Изучение термодинамических свойств коллагена I

ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ

ловного мозга кошки // Биохимия. 1995. Т. 60. № 11. С. 1860-1866.

4. Лакин Г. Ф. Биометрия. М.: Высш. шк., 1990. 352 с.

5. Ломакин М. С., Арцимович Н. Г. Биологически активные вещества, ассоциированные с плацентой // Акушерство и гинекология. 1991. № 9. С. 6-10.

6. Павлович Л. Л. Патогенетическое обоснование применения w-3-полиненасыщенных жирных кислот при осложненном течении беременности // Акушерство и гинекология. 1998. № 1. С. 48-52.

7. Подтетенев А. Д., Братчикова Г. В. Тактика ведения родов при гестозе. М.: РУДН, 2004. 237 с.

8. Радзинский В. Е., Ордиянц И. М. Плацентарная недостаточность при гестозе // Акушерство и гинекология. 1999. № 1. С.11-16.

9. Радзинский В. Е., Смалько П. Я. Биохимия плацентарной недостаточности. М: Издательство Российского университета дружбы народов, 2001. 276 с.

10. Савельева Г. М., Федорова М. В., Клименко П. А., Си-чинава Л. Г. Плацентарная недостаточность. М.: Медицина, 1991. 272 с.

11. Савельева Г. М., Шалина Р. И., Дживелегова Г. Д., Кашежева А.З ., Гандур Д. Принципы профилактики и лечения ОПГ-гестозов // Акушерство и гинекология. 1992. № 3-7. С.14-17.

12. Савельева Г. М., Шалина Р. И. Современные проблемы этиологии, патогенеза, терапии и профилактики гесто-зов // Акушерство и гинекология. 1998. № 5. С. 6-9.

13. Салов И. А., Чеснокова Н. П., Глухова Т. Н. Закономерности развития системных обменных нарушений при гестозе // Росс. Вестн. Акушера-гинеколога. 2004. Т. 4. № 3. С.4-6.

14. Flicker L. D., Plummer T. H., Snyder S. H. Enkephalin convertase: potent, selective and irreversible inhibitors // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1983. V. 11. № 3. P. 994-1000.

15. Lowry O. H., Rosebrought N. J., Farr A. G., Randall R. J. Protein measurement with Folin phenol reagent // J Biol. Chem. 1951. ol. 193. № 1. P. 256-275.

16. Reznik S. E., Salafia C. M., Lage J. M., Fricker L. D. Im-munohistochemical, localization of carboypeptidases E and D in the human placenta and umbilical cord // Histochem. Cytochem. 1998. Vol. 46. № 12. P. 1359-1368.

УДК 591.104

ИЗУЧЕНИЕ ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КОЛЛАГЕНА I

А. Н. КОНОВАЛОВ

Пензенский государственный педагогический университет им. В. Г. Белинского

кафедра биохимии

Статья посвящена вопросу исследования термодинамических свойств коллагена I при кислой и щелочной pH, а также в фосфатно-бикарбонатном буфере. Приведена методика выделения коллагена Iиз хвостов белых крыс и данные измерений термодинамических характеристик в кислой, щелочной средах и фосфатно-бикарбонатном буфере.

Молекула коллагена состоит из трех полипептидных цепей одинакового размера - а-цепей, каждая из которых имеет форму спирали, и все вместе образуют суперспираль. Аминокислотный состав коллагена является уникальным и характеризуется высоким содержанием остатков глицина, аминокислот и оксикислот, причем на долю глицина приходится 33 %, пролина -10 %, оксипролина - 10 %. Последовательность аминокислотных остатков в молекуле коллагена отличается высокой степенью регулярности, где каждый третий остаток является глицином. Часто повторяются последовательности Гли-Про-Оксипро. В организации структуры коллагена глицин играет важную роль, так как это единственная аминокислота, которая может уместиться внутри тройной спирали. Два аминокислотных остатка по обе стороны от глицина, громоздкие кольца (пролин, оксипролин) или длинные боковые цепи (лизин, фенилаланин), располагаются вне тройной спирали и могут принимать участие в образовании межмолекулярных связей. Наличие аминокислотных остатков пролина и оксипролина, а последовательностей типа Гли-Про-Оксипро определяет трехспираль-ную форму коллагена.

