ДОСТАВКА ПОЛЕЗНОЙ НАГРУЗКИ К СТВОЛОВЫМ КЛЕТКАМ
USEFUL LOAD DELIVERY TO STEM CELLS

[0001] Настоящее изобретение относится к способу нацеливания на стволовые клетки, в частности, неапоптотические стволовые клетки, с применением домена GLA, например, для облегчения проникновения в клетку.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Домены GLA содержатся в ряде GLA белков, таких как тромбин, фактор VII, фактор IX, фактор X, белок С, белок S (PrS), белок Z, остеокальцин, матриксный GLA белок, GAS6, транстиретин, периостин, пролин-богатый GLA 1, пролин-богатый GLA 2, пролин-богатый GLA 3 и пролин-богатый GLA 4.
[0003] Домены GLA так называемых GLA белков способны связывать фосфатидилсерин (PtdS, также обозначаемый как PS) на поверхности апоптотических клеток, таких как раковые клетки или клетки, инфицированные патогеном. Молекулы, за исключением каталитического домена, которые специфично связывают фосфатидилсерин, раскрыты в WO 2014/151535 и WO 2014/151683, включенные в настоящую заявку посредством ссылки.
[0004] Домены GLA (витамин К-зависимое карбоксилирование/гамма-карбоксиглутамат) представляют собой белковые домены, которые были модифицированы витамин К-зависимым посттрансляционным карбоксилированием остатков глутамата в аминокислотной последовательности для получения гамма-карбоксиглутамата (Gla).
[0005] Домен GLA связывает ионы кальция путем их хелатирования между двумя остатками карбоновой кислоты. Эти остатки представляют собой часть области, которая начинается на N-конце зрелой формы GLA белков и заканчивается консервативным ароматическим остатком. Это приводит к консервативному мотиву Gla-x(3)-Gla-x-Cys, который находится в середине домена, который, по-видимому, важен для распознавания субстрата карбоксилазой.
[0006] Считалось, что фосфатидилсерин представляет собой консервативный маркер для апоптотических клеток и часть механизма, посредством которого пораженные клетки снижают иммунный клиренс или индуцируют иммунную толерантность. Таким образом, было высказано предположение, что домены GLA связаны только с апоптотическими клетками. Однако неожиданно авторы настоящего изобретения установили, что домены GLA по настоящему изобретению могут быть использованы для нацеливания на стволовые клетки, такие как неапоптотические стволовые клетки и/или раковые стволовые клетки. Это еще более удивительно, потому что авторы изобретения имеют доказательства того, что здоровые дифференцированные клетки обычно не связаны доменами GLA, используемыми в настоящем изобретении.
[0007] Это имеет важное значение, например, для стволовой терапии, которую применяют для лечения состояний, таких как гематологические раковые заболевания, таких как лейкоз. Терапию стволовыми клетками можно проводить только после того, как собственный костный мозг/стволовые клетки/иммунная система пациента будут стерты.
[0008] Указанный процесс стирания требует «облитерационной терапии», например, высоких доз химиотерапии, лучевой терапии и/или терапии истощения В-клеток.
[0009] Указанная «облитерационная терапия» имеет много побочных эффектов, например, боль во рту и горле (которая может затруднять прием пищи у пациента), тошнота и рвота, подверженность инфекциям, таким как пневмония и цитомегаловирусная инфекция (CMV), анемия, кровотечение, бесплодие, когнитивная дисфункция и т.д. Эти побочные эффекты очень тяжелые, и пациентам, особенно детям, трудно справиться с ними. Качество жизни пациента стало бы значительно лучше, если бы эти побочные эффекты могли быть минимизированы или устранены.
[0010] Было также обнаружено, что стирание иммунной системы и ее перезагрузка приводят к ремиссии агрессивных форм рассеянного склероза (MS). Однако указанное лечение оставляют только для самых тяжелых случаев, потому что риск, связанный с лечением, является значительным. Однако настоящее изобретение позволяет химиотерапии быть специфично нацеленной на стволовые клетки с использованием GLA-компонента.
[0011] В настоящем изобретении предложен механизм для «специфичного» нацеливания на стволовые клетки, в частности, неапоптотические стволовые клетки. Стволовые клетки, нацеленные указанным способом, могут, например, быть выделенными, обработанными (включая генетическую коррекцию, увеличение, добавление), мечеными, трансформированными и/или исключенными. Таким образом, способ по настоящему изобретению можно применять для доставки терапевтических вмешательств в стволовые клетки, например, генетического материала и/или протеинового материала, и/или химической терапии.
[0012] Путем связавания домена GLA по настоящему изобретению с обнаруживаемой меткой, такой как флуоресцентная метка, his-метка или магнитный шарик, стволовые клетки можно выделить и отсортировать и т.д. Это может быть полезно при диагностике или выделении стволовых клеток для дальнейшей манипуляции, чтобы сделать их полезными в терапевтическом применении.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение кратко изложено ниже в «пронумерованных» пунктах:
1a. Способ нацеливания на стволовые клетки, включающий стадию приведения клеток в контакт с молекулой, содержащей полезную нагрузку, связанную с компонентом гамма-карбоксиглутаминовой кислоты (GLA-компонент),
отличающийся тем, что указанный GLA-компонент содержит домен GLA или его активный фрагмент и не содержит активный каталитический домен из GLA белка.
1b. Молекула, содержащая полезную нагрузку, связанную с компонентом гамма-карбоксиглутаминовой кислоты (GLA-компонент),
где указанный GLA-компонент содержит домен GLA или его активный фрагмент и не содержит активного каталитического домена из GLA белка для применения в лечении или диагностике стволовой клетки.
1c. Молекула, содержащая полезную нагрузку, связанную с компонентом гамма-карбоксиглутаминовой кислоты (GLA-компонент),
где указанный GLA-компонент содержит домен GLA или его активный фрагмент и не содержит активного каталитического домена из белка GLA для применения в производстве лекарственного средства для лечения или диагностики стволовой клетки.
2. Способ или молекула для применения по пункту 1a, 1b или 1c, где домен GLA или его активный фрагмент независимо выбран из тромбина, фактора VII, фактора IX, фактора X, белка С, белка S, белка Z, остеокальцина, матриксного GLA белка (MGP), GAS6, транстиретина (TTR), интер-альфа-ингибитора трипсина, периостина, пролин-богатого GLA 1 (PRRG1), пролин-богатого GLA 2 (PRRG2), пролин-богатого GLA 3 (PRRG3) и пролин-богатого GLA 4 (PRRG4).
3. Способ или молекула для применения по пункту 2, где домен GLA или его активный фрагмент независимо выбран из тромбина, фактора VII, фактора IX, фактора X, белка C, белка S, белка Z и GAS6, например, домена GLA из белка S, в частности последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1.
4. Способ или молекула для применения по пункту 1a, 1b или 1с-3, где GLA-компонент дополнительно содержит домен EGF, например, кальций-связывающий домен EGF.
5. Способ или молекула для применения по пункту 1a, 1b или 1c-4, где конструкция содержит домен EGF, выбранный из тромбина, фактора VII, фактора IX, фактора X, белка C, белка S, белка Z, остеокальцина, матриксного GLA белка, GAS6, транстретина, периостина, пролин-богатого GLA 1, пролин-богатого GLA 2, пролин-богатого GLA 3 и пролин-богатого GLA 4.
6. Способ или молекула для применения по пункту 5, где домен EGF выбран из тромбина, фактора VII, фактора IX, фактора X, белка C, белка S, белка Z и GAS6, например, домена EGF из белка S.
7. Способ или молекула для применения по любому из пунктов 1a, 1b или 1c-6, где GLA-компонент содержит последовательность, показанную в SEQ ID NO: 6, или ее производное, за исключением his-метки.
8. Способ или молекула для применения по пункту 1a, 1b или 1c-7, где компонент домена GLA дополнительно содержит крингл-домен.
9. Способ или молекула для применения по пункту 8, где крингл-домен имеет происхождение из белка, выбранного из группы, включающей фактор активации транскрипции 2 (ATF); Фактор XII (F12); тромбин (F2); гиалуронан-связывающий белок 2 (HABP2); фактор роста гепатоцитов (HGF); активатор фактора роста гепатоцитов (HGFAC); Белок Kremen 1 (KREMEN1); KREMEN2; липопротеин (а) (LPA); LPAL2; белок, стимулирующий макрофаги (MSP или ST MST1); белок 1, взаимодействующий с фосфоинозитид-3-киназой (PIK3IP1); активатор тканевого плазминогена (PLAT); урокиназу (PLAU); плазмин (PLG); сериновую протеазу 12 (PRSS12); трансмембранный рецептор тирозин-протеинкиназы ROR1 (ROR1); и трансмембранный рецептор тирозин-протеинкиназы ROR2 (ROR2).
in vitro
10. Способ по любому из пунктов 1a, 1b, 1c-9, отличающийся тем, что способ выполняют .
in vivo
11. Способ по любому из пунктов 1a, 1b, 1c-10, отличающийся тем, что доставка осуществляется в клетку  , например, отличающийся тем, что молекулу, содержащую GLA-компонент и полезную нагрузку, вводят пациенту, например, пациенту-человеку.
12. Способ или молекула для применения по пункту 1a, 1b или 1c-11, где молекула нацелена на внешнюю часть стволовой клетки.
13. Способ или молекула для применения по пункту 1a, 1b или 1c-12, где молекула интернализуется в стволовой клетке.
14. Способ или молекула для применения по пункту 1a, 1b или 1c-13, где клетка является неапоптотической (то есть здоровая стволовая клетка).
15. Способ или молекула для применения по пункту 1a, 1b или 1c-13, где клетка является апоптотической, например, пораженная стволовая клетка.
16. Способ или молекула для применения по пункту 1а, 1b или 1с-15, где стволовая клетка представляет собой стволовую клетку взрослого человека, например, включающую клетки-предшественники, и гемопоэтические стволовые клетки, миогенные стволовые клетки, остеопрогениторные стволовые клетки, нервные стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки, такие как сателлитные клетки, радиальные глиальные клетки, стромальные клетки костного мозга, периост, клетки-предшественники поджелудочной железы, клетки-предшественники эндотелия, бластные клетки и стволовые клетки трофобласта.
17. Способ или молекула для применения по пункту 1a, 1b или 1c-16, где стволовая клетка экспрессирует поверхностный маркер CD34.
18. Способ или молекула для применения по пункту 1a, 1b или 1c-17, где стволовая клетка является отрицательной по отношению к положительным поверхностным маркерам линии клеток (т.е. является Lin -ve).
19. Способ или молекула для применения по пункту 1a, 1b или 1c-18, где стволовая клетка представляет собой Lin-ve, CD34+ve, CD38-ve, CD45RA-ve, положительную CD90 и CD49f_+ ve.
20. Способ или молекула для применения по пункту 1a, 1b или 1c-17, где стволовая клетка представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку.
21. Способ или молекула для применения по пункту 20, где стволовая клетка экспрессирует поверхностный маркер из CD48, CD150, CD244, CD34, CD38, SCA-1, Thy1.1, C-kit, lin, CD135, slam1/CD150, Mac-1 (CD11b), CD4, фактора стволовых клеток (SCF) и комбинаций двух или более одинаковых из них.
22. Способ или молекула для применения по пункту 1a, 1b или 1c-19, где стволовая клетка представляет собой остеопрогениторную клетку.
23. Способ или молекула для применения по пункту 22, где стволовая клетка экспрессирует поверхностный маркер, выбранный из Gremlin-1, TGF-бета, bFGF, BMP-2, ALPP, MCAM, коллагена I, коллагена 1 альфа 1, коллагена II, RUNX2, декорина и комбинаций двух или более из них (таких как все указанные маркеры).
24. Способ или молекула для применения по пунктам 22 или 23, где стволовые клетки представляют собой остеобласты или их предшественников.
25. Способ или молекула для применения по пункту 24, где стволовая клетка экспрессирует поверхностный маркер, выбранный из Runx2, щелочной фосфатазы/ALPP/ ALPI, остеокальцина, BAP1, OPN, BAP31, коллагена I, SCUBE3, фибронектина, SPARC, IGFBP-3. и комбинаций двух или более из них (таких как все указанные маркеры).
26. Способ или молекула для применения по пункту 1a, 1b или 1c-16, где стволовая клетка представляет собой остеоцит или его предшественник.
27. Способ или молекула для применения по пункту 26, где стволовая клетка экспрессирует поверхностный маркер, выбранный из бета TGF, RANKL, MCSF, склеростина, DKK и комбинаций двух или более из них (таких как все указанные маркеры).
28. Способ или молекула для применения по пункту 26, где стволовая клетка экспрессирует поверхностный маркер, выбранный из Osterix+ve, CD90+ve, остеокальцина + ve, коллагена I + ve, костного сиалопротеина + ve и комбинаций двух или более из них (таких как все указанные маркеры).
29. Способ или молекула для применения по пункту 26, где стволовая клетка экспрессирует поверхностный маркер, выбранный из щелочной фосфатазы/ALPP (плацентарной щелочной фосфатазы)/ALPI + ve, коллагена I + ve, коллагена II + ve, декорина + ve, MCAM/CD146 + ve, MEPE/OF45 + ve, osterix + ve, CD90 + ve, osterix/Sp7 + ve, RUNX2/CBFA1 + ve, тромбопоэтина/Tpo + ve и комбинаций двух или более из них (таких как все указанные маркеры).
30. Способ или молекула для применения по пунктам 1a, 1b или 1c-19, где стволовая клетка представляет собой миогенную стволовую клетку.
31. Способ или молекула для применения по пункту 30, где стволовая клетка экспрессирует маркер, выбранный из CD56, CD146, VE-кадгерина, альфа-гладкомышечного актина, FABP3, интегрина альфа 7, десмина, тяжелой цепи миозина, рецептора UEA-1 и комбинаций двух или более из них (таких как все указанные маркеры).
32. Способ или молекула для применения по пункту 1a, 1b или 1c-19, где стволовая клетка представляет собой нервную стволовую клетку.
33. Способ или молекула для применения по пункту 32, где стволовая клетка экспрессирует маркер, выбранный из CD133, CD15, CD24 low или -ve, GCTM-2, CD45, CD34, нестина, Sox-2, ABCG2, FGF R4, Frizzled -9, и комбинаций двух или более из них (таких как все указанные маркеры).
34. Способ или молекула для применения по пункту 33, где маркер CD24 является low или -ve.
35. Способ или молекула для применения по пункту 33 или 34, где стволовая клетка экспрессирует маркерную комбинацию CD133 + ve, 5E12 + ve, CD34 -ve, CD45 -ve и CD24 low или -ve.
36. Способ или молекула для применения по пункту 1a, 1b или 1c-19, где стволовая клетка представляет собой мезенхимальную стволовую клетку.
37. Способ или молекула для применения по пункту 36, где стволовая клетка экспрессирует поверхностный маркер, выбранный из CD10, CD13, CD73, CD105, CD271, CD140b, CD240, frizzled-9, CD29, CD90, CD146, oct4, SSEA4, STRO-1, фактора стволовых клеток (SCF) и комбинаций двух или более из них.
38. Способ или молекула для применения по пункту 1a, 1b или 1c-19, где стволовая клетка является жировой.
39. Способ или молекула для применения по пункту 38, где стволовая клетка экспрессирует поверхностный маркер, выбранный из K15, CD34, нестина, фоллистатина, p63, интегрина альфа 6, тицина С, EGFR, IGFR, факторов frizzled и комбинаций двух или более из них.
40. Способ или молекула для применения по пункту 38 или 39, где стволовая клетка экспрессирует поверхностный маркер, выбранный из CD44, ICAM/CD54, CD34, членов семейства интегринов и комбинаций двух или более из них.
41. Способ или молекула для применения по пункту 1a, 1b или 1c-19, где стволовая клетка представляет собой эпителиальную стволовую клетку яичника и трубки.
42. Способ по п. 41, где стволовая клетка экспрессирует поверхностный маркер, выбранный из Gremlin 1, Lrig1, Lgr5, Bmi1, Tert, HopX и комбинаций двух или более из них.
43. Способ или молекула для применения по пункту 1a, 1b или 1c-15, где стволовая клетка представляет собой эмбриональную стволовую клетку.
44. Способ или молекула для применения по пункту 43, где стволовая клетка может быть идентифицирована на основе одного или нескольких поверхностных маркеров, выбранных из CD24, CD29, CD31, CD59, CD90, CD117, CD133, CD324, CD326, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, frizzled-5, фактора стволовых клеток, крипто (TDGF-1).
