КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ, СОДЕРЖАЩАЯ В КАЧЕСТВЕ АКТИВНОГО ИНГРЕДИЕНТА ЛИНИЮ СТВОЛОВЫХ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ КАМБИЯ PANAX GINSENG, ВКЛЮЧАЯ ДИКИЙ ЖЕНЬШЕНЬ ИЛИ ЖЕНЬШЕНЬ
COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING MALIGNANT NEW GROWTH CONTAINING ACTIVE INGREDIENT PRESENTED BY HERBAL STEM CELL LINE RECOVERED FROM CAMBIUM OF PANAX GINSENG, INCLUDING WILD GINSENG OR GINSENG

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к композиции для профилактики или лечения злокачественного новообразования, которая содержит в качестве активного ингредиента клеточную линию, полученную из камбия Panax ginseng; ее лизат; ее экстракт; или ее культуральную среду.
Предшествующий уровень техники
Злокачественные новообразования относятся к заболеваниям, которые являются основной причиной смерти современных людей и которые вызваны мутациями в генах, регулирующих нормальный клеточный рост. Они определяются как злокачественная опухоль, которая не следует типовым вариантам дифференцировки и роста клеток.
Традиционно, злокачественные новообразования лечили одной или комбинацией трех основных терапий: хирургией, радиотерапией и химиотерапией. В частности, лечение злокачественных новообразований хирургией, т.е. способом удаления опухолевой ткани, является весьма эффективным при удалении опухолей из конкретных участков, например молочной железы, толстой кишки и кожи. Однако хирургия не подходит для лечения опухолей, находящихся в участках, таких как позвоночник, или для лечения рассеянных опухолей. В некоторых случаях, при хирургической терапии возникает проблема побочных эффектов, например, при удалении органа и невозможности предотвратить метастазирование опухоли.
При этом радиотерапию применяют для острых воспалительных заболеваний, доброкачественных и злокачественных опухолей, дисфункций, аллергических заболеваний и т.п. Как правило, такую радиотерапию применяют для злокачественных опухолей, состоящих из быстро делящихся клеток. Однако радиотерапия может привести к ослаблению или потере функции нормальной ткани и вызвать заболевания кожи в участках лечения, к которым она была применена. Кроме того, в случае младенцев, у которых прогрессирует развитие органов, радиотерапия может вызвать серьезные побочные эффекты, такие как умственная отсталость или нарушения роста костей. Кроме того, она причиняет боль пациенту во время лечения.
Кроме того, также широко применяется химиотерапия при лечении рака молочной железы, легких и яичек путем нарушения репликации и метастазирования злокачественных клеток. Однако известно, что противоопухолевые средства демонстрируют токсичность не только против злокачественных клеток, но и против нормальных клеток пациентов. Кроме того, такая химиотерапия, как правило, страдает от недостатков, заключающихся в том, что в тяжелых случаях требуется стационарное лечение или требуется применение анальгетиков для облегчения боли.
Таким образом, было проведено множество исследований по разработке новых лекарственных препаратов и составов, обладающих противоопухолевой активностью, которая ингибирует рост злокачественных клеток и убивает злокачественные клетки. В частности, большое внимание получили исследования по разработке противоопухолевых средств, полученных из естественных материалов, которые имеют мало побочных эффектов.
Соответственно, авторы предприняли много усилий для разработки противоопухолевой композиции из естественного материала, которая обладает минимальными побочными эффектами по сравнению с обычными противоопухолевыми средствами и демонстрирует прекрасную противоопухолевую активность из-за своего вовлечения в механизм развития злокачественного новообразования. В результате авторы обнаружили, что гомогенная клеточная линия, полученная из камбия Panax ginseng, включающего дикий женьшень или женьшень, ее лизат, ее экстракт и ее культуру, демонстрирует активность, уничтожающую злокачественные клетки, в чем и заключается настоящее изобретение.
Сущность изобретения
Задача настоящего изобретения заключается в обеспечении полученной из естественного материала композиции, которая обладает минимальными побочными эффектами по сравнению с обычным терапевтическим агентом для лечения злокачественного новообразования и демонстрирует активность для профилактики и лечения злокачественного новообразования.
Для достижения указанной задачи, в одном аспекте, настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию для профилактики или лечения злокачественного новообразования, которая содержит любой или несколько из перечисленного в группе, состоящей из клеточной линии, которая получена из камбия Panax ginseng и имеет представленные ниже характеристики; ее лизата; ее экстракта; и ее культуральной среды:
(a) находится в изначально недифференцированном состоянии;
(b) морфологически характеризуется многочисленными вакуолями.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает обладающий функциональными свойствами продукт питания для профилактики злокачественного новообразования или для улучшения состояния при злокачественном новообразовании, который содержит любой или несколько из перечисленного, выбранного из группы, состоящей из указанной клеточной линии; указанного лизата; указанного экстракта; и указанной культуральной среды.
В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение любого из указанной клеточной линии, указанного лизата; указанного экстракта; и указанной культуральной среды для профилактики или лечения злокачественного новообразования.
В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ для профилактики или лечения злокачественного новообразования, где способ включает применение любого или нескольких из перечисленного, выбранного из группы, состоящей из указанной клеточной линии; указанного лизата; указанного экстракта; и указанной культуральной среды.
Другие особенности и воплощения настоящего изобретения будут видны из следующего детального описания и из приложенной формулы изобретения.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 представлены фотографии, демонстрирующие процесс индукции клеточной линии по настоящему изобретению (а), клеточной линии, полученной из камбия дикого женьшеня ((b)А) и каллюсной клеточной линии, полученной из семядоли женьшеня (центр биологических ресурсов КСТС PC10224).
50
50
На фиг.2 показано значение ЕС для клеточной линии, полученной из камбия дикого женьшеня (U2), и значение ЕС для 8 экстрактов культивируемого корня дикого женьшеня, что говорит об активности, ингибирующей клеточную пролиферацию опухолевых клеточных линий (НСС:гепатоклеточная карцинома; -:без оценки).
Фиг.3 является изображениями ПЭТ-КТ (позитронно-эмиссионная томография-компьютерная томография) пациентов с лимфомой до (А и С) и после (В и D) введения клеточной линии, полученной из камбия дикого женьшеня.
Фиг.4 является графиком, демонстрирующим количество лейкоцитов и тромбоцитов в крови пациентов с острым миелоидным лейкозом в соответствии с длительностью введения клеточной линии, полученной из камбия дикого женьшеня.
Фиг.5 является изображениями ПЭТ-КТ пациентов с раком легких до (А) и после (В) введения клеточной линии, полученной из камбия дикого женьшеня.
Фиг.6 является изображениями РЕТ-СТ пациентов с раком прямой кишки до (А) и после (В) введения клеточной линии, полученной из камбия дикого женьшеня.
Фиг.7 является изображениями, полученными с помощью гастрофиброскопа у пациентов с раком прямой кишки до (А) и после (В) введения клеточной линии, полученной из камбия дикого женьшеня.
Подробное описание изобретения и предпочтительных вариантов воплощения
Если иное не определено, все технические и научные термины, использованные здесь, имеют тот же смысл, который вкладывается в них обычным специалистом в данной области. Как правило, определения различных терминов, используемых здесь, хорошо известны и традиционно используются в данной области.
Определения основных терминов в подробном описании изобретения заключаются в следующем.
При использовании в данном документе, термин «камбий» относится к ткани, которая утолщает стебель и корень, что позволяет растению расти объемно. Ранее сообщалось, что если камбий, меристема, в которой происходит наиболее активное деление клеток, использовать в качестве экспланта для культуры растительной клеточной ткани, то возможно быстрое и массовое получение клеток (Патент Кореи 10-0533120).
