ПРОТИВООПУХОЛЕВОЕ СРЕДСТВО
ANTINEOPLASTIC AGENT

Изобретение относится к новым биологически активным веществам из класса алканоламмониевых солей ароксиуксусных кислот - 2-метилфеноксиацетата N-метил-бис-(2-гидроксиэтил)аммония (Бикрезан) формулы:
3
2
2
2
2
6
4
3
+
-
[СНN(СНСНОН)Н]⋅ООССНОСН-СН-2
и может быть использовано в медицине и фармакологии в качестве основы для создания лекарственных препаратов.
Несмотря на существование в клинической практике более 60-ти противоопухолевых препаратов эффективность большинства их них недостаточна и спектр онкологических заболеваний, чувствительных к химиотерапии, ограничен. Среди наиболее доступных и применяемых в настоящее время цитостатиков известны такие препараты, как цисплатин и 5-фторурацил, которые используются отдельно или в комплексной терапии рака желудка, рака толстой кишки, рака молочной железы, рака печени (гепатомы), меланомы и др. (Противоопухолевая химиотерапия. Справочник / Под ред. Н.И. Переводчиковой. М., 1996; Safit J.T., Bonavida В. // Cancer Res., 1992, V. 52, P. 630; Михайлов И.Б. / Настольная книга врача по клинической фармакологии - руководство для врачей. СПб, 2001, С. 615).
Как и большинство препаратов, используемых для лечения злокачественных заболеваний, цисплатин и 5-фторурацил обладают высокой токсичностью - при их применении, как правило, наблюдаются тошнота, рвота, выраженные нарушения функций почек, нарушения функций нервной системы, угнетение кроветворения и т.д. (Машковский М.Д. Лекарственные средства. М, 2001, С. 425-428).
Разработка новых, более активных в отношении злокачественных новообразований лекарственных средств, эффективных при опухолях с первичной или приобретенной резистентностью к известным противораковым препаратам, является актуальным направлением научных исследований в области современной фармакологии и онкологии.
Целью изобретения является создание синтетического средства, обладающего высокой противоопухолевой и антиметастатической активностью.
Для достижения цели предлагается использовать новое соединение из класса алканоламмониевых солей ароксиуксусных кислот - 2-метилфеноксиацетата N-метил-бис-(2-гидроксиэтил)аммония (Бикрезан) формулы:
3
2
2
2
2
6
4
3
+
-
[CHN(CHCHOH)H]⋅ООССНОСН-СН-2.
Наиболее близким техническим решением, которое выбрано в качестве прототипа для предлагаемого изобретения, является лекарственный препарат Трекрезан (Крезацин), 2-метилфеноксиацетат трис-(2-гидроксиэтил)аммония формулы
2
2
3
2
6
4
3
+
-
[N(CHCHOH)H]⋅ООССНОСН-СН-2.
Он разрешен к применению МЗ РФ в качестве адаптогена широкого спектра действия, близкий по действию к природным адаптогенам - женьшеню, аралии, золотому корню, элеутерококку (Государственный реестр лекарственных средств, Регистрационный номер ЛСР-008909/09; Регистр лекарственных средств: России, Информхим, Москва, 1995, 487 с).
Трекрезан также проявляет высокую эффективность как модулятор гемо- и иммунопоэза (Колесникова О.П., Кудаева О.Т., Сухенко Т.Г., Лимонов В.Л., Козлов В.А., Мирскова А.Н., Воронков М.Г. Трекрезан как модулятор гемо- и иммунопоэза // Докл. РАН, 2003, Т. 391, №3, С. 410-412).
Трекрезан используется в комплексной терапии различных заболеваний, в том числе онкологических, как иммуномодулятор для нормализации состава крови, восстановления физической активности и пищеварительных функций (Воронков М.Г., Колесникова О.П., Расулов М.М., Мирскова А.Н. Фармакологические свойства и клинические эффекты трекрезана // Хим.-фарм. журнал, 2007, Т. 4, №5, С. 13-17).
Исследованиями не установлено наличие у Трекрезана прямого ингибирующего действия на опухолевый рост.
Сущность изобретения заключается в том, что была изучена противоопухолевая активность Бикрезана in vitro на клетках опухолевых линий (меланома В16 и гепатома Г27), а также влияние соединения in vivo на линиях мышей, которым перевивали клетки опухолей меланомы В16 и гепатомы Г27, на процесс метастазирования клеток в легкие. В качестве контрольных препаратов для проверки противоопухолевой активности соединения использовались цисплатин и 5-фторурацил.
