Гуманизированное нейтрализующее антитело к интерферону-бета человека
HUMANISED NEUTRALIZING ANTIBODY TO HUMAN INTERFERON-BETA

-9
Изобретение относится к области биотехнологии и биохимии, а именно гуманизированному нейтрализующему моноклональному антителу. селективно связывающему интерферон-бета человека с константой диссоциации комплекса 3,3×10 М и способному нейтрализовать его биологическую активность, а также изолированному фрагменту ДНК, кодирующему участки легкой и тяжелой цепи указанного антитела, и антиген-связывающему фрагменту указанного моноклонального антитела. Специфичность гуманизированного нейтрализующего моноклонального антитела к интерферону-бета человека подтверждена методами иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга. Нейтрализующая активность антитела показана в тесте по ингибированию антипролиферативного действия интерферона-бета. Установлены аминокислотная и нуклеотидная последовательности вариабельных доменов гуманнзированного нейтрализующего моноклонального антитела. Изобретение позволяет получить новые гуманизированные моноклональные антитела, селективно связывающие интерферон-бета человека и способные нейтрализовать его биологическую активность.
Область техники
Изобретение относится к биотехнологии и биохимии, а именно к гуманизированному нейтрализующему моноклональному антителу, связывающемуся с интерфероном-бета человека и способном нейтрализовать его биологическую активность.
Уровень техники
Известны моноклональные анти-IFNα антитела, которые связываются с подтипами интерферона-альфа (IFNα): IFNα1, IFNα2, IFNα4, IFNα5, IFNα8, IFNα10, IFNα21 и содержат три CDR участка тяжелой цепи. Описанные анти-IFNα антитела содержат, по-меньшей мере, одну легкую цепь и одну тяжелую. Раскрыты варианты нуклеиновых кислот, кодирующих указанные антитела, и варианты векторов для экспрессии нуклеиновых кислот, а также варианты трансформированных клеток-хозяев. Среди векторов экспрессии описаны также векторы, депонированные под №2881 и под №2882, несущие соответственно тяжелую и легкую цепь антитела. Описан способ получения антитела из указанных клеток. Раскрыта гибридомная линия клеток мыши, депонированная в АТСС под номером №РТА-2917, и антитело, продуцируемое указанной линией. Описаны также варианты фармацевтической композиции на основе антитела и способ диагностики аутоиммунного заболевания. Раскрыто также применение антител для лечения заболевания или состояния, ассоциированного у пациента с повышенными уровнями IFNα. Использование изобретения позволяет одновременно подавлять биологическую активность, по крайней мере, семи подтипов IFNα человека, а именно IFNα1, IFNα2, IFNα4, IFNα5, IFNα8, IFNα10, IFNα21, что может найти применение в диагностике и терапии различных заболеваний человека, опосредуемых IFNα, таких как инсулинозависимый сахарный диабет или системная красная волчанка [Патент RU2314317 С07К 16 24. опубл. 10.01.2008 г.].
Известны антитела, которые избирательно нейтрализуют биологическую активность по крайней мере двух подтипов интерферона - альфа в отношении подтипов белка А, 2, В2, С, F, G, Н2, I, J1, К, 4а, 4b и WA, и не нейтрализуют по крайней мере одну биоактивность белка IFNα подтипа D. Также в этом патенте представлено применение антитела для производства лекарственного средства. Кроме того в этом патенте представлены продуцирующие антитело клетка-хозяин и гибридома. Антитела по изобретению эффективны для выявления подтипов IFNα в образце или ткани и или для терапевтического применения, включающего в себя лечение и или улучшение состояния при связанном с IFNα заболевании, таком как системная красная волчанка (SLE), волчанка, диабет типа I, псориаз, СПИД и реакция "трансплантат против хозяина" [Патент RU 2431638C2, С07К 16/24, опубл. 20.10.2011 г.].
50
Известно гуманизированное антитело и его антигенсвязывающий фрагмент (Fab), которые селективно связывают человеческий ИФН-γ и содержат вариабельный участок тяжелой цепи (VH) и вариабельный участок легкой цепи (VL), где VH и VL имеют последовательности аминокислот соответственно SEQ ID NO: 1 и 2, представленные в описании в патенте RU 2539752. Также раскрыты фрагменты ДНК. кодирующие указанные антитело и его Fab-фрагмент; плазмидные ДНК для экспрессии указанных специфичных белков; и модифицированные клетки бактерий и эукарнот, содержащие указанные плазмидные ДНК и предназначенные для экспрессии указанных антитела и его Fab-фрагмента. Предложены способы получения указанных антитела или его Fab-фрагмента, включающие культивирование указанных модифицированных клеток в питательной среде и выделение антитела и его Fab-фрагмента по изобретению RU 2539752 из культуральной жидкости. Изобретение позволяет получить гуманизированное антитело или его Fab-фрагмент, связывающиеся с ИФН-γ с Кд 4,6 и IC не менее 1,5 нМ в тесте на клетках U937, с сохранением аффинности исходного мышиного моноклонального антитела [Патент RU 2539752 C2, С07К 16/24, опубл. 27.01.2017 г.].
