Способ оценки риска развития бактериального менингита у пациентов в критическом состоянии
METHOD FOR ASSESSING THE RISK OF BACTERIAL MENINGITIS IN CRITICALLY ILL PATIENTS

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано в неврологии, хирургии, анестезиологии-реаниматологии и смежных медицинских специальностях для оценки риска развития бактериального менингита у пациентов в критическом состоянии. Способ осуществляют путем определения концентрации бактериального метаболита – 4-гидроксифенилмолочной кислоты (n-ГФМК) – в спинномозговой жидкости (СМЖ) пациентов с использованием метода газовой хромато-масс-спектрометрии.
Менингиты представляют собой заболевания центральной нервной системы, вызванные в большинстве случаев бактериями или вирусами, реже – грибами, простейшими. Менингит может быть как самостоятельным диагнозом (первичный), так и осложнением (вторичный). Вторичный менингит может развиваться за счет активации эндогенных микроорганизмов у ослабленных пациентов на фоне различных заболеваний, включая локальные инфекции или сепсис. Однако чаще это заболевание возникает у пациентов после нейрохирургических операций по поводу заболеваний головного мозга или вследствие черепно-мозговых травм. Распространенность вторичного менингита составляет 0,8-17% от общего количества прооперированных пациентов с риском неблагоприятного исхода от 20 до 50% у нейрохирургических пациентов. Кроме инфекционного вторичного менингита у пациентов в критическом состоянии может развиваться так называемый асептический или лекарственно-индуцированный менингит, причиной которого может быть реакция на прием нестероидных противовоспалительных препаратов, некоторых антибактериальных и других лекарственных средств. В некоторых случаях асептический менингит диагностируют у пациентов с аутоиммунными заболеваниями. По клиническим симптомам и по данным ликворограммы отличить асептический менингит от бактериального невозможно [Д.В. Вельский, В.А. Руднов. Нозокомиальный менингит. Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 2011, Том 13, № 2, 149-157]. Независимо от причины возникновения менингита, его ранняя дифференциальная диагностика у пациентов в критическом состоянии является важным фактором успешного лечения, уменьшения развития тяжелых неврологических последствий и частоты летального исхода.
Уровень техники
Наиболее часто встречающиеся клинические симптомы менингита (головная боль, лихорадка и др.) не являются специфичными. В настоящее время для диагностики менингита проводят люмбальную пункцию, которая позволяет получить образцы СМЖ для клинико-лабораторного анализа и выявления возбудителя.
Биохимическое исследование состава СМЖ имеет целью определение общего белка, цитоза, глюкозы, хлоридов, окрашивания по Грамму и некоторых других параметров, значения которых используют в диагностике менингита [МУК 4.2.1887-04 Лабораторная диагностика менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов, 2004 год], однако на начальных этапах развития заболевания указанные показатели могут иметь схожие значения, затрудняя дифференциальную диагностику.
На фоне проводимой ранее антибактериальной терапии, при введении антибиотиков накануне или непосредственно перед люмбальной пункцией, результат микробиологического исследования СМЖ может быть отрицательным.
Тип возбудителя обычно определяют микробиологическим исследованием с использованием посевов на питательные среды. Лаборатории, оснащенные современным оборудованием, используют методы полимерной цепной реакции (ГЩР) и иммуноферментного анализа (ИФА), являющиеся высоко селективными методами, позволяющими определять большое количество различных микроорганизмов. При этом основным недостатком известных методов является необходимость выбора определенного набора реагентов на конкретные виды возбудителей до проведения анализа, что подразумевает либо подозрение на какой-то определенный тип менингита, либо проведение нескольких анализов с использованием разных наборов реагентов, что удлиняет время от получения пробы до получения результата и увеличивает стоимость анализа.
