СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНА ДЛЯ ВНУТРИВЕННОГО ВВЕДЕНИЯ, ОБОГАЩЕННОГО ИММУНОГЛОБУЛИНОМ М, И ПРЕПАРАТ, ПОЛУЧЕННЫЙ ЭТИМ СПОСОБОМ
METHOD FOR PRODUCING IMMUNOGLOBULIN FOR INTRAVENOUS INTRODUCTION OF IMMUNOGLOBULIN M ENRICHED PREPARATION, AND PREPARATION PREPARED BY SUCH METHOD

Изобретение относится к медицине, а именно к производству препарата иммуноглобулина, обогащенного иммуноглобулином М (IgМ) и пригодного для внутривенного введения.
Плазма крови человека содержит иммуноглобулины пяти различных классов. Наибольшее значение имеют иммуноглобулины классов G, A, M (IgGAM), которые являются антителами и защищают организм от различных вирусов и бактерий.
Для лечения тяжелых бактериальных и вирусных инфекций в настоящее время широко и успешно используют внутривенное введение препаратов иммуноглобулинов, представляющих собой выделенный из плазмы крови и очищенный иммуноглобулин G (IgG). Выбор терапевтических средств, содержащих IgG, достаточно велик: все они различаются по своему качеству, частоте возникновения побочных реакций, форме, физическим параметрам, длительности циркуляции в организме и эффективности. /Сапожникова B.C., 1990, Berkman S.A. et al., 1990/.
Коммерческие препараты иммуноглобулинов на 95% состоят из IgG. При особо тяжелых септических состояниях предлагается использовать внутривенное введение препарата, обогащенного IgM.
Считается, что IgM, входящий в состав композиции препарата, обладает высокой эффективностью в связывании бактериальных клеток и их токсинов.
Сложность разработки подобного лекарственного средства заключается в трудности обеспечения высокого выхода IgM из исходного сырья, а также тем, что IgM обладает особенно высокой комплементсвязывающей активностью ин витро и необходимы специальные условия для устранения спонтанной способности препарата активировать комплемент.
Иммуноглобулин М (IgM) может быть выделен из плазмы обработкой гексаном, осаждением 6% полиэтиленгликолем 6000 (ПЭГом) и хроматографией на 6% имидуксусной агарозе /патент RU 1732518/.
Известен способ получения препарата для внутривенного введения с содержанием IgM более чем 5 мас.% путем обработки фракции плазмы, содержащей IgM, протеазой /патент RU 2191032/. Получение IgM-содержащего концентрата возможно путем последовательной обработки осадка Б (III) аэросилом и натрием каприловокислым с промежуточными центрифугированиями для удаления балластных белков с последующим концентрированием /патент RU 2158136/.
Иммуноглобулиновый препарат, содержащий IgM и IgA, получают растворением осадка Б в 0,1 М ацетатном буфере, обрабатывают октановой кислотой, подвергают диализу против раствора пиперазина и хлорида натрия, а затем проводят ионообменную хроматографию /патент US 4256631/. Возможно использование нетоксичного полимера - полиэтиленгликоля /патент US 3808189/.
Так называемый IgGAM-препарат можно выделить из плазмы или осадка Б комбинацией методов осаждения каприловой кислотой и этанолом /Stembuch М., 1980/.
Получить фракцию иммуноглобулинов, обогащенную IgM, недостаточно. Одним из основных показателей качества препаратов внутривенного иммуноглобулина является так называемая антикомплементарная активность - способность после внутривенного введения самопроизвольно связывать и активировать комплемент. Активация комплемента (системы сывороточных белков) приводит к выбросу вазоактивных веществ, которые вызывают падение артериального давления, появление одышки, дрожи, тошноты, а в некоторых случаях и коллапса /Barandun S. et al., 1962/.
В связи с этим одной из наиболее важных стадий технологического процесса получения препарата иммуноглобулина является устранение или уменьшение антикомплементарной активности.
