ГЕНЫ ПШЕНИЦЫ Triticum kiharae, КОДИРУЮЩИЕ АНТИМИКРОБНЫЕ ПЕПТИДЫ
WHEAT GENES Triticum kiharae, CODING ANTIMICROBIAL PEPTIDES

Изобретение относится к области биотехнологии растений, конкретно к защитным генам растений, кодирующим антимикробные пептиды (AMP), и может быть использовано для создания сельскохозяйственных культур, устойчивых к патогенам.
Потери урожая, вызванные патогенами растений (грибами, бактериями, вирусами, вироидами) и насекомыми-вредителями, могут достигать 45% [Oerke E.C., Dehne H.W., Schönbeck F., Weber A. Crop Production and Crop Protection: Estimated Losses in Major Food and Cash Crops. - 1994.- Elsevier, Amsterdam]. Другим негативным аспектом воздействия патогенов является снижение качества продукции. Например, присутствие микотоксинов Fusarium sp. в зерне делает его токсичным для человека и животных. В связи со стремительным ростом населения Земли проблема повышения урожайности сельскохозяйственных культур становится особенно актуальной. В настоящее время для решения этой задачи применяют: ротационное земледелие, традиционную селекцию, направленную на получение устойчивых форм, и химические средства защиты растений. Традиционные методы селекции не всегда эффективны из-за их длительности и отсутствия в ряде случаев источников устойчивости. Использование средств химической защиты растений является дорогостоящим и представляет угрозу экологической безопасности.
Альтернативой повышения устойчивости сельскохозяйственных культур к патогенам и насекомым-вредителям, а также к другим стрессовым факторам окружающей среды абиотической природы (засухе, засоленности почвы и пр.) служит генетическая инженерия, которая позволяет встраивать чужеродные гены, обусловливающие устойчивость, в геномы культурных растений.
Применение методов генной инженерии для трансформации растений открывает новые возможности создания культур, обладающих широкой устойчивостью к патогенам, вредителям, а также абиотическому стрессу (засухе, засоленности почвы и др.). Работы по получению резистентных сортов сельскохозяйственных культур с использованием технологий рекомбинантных ДНК были выполнены около 20 лет назад [Andrews R.E., Faust R.M., Wabiko H., Raymond K.C., Bulla L.A. The biotechnology of Bacillus thuringiensis. // Crit. Rev. Biotech. - 1987. - Vol.6. - P.163-232. Vaeck M., Reynaerts A., Höfne H., Jansens S., De Beuckeleer M., Dean C., Zabeau M., Van Montagu M., Leemans J. Transgenic plants protected from insect attack. // Nature - 1987. - Vol.328. - P.33-37]. С использованием гена инсектицидного белка бактерии Bacillus thuringiensis были получены трансгенные растения табака, устойчивые по отношению к паразитическим личинкам бабочки Manducta sexta. С тех пор, по крайней мере, 10 генов энтомотоксинов из Bacillus thuringiensis были перенесены и экспрессированы как минимум в 26 видах растений, приобретших устойчивость к некоторым насекомым-вредителям [Schuler Т.Н., Poppy G.M., Kerry B.R., Denholm I. Insect-resistant transgenic plants. // Trends Biotech. - 1998. - Vol.16. - P.168-175]. Значительная часть мирового урожая приходится сегодня на долю Bt-трансформированных продуктов (сайт Департамента сельского хозяйства США: www.aphis.usda.gov). Тем не менее, до сих пор не решен вопрос о безопасности Bt-содержащих продуктов для человека, а также об их влиянии на окружающую среду [Vazquez-Padron R.I., Moreno-Fierros L., Neri-Bazan L., Martinez-Gil A.F., de-la-Riva G.A., Lopez-Revilla R. Characterization of the mucosal and systemic immune response induced by Cry1Ac protein from Bacillus thuringiensis HD 73 in mice. // Braz J Med Biol Res. - 2000. - Vol.33. - P.147-155. Yu H.L., Li Y.H., Wu K.M. Risk assessment and ecological effects of transgenic Bacillus thuringiensis crops on non-target organisms. // J Integr Plant Biol. - 2011. - Vol.53. - P.520-538]. В то время как с использованием методов генетической инженерии удалось достичь существенных успехов в создании сортов, устойчивых к насекомым-вредителям, на рынке до сих пор не представлены культуры, устойчивые к грибным и бактериальным заболеваниям.
