Материально-энергетический баланс процесса роста факультативно-анаэробных микроорганизмов в переходных режимах

УДК 579.222:579.24

С. Г. Мухачев, М. Ф. Шавалиев

МАТЕРИАЛЬНО-ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ БАЛАНС ПРОЦЕССА РОСТА ФАКУЛЬТАТИВНО-АНАЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В ПЕРЕХОДНЫХ РЕЖИМАХ

Ключевые слова: материально-энергетический баланс, стехиометрия, инвариант, спиртовые дрожжи.

Разработан алгоритм расчета технологических показателей процесса культивирования факультативно-анаэробных микроорганизмов в условиях неполной обеспеченности популяции кислородом. Алгоритм основан на сочетании способа представления стехиометрических инвариантов в дифференциальной форме и концептуального описания метаболизма микробных клеток в виде аддитивного выражения совокупности парциальных обменов.

Key words: material-energy balance, stoichiometry, invariant, alcohol yeast.

An algorithm for calculating technological characteristics of the process of cultivation of facultative anaerobic microorganisms under insufficient supply of oxygen was developed. The algorithm is based on combination of method of representation of stoichiometric invariants in differential form and conceptual description of metabolism of microbial cells in the form of additive expression of partial exchanges.

Концепция парциальных обменов Ерошина и Минкевича, разработанная на основе аддитивных представлений о затратах вещества и энергии на биосинтез и энергетические потребности микробной клетки, применялась для описания метаболических процессов в популяции микроорганизмов одного вида. Причем предполагалось, что все клетки популяции находятся в идентичных условиях [1-3].

При применении в биореакторах устройств безпузырькового ввода и стерилизации кислорода на основе непористых мембран возникает ситуация неполного обеспечения клеток кислородом. В этих условиях рост факультативно анаэробных микроорганизмов частично обеспечивается дыханием, а частично за счет брожения. Независимо от механизма получения энергии (брожение или аэробное окисление) эффективность запасания выделяющейся энергии в макроэнергетических связях АТФ приблизительно одинакова [4].

Высокий уровень легко усваиваемых сахаров подавляет способность клеток осуществлять аэробное дыхание, даже когда нет недостатка в кислороде. Это явление носит название катаболитной репрессии [5].

Поэтому высокий выход дрожжей достигается в условиях эффективной аэрации на среде с низким содержанием сахара [6]. Такие условия легче реализовать в непрерывном процессе, чем в традиционно применяющемся периодическом выращивании посевного материала с дробными добавками субстрата. При отсутствии ингибирования спиртовые дрожжи могут расти в условиях брожения с высокой скоростью, не уступающей процессу аэробного роста [7]. Однако, такой режим может поддерживаться также только в условиях непрерывного культивирования, поскольку в периодическом процессе происходит быстрое накопление этанола до ингибирующих концентраций. Наконец, в условиях свободного доступа кислорода процесс спиртового брожения ингибируется и активизируется дыхание. Это явление получило название «эффекта Пастера» [8]. «Эффект Пастера» есть результат определенного взаимодействия между механизмом регуляции

различных метаболических блоков, определяющих наработку энергии. Одним из проявлений такого взаимодействия является конкуренция за АДФ и неорганический фосфат между процессами субстратного фосфорилирования гликолитического пути и окислительного фосфорилирования в дыхательной цепи [9].

Концентрация растворенного кислорода влияет на скорость потребления субстрата микроорганизмами. Известно, что критическая концентрация кислорода для различных микроорганизмов различна. Так, например, для Saccharomycescerevisiae она составляет 0,6 мг/л [10].

При анализе процессов биосинтеза необходимо учитывать, что кислород в метаболизме аэробных микроорганизмов расходуется по трем направлениям [11]:

1) потребление кислорода для биосинтеза биомассы;

2) использование кислорода на синтез продуктов метаболизма;

3) расход кислорода на поддержание метаболизма существующей биомассы.

Материальный баланс процесса роста продуцента и биосинтеза экзометаболитов может быть представлен совокупностью уравнений образования и расхода макроэргических соединений (пересчитанных, например, на АТФ). Такое выделение метаболических блоков было предложено А. Стаутхамером [12]. Метаболические блоки представляют собой совокупность биохимических реакций, сбалансированных по всем веществам, кроме носителей энергии. Именно эти блоки удачно названы парциальными обменами И.Г. Минкевичем [1].

Существенное упрощение формы записи стехиометрических соотношений может быть получено при общепринятом приведении (пересчете) формул всех углеродсодержащих веществ (составов) к одному атому углерода [13].