Наибольшее количество отечественных патентов, описывающих способы дифференциальной диагностики менингита, относятся к их диагностике у детей в остром периоде развития заболевания:
- способ дифференциальной диагностики менингитов у детей, включающий исследование субпопуляционного состава лимфоцитов СМЖ детей (CD3+ Т-лимфоциты, CD3-CD16+CD56+ натуральные киллеры, CD3-CD19+ В-лимфоциты), определение процентного содержания CD3-CD19+ В-лимфоцитов от суммы указанных субпопуляций лимфоцитов (RU2695359). При относительном содержании CD3-CD19+ В-лимфоцитов выше 2,72% диагностируют бактериальный менингит, а при значениях, равных или ниже 2,72%, - вирусный менингит. Для этого используют метод проточной цитометрии, являющийся достаточно сложным для интерпретации результатов и дорогостоящим для активного внедрения разработанного способа в клиническую практику;
- способ дифференциальной диагностики менингитов у детей, включающий определение суммарной концентрации гаптоглобина в СМЖ у детей методом количественной иммунотурбидиметрии (RU 2541150). При концентрации, равной или менее 0,7 мг/дл, диагностируют вирусный менингит, при концентрации свыше 0,7 мг/дл – бактериальный менингит.
Основным недостатком указанных способов дифференциальной диагностики менингита является определение неспецифичных видов белков и клеток, а также их верификация только в педиатрической практике, неподтвержденная для взрослого контингента пациентов.
Известен также способ дифференциальной диагностики бактериальных и вирусных менингитов, включающий определение в СМЖ содержания лактоферрина методом твердофазного иммуноферментного анализа (RU 2323444). При концентрации лактоферрина менее или равной 0,1 мг/л судят о вирусном менингите, при значениях 0,5 мг/л и более - о бактериальном менингите. Основными недостатками способа являются затруднительность верификации менингита при концентрации лактоферрина в диапазоне 0,1-0,5 мг/л («серая зона»), а также использование большого объема СМЖ (1-2 мл) из второй порции, что указывает на необходимость отбора дополнительного объема СМЖ целенаправленно на анализ лактоферрина, что в свою очередь увеличивает общий отобранный у пациентов объем СМЖ и может увеличивать частоту развития постпункционного синдрома, сопровождающегося головной болью и развитием симптомов менингизма.
Среди зарубежных патентов также известны способы диагностики менингита с использованием неспецифичных видов белков, таких как витамин D-связывающий белок (WO 2020138561), аполипопротеин A-I, С-реактивный белок, фракция С3 комплемента и кининоген (US 2019187157), белки системы комплемента (US 2017261516, US 5778895), определение которых в большинстве случаев проводится биохимическим и иммуноферментным методами, отличающимися трудоемкостью. На сегодняшний день указанные белки определяют с применением наборов реагентов, использование которых валидировано только для научных целей. Кроме того, отсутствуют отечественные аналоги реагентов для определения ряда маркеров, например, витамин D-связывающего белка, аполипопротеина A-I.
Способов ранней дифференциальной диагностики менингита у пациентов в критическом состоянии в доступной авторам информационной базе данных обнаружить не удалось.
Раскрытие сущности изобретения
Этиология вторичного менингита трудно предсказуема. Для клинической картины данного заболевания характерны острое начало, менингеальные симптомы, лихорадка, ликворный плеоцитоз. Однако эти яркие признаки не являются ранними и отражают манифестацию заболевания уже на стадии гнойно-воспалительного поражения оболочек мозга. Среди ранних признаков менингита наиболее часто указывают головную боль, лихорадку, снижение уровня сознания и др. Однако такие клинические симптомы не являются специфичными, особенно у пациентов, находящихся в состоянии медикаментозной седации, при заболеваниях мозга или у лиц с выраженной интоксикацией на фоне основного заболевания (отравление, перитонит, сепсис и др.), когда клиническая картина основного заболевания схожа с менингитом.
Заявляемое изобретение направлено на решение задачи не только диагностики бактериального менингита у пациентов в острой фазе манифестации клинических признаков заболевания, но и для оценки риска развития вторичного бактериального менингита, являющегося жизнеугрожающим осложнением у пациентов всех возрастных категорий в отделениях нейрореанимации и нейрохирургии, поскольку, как и в случае других инфекционных осложнений, эффективность лечения менингита зависит от того, насколько быстро будет начата этиотропная терапия.
