Способ получения нетоксичных гелей на основе модифицированной карбоксиметилцеллюлозы и применение их в медицине
METHOD FOR OBTAINING NON-TOXIC GELS BASED ON MODIFIED CARBOXYMETHYLCELLULOSE AND THEIR USE IN MEDICINE

Область техники
Настоящее изобретение относится к области фармации, клинической или экспериментальной медицины, или ветеринарии, а именно к способу получения нетоксичного геля на основе карбоксиметилцеллюлозы путем модифицирования карбоксиметилцеллюлозы или её фармацевтически приемлемой соли сшивающими агентами из группы замещенных эпоксидных соединений и аминокислотами и использования его в различных сферах медицины, в том числе в качестве антиадгезионного средства и имплантатов.
Уровень техники
Карбоксиметилцеллюлоза представляет собой биополимер, состоящий из связанных гликозидными связями по положениям β-(1→4) мономеров β-глюкозы, в которых некоторые гидроксильные группы замещены на карбоксильные группы (фиг. 1). Натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы широко используется в фармацевтической, пищевой и косметической промышленности в качестве загустителя, регулятора вязкости, пластификатора, наполнителя, а также при изготовлении имплантируемых медицинских изделий [1].
Широкое применение карбоксиметилцеллюлозы обусловлено ее свойствами: являясь биополимером, карбоксиметилцеллюлоза обладает такими качествами, как биосовместимость, неиммуногенность, гипоаллергенность и биодоступность; в то же время, благодаря наличию большого количества гидроксильных и карбоксильных групп, между полимерными цепями карбоксиметилцеллюлозы образуются различные химические и физические взаимодействия (водородные связи, ионные связи, электростатическое связи, силы Ван-дер-Ваальса), что и обусловливает формирование гелеобразной структуры, напрямую зависящую от концентрации карбоксиметилцеллюлозы, длины полимерных цепей, степени замещения и наличию ионов металлов [2]. Таким образом, возможно создание широкого спектра продуктов с заданной вязкостью и густотой, что и обусловливает удобство в использовании биополимеров на основе карбоксиметилцеллюлозы.
Отдельное преимущество данного биополимера обусловлено процессом производства карбоксиметилцеллюлозы: ее получают синтетически из растительного сырья, что, таким образом, обеспечивает практически полное отсутствие бактериальных эндотоксинов, остаточного белка и обеспечивает низкую бионагрузку, что особенно важно для имплантируемых медицинских изделий [3].
Среди прочих применений в медицине, особо широкое применение карбоксиметилцеллюлозы проявляется при изготовлении противоспаечных рассасывающихся гелей и антиадгезионных средств [4,5], интрадермальных филлеров, а также имплантатов [3], что, таким образом, подчеркивает клиническую безопасность данного биополимера.
Спаечный процесс после операций, в особенности на органах брюшной полости, является актуальной медицинской задачей, что связано с большой частотой его развития - 67-93% [8]. Наиболее современным и эффективным средством борьбы со спайкообразованием является интраоперационная профилактика, которая заключается во введении временных искусственных «барьеров», а именно гелей на основе карбоксиметилцеллюлозы (например, «Oxiplex»). Преимуществом использования карбоксиметилцеллюлозы при изготовлении противоспаечного геля является тот факт, что данные медицинские изделия показывают лучшие результаты по противоспаечной активности среди полимеров [5].
Среди дермальных филлеров, применяемых в качестве имплантатов, широкое применение получили филлеры на основе коллагена и гиалуроновой кислоты, в том числе химически модифицированные. Однако их существенными недостатками является наличие в составе исходного сырья с повышенным содержанием бактериальных эндотоксинов и остаточного белка, наличие которых обусловлено с их животным/микробиологическим происхождением, что, как считается, является одним из основных факторов возникновения аллергических и воспалительных реакций [6]. Именно поэтому карбоксиметилцеллюлоза является перспективным веществом для создания имплантатов или филлеров, что подтверждается их клиническим применением [3].
Также стоит отметить, что гиалуроновая кислота является более гигроскопичным веществом, чем карбоксиметилцеллюлоза. Вследствие этого, при использовании гиалуроновой кислоты в качестве филлера происходит возникновение отека, связанного с поглощением значительного количества молекул воды. Этого недостатка лишены филлеры на основе карбоксиметилцеллюлозы, что подтверждается клиническими испытаниями [3].
Однако в зависимости от медицинского назначения и терапевтических целей требуется регулирование степени биодеградации имплантируемых биополимеров. Для того, чтобы регулировать степень биодеградации карбоксиметилцеллюлозы в тканях организма, зачастую используют химические методы модификации, а именно использование сшивающих агентов, которые образуют ковалентные связи между полимерными цепями карбоксиметилцеллюлозы. Такая модификация существенно уменьшает скорость биодеградации, так как сшитые производные биополимера менее склонны к гидролизному распаду, в то же время повышая механические свойства материала, что увеличивает продолжительность полезного эффекта от их применения.
Из уровня техники известно использование модифицирующих сшивающих агентов, на основе замещенных эпоксидных соединений (включающих 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир; полиэтиленгликольдиглицидиловый эфир, полипропиленгликольдиглицидиловый эфир) (фиг. 2-4). Данная группа модифицирующих сшивающих агентов широко применяется при производстве интрадермальных филлеров и имплантатов на основе гиалуроновой кислоты; в частности, на протяжении 15 лет клинического использования 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира была подтверждена клиническая безопасность при соблюдении остаточного содержания менее 0,0001% [6]. Помимо этого, вследствие большого количества веществ из группы замещенных эпоксидов, их использование вследствие разной молекулярной массы, структуры и реакционной способности позволяет создавать продукты с различной степенью биодеградации, что важно для различных сфер применения.
Использование полиэтиленгликольдиглицидилового эфира в качестве сшивающего агента для карбоксиметилцеллюлозы с целью использования в медицинских изделиях описано в патенте [2]. Также на данный момент на коммерческом рынке присутствует интрадермальный имплантат на основе модифицированной карбоксиметилцеллюлозы путем реакции с 1,4-бутандиолдиглицидиловым эфиром [3].
В патенте [10] описана возможность использования модифицирующего сшивающего агента на основе замещенных эпоксидных соединений с использованием полипропиленгликольдиглицидилового эфира.
Однако представленных выше технические решения характеризуются ограничением, связанным с очисткой и дезактивацией модифицированного геля от остатков сшивающих агентов. После проведения химической модификации сшивающими агентами в полученном геле содержатся остатки непрореагировавшего модифицирующего сшивающего агента, и, что особенно важно, остатки сшивающих агентов, которые прореагировали только по одной эпоксидной группе с молекулой карбоксиметилцеллюлозы. В таком случае может происходить реакции изомеризации оставшейся эпоксидной группы с образованием альдегидной группы, которая обладает высокой токсичностью. Именно поэтому важно отметить, что в результате использования модифицирующих сшивающих агентов требуется очистка от остаточного свободного количества сшивающих агентов и дезактивации свободных эпоксидных групп частично прореагировавших сшивающих агентов, что в приведенных технических решениях не используется. Именно поэтому при использовании таких технических решений по их способам применения существует вероятность возникновения осложнений, связанная с повышенной токсичностью.
