ТАБЛЕТИРОВАННАЯ ЖИВАЯ РЕКОМБИНАНТНАЯ БИВАКЦИНА "РЕВАКС ВКТ" ПРОТИВ НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ И ГЕПАТИТА B ДЛЯ ЭНТЕРАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ

Полезная модель относится к сухим формам вакцинных препаратов энтерального применения и может быть использована в медицине, в частности, в иммунологии для специфической профилактики вирусного гепатита В и натуральной оспы.
8
Известна живая рекомбинантная вакцина для профилактики гепатита В и натуральной оспы для накожного применения в сухой лиофилизированной форме (патент РФ №2073524, МПК А 61 К 39/29; С 12 N 15/86, опубл. 20.02.97 г.). Вакцина содержит штамм рекомбинантного вируса осповакцины (ВОВ) ГКВ №2131 (b7,5S2-S) с титром (3-5)×10 ООЕ/мл, способного синтезировать preS2 и HbsAg вируса гепатита В и пептон в качестве стабилизатора при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Штамм рекомбинантного вируса
осповакцины ГКВ №2131с указанным
90-95
титром
Пептон
5-10
7
Недостатками известной вакцины является то, что в ней используют в качестве стабилизирующей добавки один пептон, что не достаточно обеспечивает сохранение активности вирусного материала в процессе его лиофилизации,кроме того, необходимость использования высоких доз вакцины (>10 ООЕ/мл) для иммунизации с целью получения специфических защитных титров антител, низкая производительность применения этого препарата при накожной вакцинации, необходимость квалифицированного медицинского персонала для проведения вакцинации, угроза инфицирования прививаемого пациента вирусами иммунодефицита, гепатитов и др. При вакцинации скарификацией возможно выделение вируса осповакцины в окружающую среду, что грозит неконтролируемой его передачей к непривитым людям с риском развития тяжелых осложнений.
Наиболее близким аналогом - прототипом вакцины является таблетированная живая рекомбинантная бивакцина против натуральной оспы и гепатита В на основе ВОВ для энтерального применения, содержащая в одной таблетке, покрытой кислоустойчивой оболочкой, лиофилизированный вирусный материал(наработанный на куриных эмбрионах - КЭ) на основе рекомбинантного штамма ВОВ ГКВ №2131 с типичными свойствами ВОВ, экспрессирующего preS 2-Ag и HbsAg вируса гепатита В с активностью 6,5-8,0 lg OOE на таблетку, лактозу, сахарозу, стеарат кальция и ванилин (патент РФ №2076735, МПК А 61 К 39/00; С 12 N 15/00, опубл. 10.04.97 г.).
Недостатком известной таблетированной вакцины является то, что в ней используют в качестве стабилизирующей добавки одну лактозу, что не достаточно обеспечивает сохранение активности вирусного материала в процессе его лиофилизации и особенно таблетирования и необходимость использования относительно высоких доз вакцины (6,5-8,0 lg OOE на таблетку) для иммунизации с целью получения защитных специфических титров антител.Кроме того, активный вирусный материал нарабатывается на развивающихся КЭ, что не исключает содержание в препарате дополнительных примесей и его контаминацию посторонней микрофлорой, требует дополнительный биологический контроль.
Техническим результатом предлагаемой полезной модели является создание такой бивакцины против натуральной оспы и гепатита В, которая позволила бы получить вируссодержащий материал в более очищенном виде, обеспечить сохранение активности этого вируссодержащего материала в процессе лиофилизации и таблетирования, снизить вероятность контаминации готового препарата посторонней микрофлорой, а также упростить технологию производства и обеспечить возможность стандартизации основных технологических этапов получения вакцины, без потери активности достигать кишечника (орган-мишень для получения иммунизирующего эффекта), при более низкой иммунизирующей дозе вызывать формирование защитного уровня специфического иммунитета.
Указанный технический результат достигается тем, что в таблетированной живой рекомбинантной бивакцине против натуральной оспы и гепатита В для
энтерального (через кишечник) применения, представляющей собой таблетку, состоящую из ядра и находящейся поверх ядра кислотоустойчивой оболочки, причем ядро включает лиофилизированный вирусный материал, наработанный на основе рекомбинантного штамма ВОВ ГКВ №2131 с типичными свойствами ВОВ, экспрессирующего preS 2-Ag и HbsAg вируса гепатита В, с активностью 4,5-6,0 lg БОЕ на таблетку лактозу, сахарозу, стеарат кальция и ванилин. Согласно полезной модели, ядро таблетки дополнительно содержит пептон, желатозу и солевой буфер, а вирус осповакцины наработан на перевиваемых культурах клеток животных при следующем соотношении компонентов в ядре на одну таблетку (мас.%):
лиофилизированный вирусный материал осповакцины с активностью 4,5,0-6,0 lg БОЕ на таблетку
1,04-31,3
пептон
0,12-3,8
желатоза
0,06-1,9
сахароза
10,1-11,55
солевой буфер
0,001-0,027
стеарат кальция
1,94-2,0
ванилин
0,17-0,2
лактоза остальное до
100%.