Уравнение энергетического обмена представляется в виде:

Д • CHqOr + Д  Oг + АДФ ^

^Д, • ГО2 + Д  H2O + АТФ

где АТФ - пересчитанное на энергию АТФ суммарное количество энергии, запасаемое в клетках в форме МЭС и трансмембранного потенциала и доступное для последующего использования в биохимических процессах.

Уравнения поэлементного баланса для атомов углерода, водорода и кислорода представляются с учетом образования Е^молей АТФ при окислении 1 моля субстрата: С: р81 = рс1 = 1/ е3 Н: р81 = 2-рп 0: ^ Р,1 + 2-Ра, = 2-РС1 +РН1

Откуда:

Ра1 + (2 • Рс1 +РН1 - г - Рп )/2 = (2 + ч/2 - Г)/(2 • Ев) Поскольку Гз = (4. р + ч - 2 - г)/р, получаем следующие выражения для стехиометрических коэффициентов:

Ря = 1/Е,, Ра1 = у,/ (4 - Е,), Рс1 = 1/Е,, Рн1 = ч/(2 - Е,).

Пластический обмен (преобразование вещества субстрата в биополимеры клетки без учета затрат дополнительной энергии), может быть описан уравнением:

Р 2 - сн О г + Ра 2 а +РН 2 - МП 3 + Ех- АТФ ^ ^ сньмрЛ +Рн 2 - н 2 О+Ех- АДФ

Затраты кислорода выражаются через разность степеней восстановленности субстрата и биомассы. При этом уравнения элементного баланса по углероду, водороду, кислороду и азоту имеют вид: С: в2 = 1

Н: ч-в 2 + 3-вм2 = Ь + 2-вн 2

0: Г - в,2 + 2-во2 = Л + Рн2 в,2=с

Тогда, из уравнения баланса числа атомов водорода, подстановкой значений

стехиометрических коэффициентов в,2 = 1 и вМ2 = с

получаем: вн2 = (ч + 3 - с - Ь)/2 и далее из баланса числа атомов кислорода следует:

вО2 = [Л + (ч + 3-с -Ь)/2 -г]/2 или

вО2 = (ч -2- г+2- Л + 3- с -Ь)/4 .

Поскольку у, - ух = (4 + ч -2- г)-(4 + Ь -3- с -2- Л) = = ч - 2 - г + 2 - Л + 3 - с - Ь то получаем:

Рб 2 = 1; Р02 =У-Ух )/4; Рм 2 = с; Рн 2 =(( + 3-с - Ь)/2 При необходимости аналогично

записываются уравнения синтеза экзометаболитов или их вторичного потребления.

Конструктивный обмен (синтез биомассы) может быть описан путем энергетического сопряжения уравнения образования

макроэргических соединений (1) и их расхода в процессе биосинтеза, пропорционального образованию новой биомассы в соответствии с уравнением (2). Сложим уравнения (1) и (2):

(Ех / Е, + 1) - снрг + [Ех -у, /(4 - Е, )+(?„ - ух) /4]  Ог + с-Мн, ^ (3) ^ СньЫсОЛ +(Ех / Еs )-СО2 + [х -ч /(2-Еs)+( + 3-с - Ь)/2]-нгО

Процесс роста микроорганизмов в аэробных условиях при отсутствии значительного

образования вторичных метаболитов (уравнение 3) может иметь место при полной обеспеченности популяции кислородом. В этом случае недоокисленные продукты не накапливаются в клетке в избыточных количествах и, соответственно, не выбрасываются в окружающую среду.

Выражения метаболических скоростей расхода и синтеза компонентов культуральной жидкости помимо собственно стехиометрических соотношений, соответствующих уравнению (3), должны включать, в соответствии с указанным ранее постулатом Пирта, член, учитывающий расход энергии на цели поддержания жизнедеятельности. Тогда, скорость расхода энергии в пересчете на АТФ может быть записана в виде суммы [2, 14]:

КЛТР =(е + Ех- м)-

М,

М-г

В условиях стационарного состояния биохимической системы клетки (постоянства уровней внутриклеточных пулов веществ, в том числе постоянства пула АТФ) скорость образования АТФ равна скорости ее расхода.

Таким образом, все метаболические скорости могут быть выражены через следующие неизвестные параметры: е и Ех, определение которых и составляет одну из задач исследований микробиологических процессов, реализуемых в технических системах. Это может быть осуществлено на основе обобщенной функции энергозатрат [14]:

РЕ (в) = е / м+ Ех =-

Еб <Уб - ух)

4- Мс /(Ма-яд) -уБ Полученная функция РЕ(в) линейна относительно характерного времени развития популяции в=1/ц=в(2 /1п(2), где в'2 - период удвоения биомассы. Неизвестные величины затрат макроэргических соединений на поддержание жизнедеятельности (е) и процессы, связанные с ростом (Ех), могут быть найдены по графику, построенному по экспериментальным данным с использованием метода наименьших квадратов [14].