Известно гуманизированное антитело, специфически связывающееся с интерфероном-альфа (IFN-α) человека, и его антигенсвязывающий фрагмент, причем указанное антитело представляет собой гуманизированный вариант мышиного антитела АСО-1 или АСО-2 либо их комбинации, включающий меньше донорских аминокислотных остатков, чем мышиные области, определяющие комплементарность. (CDR) по Кабату. Также известно гуманизированное антитело, специфически связывающееся с IFN-α, или его антигенсвязывающий фрагмент, в частности, указанное антитело может связываться с подтипами IFN-α А, 2, В2, С, F, G, Н2, I, J1, К, 4а, 4b и WA, но не связывается с подтипами 1 или D, при этом указанное антитело содержит меньше донорских аминокислотных остатков, чем CDR-области. отличные от человеческих, по Кабату. Антитела АСО-1 и АСО-2" исследованы и описаны в публикации WO 20060086586. Антитело АСО-1 депонировано в АТСС под №доступа РТА-6557 (WO2006086586). и антитело АСО-2 депонировано в АТСС под №доступа РТА-7778 (WO 2008021976), структурное моделирование вариабельных областей показало, что можно гуманизировать антитела АСО-1 и АСО-2, используя меньше донорских (мышиных) остатков, чем в CDR-областях Кабата, благодаря чему уменьшается риск вредного иммунного ответа у человека. Указанный анализ позволил также выявить благоприятные сайты для обратных мутаций. Кроме того, было установлено, что, вероятно, благодаря высокому сходству последовательностей вариабельных областей АСО-1 и АСО-2 (отличия обнаружены только в 13 сайтах) определенные аминокислотные остатки в последовательности гуманизированного антитела АСО-1 (hzACO-1) могут быть заменены остатками АСО-2 в соответствующем положении. В CDR-областях мутации обычно выполняют таким образом, чтобы длина последовательности антитела не была меньше, чем в человеческом антителе. В результате процесса гуманизации образуется гуманизированное антитело с улучшенными функциональными свойствами, такими как сродство связывания, устойчивость, уровень экспрессии и активность ингибирования интерферона-альфа. В гуманизированном антителе АСО-1 типичные мутации в VH-области антитела hzACO-1 (SEQ ID NO:3) включают V5Q, T28S, M69L, R71V, Т73К, S76I, S76N, T77I, V78A, Y79F и A93V, а также любую их комбинацию при использовании нумерации Кабата. Типичные мутации в VL-области антитела hzACO-1 (SEQ ID NO:6) включают E1Q, D29G, L33F, L47W, S50G, 158 V и F71Y, а также любую их комбинацию. В одном варианте осуществления изобретения VH-область антитела hzACO-1 включает мутацию, выбираемую из T28S, N31S и A93V. В другом варианте осуществления изобретения VH-область антитела hzACO-1 включает мутацию, выбираемую из T28S, N31S и A93V, и любую их комбинацию, такую как, например, T28S и N31S, T28S и A93V, N31S и A93V. В другом варианте осуществления изобретения VH-область антитела hzACO-1 включает мутацию, выбираемую из T28S, N31S и A93V, или их комбинацию, такую как, например, T28S и N31S, T28S и A93V или N31S и A93V, и по меньшей мере одну дополнительную мутацию. Описаны способы получения таких антител, а также к применение указанных антител для терапевтических целей и композициям, включающим такие антитела [Патент RU 2532832C2, С07К 16/24, опубл. 10.11.2014 г.].
50
Известно гуманизированное антитело и его антигенсвязывающий фрагмент (Fab), которые селективно связывают человеческий IFN-γ и содержат вариабельный участок тяжелой цепи (VH) и вариабельный участок легкой цепи (VL), где VH и VL имеют последовательности аминокислот соответственно SEQ IP NO:1 и 2, представленные в описании. Также раскрыты фрагменты ДНК, кодирующие указанные антитело и его Fab-фрагмент, плазмидные ДНК для экспрессии указанных специфичных белков; и модифицированные клетки бактерий и эукариот, содержащие указанные плазмидные ДНК и предназначенные для экспрессии указанных антитела и его Fab-фрагмента. Предложены способы получения указанных антитела или его Fab-фрагмента, включающие культивирование указанных модифицированных клеток в питательной среде и выделение антитела и его Fab-фрагмента по настоящему изобретению из культуральной жидкости. Изобретение позволяет получить гуманизированное антитело или его Fab-фрагмент, связывающиеся с IFN-γ с Кд 4,6 и IC не менее 1,5 нМ в тесте на клетках U937, с сохранением аффинности исходного мышиного моноклонального антитела [Патент RU 2539752C2, С07К 16/24, опубл. 27.01.2015 г.].
-9
Известно мышиное моноклональное антитело, связывающее интерферон бета-1а человека с константой диссоциации комплекса 3,2×10 М и способное нейтрализовать его биологическую активность. Также известны изолированные фрагменты ДНК. кодирующие участки легкой и тяжелой цепи указанного антитела. Специфичность моноклонального антитела к интерферону бета-1а человека подтверждена методами иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга. Нейтрализующая активность антитела показана в тесте по ингибированию антипролиферативного действия интерферона бета-1а. Установлены аминокислотная и нуклеотидная последовательности вариабельных доменов моноклонального антитела [Алиев, Т.К., Долгах, Д.А., Кирпичников, М.П., Панина, А.А., Рыбченко, B.C., Свешников, П.Г., Солопова, О.Н., Топорова, В.А., Шемчукова, О.Б. Моноклональное антитело, способное нейтрализовать биологическую активность интерферона бета-1а человека. Заявка на патент №2018147193 от 28.12.2018]. Это антитело является патентным предшественником полученного гуманизированного нейтрализующего моноклонального антитела HuB16.
Раскрытие изобретения
Технической проблемой, решаемой настоящим изобретением, было получение гуманизированного нейтрализующего моноклонального антитела, способного к связыванию с интерфероном-бета человека и нейтрализации его биологической активности, и отличающегося по аминокислотной последовательности вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей от известных из предшествующего уровня техники моноклональных антител к интерферонам человека. А также получение изолированных фрагментов ДНК, кодирующих участки легкой и тяжелой цепей указанного антитела и антиген связывающего фрагмента указанного гуманизированного моноклонального антитела.
Техническим результатом является получение нового гуманизированного нейтрализующего моноклонального антитела IgG1-изотипа, способного к связыванию с интерфероном-бета человека и нейтрализации его биологической активности, и характеризующегося константой диссоциации комплекса антиген-антитело 3,3 нМ.
Также техническим результатом является расширение арсенала средств аналогичного назначения, а именно получение нового гуманизированного нейтрализующего моноклонального антитела к интерферону-бета человека.
Поставленная техническая проблема решается получением гуманизированного нейтрализующего моноклонального антитела HuB16. селективно связывающего интерферон-бета человека и нейтрализующего его биологическую активность, включающего вариабельный участок тяжелой цепи (VH) указанного антитела, содержащего последовательность аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 1; а вариабельный участок легкой цепи (VL) указанного антитела содержит последовательность аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 2 (Фиг. 1).
Поставленная техническая проблема решается также тем, что установлен изолированный фрагмент ДНК, кодирующий VH указанного гуманизированного нейтрализующего моноклонального антитела с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 3 (Фиг. 1).
Поставленная техническая проблема решается также тем, что получен изолированный фрагмент ДНК, кодирующий VL указанного гуманизированного нейтрализующего моноклонального антитела с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4 (Фиг. 1).
Поставленная техническая проблема решается также тем, что получен антигенсвязывающий фрагмент указанного гуманизированного нейтрализующего моноклонального антитела, содержащий вариабельный участок тяжелой цепи (VH) указанного антитела с последовательностью аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 1, и вариабельный участок легкой цепи (VL) указанного антитела с последовательностью аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 2.
Гуманизированное нейтрализующее моноклональное антитело HuB16, селективно связывающее интерферон-бета человека и нейтрализующее его биологическую активность, настоящего изобретения характеризуется тем, что вариабельный участок тяжелой цепи (VH) указанного антитела содержит
(i) CDR1 с последовательностью аминокислот GFTFTSYTMS из SEQ ID NO: 1;
(ii) CDR2 с последовательностью аминокислот YISNGGGSTYYPDTYKG из SEQ ID NO: 1;
(iii) CDR3 с последовательностью аминокислот LDWVFAY из SEQ ID NO: 1.
