СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ПЕПТИДОВ
METHOD OF EXTRACTING LOW MOLECULAR PEPTIDES

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к способам выделения низкомолекулярных пептидов, которые могут служить основой для приготовления биологически активных добавок (БАД).
Известно, что низкомолекулярные пептиды имеют молекулярную массу от 3000 до 15000 кДа и играют значительную роль в поддержании гомеостаза организма, проявляя разнообразную активность - антибактериальную, противовирусную, антиоксидантную, регенерирующую. К низкомолекулярным пептидам относят трансферфакторные белки, обладающие высокой иммуностимулирующей способностью.
Существует способ получения биологически активных низкомолекулярных пептидов из молока, молозива, стародойного молока, подсырной и творожной сыворотки, ультрафильтратов обезжиренного, цельного молока, подсырной или творожной сыворотки (патент RU №2183935). Способ включает очистку от жировой фракции центрифугированием, сорбцию белков на ионообменнике, хроматографическое разделение на СМ-целлюлозе, элюирование, определение фракции с оптической плотностью при длине волны 280 нм более 1 ед., диализ и стабилизацию микрофильтрацией через полупроницаемые мембраны с селективностью более 50 кДа. Недостатком способа является использование в качестве сырья материалов, имеющих высокую пищевую ценность.
Существует способ получения БАД из низкомолекулярных катионных белков молока и полученная этим способом БАД (патент RU 2318406), по которому катионные белки молочного происхождения отделяют от жировой фракции путем центрифугирования молочного сырья, проводят их сорбцию и хроматографическое разделение на СМ-целлюлозе, диализ полученной белковой фракции против дистиллированной воды, фосфатного буфера, стерилизуют микрофильтрацией через полупроницаемую мембрану. Для получения БАД используют вторичное сырье молочной промышленности.
Целью настоящего изобретения является разработка способа выделения низкомолекулярных пептидов из неутилизируемых отходов производства лактоглобулинов.
Лактоглобулины - медицинские иммунобиологические препараты (МИБП) для лечения и профилактики острых кишечных инфекций (Peг. удостоверение №ЛС-003127 от 25.04.2008 на «Лактоглобулин противоколипротейный коровий» и Peг. удостоверение №ЛСР-002636/08 от 09.04.2008 на «Лактоглобулин против условно патогенных бактерий и сальмонелл коровий»), которые производятся из молозива иммунизированных коров. В процессе производства лактоглобулинов в качестве отхода остается казеиново-сывороточная масса (Промышленный регламент №ПР 01898776-01-06 на производство «Лактоглобулин противоколипротейный коровий»; Промышленный регламент №ПР 01898776-02-06 на производство «Лактоглобулин против условно патогенных бактерий и сальмонелл коровий»). При производстве 1000 доз препарата получают (9,3±2) кг молозивной казеиново-сывороточной массы, содержащей до (2,5±0,5) л лактосыворотки. Отобранная для выделения низкомолекулярных пептидов молозивная казеиново-сывороточная масса должна иметь соотношение казеин-сыворотка не менее 7:3, pH - не ниже 4,1±0,2.
Пептидный состав гидролизатов изучен методом хроматографического анализа на колонке с сефадексом G-25. Калибровку колонки осуществляли с использованием веществ с известной молекулярной массой. Данные о содержании в гидролизатах пептидов с разной молекулярной массой показаны в таблице 1.
Таблица 1.
Содержание пептидов разной молекулярной массы в гидролизатах молозивной казеиново-сывороточной массы
Количественный состав белковых фракций гидролизатов (хроматографический анализ)
Число серий
(%±m)
крупные пептиды
19
10,9±4,4
средние и мелкие пептиды
19
47,52±4,9.
аминокислоты
19
41,6±3,1
Как видно из данных, представленных в таблице 1, в гидролизатах молозивной казеиново-сывороточной массы преобладают пептиды со средней и низкой молекулярной массой.
Поставленную цель - разработать способ выделения низкомолекулярных пептидов из неутилизируемых отходов производства лактоглобулинов - достигают тем, что гидролизат, полученный ферментативным гидролизом молозивной казеиново-сывороточной массы с использованием 0,3-0,6 г панкреатина на 1 л гидролизуемой смеси в течение 3-4 часов и с коррекцией среды 25%-ным водным раствором аммиака (патент RU 2078811) подвергают гель-хроматографии на сефадексе G-25 в течение 10 мин, смесь гидролизата с сефадексом центрифугируют, набухший гель элюируют дистиллированной водой и повторно центрифугируют, полученные жидкие фракции стерилизуют фильтрацией через мелкопористые фильтры с диаметром пор 0,2 ммк. Наличие пептидов в полученных фракциях определяют методом электрофореза в ПААГ.
Способ осуществляется следующим образом.
К 1 л гидролизата, полученного ферментативным гидролизом молозивной казеиново-сывороточной массы с использованием 0,3-0,6 г панкреатина на 1 л гидролизуемой смеси в течение 3-4 часов и с коррекцией среды 25%-ным водным раствором аммиака, добавляют 300 г сефадекса G-25, оставляют на 10 мин, полученную смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 минут. Надосадочный раствор удаляют, набухший гель элюируют дистиллированной водой, вновь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 минут. Полученные жидкие фракции стерилизуют фильтрацией через мелкопористые фильтры с диаметром пор 0,2 ммк. Из одного литра гидролизата получают 118-123 мл фракции, содержащей низкомолекулярные пептиды с молекулярной массой от 3000 до 15000 кДа. Для получения сухой формы фракции подвергают лиофильному высушиванию.
Наличие низкомолекулярных пептидов во фракции проверяют электрофорезом в ПААГ.
Таблица 2
Содержание пептидов малой молекулярной массы в полученных по предлагаемому способу фракциях (электрофорез в ПААГ)
Число серий
%±m
Пептиды с молекулярной массой от 7000 до 14000 кДа
9
9,3±4,7
Пептиды с молекулярной массой от 3000 до 7000 кДа
9
54,3±14,0
Аминокислоты (молекулярная масса менее 3000 кДа)
9
36,4±4,2
Данные таблицы 2 показывают, что использование предлагаемого способа выделения низкомолекулярных пептидов из гидролизатов молозивной казеиново-сывороточной массы позволяет получить пептиды с молекулярной массой от 3000 до 14000 кДа с преобладанием пептидов, имеющих молекулярную массу от 3000 до 7000 кДа.
Технический результат заключается в расширении сырьевой базы для получения низкомолекулярных пептидов, в использовании для этой цели молозивной казеиново-сывороточной массы - неутилизируемых отходов производства лактоглобулинов.