Противоопухолевые вакцины на основе белков теплового шока

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ БИОТЕРАПИЯ 3

УДК 616-006-085.373:577.112

K.D. Nikitin, A.Yu. Baryshnikov

HEAT SHOCK PROTEIN-BASED ANTICANCER VACCINES

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow

ABSTRACT

Heat shock proteins (HSP) are phylogenetically old intracellular proteins that can be found in all types of nuclear cells. The variety of HSP functions is associated with their ability to bind cellular proteins and peptides; these complexes then participate in numerous processes (protein folding and transportation, anti-stress protection, etc.). One of important properties of HSPs is their recently identified ability to potentiate the immunogenicity of bound antigenic peptides. If HSP-peptide complexes (HSP-PCs) release into extracellular space they become captured by antigenpre-senting cells and induce an effective immune response. This property allows using of purified HSP-PCs for treatment and prophylaxis of infectious and oncological diseases. The proposed literature review is dedicated to molecular mechanisms of HSP-PCs immunogenicity and their use for biotherapy of cancer.

Key words: heat shock proteins, anticancer vaccines.

К.Д. Никитин, А.Ю. Барышников

ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ВАКЦИНЫ НА ОСНОВЕ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА

ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

РЕЗЮМЕ

Белки теплового шока (БТШ) - филогенетически древние внутриклеточные белки, встречающиеся во всех ядерных клетках. Многообразие функций БТШ связано с их способностью связываться с другими белками и пептидами и в виде таких комплексов участвовать в самых разнообразных клеточных процессах (фолдинг, транспортировка белков, защита клеток от стрессов и т.д.). Одним из важных свойств БТШ является открытая в последние десятилетия их способность многократно повышать иммуногенность антигенных пептидов, связанных с ними: попав во внеклеточное пространство, комплексы БТШ с пептидами (БТШ-ПК) захватываются антигенпрезентирующими клетками и вызывают эффективный иммунный ответ. Это свойство позволяет использовать очищенные БТШ-ПК для лечения и профилактики инфекционных и онкологических заболеваний. Данный обзор посвящен молекулярным механизмам иммуногенности БТШ-ПК и их применению для вакцинотерапии злокачественных новообразований.

Ключевые слова: белки теплового шока, противоопухолевые вакцины.

ВВЕДЕНИЕ

Несомненные успехи химиотерапии опухолей в последние годы привели к выраженному прогрессу в области лечения онкологических заболеваний. В то же время ряд опухолей по-прежнему остаются практически неизлечимы, особенно на поздних стадиях. Это, а также значительный прогресс науки в области иммунологии и молекулярной биологии обусловливает активные поиски способов иммунотерапии рака как самой по себе, так и в сочетании с другими методами лечения.

Иммунотерапия рака - направление в лечении злокачественных новообразований, основывающееся на усилении иммунного ответа на опухоль. Уже более

60 лет назад было показано в экспериментах на животных, что иммунизация сингенных мышей опухолевыми клетками делает их более устойчивыми к последующему повторному заражению этими клетками. Эти и другие эксперименты позволили сформулировать 2 важнейших принципа онкоиммунологии:

1) опухоли иммуногенны;

2) иммунитет против данной конкретной опухоли строго специфичен, т.е. каждая опухоль высоко индивидуальна по своему антигенному составу.

Первый из этих принципов отнюдь не нов - на нем основывается теория иммунного надзора Бернета, хотя убедительное подтверждение он получил относительно недавно. Второй же принцип является одно-

временно и главным аргументом в пользу возможности применения иммунотерапии, и главным препятствием на пути ее развития.

Два упомянутых принципа онкоиммунологии привели к активному поиску антигенов, индивидуальных для опухолевых клеток. Были идентифицированы многочисленные молекулы, как мембранные, так и локализованные в клеточной цитоплазме, более или менее специфичные для различных видов новообразований [52]. Многие из них в настоящее время активно используются в клинической практике для диагностики злокачественных новообразований и определения их прогноза (а-фетопротеин, PSA, мембранные антигены лейкоцитов). Однако попытки применения этих антигенов в качестве противоопухолевых вакцин пока что не увенчались успехом.

Одним из способов поиска опухоль-ассоциированных антигенов является разделение опухолевых гомогенатов на белковые фракции различными хроматографическими методами и иммунизация этими фракциями животных. Фракции, вызывающие протек-тивный иммунитет против опухолевых клеток, из которых они получены, далее разделяются на еще более чистые составляющие и анализируются сходным путем до тех пор, пока не будет получен непосредственно тот белок, который и вызывает иммунитет. Подобным образом были продемонстрированы иммуногенные свойства белков теплового шока (БТШ), или, в англоязычной литературе, HSP (heat shock proteins). P.K. Srivastava et al. (1986), выделили gp96 из 2 химически индуцированных сарком и определили его как антиген, ответственный за иммуногенность изучаемых опухолей. Дальнейшие исследования показали, что белки теплового шока являются многообещающими кандидатами для использования в качестве противоопухолевых вакцин.

БЕЛКИ ТЕПЛОВОГО ШОКА -УБИКВИТАРНЫЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ БЕЛКИ

БТШ впервые были описаны A. Tissieres et al. в 1974 г. у дрозофил, подвергнутых тепловому шоку [66]. БТШ обнаруживаются во множестве внутриклеточных структур (в цитоплазме, ядре, эндоплазмати-ческом ретикулуме, митохондриях и хлоропластах), во всех ядерных клетках у всех многоклеточных организмов, начиная с самых примитивных - как у растений, так и у животных. БТШ являются одними из самых консервативных и филогенетических древних белков организма: степень гомологии между БТШ эукариот и прокариот составляет более 50 %, а некоторые домены полностью идентичны [41; 73].