При этом вариабельный участок легкой цепи (VL) указанного антитела содержит
(i) CDR1 с последовательностью аминокислот KASQDVGTAVA из SEQ ID NO: 2;
(ii) CDR2 с последовательностью аминокислот WASTRHT из SEQ ID NO: 2;
(iii) CDR3 с последовательностью аминокислот LQYSSFPYT из SEQ ID NO: 2.
Гуманизированное нейтрализующее моноклональное антитело HuB 16 сконструировано на основе мышиного моноклонального антитела В16, полученного путем иммунизации мышей Balb/С человеческим рекомбинантным интерфероном-бета, экспрессированным в E.coli (E.coli-HuIFN-β), получением и селекцией линии гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к рекомбинантному интерферону-бета человека, анализа аффинности и специфичности отобранного моноклонального антитела, определения нуклеотидной и аминокислотной последовательности его вариабельных доменов. На основе анализа последовательностей антитела В16 и определения наиболее гомологичных зародышевых линий человека составлены последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей гуманизированного нейтрализующего моноклонального антитела HuB16, проведена валидация последовательностей с помощью создания моделей пространственной структуры, проведена оптимизация кодонов кодирующих последовательностей вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей антитела HuB16. получены сами кодирующие последовательности, на их основе созданы вектора для экспрессии полноразмерной версии гуманизированного антитела HuB16 в клетках СНО. Антитела выделены и их аффинность и специфичность, а также способность нейтрализовать биологическую активность интерферона-бета человека изучены.
Антитела обычно состоят из двух тяжелых цепей, связанных между собой дисульфидными связями, и легких цепей, ассоциироваиных с N-концом каждой из тяжелых цепей. Каждая тяжелая цепь содержит на N-конце вариабельный домен с константным доменом на другом конце. Каждая легкая цепь содержит на N-конце вариабельный домен с константным доменом на другом конце. Вариабельные домены каждой пары легкой и тяжелой цепей образуют антигенсвязывающий участок. Вариабельные домены легкой и тяжелой цепей обладают похожей общей структурой, и каждый домен включает каркас из четырех участков, последовательности которых являются относительно консервативными, связанных посредством трех участков, определяющих комплементарность (complementarity determining regions, CDRs). Четыре каркасных участка формируют конформацию типа бета-складчатого слоя. Участки CDRs расположены в близком соседстве друг с другом благодаря каркасным участкам и вносят вклад в образование антигенсвязывающего участка. Участки CDRs и каркасные участки антител могут быть определены путем ссылки на нумерационную систему Кабата [Kabat numbering system, Kabat et al., 1987 "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office] в сочетании с данными рентгеноструктурного анализа. Участки CDRs и каркасные участки антител могут также быть определены по номенклатуре Международной информационной системы по иммуногенетике [International Immunogenetics Information System, www.imgt.org].
Для получения антитела, которое может связываться с каким-либо специфическим антигеном, обычно используют методику Kohler и Milstein [Kohler et al., (1976) Nature 256: pp. 495-497]. Моноклональные антитела получают путем слияния клеток селезенки из иммунизированного животного и клеток миеломы с получением гибридомы. Гибридомы могут быть проверены на способность к продукции нужного антитела, затем гибридомы могут быть выращены, из них могут быть выделены указанные антитела. Термин «выращенные клетки», использованный здесь, означает гибридомы или другие линии клеток, которые производят антитела. Методы получения и проверки таких выращенных клеток описаны Harlow и др. [Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1988]. Получение материала, использующегося в качестве антигена для инъекции животных, включают в себя методики, хорошо известные из уровня техники, например использование полноразмерного белка, использование пептида, выбранного из иммуногенных участков белка, а также любыми другими методами, известными из уровня техники [Harlow и др. Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1988].
Снижение иммуногенности является одним из направлений повышения эффективности моноклональных антител при их терапевтическом применении для лечения раковых опухолей. Для этого с помощью методов генной инженерии получают химерные и гиперхимерные (гуманизированные) антитела с разным соотношением мышиного и человеческого белка. Химерное антитело содержит 30-35% мышиного и 65-70% человеческого белка, в гиперхимерном (гуманизированном) антителе содержание человеческого белка достигает 90%. а мышиного - только 10%. В результате частота образования нейтрализующих антител в ответ на введение этих модернизированных антител уменьшается с 74% в случае мышиных до 46% - химерных и 0-4% - гиперхимерных (гуманизированных) антител. Кроме того, химеризация и гуманизация антител увеличивают время полужнзни антител в кровотоке. Обычно продолжительность полужизни мышиных антител колеблется от 1 до 3 дней, продолжительность полужизни химерных или гуманизированных антител больше и колеблется от 1 до 15 дней [В.М. Моисеенко. Моноклональные антитела в лечении злокачественных опухолей. Практическая онкология. (2003), Т. 4. No 3. С. 148-156]. Поэтому гуманизация антитела с помощью методов компьютерного моделирования и генной инженерии может повысить эффективность моноклонального антитела при его клиническом применении. Однако, сложностью при таком подходе является вероятность падения аффинности и специфичности антитела при его гуманизации в связи с нарушениями в структуре гуманизированного антитела по сравнению с исходным.
Подходящий способ для выделения антител, эффективных для использования в рамках настоящего изобретения, включает (а) назначение животному эффективного количества белка или пептида с целью получения антител, (b) выделение указанных антител, (с) определение последовательности антител, (d) анализ последовательности на гомологии с зародышевыми линиями антител человека, (е) составление последовательности гуманизированных тяжелых и легких цепей, (f) получение кодирующих последовательностей гуманизированного антитела в составе экспрессионных векторов, (g) биосинтез, выделение и исследование гуманизированного антитела.
Мышей линии BALB с иммунизируют в подушечки задних лап дважды с двухнедельным интервалом. Антиген для первой иммунизации готовят следующим образом: сухой человеческий рекомбинантный интерферон-бета, экспрессированный в E.coli (E.coli-HuIIFN-β, PeproTech, London, cat# 300-02B, Lot#03729 H084), растворяют в фосфатно-солевом буфере. рН 7,2 до концентрации 0,5 мг мл, 100 мкл раствора смешивают с таким же объемом полного адъюванта Фройнда до образования гомогенной эмульсин. Антиген для повторной иммунизации готовят аналогичным образом, но вместо полного используют неполный адъювант Фройнда. Таким образом, разовая доза HuIFN-β составляет 50 мкг/мышь, а общая доза 100 мкг мышь.
