Чувствительность клинических штаммов Streptococcus pyogenes к антисептическому препарату гексэтидину и антимикробным препаратам для системного применения

Чувствительность клинических штаммов Streptococcus pyogenes к антисептическому препарату гексэтидину и антимикробным препаратам для системного применения

И. А. Эйдельштейн, Р. С. Козлов, А. Н. Чагарян

НИИ антимикробной химиотерапии ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Минздрава России, Смоленск, Россия

Охарактеризована активность 8 антибиотиков и антисептика гексэтидина в отношении клинических штаммов Streptococcus pyogenes, выделенных у пациентов с инфекциями различной локализации. Все исследованные препараты сохраняют высокую активность в отношении стрептококков группы А, за исключением тетрациклина и хлорамфеникола. Анализ вре-

менных кривых роста-отмирания для штаммов Streptococcus pyogenes свидетельствует о стабильном бактерицидном эффекте гексэтидина в отношении исследованных штаммов с высоким (16 мг/л) и низким уровнем МПК (4 мг/л).

Ключевые слова: Streptococcus pyogenes, гексэтидин, антибиотики, антимикробная активность.

Susceptibility of Streptococcus pyogenes Clinical Strains to Hexetidine and to Systemic Antimicrobals

I. A. Edelstein, R. S. Kozlov, A. N. Tchagaryan

Institute of Antimicrobial Chemotherapy, Smolensk, Russia

Minimal inhibitory concentrations (MIC) was used to describe the activity of 8 systemic antimicrobials and antiseptic hexetidine against clinical strains of Streptococcus pyogenes. All tested agents showed high activity against Group A streptococci, except tetracycline and chloram-

phenicol. Time-killing curves showed stable bactericidal effect of hexetidine against strains with both low (4 mg /l) and high (16 mg /l) MICs.

Key words: Streptococcus pyogenes, hexetidine, antibiotic, antimicrobial activity.

Контактный адрес:

Инна Александровна Эйдельштейн

Эл. почта: ie@antibiotic.ru

Введение

Streptococcus pyogenes (бета-гемолитический стрептококк группы А, БГСА) является наиболее распространенным возбудителем бактериального фарингита. Пенициллин считается препаратом выбора для лечения фарингита и других неинва-зивных стрептококковых инфекций, а препараты группы макролидов рекомендуются в качестве альтернативных средств при наличии аллергических реакций у пациента на бета-лактамные антибиотики. Также при фарингитах могут местно использоваться антисептики, в частности гексэтидин (hexetidine), противомикробное действие которого обусловлено подавлением окислительных реакций метаболизма микроорганизмов [1, 2]. Гексэтидин обладает широким спектром активности в отношении бактерий и ряда грибов, а также оказывает слабое анестезирующее действие на слизистую оболочку.

Для оценки активности антимикробных препаратов, в соответствии с рекомендациями Комитета по клиническим лабораторным стандартам США (CLSI), применяется два методологических подхода: определение минимальных подавляющих концентраций (МПК) препаратов и анализ временной кривой гибели бактерий [3]. Показатели МПК используются в качестве опорных значений для характеристики активности антибактериальных препаратов в отношении определенного вида микроорганизма in vitro. Однако метод построения и оценки временной кривой гибели микроорганизмов in vitro позволяет более точно проанализировать количество активно размножающихся бактерий в определенные промежутки воздействия ингибирующего вещества. Данный подход также используется для выявления антагонизма или синергизма между двумя (и более) антимикробными препаратами и для определения толерантности.

Целью настоящего исследования было изучение активности антимикробных препаратов в отношении штаммов S. pyogenes, выделенных у пациентов с инфекциями различной локализации, а также характеристика антимикробного действия гексэти-дина на основе анализа временных кривых гибели микроорганизмов.

