СПОСОБ СКРИНИНГА ВЕЩЕСТВ, ИМЕЮЩИХ РЕГУЛИРУЮЩЕЕ ВЕС ДЕЙСТВИЕ
METHOD FOR SCREENING SUBSTANCES HAVING WEIGHT CONTROL EFFECT

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Данное изобретение относится к способу скрининга веществ, имеющих регулирующее вес действие.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Синовиолин представляет собой белок, который был открыт как мембранный белок, который оверэкспрессируется в синовиальных клетках, полученных от пациентов, больных ревматоидным артритом (Патентный документ 1). Синовиолин был определен как молекула, которая является существенной для запуска ревматоидного артрита, согласно исследованиям, проведенным с использованием генетически модифицированных животных.
Предполагается, что синовиолин имеет мотив RING-пальца, основываясь на анализах с использованием системы предсказания структуры белка. Этот мотив обнаружен в большом количестве в ферменте, известном как E3 убиквитин лигаза, которая играет важную роль в убиквитинировании белка. В действительности показано, что синовиолин имеет самоубиквитинирующую активность, которая характерна для E3 убиквитин лигазы (Патентный документ 1). Однако многие функции синовиолина in vivo остаются неизвестными. Более конкретно, отсутствуют сообщения, касающиеся того, что повреждение гена синовиолина вызывает потерю веса.
Ожирение вызывается такими факторами, как отсутствие [физических] упражнений, пристрастие к перееданию или метаболические нарушения, приписываемые генетическим факторам или эндокринологическим заболеваниям. Ожирение представляет собой фактор риска, который индуцирует различные заболевания, возникающие во взрослом возрасте, такие как инфаркт миокарда или атеросклероз, и, поскольку это вносит вклад в усугубление этих заболеваний, их раннее лечение и предупреждение чрезвычайно важны. Хотя лечение, вовлекающее гормональные препараты или агенты, активирующие метаболизм, обычно используется в фармакотерапии ожирения, известно мало лекарств, которые способны безопасно уменьшать вес или тормозить рост веса.
ДОКУМЕНТЫ, ОТНОСЯЩИЕСЯ К ПРЕДШЕСТВУЮЩЕМУ УРОВНЮ ТЕХНИКИ
Патентные документы
[Патентный документ 1] Международная публикация № WO 02/052007
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Проблемы, которые решаются данным изобретением
Ввиду вышеизложенного, ведется разработка веществ, регулирующих вес.
Средства решения проблем
Автор данного изобретения впервые обнаружил с помощью мышей с условным нокаутом гена синовиолина, что повреждение гена синовиолина вызывает потерю веса, таким образом приведшее к завершению данного изобретения.
Конкретно, данное изобретение состоит в обозначенном ниже.
[1] Способ скрининга веществ, оказывающих регулирующее вес действие, включающий: приведение тестируемого вещества в контакт с клетками, экспрессирующими ген синовиолина, и идентификацию того, имеет или нет указанное тестируемое вещество влияние на экспрессию гена синовиолина.
[2] Способ, описанный в [1], где влияние на экспрессию гена синовиолина представляет собой ингибирование экспрессии гена синовиолина или инактивацию экспрессируемого им белка.
[3] Способ, описанный в [1], где влияние на экспрессию гена синовиолина представляет собой промотирование экспрессии гена синовиолина или активацию экспрессируемого им белка.
[4] Фармацевтическая композиция для регулирования веса тела, содержащая: нуклеиновую кислоту, состоящую из непрерывной последовательности оснований из 20-25 оснований, комплементарной продукту транскрипции гена синовиолина, где указанная нуклеиновая кислота подавляет экспрессию гена синовиолина.
[5] Фармацевтическая композиция для регуляции веса тела, содержащая: ингибитор убиквитинирующей активности белка синовиолина.
[6] Способ скрининга веществ, оказывающих регулирующее количество жировой ткани действие, включающий приведение тестируемого вещества в контакт с клетками, экспрессирующими ген синовиолина, и идентификацию того, имеет или нет указанное тестируемое вещество влияние на экспрессию гена синовиолина.
[7] Способ, описанный в [6], где влияние на экспрессию гена синовиолина представляет собой ингибирование экспрессии гена синовиолина или инактивацию экспрессируемого им белка.
[8] Способ, описанный в [6], где влияние на экспрессию гена синовиолина представляет собой промотирование экспрессии гена синовиолина или активацию экспрессируемого им белка.
[9] Фармацевтическая композиция для регуляции количества жировой ткани, содержащая: нуклеиновую кислоту, состоящую из непрерывной последовательности оснований из 20-25 оснований, комплементарной продукту транскрипции гена синовиолина, где указанная нуклеиновая кислота подавляет экспрессию гена синовиолина.