Сущность способа заключается в том, что с целью определения риска развития бактериального менингита осуществляют цитологическое, биохимическое и микробиологическое исследования состава СМЖ, полученной при диагностической люмбальной пункции пациентов. Отличительным признаком заявляемого способа является то, что дополнительно определяют концентрацию n-ГФМК в СМЖ. Риск развития бактериального менингита у пациента определяют как высокий при концентрации n-ГФМК в СМЖ больше или равном 0,7 мкмоль/л, и низкий при концентрации n-ГФМК в СМЖ менее 0,7 мкмоль/л. При концентрации n-ГФМК в СМЖ больше или равном 0,7 мкмоль/л риск развития бактериального менингита в 7 раз выше, чем при концентрации n-ГФМК в СМЖ менее 0,7 мкмоль/л.
В отличие от существующих способов диагностики менингита в заявляемом способе в качестве маркера развития бактериального менингита выбран бактериальный метаболит n-ГФМК. Установлено что это низкомолекулярное соединение является сепсис-ассоциированным микробным метаболитом тирозина, содержание которого в сыворотке крови отражает тяжесть состояния и коррелирует с исходом пациентов в критическом состоянии, вызванном перечисленными ниже инфекционными заболеваниями.
У взрослых: пневмония [Beloborodova N.V., Sarshor Yu.N., Bedova A.Yu., Chernevskaya E.A., Pautova A.K. (2018). Involvement of aromatic metabolites in the pathogenesis of septic shock. Shock, 50 273-279], абдоминальная хирургическая инфекция [Мороз В.В., Белобородова Н.В., Осипов А.А., Власенко А.В., Бедова А.Ю., Паутова А.К. Фенилкарбоновые кислоты в оценке тяжести состояния и эффективности интенсивного лечения больных в реаниматологии. Общая реаниматология. 2016; 12(4): 37-48. DOI:10.15360/1813-9779-2016-4-37-48], сепсис в кардиохирургии [Белобородова Н.В., Архипова А.С., Белобородов Д.М., Оленин А.Ю., Бойко Н.Б., Мелько А.И. Хромато-масс-спектральное определение низкомолекулярных ароматических соединений микробиологического происхождения в сыворотке больных сепсисом. Клиническая лабораторная диагностика. 2006; 61(2): 3-6].
Имеются данные о значительном повышении уровня сепсис-ассоциированных метаболитов, включая n-ГФМК, в сыворотке крови пациентов с изолированной тяжелой черепно-мозговой травмой уже в первые дни после получения травмы [Осипов А.А., Власенко А.В., Черневская Е.А., Бедова А.Ю., Гецина М.Л., Саршор Ю.Н., Белобородова Н.В. Участие метаболитов микробиоты в развитии критического состояния у пострадавших с черепно-мозговой травмой. Медицинский алфавит. Неотложная медицина. 2013; 4(26): 12-15].
Приведенные ниже данные о результатах клинических исследований указывают на участие сепсис-ассоциированных микробных метаболитов, включая n-ГФМК, в патогенезе развития критических состояний различной этиологии, что является объяснением и обоснованием для определения концентрации n-ГФМК в СМЖ как индикатора бактериального менингита.
Предложенный способ реализуют с использованием метода газовой хромато-масс-спектрометрии, что позволяет проводить точное количественное определение n-ГФМК в образце СМЖ объемом не более 200 мкл в течение 1 часа.
Способ может быть реализован с использованием лабораторного оборудования и с привлечением персонала, квалификация которого соответствует уровню специалиста в области химического, биохимического, иммуноферментного анализа. В настоящем исследовании измерение концентрации n-ГФМК в СМЖ выполнялось с использованием методик жидкость-жидкостной экстракции и газовой хромато-масс-спектрометрии. В то же время определение концентрации n-ГФМК может быть проведено любым другим методом, например, используя газовую хроматографию на доступном оборудовании отечественного производства.
Информация о высоком риске развития бактериального менингита может быть использована лечащим врачом для более целенаправленного наблюдения, обследования и своевременного начала соответствующей терапии.