При использовании в данном документе, термин «лизат» относится к клеточному лизату, полученному разрушением клеток химическим способом, например детергентом, или физическим способом. Термин «экстракт» клеточной линии относится к веществу, полученному растворением клеток в растворителе и отделением клеток, при этом экстракт может быть сконцентрирован дистилляцией или выпариванием. В данном документе клеточная линия включает клеточную линию, которая проходит через дифференцировку в состоянии культуры или которая обладает улучшенной способностью продуцировать и/или секретировать полезные вещества. Термин «культуральная среда» клеточной линии при использовании в данном документе относится к среде клеточной линии, в которой клеточную линию удаляют после культивирования клеток.
При использовании в данном документе, термин «врожденно недифференцированный» означает, что клетки не находятся в недифференцированном состоянии в ходе процесса дедифференцировки, но изначально поддерживались в предифференцированном состоянии.
В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает композицию для профилактики или лечения злокачественного новообразования, которая содержит, в качестве активного ингредиента, любое или несколько из перечисленного: клеточную линию, полученную из камбия Panax ginseng, ее лизат, ее экстракт и ее культуральную среду. В настоящем изобретении Panax ginseng включает дикий женьшень или женьшень (Lian M.L. et al., J. Plant Biology, 45:201, 2002; Han J.Y. et al., J. Plant Biology, 49:26, 2006; Teng W.L. et al., Tissue and Organ Culture, 68:233, 2002). В настоящем изобретении, дикий женьшень или женьшень включает растущий в открытом поле настоящий дикий женьшень или женьшень, культивируемый в виде ткани (придаточный корень и клеточная линия, полученная из придаточного корня).
Клеточная линия, полученная из камбия Panax ginseng в соответствии с настоящим изобретением, обладает следующими характеристиками: (а) находится во врожденно недифференцированном состоянии; и (b) морфологически характеризуется большим количеством вакуолей. Полученная из камбия Panax ginseng клеточная линия по настоящему изобретению дополнительно характеризуется тем, что: (а) находится в виде одиночных клеток в суспензионной культуре; (b) имеет слабую чувствительность к механическому воздействию в биореакторе по сравнению с клеточными линиями, полученными из тканей, отличных от камбия Panax ginseng; (с) обладает более высокой скоростью роста по сравнению с клеточными линиями, полученными из тканей, отличных от камбия Panax ginseng, и стабильно культивируется. Кроме того, клеточная линия является гомогенной.
В настоящем изобретении, в котором клеточную линию получают способом выделения, включающим стадии (а) получения ткани, содержащей камбий Panax ginseng; (b) культивирования полученной содержащей камбий ткани в среде, содержащей индол-3-уксусную кислоту (ИУК) или индол-3-маслянную кислоту (ИМК), для индукции полученной из камбия клеточной линии, где осмотический стресс применяют к ткани, содержащей камбий, в ходе, до или после культивирования; и (с) сбора индуцированной, полученной из камбия клеточной линии.
На стадии (b) оригинального способа применение осмотического стресса проводят в целях индукции клеточной линии именно в камбии. Предпочтительно, если стресс осуществляют перед культивированием ткани в содержащей ИУК или ИМК среде, так чтобы основные ткани (т.е. первичная кора, флоэма, ксилема и паренхима), за исключением камбия, теряли способность к делению и таким образом превращались в некроз до обработки камбиальными гормонами для деления, таким как ИУК или ИМК. При этом предпочтительно, если осмотический агент используют в концентрации 0,5-2 М, а осмотический стресс применяют на холоду или при комнатной температуре в течение 16-24 часов, а затем снимают. Однако сфера данного изобретения не ограничивается этим, потому что концентрация, время обработки и температура осмотического агента могут различаться в зависимости от типа растения и состояния ткани. На стадии (b) ИУК или ИМК предпочтительно содержатся в количестве 0,1-5 мг/мл.
Кроме того, предпочтительно, если стадию (с) проводят пролиферацией индуцированной полученной из камбия клеточной линии в среде, содержащей один или несколько из перечисленного: 2,4 D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота); пиклорам и ИМК), после чего проводят сбор полученной из камбия клеточной линии. В данном документе, любое из 2,4-D, пиклорама и ИМК предпочтительно применяют в количестве 1-5 мг/л, а более предпочтительно - 2 мг/л.
Среда, применяемая в настоящем изобретении, является обычной средой для культуры растительной ткани, и примеры ее могут включать, не ограничиваясь перечисленным, среду N6, среду SH, среду MS, среду АА, среду LS, среду В5, среду WPM, среду LP, среду White, среду GD, среду DKW, среду DCR и т.д.
В настоящем изобретении экстракт предпочтительно получают с помощью растворителя выбранного из группы, состоящей из дистиллированной воды, спирта, такого как низший спирт или т.п., ацетона, ДМСО (диметилсульфоксида) и их смешанных растворителей. В данном документе низший спирт включает спирты, имеющие от 1 до 5 атомов углерода, такой как метанол и этанол.
В одном примере настоящего изобретения клеточные линии из рака поджелудочной железы, рака легкий, рака печени, рака толстой кишки, рака молочной железы, рака шейки матки, рака кожи и рака простаты были обработаны экстрактом из клеточной линии, полученной из камбия Panax ginseng в соответствии с настоящим изобретением. В результате было отмечено, что экстракт клеточной линии в соответствии с настоящим изобретением обладает активностью, убивающей злокачественные клетки во всех опухолевых клеточных линиях. Также в другом примере настоящего изобретения наблюдали, что культуральная среда клеточной линии, полученной из камбия Panax ginseng в соответствии с настоящим изобретением, обладает активностью, убивающей злокачественные клетки клеточных линий рака молочной железы и рака поджелудочной железы.
Кроме того, в еще одном примере настоящего изобретения клеточную линию, полученную из камбия Panax ginseng в соответствии с настоящим изобретением, вводили пациентам, которым был поставлен диагноз злокачественное новообразование (например, лимфома, рак легких, рак прямой кишки и рак желудка и т.п.) и затем получали ПЭТ-КТ изображения. В результате наблюдали, что клеточная линия, полученная из камбия Panax ginseng, ингибирует или уменьшает образование опухоли или рост опухоли путем уничтожения клеточной линии in vivo (например, в пациенте), и уровни в крови измеряли после введения пациенту, которому был поставлен диагноз лейкоз, клеточной линии, полученной из камбия Panax ginseng в соответствии с настоящим изобретением. В результате наблюдали, что уровни в крови становились нормальными. Другими словами, клеточная линия в соответствии с настоящим изобретением была эффективной для профилактики и лечения рака поджелудочной железы, рака печени, рака толстой кишки, рака молочной железы, рака шейки матки, рака кожи, рака простаты, лимфомы, лейкоза, рака легких, рака прямой кишки, рака желудка, без ограничения перечисленным.
Соответственно, было обнаружено, как описано выше, что клеточные линии, их экстракты, и их культуральные среды обладают активностью для профилактики и лечения злокачественных новообразований. Таким образом, хотя в настоящем изобретении нет конкретного примера, показывающего, что композиция, содержащая лизат клеточной линии, демонстрирует эффект профилактики и лечения злокачественного новообразования, для специалиста в данной области будет очевидно, что композиция, содержащая лизат клеточной линии по настоящему изобретению, сможет продемонстрировать эффект профилактики и лечения злокачественного новообразования.
