Концепция «Ниша рельеф» для стволовых клеток как основа биомиметического подхода к инженерии костной и кроветворной тканей

Концепция «ниша — рельеф» для стволовых клеток как основа биомиметического подхода к инженерии костной и кроветворной тканей

И.А. Хлусов 12, Н.М. Шевцова 1, М.Ю. Хлусова 1, К.В. Зайцев 3, Ю.П. Шаркеев 4,

В.Ф. Пичугин 2, Е.В. Легостаева 4

1 Сибирский государственный медицинский университет, Томск

2 НОЦ «Биосовместимые материалы и биоинженерия» при Томском политехническом университете и Сибирском государственном медицинском университете, Томск

3 Томский НИИ курортологии и физиотерапии ФМБА России, Томск

4 Институт физики прочности и материаловедения СО РАН, Томск

«Niche - relief» conception for stem cells as a basis of biomimetic approach to bone and hemopoietic tissues engineering

I.A. Khlusov12, N.M. Shevtsova 1, M.Yu. Khlusova 1, K.V. Zaitsev3, Yu.P. Sharkeev4,

V.F. Pichugin 2, E.V. Legostaeva4

1 Siberian State Medical University, Tomsk

2 Research and Education Center "Biocompatible Materials and Bioengineering" attached to Tomsk Polytechnic University and Siberian State Medical University, Tomsk

3 Tomsk SRI of Balneology and Physiotherapy, Tomsk

4 Institute of Strength Physics and Materials Science of SB RAS, Tomsk

Изучено влияние особенностей рельефа и количественных параметров модельного минерального матрикса на структурно-функциональное состояние пренатальных стро-мальных клеток легкого человека in vitro и ремоделирование системы «кость — костный мозг мышей in vivo. Согласно полученным данным, шероховатые (Ra > 2 мкм) имплантаты с кальций-фосфатным микродуговым покрытием имитируют трехмерное состояние регенерирующего костного матрикса. Такие поверхности несут структурно-функциональные участки (микрорегионы), которые были названы «ниши — рельеф», необходимые для «созревания» и дифференцировки пренатальных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) человека в секретирующие остеобласты. При оптимальных параметрах остеогенной ниши in vitro (средний индекс площади щелочной фосфатазы в клетках к площади искусственной микротерритории приблизительно 43%) отмечается также максимальное ремоделирование системы «кость — костный мозг» мышей в гетеротопическом тесте in vivo. Установлен in vitro вероятный клеточно-молекулярный механизм влияния экспериментального Зй-моделирования поверхности кости на переключение эндостальной ниши из молчащего в активное состояние. Он связан с активацией клеточной продукции компонентов костного матрикса (щелочная фосфатаза, остеокальцин, коллаген, фосфаты кальция), пространственно разобщающих стромальные и кроветворные элементы, и параллельным снижением секреции TNFa в межклеточную среду. Полученные данные развивают наши предыдущие представления о существовании и размерах искусственной эндостальной ниши для остеогенной дифференцировки ММСК.

Ключевые слова: имплантат, кальцийфосфатные

покрытия, микротерритории, культура клеток, щелочная фосфатаза, остеокальцин, цитокины, гетеротопический тест, мыши.

An affect of relief features and quantitative parameters of model mineral matrix on in vitro structure-functional status of human lung prenatal stromal cells (HLPSC) and in vivo remodeling of mice bone/marrow system has been studied. According to data established, rough (Ra > 2 ^m) implants with calcium phosphate micro-arc coatings simulate three-dimensional state of regenerating bone matrix. Such surfaces have own structure-functional sites (microregions) which were named by «niche — relief» and were necessary for maturation and differentiation of HLPSC to secreting osteoblasts. Maximum remodeling of mice bone/marrow system in heterotopic test in vivo was also observed under optimal parameters of osteogenic niche in vitro (approximately 43% average index of cellular alkaline phosphatase square to artificial microregion area). A probable cell-molecular mechanism of influence experimental 3D-modeling of bone surface on selection of quiescent or active state by endosteal niche has been detected. It connects with activating cellular production of bone matrix components (alkaline phosphatase, osteocalcin, collagen, calcium phosphates) that dissociate dimensionally stromal and hemopoietic elements, and with parallel diminishing TNFa secretion in intercellular medium. The data obtained develop our previous speculations about existence and sizes of artificial endosteal niche for osteogenic differentiation of multipotent mesenchimal stromal cells.

Key words: implant, calcium phosphate coatings,

microterritories, cell culture, alkaline phosphatase, cytokines, osteocalcin, heterotopic test, mice.

Организация и функционирование ниш для стволовых клеток с 1978 г. является одним из интереснейших вопросов клеточной и молекулярной биологии, дискуссия находит широкое отражение в мировой научной литературе. Анализ лучших публикаций

e-mail: khlusov63@mail.ru

2007 г. в журналах с высоким импакт-фактором, проведенный нами на основе данных, предоставленных Ion Channel Media Group Ltd., показал, что не менее 10% статей связано с проблемами физиологии и патологии ниш для стволовых клеток.

До настоящего времени основное число публикаций, преимущественно на уровне гипотез, было посвящено нишам для стволовых кроветворных клеток (СКК).

В частности, встречаются упоминания о возможной иерархии ниш для самоподдержания и диффе-ренцировки кроветворных клеток [1]. Анализируются структура и функция эндотелиальных (периваску-лярных) и остеобластных (эндостальных) ниш для стволовых кроветворных клеток (СКК) [2]. Муль-типотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) рассматриваются как важный клеточный компонент ниш для СКК [3].

В то же время, вызывает удивление, что дискуссия

о существовании ниш, определяющих судьбу самих ММСК, только начинает разворачиваться в литературе [4]. Теоретическим кандидатом ниши для ММСК называют периваскулярную зону [5]. Тем не менее, D.T. Scadden (2007) определяет периваскулярную нишу для ММСК как цепочку в их дифференцировке в остеобласты и формировании ниши для СКК [6].

Авторы указывают на определенную анатомическую локализацию ниш [7]. Выделяют 3 компонента эндостальной ниши для СКК: мезенхимальные клетки, экстрацеллюлярный матрикс (ЭЦМ) и минеральную часть кости. При этом, с одной стороны, остеобласты контактируют с кроветворными элементами, с другой стороны — с поверхностью кости, одним из основных неорганических компонентов которой является гидроксиапатит (ГАП) и другие фосфаты кальция. Однако вклад минерального вещества кости в функционирование кроветворной ниши оценивают только по концентрации внеклеточного кальция [6].

