ПОЛУЧЕНИЕ ДОМАШНЕЙ ПТИЦЫ И ДРУГИХ ЖИВОТНЫХ, УСТОЙЧИВЫХ К ВИРУСНОМУ ЗАБОЛЕВАНИЮ
PRODUCING POULTRY AND OTHER ANIMALS RESISTANT TO VIRAL DISEASES

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА СВЯЗАННЫЕ ЗАЯВКИ
По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на выдачу патента США № 60/666636, поданной 31 марта 2005 г., которая включена в описание в качестве ссылки для любых целей.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к применению технологии интерференции РНК для получения животных, устойчивых к вирусным инфекциям.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Центры контроля заболеваемости (CDC) и Всемирная организация здравоохранения сообщили, что высоко летальный штамм вируса птичьего гриппа H5N1 обнаружен более чем в 47 странах, которые распространились, по меньшей мере, по 3 континентам. См., например, <http://www.cdc.gov/flu/avian/outbreaks/current.htm>. Птичий грипп представляет собой инфекцию, вызванную вирусами гриппа. Эти вирусы гриппа встречаются у птиц в природе. Дикие птицы по всему миру несут вирусы в своем кишечнике, и обычно это проходит бессимптомно. Однако, птичий грипп очень контагиозен для птиц и может вызвать серьезное заболевание и гибель домашних птиц, включая кур, уток и индеек.
Инфицированные птицы распространяют вирус гриппа через слюну, носовые выделения и кал. Чувствительные к заболеванию птицы становятся инфицированными, если они контактируют с контаминированными секретами или выделениями или с поверхностями, которые контаминированы секретами или выделениями инфицированных птиц. Домашние птицы могут инфицироваться вирусом птичьего гриппа через прямой контакт с инфицированной водной домашней птицей или другой инфицированной домашней птицой, или путем контакта с поверхностями (такими как грязь или клетки) или материалами (такими как вода или корм), контаминированными вирусом. Инфекция вирусом птичьего гриппа у домашней птицы вызывает две основные формы заболевания, которые различаются низким и высоким экстремумами вирулентности. "Низко патогенная" форма может проходить невыявленной и обычно вызывает только мягкие симптомы (например, взъерошенные перья и перерыв в продукции яиц). Однако высоко патогенная форма распространяется по группам птиц. Данная форма может вызывать заболевание, которое затрагивает множественные внутренние органы и имеет степень смертности, которая часто достигает 90-100%, часто в течение 48 часов. Таким образом, возможные экономические потери птицеферм могут быть значительно снижены при наличии способов получения птицы, устойчивой к птичьему гриппу. Данная устойчивая к вирусу птица может размножаться с получением новых видов домашней птицы, которые будут передавать свою устойчивость к вирусу от поколения к поколению.
По оценкам, глобальный рынок домашней птицы дает более 50 млрд голов в год. Таким образом, что еще важнее, возможность получения устойчивых к вирусу животных, например, домашних птиц, может предотвратить распространение пугающего "птичьего гриппа", таким образом, предотвращая пандемию птичьего гриппа у людей.
Существуют и другие типы вирусных заболеваний, которые также имеют важное значение для птицеводства. Например, болезнь Марека часто вызывает тяжелые потери среди кур, и является основной причиной убытков хозяйств по продукции бройлеров. Болезнь Марека является лимфопролиферативным заболеванием, вызванным вирусом MD (MDV), принадлежащих к семейству герпесвирусов, и является основной проблемой птицеводства в течение последних 50 лет. Выявлены три серотипа штаммов MDV. Все онкогенные штаммы классифицированы как серотип 1 (MDV-I), в то время как природные неонкогенные куриные штаммы и герпесвирусы индеек (HVT) относятся к серотипам 2 (MD V-2) и 3, соответственно. Мировые ежегодные экономические потери от болезни Марека оцениваются масштабами миллиарда долларов США, несмотря на большие кампании по вакцинации. Хотя кампании по вакцинации снижают число заболевших групп по всему миру, в большей части мира происходит большое количество вспышек заболевания, что вызывает потребность в лучших способах контроля заболевания.
Имеются ограниченные количества вирусных заболеваний, у которых возможно успешное лечение. В настоящее время вакцинация является единственным способом борьбы с вирусными заболеваниями у животных. Во многих случаях, особенно при вирусных заболеваниях домашнего скота, этот подход не применим из-за невозможности получения высокоэффективных вакцин. Другой причиной неэффективности некоторых вакцин является высокая скорость мутаций, которая приводит к антигенному дрейфу или потере эффективности вакцин. Как только вакцина теряет свою эффективность, заболевание может прогрессировать и способно вызывать большие экономические потери в случае вирусных заболеваний домашней птицы и скота.
Имеются два классических вида вакцины; один вид представляет аттенуированную живую вакцину, которая является наиболее мощной, поскольку индуцирует гуморальное и клеточное звено иммунной системы. Недостатком этого вида вакцины является риск повторного возникновения высоко вирулентных мутантов-беглецов. По данной причине многие страны воздерживаются от одобрения применения данных видов вакцин. Вторым типом является инактивированная вирусная вакцина, которая во многих случаях намного менее эффективна, поскольку индуцирует лишь гуморальную иммунную систему. В последние несколько лет были разработаны некоторые виды рекомбинантных вакцин, такие как субъединичные вакцины и ДНК-вакцины. К сожалению, многие из них не имеют широкого применения. Одним из недостатков вакцинации является высокие ежегодные экономические расходы, что показано примером болезни Марека. Согласно данным Всемирной организации ветеринарии (OIE), общее число животных, вакцинированных против болезни Марека в 2002, составляло 2,457 миллиардов. См., например, <www.oie.com>.
Имеется два известных пути вакцинации. Первый способ является бесклеточной (лиофилизованной) формой вакцины стоимостью примерно около $3/1000 единиц. Вторая форма представляет собой содержащую клетки ("влажную") форму стоимостью примерно $8/1000 единиц. По оценкам, мировые расходы на вакцинацию от болезни Марека в 2002 примерно составляли от $7,4 миллиардов до $19,7 миллиардов.
