Неспецифическая активация ионных каналов нейронов полисахаридами из Tanacetum vulgare и Oberna behen

Резюме

Изучали мембранотропное действие полисахаридов Tanacetum vulgare L. и Oberna behen (L.) I. Впервые установлено, что растительные полисахариды в концентрациях

0,1-10,0 мкг/мл неизбирательно активируют выходящий калиевый и входящие натриевый и кальциевые ионные токи (слабо дозозависимо и обратимо увеличивают их амплитуду на 5-10%), а также снижают неспецифические токи утечки мембраны, оказывая мембраностабилизирующее действие. Кинетика развития ионных токов под влиянием полисахаридов не изменялась. Вислобоков А.И. и др. Неспецифическая активация ионных каналов нейронов полисахаридами из Tanacetum vulgare и Oberna behen. // Психофармакол. биол. наркол. — 2006. — Т. 6, № 1-2. — С. 1171-1175

Ключевые слова

растительные полисахариды; Tanacetum vulgare L.; каллусная культура смолевки обыкновенной Oberna behen (L.) I.; пектины; арабиногалактан; Lymnaea stagnalis; изолированные нейроны; ионные токи

© 1А.И. ВИСЛОБОКОВ, 2В.И. ПРОШЕВА, 1К.Н. МЕЛЬНИКОВ, 2А.Я. ПОЛЛЕ, 2Е.А. ГЮНТЕР; 2006

1Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова; Льва Толстого ул., 6/8, Санкт-Петербург, 197022 2Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН; Первомайская ул., 50, Сыктывкар, 167982

НЕСПЕЦИФИЧЕСКАЯ АКТИВАЦИЯ ИОННЫХ КАНАЛОВ НЕЙРОНОВ ПОЛИСАХАРИДАМИ ИЗ TANACETUM VULGARE И OBERNA BEHEN

ВВЕДЕНИЕ

Полисахариды входят в состав стенки растительных клеток и являются существенным компонентом пищи животных и человека. В настоящее время для многих полисахаридов растений выявлено многообразное физиологическое действие: иммуномодулирующее, противоопухолевое, гастропротективное, антигипоксическое и антитоксическое [6, 12, 17].

Вместе с тем нет работ, в которых было бы изучено непосредственное влияние полисахаридов на мембрану возбудимых клеток, хотя потенциалоуправляемые ионные каналы и хеморецепторы, встроенные в поверхностные мембраны, обеспечивают генерацию биоэлектрических импульсов в этих клетках и являются мишенью для многих физиологически активных и лекарственных средств [9, 11, 14]. Сведения о мембранотропных свойствах полисахаридов необходимы для понимания механизмов их физиологического и фармакологического действия.

При поиске новых физиологически активных полисахаридов в растениях европейского севера России из соцветий пижмы обыкновенной Tanacetum vulgare L. нами выделен пектиновый полисахарид танацетан (TVF). Установлено, что основными компонентами углеводной цепи TVF являются остатки D-галактуроновой кислоты (61,4 %), L-арабинозы (14,7 %), D-галактозы (10,2 %) и L-рамнозы (3,7 %). Главная углеводная цепь TVF представляет собой линейный а-1,2^-рамно-а-1,4^-галактуронан. Его боковые углеводные цепи представлены ß-1,4-галактопирананом, а-1,5-арабинофурананом и арабиногалактаном [5]. Показано, что данный пектин оказывает ги-полипидемическое действие [13].

Из каллусной культуры смолевки обыкновенной Silene vulgaris выделены полисахариды — кислый арабиногалактан (AG) и силе-нан (SVC) — и дана их общая химическая характеристика [8]. AG содержит остатки галактозы (41,4 %), арабинозы (10,0 %) и уроно-вой кислоты (13,7 %). В состав углеводной цепи SVC входят остатки D-галактуроновой кислоты (80,0 %), а также арабинозы (2,4 %), галактозы (2,9 %) и рамнозы (1,4 %). Установлено, что оба полисахарида из каллуса смолевки являются иммуноактивными, они увеличивают поглотительную способность периферических фагоцитов млекопитающих [16].

