СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ РОСТА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК
METHOD OF INHIBITING GROWTH OF TUMOR CELLS

Изобретение относится к медицине, к области биотехнологий и генным технологиям и может быть использовано для супрессии роста опухолевых клеток, в частности, глиобластомы и рабдомиосаркомы, в онкологии, а также в молекулярной фармакологии для разработки методов генной и генно-клеточной терапии онкопатологии и в научных исследованиях.
Известно, что онкологические заболевания имеют генетическую обусловленность. При этом ряд генов обладает активностью, способствующей опухолевому росту (протоонкогены), а другие - ингибирующим действием на развитие онкопатологии (гены-супрессоры опухолевого роста). Исходя из фактов, свидетельствующих о вовлечении генетических процессов в развитие онкопатологии, формируются и соответственные этому подходы к ингибированию роста опухолевых клеток. Одним из перспективных подходов считается применение методов коррекции экспрессии генов, занимающих ключевые позиции в развитии того или иного заболевания. При внесении в клетку дополнительной генетической конструкции, с генов, расположенных в ней, происходит считывание информации с образованием матричной РНК. На основании последовательности матричной РНК в результате трансляции на рибосомах клетки синтезируется белок, который может оказывать действие как на ту клетку, которая его продуцировала (аутокринный эффект), так и на другие клетки культуры или организма (паракринный эффект). Тем самым, суть генной терапии сводится к ауто- и паракринному действию.
Идентифицированный в 1997 году ген klotho [Kuro-o М., Matsumura Y., Aizawa H., Kawaguchi H., Suga Т., Utsugi Т. et al. Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing. Nature. - 1997. - T. 390. - №. 6655. - С. 45. doi: 10.1038/36285] имеет возраст-обусловленную сниженную экспрессию в опухолевых клетках [Nabeshima Y. Klotho: a fundamental regulator of aging. Ageing research reviews. - 2002. - Т. 1. - №. 4. - C. 627-638. doi: 10.1016/S1568-1637(02)00027-2; Duce J.A., Podvin S., Hollander W., Kipling D., Rosene D.L., Abraham C.R. Gene profile analysis implicates Klotho as an important contributor to aging changes in brain white matter of the rhesus monkey. Glia. - 2008. - T. 56. - №. 1. - C. 106-117. doi.org/10.1002/glia.20593; Wolf I., Levanon-Cohen S., Bose S., Ligumsky H., Sredni В., Kanety H. et al. Klotho: a tumor suppressor and a modulator of the IGF-1 and FGF pathways in human breast cancer. Oncogene. - 2008. - T. 27. - №. 56. - C. 7094. doi: 10.1038/onc.2008.292]. Пониженная активность гена klotho коррелирует с более высокой пролиферативной активностью опухолевых клеток [Abramovitz L., Rubinek Т., Ligumsky Н., Bose S., Barshack I., Avivi C. et al. KL1 internal repeat mediates klotho tumor suppressor activities and inhibits bFGF and IGF-I signaling in pancreatic cancer // Clinical Cancer Research. - 2011. - T. 17. - №. 13. - C. 4254-4266. DOI: 10.1158/1078-0432.], снижением способности клеток к запуску внутренних апоптотических механизмов [Wang L., Wang X., Wang X., Jie P., Lu H., Zhang S. et al. Klotho is silenced through promoter hypermethylation in gastric cancer. American journal of cancer research. - 2011. - Т. 1. - №. 1. - С. 111.], а также к изменениям генетических и метаболических процессов, способствующих повышению жизнеспособности злокачественно трансформированных клеток [Li Х.Х., Huang L.Y., Peng J.J., Liang L., Shi D.B., Zheng H.T. et al. Klotho suppresses growth and invasion of colon cancer cells through inhibition of IGF1R-mediated PI3K/AKT pathway. International journal of oncology. - 2014. - T. 45. - №. 2. - C. 611-618. doi.org/10.3892/ijo.2014.2430].
Возможным вариантом индукции гиперэкспрессии (повышения активности) гена klotho в опухолевых клетках с целью ингибирования их роста является применение вирусных конструкций с встроенным геном klotho. Однако данный методологический подход вызывает необратимые изменения наследственного материала, в том числе в неопухолевых клетках в связи с встраиванием вирусной конструкции в клеточный геном. При этом имеющиеся технологии не позволяют нивелировать риск вмешательства вирусной конструкции в геном клеток с последующей индукцией мутагенеза и развитием побочных эффектов.