45. Способ или молекула для применения по пункту 1а, 1b или 1с-44, где стволовая клетка не является раковой.
46. Способ или молекула для применения по пункту 1а, 1b или 1с-44, где стволовая клетка представляет собой раковую стволовую клетку.
47. Способ или молекула для применения по пункту 46, где раковая стволовая клетка имеет эпителиальное происхождение.
48. Способ или молекула для применения по пункту 46 или 47, где раковая стволовая клетка экспрессирует поверхностный маркер, выбранный из CD44 (который избыточно экспрессирован по меньшей мере при раке молочной железы, яичника, предстательной железы, поджелудочной железы, плоскоклеточного и мочевого пузыря), CD133 (который избыточно экспрессирован по меньшей мере при раке головного мозга, толстой кишки, легкого, предстательной железы и медуллобластоме), CD24, CD90, CD271, CD4f, CD13 и комбинаций двух или более из них (другие маркеры включают ABCB5+, CD44+/CD24, CD34+/CD38- и CD44+/ESA+).
49. Способ или молекула для применения по пункту 46, где стволовая клетка имеет гемопоэтическое происхождение.
50. Способ или молекула для применения по пункту 49, где клетка имеет маркер, выбранный из CD19, WT-1 и их комбинаций.
51. Способ или молекула для применения по любому из пунктов 1-50, где GLA-компонент конъюгирован с полезной нагрузкой.
52. Способ или молекула для применения по пункту 1а, 1b или 1с-51, где полезная нагрузка содержит терапевтический агент, целенаправленно воздействующий агент и/или метку.
53. Способ или молекула для применения по пункту 52, где терапевтический агент представляет собой химическое соединение или биологическую молекулу (такую как белок), например, противораковое лекарственное средство, противораковая терапия, химиотерапевтическое средство, вирус или вирусный вектор, такой как онколитический вирус.
54. Способ или молекула для применения по пункту 1а, 1b или 1с-53, где полезная нагрузка выбрана из токсина, полимера (например, синтетических или природных полимеров), биологически активных белков (например, ферментов, других антител или фрагментов антител), лекарственного средства (например, малая молекула (химическое соединение) или химиотерапевтический агент), нуклеиновых кислот и их фрагментов (например, ДНК, РНК, такие как малая РНК, образующая шпильки, (шпРНК) и малая интерферирующая РНК (миРНК), и их фрагменты, включая гидовую РНК (гРНК) для CRISPRCas9 и CRISPRa/i), радионуклидов (в частности, радиоактивный йод, радиоизотопы), метал-хелатообразующего агента, наночастиц и репортерных групп (таких как флуоресцентные или люминесцентные метки или соединения, которые могут быть обнаружены с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) или электронного парамагнитного резонанса (ЭПР).
55. Способ или молекула для применения по пункту 54, где токсин выбран из ауристатина (например, MMAE (монометилауристатин E), MMAF (монометилауристатин F)), пирролобензодиазепина (PBD), доксорубицина, дуокармицина, майтансиноида (например, N-2'-деацетил-N2'-(3-меркапто-1-оксопропил)-майтансин (DM1), N-2'-деацетил-N2'-(4-меркапто-1-оксопентил)-майтансин (DM3) и N-2'-деацетил-N2''(4-метил-4-меркапто-1-оксопентил)-майтансин (DM4)), калохеамицина, доластатина, майтанcина, α-аманитина, экзотоксина Pseudomonas (PE38), цепи рицина A, дифтерийного токсина, противовирусного белка Pokeweed (PAP), сапорина, гелонина и тубулизина.
56. Способ или молекула для применения по пункту 53, где химиотерапевтическое средство выбрано из темозоломида, эпотилонов, мелфалана, кармустина, бусульфана, ломустина, циклофосфамида, дакарбазина, полифепросана, ифосфамида, хлорамбуцила, мехлоретамина, бусульфана, циклофосфамида, карбоплатина, цисплатина, тиотепа, капецитабина, стрептозоцина, бикалутамида, флутамида, нилутамида, лейпролида ацетата, доксорубицина гидрохлорида, блеомицина сульфата, даунорубицина гидрохлорида, дактиномицина, липосомального даунорубицина цитрата, липосомального доксорубицина гидрохлорида, эпирубицина гидрохлорида, идарубицина гидрохлорида, митомицина, доксорубицина, валрубицина, анастрозола, торемифена цитрата, цитарабина, фторурацила, флударабина, флоксуридина, интерферона альфа-2b, пликамицина, меркаптопурина, метотрексата, интерферона альфа-2, медроксипрогестерона ацетата, эстрамустина натрия фосфата, эстрадиола, лейпролида ацетата, мегестрола ацетата, октреотида ацетата, диэтилстилбестрола дифосфата, тестолактона, гозерелина ацетата, этопозида фосфата, винкристина сульфата, этопозида, винбластина, этопозида, винкристина сульфата, тенипозида, трастузумаба, гемтузумаба озогамицина, ритуксимаба, экземестана, иринотекана гидрохлорида, аспарагиназы, гемцитабина гидрохлорида, алтретамина, топотекана гидрохлорида, гидроксимочевины, кладрибина, митотана, прокарбазина гидрохлорида, винорелбина тартрата, пентростатина натрия, митоксантрона, пэгаспаргазы, денилейкина дифтитокса, альтретиноина, порфимера, бексаротена, паклитаксела, доцетаксела, мышьяка триоксида, третиноина и комбинаций двух или более из них.
57. Способ или молекула для применения по любому из пунктов 52-54, где химиотерапевтическое средство выбрано из алкилирующего агента, антиметаболита, включающего ингибиторы тимидилатсинтазы, таксана, антрациклина, антимикротрубочкового агента, включающего растительные алкалоиды, и их комбинаций из двух или более из них.
58. Способ или молекула для применения по пункту 57, где химиотерапевтическое средство выбрано из паклитаксела, доцетаксела, абраксана, карбазитаксела, производных любого из них и комбинаций двух или более из любого из вышеупомянутых.
59. Способ по пункту 57 или 58, отличающийся тем, что алкилирующий агент выбран из азотистого иприта, нитрозомочевины (например, кармустин), тетразина, азиридина, платины и ее производных, неклассического алкилирующего агента и комбинации двух или более из них.
60. Способ или молекула для применения по пункту 59, где платина выбрана из цисплатина, карбоплатина, оксалиплатина, сатраплатина, пикоплатина, недаплатина, триплатина, липоплатина и комбинации двух или более из них.
61. Способ или молекула для применения по любому из пунктов 57 или 58, где алкилирующий агент представляет собой антиметаболит, выбранный из антифолатов (например, метотрексат и пеметрексед), аналогов пурина (например, тиопурины, такие как азатиопурин, меркаптопурин, тиопурин, флударабин (включая фосфатную форму), пентостатин и кладрибин), аналогов пиримидина (например, фторпиримидины, такие как 5-фторурацил и его пролекарства, такие как капецитабин [Кселода]), флоксуридина, гемцитабина, цитарабина, децитабина, ралтитрекседа (томудекс) гидрохлорида, кладрибина и 6-азаурацила и комбинации двух или более из них.
62. Способ или молекулы для применения по любому из пунктов 56 до 60, где антрациклин выбран из даунорубицина (дауномицин), даунорубицина (липосомальный), доксорубицина (адриамицин), доксорубицина (липосомальный), эпирубицина, идарубицина, митоксантрона и комбинации двух или более из них, в частности доксорубицина.
63. Способ или молекула для применения по любому из пунктов 53-62, где лекарственное средство представляет собой противораковое лекарственное средство, например, выбранное из ингибитора топоизомеразы, ингибитора поли(аденозиндифосфат-рибоза)полимеразы (PARP) и комбинации или нескольких из них.
64. Способ или молекула для применения по любому из пунктов 53-64, где противораковая терапия представляет собой радионуклид, например, выбранный из Y-90, P-32, I-131, In-111, Sr-89, Re-186, Sm-153, Sn-117m и комбинации двух или более из них.
65. Способ или молекула для применения по любому из пунктов 1a, 1b или 1c-64, которые включают введение молекулы, содержащей GLA-компонент и полезную нагрузку, больному раком, например, когда рак является рефрактерным.
66. Способ или молекула для применения по пункту 65, где рак представляет собой эпителиальный рак, например, колоректальный рак, тестикулярный рак, рак печени, рак желчных путей, глиобластому, меланому, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичника, рак шейки матки, рак матки, рак желудка, рак пищевода, рак щитовидной железы, рак почки, рак мочевого пузыря, рак головного мозга, рак головы и шеи или рак легкого или, альтернативно, рак может представлять собой гематологический рак, например, лейкоз, лимфома, миелома и хронические миелопролиферативные заболевания, такие как острый миелоидный лейкоз (AML), хронический миелоидный лейкоз (CML), острый лимфобластный лейкоз (ALL) и хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL).
67. Способ или молекула для использования по любому из пунктов 1-66, где полезная нагрузка преобразуется в активную форму внутри клетки.
68. Способ или молекула для применения по пункту 67, где преобразование в активную форму осуществляется ферментом.
69. Способ или молекула для применения по пункту 68, где фермент выбран из карбоксилэстеразы, ацетилхолинэстеразы, параоксоназы (такой как параоксоназа 2), матриксных металлопротеаз, щелочной фосфатазы, β-глюкуронидазы, пуриннуклеозидфосфорилазы, бета-лактамазы (например, продуцированные Mycobacterium tuberculosis и kansasii) и цитозин-деминаза.
70. Способ или молекула по любому из пп. 1-69, где GLA-компонент имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 6, или эквивалентную последовательность, исключающую His-метку.
[0013] Согласно одному варианту воплощения GLA-компонент связывает поверхностно-экспонированный фосфатидилсерин на клетках перед интернализацией.
[0014] Не желая быть связанными теорией, авторы настоящего изобретения считают, что не весь фосфатидилсерин эквивалентен с биологической точки зрения. Авторы изобретения полагают, что воздействие фосфатидилсерина ферментом TMEM16F участвует в подавлении иммунитета и представляет собой то, что «видят» молекулы по настоящему изобретению.
[0015] Согласно одному варианту воплощения стволовые клетки представляют собой стволовые клетки взрослого человека или везикулы, имеющие происхождение из них, например, соматические стволовые клетки, такие как гемопоэтическая стволовая клетка, мезенхимальная стволовая клетка или стромальная стволовая клетка.
[0016] Согласно одному варианту воплощения стволовая клетка представляет собой эмбриональную стволовую клетку или везикулу, имеющую происхождение из нее. Согласно одному варианту воплощения клетка не представляет собой эмбриональную стволовую клетку.
SSEA-1
SSEA-3
SSEA-4
CD324
CD90
CD117
CD326
CD9
CD24
CD29
CD59
CD133
CD31
TRA-1-60
TRA-1-81
Frizzled5
Фактор стволовых клеток
Cripto
[0017] Согласно одному варианту воплощения указанный способ относится к стволовым клеткам млекопитающих, например, стволовым клеткам человека. Стволовые клетки, обсуждаемые здесь, представляют собой в основном стволовые клетки человека. Однако специалист в данной области способен идентифицировать релевантную или соответствующую популяцию стволовых клеток для других млекопитающих при необходимости. Например,  представляет собой маркер мышиных эмбриональных стволовых клеток, клеток зародышевой линии человека и клеток эмбриональной карциномы;  представляет собой маркер эмбриональных стволовых клеток приматов, эмбриональных зародышевых клеток человека, эмбриональных стволовых клеток человека и клеток эмбриональной карциномы;  представляет собой маркер эмбриональных стволовых клеток приматов, эмбриональных зародышевых клеток человека, стволовых клеток человека, клеток эмбриональной карциномы;  представляет собой маркер эмбриональных стволовых клеток человека и мыши, эмбриональных раковых клеток;  представляет собой маркер эмбриональных стволовых клеток человека и мыши, гемопоэтических стволовых клеток, клеток эмбриональной карциномы;  представляет собой маркер эмбриональных стволовых клеток человека и мыши, клеток-предшественников гемопоэтических стволовых клеток, меланоцитов, происходящих из нервного гребня, первичных половых клеток, клеток эмбриональной карциномы;  представляет собой маркер эмбриональных стволовых клеток человека и мыши, клеток эмбриональной карциномы;  представляет собой маркер эмбриональных стволовых клеток человека и мыши;  представляет собой маркер эмбриональных стволовых клеток человека и мыши;  представляет собой маркер эмбриональных стволовых клеток человека и мыши;  представляет собой маркер эмбриональных стволовых клеток человека и мыши;  представляет собой маркер эмбриональных стволовых клеток человека и мыши, клеток эмбриональной карциномы, гемопоэтических стволовых клеток;  представляет собой маркер эмбриональных стволовых клеток человека и мыши;  представляет собой маркер эмбриональных стволовых клеток человека, теракарциномы, эмбриональных половых клеток, клеток эмбриональной карциномы;  представляет собой маркер эмбриональных стволовых клеток человека, теракарциномы, эмбриональных половых клеток, клеток эмбриональной карциномы;  представляет собой маркер для эмбриональных стволовых клеток человека и мыши;  (SCF) представляет собой маркер эмбриональных стволовых клеток человека, гемопоэтических стволовых клеток, мезенхимальных стволовых клеток, клеток эмбриональной карциномы; и  представляет собой маркер эмбриональных стволовых клеток человека и мыши, кардиомиоцитов и клеток эмбриональной карциномы.
[0018] Согласно одному варианту воплощения полезная нагрузка содержит терапевтический агент.
[0019] Согласно одному варианту воплощения полезная нагрузка содержит детектируемую метку.
[0020] Согласно одному варианту воплощения полезная нагрузка содержит последовательность ДНК или РНК, например, комплиментарную ДНК (кДНК), содержащую трансген или последовательность интерферирующей РНК (РНКи) (такую как микроРНК (миРНК), малую интерферирующую РНК (миРНК), включая малую РНК, образующую шпильки (shRNA)). ДНК, кодирующая трансген, может быть доставлена транскрипционно-активной ДНК или плазмидой для временной или стабильной экспрессии.
[0021] Согласно одному варианту воплощения полезная нагрузка подходит для индуцирования дифференциации стволовых клеток, например, для активации и/или созревания клетки в определенной клеточной линии.
[0022] Согласно одному варианту воплощения способ по настоящему изобретению включает предварительное лечение пациента, например, для того, чтобы индуцировать или усилить экспрессию PS на стволовых клетках, например, этап предварительного лечения может быть представлять собой лечение с помощью лучевой терапии, в частности облучение клеток костного мозга.
[0023] Настоящее изобретение также распространяется на фармацевтические композиции, содержащие молекулы для применения в соответствии с настоящим изобретением, в частности, для применения, как описано здесь. Таким образом, согласно одному варианту воплощения, молекулы по настоящему изобретению используют в лечении внутриклеточной мишени.
[0024] Настоящее изобретение также распространяется на применение GLA-компонента, содержащего домен GLA или его активный фрагмент, в котором указанный GLA-компонент не содержит активный каталитический домен из GLA белка, для внутриклеточного нацеливания и доставки (включая внутриклеточную доставку полезной нагрузки).
[0025] Настоящее изобретение также распространяется на применение GLA-компонента, содержащего домен GLA или его активный фрагмент, в котором указанный GLA-компонент не содержит активный каталитический домен из GLA белка, для изготовления лекарственного средства для внутриклеточного нацеливания и доставки (включая внутриклеточную доставку полезной нагрузки, в частности, когда полезная нагрузка включает терапевтическое соединение/молекулу).
[0026] Данная технология может быть использована, чтобы уничтожить иммунные клетки пациента до трансплантации стволовых клеток, например, полезная нагрузка как правило будет представлять собой химиотерапию, например, содержащую кармустин.
2
2
2
2
[0027] Текущий режим для абляции иммунных клеток (BEAM) представляет собой кармустин (BCNU) 300 мг/м в сутки -6, этопозид 200 мг/м и цитарабин 200 мг/м ежедневно с суток -5 до -2, и мелфалан 140 мг/м в сутки 1. Антитимоцитарный глобулин кролика (2,5 мг/кг/сут) вводили в сутки -2 и -1. Этот режим может быть адаптирован путем конъюгирования каждого из агентов с молекулой GLA по настоящему изобретению.