На четвертый день после второй иммунизации берут кровь из хвостовой вены у иммунизированной мыши и у контрольной (неиммунизированной) и проверяют на наличие специфических антител против E.coli-HuIFN-β, а также против интерферона-бета, экспрессированного в яйцеклетках хомяка (CHO-HuIFN-β). Тестирование проводят методом иммуноферментного анализа следующим образом: антиген (E.coli-HuIFN-β либо CHO-HuIFN-β) сорбируют в лунках 96- луночного планшета в течение ночи при 4°С в фосфатно-солевом буфере рН 7,2 (ФСБ) в концентрации 2 мкг/мл в объеме 50 мкл.
Затем полученные лимфоциты гибридизуют с клетками миеломы SP2/0. Тестирование супернатантов гибридом проводят методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием E.coli-HuIFN-β. Все первичные культуры, показавшие активность в ИФА, клонируют методом предельных разведений. Отбирают группы клонов - потомков одной первичной культуры. Клетки каждого из субклонов нарабатывают в культуре в количестве, достаточном для получения асцитных жидкостей. Моноклональные антитела, выделенные из асцитной жидкости, сравнивают методом непрямого ИФА, по результатам которого было отобрано антитело В16.
Затем определяют субизотип полученного антитела, оценивают специфичность и иммунореактивность полученного антитела методом непрямого ИФА с сорбированным на планшеты E.coli-HuTFN-β с использованием коммерческих типирующих сывороток: козьи антитела против иммуноглобулинов мыши разных изотипов. Sigma, ISO-2, Cat# М-5532 (anti-IgG1), М-5657 (anti-IgG2a), М-5782 (anti-IgG2b), М-5907 (anti-IgG3), М-6157 (anti-IgM), М-6032 (anti-IgA). В качестве источника антител используют культуральную жидкость гибридомы В16 без разведения, иммунные комплексы выявляют антителами кролика против иммуноглобулинов козы, конъюгированные с пероксидазой хрена. ООО «Импакт». Москва, в разведении, рекомендованном производителем. Субизотип тяжелой цепи полученного антитела В16 определен как IgGl.
Субизотип легкой цепи МоАт В16 определяют аналогичным образом, используя типирующие реагенты: набор Mouse Typer Isotyping Panel, Cat# 1722055, Bio-Rad. Субизотип легкой цепи полученного антитела В16 определен как каппа.
Определяют константу диссоциации моноклонального антитела В16 и его способность нейтрализовать функциональную активность интерферона-бета человека в тестах по ингибированию антипролиферативного действия интерферона-бета человека.
Далее клонируют и секвенируют последовательности кДНК, кодирующих вариабельные домены мышиного антитела В16 к интерферону-бета человека. Для этого выделяют суммарную РНК из клеток гибридом, проводят реакцию обратной транскрипцин-амплификации. Полученные фрагменты ДНК клонируют и секвенируют. Результаты секвенирования ДНК различных клонов сравнивают между собой и с базами данных GeneBank (IgBIast). В результате найдены нуклеотидные последовательности антитела В16, на основании которых определены аминокислотные последовательности вариабельных доменов антитела В16. Участки CDRs определяют по номенклатуре Международной информационной системы по иммуногенетике (International Immunogenetics Information System, www.imgt.org) (Фиг. 2.).
Далее определяют наиболее гомологичные антителу В16 зародышевые линии антител человека, отбирают линии с большей степенью гомологии и меньшим числом неблагоприятных замен. Участки CDRs оставляют без изменения, а каркасные участки мышиного антитела заменяют на гомологичные человеческие. Проводят оптимизацию получаемых последовательностей путем создания моделей пространственной структуры гуманизированного антитела методом моделирования на основании гомологии (веб-сервис Rosetta Antibody). Определяют «возвратные» замены, необходимые для сохранения свойства антитела. На основании полученных аминокислотных последовательностей вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей гуманизированного антитела (SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, Фиг. 1) путем оптимизации кодонов составляют кодирующие последовательности (SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, Фиг. 1). Проводят получение этих последовательностей путем синтеза из олигонуклеотидных праймеров. На основании этих последовательностей конструируют векторы для биосинтеза гуманизированного моноклонального антитела HuB16 в клетках СНО. Проводят выделение антитела HuB16 из культуральной жидкости. Определяют константу диссоциации моноклонального антитела HuB16 и его способность нейтрализовать функциональную активность интерферона-бета человека в тестах по ингибированню антипролиферативного действия интерферона-бета. Константа диссоциации гуманизированного нейтрализующего моноклонального антитела HuB16 и его способность нейтрализовать функциональную активность интерферона-бета человека сравнимы с таковыми исходного моноклонального антитела В16.
В частности, антителом согласно настоящему изобретению является гуманизированное нейтрализующее моноклональное антитело, обладающее способностью к связыванию рекомбинантного интерферона-бета человека и нейтрализации его биологической активности.
Таким антителом является антитело, содержащее последовательность аминокислот не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 1 в качестве вариабельного участка тяжелой цепи (VH) указанного антитела, последовательность аминокислот не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 2 в качестве вариабельного участка легкой цепи (VL) указанного антитела и консервативные участки обеих цепей, необходимых для функционирования указанного антитела. Такое новое антитело селективно связывается с интерфероном-бета человека и нейтрализует его биологическую активность. Консервативные участки тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина IgG, IgM, IgA, IgD или IgE могут быть использованы в качестве консервативных участков для тяжелой цепи согласно настоящему изобретению. Консервативные участки легкой цепи человеческого иммуноглобулина каппа или лямбда могут быть использованы в качестве консервативных участков для легкой цепи антитела согласно настоящему изобретению.
В настоящем изобретении термин "антитело" использован для описания иммуноглобулинов или их фрагментов, мономеров или димеров легкой цепи или тяжелой цепи, одноцепочечных антител, таких как одноцепочечные антитела Fv's, в которых вариабельные домены тяжелой и легкой цепей соединены пептидным линкером, а также как природных, так и полученных методами рекомбинантных ДНК или другим образом, при условии, что антитело содержит, по крайней мере, один антигенсвязывающий участок. Остальная часть антитела не должна обязательно включать только последовательность, производную от иммуноглобулина. Например, может быть сконструирован ген, в котором часть цепи, последовательность ДНК, кодирующая часть цепи человеческого иммуноглобулина, соединена с последовательностью ДНК, кодирующей последовательность аминокислот полипептида эффектора или молекулы-репортера. Используемый в настоящем документе термин «антитело» предназначен для обозначения молекул иммуноглобулина, составленных из четырех полипептидных цепей, при этом две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи связываются друг с другом дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно называемую в настоящем документе YH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов: CH1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенно называемую в настоящем документе VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена: CL. Области VH и VL могут далее подразделяться на области гипервариабельности, которые называются определяющими комплементарность областями (CDR), перемежаемые областями с более высоким уровнем консервативности, называемыми каркасными областями (FR). Каждая область VH и VL образована тремя CDR и четырьмя FR. расположенными от амино-терминального конца к карбокси-терминальному концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
В настоящем изобретении фраза "антитело, обладающее способностью к связыванию с рекомбинантным интерфероном-бета человека» означает молекулу, которая связывается с интерфероном-бета человека и образует стабильный комплекс. Способность антитела к связыванию с антигеном может быть определена специалистом в данной области с использованием методов, включающих, но не ограничивающихся методом иммуноферментного анализа (ИФА). равновесным диализом, с использованием плазмон-поверхностного резонанса. Методы определения аффинности хорошо известны специалисту в данной области техники, подробно описаны Janeway и др. [Immunobiology: The Immune System in Health and Disease (Garland Publishing Company, 1996)].