Материал и методы

Выделение, идентификация, транспортировка и хранение штаммов. В исследование включены клинические штаммы S. pyogenes, выделенные в 12 центрах Центрального (Москва, Смоленск, Ярославль, Калуга), Южного (Краснодар), Приволжского (Пермь), Уральского (Екате-

ринбург 3 центра), Сибирского (Иркутск, Томск) и Дальневосточного (Хабаровск) федеральных округов России. Идентификацию S. pyogenes в локальных лабораториях проводили с помощью рутинных методов, принятых в каждой лаборатории. В центральной лаборатории (НИИ антимикробной химиотерапии, Смоленск) проводилась реидентификация 100% штаммов на основе изучения морфологии колоний на кровяном агаре, наличия в-гемолиза, отрицательной ката-лазной реакции, чувствительности к бацитрацину и положительных результатов латекс-агглютинации с использованием набора «Slidex Strepto-Kit» (bioMerieux, Франция). Для субкультивирования микроорганизмов использовали колумбийский агар (bioMerieux, Франция) c добавлением 5% дефибринированной лошадиной крови. Инкубация проводилась в атмосфере с повышенным содержанием СО2 (5%) при температуре 35 °C в течение 24 ч. До тестирования штаммы хранили в криопро-бирках, содержащих триптиказо-соевый бульон (bioMerieux, Франция) с добавлением 30% стерильного глицерина (Sigma, США) при температуре -70 °C.

Определение чувствительности. В соответствии с рекомендациями CLSI/NCCLS [4] исследование чувствительности S. pyogenes с определением МПК проводили методом микроразведения в кати-он-сбалансированном бульоне Мюллера-Хинтон (BBL, США) с добавлением лизированной лошадиной крови (итоговая концентрация 5%).

Для приготовления бактериальной суспензии чистую суточную культуру микроорганизмов разводили в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия до мутности, эквивалентной 0,5 по стандарту МакФарланда (DEN-1 McFarland Densitometr, BIOSAN, Латвия). Полученную взвесь S. pyogenes в стандартной концентрации 105 КОЕ/мл с помощью многоканальной пипетки вносили в лунки микротитровальных планшетов, которые инкубировали при температуре 35 °С в течение 20-24 ч в обычной атмосфере.

При тестировании использовали двойные серийные разведения химически чистых субстанций следующих антибиотиков: пенициллина (Sigma, Германия), эритромицина (Polfa, Польша), клин-дамицина (Pfizer, США), левофлоксацина (Fluka, Германия), тетрациклина (Sigma, Германия), хло-рамфеникола (Fluka, Германия), ко-тримоксазола (Sigma, Германия), ванкомицина (Eli Lilly, США), а также раствора антисептического препарата гек-сэтидина (SIGMA-ALDRICH, Германия).

Для тестирования гексэтидина из общей выборки S.pyogenes были отобраны штаммы, изолирован-

Таблица 1. Критерии интерпретации результатов определения чувствительности штаммов S. pyogenes к антибиотикам (МПК, мг/л) и допустимые диапазоны МПК (в мг/л) для контрольного штамма S. pneumoniae АТСС 49619

Антибиотик Ч S. pyogenes УР Р S. pneumoniae АТСС 49619

Пенициллин <0,12 - - 0,25-1

Эритромицин <0,25 0,5 >1 0,03-0,12

Клиндамицин <0,25 0,5 >1 0,03-0,12

Тетрациклин <2 4 >8 0,12-0,5

Левофлоксацин <2 4 >8 0,5-2

Хлорамфеникол <4 8 >16 2-8

Триметоприм/ сульфаметоксазол <2 4-8 >8 0,12/2,4-1/19

Ванкомицин <1 - - 0,12-0,5

Примечание. Ч — чувствительные, УР - - умеренно резистентные, Р — резистентные штаммы.

ные из назофарингеального материала пациентов, что составило 274 культуры.

Контроль качества тестирования с использованием референтных штаммов S. pneumoniae ATCC49619 и S. pyogenes ATCC19615 при каждой постановке чувствительности проводили в соответствии с рекомендациями CLSI. Допустимые значения МПК для S. pneumoniae представлены в табл. 1.

