СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ, И СРЕДСТВО, ПОЛУЧЕННОЕ ЭТИМ СПОСОБОМ (ВАРИАНТЫ)
METHOD FOR PRODUCING AGENT SHOWING ANTICANCER ACTIVITY, AND AGENT PRODUCED BY THIS METHOD (VERSIONS)

Изобретение относится к медицине, а именно к получению средства, обладающего противоопухолевой активностью путем культивирования базидиомицетов в погруженной культуре.
Известно, что метаболиты многих видов базидиомицетов обладают лечебными свойствами, в частности противоопухолевым действием, включающим прямое ингибирующее действие на пролиферацию и рост клеток опухоли, повышение противоопухолевого иммунитета, антиканцерогенное действие и др., антиоксидантным, противовирусным, гепатопротекторным, иммуномодулирующим действием. В последние годы в России, США, Китае, Японии, Корее ведутся работы по получению лекарственных средств на основе базидиомицетов. Создание новых лекарственных препаратов сдерживается сложной дорогостоящей технологией выращивания базидиомицетов и выделения из них веществ, обладающих стабильными биологическими свойствами, в частности противоопухолевыми.
Образование базидиомицетами ценных для фармакологии веществ зависит как от используемых видов базидиомицетов, так и от технологии их культивирования (приготовление посевного материала, условия культивирования), а также процесса выделения метаболитов.
Для лечения онкологических заболеваний используют химические вещества, такие как цитостатики, проявляющие высокую токсичность, что ограничивает их применение.
Токсичность противоопухолевых средств, полученных из съедобных или несъедобных (неядовитых) базидиомицетов по литературным данным или отсутствует, или очень низкая (Chang & But, 1986; Su et al., 1987).
В настоящее время большое внимание уделяется разработке технологии культивирования базидиомицетов с целью получения максимального количества мицелия при культивировании в возможно короткий срок и методам выделения противоопухолевых средств.
Известен способ получения средства, обладающего противоопухолевой активностью, из мицелия гриба Ganoderma lucidum. Мицелий получают путем культивирования Ganoderma lucidum в погруженной культуре на питательной среде, содержащей 50 г глюкозы, 20 г пептона, 0,87 г дигидрофосфата калия, 0,5 г сульфата магния, 10 мг хлорида железа (II), 7 мг хлорида марганца, 10 мг сульфата цинка, 4 мг хлорида цинка на 1 л воды, рН среды 5,5.
Предварительно готовят посевной материал. Для этого указанный гриб культивируют при 180 об/мин, 25°С в течение 10 суток до получения пеллет, полученную культуру пересевают в свежую питательную среду в количестве 5% и вновь культивируют в течение 10 суток. Полученным в два этапа посевным материалом засевают свежую питательную среду и культивируют при тех же условиях в течение 7 суток. Мицелий отделяют от культуральной жидкости и из него выделяют протеогликан G009 - средство, обладающее противоопухолевой активностью, очищают его и определяют противоопухолевую активность в отношении саркомы 180, привитой самцам мышей (RU 2082755 C1, 19.08.1997).
Недостатком описанного способа является длительный процесс приготовления посевного материала (до 20 суток), продолжительный процесс культивирования гриба (7 суток) и сложный процесс выделения средства, обладающего противоопухолевой активностью.
Известен способ получения средства, обладающего противоопухолевой активностью из мицелия базидиомицетов, выбранных из группы Ganoderma lucidum, Hypsizygus ulmarium, Kuhneromyces mutabilis, Omphalotus olearius, Panus conchatus, Piptoporus betulinus, Pleurotus eryngii, Trametes zonata.
Базидиомицеты вначале выращивают на агаровой среде при 27°С, а затем пересевают на жидкую среду и культивируют в погруженной культуре при 27°С, 180 об/мин в течение 2-3 недель. Среда содержит 2% глюкозы, 0,1% пептона, 0,1% дрожжевого экстракта, 0,1% дигидрофосфата калия, 0,1% сульфата магния и микроэлементы (сульфат железа (II), сульфат марганца, сульфат цинка, сульфат меди). Из погруженной культуры выделяют мицелий, высушивают и из сухого мицелия экстрагируют средство, обладающее противоопухолевой активностью. В качестве экстрагента используют метанол, этанол, ацетонитрил, этилацетат, хлороформ, дихлорметан или их смеси (US 20060057157, 16.03.2006).
Недостатком описанного способа получения средства, обладающего противоопухолевой активностью, является длительное культивирование базидиомицетов (2-3 недели) и низкая эффективность полученного средства в системе in vitro. Противоопухолевая активность экстрактов из мицелия базидиомицетов, проведенная на клетках миелогенной лейкемии человека линии К562 составляла 53,8-69,0%. В системе in vivo полученные средства испытаны не были.