С начала 1970-х большинство кур вакцинировали против MD с использованием аттенуированных штаммов серотипа 1 или HVT. Начиная с 1983 г., для защиты наиболее вирулентных полевых штаммов стали применять бивалентные и поливалентные комбинации. Хотя вакцинация очень эффективна в плане защиты кур, MD остается одним из основных в списке приоритетных заболеваний. Основной причиной высокого приоритета является постоянная эволюция штаммов MDV против повышенной вирулентности, что вызывает взлом вакцины.
Таким образом, имеется необходимость в способе профилактики или снижения переносимости вирусных заболеваний животных, например, птичьего гриппа и болезни Марека у домашней птицы. Из-за происходящих в настоящее время вспышек птичьего гриппа имеется высокая необходимость в способах, которыми можно получить генетически модифицированных животных, например, птиц, устойчивых к вирусным инфекциям, таким как птичий грипп.
В последние десять лет был описан новый подход инактивации генов посредством сайленсинга генов, называемый "интерференция РНК" (РНКи). См., например, Fire et al., Nature 391: 806-811 (1998) и патент США 6506559. Интерференция РНК относится к событию, которое происходит, когда полинуклеотид РНК действует посредством эндогенных клеточных процессов, специфично подавляющих экспрессию гена, последовательность которого соответствует таковой РНК. Сайленсинг гена-мишени происходит после деградации мРНК посредством двухцепочечной РНК (дцРНК) животного-хозяина, иногда путем расщепления РНКазой эндонуклеазой III. Расщепление приводит к образованию молекул, которые составляют примерно 21-23 нуклеотида (или основания) в длину, хотя их размер может быть и 30 оснований.
Данные короткие виды РНК опосредуют деградацию соответствующих матричных РНК и РНК-транскриптов, возможно через комплекс нуклеазы с РНКи, называемый индуцированным РНК комплексом сайленсинга (RISC), и данный комплекс помогает малым дцРНК распознавать комплементарные мРНК посредством взаимодействий за счет пар оснований. После взаимодействия миРНК с ее субстратом, мРНК направляется на деградацию, возможно, ферментами, которые присутствуют в RISC. Этот тип механизма, оказывается, используется организмами при ингибировании вирусных инфекций, перемещения транспозонов, и сходных феноменов, и для регуляции экспрессии эндогенных генов. Активность РНКи уже доказана в растениях, насекомых, нематодах и позвоночных, среди прочих организмов. Для общей информации по предпосылкам, см., например, Schutz et al., Virology 344(l):151-7 (2006); Leonard et al., Gene Ther. 13(6):532-40 (2006); Colbere-Garapin et al., Microbes Infect. 7(4):767-75 (2005); Wall, Theriogenology 57(l):189-201 (2002); El-Bashir, et al., Nature 411: 494-498 (2001); Fire, A., et al. Science 391: 806-811 (1998); Gitlin et al., Nature 418: 430-434 (2002); Gitlin, et al., J Virol. 79:1027-1035 (2005); Kahana, et al., J Gen. Virol. 85, 3213-3217 (2004); Kronke et al., J Virol. 78: 3436-3446 (2004); Leonard et al., J. Virol. 79:1645-1654 (2005); and Yokota, et al., EMBO Rep. 4: 602-608 (2003).
Благодаря широко распространенной проблеме различных вирусных заболеваний животных, в частности, домашней птицы, необходим другой подход к эффективному контролю вирусных инфекций домашней птицы и скота для решения указанной проблемы. Как таковое, описанное здесь изобретение относится к решению данной проблемы путем предоставления способов создания трансгенных, не являющихся человеком позвоночных, например, домашней птицы и скота, несущих и экспрессирующих молекулы, направленные на блокирование важных вирусных функций, которые будут значимо ингибировать репликацию патогенных вирусов, а также к самим генетически модифицированным особям домашней птицы и скота.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к зародышевым клетками, кодирующим миРНК, которая направлена на вирусные последовательности и способам ее получения. Изобретение также относится к не являющимся человеком позвоночным, которые устойчивы к вирусной инфекции, и к способам их получения.
В одном из аспектов изобретение относится к зародышевой клетке не являющегося человеком позвоночного, содержащего конструкцию, включающую последовательность, кодирующую миРНК к консервативной области вирусного генома, в которой данная последовательность функционально связана с промотором. В одном из вариантов осуществления конструкция включает последовательности, кодирующие множественные миРНК к вирусному геному. В другом варианте осуществления клетка содержит множественные конструкции, включающие последовательность, кодирующую множественные миРНК к консервативным областям вирусного генома, где указанная последовательность функционально связана с промотором. В другом варианте осуществления позвоночное представляет собой не являющееся человеком животное. В другом варианте осуществления вирус представляет собой вирус ящура (FMDV). В другом варианте осуществления консервативная последовательность выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3. В другом варианте осуществления позвоночное представляет собой вид птицы. В другом варианте осуществления вирус представляет собой вирус птичьего гриппа. В другом варианте осуществления консервативная последовательность выбрана из группы, состоящей из последовательностей, показанных на фиг. 1-16. В другом варианте осуществления вирус представляет собой вирус болезни Марека (MDV). В другом варианте осуществления зародышевая клетка представляет собой сперму.
В другом аспекте изобретение относится к не являющемуся человеком позвоночному, которое устойчиво к вирусному заболеванию, где большинство клеток в позвоночном включают последовательность, кодирующую миРНК к консервативной области генома вируса, вызывающего заболевание, в котором последовательность функционально связана с промотором. В одном из вариантов осуществления конструкция включает последовательности, кодирующие множественные миРНК к консервативным областям вирусного генома. В другом варианте осуществления клетка содержит множественные конструкции, включающие последовательности, кодирующие множественные миРНК к консервативным областям вирусного генома. В другом варианте осуществления позвоночное представляет собой не относящееся к человеку млекопитающее. В другом варианте осуществления вирусное заболевание представляет собой FMDV. В другом варианте осуществления консервативная последовательность выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3. В другом варианте осуществления позвоночное представляет вид птицы. В другом варианте осуществления вирус представляет собой вирус птичьего гриппа. В другом варианте осуществления консервативная последовательность выбрана из группы, состоящей из последовательностей на фиг. 1-16. В другом варианте осуществления вирус представляет собой MDV.