Термин «белки теплового шока» не является идеальным по нескольким причинам. Во-первых, БТШ синтезируются в некотором количестве во всех тканях постоянно, вне зависимости от воздействия стрессовых факторов [21]. Во-вторых, повышение внутриклеточного синтеза БТШ происходит отнюдь не только на тепловой шок, но на любое стрессовое воздействие: внешнее (УФ, тепловой шок, тяжелые металлы,

аминокислоты), патологическое (вирусные, бактериальные и паразитарные инфекции, лихорадка, воспаление, злакачественная трансформация, аутоиммунные реакции) или даже физиологическое (ростовые факторы, клеточная дифференциация, гормональная стимуляция, тканевой рост) [41].

ФУНКЦИИ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА

Функции БТШ в клеточном метаболизме необычайно широки и, несмотря на 30-летнюю историю интенсивного изучения, до конца не расшифрованы. Известно, что БТШ являются универсальными молекулярными шаперонами (от англ. chaperon - сопровождать), т.е. белками, связывающимися с другими молекулами, и в таком комплексе выполняющими определенные функции [27].

БТШ участвуют в фолдинге белков

Основной функцией БТШ считается связывание но-вообразующихся белков и контроль корректного формирования их третичной структуры (фолдинга): связываясь с растущими пептидными цепями еще на рибосоме, БТШ предотвращают их неспецифическую агрегацию, предохраняют от преждевременного протео-литического распада и способствуют правильному и своевременному сворачиванию полипептида в трехмерную структуру. БТШ также связывают мутантные белки или белки, чья третичная структура уже сформировалась неверно, и защищают клетку от воздействия таких белков (причем некоторые БТШ - а именно, представители семейства HSP70, обладают свойствами фермента, исправляющего неправильно сформировавшиеся белки за счет энергии АТФ) [25; 31].

БТШ - внутриклеточные транспортеры

БТШ участвуют в процессах транспортировки белковых молекул через мембраны митохондрий и ядерную оболочку [27; 32], в процессинге антигенов и связывании процессированных пептидов с молекулами МНС I класса [11; 46; 62].

БТШ препятствуют денатурации белков

При воздействии любого стрессорного фактора из перечисленных выше активность БТШ резко возрастает. БТШ в клетке, подвергнутой стрессу, интенсивно связываются с денатурирующими белками и поддерживают поврежденные белки в состоянии, способном к последующему восстановлению [38; 47]. В норме БТШ присутствуют в цитоплазме в комплексе со специальным транскрипционным фактором HSF (от англ. heat shock factor - фактор теплового шока). При стрессорном воздействии HSF отделяется от БТШ, образует тримеры, приобретает ДНК-связывающую активность и накапливается в ядре, где активирует транскрипцию дополнительных шаперонов и подавляет транскрипцию других генов. По прошествии стрессорного воздействия освободившиеся БТШ связывают HSF и переходят в исходное состояние.

Таким образом, синтез БТШ является универсальным неспецифическим ответом клетки на стресс, и, по современным данным, не известно такого вида клеточного стресса, при котором не происходило бы синтеза БТШ [24; 41].

БТШ и клеточная смерть

БТШ участвуют также в защите клеток от стресс-индуцируемого апоптоза, блокируя пути его активации и стабилизируя клеточные структуры [48]. Известно, что опухолевые клетки синтезируют повышенное количество БТШ [28], что предохраняет их от запуска апоптоза в ответ на стрессорные воздействия [34], а снижение синтеза БТШ в опухолях облегчает индукцию апоптоза [37] и понижает их способность к прогрессированию [26; 35].

Предполагается участие БТШ также в процессах клеточной смерти и очищения организма от некротизи-рованных клеток. Поскольку БТШ являются широко распространенными растворимыми внутриклеточными белками, они могут служить надежными вестниками некроза, участвовать в межклеточном сигнализировании, сообщая иммунной системе о наступлении клеточной смерти и необходимости утилизации некротических масс. Эти предположения подтверждаются также наблюдениями того, что высвобождение внутриклеточных БТШ происходит только в случае гибели клетки путем некроза, но не апоптоза [7].

СЕМЕЙСТВА БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА

Выделяют 4 основных семейства БТШ:

1) БТШ90 (HSP90) - группа высокомолекулярных БТШ, имеющих у млекопитающих молекулярную массу 90 кДа (у дрожжей 104, у дрозофил 83 кДа), наиболее изученным представителем семейства является Grp94 (Grp - от англ. glucose-regulated protein, «белок, регулируемый глюкозой») или другое его обозначение gp96 (gp - от англ. glycoprotein, гликопротеин);

2) БТШ70 (HSP70) - семейство белков с молекулярной массой около 70 кДа, наиболее широко распространенные и лучше всего изученные БТШ млекопитающих;

3) малые БТШ, чей молекулярный вес варьирует от 15 до 30 кДа [4; 41];

4) высокомолекулярные БТШ, представителем которых является gp110.

Несмотря на общую задачу всех этих белков -обеспечение выживания клетки в условиях стресса, -функции и тканеспецифичность БТШ варьируют от группы к группе в нормальных условиях и при стрессе.

БЕЛКИ ТЕПЛОВОГО ШОКА УСИЛИВАЮТ ИММУНОГЕНННОСТЬ АНТИГЕННЫХ ПЕПТИДОВ

В процессе поиска опухолеспецифических антигенов было установлено, что БТШ обладают определенными иммуногенными свойствами. Известно, что БТШ

не специфичны для каких-либо видов опухолей или даже для злокачественных новообразований вообще - они могут быть выделены из почти всех нормальных тканей организма. Иммунитет, вызываемый БТШ, строго специфичен и направлен только против той одной единственной опухоли, из ткани которой они были выделены.

Было предположено, что специфичность БТШ в зависимости от опухоли связана с тканевой гетерогенностью БТШ, т.е. их соматическим полиморфизмом: БТШ одного и того же организма отличаются от ткани к ткани, от нормальной ткани к опухоли и от опухоли к опухоли. Однако изучение последовательности комплементарных ДНК как опухолевых, так и нормальных БТШ не подтвердило этой гипотезы [60], и, таким образом, природа иммуногенности БТШ оставалась неясна.

