Строение пектиновых полисахаридов солерастворимой фракции подсолнечника

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН _2015, том 58, №4_

ФИЗИЧЕСКАЯ ХИМИЯ

УДК 541.127 :543.429.23

А.С.Джонмуродов, Х.И.Тешаев, Ш.Ё.Холов, С.Р.Усманова, З.К.Мухидинов,

Г.Д.Страхан*, Л.Ш.Лиу*

СТРОЕНИЕ ПЕКТИНОВЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ СОЛЕРАСТВОРИМОЙ

ФРАКЦИИ ПОДСОЛНЕЧНИКА

Институт химии им.В.И.Никитина АН Республики Таджикистан, Восточный региональный научно-исследовательский центр Госдепартамента США по сельскому хозяйству

В работе обсуждаются особенности структурного анализа солерастворимых фракций пектиновых полисахаридов (ПП) подсолнечника с использованием 'Н 13С и двумерной gHSQC ЯМР спектроскопиии. Определено процентное содержание функциональных групп во фракциях ПП. Наличие нескольких форм метильных групп, найденных в ЯМР-спектрах, показывает влияние их окружения, что говорит о присутствии 4 вариантов структуры, где карбоксильные группы в пектине окружены различными соседями. Спектры gHSQC также показали наличие большого количества ано-мерных атомов в макромолекуле ПП, что подтверждает присутствии нескольких вариантов структуры пектина в изученных фракциях.

Ключевые слова: пектиновые полисахариды - структура - 'И, 13 С, ЯМР -спектроскопия - двумерная gHSQC ЯМР-спектроскопия.

Пектиновые полисахариды - самые сложные по структуре и формированию полимеров клеточной стенки (КС) растения, включающие различные полимерные цепи из гомогалактуронана (HG), рамногалактуронана 1 (RG I), рамногалактуронана 2 (RG II), арабиногалактана (AG), арабинана (AR) и ряда других полисахаридов, связанных между собой и с другими полимерами клеточных стенок растений [2]. Карбоксильные группы у галактуроновых кислот (ГК) в цепи пектиновых полисахаридов (ПП) находятся в этерифицированном и свободном состояниях. Кроме того, в КС многих растений встречаются неразветвлённые, неэтерифицированные блоки ПП, которые образуют агрегаты посредством ионов кальция [3] и при экстракции из КС они выделяются из раствора гидролизата в виде микрогеля (МГ).

Кроме студнеобразующих, сорбционных и стабилизирующих свойств, которые нашли широкое использование в пищевой промышленности другие их полезные свойства, такие как эмульгирующие, гелеобразующие и токсиносвязывающие, находят применение в фармацевтической промышленности и медицине [4].

ПП могут быть последовательно и избирательно выделены из КС различными реагентами [3,5,6]. В настоящей работе ПП последовательно были экстрагированы из корзинок подсолнечника с

Адрес для корреспонденции: Мухидинов Зайниддин Камарович. 734063, Республика Таджикистан, г. Душанбе, ул. Айни, 299/2, Институт химии АН РТ. E-mail: zainy@mail.ru

помощью соли, воды и кислоты с целью избирательного структурного исследования с использованием :Н, 13С и двумерного gHSQC ЯМР-спектроскопии.

Экспериментальная часть Фракции пектина получали методом последовательной экстракции, как описано в работе [7]. Измельчённые корзинки подсолнечника подвергали последовательному гидролизу-экстракции с использованием растворов NaCl, водой и HCl при соотношении сырьё: раствор - 1:10, температуре 60 и 85°С и получили соответственно IIII F1, IIII F2 и IIII F3. Полученные фракции IIII последовательно очищались спиртовым осаждением и диаультрафильтрацией (ДУФ). Фракции IIII F1 и IIII F3 были разделены еще на две субфракции.