Анализ временной кривой гибели микроорганизмов. Антимикробная активность гексэтидина была исследована с помощью анализа временной кривой гибели микроорганизмов с использованием метода разведений в бульоне в соответствии с рекомендациями CLSI/NCCLS [4]. В исследование были включены штаммы S. pyogenes с МПК гексэтидина, равной 4 и 16 мг/л как наибольшее и наименьшее значение, полученное в результате анализа. Для выполнения процедуры были выбраны конечные концентрации гексэтидина, соответствующие одно-, двух- и четырехкратному увеличению МПК для каждого исследуемого штамма S. pyogenes. В каждый флакон, содержащий 5 мл бульона Мюллера-Хинтон (BBL, США), 5% дефи-бринированной лошадиной крови от общего объема и гексэтидин в необходимой концентрации, вносился тестируемый микроорганизм, находящийся в логарифмической фазе роста. Итоговая концентрация микробных клеток во флаконе составляла 5х105 КОЕ/мл. Флаконы инкубировали при 35 °C в обычной атмосфере. Отобранные аликвоты суспензии (50 мкл) инокулировали на чашки, содержащие колумбийский агар (bioMerieux, Франция) c добавлением 5% дефибринированной лошадиной крови, с использованием Automated Spiral Plater (Spiral Biotech) через 0, 2, 4, 6, 8, 10 и 24 часа. Все исследования проводили в повторах, а в качестве

отрицательного контроля использовали флаконы без гексэтидина. Инкубирование чашек проводилось в атмосфере с повышенным содержанием СО2 (5%) при температуре 35 °C. Подсчет растущих колоний осуществляли с использованием формул и таблиц расчета пакета SpiralBiotech QCountTM в соответствующих разведениях. Антимикробная активность препарата была интерпретирована как бактерицидная, если погибало 99,9% (>3 lg) микроорганизмов от общего количества КОЕ/мл, содержащихся во внесенном инокулюме в нулевой точке. Бактериостатическая активность определялась как гибель менее чем 99,9% (<3 lg) микроорганизмов от общего количества КОЕ/мл, внесенных во флакон для культивирования.

Методы обработки данных и статистического анализа. Ввод данных, статистическая обработка и анализ полученных результатов проводился с использованием программного обеспечения компьютерных программ Microsoft Office Excel 2010, SAS версия 6.12 (SAS Institute, США) и M-Lab (НИИАХ, Смоленск).

Результаты исследования

Распределение штаммов по центрам. В иссле-

дование включено 589 клинических штаммов

S. pyogenes. Количество штаммов S. pyogenes, полученных в каждом из 12 центров исследования, представлено на рис. 1.

Резистентность штаммов S. pyogenes. Обобщенные результаты и критерии интерпретации определения чувствительности S. pyogenes представлены в табл. 2. Категория «нечувствительный» объединяла штаммы, обладавшие умеренным и высоким уровнем резистентности.

Кроме необходимости учета данных по чувствительности, важная роль в прогнозировании ситуа-

203

93 83

52

46 39 45

24

22

//////////

0S>>

^ -рР

vitro активностью: общая частота нечувствительных штаммов не превышает 5%. Для 3% штаммов МПК90 эритромицина составляла 0,06 мг/л.

Количество нечувствительных к клиндамицину штаммов составило 0,7%, а его МПК90 — 0,03 мг/л. Учитывая незначительный уровень резистентности к клиндамицину, можно предположить, что это обусловлено циркуляцией штаммов, имеющих ген mefA (М-фенотип), который отвечает за активный выброс из микробной клетки 14-членных макроли-дов (эритромицин и кларитромицин), но не обеспе-

Рис. 1. Распределение штаммов S. pyogenes по центрам. Таблица 2. Результаты определения чувствительности штаммов S. pyogenes

Антимикробный препарат Ч, % УР, % Р, % МПК50, мг/л МПК90, мг/л Диапазон МПК, мг/л

Пенициллин 100 0 0 0,03 0,03 0,03-0,125

Эритромицин 97 0,3 2,7 0,03 0,06 0,03-2

Клиндамицин 99,3 0 0,7 0,03 0,03 0,03-2

Тетрациклин 60,1 1,7 38,2 0,125 32 0,125-64

Левофлоксацин 100 0 0 0,5 1 0,015-2

Хлорамфеникол 87,3 0,3 12,4 2 32 0,06-64

Триметоприм/ сульфаметоксазол 100 0 0 0,125 0,25 0,03-1

Ванкомицин 100 0 0 0,5 0,5 0,03-1

Гексэтидин — — — 8 16 0,03-64

579

Ч - 100%

МПК50 - 0,03 мг/л МПК90 - 0,03 мг/л

Р - 0%

Рис. 2. Распределение МПК пенициллина для штаммов S. pyogenes.

