АНТИТЕЛА К CD40 ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ЛЕЧЕНИИ СИНДРОМА ШЕГРЕНА
ANTIBODIES TO CD40 FOR USE IN THE TREATMENT OF SJOGREN'S SYNDROME

ПРЕДЫДУЩИЕ ЗАЯВКИ
Данная заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США под № 62/581212, поданной 3 ноября 2017 г., и предварительной заявки на патент США под № 62/644939, поданной 19 марта 2018 г., содержание которых включено в данный документ в их полном объеме.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к способам, схемам лечения, вариантам применения, наборам и видам терапии для лечения синдрома Шегрена, такого как первичный синдром Шегрена или вторичный синдром Шегрена, с помощью применения антител к CD40, таких как CFZ533.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Синдром Шегрена (SS), такой как первичный синдром Шегрена (pSS) или вторичный синдром Шегрена (sSS), представляет собой распространенное хроническое аутоиммунное заболевание неизвестной этиологии.
Симптомы заболевания у пациентов как при первичном, так и при вторичном SS, включают наличие аутоантител к Ro и к La, а также инфильтратов мононуклеарных клеток в слюнных и слезных железах (Bombardieri, et al. 2012). В некоторых случаях такие накопления лимфоцитов T и B образуют хорошо организованные структуры, называемые эктопическими лимфоидными структурами (ELS), которые обладают морфологическими и функциональными сходствами с GC (Voulgarelis et al. 2008). В предыдущей работе сообщалось о доказательствах наличия ELS в слюнных железах у пациентов с SS, и в доклинических моделях данного заболевания и доказательствах продолжающегося созревания аффинности (Jacobi et al. 2002; Stott et al. 1998; Bombardieri et al. 2012), связывая эти структуры с патологией заболевания (Bombardieri et al. 2017).
Влияние данного заболевания на показатели качества жизни (QoL) является значительным, и сравнительные исследования показывают, что pSS QoL получило количественную оценку хуже, чем застойная сердечная недостаточность или многие формы рака (Segal et al 2009; Kuenstner et al 2002; Komaroff et al 1996). Более того, увеличенная активность В-клеток при SS приводит к увеличенному риску для злокачественной трансформации, при этом развитие лимфомы обнаруживается у 5% пациентов с SS. Лечение для пациентов с SS ограничивается симптоматическим уходом в отношении признаков и симптомов, относящихся к слизистым оболочкам, на данный момент не существует научно обоснованной системной терапии, доступной для пациентов с SS.
Глюкортикоиды и типичные болезнь-модифицирующие антиревматические лекарственные средства (DMARD) в большинстве своем неэффективны, и не существует эффективного фармакологического вмешательства против тяжелой, ограничивающей дееспособность усталости. Несмотря на отсутствие убедительного доказательства эффективности на основании неподтвержденных данных, а также опыта подобных аутоиммунных заболеваний, таких как системная красная волчанка, иногда применяются антималярийные средства (Tishler et al 2008), метотрексат (Winzer and Aringer 2010) или азатиоприн (Kaufman et al 1999), в частности для лечения экстрагландулярных симптомов, включающих вовлечение почек или суставов.
Хотя небольшие испытания с истощающим В-клетки средством ритуксимабом продемонстрировали уровень терапевтической эффективности, не были проведены соответствующие большие рандомизированные контролируемые испытания, продемонстрировавшие явную эффективность в отношении проявлений заболевания в железистой ткани и вне железистой ткани. Модифицирующее заболевание средство, которое предупреждает разрушение секреторных желез и направлено на проявления заболевания вне железистой ткани, выведет на качественно новый уровень лечение SS, такого как хронический pSS.
CFZ533 представляет собой человеческое моноклональное антитело, направленное против CD40 человека. Оно принадлежит к подклассу изотипа IgG1 и содержит подавляющую Fc мутацию (N297A), которая устраняет связывание FcγR и связанные эффекторные функции, как например ADCC и CDC. CFZ533 раскрыто в US8828396 и US9221913, включенных в данный документ посредством ссылки.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Было обнаружено, что человеческие моноклональные антитела к CD40 с подавленной активностью ADCC являются подходящими для лечения синдрома Шегрена. В частности, в концептуальном исследовании антитела CFZ533 продемонстрировано доказательство того, что предложен новый метод лечения клинически активного pSS.
В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения обеспечивается антитело к CD40 для применения в лечении синдрома Шегрена. В одном варианте осуществления синдром Шегрена представляет собой первичный синдром Шегрена.
Антитело может быть выбрано из группы, состоящей из:
a. антитела к CD40, которое содержит VH-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, и VL-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8;
b. антитела к CD40, которое содержит VH-домен иммуноглобулина, содержащий гипервариабельные области, представленные под SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, и VL-домен иммуноглобулина, содержащий гипервариабельные области, представленные под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6;
c. антитела к CD40, которое содержит VH-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, и VL-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, и Fc-область под SEQ ID NO: 13;
d. антитела к CD40, которое содержит VH-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, и VL-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, и Fc-область под SEQ ID NO: 14; и
e. антитела к CD40, которое содержит Fc-область IgG1 с подавленной активностью.
Антитело может содержать аминокислотную последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO: 9 и аминокислотную последовательность легкой цепи под SEQ ID NO: 10 или аминокислотную последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO: 11 и аминокислотную последовательность легкой цепи под SEQ ID NO: 12.
В одном варианте осуществления предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество антитела для применения в соответствии с первым аспектом и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей.
В одном варианте осуществления путем введения антитела в соответствии с первым аспектом является подкожный или внутривенный или комбинация с подкожным или внутривенным путем введения.
Доза может составлять от приблизительно 3 мг до приблизительно 30 мг активного ингредиента на килограмм веса субъекта-человека. Дозу можно вводить каждую неделю, каждые две недели или каждые четыре недели.
В одном варианте осуществления доза составляет приблизительно 10 мг активного ингредиента на килограмм веса субъекта-человека.
В одном варианте осуществления доза составляет от приблизительно 150 мг до приблизительно 600 мг активного ингредиента. Дозу можно вводить каждую неделю, каждые две недели или каждые четыре недели.
В одном варианте осуществления доза составляет приблизительно 300 мг активного ингредиента.
В одном предпочтительном варианте осуществления доза составляет 150 мг активного ингредиента. В другом предпочтительном варианте осуществления доза составляет 300 мг активного ингредиента. В еще одном предпочтительном варианте осуществления доза составляет 600 мг активного ингредиента.
В одном варианте осуществления антитело вводится посредством введения нагрузочной дозы и введения поддерживающей дозы.
В одном варианте осуществления введение нагрузочной дозы осуществляют посредством подкожных инъекций первой дозы, и введение поддерживающей дозы осуществляют посредством подкожных инъекций второй дозы. Первая доза может быть такой же, как и вторая доза или больше, чем вторая доза.
В одном варианте осуществления первая доза составляет от приблизительно 150 мг до приблизительно 600 мг активного ингредиента, как например приблизительно 300 мг активного ингредиента, и вторая доза составляет от приблизительно 150 мг до приблизительно 600 мг активного ингредиента, как например приблизительно 300 мг активного ингредиента.
В одном варианте осуществления первая доза составляет 150 мг, 300 мг или 600 мг активного ингредиента, и вторая доза составляет 150 мг, 300 мг или 600 мг активного ингредиента.
В одном варианте осуществления введение нагрузочной дозы включает по меньшей мере две подкожные инъекции, и введение поддерживающей дозы заключается в подкожных инъекциях, вводимых еженедельно (Q1W), один раз в две недели (Q2W) или ежемесячно (Q4W). В одном варианте осуществления введение нагрузочной дозы состоит из двух подкожных инъекций. В другом варианте осуществления введение нагрузочной дозы состоит из трех подкожных инъекций.
В одном варианте осуществления подкожные инъекции при введении нагрузочной дозы представляют собой разные дозы. В другом варианте осуществления подкожные инъекции при введении нагрузочной дозы представляют собой одинаковую дозу.
В соответствии со вторым аспектом предусмотрен способ лечения синдрома Шегрена у субъекта-человека, включающий введение терапевтически эффективной дозы антитела к CD40 указанному субъекту. В предпочтительном варианте осуществления синдром Шегрена представляет собой первичный синдром Шегрена.
В одном варианте осуществления антитело выбрано из группы, состоящей из:
a. антитела к CD40, которое содержит VH-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, и VL-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8;
b. антитела к CD40, которое содержит VH-домен иммуноглобулина, содержащий гипервариабельные области, представленные под SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, и VL-домен иммуноглобулина, содержащий гипервариабельные области, представленные под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6;
c. антитела к CD40, которое содержит VH-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, и VL-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, и Fc-область под SEQ ID NO: 13;
d. антитела к CD40, которое содержит VH-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, и VL-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, и Fc-область под SEQ ID NO: 14; и
e. антитела к CD40, которое содержит Fc-область IgG1 с подавленной активностью.
В одном варианте осуществления антитело содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO: 9 и аминокислотную последовательность легкой цепи под SEQ ID NO: 10 или аминокислотную последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO: 11 и аминокислотную последовательность легкой цепи под SEQ ID NO: 12.
В одном варианте осуществления антитело вводят вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями.
В одном варианте осуществления антитело вводят подкожно или внутривенно или посредством комбинации с подкожным или внутривенным введением.
В одном варианте осуществления антитело вводят в виде дозы, составляющей от приблизительно 3 мг до приблизительно 30 мг активного ингредиента на килограмм веса субъекта-человека.
В одном варианте осуществления доза составляет приблизительно 10 мг активного ингредиента на килограмм веса субъекта-человека.
В одном варианте осуществления антитело вводят в виде дозы, составляющей от приблизительно 150 мг до приблизительно 600 мг активного ингредиента, как например 300 мг активного ингредиента.
В одном предпочтительном варианте осуществления доза составляет 150 мг активного ингредиента. В другом предпочтительном варианте осуществления доза составляет 300 мг активного ингредиента. В еще одном предпочтительном варианте осуществления доза составляет 600 мг активного ингредиента.
В одном варианте осуществления антитело вводится посредством введения нагрузочной дозы и введения поддерживающей дозы.
В одном варианте осуществления введение нагрузочной дозы осуществляют посредством подкожных инъекций первой дозы, и введение поддерживающей дозы осуществляют посредством подкожных инъекций второй дозы.
Первая доза может быть такой же, как и вторая доза или больше, чем вторая доза.
В одном варианте осуществления первая доза составляет от приблизительно 150 мг до приблизительно 600 мг активного ингредиента, как например приблизительно 300 мг активного ингредиента, и вторая доза составляет от приблизительно 150 мг до приблизительно 600 мг активного ингредиента, как например приблизительно 300 мг активного ингредиента.
В одном варианте осуществления первая доза составляет 150 мг, 300 мг или 600 мг активного ингредиента, и вторая доза составляет 150 мг, 300 мг или 600 мг активного ингредиента.
В одном варианте осуществления введение нагрузочной дозы включает по меньшей мере две подкожные инъекции, и введение поддерживающей дозы заключается в подкожных инъекциях, вводимых еженедельно еженедельно (Q1W), один раз в две недели (Q2W) или ежемесячно (Q4W).
В одном варианте осуществления введение нагрузочной дозы состоит из двух подкожных инъекций. В другом варианте осуществления введение нагрузочной дозы состоит из трех подкожных инъекций.
В одном варианте осуществления подкожные инъекции при введении нагрузочной дозы представляют собой разные дозы. В другом варианте осуществления подкожные инъекции при введении нагрузочной дозы представляют собой одинаковую дозу.
В соответствии с третьим аспектом предусмотрено применение жидкой фармацевтической композиции, содержащей антитело к CD40, буфер, стабилизатор и солюбилизатор, и средства для подкожного введения антитела к CD40 пациенту, у которого имеется синдром Шегрена, для изготовления лекарственного препарата для лечения синдрома Шегрена, где антитело к CD40
a. предназначено для подкожного введения посредством введения первой нагрузочной дозы и
b. после этого посредством введения второй поддерживающей дозы, где указанное антитело к CD40 выбрано из группы, состоящей из:
i. антитела к CD40, которое содержит VH-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, и VL-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8;
ii. антитела к CD40, которое содержит VH-домен иммуноглобулина, содержащий гипервариабельные области, представленные под SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, и VL-домен иммуноглобулина, содержащий гипервариабельные области, представленные под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6;
iii. антитела к CD40, которое содержит VH-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, и VL-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, и Fc-область под SEQ ID NO: 13;
iv. антитела к CD40, которое содержит VH-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, и VL-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, и Fc-область под SEQ ID NO: 14;
v. антитела к CD40, которое содержит Fc-область IgG1 с подавленной активностью; и
vi. антитела к CD40, которое содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO: 9 и аминокислотную последовательность легкой цепи под SEQ ID NO: 10 или аминокислотную последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO: 11 и аминокислотную последовательность легкой цепи под SEQ ID NO: 12.
В предпочтительном варианте осуществления синдром Шегрена представляет собой первичный синдром Шегрена.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На фигуре 1 схематически представлен план исследования первой и второй когорт доказательной части концептуального исследования CFZ533 у пациентов с pSS (CCFZ533X2203).
На фигуре 2 схематически представлен план исследования третьей когорты доказательной части концептуального исследования CFZ533 у пациентов с pSS (CCFZ533X2203).
На фигуре 3 изображен график, демонстрирующий предварительно симулированные фармакокинетические профили перед началом доказательной части концептуального исследования CCFZ533X2203.
На фигуре 4 изображен график, демонстрирующий фармакокинетические профили после внутривенного введения (когорта 2 исследования CCFZ533X2203; промежуточный анализ).
На фигуре 5 изображен график, демонстрирующий клинические показатели (ESSDAI) после введения IV (когорта 2; исследование CCFZ533X2203).
На фигуре 6 изображен график, демонстрирующий уровни биомаркера (CXCL13) после введения IV (когорта 2; исследование CCFZ533X2203).
На фигуре 7 схематически представлены результаты лечения для различных клинических конечных точек после введения IV (когорта 2; исследование CCFZ533X2203).
На фигуре 8 изображен график, демонстрирующий фармакодинамические профили (общий растворимый CD40 в плазме крови после введения IV; когорта 2; исследование CCFZ533X2203).
На фигуре 9 изображен график, демонстрирующий клинические показатели (ESSDAI) после подкожного введения (когорта 1; исследование CCFZ533X2203).
На фигуре 10 изображен график, демонстрирующий фармакокинетические профили после подкожного введения (когорта 1; исследование CCFZ533X2203).
На фигуре 11 изображен график, демонстрирующий фармакодинамические профили (общий растворимый CD40 после SC-введения; когорта 1; исследование CCFZ533X2203).
На фигуре 12 изображен график, демонстрирующий клинические показатели (ESSPRI) после введения SC (когорта 1; исследование CCFZ533X2203).
На фигуре 13 изображен график, демонстрирующий клинические показатели (ESSPRI) после введения IV (когорта 2; исследование CCFZ533X2203).
На фигуре 14 изображен график, демонстрирующий уровни биомаркера (CXCL13) после введения IV (когорта 2; исследование CCFZ533X2203).
На фигуре 15 изображен график, демонстрирующий клинические показатели (ESSDAI) после введения IV (когорта 2; исследование CCFZ533X2203).
На фигуре 16 изображен график, демонстрирующий ICAM и уровни В-клеток после введения IV (когорта 2; исследование CCFZ533X2203).
На фигуре 17 схематически представлены результаты лечения для различных клинических конечных точек (введения IV и SC; исследование CCFZ533X2203).
На фигуре 18 изображен график, демонстрирующий in vitro CFZ533-опосредованное ингибирование активации rCD154-индуцированного пути.
На фигуре 19 изображен график, демонстрирующий минимальную стимулирующую активность CFZ533 in vitro.
На фигуре 20 изображен график, демонстрирующий, что CFZ533 не опосредует истощение клеток in vitro.
На фигуре 21 представлены иллюстративные изображения отдельных В-клеток RI-1, демонстрирующие интернализацию рецепторов CD40 после связывания recCD154 или CFZ533.
На фигуре 22 изображен график, демонстрирующий фармакокинетику и фармакодинамику (связывание с мишенью; истощение В-клеток отсутствует) свойств CFZ533 у приматов, отличных от человека.
На фигуре 23A представлен экспериментальный схематический план PK/PD и исследование вакцинации у приматов, отличных от человека. На фигуре 23B изображен график, демонстрирующий уровни IgG к KLH (иммунный ответ) и CFZ533 в плазме крови (фармакокинетика). На фигуре 23C изображены результаты гистологического анализа зародышевых центров.
На фигурах 24A, 24B и 24C представлены графические обозначения возможных недельных нагрузочных доз активного ингредиента, вводимого подкожно, с последующим введением один раз в две недели активного ингредиента по поддерживающей схеме (подкожно).
На фигуре 25A представлено графическое обозначение возможных недельных нагрузочных доз активного ингредиента, вводимых подкожно с последующим введением активного ингредиента каждые 4 недели (подкожно), и на фигуре 25B представлено графическое обозначение возможных недельных нагрузочных доз активного ингредиента, вводимых подкожно с последующим введением активного ингредиента каждую неделю (подкожно).
На фигуре 26 показаны экспериментальные результаты; сигнатура CD40 в ELS в слюнных железах и снижение третичных лимфоидных органов в слюнных железах мышей NOD после 10-недельной обработки с помощью MR1.
На фигуре 27 показаны экспериментальные результаты; увеличенное процентное содержание AQP-5-положительных клеток в слюнных железах мышей NOD после 10-недельной обработки антителами к CD154.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Предполагается, что путь CD40-CD154 (CD154 представляет собой CD40L) играет важную роль в патогенезе синдрома Шегрена (SS).
Таким образом, любое моноклональное антитело к CD40, способное блокировать передачу сигналов CD40-CD154, такое как антитело к CD40 с подавленной активностью ADCC, могло бы подходить для лечения SS, такого как первичный синдром Шегрена (pSS).
Не желая ограничиваться теорией, авторы настоящего изобретения идентифицировали, что были необходимы устойчивые концентрации, составляющие по меньшей мере приблизительно 40 мкг/мл, антитела CFZ533 в плазме крови во время поддерживающей схемы для блокирования пути CD40-CD40L в целевой ткани у пациентов с SS, таких как пациенты с pSS. Также, поскольку CFZ533 подвергается опосредованному мишенью расположению (которое связано с целевым метаболизмом и экспрессией), и пациенты с SS характеризуются высокой экспрессией CD40 в организме, была необходима нагрузочная схема в начале лечения для полного насыщения рецепторов CD40 у этих пациентов в состояниях, при которых уровни CD40 были увеличены, что требовало больших доз или схемы с более частым введением в начале лечения. Таким образом, со схемой введения нагрузочной дозы, обеспечивающей в начале лечения (2-3 недели) быстрое насыщение рецепторов CD40, с последующей схемой введения поддерживающей дозы, обеспечивающей на протяжении всего периода лечения устойчивые концентрации в плазме крови, составляющие по меньшей мере 40 мкг/мл или по меньшей мере 100 мкг/мл, в ситуациях, при которых экспрессия CD40 в подвергнутых воздействию тканях увеличилась бы (тяжесть состояния), считается терапевтическим эффектом. Наблюдаемая максимальная концентрация плазмы в установившемся состоянии составляла от приблизительно 300 до 400 мкг/мл (когорта 3; исследование CCFZ533X2203), и в общем была безопасной, и хорошо переносилась без значительного сигнала в отношении того, чтобы предполагать повышенный риск инфекции. Тромбоэмболическое осложнение не наблюдалось.
Подходящая дозировка будет отличаться в зависимости, например, от конкретных подлежащих применению антагонистов пути CD40, например, антитела к CD40 или его антигенсвязывающего фрагмента (например, mAb1, также называемого в данном документе CFZ533, mAb2, ASKP1240) или антитела к CD40L (например, BIIB063) или его антигенсвязывающего фрагмента, субъекта, подлежащего лечению, способа введения, а также характера и тяжести состояния, подлежащего лечению, и характера предшествующего лечения, которое получал пациент. В конечном итоге лечащий врач будет принимать решение в отношении количества антагониста пути CD40, посредством которого следует лечить каждого отдельного пациента. В некоторых вариантах осуществления лечащий врач может вводить низкие дозы антагониста пути CD40 и наблюдать ответ пациента. В других вариантах осуществления начальная(-ые) доза(-ы) антагониста пути CD40, вводимая(-ые) пациенту, является(-ются) высокой(-ими), а затем титруется(-ются) в сторону понижения до появления признаков рецидива. Более высокие дозы антагониста пути CD40 можно вводить до тех пор, пока для пациента не будет достигнут оптимальный терапевтический эффект, а затем дозировку обычно не увеличивают.
При практической реализации некоторых способов лечения или вариантов применения по настоящему изобретению терапевтически эффективное количество антагониста пути CD40, например, антитела к CD40 или его антигенсвязывающего фрагмента (например, mAb1, также называемого в данном документе CFZ533, mAb2, ASKP1240) или антитела к CD40L или его антигенсвязывающего фрагмента, вводят пациенту, например млекопитающему (например, человеку). Хотя понятно, что раскрытые способы обеспечивают лечение пациентов с SS с использованием антагониста пути CD40 (например, mAb1/CFZ533, mAb2, ASKP1240), это не исключает того, что если пациент в конечном итоге получал лечение с помощью антагониста пути CD40, то такая терапия с помощью антагониста пути CD40 является обязательно монотерапией. Действительно, если пациент выбран для лечения с помощью антагониста пути CD40, то антагонист пути CD40 (например, mAb1/CFZ533, mAb2, ASKP1240) может быть введен в соответствии со способами по настоящему изобретению либо отдельно, либо в комбинации с другими средствами и видами терапии.
Будет понятно, что изменения схемы могут быть подходящими для некоторых пациентов с SS, таких как пациенты с pSS, например, пациентов которые проявляют неадекватный ответ на лечение антагонистами пути CD40, например, антителом к CD40 или его антигенсвязывающим фрагментом (например, mAb1, также называемым в данном документе CFZ533, mAb2, ASKP1240) или антителом к CD40L или его антигенсвязывающим фрагментом, подлежащим применению. Таким образом, введение (например, mAb1/CFZ533 или mAb2) может быть более частым, чем ежемесячное введение дозы, например, введение дозы один раз в две недели (каждые две недели) или еженедельное введение доз.
Некоторые пациенты могут получить пользу от нагрузочной схемы (например, еженедельные введения на протяжении нескольких недель [например, 1-4 недели, например, введение дозы в недели 0, 1, 2 и/или 3, как например неделю 2, схема введения нагрузочной дозы в недели 0 и 1] с последующей поддерживающей схемой, начиная, например, с недели 3 или 4, где CFZ533 можно вводить еженедельно, каждые две недели или каждые 4 недели в течение нескольких недель.
Например, подходящей схемой для mAb1/CFZ533 или mAb2 может быть еженедельно в течение нескольких недель [например, 1-4 недель, например, введение в недели 0, 1, 2 и 3] с последующей ежемесячной поддерживающей схемой.
В другом примере подходящей схемой для mAb1/CFZ533 или mAb2 является еженедельно в течение нескольких недель (например, 2-8 недель, как например 3 недель, введение в недели 0, 1, 2) с последующей поддерживающей схемой, предусматривающей введение раз в две недели.
Также будет понятно понимать, что введение (например, mAb1/CFZ533 или mAb2) может осуществляться с меньшей частотой, чем ежемесячное введение, например, введение дозы каждые 6 недель, каждые 8 недель (каждые два месяца), ежеквартально (каждые три месяца) и т. д.
Следует понимать, что повышение дозы на основании тяжести заболевания может быть подходящим для определенных пациентов с SS, таких как пациенты с pSS, например, пациентов которые проявляют неадекватный ответ на лечение антагонистами пути CD40, например, антителом к CD40 или его антигенсвязывающим фрагментом (например, mAb1, также называемым в данном документе CFZ533, mAb2, ASKP1240) или антителом к CD40L или его антигенсвязывающим фрагментом, подлежащим применению. Таким образом, подкожные (s.c.) дозировки (нагрузочные или поддерживающие дозы) могут составлять более чем от приблизительно 150 мг до приблизительно 900 мг s.c., например, приблизительно 75 мг, приблизительно 100 мг, приблизительно 125 мг, приблизительно 175 мг, приблизительно 200 мг, приблизительно 250 мг, приблизительно 350 мг, приблизительно 400 мг, приблизительно 450 мг, приблизительно 500 мг, приблизительно 600 мг и т. д.; подобным образом, внутривенные (i.v.) дозировки могут составлять более чем приблизительно 10 мг/кг, например, приблизительно 11 мг/кг, 12 мг/кг, 15 мг/кг, 20 мг/кг, 25 мг/кг, 30 мг/кг, 35 мг/кг и т. д. Также будет понятно, что снижение дозы также может подходить для определенных пациентов с SS, таких как пациенты с рSS, например, пациентов, которые проявляют побочные эффекты или нежелательный ответ на лечение антагонистом пути CD40 (например, антителом к CD40 или его антигенсвязывающим фрагментом (например, mAb1, также называемым в данном документе CFZ533, mAb2, ASKP1240) или антителом к CD40L или его антигенсвязывающим фрагментом). Таким образом, дозировки антагониста пути CD40 (например, антитела к CD40 или его антигенсвязывающего фрагмента (например, mAb1, также называемого в данном документе CFZ533, mAb2, ASKP1240) или антитела к CD40L или его антигенсвязывающего фрагмента) могут составлять менее чем от приблизительно 150 мг до приблизительно 900 мг s.c., например, приблизительно 25 мг, приблизительно 50 мг, приблизительно 75 мг, приблизительно 100 мг, приблизительно 125 мг, приблизительно 175 мг, приблизительно 200 мг, приблизительно 250 мг, приблизительно 350 мг, приблизительно 400 мг, приблизительно 450 мг, приблизительно 500 мг, приблизительно 600 мг и т. д.
