КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ АНТИТЕЛОМ К CD19 И АЗОТИСТЫМ ИПРИТОМ
COMBINED THERAPY WITH CD19 ANTIBODY AND NITROGEN MUSTARD

Перекрестная ссылка
Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США с серийным номером 61/654097, поданной 1 июня 2012 г., предварительной заявки на патент США с серийным номером 61/647539, поданной 16 мая 2012 г., и предварительной заявки на патент США с серийным номером 61/523861, поданной 16 августа 2011 г., включенных посредством ссылки во всей их полноте.
Область изобретения
Настоящее раскрытие относится к фармацевтической комбинации антитела к CD19 и азотистого иприта для лечения неходжкинской лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза и/или острого лимфобластного лейкоза.
Предпосылки
В-клетки представляют собой лимфоциты, играющие важную роль в гуморальном иммунном ответе. Они вырабатываются в костном мозге большинства млекопитающих и составляют 5-15% циркулирующего лимфоидного пула. Основной функцией В-клеток является выработка антител против различных антигенов, также они являются необходимой составляющей адаптивной иммунной системы.
В связи с их ключевой ролью в регуляции иммунной системы, рассогласованная работа В-клеток связана с рядом нарушений, таких как лимфомы и лейкозы. К ним относят неходжкинскую лимфому (NHL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL) и острый лимфобластный лейкоз (ALL).
NHL представляет собой гетерогенное злокачественное образование лимфоцитарного происхождения. По оценкам в Соединенных Штатах (США) частота возникновения заболевания составляет 65000/год со смертностью примерно 20000 (American Cancer Society, 2006, и SEER Cancer Statistics Review). Заболевание может встречаться в любом возрасте, обычно его проявление начинается у лиц старше 40 лет, при этом частота возникновения заболевания возрастает с возрастом. NHL характеризуется клональной пролиферацией лимфоцитов, которые скапливаются в лимфоузлах, крови, костном мозге и селезенке, однако, может быть затронут любой жизненно важный орган. Современной классификационной системой, используемой патологами и клиницистами, является Классификация опухолей Всемирной организации здравоохранения (WHO), которая относит NHL к новообразованиям из предшественников и зрелых В-клеток или Т-клеток. PDQ в настоящее время разделяет NHL на индолентную и агрессивную форму в качестве критерия включения в клинические испытания. В группу индолентных NHL входят преимущественно фолликулярные подтипы, лимфома из малых лимфоцитов, MALT-лимфома (ассоциированная с лимфоидной тканью слизистых оболочек) и лимфома маргинальной зоны; индолентная форма охватывает примерно 50% вновь диагностированных больных с В-клеточной NHL. Агрессивная NHL включает больных с гистологическими диагнозами первичной диффузной В-крупноклеточной лимфомы (DLBL, DLBCL или DLCL) (40% всех вновь диагностированных больных имеют диффузную крупноклеточную лимфому), лимфомы Беркитта и лимфомы из клеток мантийной зоны. Клиническое течение NHL значительно варьирует. Главной определяющей клинического течения является гистологический подтип.Большинство индолентных типов NHL считаются неизлечимым заболеванием. Изначально больные реагируют как на химиотерапию, так и на терапию антителами, но у большинства встречаются рецидивы. Исследования на сегодняшний день не показали повышения выживаемости при раннем вмешательстве. В случае бессимптомных больных допустимо «наблюдать и ожидать» до тех пор, пока у больного не проявятся симптомы или до видимого ускорения течения заболевания. Со временем заболевание может трансформироваться в более агрессивную гистологическую форму. Медиана выживаемости составляет от 8 до 10 лет, и больные индолентными формами часто проходят 3 или более курсов лечения во время фазы лечения их заболевания. Начальным лечением больного индолентной формой NHL с клиническими проявлениями традиционно была комбинированная химиотерапия. Наиболее часто применяемые средства включают циклофосфамид, винкристин и преднизон (CVP) или циклофосфамид, адриамицин, винкристин и преднизон (CHOP). Примерно 70-80% больных будут отвечать на начальную химиотерапию, длительность ремиссий продолжается порядка 2-3 лет. В конечном итоге, у большинства больных наступает рецидив. Разработка и клиническое применение антитела к CD20, ритуксимаба, способствовали значительному улучшению ответа и уровня выживаемости. Современным стандартом лечения для большинства больных является ритуксимаб+CHOP (R-СНОР) или ритуксимаб+CVP (R-CVP). Для начального лечения NHL одобрен интерферон в комбинации с алкилирующими средствами, однако, его применение в США ограничено. Терапия ритуксимабом показала эффективность в отношении нескольких типов NHL и в настоящее время одобрена в качестве терапии первой линии как для индолентных (фолликулярных лимфом), так и для агрессивных форм NHL (диффузной В-крупноклеточной лимфомы). Однако моноклональное антитело (mAb) к CD20 имеет существенные недостатки, включая первичную резистентность (50% ответ при рецидиве у больных с индолентными формами), приобретенную резистентность (50% частоты ответа при повторном лечении), редкий полный ответ (2% частоты полного ответа среди лиц с рецидивами) и постоянное возникновение рецидива. Наконец, многие В-клетки не экспрессируют CD20, и, таким образом, многие В-клеточные нарушения не поддаются лечению с применением терапии антителами к CD20.
Помимо NHL существует несколько типов лейкозов, которые возникают вследствие рассогласованности работы В-клеток. Хронический лимфоцитарный лейкоз (также известный как «хронический лимфоидный лейкоз» или «CLL») представляет собой один из типов лейкоза взрослых, вызываемый аномальным скоплением В-лимфоцитов. При CLL злокачественные лимфоциты могут выглядеть нормальными и зрелыми, но они не могут эффективно справляться с инфекцией. CLL является самой распространенной формой лейкоза взрослых. У мужчин вероятность развития CLL вдвое выше, чем у женщин. Однако ключевым фактором риска является возраст. Свыше 75% новых случаев диагностируют у больных старше 50 лет.Ежегодно диагностируют более 10000 случаев, и смертность составляет почти 5000 в год (American Cancer Society, 2006, и SEER Cancer Statistics Review). CLL является неизлечимой болезнью, хотя в большинстве случаев прогрессирует медленно. Многие люди с CLL в течение многих лет ведут нормальную и активную жизнь. В связи с медленным началом на ранних стадиях CLL обычно не лечат, поскольку считают, что раннее вмешательство при CLL не повышает время выживания или качество жизни. Вместо этого состояние отслеживают в динамике. Способы начального лечения CLL варьируют в зависимости от точного диагноза и прогрессирования заболевания. Для терапии CLL используют десятки средств. Схемы комбинированной химиотерапии, такой как FCR (флюдарабин, циклофосфамид и ритуксимаб) и BR (бендамустин и ритуксимаб), эффективны как при вновь диагностированных, так и при рецидивных CLL. Аллогенную трансплантацию костного мозга (стволовых клеток) редко используют в качестве терапии первой линии CLL в связи с ее риском.
Другим типом лейкоза является острый лимфобластный лейкоз (ALL), также известный как острый лимфоцитарный лейкоз. ALL характеризуется усиленной выработкой и непрерывным размножением злокачественных и незрелых белых кровяных клеток (также известных как лимфобласты) в костном мозге. «Острый» подразумевает недифференцированное, незрелое состояние циркулирующих лимфоцитов («бластов») и быстрое прогрессирование заболевания с ожидаемой продолжительностью жизни от недель до месяцев при отсутствии лечения. ALL наиболее часто встречается в детстве, достигая максимальной частоты заболевания в возрасте 4-5 лет. Чаще всего от него погибают дети в возрасте 12-16 лет. В настоящее время по меньшей мере 80% детского ALL считаются излечимыми. Ежегодно диагностируют до 4000 случаев, и смертность составляет почти 1500 в год (American Cancer Society, 2006, и SEER Cancer Statistics Review).