513

Ч - 97%

23 31 4

УР

0,3%

МПК50 - 0,03 мг/л МПК90 - 0,06 мг/л

Р - 2,7%

10 6

0

0

ъР of* о?-Ъ & "

Рис. 3. Распределение МПК эритромицина для штаммов S. pyogenes.

ции с резистентностью принадлежит распределению штаммов по значениям МПК.

Бета-лактамы. S. pyogenes сохраняет высокую чувствительность к пенициллинам. Чувствительными к пенициллину были 100% штаммов БГСА. Значения МПК50 и МПК90 для штаммов S. pyogenes составляли 0,03 мг/л (рис. 2).

Макролиды и линкозамиды. Распределение штаммов S. pyogenes по значениям МПК эритромицина представлено на рис. 3.

Следует отметить, что в целом представители этой группы антибиотиков обладают высокой in

чивает резистентность к 16-членным макролидам.

Распределение штаммов по значениям МПК клиндамицина представлено на рис. 4.

Фторхинолоны. Левофлоксацин характеризовался высоким уровнем активности в отношении исследованных штаммов S. pyogenes, его МПК90 составляла 1 мг/л (рис. 5).

Тетрациклины. К тетрациклину нечувствительными были 39,9% исследованных изолятов S. pyogenes (рис. 6). В субпопуляции, представленной чувствительными микроорганизмами, 322 штамма имели МПК <0,125 мг/л, что соответствует зна-

Ч - 99,3%

9 5

УР -

0%

0 0

МПК50 - 0,03 мг/л МПК90 - 0,03 мг/л

Р - 0,7%

0 0 0 0 0 0

Öi уф о Р ^

<§- & ф

Рис. 4. Распределение МПК клиндамицина для штаммов S. pyogenes.

МПК50 - 0,5 мг/л МПК90 - 1 мг/л

Ч - 100%

330

1 2

29

УР - Р - 0% 0%

0 0 0 0

О.0"* ^ ^ N

&

Рис. 5. Распределение МПК левофлоксацина для штаммов S. pyogenes.

322

Ч - 60,1%

30

УР

1,7%

МПК50 - 0,125 мг/л МПК90 - 32 мг/л

Р - 38,2%

91 94

58

у<гР 0уР оР ^

ф ф,

173

Ч - 100%

УР - 0%

76

10 0 0

МПК50 - 0,125 мг/л МПК90 - 0,25 мг/л

Р - 0%

0 0 0 0

Рис. 6. Распределение МПК тетрациклина для штаммов Рис. 7. Распределение МПК триметоприма/сульфаме-

S. pyogenes.

Ч - 87,3%

145

31

83

УР -

0,3%

МПК50 - 2 мг/л МПК90 - 32 мг/л

Р - 12,4%

0Р6 ъР ^

<&

токсазола для штаммов S. pyogenes.

332

248

Ч - 100%

23

МПК50 - 0,5 мг/л МПК90 - 0,5 мг/л

Р - 0%

0 0 0 0

Рис. 8. Распределение МПК хлорамфеникола для штаммов S. pyogenes.

Рис. 9. Распределение МПК ванкомицина для штаммов S. pyogenes.

Рис. 10. Гексэтидин — 1,3-бис (2-этилгексил) гексаги-дро-5-метил-5-пиримидинамин.

МПК50 - 8 мг/л МПК90 - 16 мг/л

118

0 0 0 0 0 0 0

Э^ о.* о!*

хь ъг

Рис. 11. Распределение МПК гексэтидина для штаммов S. pyogenes.

571

58

3

7

331

31

8

10

251

52

14

7

3

2

3

0

1 хМПК 2ХМПК 4хМПК Base

Бактерицидный уровень

Контроль

1 хМПК 2хМПК 4хМПК Base

Бактерицидный уровень

Контроль

Время, ч

Рис. 12. Кривые роста-отмирания штаммов S. pyogenes с МПК 4 мг/л (а) и МПК 16 мг/л (б) гексэтидина.

