Способ клонального микроразмножения шпажника болотного (Gladiolus palustris Gaudin)
METHOD FOR CLONAL MICRO MULTIPLICATION OF A MARSH GLADIOLUS (GLADIOLUS PALUSTRIS GAUDIN)

Изобретение относится к области биотехнологии растений и может быть использовано для массового получения качественного посадочного материала шпажника болотного (Gladiolus palustris Gaudin), растения, занесенного в Красную Книгу РФ и находящегося под угрозой исчезновения (статус редкости - 0) [1]. Полученные растения могут использоваться для ландшафтного озеленения и пополнения интродукционных коллекций ботанических садов, а также для возвращения в природные места обитания. Изобретение позволяет получить большое количество выровненного экологически чистого посадочного материала.
Предлагаемое изобретение является новым, так как в патентной и научно-технической литературе не найдено решения с заявленной совокупностью отличительных признаков.
Шпажник болотный - многолетнее травянистое растение высотой 30-60 см, имеющее яйцевидный клубень. Соцветие - колос. Цветки розоватые или ярко розовые. Цветет с мая по июнь. Плод - сухая коробочка. Лимитирующими факторами являлись нарушение гидрологического режима в местах исчезновения вида и сбор цветущих растений в декоративных целях [1]. Bce это делает необходимым проведение исследований по разработке методики клонального размножения и определяет актуальность данной работы [2, 3, 4].
Применение клонального микроразмножения позволяет получить однородный посадочный материал, сократить период размножения культуры, а также предоставляет возможность проведения работ в течение года и экономию площадей, необходимых для выращивания посадочного материала Gl. palustris [5, 6, 7].
В настоящее время в культуру in vitro введены некоторые представители рода Gladiolus L. - виды Gladiolus dalenii, Gl. tristis, Gl. flanaganii и различные сорта этого таксона [8, 9].
Наиболее близким способом является клональное микроразмножение сортов гладиолуса из одной апикальной почки путем пролиферации экспланта, образования побегов и боковых почек (коэффициент размножения (Кр) равен 9) [10].
Шпажник болотный является редким растением, что не позволяет использовать в качестве экспланта клубнелуковицу, так как это приведет к уменьшению популяции, поэтому предпочтительно использовать в качестве первичного экспланта семена.
Помимо этого, разработана методика получения растений-регенерантов через каллусную культуру (Кр равен от 14 до 19) [7]. Так как регенерация через каллус часто приводит к сомаклональной изменчивости, этот способ не желательно применять для размножения шпажника болотного.
Однако до настоящего времени так и не определен оптимальный состав питательной среды, обеспечивающей интенсивное формирование клубнелуковиц Gl. palustris [8, 9, 10].
Изобретение представляет собой способ размножения растений шпажника болотного Gl. palustris методом культуры in vitro, включающий стерилизацию семян, высаживание на питательные среды, собственно размножение (Кр до 12), последующее укоренение и адаптацию клубнелуковиц к условиям ex vitro. После адаптации к нестерильным условиям и доращивания получают стандартные саженцы шпажника болотного с закрытой корневой системой. Результатом изобретения является получение выровненного и оздоровленного посадочного материала - 150000 штук в течение года.
Ход работы
В ходе исследований разработана методика клонального микроразмножения шпажника болотного.
Способ реализуют следующим образом.
В качестве первичных эксплантов использовали семена.
Оптимальная система стерилизации: 1.) фунгицид - 30 минут; 2.) 70% этанол - 2 минуты; 3.) 7% гипохлорит кальция - 20 минут.
На этапе собственно микроразмножения исследовали влияние регуляторов роста и их концентраций на коэффициент размножения. Наибольшие значения морфометрических показателей были получены на питательных средах, содержащих 10 мг/л 6-БАП с добавлением 0,1 мг/л НУК. Дальнейшее увеличение концентрации регуляторов роста не дало положительного эффекта (фиг. 1). Максимальный коэффициент размножения Gl. palustris, равный 7.25±1.33, достигается при культивировании на питательной среде, содержащей 6-БАП (10 мг/л) и НУК (0,1 мг/л) (фиг. 2).
В условиях лаборатории микропобеги Gl. palustris выращивали при искусственном освещении (3000 лк) и фотопериоде 16/8 ч., температуре 23-25°С и влажности 70%.
Максимальный процент укореняемости (76,5±1,2) был получен на питательной среде, содержащей  MS, 0,3 мг/л НУК и 20 г/л сахарозы, при температуре 16-18°С и освещенности 500 лк. Уменьшение концентрации солей до  MS приводило к снижению укореняемости (фиг. 3)
Растения-регенеранты при адаптации высаживали в почвенный субстрат, предварительно простерилизованный при 85-90°С в течение 1-2 ч. Субстрат состоял из смеси верхового торфа, песка и перлита (1:1:1).
Различные стадии клонального микроразмножения шпажника болотного показаны на фиг. 4-6: фиг. 4 - стадия инициации, фиг. 5 - стадия собственно микроразмножения, фиг. 6 - стадия укоренения.
Источники информации
1. Красная книга Российской Федерации (растения и грибы). - М.: Товарищество научных изданий КМК. - 2008. - 855 с.
2. De Bruyn, М.Н., and Ferreira, D.I. In vitro corm production of Gladiolus dalenii and G. tristis // Plant Cell Tissue Organ Cult. - 1992. - V. 31. - P. 123-128.
3. Dickens, Ch., Kelley, K., Manning, J.C., and Van Staden, J. In vitro propagation of Gladiolus flanaganii. South African J. of Bot. - 1986. - V. 55. - P. 485-487.
4. Ruffoni B. Gladiolus micropropagation in temporary immersion system // Propagation of Ornamental Plants. - 2008. - V. 8. - P. 102-104.
5. Kamo K. Effect of phytohormones on plant regeneration from callus of Gladiolus cultivar ‘Jenny Lee’/ J. In vitro plants. - 1994. - V. 30. - P. 26-31.
6. Molkanova O.I., Shirnina, I.V., and Mitrofanova, I.V. Conservation and micropropagation of rare and endemic species in genepool collections of the Russian Federation. J. of Biotechnology. - 2018. - P. 83-84.
7. Prasad V. S. S., Dutta Gupta E. S. In vitro shoot regeneration of gladiolus in semi-solid agar versus liquid cultures with support systems // Plant Cell Tiss Organ Cult. - 2006. -V. 8. - P. 263-271.
8. Ахмед А.К. Создание высокоэффективной системы микроклонального размножения генетически стабильных растений гладиолуса: автореф. дис. канд. биол. наук. М., 2000. 16 с.
9. Мокшин Е.В. Морфо-физиологические особенности клонального микроразмножения in vitro различных сортов лилий и гладиолусов: автореф. дис. канд. биол. наук. Саранск, 2005. 20 с.
10. Пат. 2180165 Российская Федерация МПК. А01Н 4/00. Способ микроклонального размножения гладиолуса / А.К. Гапоненко, А.А. Абукамель, С.Г. Бабаева; заявитель и патентообладатель А.К. Гапоненко, А.А. Абукамель, С.Г. Бабаева. - заявл. 31.01.2000, опубл. 10.03.2002.