Молекула CD19 человека представляет собой структурно обособленный рецептор клеточной поверхности, экспрессируемый на поверхности В-клеток человека, включая без ограничений пре-В-клетки, В-клетки на раннем этапе развития (т.е. незрелые В-клетки), зрелые В-клетки вплоть до конечной дифференцировки в плазматические клетки и злокачественные В-клетки. CD19 экспрессируется в случае большинства пре-В-клеточных острых лимфобластных лейкозов (ALL), неходжскинских лимфом, В-клеточных хронических лимфоцитарных лейкозов (CLL), пролимфоцитарных лейкозов, лейкозов волосковых клеток, острых лимфоцитарных лейкозов и при некоторых острых лимфобластных нуль-клеточных лейкозах (Nadler et al, J. Immunol., 131:244-250 (1983), Loken et al, Blood, 70:1316-1324 (1987), Uckun et al. Blood, 71:13- 29 (1988), Anderson et al, 1984. Blood, 63:1424-1433 (1984), Scheuermann, Leuk. Lymphoma, 18:385-397(1995)). Экспрессия CD19 на плазматических клетках дополнительно предполагает, что он может экспрессироваться на опухолях из дифференцированных В-клеток, таких как множественная миелома, плазмацитомы и опухоли Вальденстрема (Grossbard et al., Br. J. Haematol, 102:509-15(1998); Treon et al, Semin. Oncol, 30:248-52(2003)).
Таким образом, антиген CD19 является мишенью для иммунотерапии при лечении неходжкинской лимфомы (включая все описанные в данном документе подтипы), хронического лимфоцитарного лейкоза и/или острого лимфобластного лейкоза.
Были продемонстрированы некоторые способы терапии в отношении CD19. Т-клетки, экспрессирующие химерный антигенный рецептор (CAR) к CD19, содержащий CD3-C, и ко-стимулирующий домен4-ВВ, вводили трем больным с поздней стадией CLL. Kalos et al., T cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia, Science Translational Medicine, vol.3, no.95 (10 August 2011), которая включена посредством ссылки во всей полноте. Sadelain et al., The promise and potential pitfalls ofchimeric antigen receptors. Current Opinion in Immunology, Elsevier, vol.21, no.2, 2 April 2009, которая включена посредством ссылки во всей полноте, в которой также описаны химерные антигенные рецепторы (CAR) к CD19. Однако, ни Kalos et al., ни Sadelain et al. не описывают антитело, специфичное к CD19, в комбинации с бендамустином, как проиллюстрировано в данном документе.
Бендамустин в качестве терапевтического средства при лечении неходжкинской лимфомы был описан в работе Bremer et al. High rates of long lasting remission after 5-day bendamustine chemotherapy cycles in pre-treated low-grade non-Hodgkin's lymphomas, Journal of Cancer Research and Clinical Oncology, Springer International, Berlin, DE, vol.128, no.11, 1 November 2002, которая включена посредством ссылки во всей полноте, и в W02006065392, которая включена посредством ссылки во всей полноте, однако, ни в одной из них не предложено антитело, специфичное к CD19, в комбинации с бендамустином, как проиллюстрировано в данном документе.
Применение антитела к CD19 при неспецифических В-клеточных лимфомах обсуждается в WO 2007076950 (US 2007154473), обе из которых включены посредством ссылки во всей их полноте, вместе с беглым упоминанием бендамустина в длинном перечне возможных участников комбинации, однако, либо не сообщается об антителе, проиллюстрированном в данном документе, либо не предполагаются синергические эффекты этой комбинации при лечении неходжкинской лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза и/или острого лимфобластного лейкоза, как проиллюстрировано в данном документе.
Применение антитела к CD19 при CLL, NHL и ALL описано в Scheuermann et al., CD19 Antigen in Leukemia and Lymphoma Diagnosis and Immunotherapy, Leukemia and Lymphoma, Vol.18, 385-397 (1995), которая включена посредством ссылки во всей полноте, однако, в ней не предлагается комбинация, проиллюстрированная в данном документе.
Дополнительные антитела, специфичные к CD19, описаны в WO 2005012493 (US7109304), W02010053716 (US 12/266,999) (Immunomedics); WO 2007002223 (US US8097703) (Medarex); WO 2008022152 (12/377251) и WO 2008150494 (Xencor), WO 2008031056 (US 11/852106) (Medimmune); WO 2007076950 (US 11/648505) (Merck Patent GmbH); WO 2009/052431 (US12/253895) (Seattle Genetics) и WO 2010095031 (12/710442) (Glenmark Pharmaceuticals), которые включены посредством ссылки во всей их полноте.
Комбинации антител, специфичных к CD19, и других средств описаны в WO 2010151341 (US 13/377514) (Институт Фейнштейна (The Feinstein Institute)); US 5686072 (Техасский университет (University of Texas)) и WO 2002022212 (PCT/USO 1/29026) (IDEC Pharmaceuticals), все из которых включены посредством ссылки во всей их полноте.
Очевидно, что, несмотря на последний прогресс в обнаружении и разработке противоопухолевых средств, многие формы рака, включая опухоли, экспрессирующие CD19, все еще имеют неблагоприятный прогноз. Таким образом, существует необходимость в усовершенствованных способах лечения подобных форм рака. Краткое описание
Как из отдельных источников известного уровня техники, так и из комбинаций нельзя предположить синергические эффекты комбинации проиллюстрированного антитела и бендамустина при лечении неходжкинской лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза и/или острого лимфобластного лейкоза.
В одном аспекте настоящее раскрытие относится к синергической комбинации антитела, специфичного к CD19, и азотистого иприта. Подобные комбинации пригодны при лечении В-клеточных злокачественных новообразований, таких как неходжкинская лимфома, хронический лимфоцитарный лейкоз и/или острый лимфобластный лейкоз.
Считается, что in vitro и in vivo модели показывают, как определенное соединение или комбинация соединений будут проявлять себя в клинической практике. В дополнение, при комбинировании соединений как in vitro, так и in vivo, предполагается, что комбинация будет характеризоваться только аддитивными эффектами. Неожиданно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что комбинация конкретного антитела, специфичного к CD19, и бендамустина опосредовала синергический уровень специфического цитолиза в клеточной линии хронического В-клеточного лейкоза (МЕС-1) в сравнении с этим антителом и бендамустином по отдельности. Эта in vitro модель демонстрирует то, как комбинация будет работать при лечении хронического лимфоидного лейкоза (CLL) в клинической практике. В дополнение к этому, и также неожиданно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что комбинация конкретного антитела, специфичного к CD19, и бендамустина на моделях лимфомы Беркитта у мышей SCID и подавляла рост опухоли, и синергически увеличивала медиану выживаемости в днях и медиану увеличения продолжительности жизни в сравнении с антителом и бендамустином по отдельности. Данные in vivo модели демонстрируют то, как комбинация будет работать при лечении неходжкинской лимфомы в клинической практике. В заключение, комбинация проиллюстрированного антитела к CD19 и бендамустина проявляла себя синергически на моделях, соответствующих NHL и CLL. Поскольку как NHL, так и CLL относятся к нарушениям, связанным с В-клетками, и CD19 характеризуется сильной экспрессией на В-клетках, проиллюстрированная комбинация будет иметь такой же механизм действия и также будет проявлять себя синергически при лечении других нарушений, связанных с В-клетками, например, ALL.
Таким образом, комбинация проиллюстрированного антитела, специфичного к CD19, и бендамустина будет эффективной при лечении больных с неходжкинской лимфомой, хроническим лимфоцитарным лейкозом и/или острым лимфобластным лейкозом. Кроме того, проиллюстрированное в настоящем описании антитело, специфичное к CD19, уже вступило в клинические испытания, в которых подобные комбинации могут быть подтверждены в клинической практике.