Функция энергозатрат может быть выражена и через соотношения других метаболических скоростей, а не только скорости затрат кислорода и продукции углекислого газа. Порядок действий по определению значений неизвестных параметров Ех и е или РЕ при этом не изменится.

После нахождения величин параметров энергопотребления могут быть рассчитаны все метаболические скорости (для любого значения ¡£).

Приведенные выше методические основы могут быть применены при анализе процесса роста популяции спиртовых дрожжей в условиях ограниченной обеспеченности кислородом, когда часть энергии популяция клеток получает за счет полного окисления субстрата (сахаров) до углекислого газа и воды, а другая часть энергозатрат обеспечивается механизмом брожения с образованием этанола и углекислого газа. При этом образование энергии, согласно концепции

парциальных обменов, выражается аддитивно через совокупность процессов дыхания и брожения.

С учетом выше сказанного, для анализа стехиометрии процесса выращивания чистых культур спиртовых дрожжей, авторами был применен метод стехиометрических инвариантов, записываемых в дифференциальной форме [2, 3, 14],и на основе концепции парциальных обменов построен алгоритм расчета материального баланса совокупности процессов метаболизма спиртовых дрожжей в условиях частичной обеспеченности популяции кислородом.

Запишем уравнения парциальных обменов в

виде:

Дыхание:

^ (1/6) • CO2 + (1/6) • H2O+ATP Брожение:

3 • CH2O + ADP ^ 2 • CH3O0,5 + CO2 + ATP

Пластический обмен:

Ps • CHfl + ри • NH3 + Ex • ATP ^

^ CHbNcOd + pc • CO2 + PH • H2O + Ex • ADP

Из балансов атомов углерода, водорода, кислорода и азота имеем:

Ps = rx/4; Ph =

8-4d-yx . 8 ;

Pc =

rx -7s . 4 ;

Pn = c

Суммируя уравнение дыхания с коэффициентом у-Ех, уравнение брожения с коэффициентом

Ух ~/s 4

+ (1 - 5у/6)• Ex

8- 4d-ух

8

+ (У/6) • Ex

H2O + 2 • (1 - у) • Ex • CH3O0,5

Введем удельный расход АТФ в метаболизме поддержания (расходный коэффициент АТФ):

Y = = ratp = ratp •x = ratp

ATP / x

Rx

ц X -ц X  Ях Тогда уравнение метаболизма поддержания жизнедеятельности можно записать на основании сложения уравнения дыхания с коэффициентом уе/м и уравнения брожения с коэффициентом (1-

у)-е/и:

(3 -17 у/б)--

Ц

• CH2O + У-е • O2 + eATP ^ 6ц ц

(1 - 5 у/6) — и

•CO2 + ^ H 2O + 6и

+ 2(1 у)-е . СИ О 5 + -ЛБР

Ц ' ц

Стехиометрические уравнения

конструктивного обмена и поддержания жизнедеятельности записаны относительно одного вновь синтезируемого условного моля биомассы. На основании сложения соответствующих

коэффициентов этих уравнений могут быть записаны выражения для расходных коэффициентов или коэффициентов выхода в расчете на моль вновь синтезируемой биомассы:

R е

Yo/x = ir = (У /6)^ Ex + (у/6)-

и

Rc

YC, x = =7x Ts +

Rx

.Rs.

Rx

r + (3 -17 у/6> Ex + (3 -17 у/6)e 4 и

Из выражений (12 - 14), исключая величину у, получаем уравнение связи метаболических скоростей (дифференциальную форму записи стехиометрического инварианта), откуда получим одну из возможных формул расчета дыхательного коэффициента:

RQ =

3

^

У

Соответственно получим выражение для энергетической функции (суммарные удельные затраты энергии при росте популяции):

Fe (в) = Ex + е / и=-

3<rx -rs )

2 - [у - (Я<2 + 5) - 6] Для строго аэробных процессов роста эта функция имеет вид [14]:

Fe (в) = е / и + Ex =

es  (rs -r-x) 4/RQ -rs

Но в случае роста части популяции спиртовых дрожжей в анаэробных условиях в формулу энергетической функции входит величина у, получаемая, например, из выражений яд и 7Х / х :

у=

54 •

51 •

При использовании выражения для Я0и 7Х / 0 получаем несколько более простое выражение для у:

у=

rx - I8 -

rx -

Это выражение более удобно использовать в вычислениях, поскольку при расчете удельной скорости роста не возникает необходимости пересчета концентрации биомассы из величины оптической плотности в концентрацию, выраженную через сухую массу клеток. А коэффициент пересчета всегда требует проверки или даже корректировки при смене среды, что увеличивает трудоемкость исследований.

