АНТИ-В7-Н3-АНТИТЕЛО
ANTI-B7-H3-ANTIBODY

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к антителу, которое связывается с B7-H3 и может использоваться в качестве терапевтического и/или профилактического средства для опухоли, а также относится к способу лечения и/или профилактики опухоли с применением антитела.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
B7-H3 представляет собой белок, имеющий однопроходную трансмембранную структуру (непатентный документ 1). N-концевой внеклеточный домен B7-H3 имеет два варианта. Вариант 1 содержит V-подобный или C-подобный домен Ig в двух сайтах, соответственно, и вариант 2 содержит V-подобный или C-подобный домен Ig в одном сайте, соответственно. C-концевой внутриклеточный домен B7-H3 содержит 45 аминокислот.
Сообщалось о TLT-2, имеющем однопроходную трансмембранную структуру, в качестве рецептора B7-H3 (непатентный документ 2). Однако также имеется сообщение, в котором утверждается, что TLT-2 не является рецептором для B7-H3 (непатентный документ 3). Согласно первому сообщению активация CD8-позитивных T-клеток усиливается, когда рецептор связан с B7-H3.
Были представлены клинические данные о том, что B7-H3 сверхэкспрессируется во многих типах злокачественных новообразований, в частности, в случае немелкоклеточного рака легкого, рака почек, уротелиальной карциномы, рака прямой и ободочной кишки, рака простаты, мультиформной глиобластомы, рака яичника и рака поджелудочной железы (непатентные документы 4-11). Кроме того, сообщалось, что при раке простаты интенсивность экспрессии B7-H3 положительно коррелирует с клинико-патологическими данными о злокачественности, такими как объем опухоли, экстрапростатическая инвазия или индекс Глисона, а также коррелирует с прогрессированием злокачественного новообразования (непатентный документ 8). Подобным образом, при мультиформной глиобластоме экспрессия B7-H3 негативно коррелирует с бессобытийной выживаемостью (непатентный документ 9), а при раке поджелудочной железы экспрессия B7-H3 коррелирует с метастазами в лимфатические узлы и прогрессированием патологии (непатентный документ 11). В случае рака яичника экспрессия B7-H3 коррелирует с метастазами в лимфатические узлы и прогрессированием патологии.
Кроме того, сообщалось, что посредством введения миРНК против гена B7-H3 в линию B7-H3-позитивных злокачественных клеток снижали адгезивность к фибронектину, чтобы уменьшить миграцию клеток и инвазию в матригель (непатентный документ 12). Кроме того, сообщалось, что в случае мультиформной глиобластомы экспрессия B7-H3 позволяла избегать опосредованной NK-клетками клеточной гибели (непатентный документ 13).
С другой стороны, сообщалось, что B7-H3 экспрессируется не только в злокачественных клетках, но также в опухолях или окружающих сосудах (непатентные документы 5 и 14). Сообщалось, что в том случае, когда B7-H3 экспрессируется в кровеносных сосудах злокачественного новообразования яичника, частота выживаемости снижается.
Было высказано предположение, что молекулы семейства В7 связаны с иммунной системой. Сообщалось, что В7-Н3 экспрессируется в моноцитах, дендритных клетках и активированных Т-клетках (непатентный документ 15). Сообщалось, что по мере того, как цитотоксические Т-клетки активируются, В7-Н3 костимулирует пролиферацию CD4-позитивных или CD8-позитивных Т-клеток. Однако также имеется сообщение о том, что В7-Н3 не играет костимулирующей роли (непатентный документ 1).
Сообщалось, что молекулы В7-Н3 связаны с аутоиммунными заболеваниями. Сообщалось, что при ревматизме и других аутоиммунных заболеваниях В7-Н3 играет важную роль во взаимодействии между фибробластоподобными синовиоцитами и активированными Т-клетками (непатентный документ 16), и что В7-Н3 функционирует как костимулирующий фактор, когда цитокины высвобождаются из активированных макрофагов, и поэтому связан с развитием сепсиса (непатентный документ 17). Кроме того, сообщалось, что при введении анти-В7-Н3-антитела в мышиной модели астмы во время фазы индукции улучшается состояние при астме вследствие супрессии опосредованной Th2-клетками продукции цитокинов в регионарных лимфатических узлах в результате введения антитела против В7-Н3 мыши (непатентный документ 18).
В отношении В7-Н3 сообщалось, что антитело против В7-Н3 мыши усиливает инфильтрацию CD8-позитивных Т-клеток внутрь опухоли и подавляет роста опухоли (непатентный документ 14). Кроме того, существует патент, в котором описано, что антитело, которое распознает В7-Н3 варианта 1, оказывает противоопухолевое действие in vivo в случае аденокарциномы (патентный документ 1).
Несмотря на указанные исследования, эпитоп для анти-B7-H3-антитела, которое оказывает противоопухолевое действие in vivo, до сих пор не выяснен, и не было сообщений о конкретной аминокислотной последовательности внеклеточного домена B7-H3, которая может быть применима в качестве эпитопа для моноклонального антитела с целью лечения злокачественного новообразования.
Даже если антитела специфичны по отношению к одному и тому же антигену, свойства антител варьируют в связи с различиями в эпитопах или последовательностях антител. Из-за различий в свойствах антител при клиническом введении человеку антитела приводят к разным реакциям в отношении эффективности лекарственного средства, частоты терапевтического ответа, частоты побочных эффектов или резистентности к лекарственному средству и т.д.
Также в случае антитела против B7-H3 настоятельно требуется создание антитела, обладающего беспрецедентными свойствами.
ДОКУМЕНТЫ ИЗВЕСТНОГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ
Патентный документ
Патентный документ 1: WO 2008/066691
Непатентные документы
Непатентный документ 1: The Journal of Immunology, 2004, vol. 172, pp. 2352-2359
Непатентный документ 2: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2008, vol. 105, pp. 10495-10500
Непатентный документ 3: European Journal of Immunology, 2009, vol. 39, pp. 1754-1764
Непатентный документ 4: Lung Cancer, 2009, vol. 66, pp. 245-249
Непатентный документ 5: Clinical Cancer Research, 2008, vol. 14, pp. 5150-5157
Непатентный документ 6: Clinical Cancer Research, 2008, vol. 14, pp. 4800-4808
Непатентный документ 7: Cancer Immunology, Immunotherapy, 2010, vol. 59, pp. 1163-1171
Непатентный документ 8: Cancer Research, 2007, vol. 64, pp. 7893-7900
Непатентный документ 9: Histopathology, 2008, vol. 53, pp. 73-80
Непатентный документ 10: Modern Pathology, 2010, vol. 23, pp. 1104-1112
Непатентный документ 11: British Journal of Cancer, 2009, vol. 101, pp. 1709-1716
Непатентный документ 12: Current Cancer Drug Targets, 2008, vol. 8, pp. 404-413
Непатентный документ 13: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004, vol. 101, pp. 12640-12645
Непатентный документ 14: Modern Pathology, 2010, vol. 23, pp. 1104-1112
Непатентный документ 15: Nature Immunology, 2001, vol. 2, pp. 269-274
Непатентный документ 16: The Journal of Immunology, 2008, vol. 180, pp. 2989-2998
Непатентный документ 17: The Journal of Immunology, 2010, vol. 185, pp. 3677-3684
Непатентный документ 18: The Journal of Immunology, 2008, vol. 181, pp. 4062-4071
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Проблемы, решаемые изобретением
Целью изобретения является получение антитела и функционального фрагмента антитела, используемого в фармацевтическом средстве, оказывающем терапевтическое действие на опухоль, способ лечения опухоли с применением антитела или функционального фрагмента антитела и тому подобное.
Способы решения проблем
Авторы настоящего изобретения провели обширные исследования, чтобы достичь указанной выше цели, и в результате было обнаружено, что антитело, которое специфично связывается с B7-H3, проявляя противоопухолевую активность, и, таким образом, осуществили изобретение. То есть, изобретение включает следующие изобретения.
(1) Антитело, отличающееся тем, что обладает следующими свойствами:
(a) специфично связывается с B7-H3;
(b) обладает активностью в антитело-зависимом клеточном фагоцитозе (ADCP); и
(c) обладает противоопухолевой активностью in vivo,
или функциональный фрагмент антитела.
2) Антитело или функциональный фрагмент антитела согласно указанному выше пункту (1), в котором B7-H3 представляет собой молекулу, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 или 10.
(3) Антитело или функциональный фрагмент антитела согласно указанному выше пункту (1) или (2), которое связывается с IgC1 и/или IgC2, каждый из которых является доменом B7-H3.
(4) Антитело или функциональный фрагмент антитела согласно указанному выше пункту (3), в котором IgC1 представляет собой домен, содержащий аминокислотную последовательность, представленную аминокислотами с номерами 140-244 в последовательности SEQ ID NO: 6, и IgC2 представляет собой домен, содержащий аминокислотную последовательность, представленную аминокислотами с номерами 358-456 в последовательности SEQ ID NO: 6.
(5) Антитело или функциональный фрагмент антитела по любому из указанных выше пунктов (1)-(4), который обладает ингибирующей активностью по отношению к антителу M30, конкурируя с ним за связывание с B7-H3.
(6) Антитело или функциональный фрагмент антитела по любому из указанных выше пунктов (1)-(5), которое обладает активностью антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) и/или активностью комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC).
(7) Антитело или функциональный фрагмент антитела по любому из указанных выше пунктов (1)-(6), в котором опухоль является злокачественным новообразованием.
(8) Антитело или функциональный фрагмент антитела согласно указанному выше пункту (7), при этом злокачественное новообразование представляет собой рак легкого, рак молочной железы, рак простаты, рак поджелудочной железы, рак прямой и ободочной кишки, меланому, рак печени, рак яичника, рак мочевого пузыря, рак желудка, рак пищевода или рак почек.
(9) Антитело или функциональный фрагмент антитела по любому из указанных выше пунктов (1)-(8), которое содержит CDRH1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 92, CDRH2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 93, и CDRH3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 94, в качестве определяющих комплементарность областей тяжелой цепи, и содержит CDRL1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 95, CDRL2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 96, и CDRL3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 97, в качестве определяющих комплементарность областей легкой цепи.
(10) Антитело или функциональный фрагмент антитела по любому из указанных выше пунктов (1)-(9), которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-141 в последовательности SEQ ID NO: 51, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 23-130 в последовательности SEQ ID NO: 53.
(11) Антитело или функциональный фрагмент антитела по любому из указанных выше пунктов (1)-(10), в котором константная область является константной областью, полученной у человека.
(12) Антитело или функциональный фрагмент антитела согласно указанному выше пункту (11), которое содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 63, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 59.
(13) Антитело или функциональный фрагмент антитела по любому из указанных выше пунктов (1)-(12), которое является гуманизированным.
(14) Антитело или функциональный фрагмент антитела согласно указанному выше пункту (13), которое содержит: вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из (a) аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-141 в последовательности SEQ ID NO: 85, (b) аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-141 в последовательности SEQ ID NO: 87, (c) аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-141 в последовательности SEQ ID NO: 89, (d) аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-141 в последовательности SEQ ID NO: 91, (e) аминокислотной последовательности, обладающей гомологией, составляющей по меньшей мере 95% или больше, с любой из последовательностей (a)-(d), и (f) аминокислотной последовательности, в которой одна или несколько аминокислот делетированы, заменены или добавлены в любой из последовательностей (a)-(d); и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из (g) аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-128 в последовательности SEQ ID NO: 71, (h) аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-128 в последовательности SEQ ID NO: 73, (i) аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-128 в последовательности SEQ ID NO: 75, (j) аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-128 в последовательности SEQ ID NO: 77, (k) аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-128 в последовательности SEQ ID NO: 79, (l) аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-128 в последовательности SEQ ID NO: 81, (m) аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-128 в последовательности SEQ ID NO: 83, (n) аминокислотной последовательности, имеющей гомологию, составляющую по меньшей мере 95% или больше с любой из последовательностей (g)-(m), и (o) аминокислотной последовательности, в которой одна или несколько аминокислот делетированы, заменены или добавлены в любой из последовательностей (g)-(m).
(15) Антитело или функциональный фрагмент антитела согласно указанному выше пункту (14), которое содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, выбранные из группы, состоящей из: вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-141 в последовательности SEQ ID NO: 85, и вариабельной области легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-128 в последовательности SEQ ID NO: 71; вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-141 в последовательности SEQ ID NO: 85, и вариабельной области легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-128 в последовательности SEQ ID NO: 73; вариабельной область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-141 в последовательности SEQ ID NO: 85, и вариабельной области легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-128 в последовательности SEQ ID NO: 75; вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-141 в последовательности SEQ ID NO: 85, и вариабельной области легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-128 в последовательности SEQ ID NO: 77; вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-141 в последовательности SEQ ID NO: 85, и вариабельной области легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-128 в последовательности SEQ ID NO: 79; вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-141 в последовательности SEQ ID NO: 85, и вариабельной области легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-128 в последовательности SEQ ID NO: 81; вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-141 в последовательности SEQ ID NO: 85, и вариабельной области легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-128 в последовательности SEQ ID NO: 83; вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-141 в последовательности SEQ ID NO: 91, и вариабельной области легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-128 в последовательности SEQ ID NO: 71; вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-141 в последовательности SEQ ID NO: 91, и вариабельной области легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-128 в последовательности SEQ ID NO: 73; вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-141 в последовательности SEQ ID NO: 91, и вариабельной области легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-128 в последовательности SEQ ID NO: 75; и вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-141 в последовательности SEQ ID NO: 91, и вариабельной области легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-128 в последовательности SEQ ID NO: 77.
(16) Антитело или функциональный фрагмент антитела согласно указанному выше пункту (14) или (15), которое содержит тяжелую цепь и легкую цепь, выбранные из группы, состоящей из: тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-471 в последовательности SEQ ID NO: 85 и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-233 в последовательности SEQ ID NO: 71; тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-471 в последовательности SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-233 в последовательности SEQ ID NO: 73; тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-471 в последовательности SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-233 в последовательности SEQ ID NO: 75; тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-471 в последовательности SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-233 в последовательности SEQ ID NO: 77; тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-471 в последовательности SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-233 в последовательности SEQ ID NO: 79; тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-471 в последовательности SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-233 в последовательности SEQ ID NO: 81; тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-471 в последовательности SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-233 в последовательности SEQ ID NO: 83; тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-471 в последовательности SEQ ID NO: 91, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-233 в последовательности SEQ ID NO: 71; тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-471 в последовательности SEQ ID NO: 91, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-233 в последовательности SEQ ID NO: 73; тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-471 в последовательности SEQ ID NO: 91, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-233 в последовательности SEQ ID NO: 75; и тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-471 в последовательности SEQ ID NO: 91, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-233 в последовательности SEQ ID NO: 77.
(17) Антитело или функциональный фрагмент антитела по любому из указанных выше пунктов (14)-(16), которое содержит тяжелую цепь и легкую цепь, выбранные из группы, состоящей из: тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 71; тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 73; тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 75; тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 77; тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 79; тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 81; тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 83; тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 91, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 71; тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 91, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 73; тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 91, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 75; и тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 91, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 77.
(18) Функциональный фрагмент антитела по любому из указанных выше пунктов (1)-(17), в котором функциональный фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, F(ab)2, Fab' и Fv.
(19) Полинуклеотид, кодирующий антитело или функциональный фрагмент антитела по любому из указанных выше пунктов (1)-(18).
(20) Полинуклеотид согласно указанному выше пункту (19), который содержит нуклеотидную последовательность, представленную нуклеотидами с номерами 58-423 в последовательности SEQ ID NO: 50, и нуклеотидную последовательность, представленную нуклеотидами с номерами 67-390 в последовательности SEQ ID NO: 52.
(21) Полинуклеотид согласно указанному выше пункту (19) или (20), который содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 62, и нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 58.
(22) Полинуклеотид согласно указанному выше пункту (19) или (20), который содержит: нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (a) нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 58-423 в последовательности SEQ ID NO: 84, (b) нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 58-423 в последовательности SEQ ID NO: 86, (c) нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 58-423 в последовательности SEQ ID NO: 88, (d) нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 58-423 в последовательности SEQ ID NO: 90, и (e) нуклеотидной последовательности, содержащей полинуклеотид, который гибридизуется с полинуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, комплементарной любой из нуклеотидных последовательностей (a)-(d) в жестких условиях; и нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из (f) нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 61-384 в последовательности SEQ ID NO: 70, (g) нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 61-384 в последовательности SEQ ID NO: 72, (h) нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 61-384 в последовательности SEQ ID NO: 74, (i) нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 61-384 в последовательности SEQ ID NO: 76, (j) нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 61-384 в последовательности SEQ ID NO: 78, (k) нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 61-384 в последовательности SEQ ID NO: 80, (l) нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 61-384 в последовательности SEQ ID NO: 82, и (m) нуклеотидной последовательности, содержащей полинуклеотид, который гибридизуется с полинуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, комплементарной любой из нуклеотидных последовательностей (f) -(l) в жестких условиях.
(23) Полинуклеотид согласно указанному выше пункту (22), который содержит нуклеотидные последовательности, выбранные из группы, состоящей из: нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 58-423 в последовательности SEQ ID NO: 84, и нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 61-384 в последовательности SEQ ID NO: 70; нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 58-423 в последовательности SEQ ID NO: 84, и нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 61-384 в последовательности SEQ ID NO: 72; нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 58-423 в последовательности SEQ ID NO: 84, и нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 61-384 в последовательности SEQ ID NO: 74; нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 58-423 в последовательности SEQ ID NO: 84, и нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 61-384 в последовательности SEQ ID NO: 76; нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 58-423 в последовательности SEQ ID NO: 84, и нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 61-384 в последовательности SEQ ID NO: 78; нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 58-423 в последовательности SEQ ID NO: 84, и нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 61-384 в последовательности SEQ ID NO: 80; нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 58-423 в последовательности SEQ ID NO: 84, и нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 61-384 в последовательности SEQ ID NO: 82; нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 58-423 в последовательности SEQ ID NO: 90, и нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 61-384 в последовательности SEQ ID NO: 70; нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 58-423 в последовательности SEQ ID NO: 90, и нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 61-384 в последовательности SEQ ID NO: 72; нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 58-423 в последовательности SEQ ID NO: 90, и нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 61-384 в последовательности SEQ ID NO: 74; и нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 58-423 в последовательности SEQ ID NO: 90, и нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 61-384 в последовательности SEQ ID NO: 76.
(24) Полинуклеотид согласно указанному выше пункту (22) или (23), который содержит нуклеотидные последовательности, выбранные из группы, состоящей из: нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 58-1413 в последовательности SEQ ID NO: 84, и нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 61-699 в последовательности SEQ ID NO: 70; нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 58-1413 в последовательности SEQ ID NO: 84, и нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 61-699 в последовательности SEQ ID NO: 72; нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 58-1413 в последовательности SEQ ID NO: 84, и нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 61-699 в последовательности SEQ ID NO: 74; нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 58-1413 в последовательности SEQ ID NO: 84, и нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 61-699 в последовательности SEQ ID NO: 76; нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 58-1413 в последовательности SEQ ID NO: 84, и нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 61-699 в последовательности SEQ ID NO: 78; нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 58-1413 в последовательности SEQ ID NO: 84, и нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 61-699 в последовательности SEQ ID NO: 80; нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 58-1413 в последовательности SEQ ID NO: 84, и нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 61-699 в последовательности SEQ ID NO: 82; нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 58-1413 в последовательности SEQ ID NO: 90, и нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 61-699 в последовательности SEQ ID NO: 70; нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 58-1413 в последовательности SEQ ID NO: 90, и нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 61-699 в последовательности SEQ ID NO: 72; нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 58-1413 в последовательности SEQ ID NO: 90, и нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 61-699 в последовательности SEQ ID NO: 74; и нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 58-1413 в последовательности SEQ ID NO: 90, и нуклеотидной последовательности, представленной нуклеотидами с номерами 61-699 в последовательности SEQ ID NO: 76.
(25) Полинуклеотид по любому из указанных выше пунктов (22)-(24), который содержит нуклеотидные последовательности, выбранные из группы, состоящей из: нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 84 и нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 70; нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 84 и нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 72; нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 84, и нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 74; нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 84, и нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 76; нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 84, и нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 78; нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 84, и нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 80; нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 84, и нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 82; нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 90, и нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 70; нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 90, и нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 72; нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 90, и нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 74; и нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 90, и нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 76.
(26) Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по любому из указанных выше пунктов (19)-(25).
(27) Клетка-хозяин, которая трансформирована вектором экспрессии согласно указанному выше пункту (26).
(28) Клетка-хозяин согласно указанному выше пункту (27), в котором клетка-хозяин является эукариотической клеткой.
(29) Способ получения антитела или функционального фрагмента антитела, отличающийся включением стадии культивирования клетки-хозяина согласно указанному выше пункту (27) или (28) и стадии сбора требуемого антитела или функционального фрагмента антитела из культивируемого продукта, полученного на стадии культивирования.
(30) Антитело или функциональный фрагмент антитела, отличающийся тем, что он получен способом получения согласно указанному выше пункту (29).
(31) Функциональный фрагмент антитела согласно указанному выше пункту (30), в котором функциональный фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, F(ab)2, Fab' и Fv.
(32) Антитело или функциональный фрагмент антитела по любому из указанных выше пунктов (1)-(18), (30) и (31), в котором регулируют модификацию гликана для усиления антитело-зависимой клеточной цитотоксической активности.
(33) Фармацевтическая композиция, отличающаяся включением, по меньшей мере, одного из антител или функциональных фрагментов антител согласно указанным выше пунктам (1)-(18) и (30)-(32).
(34) Фармацевтическая композиция согласно указанному выше пункту (33), которая предназначена для лечения опухоли.
(35) Фармацевтическая композиция для лечения опухоли, отличающаяся тем, что она содержит по меньшей мере одно из антител или функциональных фрагментов антител согласно указанным выше пунктам (1)-(18) и (30)-(32) и по меньшей мере одно терапевтическое средство для лечения злокачественного новообразования.
(36) Фармацевтическая композиция согласно указанному выше пункту (34) или (35), в котором опухоль является злокачественным новообразованием.
(37) Фармацевтическая композиция согласно указанному выше пункту (36), в котором злокачественное новообразование представляет собой рак легкого, рак молочной железы, рак простаты, рак поджелудочной железы, рак прямой и ободочной кишки, меланому, рак печени, рак яичника, рак мочевого пузыря, рак желудка, рак пищевода или рак почек.
(38) Способ лечения опухоли, отличающийся введением индивидууму по меньшей мере одного из антител или функциональных фрагментов антител согласно указанным выше пунктам (1)-(18) и (30)-(32).
(39) Способ лечения опухоли, отличающийся введением индивидууму по меньшей мере одного из антител или функциональных фрагментов антител согласно указанным выше пунктам (1)-(18) и (30)-(32) и по меньшей мере одного терапевтического средства для лечения злокачественного новообразования одновременно, по отдельности или последовательно.
(40) Способ лечения согласно указанному выше пункту (38) или (39), в котором опухоль является злокачественным новообразованием.
(41) Способ лечения согласно указанному выше пункту (40), в котором злокачественное новообразование представляет собой рак легкого, рак молочной железы, рак простаты, рак поджелудочной железы, рак прямой и ободочной кишки, меланому, рак печени, рак яичника, рак мочевого пузыря, рак желудка, рак пищевода или рак почек.
Преимущество изобретения
Согласно изобретению может быть получено терапевтическое средство или тому подобное для лечения злокачественного новообразования, содержащее антитело, которое связывается с В7-Н3 и обладает противоопухолевой активностью против злокачественных клеток.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг. 1 представлен график, показывающий присутствие или отсутствие ADCP-активности анти-В7-Н3-антитела против клеток NCI-H322. Планки погрешностей на графике представляют стандартные ошибки (n=3).
На фиг. 2 представлен график, показывающий присутствие или отсутствие ADCP-активности коммерчески доступного анти-В7-Н3-антитела против клеток NCI-H322.
На фиг. 3 представлен график, показывающий присутствие или отсутствие ADCC-активности антитела М30 против трансфицированных пустым вектором клеток 293 и В7-Н3-экспрессирующих клеток 293. Планки погрешностей на графике представляют стандартные ошибки (n=3). На чертеже «имитация» означает ADCC-активность М30 против трансфицированных пустым вектором клеток 293, и «В7Н3» означает ADCC-активность М30 против В7-Н3-экспрессирующих клеток 293.
На фиг. 4 представлен график, показывающий присутствие или отсутствие CDC-активности анти-В7-Н3-антитела против клеток NCI-Н322. Планки погрешностей на графике представляют стандартные ошибки (n=3).
На фиг. 5-1 представлен график, показывающий реактивность антитела М30 против дефицитного по В7-Н3 мутанта (IgV1 В7-Н3). Пунктирной линией указано свойство связывания для контрольного антитела, а сплошной линией указано свойство связывания антитела М30.
На фиг. 5-2 представлен график, показывающий реактивность антитела М30 против В7-Н3-дефицитного мутанта (В7-Н3 IgC1). Пунктирная линия показывает свойство связывания контрольного антитела, а сплошная линия показывает свойство связывания антитела М30.
На фиг. 5-3 представлен график, показывающий реактивность антитела М30 против В7-Н3-дефицитного мутанта (В7-Н3 IgV2). Пунктирная линия показывает свойство связывания контрольного антитела, а сплошная линия показывает свойство связывания антитела М30.
На фиг. 5-4 представлен график, показывающий реактивность антитела М30 против В7-Н3-дефицитного мутанта (В7-Н3 IgC2). Пунктирная линия показывает свойство связывания контрольного антитела, а сплошная линия показывает свойство связывания антитела М30.
На фиг. 5-5 представлен график, показывающий реактивность антитела М30 против В7-Н3-дефицитного мутанта (В7-Н3 IgC1-V2-С2). Пунктирная линия показывает свойство связывания контрольного антитела, а сплошная линия показывает свойство связывания антитела М30.
На фиг. 5-6 представлен график, показывающий реактивность антитела М30 против В7-Н3-дефицитного мутанта (В7-Н3 IgV2-C2). Пунктирная линия показывает свойство связывания контрольного антитела, а сплошная линия показывает свойство связывания антитела М30.
На фиг. 6 представлен график, показывающий противоопухолевую активность анти-В7-Н3-антител у мышей, которым имплантировали клетки NCI-H322. Планки погрешностей на графике представляют стандартные ошибки (n=10).
3
На фиг. 7 представлен график, показывающий противоопухолевую активность антитела M30 в случае истощения популяции макрофагов in vivo. Планки погрешностей на графике представляют стандартные ошибки (n=8). Кроме того, «мм3» означает «мм».
На фиг. 8 представлен график, показывающий ADCP-активности антитела M30 и антитела cM30 против клеток NCI-H322. Планки погрешностей на графике представляют стандартные ошибки (n=4).
На фиг. 9 представлен график, показывающий противоопухолевую активность антитела M30 и антитела cM30 у мышей, которым имплантировали клетки MDA-MB-231. Планки погрешностей на графике представляют стандартные ошибки (n=9).
На фиг. 10-1 представлен график, показывающий ингибирующие активности антитела cM30 и антитела M30-H1-L4 по отношению к M30, с которым они конкурируют за связывание с полипептидным антигеном внеклеточного домен антигена B7-H3 варианта 1. Планки погрешностей на графике представляют стандартные ошибки (n=3).
На фиг. 10-2 представлен график, показывающий ингибирующие активности антитела cM30 и антитела M30-H1-L4 по отношению к M30, с которым они конкурируют за связывание с полипептидным антигеном внеклеточного домена антигена B7-H3 варианта 2. Планки погрешностей на графике представляют стандартные ошибки (n=3).
На фиг. 11 представлен график, показывающий ADCP-активности антитела M30, антитела cM30 и антитело M30-H1-L4 против клеток NCI-H322. Планки погрешностей на графике представляют стандартные ошибки (n=4).