В связи с тем, что по механизму действия бендамустин и другие азотистые иприты аналогичны, поскольку они являются алкилирующими средствами, образующими межнитевые поперечные сшивки (ICL) между основаниями ДНК, блокируя, таким образом, фундаментальные процессы, такие как репликация и транскрипция, полагают, что синергия также должна наблюдаться при лечении больных с неходжкинской лимфомой, хроническим лимфоцитарным лейкозом и/или острым лимфобластным лейкозом при помощи комбинации проиллюстрированного антитела к CD19 и азотистого иприта, отличного от бендамустина.
Поскольку проиллюстрированное антитело к CD19 и другие антитела к CD19 связываются с CD19, полагают, что синергия также должна наблюдаться при лечении больных с неходжкинской лимфомой, хроническим лимфоцитарным лейкозом и/или острым лимфобластным лейкозом при помощи комбинации любого антитела к CD19 и азотистого иприта, например, бендамустина.
Поскольку проиллюстрированное антитело к CD19 связывается со специфичным эпитопом CD19, полагают, что антитела, которые перекрестно конкурируют с проиллюстрированным антителом или присоединяются к тому же эпитопу, что и проиллюстрированное антитело, должны вести себя синергически при лечении больных с неходжкинской лимфомой, хроническим лимфоцитарным лейкозом и/или острым лимфобластным лейкозом при применении в комбинации с азотистым ипритом, например, бендамустином.
Аспект настоящего раскрытия охватывает синергическую комбинацию, в которую входит антитело, специфичное к CD19, содержащее участок HCDR1 с последовательностью SYVMH (SEQ ID NO:1), участок HCDR2 с последовательностью NPYNDG (SEQ ID NO:2), участок HCDR3 с последовательностью GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO:3), участок LCDR1 с последовательностью RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO:4), участок LCDR2 с последовательностью RMSNLNS (SEQ ID NO:5) и участок LCDR3 с последовательностью MQHLEYPIT (SEQ ID NO:6), а также бендамустин. В предпочтительных аспектах данную комбинацию применяют для лечения неходжкинской лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза и/или острого лимфобластного лейкоза.
Описание графических материалов
На фигуре 1 показаны цитотоксические эффекты MOR00208 и бендамустина по отдельности и в комбинации в отношении клеток МЕС-1.
На фигуре 2 показаны кривые доза-эффект ADCC для комбинации MOR00208 и бендамустина в клетках МЕС-1.
На фигуре 3 показана аминокислотная последовательность вариабельных доменов MOR00208.
На фигуре 4 показана аминокислотная последовательность Ре-участков MOR00208.
На фигуре 5 показаны нормализованные данные по специфическому цитолизу из таблицы 2.
На фигуре 6 показаны результаты для модели выживаемости при В-клеточной Ramos лимфоме Беркитта человека у мышей SCID, как описано в примере 3. На фигуре представлены данные, показанные в таблице 6, однако, исключены летальные исходы, связанные с лечением.
На фигуре 7 показан статистический анализ результатов для модели роста опухоли с имплантированной подкожно (SC) В-клеточной Ramos лимфомой Беркитта человека у мышей SCID, как описано в примере 2.
На фигуре 8 показаны результаты для модели роста опухоли с имплантированной подкожно (SC) В-клеточной Ramos лимфомой Беркитта человека у мышей SCID, как описано в примере 2.
На фигуре 9 показаны результаты для модели роста опухоли с имплантированной подкожно (SC) В-клеточной Ramos лимфомой Беркитта человека у мышей SCID, как описано в примере 2. На этой фигуре дозировка BEN составляет 13 мг/кг.
На фигуре 10 показаны результаты для модели роста опухоли с имплантированной подкожно (SC) В-клеточной Ramos лимфомой Беркитта человека у мышей SCID, как описано в примере 2. На этой фигуре доза BEN составляет 16 мг/кг.
Подробное описание изобретения
«Синергия», «синергизм» или «синергический» означают эффект больший, чем ожидаемый аддитивный эффект комбинации. «Синергия», «синергизм» или «синергический» эффект определяют в данном документе с помощью способов из Chou et al., Clarke et al. и/или Webb et al. cm. Ting-Chao Chou, Theoretical Basis, Experimental Design, and Computerized Simulation of Synergism and Antagonism in Drug Combination Studies, Pharmacol Rev 58:621-681 (2006), включенную посредством ссылки во всей полноте. Также см. Webb, J.L. (1963) Enzyme and Metabolic Inhibitors, Academic Press, New York, включенную посредством ссылки во всей полноте.
Термин «антитело» означает моноклональные антитела, включая любой изотип, такой как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Антитело IgG состоит из двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей, которые соединены дисульфидными связями. Каждая тяжелая и легкая цепь содержит константный участок и вариабельный участок. Каждый вариабельный участок содержит три сегмента, называемые «участки, определяющие комплементарность» («CDR») или «гипервариабельные участки», отвечающие в первую очередь за связывание эпитопа антигена. Их обозначают как CDR1, CDR2 и CDR3, нумеруя последовательно от N-конца. Более высококонсервативные части вариабельных участков за пределами CDR называют «каркасными участками». «Фрагмент антитела» означает Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab(F(ab')2 фрагмент или другой фрагмент, который содержит по меньшей мере один вариабельный участок тяжелой цепи или вариабельный участок легкой цепи, каждый из которых содержит CDR и каркасные фрагменты.
n
2n+1
«Азотистый иприт» является неспецифическим средством, алкилирующим ДНК, которое применяют в химиотерапии. Алкилирующие средства добавляют алкильную группу (CH) к основаниям нуклеиновой кислоты, например, добавляют алкильную группу к гуаниновому основанию ДНК к атому азота под номером 7 имидазольного кольца. Этапы алкилирования приводят к образованию межнитевых поперечных сшивок (ICL). Эти ICL обладают высокой цитотоксичностью, поскольку они блокируют фундаментальные метаболические процессы, такие как репликация и транскрипция. Азотистые иприты включают циклофосфамид, хлорамбуцил, урамустин, ифосфамид, мелфалан и бендамустин.
Циклофосфамид предлагается на рынке как Endoxan, Cytoxan, Neosar, Procytox и Revimmune, и также известен как цитофосфан. Циклофосфамид или комбинации, включающие циклофосфамид, применяются при лечении лимфом, лейкозов и некоторых солидных опухолей. Циклофосфамид имеет следующую структуру:
Хлорамбуцил предлагается на рынке компанией GlaxoSmithKline как Leukeran. В основном он применяется при лечении хронического лимфоцитарного лейкоза. Хрорамбуцил имеет следующую структуру:
Урамустин применяется при лечении неходжкинской лимфомы. Урамустин имеет следующую структуру:
Ифосфамид предлагается на рынке как Mitoxana и Ifex. Ифосфамид имеет следующую структуру:
Мелфалан предлагается на рынке как Alkeran. Мелфалан имеет следующую структуру:
Бендамустин предлагается на рынке под названиями Ribomustin и Treanda, и также известен как SDX-105 от компании Mundipharma International Corporation Limited (лицензия Astellas Pharma GmbH) и Cephalon для лечения хронических лимфоцитарных лейкозов (CLL), индолентной В-клеточной неходжкинской лимфомы (NHL) и других лимфом. Бендамустин имеет следующую структуру:
Используемое в данном документе «BEN» означает бендамустин.
«VH» относиться к вариабельному участку иммуноглобулиновой тяжелой цепи антитела или фрагмента антитела. «VL» относится к вариабельному участку иммуноглобулиновой легкой цепи антитела или фрагмента антитела.