Изолированным фрагментом ДНК, кодирующим антитело, согласно настоящему изобретению является фрагмент ДНК, кодирующий вариабельные легкую или тяжелую цепи моноклонального антитела, селективно связывающего интерферон-бета человека и нейтрализующего его биологическую активность, содержащего последовательность аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 1, и последовательность аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 2.
Ввиду вырожденности трансляционного кода могут быть различия в последовательности ДНК. Фрагменты ДНК согласно настоящему изобретению не ограничены фрагментами, показанными в SEQ ID NO: 3 или 4 при условии, что они кодируют участки цепей антитела, содержащего последовательность аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 1, и последовательность аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 2.
2
Используемый в настоящем документе термин «антигенсвязывающая область» антитела обозначает один или несколько фрагментов антитела, которые сохраняют способность к специфическому связыванию с антигеном. К примерам связывающих фрагментов, включенных в термин «антигенсвязывающая область» антитела, относятся (i) фрагмент Fab, моноватентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) фрагмент F(ab'), бивалентный фрагмент, состоящий из двух фрагментов Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH отдельной области антитела; (v) фрагмент dAb [Ward et al. (1989) Nature 241: 544-546], состоящий из домена VH; и (vi) отдельная определяющая комплементарность область (CDR). Более того, несмотря на то что два домена в фрагменте Fv, VL и VH кодируются различными генами, их можно объединить, используя рекомбинантные технологии, посредством синтетического линкера, который позволяет построить из них единую белковую цепочку, в которой области VL и VH связываются с образованием моновалентных молекул (известных как одиночная цепь Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также включаются в сферу охвата термина «антигенсвязывающая область» антитела.
Краткое описание чертежей и таблиц, иллюстрирующих изобретение
На Фиг. 1 показаны аминокислотные (SEQ ID NO: 1 и 2) и нуклеотидные (SEQ ID NO: 3 и 4) последовательности гуманизированного нейтрализующего моноклонального антитела HuB16.
На Фиг. 2 показано расположение участков CDRs в вариабельных доменах легких (B16L и HuB 16L) и тяжелых (В16Н и HuB 16Н) цепей исходного мышиного моноклонального антитела И16 и гуманизированного моноклонального антитела HuB 16, соответственно. Участки CDRs подчеркнуты.
На Фиг. 3 показаны нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельных доменов легких цепей МоАт В16 и HuB 16 (выравнивание). Желтым цветом обозначена кодирующая последовательность сигнального пептида легкой цепи МоАт В16, зеленым - кодирующая последовательность вариабельного домена легкой цепи МоАт В16.
На Фиг. 4 показаны нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельных доменов тяжелых цепей МоАт В16 и HuB 16 (выравнивание). Желтым цветом обозначена кодирующая последовательность сигнального пептида тяжелой цепи МоАт В16, зеленым - кодирующая последовательность вариабельного домена тяжелой цепи МоАт В16.
В Таблице 1 приведены результаты определения субизотипов мышиного моноклонального антитела В16 против интерферона - бета человека.
В Таблице 2 приведены параметры уравнения Клотца для МоАт В16.
В Таблице 3 приведены параметры уравнения Клотца для гуманизированного МоАт HuB 16.
В Таблице 4 приведено определение константы диссоциации МоАт В16 и гуманизированного МоАт HuB 16 против интерферона-бета человека.
В Таблице 5 приведено ингибирование антителом В16 антипролиферативного действия интерферона-бета на клетки MCF7 (ОП - оптическая плотность).
В Таблице 6 приведено ингибирование гуманизированным нейтрализующим моноклональным антителом HuB 16 антипролиферативного действия интерферона-бета на клетки MCF7 (ОП - оптическая плотность).
Осуществление изобретения
Последующие примеры приведены для целен объяснения и не ограничивают каким-либо образом рамки настоящего изобретения.
Пример 1. Получение мышиного моноклонального антитела В16 против интерферона-бета человека
Для иммунизации берут шестинедельных мышей линии Balb/c. Мышей линии BALB/c иммунизируют в подушечки задних лап дважды с двухнедельным интервалом. Антиген для первой иммунизации готовят следующим образом: сухой человеческий рекомбинантный интерферон-бета, экспрессированный в E.coli (E.coli-HuIFN-β, PeproTech, London, cat# 300-02B, Lot#03729 H084), растворяют в фосфатно-солевом буфере. рН 7,2 до концентрации 0.5 мг мл, 100 мкл раствора смешивают с таким же объемом полного адъюванта Фройнда до образования гомогенной эмульсин. Антиген для повторной иммунизации готовят аналогичным образом, но вместо полного используют неполный адъювант Фройнда. Для первой иммунизации используют полный адъювант Фройнда, для второй иммунизации, проводимой на 14 день по той же схеме - неполный. Таким образом, разовая доза HuIFN-β составляет 50 мкг мышь, а общая доза 100 мкг мышь.
На четвертый день после второй иммунизации берут кровь из хвостовой вены у иммунизированной мыши и у контрольной (неиммуннзированной) и проверяют на наличие специфических антител против E.coli-HnlFN-β, а также против интерферона-бета, экспрессированного в яйцеклетках хомяка (CHO-HuIFN-β, PeproTech. London, eat#300-02BC Lot#121SB29 H084). Тестирование проводят методом иммуноферментного анализа следующим образом: антиген (E.coli-HuIFN-β либо CHO-HuIFN-β) сорбируют в лунках 96- луночного планшета в течение ночи при 4°С в фосфатно-солевом буфере рН 7,2 (ФСБ) в концентрации 2 мкг мл в объеме 50 мкл. далее проводят иммуноферментный анализ в стандартных условиях.