Недавно нами получены первоначальные экспериментальные данные о существовании и размерах ниш для остеогенной дифференцировки стромаль-ных стволовых клеток, их тесной зависимости от количественных параметров рельефа минерального вещества кости [8]. Известный рециклинг эндостальных ниш для СКК [9], связан, на наш взгляд, с постоянным ремоделированием губчатой и кортикальной кости [10]. В таком случае, неизбежен рециклинг костного ложа (следовательно, ниши) для ММСК и остеобластов, что будет сопровождаться изменением их функциональных свойств.

Еще в 1964 г. A.S. Curtis и M.Varde предположили важнейшую роль топографии и геометрии поверхности в детерминации клеточного поведения [11]. По мнению N.J. Sniadecki с соавт. (2006), ученые находятся только в начале понимания этого эффекта [12]. Тем не менее, уже осуществляются попытки биомимети-ческого моделирования ниш для стволовых клеток с помощью искусственных материалов [13], изучается поведение клеток в таких конструкциях [14]. При этом отмечается значение трехмерной (3D) организации микроокружения для воспроизведения физиологических условий для стволовых клеток ex vivo [1, 15].

В связи с этим, изучение влияния особенностей рельефа и количественных параметров модельного минерального ЭЦМ на структурно-функциональное состояние пула ММСК и ремоделирование системы «кость — костный мозг» с позиции теории ниш для стволовых клеток представляет несомненный интерес.

Материал и методы

В качестве источника модельного минерального ЭЦМ кости применяли диски из титана ВТ1.0 (диаметр 12 мм, толщина 1 мм), несущие двусторонние

гладкие или шероховатые кальций-фосфатные (CaP] покрытия.

Шероховатые покрытия (Ra > 2 мкм) наносили на титановую подложку с помощью модификации способа анодно-искрового (микродугового) оксидирования [16] в растворе 10% фосфорной кислоты, содержащей взвесь наноразмерных частиц ГАП синтетического происхождения. Гладкие поверхности (Ra < 1 мкм) формировали посредством высокочастотного магнетронного распыления CaP электрода-мишени [17]. Мишень для магнетронного распыления (диаметр 220 мм, толщина 10 мм) была приготовлена по керамической технологии: прессование нанопорошка при давлении 70 МПа, затем отжиг полученной пресс-формы при температуре 1100°С в течение

1 ч на воздухе. ГАП нанопорошок (диаметр частиц 10—40 нм) для изготовления электрода-мишени получали механохимическим способом, как описано ранее [18]. В отличие от исходного порошка, материал мишени представлял собой двухфазную CaP керамику на основе кристаллического ГАП и три-кальцийфосфата.

Исследования морфологии и элементного состава полученных покрытий проводились с использованием растрового электронного микроскопа (РЭМ) Quanta 200 ESEM FEG фирмы FEI со встроенной приставкой энергодисперсионного рентгеновского анализа (EDX). Для определения фазового состава покрытий и исходного ГАП использовался рентгенофазовый анализ (дифрактометр Shimadzu XRD-7000). Интерпретация дифрактограмм проводилась на основе базы данных International Center for Diffraction Data (ICDD).

Шероховатость поверхности искусственных CaP покрытий оценивали по значениям параметров вертикальных неровностей профиля с помощью измерительной системы Talysurf 5-120 (Великобритания, разрешающая способность 10 нм). Определяли Ra (мкм) как средний результат шероховатости в пределах нескольких длин участков измерений согласно ГОСТ 2789-73.

Исследования выполняли с одобрения локального этического комитета Сибирского государственного медицинского университета (заключение № 948 от

09.02.2009). Выполняли 4-суточное in vitro культивирование пренатальных стромальных клеток легкого человека (ПСКЛЧ), предоставленных ООО «Банк стволовых клеток» (Томск), с тестируемыми дисками. Препараты представляли собой популяцию клеток разной формы и размеров, с ограниченным сроком жизни, сохраняющую при 4—5 пассажах стабильный кариотип, проявляющую к 8-м сут. культивирования на пластике фибробластоподобную морфологию. Клетки были свободны от вирусных (ВИЧ, гепатит, герпес и др.) и бактериальных агентов (сифилис, микоплазмы, хламидии и др.). После размораживания жизнеспособность клеток, определяемая согласно ISO 10993-5 в тесте с 0,4% трипановым синим, составила 92%.

Культивирование ПСКЛЧ проводили в 24-луночных планшетах (Orange Scientific, Бельгия) при конечной концентрации клеток 3х104 в 1 мл остеогенной среды следующего состава: 10 мМ р-глицерофосфата («Sigma-Aldrich», США), 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты («Дальхимфарм», РФ), 10-6 М дексаметазона (KRKA, Словения), 280 мг/л L-глутамина («Биолот», РФ), 50 мг/л гентамицина сульфата («Дарница», Украина), 20% сыворотки крови эмбрионов коров

(«Sigma-Aldrich», США), 80% среды DMEM/F12 (GIBKO, Великобритания).

Состав среды, методы оценки цитохимии и морфологии культивируемых клеток, активности щелочной (ЩФ) и кислой фосфатаз (КФ), концентрации остеокальцина (ОК) в супернатантах, оптическую и растровую электронную микроскопию (РЭМ) образцов применяли согласно ранее описанным протоколам [8].

Концентрацию свободного кальция и неорганического фосфора в межклеточной среде измеряли колориметрическим стандартным методом [19]. Коллаген определяли с помощью окраски пикрофук-сином по Ван-Гизону [20].

Оценку концентраций TNFa, IL-2, IL-4 в супернатантах клеточных культур проводили с помощью наборов для иммуноферментного анализа («Протеиновый контур», Санкт-Петербург) согласно инструкциям производителя. Учет интенсивности окраски проводили с использованием фотометра для микропланшетов («Multiscan EX», США) при длине волны 450 нм. Абсолютную концентрацию цитокинов рассчитывали по калибровочной кривой.

