СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ НАНОЧАСТИЦ БИОГЕННЫХ ЭЛЕМЕНТОВ ФЕРМЕНТАМИ
METHOD OF STABILISING NANOPARTICLES OF BIOGENIC ELEMENTS WITH ENZYMES

Изобретение относится к нанохимии, нанотехнологии и биотехнологии, а конкретно, к получению нанокомплексов типа наночастица - фермент, выполняющих роль ферментов, обладающих протеолитической активностью, конформационной устойчивостью при изменении температуры и pH, а также и дополнительными свойствами, в зависимости от специфики наночастицы. Такие нанокомплексы могут найти применение в клинической медицине для разработки методов лечения ран, как транспортные средства для доставки лекарственных препаратов и как средства для иммуноанализа.
БСА
Известно использование в качестве стабилизаторов наночастиц полимеров различного строения и бычьего сывороточного альбумина (БСА) - стабилизатора наночастиц селена (J. Zhang, H. Wang, Y. Bao, L. Zhang, BioF actors 15 (2001) 27-30, Nano red elemental selenium has no size effect in the induction of seleno-enzymes in both cultured cells and mice, Zhang J, Spalholz JE. Toxicity of Selenium Compounds and Nano-Selenium Particles, Handbook of Systems Toxicology. 2010, Chapter 44:787-802). Однако использование полимеров и БСА ограничено. В частности, БСА применим для стабилизации гидрофобных частиц, таких как селеновые. Кроме того, полимеры и БСА, имея достаточно большой молекулярный вес (М=65000) образует большие по размерам нанокомплексы, что является нежелательным фактором.
Известен способ стабилизации наночастиц селена бычьим сывороточным альбумином (Huang В, Zhang J, Hou J, Chen С.Free radical scavenging efficiency of Nano-Se in vitro. Free Radic. Biol. Med. 2003, 35(7), 805-813) согласно которому к 1 ml 25- mM раствора селенита натрия добавлялся, в качестве восстановителя 4 мл 25 mM раствор глутатиона, содержащий 200, 20 и 2 мг БСА для приготовлений маленьких, средних и больших селеновых наночастиц соответственно. При этом pH среды был доведен до 7,2 с помощью 1.0 М гидроокиси натрия. Затем раствор подвергался диализу и лиофилизовался. Данный способ является наиболее близким по сущности и достигаемому результату.
Описанный способ не является универсальным для наночастиц, так как в качестве восстановителя используется глутатион, который восстанавливает селен из селенистой кислоты в нейтральной среде, и этот способ не применим для получения наночастиц металлов. Также необходимо отметить, что этим методом наночастицы были синтезированы с целью использования способности селена связывать свободные радикалы в живых организмах. Это частная задача, и полученный продукт не пригоден для использования в других сферах.
Технической задачей и положительным результатом заявляемого изобретения является разработка способа стабилизации наночастиц биогенных элементов в широком диапазоне pH, результатом которого является получение стабильных молекулярных, устойчивых во времени растворов, пригодных как для дальнейшей переработки, так и готовых к применению в широком диапазоне задач, и не обладающих недостатками заявленного прототипа.
Сущность изобретения заключается в разработке способа синтеза высокоэффективных нанокомплексов на основе наночастиц биогенных элементов (селена и серебра, и тд) и ферментов (химотрипсина). Ферменты стабилизируют наночастицы как металлов, так и неметаллов, стабильны и устойчивы в растворе и соответствуют требованиям, предъявляемым в медицине и бионанотехнологии к подобным производным. Наличие в ферментах как заряженных групп, так и гидрофобных фрагментов делает их универсальными стабилизаторами наночастиц и обеспечивает образование молекулярных растворов любых наночастиц, независимо от используемого восстановителя, поскольку фермент может быть устойчив как в кислой, так и в щелочной области. Совокупность свойств ферментов, применяемых в качестве стабилизаторов, позволяет устранить недостатки как полимерных, так других стабилизаторов.
Указанная задача и результат в изобретении достигается реализацией окислительно-восстановительной реакции с введением стабилизатора - фермента, образующихся наночастиц непосредственно в реакцию. К раствору химотрипсина, концентрация которого может варьироваться от 0,01 до 0,1% добавляют раствор прекурсора - селенистой кислоты 0,013М концентрации или азотнокислого серебра - 1%, 0,01%, 0,001%, растворы перемешивают и выдерживают при комнатной 20°C или пониженной 0°C температуре в течение 30-60 минут. Затем в реакционную колбу вводят восстановитель: аскорбиновую кислоту или боргидрид натрия, растворы перемешивают и оставляют для завершения реакции; реакцию получения наночастиц проводят в присутствии фермента и образующиеся наночастицы биогенных элементов стабилизируются практически в момент образования, при этом можно получать стабилизированные наночастицы биогенных элементов в виде молекулярных устойчивых во времени к осаждению растворов при различных pH среды, различного регулируемого диаметра с выходом 75-97%.
Отличительными признаками предлагаемого способа являются указанные выше; предлагаемый способ стабилизации наночастиц ферментами имеет очевидные преимущества перед прототипом.
Анализ известного уровня техники не позволил найти опубликованные решения, в которых была бы использована вся совокупность существенных признаков заявленного способа. Это свидетельствует о соответствии способа изобретению по условиям патентоспособности как «новизна» и «изобретательский уровень».
