СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ОСТРОГО НАРУШЕНИЯ МОЗГОВОГО КРОВООБРАЩЕНИЯ ИШЕМИЧЕСКОГО И ГЕМОРРАГИЧЕСКОГО ХАРАКТЕРА
METHOD OF TREATING ACUTE ISCHEMIC AND HEMORRHAGIC CEREBROVASCULAR DISEASE

Изобретение относится к области медицины и касается нового способа лечения острых нарушений мозгового кровообращения при применении нейропротективных средств.
Острые нарушения мозгового кровообращения (ОНМК) являются актуальной медико-социальной проблемой современной медицины, что обусловлено их высокой долей в структуре заболеваемости и смертности населения, значительными показателями временных трудовых потерь и первичной инвалидности. Смертность от сосудистых заболеваний мозга в нашей стране, среди которых особо выделяют ишемические и геморрагические инсульты, в структуре общей смертности занимает второе место, ненамного уступая смертности от сердечных заболеваний. Летальность в острой стадии инсульта составляет 35%, увеличиваясь на 12-15% к концу первого года. Инвалидизация вследствие инсульта занимает первое место среди всех причин первичной инвалидности. Последствия инсульта выражаются в повреждении и часто гибели участка мозга, затронутого инсультом, который уже не может выполнять свои функции, что влечет за собой всевозможные нарушения речи, сознания, координации движений, зрения, чувствительности и параличи.
Известен целый ряд препаратов белково-пептидной природы из сырья животного происхождения, обладающие ноотропной и нейрометаболической активностью, которые используются для лечения заболеваний нервной системы. К этим препаратам относятся:
1. Церебролизин - средство для лечения геморрагического или ишемического инсультов фирмы «Ebewe» (Австрия) [1], - является продуктом обработки мозга интактных свиней;
2. Цереброкурин - лечебное средство при заболеваниях, сопровождающихся нарушением функций центральной нервной системы, фирмы ООО «НИР» (Украина) [2], - является продуктом обработки мозга эмбрионов животных;
3. Кортексин - препарат полипептидной природы, получаемый путем экстракции из коры головного мозга крупного рогатого скота и свиней, фирмы ООО «Герофарм» (Россия) [3], обладающий ноотропным, церебропротекторным, противосудорожным и антиоксидантным действием;
4. Церебролизат - препарат, повышающий устойчивость ткани головного мозга к интоксикации, гипоксии, гипогликемии, механической травме, фирмы «Микроген» НПО ФГУП (Иммунопрепарат) [4], обладающий ноотропным действием, представляющий собой гидролизат коры головного мозга крупного рогатого скота.
5. Семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro) - синтетический полипептид - аналог фрагмента АКТГ/4-10/, обладающий ноотропными свойствами и лишенный гормональной активности. [5].
В состав "Церебролизина" входят аминокислоты (~85%), низкомолекулярные пептиды (-15%), микроэлементы, сырьем для получения которых служит мозг свиней. Нейропротективное и трофическое действие препарата осуществляется за счет специфических пептидов и аминокислот, молекулярной массы не выше 10000 дальтон, из которых доминирующими и определяющими свойства препарата являются аланин, лейцин и лизин. Препарат предназначен для внутримышечного, внутривенного введения и обладает невысокой концентрацией биологически активных компонентов, поэтому вводится в организм больного в значительных дозах длительное время (под ред. Ю.Ф.Крылова. Регистр лекарственных средств России. - М.: Инфармхим., 1993, с.935). Разнородность входящих в препарат пептидов (по молекулярной массе, формуле и свойствам) не позволяет с определенностью связать положительные эффекты препарата с конкретной составляющей субстанцией. Действие церебролизина проявляется, прежде всего, преимущественным его влиянием на выраженность очагового неврологического дефекта. Вместе с тем изолированное назначение церебролизина, например, при исходнотяжелых инсультах, сопровождающихся не только очаговой, но и общемозговой симптоматикой, признаками отека мозга, часто оказывается недостаточно эффективным и требует совместного его применения с другими противоишемическими препаратами. Кроме того, выявлена сильная зависимость эффективности церебролизина от адекватности выбранной дозы. Бесконтрольное избыточное повышение дозы церебролизина часто оказывает негативное влияние на темпы и выраженность восстановительных процессов. Таким образом, основными недостатками известного препарата являются значительная продолжительность курса лечения, низкая активность и специфичность препарата в связи со слабым нейропротективным действием, обладая и крайне низким регенеративным, в том числе и репаративным потенциалом для нервной ткани.
В состав «Цереброкурина» входят водорастворимые пренатальные нейропептиды и продукты расщепления неактивных высокомолекулярных предшественников из гомогенизата мозга эмбрионов животных, который после разбавления физиологическим раствором подвергают взаимодействию с иммобилизованным протеолитическим ферментом, причем режим взаимодействия устанавливают исходя из контрольной пробы получаемого средства, и полученный раствор выдерживают в течение 30 суток при температуре не выше 10°С. С помощью данной технологии достигается более высокая (по сравнению с Церебролизином) активность получаемого средства и значительно расширяется спектр его действия, за счет более высокой массы содержащихся пептидов и низкомолекулярных белков, оставшихся после протеолиза. Однако, несмотря на длительное формирование раствора до окончания процессов агрегации и протеолиза, данная технология не позволяет получить фракцию необходимой степени очистки для применения препарата внутривенно, что значительно затрудняет его биодоступность. Водная экстракция без буферизации раствора, детергентов, ингибиторов протеолиза и солюбилизаторов на этапах получения Цереброкурина, а также неопределенные сроки гестации эмбрионального мозга животных не позволяют обеспечить необходимую степень стандартизации, что допускает значительный разброс по составу полученных эволюционно закрепленных белково-пептидных концентрационных соотношений, снижая его тканеспецифическую нейрорегенеративную активность и стабильность фармакологического действия, ограничиваясь биологическим действием по типу обратной связи за счет сигнальной функции продуктов протеолиза ткани.
В состав «Кортексина» входит комплекс водорастворимых биологически активных щелочных, кислых и нейтральных полипептидов с мол. м. от 500 до 15000 Да и изоэлектрической точкой 3,5-9,5, получаемых из измельченной замороженной ткани головного мозга скота, путем экстракции раствором уксусной кислоты, содержащей хлористый цинк, отделения осадка, обработки надосадочной жидкости ацетоном, промывки образовавшегося осадка ацетоном, высушивания с последующей очисткой, стерилизации и лиофилизации целевого продукта. Препарат предназначен для внутримышечного введения и обладает невысокой концентрацией биологически активных низкомолекулярных компонентов, поэтому вводится в организм больного в значительных дозах длительное время. Несмотря на то, что препарат участвует в регуляции соотношений тормозных и возбуждающих аминокислот, концентрации серотонина и дофамина, оказывая ГАМК-позитивное влияние, снижает токсические эффекты нейротропных веществ, улучшает процессы обучения и памяти, ускоряет восстановление функций головного мозга после стрессовых воздействий. Кортексин имеет невысокую активность и специфичность в связи со слабым нейропротективным действием, обладая и низким регенеративным, в том числе незначительным репаративным потенциалом для нервной ткани, что требует значительной продолжительности курсового лечения.
В состав «Церебролизата» также входят водорастворимые полипептиды, как результат гидролиза коры головного мозга крупного рогатого скота, обладающие слабой ферментативной активностью, с молекулярной массой не более 15000 Да. Обозначенная в патенте вариация аминокислотного состава препарата допускает значительный разброс по составу полученных пептидных концентрационных соотношений, определяя низкую тканеспецифическую активность и стабильность фармакологического действия - со слабым нейрометаболическим и невыраженным ноотропным эффектом.
Семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro) - синтетический аналог фрагмента АКТГ/4-10/, где все аминокислоты гептапептида являются L-формами. Препарат влияет на процессы, связанные с формированием памяти и обучением. Усиливает избирательное внимание при обучении и анализе информации, улучшает консолидацию памятного следа; улучшает адаптацию организма к гипоксии, церебральной ишемии, общей анестезии и др. повреждающим воздействиям. В условиях нервно-психического утомления облегчает концентрацию внимания, улучшает операторскую деятельность, способствует сохранению и ускоряет восстановление умственной работоспособности в качестве стимулятора памяти пролонгированного действия.
В настоящее время на фоне неуклонного роста заболеваний нервной системы сосудистого, токсического, инфекционного и аутоиммунного генеза не существует препаратов группы прямых репарантов, специфичных для нервной ткани.
Технической задачей заявленного изобретения является повышение эффективности способа лечения острых нарушений мозгового кровообращения с использованием подбора условий и режимов дозирования высокоэффективного лекарственного средства - белково-полипептидного комплекса при лечении острых нарушений мозгового и спинального кровообращения в зависимости от характера и тяжести состояния пациента, стадии развития заболевания для сокращения сроков курсового лечения, обеспечение положительной динамики объективных неврологических показателей больных.
Поставленная техническая задача достигается способом лечения острых нарушений мозгового кровообращения путем введения подкожно или внутримышечно, интраназально или интратекально с первых часов появления острой очаговой неврологической симптоматики фармацевтической композиции, обладающей тканеспецифическим репаративным действием на нервную ткань, содержащей белково-полипептидный комплекс и фармацевтически приемлемый разбавитель, содержащий фармокопейный буферный раствор и вспомогательные вещества, включающие высокомолекулярные вещества, стабилизаторы, консерванты и салюбилизаторы, в количестве 0,05-0,8 мг/сут в расчете на белково-полипептидный комплекс, при этом используют белково-полипептидный комплекс, полученный из эмбрионального мозга сельскохозяйственных животных сроком гестации от середины первой до середины последней трети беременности и включающий отрицательно заряженные слабокислые нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, молекулам межклеточной адгезии, определяющим его биологическую и фармакологическую активность, с молекулярной массой от 5 до 200 кДа, причем не менее 80% от общей массы белка имеют молекулярную массу в диапазоне от 10 до 120 кДа, и характеризующийся наличием пика при длине волны 274-284 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значений изоэлектрической точки рI от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле.
В зависимости от тяжести состояния пациента осуществляют подкожное, внутримышечное, внутривенное, интраназальное или интратекальное введение фармацевтической композиции с первых часов появления острой очаговой неврологической симптоматики, при этом при осуществлении заявленного способа используют следующие дозы и способы введения указанной фармацевтической композиции.
При средней степени тяжести (суммарный клинический бал по шкале комы Глазго - не ниже 12 баллов, шкале инсульта (NISS) - нe выше 7 баллов) рекомендуемая доза в расчете на количество белково-полипептидного комплекса составляет соответственно 0,1-0,2 мг по 1-2 мл 0,1% раствора путем подкожного или внутримышечного введения 1-2 раза в сутки или осуществляют интраназальное введение 0,1% раствора по 200-400 мкл в каждый носовой проход утром и днем в течение 7-10 суток с повтором курса в раннем реабилитационном периоде через 5-10 дней.
При тяжелом состоянии (на момент поступления: суммарный клинический балл по шкале Глазго - не выше 7 и не выше 12 баллов, по шкале Инсульта (NIHSS) не ниже 7 и не выше 14 баллов) рекомендуемая доза фармкомпозиции в расчете на количество белково-полипептидного комплекса в суточной дозе от 0,2 до 0,6 мг/сут по 2-3 мл 0,1%-ного раствора путем подкожного или внутримышечного введения 1-2 раза в сутки или путем внутривенной медленной инфузии 0,2-0,4 мг/сут по 2-4 мл 0,1%-ного раствора 1 раз в сутки в течение 5-10 суток с повтором курса в раннем реабилитационном периоде через 5-10 дней.
При состоянии пациента на момент поступления с крайней степенью тяжести с выраженным нарушением сознания доза препарата (фармкомпозиции, включающей указанный белково-полипептидный комплекс) составляет от 0,4 до 0,8 мг/сут в виде внутривенной медленной инфузии 0,2-0,4 мг/сут 2-4 мл 0,1% раствора 1-2 раза в сутки в течение 7-10 суток или итратекальное введение 0,2-0,4 мг/сут 2-4 мл 0,1% раствора 1 раз в 2-4 дня (при отсутствии абсолютных противопоказаний в люмбальной пункции с дальнейшим переходом на внутривенное или подкожное введение соответствующих разовых и курсовых доз согласно тяжести пациента).
Итак, при осуществлении способа лечения острых нарушений мозгового и спинального кровообращения используют новое нейропротекторное средство, стимулирующее физиологическую и репаративную регенерацию нервной ткани, которое представляет собой белково-полипептидный комплекс, полученный из эмбриональной нервной ткани копытных сельскохозяйственных животных, с молекулярной массой входящих в него нейтральных и слабокислых белков и полипептидов молекулярной массой от 5 до 200 кДа, являющихся фактором роста, дифференцировки и сигнальными молекулами в дозе 0,1-0,8 мг/сут по 1-4 мл 0,1%раствора путем подкожного, внутримышечного или внутривенного введения 1-2 раза в сутки или интраназальное введение 0,1% раствора по 0,2-0,4 мл в каждый носовой ход утром и днем в течение 7-14 суток с повтором курса через 5-14 дней. При тяжелых инсультах рекомендовано применение комплекса в суточной дозе до 0,6 мг, при состоянии пациентов крайней степени тяжести с выраженным нарушением сознания - до 0,8 мг в сутки или интратекальное введение 0,4 мг препарата 1 раз в 2-4 дня, при отсутствии абсолютных противопоказаний к люмбальной пункции. Способ оказывает благоприятное действие на выраженность и темпы восстановительных процессов, способствует ускорению регресса общемозговых и очаговых нарушений (Таблицы 3-4).