В другом аспекте изобретение относится к способу получения зародышевой клетки не относящегося к человеку позвоночного, включающему инкубацию зародышевой клетки с конструкцией, содержащей последовательность, кодирующую миРНК к консервативному участку вирусного генома, где данная последовательность функционально связана с промотором, в условиях, которые приводят к попаданию конструкции внутрь клетки. В одном из вариантов осуществления конструкция интегрируется в геном клетки хозяина.
В другом аспекте изобретение относится к способу получения не являющегося человеком позвоночного, которое устойчиво к вирусному заболеванию, включающему (a) инкубацию зародышевой клетки с конструкцией, включающей последовательность, кодирующую миРНК к консервативной области вирусного генома, где данная последовательность функционально связана с промотором, в условиях, в которых она образует диплоидную клетку; и (b) инкубацию диплоидной клетки по (a) в условиях, в которых она образует не являющееся человеком позвоночное.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг.1-8 показаны последовательности вируса птичьего гриппа H5N1, которые могут использоваться для генома 7 данного штамма вируса птичьего гриппа.
На фиг.9-12 показаны последовательности вируса птичьего гриппа H5N1, которые могут использоваться для генома 1 данного штамма вируса птичьего гриппа.
На фиг.13-16 показаны последовательности вируса птичьего гриппа H5N1, которые могут использоваться для генома 5 данного штамма вируса птичьего гриппа.
На фиг.17 показано получение библиотеки стабильных клеточных линий с последовательностями миРНК AVA. Клетки MDCK в дополнение к экспрессии GFP инфицировали лентивирусным вектором, экспрессирующим различные миРНК или пустым вектором. Клеточные линии отбирали по устойчивости к пуромицину, выращивали в течение 2 недель до заражения гриппом. Клетки исследовали на флуоресцентном микроскопе Nikon (Х100). Для каждой контрольной линии при свете или с фильтром GFP наблюдали идентичные поля.
На фиг.18 показаны результаты количественной оценки эффективности миРНК AVA в отношении вируса гриппа H9N2. 5 различных клеточных линий (MDCK, пустой вектор, миРНК 1, миРНК 2, миРНК 3) высевали в 96-луночные планшеты, 10000 клеток на лунку. Через 3 часа после высевания клетки инфицировали вирусом гриппа H9N2, разведенным до 1:50 1:100, 1:200 1:400, 1:800, 1:1600 (представлено разведение 1:400). Инфицирование проводили в присутствии трипсина для стимуляции проникновения вируса в клетки. Клетки оценивали на наличие вирусного белка НА способом ELISA через 3 суток после инфицирования. Статистические расчеты (среднее и стандартное отклонение) основаны на 4 повторах для каждой клеточной линии. Результаты нормализованы по неинфицированным клеткам.
На фиг.19 показана оценка эффективности миРНК AVA в отношении вируса гриппа PR8.
На фиг.20 показана оценка эффективности миРНК AVA в отношении вируса гриппа H9N2 посредством анализа вестерн-блоттинга. А. За 2 часа до инфекции вируса H9N2 (разведенного 1:200) 105 клеток 4 клеточных линий MDCK (пустой вектор, миРНК №1, миРНК №2, миРНК №3) помещали в 24-луночный планшет. Через 48 часов после инфекции клетки лизировали 80 мкл буфера RIPA, содержащего смесь ингибиторов протеаз (разбавленную 1:1000). Лизаты клеток центрифугировали в течение 10 мин с максимальной скоростью (16 д) и супернатант, содержащий экстракт общего белка, помещали в новую чистую 1,5 мл пробирку. Концентрации белка определяли способом Брэдфорда (Bradford, 1976). 8 мкг экстракта общего белка разделяли посредством SDS-PAGE на 10% геле и переносили на нитро-целлюлозную мембрану (Whatman, Maidstone, England). Однородность переноса белков подтверждали окрашиванием красным Ponso (не показано). Мембраны блокировали 5% обезжиренным сухим молоком и 0,05% Tween-20 в PBS (фосфатно-солевой буфер) в течение 1 часа при комнатной температуре и промывали 0,05% Tween-20 в PBS. Затем мембраны инкубировали с антителами к нуклеопротеину гриппа A (Chemicon (Millipore), Billerica, MA) разведенными 1:1000 bPBSc 0,05% Tween-20 и 5% BSA в течение 2 часа при комнатной температуре. Перед 1 часовой инкубацией с конъюгированными с HRP антителами козы к IgG (H+L) мыши AffiniPure (JacksonIR, WestGrove, РА), разбавленными 1:10000 в0,05% Tween-20 bPBS, содержащем 5% обезжиренное сухое молоко, проводили три 5 минутные промывки (0,05% Tween-20 в PBS). После трех подобных 5 мин отмывок мембраны помещали в субстрат для хемилюминесценции SuperSignal (ECL) (Pierce, Rockford, IL) в течение 5 мин и экспонировали на световую пленку FUGI в течение 5 мин. Для проверки уровней гомогенности общего белка использовали моноклональные антитела мыши к актину (MPBiomedicals, Solon, Oh), разбавленные 1:1000 в PBS с 0,05% Tween-20 и 5% BSA, с использованием того же вторичного антитела и протокола. В. Уровни сигналов 4 белковых экстрактов тестировалис антителами к гриппу (синий) или к актину (желтый). Интенсивность сигнала определяли посредством программного обеспечения ImageJ. C. Уровни ингибирования киРНК нормализовали с результатами против актина.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к животным, устойчивым к вирусным инфекциям, и к способам получения данные типы трансгенных животных. Вирусные гены-мишени подлежат сайленсингу за счет присутствия молекул сайленсинга, таких как описанные молекулы миРНК, и, таким образом, они не могут выполнять свою роль в вирусном клеточном цикле. Исходом данного процесса является значимое блокирование репликации вируса, что приводит к неспособности инфекции индуцировать заболеваемость и/или смертность данных животных. Так, изобретение имеет существенный экономический эффект для фермеров, а также для общества в целом, обеспечивая постоянные поставки мяса и других продуктов животноводства. В осуществлении настоящего изобретения используют обычные способы молекулярной биологии (включая рекомбинантные способы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые находятся в пределах экспертизы в данной области. Такие способы в полной мере раскрыты в литературе, например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al, 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir & CC. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991) и Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999).
