Разработка схемы исследования материала с целью выделения и ускоренной идентификации бактерий видов Bacillus subtilis и Bacillus cereus

Разработка схемы исследования материала с целью выделения и ускоренной идентификации бактерий видов Bacillus subtilis и Bacillus cereus

Н.А. Феоктистова, к.б.н., А.И. Калдыркаев, соискатель, А.Х. Мустафин, соискатель, Ульяновская ГСХА

Роль бактериофага как средства терапии и профилактики некоторых инфекционных заболеваний в настоящее время невелика, а значение для лабораторной диагностики ряда инфекции этот биологический объект не только не утратил, а, наоборот, начал привлекать к себе всё более пристальное внимание исследователей [1—3]. С каждым годом повышается значимость бактериофагов как высокоспецифического диагностического средства, позволяющего надёжно дифференцировать возбудителей бактериальных видов, а порой проводить более детальную дифференциацию отдельных типов и вариантов внутри данного вида [4, 5]. Возможность фа-гоидентификации вытекает из специфичности действия фагов, которая может быть настолько выражена, что позволяет дифференцировать не только отдельные виды, но и серологически неотличимые штаммы в пределах одного вида [6].

Поэтому всё большее число исследователей предпочитают обращаться к фаговым тестам, как единственному средству, способному дифференцировать близкородственные штаммы [4, 7, 8].

Материалы, методы и объекты исследований. Используя строгую родовую и видовую специфичность селекционированных бактериофагов, нами была разработана схема выделения и ускоренной идентификации бактерий видов Bacillus subtilis и Bacillus cereus. Подготовку и посев проб кормов и пищевых продуктов, подлежащих исследованию, проводили в соответствии с ГОСТом Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб» [9] и ГОСТом 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов» [10].

В исследованиях использовали водопроводную воду, комбикорм, мясо, пряности, которые контаминировали бактериями видов Bacillus subtilis и Bacillus cereus в концентрации 105, 104, 103, 102, 101 м.к. в 1 мл.

Результаты исследований. Для искусственной контаминации пробы воды (мяса, комбикорма и пряностей) объёмом (весом) 10 мл (г) вносили в стерильные колбы, заливали стерильным МПБ из расчёта 10 мл бульона на 1 мл (г) исследуемой пробы. В колбы добавляли индикаторные культуры в концентрации 105, 104, 103, 102, 101 м.к./мл (г). Полученные смеси встряхивали в шуттель-аппарате в течение 15 минут и ставили

в термостат на 24 ч при ЗУ °С. Надосад очную жидкость исследовали в соответствии со схемой, представленной на рисунке 2. Первоначально производили посев по МПА по методу Дригальского для выделения чистой культуры Bacillus subtilis и Bacillus cereus, а затем — посевы на среды Гаузе № 2 и Громыко. Инкубировали посевы в условиях термостата в течение 24 ч при ЗУ °С. Выросшие колонии пересевали на МПБ и инкубировали в условиях термостата в течение 18 ч при ЗУ °С.

Следующим этапом наших исследований было изучение биологических свойств выделенных культур по тестам, отражённым на рисунке l. Результаты исследований представлены в таблицах l и 2.

Бульонные культуры, полученные после пересева колоний с вышеперечисленных сред на МПБ, микроскопии (окраска по Граму) и при наличии в мазках грамположительных палочек с закруглёнными концами, располагающихся одиночно и попарно, подвергали фагоиденти-фикации.

На поверхность МПА в чашках Петри пастеровской пипеткой наносили три — четыре капли бульонной 1В-часовой культуры исследуемых микроорганизмов. Нанесённую культуру равномерно распределяли по поверхности среды стерильным шпателем. Чашки ставили в термостат для подсушивания на 15—20 минут.

Чашку делили бактериологическим карандашом на три сектора. На поверхность засеянной среды, в зоне первого сектора, пастеровской пипеткой лёгким прикосновением капли наносили фаг Bs-ІЗ УГСХА, на второй сектор — фаг Bs-16 УГСХА, на третий — в качестве контроля — стерильный МПБ. Наклоняли чашку, чтобы капли стекли в виде дорожки. Чашки оставляли для подсушивания в боксе на 15—20 минут и помещали в термостат на 1В часов при ЗУ °С.

По аналогичной методике изучали работу цереусных бактериофагов Вс-4 и Вс-В серии УГСХА.

Результат исследований считали положительным, если на месте нанесения фагов на газоне сплошного роста культуры образовывалась прозрачная зона лизиса с вторичным ростом фагорезистентных микроорганизмов или без него, а также рост негативных колоний фага. Отрицательным результатом считали отсутствие лизиса на газоне роста исследуемой культуры микроорганизмов и отсутствие лизиса в кон-

Пробы крови

—Г~

Двухфазная среда или 1%-ный глюкозный бульон

і

Окраска по Граму

Среда Кларка

1%-ный глюкозный агар

Картофельный агар

Среда Гаузе № 2

МПБ с яичным желтком

Бульон с мочевиной

N Мясо-пептонный желатин

МПА

X

Бульон с нитратами в анаэростате

Рис. 1 - Схема выделения и дифференциации бактерий вида Bacillus subtilis и Bacillus cereus [11, 12]

l. Результаты исследований объектов санитарного надзора на наличие бактерий вида Bacillus subtilis и Bacillus cereus

Объекты Кол-во микробных клеток в 1 г (мл), проба № 1 Кол-во микробных клеток в 1 г (мл), проба № 2 Кол-во микробных клеток в 1 г (мл), проба № 3