Наиболее близким техническим решением является способ, изложенный в работе Во Chen at al. [Chen В., Wang X., Zhao W., Wu J. Klotho inhibits growth and promotes apoptosis in human lung cancer cell line A549 // Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. - 2010. - T. 29. - №. 1. - C. 99. doi.org/10.1186/1756-9966-29-99]. В данной работе представлены результаты трансфекции опухолевых клеток с использованием плазмидной генетической конструкции с полезным геном трансмембранной формы гена klotho. Результатами индуцированной гиперэкспрессии гена klotho к четвертым суткам культивирования стало снижение жизнеспособности клеток по данным МТТ-теста на 7-20% относительно контрольных значений и повышение доли клеток, находящихся в апоптозе.
Однако данный способ подавления роста опухолевых клеток имеет ряд недостатков, к которым можно отнести применение исключительно трансмембранной формы гена klotho и его недостаточная эффективность, проявляющаяся низким уровнем снижения жизнеспособности опухолевых клеток и невысоким повышением апоптоза (апоптотической гибели клеток). Анализ причин недостаточной эффективности способа генной терапии по протоколу Во Chen et al. обусловлен особенностями трансмембранной формы гена klotho. Так, трансмембранная форма белка Klotho после синтеза задерживается в мембранах клеток и аппарате Гольджи [Wang Y., Sun Z. Current understanding of klotho. Ageing research reviews. - 2009. - T. 8. - №. 1. - C. 43-51. doi: 10.1016/j.arr.2008.10.002], а применение данного плазмидного вектора ограничивается его аутокринным воздействием. Тем самым, противоопухолевое действие klotho находит свою реализацию только в тех клетках, которые подверглись генетической коррекции, что в условиях низкой эффективности невирусной трансфекции исключает паракринный эффект белка Klotho в околоклеточной среде в отношении нетрансфецированных клеток.
Задачей изобретения является повышение эффективности генной ингибиции роста опухолевых клеток посредством повышения экспрессии гена klotho в трансфецированных клетках за счет применения различных форм этого гена.
Задача решается тем, что выполняют трансфекцию опухолевых клеток двумя видами плазмид, одна из которых содержит трансмембранную форму гена klotho (Addgene plasmid 17712), другая - секретируемую (Addgene plasmid 17713) [Arking D.E., Krebsova A., Macek M., Arking A., Mian I.S., Fried, L. et al. Association of human aging with a functional variant of klotho // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2002. - T. 99. - №. 2. - C. 856-861. doi: 10.1073/pnas.022484299]. Этим достигается синергизм действия гиперэкспрессии двух форм гена.
Исследования по заявленному способу были выполнены на культурах опухолевых клеток линии Rd (эмбриональная рабдомиосаркома человека, АТСС CCL 136), полученной от ФБУН Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных инфекций (Екатеринбург, Россия), и А-172 (глиобластома человека, АТСС CRL 1620), полученной от ФГБУН Институт цитологии РАН (Санкт-Петербург, Россия). Плазмиды получали из трансгенного штамма E.coli DH5a с использованием набора Miniprep Kit (Zymo Research, США) в соответствии с протоколом производителя.
2
2
Способ осуществляется в следующем порядке. Опухолевые клетки культивировали при температуре 37°С, влажности 95% и концентрации CO 5% в CO-инкубаторе (Sanyo, Япония). Стандартная ростовая среда включала среду Игла в модификации Дальбекко (DMEM, Sigma Aldrich, USA) с содержанием 10% фетальной бычьей сыворотки (Sigma Aldrich, USA). Смена культуральной среды производилась раз в три дня с заменой 60% от общего объема. Субкультивирование производили методом трипсинизации с использованием 0.25% раствора трипсина (Sigma Aldrich, USA) при достижении культурой монослоя конфлюентностью не менее 85%.
2
Для трансфекции готовят трансфекционную смесь: к плазмидной ДНК добавляют культуральную среду без сыворотки до 500 мкл, комплекс поликатионных липидов также разводят культуральной средой без сыворотки из расчета 2 мкл/мл. Полученные растворы смешивают, пробирку инкубируют при комнатной температуре и плавном перемешивании в течение 60 минут. Культуры опухолевых клеток высаживают на новые культуральные поверхности и возвращают в CO-инкубатор на 24 часа. Перед трансфекцией клетки помещают в бессывороточную среду, добавляют трансфекционную смесь и возвращают в инкубатор.
Трансфекцию проводили с использованием реагента Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA), представляющего собой смесь поликатионных липидов. Соотношение поликатионных липидов и ДНК в трансфекционной смеси подбирали экспериментальным путем. При этом оценивали уровень экспрессии (активности) гена klotho в культурах опухолевых клеток, подвергшихся генетической коррекции. На фигуре 1 представлена диаграмма, отображающая зависимость уровня экспрессии гена klotho от количества плазмидной ДНК, использованной для трансфекции клеток линии А-172. Оптимальные показатели достигнуты при соотношении: 2 мкл Lipofectamine на 2 нг плазмидной ДНК и на 1 мл культуральной среды. На оси абсцисс представлена концентрация ДНК в нг, на оси ординат - экспрессия klotho, где за единицу принят максимальный средний показатель экспрессии. Как следует из представленного на фигуре 1 графика, повышение количества плазмидной ДНК после отметки 2 нг не влияет на уровень экспрессии. После добавления трансфекционной смеси к клеткам, культуры возвращали в инкубатор на 14-16 часов, затем заменяли в них среду на стандартную ростовую. Для селекции трансфецированных клеток в среду добавляли антибиотик - неомицин, в концентрации 500 мкг/мл.