Поскольку препараты БТШ, использовавшиеся для определения их иммуногенности, были одинаковы по всем критериям, было предположено, что за специфическую иммуногенность разных образцов БТШ отвечают не собственно БТШ, а некие вещества, ассоциированные с БТШ, но не определяемые стандартными методами [58]. Предположение это получило неожиданное подтверждение. Было обнаружено большое количество пептидов, ассоциированных с Hsp70 [33; 39], а удаление их из препаратов Hsp70 лишало последних иммуногенных свойств [67].

В большом количестве работ было показано, что БТШ могут связывать фрагменты практически любых белков, как эндогенных, так и экзогенных, как природных, так и модельных.

Так, D. Arnold et al. (1997) [2] показали, что иммунизация белком gp96, полученным из клеток, трансфицированным геном ß-галактозидазы, вызывает цито-токсический иммунитет против определенного эпитопа ß-галактозидазы. Аналогично иммунизация белком gp96 из клеток, экспрессирующих определенные антигены малого комплекса гистосовместимости, вызывает цитотоксический иммунитет против этих антигенов.

T.J. Nieland et al. (1996) [50] идентифицировали вирусный эпитоп, ассоциированный с gp96, выделенным из клеток, инфицированных этим вирусом; данный эпитоп не определялся с БТШ, выделенными из не инфицированных данным вирусом клеток. N.E. Blachere et al., (1997) [16] воспроизвели in vitro комплексы gp96-пептид и Шр70-пептид и показали на примере широкого спектра пептидов, что БТШ и пептиды сами по себе не вызывают иммунного ответа, но их комплексы (БТШ-пептидные комплексы, БТШ-ПК) вызывают пролиферацию цитотоксических СD8+-лимфоцитов. Сходные результаты были получены и в других исследованиях [20; 49; 72].

Принципиально важным представляется тот факт, что из БТШ-ПК, полученных из опухолевых клеток, выделяются и опухолевые антигены: Melan-A/MART-1 для меланомы, CEA и EpCAM в случае колоректального рака и некоторые другие [17; 51; 55].

Способность БТШ к связыванию пептидов также подтверждается структурными исследованиями S. Vogen et al., 2002 [70], N.A. Linderoth et al., 2000 [40], X. Zhu et

а1., 1996 [74], в которых было показано наличие пептид-связывающих карманов в молекулах Нр70 и gp96. Предполагается, что наличие пептид-связывающих структур в молекулах БТШ важно как для выполнения ими шаперонных внутриклеточных функций, так и для участия в процессах межклеточного взаимодействия при иммунных реакциях [63]. В то же время, несмотря на значительное число исследований, структурные требования для связывания пептидов с БТШ остаются окончательно не известными, поскольку первичные аминокислотные последовательности пептидов, элюированных из комплексов с БТШ, весьма различны.

Было показано, что макрофаги (но не В-лимфоциты), фибробласты и другие АПК захватывают БТШ-ПК, выделяют из них непосредственно антигенные пептиды и презентируют их на своей поверхности эффекторным клеткам иммунной системы в комплексе с молекулами МНС I и II класса [16; 18; 23; 30; 59; 61; 64]. АПК, активированные БТШ-пептидными комплексами, вызывают активацию клеточного и гуморального иммунных ответов против антигенов опухолей, из которых эти БТШ-ПК выделены. Этот процесс «реперезентации» (т.е. выделения антигенных детерминант из комплексов с одними молекулами и презентация в комплексах с другими) включает в себя перемещение антигенных пептидов по определенным внутриклеточным структурами [12] и сопровождается также синтезом широкого спектра ци-токинов и костимулирующих молекул [8].

Помимо активации CD8+ и CD4+ Т-лимфоцитов, иммунизация белками теплового шока вызывает и КК-ответ, что представляется важнейшим механизмом протективного противоопухолевого иммунитета. Вероятно, активация КК-ответа также является следствием синтеза цитокинов антигенпрезентирующими клетками и, в первую очередь, интерлейкина-12. В конечном итоге репрезентированные в комплексе с молекулами МНС I и II классов антигенные пептиды вызывают специфическую активацию иммунного ответа.

Таким образом, иммуногенность полученных из опухолевых образцов БТШ-пептидных комплексов зависит от связанных с последними пептидов. БТШ не иммуногены сами по себе, но являются эволюционно сформировавшимся физиологическим механизмом усиления иммуногенности чужеродных белков, попавших в организм или образовавшихся в нем.

РЕЦЕПТОРЫ АНТИГЕНПРЕЗЕНТИРУЮЩИХ КЛЕТОК К БТШ-ПК

Первый ключ к разгадке механизмов, посредством которых иммунизация БТШ-ПК вызывает активацию антиген-специфических CD8+ Т-лимфоцитов, был найден в исследованиях, которые показали, что инициация иммунного ответа с помощью БТШ-ПК исключительно чувствительна к нормальному функционированию фагоцитирующих клеток, но не зависит от CD4+ Т-лимфоцитов [68]. Это наблюдение, а также тот факт, что даже чрезвычайно малые количества БТШ-ПК вызывают специфический иммунный ответ, привели к предположению о

существовании рецепторов к БТШ-ПК на поверхности антигенпрезентирующих клеток (АПК) [60]. Свидетельства существования рецептора (или рецепторов) к БТШ-ПК были получены независимо несколькими группами исследователей [3; 14; 57; 71].

Первым из таких рецепторов был идентифицирован CD91, он же рецептор а2-макроглобулина (а2-МГ) [15; 44]. Впоследствии в качестве подобных рецепторов были предложены также молекулы LOX1 [22], TLR2 и TLR4 [6; 69], CD14 [5].

Наиболее изученным на сегодняшний день является взаимодействие БТШ-ПК с CD91. Связывание gp96-nK с CD91 ведет к погружению (интернализации) комплекса в клетку и через последующие внутриклеточные события к презентации антигенного пептида в комплексе с молекулами МНС I и II классов [44]. Моноклональные антитела к CD91 и а2-МГ ингибируют иммуногенные свойства gp96-nK. Кроме того, экспрессия CD91 коррелирует со способностью АПК репрезентировать пептиды из gp96-ПК [9; 13].