Осуществление изобретения
В центрифужную пробирку помещают 200 мкл СМЖ, 700 мкл воды для инъекций, 100 мкл внутреннего стандарта (3,4-дигидроксибензойная кислота, концентрация 4 нг/мкл). Для денатурации белков добавляют 0,3-0,5 г твердого хлорида натрия до получения насыщенного раствора и 15 мкл концентрированной серной кислоты. Полученный раствор тщательно перемешивают на встряхивателе типа вортекс, добавляют 1 мл диэтилового эфира, повторно перемешивают и центрифугируют 5 минут (1500 об/мин). Надосадочную жидкость декантируют в виалу. Оставшийся в центрифужной пробирке раствор перемешивают, добавляют 1 мл диэтилового эфира, повторно перемешивают и центрифугируют 5 минут (1500 об/мин). Надосадочную жидкость декантируют в виалу, объединив с первой органической фракцией. Таким образом, проводится двукратная экстракция. Полученный в виале органический экстракт упаривают досуха на твердотельном термостате при 40°C. Сухой остаток дериватизируют под крышкой с 20 мкл N,O-бис(триметилсилил)трифторацетамида в твердотельном термостате при 80°C в течение 15 мин. Полученную реакционную смесь охлаждают до 4°C, разбавляют 400 мкл гексана и 2 мкл вводят в испаритель газового хроматографа.
Анализ выполняют на газовом хроматографе Trace GC 1310 с использованием капиллярной колонки TR-5ms (95% поли(диметилсилоксан) + 5% фенилполисилоксан, 30 м × 0,25 мм, толщина пленки неподвижной фазы 0,25 мкм), оснащенном масс-сел ективным детектором ISQ LT и автоматическим дозатором проб AI 1310 фирмы Thermo Scientific (Thermo Electron Corporation, США). Условия газо-хроматографического разделения: температура инжектора - 260°C, расход газа-носителя (гелия) - 1.5 мл/мин, режим с делением потока (1:10). Режим программирования температуры термостата колонок: начальная температура - 80°C в течение 4 мин; далее нагревание со скоростью 10°C/мин до 250°C, выдержка при этой температуре в течение 4 мин. Полное время анализа - 27 мин. Условия масс-спектрометрического анализа: электронная ионизация, энергия электронов - 70 эВ, температура интерфейса - 250°C, температура ионизационной камеры - 200°C, диапазон сканирования m/z - 50-450 а.е.м., скорость сканирования - 3 скана в секунду. Время удерживания летучего три-триметилсилильного производного n-ГФМК - 17,98 мин, значение характеристичного иона m/z - 179. Масс-спектр получаемого хроматографического пика летучего три-триметилсилильного производного n-ГФМК соотносится с таковым в базе масс-спектрометрических данных NIST. Количественное определение n-ГФМК в диапазоне концентраций 0,4-9 мкмоль/л определяют с использованием градуировочной зависимости, выявленной после анализа калибровочных растворов. Калибровочные растворы готовят путем последовательного разбавления водой для инъекций ацетонового раствора с точной навеской химического стандарта n-ГФМК. Предел обнаружения n-ГФМК указанным методом составляет 0,2 мкмоль/л, предел определения - 0,4 мкмоль/л.
Для определения диагностически значимых концентраций n-ГФМК авторами проведен анализ остаточных образцов СМЖ, полученной от 84 пациентов во время проведения диагностической люмбальной пункции, и последующее сопоставление с клинико-лабораторными данными, подтверждающими или исключающими развитие бактериального менингита. Результаты статистически обработаны; по результатам ROC-анализа выбрана оптимальная точка отсечения (cut-off value) для n-ГФМК - 0,7 мкмоль/л, которая легла в основу формулы изобретения. Чувствительность метода - 77,8%, специфичность - 62,7%, AUC 0,730.
Эффективность предлагаемого способа оценки риска развития бактериального менингита иллюстрируется конкретными клиническими примерами. Во всех случаях проведено сопоставление уровня n-ГФМК в СМЖ с результатами комплекса традиционной клинико-лабораторной диагностики. Два первых примера (№ 1 и № 2) иллюстрируют случаи, когда у пациентов менингит не развился, что является обоснованием того, что применение предложенного способа позволит избежать ошибочной терапии, нерационального назначения антибиотиков и др.