Итак, в заявленном способе используют фармкомпозицию, содержащую в качестве фармакологической субстанции (биологически-активного вещества) белково-полипептидный комплекс, полученный следующим образом:
- быстрозамороженный головной мозг эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных сроком гестации от середины первой трети, до середины последней трети беременности размораживают и поэтапно, при режимах температур от 2° до 28°С:
- гомогенизируют в буферном растворе с одновременной экстракцией в присутствии ингибиторов протеолиза и неионных детергентов при рН не менее 5,2 и не выше 8,5, в объемных соотношениях раствора и ткани не менее 1: 0,5;
- отделяют гомогенат от нерастворившихся тканевых и клеточных компонентов центрифугированием при значении g в интервале 10000-30000 в течение 90-30 мин., соответственно;
- фильтруют супернатант поэтапно, заканчивая фильтрами с величиной пор не более 0,45 мкм;
- фильтрат подвергают анионообменной хроматографии, используя в качестве подвижной фазы солевой буферный раствор, разделяя связавшиеся с сорбентом белки и полипептиды ступенчатым градиентом с помощью элюента, имеющего ионную силу в интервале от 0,08 до 0,26 моль/л и рН от 5,2 до 8,5, повышая ионную силу подвижной фазы с шагом 0,02 моль/л, начиная сбор целевых фракций с раствором, ионная сила которого не ниже 0,1;
- собранные целевые фракции обессоливают методом диализа или гельфильтрации и после добавления консервантов с бактериостатическим и фунгицидным действием в общей концентрации не более 0,06 мг/мл и солюбилизатора в общей концентрации не более 0,01 мг/мл проводят ультрафильтрацию с величиной пор не более 0,22 мкм и стерильно упаковывают.
Полученный комплекс включает отрицательно заряженные слабокислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, определяющие его биологическую и фармакологическую активность, с молекулярными массами от 5 до 200 кДа, причем не менее 80% от общей массы белка имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 до 120 кДа, характеризующийся наличием пика при длине волны 274-284 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значений рI от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле.
Чтобы не нарушать порядок описания заявленного технического решения и излишне его не загромождать, более подробные сведения, касающиеся комплекса, приведены в конце данного описания.
На основе полученного таким образом биологически активного комплекса (белково-полипептидного комплекса) получают фармкомпозицию, содержащую белково-полипептидный комплекс в терапевтически эффективных количествах и фармацевтически приемлемые добавки, включающие фармацевтически приемлемый разбавитель в виде фармакопейного буферного раствора (например, фосфатный буфер), высокомолекулярные вещества (например, кармелоза), стабилизаторы (например, маннитол), консерванты (например, нипагин), солюбилизаторы (например, полисорб-80).
Пример получения данной фармкомпозиции
Полученный раствор биологически-активного комплекса из
эмбрионального мозга свиней разбавляют 50 мМ глициново-фосфатным буферным раствором, содержащим консерванты (нипагин или бензалкония хлорид) и солюбилизаторы (маннитол, кармелозу, полисорбат 80) в фармокопейно-приемлемых концентрациях и двузамещенного фосфорнокислого натрия до рН 8,0 с расчетом конечной концентрации общего белка в полученном растворе в пределах 0,9-1,2 мг/мл.
Полученную фармкомпозицию подвергают стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,1 мкм, разливают в стерильные стеклянные флаконы и закупоривают.
Таким образом, входящий в используемой в заявленном способе фармкомпозиции указанный белково-полипептидный комплекс выполняет функцию эффективного лекарственного средства в остром, подостром и раннем реабилитационном периодах нарушения мозгового кровообращения, как ишемического, так и геморрагического характера, с рекомендациями адекватных режимов суточного и курсового дозирования в зависимости от характера патологического процесса и тяжести состояния пациентов. Биологическая и фармакологическая активность белково-полипептидного комплекса осуществляется за счет наличия эффективных, эволюционно закрепленных тканеспецефических концентрационных соотношений водорастворимых отрицательно заряженных слабокислых, нейтральных белков и полипептидов, относящихся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, обеспечивая тем самым тканеспецефическое репаративно-регенеративное действие. Однако возможность и особенности применения данного известного комплекса в качестве средства лечения острых нарушений мозгового кровообращения не описана.
Клиническая эффективность применения белково-полипептидного комплекса с обоснованием режимов дозирования в зависимости от характера, тяжести состояния пациента и стадии развития заболевания, сокращением сроков курсового лечения, положительной динамики объективных неврологических показателей больных в лечении острых нарушений мозгового кровообращения подтверждено проведенным многоцентровым рандомизированным сравнительным открытым клиническим исследованием. Наряду с безопасностью, хорошей переносимостью белково-полипептидного комплекса и отсутствием каких-либо побочных нежелательных явлений применение препарата с первых часов нарушения мозгового кровообращения вызывало снижение выраженности общемозговой и очаговой неврологической симптоматики, вплоть до полного восстановления утраченных функций. Наибольшая активность комплекса проявлялась в отношении регресса двигательных нарушений у больных в остром периоде мозгового инсульта. В этом случае к 6-10 суткам выраженность неврологического дефицита в двигательной сфере снижалась почти вдвое по сравнению с группой клинического контроля, получавшей сопоставимую комплексную дифференцированную терапию. Визуализация размеров очага с помощью инструментальных методов исследования (КТ и МРТ) показало достоверное уменьшение размеров зоны повреждения мозговой ткани и перифокального отека по сравнению с группой клинического контроля.
Всего в данное исследование было включено 120 больных с острым нарушением мозгового кровообращения, 60 из которых составили контрольную группу. Все больные с момента поступления в клинику получали комплексную дифференцированную терапию, включающую коррекцию дыхательных расстройств, нарушений центральной и церебральной гемодинамики, гемореологии, при необходимости - коррекцию нарушений гомеостаза с динамическим контролем лабораторных показателей. У всех пациентов метаболически активные препараты не применялись на протяжении всего острого периода инсульта, что позволило оценить с помощью клинических шкал (шкала Инсульта (NIHSS), Тест Информация - Память - Концентрация внимания, Опросник Речи, индекс Бартел) и динамического лабораторно-инструментального обследования (КТ и МРТ головного мозга; ультразвуковое интракраниальное дуплексное сканирование сосудов головного мозга; клинический, биохимический и реологический анализы крови) влияние исследуемого белково-полипептидного комплекса на патофизиологические и патоморфологические процессы перестройки взаимоотношений нервной и сосудистой системы на фоне комплексной дифференцированной терапии заболевания, широко применяемой в различных неврологических стационарах. В группу обследуемых больных не включались лица, страдающие заболеваниями периферической нервной системы, наследственно-дегенеративными, аутоиммунными и инфекционными заболеваниями. Из группы были исключены лица, у которых диагноз острого инсульта впоследствии не подтвердился дополнительно данными компьютерного или магнитно-резонансного томографического исследования головного мозга.
Клиническая характеристика больных с острым нарушением мозгового кровообращения, получавших базисную терапию, рандомизированных в группу сравнительного контроля
: распределение пациентов по возрасту, полу, характеру и бассейну поражения при остром нарушении мозгового кровообращения в контрольной группе (см. в табл. №1).
60 Больных с острым нарушением мозгового кровообращения (50% от всех исследованных: 32 мужчин (53%) и 28 женщин (47%) в возрасте от 36 до 80 лет) были рандомизированы в группу контроля и получали комплексную дифференцированную терапию, включающую нормоволемическую управляемую гемодилюцию, восстановление водно-солевого балланса, кислотно-щелочного равновесия, направленных на поддержание внутреннего гомеостаза пациента, обеспечение клиренса продуктов метаболизма, стабилизацию работы сердечнососудистой системы с коррекцией артериального давления.
Из 60 больных, получавших базисную терапию, у 35 было верифицировано ишемическое поражение головного мозга следующих патогенетических вариантов: у 22(37%) - лакунарный инфаркт, у 10(16%) атеротромботический и у 3(5%) - эмболический.
У 25(42%>) больных (13 мужчин и 12 женщин) было верифицировано острое нарушение мозгового кровообращения по геморрагическому типу, у 20 из которых отмечалось паренхиматозное кровоизлияние в гемисфере головного мозга (у 9 - в левой гемисфере головного мозга и у 11 - в правой), а у 5 пациентов выявлено субарахноидальное кровоизлияние. При поступлении:
- у 35(58%) больных состояние оценивалось как средней тяжести (суммарный клинический балл не превышал 18 баллов по шкале Инсульта (NIHSS) и был не ниже 12 баллов по шкале комы Глазго);
- состояние 18(30%) пациентов расценивалось как тяжелое;
- 7(12%) пациентов были включены в исследование с крайней степенью тяжести 60 больных (суммарный клинический балл превышал 18 баллов по шкале Инсульта (NIHSS) и был ниже 12 баллов по шкале комы Глазго).
Клиническая характеристика больных, рандомизированных в группу, получавших белково-полипептидный комплекс:
60 больных (50% от всех исследованных: 36 мужчин (60%) и 24 женщины (40%) в возрасте от 36 до 80 лет) на фоне комплексной дифференцированной терапии в течение 10 дней и с 21-х по 28-е сутки получали белково-полипептидный комплекс (ЗАО «Фарм-Синтез», Москва) по 1-4 мл 0,1% раствора путем подкожного, внутримышечного или внутривенного введения 1-2 раза в сутки или интраназальное введение 0,1% раствора по 0,2-0,4 мл в каждый носовой ход утром и днем в течение 7-14 суток с повтором курса через 5-14 дней. При тяжелых инсультах рекомендовано применение комплекса в суточной дозе до 0,6 мг, при состоянии пациентов крайней степени тяжести с выраженным нарушением сознания - до 0,8 мг в сутки или интратекальное введение 0,4 мг препарата 1 раз в 2-4 дня при отсутствии абсолютных противопоказаний к люмбальной пункции.
Из 60 больных, получавших исследуемый препарат, у 38 было верифицировано ишемическое поражение головного мозга следующих патогенетических вариантов: у 20(33%) - лакунарный инфаркт, у 12(20%) атеротромботический, а у 6(10%) - эмболический. Распределение больных с острым нарушением мозгового кровообращения по ишемическому типу в зависимости от сосудистого бассейна и тяжести пациента (см. в табл.№2). У 22 (37%) больных (12 мужчин и 10 женщин) было верифицировано острое нарушение мозгового кровообращения по геморрагическому типу, у 18 из которых отмечалось паренхиматозное кровоизлияние в гемисфере головного мозга (у 10 - в левой гемисфере головного мозга и у 8 - в правой), а у 4 пациентов выявлено субарахноидальное кровоизлияние.
При поступлении:
- у 34 (57%) больных состояние оценивалось как средней тяжести (суммарный клинический балл не превышал 18 баллов по шкале Инсульта (NIHSS) и был не ниже 12 баллов по шкале комы Глазго);
- состояние 17 (28%) пациентов расценивалось как тяжелое;
- 9 (15%) пациентов были включены в исследование с крайней степенью тяжести, четырем из которых (1 пациенту с обширным паренхиматозным ишемическим инсультом и трем с геморрагическим препарат вводился интратекально).
У 52 больных отмечались признаки атеросклероза сосудов головного мозга и сердца, в 49 случаях сочетающегося с гипертонической болезнью. В 2 случаях у больных в возрасте до 50 лет наблюдалась артериальная гипертензия почечного генеза (нефрит и мочекаменная болезнь) и в 2 случаях высокие цифры артериального давления были обусловлены злокачественной наследственной формой гипертонической болезни. В 5 наблюдениях определялось сочетание сахарного диабета с атеросклерозом сосудов головного мозга и гипертонической болезнью. У 12 больных в анамнезе отмечались инфаркты миокарда. Сопутствующие нарушения сердечного ритма выявлялись у 11 человек в виде мерцательной аритмии постоянной формы и у 1 - в виде пароксизмов мерцания предсердий. В 47% случаев инсульт развился остро, с максимальным проявлением клинической симптоматики в течение 1 часа заболевания. В 53% случаев отмечалось подострое развитие инсульта (в течение нескольких часов). 72% больных могли связать возникновение заболевания с предшествующим действием какого-либо неблагоприятного фактора. В 7 случаях провоцирующим фактором явилось физическое перенапряжение (в 5 из них - в сочетании с отменой или нерегулярным приемом антигипертензивных препаратов), в 3 случаях - психоэмоциональное перенапряжение; 5 больных отмечали злоупотребление алкоголем накануне развития инсульта, у 2 больных провоцирующим моментом послужило посещение сауны.
У большинства больных (78%) инсульт развился на фоне повышенного артериального давления, превышающего «рабочие» значения на 20 и более мм рт.ст. В 2 случаях заболевание дебютировало в рамках кардиоцеребрального синдрома на фоне преходящей недостаточности сердечной деятельности с падением артериального давления на 40-50 мм рт.ст. В остальных наблюдениях артериальное давление сохранялось в пределах индивидуальной нормы.
Первыми симптомами заболевания в 85% случаев явились очаговые неврологические симптомы. В 21 наблюдении (у 12 больных с левополушарным инсультом и у 9 - с правополушарным) очаговая симптоматика сопровождалась общемозговой, в виде общей вялости, заторможенности, сонливости, несистемного головокружения, нелокализованной головной боли различной интенсивности. Все пациенты (60 человек, 100%) поступили в клинику в течение первых 20 часов от момента развития заболевания, из них 18 (30%) - в первые 4-6 часов, 25 (42%) - в пределах от 6 до 12 часов, остальные 17 (28%) пациентов - от 12 до 20 часов.
Среди тяжелых больных 18 человек (30%) имели суммарный клинический балл не ниже 18 по шкале Инсульта (NIHSS) и не выше 12 по шкале Глазго, что соответствовало умеренным расстройствам сознания до уровня оглушения, наличию локальных оболочечных симптомов, свидетельствующих об имеющемся перифокальном отеке; изменениям окулоцефалических рефлексов с появлением феномена «кукольных глаз», грубому очаговому дефекту. У 8 больных (13%) суммарный клинический балл был более 24 по шкале Инсульта (NIHSS) и ниже 8 по шкале Глазго, что отражало крайнюю тяжесть состояния - с глубокими нарушениями сознания (до уровня сопора или комы), с признаками отека мозга и вторичного синдрома, с центральными расстройствами дыхания по типу ритмичного тахипноэ или Чейна-Стоса (в терминальных стадиях - с появлением группового, периодического, апнейстического дыхания и, в конечном итоге, - гаспинга), с различными изменениями окулоцефалических рефлексов, с выраженными вегетативно-трофическими изменениями, грубыми очаговыми нарушениями неврологических функций. Четырем больным крайней степени тяжести исследуемый препарат вводился интратекально (эндолюмбально) на 3 и 6 сутки от начала заболевания. У 3 пациентов (1 мужчина и 2 женщины) был верифицирован полушарный инсульт (2 пациентки с паренхиматозным кровоизлиянием в правой гемисфере головного мозга и 1 пациент с обширным ишемическим инсультом в системе левой внутренней сонной артерии). У 1 пациентки было верифицировано массивное субарахноидальное кровоизлияние.