Следует отметить, что в одном из исследований не было получено подтверждения роли CD91 как рецептора к БТШ-ПК [12], однако это противоречие позднее было объяснено особенностями использованных экспериментальных методик [13].

TLR (от англ. «toll-like receptors») - группа рецепторов на поверхности клеток иммунной системы, осуществляющая неспецифическое распознавание патогенов: TLR2 распознает пептидогликан бактериальной клеточной стенки, TLR4 - липополисахарид, TLR9 - бактериальную ДНК [1; 29], и, таким образом, эти рецепторы участвуют в процессах активации врожденного иммунитета. Первоначально было установлено, что БТШ, известный как HSP60, не активирует не несущие TLR4 макрофаги мышей линии C3H/HeJ [53]. В дальнейшем было показано, что генетическая модификация таких клеток генами TLR2 или TLR4 возвращает им возможность активации в ответ на HSP60. R.M. Vabulas et al., 2002 [69] показали, что в ответ на связывание gp96 с TLR2 и TLR4 (но не TLR3, TLR7и TLR8) дендритные клетки начинают синтезировать IL-12 и фактор некроза опухолей а, на их поверхности повышается экспрессия CD86 и CD40, а в самой клетке происходит активация NF-kB сигнального пути и ряда ферментов, что в целом свидетельствует о созревании клеток.

Предполагается, что между функциями этих рецепторов существует принципиальная разница. С помощью CD91 и LOX1 происходит транспорт антигенных пептидов, находящихся в комплексе с БТШ, через межклеточное пространство и клеточные мембраны. При связывании БТШ-ПК с CD14, TLR2 или TLR4 не происходит их интернализации, но запускается каскад внутриклеточного сигнализирования, в результате которого транскрипционный фактор NF-kB перемещается в ядро и происходит синтез клеткой широкого спектра провоспалительных цитокинов и костимулирую-щих молекул, способствующих дальнейшему развитию иммунного ответа [8].

Другие детали механизмов активации иммунного ответа при иммунизации БТШ - такие, как природа структур макрофагов, участвующих в захвате БТШ-ПК, механизмы транспортировки БТШ-ПК в эндо-плазматический ретикулум, зависимость этих процессов от протеасом и, наконец, дальнейшая судьба самого gp96 - по-прежнему остаются неясны. Также остаются не изучеными иммуногенность и механизмы действия других БТШ-ПК, хотя в этом направлении ведутся интенсивные исследования.

ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА В ЛЕЧЕНИИ ОПУХОЛЕЙ

Детальное изучение свойств и функций БТШ открывает новые перспективы в иммунотерапии рака.

Несмотря на то, что большое количество опухоль-ассоциированных антигенов было идентифицировано в последние годы [52], их использование как противоопухолевых вакцин остается малоэффективным по ряду причин: слишком велико количество антигенных пептидов, формирующих иммуногенность опухоли; слишком мала вероятность обнаружения одного и того же антигенного пептида в большом количестве различных опухолей; слишком мал вклад одного антигена в общую иммуногенность опухоли.

В то же время исследования последних лет показывают, что БТШ, выделенные из опухолевых клеток, находятся в комплексе с широким спектром клеточных пептидов и теоретически могут нести в себе все антигены, присущие данной конкретной опухоли, весь ее антигенный репертуар. Соответственно становится весьма привлекательной попытка применения аутологичных противоопухолевых вакцин на основе очищенных БТШ-ПК.

Действительно, на сегодняшний день уже существуют первые, и довольно убедительные, подтверждения данных гипотез.

Первые исследования эффективности вакцинации аутологичными БТШ-ПК у людей были проведены

S. Janetzki et al., 2000, [36] на примере небольшой группы различных опухолей. Авторы отметили признаки клинического улучшения и активации Т-клеточного противоопухолевого ответа у части больных. Далее было инициировано крупное рандомизированное исследование безопасности и эффективности применения аутологичных БТШ-ПК на основе gp96 (HSPPC-96; Oncophage) в качестве противоопухолевой вакцины; исследование включило в себя 45 больных диссеминированной меланомой из 4 итальянских медицинских центров [10]. В целом исследование было организовано следующим образом: хирургически удаленные метастазы опухоли замораживались в жидком азоте и отправлялись в лабораторию на территории США, где из полученных образцов в полном соответствии с критериями GMP (Good Manufacturing Practice) выделялись и очищались БТШ-ПК, которые после тщательного контроля качества упаковывались и отсылались обратно лечащим врачам. Больные были рандомизированы в группы, получавшие 5 или 50 мг

HSPPC-96 в нед. Подкожные инъекции ЖРРС-96 производились начиная с 5-8 нед после хирургического удаления метастазов.

Через 4 нед (4 инъекции - 1 цикл лечения) 39 из 45 пациентов были признаны подходящими для оценки результатов терапии, из них 28 больных имели явления остаточной болезни, в то время, как 11 больных оставались клинически здоровы после хирургического лечения. Среди пациентов с явлениями остаточной болезни были отмечены 2 случая полного ответа (24 и >48 мес) и 3 случая длительной стабилизации клинического течения заболевания (153; 191 и 272 дня). Период, свободный от заболевания, в группе больных, получавших вакцинацию, варьировал от 29 до 642 дней и составил в среднем 117 дней. Не было обнаружено влияния дозы ЖРР^96 на клинический эффект вакцинации и не отмечалось какой-либо системной токсичности препарата, за исключением незначительной эритемы и уплотнения в месте инъекции у некоторых больных. Иммунологическими методами у 11 из 23 больных, получавших вакцинацию (в том числе и у больных, продемонстрировавших клинический эффект вакцинации), была отмечена активация специфического противоопухолевого ответа (синтез ин-терферона-у мононуклеарами периферической крови в ответ на сокультивацию с аутологичными опухолевыми клетками).