Известны несколько приемов снижения антикомплементарной активности иммуноглобулинов: обработка протеолитическими ферментами /патент SU №618958/, модификация иммуноглобулина путем ацетилирования /US patent №4356173/ или сульфонирования /US patent № 4360457/, выдерживание при температуре 37°С в течение 18 часов /Мостовская Е.В., 2004/, инкубация при температуре 30-45°С /ЕР №0085747/, обработка гелем гидроокиси алюминия с последующей температурной обработкой /Зубкова Н.В., 2002/.
Описанные методы эффективно устраняют антикомплементарную активность препаратов, содержащих IgG. Спонтанная антикомплементарная активность у IgM намного выше в связи с тем, что молекула IgM состоит из пяти мономеров, активно связывающих комплемент. Поэтому для снижения антикомплементарной активности препарата, обогащенного IgM, применяются жесткие способы - обработка бетапропиолактоном, сульфонирование или прогревание.
Так, патент US 4318902 предусматривает обработку 5% раствора иммуноглобулина, содержащего IgM, бетапропиолактоном в количестве 0,05-0,15 мл на 100 мл иммуноглобулина при температуре 20-37°С в течение 4-6 часов. Данный способ положен в основу технологии производства препарата "Пентаглобин", в настоящее время выпускаемого фирмой "Biotest" /Stephan W., 1983/. При этом постулируется сохранение биологической активности препарата, что можно считать достоверным только в отношении компонента IgM, но нереально в отношении компонента IgG в связи с высокой жесткостью этой обработки.
В патенте ЕР 0450412 предлагается обрабатывать IgM-содержащий концентрат, имеющий величину рН от 4,0 до 5,0, при температуре от 40 до 62°С в течение более 10 минут.
Препарат, содержащий более 5% IgM и более 10% IgA возможно получить, обрабатывая фракцию A (II+III) или Б (III) октановой кислотой, очисткой анионообменной хроматографией и обработкой элюата с величиной рН 4,0-4,5 при температуре 50-54°С в течение от 1 мин до 24 часов /US patent 5075425, US №5410025/.
Недостатком всех описанных способов получения препаратов иммуноглобулина, обогащенного IgM, является тот факт, что для того чтобы устранить антикомплементарную активность IgM, осуществляется жесткая обработка препарата комплекса (IgGAM), обогащенного IgM, которая приводит к значительному снижению биологической активности IgG, так как его молекула состоит только из одного мономера, обладающего в 5 раз меньшей способностью связывать комплемент и намного более чувствительной к повреждающему действию химического или температурного воздействия, чем молекула IgМ.
Наиболее близким техническим решением являются способ получения препарата иммуноглобулина для внутривенного введения и препарат для внутривенного введения. Данный известный способ получения препарата иммуноглобулина для внутривенного введения включает получение фракции, содержащей комплекс иммуноглобулинов G, A, M из осадка Б (III) и обработку 5% раствора иммуноглобулина, содержащего IgМ, бетапропиолактоном при температуре 20-37°С в течение 4-6 часов. Это решение используется в технологии производства коммерческого препарата ВВИГ, обогащенного IgM-Пентаглобин (US 4318902, прототип).
Его недостатками являются: низкая активность антител к различным антигенам (Мостовская Е.В., 2004); высокая остаточная антикомплементарная активность, требующая очень медленного внутривенного введения препарата; низкая способность активировать макрофаги, так как значительная часть Fc-фрагментов IgG повреждено при жесткой химической обработке бета-пропиолактоном.
Направление создания заявляемого препарата и заявляемого способа его получения было выбрано с учетом различной антикомплементарной активности IgM и IgG и их неодинаковой устойчивости к химическим и физическим факторам.
Технической задачей данной группы изобретений, объединенных единым изобретательским замыслом, является создание способа получения эффективного препарата иммуноглобулина для внутривенного введения, обогащенного IgM, а также создание эффективного препарата иммуноглобулина для внутривенного введения, обогащенного IgM, при полном сохранении биологической активности IgG.