[10] Фармацевтическая композиция для регуляции количества жировой ткани, содержащая ингибитор убиквитинирования белка синовиолина.
[11] Способ скрининга веществ, оказывающих регулирующее индукцию дифференцировки адипоцитов действие, включающий приведение тестируемого вещества в контакт с клетками, экспрессирующими ген синовиолина, и идентификацию того, имеет или нет указанное тестируемое вещество влияние на экспрессию гена синовиолина.
[12] Способ, описанный в [11], где влияние на экспрессию гена синовиолина представляет собой ингибирование экспрессии гена синовиолина или инактивацию экспрессируемого им белка.
[13] Способ, описанный в [11], где влияние на экспрессию гена синовиолина представляет собой промотирование экспрессии гена синовиолина или активацию экспрессируемого им белка.
[14] Фармацевтическая композиция для регуляции индукции дифференцировки адипоцитов, содержащая: нуклеиновую кислоту, состоящую из непрерывной последовательности оснований из 20-25 оснований, комплементарной продукту транскрипции гена синовиолина, где нуклеиновая кислота подавляет экспрессию гена синовиолина.
[15] Фармацевтическая композиция для регуляции индукции дифференцировки адипоцитов, содержащая ингибитор активности убиквитинирования белка синовиолина.
Эффекты данного изобретения
Способом по данному изобретению вещество может быть признано имеющим новое регулирующее вес действие.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1 представляет собой дизайн направленного вектора гена.
Фиг.2 показывает изменения веса тела по отношению к числу дней содержания.
Фиг.3 показывает изменения в величине выживания по отношению к числу дней содержания.
Фиг.4 отображает патологические срезы жировой ткани, полученные от мышей с нокаутом по гену синовиолина и контрольных мышей на 16 день после введения тамоксифена. (1) Белая жировая ткань, (2) бурая жировая ткань.
Фиг.5 показывает эффекты подавления гена синовиолина, оказывающие регулирующее индукцию дифференцировки адипоцитов действие в клеточной линии 3T3-L1. ○: дифференцированные адипоциты, : жировые капли, которые не являются нормальными адипоцитами.
ЛУЧШИЙ СПОСОБ РЕАЛИЗАЦИИ ДАННОГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
В качестве тестируемого вещества в данном изобретении может быть использовано произвольное вещество. Какие-либо ограничения для типа тестируемого вещества отсутствуют, и оно может представлять собой низкомолекулярное синтетическое вещество, соединение, присутствующее в экстракте естественного продукта, или синтетический пептид. В качестве альтернативы тестируемое вещество может быть выбрано из библиотеки соединений, библиотеки фагов или комбинированной библиотеки.
В данном изобретении регулирующее вес действие относится к действию, которое вызывает изменение веса тела со значительной разницей до и после лечения. Регулирующее вес действие действует через, например, регуляцию количества жировой ткани или регуляцию индукции дифференцировки адипоцитов.
Синовиолин является E3 убиквитин лигазой, которая участвует в деградации, связанной с эндоплазматическим ретикулумом, и является универсально присутствующей у млекопитающих. В дополнение, последовательность оснований синовиолина может быть получена из известных баз данных. Например, номер доступа синовиолина человека - AB024690.
Мыши с нокаутом по гену синовиолина обозначают мышей, у которых нормальная экспрессия синовиолина ингибирована в результате искусственной модификации последовательности участка гена синовиолина и, в результате ее, предупреждения нормального функционирования синовиолина в организме.
В дополнение, часть или весь ген синовиолина могут быть модифицированы или делетированы. В данном документе «весь» ген синовиолина обозначает участок, простирающийся от 5'-конца экзона 1 до 3'-конца финального экзона геномной ДНК синовиолина. В дополнение, «часть» гена синовиолина обозначает часть этого участка с длиной, требующейся для ингибирования нормальной экспрессии гена синовиолина. Далее [термин] «модифицированный» обозначает изменение последовательности оснований участка-мишени геномной ДНК на другую последовательность оснований путем замены, делеции, встраивания и/или перемещения одного или множества нуклеотидов.
Нокаутное животное, у которого часть или весь ген синовиолина был модифицирован или делетирован, может быть получено известным способом. Например, нокаутное животное может быть получено с помощью направленного воздействия на ген способом, описанным в нижеследующих примерах. Таким способом путем замещения участка, по меньшей мере, содержащей старт-кодон экзона 1 гена синовиолина другой последовательностью оснований путем гомологичной рекомбинации нормальная экспрессия синовиолина может быть ингибирована. В дополнение, нокаутные животные могут быть использованы в способе скрининга по данному изобретению, включая в себя не только нокаутных животных, полученных по этому способу, но также их потомство.