Задачей, на решение которой направлены изобретения, является сокращение длительности процесса культивирования базидиомицетов, повышение выхода мицелия и получение более эффективного противоопухолевого средства.
Поставленная задача в части первого варианта изобретения решается за счет того, что в способе получения средства, обладающего противоопухолевой активностью, включающего приготовление посевного мицелия базидиомицета, приготовление производственной среды, засев производственной питательной среды, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, приготовленным посевным мицелием, культивирование базидиомицета с последующим получением погруженной культуры, согласно изобретению при приготовлении производственной питательной среды в качестве источника углерода используют растительное масло, в качестве источника азота - соевую муку в количествах, соответственно равных 10-27 и 16-27 г/л воды, а в качестве минеральных солей используют дигидрофосфат калия и сульфат магния в количествах, соответственно равных 2,0-3,0 и 0,2-0,3 г/л воды.
В качестве растительного масла могут быть использованы подсолнечное, оливковое, соевое, льняное, арахисовое масло или их смеси.
Введение в состав среды растительного масла в заявленном количестве способствует не только сокращению длительности процесса культивирования и повышению выхода мицелия, но и снижает процесс пенообразования в процессе культивирования.
Соевая мука может быть использована из сортов сои как генетически модифицированных, так и немодифицированных.
Приготовление посевного материала базидиомицета может осуществляться в два этапа, первый из которых - на стерильной питательной среде, содержащей: кукурузный экстракт - 10-15 мл, агар-агар - 10-20 г и отвар зерен пшеницы - до 1 литра, а второй - на стерильной жидкой питательной среде, содержащей (г/л): глюкозу и соевую муку в количествах, соответственно равных 17-23 и 8-15, дигидрофосфат калия 2,0-3,0, сульфат магния 0,2-0,4, воду - до 1 литра, при температуре 24-30°С в течение 2-4 суток при аэрации, при этом жидкую питательную среду перед стерилизацией выдерживают в течение 8-12 часов при комнатной температуре.
Из базидиомицетов целесообразно использовать Ganoderma lucidum (Curt.:Fr.) P.Karst или Hypsizygus ulmarius (Bull.) Redhead, или Trametes versicolor (L.: Fr.) Pilat.
После культивирования полученную погруженную культуру можно высушить и использовать в качестве противоопухолевого средства.
Из полученной после культивирования погруженной культуры рекомендуется отделить мицелий, высушить его при температуре 30-90°С, измельчить до порошкообразного состояния и полученный порошок использовать в качестве средства, обладающего противоопухолевой активностью.
Выделение средства, обладающего противоопухолевой активностью, может быть осуществлено путем получения водного экстракта из сухого измельченного мицелия, взятого в количестве 18-100 г/л, кипящей водой в течение 2-3 часов при 1,0-1,5 атм.
В полученный водный экстракт можно добавить этанол в соотношении объемов 1:2-4, отделить образовавшийся осадок и высушить его и использовать в качестве средства, обладающего противоопухолевой активностью.
Полученную после культивирования базидиомицета погруженную культуру следует автоклавировать в течение 2-3 часов при 1,0-1,5 атм, отделить жидкую фазу и использовать ее в качестве средства, обладающего противоопухолевой активностью.
Жидкую фазу, полученную после автоклавирования погруженной культуры, целесообразно высушить и использовать в качестве противоопухолевого средства.
Противоопухолевое средство, полученное описанным способом, является самостоятельным объектом изобретения.
Поставленная задача в части второго варианта изобретения решается за счет того, что в способе получения средства, обладающего противоопухолевой активностью, включающем приготовление посевного мицелия каждого из базидиомицетов, приготовление стерильной производственной среды, засев производственной питательной среды, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, приготовленным посевным мицелием, культивирование базидиомицетов и выделение средства, обладающего противоопухолевой активностью, согласно изобретению осуществляют культивирование базидиомицетов таких видов, как Ganoderma lucidum (Curt.:Fr.) P.Karst, Hypsizygus ulmarius (Bull.) Redhead, Trametes versicolor (L.: Fr.) Pilat, при этом каждый из указанных базидиомицетов культивируют отдельно, готовят производственную среду, содержащую (г/л): в качестве источника углерода - растительное масло, в качестве источника азота - соевую муку в количествах соответственно равных 10-27 и 16-27, в качестве минеральных солей дигидрофосфат калия и сульфат магния в количествах, соответственно равных, 2,0-3,0 и 0,2-0,3, воду - до 1 литра.
В качестве растительного масла может быть использованы подсолнечное, оливковое, соевое, льняное, арахисовое масло или их смеси.