Термин «CD19» относится к белку, известному как CD19, имеющему следующие синонимы: В4, В-лимфоцитарный антиген CD19, В-лимфоцитарный поверхностный антиген В4, CVID3, антиген дифференциации CD19, MGC12802 и Т-клеточный поверхностный антиген Leu-12.
CD19 человека имеет аминокислотную последовательность:
MPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKLNRSSEGPSSPSGICLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVSAVTLAYLIFCLCSLVGILHLQRALVLRRKRKRMTDPTRRFFKVTPPPGSGPQNQYGNVLSLPTPTSGLGRAQRWAAGLGGTAPSYGNPSSDVQADGALGSRSPPGVGPEEEEGEGYEEPDSEEDSEFYENDSNLGQDQLSQDGSGYENPEDEPLGPEDEDSFSNAESYENEDEELTQPVARTMDFLSPHGSAWDPSREATSLGSQSYEDMRGILYAAPQLRSIRGQPGPNHEEDADSYENMDNPDGPDPAWGGGGRMGTWSTR (SEQ ID NO:7).
«MOR00208» представляет собой антитело к CD19. Аминокислотная последовательность вариабельных доменов представлена на фигуре 3. Аминокислотная последовательность Fc-участков тяжелой и легкой цепи MOR00208 представлена на фигуре 4. «MOR00208» и «XmAb 5574» используются как синонимы для описания антитела, изображенного на фигурах 3 и 4. Антитело MOR00208 описано в заявке на патент США с серийным номером 12/377251, которая включена посредством ссылки во всей полноте.
Дополнительные антитела, специфичные к CD19, описаны в патенте США №7109304 (Immunomedics), включенном посредством ссылки во всей полноте; заявке на патент США с серийным номером 11/917750 (Medarex), включенной посредством ссылки во всей полноте;
заявке на патент США с серийным номером 11/852106 (Medimmune), включенной посредством ссылки во всей полноте; заявке на патент США с серийным номером 11/648505 (Merck Patent GmbH), включенной посредством ссылки во всей полноте; патенте США №7968687 (Seattle Genetics), включенном посредством ссылки во всей полноте, и заявке на патент США с серийным номером 12/710442 (Glenmark Phannaceuticals), включенной посредством ссылки во всей полноте.
«Fc-участок» означает константный участок антитела, которое, в случае человека, может относиться к подклассу IgGI, 2, 3, 4 или другим подклассам. Последовательности Fc-участков человека доступны на IMGT, Human IGH C-REGIONs, http://www.imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/protein/human/IGH/IGHC/Hu_IGHCallgenes.html (данные загружены 16 мая 2011).
«RefmAb33» представляет собой антитело со следующей аминокислотной последовательностью:
Тяжелая цепь, включая Fc-участок:
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTAGMSVGWIRQPPGKALEWLADIWWDDKKHYNPSLKDRLTISKDTSKNQVVLKVTNMDPADTATYYCARDMIFNFYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:8)
Легкая цепь, включая Fc-участок:
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCSASSRVGYMHWYQQKPGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGSGYPFTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:9)
RefmAb33 специфично к RSV и используется в качестве изотипического контроля, поскольку оно имеет такой же Fc-участок, что и MOR00208.
«Комбинация» означает наличие более одного элемента, например, соединение, такое как антитело, и бендамустин.
Настоящее раскрытие также относится к комбинациям, лекарственным препаратам и фармацевтическим композициям, содержащим описанные комбинации. Два компонента синергической комбинации по настоящему изобретению, например, антитело, специфичное к CD19, и бендамустин, могут вводиться совместно, одновременно или по отдельности. При совместном введении эти два компонента можно составлять вместе в одну фармацевтическую композицию, которая может включать фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. В качестве альтернативы, эти два компонента можно также составлять в различных фармацевтических композициях. В этом случае эти два компонента могут вводиться одновременно или последовательно. В одном варианте осуществления бендамустин вводят перед введением антитела, специфичного к CD19, например MOR00208, и/или отдельно от него.
Фармацевтическая композиция включает активное средство, например, антитело для применения в терапевтических целях в клинической практике. Фармацевтическая композиция может включать приемлемые носители или наполнители.
«Введенный» или «введение» включает без ограничений доставку посредством инъецируемой формы, как, например, внутривенным, внутримышечным, внутрикожным или подкожным путем, или путем введения через слизистые оболочки, например, как назальный спрей или аэрозоль для ингаляции, или в качестве проглатываемого раствора, капсулы или таблетки.
«Терапевтически эффективное количество» соединения или комбинации относится к количеству, достаточному для излечения, облегчения или частичного подавления клинических проявлений данного заболевания или нарушения и его осложнений. Количество, которое эффективно для конкретной терапевтической цели, будет зависеть от тяжести заболевания или повреждения, а также от веса и общего состояния субъекта. Будет понятно, что определение подходящей дозировки может осуществляться с использованием обычного экспериментирования, путем создания матрицы значений и тестирования различных точек этой матрицы, все это находится в рамках обычной компетенции опытного врача или ученого-клинициста.
«CDR» в данном документе определены либо по Chothia et al, либо по Kabat et al. См. Chothia С, Lesk AM. (1987) Canonical structures for the hypervariable regions ofimmunoglobulins. J Mol Biol., 196(4):901-17, включенную посредством ссылки во всей полноте. См. Kabat Е.А, Wu Т.Т., Perry H.M., Gottesman K.S. and Foeller С.(1991). Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th edit., NIH Publication no. 91-3242, US Dept. of Health and Human Services, Washington, DC, включенную посредством ссылки во всей полноте.
«Перекрестная конкуренция» означает способность антитела или другого средства связывания препятствовать связыванию других антител или средств связывания с CD19 в стандартном анализе конкурентного связывания. Способность и степень, с которой антитело или другое средство связывания способно препятствовать связыванию другого антитела или молекулы связывания с CD19, и, следовательно, где можно сказать о перекрестной конкуренции согласно настоящему изобретению, можно определить с помощью стандартных анализов конкурентного связывания. Один подходящий анализ включает применение технологии Biacore (например, путем применения BIAcore 3000 instrument (Biacore, Уппсала, Швеция)), которая может измерять степень взаимодействий с помощью технологии поверхностного плазменного резонанса. Другой анализ для измерения перекрестной конкуренции использует подход на основе ELISA. Высокопроизводительный способ для «эпитопной сортировки» антител, основанный на их перекрестной конкуренции, описан в международной заявке на патент № WO 2003/48731.
Термин «эпитоп» включает любую белковую детерминанту, способную к специфичному связыванию с антителом или иным образом взаимодействующую с молекулой. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или углеводы или боковые цепи Сахаров, и они могут характеризоваться специфическими пространственными структурными свойствами, а также специфическими зарядными характеристиками. Эпитоп может быть «линейным» или «конформационным». Термин «линейный эпитоп» относится к эпитопу, у которого все точки взаимодействия между белком и взаимодействующей молекулой (такой как антитело) располагаются линейно вдоль первичной аминокислотной последовательности белка (непрерывно). Термин «конформационный эпитоп» относится к эпитопу, у которого прерывисто расположенные аминокислоты сближаются в пространственной конформации. В конформационном эпитопе точки взаимодействия располагаются на аминокислотных остатках белка, которые отделены друг от друга.
