Применение методов окраски дрожжей для оценки их физиологического состояния

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕИННОВАЦИИ в ОТРАСЛИ"^^^^^^^

УДК 66.663.45

Применение методов окраски дрожжей для оценки их физиологического состояния

С. Г. Давыденко, канд. биол. наук; Л. М. Васильева; Б. Э. Баташов; А. Т. Дедегкаев, канд. техн. наук ОАО «Пивоваренная компания «Балтика»

Ключевые слова: витальные красители; дрожжи; микроскопия;

физиологическая активность; флуоресцентные красители.

Keywords: vital dyes; yeast; microscopy; physiological activity; fluorescent dyes.

Физиологическое состояние засеваемых дрожжей — очень важный фактор для правильного хода брожения, который обеспечивает получение пива требуемого качества.

Состояние дрожжей определяется терминами «жизнеспособность» и «жизненность». Жизнеспособность — соотношение мертвых и живых клеток, жизненность — мера активности метаболизма или физиологического состояния живых клеток. Физиологическое состояние имеет большое значение для ведения технологического процесса пивоварения, поскольку его главный участник — дрожжи. В связи с этим было проведено много исследований, направленных на разработку точного метода измерения состояния дрожжей с использованием современных технологий.

Изучение микроорганизмов объективно осложнено в связи с их размерами, недоступными для восприятия человеческому глазу, который способен различать детали объекта, отстоящие друг от друга не менее чем на 0,08 мм. С помощью светового и электронного микроскопа можно получить большее разрешение — 0,2 мкм и 0,1-0,01 нм соответственно. Увидеть детали строения микроорганизмов сложно, для

этого нужна специальная дорогостоящая техника, основанная на разработке особых способов освещения (косое освещение, люминесценция, микроскопия в темном поле, метод фазового контраста и т. д.). Однако наиболее эффективно применение красителей, позволяющих не только преодолевать проблему практически неокрашеных живых микроорганизмов, попадающих в поле зрения микроскопа, но и выявлять их органел-лы (ядро, цитоплазму, митохондрии) или специфически окрашивать белки, жиры, полисахариды и нуклеиновые кислоты.

Красители широко применяют в современной гистологии и цитологии, для решения задач в прикладной науке и производстве. В пивоварении дрожжи являются основным активным объектом, осуществляющим процесс брожения пивного сусла, поэтому оценка их физиологического состояния необходима для ведения технологического процесса.

Физиологическую активность микроорганизмов можно определить методами окрашивания различными красителями. Окраска проводится для выяснения их морфологии, физиологии, наличия определенных веществ (белков, жиров, полисахаридов, ионов

Окрашивание в видимом свете Флуоресцентные красители

Метиленовый синий Магниевая соль 1-анилин-8-нафтален-

Метиленовый синий + сафранин О сульфоновой кислоты

Раствор Люголя Родамин В

Иодонитротетразолиум хлорид Акридиновый оранжевый

Красный Понсо Бромкрезоловый зеленый

Метиленовый фиолетовый Диацетат флуоресцеина

Дигидрородамин 123

Эозин

Примулин

Эритрозин В

металлов). Физиологическая активность определяет и технологическую эффективность дрожжей, применяемых в производстве.

Методы окрашивания основаны либо на микроскопировании в видимом свете, либо на флуоресцентной микроскопии. Наиболее широко распространенные красители при микро-скопировании в видимом свете — ме-тиленовый синий, сафранин, раствор Люголя, иодонитротетразолиум хлорид (INT) и т. д. К флуоресцентным относят такие красители как магниевая соль 1-анилин-8-нафталенсульфоновой кислоты (Mg-ANS), родамин и т. д. (см. таблицу) [1, 2].

Окрашивание метиленовым синим: 0,01 г метиленового синего и 2,0 г двуводного цитрата натрия растворяют в 10 мл дистиллированной воды, фильтруют и доводят объем до 100 мл. Для окраски используют суспензию дрожжей концентрацией 107 клеток/мл. Тщательно перемешивают образец дрожжей. Делают ряд разведений в физиологическом растворе, чтобы получить удобную для подсчета концентрацию 107 клеток/ мл. Смешивают суспензию клеток и краситель в соотношении 1:1. Закрывают препарат покровным стеклом и производят подсчет не менее 500 клеток. Окрашенные синие клетки считаются мертвыми [3].

