Исследование воздействия гамма-излучения на эритроциты с помощью электропорации

УДК 612.11.014.4

ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ГАММА-ИЗЛУЧЕНИЯ НА ЭРИТРОЦИТЫ С ПОМОЩЬЮ ЭЛЕКТРОПОРАЦИИ

Е. К. Козлова, А. П. Черняев, А. М. Черныш, П. Ю. Алексеева

Представлены экспериментальные данные по исследованию воздействия 7-излучения на красные кровяные клетки человеческого организма при разной температуре для доз до 30 рентген. Скрытые мембранные повреждения эритроцитов после облучения выявлялись с помощью метода последующей электропорации калиброванным импульсом электрического поля. Предлагается математическая модель, позволяющая описать представленные результаты экспериментов и численно оценить характеристики электропорации мембран эритроцитов при действии 7-излучения.

Исследование особенностей действия ионизирующего излучения, в частности 7-излучения, как на организм в целом, так и на отдельные клетки, продолжает оставаться актуальным в связи с развитием методов лучевой терапии [1-4]. В последние годы отмечается возросший интерес к выяснению механизмов действия малых доз (менее 25 рентген) [4-6].

Цель работы: исследование влияния 7-излучения (226Йа) на мембраны эритроцитов крови человека с помощью метода последующей электропорации калиброванным импульсом электрического поля. Данный метод изучения действия различных физико-химических факторов на модифицированную электрическим импульсом мембрану описан нами в работах [7, 8].

Выделенные эритроциты человека помещались в 0.9% раствор №С1 (концентрация 230 млн эритроцитов на 1 мл суспензии крови). Степень воздействия 7-излучения оценивали методом сравнения кинетики гемолиза (гибели) эритроцитов облученной суспензии с кинетикой гемолиза эритроцитов контрольной суспензии. Количество оставшихся в суспензии клеток в данный момент времени определяли с помощью фотоколориметрического анализа.

Известно, что повреждения от малых доз ионизирующего излучения могут оказаться скрытыми (потенциальными). Действительно, в наших опытах скорости гемолиза эритроцитов в облученной и в контрольной суспензиях статистически не отличались. Поэтому для выявления скрытых повреждений мембрану подвергали электропорации калиброванным импульсным электрическим полем клинического дефибриллятора. Напряженность электрического поля в растворе составляла 1700 В/см, что обеспечивало необратимый электрический пробой мембраны эритроцитов. Подробно методика экспериментов описана ранее в работе [8].

Для облучения суспензии эритроцитов излучением источника 226 Яа был сконструирован металлический контейнер с высотой внутренних стенок 30 мм. В центр помещали колбу с радионуклидом,

пробирки с суспензией размещали на расстоянии 30 мм от источника. Высота суспензии в пробирке составляла 20 мм. Пробирки с суспензией подвергали действию 7-излучения, после этого пробирки с облученной и контрольной суспензией оставляли на сутки в темном изолированном хранилище. Затем на суспензию воздействовали импульсным электрическим полем и измеряли кинетически кривые (зависимость оптической плотности суспензии Б от времени).

В экспериментах использовали излучение двух источников 226Яа с активностью 2.04 и 9.25 мКи, время облучения варьировалось от 5 мин до 24 ч. Опыты проводились для трех диапазонов температур суспензии крови: 14-15 С. 17-18°С и 20-21 °С.

В зависимости от дозы облучения наблюдали эффекты замедления и ускорения кинетики гемолиза эритроцитов. На рис. 1 представлены кинетические кривые (кривая 2) для эритроцитов, которые облучались в течение 3 ч при температуре Т = 19-20 °С (а) и при Т = 14-15°С (б) источником с активностью 2.04 мКи, а затем через 24 ч подвергались электропорации с помощью калиброванного импульса. Для сравнения представлены кинетические кривые для соответствующих контрольных суспензий для данных температур (кривая /). На рис. 1, а кривая 2 проходит ниже кривой /, что соответствует ускорению гемолиза. А на рис. 1,6 — наоборот, выше, что соответствует его замедлению. Облученные эритроциты без последующей электропорации (кривая 3 на рис. 1) вели себя подобно клеткам в контрольной суспензии, которая не подвергалась облучению и электропорации (кривая 3' на рис. 1).

Экспериментальные кинетические кривые могут быть описаны экспоненциальной зависимостью. На рис. 2 показаны данные для характерной константы А уменьшения числа эритроцитов. Данные для каждого значения дозы обработаны с помощью стандартных методов математической статистики, указаны средние значения и соответствующие ошибки. Средние результаты опытов, соответствующие разным дозам облучения, соединены для наглядности

10 ВМУ, физика, астрономия, №3

D, отн. ед. 1.1-

Ш

0.9

0.8 0.7  0.6  0.5  0.4. 0.3

3

3'

<

u\ I

i t t

ч I 7

J_ J

2 ' 1

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220

t, мин

D, отн. ед. б

1.1

т

0.9  0.8 0.7  0.6 0.5 0.4. 0.3

3'