В настоящее время для повышения устойчивости сельскохозяйственных культур более перспективным считается подход, направленный на усиление защитного потенциала самих растений, как за счет активации экспрессии собственных защитных генов, так и за счет встраивания генов защитных соединений из других видов растений, в частности дикорастущих, которые, в отличие от культурных растений, более устойчивы к патогенным микроорганизмам. Наибольший интерес в этом направлении представляют гены антимикробных пептидов. Антимикробные пептиды обладают широким спектром антимикробного действия, не вызывают появления устойчивых форм, и их гены могут быть непосредственно встроены в геном чувствительных к патогенам растений.
Известна наиболее близкая к заявленной нуклеотидная последовательность АК333848.1 из мягкой пшеницы Triticum aestivum [Kawaura К., Mochida К., Enju A., Totoki Y., Toyoda A., Sakaki Y., Kai C., Kawai J., Hayashizaki Y., Seki M., Shinozaki K., Ogihara Y. Assessment of adaptive evolution between wheat and rice as deduced from full-length common wheat cDNA sequence data and expression patterns. // BMC Genomics. - 2009. - Vol.10. - P.271]. Продукт, кодируемый данной последовательностью, неизвестен, и его биологическая активность не установлена, что исключает возможность использования данной последовательности для трансформации растений с целью повышения их устойчивости к патогенам.
Изобретение решает задачу расширения ассортимента защитных генов растений для использования в биотехнологии при создании новых форм растений, устойчивых к факторам внешней среды, с помощью методов генной инженерии.
Поставленная задача решается с помощью гена пшеницы Triticum kiharae, обладающего нуклеотидной последовательностью SEQ ID №1, кодирующей антимикробные пептиды, названные Tk-AMP, в том числе антимикробные пептиды ТК-AMP-L-2-2 и TK-AMP-S-2-5, проявляющие антифунгальную активность в тестах in vitro против Bipolaris sorokiniana, Fusarium graminearum и Fusarium oxysporum в микромолярных концентрациях (Таблице 1). Это означает, что их гены можно использовать для повышения устойчивости растений к патогенам с использованием методов генетической инженерии.
Таблица 1
Антифунгальные свойства пептидов TK-AMP-L-2-2 и TK-AMP-S-2-5, кодируемых нуклеотидной последовательностью Tk-AMP и выделенных из Triticum kiharae Dorof. et Migusch
Гриб
IC<sub>50</sub>, мкM*
TK-AMP-L-2-2
TK-AMP-S-2-5
Bipolaris sorokiniana
15,5
14,5
Fusarium graminearum
6,5
7,0
Fusarium oxysporum
8,5
8,0
*IC<sub>50</sub> соответствует концентрации пептида, при которой достигается 50%-ное ингибирование спор гриба.
Нуклеотидная последовательность Tk-AMP (SEQ ID №1) соответствует кодирующей части кДНК (мРНК), полученной из незрелых семян пшеницы Кихара Triticum kiharae Dorof. et Migusch. Пшеница Кихара относится к семейству злаки (мятликовые) Gramineae (Poaceae), классу однодольные (лилиопсиды) Monocotyledones (Liliopsida), отделу покрытосеменные (цветковые) Magnoliophyta (Angiospermae).
Нуклеотидная последовательность Tk-AMP кодирует белки-предшественники защитных пептидов TK-AMP-L-2-2 и TK-AMP-S-2-5 длиной 247-362 аминокислотных остатков, состоящие из N-концевого сигнального пептида длиной 25 аминокислотных остатков; пяти, шести или семи пептидных доменов длиной 27-44 остатков, разделенных сайтами специфического протеолиза; С-концевого продомена длиной 15-25 остатков.
Техническим результатом изобретения является кодирование нескольких (от пяти до семи) защитных пептидов одним геном.
Изобретение иллюстрируют следующие примеры.
Пример 1
Установление структуры кДНК пшеницы Кихара Triticum kiharae, кодирующей новые антимикробные пептиды TK-AMP-L-2-2 и TK-AMP-S-2-5. Аминокислотная последовательность пептидов TK-AMP-L-2-2 и TK-AMP-S-2-5:
TK-AMP-L-2-2:
GlyAspSerPheAspSerCysValSerGlnCysArgGlyHisGlyGlyTrpTrpGlyLysGluArgTrpAspArgCysArgArgIleCysArgGlnSerGlnGlu;
TK-AMP-S-2-5:
HisHisGlyGlySerSerCysGluGlnLysCysGlnGlnArgTyrArgHisGluTyrGluLysGluGlnCysValArgAspCysLysSerGlyGlyHisGlyGlyAlaGlyGlyArgGlyArgGlu.