Коллаген типа I относится к классу фибриллярных белков. Длина молекулы ~ 300 нм и диаметр ~1,5 нм. Молекула коллагена представляет собой полужесткий стержень с тремя более гибкими областями. Установлено, что гибкие области состоят из аминокислотных

последовательностей, лишенных пролина и оксипролина. На N и С-концах тройной спирали расположены соответственно 6 и 8 трипептидов с пониженной стабильностью (участки Н2, Н6). На участке Н7 вблизи С-концевого телопептида находятся трипептиды Гли-Про-Оксипро. Эта область является наиболее стабильной в молекуле коллагена.

Для строения фибрилл характерно ступенчатое расположение молекул со сдвигом на четверть их длины. Расположенные в один ряд молекулы не связаны N и С-концами. Между концом одной молекулы и началом следующей существует промежуток размером ~ 40 нм. На электронно-микроскопических снимках наблюдается чередование светлых и темных полос, где светлой полосе соответствует область перекрывания молекул (overlap-зона), а темной полосе - область с промежутками между молекулами ^ар-зона). Кол-лагеновые фибриллы по данным рентгеновской диф-фракции и электронной микроскопии имеют период поперечной исчерченности D, равный 64-67 нм. Анализ аминокислотных последовательностей полипептидных цепей выявил, что D-периоду соответствует группировка аминокислот в блоки по 234 аминокислотных остатка на а-цепь. В молекуле коллагена четыре таких последовательно расположенных блока.

Пятый, С-концевой участок тройной спирали, имеет размер 0,4D и состоит из ~ 90 аминокислотных остатка. На С-участке одной молекулы и перекрываю-

щего его такого же размера ^концевом участке другой молекулы в связывании молекул участвуют глобулярные N и С-телопептиды. Телопептиды составляют 2 % от молекулярного веса коллагена, тем не менее они существенно влияют на структуру фибрилл. Включение телопептидов в поперечное связывание молекул способствует не только образованию прочных фибрилл, но и сохраняет им гибкость. В этих участках молекул происходит образование ковалентных связей между тройной спиралью и концевыми телопептидами.

Ранее проведенные исследования по коллагену были сосредоточены преимущественно на выяснении механизмов образования и стабилизации тройной спирали коллагена. Однако как из молекул коллагена формируются фибриллы с высокой степенью упорядоченности, остается слабо исследованным. основные принципы самосборки коллагена известны, при этом мало сведений о молекулярных механизмах фибрилло-генеза. До настоящего времени недостаточно изучены и пути самосборки молекул в фибриллы, и упаковка молекул в фибриллах, и упаковка фибрилл в тканях [1].

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

методика выделения коллагена из сухожилий хвостов крыс

Коллаген получали из сухожилий хвостов молодых белых крыс. Хвосты замачивали на ночь в дистиллированной воде. Сухожилия выделяли следующим образом: делали продольный разрез хвоста, снимали кожу и, начиная с конца, разламывали хвост на фрагменты и вытягивали сухожилия. Сухожилия промывали в дистиллированной воде и обрабатывали 10-кратным объемом раствора 0,5 М уксусной кислоты. Экстракцию проводили при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в течение 72 час. В результате 3-х последовательных экстракций, каждая по 24 часа, 1-ый, 2-ой и 3-ий экстракты объединяли и фильтровали через несколько слоев марли. Экстракт разбавляли раствором 0,5М уксусной кислоты и центрифугировали при 30000 g в течение 2-х час. Нерастворимые остатки ткани отбрасывали, коллаген супернатанта подвергали 3-х кратной очистке. коллаген получали путем осаждения с последующим центрифугированием и перерастворением в растворе 0,5 М уксусной кислоты. Осаждение проводили раствором 30 % №С1 до конечной концентрации 5 % №С1 при постоянном перемешивании экстракта на магнитной мешалке и добавлении раствора №С1 из бюретки небольшими порциями. Экстракт оставляли на 12 час. Осадок коллагена отделяли центрифугированием при 7000 g в течение 1 час. Перерастворяли коллаген в растворе 0,5 М уксусной кислоты в течение 12 час. Затем проводили диализ в течение 24 часов против 40-кратного объема раствора 0,5 М уксусной кислоты с 3-4-хкратной сменой раствора. Диализат центрифугировали при 30000 g в течение 2-х час. Верхнюю половину супер-натанта использовали для 2-й очистки по описанной выше процедуре. Нижнюю половину супернатанта с осадком отбрасывали. 3-е осаждение коллагена проводили охлажденным этиловым спиртом до конечной

