СПОСОБ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО ВЫДЕЛЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНА
METHOD FOR CHROMATOGRAPHIC EXTRACTION OF IMMUNOGLOBULIN

Изобретение относится к области выделения и очистки веществ методами хроматографии и может быть использовано для получения высокоочищенного иммуноглобулина.
Для разделения смеси белков используют различные физико-химические и химические методы. Общепринятым способом фракционирования белков плазмы крови человека является метод Кона, предусматривающий использование этанола при низкой температуре от -3 до -5°С. В этих условиях белки сохраняют свои нативные свойства. Для дальнейшего выделения и очистки индивидуальных компонентов из полученных фракций наибольшее распространение в последнее время получил метод хроматографии.
Известен способ очистки иммуноглобулина, содержащегося в белковой фракции плазмы крови, включающий ее растворение в буферном растворе, вирусную сольвент-детергентную инактивацию при комнатной температуре и хроматографическую очистку, при которой надосадочная жидкость, содержащая IgG, подвергается, по меньшей мере, одной операции обработки, например, в два этапа, но при необходимости и нескольким этапам анионообменной и катионообменной хроматографии для удаления значительной доли оставшихся загрязняющих примесей. В предпочтительном варианте осуществления изобретения осветленная и, при необходимости, профильтрованная надосадочная жидкость, содержащая IgG, наносится на анионообменную смолу и затем на катионообменную смолу, которыми заполнены две последовательно установленные колонки, уравновешенные одним и тем же буферным раствором. После промывки колонку с анионитом отключают, а колонку с катионитом, на которой сорбирован иммуноглобулин, элюируют буферным раствором с рН и концентрацией, достаточными для эффективного выделения целевого продукта в градиенте хлорида натрия. Элюированную фракцию с IgG концентрируют и обессоливают с помощью ультрафильтрации и обрабатывают Tween-80 и трибутилфосфатом для разрушения вирусов. Полученный раствор снова пропускают через две последовательно соединенные колонки с анионитом и катеонитом аналогично описанному выше. Колонку с анионитом отсоединяют и элюируют фракцию с IgG в градиенте хлорида натрия. Элюированную фракцию с IgG собирают в мальтозе и подвергают концентрированию (RU 2197500, 27.01.2003).
Недостатками способа являются его сложность, многостадийность и низкий выход целевого продукта (менее 73%). При этом в качестве сырья может быть использована только предварительно очищенная фракция, т.е. осадок В по методу Кона, содержащая около 30% иммуноглобулинов.
Известен способ получения иммуноглобулина, включающий фракционирование этиловым спиртом донорской плазмы с получением осадка В по Кону и очистку выделенного иммуноглобулина, при этом осадок В растворяют в 0,9%-ном растворе натрия хлорида при рН 5,15 и смешивают с 2 М ацетатным буферным раствором и 53%-ным этиловым спиртом, центрифугируют, центрифугат смешивают с гидрокарбонатом натрия при рН раствора 5,5, после центрифугирования центрифугат осветляют, смешивают с ацетатным буферным раствором при рН 5,4, 96%-ным (об./об.) этиловым спиртом и бикарбонатом натрия при рН 7,2, центрифугируют при минус (10-12)°С, выделенный осадок растворяют в 0,05 М ацетатном буферном растворе с рН 5,5, добавляют к нему сольвент-детергентную смесь, содержащую 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, 1 мас.% три-н-бутилфосфата и 1 мас.% полисорбата 80, смесь перемешивают, затем разбавляют 0,05 М ацетатным буферным раствором при рН 5,5, содержащим 1 мас.% октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л, обработанный таким образом иммуноглобулин иммобилизируют и промывают в две стадии на сульфопропилкатионитном сорбенте с помощью колоночной хроматографии с последующей элюцией, ультрафильтрацией и стерилизующей фильтрацией (RU 2372939, 20.11.2009).