В экспериментах in vivo по гетеротопическому костеобразованию использовали 40 мышей-самцов линии BALB/c из коллекционного фонда НИИ фармакологии СО РАМН (Томск). Работы проводились согласно нормам Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации, приказу Минздрава СССР № 577 от 12.08.77 «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных».

В одном из вариантов гетеротопического теста искусственный образец имплантируется под кожу или внутримышечно [21]. Нами были получены воспроизводимые результаты подкожного остеогенеза у мышей из столбика сингенного костного мозга, предварительно нанесенного на CaP поверхности [22]. Костный мозг служил источником стромаль-ных стволовых клеток и ростовых факторов. При раздельном подкожном введении подложек или фрагментов костного мозга образования тканевых пластинок не наблюдалось.

В текущем исследовании 23 мышам под эфирным наркозом подкожно вводили по 1 имплантату с нанесенным в асептических условиях in vitro столбиком сингенного костного мозга (средняя площадь мозга 7,5 мм2), выдавленного мандреном из бедренной кости. Перед имплантацией органную культуру костного мозга предварительно культивировали на дисках при 37°С в течение 45 мин в культуральной среде, содержащей 95% среды DMEM/F12 (GIBKO, Великобритания) и 5% сыворотки крови плодов коров («Sigma», США).

Через 45 сут. животных выводили из эксперимента эфирным наркозом, имплантаты извлекали, декальцинировали, снимали тканевые пластинки с поверхности дисков, заливали парафином и выполняли серийные срезы (10 мкм) в проекции, перпендикулярной поверхности имплантатов, окрашивали гематоксилином-эозином для гистологических исследований. Позитивным результатом считали рост костного мозга и/или кости на поверхности имплантата (рис. 1), негативным — развитие соединительной, мышечной или жировой ткани. На срезах тканевых пластинок определяли площадь кости и костного мозга с помощью методов компьютерной морфоме-трии, как описано ранее [22].

Рис. 1. Гетеротопическая кость (костно-мозговой орган), образованный на поверхности имплантата в гетеротопическом тесте у мышей: 1 - костная ткань; 2 - красный костный мозг. Окраска: гематоксилин и эозин. Ув. х100

При оценке полученных данных были использованы методы статистического описания, а также методы проверки статистических гипотез, использующиеся в стандартных пакетах программы ЗЬай1вй1оа 6.0. Для анализа имеющихся выборок данных использовали гипотезу нормальности распределения (критерий Колмогорова — Смирнова). Полученные результаты выражали как среднее арифметическое (Х), 25% (Ш1) и 75% (Ш3) квартили или статистическую девиацию (Бй). В основном, в выборках наблюдалось распределение показателей, отличное от нормального. В связи с этим, для оценки статистической значимости различий выборок применяли непараметрический критерий Манна — Уитни Ш-тест). С целью выявления связи между исследуемыми показателями проводили корреляционный анализ по Спирмену. Различия считались статистически значимыми при уровне значимости р < 0,05.

Результаты и обсуждение

Дизайн искусственных матриц, способных био-миметически воспроизводить клеточное и тканевое микроокружение на основе идей и основных элементов, заимствованных из живой природы, рассматривается как обещающее направление биоинженерии. Реальные технологические успехи достигнуты при воспроизведении физико-химических свойств кости. Следующим перспективным шагом биоинженерии тканей является имитация ниш для стволовых клеток [1, 13]. С нашей точки зрения, многообещающим представляется поиск и дизайн ниш для ММСК [8], что позволит в будущем проектировать строму различных органов. К настоящему времени наибольший массив сведений накоплен для стволовых клеток крови и костной ткани, что и обусловило поиск моделей микроокружения, позволяющих регулировать дифференцировку ММСК в остеогенном направлении.

В свою очередь, популяция ММСК представляет собой разнородный многоклеточный пул, регионарные представители которого имеют, тем не менее, схожие характеристики [5]. Ни одна из известных поверхностных антигенных детерминант не является надежным маркером культуры ММСК [23]. В связи с этим, важным показателем «стволово-сти» стромальной клетки является ее способность дифференцироваться в определенные типы клеток и тканей мезенхимального происхождения, что воз-

можно определить с помощью цито-, гисто-, и биохимических методик. Так, в качестве молекулярных маркеров остеогенной дифференцировки культуры ММСК часто используются щелочная фосфатаза и остеокальцин [10, 23].

Ранее нами показано, что in vitro контакт ПСКЛЧ c CaP покрытиями, но не с пластиковой поверхностью культуральной посуды, способствовал появлению клеток с остеобластным фенотипом [8]. Это свидетельствует о том, что культура ПСКЛЧ, находящаяся в остеогенной среде, не содержит преостеобластов, может служить источником регионарных стромальных стволовых клеток, дифференцирующихся в костные клетки только в подходящем микроокружении. В то же время, в культуре ММСК костного мозга невозможно исключить примесь элементов с остеогенным потенциалом, что искажает результаты поисков микротерриторий для стволовых клеток.

В свою очередь, остеобласты отличаются по функциональной активности [10] и топографическому расположению (трабекулярные и кортикальные). По своим свойствам кортикальная костная ткань более тонкая, плотная, кальцифицированная [7], скорость ее ремоделирования существенно ниже таковой для трабекулярной зоны [10]. При этом в любом состоянии поверхность кости является природной подложкой для стромальных клеток.

С точки зрения дизайна исследования, применение в экспериментах in vitro ПСКЛЧ позволило получить информацию о ранних этапах регенерации костной ткани, так как известно, что эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) способны самоорганизовывать ниши для своего развития [24]. С другой стороны, факторы микроокружения, в том числе физико-химические, регулируют самоподдержание и дифференцировку ЭСК таким же способом, что и в случае тканеспецифических стволовых клеток [1]. Кроме того, с целью понимания результатов, полученных для стромальных клеток, мы использовали аналогии с нишами для СКК, как наиболее изученными микротерриториями, тесно связанными со стромальными клетками кроветворного микроокружения.

Известно, что рельеф минерализованной кости оказывает заметное влияние на судьбу клеток [1]. На культуре остеобластов показано, что они реагируют на микроархитектонику подложки [25]. На гладких поверхностях (пластике, стекле и титане) клетки прикрепляются и пролиферируют, но имеют относительно низкие показатели дифференцировки. При инкубировании на микрошероховатых поверхностях с показателем Ra = 4—7 мкм пролиферация клеток уменьшена, а дифференцировка увеличена.