Наши данные о влиянии пектинового полисахарида из пижмы на калиевые каналы нейронов опуб-1172 ликованы [3]. В данной работе проведено сравнительное изучение влияния трех полисахаридов, выделенных из пижмы обыкновенной Tanacetum vulgare L. и каллусной культуры смолевки обыкновенной Oberna behen (L.) I. (Silene vulgaris (M.) G.) на ионные каналы мембраны изолированных нервных клеток моллюска Lymnaea stagnalis.

МЕТОДИКА

Опыты проведены на изолированных неиденти-фицированных нейронах брюхоногого моллюска — прудовика обыкновенного (Lymnaea stagnalis) — при комнатной температуре (20—22 °С). Для получения изолированных нейронов из тела животного вырезали окологлоточное кольцо нервных ганглиев, которое подвергали ферментативной обработке, поместив его на 40—60 минут в 0,25 %-ный раствор трипсина на физиологическом растворе для прудовиков. Использовали методику внутриклеточного диализа и фиксации мембранного потенциала [4]. Пер-фузирующий раствор подавали в камеру, где находился нейрон на полиэтиленовой микропипетке, а диализирующий — внутрь этой пипетки. Регистрировали входящие натриевый и кальциевый и выходящие (калиевый быстрый и калиевый медленный) трансмембранные ионные токи. Неспецифические токи (токи утечки) мембраны из регистрирумых ионных токов вычитали автоматически (компенсировали). Разделение ионных токов производили с помощью перфузирующих (внеклеточных) и диализиру-ющих (внутриклеточных) растворов с различным ионным составом и путем поддержания соответствующих мембранных потенциалов.

Пижму обыкновенную заготавливали в период цветения в окрестностях г. Сыктывкара (Республика Коми, Россия). Каллусные культуры смолевки обыкновенной получали как описано ранее [5]. TVF выделяли из соцветий пижмы экстракцией водным раствором оксалата аммония [15]. Выделение AG и SVC проводили так же, как было описано ранее [12].

Полисахариды предварительно растворяли в дистиллированной воде (1 мг в 10 мл), а затем последовательно разбавляли в 10 раз в наружных (перфузирующих) физиологических растворах, создавая их в следующих концентрациях: 0,1; 1,0 и 10,0 мкг/мл. Эффекты от действия полисахаридов развивались быстро и стабилизировались через 2—3 мин, а отмывание проводили 7—10 мин. Исходные величины ионных токов принимали за 100 %, а установившие-

ся при действии полисахаридов выражали в процентах к исходным.

Оценку изменений амплитуды и кинетики ионных токов при действии полисахаридов вели визуально с экрана осциллографа, а также с монитора компьютера с помощью специальных программ и Excel.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica 5.0. Различия между средними значениями (n = 5—6) определяли с использованием t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Полисахариды AG и SVC в диапазоне концентраций от 0,1до 10,0 мкг/мл при внеклеточном приложении увеличивали амплитуду калиевого медленного тока на 4—8 %, а TVF — на 6—12 % (рис. 1). Эффекты были обратимы. После отмывания в контрольном физиологическом растворе в течение 7—10 мин К+-ток восстанавливался до исходных значений. Кинетика развития тока под влиянием изученных полисахаридов практически не изменялась (рис. 2А). Характер активирующего влияния данных полисахаридов на быстрый калиевый ток сходен с влиянием на медленный калиевый ток, то есть наблюдалось незначительное обратимое увеличение амплитуды быстрого тока без изменений его кинетики.

Установлено также, что влияние полисахаридов на входящие натриевый и кальциевый токи было сходным с влиянием на калиевые токи, то есть наблюдалось незначительное обратимое увеличение амплитуды без изменений кинетики (рис. 2Б — кальциевые токи при действии арабиногалактана и рис. ЗА — натриевый ток при действии танацета-на). Пример увеличения максимума вольт-амперной характеристики (ВАХ) для натриевых каналов под влиянием TVF в концентрации 1 мкг/мл показан на рис. ЗБ. При этом максимум ВАХ при действии TVF не смещался по оси потенциалов, что указывает на отсутствие изменений потенциала поверхностного заряда мембраны вблизи натриевых каналов. Эффекты были обратимы, но обращает на себя внимание, что увеличение максимума ВАХ сохранилось и после действия пектина в течение пяти минут.

Неспецифические токи утечки мембраны при действии изученных полисахаридов изменялись двухфазно: в первые 1-2 мин — незначительно увеличивались, а при дальнейшем действии — снижались, что указывает на увеличение стабильности мембраны нервной клетки.