Мышей забивают, и спленоциты из подколенных лимфоузлов используют для гибридизации с клетками мышиной миеломы.
Полученные лимфоциты гибридизуют с клетками миеломы SP2/0 по стандартной методике с использованием 50% ПЭГ 4000 (Kohler G., Milstein С. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity // Nature. 1975. Vol.256. N 5517. P. 495-497). Клетки высевают в 96-луночные культуральные планшеты (по 6 планшетов на каждую гибридизацию) в ростовой среде DMEM с добавлением фетальной бычьей сыворотки до концентрации 8%, L-глутамина, пирувата, гентамицнна, а также гипоксантина, тимидина и аминоптерина (HAT) в концентрациях, рекомендованных производителями добавок (полная селективная ростовая среда). Рост клеточных колоний оценивают визуально при помощи микроскопа. В большинстве лунок 96-луночных планшетов наблюдают рост 1-2 первичных культур на седьмой-десятый день после гибридизации. От каждой гибридизации получают около 4000 НАТ-устойчивых первичных культур. Тестирование супернатантов гибридом проводят методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием рекомбинантного интерферона-бета человека.
Моноклональные антитела нарабатывают в асцитных жидкостях мышей линии Balb/c. Асцитные жидкости получают введением 1 млн. гибридомных клеток в перитонеальную полость мышей линии BALB/c. Мышам предварительно за неделю до введения клеток внутрибрюшинно вводят пристан по 0,5 мл на мышь. Через 11-14 сут после введения клеток собирают асцитную жидкость.
Определение субизотипов МоАт В16 против интерферона-бета проводят методом непрямого ИФА с использованием коммерческих типирующих сывороток: козьи антитела против иммуноглобулинов мыши разных изотопов. Sigma, ISO-2, Cat# М-5532 (anti-IgG1), М-5657 (anti-IgG2a), М-5782 (anti-IgG2b), М-5907 (anti-IgG3), М-6157 (anti-IgM), М-6032 (anti-IgA). Непрямой ИФА с сорбированным на планшеты E.coli-HuIFN-β проводят в стандартных условиях. В качестве источника антител используют культуральную жидкость гибридомы В16 без разведения, иммунные комплексы выявляют антителами кролика против иммуноглобулинов козы, конъюгарованные с пероксидазой хрена, ООО «Импакт», Москва, в разведении, рекомендованном производителем. Субизотип тяжелой цепи полученного антитела В16 определен как IgG1 (Таблица 1).
Субизотип легкой цепи МоАт В16 определяют аналогичным образом, используя типирующие реагенты: набор Mouse Typer Isotyping Panel, Cat# 1722055, Bio-Rad. Субизотип легкой цепи полученного антитела В16 определен как каппа (Таблица 1).
Таблица 1. Результаты определения субизотипов МоАт В16 против интерферона-бета.
Одноименное антитело выделяют из асцитной жидкости методом аффинной хроматографии на белож G- сефарозе (GE Healthcare, США) в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем и переводят диализом в фосфатно-солевой буфер ФСБ. Степень чистоты МоАт контролируют при помощи электрофореза в 10%-ом поли акрилами дном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) и β-меркаптоэтанола в ступенчатой буферной системе Лэммли (SDS-PAGE), используя Mini PROTEAN 3 Electrophoresis System, а также при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе «АКТА explorer purifier/basic» (GE Healthcare. США) в режиме гель-фильтрации с использованием колонки Superdex 200 (1×40 см). По данным электрофореза в восстанавливающих условиях на геле присутствуют 2 полосы, соответствующие тяжелой и легкой цепям иммуноглобулина мыши IgG1-изотипа.
Пример 2. Клонирование и секвенирование последовательностей кДНК, кодирующих вариабельные домены мышиного антитела В16 к интерферону-бета человека.
6
Гены вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела В16 получают с помощью реакции обратной транскрипции-амплификации тотальной РНК В16. РНК выделяют из 1-2×10 клеток гибридомы В16 с помощью реагента Trizol (Life Technologies, США) согласно рекомендуемому производителем протоколу. Обратную транскрипцию проводят, применяя обратную транекриптазу MMuLV (Евроген, Россия) и олиго(dT18)-праймер. Полученную кДНК амплифицируют с помощью ДНК-полимеразы Tersus (Евроген, Россия) с использованием набора праймеров. комплементарных областям константных доменов МоАт:
Полученные ПЦР-фрагменты длиной 600-650 п. о. клонируют в вектор pAL2-T (Евроген, Россия) и отбирают не менее 10 положительных клонов как для легкой, так и для тяжелой цепи моноклонального антитела В16, после чего с помощью секвенирования определяют нуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельные фрагменты. Затем проводят сравнение нуклеотидных последовательностей с помощью программ Chromas, CLC Sequence Viewer и GeneBee. В результате анализа определяют консенсусные нуклеотидные последовательности вариабельных доменов легкой (последовательность B16L на Фиг. 3) и тяжелой (последовательность В16Н на Фиг. 4) цепей моноклонального антитела В16. На их основании с учетом трансляционного кода определяют аминокислотные последовательности вариабельных доменов тяжелой (Фиг. 2 и Фиг. 4) и легкой (Фиг. 2 и Фиг. 3) цепей моноклонального антитела В16. Для подтверждения достоверности определения аминокислотных последовательностей моноклонального антитела В16 проводят масс-спектрометрический анализ фрагментов трипсинового гидролиза легких и тяжелых цепей исходного моноклонатьного антитела В16. Полученные последовательности оценивают с помощью сравнения с гомологичными последовательностями, находящимися в базе данных GeneBank (IgBlast) и подтверждают их принадлежность к генам вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи антител Mus rausculus. Участки CDRs VL и VH (Фиг. 2) определяют по номенклатуре Международной информационной системы по иммуногенетике (International Inunimogenetics Information System, www.imgt.org).
Таким образом. были получены аминокислотные и нуклеотидные последовательности мышиного моноклонального антитела В16, на основании которых антитело В16 было гуманизировано.
Пример 3. Гуманизация моноклонального антитела В16 и биосинтез полученного гуманизированного моноклонального антитела HuB 16 в клетках эукарнот.
Метод «пересадки CDR» заключается в нахождении последовательностей зародышевых линий антител человека, наиболее гомологичных последовательностям моноклональных мышиных антител, и создании гибридных молекул, содержащих каркасные участки антител человека и гипервариабельные участки исходных мышиных антител. Путем сравнения с последовательностями зародышевых линий человека в сервисе IgBLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) определяют наиболее гомологичные антителу В16 зародышевые линии антител человека и отбирают линии с большей степенью гомологии и меньшим числом неблагоприятных замен. Для легкой цепи моноклонального антитела В16 наибольшую степень гомологии демонстрирует последовательность линии IGKV 1-9*01 для V-сегмента и IGKJ2*01 для J-сегмента, а для тяжелой цепи наиболее гомологичный V-сегмент относится к зародышевой линии IGHV3-23*04 и J-сегмент к линии IGHJ4*03.
