Особенности кристаллизации оксалата кальция в присутствии валина и лизина

ХИМИЯ

Вестн. Ом. ун-та. 2013. № 2. С. 112-117.

УДК 544.774.4.548.5

О.А. Голованова, В.В. Корольков, Ю.О. Пунин, А.С. Высоцкий

ОСОБЕННОСТИ КРИСТАЛЛИЗАЦИИ ОКСАЛАТА КАЛЬЦИЯ В ПРИСУТСТВИИ ВАЛИНА И ЛИЗИНА*

На основе экспериментального материала рассмотрен комплекс проблем, связанных с особенностями кристаллизации оксалата кальция в присутствии аминокислот. Изучено действие двух аминокислот, противоположным образом влияющих на кристаллизацию, - промотора DL-валина и ингибитора L-лизина. Исследовано влияние концентрации добавок данных аминокислот на рост кристаллов. Определены кинетические параметры кристаллизации. Показано, что с увеличением концентрации лизина константа скорости роста уменьшается, а с увеличением концентрации валина - увеличивается.

Ключевые слова: моногидрат оксалата кальция, рост, адсорбция, аминокислоты, ингибирование, кристаллизация, валин, лизин.

Введение

На сегодняшний день все более ощутимой и реальной угрозой для человека становится проблема камнеобразования. Согласно официальной статистике, каждый десятый человек на планете может пострадать от таких заболеваний [1-5]. В качестве факторов, способствующих образованию камней, некоторые исследователи выделяют наследственность, образ жизни человека, в особенности рацион питания, негативную экологическую обстановку в крупных городах и др. Однако причины и механизмы образования в организме камней различного состава остаются не до конца изученными. Получается, что камнеобразование - это проблема глобального масштаба, к которой нельзя относиться без должного внимания.

Известно, что патогенные органоминеральные агрегаты (ОМА) имеют сложный и неоднородный состав [3-6]. Наиболее распространенными минералами патогенных ОМА являются оксалаты кальция - уевеллит СаС204  Н20 и уедделлит СаС204  2Н20 [4-8]. Эти соединения - наиболее частые компоненты камней мочеполовой системы [2-7]. Кроме того, оксалаты кальция могут входить в состав зубных и желчных камней, камней слюнных желез. Они также обнаружены в минеральных отложениях в легких, сосудах, селезенке, в предстательной и поджелудочной железах, в мышцах и суставах [8].

Установлено, что образование ОМА любых составов, и в частности оксалатных агрегатов, протекает в неравновесных условиях; за их образование отвечают кинетические факторы, что доказано термодинамическими расчетами и модельными экспериментами [4]. В существенной степени патогенное фазообразование определяется органическими компонентами физиологических жидкостей [9]. Особенно важная роль здесь принадлежит аминокислотам, содержание которых достигает 70 % от органического вещества почечных камней [10-15].

К настоящему времени опубликовано значительное количество работ по кристаллизации уевеллита и уеделлита в сложных по составу физиологических растворах, в том числе и в присутствии аминокислот [16-22]. Несмотря на это имеющиеся данные о влиянии аминокислот на нуклеа-цию и рост кристаллов оксалатов кальция весьма противоречивы и их явно недостаточно для понимания закономерностей камнеобразования в организме человека. Очевидна необходимость дальнейшего изучения это-

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (№ 12-03-98011-р_сибирь_а).

© О.А. Голованова, В.В. Корольков, Ю.О. Пунин, А.С. Высоцкий, 2013

го вопроса как с медицинской точки зрения для предупреждения образования оксалат-ных биоминералов в организме человека, так и в плане разработки фундаментальной проблемы биоминерализации.

Ранее нами были проведены исследования фазообразования и кристаллизации в растворах оксалата кальция, содержащих как неорганические, так и органические добавки [18; 21-24]. В частности, в работах [23; 24] изучалось воздействие широкого набора аминокислот, входящих в состав почечных камней, на процесс нуклеации и роста кристаллов уевеллита. Установлено, что присутствие аминокислот оказывает различное действие на процессы роста кристаллов оксалата кальция. Так, наиболее сильным ингибирующим эффектом обладают глутаминовая кислота, лизин, аргинин и глицин. Ярко выраженным промотирующим действием обладают пролин, валин, серин и аспарагин. Остальные аминокислоты влияют на кинетику кристаллизации одноводного оксалата кальция незначительно.