Окрашивание сафранином и метиленовым синим: готовят 5%-ный раствор танина и 1%-ный раствор сафранина на дистиллированной воде. Раствор метиленового синего готовят, как описано выше. Суспензию клеток центрифугируют при 4000 мин-1 в течение 5 мин. Сливают надосадочную жидкость, промывают физиологическим раствором и снова центрифугируют при тех же условиях. На обезжиренное стекло наносят каплю суспензии 107 клеток/ мл. После высыхания капли при комнатной температуре препарат фиксируют в пламени. Далее заливают стекло раствором метиленового синего на 4 мин при комнатной температуре. Смывают струей теплой воды. Заливают стекло свежеприготовленным 5%-ным раствором таннина на 2 мин. Таннин играет роль бесцветного протравного красителя. Смывают краситель под струей воды. Заливают стекло раствором сафранина на 16 мин, затем смывают краситель [1].

Сафранин (арабск. zafaran — шафран) — анилиновый краситель,

с;

ПИВО и НАПИТКИ

б • 2011

'ГЕХНОЛОГИЧЕСКИЕИННОВАЦИИ в ОТРАСЛИ |

применяемым в гистологическом технике для выявления клеточных ядер, которые окрашиваются в красный цвет. Сафранин (иногда Шафраник) — красящее вещество, принадлежащее к группе азокрасок, основного характера, обыкновенно в виде солянокислых солей. Самую простую формулу имеет фено-С, сложнее состав толу-С, содержащего метиловые группы. В технику микроскопи-рования сафранин введен в 1881 г. (Hermann, Flemming, Pfitzner) для окраски ядер и главным образом кариокинеза и с тех пор получил широкое применение [4].

Окрашивание раствором Люголя: 2 г иодистого калия растворяют в 5 мл дистиллированной воды, к раствору добавляют 1 г кристаллического иода. После растворения иода полученный раствор в колбе доводят дистиллированной водой до объема 300 мл. Смешивают суспензию и краситель в соотношении 1:1. Закрывают препарат покровным стеклом и производят подсчет не менее 500 клеток. Оценивают интенсивность коричневого окрашивания. Более окрашенные клетки содержат больше гликогена [5].

Окрашивание иодонитроте-тразолиум хлоридом (INT): 40 мг INT (Sigma) растворяют в 10 мл стерильной воды до конечной концентрации 0,4%. Дрожжи центрифугируют 5 мин при 4000 мин-1, сливают надосадочную жидкость и снова ресуспензируют в физиологическом растворе до конечной концентрации 107 клеток/мл. К 1 мл дрожжевой суспензии добавляют 0,4 мл 0,4%-ного раствора INT и инкубируют 30 мин при 30 °С. Водный раствор красителя свободно проникает в клетки. В результате окислительно-восстановительной реакции в живых клетках образуется нерастворимое вещество — фармазан (красного или малинового цвета). Мертвые же клетки остаются неокрашенными [6, 7].

Окрашивание флуоресцентной магниевой солью 1-анилин-8-нафталенсульфоновой кислоты (Mg-ANS): 300 мг Mg-ANS (Sigma) растворяют в 2 мл спирта и добавляют 98 мл стерильной воды до конечной концентрации 0,3%. Этот раствор можно хранить при 4 °С в стеклянных бутылках из темного стекла в течение 6 мес. Для выполнения процедуры окрашивания дрожжи центрифугируют 5 мин при 4000 мин-1, сливают надосадочную жидкость и снова ресу-

Рис. 1. Клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae, окрашенные метиленовым синим

спензируют в физиологическом растворе до конечной концентрации 10 млн клеток в 1 мл. К 0,5 мл этой суспензии добавляют 0,5 мл 0,3%-ного раствора Mg-ANS и инкубируют 5 мин при 25 °С. Живые клетки не окрашиваются красителем, а мертвые имеют желто-зеленое флуоресцентное свечение при микроскопировании [8, 9].

Окрашивание дигидрородамином 123: в 1 мл 0,1 M буфер Tris (2-Amino-2-hydroxy-methyl-1,3-propanediol) HCl pH 8,0 растворяют 2 мг дигирородами-на 123 (Fluka). К 100 мкл суспензии дрожжей с концентрацией 107 клеток/ мл добавляют 1 мл 0,2%-ного раствора дигидрородамина 123, который окисляется до флуоресцирующего родамина в присутствии активных радикалов кислорода [10].

Различные методы окрашивания могут дать дополнительную информацию о том, что происходит или уже произошло с клеткой. Производят окрашивание как прижизненных, так и фиксированных препаратов.