Композиция для профилактики или лечения злокачественного новообразования, содержащая любое или несколько из перечисленного: клеточную линию по настоящему изобретению; ее лизат; ее экстракт; и ее культуральную среду, может быть представлена в виде фармацевтической композиции, содержащей любое или несколько из перечисленного в группе, состоящей из клеточной линии; ее лизата; ее экстракта; и ее культуральной среды отдельно или в комбинации, по меньшей мере, с одним фармацевтически приемлемым носителем, наполнителем или разбавителем. Клеточная линия, ее лизат, ее экстракт или ее культуральная среда может содержаться в виде фармацевтической композиции в фармацевтически эффективном количестве в зависимости от заболевания и его тяжести, возраста пациента, массы, состояния здоровья и пола, пути введения и периода лечения.
При использовании в данном документе термин «фармацевтически приемлемая композиция» относится к композиции, которая является физиологически приемлемой и не вызывает желудочные нарушения, аллергические реакции, такие как вертиго, или подобные реакции, при введении человеку. Примеры указанного носителя, наполнителя или разбавителя включают лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, малтит, крахмал, акациевую камедь, алгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стерат магния и минеральные масла.
Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать наполнители, средства против агрегации, смазывающие вещества, увлажняющие вещества, отдушки, эмульгаторы и консерванты. Также фармацевтическая композиция настоящего изобретения может быть составлена с помощью способа, хорошо известного в данной области, так чтобы она могла обеспечивать быстрый, устойчивый или с замедленным высвобождением активный ингредиент после введения млекопитающим. Состав может быть в форме порошков, гранул, таблеток, эмульсий, сиропов, аэрозолей, твердых или мягких желатиновых капсул, стерильных растворов для инъекции, стерильных порошков, и т.п.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает обладающий функциональными свойствами продукт питания для профилактики злокачественного новообразования или улучшения состояния при злокачественном новообразовании, который содержит любой или несколько из перечисленного выбранного из группы, состоящей из указанной клеточной линии, полученной из камбия Panax ginseng; ее лизата; ее экстракта; и ее культуральной среды.
При использовании в данном документе термин «обладающий функциональными свойствами продукт питания» относится к продукту питания, функциональность которого была улучшена добавлением клеточной линии по настоящему изобретению, ее лизата или ее экстракта.
Примеры
Далее по тексту настоящее изобретение будет описано более подробно с отсылкой на примеры. Для специалиста в данной области будет очевидно, что эти примеры приведены исключительно для иллюстративных целей и не должны трактоваться с ограничением сферы применения настоящего изобретения.
В частности, хотя эффекты профилактики злокачественных новообразований и эффекты ингибирования злокачественных новообразований клеточной линии, полученной из камбия дикого женьшеня, ее экстракта и ее культуральной среды, были подтверждены в представленных ниже примерах, специалисту в данной области будет очевидно, что применение лизата клеточной линии может обеспечить такие результаты, что и полученные с помощью клеточной линии или ее экстракта.
Пример 1. Приготовление клеточной линии, полученной из камбия Panax ginseng
1-1: Подготовка растительного материала.
(1) В «А» фиг.1(а) показан типичный признак дикого женьшеня, использованного в настоящем изобретении. Для использования главного корня приобретенного дикого женьшеня главный корень приобретали, после чего промывали его в проточной воде для удаления с его поверхности земли и других загрязнителей и отмывали поверхность главного корня с помощью жидкого детергента. Затем главный корень оставляли в проточной воде. Отмытую ткань помещали в стерильный флакон в ламинаре и стерилизовали 70% этанолом в течение периода времени от 30 секунд до около 1 минуты. Затем ткань споласкивали стерильной дистиллированной водой и обрабатывали дезинфицирующим раствором, содержащим 1-1,5% гипохлорит натрия в течение около 5-15 минут. В этот момент времени, для того чтобы дать дезинфицирующему раствору эффективно проникнуть в ткань, добавляли несколько капель «TWEEN 20» (полиоксиэтиленсорбитан монолаурат, Junsei, Япония)). После этого ткань споласкивали 3-5 раз стерильной дистиллированной водой. Затем, в целях предотвращения потемнения стерилизованной ткани, стерилизованный главный корень помещали в содержащую антиоксиданты среду для ингибирования потемнения (BIM) и культивировали со встряхиванием в течение от около 30 мин до 1 часа. Затем ткань помещали на стерильный фильтр для удаления воды.
Композиция примененной среды для ингибирования потемнения (BIM) и концентрации его компонентов показаны в таблице 1 ниже.
Таблица 1
Композиция среды BIM и концентрации ее компонентов
Композиция
Концентрации
Соль среды для древесных растений (WPM, McCown)
1/4 дозировки
Сахароза
1% (масс./об.)
ПВП (поливинилпирролидон)
0,5% (масс./об.)
Аскорбиновая кислота
100 мг/л
Лимонная кислота
150 мг/л
Скорректировать до рН 5,8
Здесь, соль добавляли в количестве, соответствующем от 1/4 от общего количества. Затем в целях предотвращения потемнения обработанного материала материал помещали в стерилизованную чашку Петри, содержащую CS-раствор (cutting solution) с антиоксидантами (таблица 2), и очищали. Затем материал разрезали на две равные части и каждую часть разрезали до размера 0,5-0,7 см (ширину) × 0,5-0,7 см (длину) × 0,2-0,5 мм (толщину) таким образом, чтобы каждая отрезанная часть содержала часть камбия, обладающего способностью к делению. На "В" фиг.1(а) показан эксплант, приготовленный разрезанием основного корня дикого женьшеня до вышеуказанного размера таким образом, чтобы эксплант содержал камбий.
Таблица 2
CS (cutting solution)
Компонент
Концентрация
Поливинилпирролидон
0,5% (масс./об.)
Аскорбиновая кислота
100 мг/л
Лимонная кислота
150 мг/л
(2) придаточный корень 100-летнего дикого женьшеня, который содержали в биореакторе, подготовили и поместили в стерилизованную чашку Петри, содержащую CS-раствор таблицы 2, а эксплант, содержащий камбий корня дикого женьшеня, был получен таким же образом, как описано выше.
1-2: Обработка экспланта, содержащего камбий основного корня дикого женьшеня осмотическим агентом
Эксплант, подготовленный в примере 1-1, обрабатывали с помощью осмотического стресса в целях некротизации дифференцированных тканей (флоэмы, кслиемы, паренхимы и т.д.) для того, чтобы позволить выжить только меристемному камбию. Содержащий камбий эксплант промокали в среде для предварительного культивирования (среда 1, таблица 3), размещали затем на фильтровальной бумаге, помещали его во флакон, содержащий 1 М раствор сахарозы (Duchefa, Нидерланды), и обрабатывали осмотическим стрессом в холодном состоянии в течение 16-24 часов. Затем эксплант обрабатывали в 0,05 М растворе сахарозы в течение 5 минут и в 0,1 М растворе сахарозы в течение 5 минут для снятия стресса, вызванного высококонцентрированной сахарозой. Содержащий камбий эксплант после снятия осмотического стресса помещали в среду для предварительного культивирования (среда 1) с последующим промоканием фильтровальной бумагой для удаления влаги.
Таблица 3
Композиция среды для предварительного культивирования (среда 1)
Композиция
мМ
мг/л
Макроэлементы
Ca(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>
2,35
471,26
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>
5,00
400,00
MgSO<sub>4</sub>*7H<sub>2</sub>O
1,50
180,54
K<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
5,68
990,00
CaCl<sub>2</sub>*2H<sub>2</sub>O
0,65
72,50
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
1,25
170,00
Композиция
мкМ
МГ/Л
Микроэлементы
MnSO<sub>4</sub>*4H<sub>2</sub>O
131,94
22,3
ZnSO<sub>4</sub>*7H<sub>2</sub>O
29,91
8,60
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>*2H<sub>2</sub>O
1,03
0,25
Н<sub>2</sub>ВО<sub>3</sub>
100,27
6,20
CuSO<sub>4</sub>*5H<sub>2</sub>O
1,00
0,25
FeNa-EDTA
100,00
36,70
Витамины
Глицин
26,64
2,00
Мио-инозитол
554,94
100,00
Никотиновая кислота
4,06
0,50
Пиридоксин-HCl
2,43
0,50
Тиамин-HCl
2,96
1,00
1-3: Индукция полученной из камбия гомогенной клеточной линии в экспланте, содержащем камбий основного корня женьшеня.