На фиг. 12 представлен график, показывающий ADCC-активности антитела cM30 и антитела M30-H1-L4 против клеток NCI-H322. Планки погрешностей на графике представляют стандартные ошибки (n=3).
На фиг. 13-1 показана нуклеотидная последовательность варианта 1 B7-H3 (SEQ ID NO: 5).
На фиг. 13-2 показана аминокислотная последовательность варианта 1 B7-H3 (SEQ ID NO: 6).
На фиг. 14-1 показана нуклеотидная последовательность варианта 2 B7-H3 (SEQ ID NO: 9).
На фиг. 14-2 показана аминокислотная последовательность варианта 2 B7-H3 (SEQ ID NO: 10).
На фиг. 15-1 показана нуклеотидная последовательность IgV1 B7-H3 (SEQ ID NO: 20).
На фиг. 15-2 показана аминокислотная последовательность IgV1 B7-H3 (SEQ ID NO: 21).
На фиг. 16-1 показана нуклеотидная последовательность IgC1 B7-H3 (SEQ ID NO: 22).
На фиг. 16-2 показана аминокислотная последовательность IgC1 B7-H3 (SEQ ID NO: 23).
На фиг. 17-1 показана нуклеотидная последовательность IgV2 B7-H3 (SEQ ID NO: 24).
На фиг. 17-2 показана аминокислотная последовательность IgV2 B7-H3 (SEQ ID NO: 25).
На фиг. 18-1 показана нуклеотидная последовательность IgC2 B7-H3 (SEQ ID NO: 26).
На фиг. 18-2 показана аминокислотная последовательность IgC2 B7-H3 (SEQ ID NO: 27).
На фиг. 19-1 показана нуклеотидная последовательность IgC1-V2-C2 B7-H3 (SEQ ID NO: 28).
На фиг. 19-2 показана аминокислотная последовательность IgC1-V2-C2 B7-H3 (SEQ ID NO: 29).
На фиг. 20-1 показана нуклеотидная последовательность IgV2-C2 B7-H3 (SEQ ID NO: 30).
На фиг. 20-2 показана аминокислотная последовательность IgV2-C2 B7-H3 (SEQ ID NO: 31).
На фиг. 21-1 показана нуклеотидная последовательность тяжелой цепи антитела M30 (SEQ ID NO: 50).
На фиг. 21-2 показана аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела M30 (SEQ ID NO: 51).
На фиг. 22-1 показана нуклеотидная последовательность легкой цепи антитела M30 (SEQ ID NO: 52).
На фиг. 22-2 показана аминокислотная последовательность легкой цепи антитела M30 (SEQ ID NO: 53).
На фиг. 23 показана нуклеотидная последовательность сигнала секреции κ-цепи человека, константной области κ-цепи человека и дополнительного поли-A-сигнала человека (SEQ ID NO: 56).
На фиг. 24 показана нуклеотидная последовательность сигнальной последовательности и константной области IgG1 человека (SEQ ID 57).
На фиг. 25-1 показана нуклеотидная последовательность легкой цепи антитела M30 химерного типа (SEQ ID NO: 58).
На фиг. 25-2 показана аминокислотная последовательность легкой цепи антитела M30 химерного типа (SEQ ID NO: 59).
На фиг. 26-1 показана нуклеотидная последовательность тяжелой цепи антитела M30 химерного типа (SEQ ID NO: 62).
На фиг. 26-2 показана аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела M30 химерного типа (SEQ ID NO: 63).
На фиг. 27-1 показана нуклеотидная последовательность легкой цепи M30-L1-типа (SEQ ID NO: 70).
На фиг. 27-2 показана аминокислотная последовательность легкой цепи M30-L1-типа (SEQ ID NO: 71).
На фиг. 28-1 показана нуклеотидная последовательность легкой цепи M30-L2-типа (SEQ ID NO: 72).
На фиг. 28-2 показана аминокислотная последовательность легкой цепи M30-L2-типа (SEQ ID NO: 73).
На фиг. 29-1 показана нуклеотидная последовательность легкой цепи M30-L3-типа (SEQ ID NO: 74).
На фиг. 29-2 показана аминокислотная последовательность легкой цепи M30-L3-типа (SEQ ID NO: 75).
На фиг. 30-1 показана нуклеотидная последовательность легкой цепи M30-L4-типа (SEQ ID NO: 76).
На фиг. 30-2 показана аминокислотная последовательность легкой цепи M30-L4-типа (SEQ ID NO: 77).
На фиг. 31-1 показана нуклеотидная последовательность легкой цепи M30-L5-типа (SEQ ID NO: 78).
На фиг. 31-2 показана аминокислотная последовательность легкой цепи M30-L5-типа (SEQ ID NO: 79).
На фиг. 32-1 показана нуклеотидная последовательность легкой цепи M30-L6-типа (SEQ ID NO: 80).
На фиг. 32-2 показана аминокислотная последовательность легкой цепи M30-L6-типа (SEQ ID NO: 81).
На фиг. 33-1 показана нуклеотидная последовательность легкой цепи M30-L7-типа (SEQ ID NO: 82).
На фиг. 33-2 показана аминокислотная последовательность легкой цепи M30-L7-типа (SEQ ID NO: 83).
На фиг. 34-1 показана нуклеотидная последовательность тяжелой цепи M30-H1-типа (SEQ ID NO: 84).
На фиг. 34-2 показана аминокислотная последовательность тяжелой цепи M30-H1-типа (SEQ ID NO: 85).
На фиг. 35-1 показана нуклеотидная последовательность тяжелой цепи M30-H2-типа (SEQ ID NO: 86).
На фиг. 35-2 показана аминокислотная последовательность тяжелой цепи M30-H2-типа (SEQ ID NO: 87).
На фиг. 36-1 показана нуклеотидная последовательность тяжелой цепи M30-H3-типа (SEQ ID NO: 88).
На фиг. 36-2 показана аминокислотная последовательность тяжелой цепи M30-H3-типа (SEQ ID NO: 89).
На фиг. 37-1 показана нуклеотидная последовательность тяжелой цепи M30-H4-типа (SEQ ID NO: 90).
На фиг. 37-2 показана аминокислотная последовательность тяжелой цепи M30-H4-типа (SEQ ID NO: 91).
На фиг. 38 представлен график, показывающий противоопухолевую активность гуманизированного антитела M30 (M30-H1-L4) у мышей, которым имплантировали клетки MDA-MB-231. Планки погрешностей на графике представляют стандартные ошибки (n=6).
СПОСОБЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Термины «злокачественное новообразование» и «опухоль», в используемом в настоящем описании смысле имеют одно и то же значение.
Термин «ген» в используемом в настоящем описании смысле включает не только ДНК, но также его мРНК, его кДНК и его кРНК.
Термин «полинуклеотид» в используемом в настоящем описании смысле имеет такое же значение, как и нуклеиновая кислота, и также включает ДНК, РНК, зонды, олигонуклеотиды и праймеры.
Термины «полипептид» и «белок» в используемом в настоящем описании смысле применимы в равной мере.
Термин «клетка» в используемом в настоящем описании смысле также включает клетки в организме животного и культивируемые клетки.
Термин «B7-H3» в используемом в настоящем описании смысле имеет такое же значение как и белок B7-H3, а также относится к варианту 1 B7-H3 и/или варианту 2 B7-H3.
Термин «повреждение клетки» в используемом в настоящем описании смысле относится к состоянию, при котором в клетках вызвано патологическое изменение определенного вида, и повреждение клеток не ограничено непосредственным повреждением и включает все виды нарушений структуры и функции клеток, такие как расщепление ДНК, образование димеров оснований, хромосомные поломки, повреждение аппарата клеточного деления и снижение различных ферментативных активностей.
Термин «цитотоксическая активность» в используемом в настоящем описании смысле относится к активности, вызывающей появление описанного выше повреждения клеток.
Термин «активность в антитело-зависимом клеточном фагоцитозе» в используемом в настоящем описании смысле относится к «активности в антитело-зависимом клеточном фагоцитозе (ADCP)» и означает опосредованную антителом фагоцитарную активность моноцитов или макрофагов по отношению к клеткам-мишеням, таким как опухолевые клетки. Термин также звучит как «антитело-зависимая фагоцитарная активность».
Термин «активность в антитело-зависимой клеточной цитотоксичности» в используемом в настоящем описании смысле относится к «активности в антитело-зависимой цитотоксичности (ADCC)» и означает активность в повреждении клеток-мишеней, таких как опухолевые клетки, NK-клетками, опосредованном антителом.
Термин «комплемент-зависимая цитотоксическая активность» в используемом в настоящем описании смысле относится к «комплемент-зависимой цитотоксической (CDC) активности» и означает опосредованное антителом повреждение клеток-мишеней, таких как опухолевые клетки, комплементом.
Термин «функциональный фрагмент антитела» в используемом в настоящем описании смысле относится к неполному фрагменту антитела, обладающему антигенсвязывающей активностью, при этом фрагмент полностью или частично выполняет функцию антитела, включая Fab, F(ab')2, scFv и тому подобное. Термин также охватывает Fab', который является моновалентным фрагментом в вариабельной области антитела, получаемым при обработке F(ab'')2 в восстанавливающих условиях. Однако термин не ограничен такими молекулами при условии, что фрагмент обладает аффинностью связывания по отношению к антигену. Кроме того, такие функциональные фрагменты включают не только фрагмент, получаемый при обработке полноразмерной молекулы белка антитела подходящим ферментом, но также белка, продуцируемого в подходящей клетке-хозяине с использованием генетически модифицированного гена антитела.
Термин «Fab'» в используемом в настоящем описании смысле относится к моновалентному фрагменту в вариабельной области антитела, получаемому при обработке F(ab')2 в восстанавливающих условиях, как описано выше. Однако Fab', получаемый с использованием генетически модифицированного гена антитела, также подпадает под определение «Fab'» согласно изобретению.
Термин «эпитоп» в используемом в настоящем описании смысле относится к неполному пептиду или неполной третичной структуре В7-Н3, с которой связывается специфичное анти-В7-Н3-антитело. Эпитоп, который является неполным пептидом описанного выше В7-Н3, можно определить способом, хорошо известным специалистам в данной области, таким как иммуноанализ, и можно использовать, например, следующий способ. Сначала получают различные неполные структуры антигена. При получении неполных структур можно использовать известную методику синтеза олигопептидов. Например, серию полипептидов, имеющих соответствующим образом уменьшенную длину, получаемых последовательным укорочением В7-Н3, начиная с С-конца или N-конца, получают, используя методику генетической рекомбинации, известную специалистам в данной области. Затем исследуют реактивность антитела против таких полипептидов и приблизительно определяют сайт узнавания. Затем синтезируют пептиды, имеющие более короткие длины, и исследуют реактивность антитела с использованием таких пептидов, таким образом может быть определен эпитоп. Кроме того, может быть определен эпитоп, который представляет собой неполную третичную структуру антигена, с которым связывается специфичное антитело, благодаря определению аминокислотных остатков антигена, которые располагаются вблизи антитела, в использованием рентгеноструктурного анализа.
Фраза «антитела, которые связываются с одним и тем же эпитопом» в используемом в настоящем описании смысле относится к разным антителам, которые связываются с общим эпитопом. Если второе антитело связывается с неполным пептидом или неполной третичной структурой, с которой связывается первое антитело, то можно сделать вывод, что первое антитело и второе антитело связываются с одним и тем же эпитопом. Кроме того, подтверждая, что второе антитело конкурирует с первым антителом за связывание с антигеном (то есть, второе антитело ингибирует связывание между первым антителом и антигеном), можно сделать вывод, что первое антитело и второе антитело связываются с одним и тем же эпитопом, даже если конкретная последовательность или структура эпитопа не были определены. Кроме того, когда первое антитело и второе антитело связываются с одним и тем же эпитопом, а также первое антитело обладает специфичной активностью, такой как противоопухолевая активность, можно ожидать, что и второе антитело также обладает такой же активностью. Соответственно, когда второе анти-B7-H3-антитело связывается с неполным пептидом, с которым связывается первое анти-B7-H3-антитело, можно сделать вывод, что первое антитело и второе антитело связываются с одним и тем же эпитопом B7-H3. Кроме того, подтверждая, что второе анти-B7-H3-антитело конкурирует с первым анти-B7-H3-антителом за связывание с B7-H3, можно сделать вывод, что первое антитело и второе антитело являются антителами, которые связываются с одним и тем же эпитопом B7-H3.
Термин «CDR» в используемом в настоящем описании смысле относится к определяющей комплементарность области (CDR), и известно, что каждая тяжелая и легкая цепь молекулы антитела имеет три определяющих комплементарность области (CDR). CDR также называют гипервариабельной областью, и она присутствует в вариабельной области каждой тяжелой и легкой цепи антитела. Это участок, который имеет необычно высокую вариабельность в своей первичной структуре, и существуют три отдельных CDR в первичной структуре каждой тяжелой и легкой полипептидной цепи. Что касается CDR антитела, то в настоящем описании CDR тяжелой цепи представлены CDRH1, CDRH2 и CDRH3, начиная с амино-концевого участка аминокислотной последовательности тяжелой цепи, и CDR легкой цепи представлены CDRL1, CDRL2 и CDRL3, начиная с амино-концевого участка аминокислотной последовательности легкой цепи. Такие участки находятся рядом друг с другом в третичной структуре и определяют специфичность по отношению к антигену, с которым антитело связывается.
Фраза «гибридизацию осуществляют в жестких условиях» в используемом в настоящем описании смысле относится к способу, в котором гибридизацию осуществляют в условиях, в которых может быть достигнута идентификация в случае проведения гибридизации при 68°C в коммерчески доступно растворе для гибридизации ExpressHyb (производства Clontech, Inc.) или в случае проведения гибридизации при 68°C в присутствии 0,7-1,0 М NaCl с использованием фильтра, на котором иммобилизована ДНК, с последующим осуществлением промывки при 68°C с использованием раствора 0,1-2×SSC (раствор 1×SSC состоит из 150 мМ NaCl и 15 мМ цитрата натрия) или в эквивалентных условиях.
1. B7-H3
B7-H3 является представителем семейства B7, экспрессируемым на антигенпрезентирующих клетках в качестве костимулирующей молекулы, и считают, что он действует на рецептор на T-клетках, усиливая или подавляя иммунную активность.
B7-H3 является белком, имеющим однопроходную трансмембранную структуру, и N-концевой внеклеточный домен B7-H3 имеет два варианта. Вариант 1 B7-H3 (4Ig-B7-H3) содержит V-подобный или C-подобный домен Ig в двух участках, соответственно, а вариант 2 B7-H3 (2Ig-B7-H3) содержит V-подобный или C-подобный домен Ig в одном участке, соответственно.
Что касается B7-H3, используемого в изобретении, то B7-H3 может быть непосредственно очищен из B7-H3-экспрессирующих клеток человека или животного, отличного от человека (такого как крыса или мышь) и использован, или может быть получена и использована фракция клеточных мембран описанных выше клеток. Кроме того, B7-H3 может быть получен посредством его синтеза in vitro или его продукции в клетке-хозяине с использованием генетической инженерии. В частности, в случае генетической инженерии, после интеграции кДНК B7-H3 в вектор, способный экспрессировать кДНК B7-H3, B7-H3 может быть получен в результате его синтеза в растворе, содержащем фермент, субстрат и вещество для получения энергии, необходимые для транскрипции и трансляции, или в результате экспрессии B7-H3 в другой прокариотической или эукариотической трансформированной клетке-хозяине.
Нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания (ORF) гена B7-H3 человека варианта 1 представлена в виде SEQ ID NO: 5 в списке последовательности, и соответствующая аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 6 в списке последовательностей. Кроме того, последовательности SEQ ID NO: 5 и 6 показаны на фиг. 13.
Нуклеотидная последовательность ORF гена B7-H3 человека варианта 2 представлена в виде SEQ ID NO: 9 в списке последовательностей, и соответствующая аминокислотная последовательность представлена в виде SEQ ID NO: 10 в списке последовательностей. Кроме того, последовательности SEQ ID NO: 9 и 10 показаны на фиг. 14.
Кроме того, белок, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой одна или несколько аминокислот заменены, делетированы и/или добавлены в любую из описанных выше аминокислотных последовательностей B7-H3, а также обладает биологической активностью, эквивалентной активности такого белка, также включен в термин B7-H3.
Зрелый B7-H3 человека варианта 1, из которого была удалена сигнальная последовательность, соответствует аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 27-534 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6. Кроме того, зрелый В7-Н3 человека варианта 2, из которого была удалена сигнальная последовательность, соответствует аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 27-316 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.
В варианте 1 В7-Н3 соответствующие домены присутствуют в следующем порядке: IgV1, IgC1, IgV2 и IgC2, начиная с N-конца, и в последовательности SEQ ID NO: 6 в списке последовательностей IgV1 соответствует аминокислотам с номерами 27-139, IgC1 соответствует аминокислотам с номерами 140-244, IgV2 соответствует аминокислотам с номерами 245-357, и IgC2 соответствует аминокислотам с номерами 358-456. Кроме того, в варианте 2 В7-Н3 соответствующие домены присутствуют в следующем порядке: IgV1 и IgC2, начиная с N-конца, и в последовательности SEQ ID NO: 10 в списке последовательностей IgV1 соответствует аминокислотам с номерами 27-140, и IgC2 соответствует аминокислотам с номерами 141-243.
кДНК В7-Н3 может быть получена, например, так называемым способом ПЦР, в случае которого полимеразную цепную реакцию (далее называемую «ПЦР») осуществляют, используя библиотеку кДНК, зкспрессирующую кДНК В7-Н3, в качестве матрицы и праймеры, которые специфично амплифицируют кДНК В7-Н3 (Saiki, R.K., et al., Science, (1988) 239, 487-49). В частности, полинуклеотид, который гибридизуется с полинуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5 или 9 в списке последовательностей, в жестких условиях и кодирует белок, обладающий биологической активностью, эквивалентной активности В7-Н3, также включен в термин «кДНК В7-Н3». Кроме того, полинуклеотид, который представляет собой вариант сплайсинга, транскрибированный с локуса В7-Н3 человека или мыши, или полинуклеотид, который гибридизуется с полинуклеотидом, состоящим из комплементарной ей нуклеотидной последовательности, в жестких условиях, и кодирует белок, обладающий биологической активностью, эквивалентной активности В7-Н3, также включен в термин «кДНК В7-Н3».
Кроме того, белок, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой одна или несколько аминокислот заменены, делетированы или добавлены в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6 или 10 в списке последовательностей, или аминокислотной последовательности, полученной удалением сигнальной последовательности из любой из указанных последовательностей, и обладает биологической активностью, эквивалентной активности В7-Н3, также включен в термин «В7-Н3». Кроме того, белок, который состоит из аминокислотной последовательности, кодируемой вариантом сплайсинга, транскрибированным с локуса В7-Н3 человека или мыши, или аминокислотной последовательности, в которой одна или несколько аминокислот заменены, делетированы или добавлены в указанную выше аминокислотную последовательность, и обладает биологической активностью, эквивалентной активности В7-Н3, также включен в термин «В7-Н3».
2. Получение анти-В7-Н3-антитела
Антитело против В7-Н3 согласно изобретению может быть получено посредством иммунизации животного В7-Н3 или случайным полипептидом, выбранным из аминокислотной последовательности B7-H3, и сбора и очистки антитела, продуцированного in vivo, обычным способом. Биологический вид, из которого происходит B7-H3, используемый в качестве антигена, не ограничен человеком, и животное можно иммунизировать B7-H3, полученным от другого животного, отличного от человека, такого как мышь или крыса. В данном случае, исследуя перекрестную реактивность между связыванием антитела с полученным гетерологичным B7-H3 и B7-H3 человека, можно отобрать антитело, применимое для лечения заболевания человека.
Кроме того, моноклональное антитело может быть получено из гибридомы, получаемой слиянием антитело-продуцирующих клеток, которые продуцируют антитело против B7-H3, с клетками миеломы согласно известному способу (например, Kohler and Milstein, Nature, (1975) 256, pp. 495-497; Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, pp. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)).
В частности, B7-H3, используемый в качестве антигена, можно получить в результате экспрессии гена B7-H3 в клетке-хозяине с использованием генетической инженерии.
В частности, получают вектор, способный экспрессировать ген B7-H3, и полученный вектор трансфицируют в клетку-хозяина, чтобы экспрессировать ген, и затем очищают экспрессированный B7-H3. Далее конкретно описан способ получения антитела против B7-H3.
(1) Получение антигена
Примеры антигена, используемого для получения анти-B7-H3-антитела, включают B7-H3, полипептид, состоящий из неполной аминокислотной последовательности, содержащий по меньшей мере 6 следующих друг за другом аминокислот B7-H3, и производное, получаемое добавлением к нему определенной аминокислотной последовательности или носителя.
B7-H3 может быть очищен непосредственно из опухолевых тканей человека или опухолевых клеток и использован. Кроме того, B7-H3 может быть получен в результате его синтеза in vitro или в результате его продуцирования в клетке-хозяине с использованием генетической инженерии.
В частности, что касается генетической инженерии, то после интеграции кДНК B7-H3 в вектор, способный экспрессировать кДНК B7-H3, B7-H3 может быть получен в результате его синтеза в растворе, содержащем фермент, субстрат и вещество, являющееся источником энергии, необходимые для транскрипции и трансляции, или в результате экспрессии B7-H3 в другой прокариотической или эукариотической трансформированной клетке-хозяине.
Кроме того, антиген также может быть получен в виде секретируемого белка при экспрессии слитого белка, получаемого лигированием внеклеточного домена B7-H3, который представляет собой мембранный белок, с константной областью антитела, в соответствующей системе хозяин-вектор.
кДНК B7-H3 может быть получена, например, так называемым способом ПЦР, в котором полимеразную цепную реакцию (далее называемую «ПЦР») осуществляют, используя библиотеку кДНК, экспрессирующую кДНК B7-H3, в качестве матрицы и праймеры, которые специфично амплифицируют кДНК B7-H3 (см. Saiki, R. K., et al., Science, (1988) 239, pp. 487-489).
В качестве примера системы для синтеза полипептида in vitro может быть приведена система быстрой трансляции (RTS), производства Roche Diagnostics, Inc., но без ограничения указанным.
Примеры прокариотических клеток-хозяев включают Escherichia coli и Bacillus subtilis. Чтобы трансформировать клетки-хозяева геном-мишенью, клетки-хозяева трансформируют плазмидным вектором, содержащим репликон, т.е. начало репликации, полученное от вида, совместимого с хозяином, и регуляторную последовательность. Кроме того, вектор, предпочтительно, имеет последовательность, обеспечивающую возможность отбора трансформированной клетки по фенотипу.
Примеры эукариотических клеток-хозяев включают клетки позвоночных, клетки насекомых и дрожжевые клетки. В качестве клеток позвоночных часто используют, например, клетки обезьян COS (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, pp. 175-182, ATCC CRL-1650), фибробласты мышей NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658) и дефицитные по дигидрофолатредуктазе штаммы (Urlaub, G. and Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220) клеток яичника китайского хомячка (клетки CHO; ATCC: CCL-61); и тому подобные, однако клетки не ограничены указанными клетками.
Полученный таким образом трансформант можно культивировать обычным способом, и при культивировании трансформанта полипептид-мишень продуцируется внутриклеточно или внеклеточно.
Подходящая среда, используемая для культивирования, может быть выбрана из различных обычно используемых культуральных сред, в зависимости от используемых клеток-хозяев. Если используют Escherichia coli, то можно, например, использовать среду LB с добавлением при необходимости антибиотика, такого как ампициллин или IPMG.
Рекомбинантный белок, продуцируемый внутриклеточно или внеклеточно трансформантом при таком культивировании, можно отделить и очистить любым из различных известных способов разделения с использованием физического или химического свойства белка.
Конкретные примеры способов включают обработку обычным преципитирующим белки агентом, ультрафильтрацию, различные типы жидкостной хроматографии, такие как хроматографию на молекулярных ситах (гель-фильтрацию), адсорбционную хроматографию, ионообменную хроматографию и аффинную хроматографию, диализ и их сочетание.
Кроме того, благодаря связыванию метки из шести остатков гистидина с рекомбинантным белком, который необходимо экспрессировать, белок может быть эффективно очищен на аффинной колонке с никелем. Альтернативно, благодаря связыванию Fc-области IgG с рекомбинантным белком, который необходимо экспрессировать, белок может быть эффективно очищен на колонке с белком A.
При сочетании описанных выше способов можно легко получить большое количество полипептида-мишени с высоким выходом и высокой чистотой.
(2) Получение моноклонального анти-B7-H3-антитела
Примеры антитела, специфично связывающегося с B7-H3, включают моноклональное антитело, специфично связывающееся с B7-H3, и способ получения антитела описан ниже.
Получение моноклонального антитела обычно требует осуществления следующих стадий работы:
(a) очистки биополимера, используемого в качестве антигена;
(b) получения антитело-продуцирующих клеток в результате иммунизации животного посредством инъекции антигена, сбора крови, анализа титра антител в крови, чтобы определить момент, когда можно вырезать селезенку;
(c) получения клеток миеломы (далее называемых «миелома»);
(d) слияния антитело-продуцирующих клеток с миеломой;
(e) скрининга группы гибридом, продуцирующих требуемое антитело;
(f) деления гибридом на отдельные клоны клеток (клонирование);
(g) необязательно, культивирования гибридомы или разведения животного, которому имплантирована гибридома, для продуцирования большого количества моноклонального антитела;
(h) исследования полученного таким образом моноклонального антитела в отношении биологической активности и специфичности связывания или исследования свойств антитела в качестве меченого антитела-реагента; и тому подобное.
Далее способ получения моноклонального антитела описан подробно в порядке следования указанных выше стадий, однако способ не ограничен таким описанием, и можно использовать, например, другие продуцирующие антитела клетки, отличные от клеток селезенки и миеломы.
(a) Очистка антигена
В качестве антигена можно использовать B7-H3, получаемый способом, который описан выше, или его неполный пептид.
Кроме того, в качестве антигена также можно использовать фракцию мембран, полученную из рекомбинантных клеток, экспрессирующих B7-H3, или сами рекомбинантные клетки, экспрессирующие B7-H3, а также неполный пептид белка согласно изобретению, химически синтезированный способом, известным специалистам в данной области.
(b) Получение продуцирующих антитела клеток
Антиген, полученный на стадии (a), смешивают с адъювантом, таким как полный или неполный адъювант Фрейнда или сульфат алюминия-калия, и полученную смесь используют в качестве иммуногена для иммунизации экспериментального животного. В качестве экспериментального животного можно использовать без всякого сомнения любое животное, используемое в известном способе получения гибридом. В частности, можно использовать, например, мышь, крысу, козу, овцу, корову, лошадь или тому подобных. Однако с точки зрения более простой доступности клеток миеломы, сливаемых с выделенными продуцирующими антитела клетками, предпочтительно, используют мышь или крысу в качестве животного, подвергаемого иммунизации.
Кроме того, используемая линия мышей или крыс особым образом не ограничена, и в случае мышей можно использовать различные линии мышей, например, такие как A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB и 129 и тому подобные, и в случае крыс можно использовать, например, крыс Wistar, Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN, Fischer и тому подобные.
Такие мыши и крысы коммерчески доступны из организаций, занимающихся разведением/распространением экспериментальных животных, например, CLEA Japan, Inc. и Charles River Laboratories Japan, Inc.
С учетом совместимости при слиянии с клетками миеломы, описанными ниже, наряду с прочими в случае мышей линия BALB/c и в случае крыс линии Wistar и Low являются особенно предпочтительными в качестве подвергаемого иммунизации животного.
Кроме того, с учетом антигенной гомологии между человеком и мышами, также, предпочтительно, использование мыши, имеющей пониженную биологическую функцию удаления аутоантител, то есть, мыши с аутоиммунным заболеванием.
Возраст такой мыши или крысы во время иммунизации, предпочтительно, составляет 5-12 недель, более предпочтительно, 6-8 недель.