Результаты клинического изучения белково-полипептидного комплекса у пациентов с острым нарушением мозгового кровообращения на фоне комплексной дифференцированной терапии
Для оценки эффективности (по объективным клиническим показателям) и безопасности (по показателям переносимости) применения белково-полипептидного комплекса, на фоне комплексной дифференцированной терапии у больных с острым нарушением мозгового кровообращения в рамках многоцентрового рандомизированного сравнительного открытого клинического исследования, использовались клинические шкалы: комы Глазго, Прогностического Балла Алена, шкала Инсульта (NIHSS); Тест Информация - Память - Концентрация внимания и Опросник Речи. Проводилось динамическое лабораторно-инструментальное обследование пациентов, включающее компьютерное или магнитно-резонансное томографическое исследование головного мозга, транскраниальную доплерографию и дуплексное сканирование сосудов головного мозга с эмболодетекцией, ЭхоКГ для верификации тромбообразования в полостях сердца, биохимическое и клиническое мониторирование параметров крови, с основными реологическими показателями.
Анализ полученных результатов исследования доказал, что за десятидневный курс применения белково-полипептидного комплекса, как при подкожном, внутримышечном, внутривенном, так и при интратекальном введении препарата, у всех пациентов различной степени тяжести, отличающихся как характером, так и локализацией сосудистого поражения головного мозга, серьезных нежелательных явлений отмечено не было. Такие же результаты были получены при повторном назначении комплекса в раннем восстановительном периоде - с 21-х по 28-е сутки.
Динамика суммарного клинического балла всех групп больных, получавших комплекс на фоне комплексной дифференцированной терапии, в остром периоде инсульта представлена в табл. №3 и наглядно показывают динамику регресса неврологического дефицита, который более выражен в группе больных, получавших комплекс (особенно к третьим и шестым суткам от начала заболевания) по сравнению с контрольной группой. Более детальный анализ регресса общемозговой и очаговой неврологической симптоматики, а также высших корковых функций по группам сравнения представлен в табл. №4. Динамика регресса двигательных нарушений у пациентов, получавших белково-полипептидный комплекс, к 6 и 10 суткам почти вдвое опережает показатели контрольной группы, продолжая снижение выраженности пареза к концу острого периода инсульта.
Регресс речевых нарушений в группе комплекса при использовании теста Опросник речи также значительно опережает восстановление в контрольной группе, что параллельно подтверждается при использовании Теста Информация - Память - Концентрация внимания. Полученная оценка изменения данных параметра «понимание» в вышеупомянутом тесте не выявила значимых преимуществ у пациентов, получавших комплекс, по сравнению с контрольной группой.
Таким образом, данные сравнения динамики баллов, полученные при использовании международных клинических шкал для групп сравнения, позволяют сделать выводы о достаточно высокой эффективности белково-полипептидного комплекса в остром периоде ишемического инсульта. Применение комплекса позволяет значительно ускорить регресс двигательных и речевых нарушений у всех пациентов различной степени тяжести, отличающихся как характером, так и локализацией сосудистого поражения головного мозга.
Одним из важных показателей эффективности белково-полипептидного комплекса при остром нарушении мозгового кровообращения является возможность его влияния на объем и регресс очага поражения головного мозга с уменьшением выраженности перифокального отека по данным компьютерного или магнитно-резонансного томографического исследования в динамике. Несмотря на то, что на клинические проявления мозгового инсульта большое влияние оказывает не только объем поражения, но и его локализация, при подборе однородных клинических групп и достаточной выборке пациентов можно косвенно оценить влияние препарата на эти параметры. Результаты КТ и МРТ исследования головного мозга по группам сравнения представлены в табл.5. Несмотря на то, что данные уменьшения размеров очага (почти на 30%) при мозговом инсульте повторяют экспериментальные данные, полученные на лабораторных животных при влиянии белково-полипептидного комплекса на очаговое ишемическое поражение головного мозга методом фотоиндуцированного тромбоза, они требуют подтверждения более точными инструментальными методами исследования на большой выборке клинических наблюдений.
Таким образом, данные сравнения динамики баллов, полученные при использовании международных клинических шкал для групп сравнения, позволяют сделать выводы о достаточно высокой эффективности белково-полипептидного комплекса в остром периоде ишемического инсульта. Применение комплекса позволяет значительно ускорить регресс двигательных и речевых нарушений у всех пациентов различной степени тяжести, отличающихся как характером, так и локализацией сосудистого поражения головного мозга.
В группе больных (4 чел.) крайней степени тяжести, которым исследуемый препарат вводился интратекально (эндолюмбально), к 6 суткам отмечалась незначительная положительная динамика в виде изменения расстройствам сознания до уровня глубокого сопора - комы 1, однако у всех больных оставались выраженные локальные оболочечные симптомы, свидетельствующие об имеющемся выраженном перифокальном отеке, у 2 больных отмечались изменения окулоцефалических рефлексов с появлением феномена «кукольных глаз». После повторного эндолюмбального введения белково-полипептидного комплекса к 10 суткам у 3 больных, несмотря на нарушение сознания, отмечалось невыраженное двигательное возбуждение на слабую болевую стимуляцию, отмечалось более активная защитная реакция, уменьшение выраженности оболочечных с-мов, отсутствие окулоцефалических рефлексов. К 15 суткам уровень сознания данных больных оценивался как глубокий сопор. Отмечался хороший регресс оболочечных симптомов, на выраженные болевые и звуковые стимулы пациенты реагировали движениями век и здоровыми конечностями, однако оставалась грубая очаговая неврологическая симптоматика с вегетативно-трофическими изменениями. К 21 суткам уровень сознания этих пациентов соответствовал сопору. К 28 суткам пациенты реагировали на различные стимулы открытием глаз, у 2 больных появился глотательный рефлекс, отмечались попытки выполнения простых заданий. У 1 больного, несмотря на незначительное двигательное возбуждение после каждого эндолюмбального введения препарата, сохраняющееся в течение суток, оставались выраженные оболочечные с-мы, грубый очаговый неврологический дефицит, периодически отмечались центральные расстройства дыхания по типу ритмичного тахипноэ, различные изменения окулоцефалических рефлексов с выраженными вегетативно-трофическими расстройствами. К концу исследования отмечался незначительный регресс общемозговой и оболочечной симптоматики без положительной динамики в неврологическом статусе к 28 суткам.
Анализ показателей летальности в группе белково-полипептидного комплекса свидетельствовал о том, что 67% смертных случаев наблюдалось у исходно крайне тяжелых больных (с суммарным клиническим баллом по шкале комы Глазго не более 8 (по шкале Инсульта (NIHSS) менее 24). Процент летальности в группе белково-полипептидного комплекса составил 5% (3 пациента), что достоверно ниже по сравнению с контрольной группой - 12% (7 пациентов), при сопоставимо большем количестве изначально крайне тяжелых больных в группе, получавших исследуемый препарат (см. табл. №№1 и 2).
Летальный исход наблюдался: у 1 тяжелого больного 78 лет с ишемическим инсультом в стволе мозга и у 1 больного крайней степени тяжести 73 лет с обширным геморрагическим инсультом в правой гемисфере мозга отмечалось неуклонно прогрессирующее течение заболевания с летальным исходом в острейшем периоде инсульта (на 5 и 3 сутки соответственно). В обоих случаях смерть наступила при явлениях нарастания отека мозга и развития дислокационного синдрома с нарушением жизненно важных функций. У этих больных отмечалась выраженная сопутствующая хроническая соматическая патология в стадии декомпенсации с острыми сердечнососудистыми расстройствами. В третьем случае внезапная смерть на 5 сутки наступила у пациента средней тяжести 53 лет с правополушарным геморрагическим инсультом, хорошим регрессом общемозговой и очаговой неврологической симптоматики (от изначальных 9 баллов при поступлении до 5 баллов по суммарной шкале Инсульта к третьим суткам за счет положительной динамики двигательных нарушений). Предположительно, учитывая клиническую картину, причиной смерти явилась тромбоэмболия легочной артерии. К глубокому сожалению лечащего врача и главного исследователя патоморфологическое исследование по завещанию больного и настойчивому пожеланию родственников не проводилось. Следует отметить отсутствие клинически значимых изменений в общем и биохимическом анализах крови и моче пациента, а также изменений со стороны коагулограммы и ЭКГ.
Среди умерших больных в группе контроля преобладали больные с обширным ишемическим повреждением полушария, а также больные с сопутствующей хронической соматической патологией в стадии декомпенсации или острыми сердечно-сосудистыми расстройствами. В 2 случаях причиной смерти явилась тромбоэмболия легочной артерии. В остальных наблюдениях смерть наступила при явлениях нарастания отека мозга и развития дислокационного синдрома с нарушением жизненно важных функций.
При анализе лабораторных показателей клинического, биохимического и реологического исследования крови обращает на себя внимание повышение уровня фибриногена и РФМК практически у всех пациентов. Данное повышение было более выражено у пациентов с геморрагическим инсультом и недостоверно выше в группе больных, получавших комплекс. Анализ литературных данных позволяет провести прямую корреляцию между величиной объема поражения мозга и уровнем повышения фибриногена (следовательно, и РФМК), а также с выраженностью воспалительной реакции. Некоторые авторы связывают повышение уровня фибриногена с активностью репаративных процессов, что находит свое отражение в группе белково-полипептидного комплекса.
Таким образом, результатом многоцентрового рандомизированного сравнительного открытого клинического исследования стало доказательство безопасности и клинической эффективности препарата белково-полипептидного комплекса в лечении больных с острым нарушением мозгового кровообращения. Было показано клинически значимое влияние белково-полипептидного комплекса на показатели выживаемости, динамику и сроки восстановления утраченных функций при его применении у больных в остром периоде инсульта.
Ниже представлены примеры осуществления способа, иллюстрирующие его, но не ограничивающие объем притязаний.
Пример 1.
3
3
3
3
Больной М., 68 лет, поступил с диагнозом: острое нарушение мозгового кровообращения (ОНМК) по смешанному типу в системе левой внутренней сонной артерии через 6 ч от начала заболевания. Жалоб не предъявлял в связи с расстройствами речи. В анамнезе: ИБС, мерцательная аритмия, гипертоническая болезнь III ст. Развитие ОНМК носило острый характер и проявилось внезапным расстройством речи и слабостью правых конечностей на фоне пароксизма мерцательной аритмии и повышения артериального давления. Потери сознания не было. Объективно: при поступлении общемозговой и менингеальной симптоматики нет. Отмечаются сенсомоторная афазия, ограничение ориентации больного в происходящих событиях. Центральный парез 7, 12 пар черепных нервов справа, правосторонний спастический гемипарез до 3 баллов в дистальных отделах кисти и 4 баллов в ноге, анизорефлексия d>s, гемигипестезия справа. Суммарный клинический балл по шкале комы Глазго составил - 9 баллов, шкале Инсульта (NIHSS) - 10 баллов, согласно теста Опросник речи - 6 баллов, Теста Информация - Память - Концентрация внимания - 21 балл. По данным перфузионно-взвешенной МРТ в лобно-теменной доле слева выявлен корко-подкорковой ишемический очаг с вторичным диапедезным пропитыванием объемом до 9 см и перифокальной зоной с отеком объемом до 12 см. Лечение: на фоне унифицированной базисной терапии был назначен 0,1%-ный раствор белково-полипептидного комплекса в дозе 0,1 мг подкожно 2 раза в сутки в течение 10 дней, а затем интраназально по 400 мкл (по 200 мкл в каждый носовой ход, утром) с 21 по 28 сутки. Результат: на фоне первого введения препарата у больного уменьшилась дезориентированность и к концу вторых суток заметно уменьшились расстройства слуховой речи. На третьи сутки лечения уменьшились моторные речевые расстройства - появилась "бедная", но фразовая речь, больной достаточно ориентирован в происходящем, парез кисти и ноги регрессировал до 4 баллов. К концу острого периода больной выписан из стационара на 28 сутки в связи с полным восстановлением речевых функций, полным регрессом двигательных чувствительных расстройств. В неврологическом статусе на момент выписки сохранялась лишь анизорефлексия d>s без патологических стопных знаков. Клинический контроль: к 10 суткам суммарный клинический балл по шкале комы Глазго составил - 11 баллов, шкале Инсульта (NIHSS) - 7 баллов, согласно теста Опросник речи - 10 баллов, Теста Информация - Память - Концентрация внимания - 26 баллов; к 21 суткам суммарный клинический балл по шкале комы Глазго составил - 12 баллов, шкале Инсульта (NIHSS) - 6 баллов, согласно теста Опросник речи - 15 баллов, Теста Информация - Память - Концентрация внимания - 29 баллов; к 28 суткам суммарный клинический балл по шкале комы Глазго составил - 15 баллов, шкале Инсульта (NIHSS) - 4 балла, согласно теста Опросник речи - 18 баллов, Теста Информация - Память - Концентрация внимания - 32 балла. По данным повторной МРТ на 21 сутки отмечалось уменьшение объема смешанного очага инсульта до 8 см с перифокальной зоной отека объемом до 9 см. К 28 суткам отмечалось уменьшение объема смешанного очага инсульта до 5,5 см с отсутствием перифокального отека.
Пример 2.