SVC

AG

TVF

1 10 C, мкг/мл

отмывание

Рис. 1

Влияние арабиногалактана (AG), силенана (SVC) и танацетана (TVF) в различных концентрациях на выходящие калиевые медленные токи изолированных нейронов прудовика:

По оси абсцисс — I/I0, % — отношение амплитуды калиевого тока I при действии полисахарида к его исходной величине I0 (в контроле), по оси ординат — концентрация; вертикальные линии — доверительные интервалы при p = 95 %, N = 5-6

!Са, na

Увеличение амплитуды калиевого (А) и кальциевого (Б) токов нейронов под влиянием арабиногалактана (AG) в концентрации 10 мкг/мл:

А — влияние на быстрый и медленный калиевые ионные токи: 1 — контроль, 2 — АО, 3 — отмывание, поддерживаемый потенциал -100 тУ, тестирующий 30 тУ; Б — влияние на кальциевый ионный ток: 1 — контроль,

2 — АО, 3 — отмывание, поддерживаемый потенциал -100 тУ, тестирующий 10 тУ

Таким образом, в данной работе нами впервые показана активация ионных токов нейрональной элек-тровозбудимой мембраны полисахаридами из пижмы обыкновенной T. vulgare и каллусной культуры смолевки обыкновенной O. behen. Обнаружено, что в концентрациях 0,1 — 10,0 мкг/мл TVF, AG и SVC быстро, обратимо и слабо дозозависимо увеличивают выходящие калиевые и входящие натриевый и кальциевый ионные токи через потенциал-управля-емые ионные каналы нейронов прудовика. Показано, что кинетика развития ионных токов при действии полисахаридов остается практически неизменной, что указывает на отсутствие взаимодействия данных веществ с воротными механизмами ионных каналов. Обратимость эффектов изученных растительных полисахаридов свидетельствует о непрочном их связывании со структурными элементами мембраны.

Б

INa, na

-60

-40

-20

20 40

Рис. 3

Изменения натриевых токов нейронов под влиянием пектинового полисахарида TVF в концентрации 1 мкг/мл:

А — увеличение амплитуды натриевого тока,

1 — контроль, 2 — TVF,

поддерживаемый потенциал -100 mV, тестирующий 0 mV; Б — увеличение максимума вольт-амперной характеристики натриевого тока (INa) и отсутствие смещения ее максимума, 1 — контроль, 2 — TVF,

3 — отмывание, V — тестирующий потенциал; поддерживаемый потенциал -100 mV

0

Б

Необходимо обратить внимание на изменения неспецифических мембранных токов утечки (неспе-1174 цифической проводимости), отражающих количество ионных пор, через которые происходит свободная диффузия ионов, что можно рассматривать в качестве показателя стабильности мембраны. Известно, что сохранение концентрационных градиентов цитоплазма—наружная среда обеспечивается активной транспортной функцией всех клеточных мембран, поддерживающих необходимую скорость метаболических процессов в каждом участке клетки, ограниченном замкнутыми мембранами.

Фармакологическое вещество может адсорбироваться на ферментах, в частности, на фосфолипазах и снизить конформационную подвижность макромолекул, в результате чего может нарушаться активный и пассивный транспорт ионов. Изменения кон-формационной активности макромолекул мембраны зависит от концентрации фармакологического агента. В случае малых доз конформационная активность молекул может быть повышена, а в случае больших — может наблюдаться повреждающее действие. В наших экспериментах под влиянием полисахаридов наблюдалось сначала незначительное увеличение неспецифических токов утечки мембраны нервной клетки, а затем — их уменьшение, что указывает на мембраностабилизирующее действие полисахаридов.

Следует отметить, что наблюдаемое в наших экспериментах увеличение примерно в равной степени калиевых и натриевых токов при действии мембраноактивных ТУР, АО и БУС свидетельствует о неспецифичности (неизбирательности) их влияния на ионные каналы. Можно предположить, что это связано с каким-то единым мембранным механизмом действия, возможно, — с активацией процессов фосфорилирования клеточных белков, регулирующих проницаемость мембран и единообразным изменением функционирования этих ионных каналов.