Введение в состав среды растительного масла в заявленном количестве способствует не только сокращению длительности процесса культивирования и повышению выхода мицелия, но и снижает процесс пенообразования в процессе культивирования.
Соевая мука может быть использована из сортов сои как генетически модифицированных, так и немодифицированных.
Приготовление посевного мицелия каждого из указанных видов базидиомицетов может осуществляться в два этапа, первый из которых - на стерильной питательной среде, литр которой содержит (в 1 л среды): кукурузный экстракт - 10-15 мл, агар - 10-20 г и отвар зерен пшеницы - до 1 литра, а второй - на стерильной жидкой питательной среде, содержащей (г/л): глюкозу и соевую муку в количествах, соответственно равных 17-23 и 8-15, дигидрофосфат калия - 2,0-3,0, сульфат магния - 0,2-0,4, воду - до 1 литра, при температуре 24-30°С в течение 2-4 суток при аэрации. Перед стерилизацией производственную питательную среду целесообразно выдержать при комнатной температуре в течение 8-12 часов.
При культивировании базидиомицета Ganoderma lucidum в производственную питательную среду следует вводить (г/л): растительное масло и соевую муку в количествах, соответственно равных 10-17 и 16-20, дополнительный источник углерода в виде глюкозы - 8-9, дигидрофосфат калия - 2,0-2,5, сульфат магния - 0,25-0,30, воду - до 1 литра, при этом культивирование целесообразно осуществлять при температуре 28-35°С в течение 3-5 суток.
При культивировании базидиомицета Hypsizygus ulmarius в производственную питательную среду рекомендуется вводить (г/л): растительное масло и соевую муку в количествах, соответственно равных 20-27 и 20-27, дигидрофосфат калия - 2,0-2,5, сульфат магния - 0,25-0,3, воду - до 1 литра, при этом культивирование целесообразно осуществлять при температуре 25-32°С в течение 2-4 суток.
При культивировании базидиомицета Trametes versicolor в производственную питательную среду следует вводить (г/л): растительное масло и соевую муку в количествах, соответственно равных 18-22 и 20-27, дигидрофосфат калия - 2,5-3,0, сульфат магния - 0,20-0,25, воду - до 1 литра, при этом культивирование рекомендуется осуществлять при температуре 25-32°С в течение 3-4 суток.
Целесообразно мицелий каждого базидиомицета по отдельности высушить при температуре 30-90°С, измельчить, взять в количестве 18-100 г/л и экстрагировать кипящей водой в течение 2-3 часов при 1,0-1,5 атм, полученные водные экстракты, отделенные от мицелия, смешать в соотношении 0,5-1,0:0,5-1,0:0,5-1,0 и использовать в качестве средства, обладающего противоопухолевой активностью.
Рекомендуется мицелий каждого базидиомицета по отдельности высушить, измельчить, взять в количеств 18-100 г/л и экстрагировать кипящей водой в течение 2-3 часов при 1,0-1,5 атм, отделить водные экстракты от мицелия, а затем в каждый из полученных водных экстрактов ввести этанол в соотношении объемов 1:2-4, отделить каждый из образовавшихся осадков от жидкой фазы, высушить, смешать полученные осадки в соотношении 0,5-1,0:0,5-1,0:0,5-1,0 и использовать полученную смесь в качестве средства, обладающего противоопухолевой активностью.
Мицелий каждого базидиомицета, отделенный от погруженной культуры, рекомендуется высушить при температуре 30-90°С, измельчить до порошкообразного состояния, смешать в соотношении 0,5-1,0:0,5-1,0:0,5-1,0 и использовать в качестве средства, обладающего противоопухолевой активностью.
Смесь сухого измельченного мицелия базидиомицетов, взятого в количестве 18-100 г/л воды, можно экстрагировать кипящей водой в течение 2-3 часов при 1,0-1,5 атм, получая при этом водный экстракт, который можно использовать в качестве средства, обладающего противоопухолевой активностью.
Рекомендуется в полученный водный экстракт ввести этанол в соотношении объемов 1:2-4, отделить образовавшийся осадок, высушить его и использовать в качестве средства, обладающего противоопухолевой активностью.
Целесообразно после отделения мицелия каждого базидиомицета из погруженной культуры высушить при 30-90°С, измельчить до порошкообразного состояния, проэкстрагировать кипящей водой при соотношении 18-100 г/л в течение 2-3 часов при 1,0-1,5 атм, смешать два из полученных водных экстрактов любых базидиомицетов: Trametes versicolor и Hypsizygus ulmarius(1) или Trametes versicolor и Ganoderma lucidum (2), или Hypsizygus ulmarius и Ganoderma lucidum (3) в соотношении 0,5-1,0:0,5-1,0, в третий экстракт Ganoderma lucidum или Hypsizygus ulmarius, или Trametes versicolor добавить этанол в соотношении объемов 1:2-4, полученный осадок высушить, добавить его в смесь водных экстрактов (1), (2) или (3), соответственно в количестве 0,01-0,03% и использовать в качестве средства, обладающего противоопухолевой активностью.