В результате проведенных исследований установлено, что Бикрезан проявляет выраженные противоопухолевые свойства (in vitro и in vivo).
В работе использовали клеточные опухолевые линии (меланомы В16, гепатомы Г27) и здоровых половозрелых животных - мыши С57В 1/6 и СВА обоего пола, 8-10-недельного возраста, массой тела 18-20 г (разброс в группах животных по исходной массе тела не превышал ±10%). Контрольные и опытные животные одного возраста были получены одновременно из одного питомника ("Рассвет", г. Томск). До и в период эксперимента контрольные и опытные животные содержались в виварии в одинаковых условиях: в стандартных пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой (не более 10 особей в одной клетке) на стандартном рационе. Все исследования проводились в одно и то же время суток (утром).
Возможность осуществления изобретения может быть проиллюстрирована следующими примерами:
Пример 1
Синтез 2-метилфеноксиацетата N-метил-бис-(2-гидроксиэтил)аммония (Бикрезан):
3
6
4
2
3
2
2
2
К спиртовому (метанол, этанол, изопропанол) раствору 2-метилфеноксиуксусной кислоты (2-СН-СНОСНСООН) 16.62 г (0.1 моль) при перемешивании прикапывали спиртовый раствор 11.92 г (0.1 моль) метилдиэтаноламина СНN(СНСНОН). Нагревали до кипения 1 час. Реакционную смесь охлаждали до 5°С. Выпавший осадок отфильтровывали, многократно промывали эфиром и высушивали в вакууме. Выход 27.07 (95%). Порошок розового цвета с т.пл. 45-47°С, хорошо растворимый в воде, спиртах, ацетоне и нерастворимый в эфире, гексане, гептане.
1
6
4
2
2
2
3
3
Спектр ЯМР Н (метанол-D4, δ, м.д.): 7.10-6.72 (м, 4Н, СН), 4.43 (с, 2Н, СНСОО), 3.87 (т, 4Н, ОСН), 3.27 (т, 4Н, NCH), 2.89 (NCH), 2.25 (с, 3Н, СН).
13
6
4
6
4
2
2
2
3
3
Спектр ЯМР С (метанол-D4, δ, м.д.): 175.20 (С=О), 155.62 (СНO), 129.77-112.07 (СН), 67.37(СНСОО), 57.59 (ОСН), 55.38 (NCH), 40.12 (NCH), 15.14 (СН).
15
3
2
Спектр ЯМР N (метанол-D4, δ, м.д., отн. CHNO): - 338.10.
-1
+
ИК-спектр, v/см: 1609 (С=О), 2486-2870 (NH), 3275 (ОН).
14
23
5
Найдено (%): С, 59.15; Н, 8.00; N, 4.90. CHNO. Вычислено (%): С, 58.93; Н, 8.12; N, 4.90.
Пример 2. Оценка противоопухолевых свойств in vitro (табл. 1)
3
3
3
3
Оценка противоопухолевых свойств Бикрезана проводилась Н тимидиновым методом на клетках меланомы В16 и гепатомы Г27. Клетки засевали в концентрации 10×10/лунку, инкубировали с соединением в течение 24 часов, за 6 часов до конца инкубации вносили 1 мкКи Н-тимидина. По окончании инкубации клетки собирали на стеклянно-волокнистые фильтры ("Flow Lab") с помощью аппарата Harvester ('Titertek'). Результаты выражали в имп./мин включенного тимидина на 10×10 клеток (средние данные по триплету). Степень подавления роста опухолевых клеток под влиянием тестируемых соединений вычисляли по формуле: N=(опыт/контроль)×100%. В таблице 1 представлены данные по ингибиции пролиферативной активности опухолевых клеток под действием тестируемых соединений относительно контрольных значений пролиферативной активности этих клеток.
Бикрезан испытывался в дозах 5, 25, 50 мкг/мл. В качестве контрольных противоопухолевых препаратов использовали 5-фторурацил в дозе 5, 25 и 50 мкг/мл.
В таблице 1 представлены данные по цитотоксическому (ингибирующему) эффекту Бикрезана in vitro на опухолевые клетки различного генеза.