Участки CDRs оставляют без изменения, а каркасные участки мышиного антитела заменяют на гомологичные человеческие.
Проводят оптимизацию получаемых последовательностей путем создания моделей пространственной структуры гуманизированного антитела методом моделирования на основании гомологии (веб-сервис Rosetta Antibody), Реализация этого метода включает следующие шаги: 1) поиск шаблонов среди антител с известной пространственной структурой и сходной аминокислотной последовательностью, 2) построение начальных моделей с использованием консервативных фрагментов шаблонов и VH/VL последовательности запроса, 3) улучшение начальных моделей путем подбора оптимальных конформаций основной цепи VH/VL и боковых цепей по всем моделям в целом. Полученные стартовые модели дополнительно оптимизируют с учетом окружающего растворителя, для чего в программе Gromacs (http://www.gromacs.org/) с использованием силового поля charmm36 проводят расчет молекулярной динамики (МД) моделей в водном растворе при температуре 300К и физиологической концентрации NaCl в течение 10 не. Анализ МД показывает, что модели принимают свои равновесные конформации уже через 1 не. Полученные траектории МД подвергают кластерному анализу и наиболее представительные конформации для каждой из стартовых моделей в дальнейшем используются в качестве окончательных моделей, анализ которых позволяет сформулировать ряд «возвратных» замен в каркасных участках VH (Q3K, S49A, K94R) и VL (L4M, L78V) гуманизированного моноклонального антитела к интерферону-бета человека.
На основании полученных аминокислотных последовательностей вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей гуманизированного антитела HuB 16 (SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, Фиг. 1) путем оптимизации кодонов составляют кодирующие последовательности тяжелой и легкой цепей гуманизированного антитела HuB 16 (SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, Фиг. 1). Проводят получение этих последовательностей путем синтеза из олигонуклеотидных праймеров.
На основании этих последовательностей конструируют векторы для биосинтеза гуманизированного моноклонального антитела HuB 16 в клетках СНО. Для этого кодирующую последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела HuB 16 состыковывают с кодирующей последовательностью сигнального пептида легкой цепи исходного моноклонального антитела В16 и кодирующей последовательностью каппа константного домена легкой цепи антител человека и помещают в экспрессионный вектор. Аналогично кодирующую последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела HuB 16 состыковывают с кодирующей последовательностью сигнального пептида тяжелой цепи моноклонального антитела В16 и кодирующей последовательностью IgG1 константных доменов тяжелой цепи антител человека и помещают в экспрессионный вектор.
2
2
2
6
Клетки яичника китайского хомячка СНО DG44 (dhjr -/-) используют для секретеруемой экспрессии рекомбинантного гуманизированного моноклонального антитела HuB 16. Для этого клетки культивируют в колбах Эрленмейера в СО-инкубаторе при 37°С, 95% влажности и 8% СО в стандартной бессывороточной среде CD DG44 (Invitrogen) с добавлением 200 мМ раствора L-Глутамина до конечной концентрации 8 мМ и содержащей 0,18% (v/v) Phironic F-68 (Invitrogen. USA) до концентрации 4×10 клеток/мл 24 часа до трансфекции. Во флаконы Эрленмейера объемом 125 мл засевают 30 мл клеточной суспензии (4,5 млн клеток) при постоянном перемешивании на орбитальном шейкере с частотой 130 об мин и через 20-24 ч проводят трансфекцию с использованием трансфецирующего реагента Lipofectamme-3000 Transfection Kit (Invitrogen, USA) согласно стандартному протоколу производителя [Lipofectamme-3000 Reagent Protocol, https://tools.tliermofisher.com/content/sfs/manuals/lipofectamine3000_protocol.pdf]. Плазмидную ДНК добавляют к клеткам в виде ДНК-липосомного преципитата. Куль туральный флакон инкубируют при температуре 37°С, 95% влажности, в атмосфере 8% CO и непрерывном перемешивании 130 об мин. После 7-9 дней инкубации культуры осаждают центрифугированием при 1200 оборотах мин в течение 10 минут. Супернатант дополнительно центрифугируют при 4000 оборотов мин в течение 15 минут.
Измерение концентрации клеток и их жизнеспособности проводят с использованием 0.04% раствора трипанового синего в камере Горяева. Продуктивность измеряют с помощью иммуноферментного анализа по стандартной методике.
2
4
Проводят выделение антитела HuB16 из культуральной жидкости на колонке с носителем HiTrap KappaSelect (GE Healtcare) объемом 5 мл. К культуральной жидкости добавляют 0,1 объема 10-кратного Tris-HCl буфера (200 мМ Tris-HCl, 1,5 М NaCl рН 7.2) и наносят на предварительно уравновешенную колонку при скорости потока 2-3 мл мин при давлении не более 0,5 МПа. Колонку промывают буфером Tris-HCl объемом равным 5 объемам колонки. Элюцию осуществляют с помощью глицинового буфера (0.1 М глицин. рН 3.0). Элюированный раствор нейтрализуют, добавляя 0,1 объема буфера для нейтрализации (1 М Tris рН 8.0). Полученный раствор белка диализуют против фосфатного буфера (0.01 М NaHPO, 0.137 M NaCl, 0.0027 М KCl, рН 7,2) и стерилизуют через мембранные фильтры 0.22 мкм. Оценку гомогенности и степени очистки препарата проводят с использованием электрофоретического метода. Дополнительно образцы характеризуют с помощью гель-фильтрации по стандартной методике.
Пример 4. Анализ мышиного моноклонального антитела В16 и гуманизированного моноклонального антитела HuB 16 против интерферона-бета человека.
Метод оценки количественных параметров, характеризующих специфическую активность моноклональных антител против интерферона-бета, основан на измерении константы диссоциации комплекса антиген-антитело в растворе, т.к. именно этот параметр количественно определяет аффинность и специфичность взаимодействия МоАт с целевыми белками E.coli-HuIFN-P и CHO-HuIFN-β и не зависит от концентрации антител. В основу методики определения Кд положен двухстадийный анализ, предложенный Фриге и соавторами в 1985 [В. Fnguet et. al. Measurements of the True Affinity Constant in Solution of Antigen-Antibody Complex by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Journal of Immunological Methods, 77 (1985) 305-319]. На первом этапе проводят инкубацию МоАт в постоянной концентрации с антигеном интерфероном-бета в диапазоне концентраций 0.18-240 нМ в течение 2 часов при комнатной температуре с постоянным перемешиванием на шейкере для достижения термодинамического равновесия в трехкомпонентной системе: свободный антиген, свободное антитело и комплекс антиген-антитело. На втором этапе осуществляют измерение концентрации свободных антител методом твердофазного ИФА с иммобилизованным на планшет интерфероном-бета. На заключительном этапе рассчитывают Кд по уравнению Клотца с использованием значений общей концентрации антигена и концентрации свободных МоАт [Klotz I.M. The Proteins. Ed. H. Neurath and К. Bailey Academic Press. New York. 1953. V.I.Р.727].