Для того чтобы индуцировать полученную из камбия гомогенную клеточную линию, обладающую способностью к делению, эксплант, подвергнутый осмотическому стрессу в примере 1-2, переносили в среду для индукции клеточной линии (среда 2, таблица 4). Композиция использованной среды показана в таблице 5 ниже. Перенесенный эксплант культивировали в темноте при температуре 22±1°С.
Таблица 4
Композиция среды (среда 2) для индукции гомогенной клеточной линии полученной из камбия
Компонент
Концентрация и состояние
Соль
полная концентрация среды для древесных растений (WPM)
Сахароза
3% (масс./об.)
IAA (индолил-3-уксусная кислота)
2 мг/л
РН
5,8
Гелрит
0,3% (масс./об.)
Аскорбиновая кислота
100 мг/л
Лимонная кислота
150 мг/л
В таблице 5 ниже показано, что в эксплантах, сразу перенесенных в среду для индукции клеточной линии из камбия (среда 2) без проведения обработки осмотическим стрессом, желтая цветная реакция была показана в отношении камбия на начальном стадии (2-3 дня) после переноса, а затем с течением времени весь эксплант желтел. Эксплант, который показал реакцию желтого цвета в отношении камбия, субкультивировали в оптимальной среде (среда 3) для выделения и пролиферации полученной из камбия клеточной линии для того, чтобы индуцировать и пролиферировать полученную из камбия клеточную линию, но феномен потемнения становится серьезным, и любая реакция, отличная от реакции потемнения, не была продемонстрирована с течением времени.
Однако, после приложения и снятия осмотического стресса было отмечено, как показано в таблице 5, что в экспланте, инокулированном в среду для индукции клеточной линии из камбия, гомогенная клеточная линия специфично индуцировалась только в камбии, без какой-либо индукции в других тканях. В частности, было отмечено, что в перенесенном экспланте, обработанном осмотическим стрессом и с которого осмотический стресс был снят, камбий экспланта становится светло-желтым после 3-7 дней в культуре, а через 7-14 дней после этого в части, которая меняет цвет на светло-желтый, индуцируется круглоклеточная линия. В данном документе такие же результаты были получены как для экспланта, содержащего камбий из настоящего женьшеня, растущего под открытым небом, так и для экспланта, содержащего камбий из придаточного корня дикого женьшеня. «С» фиг.1(а) показано, что гомогенную клеточную линию, имеющую специфичную для камбия способность к делению, индуцировали в экспланте, содержащем камбий дикого женьшеня.
При этом эксплант культивировали в среде, содержащей 2,4-D, которая не являлась средой для индукции гомогенной клеточной линии и которую применяли в обычной культуре Panax ginseng, включая женьшень и дикий женьшень. В этом случае было отмечено, что весь эксплант начал желтеть через 7-10 дней культивирования, а через около 7-14 дней клетки индуцировались по всему поперечному сечению.
1-4: Пролиферация выделенной гомогенной клеточной линии, полученной из камбия дикого женьшеня.
Полученной из камбия гомогенной клеточной линии, обладающей способностью к делению, индуцированной в примере 1-3, позволяли пролиферировать. Для пролиферации использовали оптимальную среду (таблица 7) для пролиферации полученной из камбия гомогенной клеточной линии, обладающей способностью к делению, которая содержала композицию основных солей (таблица 6). 2,4-D в таблице 7 использовали для пролиферации гомогенной клеточной линии, полученной из камбия выращиваемого в открытом поле истинного дикого женьшеня, а ИМК в таблице 7 применяли для пролиферации гомогенной клеточной линии, полученной из придаточного корня дикого женьшеня.
Таблица 6
Композиция основных солей оптимальной среды для выделения и пролиферации полученной из камбия гомогенной клеточной линии, обладающей способностью к делению
Композиция
мМ
мг/л
Макроэлементы
CaCl<sub>2</sub>*2H<sub>2</sub>O
2,99
332,02
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
1,25
170
KNO<sub>3</sub>
18,79
1900
MgSO<sub>4</sub>
1,50
180,54
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>
20,61
1650
Композиция
мкМ
мг/л
Микроэлементы
CoCl<sub>2</sub>*6H<sub>2</sub>O
0,11
0,025
CuSO<sub>4</sub>*5H<sub>2</sub>O
0,10
0,03
FeNa-EDTA
100,00
36,7
Н<sub>3</sub>ВО<sub>3</sub>
100,27
6,2
KI
5,00
0,83
MnSO<sub>4</sub>*4H<sub>2</sub>O
100,00
16,9
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>*2H<sub>2</sub>O
1,03
0,25
ZnSO<sub>4</sub>*7H<sub>2</sub>O
29,91
8,6
Витамины
Глицин
26,64
2
Мио-инозитол
554,94
100
Никотиновая кислота
4,06
0,5
Пиридоксин-HCl
2,43
0,50
Тиамин-HCl
0,30
0,1
Таблица 7
Композиция оптимальной среды (среды 3) для выделения и пролиферации полученной из камбия гомогенной клеточной линии, обладающей способностью к делению
Компонент
Концентрация и состояние
Соль
полная концентрация MS
Сахароза
3% (масс./об.)
2,4-D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота)
2 мг/л
РН
5,8
Гелрит
0,3% (масс./об.)
Аскорбиновая кислота
100 мг/л
Лимонная кислота
150 мг/л
Как показано в «С» фиг.1(а), после того как гомогенная клеточная линия была специально индуцирована только в камбии с помощью обработки осмотическим стрессом и средой 2, гомогенную клеточную линию субкультивировали в среде 3, как показано в таблице 7. В результате обладающая способностью к делению гомогенная клеточная линия, полученная из камбия, постоянно делилась и пролиферировала, и таким образом, полученную из камбия гомогенную клеточную линию, обладающую способностью к делению, можно выделить через около 10-20 дней культивирования. Выделенной таким образом гомогенной клеточной линии, полученной из камбия дикого женьшеня, вновь было позволено пролиферировать при культивировании в той же самой среде. На «D» фиг.1(а) показано, что изолированной камбий-специфичной гомогенной клеточной линии было позволено пролиферировать в среде 3, представленной в таблице 7.
1-5: Наблюдение характеристик изолированной клеточной линии
Полученную из камбия дикого женьшеня гомогенную клеточную линию помещали во флаконы, содержащие жидкую среду, представленную в таблице 8. После этого клеточную линию культивировали во вращающемся шейкере на скорости 100 об/мин в темноте при 25±1°С. В данном случае интервал пересевания был установлен равным 2 неделям, так чтобы культивируемые клетки могли всегда поддерживать высокую живучесть в экспоненциальной фазе роста. 2,4-D в таблице 8 применяли для пролиферации гомогенной клеточной линии, полученной из камбия выращиваемого в открытом поле настоящего дикого женьшеня, а ИМК в таблице 8 применяли для пролиферации гомогенной клеточной линии, полученной из придаточного корня дикого женьшеня.
При этом каллюс, полученный из семядоли женьшеня, также культивировали в среде 4 таблицы 8 и культивируемый каллюс сравнивали с гомогенной клеточной линией, полученной из камбия дикого женьшеня настоящего изобретения.