«Связывается с тем же эпитопом, что» означает способность антитела или другого средства связывания связываться с CD19 и удержание того же эпитопа, что и проиллюстрированное антитело. Эпитопы для проиллюстрированного антитела и других антител к CD19 можно определять с помощью стандартных методик картирования эпитопов. Методики картирования эпитопов, общеизвестные в данной области техники, включают Epitope Mapping Protocols в Methods in Molecular Biology, Vol.66 (Glenn E.Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Например, линейные эпитопы можно определять, к примеру, путем одновременного синтеза большого числа пептидов на твердых подложках, при этом пептиды соответствуют частям белковой молекулы, и проведения реакции пептидов с антителами, при этом пептиды все еще остаются прикрепленными к подложкам. Такие методики известны в данной области техники и описаны, например, в патенте США №4708871; Geysen et al, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002; Geysen et al, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182; Geysen et al, (1986) Mol. Immunol. 23:709-715. Аналогично, конформационные эпитопы легко устанавливать с помощью определения пространственной конформации аминокислот, например, путем замены водорода на дейтерий, рентген-кристаллографии и двумерного ядерного магнитного резонанса. См., например, Epitope Mapping Protocols, выше. Антигенные участки белков также можно устанавливать с помощью стандартных графиков антигенности и гидрофобности, таких как рассчитываемые, например, с помощью программного обеспечения Omiga версия 1.0, доступного от Oxford Molecular Group.Эта компьютерная программа использует метод Хопа-Вудса, Норр et al, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828, для определения профилей антигенности и методику Кайта-Дулиттла, Kyte et al, (1982) J. Mol. Biol. 157:105-132, для графиков гидрофобности.
Варианты осуществления
Аспект настоящего раскрытия включает комбинацию антитела, специфичного к CD19, и азотистого иприта для применения при лечении неходжкинской лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза и/или острого лимфобластного лейкоза. В вариантах осуществления комбинация является синергической.
В данном документе комбинация проиллюстрированного антитела к CD19 и бендамустина проявляла себя синергически в in vitro и in vivo моделях, соответствующих NHL и CLL. Поскольку как NHL, так и CLL относятся к нарушениям, связанными с В-клетками, и CD19 характеризуется сильной экспрессией на В-клетках, проиллюстрированная комбинация должна иметь такой же механизм действия и также должна проявлять себя синергически при лечении других нарушений, связанных с В-клетками, например, ALL. Таким образом, комбинация проиллюстрированного антитела, специфичного к CD19, и бендамустина будет эффективной при лечении больных с неходжкинской лимфомой, хроническим лимфоцитарным лейкозом и/или острым лимфобластным лейкозом.
В связи с тем, что по механизму действия бендамустин и другие азотистые иприты аналогичны, поскольку они являются алкилирующими средствами, образующими межнитевые поперечные сшивки (ICL) между основаниями ДНК, блокируя, таким образом, фундаментальные процессы, такие как репликация и транскрипция, полагают, что синергия также должна наблюдаться при лечении больных с неходжкинской лимфомой, хроническим лимфоцитарным лейкозом и/или острым лимфобластным лейкозом при помощи комбинации проиллюстрированного антитела к CD19 и азотистого иприта, отличного от бендамустина, например, циклофосфамида, хлорамбуцила, урамустина, ифосфамида и мелфалана.
Поскольку проиллюстрированное антитело к CD19 и другие антитела к CD19 связываются с CD19, полагают, что синергия также должна наблюдаться при лечении больных с неходжкинской лимфомой, хроническим лимфоцитарным лейкозом и/или острым лимфобластным лейкозом при помощи комбинации любого антитела к CD19 и азотистого иприта, при этом антитело к CD19 представляет собой, например, описанное в заявке на патент США с серийным номером 12/377251 (Xencor), WO 2005012493, WO 2010053716 (Immunomedics); WO 2007002223 (Medarex); WO 2008022152 (Xencor); WO 2008031056 (Medimmune); WO 2007/076950 (Merck Patent GmbH); WO 2009/052431 (Seattle Genetics) и WO 2010095031 (Glenmark Pharmaceuticals), включенные посредством ссылки во всей их полноте.
В вариантах осуществления антитело, специфичное к CD19, включает антитело, которое перекрестно конкурирует с антителом, содержащим участок HCDR1 с последовательностью SYVMH (SEQ ID NO:1), участок HCDR2 с последовательностью NPYNDG (SEQ ID NO:2), участок HCDR3 с последовательностью GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO:3), участок LCDR1 с последовательностью RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO:4), участок LCDR2 с последовательностью RMSNLNS (SEQ ID NO:5) и участок LCDR3 с последовательностью MQHLEYPIT (SEQ ID NO:6).
В вариантах осуществления антитело, специфичное к CD19, включает антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело, содержащее участок HCDR1 с последовательностью SYVMH (SEQ ID NO:1), участок HCDR2 с последовательностью NPYNDG (SEQ ID NO:2), участок HCDR3 с последовательностью GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO:3), участок LCDR1 с последовательностью RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO:4), участок LCDR2 с последовательностью RMSNLNS (SEQ ID NO:5) и участок LCDR3 с последовательностью MQHLEYPIT (SEQ ID NO:6).
В вариантах осуществления антитело, специфичное к CD19, содержит участок HCDR1 с последовательностью SYVMH (SEQ ID NO:1), участок HCDR2 с последовательностью NPYNDG (SEQ ID NO:2), участок HCDR3 с последовательностью GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO:3), участок LCDR1 с последовательностью RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO:4), участок LCDR2 с последовательностью RMSNLNS (SEQ ID NO:5) и участок LCDR3 с последовательностью MQHLEYPIT (SEQ ID NO:6).
В вариантах осуществления антитело, специфичное к CD19, содержит вариабельный участок тяжелой цепи с последовательностью EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFQGRVTISSDKSISTAYMELSSLRSEDTAMYYCARGTYYYGTRVFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:10) и вариабельный участок легкой цепи с последовательностью DIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLQNVNGNTYLYWFQQKPGQSPQLLIYRMSNLNSGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCMQHLEYPITFGAGTKLEIK (SEQ ID NO:11).
В вариантах осуществления антитело, специфичное к CD19, содержит константный домен тяжелой цепи с последовательностью ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:12).
В вариантах осуществления антитело, специфичное к CD19, содержит константный домен легкой цепи с последовательностью
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:13).
В вариантах осуществления азотистым основанием является бендамустин.
В вариантах осуществления компоненты комбинации, антитело, специфичное к CD19, и бендамустин, вводят по отдельности. В варианте осуществления бендамустин вводят до введения антитела, специфичного к CD19.
В вариантах осуществления комбинацией является фармацевтическая композиция. В вариантах осуществления композиция содержит приемлемый носитель. В вариантах осуществления комбинацию вводят в эффективном количестве.
В другом аспекте синергическая комбинация антитела, специфичного к CD19, содержащего участок HCDR1 с последовательностью SYVMH (SEQ ID NO:1), участок HCDR2 с последовательностью NPYNDG (SEQ ID NO:2), участок HCDR3 с последовательностью GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO:3), участок LCDR1 с последовательностью RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO:4), участок LCDR2 с последовательностью RMSNLNS (SEQ ID NO:5) и участок LCDR3 с последовательностью MQHLEYPIT (SEQ ID NO:6), и бендамустина может опосредовать цитолиз клеток МЕС-1 путем ADCC в присутствии изолированных РВМС человека с эффективностью, превышающей по меньшей мере в два раза, три раза, четыре раза или пять раз эффективность бендамустина самого по себе.
Аспект настоящего раскрытия включает синергическую комбинацию антитела, специфичного к CD19, содержащего участок HCDR1 с последовательностью SYVMH (SEQ ID NO:1), участок HCDR2 с последовательностью NPYNDG (SEQ ID NO:2), участок HCDR3 с последовательностью GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO:3), участок LCDR1 с последовательностью RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO:4), участок LCDR2 с последовательностью RMSNLNS (SEQ ID NO:5) и участок LCDR3 с последовательностью MQHLEYPIT (SEQ ID NO:6), и бендамустина для лечения неходжкинской лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза и/или острого лимфобластного лейкоза. В вариантах осуществления неходжкинская лимфома выбрана из группы, состоящей из фолликулярной лимфомы, лимфомы из малых лимфоцитов, лимфомы, ассоциированной с лимфоидной тканью слизистых оболочек, лимфомы маргинальной зоны, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, лимфомы Беркитта и лимфомы из клеток мантийной зоны.
