Формирование резистентности и восстановление чувствительности бактерий к комплексному антимикробному препарату диоксинор

EXPRESSION OF XENOBIOTIC METABOLISM PHASES I AND II ENZYMES DURING ANTIVICROBIAL DRUGS ADMINISTRATION E.V. Bratchenko, O.Yu. Fomenko

Summary. The aim of this work was to study the relative expression levels of xenobiotic metabolism phases I and II enzymes in rat liver during administration of antimicrobial agents of different pharmacological groups (tylosin and tsiminal).

Expression level of the genes of interest was determined using real time polymerase chain reaction. GAPDH was used as house-keeping gene. Differences reliability was determined by pairwise comparisons using Student’s t-test (p < 0,05).

It was shown that the usage of tylosin at a dose of 2.4 mg per 100 g of body weight cause a significant induction of CYP1A1 and CYP1A2 genes. The level of their transcripts in the liver was 3,16 ± 0,12 and 8,06 ± 0,4 fold than in the control group. In this case also there was a slight increase in expression of CYP2B1 and CYP3A1 genes (in 1,46 ± 0,04 and 1,82 ± 0,09, respectively). There were no statistically significant differences in expression levels between control group and rats treated with «Tsidisept-O».

We can conclude that in contrast to tylosin, the administration of antimicrobial agents based on tsiminal did not exert an inducing effect on xenobiotics metabolism gene expression patterns and did not lead to imbalance in microsomal and free radical oxidation systems. Key words: expression, antimicrobial drugs, liver, cytochrome P450, glutathione-S-transferase.

УДК619: 579.252.55:578.81: 615.28

ФОРМИРОВАНИЕ РЕЗИСТЕНТНОСТИ И ВОССТАНОВЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БАКТЕРИЙ К КОМПЛЕКСНОМУ АНТИМИКРОБНОМУ ПРЕПАРАТУ ДИОКСИНОР

Л.Ю. САШНИНА, кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник

ВНИВИ патологии, фармакологии и терапии Рос-сельхозакадемии

E-mail: vnivipat@mail.ru

Резюме. Одно из направлений предотвращения формирования устойчивости микроорганизмов к антибиотикам или снижения степени ее развития - применение при бактериальных инфекциях комплексных препаратов. Цель наших исследований - изучение формирования резистентности и восстановления чувствительности у эшерихий, сальмонелл, золотистого стафилококка и пастерелл к препарату диоксинор, разработанному на основе ди-оксидина и норфлоксацина и рекомендованному для применения в качестве этиотропного средства прижелудочно-кишечныхи респираторных болезнях молодняка сельскохозяйственных животных. Исследования проводили путем культивирования перечисленных микроорганизмов в мясо-пептонном бульоне (МПБ), содержащем возрастающие суббактериостатические концентрации препарата. У пассируемых культур степень устойчивости кпрепарату оценивали по коэффициенту резистентности (отношению максимальной, не препятствующей росту бактерий концентрации, к исходной). Стабильность приобретенной устойчивости и восстановление чувствительности кдиоксинору изучали путем последовательных пассажей микроорганизмов в МПБ, не содержащем препарат. Минимальная бактериостатическая концентрация диоксинора для эшерихий и сальмонелл составила 0,39 мкг/мл, золотистого стафилококка - 1,56 мкг/мл, пастерелл - 0,78 мкг/мл. Формирование резистентности микроорганизмов к препарату происходило медленно, ее коэффициент у эшерихий и сальмонелл был равен 8 (через 40 пассажей), золотистого стафилококка и пастерелл - 4 (через 30 пассажей). Приобретенная микроорганизмами устойчивость нестабильна, и восстановление их чувствительности к препарату происходит относительно быстро: у эшерихий и сальмонелл через 60 пассажей, у золотистого стафилококка и пастерелл - после 50 пассажей. Полученные результаты обосновывают целесообразность включения диоксидина и норфлоксацина в состав комплексного препарата диоксинор.

Ключевые слова: диоксинор, диоксидин, норфлоксацин, резистентность, эшерихии, сальмонеллы, золотистый стафилококк, пастереллы.

