Способ оценки рецептивности эндометрия в секреторную фазу у женщин с первичным бесплодием, обусловленным гипоплазией эндометрия
METHOD FOR EVALUATING RECEPTIVITY OF ENDOMETRIUM IN SECRETORY PHASE IN WOMEN WITH PRIMARY INFERTILITY CAUSED BY ENDOMETRIAL HYPOPLASIA

Изобретение относится к области медицины, а именно к патоморфологии, акушерству и гинекологии, и предназначено для оценки рецептивности эндометрия в период «имплантационного окна» у женщин с первичным бесплодием, обусловленным гипоплазией эндометрия. Изобретение обеспечивает возможность коррекции протоколов ВРТ у женщин с гипоплазией эндометрия и бесплодием.
Нарушение полноценной имплантации при переносе эмбрионов хорошего качества в связи с нерецептивным эндометрием является наиболее значимой причиной репродуктивных неудач ВРТ, занимая в их структуре до 70% (Боярский К.Ю., Гайдуков С.Н., Пальченко Н.А. Современный взгляд на проблему рецептивности и тонкого эндометрия в программах ВРТ. Обзор литературы. Проблемы репродукции. 2013;4:3-7. Ссылка активна на 28.08.2017.). Поэтому в последние годы особый интерес представляют исследования, посвященные изучению рецептивности эндометрия при патологии имплантации, связанной с бесплодием, обусловленным, в том числе, гипоплазией эндометрия.
Аналогами данного изобретения являются описанные в научно-медицинской и патентной литературе способы оценки рецептивности эндометрия путем исследования морфологической картины и экспрессии рецепторов гормонов.
Способ прогнозирования рецептивности эндометрия в циклах ЭКО (Патент RU 2562559, опубл. 27.05.2014 г.) на основании определения оптической плотности экспрессии лейкемия ингибирующего фактора (LIF) в поверхностном и железистом эпителии эндометрия в период окна имплантации в цикле, предшествующем проведению экстракорпорального оплодотворения, и содержания сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) в цервикальной слизи в день трансвагинальной пункции фолликулов, систолодиастолическое отношение (S/D) и индекс резистентности (IR) спиральных артерий в день введения триггера овуляции.
Способ позволяет прогнозировать наступление беременности только в программах ВРТ, с учетом дня трансвагинальной пункции, дня введения триггера овуляции,  однако нет данных о прогнозировании спонтанной беременности. Недостатком метода также является его проведение непосредственно в течение протокола ВРТ, что не позволяет заранее прогнозировать исход протокола,  анализируется только LIF, который не отражает механизмы нарушения рецептивности эндометрия.
Из патента RU 2580629, опубликованного 15.05.2015 г., известен способ прогнозирования рецептивности эндометрия на основании оценки уровня экспрессии и внутриклеточной локализации эзрина в эндометрии женщин с бесплодием и повторными неудачами программы ЭКО. Показано, что в период «окна имплантации» рецепторный эндометрий характеризуется средней стадией фазы секреции, зрелыми пиноподиями более чем на 20% поверхностного эпителия и высоким уровнем экспрессии эзрина и в эпителии, и пиноподиях. Изобретение позволяет прогнозировать наступления беременности в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и естественных циклах у женщин с бесплодием.
Недостатком способа прогнозирования является ориентация только на один из показателей из целого спектра молекул рецептивности эндометрия - экспрессию фактора адгезии - эзрина. Кроме того, способ прогнозирования основан только на исследовании пациенток с трубно-перитонеальным фактором бесплодия без учета других факторов нарушения рецептивности эндометрия.
Из патента RU 2617061, опубл. 16.12.2015 г., известен способ оценки готовности женщин с хроническим эндометритом к экстракорпоральному оплодотворению. У женщин с хроническим эндометритом на 19-21 день менструального цикла, предшествующего проведению программы ЭКО, получают смыв из полости матки, в котором методом твердофазного иммуноферментного анализа определяют содержание альфа-2-макроглобулина (а2-МГ) и при содержании а2-МГ равном или более 4,5 мг/л оценивают готовность женщин к ЭКО как низкую, рекомендуют дополнительное лечение и перенос сроков ЭКО, а при содержании а2-МГ менее 4,5 мг/л оценивают готовность женщин к ЭКО как высокую и рекомендуют инициацию программы ЭКО. Осуществление изобретения обеспечивает неинвазивный способ оценки готовности к ЭКО, позволяющий повысить эффективность ЭКО за счет выбора оптимального периода начала программы.