Кроме того, экспериментальным образом определяли наиболее эффективное соотношение трансмембранной и секретируемой формы klotho. На фигуре 2 представлены результаты МТТ-теста, выполненного однократно через 96 часов после трансфекции на клетках линии А-172 с целью оценки эффективности онкосупрессивного действия гиперэкспрессии гена klotho при различном соотношении секретируемой и трансмембранной формы. На оси абсцисс отмечена доля серетируемой формы klotho от общего количества использованных плазмид, на оси ординат - оптическая плотность при 570 нм. Как следует из графика, наибольшая эффективность ингибирования опухолевых клеток достигнута при соотношении трансмембранной формы к секретируемой - 2:3, соответственно.
После индукции гиперэкспрессии гена klotho, культуры клеток подвергали контролю экспрессии исследуемого гена посредством ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Экспрессию исследуемого гена klotho оценивали относительно стабильно экспрессирующегося гена «домашнего хозяйства» abl-1. Все трансфецированные культуры продемонстрировали статистически значимое повышение экспрессии (активности) гена klotho по сравнению с контролем с высоким уровнем достоверности полученных результатов (p<0.001).
2
Влияние klotho на жизнеспособность опухолевых клеток подтверждали методом МТТ-теста с использованием набора ТОХ-1 (Sigma Aldrich, США). Оценивали жизнеспособность клеток, высаженных заранее в 96-луночные планшеты. Подсчеты проводили 4-х кратно: через 24, 48, 72 и 96 часов после трансфекции. При этом в культуры добавляли краситель МТТ [3-(4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyltetrazolium bromide, 20 мкл, 10 мг/мл], затем клетки возвращали в CO-инкубатор на 4 часа. После чего из каждой лунки забирали кондиционную среду и добавляли по 200 мкл солюбилизирующего раствора (изопропанол и ДМСО, 1:1), культуры помещали на шейкер на 10 минут и проводили колориметрические измерения на планшетном спектрофотометре MultiscanGo (ThermoFisherScientific, Finland). Оценивали оптическую плотность в каждой лунке при длине волны 570 нм (за вычетом фонового значения при длине волны 690 нм).
Для оценки апоптоза в клеточных культурах использован коммерческий набор флуоресцентных красителей Caspase Apoptosis Kit (Novus, США), позволяющий провести окраску апоптотических клеток. Окраска проведена по протоколу производителя. Подсчет клеток проведен на микроскопе ZOE (BIO RAD, Singapore).
Статистическая обработка данных проведена в программе RStudio (Version 1.1.463 - © 2009-2018 RStudio, Inc.) с использованием пакета R версии 3.5.1. Данные представлены в виде среднего арифметического ± стандартная ошибка (SE). Нормальность распределения оценивали по тесту Шапиро-Уилка. Гомогенность дисперсии - по тесту Бартлетта. Сравнение групп проводилось по методу дисперсионного анализа (с поправкой на множественность сравнений) и регрессионных моделей. Различия считали статистически значимыми при p<0.05.
Пример 1. Исследования выполняли на сертифицированной линии клеток глиобластомы человека А-172 выше описанным способом. Культуры клеток разделяли на 4 группы. Группа №1 включала культуры клеток, подвергшиеся воздействию трансфекционной смеси без конструкции с геном klotho. Группа №2 включала культуры клеток, подвергшиеся трансфекции плазмидой с геном трансмембранной формы klotho (2 нг ДНК). Группа №3 представлена культурами опухолевых клеток, в которых с применением 2 нг невирусной конструкции индуцировали гиперэкспрессию секретируемой формы klotho. Группа №4 образована культурами клеток, которые трансфецировали плазмидами с обеими формами гена klotho (0.8 нг плазмид с трансмембранной формой Klotho, 1.2 нг - с секретируемой).
Результаты МТТ-теста продемонстрировали статистически значимое влияние индуцированной гиперэкспрессии гена klotho на характеристики роста и жизнеспособность клеток линии А-172. Результаты исследования представлены в таблице 1.