Раскрытие сущности изобретения
Задачей настоящего изобретения является разработка нового эффективного способа получения геля модифицированной карбоксиметилцеллюлозы.
Техническим результатом настоящего изобретения является разработка нового эффективного способа получения геля путем модификации карбоксиметилцеллюлозы или её фармацевтически приемлемой соли, который обладают низкой токсичностью; указанный способ по изобретению хорошо масштабируем и позволяют получить низкотоксичные и биосовместимые гели с высокой степенью чистоты. Гель, полученный способом по изобретению, может найти широкое применение в медицине, в том числе хирургии и эстетической медицине, в частности для использования в качестве наполнителя для медицинских имплантатов, вещества-носителя, лубриканта и/или антиадгезионного барьера, противоспаечного геля или интрадермального филлера.
Указанный технический результат достигается за счет осуществления способа получения геля на основе модифицированной карбоскиметилцеллюлозы или её фармацевтически приемлемой соли, включающий следующие стадии:
а) создание ковалентных связей между молекулами карбокcиметилцеллюлозы или её фармацевтически приемлемой соли посредством осуществления в растворе взаимодействия карбоксиметилцеллюлозы или её фармацевтически приемлемой соли с сшивающим агентом, представляющим собой замещенный оксиран;
б) нейтрализация свободных эпоксидных групп в модифицированной карбокcиметилцеллюлозе или её фармацевтически приемлемой соли, полученной на стадии а), и нейтрализация остатков сшивающего агента посредством добавления аминокислоты или комбинации, по меньшей мере, двух аминокислот в реакционную смесь, полученную на стадии а);
в) удаление остатков аминокислоты и/или сшивающего агента посредством осуществления диализа полученного после проведения стадии б) геля в натрий-фосфатном физиологическом буферном растворе или воде для инъекций.
В частных вариантах воплощения изобретения в качестве замещенного оксирана используется 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир с молекулярной массой 202,25 Да; полиэтиленгликольдиглицидиловый эфир с молекулярной массой 500 Да; или полипропиленгликольдиглицидиловый эфир с молекулярной массой 380 Да или 640 Да.
В частных вариантах воплощения изобретения молекулярная масса карбоксиметилцеллюлозы или её фармацевтически приемлемой соли на стадии а) составляет от 50 000 Да до 1 000 000 Да.
В частных вариантах воплощения изобретения степень замещения карбоксиметилцеллюлозы или её фармацевтически приемлемой соли на стадии а) составляет 50-150.
В частных вариантах воплощения изобретения фармацевтически приемлемая соль представляет собой натриевую соль.
В частных вариантах воплощения изобретения стадию а) осуществляют в основной среде при значении водородного показателя pH в диапазоне от 8 до 14 единиц и при температуре в диапазоне от +4 °С до +60 °С.
В частных вариантах воплощения изобретения стадию б) осуществляют в основной среде при значении водородного показателя pH в диапазоне от 8 до 14 единиц и при температуре в диапазоне от +4 °С до +60 °С.
В частных вариантах воплощения изобретения стадию а) осуществляют в течение от 1 часа до 48 часов.
В частных вариантах воплощения изобретения стадию б) осуществляют в течение от 1 часа до 24 часов.
В частных вариантах воплощения изобретения аминокислота выбирается независимо и представляет собой глицин, аланин, валин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, серин, треонин, цистеин, аспарагин, глутамин, тирозин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, лизин, аргинин, гистидин и/или таурин.
В частных вариантах воплощения изобретения после проведения стадии б) реакционную смесь нейтрализуют до значения водородного показателя pH 6,0-8,5 с использованием неорганической или органической кислоты.
В частных вариантах воплощения изобретения неорганическая или органическая кислота выбирается независимо и представляет собой хлороводородную кислоту, уксусную кислоту, лимонную кислоту или молочную кислоту.
В частных вариантах воплощения изобретения диализ на стадии в) осуществляется с использованием целлюлозной мембраны с пределом отсечения 12000 Да.
В частных вариантах воплощения изобретения массовая концентрация карбоксиметилцеллюлозы или её фармацевтически приемлемой соли в растворе на стадии а) составляет от 2 до 12 массовых %.
В частных вариантах воплощения изобретения массовая концентрация сшивающего агента в растворе на стадии а) составляет от 0,1 до 10 массовых %.
В частных вариантах воплощения изобретения массовая концентрация аминокислоты или комбинации, по меньшей мере, двух аминокислот на стадии б) составляет от 0,2% до 14 массовых %.
В частных вариантах воплощения изобретения полученный после диализа гель доводят водой для инъекций или натрий-фосфатным физиологическим буферным раствором до требуемой для медицинского применения концентрации модифицированной карбоксиметилцеллюлозы, но не более чем в 2 раза, так как степень набухания модифицированного геля ограничена и при большем разбавлении будет наблюдаться расслоение геля.
Предметом настоящего изобретения также является гель на основе модифицированной карбоксиметилцеллюлозы или её фармацевтически приемлемой соли для использования в качестве наполнителя для медицинских имплантатов, вещества-носителя, лубриканта и/или антиадгезионного барьера, противоспаечного геля или интрадермального филлера, полученный способом по изобретению.
В частных вариантах воплощения изобретения гель дополнительно включает по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. Более конкретно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество выбирается из растворителя, буфера, консерванта, антиоксиданта или изотонического агента.
В частных вариантах воплощения изобретения растворитель представляет собой воду для инъекций.
В частных вариантах воплощения изобретения буфер представляет собой натрий-фосфатном физиологический буфер.
В частных вариантах воплощения изобретения массовая концентрация модифицированной карбоксиметилцеллюлозы или её фармацевтически приемлемой соли составляет не менее 1 масс. % и не более 12 массовых. %.
Подробное раскрытие настоящего изобретения
Краткое описание чертежей
Фигура 1. Структурная формула молекулы натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы.
2
Фигура 2. Химическая схема реакции сшивания натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы посредством использования модифицирующего сшивающего агента 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира; R = H, CHCOONa.
2
Фигура 3. Химическая схема реакции сшивания натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы посредством использования модифицирующего сшивающего агента полиэтиленгликольдиглицидилового эфира; R = H, CHCOONa.
2
Фигура 4. Химическая схема реакции сшивания натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы посредством использования модифицирующего сшивающего агента полипропиленгликольдиглицидилового эфира; R = H, CHCOONa.
Фигура 5. Химическая схема реакции нейтрализации аминокислотой остатков свободных эпоксидных групп в модифицированной сшивающим агентом карбоксиметилцеллюлозе на примере взаимодействия с глицином и полипропиленгликольдиглицидиловым эфиром в качестве модифицирующего сшивающего агента.
Фигура 6. Химическая схема реакции замещенного оксирана на примере полипропиленгликольдиглицидилового эфира с аминокислотой на примере глицина.
