Изучение антигенных детерминант Helicobacter pylori с помощью моноклональных антител (мкА)

Однако на данном этапе работы сделать однозначный вывод о пространственном строении молекул комплексных соединений не представляется возможным.

Литература

1. Скляр А.А. и др. // Междунар. Чугаевская конф. по координационной химии. Кишинев, 20-24 июня, 2005: Тез. докл. 2005. С. 495.

2. Громачевская Е.В. и др. // ХГС. 1988. № 6. С. 842.

3. Белами А. Инфракрасные спектры сложных молекул. М., 1963.

4. Накамото К. ИК-спектры и спектры КР неорганических и координационных соединений. М., 1991.

5. Гарновский А.Д., Васильченко И.С., Гарновский Д.А. Современные аспекты синтеза металлокомплексов. Основные лиганды и методы. Ростов н/Д, 2000.

Кубанский государственный университет,

Кубанский государственный технологический университет 5 декабря 2005 г.

УДК 591.543.42

ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННЫХ ДЕТЕРМИНАНТ HELICOBACTER PYLORI С ПОМОЩЬЮ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

© 2006 г. Е.М. Вечканов

The goals of the present study were to assess the efficiency and specificity monoclonal antibodies (MAbs) to antigens prepared from H. pylori. Monoclonal antibodies were secreted of hybridomas B10. Hybridomas B10 was prepared in the laboratory of Rostov Scientific Research Institute of a plague. The paper contains 3 figures and 10 bibliographic sources.

В настоящее время приоритетной является гипотеза о симбиотическом характере взаимоотношений человека и Н. pylori. Однако, если подвергнуть Н. pylori воздействию стрессорных факторов, микроорганизм начинает производство особых факторов, которые являются патогенными по отношению к человеку. Индуцируется повреждение эпителия слизистой оболочки желудка, ведущее к язвенной болезни, и стимулируется раковое перерождение железистого эпителия желудка [1, 2]. Успех в лечении в данном случае зависит от своевременности диагностики, а также в отслеживании полноты эрадикации микроорганизма из организма человека в ходе лечения. Очевидна необходимость в точном, быстром и достаточно простом диагностикуме Н. pylori. В то же время существующие на данный момент тест-системы либо недостаточно точны, либо некомфортны для пациента (инвазивные методы диагностики). В связи с этим представляется перспективным использование моноклональных антител (МКА), получаемых к поверхностным антигенам Н. pylori, для создания точной и чувствительной тест-системы для обнаружения этого микроорганизма в клиническом материале. Своевременная диагностика Н. pylori позволяет ука-

зать на факторы риска развития язвенной болезни, если обследуемый здоров, или выработать правильную схему лечения, если патологии уже «дан ход». Цель работы - получение МКА к поверхностным антигенам H. pylori и исследование с их помощью антигенных детерминант возбудителя.

Материалы и методы

В работе использовали мышей-самок BalbC в возрасте 6-10 недель с целью получения иммунных спленоцитов. Для этого мышей иммунизировали микробными клетками H. pylori, убитыми мертиолятом. Иммунизацию мышей проводили по следующей схеме: каждому животному трехкратно с интервалом 3 недели вводили внутрибрюшинно в полном адъю-ванте Фрейнда инактивированную взвесь микробных клеток H.pylori в дозе 107 клеток/мышь.

Селезенку мышей извлекали на третьи сутки после заключительной инъекции антигена. Суспензию иммунных спленоцитов готовили путем растирания селезенки в гомогенизаторе при добавлении бессывороточной среды RPMI-1640 (Sigma).

Культивирование мышиных миеломных клеток NSO проводили в ростовой среде следующего состава: солевая среда RPMI-1640 (Sigma), дополненная 10 % сыворотки плода коровы, производства БелНИИЭМ и РПЧИ, 2 ммоль 1-глутамина и 10 ммоль Hepes. Клеточные линии перед гибридизацией поддерживали в логарифмической фазе роста ежедневным разведением с кратностью 1:1,5-1:2. Жизнеспособность клеточных культур оценивали с помощью суправитальной окраски 0,5%-м трипановым синим в забуференном физ. растворе (рН 7,2-7,4).

Слияние селезеночных клеток мыши с миеломой NSO проводили в соответствии с методикой, описанной в [3]. Наблюдение за ростом клонов осуществляли с помощью инвертированного микроскопа. Определение антителопродукции гибридом проводили методом ИФА.

