БЛОК КОМПОЗИТНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ТКАНЕВОЙ КОСТНОЙ ИНЖЕНЕРИИ НА ОСНОВЕ КОСТНОГО НЕДЕМИНЕРАЛИЗОВАННОГО КОЛЛАГЕНА, СОДЕРЖАЩИЙ ФАКТОР РОСТА ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ

Область техники настоящей полезной модели
Настоящая полезная модель относится к медицине, а именно к стоматологии, травматологии, ортопедии и челюстно-лицевой хирургии.
Предшествующий уровень техники настоящей полезной модели
Из предшествующего уровня техники авторам настоящей полезной модели известен ряд аналогичных решений.
Так, наиболее близкими аналогами изобретения являются следующие:
В соответствии с патентом РФ №2227037 (МАТЕРИАЛ ДЛЯ ОСТЕОПЛАСТИКИ) изобретение относится к медицине, а именно к материалам для реконструктивной костно-восстановительной хирургии в травматологии-ортопедии. Материал состоит из обработанной, обезжиренной и лиофилизированной губчатой костной ткани с размерами пор 0,05-5 мм, на поверхность которой нанесена композиция из биосовместимого сополимера и физиологически активных веществ при следующем соотношении компонентов в композиции: биосовместимый сополимер винилпирролидона с акрилатами 50-99 мас.%, физиологически активные вещества 1-50 мас.%, при этом соотношение пористой костной ткани и физиологически активной полимерной композиции составляет: костная ткань 60-99,3 мас.%, физиологически активная полимерная композиция 0,7-40 мас.%.
В соответствии с заявкой на выдачу патента РФ №2007129845 (МЕСТНОЕ ЛЕЧЕНИЕ КОСТНЫХ ДЕФЕКТОВ С ПОМОШЬЮ BMP ИЛИ РТН, ВЫСВОБОЖДАЕМЫХ ИЗ МАТРИКСА) изобретение относится к применению композиции, содержащей биоактивный фактор, выбранный из группы, состоящей из РТН и BMP, или гибридного пептида, содержащего РТН или BMP в первом домене, и субстрат, способный образовывать ковалентные поперечные связи, во втором домене, где композиция способна к образованию матрикса в участке кости, требующем лечения, для производства лекарственного средства для местного лечения пораженных участков костей.
В соответствии с патентом РФ №2308974 (КАРКАСЫ ДЛЯ ИНЖЕНЕРИИ КОСТНОЙ ТКАНИ ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБЫ ИХ ИЗГОТОВЛЕНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ) изобретение относится к каркасам, изготовленным из композитных материалов, для инженерии костной ткани, в частности к каркасам, изготовленным из новых медицинских композитных материалов, и их применению в области биомедицинской инженерии, где композитные материалы содержат биологически активные микрочастицы, которые могли бы стимулировать костную ткань человека к регенерации. В данных каркасах использована комбинация микрочастиц кремния, кальция и фосфора в качестве биологически активного вещества, которая могла бы активно стимулировать остеобласты человека к пролиферации и дифференцировке, способствовать образованию и кальцификации новой кости. Кроме того, в данных каркасах использован органический полимер в качестве носителя, образующий трехмерную структуру и внешнюю анатомическую форму и проявляющий несколько характеристик, сочетаемых с регенерацией костей и неогенезом кровеносных сосудов.
В соответствии с патентом РФ №2335258 (СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КОСТИ АЛЬВЕОЛЯРНОГО ГРЕБНЯ ЧЕЛЮСТИ И ТКАНЕЙ ПАРОДОНТА С РЕДУЦИРОВАННЫМ РЕГЕНЕРАТОРНЫМ ПОТЕНЦИАЛОМ) изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, к способам пластики дефектов костной ткани, возникающих в результате травмы или после удаления новообразований. Изготавливают имплантат для пластики костных полостей на основе крупноячеистой коллагеновой матрицы из декальцинированной губчатой кости. При этом на нем осуществляют иммобилизацию антибактериальных препаратов, культур бластных клеток, стимуляторов остеогенеза и витаминов. На коллагеновую матрицу с иммобилизованными на ней препаратами наносят композицию, обладающую адгезивными свойствами.