Кислотоустойчивая оболочка таблетки перед ее 4-х кратным нанесением на поверхность ядра содержит шеллак, кислоту олеиновую, аммиак водный 25%-ный и дистиллированную воду при следующем содержанием компонентов в весовых частях:
Шеллак
10,0
Кислота олеиновая
2,0
Аммиак водный 25 %-ный
3,0
Вода дистиллированная
85,0
Механизм действия вакцины: таблетка с кислотоустойчивой оболочкой без потери активности достигает кишечника (орган-мишень для получения иммунизирующего эффекта), при более низкой иммунизирующей дозе вызывает формирование защитного уровня специфического иммунитета на маркер гепатита В и вирус осповакцины.
На фиг.1 изображена таблетированная форма препарата в разрезе. Таблетированная живая рекомбинантная бивакцина против натуральной оспы и гепатита В для энтерального применения содержит двояковыпуклую таблетку, состоящую из ядра 1 и находящейся поверх ядра 1 кислоустойчивой оболочки 2 (фиг.1). Таблетированная форма распадается в кишечном тракте под действием влаги, имеющей щелочную рН, и температуры организма.
Ниже приведены примеры 1-4 составов ядра 1 таблетки живой рекомбинантной бивакцины против натуральной оспы и гепатита В энтерального применения (через кишечник).
Пример 1.
Лиофилизированный материал с рекомбинантным штаммом ВОВ с активностью 4,5 lg БОЕ на таблетку 1,04;
пептон
0,12;
желатоза
0,06;
сахароза
10,10;
мочевина
0,20;
буфер
0,001;
стеарат кальция 2,0 ванилин 0,2;
лактоза остальное до 100%.
Пример 2.
Лиофилизированный материал с рекомбинантным штаммом ВОВ с активностью 5,0 lg БОЕ на таблетку
3,20;
пептон
0,38;
желатоза
0,19;
сахароза
10,29;
мочевина
0,01;
буфер
0,003;
стеарат кальция
1,99
ванилин
0,2;
лактоза остальное до
100%.
Пример 3.
Лиофилизированный материал с рекомбинантным штаммом ВОВ с активностью 5,5 lg БОЕ на таблетку
10,40;
пептон
1,20;
желатоза
0,60;
сахароза
10,85;
буфер
0,009;
стеарат кальция
1,97
ванилин
0,19;
лактоза
остальное до 100%.
Пример 4.
Лиофилизированный материал с рекомбинантным штаммом ВОВ с активностью 5,0 lg БОЕ на таблетку
31,30;
пептон
3,80;
желатоза
1,90;
сахароза
11,55;
буфер
0,027;
стеарат кальция
1,94
ванилин
0,17;
лактоза
остальное до 100%.
Штамм рекомбинантного ВОВ ГКВ №2131 (b7,5S2-S) депонирован в государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского (патент РФ №1575576, С 12 N 15/00, опубл. 1994 г.).
Желатоза - частично гидролизованный желатин - компонент стабилизатора; мочевина - хелатирующий агент, компонент стабилизатора. Лактоза (ТУ 6-09-2293-77), стабилизатор и наполнитель; сахароза (ГОСТ 5833-75), стабилизатор и
органолептик; стеарат кальция (ТУ 6-09-4233-76) - скользящая добавка; ванилин (ГОСТ 16599-71), органолептик.
Пример 5. Кислотоустойчивая оболочка 2 ядра 1 таблетки (фиг.1) перед ее 4-х кратным нанесением на поверхность ядра содержит шеллак, кислоту олеиновую, аммиак водный 25%-ный и дистиллированную воду при следующем содержанием компонентов в весовых частях:
Шеллак
10,0
Кислота олеиновая
2,0
Аммиак водный 25%-ный
3,0
Вода дистиллированная
85,0
Пример 6.