Чтобы иммунизировать животное с использованием B7-H3 или рекомбинантного B7-H3 можно использовать, например, известный способ, подробно описанный, например, в публикациях Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964) или тому подобных.
Наряду с такими способами иммунизации конкретным предпочтительным способом, применяемым в изобретении, является, например, следующий способ.
А именно, сначала фракцию мембранного белка, служащего в качестве антигена, или клетки, в которых была вызвана экспрессия антигена, внутрикожно или внутрибрюшинно вводят животному.
Однако сочетание обоих путей введения является предпочтительным для повышения эффективности иммунизации, и когда внутрикожное введение осуществляют в первой половине, а внутрибрюшинное введение осуществляют во второй половине или только в виде последней дозы, эффективность иммунизации может быть особенно повышена.
Схема введения антигена варьирует в зависимости от вида иммунизируемого животного, индивидуальных различий и тому подобного. Однако, в общем, более предпочтительна схема введения, согласно которой количество введений антигена составляет от 3 до 6 раз, и интервал между введением доз составляет от 2 до 6 недель, и более предпочтительна схема введения, согласно которой количество введений антигена составляет от 3 до 4 раз и интервал между введениями доз составляет от 2 до 4 недель.
Кроме того, доза антигена варьирует в зависимости от вида животного, индивидуальных различий или тому подобного, однако доза обычно составляет от 0,05 до 5 мг, предпочтительно, примерно от 0,1 до 0,5 мг.
Бустер-иммунизацию осуществляют через 1-6 недель, предпочтительно, 2-4 недели, более предпочтительно, 2-3 недели после введения антигена, как описано выше.
Доза антигена во время осуществления бустер-иммунизации варьирует в зависимости от вида или размера животного или тому подобного, однако, например, в случае мыши доза обычно составляет от 0,05 до 5 мг, предпочтительно, от 0,1 до 0,5 мг, более предпочтительно, примерно от 0,1 до 0,2 мг.
Клетки селезенки или лимфоциты, включая клетки, продуцирующие антитела, асептически извлекают из организма иммунизированного животного через 1-10 дней, предпочтительно, через 2-5 дней, более предпочтительно, через 2-3 дня после бустер-иммунизации. В этом время измеряют титр антител, и если в качестве источника получения клеток, продуцирующих антитела, используют животное, имеющее в достаточной степени повышенный титр антител, последующая операция может быть осуществлена более эффективно.
Примеры способа измерения титра антител, используемого в настоящем изобретении, включают способ РИА и способ ELISA, но способ не ограничен указанным.
Например, если используют способ ELISA, измерение титра антител согласно изобретению можно осуществлять способами, которые описаны ниже.
Сначала очищенный или частично очищенный антиген адсорбируют на поверхности твердой фазы, такой как 96-луночный планшет для ELISA, и поверхность твердой фазы, на которой нет адсорбированного антигена, покрывают белком, неродственным антигену, таким как бычий сывороточный альбумин (далее называемым «БСА»). После промывки поверхности поверхность приводят в контакт с серийно разбавленным образцом (например, сывороткой мыши) в качестве первого антитела, позволяя антителу в образце связаться с антигеном.
Кроме того, в качестве второго антитела добавляют антитело, меченое ферментом, против антитела мыши и обеспечивают возможность для связывания с антителом мыши. После промывки добавляют субстрат для фермента и измеряют изменение поглощения, которое происходит вследствие развития окраски, индуцированного распадом субстрата или тому подобным, и на основе измерения вычисляют титр антител.
Отделение продуцирующих антитела клеток от клеток селезенки или лимфоцитов иммунизированного животного можно осуществить известным способом (например, Kohler et al., Nature (1975), 256, p. 495; Kohler et al., Eur. J. Immunol. (1977), 6, p. 511; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550; Walsh, Nature (1977), 266, p. 495). Например, в случае клеток селезенки можно использовать общий способ, когда клетки, продуцирующие антитела, отделяют, гомогенизируя селезенку, получая клетки после фильтрации с использованием стальной сетки и суспендируя клетки в минимальной питательной среде Игла (MEM).
(c) Получение клеток миеломы (далее называемых «миеломой»)
Клетки миеломы, используемые для слияния клеток, особым образом не ограничены, и подходящие клетки могут быть выбраны из известных клеточных линий. Однако с точки зрения удобства отбора гибридом из слитых клеток, предпочтительно, использование дефицитной по HGPRT (гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазе) линии, для которой был разработан способ селекции.
Более конкретно, примеры HGPRT-дефицитной линии включают X63-Ag8(X63), NS1-ANS/1(NS1), P3X63-Ag8.U1(P3U1), X63-Ag8.653(X63.653), SP2/0-Ag14(SP2/0), MPC11-45.6TG1.7(45.6TG), FO, S149/5XXO и BU.1, полученные от мышей; 210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3), полученная от крыс; и U266AR(SKO-007), GM1500-GTG-A12(GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2(НМу2) и 8226AR/NIP4-1(NP41), полученные от человека. Такие HGPRT-дефицитные линии доступны, например, из Американской коллекции типов культур (АТСС) или тому подобных.
7
Такие линии клеток субкультивируют в подходящей среде, такой как среда, содержащая 8-азагуанин [среда, получаемая добавлением 8-азагуанина к среде RPMI 1640, дополненной глутамином, 2-меркаптоэтанола, гентамицина и фетальной бычьей сыворотки (далее называемой «FBS»)], среда Дульбекко, модифицированная по способу Исков (далее называемая «IMDM»), или среда Игла в модификации Дульбекко (далее называемая «DMEM»). В таком случае за 3-4 дня до осуществления слияния клеток клетки субкультивируют в нормальной среде [например, в среде ASF104 (производства Ajinomoto Co., Ltd.), содержащей 10% FBS], чтобы получить не менее 2×10 клеток ко дню слияния клеток.
(d) Слияние клеток
Слияние между клетками, продуцирующими антитела, и клетками миеломы может быть соответствующим образом осуществлено согласно известному способу (Weir, D.М. Handbook of Experimental Immunology Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E.A. and Mayer, M.M., Experimental Immunochemistry, Charles С Thomas Publisher, Springfield, Ill. (1964), и т.д.), в таких условиях, чтобы уровень выживаемости клеток существенно не снижался.
В качестве такого способа можно использовать, например, химический способ, согласно которому клетки, продуцирующие антитела, и клетки миеломы смешивают в растворе, содержащем полимер, такой как полиэтиленгликоль, в высокой концентрации, физический способ с использованием электрической стимуляции или тому подобные. Из множества способов конкретный пример химического способа описаны ниже.
А именно, в случае, когда используют полиэтиленгликоль в растворе, содержащем полимер в высокой концентрации, клетки, продуцирующие антитела и клетки миеломы смешивают в растворе полиэтиленгликоля, имеющего молекулярную массу 1500-6000, более предпочтительно, 2000-4000, при температуре от 30 до 40°C, предпочтительно, 35-38°C в течение 1-10 минут, предпочтительно, 5-8 минут.
(e) Отбор группы гибридом
Способ отбора гибридом, полученных в результате описанного выше слияния клеток, особым образом не ограничен. Обычно используют способ селекции на основе HAT (гипоксантин, аминоптерин, тимидин) (Kohler et al., Nature (1975), 256, p. 495; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550).
Такой способ является эффективным, когда гибридомы получают с использованием клеток миеломы HGPRT-дефицитной линии, которая не может жить в присутствии аминоптерина.
То есть, при культивировании неслитых клеток и гибридом в среде HAT, только гибридомы, резистентные к аминоптерину избирательно могут выживать и пролиферировать.
(f) Деление на клоны отдельных клеток (клонирование)
В качестве способа клонирования гибридом можно использовать известный способ, такой как способ на основе метилцеллюлозы, способ на основе мягкой агарозы или способ лимитирующего разведения (смотри, например, Barbara, B. M. and Stanley, M. S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980)). В частности, среди таких способов предпочтительным является способ трехмерного культивирования, такой как способ с использованием метилцеллюлозы. Например, группу гибридом, полученных слиянием клеток, суспендируют в среде с метилцеллюлозой, такой как среда для селекции ClonaCell-HY D (производства StemCell Technologies, inc., № 03804) и культивируют. Затем образованные колонии гибридом собирают, при этом могут быть получены моноклональные гибридомы. Соответствующие собранные колонии гибридом культивируют и гибридому, которая, как было подтверждено, дает стабильный титр антител в полученном надосадке культуры гибридом, отбирают в качестве линии гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело B7-H3.
Примеры полученной таким образом линии гибридомы включают гибридому B7-H3 M30. В настоящем описании антитело, продуцируемое гибридомой B7-H3 M30, называют «антителом M30» или просто «M30».
Тяжелая цепь антитела M30 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51 в списке последовательностей. Кроме того, легкая цепь антитела M30 имеет аминокислотную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 53 в списке последовательностей. В аминокислотной последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 51 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков 1-19, является сигнальной последовательностью, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков 20-141, является вариабельной областью, и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков 142-471, является константной областью. Кроме того, в аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 53 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков 1-22, является сигнальной последовательностью, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков 23-130, является вариабельной областью, и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков 131-235, является константной областью.
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи, представленная в виде SEQ ID NO: 51 в списке последовательностей, кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 50 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 50 в списке последовательностей, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов 1-57, кодирует сигнальную последовательность тяжелой цепи антитела, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов 58-423, кодирует вариабельную область тяжелой цепи антитела, и нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов 424-1413, кодирует константную область тяжелой цепи антитела.
Аминокислотная последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 53 в списке последовательностей, кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 52 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 52 в списке последовательностей, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов 1-66, кодирует сигнальную последовательность легкой цепи антитела, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов 67-390, кодирует вариабельную область легкой цепи антитела, и нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов 391-705, кодирует константную область легкой цепи антитела.
(g) Получение моноклонального антитела с использованием культивирования гибридомы
Посредством культивирования отобранной таким образом гибридомы может быть эффективно получено моноклональное антитело. Однако перед культивированием, предпочтительно, проведение скрининга гибридомы, которая продуцирует целевое моноклональное антитело.
В таком скрининге можно применять известный способ.
Измерение титра антител согласно изобретению можно осуществить, например, способом ELISA, пояснения к которому приведены в пункте (b) выше.
Гибридому, полученную описанным выше способом, можно хранить в замороженном состоянии в жидком азоте или в морозильнике при -80°C или более низкой температуре.
После завершения клонирования среду HT заменяют на нормальную среду и культивируют гибридому.
Крупномасштабное культивирование осуществляют в ротационной культуре, используя большой культуральной сосуд, или в культуре с постоянным перемешиванием. Из надосадка, полученного при крупномасштабном культивировании, моноклональное антитело, которое специфично связывается с белком согласно изобретению, может быть получено очисткой с использованием способов, известных специалистам в данной области, таких как гель-фильтрация.
Кроме того, гибридому инъецируют в брюшную полость мыши такой же линии, что и гибридома (например, описанной выше линии BALB/c), или мыши Nu/Nu, чтобы гибридома пролиферировала, при этом могут быть получены асциты, содержащие большое количество моноклональных антител согласно изобретению.
В тех случаях, когда гибридому вводят в брюшную полость, если за 3-7 дней до введения гибридомы вводят минеральное масло, такое как 2,6,10,14-тетраметилпентадекан (пристан), может быть получено большое количество асцитов.
6
7
Например, предварительно инъецируют иммунодепрессант в брюшную полость мыши той же линии, что и гибридома, чтобы инактивировать T-клетки. Через 20 дней от 10 до 10 клеток клона гибридомы суспендируют в бессывороточной среде (0,5 мл) и суспензию вводят в брюшную полость мыши. В общем, когда живот вздувается и заполняется асцитами, асциты собирают из организма мыши. Таким способом может быть получено моноклональное антитело в концентрации, которая примерно в 100 раз или намного больше, чем в культуральном растворе.
Моноклональное антитело, полученное описанным выше способом, может быть очищено способом, описанным, например, в публикации Weir, D. M.: Handbook of Experimental Immunology Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978).
Полученное таким образом моноклональное антитело обладает высокой специфичностью к антигену B7-H3.
(h) Анализ моноклонального антитела
Изотип и подкласс полученного таким образом моноклонального антитела могут быть определены следующим образом.
Во-первых, примеры способа идентификации включают способ Оухтерлони, способ ELISA и способ РИА.
Способ Оухтерлони прост, но при низкой концентрации моноклонального антитела требуется операция конденсации.
С другой стороны, когда используют способ ELISA или способ РИА, можно идентифицировать изотип и подкласс моноклонального антитела, используя прямое взаимодействие надосадка культуры с твердой фазой, на которой адсорбирован антиген, и используя антитела, соответствующие различным типам изотипов и подклассов иммуноглобулинов в качестве вторых антител.
Кроме того, в качестве более простого способа также можно использовать коммерчески доступный набор для идентификации (например, набор Mouse Typer производства Bio-Rad Laboratories, Inc.) или тому подобное.
Кроме того, количественное определение белка можно осуществить способом Фолина-Лоури и способом расчета на основе поглощения при 280 нм [1,4 (OD 280) = 1 мг/мл иммуноглобулина].
Кроме того, даже когда моноклональное антитело получают отдельно и независимо, снова осуществляя стадии (a)-(h), указанные в пункте (2), можно получить антитело, обладающее цитотоксической активностью, эквивалентной активности антитела M30. В качестве примера такого антитела можно привести пример антитела, которое связывается с таким же эпитопом, как и антитело M30. M30 распознает эпитоп в домене IgC1 или IgC2, который является доменом во внеклеточном домене B7-H3, и связывается с доменом IgC1 или доменом IgC2 или двумя доменами. Таким образом, в качестве примера эпитопа для антитела M30 можно, в частности, привести эпитоп, присутствующий в домене IgC1 или IgC2 B7-H3. Если вновь полученное моноклональное антитело связывается с неполным пептидом или неполной третичной структурой, с которой антитело M30 связывается, то можно определить, что моноклональное антитело связывается с тем же эпитопом, что антитело M30. Кроме того, в случае подтверждения того, что моноклональное антитело конкурирует с антителом M30 за связывание с B7-H3 (то есть, моноклональное антитело ингибирует связывание между антителом M30 и B7-H3), можно определить, что моноклональное антитело связывается с тем же эпитопом, что и антитело M30, даже если конкретная последовательность или структура эпитопа не была определена. Когда подтверждают, что моноклональное антитело связывается с тем же эпитопом, что и антитело M30, с высокой вероятностью предполагают, что моноклональное антитело обладает цитотоксической активностью, эквивалентной активности антитела M30.
(3) Другие антитела
Антитело согласно изобретению включает не только описанное выше моноклональное антитело против B7-H3, но также рекомбинантное антитело, получаемое искусственной модификацией в целях снижения гетерологичной антигенности для человека, такое как химерное антитело, гуманизированное антитело и антитело человека. Такие антитела могут быть получены с использованием известного способа.
В качестве примера химерного антитела можно привести антитело, в котором вариабельные и константные области антитела получены от разных видов, например, химерное антитело, в котором полученная от мыши или крысы вариабельная область антитела связана с константной областью, полученной от человека (смотри Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855, (1984)). Химерное антитело, полученное из антитела мыши M30 против B7-H3 человека, представляет собой антитело, состоящее из тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, аминокислотная последовательность которой состоит из аминокислотных остатков 20-141 последовательности SEQ ID NO: 51, и легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, аминокислотная последовательность которой состоит из аминокислотных остатков 23-130 последовательности SEQ ID NO: 53, и может иметь константную область, полученную произвольно от человека. В качестве одного из примеров такого химерного антитела можно привести антитело, состоящее из тяжелой цепи, в которой аминокислотная последовательность состоит из аминокислотных остатков 1-471 последовательности SEQ ID NO: 63, указанной в списке последовательностей, и легкой цепи, аминокислотная последовательность которой состоит из аминокислотных остатков 1-233 последовательности SEQ ID NO: 59, указанной в списке последовательностей. В частности, в последовательности тяжелой цепи, представленной в виде SEQ ID NO: 63 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков 1-19, является сигнальной последовательностью, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков 20-141, является вариабельной областью, и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков 142-471 является константной областью. Кроме того, в последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 59 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков 1-20, является сигнальной последовательностью, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков 21-128, является вариабельной областью, и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков 129-233, является константной областью.
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи, представленная в SEQ ID NO: 63 в списке последовательностей, кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 62 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 62 в списке последовательностей, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов 1-57, кодирует сигнальную последовательность тяжелой цепи антитела, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов 58-423, кодирует вариабельную область тяжелой цепи антитела, и нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов 424-1413, кодирует константную область тяжелой цепи антитела.
Аминокислотная последовательность легкой цепи, представленная в SEQ ID NO: 59 в списке последовательностей, кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 58 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 58 в списке последовательностей, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов 1-60, кодирует сигнальную последовательность легкой цепи антитела, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов 61-384, кодирует вариабельную область легкой цепи антитела, и нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов 385-699, кодирует константную область легкой цепи антитела.
В качестве примера такого гуманизированного антитела можно привести антитело, полученное в результате интеграции только определяющей комплементарность области (CDR) в полученное от человека антитело (см. Nature (1986) 321, pp. 522-525), и антитело, полученное в результате прививания части аминокислотных остатков каркаса, а также последовательности CDR в антитело человека способом прививания CDR (WO 90/07861).
Однако гуманизированное антитело, полученное из антитела M30, не ограничено конкретным гуманизированным антителом, при условии, что гуманизированное антитело имеет все 6 типов последовательностей CDR антитела M30 и обладает противоопухолевой активностью. В частности, вариабельная область тяжелой цепи антитела M30 имеет CDRH1 (NYVMH), состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 92 в списке последовательностей, CDRH2 (YINPYNDDVKYNEKFKG), состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 93 в списке последовательностей, и CDRH3 (WGYYGSPLYYFDY), состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 94 в списке последовательностей. Кроме того, вариабельная область легкой цепи антитела M30 имеет CDRL1 (RASSRLIYMH), состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 95 в списке последовательностей, CDRL2 (ATSNLAS), состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 96 в списке последовательностей, и CDRL3 (QQWNSNPPT), состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 97 в списке последовательностей.
В качестве примера гуманизированного антитела, полученного из антитела мыши M30, можно привести произвольное сочетание тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из любой из следующих последовательностей: (1) аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 20-141 последовательности SEQ ID NO: 85, 87, 89 или 91, указанной в списке последовательностей, (2) аминокислотной последовательности, имеющей гомологию, составляющую, по меньшей мере, 95% или больше, с аминокислотной последовательностью (1), описанной выше, и (3) аминокислотной последовательности, в которой одна или несколько аминокислот в аминокислотной последовательности (1), описанной выше, делетированы, заменены или добавлены, и легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, состоящую из любой из следующих последовательностей: (4) аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 21-128 последовательности SEQ ID NO: 71, 73, 75, 77, 79, 81, или 83, указанных в списке последовательностей, (5) аминокислотной последовательности, имеющей гомологию, составляющую по меньшей мере 95% или больше, с аминокислотной последовательностью (4), описанной выше, и (6) аминокислотной последовательности, в которой одна или несколько аминокислот в аминокислотной последовательности (4), описанной выше, делетированы, заменены или добавлены.
В частности, термин «несколько» в используемом в настоящем описании смысле относится к 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3 или 1 или 2.
В качестве аминокислотной замены, указанной в настоящем описании, предпочтительной является консервативная аминокислотная замена. Консервативная аминокислотная замена относится к замене, происходящей в пределах группы аминокислот, родственных по боковым цепям аминокислот. Предпочтительными группами аминокислот являются следующие группы: группа кислых аминокислот (аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота); группа основных аминокислот (лизин, аргинин и гистидин); группа неполярных аминокислот (аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин и триптофан); и семейство полярных незаряженных аминокислот (глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серии, треонин и тирозин). Более предпочтительными группами аминокислот являются следующие группы: группа алифатических гидроксиаминокислот (серии и треонин); группа аминокислот, содержащих амид (аспарагин и глутамин)/ группа алифатических аминокислот (аланин, валин, лейцин и изолейцин); и группа ароматических аминокислот (фенилаланин, триптофан и тирозин). Такую аминокислотную замену, предпочтительно, осуществляют в диапазоне, в котором не нарушены свойства вещества, имеющего исходную аминокислотную последовательность.
В качестве примера антитела, которое имеет предпочтительное сочетание тяжелой цепи и легкой цепи, описанных выше, можно привести антитело, состоящее из тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 20-141 последовательности SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 21-128 последовательности SEQ ID NO: 71; антитело, состоящее из тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 20-141 последовательности SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 21-128 последовательности SEQ ID NO: 73; антитело, состоящее из тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 20-141 последовательности SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 21-128 последовательности SEQ ID NO: 75; антитело, состоящее из тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 20-141 последовательности SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 21-128 последовательности SEQ ID NO: 77; антитело, состоящее из тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 20-141 последовательности SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 21-128 последовательности SEQ ID NO: 79; антитело, состоящее из тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 20-141 последовательности SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 21-128 последовательности SEQ ID NO: 81; антитело, состоящее из тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, включающей аминокислотные остатки 20-141 последовательности SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 21-128 последовательности SEQ ID NO: 83; антитело, состоящее из тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 20-141 последовательности SEQ ID NO: 91, и легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 21-128 последовательности SEQ ID NO: 71; антитело, состоящее из тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 20-141 последовательности SEQ ID NO: 91, и легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 21-128 последовательности SEQ ID NO: 73; антитело, состоящее из тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 20-141 последовательности SEQ ID NO: 91, и легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 21-128 последовательности SEQ ID NO: 75; и антитело, состоящее из тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 20-141 последовательности SEQ ID NO: 91, и легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 21-128 последовательности SEQ ID NO: 77.
В качестве примера антитела, которое имеет предпочтительное сочетание тяжелой цепи и легкой цепи, как описано выше, можно привести
антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-471 в последовательности SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-233 в последовательности SEQ ID NO: 71;
антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-471 в последовательности SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-233 в последовательности SEQ ID NO: 73;
антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-471 в последовательности SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-233 в последовательности SEQ ID NO: 75;
антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-471 в последовательности SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-233 в последовательности SEQ ID NO: 77;
антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-471 в последовательности SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-233 в последовательности SEQ ID NO: 79;
антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-471 в последовательности SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-233 в последовательности SEQ ID NO: 81;
аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-471 в последовательности SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-233 в последовательности SEQ ID NO: 83;
антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-471 в последовательности SEQ ID NO: 91, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-233 в последовательности SEQ ID NO: 71;
антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-471 в последовательности SEQ ID NO: 91, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-233 в последовательности SEQ ID NO: 73;
антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-471 в последовательности SEQ ID NO: 91, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-233 в последовательности SEQ ID NO: 75; и
антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 20-471 в последовательности SEQ ID NO: 91, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами с номерами 21-233 в последовательности SEQ ID NO: 77.
Более того, в качестве примера антитела, которое имеет предпочтительную комбинацию тяжелой цепи и легкой цепи, как описано выше, можно привести антитело, состоящее из тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; антитело, состоящее из тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; антитело, состоящее из тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; антитело, состоящее из тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79; антитело, состоящее из тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81; антитело, состоящее из тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 85, и легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83; антитело, состоящее из тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91, и легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71; антитело, состоящее из тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91, и легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; антитело, состоящее из тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91, и легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; и антитело, состоящее из тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91, и легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77.
В результате сочетания последовательности, имеющей высокую гомологию с описанной выше аминокислотной последовательностью тяжелой цепи, с последовательностью, имеющей высокую гомологию с описанной выше аминокислотной последовательностью легкой цепи, можно отобрать антитело, обладающее цитотоксической активностью, эквивалентной активности каждого из описанных выше антител. Такая гомология обычно представляет собой гомологию на 80% или больше, предпочтительно, гомологию на 90% или больше, более предпочтительно, гомологию на 95% или больше, наиболее предпочтительно, гомологию на 99% или больше. Кроме того, в результате сочетания аминокислотной последовательности, в которой один или несколько аминокислотных остатков заменены, делетированы или добавлены в аминокислотной последовательности тяжелой цепи или легкой цепи, также можно отобрать антитело, обладающее цитотоксической активностью, эквивалентной активности каждого из описанных выше антител.
Гомология между двумя аминокислотными последовательностями может быть определена с использованием параметров по умолчанию алгоритма Blast версии 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, и David J. Lipman (1997), «Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs», Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Алгоритм Blast также можно использовать из Интернета, где он доступен на сайте 1334907992153-0.
В частности, в аминокислотной последовательностью тяжелой цепи SEQ ID NO: 85, 87, 89 или 91 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков 1-19, является сигнальной последовательностью, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков 20-141, является вариабельной областью, и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков 142-471, является константной областью.
Кроме того, в аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 71, 73, 75, 77, 79, 81 или 83 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков 1-20, является сигнальной последовательностью, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков 21-128, является вариабельной областью, и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков 129-233, является константной областью.
Аминокислотные последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 85, 87, 89 или 91 в списке последовательностей, кодируются нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 84, 86, 88 или 90, соответственно, в списке последовательностей. Кроме того, последовательности SEQ ID NO: 84 и 85, показаны на фиг. 34, последовательности SEQ ID NO: 86 и 87, показаны на фиг. 35, последовательности SEQ ID NO: 88 и 89, показаны на фиг. 36, и последовательности SEQ ID NO: 90 и 91, показаны на фиг. 37. В каждой из указанных выше нуклеотидных последовательностей, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов 1-57, кодирует сигнальную последовательность тяжелой цепи антитела, нуклеотидная последовательности, состоящая из нуклеотидов 58-423, кодирует вариабельную область тяжелой цепи антитела, и нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов 424-1413, кодирует константную область тяжелой цепи антитела.
Аминокислотные последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 71, 73, 75, 77, 79, 81 или 83 в списке последовательностей, кодируются нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 70, 72, 74, 76, 78, 80 или 82, соответственно, в списке последовательностей. Кроме того, последовательности SEQ ID NO: 70 и 71, показаны на фиг. 27, последовательности SEQ ID NO: 72 и 73, показаны на фиг. 28, последовательности SEQ ID NO: 74 и 75, показаны на фиг. 29, последовательности SEQ ID NO: 76 и 77, показаны на фиг. 30, последовательности SEQ ID NO: 78 и 79, показаны на фиг. 31, последовательности SEQ ID NO: 80 и 81, показаны на фиг. 32, и последовательности SEQ ID NO: 82 и 83, показаны на фиг. 33. В каждой из указанных выше нуклеотидных последовательностей нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов 1-60 кодирует сигнальную последовательность легкой цепи антитела, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов 61-384, кодирует вариабельную область легкой цепи антитела, и нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов 385-699, кодирует константную область легкой цепи антитела.
Гомологию между любой из таких нуклеотидных последовательностей и нуклеотидной последовательностью другого антитела также можно определить, используя алгоритм Blast.
Кроме того, антитело согласно изобретению включает антитело человека, которое связывается с таким же эпитопом, как и антитело M30. Анти-B7-H3-антитело человека относится к антителу человека, при этом последовательность гена антитела получена только из хромосомы человека. Анти-B7-H3-антитело человека может быть получено способом, основанном на использовании мыши, продуцирующей антитела человека, имеющей фрагмент хромосомы человека, содержащий гены тяжелой и легкой цепи антитела человека (см., Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, pp. 133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, pp. 3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima, S. и т.д.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, pp. 722-727, и т.д.).
Такая мышь, продуцирующая антитела человека, может быть специально создана следующим образом. Генетически модифицированное животное, в котором был разрушен локус эндогенных генов тяжелой и легкой цепи иммуноглобулинов, и вместо него был введен локус генов тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина человека с использованием вектора на основе искусственной дрожжевой хромосомы (YAC) или тому подобного, создают в результате получения нокаутированного животного и трансгенного животного и скрещивания таких животных.