Рекомендуется после отделения мицелия каждого базидиомицета высушить при 30-90°С, измельчить до порошкообразного состояния, проэкстрагировать кипящей водой при соотношении 18-100 г/л в течение 2-3 часов при 1,0-1,5 атм, в два из полученных водных экстрактов любых базидиомицетов: Trametes versicolor и Hypsizygus ulmarius(1) или Trametes versicolor и Ganoderma lucidum (2), или Hypsizygus ulmarius и Ganoderma lucidum (3) добавить этанол в каждый экстракт в соотношении объемов 1:2-4, полученные осадки высушить, смешать в соотношении 0,5-1,0:0,5-1,0, растворить смесь в третьем экстракте Ganoderma lucidum или Hypsizygus ulmarius, или Trametes versicolor в количестве 0,01-0,03% и использовать в качестве средства, обладающего противоопухолевой активностью.
Противоопухолевое средство, полученное вторым описанным вариантом, является самостоятельным объектом изобретения.
Как следует из вышесказанного, противоопухолевое средство может быть использовано как в сухом порошкообразном виде, так и в жидком. К полученному противоопухолевому средству могут быть добавлены различные фармацевтические добавки, такие как витамины, микроэлементы, антиоксиданты, совместимые противоопухолевые средства.
Противоопухолевое средство может быть изготовлено в виде таблеток, капсул, напитка и может быть использовано per os, в виде микроклизм.
Дозировка противоопухолевого средства зависит от заболевания, возраста пациента, его веса, состава средства. В пересчете на содержание водорастворимых полисахаридов предпочтительная дозировка для лабораторных животных может быть 1-3 мг полисахаридов на кг веса, для человека - 0,08-0,25 мг/кг.
Технический результат заключается в сокращении длительности процесса культивирования базидиомицета с 2-3 недель до одной и увеличении выхода мицелия за счет разработки состава производственной среды, условий культивирования, а также за счет подбора состава среды для получения посевного материала. Включение в состав производственной среды растительного масла позволило предотвратить пенообразование среды в процессе культивирования базидиомицета.
Кроме того, разработанная технология процесса выделения противоопухолевого средства позволила получить эффективное средство, которое ингибирует рост опухоли в опытах in vivo до 83%.
Изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами, которые не охватывают весь объем притязаний, но и не ограничивают его.
Пример 1. Приготовление посевного мицелия базидиомицета Ganoderma lucidum.
Агаровую стерильную среду готовили на основе отвара зерен пшеницы, в который добавляли кукурузный экстракт 10 мл/л и агар 20 г/л. Среду разливали в пробирки, стерилизовали и засевали кусочком мицелия базидиомицета Ganoderma lucidum штамм G1-3. Мицелий выращивали в течение 7 суток.
Была приготовлена жидкая питательная среда, содержавшая (г/л): глюкозу - 22, соевую муку - 10, дигидрофосфат калия - 2,0 г/л, сульфат магния - 0,3 г/л, воду - до 1 литра. Подготовленную среду выдерживали 10 часов при комнатной температуре, затем стерилизовали.
Приготовленную жидкую среду засевали предварительно выращенным на агаровой среде мицелием G. lucidum. Культивирование проводили при 30°С в течение 3 суток, получая в результате посевной мицелий.
Пример 2. Культивирование базидиомицета Ganoderma lucidum.
Была приготовлена стерильная производственная питательная среда, содержащая (г/л): подсолнечное масло - 12, соевую муку - 16, глюкозу - 9, дигидрофосфат калия - 2,2, сульфат магния - 0,3, воду - до 1 литра. Среду засевали посевным мицелием Ganoderma lucidum штамм G1-3, приготовленным способом, описанным в примере 1, культивировали в 750 мл колбах при температуре 32°С на ротационной качалке при 180 об/мин в течение 4 суток и получали погруженную культуру. Выход воздушно-сухой биомассы - 22 г/л.
Пример 3. Приготовление посевного мицелия базидиомицета Hypsizygus ulmarius.
Агаровую стерильную среду готовили на основе отвара зерен пшеницы, в который добавляли кукурузный экстракт 12 мл/л и агар 10 г/л. Среду разливали в пробирки, стерилизовали и засевали кусочком мицелия базидиомицета Hypsizygus ulmarius штамм Hu-2. Мицелий выращивали в течение 7 суток.
