 и BT-15). Мы иммобилизировали очищенный рекомбинантный белок LANCL2 на сенсорных чипах BIACORE™ и вводили небольшие молекулы на поверхность белка, используя микрофлюидную систему устройства. Изменения общей массы на поверхности чипа измеряли, что соответствует небольшому связыванию с белком. Путем введения ряда концентраций небольших молекул мы смогли рассчитать аффинности связывания установившегося режима для связывания BT-11 с LANCL2 и связывания BT-15 с LANCL2. Сенсорограммы связывания показали обычное взаимодействие небольших молекул и белка с очень быстрыми скоростями ассоциации и очень быстрыми скоростями диссоциации (). Эти быстрые взаимодействия находятся за пределами технических возможностей устройства. Таким образом, достоверные константы скорости ассоциации () и константы скорости диссоциации () не были определены. Равновесная константа диссоциации () обычно используется для описания аффинности между лигандом и белком, например, как прочно лиганд связывается с конкретным белком. На аффинности лиганда и белка влияют нековалентные межмолекулярные взаимодействия между двумя молекулами, например, водородное связывание, электростатические взаимодействия, гидрофобные и силы Ван-дер-Ваальса. Путем указания на графике уровня равновесного связывания относительно концентрации соединения мы смогли измерить аффинность () установившегося режима для каждого взаимодействия (). Обе небольшие молекулы показали аналогичную аффинность связывания для LANCL2 (BT-11: 7,7 мкM, BT-15 11,4 мкM).
BT-ABA-5a и BT-6 надежно связываются с LANCL2
фиг. 9A и 9B
. Аналогично результатам, описанным выше, и для подтверждения связывания BT-6 и BT-ABA-5a с LANCL2 мы проводили анализы ППР на устройстве BIACORE™ T-200. В этом случае мы также иммобилизировали очищенный рекомбинантный белок LANCL2 на сенсорных чипах BIACORE™ и вводили небольшие молекулы на поверхность белка при помощи микрофлюидной системы устройства. Изменения общей массы на поверхности чипа измеряли, что соответствует небольшому связыванию с белком. При более подробном рассмотрении сенсорограмм связывания () наши результаты показали, как BT-6 и BT-ABA-5a очень быстро связываются, но не так быстро как диссоциируют, по сравнению с BT-11/BT-15, которые очень быстро ассоциируют и очень быстро диссоциируют. Известно, что время пребывания для BT-ABA-5a показало самую медленную скорость диссоциации, что означает, что BT-ABA-5a остается дольше всего в кармане связывания LANCL2. Это самое длительное связывание может потенциально влиять на активацию пути LANCL2 путем запуска более эффективных противовоспалительных, и противодиабетических и других терапевтических ответов.
фиг. 1A и 1B
Другие соединения тестировали посредством ППР и результаты доступным образом показаны на .
ПРИМЕРЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Пример 20: Применение BT-11 на модели острого ВЗК
Введение
Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), хроническое, повторяющееся заболевание желудочно-кишечного тракта, поражает более 1,4 миллиона людей в CША. ВЗК имеет два различных проявления: язвенный колит и болезнь Крона. Существующая терапия против ВЗК является умеренно успешной и имеет значительные побочные эффекты при длительном лечении заболевания [17]. Тогда как болезнь Крона представляет хроническую стадию заболевания, острый язвенный колит (ЯК) проявляется как ранняя патология, которая влияет на ткань толстой кишки. ЯК является хроническим идиопатический воспалительным заболеванием ЖКТ, которое характеризуется воспалением слизистой прямой кишки, которое проходит проксимально через толстую кишку, непрерывным образом, но с переменной степенью тяжести. Расстройство характеризуется как рецидивами, так и ремиссиями различной тяжести. Основная масса пациентов имеет заболевание левосторонней или дистальной части умеренной-средней тяжести. Большинство пребывает в состоянии ремиссии в течение длительных периодов при применении медицинской терапии. Однако исследования течения болезни показывают, что от 10 до 40% будут испытывать колэктомию в некоторый момент времени в течение хода их заболевания.
Медицинское лечение устойчивого к стероидам тяжелого ЯК несколько расширилось в последние годы с увеличением доступности как циклоспорина, так и инфликсимаба в качестве восстанавливающих средств; однако хирургическое вмешательство все еще остается единственным «лечебным» вариантом. Настоящее изобретение обеспечивает новый лекарственный продукт для лечения ЯК путем нацеливания на новый рецептор под названием LANCL2. BT-11, наше наилучшее рабочее соединение, вводится перорально и системно распределяется, и влияет на иммуномодулирующие эффекты при ЯК путем нацеливания на LANCL2 в иммунноцитах пищеварительного тракта. Наши доклинические исследования эффективности при остром ЯК на мышах показали, как введение BT-11 снижает индекс активности заболевания и снижает воспаление пищеварительного тракта путем значительного снижения лейкоцитарной инфильтрации в слизистой пищеварительного тракта, а также снижения утолщения слизистой и эрозии эпителия. Анализы экспрессии гена подтвердили, что пероральное введение BT-11 активирует экспрессию IL-10 и LANCL2, и подавляет экспрессию TNFα mRNA в модели острого индуцированного DSS язвенного колита у мышей.
Способы
Мыши
. C57BL/6 закупали в Jackson Laboratory и содержали в специальных непатогенных условиях в вентилируемых клетках. Мышей LANCL2-/- закупали в репозитории KOMP в Калифорнийском университете в Дейвисе. Всех мышей содержали в вивариях. Все протоколы экспериментов были утверждены Комитетом по биоэтике и соответствовали руководства Управления защиты лабораторных животных Национального института здравоохранения США и политику Министерства здравоохранения или превосходили их.
DSS-индуцированный колит
. Колит индуцировали у мышей C57BL/6J путем введения 5% (масс./об.) декстрана натрия сульфата (DSS; молекулярная масса 42 кДА; ICN Biochemicals, Аврора, Огайо), добавленного в питьевую воду. Воспаление толстой кишки оценивали через 7 дней после введения DSS. Группы в проекте DSS состояли из i. мышей без DSS, которых лечили средой, ii. мышей без DSS, которых лечили при помощи BT-11 (80 мг/кг), iii. мышей, которым вводили DSS и которых лечили средой, и iv. мышей, которым вводили DSS и которых лечили при помощи BT-11 (80 мг/кг). В каждой группе было по двенадцать мышей.
Гистопатология
. Участки толстой кишки из исследований ВЗК у мышей фиксировали в 10% буферном нейтральном формалине, затем вдавливали в парафин, а затем нарезали (5 мкм) и окрашивали гематоксилином и эозином для гистологического исследования. Толстые кишки распределяли по сложному гистопатологическому показателю, включающему степень (1) лейкоцитарной инфильтрации, (2) утолщение слизистой и (3) эрозию эпителиальных клеток. Срезы оценивали как 0-4 для каждой из предыдущих категорий, и данные анализировали в виде нормализованных сложных оценок.
Количественный PCR в режиме реального времени
. Общую РНК выделяли из толстых кишок мышей при помощи RNEASY PLUS MINI KIT (Qiagen, Валенсия, Калифорния), согласно инструкциям производителя. Общую РНК (1 мкг) использовали для создания шаблона кДНК при помощи набора для синтеза кДНК ISCRIPT™ (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния). Общий реакционный объем составлял 20 мкл, причем реакцию инкубировали следующим образом в термоциклере MJ MINI™ (Bio-Rad): 5 минут при 25°C, 30 минут при 52°C, 5 минут при 85°C и выдерживали при 4°C. PCR проводили на кДНК при помощи Taq ДНК полимеразы (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния). Каждый ампликон гена очищали при помощи набора для очистки MINELUTE PCR (Qiagen) и количественно определяли как на геле арагозы при помощи маркера длин ДНК (Promega, Мадисон, Висконсин) и технологии «nanodrop». Эти очищенные ампликоны использовали для оптимизации условий PCR в режиме реального времени и для получения стандартных кривых в анализе PCR в режиме реального времени. Праймеры получали при помощи программного обеспечения Oligo 6. Концентрации праймеров и температуры отжига оптимизировали для системы ICYCLER IQ™ (Bio-Rad) для каждого набора праймеров, используя градиентный протокол системы. Эффективности PCR поддерживали от 92 до 105% и коэффициенты корреляции >0,98 для каждого набора праймеров при оптимизации, а также при PCR в режиме реального времени образца ДНК. Концентрации кДНК для интересующих генов тестировали при помощи qPCR в режиме реального времени, используя систему ICYCLER IQ™ и IQ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Стандартную кривую получали для каждого гена при помощи 10-кратных разбавлений очищенных ампликонов начиная с 5 пг кДНК и используя последний для расчета исходного количества целевой кДНК неизвестных образцов. SYBR green I является обычным специфичным к двунитевой ДНК красителем и может, таким образом, детектировать неспецифичные продукты и праймеры/димеры помимо интересующего ампликона. Для определения ряда продуктов, синтезированных во время PCR в режиме реального времени, анализ кривой плавления проводили для каждого продукта. PCR в режиме реального времени использовали для измерения исходного количества нуклеиновой кислоты каждого неизвестного образца кДНК на том же 96-луночном планшете.
Статистический анализ
. Параметрические данные анализировали при помощи ANOVA с последующим способом множественного сравнения Шеффе. Непараметрические данные анализировали при помощи U-критерия Манна-Уитни с последующим тестом множественного сравнения Данна. ANOVA проводили при помощи процедуры общей линейной модели SAS, вып. 6.0.3 (SAS Institute). Статистическую значимость оценивали как P≤0,05.
Результаты
BT-11 улучшает состояние при заболевании и снижает патологию ткани в модели DSS колита
фиг. 10, панель A
фиг. 10, панель B
фиг. 10, панель C
фиг. 10, панель D
. Целью данного исследования была оценка того, активирует ли введение BT-11 LANCL2 и оказывает ли противовоспалительные свойства в контексте ВЗК. Для оценки эффективности нашего типичного соединения BT-11 в модели острого ВЗК, мы вводили мышам C57BL/6J 5% DSS на протяжении 7 дней. В течение периода введения лечение при помощи BT-11 значительно улучшало показатель активности заболевания (). Кроме того, макроскопические повреждения в селезенке (), БЛУ () и толстой кишке () также значительно уменьшались после активации пути LANCL2 при помощи BT-11 на 7 день после введения.