Фигура 7. Подкожное введение геля по изобретению мышам линии BALB/c. Фотографии места введения на 16 и 35 дни после введения двум мышам в группе (верхняя и нижняя панели). Препарат 1 – гель, полученный по Примеру 1; Препарат 2 – гель, полученный по Примеру 2; Препарат 3 – гель, полученный по Примеру 3.
Фигура 8. Введение геля по изобретению мышам линии BALB/c в паховую область. Препарат 1 – гель, полученный по Примеру 1; Препарат 2 – гель, полученный по Примеру 2; Препарат 3 – гель, полученный по Примеру 3.
exp
cont
Фигура 9. Анализ пролиферации клеток MiaPaCa-2 в присутствии геля на основе модифицированной карбоксиметилцеллюлозы. Данные приведены в виде индекса цитотоксичности (II), определенного по формуле II=1-OD/OD. Образец 1 – гель, полученный по Примеру 1; Образец 2 – гель, полученный по Примеру 2; Образец 3 – гель, полученный по Примеру 3; Образец 4 – гель сравнения, полученный по Примеру 13 (без использования аминокислот, без диализа); Образец 5 – гель сравнения, полученный по Примеру 12 (без использования аминокислот, с диализом).
Определения и термины
Для лучшего понимания изобретения ниже приведены термины, использованные в настоящем описании изобретения.
Термины «включает» и «включающий» означают в описании данного изобретения «включает, помимо всего прочего», то есть указанные термины не истолковываются как «состоит только из».
Термины «сшитый», «сшивка» означает ковалентное связывание молекул карбоксиметилцеллюлозы или её фармацевтически приемлемой соли с использованием сшивающих агентов.
Термин «сшивающий агент» означает химический агент, модифицирующий агент, который используется при ковалентном химическом связывании молекул карбоксиметилцеллюлозы или её фармацевтически приемлемой соли.
Термин «Дальтон» или «Да» означает внесисистемную единицу измерения молекулярной массы, рекомендованную к применению ИЮПАК, эквивалентную молярной массе вещества, выраженной в граммах на моль.
Термин «степень замещения» означает число гидроксильных групп (-ОН), замещенных карбоксиметильными группами в цепи, состоящей из 100 звеньев остатков глюкозы (CH2COONa). При полном замещении всех гидроксильных групп степень замещения равна 300, при отсутствии карбоксиметильных групп (то есть в исходной целлюлозе) равна 0.
-6
-3
-6
-3
Термин «гарантированный уровень стерильности» или «sterility assurance level» или «SAL» означает вероятность выживания микроорганизма на оборудовании после стерилизации. Термин «SAL» является количественной величиной, обычно в пределах от 10 до 10. Процесс стерилизации с уровнем 10 более эффективен, чем процесс стерилизации с уровнем 10.
2
6
7
2
3-x
2
x
n
Карбоксиметилцеллюлоза – полимер, производное целлюлозы, в котором карбоксилметильная группа (–CH–COOH) соединяется гидроксильными группами глюкопиранозных мономеров; общая формула - [СНО(ОН)(ОСНСООН)], где х = 0,02–1,5).
6
7
2
3-x
2
x
n
Карбоксиметилцеллюзы натриевая соль, или натрий карбоксиметилцеллюлозы - анионная форма карбоксиметилцеллюлозы; общая формула - [СНО(ОН)(OCHCOONa)], где x = 0,02-1,50.
Используемый здесь термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к таким солям, которые, в рамках проведенного медицинского заключения, пригодны для использования в контакте с тканями человека и животных без излишней токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.д., и отвечают разумному соотношению пользы и риска, к примеру натриевая, калиевая, магниевая соли карбоксиметилцеллюзы.
Замещенный эпоксид, или замещенный оксиран, или эпоксидное соединение – группа химических веществ, относящихся к сшивающим агентам, имеющая в своем составе функциональную группу в виде насыщенного трехчленного гетероцикла, циклического эфира, в котором к двум соседним атомам углерода присоединяется атом кислорода. В частных вариантах воплощения изобретения замещенный оксиран представляет собой 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир, полиэтиленгликольдиглицидиловый эфир или полипропиленгликольдиглицидиловый эфир.
10
18
4
1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир или 1,4-бис(2,3-эпоксипропилокси)бутан – сшивающий агент, замещенный эпоксид, с брутто-формулой CHO.
3
5
2
2
4
n
3
5
Полиэтиленгликольдиглицидиловый эфир – сшивающий агент, замещенный эпоксид, с общей формулой CHO-(CHO)-CHO.
3
5
2
2
3
3
n
3
5
Полипропиленгликольдиглицидиловый эфир – сшивающий агент, замещенный эпоксид, с общей формулой CHO-(CH(CH)O)-CHO, в частности, средняя молекулярная масса которого может быть 380 Да и 640 Да.
Под термином «аминокислота» в настоящем документе понимается органическое соединение, в молекуле которого одновременно содержатся карбоксильные и аминные группы, в частных вариантов аминокислоты выбираются из 20 стандартных (протеиногенных) α-аминокислот (включая D-, L-формы или рацематы), в частности, аминокислота выбирается независимо и представляет собой глицин, аланин, валин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, серин, треонин, цистеин, аспарагин, глутамин, тирозин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, лизин, аргинин и/или гистидин (за исключением пролина). Помимо этого, под термином аминокислота в настоящем документе понимают серосодержащую аминокислоту, в которой отсутствует карбоксильная группа, в частности, таурин.
2
4
2
4
В настоящем документе под термином «натрий-фосфатный физиологический буферный раствор» понимается буферный раствор приготовленный по следующей рецептуре (из расчета на 1 литр итогового раствора): в воду для инъекций объемом 800 мл добавляются следующие компоненты: NaCl массой 8 г, KCl массой 0,2 г, NaHPO массой 1,44 г и KHPO массой 0,24 г, и перемешиваются до полного растворения всех компонентов. После этого объем полученного раствора доводится водой для инъекций до 1 л.
Осуществление изобретения
Способ получения нетоксичного геля на основе карбоксиметилцеллюлозы или её фармацевтически приемлемой соли, модифицированной химически путем реакции со сшивающими агентами на основе замещенных эпоксидов и аминокислоты, согласно изобретению, заключается в создании ковалентных эфирных связей между молекулами карбоксиметилцеллюлозы или её фармацевтически приемлемой соли в результате введения сшивающих агентов в виде замещенных эпоксидов и далее путем ковалентного связывания остатков свободных эпоксидных групп в составе сшитой карбоксиметилцеллюлозы с аминокислотой, после чего полученный гель проходит стадию дезактивации и удаления остаточного количества сшивающего агента за счет реакции с аминокислотой и диализного процесса.
Аминокислоты являются нуклеофильными агентами за счет наличия в их структуре аминогруппы, в результате чего они присоединяются к свободным эпоксидным группам модифицированной композиции, таким образом блокируя их дальнейшую изомеризацию; использование аминокислот в качестве нуклеофильных агентов, в частности, обусловлено их биологической совместимостью, вследствие чего они не проявляют токсичности; выбор конкретной аминокислоты для воплощения изобретения обусловливается методом стерилизации изделия, медицинским применением и экономической себестоимостью.