3
3
3
Больная К., 38 лет. Поступила с диагнозом: ОНМК по геморрагическому типу в правой гемисфере головного мозга. Госпитализирована через 4 ч от начала заболевания. Жалоб не предъявляла в связи с тяжестью состояния. В анамнезе выявленная аневризма правой средней мозговой артерии. Начало заболевания в момент физической нагрузки и характеризовалось постепенным нарастанием слабости левых конечностей, изменением речи, угнетением сознания. Объективно: у больной при поступлении нарушение сознания до сопора, умеренный менингеальный синдром, центральный парез 7, 12 пар черепных нервов справа, левосторонняя гемиплегия, анизорефлексия d>s, гемианестезия справа. Данными компьюторно-томографическими исследованиями (КТ-исследования) выявлен обширный геморрагический очаг в правом полушарии головного мозга объемом до 24 см с деформацией желудочковой системы. Суммарный клинический балл по шкале комы Глазго составил 7 баллов, шкале Инсульта (NIHSS) - 18 баллов, согласно теста Опросник речи - 4 баллов, Теста Информация - Память - Концентрация внимания - 5 баллов. Лечение: на фоне унифицированной базисной терапии был назначен 0,1%-ный раствор белково-полипептидного комплекса в дозе 0,2 мг интратекально в первые и на третьи сутки, с четвертых суток по 0,2 мг в виде внутривенных инфузий на физиологическом растворе 1 раз в сутки в течение 7 дней, а затем подкожно по 0,4 мг 1 раз с 21 по 28 сутки. Результат: на фоне первого введения препарата у больной отмечалось ускорение целенаправленной реакции на внешние раздражители в здоровых конечностях, после второго введения ускорилось "пробуждение" в ответ на звук и ноцицептивные раздражители. К концу третьих суток у больной полностью регрессировали расстройства сознания, появились признаки ориентации в месте действия и собственной личности, а также возможность элементарного контакта - понимание больным простых вопросов и заданий, собственная речевая продукция на уровне "да" и "нет", стали возможными минимальные движения в нижней конечности. К пятым суткам заболевания значительно регрессировал менингеальный синдром, расширился диапазон воспринимаемой речи, парез нижней конечности уменьшился до 2,5 баллов. К концу острого периода инсульта (21 сут) у больного отмечалось значительное улучшение артикуляции, стало возможным сгибание левой ноги в колене, однако движения в руке не восстановились, уменьшились чувствительные расстройства. Важно отметить, что у больной, несмотря на обширный очаг поражения головного мозга и грубый двигательный дефект, быстро регрессировали общемозговые и менингеальные симптомы, течение заболевания носило регредиентный характер, не развились трофические расстройства. Клинический контроль: к 10 суткам суммарный клинический балл по шкале комы Глазго составил 8 баллов, шкале Инсульта (NIHSS) - 16 баллов, согласно тесту Опросник речи - 9 баллов, Теста Информация - Память - Концентрация внимания - 11 баллов; к 21 суткам суммарный клинический балл по шкале комы Глазго составил 10 баллов, шкале Инсульта (NIHSS) - 14 баллов, согласно теста Опросник речи - 12 баллов, Теста Информация - Память -Концентрация внимания - 15 баллов; к 28 суткам суммарный клинический балл по шкале комы Глазго составил - 12 баллов, шкале Инсульта (NIHSS) - 12 баллов, согласно тесту Опросник речи - 15 баллов, Теста Информация - Память - Концентрация внимания - 21 балл. По данным повторной КТ на 21 сутки отмечалось уменьшение объема смешанного очага инсульта до 14 см с перифокальной зоной отека объемом до 8 см.
Пример 3.
3
3
3
Больная Л., 69 лет. Поступила с диагнозом: ОНМК по ишемическому типу в системе правой внутренней сонной артерии. Госпитализирована через 3 ч от начала заболевания с жалобами на слабость левых конечностей. В анамнезе гипертоническая болезнь II ст. Заболевание началось остро, больная на фоне стрессовой ситуации упала (без потери сознания) из-за внезапной слабости левых конечностей. Объективно: сознание ясное, однако аспонтанна, недооценивает собственный дефект, некритично относится к заболеванию, умеренный менингеальный синдром, парез взора влево, центральный парез 7, 12 пар черепных нервов слева, корковая дизартрия, поперхивание при глотании в связи с угнетением глоточного рефлекса слева, левосторонний глубокий спастический гемипарез до 2-х баллов в дистальных отделах конечностей и 3-х баллов в проксимальных отделах. Анизорефлексия s>d. Нарушение сложных видов чувствительности слева, расстройства мочеиспускания центрального характера. Данными компьюторно-томографическими исследованиями (КТ-исследования) выявлен обширный геморрагический очаг в правом полушарии головного мозга объемом до 18 см и выраженным перифокальным отеком до 12 см с деформацией желудочковой системы. Суммарный клинический балл по шкале комы Глазго составил 8 баллов, шкале Инсульта (NIHSS) - 16 баллов, согласно тесту Опросник речи - 5 баллов, Теста Информация - Память - Концентрация внимания - 7 баллов. Лечение: на фоне унифицированной базисной терапии был назначен 0,1%-ный раствор белково-полипептидного комплекса в дозе 0,2 мг подкожно 2 раза в сутки в течение 10 дней, а затем интраназально по 400 мкл (по 200 мкл в каждый носовой ход, утром и днем) с 21 по 28 сутки. Результат: на первое введение препарата больная стала активнее включаться в разговор, появилась критика к своему состоянию; к концу первых - на вторые сутки у больной отмечается объективная оценка имеющегося дефекта, уменьшились оболочечные симптомы и нарос объем движений в кисти и стопе до 3 баллов. К пятым суткам от начала заболевания полностью регрессировал менингеальный синдром, восстановился объем движений глазных яблок, нормализовалось глотание. На 15 сутки гемипарез уменьшился до 4 баллов, исчезли расстройства мочеиспускания. К 21 суткам у больной регрессировали чувствительные расстройства, отмечается внятная речь, остается лишь минимальная мышечная слабость левых конечностей, нормализовался мышечный тонус в ноге, сохраняется анизорефлексия s>d, имеются патологические стопные знаки сгибательного и разгибательного типа. Расстройства трофики на протяжении острого периода инсульта не было. Клинический контроль: к 10 суткам суммарный клинический балл по шкале комы Глазго составил - 10 баллов, шкале Инсульта (NIHSS) - 15 баллов, согласно тесту Опросник речи - 14 баллов, Теста Информация - Память - Концентрация внимания - 17 баллов; к 21 суткам суммарный клинический балл по шкале комы Глазго составил 12 баллов, шкале Инсульта (NIHSS) - 14 баллов, согласно тесту Опросник речи - 17 баллов, Теста Информация - Память - Концентрация внимания - 18 баллов; к 28 суткам суммарный клинический балл по шкале комы Глазго составил 12 баллов, шкале Инсульта (NIHSS) - 10 баллов, согласно тесту Опросник речи - 19 баллов, Теста Информация - Память -Концентрация внимания - 25 баллов. По данным повторной КТ на 21 сутки отмечалось уменьшение объема смешанного очага инсульта до 12 см с отсутствием перифокальной зоны и компрессии желудочковой системы.
Пример 4.
3
3
3
3
3
Больной М., 56 лет, поступил с диагнозом: острое нарушение спинального кровообращения (ОНСК) по ишемическому типу в системе артерии Депрож-Готтерона через 6 ч от начала заболевания. Жалобы на ноющую боль в области поясницы, слабость в нижних конечностях со снижением чувствительности и объема движения. В анамнезе: гипертоническая болезнь II ст., остеохондроз поясничного отдела позвоночника, компрессионный перелом 2 поясничного позвонка (авто), грыжи межпозвоночных дисков L2-L3, L4-L5-S1. Развитие ОНМК носило острый характер, после падения (гололед) проявилось внезапное расстройство чувствительности ниже пояса и слабость в ногах на фоне повышения артериального давления. Потери сознания не было. Объективно: при поступлении общемозговой и менингеальной симптоматики нет. Черепные нервы без особеннностей, нижняя вялая параплегия с объемом до 4 баллов в проксимальных отделах и до 2,5 в дистальных, двусторонняя гипорефлексия, парагипестезия поверхностной чувствительности с уровня L2 D≥S и глубокой чувствительности с уровня L5. Суммарный клинический балл по шкале комы Глазго составил - 12 баллов, шкале Инсульта (NIHSS) - 10 баллов. По данным перфузионно-взвешенной МРТ в сегментах спинного мозга D12-L1 выявляется зона пониженной плотности по типу ишемического очага объемом 0,8-0,9 см с невыраженной перифокальным отеком объемом до 0,5 см. Лечение: на фоне унифицированной базисной терапии был назначен 0,1%-ный раствор белково-полипептидного комплекса в дозе 0,2 мг подкожно 2 раза в сутки в течение 10 дней с повтором курса через 5 дней. Результат: к концу вторых суток введения препарата у больного уменьшился болевой синдром. На пятые сутки лечения отмечалось повышение мышечного тонуса в проксимальных отделах с нарастанием объема движений до 4 баллов. К концу острого периода больной выписан из стационара с полным восстановлением двигательных нарушений в проксимальных отделах нижних конечностей. Объем движений в дистальных отделах нарос до 4 баллов. Глубокие чувствительные расстройства регрессировали полностью. В неврологическом статусе на момент выписки сохранялась лишь снижение коленных и стопных рефлексов с легкой анизорефлексией d>s без патологических стопных знаков. Клинический контроль: к 10 суткам суммарный клинический балл по шкале комы Глазго составил 12 баллов, шкале Инсульта (NIHSS) - 7 баллов; к 21 суткам суммарный клинический балл по шкале комы Глазго составил 13 баллов, шкале Инсульта (NIHSS) - 6 баллов; к 28 суткам суммарный клинический балл по шкале комы Глазго составил 15 баллов, шкале Инсульта (NIHSS) - 4 балла. По данным повторной МРТ на 21 сутки отмечалось уменьшение объема смешанного очага инсульта до 8 см с перифокальной зоной отека объемом до 9 см. К 28 суткам отмечалось уменьшение объема смешанного очага инсульта до 0,5 см с отсутствием перифокального отека.
Пример 5.
Изучили зависимость эффективности лечения групп больных различной тяжести от используемой дозы белково-полипептидного комплекса. Использованы следующие клинические шкалы: комы Глазго, шкала Инсульта (NIHSS), тест Опросник речи, Теста Информация - Память - Концентрация внимания, по которым показан прирост суммарного клинического балла к 6, 10, 21 и 28 суткам инсульта соответственно. Отмечены группы больных, получавших 0,1; 0,2; 0,4; 0,8 мг белково-полипептидного комплекса в сутки подкожно, внутривенно, интратекально и внутривенно. Полученные данные свидетельствуют о большей эффективности дозы 0,2 мг в сутки у больных с ишемическим инсультом средней тяжести с подкожным введением препарата в острый период инсульта с повторным интраназальным курсом в раннем реабилитационном периоде (с 21 по 28 сутки) в дозе 400 мкл 0,1% раствора (по 200 мкл в каждый носовой ход, утром); дозы 0,4 мг у тяжелых больных с внутривенным введением комплекса, с повторным интраназальным курсом в раннем реабилитационном периоде, в дозе 400 мкл 0,1% раствора (по 200 мкл в каждый носовой ход, утром и днем); у больных крайней степени тяжести ишемического инсульта - интратекальное введение комплекса в первые и на третьи сутки в дозе 0,4 мг с последующим подкожным введением 0,8 мг препарата до 10-х суток включительно, с повторным курсом в раннем реабилитационном периоде, в дозе 0,2 мг подкожно 1 раз в сутки. Таким образом, сопоставление эффективности различных доз и способов введения белково-полипептидного комплекса выявило в группе больных средней тяжести некоторое преобладание эффективности суточной дозы 0,2 мг (в среднем 2 мкг/кг) по сравнению с более высокими дозами. Вместе с тем в группе тяжелых больных выраженность клинической динамики несколько преобладала при лечении суточными дозами 0,8 мг (в среднем 10 мкг/кг).
В представленных табл.№№1-5 наглядно показана эффективность заявленного в качестве изобретения способа лечения острых нарушений мозгового кровообращения.
Таблица №3
Динамика суммарного клинического балла по шкале Инсульта (NIHSS) в группах исследованных больных
Время исследования
1 сутки
3 сутки
6 сутки
10 сутки
15 сутки
21 сутки
28 сутки
М
±m
М
±m
М
±m
М
±m
М
±m
М
±m
М
±m
Белково-полипептидного комплекса
<b>11</b>
3
<b>8,2</b>
2,5
<b>6</b>
2,3
<b>4,4</b>
2,2
<b>4,4</b>
2,1
<b>3,6</b>
2,1
<b>3,5</b>
2,4
Контрольная группа
<b>10,7</b>
3,4
<b>10,2</b>
3,2
<b>9</b>
2,7
<b>7,8</b>
2,9
<b>8,1</b>
3,3
<b>7,2</b>
2,8
<b>6,4</b>
2,7
Таблица №4
Динамика регресса общемозговой и очаговой неврологической симптоматики, восстановления высших корковых функций по группам сравнения
Время исследования
1 сутки
3 сутки
6 сутки
10 сутки
15 сутки
21 сутки
28 сутки
М
±m
М
±m
М
±m
М
±m
М
±m
М
±m
М
±m
Динамика двигательных нарушений по шкале Инсульта (NIHSS)
Белково-полипептидный комплекс
<b>6,6</b>
3
<b>4,8</b>
1,9
<b>3,6</b>
1,6
<b>2,3</b>
1,1
<b>2,3</b>
1,2
<b>1,9</b>
0,9
<b>1,6</b>
0,9
Контрольная группа
<b>6,3</b>
3,2
<b>5,9</b>
2,8
<b>5,1</b>
2,8
<b>4,7</b>
2,7
<b>4,8</b>
3
<b>3,7</b>
2,8
<b>3,3</b>
2,5
Динамика регресса речевых нарушений по Опроснику Речи
Белково-полипептидный комплекс
<b>11</b>
5,8
<b>13,8</b>
4,3
<b>15,4</b>
2,7
<b>18</b>
2,3
<b>17,1</b>
2,1
<b>17</b>
2,4
<b>18,1</b>
1,9
Контрольная группа
<b>11,2</b>
5,5
<b>11,5</b>
6,4
<b>12,1</b>
4,9
<b>14,3</b>
4,2
<b>14,4</b>
5,1
<b>14,6</b>
4,7
<b>15,5</b>
3,4
Динамика регресса речевых нарушений по Тест Информация - Память - Концентрация - Внимание
Белково-полипептидный комплекс
<b>8Д</b>
2.5
<b>10,1</b>
3,8
<b>11,3</b>
1,8
<b>13,4</b>
1,2
<b>13</b>
1,3
<b>13</b>
2,1
<b>13,6</b>
1,4
Контрольная группа
<b>8,5</b>
3,3
<b>8,9</b>
3,5
<b>9,2</b>
2,8
<b>9,3</b>
2,7
<b>9,4</b>
2,9
<b>9,6</b>
2,8
<b>10,3</b>
2,2
Динамика регресса параметра «понимание» Тесту Информация - Память - Концентрация внимания
Белково-полипептидный комплекс
<b>4</b>
1,4
<b>3,8</b>
1,9
<b>4,1</b>
1,8
<b>4,6</b>
1,2
<b>4,6</b>
1,3
<b>4</b>
1,5
<b>4,5</b>
1,2
Контрольная группа
<b>4,1</b>
2
<b>4</b>
2,2
<b>4,1</b>
2,3
<b>4,4</b>
2,2
<b>4,3</b>
1,9
<b>3,9</b>
1,8
<b>4,4</b>
1,9
Таблица №5
Динамика суммарного размера очагового поражения головного мозга в группах сравнения по данным компьютерного и магнитно-резонансного методов исследования
Группы сравнения
Размер очага поражения (см)
При поступлении (1 сутки)
21 сутки
М
<b>±m</b>
<b>М</b>
<b>±m</b>
Белково-полипептидный комплекс
<b>1,82</b>
1.2
<b>1,2</b>
1,1
Контрольная группа
<b>1,76</b>
1,18
<b>1,51</b>
1,2
В соответствии с обещанием в начале данного описания далее заявитель приводит более подробные сведения, касающиеся белково-полипептидного комплекса, содержащегося в качестве фармакологической субстанции (биологически-активного вещества) в фармкомпозиции, используемой в заявленном изобретении.