BT-11 улучшает гистопатологию толстой кишки у мышей с острым воспалительным колитом дозозависимым образом
фиг. 11, панель G
фиг. 11, панель H
фиг. 11, панель I
фиг. 11, панель A-F
фиг. 12, панели A-C
. Затем мы тестировали влияние BT-11 на гистопатологические воспалительные повреждения толстой кишки. В соответствии с нашими наблюдениями активности заболевания и макроскопических повреждений, гистопатологический анализ подтвердил, что лечение при помощи BT-11 значительно снижает в 5 раз воспаление в слизистой пищеварительного тракта на основании оценки лейкоцитарной инфильтрации (), эрозии эпителия () и утолщения слизистой (). Типичные микрофотографии толстой кишки показали, как лечение при помощи BT-11 при DSS-индуцированном колите у мышей значительно улучшает состояние слизистой пищеварительного тракта путем повышения целостности эпителиальных клеток и снижения разрушения структуры пищеварительного тракта, а также инфильтрации некоторых субпопуляций иммунноцитов (). Мы проводили исследования дозы-ответа при помощи BT-11, и мы, что интересно, наблюдали то, как три пробы воспаления толстой кишки (лейкоцитарная инфильтрация, утолщение слизистой и эрозия эпителия) уменьшались у мышей с колитом, когда доза BT-11 повышалась от 10 до 80 мг/кг ().
Пероральное лечение при помощи BT-11 снижает экспрессию TNFα и активирует LANCL2 и IL-10
фиг. 13, панель A
фиг. 13, панель B
фиг. 13, панель C
фиг. 14, панель B
фиг. 14, панель A
фиг. 14, панель C
. Для более точного изучения влияния BT-11 на модуляцию иммунной системы мы оценивали экспрессию генов IL-10, LANCL2 и TNFα. Результаты показали, как лечение при помощи BT-11 подавляют экспрессию фактора некроза опухолей альфа (TNFα) (), а также активирует уровни интерлейкина 10 (IL-10) () и рецептор LANCL2 (), таким образом создавая положительный контур обратной связи, который активирует противовоспалительное действие и подавляет воспалительный ответ, побуждаемый TNFα. Путем проведения исследования дозы-ответа мы смогли предположить, что наш лиганд BT-11 и последующая активация пути LANCL2 непосредственно повышают продуцирование IL-10 толстой кишки, поскольку его экспрессия, оцененная проточной цитометрией, следует динамике доза-ответ при лечении при помощи BT-11 (). Мы наблюдали, что снижение экспрессирующих TNFα клеток в толстой кишке значительно отличалось как при 40, так и 80 мг/кг BT-11, но не при более низких дозах, например, 10 или 20 мг/кг (). Мы также наблюдали, что экспрессия FOXP3 в БЛУ является дозозависимой ().
Влияние BT-11 при остром колите зависит от LANCL2
фиг. 15, панель A
фиг. 15, панель B
фиг. 15, панель C
фиг. 15, панель D
фиг. 16
. Для того чтобы продемонстрировать то, каким образом положительные результаты введения BT-11 действуют при остром колите у мышей, мы проводили исследования, сравнивая такие эффекты у мышей с диким типом и нокаутом LANCL2 (LANCL2-/-). Наши результаты продемонстрировали, что LANCL2 необходим для BT-11, чтобы он оказал свои противовоспалительные эффекты, поскольку потеря LANCL2 не дает мышам восстановиться после острого DSS-индуцированного колита (). Аналогично, потеря LANCL2 не снижает макроскопические показатели в толстой кишке (), БЛУ () и селезенке () по сравнению с однопометными животными с диким типом и LANCL2-/-. Кроме того, влияние BT-11 на образование повреждений в слизистой толстой кишки также зависит от LANCL2, как мы оценивали гистопатологические анализы у мышей LANCL2-/-, которых лечили или средой, или BT-11, и мы наблюдали, как потеря LANCL2 полностью исключает эффект от BT-11 ().
фиг. 17, панель A
фиг. 17, панель B
фиг. 17, панель C
фиг. 17, панель D
фиг. 17, панель E
фиг. 17, панель F
Для дальнейшей характеристики клеточных ответов после лечения при помощи BT-11, мы проводили дополнительные исследования нокаута LANCL2 для определения того, было ли снижение провоспалительных белков и повышение противовоспалительных факторов. Наши результаты проточной цитометрии показали, что снижение провоспалительного фактора MCP1 является зависимым от LANCL2 как в толстой кишке (), так и БЛУ (), поскольку потеря гена LANCL2 отменяет действие BT-11. Мы также обнаружили, что секреция TNFα в толстой кишке является зависимым от LANCL2 (), а также активация MHC-II+ CD11c+ популяций гранулоцитов (). В соответствии с этими результатами мы обнаружили, что активация секреции IL-10 после лечения при помощи BT-11 полностью отсутствует у мышей с нокаутом LANCL2 как в толстой кишке (), так и селезенке (), показывая снова зависимость нашего наилучшего соединения от нашей интересующей мишени.
Обсуждение
in vivo
LANCL2, как обнаружили, является новой терапевтической целью для воспалительных и связанных с иммунной системой заболеваний [18]. Наши  результаты впервые продемонстрировали, что пероральное лечение лигандом LANCL2 с BT-11 улучшает иммунопатологию пищеварительного тракта в моделях мышей с ВЗК путем подавления воспаления. LANCL2 в последнее время уделено внимание, как возможной терапевтической цели ввиду его функции, связанной с связыванием и сигналингом ABA [19], и недавним открытием альтернативного мембранного механизма активации PPAR γ [8]. Кроме того, мы определили экспрессию LANCL2 в ряде тканей мышей, что показало, что помимо мозга и яичек, LANCL2 также экспрессируется в других тканях, таких как тимус, селезенка, толстая кишка и пейеровы бляшки, что указывает на возможную взаимосвязь между LANCL2 и иммунными ответами и предполагает более широкий потенциал LANCL2 в качестве терапевтической мишени.
фиг. 10
фиг. 11
фиг. 15 и фиг. 16
фиг. 13
фиг. 17
Ранее мы сообщали, что ABA трансактивирует PPARγ in vitro и подавляет системное воспаление, аналогично другим агонистам PPARγ. Поскольку как ABA, так и NSC61610 нацелены на LANCL2, NSC61610 может также действовать посредством активации PPARγ. Результаты экспериментов показали, что лечение при помощи NSC61610 активирует PPARγ в необработанных макрофагах, при этом обеспечивая признак возможной сигнальной связи между LANCL2 и PPARγ и показывая, что NSC61610 может нацеливаться на ось LANCL2-PPAR γ in vitro. Для изучения важности LANCL2 в опосредованной NSC61610 активации PPAR γ, мы определили, ослабляет ли или устраняет нокдаун LANCL2 в необработанных макрофагах при помощи siRNA влияние NSC61610 на активность репортера PPAR γ. Наши данные показали, что нокдаун LANCL2 значительно ухудшает эффект NSC61610 на активность PPAR γ [12]. В этом примере мы продемонстрировали то, каким образом введение BT-11 влияет на противовоспалительные свойства путем снижения не только показателя индекса активности заболевания и макроскопических показателей в селезенке, БЛУ и толстой кишке (), но также значительного снижения гистопатологических повреждений (). Мы показали, как эти два специфических эффекта зависят от LANCL2 (). Мы также продемонстрировали то, что BT-11 снижает уровни TNFa и активирует как LANCL2, так и IL-10 (). Мы также продемонстрировали то, что эти эффекты зависят от LANCL2, поскольку мы не наблюдали этих тенденций у мышей с LANCL2-/- (). Эти результаты подтвердили, что LANCL2 является новой терапевтической мишенью для воспалительное заболеваний, а BT-11 является соединением, которое нацелено на нее.
Пример 21: Применение BT-11 в хронической модели болезни Крона
Введение
Как указано выше, воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) с их двумя клиническими проявлениями, язвенным колитом и болезнью Крона, являются опосредованными иммунной системой заболеваниями, отличающимися сильным воспалением и инфильтрацией иммуноцитов желудочно-кишечного тракта. Этиология ВЗК является мультифакторной и приводит к взаимодействию генетической предрасположенности, факторов окружающей среды и микробиоты пищеварительного тракта.
Данный пример будет направлен на хроническое проявление ВЗК: болезнь Крона. Тогда как воспаление при язвенном колите характеризуется непрерывным характером, который вовлекает поверхностные слои слизистой и подслизистой, но ограничено толстой кишкой, при болезни Крона это воспаление является трансмуральным и прерывистым, и любой участок пищеварительного тракта может быть поврежден за пределами подвздошной кишки, которая подвергается наибольшему воздействию. Патогенез болезни Крона является сложным и на него действуют генетические факторы, и факторы окружающей среды, и опосредованные иммунной системой повреждения слизистой пищеварительного тракта, вызванной длительной активацией иммунной системы слизистой.
Лечения, нацеленные на супрессию иммунных и воспалительных ответов, таких как кортикостероид преднизон или антитело к фактору некроза опухоли-α REMICADE (Janssen Biotech, Inc., Хоршам, Пенсильвания) (инфликсимаб), показали перспективу снижения тяжести и повторного возникновения заболевания. Эти лечения, однако, также связаны с различными отрицательными побочными эффектами, такими как появление кушингоида, набор массы и системная иммуносупрессия, тем самым увеличивая необходимость в разработке более безопасных альтернативных средств для длительного лечения ВЗК [20].
Настоящее изобретение обеспечивает новый лекарственный продукт для лечения болезни Крона путем нацеливания на новый рецептор под названием LANCL2. BT-11, типичное соединение, вводится перорально и системно распределяется, и оказывает иммуномодулирующие эффекты не только на ЯК, но и болезнь Крона, путем нацеливания на LANCL2 в иммунноцитах пищеварительного тракта. Наши доклинические исследования эффективности на хронических моделях болезни Крона у мышей показали то, каким образом введение BT-11 снижает индекс активности заболевания и снижает воспаление пищеварительного тракта путем значительного снижения лейкоцитарной инфильтрации в слизистой пищеварительного тракта, а также снижает утолщение слизистой и эрозию эпителия. Анализ экспрессии гена подтвердил, что пероральное введение BT-11 активирует экспрессию LANCL2 и подавляет экспрессию TNFα mRNA в хронической модели ВЗК у мышей. Кроме того, введение BT-11 снижает количество провоспалительных макрофагов и инфильтрацию дендритных клеток в собственную пластинку слизистой оболочки толстой кишки, а также активирует экспрессирующие FOXP3 CD4+ T-клетки и подавляет число эффекторных Th1 клеток в толстой кишке. Мы также проводили исследования нокаута для подтверждения, что эти эффекты зависят от LANCL2. Наконец, на сайтах индуцирования BT-11 способен подавлять образование Th17 клеток, а также активировать компартмент регуляторных CD4+ T-клеток посредством активации экспрессии FOXP3.
Способы
Мыши
. Мышей с C57BL/6 и нокаутом IL-10 закупали в Jackson Laboratory и держали в специальных непатогенных условиях в вентилируемых клетках. Мышей LANCL2-/- закупали в репозитории KOMP в Калифорнийском университете в Дейвисе. Всех мышей содержали в вивариях. Все протоколы экспериментов утверждались Комитетом по биоэтике и соответствовали руководства Управления защиты лабораторных животных Национального института здравоохранения США и политику Министерства здравоохранения или превосходили их.