В связи с этим, была поставлена экспериментальная задача, связанная с определением реакции культуры стромальных стволовых клеток на искусственные поверхности, имитирующие рельеф кости согласно биомиметическим принципам.

Проведенные нами исследования показали, что магнетронные CaP покрытия представляют собой тонкий (толщина менее 1—2 мкм), беспористый, относительно «гладкий» (Ra < 1 мкм) слой карбоксили-рованных апатитов с соотношением кальций/фосфор выше стехиометрического (более чем 1,67). На наш взгляд, подобные искусственные поверхности в определенной степени имитируют состояние минеральной части ЭЦМ кости в спокойном состоянии, вне зоны

его ремоделирования. В то же время, шероховатые (Ra > 2 мкм) CaP покрытия (соотношение кальций/ фосфор меньше стехиометрического) позволяют моделировать состояние регенерирующей кости, связанное с перестройкой ее топографии, активным ионообменном с кровью и тканевой жидкостью.

Естественно, что контроль судьбы стволовых клеток со стороны микроокружения, помимо топографии поверхности [12], обусловлен разнообразными компонентами ЭЦМ (продукты жизнедеятельности клеток, ионы, цитокины, интегрины, фибриллярные белки и т.д.) [13]. Тем не менее, между 2D- и 3D-культурами клеток, а также их поведением in vivo, обнаружены существенные различия [26].

С одной стороны, в культуре ПСКЛЧ шероховатые (Ra > 2 мкм) CaP микродуговые покрытия, по сравнению с гладкими магнетронными CaP покрытиями, значительно (более чем в 3 раза) увеличивали долю клеток, экспрессирующих кислую фосфатазу (КФ). Клетки, преимущественно неправильной формы, располагались, как отмечено нами ранее [8], на поверхности покрытий. Вместе с тем, показатели функциональной активности КФ-позитивных клеток, в частности, их оптическая плотность (табл. 1) и активность фермента в межклеточном пространстве (табл. 4), снижались.

В связи с этим, структурно-функциональный статус КФ-позитивных клеток (моноцитов, остеокластов, фиброкластов, [10, 27]) на шероховатых и гладких CaP покрытиях мог оказаться сопоставимым. КФ считается ферментом резорбции костного матрикса, поскольку КФ-позитивные клетки (остеокласты) способны формировать в нем углубления диаметром до 40 мкм, что стимулирует синтез остеобластами компонентов нового костного матрикса [10, 28].

РЭМ показала, что неровности рельефа шероховатого CaP покрытия представлены сферолита-ми диаметром до 20—30 мкм с единичными или множественными порами c диаметром 5—20 мкм (рис. 2). Между сферолитами располагаются углубления, сообщающиеся между собой (рис. 3), сопоставимые по общей площади со сферолитами.

В связи с этим, исходя из биомиметических принципов, покрытия с неровным рельефом должны стимулировать процессы ремоделирования искусственной поверхности, в основном, за счет активации остеобластов. Согласно выполненным in vitro экспериментам, в углублениях шероховатых CaP подложек ПСКЛЧ принимали округлую форму (рис. 4), синтезировали компоненты ЭЦМ (табл. 1—5) для заполнения дефекта (ямки) поверхности.

Действительно (табл. 2; рис. 3, 5), в сравнении с гладким модельным матриксом, в культурах клеток на шероховатых CaP покрытиях резко возрастали доля и оптическая плотность ЩФ-позитивных клеток, занимающих углубления поверхности. В 4 раза увеличился процент клеток, окрашивающихся на коллаген (табл. 3, рис. 6), в супернатантах повышалась активность ЩФ и концентрация ОК (табл. 4). В совокупности с уменьшением содержания межклеточного кальция эти процессы свидетельствуют, по-видимому, о начальных этапах отложения минерализованного костного вещества на искусственной поверхности. В таком случае, функцией поверхностно расположенных клеток с разнообразной формой (табл.1), позитивно воспринимающих окраску на КФ (рис. 7), можно считать циклическое

ремоделирование покрытия и вновь формирующегося межклеточного матрикса.

Имплантаты, способствующие проявлению остеогенной (интенсивная окраска клеток на ЩФ, секреция ЩФ и ОК) активности культуры ММСК, должны стимулировать ремоделирование костной ткани in vivo. При этом, по мнению Y. Miura (2006) с соавт. [29], остеогенная дифференцировка ММСК изменяет характер их взаимодействия с СКК через модуляцию свойств ниши. Например, ряд авторов считают, что остеоиндуцированные ММСК костного мозга ограничивают миграцию и пролиферацию кроветворных CD34+ клеток [30]. Однако не анализируется тот факт, что стромальные клетки эндоста неизбежно контактируют с поверхностью кости, свойства

которой могут определять как жизнедеятельность ММСК, так и структурно-функциональные особенности эндостальной кроветворной ниши.

Знания, полученные по клеточной биологии in vitro, требуют их обязательной валидации in vivo [13, 14], в том числе при помощи теста гетеротопи-ческого остеогенеза, когда при подкожном или внутримышечном введении искусственных материалов на их поверхности формируются костные структуры [21, 22]. Использование материалов с оптимальными физико-химическими характеристиками поверхности позволяет имитировать природный ЭЦМ и, таким образом, приближать процессы эктопического ремоделирования системы «кость — костный мозг» к естественным условиям.

Таблица 1. Результаты компьютерной морфометрии пренатальных стромальных клеток легкого человека, окрашенных на кислую фосфатазу на различных кальцийфосфатных покрытиях, Х

Группа покрытий Средний Ra, мкм, n = 10 % окрашенных клеток от числа засеянных клеток на 1 мм2 поверхности Оптическая плотность S окраски клеток, мкм2 Форма клеток,%

Правильная форма Неправильная форма

Гладкие покрытия 0,75 9,86 (6,75-10,13) n1 = 12 24,08 (3,56-7,78-13,25) n2 = 35 209,89 (78-216,5) n2 = 35 85,71 14,29

Шероховатые покрытия 2,76 34,99* (23,64-50,65) n1 = 14 p = 8х10-6 8,51* (5,49-11,63) n2=145 p = 0,0006 147,30* (85,5-159) n2 = 145 p = 0,005 40,16 59,85

Примечание: Здесь и в табл. 2—3 (*) — статистически значимые различия с группой гладких покрытий согласно и-критерию Манна — Уитни; п — число определений шероховатости искусственных поверхностей; гц — число подсчитанных оптических снимков (полей зрения); п2 — число подсчитанных клеток в полях зрения, Б — площадь. Использовали по 3 имплантата на каждую группу покрытий.