Указанная фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза, выполнена в виде раствора для парентерального, интраназального и субъконьюктивального введения и содержит в качестве активного инградиента биологически активный белково-полипептидный комплекс в концентрации 0,01-2,0 мг/мл, обладающий тканеспецифическим репаративным действием на нервную ткань, получаемый из эмбрионального мозга сельскохозяйственных копытных животных, сроком гестации от середины первой до середины последней трети беременности, включающий отрицательно заряженные слабокислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, определяющим его биологическую и фармакологическую активность, с молекулярными массами от 5 до 200 кДа, причем не менее 80% от общей массы белка имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 до 120 кДа, характеризующийся наличием пика при длине волны 274-284 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значений рI от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле и фармацевтически приемлемый разбавитель.
При этом фармацевтическая композиция в качестве разбавителя, предпочтительно, может содержать фармакопейный буферный раствор и вспомогательные вещества, включающие высокомолекулярные соединения, стабилизаторы, консерванты и солюбилизаторы.
Итак, описываемая фармкомпозиция содержит в качестве активного инградиента биологически активный белково-полипептидный комплекс, состоящий из отрицательно заряженных слабокислых, нейтральных белков и полипептидов с молекулярной массой от 5 до 200 кДа, полученных из эмбриональной ткани мозга копытных сельскохозяйственных животных, сроком гестации от середины первой трети до середины последней трети беременности, включающий органоспецифические факторы роста и дифференцировки нервной ткани, а также сигнальные молекулы в терапевтически эффективных соотношениях и концентрациях, фармацевтически приемлемый разбавитель, состоящий из буферного раствора, например фосфатный буфер, и вспомогательных веществ - высокомолекулярные соединения, например кармелоза; стабилизаторы, например маннитол, консерванты, например нипагин, и солюбилизаторы, например полисорбат-80.
Эта фармакологическая композиция, представляющая собой белково-полипептидный комплекс и фармацевтически приемлемый разбавитель, отличается от известных ранее субстанций и композиций, выделенных из головного мозга животных, по источнику сырья, взятого на определенных сроках гестации, молекулярным массам входящих в него белково-полипептидных фракций (до 200 кДа), их качественному составу, по эволюционно закрепленным в онтогенезе концентрационным соотношениям белков роста, факторов дифференцировки и сигнальных молекул, по способу применения (парентерально, интратекально, интраназально, субъконбюктивально), по безопасности применения (отсутствие токсических, мутагенных, канцерогенных и аллергизирующих свойств), по биологической и фармакологической активности и ее специфичности (ткане- и органоспецифичная, репаративно-регенеративная).
Ниже приведены примеры, иллюстрирующие это техническое решение.
Пример 1'. Способ получения биологически активного комплекса
2
Получение белковой фракции из эмбрионального мозга свиней. 250 г быстрозамороженного головного мозга эмбрионов свиней сроком гестации 12 недель размораживают и гомогенизируют в 1200 мл 0,05 М трис-глициново-фосфатного буфера рН 7,0, содержащего 1 мМ ЭДТА и 0,1% мальтозы, в течение 7 минут при 8°С. Гомогенат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при 18000 g и фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм при 8°С. Фильтрат наносят на уравновешенную 4 объемами 0,05 М ТРИС-глициново-фосфатного буфера рН 7,0, содержащего 0,1 мМ ЭДТА и 0,1 мМ NaCl, хроматографическую колонку объемом 200 мл с анионообменным носителем Toyopearl DEAE-650M. Разделение связавшихся с носителем белков производят ступенчатым градиентом, повышая концентрацию соли с шагом 10%, собирая целевые фракции. Хроматографический процесс производят при температуре 8°С. Целевую фракцию поэтапно подвергают ультрафильтрации на установке при противодавлении не более 8,0 кгс/см через материалы с задерживающей способностью 5 кДа и 200 кДа, обессоливают, разводят 0,05 М раствором глицин-NaOH рН 7,4 до концентрации белка 1,0 мг/мл. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм. Для характеристики полученной белковой фракции использовали методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле и аминокислотного анализа. Ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 250 до 350 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 280±5 нм. Молекулярную массу белков, входящих в препарат, определяют следующими методами: - гель-хроматографии на Superdex 75 («GE Healthcare») и методом денатурирующего «SDS-Page» электрофореза в 12%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков. Для калибровки колонки используют белковые стандарты с диапазоном молекулярных масс от 13 кДа до 200 кДа. Перечисленными выше методами установлено, что в состав препарата входят отрицательно заряженные слабокислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, с молекулярными массами от 5 до 200 кДа, причем 82% от общей массы белка имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 до 120 кДа, характеризующийся наличием пика при длине волны 274 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в значении рI 4,2 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле и фармацевтически приемлемый разбавитель.
Аминокислотный анализ (%): Asp - 10,82+2,8; Thr - 5,4+1,6; Ser - 5,2+1,8; Glu - 16,2+3,4; Pro - 7,045+2,5; Gly - 5,2+2,4; Ala - 5,4+1,8; Val - 7,08+2,9; Met - 2,65+1,4; He - 4,45+1,8; Leu -9,4+2,6; Тyr - 4,02+1,2; Phe - 4,8+1,9; Orn - 0,48+0,2; Lys - 8,48+2,4; His - 2,8+0,9; Arg - 6,52+2,2.
Пример 2'. Способ получения биологически активного комплекса
2
Получение белковой фракции из эмбрионального мозга поросят. 200 г быстрозамороженного головного мозга эмбрионов поросят сроком гестации от 12 до 13 недель размораживают и гомогенизируют в 800 мл 50 мМ Трис-малеатного буферного раствора рН 5,8, содержащего 1 мМ (ЭДТА) и 0,1% маннит, в течение 5 минут при 25°С. Гомогенат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при 30000 g в течение 30 минут и фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм при 25°С. Фильтрат наносят на уравновешенную 4 объемами малеатного буферного раствора рН 5,8, содержащего 0,1 мМ ЭДТА, хроматографическую колонку объемом 250 мл с анионообменным носителем DEAE-Сефароза. Разделение связавшихся с носителем белков производят ступенчатым градиентом малеатного буферного раствора рН 5,8, содержащего 0,04 М NaCl, повышая концентрацию соли с шагом 0,02 М, начиная сбор целевых фракции с концентрации соли 0,06 М. Хроматографический процесс производят при температуре 2-4°С. Целевую фракцию поэтапно подвергают ультрафильтрации на установке при противодавлении не более 8,0 кгс/см через материалы с задерживающей способностью 5 кДа и 200 кДа, обессоливают, разводят 50 мМ раствором аспартата-NaOH рН 7,4 до концентрации белка 1,0 мг/мл, добавляя моноолеат полиоксиэтиленсорбита (Твин-80) до общей концентрации 0,01 мг/мл. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм. Для характеристики полученной белково-полипептидной фракции использовали методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле и аминокислотного анализа. Ультрафиолетовый спектр раствора снимают в области длин волн от 250 до 350 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 280±5 нм. Молекулярную массу белков и полипептидов, входящих в комплекс, определяют следующими методами: - гель-хроматографии на Superdex 75 («GE Healthcare») и методом денатурирующего «SDS-Page» электрофореза в 12%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков. Для калибровки колонки используют белковые стандарты с диапазоном молекулярных масс от 13 кДа до 250 кДа. Перечисленными выше методами установлено, что в состав препарата входят отрицательно заряженные слабокислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, с молекулярными массами от 5 до 200 кДа, причем 82% от общей массы белка имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 до 120 кДа, характеризующийся наличием пика при длине волны 284 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в значении рI 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле и фармацевтически приемлемый разбавитель.
Аминокислотный анализ полученного комплекса (%): Asp - 10,82+1,3; Thr - 5,4+0,9; Ser - 5,2+1,1; Glu -16,2+1,9; Pro - 7,045+1,7; Gly - 5,2+0,8; Ala - 5,4+1,1; Val - 7,08+2,3; Met - 2,65+0,6; He - 4,45+0,8; Leu - 9,4+2,5; Тyr - 4,02+0,6; Phe - 4,8+1,1; Orn - 0,48+0,1; Lys - 8,48+2,3; His - 2,8+0,7; Arg - 6,52+2,1.
Пример 3'. Способ получения фармкомпозиции
Полученный по примеру 1' раствор биологически-активного комплекса из эмбрионального мозга свиней разбавляют 50 мМ глициново-фосфатным буферным раствором, с общим содержанием 0,5% маннитола, 0,1% кармелозы, 0,0005% полисорбата 80 и двузамещенного фосфорнокислого натрия до рН 8,0, с расчетом конечной концентрации общего белка в полученном растворе в пределах 0,9 -1,2 мг/мл.
Полученную фармкомпозицию подвергают стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,1 мкм, разливают в стерильные стеклянные флаконы и закупоривают.
Свойства полученной фармкомпозиции были изучены с помощью общепринятых методик по экспериментальному (доклиническому) изучению фармакологических веществ [5].
Пример 4'. Способ получения фармкомпозиции
Полученный по примеру 2' раствор биологически-активного комплекса из эмбрионального мозга свиней разбавляют 50 мМ малеатным буферным раствором рН 5,8, с общим содержанием 0,3% молочной кислоты, 0,5% маннита, 0,1% кармелозы, до 0,0005% полисорбата 80 с расчетом конечной концентрации общего белка в полученном растворе в пределах 0,9-1,2 мг/мл.
Полученную фармкомпозицию подвергают стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,1 мкм, разливают в стерильные стеклянные флаконы и закупоривают.
Пример 5'. Исследование токсичности
Проведены исследования токсичности в остром и субхроническом эксперименте оригинальной фармкомпозиции. Лекарственная форма: стерильный интраназальный дозированный спрей в стеклянном или полимерном флаконе емкостью 10 и 30 мл (0,1 мг/мл); раствор для инъекций: 5 ампул по 1 мл (0,1 мг/мл), 5 ампул по 2 мл (0,1 мг/мл), 1 ампула по 2 мл (0,2 мг/мл). Максимальная рекомендуемая суточная доза 0,4 мг при эндолюмбальном введении и 0,1 мг при внутривенном введении.
Условия проведения эксперимента и методы исследований
Целью исследования явилось определение переносимых, токсических и летальных доз оригинальной фармкомпозиции. Исследование проводили на мышах обоего пола линии BALB/C массой 18-20 г при внутрижелудочном и внутрибрюшинном способах введения. Срок наблюдения составил 14 дней. Животные получены из питомника, паспортизированы. Животных содержали в стандартных условиях, в пластмассовых клетках по 10 особей, количество в группе - 10. Для кормления использовали комбинированный корм, свежие овощи, творог. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха 18-20°C. Максимально возможная для введения мышам доза готовой лекарственной формы 0,2 мл и составила 10 мг/кг, что превысило суточную терапевтическую дозу в 600 раз. Из эксперимента животных выводили эфирным наркозом, подвергали вскрытию и анализу состояния внутренних органов.
Результаты исследования острой токсичности
Мыши. Масса животных составила от 18 до 20 г. Вводимая доза 0,2 мл, что составило 10 мг/кг. Количество животных в группе 10 голов. Всего две группы: внутрижелудочное и внутрибрюшинное введение. Срок наблюдения 14 суток.
Внешний вид. К концу эксперимента все животные выглядели здоровыми. Шерстяной покров густой, белого цвета. По внешнему виду животные между группами не отличались.
Поведение. Не отличалось между группами и от нормы.
Смертность. Во всех трех группах летальных исходов зафиксировано не было.
Масса животных. В течение всего срока наблюдения произведено шесть контрольных взвешиваний. Резкой потери или увеличения не выявлено.
Внутренние органы. По состоянию внутренних органов группы не отличались между собой. Изменения или увеличения внутренних органов не наблюдалось.
Исследование подострой (субхронической) токсичности
Условия проведения эксперимента и методы исследований
Исследования токсичности оригинальной фармкомпозиции в субхроническом эксперименте проводили на самцах и самках крыс линии Вистар массой от 200 до 250 г. Животные получены из питомника. Крыс содержали в стандартных условиях, в пластмассовых клетках по 5 особей. Для кормления использовали брикетированный корм, свежие овощи, творог. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха 18-20°С. До начала эксперимента животных выдерживали в карантине в течение 10 дней. В группе 10 животных (5 самцов и 5 самок). Группы разделены следующим образом:
1 группа (контроль) интактные животные
2 группа - оригинальная фармкомпозиция и т.д. подкожное введение (п/к)
3 группа - оригинальная фармкомпозиция ×10 п/к
4 группа - оригинальная фармкомпозиция внутривенное введение (в/в), т.д.
5 группа - оригинальная фармкомпозиция в/в ×10.
Срок наблюдения: 1 месяц введения, 1 месяц наблюдение резорботивного действия.
Токсичность оценивали согласно пунктам контрольного листа наблюдения:
по выживаемости и общему виду: (шерстяной покров, глаза, уши, конечности, зубы);
состоянию и поведению животных (активность, походка, темперамент, питание);
изменению массы тела (взвешивание крыс проводили до начала и в конце эксперимента);
физиологическим функциям (дыхание, слюноотделение, мочеиспускание, экскрет).