В некоторых вариантах осуществления антагонист CD40, например, антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент (например, mAb1, также называемый в данном документе CFZ533, mAb2, ASKP1240) или антитело к CD40L или его антигенсвязывающий фрагмент можно вводить пациенту в исходной дозе 600 мг, вводимой s.c., и дозу можно затем доводить до 150 мг или 300 мг, доставляемой s.c., если необходимо, как определяется врачом.
В некоторых вариантах осуществления антагонист CD40, например, антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент (например, mAb1, также называемый в данном документе CFZ533, mAb2, ASKP1240) или антитело к CD40L или его антигенсвязывающий фрагмент можно вводить пациенту в исходной дозе 10 мг/кг, вводимой i.v., и доза может быть затем доведена до 150 мг или 300 мг, вводимой s.c., если необходимо, как определяется врачом.
В конкретном варианте осуществления 3 мг/кг CFZ533 вводят s.c. в день 1 (D1), день 15 (D15), D29, D57, D85, D99, D113 и D141.
В другом конкретном варианте осуществления 10 мг/кг CFZ533 вводят i.v. в D1, D15, D29, D57, D85, D99, D113 и D141.
В еще одном конкретном варианте осуществления нагрузочную дозу, которая содержит четыре однократных дозы по 600 мг CFZ533, вводят s.c. один раз в неделю (Q1W), т. е. 600 мг CFZ533 s.c. в D1, D8, D15 и D22, с последующей поддерживающей дозой, которая предусматривает однократные дозы по 300 мг, которую вводят s.c. один раз в неделю (Q1W), т. е. 300 мг CFZ533 s.c. один раз в неделю от D29 до D85.
В другом конкретном варианте осуществления нагрузочную дозу, которая предусматривает одну дозу 10 мг CFZ533 на кг веса субъекта, вводят i.v. один раз в день 1 с последующей поддерживающей дозой, которая предусматривает однократные дозы 300 мг, вводимые s.c. один раз в неделю (Q1W), т. е. 300 мг CFZ533 s.c. один раз в неделю от D8 до D85.
CFZ533 можно вводить ежеквартально, ежемесячно, еженедельно или один раз в две недели, например подкожно, в дозе от приблизительно 75 мг до приблизительно 600 мг или от приблизительно 150 мг до приблизительно 300 мг, подлежащей введению посредством подкожной инъекции, в однократной дозе, составляющей приблизительно 75 мг, приблизительно 150 мг, приблизительно 300 мг, приблизительно 450 мг или приблизительно 600 мг.
CFZ533 можно вводить посредством подкожной инъекции, еженедельно, с нагрузочными дозами от приблизительно 150 мг до приблизительно 600 мг, где нагрузочные дозы вводят в течение 1-4 недель.
Нагрузочную дозу можно также вводить i.v. от приблизительно 10 мг/кг до приблизительно 30 мг/кг. Также нагрузочные дозы можно вводить подкожно еженедельно или один раз в две недели с дозами, составляющими приблизительно 150 мг, 300 мг и/или 600 мг активного ингредиента.
После нагрузочной схемы или введения доз CFZ533 (как например, 150/300/600 мг, вводимых еженедельно или один раз в две недели) предпочтительно следует поддерживающая схема или введение доз, осуществляемое еженедельно, раз в две недели или ежемесячно (каждые четыре недели). Поддерживающая доза составляет предпочтительно 300 мг s.c. еженедельно или один раз в две недели, или 600 мг один раз в две недели, или 600 мг каждые 4 недели.
Антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой CFZ533, его функциональное производное или его биоаналог.
Как определено в данном документе "однократная доза" относится к s.c. дозе, которая может составлять от приблизительно 75 мг до 900 мг, например, от приблизительно 150 мг до приблизительно 600 мг, например, от приблизительно 150 мг до приблизительно 600 мг, например, от приблизительно 300 мг до приблизительно 600 мг или, например, от приблизительно 150 мг до приблизительно 300 мг. Например, однократная s.c. доза составляет приблизительно 75 мг, приблизительно 150 мг, приблизительно 300 мг, приблизительно 350 мг, приблизительно 400 мг, приблизительно 450 мг, приблизительно 500 мг, приблизительно 550 мг, приблизительно 600 мг.
Определения
Используемый в данном документе термин CD40 относится к кластеру дифференцировки 40, также называемому представителем 5 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли. Термин CD40 относится к человеческому CD40, например, как определено в SEQ ID NO: 19, если не указано иное.
Термин "приблизительно" в отношении числового значения х означает, например, +/-10%. При использовании перед числовым диапазоном или перечнем чисел термин "приблизительно" используется в отношении каждого числа в серии, например, фразу "приблизительно 1-5" следует интерпретировать как "приблизительно 1 - приблизительно 5", или, например, фразу "приблизительно 1, 2, 3, 4" следует интерпретировать как "приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4 и т. д."
Слово "фактически" не исключает "полностью", например, композиция, которая "фактически не содержит" Y, может совсем не содержать Y. В случае необходимости слово "фактически" может быть опущено из определения настоящего изобретения.
Термин "содержащий" охватывает "включающий", а также "состоящий", например, композиция, "содержащая" X, может состоять исключительно из X или может включать что-либо дополнительное, например X+Y.
AUC0-t обозначает площадь под кривой зависимости концентрации плазмы крови от времени с начального времени до времени ‘t', где t представляет собой определенный момент времени после введения [масса x время/объем].
AUCtx-ty представляет собой площадь под кривой зависимости концентрации плазмы крови от времени с времени ‘x' до времени ‘y', где ‘время x' и ‘время y' представляют собой определенные моменты времени после введения.
max
C представляет собой наблюдаемый максимум концентрации плазмы крови, следующий за введением лекарственного средства [масса/объем].
min
C представляет собой наблюдаемый минимум концентрации плазмы крови, следующий за введением лекарственного средства.
trough
C представляет собой наблюдаемую концентрацию плазмы перед началом или в конце интервала между введениями доз.
max
T представляет собой время достижения максимальной концентрации после введения лекарственного средства [время].
ss (надпись) указывает на то, что параметр определен в установившемся состоянии.
Используемый в данном документе термин "антитело" или "антитело к CD40" и т. п. относится к целым антителам, которые взаимодействуют с CD40 (например, посредством связывания, стерического препятствования, стабилизации/дестабилизации, пространственного распределения). Встречающееся в природе "антитело" представляет собой гликопротеин, содержащий по меньшей мере две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные между собой с помощью дисульфидных связей. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращено в данном документе как VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов - CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращено в данном документе как VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена CL. VH- и VL-области могут дополнительно подразделяться на области гипервариабельности, обозначаемые как определяющие комплементарность области (CDR), разделенные областями, которые являются более консервативными, обозначенными как каркасные области (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями хозяина или факторами, включающими различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (Clq) классической системы комплемента. Термин "антитело" подразумевает, например, моноклональные антитела, антитела человека, гуманизированные антитела, антитела верблюдовых или химерные антитела. Антитела могут относиться к любому изотипу (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), классу (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подклассу, предпочтительно к IgG и наиболее предпочтительно к IgG1. Иллюстративное антитело предусматривает CFZ533 (в данном документе также обозначено как mAb1) и mAb2, как представлено в таблице 1.
Как легкая, так и тяжелая цепи подразделяются на области структурной и функциональной гомологии. Термины "константный" и "вариабельный" используются в функциональном смысле. В связи с этим следует понимать, что вариабельные домены из частей как легкой (VL), так и тяжелой (VH) цепей определяют распознавание антигена и специфичность. Напротив, константные домены легкой цепи (CL) и тяжелой цепи (CH1, CH2 или CH3) придают важные биологические свойства, такие как секреция, перенос через плаценту, связывание с рецептором Fc, связывание с комплементом и т. п. Принято, что номера доменов константной области увеличиваются по мере их удаления от антигенсвязывающего участка или аминоконца антитела. N-конец представляет собой вариабельную область, и C-конец представляет собой константную область; домены CH3 и CL фактически содержат С-конец тяжелой и легкой цепей, соответственно. В частности, термин "антитело" специфически включает формат IgG-scFv.
Термин "антигенсвязывающая часть" антитела (или просто "антигенная часть"), используемый в данном документе, относится к полноразмерному или одному или более фрагментам антитела, таким как белок, который сохраняет способность специфически связываться с антигеном или эпитопом (например, часть CD40).
"Определяющие комплементарность области" ("CDR") представляют собой аминокислотные последовательности с границами, определенными с использованием любой из ряда широко известных схем, в том числе описанных в Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (схема нумерации "Kabat"), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948 (схема нумерации "Chothia") и нумерации ImMunoGenTics (IMGT) (Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003) (схема нумерации "IMGT"). Согласно IMGT CDR-области антитела можно определять с использованием программы IMGT/DomainGapAlign.
Термин "эпитоп", используемый в данном документе, относится к любой детерминанте, способной связываться с высокой аффинностью с иммуноглобулином. Эпитоп представляет собой область антигена, связанную антителом, которое специфически целенаправленно воздействует на данный антиген, и в случае если антиген представляет собой белок, эпитоп включает в себя специфические аминокислоты, которые непосредственно контактируют с антителом. Наиболее часто эпитопы локализуются на белках, однако в некоторых случаях могут локализоваться на молекулах других видов, таких как нуклеиновые кислоты. Эпитопные детерминанты могут включать в себя химически активные поверхностные группировки молекул, такие как аминокислоты, боковые цепи сахаров, фосфориловые или сульфониловые группы, и могут иметь специфические характеристики трехмерной структуры и/или специфические характеристики заряда. Кроме того, хотя два домена VL и VH Fv-фрагмента кодируются отдельными генами, - они могут быть объединены с применением рекомбинантных способов с помощью синтетического линкера, который дает возможность преобразовать их в единую белковую цепь, в которой области VL и VH спариваются с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечные Fv (scFv); см., например, Bird et al., 1988 Science 242:423-426 и Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883).
in vitro
in vivo
in vivo
Фраза "выделенное антитело", используемая в данном документе, относится к антителу, которое фактически не содержит других антител, характеризующихся отличающейся антигенной специфичностью (например, выделенное антитело, которое специфически связывает CD40, фактически не содержит других антител, которые специфически связывают антигены, отличные от CD40). Выделенное антитело, которое специфически связывает CD40, может, однако, характеризоваться перекрестной реактивностью по отношению к другим антигенам, таким как молекулы CD40 из других видов. Более того, выделенное антитело может фактически не содержать другого клеточного материала и/или химических веществ. Используемые в данном документе термины "моноклональное антитело" или "композиция на основе моноклональных антител" относятся к препарату из молекул антитела одного молекулярного состава. Подразумевается, что термин "человеческое антитело", используемый в данном документе, включает антитела, имеющие вариабельные области, в которых как каркасные, так и CDR-области получены из последовательностей, происходящих из человека. "Человеческое антитело" не обязательно должно вырабатываться человеком, тканью человека или клеткой человека. Человеческие антитела по настоящему изобретению могут включать в себя аминокислотные остатки, не кодируемые человеческими последовательностями (например, мутации, введенные с помощью случайного или сайт-специфического мутагенеза , с помощью добавления N-нуклеотидов в местах соединения  во время рекомбинации генов антител или с помощью соматической мутации ).
"Идентичность" в отношении нативного полипептида и его функционального производного определяется в данном документе как процентное содержание аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые идентичны остаткам соответствующего нативного полипептида после выравнивания последовательностей и введения гэпов, при необходимости, для достижения максимальной процентной идентичности, и не учитывая при этом любые консервативные замены как часть идентичности последовательностей. Ни N- или C-концевые удлинения, ни вставки не должны рассматриваться как уменьшение идентичности. Способы и компьютерные программы для выравнивания хорошо известны. Процент идентичности можно определить с помощью стандартных алгоритмов выравнивания, например, с помощью средства поиска основного локального выравнивания (BLAST), описанного Altshul et al. ((1990) J. Mol. Biol., 215: 403 410); алгоритма Needleman et al. ((1970) J. Mol. Biol., 48: 444 453) или алгоритма Meyers et al. ((1988) Comput. Appl. Biosci., 4: 11 17). Набором параметров может служить матрица весов Blossum 62 со штрафом за гэп 12, штрафом за продление гэпа 4 и штрафом за сдвиг рамки гэпа 5. Процент идентичности между двумя аминокислотными или нуклеотидными последовательностями можно определить с помощью алгоритма E. Meyers and W. Miller ((1989) CABIOS, 4:11-17), который был включен в программу ALIGN (версия 2.0) с использованием таблицы весов замен остатков PAM120, штрафа за продление гэпа 12 и штрафа за гэп 4.
Термин "аминокислота(-ы)" относится, например, ко всем встречающимся в природе L-α-аминокислотам и включает D-аминокислоты. Фраза "вариант аминокислотной последовательности" относится к молекулам с некоторыми отличиями в их аминокислотных последовательностях по сравнению с последовательностями в соответствии с настоящим изобретением. Варианты аминокислотной последовательности антитела в соответствии с настоящим изобретением, например, указанной последовательности, все еще обладают способностью связывать CD40 человека. Варианты аминокислотной последовательности включают варианты с заменой (те, в которых был удален по меньшей мере один аминокислотный остаток и другая аминокислота вставлена на его место в то же положение в полипептиде в соответствии с настоящим изобретением), варианты со вставкой (варианты с одной или несколькими аминокислотами, вставленными в непосредственной близости от аминокислоты в определенном положении в полипептиде в соответствии с настоящим изобретением) и варианты с делецией (те, в которых одна или несколько аминокислот удалены в полипептиде в соответствии с настоящим изобретением).
каппа/лямбда
Термин "Fc-область", используемый в данном документе, относится к полипептиду, содержащему CH3, CH2 и по меньшей мере часть шарнирной области константного домена антитела. Fc-область может необязательно включать в себя CH4-домен, присутствующий у некоторых классов антител. Fc-область может содержать всю шарнирную область константного домена антитела. В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предусмотрены Fc-область и CH1-область антитела. В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предусмотрены Fc-область и CH3-область антитела. В другом варианте осуществления в настоящем изобретении предусмотрены Fc-область, CH1-область и С-область константного домена антитела. В одном варианте осуществления связывающая молекула по настоящему изобретению содержит константную область, например, константную область тяжелой цепи. В одном варианте осуществления такая константная область является модифицированной по сравнению с константной областью дикого типа. Иными словами, полипептиды по настоящему изобретению, раскрытые в данном документе, могут содержать изменения или модификации одного или нескольких из трех константных доменов тяжелой цепи (CH1, CH2 или CH3) и/или домена константной области легкой цепи (CL). Примеры модификаций включают добавления, делеции или замены одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких доменах. Такие изменения могут быть включены с целью оптимизации эффекторной функции, периода полужизни и т. д.
D
D
-8
-9
-10
-11
-12
-13
-7
-8
Используемый в данном документе термин "аффинность" относится к силе взаимодействия между антителом и антигеном в отдельных антигенных сайтах. В пределах каждого антигенного сайта вариабельная область "плеча" антитела взаимодействует с антигеном через слабые нековалентные силы во многих участках; при этом чем больше взаимодействий - тем сильнее аффинность. В контексте настоящего документа термин "высокая аффинность" в отношении антитела IgG или его фрагмента (например, Fab-фрагмента) относится к антителу, которое характеризуется K, составляющей 10 M или меньше, 10 M или меньше, или 10 M, или 10 M или меньше, или 10 M или меньше, или 10 M или меньше для целевого антигена. Однако высокоаффинное связывание может 10-кратно варьировать для других изотипов антител. Например, высокоаффинное связывание для изотипа IgM относится к антителу, которое характеризуется K, составляющей 10 M или меньше или 10 M или меньше.
D
Предполагается, что используемый в данном документе термин "антитело или белок, который специфически связывается с полипептидом CD40" относится к антителу или белку, которые связываются с полипептидом CD40 человека с K, составляющей 100 нМ или меньше, 10 нМ или меньше, 1 нМ или меньше.
D
D
D
D
Предполагается, что антитело, которое "перекрестно реагирует с антигеном, отличным от CD40" относится к антителу, которое связывает этот антиген с K, составляющей приблизительно 1 мкM или меньше, 100 нМ или меньше, 10 нМ или меньше, 1 нМ или меньше. Предполагается, что антитело, которое "не реагирует перекрестно с конкретным антигеном", относится к антителу, которое связывается с этим антигеном с K, составляющей 100 нM или больше, или K, составляющей 1 мкM или больше, или K, составляющей 10 мкМ или больше. В некоторых вариантах осуществления такие антитела, которые не реагируют перекрестно с антигеном, проявляют практически невыявляемое связывание с этими белками в стандартных анализах связывания.
assoc
a
dis
d
Предполагается, что термины "K" или "K", используемые в данном документе, относятся к скорости ассоциации для конкретного взаимодействия антитело-антиген, тогда как термины "K" или "K", используемые в данном документе, как предполагается, относятся к скорости диссоциации для конкретного взаимодействия антитело-антиген.
D
d
a
d
a
D
D
Предполагается, что термин "K", используемый в данном документе, относится к константе диссоциации, которая получена из соотношения K и K (т. е. K/K) и которая выражена в виде молярной концентрации (М). Значения K для антител можно определить с помощью способов, хорошо известных из уровня техники. Способ определения K антитела осуществляют с помощью поверхностного плазмонного резонанса или с помощью биосенсорной системы, такой как система Biacore.
Используемый в данном документе термин "ADCC" или "антителозависимая клеточная цитотоксическая" активность относится к активности, истощающей клетки. Активность ADCC может быть измерена с помощью анализа ADCC, как широко известно специалисту в данной области.
Используемый в данном документе термин "подавленное" антитело относится к антителу, которое не проявляет или проявляет низкую активность ADCC, что измерено в анализе ADCC.
В одном варианте осуществления термин "отсутствующая или низкая активность ADCC" означает, что подавленное антитело проявляет активность ADCC, которая ниже 50% специфического клеточного лизиса, например, ниже 10% специфического клеточного лизиса, как измерено в стандартном анализе ADCC. Отсутствующая активность ADCC означает то, что подавленное антитело проявляет активность ADCC (специфический клеточный лизис), которая ниже 1%.
Подавленные эффекторные функции могут быть получены посредством мутации в Fc-области антител и были описаны в уровне техники: LALA и N297A (Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. vol. 20(6):685-691) и D265A (Baudino et al., 2008, J. lmmunol. 181:6664-69; Strohl, W., выше). Примеры антител с Fc-доменом IgG1 с подавленной активностью включают так называемый мутантный LALA, содержащий мутации L234A и L235A в аминокислотной последовательности Fc-домена IgG1. Другой пример подавленного антитела IgG1 содержит мутацию D265A. Другое подавленное антитело IgG1 содержит мутацию N297A, которая дает в результате агликозилированные/негликозилированные антитела.
Термин "лечение" или "лечить" в данном документе определен как применение или введение субъекту антитела к CD40 или белка в соответствии с настоящим изобретением, например антитела mAb1 или mAb2, или применение или введение фармацевтической композиции, содержащей указанное антитело к CD40 или белок по настоящему изобретению, в выделенную ткань или клеточную линию, полученные из субъекта, где у субъекта имеется аутоиммунное заболевание и/или воспалительное заболевание, симптом, связанный с аутоиммунным заболеванием и/или воспалительным заболеванием, или предрасположенность к развитию аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания, где целью является ослабление тяжести, уменьшение интенсивности или улучшение течения аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания, любых ассоциированных симптомов аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания или предрасположенности к развитию аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания.
Термин "лечение" предназначен также для обозначения применения или введения субъекту фармацевтической композиции, содержащей антитела к CD40 или белок по настоящему изобретению, например антитела mAb1 или mAb2, или применение или введение фармацевтической композиции, содержащей указанное антитело к CD40 или белок по настоящему изобретению, в выделенную ткань или клеточную линию, полученные от субъекта, где у субъекта имеется аутоиммунное заболевание и/или воспалительное заболевание, симптом, ассоциированный с аутоиммунным заболеванием и/или воспалительным заболеванием, или предрасположенность к развитию аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания, где целью является ослабление тяжести, уменьшение интенсивности или улучшение течения аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания, любых ассоциированных симптомов аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания, или предрасположенности к развитию аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания.
Термин "предупреждать" или "предупреждающий" относится к профилактическому или предупреждающему лечению; он относится к задержке начала или предупреждению начала заболевания, нарушений и/или симптомов, ассоциированных с ним.
Как используется в данном документе, субъект "нуждается в" лечении, если в результате такого лечения такой субъект получил бы пользу с биологической, медицинской точки зрения, или с точки зрения улучшения качества его жизни.
Термин "фармацевтически приемлемый" означает нетоксичный материал, который не влияет на эффективность биологической активности активного(-ых) вещества(-ств).
Используемый в данном документе термин "вводят" или "введение" рассматриваемого соединения означает предоставление соединения по настоящему изобретению и его пролекарств субъекту, нуждающемуся в лечении. Введение "в комбинации с" одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами включает одновременное (конкурентное) и последовательное введение в любом порядке и любым путем введения. Одно введение может представлять собой однократную инъекцию или многократную инъекцию, доставляемые совместно друг с другом, в зависимости от того, какое количество лекарственного средства должно вводиться для достижения терапевтического эффекта.
Используемый в данном документе термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству антитела к CD40 или его антигенсвязывающего фрагмента, например mAb1, которое эффективно при введении в виде одной или нескольких доз пациенту (такому как человек) для лечения, предупреждения, предотвращения начала развития, излечения, отсрочки, уменьшения тяжести, улучшения по меньшей мере одного симптома расстройства или рецидивирующего расстройства или продления выживаемости пациента сверх ожидаемого в отсутствие такого лечения. В случае применения в отношении индивидуального активного компонента (например, антитела к CD40, например mAb1), вводимого отдельно, данный термин относится только к этому компоненту. В случае использования в отношении к комбинации, термин относится к объединенным количествам активных компонентов, которые приводят в результате к терапевтическому эффекту, независимо от того, вводят ли их в комбинации, последовательно или одновременно.
Фраза "терапевтическая схема" означает схему, применяемую для лечения заболевания, например, протокол введения доз, применяемый во время лечения SS, такого как pSS. Терапевтическая схема может включать нагрузочную схему (или введение нагрузочной дозы) с последующей поддерживающей схемой (или введение поддерживающей дозы).
Фраза "нагрузочная схема" или "нагрузочный период" относится к схеме лечения (или части схемы лечения), которую применяют для начального лечения заболевания. В некоторых вариантах осуществления в раскрытых способах, вариантах применения, наборах, процессах и схемах (например, способах лечения SS) используется нагрузочная схема (или введение нагрузочной дозы). В некоторых случаях нагрузочный период представляет собой период, который длится до тех пор, пока не будет достигнута максимальная эффективность. Общая цель нагрузочной схемы заключается в обеспечении высокого уровня лекарственного средства пациенту в течение начального периода схемы лечения. Нагрузочная схема может включать введение большей дозы лекарственного средства, чем врач назначал бы во время поддерживающей схемы, введение лекарственного средства чаще, чем врач вводил бы лекарственное средство во время поддерживающей схемы, или и то, и другое. Повышение дозы может происходить во время или после нагрузочной схемы.
Фраза "поддерживающая схема" или "поддерживающий период" относится к схеме лечения (или части схемы лечения), которую применяют для поддержки пациента во время лечения заболевания, например, для поддержания пациента в состоянии ремиссии в течение длительного периода времени (месяцев или лет) после нагрузочной схемы или периода. В некоторых вариантах осуществления в раскрытых способах, вариантах применения и схемах используют поддерживающую схему. В поддерживающей схеме можно использовать непрерывную терапию (например, введение лекарственного средства через равные промежутки времени, например, еженедельно, один раз в две недели или ежемесячно (каждые 4 недели), ежегодно и т. д.) или прерывистую терапию (например, прерванное лечение, прерывистую терапию, лечение при рецидиве или лечение по достижении заранее определенного конкретного критерия [например, боли, проявлений заболевания и т. д.]). Повышение дозы может происходить во время поддерживающей схемы.
Фразу "средства для введения" используют для определения любого доступного инструмента для системного введения лекарственного средства пациенту, включая без ограничения предварительно заполненный шприц, флакон и шприц, шприц-ручку, автоинжектор, i.v. капельницу и мешок, насос, пластырь и т. д. С помощью таких изделий пациент может самостоятельно вводить лекарственное средство (т. е. вводить лекарственное средство себе самостоятельно) или врач может вводить лекарственное средство.
Пример 1. Антитела к CD40
mAb к CD40 с подавленной активностью ADCC раскрыты в патентах US8828396 и US9221913, включенных в данных документ посредством ссылки в их полном объеме. Предполагается, что mAb к CD40 с подавленной активностью ADCC характеризуются улучшенным профилем безопасности относительно других антител к CD40, и в частности могут быть более подходящими для неонкологических показаний, таких как синдром Шегрена (SS) и, в частности, первичный синдром Шегрена (pSS).
В соответствии с гипотезой несвязывания от авторов настоящего изобретения, два mAb из патентов US8828396 и US9221913, обозначенных mAb1 и mAb2, считаются подходящими соединениями для лечения SS. В частности, предпочтительным является антитело mAb1, также называемое CFZ533.
in vitro
in vivo
mAb1 ингибирует CD154-индуцированную активацию  и зависимое от T-клеток образование антител и образование зародышевого центра . У пациентов с pSS блокада CD40 с помощью mAb1 продемонстрировала новый метод лечения (пример 7).
Чтобы дать возможность специалисту в данной области применять настоящее изобретение на практике, аминокислотная и нуклеотидная последовательности mAb1 и mAb2 приведены в таблице 1 ниже.
Другое mAb к CD40, известное из уровня техники, представляет собой ASKP1240 от Astellas Pharma/Kyowa Hakko Kirin Co, как описано, например, в US8568725B2, который включен в данный документ посредством ссылки.
Еще одно mAb к CD40, известное из уровня техники, представляет собой BI655064 от Boehringer Ingelheim, как описано, например, в US8591900, который включен в данный документ посредством ссылки.
Дополнительное mAb к CD40, известное из уровня техники, представляет собой FFP104 от Fast Forward Pharmaceuticals, как описано, например, в US8669352, который включен в данный документ посредством ссылки.