Таблица 2. Результаты компьютерной морфометрии пренатальных стромальных клеток легкого человека, окрашенных на щелочную фосфатазу на различных кальцийфосфатных покрытиях, Х

Группа покрытий Средний Ra, мкм, n = 10 % окрашенных клеток от числа засеянных клеток на 1 мм2 поверхности Оптическая плотность S окраски клетки, мкм2 s" 3 о 5 т е й, иай S окраски клетки/ S территории, %

Гладкие покрытия, n2 = 12 0,87 10,12 (4,34-16,78) n1 = 13 -0,78 (-10,34-8,00) 267,37 (212,03-460,69) 833,0 (148,01-645,11) 32

Шероховатые покрытия, n2 = 29 2,87 22,82* (11,93-27,12) n1 = 12 p = 0,01 35,42* (31,35-41,35) p = 2х10-6 80,24* (39,73-98,09) p = 0,007 186,86* (92,2-232,24) p = 0,014 43

Таблица 3. Результаты компьютерной морфометрии пренатальных стромальных клеток легкого человека, окрашенных на коллаген на различных кальцийфосфатных покрытиях, Х

Группа покрытий Средний Яа, мкм, п = 10 % коллаген-позитивных клеток от числа засеянных клеток на 1 мм2 поверхности Форма клеток,%

Правильная Неправильная

Гладкие покрытия 0,75 9,22 (6,75-10,13) п1 = 11 96,67 3,33

Шероховатые покрытия 2,87 37,72* (30,39-47,28) п1 = 12 р = 0,00002 58,21 41,79

Примечание: Площадь окраски и оптическая плотность клеток, окрашенных на коллаген, статистически значимо не отличались в сравниваемых группах.

Таблица 4. Минеральный и биохимический состав супернатантов в 4-суточной культуре пренатальных стромальных клеток легкого человека (контроль роста) в присутствии модельных имплантатов с различным рельефом кальцийфосфатной поверхности, Х±Б0

Исследуемая группа Средний Яа, мкм, п = 10 Кальций, мМ Фосфат-ионы, мМ Активность ЩФ, Е/л Активность КФ, Е/л Остеокальцин, нг/мл

Культуральная среда - 1,51 9,19 44,15 0,02 0,43

Контроль роста клеток на пластике п1 = 5 1,53±0,06 8,71±0,17 46,64±1,16 0,04±0,02 0,74±0,14

Гладкие покрытия п1 = 6 0,94 1,44±0,17 8,06±0,46* р = 0,046 47,03±5,10 0,073±0,012* р = 0,041 0,80±0,22

Шероховатые покрытия п1 = 6 2,42 1,31±0,07* р = 0,007 8,86±0,25 53,60±1,18* р = 0,0002 0,047±0,006# р = 0,023 1,04±0,08* р = 0,036

Примечание: Здесь и в табл. 5 (*) — статистически значимые различия с контролем роста клеток на пластике; (#) — с группой гладких покрытий согласно и-критерию Манна — Уитни при р < 0,05; п — число определений шероховатости искусственных поверхностей; п., — количество исследованных лунок в планшете.

Таблица 5. Цитокиновый профиль (пг/мл) супернатантов в 1-суточной культуре пренатальных стромальных клеток легкого человека (контроль роста) в присутствии модельных имплантатов с различным типом кальцийфосфатной поверхности, Х±БП

Исследуемая группа, П1 = 3 Яа, мкм, п = 10 ТЫРа !Ь-2 !Ь4

Контроль роста клеток на пластике - 46,52±1,16 78,01±0,77 66,33±2,21

Гладкие покрытия 0,17 62,26±6,0* р = 0,011 77,32±2,75 65,86±5,76

Шероховатые покрытия 2,86 51,56±6,81 77,57±1,85 68,77±6,25

Рис. 2. Поверхность шероховатого кальцийфосфатного покрытия, нанесенного на титановую подложку микродуговым способом.

Растровая электронная микроскопия.

Ув. х625

Рис. 3. Поверхность шероховатого кальцийфосфатного покрытия с культивированными клетками: ЩФ-положительные клетки черного цвета. Цитохимическая реакция на ЩФ.

Темнопольная микроскопия.

Ув. х1000

Рис. 4. Стромальная клетка (указано стрелкой) легкого человека в углублении шероховатой кальций-фосфатной поверхности.

Растровая электронная микроскопия.

Ув. х10000

Рис. 5. Поверхность гладкого кальций-фосфатного покрытия с культивированными клетками: ЩФ-положительные клетки черного цвета. Цитохимическая реакция на ЩФ.

Темнопольная микроскопия.

Ув. х500

Рис. 7. Поверхность гладкого кальций-фосфатного покрытия с культивированными клетками: КФ-положительные клетки черного цвета. Цитохимическая реакция на КФ.

Темнопольная микроскопия.

Ув. х500

Гетеротопическая метаплазия костного мозга протекает через активацию пула донорских ММСК, дифференцирующихся в предшественники и потомки хондро-остеобластогенеза [31]. В свою очередь, эндохондральная оссификация является важнейшим условием для развития кроветворного микроокружения, костномозговых лакун и ниш для СКК реципиента [32].

Гетеротопический тест с шероховатыми CaP модельными имплантатами показал, что гистологический состав тканевой пластинки может быть представлен ретикулофиброзной костной тканью без костного мозга, которая формировалась, скорее всего, по типу прямого остеогенеза. Однако на 75% препаратов тканевых пластинок обнаружена ретику-лофиброзная костная ткань с лакунами, заполненными красным костным мозгом (см. рис. 1). При этом базофильные участки хряща, прилежащие к CaP поверхности, в динамике наблюдения перестраиваются в оксифильную костную ткань (рис. 8). Другими словами, со стороны искусственной шероховатой поверхности кость развивается непрямым способом, через стадию эндохондрального окостенения, как это происходит в зоне роста трабекулярной кости

Поскольку эндохондральная оссификация является обязательным условием возникновения ниш для длительно репопулирующих СКК, можно заключить, что именно искусственная CaP поверхность является источником для инженерии de novo естественного микроокружения, необходимого для регенерации системы «кость — костный мозг». При этом площадь костной ткани на поперечных срезах коррелировала с площадью тканевых пластинок (rS = 0,69; n = 11; p < 0,019), которую определяли параллельно поверхности дисков. Другими словами, границы роста костной ткани определяются гистокондуктивными свойствами CaP покрытий.

