СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ N-[3-(4-НИТРОФЕНИЛАМИНО)-ИНДОЛ-2-ИЛМЕТИЛЕН]АМИНОГУАНИДИНА МЕТАНСУЛЬФОНАТА В ПЛАЗМЕ КРОВИ
METHOD FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF N-[3-(4-NITROPHENYLAMINO)-INDOLE-2-YLMETHYLENE]AMINOGUANIDINE METHANESULPHONATE IN BLOOD PLASMA

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Изобретение относится к области медицины, а именно к фармакологии и токсикологии, и может быть использовано для определения N-[3-(4-нитрофениламино)-индол-2-илметилен]аминогуанидина метансульфоната в плазме крови.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Производное аминогуанидина - N-[3-(4-нитрофениламино)-индол-2-илметилен]аминогуанидина метансульфонат является действующим веществом разрабатываемого противовоспалительного средства для лечения воспалительных и дегенеративных заболеваний опорно-двигательного аппарата.
Одной из актуальных задач при создании нового лекарственного средства является проведение исследований фармакокинетики с целью оценки всасывания, распределения, метаболизма и экскреции. Для проведения исследований фармакокинетики требуется разработать биоаналитическую методику количественного определения действующего вещества в биологических средах, в частности в плазме крови.
В настоящее время не известно способов количественного определения N-[3-(4-нитрофениламино)-индол-2-илметилен]аминогуанидина метансульфоната в плазме крови и других биологических средах организма. Для поиска возможных прототипов проведен анализ сведений о методах определения веществ с подобной химической структурой, в частности - производных аминогуанидина и производных индола, используемых в качестве действующих веществ лекарственных средств.
Известен способ количественного определения аминогуанидина в плазме крови и других биологических образцах с использованием экстракции вещества из образцов трихлоруксусной кислотой, реакции с 6-метил-2-пиридин-карбоксальдегидом при температуре 95-100°С, и определением вещества методом ВЭЖХ с использованием в качестве подвижной фазы смеси ацетонитрил (15%) : метанол (10%) : 0,01 М гептансульфоната в растворе натри фосфорнокислого однозамещенного и УФ-детектированием при длине волны 302 нм [патент US 5108930, МПК G01N 33/00, опубл. 28.04.1992].
В качестве прототипа использован описанный ранее способ количественного определения производного индола-сертиндола (1-[-2-[4-[5-Хлор-1-(4-фторфенил)-1Н-индол-3-ил]-1-пиперидинил]этил]-2-имидазолидинона). Данный способ основан на методе ВЭЖХ с УФ-детектированием при длине волны 230 нм, с использованием в качестве подвижной фазы А-0,1% раствора кислоты трифторуксусной, фазы Б - ацетонитрила с градиентом концентраций 10-90% [Ремезова И.П. и соавт. Разработка методик обнаружения некоторых атипичных нейролептиков для целей химико-токсикологического анализа. Фармация и фармакология. 2014, №6 (7), С. 54-58].
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Предлагаемое изобретение решает задачу разработки нового способа количественного определения действующего вещества противовоспалительного лекарственного средства - N-[3-(4-нитрофениламино)-индол-2-илметилен] аминогуанидина метансульфоната в плазме крови.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Поставленная задача решается способом количественного определения N-[3-(4-нитрофениламино)-индол-2-илметилен]аминогуанидина метансульфоната в плазме крови, включающим экстракцию определяемого вещества ацетонитрилом с добавлением натрия хлорида с последующим определением его методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с градиентным режимом элюирования с использованием в качестве подвижной фазы А - смеси 0,2 М раствора лития перхлората в 0,005 М растворе хлорной кислоты, подвижной фазы Б - ацетонитрила, с последующим УФ-детектированием при длине волны 330 нм.
Наиболее оптимальными, но не необходимыми хроматографическими условиями при этом являются:
Общее время анализа
- 25 мин;
Колонка
- колонка ProntoSIL, 75×2,0 мм, 5 мкм (ООО ИХ «ЭкоНова»);
Температура колонки
- 35°С;
Скорость потока
- 0,15 мл/мин;
Детектор
- спектрофотометрический, 330 нм;
Объем пробы
- 20 мкл.
Аналитическую длину волны подбирали по результатам анализа УФ-спектра N-[3-(4-нитрофениламино)-индол-2-илметилен]аминогуанидина метансульфоната (далее по тексту - субстанция LIS-M) в смеси ацетонитрил-ПФ А в соотношении (1:1) (Фиг. 1) и особенностей матрицы, в которой необходимо проводить количественное определение. На УФ-спектре субстанции LIS-M в области от 210 до 400 нм наблюдается 3 максимума поглощения - 230, 255 и 330 нм. 330 нм выбрана основной аналитической длиной волны, так как она является наиболее селективной и характеризуется практически полным отсутствием поглощения другими компонентами матрицы.
Отсутствие источников информации, содержащих ту же совокупность признаков, что и в разработанном способе, сообщает ему соответствие критерию «новизна».
Та же совокупность признаков позволяет получить новый непредсказуемый эффект - разработка высокоэффективного способа количественного определения в плазме крови нового лекарственного средства - N-[3-(4-нитрофениламино)-индол-2-илметилен]аминогуанидина метансульфоната и, таким образом, сообщает ему соответствие критерию «изобретательский уровень».
Проведение количественного определения нового лекарственного средства с использованием известного оборудования с помощью известных препаратов сообщает разработанному способу соответствие критерию «промышленная применимость».
Таким образом, разработанный способ соответствует всем 3 критериям охраноспособности изобретения и может быть квалифицирован как изобретение.