Другое клиническое исследование возможностей применения БТШ-ПК было проведено среди больных с метастазами колоректального рака в печень [45]. Пациенты, у которых развились метастазы в печень после первичного лечения их основной опухоли, подвергались полной резекции метастазов, и из удаленных тканей приготовлялись БТШ-ПК (ЖРР^96) для вакцинации по описанному выше методу. В целом полученные результаты сопоставимы с таковыми при применении различных химиотерапевтических схем, хотя переносимость иммунотерапии значительно лучше. Следует отметить значительно лучшие клинические результаты у тех больных, у которых в ответ на вакцинацию развился иммунный ответ (17 из 29): у таких больных наблюдалось статистически достоверное увеличение 2-летней выживаемости.

Помимо описанных выше исследований к настоящему времени уже проведены или продолжаются другие исследования вакцинации БТШ-ПК в качестве моно- или адъювантной терапии опухолей, в которые вовлечены свыше 150 медицинских центров. Проводится III фаза клинических исследований вакцины на основе БТШ-ПК в лечении рака почки, I и II фазы исследований аутологичных БТШ-ПК для терапии хронического миелолейкоза, неходжкинских лимфом, немелкоклеточного рака легкого, рака желудка и поджелудочной железы (см. таблицу). Исследуется возможность применения БТШ-ПК в сочетании с грану-лоцит-моноцит колониестимулирующим фактором (ГМ-КСФ) и интерфероном-а2Ь. [54]

Безопасность применения вакцин на основе БТШ-ПК тщательно изучалась в каждом исследовании в

8 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ БИОТЕРАПИЯ

Клинические исследования БТШ-ПК в качестве противоопухолевых вакцин [54]

Фаза исследования Заболевание Тип вакцины Характеристика пациентов Количество пациентов

I Различные опухоли HSPPC-96 IV стадия, при неэффективности других методов лечения 16

I ХМЛ HSPPC-70 Хроническая стадия 20

II ХМЛ HSPPC-70 Хроническая стадия 40

II КРР HSPPC-96 IV стадия, после радикального хирургического лечения 40

I/II Рак желудка HSPPC-96 Распространенный 20

I/II Меланома HSPPC-96 Ш-ГУ стадия 36

II Меланома HSPPC-96 IV стадия, при неэффективности других методов лечения 45

III Меланома HSPPC-96 IV стадия, нелеченая Предполагается 350, исследование продолжается

II НХЛ HSPPC-96 Низкой степени дифферен-цировки 17, исследование продолжается

I РПЖ HSPPC-96 ЫИ стадия 10

I/II ПКК HSPPC-96 IV стадия 38

II ПКК HSPPC-96 IV стадия 72

III ПКК HSPPC-96 I-ГVстадия, после нефрэкто-мии, высокий риск рецидива Предполагается 650, исследование продолжается

ХМЛ - хронический миелолейкоз; КРР - колоректальный рак; НХЛ - неходжкинская лимфома; РПЖ - рак поджелудочной железы; ПКК - почечно-клеточная карцинома; НБРРС-96 - вакцина на основе gp96; НБРРС- 70 - вакцина на основе НБР-70

связи с теоретической возможностью развития аутоиммунных реакций, однако среди более, чем 800 пролеченных на сегодняшний день больных не было сообщено случаев серьезных клинических или лабораторных свидетельств аутоиммунных реакций. Вакцины на основе БТШ-ПК хорошо переносятся, и побочные эффекты от их введения обычно ограничиваются местными реакциями или незначительным повышением температуры.

Применение вакцин на основе БТШ-ПК ограничивается, во-первых, необходимостью хирургического получения образца опухолевой ткани (желательно не менее 3 г для приготовления непосредственно вакцины и, как правило, еще 1-2 г - для проведения дополнительных исследований) и, во-вторых, значительными затратами времени на приготовление вакцины, что может привести в результате к неэффективности и даже бессмысленности терапии (например, при прогрессировании заболевания). В целях преодоления этих препятствий разрабатываются новые подходы, например, получение рекомбинантных БТШ [42] или генетическая модификация опухолевых клеток [43]. Другими разрабатываемыми подходами являются

вакцинация белками теплового шока, выделенными из бактериальных клеток или нормальных тканей и связанными с антигенными пептидами in vitro [16; 56], создание химерных белков путем слияния БТШ и антигенных пептидов [19; 65]. Однако эти методы имеют ряд существенных недостатков (необходимость выделения отдельных опухолеспецифических антигенов и в то же время утрата всего того широкого спектра неидентифицированных опухолеспецифических антигенов, присущих БТШ-ПК, полученных непосредственно из опухоли) и определение наиболее эффективных и целесообразных методов использования БТШ-ПК является задачей исследований будущего.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Значительный прогресс онкологии и иммунологии внушает надежду на возможность успешной иммунотерапии злокачественных заболеваний. На основе последних достижений молекулярной биологии уже внедрены в практику и успешно применяются многочисленные методики и препараты, значительно улучшившие диагностику и лечение рака. Одним из наиболее многообещающих открытий последних десяти-

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ БИОТЕРАПИЯ

летий стало обнаружение иммуногенных свойств белков теплового шока и расшифровка их роли в иммунной системе.

БТШ являются повсеместно распространенными молекулярными шаперонами, выполняющими многочисленные внутриклеточные функции. БТШ клетки образуют комплексы со всеми возможными пептидами, синтезирующимися в клетке как с нормальными, так и с чужеродными, мутантными или патологически измененными. В случае гибели клетки, в особенности по некротическому механизму, комплексы БТШ и внутриклеточных пептидов (БТШ-ПК) попадают во внеклеточное пространство и становятся доступными для клеток иммунной системы. На поверхности антигенпрезентирующих клеток (АПК) предполагается существование нескольких типов специфических рецепторов к БТШ-ПК. Одни из них (CD91 и, возможно, LOX-1) опосредуют погружение БТШ-ПК в эндоплазматиче-ский ретикулум АПК, где происходит диссоциация БТШ-ПК на БТШ и пептиды. Последние в дальнейшем связываются с молекулами МНС I и, возможно, II классов и репрезентируются на поверхности АПК для распознавания эффекторными клетками иммунной системы - Т-лимфоцитами. Другие рецепторы (предположительно TLR2, TLR4, CD14) связываются с БТШ-ПК, что ведет к запуску каска-

дов внутриклеточного сигнализирования, к активации АПК и синтезу ими широкого спектра цитоки-нов, преимущественно провоспалительных. В конечном итоге выход БТШ-ПК во внеклеточное пространство ведет к активации как врожденного (NK-клетки), так и адаптивного (цитотоксические лимфоциты) иммунитета (см. рисунок).