Другой аспект включает способ лечения неходжкинской лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза и/или острого лимфобластного лейкоза у лица, нуждающегося в этом, при этом способ включает введение антитела, специфичного к CD19, и азотистого иприта. В вариантах осуществления способа антитело, специфичное к CD19, содержит участок HCDR1 с последовательностью SYVMH (SEQ ID NO:1), участок HCDR2 с последовательностью NPYNDG (SEQ ID NO:2), участок HCDR3 с последовательностью GTYYYGTRVFDY (SEQ ID NO:3), участок LCDR1 с последовательностью RSSKSLQNVNGNTYLY (SEQ ID NO:4), участок LCDR2 с последовательностью RMSNLNS (SEQ ID NO:5) и участок LCDR3 с последовательностью MQHLEYPIT (SEQ ID NO:6). В вариантах осуществления способа антитело включает проиллюстрированное антитело, специфичное к CD19. В вариантах осуществления способа азотистым ипритом является бендамустин.
Примеры
Пример 1: Ингибирование пролиферации клеток МЕС-1 с помощью MOR00208 и бендамустина по отдельности и в комбинации
Материалы
Клетки МЕС-1: клеточная линия хронического В-клеточного лейкоза DSMZ #ACC497; питательная среда: среда Дульбекко в модификации Искова (IMDM) с GlutaMAX™, Invitrogen, №по каталогу: 31980-048, 20% PCS; РВМС: RPMI1640 со стабильным глутамином, PAN Biotech GmbH, №по каталогу: Р04-13500 с добавлением 10% FCS; Biocoll: Biochrome AG, №по каталогу: L6115, №партии: 1050Т; бендамустин: Mundipharma, №партии: 88018; FCS: PAN, № по каталогу: 3302-Р282403, №партии: Р282403; и RefmAb33 (антитело к RSV) с таким же Fc-участком, что и у MOR00208.
Методы
50
2
5
6
Цитотоксичность MOR00208 и бендамустина по отдельности и в комбинации тестировали на клетках МЕС-1. BEN является алкилирующим средством, поэтому действует путем прямой цитотоксичности на клетки МЕС-1. MOR00208 нацеливается на CD19 и дополнительно действует путем ADCC при цитолизе клеток МЕС-1. Цитолиз клеток МЕС-1 измеряли для следующих групп: BEN из расчета 100 мкг/мл, MOR00208 из расчета 6,6pm и комбинация MOR00208 из расчета 6,6 pm и BEN из расчета 100 мкг/мл. Эти концентрации выбирали, поскольку они представляют собой EC для MOR00208 и BEN или близки к ним. В качестве контролей использовали: RefmAb33, или РВМС сами по себе. Группу BEN и группу комбинация BEN+MOR00208 клетки МЕС-1 проинкубировали с BEN за 48 ч до измерений в анализе ADCC. Клетки МЕС-1 окрашивали с помощью 1 мг/мл Calcein AM, затем подсчитывали и доводили до 2×10/мл. РВМС подсчитывали и доводили до 6×10/мл. Методики цитолиза выполняли следующим образом: с применением 96-луночных микропланшетов, в лунку помещали 100 мкл суспензии клеток МЕС-1, затем в каждую лунку добавляли 100 мкл суспензии клеток РВМС, результатом чего было соотношение Е:Т 30:1, Антитела разбавляли до 1 мкг/мл средой. Клетки центрифугировали и ресуспендировали. К осадку из целевых-эффекторных клеток добавляли 100 мкл раствора антитела или соответствующего контрольного раствора. Смесь выдерживали 4 ч в CO-инкубаторе при 37°С. Измерения цитолиза проводили следующим образом: выдержанный раствор клеток (-100 мкл) переносили в пробирки для FACS и в каждую пробирку добавляли по 200 мкл буфера для FACS (DPBS+3%FCS) и 0,5 мкл исходного раствора Р1. Использовали FACS-Calibur. Погибшие клетки МЕС-1 окрашивались йодидом пропидия. В таблице 1 и на фигуре 1 представлены первичные данные.
Таблица 1
Контроль
MOR00208 6,6 pm
BEN100 мкг/мл
Комбинация BEN+MOR00208
Эксперимент 1
25,2
73,6
83,6
94,0
Эксперимент 2
18
41,5
53,3
64,9
Эксперимент 3
30,9
57,2
75,6
83,6
Значения представляют % погибших клеток. В каждом эксперименте представлены РВМС от разных доноров. Контролем, применяемым в каждом эксперименте, служило RefmAb33.
В таблице 2 представлены первичных данные таблицы 1, нормализованные относительно специфического цитолиза, и результаты расчетов индекса Чоу, выполненные для определения синергизма.
Таблица 2
Бендамустин,100 мкг/мл
MOR00208, 6,6 pm
BEN+MOR00208 (комбинация)
Индекс Чоу
Эксперимент 1
0,85
0,70
1,0
0,2
Эксперимент 2
0,75
0,50
1,0
0,7
Эксперимент 3
0,85
0,50
1,0
0,8
Среднее
0,8
0,6
1,0
0,6
Значения, представленные в таблице 2, рассчитывали следующим образом: 1) из первичных данных (% погибших клеток), представленных в таблице 1, вычитали фоновые (контрольные) значения, в результате чего получали специфический цитолиз для каждой группы обработки; затем 2) значения специфического цитолиза нормализовали, задавая комбинации MOR00208+BEN значение 1. Средние значения из таблицы 2 отражены на фигуре 5. Иллюстративные кривые доза-эффект ADCC, используемые при расчетах фактора Чоу для комбинации MOR00208+BEN, изображены на фигуре 2.
Расчеты индекса Чоу выполняли для определения синергии комбинации проиллюстрированного антитела к CD19 и бендамустина в сравнении с MOR00208 и BEN по отдельности. Подобные расчеты описаны в Ting-Chao Chou, Theoretical Basis, Experimental Design, and Computerized Simulation of Synergism and Antagonism in Drug Combination Studies, Pharmacol Rev 58:621-681 (2006), включенной посредством ссылки во всей полноте, и Chou ТС, Talalay P, Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Adv Enzyme Regul 22:27-55 (1984), включенной посредством ссылки во всей полноте. Способы Чоу-Талалая выполняли с помощью способа CI-изоболы.
Уравнение среднего эффекта
a
u
50
a
u
a
u
50
50
50
50
m
Уравнение среднего эффекта моделирует влияние ингибитора (такого как лекарственное средство), как F/F=(D/D), где D - доза, F и F - доли системы, на которые воздействует и не воздействует данная доза D (F+F=1); D - доза, дающая средний эффект (напр., IC, ED, LD). Константа т определяет форму кривой доза-эффект.
50
Чтобы оценить параметры m и D, использовали программное обеспечение Excel Fit для проведения расчета линейной регрессии.
Влияние комбинации на клетки МЕС-1 измеряли в % клеточной гибели, как описано выше. Долю F„ определяли как отношение % клеточной гибели у обработанной клеточной линии к % клеточной гибели у клеточной линии после воздействия контроля. Т.е.
u
F=% клеточной гибели (обработанная клеточная линия)/% клеточной гибели (необработанная клеточная линия).
50
Тогда, % клеточной гибели клеточной линии представляет собой константу D в уравнении среднего эффекта, которую можно оценить с помощью вышеописанной линейной регрессии.