Кроме того, в соответствии с методикой получения рекомбинантной ДНК эукариотические клетки трансформируют, используя кДНК, кодирующие тяжелые цепи и легкие цепи антитела человека, и, предпочтительно, вектор, содержащей такие кДНК, и трансформированную клетку, которая продуцирует рекомбинантное моноклональное антитело человека, культивируют, при этом антитело также может быть получено из надосадка культуры.
В данном случае в качестве хозяина можно использовать, например, эукариотические клетки, предпочтительно, клетки млекопитающих, такие как клетки CHO, лимфоциты или клетки миеломы.
Кроме того, также известен способ получения производимого в фаговом дисплее антитела человека, выбранного из библиотеки антител человека (см., Wormstone, I. M. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), pp. 2301-2308; Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), pp. 189-203; Siriwardena, D. et al., Ophthalmology (2002) 109 (3), pp. 427-431 и т.д.).
Например, можно применять способ, основанный на фаговом дисплее, в случае которого вариабельную область антитела человека экспрессируют на поверхности фага в виде одноцепочечного антитела (scFv) и отбирают фаг, который связывается с антигеном (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), pp. 1105-1116).
В результате анализа гена фага, выбранного на основе связывания с антигеном, может быть определена последовательность ДНК, кодирующая вариабельную область антитела человека, которая связывается с антигеном.
Если определена последовательность ДНК scFv, которая связывается с антигеном, антитело человека может быть получено в результате создания вектора экспрессии, содержащего такую последовательность, и введения вектора в подходящего хозяина, чтобы его экспрессировать (WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388, Annu. Rev. Immunol. (1994) 12, pp. 433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), pp. 1105-1116).
Если вновь полученное антитело человека связывается с неполным пептидом или неполной третичной структурой, с которой связывается антитело M30, то можно сделать вывод, что антитело человека связывается с тем же самым эпитопом, что и антитело M30. Кроме того, подтверждая, что антитело человека конкурирует с антителом M30 за связывание с B7-H3 (то есть, антитело человека ингибирует связывание между антителом M30 и B7-H3), можно определить, что антитело человека связывается с тем же самым эпитопом, что и антитело M30, даже если конкретная последовательность или структура эпитопа не были определены. Когда подтверждают, что антитело человека связывается с тем же самым эпитопом, что и антитело M30, с высокой вероятностью предполагают, что антитело человека обладает цитотоксической активностью, эквивалентной активности антитела M30.
Химерные антитела, гуманизированные антитела или антитела человека, полученные описанным выше способом, оценивают в отношении свойства связывания с антигеном способом, показанным в примере 3, или тому подобным и отбирают предпочтительное антитело.
В качестве одного из примеров другого показателя, применимого для сравнения свойств антител, можно привести стабильность антител. Дифференциальная сканирующая калориметрия (DSC) является способом, позволяющим быстро и точно измерять среднюю температуру термической денатурации (Tm), используемую в качестве предпочтительного показателя относительной конформационной стабильности белков. Благодаря измерению значений Tm с использованием DSC и сравнения таких значений можно выявлять различия в термостабильности. Известно, что стабильность антител при хранении в некоторой степени коррелирует с термостабильностью антител (Lori Burton et al., Pharmaceutical Development и Technology (2007) 12, pp. 265-273), и предпочтительное антитело может быть выбрано с использованием термостабильности в качестве показателя. Примеры других показателей для отбора антител включают следующие признаки: высокий выход в подходящей клетке-хозяине и низкая способность к агрегации в водном растворе. Например, антитело, в случае которого наблюдают самый высокий выход, не всегда проявляет самую высокую термостабильность, и поэтому необходимо отбирать антитело, наиболее подходящее для введения человеку, проводя тщательную оценку на основе описанных выше показателей.
Кроме того, также известен способ, в котором полноразмерные последовательности тяжелой и легкой цепи антитела связывают с использованием подходящего линкера, получая при этом одноцепочечный иммуноглобулин (Lee, H-S et al., Molecular Immunology (1999) 36, pp. 61-71; Shirrmann, T. et al., mAbs (2010), 2, (1) pp. 1-4). При димеризации такого одноцепочечного иммуноглобулина получаемый димер может иметь структуру и активность, сходные со структурой и активностью антитела, которое является тетрамером. Кроме того, антитело согласно изобретению может представлять собой антитело, которое имеет одну вариабельную область тяжелой цепи и не имеет последовательности легкой цепи. Такое антитело называют однодоменным антителом (sdAb) или нанотелом, и в действительности, такое антитело встречается у верблюда и ламы, и как сообщалось, оно обладает аффинностью в связывании антигена (Muyldemans S. et al., Protein Eng. (1994) 7 (9), 1129-35, Hamers-Casterman C. et al., Nature (1993) 363 (6428) 446-8). Описанные выше антитела также могут быть сконструированы в виде функционального фрагмента антитела согласно изобретению.
В изобретение также включен модифицированный вариант антитела или функциональный фрагмент антитела. Модифицированный вариант относится к варианту, получаемому в том случае, когда антитело или функциональный фрагмент антитела согласно изобретению подвергают химической или биологической модификации. Примеры такого химически модифицированного варианта включают варианты, химически модифицированные связыванием химического остатка с аминокислотным остовом, варианты, химически модифицированные N-связанными или O-связанными углеводными цепями и т.д.. Примеры такого биологически модифицированного варианта включают варианты, получаемые модификацией после трансляции (такой как N-связанное или O-связанное гликозилирование, N- или C-концевой процессинг, дезаминирование, изомеризация аспарагиновой кислоты или окисление метионина), и варианты, в которых остаток метионина был добавлен к N-концу при экспрессии в прокариотической клетке-хозяине.
Кроме того, антитело, меченое таким образом, чтобы можно было выявлять и выделять антитело или антиген согласно изобретению, например, меченое ферментом антитело, меченое флуоресцирующей меткой антитело и аффинно-меченое антитело также включены в значение «модифицированный вариант». Такой модифицированный вариант антитела или функционального фрагмента антитела согласно изобретению применим для повышения стабильности и улучшения сохранения в крови исходного антитела или функционального фрагмента антитела согласно изобретению, уменьшения его антигенности, выявления или выделения такого антитела или антигена и тому подобного.
Кроме того, регулируя модификацию гликаном, который связывают с антителом согласно изобретению (гликозилирование, дефукозилирование и т.д.), можно усиливать зависимую от антител клеточную цитотоксическую активность. Способы регуляции модификации антител гликанами известны, WO 99/54342, WO 00/61739, WO 02/31140 и т.д.. Однако способ не ограничен указанным. В понятие антитела и функционального фрагмента антитела согласно изобретению также включено антитело или функциональный фрагмент антитела, в котором регулируют модификацию гликаном.
В случаях, когда антитело получают, сначала выделяя ген антитела и затем вводя ген в подходящего хозяина, можно использовать сочетание соответствующего хозяина и соответствующего вектора экспрессии. Конкретные примеры гена антитела включают сочетание гена, кодирующего последовательность тяжелой цепи антитела, и гена, кодирующего последовательность его легкой цепи, описанные в настоящей публикации. В случае трансформации клетки-хозяина можно встраивать последовательность гена тяжелой цепи и последовательность гена легкой цепи в один и тот же вектор экспрессии, а также отдельно в разные векторы экспрессии.
В случаях, когда в качестве хозяина используют эукариотические клетки, можно использовать клетки животных, клетки растений и эукариотические микроорганизмы. В качестве примеров таких клеток животных можно привести клетки млекопитающих, например, клетки обезьяны COS (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, pp. 175-182, ATCC CRL-1650), фибробласты мыши NIH3T3 (АТСС № CRL-1658) и дефицитные по дигидрофолатредуктазе линии (Urlaub, G. and Chasin, L.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220) клеток яичника китайского хомячка (клетки СНО; АТСС: CCL-61).
В случаях, когда используют прокариотические клетки, можно указать, например, Escherichia coli и Bacillus subtilis.
В результате введения гена требуемого антитела или функционального фрагмента антитела в такие клетки посредством трансформации и культивирования таких трансформированных клеток in vitro, может быть получено антитело. В описанном выше способе культивирования выход может иногда варьировать в зависимости от последовательности антитела и поэтому можно отобрать антитело, которое легко получают в виде фармацевтического средства, из антител, обладающих эквивалентной активностью связывания, используя выход в качестве показателя. Таким образом, термин «антитело и функциональный фрагмент антитела согласно изобретению» также охватывает антитело или функциональный фрагмент антитела, получаемые способом получения антитела или функционального фрагмента антитела, характеризуемым включением стадии культивирования трансформированной клетки-хозяина и стадии сбора требуемого антитела или функционального фрагмента антитела из продукта культивирования, получаемого на стадии культивирования.
К тому же известно, что остаток лизина на карбоксильном конце тяжелой цепи антитела, продуцируемого в культивируемой клетки млекопитающего, делетирован (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)), а также известно, что два аминокислотных остатка (глицин и лизин) на карбоксильном конце тяжелой цепи антитела, продуцируемого в культивируемой клетке млекопитающего делетирован, и остаток пролина, заново расположенный на карбоксильном конце, амидирован (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)). Однако, такая делеция и модификация последовательности тяжелой цепи не влияет на аффинность связывания антигена и эффекторную функцию антитела (активация комплемента, зависимая от антител клеточная цитотоксичность и т.д.). Поэтому в изобретение также включено антитело и функциональный фрагмент антитела, подвергнутые такой модификации, и в качестве примера можно привести делеционный вариант, в котором одна или две аминокислоты были делетированы на карбоксильном конце тяжелой цепи, вариант, получаемый амидированием делеционного варианта (например, тяжелая цепь, в которой остаток пролина на карбоксильном конце был амидирован) и тому подобные. Тип делеционного варианта, имеющего делецию на карбоксильном конце тяжелой цепи антитела согласно изобретению, не ограничен указанными выше вариантами, при условии, что аффинность связывания антигена и эффекторная функция сохраняются. Две тяжелых цепи, входящие в состав антитела согласно изобретению, могут быть одного типа, выбранного из группы, состоящей из полноразмерной тяжелой цепи и описанного выше делеционного варианта, или могут быть двух типов в выбранном сочетании. На соотношение количеств делеционных вариантов может влиять тип культивируемых клеток млекопитающих, которые продуцируют антитело согласно изобретению, и условия культивирования, однако в качестве примера можно привести случай, когда один аминокислотный остаток на карбоксильном конце делетирован в обеих тяжелых цепях, входящих в качестве основных компонентов в антитело согласно изобретению. Ограничения по изотипу антитела согласно изобретению не существует, и примеры антитела включают IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (IgA1, IgA2), IgD и IgE, и предпочтительные примеры антитела включают IgG и IgM, и еще более предпочтительные примеры включают IgG1 и IgG2.
Кроме того, антитело согласно изобретению может представлять собой функциональный фрагмент антитела, имеющий антигенсвязывающий участок антитела или его модифицированный фрагмент. Фрагмент антитела может быть получен при обработке антитела протеазой, такой как папаин или пепсин, или в результате модификации гена антитела способом генетической инженерии и экспрессии модифицированного гена в подходящих культивируемых клетках. Среди таких фрагментов антител фрагмент, обладающий всеми или частью функций антитела, можно назвать функциональным фрагментом антитела.
В качестве примеров функций антитела обычно можно привести активность в связывании антигена, активность в нейтрализации активности антигена, активность в усилении активности антигена, активность в антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) и активность в комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC). Функцией антитела и функционального фрагмента антитела согласно изобретению является активность связывания с B7-H3, предпочтительно, активность в антитело-зависимом клеточном фагоцитозе (ADCP), более предпочтительно, цитотоксическая активность (противоопухолевая активность), опосредованная ADCP-активностью, направленной против опухолевых клеток. Кроме того, антитело согласно изобретению может обладать ADCC-активностью и/или CDC-активностью в дополнение к ADCP-активности. В частности, сообщалось, что фармацевтический препарат, содержащий имеющееся в настоящее время потивоопухолевое антитело, непосредственно действует на опухолевые клетки, блокируя пролиферативный сигнал, непосредственно действует на опухолевые клетки, индуцируя сигнал гибели клеток, подавляет ангиогенез, индуцирует ADCC-активность, опосредованную NK-клетками, и индуцирует CDC-активность, опосредованную комплементом, тем самым подавляя рост опухолевых клеток (J. Clin. Oncol. 28: 4390-4399, (2010), Clin. Cancer Res.; 16 (1); 11-20. (2010)), однако, по меньшей мере, авторы настоящего изобретения не имеют сведений о том, что ранее сообщалось о ADCP-активности анти-B7-H3-антитела согласно изобретению, описанного в настоящей заявке, в качестве активности фармацевтического средства, содержащего доступное в настоящее время противоопухолевое антитело.
Примеры фрагмента антитела включают Fab, F(ab')2, Fv, одночепочечное Fv (scFv), в котором молекулы Fv тяжелой цепи и легкой цепи соединены соответствующим линкером, диатело (диатела), линейное антитело и полиспецифичное антитело, состоящее из фрагмента антитела. Кроме того. Fab', который представляет собой моновалентный фрагмент в вариабельной области антитела, получаемый обработкой F(ab')2 в восстанавливающих условиях, также включен в значение термина «фрагмент антитела».
Кроме того, антитело согласно изобретению может представлять собой полиспецифичное антитело со специфичностью, по меньшей мере, для двух разных типов антигенов. Обычно такое антитело связывается с двумя типами антигенов (то есть, биспецифичное антитело), однако термин «полиспецифичное антитело» в используемом в настоящем описании смысле включает антитело, обладающее специфичностью по отношению к двум или более (например, трем) типам антигенов.
Полиспецифичное антитело согласно изобретению может представлять собой полноразмерное антитело или фрагмент такого антитела (например, биспецифичное антитело F(ab')2). Биспецифичное антитело может быть получено связыванием тяжелых и легких цепей (пар HL) двух типов антител или также может быть получено слиянием гибридом, которые продуцируют разные моноклональные антитела, с получением слитых клеток, продуцирующих биспецифичные антитела (Millstein et al., Nature (1983) 305, pp. 537-539).
Антитело согласно изобретению может представлять собой одноцепочечное антитело (также называемое scFv). Одноцепочечное антитело может быть получено связыванием вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи антитела полипептидным линкером (Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113 (под редакцией Rosenberg и Moore), Springer Verlag, New York, pp. 269-315 (1994), Nature Biotechnology (2005), 23, pp. 1126-1136). Кроме того, фрагмент BiscFv, получаемый связыванием двух молекул scFv полипептидным линкером, также можно использовать в качестве биспецифичного антитела.
Способ получения одноцепочечного антитела известен в данной области (см., например, патенты США № 4946778, 5260203, 5091513, 5455030 и т.д..). В таком scFv вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи соединены линкером, который не образует конъюгата, предпочтительно, полипептидным линкером (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988), 85, pp. 5879-5883). В scFv вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи могут быть получены из одного и того же антитела или разных антител.
В качестве полипептидного линкера, используемого для связывания вариабельных областей, используют, например, одноцепочечный пептид, состоящий из 12-19 остатков.
ДНК, кодирующая scFv, может быть получена в результате осуществления амплификации посредством ПЦР с использованием в качестве матрицы ДНК, которая содержит всю или требуемую часть ДНК, выбранной из ДНК, кодирующей тяжелую цепь или вариабельную область тяжелой цепи описанного выше антитела, и ДНК, кодирующей легкую цепь или вариабельную область легкой цепи такого антитела, и также с использованием пары праймеров, которые определяют оба конца ДНК-матрицы, и, кроме того, в результате осуществления амплификации, при которой объединяют ДНК, кодирующую часть, представленную полипептидным линкером, и пару праймеров, которые определяют оба конца полипептида, так чтобы связать оба его конца с каждой тяжелой цепью и легкой цепью.
Кроме того, после получения ДНК, кодирующей scFv, может быть получен вектор экспрессии, содержащей такую ДНК, и может быть получен хозяин, трансформированный вектором экспрессии, согласно обычному способу. Кроме того, используя полученного хозяина, можно получить scFv согласно обычному способу. Фрагмент антитела может быть получен в хозяине благодаря получению гена и экспрессии гена таким образом, как описано выше.
Антитело согласно изобретению можно подвергнуть мультимеризации для повышения его аффинности по отношению к антигену. Антитела, которые необходимо подвергнуть мультимеризации, могут представлять собой один тип антитела или множество антител, которые распознают множество эпитопов одного и того же антигена. В качестве примера способа мультимеризации антитела можно привести связывание домена CH3 IgG с двумя молекулами scFv, связывание со стрептавидином, введение мотива спираль-поворот-спираль и тому подобное.
Антитело согласно изобретению может представлять собой поликлональное антитело, которое представляет собой смесь множества типов анти-B7-H3-антител, имеющих разные аминокислотные последовательности. В качестве одного из примеров можно привести поликлональное антитело, смесь множества типов антител, имеющих разные CDR. В качестве такого поликлонального антитела можно использовать антитела, получаемые при культивировании смеси клеток, которые продуцируют разные антитела с последующей очисткой антител из полученной культуры (см. WO 2004/061104).
В качестве модифицированного антитела также можно использовать антитело, связанное с молекулами любого типа, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ).
111
99m
111
90
131
Кроме того, антитело согласно изобретению может быть в форме конъюгата, образованного между любым из таких антител и другим лекарственным средством (иммуноконъюгат). Примеры такого антитела включают конъюгат, в котором антитело конъюгировано с радиоактивным веществом или соединением, оказывающим фармакологическое действие (Nature Biotechnology (2005) 23, pp. 1137-1146). Примеры таких веществ включают индий (In)-капромаб пендетид, технеций (Tc)-нофетумомаб мерпентан, индий (In)-ибритумомаб, иттрий (Y)-ибритумомаб и йод (I)-тозитумомаб.
Полученное антитело может быть очищено до гомогенности. Отделение и очистка антитела может быть осуществлена с использованием обычного способа разделения и очистки белков. Например, антитело может быть отделено и очищено посредством соответствующего выбора и сочетания следующих способов: хроматографии на колонке, фильтрации через фильтры, ультрафильтрации, преципитации солями, диализа, препаративного электрофореза в полиакриламидном геле, электрофореза с изоэлектрофокусировкой и тому подобных (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), но способ не ограничен указанным.
Примеры таких способов хроматографии включают аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, хроматографию на основе гель-фильтрации, обращенно-фазовую хроматографию и адсорбционную хроматографию.
Такую хроматографию можно осуществлять с использованием жидкостной хроматографии, такой как ВЭЖХ или ЖЭХБ.
В качестве примера колонки, используемой для аффинной хроматографии, можно привести колонку с белком A и колонку с белком G. Например, в качестве примера колонки, в которой используют белок A, можно привести Hyper D, POROS, Sepharose FF (Pharmacia) и тому подобные.
Кроме того, используя носитель, на котором иммобилизован антиген, также можно очистить антитело благодаря свойству антитела связываться с антигеном.
3. Фармацевтическое средство, содержащее анти-B7-H3-антитело
Антитела, получаемые способом, описанным выше в разделе «2. Получение анти-B7-H3-антитела», проявляют цитотоксическую активность, направленную против злокачественных клеток, и поэтому могут быть применены в качестве фармацевтического средства, в частности, терапевтического средства и/или профилактического средства для злокачественного новообразования.
Цитотоксическую активность, проявляемую антителом in vitro, можно определить, измеряя активность ингибирования клеточного роста.
Например, культивируют линию злокачественных клеток, которые сверхэкспрессируют B7-H3, в систему культивирования добавляют антитело в разных концентрациях и измеряют ингибирующую активность, направленную против образования бляшек, образования колоний и роста сфероидов.
Терапевтическое действие антитела на злокачественное новообразование in vivo можно определить с использованием экспериментальных животных, например, вводя антитело мышам nude, которым имплантировали линию опухолевых клеток, которая сверхэкспрессирует B7-H3, и измеряя изменение злокачественных клеток.
Примеры типов злокачественных новооразований включают рак легкого, рак почек, уротелиальную карциному, рак прямой и ободочной кишки, рак простаты, мультиформную глиобластому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, меланому, рак печени, рак мочевого пузыря, рак желудка и рак пищевода, однако, тип злокачественного новообразования не ограничен указанным, при условии, что злокачественная клетка, подвергаемая лечению, экспрессирует B7-H3.
Подходящее вещество, используемое для получения фармацевтической композиции согласно изобретению, предпочтительно, является нетоксичным для индивидуума, которому необходимо ввести фармацевтическую композицию, в соответствующей дозе и концентрации.
Фармацевтическая композиция согласно изобретению может содержать вещество для фармацевтического применения, которое способно изменять или поддерживать ее pH, осмотическое давление, вязкость, прозрачность, окраску, изотоничность, асептические условия, стабильность, растворимость, скорость высвобождения, скорость всасывания и проницаемость. Примеры таких веществ для фармацевтического применения включают без ограничения аминокислоты, такие как глицин, аланин, глутамин, аспарагин, аргинин и лизин; противомикробные средства; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, сульфат натрия и гидросульфит натрия; буферы такие как фосфатный, цитратный, боратный буферы, гидрокарбонат натрия и растворы трис-HCl; наполнители, такие как маннит и глицин; хелатирующие средства, такие как этилендиаминтетраацетат (EDTA); комплексообразующие средства, такие как кофеин, поливинилпирролидон, β-циклодекстрин и гидроксипропил-β-циклодекстрин; расширяющие вещества, такие как глюкоза, манноза и декстрин; другие углеводы, такие как моносахариды и дисахариды; красители; корригенты; разбавители; эмульгаторы; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; консерванты, такие как низкомолекулярные полипептиды, солеобразующие противоионы, хлорид бензалкония, бензойная кислота, салициловая кислота, тимеросал, фенетиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота и пероксид водорода; растворители, такие как глицерин, пропиленгликоль и полиэтиленгликоль; сахарные спирты, такие как маннит и сорбит; суспендирующие средства; поверхностно-активные вещества, такие как сложный эфир сорбитана, полисорбаты, включая полисорбат 20 и полисорбат 80, тритон, трометамин, лецитин и холестерин; средства для повышения стабильности, такие как сахароза и сорбит; средства для повышения эластичности, такие как хлорид натрия, хлорид калия и маннит и сорбит; транспортные средства; эксципиенты; и/или фармацевтические адъюванты. Количество таких поверхностно-активных веществ для фармацевтического применения предпочтительно, является от 0,001 до 100-кратного, предпочтительно, от 0,1 до 10-кратного относительно массы анти-B7-H3-антитела. Специалисты в данной области могут соответствующим образом определить предпочтительный способ приготовления фармацевтической композиции в виде препарата в зависимости от заболевания, в случае которого применяют композицию, используемого пути введения или тому подобного.
Эксципиент или носитель в фармацевтической композиции может быть в форме жидкости или твердого вещества. Подходящим эксципиентом или носителем может быть инъекционная вода, физиологический раствор соли, искусственная спинномозговая жидкость или другое вещество, обычно используемое для парентерального введения. Кроме того, нейтральный физиологический раствор соли или физиологический раствор соли, содержащий сывороточный альбумин, также можно использовать в качестве носителя. Фармацевтическая композиция может содержать трис-буфер с pH 7,0-8,5, ацетатный буфер с pH 4,0-5,5 или цитратный буфер с pH 3,0-6,2. Кроме того, в такой буфер может быть добавлен сорбит или другое соединение.
Примеры фармацевтической композиции согласно изобретению включают фармацевтическую композицию, содержащую анти-B7-H3-антитело, и фармацевтическую композицию, содержащую анти-B7-H3-антитело и по меньшей мере одно терапевтическое средство для лечения злокачественного новообразования. Фармацевтическую композицию согласно изобретению получают в форме лиофилизированного продукта или жидкости в качестве лекарственного средства, имеющего выбранный состав и требуемую чистоту. Фармацевтическая композиция, содержащая анти-B7-H3-антитело, и фармацевтическая композиция, содержащая анти-B7-H3-антитело и, по меньшей мере, одно терапевтическое средство для лечения злокачественного новообразования, также могут быть получены в виде лиофилизированного продукта с использованием подходящего эксципиента, такого как сахароза.
В описанной выше фармацевтической композиции терапевтическое средство для лечения злокачественного новообразования, вводимое вместе с анти-B7-H3-антителом, может быть введено одновременно, отдельно или последовательно с анти-B7-H3-антителом, или терапевтическое средство и анти-B7-H3-антитело могут быть введены с разными интервалами между введениями доз. Примеры такого терапевтического средства для лечения злокачественного новообразования включают абраксан, карбоплатин, цисплатин, гемцитабин, иринотекан (CPT-11), паклитаксел, пеметрексед, сорафениб, винбластин и лекарственные средства, описанные в WO 2003/038043, и дополнительные примеры такого терапевтического средства включают аналоги LH-RH (такие как лейпрорелин и госерелин), фосфат эстрамустина, антагонисты эстрогенов (такие как тамоксифен и ралоксифен) и ингибиторы ароматазы (такие как анастрозол, летрозол и эксеместан), однако средство не ограничено указанным, при условии, что средство является лекарственным средством, обладающим противоопухолевой активностью.
Индивидуум, которому вводят фармацевтическую композицию, особым образом не ограничен, однако предпочтительными являются млекопитающие и более предпочтительным является человек.
Фармацевтическая композиция согласно изобретению может быть получена для парентерального введения или для всасывания в желудочно-кишечном тракте после перорального введения. Состав и концентрация препарата может быть определена в зависимости от способа введения. Чем выше аффинность анти-В7-Н3-антитела, входящего в состав фармацевтической композиции согласно изобретению, по отношению к В7-Н3, то есть, чем ниже константа диссоциации (значение Kd) его комплекса с В7-Н3, тем большую лекарственную эффективность может проявлять анти-В7-Н3-антитело человека, даже при снижении дозы. Поэтому доза фармацевтической композиции согласно изобретению для человека также может быть определена на основе полученного результата. Что касается дозы, то в случае, когда анти-В7-Н3-антитело человека вводят человеку, антитело можно вводить в дозе примерно от 0,001 до 100 мг/кг один или несколько раз с интервалами от 1 до 180 дней. Примеры формы дозирования фармацевтической композиции согласно изобретению включают инъекции, включая инфузии, суппозитории, трансназальные средства, подъязычные средства и всасываемые через кожу средства.
Далее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры, однако изобретение не ограничено указанными примерами.
ПРИМЕРЫ
Следует отметить, что соответствующие операции по обработке генов, описанные в следующих примерах, осуществляют согласно способам, описанным в работе «Molecular Cloning» (написанной Sambrook, J., Fritsch, E.F. и Maniatis, Т., опубликованной Cold Spring Harbor Laboratory Press, в 1989 году), или в случае использования коммерчески доступных реагентов или наборов, их применяли согласно прилагаемым к ним инструкциям, если не указано иное.
Пример 1. Получение плазмиды
1)-1 Получение вектора, экспрессирующего В7-Н3 человека
1)-1-1 Получение вектор экспрессии для варианта 1 полноразмерного В7-Н3 человека
Реакцию ПЦР осуществляли, используя кДНК, синтезированную с общей РНК клеток LNCaP (Американская коллекция типов культур (АТСС)), в качестве матрицы, а также используя указанный ниже набор праймеров, таким образом амплифицируя кДНК, кодирующую вариант 1 В7-Н3 человека:
Праймер 1:
5'-ctatagggagacccaagctggctagcatgctgcgtcggcggggcag-3' (SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей); и
Праймер 2:
5'-aacgggccctctagactcgagcggccgctcaggctatttcttgtccatcatcttctttgctgtcag-3' (SEQ ID NO: 2 в списке последовательностей).
Затем полученный таким образом продукт ПЦР очищали, используя MagExtractor PCR & Gel cleanup (TOYOBO, Co., Ltd.). Затем продукт ПЦО расщепляли ферментами рестрикции (NheI и NotI) с последующей очисткой с использованием MagExtractor PCR & Gel cleanup (TOYOBO, Co., Ltd.). ДНК плазмиды pcDNA3.1(+) расщепляли такими же ферментами рестрикции (NheI и NotI) с последующей очисткой с использованием MagExtractor PCR & Gel cleanup (TOYOBO, Co., Ltd.).