Была приготовлена жидкая питательная среда, содержавшая (г/л): глюкозу - 17, соевую муку - 8, дигидрофосфат калия - 2,5, сульфат магния - 0,2, воду - до 1 литра. Подготовленную среду выдерживали 8 часов при комнатной температуре, затем стерилизовали.
Приготовленную жидкую среду засевали предварительно выращенным на агаровой среде мицелием H.ulmarius. Культуру гриба выращивали при 24°С в течение 2 суток, получая в результате посевной мицелий.
Пример 4. Культивирование базидиомицета Hypsizygus ulmarius.
Была приготовлена стерильная производственная питательная среда, содержащая (г/л): соевое масло - 26, соевую муку - 26, дигидрофосфат калия - 2,5, сульфат магния - 0,25, воду - до 1 литра. Среду засевали посевным мицелием Hypsizygus ulmarius Hu-2, приготовленным способом, описанным в примере 3, культивировали в 750 мл колбах при температуре 28°С на ротационной качалке при 230 об/мин в течение 3 суток. Выход воздушно-сухой биомассы составил 39 г/л.
Пример 5. Приготовление посевного мицелия базидиомицета Trametes versicolor.
Агаровую стерильную среду готовили на основе отвара зерен пшеницы, в который добавляли кукурузный экстракт 15 мл/л и агар 15 г/л. Среду разливали в пробирки, стерилизовали и засевали кусочком мицелия базидиомицета Trametes versicolor штамм Tv-12. Мицелий выращивали в течение 7 суток.
Была приготовлена жидкая питательная среда, содержавшая (г/л): глюкозу - 20, соевую муку - 15, дигидрофосфат калия - 3,0, сульфат магния - 0,4, воду - до 1 литра. Подготовленную среду выдерживали 12 часов при комнатной температуре, затем стерилизовали.
Приготовленную жидкую среду засевали предварительно выращенным на плотной среде мицелием T.versicolor и культивировали при 26°С в течение 4 суток, получая в результате посевной мицелий.
Пример 6. Культивирование базидиомицетов Trametes versicolor.
Была приготовлена стерильная производственная питательная среда, содержащая (г/л): оливковое масло - 19, соевую муку - 21, дигидрофосфат калия - 2,5, сульфат магния - 0,25, воду - до 1 литра. Среду засевали посевным материалом Trametes versicolor Tv-12, приготовленным способом, описанным в примере 5, культивировали в 750 мл колбах при температуре 26°С на ротационной качалке при 200 об/мин в течение 3 суток. Выход воздушно-сухой биомассы 27 г/л.
Пример 7. Культивирование базидиомицета Hypsizygus ulmarius в биореакторе.
3
Культивирование проводили в биореакторе объемом 1 м, объем питательной среды 300 л. Производственная питательная среда содержала (г/л): смесь растительных масел (подсолнечное масло и соевое масло в соотношении 4:1) - 22, соевую муку - 26, дигидрофосфат калия - 2,0, сульфат магния - 0,2, воду - до 1 литра. Стерильную среду засевали посевным материалом Hypsizygus ulmarius Hu-2, приготовленным по способу, описанному в примере 2. Штамм выращивали в биореакторе в течение 3 суток при температуре 28°С, вращении лопастной мешалки 200 об/мин, подаче воздуха 1,5 объема на 1 объем среды в минуту. Выход воздушно-сухой биомассы был 35 г/л.
Пример 8. Получение средства, обладающего противоопухолевой активностью.
Каждую погруженную культуру, полученную по примерам 2, 4, 6, 7, фильтровали, отделяли мицелий. Мицелий каждой полученной культуры сушили при температуре 40°С, измельчали до порошкообразного состояния и использовали в качестве противоопухолевого средства. Полученные результаты представлены в таблице.
Пример 9. Получение средства, обладающего противоопухолевой активностью.
Каждую погруженную культуру, полученную по примерам 2, 4, 6, 7, фильтровали, отделяли мицелий. Мицелий каждой полученной культуры сушили при температуре 30°С, измельчали до порошкообразного состояния. Сухой порошок каждого базидиального гриба заливали дистиллированной водой из расчета 30 г/л, автоклавировали при 1,2 атм в течение 2 часов, фильтровали и получали водные экстракты каждого базидиомицета, которые использовали в качестве противоопухолевого средства. Полученные результаты представлены в таблице.
Пример 10. Получение средства, обладающего противоопухолевой активностью.