Другим методом лечения мог бы быть MEDI4920 от AstraZeneca, который представляет собой слитый белок Tn3 и антитела к CD40L, или антитело к CD40L BIIB063 от Biogen.
Антитела с аналогичным механизмом действия, как у вышеуказанных антител, так называемые биоаналоги, также охвачены настоящим изобретением, что будет понятно специалисту в данной области.
Таблица 1. Таблица последовательностей
SEQ ID NO:
Описание последовательности
Подробная аминокислотная или нуклеотидная последовательности
1
HCDR1 mAb 1 и mAb2 (Kabat)
SYGMH
2
HCDR2 mAb 1 и mAb2 (Kabat)
VISYEESNRYHADSVKG
3
HCDR3 mAb 1 и mAb2 (Kabat)
DGGIAAPGPDY
4
LCDR1 mAb 1 и mAb2 (Kabat)
RSSQSLLYSNGYNYLD
5
LCDR2 mAb 1 и mAb2 (Kabat)
LGSNRAS
6
LCDR3 mAb 1 и mAb2 (Kabat)
MQARQTPFT
7
Вариабельная область тяжелой цепи mAb1 и mAb2
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYEESNRYHADSVKGRFTISRDNSKITLYLQMNSLRTEDTAVYYCARDGGIAAPGPDYWGQGTLVTVSS
8
Вариабельная область легкой цепи mAb1 и mAb2
DIVMTQSPLSLTVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNYLDWYLQKPGQSPQVLISLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQARQTPFTFGPGTKVDIR
9
Полноразмерная тяжелая цепь mAb1
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYEESNRYHADSVKGRFTISRDNSKITLYLQMNSLRTEDTAVYYCARDGGIAAPGPDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
10
Полноразмерная легкая цепь mAb1
DIVMTQSPLSLTVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNYLDWYLQKPGQSPQVLISLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQARQTPFTFGPGTKVDIRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
11
Полноразмерная тяжелая цепь mAb2
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYEESNRYHADSVKGRFTISRDNSKITLYLQMNSLRTEDTAVYYCARDGGIAAPGPDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
12
Полноразмерная легкая цепь mAb2
DIVMTQSPLSLTVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNYLDWYLQKPGQSPQVLISLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQARQTPFTFGPGTKVDIRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
13
Fc-область mAb1
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
14
Fc-область mAb2
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
15
ДНК, кодирующая полноразмерную тяжелую цепь mAb1
CAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGCCGGTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACGGCATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGGCCGTGATCTCCTACGAGGAATCCAACAGATACCACGCTGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACAATCTCCCGGGACAACTCCAAGATCACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGACCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGACGGAGGAATCGCCGCTCCTGGACCTGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCCGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCCTCCAGCAAGTCCACCTCTGGCGGCACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAAGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCCTCTAGCTCTCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAACCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAACTGCTGGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTACGCCTCCACCTACCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCACAGGTGTACACACTGCCCCCCAGCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGCAAG
16
ДНК, кодирующая полноразмерную легкую цепь mAb1
GACATCGTGATGACCCAGTCCCCCCTGTCCCTGACCGTGACACCTGGCGAGCCTGCCTCTATCTCCTGCAGATCCTCCCAGTCCCTGCTGTACTCCAACGGCTACAACTACCTGGACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCACAGGTGCTGATCTCCCTGGGCTCCAACAGAGCCTCTGGCGTGCCCGACCGGTTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTCACACTGAAGATCTCACGGGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCATGCAGGCCCGGCAGACCCCCTTCACCTTCGGCCCTGGCACCAAGGTGGACATCCGGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC
17
ДНК, кодирующая полноразмерную тяжелую цепь mAb2
CAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGCCGGTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACGGCATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGGCCGTGATCTCCTACGAGGAATCCAACAGATACCACGCTGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACAATCTCCCGGGACAACTCCAAGATCACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGACCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGACGGAGGAATCGCCGCTCCTGGACCTGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCCGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCCTCCAGCAAGTCCACCTCTGGCGGCACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAAGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCCTCTAGCTCTCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAACCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAACTGCTGGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGCCGTGTCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCACAGGTGTACACACTGCCCCCCAGCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGCAAG
18
ДНК, кодирующая полноразмерную легкую цепь mAb2
GACATCGTGATGACCCAGTCCCCCCTGTCCCTGACCGTGACACCTGGCGAGCCTGCCTCTATCTCCTGCAGATCCTCCCAGTCCCTGCTGTACTCCAACGGCTACAACTACCTGGACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCACAGGTGCTGATCTCCCTGGGCTCCAACAGAGCCTCTGGCGTGCCCGACCGGTTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTCACACTGAAGATCTCACGGGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCATGCAGGCCCGGCAGACCCCCTTCACCTTCGGCCCTGGCACCAAGGTGGACATCCGGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC
19
Аминокислотная последовательность CD40 человека
MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRLRALVVIPIIFGILFAILLVLVFIKKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ
В одном варианте осуществления предусмотрено антитело к CD40, при этом указанное антитело содержит VH-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, и VL-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8.
В одном варианте осуществления предусмотрено антитело к CD40, при этом указанное антитело содержит VH-домен иммуноглобулина, содержащий гипервариабельные области, представленные под SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, и VL-домен иммуноглобулина, содержащий гипервариабельные области, представленные под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6.
В одном варианте осуществления предусмотрено антитело к CD40, при этом указанное антитело содержит VH-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, и VL-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, и Fc-область под SEQ ID NO: 13.
В одном варианте осуществления предусмотрено антитело к CD40, при этом указанное антитело содержит VH-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, и VL-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, и Fc-область под SEQ ID NO: 14.
В одном варианте осуществления предусмотрено антитело к CD40, при этом указанное антитело содержит Fc-область IgG1 с подавленной активностью.
В предпочтительном варианте осуществления предусмотрено антитело к CD40, обозначенное как mAb1. В частности, mAb1 содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO: 9 и аминокислотную последовательность легкой цепи под SEQ ID NO: 10; и mAb2 содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO: 11 и аминокислотную последовательность легкой цепи под SEQ ID NO: 12.
1. Экспрессионные системы
Для экспрессии легкой и тяжелой цепей, вектор(-ы) экспрессии, кодирующий(-ие) тяжелую и легкую цепи, трансфицировали в клетку-хозяина с помощью стандартных методик. Предполагается, что различные формы термина "трансфекция" предназначены для охватывания широкого разнообразия методик, обычно применяемых для введения экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, например, электропорация, осаждение фосфатом кальция, трансфекция DEAE-декстраном и т. п. Теоретически возможно экспрессировать антитела по настоящему изобретению либо в прокариотических, либо в эукариотических клетках-хозяевах. Рассматривается экспрессия антител в эукариотических клетках, например, в клетках-хозяевах млекопитающих, дрожжей или нитчатых грибов, поскольку такие эукариотические клетки, и в частности клетки млекопитающих, с большей вероятностью, чем прокариотические клетки, собирают и секретируют правильно свернутое и иммунологически активное антитело.
В частности, вектор клонирования или экспрессии может содержать по меньшей мере одну из следующих кодирующих последовательностей (a)-(b), функционально связанных с подходящей промоторной последовательностью:
(a) SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16, кодирующих соответственно полноразмерную тяжелую и легкую цепи mAb1; или
(b) SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18, кодирующих соответственно полноразмерную тяжелую и легкую цепи mAb2.
Клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител по настоящему изобретению включают клетки яичника китайского хомяка (клетки CHO) (включая клетки dhfr-CHO, описанные в Urlaub and Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, используемые с селектируемыми маркерами DH FR, например, как описано в R.J. Kaufman and P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621), CHOK1 dhfr+ клеточные линии, клетки миеломы NSO, клетки COS и клетки SP2. В частности, для использования с клетками миеломы NSO, другой системой экспрессии является система экспрессии гена GS, показанная в публикациях согласно PCT WO 87/04462, WO 89/01036 и EP0338841.
В случае если рекомбинантные векторы экспрессии, кодирующие гены антитела, вводят в клетки-хозяева млекопитающих, антитела получают путем культивирования клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для обеспечения возможности экспрессии антитела в клетках-хозяевах или секреции антитела в культуральную среду в которой выращивают клетки-хозяева. Антитела могут быть восстановлены из культуральной среды с применением стандартных способов очистки белков (см. например Abhinav et al. 2007, Journal of Chromatography 848: 28-37).
Клетки-хозяева могут культивироваться в подходящих условиях для экспрессии и продуцирования mAb1 или mAb2.
2. Фармацевтические композиции
Терапевтические антитела обычно составляют либо в водной форме, готовой для введения, либо в виде лиофилизата для разбавления подходящим разбавителем перед введением. Антитело к CD40 может быть составлено либо как лиофилизат, либо как водная композиция, например, в предварительно заполненных шприцах. Состав также называют лекарственным продуктом (DP).
Подходящий состав может обеспечить водную фармацевтическую композицию или лиофилизат, которые могут быть восстановлены с получением раствора с высокой концентрацией активного ингредиента антитела и низким уровнем агрегации антитела для доставки пациенту. Высокие концентрации антитела пригодны, поскольку они уменьшают количество материала, который должен быть доставлен пациенту. Уменьшенные объемы введения доз минимизируют время, необходимое для доставки пациенту фиксированной дозы. Водные композиции по настоящему изобретению с высокой концентрацией антител к CD40, в частности, являются подходящими для подкожного введения.
Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает водную фармацевтическую композицию, подходящую для введения субъекту, например для подкожного введения, содержащую антитело к CD40, такое как mAb1 или mAb2.
Антитело к CD40 может применяться как фармацевтическая композиция в случае объединения с фармацевтически приемлемым носителем. Помимо антитела к CD40, такого как mAb1 или mAb2, такая композиция может содержать носители, различные разбавители, наполнители, соли, буферы, стабилизаторы, солюбилизаторы и другие материалы, хорошо известные из уровня техники. Характеристики носителя будут зависеть от пути введения. Фармацевтические композиции для применения в раскрытых способах также могут содержать дополнительные терапевтические средства для лечения конкретного целевого нарушения.
В одном конкретном варианте осуществления композиция, также называемая лекарственным продуктом (DP) представляет собой лиофилизированный состав, полученный из водного состава, характеризующийся pH 6,0 и содержащий:
(i) 150 мг/мл mAb1 или mAb2;
(ii) 270 мM сахарозы в качестве стабилизатора;
(iii) 30 мM L-гистидина в качестве буферного средства и
(iv) 0,06% полисорбата 20 в качестве поверхностно-активного вещества.
В другом конкретном варианте осуществления фармацевтическая композиция, также называемая лекарственным продуктом (DP), представляет собой водную фармацевтическую композицию, характеризующуюся pH 6,0 и содержащую:
(i) 150 мг/мл mAb1 или mAb2;
(ii) 270 мM сахарозы в качестве стабилизатора;
(iii) 30 мM L-гистидина в качестве буферного средства и
(iv) 0,06% полисорбата 20 в качестве поверхностно-активного вещества.
3. Путь введения
Как правило, антитела или белки вводят с помощью инъекции, например, либо внутривенно, внутрибрюшинно, либо подкожно. Способы осуществления этого введения известны специалистам обычной квалификации в данной области. Также возможным является получение композиции, которую можно вводить местно или перорально, или которая может быть способна к проникновению через слизистые оболочки. Как будет понятно специалисту в данной области, могут использоваться любые подходящие средства для введения, подходящие для конкретного выбранного пути введения.
Примеры возможных путей введения включают парентеральный, (например, внутривенный (I.V. или IV), внутримышечный (IM), внутрикожный, подкожный (S.C. или SC) или инфузию), пероральный и легочный (например, ингаляция), назальный, трансдермальный (местный), чресслизистое и ректальное введение. Растворы или суспензии, используемые для парентерального, внутрикожного или подкожного применения, могут включать следующие компоненты: стерильный разбавитель, такой как вода для инъекции, солевой раствор, нелетучие масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные средства, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие средства, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и средства для регуляции тонуса, такие как хлорид натрия или декстроза. Уровень pH можно регулировать с помощью кислот или оснований, таких как хлористоводородная кислота или гидроксид натрия. Препарат для парентерального введения можно заключать в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы для многоразовых доз, сделанные из стекла или пластика.
Терапия с помощью антител к CD40 может быть инициирована введением субъекту нагрузочной схемы или введением нагрузочной дозы антитела или белка по настоящему изобретению, нуждающемуся в терапии с помощью антител к CD40. Под термином "нагрузочная(-ые) доза(-ы)" предполагается начальное введение дозы антитела к CD40 или белка по настоящему изобретению, которую вводят субъекту один или несколько раз, где доза вводимого антитела или белка по настоящему изобретению находится в диапазоне высоких доз (т. е. от приблизительно 10 мг/кг до приблизительно 50 мг/кг, как например, приблизительно 30 мг/кг внутривенно, или приблизительно 600 мг, или приблизительно 300 мг, или приблизительно 150 мг еженедельно, один раз в две недели в течение не более 4 недель). "Введение нагрузочной дозы" можно осуществлять в виде однократного введения или многократного введения, например, в виде однократной(-ых) или многократной(-ых) внутривенной(-ых) инфузии(-й), или в качестве подкожных введений, объединенных в схему "введения нагрузочной дозы", в зависимости от тяжести заболевания. При последующих введениях субъекту "нагрузочной схемы" затем вводят одну или несколько дополнительных терапевтически эффективных доз антитела к CD40 или белка по настоящему изобретению. Последующие терапевтически эффективные дозы можно вводить, например, в соответствии с еженедельным режимом введения доз, или один раз каждые две недели (один раз в две недели), один раз каждые три недели или один раз каждые четыре недели. В таких вариантах осуществления последующие терапевтически эффективные дозы, как правило, находятся в диапазоне низких доз (т. е. от приблизительно 0,003 мг/кг до приблизительно 30 мг/кг, как например, приблизительно 10 мг/кг, например, 10 мг/кг IV или приблизительно 150 мг, приблизительно 300 мг или приблизительно 600 мг, вводимые еженедельно, один раз в две недели или каждые 4 недели подкожно).
В качестве альтернативы, в некоторых вариантах осуществления после "нагрузочной схемы" последующие терапевтически эффективные дозы антитела к CD40 или белка по настоящему изобретению вводят в соответствии с "поддерживающей схемой", где терапевтически эффективную дозу антитела или белка по настоящему изобретению вводят один раз в месяц, один раз каждые 6 недель, один раз каждые два месяца, один раз каждые 10 недель, один раз каждые три месяца, один раз каждые 14 недель, один раз каждые четыре месяца, один раз каждые 18 недель, один раз каждые пять месяцев, один раз каждые 22 недели, один раз каждые шесть месяцев, один раз каждые 7 месяцев, один раз каждые 8 месяцев, один раз каждые 9 месяцев, один раз каждые 10 месяцев, один раз каждые 11 месяцев или один раз каждые 12 месяцев. В таких вариантах осуществления терапевтически эффективные дозы антитела к CD40 или белка по настоящему изобретению находятся в диапазоне низких доз (т. е. от приблизительно 0,003 мг/кг до приблизительно 30 мг/кг, как например, приблизительно 10 мг/кг, например 10 мг/кг), в частности, в случае если последующие дозы вводят в более частые промежутки времени, например, еженедельно, от одного раза каждые две недели до одного раза каждые четыре недели, или в диапазоне высоких доз (т. е. от 10 мг/кг до 50 мг/кг, как например 30 мг/кг), в частности, в случае если последующие дозы вводят в менее частые промежутки времени, например, где последующие дозы вводят от одного раза в месяц до одного раза в 12 месяцев.
Время введения доз, как правило, измеряют с дня введения первой дозы активного соединения (например, mAb1), который также известен как "исходный уровень". Однако, разные лечащие врачи используют различные условные названия.
Примечательно, что неделя ноль может некоторыми лечащими врачами называться неделей 1, в то время как день ноль может некоторыми лечащими врачами называться первым днем. Таким образом, возможно, что разные врачи обозначат, например, дозу, подлежащую введению в течение недели 3/в день 21, в течение недели 3/в день 22, в течение недели 4/в день 21, в течение недели 4/в день 22, ссылаясь при этом на тот же самый режим введения доз. Для соответствия, первая неделя введения доз будет называться в данном документе как неделя 0, при этом первый день введения доз будет называться день 1. Однако, специалисту в данной области будет понятно, что это условное название используется просто для соответствия и не должно рассматриваться как ограничивающее, т. е. еженедельное введение доз представляет собой предоставление еженедельной дозы антитела к CD40, например mAb1, вне зависимости от того, упоминает ли врач конкретную неделю как "неделю 1" или "неделю 2". Пример схем дозировок, указанных в данном документе, изображен на фигуре 1 и 2. Следует понимать, что введение дозы не должно обеспечиваться в точный момент времени, например, дозу, которая должна вводиться примерно в день 29, можно было бы вводить, например, в дни от 24 до 34, например день 30, до тех пор, пока ее введение обеспечивается в подходящую неделю.
Используемая в данном документе фраза "контейнер, содержащий достаточное количество антитела к CD40 для обеспечения доставки [определенной дозы]" используется для обозначения того, что данный контейнер (например, флакон, ручка, шприц) вмещает в себе объем антитела к CD40 (например, в качестве части фармацевтической композиции), который можно использовать для обеспечения требуемой дозы. В качестве примера, если требуемая доза составляет 500 мг, тогда врач-клиницист может использовать 2 мл из контейнера, который содержит состав на основе антитела к CD40 с концентрацией 250 мг/мл, 1 мл из контейнера, который содержит состав на основе антитела к CD40 с концентрацией 500 мг/мл, 0,5 мл из контейнера, который содержит состав на основе антитела к CD40 с концентрацией 1000 мг/мл, и т. д. В каждом таком случае эти контейнеры содержат достаточное количество антитела к CD40, что дает возможность осуществлять доставку требуемой дозы 500 мг.
Используемая в данном документе фраза "составленный в дозировке, дающей возможность осуществлять [путь введения] доставку [назначенной дозы]" используется для обозначения того, что данная фармацевтическая композиция может использоваться для обеспечения требуемой дозы антитела к CD40, например mAb1, посредством назначенного пути введения (например, s.c. или i.v.). В качестве примера, если требуемая подкожная доза составляет 500 мг, тогда врач-клиницист может использовать 2 мл состава на основе антитела к CD40, имеющего концентрацию 250 мг/мл, 1 мл состава на основе антитела к CD40, имеющего концентрацию 500 мг/мл, 0,5 мл состава на основе антитела к CD40, имеющего концентрацию 1000 мг/мл, и т. д. В каждом таком случае эти составы на основе антитела к CD40 имеют достаточно высокую концентрацию, дающую возможность осуществлять подкожную доставку антитела к CD40. Подкожная доставка обычно требует доставки объемов, составляющих менее чем приблизительно 2 мл, предпочтительно объема, составляющего приблизительно 1 мл или меньше. Однако, большие объемы могут доставляться в течение времени с использованием, например, пластыря/насосного механизма.
В данном документе раскрыто применение антитела к CD40 (например, mAb1) для изготовления лекарственного препарата для лечения синдрома Шегрена у пациента, где лекарственный препарат составлен с возможностью содержания контейнеров, где каждый контейнер имеет достаточное количество антитела к CD40 для доставки по меньшей мере приблизительно 75 мг, 150 мг, 300 мг или 600 мг антитела к CD40 или его антигенсвязывающего фрагмента (например, mAb1) на однократную дозу.
В данном документе раскрыто применение антитела к CD40 (например, mAb1) для изготовления лекарственного препарата для лечения синдрома Шегрена у пациента, где лекарственный препарат составлен в дозировке, дающей возможность осуществлять системную доставку (например, внутривенную или подкожную доставку) 75 мг, 150 мг, 300 мг или 600 мг антитела к CD40 или его антигенсвязывающего фрагмента (например, mAb1) на однократную дозу.
4. Наборы
Раскрытие также охватывает наборы для лечения пациента с синдромом Шегрена (в зависимости от обстоятельств) с помощью антитела к CD40 или его антигенсвязывающего фрагмента, например mAb1. Такие наборы содержат антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, например, mAb1 (например, в жидкой или лиофилизированной форме) или фармацевтическую композицию, содержащую антитело к CD40 (описанное выше). Дополнительно, такие наборы могут содержать средства для введения антитела к CD40 (например, шприц и флакон, предварительно заполненный шприц, предварительно заполненный шприц-ручку, пластырь/насос) и инструкции по применению. Инструкции могут раскрывать предоставление пациенту антитела к CD40 (например, mAb1) в виде части конкретной схемы введения доз. Такие наборы могут также содержать дополнительные терапевтические средства (описанные выше) для лечения псориаза, например, для доставки в комбинации с инкапсулированным антителом к CD40, например mAb1.
Фраза "приспособления для введения" используется для определения любого доступного инструмента для системного введения лекарственного средства пациенту, включая без ограничения предварительно заполненный шприц, флакон и шприц, шприц-ручку, автоинжектор, i.v. капельницу и мешок, насос, пластырь и т. д. С такими предметами пациент может самостоятельно вводить лекарственное средство (т. е. вводить лекарственное средство себе самостоятельно) или лекарственное средство могут вводить лицо, обслуживающее больного, или врач.
В данном документе раскрыты наборы для лечения пациента, у которого имеется синдром Шегрена, содержащие: a) фармацевтическую композицию, которая содержит терапевтически эффективное количество антитела к CD40 или его антигенсвязывающего фрагмента; b) средства для введения пациенту антитела к CD40 или его антигенсвязывающего фрагмента и c) инструкции, обеспечивающие осуществление подкожного введения пациенту, нуждающемуся в этом, антитела к CD40 или его антигенсвязывающего фрагмента в виде дозы от приблизительно 3 до приблизительно 30 мг активного ингредиента на килограмм веса субъекта-человека, три раза, один раз каждые две недели с последующим ежемесячным введением доз от приблизительно 3 до приблизительно 30 мг, как например 10 мг, активного ингредиента на килограмм веса субъекта-человека, или приблизительно 150 мг, приблизительно 300 мг или приблизительно 600 мг еженедельно, один раз в две недели или ежемесячно во время поддерживающей схемы.
В одном конкретном варианте осуществления предусмотрено применение a) жидкой фармацевтической композиции, содержащей антитело к CD40, буфера, стабилизатора, и солюбилизатора, и b) средства для подкожного введения антитела к CD40 пациенту, у которого имеется синдром Шегрена, для изготовления лекарственного препарата для лечения синдрома Шегрена, где антитело к CD40
i) подлежит внутривенному введению пациенту в дозе от приблизительно 3 до приблизительно 30 мг, как например 10 мг, активного ингредиента на килограмм веса субъекта-человека три раза, один раз каждые две недели и
ii) после этого подлежит внутривенному введению пациенту в виде ежемесячных доз от приблизительно 3 до приблизительно 30 мг, как например 10 мг, активного ингредиента на килограмм веса субъекта-человека, где указанное антитело к CD40 выбрано из группы, состоящей из:
а) антитела к CD40, которое содержит VH-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, и VL-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8;
b) антитела к CD40, которое содержит VH-домен иммуноглобулина, содержащий гипервариабельные области, представленные под SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, и VL-домен иммуноглобулина, содержащий гипервариабельные области, представленные под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6;
c) антитела к CD40, которое содержит VH-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, и VL-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, и Fc-область под SEQ ID NO: 13;
d) антитела к CD40, которое содержит VH-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, и VL-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, и Fc-область под SEQ ID NO: 14;
e) антитела к CD40, которое содержит Fc-область IgG1 с подавленной активностью; и
f) антитела к CD40, которое содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO: 9 и аминокислотную последовательность легкой цепи под SEQ ID NO: 10 или аминокислотную последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO: 11 и аминокислотную последовательность легкой цепи под SEQ ID NO: 12.
В соответствии с третьим аспектом предусмотрено применение a) жидкой фармацевтической композиции, содержащей антитело к CD40, буфера, стабилизатора, и солюбилизатора, и b) средства для подкожного введения антитела к CD40 пациенту, у которого имеется синдром Шегрена, для изготовления лекарственного препарата для лечения синдрома Шегрена, где антитело к CD40
i) подлежит подкожному введению пациенту в виде дозы, составляющей приблизительно 150 мг активного вещества, приблизительно 300 мг активного вещества или приблизительно 600 мг активного вещества (еженедельно или один раз в две недели); и
ii) после этого оно подлежит подкожному введению пациенту еженедельно, один раз в две недели или ежемесячно (каждые четыре недели) в дозах, составляющих приблизительно 150 мг активного вещества, приблизительно 300 мг активного вещества или приблизительно 600 мг активного вещества, где указанное антитело к CD40 выбрано из группы, состоящей из:
а) антитела к CD40, которое содержит VH-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, и VL-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8;
b) антитела к CD40, которое содержит VH-домен иммуноглобулина, содержащий гипервариабельные области, представленные под SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, и VL-домен иммуноглобулина, содержащий гипервариабельные области, представленные под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6;
c) антитела к CD40, которое содержит VH-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, и VL-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, и Fc-область под SEQ ID NO: 13;
d) антитела к CD40, которое содержит VH-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, и VL-домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, и Fc-область под SEQ ID NO: 14;
e) антитела к CD40, которое содержит Fc-область IgG1 с подавленной активностью; и
f) антитела к CD40, которое содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO: 9 и аминокислотную последовательность легкой цепи под SEQ ID NO: 10 или аминокислотную последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO: 11 и аминокислотную последовательность легкой цепи под SEQ ID NO: 12.
Пример 2. Фармакология
1. Первичная фармакология
d
mAb1 связывается с CD40 человека с высокой аффинностью (K 0,3 нМ). Однако оно не связывается с рецепторами Fcγ (включая CD16) или опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность или комплементзависимую цитотоксичность. mAb1 ингибирует активацию лейкоцитов человека, индуцированную рекомбинантным CD154 (rCD154), но не индуцирует пролиферацию PBMC или продуцирование цитокинов дендритными клетками, происходящими из моноцитов (DC). mAb1 связывается с CD40 человека и приматов, отличных от человека, с очень схожей аффинностью.