Таблица 8
Суспензионная среда для Panax ginseng (среда 4)
Компонент
Концентрация и состояние
Соль
полная концентрация MS
Сахароза
3% (масс./об.)
ИМК (индол-3-уксусная кислота) или 2,4-D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота)
2 мг/л
РН
5,8
Количественную оценку клеточной агрегации осуществляли с помощью оптического микроскопа (биологический микроскоп СХ31, Olympus, Япония). В результате было отмечено, что, как показано в таблице 9 ниже, более чем 95% клеток клеточной линии, полученной из растущего под в открытом поле настоящего дикого женьшеня, обработанной 2,4-D по настоящему изобретению, находились в одноклеточном состоянии в суспензионной культуре, и более чем 60% клеток клеточной линии, полученной из камбия придаточного корня, обработанной ИМК по настоящему изобретению, также находились в одноклеточном состоянии, что подтверждает факт того, что клеточная линия по настоящему изобретению характеризуются тем, что она находится в одноклеточном состоянии в суспензионной культуре. Также, как показано в «А» фиг.1(b), можно отметить, что клеточная линия, полученная из камбия растущего в открытом поле настоящего дикого женьшеня, обработанная 2,4-D, и клеточная линия, полученная из камбия придаточного корня, обработанная ИМК, морфологически характеризовались множественными вакуолями и находились в недифференцированном состоянии. С другой стороны, в каллюсе, полученном из семядоли женьшеня (Центр Биологических Ресурсов КСТС PC 10224), множественные вакуоли не наблюдались, а наблюдалась одиночная большая вакуоль, как показано в «В» фиг.1(b).
Таблица 9
Тип клеточных агрегатов длительных культур Panax ginseng
Большие клеточные агрегаты
Средние клеточные агрегаты
Малые клеточные агрегаты
Одноклеточная популяция
Источник экспланта
90%
7%
2%
1%
Семядоля
0
0
5%
95%
камбий (обработка 2,4-D)
5%
10%
25%
60%
камбий (обработка ИМК)
3
Большие клеточные агрегаты, размер больше чем 1,5×10 мкм;
3
Средние клеточные агрегаты, 1×10 мкм;
2
3
Малые клеточные агрегаты, 4×10 мкм<размер <1×10 мкм
При этом для оценки возможности масштабирования выращивания культуры каллюс, полученный из семядоли женьшеня, и клеточная линия, полученная из камбия дикого женьшеня настоящего изобретения, культивировали в аэрлифтном биореакторе (Swig-Won Cytec, Корея) с внутренним объемом 3 л. Используемую в культуре жидкую среду, представленную в таблице 8, выдерживали в темноте при 25±1°С.
В результате, как показано в таблице 10 ниже, время удвоения клеточной культуры, полученной из семядоли женьшеня, составило 21 день в колбе, а в биореакторе - 28 дней. Другими словами, было видно, что при культивировании во флаконах гомогенная клеточная линия, полученная из камбия по настоящему изобретению, демонстрировала в около 3-5 раз более высокую скорость роста по сравнению с клеточными линиями, полученными из других тканей, а при культивировании в реакторе клеточная линия, полученная из камбия по настоящему изобретению, демонстрировала в 5-9 раз более высокую скорость роста по сравнению с клеточными линиями, полученными из тканей, отличных от камбия. Считается, что так происходит, потому что жизнеспособность клеток быстро уменьшается из-за образования кольца роста в реакторе, из-за агрегации растительных клеток в культуре и из-за чувствительности твердых клеточных стенок к механическому воздействию.
При этом время удвоения гомогенной клеточной культуры, полученной из камбия дикого женьшеня, выращенного в открытом поле, обработанной 2,4-D по настоящему изобретению, составило 3-4 дня в реакторе, а время удвоения гомогенной клеточной культуры, полученной из придаточного корня дикого женьшеня, обработанной ИМК, составило 5-6 дней в реакторе, что не отличалось от времени удвоения в колбе или даже было меньше по сравнению со временем удвоения в колбе. Гомогенная клеточная линия, полученная из камбия, формирует очень небольшие по площади кольца роста в биореакторе, и кольца на внутренней стенке легко удалялись простым путем - встряхиванием среды в биореакторе. Также было показано, что клеточная линия настоящего изобретения обладала низкой способностью к агрегации и содержала большое количество вакуолей и, таким образом, обладала низкой чувствительностью к механическому воздействию, так что жизнеспособность клеток не уменьшалась.
Другими словами, было видно, что полученная из камбия клеточная линия по настоящему изобретению обладала низкой чувствительностью к механическому воздействию, которое являлось результатом встряхивания в биореакторе для масштабной культуры, и, таким образом, клеточная линия может быть произведена в биореакторе быстро в больших количествах. Соответственно, было видно, что полученная из камбия клеточная линия по настоящему изобретению обладала в 5-9 раз более низкой чувствительностью к механическому воздействию по сравнению с клеточными линиями, полученными из тканей, отличных от камбия.
Таблица 10
Время удвоения клеточных линий, полученных из камбия и из семядоли женьшеня в жидкой суспензионной культуре и в биореакторе
Источник экспланта
время удвоения (дни)
колба
Биореактор
Семядоля
21
28
камбий (обработка 2,4-D)
5
3-4
камбий (обработка ИМК)
7
5-6
При этом криоконсервировали гетерогенный каллюс, полученный из семядоли (центр биологических ресурсов КСТС PC 10224), и полученную из камбия гомогенную клеточную линию. Суспензионную культуру инкубировали в течение 6-8 дней, после чего переносили в 5 мл криопробирки (Duran, США) в криконсервирующее средство - среду, содержащую 0,5 М глицерин (DUCHEFA, Нидерланды) и 0,5 М ДМСО (DUCHEFA, Нидерланды). Концентрация клеток, перенесенных в криоконсервант, составляла 200 мг/мл. Суспендированные клетки, обработанные криоконсервантом, замораживали путем помещения их в холодильник на 30 минут, после чего их переносили в холодильник глубокой заморозки на 3 часа, а затем выдерживали в жидком азоте.
Затем для оттаивания культивируемые клетки, выдержанные в жидком азоте в течение 20 или более минут, вынимали и размещали в водяной бане с постоянной температурой 40°С и размораживали 1-2 минуты. Для возобновления роста клеток клеточную суспензию фильтровали через стерилизованные воронку и фильтровальную бумагу. Отфильтрованные клетки помещали на твердую питательную среду с фильтровальной бумагой и стабилизировали при комнатной температуре в течение 30 минут, а затем переносили в свежую твердую питательную среду.
В результате гетерогенная клеточная линия, полученная из семядоли женьшеня, не восстановилась, а клеточная линия, полученная из камбия, напротив через 4 недели начала расти и пролиферировать без какой-либо разницы в скорости роста до и после криоконсервации.
Пример 2. Высушивание клеточной линии, полученной из камбия дикого женьшеня, и приготовление экстракта клеточной линии
Клеточную линию, полученную из придаточного корня дикого женьшеня примера 1, сушили и экстрагировали следующим образом.
(1) Приготовление высушенной клеточной линии
(i) клеточную линию, от которой отделяли культуральную среду, лиофилизировали или высушивали нагретым воздухом.
(ii) высушенную клеточную линию размельчали с помощью дробилки.
(2) Приготовление дистиллированного водного экстракта
(i) По 500 г клеточной линии, от которой отделяли культуральную среду, и лиофилизированной или высушенной горячим воздухом клеточной линии экстрагировали в 5000 мл дистиллированной воды с перемешиванием в течение 24 часов.