концентрации спирта 14 %. Предварительно раствор коллагена подщелачивали раствором 1М №OH до рН 5,0. Центрифугирование и перерастворение коллагена было выполнено, как ранее. Диализ был проведен против раствора 0,1 М уксусной кислоты. Диализо-ванный раствор коллагена центрифугировали на ультрацентрифуге при 160000 g в течение 2 час. Верхнюю половину супернатанта использовали для проведения экспериментов. Нижнюю половину супернатанта с осадком отбрасывали [1].

калориметрический метод

Калориметрические исследования фибрилл проводили на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4 при скорости сканирования 1 К/мин., избыточном давлении 2,0 атм. В калориметрах дифференциального типа одна измерительная ячейка служит для заполнения раствора образца, а вторая для растворителя. При прогреве калориметрических камер с постоянной скоростью разность тепловых мощностей калориметрических камер компенсируется электрическим путем перераспределением части прогрева между калориметрическими камерами. Адиабатическая система тепловых экранов в калориметре ДАСМ-4 позволяет исключить теплообмен с окружающей средой. Высокая чувствительность прибора позволяет проводить измерения с небольшими количествами образца.

Базовая линия получена после заполнения обеих калориметрических ячеек растворителем или буферным раствором. Воспроизводимость базовой линии высокая. Сбор данных осуществляли автоматически на IBM-совместимом компьютере с калориметром ДАСМ-4 с шагом температуры 1К при помощи программы SCAL.

Были определены следующие термодинамические характеристики перехода фибрилл из нативного состояния в разупорядоченное: температура перехода (Tm), полуширина перехода (ДТ), энтальпия перехода (ДН) и энтропия перехода ^S). Величины энтальпии перехода ДН определяли по площади под калориметрическими кривыми. Температуру перехода Tm определяли на максимуме пика перехода. Рассматривая переход коллагеновых молекул и фибрилл из натив-ного состояния в разупорядоченное как фазовый переход и считая, что в точке перехода свободная энергия ДG = ДН - Tm^S = 0, величины энтропии перехода вычисляли по формуле: ДS = ДН/Tm. Разделение a-цепей происходит на последней стадии плавления, поэтому в 1-м приближении процесс разрушения структуры коллагена может быть отнесен к равновесному [1].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты определения концентрации коллагена представлены в таблице 1. определение концентрации коллагена проводили по следующему алгоритму: 1) взвешивание пенфлаконов; 2) помещение в пен-флаконы по 2 мл раствора коллагена; 3) взвешивание пенфлаконов с раствором коллагена; 4) в сушильном

ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ

Таблица 1.

Сводные данные определения концентрации коллагена

Масса пенфлакона, г Масса пенфлакона с раствором коллагена, г Масса пенфлакона с коллагеном, г Масса раствора коллагена, г Масса коллагена, г Концентрация коллагена, %

12,1504 13,9285 12,1561 1,7781 0,0057 0,32

12,3567 14,1000 12,3623 1,7433 0,0056 0,32

13,2217 14,7828 13,2264 1,5611 0,0047 0,30

12,9263 14,5288 12,9316 1,6025 0,0053 0,33

Среднее 0,32

шкафу упаривание растворов до постоянной массы, не допуская обугливание коллагена; 5) взвешивание пен-флаконов с упаренным коллагеном; 6) по разнице масс нахождение массы раствора коллагена и коллагена; 7) нахождение процентной концентрации.