Недостатками способа являются отсутствие гистологического исследования эндометрия для верификации точного диагноза, ориентация в прогнозировании на единственный параметр - альфа 2 микроглобулин, а также использование способа прогноза только для циклов ВРТ, но не для естественных циклов. Кроме того предложенный способ прогноза определяет только контингент женщин с хроническим эндометритом, не учитывая другие факторы нарушения рецептивности эндометрия. Тест обладает довольно низкой чувствительностью - около 80%.
Из патента RU 2617515, опубл. 22.04.2016 г., известен способ прогнозирования рецептивности эндометрия на основании оценки экспрессии гонадотропин - рилизинг гормона (GnRG) и  его рецептора (GnRGR) в "окно имплантации" в эндометрии женщин бесплодием и неудачными попытками программы ЭКО. Прогностически неблагоприятными показателями рецептивности эндометрия считают отставание секреторной трансформации эндометрия, снижение количества клеток, содержащих зрелые пиноподии в поверхностном эпителии, менее чем 20%, а также низкую экспрессию (<2 баллов) GnRG и GnRGR.
Недостатками способа являются отсутствие учета экспрессии целого ряда молекул рецептивности эндометрия, характеризующих основные физиологические этапы имплантации, отсутствие данных о методе подсчета клеток, имеющих пиноподии. Модель прогнозирования была определена только для пациенток с трубно-перитонеальным фактором бесплодия, не учитывались другие факторы бесплодия, приводящие к нарушению рецептивности эндометрия.
Наиболее близким аналогом (прототипом) заявляемого изобретения является описанный О.А. Мелкозеровой и соавт. (2018) способ оценки рецептивности эндометрия в период «имплантационного окна» RU 2651762 C1, опубл. 23.04.2018 г., заключающийся в том, что на 20-23 день менструального цикла производят пайпель-биопсию эндометрия и исследуют методом иммуногистохимии с использованием двухэтапного стрептавидин-биотин-пероксидазного метода следующие маркеры: ERб в строме, PR в строме, р53 в железах, bcl 2 в строме, CD95 в строме, Ki67 в строме, LIFR в железах, LIF в железах эндометрия, после чего рассчитывают прогноз рецептивности эндометрия.
Задачей изобретения является разработка способа оценки рецептивности эндометрия в секреторную фазу у женщин с первичным бесплодием, обусловленным гипоплазией эндометрия на основании иммуногистохимического исследования уровня экспрессии в эндометрии (Т-лимфоцитов – CD3+, р53 – маркера индукции апоптоза и PTEN – фосфотазы с двойной субстратной специфичностью), с последующим вычислением прогностического индекса (PI).
Технический результат при использовании изобретения – повышение эффективности прогнозирования репродуктивных неудач у женщин с гипоплазией эндометрия и маточной формой бесплодия.
,
Указанный технический результат достигается тем, что заявляется способ оценки рецептивности эндометрия в секреторную фазу цикла у женщин с маточной формой бесплодияобусловленной гипоплазией эндометрия, отличающийся тем, что определяют экспрессию рецепторов р53 и PTEN – в железах и строме, с последующим вычислением прогностического индекса (PI) по формуле:
PI=Х1×-0,69+0,59×Х2+0,99×Х3+0,37×Х4-69,3,
где:
Х1 – балл H-score экспрессии PTEN в железах;
Х2 – балл H-score экспрессии PTEN в строме
Х3 – р53 в строме эндометрия (% окрашенных ядер в поле зрения),
Х4  – р53 в железах эндометрия (% окрашенных ядер в поле зрения),
-69,3– Const.
При PI более 0 делают заключение о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона и возможности направления женщины в программу ВРТ.
При PI менее 0 прогнозируют низкую рецептивноть эндометрия и высокий риск репродуктивных неудач в программах ВРТ у женщин с первичным бесплодием, обусловленной гипоплазией эндометрия.
Способ осуществляют следующим образом: Иммуногистохимическое исследование биоптатов эндометрия, взятых методом пайпель-биопсии на 20-22 день 28-дневного менструального цикла (в период предполагаемого «окна имплантации»), проводилось с использованием двухэтапного стрептавидин-биотин-пероксидазного метода с демаскировкой антигена и применением стандартных наборов моноклональных и поликлональных антител фирмы «Bond RTU Primary» и «DAКO», США. На парафиновых срезах по стандартной методике с предварительной демаскировкой антигенов с использованием соответствующих стандартных антител выявляли следующие маркеры: PTEN и р53.
Проявление реакции осуществлялось системой визуализации «Dako Cytomation». Для визуализации первичных антител использовали безбиотиновую систему детекции Super Sensitive Polymer-HPR Detection System (Biogenex).