[0028] Согласно одному варианту воплощения иммунная облитерация предназначена для рака, для гематологического рака (например, выбранного из миеломы, лимфомы, лейкоза, такого как острый миелолейкоз (AML), хронической миелопролиферативной болезни, моноклональной гаммапатит неопределенного значения, миелодиспластического синдрома и амилоидоза, такого как AML, CML, CLL или ALL)
[0029] Согласно одному варианту воплощения миелома выбрана из множественной миеломы, амилоидоза и плазмоцитомы.
[0030] Согласно одному варианту воплощения миелома выбрана из моноклональной гаммапатии неопределенного значения, асимптоматической миеломы, симптоматической миеломы и болезни Келера.
[0031] Согласно одному варианту воплощения лимфома выбрана из анапластической крупноклеточной лимфомы, лимфомы Беркитта, Беркитта-подобной лимфомы, кожной Т-клеточной лимфомы, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, лимфобластной лимфомы, лимфомы, ассоциированной со слизистыми оболочками (MALT-лимфома), мантийноклеточной лимфомы, медиастинальной В-крупноклеточной лимфомы, нодальной В-клеточной лимфомы маргинальной зоны, лимфомы из малых лимфоцитов, лимфомы щитовидной железы и макроглобулинемии Вальденстрема.
[0032] Согласно одному варианту воплощения хроническое миелопролиферативное заболевание выбрано из эссенциальной тромбоцитемии, хронического идиопатического миелофиброза и полицитемии рубры вера.
[0033] Согласно одному варианту воплощения лейкоз выбран из острого миелоидного лейкоза (AML), волосатоклеточного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза и хронического лимфобластного лейкоза, такого как AML.
[0034] В последнее время стало очевидно, что при тяжелых аутоиммунных заболеваниях, таких как тяжелый рассеянный склероз и тяжелый артрит, облитерация иммунных клеток с последующей трансплантацией стволовых клеток может привести к ремиссии заболевания. Таким образом, абляционная терапия по настоящему изобретению может быть применена при аутоиммунном заболевании, таком как рассеянный склероз и артрит.
[0035] Согласно одному варианту воплощения молекула GLA по настоящему изобретению связана, например, конъюгирована, с полезной нагрузкой, которая содержит обнаруживаемую метку. Примеры обнаруживаемых меток приведены ниже. Обнаруживаемая метка может быть использована для сортировки или выделения стволовых клеток, например, с помощью сортировки с возбуждением флуоресценции (FACS), магнитной сортировки или подобного. Таким образом, в одном варианте воплощения предложен способ выделения или обогащения стволовых клеток с использованием молекулы GLA по настоящему изобретению. Это является преимуществом, потому что исторически выделение определенных популяций стволовых клеток, таких как раковые стволовые клетки, было очень трудным.
in vivo
[0036] Меченая молекула GLA может также быть использована  в качестве визуализирующего агента, в частности, в качестве диагностического инструмента, например, для идентификации раковых стволовых клеток в первичных опухолях или метастазировании. Это может быть важно для наблюдения за пациентами после операции и/или химиотерапии, чтобы убедиться, что рак находится в стадии ремиссии.
[0037] Линкер полезных нагрузок ДНК-трансгена и/или полезных нагрузок РНК с молекулой GLA может быть использован в качестве альтернативной внутриклеточной доставки к доставке вирусного вектора (трансдукции) или традиционной трансфекции. Он может быть использован in vitro для экспрессии экзогенных или эндогенных белков в клетке (например, когда модифицированные стволовые клетки предназначены для повторной инфузии пациенту) или может быть применен in vivo. Гены могут быть экспрессированы временно или могут быть предназначены для стабильной интеграции в стволовую клетку.
[0038] Неожиданно авторы настоящего изобретения показали, что молекулы по настоящему изобретению не только связывают стволовые клетки, они быстро интернализуются в них вместе с прикрепленной к ним полезной нагрузкой.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0039] В настоящей заявке внутриклеточная доставка относится к переносу, например, полезной нагрузки внутрь клетки.
[0040] Согласно одному варианту воплощения полезная нагрузка не интернализована.
[0041] Согласно одному варианту воплощения GLA-компонент и полезная нагрузка не интернализованы.
[0042] В настоящей заявке полезная нагрузка относится к молекуле, которая связана с доменом GLA, в частности, с целью внутриклеточной доставки. Связь может представлять собой связь посредством химической конъюгации с использованием, например, химии малеимида или клик-химии для закрепления фрагмента к гидрофильному лизину. В качестве альтернативы, связь может представлять собой слияние, например, пептидную связь, где связанное вещество экспрессировано в виде слитого белка с GLA компонентом, например, это может подходить для определенных детектируемых меток, таких как флуоресцентные белки или антитела. Линкеры могут быть использованы между GLA-компонентом и полезной нагрузкой. Полезные нагрузки могут содержать лекарственное средство, токсин, полимер, биологически активный белок, терапевтический вирус, онколитический вирус, вирусный вектор, радионуклиды, металл-хелатообразующий агент и/или репортерную группу (такую как метка).
[0043] Согласно одному варианту воплощения 1, 2, 3, 4 или 5 полезных нагрузок связаны с GLA-компонентом.
[0044] GLA-компонент (в настоящей заявке также называемый как компонент гамма-карбоксиглутаминовой кислоты) относится к полипептиду, содержащему GLA-домен в отсутствие каталитического домена из GLA белка, такого как белок S. Полипептид может дополнительно содержат домен EGF и крингл-домен, например, из белка S. Согласно одному варианту воплощения GLA-компонент содержит от 30 до 300 аминокислотных остатков, например, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 или 300 остатков. Согласно одному варианту воплощения GLA-компонент находится в диапазоне от 4,5 до 30 кДа. Согласно одному варианту воплощения GLA-компонент содержит последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1. Согласно одному варианту воплощения GLA-компонент содержит последовательность, показанную в SEQ ID NO: 6, или ее производное, за исключением his-метки.
[0045] В настоящей заявке домены GLA (витамин К-зависимое карбоксилирование/гамма-карбоксиглутамат) представляют собой белковые домены, которые были модифицированы витамин К-зависимым посттрансляционным карбоксилированием остатков глутамата в аминокислотной последовательности для получения гамма-карбоксиглутамата (Gla). Согласно одному варианту воплощения домен GLA, используемый в молекулах по настоящему изобретению, содержит от 30 до 45 последовательных остатков из нативного (дикого типа) домена GLA. Согласно одному варианту воплощения домен GLA содержит 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 остатков GLA.
[0046] Согласно одному варианту воплощения 30% или менее от GLA-компонента составляют остатки GLA.
[0047] Согласно одному варианту воплощения GLA-компонент содержит от 1 до 5 дисульфидных связей, например, 1, 2, 3, 4 или 5 дисульфидных связей.
[0048] Домен GLA связывает ионы кальция путем их хелатирования между двумя остатками карбоновой кислоты. Эти остатки представляют собой часть области, которая начинается на N-конце зрелой формы белков Gla и заканчивается консервативным ароматическим остатком. Это приводит к консервативному мотиву Gla-x(3)-Gla-x-Cys, который находится в середине домена и который, по-видимому, важен для распознавания субстрата карбоксилазой.
[0049] Домены GLA содержатся в ряде белков, таких как тромбин, фактор VII, фактор IX, фактор X, белок С, белок S (PrS), белок Z, остеокальцин, матриксный GLA белок, Gas6, транстиретин, периостин, пролин-богатый GLA 1, пролин-богатый GLA 2, пролин-богатый GLA 3 и пролин-богатый GLA 4.
in vitro
[0050] В настоящей заявке домен GLA также распространяется на белки, где от 1 до 10 процентов (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10%) аминокислот в нативном домене GLA могут быть заменены и удалены при условии, что модифицированный домен сохраняет по меньшей мере 70% (например, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%) нативной активности нативного (немодифицированного домена GLA) в подходящем анализе .
[0051] В настоящей заявке домен EGF представляет собой консервативный домен белка. Он содержит приблизительно от 30 до 40 аминокислотных остатков и обнаружен в большом количестве преимущественно в животных белках. В большинстве случаев EGF-подобный домен находится во внеклеточном домене мембраносвязанных белков или в белках, известных как секретируемые. EGF-подобный домен включает в себя 6 остатков цистеина. Основная структура EGF-подобных доменов представляет собой двухцепочечный β-лист, за которым следует петля до короткого C-конца двухцепочечного β-листа. Эти два β-листа обычно обозначаются как основной (N-конец) и вспомогательный (C-конец) листы. EGF-подобные домены часто встречаются в многочисленных тандемных копиях в белках: эти повторы обычно складываются вместе, образуя единый линейный блок соленоидный домен в качестве функциональной единицы. Согласно одному варианту воплощения используемый домен представляет собой полноразмерный нативный домен.
[0052] В настоящей заявке домен EGF также распространяется на белки, где от 1 до 10 процентов (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10%) аминокислот в нативном домене EGF могут быть заменены и удалены при условии, что модифицированный домен сохраняет по меньшей мере 70% (например, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%) нативной активности нативного (немодифицированного EGF-домена) в подходящем анализе in vitro. Согласно одному варианту воплощения белок представляет собой полноразмерный нативный домен.
[0053] В настоящей заявке крингл-домен относится к автономным белковым доменам, которые складываются в большие петли, стабилизированные 3 дисульфидными связями. Они характеризуются тройной петлей, 3-дисульфидной мостиковой структурой, конформация которой определяется количеством водородных связей и небольшими кусочками антипараллельного бета-листа. Они обнаружены в белках свертывания крови и в фибринолитических белках в разном количестве копий, в некоторых белках плазмы, включая активатор плазминогена протромбинового и урокиназного типа, которые представляют собой сериновые протеазы, принадлежащие к пептидазе семейства MEROPS S1A.
in vitro
[0054] В настоящей заявке крингл-домен также распространяется на белки, где от 1 до 10 процентов (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10%) аминокислот в нативном крингл-домене могут быть заменены и удалены при условии, что модифицированный домен сохраняет по меньшей мере 70% (например, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%) нативной активности нативного (немодифицированного крингл-домена) в подходящем анализе . Согласно одному варианту воплощения используемый домен представляет собой полноразмерный нативный домен.
in vitro
[0055] В настоящей заявке активный фрагмент белка меньше целого нативного белка (или соответствующего домена), который сохраняет по меньшей мере 50% (например, 60, 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%) активного вещества нативного полноразмерного домена или белка в соответствующем анализе .
[0056] В настоящей заявке каталитический домен представляет собой домен (или фрагмент) ниже домена EGF в направлении С-конца, например, как показано на фиг. 1А.
[0057] В настоящей заявке термин in vitro относится к лабораторной работе, не проводимой на теле человека или животного.
[0058] В настоящей заявке термин in vivo относится к работе/проведению испытания/лечения в живом организме, в частности, у человека или животного.
[0059] В настоящей заявке стволовая клетка относится к недифференцированным клеткам, способным к дифференцированию, и включает эмбриональные стволовые клетки и стволовые клетки взрослого человека, в частности стволовые клетки взрослого человека.
[0060] Гемопоэтические стволовые клетки (HSC) или гемоцитобласты представляют собой стволовые клетки, которые дают начало всем другим клеткам крови в процессе кроветворения. Они имеют происхождение из мезодермы и расположены в красном костном мозге, который содержится в ядре большинства костей.
[0061] В настоящей заявке раковые стволовые клетки относятся к опухолеобразующим клеткам (т.е. раковые клетки найдены в опухолях или гематологическом раке), которые обладают характеристиками, связанными с нормальными стволовыми клетками, в частности, в определенном образце рака обнаружена способность давать начало всем типам клеток. См., например, Identification and Targeting of Cancer Stem Cells, BioessayS 2009 Oct; 31 (10) 1038-1049. Раковые стволовые клетки определяют по трем различным свойствам: 1) избирательная способность инициировать опухоль и стимулировать неопластическую пролиферацию; 2) способность создавать бесконечные копии себя посредством самообновления и 3) потенциал создания более зрелого потомства раковых клеток с помощью дифференцировки. Раковые стволовые клетки необязательно имеют происхождение из здоровых стволовых клеток, они могут брать начало из дифференцированной клетки.
[0062] CD34 также известен как антиген CD34 гематопоэтических клеток-предшественников, который выполняет функцию клеточного фактора адгезии. Он может быть использован в качестве маркера для обогащения популяций стволовых клеток.
[0063] В настоящей заявке молекула используется в самом широком смысле и включает синтетическую химическую молекулу, но также макромолекулы, такие как белки, полимеры (природные или иные), молекулы рибонуклеиновой кислоты, метки и т.д.
[0064] Полезные нагрузки могут содержать лекарственное средство, токсин, полимер, биологически активный белок, радионуклиды, металл-хелатирующий агент и/или репортерную группу.
[0065] В настоящей заявке лекарственное средство предназначено для обозначения небольшого химического соединения, например, которое было синтезировано методами органической химии, в частности молекула, одобренная или разрешенная для применения, или находящаяся процессе получения разрешения для терапевтического использования, особенно у людей, если не указано иное. В настоящей заявке лекарственное средство также содержит противовирусное соединение, антибиотик и противораковую терапию.
[0066] В настоящей заявке противовирусное соединение (противовирусный агент) относится к классу лекарственных средств, используемых специально для лечения вирусных инфекций, включая противовирусные агенты широкого спектра действия, а также «узкого» спектра, специфичных для конкретного вируса или конкретного семейства вирусов.
[0067] В настоящей заявке антибиотик относится к лекарству или агенту, который ингибирует рост бактерий или уничтожает бактерии. Антибактериальные вещества и антибиотики используются здесь взаимозаменяемо, если в контексте не указано иное.
[0068] В настоящей заявке антипаразитарный относится к лекарственному средству или агенту, который ингибирует рост паразита, уничтожает паразита или удаляет паразитов из организма-хозяина.
[0069] Противораковая терапия представляет собой широкий термин, который включает противораковые лекарственные средства, химиотерапию, лучевую терапию, иммунно-онкологическую терапию и т.д.
[0070] В настоящей заявке противораковое лекарственное средство, как правило, относится к низкомолекулярной терапии раковых заболеваний.
[0071] В настоящей заявке химиотерапия, как правило, относится к цитотоксическому агенту и включает противоопухолевые средства.
[0072] Биологическое лекарственное средство (также называемое биофармацевтическим, биологическим или биологическим) представляет собой терапевтический продукт, «имеющий происхождение» из биологического источника, например, рекомбинантных белков и фрагментов, включающие молекулы антител, включающие антитела, фрагменты, связывающие антитела, и молекулы мультиспецифических антител и сложные комбинации таких материалов. Биологически активный белок представляет собой подгруппу биологических терапевтических средств и включает рекомбинантные белки и их активные фрагменты (включая молекулы антител).
[0073] В настоящей заявке молекулы антител включают в себя полное антитело, имеющее тяжелые и легкие цепи полной длины или его фрагмент, и молекулу, содержащую любой из них, например, Fab, модифицированный Fab, Fab', модифицированный Fab', F(ab')2, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, однодоменные антитела (например, VH или VL или VHH), scFv, би-, три- или тетравалентные антитела, бис-scFv, диатела, триатела, тетратела и эпитоп-связывающие фрагменты любого из вышеперечисленного (см., например, Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23 (9): 1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2 (3), 209-217). Способы создания и изготовления этих фрагментов антител хорошо известны в данной области техники (см., например, Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181). Другие фрагменты антител для использования в настоящем изобретении включают фрагменты Fab и Fab', описанные в международных заявках на патент WO 2005/003169, WO 2005/003170 и WO 2005/003171. Мультивалентные антитела могут иметь множество специфичностей, например, быть биспецифическими или моноспецифическими (см., например, WO 92/22853 и WO 05/113605). Варианты биспецифичных и мультиспецифических антител особенно рассматриваются в этом примере, поскольку целью является нейтрализация двух независимых белков-мишеней. Вариабельные области из антител, раскрытые в указанном документе, могут быть сконфигурированы таким образом, чтобы продуцировать один вариант антитела, который способен связываться и нейтрализовать два антигена-мишени.
[0074] Антитела и их связывающие фрагменты, в частности, небольшие фрагменты антител, такие как домен антитела, VHHs, одноцепочечный Fvs (scFvs), ds-scFvs, и dsFv, могут быть доставлены внутриклеточно с использованием технологии по настоящему изобретению.
[0075] Согласно одному варианту воплощения антитело или его связывающий фрагмент представляет собой ингибитор контрольной точки, например, анти-PD-1 или ингибитор анти-PD-L1.
[0076] Согласно одному варианту воплощения молекула антитела является человеческой или гуманизированной.