Для исследования на микрокалориметре было приготовлено 3 образца: 1) коллаген в 0,2 М уксусной кислоте (рН = 3,0) (концентрация коллагена 0,5 мг/мл); 2) коллаген в фосфатном буфере (PBS) (рН = 7,4) (концентрация коллагена 0,5 мг/мл); 3) коллаген в минимальной среде Игла, модифицированной Дюльбеко (DMEM) (рН = 7,4) (концентрация коллагена 0,5 мг/мл). Данные, полученные при мик-рокалориметрировании, представлены в таблице 2, а

термодинамические характеристики перехода фибрилл из нативного состояния в разупорядоченное -в таблице 3. Для расчета энтальпии была использована формула:

ДН =

Pk (T - T)S' SkVmp

где ДН - энтальпия;

Рк - калиброванная мощность 10-4 Дж/с; Т и Т2 - температуры включения и выключения калибровочной мощности;

S - площадь пика плавления; V - скорость прогрева; тр - масса образца в камере.

Таблица 2.

Данные, полученные на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4

Образцы s Tm, °С T1/2, К

1 23485 40,2 1,6

2 22166 47,8 3,2

3 21024 51 2,2

калибровка* 54068 39,3 5,9

*калиброванная мощность 10-4 Дж/с

Таблица 3.

Термодинамические характеристики перехода фибрилл из нативного состояния в разупорядоченное

Образцы Tm, К AT, К AH, Дж/К AS, кДж/К*с

1 313,2 1,6 63,7 203,4

2 320,8 3,2 61,2 190,8

3 324,8 2,2 57,1 176,8

Кроме того, был определен пересчетный коэффициент (А) для перевода сигнала микрокалориметра в единицы удельной теплоемкости.

A = Pk (T2 - T,) SkVmp

Cp=A*sig

В результате проведенных исследжований была выявлена степень влияния кислой, нейтральной рН, а также DMEM на фибриллогенез коллагена типа I.

В условиях кислой среды температура максимума пика теплопоглощения коллагена была минимальной в ряду исследуемых образцов. При этом фазовый пере-

ход в данных условиях был наиболее кооперативным, что свидетельствует об однородной организации молекул коллагена.

При физиологических значениях рН и ионной силы среды мы наблюдали процесс формирования коллагеновых фибрилл, температура плавления которых была значительно выше, чем у молекул в растворе с кислым рН.

Имеющиеся различия в термодинамических характеристиках фибрилл, приготовленных в фосфатном буфере и ростовой среде, могут быть связаны с тем, что приготовление образцов происходило при разных рН среды.

Данные по исследованию энтальпии и энтропии СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

плавления коллагена говорят соответственно об энер- 1. Гаврилюк Б. К., Рочев Ю. А., Николаева Т. И. Культура

гии межмолекулярных связей и степени организован- клеток и реконструкция ткани (на примере кожи). Пу-

ности коллагеновых структур. щино: ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1988.128 с.

ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ ИХТИОФАУНЫ ПЕНЗЕНСКОЙ ОБЛАСТИ

С. М. КОТЕЛЬНИКОВ Пензенский государственный педагогический университет им. В. Г. Белинского

кафедра зоологии и экологии

Степень изученности ихтиофауны территории Европейской России зачастую уступает таковой географическим окраинам страны. Примером могут служить не полные сведения по разнообразию рыбообразных и рыб рек Суры и Мокши (Волжская система), Хопра и Вороны (Донская система). Истоки этих рек расположены преимущественно на территории Пензенской области.