Полученные в результате растворы очищенной ДНК перемешивали и затем к ним добавляли Ligation high (TOYOBO, Co., Ltd.) и полученную смесь инкубировали при 16°C в течение 8 часов, чтобы осуществить лигирование. Полученную реакционную смесь добавляли к компетентным клеткам E. coli DH5α (Invitrogen Corporation), чтобы осуществить трансформацию.
Прямую ПЦР на колониях осуществляли на полученных колониях, используя ПЦР-праймеры и обратный праймер BGH и отбирали клон для исследования.
Полученный выбранный для исследования клон культивировали в жидкой среде (LB/Amp), и плазмидную ДНК экстрагировали, используя MagExtractor-Plasmid-(TOYOBO, Co., Ltd.).
Используя полученную плазмидную ДНК в качестве матрицы, определяли последовательность между указанными ниже праймером 3 и праймером 4, используя анализ последовательности, и сравнивали последовательности между полученным клоном и установленной кодирующей последовательностью:
Праймер 3 (праймер промотора CMV):
5'-cgcaaatgggcggtaggcgtg-3' (SEQ ID NO: 3 в списке последовательностей); и
Праймер 4 (обратный праймер BGH):
5'-tagaaggcacagtcgagg-3' (SEQ ID NO: 4 в списке последовательностей).
После подтверждения последовательности полученный клон культивировали в 200 мл среды LB/Amp и плазмидную ДНК экстрагировали, используя набор для плазмид Plasmid Midi V-100 (VioGene, Inc.).
Полученный таким образом вектор был назван «pcDNA3.1-B7-H3». Последовательность области ORF гена варианта 1 B7-H3, клонированного в таком векторе, представлена нуклеотидами с номерами 1-1602 в последовательности SEQ ID NO: 5 в списке последовательностей. Кроме того, аминокислотная последовательность варианта 1 B7-H3 представлена в SEQ ID NO: 6 в списке последовательностей.
1)-1-2 Получение вектора экспрессии для полноразмерного варианта 2 B7-H3 человека
ПЦР осуществляли, используя кДНК, синтезированную с суммарной РНК клеток LNCaP, в качестве матрицы, а также используя указанный ниже набор праймеров, таким образом амплифицируя кДНК, кодирующую вариант 2 B7-H3 человека:
Праймер 5
5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcaccatgctgcgtcggcggggcagccctg-3' (SEQ ID NO: 7 в списке последовательностей)
Праймер 6
5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcggctatttcttgt-3' (SEQ ID NO: 8 в списке последовательностей).
Очистку осуществляли таким же образом, как описано в примере 1)-1-1, и ПЦР-продукт после очистки интегрировали в вектор pDONR221 (Invitrogen Corporation), используя реакцию Gateway BP, трансформируя при этом клетки E. coli TOP10 (Invitrogen Corporation).
Для клонов, полученных после трансформации размер вставки подтверждали, используя ПЦР, выполняемую на колониях. Для 8 клонов, размер вставки в которых был подтвержден, подтверждали последовательность ДНК на 3'-конце и 5'-конце вставки, осуществляя одну реакцию секвенирования в направлении от векторного участка в сторону вставки для обоих концов. Осуществляли реакцию Gateway LR между исходным клоном, последовательность которого была подтверждена, и целевым вектором для Gateway pcDNA-DEST40 (Invitrogen Corporation). В случае клона, полученного после трансформации E. coli TOP10, размер вставки подтверждали, используя ПЦР на колониях. В случае клона, в котором размер вставки подтвержден, последовательность ДНК на 3'-конце и 5'-конце вставки анализировали, чтобы подтвердить, что представляющая интерес вставка правильно встроена. По меньшей мере 1 мг полученной таким образом плазмиды клона очищали, используя набор PureLink HiPure Plasmid Megaprep (Invitrogen Corporation).
Полученный таким образом вектор был назван «pcDNA-DEST40-B7-H3 вариант 2». Последовательность области ORF гена варианта 2 B7-H3, клонированного в таком векторе, представлена нуклеотидами с номерами 1-948 в последовательности SEQ ID NO: 9 в списке последовательностей. Кроме того, аминокислотная последовательность варианта 2 B7-H3 представлена в SEQ ID NO: 10 в списке последовательностей.
1)-2 Получение вектора экспрессии для неполного белка B7-H3
Используя полноразмерную плазмиду B7-H3, относящуюся к варианту 1 B7-H3 из примера 1)-1-1, в качестве матрицы, амплифицировали каждую из указанных ниже областей в ПЦР. Номера, указывающие каждую из представляющих интерес областей, соответствуют номерам нуклеотидов B7-H3, представленных в SEQ ID NO: 5. Праймер конструировали так, чтобы он содержал стоп-кодон на 3'-конце в дополнение к последовательности Gateway att.
Каждую из указанных ниже областей 1), 2) и 3) получали амплификацией двух областей с последующим лигированием областей в ПЦР с образованием одного фрагмента. То есть, что касается области 1), то амплификацию осуществляли, используя праймеры 7 и 12, и праймеры 15 и 11, и полученные продукты ПЦР затем амплифицировали, используя праймеры 7 и 11. Что касается области 2), то амплификацию осуществляли, используя праймеры 8 и 13, и праймеры 15 и 11, и полученные в результате продукты ПЦР амплифицировали, используя праймеры 8 и 11. Что касается области 3), то амплификацию осуществляли, используя праймеры 9 и 14, и праймеры 15 и 11, и полученные в результате продукты ПЦР затем амплифицировали, используя праймеры 9 и 11. Что касается области 4), то амплификацию осуществляли, используя праймеры 10 и 11. Что касается области 5), то амплификацию осуществляли, используя праймеры 8 и 11. Что касается области 6), то амплификацию осуществляли, используя праймеры 9 и 11.
Представляющие интерес области:
1) ORF варианта 1 B7-H3: 79-417 и 1369-1602 (573 п.н.);
2) ORF варианта 1 B7-H3: 418-732 и 1369-1602 (549 п.н.);
3) ORF варианта 1 B7-H3: 733-1071 и 1369-1602 (573 п.н.);
4) ORF варианта 1 B7-H3: 1072-1602 (531 п.н.);
5) ORF варианта 1 B7-H3: 418-1602 (1185 п.н.);
6) ORF варианта 1 B7-H3: 733-1602 (870 п.н.).
Номера и последовательности нуклеотидов праймеров
Праймер 7
5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcggagccctggaggtccaggtc-3' (SEQ ID NO: 11 в списке последовательностей)
Праймер 8
5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcgctccctactcgaagcccagcatg-3' (SEQ ID NO: 12 в списке последовательностей)
Праймер 9
5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcggagccgtggaggtccaggtc-3' (SEQ ID NO: 13 в списке последовательностей)
Праймер 10
5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcgctccctactcgaagcccagcatg-3' (SEQ ID NO: 14 в списке последовательностей)
Праймер 11
5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctcaggctatttcttgtccatcatc-3' (SEQ ID NO: 15 в списке последовательностей)
Праймер 12
5'-gggaatgtcataggctgcccggccacctgcaggctgacggcag-3' (SEQ ID NO: 16 в списке последовательностей)
Праймер 13
5'-gggaatgtcataggctgccctgtggggcttctctggggtgtg-3' (SEQ ID NO: 17 в списке последовательностей)
Праймер 14
5'-gggaatgtcataggctgcccggccacctgcaggctgacggcag-3' (SEQ ID NO: 18 в списке последовательностей)
Праймер 15
5'-gggcagcctatgacattccccccagag-3' (SEQ ID NO: 19 в списке последовательностей)
Очистку осуществляли таким же образом, как в примере 1)-1-1, и каждый из амплифицированных продуктов после очистки интегрировали в вектор pDONR221, используя реакцию Gateway BP, трансформируя при этом клетки E. coli TOP10 (Invitrogen Corporation). Для клонов, полученных после трансформации, размер вставки подтверждали, используя ПЦР, выполняемую на колониях.
Для каждого из клонов, размер вставки в которых был подтвержден, подтверждали последовательность ДНК на 3'-конце и 5'-конце вставки, осуществляя одну реакцию секвенирования в направлении от векторного участка в сторону вставки для обоих концов.
Для клонов, которые, как было подтверждено, имеют представляющую интерес вставку, также подтверждали общую последовательность ДНК вставки, используя указанные ниже праймеры. В результате последовательности анализа было подтверждено, что все последовательности имели информацию, полностью идентичную информации представляющих интерес последовательностей.
Осуществляли реакцию Gateway LR между каждым из исходных клонов, последовательность которых была подтверждена, и pFLAG-myc-CMV-19-DEST (Invitrogen Corporation). Для клонов, полученных после трансформации E. coli DH10B (Invitrogen Corporation) размер вставки подтверждали, используя ПЦР на колониях.
В случае каждого из клонов, в котором размер вставки был подтвержден, анализировали последовательность ДНК на 3'-конце и 5'-конце вставки, чтобы подтвердить, что представляющая интерес вставка правильно встроена. Далее векторы экспрессии, полученные в результате интеграции каждой из описанных выше областей 1)-6), обозначены «IgV1 B7-H3», «IgC1 B7-H3», «IgV2 B7-H3», «IgC2 B7-H3», «IgC1-V2-C2 B7-H3» и «IgV2-C2 B7-H3», соответственно.
Нуклеотидные последовательности областей ORF генов IgV1 B7-H3, IgC1 B7-H3, IgV2 B7-H3, IgC2 B7-H3, IgC1-V2-C2 B7-H3 и IgV2-C2 B7-H3, каждый из которых был клонирован в таком векторе, представлены в виде последовательностей SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28 и 30, соответственно, в списке последовательностей. Кроме того, аминокислотные последовательности IgV1 B7-H3, IgC1 B7-H3, IgV2 B7-H3, IgC2 B7-H3, IgC1-V2-C2 B7-H3 и IgV2-C2 B7-H3 представлены в виде последовательностей SEQ ID NO: 21, 23, 25, 27, 29 и 31, соответственно, в списке последовательностей. Кроме того, последовательности SEQ ID NO: 20 и 21, показаны на фиг. 15, последовательности SEQ ID NO: 22 и 23, показаны на фиг. 16, последовательности SEQ ID NO: 24 и 25, показаны на фиг. 17, последовательности SEQ ID NO: 26 и 27, показаны на фиг. 18, последовательности SEQ ID NO: 28 и 29, показаны на фиг. 19, и последовательности SEQ ID NO: 30 и 31, показаны на фиг. 20.
1)-3 Получение векторов экспрессии для генов семейства B7.
Все векторы pCMV6-XL-4-B7RP-1, pCMV6-XL-4-B7-H1 и pCMV6-XL-4-B7-DC (которые являются экспрессирующими гены векторами, полученными в результате интеграции каждого из генов B7RP-1, B7-H1 и B7-DC (которые являются генами семейства B7) в вектор экспрессии pCMV6-XL-4) приобретали из OriGene, Inc.
Векторы, экспрессирующие каждый из генов CD80, CD86 и B7-H4, которые являются генами семейства B7, получали следующим образом.
pENTR/221-CD80, pENTR/221-CD86 и pENTR/221-B7-H4, которые являются клонами, полученными в результате интеграции каждого из CD80, CD86 и B7-H4 в исходный вектор pENTR/221, приобретали из Invitrogen Corporation.
Осуществляли реакцию Gateway LR между каждым из исходных клонов, последовательность которых была подтверждена, и pcDNA3.1-DEST (Invitrogen Corporation). В случае клонов, полученных после трансформации E. coli DH10B, размер вставки подтверждали, используя ПЦР на колониях. Для каждого из клонов, размер вставки в которых был подтвержден, анализировали последовательность ДНК на 3'-конце и 5'-конце вставки, чтобы подтвердить, что вставка была встроена правильно.
Нуклеотидные последовательности областей ORF генов B7RP-1, B7-H1, B7-DC, CD80, CD86 и B7-H4, каждый из которых был клонирован в таком векторе, представлены в виде последовательностей SEQ ID NO: 32, 34, 36, 38, 40 и 42, соответственно, в списке последовательностей. Кроме того, аминокислотные последовательности B7RP-1, B7-H1, B7-DC, CD80, CD86 и B7-H4 представлены в виде последовательностей SEQ ID NO: 33, 35, 37, 39, 41 и 43, соответственно, в списке последовательностей.
Пример 2
Получение моноклонального антитела и скрининг антитела
2)-1 Иммунизация
6
6
Использовали мышей BALB/cAnNCrlCrlj (Charles River Laboratories Japan, Inc.), мышей FcgRII KO (Taconic, Inc., IBL Co., Ltd.) или мышей GANP (Transgenic, Inc.) 4-6-недельного возраста. В 0, 7, 15 и 24 день клетки LNCaP, клетки MCF7 (ATCC) или клетки AsPC1 (ATCC), открепленные версеном (Invitrogen Corporation), вводили подкожно в область спины каждой мыши в дозе 5×10 клеток/мышь. На 31 день такие же клетки вводили внутривенно каждой мыши в дозе 5×10 клеток. На 34 день селезенки вырезали из каждой мыши и использовали для получения гибридом.
2)-2 Получение гибридом
Клетки селезенки и клетки миеломы мышей P3X63Ag8U.1 (ATCC) подвергали слиянию клеток с использованием ПЭГ 4000 (производства IBL Co., Ltd.), получая при этом гибридомы.
В результате получали 9639 клонов от вышей, иммунизированных клетками LNCaP, 4043 клонов от мышей, иммунизированных клетками MCF7, и 3617 клонов от мышей, иммунизированных клетками AsPC1, в виде гибридом. Используя полученные надосадки культуры каждой гибридомы, проводили скрининг продуцирующих антитела гибридом в CDC-анализе.
2)-3 Скрининг антител с использованием анализа CDC
В 0 день клетки LNCaP или клетки MCF7 разбавляли до получения 5000 клеток в 80 мкл и полученный раствор добавляли в 96-луночный планшет по 80 мкл/лунку. Затем клетки культивировали в течение ночи. Надосадок культуры гибридомы добавляли по 20 мкл/лунку в планшет, в который высевали клетки, и планшет оставляли стоять при 4°C в течение 1 часа. К разбавленному и лиофилизированному комплементу кролика (Cedarlane Laboratories) добавляли по 1 мл стерильной воды на каждый флакон на льду и флакон оставляли стоять в течение 1 минуты с последующим перемешиванием и затем полученную в результате смесь смешивали с 19 мл среды 0,1% БСА/RPMI 1640 (БСА, Sigma Co., Ltd.). Реакции давали возможность протекать при 37°C в течение 1 часа.
Планшет оставляли при комнатной температуре на 30 минут, чтобы его температура вернулась к комнатной температуре. В каждую лунку добавляли 120 мкл реагента CellTiter-Glo (Promega Corporation) и реакции давали возможность протекать при комнатной температуре в течение 10 минут. Количество люминесценции измеряли, используя считывающее устройство для планшетов (ARVO HTS, PerkinElmer, Inc.). Считали, что в лунке, которой наблюдали низкую люминесценцию, была индуцирована зависимая от комплемента гибель клеток. Отбирали гибридому, от которой получали культуральный надосадок, который индуцировал такую комплемент-зависимую гибель клеток.
В результате скрининга в качестве позитивных клонов получили 24 клона из клонов, полученных в случае иммунизации LNCaP, 36 клонов из клонов, полученных в случае иммунизации MCF7, и 3 клона из клонов, полученных в случае иммунизации AsPC1.
Пример 3. Идентификация антигена
3)-1. Идентификация иммунопреципитируемого вещества
3)-1-1. Иммунопреципитация
8
Культивировали по 5-10×10клеток MCF7. Такие клетки открепляли, используя скребок для клеток, и открепленные клетки собирали подвергали криоконсервации при -80°C. К криоконсервированным клеткам добавляли 10 мл лизирующего буфера, который содержал 1% NP-40 (Sigma-Aldrich Co., Ltd.) и ингибитор протеаз (F. Hoffmann-La Roche, Ltd.), охлажденные до 4°C, и осадок клеток лизировали на льду, используя пипетку таким образом, чтобы избежать образования пузырьков. После полного лизиса осадок оставляли на льду на 30 минут. Солюбилизированный образец центрифугировали при 4°C в течение 20 минут при 10000-15000 об./мин и полученный надосадок переносили в пробирку Falcon объемом 15 мл.
500 мкл шариков с белком G-сефарозой 4FF (Amersham Pharmacia Biotech Co., Ltd.) три раза промывали и подвергали процедуре замене буфера на лизирующий буфер. 500 мкл шариков с белком G-сефарозой 4FF добавляли к солюбилизированному надосадку образца на льду и полученную смесь подвергали ротационному перемешиванию в течение ночи при 4°C.
Образец пропускали через хроматографические колонки Poly-Prep (Bio-Rad Laboratories, Inc.), и проходящую фракцию использовали в качестве образца для иммунопреципитации.
3 мкг раствора антитела, используемого для иммунопреципитации, добавляли к 50 мкл шариков с белком G-сефарозой 4FF, подвергнутых процедуре замены буфера на фосфатно-солевой буфер (PBS) (пробирка объемом 1,5 мл), и полученную в результате смесь подвергали ротационному перемешиванию при 4°C в течение 1-16 часов, при этом антитело связывалось с шариками. К образцу для иммунопреципитации добавляли шарики, с которыми было связано антитело, и полученную в результате смесь подвергали ротационному перемешиванию при 4°C в течение 3 часов.
Колонку переносили в пустую пробирку Falcon объемом 15 мл и добавляли 6,5 мл лизирующего буфера. Такую процедуру повторяли 4 раза.
Выход с колонки закрывали крышкой и осуществляли пипетирование, используя 500 мкл лизирующего буфера, и шарики собирали в пробирке объемом 1,5 мл. Такую процедуру повторяли два раза.
После центрифугирования при 4°C в течение 1 минуты при 5000 об./мин надосадок осторожно удаляли. Затем добавляли 90 мкл элюирующего буфера (10 мМ глицин-HCl, pH 2,0) с последующим встряхиванием и центрифугированием. Колонку центрифужной колонки объемом 1,5 мл снимали и добавляли 10 мкл 1 М трис-HCl (pH 8,5) и колонку возвращали на исходное место. На нее переносили элюированную фракцию и осуществляли центрифугирование при 10000 об./мин в течение 1 минуты, при этом получая 100 мкл образца.
Полученный образец подвергали МС-анализу, используя методику расщепления в жидкой фазе, как показано в следующем разделе 3)-1-2.
3)-1-2 Идентификация антигена с использованием масс-спектрометрического анализа
Согласно общему способу фракцию, полученную способом иммунопреципитации, подвергали реакции расщепления при 37°C в течение 16 часов, добавляя трипсин (модифицированный трипсин, Promega Corporation), используя методику расщепления в жидкой фазе. Полученные расщепленные пептиды подвергали жидкостной хроматографии (ЖХ)/тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) (Thermo Fisher Scientific K.K.). Полученные масс-спектрометрические данные анализировали, используя компьютерную программу для поиска в базе данных (Mascot, Matrix Science K.K.). В качестве базы данных использовали International Protein Index (IPI). В результате идентифицировали 34 типа антигенов.
Исходя из характеристик идентифицированных антигенов было осуществлено извлечение библиографической информации, на основании которой В7-Н3 является белком клеточной мембраны, и фокусируя внимание на антигене В7-Н3 (CD276) (вариант 1 В7-Н3), осуществляли эксперименты, описанные в следующих разделах 3)-2 и 3)-3.
3)-2. Получение клеток, экспрессирующих ген антигена
4
2
2
Клетки NIH-3T3 (АТСС) высевали по 5×10 клеток/см в покрытый коллагеном типа I флакон (производства IWAKI Co., Ltd.) и культивировали в течение ночи в среде DMEM (Invitrogen Corporation), содержащей 10% фетальную сыворотку теленка (FBS), в условиях 37°C и 5% CO.
На следующий день клетки NIH-3T3 трансфицировали каждым из векторов: pcDNA3.1-В7-Н3, полученным, как описано в примере
2
Пример 1)-1-1, pcDNA-DEST40-B7-H3 варианта 2, полученным, как описано в 1)-1-2, и pcDNA-DEST40, который является пустым вектором, с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen Corporation), и дополнительно культивировали в течение ночи в условиях 37°C и 5% CO.
На следующий день трансфицированные клетки NIH-3T3 обрабатывали трипсином и промывали DMEM, содержащей 10% FBS, и затем суспендировали в PBS, содержащем 5% FBS. Полученную таким образом суспензию клеток использовали в анализе, основанном на проточной цитометрии.
3)-3. Проточно-цитометрический анализ
Специфичность связывания B7-H3 антителом, продуцированным гибридомой, которое иммунопреципитировало вариант 1 B7-H3, идентифицированный с использованием МС, подтверждали способом проточной цитометрии. Суспензию клеток, полученную, как описано в примере 3)-2, центрифугировали и извлекали надосадок. Затем надосадок культуры гибридомы добавляли к клеткам NIH-3T3, трансфицированным каждым вектором, суспендировали клетки и оставляли клетки стоять при 4°C на 1 час.
После двух промывок клеток с использованием PBS-буфера, содержащего 5% FBS, к суспендированным клеткам добавляли конъюгированную с флуоресцеином фракцию IgG козы к IgG мыши (полная молекула) (производства ICN Pharmaceuticals, Inc., №55493), разбавленную в 1000 раз в PBS, содержащем 5% FBS, и клетки оставляли стоять при 4°C на 1 час.
После двух промывок клеток с использованием PBS-буфера, содержащего 5% FBS, клетки ресуспендировали в PBS, содержащем 5% FBS с добавлением 2 мкг/мл 7-аминоактиномицина D (производства Invitrogen Corporation (Molecular Probes)), и регистрацию осуществляли, используя проточный цитометр (FC500, Beckman Coulter, Inc.). Данные анализировали, используя Flowjo (Tree Star, Inc.).
7-Аминоактиномицин D-позитивные мертвые клетки исключали, используя окно пропускания. Затем получали гистограммы интенсивности флуоресценции ФИТЦ для живых клеток.
Гибридому, которая продуцировала образец, который давал более высокую интенсивность флуоресценции на гистограммах интенсивности флуоресценции клеток NIH-3T3, экспрессирующих вариант 1 B7-H3, и клеток NIH-3T3, экспрессирующих вариант 2 B7-H3, чем на гистограммах интенсивности флуоресценции клеток NIH-3T3, трансфицированных пустым вектором, служащим в качестве контроля, выбирали в качестве гибридомы, продуцирующей анти-B7-H3-антитело.
В результате было обнаружено, что антитела, получаемые из продуцирующих анти-B7-H3-антитела гибридом 5 клонов (L7, L8, L11, M30 и M31), обладают перекрестной реактивностью по отношению к варианту 1 B7-H3 и варианту 2 B7-H3.
3)-4. Подтверждение свойства связывания моноклонального антитела с линией злокачественных клеток
Проводили исследование того, связываются ли моноклональные антитела, которые, как было подтверждено, связываются с вариантом 1 B7-H3 и вариантом 2 B7-H3, описанными в примере 3)-3, со злокачественными клетками, которые сверхэкспрессируют вариант 1 B7-H3 и вариант 2 B7-H3, используя способ, основанный на проточной цитометрии, таким же образом, как описано в примере 3)-3.
Вместо трансфицированных клеток NIH-3T3 использовали линию злокачественных клеток молочной железы человека (MDA-MB-231) (ATCC) и линию злокачественных клеток легкого человека (NCI-H322) (ATCC). В результате было подтверждено, что все полученные моноклональные антитела связываются с такими линиями злокачественных клеток.
3)-5. Определение изотипа моноклонального антитела
Изотипы моноклональных антител определяли, используя набор для изотипирования моноклональных антител мыши (производства Serotec Co., Ltd.). В результате все антитела, полученные из гибридом, продуцирующих анти-B7-H3-антитела (L7, L8, L11, M30 и M31), имели изотип IgG2a.
3)-6. Получение моноклонального антитела
Моноклональное антитело очищали из асцитов мыши, которой имплантировали гибридому или надосадок культуры гибридомы (далее называемых «исходным материалом для очистки антител»).
7
Асциты мышей получали следующим образом. Сначала мышей BALB/cAJcl-nu/nu (CLEA Japan, Inc.) 7-8-недельного возраста обрабатывали пристаном (производства Sigma Co., Ltd.) и примерно через 3 недели гибридому, промытую физиологическим раствором, имплантировали в брюшную полость по 1×10 клеток на мышь. Через 1-2 недели асциты, накопленные в брюшной полости, собирали и стерилизовали, пропуская через фильтр 0,22 мкм, и полученный материал использовали в качестве исходного материала для очистки антител.
Надосадок культуры гибридомы получали, используя CELLine (производства BD Biosciences, Inc.). Культивирование осуществляли согласно протоколу производителя, за исключением того, что в качестве среды использовали ростовую среду E ClonaCell-HY (производства StemCell Technologies, Inc., №03805). Собранный надосадок культуры фильтровали через фильтр 0,45 мкм и полученный в результате материал использовали в качестве исходного материала для очистки антител.
Антитело очищали на аффинной колонке, полученной иммобилизацией рекомбинантного белка A rPA50 (производства RepliGen Corporation) на формил-целлулофин (производства Seikagaku Corporation) (далее сокращенно называемый «формил-целлулофин-белок A») или Hitrap MabSelect SuRe (производства GE Healthcare Bio-Sciences Corporation). В случае формил-целлулофин-белка A, исходный материал для очистки антител разбавляли в 3 раза буфером для связывания (3 М NaCl, 1,5 М глицин, pH 8,9), и полученный раствор добавляли на колонку, затем колонку промывали буфером для связывания с последующим элюированием 0,1 М лимонной кислотой (pH 4,0). С другой стороны, в случае Hitrap MabSelect SuRe (GE Healthcare Corporation) исходный материал для очистки антител добавляли на колонку и колонку промывали PBS с последующим элюированием 2 М аргинином-HCl (pH 4,0).
После нейтрализации элюированного раствора антитела буфер заменяли на PBS.
Концентрацию антитела получали, элюируя антитело, связанное с POROS G колонкой PEEK 20 мкм, 4,6 мм × 100 мм, 1,7 мл (Applied Biosystems, Inc.) и измеряя поглощение (O.D. 280 нм) элюата. В частности, образец антитела, разбавленный PBS, добавляли к POROS G 20 мкм, уравновешенной буфером для уравновешивания (30,6 мМ дигидрофосфат натрия/12-водный, 19,5 мМ дифосфат калия, 0,15 М NaCl, pH 7,0). Затем колонку промывали буфером для уравновешивания и затем антитело, связанное с колонкой, элюировали элюентом (0,1% (об./об.) HCl, 0,15 М NaCl). Измеряли площадь пика поглощения (O.D. 280 нм) элюата и концентрацию вычисляли, используя следующее уравнение:
Концентрация антитела в образце (мг/мл) = (площадь пика образца антитела)/(площадь пика эталонного стандарта (IgG1 человека)) × концентрация эталонного стандарта (мг/мл) × коэффициент разбавления образца.
Кроме того, концентрацию эндотоксина, содержащегося в полученном антитела, измеряли, используя набор Endospecy ES-50M (Seikagaku Corporation, № 020150) и набор эталонного стандарта эндотоксина CSE-L (Seikagaku Corporation, № 020055), и подтверждали присутствие 1 единицы эндотоксина/мг или меньше. Полученное антитело использовали в последующем эксперименте.
Пример 4. Свойства анти-B7-H3-антитела
4)-1. ADCP-активность
5
1,5 мл тиогликоля вводили в брюшную полость мыши Balb/c-nu/nu (самка, 6-10-недельного возраста) (Charles River Laboratories Japan, Inc.). Через 5 дней собирали макрофаги из брюшной полости. Макрофаги добавляли в 24-луночный планшет по 500 мкл/лунку (1×10клеток/лунку) и культивировали в течение ночи при 37°C. Полученные таким образом макрофаги использовали в качестве эффекторных клеток.