В соответствии с предложенным техническим решением можно получать стабилизированные наночастицы биогенных элементов в виде молекулярных устойчивых во времени к осаждению растворов при различных pH среды, различного регулируемого диаметра с выходом 75-97%. Размер нанокомплекса регулируется введением количества восстановителя и pH среды.
При выявлении существенности новизны признаков было получено следующее.
Фермент является хорошим стабилизатором различных по своей природе наночастиц биогенных элементов (металл и неметалл).
Реакция получения наночастиц идет в присутствии фермента и образующиеся наночастицы биогенных элементов стабилизируются (вступают во взаимодействие с ферментом) практически в момент образования.
Изменением концентрации стабилизирующего фермента достигается различная степень устойчивости образующегося нанокомплекса во времени.
Изменяя соотношение наночастица:фермент можно получать нанокомплексы в широком диапазоне pH.
Полученный нанокомплекс позволяет использовать свойства наночастиц (антимикробные, антиоксидантные, противовоспалительные, антиканцерогенные, детоксицирующие) и свойства фермента (протеолитическую активность).
Для доказательства соответствия заявленного решения условию патентоспособности «промышленная применимость» и для лучшего понимания сущности заявленного изобретения приводятся примеры конкретного исполнения.
2
3
6
8
6
Пример 1. Синтез наночастиц селена стабилизированных химотрипсином в соотношении селен:химотрипсин 0,01:0,01 масс %. В плоскодонную колбу на 30 мл помещают 0,5 мл 0,2% раствора XT, прибавляют 7,5 мл дистиллированной воды, затем при перемешивании на магнитной мешалке добавляют 1 мл 0,013М селенистой кислоты (HSeO) и после перемешивания в течение 10 мин добавляют в качестве восстановителя аскорбиновую кислоту (CHO) 1 мл 0,025М. Продолжают перемешивать еще 5 мин и затем оставляют до завершения реакции (24 часа) при комнатной температуре. Полученный молекулярный раствор имеет характерный красновато-оранжевый цвет, pH раствора 3,2. Раствор устойчив до 4 лет.
4
4
4
3
Пример 2. Синтез наночастиц серебра стабилизированных химотрипсином в соотношении серебро:химотрипсин 0,1:0,1. В плоскодонную колбу на 30 мл помещают навеску боргидрида натрия (NaBH) 0,2114 г, помещают колбу в лед и добавляют 10 мл дистиллированной воды. Растворенный NaBH выдерживается во льду 30-40 мин. Одновременно с NaBH в лед помещается колба на 50 мл, в которую вводится 5 мл 0,2% раствора XT и 1 мл 1% раствора азотнокислого серебра (AgNO). Смесь перемешивается круговыми движениями колбы в кристаллизаторе со льдом и остается в нем 30-40 минут. После выравнивания температуры в колбу с XT и азотнокислым серебром вводится 4 мл приготовленного раствора. Начинается бурная реакция, реакционная колба остается во льду в течение 1 часа, а затем помещается в холодильник на 18-24 часа. В результате реакции получается раствор черного цвета, pH которого 10,4. Раствор стабилен от 1 месяца до 1 года.
Данные конкретных примеров синтеза сведены в таблице:
XT
Прекурсор
Условия
Восстановитель
Селен: химотрипсин
0,5 мл
H<sub>2</sub>SeO<sub>3</sub>
Комн. тем.
C<sub>6</sub>H<sub>8</sub>O<sub>6</sub>
0,01:0,01
0,2%
1 мл, 0,013 М
1 мл, 0,025 М
0,5 мл
H<sub>2</sub>SeO<sub>3</sub>
Комн. тем.
C<sub>6</sub>H<sub>8</sub>O<sub>6</sub>
0,02:0,01
0,2%
2 мл
2 мл
0,5 мл
H<sub>2</sub>SeO<sub>3</sub>
Комн. тем.
C<sub>6</sub>H<sub>8</sub>O<sub>6</sub>
0,015:0,01
0,2%
1,5 мл
1,5 мл
5 мл
H<sub>2</sub>SeO<sub>3</sub>
Комн. тем.
C<sub>6</sub>H<sub>8</sub>O<sub>6</sub>
0,01:0,1
0,2%
1 мл
1 мл
5 мл
AgNO<sub>3</sub>
Охлажд.
NaBH<sub>4</sub>
0,1:0,1
0,2%
1 мл 1%
4 мл
5 мл
AgNO<sub>3</sub>
Охлажд.
NaBH<sub>4</sub>
0,01:0,1
0,2%
1 мл 0,1%
0,4 мл
5 мл
AgNO<sub>3</sub>
Охлажд.
NaBH<sub>4</sub>
0,001:0,1
0,2%
1 мл 0,01%
0,04 мл
0,5 мл
AgNO<sub>3</sub>
Охлажд.
NaBH<sub>4</sub>
0,01:0,01
0,2%
1мл 0,1%
4 мл
Таким образом, как раскрыто выше, эффективность способа заключается в том, что осуществляется стабилизации любых наночастиц в широком диапазоне pH, результатом которого является получение стабильных молекулярных, устойчивых во времени растворов, пригодных как для дальнейшей переработки, так и готовых к применению в широком диапазоне задач.