Первые опубликованные сведения по ихтиофауне Пензенской губернии оставил П. С. Паллас (1768), в работе которого упоминаются находки несколько видов промысловых рыб в р. Суре (стерлядь, ручьевая форель, язь, сом, лещ, сазан и др.). К. Ф. Кесслер (1870) дополнил материалы по рыбам этой реки и указал конкретные места находок ручьевой форели (рр. Айва, Веж-Няньга) и других видов. Позднее выходит наиболее полная сводка Н. А. Варпаховского (1884) по ихтиофауне р. Суры. Этот исследователь спустился по реке от г. Пензы до устья, и, как пишет автор: «на что употребил вторую половину июля и первую - августа, коллектируя рыб, как самой Суры, так и её притоков и встречающихся озёр». Поскольку свои исследования Н. А. Варпаховский проводил во второй половине лета - в его работе отсутствуют данные по проходным видам, характерным для р. Суры того времени: каспийская минога, взрослые особи осётра, белорыбица. Им же кратко описано распространение видов по биотопам. В верховьях Суры Н. А. Варпаховским отмечено 32 вида рыб. В одной из своих работ (Варпаховский, 1889) он указывает на обитание в некоторых притоках реки хариуса.

В 1928 г. в трудах «Пензенского общества любителей естествознания и краеведения» выходит статья А.Н. Магницкого. В ней указаны места и даты отловов всех обнаруженных видов рыб, краткое описание местных ареалов, иногда морфологические особенности, приведены также некоторые местные названия видов. В этой работе впервые отражены достоверные сведения о заходе в Суру каспийской миноги: «заход этой рыбы в Суру около Пензы в первый раз был установлен в 1920 году, когда гражданином С.Р. Орловым в вивариум губернского музея была доставлена живая минога, пойманная в Суре 19 мая (ст. стиль). Начиная с 1923 года, имеются данные о заходе миноги в Суру ежегодно. Кроме р. Суры каспийская минога ловилась в притоках: Пензе, Инзе, Айве, Большом Вьясе, Инса-ре». Определённый интерес представляет следующее сообщение А. Н. Магницкого: «Среди миног, пойман-

ных в этом году (1925) в реке Пензе и Инзе, большинство, как по величине, так и по внешнему виду отличаются от типичной Caspiomyzon wagneгi, особенно своими соприкасающимися плавниками. Может быть, это только возрастное отличие миноги, но не вероятно и допущение, что это другой вид Caspiomyzon, относящийся к Caspiomyzon wagneгi так же, как Ьатре^а р1апеп относится к Ьатре^а До 26 года та-

ких не ловили». В выше упомянутой работе А. Н. Магницкий также сообщает о поимке в 1921 г белорыбицы в Суре около с. Бессоновка и 1926 г. в г. Пензе под турбинами писчебумажной фабрики.

Исследования А. Н. Магницкого (1928), в отличие от его предшественников, охватили и бассейны рек Мокши, Вороны, Хопра в пределах Пензенской губернии. Первое исследование рыб р. Мокши было предпринято им на основании опросных данных, произведенных в 1925 г. Пензенским губернским статистическим бюро. Опросные данные были составлены в виде карточек, охвативших 118 мест. Охват и подробность работы позволили пензенскому краеведу составить карту: «Схематическая карта распространения некоторых, наиболее интересных пород рыб в Пензенской губернии». Всего за годы исследований А. Н. Магницким отмечено 32 вида рыб и 1 вид круглоротых.

После работы Н. А.Магницкого лишь спустя полвека выходит сводка А. И. Душина, (1978) по рыбному населению р. Суры. В ней содержатся относительно подробные сведения по рыбам среднего течения реки, тогда как данные по верховьям носят фрагментарный характер. Тем не менее, эти исследования показывают определённую динамику видового состава рыб этой реки. Так, А. И. Душиным отмечается исчезновение ценных проходных видов после постройки плотин ГЭС на Волге, описаны интродуцированные виды амурского комплекса. Приведены данные по биологи и экологии некоторых видов.

Незадолго до работы А. И. Душина (1978), верховья р. Суры были исследованы Г. М. Гурелёвой и В. Е. Рощиным (1971). Исследования рыбного населения реки от истока до г. Пензы выявили наличие 32 видов рыб, а также позволили выделить несколько участков реки, отличающихся видовым составом рыб.

Позднее редким и малочисленным видам водоемов области был посвящен ряд работ (Ильин и др.,2005; Лёвин, 2001а, 2001б). В последние годы пензенскими зоологами в рамках подготовки к изданию тома