3

•T i

2

1 I 1

' 1

0 20 40 60 80 100 120

140 160 t мин

Рис. 1. Кинетические кривые — время

после воздействия импульсным электрическим полем): (а) Т = 19-20 °С, (б) Т = 14-15 °С. Кривая / - контрольная суспензия (без облучения), кривая 2 — суспензия, облученная источником 226 На (активность А = 2.04 мКи, доза 4 рентген), затем через 24 ч воздействие на суспензию калиброванным импульсным электрическим полем (напряженность поля в суспензии 1700 В/см); кривая 3 -облученная суспензия через 24 ч (без электропорации), кривая 3' — без облучения и без электропорации

линиями. Проверена гипотеза о равенстве средних значений для данной дозы и для контроля (элек-тропорация без облучения). Так, при температуре 14-15 С (кривая /) при дозе 3.8 рентген наблюдалось уменьшение (достоверное различие при уровне значимости р = 0.005), а при дозе 26 рентген результаты совпадали с контрольным. При повышении температуры до 17-18°С (кривая 2) замедляющий эффект наблюдался при дозе около 0.5 рентген (р = 0.3) и сменялся на ускоряющий при дозе 0.7-1 рентген. При температуре 20-21 °С (кривая 3) наблюдался только ускоряющий эффект. При облучении суспензии в течение 24 ч (доза 134 рентген) относительное изменение скорости составило +1.6. В случае температуры

25 30 Доза, рентген

Рис. 2. Экспериментальные данные для характерной константы А уменьшения числа эритроцитов в зависимости от дозы для разных температур: 14—15°С (/), 17—18°С (2), 20-21 °С (3). Данные нормированы на среднюю величину контроля Acontroi для соответствующей температуры (Control — электропорация без облучения), пунктиром показаны ошибки контроля

11—12°С результаты опытов для исследуемых доз (до 30 рентген) совпадали с контрольными.

Таким образом, в экспериментах наблюдали изменение величины эффекта в зависимости от дозы: замедление гемолиза сменялось его ускорением.

Экспериментальные данные показывают, что скорость уменьшения числа клеток при комбинированном воздействии импульсного электрического поля и 7-излучения не является суммой скоростей в результате воздействия данных факторов по отдельности. Причем этот эффект зависел от дозы 7-излучения. Под действием 7-излучения изменялись условия электрического пробоя мембран калиброванным импульсом. Количество пор и их радиус при электропорации определяются наведенным трансмембранным потенциалом <р и пороговым потенциалом электрического пробоя (рр.

Математическая модель. Будем считать, что скорость уменьшения численности эритроцитов прямо пропорциональна суммарной площади пор, образуемых в мембране эритроцита в результате электропорации. Выделим поверхность мембраны единичной площади, разобьем эту площадь на N одинаковых областей, каждая из которых имеет собственные свойства и в каждой из которых может образоваться пора (N велико). Вероятность образования поры в каждой такой области зависит от собственных свойств этой области [9]. Эти свойства определяют два параметра электропорации: пороговый потенциал электрического пробоя и радиус поры. Для возникновения пор требуется, чтобы трансмембранный потенциал превысил пороговый потенциал электрического пробоя в данной области мембраны. В области, где пороговый потенциал меньше, радиус образовавшейся поры будет больше: г = k/tpi. Даль-

нейшее увеличение радиуса образовавшейся поры зависит от состояния мембраны и от длительности электрического импульса. Набор элементарных макроскопических областей мембраны N можно рассматривать как ансамбль Гиббса.

Допустим, что (fp подчиняется нормальному закону распределения. При наведенном трансмембранном потенциале <р поры будут образовываться в тех областях, где <рр <<р. Найдем площадь пор, образуемых на поверхности мембраны площадью 1 м2:

4>v

S = —= / exp (-(ipp - ippav)2/2a2) (k/ip2)2 dipp. ayjzK J

min

Величина N — максимальное число пор, которые могут уместиться на рассматриваемой поверхности мембраны площадью 1 м2 при условии, что радиус поры минимален, (ррш — среднее по ансамблю областей N значение порогового потенциала (средний пороговый потенциал в каждом участке мембраны определяется ее состоянием и ее микропараметрами [9]), о — среднее квадратическое отклонение. Предел интегрирования ц>р = Наведенная на клетку разность потенциалов щ зависит от напряженности электрического поля в растворе Е и радиуса клетки г (fk = 1.ЪЕг cos 0, в — угол между вектором Е и радиус-вектором точки наблюдения на сфере.