In vivo
in vivo
mAb1 блокирует первичный и вторичный ответы антител, зависимые от Т-клеток (TDAR), и может продлить выживание аллотрансплантатов почки у приматов, отличных от человека (Cordoba et al 2015). Кроме того, mAb1 может нарушать прижившиеся зародышевые центры (GC) .
in vitro
Степень занятости и функциональную активность рецептора CD40 оценивали одновременно  с использованием культур цельной крови человека. Функциональную активность количественно определяли с помощью CD154-индуцированной экспрессии CD69 (маркер активации) на CD20-положительных клетках (В-клетки), и занятость CD40 контролировали с использованием флуоресцентно меченого mAb1. Необходима была почти полная занятость CD40 mAb1 для полного ингибирования rCD154-индуцированной экспрессии CD69.
2. Вторичная фармакология
Исследовали эффекты mAb1 в отношении тромбоцитарной функции и гемостаза крови, указывающие на то, что mAb1 не индуцирует ответы на агрегацию тромбоцитов, а скорее демонстрирует некоторые легкие ингибирующие эффекты в отношении агрегации тромбоцитов при высоких концентрациях.
Пример 3. Доклиническая фармакологическая токсикология и безопасность
ss
Токсикологические исследования mAb1 не выявили какой-либо значительной токсичности по отношению к органам, включая отсутствие тромбоэмболических осложнений, как указано в клинических испытаниях с mAb к CD154 (Kawai et al 2000). В 13-недельном исследовании GLP на макаках-резусах (еженедельное введение при 10, 50 и 150 мг/кг), обнаружили увеличенную клеточность лимфоидной ткани у 5/22 животных, которая, как считалось, возникла из-за протекающей инфекции, при этом наблюдение соответствовало фармакологии mAb1. Были замечены воспалительные очаги в почках и легких 2 животных при 50 мг/кг, и у одного из двух животных также были замечены очаги в глазах и трахее. Несмотря на то, что непосредственный эффект mAb1 в отношении почек и легких нельзя исключать, убедительность доказательств, включая подтверждение присутствия оппортунистических патогенов, предполагает, что такие результаты скорее всего опосредованы вторичными по отношению к mAb1-опосредованной иммуносупрессии факторами и обусловлены источником инфекции. С точки зрения таких воспалительных результатов уровень, при котором не наблюдалось никаких нежелательных эффектов (NOAEL), для 13-недельного исследования токсичности составлял 10 мг/кг. В 26-недельном исследовании хронической токсичности на макаках-крабоедах не было обнаружено каких-либо неблагоприятных результатов, связанных с mAb1. На основе таких данных NOAEL находился при 150 мг/кг (26-недельный). Среднее значение (все животные) Cmax, ss составляло 44, 3235 и 9690 мкг/мл соответственно при 1, 50 и 150 (NOAEL) мг/кг S.C. еженедельно. NOAEL, полученный в результате 26-недельного исследования на макаках-крабоедах, считается наиболее подходящим для поддержки клинической схемы введения доз.
Гистологическая и иммуно-гистологическая оценки после умерщвления выявили уменьшение GC в кортикальных областях B-клеток в селезеночной и лимфатической тканях. У животных из группы восстановления обнаружили несколько случаев увеличенной клеточности лимфатических узлов с нормальными участками T-клеток и увеличенными участками В-клеток, которые соответствовали восстановлению GC после прекращения введения лекарственного средства. У животных из группы восстановления закреплялся первичный TDAR в отношении гемоцианина лимфы улитки (KLH) непосредственно после падения уровней mAb1 в крови ниже уровня, необходимого для полной занятости рецепторов.
Из-за полного ингибирования ответов антител, зависимых от Т-клеток (TDAR), KLH, образование антител против лекарственного средства (ADA) к mAb1 не ожидалось, а следовательно связанные с ADA побочные эффекты считались маловероятными, в случае если концентрации mAb1 поддерживались непрерывно на фармакологических уровнях.
in vitro
Исследования перекрестной реактивности со схожими эпитопами тканей выявили, что CD40 присутствует не только в иммунных клетках, но также в различных тканях. Это в основном обусловлено его экспрессией в эндотелиальных и эпителиальных клетках, где CD40 вовлечен в передачу сигналов, как например, в ответ на процессы заживления ран, активирование защиты от вирусов и связанные с воспалением медиаторы. Не ожидалось, что антагонистическое моноклональное антитело к CD40, как и mAb1, будет обусловливать воспалительные процессы, что подтверждали с помощью исследования  с использованием эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC).
До сих пор полноценные, соответствующие методическим рекомендациям, исследования токсичности в отношении репродуктивной системы не проводились. Однако было проведено исследование на кроликах для определения диапазона доз, эмбриофетального развития (EFD) с целью подтверждения кроликов как подходящих видов для исследования токсичности в отношении репродуктивной системы. В любой из групп не наблюдали каких-либо эффектов в отношении эмбриофетального развития и не обнаруживали каких-либо внешних мальформаций, связанных с лечением эмбриона.
В заключение, доклинические данные поддерживают первые исследования многократной дозы у пациентов с первичным синдромом Шегрена.
Пример 4. Доклиническая фармакокинетика и фармакодинамика
1. Фармакокинетика (PK)
Для иммуноглобулинов IgG типичным является то, что первичным путем удаления mAb1, вероятно, является посредством протеолитического катаболизма, происходящего в участках, которые характеризуются равновесным связыванием с белками плазмы крови. Кроме того, связывание и интернализация комплекса mAb1-CD40 обусловливает быстрые и насыщаемые пути выведения. Это проиллюстрировано с помощью нелинейных профилей зависимости концентрации mAb1 в сыворотке крови от времени, демонстрирующих точку перегиба кривой при приблизительно 10-20 мкг/мл. Вклад CD40-опосредованного выведения в общее выведение зависит от концентрации mAb1, вместе с уровнями экспрессии CD40, интернализацией и скоростями метаболизма рецепторов. Для концентраций в сыворотке крови mAb1 > 10-20 мкг/мл ожидалась линейная кинетика, в то время как нелинейная кинетика проявлялась при более низких концентрациях.
2. Фармакодинамика (PD)
В исследовании PK/PD на макаках-крабоедах точка перегиба кривой (приблизительно 10 мкг/мл) в профилях PK была связана с падением насыщения CD40, что было определено в независимом анализе целевого насыщения лимфоцитов. Как таковая, эта точка перегиба кривой рассматривается как маркер для уровней насыщения CD40 и доказательство связывания с мишенью.
Связь между занятостью и фармакодинамической активностью CD40 была дополнительно продемонстрирована на макаках-резусах, иммунизированных KLH. Обезьян иммунизировали с помощью KLH три раза (первый раз приблизительно 3 недели до введения доз, второй 2 недели после введения mAb1 и третий после полного выведения mAb1). Занятость CD40 mAb1 при концентрациях в плазме крови > 40 мкг/мл во время второй вакцинации KLH полностью предупреждала восстановление ответов антител. Как только mAb1 было выведено, у всех животные закрепилась полная память в отношении иммунного ответа на третий KLH. Эти результаты указывают на то, что функция ранее существовавшей памяти В-клеток не была затронута. После полного удаления mAb1, иммунизация столбнячным токсином (TTx) привела к образованию титров IgG/IgM к TTx, подобно необработанным животным, и продемонстрировала, что полная TDAR была восстановлена после удаления mAb1.
3. Иммуногенность
Как и ожидалось от иммуносупрессорного лекарственного средства, данные иммуногенности, полученные на макаке-резусе (однократная доза), согласовывались с результатами, полученными из опыта KLH-TDAR, и подтвердили, что какой-либо иммунный ответ в отношении mAb1 не закреплялся при полной занятости CD40 mAb1.
4. Терапевтические схемы
На основе профилей фармакокинетики и фармакодинамики mAb1, а также результатов из доклинических и клинических исследований mAb1, могут применяться следующие терапевтические схемы.
В одном варианте осуществления (см. ФИГ. 24A, 1) терапевтическая схема mAb1 состояла из введения нагрузочной дозы, включающей две дозы по 600 мг mAb1, вводимые с недельным перерывом между двумя дозами, с последующим введением поддерживающей дозы, включающей дозы по 600 мг mAb1, вводимые каждые 2 недели (Q2W). Дозу 600 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 2 инъекций по 2 мл лекарственного продукта (150 мг/мл).
В другом варианте осуществления (см. ФИГ. 24A, 2) терапевтическая схема mAb1 состояла из введения нагрузочной дозы, состоящей из первой дозы 600 мг mAb1 и второй дозы 300 мг mAb1, где вторую дозу вводили через одну неделю после первой дозы с последующим введением поддерживающей дозы, состоящей из доз по 600 мг mAb1, вводимых каждые 2 недели (Q2W). Дозу 300 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 1 инъекции 2 мл лекарственного продукта (150 мг/мл). Дозу 600 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 2 инъекций по 2 мл лекарственного продукта (150 мг/мл).
В другом варианте осуществления (см. ФИГ. 24A, 3) терапевтическая схема mAb1 состояла из введения нагрузочной дозы, состоящей из первой дозы 600 мг mAb1 и второй дозы 150 мг mAb1, где вторую дозу вводили через одну неделю после первой дозы с последующим введением поддерживающей дозы, состоящей из доз по 600 мг mAb1, вводимых каждые 2 недели (Q2W). Дозу 150 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 1 инъекции 1 мл лекарственного продукта (150 мг/мл), альтернативно посредством 1 инъекции 2 мл лекарственного продукта, разбавленного в ½ раза (75 мг/мл). Дозу 600 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 2 инъекций по 2 мл лекарственного продукта (150 мг/мл).
В одном варианте осуществления (см. ФИГ. 24B, 1) терапевтическая схема mAb1 состояла из введения нагрузочной дозы, включающей две дозы по 600 мг mAb1, вводимые с недельным перерывом между двумя дозами, с последующим введением поддерживающей дозы, включающей дозы по 300 мг mAb1, вводимые каждые 2 недели (Q2W). Дозу 600 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 2 инъекций по 2 мл лекарственного продукта (150 мг/мл). Дозу 300 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 1 инъекции 2 мл лекарственного продукта (150 мг/мл).
В другом варианте осуществления (см. ФИГ. 24B, 2) терапевтическая схема mAb1 состояла из введения нагрузочной дозы, состоящей из первой дозы 600 мг mAb1 и второй дозы 300 мг mAb1, где вторую дозу вводили через одну неделю после первой дозы с последующим введением поддерживающей дозы, состоящей из доз по 300 мг mAb1, вводимых каждые 2 недели (Q2W). Дозу 300 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 1 инъекции 2 мл лекарственного продукта (150 мг/мл). Дозу 600 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 2 инъекций по 2 мл лекарственного продукта (150 мг/мл).
В еще одном варианте осуществления (см. ФИГ. 24B, 3) терапевтическая схема mAb1 состояла из введения нагрузочной дозы, состоящей из первой дозы 600 мг mAb1 и второй дозы 150 мг mAb1, где вторую дозу вводили через одну неделю после первой дозы с последующим введением поддерживающей дозы, состоящей из доз по 300 мг mAb1, вводимых каждые 2 недели (Q2W). Дозу 150 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 1 инъекции 1 мл лекарственного продукта (150 мг/мл), альтернативно посредством 1 инъекции 2 мл лекарственного продукта, разбавленного в ½ раза (75 мг/мл). Дозу 600 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 2 инъекций по 2 мл лекарственного продукта (150 мг/мл). Дозу 300 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 1 инъекции 2 мл лекарственного продукта (150 мг/мл).
В одном варианте осуществления (см. ФИГ. 24C, 1) терапевтическая схема mAb1 состояла из введения нагрузочной дозы, включающей две дозы по 600 мг mAb1, вводимые с недельным перерывом между двумя дозами, с последующим введением поддерживающей дозы, включающей дозы по 150 мг mAb1, вводимые каждые 2 недели (Q2W). Дозу 600 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 2 инъекций по 2 мл лекарственного продукта (150 мг/мл). Дозу 150 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 1 инъекции 1 мл лекарственного продукта (150 мг/мл), альтернативно посредством 1 инъекции 2 мл лекарственного продукта, разбавленного в ½ раза (75 мг/мл).
В другом варианте осуществления (см. ФИГ. 24C, 2) терапевтическая схема mAb1 состояла из введения нагрузочной дозы, состоящей из первой дозы 600 мг mAb1 и второй дозы 300 мг mAb1, где вторую дозу вводили через одну неделю после первой дозы с последующим введением поддерживающей дозы, состоящей из доз по 150 мг mAb1, вводимых каждые 2 недели (Q2W). Дозу 300 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 1 инъекции 2 мл лекарственного продукта (150 мг/мл). Дозу 600 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 2 инъекций по 2 мл лекарственного продукта (150 мг/мл). Дозу 150 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 1 инъекции 1 мл лекарственного продукта (150 мг/мл), альтернативно посредством 1 инъекции 2 мл лекарственного продукта, разбавленного в ½ раза (75 мг/мл).
В еще одном варианте осуществления (см. ФИГ. 24C, 3) терапевтическая схема mAb1 состояла из введения нагрузочной дозы, состоящей из первой дозы 600 мг mAb1 и второй дозы 150 мг mAb1, где вторую дозу вводят через одну неделю после первой дозы с последующим введением поддерживающей дозы, состоящей из доз по 150 мг mAb1, вводимых каждые 2 недели (Q2W). Дозу 150 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 1 инъекции 1 мл лекарственного продукта (150 мг/мл), альтернативно посредством 1 инъекции 2 мл лекарственного продукта, разбавленного в ½ раза (75 мг/мл). Дозу 600 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 2 инъекций по 2 мл лекарственного продукта (150 мг/мл). Дозу 300 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 1 инъекции 2 мл лекарственного продукта (150 мг/мл).
В дополнительном варианте осуществления (см. ФИГ. 25A, 1) терапевтическая схема mAb1 состояла из введения нагрузочной дозы, включающей две дозы по 600 мг mAb1, вводимые с недельным перерывом между двумя дозами, с последующим введением поддерживающей дозы, включающей дозы по 600 мг mAb1, вводимые каждые 4 недели (Q4W). Дозу 600 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 2 инъекций по 2 мл лекарственного продукта (150 мг/мл).
В другом варианте осуществления (см. ФИГ. 25A, 2) терапевтическая схема mAb1 состояла из введения нагрузочной дозы, состоящей из первой дозы 600 мг mAb1 и второй дозы 300 мг mAb1, где вторую дозу вводят через одну неделю после первой дозы с последующим введением поддерживающей дозы, состоящей из доз по 600 мг mAb1, вводимых каждые 4 недели (Q4W). Дозу 300 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 1 инъекции 2 мл лекарственного продукта (150 мг/мл). Дозу 600 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 2 инъекций по 2 мл лекарственного продукта (150 мг/мл).
В другом варианте осуществления (см. ФИГ. 25A, 3) терапевтическая схема mAb1 состояла из введения нагрузочной дозы, состоящей из первой дозы 600 мг mAb1 и второй дозы 150 мг mAb1, где вторую дозу вводили через одну неделю после первой дозы с последующим введением поддерживающей дозы, состоящей из доз по 600 мг mAb1, вводимых каждые 4 недели (Q4W). Дозу 150 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 1 инъекции 1 мл лекарственного продукта (150 мг/мл), альтернативно посредством 1 инъекции 2 мл лекарственного продукта, разбавленного в ½ раза (75 мг/мл). Дозу 600 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 2 инъекций по 2 мл лекарственного продукта (150 мг/мл).
В дополнительном варианте осуществления (см. ФИГ. 25В, 1) терапевтическая схема mAb1 состоит из введения нагрузочной дозы, включающей две дозы по 600 мг mAb1, вводимые с недельным перерывом между дозами, с последующим введением поддерживающей дозы, включающей дозы по 300 мг mAb1, вводимые каждую неделю (Q1W). Дозу 600 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 2 инъекций по 2 мл лекарственного продукта (150 мг/мл). Дозу 300 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 1 инъекции 2 мл лекарственного продукта (150 мг/мл).
В другом варианте осуществления (см. ФИГ. 25B, 2) терапевтическая схема mAb1 состояла из введения нагрузочной дозы, состоящей из первой дозы 600 мг mAb1 и второй дозы 300 мг mAb1, где вторую дозу вводили через одну неделю после первой дозы с последующим введением поддерживающей дозы, состоящей из доз по 300 мг mAb1, вводимых каждую неделю (Q1W). Дозу 300 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 1 инъекции 2 мл лекарственного продукта (150 мг/мл). Дозу 600 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 2 инъекций по 2 мл лекарственного продукта (150 мг/мл).
В еще одном варианте осуществления (см. ФИГ. 25B, 3) терапевтическая схема mAb1 состояла из введения нагрузочной дозы, состоящей из первой дозы 600 мг mAb1 и второй дозы 150 мг mAb1, где вторую дозу вводили через одну неделю после первой дозы с последующим введением поддерживающей дозы, состоящей из доз по 300 мг mAb1, вводимых каждую неделю (Q1W). Дозу 150 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 1 инъекции 1 мл лекарственного продукта (150 мг/мл), альтернативно посредством 1 инъекции 2 мл лекарственного продукта, разбавленного в ½ раза (75 мг/мл). Дозу 300 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 1 инъекции 2 мл лекарственного продукта (150 мг/мл). Дозу 600 мг предпочтительно вводили подкожно посредством 2 инъекций по 2 мл лекарственного продукта (150 мг/мл).
Преимущество наличия терапевтической схемы, разделенной на часть введения нагрузочной дозы и часть введения поддерживающей дозы, состоит в том, что это позволяет добиться оптимального терапевтического эффекта.
Для всех терапевтических схем, описанных в данном документе, цель введения нагрузочной дозы состоит в достижении целевого насыщения (концентрации в плазме крови близки к 40 мкг/мл) и, таким образом, начале развития терапевтического эффекта, и цель введения поддерживающей дозы состоит в поддержании эффективности.
Пример 5. Безопасность для человека и данные о переносимости
Безопасность, переносимость, активность PK и PD mAb1 оценивали в продолжающемся рандомизированном двойном слепом плацебо-контролируемом, с однократной нарастающей дозой исследовании mAb1 на здоровых субъектах и пациентах с ревматоидным артритом (RA). Всего было включено 48 субъектов: 36 здоровых субъектов, которые получали однократные дозы mAb1 не более 3 мг/кг IV или S.C., и 12 пациентов с RA, 6 из которых получали однократные дозы mAb1 10 мг/кг IV. В целом, однократные дозы не более 3 мг/кг mAb1 у здоровых добровольцев и однократные дозы 10 мг/кг mAb1 у пациентов с RA были безопасны и хорошо переносились, и каких-либо предполагаемых серьезных побочных эффектов (SAE) не выявляли. Исследование 30 мг/кг IV дозы продолжается на пациентах с RA. Поскольку данное исследование все еще продолжается, все клинические данные носят предварительный характер и основываются на промежуточных анализах, проводимых с дозой не более 10 мг/кг на пациентах с RA.
Пример 6. Фармакокинетика и фармакодинамика у человека (здоровые добровольцы и пациенты с ревматоидным артритом)
У здоровых субъектов, а также у пациентов с ревматоидным артритом, после однократного IV или SC введения, профили PK CFZ533 соответствовали опосредованному мишенью распределению, что приводило в результате к нелинейным профилям PK и более быстрому выведению, в случае если занятость рецептора CD40 падала ниже примерно 90%.
Несмотря на межиндивидуальную вариабельность в профилях PK от субъектов-китайцев, распределение CFZ533 у субъектов-китайцев в общем было подобно таковым для субъектов, не являющихся китайцами, и связывание с мишенью также было подобным (приблизительно 4 недели) после 3 мг/кг IV CFZ533. При этом уровне дозы аналогичные профили PK/PD демонстрировали посредством профилей свободного CFZ533 в плазме крови, занятости CD40 на периферических В-клетках, измеряя свободный CD40, и общий CD40, и общие концентрации sCD40 в плазме крови.
После SC введения здоровым субъектам CFZ533 быстро всасывалось и распределялось у человека в соответствии с ожиданиями для типичного антитела IgG1. При введении 3 мг/кг SC пиковый уровень CFZ533, как правило, наблюдали через 3 дня после введения дозы (7 дней для 2 субъектов), и через 1 неделю после дозирования концентрации в плазме крови находились в том же диапазоне, как и после IV введения. При SC введении 3 мг/кг продолжительность связывания с мишенью также составляла приблизительно 4 недели.
У пациентов с ревматоидным артритом при 10 мг/кг IV, как измерено с помощью свободного CD40 на В-клетках цельной крови по сравнению со средними профилями перед введением дозы и общего sCD40 в плазме крови, полная занятость CD40, как правило, поддерживалась в течение 8 недель. При 30 мг/кг IV профили PK и общего sCD40 в плазме крови соответствовали продолжительности связывания с мишенью в течение 16 недель.
У здоровых субъектов, при отслеживании занятости CD40 на В-клетках, связывание CD40 с помощью CFZ533, как правило, приводило к уменьшению общего CD40 на периферических В-клетках на приблизительно 50%, как измерено с помощью свободного CD40 на В-клетках. Это происходило скорее всего из-за интернализации и/или выведения мембраносвязанного CD40 после связывания с CFZ533. У пациентов с ревматоидным артритом уменьшение общего CD40 на периферических В-клетках не подтверждалось.
Была определена взаимосвязь между концентрацией CFZ533 в плазме крови и занятостью CD40 на В-клетках цельной крови (свободный CD40 на В-клетках), и концентрации CFZ533 0,3-0,4 мкг/мл были связаны с полной (определенной как ≥ 90%) занятостью CD40 на В-клетках цельной крови.
В более широком смысле для CFZ533 были идентифицированы неспецифические и специфические пути удаления. Неспецифические пути и пути высокой емкости, опосредованные рецепторами FcRn, обычно идентичны эндогенным IgG. Специфическое опосредованное мишенью распределение CFZ533 приводило к образованию комплексов CFZ533-CD40, которые были частично интернализированы (с последующей лизосомной деградацией) и/или выводились из мембраны. Опосредованные мишенью процессы приводили к насыщению и нелинейному расположению CFZ533. Образование комплексов CFZ533-CD40 зависело от дозы/концентрации, при этом насыщение происходило при высоких концентрациях CFZ533.
В целом, распределение CFZ533 зависело от относительного влияния специфических (опосредованных мишенью) и неспецифических путей удаления на общее выведение CFZ533. Наблюдали нелинейный характер PK, в случае если концентрации CFZ533 были ниже, чем целевые, при этом при более высоких концентрациях с насыщенными рецепторами CD40 неспецифические пути преобладали, и удаление CFZ533 было линейным.
Как и ожидалось, для типичного антитела IgG1, нацеленного на мембраносвязанный рецептор и демонстрирующего опосредованное мишенью распределение, степень воздействия CFZ533 (AUClast) увеличилась больше, чем увеличение дозы (сверхпропорциональность). Следовательно, ожидается, что это связано с уменьшением в объеме распределения и выведения CFZ533 при больших дозах.
У одного субъекта при вводимой IV дозе 1 мг/кг CFZ533 (1 неделя полной занятости CD40) развились специфические антитела к CFZ533, выявленные через 6 недель после того, как концентрации CFZ533 в плазме крови были ниже предела количественного определения, и определенно слишком низкими для блокирования любых соответствующих пути CD40 эффектов в ткани. Наличие антител к лекарственному средству (ADA) у данного субъекта не нарушало воздействия и не связано с сигналом безопасности, связанным с иммунитетом. В данном исследовании это соответствовало частоте возникновения ADA, составляющей 2%.
Однократная доза 3 мг/кг (IV и SC) CFZ533 временно подавляла ответы на антитела к KLH при первой иммунизации KLH, при этом концентрации CFZ533 соответствовали полной (≥ 90%) занятости рецептора (в течение приблизительно 3-4 недель). Первичные ответы на антитела к KLH выявляли у всех субъектов как концентрацию CFZ533, и сопутствующая занятость рецептора уменьшалась. Все субъекты были способны закреплять восстановленные ответы при второй иммунизации KLH (вводимой после ожидаемой утраты занятости рецептора).
Данные указывают на то, что связывание CD40 с помощью CFZ533 предупреждало активацию В-клеток, опосредованную рекомбинантным CD154 (rCD154) человека, в цельной крови человека. rCD154-индуцированная экспрессия CD69 в В-клетках, как правило, подавлялась во время периода, соответствующего полной занятости CD40 на В-клетках. В случае если занятость CD40 была неполной, функциональная активность rCD154 восстанавливалась.
Не существовало каких-либо доказательств эффектов CFZ533 в отношении данных иммунофенотипирования.
Пример 7. Многоцентровое рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование в параллельных группах для оценки безопасности, переносимости, фармакокинетики и предварительной эффективности CFZ533 у пациентов с первичным синдромом Шегрена
Для оценки пригодности использования моноклональных антител человека к CD40 с подавленной активностью ADCC в лечении синдрома Шегрена было разработано и проведено клиническое исследование с использованием антитела CFZ533, в данном документе также называемого mAb1.
Синдром Шегрена (SS) может являться первичным или часто связан с другими аутоиммунными заболеваниями такими как системная красная волчанка (SLE) или ревматоидный артрит (RA). В данном случае SS называется вторичным. Пациенты с вторичным синдромом Шегрена были исключены из клинических испытаний CFZ533, поскольку первичное заболевание (например, RA или SLE) и сопутствующие ему виды лечения будут в значительной степени мешать оценке первичного SS. Например, вовлечение/повреждение суставов при RA не позволило бы интерпретировать так, что домен ESSDAI или лечение антителом к TNF не будет совместимым с использованием CFZ533. Однако, патогенез вторичного SS обусловлен теми же патобиологическими явлениями, как и при pSS, как например, образованием зародышевого центра и образованием аутоантител, опосредованных аномальной активацией пути CD40-CD154, при этом ожидалось, что лечение с помощью CFZ533 принесет пользу пациентам с вторичным SS, гарантируя последующие клинические испытания.