Целью данной работы является сравнительное исследование кинетики роста кристаллов уевеллита в присутствии аминокислот, оказывающих противоположное влияние на кристаллизацию - валина (промотор) и лизина (ингибитор) [24].

Лизин и валин являются незаменимыми аминокислотами для организма человека, они входят в состав практически любых белков. Валин необходим для метаболизма в мышцах, восстановления поврежденных тканей и для поддержания нормального обмена азота в организме, он оказывает стимулирующее действие и может быть использован мышцами в качестве источника энергии. Физиологическая роль лизина - участие в процессах роста, восстановления тканей, производстве антител, гормонов, ферментов, альбуминов.

Различное действие валина и лизина на кристаллизацию уевеллита, очевидно, связано с различным химическим строением и свойствами этих аминокислот (табл. 1). Валин проявляет амфотерные свойства, тогда как лизин обладает ярко выраженными основными свойствами, что обусловлено наличием в молекуле еще одной МН2-группы. Анализ значений констант ионизации и изо-электрической точки показывает, что лизин при значениях pH, термодинамически оптимальных для образования одноводного оксалата кальция (pH = 5,0-7,0) [4], находится в растворе в виде положительно заряженного иона, а валин - в виде нейтральных молекул (цвиттер-ионов). Как следствие, данные аминокислоты должны по-разному адсорбироваться на кристаллах моногидрата оксалата кальция.

Таблица 1 Аминокислоты, используемые в качестве примесей, и их характеристики [25]

Аминокислота DL-Валин Y H,„V O L-Лизин „Г^”2 ».»V" O

Изоэлектрическая точка pi 5,96 9,74

pKa 2,27 9,52 2.15 9.16 10,67

Экспериментальная часть

Процесс кристаллизации оксалата кальция изучался при температуре 37 °С и пересыщении растворов у = C0/Cs = 7 (Со - концентрация оксалата кальция в пересыщенном растворе; Cs - растворимость оксалата кальция, равная 0,5-10-4 моль/л). Выбор данного значения пересыщения обоснован наличием такового в биологических средах, а именно в моче здорового взрослого среднестатистического человека [2].

Пересыщение по оксалату кальция создавалось за счёт химической реакции Ca2 + + C2O42- ^ CaC2O4, которая реализовывалась при смешении исходных растворов стехиометрического состава легкорастворимых соединений - хлорида кальция и окса-лата аммония. В качестве растворителя использовалась бидистиллированная вода. Для приготовления исходных растворов использовались соли квалификации ч.д.а. Ввиду того что хлорид кальция в процессе хранения способен гидратироваться, перед экспериментом проводилась стандартизация его раствора, которая осуществлялась ком-плексонометрическим титрованием трило-ном [26].

Исходные растворы смешивались в эквивалентных объемах. Готовый раствор сливали в коническую колбу и перемешивали в течение 5-10 секунд. Кристаллизация проводилась in vitro с добавками аминокислот - DL-валина и L-лизина - в концентрации 0,002, 0,004 и 0,008 моль/л, что соответствует их содержанию в физиологическом растворе. Примеси аминокислот вводились в раствор хлорида кальция перед смешением исходных растворов.

Кинетику кристаллизации изучали по изменению концентрации раствора в ходе осаждения оксалата кальция. Концентрация определялась кондуктометрическим методом, путем измерения удельной электропроводности раствора в ячейке Кольрауша и автоматического умножения результатов на постоянную ячейки. Использовался кондуктометр Анион-4154, диапазон измеряемых величин удельной электропроводности (УЭ) раствора - от 0,001 до 100 мСм/см. Преде-

лы допускаемых значений основной погрешности при измерении удельной электропроводности растворов - ±2,0 % (но не менее 0 мкСм/см), погрешность автоматической температурной компенсации при измерении УЭ - не более ±2,5 %. Постоянная датчика К - (1/см) 1 ± 0,2. Эксперименты проводили в диапазоне концентраций с линейной зависимостью УЭ от концентрации (рис. 1).

da

dr

a/3 = k\ct - cs )n

Рис. 1. Зависимость УЭ растворов от исходной концентрации оксалата кальция

Расчет кинетических параметров процесса кристаллизации проводился по алгоритму, подробно описанному в работах [21; 24]. По кондуктометрическим данным вычисляли степень полноты протекания процесса кристаллизации в зависимости от времени:

a =

C - C

C - C

^0 ^s

где С0 - начальная концентрация оксалата кальция в пересыщенном растворе; С -концентрация оксалата кальция в момент времени т; Cs - растворимость оксалата кальция.