Клонирование и реклонирование клеточных культур осуществляли методом предельного разведения.

После покрытия клетками 2/3 поверхности дна микролунок их переносили в лунки объемом 2 мл. Для этого за сутки до переноса гибридом в планшеты для культивирования вносили по 50 • 103 перитонеальных макрофагов. Гибридомы аккуратно суспендировали при помощи движения поршня автоматической пипетки и переносили из каждой исходной лунки в лунку объемом 2 мл. После разрастания гибридом их переносили в планшеты с лунками объемом 5 мл, а затем в культуральные флаконы емкостью 50-100 мл.

В этих сосудах ростовую среду меняли каждые 2-3 дня.

Определение специфичности МКА осуществляли с помощью анализа дот-блот и ИФА с привлечением в тестировании микробных клеток V с!ю-lerae, Y. pestis, F. tularensis, L. pneumophila. Методику проводили по [4]. Результат реакции учитывали визуально.

Для характеристики антигенных детерминант к H. pylori использовали метод иммуноблоттинга на нитроцеллюлозе.

В работе использовали микробные клетки Н. pylori кокковидной и ве-гетирующей форм, убитые нагреванием (100 °С, 30 мин) и мертиолятом Ростовского НИПЧИ. Микробные клетки осторожно смывали с чашек Петри и суспендировали в буфере состава: Tris-HCl 50 мМ, ЭДТА 1 мМ, рН = 6,5. Подготовленные таким образом образцы хранились в замороженном состоянии при -20 °С до использования. Перед проведением опыта образцы размораживали и смешивали в соотношении 1:1 с лизис-буфером состава: Tris-HCl 200 мМ, SDS 4 %, бромфеноловый синий, натриевая соль 0,01 %, глицерин 40 %, ß-меркаптоэтанол 400 мМ. Подготовленные таким образом пробы прогревали на водяной бане при 100 °С в течение 5 мин. В пробах определяли количества белка по Лоури.

Характеристику антигенных детерминант осуществляли методом иммуноблоттинга. Принцип метода - разделение антигенов с помощью диск-электрофореза в полиакриламидном геле по методу Laemmli [5] с последующим переносом разделённых белков на нитроцеллюлозную мембрану по методу, описанному в [6] и иммуноферментным анализом дот-блот по [4]. Отдельно готовили пробы с вегетирующей и кокковидной формой Н. pylori. При приготовлении проб исходили из расчёта, чтобы на один карман геля приходилось порядка 100 мкг белка. Разделяющий гель готовился исходя из конечной концентрации акриламида (акриламид + бис-акриламид) 12,5 %, с 0,1%-м содержанием SDS.

Электрофорез проводился в течение 5 ч при напряжении 50 В. О ходе и скорости движения образцов судили по перемещению полосы красителя - бромфенолового синего. В качестве белков-метчиков использовались бычий сывороточный альбумин (Merck) (М = 68 кДа) и химотрипсин (М = 24 кДа) (Sigma).

По завершении электрофоретического разделения гель снимали со стёкол, складывали «сэндвич» для переноса и осуществляли перенос на нитроцеллюлозную мембрану, согласно [6]. Подготавливали нитроцеллюлозную мембрану (Membranfilter Scheicher & Schuell) (0,2 цт) на 6 мм шире и длиннее геля, предварительно смоченную в буфере для переноса. Полиак-риламидный гель после проведения электрофореза подрезали, помещали в буфер для переноса состава: Tris 47,9 мМ, глицин 38,6 мМ, SDS 0,0385 %, этанол 20 % на 10 мин при 0 °С. Накладывали гель на мембрану, прокладывали фильтровальным ватманом и помещали в камеру для переноса, который осуществлялся в течение 30 мин при напряжении 60 В. После блоттинга треки маркёров молекулярной массы окрашивали до проявления полос [7], а ту часть, где происходил перенос белковых антигенов, инкубировали с МКА и специфической поликлональной мышиной сывороткой по методу [4]. Использовался готовый набор вторичных антимышиных иммуноглобулинов, коанъюгированных с пероксидазой хрена -

Goat Anti-Mouse Immunoglobulins-Peroxidase Conjugate Calbiochem Immunochemicals.

Результаты исследования

Проведение гибридизации позволило получить и исследовать антите-лообразующую активность в общей сложности 380 первичных культур. Доля антителопродуцентов, выявленных при первичном тестировании, составила 15 %. Дальнейшая работа была направлена на выведение моноклонов гибридом, стабильно продуцирующих МКА к поверхностным антигенным детерминантам H. pylori.