Два других примера (№ 3 и № 4) подтверждают целесообразность измерения концентрации n-ГФМК в СМЖ для раннего выявления бактериального менингита и раннего начала адекватной жизнеспасающей терапии, в том числе, когда классическое микробиологическое исследование дает отрицательный результат (пример №3).
Клинические примеры
6
Пример 1. Пациент С., 46 лет, поступил в отделение нейрореанимации в тяжелом состоянии с подозрением на острое нарушение мозгового кровообращения. Сопутствующие заболевания: гипертоническая болезнь III АГ 3 ст. При КТ-исследовании данных за острое нарушение мозгового кровообращения не получено. МРТ-данные: выявлены изменения в веществе головного мозга, соответствующие подострому лейкоэнцефалиту. Для верификации причин проведена люмбальная пункция на 2-е сутки. Исследование СМЖ: Объем: 4.00 мл. Цвет: Бесцветный (N: Бесцветный). Прозрачность: Прозрачная (N: Прозрачная). Осадок после центрифугирования: Нет (N: Нет). Цвет надосадочной жидкости: Бесцветная (N: Бесцветная). Прозрачность надосадочной жидкости: Прозрачная (N: Прозрачная). Реакция Нонне-Апельта: Отрицательная (N: Отрицательная). Реакция Панди: Отрицательная (N: Отрицательная). Белок: 0.16 г/л (N: 0.22-0.33). Глюкоза: 3.40 ммоль/л (N: 2.80-3.90). Хлориды: 115.00 ммоль/л (N: 118.00-132.00). Калий: 2.74 ммоль/л (N: 2.50-3.20). Натрий: 143.00 ммоль/л (N: 138.00-150.00). Цитоз: 3 кл. в 3 мкл (N: 10 кл в 3 мкл). Цитоз: 1.00 10/л (N: 2.00-4.00). Нейтрофилы: 0.00 кл/мкл (N: не найдены). Лимфоциты: 3.00 кл/мкл (N: 2.00-4.00). Результат микробиологического исследования СМЖ получен на 3-й сутки: микрофлора не выделена. На основании клинической картины и результатов анализа СМЖ диагноз бактериальный менингит исключен. Определение концентрации n-ГФМК произведено в образце ликвора, полученного при первой люмбальной пункции, результат - 0,4 мкмоль/л (<0,7 мкмоль/л, то есть риск развития бактериального менингита низкий). Пациенту проводилось лечение дексаметазоном с положительной динамикой. Выписан из стационара с улучшениями на 16-е сутки.
6
Пример 2. Пациентка К., 35 лет, поступила в отделение нейрореанимации в состоянии средней тяжести с подозрением на острое нарушение мозгового кровообращения. Сопутствующие заболевания: гипертоническая болезнь III ст., 2 степени, риск 4. КТ-данных за острое нарушение мозгового кровообращения не получено. Проведена диагностическая люмбальная пункция на 2-е сутки. Исследование СМЖ: Объем: 2.00 мл; Цвет: Бесцветный (N: Бесцветный). Прозрачность: Прозрачная (N: Прозрачная). Осадок после центрифугирования: Нет (N: Нет). Цвет надосадочной жидкости: Бесцветная (N: Бесцветная). Прозрачность надосадочной жидкости: Прозрачная (N: Прозрачная). Реакция Нонне-Апельта: Отрицательная (N: Отрицательная). Реакция Панди: Отрицательная (N: Отрицательная). Белок: 0.13 г/л (N: 0.22-0.33). Глюкоза: 2.90 ммоль/л (N: 2.80-3.90). Хлориды: 114.00 ммоль/л (N: 118.00-132.00). Калий: 2.68 ммоль/л (N: 2.50-3.20). Натрий: 141.00 ммоль/л (N: 138.00-150.00). Цитоз: 3 кл. в 3 мкл (N: 10 кл в 3 мкл). Цитоз: 1.00 10/л (N: 2.00-4.00). Нейтрофилы: 0.00 кл/мкл (N: не найдены). Лимфоциты: 3.00 кл/мкл (N: 2.00-4.00). Результат микробиологического исследования СМЖ получен на 4-е сутки: микрофлора не выделена. На основании клинической картины и результатов анализа СМЖ диагноз бактериальный менингит исключен.