На всем протяжении технологического процесса производства модифицируемый гель доводится до требуемых показателей по параметрам ионной силы раствора, осмоляльности, водородного показателя pH. Так, после стадии сшивки в основной среде и присоединения аминокислоты к свободным эпоксидным группам идет стадия нейтрализации раствором кислоты; стадия диализа в физиологическом натрий-фосфатном физиологическом буфере или воде для инъекций помимо очистки способствует достижению данных показателей осмоляльности до физиологических значений либо тех значений, которые необходимы для конкретного медицинского применения.
Основным сырьем для получения геля по изобретению является карбоксиметилцеллюлоза или её фармацевтически приемлемая соль, в частности натриевая, калиевая или магниевая, которая, согласно данному изобретению, может использоваться в диапазоне массовых концентраций от 2 % до 12 % в исходном растворе, так как при более низкой концентрации расстояние между молекулами слишком велико и не происходит сшивания молекул; при более высоких концентрациях растворимость карбоксиметилцеллюлозы или её фармацевтически приемлемой соли затруднена; степень замещения может быть в диапазоне от 50 до 150, так как при значениях меньше 50 карбоксиметилцеллюлоза или её фармацевтически приемлемая соль не растворяется в нейтральной среде, что снижает степень набухания полимера после стадии сшивки, а при значениях выше 150 карбоксиметилцеллюлоза или её фармацевтически приемлемая соль имеет слишком малое количество гидроксильных групп, которые участвуют в реакции со сшивающим агентом, что приводит к недостаточной вязкости; молекулярная масса может быть, в частности, в диапазоне от 50 000 Да до 1 000 000 Да.
Сшивающими агентами могут выступать любые соединения из группы замещенных оксиранов, включая следующие (но не ограничивающиеся ими): 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир; полиэтиленгликольдиглицидиловый эфир; полипропиленгликольдиглицидиловый эфир. Использование сшивающих агентов, согласно данному изобретению, возможно в диапазоне массовых концентраций от 0,1 % до 10 % в исходном растворе. При меньшей концентрации не происходит эффективная реакция между молекулами, при более высокой – происходит чрезмерная сшивка молекул, непригодная для медицинского применения. Молекулярная масса некоторых соединений из группы замещенных эпоксидов, включая полиэтиленгликольдиглицидиловый эфир и полипропиленгликольдиглицидиловый эфир, вследствие химических особенностей данных веществ может варьироваться; в частности, согласно данному изобретению, для изготовления изделий может быть использован полиэтиленгликольдиглицидиловый эфир с молекулярной массой 500 Да, полипропиленгликольдиглицидиловый эфир со средней молекулярной массой 380 Да и 640 Да.
В качестве основания может использоваться любое неорганическое основание, в частности гидроксид натрия или гидроксид калия. Его количество определяется величиной показателя pH, который должен быть в диапазоне 8-14 ед.
В общем случае для производства геля, согласно данному изобретению, предварительно взвешенная масса карбоксиметилцеллюлозы или её фармацевтически приемлемой соли добавляется в емкость с основным раствором (pH которого выше 8 ед.), при этом массовая концентрация карбоксиметилцеллюлозы или её фармацевтически приемлемой соли в основном растворе составляет от 2% до 12%, и перемешивается до полного растворения при температуре не выше плюс 60 °С.
После этого к полученному раствору добавляется сшивающий агент при постоянном перемешивании до получения гомогенной смеси. Массовая концентрация сшивающего агента в реакционной смеси может составлять от 0,1 до 10%.
После процесса химической сшивки к полученной смеси добавляется аминокислота, при этом массовая концентрация аминокислоты в реакционной смеси составляет от 0,2% до 14%, и осуществляется перемешивание.  При более низких концентрациях цитотоксичность геля сравнима с гелем без добавления аминокислоты; при более высоких концентрациях цитотоксичность не изменяется. Время перемешивания смеси с аминокислотой должно составлять не менее 1 часа; температура не должна превышать 60 °С. После этого реакционная смесь нейтрализуется путем добавления кислоты до значения водородного показателя pH в диапазоне значений от 6,0 до 8,5. В качестве нейтрализующей кислоты может быть использована любая неорганическая или органическая кислота, в частности хлороводородная кислота, или уксусная кислота, или лимонная кислота, или молочная кислота. Затем полученный модифицированный гель подвергается процессу диализа в натрий-фосфатном физиологическом буферном растворе, либо в воде для инъекций, таким образом итоговое значение водородного показателя pH, ионной силы раствора и осмоляльности принимают физиологические значения либо те значения, которые необходимы для конкретного медицинского применения.
После процедуры диализа полученный гель гомогенизируется путем перемешивания, при необходимости добавляется требуемое количество воды для инъекции или натрий-фосфатного физиологического буфера согласно целевому показателю концентрации модифицированной карбоксиметилцеллюлозы в готовом изделии в зависимости от медицинского применения, но не более чем в 2 раза, так как степень набухания модифицированного геля ограничена и при большем разбавлении будет наблюдаться расслоение геля. Таким образом, массовая концентрация модифицированной карбоксиметилцеллюлозы или ее фармацевтически приемлемой соли не может быть выше 12% (в случае использования карбоксиметилцеллюлозы или ее фармацевтически приемлемой соли концентрацией 12 % в исходном растворе и без разбавления полученного модифицированного геля) и ниже 1% (в случае использования карбоксиметилцеллюлозы или ее фармацевтически приемлемой соли концентрацией 2 % в исходном растворе и с максимальным двукратным разбавлением полученного модифицированного геля).
Полученный модифицированный гель перемешивается или гомогенизируется до однородного состояния.
Далее полученный гель может поступать на стадию фасовки, где возможно два метода фасовки и стерилизации: фильтрование через фильтр с размером пор 0,22 мкм и розливом в фасовочную емкость, включающую в себя первичную упаковку системы «контейнер-укупорка», либо розлив без фильтрации в фасовочную емкость и стерилизация влажным теплом.
Гель, согласно настоящему изобретению, дополнительно может включать по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, используемое при создании фармацевтических композиций, в частности растворитель (в частности, вода для инъекций), буфер (в частности, натрий-фосфатный физиологический буферный раствор), консервант, антиоксидант, изотонические агенты.
Полученный таким образом гель является нетоксичным и биосовместимым, что позволяет использовать его в различных областях медицины, включающих в себя:
1) в хирургии в качестве наполнителя для различных медицинских имплантатов, в частности для межостистых динамических имплантатов, применяемых при дегенеративных заболеваниях позвоночника, а также в качестве наполнителя для грудных имплантатов;
2) в качестве вещества-носителя при использовании систем доставки лекарственных средств и систем контролирования высвобождения лекарственных средств, в том числе при доставке токсичных веществ в химиотерапии;
3) при лечении травм и оперировании, связанных с возникновением пустот и потери объема ткани разных органов, что может влиять на функционирование данного органа, а именно в качестве заполняющего пустоты состава;
4) в качестве лубриканта и/или антиадгезионного барьера при хирургических вмешательствах; в данном случае модифицированный состав может использоваться путем нанесения на медицинские изделия перед операциями с целью снижения болевых и повреждающих действий на органы, а также в качестве лубриканта и/или антиадгезионного барьера при операциях на суставах с целью снижения трения между органами и снижением вероятности воспалительных реакций;
5) в качестве противоспаечного геля при хирургических вмешательствах;
6) в качестве интрадермального филлера для коррекции косметических дефектов.