Каждую погруженную культуру, полученную по примерам 2, 4, 6, фильтровали, отделяли мицелий. Мицелий каждой полученной культуры сушили при температуре 50°С, измельчали до порошкообразного состояния. Сухой порошок каждого базидиального гриба заливали дистиллированной водой, при этом порошок брали в количестве 40 г/л, экстрагировали водой в течение 3 часов при 1,5 атм, фильтровали, получали водные экстракты. В каждый полученный водный экстракт мицелия Ganoderma lucidum, Trametes versicolor, Hypsizygus ulmarius вводили этанол в соотношении 4 объема этанола на 1 объем водного экстракта. Образовавшиеся осадки, представляющие собой полисахаридные фракции, отделяли центрифугированием и лиофилизировали, получая, таким образом, противоопухолевые средства. Противоопухолевые свойства средств изучали по отдельности. Полученные результаты представлены в таблице.
Пример 11. Получение средства, обладающего противоопухолевой активностью.
Каждую погруженную культуру, полученную по примерам 2, 4, 6, автоклавировали при 1,5 атм 3 часа, из каждой отделяли жидкую фазу фильтрованием и получали противоопухолевое средство в виде жидкого экстракта. Часть каждого жидкого экстракта высушивали на распылительной сушке, получая противоопухолевые средства в виде порошка. Эффективность полученных в жидком и сухом виде противоопухолевых средств представлена в таблице.
Пример 12. Получение средства, обладающего противоопухолевой активностью.
Каждую погруженную культуру, полученную по примерам 2, 4, 6, фильтровали, отделяли мицелий. Мицелий Ganoderma lucidum, Trametes versicolor, Hypsizygus ulmarius сушили при температуре 90°С, измельчали до порошкообразного состояния, смешивали в соотношении 0,50:0,75:1,00 и использовали в качестве противоопухолевого средства. Полученные результаты представлены в таблице.
Пример 13. Получение средства, обладающего противоопухолевой активностью.
Каждую погруженную культуру, полученную по примерам 2, 4, 6, фильтровали, отделяли мицелий. Мицелий Ganoderma lucidum, Trametes versicolor, Hypsizygus ulmarius сушили при температуре 30°С, измельчали до порошкообразного состояния, смешивали в соотношении 1:1:1. Полученную смесь сухого мицелия заливали дистиллированной водой, при этом мицелий брали в количестве 50 г/л, экстрагировали кипящей водой при 1,2 атм в течение 2 часов, фильтровали, получали водный экстракт, который использовали в качестве противоопухолевого средства. Полученные результаты представлены в таблице.
Пример 14. Получение средства, обладающего противоопухолевой активностью.
Каждую погруженную культуру, полученную по примерам 2, 4, 6, фильтровали, отделяли мицелий. Мицелий Ganoderma lucidum, Trametes versicolor, Hypsizygus ulmarius сушили при температуре 40°С, измельчали до порошкообразного состояния, смешивали в соотношении 0,75:0,75:1,00. Полученную смесь сухого мицелия заливали дистиллированной водой, при этом мицелий брали в количестве 40 г/л, экстрагировали кипящей водой при 1,3 атм в течение 2 часов, фильтровали, получали водный экстракт. В полученный водный экстракт добавляли этанол из расчета 1:2. Полученный осадок - полисахаридную фракцию отделяли центрифугированием, лиофилизировали и использовали в качестве противоопухолевого средства. Полученные результаты представлены в таблице.
Пример 15. Получение средства, обладающего противоопухолевой активностью.
Каждую погруженную культуру, полученную по примерам 2, 4, 6, фильтровали, отделяли мицелий. Мицелий каждой полученной культуры сушили при температуре 40°С, измельчали до порошкообразного состояния. Сухой порошок каждого базидиального гриба заливали дистиллированной водой из расчета 100 г/л, экстрагировали кипящей водой при 1,0 атм в течение 3 часов, фильтровали, получали водные экстракты. Полученные водные экстракты мицелия Ganoderma lucidum, Trametes versicolor, Hypsizygus ulmarius смешивали в соотношении 1:1:1 и использовали в качестве противоопухолевого средства. Полученные результаты представлены в таблице.
Пример 16. Получение средства, обладающего противоопухолевой активностью.
Каждую погруженную культуру, полученную по примерам 2, 4, 6, фильтровали, отделяли мицелий. Мицелий каждой полученной культуры сушили при температуре 30°С, измельчали до порошкообразного состояния. Сухой порошок каждого базидиального гриба заливали дистиллированной водой из расчета 100 г/л, экстрагировали кипящей водой при 1,0 атм в течение 3 часов, фильтровали, получали водные экстракты. В каждый из полученых водных экстрактов мицелия добавляли этанол в соотношении 1:4. Полученные осадки - полисахаридные фракции Ganoderma lucidum, Trametes versicolor, Hypsizygus ulmarius отделяли центрифугированием, лиофилизировали и смешивали в соотношении 1,0:0,5:1,0 и использовали в качестве противоопухолевого средства. Полученные результаты представлены в таблице.