ЯМР-спектры были сняты на приборе 14 Tesla Agilent VNMRS NMR spectrometer (Santa Clara, CA, США). Спектры 1H и 13C регистрировались при 400С в растворе Д2О в системе с 5 мм ампулы, помещённой в пульсирующее поле направленной в оси-z, в качестве эталонного соединения для отсчёта химического сдвига использовали натриевую соль 3-(триметилсилил)-пропионовой кислоты (ТСЦ) для обоих ядер. Спектры 1H были сняты при частоте 600 МГц, диапазон измерения химического сдвига 12 м.д., ширина пульсации импульсов 450 и время задержки релаксации 4 сек. Спектры 13C записывались при частоте 150 МГц со шкалой диапазона до 250 м.д., время задержки релаксации 1 сек., в режиме накопления 50000-80000 повторности (сканированием).

Двумерные эксперименты градиентной версии гетероядерные протон-углеродные корреляционные спектры (gHSQC ЯМР) с высоким разрешением проводились с использованием адиабатической пульсации. Спектры получены в диапазоне химических сдвигов 12 м.д. для 1H и 200 м.д. для 13С с применением 4092 точек при прямом измерении и еще 400 дополнительно во втором измерении, производилось 64 сканирования и задержки релаксации между запусками составили 2 сек.

Результаты исследования и их обсуждение Содержание галактуроновой кислоты, степени этерификации (СЭ) карбоксильных групп и молекулярный вес (Mw) фракции пектинов подсолнечника были определены методами, которые описаны в предыдущей работе [7]. Для обсуждения в табл. 1 приведены физико-химические свойства пектиновых фракций, полученных солевым раствором [7].

Таблица 1

Физико-химические свойства пектиновых солерастворимых фракций, полученных из корзинок подсолнечника

Фракции III1 Выход фракции ГО, % ГК, СЭ, % МГ,

ГО ГО ОС % %

F1 (NaCl) нижняя часть 3.58 7.37 14.2 75.5 49.5 10.2

F1 (NaCl) верхняя часть 2.74 65.4 39.2 12.0

Спектры 13С и gHSQC были сняты для пяти фракций 1111 подсолнечника. В данной работе мы обсуждаем спектры ЯМР и строение только солерастворимой фракции ПП. На рис. 1а приведены 1Н и 13С ЯМР-спектры нижней части фракции Б1. В спектрах 1Н протонов метильных групп обнаружены сигналы между 1 ~ 1.4 м.д., в то время протоны ацетильных групп проявились при 1.5 ~ 2.5 м.д. Интегрируя интенсивность сигнала в этих областях и сравнивая с оставшимися протонами сахарных

остатков, можно определить процентное содержание этих групп во фракциях 1111. Например, для фракции, представленной на рис. 1б, интегрированная сумма сигналов протонов, кроме метильных и ацетильных групп составляет 1000, а относительная интенсивность метильных и ацетильных групп, равно 37,44 и 28,77 соответственно. Так как эти группы имеют по 3 протона, а остальные протоны в сахарных остатках пектина представлены метиновыми группами (СН), то при расчётах необходимо учитывать вклад интенсивности протонов других присутствующих сахарных остатков.

LlaS&i-B

Simple Нэпе:

LlnSbu-3 Data Collected out

Agl le л t - КМ&- vzLnr ni BO Ircblve directory:

/bcoB/toit/Tonrsys/data Sasple directory I

LlnSlm-3_2013112BJ>l FldPllOj ГВОГОН 01

Pulls Sequence: JBOTOX I»2pul) Solvent I d2o

Data collected oc. Nov 23 2013

Ealax. delay 2.ООО sac Tulsa 45.0 decrees

tlM 2.251 sec lfltt 7183.9 El S12 repetltlccs OaSCEVE EL, 599.7 BIT* PBDCESEIMC FT SlIS 32768 Total tlxe 4« olo

m

'—1—I 3

-1—'—r~

2

-1-1-1-I

0 ppm

Рис. 1а. Спектры ЯМР 1Н фракции ПП (нижняя фракция).

Рис. 1б. Спектры ЯМР С фракции ПП (верхняя фракция).

I I I

Другой важной информацией, вытекающей из спектров ЯМР, является наличие разнообразия количества метильных групп во фракциях, показывающих влияние их окружения. В этом плане для анализа принимаются во внимание только интенсивные пики, затем полученный результат сравнивается с количеством пиков в двумерных спектрах gHSQC. При сравнении ЯМР-спектров :Н с диаграммами gHSQC эксперимента для данной фракции видно появление 4-х резонансов для метильных и 3 резонанса для ацетильных групп одинаково в обеих фракциях, что говорит о присутствии 4 вариантов структуры, где карбоксильные группы в пектине окружены различными группами.