(ii) После окончания экстракции клеточный раствор центрифугировали при 3000 g в течение 10 минут и надосадочную жидкость собирали, получая, таким образом, дистиллированное водорастворимое вещество.
(iii) Полученное дистиллированное водорастворимое вещество концентрировали в условиях сниженного давления с помощью роторного вакуумного концентратора.
(3) Приготовление этанольного экстракта
(i) По 500 г клеточной линии, от которой отделяли культуральную среду, и лиофилизированной или высушенной горячим воздухом клеточной линии экстрагировали в 5000 мл этанола с перемешиванием в течение 24 часов.
(ii) После окончания экстракции клеточный раствор центрифугировали при 3000 g в течение 10 минут и надосадочную жидкость собирали, получая, таким образом, этанолрастворимое вещество.
(iii) Полученное этанолрастворимое вещество концентрировали в условиях сниженного давления с помощью роторного вакуумного концентратора.
(4) Приготовление метанольного экстракта
(i) По 500 г клеточной линии, от которой отделяли культуральную среду, и лиофилизированной или высушенной горячим воздухом клеточной линии экстрагировали в 5000 мл метанола с перемешиванием в течение 24 часов.
(ii) После окончания экстракции клеточный раствор центрифугировали при 3000 g в течение 10 минут и надосадочную жидкость собирали, получая, таким образом, метанолрастворимое вещество.
(iii) Полученное метанолрастворимое вещество концентрировали в условиях сниженного давления с помощью роторного вакуумного концентратора.
Экспериментальный пример 1: In vitro цитостатическая активность клеточной линии, полученной из камбия Panax ginseng (1)
Для подтверждения цитостатического воздействия на опухолевую клеточную линию клеточной линии, полученной из камбия Panax ginseng, проводили измерение эффективности ингибирования путем добавления метанольного экстракта примера 2-(4) к 8 видам опухолевых клеточных линий.
В этом эксперименте использовали AsPC-1 (рак поджелудочной железы), А549 (рак легких) SK-Hep1 (рак печени), НТ-29 (рак толстой кишки), MDA-MB-231 (рак молочной железы), HeLa (рак шейки матки), А375Р (меланома кожи), Du-145 (рак простаты), предоставленные KCLB (Korean Cell Line Bank), и среды RPM1640 и DMEM, дополненные 10% телячьей сывороткой.
Вначале каждую клеточную линию рассевали на 96-луночный планшет в различных концентрациях в зависимости от скорости роста клеточной линии и культивировали при 37°С в течение 16-24 часов. Затем экстракт в метаноле примера 2-(4) и экстракт растущего в открытом поле истинного дикого женьшеня для контрольной группы разводили в дозы 12 категорий и обрабатывали ими. Экстракт растущего в открытом поле истинного дикого женьшеня предназначен для сравнения эффекта на клеточную линию в соответствии с настоящим изобретением, при этом обычный растущий в открытом поле истинный дикий женьшень и экстракт в метаноле лиофилизированного растущего в открытом поле истинного дикого женьшеня перед использованием готовили так же, как в примере 2-(4).
50
Через 72 часа 15 мкл раствора красителя МТТ (Promega Corp.) добавляли к каждой лунке и инкубировали в течение 4 часов при 37°С. Затем 100 мкл раствора для солюбилизации/стоп-смеси вносили в каждую лунку и осуществляли инкубирование при 37°С в течение ночи. Поглощение в каждой лунке считывали при 570 нм после подтверждения того, что окрашенный продукт - формазан - был прекрасно солюбилизирован. Поглощение рассчитывали как процент на основе обработанной растворителем группы и представляли как концентрацию образца (ЕС), когда поглощение образца уменьшалось на 50% по сравнению с обработанной растворителем группой.
50
В результате, как показано на фиг.2, было подтверждено, что экстракт клеточной линии, полученной из Panax ginseng в соответствии с настоящим изобретением, ингибирует пролиферацию 8 видов опухолевых клеточных линий в концентрации значительно более низкой, чем при использовании придаточных корней дикого женьшеня. В частности, экстракт клеточной линии, полученной из камбия Panax ginseng, демонстрирует активность ингибирования клеточной пролиферации клеточной линии рака толстой кишки, на которой экстракт растущего в открытом поле дикого женьшеня даже при высокой концентрации не давал значение ЕС.
Соответственно, подтверждено, что клеточная линия, полученная из камбия Panax ginseng, обладает значительно более высокой цитостатической активностью по отношению к опухолевой клеточной линии по сравнению с экстрактом растущего в открытом поле истинного дикого женьшеня и может быть применена в качестве прекрасного противоопухолевого средства.
Экспериментальный пример 2: In vitro цитостатическая активность культуральной среды клеточной линии, полученной из камбия Panax ginseng (2)
В целях проверки активности уничтожения злокачественных клеток культуральной средой клеточной линии, полученной из камбия Panax ginseng, эксперимент проводили в виде следующих процедур.
В этом эксперименте культуральную среду, которую выделяли в процессе получения экстракта клеточной линии в примере 2-(4), применяли в качестве образца, MDA-MB-231 (рак молочной железы) and AsPC-1 (рак поджелудочной железы), предоставленные KCLB, применяли в качестве групп опухолевых клеточных линий, а RPM1640, содержащую 10% телячью сыворотку, и среду DMEM применяли в качестве сред.
50
Вначале каждую клеточную линию рассевали на 96-луночный планшет в различных концентрациях в зависимости от скорости роста клеточной линии и культивировали при 37°С в течение 16-24 часов. Затем культуральную среду разводили на дозы 12 категорий и обрабатывали ими. Через 72 часа 15 мкл раствора красителя МТТ (Promega Corp.) добавляли к каждой лунке и инкубировали в течение 4 часов при 37°С. Затем 100 мкл раствора для солюбилизации/стоп-смеси вносили в каждую лунку и осуществляли инкубирование при 37°С в течение ночи. Поглощение в каждой лунке считывали при 570 нм после подтверждения того, что окрашенный продукт - формазан - был прекрасно солюбилизирован. Поглощение рассчитывали как процент на основе обработанной растворителем группы и представляли как концентрацию образца (ЕС), когда поглощение образца уменьшалось на 50% по сравнению с обработанной растворителем группой.
50
В результате для MDA-MA-231 (рак молочной железы) и AsPC-1 (рак поджелудочной железы) получили значения ЕС>7,57 мг/мл и >1,0 мг/мл соответственно. Таким образом, подтвердили, что культуральная среда клеточной линии, а также клеточная линия сама по себе в соответствии с настоящим изобретением обладают цитостатической активностью по отношению к опухолевой клеточной линии.
Экспериментальный пример 3: Наблюдение эффекта профилактики и лечения злокачественного новообразования с помощью полученной из камбия Panax ginseng (1) клеточной линии.
Для наблюдения эффекта профилактики и лечения злокачественного новообразования клеточной линией, полученной из камбия Panax ginseng в соответствии с настоящим изобретением, размельченную клеточную линию, полученную в примере 2-(1), вводили в виде порошка пациенту, у которого было диагностировано злокачественное новообразование. Введение осуществляли перорально по 1 г перорально растворенной в воде формы, 3 раза в день (утром, днем и вечером), а подробная дозировка и период даны ниже. При этом было отмечено отсутствие побочного эффекта в течение введения.
3-1: Введение пациенту с лимфомой
Пациентке (г-же Ким, 1957 года рождения), которой 9 января 2004 года поставили диагноз лимфома, перорально вводили порошок сухой клеточной линии по 3 г в день в течение 2 месяцев и не комбинировали с другой противоопухолевой терапией в течение введения. Для наблюдения in vivo активности по уничтожению злокачественных клеток осуществляли ПЭТ-КТ в Медицинском центре университета Ханьяна (Hanyang), до введения и через 2 месяца после введения, соответственно, и сравнивали результаты ПЭТ-КТ.