Пример 17. Получение средства, обладающего противоопухолевой активностью.
Каждую погруженную культуру, полученную по примерам 2, 4, 6, автоклавировали при 1,5 атм 3 часа, фильтровали и отделяли жидкую фазу. Полученные таким образом из погруженной культуры Ganoderma lucidum, Trametes versicolor, Hypsizygus ulmarius жидкие фазы смешивали в соотношении 1:1:1 и получали противоопухолевое средство в жидком виде. Часть жидкого экстракта высушивали на распылительной сушилке, получая противоопухолевое средство в виде порошка. Эффективность противоопухолевого средства в жидком и сухом виде представлена в таблице.
Пример 18. Получение средства, обладающего противоопухолевой активностью.
Каждую погруженную культуру, полученную по примерам 2, 4, 6, высушивали на сублимационной сушилке при профильном изменении температуры, включая многократное снижение температуры до минус 30°С. Получали противоопухолевые средства в виде сухого порошка. Противоопухолевые свойства средств изучали по отдельности. Полученные результаты представлены в таблице.
Пример 19. Получение средства, обладающее противоопухолевой активностью.
Сухие порошки сублимационно высушенной погруженной культуры базидиомицетов, полученные по примеру 18, объединяли в соотношении 1:1:1 и изучали противоопухолевые свойства композиционного средства. Полученные результаты представлены в таблице.
Пример 20. Получение средства, обладающего противоопухолевой активностью.
Каждую погруженную культуру, полученную по примерам 2, 4, 6, фильтровали, отделяли мицелий. Мицелий каждой полученной культуры сушили при температуре 45°С, измельчали до порошкообразного состояния. Сухой порошок каждого базидиального гриба заливали дистиллированной водой из расчета 45 г/л, экстрагировали кипящей водой при 1,5 атм в течение 2 часов, фильтровали, получали водные экстракты. Водные экстракты Trametes versicolor и Hypsizygus ulmarius смешивали в соотношении 0,75:1,00. В водный экстракт мицелия Ganoderma lucidum добавляли этанол в соотношении 1:4. Полученный осадок Ganoderma lucidum, представляющий собой полисахаридную фракцию, отделяли центрифугированием, лиофилизировали и добавляли в количестве 0,02% в смесь экстрактов Trametes versicolor и Hypsizygus ulmarius, получая противоопухолевое средство. Эффективность противоопухолевого средства представлена в таблице.
Пример 21. Получение средства, обладающего противоопухолевой активностью.
Каждую погруженную культуру, полученную по примерам 2, 4, 6, фильтровали, отделяли мицелий. Мицелий каждой полученной культуры сушили при температуре 37°С, измельчали до порошкообразного состояния. Сухой порошок каждого базидиального гриба заливали дистиллированной водой из расчета 18 г/л, экстрагировали кипящей водой при 1,2 атм в течение 3 часов, фильтровали, получали водные экстракты Ganoderma lucidum, Trametes versicolor, Hypsizygus ulmarius. В экстракты Ganoderma lucidum и Trametes versicolor добавляли этанол в соотношении 1:2. Полученные осадки Ganoderma lucidum, Trametes versicolor, представляющие собой полисахаридные фракции, отделяли центрифугированием, лиофилизировали, смешивали в соотношении 1:0,5, добавляли полученную смесь в водный экстракт Hypsizygus ulmarius в количестве 0,01% и использовали в качестве противоопухолевого средства. Полученные результаты представлены в таблице.
Пример 22. Оценка противоопухолевой активности средств, полученных по примерам 8-21.