[0077] Токсин представляет собой отравляющее вещество, главным образом имеющее происхождение из природного источника, в частности, из белка. Многие токсины, такие как калихеамицин, используют в терапии раковых заболеваний. Кроме того, химиотерапевтические агенты могут считаться токсичными (или токсинами). Таким образом, определение токсина частично совпадает с другими определениями в данной заявке. Однако нейротоксины, такие как змеиный яд, являются токсином, но не химиотерапевтическим средством. Однако специалисты в данной области техники знакомы с этими техническими определениями и способны понять значение контекста настоящего описания.
[0078] В настоящей заявке термин «диагностика» представляет собой средство, используемое в анализе или визуализации для диагностики, маркировки или мониторинга или понимания состояния заболевания. Диагностика обычно включает репортерную молекулу, такую как метка или подобное, которую можно визуализировать, измерить или контролировать каким-либо образом.
[0079] Радионуклиды, подходящие для использования в настоящем изобретении, включают таллий-201, технеций-99m, йод-123, йод-131, йод-125, фтор-18 и кислород-15.
[0080] Кроме того, особый интерес представляет использование GLA-компонента для доставки интратела, например, с помощью GLA-слияний, например, где интратело слито с N или C-концом GLA-компонента. Интратела способны нацеливаться на внутриклеточные антигены.
[0081] Согласно одному варианту воплощения антитела, которые взаимодействуют и ингибируют RAS или белки в сигнальном пути RAS, используют в полезной нагрузке. Гены RAS составляют мультигенное семейство, которое включает HRAS, NRAS и KRAS. Белки RAS представляют собой малые гуанозин-нуклеотид-связывающие ГТФазы, которые функционируют как критический сигнальный центр внутри клетки. Путь RAS/MAPK хорошо изучен в контексте онкогенеза, поскольку его соматическая дисрегуляция является одной из основных причин рака. RAS соматически мутирует приблизительно в 20% случаев злокачественных новообразований (Bos JL, Cancer Res. 49: 4682-4689, 1989). В данном конкретном случае предполагают, что, например, GLA-компонент присоединяется к интрателу RAS (описано в Cetin M et al. J Mol Biol 429: 562-573., 2017).
[0082] В настоящей заявке апоптоз представляет собой путь гибели клеток, который является нормальной и контролируемой частью роста организма. Гибель клеток путем апоптоза менее вредна для окружающей ткани, чем механизмы гибели клеток, такие как некроз.
[0083] В настоящей заявке некроз представляет собой гибель клеток от заболевания или травмы. Он высвобождает цитокины и факторы в окружающую ткань, которые могут повредить окружающие клетки. Примером некротической гибели клеток является гангрена.
Химиотерапевтические агенты
[0084] В настоящей заявке химиотерапевтический агент и химиотерапия или цитотоксический агент используются взаимозаменяемо, если не указано иное.
[0085] В настоящей заявке термин «химиотерапия» предназначен для обозначения специфических противоопухолевых химических агентов или лекарственных средств, которые «избирательно» разрушают злокачественные клетки и ткани, например, алкилирующие агенты, антиметаболиты, включая ингибиторы тимидилатсинтазы, антрациклины, антимикротрубочковые агенты, включая растительные алкалоиды, ингибиторы топоизомеразы, ингибиторы PARP и другие противоопухолевые агенты. В этом контексте термин «выборочно» используется условно, потому что, разумеется, многие из этих агентов имеют серьезные побочные эффекты.
[0086] Предпочтительная доза может быть выбрана практикующим врачом в зависимости от природы подвергаемого лечению ракового заболевания.
[0087] Примеры алкилирующих агентов, которые могут быть использованы в способе по настоящему изобретению, включают азотистые иприты, нитрозомочевины, тетразины, азиридины, платины и ее производные и неклассические алкилирующие агенты.
[0088] Пример химиотерапевтического агента, содержащего платину (также называемого платины) представляет собой цисплатин, карбоплатин, оксалиплатин, сатраплатин, пикоплатин, недаплатин, триплатин и липоплатин (липосомальный вариант цисплатина), в частности цисплатин, карбоплатин и оксалиплатин.
2
2
[0089] Доза для цисплатина составляет от примерно 20 до примерно 270 мг/м в зависимости от конкретного ракового заболевания. Часто доза находится в диапазоне от примерно 70 до примерно 100 мг/м.
[0090] Азотистые иприты включают мехлорэтамин, циклофосфамид, мелфалан, хлорамбуцил, ифосфамид и бусульфан.
[0091] Нитрозомочевины включают N-нитрозо-N-метилмочевину (MNU), кармустин (BCNU), ломустин (CCNU) и семустин (MeCCNU), фотемустин и стрептозотоцин. Тетразины включают дакарбазин, митозоломид и темозоломид.
[0092] Азиридины включают тиотепу, митомицин и диазиквон (AZQ). Примеры антиметаболитов, которые могут быть использованы в способе по настоящему изобретению, включают анти-фолаты (например, метотрексат и пеметрексед), аналоги пурина (например, тиопурины, такие как азатиопурин, меркаптопурин, тиопурин, флударабин (включая фосфатную форму), пентостатин и кладрибин), аналоги пиримидина (например, фторпиримидины, такие как 5-фторурацил и его предшественники, такие как капецитабин [Xeloda]), флоксуридин, гемцитабин, цитарабин, децитабин, ралтитрексед (томудекс) гидрохлорид, кладрибин и 6-азаурацил.
[0093] Примеры антрациклинов, которые могут быть использованы в способе по настоящему изобретению, включают даунорубицин (дауномицин), даунорубицин (липосомальный), доксорубицин (адриамицин), доксорубицин (липосомальный), эпирубицин, идарубицин, валрубицин в настоящее время используется только для лечения рака мочевого пузыря и антрациклиновый аналог митоксантрон, в частности доксорубицин.
[0094] Примеры антимикротрубочковых агентов, которые могут быть использованы в способе по настоящему изобретению, включают алкалоиды барвинка и таксаны.
[0095] Алкалоиды барвинка включают в себя полностью натуральные химические вещества, например, винкристин и винбластин, а также полусинтетические алкалоиды барвинка, например, винорелбин, виндезин и винфлунин.
[0096] Таксаны включают паклитаксел, доцетаксел, абраксан, карбазитаксел и их производные. В настоящей заявке производные таксанов включают измененные таксаны, такие как таксол, например, в мицеллярных составах, производные также включают химические производные, в которых синтетическая химия используют для модификации исходного материала, который представляет собой таксан.
[0097] Ингибиторы топоизомеразы, которые могут быть использованы в способе по настоящему изобретению включают ингибиторы топоизомеразы I типа, ингибиторы топоизомеразы II типа и яды топоизомеразы II типа. Ингибиторы I типа включают топотекан, иринотекан, индотекан и индимитекан. Ингибиторы II типа включают генистеин и ICRF 193, который имеет следующую структуру:
[0098] Яды типа II включают амсакрин, этопозид, этопозид фосфат, тенипозид и доксорубицин, и фторхинолоны.
[0099] Согласно одному варианту воплощения химиотерапевтическое средство представляет собой ингибитор PARP.
Метки
[0100] Согласно одному варианту воплощения полезная нагрузка содержит флуоресцентную метку, хемилюминесцентную метку, радио метку, фермент, краситель или лиганд.
[0101] В настоящем изобретении метка представляет собой любую группу, которая может быть обнаружена с использованием анализа. Неограничивающие примеры репортерных молекул включают ферменты, радио метки, гаптены, флуоресцентные метки, фосфоресцентные молекулы, хемилюминесцентные молекулы, хромофоры, фотоаффинные молекулы, цветные частицы или лиганды, такие как биотин.
in vitro
in vivo
[0102] Конъюгаты меток обычно являются предпочтительными для использования в качестве диагностических агентов. Диагностические агенты обычно подразделяются на два класса: те, которые используются для диагностики , и те, которые используются для диагностических протоколов , обычно называемые «направленной визуализацией». В данной области техники известно много подходящих агентов визуализации, как и способов их прикрепления к пептидам и полипептидам (см., например, патенты США 5021236, 4938948 и 4472509). Используемые фрагменты изображения могут представлять собой парамагнитные ионы, радиоактивные изотопы, флуорохромы, вещества, обнаруживаемые с помощью ЯМР и рентгеновские визуализирующие агенты.
[0103] В случае парамагнитных ионов, можно упомянуть в качестве примера такие ионы, как хром (III), марганец (II), железо (III), железо (II), кобальт (II), никель (II), медь (II), неодим (III), самарий (III), иттербий (III), гадолиний (III), ванадий (II), тербий (III), диспрозий (III), гольмий (III) и/или эрбий (III), причем гадолиний является особенно предпочтительным. Ионы, полезные в других случаях, таких как рентгенография, включают лантан (III), золото (III), свинец (II) и особенно висмут (III), но не ограничиваются ими.
211
14
51
36
57
58
67
152
67
3
123
125
131
111
59
32
186
188
75
35
99m
90
125
99m
111
99m
2
В случае радиоактивных изотопов для терапевтического и/или диагностического применения можно упомянуть астат, углерод, хром, хлор, кобальт, кобальт, медь, Eu, галлий, водород, йод, йод, йод, индий, железо, фосфор, рений, рений, селен, сера, техниций и/или иттрий. I подходит для использования в определенных вариантах воплощения, а техниций и/или индий особенно подходят из-за их низкой энергии и пригодности для обнаружения на большом расстоянии. Радиоактивно меченные пептиды и полипептиды могут быть получены в соответствии с хорошо известными в данной области техники способами. Например, пептиды и полипептиды могут быть йодированы путем контакта с йодидом натрия и/или калия и химическим окислителем, таким как гипохлорит натрия, или ферментативным окислителем, таким как лактопероксидаза. Пептиды могут быть помечены технецием с помощью процесса обмена лигандами, например, путем восстановления пертехната раствором олова, хелатирования восстановленного технеция на колонку с сефадексом и нанесения пептида на эту колонку. Альтернативно, могут быть использованы методы прямой маркировки, например, путем инкубации пертехната, восстановителя, такого как SNCl, буферного раствора, такого как раствор фталата натрия-калия, и пептида. Промежуточными функциональными группами, которые часто используются для связывания радиоизотопов, которые существуют в виде ионов металлов с пептидом, являются диэтилентриаминпентауксусная кислота (DTPA) или этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA).
[0104] Флуоресцентные метки, подходящие для использования в качестве полезной нагрузки, включают Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-Р6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, Cascad Blue, Cy3, Cy5,6-FAM, изотиоцианат флуоресцеина, HEX, 6-JOE, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, REG, родамин зеленый, родамин красный, ренографин, ROX, TAMRA, TET, тетраметилродамин и/или Texas Red.
in vitro
[0105] Другой тип полезной нагрузки, подходящий для использования , когда пептид связан с вторичным связывающим лигандом и/или с ферментом (ферментной меткой), который будет образовывать окрашенный продукт при контакте с хромогенным субстратом. Примеры подходящих ферментов включают уреазу, щелочную фосфатазу, пероксидазу водорода (хрена) или глюкозооксидазу. Предпочтительные вторично связывающие лиганды представляют собой соединения биотина и авидина, и стрептавидина. Использование таких меток хорошо известно специалистам в данной области техники и описано, например, в патентах США 3817837, 3850752, 3939350, 3996345, 4277437, 4275149 и 4366241.
[0106] В данной области техники известны другие способы присоединения для связывания пептида с его конъюгатным фрагментом. Некоторые способы присоединения включают использование хелатного комплекса металла с использованием, например, органического хелатирующего агента, такого как ангидрид диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA); этилентриаминтетрауксусная кислота; N-хлор-п-толуолсульфонамид; и/или тетрахлор-3-6-дифенилгликурил-3, присоединенный к антителу (патенты США 4472509 и 4938948). Пептиды или полипептиды также могут реагировать с ферментом в присутствии связующего агента, такого как глутаральдегид или периодат. Конъюгаты с флуоресцеиновыми маркерами получают в присутствии этих связующих агентов или путем реакции с изотиоцианатом.
[0107] Согласно одному варианту воплощения метка может окрашивать или маркировать ядро стволовой клетки.
Вирусы, подходящие для использования в качестве полезных нагрузок в настоящем изобретении
[0108] Согласно одному варианту воплощения вирус, используемый в настоящем изобретении, представляет собой оболочечный вирус, например, выбранный из герпесвируса (например, вирус простого герпеса 1), поксвируса (например, вирус оспы), гепаднавируса, флавивируса, тогавируса, коронавируса, гепатита D, ортомиксовируса, парамиксовируса (например, корь или вирус болезни Ньюкасла), рабдовируса, буньявируса, филовируса и рабдовирусы (например, вирус везикулярного стоматита, штамм Indiana (VSV)).
[0109] Согласно одному варианту воплощения вирус , используемый в настоящем изобретении, представляет собой вирус без оболочки, например, выбранный из Adenoviridae (например, аденовирус), Papilomaviridae, Picornaviridae (например, вирус Коксаки или вирус Сенека-Валли (например, сенекавирус)), реовируса.
[0110] Согласно одному варианту воплощения вирус представляет собой аденовирус, например, аденовирус человека, например, выбранный из вируса группы В (в частности, Ad3, Ad7, Ad11, Ad14, Ad16, Ad21, Ad34, Ad35, Ad51 или его химеру, такую как Enadenotucirev), вируса группы C (в частности Ad1, 2, 5, 6 или его химеру), вируса группы D (в частности, Ad8, Ad10, Ad13, Ad15, Ad17, Ad19, Ad20, Ad22, Ad30, Ad32, Ad33, Ad36, Ad37, Ad38, Ad39, Ad42, Ad43, Ad44, Ad45, A46, Ad47, Ad48, Ad49, Ad50 или их химеру), вируса группы E (в частности, Ad4), вируса группы F (в частности, Ad40, Ad41 или его химеру) и химеры двух или более вирусов группы B, C, D, E или F.
[0111] Подавляющее большинство вирусов имеет подробно описанные белки, связанные с распознаванием и поглощением клеток-мишеней. Модификация их тропизма для перенаправления или обеспечения более селективного нацеливания на опухоли в онколитических вирусах может быть введена способами, описанными в статье Verheije и Rottier, Adv. Virology 2012: 798526, 2012.
[0112] Дополнительные вирусные белки клеточной поверхности, не участвующие в нативном вирусном нацеливании, могут иметь мотивы нацеливания, сконструированные на них (например, Ad virion minor coat protein IX Salisch et al., PLoS One 12: e0174728, 2017).
[0113] Оболочечные вирусы имеют внешнюю мембрану (оболочку), покрывающую капсид вируса. Оболочка обычно имеет происхождение из частей мембран клетки-хозяина (фосфолипидов и белков), но также включает некоторые вирусные белки. Гликопротеины на поверхности оболочки служат для идентификации и связываются с рецепторными участками на мембране хозяина. Затем оболочка вируса сливается с мембраной хозяина, позволяя капсиду и геному вируса войти и инфицировать хозяина.
[0114] Различные онколитические вирусы раскрыты в WO 2014/13834, включенном в настоящий документ в качестве ссылки.
[0115] Вирус простого герпеса (HSV) проникает в клетки с помощью четырех основных гликопротеинов - gD, gH/gL, gB, активируемых каскадным способом путем связывания gD с одним из его рецепторов, нектином 1 и HVEM. Перенацеливание HSV было достигнуто путем введения лигандов и scFv в белок gC и/или gD или gH (Campadelli-Fiume, G et al., Rev in Med Virol 21: 213-226, 2011, Gatta, V PLoS Pathog 11: e1004907, 2015). Векторы онколитического вируса простого герпеса 1 типа были разработаны для клинического применения. Эти вирусы способны к репликации и имеют мутации в генах, которые влияют на репликацию вируса, нейропатогенность и уклонение от иммунитета, и, например, включают вирусы первого поколения, такие как NV1020 (R7020), dls ptk, d18.36tk, hrR3, R3616, 1716, вирусы второго поколения, такие как G207 (MGH-1), 3616UB, SUP, NV1023, вирусы третьего поколения, такие как G47Δ, векторы, экспрессирующие транскрипцию, такие как G92A, d12.CALP, Myb34.5, векторы, экспрессирующие трансген, такие как rRP450, и другие вирусы такие как Talimogene laherparepvec (T-Vec). Считается, что векторы HSV-1 полезны при лечении широкого спектра солидных опухолей, например, включающие рак глиомы, меланому, рака молочной железы, предстательной железы, толстой кишки, яичника и поджелудочной железы. Вирус HSV-1 инфицирует широкий спектр типов и видов клеток, он является цитолитическим по природе, репликативный жизненный цикл вируса приводит к разрушению клеток-хозяев, он имеет хорошо охарактеризованный и большой геном (152K), но содержит много несущественных генов, обеспечивающих пространство до 30К для введения терапевтических генов. Как правило, вирусы HSV не мутируют в гене тимидинкиназы по соображениям безопасности. Talimogene laherparepvec представляет собой онколитический вирус герпеса, который одобрен для использования в лечении меланомы. Другие вирусы на основе вируса герпеса включают G207, SEPREHVIR (HSV-1716) по Virttu Biologics, HSV-1 R3616 мутант, HSV-1 1716 мутант, NV1020 (R7020), R3616 мутант (удалена RL1), KM100 мутант, имеющий вставки в UL48 (кодирует трансактиваторный тегументный белок pUL48 [VP16]), и гены RL2, G92A, мутанты, Myb34.5 и rQNestin34.5.