Далее результаты показали, что при индексе Са/Р выше стехиометрического, но малой шероховатости (Ra < 1 мкм), магнетронные покрытия, в принципе, не обладают способностью индуцировать гетеро-пическое развитие системы «кость — костный мозг». Вероятность формирования тканевой пластинки,

роста кости и образования очагов гемопоэза in vivo на «гладких» CaP покрытиях равна нулю (10 из 10 имплантаций не дали положительного результата теста), несмотря на их высокую биосовместимость.

В то же время, при подкожном введении 13 имплантатов с шероховатой CaP поверхностью тканевая пластинка формировалась в 12 случаях (92%). Ремоделирование системы «кость — костный мозг» отмечалось в среднем в 83% случаев (в зависимости от показателя Ra в пределах 1—7 мкм вариации показателя составили 62—100%), эндохондральная оссификация стабильно протекала на CaP модельных матриксах с Ra > 2 мкм. Логическая цепочка событий подводит нас к пониманию того, что тесный контакт костной ткани с CaP покрытиями имплантатов предполагает наличие микротерриторий или ниш (в нашем случае, искусственных), количественные параметры которых определяют хондрогенные и остеогенные потенции ММСК.

Различают несколько типов остеобластов (например, веретенообразные «выстилающие» и «овальные», активно секретирующие костный ЭЦМ). Стадия созревания и топографическое расположение гемопоэтически активных остеобластов неизвестны [7]. Кроме того, многочисленные данные свидетельствуют о двойственной природе регуляторных стимулов в остеобластных нишах. С одной стороны, они обеспечивают самоподдержа-ние СКК, с другой — их дифференцировку [33—35]. Существуют различные гипотезы, пытающиеся объяснить данное противоречие.

Так, вероятным механизмом контроля константы полипотентных и коммитированных СКК рассматриваются размер [2] и иерархия кроветворных ниш [7], эластичность и жесткость ЭЦМ [36]. Тем не менее, интригующие рассуждения о клеточно-молекулярных процессах функционирования ниш никак не соотносятся с пространственной системой координат, точкой отсчета которой для костного мозга выступает кость, на которой расположены стромальные (остеогенные) клетки эндостальной ниши. Однако свойства кости, как специализированного представителя ЭЦМ, практически выпали из поля зрения исследователей.

Недавно для in vitro характеристики искусственной поверхности, несущей остеогенные ниши, мы предложили структурно-функциональный индекс, выражающий соотношение площади окраски клеток (остеобластов) на ЩФ к площади углубления в искусственной поверхности, занимаемой окрашенной клеткой (S ЩФ / S микротерритории (ниши), %) [8]. Текущие исследования показали, что абсолютная площадь ремодели-рованной системы «кость — костный мозг» достигала максимальных значений (0,7—0,8 мм2) при in vivo использовании шероховатых CaP поверхностей, несущих in vitro «ниши» для ЩФ-позитивных клеток в узком диапазоне их относительной размерности около 43% (см. табл. 2). При этом соотношение площади ремоделирования кости (52±18% от площади поперечного среза тканевой пластинки) и костного мозга (50±17%] составило 1:1.

В нашей интерпретации, шероховатые CaP подложки, моделирующие состояние регенерирующей кости, имитируют структурно-функциональные «ниши» для активных остеогенных остеобластов, которые при их оптимальном размере способствуют также активации и расширению плацдарма крове-

Рис. 8. Гетеротопическая кость (костно-мозговой орган), образованный на поверхности имплантата в гетеротопическом тесте у мышей; нижняя часть прилегала к шероховатей поверхности имплантата. Окраска: гематоксилин и эозин.

Ув. х100

творения. В то же время, при убывающем индексе

S ЩФ / S ниши, соответствующем модели гладкой поверхности кости (см. табл. 2), остеогенные и кроветворные ниши приобретали «молчащий» функциональный статус.

Возникает вопрос, посредством каких клеточномолекулярных механизмов может осуществляться контроль судьбы стромальных и кроветворных стволовых клеток на подложках, имитирующих различный рельеф поверхности кости?

Наши результаты позволяют полагать, что состояние эндостальной ниши (молчащее/активированное [7]) зависит от структурно-функционального состояния минеральной части костного ЭЦМ. При этом в условиях его постоянного физиологического ремоделирования особая роль в определении судьбы ниши принадлежит остеокластам.

Остеокласты и их предшественники (прежде всего, моноциты/макрофаги) играют многогранную роль в формировании и ремоделировании гемопоэти-ческого микроокружения. Они, как клеточные компоненты кроветворной ниши [7, 34], способствуют мобилизации гемопоэтических прекурсоров в циркулирующую кровь [37]. В условиях дефицита остеокластов нарушается формирование лакун в очагах экстрамедуллярного гемопоэза, что препятствует формированию активных кроветворных микротерриторий резидентной костномозговой стромой и мигрирующими СКК [33].

Согласно общим принципам построения гемопоэ-тического микроокружения [38], эндостальная ниша регулирует СКК посредством клеточных контактов и гуморальных сигналов [3]. Описаны секреторные факторы позитивной и негативной стромальной регуляции СКК [7]. Скорее всего, прямой контакт с ММСК и остеобластами тормозит активацию СКК [15, 30].

По-видимому, остеокласты при ремоделировании костного ЭЦМ увеличивают его рельефность, что пространственно разобщает тесные межклеточные контакты стромальных клеток (ММСК, неактивный остеобласт) с СКК. Это обусловлено тем, что активирующиеся стромальные клетки дифференцируются в «овальные» остеобласты, которые заполняют образующиеся дефекты (углубления) костного ЭЦМ, синтезируют коллаген и способны осуществлять негативный и позитивный контроль судьбы СКК только посредством секретируемых факторов. В свою очередь, считают [39], что следует различать два аспекта самоподдержания пула СКК: пролиферацию клеток и ограничение их дифференцировки.