Все ссылки, патенты, и заявки на выдачу патента, цитируемые в данной заявке на выдачу патента включены в описание полностью в качестве ссылки для любых целей.
Определения
Все научные и технические термины, используемые в данной заявке, имеют значения, обычно принятые в данной области, за исключением определенных иначе. При использовании в данной заявке следующие слова или выражения имеют определенное значение.
Термины "полинуклеотид" и "нуклеиновая кислота", используемые здесь взаимозаменяемо, относятся к полимерной форме любой длины, к рибонуклеотидам или дезоксирибонуклеотидам. Данные термины включают в себя одно-, двух- или трехцепочечную ДНК, геномную ДНК, кДНК, РНК, ДНК-РНК-гибрид или полимер, включающий в себя пуриновые и пиримидиновые основания, или другие природные, химически, биохимически модифицированные, неприродные или дериватизированные нуклеотидные основания.
"Промотор" представляет собой последовательность контроля, которая представляет собой область полинуклеотидной последовательности, в которой инициация и скорость транскрипции контролируются. Она может содержать генетические элементы, с которыми могут связываться регуляторные белки и молекулы, например, РНК-полимераза и другие факторы транскрипции. Промоторы могут быть конститутивными, индуцируемыми, репрессируемыми, или, например, тканеспецифичными. Фразы "функционально связанный", "функционально расположенный", "под контролем" и "под транскрипционным контролем" означают, что промотор находится в правильном функциональном положении и/или ориентации по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты для контроля инициации транскрипции и/или экспрессии данной последовательности. Промотор может или может не использоваться в связи с "энхансером", что относится к действующей в цис-положении регуляторной последовательности, вовлеченной в активацию транскрипции последовательности нуклеиновой кислоты. Один промотор может регулировать экспрессию одного или нескольких генов.
Мишени РНКи
Изобретение относится к способам сайленсинга генов, так что могут продуцироваться устойчивые к вирусу животные. В одном из вариантов осуществления в изобретении используется технология сайленсинга генов, такая как РНКи, ассоциированная с липофекцией, для создания трансгенной домашней птицы и скота с внутренним иммунитетом. В предпочтительном варианте осуществления в изобретении применяется опосредованная рестрикционными ферментами интеграция ("REMI"), как описано, например, в WO 99/42569, для создания устойчивых к вирусу животных. Животные несут и экспрессируют единичные или множественные молекулы сайленсинга генов, направленные на вирусные гены (например, необходимые для репликации вируса гена).
Малая интерферирующая РНК ("миРНК") по настоящему изобретению обеспечивает модулирование и/или аттенуацию экспрессии гена-мишени, когда такой ген присутствует и способен экспрессироваться в клетке. Модулирование экспрессии может представляться собой частичное, более предпочтительно, полное ингибирование клеточной функции, или даже положительную регуляцию других вторичных генов-мишеней или усиление экспрессии таких генов в ответ на ингибирование первичного гена-мишени.
Ослабление генной экспрессии может включать в себя частичную или полную супрессию или ингибирование функции гена, процессинг транскрипта или трансляцию транскрипта. В контексте РНК-интерференции, полагают, что модуляция генной экспрессии осуществляется комплексом белков и РНК, конкретно, включающих в себя малые dsРНК, которые могут действовать, "управляя" РНК. Поэтому полагают, что миРНК эффективная, когда ее нуклеотидная последовательность в достаточной мере соответствует, по меньшей мере, части нуклеотидной последовательности гена-мишени. Хотя настоящее изобретение не ограничено механистической гипотезой, очень предпочтительно, чтобы последовательность нуклеотидов в миРНК была, по существу, идентичной, по меньшей мере, части последовательности гена-мишени. В одном из вариантов осуществления идентичность последовательности между вирусным нуклеотидом-мишенью и миРНК равна 100%, т.е., соответствует точной гомологии. В другом варианте осуществления имеется различие в 1 паре оснований (н.п.). В другом варианте осуществления имеется различие в 2 парах оснований. В другом варианте осуществления имеется различие в 3 парах оснований.
"Ген-мишент" или "последовательность-мишень" в основном означает полинуклеотид, включающий в себя область, которая кодирует генный продукт, такой как полипептид, или полинуклеотидную область, которая регулирует репликацию, транскрипцию или трансляцию или другие процессы, значимые при экспрессии полипептида, или полинуклеотид, включающий в себя область, кодирующую полипептид, и область, функционально связанную с ней, которая регулирует экспрессию. Последовательность-мишень не обязательно должна кодировать целый генный продукт. В контексте изобретения "функционально связанный" относится к промотору, находящемуся в правильном функциональном расположении и/или ориентации по отношению к полинуклеотидной последовательности, для контроля инициации и/или экспрессии данной последовательности.
В одном из аспектов гены-мишени миРНК представляют собой вирусные гены. В одном из вариантов осуществления вирусные гены представляют собой гены, вовлеченные в распространение вирусных заболеваний птиц (например, птичий грипп и болезнь Марек). Генные последовательности, относящиеся к объему изобретения, включают последовательности, показанные на фиг. 1-16.