Для определения кинетических параметров роста кристаллов оксалата кальция по зависимости a = f (т) рассчитывали скорость осаждения как функцию текущего абсолютного пересыщения (CT - Cs) по формуле (2):

а kA •

dr

где A - суммарная площадь поверхности осадка, k - константа скорости реакции, n -порядок реакции. Оценка общей площади поверхности для постоянной формы частиц дается выражением:

A = в NT -V^,

где в - фактор формы, NT - общее число частиц, VT - объем осадка к моменту времени т. Учитывая, что a = VT/Vmax , а Vmax - максимальный объем осадка при полном сбросе пересыщения, то после преобразований получим формулу для расчета кинетических характеристик процесса кристаллизации оксалата кальция (считая постоянным количество частиц NT = N = const):

где к' включает в себя все константы (Утах,

в, N и к) и постоянно для данных начальных условий. При логарифмировании получим:

!е

Построение зависимости в координатах 1g(ёа/ёт)-2/3^а = /(^(С -Сз)) должно дать

прямую линию, причем отрезок, отсекаемый прямой на оси ординат, является ^ к', а тангенс угла наклона этой прямой соответствует порядку скорости роста п.

Результаты и их обсуждение

Примеры полученных кинетических кривых приведены на рис. 2, 3. На рис. 2 хорошо видно различие в кинетических эффектах, вызываемых исследуемыми аминокислотами: валин является промотором, а лизин - ингибитором кристаллизации уевел-лита. Рис. 3 показывает, что в обоих случаях эффект усиливается с возрастанием концентрации примеси в растворе.

Из рисунков видно - степень превращения монотонно увеличивается со временем, причем процесс постепенно замедляется, что вызвано сбросом пересыщения и, соответственно, уменьшением движущей силы в ходе кристаллизации. Необычным является прекращение процесса кристаллизации уже при небольших значениях а, соответствующих весьма высоким пересыщениям. При этом остаточное пересыщение растет с увеличением начального пересыщения, что сразу отвергает связь этого явления с механизмом 2^-зарождения. Не может оно быть связано и с агрегацией кристаллов, поскольку за время эксперимента размер кристаллов увеличивается не более чем в 3 раза [21] и в такой же пропорции падает суммарная площадь поверхности кристаллов. Причины высоких остаточных пересыщений не ясны и требуют отдельного изучения.

0,3

0,2

0,1

0,0

♦♦

♦

♦♦

♦

к*, а*

• •

А А

0 1000 2000 3000 4000 т, с

Рис. 2. Кинетические кривые кристаллизации оксалата кальция в присутствии аминокислот (С = 0,004 моль/л): • - без добавок;  - 1_-лизин; ♦ - 01_-валин

a

0,1

0,0

......................................................

#

1000 2000 3000 4000 т,с

а б

Рис. 3. Влияние концентрации аминокислот на кинетические кривые кристаллизации оксалата кальция (♦ - 0,002; • - 0,004;  - 0,008 моль/л): а) 01_-валин; б) 1_-лизин

1§

1§ (Ст- с,) б

Рис. 4. Определение кинетических параметров кристаллизации оксалата кальция в присутствии аминокислот (С = 0,008 моль/л): а) 01_-валин; б) 1_-лизин

а

а

0,3

0,2

Полученные кинетические данные были обработаны с помощью описанного выше алгоритма. Зависимости, построенные в координатах ^ (а/ёт) - 2/3^ а = / ((Ст - С)) ,

представлены кривыми, на которых можно выделить несколько линейных участков с разными наклонами (рис. 4). Участок А соответствует увеличению общего числа частиц за счет образования зародышей кристаллизации, участок В - росту образовавшихся частиц без увеличения их общего количества, участок С отвечает вторичным процессам - уменьшению общего числа образующихся частиц за счет растворения мелких и роста более крупных кристаллов, а также агрегации частиц [21]. Для изучения закономерностей роста кристаллов интерес представляет участок В, поэтому в дальнейшем именно он используется для расчета основных кинетических характеристик кристаллизации оксалата кальция.

Определенные в результате обработки экспериментальных данных константы ^ К и п приведены в табл. 2.