В результате воздействия на суспензию эритроцитов 7-излучения поверхностный заряд эритроцита и С-потенциал уменьшаются [4]. Допустим, С-потенциал уменьшается с увеличением дозы по закону С = Со©хР(-k(T)D), где D — экспозиционная доза, Со соответствует нулевой дозе. С ростом температуры коэффициент к(Т) растет. В данной модели не рассматриваются электрокинетические явления в суспензии. Величина Со уменьшается с течением времени хранения эритроцитов в суспензии [10, 11] и тем быстрее, чем выше температура. Изменение С-потенциала влияет на трансмембранный потенциал <р, причем по-разному на поверхностях клетки, обращенных к катоду и аноду. Со стороны поверхности клетки, повернутой к катоду, результирующий потенциал ц>с = —— |С|, к аноду: 4>а = |Vfc/2| — |С|, гДе С-потенциал. В результате изменяется предел интегрирования в формуле (1) и соответственно суммарная площадь пор. Введем коэффициент Kç, который характеризует относительное уменьшение суммарной площади пор за счет уменьшения С-потенциала.

Продукты ионизации, локализуясь на поверхности эритроцита, могут изменить порог электропора-ции данной области. В результате суммарная площадь пор в мембране увеличится на величину AS. В наших расчетах учитывается многократное повреждение эритроцита продуктами ионизации, образующимися непосредственно у поверхности эритроцита, с учетом их концентрации в суспензии:

= жЯ2 2^(2 • 10э1))1/'3^/4^ . Эта зависимость

хорошо согласуется с известной экспоненциальной зависимостью доли эритроцитов, получивших одно повреждение, от дозы 7-излучения [12]. Кроме этого учитывается повреждение мембраны эритроцита продуктами радиолиза, возникающими в объеме

раствора: А52 = аттЯ2 2^(2 • 10э£)1/3)/2) . Этот

эффект усиливается с повышением температуры, соответственно увеличивается коэффициент а. Введем коэффициент Кр, характеризующий относительное увеличение суммарной площади за счет уменьшения порогового потенциала в локальных участках мембраны.

В результате относительное изменение суммарной площади пор, возникающих при электропорации, облученной и контрольной суспензий, будет определяться величиной произведения этих коэффициентов: К = К^Кр. На рис. 3 приведена расчетная зависимость данного коэффициента от дозы К (Б) для разных значений температуры (14—15°С, 17—18°С, 20-21 °С). Расчеты выполнены для следующих параметров: Со = 50 мВ, к = 10, а = 2 (Т = 14-15 °С); Со = 30, к = 60, а = 3 (Т = 17-18 °С); Со = 0, а = 3.5 (Т = 20-21 °С); Я = 30 нм при = 0.18 В. Результаты расчетов (рис. 3) согласуются с экспериментальными данными, представленными на рис. 2. Величина дозы, при которой замедляющий эффект переходит в ускоряющий, уменьшается при увеличении температуры.

0 10 20 30 40

Доза, Р

Рис. 3. Расчетные данные относительной скорости уменьшения числа эритроцитов в зависимости от дозы K

Предложенная математическая модель позволила описать представленные результаты экспериментов и численно оценить характеристики электропорации мембран эритроцитов при действии 7-излучения.

11 ВМУ, физика, астрономия, №3

В рамках данной модели может быть решена обратная задача: исследование функции уменьшения поверхностного заряда эритроцитов под воздействием ионизирующего излучения. Экспериментальный подход, представленный в статье, позволит в дальнейшем исследовать механизм биофизического действия малых доз облучения на биологические клетки.

Авторы выражают благодарность д.ф.-м.н., профессору Б. С. Ишханову, а также сотруднику НИИЯФ МГУ В. И. Смирнову за поддержку и совместное проведение экспериментов в НИИЯФ МГУ им. Д. В. Скобельцына.

Литература

1. Sharifi S., Dzik W.H., Sadrzadeh 5.М. // Transfus. Med.

2000. 10, N 2. P. 125.

2. Hao J., Luo Q., Xiong G. // Zhonghua Zhong Liu Za Zhi.

2001. 23, N 1. P. 21.

3. Koziczak R., Krokosz A., Szweda-Levandowska Z. // Bio-

chern. Mol. Biol. Int. 1999. 47, N 5. P. 865.

4. Zima G.V., Dreval' V.I. // The Radiats. Biol. Radioecol. 2000. 40, N 3. P. 261.

5. Ulsh B.A., Miller S.M., Mallory F.F. et.al. 11 J. Environ. Radioact. 2004. 74, N 1. P. 73.

6. Бурлакова Е.Б., Конрадов A.A., Мальцева Е.Л. // Химическая физика. 2003. 22, №2. С. 21.

7. Козлова Е.К., Черняев А.П., Черныш A.M. и др. // Медицинская физика. 2003. 17, №1. С. 50.

8. Мороз В.В., Богушевич М.С., Черныш A.M. и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2004.137, №2. С. 140.

9. De Bruin К., Krassowska W. 11 Biophys. J. 1999. 77, N 3. P. 1213.

10. Godin C., Caprani A. 11 Eur. Biophys. J. 1997. 26, N 2. P. 175.

11. Lu W.H., Deng W.H., Liu S.T. et.al. 11 Anal. Biochem. 2003. 314, N 2. P. 194.

12. Кудряшов Ю.Б., Беренфельд Б.С. // Основы радиационной биофизики. М., 1982.

Поступила в редакцию 19.07.04