Реализацию способа получения геля модифицированной карбоксиметилцеллюлозы или её фармацевтически приемлемой соли по изобретению можно проиллюстрировать на следующих примерах:
Пример 1.
В круглодонную колбу (100 мл), снабженную верхнеприводной мешалкой с редуктором, поместили 4 г натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (молекулярная масса 380 000 Да, степень замещения 75). Затем в колбу добавили 1%-ый раствор по массе гидроксида натрия в воде для инъекций в количестве 50 мл. Проводили растворение карбоксиметилцеллюлозы в щелочном растворе в течении 1 часа при температуре 20 °С и перемешивании при 50-60 об/мин. После полного растворения добавили 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир (молекулярная масса 202,25 Да) массой 1 г. Полученную смесь перемешивали при температуре 20 °С в течение 19 часов при скорости перемешивания 40 об/мин. После проведения реакции добавили 3,5 г глицина, смесь перемешивали в течение часа при температуре 20 °С при скорости перемешивания 40 об/мин, и затем нейтрализовали раствором соляной кислоты с молярной концентрацией 1 М до значений показателя pH от 6,0 до 8,5. После этого реакционная смесь в виде геля была помещена в стерильный диализный мешок соответствующего размера (размер пор соответствует пределу отсечения в 12000 Да) и поместили в емкость объемом 1 л. Емкость заполнили натрий-фосфатным физиологическим буфером. Диализ вели при температуре плюс 20 °С, общее время диализа составило 24 часа.
После проведения диализа полученный гель может быть расфасован. Более конкретно, после диализа гель довели до объема 100 мл натрий-фосфатным физиологическим буферным раствором и расфасовали по шприцам, предназначенным для предварительного наполнения и укупорили, после чего простерилизовали влажным теплом с режимом стерилизации 20 мин при температуре 121 °С.
Пример 2.
В круглодонную колбу (100 мл), снабженную верхнеприводной мешалкой с редуктором, поместили 4 г натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (молекулярная масса 380 000 Да, степень замещения 75). Затем в колбу добавили 1%-ый раствор по массе гидроксида калия в воде для инъекций в количестве 50 мл. Проводили растворение карбоксиметилцеллюлозы в щелочном растворе в течении 1 часа при температуре 20 °С и перемешивании при 50-60 об/мин. После полного растворения добавили полиэтиленгликольдиглицидиловый эфир (молекулярная масса 500 Да) массой 2,5 г.  Полученную смесь перемешивали при температуре 20 °С в течение 19 часов при скорости перемешивания 40 об/мин. После проведения реакции добавили 3,5 г глицина, смесь перемешивали в течение часа при температуре 20 °С при скорости перемешивания 40 об/мин, и затем нейтрализовали раствором соляной кислоты с молярной концентрацией 1 М до значений показателя pH от 6,0 до 8,5. После реакционная смесь в виде геля была помещена в стерильный диализный мешок соответствующего размера (размер пор соответствует пределу отсечения в 12000 Да) и поместили в емкость объемом 1 л. Емкость заполнили натрий-фосфатным физиологическим буферным раствором. Диализ вели при температуре плюс 20 °С, общее время диализа составило 24 часа.
После проведения диализа полученный гель может быть расфасован. Более конкретно, после диализа гель довели до объема 100 мл натрий-фосфатным физиологическим буферным раствором и расфасовали по шприцам, предназначенным для предварительного наполнения и укупорили, после чего простерилизовали влажным теплом с режимом стерилизации 20 мин при температуре 121 °С.
Пример 3.
В круглодонную колбу (100 мл), снабженную верхнеприводной мешалкой с редуктором, поместили 4 г натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (молекулярная масса 380 000 Да, степень замещения 75). Затем в колбу добавили 1%-ый раствор по массе гидроксида натрия в воде для инъекций в количестве 50 мл. Проводили растворение карбоксиметилцеллюлозы в щелочном растворе в течении 1 часа при температуре 20 °С и перемешивании при 50-60 об/мин. После полного растворения добавили полипропиленгликольдиглицидиловый эфир (молекулярная масса 380 Да) массой 2 г. Полученную смесь перемешивали при температуре 20 °С в течение 19 часов при скорости перемешивания 40 об/мин. После проведения реакции добавили 3,5 г глицина, смесь перемешивали в течение часа при температуре 20 °С при скорости перемешивания 40 об/мин, и затем нейтрализовали раствором соляной кислоты с молярной концентрацией 1 М до значений показателя pH от 6,0 до 8,5. После реакционная смесь в виде геля была помещена в стерильный диализный мешок соответствующего размера (размер пор соответствует пределу отсечения в 12000 Да) и поместили в емкость объемом 1 л. Емкость заполнили натрий-фосфатным физиологическим буферным раствором. Диализ вели при температуре плюс 20 °С, общее время диализа составило 24 часа.
После проведения диализа полученный гель может быть расфасован. Более конкретно, после диализа гель довели до объема 100 мл натрий-фосфатным физиологическим буферным раствором и расфасовали по шприцам, предназначенным для предварительного наполнения и укупорили, после чего простерилизовали влажным теплом с режимом стерилизации 20 мин при температуре 121 °С.
Пример 4.
В круглодонную колбу (100 мл), снабженную верхнеприводной мешалкой с редуктором, поместили 1 г натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (молекулярная масса 380 000 Да, степень замещения 50). Затем в колбу добавили 1%-ый раствор по массе гидроксида натрия в воде для инъекций в количестве 50 мл. Проводили растворение карбоксиметилцеллюлозы в щелочном растворе в течение 1 часа при температуре 20 °С и перемешивании при 50-60 об/мин. После полного растворения добавили полипропиленгликольдиглицидиловый эфир (молекулярная масса 640 Да) массой 5 г.  Полученную смесь перемешивали при температуре 20 °С в течение 19 часов при скорости перемешивания 40 об/мин. После проведения реакции добавили 2 г валина, смесь перемешивали в течение часа при температуре 20 °С при скорости перемешивания 40 об/мин, и затем нейтрализовали раствором соляной кислоты молярной концентрацией 1 М до значений показателя pH от 6,0 до 8,5. После реакционная смесь в виде геля была помещена в стерильный диализный мешок соответствующего размера (размер пор соответствует пределу отсечения в 12000 Да) и поместили в емкость объемом 1 л. Емкость заполнили водой для инъекций. Диализ вели при температуре плюс 20 °С, общее время диализа составило 24 часа.
После проведения диализа полученный гель может быть расфасован. Более конкретно, после диализа гель довели до объема 100 мл натрий-фосфатным физиологическим буферным раствором и расфасовали по шприцам, предназначенным для предварительного наполнения и укупорили, после чего простерилизовали влажным теплом с режимом стерилизации 20 мин при температуре 121 °С.
Пример 5.