Спектры gHSQC дают ясную картину наличия аномерных резонансов в макромолекуле 1111. Для солерастворимых фракции 1111 подсолнечника этим методом обнаружены по 10 аномерных пиков для верхней и нижней частей. Из этих моносахаридных единиц две структуры могут быть одинаковыми. Следовательно, в данной фракции можно с уверенностью констатировать присутствие как минимум 5 моносахаридных остатков. Однако для идентификации каждой единицы необходимо дополнительная информация, которую можно получить из совместного анализа спектров ЯМР 13г ГЖХ-масс спектрометрией продуктов гидролиза этих остатков.

Наличие разнообразия в положении карбоксильных групп 1111 в изученных солерастворимых фракциях доказывается резонанс между 170 ~ 185 м.д. в ЯМР спектрах 13С. В ЯМР 13С спектрах нижней части обнаружены сигналы для карбоксильных групп при 173.7, 176.4, 176.7 и 183.5 м.д., а для верхней части фракции пектинов эти сигналы проявляются при 170.5, 172.9, 173.6 и 181.0 (табл.2.) Учитывая, что эти фракции отличаются по СЭ и Mw, можно предположить, что отличие в химических сдвигах для карбоксильных групп скорее являются следствием конформационно изменённого аналога макромолекул 1111, имеющих низкую СЭ.

Анализ распределения углеродных атомов по различным типам в области углеродных резонансов 103-99 м.д. (аномерные атомы углеводов) и 8171 м.д. (СНО- и СН2О-фрагменты) спектра ЯМР 13С солерастворимой фракции ПП подсолнечника показывает, что данная фракция пектина содержит значительное количество углеводных фрагментов (рис. 2).

Результаты количественного анализа изученных фракций пектинов методом ЯМР 1Н и 13С и gHSQC представлены в виде процентного содержания метильных, ацетильных и карбоксильных групп. В табл. 2 дается анализ содержания функциональных групп найденных из отношения qx=Ix/Iобщ.

a

m

~~1 '—  • I

anomeric

п 1рра1

Рис. 2. Спектры верхней фракции 1111 подсолнечника.

Таблица 2

Анализ содержания функциональных групп

Фракция ПП Метильные группы, % Количество сигналов метильных групп * Ацетильные группы, % Количество сигналов ацетильных групп* Резонансы карбоксильных групп Количество ано-мерных атомов

F1 (NaCl) нижняя часть 1.17 4 0.90 3 173.7 176.4 176.7 183.5 10

F1 (NaCl) верхняя часть 0.91 4 0.91 3 170.5 172.9 173.6 181.0 10

* Из-за отношения сигналов к шуму, количество резонансов даётся в приблизительных цифрах, для того чтобы оценить относительное количество углеводных остатков во фракциях пектиновых полисахаридов.

Таким образом, из анализа ЯМР :H, 13C и gHSQC спектров солерастворимой фракции IIII становится ясно, что данная фракция представляет гетерополимер, образованный минимум из пяти сахарных остатков, в основе которых лежат цепи галактуроновых кислот, карбоксильные группы, которые этерифицированы метильными и ацетильными группами.

Выводы

С помощью количественного анализа ЯМР спектров определено процентное содержание этих групп во фракциях IIII. Наличие разнообразия в количестве метильных групп найденных из ЯМР спектров изученных фракций, показывают влияние их окружения, появление 4 резонансов для метильных и 3 резонанса для ацетильных групп одинаково в обеих фракциях, что говорит о присутствии 4 вариантов структуры, где карбоксильные группы в пектине окружены различными группами. Спектры gHSQC показали наличие аномерных резонансов в макромолекуле данных фракций IIII. Для солерастворимых IIII подсолнечника этим методом обнаружено по 10 аномерных пиков для верхней и нижней частей фракции.

Работа выполнена в рамках проекта Международного научно-технического центра Т-1419 при финансовой поддержке Госдепартамента США по сельскому хозяйству.