Для иммуногистохимического исследования использовали серийные парафиновые срезы. Результаты реакции рецепторов к PTEN  идентифицировались по ядерному или мембранному окрашиванию клеток для соответствующих маркеров с оценкой процента окрашенных клеток и интенсивностью окраски клеток. Для анализа результатов ИГХ реакций использовали метод гистологического счета H-score по формуле: HS=1а+2b+3с, где а - % слабо окрашенных клеток, b - % умеренно окрашенных клеток, с - % сильно окрашенных клеток, 1, 2, 3 - интенсивность окрашивания, выраженная в баллах.
Для оценки уровня экспрессии антигенов р53 в железах и строме подсчитывались индексы пролиферации и апоптоза - отношение количества окрашенных ядер клеток к общему числу ядер в процентах при подсчете не менее 400 ядер.
Статистическую обработку полученных данных проводили на персональном компьютере с использованием стандартного пакета «Microsoft Excel» и пакета прикладных программ «Statisticafor Windows» версия 6.0, StatSoftInc. (США) и SPSS-19 с использованием методов параметрической и непараметрической статистики.
Для выполнения поставленной задачи проведено когоротное сравнительное исследование 26 женщин с первичным бесплодием и гипоплазией эндометрия, в том числе,  с неудачными попытками ВРТ. Все пациентки имели рефрактерный эндометрий, толщина которого в период «имплантационного окна» - (пик секреции лютеинизирующего гонадотропина – ЛГ+7 - ЛГ+9 день цикла) не превышала 7 мм. Контрольную группу составили 24 пациентки с гипоплазией и бесплодием, у которых в результате ВРТ наступила беременность, добровольно принимавших участие в исследовании и подписавших информированное согласие.
Методом пошагового дискриминантного анализа с исключением переменных определены наиболее значимые иммуногистохимические параметры функционального состояния эндометрия, определяющие рецептивность эндометрия (таблица 1).
Таблица 1
Результаты пошагового дискриминантного анализа
Показатели
Уилкса лямбда
Частнаялямбда
F-исключения
p-уровеньзначимости
Толерантность
1-толерантность(R-квадрат)
балл H-score экспрессии PTEN в железах
0,688611
0,112124
158,3736
0,000000
0,042849
0,957151
балл H-score экспрессии PTEN в строме
0,336036
0,229767
67,0446
0,000000
0,065319
0,934681
р53 в строме эндометрия (% окрашенных ядер в поле зрения),
0,128400
0,601322
13,2601
0,001624
0,289231
0,710769
р53 в железах эндометрия (% окрашенных ядер в поле зрения),
0,133011
0,580479
14,4543
0,001118
0,407920
0,592080
Количество шагов-4
Число переменных в модели: 4
F (1,20) = 5,462790 p <  ,0299
Лямбда Уилкса: ,0772099   прибл.  F (4,20) = 59,75849 p <  ,0000
,
С помощью, выявленных показателей была разработана математическая модель оценки рецептивности эндометрия в секреторную фазу у женщин с маточной формой бесплодияобусловленной гипоплазией эндометрия, отличающийся тем, что иммуногистохимическим методом определяют экспрессию рецепторов р53 и PTEN – в железах и строме, с последующим вычислением прогностического индекса (PI) по формуле:
PI = Х1×-0,69+0,59×Х2+0,99×Х3+0,37× Х4-69,3, где
Х1 – балл H-score экспрессии PTEN в железах;
Х2 – балл H-score экспрессии PTEN в строме
Х3 – р53 в строме эндометрия (% окрашенных ядер в поле зрения),
Х4  – р53 в железах эндометрия (% окрашенных ядер в поле зрения),
-69,3– Const
При PI более 0 делают заключение о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона и возможности направления женщины в программу ВРТ.
При PI менее 0 прогнозируют низкую рецептивноть эндометрия и высокий риск репродуктивных неудач в программах ВРТ у женщин с первичным бесплодием, обусловленной гипоплазией эндометрия.
Чувствительность,  специфичность и диагностическая эффективность метода составляет 100%.
Клинические примеры
Пример 1
Пациентка Т., 41 год, диагноз первичное бесплодие 1 степени в течение 8 лет, две неудачные попытки ЭКО в анамнезе, диагноз гипоплазия эндометрия, высота эндометрия по М-эхо менее 8 мм. Жалоб пациентка не предъявляла, соматически не отягощена. Материал получен методом Пайпель биопсии на 20 день менструального цикла. При расширенном гистологическом и ИГХ исследовании балл HSCORE PTEN в железах 120; балл HSCORE PTEN в строме 190; р53 в строме эндометрия (% окрашенных ядер в поле зрения) -31; р53 в железах эндометрия (% окрашенных ядер в поле зрения) -10,
По формуле определили значение прогностического индекса:
PI = 120×-0,69+0,59×190+0,99×31+0,37×10-69,3= -5,61
PI < 0, что свидетельствует о высоком риске репродуктивных неудач в программах ВРТ у женщин с первичным бесплодием, обусловленной гипоплазией эндометрия.