В круглодонную колбу (100 мл), снабженную верхнеприводной мешалкой с редуктором, поместили 6 г натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (молекулярная масса 50 000 Да, степень замещения 100). Затем в колбу добавили 1%-ый раствор по массе гидроксида натрия в воде для инъекций в количестве 50 мл. Проводили растворение карбоксиметилцеллюлозы в щелочном растворе в течении 1 часа при температуре 20 °С и перемешивании при 50-60 об/мин. После полного растворения добавили 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир (молекулярная масса 202,25 Да) массой 0,05 г. Полученную смесь перемешивали при температуре 60 °С в течение 1 часа при скорости перемешивания 40 об/мин. После проведения реакции добавили 0,1 г лейцина, смесь перемешивали в течение часа при температуре 20 °С при скорости перемешивания 40 об/мин, и затем нейтрализовали раствором уксусной кислоты концентрированной до значений показателя pH от 6,0 до 8,5. После реакционная смесь в виде геля была помещена в стерильный диализный мешок соответствующего размера (размер пор соответствует пределу отсечения в 12000 Да) и поместили в емкость объемом 1 л. Емкость заполнили натрий-фосфатным физиологическим буферным раствором. Диализ вели при температуре плюс 60 °С, общее время диализа составило 24 часа.
После проведения диализа полученный гель может быть расфасован. Более конкретно, после диализа гель довели до объема 100 мл натрий-фосфатным физиологическим буферным раствором и расфасовали по шприцам, предназначенным для предварительного наполнения и укупорили, после чего простерилизовали влажным теплом с режимом стерилизации 20 мин при температуре 121 °С.
Пример 6.
В круглодонную колбу (100 мл), снабженную верхнеприводной мешалкой с редуктором, поместили 1 г натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (молекулярная масса 1 000 000 Да, степень замещения 150). Затем в колбу добавили 1%-ый раствор по массе гидроксида натрия в воде для инъекций в количестве 50 мл. Проводили растворение карбоксиметилцеллюлозы в щелочном растворе в течении 1 часа при температуре 20 °С и перемешивании при 50-60 об/мин. После полного растворения добавили 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир (молекулярная масса 202,25 Да) массой 2,75 г. Полученную смесь перемешивали при температуре 4 °С в течение 48 часов при скорости перемешивания 40 об/мин. После проведения реакции добавили 7 г аланина, смесь перемешивали в течение часа при температуре плюс 4 °С при скорости перемешивания 40 об/мин, и затем нейтрализовали раствором лимонной кислоты концентрацией 60% до значений показателя pH от 6,0 до 8,5. После реакционная смесь в виде геля была помещена в стерильный диализный мешок соответствующего размера (размер пор соответствует пределу отсечения в 12000 Да) и поместили в емкость объемом 1 л. Емкость заполнили натрий-фосфатным физиологическим буферным раствором. Диализ вели при температуре плюс 4 °С, общее время диализа составило 24 часа.
После проведения диализа полученный гель может быть расфасован. Более конкретно, после диализа гель довели до объема 100 мл натрий-фосфатным физиологическим буферным раствором и расфасовали по шприцам, предназначенным для предварительного наполнения и укупорили, после чего простерилизовали влажным теплом с режимом стерилизации 20 мин при температуре 121 °С.
Пример 7.
В круглодонную колбу (100 мл), снабженную верхнеприводной мешалкой с редуктором, поместили 3 г натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (молекулярная масса 300 000 Да, степень замещения 75). Затем в колбу добавили 1%-ый раствор по массе гидроксида натрия в воде для инъекций в количестве 50 мл. Проводили растворение карбоксиметилцеллюлозы в щелочном растворе в течении 1 часа при температуре 20 °С и перемешивании при 50-60 об/мин. После полного растворения добавили 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир (молекулярная масса 202,25 Да) массой 0,05 г. Полученную смесь перемешивали при температуре 20 °С в течение 19 часов при скорости перемешивания 40 об/мин. После проведения реакции добавили 0,1 г фенилаланина, 4 г лизина и 2 г изолейцина, смесь перемешивали в течение часа при температуре 20 °С при скорости перемешивания 40 об/мин, и затем нейтрализовали раствором молочной кислоты 90% до значений показателя pH от 6,0 до 8,5. После реакционная смесь в виде геля была помещена в стерильный диализный мешок соответствующего размера (размер пор соответствует пределу отсечения в 12000 Да) и поместили в емкость объемом 1 л. Емкость заполнили натрий-фосфатным физиологическим буферным раствором. Диализ вели при температуре плюс 20 °С, общее время диализа составило 24 часа.
После проведения диализа полученный гель может быть расфасован. Более конкретно, после диализа гель довели до объема 100 мл натрий-фосфатным физиологическим буферным раствором и расфасовали по шприцам, предназначенным для предварительного наполнения и укупорили, после чего простерилизовали влажным теплом с режимом стерилизации 20 мин при температуре 121 °С.
Пример 8.
В круглодонную колбу (100 мл), снабженную верхнеприводной мешалкой с редуктором, поместили 1 г натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (молекулярная масса 50 000 Да, степень замещения 150). Затем в колбу добавили 1%-ый раствор по массе гидроксида натрия в воде для инъекций в количестве 50 мл. Проводили растворение карбоксиметилцеллюлозы в щелочном растворе в течении 1 часа при температуре 20 °С и перемешивании при 50-60 об/мин. После полного растворения добавили 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир (молекулярная масса 202,25 Да) массой 0,05 г. Полученную смесь перемешивали при температуре 20 °С в течение 19 часов при скорости перемешивания 40 об/мин. После проведения реакции добавили 0,5 г таурина, 2 г гистидина и 3 г аргинина, смесь перемешивали в течение часа при температуре 20 °С при скорости перемешивания 40 об/мин, и затем нейтрализовали раствором соляной кислоты молярной концентрацией 1 М до значений показателя pH от 6,0 до 8,5. После реакционная смесь в виде геля была помещена в стерильный диализный мешок соответствующего размера (размер пор соответствует пределу отсечения в 12000 Да) и поместили в емкость объемом 1 л. Емкость заполнили натрий-фосфатным физиологическим буферным раствором. Диализ вели при температуре плюс 20 °С, общее время диализа составило 24 часа.
После проведения диализа полученный гель может быть расфасован. Более конкретно, после диализа гель довели до объема 100 мл натрий-фосфатным физиологическим буферным раствором и расфасовали по шприцам асептически.
Пример 9.
В круглодонную колбу (100 мл), снабженную верхнеприводной мешалкой с редуктором, поместили 1 г натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (молекулярная масса 50 000 Да, степень замещения 150). Затем в колбу добавили 1%-ый раствор по массе гидроксида натрия в воде для инъекций в количестве 50 мл. Проводили растворение карбоксиметилцеллюлозы в щелочном растворе в течении 1 часа при температуре 20 °С и перемешивании при 50-60 об/мин. После полного растворения добавили 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир (молекулярная масса 202,25 Да) массой 0,05 г. Полученную смесь перемешивали при температуре 20 °С в течение 19 часов при скорости перемешивания 40 об/мин. После проведения реакции добавили 0,1 г метионина, 0,5 г триптофана, 0,8 г серина и 2 г треонина, смесь перемешивали в течение часа при температуре 20 °С при скорости перемешивания 40 об/мин, и затем нейтрализовали раствором соляной кислоты молярной концентрацией 1 М до значений показателя pH от 6,0 до 8,5. После реакционная смесь в виде геля была помещена в стерильный диализный мешок соответствующего размера (размер пор соответствует пределу отсечения в 12000 Да) и поместили в емкость объемом 1 л. Емкость заполнили натрий-фосфатным физиологическим буферным раствором. Диализ вели при температуре плюс 20 °С, общее время диализа составило 24 часа.