Обогащение и сортировка CD4+ T-клеток
. Спленоциты, полученные от мышей C57BL/6J (дикого типа), обогащали CD4+ T-клетками путем отрицательной сортировки на магнитных шариках при помощи системы разделения клеток I-Mag (BD Pharmingen). Клетки инкубировали смесью биотинилированной Abs с последующей второй инкубацией частицами стрептавидина и подвергали действию магнита для удаления нежелательных клеток. Чистота обогащенной CD4+ клеточной суспензии составляла от 93 до 96%. Обогащенные CD4 клетки использовали для адоптивного переноса, или дополнительно очищали при помощи FACS. Для сортировки FACS клетки помечали как CD45RB, CD4 и CD25 и разделяли на клетки CD4+ CD45RBhigh CD25- (т.е. эффекторные T-клетки) в клеточном сортере FACSARIA™ (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния). Чистота сортированных при помощи FACS субпопуляций CD4+ составляла ≥98%.
Адоптивный перенос
5
. Мышам SCID и RAG2-/- возрастом шесть недель вводили внутрибрюшинно (i.p.) 4×10 CD4+ CD45RBhigh CD25- от мышей C57BL/6J (дикий тип) или LANCL2-/-. Мышей взвешивали каждую неделю и клинические признаки заболевания записывали каждый день в течение 14 недель. Мышей, которые проявляли тяжелые признаки изнуряющей болезни, умертвляли. В ином случае, мышей умертвляли через 90 дней после переноса. Группы для изучения адоптивного переноса были следующими: i. без переноса, лечили средой, ii. без переноса, лечили при помощи BT-11 (80 мг/кг), iii. с переносом, лечили средой, iv. с переносом, лечили при помощи BT-11 (80 мг/кг). В каждой группе было по 12 мышей.
Гистопатология
. Участки толстой кишки из исследований ВЗК у мышей фиксировали в 10% забуренном нейтральном формалине, затем вдавливали в парафин, а затем нарезали (5 мкм) и окрашивали гематоксилином и эозином для гистологического исследования. Толстые кишки распределяли по сложному гистопатологическому показателю, включающему степень (1) лейкоцитарной инфильтрации, (2) утолщение слизистой и (3) эрозию эпителиальных клеток. Срезы оценивали как 0-4 для каждой из предыдущих категорий, и данные анализировали в виде нормализованных сложных оценок.
Выделение клеток
. Селезенки и брыжеечные лимфатические узлы (БЛУ) иссекали и измельчали в 1×PBS/5% FBS, используя замороженные кончики двух стерильных предметных стекол. Одноклеточные суспензии центрифугировали при 300× g в течение 10 минут и промывали один раз 1×PBS. Эритроциты удаляли путем осмотического лизиса перед стадией промывки. Все дебрисы повторно суспендировали в буфере FACS (1×PBS с добавкой 5% FBS и 0,09% азида натрия) и подвергали анализу проточной цитометрией. Параллельно толстые кишки иссекали и выделяли лейкоциты собственной пластинки слизистой оболочки (LPL). Кусочки ткани промывали в CMF (1× HBSS/10% FBS/25 мM Hepes), и ткань инкубировали дважды при помощи CMF/5 мM EDTA в течение 15 минут при 37°C при перемешивании. После промывания 1×PBS ткань дополнительно обрабатывали ы CMF с добавкой 300 ед./мл коллагеназой типа VIII и 50 ед./мл ДНКазой I (обе от Sigma-Aldrich) в течение 1,5 ч при 37°C при перемешивании. После отфильтровывания супернатантов, клетки промывали один раз 1×PBS, дебрисы повторно суспендировали в буфере FACS и подвергали анализу проточной цитометрией.
Иммунофенотипирование и анализ цитокинов при помощи проточной цитометрии
5
. Для флуоресцентного окрашивания субпопуляций иммунноцитов 4-6×10 клеток инкубировали в течение 20 минут при помощи специфичных первичных мышиных антител, конъюгированных с флуорохромом: анти-CD3 PE-Cy5 клон 145-2C11 (eBioscience, Сан-Диего, Калифорния), анти-CD4 PE-Cy7 клон GK1.5 (eBioscience), анти-CD4 APC клон RM4-5 и анти-CD25 биотин клон 7D4 (BD Biosciences). Клетки промывали буфером FACS (1×PBS с добавкой 5% FBS и 0,09% азида натрия). Для внутриклеточного окрашивания транскрипционных факторов и цитокинов, клетки фиксировали и нарушали проницаемость мембраны при помощи коммерческого набора согласно инструкциям изготовителя (eBioscience). Вкратце, клетки фиксировали и нарушали проницаемость мембраны в течение 20 минут, рецепторы Fc блокировали мышиным анти-CD16/CD32 FcBlock (BD Biosciences) и клетки окрашивали при помощи антител, конъюгированных с флуорохромом, в отношении антимышиный FOXP3 FITC клон FJK-16s, антимышиный ROR гамма (t) PE, клон B2B и антимышиный IL17-A APC, клон eBio17B7 (eBioscience). Все образцы хранили фиксированными при 4°C в темноте до внесения в проточный цитометр FACS Aria (BD Biosciences). Диапазон живых клеток (FSC-A, SSC-A) применяли ко всем образцам с последующим стробированием одиночными клетками (FSC-H, FSC-W) перед анализом клеток на экспрессию специфических маркеров. Анализ данных проводили при помощи FACS DIVA™ (BD Biosciences) и Flow Jo (Tree Star Inc.).
Количественный PCR в режиме реального времени
. Общую РНК выделяли из толстых кишок мышей при помощи RNEASY PLUS MINI KIT (Qiagen, Валенсия, Калифорния) согласно инструкциям производителя. Общую РНК (1 мкг) использовали для создания шаблона кДНК при помощи набора для синтеза кДНК ISCRIPT™ (Bio-Rad). Общий реакционный объем составлял 20 мкл, причем реакцию инкубировали следующим образом в термоциклере MJ MINI™ (Bio-Rad): 5 минут при 25°C, 30 минут при 52°C, 5 минут при 85°C и выдерживали при 4°C. PCR проводили на кДНК при помощи Taq ДНК полимеразы (Invitrogen). Каждый ампликон гена очищали при помощи набора для очистки MINELUTE PCR (Qiagen) и количественно определяли как на геле арагозы при помощи маркера длин ДНК (Promega) и nanodrop. Эти очищенные ампликоны использовали для оптимизации условий PCR в режиме реального времени и для получения стандартных кривых в анализе PCR в режиме реального времени. Праймеры получали при помощи программного обеспечения Oligo 6. Концентрации праймеров и температуры отжига оптимизировали для системы ICYCLER IQ™ (Bio-Rad) для каждого набора праймеров, используя градиентный протокол системы. Эффективности PCR поддерживали от 92 до 105% и коэффициенты корреляции >0,98 для каждого набора праймеров при оптимизации, а также при PCR в режиме реального времени образца ДНК. Концентрации кДНК для интересующих генов тестировали при помощи qPCR в режиме реального времени, используя систему ICYCLER IQ™ и IQ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Стандартную кривую получали для каждого гена при помощи 10-кратных разбавлений очищенных ампликонов начиная с 5 пг кДНК и используя последний для расчета исходного количества целевой кДНК неизвестных образцов. SYBR green I является обычным специфичным к двунитевой ДНК красителем и может, таким образом, детектировать неспецифичные продукты и праймеры/димеры помимо интересующего ампликона. Для определения ряда продуктов, синтезированных во время PCR в режиме реального времени, анализ кривой плавления проводили для каждого продукта. PCR в режиме реального времени использовали для измерения исходного количества нуклеиновой кислоты каждого неизвестного образца кДНК на том же 96-луночном планшете.
Статистический анализ
. Параметрические данные анализировали при помощи ANOVA с последующим способом множественного сравнения Шеффе. Непараметрические данные анализировали при помощи U-критерия Манна-Уитни с последующим тестом множественного сравнения Данна. ANOVA проводили при помощи процедуры общей линейной модели SAS, версия 6.0.3 (SAS Institute). Статистическую значимость оценивали как P≤0,05.
Результаты
BT-11 улучшает состояние при заболевании в модели хронического IL-10-/- ВЗК
фиг. 18
. В ряде исследований на животных, проводимых для изучения хроники болезни Крона, использовали мышиную модель с дефицитными по интерлейкину-10 мышами (IL-10-/-), при условии, что IL-10, как известно, подавляет секрецию множества провоспалительных цитокинов [21]. Для оценки эффективности BT-11 не только в острых моделях колита, но и в хронических моделях, мы устанавливали модель мышей с нулевым IL-10 для исследования колита и лечили мышей увеличивающимися дозами BT-11 (20, 40 и 80 мг/кг). Лечение при помощи BT-11 значительно снижало показатели индекса активности заболевания в мышей, получавших лечение, по сравнению с их однопометными животными, которых лечили средой (). Кроме того, у мышей, которых лечили наибольшими дозами BT-11 (80 мг/кг), значительно снижены показатели по сравнению с теми, которых лечили или 20, или 40 мг/кг соединения BT-11, начиная с 13 недели и до конца эксперимента.
BT-11 снижает макроскопические повреждения в селезенке, БЛУ и толстой кишке в хронической модели IL10-/- ВЗК
фиг. 19, панель A
фиг. 19, панель B
фиг. 19, панель C
. Чтобы изначально определить клиническую эффективность мы оценивали макроскопические повреждения ткани после лечения при помощи BT-11 и последующей активации пути LANCL2. Мы оценивали макроскопические показатели селезенки (), БЛУ () и толстой кишки () сразу после эвтаназии и отбора тканей через 19 недель после начала испытания. Лечение при помощи BT-11 с концентрациями лишь 20 мг/кг сильно и значительно снижало макроскопические показатели в трех тканях, показывая свою сильную эффективность.
BT-11 уменьшает гистопатологические повреждения и воспаление в хронической модели IL-10-/- ВЗК
фиг. 20, панель A
фиг. 20, панель B
фиг. 20, панель C
. Для оценки гистопатологических повреждений и общей патологии в слизистой пищеварительного тракта, участки толстой кишки окрашивали гематоксилином и эозином и рассматривали под микроскопом. Наши результаты продемонстрировали то, каким образом лечение при помощи BT-11 значительно снижало воспаление на основании снижения лейкоцитарной инфильтрации (), эрозии эпителия () и утолщения слизистой (). Мы также наблюдали дозозависимый механизм количества инфильтрации в слизистую пищеварительного тракта, что соответствует утолщению слизистой.