Способ получения таблетированной живой рекомбинантной бивакцины "Ревакс ВКТ" с кислотоустойчивой оболочкой
6
Вначале проведена проверка однородности вирусных материалов, полученных путем 10-кратного пассирования музейного штамма ГКВ №2131 (b7,5S2-S) на перевиваемых культурах клеток Vero и 4647. Для этого проведены исследования пассажного материала (5 и 10-й пассажи) путем анализа экспрессии HBs-антигена - методом ИФА и наличие встройки pre-S2-S гена в вирусной ДНК - методом ПЦР. Необходимость этих исследований диктуется требованиями производства препарата, когда количество пассажей производственного штамма на клеточных культурах-поду центах может достигнуть 10. В результате этих исследований было отмечено, что пассажный материал (5 и 10-й пассажи на культурах клеток Vero и 4647) не содержат примесей ВОВ дикого типа и экспрессирует HBs-антиген на уровне 100-200 нг/10 клеток. Это свидетельствует о высокой стабильности созданной генетической конструкции и открывает перспективы использования любой из испытанных культур клеток для производства бивакцины против натуральной оспы и гепатита В.
После этого выращивают монослои перевиваемых культур клеток почки зеленой мартышки №4647 или VERO на питательной среде ДМЕМ с 10%-ной сывороткой крупного рогатого скота или 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой. Использованную среду сливают и монослой клеток помещают в роллерные бутыли объемом, например, 2 литра с питательной средой ДМЕМ или Игла MEM с 2%-ной сывороткой крупного рогатого скота или 2%-ной
эмбриональной телячьей сывороткой в количестве 200 мл на бутыль. Клетки инфицируют штаммом рекомбинантного ВОВ ГКВ №2131 (b7,5S2-S) с дозой заражения - 1,0-100,0 БОЕ на клетку. Культивирование проводят при скорости вращения бутылей 3-12 оборотов в минуту до 50-70% цитопатического эффекта (при этом условии достигается наиболее высокая урожайность вируса). Ниже в таблице 1 приведены результаты культивирования.
Таблица 1Данные о накоплении штамма b7,5S2-S вируса осповакцины в культурах клеток 4647 и Vero при роллерном культивировании
Номер эксперимента
Концентрация вируса в lg БОЕ/мл в культурах клеток (I<sub>95</sub>=± 0,5 lg БОЕ/мл)
4647
Vero
1
7,0
7,0
2
7,5
7,3
3
7,5
7,5
4
7,3
6,8
Примечание. (*) - низкая плотность клеточного монослоя перед его инфицированием.
Далее питательную среду (200 мл в одной бутыли) заменяют на буферный раствор с объемом (20 мл), то есть в 10 раз меньшим, чем объем питательной среды. В качестве буферного раствора используют 0,1 М Tris для поддержания рН=8,8-9,0. Замена питательной среды на меньший по объему буфер (0,1М Tris с рН 8,8-9,0) перед экстракцией вируса из животных клеток производится с целью снижения объема вирусной биомассы (при сохранении общего количества жизнеспособных вирусных частиц), что сокращает финансовые и временные затраты при проведении процесса последующей лиофилизации вирусного материала. Получение вируссодержащего материала осуществляют после замены питательной среды на буферный раствор путем экстракции вируса при трехкратном замораживании при температуре минус 20°С в течение не менее 5 часов и оттаивании клеточного монослоя при температуре плюс 20°С в течение не менее 1 часа. Далее полученную вируссодержащую суспензию отстаивают и отделяют целевую надосадочную фракцию с титром не менее 7,0 lg БОЕ/мл, в которую вводят стабилизирующие добавки: пептон, сахарозу и желатозу в конечной их концентрации в смеси (мас.%): 2,0-4,0; 2,0-3,0; 1,0-3,0 соответственно или мочевину, пептон, сахарозу и желатозу в конечной их концентрации в смеси (мас.%): 1,0-2,0; 2,0-4,0; 2,0-3,0; 1,0-3,0 соответственно. Полученную жидкую препаративную форму разливают в емкости, которые размещают в лиофильной установке типа СУПЕР-4. После проведения стандартной процедуры лиофилизации в препарате практически не снижается инфекционная вирусная активность, что свидетельствует о высокой устойчивости штамма b7,5S2-S BOB к лиофилизации в присутствии заявляемых стабилизирующих добавок. Далее сухой материал измельчают и смешивают с наполнителем. Ниже в таблице 2 приведен рецептурный состав ядра таблеток с разной активностью вакцинного материала (в соответствии с примерами 1-4).