В результате, как показано на фиг.3, до введения, часть, демонстрирующую аномальный и повышенный метаболизм, детектировали в полости малого таза и в брюшной полости слева. Также злокачественная опухоль была продемонстрирована в перикарде, брюшине и правой почке (фиг.3А и С). Напротив, через 2 месяца введения в соответствии с этим изобретением было отмечено, что часть, демонстрирующая аномальный и повышенный метаболизм, исчезла (фиг.3В и D). Следовательно, эти экспериментальные результаты подтверждают, что клеточная линия в соответствии с настоящим изобретением обладает эффектом профилактики и лечения посредством активности, убивающей злокачественные клетки.
Известно, что в течение введения противоопухолевого средства, как правило, отмечаются побочные эффекты, такие как аномальное увеличение уровней печени и почек. В связи с этим уровни печени и почек определяли регулярно в течение введения клеточной линии в соответствии с настоящим изобретением следующим образом. Как показано в таблице 12, Bil, ALP, AST, ALT и LDH являлись маркерами для уровня печени, a BUN и CRE являлись маркерами для значения печени, и все они были измерены в медицинском центре университета Ханьяна (Hanyang). BUN и CRE измеряли методом определения креатинина сыворотки (Метод Фолин-Ву) AST, ALT и LDH измеряли с помощью «ATBA-200FR» и «HITACHI 7170 Auto Analyzer», ALP измеряли методом детекции сыворотки, а Т.В11 измеряли с помощью тестового раствора «Asanset bilirubin test solution» (Asan Pharm. Co.).
Таблица 11
Нормальное значение
1 месяц после введения
38 дней после введения
45 дней после введения
75 дней после введения
105 дней после введения
BUN
7~20 (мг/мл)
17
11
14
9
13
CRE
0,6~1,8 (мг/мл)
0,9
0,9
1,0
0,9
1,1
T, Bil
0,2~1,2 (мг/мл)
0,3
0,2
0,2
0,4
0,2
ALP
30~110 (ЕД./л)
79
78
71
76
75
AST
5~40 (ЕД./л)
10
10
18
14
17
ALT
5~45 (ЕД./л)
15
11
23
16
13
LDH
60~200 (ЕД./л)
127
117
139
156
144
В результате, как показано выше в таблице 11, было отмечено, что уровни печени и почек остались на нормальном уровне, что тем самым подтверждает, что клеточная линия в соответствии с настоящим изобретения была нетоксична.
3-2: Введение пациенту с острым миелолейкозом
Пациентке, которой был поставлен диагноз острый миелолейкоз (г-же Ли, 1995 года рождения), перорально вводили по 3 г в день в течение 8 месяцев. Кроме того, для проверки эффекта лечения злокачественного новообразования in vivo измеряли количества лейкоцитов и тромбоцитов до введения и через 1 месяц после введения с помощью автоматического анализатора крови «Celldyn3000» (Abbott, Висбаден, Германия) в соответствии с инструкцией производителя.
Таблица 12
Количество лейкоцитов
Количество тромбоцитов
Нормальное значение
(4,000~10,000/мм<sup>5</sup>)
(141,000~316,000/мм<sup>3</sup>)
1 сентября
600
73000
2 сентября
500
42000
3 сентября
400
24000
4 сентября
400
52000
5 сентября
500
36000
6 сентября
400
22000
7 сентября
500
16000
8 сентября
500
58000
9 сентября
300
40000
10 сентября
300
27000
11 сентября
400
40000
12 сентября
600
26000
13 сентября (дата начала введения клеточной линии)
300
13000
14 сентября
400
51000
15 сентября
400
33000
16 сентября
400
16000
17 сентября
400
50000
18 сентября
600
30000
19 сентября
1000
23000
20 сентября
1700
18000
21 сентября
1400
57000
22 сентября
6700
41000
23 сентября
3900
45000
26 сентября
3400
121000
27 сентября
4400
117000
28 сентября
3400
142000
29 сентября
3000
164000
2 октября
3000
165000
17 октября
4400
200000
3
3
3
Как показано выше на фиг.4 и в таблице 12, количество лейкоцитов до введения составляло 2000/мм, и оно значительно повысилось через 9 дней после введения. Через 1 месяц введения количества лейкоцитов и тромбоцитов детектировались на нормальных уровнях (нормальный диапазон количества лейкоцитов: 4000-10000/мм; нормальный диапазон тромбоцитов: 141000-316000/мм). Соответственно, можно утверждать, что клеточная линия по настоящему изобретению является эффективной при облегчении симптомов и лечении лейкоза.
3-3: Введение пациенту с острым лимфобластным лейкозом
Пациенту, которому был поставлен диагноз острый лимфобластный лейкоз (г-ну Чхве, 2001 года рождения), перорально вводили по 3 г в день в течение 14 месяцев. Кроме того, для проверки эффекта лечения злокачественного новообразования in vivo измеряли количества лейкоцитов и тромбоцитов до введения и через 1 месяц после введения с помощью автоматического анализатора крови «celldyn3000» (Abbott, Висбаден, Германия) в соответствии с инструкцией производителя.
Таблица 13
Уровни гемоглобина
(нормальное значение)
(13,6~17.4 г/дл)
До введения
3,6 г/дл
После введения
12,8 г/дл
Как показано выше в таблице 13, уровни гемоглобина после введения повысились до нормальных уровней по сравнению с уровнями до введения.
В основе лейкоза лежит пролиферация незрелых клеток без входа в стадию клеточной дифференцировки в связи с прекращением определенных стадий в ходе процесса дифференцировки, и при лейкозе пролиферируют незрелые клетки, обладающие обычным иммунологическим фенотипом (In-sang Chun, Medical postgraduates 33, 2005). Острый лимфобластный лейкоз вызывает снижение уровней нормальных клеток в крови из-за злокачественной пролиферации клеток-предшественников лейкоцитов, незрелых клеток, которые приводят к повторяющейся анемии, геморрагии, инфекциям и т.п. Это также вызывает боль в костях и гипертрофию печени, селезенки и т.п. из-за инвазии органа и приводит к повреждениям органов.
Перед введением уровень гемоглобина пациента составлял всего лишь 3,6 г/дл, что подтверждает, что пациент страдал от острой анемии. Однако после введения клеточной линии по настоящему изобретению измеренные уровни гемоглобина стали ровняться 12,8 г/дл, увеличились до нормальных уровней, что подтверждает, что симптом лейкоза ослаблен. Следовательно, было подтверждено, что введение клеточной линии в соответствии с настоящим изобретением было эффективно при облегчении симптомов лейкоза.
Дополнительно пероральное введение также было объединено с другой противоопухолевой терапией. При этом противоопухолевую терапию осуществляли непрерывно со времени изначального диагностирования лейкоза, что тем самым подтверждает, что противоопухолевая терапия не влияет на результаты до и после введения.
3-4: Введение пациенту с раком легких
(1) Пациентке (г-же Юн, 1939 года рождения), которой 3 июля 2006 года был поставлен диагноз рак легких, перорально вводили по 3 г ежедневно в течение 13 месяцев и лечение не объединяли с другой противоопухолевой терапией. Для наблюдения in vivo активности уничтожения злокачественных клеток в Медицинском центре университета Сеула осуществляли ПЭТ-КТ, до введения и через 13 месяцев после введения, соответственно, и сравнивали результаты ПЭТ-КТ.