Тотальную РНК выделяют из семян в стадии молочной спелости с помощью набора реагентов Trizol RNA Prep 100 (Изоген, Россия) в соответствии с протоколом фирмы-производителя. 2 мкг тотальной РНК используют в качестве матрицы для синтеза кДНК с помощью набора Mint (Евроген, Россия).
Определение структуры кДНК проводят в несколько этапов: определение 3'-концевой части кДНК, определение 5'-концевой части кДНК, получение кодирующей части гена. Для этой цели на основе известных аминокислотных последовательностей пептидов TK-AMP-L-2-2 и TK-AMP-S-2-5 сконструированы и синтезированы праймеры. Для TK-AMP-L-2-2 - это праймеры Dir1-1 и Dir1-2; для TK-AMP-S-2-5 - праймеры Dir2-1 и Dir2-2 (Таблица 2).
3'-концевую область кДНК амплифицируют с помощью «вложенной» ПЦР, для первого раунда используют универсальный праймер Т7Сар и специфические праймеры Dir1-1 и Dir2-1, для второго раунда - универсальный праймер Т7Сар и специфические праймеры Dir1-2 и Dir2-2. Амплифицированные фрагменты клонируют и секвенируют на автоматическом секвенаторе.
На основе установленных нуклеотидных последовательностей фрагментов кДНК сконструированы и синтезированы праймеры для амплификации 5'-областей кДНК Tk-АМР: Rev1 и Rev2 (Таблица 2). 5'-фрагменты кДНК амплифицируют с использованием универсального праймера Т7Сар и специфичных праймеров Rev1 и Rev2.
Для получения кодирующей области кДНК сконструированы и синтезированы два праймера: 5e3 и 5r (Таблица 2), использование которых для ПЦР на матрице кДНК позволяет полностью амплифицировать кодирующую часть генов. Полученные фрагменты клонируют и секвенируют, в результате чего получают нуклеотидные последовательности SEQ ID №2 (Tk-AMP-L1), SEQ ID №3 (Tk-AMP-L2), SEQ ID №4 (Tk-AMP-M1), SEQ ID №5 (Tk-AMP-S1), SEQ ID №6 (Tk-AMP-S2), SEQ ID №7 (Tk-AMP-S3), SEQ ID №8 (Tk-AMP-S4).
Последовательности Tk-AMP-L1, Tk-AMP-L2, Tk-AMP-M1, Tk-AMP-S1, Tk-AMP-S2, Tk-AMP-S3 и Tk-AMP-S4 являются гомологичными (66% гомологии) и могут быть объединены общей формулой SEQ ID №1.
Пример 2
Анализ продуктов защитных генов пшеницы Кихара Triticum kiharae Установленные нуклеотидные последовательности (SEQ ID №2, SEQ ID №3, SEQ ID №4, SEQ ID №5, SEQ ID №6, SEQ ID №7, SEQ ID №8) кодируют гомологичные (68% гомологии) белки-предшественники (препробелки) Tk-AMP-L1 (SEQ ID №9), Tk-AMP-L2 (SEQ ID №10), Tk-AMP-M1 (SEQ ID №11), Tk-AMP-S1 (SEQ ID №12), Tk-AMP-S2 (SEQ ID №13), Tk-AMP-S3 (SEQ ID №14), и Tk-AMP-S4 (SEQ ID №15), соответственно.
Нуклеотидная последовательность SEQ ID №2 кодидует белок-предшественник Tk-AMP-L1 (SEQ ID №9), который содержит следующие составные части: N-концевой сигнальный пептид (25 остатков), спейсерную последовательность (8 остатков), зрелые пептиды TK-AMP-L1-1, TK-AMP-L1-2, TK-AMP-L1-3, TK-AMP-L1-4, TK-AMP-L1-5, ТК-AMP-L1-6, TK-AMP-L1-7 (27-44 остатка), разделенные короткими (0-11 остатков) спейсерными последовательностями, С-концевую пропоследовательность (25 остатков). Последовательности зрелых пептидов представлены в Таблице 3.