Поступило 11.02.2015 г.

ЛИТЕРАТУРА

1. O'Neil M.A., & York W.S. In J. K. C. Rose (Ed.). - The plant cell wall. Annual Plant Reviews. Oxford: Blackwell Publishing Ltd., 2003, v. 8, рр.1-54.

2. Jarvis M.C. Structure and properties of pectin gels in plant cell walls Plant, Cell & Environment, 1984, v.7 (3), pр. 153-164.

3. Round A.N., Rigby N.M., MacDougall A.J., Ring S.G. & Morris V.J. Investigating the nature of branching in pectin by atomic force microscopy andcarbohydrate analysis. - Carbohydrate Research, 2001, v. 331, рр. 337-342.

4. Бобокалонов Д.Т., Мухидинов З.К., Исупов С.Д., Комилова Г.И. !рименение пектинов в медицине и фармации. - Вестник Академии медицинских наук Таджикистана, 2013, №4 (08), с. 39-52.

5. Muhidinov Z.K., Teshaev Kh., Dzhonmurodov A., Khalikov D. and Fishman M. Physico-chemical characterization of pectic polysaccharides from various sources obtained by steam assisted flash extraction (SAFE). - Macromolecular Symposia. 2012, v. 317-318, issue 1, pp. 142-148.

6. Патент РТ TJ 563; Тадж. НЛИЦентр. Бюлл. №86, 2013. Флеш способ экстракции пектина из растительного сырья. / Мухидинов З.К., Тешаев Х.И., Джонмуродов А.С., Лиу Л.С.

7. Джонмуродов А.С., Тешаев Х.И., Холов Ш.Ё.и др. Физико-химические и гидродинамические свойства пектиновых полисахаридов подсолнечника. - ДАН РТ, 2015, т.58, № 3, с.

А.С.Чрнмуродов, Х.И.Тешаев, Ш.Ё.Холов, С.Р.Усманова, З.^.Мухидинов,

Г.Д.Страхан*, Л.Ш.Лиу*

СОХТИ ПЕКТИЩОИ ПОЛИСАХАРИДИИ ДАР НАМАК ^АЛШАВАНДАИ

ОФТОБПАРАСТ

Институти кимиёи ба номи В.И.Никитини Академияи илмх;ои ЦумхурииТоцикистон, *Маркази тадцицотии Шарции Департаменти давлатии ИМА оид ба кишоварзи

Дар мак;ола тарзи тадк;ик;и сохти як к;исми дар намак хдлшавандаи пектинх,ои полисахаридии офтобпарастро бо усули чадиди спектроскопияи РМХ, Щ, 13С ва дученакаи gHSQC омухта шудааст. Микдори фоизии гурухдои метилй ва ацетилй бо ин усул муайян карда шудааст.

Калима^ои калиди: полисахаридцои пектини - сохт - спектроскопияи 'Н, '3С РМХ, -спектроскопияи gHSQC РМХ-и дученака.

A.S.Dzhonmurodov, Kh.I.Teshaev, Sh.E.Kholov, S.R.Usmanova, Z.K.Muhidinоv,

G.D.Strahan*, L.S.Liu*

STRUCTURE OF PECTIC POLYSACCHARIDES FROM SUNFLOWER SALT

SOLUBLE FRACTION

V.I.Nikitin Institute of Chemistry, Academy of Sciences of the Republic of Tajikistan, *Eastern Regional Research Center ARS USDA, USA The manuscript discusses analysis of the structural features of pectin polysaccharides (PP) salt-soluble fractions obtained from sunflower by :H, 13C and two-dimensional gHSQC NMR spectroscopy. Using :H, 13C NMR spectra the percentage content of functional groups in the fractions PP were determined. The diversity number of methyl groups found in NMR spectra of the two fractions, show the presence of the four structure varieties, where the carboxyl groups in the PP are surrounded by various groups. gHSQC spectra showed the presence of a large number of anomeric carbon in the sunflower PP macromolecules of studied fraction.

Key words: pectic polysaccharides - structure - 1H, 13C NMR spectroscopy - two-dimensional gHSQC NMR spectroscopy.