миРНК имеет длину, достаточную для значимого блокирования репликации вируса, но не для того, чтобы вызвать разрушение клеток, и обычно находящуюся в интервале примерно от 19 пар оснований до 27 пар оснований. В одном из вариантов осуществления миРНК составляет 21 н.п. в длину. В другом варианте осуществления миРНК составляет 21 н.п. в длину. В других вариантах осуществления миРНК составляют примерно 19, 20, 23, 24, 25, 26, или 27 н.п. в длину. В другом варианте осуществления миРНК составляют примерно 28, 29, или 30 н.п. в длину. Специалисту в данной области ясно, что длина миРНК не может быть очень большой, поскольку это запустит один из механизмов саморазрушения клетки, в которой находится миРНК. Например, в Elbashir et al. указано, что длина 21 н.п. была эффективной для индукции противовирусных механизмов в клетке, например, интерфероновой реакции (см. Elbashir et al., Nature 411:494-498 (2001)).
Как показано на фиг. 1-16, в качестве интерферирующей РНК могут использоваться РНК различной длины. В одном из предпочтительных осуществлений длина составляет 21 н.п. Специалист в данной области может использовать последовательности, обозначенные на фиг. 1-16 и двигаться, изменяя последовательность с шагом в одну пару оснований, для получения другой миРНК длиной 21 нм. Некоторые из таких изменений показаны на данных фигурах. Однако, показаны не все возможные последовательности миРНК длиной 21 н.п., поскольку если, как на фиг. 1-16, показана основная последовательность, для специалиста в данной области будет рутинной процедурой пошагово двигаться ниже по последовательности. Кроме того, длины, отличные от 21 н.п., также относятся к данному изобретению. Как обсуждалось выше, в одном из осуществлений миРНК составляет примерно от 21 н.п. до 27 н.п. в длину. Специалист в данной области может использовать последовательности, показанные на фиг. 1-16, и применять требуемую длину и двигаться вниз по последовательности с шагом в одну н.п. для получения другой рамки. Например, если следовало бы сделать миРНК длиной 23 н.п., специалист начал бы с одного конца последовательности и использовал бы первые 23 н.п. в качестве одной из комбинаций миРНК. Затем он мог бы сдвинуться на одну пару оснований вниз по последовательности, и следующие 23 пары оснований стали бы следующей комбинацией, и так далее.
Данные по последовательностям, определенные экспериментально, или доступные через общественные базы данных могут подвергаться скринингу биоинформационными инструментами. Анализ гомологии выполняют с использованием общественно доступных или коммерчески доступных программ (например, программы PILEUP и PRETTY в пакете GCG). Поиск гомологии необязательно проводят с использованием общественно доступных последовательностей (например, Genbank) с использованием программ PILEUP и PRETTY или программы FASTA (Pearson et al, PNAS 85: 2444-2448 (1988)).
Последовательности вирусных генов, особенно тех, которые воздействуют на здоровье и безопасность животных, рассматриваются в качестве генов-мишеней по изобретению. Идеальными вирусными последовательностями, которые служат в качестве мишеней, являются те, которые высоко консервативны. Высокая степень консервативности в основном является указанием давления селекции не мутировать за пределами консервативной последовательности. Для многих вирусов неструктурные гены имеют тенденцию к высокой консервативности среди их различных серотипов и поэтому являются хорошей мишенью для технологии РНКи. Другие вирусные гены, которые также хороши как мишени, представляют собой гены, значимые или необходимые для репликации вируса и последующего его размножения. В одном из аспектов для создания миРНК используют структурный (S) ген вируса Акабане.
В других аспектах последовательности-мишени являются короткими участками последовательности, которые являются консервативными среди различных штаммов птичьего гриппа. В одном из вариантов осуществления последовательность-мишень, используемая для миРНК происходит из генома 1 штамма H5N1 вируса птичьего гриппа. Ее неограничивающие примеры показаны на фиг. 9-12. Выделенный(-е) жирным шрифтом нуклеотид(ы) указывает(-ют) на место, где было выявлено различие пары оснований при анализе гомологии. В другом варианте осуществления последовательность-мишень, используемая для миРНК происходит из генома 5 штамма H5N1 вируса птичьего гриппа. Ее неограничивающие примеры показаны на фиг. 13-16. В другом варианте осуществления последовательность-мишень, используемая для миРНК происходит из генома 7 штамма H5N1 вируса птичьего гриппа. Ее неограничивающие примеры показаны на фиг. 1-8. В других вариантах осуществления последовательность-мишень происходит из других типов генома H5N1. Более того, миРНК для борьбы с другими штаммами птичьего гриппа (например, H5N2, H5N3, и т.д.) также входят в объем изобретения и могут быть получены специалистом в данной области, следуя приведенным здесь сведениям.
В другом аспекте, консервативные участки вируса ящура (FMDV) используют в качестве последовательностей-мишеней для конструирования миРНК. В других аспектах для конструирования миРНК в качестве последовательностей-мишеней могут использоваться последовательности неограниченного списка вирусов, которые вызывают следующие заболевания: ньюкаслская болезнь, лихорадка Западного Нила, оспа птиц, инфекционный бронхит птиц, энцефаломиелит птиц, лейкоз птиц, вирусный гепатит уток, вирусный энтерит уток, нодулярный дерматоз, инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота, вирусная диарея крупного рогатого скота, лейкоз крупного рогатого скота, лихорадка Рифт-Вэлли, чума рогатого скота, инфекционная катаральная лихорадка овец, чума мелких жвачных (PPR), оспа овец и коз, контагиозный пустулярный дерматит (эктима), пограничная болезнь овец, маеди-висна, трансмиссивный гастроэнтерит (TGE), грипп лошадей, африканская болезнь лошадей, венесуэльский энцефаломиелит лошадей, и весенняя виремия карпа.