Таблица 2

Влияние концентрации аминокислот на кинетические характеристики кристаллизации оксалата кальция

Концентрация, моль/л йЬВалин ЬПизин

С = 0,002 9,5 31,3 8,1 25,3

С = 0,004 10,2 34,1 7,5 23,6

С = 0,008 10,4 34,5 7,4 23,0

Высокие значения показателя п мы связываем с ростом кристаллов по механизму двумерного зарождения [24]. Величина константы скорости отражает влияние примесей аминокислот на кристаллизацию уэве-лита. Данные табл. 2 показывают, что с увеличением концентрации Ь-лизина константа скорости уменьшается. Аминокислота, адсорбируясь на растущей грани кристалла, препятствует ее росту, при этом увеличение концентрации добавки аминокислоты приводит к блокировке большего количества активных центров, что способствует дальнейшему замедлению роста кристалла. Од-

нако при концентрации более 0,004 моль/л уменьшение менее значительное, чем в диапазоне концентраций от 0,002 до 0,004 моль/л. По нашему мнению, в данном диапазоне концентраций происходит полное покрытие аминокислотой поверхности растущего кристалла, и дальнейшее повышение концентрации примеси не приводит к существенному снижению константы скорости кристаллизации. Такое поведение соответствует адсорбции по изотерме Лэнгмюра.

Значительное ингибирующее влияние лизина и высокую адсорбционную способность можно объяснить химическим строением аминокислоты на основе правила Дюкло - Траубе. Так, согласно данному правилу коллоидные ПАВ проявляют высокую адсорбционную активность, которая зависит главным образом от длины углеводородного радикала. Увеличение его длины на одну группу -СН2- приводит к возрастанию поверхностной активности приблизительно в два раза [27].

При добавлении ОЬ-валина наблюдается иная картина: с увеличением концентрации аминокислоты константа скорости возрастает (но тоже с замедлением). Промотирующий эффект валина и его усиление с увеличением концентрации примеси можно объяснить созданием на поверхности кристаллов адсорбирующейся аминокислотой добавочных центров двумерного зарождения, что подробно рассмотрено нами в [24].

Оба эффекта - и промотирование кристаллизации валином, и ингибирование лизином - существенно ослабляются при больших пересыщениях у > 15. Это вполне совместимо с адсорбционным механизмом действия аминокислот. С одной стороны, увеличение пересыщения всегда снижает примесное торможение роста кристаллов. С другой стороны, возрастание интенсивности двумерного зарождения при больших пересыщениях естественно снижает вклад добавочных адсорбционных центров зарождения.

В результате проведенного исследования кинетики кристаллизации одноводного оксалата кальция в присутствии добавок ОЬ-валина и Ь-лизина в концентрациях, близких к физиологическим, получены следующие результаты:

- ОЬ-валин оказывает промотирующее действие на кинетику кристаллизации уевеллита; с увеличением концентрации ОЬ-валина константа скорости роста увеличивается;

- эффект промотирования может быть объяснен увеличением на поверхности растущего кристалла центров двумерного зарождения;

- Ь-лизин ингибирует кристаллизацию уе-веллита; с увеличением концентрации Ь-ли-зина константа скорости уменьшается;

- наибольшее влияние аминокислот проявляется в диапазоне концентраций от

0,002 до 0,004 моль/л, при дальнейшем увеличении концентраций оба эффекта ослабляются; это может быть связано с адсорбцией аминокислоты по изотерме Лэнгмюра и полным покрытием поверхности растущего кристалла при больших концентрациях примесей;

- воздействие исследованных аминокислот на кинетику кристаллизации уевел-лита существенно уменьшается при больших пересыщениях.

ЛИТЕРАТУРА

[1] Ларина Т. А., Кузнецова Т. А., Королева Л. Ю. Факторы риска мочекаменной болезни у детей Орловской области // Ученые записки Орловского государственного университета. Научные труды научно-исследовательского центра педагогики и психологии. Т. 7. Орел, 2006. С. 135-138.

[2] Тиктинский О. Л., Александров В. П. Мочекаменная болезнь. СПб. : Питер, 2000. 384 с.

[3] Кораго А. А. Введение в биоминералогию. М. : Недра, 1992. 280 с.

[4] Голованова О. А. Патогенные минералы в организме человека. Омск, 2007. 395 с.

[5] Севостьянова О. А, Полиенко А. К. Минеральный состав уролитов // Известия Томского политехнического университета. 2004. Т. 307. № 2. С. 62-64.

[6] Козловский Ю. Г. О минералогической классификации мочевых камней // Урология и нефрология. 1973. № 2. С. 24-26.