В двух последующих  менструальных  циклах пациентке проводилось ВРТ в программе криопротокола, осуществлялся перенос двух размороженных эмбрионов хорошего качества. Имплантации эмбрионов не произошло.
Пример 2.
Пациентка С., 35 лет (диагноз первичное бесплодие 1 степени в течение 7 лет, попытки ЭКО не предпринимались, гипоплазия эндометрия). Жалобы на скудные, короткие менструации. Соматически вегето-сосудистая дистония 1 типа. Материал получен методом Пайпель биопсии на 20 день менструального цикла. При ручном гистологическом исследовании: фрагменты эндометрия соответствуют начальной стадии фазы секреции. При расширенном гистологическом и ИГХ исследовании балл HSCORE PTEN в железах 125; балл HSCORE PTEN в строме 170; р53 в строме эндометрия (% окрашенных ядер в поле зрения) -25; р53 в железах эндометрия (% окрашенных ядер в поле зрения)-10,
По формуле определили значение прогностического индекса:
PI = 125×Ч-0,69+0,59×170+0,99×25+0,37×10-69,3= -26,8
PI < 0, что свидетельствует о высоком риске репродуктивных неудач в программах ВРТ у женщин с первичным бесплодием, обусловленной гипоплазией эндометрия.
Лечение не проводилось, женщина была направлена на ВРТ. После гормональной стимуляции перенос эмбриона без эффекта, беременность не наступила.
Пример 3.
Пациентка А. 29 лет. Диагноз: гипоплазия эндометрия, бесплодие 1 в течение 5 лет, попытки ЭКО не предпринимались. Соматически генетическая тромбофилия: гены MTR AG, MTHFR AC. Материал получен методом Пайпель биопсии на 20 день менструального цикла При расширенном гистологическом и ИГХ исследовании балл HSCORE PTEN в железах 10; балл HSCORE PTEN в строме 130; р53 в строме эндометрия (% окрашенных ядер в поле зрения) -15; р53 в железах эндометрия (% окрашенных ядер в поле зрения)-16,
По формуле определили значение прогностического индекса:
PI = 10×-0,69+0,591×30+0,99×15+0,37×16-69,3= 21,27
PI > 0, что свидетельствует о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с первичным бесплодием, обусловленной гипоплазией эндометрия.
В процессе наблюдения успешный перенос 2-х замороженных эмбрионов, в данный момент беременность одним  плодом.
Таким образом, прогнозирование готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с маточной формой бесплодия с использованием компьютерной морфометрии, предлагаемым способом позволит уменьшить количество неэффективных протоколов лечения и циклов ВРТ.
Заявляемый способ прост в исполнении,  не требует дорогостоящего оборудования.
В отличие от прототипа:
- для вычисления прогностического индекса используется 2 иммуногистохимических показателя;
- не требует длительной и трудоемкой подготовки образцов перед исследованием и наличия громоздкого оборудования, дополнительных сред;
- используется в повседневной клинической практике без специальной подготовки врача-патоморфолога.
Источники информации
1. Боярский К.Ю., Гайдуков С.Н., Пальченко Н.А. Современный взгляд на проблему рецептивности и тонкого эндометрия в программах ВРТ. Обзор литературы. Проблемы репродукции. - 2013.- Том.4.-С. 3-7.
2. Патент РФ № 2562559, 27.05.2014 г., Способ прогнозирования рецептивности эндометрия в циклах экстракорпорального оплодотворения. Айламазян Э. К.,
Ниаури Д.А., Коган И. Ю. и др.
3. Патент RU 2580629, опубликованный 15.05.2015 г. Способ прогнозирования рецептивности эндометрия на основании оценки экспрессии и внутриклеточной локализации эзрина в эндометрии женщин с бесплодием и повторными неудачами программы эко. Перминова С.Г., Коган Е.А., Демура Т.А., Сеидова Л.А.
4. Патент РФ №  2617061, 16.12.2015, Способ оценки готовности женщин с хроническим эндометритом к экстракорпоральному оплодотворению. Третьякова Я. Н., Лихачева В. В., Зорина В. Н. и др.
5. Патент РФ № 2617515, 22.04.2016, Способ прогнозирования рецептивности эндометрия на основании оценки экспрессии GnRG и GnRGR в "окно имплантации" в эндометрии женщин бесплодием и неудачными попытками программы ЭКО. Демура Т. А., Савельева Е. М., Перминова С. Г.
6. Патент РФ № 2651762, 23.04.2018 Способ оценки рецептивности эндометрия в период имплантационного окна. Мелкозерова О.А., Башмакова Н.В., Есарева А.В., Чистякова Г.Н., Барлит О.Г., Гиниятова А.А.