Поксвирус
[0116]  - вирус осповакцины, такой как модифицированный вирус осповакцины Анкара (MVA) (Galmiche MC et al., J Gen Virol 78: 3019-3027, 1997), MVA может быть заменен слитой молекулой p14, несущей вставленный scFv, направленный против ассоциированного с опухолью антигена MUC-1 (Paul, S. et al., Viral Immunol. 20: 664-671, 2007). См. также статью Liang L et al., Viruses 6: 3787-3808, 2014, Hsiao JC et al., J Virol 73: 8750-8761, 1999, статью Chen TL и Roffler S, Med Res. Rev. 28: 885-928, 2008 и Kinoshita T et al., J Biochem 144: 287-294, 2008. JX-594, созданный Jennerex, представляет собой вирус осповакцины с делецией тимидинкиназы и добавлением GM-CSF. GL-ONC1 представляет собой аттенуированный вирус осповакцины (штамм Lister), который вызывает регрессию и устранение широкого спектра солидных опухолей в доклинических исследованиях на моделях мышей.
Парамиксовирус
[0117] (например, вирус кори или болезни Ньюкасла).
[0118] Вирус кори (MeV) представляет собой однонитевый, отрицательно-полярный, оболочечный (несегментированный) РНК-вирус рода Morbillivirus, семейства Paramyxoviridae. Вирус кори имеет два оболочечных гликопротеина: белок прикрепления гемагглютинин (H) и белок слияния (F). Прикрепление, проникновение и последующее слияние клетка-клетка опосредовано через 2 рецептора кори, CD46 и сигнальную молекулу активации лимфоцитов (SLAM). См., например, статью Msaouel P et al., Methods Mol Biol 797: 141-162, 2012, Robinson S. and Galanis, E. Expert Opin Biol Ther. 17: 353-363, 2017, Aref S et al., Viruses 8. Pii:E294, 2016) ); (статью Chen TL and Roffler S, Med Res. Rev. 28: 885-928, 2008 и Kinoshita T et al., J Biochem 144: 287-294, 2008), и (Russell SJ and Peng KW, Curr Topic Microbiol. Immunol 330: 213-241, 2009, Robinson S and Galanis, E Expert Opin Biol. Ther 17: 353-363, 2017, Aref S et al., Viruses 8. Pii: E294, 2016). Вирус кори, кодирующий натрий-йодидный симпортер щитовидной железы человека или МВ-NIS, представляет собой аттенуированный онколитический штамм Эдмонстона (Ed) вируса кори. Отображение радиоактивного йода обеспечивает новый метод мониторинга экспрессии генов NIS.
[0119] Вирус болезни Ньюкасла также может быть использован.
Аденовирусы.
[0120]  Аденовирусы являются одними из наиболее широко изученных вирусов, используемых в качестве онколитических агентов. Множество пептидов и белков было сконструировано в вирусные белки, ассоциированные с вирионом, для изменения нативного тропизма вируса (статья Verheije MH и Rottier PJM Adv Virol 2012: 798526, 2012). Однако все они зависят от вирусной сборки в ядре, что создает значительные проблемы.
[0121] Другие безоболочечные вирусы включают вирус Коксаки, полиовирус и реовирус. См., например, статьи Altan-Bonnet, N, Curr Opin Microbiol 32: 77-81, 2016 и Chen YH et al., Cell 160: 619-630, 2015, статьи Chen TL и Roffler S, Med Res. Rev. 28: 885-928, 2008 и Kinoshita T et al., J Biochem 144: 287-294, 2008 и статью Verheije MH и Rottier PJM Adv Virol 2012: 798526, 2012).
[0122] Существует множество аденовирусов, например, Ad5-YCD/mutTKSR39rep-hIL12, инициированный для лечения рака предстательной железы, CGTG-102 (Ad5/3-D24-GMCSF), созданный Oncos Therapeutics, например, для лечения сарком мягких тканей, Oncorine (H101), CG0070, Enadenotucirev (EnAd) WO 2005/118825, OvAd1 и OvAd2, раскрытые в WO 2008/080003, ONCOS-102, например, для неоперабельной злокачественной плевральной мезотелиомы и DNX-2401, например, для глиомы.
[0123] Cavatak представляет собой торговое название для препарата вируса Коксаки дикого типа А21, полезного для лечения злокачественной меланомы. Вирус Сенека-Валли (NTX-010) и (SVV-001), например, для мелкоклеточного рака легкого и нейробластомы.
Реовирус
[0124]  - Реолизин (пелареореп; реовирус дикого типа; серотип 3 Dearing; Oncolytics Biotech), например, для лечения различных видов рака и нарушений пролиферации клеток.
Вирус везикулярного стоматита (VSV)
[0125] . VSV - это другой оболочечный вирус, который исследован как онколитический агент. См., например, Betancourt D et al., J Virol 89: 11786-11800, 2015) и статью Hastie E и Grdzelishvili VZ J Gen Virol 93: 2529-2545, 2012).
Белки, кодируемые вирусом
[0126] Согласно одному варианту воплощения вирус или вектор, используемый в способе по настоящему изобретению содержит трансген, например, где трансген заменяет дефектный генетический материал в клетке, чтобы обеспечить новую или расширенную функцию в клетке, чтобы повысить чувствительность клетки к лечение, чтобы заблокировать функцию в клетке, или экспрессировать терапевтический белок или пептид.
[0127] Согласно одному варианту воплощения вирус используемый в качестве полезной нагрузки в соответствии с настоящим изобретением, содержит трансген или трансгены, например, кодирующие агент, независимо выбранный из последовательности иРНК, белка, полипептида или пептида (например, молекула антитела или его связывающий фрагмент, хемокин, цитокин, иммуномодулятор, флуоресцентная метка или фермент).
[0128] Это включает, но не ограничивается, уникальные форматы, которые продемонстрировали доклиническую перспективу, но не обладали эффективным и экономичным средством доставки, например, пептидами, интрателами и альтернативными каркасами (статьи Boldicke T, Protein Sci 26: 925-945, 2017, Marschall and Dubel, Comput Struct Biotechnol J 14: 304-308, 2016, Miersch and Sidhu F1000Res 5.pii.F1000 Faculty Rev. 1947, 2016, Peptides, Tsomaia Eur J Med Chem 94:459-470, 2015, Marschall ALJ et al, Mabs 7: 1010-1035, 2015, AlDeghaither D et al., J Clin Pharmacol. 55: S4-S20, 2015))) и включает средства, оказывающие терапевтическое воздействие на опухолевые клетки, опухолевые стволовые клетки, эндотелий, ассоциированный с опухолью, и строму, ассоциированную с опухолью. Особый интерес представляют молекулы, которые могут выполнять множество функций, например, в качестве терапевтических средств, биомаркеров и/или средств диагностики. Ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV-TK) представляет собой хорошо зарекомендовавший себя пролекарственный фермент с клинически одобренным пролекарством (ганцикловир-GCV) (см., например, Holder et al., Cancer Res. 53: 3475-3485, 1993, Touraine RL et al., Gene Therapy 5: 1705-1711, 1998).
[0129] Кроме того, экспрессия белка тимидинкиназы также может быть использована для изображения и отслеживания активности виротерапии в течение курса лечения. Позитронно-эмиссионная томография и однофотонная эмиссионная компьютерная томография представляют собой оба метода, которые обычно используются для обнаружения и мониторинга рака и лечения рака, и оба представляют собой жизнеспособные средства для обнаружения экспрессии белка тимидинкиназы при введении соответствующего субстрата тимидинкиназы (Wang JQ et al., Bioorg Med Chem 13: 549-556, 2005, Tjuvajev JG et al, J Nucl Med 43: 1072-1083, 2002). Альтернативно, ген NIS может быть использован и исследован в качестве агента для диагностических и терапевтических целей в онколитических вирусах, во многом как тимидинкиназа (TK) (Miller A and Russell S Expert Opin Biol Ther 16: 15-32, 2016, Ravera S et al., Annu Rev Physiol 79: 261-289, 2017, Portulano et al., Endocr Rev. 35: 106-149, 2014).
[0130] Согласно одному варианту воплощения антитела, которые взаимодействуют и ингибируют RAS или белки в сигнальном пути RAS, кодируют в вирусе по настоящему изобретению, например, в виде слитого белка с GLA-компонентом. Гены RAS составляют мультигенное семейство, которое включает HRAS, NRAS и KRAS. См., например, Bos JL, Cancer Res. 49: 4682-4689, 1989; и Cetin M et al., J Mol Biol. 429:562-573, 2017.
Комбинированная терапия
[0131] Согласно одному варианту воплощения GLA-компонент используют в комбинации со второй терапией, например, противораковой терапией. Указанную терапию вводят отдельно от GLA-компонента (т.е. не связана с GLA-компонентом).
[0132] Согласно одному варианту воплощения комбинация используемых химиотерапевтических агентов представляет собой химиотерапевтическое средство, раскрытое в настоящей заявке, например, препарат, содержащий платину и 5-FU или его пролекарство, например, цисплатин или оксалиплатин и капецитабин или гемцитабин, такие как FOLFOX.
[0133] Согласно одному варианту воплощения химиотерапия включает комбинацию химиотерапевтических агентов, в частности цитотоксических химиотерапевтических агентов.
[0134] Согласно одному варианту воплощения химиотерапевтическая комбинация включает препарат, содержащий платину, такой как цисплатин и фторурацил или капецитабин.
[0135] Согласно одному варианту воплощения химиотерапевтическая комбинация включает капецитабин и оксалиплатин (Xelox).
[0136] Согласно одному варианту воплощения химиотерапия представляет собой комбинацию из фолиновой кислоты и 5-FU, возможно в комбинации с оксалиплатином.
2
2
2
2
2
[0137] Согласно одному варианту воплощения химиотерапия представляет собой комбинацию из фолиновой кислоты, 5-FU и иринотекана (FOLFIRI), возможно в комбинации с оксалиплатином (FOLFIRINOX). Схема состоит из следующего: иринотекан (180 мг/м внутривенно(в/в) в течение 90 минут) одновременно с фолиновой кислотой (400 мг/м [или 2×250 мг/м] в/в в течение 120 минут); затем фторурацил (400-500 мг/м в/в болюсно), затем фторурацил (2400-3000 мг/м в/в в течение 46 часов). Указанный цикл обычно повторяют каждые две недели. Показанные выше дозировки могут варьироваться от цикла к циклу.
[0138] Согласно одному варианту воплощения химиотерапевтическая комбинация включает ингибитор микротрубочек, например, винкристина сульфат, эпотилон А, N-[2-[(4-гидроксифенил)амино]-3-пиридинил]-4-метоксибензолсульфонамид (АВТ-751), химиотерапевтический агент, имеющий происхождение из таксола, например, паклитаксел, абраксан или доцетаксел или их комбинацию.
[0139] Согласно одному варианту воплощения в комбинированной терапии используют ингибитор mTor. Примеры ингибиторов mTor включают: эверолимус (RAD001), WYE-354, KU-0063794, папамицин (сиролимус), темсиролимус, дефоролимус (МК-8669), AZD8055 и BEZ235 (NVP-BEZ235).
[0140] Согласно одному варианту воплощения в комбинированной терапии используют ингибитор MEK. Примеры ингибиторов MEK включают: AS703026, CI-1040 (PD184352), AZD6244 (селуметиниб), PD318088, PD0325901, AZD8330, PD98059, U0126-EtOH, BIX 02189 или BIX 02188.
[0141] Согласно одному варианту воплощения в комбинированной терапии используют ингибитор AKT. Примеры ингибиторов AKT включают: MK-2206 и AT7867. Согласно одному варианту воплощения в комбинации используют ингибитор авроракиназы. Примеры ингибиторов авроракиназы включают: ингибитор авроры А I, VX-680, AZD1152-HQPA (барасертиб), мезилат SNS-314, PHA-680632, ZM-447439, CCT129202 и гесперадин.
трет
[0142] Согласно одному варианту воплощения в комбинированной терапии используют ингибитор р38, например, как описано в WO 2010/038086, такие как N-[4-({4-[3-(3--бутил-1-р-толил-1Н-пиразол-5-ил)уреидо]нафталин-1-илокси}метил)пиридин-2-ил]-2-метоксиацетамид.
[0143] Согласно одному варианту воплощения в комбинации используют ингибитор Bcl-2. Примеры ингибиторов Bcl-2 включают: обатоклакс мезилат, ABT-737, ABT-263 (навитоклакс) и TW-37.
[0144] Согласно одному варианту воплощения комбинированная терапия содержит ингибитор контрольных точек для ингибитора анти-PD-1 или ингибитора анти-PD-L1.
[0145] Согласно одному варианту воплощения химиотерапевтическая комбинация содержит антиметаболит, такой как капецитабин (кселода), флударабин фосфат, флударабин (флудара), децитабин, ралтитрексед (томудекс), гемцитабина гидрохлорид и кладрибин.
[0146] Согласно одному варианту воплощения химиотерапевтическая комбинация содержит ганцикловир, который может способствовать контролю иммунных реакций и/или васкуляризации опухоли.
[0147] Согласно одному варианту воплощения химиотерапия включает ингибитор PARP.
[0148] Согласно одному варианту воплощения комбинированная терапия включает ингибитор метаболизма рака со специфичным ингибированием активности фермента DHODH.
[0149] Согласно одному варианту воплощения одна или несколько видов терапии, применяемых в способе по настоящему изобретению, представляют собой метрономную, то есть непрерывную или с частым лечением низкими дозами противораковых лекарственных средств, часто назначаемыми одновременно с другими способами терапии.
[0150] Согласно одному варианту воплощения предложено применение нескольких циклов лечения (например, химиотерапии), например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8.
[0151] Согласно одному варианту воплощения химиотерапию применяют в 28-дневном цикле.
[0152] Согласно одному варианту воплощения молекулы по настоящему изобретению предложены в фармацевтической композиции, содержащей наполнитель, разбавитель и/или носитель. Согласно одному варианту воплощения композиция представляет собой парентеральный состав.
[0153] "Парентеральный состав" означает состав, предназначенный для доставки через желудочно-кишечный тракт. Типичные пути парентеральной доставки включают инъекцию, имплантацию или инфузию.
[0154] Согласно одному варианту воплощения парентеральный состав находится в форме инъекции. Инъекция включает внутривенную, подкожную, внутричерепную, подоболочечную, внутриопухолевую или внутримышечную инъекцию. "Инъекция" в настоящей заявке означает введение жидкости в организм через шприц.
[0155] Согласно одному варианту воплощения парентеральный состав находится в форме инфузии.
[0156] "Инфузия" в настоящей заявке означает введение жидкостей с более медленной скоростью с помощью капельницы, инфузионного насоса, шприцевой помпы или эквивалентного устройства. Согласно одному варианту воплощения инфузию вводят в течение периода времени в диапазоне от 1,5 минут до 120 минут, например, приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 15, 16, 17, 18, 19 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 65, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110 или 115 минут.
[0157] Согласно одному варианту воплощения состав предназначен для внутривенного (в/в) введения. Этот путь особенно эффективен, поскольку обеспечивает быстрый доступ к большинству органов и тканей и особенно полезен для лечения метастазов, например, укоренившихся метастазов, особенно тех, которые расположены в областях с высокой васкуляризацией, таких как печень и легкие.
[0158] Терапевтические составы обычно будут стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может быть составлена в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или другого парентерального состава, подходящего для введения человеку, и может быть приготовлена в виде предварительно заполненного устройства, такого как шприц или флакон, особенно в виде однократной дозы.