Лечение при помощи BT-11 индуцирует сильный противовоспалительный ответ и снижает провоспалительные субпопуляции в собственной пластинке слизистой оболочки толстой кишки, селезенке и БЛУ
фиг. 21, панель A
фиг. 21, панель B
фиг. 21, панель D
фиг. 21, панель C
. Для определения влияния BT-11 на субпопуляции иммунноцитов мы фенотипически охарактеризовали клетки, выделенные из толстой кишки, селезенки и БЛУ. Наши анализы показали, что BT-11 значительно снижал процент провоспалительныхF4/80+ макрофагов (), MHC-II+ CD11c+ дендритных клеток () и эффекторных Th1 клеток () в собственной пластинке слизистой оболочки толстой кишки. Кроме того, BT-11 проявлял противовоспалительные свойства посредством активации экспрессирующих FOXP3 CD4+ T-клеток в LP толстой кишки ().
фиг. 22, панель B
фиг. 22, панель C
фиг. 22, панель D
фиг. 22, панель A
Активация экспрессирующих FOXP3 CD4+ T-клеток также отмечалась как в БЛУ (), так и в селезенке (), показывая и демонстрируя то, что BT-11 имеет также системный эффект. Подавление провоспалительных Th1 клеток также наблюдалось в селезенке дозозависимым образом (). Наконец, эффекторные Th17 клетки, характеризующиеся своей экспрессиией RORγt, подавлялись в БЛУ ().
фиг. 23, панель A
Фиг. 23, панель B
Кроме того, анализ экспрессии гена подтвердил, что лечение при помощи BT-11 активирует экспрессию LANCL2 в толстой кишке () и подавляет экспрессию TNFα (). Эти эффекты экспрессии были дозозависимыми от количества вводимого BT-11.
BT-11 показал улучшение активности заболевания в индуцировании CD4+ T-клеток модели колита ВЗК
Фиг. 24
фиг. 25
. Для дополнительного подтверждения эффективности BT-11 в другой хронической модели ВЗК, мы адоптивно переносили необработанные CD4+ T-клетки от мышей с диким типом и LANCL2-/- реципиентам RAG2-/-. Мышей RAG2-/- лечили или средой, или BT-11 на основе эксперимента. Лечение при помощи наших наилучших соединений BT-11 значительно снижало показатель индекса активности заболевания у мышей, получавших лечение, по сравнению с их однопометными животными с диким типом (). Мы обнаружили, что эти результаты зависят от LANCL2, поскольку эффект BT-11 полностью исчезал при потере LANCL2 ().
фиг. 26
Интересно, что потеря массы у мышей, которых лечили при помощи BT-11, была значительно эффективнее, по сравнению с мышами, которым давали среду, начиная с 7 недели до конца эксперимента ().
BT-11 снижал макроскопические повреждения в селезенке, БЛУ и толстой кишке в хронической модели адоптивного переноса ВЗК
фиг. 27, панель A
фиг. 27, панель B
фиг. 27, панель C
фиг. 27, панель D
Фиг. 28
. Для подтверждения клинической эффективности во второй модели хронического колита мы оценивали макроскопические повреждения ткани после лечения при помощи BT-11 и последующей активации пути LANCL2 у мышей, которым адоптивно переносили клетки дикого типа или LANCL2-/- и которых лечили или средой, или BT-11. Мы давали макроскопические оценки селезенке (), БЛУ () и толстой кишке () и подвздошной кишке () сразу после эвтаназии и отбора тканей через 11 недель после начала испытания. Лечение при помощи BT-11 с концентрацией 80 мг/кг сильно и значительно снижает макроскопические показатели в четырех тканях, показывая его сильную эффективность. Как мы обнаружили, эти наблюдения являются зависимыми от LANCL2, а также потеря LANCL2 полностью устраняет эффект BT-11 ().
BT-11 также снижает гистопатологические повреждения и воспаление в модели адоптивного переноса хронического колита
фиг. 29, панели A и B
фиг. 29, панели E и F
фиг. 29, панель D
фиг. 29, панель C
фиг. 30
. Аналогично эксперименту с индуцированным IL-10-/- колитом и для подтверждения гистопатологических повреждений и общей патологии в слизистой пищеварительного тракта при помощи второй мышиной модели ВЗК, участки толстой кишки окрашивали гематоксилином и эозином и наблюдали под микроскопом. Наши результаты подтвердили, что лечение при помощи BT-11 значительно снижает воспаление на основании снижения лейкоцитарной инфильтрации как в толстой кишке, так и подвздошной кишке () и утолщение слизистой (). Известно, что подвздошная кишка была менее подвержена эрозии эпителия (), но что эрозия в толстой кишке, как обнаружили, была значительно ниже у мышей, которых лечили нашим наилучшим соединением BT-11 (). Для подтверждения зависимости BT-11 от LANCL2, мы проводили исследования адоптивного переноса и переносили CD4+ T-клетки от доноров с LANCL2-/-. Наши результаты показали как снижение лейкоцитарной инфильтрации, эрозии эпителия и утолщения слизистой сильно снижаются у реципиент с перенесенным LANCL2-/- ().
BT-11 согласованно индуцирует сильный противовоспалительный ответ и подавляет провоспалительные медиаторы у мышей
фиг. 31, панель A
фиг. 31, панель B
фиг. 31, панель C
фиг. 31, панель D
. Чтобы охарактеризовать профиль иммунноцитов у мышей, которых лечили при помощи BT-11, относительно среды, мы проводили анализы проточной цитометрией в клетках, выделенных из толстой кишки, селезенки и брыжеечных лимфатических узлов. Мы подтвердили на второй хронической мышиной модели ВЗК, что мыши-реципиенты, которых лечили при помощи BT-11 в течение периода в 11 недель, проявляли значительно более низкий уровень инфильтрации F4/80+ CD11b+ провоспалительных макрофагов (), а также имели сниженные уровни IFNγ на основании анализа, сделанного на общих CD45+ лейкоцитах () в толстой кишке. Кроме того, лечение при помощи BT-11 сообразно активирует регуляторные CD4+ T-клетки путем активации экспрессии FOXP3 () и сильного противовоспалительного цитокина IL-10 () в месте воспаления, в этом случае, слизистой толстой кишки.
фиг. 32, панели A, B, D и E
фиг. 32, панели C и F
Аналогично профилю, наблюдаемому в клетках собственной пластинки слизистой оболочки толстой кишки, мы характеризовали эти популяции в сайтах индуцирования, таких как селезенка и БЛУ. Результаты иммунофенотипирования показали, что лечение при помощи BT-11 также повышает уровни FOXP3 и IL-10 в сайтах индуцирования, таких как селезенка и БЛУ (). Известно, что лечение при помощи BT-11 снижало экспрессию IFNγ в CD45+ популяции как в БЛУ, так и в селезенке ().
Влияние нацеливания BT-11 на LANCL2 не зависит от PPARγ
фиг. 33, панели A-D
. Активация LANCL2 активирует избыток путей, которые в конечном счете регулируют основанные на IL-10 противовоспалительные ответы, которые регулируют воспаление на системном уровне, на основании наших экспериментальных результатов. Одним активированным последующим путем LANCL2 является путь PPARγ. Для преодоления возможных проблем с токсичностью на вторичную активацию этого ядерного и транскрипционного фактора, мы также переносили мышам RAG2-/- CD4+ T-клетки от доноров PPARγ -/-. Затем мы лечили этих мышей или средой, или BT-11 при 80 мг/кг. Наши результаты явным образом демонстрируют то, что положительные результаты BT-11 посредством активации LANCL2 на активность заболевания и гистопатологию происходят независимым от PPARγ образом (). Эти результаты показали, что активация LANCL2 также регулирует другие пути, которые модулируют противовоспалительные эффекты активации LANCL2.
Обсуждение
Существующие терапии против воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК) умеренно успешны и имеют значительные отрицательные побочные эффекты для длительного лечения заболевания [17]. Растительное соединение абсцизовая кислота (ABA) проявляет сильные противовоспалительные эффекты в мышиных моделях колита [22, 23]. Лантионинсинтетазный компонент C-подобный белок 2 (LANCL2) является мишенью для связывания и сигналинга ABA [15, 19, 24]. Таким образом, LANCL2 возник как многообещающая новая терапевтическая мишень против воспаления [18]. Соединение 61610, бис(бензимидазоил)терефталанилид (BTT), определили как связывающееся с LANCL2 с наибольшей аффинностью в библиотеке из нескольких миллионов химических веществ. Кроме того, 61610 проявляет сильные противовоспалительные эффекты в мышиных моделях воспаления пищеварительного тракта [25]. Тематический список из 20 полученных из 61610 BTT создавали и BT-11 определяли как наилучшее типичное соединение. BT-11 связывается с LANCL2, перорально активное, показало противовоспалительную эффективность в 3 мышиных моделях колита и превосходный профиль безопасности.
Согласно Организации поддержки пациентов с болезнью Крона и колитом в США, ВЗК поражает свыше 1 миллиона людей в Северной Америке и 4 миллиона по всему миру. Это распространенное и ослабляющее здоровье заболевание приводит к снижению качества жизни и значительным затратам, связанным с медицинским уходом [26]. Средние медицинские расходы для лечения одного случая ВЗК превышают 55000 долларов США на пациента [27], причем общие расходы превышают 15 миллиардов долларов США каждый год в США. Кроме того, косвенные затраты включают стоимость лечения периодического панкреатита [28] или других осложнений ВЗК, таких как абсцессы, непроходимость кишечника, анемия, тромбоз, околоанальные повреждения, артрит, увеит, ирит или кожные повреждения [29]. ВЗК несет значительную нагрузку для пациентов, часто изолируя их от общества, влияя на отношения в семье и ограничивая их профессиональные возможности [17]. В связи с этим пациенты, страдающие от ВЗК, имеют более высокий уровень безработицы; этот высокий уровень сохраняется с течением времени [30]. Кроме того, воспаление кишечника (язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (БК)) повышает риск развития рака толстой кишки, особенно в молодости (возраст < 30 лет) [31]. Мировой рынок лекарственных средств против ВЗК, как предполагается, достигает 4,3 миллиарда долларов на 2015 г., согласно новому отчету мировым специалистам-аналитикам в области мировой промышленности.
Даже хотя существующие методы лечения ВЗК улучшились [17, 32], они являются лишь умеренно успешными для хронического лечения заболевания и приводят к значительным побочным эффектам, включая сниженную способность иммунной системы строить защитные иммунные ответы против патогенов или злокачественных новообразований. Варианты лечения для пациентов включают устранение симптомов воспаления. Основная масса фармакологических лечений, используемых на рынке в настоящее время, включает аминосалицилаты, кортикостероиды, иммуномодуляторы, антибиотики, биопрепараты (антитела к фактору некроза опухоли-альфа). Аминосалицилаты очень эффективны и обычно хорошо переносятся. Однако пациентам с рецидивами или более умеренными степенями заболевания может быть необходимо более агрессивное лечение, что включает короткие периоды дозирования кортикостероидов для контроля симптомов. Этот тип быстродействующей терапии нельзя выдерживать в течение длительных периодов. Для сохранения состояния иммуномодуляторы также обычно используют для БК и ЯК, но они имеют медленное вступление в действие (3-6 месяцев для полного эффекта). Эти лекарственные средства имеют теоретически значительные отрицательные побочные эффекты от панкреатита, до диабета, до рубцах на печени и воспаления легких. Для случаев заболевания от умеренных до тяжелых, которое не смогли вылечить другими средствами, пациентам будут заменять на анти-TNF-α, которое вводят внутривенно в контролируемом режиме каждые 6-8 недель. Данная чрезвычайно дорогостоящая терапия, хотя и эффективная, является труднодоступной, поскольку для введения необходимо наличие обученного персонала и клинических условий. Кроме того, присутствуют значительные побочные эффекты, такие как синдром Кушинга, маниакальный синдром, бессонница, гипертония, высокое содержание глюкозы в крови, остеопороз, злокачественные новообразования, инфекции и аваскулярный некроз длинных костей.