Известен также способ инактивации вирусов при получении иммуноглобулина фракции G, который включает очистку раствора иммуноглобулина, выделенного спиртовым фракционированием по методу Кона, обработку сольвент-детергентной смесью, в качестве которой используют 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, содержащий 1 мас.% три-н-бутилфосфата и 1 мас.% полисорбата 80 при перемешивании, с последующим разбавлением 0,05 М ацетатным буферным раствором при рН 5,5, содержащим 1 мас.% октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л, после чего иммуноглобулин иммобилизируют на сульфопропилкатионитном сорбенте и осуществляют промывание в две стадии с помощью колоночной хроматографии с последующей элюцией, причем на первой стадии промывания используют 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, содержащий 1 мас.% октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л (RU 2372939, 20.11.2009).
Однако вышеописанные способы не позволяют осуществить экономичную и эффективную очистку иммуноглобулина из необогащенной фракции - осадка А (по Кону) при обеспечении высокого выхода целевого продукта.
Наиболее близким по технической сущности и достигнутому результату является способ выделения и очистки иммуноглобулина, содержащегося в белковой фракции плазмы крови, включающий ее растворение в буферном растворе, вирусную сольвент-детергентную инактивацию и хроматографическую очистку, осуществляемую путем пропускания раствора через систему из трех последовательно соединенных колонок, заполненных анионитом, гидрофобным сорбентом и катионитом, соответственно, с промывкой системы колонок, элюированием иммуноглобулина с катионита буферным раствором, и направлением на регенерацию анионита и гидрофобного сорбента. Способ обеспечивает достижение высокого выхода и высокой чистоты иммуноглобулина, свободного от вирусов при использовании в качестве исходного сырья обогащенной фракции осадка В, содержащей примерно 30% иммуноглобулина (RU 2332247, 01.07.2007).
Однако способ, выбранный за прототип, не позволяет получить высокоочищенный иммуноглобулин из осадка А (по Кону), содержащего значительные количества других белковых примесей, примеси липидов и лишь около 10% иммуноглобулина. Если же предварительно осадок А перевести в осадок В осаждением органическими растворителями и центрифугированием, то эти операции приведут к 30%-ной потере иммуноглобулина. Например, из 170 л плазмы при фракционировании обычно получают около 9 кг осадка А с содержанием иммуноглобулина 1,4-1,5 кг, из этого количества получают около 3,5 кг осадка В с содержанием иммуноглобулина 1,0-1,1 кг, что соответствует выходу 72-73%. Стадия хроматографии обеспечивает выход на уровне 90%. Таким образом, общий выход иммуноглобулина из осадка А с использование способа-прототипа составит только около 65%.
Задачей настоящего изобретения является разработка высокопроизводительного способа хроматографического выделения высокочистого иммуноглобулина из бедного исходного сырья, каким является, в частности, осадок А, получаемый при фракционировании белков плазмы крови по методу Кона.
Поставленная задача решается описываемым способом хроматографического выделения иммуноглобулина, который предусматривает растворение в буферном растворе белковой фракции плазмы крови, в качестве которой используют осадок А спиртового фракционирования плазмы крови по Кону, осуществление предварительной очистки раствора в двух последовательно соединенных колонках, заполненных гидрофобным сорбентом и анионитом, соответственно, с последующим пропусканием через упомянутые две колонки буферного раствора и сбором предварительно очищенной жидкой фракции, которую затем направляют на вирусную сольвент-детергентную инактивацию и хроматографическую очистку путем пропускания через систему из трех последовательно соединенных колонок, заполненных анионитом, гидрофобным сорбентом и катионитом, соответственно, после чего проводят промывку системы колонок, элюирование иммуноглобулина с катионита буферным раствором, имеющим рН и концентрацию, достаточные для его эффективного выделения, и направление на регенерацию анионита и гидрофобного сорбента.
Предпочтительно, в качестве осадка А используют необогащенную фракцию, содержащую около 10% иммуноглобулина, посторонние белки и липиды.
Предпочтительно, в качестве анионита используют полимерный акриловый сорбент с диэтиламиноэтильными группами, в качестве катионита используют полимерный акриловый сорбент с сульфопропильными группами, а в качестве гидрофобного сорбента используют пористый стиролдивинилбензол с размером пор менее 10 нм.
Вирусную сольвент-детергентную инактивацию, преимущественно, осуществляют в растворе, содержащем твин-80 и трибутилфосфат.