Техническим результатом, обеспечивающим решение поставленной задачи, является снижение антикомплементарной активности IgG и IgM, входящих в фармацевтическую композицию с сохранением их биологической активности, т.е. сохранение всех биологических свойств IgG при одновременном эффективном снижении антикомплементарной активности IgM, повышение терапевтической активности фармацевтической композиции (препарата).
Сущность изобретения в части способа заключается в том, что для получения препарата иммуноглобулина для внутривенного введения плазму донорской крови подвергают фракционированию белков этанолом при температуре ниже 0°С (метод Кона), из полученного фильтрата Б (III) выделяют очищенный иммуноглобулин G, из полученного осадка Б (III) выделяют очищенный концентрат, обогащенный иммуноглобулином М, после чего проводят по отдельности снижение антикомплементарной активности иммуноглобулина G и снижение антикомплементарной активности иммуноглобулина М, а затем составляют фармацевтическую композицию путем соединения иммуноглобулинов G и М со сниженной антикомплементарной активностью.
Предпочтительно, составляют препарат путем смешения в равных долях иммуноглобулинов G и М со сниженной антикомплементарной активностью.
При этом снижение антикомплементарной активности иммуноглобулинов G и М проводят дифференцированно разными методами, выбранными исходя из более полного сохранения биологической активности каждого из иммуноглобулинов G и М под воздействием физических и химических факторов соответствующего метода.
Проводят снижение антикомплементарной активности иммуноглобулина G до значения не более 1 гемолитической единицы (СН50) на 1 мг иммуноглобулина путем молекулярной диализ-фильтрации с использованием воды очищенной с величиной рН 3,8-4,5, проводят снижение антикомплементарной активности иммуноглобулина М до значения не более 1 гемолитической единицы (СН50) на 1 мг иммуноглобулина, выдерживая полуфабрикат при температуре 45±5°С в течение 24-48 часов.
Сущность изобретения в части препарата заключается в том, что препарат иммуноглобулина для внутривенного введения содержит иммуноглобулины G и М со сниженной антикомплементарной активностью, полученные вышеизложенным способом, для получения препарата иммуноглобулина для внутривенного введения плазму донорской крови подвергают фракционированию белков этанолом при температуре ниже 0°С (метод Кона), из полученного фильтрата Б (III) выделяют очищенный иммуноглобулин G, из полученного осадка Б (III) выделяют очищенный концентрат, обогащенный иммуноглобулином М, после чего проводят по отдельности снижение антикомплементарной активности иммуноглобулина G и снижение антикомплементарной активности иммуноглобулина М, а затем составляют фармацевтическую композицию путем соединения иммуноглобулинов G и М со сниженной антикомплементарной активностью. Предпочтительно, составляют препарат путем смешения в равных долях иммуноглобулинов G и М со сниженной антикомплементарной активностью. При этом снижение антикомплементарной активности иммуноглобулинов G и М проводят дифференцированно разными методами, выбранными исходя из более полного сохранения биологической активности каждого из иммуноглобулинов G и М под воздействием физических и химических факторов соответствующего метода. Проводят снижение антикомплементарной активности иммуноглобулина G до значения не более 1 гемолитической единицы (СН50) на 1 мг иммуноглобулина путем молекулярной диализ-фильтрации с использованием воды очищенной с величиной рН 3,8-4,5, проводят снижение антикомплементарной активности иммуноглобулина М до значения не более 1 гемолитической единицы (СН50) на 1 мг иммуноглобулина, выдерживая полуфабрикат при температуре 45±5°С в течение 24-48 часов.
Предпочтительно препарат содержит в равных долях иммуноглобулины G и М со сниженной антикомплементарной активностью и стабилизатор, предпочтительно мальтозу, в концентрации не более 10%.
Препарат подвергнут вирусинактивации и высушиванию.
Способ осуществляют следующим образом.
Каждую партию сырья для получения препарата готовят из плазмы крови, полученной от группы доноров, путем фракционирования ее белков этанолом при температуре ниже 0°С (метод Кона).