Большая часть полученных первично положительных клонов в первые недели после слияния утрачивала способность продуцировать антитела. Этот процесс протекал особенно интенсивно в течение первых трех недель. Для достижения стабилизации антителопродукции, а также проли-феративной активности культуры были подвержены неоднократному клонированию. Первичное тестирование в ИФА проводили на клетках H. pylori, убитых мертиолятом. В результате из имеющихся гибридных культур была отобрана гибридома, стабильно продуцирующая МКА.

При изучении с помощью дот-блотспецифичности МКА гибридомы В10 с привлечением к тестированию V cholerae, Y. pestis, F. tularensis, L. pneumophila при помощи дот-блота были получены данные, что МКА дают положительную реакцию только с клетками H. pylori (рис. 1).

1*3*567

Рис 1. Оценка специфичности МКА гибридом, полученных к H. ру1оп в дот-блот ИФА: 1, 2, 3 — антигены H. pylori; 4 — антигены V. cholerae; 5 — антигены L. pneumophila;

6 — антигены Y. pestis; 7 — антигены B. abortus

С целью установления эпитопной направленности МКА гибридомы В1 исследовали состав белков H. pylori. Используемые пробы были следующего состава: № 1 - белковые метчики (бычий сывороточный альбумин (М = 68 кДа)) и химотрипсин (М = 24 кДа); № 2 - лизат бактериальной массы H. pylori кокковидный формы; № 3 - лизат бактериальной массы H. pylori вегетирующей формы.

В результате электрофоретического фракционирования в полиакрила-мидном геле с добавлением додецилсульфата натрия, по методу [5], был получен «белковый профиль», представленный на рис. 2. Окрашивание белковых полос осуществляли с помощью красителя Кумасси R-250 [7].

Как видно из рис. 2, визуализированы 11 основных белковых фракций, в пределах 15-70 кДа. Далее осуществляли перенос фракционированных белков с пластины полиакриламидного геля на нитроцеллюлозную мембрану по методам [6]. После электроблоттинга нитроцеллюлозную мембрану обрабатывали моноклональными антителами гибридомы В10, специфичной поликлональной и нормальной сыворотками. Используемые

пробы были следующего состава: № 1 - лизат бактериальной массы H. pylori кокковидной формы и МКА гибридомы В10; № 2 - лизат бактериальной массы H. pylori вегетирующей формы и МКА гибридомы В10; № 3 - лизат бактериальной массы H. pylori кокковидной формы и специфическая поликлональная сыворотка; № 4 - лизат бактериальной массы H. pylori вегетирующей формы и специфическая поликлональная сыворотка; № 5 - лизат бактериальной массы H. pylori вегетирующей формы и нормальная мышиная сыворотка (контроль); № 6 - белковые метчики (бычий сывороточный альбумин (М = 68 кДа) и химотрипсин (М = 24 кДа)).

№ 1

№ 2

№ 3

да

БСА

_ »и т^

Рис. 2. Электрофоретический профиль белков H. pylori

После проявления иммуноблота полученную картину документировали путём сканирования. Блоттограмма приведена на рис. 3.

№ 1 № 2 № 3 №4 № 5 № 6

f

БСА

• Трипсин

Рис. 3. Блоттограмма антигенных фракций H. pylori

Согласно блоттограмме, моноклональные антитела взаимодействуют с белковым антигеном молекулярной массой 30 кДа в одинаковой степени как у кокковидной, так и у вегетирующей формы H. pylori (дорожки № 1, 2). Специфическая поликлональная сыворотка даёт более пёструю картину взаимодействия с белковыми антигенами (дорожки № 3, 4).

Обсуждение результатов

Сегодня можно считать практически доказанной роль бактерии H. pylori в этногенезе язвенных и онкологических патологий желудочно-кишечного тракта. Несмотря на допускаемые симбиотические взаимоотношения человека и H. pylori, это микроорганизм всё же является одним из самых существенных факторов риска развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, хронического гастрита, аденокарци-номы желудка. В связи с этим изменилось представление о методах лечения и диагностики этих заболеваний. Теперь всё большее внимание уделя -ется неинвазивным методам их диагностики. Проводится усовершенствование методов с целью сокращения времени проведения анализа, повышения его достоверности и снижения стоимости диагностики. Одним из путей решения данной проблемы является использование моноклональ-ных антител для создания диагностического препарата, позволяющего идентифицировать возбудителя.