Метод CI-изоболы
Метод CI-изоболы предусматривает количественную оценку синергизма между лекарственными средствами. Показатель аддитивности (CI) рассчитывали из данных доза-эффект для лечения одним лекарственным средством и комбинированными лекарственными средствами. Значение CI меньше 1 указывает на синергизм, CI=1 указывает на аддитивный эффект, и Ct>1 указывает на антагонизм. Взаимодействие лекарственных средств (синергизм или антагонизм) более выражено, чем дальше значение CI от 1.
Формально индекс аддитивности (CI) лечения комбинированными лекарственными средствами определяется как
l
x1
2
x2
CI=D/D+D/D.
1
2
x1
x2
x1
x2
a
u
В данном случае D и D представляют собой дозы лекарственного средства 1 и лекарственного средства 2 в комбинации, соответственно, a D и D - доза при лечении только лекарственным средством 1 или лекарственным средством 2, которая будет давать такой же эффект, что и у комбинации. Дозы D и D необходимо оценивать из данных доза-эффект для лечения одним лекарственным средством. Фактически, уравнение среднего эффекта согласуют с данными для каждого лекарственного средства. Из уравнения среднего эффекта лекарственного средства можно оценить дозу (например, D), необходимую для достижения эффекта (например, F, F). Чем дальше от аддитивной линии располагается точка, тем больше разница между 1 и ее CI, а значит и сильнее (синергический или антагонистический) эффект.
Результаты
Как показано в таблице 2, значения индекса Чоу указывают на явный синергизм комбинации MOR00208 и бендамустина при специфическом цитолизе клеток МЕС-1 по сравнению с MOR00208 и бендамустином по отдельности. Этот вывод основан на расчетах индексов Чоу, составляющих 0,2, 0,7 и 0,75 в каждом из трех экспериментов, соответственно, со средним значением 0,6, где CI<1 указывает на синергизм. Таким образом, комбинация MOR00208 и бендамустина также будет проявлять себя синергически при лечении неходжкинской лимфомы (NHL), хронического лимфоидного лейкоза (CLL) и/или острого лимфобластного лейкоза (ALL) у людей. Для подтверждения результатов приведенных выше расчетов индексов Чоу, нормализованные данные таблицы 2 оценивали в отношении статистической значимости с помощью критерия Бонферрони для множественных сравнений. См. James, et al. Antibody-mediated B-cell depletion before adoptive immunotherapy with Т cells expressing CD20-specific chimeric T-cell receptors facilitates eradication of leukemia in immunocompetent mice, Blood, 1 14(27):5454-63 (Epub 2009 Oct 30), включенную посредством ссылки во всей полноте. Результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3
Критерий Бонферрони для множественных сравнений
Средняя разница
Т-значение
Значимо? (р<0,05)
Вывод
Бендамустин (100 мкг/мл) по сравнению с комбинацией BEN+MOR00208
-0,1834
2,997
Да
*
MOR00208 (6,6 рМ) по сравнению с комбинацией BEN+MOR00208
-0,4321
7,060
Да
***
**р<0,05
***р<0,001
Результаты
Как показано в таблице 3, критерий Бонферрони для множественных сравнений демонстрирует, что комбинированная обработка BEN+MOR00208 статистически более эффективна при специфическом цитолизе клеток МЕС-1 по сравнению с обработкой BEN и MOR00208 по отдельности.
Пример 2: MOR00208 и BEN по отдельности и в комбинации на модели роста опухоли с имплантированной подкожно (SC) В-клеточной Ramos лимфомой Беркитта человека Материалы
Клетки RAMOS лимфомы Беркитта человека (номер АТСС CRL-1596, №партии 3953138); среда-контроль: 150 мМ NaCl, 25 мг/мл маннита, рН 5,5-6,0 (доведенный 0,01 М NaOH). Ref_mAb_33_IgG_Xen (10 мг/мл в PBS, называется Ref_mAb_33). Шестинедельных самок мышей С. В-17 SCID (CB17/lcr-Prkdcscid/lcrlcoCrl) приобретали в Charles River Laboratories (Вилмингтон, Массачуссетс) и акклиматизировали в лабораториях в течение девяти дней до проведения экспериментов.
Методы
6
3
Мышам SCID подкожно имплантировали клетки RAMOS (~5×10 клеток/мышь). После образования у мышей опухолей размером приблизительно 150 мм, или примерно через 14 дней после инокуляции, их разделяли на группы, при этом в каждой группе объемы опухоли были приблизительно одного размера. Лечение начинали в День 15. Схемы лечения представлены в таблице 4. Продолжительность исследования составляла 60 дней.
Таблица 4
№ группы
Число животных
Тестируемые препараты
Доза (мг/кг)
Путь введения лечения и график
А/В
10
Бендамустин
13 и 16
IP,Q1D×5
D
10
MOR00208
6/10
IV, 6 мг/кг Q3D×2; 10 мг/кг Q3D×2/3 недели, начиная с Дня 22
Е
10
Среда/ RefmAb33
6/10
IP,Q1D×5 IV, 6 мг/кг Q3D×2; 10 мг/кг Q3D×2/3 недели, начиная с Дня 22
F/G
10
MOR00208/ Бендамустин
6 или 10/13 и 6 или 10/16
MOR00208 и BEN, как указано выше
Из-за технической ошибки в День 18 MOR00208 не вводили.
MOR00208 и бендамустин вводили в объеме 0,1 мл/10 г веса тела, MOR00208 и среду-контроль/Ref_mAb_33 в концентрации 0,6/1,0 мг/мл и бендамустин в концентрации 1,3 и 1,6 мг/мл.
Регистрируемыми величинами были 1) медиана дней для достижения размера 4000 мг, при этом статистический анализ выполняли с помощью логрангового критерия, и 2) размер опухоли на День 34 исследования, при этом статистический анализ выполняли с помощью однофакторного ANOVA и апостериорного критерия Бонферрони (первичные данные не показаны). Вес опухолей рассчитывали с помощью уравнения (I×w2)/2, где I и w описывают больший и меньший линейный размер, полученные при каждом измерении. Результаты показаны на фигурах 7-10. Комбинированная терапия значимо не превосходила соответствующие монотерапии в данной подкожной модели по сравнению с явной синергией, показанной в ортотопической модели выживаемости ниже. Предположили, что это связано с неэффективной схемой дозировки MOR00208 в данной модели. В то же время полагают, что описанная ниже ортотопическая модель выживаемости является более прогностической в отношении того, как комбинированное лечение будет работать при лечении CLL, NHL и ALL в клинической практике, поскольку ортотопическая модель лучше имитирует множественную природу заболевания, включая поражение сосудистой системы, по сравнению с приведенной выше подкожной моделью солидной опухоли.
Пример 3: MOR00208 и BEN по отдельности и в комбинации на модели выживаемости с RAMOS неходжкинской опухолью человека у мышей SCID
Материалы
b
scid
Циклофосфамид (Baxter, №партии 1А548С); среда-контроль: 0,9% хлорид натрия, 25 мг/мл маннита, рН 6,5-6,8 (доведенный 0,01 М NaOH); мыши SCID (Университет Аделаиды, Кампус Уайт, Уррбри, Южная Австралия, Австралия, линия С.В.-17-Igh-1-Prkdc); клетки RAMOS лимфомы Беркитта человека (номер АТСС CRL-1596); Ref_mAb_33_IgG_Xen (10 мг/мл в PBS, называется Ref_mAb_33); бендамустин (Mundipharma, №партии 83889).
Методы
6
Мышей SCID предварительно обрабатывали циклофосфамидом (75 мг/кг, i.p., дважды в день) в течение двух дней до инокуляции клеток RAMOS (День -2 и -1). В день инокуляции (День 0) мышей разделяли на семь групп по 10 мышей в каждой и внутривенно в хвостовую вену инокулировали по 1×10 клеток RAMOS. Запланированная схема дозирования для каждой группы показана в таблице 5 и начиналась в День 3. Продолжительность исследования составляла 60 дней.