В литературе имеются данные о том, что физиологически активные растительные полисахариды вызывают экспрессию рецепторов у иммунокомпетент-ных клеток [17], что чрезвычайно важно для внутриклеточной сигнализации. Важно отметить, что оба соединения, полученные из каллуса смолевки, обладают также иммуномодулирующим действием [16]. Можно предположить, что и у нервных клеток могут быть рецепторы, которые опосредуют «узнавание» их мембранами углеводсодержащих полимеров, оказывающих на них активирующее влияние.

Как известно, межклеточное пространство имеет гелеобразное строение [11], поэтому, по нашему

мнению, физиологические и фармакологические эффекты пектинов, склонных к гелеобразованию и, возможно, модифицирующих клеточное микроокружение, методически целесообразно изучать как на клеточных, так и на клеточно-тканевых экспериментальных моделях. В предыдущих работах [2, 18] мы изучали действие фармакологических средств разных групп на нейроны моллюсков и показали, что эти нейроны являются удобным и информативным модельным объектом, а использованная методика внутриклеточного диализа и фиксации потенциала адекватна задачам исследования мембранотропно-го влияния физиологически активных веществ.

В мембранотропном действии различных веществ можно найти отличительные особенности [1], которые определяются спецификой строения их молекул и взаимодействия со структурами мембраны (связь структура—активность). Электрофизиологические эффекты у всех трех полисахаридов сходны, но можно отметить наибольшую мембранную активность пектина из пижмы. Возможно, это обусловлено тем, что в макромолекуле TVF разветвленная область, являющаяся физиологически активной у пектинов, занимает большую ее часть. Общеизвестно, что пектины, в отличие от арабиногалактанов, образуют вязкие водные растворы. Неожиданным оказалось то, что слабокислый арабиногалактан AG и пектиновый полисахарид SVC, которые отличаются по вязкости, в наших экспериментах вызвали практически одинаковые эффекты. Имеющиеся в литературе данные указывают на то, что важным фактором проявления физиологической активности пектинов является наличие в их боковых цепях арабиногалактана [б]. Можно предположить, что обнаруженная нами нейротропная и мембраностабилизирующая активность изученных полисахаридов непосредственно связана с фрагментом арабиногалактана, поскольку именно он является их общим структурным элементом. Вероятно, в дальнейшем целесообразно провести химическую модификацию исследованных полисахаридов, чтобы изучить физиологическую активность их различных фрагментов.

Следовательно, обнаруженные нами эффекты могут лежать в основе активации или модуляции многих клеточных функций полисахаридами. Это еще раз указывает на возможность осуществления растительными полисахаридами роли регуляторов физиологических процессов. В связи с этим, особый интерес представляет комплексное изучение эффектов полисахаридов растений на клеточные элементы нервной, иммунной и эндокринной систем, которые, как известно, осуществляют контроль над регуляторными процессами в животном организме.

Работа выполнена при частичной поддержке гранта № НШ-1260.2003.4.

ЛИТЕРАТУРА

1. Вислобоков А.И., Игнатов Ю.Д. Цитофармакологи-

ческое исследование механизмов действия мемб-ранотропных средств. // Обз. клин. фармакол. лек. тер. — 2003. — Т. 2, № 1. — С. 14-22.

2. Вислобоков А.И., Мельников К.Н., Марышева В.В.,

Шабанов П.Д. Мембранотропные эффекты антиги-поксантов с тиомочевинной группировкой. // Психо-фармакол. биол. наркол. — 2003. — Т. 3, № 1-2. — С. 522-525.

3. Вислобоков А.И., Прошева В.И., Полле А.Я. Активи-

рующее влияние пектинового полисахарида из пижмы обыкновенной Tanacetum vulgare L. на ионные каналы нейрональной мембраны. // Бюл. экс-перим. биол. и мед. — 2004. — Т. 138, № 10. — С. 439-441.

4. Костюк П.Г., Крышталь О.А. Механизмы электричес-

кой возбудимости нервной клетки. — М.: Наука, 1981. — 204 с.

5. Мишарина Е.А., Оводова Р.Г., Бушнева О.А., Оводов

Ю.С. Каллусообразование Silene vulgaris (Moench) Garcke in vitro. // Раст. ресурсы. — 1999. — Т. 35. — С. 88-95.

6. Оводов Ю.С. Полисахариды цветковых растений:

структура и физиологическая активность. // Биоорган. химия. — 1998. — Т. 24, № 7. — С. 483-501.