Экспериментальным животным до начала и в конце эксперимента исследовали кровь: морфологический состав периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина); биохимические показатели (уровень белка, мочевины, креатинина, глюкозы), активность некоторых ферментов сыворотки крови (аспартат- и аланинаминотрансферазы, щелочная фосфатаза, лактат дегидрогеназа). Забор крови для гематологических исследований производили из хвостовой вены. Подсчет форменных элементов крови производили на автоматическом счетчике крови «Пикоскель» (Венгрия). Уровень гемоглобина определяли гемиглобинцианидным методом. Уровень биохимических показателей определяли с помощью автоматизированной системы ФП-901, «Labsystems» (Финляндия). После окончания хронического эксперимента животных умерщвляли с помощью передозировки наркоза для патоморфологических исследований органов и тканей. Вскрытие животных производили сразу после их гибели по полной патологоанатомической схеме. Для патоморфологических исследований образцы ткани подвергали желатинированию и криостатированию с получением срезов толщиной до 5 мкм. Затем ткани фиксировали и окрашивали гематоксилин-эозином. Микроскопию проводили на микроскопе фирмы «Opton» (Германия). Полученные экспериментальные данные сравнивали с контрольными данными и обсчитывали с помощью компьютерной статистической программы.
Результаты исследования.
Макроскопические исследования
Выживаемость: все подопытные животные перенесли все способы введения. Гибели не наблюдалось ни в экспериментальных, ни в контрольных группах животных.
Поведение: каких-либо существенных отклонений в поведении (повышенной или пониженной активности) и состоянии подопытных животных по сравнению с контрольными группами не отмечено. Мышечный тонус не отличался повышенной возбудимостью.
Внешний вид: все животные были средней упитанности, истощением или ожирением не страдали. Шерстяной покров ровный и блестящий; выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Помутнения роговицы, слезотечения или каких-либо патологических признаков не отмечено. Ушные раковины розового цвета без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета у всех животных, поломок не наблюдалось.
Функции: дыхание у подопытных животных, как и у контрольных, было спокойное обычного ритма, незатрудненное; слюноотделение без патологии; частота, количество и цвет мочи был в пределах физиологической нормы.
Клинические исследования: динамика массы тела: во всех подопытных группах положительная. Достоверных различий между опытными и контрольными животными нет.
Гематологические показатели: содержание гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов во всех группах в пределах физиологической нормы.
Биохимические исследования: пептидный комплекс в испытуемой дозе не влиял на уровень содержания общего белка сыворотки крови подопытных животных, что свидетельствует об отсутствии повреждающего действия изучаемого препарата на белок-образующую функцию печени. Для выявления возможного повреждающего воздействия на печень в сыворотке крови животных во время хронического эксперимента определяли активность щелочной фосфатазы, аспартат и аланинаминотрансферазы.
Анализ полученных данных показал отсутствие достоверных изменений активности указанных ферментов сыворотки крови.
Патоморфологические данные: Макроскопическое исследование
У животных во всех группах при вскрытии кожа чистая, подкожно-жировой слой развит умеренно. Расположение внутренних органов правильное, свободной жидкости ни в плевральной и ни в брюшной полостях нет. Просвет трахеи и бронхов свободен, слизистая их чистая, влажная, блестящая. Ткань легких опытных групп более интенсивно окрашена, чем у животных интактного контроля, однако без признаков отека.
Миокард на разрезе без патологических изменений
Язык чистый. Слизистая полости рта и пищевода без дефектов. Желудок и кишечник без следов раздражения. Печень не увеличена.
Капсула почек отделяется легко, мозговое и корковое вещество на разрезе хорошо различимы.
Селезенка с гладкой капсулой, на разрезе серовато-бурого цвета, пульпа без соскоба.
Семенники и яичники без особенностей.
Тимус сероватого цвета, без кровоизлияний.
Щитовидная железа плотная с симметричными долями.
Оболочки головного мозга умеренного кровенаполнения, влажные, блестящие. Мозговое вещество имеет симметричный рисунок на разрезе.
Весовые индексы органов испытуемых животных не имели достоверных отличий от контрольных групп.
Микроскопическое исследование. Во всех исследуемых группах: во внутренних органах (печень, почки, легкие, сердце, селезенка, желудок, толстый и тонкий кишечник), железах внутренней секреции (щитовидная железа, тимус, надпочечники, поджелудочная железа), репродуктивных органах (матка, яичники), лимфатических узлах, головном мозге, коже, слизистых носа и горла - патоморфологических изменений не выявлено.
Исследование субхронической токсичности при интраназальном введении
На половозрелых животных
Исследования проводили на половозрелых кроликах самках породы Шиншилла весом 2500 г. Животные получены из питомника. Кроликов содержали в стандартных металлических клетках по 1 особи. Для кормления использовали брикетированный корм, свежие овощи. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха 18-20°C. В группе 5 животных, количество групп 3. Группы разделены следующим образом: 1 группа (терапевтическая доза) - фармкомпозиция 0,1 мг/мл 0,2 мл, вводимая ежедневно 1 раз в день; 2 группа - фармкомпозиция 0,1 мг/мл 0,2 мл, вводимая ежедневно 2 раз в день; 3 группа - интактные животные. Срок введения 1 месяц.
Токсичность оценивали согласно пунктам контрольного листа наблюдения: по выживаемости, общему виду, состоянию и поведению животных, изменению массы тела (взвешивание проводили в начале и в конце эксперимента). О местном раздражающем действии в ходе эксперимента судили по изменениям слизистых оболочек носа.
Экспериментальным животным до начала и в конце эксперимента исследовали морфологический состав периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина), биохимические показатели (уровень белка, мочевины, креатина, глюкозы, общего холестерина и триглицеридов), активность некоторых ферментов сыворотки крови (аспартат- и аланинаминотрансферазы, щелочная фосфатаза, лактат дегидрогеназа). Для определения указанных показателей кровь брали из ушной вены в объеме 1,5-2,0 мл.
Подсчет форменных элементов крови производили на автоматическом счетчике крови «Пикоскель» (Венгрия). Уровень гемоглобина определяли гемиглобинцианидным методом. Уровень биохимических показателей определяли с помощью автоматизированной системы ФП-901, «Labsystems» (Финляндия).
После окончания хронического эксперимента животных умерщвляли с помощью передозировки наркоза. Вскрытие животных производили сразу после их гибели по полной патологоанатомической схеме.
Морфометрическую оценку параметров органов животных проводили с помощью весов фирмы «Sartorius» (Германия) с последующим вычислением массы органов и их стандартных отклонений.
Для патоморфологических исследований образцы свежей ткани подвергали желатинированию и криостатированию с получением срезов толщиной до 5 мкм. Затем ткани фиксировали и окрашивали гематоксилин-эозином. Микроскопию проводили на микроскопе фирмы «Opton» (Германия).
Полученные экспериментальные данные сравнивали с контрольными и обсчитывали с помощью компьютерной статистической программы.
Результаты исследования
1. Визуальные наблюдения:
Выживаемость: все подопытные животные перенесли введение фармкомпозиции в исследуемых дозах. Гибели не наблюдалось.
Поведение: повышенной или пониженной активности у подопытных животных сравнительно с контрольными группами не отмечено. Мышечный тонус у подопытных животных и контрольных не отличался повышенной возбудимостью. Замечено, что введение препарата не вызывает у животных чувство дискомфорта.
Внешний вид: все животные независимо от применяемой дозы были средней упитанности, истощением или ожирением не страдали.
Шерстяной покров ровный и блестящий; выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Помутнения роговицы, слезотечения или каких-либо патологических признаков не отмечено. Ушные раковины розового цвета без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета у всех животных, поломок не наблюдалось.
Функции: дыхание у подопытных животных, как и у контрольных, было спокойное обычного ритма, незатрудненное; слюноотделение без патологии; частота, количество и цвет мочи был в пределах физиологической нормы; экскрет по цвету и оформленности не отличался от контроля.
2. Клинические исследования:
Динамика массы тела: во всех подопытных группах положительная и достоверно не отличалась от интактного контроля.
Анализ крови: содержание гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов во всех группах в пределах физиологической нормы.
Биохимические исследования: глюкоза крови, активность аланиновой и аспарагиновой аминотрансфераз во всех группах в пределах нормы. Концентрация белка у кроликов, получавших фармкомпозицию 1 и 2 раза в день, статистически не различалась.
3. Патоморфологические данные:
Во всех исследуемых группах: во внутренних органах (печень, почки, легкие, сердце, селезенка, желудок, толстый и тонкий кишечник), железах внутренней секреции (щитовидная железа, тимус, надпочечники, поджелудочная железа), репродуктивных органах (матка, яичники), лимфатических узлах, головном мозге, коже, слизистых носа и горла - патоморфологических изменений не выявлено.
Таким образом, проведены исследования субхронической токсичности назальной формы фармкомпозиции. При субхроническом исследовании спрея не было выявлено значимых изменений внутренних органов испытуемых животных, не обнаружено местнораздражающего действия. При изучении субхронической токсичности использовали клинические методы исследования, общепринятые методы исследования гематологических, биохимических показателей крови, а также гистологических исследований внутренних органов и слизистых носа.
Исследование субхронической токсичности на неполовозрелых кроликах при интраназальном введении на неполовозрелых животных
Исследования проводили на 3-х недельных крольчатах породы Шиншилла весом от 300 до 500 г. Нанесение препарата производили ежедневно 1 и 2 раза в день по 1 впрыску в течение 2 недель. Животные получены из питомника. Кроликов содержали в стандартных металлических клетках по 1 особи. Для кормления использовали брикетированный корм, свежие овощи. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха 18-20°C. В группе 5 животных, количество групп 3. Группы разделены следующим образом: 1 группа (терапевтическая доза) - фармкомпозиция 0,1 мг/мл 0,2 мл, вводимая ежедневно 1 раз в день; 2 группа - фармкомпозиция 0,1 мг/мл 0,2 мл, вводимая ежедневно 2 раза в день; 3 группа - интактные животные. Срок введения 2 недели.
Токсичность оценивали согласно пунктам контрольного листа наблюдения: по выживаемости, общему виду, состоянию и поведению животных, изменению массы тела (взвешивание проводили в начале и в конце эксперимента). О местном раздражающем действии в ходе эксперимента судили по изменениям слизистых оболочек носа.
Экспериментальным животным до начала и в конце эксперимента исследовали морфологический состав периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина), биохимические показатели (уровень белка, мочевины, креатина, глюкозы, общего холестерина и триглицеридов), активность некоторых ферментов сыворотки крови (аспартат- и аланинаминотрансферазы, щелочная фосфатаза, лактат дегидрогеназа). Для определения указанных показателей кровь брали из ушной вены в объеме 1,5-2,0 мл. Подсчет форменных элементов крови производили на автоматическом счетчике крови «Пикоскель» (Венгрия). Уровень гемоглобина определяли гемиглобинцианидным методом. Уровень биохимических показателей определяли с помощью автоматизированной системы ФП-901, «Labsystems» (Финляндия).
После окончания хронического эксперимента животных умерщвляли с помощью передозировки наркоза. Вскрытие животных производили сразу после их гибели по полной патологоанатомической схеме.
Морфометрическую оценку параметров органов животных проводили с помощью весов фирмы «Sartorius» (Германия) с последующим вычислением массы органов и их стандартных отклонений.
Для патоморфологических исследований образцы свежей ткани подвергали желатинированию и криостатированию с получением срезов толщиной до 5 мкм. Затем ткани фиксировали и окрашивали гематоксилин-эозином. Микроскопию проводили на микроскопе фирмы «Opton» (Германия).
Полученные экспериментальные данные сравнивали с контрольными и обсчитывали с помощью компьютерной статистической программы.
Результаты исследования
Оценка раздражающего действия на слизистую оболочку носа
Прижизненные биомикроскопические исследования
На протяжении всего срока наблюдения у животных сохранялось нормальное поведение, выделений из носовых ходов и образования корок не замечено. При использовании капель у кроликов возникал рефлекс чихания, который прекращался через 1-2 минуты. При закапывании капель как в терапевтической группе, так и в группе превышенной дозы, у крольчат отмечалось механическое раздражающее действие, выразившееся в рефлексе чихания, подергивания носом, животные терли лапами нос.
Контрольная интактная группа. Слизистая оболочка бледно-розового цвета, без отеков и выделений. Во время наблюдение с отоларингологическим зеркалом изъянов на эпителии не обнаруживались. Слизистое отделяемое носа прозрачного водянистого вида. Рефлексы соответствовали физиологической норме.
При конфокальной микроскопии: эпителиальный слой имеет плотно упакованную структуру четко дифференцированных клеток. Клетки связаны щелевыми контактами.
В группе терапевтической дозы слизистые носа оставались чистыми на протяжении всего срока наблюдения: слабо-розового цвета без выделений, отеков не наблюдалось. Сосуды слизистой оболочки не изменены. Состояние эпителия исследовали на щелевом освещение. Ни в одном случае патологических изменений не выявлено.
В группе ×10. Ни в одном случае патологических изменений слизистой не выявлено.
Клинические и биохимические исследования
Анализ крови: содержание гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов во всех группах в пределах физиологической нормы. Показатели, полученные в опытных группах, достоверно не отличались от контрольных групп интактных животных и препарата сравнения.
Биохимические исследования, глюкоза крови, активность аланиновой и аспарагиновой аминотрансфераз во всех группах в пределах номы.
Заключение. Проведены исследования токсичности в субхроническом эксперименте на неполовозрелых животных оригинальной фармкомпозиции.
Введение препарата интраназально как в терапевтической дозе, так и в десятикратно превышающих в течение 2 недель, не вызывало изменений внутренних органов, не оказывало токсического действия на систему крови. Не оказывало местнораздражающего действия.
Пример 6'. Мутагенность фармкомпозиции
Для оценки мутагенных свойств заявляемого белково-полипептидной фармкомпозиции применили набор следующих тестов: - учет генных мутаций в тесте Эймса Salmonella /микросомы с использованием в качестве тест-объектов штаммов Salmonella typhimurium ТА 97, ТА 98 и ТА 100; - учет микроядер в клетках костного мозга мышей. Испытан образец белково-полипептидной фармкомпозиции, представляющий собой прозрачную жидкость, стерильно упакованную во флакон темного стекла в количестве 20 мл, содержащую субстанцию в концентрации 0,1 мг/мл.