На крупных животноводческих комплексах желудочно-кишечные и респираторные болезни мо-

лодняка, как правило, протекают по типу смешанных инфекций, в возникновении и развитии которых принимают участие несколько возбудителей, в том числе антибиотикорезистентные бактерии [3, 7, 9].

В связи с этим для терапии больных животных разрабатывают комплексные препараты с широким спектром антимикробного действия [1, 6, 8].

Добиться такого эффекта можно при рациональном подборе сочетаний антибактериальных веществ, которые одновременно позволяют снизить минимальную ингибирующую концентрацию благодаря синергизму, уменьшить побочный эффект, по сравнению с монопрепаратами, и при наличии разных механизмов воздействия на микроорганизмы уменьшить вероятность развития резистентности [2, 4].

В качестве этиотропного средства при желудочнокишечных и респираторных болезнях молодняка сельскохозяйственных животных перспективно использование комплексного препарата диоксинор, созданного на основе норфлоксацина и диоксидина [5].

Цель нашего исследования - изучить формирование резистентности и восстановления чувствительности у эшерихий, сальмонелл, золотистого стафилококка и пастерелл к диоксинору.

Условия, материалы и методы. Материалом для исследования служили референтные штаммы микроорганизмов Escherichia coli 866, Salmonella cholerae suis, Staphylococcus aureus 209 Р, Pasteurella multocida В14, комплексный препарат диоксинор и его составляющие - норфлоксацин и диоксидин. Изучение формирования резистентности у микроорганизмов проводили путем культивирования их в мясо-пептонном бульоне (МПБ), содержащем возрастающие суббактериостатические концентрации перечисленных препаратов. После каждых десяти пассажей определяли антимикробную активность диоксинора, норфлоксацина и диоксидина в отношении указанных микроорганизмов.

При изучении антимикробной активности препаратов минимальную бактериостатическую концентрацию

Таблица 1. Минимальная бактериостатическая концентрация диоксидина и норфлоксацина, мкг/мл*

Препарат Число пасса- жей Вид микроорганизмов

E. coli 866 S. cholerae suis Staph. aureus 209Р P. multo cida В 14

Диоксидин Исх. 12,5 12,5 25,0 12,5

10 25,0 25,0 25,0 12,5

20 50,0 50,0 50,0 12,5

30 100,0 50,0 100,0 25,0

40 100,0 100,0 200,0 50,0

50 200,0 100,0 200,0 50,0

60 200,0 100,0 200,0 50,0

Норфлок- Исх. 0,39 0,39 1,56 0,78

сацин 10 0,39 0,39 1,56 0,78

20 0,39 0,39 1,56 0,78

30 1,56 1,56 3,12 3,12

40 1,56 1,56 3,12 3,12

50 1,56 1,56 3,12 3,12

60 1,56 1,56 3,12 3,12

* Минимальные бактерицидные концентрации препаратов для всех видов микроорганизмов превышали бактериостатические в 2 раза.

(МБсК) определяли методом серийных разведений в мясо-пептонном бульоне; минимальную бактерицидную концентрацию (МБцК) - путем высева из пробирок с прозрачной средой на плотные питательные среды (МПА), не содержащие препарат.

У пассируемых культур степень устойчивости к препаратам оценивали по коэффициенту резистентности - отношение максимальной не препятствующей росту бактерий концентрации к исходной.

Для изучения стабильности приобретенной бактериями устойчивости и восстановления их чувствительности к диоксинору проводили их последовательные пассажи в МПБ, не содержащем препарат.

После каждых десяти пассажей изучали культуральноморфологические и биохимические свойства, а также чувствительность к препарату.

Результаты и обсуждение. Все взятые в опыт микроорганизмы обладали типичными для своего вида морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами.