[0159] Как обсуждалось выше, такой состав, как правило, содержит фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель, например, нетоксичный, изотонический носитель, который совместим с вирусом и в котором вирус стабилен в течение необходимого периода времени.
[0160] Носителем может быть растворитель или дисперсионная среда, содержащая, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и тому подобное) и их подходящие смеси. Надлежащая текучесть может поддерживаться, например, путем использования диспергатора или поверхностно-активного вещества, такого как лецитин, или неионного поверхностно-активного вещества, такого как полисорбат 80 или 40. В дисперсиях поддержанию необходимого размера частиц может способствовать присутствие поверхностно-активного вещества. Примеры изотонических агентов включают сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия в композиции.
[0161] Согласно одному варианту воплощения предложен набор частей, содержащий GLA-компонент по настоящему изобретению и полезную нагрузку, где полезная нагрузка связана или не связана с указанным GLA-компонентом.
[0162] «Содержащий» в настоящей заявке означает «включающий».
[0163] Там, где это технически целесообразно, варианты осуществления изобретения могут быть объединены.
[0164] Варианты осуществления описаны в настоящей заявке как содержащие определенные признаки/элементы. Раскрытие изобретения также распространяется на отдельные варианты осуществления, состоящие или состоящие по существу из указанных признаков/элементов.
[0165] Технические ссылки, такие как патенты и заявки, включены в настоящую заявку посредством ссылки.
[0166] Технические основы являются частью технического раскрытия настоящего описания и могут использоваться в качестве основы для поправок, поскольку обсуждение в нем не ограничивается обсуждением предшествующего уровня техники, поскольку оно также включает обсуждение технических проблем, возникающих в данной области и применения настоящей технологии.
[0167] Любые варианты осуществления, конкретно и явно указанные в настоящей заявке, могут составлять основу отказа от ответственности либо по отдельности, либо в сочетании с одним или несколькими дополнительными вариантами осуществления.
[0168] Настоящая заявка испрашивает приоритет по серийным номерам США: 62/554530, 62/569403, 62/554533, 62/569411, 62/584565 и 62/593,014. Каждая из этих заявок включена посредством ссылки. Каждая из этих заявок включена посредством ссылки. Эти заявки могут использоваться в качестве основы для исправления для настоящей заявки.
[0169] Изобретение теперь будет описано со ссылкой на следующие примеры, которые являются только иллюстративными и не должны никоим образом быть истолкованы как ограничивающие объем настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
Фиг. 1A-D
демонстрирует различные представления структур белка GLA.
Фиг. 1E д
емонстрирует вариант осуществления GLA-компонента по настоящему изобретению.
Фиг. 2
А -
B
C -
D
E -
F -
демонстрирует окрашивание белком S (PrS) и аннексином клеточных линий рака молочной железы, обработанных пероксидом для индукции апоптоза.  клетки MDA-231 человека, обработанные пероксидом и окрашенные FITC-PrS.  - необработанные клетки MDA-231, окрашенные как в A.  обработанные клетки MDA-231, окрашенные аннексином.  - клетки MCF-7 человека, обработанные пероксидом и окрашенные PrS.  мышиные клетки MET-1, как в D.  мышиные клетки 4T1, как в D.
Фиг. 3
А -
B -
C
демонстрирует перекрывающуюся, но отдельную клеточную локализацию PrS и аннексина.  мышиные клетки 4T1, обработанные пероксидом и окрашенные Cy5 PrS (КРАСНЫЙ) и аннексином FITC (ЗЕЛЕНЫЙ). Светлая стрелка, совместно локализованные сигналы; красные стрелки, клетки, окрашенные PrS, а не аннексином; зеленая стрелка, клетки окрашены относительно ярче аннексином, но менее ярко PrS, что указывает на различные картины связывания (на вставках окрашивание PrS и аннексина раздельно).  обработанные клетки 4T1, окрашенные FITC PrS и Cy5 аннексином. Зеленые стрелки, клетки окрашиваются PrS, а не аннексином.  - окрашивание аннексина Cy5 обработанных клеток 4T1, предварительно инкубированных с 1000-кратным избытком холодного аннексина.
Фиг. 4
демонстрирует окрашивание апоптотических клеток COS-1 PrS и аннексином. Клетки обрабатывали t-BHP, как описано, и окрашивали аннексином FITC (слева) и Cy5 PrS (справа). Стрелки указывают на субклеточные структуры, предположительно являющиеся апоптотическими телами. Стрелки указывают на субклеточные структуры, предположительно являющиеся апоптотическими телами.
Фиг. 5
демонстрирует дифференциальное окрашивание внеклеточных везикул PrS и аннексином. Внеклеточные везикулы получали из клеток 4T1 и окрашивали FITC PrS (ЗЕЛЕНЫЙ) и аннексином Cy5 (КРАСНЫЙ). Стрелки указывают на везикулы, окрашенные только аннексином (красная стрелка), только PrS (зеленая стрелка) и обоими белками (светлая стрелка).
Фиг. 6
А
В -
С
демонстрирует внутриклеточную локализацию PrS и аннексина. ,  апоптотические клетки 4Т1 окрашивали FITC PrS (ЗЕЛЕНЫЕ стрелки) и Cy5 аннексином (КРАСНЫЕ стрелки); светлые стрелки, совместная локализация.  - возможные апоптотические тела.
Фиг. 7
A
B
демонстрирует интернализацию PrS в течение 5 минут. Апоптотические клетки 4T1 окрашивали FITC PrS (зеленый) и Cy5 аннексином (красный) и визуализировали в течение 10 минут после добавления белков.  - объединенное изображение.  - только ядерное окрашивание Hoescht.
Фиг. 8
демонстрирует изображения BLI опухолей 4T1 у мышей.
Фиг. 9
99m
SPECT-визуализация влияния доксорубицина на опухоли 4T1 с использованием радиоактивно меченного PrS и аннексина. Мышей с опухолями рака молочной железы 4T1 визуализировали с использованием Tc PrS (A и B) или аннексина (C и D) до (A и C) и через 24 часа после доксорубицина (B и D).
Фиг. 10
A
C
B
D
A
B
C
D
99m
SPECT-визуализация мышей, подверженных лечению циклогексамидом. На снимке показаны 5 мышей до ( и ) и через 24 ч после ( и ) лечения. Мышей визуализировали либо с Tc PrS ( и ), либо с аннексином ( и ), стрелки показывают усиленный сигнал печени.
Фиг. 11
А
С
B
D
демонстрирует локализацию Cy5 PrS на инфицированной селезенке. Мышей CD1 инфицировали биолюминесцентной бактерией Listeria и визуализировали на 2 день после заражения. Мышам вводили Cy5 PrS за 30 мин до умерщвления, и селезенки удаляли и замораживали. Показаны умеренно инфицированные () и контрольные неинфицированные () мыши. Показаны участки инфицированной () и неинфицированной () селезенки каждой мыши в канале Cy5, объединенные с фазово-контрастными изображениями.
Фиг. 12
демонстрирует локализацию Cy5 PrS для опухолей, подверженных лечению доксорубицином. Мышей, имплантированных опухолями рака молочной железы 4Т1, лечили доксорубицином (снимки справа) или оставляли необработанными (снимки слева). Через 24 часа спустя мышам внутривенно вводили Cy5 PrS и умерщвляли через 30 минут. Опухоли удаляли, замораживали и делали срезы для флуоресцентной микроскопии. Объединенные Cy5/фазово-контрастные изображения от четырех разных мышей показаны.
Фиг. 13
демонстрирует дифференциацию TSC. TSC культивировали в присутствии (слева) или в отсутствие (справа) факторов роста. Стрелки на правом снимке указывают на гигантские клетки, характерные для дифференциации.
Фиг. 14
Демонстрирует окрашивание PrS стволовых клеток трофобласта и дифференцированных трофобластов. Стволовые клетки трофобласта (слева) были дифференцированы в гигантские клетки трофобласта (справа) путем удаления факторов роста. Клетки окрашивали Cy5 PrS и визуализировали.
Фиг. 15
демонстрирует дифференциацию MSC. MSC обрабатывали, как описано в тексте, для дифференциации в адипоциты (верхние снимки) или остеобласты (нижние снимки). Дифференцированные клетки демонстрировали ожидаемую морфологию в каждом случае.
Фиг. 16
демонстрирует MSC, окрашенные PrS (зеленый), аннексином (красный) и Hoechst (синий). Клетки визуализировали в течение 10 минут после добавления окрашивающей смеси.
Фиг. 17
демонстрирует TSC, окрашенные PrS (зеленый, самая светлая область), аннексином (красный, светлая часть вокруг клеточной мембраны) и Hoechst (синий). Клетки визуализировали в течение 5 минут после добавления окрашивающей смеси.
Фиг. 18
фиг. 17
демонстрирует дифференциальное окрашивание TSC везикул. TSC были окрашены, как на . Группа клеток секретирует большие везикулы, которые окрашиваются аннексином (красный), и не окрашиваются PrS (зеленый).
Фиг. 19
демонстрирует окрашивание PrS нервных клеток-предшественников C17.2. Клетки окрашивали PrS-FITC и визуализировали с помощью стандартной (неконфокальной) микроскопии.
Фиг. 20
демонстрирует интернализацию PRS в TSC при 4°С. FITC PrS (зеленый) и Cy5 аннексин (красный) добавляли к TSC при 4°С и визуализировали с помощью конфокальной микроскопии.
Фиг. 21
демонстрирует окрашивающие клетки негативной линии SCA-1/c-kit из мышиного костного мозга. Клетки не окрашивались ни PI (пропидий йодид; для обнаружения мертвых клеток), ни PrS в этот момент анализа. Отсутствие окрашивания гемопоэтических линий клеток (левый снимок) и окрашивания c-kit и SCA1 (правый снимок) определяют популяцию HSC, показанную зеленым цветом (самые светлые области).
Фиг. 22
PrS окрашивание длительных HSC. HSC были выделены, как на фиг. 1, и окрашены FITC PrS. Картину SLAM определяли с помощью Cy7 (ось X).
Фиг. 23
PrS окрашивание кратковременных HSC. HSC были выделены, как на фиг. 1, и окрашены FITC PrS. Картину SLAM определяли с помощью Cy7 (ось X).
Фиг. 24
Демонстрирует интернализацию PrS в длительных HSC. HSC получали, как описано, окрашивали PrS и исследовали с помощью конфокальной микроскопии. Зеленый (самые светлые области), FITC PrS; синий, Hoescht окрашивание ядер; красный, PI. Обратите внимание, что окрашивание PI исключено из ядра, что указывает на то, что клетки живы.
Фиг. 25
Демонстрирует пример мертвого HSC с ядерным окрашиванием PI.
Фиг. 26
GLA-опосредованная доставка нетоксична для клеток.
[0170] Настоящая заявка также включает последовательности от 1 до 6, в соответствующем перечне последовательностей.
in vivo
[0171] Настоящее изобретение инициировало исследование меченого рекомбинантного PrS в качестве визуализирующего агента  для SPECT (однофотонной компьютерной томографии). Неожиданно было обнаружено, что молекула быстро интернализуется в апоптотические клетки. Это неожиданное открытие привело нас к дальнейшему изучению этого явления, после чего мы обнаружили, что PrS также интернализуется в подмножество неапоптотических стволовых клеток нескольких типов.
[0172] PrS представляет собой домен GLA белка S и EGF домен белка S, как показано в SEQ ID NO: 6.
Методы
трет
4
4
2
2
[0173] Для флуоресценции осуществляли конъюгацию Cy5 и FITC с использованием наборов для маркировки Amersham (GE Heathcare) и Molecular Probes (Invitrogen), соответственно, в соответствии с инструкциями производителей. Оба набора оснащены колонками для удаления неконъюгированного флуорофора. Сначала 0,77 мг PrS (фракция 2) в 1 мл и 0,77 мг аннексина в 1 мл помечали с помощью FITC для проверки специфичности связывания с апоптотическими клетками. Для совместной локализации и исследований конкуренции 0,68 мг PrS (фракция 3) в 1 мл и 0,68 мг аннексина помечали с помощью Cy5. Для конфокальной микроскопии 0,76 мг PrS из второй партии помечали с помощью FITC и использовали ранее меченый Cy5-конъюгированный аннексин. Следует отметить, что точная эффективность маркировки не была определена, а извлечение из колонок предположительно была равна 85%, согласно инструкциям производителей наборов для маркировки. Таким образом, относительная интенсивность окрашивания двух белков в любом случае может отражать эти обстоятельства. Сначала клетки окрашивали в течение 30 минут, но впоследствии было определено, что достаточно менее 5 минут. Для исследования PrS на апоптотическую клеточную специфичность сначало использовали четыре клеточные линии рака молочной железы; MDA-231 и MCF7 человека и мышиные 4T1 и MET-1. Впоследствии также использовали клетки почки обезьяны COS-1. Апоптоз индуцировали перекисью водорода или -бутилгидропероксидом (t-BHP). Клетки высевали в 24-луночные планшеты по 6×10 клеток на лунку или предметные стекла с лунками Eppendorf по 1×10 клеток на лунку, и на следующий день индуцировали апоптоз, используя 2 мМ HO или t-BHP в моменты времени от 30 мин до 2 часов. После индуцирования лунки промывали аннексин-связывающим буфером (AB; Santa Cruz Biotech) и окрашивали меченым белком. На основании прошлого опыта и литературы, 5,5 г/мл белка аннексина использовали для окрашивания. Это количество корректировали для эквимолярного добавления PrS, предполагая, что молекулярная масса аннексина составляет 36 кДа, а рекомбинантного PrS - 30 кДа, на основании предоставленных гелевых изображений. Клетки окрашивали в течение 15 мин. Краситель Hoechst 33342 использовали для визуализации нуклеиновой кислоты. Затем лунки промывали AB и наблюдали с использованием флуоресцентного микроскопа EVOS, пока еще оставались жизнеспособными. Для конфокальной микроскопии использовали микроскоп Leica SP8 в Stanford Cell Sciences Imaging Facility. Затем лунки промывали AB и наблюдали с использованием микроскопа Leica sp8. Краситель Hoechst 33342 использовали для визуализации ядер. Для исследований токсичности PrS добавляли к стволовым клеткам трофобласта (TSC), и жизнеспособность тестировали с трипановым синим с использованием счетчика клеток Nexcelom Cellometer.
4
in vivo
[0174] Для исследования меченых белков на способность обнаруживать опухоли 5×10 клеток 4T1-luc имплантировали группам из 5 мышей-самцов BALB/c в жировую подушку левой подмышечной впадины. Мышей подвергали визуализации с помощью биолюминесцентной визуализации (BLI)  каждый день для мониторинга роста опухоли, начиная с 1 недели после имплантации. Затем мышей подвергали лечению на 11 день после имплантации путем введения 13мг/кг массы тела доксорубицина внутрибрюшинно (IP), и проводили BLI на следующий день. Контрольных мышей с опухолями не подвергали лечению доксорубицином. Через 48 часов после лечения мышей подвергали визуализации через 1 час после внутривенной инъекции метки (анестезия 1,3 г/кг уретанового IP) с помощью гамма-камеры с одной головкой A-SPECT (Gamma Medica); Коллиматор «pin hole» 1 мм, 128 шагов в матрицу визуализации 128x128, 15 секунд на шаг, 2,7 см ROR; FOV = верхняя часть груди/шея. Введенная доза каждого белка составляла 160 мкл (800 мкКи). Затем животных умерщвляли и проводили биораспределение. Для эксперимента по лечению циклогексамидом группы из 5 молодых (7-недельных) мышей Swiss Webster мужского пола анестезировали (1,3 г/кг уретанового IP) и внутривенно вводили 50 мг/кг циклогексимида. Через 1 час 45 минут после введения циклогексимида вводили метку (PrS = 180 мкл/1,2 мКи на дозу; аннексин V = 170 мкл/1,05 мКи на дозу). Через 45 минут после введения метки мышей подвергали визуализированию, получая 10-минутные статические изображения всего тела, с использованием коллиматора с одной головкой с параллельными отверстиями (матрица 128×128) на гамма-камере A-SPECT.