Таблица 2Рецептурный состав таблеток бивакцины "Ревакс ВКТ"
Наименование добавок и наполнителей
Составляющие компоненты таблетки (мас.%) для примеров:
Пример 14,5 lg БОЕ/табл.
Пример 2 ,5,0 lg БОЕ/табл.
Пример 3 5,5 lg БОЕ/табл.
Пример 4 6,0 lg БОЕ/табл.
Активное вещество
1,04
3,20
10,40
31,30
Сахароза
10,10
10,29
10,85
11,55
Стеарат кальция
2,00
1,99
1,97
1,94
Пептон
0,12
0,38
1,20
3,80
Желатоза
0,06
0,19
0,60
1,90
Ванилин
0,20
0,20
0,19
0,17
Буфер ТРИС
0,001
0,003
0,009
0,027
Лактоза
остальное до 100%
остальное до 100%
остальное до 100%
остальное до100%
Прессование в таблетки препарата производят на двенадцатипуансонном таблетпрессе модели К-VIII (Дрезден, Германия). Количество вируссодержащего материала в каждой таблетке закладывают столько, чтобы концентрация жизнеспособного вируса в них по расчетным данным, исходя из активности лиофильно высушенных материалов, находилось в диапазоне от 4,5 до 6,0 lg БОЕ/таблетку.
Таблетки покрывали кислотоустойчивой оболочкой следующего состава (масс.%):
шеллак -
10,0%
кислота олеиновая -
2,0%
аммиак водный -
3,0%
25%-ный
вода дистиллированная -
85,0%
Для приготовления 1 л раствора в колбу вместимостью 1 л, наливали 850 мл дистиллированной воды. Далее в нее вносили 20 г олеиновой кислоты. Содержимое колбы нагревали до температуры 80...90°С. К содержимому колбы добавляли 33 мл аммиака водного 25%-ного и тщательно перемешивали содержимое. После чего небольшими порциями в 5-6 приемов, при непрерывном перемешивании, вводили навеску шеллака массой 100 г. Содержимое колбы перемешивали до полного растворения шеллака. Полученный раствор охлаждали до комнатной температуры.
В приготовленный раствор с целью нанесения покрытия опускали таблетки 4-кратно (интервал между опусканиями 15 минут), беря каждую таблетку пинцетом за торцевую грань и при этом регулярно меняя место его расположения на этой грани.
Приготовленная таким образом серия таблеток представляла собой культуральную бивакцину против оспы и гепатита В для энтерального применения и имела специфическую активность - 4,8gБОЕ/табл. Таблетки имеют следующие биологические характеристики:
- по описанию: форма - круглая двояковыпуклая, края - цельные, диаметр -6 мм, цвет поверхности - темно-коричневый, а на изломе - серо-белый;
- по распадаемости: в растворе NaOH (рН-7,8) - деструкция покрытия через 20 минут, в растворе НС1 (рН-5,0) - отсутствие изменений в течение 1 часа;
- по подлинности: содержание на ХАО РКЭ однотипных ООЕ диаметром от 0,5 до 3,0 мм - 100%; продукция в ПЦР фрагмента 1150 п.о., содержащего расчетную встройку, размером 600 п.о., что соответствует pre s2-S - гену вируса гепатита В - наличие продукции фрагмента 1150 п.о.;
-1
-
- по микробиологической чистоте: содержание бактерий - 4 KOE-табл, содержание дрожжевых и плесневых грибов (суммарно), менее 2 КОЕ-табл.
1
; бактерии семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas aerugmosa и Staphylococcus aureus отсутствуют;
- по токсичности: для морских свинок в дозе 1 таблетка и белых мышей в дозе 1/25 таблетки - нетоксичны;
-1
6
- по специфической активности: 4,81gБОЕ-табл, 150 нг/мл/ кл HbsAg. Экспериментальные исследования активности полученных таблеток с кислотоустойчивым покрытием показали, что в процессе приготовления таблеток бивакцины «Ревакс ВКТ» на базе лиофилизированного вирусного материала в присутствии стабилизирующей добавки не наблюдалось достоверной инактивация вирусного компонента. Расчетные данные по концентрации вируса в таблетках, как правило, совпадали с результатами раститровок вируса в таблетках.
Пример 7.