Первичный синдром Шегрена (pSS) представляет собой системное прогрессирующее аутоиммунное заболевание, характеризующееся образованием эктопических зародышевых центров в экзокринных железах и дисфункцией секреторных желез. У некоторых пациентов также развиваются экстрагландулярные проявления. CFZ533 представляет собой новое моноклональное антитело, которое сильно и избирательно блокирует CD40, рецептор костимулирующего пути, необходимый для реакций зародышевого центра и других опосредованных иммунных функций, вовлеченных в патогенез pSS. Проводили рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое многоцентровое, частично перекрестное (PoC) исследование доказательной части фазы IIa для расчета безопасности, переносимости и эффективности CFZ533 у пациентов с pSS.
Несколько наборов данных указывают на то, что патология заболевания обусловлена или тесно связана с путем CD40-CD154, который является основным при pSS. Характерные диагностические признаки pSS включают сверхреакционную способность В-клеток, такую как образование структур, подобных зародышевому центру в слюнных железах (наблюдали у 18-59% пациентов), и аутоантител (Vossenkämper et al 2012). В очагах pSS преобладали активированные T-клетки, и они были способны провоцировать гиперактивность В-клеток, выделение Ig и облегчать разрушение желез (Manganelli and Fietta 2003). Кроме того, инфильтраты T- и В-клеток в этих слюнных железах пациентов демонстрировали активирование CD40 и CD154. Опосредованное CD40-CD154 воспаление ткани может также обусловливать патогенез pSS.
Кроме того, опосредованное CD40-CD154 воспаление ткани может также обусловливать патогенез pSS. Эпителиальные клеточные линии, полученные из пациентов с pSS, конститутивно активировали поверхностный CD40 (Dimitriou et al 2002). Сообщалось об обнаруженных повышенных уровнях микрочастиц, полученных из тромбоцитов, а также из лейкоцитов, вместе с повышенными концентрациями sCD154 в сыворотке крови пациентов с pSS (Sellam et al 2009).
1. Разработка доказательной части концептуального исследования CCFZ533X2203 при SS.
Здесь представлено двойное слепое, с последующим открытым режимом, рандомизированное плацебо-контролируемое, не являющееся подтверждающим исследование с параллельными группами для оценки безопасности, переносимости, фармакокинетики и предварительной клинической эффективности многократных доз CFZ533 в следующих когортах 1 и 2.
• Когорта 1: 3 мг/кг CFZ533, вводимые подкожно пациентам с pSS, в двойном слепом и плацебо-контролируемом методе с последующим лечением в открытом режиме.
• Когорта 2: 10 мг/кг CFZ533, вводимые с помощью внутривенной инфузии пациентам с pSS, в двойном слепом и плацебо-контролируемом методе с последующим лечением в открытом режиме.
За этими когортами следовала открытая рандомизированная параллельная группа, не являющаяся подтверждающей часть когорты 3.
• Когорта 3: в группе лечения 1 CFZ533 вводили в концентрации 600 мг s.c. еженедельно в 4 повторностях (нагрузочная схема) с последующим введением 300 мг s.c. еженедельно в 9 повторностях (поддерживающая схема, исходя из исследования дня 29).
В группе лечения 2 нагрузочная схема представляла собой однократную i.v. дозу 10 мг/кг CFZ533 (в день 1 исследования) с последующей еженедельной s.c. дозой 300 мг в 12 повторностях (поддерживающая схема, исходя из дня 8 исследования).
В когортах 1 и 2 рандомизация будет стратифицирована по исходному значению приема пероральных кортикостероидов (да/нет). Стратификация в когорте 3 будет отсутствовать.
Исследование включало три периода для когорты 1 и когорты 2:
1. плацебо-контролируемый период (с дня 1 недели 1 до завершения оценок перед введением дозы в день 85 недели 13), во время которого 4 дозы CFZ533 или плацебо вводили в дополнение к стандарту терапии, (например, низкая доза кортикостероида) который необходим для лечения pSS;
2. период открытого режима (с дня 85 недели 13 дозирования до завершения оценок в день 169 недели 25), когда все пациенты получили 4 дозы CFZ533 в открытом режиме лечения, и
3. период последующего наблюдения (недели 25-32), когда пациенты находились под последующим наблюдением без исследуемого медикамента.
На фигура 1 представлено схематическое представление плана исследования когорт 1 и 2.
Когорта 3 включала два периода:
1. период открытого режима лечения (с дозирования в день 1 недели 1 до последней дозы и завершения оценок в день 85 недели 13);
2. период последующего наблюдения (с недели 13 после завершения последнего дозирования до дня 141 недели 21), когда пациенты находились под последующим наблюдением в течение 8 недель без исследуемого медикамента.
В периоде открытого режима введение доз в группе лечения 1 начиналось с 600 мг s.c. CFZ533 один раз еженедельно в течение 4 недель; в группе лечения 2 введение доз начиналось с 10 мг/кг i.v. CFZ533 в день 1.
После этого введение доз продолжали с 300 мг s.c. CFZ533 один раз еженедельно в течение 4 недель (группа лечения 1) и 9 недель (группа лечения 2), соответственно.
На фигуре 2 представлено схематическое представление плана исследования когорты 3.
Когорта 1
В этой когорте рандомизировали примерно 12 пациентов. Для каждого пациента проводили скрининговый период с дня -28 до дня -2. Пациентов, которые соответствовали критериям отбора при скрининге, допускали к исходным оценкам. Исходные оценки проводили с дня -6 с завершением оценок в день -1 до лечения в день 1.
Все результаты оценок безопасности на исходном уровне были доступны до начала введения доз и соответствовали критериям отбора. Отобранные пациенты входили в плацебо-контролируемый период в день 1 (неделя 1) и были рандомизированы в соотношении 2:1 с получением лечения либо CFZ533, либо плацебо. В день 1 дозу 3 мг/кг CFZ533 или плацебо вводили с помощью подкожной инъекции (s.c.) с последующей PK, фармакодинамикой (PD) и оценками безопасности в течение не более 6 часов. Пациентов выписывали из центра в тот же день после завершения всех оценок с гарантией того, что не было обнаружено проблем, связанных с безопасностью.
Пациенты возвращались в исследовательский центр для получения трех s.c. доз либо CFZ533, либо плацебо (таких же, как они получали в день 1) в день 15 (неделя 3), день 29 (неделя 5) и день 57 (неделя 9), соответственно. Во время таких визитов проводили оценки безопасности и эффективности и собирали образцы биомаркеров и PK.
В день 85 (неделя 13) после оценок безопасности и других оценок, которые являлись оценками в конце плацебо-контролируемого периода, все пациенты входили в период с открытым режимом и получали s.c. дозу 3 мг/кг CFZ533 с открытым режимом. За этим следовали три s.c. дозы CFZ533 с открытым режимом (3 мг/кг каждая) в день 99 (неделя 15), день 113 (неделя 17) и день 141 (неделя 21), соответственно. Во время таких визитов проводили оценки безопасности и эффективности и собирали образцы биомаркеров и PK. "Слепоту" контролируемого периода поддерживали для исследователя и пациента до конца исследования.
В день 169 (неделя 25) пациенты получали оценки в конце периода с открытым режимом и входили в период с последующим наблюдением без введения исследуемого медикамента. Пациенты возвращались в исследовательский центр для контроля безопасности во время данного периода.
Конец визита исследования наставал в день 225 (неделя 33), что включало завершение оценок исследования с последующим освобождением от исследования.
Когорта 2
Когда примерно 12 субъектов были включены в когорту 1, началось включение в когорту 2 для рандомизации примерно 30 пациентов с получением примерно 24 пациентов, проходящих 12 недель лечения. План исследования для когорты 2 был идентичным плану для когорты 1, за исключением схемы введения доз, которая включала многократные внутривенные введения доз 10 мг/кг CFZ533 с последующими оценками PK, фармакодинамики (PD) и безопасности в течение не более 2 часов после окончания инфузии. Дополнительно, вес тела измеряли при каждом визите для введения доз для расчета дозировки лекарственного средства в соответствии с актуальным весом (в когорте 1 исходные значения веса пациента использовали на протяжении всего исследования).
Когорта 3
В когорте 3 рандомизировали примерно 24 пациента с получением примерно 20 пациентов (10 в группе лечения 1, 10 в группе лечения 2), прошедших 12-недельное лечение.
Пациенты могли оставаться на их стандартных видах терапии при условии, что виды лечения поддерживались на постоянном уровне во время исследования.
Оценки безопасности включали физикальные осмотры, ЭКГ, основные показатели жизнедеятельности, стандартные клинические лабораторные оценки (общий анализ крови, биохимический анализ крови, общий анализ мочи, тест на беременность, свертывание крови), контроль побочных эффектов и серьезных побочных эффектов.
Все s.c. инъекции и i.v. инфузии происходили в учреждении для контроля. Пациенты находились под пристальным контролем в течение по меньшей мере 6 часов после s.c. инъекции в когорте 1, 2 часа после завершения i.v. инфузии в когорте 2. В когорте 3 пациенты находились под контролем в течение по меньшей мере 1 часа после завершения i.v. инфузии и 30 минут после s.c. инъекции или дольше, на усмотрение исследователя, для оценки основных показателей жизнедеятельности и признаков или симптомов побочных эффектов, включая развитие реакции на инъекцию. Оценки фармакокинетики, фармакодинамики и безопасности осуществляли не более чем через 6 часов после s.c. инъекции в когорте 1, 2 часа после завершения i.v. инфузии в когорте 2 или 1 час после завершения i.v. инфузии и 30 минут после s.c. инъекции в когорте 3. Субъекты освобождались после этих оценок по усмотрению исследователя после удовлетворительного анализа данных безопасности.
Оценка PK включала измерения свободного CFZ533 в плазме крови.
Конкурентные маркеры PD: насыщение CD40 на В-клетках периферической крови (свободный CD40 и общий CD40 на В-клетках, только когорты 1 и 2), общий растворимый CD40 и общий растворимый CD154 (необязательно только когорты 1 и 2) измеряли в плазме крови пациентов для осуществления моделирования PK/PD. Дополнительно, исследовали аутоантитела, а также некоторые поисковые биомаркеры. Иммуногенность оценивали с помощью квазиколичественного анализа антител к CFZ533.
В когорте 1 и когорте 2 необязательно отбирали губную биопсию на исходном уровне и в конце плацебо-контролируемого периода (день 85, неделя 13).
Промежуточный анализ (1-й IA) проводили, включая примерно 12 пациентов, которые прошли 12-недельный период лечения в когорте 1. Для таких пациентов оценивали ключевые данные в отношении безопасности и переносимости, а также предварительной эффективности.
Дополнительные промежуточные анализы в отношении безопасности и эффективности могли проводиться для поддержки принятия решений относительно текущего клинического исследования, проектов спонсора по клиническим испытаниям в целом или в случае каких-либо проблем, связанных с безопасностью.
2. Обоснование плана исследования
Когорты 1 и 2
Оценивали две разных дозы (3 мг/кг s.c. и 10 мг/кг i.v.) CFZ533 в двух отдельных когортах.
Применяли рандомизированный плацебо-контролируемый двойной слепой подход для устранения потенциального смещения при представлении данных о безопасности и клинической эффективности в этом первой поисковом исследовании с участием пациентов с pSS.
Пациенты были рандомизированы в отношении CFZ533 или плацебо в соотношении 2:1 с целью минимизировать воздействие плацебо и для того, чтобы собрать больше данных о CFZ533. Проводили стратифицированную рандомизацию с целью ограничить дисбаланс между активной и плацебо группами по приему пероральных кортикостероидов на исходном уровне.
В течение периода с открытым режимом вводили CFZ533 всем пациентам, включая тех, которым вводили плацебо в течение плацебо-контролируемого периода. Это обеспечивало потенциальное преимущество в лечении этим пациентам и сбор дополнительных данных в отношении безопасности и эффективности для CFZ533 у пациентов с pSS. После периода с открытым режимом пациенты проходили период с последующим наблюдением, для которого была выбрана продолжительность 8 недель (12 недель после последнего введения доз CFZ533) с обеспечением достаточного времени для контроля безопасности и исследования продолжительности ответа.
В дополнение к безопасности, эффективности, рассчитанных Европейской лигой по борьбе с ревматизмом (EULAR), Индекс активности заболевания при синдроме Шегрена (ESSDAI) был выбран как ключевая конечная точка исследования. Показатель ESSDAI широко известен специалисту в данной области (см., например, Seror et al. 2011a). ESSDAI продемонстрировал восприимчивость в ретроспективном анализе рандомизированного контролируемого испытания ритуксимаба и был предложен в качестве чувствительного инструмента для оценки эффективности лечения ритуксимабом (Moerman et al 2014). Авторы сообщали о значительно сниженном ESSDAI в группе ритуксимаба по сравнению с группой плацебо в неделю 12 и неделю 24, демонстрируя некоторую эффективность в уменьшении активности заболевания в данном небольшом исследовании.
Подобным образом в исследовании использовали индекс данных EULAR, полученных от пациентов с синдромом Шегрена (ESSPRI) (см., например, Seror et al. 2011b)
Когорта 3
Из-за ключевой цели этой когорты плацебо-контроль не являлся необходимым и открытый режим лечения был оправдан. В когорте 3 использовались две группы лечения для оценки двух нагрузочных схем (многократные s.c. дозы в группе лечения 1 или однократное i.v. введение в группе лечения 2) с последующей поддерживающей схемой (многократные s.c. дозы, обе группы), которые составляли 12 недель (от дня 1 до дня 85), для обеспечения условий равновесного состояния для концентраций CFZ533 в плазме крови на уровне, аналогичном минимальным концентрациям, наблюдаемым в когорте 2 (схема 10 мг/кг i.v.).
Длительность периода с последующим наблюдением составляла 8 недель (от дня 85 до дня 141):
(i) для слежения за удалением CFZ533 в условиях, где цель была полностью насыщена (медленное удаление), и при неполном насыщении CD40 (быстрое удаление), и
(ii) для того, чтобы охарактеризовать возможность пути опосредованного мишенью удаления для CFZ533 после 12-недельного лечения.
3. Обоснование дозы/режима, продолжительности лечения
Не существует ранее описанного опыта применения блокирующего средства CD40 при первичном синдроме Шегрена человека. Однако, доказательство указывает на вовлечение CD40-зависимых иммунных процессов в патофизиологию заболевания, включая присутствие лимфоидных агрегатов и структур, подобных зародышевому центру, в слюнных железах пораженных индивидуумов, аутоантител, специфических для данного заболевания, и экспрессию CD40 и его лигандов в железах. Доклинические результаты исследования и первые результаты исследования на человеке указывали на то, что требовалась полная занятость рецептора CD40 для полного подавления функции В-клеток, зависимой от Т-клеток, а также блокирования паренхимальных функций, связанных с CD40, и будет необходимо для достижения максимальной терапевтической пользы. Например, результаты из 26-недельного исследования токсичности указывали на то, что при 1 мг/кг CFZ533, вводимых еженедельно, измеряли полную занятость CD40 на периферических В-клетках, однако наблюдали неполноценный фармакологический эффект у некоторых животных (3/6), проявлявшийся в частичном уменьшении в зародышевых центрах.
Это указывало на то, что будут необходимы дозы более чем 1 мг/кг CFZ533 (еженедельно) для полного подавления взаимодействий CD40-CD154 и последующих сигнальных событий в ткани.
Когорта 1 (подкожное, 3 мг/кг)
Самая высокая подкожная доза CFZ533, которая тестировалась на здоровых добровольцах, в настоящее время составляет 3 мг/кг и обладает доказанной безопасностью, а также хорошо переносится, как и однократная доза для здоровых добровольцев. Дозы 1 и 3 мг/кг i.v. были связанны с неделями 1 и 4 полной (определено как > 90%) занятости CD40 на В-клетках периферической крови, соответственно. Кроме того, индуцированная CD154 ex vivo экспрессия CD69 подавлялась в течение примерно 4 недель с использованием PBMC от здоровых добровольцев, которые получали 3 мг/кг CFZ533 i.v. Занятость CD40 составляла 90% (среднее n=6; диапазон 73-97%) через 4 недели после однократной подкожной дозы 3 мг/кг CFZ533.
В итоге, 3 мг/кг s.c. выбрали для существующей когорты 1, поскольку эта доза была безопасной и хорошо переносилась здоровыми добровольцами, а также могла приводить к требуемому фармакологическому и фармакодинамическому эффекту.
2-х недельные интервалы между введениями доз в начале предназначались для обеспечения полного насыщения CD40 на периферических В-клетках, а также полного подавления взаимодействия CD40-CD154 в тканях после подкожного введения. В конце 12-недельного периода лечения ожидали клинически значимые изменения в первичной конечной точке и других ключевых показаниях эффективности и биомаркеров. На основе опубликованных результатов с однократным циклом ритуксимаба, клинически значимые ответы у пациентов с pSS могли обнаруживаться уже на неделе 5 с максимальным эффектом, проявлявшимся на неделе 12 (Meijer et al 2010). Во время дополнительного 12-недельного продленного периода с открытым режимом собирали дополнительные данные в отношении длительной эффективности и безопасности CFZ533.
Когорта 2 (внутривенное, 10 мг/кг)
Была представлена схема 10 мг/кг i.v. для обеспечения большего влияния в плазме крови в течение периода лечения с целью обеспечения полной и стабильной блокады пути CD40 в целевой ткани, в условиях, где вероятно экспрессия CD40 выше. Эта схема поддерживается данными в отношении безопасности у людей, соответствующими соотношениями безопасности из доклинических токсикологических исследований, подходящими PD-эффектами в тканях у приматов, отличных от человека, и недавно опубликованными данными из ASKP1240.
Подтвержденная безопасность и переносимость у людей
: в фазе 1 исследования (CCFZ533X2101) тестировали однократные возрастающие дозы (от 0,03 до 30 мг/кг) CFZ533 i.v. и дозы 3 мг/кг s.c., после завершения не выявили серьезной проблемы в отношении безопасности вплоть до самой высокой тестируемой дозы (10 мг/кг i.v.). На основе клинического опыта к настоящему времени ожидается, что схема введения доз 10 мг/кг i.v. является безопасной и переносимой у пациентов с pSS.
Соответствующий резерв безопасности из доклинических токсикологических исследований
: в исследованиях токсикологии GLP на данный момент было протестировано CFZ533 при (i) еженедельном s.c. введении доз в течение 13 недель при 10, 50 и 150 мг/кг (s.c. и i.v.) у макаков-резусов и (ii) еженедельном s.c. введении доз в течение 26 недель при 1, 50 и 150 мг/кг у макаков-крабоедов. Такие исследования не выявили каких-либо серьезных проблем, которые препятствовали применению CFZ533 по предложенной схеме внутривенного введения в течение 12 недель или 24 недель. В 26-недельном исследовании токсичности у макаков-крабоедов в стационарном состоянии получили среднюю концентрацию 8300 мкг/мл (Cav, ss) после введения доз еженедельно при 150 мг/кг (NOAEL). Соответствующее системное воздействие (AUC, условия стационарного состояния) в течение 1-месячного периода составило бы 232400 день*мкг/мл, что приблизительно в 57 раз больше, чем предсказанное системное воздействие в плазме крови в течение первого месяца (AUC0-28 дней; фигура 3). В 26-недельном исследовании токсикологии при NOAEL, Cmax, ss составило 9495 мкг/мл, что в 24 раза больше, чем ожидаемое Cmax (приблизительно 400 мкг/мл) для предложенной внутривенной схемы у пациентов с pSS (фигура 3).
max
На фигуре 3 продемонстрирован ожидаемый профиль зависимости средней концентрации в плазме крови от времени для CFZ533, вводимого внутривенно при 10 мг/кг (когорта 2). Средние профили PK симулировали для 10 мг/кг i.v. CFZ533 вводили в дни 1, 15, 29 и 57 исследования (плацебо-контролируемый период) и дни 85, 99, 113 и 141 исследования (период с открытым режимом). Применяли модель Михаэлиса-Ментен с использованием параметров, полученных из предварительного популяционного анализа на основе модели когорты 5 (3 мг/кг i.v.) Данные PK из исследования FIH CCFZ533X2101 у здоровых субъектов. Не существовало какого-либо предыдущего опыта с блокирующим средством, связывающим CD40, полученного от человека с pSS, и не было известно о каких-либо потенциальных отличиях в биологии CD40 (экспрессия, метаболизм) между здоровыми субъектами и пациентами с pSS. Ожидается, что предложенная i.v. схема обеспечит на протяжении всего периода лечения стабильные концентрации в плазме крови выше 40 мкг/мл при ожидаемой повышенной экспрессии CD40 в целевых тканях у пациентов с pSS. Горизонтальная пунктирная линия при 40 мкг/мл представляет собой концентрацию в плазме крови, выше которой ожидалась полная занятость и блокирование пути CD40 в целевых тканях (на основе данных PD из 26-недельного токсикологического исследования на макаках-крабоедах - группа, получавшая дозу 1 мг/кг). Ожидаемое системное воздействие для первого месяца (повышенная частота дозирования) составляло 4087 день*мкг/мл (в 57 раз меньше, чем наблюдаемое системное воздействие в плазме крови более одного месяца в стационарном состоянии в 26-недельном токсикологическом исследовании на макаках-крабоедах - NOAEL при 150 мг/кг еженедельно), ожидаемое C составляло приблизительно 400 мкг/мл.
Соответствующие эффекты PD в тканях приматов, отличных от человека
: В 26-недельном токсикологическом исследовании (группа, получавшая дозу 1 мг/кг) у животные со средними концентрациями в плазме крови в стационарном состоянии ≥ 38 мкг/мл имелось полное подавление В-клеток зародышевых центров в кортикальных областях лимфатических узлов. Ожидалось, что схема 10 мг/кг i.v. обеспечит на протяжении всего периода лечения (плацебо-контролируемого и открытого, см. фигуру 3) стабильные концентрации в плазме крови выше 40 мкг/мл для ожидаемой повышенной экспрессии CD40 у пациентов с pSS и неполноценных эффектов PD в целевых тканях из-за потери целевого насыщения.
Данные из ASKP1240, моноклональное антитело, блокирующее CD40
: недавний анализ раскрытых данных PK/эффективности антитела к CD40 Astella ASKP1240 при трансплантации солидного органа (Harland et al 2015) продемонстрировал, что эффективное опосредованное мишенью выведение антитела в ткани может привести к утрате блокады CD40 и вероятной утрате эффективности вследствие значительного повышения целевой экспрессии в целевых тканях. Предложенная схема внутривенного введения нацелена на насыщение, на протяжении всего периода лечения, путей удаления CD40 в условиях, где вероятна повышенная экспрессия CD40. Внутренние данные предполагали сверхэкспрессию CD40 в тканях, полученных от пациентов с первичным синдромом Шегрена (неопубликованные данные), и изначальная схема подкожного введения могла не обеспечить полной и стабильной блокады пути CD40 в целевой ткани в таких условиях.
Когорта 3
На основе результатов из когорт 1 и 2 считалось, что эффективная схема введения доз у пациентов с pSS требовала нагрузочной схемы (i.v. или s.c.), обеспечивающей раннее полное насыщение CD40 и минимальное опосредованное мишенью распределение (TMDD) с последующей s.c. поддерживающей схемой.
В когорте 3 доза/схема в группе лечения 1 и в группе лечения 2 установлены для оценки того, способна ли нагрузочная схема (i.v. или s.c.) с последующей s.c. поддерживающей схемой осуществлять доставку при стабильных концентрациях в плазме крови, как и в i.v. схеме, тестируемой в когорте 2, и обладать способностью преодолевать опосредованное мишенью распределение CFZ533 посредством s.c. пути.
Группа лечения 1
: CFZ533 вводили s.c. при 600 мг (4 инъекции по 1 мл) еженедельно в 4 повторностях (нагрузочная) с последующим 300 мг s.c. (2 инъекции по 1 мл) еженедельно в 9 повторностях (поддерживающая; начиная с дня 29 исследования). Во время нагрузочной фазы были неизвестны скорость насыщения пула CD40, а также биологическая доступность s.c. доз. Тем не менее, ожидалось, что кумулятивная доза 2700 мг в течение 1-го месяца (вплоть до дня 29) имела способность преодолевать TMDD (кумулятивная доза составляла 630 и 2100 мг в день 29 в когорте 1 и когорте 2, соответственно). Ожидалось, что еженедельная нагрузочная схема 600 мг с последующей поддерживающей схемой 300 мг еженедельно обеспечат доставку в стационарных условиях к дню 85, поскольку, в случае если целевое насыщение будет достигнуто, ожидалось, что биологическая доступность подкожных доз будет составлять ≥ 75%, как для здоровых добровольцев. В группе лечения 1 кумулятивная доза вплоть до дня 85 (последняя доза) составляла бы 5100 мг по сравнению с 1050 и 3500 мг в когорте 1 и когорте 2, соответственно).
группе лечения 2
В  нагрузочная схема состояла из однократной i.v. дозы 10 мг/кг CFZ533 (в день 1 исследования) с последующей s.c. 300 мг еженедельно в 12 повторностях (поддерживающая схема, исходя из дня 8 исследования). Ожидалось, что в группе лечения 2 когорты 3, что уже было продемонстрировано i.v. в когорте 2, однократная i.v. доза 10 мг/кг (день 1) обеспечит концентрации в плазме крови ≥ 100 мкг/мл к дню 8 исследования (начало поддерживающей схемы) и условия для полного насыщения CD40. В группе лечения 2 еженедельную s.c. поддерживающую схему оценивали в отсутствие значительного опосредованного мишенью распределения и эффекта первого прохождения (s.c. путь).