Из осадка A (II+III) одним из известных способов выделяют очищенный иммуноглобулин G. Из осадка Б (III) выделяют концентрат, обогащенный IgM. Получают два полуфабриката, один из которых представляет собой раствор иммуноглобулина G, а второй полуфабрикат представляет собой раствор иммуноглобулинов, обогащенный IgM. Примечание: каждый из этих полуфабрикатов содержит также IgА, для упрощения в описании отражается последовательность действий над полученными полуфабрикатами в отношении их основных действующих компонентов: IgМ и IgG.
Проводят снижение антикомплементарной активности иммуноглобулина G одним из известных способов (предпочтительно, в соответствии с патентом №2302427). Затем проводят снижение антикомплементарной активности иммуноглобулина М одним из известных способов. Например, выдерживают полуфабрикат, обогащенный иммуноглобулином М, при температуре 45±5°С в течение 24-48 часов.
Таким образом, способ получения иммуноглобулина, обогащенного IgM, пригодного для внутривенного введения характеризуется тем, что снижение антикомплементарной активности IgG и IgM, входящих в состав препарата, проводят дифференцированно (отдельно уменьшают антикомплементарную активность полуфабриката, обогащенного IgM, отдельно - полуфабриката, содержащего IgG) с учетом их устойчивости к физическим и химическим факторам исходя из обеспечения наиболее полного сохранения биологической активности иммуноглобулинов, после чего составляют фармацевтическую композицию.
В заключение составляют фармацевтическую композицию, включающую предпочтительно 1 часть полуфабриката иммуноглобулина G со сниженной антикомплементарной активностью и предпочтительно 1 часть полуфабриката, обогащенного иммуноглобулином М со сниженной антикомплементарной активностью. В результате получают препарат, обогащенный иммуноглобулином М и пригодный для внутривенного введения.
Пример 1
Сырьем для получения препарата служит карантинизированная плазма крови от группы доноров путем фракционирования ее белков этанолом при температуре ниже 0°С (метод Кона).
Во фракции III (фильтрате «Б») спиртового метода Кона устанавливают величину рН 3,5-5,0 и концентрируют на ультрафильтрационной установке до уменьшения объема раствора в 10-12 раз. Затем удаляют этанол, используя 5-6 объемов воды очищенной с величиной рН от 3,8 до 4,5, а далее концентрируют раствор иммуноглобулина до содержания белка 6-7%. После этого проводят восстановление гидратных оболочек иммуноглобулина, для чего вводят в раствор иммуноглобулина низкомолекулярное вещество, предпочтительно мальтозу или NaCL, в количестве 0,1-2,5% и выполняют молекулярную диафильтрацию с использованием воды очищенной с величиной рН 3,8-4,5. Получают полуфабрикат иммуноглобулина G с низкой антикомплементарной активностью.
Из осадков фракции Б (III) извлекают комплекс иммуноглобулинов (G+A+M). Осадки гомогенизируют в 0,3-0,7% растворе хлорида натрия с получением суспензии, которую обрабатывают 1-3% хлороформом при величине рН 4,9-5,6, перемешивают, выдерживают суспензию 30-60 мин, центрифугируют, а затем выделяют целевой продукт удалением избытка жидкости. Вводят стабилизатор, предпочтительно мальтозу в концентрации 10%, и проводят снижение антикомплементарной активности иммуноглобулина М, выдерживая полуфабрикат при температуре 45±5°С в течение 24-48 часов.
В заключение составляют фармацевтическую композицию, состоящую из 1 части полуфабриката иммуноглобулина G с низкой антикомплементарной активностью и 1 части полуфабриката, обогащенного иммуноглобулином М со сниженной антикомплементарной активностью. В результате получают фармацевтическую композицию - целевой продукт, представляющий собой комплекс иммуноглобулинов (G+A+M), пригодный для внутривенного введения с высокой биологической активностью.
При этом препарат иммуноглобулина для внутривенного введения, обогащенный IgM, содержит не менее 50% IgG, не менее 5% IgM, предпочтительно от 5% до 25% IgM, стабилизатор и хлорид натрия не более 0,4% с антикомплементарной активностью менее 1 единицы СН 50 на 1 мг белка.