фиг. 18 и 24
фиг. 26
фиг. 25
фиг. 21, 22, 31 и 32
фиг. 22, 23, 31 и 32
фиг. 23
фиг. 20, 29 и 30
фиг. 33
Типичное соединение, BT-11, показало очень хороший профиль токсикологической безопасности. Наши данные эффективности в хронических моделях ВЗК показали то, каким образом BT-11 улучшает показатели активности заболевания в двух моделях хронического ВЗК (), а также потери массы тела (). Наши данные показали, как эти эффекты зависят от LANCL2 (). Наши данные эффективности также показали, как активация пути LANCL2 при помощи BT-11 активирует противовоспалительный ответ, главным образом отличающийся продуцированием IL-10 и экспрессирующими FOXP3 CD4+ T-клетками (), а также значительное снижение воспалительных макрофагов, дендритных клеток и провоспалительных факторов, таких как IFNγ (). Кроме того, анализ экспрессии гена подтвердил эти клеточные наблюдения путем того, как лечение при помощи BT-11 снижает уровни TNFα в толстой кишке (). Все эти данные вместе отвечают за очень сильное зависящее от LANCL2 улучшение в слизистой толстой кишки в отношении лейкоцитарной инфильтрации, эрозии эпителия и утолщения слизистой в двух моделях хронического ВЗК (). Мы также показали, что эффекты BT-11 с последующим связыванием с LANCL2 не зависят от PPARγ (). Эти результаты подтвердили, что активация LANCL2 активирует множество дальнейших активаторов, которые регулируют воспаление посредством независимого от PPARγ механизма. Вместе эти результаты сильно подтверждают тот факт, что LANCL2 является новой терапевтической мишенью для воспалительных заболеваний, а BT-11 пригоден в качестве нового лекарственного средства.
Пример 22: Применение BT-11 для лечения диабета 1 типа (T1D)
Введение
Сахарный диабет (СД), также известный как простой диабет, представляет собой группу болезней обмена веществ, при которых существуют высокие уровни сахара в крови в течение длительного периода времени. Два типа диабета называются 1 типом и 2 типом. Прежние названия для этих состояний были инсулинозависимый и инсулиннезависимый диабет, или юношеский диабет и диабет зрелого возраста. При T1D организм не продуцирует инсулин. В отношении T2D T1D не настолько распространен, как T2D. Конечно, приблизительно 10% всех случаев диабета являются 1 типа. T1D поражает 3 миллиона американцев. Каждый год у более чем 15000 детей и 15000 взрослых диагностируют T1D в США. Частота возникновения T1D среди детей возрастом менее 14 лет, как оценивается, увеличивается на 3% в год в мире. Пациентам с T1D требуются инъекции инсулина, чтобы оставаться в живых, но они не лечат заболевание или не предотвращают его серьезные побочные эффекты.
Существующие противодиабетические лекарственные средства эффективны для улучшения чувствительности к инсулину, но их постоянное введение имеет значительные побочные эффекты, такие как осложнения для сердечно-сосудистой системы, токсическое действие на печень, набор веса, удержание жидкости и опухоли мочевого пузыря. Путь лантионинсинтетазный компонент C-подобного белка 2 (LANCL2) проявляет противодиабетическое действие без побочных эффектов [18]. BT-11 связывается с LANCL2, перорально активен, показал противодиабетическую эффективность у мышей и превосходный профиль безопасности.
Способы
Мыши
. Мышей NOD закупали в Jackson Laboratory и содержали в специальных непатогенных условиях в вентилируемых клетках. Мышей содержали в вивариях. Все протоколы экспериментов утверждались Комитетом по биоэтике и соответствовали руководства Управления защиты лабораторных животных Национального института здравоохранения США и политику Министерства здравоохранения или превосходили их.
Оценка массы тела и толерантности к глюкозе
. Определили, что все мыши были нормогликемическими (уровни глюкозы в крови натощак менее 250 мг/дл) и имели одинаковый вес (20±1,5 г) перед началом испытания. Мышей взвешивали каждую неделю и тестировали на наличие клинических признаков заболевания ослепленным способом. Затем через 12 ч голодовки измеряли глюкозу при помощи глюкометра ACCU-CHEK (Индианаполис, Индиана). Кровь отбирали из боковой хвостовой вены и помещали в пробирки для сбора образцов капиллярной крови.
Гистопатология
. Участки поджелудочной железы из NOD исследований на мышах фиксировали в 10% забуренном нейтральном формалине, затем вдавливали в парафин, а затем нарезали (5 мкм) и окрашивали гематоксилином и эозином для гистологического исследования. Участки оценивали по шкале от 0 до 4 в зависимости от лимфоцитарной инфильтрации, клеточному повреждению и эрозии ткани, и данные анализировали в виде нормализованных сложных оценок.
Статистический анализ
. Параметрические данные анализировали при помощи ANOVA с последующим способом множественного сравнения Шеффе. Непараметрические данные анализировали при помощи U-критерия Манна-Уитни с последующим тестом множественного сравнения Данна. ANOVA проводили посредством процедуры общей линейной модели SAS, версия 6.0.3 (SAS Institute). Статистическую значимость оценивали как P≤0,05.
Результаты
BT-11 снижает уровни глюкозы в крови натощак и повышает уровень инсулина в мышиной модели диабета 1 типа
.
фиг. 34, панель A
фиг. 34, панель B
Для определения влияния BT-11 на модулирование гликемических уровней в мышиной модели T1D, мы проводили тест на содержание глюкозы в крови натощак на 0, 1, 3, 4, 5, 10 и 11 неделе после начала испытания. Наши результаты показали, что мыши, которых лечили при помощи нашего соединения BT-11, имели значительно более низкие уровни глюкозы в крови через период в 12 часов голодания (). Параллельно мы оценивали уровни инсулина на 5 неделе и наши результаты показали, что мыши, которых лечили при помощи BT-11, значительно более высокие уровни инсулина в плазме крови ().
BT-11 уменьшает клинические гистопатологические повреждения поджелудочной железы и воспаление в мышиной NOD модели
фиг. 35
. Для оценки гистопатологических повреждений в мышиной модели T1D поджелудочную железу иссекали и фиксировали в 10% формалине. Участки поджелудочной железы затем окрашивали гематоксилином и эозином и наблюдали под микроскопом. Наши результаты показали, что лечение при помощи BT-11 значительно снижает клинические гистопатологические повреждения в поджелудочной железе у мышей по сравнению с мышами, которым давали среду ().
Обсуждение
фиг. 34 и 35
Существует необходимость в эффективных и безопасных пероральных лекарственных средствах для диабета 1 типа (T1D), заболевания, которое поражает свыше 3 миллионов американцев. Лечение при помощи ABA проявляет противодиабетические эффекты [2]. Лантионинсинтетазный компонент C-подобный белок 2 (LANCL2) является мишенью для связывания и сигналинга ABA [15, 19, 24]. Таким образом, LANCL2 является многообещающей новой терапевтической мишенью против воспаления [18]. ABA эффективна для улучшения состояния при диабете [2, 33] и опосредованных иммунной системой заболеваний, таких как воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) [22, 23]. Соединение 61610, бис(бензимидазоил)терефталанилид (BTT), связывается с LANCL2 с наибольшей аффинностью в библиотеке из нескольких миллионов химических веществ. Кроме того, 61610 проявляет сильные иммунномодулирующие эффекты в мышиных моделях воспаления пищеварительного тракта [25]. BT-11 проявляет противодиабетические эффекты у NOD мышей (). Кроме того, ABA увеличивает секрецию инсулина в бета-клетках поджелудочной железы человека [34], предполагая возможное применение ABA в качестве лечения диабета 1 типа (T1D).
in silico,
in vitro,
Фиг. 34
В иммунноцитах ABA распознается LANCL2, сопряженным с G-белком рецептором, который связывается с клеточной мембраной после миристоилирования [19, 35]. Связывание ABA с LANCL2 повышает cAMP и инициирует сигналинг посредством PKA и модулирует иммунные ответы в макрофагах и T-клетках [8]. Мы проводили моделирование гомологии для получения трехмерной структуры LANCL2 при помощи кристаллической структуры LANCL1 в качестве шаблона. При помощи молекулярной стыковки было показано сначала  а затем  что ABA связывается с LANCL2. Это компьютерное прогнозирование подтверждалось результатами ППР и испытанием на связывание с LANCL2 человека [35]. Мы проводили виртуальный скрининг на основании LANCL2 при помощи структуры LANCL2, полученной посредством моделирования гомологии для получения новых лигандов LANCL2. Соединения из баз данных природных веществ NCI Diversity Set II, ChemBridge и ZINC стыковали в модели LANCL2 при помощи Auto Dock и классифицировали по расчетной аффинности. Тогда как ABA имела высокую аффинность к LANCL2, другие диенсодержащие природные соединения, такие как 61610, также предполагались как связывающиеся с тем же участком и могут также являться связывающимися с LANCL2 лекарственными средствами [12]. BT-11 также показал сильное связывание с LANCL2 и терапевтическую эффективность в NOD мышиной модели T1D (). Эти данные показали некоторое подтверждение того, что путь LANCL2 и другие соединения настоящего изобретения пригодны в качестве иммуномодулирующих лекарств для T1D. Дополнительные доказательства в поддержку роли пути LANCL2 в качестве средств модулирования иммунных ответов и снижения тяжести аутоиммунных заболеваний включают LANCL2 связывание и защитные эффекты ABA [22, 23], 61610 [12, 18] и BT-11 в мышиных моделях воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК).