Нуклеотидная последовательность SEQ ID №3 кодидует белок-предшественник Tk-AMP-L2 (SEQ ID №10), который содержит следующие составные части: N-концевой сигнальный пептид (25 остатков), спейсерную последовательность (12 остатков), зрелые пептиды TK-AMP-L2-1, TK-AMP-L2-2, TK-AMP-L2-3, TK-AMP-L2-4, TK-AMP-L2-5, ТК-AMP-L2-6, TK-AMP-L2-7 (28-43 остатка), разделенные короткими (6-13 остатков) спейсерными последовательностями, С-концевую пропоследовательность (25 остатков). Последовательности зрелых пептидов представлены в Таблице 3.
Нуклеотидная последовательность SEQ ID №4 кодидует белок-предшественник Tk-AMP-M1 (SEQ ID №11), который содержит следующие составные части: N-концевой сигнальный пептид (25 остатков), спейсерную последовательность (12 остатков), зрелые пептиды ТК-АМР-М1-1, ТК-АМР-М1-2, ТК-АМР-М1-3, ТК-АМР-М1-4, ТК-АМР-М1-5, ТК-АМР-М1-6 (28-43 остатка), разделенные короткими (6-13 остатков) спейсерными последовательностями, С-концевую пропоследовательность (25 остатков). Последовательности зрелых пептидов представлены в Таблице 3.
Нуклеотидная последовательность SEQ ID №5 кодидует белок-предшественник Tk-AMP-S1 (SEQ ID №12), который содержит следующие составные части: N-концевой сигнальный пептид (25 остатков), спейсерную последовательность (12 остатков), зрелые пептиды TK-AMP-S1-1, TK-AMP-S1-2, TK-AMP-S1-3, TK-AMP-S1-4, TK-AMP-S1-5 (28-43 остатка), разделенные короткими (6-11 остатков) спейсерными последовательностями, С-концевую пропоследовательность (25 остатков). Последовательности зрелых пептидов представлены в Таблице 3.
Нуклеотидная последовательность SEQ ID №6 кодидует белок-предшественник Tk-AMP-S2 (SEQ ID №13), который содержит следующие составные части: N-концевой сигнальный пептид (25 остатков), спейсерную последовательность (12 остатков), зрелые пептиды TK-AMP-S2-1, TK-AMP-S2-2, TK-AMP-S2-3, TK-AMP-S2-4, TK-AMP-S2-5 (28-42 остатка), разделенные короткими (6-9 остатков) спейсерными последовательностями, С-концевую пропоследовательность (15 остатков). Последовательности зрелых пептидов представлены в Таблице 3.
Нуклеотидная последовательность SEQ ID №7 кодидует белок-предшественник Tk-AMP-S3 (SEQ ID №14), который содержит следующие составные части: N-концевой сигнальный пептид (25 остатков), спейсерную последовательность (8 остатков), зрелые пептиды TK-AMP-S3-1, TK-AMP-S3-2, TK-AMP-S3-3, TK-AMP-S3-4, TK-AMP-S3-5 (27-44 остатка), разделенные короткими (0-11 остатков) спейсерными последовательностями, С-концевую пропоследовательность (15 остатков). Последовательности зрелых пептидов представлены в Таблице 3.
Нуклеотидная последовательность SEQ ID №8 кодидует белок-предшественник Tk-AMP-S4 (SEQ ID №15), который содержит следующие составные части: N-концевой сигнальный пептид (25 остатков), спейсерную последовательность (12 остатков), зрелые пептиды TK-AMP-S4-1, TK-AMP-S4-2, TK-AMP-S4-3, TK-AMP-S4-4, TK-AMP-S4-5 (27-43 остатка), разделенные короткими (2-10 остатков) спейсерными последовательностями, С-концевую пропоследовательность (25 остатков). Последовательности зрелых пептидов представлены в Таблице 3.
Таким образом, нуклеотидные последовательности Tk-AMP-L1, Tk-AMP-L2, Tk-АМР-М1, Tk-AMP-S1, Tk-AMP-S2, Tk-AMP-S3 и Tk-AMP-S4 (SEQ ID №2, SEQ ID №3, SEQ ID №4, SEQ ID №5, SEQ ID №6, SEQ ID №7, SEQ ID №8, соответственно) кодируют предшественники Tk-AMP-L1, Tk-AMP-L2, Tk-AMP-M1, Tk-AMP-S1, Tk-AMP-S2, Tk-AMP-S3 и Tk-AMP-S4 (SEQ ID №9, SEQ ID №10, SEQ ID №11, SEQ ID №12, SEQ ID №13, SEQ ID №14, SEQ ID №15), содержащие от пяти до семи зрелых пептидов (и их производных).