В заявленном способе, преимущественно, используют натрий-ацетатный буферный раствор, при этом все колонки предварительно уравновешены этим раствором.
Предпочтительно, перед элюированием катионит промывают вначале раствором, содержащим 2% твин-80, затем раствором, содержащий 1% твин-80 и 20% этанола, а затем буферным раствором.
Возможно, элюирование иммуноглобулина с катеонита проводить натрий-ацетатным буферным раствором, имеющим рН 5,65 и концентрацию 0,35 М.
Возможно также, элюирование иммуноглобулина с катеонита проводить натрий-ацетатным буферным раствором, имеющим рН 6,0, концентрацию 50 мМ и содержащим 300 мМ хлористого натрия.
Ниже приведены конкретные примеры осуществления изобретения.
Пример 1.
9,2 г осадка А растворяют в 250 мл буфера А (0,02 М натрий-ацетатный буфер, рН 5,65) при перемешивании в течение ночи при температуре +5°С, затем в течение 4 ч при комнатной температуре.
Полученный раствор пропускают последовательно через две соединенные хроматографические колонны: первую - объемом 50 мл (2,5×10,2 мм), заполненную гидрофобным сорбентом на основе стиролдивинилбензола с размером частиц 100-250 мкм, и вторую - объемом 35 мл (2,5×7,1 см), заполненную ДЕАЕ-сорбентом на основе акрилового полимера с диэтиламиноэтильными группами с размером частиц 100-250 мкм. Колонны предварительно уравновешены буфером А. Скорость потока 2 мл/мин. Вслед за раствором иммуноглобулина пропускают буфер А до снижения оптической плотности до уровня базовой линии.
На гидрофобном и ДЕАЕ сорбентах сорбируются пирогены, альбумин, гидрофобные белки, липидная фракция и белковые агрегаты.
Объем предварительно очищенной фракции составляет 450 мл.
К 450 мл полученного раствора иммуноглобулина добавляют твин-80 и трибутилфосфат до концентрации 1% каждого и инкубируют 6 ч при перемешивании при комнатной температуре.
Подготовленный таким образом раствор иммуноглобулина пропускают последовательно через соединенные между собой три колонны. Первая - диаметром 2,5 и длиной 3,0 см - заполнена ДЕАЕ-полимерным сорбентом на основе акрилового полимера с диэтиламиноэтильными группами с размером частиц 100-250 мкм, вторая колонна диаметром 2,5 и длиной 3,0 см заполнена гидрофобным сорбентом на основе стиролдивинилбензола с размером частиц 100-250 мкм, третья колонна заполнена сульфокатионитом на основе акрилового полимера с размером частиц 100-250 мкм и имеет размеры: диаметр 2,5 см, длина 10 см. Все колонны предварительно уравновешены буфером А.
На первой колонне (анионит) происходит удаление пирогенов, ДНК-, РНК-примесей, белковых агрегатов.
На второй колонне (гидрофобный сорбент) происходит удаление пирогенов и связывание трибутилфосфата.
На третьей колонне (катионит) осуществляется сорбция иммуноглобулинов.
После окончания процесса сорбции для промывки через все колонны пропускают 100 мл буфера А. Затем колонки с анионитом и с гидрофобным сорбентом отключают и направляют на регенерацию. Колонку с катионитом промывают в три этапа: на первом этапе пропускают раствор, содержащий 2% твин-80 (300 мл), на втором - раствор, содержащий 1% твин-80 и 20% этанола (350 мл), и на третьем колонку промывают 200 мл буфера А. Затем осуществляют элюирование иммуноглобулина 0,35 М натрий-ацетатным буфером с рН 5,65 (буфер Б). Пропускание растворов при элюировании и сорбции осуществляют со скоростью 2 мл/мин, процессы отмывки и регенерации ведут со скоростью 7 мл/мин.
В результате осуществления способа получено 1,2 г иммуноглобулина (50 мл раствора с концентрацией иммуноглобулина порядка 20 г/л).
Выход - 75%, чистота по ВЭЖХ (гель-фильтрация) - более 97,8%.