Конструкции, кодирующие миРНК
Конструкции, кодирующие миРНК, включают в себя несколько компонентов, включая в качестве неограничивающих примеров промоторы и последовательности, "направляющие" миРНК на правильную мишень в клетке. Промоторы, которые могут использоваться, включают в себя в качестве неограничивающих примеров промоторы РНК-полимеразы II и РНК-полимеразы III. Промоторы РНК-полимеразы III работают особенно хорошо в качестве промоторов для конструкции миРНК. Неограничивающие примеры промоторов (pol II и pol III), которые могут использоваться, включают в себя: промотор 5S рибосомальной (р) РНК, мышиный U6, человеческий U6, мышиный HI, человеческий HI, цитомегаловирусный промотор, промотор куриного убиквитина C, человеческий промотор 7SK, бычий промотор U6, куриный промотор U6, промотор гена фосфорилированного белка массой 38 кДа (pp38) вируса болезни Марека, промотор куриной мРНК длиной 1,8 тыс.н.п., промотор человеческого, бычьего бета-актина, куриный промотор PRL, промотор куриных генов SPATA4, промотор куриного Poll, промотор гена US1 вируса болезни Марека, промотор гена малой субъединицы рибонуклеотидредуктазы вируса болезни Марека, LTR вирусов лейкоза и саркомы птиц, RSV-LTR, синтетические поксвирусные промоторы, промотор вируса коровьей оспы Pl 1, промоторы вируса коровьей оспы P 174 и P 190, ранний/поздний промотор P.E/L вируса оспы птиц, промотор тимидинкиназы вируса оспы птиц, промотор коровьей оспы p7.5 и промотор PFLl вируса оспы птиц.
С использованием стандартных способов молекулярной биологии данные промоторы функционально связаны с последовательностями, которые направлены на вирусные гены и подвергают их сайленсингу. Один промотор может регулировать экспрессию одной или нескольких последовательностей-мишеней. Промотор(-ы) и последовательность(-и)-мишень(-и) клонируют в стандартные клонирующие или экспрессирующие векторы. Используемый здесь термин «вектор» относится к молекулам нуклеиновой кислоты, способным доставлять другие молекулы нуклеиновой кислоты в клетку. Векторы могут происходить из плазмид, бактериофагов, растений или других вирусов животных.
Конструкции миРНК получают таким образом, что они становятся способны экспрессировать миРНК. Специалисту в данной области понятно, что некоторые типы промоторов лучше регулируют экспрессию миРНК в одних позвоночных, чем в других позвоночных, в зависимости от физиологии позвоночных, и следует принимать меры по использованию промотора, который наилучшим образом подходит конкретному позвоночному. Промотор также может регулировать экспрессию одной или нескольких миРНК. Вектор может содержать последовательности, которые кодируют одну или несколько миРНК. Энхансеры, селективные маркеры и другие стандартные молекулярные инструменты могут также использоваться для упрощенных молекулярных манипуляций. При использовании способа REMI следует конструировать вектор, который облегчает применение способа REMI. Подходящие указания для данного способа находятся в WO 99/42569.
В одном из аспектов изобретения может использоваться вектор с несколькими генами миРНК, который соответствует различным мишеням на вирусном геноме. Данный тип векторной конструкции гарантирует значительное, вплоть до полного, ингибирование вследствие одновременного расщепления в различных участках. Кроме того, он будет активным, если одна из вирусных последовательностей-мишеней мутирует или изменится. Для двухцепочечной миРНК возможно наличие стандартного липкого конца в 2 н.п., а также липкий конец в 1 н.п., или отсутствие липкого конца.
Конструирование зародышевых клеток
Используемый здесь термин «зародышевая клетка» определяется как сперматозоиды и яйцеклетки, и их предшественники. Зародышевые клетки являются гаплоидными и имеют только один набор хромосом, тогда как другие незародышевые клетки имеют два набора хромосом. Настоящее изобретение относится к конструированию зародышевой клетки не являющегося человеком позвоночного, содержащей конструкцию, которая кодирует миРНК к консервативной области вирусного генома, где последовательность функционально связана с промотором. Зародышевая клетка может содержать конструкцию, которая включает в себя последовательности, кодирующие множественные миРНК к вирусному геному. Примеры вирусных последовательностей, которые могут использоваться, приведены выше. В одном из вариантов осуществления вирусная последовательность представляет собой вирус ящура (FDMV). В другом варианте осуществления вирусная последовательность представляет собой вирус птичьего гриппа.
Изобретение относится к способу получения зародышевой клетки не относящегося к человеку животного, в котором зародышевая клетка содержит конструкцию, содержащую последовательность, кодирующую миРНК к консервативной области вирусного генома. Для воплощения способа по изобретению специалист в данной области инкубирует зародышевую клетку с конструкцией, кодирующей миРНК к консервативной области вирусного генома, в которой последовательность функционально связана с промотором, в условиях, которые обеспечивают захват конструкции внутрь клетки. В одном из вариантов осуществления конструкция интегрируется в геном клетки хозяина с использованием технологии REMI.
В одном из аспектов зародышевые клетки содержат множественные конструкции, включающие в себя последовательность, кодирующую множественные миРНК к консервативным областям вирусного генома, где последовательность функционально связана с промотором. В другом варианте осуществления зародышевая клетка не являющегося человеком позвоночного относится к не являющемуся человеком млекопитающему. Неограничивающие примеры не являющихся человеком позвоночных включают в себя кур, уток, гусей, дичь, крупный рогатый скот, коров, свиней, рыб, овец, коз и лошадей. В другом варианте осуществления позвоночное является видом птицы. В другом аспекте зародышевая клетка содержит один вектор, содержащий несколько генов под контролем различных промоторов.
В одном из вариантов осуществления зародышевая клетка содержит конструкцию, содержащую последовательность, кодирующую миРНК, которая направлена на вирус ящура (FMDV). Примерами таких последовательностей-мишеней являются: i). 5′-CCTGTCGCTTTGAAAGTGAAAGC-S′ (SEQ ID NO:1) в нуклеотидах 4900-4922, расположенных в области 3B; (ii) 5′-GAGATTCCAAGCTACAGATCACTTTACCTGCGTTGGGTGAACGCCGTGTGCGGTGACGC-3′ (SEQ ID NO:2) в нуклеотидах 6934-6992, расположенных в области 3D; и (iii) 5′-GACGAGTACCGGCGTCTCTTTGAGCC-S′ (SEQ ID NO:3) в нуклеотидах 6892-6917, расположенных в области 3D. Все положения относятся к последовательности FMDV серотипа O1 (G) (инвентарный номер GenBank AF189157).