После проведения диализа полученный гель может быть расфасован. Более конкретно, после диализа гель довели до объема 100 мл натрий-фосфатным физиологическим буферным раствором и расфасовали по шприцам асептически.
Пример 10.
В круглодонную колбу (100 мл), снабженную верхнеприводной мешалкой с редуктором, поместили 1 г натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (молекулярная масса 50 000 Да, степень замещения 150). Затем в колбу добавили 1%-ый раствор по массе гидроксида натрия в воде для инъекций в количестве 50 мл. Проводили растворение карбоксиметилцеллюлозы в щелочном растворе в течении 1 часа при температуре 20 °С и перемешивании при 50-60 об/мин. После полного растворения добавили 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир (молекулярная масса 202,25 Да) массой 0,05 г. Полученную смесь перемешивали при температуре 20 °С в течение 19 часов при скорости перемешивания 40 об/мин. После проведения реакции добавили 0,2 г цистеина, 0,5 г аргнина, 2 г глутаминовой кислоты, смесь перемешивали в течение часа при температуре 20 °С при скорости перемешивания 40 об/мин, и затем нейтрализовали раствором соляной кислоты молярной концентрацией 1 М до значений показателя pH от 6,0 до 8,5. После реакционная смесь в виде геля была помещена в стерильный диализный мешок соответствующего размера (размер пор соответствует пределу отсечения в 12000 Да) и поместили в емкость объемом 1 л. Емкость заполнили натрий-фосфатным физиологическим буферным раствором. Диализ вели при температуре плюс 20 °С, общее время диализа составило 24 часа.
После проведения диализа полученный гель может быть расфасован. Более конкретно, после диализа гель довели до объема 100 мл натрий-фосфатным физиологическим буферным раствором и расфасовали по шприцам асептически.
Пример 11.
В круглодонную колбу (100 мл), снабженную верхнеприводной мешалкой с редуктором, поместили 1 г натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (молекулярная масса 50 000 Да, степень замещения 150). Затем в колбу добавили 1%-ый раствор по массе гидроксида натрия в воде для инъекций в количестве 50 мл. Проводили растворение карбоксиметилцеллюлозы в щелочном растворе в течении 1 часа при температуре 20 °С и перемешивании при 50-60 об/мин. После полного растворения добавили 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир (молекулярная масса 202,25 Да) массой 0,05 г. Полученную смесь перемешивали при температуре 20 °С в течение 19 часов при скорости перемешивания 40 об/мин. После проведения реакции добавили 0,5 г аспарагина, 0,8 г глутамина, 1,5 г тирозина и 0,4 г аспарагиновой кислоты, смесь перемешивали в течение часа при температуре 20 °С при скорости перемешивания 40 об/мин, и затем нейтрализовали раствором соляной кислоты молярной концентрацией 1 М до значений показателя pH от 6,0 до 8,5. После реакционная смесь в виде геля была помещена в стерильный диализный мешок соответствующего размера (размер пор соответствует пределу отсечения в 12000 Да) и поместили в емкость объемом 1 л. Емкость заполнили натрий-фосфатным физиологическим буферным раствором. Диализ вели при температуре плюс 20 °С, общее время диализа составило 24 часа.
После проведения диализа полученный гель может быть расфасован. Более конкретно, после диализа гель довели до объема 100 мл натрий-фосфатным физиологическим буферным раствором и расфасовали по шприцам асептически.
Пример 12. Образец сравнения без добавления аминокислот.
В круглодонную колбу (100 мл), снабженную верхнеприводной мешалкой с редуктором, поместили 4 г натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (молекулярная масса 380 000 Да, степень замещения 75). Затем в колбу добавили 1%-ый раствор по массе гидроксида натрия в воде для инъекций в количестве 50 мл. Проводили растворение карбоксиметилцеллюлозы в щелочном растворе в течении 1 часа при температуре 20 °С и перемешивании при 50-60 об/мин. После полного растворения добавили 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир (молекулярная масса 202,25 Да) массой 1 г. Полученную смесь перемешивали при температуре 20 °С в течение 19 часов при скорости перемешивания 40 об/мин. После проведения реакции реакционную смесь нейтрализовали раствором соляной кислоты молярной концентрацией 1 М до значений показателя pH от 6,0 до 8,5. После реакционная смесь в виде геля была помещена в стерильный диализный мешок соответствующего размера (размер пор соответствует пределу отсечения в 12000 Да) и поместили в емкость объемом 1 л. Емкость заполнили натрий-фосфатным физиологическим буферным раствором. Диализ вели при температуре плюс 20 °С, общее время диализа составило 24 часа.
После проведения диализа полученный гель может быть расфасован. Более конкретно, после диализа модифицированный гель довели до объема 100 мл натрий-фосфатным физиологическим буферным раствором и расфасовали по шприцам, предназначенным для предварительного наполнения и укупорили, после чего простерилизовали влажным теплом с режимом стерилизации 20 мин при температуре 121 °С.
Пример 13. Образец сравнения без диализа и без добавления аминокислот.
В круглодонную колбу (100 мл), снабженную верхнеприводной мешалкой с редуктором, поместили 4 г натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (молекулярная масса 380 000 Да, степень замещения 75). Затем в колбу добавили 1%-ый раствор по массе гидроксида натрия в воде для инъекций в количестве 50 мл. Проводили растворение карбоксиметилцеллюлозы в щелочном растворе в течение 1 часа при температуре 20 °С и перемешивании при 50-60 об/мин. После полного растворения добавили 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир (молекулярная масса 202,25 Да) массой 1 г. Полученную смесь перемешивали при температуре 20 °С в течение 19 часов при скорости перемешивания 40 об/мин. После проведения реакции реакционную смесь нейтрализовали раствором соляной кислоты молярной концентрацией 1 М до значений показателя pH от 6,0 до 8,5; довели до объема 100 мл натрий-фосфатным физиологическим буферным раствором и расфасовали по шприцам, предназначенным для предварительного наполнения, после чего укупорили и простерилизовали влажным теплом с режимом стерилизации 20 мин при температуре 121 °С.
.
in vivo
Пример 14Исследование биодеградации
Для определения продолжительности биодеградации геля, полученного по Примерам 1 – 3 настоящего изобретения, вводили в три различные анатомические точки, характеризующиеся различным микроокружением: подкожно в бок, в паховую область, внутрибрюшинно мышам линии BALB/c.