Животные, предназначенные для использования как нокаутные животные по данному изобретению, не являются человекоподобными животными, и в этом отношении конкретные ограничения отсутствуют. Примеры включают в себя млекопитающих, таких как коровы, свиньи, овцы, козы, кролики, собаки, кошки, морские свинки, хомячки, мыши или крысы. Кролики, собаки, кошки, морские свинки, хомячки, мыши или крысы являются предпочтительными для использования в качестве экспериментальных животных. В частности, грызуны являются более предпочтительными, причем мыши и крысы являются особенно предпочтительными с учетом того, что создано большое количество инбредных линий, а также с учетом технологий, таких как культивирование оплодотворенных яйцеклеток или оплодотворение in vitro.
Часть гена синовиолина животного-мишени была выделена, чтобы сконструировать направленный вектор. Например, в случае получения нокаутных мышей, библиотека геномной ДНК была скринирована на ген синовиолина. Затем конструировали направленный вектор для гомологичной рекомбинации с использованием полученного клона геномной ДНК. Не требуется, чтобы клон геномной ДНК имел полный размер гена. Все, что требуется, - это клонирование участка, требующегося для подавления экспрессии синовиолина путем повреждения гена синовиолина. В дополнение, направленный вектор также может быть получен известным способом и, например, может быть получен с использованием коммерчески доступной плазмиды как основы, подходящим образом связывающей соответствующие фрагменты, состоящие из вышеупомянутого клона геномной ДНК, маркера положительного отбора, маркера негативного отбора и подобного.
Направленный вектор, полученный по вышеупомянутому способу, затем вводили в клетки, имеющие способность формировать индивид (тотипотентные), такие как оплодотворенные яйцеклетки, ранние зародыши или эмбриональные стволовые клетки (клетки ES), путем электропробоя мембраны и подобного, после чего следовал отбор тех клеток, в которых обнаруживается целевая гомологичная рекомбинация. Скрининг выполняли путем отбора клеток с помощью химического агента по способу позитивно-негативной селекции. После отбора тех клеток, в которых обнаруживается целевая гомологичная рекомбинация, это подтверждалось с помощью саузерн-блоттинга или полимеразной цепной реакции (PCR) или подобного. Наконец, клетки, в которых желаемая гомологичная рекомбинация была подтверждена, вводили в зародыш на стадии 8 бластомеров или бластоцисту, собранные из фаллопиевых труб или матки в ходе беременности.
Вышеупомянутый зародыш на стадии 8 бластомеров или бластоцисту трансплантировали суррогатной матери обычными способами. Путем скрещивания химерных животных зародышевой линии (предпочтительно самцов), рожденных от суррогатной матери, с животными дикого типа (предпочтительно самками), гомологичными по гену JLP дикого типа, может быть получено первое поколение (F1) в форме гетерозигот, в которых один из генов JLP на гомологичной хромосоме был поврежден гомологичной рекомбинацией. Далее путем скрещивания этих гетерозигот может быть получено второе поколение (F2) в форме гомозигот, в которых оба гена JLP гомологичной хромосомы были повреждены, то есть нокаутные по JLP животные по данному изобретению. Гомозиготы идентифицируются путем отделения части тела (такой как хвост), экстракции ДНК и определения генома путем саузерн-блоттинга или PCR и подобного.
Хотя нижеследующее представляет более подробное объяснение данного изобретения с помощью нижеследующих примеров, данное изобретение не ограничено этими примерами.
ПРИМЕРЫ
Чертеж дизайна направленного на ген вектора, использованного для получения нокаутных по синовиолину мышей по данному примеру, показан на фиг.1. На чертеже структуры нормального гена синовиолина (аллель дикого типа), направленного вектора для получения нокаутных по синовиолину мышей (направленный вектор), аллеля, который подвергается гомологичной рекомбинации (аллель-мишень), аллеля, содержащего последовательность loxP (аллель Flox), и аллеля, в котором делетированы экзоны от loxP-Exon 2 до 14-loxP (делетированный аллель), схематически показаны, соответственно, начиная сверху, в таком порядке.
Участок выше экзона 1 и ниже экзона 16 гена синовиолина мыши в форме участка гена 14,8 kb использовали для конструирования направленного вектора. Neo-резистентный ген, помещенный между последовательностями FRT, вставляли между экзоном 1 и экзоном 2. В дополнение, последовательности loxP вводили выше экзона 2 и ниже экзона 14.