Раскрытие настоящей полезной модели
Целью авторов настоящей полезной модели явилось создание нового костезамещающего материала, способного оптимизировать процессы репаративного остегенеза благодаря своим остеокондуктивным и остеоиндуктивным свойствам и возможностью стимулировать неоангиогенез и изготовленного в виде удобных для практического применения блоков. Цель достигнута путем создания блоков нового композитного материала для тканевой костной инженерии на основе костного недеминерализованного коллагена животного происхождения, насыщенного рекомбинантым фактором роста эндотелия сосудов (ФРЭС), от англ. vascular endothelial growth factor (VEGF).
Выбор ФРЭС в качестве фактора стимулирующего остеогенез основан на исследованиях, описанных в публикациях Bouletreau et al., 2002 Bouletreau PJ, Warren SM, Spector JA, Peled ZM, Gerrets RP, Greenwald JA, Longaker MT (2002) Hypoxia and VEGF up-regulate BMP-2 mRNA and protein expression in microvascular endothelial cells: implications for fracture healing. Plast Reconstr Surg 109: 2384-2397; Clarkin et al., 2008 Clarkin CE, Emery RJ, Pitsillides AA, Wheeler-Jones CP (2008) Evaluation of VEGF-mediated signaling in primary human cells reveals a paracrine action for VEGF in osteoblast-mediated crosstalk to endothelial cells. J Cell Physiol 214: 537-544; Gerber HP, Vu TH, Ryan AM, Kowalski J, Werb Z, Ferrara N (1999) VEGF couples hypertrophic cartilage remodeling, ossification and angiogenesis during endochondral bone formation. Nat Med 5: 623-628; Grellier et al., 2009 Grellier M, Ferreira-Tojais N, Bourget C, Bareille R, Guillemot F, Amedee J (2009) Role of vascular endothelial growth factor in the communication between human osteoprogenitors and endothelial cells. J Cell Biochem 106: 390-398; Mayr-Wohlfart U, Waltenberger J, Hausser H, Kessler S, Gunther KP, Dehio C, Puhl W, Brenner RE (2002) Vascular endothelial growth factor stimulates chemotactic migration of primary human osteoblasts. Bone 30: 472-477; Street J, Bao M, deGuzman L, Bunting S, Peale FV, Jr., Ferrara N, Steinmetz H, Hoeffel J, Cleland JL, Daugherty A, van Bruggen N, Redmond HP, Carano RA, Filvaroff EH (2002) Vascular endothelial growth factor stimulates bone repair by promoting angiogenesis and bone turnover. Proc Natl Acad Sci USA 99: 9656-9661; Deckers MM, van Bezooijen RL, van der Horst G, Hoogendam J, van der Bent C, Papapoulos SE, Lowik CW (2002) Bone morphogenetic proteins stimulate angiogenesis through osteoblast-derived vascular endothelial growth factor A. Endocrinology 143: 1545-1553. К механизмам, обеспечивающим регенерацию костных дефектов с участием ФРЭС относятся: улучшение локальной васкуляризации, что благоприятно влияет на реализацию физиологических функций костномозговых клеток предшественников (остеопрогениторных клеток); увеличение экспрессии факторов опосредованно стимулирующих дифференцировку остеобластов эндотелиальными клетками; прямая стимуляция миграции и дифференцировки остеобластов со стороны VEGF (Bouletreau et al., 2002; Clarkin et al., 2008; Gerber et al., 1999; Grellier et al., 2009; Mayr-Wohlfart et al., 2002; Street et al., 2002). Доказано, что ФРЭС может синергично взаимодействовать с остеогенными белками, такими как BMP 4, стимулируя костеобразование и заживление кости увеличивая мобилизацию клеток, пролонгируя их жизнеспособность и увеличивая ангиогенез [Deckers MM и др. 2002].
3
В результате работ авторами настоящей полезной модели были разработаны и созданы блоки биокомпозиционного остеопластического материала под рабочим наименованием "Неоматрикс-ФРЭС" - высоко очищенного костного матрикса с сохраненными коллагеновым и минеральным компонентами и природной архитектоникой губчатой кости. Материал содержит в 1 см не менее 1,5 мг аффинно-связанных костных сульфатированных гликозаминогликанов (сГАГ) и фактор роста эндотелия сосудов (ФРЭС). Основным достоинством биокомпозиционного материала по сравнению с известными аналогами является то, что он не только остеоиндуктивными и остеокондуктивными свойствами, но также и свойствами индуктора неоангиогенеза. Использование блоков для реконструкции кости увеличивает число кровеносных сосудов в регенерате на единицу площади соединительной ткани в 4 раза, а площадь сосудистого русла - в 8 раз.