Данные по оценке реактогенности субстанции заявляемой бивакцины "Ревакс ВКТ"
Для оценки реактогенности субстанции заявляемой бивакцины была изучена динамика развития инфильтратов у кроликов, вакцинированных внутрикожно субстанциями штаммов ВОВ, полученными разными способами:
на основе заявляемого способа (при культивировании штамма ГКВ №2131 BOB на культурах клеток);
- на основе способа-прототипа (при культивировании штамма ГКВ №2131 BOB на КЭ;
- на основе способа-прототипа (при культивировании родительского штамма Л-ИВП на РКЭ);
Животных инфицировали по методу Гротта. Максимальное развитие инфильтрата у кроликов наблюдалось в месте введения 5 lg ООЕ/0,1 мл и 4 lg ООЕ/0,1 мл штаммов b7,5S2-S эмбрионального и Л-ИВП, на 4-е сутки после вакцинации. Причем, появление же инфильтратов в обоих случаях было зарегистрировано на вторые сутки после инфицирования. При этом наименьшие по площади инфильтраты образовывались при введении штамма b7,5S2-S эмбрионального (Р<0,05) по сравнению со штаммам Л-ИВП. В то же время внутрикожное введение кроликам 5 lg БОЕ/0,1 мл и 4 lg БОЕ/0,1 мл штамма b7,5S2-S культурального приводило к появлению инфильтратов на месте введения лишь на 7-е сутки с максимумом по площади на 8-е сутки. Кроме того, размеры этих инфильтратов были достоверно меньшими (Р<0,05) по сравнению даже с таковыми для штамма b7,5S2-S эмбрионального.
Полученные результаты свидетельствуют, что рекомбинантный штамм b7,5S2-S культурального происхождения обладает достоверно более низкой реактогенностью по сравнению с таковым эмбрионального происхождения.
Таким образом, заявляемая таблетированная бивакцина "Ревакс ВКТ", наработанная на перевиваемых культурах клеток животных, по сравнению с такой же таблетированной формой вакцины "Ревакс ВТ", наработанной на КЭ, менее реактогенна, так как содержит меньше посторонних примесей, не контаминируется посторонней микрофлорой, более технологична при изготовлении в промышленных масштабах.
Пример 8.
Экспериментальные данные испытания бивакцины «РЕВАКС
ВКТ» на добровольцах
С целью получения более объективных данных проведена однократная энтералъная (через кишечник) иммунизация таблетированной бивакциной «РЕВАКС ВКТ» с кислотоустойчивой оболочкой ранее не привитых против оспы добровольцев. Данные приведены в таблице 3.
Таблица 3Данные по энтералъной иммунизации бивакциной на добровольцах
Номер добровольца, (возраст)
Дни после вакцинации
Титр антител в ρ-ции нейтрализции к вирусу оспы
Концяантител KHBs Ag, мМЕ/м л
Вирус в плазме, слюне и моче в течение 14 суток после вакцинации,в ООЕ/мл
Общие и местные реакции у добровольцев
Дата и иммунизирующая доза (БОЕ/мл) и серия бивакцины
15(18)
0 30Р
<1:5
Отр.
Отр.
Отсутствие местных и общих реакций
02.08.04. (1,6×10<sup>5</sup>),Cl
1:125-1:125
10
Отр.
16(18)
0 30Р
<1:5 1:125-
Отр. 30
Отр.
Отсутствие местных и общих реакций
02.08.04. (1,6×10<sup>5</sup>),Cl
1:625
Отр.
17(18)
0 30Р
<1:5
Отр. 40
Отр.
Отсутствие местных и общих реакций
02.08.04. (1,6×10<sup>5</sup>),Cl
1:125
Отр.
18(18)
0 30Р
<1:5
Отр.
Отр.
Отсутствие местных иобщих реакций
02.08.04. (1,6×10<sup>5</sup>),Cl
1:25
90
Отр.
Примечания:
1 Минимальной защитной концентрацией антител к HBs Ag в сыворотке крови людей в реакции иммуноферментного анализа является 10 мМЕ/мл;
2 Минимальным защитным титром антител к оспе в сыворотке крови людей в реакции нейтрализации является 1:20-1:25.
Механизм действия вакцины: таблетка с кислотоустойчивой оболочкой без потери активности достигает кишечника (орган-мишень для получения иммунизирующего эффекта), при более низкой иммунизирующей дозе вызывает формирование защитного уровня специфического иммунитета на маркер гепатита В и вирус осповакцины.
Анализ таблицы 3 показывает, что все добровольцы имеют концентрацию антител к HBs Ag и титр антител к оспе в сыворотке крови, превышающие их минимальный защитный уровень, что подтверждает эффективность действия вакцины.