Пример 2.
9,0 г осадка А растворяют в 250 мл буфера А (0,02 М натрий-ацетатный буфер, рН 5,75) при перемешивании в течение ночи в при температуре +5°С, затем в течение 4 ч при комнатной температуре.
Полученный раствор пропускают последовательно через две соединенные хроматографические колонны: первую - объемом 50 мл (2,5 х 10,2 мм), заполненную гидрофобным сорбентом на основе стиролдивинилбензола с размером частиц 63-200 мкм, и вторую - объемом 35 мл (2,5×7,1 см), заполненную ДЕАЕ-сорбентом на основе агарозы с диэтиламиноэтильными группами с размером частиц 40-60 мкм. Колонны предварительно уравновешены буфером А. Скорость потока 2 мл/мин. Вслед за раствором иммуноглобулина пропускают буфер А до снижения оптической плотности до уровня базовой линии.
Объем предварительно очищенной фракции составляет 440 мл.
К 440 мл полученного раствора иммуноглобулина добавляют твин-80 и трибутилфосфат до концентрации 1% каждого и инкубируют 6 ч при перемешивании при комнатной температуре.
Подготовленный таким образом раствор иммуноглобулина далее пропускают последовательно через соединенные между собой три колонны. Первая - диаметром 2,5 и длиной 3,0 см заполнена ДЕАЕ-полимерным сорбентом на основе агарозы с диэтиламиноэтильными группами с размером частиц 40-60 мкм, вторая колонна диаметром 2,5 и длиной 3,0 см заполнена гидрофобным сорбентом на основе стиролдивинилбензола с размером частиц 63-200 мкм, третья колонна заполнена сульфокатионитом на основе агарозы с размером частиц 40-60 мкм и имеет размеры: диаметр 2,5 см, длина 10 см. Все колонны предварительно уравновешены буфером А.
После окончания процесса сорбции осуществляют промывку. Для промывки через все колонки пропускают 100 мл буфера А. Затем колонки с анионитом и с гидрофобным сорбентом отключают и подвергают регенерации.
Колонку с катионитом промывают в три этапа: на первом этапе пропускают раствор, содержащий 2% твин-80 (300 мл), на втором - раствор, содержащий 1% твин-80 и 20% этанола (350 мл), а затем колонку промывают 200 мл буфера А.
Элюирование иммуноглобулина осуществляют 50 мМ натрий-ацетатным буфером, рН 6,0, содержащим 300 мМ хлористого натрия (буфер Б).
Пропускание растворов при элюировании и сорбции осуществляют со скоростью 3 мл/мин, процессы отмывки и регенерации ведут со скоростью 7 мл/мин.
В результате получено 1,25 г иммуноглобулина (50 мл раствора с концентрацией иммуноглобулина порядка 20 г/л).
Выход -81%, чистота по ВЭЖХ (гель-фильтрация) - более 98,2%.
Заявленный способ был проведен также с другими анионообменниками и катионообменниками, обладающими достаточной емкостью и соответствующей присутствующим белкам пористой структурой. Наилучшим гидрофобным сорбентом для осуществления способа оказался сорбент с диаметром пор менее 10 нм. В способе были применены также другие не денатурирующие кислотные буферные растворы, однако, предпочтительно, оказалось использовать ацетатный буферный раствор с рН от 5 до 6 и концентрацией 0,01-0,5 М.
Таким образом, сущность настоящего изобретения сводится к использованию в голове процесса соединенных между собой двух колонок с гидрофобным сорбентом и ДЕАЕ-сорбентом, что позволяет очистить жидкую фазу, полученную растворением осадка А (по Кону), от липидных примесей и белковых агрегатов без применения органических растворителей и подготовить полученный раствор для эффективной инактивации. Далее использование для хроматографии системы из трех колонок позволяет получить высокоочищенный продукт без дополнительных рехроматографий. Изобретение позволяет использовать единый буферный раствор в качестве элюента для всех пяти колонок, что существенно упрощает процесс. Технический результат изобретения заключается в возможности выделения иммуноглобулина из бедного (необогащенного) сырья при обеспечении высокого выхода и чистота целевого продукта.