Для удобства практического применения указанный биокомпозиционный материал находится в форме блоков, представляющих собой параллелепипеды различного размера с длинами граней от 0,2 мм до 5 см.
Применение более или менее крупных блоков зависит от размера костного дефекта. Блоки разных размеров могут применяться в необходимых сочетаниях и количестве для наилучшего заполнения ими костного дефекта. Кроме того, оперирующий врач может в тех же целях по необходимости разделять блоки и использовать их фрагменты.
В итоге разработанные и созданные блоки остеокондуктивного и остеоиндуктивного пористого биоматериала, индуцирующего неоангиогенез, могут быть применены для заполнения объема костного дефекта. Указанный материал в отличие от известных аналогов характеризуется высокой биосовместимостью и биоинтегрируемостью в костную ткань пациента и экспериментальных животных благодаря сохраненным природной архитектонике костного матрикса и его коллагеновому и минеральному компонентам, а также за счет крайне низкой антигенности самого материала. Заполнение костных дефектов блоками согласно настоящей полезной модели и/или их фрагментами улучшает регенерацию костной ткани за счет быстрого и эффективного восстановления микроциркуляции и улучшения трофики костной ткани.
Разработанные и созданные блоки остеокондуктивного и остеоиндуктивного пористого биоматериала, индуцирующего неоангиогенез, могут быть применены, в частности, для:
- реконструкции альвеолярной части нижней челюсти и альвеолярного отростка верхней челюсти ("сэндвич"-пластика, межкортикальная остеотомия, метод "скользящего костного лоскута");
- заполнения полостей при синус-лифтинге;
- заполнения пародонтальных дефектов;
- заполнения дефектов после цистэктомии, резекции корней зубов
- заполнения лунок удаленных зубов для предотвращения атрофии альвеолярного гребня.
Специалисту в данной области техники будет очевидно, что приведенный выше перечень возможных применений настоящей полезной модели отнюдь не является исчерпывающим, но может быть дополнен любыми иными применениями в области стоматологии, травматологии, ортопедии и хирургии, в соответствии с которыми проводят заполнение костного дефекта или конструируют кость de novo (например, при врожденных патологиях).
Краткое описание фигур
На фиг.1 графически представлены результаты определения биологической активности ФРЭС в супернатантах, полученых в ходе инкубирования коллагена, покрытого ФРЭС, и контрольного исходного образца в среде ЕВМ-2. Результаты эксперимента выражены в процентах от максимального значения пролиферации, вызванной культивированием клеток HUVEC в присутствии рекомбинантного ФРЭС.
На фиг.2 показана динамика изменения площади микроциркуляторного русла в разные сроки эксперимента.
Описание вариантов практического применения настоящей полезной модели
В качестве носителя использован недеминерализованный костный коллаген, насыщенный ФРЭС производства ЗАО "Протеинсинтез" (Москва, Россия). Использовали материал в виде блоков и их фрагментов различных размеров.
Культивирование клеточных линий и определение биологической активности ФРЭС в разработанном материале.
2
В работе были использованы клетки эндотелия пупочной вены человека (HUVEC). Клетки культивировали при 37°C в присутствии 5% СО в пластиковых чашках Петри (Costar) в термостате.
Культивирование проводили в базальной среде для роста эндотелиальных клеток ЕВМ-2 (Lonza). При пересеве клетки промывали раствором фосфатного буфера и десорбировали с пластика с использованием трипсина (Lonza). Затем отмывали в среде для культивирования и засевали в необходимой для дальнейшей экспериментальной работы плотности.
Биологическую активность очищенного белка VEGF-A165 определяли по его способности поддерживать пролиферацию HUVEC. Клетки HUVEC засевали в лунки 96-луночного планшета (2000 клеток/лунка) в базальной среде для роста эндотелиалных клеток ЕВМ-2 (Lonza). После прикрепления клеток (через 4 часа) добавляли белок VEGF-A165 до концентрации от 1 до 100 нг/мл. Количество клеток определяли через 96 часов.