В одном из аспектов зародышевая линия содержит конструкцию, включающую в себя последовательность, кодирующую миРНК, которая направлена на вирус птичьего гриппа. В вариантах осуществления данного аспекта зародышевая клетка содержит конструкцию, в которой консервативная последовательность выбрана из любой из последовательностей, обозначенных на фиг. 1-16.
В другом аспекте зародышевая клетка содержит конструкцию, включающую в себя последовательность, которая кодирует миРНК, направленную на вирус болезни Марека (MDV). В любом из указанных выше случаев зародышевая клетка представляет собой сперму.
Конструирование трансгенных животных
Описанные выше конструкции затем вводят в животные клетки любыми стандартными способами, например, липофекцией. Однако, некоторые из ранних способов, например, липофекция, дают очень малый процент успеха. Авторы изобретения нашли, что предпочтительный способ достижения успешного введения данных конструкций, кодирующих миРНК, является применение опосредованной ферментом рестрикции интеграции ("REMI") по WO 99/42569. В соответствии с этим, в одном из вариантов осуществления полинуклеотид, кодирующий миРНК, вводят в зародышевые клетки животного (например, в сперматозоиды) с использованием REMI. Животные, полученные в результате применения данных зародышевых клеток, становятся устойчивыми к заболеваниям. Данных трансгенных животных можно подвергать скрещиванию с получением целой популяции устойчивых к вирусу животных. В случае домашней птицы вирусы, которые являются мишенями миРНК, включают в себя в качестве неограничивающих примеров вирусы болезни Марека, инфекционного бурсита, и птичьего гриппа.
Число миРНК, введенное в клетку животного (например, в зародышевую клетку) может меняться. В одном из вариантов осуществления вводят 1 или несколько миРНК. Специалисту в данной области понятно, что могут вводиться различные комбинации миРНК на основе вирусного заболевания-мишени.
Изобретение относится к получению не являющегося человеком позвоночного, устойчивого к вирусному заболеванию, где большинство клеток позвоночного включают в себя последовательность, кодирующую миРНК к консервативной области генома вируса, вызывающего данное заболевание, где последовательность функционально связана с промотором. Примеры вирусных последовательностей обсуждаются выше. В одном из вариантов осуществления конструкция включает в себя последовательности, кодирующие множественные миРНК к консервативным областям вирусного генома. В другом варианте осуществления клетки содержат множественные конструкции, включающие в себя последовательность, которая кодирует множественные миРНК к консервативным областям вирусного генома. В другом варианте осуществления не являющееся человеком позвоночное является не являющимся человеком млекопитающим.
В одном из вариантов осуществления большинство клеток не являющегося человеком позвоночного содержат конструкцию, включающую в себя последовательность, кодирующую миРНК, которая направлена на вирус ящура (FMDV). Примерами таких последовательностей-мишеней являются: i). 5′-CCTGTCGCTTTGAAAGTGAAAGC-S′ (SEQ ID NO:1) в нуклеотидах 4900-4922, расположенных в области 3B; (ii) 5′-GAGATTCCAAGCTACAGATCACTTTACCTGCGTTGGGTGAACGCCGTGTGCGGTGACGC-3′ (SEQ ID NO:2) в нуклеотидах 6934-6992, расположенных в области 3D; и (iii) 5′-GACGAGTACCGGCGTCTCTTTGAGCC-S′ (SEQ ID NO:3) в нуклеотидах 6892-6917, расположенных в области 3D. Все положения относятся к последовательности FMDV серотипа O1 (G) (инвентарный номер GenBank AF189157).
Неограничивающие примеры не являющихся человеком позвоночных включают в себя кур, уток, гусей, дичь, крупный рогатый скот, коров, свиней, рыб, овец, коз и лошадей. В другом варианте осуществления позвоночное относится к виду птицы. Еще в одном варианте осуществления не являющееся человеком позвоночное имеет клетки, содержащие конструкцию, кодирующую миРНК, где консервативная последовательность выбрана из любой из последовательностей, обозначенных на фиг. 1-16. В другом варианте осуществления не являющееся человеком позвоночное устойчиво к MDV.
Изобретение относится к способу получения не являющегося человеком позвоночного, устойчивого к вирусному заболеванию, включающему стадии: (a) инкубации зародышевых клеток, описанных выше, в условиях, в которых они образуют диплоидную клетку; и (b) инкубации диплоидной клетки по (a) в условиях, в которых она образует не являющееся человеком позвоночное.
Изобретение также относится к получению не являющегося человеком позвоночного, устойчивого к вирусному заболеванию, посредством клонирования. В таких случаях одна или несколько миРНК может быть встроена в геном клонируемой клетки. Различные способы данной технологии доступны коммерчески, например, протоколы трансплантации ядра компании Advanced Cell Technology.
Варианты применения
Изобретение относится к способу получения домашней птицы, устойчивой к вирусным заболеваниям. Данные заболевания включают в себя в качестве неограничивающих примеров ньюкаслскую болезнь, лихорадку Западного Нила, оспу птиц, инфекционный бронхит птиц, энцефаломиелит птиц, лейкоз птиц, вирусный гепатит уток и вирусный энтерит уток.
Изобретение относится к способу получения крупного рогатого скота, устойчивого к вирусным заболеваниям. Данные заболевания включают в себя в качестве неограничивающих примеров нодулярный дерматоз, инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота, вирусную диарею крупного рогатого скота, лейкоз крупного рогатого скота, лихорадку Рифт-Вэлли, чуму рогатого скота, инфекционную катаральную лихорадку.
Изобретение относится к способу получения овец и коз, устойчивых к вирусным заболеваниям. Данные заболевания включают в себя в качестве неограничивающих примеров чуму мелких жвачных (PPR), оспу овец и оспу коз, контагиозный пустулярный дерматит (эктиму), пограничную болезнь овец, инфекционную катаральную лихорадку, маеди-висна, и лихорадку Рифт-Вэлли.