Предварительное изучение антимикробной активности диоксидина и норфлоксацина и развитие к ним устойчивости эшерихий, сальмонелл, золотистого стафилококка и пастерелл показало, что минимальная бактериостатическая концентрация диоксидина для Escherichia coli 866, Salmonella cholerae suis, Pasteurella multocida В14 составляет 12,5 мкг/мл, Staphylococcus aureus 209 P - 25,О мкг/мл (табл. 1). МБцК препарата в отношении этих микроорганизмов в 2 раза превышали

(5О,О мкг/мл), после ЗО пассажей - в 4 раза (1ОО,О мкг/ мл), через 4О пассажей - в 8 раз (2ОО,О мкг/мл).

Повышение (в 2 раза, по сравнению с начальной) минимальной бактерио-статической концентрации препарата в отношении пастерелл отмечено только через ЗО пассажей (25,О мкг/мл), после 4О пассажей она возросла в 4 раза к исходной (5О,О мкг/мл).

Рост минимальной бактерицидной концентрации препарата для всех видов микроорганизмов происходило аналогично.

При дальнейших пассажах бактерий изменение МБсК и МБцК диоксидина прекратилось, что свидетельствует о завершении формирования у них резистентности к препарату.

При изучении антимикробной активности норфлоксацина установлено, что его минимальная бактериостатическая концентрация в отношении Escherichia coli 866 и Salmonella cholerae suis составляет О,39 мкг/мл, Staphylococcus aureus 209 P - 1,56 мкг/мл, Pasteurella multocida В14 - О,78 мкг/мл.

МБсК норфлоксацина для эшерихий, сальмонелл и пастерелл после ЗО пассажей увеличилась в 4 раза (1,56 мкг/мл для эшерихий и сальмонелл и 3,12 мкг/ мл для пастерелл), для стафилококков - в 2 раза (3,12 мкг/мл). Минимальная бактерицидная концентрация препарата изменялась аналогично.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о высокой антимикробной активности препаратов, особенно норфлоксацина и низком коэффициенте устойчивости к ним микроорганизмов (к норфлокса-цину от 4 до 8, к диоксидину от 4 до 16 в зависимости от возбудителя), что подтверждает обоснованность их включения в состав комплексного препарата.

Исходная минимальная бактериостатическая концентрация диоксинора для Escherichia coli866 и Salmonella cholerae suis составила О,39 мкг/мл, Staphylococcus aureus 209 P - 1,56 мкг/мл, Pasteurella multocida В14 - О,78 мкг/мл и после 1О пассажей микроорганизмов не изменилась (табл. 2).

минимальные бактериоста-тические концентрации.

Через 10 пассажей МБсК диоксидина в отношении эшерихий увеличилась, по сравнению с исходной, в 2 раза (25,0 мкг/мл), после 20 пассажей - в 4 раза (50,0 мкг/мл), через 30 и 40 пассажей - в 8 раз (100,0 мкг/ мл), а через 50 пассажей - в 16 раз (200,0 мкг/мл).

МБсК диоксидина для сальмонелл после 10 пассажей выросла, по сравнению с исходной, в 2 раза (25,0 мкг/мл), через 20 и 30 пассажей - в 4 раза (50,0 мкг/мл), а через 40 пассажей - в 8 раз (100,0 мкг/мл).

Минимальная бактериостатическая концентрация препарата в отношении стафилококка через 20 пассажей увеличилась, по сравнению с исходной, в 2 раза

Таблица 2. Формирование устойчивости микроорганизмов к диоксинору

Вид микроорганизмов МБсК/МБцК, мкг/мл

исх. 1 10 пас. 1 20 пас. 30 пас. I 40 пас. 50 пас.

E. coli 866 0,39/ 0,39/ 0,78/ 1,56/ 3,12/ 3,12/

0,78 0,78 1,56 3,12 6,25 6,25

S. ^olerae suis 0,39/ 0,39/ 0,78/ 1,56/ 3,12/ 3,12/

0,78 0,78 1,56 3,12 6,25 6,25

Staph. aureus 209Р 1,56/ 1,56/ 3,12/ 6,25/ 6,25/ 6,25/

3,12 3,12 6,25 12,5 12,5 12,5

P.multocida В 14 0,78/ 0,78/ 0,78/ 3,12/ 3,12/ 3,12/

1,56 1,56 1,56 6,25 6,25 6,25

МБсК препарата в отношении эшерихий и сальмонелл через 20 пассажей увеличилась, по сравнению с исходной, в 2 раза (0,78 мкг/мл), после 30 пассажей - в 4 раза (1,56 мкг/мл). Формирование устойчивости эшерихий и сальмонелл к диоксинору завершилось через 40 пассажей, когда МБсК комплексного препарата достигла 3,12 мкг/мл.