Образцы, приготовленные в соответствии с Примерами 1-3 настоящего способа, вводили мышам по 50 мкл подкожно в бок. Данное введение моделирует биодеградацию подкожных косметических филлеров. Подкожная клетчатка представлена в основном фибробластами. По истечении 35 дней все образцы находятся на месте введения (фиг. 7). Размер введенных препаратов незначительно уменьшается. Воспалительного процесса не наблюдалось.
Мышам линии BALB/c образцы, приготовленные в соответствии с Примерами 1 – 3 настоящего способа, вводили по 100 мкл в ткань в область 3-ей жировой подушки. Клеточный компонент представлен жировыми и эпителиальными клетками, а также фибробластами. Данное введение моделирует заместительную реконструкцию тканей. Анализ биодеградации провели на 16 день после введения. Все образцы находились в месте введения примерно в том же объеме (фиг. 8). Визуализируется формирование капилляров вокруг и внутри препаратов. Признаков воспаления не выявили.
Мышам линии BALB/c образцы, приготовленные в соответствии с Примерами 1-3 настоящего способа, вводили по 200 мкл при проведении операции по индукции спаечного процесса. Перитонеальный экссудат содержит значительное количество макрофагов, гранулоцитов и лимфоцитов. При внутрибрюшинном введении образцы, приготовленные в соответствии с Примерами 1-3 настоящего способа, поглощались макрофагами и быстро выводились из полости. Образец 1, полученный по Примеру 1, отсутствовал уже через 1 день; образец 3, полученный по Примеру 3, отсутствовал через 2 дня; образец 2, полученный по Примеру 2, не регистрировался через 3 дня (табл. 1).
Таблица 1 – Результаты исследования противоспаечной активности препаратов модифицированной натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, полученной способом по изобретению. Образец 1 – гель, полученный по Примеру 1; образец 2 – гель, полученный по Примеру 2; образец 3 – гель, полученный по Примеру 3.
Образец
Объем, мл
Остатки геля по изобретению
1 день
2 дня
3 дня
Образец 1
200
отсутствуют
отсутствуют
отсутствуют
Образец 2
200
присутствуют
присутствуют
отсутствуют
Образец 3
200
присутствуют
отсутствуют
отсутствуют
Таким образом, результаты проведенных исследований продемонстрировали возможность использования гелей, полученных способом по изобретению, для различных медицинских применений.
in vitro
Пример 15. Исследование токсичности .
exp
cont
Линии клеток поджелудочной железы MiaPaCa-2 выращивали в среде DMEM с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка (FCS), пенициллин, стрептамицин, глютамин. Клетки снимали с планшетов раствором 0.05% трипсина–ЭДТА, определяли концентрацию. Для определения токсичности геля по изобретению использовали МТТ тест [9]. Цитотоксичность препаратов оценивалась с помощью стандартного 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид (МТТ) теста, как описано в [9]. Различные разведения препаратов (от 10 до 1280 раз) готовили в культуральной среде. Клетки вносили по 5 тыс/лунку. В качестве контроля служили необработанные клетки. Планшеты инкубировали в течение 72 ч. За последние 6 ч в каждую лунку добавляли по 5 мг/мл МТТ в количестве 10 мкл. После инкубации культурную среду удаляли и в каждую лунку добавляли 100 мкл диметилсульфоксида. Планшеты инкубировали при встряхивании в течение 15 мин для растворения образовавшегося формазана. Оптическая плотность считывалась на спектрофотометре при 540 Нм. По кривым титрования рассчитана цитотоксическая концентрация, дающая 50% максимального токсического эффекта (IC50). Данные приведены в виде индекса цитотоксичности (II), определенный по формуле II=1-OD/OD(фиг. 9). Результаты теста представлены в Таблице 2.
exp
cont
Таблица 2 – Анализ пролиферации клеток MiaPaCa-2 в присутствии гелей на основе модифицированной натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы. Данные приведены в виде индекса цитотоксичности (II), определенного по формуле II=1-OD/OD. Образец 1 –  гель, полученный по Примеру 1; Образец 2 – гель, полученный по Примеру 2; Образец 3 – гель, полученный по Примеру 3; Образец 4 – гель сравнения, полученный по Примеру 13 (без использования аминокислот, без диализа); Образец 5 – гель сравнения, полученный по Примеру 12 (без использования аминокислот, с диализом).
<b>Образец</b>
<b>Разбавление, раз</b>
<b>10</b>
<b>20</b>
<b>40</b>
<b>80</b>
<b>160</b>
<b>320</b>
<b>640</b>
<b>1280</b>
<b>1</b>
0,27
0,18
-0,05
-0,08
-0,11
-0,23
-0,27
-0,38
<b>2</b>
0,56
0,36
0,19
0,01
-0,04
0,06
-0,2
-0,37
<b>3</b>
0,52
0,31
0,21
0,08
-0,03
-0,05
-0,09
-0,29
<b>4</b>
0,88
0,77
0,58
0,39
0,26
0,15
0,04
-0,04
<b>5</b>
0,67
0,47
0,28
0,25
0,15
0,08
0,04
0,03
На основе данных МТТ-теста было установлено, что гель, полученный способом по изобретению, характеризуются низкой токсичностью, в частности, самым низкотоксичным является Образец 1, приготовленный в соответствии с Примером 1, токсичность Образца 2 и Образца 3 сравнима и ниже IC50, что соответствует низкотоксичным препаратам. Важно отметить, что использование аминокислот и диализа обладает синергетическим эффектом: токсичность Образца 5 (приготовленного с диализом, без добавления аминокислот) выше, чем токсичность Образцов 1-3, а токсичность Образца 4, приготовленного без диализа и без добавления аминокислот, существенно выше всех остальных образцов и данный препарат является токсичным.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.
Список литературы, которая включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылок:
1) Behra J.S., Mattsson J., Cayre O.J., Robles E.S.J., Tang H., Hunte T.N. Characterization of Sodium Carboxymethyl Cellulose Aqueous Solutions to Support Complex Product Formulation: A Rheology and Light Scattering Study // ACS Applied Polymer Materials. - 2019. - V. 1(3). - P. 344-358.
2) US 9,682,167 B2, дата публикации 20.06.2017.
3) Leonardis M, Palange A. New-generation filler based on cross-linked carboxymethylcellulose: study of 350 patients with 3-year follow-up. // Clin Interv Aging. - 2015. - V. 10 – P. 147-155.
4) US 7,265,098 B2, дата публикации 04.09.2007.
5) EP1508344 B1, дата публикации 25.10.2006.
6) Kablik J, Monheit GD, Yu L, Chang G, Gershkovich J. Comparative physical properties of hyaluronic acid dermal fillers. // Dermatol Surg. - 2009. - V.1 - P. 302-312.
8) Risberg B. Adhesions: preventive strategies. // Eur J Surg Suppl. - 1997. - V. 577. - P. 32-39.
9) Коновалова М.В., Курек Д.В., Дурнев Е.А., Литвинец С.Г., Варламов В.П. Деградация in vitro пектин-хитозановых криогелей // Известия Уфимского научного центра РАН, 2016, №3(1), с.42-45.
10) US 9,352,046B2, дата публикации 11.05.2015.