Наибольшее распространение получил метод выявления мертвых клеток на прижизненных препаратах микроорганизмов с помощью мети-ленового синего (рис. 1). После по-

Рис. 2. Клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae, окрашенные раствором Люголя

падания в клеточную цитоплазму под действием ферментов редуктаз этот краситель восстанавливается живыми дрожжевыми клетками до бесцветных соединений. Эффективность данного метода зависит не только от состояния клеточной мембраны, но и от активности определенных оксидоредуктаз в клетке, и таким образом он отражает и жизнестойкость, и жизнеспособность дрожжей (мертвые клетки окрашиваются в синий цвет) [3].

Для выявления запасного полисахарида дрожжей — гликогена — дрожжи окрашивают раствором Люголя. В результате клетки дрожжей становятся желтыми, а гликоген — коричневым (рис. 2). Количество гликогена в клетках дрожжей меняется в зависимости от их возраста и условий культивирования. У очень молодых клеток гликоген отсутствует, а клетки при окрашивании раствором иода приобретают бледно-желтый цвет [5]. Постепенно дрожжи накапливают гликоген, и при обработке раствором Люголя выявляются темно-коричневые гранулы гликогена, свидетельствующие о накоплении питательных веществ клеткой.

Метод, основанный на редукции трифенилтеразолиновых солей

ФШЦЛТЛ

ООО «ФЕАИЦАТА ХОЛДИНГ»

Производитель пребиотиков и витаминных премиксов на основе лактулозы

Телефон/факс: (495) 648-69-03, (495) 911-70-54 E-mail: i.vasileva@felizata.ru www.felizata.ru

5 • 2011

ПИВО и НАПИТКИ 9

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕИННОВАЦИИ в ОТРАСЛИ

на основе изменения активности Д-глицеральдегид-3-фосфат NAD ок-сидоредуктазы, характеризует активность клеток при брожении. Проникая в дрожжевую клетку, иодонитротетра-золиум хлорид (iodonitrotetrazolium chloride, INT) образует за счет клеточных ферментов нерастворимые гранулы иодонитротетразолиум-формазана, которые имеют интенсивную красную окраску, наблюдаемую при микроско-пировании в светлом поле (рис. 3). Количество и размер гранул свидетельствует об активности окислительно-восстановительных процессов в клетке [6, 7].

Более полную информацию о физиологическом состоянии клеток дает

Рис. 3. Клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae, окрашенные раствором иодонитротетразолиум хлорида

окраска фиксированных препаратов метиленовым синим, таннином и сафранином (рис. 4).

а 6

Рис. 5. Клетки дрожжей в видимом свете и окрашенные Mg-ANS (увеличение х1000): а — микроскопирование в видимом свете; б — флуоресцентное микроскопирование с Mg-ANS

а

Рис. б. Клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae, окрашенные дигидрородамином 123 (увеличение х1000): а — красный; б — зеленый светофильтр

а 6

Рис. 7. Окрашенные клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae: а — дигидрородамином 123; б — метиленовым синим

Рис. 4. Клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae, окрашенные метиленовым синим, таннином и сафранином

Суть процессов окраски заключается в том, что остатки фосфорной кислоты, которые обычно связаны с ядерными белками (чаще всего ги-стонами), при вытеснении последних легко вступают в химические реакции с основными красителями. Для этого могут быть использованы сафранин О, янус зеленый В, толуидиновый синий, тионин, азур А и некоторые другие красители, разведенные растворы которых в уксусной кислоте избирательно окрашивают хроматин. Во время активной транскрипции определенного участка ДНК формирующие хроматин гистоны покидают поверхность ДНК и освобождаются фосфорные группы молекулы ДНК, которые вступают в реакцию с сафранином и другими основными красителями. Таким образом, «покраснение» клеток может свидетельствовать об активном процессе транскрипции, а следовательно, и об активном метаболизме. Метиленовый синий окрашивает белки цитоплазмы [1].

Для определения жизнеспособности дрожжевых клеток используют Mg-ANS. Проникая в клетку, Mg-ANS образует флуоресцирующие желто-зеленые комплексы с белками цитоплазмы (рис. 5). По сравнению с окраской метиленовым синим для детекции используется в 1000 раз меньше красителя, что снижает вероятность ингибирования им клеток. Результаты, полученные этим методом, считаются более точными, но требуют наличия хорошей техники для микроскопиро-вания. Живые клетки не окрашиваются красителем, а мертвые имеют желто-зеленое флуоресцентное свечение при микроскопировании [8, 9].