Концентрация n-ГФМК в первом образце СМЖ оказалась ниже предела обнаружения - менее 0,4 мкмоль/л (менее 0,7 мкмоль/л, то есть риск развития бактериального менингита низкий). Пациентке проводилось комплексное медикаментозное лечение с положительной динамикой. Выписана из стационара с улучшениями на 12-е сутки.
Пример 3. Пациентка Б., 52 года, переведена в отделение нейрореанимации в крайне тяжелом состоянии с последствиями бактериального менингита и энцефалопатией сложного генеза (токсическая, дисметаболическая, постгипоксическая). Осложнения: полиорганная недостаточность, искусственная вентиляция легких, трахеостома, двусторонняя пневмония, множественные пролежни, полинейропатия критических состояний. Сопутствующие заболевания: гипертоническая болезнь II ст., 2 ст., высокий риск; хроническая сердечная недостаточность; симптоматическая эпилепсия. КТ-признаки дисциркуляторной энцефалопатии на фоне смешанной заместительной гидроцефалии. Для верификации причин проведена люмбальная пункция на 1-е сутки. Исследование СМЖ: Объем: 5.00 мл. Цвет: Желтоватый (N: Бесцветный). Прозрачность: Прозрачная (N: Прозрачная). Осадок после центрифугирования: Нет (N: Нет). Цвет надосадочной жидкости: Желтоватая (N: Бесцветная). Прозрачность надосадочной жидкости: Прозрачная (N: Прозрачная). Реакция Нонне-Апельта: Отрицательная (N: Отрицательная). Реакция Панди: Положительная (N: Отрицательная). Белок: 0.49 г/л (N: 0.22-0.33). Глюкоза: 3.50 ммоль/л (N: 2.80-3.90). Хлориды: 114.00 ммоль/л (N: 118.00-132.00). Калий: 2.42 ммоль/л (N: 2.50-3.20). Натрий: 142.00 ммоль/л (N: 138.00-150.00). Цитоз: 4 кл в 3 мкл (N: 10 кл в 3 мкл). Цитоз: 1.30 1 06/л (N: 2.00-4.00). Результат микробиологического исследования СМЖ получен на 6-е сутки: микрофлора не выделена. На основании клинической картины и результатов анализа СМЖ диагноз бактериальный менингит был подтвержден, назначена антибиотикотерапия.
Концентрация n-ГФМК в СМЖ - 0,7 мкмоль/л (≥0,7 мкмоль/л, следовательно, риск развития бактериального менингита высокий). Пациентке проводилось комплексное медикаментозное лечение, включая антибактериальную терапию, с положительной динамикой. Выписана из стационара с улучшениями на 27-е сутки.
Пример 4. Пациент Б., 33 года, переведен в отделение нейрореанимации с осложнениями после острой черепно-мозговой травмы. Осложнения: двусторонняя пневмония, полиорганная недостаточность. Диагностическая люмбальная пункция проводилась неоднократно. На 25-е сутки развился вторичный менингит. Основные результаты исследования СМЖ: Цитоз на 25-е сутки - 4106; 27-е сутки - 8936; 29-е сутки - 10496; 39-е сутки - 347; 42-е сутки - 662; 47-е сутки - 5207; 52-е сутки - 864; 66-е сутки - 64. Результат микробиологического исследования СМЖ получен на 27-е сутки: рост Klebsiella pneumonia ss pneumonia. На основании клинической картины и результатов анализа СМЖ диагноз вторичный бактериальный менингит был подтвержден, назначена антибиотикотерапия. Концентрация n-ГФМК в СМЖ на 52-е сутки - 1,9 мкмоль/л, 53-е сутки - 2,7 мкмоль/л, 67-е сутки - 2,2 мкмоль/л (≥0,7 мкмоль/л - риск развития бактериального менингита высокий). На 48-е сутки развилась кома II степени. На 96-е сутки констатирована смерть от полиорганной недостаточности.