Как видно из представленных в табл.1 данных, Бикрезан проявляет выраженные дозозависимые противоопухолевые свойства в системе in vitro, причем его противоопухолевый (ингибирующий рост раковых клеток) эффект значительно превышает аналогичный эффект известного препарата 5-фторурацила в сравнимых дозах.
Пример 3. Влияние Бикрезана на метастазирование клеток гепатомы Г27 in vivo. (табл. 2)
3
Мышам линии СВА внутривенно вводили клетки гепатомы Г27 в дозе 100×10/мл. Учет метастазов в легких проводили на 14 день после перевивки опухоли. Бикрезан в дозе 2, 20, 200 мг/кг вводили внутрибрюшинно ежедневно 5 дней подряд (начиная с первого дня после перевивки гепатомы). В контроле и опыте использовали по 15 мышей. В качестве контрольного противоопухолевого препарата использовали цисплатин в дозе 5 мг/кг.
Как видно из данных таблицы 2, введение Бикрезана от момента введения клеток опухоли вызывает дозозависимый антиметастатический эффект, а доза 200 мг/кг приводит к достоверному уменьшению количества метастазов в легких на 58%.
Для сравнения: торможение роста опухоли гепатомы Г27 in vivo при введении цисплатина (в дозе 5 мг/кг) составляет 23.5%.
Пример 4. Влияние Бикрезана на метастазирование клеток меланомы В16 in vivo (табл. 3)
3
Мышам линии СВА внутривенно вводили клетки меланомы В16 в дозе 100×10/мл. Бикрезан в дозе 200 мг/кг вводили внутрибрюшинно ежедневно от момента введения клеток опухоли с продолжением введения соединения 5 дней подряд (начиная с первого дня после перевивки меланомы). Учет метастазов в легких проводили на 14 день после перевивки опухоли. В качестве контрольного противоопухолевого препарата использовали цисплатин в дозе 5 мг/кг. В контроле и опыте использовали по 15 мышей.
В последующих опытах соединение в меньших дозах вводили за 5 дней до перевивки опухоли и продолжали вводить после перевивки клеток опухоли В16 в течение 5 дней (табл. 4).
Для сравнения: уменьшение количества метастазов меланомы В16 в легкие in vivo при введении цисплатина (в дозе 5 мг/кг) составляет 49.4%.
Как видно из данных таблиц 2 и 4, антиметастатический эффект нетоксичного Бикрезана in vivo на меланоме В16 (-81-93%) и на гепатоме Г27 (-58%) превышает эффект используемого в медицине лекарственного препарата цисплатина. Противоопухолевый эффект Бикрезана in vivo более выражен на меланоме, чем на гепатоме.
50
При определение острой токсичности Бикрезана на мышах установлено, что LD=2500 мг/кг. Это позволяет отнести Бикрезан к IV классу опасности, к безопасному веществу как потенциальному лекарственному средству. Патологических изменений, связанных с токсическим действием препарата, не выявлено.
Таким образом, проведенные нами исследования позволяют констатировать наличие у Бикрезана в системах in vitro и эксперименте на животных выраженной противоопухолевой и антиметастатической активности в сочетании с отсутствием токсических свойств.
ЛИТЕРАТУРА
1. Противоопухолевая химиотерапия. Справочник / Под ред. Н.И. Переводчиковой. М., 1996.
2. Safit J.T., Bonavida В. // Cancer Res., 1992, V. 52, P. 630.
3. Михайлов И.Б. / Настольная книга врача по клинической фармакологии - руководство для врачей. СПб, 2001, С. 615.
4. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М., 2001, С. 425-428.
5. Государственный реестр лекарственных средств, Регистрационный номер ЛСР-008909/09.
6. Регистр лекарственных средств: России, Информхим, Москва, 1995, 487 с.
7. Колесникова О.П., Кудаева О.Т., Сухенко Т.Г., Лимонов В.Л., Козлов В.А., Мирскова А.Н., Воронков М.Г. Трекрезан как модулятор гемо- и иммунопоэза // Докл. РАН, 2003, Т. 391, №3, С. 410-412.
8. Воронков М.Г., Колесникова О.П., Расулов М.М., Мирскова А.Н. Фармакологические свойства и клинические эффекты трекрезана // Хим.-фарм. журнал, 2007, Т. 4, №5, С. 13-17.