фиг. 34
фиг. 35
фиг. 34 и 35
Распространенность T1D повышается с оцененной ежегодной скоростью 3% по всему миру [36-38]. Хотя успешная трансплантация панкреатических островков может лечить T1D, отсутствие достаточного количества панкреатических островков, продолжающееся вызванное иммунной системой разрушение трансплантированных панкреатических островков и побочные эффекты от подавляющих иммунитет лекарственных средств сильно ограничивает широкое применение этого подхода [39]. В связи с этим терапии, которые безопасно объединяют способность активации функции β-клеток поджелудочной железы и иммуномодулирования являются фундаментальными стратегиями для лечения T1D. Наши данные показали, что активация LANCL2 при помощи BT-11 не только улучшает уровни глюкозы в крови, но также улучшает их нормализацию после сахарной нагрузки (). Кроме того, лечение при помощи BT-11 при наступлении T1d улучшает гистопатологию поджелудочной железы (). Конечно, ABA профилактически и терапевтически подавляет воспаление и улучшает толерантность к глюкозе [2, 3]. Таким образом, природная активация LANCL2 приводит как к иммуномодулированию, что показано ее терапевтическими эффектами при ВЗК [12, 18, 22, 23], так и регуляции гомеостаза глюкозы вследствие подавления воспаления и повышения чувствительности к инсулину [2, 3]. На основании этих предпосылок и данных, представленных на , оценка роли LANCL2 в качестве терапевтической мишени для T1D важна.
Пример 23: Применение BT-11 для лечения диабета 2 типа (T2D)
Введение
Сахарный диабет (СД) является хроническим состоянием, которое возникает, когда организм не может продуцировать достаточное количество инсулина или не может эффективно его использовать, и вызывается генетической предрасположенностью вместе с факторами окружающей среды. В отличие от людей с диабетом 1 типа, диабетики с 2 типом способны продуцировать инсулин. Однако поджелудочная железа таких пациентов не производит достаточное количество инсулина или организм не может использовать инсулин в достаточной мере. Это явление называется резистентностью к инсулину. Когда нет достаточного количества инсулина, или инсулин не используется должным образом, глюкоза не может перерабатываться и использоваться. В результате, когда глюкоза накапливается в потоке крови вместо поступления в клетки и подвергания метаболизму, другие клетки в системе не могут надлежащим образом функционировать. Конечно, гипергликемия и диабет являются важными случаями заболеваемости и смертности ввиду сердечно-сосудистого заболевания (ССЗ), нефропатии, невропатии, язв на ногах и ретинопатии.
Приблизительно 28,3 миллионов американцев страдают от диабета 2 типа (T2D) и свыше 40,1% взрослых среднего возраста страдают от преддиабета, состояния, характеризующегося ухудшенной толерантностью к глюкозе, системным воспалением и резистентностью к инсулину. По оценкам Всемирной организации здравоохранения, число людей с T2D будет увеличиваться до 366 миллионов к 2030 г.
Как указано выше, существующие противодиабетические лекарственные средства эффективны для улучшения чувствительности к инсулину, но их постоянное введение имеет значительные побочные эффекты, такие как осложнения для сердечно-сосудистой системы, токсическое действие на печень, набор массы, удержание жидкости и опухоли мочевого пузыря. Путь лантионинсинтетазный компонент C-подобного белка 2 (LANCL2) проявляет противодиабетические действия без побочных эффектов [18]. BT-11 связывается с LANCL2, перорально активный, имеет показанную противодиабетическую эффективность для мышей и превосходный профиль безопасности.
Способы
Мыши и диетологическое лечение
. Мышей C57BL/6 и db/db закупали в Jackson Laboratory и содержали в специальных непатогенных условиях в вентилируемых клетках. Мышей в модели диабета с вызванным рационом питания ожирением (DIO) кормили рационом с высоким содержанием жира (40 ккал % жира). Мышей содержали в вивариях. Все протоколы экспериментов утверждались Комитетом по биоэтике и соответствовали руководства Управления защиты лабораторных животных Национального института здравоохранения США и политику Министерства здравоохранения или превосходили их.
Оценка массы тела и толерантность к глюкозе
. Определили, что все мыши были нормогликемическими (уровни глюкозы в крови натощак менее 250 мг/дл) и имели одинаковый вес (20±1,5 г) перед началом испытания. Мышей взвешивали каждую неделю и тестировали на наличие клинических признаков заболевания ослепленным способом. Затем через 12 ч голодовки измеряли определяли в различные дни. Вкратце, отбирали кровь из боковой хвостовой вены и помещали в пробирки для сбора образцов капиллярной крови. Мышам затем вводили тест на толерантность к глюкозе путем внутрибрюшинной инъекции D-глюкозы (2 г/кг массы тела) и образцы крови отбирали перед инъекцией (время 0) (что соответствует исходному уровню FBG с последующей голодовкой в течение 12ч, которая начиналась в 6 утра) и через 15, 60 и 90 минут (модель db/db) или 15, 30, 60, 90, 120, 180, 220 и 265 минут (модель DIO) с последующей инъекцией глюкозы. Абдоминальную (эпидидимальную) белую жировую ткань (БЖТ), подкожную БЖТ и печень затем иссекали и взвешивали. Абдоминальную (эпидидимальную) БЖТ затем обрабатывали и разделяли.
Обработка белой жировой ткани
. Абдоминальную БЖТ иссекали, взвешивали, измельчали на небольшие <10 мг кусочки и помещали в среду для обработки (1XHBSS (Mediatech, Херндон, Вирджиния) с добавкой 2,5% HEPES (Mediatech) и 10% эмбриональной бычей сыворотки, содержащей коллагеназу II типа (0,2%, Sigma-Aldrich)). Образцы инкубировали в инкубаторе при 37°C в течение 30 минут, фильтровали через 100 мкм нейлоновый сетчатый фильтр для удаления необработанных частиц, и центрифугировали при 4°C с 1000 × g в течение 10 мин. Остаток, состоящий из стромальных сосудистых клеток (ССК), промывали 1XHBSS и центрифугировали при 4°C с 1000 × g в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали и эритроциты лизировали путем инкубации ССК в 2 мл буфера для лизиса эритроцитов в течение 2 минут перед остановкой реакции при помощи 9 мл 1X PBS. Клетки затем повторно центрифугировали при 4°C с 1000 × g в течение 10 мин, суспендировали в 1 мл 1X PBS и подсчитывали счетчиком Коултера (Beckman Coulter, Фуллертон, Калифорния).
Иммунофенотипирование стромальных сосудистых клеток
. Для иммунофенотипирования SVC высеивали в 96-луночный планшет (Costar) при 2 × 105 клеток/ячейку. После начальных 20 минут инкубирования с FcBlock (20 мкг/мл; BD Biosciences - Pharmingen) для ингибирования неспецифичного связывания, клетки промывали в PBS, содержащем 5% сыворотки и 0,09% азида натрия (FACS буфер) и окрашивали специфичных первичных мышиных антител. Результаты обрабатывали проточным цитометром FacsAria и анализ данных проводили при помощи FACS DIVA™ (BD Biosciences) и FlowJo (TreeStar).
Количественный PCR в режиме реального времени
. Общую РНК выделяли из жировой ткани при помощи RNEASY Lipid Mini Kit (Qiagen) и из клеток при помощи RNEASY Mini Kit (Qiagen) согласно инструкциям производителя. Общую РНК использовали для создания шаблона комплементарной ДНК (кДНК) при помощи набора для синтеза кДНК QSCRIPT™ (Quanta Biosciences, Гейтерсберг, Мэриленд). Общий реакционный объем составлял 20 мкл, причем реакцию инкубировали следующим образом в термоциклере MJ MINI™ (Bio-Rad): 5 минут при 25°C, 30 минут при 52°C, 5 минут при 85°C и выдерживали при 4°C. PCR проводили на кДНК при помощи Taq ДНК полимеразы (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния). Каждый ампликон гена очищали при помощи набора для очистки MINELUTE PCR (Qiagen) и количественно определяли как на геле арагозы при помощи маркера длин ДНК (Promega). Эти очищенные ампликоны использовали для оптимизации условий PCR в режиме реального времени и для получения стандартных кривых в анализе PCR в режиме реального времени. Концентрации праймеров и температуры отжига оптимизировали для системы CFX (Bio-Rad) для каждого набора праймеров, используя градиентный протокол системы. Эффективности PCR поддерживали от 92 до 105% и коэффициенты корреляции >0,98 для каждого набора праймеров при оптимизации, а также при PCR в режиме реального времени образца ДНК. Данные показаны при помощи способа количественного определения ΔΔCt.
Результаты
BT-11 снижал уровни глюкозы в крови натощак в мышиной DIO модели T2D
фиг. 36, панель A
фиг. 36, панель B
. Для оценки эффективности типичного соединения BT-11 в модели T2D мы кормили мышей C57BL/6 рационом с высоким содержанием жира (модель DIO). Пероральное введение BT-11 значительно снижало уровни глюкозы в крови у мышей, которых лечили при помощи BT-11, по сравнению с их однопометными животными, которых лечили средой, на 12 неделе кормления рационом с высоким содержанием жира (). Кроме того, после голодания в течение 12ч и сахарной нагрузки при 2 г/кг массы тела посредством IP, мыши, которых лечили при помощи BT-11, были способны нормализовать уровни глюкозы в крови быстрее, чем мыши, которые не получали лечения ().
Лечение при помощи
BT-11 снижало инфильтрацию провоспалительных макрофагов, а также провоспалительных гранулоцитов в белую жировую ткань
фиг. 37, панель A
фиг. 37, панель B
. Для описания клеточной инфильтрации в белую жировую ткань, абдоминальную БЖТ, собирали и обрабатывали, как описано в разделе способов. Анализ проточной цитометрией проводили для оценки различных провоспалительных популяций в БЖТ. Наши результаты показали, что лечение при помощи BT-11 значительно снижает уровни F4/80+ CD11b+ провоспалительных макрофагов (), а также число провоспалительных гранулоцитов с высокими уровнями Ly6c (GR1+Ly6chigh) ().
BT-11 снижал уровни глюкозы в крови натощак в мышиной db/db модели T2D
фиг. 38, панель A
фиг. 38, панель B
фиг. 38, панель B
. Для оценки терапевтической эффективности перорального лечения при помощи BT-11 в двух мышиных моделях диабета мы также использовали мышей db/db, у которых развивался спонтанный T2D ввиду мутации рецептора лептина. Мышам db/db вводили дневную дозу BT-11 в 80 мг/кг через зонд. Мы определяли влияние BT-11 на гомеостаз глюкозы путем измерения концентраций глюкозы в крови натощак. Лечение при помощи BT-11 значительно снижало уровни глюкозы в крови по сравнению с их однопометными животными, которым давали среду, уже через неделю, подчеркивая разницы с течением времени на 3 неделе (). Для определения того, модулирует ли пероральное лечение при помощи BT-11 то, как инициируется гомеостаз глюкозы у животного, мы давали внутрибрюшинную сахарную нагрузку экспериментальным животным и оценивали кинетику глюкозы в плазме от 0 до 265 минут после инъекции глюкозы. Образцы крови отбирали перед инъекцией (время 0) (что соответствовало исходному уровню FBG после 12 ч голодовки). Наши результаты показали, что пероральное лечение при помощи BT-11 значительно снижало уровни глюкозы перед IP сахарной нагрузкой (время 0, ). После сахарной нагрузки в модели db/db наши результаты показали, что уровни глюкозы у мышей, которых лечили нашими наилучшими соединениями BT-11, падало до нормальных уровней быстрее, чем у мышей, которых лечили средой ().