Как следует из табличных данных, максимальные различия между опытными и контрольной группами наблюдались на 4-е сутки исследований. В культуре клеток глиобастомы А-172 в группе №2 максимальная разница от группы №1 составила 22.52% (p<0.001). Максимальные различия групп №3 и №1 достигли 27.91% (р<0.001). Разница между показателями групп №4 и №1 к 96-му часу составила 49.05% (р<0.001). Результаты эксперимента представлены также графически на диаграмме (фигура 3). На фигуре 3 представлено динамическое изменение оптической плотности, регистрируемой при МТТ-тесте, по оси абсцисс указано время, прошедшее после трансфекции, в диапазоне от 24 до 96 часов, по оси ординат - оптическая плотность при длине волны 570 нм. Из полученных данных следует, что к 96 часам после трансфекции достигнута ингибиция роста опухолевых клеток практически на 50%. Это значительно превышает максимальную ингибицию, полученную по способу в прототипе (20%).
Оценка апоптоза в клеточных культурах позволила выявить значимое влияние индуцированной гиперэкспрессии гена klotho на механизмы программируемой гибели клеток глиобластомы. Оценку производили через 24 часа после трансфекции. Результаты представлены в таблице 2.
Как следует из таблицы в культурах клеток линии А-172 зарегистрировано повышение уровня апоптоза. В группе №2 на 100.45% относительно контрольных значений (р<0.001), в группе №3 на 139.99% (р<0.001), в группе №4 - на 255.38% (р<0.001). На фигуре 4 представлена столбчатая диаграмма, отображающая уровень апоптоза в культурах клеток глиобластомы под действием гиперэкспрессии различных форм гена klotho и их смеси в сравнении с контролем (в процентах от общего количества клеток). Тем самым, уровень апоптоза в группе №4 превышает контрольные значения более чем в 3.5 раза, что существенно превосходит показатели прототипа. Между тем, гиперэкспрессия трансмембранной формы Klotho, использованной в прототипе, индуцировала только 2-кратное повышение уровня апоптоза.
Пример 2. Исследования выполняли на сертифицированной линии клеток эмбриональной рабдомиосаркомы человека Rd в соответствии с описанным способом. Культуры клеток разделяли на 4 группы. Группа №1 включала культуры клеток, подвергшиеся воздействию трансфекционной смеси без конструкции с геном klotho. Группа №2 включала культуры клеток, подвергшиеся трансфекции 2 нг плазмиды с геном трансмембранной формы klotho. Группа №3 представлена культурами опухолевых клеток, в которых с применением 2 нг невирусной конструкции индуцировали гиперэкспрессию секретируемой формы klotho. Группа №4 образована культурами клеток, которые трансфецировали плазмидами с обеими формами гена klotho (0.8 нг плазмид с трансмембранной формой Klotho, 1.2 нг - с секретируемой).
По результатам МТТ-теста (таблица 3), максимальные различия между группами, зарегистрированные при последнем подсчете составили: группы №2 и №1 - 19.13% (р<0.001), группы №3 и №1 - 23.34% (р<0.001), группы №4 и №1 - 50.67% (р<0.001). Графическое изображение результатов МТТ-теста на культуре клеток рабдомиосаркомы представлено на диаграмме (фигура 5). На фигуре 5 продемонстрировано графическое изображение динамических изменений оптической плотности в группах сравнения, по оси абсцисс указано время в диапазоне от 24 до 96 часов, по оси ординат - оптическая плотность при длине волны 570 нм. Таким образом, к 96 часам после трансфекции зарегистрировано подавление роста опухолевых клеток, превысившее 50%. Тогда как максимальная ингибиция, полученная по способу прототипа, отмечается на уровне 20%.
Отклонение в показателях активности апоптогенных факторов для клеток рабдомиосаркомы составили: группа №2 - 107.42% (р<0.001), группа №3 - 115.3% (р<0.001), группа №4 - 257.88% (р<0.001). Зарегистрированные результаты представлены на диаграмме (фигура 6). На фигуре 6 представлена столбчатая диаграмма, отображающая уровень апоптоза в процентах от общего количества клеток в культурах эмбриональной рабдомиосаркомы под действием гиперэкспрессии различных форм гена klotho и их смеси в сравнении с контролем. Тем самым, доля апоптотических клеток в культурах линии Rd, подвергшихся гиперэкспрессии гена klotho по предложенному способу, составила 55%. Тогда как использование способа, применяемого в прототипе, способствует апоптотической гибели менее 32% клеток рабдомиосаркомы.
Проведенное испытание свидетельствует о технической осуществимости способа ингибирования роста опухолевых клеток, что может послужить основой для разработки нового способа терапии онкозаболеваний. Использованное техническое решение перед существующими аналогами и прототипом отличает повышенная эффективность генной ингибиции роста опухолевых клеток, которое заключается в 2-3-х кратном снижении количественных характеристик роста и жизнеспособности опухолевых клеток, что находит свое отражение как в результатах МТТ-теста, так и в результатах оценки апоптоза.