7. Полле А.Я., Гюнтер Е.А., Попов С.В., Оводова Р.Г.

Полисахариды пижмы обыкновенной Tanacetum vulgare L. // Химия и технология растительных веществ: Тез. докл. Всерос. конф. — Сыктывкар,

2000. — С. 121.

8. Полле А.Я., Оводова Р.Г., Шашков А.С., Оводов Ю.С.

Выделение и общая характеристика полисахаридов из пижмы обыкновенной. // Биоорган. химия. —

2001. — Т. 27, № 1. — С. 52-56.

9. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л. Рецепторы физио-

логически активных веществ. — М.: Медицина, 1987. — 400 с.

10. Хасина Э.И., Сгребнева М.Н., Оводова Р.Г., Голов-ченко В.В., Оводов Ю.С. Гастропротективное действие лемнана — пектинового полисахарида, выделенного из ряски малой Lemna minor L. // ДАН. — 2003. — Т. 390, № 3. — С. 413-415.

11. Ямсков И.А., Ямскова В.П. Фармакологические препараты нового поколения на основе гликопротеинов клеточного микроокружения. // Рос. хим. журн. — 1998. — Т. 17, № 3. — С. 85-90.

12. Gunter E.A., Ovodov Yu.S. Changes in cell wall polysaccharides of Silene vulgaris callus during culture. // Phytochemistry. — 2002. — Vol. 59. — P. 703-708.

13. Hille B. Ion channels of excitable membranes: Third Edition. — University of Washington, 2001. — 722 p.

14. Pellegrini-Giampietro D.E., Moroni F. Voltage-sensitive ion channels: modulation by neurotransmitters and drugs. — Press: Springer Verlag, 1988.

15. Polle A. Ya., Ovodova R.G., Shashkov A.S., Ovodov Yu.

S. Some structural features of pectic polysaccharide from tansy Tanacetum vulgare L. // Carbohydrate Polymers. — 2002. — Vol. 49. — P. 337-344.

16. Popov S.V., Popova G.Yu., Ovodova R.G., Bushne-va O.A., Ovodov Yu.S. Effects of polysaccharides from Silene vulgaris on phagocytes. // Int. J. Immuno-pharmacol. — 1999. — Vol. 21. — P. 617-624.

17. Shin K.S., Kiyohara H., Matsumoto T., Yamada H. Rhamnogalacturonan II from leaves of Panax ginseng C.A.Meyer as a macrophage Fc receptor expression-enhancing polysaccharide. // Carbohydr. Res. — 1997. — Vol. 300. — P. 239-249.

18. Vislobokov A.I., Mantsev V.V., Kuzmin A.V. Cocaine, amphetamine and cathinone, but not nomifensine and pargyline increase calcium inward current in internally perfused neurons. // Life Sci. — 1993. — Vol. 52, I. 23. — P. 261-265.

Vislobokov A.I., Prosheva V.I., Melnikov K.N., Polle A.Ya., Gunter E.A. Nonspecific activation of neuron ionic channels with polysaccharides from Tanacetum vulgare and Oberna behen. // Psychopharmacol. Biol. Narcol. — 2006. — Vol. 6, N 1-2. — P. 1171-1175. I.P. Pavlov State Medical University; 6/8, Lev Tolstoy str., Saint-Peters-burg,197022; Institute of Physiology, Komi Sci. Center, Urals Branch RAMS; 50, Pervomayskaya str., Syktyvkar, 167982

Summary: We have investigated the membranetropic effects of polysaccharides from tansy Tanacetum vulgare L. and from the callus of campion Oberna behen (L.)I. in isolated neurons of the snail Lymnaea stagnalis using voltage-clamp technique. The studied polysaccharides (applied from outside in 0,1-10,0 mg/ml range concentration) was shown for the first time to activate non-selectively outward potassium, inward sodium and calcium ionic currents (they increase currents amplitude by 5-10 % in a weakly concentration-dependent manner and reversibly) and reduce nonspecific membrane leakage currents. The kinetics of currents under the influence of polysaccharides was not changed.

Key words: plant polysaccharides; Tanacetum vulgare L.; callus of campion Oberna behen (L.)I.; pectins; arabinoga-lactan; Lymnaea stagnalis; isolated neurons; ionic currents

электронная копия статьи — http://www.elibrary.ru, © Архив