Нам не удалось обнаружить статистически значимых изменений в секреции IL-2 и IL-4 культурой клеток на шероховатой CaP поверхности в сравнении с моделью «гладкой» кости (см. табл. 5). Выбор данных цитокинов был связан с участием остеобластов в модуляции лимфопоэза [40], формировании предполагаемой эндостальной ниши для ранних предшественников B-лимфоцитов [2].

Однако при остеогенной активации ПСКЛЧ на рельефных покрытиях in vitro (см. табл.1—4), в сравнении с 1-суточной культурой клеток на гладких CaP покрытиях, отмечено торможение секреции TNFa до фонового значения, отмеченного в контроле роста клеток на пластике (см. табл. 5). Интересно, что при увеличении срока культивирования ПСКЛЧ до 3-х суток средняя концентрация цитокина в межклеточной среде культур на пластике возрастала почти в 3 раза

(до 131,37±3,38 пг/мл), но оставалась практически стабильной (57,49±4,34 пг/мл) для супернатантов клеток на шероховатом CaP покрытии.

TNFa может быть одним из мультифункциональ-ных молекулярных факторов регуляции самоподдер-жания и коммитирования стромальных стволовых клеток, который по типу аутокринной и паракрин-ной регуляции повышает выживаемость ММСК, но тормозит их дифференцировку в остеобласты [41]. С другой стороны, цитокин (и его рецепторы) является молекулярным компонентом остеобластной ниши для СКК [33], белок ингибирует пролиферацию ранних предшественников гемопоэза [42]. TNFa стимулирует остеокласты к ремоделированию рельефа кости и имплантатов [28], что неизбежно сопровождается изменением морфофункциональных параметров как остеогенных, так и кроветворных ниш.

Таким образом, полученные данные позволяют интерпретировать остеобластную нишу как топографическое пересечение судьбы ММСК и СКК, имеющую функциональную (возможно, возрастную) иерархию (молчащее/активное состояние) в зависимости от количественных характеристик рельефа эндостальной поверхности кости, динамически меняющейся при ее физиологическом, репаративном и патологическом ремоделировании.

Многие вопросы теории ниши остаются неясными. Например, является стволовая клетка пассивным или активным участником заселения микротерриторий и, следовательно, своей судьбы. Тем не менее, разрабатываемые концепция и экспериментальная модель «ниша — рельеф» для стволовых клеток позволяют говорить о новом шаге в понимании взаимосвязанных механизмов остеоиндукции, остеокондукции и гемопоэза, контроля процессов многоуровневой биоинженерии костной и кроветворной тканей. Кроме того, применение в экспериментах стромальных клеток легкого и известная пластичность ММСК [5, 23] позволяют надеяться на возможное распространение концепции в приложении к технологическому дизайну «биоконструкторов» для других тканей организма.

Заключение

Разрабатываемая экспериментальная модель позволяет в цифровом формате изучать и проверять многочисленные гипотезы организации и функционирования ниш для стволовых клеток. Полученные данные развивают наши предыдущие представления о существовании и размерах искусственной эндостальной ниши (по аналогии с эндостальной нишей для СКК) для остеогенной дифференцировки ММСК.

Так, имплантаты с шероховатым (Ra > 2 мкм) CaP покрытием, имитирующие трехмерное состояние регенерирующей кости, несут структурнофункциональные участки (микрорегионы), которые мы назвали «ниши-рельеф», необходимые для созревания и дифференцировки пренатальных ММСК человека в секретирующие остеобласты. При оптимальных параметрах остеогенной ниши in vitro (средний индекс S ЩФ в клетках / S микротерритории порядка 43%) отмечается также максимальное ремоделирование системы «кость — костный мозг» мышей в гетеротопическом тесте in vivo.

Установлен in vitro вероятный клеточномолекулярный механизм влияния экспериментального 3й-моделирования поверхности кости на

переключение эндостальной ниши из молчащего в активное состояние. Он связан с активацией клеточной продукции компонентов ЭЦМ (щелочная фосфатаза, остеокальцин, коллаген, фосфаты кальция), пространственно разобщающих стромальные и кроветворные элементы, и параллельным снижением секреции TNFa в межклеточную среду.

Исследование выполнено при поддержке федеральных целевых программ «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России

ЛИТЕРАТУРА:

1. Dellatore S.M., Garsia A.S., Miller W.M. Mimicking stem cell niches to increase stem cell expansion. Curr.Opin.Biotechnol. 2008; 19: 534-40.

2. Yin T., Li L. The stem cell niches in bone. J. Clin. Inv. 2006; 116(5): 1195-201.

3. Jing D., Fonseca A.-V., Alakel N. et al. Hematopoietic stem cells in co-culture with mesenchemal stromal cells — modeling the niche compartments in vitro. Haematologica 2010; 95: 542—50.

4. Kolf C.M., Cho E., Tuan R.S. Mesenchemal stromal cells. Biology of adult mesenchymal stem cells: regulation of niche, self-renewal and differentiation. Arthritis Res.Ther. 2007; 9: 204—19.

5. Meirelles L., Chagastelles P.C., Nardi N.B. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J. Cell Sci. 2006; 119: 2204—13.

6. Scadden D.T. The stem cell niche in health and leukemic disease. Best Pract. Res.Clin. Haematol. 2007; 20: 19—27.

7. Purton L.E., Scadden D.T. The hematopoietic stem cell niche. In:

Silberstein L., editor. StemBook. The Stem Cell Research Community; 2008. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK27051/pdf/The_

hematopoietic_stem_cell_niche.pdf.

8. Хлусов И.А., Хлусова М.Ю., Зайцев К.В. и др. Пилотное исследование in vitro параметров искусственной ниши для остеогенной дифференцировки пула стромальных стволовых клеток человека. Клеточные технологии в биологии и медицине 2010; (4): 216—24.

9. Bhattacharya D., Czechowicz A., Ooi A.G.L. et al. Niche recycling through division-independent egress of hematopoietic stem cells. J. Exp.Med. 2009; 206: 2837—50.

10. Риггз Б.Л., Мелтон 111.Л. Остеопороз: пер. с англ. СПб.: Издательство БИНОМ, Невский диалект; 2000.