Препарат содержит стабилизатор и хлорид натрия не более 0,4%. Препарат пригоден для внутривенного введения и включает иммуноглобулин G не менее 50%, иммуноглобулин М - не менее 5% (остальное - IgA и другие белки), и состоит из иммуноглобулина G с восстановленными гидратными оболочками и иммуноглобулина М со сниженной антикомплементарной активностью.
Пример 2
Исходным сырьем для получения препарата является плазма крови доноров, которая подверглась карантинизации и проверке на отсутствие маркеров возбудителей трансмиссивных заболеваний. Плазму фракционируют этанолом при температуре ниже 0°С (метод Кона).
50
Супернатант фракции Б (III) в количестве 300 л помещают в реактор (емкость) и устанавливают величину рН 4,1 с помощью 1 М раствора HCL, после чего подвергают концентрированию на ультрафильтрационной установке. После уменьшения раствора до 30 л проводят удаление этанола, используя 150 л воды очищенной с величиной рН 4,2, и концентрируют иммуноглобулин до объема 25 л. Проводят восстановление гидратных оболочек иммуноглобулина методом молекулярной фильтрации. После этого проверяют и при необходимости корректируют величину рН, вводят стабилизатор и устанавливают содержание (концентрацию) белка 5,2%. После осветляющей и стерилизующей фильтрации получают полуфабрикат иммуноглобулина G с антикомплементарной активностью 10 мг белка, не активирующих 2 CH.
Для получения полуфабриката, содержащего IgM, осадок фракции Б (III) в количестве 15 кг помещают в гомогенизатор, заливают 10-кратным объемом 0,3% раствора хлорида натрия, содержащего 0,05 М натрия ацетата, и гомогенизируют суспензию до исчезновения видимых частиц осадка. Затем с помощью 1 М раствора NaOH или 1 М раствора HCL устанавливают величину рН 4,9 и вводят трихлорметан до конечной концентрации 1,5%. Перемешивают смесь при скорости вращения мешалки 500-1500 об/мин в течение 20 минут. Проводят инактивацию возможно присутствующих вирусов, выдерживая суспензию 60 мин, и удаляют возможно присутствующие вирусы, липопротеиды и денатурированные белки центрифугированием. К центрифугату добавляют равный объем 0,1% раствора каприлата натрия, устанавливают величину рН 4,8, ионную силу менее 0,05 и выдерживают раствор для формирования осадка в течение 18 часов. Осадок удаляют, а осветленный центрифугат подвергают концентрированию ультрафильтрацией до содержания белка 5,5-6,5%. Вводят стабилизатор - мальтозу, устанавливают величину рН 4,2 и подвергают осветляющей и стерилизующей фильтрации. Получают полуфабрикат, содержащий 18% иммуноглобулина М в количестве 19 л.
Проводят снижение антикомплементарной активности иммуноглобулина М, выдерживая полуфабрикат при температуре 50°С в течение 36 часов.
После этого составляют фармацевтическую композицию, объединяя одну часть полуфабриката иммуноглобулина G и 1,5 части полуфабриката, обогащенного иммуноглобулином М. В результате получают целевой продукт, содержащий комплекс иммуноглобулинов G (78,4%), М (11,8%) и А (9,8%). Фармацевтическую композицию повторно подвергают осветляющей и стерилизующей фильтрации, вирусинактивации, контролируют, разливают по флаконам и получают препарат иммуноглобулина, обогащенного иммуноглобулином М, пригодного для внутривенного введения, содержащий иммуноглобулин с повышенной биологической активностью IgG и низкой спонтанной антикомплементарной активностью.
Высокую биологическую активность препарата, получаемого согласно настоящей группе изобретений, при сниженной до менее 1 единицы СН50 на 1 мг белка спонтанной способности препарата активировать комплемент подтверждают в результате сравнения с прототипом (пентаглобином).