Для учета количества жизнеспособных клеток HUVEC в зависимости от биологической активности ФРЭС использовали набор CellTiter 96 AQueous Cell Proliferation Assay (Promega, США) согласно инструкции производителя. К исследуемым образцам и контрольным лункам добавляли по 20 мкл реагента MTS (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолий) и через 3 часа определяли оптическую плотность (OD490) в лунках.
Результаты влияния костного коллагена, насыщенного ФРЭС, на культуру клеток.
Для оценки биологической активности ФРЭС после его нанесения на костный коллаген и сохранения проангиогенных свойств биоматериала, содержащего ФРЭС, проводили исследование его биологической активности на модели клеток HUVEC. Пролиферация клеток HUVEC является зависимой от содержания ФРЭС и тормозится в отсутствии этого цитокина. Для оценки сохранности биологической активности ФРЭС фрагменты биоматериалов, покрытых ФРЭС, и контрольного исходного коллагена инкубировали в среде ЕВМ-2 в течение 24 часов при 37°C. В дальнейшем образцы среды, полученной таким образом, использовали в пролиферативном тесте клеток HUVEC. Параллельно с экспериментальными пробами, полученными при инкубации покрытого ФРЭС матрикса, готовили образцы контрольных супернатантов, полученных при инкубации исходного немодифицированного коллагена в среде ЕВМ-2.
50
Полученные супернатанты добавляли в среду для культивирования и определяли пролиферативную активность клеток HUVEC в ответ на присутсвующий в супернатанте ФРЭС. За 100% ответа принимали значение оптической плотности после остановки реакции MTS в лунках планшета, содержащих 50 нг/мл контрольного рекомбинантного ФРЭС, с известной ЕD, равной 2,3 нг/мл. Результаты тестирования изучаемых образцов представлены на фиг.1.
На фиг.1 видно, что супернатанты, полученные в ходе инкубации с препаратами костного коллагена, покрытого ФРЭС, проявляли биологическую активность, свойственную образцам ФРЭС, что нашло отражение в пролиферации ФРЭС-зависимых клеток HUVEC.
Таким образом, можно говорить о наличии у насыщенного ФРЭС коллагена проангиогенной активности in vitro в рамках традиционных моделей.
Методика исследований разработанного материала, насыщенного ФРЭС, на регенерацию костной ткани у животных (заживление костного дефекта в гребне подвздошной кости кроликов).
Для проведения эксперимента использовали кроликов породы шиншилла массой 3 кг, которые были разделены на 2 группы: опытную и контрольную
Для исследования процесса репаративной регенерации костной ткани создавали костные дефекты в гребне подвздошной кости.
Под наркозом и местной анестезией проводили линейный разрез в области бедра длиной 3 см, острым путем рассекали мышцы над гребнем подвздошной кости, скелетировали наружный край и наружная поверхность гребня подвздошной кости. С помощью трепана диаметром 5 мм формировали два сквозных отверстия на расстоянии 5 мм друг от друга. Группе исследуемых животных в созданный дефект помещали блоки (фрагменты) недеминерализованного костного коллагена, насыщенного ФРЭС. Перед внесением в дефект кости материал смешивали с кровью из операционной раны, мягкие ткани над дефектом ушивали наглухо. После операции кроликам вводили 0,5% раствор диоксидина по 1 мл подкожно в область раны. Через 10 дней швы снимали и продолжали наблюдения за животными.
В опытной группе дефект заполняли разработанным материалом недеминерализованным коллагеном, насыщенным ФРЭС. В контрольной группе дефект заполняли недеминерализованным коллагеном без насыщения ФРЭС.
Животных из каждой группы выводили из эксперимента в срок через 2 недели и 1 месяц
Исследования влияния материала на основе костного недеминерализованного коллагена, насыщенного или не насыщенного ФРЭС, на процесс заживления костных дефектов у животных.