Для стафилококка минимальная ингибирующая концентрация диоксинора после 20 пассажей увеличилась,

Таблица 3. Восстановление чувствительности микроорганизмов к диоксинору

Вид микроорганизмов МБсК/МБцК, мкг/мл

исх. 110 пас. 20 пас. 30 пас. 1 40 пас. 50 пас. 60 пас.

E. coli 866 3,12/ 3,12/ 3,12/ 3,12/ 1,56/ 0,78/ 0,39/

6,25 6,25 6,25 6,25 3,12 1,56 0,78

S. cholerae suis 3,12/ 3,12/ 3,12/ 3,12/ 1,56/ 0,78/ 0,39/

6,25 6,25 6,25 6,25 3,12 1,56 0,78

Staph. aureus 209Р 6,25/ 6,25/ 6,25/ 6,25/ 3,12/ 1,56/ 1,56/

12,5 12,5 12,5 12,5 6,25 3,12 3,12

P. multocida В 14 3,12/ 3,12/ 3,12/ 3,12/ 1,56/ 0,78/ 0,78/

6,25 6,25 6,25 6,25 3,12 1,56 1,56

по сравнению с начальной, в 2 раза (3,12 мкг/мл), через ЗО пассажей - в 4 раза (6,25 мкг/мл). В последующие 2О пассажей она осталась без изменений.

МБсК диоксинора в отношении пастерелл после 2О пассажей не изменилась, а через ЗО пассажей увеличилась в 4 раза (3,12 мкг/мл). После этого ее повышение завершилось.

Минимальная бактерицидная концентрация препарата в отношении микроорганизмов возрастала аналогично.

У эшерихий, сальмонелл, стафилококков и пастерелл со сформировавшейся резистентностью к диоксинору изменений морфологических и биохимических свойств не установлено. Лишь у эшерихий и сальмонелл после ЗО пассажей отмечено замедление роста.

При последовательных пассажах в МПБ, не содержащем препарат, бактерий, со сформировавшейся резистентностью, минимальная бактериостатическая концентрация диоксинора в отношении эшерихий и сальмонелл снижалась, по сравнению с начальной, только после 4О пассажей в 2 раза (1,56 мкг/мл), через 5О пассажей - в 4 раза (О,78 мкг/мл) и спустя 6О пас-

сажей достигала исходной величины (О,39 мкг/мл).

МБсК диоксинора в отношении стафилококков и пастерелл через 4О пассажей уменьшалась в 2 раза (3,12 и 1,56 мкг/мл соответственно), после 5О пассажей - в 4 раза от начальной концентрации и достигла исходных величин: 1,56 мкг/мл для стафилококков и О,78 мкг/ мл - для пастерелл.

Аналогично происходило изменение МБцК препарата.

Выводы. Комплексный препарат диоксинор благодаря синергетическому эффекту составляющих его компонентов обладает широким спектром антибактериального действия и высокой антимикробной активностью. Минимальная бактериостатическая концентрация препарата для эшерихий и сальмонелл составляет О,39 мкг/мл, золотистого стафилококка -1,56 мкг/мл, пастерелл - О,78 мкг/мл.

Важное свойство препарата - медленное развитие резистентности к нему у микроорганизмов, характеризующееся низким коэффициентом, который у эшерихий и сальмонелл был равен 8 (через 4О пассажей), золотистого стафилококка и пастерелл - 4 (через ЗО пассажей).

Приобретенная микроорганизмами устойчивость к диоксинору нестабильна и восстановление их чувствительности к препарату происходит относительно быстро: у эшерихий и сальмонелл через 6О пассажей, у золотистого стафилококка и пастерелл - после 5О пассажей.