Вышеупомянутый направленный вектор был введен в клетки ES. Клоны, имеющие аллель, в котором присутствует гомологичная рекомбинация, были отобраны на основании подтверждения удаления последовательности loxP-экзон-loxP путем обработки Cre и удаления последовательности FRT-неомицин-FRT путем обработки FLP с использованием длины продуктов PCR.
Химерные мыши были получены введением вышеупомянутых клонов ES клеток, которые подверглись гомологичной рекомбинации, в зародыши мыши, как описано в известном способе (например, EMBO J 16:1850-1857). Далее эти химерные мыши скрещивались с мышами дикого типа C57BL/6 для получения мышей, у которых удалена последовательность неомицина. В дополнение, поскольку последовательность loxP между экзонами и длинное плечо, включенные в направленный вектор, могут быть утрачены при гомологичной рекомбинации, их присутствие подтверждали с помощью PCR.
f1/f1
Полученных безнеомициновых мышей скрещивали с мышами CAG-CreER для получения мышей CAG-CreERsyno.
f1/f1
f1/f1
f1/f1
Тамоксифен вводили полученным мышам CAG-CreERsyno (20 мг/мл (кукурузное масло), 5 мг/40 г веса тела, интраперитонеальным введением, последовательное введение в течение 5 дней - в дни 0-4), чтобы индуцировать удаление loxP-экзон-loxP (CAG-CreER(+)syno). Группа C57BL/6J (контроль носителя, введение тамоксифена) и группа CAG-CreER(-)syno (контроль носителя, введение тамоксифена) использовались как контроли.
f1/f1
f1/f1
В результате уменьшение веса тела, зависящее от числа дней, в течение которых животные выдерживались, наблюдалось в группе, которой вводили CAG-CreER(+)syno тамоксифен. С другой стороны, уменьшение веса тела не наблюдалось ни в одной из контрольных групп (фиг.2). Все животные из группы, которой вводили CAG-CreER(+)syno тамоксифен, погибали на 18-й - 20-й день содержания (фиг.3). Вскрытие погибших животных показало слабые посмертные изменения в органах брюшной и грудной полостей. В дополнение, селезенка и желчный пузырь были уменьшены в размерах, и желчь, имеющая в норме желтоватый цвет, была бесцветной. Чрезвычайно тонким был подкожный, околопочечный и перитестикулярный жир.
Ткани мыши, полученные после содержания в течение 16 дней после введения тамоксифена, фиксировали в 4% формальдегиде и заключали в парафин, после чего на микротоме готовили среды жировой ткани.
f1/f1
f1/+
В результате уменьшение белой жировой ткани и бурой жировой ткани наблюдалось у нокаутных по синовиолину мышей (CAG-CreER(+)syno) по сравнению с гетерозиготными нокаутными по синовиолину мышами (CAG-CreER(+)syno) (фиг.4).
Клетки 3T3-L1 культивировали в течение 3 дней после достижения конфлюентного состояния в DMEM (10% фетальная бычья сыворотка (FBS), высокий уровень глюкозы). Дифференцировку индуцировали добавлением 500 мкМ IBMX (изобутилметилксантин), 1 мкМ дексаметазона и 5 мкг/мл инсулина. 10 мкМ LS-102 (ингибитор активности убиквитинирования синовиолина) или DMSO добавляли в то же самое время. После культивирования в течение 3 дней среду заменяли средой, содержащей 4 мкг/мл инсулина, после чего добавляли 10 мкМ LS-102 или DMSO. После повторного культивирования в течение 3 дней среду заменяли на DMEM (10% FBS, высокий уровень глюкозы), после чего культивировали в течение 3 дней. Что касается siPHK, 200 пмоль siPHK Syno770 были введены с помощью Lipofectamine 2000 за два дня до индуцирования дифференцировки.
Окрашивание масляным красным O
После отмывки клеток 3T3-L1 фосфатно-солевым буфером (PBS)(-), клетки фиксировали 10% формалином. Затем клетки отмывали PBS(-) и переносили в 60% изопропанол. Клетки окрашивали в течение 20 минут с помощью 18мг/мл масляного красного О/изопропанола, а затем отмывали 60% изопропанолом и PBS(-), после чего просматривали под микроскопом.
В результате в тех клетках, в которых активность гена синовиолина была ингибирована LI102 или siPHK Syno770, число дифференцированных адипоцитов было ниже по сравнению с контролем, предполагая, таким образом, что дифференцировка была подавлена (фиг.5). В дополнение, также наблюдались жировые капли, которые не являлись нормальными кольцеобразными адипоцитами.
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
Способ по данному изобретению пригоден для скрининга веществ, имеющих регулирующее вес действие.