7
Мечение клеток NCI-H322, используемых в качестве клеток-мишеней, осуществляли с использованием набора для мечения красителем PKH26 (Sigma Co., Ltd.). Клетки-мишени открепляли, используя TrypLE (Invitrogen Corporation) и два раза промывали PBS. Клетки суспендировали в разбавителе C в концентрации 1×10 клеток/мл. Исходный раствор красителя PKH26 (1 мМ) разбавляли до 8 мкМ разбавителем C и сразу после этого разбавленный раствор красителя добавляли к клеткам в количестве, равном количеству суспензии клеток. Полученную смесь оставляли при комнатной температуре на 5 минут. Затем к смеси добавляли 1 мл сыворотки и затем добавляли среду с сывороткой и промывали два раза. Полученные таким образом клетки использовали в качестве клеток-мишеней.
6
2
Антитело, полученное, как описано в примере 3)-6, разбавляли до концентрации 20 мкг/мл культуральным раствором. Затем клетки-мишени, полученные, как описано в примере 4)-1-1, распределяли по 2×10 клеток/100 мкл/пробирку и перемешивали. Полученную смесь оставляли стоять на льду на 30 минут. Надосадок удаляли и клетки промывали два раза культуральным раствором и суспендировали в 500 мкл культурального раствора. Надосадок из эффекторных клеток удаляли и к ним добавляли клетки, обработанные антителом и суспендированные в культуральном раствор, и перемешивали. Затем клетки культивировали в течение 3 часов в CO-инкубаторе. Затем клетки открепляли трипсином-EDTA и собирали. К собранным клеткам добавляли ФИТЦ-меченое антитело против CD11b мыши (Becton, Dickinson and Company, Ltd.) и полученную в результате смесь оставляли стоять на льду на 30 минут. Надосадок удаляли и клетки два раза промывали культуральным раствором. Собранные клетки суспендировали в 300 мкл культурального раствора и анализировали, используя FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company, Ltd.). В CD11b-позитивных макрофагах оценивали PKH26-позитивную фракцию в качестве позитивных в отношении фагоцитоза клеток (n=3).
В результате, как показано на фиг. 1, L7, L8, L11, M30 и M31 индуцировали фагоцитоз клеток NCI-H322 макрофагами, получая, соответственно, процент фагоцитоза 48,0±0,9%, 52,3±1,1%, 57,1±2,5%, 61,9±2,1% и 57,7±3,0%. Соответственно, было показано, что антитела L7, L8, L11, M30 и M31 обладают ADCP-активностью, направленной против клеток NCI-H322 клетки.
Таким же образом получали коммерчески доступные анти-B7-H3-антитела и измеряли их ADCP-активность. Получали антитело крысы против B7-H3 человека MIH35 (eBioscience Company), антитело мыши против B7-H3 человека 185504 (R&D Systems, Inc.), MIH42 (Serotec Co., Ltd.) и DCN70 (Biolegend Company). Было подтверждено, что такие антитела связываются с B7-H3 таким же образом, как в примере 3)-3. Используя такие антитела измеряли ADCP-активность описанным выше способом.
В результате, как показано на фиг. 2, при добавлении в концентрации 1 мкг/мл MIH35, MIH42 и DCN70 индуцировали фагоцитоз клеток NCI-H322 макрофагами, получая процент фагоцитоза до 4,2%, 8,2% и 10,8%, соответственно. Таким образом, было обнаружено, что MIH35, MIH42 и DCN70 почти не проявляли ADCP-активности.
На основании полученных результатов было показано, что клоны M30, распознающие B7-H3, полученные на этот раз в результате скрининга, обладают более высокой ADCP-активностью. Чем коммерчески доступные антитела против B7-H3.
4)-2. ADCC-активность
4)-2-1. Получение эффекторных клеток
nu
7
Селезенку асептически вырезали из организма мыши nude CAnN.Cg-Foxn1/CrlCrlj (Charles River Laboratories Japan, Inc.). Вырезанную селезенку гомогенизировали, используя два предметных стекла, и подвергали гемолитической обработке, используя BD Pharm Lyse (производства BD Biosciences, Ltd. №555899). Полученные таким образом клетки селезенки суспендировали в не содержащей фенолового красного среде RPMI 1640 (производства Invitrogen Corporation), которая содержала 10% фетальной сыворотки теленка с ультранизким содержанием IgG (производства Invitrogen Corporation) (далее называемой «средой ADCC»), и суспензию клеток пропускали через клеточное сито (размер пор: 40 мкм, производства BD Biosciences, Ltd.). Затем подсчитывали живые клетки в анализе, основанном на исключении клеток при окрашивании красителем трипановым синим. Затем суспензию клеток селезенки центрифугировали, среду удаляли и клетки ресуспендировали в среде ADCC при плотности живых клеток 1,5×10 клеток/мл и использовали в качестве эффекторных клеток.
4)-2-2. Получение клеток-мишеней
6
5
2
B7-H3-экспрессирующие клетки 293 (ATCC) и клетки 293, трансфицированные пустым вектором, полученные также, как описано в примере 3)-3, обрабатывали трипсином и обработанные клетки каждого типа промывали RPMI 1640 (Invitrogen Corporation), содержащей 10% FBS, и затем ресуспендировали в RPMI 1640, содержащей 10% FBS. Клетки (4×10 клеток) каждого типа смешивали с хромом-51 (5550 кБк), стерилизованным пропусканием через фильтр 0,22 мкм, и мечение осуществляли в течение 1 часа в условиях 37°C и 5% CO. Меченые клетки промывали три раза средой RPMI 1640, содержащей 10% FBS, (Invitrogen Corporation), и клетки ресуспендировали в концентрации 2×10 клеток/мл в среде ADCC и использовали в качестве клеток-мишеней.
51
4)-2-3. Анализ высвобождения Cr
5
7
2
Клетки-мишени с плотностью клеток 2×10 клеток/мл распределяли по 50 мкл/лунку в 96-луночный планшет с микролунками с U-образным дном. В него добавляли по 50 мкл M30 или антитела для контроля изотипа (mIgG2a) (eBioscience Company), разбавленного средой ADCC так, чтобы конечная концентрация антитела после добавления эффекторных клеток составляла 2,5 мкг/мл. Затем планшет оставляли стоять при 4°C на 1 час. Затем добавляли 100 мкл эффекторных клеток с плотностью клеток 1,5×10 клеток/мл и клетки культивировали в течение ночи в условиях 37°C и 5% CO. На следующий день надосадок собирали в LumaPlate (производства PerkinElmer, Inc.) и измеряли испускаемое гамма-излучение, используя гамма-счетчик. Процент лизиса клеток, вызываемого ADCC-активностью, вычисляли согласно следующему уравнению.
Лизис клеток в процентах (%) = (A-B)/(C-B)×100
A: количество излучения от лунки с образцом.
В: среднее количество испускаемого спонтанного излучения (от лунок, в которые не добавляли антитело и эффекторные клетки) (n=3). Осуществляли такой же способ, как и в случае лунок с образцом, за исключением того, что добавляли среду ADCC в количестве 50 мкл во время добавления антитела и в количестве 100 мкл во время добавления эффекторных клеток.
С: Среднее максимальное количество испускаемого излучения (от лунок, в которых клетки-мишени были растворены с использованием поверхностно-активного вещества) (n=3). Осуществляли такой же способ, как и в случае лунки с образцом, за исключением того, что добавляли 50 мкл среды ADCC во время добавления антитела и 100 мкл среды ADCC, содержащей 2% (об./об.) тритона Х-100, во время добавления эффекторных клеток.
Показанные данные являются средними для измерений в трех повторах, и планки погрешностей представляют стандартные отклонения. P-значение вычисляли, используя t-критерий Стьюдента. Результаты измерения показаны на фиг. 3.
В результате М30 проявляло активность в лизировании клеток, при которой процент лизиса клеток составлял 31,6±3,3% против В7-Н3-экспрессирующих клеток 293, и поэтому было показано, что антитело М30 обладает ADCC-активностью против В7-Н3-экспрессирующих клеток 293.
4)-3. CDC-активность
2
Эксперимент осуществляли таким же образом, как описано в примере 2)-3. В качестве клеток, используемых для оценки, использовали клетки NCI-H322. Добавляли каждое из анти-В7-Н3-антител (L7, L8, L11, М30 и М31), полученных, как описано в примере 3)-6, и антитело для контроля изотипа (mIgG2a), разбавленные средой RPMI 1640, содержащей 10% FBS (содержащей антибиотики: пенициллин и стрептомицин), так, чтобы конечная концентрация антитела после добавления комплемента составляла 25 мкг/мл, и полученную в результате смесь оставляли стоять при 4°C на 1 час. К смеси добавляли комплемент кролика (производства Cedarlane Laboratories, №CL3051), разбавленный до 30% средой RPMI 1640, так чтобы конечная концентрация комплемента составляла 5%, и полученную смесь инкубировали в течение 1 часа в условиях 37°C и 5% CO. Затем смесь оставляли стоять при комнатной температуре в течение 30 минут. Чтобы измерить жизнеспособность клеток, к смеси добавляли реагент из набора для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (производства Promega Corporation) в количестве, равном количеству культурального раствора, и полученную в результате смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем измеряли количество люминесценции, используя устройство для считывания планшетов. Жизнеспособность клеток вычисляли согласно следующему уравнению.
Жизнеспособность клеток (%) = (a-b)/(c-b)×100
a: количество люминесценции от лунки с образцом.
b: среднее количество фоновой люминесценции (от лунок, в которые не добавляли клетки и антитело) (n=3). Осуществляли такой же способ, как и в случае лунки с образцом, за исключением того, что добавляли равное количество RPMI 1640, содержащей 10% FBS (содержащей антибиотики: пенициллин и стрептомицин) вместо суспензии клеток во время посева клеток и добавляли RPMI 1640, содержащую 10% FBS (содержащую антибиотики: пенициллин и стрептомицин) в количестве, равном количеству разбавленного раствора антитела, во время добавления антитела.
c: Среднее количество люминесценции от лунок, в которые не добавляли антитело (n=3). Осуществляли такой же способ, что и в случае лунки с образцом, за исключением того, что RPMI 1640, содержащую 10% FBS (содержащую антибиотики: пенициллин и стрептомицин) добавляли в количестве, равном количеству разбавленного раствора антитела, во время добавления антитела.
Результаты измерения показаны на фиг. 4. Показанные данные представляют собой средние измерения для трех повторов, и планки погрешностей представляют стандартные отклонения. В результате, контрольное антитело, L7, L8, L11, M30 и M31 индуцировали снижение жизнеспособности клеток NCI-H322 до 101,5±3,3%, 6,3±4,2%, 13,6±9,1%, 7,2±1,4%, 7,5±1,8% и 12,8±2,0%, соответственно, в присутствии комплемента. Таким образом, было показано, что антитела L7, L8, L11, M30 и M31 обладают CDC-активностью, направленной против клеток NCI-H322.
4)-4. Определение домена связывания
Исследовали, с каким доменом B7-H3 связывается M30, используя способ проточной цитометрии таким же образом, как описано в примере 3)-3. Использовали клетки NIH-3T3, трансфицированные каждым из векторов экспрессии для неполных белков B7-H3, полученных, как описано в примере 1)-1-3.
В результате, как показано на фиг. 5, было подтверждено, что M30 связывается с IgC1 B7-H3, IgC2 B7-H3, IgC1-V2-C2 B7-H3 и IgV2-C2 B7-H3. M30 не связывался с IgV1 B7-H3 и IgV2 B7-H3.
На основании полученных результатов было показано, что M30 связывается с доменом C1 (аминокислотной последовательностью, представленной аминокислотами с номерами 140-244 в последовательности SEQ ID NO: 6) и доменом C2 (аминокислотной последовательностью, представленной аминокислотами с номерами 358-456 в последовательности SEQ ID NO: 6) B7-H3. Таким же образом было показано, что L8, L11 и M31 также связываются с доменом C1 и доменом C2, а L7 связывается с доменом V1 (аминокислотной последовательностью, представленной аминокислотами с номерами 27-139 в последовательности SEQ ID NO: 6) и доменом V2 (аминокислотной последовательностью, представленной аминокислотами с номерами 245-357 в последовательности SEQ ID NO: 6).
Таким образом, было показано, что M30 распознает эпитоп в домене IgC1 и/или домене IgC2, каждый из которых представляет собой домен во внеклеточном домене B7-H3, и связывается с доменом IgC1 или доменом IgC2 или обоими доменами.
4)-5. Антигенная специфичность
Антигенную специфичность M30 исследовали способом проточной цитометрии таким же образом, как описано в примере 3)-3.
Использовали клетки 293T, трансфицированные каждым из векторов экспрессии для белков CD80, CD86, B7-RP-1, B7-H1, B7-DC и B7-H4, которые являются белками семейства B7, полученными, как описано в примере 1)-1-4.
В результате было показано, что M30 не связывается с CD80, CD86, B7-RP-1, B7-H1, B7-DC и B7-H4, которые являются молекулами семейства B7.
Пример 5. Противоопухолевое действие in vivo
5)-1. Противоопухолевое действие анти-B7-H3-антителаin vivo
7
Клетки NCI-H322 открепляли от культурального флакона обработкой трипсином и затем суспендировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% FBS (Invitrogen Corporation), с последующим центрифугированием, и надосадок удаляли. Клетки два раза промывали такой же средой и затем суспендировали в физиологическом растворе (производства Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.). Затем клетки имплантировали подкожно в подмышечную область каждой мыши BALB/cAJcl-nu/nu (CLEA Japan, Inc.) 6-недельного возраста в дозе 1×10 клеток/мышь. День имплантации считали 0 днем, и на 10, 17, 24, 31 и 38 день внутрибрюшинно вводили каждое из антител L7, L8, L11, M30 и M31 в дозе 500 мкг/мышь (примерно 25 мг/кг). Для контроля внутрибрюшинно вводили PBS в объеме (500 мкл), равном объему раствора антитела. Объем опухоли измеряли на 10, 17, 24, 31, 38 и 45 день и исследовали противоопухолевое действие введения антитела.
В результате, в группах введения M30 и M31 рост опухолей был значимо подавлен, по сравнению с группой введения PBS (P-значения для M30 и M31 по сравнению с группой введения PBS в отношении объема опухолей на 45 день составляли P<0,05 и P<0,01, соответственно. P-значения вычисляли, используя критерий Стьюдента). Кроме того, степень ингибирования роста опухолей (= 100-(средний объем опухолей в группе введения антитела)/(средний объем опухолей в группе введения PBS)×100) на 45 день в случае L7, L8, L11, M30 и M31 составляла -16,1%, 0,2%, 25,5%, 47,2% и 58,2%, соответственно. Таким образом, обнаружено, что антитела M30 и M31 оказывают очень сильное противоопухолевое действие in vivo (фиг. 6).
На основании указанных выше результатов было выявлено, что антитела M30 и M31 являются антителами, которые распознают антиген B7-H3 и оказывают противоопухолевое действие.
5)-2. Противоопухолевое действие в условиях истощения макрофагов in vivo
Чтобы истощить популяцию макрофагов in vivo, получали инкапсулированный в липосомы клодронат. Сообщалось, что при введении липосом с инкапсулированным клодронатом in vivo происходит истощение популяции макрофагов in vivo (Journal of immunological methods 1994, vol. 174, pp. 83-93). Согласно способу, описанному в указанном сообщении, получали липосомы с инкапсулированным клодронатом и использовали в следующем эксперименте.
7
Клетки NCI-H322 открепляли от культурального флакона обработкой трипсином и затем суспендировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% FBS (Invitrogen Corporation), с последующим центрифугированием и надосадок удаляли. Клетки дважды промывали такой же средой и затем суспендировали в физиологическом растворе (PBS, производства Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.). Затем клетки подкожно имплантировали в подмышечную область каждой мыши BALB/cAJcl-nu/nu (CLEA Japan, Inc.) 6-недельного возраста в дозе 1×10 клеток/мышь. В качестве дня имплантации был выбран день -14, и формирование групп осуществляли в 0 день.
В группе, в которой у мышей были истощены популяции макрофагов in vivo, инкапсулированный в липосомы клодронат внутривенно инъецировали в дозе 0,2 мл/мышь в 0, 4, 7, 11, 14, 18, 21, 25, 28 и 32 день. Кроме того, в группе, предназначенной в качестве негативного контроля, внутривенно инъецировали PBS в дозе 0,2 мл/мышь в такие же дни (в 0, 4, 7, 11, 14, 18, 21, 25, 28 и 32 дни).
Затем антитело M30 вводили внутрибрюшинно обеим группам в дозе 500 мкг/мышь (примерно 25 мг/кг) в 1, 8, 15, 22 и 29 дни. Кроме того, в качестве негативного контроля внутрибрюшинно вводили PBS в обеих группах в объеме (500 мкл), равном объему антитела M30, в такие же дни (в 1, 8, 15, 22 и 29 дни).
Объем опухолей измеряли в 0, 8, 15, 22, 29 и 36 дни и исследовали противоопухолевое действие введения антитела (n=8).
Результаты показаны в таблицах 1 и 2, и на фиг. 7.
Таблица 1
Объем опухоли
0 день
8 день
15 день
Средний (мм<sup>3</sup>)
стандартное отклонение
Средний (мм<sup>3</sup>)
стандартное отклонение
Средний (мм<sup>3</sup>)
стандартное отклонение
группа введения PBS+PBS
104,375
6,491581086
149
10,60828517
227,5
18,20027472
группа введения липосом с клодронатом + PBS
114,625
4,862162585
159,375
7,676349346
318,625
26,37567704
группа введения PBS + M30
103,5
7,221001118
123,625
14,89958952
145
19,58497967
группа введения липосом с клодронатом + M30
104,625
5,47049717
143,375
10,46753058
247,75
24,44947414
Объем опухоли
22 день
29 день
36 день
Средний (мм<sup>3</sup>)
стандартное отклонение
Средний (мм<sup>3</sup>)
стандартное отклонение
Средний (мм<sup>3</sup>)
стандартное отклонение
группа введения PBS + PBS
394,75
25,77772433
601,25
43,17065389
827
50,82638516
группа введения липосом с
443,625
23,52653327
619,75
40,9550058
1002,75
78,18493415
клодронатом + PBS
группа введения PBS + M30
186,25
25,920036
301,75
47,13610612
415,25
79,84175197
группа введения липосом с клодронатом + M30
384,25
40,10644319
641,375
80,12176836
837,25
121,3499223
В группе, получавшей внутривенное введение PBS + внутрибрюшинное введение антитела M30 (группа введения PBS+M30), рост опухолей был значимо подавлен по сравнению с группой, получавшей внутривенное введение PBS + внутрибрюшинное введение PBS (группа введения PBS+PBS), служащей в качестве негативного контроля. Более конкретно, P-значение для группы введения PBS + M30 по сравнению с группой введения PBS + PBS в отношении объема опухоли на 36 день составляло P<0,05 (P-значение вычисляли, используя t-критерий Стьюдента). Кроме того, степень ингибирования роста опухолей (= 100-(средний объем опухоли в группе введения PBS + M30)/(средний объем опухоли в группе введения PBS + PBS)×100) на 36 день составляла 49,8% (таблица 2).
С другой стороны, в группе, получавшей внутривенное введение липосом с инкапсулированным клодронатом + внутрибрюшинное введение PBS (группа введения липосом с клодронатом + PBS), и в группе, получавшей внутривенное введение липосом с инкапсулированным клодронатом + внутрибрюшинное введение антитела M30 (группа введения липосом с клодронатом + M30), подавление опухолевого роста не наблюдали. Более конкретно, P-значения для группы введения липосом с клодронатом + PBS и группы введения липосом с клодронатом + M30 по сравнению с группой введения PBS + PBS в отношении объема опухоли на 36 день составляли P=0,52 и P=1, соответственно (P-значения вычисляли, используя t-критерий Стьюдента). Кроме того, степень ингибирования роста опухолей (=100-(средний объем опухоли в группе введения липосом с клодронатом + PBS или в группе введения липосом с клодронатом + M30)/(средний объем опухоли в группе введения PBS + PBS)×100) на 36 день составляла -21,2% и -1,4%, соответственно (таблица 2).
Таблица 2
Степень ингибирования роста опухолей (%)
8 день
15 день
22 день
29 день
36 день
группа введения липосом с клодронатом + PBS
-6,6
-39,4
-12,6
-3,5
-21,2
группа введения PBS + M30
17,5
36,4
52,8
49,7
49,8
группа введения липосом с клодронатом + M30
3,2
-8,6
2,6
-6,6
-1,4
На основании описанных выше результатов было показано, что противоопухолевое действие антитела M30 было подавлено при введении липосом с инкапсулированным клодронатом, и следовательно, было обнаружено, что противоопухолевое действие антитела M30, главным образом, представляет собой действие, опосредованное макрофагами.
Пример 6. Клонирование кДНК антитела мыши M30 и определение последовательности
6)-1. Определение N-концевой аминокислотной последовательности тяжелой и легкой цепей антитела мыши M30
Чтобы определить N-концевые аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей антитела мыши M30, антитело мыши M30, очищенное, как описано в примере 3)-6, разделяли в SDS-ПААГ. Белок, имеющийся в геле, после разделения переносили из геля на мембрану PVDF (размер пор: 0,45 мкм, производства Invitrogen Corporation). Мембрану промывали буфером для промывки (25 мМ NaCl, 10 мМ натрий-боратный буфер pH 8,0) и затем красили погружением в раствор красителя (50% метанол, 20% уксусная кислота, 0,05% Кумасси бриллиантовый синий) в течение 5 минут с последующим удаляли краситель 90% метанолом. Части полосы, соответствующей тяжелой цепи (полоса с меньшей подвижностью), и полосы, соответствующей легкой цепи (полоса с большей подвижностью), визуализированные на мембране PVDF, вырезали.
Часть полосы, соответствующей легкой цепи, инкубировали при 37°C в течение 30 минут в небольшом количестве раствора 0,5% поливинилпирролидона/100 мМ уксусной кислоты с последующей промывкой лунки водой. Затем модифицированный N-концевой остаток удаляли, используя набор, содержащий пироглутаматаминопептидазу Pfu (TaKaRaBio, Inc.), с последующей промывкой водой и сушкой на воздухе. Затем была осуществлена попытка идентифицировать их соответствующие N-концевые аминокислотные последовательности автоматизированным способом по Эдману (см. публикацию Edman et al. (1967) Eur. J. Biochem. 1, 80) с использованием секвенатора белков Procise (зарегистрированное торговое название) cLC, модели 492cLC (Applied Biosystems, Inc.).
В результате, N-концевая аминокислотная последовательность полосы, соответствующей тяжелой цепи антитела мыши M30 представляла собой последовательность EVQLQQSGPE (SEQ ID NO: 44 в списке последовательностей), и N-концевая аминокислотная последовательность полосы, соответствующей легкой цепи такого антитела представляла собой последовательность IVLSQSPTILSASP (SEQ ID NO: 45 в списке последовательностей).
6)-2. Получение мРНК из гибридомы, продуцирующей антитело мыши M30
Чтобы клонировать кДНК, кодирующую каждую тяжелую цепь и легкую цепь антитела мыши M30, получали мРНК из гибридомы, продуцирующей антитело мыши M30, используя набор для очистки мРНК Quick Prep (GE Healthcare Corporation).
6)-3. Клонирование кДНК антитела мыши M30 и определение последовательности
На основании данных о том, что тяжелая и легкая цепи антитела мыши M30 имеют изотипы γ2a и κ, полученных, как описано в примере 3)-5, и на основании N-концевых аминокислотных последовательностей тяжелой и легкой цепей, определенных, как описано в примере 1-1), и базы данных об аминокислотных последовательностях антител (см. публикацию Kabat, E. A. et al., (1991), в Sequences of Proteins of Immunological Interest Vol. I and II, U.S. Department of Health and Human Services) синтезировали несколько олигонуклеотидных праймеров, гибридизующихся с 5'-концевой областью кодирующей области гена антитела и его 3'-концевой областью, содержащих стоп-кодон, и амплифицировали кДНК, кодирующую тяжелую цепь, и кДНК, кодирующую легкую цепь, используя мРНК, полученную, как описано в примере 6-2) и набор для ПЦР РНК в одну стадию TaKaRa (AMV) (TaKaRa Bio, Inc.). В результате, кДНК, кодирующая тяжелую цепь антитела, и кДНК, кодирующая легкую цепь антитела, может быть амплифицирована с использованием следующих наборов праймеров.
Набор праймеров для тяжелой цепи:
Праймер 16
5'-aagaattcatggaatggagttggata-3' (SEQ ID NO: 46 в списке последовательностей).
Праймер 17
5'-aagatatctcatttacccggagtccgggagaa-3' (SEQ ID NO: 47 в списке последовательностей).
Набор праймеров для легкой цепи:
Праймер 18
5'-aagaattcatggattttctggtgcag-3' (SEQ ID NO: 48 в списке последовательностей).
Праймер 19
5'-aagatatcttaacactcattcctgttgaagct-3' (SEQ ID NO: 49 в списке последовательностей).
Каждую из кДНК: кДНК, кодирующую тяжелую цепь, и кДНК, кодирующую легкую цепь, амплифицированные в ПЦР, клонировали с использованием набора для экспрессии pEF6/V5-His TOPO TA (Invitrogen Corporation), и каждую из клонированных нуклеотидных последовательностей тяжелой цепи и легкой цепи, определяли, используя анализатор последовательностей генов («анализатор ДНК ABI PRISM 3700; Applied Biosystems» или «анализатор Applied Biosystems 3730xl; Applied Biosystems»). Для реакции секвенирования использовали GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Inc.).
Определенная нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующей тяжелую цепь антитела мыши M30, представлена в SEQ ID NO: 50 в списке последовательностей, и его аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 51. Кроме того, последовательности SEQ ID NO: 50 и 51 показаны на фиг. 21.
Определенная нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующей легкую цепь антитела мыши М30, представлена в SEQ ID NO: 52 в списке последовательностей, и его аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 53 в списке последовательностей. Последовательности SEQ ID NO: 52 и 53 показаны на фиг. 22.
Кроме того, аминокислотные последовательности тяжелой цепи легкой цепи анализировали путем сравнения с использованием базы KabatMan (см. Proteins: Structure, Function and Genetics, 25 (1996), 130-133), которая представляет собой базу данных об аминокислотных последовательностях антител. В результате было обнаружено, что в тяжелой цепи антитела мыши М30 аминокислотная последовательность, представленная аминокислотами с номерами 20-141 в последовательности SEQ ID NO: 51 в списке последовательностей, является вариабельной областью. Также было обнаружено, что в легкой цепи антитела мыши М30 аминокислотная последовательность, представленная аминокислотами с номерами 23-130 в последовательности SEQ ID NO: 53 в списке последовательностей, является вариабельной областью.
Пример 7. Получение химерного антитела М30 (антитела сМ30)
7)-1. Конструирование вектора pEF6KCL, экспрессирующего химерную и гуманизированную легкую цепь
Осуществляя ПЦР с использованием плазмиды pEF6/V5-HisB (Invitrogen Corporation) в качестве матрицы, а также с использованием указанных ниже праймеров получали фрагмент ДНК от точки, расположенной непосредственно ниже BGHpA (положение последовательности: 2174), до SmaI (положение последовательности: 2958) (фрагмент ДНК, содержащий начало репликации f1 и промотор и начало репликации SV40, далее называемый «фрагментом A»).
Праймер 20
5'-ccacgcgccctgtagcggcgcattaagc-3' (SEQ ID NO: 54 в списке последовательностей).
Праймер 21
5'-aaacccgggagctttttgcaaaagcctagg-3' (SEQ ID NO: 55 в списке последовательностей).