Было предположено, что БТШ-ПК, полученные из опухолей, содержат не только нормальные пептиды, присущие всем тканям данного больного, но и все уникальные опухолеспецифические антигены, присущие данной опухоли. Это послужило предпосылкой для исследования возможности создания аутологичных противоопухолевых вакцин на основе БТШ-ПК. Экспериментальные и клинические исследования подтверждают возможность терапии злокачественных опухолей противоопухолевыми вакцинами на основе аутологичных БТШ-ПК, их безопасность и определенную эффективность, однако для определения их реальной терапевтической ценности требуются дальнейшие исследования.

ЛИТЕРАТУРА

1. Aderem, A., and Ulevitch, R. J. // Nature - 2000.

- Vol. 406. - P. 782-7.

2. Arnold D., Wahl C., Faath S. et al. Influences of

Механизм развития цитотоксического иммунного ответа на комплексы белков теплового шока с антигенными пептидами

transporter associated with antigen processing (TAP) on the repertoire of peptides associated with the endoplasmic reticulum-resident stress protein gp96 // J. Exp. Med. -

1997. - Vol. 186. - P. 461-6.

3. Arnold-Schild D., Hanau D., Spehner D. et al. Cutting edge: receptor-mediated endocytosis of heat shock proteins by professional antigen-presenting cells // J. Immunol. - 1999. - Vol. 162. - P. 3757-60.

4. Arrigo A.-P. Landry J. Expression and function of the low-molecular-weight heat shock proteins / The Biology of Heat Shock Proteins and Molecular Chaperones / Eds R.I. Morimoto, A. Tissieres, C. Georgopulos. Cold Spring Harbor Lab. Press, 1994. - P. 335-78.

5. Asea A., Kraeft S.K., Kurt-Jones E.A. et al. Hsp70 stimulates cytokine production through a CD 14-dependent pathway, demonstrating its dual role as a chaperone and cytokine // Nat. Med. - 2000. - Vol. 6. - P. 435-42.

6. Asea A., Rehli M., Kabingu E. et al. Novel signal transduction pathway utilized by extracellular HSP70: role of toll-like receptor (TLR) 2 and TLR4 // J. Biol. Chem. - 2002. - Vol. 277. - P. 15028-34.

7. Basu S., Binder R.J., Suto R. et al. Necrotic but not apoptotic cell death releases heat shock proteins, which deliver a partial maturation signal to dendritic cells and activate the NKkB pathway // Intl. Immunol. - 2000.

- Vol 12, No. 11. - P. 1539-46.

8. Basu S., Suto R., Binder R.J., Srivastava P.K. Heat shock proteins as novel mediators of cytokine secretion by macrophages // Cell Stress Chaperones. - 1998. -Vol. 3. - P. 11.

9. Basu S., Binder R. J., Ramalingam T., Srivastava P. K. // Immunity. - 2001. - Vol. 14. - P. 303-13.

10. Belli F., Testori A., Rivoltini L. et al. Vaccination of metastatic melanoma patients with autologous tumor-derived heat shock protein gp96-peptide complexes: clinical and immunologic findings // J. Clin. Oncol. - 2002. -Vol. 20. - P. 4169-80.

11. Berwin B., Rosser M.F., Brinker K.G., Nicchitta C.V. Transfer of GRP94(gp96)-associated peptides onto endosomal MHC class I molecules // Traffic. - 2002 -Vol. 3. - P. 358-66.

12. Berwin B., Hart J.P., Pizzo S.V., Nicchitta C.V. Cutting Edge: CD91-Independent Cross-Presentation of GRP94(gp96)-Associated Peptides // J. Immunol. - 2002.

- Vol. 168. - P. 4282-86.

13. Binder R.J., Srivastava PK. Essential role of CD91 in re-presentation of gp96-chaperoned peptides // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2004. - Vol. 101. - P. 6128-33.

14. Binder R.J., Harris M.L., Menoret A., Srivastava P.K. Saturation, competition and specificity in interaction of heat shock proteins (hsp) gp96, hsp90 and hsp70 with CD11b+ cells // J. Immunol. - 2000. - Vol. 165. - P. 2582-7.

15. Binder R.J., Han D.K., Srivastava P.K. CD91: a receptor for heat shock protein gp96 // Nat. Immunol. -2000. - Vol. 1. - P.151.

16. Blachere N.E., Li Z., Chandawarkar R.Y. et al. Heat shock protein-peptide complexes, reconstituted in vitro, elicit

peptide-specific cytotoxic T lymphocyte response and tumor immunity // J. Exp. Med. - 1997. - Vol. 186. - P. 1315-22.

17. Castelli C., Ciupitu A.M. Rini F. et al. Human heat shock protein 70 peptide complexes specifically activate anti-melanoma T cells // Cancer Res. - 2001. - Vol.

61. - P. 222-7.

18. Castellino F., Boucher P.E., Eichelberg K. et al. Receptor-mediated uptake of antigen/heat shock protein complexes results in major histocompatibility complex class I antigen presentation via two distinct processing pathways // J. Exp. Med. - 2000. - Vol. 191. - P. 1957-64.

19. Cho B.K., Palliser D., Guillen E. et al. A proposed mechanism for the induction of cytotoxic T lymphocyte production by heat shock fusion proteins // Immunity. - 2000. - Vol. 12. - P. 263-72.