Выявление активных форм кислорода (АФК) в клетке свидетельствует либо о ее старении, либо о том, что она находится в состоянии стресса. Метод дигидрородаминового окрашивания

10 ПИВО и НАПИТКИ 5 • 2011

ТТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕИННОВАЦИИ в ОТРАСЛИ

позволяет оценивать количество АФК по количеству флуоресцирующих (красных или зеленых в зависимости от использования соответствующего фильтра) клеток (рис. 6). Дигидроро-дамин 123 (Fluka) окисляется до флуоресцирующего родамина [10].

Окрашивание дигидрородами-ном 123 — чувствительный метод, позволяющий производить оценку физиологического состояния живых, но уже ослабленных клеток, что дает важную информацию о ходе процесса брожения и позволяет диагностировать проблемы, влияющие на жизнеспособность. Для сравнения на рис. 7 представлены препараты одной и той же суспензии дрожжей, окрашенные дигидрородамином 123 (рис. 7, а) и метиленовым синим (рис. 7, б) при использовании зеленого светофильтра.

Дигидрородамин 123 выявляет ослабленные клетки, неспособные эффективно бороться с АФК (см. рис. 7, а), в то время как метиленовый синий окрашивает уже мертвые клетки (см. рис. 7, б). Такое окрашивание дает информацию о том, как будут вести себя дрожжи во время брожения.

Применение красителей для оценки физиологического состояния дрожжей в пивоварении достаточно велико, однако многие флуоресцентные красители широко не используются, так как для них необходимы дорогостоящие микроскопы. Наиболее применяемый — классический метод окрашивания метиленовым синим, дающий стабильные, но иногда завышенные результаты из-за незначительной токсичности самого красителя. Именно этот краситель широко используется в пивоварении для оценки технологической эффективности дрожжей. Остальные красители применяют для уточнения результатов, полученных с помощью метиленового синего, например Mg-ANS, или для характеристики определенных процессов в клетке (INT, дигидрородамин 123).

ЛИТЕРАТУРА

1. Селиванов, Е. В. Красители в биологии и медицине: справочник/Е. В. Селиванов. — Барнаул: Азбука, 2003. — 44 с.

2. http ://www.propivo .ru / prof/ technology / 22 / izmerenie.htm.

3. Smart, K.A. Use of Methylene Violet Staining Procedures to Determine Yeast Viability and Vitality/K. A. Smart, K. M. Chambers, I. Lambert, C. J. Jenkins // Journal-American society of brewing chemists. — 1999. — Vol. 57. — № 1. — P. 18-23.

4. top//bigmeden.ru/article.

5. Теппер, Е. З. Практикум по микробиологии: изд. 2-е, перераб. и доп./Е. З. Теппер, В. К. Шильникова, Г. И. Переверзева. — М.: Колос, 1979. — 216 с.

6. Munujos, P. Assay of succinate dehydrogenase activity by a colorimetric-continuous method using iodonitrotetrazolium chloride as electron acceptor/P. Munujos, J. Coll-Cantí, F. González-Sastre, F. Gella // J. Anal Biochem. - 1993. — Vol. 212. — № 2. — P. 506-509.

7. Mailloux, R. J. The monitoring of nucleotide diphosphate kinase activity by blue native polyacry lamide gel electrophoresis/ R. J. Mailloux, R. Darwich, J. Lemire, V. Appanna // Electrophoresis. — 2008. — Vol. 29. — № 7. — P. 1484-1489.

8. Jenkins, C.L. Impact of Serial Repitching on Lager Brewing Yeast Quality/C. L. Jenkins [et al.] // Journal-American society of brewing chemists. — 2003. — Vol. 61. — № 1. — P. 1-9.

9. Van Zandycke, S. M. Determination of Yeast Viability Using Fluorophores/S. M. Van Zandycke, O. Sima, S. Gualdoni, A. Smart // Journal-American society of brewing chemists. — 2003. — Vol. 61. — № 1. — P. 15-22.

10. Nevzglyadova, O. V. Bud selection and apoptosis-like degradation of nuclei in yeast heterokaryons: a KAR1 effect/O. V. Nevzglyadova, A. V. Ar-tyomov, E. V. Mikhailova, T. R. Soidla // Molecular Genetics and Genomics. — Vol. 274. — № 4. — P. 419-427.