Изобретение относится к способу получения лошадей, устойчивых к вирусным заболеваниям. Данные заболевания включают в себя в качестве неограничивающих примеров грипп лошадей, африканскую болезнь лошадей, венесуэльский энцефаломиелит лошадей.
Изобретение относится к способу получения рыбы, устойчивой к вирусным заболеваниям. Данные заболевания включают в себя в качестве неограничивающих примеров весенную виремию карпа.
Изобретение может применяться к свиньям для создания устойчивости против классической чумы свиней, африканской чумы свиней, трансмиссивного гастроэнтерита (TGE) и ящура. В общем, приведенные здесь сведения могут относиться к любому животному, чувствительному к вирусному заболеванию.
В случае развитой индустрии птицеводства, которая испытывает большие экономические потери вследствие заболеваний практическое решение лежит в области воплощения технологии миРНК для создания племенных птиц бройлеров и несушек, устойчивых к птичьему гриппу и болезни Марека, инфекционному бурситу и другим вирусам птиц. Применение описанного здесь изобретения предоставляет безопасный источник птицы для потребителей и всей популяции, поскольку останавливается распространение птичьих вирусов от птиц человеку.
Следующее предоставлено для иллюстрации изобретения, но не для его ограничения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Получение животных, устойчивых к ящуру
Трансгенных животных, устойчивых к ящуру, получали встраиванием миРНК, сконструированной из последовательностей вируса ящура (FMDV), в зародышевые клетки животных. В общем, животные, чувствительные к FMDV, являются парнокопытными.
Конструирование миРНК ящура
Для конструирования миРНК вначале идентифицировали вирусную последовательность-мишень. Один способ выполнения этого состоит в проведении анализа локальной гомологии на последовательностях FMDV из различных штаммов или серотипов и в идентификации коротких участков гомологии последовательности. В одном из вариантов осуществления гомология составляет 100%, то есть абсолютно одинаковая последовательность во всех серотипах. В другом варианте осуществления наблюдается различие в 1 или 2 парах оснований. Анализ гомологии проводят с использованием общественно доступных или коммерчески доступных программ (например, программы PILEUP и PKETTY в пакете GCG). Поиск гомологии необязательно проводят с использованием общественно доступных последовательностей (например, Genbank) с использованием программ PILEUP и PRETTY или программы FASTA (Pearson et al, PNAS 85: 2444-2448 (1988)).
Как только короткие участки гомологии идентифицированы, синтезируют миРНК с использованием коммерчески доступных служб. миРНК синтезируют различной длины. Некоторые миРНК составляют 19 н.п. длиной, тогда как другие составляют 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27 н.п. длиной. Каждая из данных миРНК является на 100% консервативной среди всех серотипов, или в каждой миРНК имеется различие на 1-2 н.п. Данные консервативные последовательности необязательно связаны, по меньшей мере, с одним промотором в векторе, подходящем для доставки в зародышевую клетку. Другой альтернативой является применение миРНК, которая уже была синтезирована, см., например, миРНК, описанную в Kahana et al. J. Gen. Virol. 85: 3213-3217 (2004).
Данные конструкции миРНК затем встраивают в зародышевые клетки (например, сперматозоиды или яйцеклетки) парнокопытных животных с использованием способа REMI, описанного в WO 99/42569, с получением зародышевой клетки со стабильно интегрированной миРНК. Зародышевые клетки затем используют для продукции трансгенных животных способами, известными в данной области (например, оплодотворение in vitro, искусственное осеменение) с получением животного, устойчивого к вирусу ящура.
Пример 2
Получение спермы, содержащей миРНК для вируса Акабане
Линию сперматозоидов из не являющегося человеком позвоночного получают инкубацией спермы с конструкцией, включающей в себя последовательность, кодирующую миРНК к консервативной области вируса Акабане, где последовательность функционально связана с промотором в условиях, которые обеспечивают захват конструкции в клетку. Неограничивающие примеры включают в себя применение липофекции или сходного механизма, хлорида кальция или протамина. В качестве альтернативы, конструкция стабильно интегрируется в геном клетки хозяина с использованием технологии REMI. миРНК конструируют по двум критериям: области имеют высокую гомологию среди различных изолятов, и имеется высокая вероятность сайленсинга, что определяется программами поиска мишени для миРНК. Применение молекул миРНК, направленных на консервативные последовательности, должно гарантировать способность данных молекул расщеплять большинство, если не все вирусы одного штамма, независимо от их происхождения. Вторая и более важная причина состоит в том, что консервативность последовательности указывает на сильное давление отбора против изменения. Давление отбора, как ожидается, сохранило данные области-мишени неизменными, хотя если они изменяться, это может подавить противовирусную активность молекул миРНК.
Пример 3
Получение спермы, содержащей миРНК против вируса ящура
Линию сперматозоидов из не являющегося человеком позвоночного получают инкубацией спермы с конструкцией, включающей в себя последовательность, кодирующую миРНК к консервативной области вируса ящура, где последовательность функционально связана с промотором в условиях, которые обеспечивают захват конструкции в клетку. Неограничивающие примеры включают в себя применение липофекции или сходного механизма, хлорида кальция или протамина. В качестве альтернативы, конструкция стабильно интегрируется в геном клетки хозяина с использованием технологии REMI.
Пример 4
Получение спермы, содержащей миРНК против вируса птичьего гриппа
Линию сперматозоидов из не являющегося человеком позвоночного получают инкубацией спермы с конструкцией, включающей в себя последовательность, кодирующую миРНК к консервативной области вируса птичьего гриппа, где последовательность функционально связана с промотором в условиях, которые обеспечивают захват конструкции в клетку. Неограничивающие примеры включают в себя применение липофекции или сходного механизма, хлорида кальция или протамина. В качестве альтернативы, конструкция стабильно интегрируется в геном клетки хозяина с использованием технологии REMI.