В результате, как показано на фиг.5, при сравнении результатов до введения (фиг.5А) и после введения (фиг.5В) было отмечено, что непрозрачность снизилась. Следовательно, было признано, что размер опухоли также уменьшился.
Соответственно, эти экспериментальные результаты подтверждают, что клеточная линия в соответствии с настоящим изобретением обладает эффектом профилактики и лечения посредством активности, убивающей злокачественные клетки.
(2) Дополнительно 62-летнему пациенту с раком легких (г-ну Дж. 1946 года рождения), получавшему противоопухолевую терапию (авастин, Genentech Inc.), вводили клеточную линию в соответствии с настоящим изобретением по 3 г в день в течение 3 месяцев. Для наблюдения активности уничтожения злокачественных клеток с помощью КТ измеряли диаметр опухоли.
В результате было отмечено, что диаметр опухоли уменьшился с 7 см (до введения) до 5,6 см (после введения). Следовательно, эти экспериментальные результаты подтверждают, что клеточная линия в соответствии с настоящим изобретением обладает эффектом профилактики и лечения посредством активности, убивающей злокачественные клетки.
Кроме того, введение авастатина было объединено с пероральным введением. До перорального введения клеточной линии размер опухоли непрерывно увеличивался, несмотря на введение авастатина отдельно, из чего можно сделать вывод, что противоопухолевая терапия не оказывает влияние на результаты до и после введения.
3-5: Введение пациенту с раком прямой кишки
Пациентке (г-же Квон, 1949 года рождения), которой 13 ноября 2007 года был поставлен диагноз рак прямой кишки, перорально вводили по 3 г ежедневно и лечение не объединяли с другой противоопухолевой терапией. Для наблюдения in vivo активности уничтожения злокачественных клеток осуществляли ПЭТ-КТ в госпитале университета Чонбука, до введения и через 49 дней после введения, соответственно, и сравнивали результаты ПЭТ-КТ.
В результате, как показано на фиг.6, при сравнении результатов до введения (фиг.6А) и после введения (фиг.6В) было отмечено, что непрозрачность снизилась. Таким образом, было признано, что злокачественные клетки были убиты.
Соответственно, подтверждается, что клеточная линия в соответствии с настоящим изобретением обладает эффектом профилактики и лечения посредством активности, убивающей злокачественные клетки.
3-6: Введение пациенту с раком желудка
Пациенту (г-ну Ли, 1967 года рождения), которому 5 октября 2007 года был поставлен диагноз рак желудка, перорально вводили по 3 г ежедневно и лечение не объединяли с другой противоопухолевой терапией. Для наблюдения in vivo активности, убивающей злокачественные клетки, размер опухолей измеряли с помощью гастрофиброскопа в госпитале Ульсана, до введения и через 4 месяца введения, соответственно, и сравнивали результаты.
В результате, как показано на фиг.7, размер опухоли был равен 7 см на момент начала введения (фиг.7(а)) и стал 2 см через четыре месяца введения (фиг.7(b)), и, таким образом, размер опухоли резко уменьшился.
Соответственно, подтверждается, что клеточная линия в соответствии с настоящим изобретением обладает эффектом профилактики и лечения посредством активности, убивающей злокачественные клетки.
Экспериментальный пример 4: Наблюдение эффекта профилактики и лечения злокачественного новообразования с помощью полученной из камбия Panax ginseng (2) клеточной линии.
Для наблюдения эффекта профилактики и лечения злокачественного новообразования клеточной линией, полученной из камбия Panax ginseng в соответствии с настоящим изобретением, размельченную клеточную линию, полученную в примере 2-(1), вводили в виде порошка пациенту, у которого было диагностировано злокачественное новообразование. Введение осуществляли перорально по 1 г растворенной в воде формы, 3 раза в день (утром, днем и вечером). При этом было отмечено отсутствие побочного эффекта в течение введения.
Введение было начато 1 июля 2008 года, и через около 1 год, 15 июля 2009 года, была проведена КТ грудной клетки в медицинском центре Dongsan университета Keimyung для наблюдения эффекта профилактики и лечения злокачественного новообразования клеточной линией, полученной из камбия Panax ginseng в соответствии с изобретением. В результате было отмечено, что размер предполагаемой массы в LLL латерального базального сегмента составил 26×20 мм до введения и резко уменьшился до 14×14 мм впоследствии. Кроме того, размер множественных метастатических узлов в обоих легких заметно уменьшился.
Соответственно, было получено подтверждение, что клеточная линия из камбия Рапса ginseng в соответствии с настоящим изобретением уменьшает размер злокачественных опухолей и поэтому клеточная линия является эффективной при профилактике и лечении злокачественного новообразования.
Пример получения 1. Приготовление фармацевтических составов
Состав 1: Приготовление состава в виде таблеток
100 мг экстракта клеточной линии, приготовленного в примере 2, смешивали со 100 мг маисового крахмала, 100 мг лактозы и 2 мг стеарата магния, смесь спрессовывали в таблетки в соответствии с обычным способом таблетирования.
Состав 2: Приготовление состава в виде капсул
500 мг экстракта клеточной линии, полученного в примере 2, вносили в капсулы из мягкого желатина для приготовления состава в виде капсул.
Состав 3: Приготовление состава в виде сиропа
1 г клеточной линии, приготовленной в примере 1, смешивали с 10 мг изомеризованного сахара, 5 г маннита и подходящим количеством очищенной воды и доводили смесь сиропного состава до 100 мл в соответствии с обычным способом.
Состав 4: Приготовление раствора для инъекций
200 мг экстракта клеточной линии, приготовленного в примере 2, нагревали и растворяли в 200 мг физиологического раствора, содержащего полиоксиэтилен-гидрогенированное касторовое масло, таким образом получали раствор для инъекций, содержащий смешанный экстракт в концентрации 0,1%.
Пример приготовления 2. Препарат функционального продукта питания - Препарат функционального напитка
Препарат 1: 200 мг клеточной линии, приготовленной в примере 1, разводили в 96 мл воды, затем добавляли в него в качестве добавки 500 мг витамина С, по 1 г лимонной кислоты и олигосахарида в качестве усилителя вкуса и 0,05 г бензоата натрия в качестве консерванта. Затем к этому добавляли очищенную воду, получив таким образом 100 мл функционального напитка.
Препарат 2: 200 мг клеточной линии, приготовленной в примере 2, разводили в 96 мл воды и затем добавляли в него 500 мг витамина С в качестве добавки, по 1 г лимонной кислоты и олигосахарида в качестве усилителя вкуса и 0,05 г бензоата натрия в качестве консерванта. Затем к этому добавили очищенную воду, приготовив таким образом 100 мл функционального напитка.
Промышленная применимость
Как описано выше, клеточная линия по настоящему изобретению, ее лизат, ее экстракт и ее культуральная среда получены из природного сырья и обладают минимальными побочными эффектами по сравнению с обычными терапевтическими лекарственными средствами, и, таким образом, безопасны для человеческого организма. Также они напрямую оказывают влияние на рост злокачественного новообразования путем эффективной индукции смерти злокачественных клеток и демонстрируют противоопухолевую активность путем ингибирования или уменьшения образования опухоли или роста опухоли. Соответственно, клеточная линия, ее лизат, ее экстракт, и ее культуральная среда полезны при профилактике, лечении и ослаблении симптомов злокачественного новообразования.
Хотя настоящее изобретение описано в деталях со ссылкой на специфические особенности, для специалиста в данной области будет очевидно, что это описание является всего лишь предпочтительным воплощением и не ограничивает сферу применения настоящего изобретения. Таким образом, реальная сфера применения настоящего изобретения будет определяться приложенной формулой изобретения или ее эквивалентами.