Полученный фрагмент A и фрагмент ДНК (SEQ ID NO: 56, далее называемый «фрагментом B», последовательность SEQ ID NO: 56 также показана на фиг. 23), содержащий последовательность ДНК, кодирующую сигнал секреции цепи κ человека, константную область цепи κ человека и дополнительный сигнал поли-A человека, лигировали друг с другом в ПЦР с перекрывающимися удлинениями. Полученный таким образом фрагмент ДНК, в котором фрагмент A и фрагмент B лигированы друг с другом, расщепляли ферментами рестрикции KpnI и SmaI, и лигировали с плазмидой pEF6/V5-HisB (Invitrogen Corporation), которая была расщеплены ферментами рестрикции KpnI и SmaI, таким образом конструировали вектор pEF6KCL, экспрессирующий химерную и гуманизированную легкую цепь, имеющий сигнальную последовательность, сайт клонирования, константную область цепи κ человека и последовательность дополнительного сигнала поли-A человека ниже промотора EF1.
7)-2. Конструирование pEF1KCL
Фрагмент ДНК, полученный расщеплением вектора pEF6KCL, полученного описанным выше способом, с использованием ферментов рестрикции KpnI и SmaI, лигировали в pEF1/myc-HisB (Invitrogen Corporation), который был расщеплен KpnI и SmaI, таким образом конструировали плазмиду pEF1KCL.
7)-3. Конструирование вектора pEF1FCCU, экспрессирующего химерную и гуманизированную тяжелую цепь
Фрагмент ДНК (SEQ ID NO: 57, последовательность SEQ ID NO: 57 также показана на фиг. 24), содержащий последовательность ДНК, кодирующую аминокислоты сигнальной последовательности и константной области IgG1 человека, расщепляли ферментами рестрикции NheI и PmeI и лигировали в плазмиду pEF1KCL, которая была расщеплена NheI и PmeI, таким образом конструируя вектор pEF1FCCU, экспрессирующий химерную и гуманизированную тяжелую цепь, имеющий сигнальную последовательность, сайт клонирования, константную область тяжелой цепи человека и последовательность дополнительного сигнала поли-A человека ниже промотора EF1.
7)-4. Конструирование вектора, экспрессирующего легкую цепь M30 химерного типа
Используя кДНК, кодирующую легкую цепь антитела мыши M30, в качестве матрицы, а также используя KOD-Plus- (TOYOBO, Co., Ltd.) и указанный ниже набор праймеров, амплифицировали область, содержащую кДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи. Фрагмент ДНК, полученный расщеплением амплифицированного продукта ферментами рестрикции NdeI и BsiWI, встраивали в универсальный вектор, экспрессирующий химерную и гуманизированную легкую цепь антитела (pEF6KCL), в участок, расщепляемый ферментами рестрикции NdeI и BsiWI, таким образом конструируя вектор, экспрессирующий легкую цепь M30 химерного типа. Полученный таким образом вектор экспрессии назван «pEF6KCL/M30L». Нуклеотидная последовательность легкой цепи M30 химерного типа представлена в SEQ ID NO: 58 в списке последовательностей, и ее аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 59. Последовательности SEQ ID NO: 58 и 59 показаны на фиг. 25. В данном случае остаток треонина в положении 128 в аминокислотной последовательности легкой цепи антитела cM30 SEQ ID NO: 59 в списке последовательностей, локализован на карбоксильном конце вариабельной области легкой цепи и соответствует остатку аланина в положении 130 в аминокислотной последовательности легкой цепи антитела M30 SEQ ID NO: 53 в списке последовательностей, однако в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 59, остаток уже заменен остатком треонином, полученным из легкой цепи антитела человека.
Набор праймеров для легкой цепи
Праймер 22
5'-aaacatatggcaaattgttctctcccagtctccaacaatcc-3' (SEQ ID NO: 60 в списке последовательностей).
Праймер 23
5'-aaacgtacgtttcagctccagcttggtcccagtaccg-3' (SEQ ID NO: 61 в списке последовательностей).
7)-5. Конструирование вектора, экспрессирующего тяжелую цепь M30 химерного типа
Используя кДНК, кодирующую тяжелую цепь антитела мыши M30 в качестве матрицы, фрагмент ДНК, полученный при осуществлении ПЦР с использованием KOD-Plus-(TOYOBO, Co., Ltd.) и указанного ниже набора праймеров A лигировали с фрагментом ДНК, полученным при осуществлении ПЦР с использованием указанного ниже набора праймеров B посредством ПЦР с перекрывающимися удлинениями, используя указанный ниже набор праймеров C, при этом удаляли BlpI из вариабельной области, а также амплифицировали область, содержащую кДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи. Фрагмент ДНК, получаемый при расщеплении амплифицированного продукта ферментом рестрикции BlpI, встраивали в универсальный вектор, экспрессирующий химерную и гуманизированную тяжелую цепь антитела (pEF1FCCU), в сайт, расщепленный ферментом рестрикции BlpI, таким образом конструируя вектор, экспрессирующий тяжелую цепь M30 химерного типа. Полученный таким образом вектор экспрессии назван «pEF1FCCU/M30H».
Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи M30 химерного типа представлена в SEQ ID NO: 62 в списке последовательностей, и ее аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 63. Кроме того, последовательности SEQ ID NO: 62 и 63 показаны на фиг. 26.
Набор праймеров A
Праймер 24
5'-aaagctgagcgaggtccagctgcagcagtctggacctgag-3' (SEQ ID NO: 64 в списке последовательностей).
Праймер 25
5'-gaggtcaggctgctgagttccatgtaggctgtgctg-3' (SEQ ID NO: 65 в списке последовательностей).
Набор праймеров B
Праймер 26
5'-cagcacagcctacatggaactcagcagcctgacctc-3' (SEQ ID NO: 66 в списке последовательностей).
Праймер 27
5'-aaagctgagctgactgtgagagtggtgccttggccccag-3' (SEQ ID NO: 67 в списке последовательностей).
Набор праймеров C
Праймер 28
5'-aaagctgagcgaggtccagctgcagcagtctggacctgag-3' (SEQ ID NO: 68 в списке последовательностей).
Праймер 29
5'-aaagctgagctgactgtgagagtggtgccttggccccag-3' (SEQ ID NO: 69 в списке последовательностей).
7)-6. Получение химерного антитела M30
7)-6-1. Продуцирование химерного антитела M30
9
2
2
1,2×10 клеток FreeStyle 293F (Invitrogen Corporation) в логарифмической фазе роста высевали в 1,2 л свежей среды для экспрессии FreeStyle 293 (Invitrogen Corporation) и культивировали в течение 1 часа при встряхивании со скоростью 90 об./мин при 37°C в инкубаторе с 8% CO. 3,6 мг полиэтиленимина (Polyscience №24765) растворяли в 20 мл среды Opti-Pro SFM (Invitrogen Corporation). Затем pEF1FCCU/M30H (0,4 мг) и pEF6KCL/M30L (0,8 мг), полученные с использованием набора для плазмид PureLink HiPure (Invitrogen Corporation), суспендировали в 20 мл среды Opti-Pro SFM. Затем 20 мл полученной жидкой смеси векторы экспрессии/Opti-Pro SFM добавляли к 20 мл полученной жидкой смеси полиэтиленимин/Opti-Pro SFM и полученную в результате смесь осторожно перемешивали и затем оставляли на 5 минут. Затем смесь добавляли к клеткам Freestyle 293F и осуществляли культивирование со встряхиванием при 90 об./мин в течение 7 суток при 37°C в инкубаторе с 8% CO. Полученный надосадок культуры фильтровали через одноразовый капсульный фильтр (Advantec № CCS-045-E1H).
Химерное антитело М30, полученное в случае сочетания pEF1FCCU/М30Н и pEF6KCL/M30L, названо «сМ30» или «антитело сМ30».
7)-6-2. Очистка сМ30
Надосадок культуры, полученный, как описано в примере 7)-6-1, очищали двухстадийным способом, включающим аффинную хроматографию на белке A (rProtein А) (при 4-6°C) (GE Healthcare Japan Corporation) и керамическом гидроксиапатите (при комнатной температуре). Стадию замены буфера А после очистки аффинной хроматографии на rProtein А и после очистки на керамическом гидроксиапатите осуществляли при комнатной температуре. Сначала 1100-1200 мл надосадка культуры наносили на MabSelect SuRe (производства GE Healthcare Bio-Sciences Corporation, две колонки HiTrap (объем: 1 мл), соединенные последовательно), уравновешенные PBS. После выливания всего культурального раствора на колонку, такую колонку промывали, используя 15-30 мл PBS. Затем осуществляли элюирование 2 М раствором гидрохлорида аргинина (pH 4,0) и собирали фракцию, содержащую антитело. Фракцию наносили на колонку для обессоливания (производства GE Healthcare Bio-Sciences Corporation, две колонки для обессоливания HiTrap (объем: 5 мл), соединенные последовательно), при этом буфер заменяли на буфер, содержащий 5 мМ фосфат натрия, 50 мМ MES и 20 мМ NaCl, pH 6,5.
Затем раствор антитела, подвергнутый замене буфера, наносили на колонку с керамическим гидроксиапатитом (Japan Bio-Rad Laboratories, Inc., колонка с гидроксиапатитом Bio-Scale CHT2-1 (объем: 2 мл)), уравновешенную буфером, содержащим 5 мМ NaPi, 50 мМ MES и 20 мМ NaCl, pH 6,5. Затем осуществляли элюирование, используя линейный градиент концентрации хлорида натрия, и собирали фракцию, содержащую антитело. Фракцию наносили на колонку для обессоливания (производства GE Healthcare Bio-Sciences Corporation, две колонки для обессоливания HiTrap (объем: 5 мл), соединенные последовательно), при этом жидкость заменяли на CBS (содержащий 10 мМ цитратный буфер и 140 мМ хлорид натрия, pH 6,0).
Наконец полученный раствор концентрировали, используя центрифужное устройство для ультрафильтрации UF VIVASPIN 20 (молекулярная масса фракции: 30 К, Sartorius Co., Ltd., при 4°C), и концентрацию IgG доводили до 1,0 мг/мл или больше и полученный таким образом раствор использовали в качестве очищенного образца.
Пример 8. Активность антитела cM30
8)-1. Активность связывания антитела cM30 с B7-H3
Аффинность антитела M30 или антитела cM30 по отношению к антигену B7-H3 измеряли, используя устройство для измерения резонанса поверхностного плазмона (SPR) (GE Healthcare Corporation). Согласно общепринятому способу, антитело против IgG мыши или антитело против IgG человека иммобилизовали на сенсорном чипе и затем связывали с ним образец антитела М30 или антитело сМ30. Затем добавляли полипептид внеклеточного домена рекомбинантного антигена В7-Н3 варианта 2 (производства R&D Systems, Inc., №2318-B3-050/CF) в разных концентрациях и измеряли количество антигена, связанного с антителом в рабочем буфере (фосфатный буфер, 0,05% SP20) с течением времени. Измеряемое количество анализировали с помощью специальной компьютерной программы (BIAevaluation, версия 4.1, GE Healthcare Corporation) и вычисляли константу диссоциации.
В результате, антитело М30 и антитело сМ30 связывались с рекомбинантным антигеном В7-Н3 с константой диссоциации 5,89 нМ и 3,43 нМ, соответственно. На основании полученных результатов было подтверждено, что антитело М30 и антитело сМ30 связываются с антигеном В7-Н3 и аффинности их связывания по существу равны.
8)-2. ADCP-активность антитела сМ30
2
5
Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) здорового человека выделяли общепринятым способом и суспендировали в 10% FCS-содержащем RPMI 1640 (Invitrogen Corporation) и затем высевали во флакон. Клетки культивировали в течение ночи в CO-инкубаторе. Надосадок культуры удаляли и к клеткам, прикрепленным к стенкам флакона, добавляли 10% FBS-содержащий PRMI 1640 с добавлением M-CSF и GM-CSF (PeproTech, Inc.) и клетки культивировали в течение 2 недель. Клетки открепляли, используя TrypLE, и собирали. Затем клетки добавляли в 24-луночный планшет по 500 мкл/лунку (1×10 клетки/лунку) и культивировали в течение ночи при 37°C. Полученные таким образом клетки использовали в качестве эффекторных клеток.
7
Мечение клеток NCI-H322, используемых в качестве клеток-мишеней, осуществляли с использованием набора для мечения красителем PKH26 (Sigma Co., Ltd.). Клетки-мишени открепляли, используя TrypLE (Invitrogen Corporation), и два раза промывали PBS. Клетки суспендировали в разбавителе C в концентрации 1×10 клеток/мл. Исходный раствор красителя PKH26 (1 мМ) разбавляли до 8 мкМ разбавителем C и сразу после этого разбавленный раствор красителя добавляли к клеткам в количестве, равном количеству суспензии клеток. Полученную смесь оставляли при комнатной температуре на 5 минут. Затем к смеси добавляли 1 мл сыворотки и затем добавляли среду с сывороткой и промывали два раза.
6
2
Каждое из антител: антитело M30 и антитело cM30, разбавляли до концентрации 20 мкг/мл культуральным раствором. Затем клетки-мишени распределяли по 2×10 клеток/100 мкл/пробирку и перемешивали. Полученную смесь оставляли стоять на льду на 30 минут. Надосадок удаляли и клетки промывали два раза культуральным раствором и суспендировали в 500 мкл культурального раствора. Надосадок из эффекторных клеток удаляли и к ним добавляли клетки, обработанные антителом и суспендированные в культуральном раствор, и перемешивали. Затем клетки культивировали в течение 3 часов в CO-инкубаторе. Затем клетки открепляли трипсином-EDTA и собирали. К собранным клеткам добавляли ФИТЦ-меченое антитело против CD11b мыши (Becton, Dickinson and Company, Ltd.) и полученную в результате смесь оставляли стоять на льду на 30 минут. Надосадок удаляли и клетки два раза промывали культуральным раствором. Собранные клетки суспендировали в 300 мкл культурального раствора и анализировали, используя FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company, Ltd.). В CD11b-позитивных макрофагах оценивали PKH26-позитивную фракцию в качестве позитивных в отношении фагоцитоза клеток.
В результате, как показано на фиг. 8, при добавлении антитела M30 и антитела cM30 в концентрации 10 мкг/мл фагоцитоз клеток NCI-H322 макрофагами был индуцирован до 33±1% и 35±2%, соответственно. Соответственно, было показано, что антитело cM30 обладает ADCP-активностью, направленной против клеток NCI-H322, также как и антитело M30. Сходный экспериментальный результат также наблюдали в отношении ADCP-активности, направленной против клеток MDA-MB-231 (ATCC).
8)-3. Противоопухолевое действие антитела cM30 in vivo
6
Клетки MDA-MB-231 открепляли от культурального флакона обработкой трипсином и затем суспендировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% FBS (Invitrogen Corporation), с последующим центрифугированием, и надосадок удаляли. Клетки два раза промывали такой же средой и затем суспендировали в матриксе базальной мембраны BD Matrigel (производства BD Biosciences, Inc.). Затем клетки имплантировали подкожно в подмышечную область каждой мыши (CB17/Icr-Prkdc[scid]/CrlCrlj, Charles River Laboratories Japan, Inc.) 6-недельного возраста в дозе 5×10 клеток/мышь. День имплантации считали 0 днем, и на 14, 21, 28, 35 и 42 день внутрибрюшинно вводили антитело M30 или антитело cM30 в дозе 500 мкг/мышь (примерно 25 мг/кг). Объем опухоли измеряли на 14, 18, 21, 25, 28, 32, 35, 39, 42, 46, 49 и 52 день и оценивали противоопухолевое действие введения антитела.
В результате, в группах введения антитела M30 и антитела cM30 рост опухолей был значимо подавлен по сравнению с необработанной группой, в которой антитело не вводили. The P-значения для антитела M30 и антитела cM30 по сравнению с необработанной группой в отношении массы опухолей на 52 день составляли P<0,001. P-значения вычисляли, используя критерий Даннета для множественного сравнения.
Кроме того, степень ингибирования роста (=100-(средний объем опухоли в группе введения антитела)/(средний объем опухоли в необработанной группе)×100) на 52 день составляла 71,3% в случае антитела M30 и 71,7% в случае антитела cM30. Таким образом обнаружено, что антитело cM30 оказывает очень сильное противоопухолевое действие in vivo, также как и антитело M30 (фиг. 9).
Пример 9. Конструирование гуманизированного антитела из антитела мыши против B7-H3 человека № M30
9)-1. Конструирование гуманизированного антитела M30
9)-1-1. Молекулярное моделирование вариабельных областей M30
Молекулярное моделирование вариабельных областей M30 осуществляли согласно способу, обычно известному как моделирование гомологии (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). Первичные последовательности (доступны трехмерные структуры, полученные на основании рентгеноструктурных данных о кристаллических структурах) вариабельных областей иммуноглобулина человека, зарегистрированные в банке данных о белках (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007)) сравнивали с вариабельными областями M30, определенными, как описано в примере 6-3).
В результате, 3BKY выбрали в качестве последовательности, имеющей наиболее высокую гомологию последовательности с вариабельной областью легкой цепи M30 среди антител, которые подобным образом имеют делецию в каркасе. Кроме того, 3DGG выбрали в качестве последовательности, имеющей наиболее высокую гомологию последовательности с вариабельной областью тяжелой цепи M30.
Трехмерную структуру каркасной области получали на основании «модели каркаса», объединяя координаты 3BKY, соответствующей легкой цепи M30, с координатами 3DGG, соответствующей тяжелой цепи M30. Что касается CDR M30, в качестве координат, определяющих границы конформационных структур, наиболее сходным с конформациями CDRH1 (SEQ ID NO: 92), CDRH2 (SEQ ID NO: 93), CDRH3 (SEQ ID NO: 94), CDRL1 (SEQ ID NO: 95), CDRL2 (SEQ ID NO: 96) и CDRL3 (SEQ ID NO: 97) согласно классификации Thornton et al. (J. Mol. Biol., 263, 800-815, (1996)) и правилу H3 (FEBS letters 399, 1-8 (1996)), выбирали 2HOJ, 1BBD, 1Q9O, 2FBJ, 1LNK, и 1TET, соответственно, и включали в модель каркаса.
Наконец, чтобы получить возможную молекулярную модель вариабельной области M30 с помощью расчета энергии, такой расчет энергии осуществляли исключением невыгодных межмолекулярных контактов. Описанный выше способ осуществляли, используя коммерчески доступную программу прогнозирования третичной структуры белка Prime и программу поиска координат MacroModel (Schrodinger, LLC).
9)-1-2. Конструирование аминокислотной последовательности гуманизированного М30
Гуманизированное антитело М30 конструировали согласно способу, обычно называемому прививкой CDR (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)).
Акцепторное антитело выбирали на основе гомологии аминокислот в каркасной области. Последовательность каркасной области М30 сравнивали во всеми каркасными последовательностями человека в базе данных Kabat (Nuc. Acid Res. 29, 205-206 (2001)) аминокислотных последовательностей антител. В результате в качестве акцептора было выбрано антитело mAb49'CL (GenBank в NCBI: D16838.1 и D16837.1) на основании гомологии последовательностей, составляющей 70%, в каркасной области.
Аминокислотные остатки в каркасной области mAb49'CL выравнивали с аминокислотными остатками М30 и выявляли положения, в которых были использованы разные аминокислоты. Положения таких остатков анализировали, используя трехмерную модель М30, сконструированную, как описано выше. Затем выбирали донорные остатки, которые необходимо привить в акцептор, согласно критериям, описанным Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Благодаря переносу некоторых выбранных остатков в акцепторное антитело были сконструированы гуманизированные последовательности антитела М30, как описано в следующем примере.
9)-2. Гуманизация тяжелой цепи М30
9)-2-1. Тяжелая цепь М30-Н1-типа:
Гуманизированная тяжелая цепь М30, сконструированная с использованием замен аминокислот с номерами 20 (глутаминовая кислота), 24 (глутамин), 28 (пролин), 30 (лейцин), 31 (валин), 35 (аланин), 39 (метионин), 57 (лизин), 59 (лизин), 67 (изолейцин), 86 (лизин), 87 (аланин), 89 (глутамин), 91 (серин), 93 (лизин), 95 (серин), 106 (треонин), 110 (серин), 136 (треонин) и 137 (лейцин) тяжелой цепи cM30, представленной в SEQ ID NO: 63 в списке последовательностей, глутамином, валином, аланином, валином, лизином, серином, валином, аргинином, аланином, метионином, аргинином, валином, изолейцином, аланином, глутаминовой кислотой, треонином, аргинином, треонином, лейцином и валином, соответственно, была названа «тяжелой цепью M30-H1-типа».
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи M30-H1-типа представлена в SEQ ID NO: 85.
9)-2-2. Тяжелая цепь M30-H2-типа:
Гуманизированная тяжелая цепь M30, сконструированная с использованием замены аминокислот с номерами 20 (глутаминовая кислота), 24 (глутамин), 28 (пролин), 30 (лейцин), 31 (валин), 35 (аланин), 39 (метионин), 57 (лизин), 59 (лизин), 86 (лизин), 87 (аланин), 89 (глутамин), 91 (серин), 93 (лизин), 95 (серин), 106 (треонин), 110 (серин), 136 (треонин) и 137 (лейцин) тяжелой цепи cM30, представленной в SEQ ID NO: 63 в списке последовательностей, глутамином, валином, аланином, валином, лизином, серином, валином, аргинином, аланином, аргинином, валином, изолейцином, аланином, глутаминовой кислотой, треонином, аргинином, треонином, лейцином и валином, соответственно, названа «тяжелой цепью M30-H2-типа».
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи M30-H2-типа представлена в SEQ ID NO: 87.
9)-2-3. Тяжелая цепь M30-H3-типа:
Гуманизированная тяжелая цепь M30, сконструированная с использованием замены аминокислот с номерами 24 (глутамин), 28 (пролин), 30 (лейцин), 31 (валин), 35 (аланин), 39 (метионин), 59 (лизин), 89 (глутамин), 91 (серин), 93 (лизин), 95 (серин), 106 (треонин), 110 (серин), 136 (треонин) и 137 (лейцин) тяжелой цепи cM30, представленной в SEQ ID NO: 63 в списке последовательностей, валином, аланином, валином, лизином, серином, валином, аланином, изолейцином, аланином, глутаминовой кислотой, треонином, аргинином, треонином, лейцином и валином, соответственно, названа «тяжелой цепью M30-H3-типа».
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи M30-H3-типа представлена в SEQ ID NO: 89.
9)-2-4. Тяжелая цепь M30-H4-типа:
Гуманизированная тяжелая цепь M30, сконструированная с использованием замены аминокислот с номерами 24 (глутамин), 28 (пролин), 30 (лейцин), 31 (валин), 35 (аланин), 39 (метионин), 59 (лизин), 95 (серин), 106 (треонин), 110 (серин), 136 (треонин) и 137 (лейцин) тяжелой цепи cM30, представленной в SEQ ID NO: 63 в списке последовательностей, валином, аланином, валином, лизином, серином, валином, аланином, треонином, аргинином, треонином, лейцином и валином, соответственно, названа «тяжелой цепью M30-H4-типа».
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи M30-H4-типа представлена в SEQ ID NO: 91.
9)-3. Гуманизация легкой цепи M30
9)-3-1. Легкая цепь M30-L1-типа:
Гуманизированная легкая цепь M30, сконструированная с использованием замены аминокислот с номерами 21 (глутамин), 25 (серин), 29 (треонин), 30 (изолейцин), 33 (аланин), 38 (лизин), 39 (валин), 41 (метионин), 42 (треонин), 61 (серин), 62 (серин), 64 (лизин), 65 (пролин), 66 (триптофан), 77 (валин), 89 (серин), 90 (тирозин), 91 (серин), 97 (валин), 99 (аланин), 102 (аланин), 104 (треонин), 119 (треонин), 123 (лейцин) и 125 (лейцин) легкой цепи cM30, представленной в SEQ ID NO: 59 в списке последовательностей, глутаминовой кислотой, треонином, аланином, треонином, лейцином, аргинином, аланином, лейцином, серином, глутамином, аланином, аргинином, лейцином, лейцином, изолейцином, аспарагиновой кислотой, фенилаланином, треонином, лейцином, пролином, фенилаланином, валином, глутамином, валином и изолейцином, соответственно, названа «легкой цепью M30-L1-типа».
Аминокислотная последовательность легкой цепи M30-L1-типа представлена в SEQ ID NO: 71.
9)-3-2. Легкая цепь M30-L2-типа:
Гуманизированная легкая цепь M30, сконструированная с использованием замены аминокислот с номерами 21 (глутамин), 25 (серин), 29 (треонин), 30 (изолейцин), 33 (аланин), 38 (лизин), 39 (валин), 41 (метионин), 42 (треонин), 61 (серин), 62 (серин), 64 (лизин), 65 (пролин), 77 (валин), 89 (серин), 91 (серин), 97 (валин), 99 (аланин), 102 (аланин), 104 (треонин), 119 (треонин), 123 (лейцин) и 125 (лейцин) легкой цепи cM30, представленной в SEQ ID NO: 59 в списке последовательностей, глутаминовой кислотой, треонином, аланином, треонином, лейцином, аргинином, аланином, лейцином, серином, глутамином, аланином, аргинином, лейцином, изолейцином, аспарагиновой кислотой, треонином, лейцином, пролином, фенилаланином, валином, глутамином, валином и изолейцином, соответственно, названа «легкой цепью M30-L2-типа».
Аминокислотная последовательность легкой цепи M30-L2-типа представлена в SEQ ID NO: 73.
9)-3-3. Легкая цепь M30-L3-типа:
Гуманизированная легкая цепь M30, сконструированная с использованием замены аминокислот с номерами 29 (треонин), 30 (изолейцин), 33 (аланин), 38 (лизин), 39 (валин), 41 (метионин), 62 (серин), 65 (пролин), 77 (валин), 91 (серин), 97 (валин), 99 (аланин), 102 (аланин), 104 (треонин), 119 (треонин), 123 (лейцин) и 125 (лейцин) легкой цепи cM30, представленной в SEQ ID NO: 59 в списке последовательностей, аланином, треонином, лейцином, аргинином, аланином, лейцином, аланином, лейцином, изолейцином, треонином, лейцином, пролином, фенилаланином, валином, глутамином, валином и изолейцином, соответственно, названа «легкой цепью M30-L3-типа».
Аминокислотная последовательность легкой цепи M30-L3-типа представлена в SEQ ID NO: 75.
9)-3-4. Легкая цепь M30-L4-типа:
Гуманизированная легкая цепь M30, сконструированная с использованием замены аминокислот с номерами 21 (глутамин), 25 (серин), 29 (треонин), 30 (изолейцин), 33 (аланин), 38 (лизин), 39 (валин), 41 (метионин), 42 (треонин), 61 (серин), 62 (серин), 64 (лизин), 66 (триптофан), 77 (валин), 89 (серин), 90 (тирозин), 91 (серин), 96 (аргинин), 97 (валин), 99 (аланин), 102 (аланин), 104 (треонин), 119 (треонин), 123 (лейцин) и 125 (лейцин) легкой цепи cM30, представленной в SEQ ID NO: 59 в списке последовательностей, глутаминовой кислотой, треонином, аланином, треонином, лейцином, аргинином, аланином, лейцином, серином, глутамином, аланином, аргинином, лейцином, изолейцином, аспарагиновой кислотой, фенилаланином, треонином, серином, лейцином, пролином, фенилаланином, валином, глутамином, валином и изолейцином, соответственно, названа «легкой цепью M30-L4-типа».
Аминокислотная последовательность легкой цепи M30-L4-типа представлена в SEQ ID NO: 77.
9)-3-5. Легкая цепь M30-L5-типа:
Гуманизированная легкая цепь M30, сконструированная с использованием замены аминокислот с номерами 29 (треонин), 30 (изолейцин), 33 (аланин), 38 (лизин), 39 (валин), 41 (метионин), 62 (серин), 77 (валин), 91 (серин), 97 (валин), 99 (аланин), 102 (аланин), 104 (треонин), 119 (треонин), 123 (лейцин) и 125 (лейцин) легкой цепи cM30, представленной в SEQ ID NO: 59 в списке последовательностей, аланином, треонином, лейцином, аргинином, аланином, лейцином, аланином, изолейцином, треонином, лейцином, пролином, фенилаланином, валином, глутамином, валином и изолейцином, соответственно, названа «легкой цепью M30-L5-типа».