BT-11 снижал уровни мРНК TNFα и MCP-1 и активировал LANCL2
фиг. 39
. Для дополнительного подтверждения противовоспалительной эффективности BT-11 мы оценивали экспрессию гена на БЖТ, как указано в разделе способов. Наши результаты показали, что при сравнении с мышами, не получавшими лечение, мыши, которых лечили при помощи BT-11, имели более высокие уровни экспрессии LANCL2 и значительно более низкие уровни мРНК провоспалительного фактора TNFα и MCP-1 ().
Обсуждение
Поскольку скорости ожирения и диабета 2 типа (T2D) в США продолжают расти, все увеличивающееся число людей становится зависимым от пероральных противодиабетических лекарств. Приблизительно 28,3 миллиона (8,3% населения) американцев имеют T2D и свыше 40,1% взрослых среднего возраста имеют преддиабет, состояние, отличающееся уменьшенной толерантностью к глюкозе и резистентностью к инсулину [40]. Общие прямые и непрямые расходы, относящиеся к T2D, в США составляют свыше 132 миллиарда долларов [40]. Несмотря на эту растущую проблему, фармацевтические компании не были способны разработать одновременно и безопасные и эффективные лекарственные средства. Одним из наиболее распространенных и эффективных пероральных противодиабетических лекарств является тиазолидиндионовый (TZD) класс чувствительных к инсулину лекарств. Хотя TZD повышают чувствительность к инсулину, они имеют значительные отрицательные побочные эффекты, которые ограничивали их доступность, включая набор массы, острую сердечную недостаточность, рак поджелудочной железы, токсическое действие на печень и удержание жидкости [41, 42]. Например, приблизительно 10-15% пациентов, применяющих TZD, не могут прекратить лечение ввиду отечности, и повышение внеклеточного объема ввиду избытка удерживаемой жидкости также является большой проблемой для людей, имевших ранее острую сердечную недостаточность. В 2000 г. троглитазон (REZULIN) изъяли с рынка через 3 года после его открытия ввиду отчетов о серьезных повреждениях печени и смертях [43]. Забота о безопасности в отношении других TZD приводила к обязательной маркировке ослеплением и последующих ограничений использования.
LANCL2 был вторым определенным членом семейства LanC-подобных белков. Первый член, LANCL1, выделили из мембран эритроцитов человека [44]. LANCL2 затем определили и обнаружили во всем организме [1, 18], включая иммуноциты, поджелудочную железу, легкое и кишечник [1, 44]. Путь лантионинсинтетаза C-подобного белка 2 (LANCL2) возник как новая терапевтическая мишень для T2D [18]. Обширные доклинические испытания дали достаточное доказательство терапевтического потенциала для лигандов LANCL2, таких как абсцизовая кислота (ABA), при диабете и хронических воспалительных заболеваниях [2, 3, 22, 23, 45]. Соединение 61610, бис(бензимидазоил)терефталанилид (BTT), связывается с LANCL2 с наибольшей аффинностью в библиотеке из нескольких миллионов химических веществ.
фиг. 36 и 38
фиг. 36 и 38
фиг. 37
фиг. 39
Учитывая, что существующие лекарственные средства для T2D не смогли удовлетворить первоначальную потребность пациентов, такую как гликемический контроль, без побочных эффектов, BT-11 представляет очень привлекательное возможную замену. Наши результаты показали, что введение BT-11 в различных мышиных моделях T2D значительно снижает уровни глюкозы в крови после периода голодовки (). Кроме того, введение этого соединения также способствует нормализации уровней глюкозы после сахарной нагрузки (). Противовоспалительный свойства BT-11 также отражены в наших результатах иммунофенотипирования. Конечно, введение BT-11 давало меньшую инфильтрацию провоспалительных макрофагов и провоспалительных гранулоцитов в абдоминальную БЖТ (). Эти результаты подтверждены данными экспрессии гена для двух очень важных провоспалительных факторов, TNFα и MCP-1, что, как обнаружили, значительно снижаются у мышей, которых лечили при помощи BT-11 ().
Пример 24: Применение BT-11 при инфекции гриппа
Введение
Респираторные патогены, вызывающие пневмонию, являются основной причиной связанных с инфекционными заболеваниями смертей в развитых странах. Отсутствие эффективных вакцин и противовирусных препаратов вместе с растущими проблемами относительно появления устойчивости к противовирусным препаратам поднимает вопрос о необходимости разработки нацеленных на организм-хозяин иммунотерапевтических подходов. Патогенез легких и клиническое заболевание, связанное с респираторной инфекцией, часто происходит ввиду комбинации цитопатических эффектов вируса и иммунного ответа организма-хозяина. В связи с этим терапии, направленные на модулирование природного иммунного ответа, рассматривают для лечения гриппа [46].
Грипп остается основной проблемой общественного здравоохранения в мире. Сезонный грипп связан с процессом в верхних дыхательных путях, который часто делает нетрудоспособным и требует несколько дней ограничения активности. Оценили, что только в США ежегодные эпидемии гриппа приводят к 30 миллионам посещениям поликлиник и 300000 людей, поступивших в лечебные заведения. Некоторые группы населения (например, дети младшего возраста, пожилые люди и люди с медицинскими состояниями, вызывающими предрасположенность) имеют высокий риск развития вирусной пневмонии. Эксперты оценили, что от 25000 до 35000 людей умирают ежегодно от сезонного гриппа в США, а мировые финансовые затраты были рассчитаны как составляющие сотни миллиардов долларов [47]. Циклы пандемического гриппа происходят каждые 30-50 лет с дополнительной осложнениями ввиду их непредсказуемых форм и отсутствия заранее существующего иммунитета и связаны с высокими показателями смертности [48]. Грипп связан со значительной заболеваемостью и смертностью, и эффективные и безопасные лекарственные средства отсутствуют.
Данные, которые предлагают лантионинсинтетазный компонент C-подобный белок 2 (LANCL2) как мишень для связывания и сигналинга ABA [15, 19, 24]. Таким образом, LANCL2 возник как многообещающая новая терапевтическая мишень для иммуномодуляции. Используя молекулярное моделирование и поверхностный плазмонный резонанс (ППР), BTI определили соединение BT-11, бис(бензимидазоил)терефталанилид (BTT), который связывается с LANCL2 с высокой аффинностью. Также BT-11 проявляет сильные прорезолютивные эффекты в легких, и снижает смертность и заболеваемость в мышиных моделях гриппа.
Способы
Мыши
. Мышей C57BL/6 закупали в Jackson Laboratory и содержали в специальных непатогенных условиях в вентилируемых клетках. Все протоколы экспериментов утверждались Комитетом по биоэтике и соответствовали руководства Управления защиты лабораторных животных Национального института здравоохранения США и политику Министерства здравоохранения или превосходили их.
Интраназальная инъекция мышей вирусом гриппа
3
. Мышам делали анестезию при помощи 2-5% изофлурана, используя аэрозольный аппарат, и 50 мкл раствора вируса при 10 TCID50 вводили через ноздри (25 мкл в каждую). Мышей затем помещали в их клетки и смотрели, когда они восстановятся после анестезии.
Пероральное введение BT-11 путем орогастрального зонда
. BT-11 вводили мышам при помощи орогастрального зонда, используя коммерчески доступную иголку зонда с предохранительным шариком (18-24 размер, в зависимости от массы животного). Эта процедура не вызывает боли или расстройства. Мышей лечили при помощи BT-11 с дозой 80 мг/кг каждые 24ч в течение времени эксперимента.
Наблюдение за мышами и контроль активности заболевания и массы
. Мышей наблюдали раз в день после инъекции (или каждые 4 часа, если у них развивались тяжелые клинические признаки заболевания, эквивалентные оценке заболевания 2) и проводили эвтаназию перед запланированным окончанием, если у них развивались существенные признаки заболевания, что измерено потерей массы (т.е. 25% постепенного потеря исходной массы тела), обезвоживание, потеря подвижности, защита болезненной области, взъерошенный мех (пилоэрекция). Мышей взвешивали раз в день в течение эксперимента.
Результаты
Пероральное введение BT-11 снижало клинические оценки и заболеваемость у мышей с вирусом гриппа
.
фиг. 40, панель A
фиг. 40, панель B
Для оценки терапевтической эффективности BT-11 мы использовали мышиную модель инфекции гриппа. Вкратце, мышей инфицировали интраназально после анестезии при помощи 5% изофлурана. Мышей лечили каждый день пероральным введением суспензии BT-11 с 80 или 40 мг/кг. Мышей взвешивали и оценивали в течение эксперимента (16 дней). Результаты показали, что введение BT-11 значительно снижало клинические показатели активности, начиная с 3 дня и в течение всего эксперимента (). Кроме того, клинический показатель внешнего вида значительно снижался у мышей, получающих лечение как с 40, так и 80 мг/кг BT-11 ().
фиг. 40, панель C
Для оценки эффекта лечения при заболеваемости, мы рассчитали процент потери массы и затем оценили число мышей, потерявших свыше 15%, в каждой экспериментальной группе. Начиная с 6 дня после инфицирования, лечение 80 мг/кг BT-11 давало меньшую заболеваемость по сравнению с группой, получавшей среду. Разницы усиливались, начиная с 10 дня и до 12 дня ().
Обсуждение
Традиционные подходы к контролю распространения гриппа и заболевания сфокусированы на стороне вируса посредством вакцинации и противовирусного лечения. Вакцины составлялись каждый год на основании распространенных штаммов с предыдущего сезона. Однако занимает приблизительно 4-6 месяцев, чтобы произвести, лицензировать и протестировать эффективность новой вакцины [49], или против сезонного, или пандемического гриппа. Основным недостатком противовирусных препаратов является очень частое появление и выбор устойчивых штаммов. Помимо нацеленных на вирус лечений, разработка терапий на основании контроля усиления ответов организма-хозяина имеет очень высокую вероятность приспособления для дополнения противомикробных и профилактических стратегий. Терапевтические препараты, нацеленные на организм-хозяин, имеют преимущество, заключающееся в предложении перекрестного иммунитета для различных реассортантов, и таким образом эффективны от сезона к сезону, их можно производить и складировать, и можно использовать для лечения заболевания после воздействия вируса [46, 50, 51].
фиг. 33
Идентификация LANCL2 в качестве нового терапевтического средства против гриппа открывает новые направления для нацеленных на организм-хозяин терапевтических средств. Мы показали, что активация LANCL2 при помощи BT-11 улучшает не только активность и клинические показатели, но также снижает заболеваемость, вызванную вирусом гриппа, и ускоряет восстановление после инфекции гриппа (). Эти результаты явным образом подтверждают то, что LANCL2 является новой терапевтической мишенью для гриппа, а BT-11 является потенциальным новым лекарственным средством, нацеленным на организм-хозяин.
