ВИРИОНЫ АДЕНОАССОЦИИРОВАННОГО ВИРУСА С ВАРИАНТНЫМ КАПСИДОМ И СПОСОБЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

1. Вирион рекомбинантного аденоассоциированного вируса rAAV, содержащий
a) капсидный белок вариантного AAV, который содержит пептидную вставку, по сравнению с соответствующим капсидным белком родительского AAV, где пептидная вставка имеет длину от 7 аминокислот до 10 аминокислот, где участок вставки расположен между двумя соседствующими аминокислотами в положении между аминокислотами, соответствующем аминокислотам 570 и 611 VP1 из AAV2 или соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа AAV; и
b) гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую генный продукт.
2. Вирион rAAV по п. 1, где пептидная вставка включает последовательность TRP или TRPA на ее С-конце.
3. Вирион rAAV по п. 2, где участок вставки расположен между аминокислотами, которые соответствуют аминокислотам 587 и 588 VP1 из AAV2 или соответствующем положении в капсидном белке AAV другого серотипа.
4. Вирион rAAV по п. 3, где вариантный капсидный белок придает повышенную инфекционность ретинальной клетки вирионом rAAV по сравнению с инфекционностью ретинальной клетки вирионом AAV, который включает соответствующий капсидный белок родительского AAV.
5. Вирион rAAV по п. 4, где ретинальная клетка является фоторецептором, ганглиозной клеткой сетчатки, клеткой Мюллера, биполярной клеткой, амакринной клеткой, горизонтальной клеткой, ретинальной пигментированной эпителиальной клеткой.
6. Вирион rAAV по п. 1, где пептидная вставка позволяет осуществить трансдукцию фоторецепторной клетки с помощью rAAV, когда rAAV вводят интравитреальной инъекцией.
7. Вирион rAAV по п. 1, где генный продукт является интерферирующей РНК или аптамером.
8. Вирион rAAV по п. 1, где генный продукт является полипептидом.
9. Вирион rAAV по п. 8, где полипептид является нейропротекторным полипептидом, анти-ангиогенным полипептидом или полипептидом, который повышает функцию ретинальной клетки.
10. Вирион rAAV по п. 1, где вирион rAAV демонстрирует повышенную способность к пересечению внутренней пограничной мембраны (ILM), по сравнению со способностью пересекать ILM у вириона AAV, который включает соответствующий капсидный белок родительского AAV.
11. Вирион rAAV по п. 1, где пептидная вставка включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей LGETTRP (SEQ ID NO: 13) и NETITRP (SEQ ID NO: 14).
12. Фармацевтическая композиция, содержащая
a) вирион рекомбинантного аденоассоциированного вируса rAAV по любому из пп. 1-11;
b) фармацевтически приемлемый эксципиент.
13. Способ доставки генного продукта в ретинальную клетку в индивидууме, который включает введение индивидууму вириона рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV) по любому из пп. 1-11.
14. Способ по п. 13, где генный продукт является интерферирующей РНК или аптамером.
15. Способ по п. 13, где генный продукт является полипептидом.
16. Способ по п. 15, где полипептид является нейропротективным фактором, антиангиогенным полипептидом, антиапоптотическим фактором или полипептидом, который усиливает функцию ретинальной клетки.
17. Способ по п. 15, где полипептид является глиальным нейротрофическим фактором, фактором роста фибробластов 2, нейротурином, цилиарным нейротрофическим фактором, фактор роста нервов, нейротрофическим фактором из тканей мозга, эпидермальным фактором роста, родопсином, X-сцепленным ингибитором апоптоза, ретиношизином, RPE65, взаимодействующим белком-1 регулятора ГТФазы пигментной дистрофии сетчатки, периферином, периферином-2, родопсином или SHH-белком (Sonic hedgehog).
18. Способ лечения заболевания сетчатки, который включает введение индивидууму, нуждающемуся в этом, эффективного количества вириона рекомбинантного аденоассоциированного вируса rAAV по любому из пп. 1-11.
19. Способ по п. 18, где указанное введение является внутриглазной инъекцией.
20. Способ по п. 18, где указанное введение является интравитреальной инъекцией.
21. Способ по п. 18, где глазная болезнь является глаукомой, пигментной дистрофией сетчатки, макулярной дегенерацией, ретиношизисом, врожденным амаврозом Лебера, диабетической ретинопатией, ахроматопсией или дальтонизмом.
22. Вариантный капсидный белок аденоассоциированного вируса AAV, который содержит вставку пептида по сравнению с соответствующим родительским капсидным белком AAV, где пептидная вставка имеет длину от 7 аминокислот до 10 аминокислот, где участок вставки расположен между двумя соседствующими аминокислотами в положении между аминокислотами, соответствующем аминокислотам 570 и 611 VPl из AAV2 или соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа AAV.