[7] Пальчик Н. А, Мороз Т. Н., Максимова Н. В., Дарьин А. В. Минеральный и микроэлемент-ный состав мочевых камней // Неорганическая химия. 2006. Т. 51. № 7. С. 1177-1184.

[8] Поспехова Г. П., Шайлиева Л. О., Федосеева Г. Б., Петрова М. А. Хроническая обструктивная болезнь лёгких с респираторным окса-лозом // Врачу общей практики. 2001. № 1. С. 174-190.

[9] Изатулина А. Р., Голованова О. А, Пунин Ю. О., Войтенко Н. Н., Дроздов В. А. Изучение факторов, влияющих на кристаллизацию одноводного оксалата кальция // Вестн. Ом. унта. 2006. № 3. С. 45-47.

[10] Рашкович Л. Н., Петрова Е. В. Кристаллизация оксалата кальция // Химия и жизнь. 2006. № 1. С. 158-168.

[11] Grases F., March J.G., Bibiloni F., Amat E. The crystallization of calcium oxalate in the presence of aminoacids // Cryst. Growth. 1988. V. 87. P. 299-304.

[12] Голованова О. А., Борбат В. Ф. Почечные камни. М. : Медицинская книга, 2005. 172 с.

[13] Walter-Levy L., Laniepce J. Sur la termolise des hydratesde oxalate de calcium // Cryst. Growth. 1994. V. 54. № 3. P. 165-179.

[14] ^кол Э. В., Нигматуллина Е. Н., Максимова Н. В. Сферолиты оксалата кальция в почечных камнях: морфология и условия образования // Химия в интересах устойчивого развития. 2003. № 11. С. 547-558.

[15] Зузук Ф. В. Мшералопя уролтв : автореф. дис. ... д-ра геол. наук. Л., 2005. 52 с.

[16] Каткова В. И., Симаков А. Ф. Роль аминокислот в генезисе биоминеральных образований //

Сыктывкарский минералогический сборник. 1998. № 27. С. 58-66.

[17] Голованова О. А., Пятанова П. А, Россее-ва Е. В. Анализ закономерностей распределения белковой составляющей мочевых камней // Доклады Академии наук. 2004. Т. 395. № 5. С. 1-3.

[18] Голованова О. А, Россеева Е. В., Франк-Каменецкая О. В. Аминокислотный состав камней мочевой системы человека // Вестник СПбГУ. 2006. Сер. 4. Вып. 2. С. 123-127.

[19] Ozgurtas T., Yakut G., Gulec M., Serdar M., Kut-luay T. Role of urinary zinc and copper on calcium oxalate stone formation // Urol Int. 2004. V. 72(3). P. 233-236.

[20] Shad Muhammad Aslam, Ansari Tariq Mahmood, Afzal Uzma, Kauser Samina, Rafique Muhammad and Khan Misbahul Islam. Major constituents, free amino acids and metal levels in renal calculi from Multan Region // OnLine Journal of Biological Sciences. 2001. V. 1. № 11. P. 1063-1065.

[21] Голованова О. А., Ачкасова Е. Ю., Пунин Ю. О., Желяев Е. В. Основные закономерности кристаллизации оксалата кальция в присутствии аминокислот // Кристаллография. 2006. Т. 51. № 2. С. 376-382.

[22] Голованова О. А., Пунин Ю. О., Изатулина А. Р. Кристаллизация оксалата кальция в присутствии органических и неорганических добавок // Кинетика и механизм кристаллизации. Нанокристаллизация. Биокристаллизация : тезисы докладов IV Международной научной конференции. Иваново, 2006. С. 48.

[23] Голованова О. А, Пунин Ю. О., Высоцкий А. С., Ханнанов В. Р. Влияние неорганических и органических примесей на нуклеацию одноводного оксалата кальция // Химия в интересах устойчивого развития. 2011. № 19. С. 501-508.

[24] Голованова О. А., Корольков В. В., Пунин Ю. О., Высоцкий А. С. Влияние аминокислот на кинетику кристаллизации одноводного оксалата кальция // Химия в интересах устойчивого развития. 2013 (в печати).

[25] David R. Lide, ed. CRC Handbook of Chemistry and Physics. CRC Press, 2010.

[26] Васильев В. П. Аналитическая химия. Гравиметрический и титриметрический методы анализа. М. : Высш. шк., 1989. Ч. 1. 320 с.

[27] Фролов Ю. Г. Курс коллоидной химии. М. : Химия, 1982. С. 98-106.