чению, наблюдаемому у изолятов «дикого» фенотипа. Нечувствительные к тетрациклину штаммы были представлены двумя субпопуляциями: с низким (1,7% штаммов) и высоким (38,2% штаммов) уровнями резистентности с МПК тетрациклина соответственно 4 и >8 мг/л. Преобладание чувствительных штаммов подтверждается значением МПК50 (0,125 мг/л). В то же время, МПК90 (32 мг/л) находится в диапазоне значений, характерных для высоких показателей резистентности. Резистентность к тетрациклину в выборке эритро-мицинорезистентных штаммов БГСА была значительно выше (94,4% — 17 из 18 штаммов), чем среди эритромициночувствительных штаммов (36,4% — 208 из 571 штамма).

Триметоприм/сульфаметоксазол. Тримето-прим/сульфаметоксазол характеризовался высокой активностью в отношении тестированных штаммов БГСА (100% чувствительных). МПК50 и МПК90 составили соответственно 0,125 и 0,25 мг/л и нахо-

дятся в диапазоне чувствительности (рис. 7).

Хлорамфеникол. К хло-рамфениколу нечувствительными были 12,7% изолятов (рис. 8). Его МПК50 составила 2 мг/л и находится в диапазоне чувствительности. В то же время, МПК90 (32 мг/л) находится в диапазоне резистентности.

Гликопептиды. Ванкоми-цин проявлял активность в отношении всех исследованных штаммов. Его МПК50 и МПК90 составляли 0,5 мг/л (рис. 9).

Гексэтидин. Химическая структура гексэтидина представлена на рис. 10.

Для исследования антибактериальных свойств гексэтидина было проанализировано 274 штамма S. pyogenes, выделенных из ротоглотки. Штаммы, выделенные из других источников или видов клинического материала, в исследование не включались. Поскольку на настоящий момент не существует критериев интерпретации для препарата, оценивались показатели МПК50 и МПК90, которые составили 8 и 16 мг/л соответственно (рис. 11).

Анализ временных кривых роста-отмирания S. pyogenes. Для оценки активности гексэтидина в отношении штаммов S. pyogenes с МПК 4 мг/л и S. pyogenes с МПК 16 мг/л были построены временные кривые роста-отмирания (рис. 12).

Гексэтидин демонстрирует бактерицидную активность как в отношении S. pyogenes с низким уровнем МПК (4 мг/л), так и с высоким уровнем МПК (16 мг/л) через 24 часа инкубирования. Снижение более чем на 3 lg видимого роста микроорганизмов наблюдается через 4 часа культивирования для всех выбранных концентраций гексэтидина.

Время гибели штаммов S. pyogenes дополнительно оценивалось при нескольких концентра-

Таблица 3. Время гибели штаммов S. pyogenes при различных концентрациях гексэтидина, входящих в состав лекарственных форм

Показатель

Концентрация гексэтидина, %

0,2

0,1

МПК гексэтидина, мг/л

Время гибели, ч Время гибели, ч

4 16

2

циях гексэтидина, входящих в состав различных лекарственных форм: 0,1% раствора для наружного применения и 0,2% раствора для наружного применения в виде аэрозоля. При использовании 0,1% и 0,2% растворов препарата через 2 часа отсутству-

ет рост S. pyogenes с МПК, равной 4 мг/л, а через 4 часа наблюдается угнетение роста S. pyogenes с МПК 16 мг/л. Данные анализа для двух штаммов S. pyogenes представлены в табл. 3.

Литература

1. Kapic E., Becic F. Hexetidine - an oral antiseptic. Med Arh 2002; 56(1):43-8.

2. Pilloni A.P., Buttini G., Giannarelli D., et al. Antimicrobial action of Nitens mouthwash (cetyltrimethylammonium naproxenate) on multiple isolates of pharyngeal microbes: a controlled study against chlorhexidine, benzydamine, hexetidine, amoxicillin, amoxicillin-clavulanate, clarithromycin, and cefaclor. Chemotherapy 2002; 48(4):168-73.

3. NCCLS. (1999). National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing (6th ed.). Methods for Determining Bactericidal Activity of Antimicrobial Agents. Approved Standards. M26-A.

4. National Committee for Clinical Laboratory Standards. (2000). Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically. - Fifth Edition Approved Standard M7-A5 NCCLS, Wayne, PA.