Оценка мутагенных свойств белково-полипептидной фармкомпозиции в тесте Эймса
Мутационный тест на Salmonella typhimurium является бактериальной тест-системой для учета генных мутаций к прототрофности по гистидину при действии химических соединений и (или) их метаболитов, индуцирующих мутации типа замены оснований или сдвига рамки считывания в геноме этого организма. Мутагены, индуцирующие замены пар оснований - агенты, вызывающие мутации замены пар оснований в молекуле ДНК. Мутагены, индуцирующие мутации сдвига считывания генетического кода (фреймшифт мутации), - агенты, вызывающие добавление или нехватку одиночных или множественных пар оснований в молекуле ДНК.
Данный метод предназначен для выявления способности фармакологических веществ или их метаболитов индуцировать генные мутации у индикаторных штаммов Salmonella typhimurium. Бактерии обрабатываются тестируемым соединением с системой метаболической активации (СМ+) или без метаболической активации (СМ-). После инкубации в течение определенного периода времени под-считывается количество ревертантных колоний у разных тестерных штаммов в сравнении с количеством спонтанных ревертантов в вариантах негативного контроля (необработанные культуры или культуры, обработанные растворителем). Если тестируемое соединение и (или) его метаболиты обладают мутагенной активностью, то они будут индуцировать обратные мутации от ауксотрофности к прототрофности по гистидину у гистидин-зависимых штаммов Salmonella typhimurium.
Для тестирования использовали набор индикаторных штаммов Salmonella typhimurium, позволяющий регистрировать мутации типа сдвига рамки считывания генетического кода (ТА 98 и ТА 97) и замены пар оснований (ТА 100). Штаммы получены из Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИ Генетика.
Регламент работы с бактериальными культурами, проверка генотипов штаммов, правила их музейного хранения, необходимые для проведения экспериментов оборудование, посуда, реактивы и питательные среды и растворы, проведение работ по получению гомогената печени крыс и составление активирующей смеси, а также методы статистического анализа полученных результатов соответствовали стандартным, подробно описанным в соответствующей литературе.
Для метаболической активации использовали фракцию S9 печени самцов крыс Вистар, которым за 5 дней до забоя вводили индуктор микросомальных ферментов - совол (300 мг/кг, однократно, внутрибрюшинно). Для контроля активности системы метаболической активации использовали бромид этидия (10 мкг/чашку) на штамме ТА 98 при СМ+.
Белково-полипептидная фармкомпозиция в виде стерильного раствора с содержанием белка 0,1 мг/мл исследовали 1,0 и 0,3 мл исходного раствора на чашку и три 10-кратных разведения в физиологическом растворе (по 0,1 мл/ч). Тестируемые дозы субстанции составили 300; 100; 10; 1 и 0,1 мкг на чашку.
Эксперимент сопровождали положительными контролями, в качестве которых использовали вещества, индуцирующие мутации у соответствующих штаммов-тестеров при наличии или отсутствии условий активации. Для вариантов без активации использовали азид натрия в количестве 10 мкг на чашку для штамма ТА 100 при СМ-; 2,7-диамино-4,9-диокси-5,10-диоксо-4,5,9,10-тетрагидро-4,9-диазопирен (ДИАМ) - 10 мкг на чашку для штамма ТА 98 при СМ-; 9-аминоакридин (9АА) - 50 мкг/чашку для штамма ТА 97 при СМ-. Для контроля активности системы метаболической активации использовали этидиум бромид - 10 мкг на чашку на штамме ТА 98 при СМ+. В качестве негативного контроля использовали физиологический раствор (0,1 мл на чашку).
Селективный полуобогащенный агар (0,7%) в пробирках плавили в водяной бане при 100°С и помещали в термостатируемую водяную баню с температурой 45-46°С.
Сначала в пробирки с агаром вносили 0,1 мл образца в необходимых разведениях, затем - 0,1 мл суспензии бактерий и 0,5 мл микросомальной активирующей смеси (для варианта с метаболической активацией). Затем содержимое пробирки быстро перемешивали и выливали на слой нижнего минимального агара в чашки Петри. Продолжительность времени внесения микросомальной активирующей смеси и розлива полужидкого агара на чашку не превышала 10-15 секунд. Чашки оставляли при комнатной температуре на 30-40 минут и после полного застывания агара переносили в термостат при 37°С. Учет результатов проводили через 48 часов инкубации.
Параллельно в опыт включали варианты без системы метаболической активации (СМ-) и в присутствии системы метаболической активации (СМ+). В варианте CM- может быть зарегистрировано действие прямых мутагенов, то есть препаратов, проявляющих мутагенный эффект за счет активности исходной структуры вещества. Действие же промутагенов, то есть соединений, эффект которых связан с образованием мутагенных метаболитов, может быть учтено при сравнении результатов, полученных при анализе данных испытаний вещества в вариантах СМ- и СМ+. В каждом контрольном и опытном вариантах использовали по 2 чашки. Мутагенный эффект считали значимым, если среднее количество колоний ревертантов на чашку в опытном варианте превышало таковое в контрольном варианте в 2 и более раз. Результаты эксперимента учитывали при наличии стандартного ответа во всех вариантах позитивного и негативного контроля. Количество колоний ревертантов в контроле с растворителем в вариантах СМ- и СМ+ было в пределах колебаний спонтанного уровня для данных штаммов. Ответ штаммов на стандартные мутагены был в пределах обычных уровней.
Исследованный белково-полипептидная фармкомпозиция во всех тестируемых концентрациях не показал мутагенного эффекта на штаммах ТА 100, ТА 98 и ТА 97 в вариантах без- и в присутствии системы метаболической активации.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ: белково-полипептидная фармкомпозиция не обладает способностью индуцировать генные мутации на тестерных штаммах Salmonella typhimurium во всем диапазоне испытанных концентраций.
Оценка мутагенных свойств белково-полипептидной композиции микроядерным методом в клетках млекопитающих
Цитогенетическая активность - способность вещества вызывать структурные и численные хромосомные нарушения в соматических и зародышевых клетках.
Микроядра - небольшие ДНК-содержащие образования, состоящие из ацентрических фрагментов хромосом или отставших на стадии анна-телофазы хромосом. На стадии телофазы эти фрагменты могут включаться в ядра дочерних клеток или образовывать одиночные или множественные микроядра в цитоплазме.
Цель исследования - выявление и количественная оценка цитогенетической (мутагенной) активности фармакологических средств в полихроматофильных эритроцитах (ПХЭ) костного мозга млекопитающих. Метод основан на микроскопической регистрации клеток с микроядрами.
Эксперименты проводили на самцах и самках мышей-гибридов Fl(CBAx C57B I6/J) двухмесячного возраста массой 18-20 г. В состав каждой группы входило по 6 особей. Животных содержали при 12-часовом световом режиме в условиях свободного доступа к воде и пище. Эксперименты на животных по оценке мутагенных свойств белково-полипептидного комплекса при однократном и пятикратном введении осуществляли в соответствии с официальными протоколами. Проведено 3 серии экспериментов с соответствующими контролями: терапевтическая доза испытана на самцах при однократном введении; субтоксическая доза испытана на самцах при однократном введении; терапевтическая доза испытана на самцах и самках при пятикратном введении.
Учитывая, что возможным предполагаемым способом применения белково-полипептидной фармкомпозиции в клинике - внутривенный или эндолюмбальный, в данном исследовании использовали внутрибрюшинное введение субстанции мышам. Дозу белково-полипептидного комплекса для оценки мутагенной активности рассчитывали исходя из наибольшей рекомендованной суточной терапевтической дозы (ТД) для человека. Рекомендовано внутривенное введение белково-полипептидной фармкомпозиции в количестве 2 мл при концентрации 0,1 мг/мл. При этом терапевтическая доза (ТД) для человека, в том числе для ребенка, может составить 0,05 мг/кг/сутки. Для расчета дозы в экспериментах на мышах рекомендуется использовать коэффициент пересчета, учитывающий соотношение площади поверхности тела и массы тела человека и мыши. В нашем исследовании он составил 8,33. Поэтому в качестве ТД для мышей использовали дозу, приблизительно равную 8,33 ТД для человека (0,42 мг/кг).
В качестве субтоксической использовали максимально возможную в условиях данного эксперимента дозу 10 мг/кг, поскольку вещество было предоставлено в концентрации 0,1 мг/мл, а общепринятое количество вещества, вводимое мышам, составляет 0,1 мл на 10 г веса. Соответственно в пересчете для человека максимальная испытанная доза составляет 1,7 мг/кг.
Было сформировано 7 групп животных: четыре опытных и три соответствующих контрольных. Субстанцию в дозе 0,1 мг/кг вводили пятикратно с интервалом 24 часа самцам и самкам. Забой во всех группах проводили через 6 часов после последнего введения белково-полипептидного комплекса.
В двух других опытных группах белково-полипептидный комплекс вводили однократно самцам в дозах 0,2 мг/кг и 0,5 мг/кг.
В качестве негативного контроля использовали растворитель - физраствор. Его вводили внутрибрюшинно самцам и самкам двух контрольных групп в те же сроки и в тех же объемах, что и животным опытных серий. В качестве позитивного контроля использовали циклофосфамид в дозе 20 мг/кг, растворенный ex tempore в физрастворе при однократном внутрибрюшинном введении за 24 часа до забоя.
Препараты клеток костного мозга для учета микроядер готовили общепринятым способом в соответствии с методическими рекомендациями «Оценка мутагенной активности факторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих микроядерным методом». Животных умерщвляли методом цервикальной дислокации через 6 часов после последнего введения препарата. Выделяли обе бедренные кости и очищали их от мышц. Для вымывания костного мозга использовали эмбриональную телячью сыворотку (НПП ПанЭ-КО). Костный мозг из обеих бедренных костей вымывали шприцем в микропробирку. Суспензию центрифугировали при 1000 об/мин, в течение 5 минут супернатант удаляли, осадок осторожно ресуспендировали. Из капли суспензии готовили мазок, высушивали его на воздухе. Фиксировали метанолом 3 минуты. Окрашивали по методу Романовского-Гимза. Анализировали на зашифрованных препаратах по 2000 полихроматофильных эритроцитов от каждого животного. При подсчете 500 эритроцитов определяли соотношение полихроматофильных и нормохромных эритроцитов. Препараты расшифровывали по окончании анализа.
Критерием позитивного результата является воспроизводимое и статистически значимое увеличение числа полихроматофильных эритроцитов с микроядрами по крайней мере в одной из опытных групп по сравнению с контрольной. Полученный положительный результат свидетельствует, что вещество индуцирует хромосомные повреждения и/или нарушения митотического аппарата клеток у экспериментальных животных.
Статистическую обработку результатов по учету микроядер проводили путем сравнения опытных серий с контрольными по критерию Х2; межгрупповое сравнение доли полихроматофильных эритроцитов проводили с помощью критерия Манна-Уитни.
Результаты учета микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей: во всех вариантах опыта белково-полипептидная фармкомпозиция не вызывала увеличения частоты клеток с микроядрами в костном мозге мышей при сравнении опытных и соответствующих контрольных серий. Циклофосфамид (позитивный контроль) при внутри-брюшинном введении самцам мышей в дозе 20 мг/кг вызывал повышение частоты клеток с микроядрами в 19,6 раза (62,1‰ против 3,16‰ в контроле, Р<0,001). Доля ПХЭ от общего числа эритроцитов костного мозга была приблизительно на одном уровне в группах опытных и контрольных серий, что свидетельствует об отсутствии токсического действия композиции в испытанных дозах на кроветворение. При действии позитивного контроля (пиклофосфамида) отмечен сдвиг соотношения полихроматофильных и нормохромных эритроцитов в сторону последних (при сравнении с контролем Р<0,005).
Таким образом, мутагенная активность белково-полипептидной фармкомпозиции не выявлена в тесте на индукцию микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей при условии однократного и пятикратного введения самцам и самкам внутрибрюшинно в дозе 0,42 мг/кг массы тела, что в пересчете соответствует суточной терапевтической дозе для человека. Мутагенная активность не выявлена также в условиях однократного введения белково-полипептидной фармкомпозиции самцам в максимально возможной дозе 10 мг/кг. Белково-полипептидный комплекс не проявил токсического действия по показателю «доля полихроматофильных эритроцитов».
Заключение по оценки мутагенных свойств белково-полипептидной фармкомпозиции
Белково-полипептидная фармкомпозиция не обладает мутагенной активностью в тесте Эймса Salmonella /микросомы и в тесте на индукцию микроядер в клетках костного мозга мышей в условиях экспериментов, проведенных в соответствии с Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ.
Пример 7. Влияние фармкомпозиции на выживаемость крыс в условиях ишемического поражения мозга при перевязке обеих сонных артерий (неполная глобальная ишемия мозга)
Исследование проводили на крысах-самцах линии Вистар массой 180-250 г в условиях необратимой двусторонней окклюзии общих сонных артерий [3-5]. Полученных из питомника лабораторных животных подвергали карантину в течение 5 дней. Все ветеринарные манипуляции проводились в асептических условиях, позволяющие сохранить статус экспериментальных животных. Для содержания экспериментальных животных использовали стандартные условия [6]. У крыс под эфирным наркозом (эфир диэтиловый х/ч, ОАО «Медхимпром») в области шеи по средней линии делали небольшой разрез кожи длиной 8-10 мм для обеспечения доступа к сонным артериям. Выделяли обе сонные артерии, отделяя блуждающий и симпатический нервы, проходящие вместе с артериями. Под сосуды подводили шелковые лигатуры (Silk blk 17×45 см/M3/USP2/ Non needled/ «Ethicon Johnson & Johnson», кат. №W203) и вместе с ассистентом производили одномоментную перевязку обеих сонных артерий тройным хирургическим узлом. Кожный разрез зашивали хирургическим шелком (Silk blk 100 см/M5/Sgle armed KP-3USP2/ Non needled/ «Ethicon Johnson & Johnson», кат. №W794), накладывая один или два хирургических кожных шва, с последующей обработкой раны 5% раствором настойки йода. Физиологический раствор или фармкомпозицию вводили внутрибрюшинно. Продолжительность всех манипуляций составляла 8-10 минут, затем животных помещали в клетку. Для исследования использовали три группы животных:
- группа 1 - контрольные животные после перевязки сонных артерий, получавшие физиологический раствор стерильным одноразовым инсулиновым шприцем 0,5 мл на крысу через 1 час и 0,5 мл на крысу через 5 часов после перевязки сонных артерий;
- группа 2 - ложнооперированные животные, у которых проводились те же манипуляции, что и у контрольных, только без перевязки сонных артерий, которым вводили физиологический раствор 0,5 мл на крысу через 1 час и 0,5 мл на крысу через 5 часов;
- группа 3 - животные после перевязки сонных артерий, которым вводили фармкомпозицию в дозе 0,5 мл 0,1% раствора (0,2 мг/кг) на крысу через 1 час и 0,5 мл на крысу через 5 часов.