Литература.

1. Гоби Л. Комбинирование антибиотиков //Животноводство России.-2009.-№12-С.32-33.

2. Данилевская Н. В. Особенности применения антибиотиков в ветеринарной практике. //Актуальные вопросы ветеринарной биологии. -2010. - №3(7), С. 37-41.

3. Джупина С.И. Этиология и профилактика массовых желудочно-кишечных болезней телят. //Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях. Материалы междунар. науч-практич. конференции.- Воронеж, 2002. - С.8-10.

4. Лагуткин Н.А. Химиотерапия при инфекционных болезнях. //Ветеринария.-2006.-№ 2- С.24-28.

5. Пат. 2307652 Российская Федерация. Способ лечения респираторных болезней молодняка сельскохозяйственных животных/ Ю.В. Водолазский, Г.А. Востроилова, Н.П. Мещеряков, С. В. Шабунин, Т.Е. Рогачева; заявитель и патентообладатель ЗАО НПП «Агрофарм».- №2006120251/15 заявл.08.06.2006; опубл.10.10.2007; Бюл.№28.

6. Перес Куэвас А., Семенычев А.В. Комплексные лекарственные средства при бактериальных инфекциях. //Ветеринария.-2006.- №3.- С.6 - 9.

7. Терехов В.И. Проблемы острых кишечных болезней молодняка сельскохозяйственных животных и пути их решения // Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях. Материалы междунар. науч-практич. конференции.-Воронеж, 2002. - С.48-51.

8. Шабунин С.В. Лечебная эффективность комплексных препаратов на основе колистина при желудочно-кишечных болезнях телят//Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях. Материалы международной конференции.- Воронеж, изд-во «Истоки», 2008. - С.13-16.

9. Шахов А.Г. Этиология и профилактика желудочно-кишечных и респираторных болезней телят и поросят //Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях. Материалы междунар. науч-практич. конференции. - Воронеж, 2002. - С.3-8.

THE FORMATION OF RESISTANCE AND RESTORE SENSITIVITY OF BACTERIA TO COMPOSITE ANTIBIOTIC SPECIMEN DIOXYNOR

L.Yu. Sashnina

Summary. One way to prevent the formation of resistance to antibiotics or reduce its promising application of bacterial infections of complex antibiotics. The purpose of research - the study of the development of resistance and restore sensitivity in Escherichia, Salmonella, Staphylococcus aureus and Pasteurella to dioxinor developed on the basis of dioxidin and norfloxacin. It is recommended for use as a means ethiotropic in the gastro-intestinal and respiratory diseases of young farm animals. The study of the development of resistance of microorganisms to dioxinor performed by culturing them in the meat-peptone broth (MPB) containing increasing subbacteriostatic concentrations of the drug. In cultures of microorganisms degree of resistance to the drug resistance was assessed by the ratio - the ratio of the maximum, not hinder the growth of bacteria concentration to the original. The stability of acquired bacterial resistance and restore sensitivity to dioxinor studied by successive passages of microorganisms in the MPB that contains no drug. The investigation has found a high antimicrobial activity dioxinor: minimum bacteriostatic concentration for Escherichia and Salmonella was 0.39 mg / ml of Staphylococcus aureus - 1.56 micrograms / ml and Pasteurella - 0.78 micrograms / ml. The formation of resistance of microorganisms to the drug has been slow rate which was at the Escherichia and Salmonella 8 (after 40 passages), Staphylococcus aureus and Pasteurella - 4 (30 passages). Acquired resistance to microorganisms dioxinor is an unstable trait, and restore their sensitivity to the drug occurred relatively quickly: the Escherichia and Salmonella after 60 passages, S. aureus and Pasteurella after 50 passages. The results obtained justify the appropriateness of including dioxidin and norfloxacin in the complex preparation dioxinor.

Key words: dioxynor, dioxydin, norphloxacin, resistance, escherichia, salmonella, staphylococcus aureus, pasteurella.