Для построения калибровочных кривых используют диапозон концентраций моноклональных антител В16 и HuB 16 от 200 нг мл до 10 нг мл.
Константу диссоциации (Kd) рассчитывают по уравнению Клотца:
Ао/Ао-А=1+1/а Kd, где
Ао - оптическая плотность, измеренная для антител в отсутствии антигена А - оптическая плотность, измеренная для свободных антител в смеси антиген-антитело.
а - концентрация антигена.
Значения этих параметров для МоАт В16 приведены в Таблице 2, для гуманизированного моноклонального антитела HuB16 - в Таблице 3. Константа диссоциации МоАт В16 определена как 3,2 nM, а гуманизированного МоАт HuB 16 - как 3,3 nM (Таблица 4). Концентрацию МоАт, для измерения Kd выбирают на линейном участке калибровочной кривой.
Таблица 2. Параметры уравнения Клотца для МоАт В16.
Таблица 3. Параметры уравнения Клотца для гуманизированного МоАт HuB 16. Таблица 4. Определение константы диссоциации МоАт В16 и гуманизированного МоАт HuB 16 против интерферона-бета человека.
Пример 5. Определение способности гуманизированного моноклонатьного антитела HuB 16 нейтрализовать функциональную активность интерферона-бета человека в тестах по ингибированию антипролиферативного действия интерферона-бета в сравнении с исходным антителом В16.
2
4
Постановку антипролиферативного теста осуществляют следующим образом. Клетки MCF7 ((АТСС НТВ-22™) карцинома рака груди) выращивают в чашках Петри до 80-90% монослоя в полной ростовой среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Монослой промывают дважды буфером ФСБ (0,01 М КНРО, 0,1 М NaCl;), затем инкубируют с буфером ФСБ с добавлением 1 мМ ЭДТА в течение 5 минут при помешивании. Затем клетки отделяют от подложки пипетированием в ФСБ с добавлением 1 мМ ЭДТА и центрифугируют в течение 10 минут при 1200 об мин. Клеточный осадок ресуспендируют в полной ростовой среде DMEM с добавлением 2% ЭТС, подсчитывают в камере Горяева и высаживают в 96-луночный планшет из расчета 5 тысяч клеток в 100 мкл суспензии на лунку. Краевые лунки заполняют денонизованной водой.
2
Через 24 часа готовят разведения интерферона-бета 1000 ед мл (дающее около 50% ингнбнрования роста клеток), интерферона-бета 1000 ед мл с моноклональнымн антителами от 50 мкт мл (молярное соотношение 1>>100), моноклональных антител 50 мкг мл в полной ростовой среде DMEM с 2% ЭТС. Каждое разведение делают в трех повторах. Позитивные контр о ли - лунки без интерферона-бета: 0 (среда) и 0+50 (среда с максимальной концентрацией антител 50 мкпмл). Негативные контроли - лунки с интерфероном-бета без антител (ИФН 1000 ед мл). Смеси интерферона-бета с антителами инкубируют в течение 60 минут в СО-инкубаторе при температуре 37°С для формирования иммунных комплексов.
2
Приготовленные разведения вносят в лунки планшетов по 100 мкл. Инкубацию проводят в течение 72 часов. В лунки добавляют МТТ до конечной концентрации 0,05% и помещают в СО-инкубатор на 4 часа при температуре 37°С. После инкубации с МТТ супернатанты вытряхивают из лунок и добавляют по 100 мкл в лунку диметолсульфоксида и держат на шейкере при комнатной температуре в течение 15 минут.
Оптические плотности в лунках определяют при помощи спектрофотометра Thermo Multiscan EX при длине волны 594 нм. Результаты для антитела В16 к интерферону-бета человека приведены в Таблице 5. для гуманизированного моноклонального антитела HuB 16 - в Таблице 6. HuB 16 демонстрирует способность нейтрализовать антипролиферативное действие интерферона-бета человека, сравнимую с исходным моноклональным антителом В16.
Таблица 5. Ингибирование моноклональным антителом В16 антипротиферативного действия интерферона-бета на клетки MCF7 (ОП - оптическая плотность).
Таблица 6. Ингибирование гуманизированным нейтрализующим моноклональным антителом HuB 16 антипролиферативного действия интерферона-бета на клетки MCF7 (ОП - оптическая плотность).
Константа диссоциации гуманизированного нейтрализующего моноклонального антитела HuB 16 и его способность нейтрализовать функциональную активность интерферона-бета человека сравнимы с таковыми исходного моноклонального антитела В16. Потери аффинности и специфичности после гуманизации антитела не наблюдается.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН)
<120> Гуманизированное нейтрализующее антитело к интерферону-бета
человека
<160> 4
<210> SEQ ID NO:1
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 1
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Asn Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Leu Asp Trp Val Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
<210> SEQ ID NO:2
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210> SEQ ID NO:3
<211> 349
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
gaggtgaagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggctc 50
actgagactg agctgtgctg ccagtggctt caccttcacc agctacacca 100
tgagctgggt gagacaagct cctggcaaag gcttggagtg ggttgcctac 150
atcagcaatg gtggaggctc cacctactat cccgacaccg tgaagggcag 200
gttcaccatc agcagagaca actccaagaa caccttgtac ctgcagatga 250
acagcctgag agccgaagac acagccgtgt actactgtgc cagactggac 300
tgggtgtttg cctactgggg tcaaggcacc cttgtgacag tgtcctctg  349
<210> SEQ ID NO:4
<211> 322
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
gacatccaga tgacccagtc acccagcttt ctgtctgcct cagttggaga 50
cagagtgacc atcacctgca aggcttctca agacgttggc acagccgttg 100
cctggtatca gcagaagcct ggcaaagctc ccaagctgtt gatctactgg 150
gcaagcacca gacacacagg agttccagac aggttcagtg gctcaggctc 200
tggcacagag ttcactctga ccatcagctc agtgcagcca gaggactttg 250
ccacctacta ctgtctgcag tactccagct ttccctacac cttcggacaa 300
ggcaccaagc tggagatcaa ac                               322
<---