Listeria monocytogenes
5
[0175] Для исследования специфической локализации флуоресцентного PrS в апоптотических участках вследствие инфекции у живых животных мышам CD1 внутривенно вводили биолюминесцентные . Этот бактериальный патоген поражает многие органы, включая селезенку, в которой происходит обширный апоптоз моноцитов и гранулоцитов. В определенные периоды времени после инфицирования селезенка представляет собой основное место бактериальной репликации, и поэтому сигналы BLI селезенки от бактерий могут быть соотнесены с локализацией зондов для апоптоза. Мыши инфицировали и подвергали визуализации каждый день. Когда были обнаружены сигналы селезенки (день 2 после заражения для 2×10 колониеобразующих единиц бактерий у 8-недельных мышей CD1 женского пола), мышам вводили 300 мг/кг массы тела Cy5 PrS, животных умерщвляли через 30 минут и селезенки удаляли, замораживали в ОСТ и делали срезы для флуоресцентной микроскопии. В качестве контрольных мышей использовали неинфицированных.
[0176] Выполняли проточную цитометрию. Использовали свежеприготовленный FITC PrS, полученный как описано выше. Мышиные гемопоэтические стволовые клетки (HSC) обычно очищают в указанной лаборатории. Клетки выделяли из нормального костного мозга мыши путем окрашивания на c-Kit +, клетки негативной линии дифференциации. Для дальнейшей характеристики клеток также проводили окрашивание маркера SLAM. Эти маркеры окрашивают клетки, которые могут самообновляться и дифференцироваться, тогда как неокрашенные HSC могут только дифференцироваться. Последующее окрашивание с помощью FITC PrS выявило процент положительных в SLAM-окрашивающих клетках, как показано в результатах. Последующее окрашивание с помощью FITC PrS выявило процент положительных в SLAM-окрашивающих клетках, как показано в результатах. Затем клетки сортировали на FITC и исследовали с помощью конфокальной микроскопии, используя Hoechst 33342 для ядерной визуализации.
Результаты
фиг. 2
фиг. 2
фиг. 3
фиг. 3
фиг. 3А
фиг. 3C
фиг. 4
[0177] Для оценки специфичности связывания PrS в контексте апоптоза в культуре клеток, мы использовали несколько клеточных линий рака молочной железы человека и мыши. Апоптоз индуцировали пероксидом, как описано выше, и оценивали связывание FITC PrS. Примеры этих экспериментов показаны на . Необработанные клетки демонстрировали минимальное связывание, такое как показано на снимке B на . Концентрации перекиси и время выдерживания были выбраны таким образом, чтобы было затронуто только меньшинство клеток, потому что при более высоких концентрациях и/или более длительном времени выдерживания клетки отделялись, и окрашивание и микроскопия были невозможны. Кроме того, присутствие многих незатронутых клеток служило внутренним отрицательным контролем в каждом поле. FITC-аннексин проявлял специфичность к апоптозу, аналогичную PrS, выступая в качестве внутреннего положительного контроля. Затем мы исследовали два белка на совместную локализацию и конкурентное связывание. Для совместной локализации готовили FITC и Cy5, меченные PrS и аннексином. Клетки 4T1 обрабатывали пероксидом и окрашивали Cy5 и FITC, меченными PrS и аннексином, используя обе комбинации флуорофоров. Затем клетки визуализировали в флуоресцентном микроскопе EVOS. Результаты показаны на . В тестируемых условиях все ярко окрашенные клетки демонстрировали окрашивание обоими белками. Однако при использовании Cy5 или FITC PrS, по-видимому, слабо, но окрашивал некоторые клетки, которые не окрашивал аннексин (). Относительная интенсивность окрашивания разных клеток каждым белком иногда различалась между двумя зондами, т.е. иногда аннексин окрашивал две клетки с одинаковой интенсивностью, а PrS - нет, и наоборот (, зеленая стрелка и вставка). Таким образом, в то время как оба зонда обычно окрашивали одни и те же клетки, они, по-видимому, проявляли незначительные различия. В конкурентном анализе увеличивающиеся избыточные количества немеченого аннексина предварительно выдерживали с апоптотическими клетками 4Т1 в течение 15 минут, а затем клетки окрашивали Cy5 PrS. Удивительно, что окрашивание PrS не блокировалось даже 1000-кратным избытком аннексина, наибольшего испытанного избыточного количества (), хотя считается, что эти белки связываются с той же молекулой-мишенью, подвергшейся воздействию PS. Совместное окрашивание аннексина и PrS наблюдали со многими типами клеток. Хотя два белка обычно окрашивали одни и те же клетки в каждом типе клеток, другие различия стали очевидными. В частности, некоторые объекты, меньшие, чем клетки, были дифференциально окрашены (). Эти объекты, присутствовавшие в увеличенном количестве после обработки перекисью, были интерпретированы как апоптотические тела; мембраносвязанные фрагменты клеток, образующиеся при фрагментации апоптотических клеток. Как показано на фиг. 4, PrS окрашивал эти объекты, в то время как аннексин не окрашивал, хотя некоторые из этих объектов окрашивали оба белка. Это наблюдение было неожиданным. Для дальнейшего изучения дифференциального окрашивания субклеточных объектов получали внеклеточные везикулы (EV) из опухолевых клеток мыши 4T1 с использованием стандартного протокола центрифугирования. Два белка также по-разному окрашивали эти везикулы (фиг. 5), что может иметь биологические и терапевтические последствия.
[0178] EV, в частности экзосомы, микропузырьки (MV) и апоптотические тельца (AB), предположительно играют ключевую роль в межклеточной коммуникации путем передачи биомолекул между клетками. Биогенез этих типов EV различен, и они происходят из эндосомальных (экзосом) или плазматических мембран (MV) или являются продуктами запрограммированной гибели клеток (ABs). Считается, что все клетки млекопитающих секретируют EV. Каждый тип EV может передавать молекулярный груз как соседним, так и удаленным клеткам, влияя на клеточное поведение, такое как вовлеченное в развитие и прогрессирование опухоли. Фактически, EV могут играть роль почти во всех отличительных признаках рака, включая поддержание пролиферативной передачи сигналов, уклонение от подавления роста, сопротивление гибели клеток, перепрограммирование энергетического метаболизма, приобретение нестабильности генома и развитие микроокружения опухоли. Они также имеют отношение к индукции ангиогенеза, контролю заражения, инициированию преметастатических ниш, поддержанию воспаления и уклонению от иммунного контроля. Иммунные клетки, по-видимому, также связываются через EV, и могут распознавать EV как сигналы от опухолевых клеток, инфицированных тканей и ран. Более глубокое понимание биологии EV и их вклада в отличительные признаки рака приводит к появлению новых возможностей для диагностики и лечения рака. Разработка дополнительных поверхностных маркеров EV важна для развития этой области, и PrS может быть таким определяющим фактором.
4
99m
2
2
фиг. 6
фиг. 7
фиг. 7
фиг. 3A
B
фиг. 8
фиг. 9
in vivo
in vivo
[0179] После этих исследований с флуоресцентной микроскопией, субклеточную локализацию окрашивания PrS и аннексином затем оценивали с помощью конфокальной микроскопии. Клетки мыши 4T1 (без репортеров Luc-GFP) высевали на предметные стекла с 8 частями с 1×10 клеток на камеру и на следующий день индуцировали апоптоз с помощью 2 мМ HO или t-BHP (воздействие в течение 2 часов). Затем клетки промывали и окрашивали в течение 15 минут PrS и аннексином. Краситель Hoechst 33342 использовали для окрашивания нуклеиновой кислоты. Во всех случаях наиболее ярко окрашенные клетки были окрашены обоими зондами. Однако во многих клетках наблюдали меченый PrS в цитоплазме, тогда как меченый аннексин нет (). Хотя аннексин был интернализован и встречается в везикулах нескольких клеток, интернализованный аннексин вместе с локализованным на поверхности PrS в той же клетке не наблюдали. Эти результаты были неожиданными, поскольку предполагается, что оба белка связывают PS. Для дальнейшего изучения интернализации PrS проводили эксперимент по определению зависимости от времени. Апоптотические клетки 4T1 окрашивали в течение 5 минут аннексином Cy5 и FITC PrS и наблюдали в течение 5 минут после добавления зондов. PrS наблюдали в цитоплазме этих клеток сразу же, что указывает на интернализацию в течение 5 минут (). Изображения зависимости от времени также показали, что PrS и аннексин не всегда окрашивали одни и те же клетки одинаково в ранние моменты времени. Клетки на , по-видимому, находятся на разных стадиях апоптоза, так как клетка слева показывает неконденсированное ядро, окруженное явно неповрежденной ядерной мембраной, тогда как правая клетка демонстрирует сильное окрашивание, часто характерное для конденсации хроматина, которое происходит позже в апоптотическом процессе. Образцы окрашивания, подобные этим, могут указывать на то, что PrS связывается при апоптозе раньше, чем аннексин. Хотя это лишь предположение на данный момент, такое предпочтение объясняет многие различия между этими белками, которые наблюдали до сих пор. Например, окрашивание некоторых клеток PrS, а не аннексином, как, например, на  и , может быть благодаря связыванию PrS ранее в процессе апоптоза. Для изучения локализации PrS у живых животных проводили несколько экспериментов. В этих исследованиях использовали химическое и инфекционное индуцирование апоптоза , а также локализацию PrS в опухолях, обработанных доксорубицином, который, как известно, вызывает апоптоз. Визуализацию SPECT с использованием HYNIC-меченного PrS и аннексина проводили на животных с опухолью молочной железы 4T1luc, которых подвергали лечению доксорубицином. Поскольку опухоли 4Т1 были мечены люциферазой, их можно визуализировать на мышах с использованием биолюминесцентной визуализации  (BLI). Одно из изображений из этого эксперимента показано на . Этот способ можно использовать для оценки имплантации опухоли и отслеживания прогрессирования у отдельных животных с течением времени. PrS и аннексин, меченные Tc, затем использовали для SPECT-визуализации животных, подвергнутых лечению доксорубицином, и контрольных. Пример результатов показан на . Изображения головы и грудной клетки двух животных демонстрируют неспецифическое накопление зонда PrS в слюнной железе и низкое отношение сигнал/шум при использовании этого зонда. Поэтому порог отображения на продемонстрированных изображениях PrS был снижен, чтобы показать больше фона, что привело к более яркому ложному цвету изображений. Низкое отношение сигнал/шум, вероятно, связано с маркировкой HYNIC только 1 мг белка, что является неоптимальным, а также из-за невозможности проведения контролируемых исследований соотношения маркировки HYNIC:белок.
фиг. 10
фиг. 10
фиг. 11
фиг. 11
Listeria monocytogenes
[0180] Также проводили SPECT-визуализацию мышей, подвергнутых лечению циклогексамидом, который вызывает апоптоз в печени (). На  продемонстрированы тела 5 мышей полностью на каждом снимке. Как и в случае многих радиоактивно меченных зондов, фон виден в почках. Лечение мышей циклогексамидом усиливало сигнал SPECT аннексина в печени. PrS снова показал низкий сигнал по сравнению с аннексином. Аннексин был способен обнаруживать апоптотическую печень у мышей, подвергнутых лечению циклогексамидом, тогда как PrS показал лишь незначительное увеличение сигнала в печени из-за лечения. Чтобы проверить локализацию PrS в апоптотических тканях и обработанных опухолях независимо от визуализации SPECT и сопутствующих осложнений мечения HYNIC, мышам, инфицированным бактериями, которые вызывают апоптотический ответ, и мышам, несущим опухоль, инъецировали Cy5 PrS. Для инфицирования мы использовали , бактериальный патоген, меченный люциферазой и хорошо характеризующийся для BLI. Характерные сигналы BLI из селезенки обеспечивают превосходные исследования совместной локализации. Мышей CD1 инфицировали, как описано выше, и визуализировали с помощью BLI на день 2 после заражения. Затем мышам вводили Cy5 PrS и через 30 минут умерщвляли, и селезенки удаляли для рассечения и флуоресцентной микроскопии (). Во всех случаях срезы селезенки от инфицированных мышей показали гораздо более высокие сигналы флуоресценции Cy5, чем контрольные. На  продемонстрированная зараженная мышь показала низкое количество фотонов, что указывает на то, что инфекция еще не очень далеко прогрессировала у этого животного. У многих мышей в 10 раз выше интенсивность указанного сигнала от селезенки в этот день. Однако флуоресценция канала Cy5 все еще была очень сильной по сравнению с показанным неинфицированным контролем. Этот результат может отражать продолжающийся врожденный иммунный ответ на инфекцию, поскольку было показано, что гранулоциты и макрофаги являются основным источником сигнала аннексина у таких животных (эти клетки запрограммированы на апоптоз для ограничения разрушения ткани).
фиг. 12
[0181] Затем исследовали локализацию флуоресцентных PRS в 4Т1 опухолях, обработанных доксорубицином. Мышей, имплантированных опухолями, подвергали лечению доксорубицином, как описано выше, и Cy5 PrS вводили внутривенно за 30 мин до умерщвления и удаления опухолей для рассечения и флуоресцентной микроскопии. Результаты показаны на . Области интенсивного окрашивания наблюдали у подвергнутых лечению животных, тогда как от необработанных срезов опухоли наблюдали более умеренный сигнал. Хотя в некоторых необработанных опухолях обнаруживали небольшие участки с более высоким уровнем сигнала, чем в фоновом режиме, ни в одном из необработанных участков не было обнаружено сигналов, аналогичных по интенсивности с обработанными опухолями.
фиг. 14
фиг. 15
[0182] Стволовые клетки отличаются по фенотипу от дифференцированных клеток и могут экспрессировать PS неапоптотически, чтобы избежать индуцирования иммунных ответов. Стволовые клетки трофобласта (TSC) дифференцируются в несколько типов трофобластов в культуре. TSC получают из соскобов матки мыши, выращенных в присутствии фактора роста фибробластов, активина и гепарина. TSC спонтанно дифференцируются в гигантские клетки, когда эти факторы удалены из среды (фиг. 13). TSC окрашивали PrS, тогда как дифференцированные трофобласты, полученные из этих клеток в культуре, не окрашивали (). Мы также определили, что PrS интернализуется в стволовые клетки без апоптотического индуцирования. Этот результат подтверждает наблюдения, сделанные на линиях опухолевых клеток, в которых индуцировали апоптоз. Без индуцирования апоптоза в опухолевых клетках наблюдали минимальное окрашивание. Чтобы проверить интернализацию в стволовых клетках, мы использовали мезенхимальные стволовые клетки (MSC) и TSC. MSC получали из костного мозга мыши. Костный мозг мышей отмывали и культивировали в течение 6 дней в отсутствии факторов роста. Во время этой инкубации MSC и гемопоэтические стволовые клетки (HSC) реплицируются, тогда как фибробласты прилипают, но не увеличиваются в числе в течение нескольких поколений. Через 6 дней монослой становится видимым. При прохождении трипсинизации адгезивные MSC сохраняются, тогда как HSC, которые растут в суспензии, теряются. Фибробласты не выживают из-за отсутствия факторов роста и также не сохраняются. Таким образом, эта простая процедура приводит к почти однородной популяции MSC. Чтобы подтвердить идентичность этих клеток, мы обрабатывали культуры отдельно дексаметазоном и глицеролфосфатом (чтобы вызвать дифференциацию в остеобласты) или дексаметазоном и индометацином (чтобы вызвать дифференциацию в адипоциты). Результаты показаны на . В ответ на вышеуказанные обработки дифференцированные клетки показали появление соответствующих клеток. Адипоциты содержали крупные жировые везикулы, а остеобласты были темными с характерным внутриклеточным коллагеном и минерализацией.