Аминокислотная последовательность легкой цепи M30-L5-типа представлена в SEQ ID NO: 79.
9)-3-6. Легкая цепь M30-L6-типа:
Гуманизированная легкая цепь M30, сконструированная с использованием замены аминокислот с номерами 21 (глутамин), 25 (серин), 29 (треонин), 30 (изолейцин), 33 (аланин), 38 (лизин), 39 (валин), 41 (метионин), 42 (треонин), 61 (серин), 62 (серин), 64 (лизин), 66 (триптофан), 77 (валин), 89 (серин), 90 (тирозин), 91 (серин), 97 (валин), 99 (аланин), 102 (аланин), 104 (треонин), 119 (треонин), 123 (лейцин) и 125 (лейцин) легкой цепи cM30, представленной в SEQ ID NO: 59 в списке последовательностей, глутаминовой кислотой, треонином, аланином, треонином, лейцином, аргинином, аланином, лейцином, серином, глутамином, аланином, аргинином, лейцином, изолейцином, аспарагиновой кислотой, фенилаланином, треонином, лейцином, пролином, фенилаланином, валином, глутамином, валином и изолейцином, соответственно, названа «легкой цепью M30-L6-типа».
Аминокислотная последовательность легкой цепи M30-L6-типа представлена в SEQ ID NO: 81.
9)-3-7. Легкая цепь M30-L7-типа:
Гуманизированная легкая цепь M30, сконструированная с использованием замены аминокислот с номерами 21 (глутамин), 25 (серин), 29 (треонин), 30 (изолейцин), 33 (аланин), 38 (лизин), 39 (валин), 41 (метионин), 42 (треонин), 61 (серин), 62 (серин), 64 (лизин), 66 (триптофан), 77 (валин), 89 (серин), 91 (серин), 97 (валин), 99 (аланин), 102 (аланин), 104 (треонин), 119 (треонин), 123 (лейцин) и 125 (лейцин) легкой цепи cM30, представленной в SEQ ID NO: 59 в списке последовательностей, глутаминовой кислотой, треонином, аланином, треонином, лейцином, аргинином, аланином, лейцином, серином, глутамином, аланином, аргинином, лейцином, изолейцином, аспарагиновой кислотой, треонином, лейцином, пролином, фенилаланином, валином, глутамином, валином и изолейцином, соответственно, названа «легкой цепью M30-L7-типа».
Аминокислотная последовательность легкой цепи M30-L7-типа представлена в SEQ ID NO: 83.
Пример 10. Получение гуманизированного антитела
10)-1. Конструирование векторов, экспрессирующих легкие цепи M30-L1-, M30-L2-, M30-L3-, M30-L4-, M30-L5-, M30-L6- и M30-L7-типа
Синтезировали ДНК, содержащие гены, кодирующие вариабельные области легкой цепи M30-L1-, M30-L2-, M30-L3-, M30-L4-, M30-L5-, M30-L6- или M30-L7-типа, представленные аминокислотами с номерами 21-128 в последовательности SEQ ID NO: 71, аминокислотами с номерами 21-128 в последовательности SEQ ID NO: 73, аминокислотами с номерами 21-128 в последовательности SEQ ID NO: 75, аминокислотами с номерами 21-128 в последовательности SEQ ID NO: 77, аминокислотами с номерами 21-128 в последовательности SEQ ID NO: 79, аминокислотами с номерами 21-128 в последовательности SEQ ID NO: 81 или аминокислотами с номерами 21-128 в последовательности SEQ ID NO: 83 в списке последовательностей, (GENEART, Inc. Artificial Gene Synthesis Service) на основе последовательностей с номерами SEQ ID NO: 70, 72, 74, 76, 78, 80 и 82, соответствующих нуклеотидным последовательностям, которые соответствуют указанным выше номерам последовательностей, соответствующим аминокислотным последовательностям. Затем каждый из фрагментов ДНК, полученных расщеплением синтезированных ДНК ферментами рестрикции NdeI и BsiWI, встраивали в универсальный вектор, экспрессирующий химерную и гуманизированную легкую цепь антитела (pEF6KCL), в участок, расщепленный ферментами рестрикции NdeI и BsiWI, конструируя таким образом векторы, экспрессирующие легкие цепи M30-L1-, M30-L2-, M30-L3-, M30-L4-, M30-L5-, M30-L6 и M30-L7-типа.
Полученные таким образом векторы экспрессии названы «pEF6KCL/M30-L1», «pEF6KCL/M30-L2», «pEF6KCL/M30-L3», «pEF6KCL/M30-L4», «pEF6KCL/M30-L5», «pEF6KCL/M30-L6» и «pEF6KCL/M30-L7», соответственно.
10)-2. Конструирование векторов, экспрессирующих тяжелую цепь M30-H1-, M30-H2-, M30-H3- и M30-H4-типа
Синтезировали ДНК, содержащие гены, кодирующие вариабельные области тяжелой цепи M30-H1-, M30-H2-, M30-H3- или M30-H4-типа, представленные аминокислотами с номерами 20-141 в последовательности SEQ ID NO: 85, аминокислотами с номерами 20-141 в последовательности SEQ ID NO: 87, аминокислотами с номерами 20-141 в последовательности SEQ ID NO: 89 или аминокислотами с номерами 20-141 в последовательности SEQ ID NO: 91 в списке последовательностей (GENEART, Inc. Artificial Gene Synthesis Service), на основе последовательностей с номерами SEQ ID NO: 84, 86, 88 и 90, соответствующих нуклеотидным последовательностям, которые соответствуют указанным выше номерам последовательностей, соответствующих аминокислотным последовательностям. Затем каждый из фрагментов ДНК, полученных расщеплением синтезированных ДНК ферментом рестрикции BlpI, встраивали в универсальный вектор, экспрессирующий гуманизированную тяжелую цепь антитела (pEF1FCCU), в участок, расщепленный ферментом рестрикции BlpI, таким образом конструируя векторы, экспрессирующие тяжелые цепи M30-H1-, M30-H2-, M30-H3- и M30-H4-типа.
Полученные таким образом векторы экспрессии названы «pEF1FCCU/M30-H1», «pEF1FCCU/M30-H2», «pEF1FCCU/M30-H3» и «pEF1FCCU/M30-H4», соответственно.
10)-3. Продуцирование гуманизированного антитела
9
2
2
1,2×10 клеток FreeStyle 293F (Invitrogen Corporation) в логарифмической фазе роста высевали в 1,2 л свежей среды для экспрессии FreeStyle 293 (Invitrogen Corporation) и культивировали в течение 1 часа при встряхивании со скоростью 90 об./мин при 37°C в инкубаторе с 8% CO. 3,6 мг полиэтиленимина (Polyscience №24765) растворяли в 20 мл среды Opti-Pro SFM (Invitrogen Corporation). Затем вектор для экспрессии тяжелой цепи (0,4 мг) и вектор для экспрессии легкой цепи (0,8 мг), полученные с использованием набора для плазмид PureLink HiPure (Invitrogen Corporation), суспендировали в 20 мл среды Opti-Pro SFM. Затем 20 мл полученной жидкой смеси векторы экспрессии/Opti-Pro SFM добавляли к 20 мл полученной жидкой смеси полиэтиленимин/Opti-Pro SFM и полученную в результате смесь осторожно перемешивали и затем оставляли на 5 минут. Затем смесь добавляли к клеткам FreeStyle 293F и осуществляли культивирование со встряхиванием при 90 об./мин в течение 7 суток при 37°C в инкубаторе с 8% CO. Полученный надосадок культуры фильтровали через одноразовый капсульный фильтр (Advantec № CCS-045-E1H).
Гуманизированное антитело М30, полученное в результате сочетания pEF1FCCU/M30-H1 и pEF6KCL/M30-L1, названо «М30-Н1-L1», гуманизированное антитело М30, полученное в результате сочетания pEF1FCCU/М30-H1 и pEF6KCL/M30-L2, названо «M30-H1-L2», гуманизированное антитело М30, полученное в результате сочетания pEF1FCCU/M30-H1 и pEF6KCL/M30-L3, названо «M30-H1-L3», гуманизированное антитело М30, полученное в результате сочетания pEF1FCCU/M30-H1 и pEF6KCL/M30-L4, названо «M30-H1-L4», гуманизированное антитело М30, полученное в результате сочетания pEF1FCCU/M30-H4 и pEF6KCL/M30-Ll, названо «М30-Н4-L1», гуманизированное антитело М30, полученное в результате сочетания pEF1FCCU/M30-H4 и pEF6KCL/M30-L2, названо «M30-H4-L2», гуманизированное антитело М30, полученное в результате сочетания pEF1FCCU/M30-H4 и pEF6KCL/M30-L3, названо «M30-H4-L3», гуманизированное антитело М30, полученное в результате сочетания pEF1FCCU/М30-Н4 и pEF6KCL/M30-L4, названо «M30-H4-L4», гуманизированное антитело М30, полученное в результате сочетания pEF1FCCU/М30-H1 и pEF6KCL/M30-L5, названо «M30-H1-L5», гуманизированное антитело М30, полученное в результате сочетания pEF1FCCU/M30-H1 и pEF6KCL/M30-L6, названо «M30-H1-L6» и гуманизированное антитело М30, полученное в результате сочетания pEF1FCCU/M30-H1 и pEF6KCL/M30-L7, названо «M30-H1-L7».
10)-4. Очистка гуманизированного антитела
Надосадок культуры, полученный, как описано в примере 10)-3, очищали двухстадийным способом, включающим аффинную хроматографию на белке A (rProtein A) (при 4-6°C) и керамическом гидроксиапатите (при комнатной температуре). Стадию замены буфера A после очистки аффинной хроматографии на rProtein A и после очистки на керамическом гидроксиапатите осуществляли при комнатной температуре.
Сначала 1100-1200 мл надосадка культуры наносили на MabSelect SuRe (производства GE Healthcare Bio-Sciences Corporation, две колонки HiTrap (объем: 1 мл), соединенные последовательно), уравновешенные PBS. После выливания всего культурального раствора на колонку такую колонку промывали, используя 15-30 мл PBS. Затем осуществляли элюирование 2 М раствором гидрохлорида аргинина (pH 4,0) и собирали фракцию, содержащую антитело. Фракцию наносили на колонку для обессоливания (производства GE Healthcare Bio-Sciences Corporation, две колонки для обессоливания HiTrap (объем: 5 мл), соединенные последовательно), при этом буфер заменяли на буфер, содержащий 5 мМ фосфат натрия, 50 мМ MES и 20 мМ NaCl, pH 6,5.
Затем раствор антитела, подвергнутый замене буфера, наносили на колонку с керамическим гидроксиапатитом (Japan Bio-Rad Laboratories, Inc., колонка с гидроксиапатитом Bio-Scale CHT2-1 (объем: 2 мл)), уравновешенную буфером, содержащим 5 мМ NaPi, 50 мМ MES и 20 мМ NaCl, pH 6,5. Затем осуществляли элюирование, используя линейный градиент концентрации хлорида натрия, и собирали фракцию, содержащую антитело.
Фракцию наносили на колонку для обессоливания (производства GE Healthcare Bio-Sciences Corporation, две колонки для обессоливания HiTrap (объем: 5 мл), соединенные последовательно), при этом жидкость заменяли на CBS (содержащий 10 мМ цитратный буфер и 140 мМ хлорид натрия, pH 6,0).
Наконец, полученный раствор концентрировали, используя центрифужное устройство для ультрафильтрации UF VIVASPIN 20 (молекулярная масса фракции: 30 К, Sartorius Co., Ltd., при 4°C), и концентрацию IgG доводили до 1,0 мг/мл или больше и полученный таким образом раствор использовали в качестве очищенного образца.
10)-5. Свойство гуманизированного антитела связываться с антигеном B7-H3
Свойство гуманизированного антитела M30 связываться с B7-H3 человека, который является антигеном, измеряли с использованием устройства для измерения резонанса поверхностного плазмона (SPR) (Biacore, Inc.). Согласно общепринятым способам, антитело против IgG человека иммобилизовали на сенсорном чипе и затем связывали с ним каждый из очищенных образцов гуманизированных антител M30, полученных, как описано выше в разделе 10)-4. Затем добавляли полипептид внеклеточного домена антигена B7-H3 варианта 2 (производства R&D Systems, Inc., №2318-B3-050/CF) в разных концентрациях и измеряли количество антигена, связанного с антителом в рабочем буфере (фосфатный буфер, 0,05% SP20) с течением времени. Измеряемое количество анализировали с помощью специальной компьютерной программы (BIAevaluation) и вычисляли константу диссоциации (Kd [М]). Измерение осуществляли, используя антитело cM30 в качестве позитивного контроля для каждой операции измерения. Результаты показаны в таблице 3. Все гуманизированные антитела M30 обладают активностью связывания антигена B7-H3.
Таблица 3
Kd [M]
M30-H1-L1
8,7E-08
M30-H1-L2
1,0E-07
M30-H1-L3
1,0E-07
M30-H1-L4
1,6E-08
M30-H4-L1
1,3E-07
M30-H4-L2
1,4E-07
M30-H4-L3
1,6E-07
M30-H4-L4
1,2E-08
M30-H1-L5
1,9E-09
M30-H1-L6
3,4E-09
M30-H1-L7
2,7E-09
cM30
7,3E-10
Пример 11. Измерение ингибирующих активностей антитела cM30 и гуманизированного антитела M30, конкурирующих с антителом M30 за связывание с антигеном B7-H3
Ингибирующие активности антитела cM30 и гуманизированного антитела M30 (антитела M30-H1-L4), конкурирующих с антителом M30 за связывание с вариантом 1 и вариантом 2 B7-H3, измеряли следующим способом.
Используя набор для биотинилирования EZ-Link Sulfo-NHS-LC (производства Thermo Scientific Corporation, №21435) и следуя прилагаемому протоколу, биотинилировали соответствующие мышиные моноклональные антитела M30 (далее соответствующие биотинилированные антитела M30 называют «bM30»). Кроме того, в качестве буфера, используемого в следующем способе ELISA, во всех случаях использовали BD OPTI EIA (BD Biosciences, Inc., №550536).
Каждый из полипептидов: полипептид внеклеточного домена B7-H3 варианта 1 (производства R&D Systems, Inc., № 1949-B3-050/CF) и полипептид внеклеточного домена B7-H3 варианта 2 (производства R&D Systems, Inc., № 2318-B3-050/CF), разбавляли до 0,5 мкг/мл буфером для покрывания и полученный в результате раствор распределяли по 100 мкл/лунку в иммунологический планшет (производства Nunc, Inc., № 442404). Затем планшет оставляли стоять в течение ночи при 4°C, при этом белок адсорбировался на планшете. На следующий день разносили разбавитель для анализа по 200 мкл/лунку и планшет оставляли стоять при комнатной температуре в течение 4 часов.
После удаления раствора из каждой лунки вносили раствор смеси биотинилированного антитела в концентрации 5 мкг/мл и немеченого антитела в разных концентрациях (0 мкг/мл, 1 мкг/мл, 5 мкг/мл, 25 мкг/мл, 50 мкг/мл или 125 мкг/мл) по 100 мкл/лунку в разбавителе для анализа и планшет оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа.
После промывки каждой лунки два раза буфером для промывки добавляли конъюгат стрептавидина-пероксидазы хрена (производства GE Healthcare Bio-Sciences Corporation, № RPN1231V), разбавленного в 500 раз разбавителем для анализа, по 100 мкл/лунку и планшет оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа.
После удаления раствора из каждой лунки и промывки каждой лунки два раза буфером для промывки добавляли раствор субстрата по 100 мкл/лунку и обеспечивали возможность протекания реакции развития окраски при перемешивании реакционной смеси. После завершения развития окраски добавляли блокирующий буфер по 100 мкл/лунку, чтобы остановить реакцию развития окраски. Затем измеряли поглощение при 450 нм, используя устройство для считывания планшетов.
В результате поглощение в лунке, в которую добавляли только bM30, составляло 2,36±0,05 (среднее ± стандартное отклонение (n=12)) в планшете, с которым связывали полипептид внеклеточного домена B7-H3 варианта 1, и 1,90±0,20 (среднее ± стандартное отклонение (n=12)) в планшете, с которым связывали полипептид внеклеточного домена B7-H3 варианта 2.
Поглощение, показанное на графиках на фиг. 10, выражено в виде среднего ± стандартное отклонение (n=3). Контрольный IgG не ингибировал связывание bM30 с B7-H3.
С другой стороны, было показано, что связывание bM30 с B7-H3 ингибируется самим антителом M30, антителом cM30, которое представляет собой химерное антитело, полученное из антитела M30, и M30-H1-L4, которое представляет собой гуманизированное антитело, в обоих планшетах; в планшете, с которым связывали полипептид внеклеточного домена B7-H3 варианта 1, и в планшете, с которым связывали полипептид внеклеточного домена B7-H3 варианта 2.
То есть, было показано, что антитело cM30 и гуманизированное антитело (антитело M30-H1-L4) распознают тот же эпитоп антигена B7-H3, что и антитело M30.
Пример 12. Активность гуманизированного антитела М30
12)-1. ADCP-активность гуманизированного антитела М30
2
5
РВМС здорового человека выделяли общепринятым способом и суспендировали в 10% FSB-содержащем RPMI 1640 и затем высевали во флакон. Клетки культивировали в течение ночи в CO-инкубаторе. Надосадок культуры удаляли и к клеткам, прикрепленным к стенкам флакона, добавляли 10% FBS-содержащий RPMI 1640 с добавлением М-CSF и GM-CSF (PeproTech, Inc.) и клетки культивировали в течение 2 недель. Клетки открепляли, используя TrypLE, и собирали. Затем клетки добавляли в 24-луночный планшет по 500 мкл/лунку (1×10 клетки/лунку) и культивировали в течение ночи при 37°C. Полученные таким образом клетки использовали в качестве эффекторных клеток.
7
Мечение клеток NCI-H322, используемых в качестве клеток-мишеней, осуществляли с использованием набора для мечения красителем PKH26 (Sigma Co., Ltd.). Клетки-мишени открепляли, используя TrypLE, и два раза промывали PBS. Клетки суспендировали в разбавителе С в концентрации 1×10 клеток/мл. Исходный раствор красителя PKH26 (1 мМ) разбавляли до 8 мкМ разбавителем С и сразу после этого разбавленный раствор красителя добавляли к клеткам в количестве, равном количеству суспензии клеток. Полученную смесь оставляли при комнатной температуре на 5 минут. Затем к смеси добавляли 1 мл сыворотки и затем добавляли среду с сывороткой и промывали два раза.
6
Каждое из антител: антитело М30, антитело сМ30 и гуманизированное антитело М30 (антитело M30-H1-L4), разбавляли до концентрации 20 мкг/мл, используя 10% FBS-содержащий RPMI (Invitrogen Corporation). Затем клетки-мишени (клетки NCI-H322) распределяли по 2×10 клеток/100 мкл/пробирку и перемешивали. Полученную смесь оставляли стоять на льду на 30 минут. Надосадок удаляли и клетки промывали два раза культуральным раствором и суспендировали в 500 мкл культурального раствора.
2
Надосадок из эффекторных клеток удаляли и к клеткам добавляли клетки, обработанные антителом M30, антителом cM30 или гуманизированным антителом M30 (антитело M30-H1-L4) и суспендированные в культуральном раствор, и перемешивали. Затем клетки культивировали в течение 3 часов в CO-инкубаторе.
Затем клетки открепляли трипсином-EDTA и собирали.
К собранным клеткам добавляли ФИТЦ-меченое антитело против CD11b мыши (Becton, Dickinson and Company, Ltd.) и полученную в результате смесь оставляли стоять на льду на 30 минут.
Надосадок удаляли и клетки два раза промывали культуральным раствором.
Собранные клетки суспендировали в 300 мкл культуральной среды и анализировали, используя FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company, Ltd.). В CD11b-позитивных макрофагах оценивали PKH26-позитивную фракцию в качестве позитивных в отношении фагоцитоза клеток.
Результаты показаны на фиг. 11.
В группе, в которой добавляли гуманизированное антитело M30 (антитело M30-H1-L4), наблюдали ADCP-активность, направленную против клеток NCI-H322, так же, как в группах, в которых добавляли антитело M30 или антитело cM30.
12)-2. ADCC-активность гуманизированного антитела M30
2
РВМС здорового человека выделяли общепринятым способом и суспендировали в 10% FBS-содержащем RPMI 1640 и затем высевали во флакон. Клетки культивировали в течение ночи в CO-инкубаторе.
6
Плавающие клетки собирали, затем осуществляли промывку и полученные клетки использовали в качестве лимфоцитов периферической крови (PBL). Полученные PBL суспендировали вне содержащей фенолового красного среде RPMI 1640 (производства Invitrogen Corporation), содержащей 10% фетальной сыворотки теленка (производства Invitrogen Corporation) (далее сокращенно называемой «средой ADCC»), и суспензию клеток пропускали через клеточное сито (размер пор: 40 мкм, производства BD Biosciences, Ltd.). Затем подсчитывали живые клетки в анализе, основанном на исключении клеток при окрашивании красителем трипановым синим. После центрифугирования суспензии PBL, среду удаляли и клетки ресуспендировали в среде ADCC при плотности живых клеток 2,5×10 клеток/мл и использовали в качестве эффекторных клеток.
6
5
2
Клетки NCI-H322 обрабатывали трипсином и обработанные клетки промывали RPMI 1640, содержащей 10% FBS, и затем ресуспендировали в RPMI 1640, содержащей 10% FBS. Клетки (4×10 клеток) смешивали с хромом-51 (5550 кВк), стерилизованным пропусканием через фильтр 0,22 мкм, и мечение осуществляли в течение 1 часа в условиях 37°C и 5% CO. Меченые клетки промывали три раза средой ADCC и клетки ресуспендировали в концентрации 2×10 клеток/мл в среде ADCC и использовали в качестве клеток-мишеней.
5
6
2
Клетки-мишени с плотностью клеток 2×10 клеток/мл распределяли по 50 мкл/лунку в 96-луночный планшет с микролунками с U-образным дном. В него добавляли по 50 мкл каждого из антител: антитела cM30 и гуманизированных антител M30 (M30-H1-L4, M30-H4-L4, M30-H1-L5, M30-H1-L6 и M30-H1-L7), разбавленных средой ADCC так, чтобы конечная концентрация антитела после добавления эффекторных клеток составляла 1, 10, 100 или 1000 нг/мл. Затем добавляли 100 мкл эффекторных клеток с плотностью клеток 2,5×10 клеток/мл и клетки культивировали в течение 4 часов в условиях 37°C и 5% CO. Надосадок собирали в LumaPlate (производства PerkinElmer, Inc.) и измеряли испускаемое гамма-излучение, используя гамма-счетчик. Процент лизиса клеток, вызываемого ADCC-активностью, вычисляли согласно следующему уравнению.
Лизис клеток в процентах (%) = (A-B)/(C-B)×100
A: количество излучения от лунки с образцом.
B: среднее количество испускаемого спонтанного излучения (от лунок, в которые не добавляли антитело и эффекторные клетки) (n=3). Осуществляли такой же способ, как и в случае лунок с образцом, за исключением того, что добавляли среду ADCC в количестве 50 мкл во время добавления антитела и в количестве 100 мкл во время добавления эффекторных клеток.
C: Среднее максимальное количество испускаемого излучения (от лунок, в которых клетки-мишени были растворены с использованием поверхностно-активного вещества) (n=3). Осуществляли такой же способ, как и в случае лунки с образцом, за исключением того, что добавляли 50 мкл среды ADCC во время добавления антитела и 100 мкл среды ADCC, содержащей 2% (об./об.) тритона X-100, во время добавления эффекторных клеток.
Результаты показаны в таблице 4 и на фиг. 12.
Данные показаны в виде средних измерений из трех повторов, и планки погрешностей представляют стандартные отклонения. P-значение вычисляли, используя t-критерий Стьюдента.
В группе с добавлением антитела M30-H1-L4 наблюдали ADCC-активность так же, как и в группе с добавлением антитела cM30. Также наблюдали, что другие гуманизированные антитела M30 (M30-H4-L4, M30-H1-L5, M30-H1-L6 и M30-H1-L7) обладают ADCC-активностью.
Таблица 4
1 нг/мл
10 нг/мл
100 нг/мл
1000 нг/мл
Среднее (%)
Стандартное отклонение
Среднее (%)
Стандартное отклонение
Среднее (%)
Стандартное отклонение
Среднее (%)
Стандартное отклонение
IgG человека
3,8
1,6
6,8
1,5
3,9
1,4
6,5
0,5
cM30
11,1
1,2
40,5
2,7
84,3
2,3
88,2
4,0
M30-H1-L4
11,5
1,0
43,1
0,1
83,6
0,7
84,7
1,0
M30-H4-L4
7,6
1,1
26,6
1,6
68,9
2,6
81,7
1,5
M30-H1-L5
9,6
1,1
30,5
2,0
67,8
5,0
78,8
3,0
M30-H1-L6
9,8
1,6
32,0
2,2
74,7
4,0
81,3
2,0
M30-H1-L7
8,3
0,7
29,4
0,7
71,7
2,0
80,7
0,7
12)-3. Противоопухолевое действие гуманизированного антитела M30 in vivo
6
Клетки MDA-MB-231 открепляли от культурального флакона обработкой трипсином и затем суспендировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% FBS (Invitrogen Corporation), с последующим центрифугированием и надосадок удаляли. Клетки два раза промывали такой же средой и затем суспендировали в матриксе базальной мембраны BD Matrigel (производства BD Biosciences, Inc.). Затем клетки имплантировали подкожно в подмышечную область мышей каждой группы (FOX CHASE SCID C.B.17/Icr-scid/scidJcl, CLEA Japan, Inc.) 6-недельного возраста в дозе 5×10 клеток/мышь. День имплантации считали 0 днем, и на 14, 21, 28, 35 и 42 день внутрибрюшинно вводили гуманизированное антитело M30 (M30-H1-L4) в дозе 10, 1, 0,1 или 0,01 мг/кг (примерно 200, 20, 2 или 0,2 мкг/мышь, соответственно). Объем опухоли измеряли на 14, 18, 21, 25, 28, 31, 35, 39, 42, 45 и 49 день и оценивали противоопухолевое действие введения антитела.
В результате, в группах введения гуманизированного антитела M30 (антитела M30-H1-L4) в дозе 10, 1 и 0,1 мг/кг рост опухолей был значимо подавлен по сравнению с необработанной группой, в которой антитело не вводили. В группах введения гуманизированного антитела M30 (антитела M30-H1-L4) в дозе 10, 1 и 0,1 мг/кг степень ингибирования роста опухолей (= 100-(средняя масса опухолей в группе введения антитела)/(средняя масса опухолей в необработанной группе)×100) по сравнению с необработанной группой в расчете на массу опухолей на 49 день составляла 67, 54 и 51%, соответственно, и все P-значения были < 0,0001. P-значения вычисляли, используя критерий Даннета для множественного сравнения.
Кроме того, степень ингибирования роста опухолей (%) (= 100 - (средний объем опухоли в группе введения антитела)/(средний объем опухоли в необработанной группе)×100) антителом M30-H1-L4 на 49 день в группах введения 10, 1, 0,1 и 0,01 мг/кг составляла 84, 68, 61 и 30%, соответственно. Также наблюдали, что гуманизированное антитело M30 (антитело M30-H1-L4) оказывает очень сильное противоопухолевое действие in vivo также как и антитело M30 и антитело cM30, и было подтверждено, что эффект проявляется зависимым от дозы образом (Фиг. 38).
Промышленная применимость
Анти-B7-H3-антитело согласно изобретению обладает противоопухолевой активностью, и фармацевтическая композиция, содержащая анти-B7-H3-антитело, может быть противораковым средством.