20. Ciupitu A., Peterson M., O’Donnell C. et al. Immunization with a lymphocytic choriomeningitis virus peptide mixed with heat shock protein 70 results in protective antiviral immunity specific cytotoxic T lymphocytes // J. Exp. Med. - 1998. - Vol. 187. - P. 685.

21. Craig, E. A., Gross, C.A. // Trends Biochem. Sci. —1991. - Vol. 16. - P. 135-40.

22. Delneste, Y., Magistrelli, G., Gauchat, J. et al. Involvement ofLOX-1 in dendritic cell-mediated antigen crosspresentation // Immunity - 2002. - Vol. 17. - P. 353-62.

23. Doody A.D.H., Kovalchin J.T., Mihalyo M.A. et al. Glycoprotein 96 can chaperone both MHC class I- and class II-restricted epitopes for in vivo presentation, but selectively primes CD8 +T cell effector function // J. Immunol. - 2004. - Vol. 172. - P. 6087.

24. Feder M.E., Parsell D.A., Lindquist S. The stress response and stress proteins // Cell Biology of Trauma. Boca Raton: CRC Press - 1995. - P. 177-91.

25. Freeman B.C., Morimoto R.I. The human cytosolic molecular chaperones in hsp90, hsp70 (hsc70) and hdj-1 have distinct roles in recognition of a non-native protein and protein refolding // EMBO J. - 1996. - Vol. 15. - P. 2969-79.

26. Gurbuxani, S., Bruey, J.M., Fromentin, A. et al. Selective depletion of inducible HSP70 enhances immu-nogenicity of rat colon cancer cells // Oncogene - 2001. -Vol. 20. - P. 7478-85

27. Hartl F.U. Molecular chaperones in cellular protein folding // Nature. - 1996. - Vol. 381. - P. 571-9.

28. Heike M., Frenzel C., Meier D., Galle P.R. Expression of stress protein gp96, a tumor rejection antigen, in human colorectal cancer // Int. J. Cancer. - 2000. - Vol. 86. - P. 489-93.

29. Hemmi H. et al. // Nature - 2000. - Vol. 408. -P. 740-5.

30. Hilf N., Singh-Jasuja H., Schild H.J. The heat shock protein gp96 links innate and specific immunity // Int. J. Hyperthermia. - 2002. - Vol. 18. - P. 521-33.

31. Hohfeld J., Hard F.-U. Posttranslational protein import and folding // Curr. Opin. Cell. Biol. - 1994. -Vol. 6. - P. 499-509.

32. Horst M., Opplige W., Rospert S. et al. Sequence action of two hsp70 complexes during protein import into mitochondria // EMBO J. - 1997. - Vol. 16. - P. 1842-9.

33. Ishii T. et al. Isolation of MHC Class I-Restricted Tumor Antigen Peptide and Its Precursors Associated with Heat Shock Proteins hsp70, hsp90, and gp96 // The Journal of Immunology. - 1999. - Vol. 162. - P. 1303-9.

34. Jaattela M. Escaping cell death: survival proteins in cancer // Exp. Cell Res. - 1999. - Vol. 248 —P. 30-43.

35. Jamora C., Dennert G., Lee A.S. Inhibition of tumor progression by suppression of stress protein GRP78/BiP induction in fibrosarcoma B/C10ME // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1996. - Vol. 93. - P. 7690-4.

36. Janetzki S., Polla D., Rosenhauer et al. Immunization of cancer patients with autologous cancer-derived heat shock protein gp96: a pilot study // Intl. J. Cancer. -1996. - Vol. 88. - P. 232-8.

37. Kaur J., Ralhan R. Induction of apoptosis by abrogation of HSP70 expression in human oral cancer cells // Int. J. Cancer - 2000. - Vol. 85. - P. 1-5.

38. Lee G.J., Roseman A.M., Saibil H.R., Vierling E. A small heat shock protein stably binds heat-denatured model substrates and can maintain a substrate in a folding-competent state // EMBO J. - 1997. - V. 16. - P. 659-71.

39. Li Z., Srivastava P.K. Tumor rejection antigen gp96/grp94 is an ATPase: implications for protein folding and antigen presentation // EMBO J. - 1993. - Vol. 12. -P. 3143-51.

40. Linderoth N.A., Popowicz A., Sastry S. Identification of the peptide-binding site in the heat shock chaperone/tumor rejection antigen gp96 (Grp94) // J. Biol. Chem. - 2000. - Vol. 275. - P. 5472-7.

41. Lindquist S.. Craig E. The heat-shock proteins // Annu. Rev. Genet. - 1988. - Vol. 22. - P. 631-77.

42. Manjili M.H., Henderson R., Wang X.-Y. et al. Development of a recombinant HSP110-HER-2/neu vaccine using the chaperoning properties of HSP110 // Cancer Res. - 2002. - Vol. 62. - P. 1737-42.

43. Massa C., Guiducci C., Arioli I. et al. Enhanced efficacy of tumor cell vaccines transfected with secretable hsp70 // Cancer Res. - 2004. - Vol. 64 - P. 1502-8.

44. Matsuke T., Srivastava P. CD91 is involved in MHC class II presentation ofgp96-chaperoned peptides // Cell Stress Chaperones. - 2000. - Vol. 5. - P. 378.

45. Mazzaferro V., Coppa J., Carabba M. et al. Vaccination with autologous tumor-derived heat-shock protein gp96 after liver resection for metastatic colorectal cancer // Clin. Cancer. Res. - 2003. - Vol. 9. - P. 3235-45.

46. Menoret A., Li Z., Niswonger M.L. et al. An Endoplasmic Reticulum Protein Implicated in Chaperoning Peptides to Major Histocompatibility of Class I Is an Aminopeptidase // J. Biol. Chem. - 2001. - Vol. 276. -No. 36. - P. 33313-18.

47. Miyata Y., Yahara I. The 90 kDa heat shock protein Hsp90 binds and protects casein kinase II from selfaggregation and enhances its kinase activity // J. Biol. Chem. - 1992. - Vol. 267. - P. 7042-7.