Проведено сравнительное изучение влияния различных препаратов внутривенных иммуноглобулинов (ВВИГ) отечественного и зарубежного производства на оксидазную активность нейтрофилов в тесте люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) in vitro у здоровых доноров. Для этого лейкоцитарную суспензию 10 здоровых доноров индивидуально инкубировали с каждым из ВВИГ, содержащих IgG: Габриглобин-IgG (Иваново), Иммуноглобулин человека нормальный (ИЧН) (Н. Новгород), Хумаглобин (Венгрия), Октагам (Австрия), ИЧН Вена (Италия), Интраглобин (Германия) и с ВВИГ, обогащенными IgM: Пентаглобин (Германия) и экспериментальным препаратом Габриглобин-IgM (заявляемый препарат), оценивая оксидазную активность методом ЛЗХЛ с использованием фотометра-люминометра LUCY-2 (зонд-люминол, активатор «респираторного взрыва» - зимозан («Sigma», CIUA). Учитывали индекс стимуляции (ИС) - соотношение показателей ЛЗХЛ с ВВИГ к ЛЗХЛ без ВВИГ; ИС>1,1 принимали за норму. Результаты исследования показали, что ЛЗХЛ у 10 доноров в среднем составила 13,2±3,1 мВ/мин, а ЛЗХЛ, индуцированная зимозаном, - 146,8±13,4 мВ/мин (р<0,05). ИЧН, Октагам, Интраглобин показали оксидазную активность у 50% доноров (ИС 1,25±0,10); Пентаглобин - у 60% (ИС 2,04±0,42); Габриглобин-IgM - у 70% (ИС 1,33±0,16); Габриглобин-IgG, Хумаглобин, ИЧН Вена - у 80% (ИС 1,54±0,40). Полученные данные продемонстрировали неодинаковое влияние разных ВВИГ на оксидазную активность нейтрофилов у доноров (р<0,05), что важно для клинического применения ВВИГ. Среди отечественных ВВИГ наибольший эффект выявлен у препарата Габриглобин-IgG и Габриглобин-IgM /Козлова М.Н. и соавт., 2008/.
Среди множества аспектов действия внутривенного иммуноглобулина основным фактором, определяющим эффективность препарата, является нейтрализация микробных токсинов, вирусов и связывание патогенных антител. Это объясняется тем, что по данным Good R.A., Lorenz E. (1991) 1 г нормального внутривенного иммуноглобулина содержит более 10000000 молекул антител различной специфичности.
В процессе получения фармацевтического препарата антитела - иммуноглобулины в процессе фракционирования и концентрирования теряют свою нативность и повреждаются из-за воздействия этанола, химических агентов и снятия антикомплементарной активности.
Поэтому титр антител к различным вирусам и бактериям является одним из наиболее важных параметров качества внутривенных иммуноглобулинов.
Иммуноферментным методом было изучено содержание антител к возбудителям некоторых инфекционных заболеваний в прототипе (Пентаглобин) и препарате, полученном по заявляемому методу (Габриглобин-IgM).
Использовали иммуноферментные тест-системы производства «Вектор-Бест», результаты выражали в виде титра (последнего положительного разведения иммуноглобулина) или арбитражных единицах АЕ /Handsfield H. et al., 1987/. Уровень IgG-антител к полисахариду менингококка представляли в виде «Коэффициента позитивности», вычисляемого как ОП: cut off. Антитела к коклюшному, дифтерийному токсинам и менингококку выявляли диагностическими иммуноферментными тест-системами, разработанными сотрудниками ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского» /Макарова С.И., 2005/.
Данные представлены в таблице.
Содержание антител к возбудителям некоторых инфекционных заболеваний в препаратах иммуноглобулина
№ п/п
Наименование антител
Содержание антител в препаратах ИГ, полученных:
по прототипу М±m
заявляемым способом, М±m
1.
AT к вирусу кори, АЕ
2869±332
8834±721
2.
Противодифтерийные антитела, мкг/мл
27,9±3,6
36,2±5,4
3.
Противококлюшные антитела, ЕД/мл
72±7,9
279,4±23,1
4.