У животных опытной группы через 2 недели обнаружено практически полное отсутствие недеминерализованного коллагена с наличием множественных зон лакунарного и пазушного рассасывания имплантированных фрагментов блоков. В опытной группе животных происходит более быстрая резорбция материала макрофагами и формирование грануляционной ткани, которая, созревая, трансформируется в зрелую соединительную ткань, что видно особенно на периферии костного дефекта. Гистологическое исследование костной ткани животных контрольной группы через 2 недели после операции выявило, что недеминерализованный коллаген практически по всей площади дефекта сохраняет свою структуру. Вокруг костных фрагментов имеет место диффузный воспалительный инфильтрат, в котором доминируют макрофагальные элементы с наличием небольшого количества нейтрофильных лейкоцитов. Кроме того, есть единичные фокусы рассасывания материала макрофагами.
Гистологическое исследование костных фрагментов животных опытной группы через 1 месяц эксперимента позволило выявить, что в центре костного дефекта определяются зоны зрелой соединительной ткани с большим количеством тонкостенных кровеносных сосудов, а на периферии дефекта идет формирование зон хрящевой и костной ткани. Причем костная ткань формируется в виде зрелой кости с наличием остеонов типичного строения.
В тот же срок эксперимента у животных контрольной группы выявлено отсутствие фрагментов материала с формированием на ее месте грануляционной и соединительной ткани в обеих группах. Причем в контрольной группе соединительная ткань формируется на периферии костного дефекта и представляет собой тонковолокнистую ткань с небольшим числом кровеносных сосудов.
Оценку площади сосудистого русла мы провели только в фокусах разрастания соединительной ткани в регенерате, поскольку хрящевая и костная ткань в силу своих анатомических особенностей содержит небольшое количество сосудов. Морфометрически измеряли площадь кровеносных сосудов, число сосудов на единицу площади соединительной ткани и коэффициент отношения площади кровеносных сосудов к площади соединительной ткани.
Таблица 1.
Соотношение площади сосудистого русла в зоне соединительной ткани в регенерате через 1 месяц эксперимента.
Группа
Площадь сосудистого русла (мкм<sup>2</sup>)
Сосудисто-тканевой коэффициент
Число сосудов на единицу площади соединительной ткани
Контрольная группа
5,6±0,7
0,105±0,001
2,1±0,1
Опытная группа
43,2±3,5**
0,937±0,002**
8,4±0,9**
**р≤0,0001.
Из таблицы 1 видно, что в опытной группе животных определяется большая площадь кровеносных сосудов в зрелой соединительной ткани. Этот факт является ключевым в развитии конечных этапов регенераторного процесса - созревания грануляционной ткани с последующим формированием зрелой фиброзной ткани с наличием всех функционально-морфологических ее элементов (в частности, кровеносных сосудов), что обеспечивает формирование костной ткани через этап образования хрящевой ткани. Последовательность процессов соответствует физиологической полной регенерации (реституции), обеспечивая развитие новообразованной костной ткани в области костного дефекта.
В то же время, в группе контроля к концу первого месяца эксперимента в зоне костного дефекта формируется грубоволокнистая соединительная ткань в виде грубого рубца, содержащего небольшое количество кровеносных сосудов, что не только замедляет процесс регенерации, но и приводит к неполной репарации ткани (субституции), что снижает прочностные характеристики кости. Разница тканевых соотношений в опытной и контрольной группах проиллюстрирована таблицей 2.
Таблица 2
Тканевые соотношения в зоне регенерации через 1 месяц.
Группа
Имплантированный материал
Грануляционная ткань
Соединительная ткань
Новообразованная хрящевая ткань
Новообразованная костная ткань
Контрольная группа
6,6±1,1
31,1±4,0
52,1±7,2
0
4,5±0,3
Опытная группа
0
5,3±0,6**
34,6±9,1*
15,8±3,3**
43,11±12,0**
*р≤0,005
**р≤0,0001.
Таким образом, разработанный авторами материал на основе костного недеминерализованного коллагена, содержащего ФРЭС, способствует процессу репаративной костной регенерации в области костных дефектов. Новая костная ткань формируется по механизму энхондрального окостенения. Также можно отметить, что полноценная репаративная регенерация костного дефекта при его заполнении разработанным материалом происходит без использования барьерных мембран. Это может быть обусловлено биологическими свойствами ФРЭС, который направляет процесс регенерации в сторону костной ткани.