1
1
к
о
к
к
о
6
Полученные средства испытывали в опытах in vivo на взрослых самцах мышей-гибридов (С57В1/6×DBA/2)F (далее B6D2F) с перевиваемой солидной Т-клеточной лимфомой Р388. Мышей получали из питомника РАМН «Крюково». После поступления мышей выдерживали в карантине 21 день. Лимфому поддерживали в сингенных условиях в асцитной форме серийными внутрибрюшинными пассажами на мышах линии DBA/2. В опыте опухоль прививали под кожу правого бока по 10 клеток в день «0». Лечение начинали через 48 часов после прививки опухоли. Полученные средства вводили перорально с помощью внутригастрального зонда ежедневно 1 раз в сутки в течение 10 суток. Сухую измельченную биомассу грибов и сублимированные погруженные культуры грибов испытывали в дозе 50 мг/кг/сут, препараты готовили, добавляя измельченный грибной материал в крахмальный клейстер таким образом, чтобы суточная доза для каждого животного содержалась в 0,3 мл клейстера. Полисахаридные фракции применяли в дозе 2 мг/кг/сут в виде водных растворов, суточная доза раствора составляла 0,3 мл/мышь. Доза водных экстрактов мицелия Ganoderma lucidum, Trametes versicolor и Hypsizygus ulmarius составляла 0,25-0,3 мл/кг/сут, содержание сухих веществ в водных экстрактах варьировало в диапазоне 14-18 мг/мл. Высушенные с помощью распылительной сушки водные экстракты мицелия грибов испытывали в дозе 4,8 мг/кг/сут, навески сухих экстрактов растворяли в воде, объем вводимого раствора составлял 0,3 мл/мышь. Количество мышей в контрольных и экспериментальных группах составляло 10 и 8 животных соответственно. В течение опытов следили за общим состоянием мышей, изменением массы тела, прививаемостью опухоли, динамикой роста опухоли. Массу опухоли рассчитывали по формуле М (мг)=(а×b×с)/2, где М - расчетная масса опухоли, а, b, с - 3 наибольших взаимоперпендикулярных диаметра опухолевого узла в мм. Торможение роста опухоли (ТРО) рассчитывали по формуле: ТРО (%)=(М-М)/(М)×100, где М и М - средняя расчетная масса опухоли в контроле и опыте соответственно. Расчет проводили по показателям, полученным на 14 сутки опыта. Достоверность различий средних значений массы опухоли определяли по t-критерию Стъюдента. За достоверные принимали различия при Р≤0,05. Результаты представлены в таблице. В таблице представлено противоопухолевое действие средств, полученных из погруженной культуры грибов.
Таблица
Пример
Препарат
ТРО, %
8
Сухой мицелий Ganoderma lucidum (культивирование в колбах)
51
Сухой мицелий Trametes versicolor (культивирование в колбах)
65
Сухой мицелий Hypsizygus ulmarius (культивирование в колбах)
55
Сухой мицелий Hypsizygus ulmarius (культивирование в биореакторе)
63
9
Водный экстракт мицелия Ganoderma lucidum
57
Водный экстракт мицелия Trametes versicolor
56
Водный экстракт мицелия Hypsizygus ulmarius
80
Водный экстракт мицелия Hypsizygus ulmarius, выращенного в биореакторе
77
10
Полисахаридная фракция мицелия Ganoderma lucidum
71
Полисахаридная фракция мицелия Trametes versicolor
74
Полисахаридная фракция мицелия Hypsizygus ulmarius
72
11
Жидкий экстракт, полученный из погруженной культуры Ganoderma lucidum
65
Жидкий экстракт, полученный из погруженной культуры Trametes versicolor
56
Жидкий экстракт, полученный из погруженной культуры Hypsizygus ulmarius
66
Сухой экстракт, полученный из погруженной культуры Ganoderma lucidum
62
Сухой экстракт, полученный из погруженной культуры Trametes versicolor
60
Сухой экстракт, полученный из погруженной культуры Hypsizygus ulmarius
67
12
Смесь сухих мицелиев Ganoderma lucidum, Trametes versicolor и Hypsizygus ulmarius
60
13
Водный экстракт смеси мицелиев Ganoderma lucidum, Trametes versicolor, Hypsizygus ulmarius
73
14
Полисахаридная фракция смеси мицелиев Ganoderma lucidum, Trametes versicolor, Hypsizygus ulmarius, 2 мг/кг/сут
79
15
Смесь водных экстрактов мицелия Ganoderma lucidum, Trametes versicolor и Hypsizygus ulmarius
68
16
Смесь полисахаридных фракций мицелия Ganoderma lucidum, Trametes versicolor и Hypsizygus ulmarius
83
17
Жидкая смесь экстрактов, полученных из погруженных культур Ganoderma lucidum, Trametes versicolor и Hypsizygus ulmarius
68
Высушенная смесь экстрактов, полученных из погруженных культур Ganoderma lucidum, Trametes versicolor и Hypsizygus ulmarius
64
18
Сублимированная погруженная культура Ganoderma lucidum
50
Сублимированная погруженная культура Trametes versicolor
67
Сублимированная погруженная культура Hypsizygus ulmarius
43
19
Смесь сублимированных погруженных культур Ganoderma lucidum, Trametes versicolor, Hypsizygus ulmarius
77
20
Смесь водных экстрактов мицелия Trametes versicolor и Hypsizygus ulmarius и полисахаридной фракции мицелия Ganoderma lucidum
79
21
Смесь полисахаридных фракций мицелия Ganoderma lucidum и Trametes versicolor и водного экстракта мицелия Hypsizygus ulmarius
75
Из представленных материалов следует, что сокращается длительность приготовления посевного мицелия с двух недель до 9-10 суток, сокращается длительность процесса культивирования до 2-4 суток с одновременным повышением выхода мицелия и эффективности полученного средства, обладающего противоопухолевой активностью.