Таблица 5:
Схема дозирования
Группа
Соединение
Лечение
График
2 и 3
Бендамустин
13/16 мг/кг, i.p., в 10 мл/кг
Один раз в день (Дни 5-9)
1
MOR00208
3 мг/кг, i.v., в 10 мл/кг
Дважды в неделю в течение 3-х недель (Дни 3,6, 10, 13, 17 и 20)
10
Среда-контроль
i.p., 10 мл/кг
Один раз в день (Дни 5-9)
5 и 6
Бендамустин/MOR00208
13/16 мг/кг i.p., 3 мг/кг i.v., в 10 мл/кг
Один раз в день (Дни 5-9)/дважды в неделю в течение 3-х недель (Дни 3,6, 10, 13, 17 и 20)
4
Бендамустин
26 мг/кг, i.p., в 10 мл/кг
Один раз в день (Дни 5-9)
10
RefmAb
3 мг/кг, i.v.
День 3,6, 10, 13, 17 и 20
Данные по выживаемости представлены в таблице 6 и на фигуре 6.
Таблица 6:
Гибель мышей
Группа
Соединение
Лечение
Гибель мышей во время проведения исследования [День после инокуляции]
1
MOR00208
3 мг/кг, i.v.
25; 29; 29; 30; 31; 33; 35; 38; 38; 39
2
Бендамустин
13 мг/кг, i.p.
10*; 21; 21; 23; 24; 24; 24; 24; 25; 26
3
Бендамустин
16 мг/кг, i.p.
24; 24; 24; 24; 24; 24; 25; 26; 26; 27
4
Бендамустин
26 мг/кг i.p.
10*; 10*; 10*; 10*; 10*; 12*;1 2*; 14*; 16*; 23
5
Бендамустин/ MOR00208
13/3 мг/кг, i.p./i.v.
12*; 30; 33; 33; 35; 40; 45; 45; 56; 56
6
Бендамустин/ MOR00208
16/3 мг/кг, i.p./i.v.
33; 35; 38; 39; 40; 40; 45; 45; 45; 45
10
Среда/RefjnAb
i.p./3 мг/кг, i.v.
24; 24; 25; 25; 25; 26; 26; 26; 26; 29
*Гибель, связанная с токсичностью соединения.
Из первичных данных, приведенных в таблице 6, рассчитывали медиану выживаемости в днях и медиану увеличения продолжительности жизни. Все гибели, связанные с лечением, исключали из расчетов. Результаты представлены в таблице 7.
Таблица 7
Группа
Лечение
Медиана выживаемости (дни после инокуляции)
Медиана % увеличения продолжительности жизни (ILS)<sup>§</sup>
Оценка эффектов комбинации
1
MOR00208
32<sup>a</sup>
25,5
п.а.
2
Бендамустин 13 мг/кг
24<sup>b</sup>
-5,88
п.а.
3
Бендамустин 16 мг/кг
24<sup>c</sup>
-5,88
п.а.
4
Бендамустин 26 мг/кг
n.а.
n.а.
п.а.
5
Бендамустин/MOR0020813/3 мг/кг
40<sup>d</sup>
56,86
Синергия/Потенцирование*
6
Бендамустин/ MOR00208<sup></sup>16/3 мг/кг
40<sup>d</sup>
56,86
Синергия/Потенцирование**
10
Среда/Ref_mAb 3 мг/кг
25,5
п.а.
n.а.
а - значимо отличается от среды-контроля/Ref_mAb 3 (группа 10) (р<0,001), бендамустина из расчета 13 мг/кг (группа 2) (р<0,001), бендамустина/МОР00208 из расчета 13/3 мг/кг (группа 5) (р<0,05) и бендамустина/МОК00208 из расчета 16/3 мг/кг (группа 6) (р<0,001).b - значимо отличается от среды-контроля/Ref_mAb_33 (группа 10) (р<0,05) и бендамустина/МОК00208 из расчета 13/3 мг/кг (группа 5) (р<0,001).с - значимо отличается от бендамустина/М(Ж00208 из расчета 16/3 мг/кг (группа 6) (р<0,001).d - значимо отличается от среды-контроля/Ref_mAb_33 (группа 10) (р<0,001).§ - по сравнению с средой-контролем/Ре1_тАЬ_33.* Синергия/Потенцирование по сравнению с соответствующими группами монотерапии, как например, ILSCombo (56,86%) >ILSMOR00208 3 мг/кг+ILSбендамустина 13 мг/кг (25,5%+(-5,88)%=19,62%).** Синергия/Потенцирование по сравнению с соответствующими группами монотерапии, как например ILSCombo (56,86%) >ILSMOR00208 3 мг/кг+ILSбендамустина 16 мг/кг (25,5%+(-5,88)%=19,62%).
Медианный % увеличения продолжительности жизни (ILS) рассчитывали следующим образом:
Лечение
Контроль
Медианный % увеличения продолжительности жизни=(Выживаемость-Средняя выживаемость)/Средняя выживаемостьконтроль×100. Время выживания измеряли в днях после инокуляции.
Классификация эффектов комбинации
Классификацию эффекта комбинированной терапии (combo) MOR00208/бендамустином оценивали путем сравнения ILS для данной комбинации с суммарными ILS соответствующих монотерапий:
Синергия/Потенцирование*: ILSCombo>ILSMOR00208 3 мг/кг+ILSбeндaмycтинa. Синергические эффекты классифицировали как потенцирование в случае отсутствия эффекта хотя бы у одной из монотерапий. Аддитивность: ILSCombo=ILSMOR00208 3 мг/кг+ILSбeндaмycтинa. Антагонизм: ILSCombo<ILSMOR00208 3 мк/кг+ILSбeндaмycтинa.
В дополнение к анализу данных с целью выявления синергии выполняли также следующий статистический анализ. Статистические анализы выполняли, используя медианные значения. Любое животное, которое случайно погибало или отбраковывалось до Дня 17 исследования в группах лечения тестируемыми препаратами, исключали из расчета анализа выживаемости. Гибель/отбраковку этих животных скорее связывали с токсичностью соединения, а не с прогрессированием заболевания, поскольку они происходили задолго до первых гибелей у животных среды-контроля. Кривую выживаемости строили с помощью множительных оценок Каплана-Мейера, и кривые выживаемости сравнивали с помощью логрангового критерия (Мантеля-Кокса). При обнаружении значимых отличий выполняли множественное попарное сравнение (тест Холма-Сидака). Сравнение выполняли между всеми группами. Кроме того, сравнение следующих групп обобщали на отдельных фигурах для каждого тестируемого препарата: среда-контроль/Ref÷mAb (группа 10) по сравнению с группами бендамустина (группы 2, 3 и 4) и среда-контроль/Ref_mAb (группа 10) по сравнению с группами комбинации (группы 5 и 6) или соответствующей группой монотерапии MOR00208 (группа 1). р-Значение меньше 0,05 считалось значимым. Результаты представлены в таблицах 8-10.
Результаты
Как показано в таблицах 7-10 и на фигуре 6, комбинация MOR00208 и бендамустина проявляла себя синергически и имела статистическую значимость в модели выживаемости с ортотопической опухолью при неходжкинской RAMOS лимфоме по сравнению с MOR00208 и бендамустином по отдельности.
Следует понимать, что настоящее описание, конкретные примеры и данные, несмотря на то, что указывают на иллюстративные варианты осуществления, приведены для иллюстрации и не предполагают ограничениянастоящего изобретения. Различные изменения и модификации в пределах настоящего изобретения станут очевидны опытному специалисту из обсуждения, раскрытия и данных, содержащихся в данном документе, и считаются, таким образом, частью настоящего изобретения.