11. Curtis A.S., Varde M. Control of cell behavior: Topological factors. J. Natl. Cancer Inst. 1964; 33: 15—26.

12. Sniadecki N.J., Desai R.A., Ruiz S.A. et al. Nanotechnology for cell-substrate interactions. An. Biomed. Engin. 2006; 34: 59—74.

13. Lutolf M.P., Gilbert P.M., Blau H.M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature 2009; 462: 433—41.

14. Lutolf M.P., Doyonnas R., Havenstrite K. et al. Perturbation of single hematopoietic stem cell fates in artificial niches. Integr. Biol. (Camb). 2009; 1: 59—69.

15. Wilson A., Trumpp A. Bone-marrow haematopoietic-stem-cell niches. Nat. Rev. Immunol. 2006; 6: 93—106.

16. Sharkeev Yu.P., Legostaeva E.V., Eroshenko A.Yu. et.al. The structure and physical and mechanical properties of a novel biocomposite material, nanostructured titanium-calcium-phosphate coating. Composite Interfaces 2009; 16: 535—46.

17. Pichugin V. F., Eshenko E. V., Surmenev R.A. et al. Application of high-frequency magnetron sputtering to deposit thin calcium-phosphate biocompatible coatings on a titanium surface. J. Surface Investigation 2007; 1(6): 679—82.

18. Чайкина М.В., Хлусов И.А., Карлов А.В. и др. Механохи-мический синтез нестехиометрических и замещенных апатитов с наноразмерными частицами для использования в качестве био-совместимых материалов. Химия в интересах устойчивого развития 2004; 12: 389—99.

19. Тиц Н. Клиническое руководство по лабораторным тестам: пер.с англ. М.: Юнимед-Пресс; 2003.

20. Хейхоу Ф.Г., Кваглино Д. Гематологическая цитохимия. М.: Медицина; 1983.

21. Klein C., De Groot K., Chen W. et al. Osseous substance formation induced in porous calcium phosphate ceramics in soft tissues. Biomaterials 1994; 15: 31—4.

на 2007-2012 годы» (государственный контракт № 16.512.11.2087), «Научные и научно-педа-

гогические кадры инновационной России» на 2009— 2013 годы (государственный контракт П861 от

25.05.2010), Аналитической ведомственной целевой программы (АВЦП) «Развитие научного потенциала высшей школы на 2009—2011 годы» (регистрационный номер проекта 2.1.1/14204), гранта №5ФНМ-27 программы Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине», интеграционного проекта №126 СО РАН и гранта РФФИ № 09-04-00287а.

22. Khlusov I.A., Karlov A.V., Sharkeev Yu.P. et al. Osteogenic potential of mesenchymal stem cells from bone marrow in situ: role of physicochemical properties of artificial surfaces. Bull. Exp. Biol. Med. 2005; 140(1): 144—52.

23. Aerts F., Wagemaker G. Mesenchymal stem cell engineering and transplantation. In: J.A. Nolta, editor. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells. Springer; 2006: p. 1—44.

24. Peerani R., Rao B.M., Bauwens C. et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO 2007; 26: 4744—55.

25. Boyan B.D., Lossdorfer S., Wang L. et al. Surface microtopography regulates osteoblasts. Eur. Cells Mat. 2003; 6: 22—7.

26. Birgersdotter A., Sandberg R., Ernberg I. Gene expression perturbation in vitro — a growing case for three-dimensional (3D) culture systems. Semin. Cancer Biol. 2005; 15: 405—12.

27. Серов В.В., Шехтер А.Б. Соединительная ткань: функциональная морфология и общая патология. М.: Медицина;1981.

28. Ratner B.D., Hoffman A.S., Schoen F.J. et al, editors. Biomaterials Science: an introduction to materials in medicine. 2nd ed. Elsevier Inc.; 2004.

29. Miura Y., Gao Zh., Miura M. et al. Mesenchymal stem cell-organized bone marrow elements: an alternative hematopoietic progenitor resource. Stem Cells 2006; 24(11): 2428—36.

30. De Barros A.P., Takiya C.M., Garzoni L.R. et al. Osteoblasts and bone marrow mesenchemal stromal cells control hematopoietic stem cell migration and proliferation in 3D in vitro model. PLoS One. 2010; 5: e9093—9111.

31. Фриденштейн А.Я., Лурия Е.А. Клеточные основы кроветворного микроокружения. М.: Медицина; 1980.

32. Chan C.K., Chen C.C., Luppen C.A. et al. Endochondral ossification is required for hematopoietic stem cell niche formation. Nature 2009; 457: 490—4.

33. Taichman R.S. Blood and bone: two tissues whose fates are intertwined to create the hematopoietic stem-cell niche. Blood 2005; 105(7): 2631—9.

34. Frisch B.J., Porter R.L., Calvi L.M. Hematopoietic niche and bone meet. Curr. Opin. Support. Palliat. Care. 2008; 2: 211—7.

35. Porter R.L., Calvi L.M. Comunications between bone cells and hematopoietic stem cells. Arch. Biochem. Biophys. 2008; 473(2): 193—200.

36. Eshghi S., Schaffer D.V. Engineering microenvironments to control stem cell fate and function. In: Bhatia S., Polak J., editors. StemBook. The Stem Cell Research Community; 2008. http://www. ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK27048.

37. Kollet O., Dar A., Shivtiel S. et al. Osteoclasts degrade endosteal components and promote mobilization of hematopoietic progenitor cells. Nat. Med. 2006; 12: 657—64.

38. Trentin J.J. Determination of bone marrow stem cell differentiation by stromal hemopoietic inductive microenvironments (HIM). Am. J. Pathol. 1971; 65: 621—8.

39. Duncan A.W., Rattis F.M., DiMascio L.N. et al. A role for Wnt signalling in self-renewal of haematopoietic stem cells. Nat. Immunol. 2005; 6: 314—22.

40. Corcione A., Benvenuto F., Ferretti E. et al. Human mesenchymal stem cells modulate B-cell functions. Blood 2006; 107(1): 367—72.

41. Li W., Yu B., Li M. et al. NEMO-binding domain peptide promotes osteoblast differentiation impaired by tumor necrosis factor alpha. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2010; 391(2): 1228—33.

42. Волкова М.А. Клиническая онкогематология. М.: Медицина; 2001.

Поступила 13.03.2011