AT к полисахариду менингококка серотипа А, КП
2,79±0,16
2,91±0,11
5.
AT к родовому антигену вируса простого герпеса
16240±1195
24862±1280
6.
AT к цитомегаловирусу, АЕ
2188±92
3575±172
7.
AT к вирусу Varicella Zoster, AE
443±40
360±20
8.
AT к вирусу простого герпеса, серотип 2
348±83
5636±1264
9.
AT к вирусу простого герпеса, серотип 6
921±2
1166±19
10.
AT к вирусу краснухи, АЕ
5524±274
11350±2762
Результаты свидетельствуют, что титр антител к подавляющему большинству антигенов был выше в препарате, полученном заявляемым способом.
Таким образом, в результате реализации настоящей группы изобретений получают препарат иммуноглобулина, обогащенного иммуноглобулином М, пригодного для внутривенного введения, содержащий иммуноглобулин с повышенной биологической активностью IgG и низкой спонтанной антикомплементарной активностью фармацевтической композиции.
Источники информации
1. Сапожникова B.C. Разработка и изучение свойств антистафилококкового и противостолбнячного иммуноглобулинов для внутривенного введения.: Автореф. дисс канд. биол. наук. - Л., 1990. - 20 с.
2. Berkman S.A., Lee M.L., Gale R.P. Clinical uses of intravenous immunoglobulins.// Annals of internal medicine. - 1990. - V.112, №4. - P.278-292.
3. Патент RU 1732518.
4. Патент RU 2191032.
5. Патент RU 2158136.
6. Патент US 4256631.
7. Патент US 3808189.
8. Steinbuch M. Protein fractionation by ammonium sulphate, rivanol and caprylic acid precipitation. In Methods of plasma protein fractionation. Ed. Curling J.M. Academic Press, N.Y., 1980.
9. Barandun S., Kistler P., Jenet F., Isliker H. Intravenous administration of human γ-globulin. //Vox sanguinis. - 1962. - V.7. - №2. - P.157-174.
10. Патент SU №618958.
11. US patent №4356173.
12. US patent №4360457. Ono et al. S-sulfonated immunoglobulin composition having a high monomer content and a process for production thereof. 1982.
13. Мостовская Е.В. Оптимизация технологии получения жидкой формы иммуноглобулина для внутривенного введения. Автореф. дисс. канд. М., 2004, 22 с.
14. ЕР №0085747.
15. 3убкова Н.В. Физико-химические и биологические свойства препаратов иммуноглобулинов при разных способах удаления и инактивации вирусов. Автореф. дисс. канд. биол. наук. M., 2002, 24 с.
16. US 4318902.
17. Stephan W. Intravenous IgM by means of treatment of Cohn fraction III with β-propiolactone. In: Curling J.M. (ed) Pharmacia fine chemicals. Uppsala, Budapest, 1982, P.153.
18. EP 0450412.
19. Stephan W., Spilles C., 1983.
20. US patent 5075425. Kotitschke R., Stephan W., Moller W. et al. Process for the preparation of pharmaceutical which contains IgG, IgA and IgM and can be administered intravenous. 1990.
21. US patent 5410025. Moller W., Piechaczek. Unmodified intravenously administered immunoglobulin preparations containing imminoglobulin M and/or A., 1995.
22. Козлова М.Н. и соавт. Российский иммунологический журнал, 2008, Т.2, №2-3, с.142.
23. Good R.A., Lorenz E. Historic aspects of intravenous immunoglobulin therapy. Cancer., 1991, N 68, 6 Suppl., P.1415-1421.
24. Handsfield H.H., Wandell M., Golgstein L., Shriver К. // Screening and diagnostic performance of enzyme immunoassay for antibody to lymphadenopathy-associated virus. Journal of clinical microbiology., 1987. - N.5, p.879-884.
25. Макарова С.И. Выявление противодифтерийных антибактериальных антител с помощью иммуноферментного анализа. Автореф. дисс. канд. биол. наук, M., 2005, 22 с.