Если при экспериментальном исследовании удельная скорость роста варьируется в малых пределах, например, оцениваются показатели стационарного режима, близкого к заданному или оптимальному значению протока, то раздельное определение затрат энергии на биосинтез и поддержание жизнедеятельности становится невозможным, поскольку ошибка измерения удельной скорости роста будет соизмерима с величиной е. В этом случае приходится ограничиваться расчетом суммарной величины энергозатратРЕ=е/м+Ехпри фиксированном

значении удельной скорости роста. Однако, это не препятствует возможности расчета величины доли популяции, находящейся в аэробных условиях (точнее доли энергии, получаемой популяцией за счет аэробного окисления субстрата). При этом расчет у, с целью выявления суммарной

^ CHhNOi +

CO2 +

+

погрешности косвенного определения, дублируется с использованием альтернативных алгоритмов.

Выводы: предложен способ обработки информации о процессе культивирования факультативных анаэробов, позволяющий использовать альтернативные алгоритмы расчета затрат энергии и обеспеченности популяции микроорганизмов кислородом. Способ может быть рекомендован для оценки технологических характеристик непрерывных процессов

выращивания посевных культур спиртовых дрожжей.

Литература

1. Минкевич, И. Г. Материально-энергентический баланс и кинетика роста микроорганизмов / И. Г. Минкевич. -Москва-Ижевск.: НИЦ «Регулярная и хаотическая динамика»; Институт компьютерных исследований. -2005. - 352 с.

2. С.Г. Мухачев, Вестник Каз. технол. ун-та, 5, 96 - 110 (2006).

3. М.Ф. Шавалиев и др., Вестник Каз. технол. ун-та, 5, 150

- 153 (2011).

4. RoseA.N., Economic microbiology. Alcoholic Beverages, Academic Press, 1977.

5. Берри, Д. Биологиядрожжей / Д. Берри. М. : Мир, 1985.

- 95 с.

6. Перт, С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / С. Дж. Перт. - М. : Мир, 1978. - 331 с.

7. Инге-Вечтомов С.Г. Дрожжи. // Итоги науки и техники. Серия общие проблемы биологии. ВИНИТИ. 1981. 1 С. - С.148-192.

8. Иерусалимский, Н.Д. Основы физиологии микроорганизмов / Н. Д. Иерусалимский. - М. : Наука, 1967. - 210 с.

9. Климовский, Д. Н. Технология спирта / Д. Н. Климовский, В. А. Смирнов, В. Н. Стабников. - М. : 1967. - 452 с.

10. Виестур, У. Э. Влияние кислорода на рост и размножение Saccharomycescerevisiae / У. Э. Виестур, Т. К. Аболинь // Изв. Ан Латв.ССР. - 1966. - № 12. - С. 8186.

11. Коновалов, С. Ф. Биохимия дрожжей / С. Ф. Коновалов. - 2 изд.. -М. : Пищевая промышленность, 1980. - 284 с.

12. Stouthamer A. H. Energetic aspects of the growth of microorganisms. - In: Microbial energetics: 27 thSymp. Soc. Gen. Microbiol. (London, 1977). - Cambridg, 1977, p. 285-315.

13. Иванов, В. Н. Стехиометрия и энергетика микробиологических процессов / В. Н. Иванов, Е. В. Стабникова. - Киев. : Наукова Думка, 1987. - 152 с.

14. Мухачев, С. Г. Методика лабораторного культивирования аэробных микроорганизмов и определение энергетических параметров микробного роста [Текст] : учебное пособие / С. Г. Мухачев. -Казань: КНИТУ, 2011. - 80 с.

© С. Г. Мухачев - канд.техн.наук, доцент кафедры химической кибернетики КНИТУ, ksoes@mi.ru; М. Ф. Шавалиев - канд. техн. наук, ассистент той же кафедры, Marat_Shavaliev@mail.ru.

© S. G. Mukhachev - candidate of chemical sciences, associate Professor of the Department of Chemical Cybernetics, KNRTU, ksoes@mi.ru; M.F. Shavaliev - candidate of technical sciences, assistant lecturer of the Department of Chemical Cybernetics, KNRTU, Marat_Shavaliev@mail.ru.