1O1 1O2 1O3 1O4 1O1 1O2 1O3 1O4 1O1 1O2 1O3 1O4

1 Вода - - - + - - - + - - - +

2 Пряности - - - + - - - + - - - +

3 Мясо - - - + - — - + - — - +

4 Комбикорм - - - + - - - + - - - +

Примечание: «+» — положительный результат; «—» — отрицательный результат

2. Результаты исследований объектов санитарного надзора на наличие бактерий вида Bacillus subtilis и Bacillus cereus

Объекты Кол-во микробных клеток в 1 г (мл), проба № 1 Кол-во микробных клеток в 1 г (мл), проба № 2 Кол-во микробных клеток в 1 г (мл), проба № 3

1O1 1O2 1O3 1O4 1O1 1O2 1O3 1O4 1O1 1O2 1O3 1O4

1 Вода - - - + - - - + - - - +

2 Пряности - - - + - - - + - - - +

3 Мясо - - - + - — - + - - - +

4 Комбикорм - - - + - - - + - - - +

Примечание: «+» — положительный результат; «—» — отрицательный результат

троле. При положительном результате культуру относили к виду Bacillus subtilis или Bacillus cereus. Результаты опытов представлены в таблице З.

Таким образом, фагоидентификация бактерий вида Bacillus subtilis бактериофагами Bs-ІЗ и Bs-16 серии УГСХА и бактерий вида Bacillus cereus бактериофагами Вс-4 и Вс-В серии УГСХА дала положительные результаты: из всех искусственно контаминированных бактериями видов Bacillus subtilis и Bacillus cereus проб пряностей, комбикорма, водопроводной воды и мяса были выделены культуры, которые при взаимодей-

ствии с вышеуказанными фагами были лизи-рованы ими.

При получении отрицательных результатов фагоидентификации необходимо детальное изучение ферментативных, серологических и патогенных свойств выделенных микроорганизмов.

На рисунке 2 изображена схема фагоидентификации бактерий вида Bacillus subtilis и Bacillus cereus. Она представлена в сравнении с традиционной схемой выделения и дифференциации бацилл первой морфологической группы [11], изложенной в «Определителе бактерий Берджи» [12].

З. Фагоидентификация бактерий вида Bacillus subtilis бактериофагами Bs-ІЗ и Bs-16 серии УГСХА и бактерий вида Bacillus cereus бактериофагами Вс-4 и Вс-В серии УГСХА

Объекты Результат воздействия фагов Bs-13 и Bs-16 серии УГСХА Результат воздействия фагов Вс-4 и Вс-8 серии УГСХА

Проба 1 Проба 2 Проба 3 Проба 1 Проба 2 Проба 3

1 Вода + + + + + +

2 Мясо + + + + + +

3 Пряности + + + + + +

4 Комбикорм + + + + + +

Примечание: «+» — положительный результат; «—» — отрицательный результат

I

Фагоидентификация бактерий при помощи бактериофагов Bs-13 и Bs-16; Bs-4 и Bs-8 серии УГСХА

/\

положительный -бактерии вида Bacillus subtilius, Bacillius cereus

отрицательный

II

Исследуемый

материал

с

Среда Гаузе № 2 Среда Громыко

Выделение чистой культуры по методу Дригальского

I

Посев на МПБ

Среда Кларка, 1% глюкозный агар, картофельный агар, МПБ с мочевиной, мясо-пептонный желатин,

МПБ с яичным желтком,

МПБ с нитратами в анаэростате

/\

положительный -бактерии вида Bacillus subtilius, Bacillius cereus

со

о

о

со

т

}

отрицательный

Итого: 25 часов Итого: 96 часов

Рис. 2 - Схема ускоренной идентификации бактерий вида Bacillus subtilis и Bacillus cereus с помощью селекционированных бактериофагов (I) в сравнении со схемой выделения и дифференциации бацилл первой морфологической группы, изложенной в «Определителе бактерий Берджи»

Доказано, что время исследований в соответствии с разработанной нами схемой короче на 71 час с меньшими затратами посуды и реактивов.

Литература

1. Адамс М. Бактериофаги. М., 1961. С. 26—121.

2. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии. Ульяновск, 1988. С. 45.

3. Габрилович И.М. Общая характеристика бактериофагов // Основы бактериофагии. Минск, 1973. С. 5—24.

4. Адельсон Л.И. Бактериофаги, активные по отношению к энтеропатогенным кишечным палочкам // Вопросы микробиологической диагностики и бактериофагии. М., 1962. С. 184-194.

5. Егоров В.В. Практикум по микробиологии. М.: Изд-во МГУ, 1986. С. 35-42.

6. Габрилович И.М. Биологические свойства бактериофагов Serratia marcences // ЖМЭИ. 1992. № 6. С. 10-12.

7. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская И.А. Спорообразующие аэробные бактерии — продуценты биологически активных веществ. Киев: Наукова Думка, 1982. С. 117—120.

8. Клевакин В.М., Карцев В.В. Санитарная микробиология пищевых продуктов. Л.: Медицина, 1986. С. 164.

9. ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб».

10. ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов».

11. Gordon R. The genus Bacillus // In: Handb. Microbiol. Cleveland (Ohio). 1973. V. l. P. 71—88.

12. Bergey’s manual of determinative bacteriology, Williams and Wilkins Co, Baltimore, Md., 8th ed., 1974. 1246. p. 191.