В когорте 3 все подкожные введения (300 мг или 600 мг еженедельно) предоставляли в виде фиксированных доз (без поправки на вес тела) для облегчения введения и улучшения удобства, поскольку каждый флакон с лекарственным продуктом содержал 150 мг/мл CFZ533.
max
max
max
В когорте 1 (схема s.c. 3 мг/кг) в промежуточном анализе средний вес тела составлял 70,7 кг (диапазон 50,0-91,1 кг), что соответствовало 212,2 мг фиксированной дозы (диапазон 150-273,3 мг). В когорте 2 (схема i.v. 10 мг/кг) в промежуточном анализе средний вес тела составлял 72,6 кг (диапазон 50,0-107,2 кг), что соответствовало 726 мг фиксированной дозы (диапазон 500-1072 мг). В когорте 3 подкожные дозы 300 мг или 600 мг в каждой повторности находился в диапазоне доз, уже применяемых в когортах 1 и 2, и с низкой вероятностью влияли на безопасность и переносимость. То, как вес тела влиял на распределение CFZ533, было охарактеризовано не полностью, однако для обеих групп на протяжении всего периода лечения ожидалось, что средняя максимальная концентрация в плазме крови (C) будет ниже приблизительно 300 мкг/мл (предполагая, что все подкожные дозы имели 100% биологическую доступность в целях безопасности и средний вес тела составлял 70 кг для пациентов с pSS), и при этом не наблюдали ожидаемого превышения среднего C в когорте 2 (приблизительно 386 мкг/мл, пятая доза в день 85 плацебо-контролируемого периода 1 когорты 2). Это было бы в 32 раза меньше, чем значения C (среднее 9495 мкг/мл) в 26-недельном токсикологическом исследовании у макаков-крабоедов, при NOAEL (150 мг/кг s.c. еженедельно).
Конечные точки PK/PD и иммуногенность оценивали во время периодов лечения и последующего наблюдения. В таблице 2 представлен синопсис протокола для исследования.
Таблица 2. Синопсис протокола
<b>Замысел и обоснование</b>
• Данное исследование предназначено для оценки безопасности, переносимости, фармакокинетики, фармакодинамики и предварительной терапевтической эффективности многократных доз моноклонального антитела CFZ533 у пациентов с первичным синдромом Шегрена (pSS), что предоставит данные для дальнейшего развития CFZ533 в лечении pSS.
<b>Первостепенные цели</b>
• Оценить безопасность и переносимость множественных внутривенных инфузий CFZ533 у пациентов с первичным синдромом Шегрена, как измерено по побочным эффектам (AE).• Сравнить эффект множественных внутривенных инфузий CFZ533 по сравнению с плацебо в отношении клинической активности заболевания у пациентов с первичным синдромом Шегрена, как измерено по изменению индекса активности заболевания EULAR при синдроме Шегрена (ESSDAI) после 12 недель лечения.
<b>Второстепенные цели</b>
• Оценить безопасность и переносимость множественных подкожных доз CFZ533 у пациентов с первичным синдромом Шегрена, как измерено по побочным эффектам (AE).• Сравнить эффект множественных подкожных доз CFZ533 по сравнению с плацебо в отношении клинической активности заболевания у пациентов с первичным синдромом Шегрена, как измерено по изменению индекса активности заболевания EULAR при синдроме Шегрена (ESSDAI) после 12 недель лечения.• Оценить фармакокинетику множественных подкожных доз и множественных внутривенных инфузий CFZ533 у пациентов с первичным синдромом Шегрена.• Оценить эффект множественных подкожных доз и множественных внутривенных инфузий CFZ533 по сравнению с плацебо в отношении результатов самоотчета у пациентов с первичным синдромом Шегрена после 12-недельного лечения, как измерено с помощью отчета пациента об интенсивности EULAR при синдроме Шегрена (ESSPRI), краткой формы (36) исследования в области здравоохранения (SF-36) и многофакторного опросника на утомляемость (MFI).• Оценить изменения в общей оценке врачом общей активности заболевания пациента, как зарегистрировано с помощью визуальной аналоговой шкалы (VAS) после 12 недель лечения.• Оценить изменения в общей оценке пациентом общей активности его заболевания, как зарегистрировано с помощью VAS после 12 недель лечения.
<b>План исследования</b>
• Рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое, не являющееся подтверждающим исследование примерно 12 пациентов в когорте 1 и 30 пациентов в когорте 2 и открытое рандомизированное исследование примерно 24 пациентов в когорте 3
<b>Популяция</b>
Пациенты мужского и женского пола с первичным синдромом Шегрена возрастом от 18 до 75 лет (включительно).
<b>Критерии включения</b>
• Диагностика первичного синдрома Шегрена в соответствии с пересмотренными едиными критериями EU/US (Vitali et al 2002).• Активность заболевания от умеренного до тяжелого с показателем ESSDAI ≥ 6.• Присутствие аутоантител при скрининге, как определено с помощью любого из следующего:• повышенные титры ANA сыворотки крови (≥ 1:160) и положительный ревматоидный фактор (RF); или• положительный результат в отношении связывания SSA.• Стимулированная скорость потока слюны > 0 мл/мин. для когорт 1 и 2 и нестимулированная скорость потока слюны > 0 мл/мин. для когорты 3.• Если пациент получает пероральное лечение глюкокортикоидами при скрининге, то доза не должна превышать 10 мг преднизона или его эквивалента в день и должна быть стабильной в течение по меньшей мере 2 недель до рандомизации и в течение всего периода исследования.• Если при скрининге пациент принимает хлорохин или гидроксихлорохин, то доза должна быть стабильной в течение по меньшей мере 4 недель до рандомизации и в течение всего периода исследования.• Если пациент получает пероральное или парентеральное лечение метотрексатом при скрининге, то доза не должна превышать 25 мг в неделю в течение по меньшей мере 3 месяцев до рандомизации и должна быть стабильной на протяжении всего исследования.• Если пациент подвергается пероральному лечению азатиоприном при скрининге, то доза не должна превышать 100 мг в день в течение по меньшей мере 3 месяцев до рандомизации и должна быть стабильной на протяжении всего исследования.
<b>Критерии исключения</b>
• Вторичный синдром Шегрена• Применение других исследуемых лекарственных средств при включении в исследование или в течение пяти периодов полувыведения при использовании других исследуемых лекарственных средств или дольше, если это требуется местными нормативными актами, на момент включения в исследование.• Наличие в анамнезе повышенной чувствительности к исследуемому лекарственному средству или к лекарственным средствам аналогичных химических классов.• Пациенты получали лечение:• циклосфосфамидом в течение 6 месяцев;• кортикостероидным болюсом i.v. дозой > 1 мг/кг в течение 3 месяцев;• ритуксимабом в течение 12 месяцев;• белимумабом в течение 6 месяцев;• любым другим биологическим препаратом в течение 1 месяца или пятикратного периода полужизни;• любыми другими иммунодепрессантами, такими как циклоспорин А или микофенолат, в течение 3 месяцев.• Пациенты, у которых первичная причина симптомов сухости связана с приемом лекарств, которые принимались регулярно или периодически, а не с первичным синдромом Шегрена.• При значительном риске тромбоэмболических событий.• Панкреатическое повреждение или панкреатит.• Анамнез или наличие медицински значимых заболеваний сердца.• Клинически значимая системная вирусная, бактериальная или грибковая инфекция в течение 30 дней после рандомизации.• Состояние, которое может привести к значительно повышенному риску инфекций.• Анамнез или событие в виде туберкулеза.• Значительное хирургическое, медицинское, психиатрическое или дополнительное физическое условие.
<b>Исследуемое и эталонное средство терапии</b>
Когорта 1:150 мг порошка CFZ533 для получения раствора для инъекций и соответствующего плацебо.• CFZ533: 3 мг/кг вводили подкожно.• Контроль: плацебо CFZ533, когорта 2:150 мг порошка CFZ533 для получения раствора для инъекций и соответствующего плацебо.• CFZ533: 10 мг/кг вводили с помощью внутривенной инфузии.• Контроль: плацебо CFZ533, когорта 3:150 мг жидкости CFZ533 во флаконе для инъекции.• 600 мг CFZ533 s.c. один раз в неделю в течение 4 недель с последующими 300 мг s.c. один раз в неделю в течение 9 недель.• 10 мг/кг CFZ533 i.v. в день 1 с последующими 300 мг s.c., начиная с дня 8 один раз в неделю в течение 12 недель.
<b>Эффективность и фармакодинамические оценки</b>
• Индекс активности заболевания EULAR при синдроме Шегрена (ESSDAI).• Общее количество растворимого CD40 в плазме крови, общее количество растворимого CD154 в плазме крови, насыщенность CD40 в В-клетках периферической крови.
<b>Оценки безопасности</b>
Все когорты:• Физикальное обследование.• Основные показатели жизнедеятельности.• Лабораторные оценки: гематология, клиническая химия, анализ мочи.• Электрокардиограмма (ECG).• Тест на беременность.• Побочный эффект.• Серьезный побочный эффект.• Иммуногенность (антитела к CFZ533).
<b>Другие оценки</b>
Все когорты:• Фармакокинетика CFZ533.• Растворимые биомаркеры (например, CXCL13).• Отчет пациента об интенсивности EULAR при синдроме Шегрена (ESSPRI).• Оценка врачом и пациентом общей активности заболевания (VAS), когорты 1 и 2:• краткая форма (36) исследования в области здравоохранения (SF-36);• Многофакторный опросник на утомляемость (MFI).
<b>Анализ данных</b>
Когорты 1 и 2:продольная модель, описывающая изменение ESSDAI от исходного уровня с течением времени, была снабжена для контролируемой части исследования (не более 13 недель) следующими ковариатами: исходная ESSDAI, исходная доза преднизона, лечение (плацебо, 3 мг/кг CFZ533 s.c. или 10 мг/кг CFZ533 i.v), время, как непрерывный фактор и квадратичный временной эффект, а также случайный перехват, случайный наклон и случайный квадратичный эффект для субъекта. Изменение от исходного ESSDAI на неделе 13 оценивали на основе модели для всех видов лечения. Вывод был сделан в рамках анализа с частотным подходом. Результаты первичного анализа оценивали по следующим критериям эффективности для поддержания внутреннего принятия решений:• статистически значимое снижение ESSDAI на неделе 13 в группе CFZ533 по сравнению с плацебо при одностороннем уровне значимости 10% и• предполагаемое среднее снижение ESSDAI в группе CFZ533 должно составлять 5 баллов или больше, чем у плацебо.Положительный признак эффективности засчитывали, если оба критерия выполнялись.Когорта 3:описательные статистические данные и графические отображения использовали для суммирования концентраций PK в каждой группе лечения.
4. Результаты
Когорты 1 и 2
Сорок четыре пациента включали: 8 пациентов, получавших 3 мг/кг CFZ533 s.c. и 4 плацебо в когорте 1, и 21, получавших 10 мг/кг CFZ533 i.v. и 11 плацебо в когорте 2. В то время как PK/PD были такими, как ожидалось в когорте CFZ533 10 мг/кг i.v., на основе данных из первого испытания с участием людей воздействие CFZ533 оказалось ниже, чем ожидаемое в когорте 3 мг/кг s.c., вероятно из-за эффективного опосредованного мишенью расположения (эффект первого прохождения) в условиях, когда экспрессия CD40, вероятно, была улучшена. В целом, CFZ533 было безопасным и хорошо переносимым, и большинство АЕ были легкими или умеренными. Был один серьезный AE (бактериальный конъюнктивит) в когорте с 3 мг/кг s.c., что не было связано с изучаемым лекарственным средством. В когорте 1 наблюдали улучшение ESSDAI на примерно 2 балла по сравнению со средними исходными оценками, равными примерно 12 как для группы плацебо, так и для группы 3 мг/кг s.c., а следовательно нет доказательств различия в лечении (ΔESSDAI=0,68, 95% CI = -4,71-6,46). Однако в когорте 2 наблюдали улучшение ESSDAI по сравнению со средними исходными значениями, составляющими примерно 11, которое составляло 6,35 в группе с 10 мг/кг i.v. по сравнению с 1,27 в группе плацебо, со смоделированной разницей между группами ΔESSDAI=5,2 (95% CI=1,02-10,58), что сильно благоприятствовало лечению CFZ533 i.v. Улучшения других показателей, таких как ESSPRI, MFI, общая оценка врача, и общая оценка пациента, и снижение биомаркера CXCL13, связанного с зародышевым центром, в сыворотке крови, также наблюдали в группе 10 мг/кг CFZ533 i.v.
На фигуре 4 изображен график, показывающий фармакокинетику CFZ533-10 мг/кг IV. IV схема обеспечивала полное целевое насыщение и полную блокаду пути CD40 в тканях-мишенях. Ожидалось блокирование пути CD40 в ткани с концентрацией в плазме > 40 мкг/мл (подавление развития GC и Т-зависимого ответа антигена), пунктирная линия на графике. После 12/24 недель лечения появились признаки того, что экспрессия CD40 была снижена у некоторых пациентов с pSS.
На фигуре 5 показан исходный скорректированный общий показатель ESSDAI - 10 мг/кг IV. Верхняя линия представляет плацебо iv, а нижняя линия представляет 10 мг/кг CFZ533 iv. Как можно увидеть, в группе CFZ533 по сравнению с плацебо наблюдалось явное улучшение (среднее значение дельта=5,6 к неделе 12).
На фигуре 6 показан исходный скорректированный CXCL13-10 мг/кг IV. Верхняя линия представляет плацебо iv, а нижняя линия представляет 10 мг/кг CFZ533 iv.
На фигуре 7 показано различие в группах лечения в разных конечных точках для 10 мг/кг CFZ533 по сравнению с плацебо на неделе 13 (после 12 недель лечения - период 1).
Можно сделать вывод, что существуют явные улучшения в ESSDAI и общей оценке врача (VAS). Кроме того, тенденции в большинстве вторичных конечных точек благоприятствуют CFZ533. Изменения ESSDAI сохранялись в период открытого исследования. Некоторое улучшение в группе плацебо при переходе на 10 мг/кг CFZ533 IV со значительным снижением уровней CXCL13 следовало той же схеме.
В этом доказательстве концептуального исследования, впервые тестирующего блокирующее, не истощающее антитело к CD40 для первичного синдрома Шегрена, результаты показали, что CFZ533 может обеспечить новый метод лечения клинически активного pSS.
Кроме того, на фигуре 8 показаны фармакодинамика/связывание с мишенью (10 мг/кг IV). В целом, растворимый CD40 в плазме - устойчивое связывание с мишенью во время периода лечения и наблюдения. После 12/24 недель лечения появились признаки того, что экспрессия CD40 была снижена у некоторых пациентов с pSS.
На фигуре 9 показан график профиля общего показателя ESSDAI - когорта 1: 3 мг/кг SC.
На фигуре 10 показана фармакокинетика: свободное CFZ533 - когорта 1: 3 мг/кг SC. Как можно увидеть, существует эффективное пресистемное опосредованное мишенью выведение (эффект первого прохождения; вероятно из-за повышенной экспрессии CD40) - блокада пути CD40 в тканях не достигалась (CFZ533<40 мкг/мл).
На фигуре 11 показана фармакодинамика/связывание с мишенью: общий растворимый CD40 в плазме крови - когорта 1: 3 мг/кг SC. Как можно увидеть, связывание с мишенью не сохранялось из-за опосредованного мишенью удаления в условиях, когда экспрессия CD40, вероятно, была повышена.
На фигуре 12 показан график профиля общего показателя ESSPRI - когорта 1: 3 мг/кг SC.
На фигуре 13 показан график профиля общего показателя ESSPRI - когорта 2: 10 мг/кг IV.
На фигуре 14 показан график профиля CXCL13 (пг/мл) - когорта 2: 10 мг/кг IV.
На фигуре 15 показан график профиля общего показателя ESSDAI в когорте с 10 мг/кг CFZ533.
На фигуре 16 показан график профиля ICAM+ В-клетки (%) - когорта 2: 10 мг/кг IV.
На фигуре 17 показана разница в группах лечения в разных конечных точках CFZ533 по сравнению с плацебо на неделе 13 (после 12 недель лечения - период 1).
Передача сигналов CD40 была связана с патогенезом аутоиммунных заболеваний (AD), и у пациентов с системными AD (включая pSS) обычно наблюдалась повышенная экспрессия CD40 и повышенные уровни sCD40 в сыворотке/плазме крови. В биопсиях слюнных желез, полученных из пациентов с первичным синдромом Шегрена, CD40 был конститутивно экспрессирован лимфоцитами, эпителиальными клетками протоков и эндотелиальными клетками (Dimitriou et al, 2002), что соответствовало повышенным уровням в плазме крови на исходном уровне, отмеченным в исследовании CCFZ533X2203.
CFZ533 являлось объектом опосредованного мишенью расположения (TMD), процесса, в котором значительная часть CFZ533 (относительно дозы) связана с высокой аффинностью к CD40, так что это взаимодействие отражалось в профиле PK CFZ533. В таких обстоятельствах дополнительные факторы, которые следует учитывать для определения подходящей позологии для лечения пациентов с pSS, включают уровень экспрессии CD40 в организме, синтез и деградацию CD40 (биология мишени) и кинетику связывания CFZ533-CD40.
Предыдущий клинический опыт применения CFZ533 у здоровых добровольцев, добровольцев с ревматоидным артритом, первичным синдромом Шегрена, трансплантацией почки, болезнью Грейвса и миастенией, показал, что повышенная экспрессия CD40 связана с высокой частотой удаления (выведения) CFZ533, утратой связывания с мишенью и утратой блокады пути CD40 в тканях-мишенях, если CD40 не полностью насыщен. При полной занятости CD40 вклад CD40 в общее выведение CFZ533 минимален, и расположение CFZ533 являлось главным образом следствием связывания CFZ533 с рецепторами FcRn (рецептор высокой емкости, ответственный за гомеостаз IgG с помощью рециркуляции/утилизации).
Как видно из данных, с фармакокинетической/фармакодинамической точки зрения и стратегии подбора дозы, вероятно, что соответствующая позология у пациентов с pSS будет включать нагрузочную схему с последующей поддерживающей схемой.
Нагрузочная схема, вероятно, в течение первого месяца посредством IV или SC введения оправдана, потому что CFZ533 подлежит CD40-опосредованному удалению. Если CD40 не полностью насыщен в начале лечения, в условиях повышенной экспрессии CD40, то высокая скорость удаления (выведения) CFZ533, вероятно, связана утратой связывания с мишенью и утратой блокады пути CD40 в тканях-мишенях. После периода загрузки и на основе предварительного моделирования с использованием данных PK из продолжающегося исследования CCFZ533X2203 у пациентов с pSS выбирали поддерживающую схему SC для обеспечения полной блокады пути CD40 в тканях-мишенях.
Когорта 3
Снижение ESSDAI от исходного уровня до недели 12 в когорте 3 показало аналогичную закономерность в обеих группах введения доз, такую как в когорте 2, что подтверждает эффективность двух схем IV/SC или SC/SC введения доз CFZ533. Однако поскольку когорта 3 была открытой и без плацебо-контроля, то данные об эффективности были только исследовательскими и должны интерпретироваться с осторожностью.
Пример 8. Блокада путей взаимодействия CD40-CD154 подавляла эктопические зародышевые центры и ингибировала патологию в мышиной модели синдрома Шегрена NOD/ShiLtJ
Синдром Шегрена (SS) представляет собой хроническое, аутоиммунное заболевание, которое характеризуется сиаладенитом и дисфункцией экзокринных желез. Это одно из наиболее распространенных ревматических системных аутоиммунных заболеваний после RA с распространенностью среди взрослого населения 0,3-0,5%. Клинические проявления включали утомляемость, сухой кератоконъюнктивит, ксеростомию, сухость носа, сухость влагалища, сухость трахеи, сухость кожи, артралгию/артрит, болезнь Рейно, лимфаденопатию, интерстициальный пневмонит, васкулит (обычно кожный), нефрит и лимфому.
Индекс активности заболевания EULAR при синдроме Шегрена (ESSDAI) был разработан для измерения активности заболевания у пациентов с первичным SS. ESSDAI является принятой HA первичной оценкой исхода для SS и разработана как дополнение к результатам отчета пациентов (ESSPRI).
Специфические проявления заболевания у пациентов как при первичном, так и при вторичном SS включают наличие аутоантител к Ro и La, а также инфильтратов мононуклеарных клеток в слюнных и слезных железах (Bombardieri, et al. 2012). В некоторых случаях такие накопления лимфоцитов T и B образуют хорошо организованные структуры, называемые эктопическими лимфоидными структурами (ELS), которые обладают морфологическими и функциональными сходствами с GC (Voulgarelis et al., 2008). В предыдущей работе сообщалось о доказательствах наличия ELS в слюнных железах у пациентов с SS, и в доклинических моделях данного заболевания и доказательствах продолжающегося созревания аффинности (Jacobi et al., 2002; Stott et al., 1998; Bombardieri et al., 2012), связывая эти структуры с патологией заболевания (Bombardieri et al., 2017).
Существует относительно мало опубликованных данных о роли различных иммуностимулирующих путей в формировании и функционировании ELS, несмотря на однозначные данные, подтверждающие существенную роль таких путей, как например CD40-CD154 (лиганд CD40) в биологии GC (Laman et al., 1996). Если бы такие взаимодействия играли роль в формировании и функционировании ELS, тогда была бы предсказана блокада пути, чтобы устранить установленные структуры в пораженной ткани и потенциально улучшить функцию органа. Чтобы проверить эту гипотезу, авторы настоящего изобретения исследовали эффект терапевтического введения моноклонального антитела к CD154 на мышиной модели с диабетом без ожирения с вторичным SS (NOD/ShiLtJ) (Humphreys-Beher et al., 1996) и контролировали ELS слюнных желез, секретирующие антитела клетки, а также экспрессию аквапорина-5 (AQP-5), белка, необходимого для функции секреторных клеток (Delporte et al., 2006).
1. Материалы и способы
Сигнатура гена пути CD40 в слюнных железах
Криосрезы слюнных желез из необработанных мышей NOD/ShiLtJ (Charles River, Германия) использовали для профилирования экспрессии генов с помощью микроматрицы. Лазерный захват микродиссекции применяли для обогащения ELS.
Мышиная модель NOD/ShiLtJ вторичного SS
Штамм NOD/ShiLtJ развивает заболевания, подобные диабету 1 типа, в дополнение к заболеванию, подобному SS, а следовательно мог рассматриваться как модель вторичного SS (Humphreys-Beher et al., 1994). 12-недельных самок NOD/ShiLtJ рандомизировали в 2 группы лечения (n=15 на группу, два эксперимента): MR1 (IgG армянского хомяка к мышиному CD154) и изотипический контроль (IC, антитело хомяка к мышиному IgG, BioXcell) в дозе 15 мг/кг, внутрибрюшинно (i.p.), 2х/неделя в течение 10 недель. Все процедуры выполняли в соответствии со швейцарским законодательством о защите животных и были одобрены кантональным ветеринарным офисом в Базеле, Швейцария (лицензия на животных № BS-2482).
Гистопатология и иммуногистохимия селезенки и слюнных желез у мышей NOD/ShiLtJ
Парафиновые срезы левых слюнных желез толщиной три мкм окрашивали гематоксилином и эозином (HE). Автоматические иммуногистохимические окрашивания для CD3, CD45R, CD138, Iba-1, Ki-67 и AQP-5 осуществляли на приборе для иммуноокрашивания Ventana Discovery XT (Roche Diagnostics, Швейцария). Селезенки из мышей NOD окрашивали Ki-67.
Анализы ELISPOT для клеток, секретирующих антитела (ASC)
Получали суспензии отдельных клеток из слюнных желез, и селезенки (онлайн-файл с дополнительными данными) и свежие CD45+ клетки добавляли в предварительно покрытые планшеты ELISPOT и инкубировали в течение 20 часов при 37°C в темноте. Связывание ASC с планшетами выявляли путем добавления раствора субстрата TMB, и плотность пятен измеряли с помощью EliSpot Reader "AID classic".
Антитело к Ro, ELISA
Мышиное антитело к SSA/Ro60 оценивали в сыворотке крови с применением набора ELISA под № в кат. 5710 (Alpha Diagnostic International, Inc. США) в соответствии с инструкциями производителя.
2. Результаты
Активирование сигнатуры гена CD40 В-клеток слюнных желез
Микроматричные анализы использовали для идентификации последующих генов CD40 в В-клетках после стимуляции rCD154 первичных В-клеток CD19pos человека, 43 из которых можно сопоставить с мышиными генами. Затем было исследовано, модулировалась ли экспрессия этих генов в ткани слюнных желез (SG) у мышей NOD в возрасте 12 и 24 недель. Четырнадцать генов, включая Cd40, Cd80 и Aicda, были значительно активированы в микродиссецированной ELS по сравнению с тканью цельной слюнной железы (WS) в оба момента времени, что указывало на хроническую активацию пути (фигура 26A). Ingenuity Pathway Analysis также указывало на то, что CD40 и CD154 (CD40LG) были в числе верхних восходящих регуляторов как на неделе 12, так и на 24 (фигура 26B), и было возможно продемонстрировать перекрытие между генами пути CD40, активированными в SG, полученными от мышей NOD/ShiLtJ и от пациентов с pSS (Horvath et al., 2012).
Взаимодействия CD40-CD154 необходимы для образования ELS
У мышей NOD/ShiLtJ развивались очаговые клеточные инфильтраты в SG в возрасте 8-12 недель со 100% частотой возникновения, которая предшествовала снижению функции SG (Jonsson et al. 2012). Приведенные выше данные свидетельствуют о хронической передаче сигналов CD40 в ткани NOD SG, и это подтверждалось свидетельством экспрессии CD40 мононуклеарными клетками в очагах воспаления (Roescher et al. 2012). Поэтому было решено протестировать эффекты терапевтической блокады CD40-CD154 путем введения доз mAb к CD154 MR1 в количестве 15 мг/кг один раз в две недели, начиная с 12-недельного возраста, в течение десяти недель.
На фигуре 26B показано, что постоянное дозирование MR1 в течение 10 недель у мышей NOD/ShiLtJ приводило к значительному снижению ELS в слюнных железах, что определяется кластерами Ki67-положительных клеток. Кроме того, наблюдали сильное снижение процентного содержания резидентных B- и T-клеток SG и макрофагов. Гистологические изображения показали, что MR1 был способен подавлять ELS через десять недель после начала введения доз (фигура 26C).