На Фиг. 1 представлен УФ-спектр субстанции LIS-M.
Пример 1. Подбор условий извлечения определяемого вещества
Для извлечения определяемого вещества из плазмы крови используется несколько подходов. Наиболее простой и быстрый способ пробоподготовки - осаждение белков органическими растворителями с последующим центрифугированием. Кратность разбавления образца при этом варьируется от 1 до 5, а степень извлечения определяемого вещества обычно находится в интервале 90-100%. После центрифугирования надосадочную жидкость (супернатант) вводят в хроматографическую систему. После осаждения белка в пробе остается большое количество компонентов, которые могут помешать при определении исследуемого вещества. Также при осаждении белков очень проблематично сконцентрировать образец, что не позволяет снизить предел обнаружения.
Другой метод подготовки проб - жидкостно-жидкостная экстракция. Данный метод удобно применять, если требуется концентрирование исследуемого вещества перед определением. Степень извлечения методом жидкостно-жидкостной экстракции составляет обычно 70-90% и при этом концентрацию определяемого ЛВ в инжектируемом образце можно повысить в 5-10 раз по сравнению с исходной пробой, что позволяет существенно снизить предел обнаружения. Таким образом, для проведения фармакокинетических исследований нового лекарственного средства LIS-M более оптимально использовать метод жидкостно-жидкостной экстракции.
Исходя из физико-химических свойств субстанции LIS-M были использованы два экстрагента: ацетонитрил и этилацетат.
Экстракция LIS-M из раствора этилацетатом
В 3 пластиковых центрифужных микропробирки типа «Эппендорф» вместимостью 2 мл помещали по 500 мкл раствора LIS-M, с содержанием 1 мкг/мл, прибавляли 50 мкл 20% раствора натрия гидроксида и перемешивали на встряхивателе типа «Vortex» при 3000 об/мин в течение 1 мин. Экстрагировали на встряхивателе типа «Vortex» при 3000 об/мин в течение 10 мин. Центрифугировали при 16060 g в течение 10 мин. Органический слой отбирали и упаривали под вакуумом при температуре 50°С до сухого остатка. К сухому остатку прибавили 500 мкл смеси ПФ А - ПФ Б в соотношении (1:1), перемешали на встряхивателе типа «Vortex» при 3000 об/мин в течение 10 мин.
Экстракция LIS-M из раствора ацетонитрилом
В 3 пластиковых центрифужных микропробирки типа «Эппендорф» вместимостью 2 мл помещали по 500 мкл раствора LIS-M, с содержанием 1 мкг/мл. Экстрагировали на встряхивателе типа «Vortex» при 3000 об/мин в течение 10 мин. Центрифугировали при 16060 g в течение 10 мин. Органический слой отбирали и упаривали под вакуумом при температуре 50°С до сухого остатка. К сухому остатку прибавили 500 мкл смеси ПФ А - ПФ Б в соотношении (1:1), перемешали на встряхивателе типа «Vortex» при 3000 об/мин в течение 10 мин.
Для определения степени извлечения полученные результаты сравнивали с аналитическим сигналом, полученным для раствора LIS-M, с содержанием 1 мкг/мл.
Результаты определения степени извлечения представлены в таблице 1.
Как видно из таблицы 1, наибольшая степень извлечения достигается ацетонитрилом. Таким образом, данный экстрагент можно использовать для экстракции LIS-M из биологических сред.
Были проведены валидационные тесты, в ходе которых не обнаружено отклонений от установленных критериев приемлемости.
Пример 2. Подтверждение точности.
Точность биоаналитической методики характеризуется близостью полученных с помощью нее значений к номинальным концентрациям аналита.
Точность внутри цикла.
Был проанализирован один аналитический цикл, состоящий из четырех уровней концентраций, по 5 образцов на каждом уровне. Уровни концентрации: 50 нг/мл (нижний предел количественного определения - НПКО), 150 нг/мл (тройная величина НПКО), 1000 нг/мл (50% диапазона калибровочной кривой - КК) и 1500 нг/мл (75% от верхнего диапазона калибровочной кривой).
Критерий приемлемости:
- отклонение среднего значения каждого уровня концентрации от номинального содержания должно быть в пределах 15% для всех уровней концентрации, кроме НПКО для которой допускается отклонение 20%.
Результаты определения точности представлены в таблице 2.
Отклонение от номинального значения средних значений рассчитанных концентраций находится в диапазоне от -6,11 до 2,82%, что удовлетворяет критерию приемлемости.
Точность между циклами
В течение не менее двух дней были проанализированы три аналитических цикла, состоящий из четырех уровней концентраций, по 5 образцов на каждом уровне. Уровни концентрации: НПКО, тройная величина НПКО, около 50% диапазона калибровочной кривой и не менее 75% от верхнего диапазона калибровочной кривой.
Критерий приемлемости:
Отклонение среднего значения каждого уровня концентрации от номинального содержания должно быть в пределах 15% для всех уровней концентрации, кроме НПКО для которой допускается отклонение 20%.
Результаты определения точности между циклами представлены в таблицах 3-6.
Отклонение от номинального значения средних значений рассчитанных концентраций для всех аналитических циклов находится в диапазоне от -4,13 до 2,82%, что удовлетворяет критерию приемлемости.
Как видно из приведенных примеров, предлагаемое изобретение позволяет получить необходимую и достоверную информацию о способе количественного определения N-[3-(4-нитрофениламино)-индол-2-илметилен]аминогуанидина метан-сульфоната в биологических средах.