ССЫЛКИ
DNA Seq
1. Mayer, H., M. Pongratz, and R. Prohaska, Molecular cloning, characterization, and tissue-specific expression of human LANCL2, a novel member of the LanC-like protein family. , 2001. 12(3): p. 161-6.
Clin Nutr
2. Guri, A.J., et al., Dietary abscisic acid ameliorates glucose tolerance and obesity-related inflammation in db/db mice fed high-fat diets. , 2007. 26(1): p. 107-16.
J Nutr Biochem
3. Guri, A.J., et al., Loss of PPAR gamma in immune cells impairs the ability of abscisic acid to improve insulin sensitivity by suppressing monocyte chemoattractant protein-1 expression and macrophage infiltration into white adipose tissue. , 2008. 19(4): p. 216-28.
.
Curr Med Chem
4. Bassaganya-Riera, J., et al., Mechanisms of action and medicinal applications of abscisic Acid. , 2010. 17(5): p. 467-78.
Clin Nutr
5. Guri, A.J., R. Hontecillas, and J. Bassaganya-Riera, Abscisic acid synergizes with rosiglitazone to improve glucose tolerance and down-modulate macrophage accumulation in adipose tissue: possible action of the cAMP/PKA/PPAR gamma axis. , 2010. 29(5): p. 646-53.
Clin Nutr
6. Guri, A.J., R. Hontecillas, and J. Bassaganya-Riera, Abscisic acid ameliorates experimental IBD by downregulating cellular adhesion molecule expression and suppressing immune cell infiltration. , 2010. 29(6): p. 824-31.
J Nutr Biochem
7. Guri, A.J., et al., Abscisic acid ameliorates atherosclerosis by suppressing macrophage and CD4+ T cell recruitment into the aortic wall. , 2010. 21(12): p. 1178-85.
J Biol Chem
8. Bassaganya-Riera, J., et al., Abscisic acid regulates inflammation via ligand-binding domain-independent activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. , 2011. 286(4): p. 2504-16.
J Nutr Biochem
9. Guri, A.J., et al., T cell PPARgamma is required for the anti-inflammatory efficacy of abscisic acid against experimental IBD. , 2011. 22(9): p. 812-9.
J Mol Model
10. Lu, P., et al., Molecular modeling of lanthionine synthetase component C-like protein 2: a potential target for the discovery of novel type 2 diabetes prophylactics and therapeutics. , 2011. 17(3): p. 543-53.
J Nutr Biochem
11. Hontecillas, R., et al., Dietary abscisic acid ameliorates influenza-virus-associated disease and pulmonary immunopathology through a PPARgamma-dependent mechanism. , 2013. 24(6): p. 1019-27.
PLoS One
12. Lu, P., et al., Computational modeling-based discovery of novel classes of anti-inflammatory drugs that target lanthionine synthetase C-like protein 2. , 2012. 7(4): p. e34643.
Curr Drug Targets
13. Lu, P., et al., Lanthionine synthetase component C-like protein 2: a new drug target for inflammatory diseases and diabetes. , 2014. 15(6): p. 565-72.
J Comput Chem
14. Trott, O. and A.J. Olson, AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading. , 2010. 31(2): p. 455-61.
Journal of Molecular Modeling
15. Lu, P., et al., Molecular modeling of lanthionine synthetase component C-like 2: a potential target for the discovery of novel type 2 diabetes prophylactics and therapeutics. , 2011. 17(3): p. 543-53.
J Comput Chem
16. Morris, G.M., et al., AutoDock4 and AutoDockTools4: Automated docking with selective receptor flexibility. , 2009. 30(16): p. 2785-91.
17. Lichtenstein, G.R., M. Abreu, and D. Present, Recent advances in the treatment of Crohn's colitis, 2003, The center for health care education, LLC.
Curr Drug Targets
18. Lu, P., et al., Lanthionine Synthetase Component C-like Protein 2: A New Drug Target for Inflammatory Diseases and Diabetes. , 2014.
J Biol Chem
19. Sturla, L., et al., LANCL2 is necessary for abscisic acid binding and signaling in human granulocytes and in rat insulinoma cells. , 2009. 284(41): p. 28045-57.
Rev Gastroenterol Disord
20. Hanauer, S.B. and D.H. Present, The state of the art in the management of inflammatory bowel disease. , 2003. 3(2): p. 81-92.
Aliment Pharmacol Ther
21. Lindsay, J.O. and H.J. Hodgson, Review article: the immunoregulatory cytokine interleukin-10--a therapy for Crohn's disease? , 2001. 15(11): p. 1709-16.
Clinical Nutrition
22. Guri, A.J., R. Hontecillas, and J. Bassaganya-Riera, Abscisic acid ameliorates experimental IBD by downregulating cellular adhesion molecule expression and suppressing immune cell infiltration. , 2010. 29(6): p. 824-31.
Journal of Nutritional Biochemistry
23. Guri, A.J., et al., T cell PPAR gamma is required for the anti-inflammatory efficacy of abscisic acid against experimental inflammatory bowel disease. , 2011. 22(9): p. 812-9.
Journal of Biological Chemistry
24. Bassaganya-Riera, J., et al., Abscisic acid regulates inflammation via ligand-binding domain-independent activation of PPAR gamma. , 2011. 286(4): p. 2504-16.
PLoS One
25. Lu, P., et al., Computational modeling-based discovery of novel classes of anti-inflammatory drugs that target LANCL2. , 2012. In Press.
Gastroenterology
26. Stenson, W.F., Interleukin-4 hyporesponsiveness in inflammatory bowel disease: immune defect or physiological response? , 1995. 108(1): p. 284-6.
Am J Gastroenterol
27. Cohen, R.D., et al., The cost of hospitalization in Crohn's disease. , 2000. 95(2): p. 524-30.
Arch Pediatr
28. Barba, G., et al., Recurrent pancreatitis revealing Crohn's disease. , 2002. 9(10): p. 1053-5.
Gastroenterology
29. Braverman, I.M., Skin signs of gastrointestinal disease. , 2003. 124(6): p. 1595-614.
Inflamm Bowel Dis
30. Marri, S.R. and A.L. Buchman, The education and employment status of patients with inflammatory bowel diseases. , 2005. 11(2): p. 171-7.
31. Spunt, S., et al., Cancer Epidemiology in Older Adolescents and Young Adults 15 to 29 Years of Age, in SEER AYA Monograph. 2008, National Cancer Institute: Bethesda, MD. p. 123-133.
Clinical Gastroenterology and Hepatology
32. Camilleri, M., GI clinical research 2002-2003: The year in review. , 2003. 1: p. 415-420.
Clinical Nutrition
33. Guri, A.J., R. Hontecillas, and J. Bassaganya-Riera, Abscisic acid synergizes with rosiglitazone to improve glucose tolerance and down-modulate macrophage accumulation in adipose tissue: possible action of the cAMP/PKA/PPAR gamma axis. , 2010. 29(5): p. 646-653.
J Biol Chem
34. Bruzzone, S., et al., Abscisic Acid Is an Endogenous Stimulator of Insulin Release from Human Pancreatic Islets with Cyclic ADP Ribose as Second Messenger. , 2008. 283(47): p. 32188-32197.
Biochem Biophys Res Commun
35. Sturla, L., et al., Binding of abscisic acid to human LANCL2. , 2011. 415(2): p. 390-5.
Mol Cell Proteomics
36. Sparre, T., et al., Unraveling the pathogenesis of type 1 diabetes with proteomics: present and future directions. , 2005. 4(4): p. 441-57.
Diabetes Care
37. Vehik, K., et al., Increasing incidence of type 1 diabetes in 0- to 17-year-old Colorado youth. , 2007. 30(3): p. 503-9.
Nat Rev Endocrinol
38. Ma, R.C. and J.C. Chan, Diabetes: incidence of childhood type 1 diabetes: a worrying trend. , 2009. 5(10): p. 529-30.
Cell Transplant
39. Suarez-Pinzon, W.L., J.R. Lakey, and A. Rabinovitch, Combination therapy with glucagon-like peptide-1 and gastrin induces beta-cell neogenesis from pancreatic duct cells in human islets transplanted in immunodeficient diabetic mice. , 2008. 17(6): p. 631-40.
40. CDC. National Diabetes Fact Sheet: general information and national estimates on diabetes in the United States, 2005. in U. S. Department of Health and Human Services, Center for Disease Control and Prevention, 2005. 2005. Atlanta, Georgia.
Current Nutrition & Food Science
41. Bassaganya-Riera, J., A. Guri, J. King, and R. Hontecillas, Peroxisome Proliferator-Activated Receptors: the Nutritionally Controlled Molecular Networks that Integrate Inflammation, Immunity and Metabolism. ., 2005. 1: p. 179-187.
Circulation
42. Nesto, R.W., et al., Thiazolidinedione use, fluid retention, and congestive heart failure: a consensus statement from the American Heart Association and American Diabetes Association. October 7, 2003. , 2003. 108(23): p. 2941-8.
Diabetes Care
43. Wysowski, D.K., G. Armstrong, and L. Governale, Rapid increase in the use of oral antidiabetic drugs in the United States, 1990-2001. , 2003. 26(6): p. 1852-5.
Biochim Biophys Acta
44. Mayer, H., et al., Isolation, molecular characterization, and tissue-specific expression of a novel putative G protein-coupled receptor. , 1998. 1395(3): p. 301-8.
Journal of Nutritional Biochemistry
45. Hontecillas, R., et al., Dietary abscisic acid ameliorates influenza virus-associated disease and pulmonary immunopathology through a PPAR g-dependent mechanism. , 2012. 24(6): p. 1019-27.
Science
46. Enserink M. Infectious disease. Old drugs losing effectiveness against flu; could statins fill gap? . 2005 Sep 23;309(5743):1976-7.
Am J Med
47. Rothberg, M.B., S.D. Haessler, and R.B. Brown, Complications of viral influenza. . 2008. 121(4): p. 258-64.
Lancet Infect Dis
48. Dawood FS, et al. Estimated global mortality associated with the first 12 months of 2009 pandemic influenza A H1N1 virus circulation: a modelling study. . 2012 Sep;12(9):687-95.
Drug Discov Today
49. Quigley, E., Influenza therapies: vaccines and antiviral drugs. , 2006. 11(11-12): p. 478-80.
Nature
50. Butler D. Cheaper approaches to flu divide researchers. . 2007 Aug 30;448(7157):976-7.
51. Fedson DS. Confronting an influenza pandemic with inexpensive generic agents:
Lancet Infect Dis
can it be done? . 2008 Sep;8(9):571-6.
J Mol Biol.
52. Melo F, Feytmans E. Assessing protein structures with a non-local atomic interaction energy.  1998 Apr 17;277(5):1141-52.
53. SMILES Translator and Converter. http://cactus.nci.nih.gov/translate/.