Блокада взаимодействий CD40-CD154 ингибировала образование ASC и продуцирование аутоантител
Введение MR1 также приводило к снижению общего IgG (но не IgM) ASC в селезенке, SG и костном мозге (фигура 26B), а также к полному подавлению GC селезенки. Мыши, обработанные против CD154, также продемонстрировали значительное снижение уровней IgG к Ro в сыворотке крови, хотя частота Ro-специфических ASC в слюнных железах, по-видимому, не была значительно затронута (фигура 26C).
Блокада взаимодействий CD40-CD154 предотвращала потерю AQP-5-положительных клеток
Хотя было возможно оценить стимулированный поток слюны у мышей, отбор проб для таких анализов требовал голодания, анестезии и стимуляции пилокарпином (Jonsson et al. 2006); факторы, которые могли повлиять на благополучие животных и интерпретацию показаний. Поэтому было решено контролировать экспрессию AQP-5, белка водного канала, участвующего в регуляции образования слюны и слез (Delporte et al., 2006), который предположительно участвует в секреторной функции при SS (Yoshimura et al., 2016). Оценка позитивности AQP-5, оцененная с помощью окрашивания (фигура 27), показала более высокое процентное содержание AQP-5-позитивных клеток в обработанных MR1 по сравнению с контрольными животными, что позволило предположить, что блокада CD40-CD154 может предотвратить или отсрочить утрату секреторной функции клеток слюнных желез.
3. Обсуждение
Доказательства созревания аффинности и наличия аутореактивных В-клеток в ELS слюнных желез предполагают потенциальную роль этих структур в патологии SS (Stott et al., 1998). Учитывая функциональное сходство между ELS и GC, было сделано предположение, что иммунологические костимуляторные пути, участвующие в биологии GC, могут играть аналогичную роль в ELS. Дефицит либо CD40, либо CD154 предотвращал образование GC, а фармакологическая блокада лиганда или рецептора также нарушала установленные GC (Ristov et al., 2018; Kim et al. 2014). Взаимодействия CD40-CD154 также участвовали в биологии ELS, поскольку экспрессия CD40 наблюдалась на инфильтрирующих клетках в SG-железах, полученных от пациентов с pSS, а также у мышей NOD (Roescher et al. 2012; Ohlsson et al. 2002). В сочетании с устойчивым активированием генов ниже CD40 в ELS из мышей NOD, а также в биопсиях SG у пациентов с pSS, эти данные свидетельствовали о том, что этот костимуляторный путь был активным в инфильтрации лейкоцитов слюнных желез.
Кроме того, было продемонстрировано, что терапевтическая блокада взаимодействий CD40-CD154 приводила к удалению ELS, глубокому снижению инфильтрирующих лейкоцитов, а также к снижению уровней аутоантител к Ro в сыворотке крови, блокада CD40-CD154 также предотвращала потерю клеток, экспрессирующих AQP-5, белок, необходимый для функционирования секреторных клеток (Delporte et al., 2006), хотя оценка продуцирования слюны будет более прямой оценкой функции SG. Предыдущие данные указывали на то, что профилактическое введение однократной дозы MR1 молодым мышам NOD (возраст 4-5 недель; 1-2 месяца до появления признаков сиаладенита) могло предотвратить развитие сиаладенита и снизить уровень аутоантител к Ro (Mahmoud et al., 2016), что соответствовало результатам, полученным из мышей NOD с дефицитом CD40. Однако ранее не было показано, что терапевтическая блокада взаимодействий CD40-CD154 могла устранить воспаление SG, ELS и снизить уровни аутоантител в этой модели.
Данные контрастируют с более ранней работой, где аденоассоциированная вирусная экспрессия растворимого слитого белка CD40-Ig в SG мышей NOD не смогла уменьшить сиаладенит (Roescher et al., 2012). Поскольку авторы сообщали об отсутствии доказательств экспрессии слитого белка в SG, вероятно, что концентрации лекарственного средства были недостаточны для достижения полной блокады пути CD40-CD154. Напротив, с помощью этого исследования можно было четко продемонстрировать отмену GC селезенки, что предполагало то, что было достаточно воздействия MR1 для полного, относящегося к пути эффекта PD в ткани. В совокупности, данные свидетельствовали о том, что терапевтическая блокада костимуляторного пути CD40-CD154 с помощью биопрепаратов, таких как антитело mAb1 к CD40, могла оказывать благоприятный терапевтический эффект у пациентов с SS (Ristov et al., 2018).
Пример 9. Характеристика in vitro и in vivo свойств CFZ533, блокирующего и не истощающего моноклонального антитела к CD40
1. Способы
Анализ аффинности CFZ533 в отношении CD40 с использованием поверхностного плазмонного резонанса
Анализы связывания рекомбинантного CFZ533 проводили при 25°C с HBS-EP+ в качестве подвижного буфера. Типичный цикл анализа связывания состоял из трех стадий: (i) захват антитела посредством ProteinA, иммобилизованного на поверхности чипа, (ii) связывание антигена CD40 с захваченным антителом к CD40 и (iii) регенерация поверхности ProteinA. Для определения кинетических констант скорости взаимодействий связывания антиген-антитело обрабатывали данные в отношении связывания, дважды ссылаясь на ответы от контрольных инъекций. Кривые связывания подбирали локально с использованием модели взаимодействия 1:1 программного обеспечения Biacore T100 Evaluation для определения кинетических констант скорости. Значение константы диссоциации равновесия (KD) рассчитывали как соотношение констант скорости kd/ka. Все измерения связывания проводили в двух независимых экспериментах.
Анализ аффинности CFZ533 в отношении FcγRIIIA с использованием поверхностного плазмонного резонанса
D
Внеклеточные домены человеческого FcγRIIIA, меченые меткой очистки из 4 аминокислот (4APP; Novartis) и меткой биотинилирования Avi (GLNDIFEAQKIEWHE; Avidity) были синтезированы Geneart: FcγRIIIA человека (CD16a) 158V (Uniprot: P08637, 17-199), 158F FcγRIIIA человека (Uniprot: P08637, 17-199), экспрессировали в клетках HEK293 и очищали с помощью аффинной хроматографии, связывающей 4APP. Рецепторы были сайт-направленными, биотинилированными BirA (Avidity), связанными с сенсорными чипами стрептавидина (General Electric), и равновесные уровни связывания различных Ab анализировали с помощью поверхностного плазмонного резонанса (T100, General Electric), как описано (Warncke et al. 2012). Равновесные константы диссоциации (K) рассчитывали с помощью модели 1:1.
Культуры лейкоцитов человека
3
Лейкоцитарные пленки цельной крови получали из здоровых добровольцев (Blutspendezentrum, Базель, Швейцария) или цельную кровь собирали из здоровых добровольцев, предоставленных с осознанным согласием в соответствии со Швейцарским законом об исследованиях с участием людей и одобрением ответственного этического комитета (Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz; EKNZ). Образцы миндалин человека были получены как от Ergolz Klinik (Листаль, Швейцария) (протокол исследования № 1000244 v.03; одобренный Ethikkommission beider Basel; EKBB), так и из Kantonspital (Листаль, Швейцария) (протокол исследования № TRI0149 v.01; одобренный EKNZ). В отношении экспериментов по культивированию in vitro смотрите дополнительные материалы для подробных способов, пожалуйста. Вкратце, цельную кровь, выделенные PBMC, полученные in vitro моноцитарные DC или B-клетки миндалин человека инкубировали с единичными концентрациями, или титрованием дозы CFZ533, или соответствующих контрольных антител. Для экспериментов по блокированию пути эти культуры также включали концентрацию EC80 рекомбинантного CD154 человека (5 мкг/мл) и IL-4 (75 нг/мл). Результаты анализа in vitro включали пролиферацию, оцененную по включению тимидина (H-TdR), оценку на основе проточной цитометрии экспрессии молекулы активации CD69 на В-клетках и секрецию цитокинов, оцененную с помощью ELISA. Подобные анализы использовали для цельной крови NHP и PBMC. В некоторых экспериментах на цельной крови человека занятость рецептора CD40 также оценивали с использованием флуоресцентно меченого CFZ533. Если это необходимо, значения IC50 оценивали с использованием подбора кривой на основе линейной регрессии в программном обеспечении GraphPad Prism.
Анализы истощения клеток in vitro
pos
В отношении подробных способов смотрите дополнительные материалы. Вкратце, способность CFZ533 к опосредованному истощению CD20 B-клеток контролировали в цельной крови человека в течение периода времени три дня по сравнению с истощением антитела ритуксимаба B-клеток. Для CDC CFZ533 или ритуксимаб инкубировали с B-клетками RAJI в присутствии или в отсутствие комплемента кролика, и лизис клеток оценивали по люминесценции.
Интернализация CFZ533
X
Интернализацию флуоресцентно меченых CFZ533 и rCD154 оценивали in vitro с использованием линии B-клеток RI-1 человека (Th'ng et al, 1987). CD40-зависимость интернализации CFZ533 оценивали с использованием нокаутной по CD40 клеточной линии RI-1. Интернализацию оценивали с использованием проточного цитометра Amnis (Merck KHaA, Дарнштадт) в соответствии с инструкциями производителя и данными, проанализированными с использованием программного обеспечения ImageStream.
In vivo исследования
В фармакокинетических/фармакодинамических (PK/PD) исследованиях с однократной дозой для обработки биологическими препаратами использовали макаков-крабоедов (Macaca fascicularis) возрастом 7,5-8,5 лет (6,5±2,6 кг) и выращенных в неволе из Филиппин (Siconbrec, Макати, Филиппины). Обращение с животными, уход за ними, обработки лекарственным средством и забор крови выполняли в соответствии с Федеральным законом Швейцарии о защите животных (лицензии в отношении животных BS № 1900, BS № 1495). Для экспериментов восстановления иммунизации авторы настоящего изобретения использовали животных из токсикологического исследования, проведенного в Covance Laboratories GmbH, Мюнстер, Германия (оригинал готовится). Исследование проводили в соответствии с утвержденным протоколом исследования и местными стандартными рабочими процедурами в строгом соответствии с национальными правовыми нормами в области законодательства по охране животных и принятых стандартов по защите животных.
В исследовании PK CFZ533 вводили трем животным в рассчитанных однократных дозах, составляющих 16,2 (5532), 18,5 (5531) и 20 (5530) мг/кг. Образцы крови отбирали для анализа концентраций CFZ533 в сыворотке крови, количества периферических Т- и В-лимфоцитов и занятости CD40 на периферических В-клетках с помощью CFZ533. Для экспериментов восстановления TDAR животных иммунизировали гемоцианином лимфы улитки (KLH) в квасцах в дни исследования 8 (примирование) и 43 (восстановление; во время обработки CFZ533), соответственно. Сыворотку крови отбирали за один день до и через 7, 14 и 21 день после примирования и восстановительных иммунизаций. Специфичные в отношении KLH титры IgM/IgG определяли с помощью сэндвич-ELISA с использованием эталонной сыворотки крови IgM/IgG к KLH макаков-крабоедов в качестве стандарта. Оценку PK проводили, как описано выше. Для дополнительных подробностей в отношении экспериментов PK и TDAR см. дополнительные материалы.
Гистологический анализ зародышевых центров
Срезы фиксированных формалином, залитых парафином (FFPE) селезенки и лимфатических узлов (подмышечные, нижнечелюстные и брыжеечные), окрашенные гематоксилином и эозином, а также со способом непрямой иммунопероксидазы (HRP+DAB от Dako) со следующими маркерами: антитело к CD20 (M0755, Dako), антитело к CD8 (RM-9116-SO, Medac) и Ki67 (M7240, Dako). Все препараты оценивали и классифицировали в соответствии с интенсивностью окрашивания (от отрицательного до интенсивного). Кроме того, были также описаны картина окрашивания и распределение любых иммуногистохимически окрашенных клеток в ткани.
2. Результаты
CFZ533 связывает CD40 человека и ингибирует rCD154-индуцированную активацию многих типов клеток, экспрессирующих CD40
В таблице 3 показано, что KD CFZ533 для рекомбинантного CD40 человека была определена с помощью поверхностного плазмонного резонанса как 0,3 нМ, таким образом, оно очень похоже на исходное антитело HCD122 (версия IgG1 дикого типа CFZ533).
Таблица 3. Аффинность связывания (KD) и кинетика HCD122 и CFZ533 с CD40 человека.
HCD122
CFZ533
K<sub>D</sub> [М]
4,67 ± 1,00×10<sup>-10</sup>
3,05 ± 0,26×10<sup>-10</sup>
k<sub>a</sub> [1/M⋅с]
2,84 ± 0,67×10<sup>5</sup>
3,13 ± 0,73×10<sup>5</sup>
k<sub>d</sub> [1/с]
1,26 ± 0,03×10<sup>-4</sup>
0,93 ± 0,14×10<sup>-4</sup>
Chi<sup>2</sup>[RU<sup>2</sup>]
0,17-0,19
0,10-0,15
На фигуре 18A показан эффект CFZ533 в отношении rCD154 и IL-4-опосредованная пролиферация (3H-TdR) культур цельной крови человека, PBMC и выделенных B-клеток миндалин из нескольких доноров (соответственно 5, 32 и 6 доноров). Данные представлены в виде нормализованного числа импульсов в минуту (cpm) (rCD154+IL-4=100; пунктирные линии). На фигуре 18B показано получение TNF-альфа, ингибированное CFZ533, с помощью rCD154-стимулированных moDC после культивирования в течение ночи. На фигуре 18C показано отсроченное добавление ингибированной CFZ533, опосредованной rCD154+IL-4 пролиферации PBMC человека. CFZ533 добавляли к РВМС человека за час до, одновременно или через два и шесть часов после стимуляции rCD154+IL-4, и пролиферацию (3H-TdR) оценивали после последующих четырех дней культивирования (пунктирная с точками и пунктирная линии представляют rCD154+IL-4 и контроли клетки плюс среды). Для всех данных среднее значение и SD показаний rCD154-индуцированной стимуляции были построены в зависимости от log-трансформированных концентраций CFZ533. Где это уместно, значения IC50 определяли с использованием подбора кривой на основе линейной регрессии. На фигуре 18D показана взаимосвязь между занятостью CD40 и блокадой пути CFZ533. Цельную кровь человека от 10 доноров культивировали в течение ночи с rCD154 в присутствии титрования дозы CFZ533. Оценивали степень активации пути (% CD69pos на B-клетках) и степень занятости CD40 (окрашивание AlexaFlour 488, меченым CFZ533). Незаполненные и заполненные кружки показывают процент CD40, занятых CFZ533, и процент клеток, экспрессирующих CD69pos, на B-клетках CD20pos в зависимости от log-трансформированной концентрации CFZ533, соответственно (показано среднее значение и SD). Пунктирная с точками и пунктирная линии представляют rCD154-индуцированную экспрессию CD69 и контрольные культуры клетки плюс среды, нормализованные по всем донорам.
На фигуре 18A показано, что CFZ533 полностью ингибировало rCD154-индуцированную пролиферацию культур цельной крови человека, PBMC, а также очищенных B-клеток миндалин от многих доноров с активностями (значения IC50) 0,024 мкг/мл (0,16 нM), 0,017 мкг/мл (0,12 нM) и 0,071 мкг/мл (0,47 нM), соответственно. Кроме того, авторы настоящего изобретения смогли продемонстрировать, что CFZ533 полностью блокировало rCD154-индуцированное продуцирование TNF первичными дендритными клетками, происходящими из моноцитов (moDC), с IC50 0,04 мкг/мл (0,27 нМ) (фигура 18B).
Как было опубликовано ранее, CFZ533 ингибировало rCD154-индуцированную пролиферацию PBMC из макаков-крабоедов (Cordoba et al., 2015). CFZ533 ингибировало rCD154-индуцированную пролиферацию РВМС из людей, животных макаков-резусов и макаков-крабоедов с аналогичной активностью (IC50 0,02, 0,03 и 0,01 мкг/мл, соответственно), а также могло связывать CD40 на В-клетках из этих видов со значениями EC50 примерно 0,2 мкг/мл, см. таблицу 4.
Таблица 4. Клеточное связывание и функциональные свойства CFZ533 у человека иNHP.
Ингибирование rCD154-индуцированной пролиферации (IC50 PBMC)
Занятость CD40 CFZ533 (MFI EC50 на CD20+ клетках)
Человек
0,017+0,012 мкг/л0,12+0,08 мкM(n=32)
0,22+0,042 мкг/мл1,49+0,28 мкM(n=4)
Макак-резус
0,026+0,017 мг/мл0,18+0,12 мкM(n=8)
0,22+0,033 мкг/мл1,49+0,22 мкM(n=6)
Макак-крабоед
0,010+0,003 мг/мл0,07+0,02 мкM(n=4)
0,20+0,068 мкг/мл1,35+0,46 мкM(n=4)
Вышеуказанные клеточные данные были получены из экспериментов, в которых CFZ533 добавляли до или одновременно с rCD154, что указывало на то, что антитело могло предотвращать связывание эндогенного лиганда. Авторы настоящего изобретения также смогли продемонстрировать, что добавление CFZ533 в течение не более 6 часов после начала культивирования лейкоцитов, содержащих rCD154, приводило в результате к полному ингибированию клеточной активации с минимальной утратой активности, что указывало на то, что CFZ533 могло вытеснять эндогенный лиганд из CD40 (фигура 18C).
Авторы изобретения также хотели оценить взаимосвязь между степенью занятости CD40 CFZ533 и степенью ингибирования пути. С данной целью авторы изобретения одновременно оценивали занятость рецептора CD40 CFZ533 и rCD154-индуцированного CD69 в цельной крови из нескольких доноров. На фигуре 18D показано, что занятость рецептора CD40 CFZ533 на по меньшей мере 90% требовалась для полной блокады активации пути CD40. Аналогичная взаимосвязь между занятостью рецептора и ингибированием пути также наблюдалась с использованием CD23 и CD54 в качестве показаний активации пути CD40 (данные не показаны).
CFZ533 проявляло минимальный стимулирующий потенциал in vitro
3
3
Способность CFZ533 стимулировать активацию лейкоцитов человека оценивали с использованием пролиферации и активирования молекулы активации CD69 на В-клетках в цельной крови. На фигуре 19А показаны данные относительно i. цельной крови человека от нескольких доноров (n=13), которую инкубировали с титрованием дозы CFZ533, и пролиферацию (H-TdR) оценивали после трех дней культивирования. ii. PBMC человека из нескольких доноров (n=26) инкубировали с титрованием дозы CFZ533 и пролиферацию (H-TdR) оценивали после трех дней культивирования. Для обоих графиков данные представлены в виде среднего значения и SD нормализованного cpm в зависимости от log-трансформированной концентрации CFZ533 (rCD154+IL-4=100; пунктирные линии, клетки плюс среды=0; пунктирные линии). На фигуре 19B показано, что CFZ533 не индуцировало пролиферацию PBMC человека в присутствии дополнительных стимулов. РВМС человека стимулировали в течение 3 дней титрованием дозы CFZ533 в присутствии IL-4 (i) или F(ab')2 антитела IgM. (ii). Среднее значение и SD 3H-TdR (cpm) показаны в зависимости от log-трансформированной концентрации CFZ533. На фигуре 19C показано, как цельную кровь человека (41 донор) культивировали в течение ночи без стимулов, CFZ533, контроль изотипа или rCD154 и экспрессию CD69 на В-клетках оценивали с помощью FACS. Каждая точка представляет данные от одного донора со средними значениями % CD69, обозначенными горизонтальной красной линией.
На фигуре 19А показано, что CFZ533 не способно индуцировать внедрение тимидина в цельную кровь человека (разбавление 1:10) или РВМС, в отличие от rCD154. На неспособность CFZ533 индуцировать пролиферацию не влияло добавление дополнительных костимулов, таких как IL-4 или антитело IgM (фигура 19B). Авторы настоящего изобретения также смогли продемонстрировать, что CFZ533 было неспособно индуцировать активирование CD69 на B-клетках в цельной крови от нескольких доноров, опять же, в отличие от rCD154 (фигура 19C). Наконец, CFZ533 было неспособно индуцировать продуцирование цитокинов с помощью CD40, экспрессирующего DC, полученные из моноцитов или эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) (данные не представлены).
CFZ533 не опосредовало истощение клеток
CFZ533 было сконструировано так, чтобы содержать мутацию N297A, ранее продемонстрировавшую отмену связывания FcγR, что приводило в результате к неспособности опосредовать антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC). CFZ533 не было способно связывать FcγRIIIA по сравнению с HCD122 (IgG1 дикого типа) (таблица 5), и авторы изобретения хотели изучить, как это отсутствие связывания влияет на способность CFZ533 опосредовать истощение клеток.
a
Таблица 5. Аффинность связывания (k[1/M]) HCD122 и CFZ533 с FcγRIIIA человека
Виды FcγR
HCD122 (IgG1 дикого типа)
CFZ533 (N297A IgG1)
158V FcγRIIIA человека
1,72×106
н. о.
158F FcγRIIIA человека
6,99×105
н. о.
н. о. - не обнаружено
На фигуре 20A показаны данные культур из цельной крови человека, инкубированных в течение 72 часов в присутствии дозы титрования CFZ533 или 50 мкг/мл ритуксимаба. Количество В-клеток определяли на основании событий CD45pos и CD19pos, попадающих в гейты FSC/SSC лимфоцитов. Результаты для отдельных концентраций антител рассчитывали в виде процента оставшихся В-клеток по отношению к необработанным образцам и представляли на графике в зависимости от log-трансформированной концентрации антител (доведенной до 100% и показанной в виде пунктирной линии). Данные представляют собой среднее значение и SD восьми независимых доноров. На фигуре 20B показаны результаты для В-клеток Raji, инкубированных с различными концентрациями ритуксимаба или CFZ533 и фиксированной концентрацией комплемента кролика. Зависимое от концентрации уничтожение клеток Raji анализировали через 2 часа, при этом жизнеспособность клеток измеряли с помощью определения концентрации ATP в каждой лунке с использованием люциферазы. Результаты представлены в виде нормализованных по изотипу относительных единиц люциферазы (RLU) в зависимости от log-трансформированной концентрации антител.
На фигуре 20A показано, что не только истощающее антитело к CD20 ритуксимаб было способно удалить примерно 80% В-клеток в цельной крови человека, но и CFZ533 не смогло опосредовать любое истощение клеток. Кроме того, CFZ533 было неспособно опосредовать комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) В-клеток Raji, в отличие от ритуксимаба (фигура 20B).
CFZ533 интернализировано В-клетками CD40-зависимым образом
Затем авторы настоящего изобретения хотели проверить, могло ли CFZ533 быть интернализировано CD40, экспрессирующим линию RI-1 В-клеток человека. На фигуре 21A показано, что rCD154 было интернализировано в допустимых условиях (37°C) по сравнению с недопустимыми условиями (4°C), где на плазматической мембране можно было наблюдать слабое окрашивание rCD154. CFZ533 также было интернализировано, хотя, по-видимому, при 37°С оставалось остаточное окрашивание мембраны. На фигуре 21B показано, что степень интернализации rCD154 оказалась больше, чем наблюдаемая для CFZ533. С использованием нокаутной по CD40 клеточной линии RI-1 авторы изобретения смогли продемонстрировать, что связывание и интернализация CFZ533 (фигура 21C) и rCD154 (данные не показаны) зависели от CD40.
На фигуре 21А показаны репрезентативные изображения отдельных В-клеток RI-1, культивируемых с AlexaFlour 488, мечеными rCD154 или CFZ533, в течение 3 часов при 37°С или 4°С. Фигура 21B. Относительное разрушение интернализации CFZ533 и rCD154 в допустимых условиях (вычтены значения недопустимого разрушения). Каждая точка представляет данные из отдельного эксперимента, и среднее значение популяции обозначено горизонтальной красной линией. Фигура 21C. Репрезентативные изображения отдельных экспрессирующих CD40 или нокаутных по CD40 клеток RI-1, культивируемых с Alexa488, мечеными CFZ533, в течение 3 часов при 37°С. Во всех экспериментах клетки окрашивали совместно с AlexaFlour 647, меченым CD45, для разметки клеточной мембраны.
Фармакокинетические свойства CFZ533 у приматов, отличных от человека
Фигура 22A. Концентрации CFZ533 в сыворотке крови у трех макаков-крабоедов после введения однократной дозы при рассчитанных дозах, составляющих 16,2 (5532), 18,5 (5531) и 20 (5530) мг/кг внутривенно. Фигура 22B. Занятость CD40: процент имеющегося CD40 (i) и процент общего CD40 (ii) C. Периферические B/T-клетки: процент B-клеток периферической крови после однократной дозы. День 0 представляет собой время, когда вводили CFZ533.
in vivo
Приведенные выше данные указывают на то, что CFZ533 связывает NHP CD40 и может ингибировать rCD154-индуцированную активацию В-клеток NHP с аналогичными активностями. Это говорит о том, что макаки-крабоеды и макаки-резусы были бы подходящими видами для исследований , в которых исследуется связь между PK и PD CFZ533. Данные на фигуре 22A показывают профили PK трех макаков-крабоедов после однократной внутривенной дозы CFZ533 (расчетные дозы 16,2, 18,5 и 20 мг/кг). Как правило, для моноклонального антитела, нацеленного на интернализирующий мембраносвязанный антиген (Mager et al. 2006 и Ng et al. 2006), временная динамика концентрации CFZ533 демонстрировала четкое опосредованное мишенью расположение, что приводило к нелинейным профилям PK и периоду полужизни и скорости выведения, зависящих от концентрации. Точка перегиба, наблюдаемая в профилях PK, являлась маркером связывания с мишенью и связана с повышенным вкладом CD40 в общее выведение CFZ533 и более коротким периодом полужизни. Кроме того, точка перегиба в профилях PK совпадала со временем, когда наблюдалось падение насыщения CD40 (фигура 22B, i). Это происходило при примерно 10-20 мкг/мл, когда CFZ533 подвергалось более быстрому удалению. У всех животных не было утраты экспрессии рецептора CD40 на клетках (фигура 22B, ii). Кроме того, CFZ533 не истощало B-клетки периферической крови (фигура 22C) или T-клетки (данные не показаны), несмотря на некоторые наблюдаемые изменения на протяжении всего исследования.