23. Вариантный капсидный белок rAAV по п. 22, где пептидная вставка содержит последовательность TRP или TRPA на ее C-конце.
24. Вариантный капсидный белок rAAV по п. 22, где участок вставки расположен между аминокислотами, соответствующими аминокислотам 587 и 588 VP1 из AAV2 или соответсвующему положению в капсидном белке AAV другого серотипа.
25. Вариантный капсидный белок rAAV по п. 22, где вариантный капсидный белок, когда присутствует в вирионе AAV, придает повышенную инфекционность ретинальной клетки вирионом rAAV по сравнению с инфекционностью ретинальной клетки вирионом AAV, который включает соответствующий капсидный белок родительского AAV.
26. Вариантный капсидный белок rAAV по п. 22, где вариантный капсидный белок, когда присутствует в вирионе AAV, обеспечивает повышенную способность к пересечению внутренней пограничной мембраны (ILM) по сравнению со способностью пересекать ILM у вириона AAV, который включает соответствующий капсидный белок родительского AAV.
27. Вариантный капсидный белок rAAV по п. 26, где ретинальная клетка является фоторецептором, ганглиозной клеткой сетчатки, клеткой Мюллера, биполярной клеткой, амакринной клеткой, горизонтальной клеткой, ретинальной пигментированной эпителиальной клеткой.
28. Нуклеиновая кислота, включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую вариантный капсидный белок AAV по любому из пп. 22-27.
29. Выделенная генетически модифицированная клетка-хозяин, включающая нуклеиновую кислоту по п. 28.
30. Способ скрининга библиотеки вариантных рекомбинантных вирионов адено-ассоциированного вируса (rAAV) для идентификации новых вариантных вирионов rAAV, обладающих повышенной инфекционностью к целевым фоторецепторным клеткам, по сравнению с нецелевыми глазными клетками, который включает:
введение композиции бибилотеки, по меньшей мере, из 10^6 вариантных вирионов rAAV в глаз животному внутриглазной инъекцией, где каждый вариантный вирион rAAV в библиотеке включает капсидный белок вариантного AAV, по меньшей мере, с одной аминокислотной модификацией и ДНК, кодирующей капсидный белок вариантного вириона AAV;
выделение целевых фоторецепторных клеток из нецелевых глазных клеток, где целевые фоторецепторные клетки были инфицированы вариантными вирионами rAAV;
клонирование и упаковка ДНК из выделенных целевых фоторецепторных клеток для получения уменьшенной библиотеки вариантных вирионов rAAV.
повторение один или несколько раз стадий введения, выделения, клонирования и упаковки для получения обогащенной популяции вирионов, включающей вариантные вирионы rAAV с высокой инфекционностью для целевых фоторецепторных клеток по сравнению с нецелевыми глазными клетками;
полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для амплификации ДНК, кодирующей капсид вариантного вириона AAV из обогащенной популяции вариантных вирионов rAAV с дополнительными мутациями, где ПЦР-амплификация включает ПЦР пониженной точности; и где обогащенная популяция вариантных вирионов rAAV с дополнительными мутациями подвергается одному или нескольким раундам in vivo скрининга для получения другой обогащенной популяции вариантных вирионов rAAV; и
идентификацию ДНК, кодирующую капсид вариантного AAV из конечного раунда выделенных целевых фоторецепторных клеток, полученных из in vivo скрининга конечной обогащенной популяции вариантных вирионов rAAV с высокой инфекционностью целевых фоторецепторных клеток по сравнению с нецелевыми глазными клетками.
31. Способ по п. 30, где капсидный белок вариантного вириона AAV включает пептид, вставленный в GH-петлю соответствующего капсидного белка родительского AAV.
32. Способ по п. 31, где пептид состоит из 5-11 аминокислот.
33. Способ по п. 31, где участок вставки расположен в положении между аминокислотами 570 и 611 VP1 из AAV2 или в соответствующем положении в капсидном белке AAV другого серотипа.
34. Способ по п. 31, где вариантный вирион AAV включает 1-25 аминокислотных замен.
35. Способ по п. 31, где капсидный белок вариантного вириона AAV является химерным капсидным белком.
36. Способ по п. 31, дополнительно включающий: секвенирование идентифицированной ДНК, кодирующей капсидный белок вариантного вириона AAV.
37. Способ по п. 31, где повышенная инфекционность является более значительной инфекционностью указанных фоторецепторных клеток после введения вариантного вириона rAAV in vivo по сравнению с инфекционностью вириона AAV, который включает соответствующий капсидный белок родительского AAV при введении in vivo.