48. Mosser D.D., Caron A.W., Bourget L. et al. Role of the human heat shock protein hsp70 in protection against stress-induced apoptosis // Mol. Cell. Biol. - 1997.

- Vol. 17. - P. 5317-27.

49. Navaratnam M., Deshpande M.S., Hariharan M.J. et al. Heat shock protein-peptide complexes elicit cytotoxic T-lymphocyte and antibody responses specific for bovine herpesvirus 1 // Vaccine. - 2001. - Vol. 19. -P. 1425-34.

50. Nieland T.J., Tan M.C., Monne-van Muijen M. et al. Isolation of an immunodominant viral peptide that is endogenously bound to the stress protein GP96/GRP94 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA - 1996. -Vol. 93. - P. 6135-9.

51. Noessner E., Gastpar R., Milani V. et al. Tumor-derived heat shock protein 70 peptide complexes are cross-presented by human dendritic cells // J. Immunol. -2002. - Vol. 169. - P. 5424-32.

52. Novellino L., Parmiani G., Castelli C. A listing of human tumor antigens: March 2004 update // Cancer Immunol. Immunother. - 2004. - Aug 7.

53. Ohashi K., Burkart V., Flohe S., Kolb H. // J. Immunol. - 2000. - Vol. 164. - P. 558-61.

54. Parmiani G., Testori A., Maio M. et al. Heat shock proteins and their use as anticancer vaccines // Clinical Cancer Research. - 2004. - Vol. 10. - P. 8142-6.

55. Rivoltini L., Castelli C., Carrabba M. et al. Human tumor-derived heat shock protein gp96 mediates in vitro activation and in vivo expansion of melanoma- and colon carcinoma-specific T cells // J. Immunol. - 2003. -Vol. 171. - P. 3467-74.

56. Roman E., Moreno C. Synthetic peptides non-covalently bound to bacterial hsp70 elicit peptide-specific T-cell responses in vivo // Immunology - 1996. - Vol. 88.

- P. 487-92.

57. Singh-Jasuja H., Toes R.E., Spee P. et al. Crosspresentation of glycoprotein 96-associated antigens on major histocompatibility complex class I molecules requires receptor-mediated endocytosis // J. Exp. Med. -2000. - Vol. 191. - P. 1965-74.

58. Srivastava P.K., Maki R.G. Stress induced proteins in immune response to cancer // Curr. Top Microbiol. Immunol. - 1991. - Vol. 167. - P. 109-23.

59. Srivastava P.K. Udono H., Blachere N.E., Li Z. Heat shock proteins transfer peptides during antigen processing and CTL priming // Immunogenetics. - 1994. -Vol. 39 - P. 93-8.

60. Srivastava P.K. Peptide-binding heat shock proteins in the endoplasmic reticulum: role in immune response to cancer and in antigen presentation // Adv. Cancer. Res. - 1993. - Vol. 62. - P. 153-77.

61. Srivastava P. Interaction of heat shock proteins with peptides and antigen presenting cells: chaperoning of the innate and adaptive immune responses // Annu. Rev. Immunol. - 2002. - Vol. 20. - P. 395.

62. Srivastava P.K., Udono H., Blachere N.E., Li Z. Heat shock proteins transfer peptides during antigen processing and CTL priming // Immunogenetics. - 1994. -Vol. 39. - P. 93.

63. Srivastava P.K., Menoret A., Basu S. et al. Heat shock proteins come of age: primitive functions acquire new roles in an adaptive world // Immunity. - 1998. -Vol. 8. - P. 657-65.

64. Staib F., Distler M., Bethke K. et al. Crosspresentation of human melanoma peptide antigen MART-1 to CTLs from in vitro reconstituted gp96/MART-1 complexes // Cancer Immun. - 2004. - Vol. 4. - P. 3-17.

65. Suzue K., Zhou X., Eisen H.N., Young R.A. Heat shock fusion proteins as vehicles for antigen delivery into the major histocompatibility complex class I presentation pathway // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1997. - Vol. 94.

- P. 13146-51.

66. Tissieres A., Mitchell H.K., Tracy U.M. // J. Mol. Biol. - 1974. - Vol. 84. - P. 389-98.

67. Udono H., Srivastava P.K. Heat shock protein 70-associated peptides elicit specific cancer immunity // J. Exp. Med. - 1993. - Vol. 178. - P. 1391-6.

68. Udono H., Levey D.L., Srivastava P.K. Cellular requirements for tumor-specific immunity elicited by heat shock proteins: tumor rejection antigen gp96 primes CD8+ T cells in vivo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1994. - Vol. 91. - P. 3077.

69. Vabulas R.M., Braedel S., Hilf N. et al. The endoplasmic reticulum-resident heat shock protein Gp96 activates dendritic cells via the toll-like receptor 2/4 pathway // J. Biol. Chem. - 2002. - Vol. 277. - P. 20847-53.

70. Vogen S., Gidalevitz T., Biswas C. et al. Radicicol-sensitive peptide binding to the N-terminal portion of GRP94 // J. Biol. Chem. - 2002. - Vol. 277.

- P. 40742-50.

71. Wassenberg J.J., Dezfulian C., Nicchitta C.V. Receptor mediated and fluid phase pathways for internalization of the ER Hsp90 chaperone GRP94 in murine macrophages // J. Cell. Sci. - 1999. - Vol. 12(pt 13) - P. 2167-75.

72. Wells A., Rai S., Salvato M. et al. Hsp 72-mediated augmentation of MHC class I surface expression and endogenous antigen presentation // Int. Immunol. -

1998. - Vol. 10. - P. 609.

73. Yura Т., NagaiH., Mori H. Regulation of the heat-shock response in bacteria // Annu. Rev. Microbiol. -1993. - Vol.47. - P. 321-50.

74. Zhu X., Zhao X., Burkholder W.F. et al. Structural analysis of substrate binding by the molecular chaperone DnaK // Science - 1996. - Vol. 272. - P. 1606-14.

Поступила 23.11.2006.