фиг. 16
фиг. 17
фиг. 18
фиг. 19
фиг. 20
[0183] Чтобы оценить картину внутриклеточного окрашивания, недифференцированные MSC окрашивали PrS и аннексином, а также реагентом ядерного окрашивания Hoechst, и наблюдали с помощью конфокальной микроскопии. Результаты наблюдений показаны на . PrS был быстро интернализован. В случае MSC приблизительно 1 из 20 клеток, окрашенных PrS, согласуется с предыдущими данными, однако точный процент окрашивания не был определен. Морфология MSC неоднородна, и клетки выделяют в среду обильный материал, часть которого прилипает к поверхности предметного стекла, в результате чего на некоторых изображениях образуется фон. Тем не менее, данные четко показывают интернализованный PrS через 5 минут после добавления и аннексин на поверхности. TSC также окрашивали и визуализировали, как это было сделано с MSC. Наблюдения также подтверждают интернализацию в эти клетки, которая также происходит в течение 5 минут после добавления белка. Результаты показаны на . TSC морфологически достаточно вариабельны и могут быть многоядерными в отсутствие дифференциации, как видно на фиг. Как и в случае с MSC, эти первичные клетки выделяют в среду обильный материал, некоторые из которых мы установили как внеклеточные везикулы (предыдущие данные). Этот материал снова усложняет визуализацию. Некоторые EV окрашиваются аннексином, а не PrS, и это явление можно увидеть в TSC на . На этом изображении кластера TSC везикулы, выделяемые клетками, окрашиваются аннексином, а не PrS, который интернализован. Эти картины поднимают интересные вопросы, касающиеся специфичности и связывающих меток PrS и аннексина. Считается, что оба белка связывают PS. Тем не менее, с учетом дифференциального связывания с EV, а также различных субклеточных образцов локализации предполагают, что они не связываются точно таким же образом. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы установить основу этого различия, которое может оказаться значительным. Мы также наблюдали окрашивание PrS линии нейрональных клеток-предшественников C17.2 (), которая представляет собой трансформированную клеточную линию, способную дифференцироваться in vitro в астроциты и другие нейрональные клетки. Приблизительно 5% этих трансформированных клеток окрашивают, хотя этот процент является приблизительным. Примечательно, что проникновение в TSC происходило даже тогда, когда клетки были охлаждены до 4°C (). Однако следует отметить, что камера не может быть постоянно охлаждена после размещения на микроскопе. Тем не менее, температура не могла бы сильно повыситься в течение 5 минут времени процедуры визуализации. Этот результат, хотя и является провокационным, должен явно повторяться в более контролируемых условиях. Если этот вывод будет обоснован, механизм должен быть действительно очень интересным.
фиг. 21
фиг. 22
фиг. 23
[0184] Нам удалось окрашивать гемопоэтические стволовые клетки (HSC) PrS. Используя проточную цитометрию, мы определили, что HSC окрашивают PrS, и наблюдали интернализацию PrS в этих клетках с помощью конфокальной микроскопии. HSC идентифицировали и выделили с использованием флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS). Клетки идентифицировали в костном мозге как отрицательные по линии, SCA/c-kit-положительные клетки (). Затем их окрашивали FITC-PrS. Две популяции HSC, кратковременная и длительная, могут быть идентифицированы по схеме окрашивания маркера SLAM. SLAM (сигнальная молекула активации лимфоцитов) маркеры CD48, CD150, CD229 и CD244 по-разному окрашивают HSC с различными картинами, так что SLAM-картина позитивного окрашивания свидетельствует о способности как самообновляться, так и дифференцироваться, тогда как SLAM-картина отрицательного окрашивания - HSC может только дифференцироваться. PrS окрашивал подмножество длительных HSC (), а также кратковременных HSC (). Показанные клетки являются отрицательными к йодиду пропидия (PI), что означает, что все они являются живыми клетками. Этот результат подтверждает предыдущие эксперименты, демонстрирующие, что подмножество стволовых клеток окрашивается PrS без индукции апоптоза.
фиг. 24
фиг. 25
[0185] Затем мы приступили к исследованию интернализации PrS в HSC. Этот эксперимент был осложнен многими факторами. Пожалуй, самым сложным было выживание в культуре HSC, которые в больших количествах гибнут в течение ночи. Поэтому нам пришлось рассчитать время эксперимента таким образом, чтобы анализ с помощью проточной цитометрии и конфокальная микроскопия проводились в один и тот же день. Кроме того, клетки не прилипают, что делает микроскопию менее оптимальной. Чтобы сделать микроскопию более эффективной, клетки ресуспендировали в маленькой капле среды. Наконец, нам нужно было убедиться, что окрашенные PrS клетки, проанализированные под микроскопом, были еще живы. Многие HSC погибли во время процессов анализа и выделения. Поэтому PI добавляли и сканировали в дополнение к ядерному окрашиванию Hoescht, и использовали другой канал. Наличие PI-ярких ядер указывало на мертвые клетки. Несмотря на эти трудности и сложности выбора времени, мы смогли выполнить эксперимент и подтвердили интернализацию PrS в живые HSC (). Клетки были подтверждены как живые из-за отсутствия ядерного окрашивания PI. Однако некоторые клетки были мертвы или умирали, как показано на . Несмотря на сложность и длительность показанного эксперимента, результаты показывают интернализацию.
фиг. 26
[0186] Наконец, на  мы провели предварительные исследования токсичности TSC и определили, что при концентрации 135 мкг/мл жизнеспособность снижалась только в очень минимальной степени через 30 минут, c 78% до 74%, относительно PBS. Учитывая, что на этом уровне 10% объема культуры составлял PrS-содержащий раствор, этот результат подтвердил наши качественные наблюдения, что PrS в основном нетоксичен для стволовых клеток, и наблюдаемая незначительная токсичность может быть связана с загрязнением содержимого самого препарата. Более низкие концентрации PrS не показали влияния на жизнеспособность. Самый высокий уровень протестированного белка был более чем в 1000 раз больше концентрации, используемой для окрашивания. В то время как исследования полной токсичности, которые формально не были частью этого проекта, потребуют гораздо более обширных испытаний, в данных исследованиях PrS проявляет очень небольшую токсичность.
Выводы
фиг. 3
7
[0187] Вышеуказанные результаты продемонстрировали, что PrS быстро интернализуется во множество клеток, экспрессирующих PrS, включая стволовые клетки многих типов, что говорит о том, что PrS обладает уникальными характеристиками, поддающимися манипулированию для достижения цели разработки терапевтического агента. Кроме того, различие в специфичности между PrS и аннексином, как видно на  и , предполагает, что само связывание между этими двумя белками различно. Тот факт, что аннексин представляет собой тетрамер, а PrS представляет собой мономер, не может объяснить эти различия, и эти данные предполагают, что какой-то другой компонент на клеточной поверхности может участвовать в связывании PrS. Механизм связывания, специфичность и интернализация PrS, а также возможность модульных манипуляций предоставляют множество возможностей.
Пример 2
[0188] Стволовые клетки отличаются по фенотипу от дифференцированных клеток и могут экспрессировать PS неапоптотически, чтобы избежать индуцирования иммунных ответов. Стволовые клетки окрашивали молекулой домена GLA по настоящему изобретению, содержащей полезную нагрузку флуоресцентной метки, без индуцирования апоптоза.
фиг. 14
in vivo
in vitro
[0189] Стволовые клетки трофобласта (), которые дифференцируются в несколько типов трофобластов в плаценте, окрашивались белком S, в то время как дифференцированные трофобласты, имеющие происхождение из этих клеток в культуре не окрашивались. Окрашиванием можно было различить стволовые клетки, дифференцированные , и клетки, дифференцированные .
in vivo
ex vivo
[0190] Эти молекулы по настоящему изобретению могут быть использованы для нацеливания клеток  или в образцах .
Ссылки
1. Thompson, W.W., et al., Estimates of US influenza-associated deaths made using four different methods. Influenza Other Respir Viruses, 2009. 3(1): p. 37-49.
2. Osterholm, M.T., et al., Efficacy and effectiveness of influenza vaccines: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis, 2012. 12(1): p. 36-44.
3. Dixit, R., et al., Emergence of oseltamivir resistance: control and management of influenza before, during and after the pandemic. Infect Disord Drug Targets, 2013. 13(1): p. 34-45.
4. Jefferson, T., et al., Oseltamivir for influenza in adults and children: systematic review of clinical study reports and summary of regulatory comments. BMJ, 2014. 348: p. g2545.
5. Godfrey, C., et al., Delivery is key: lessons learnt from developing splice-switching antisense therapies. EMBO Mol Med, 2017. 9(5): p. 545-557.
6. Kaczmarek, J.C., P.S. Kowalski, and D.G. Anderson, Advances in the delivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality. Genome Med, 2017. 9(1): p. 60.
7. Ling, H., Non-coding RNAs: Therapeutic Strategies and Delivery Systems. Adv Exp Med Biol, 2016. 937: p. 229-37.
8. Poon, I.K., et al., Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nat Rev Immunol, 2014. 14(3): p. 166-80.
9. Birge, R.B., et al., Phosphatidylserine is a global immunosuppressive signal in efferocytosis, infectious disease, and cancer. Cell Death Differ, 2016. 23(6): p. 962-78.
10. Amara, A. and J. Mercer, Viral apoptotic mimicry. Nat Rev Microbiol, 2015. 13(8): p. 461-9.
11. Moller-Tank, S. and W. Maury, Phosphatidylserine receptors: enhancers of enveloped virus entry and infection. Virology, 2014. 468-470: p. 565-80.
12. Ludwig, S., et al., MEK inhibition impairs influenza B virus propagation without emergence of resistant variants. FEBS Lett, 2004. 561(1-3): p. 37-43.
13. Sharma, R., et al., Detection of phosphatidylserine-positive exosomes for the diagnosis of early-stage malignancies. Br J Cancer, 2017. 117(4): p. 545-552.
14. Azuma, K., et al., Liver-specific gamma-glutamyl carboxylase-deficient mice display bleeding diathesis and short life span. PLoS One, 2014. 9(2): p. e88643.
15. Hjortoe, G., et al., Factor VIIa binding and internalization in hepatocytes. J Thromb Haemost, 2005. 3(10): p. 2264-73.
16. Meliopoulos, V.A., et al., Host gene targets for novel influenza therapies elucidated by high-throughput RNA interference screens. FASEB J, 2012. 26(4): p. 1372-86.
17. Pleschka, S., et al., Influenza virus propagation is impaired by inhibition of the Raf/MEK/ERK signalling cascade. Nat Cell Biol, 2001. 3(3): p. 301-5.
18. Makkoch, J., et al., Human microRNAs profiling in response to influenza A viruses (subtypes pH1N1, H3N2, and H5N1). Exp Biol Med (Maywood), 2016. 241(4): p. 409-20.
19. Wolf, S., et al., MicroRNA Regulation of Human Genes Essential for Influenza A (H7N9) Replication. PLoS One, 2016. 11(5): p. e0155104.
20. Skalickova, S., et al., Perspective of Use of Antiviral Peptides against Influenza Virus. Viruses, 2015. 7(10): p. 5428-42.
21. Matsubara, T., et al., Sialic acid-mimic peptides as hemagglutinin inhibitors for anti-influenza therapy. J Med Chem, 2010. 53(11): p. 4441-9.
22. Wunderlich, K., et al., Identification of a PA-binding peptide with inhibitory activity against influenza A and B virus replication. PLoS One, 2009. 4(10): p. e7517.
23. Ozcan, G., et al., Preclinical and clinical development of siRNA-based therapeutics. Adv Drug Deliv Rev, 2015. 87: p. 108-19.
24. Mack, S., et al., Pseudo-Ligandless Click Chemistry for Oligonucleotide Conjugation. Curr Protoc Chem Biol, 2016. 8(2): p. 83-95.
25. Paredes, E. and S.R. Das, Click chemistry for rapid labeling and ligation of RNA. Chembiochem, 2011. 12(1): p. 125-31.
26. Zheng, Y. and P.A. Beal, Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA. Bioorg Med Chem Lett, 2016. 26(7): p. 1799-802.
27. Jain, N., et al., Current ADC Linker Chemistry. Pharm Res, 2015. 32(11): p. 3526-40.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  GLAdiator BioSciences Inc
<120>  ДОСТАВКА ПОЛЕЗНОЙ НАГРУЗКИ К СТВОЛОВЫМ КЛЕТКАМ
<130>  P000227_WO
<150>  US 62/569,403
<151>  2017-10-06
<150>  US 62/554,530
<151>  2017-09-05
<160>  6
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  45
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический пептид
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (6)..(7)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (14)..(14)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (16)..(16)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (19)..(20)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (25)..(26)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (29)..(29)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (32)..(32)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (36)..(36)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<400>  1
Ala Asn Ser Leu Leu Xaa Xaa Thr Lys Gln Gly Asn Leu Xaa Arg Xaa
1               5                   10                  15
Cys Ile Xaa Xaa Leu Cys Asn Lys Xaa Xaa Ala Arg Xaa Val Phe Xaa
20                  25                  30
Asn Asp Pro Xaa Thr Asp Tyr Phe Tyr Pro Lys Tyr Leu
35                  40                  45
<210>  2
<211>  46
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический пептид
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (7)..(8)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (11)..(11)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (15)..(15)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (17)..(17)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (20)..(21)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (26)..(27)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (30)..(30)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (33)..(33)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (35)..(35)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (40)..(40)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<400>  2
Ala Gly Ser Tyr Leu Leu Xaa Xaa Leu Phe Xaa Gly Asn Leu Xaa Lys
1               5                   10                  15
Xaa Cys Tyr Xaa Xaa Ile Cys Val Tyr Xaa Xaa Ala Arg Xaa Val Phe
20                  25                  30
Xaa Asn Xaa Val Val Thr Asp Xaa Phe Trp Arg Arg Tyr Lys
35                  40                  45
<210>  3
<211>  45
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический пептид
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (6)..(7)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (14)..(14)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (16)..(16)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (19)..(20)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (25)..(26)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (29)..(29)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (32)..(32)
<223>  X is представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<400>  3
Ala Asn Thr Phe Leu Xaa Xaa Val Arg Lys Gly Asn Leu Xaa Arg Xaa
1               5                   10                  15
Cys Val Xaa Xaa Thr Cys Ser Tyr Xaa Xaa Ala Phe Xaa Ala Leu Xaa
20                  25                  30
Ser Ser Thr Ala Thr Asp Val Phe Trp Ala Lys Tyr Thr
35                  40                  45
<210>  4
<211>  45
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический пептид
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (6)..(7)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (14)..(14)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (16)..(16)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (19)..(20)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (25)..(26)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (29)..(29)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (35)..(35)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<400>  4
Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Pro Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa
1               5                   10                  15
Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Ile Phe Lys
20                  25                  30
Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser
35                  40                  45
<210>  5
<211>  45
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический пептид
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (6)..(7)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (14)..(14)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (16)..(16)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (19)..(20)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (25)..(26)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (29)..(29)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (32)..(32)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (35)..(35)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<400>  5
Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Gln Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa
1               5                   10                  15
Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Ile Phe Xaa
20                  25                  30
Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser
35                  40                  45
<210>  6
<211>  250
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический пептид
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (6)..(7)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (14)..(14)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (16)..(16)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (19)..(20)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (25)..(26)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (29)..(29)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (32)..(32)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (36)..(36)
<223>  X представляет собой остаток гамма-карбоксиглутаминовой кислоты
<400>  6
Ala Asn Ser Leu Leu Xaa Xaa Thr Lys Gln Gly Asn Leu Xaa Arg Xaa
1               5                   10                  15
Cys Ile Xaa Xaa Leu Cys Asn Lys Xaa Xaa Ala Arg Xaa Val Phe Xaa
20                  25                  30
Asn Asp Pro Xaa Thr Asp Tyr Phe Tyr Pro Lys Tyr Leu Val Cys Leu
35                  40                  45
Arg Ser Phe Gln Thr Gly Leu Phe Thr Ala Ala Arg Gln Ser Thr Asn
50                  55                  60
Ala Tyr Pro Asp Leu Arg Ser Cys Val Asn Ala Ile Pro Asp Gln Cys
65                  70                  75                  80
Ser Pro Leu Pro Cys Asn Glu Asp Gly Tyr Met Ser Cys Lys Asp Gly
85                  90                  95
Lys Ala Ser Phe Thr Cys Thr Cys Lys Pro Gly Trp Gln Gly Glu Lys
100                 105                 110
Cys Glu Phe Asp Ile Asn Glu Cys Lys Asp Pro Ser Asn Ile Asn Gly
115                 120                 125
Gly Cys Ser Gln Ile Cys Asp Asn Thr Pro Gly Ser Tyr His Cys Ser
130                 135                 140
Cys Lys Asn Gly Phe Val Met Leu Ser Asn Lys Lys Asp Cys Lys Asp
145                 150                 155                 160
Val Asp Glu Cys Ser Leu Lys Pro Ser Ile Cys Gly Thr Ala Val Cys
165                 170                 175
Lys Asn Ile Pro Gly Asp Phe Glu Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Arg
180                 185                 190
Tyr Asn Leu Lys Ser Lys Ser Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Ser Glu
195                 200                 205
Asn Met Cys Ala Gln Leu Cys Val Asn Tyr Pro Gly Gly Tyr Thr Cys
210                 215                 220
Tyr Cys Asp Gly Lys Lys Gly Phe Lys Leu Ala Gln Asp Gln Lys Ser
225                 230                 235                 240
Cys Glu Ser Arg His His His His His His
245                 250
<---