CFZ533 ингибировало восстановительное продуцирование антител, зависимое от Т-клеток
На фигуре 23A показан экспериментальный схематический план для оценки эффекта CFZ533 в отношении восстановления TDAR. Стрелки под осью х обозначают первичную и вторичную иммунизации KLH. Время введения однократной дозы 10 мг/кг CFZ533 показано выше. Звездочками обозначены моменты времени, в которые были измерены уровни IgG к KLH и/или CFZ533. Фигура 23B. На каждом графике показаны уровни IgG к KLH (закрашенные символы) и уровни CFZ533 в плазме (логарифмическая шкала; непрерывная линия) для отдельного животного. Средние уровни IgG к KLH из контрольных животных (незакрашенные символы) наложены на каждый график для сравнительных целей. Фигура 23C. Гистологический анализ зародышевых центров (окрашивание Ki67) в mLN из макаков-резусов из 26-недельного исследования c подкожной многократной дозой 1 мг/кг/неделя с использованием CFZ533. Представлены срезы mLN из шести животных (i) вместе с контрольным изображением (ii). iii. Средние установившиеся концентрации CFZ533 в сыворотке крови в течение периода введения доз из отдельных животных в конце периода лечения.
Ожидаемым целевым эффектом PD в отношении блокированного CD40 являлось ингибирование TDAR (Kawabe et al. 1994). CFZ533 ингибировало первичные TDAR у NHP и людей, и авторы настоящего изобретения также хотели исследовать эффекты этого антитела в отношении восстановления TDAR. Экспериментальный план кратко изложен на фигуре 23A. Вкратце, четырех макаков-резусов иммунизировали KLH в квасцах в день исследования -28 (примирование) перед однократной внутривенной дозой CFZ533 в дозе 10 мг/кг в день исследования 1 с последующей второй иммунизацией KLH в день исследования 15.
in vivo
На фигуре 23B показаны эффекты CFZ533 в отношении восстановленных ответов на IgG к KLH у четырех отдельных животных по сравнению с данными из иммунизированного контроля (без CFZ533). Была выявлена вариабельность между животными в профилях PK CFZ533 с более быстрым удалением CFZ533, наблюдаемым у животных № 1 и № 3. Более высокие концентрации в плазме наблюдали в течение более длительного периода времени у животных № 2 и № 4. Интересно, что эти животные продемонстрировали полное подавление восстановленного ответа IgG к KLH (и IgM; данные не показаны) в день исследования 15 (обратите внимание, что у всех животных был установлен основной TDAR для KLH). Напротив, ответы IgG к KLH наблюдали (хотя и с некоторой задержкой) у животных с более быстрым выведением CFZ533 (более высокая задержка для животного № 3 по сравнению с животным № 1), особенно когда уровни CFZ533 в сыворотке крови составляли менее чем примерно 40 мкг/мл во время второй иммунизации KLH. Как наблюдали в предыдущих экспериментах  с CFZ533 на подвергаемых трансплантации (Cordoba et al. 2015) и не подвергаемых трансплантации животных (фигура 22B), не наблюдали истощения периферических B-клеток (данные не показаны).
pos
Вышеуказанные результаты показали, что концентрации CFZ533 в сыворотке крови выше чем приблизительно 40 мкг/мл были необходимы для полного подавления восстановления TDAR в NHP. Авторы настоящего изобретения хотели дополнительно изучить взаимосвязь между воздействием CFZ533 и фармакодинамическими эффектами ткани, зависимыми от пути CD40. По окончании 26-недельного токсикологического исследования, при 1 мг/кг/неделя CFZ533 подкожно, авторы изобретения провели гистологический и молекулярный анализы GC в брыжеечных лимфатических узлах (mLN). На фигуре 23C (i) показано, что из шести дозированных животных авторы изобретения могли наблюдать полное подавление GC у трех индивидуумов, тогда как GC все еще можно было наблюдать в mLN оставшихся животных. На фигуре 23C (iii) показано, что концентрации в сыворотке крови, составляющие по меньшей мере 38 мкг/мл (средняя концентрация в равновесном состоянии в течение интервала введения доз), были связаны с полным подавлением развития GC в кортикальных участках В-клеток лимфатических узлов, в то время как наблюдали неполное подавление (животное 26842) или отсутствие подавления (животные 26772 и 26837) GC при концентрациях в сыворотке крови ниже 20 мкг/мл, несмотря на полную занятость CD40 на B-клетках CD20 цельной крови (животные 26842 и 26772; данные не показаны). Не было выявлено истощения периферических В-клеток (данные не показаны).
Обсуждение
CFZ533 разрабатывали в качестве потенциальной терапии для трансплантации солидных органов и аутоиммунных заболеваний, связанных с нарушением регуляции костимулирующего пути CD40-CD154. В данном документе авторы настоящего изобретения описывают характеристику функциональных свойств CFZ533 в пути CD40, соответствующих модельным системам in vitro и in vivo, а также исследуют взаимосвязь между воздействием CFZ533 и эффектами PD.
CFZ533 было способно связывать CD40 и полностью предотвращать rCD154-индуцированную активацию пути на различных типах иммунных клеток человека, включая B-клетки и DC. Кроме того, по-видимому, для CFZ533 требовалось более 90% занятости CD40, чтобы полностью блокировать активацию пути в цельной крови. В совокупности эти данные позволили предположить, что CFZ533 обладает потенциалом блокировать зависимые от пути CD40 эффекторные функции независимо от типа клеток, при условии, что была достигнута достаточная занятость рецептора. Эти данные также указывают на то, что в РВМС CFZ533 было способно вытеснять предварительно связанный rCD154 из CD40, что предполагает то, что эпитопы mAb и физиологического лиганда могут перекрываться; понятие в стадии исследования в структурных исследованиях.
In vivo
in vitro
, в зависимости от концентрации, скорость выведения и период полужизни наблюдали для CFZ533 в исследованиях однократной дозы PK. Этот профиль PK предполагал, что экспрессия рецептора CD40 влияла на удаление CFZ533. При низких концентрациях CFZ533 (т. е. неполное насыщение мишени) вклад CD40 в общее выведение CFZ533 был повышен, а период полужизни был несколько короче, чем обычно наблюдается для антител типа IgG1. При более высоких концентрациях, соответствующих полному насыщению мишени (и полному ингибированию функционального пути), вклад рецептора в общее выведение CFZ533 был ограничен, а период полужизни увеличивался. Опосредованное мишенью выведение CFZ533 соответствовало CD40-опосредованной интернализации CFZ533, наблюдаемой , что вероятно сопровождалось лизосомальной деградацией комплекса.
in vivo
Дополнительные данные из исследований PK/PD подтвердили неспособность CFZ533 истощать периферические В-клетки (Cordoba et al. 2015). Как упоминалось, неспособность CFZ533 истощать экспрессирующие CD40 клетки обусловлена наличием мутации N297A в антителе, приводящей к отсутствию N-связанного гликозилирования в шарнирной области, что делало его неспособным связывать FcγRIIIA или опосредовать ADCC или CDC. Подавление Fc CFZ533 осуществляли для предотвращения истощения типов клеток, экспрессирующих CD40; особое беспокойство вызывало широкое распределение этого рецептора в тканях по иммунным и неиммунным типам клеток, особенно при воспалительных состояниях.
В дополнение к эффективности при трансплантации почки NHP (Cordoba et al. 2015), результаты в этом документе указывают на то, что CFZ533 полностью ингибировало восстановление TDAR. Этот результат позволяет предположить, что ответы В-клеток памяти на Т-клеточные антигены полностью зависели от взаимодействий CD40-CD154. Степень ингибирования восстановленного ответа, по-видимому, связана с концентрацией CFZ533 с уровнями сыворотки крови, превышающими 30-40 мкг/мл (в течение по меньшей мере недели после стимулирования), необходимыми для полного подавления ответа антигенспецифического антитела. Эта взаимосвязь между концентрацией в сыворотке крови и считыванием PD ткани, имеющей отношение к пути CD40, также сохранялась при изучении эффекта CFZ533 в отношении GC брыжеечного лимфатического узла, где для полного подавления GC требовался минимальный порог средних устойчивых концентраций CFZ533 в сыворотке крови. Эти данные указывают на важность установления взаимосвязи между периферическими воздействиями лекарственных средств и целевым эффектом PD в тканях для обоснования стратегий введения доз. Для различных аутоиммунных заболеваний разрабатываются несколько биологических препаратов, нацеленных на путь костимуляции CD40-CD154. Помимо mAb к CD40, таких как CFZ533, в клинической практике остаются mAb к CD154, несмотря на потенциальный риск в отношении тромбоэмболических осложнений (Boumpas et al., 2003). Недавние результаты показали, что подходы в отношении подавления Fc и пегилированного F(ab')2 могут устранять тромбоэмболические недостатки антител, нацеленных на CD154, однако имеются сообщения о том, что mAb к CD154 с подавленной Fc могут быть менее эффективными. На сегодняшний день нет данных о тромбоэмболических событиях, связанных с введением нескольких антител к CD40 на доклинических моделях или в клинической практике.
В заключение, эти данные указывают на то, что CFZ533 является блокирующим путь, неистощающим антителом к CD40 с минимальными агонистическими свойствами. При достаточных фармакологически значимых воздействиях CFZ533 способно полностью ингибировать восстановление TDAR, а также подавляет зародышевые центры без истощения типов клеток, экспрессирующих CD40. Эти данные, объединенные с доклинической эффективностью при трансплантации почки, обеспечивают солидное научное обоснование для потенциальной клинической применимости CFZ533 в некоторых аутоиммунных заболеваниях и трансплантации солидных органов.
ССЫЛОЧНЫЙ МАТЕРИАЛ
Bombardieri M, Pitzalis C. Ectopic lymphoid neogenesis and lymphoid chemokines in Sjogren's syndrome: at the interplay between chronic inflammation, autoimmunity and lymphomagenesis. Curr Pharm Biotechnol. 2012 Aug; 13(10):1989-1996.
Bombardieri M, Barone F, Lucchesi D, Nayar S, van den Berg WB, Proctor G, et al. Inducible tertiary lymphoid structures, autoimmunity, and exocrine dysfunction in a novel model of salivary gland inflammation in C57BL/6 mice. J Immunol. 2012 Oct 1; 189(7):3767-3776.
Bombardieri M, Lewis M, Pitzalis C. Ectopic lymphoid neogenesis in rheumatic autoimmune diseases. Nat Rev Rheumatol. 2017 Mar; 13(3):141-154.
Boumpas DT, Furie R, Manzi S, Illei GG, Wallace DJ, Balow JE et al. A short course of BG9588 (anti-CD40 ligand antibody) improves serologic activity and decreases hematuria in patients with proliferative lupus glomerulonephritis. Arthritis Rheum 2003; 48(3):719-727.
Cordoba F, Wieczorek G, Audet M, Roth L, Schneider MA, Kunkler A et al. A novel, blocking, Fcsilent anti-CD40 monoclonal antibody prolongs nonhuman primate renal allograft survival in the absence of B cell depletion. Am J Transplant 2015; 15(11):2825
Dimitriou ID, Kapsogeorgou EK, Moutsopoulos HM, et al (2002) CD40 on salivary gland epithelial cells: high constitutive expression by cultured cells from Sjögren's syndrome patients indicating their intrinsic activation. Clin Exp Immunol; 127(2):386-92.
Delporte C, Steinfeld S. Distribution and roles of aquaporins in salivary glands. Biochim Biophys Acta. 2006 Aug; 1758(8):1061-1070.Harland R, Klintmalm G, Yang H, et al. (2015) ASKP1240 in De Novo Kidney Transplant Recipients. Am J Transplant; 15(S3): Abstract # 3012.
Horvath S, Nazmul-Hossain AN, Pollard RP, Kroese FG, Vissink A, Kallenberg CG, et al. Systems analysis of primary Sjogren's syndrome pathogenesis in salivary glands identifies shared pathways in human and a mouse model. Arthritis Res Ther. 2012 Nov 1; 14(6):R238.
Jacobi AM, Hansen A, Kaufmann O, Pruss A, Burmester GR, Lipsky PE, et al. Analysis of immunoglobulin light chain rearrangements in the salivary gland and blood of a patient with Sjogren's syndrome. Arthritis Res. 2002; 4(4):R4.
Jonsson MV, Delaleu N, Brokstad KA, Berggreen E, Skarstein K. Impaired salivary gland function in NOD mice: association with changes in cytokine profile but not with histopathologic changes in the salivary gland. Arthritis Rheum. 2006 Jul; 54(7):2300-2305.
Kaufman I, Schwartz D, Caspi D, et al (1999) Sjögren's syndrome - not just Sicca: renal involvement in Sjögren's syndrome. Ann Rheum Dis. 58:253-6.
Kawabe T, Naka T, Yoshida K, Tanaka T, Fujiwara H, Suematsu S et al. The immune responses in CD40-deficient mice: impaired immunoglobulin class switching and germinal center formation. Immunity 1994; 1(3):167-178.
Kim EJ, Kwun J, Gibby AC, Hong JJ, Farris AB, 3rd, Iwakoshi NN, et al. Costimulation blockade alters germinal center responses and prevents antibody-mediated rejection. Am J Transplant. 2014 Jan; 14(1):59-69.
Komaroff AL, Fagioli LR, Doolittle TH, et al (1996) Health status in patients with chronic fatigue syndrome and in general population and disease comparison groups. Am J Med; 101:281-90.
Kuenstner S, Langelotz C, Budach V, et al (2002) The comparability of quality of life scores. A multitrait multimethod analysis of the EORTC QLQ-C30, SF-36 and FLIC questionnaires. Eur J Cancer; 38:339-48.
Laman JD, Claassen E, Noelle RJ. Functions of CD40 and its ligand, gp39 (CD40L). Crit Rev Immunol. 1996; 16(1):59-108.
Mager DE. Target-mediated drug disposition and dynamics. Biochem Pharmacol 2006; 72(1):1-10.
Mahmoud TI, Wang J, Karnell JL, Wang Q, Wang S, Naiman B, et al. Autoimmune manifestations in aged mice arise from early-life immune dysregulation. Sci Transl Med. 2016 Oct 19; 8(361):361ra137.
Manganelli P and Fietta P (2003) Apoptosis and Sjögren syndrome. Semin Arthritis Rheum; 33(1):49-65.
Meijer JM, Meiners PM, Vissink A, et al (2010) Effectiveness of rituximab treatment in primary Sjögren's syndrome: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Arthritis Rheum; 62:960-8.
Moerman RV, Arends S, Meiners PM, et al (2014) EULAR Sjögren's Syndrome Disease Activity Index (ESSDAI) is sensitive to show efficacy of rituximab treatment in a randomized controlled trial. Ann Rheum Dis; 73:472-4.
Ng CM, Stefanich E, Anand BS, Fielder PJ, Vaickus L. Pharmacokinetics/pharmacodynamics of nondepleting anti-CD4 monoclonal antibody (TRX1) in healthy human volunteers. Pharm Res 2006; 23(1):95-103.
Ohlsson M, Szodoray P, Loro LL, Johannessen AC, Jonsson R. CD40, CD154, Bax and Bcl-2 expression in Sjogren's syndrome salivary glands: a putative anti-apoptotic role during its effector phases. Scand J Immunol. 2002 Dec; 56(6):561-571.
Ristov J, Espie P, Ulrich P, Sickert D, Flandre T, Dimitrova M, et al. Characterization of the in vitro and in vivo properties of CFZ533, a blocking and non-depleting anti-CD40 monoclonal antibody. Am J Transplant. 2018 Apr 17.
Roescher N, Lodde BM, Vosters JL, Tak PP, Catalan MA, Illei GG, et al. Temporal changes in salivary glands of non-obese diabetic mice as a model for Sjogren's syndrome. Oral Dis. 2012 Jan; 18(1):96-106.
Roescher N, Vosters JL, Lai Z, Uede T, Tak PP, Chiorini JA. Local administration of soluble CD40:Fc to the salivary glands of non-obese diabetic mice does not ameliorate autoimmune inflammation. PLoS One. 2012; 7(12):e51375.
Segal B, Bowman SJ, Fox PC, et al (2009) Primary Sjögren's Syndrome: health experiences and predictors of health quality among patients in the United States. Health Qual Life Outcomes; 7:46.
Sellam J, Proulle V, Jüngel A, et al (2009) Increased levels of circulating microparticles in primary Sjögren's syndrome, systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis and relation with disease activity. Arthritis Res Ther; 11:R156.
Seror R, et al (2011a) EULAR Sjogren's syndrome disease activity index: development of a consensus systemic disease activity index for primary Sjogren's syndrome. Ann Rheum Dis.; 69(6):1103-9.
Seror R, et al (2011b) EULAR Sjogren's Syndrome Patient Reported Index (ESSPRI): development of a consensus patient index for primary Sjogren's syndrome. Ann Rheum Dis.; 70(6):968-72.
Stott DI, Hiepe F, Hummel M, Steinhauser G, Berek C. Antigen-driven clonal proliferation of B cells within the target tissue of an autoimmune disease. The salivary glands of patients with Sjogren's syndrome. J Clin Invest. 1998 Sep 1; 102(5):938-946.
Tishler M, Yaron I, Shirazi I, et al (2008) Hydroxychloroquine treatment for primary Sjögren's syndrome: its effect on salivary and serum inflammatory markers. Scand J Rheumatol. 37:213-8.
Th'ng KH, Garewal G, Kearney L, Rassool F, Melo JV, White H et al. Establishment and characterization of three new malignant lymphoid cell lines. Int J Cancer 1987; 39(1):89-93.
Vossenkämper A, Lutalo PM, Spencer J (2012) Translational mini-review series on B cell subsets in disease. Transitional B cells in systemic lupus erythematosus and Sjögren's syndrome: clinical implications and effects of B cell-targeted therapies. Clin Exp Immunol; 167:7-14.
Voulgarelis M, Moutsopoulos HM. Mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma in Sjogren's syndrome: risks, management, and prognosis. Rheum Dis Clin North Am. 2008 Nov; 34(4):921-933, viii.
Warncke M, Calzascia T, Coulot M, Balke N, Touil R, Kolbinger F et al. Different adaptations of IgG effector function in human and nonhuman primates and implications for therapeutic antibody treatment. J Immunol 2012; 188(9):4405-4411.
Winzer M, Aringer M. (2010) Use of methotrexate in patients with systemic lupus erythematosus and primary Sjögren's syndrome. Clin Exp Rheumatol. 28 (5 Suppl 61):S156-9.
Yoshimura S, Nakamura H, Horai Y, Nakajima H, Shiraishi H, Hayashi T, et al. Abnormal distribution of AQP5 in labial salivary glands is associated with poor saliva secretion in patients with Sjogren's syndrome including neuromyelitis optica complicated patients. Mod Rheumatol. 2016; 26(3):384-390.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Novartis AG
<120>  АНТИТЕЛА К CD40 ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ЛЕЧЕНИИ СИНДРОМА ШЕГРЕНА
<130>  PAT057947
<150>  US 62/581212
<151>  2017-11-03
<150>  US 62/644939
<151>  2018-03-19
<160>  19
<170>  PatentIn версия 3.5
<210>  1
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  1
Ser Tyr Gly Met His
1. 5
<210>  2
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  2
Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  3
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  3
Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr
1               5                   10
<210>  4
<211>  16
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  4
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp
1               5                   10                  15
<210>  5
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  5
Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser
1               5
<210>  6
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  6
Met Gln Ala Arg Gln Thr Pro Phe Thr
1               5
<210>  7
<211>  120
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  7
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ile Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  8
<211>  112
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapeins
<400>  8
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Thr Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20                  25                  30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Val Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85                  90                  95
Arg Gln Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Arg
100                 105                 110
<210>  9
<211>  450
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  9
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ile Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly Lys
450
<210>  10
<211>  219
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  10
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Thr Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20                  25                  30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Val Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85                  90                  95
Arg Gln Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Arg
100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  11
<211>  450
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  11
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ile Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly Lys
450
<210>  12
<211>  219
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  12
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Thr Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20                  25                  30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Val Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85                  90                  95
Arg Gln Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Arg
100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  13
<211>  217
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  13
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1               5                   10                  15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20                  25                  30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35                  40                  45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50                  55                  60
Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65                  70                  75                  80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85                  90                  95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100                 105                 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115                 120                 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130                 135                 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145                 150                 155                 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165                 170                 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180                 185                 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195                 200                 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210                 215
<210>  14
<211>  217
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  14
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1               5                   10                  15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20                  25                  30
Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35                  40                  45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50                  55                  60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65                  70                  75                  80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85                  90                  95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100                 105                 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115                 120                 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130                 135                 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145                 150                 155                 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165                 170                 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180                 185                 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195                 200                 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210                 215
<210>  15
<211>  1350
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  15
caggtgcagc tggtggaatc tggcggcgga gtggtgcagc ctggccggtc cctgagactg       60
tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agctacggca tgcactgggt gcgacaggcc      120
cctggcaagg gactggaatg ggtggccgtg atctcctacg aggaatccaa cagataccac      180
gctgactccg tgaagggccg gttcacaatc tcccgggaca actccaagat caccctgtac      240
ctgcagatga actccctgcg gaccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggacgga      300
ggaatcgccg ctcctggacc tgattattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcctcc      360
gctagcacca agggcccctc cgtgttccct ctggccccct ccagcaagtc cacctctggc      420
ggcaccgccg ctctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc      480
tggaactctg gcgccctgac ctccggcgtg cacacctttc cagccgtgct gcagtcctcc      540
ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtgacc gtgccctcta gctctctggg cacccagacc      600
tacatctgca acgtgaacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaaccc      660
aagtcctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga      720
ccttccgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatctc ccggaccccc      780
gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg      840
tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacgcc      900
tccacctacc gggtggtgtc tgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa      960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgaaaa gaccatctcc     1020
aaggccaagg gccagccccg cgagccacag gtgtacacac tgccccccag ccgggaagag     1080
atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtcaaag gcttctaccc ctccgatatc     1140
gccgtggagt gggagtccaa cggacagccc gagaacaact acaagaccac cccccctgtg     1200
ctggactccg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gtcccggtgg     1260
cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc     1320
cagaagtccc tgtccctgag ccccggcaag                                      1350
<210>  16
<211>  657
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  16
gacatcgtga tgacccagtc ccccctgtcc ctgaccgtga cacctggcga gcctgcctct       60
atctcctgca gatcctccca gtccctgctg tactccaacg gctacaacta cctggactgg      120
tatctgcaga agcccggcca gtccccacag gtgctgatct ccctgggctc caacagagcc      180
tctggcgtgc ccgaccggtt ctccggctct ggctctggca ccgacttcac actgaagatc      240
tcacgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgca tgcaggcccg gcagaccccc      300
ttcaccttcg gccctggcac caaggtggac atccggcgta cggtggccgc tcccagcgtg      360
ttcatcttcc cccccagcga cgagcagctg aagagcggca ccgccagcgt ggtgtgcctg      420
ctgaacaact tctacccccg ggaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag      480
agcggcaaca gccaggagag cgtcaccgag caggacagca aggactccac ctacagcctg      540
agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc ataaggtgta cgcctgcgag      600
gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg accaagagct tcaacagggg cgagtgc         657
<210>  17
<211>  1350
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  17
caggtgcagc tggtggaatc tggcggcgga gtggtgcagc ctggccggtc cctgagactg       60
tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agctacggca tgcactgggt gcgacaggcc      120
cctggcaagg gactggaatg ggtggccgtg atctcctacg aggaatccaa cagataccac      180
gctgactccg tgaagggccg gttcacaatc tcccgggaca actccaagat caccctgtac      240
ctgcagatga actccctgcg gaccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggacgga      300
ggaatcgccg ctcctggacc tgattattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcctcc      360
gctagcacca agggcccctc cgtgttccct ctggccccct ccagcaagtc cacctctggc      420
ggcaccgccg ctctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc      480
tggaactctg gcgccctgac ctccggcgtg cacacctttc cagccgtgct gcagtcctcc      540
ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtgacc gtgccctcta gctctctggg cacccagacc      600
tacatctgca acgtgaacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaaccc      660
aagtcctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga      720
ccttccgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatctc ccggaccccc      780
gaagtgacct gcgtggtggt ggccgtgtcc cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg      840
tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac      900
tccacctacc gggtggtgtc tgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa      960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgaaaa gaccatctcc     1020
aaggccaagg gccagccccg cgagccacag gtgtacacac tgccccccag ccgggaagag     1080
atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtcaaag gcttctaccc ctccgatatc     1140
gccgtggagt gggagtccaa cggacagccc gagaacaact acaagaccac cccccctgtg     1200
ctggactccg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gtcccggtgg     1260
cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc     1320
cagaagtccc tgtccctgag ccccggcaag                                      1350
<210>  18
<211>  657
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  18
gacatcgtga tgacccagtc ccccctgtcc ctgaccgtga cacctggcga gcctgcctct       60
atctcctgca gatcctccca gtccctgctg tactccaacg gctacaacta cctggactgg      120
tatctgcaga agcccggcca gtccccacag gtgctgatct ccctgggctc caacagagcc      180
tctggcgtgc ccgaccggtt ctccggctct ggctctggca ccgacttcac actgaagatc      240
tcacgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgca tgcaggcccg gcagaccccc      300
ttcaccttcg gccctggcac caaggtggac atccggcgta cggtggccgc tcccagcgtg      360
ttcatcttcc cccccagcga cgagcagctg aagagcggca ccgccagcgt ggtgtgcctg      420
ctgaacaact tctacccccg ggaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag      480
agcggcaaca gccaggagag cgtcaccgag caggacagca aggactccac ctacagcctg      540
agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc ataaggtgta cgcctgcgag      600
gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg accaagagct tcaacagggg cgagtgc         657
<210>  19
<211>  277
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  19
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
1               5                   10                  15
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
20                  25                  30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
35                  40                  45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
50                  55                  60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
65                  70                  75                  80
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
85                  90                  95
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
100                 105                 110
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
115                 120                 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
130                 135                 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145                 150                 155                 160
Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln
165                 170                 175
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu
180                 185                 190
Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile
195                 200                 205
Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn
210                 215                 220
Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp
225                 230                 235                 240
Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His
245                 250                 255
Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser
260                 265                 270
Val Gln Glu Arg Gln
275
<---