Моноклональные антитела являются сегодня наиболее эффективным инструментом, с помощью которого возможно, с одной стороны, проведение тонких исследований антигенной композиции микробной клетки, выяснение функций отдельных антигенных детерминант, с другой - повышение чувствительности и специфичности серологического анализа, создание на их основе новых, более точных и быстрых методов идентификации и дифференциации.

Выяснение биологических и иммунохимических свойств антител и распознаваемых ими антигенов является необходимым условием их последующего успешного применения в диагностических целях, и нашей задачей было изучение свойств МКА, секретируемых гибридомой В10.

По данным иммуноблоттинга, поверхностный белковый антиген с молекулярной массой 30 кДа связывается с моноклональными антителами гибридомы В10.

Антигенные детерминанты белковой природы, как видно из рис. 3, обнаруживаемые моноклональными антителами гибридомы В10, присутствуют в равной степени как у кокковидной, так и у вегетирующей форм. Кроме того, было выяснено, что по активности связывания с моноспецифическими иммуноглобулинами упомянутые формы H. pylori существенно не различаются. Исходя из этого, гибридому В10, продуцирующую МКА, можно рассматривать как эффективного кандидата на создание современной диагностической тест-системы.

Таким образом, представляется достаточно перспективным дальнейшее изучение иммунохимических свойств антител, продуцируемых гиб-ридомой В10, с целью разработки на их основе точного и быстрого диаг-ностикума для обнаружения Н. pylori-инфекции.

Литература

1. Blaser M. II J. Clinical Investigation. 1997. Vol. 100. P. 759-762.

2. BlaserM. // J. Infect Dis. 1999. Vol. 179. № 6. P. 1523-1530.

3. Fazekas de St., Groth S. // J. Immunol. Meth. 1980. Vol. 35. P. 1-21.

4. HaidA., SuissaM. // Methods in Enzymology. New York, 1983. Vol. 96. P. 192.

5. Laemmli U.K. // Nature. London, 1970. Vol. 227. P. 680-685.

6. Bjerrum O.J., Schafer-Nielsen C. // Electrophoresis. Weinheim, Germany. 1986. P. 315-327.

7. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М., 1981.

Ростовский государственный университет 13 января 2006 г.

УДК 678.01:541.64

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ДОБАВОК ГИДРОФОБНЫХ ВЕЩЕСТВ К СВЯЗУЮЩЕМУ МЛС НА ПРИЛИПАЕМОСТЬ СТЕРЖНЕВЫХ СМЕСЕЙ К ЛИТЕЙНОЙ ОСНАСТКЕ

© 2006 г. Е.Н. Евстифеев, А.А. Нестеров, В.Л. Гапонов

The technology of modified lignosulphonates rendering hydrophobic has been worked out.

The core mixtures on the basis of this type of linking substances don't possess sticking qualities to the equipment and can be formed without any rectrictins.

В результате модифицирования технических лигносульфонатов

[1] резко уменьшается их вязкость, что существенно влияет на увеличение покрывающих свойств связующего. В связи с этим возникает проблема отделения стержней от литейной оснастки. Уменьшению прилипаемости модифицированных ТЛС (связующего МЛС) может способствовать блокирование полярных групп молекул лигносульфонатов. Для этой цели в связующее МЛС необходимо ввести гидрофобные вещества.

С целью гидрофобизации связующего МЛС разработан способ ввода в него гудрона, образующегося при дистилляции жирных кислот саломассы

[2], который состоит из нейтрального жира, жирных кислот, оксикислот, лактонов, неомыляемых, красящих веществ, полимерных продуктов и других нелетучих примесей; представляет собой темно-коричневую твёрдую массу, нерастворимую в воде.

Составы гидрофобизованного связующего МЛС готовили в лопастной мешалке (скорость перемешивания не менее 1000 мин-1). В модифицированные технические лигносульфонаты загружали жировой гудрон, затем эту смесь нагревали до температуры 70-90 °С и выдерживали до полного расплавления гудрона. После перемешивания реакционной массы в течение 10-15 мин она выдерживалась на воздухе для исчезновения пены. Ус -ловная вязкость определялась при температуре 20 °С по ВЗ-1.

«Растворение» неполярного жирового гудрона в полярном связующем МЛС объясняется явлением солюбилизации. Гудрон поглощается мицел-