Выживаемость животных отслеживали сразу после проведения процедуры перевязки и в течение первых суток, т.е. конечную выживаемость фиксировали через 24 часа. Биологическая активность препарата в виде защиты головного мозга в условиях неполной глобальной ишемии при одномоментной перевязке сонных артерий оценивалась следующим образом:
- выраженная - при выживании более 80% крыс;
- средневыраженная - при выживании 70-80% крыс;
- невыраженная - при выживании менее 70% крыс.
Статистическую обработку данных проводили с использованием точного критерия Фишера с учетом множественности сравнений. Проведенные опыты показали, что в контрольных опытах после перевязки обеих сонных артерий в первый час погибает наибольшее количество животных, т.е. 11 из 24, а через сутки еще 4 животных, всего погибло 15 крыс из 24 (63%, табл.1). Среди ложнооперированных животных погибло 2 крысы сразу после операции (17%). Фармкомпозиция при введении крысам через 1 час и 5 часов по 0,2 мг/кг (0,5 мл 0,1% раствора) внутрибрюшинно вызывала гибель только двух животных, а 34 из 36 крыс выжило. Увеличение выживаемости животных по сравнению с контролем составляет 95%. Полученные данные представлены в табл.6.
Таблица 6
Влияние фармкомпозиции на выживаемость крыс в условиях перевязки обеих сонных артерий.
Группы животных
Выраженная биоактивность
выжившие
умершие
1 группаКонтроль - 24 крысы
9 из 24 (37%)
15 из 24 (63%)
2 группаЛожно оперированные - 12 крыс
10 из 12* (83%)
2 из 12 (17%)
3 группаФармкомпозиция 0,2 мг/кг - 36 крыс
34 из 36* (95%)
2 из 36 (5%)
*-Р≤0,01 по сравнению с контролем.
Таким образом, фармкомпозиция оказывает статистически значимое увеличение выживаемости животных по сравнению с контролем в условиях неполной глобальной ишемии мозга, вызываемой одномоментной перевязки обеих сонных артерий.
В результате проведенных исследований установлено, что заявленная фармкомпозиция обладает выраженным нейропротекторным и нейрометаболическим действием, стимулирующим физиологическую и репаративную регенерацию нервной ткани, превосходит по биологической активности препарат сравнения - церебролизин.
Заявленная фармкомпозиция может найти применение при создании новых лекарственных препаратов для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза.
Пример 8. Изучение влияния фармакологической композиции на локальный мозговой кровоток в коре головного мозга наркотизированных крыс в условиях глобальной преходящей ишемии.
Опыты проводили на наркотизированных крысах-самцах линии Вистар массой 220-250 г при естественном дыхании. Крыс наркотизировали уретаном (фирма Sigma Aldrich Chemie GmbH, Germany) в дозе 1400 мг/кг внутрибрюшинно.
Методика.
Состояние мозгового кровообращения у животных оценивали по регистрации локального мозгового кровотока в коре головного мозга крыс с помощью метода лазерной Допплеровской флоуметрии. Для регистрации локального мозгового кровотока в теменной области коры головного мозга крыс использовали флоуметр ALF-21 фирмы "Transonic System Inc." (США). Для этой цели игольчатый датчик флоуметра диаметром 0,8 мм устанавливали на теменной области коры большого мозга крысы с помощью микроманипулятора и коромысла. Одновременно регистрировали изменения артериального давления через предварительно введенный в бедренную артерию полиэтиленовый катетер. Запись показателей кровотока и артериального давления производили на полиграфе фирмы «BIOPAK» (США) и персональном компьютере. Фармакологическую композицию вводили в дозе 0,2 мг/кг (0,5 мл 0,1% раствора) через полиэтиленовый катетер в бедренную вену животных.
Модель глобальной преходящей ишемии широко используется для изучения как нарушений мозгового кровотока, так и изменений различных биохимических показателей функции мозга, происходящих после ишемического поражения. Глобальную преходящую ишемию у крыс вызывали 10-минутной окклюзией обеих общих сонных артерий с помощью специальных зажимов с одновременным снижением артериального давления до 40-50 мм рт.ст. путем забора артериальной крови из предварительно вставленного полиэтиленового катетера в бедренную артерию. Через 10 минут зажимы с сонных артерий снимают, а забранную ранее кровь вводили обратно животному [3-5].
Результаты исследования обрабатывали методом вариационной статистики с помощью дисперсионного анализа для повторных измерений и критерия множественных сравнений по Даннету с использованием программы Biostat.
Результаты исследования
Проведенные опыты показали, что в результате глобальной преходящей ишемии в коре головного мозга крыс наблюдается резкое снижение локального мозгового кровотока, которое в среднем составляет 6,1±1,0 усл.ед. или 82±2,2% от исходного уровня. После снятия зажимов с сонных артерий и последующей реинфузии крови наблюдается резкое увеличение локального кровотока, которое постепенно снижается и через 30 минут после реперфузии составляет в среднем 25±2,8 усл.ед. или 23±2,4% от исходного уровня (р<0,05).
Фармакологическая композиция, введенная через 30 минут после реперфузии внутривенно в дозе 0,2 мг/кг (0,5 мл 0,1% раствора), уже через 10 минут после введения в большинстве опытов вызывал увеличение локального мозгового кровотока в коре головного мозга крыс в среднем на 12±3,3% (в 7 из 10 опытов). Статистически значимое увеличение локального мозгового кровотока начинало проявляться на 50 минуте, которое составляло в среднем 39±9,2%, и продолжалось до 90 минуты наблюдения (табл.№2). 3десь следует отметить, что в контрольных опытах с введением физиологического раствора уровень локального мозгового кровотока практически не изменяется.
Параллельно изменениям мозгового кровотока проводили регистрацию артериального давления. Опыты показали, что через 10 минут после введения фармакологической субстанции крысам наблюдалось постепенное снижение уровня артериального давления, которое через 50 минут снижалось в среднем на 15±3,4% и оставалось пониженным до конца эксперимента (табл.).
Следует отметить, что в контрольных опытах с введением физиологического раствора также наблюдается небольшое снижение уровня артериального давления в среднем на 18%, поэтому можно сказать, что фармакологическая субстанция не оказывает существенного влияния на уровень артериального давления.
Заключение
Таким образом, в результате проведенного исследования показано, что фармакологическая субстанция увеличивает выживаемость экспериментальных животных в условиях полной перевязки сонных артерий. Вместе с тем, фармакологическая субстанция увеличивает локальный мозговой кровоток в коре головного мозга крыс, сниженный после глобальной преходящей ишемии головного мозга, который к концу эксперимента по величине превосходит контрольный уровень, наблюдаемый до ишемии. Можно полагать, что повышение выживаемости животных при перевязке сонных артерий под влиянием фармакологической субстанции может быть обусловлено его способностью усиливать кровоснабжение коры головного мозга экспериментальных животных.
Пример 9. Нейропротекторные свойства фармкомпозиции при глутаматной токсичности in vitro
+
2
Исследование нейропротекторных свойств фармкомпозиции из биологически активного белково-полипептидного комплекса при глутаматной токсичности in vitro выполнено на 7-дневных культурах клеток-зерен мозжечка, полученных из мозга 7-суточных крыс линии Вистар методом ферментно-механической диссоциации. Диссоциацию ткани мозга проводили следующим образом: выделенные мозжечки переносили в пластиковую чашку Петри, заполненную фосфатным буфером, промывали этим же раствором несколько раз и измельчали. Фрагменты ткани инкубировали 15 мин при 37°С в смеси ферментов, приготовленной на фосфатном буфере и содержащей 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА. После инкубации ткань промывали в двух сменах фосфатного буфера и 1 раз средой культивирования, далее подвергали механической диссоциации в среде культивирования. Питательная среда содержала: 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина и 10 мМ буфера HEPES, рН 7,2-7,4. Суспензию клеток центрифугировали 1 минуту при 1000 об/мин, супернатант сливали, а осадок ресуспендировали в питательной среде, где концентрация К была доведена до 25 мМ, что оказывает трофическое действие на клетки-зерна мозжечка. Культивирование производили в 96-луночных пластиковых камерах. В каждую ячейку добавляли 0,1 мл суспензии клеток. Культуры развивались в СО-инкубаторе при температуре 35,5°С и относительной влажности 98%.
2
2
3
2
4
2
2
К 7 дню культивирования, при созревании глутаматных рецепторов, проводили токсическую обработку глутаматом (25, 37, 50 мкМ, 15 мин) в сбалансированном солевом растворе следующего состава (в мМ): 154 NaCl, 25 KСl, 2,3 CaCl, 1 MgCl, 3,6 NaHCO, 0,35 NaHPO, 10 HEPES (pH 7,6) в течение 15 минут, затем промывали дважды, в третью смену раствора вносили фармкомпозицию (0,05 и 0,1 мг/мл), в качестве контроля в том же объеме - НО, глициновый буфер и бычий сывороточный альбумин (0,15 мг/мл), оставляли на 4 часа в СО-инкубаторе для развития нейродегенерации. Затем фиксировали 20 минут смесью формалин-спирт-уксусной кислоты (ФУС) в пропорции 2:7:1, окрашивали трипановым синим и заливали глицерином, съемку проводили цифровой камерой.
Оценку жизнеспособности нейронов проводили с помощью подсчета нейронов с нормальной морфологией на фиксированных препаратах, окрашенных трипановым синим и заключенных в глицерин.
На каждую точку было использовано по 3 сестринских культуры, клетки считали в 5 полях зрения с культуры при объективе ×40. Выживаемость вычисляли как процент от контроля.
Защитный эффект нагляднее видно, если вычислить коэффициент эффективности защиты (КЭ3) по формуле:
o
в
o
KЭЗ=(N-N)/N×100%,
o
2
в
где N - средний процент гибели нейронов от повреждающего воздействия (в данном случае - глутамата) в культурах с добавлением HO, N - средний процент гибели нейронов в культурах с добавлением фармкомпозиции. Этот параметр позволяет сравнивать эффективность действия различных веществ на разных моделях ишемии.
Результаты исследования
1 серия. Диссоциированные культуры мозжечка состоят из нейронов и глиальных. Нейрональная популяция представлена клетками-зернами, поскольку остальные типы нейронов мозжечка более крупные и к моменту диссоциации уже дифференцированы, следовательно, не переживают эту процедуру. Клетки-зерна - самый многочисленный класс нейронов головного мозга, они морфологически и нейрохимически однородны. К 7 дню культивирования происходит созревание глутаматных рецепторов.
3-4-часовое пребывание в сбалансированном солевом растворе с добавлением глицинового буфера (GB) и бычьего сывороточного альбумина (BSA), а также 0,05 и 0,1 мг/мл фармкомпозици не приводило к изменению количества живых нейронов по сравнению с контролем.
Глутамат в концентрации 25, 37, 50 мкМ (15 мин) вызывал дозозависимую гибель культивированных клеток-зерен мозжечка крыс.
Для выявления защитных эффектов различных веществ необходимо, чтобы глутаматиндуцированная гибель не превышала 70%. Следовательно, для экспериментов по определению нейропротекторных свойств была использована концентрация глутамата 25 мкМ. Как 0,1, так и 0,05 мг/мл фармкомпозиции оказывают защитный эффект, повышая выживаемость зернистых нейронов мозжечка с 54,97+6,5% до 72,76+9,7% соответственно. Однако, он был более выражен при более низкой концентрации.
В данном случае для 0,05 мг/мл фармкомпозиции КЭЗ=(45,03-27,24)/45,03×100%=39,51%; для дозы 0,1 мг/мл КЭЗ=(45,03-37,85)/45,03×100%=15,94%.
Глициновый буфер и бычий сывороточный альбумин, добавленные в постглутаматном периоде, не изменяли токсичности глутамата. Всего в первой серии экспериментов было просчитано около 2 тысяч клеток из 60 сестринских культур.
2 серия. Вторая серия выполнена по тем же методикам и схеме эксперимента, что и 1 серия, лишь фармкомпозиция была взята в 2 концентрациях: 0,05 и 0,01 мг/мл и в качестве препарата сравнения был использован церебролизин в таких же концентрациях. Из полученных данных обсчета контролей видно, что 3-4-х-часовое пребывание в сбалансированном солевом растворе с добавлением глицинового буфера фармкомпозиции и церебролизина в концентрациях 0,05 и 0,01 мг/мл не приводило к изменению количества живых нейронов по сравнению с контролем.
Глутамат в концентрации 25, 37, 50 мкМ (15 мин) вызывал дозозависимую гибель культивированных клеток-зерен мозжечка крыс. Для выявления защитных эффектов различных веществ необходимо, чтобы глутаматиндуцированная гибель нейронов не превышала 70% от контроля. Следовательно, для экспериментов по определению нейропротекторных свойств была использована концентрация глутамата 25 мкМ. Наблюдаемое одинаковое дозозависимое снижение количества выживших нейронов в зависимости от концентрации глутамата при 35 и 50 мкМ свидетельствовало о насыщении рецепторов. Фармкомпозиция оказывала достоверный защитный эффект, повышая выживаемость зернистых нейронов мозжечка. Этот эффект носит дозозависимый характер с максимальной защитой при максимальной концентрации биологически активного белково-полипептидного комплекса в фармкомпозиции (0,05 мг/мл). В данном случае КЭЗ=(45-20)/45×100%=55,6%.
Для 0,01 мг/мл КЭЗ=(45-36)/45×100%=20%
Церебролизин в исследованных дозах не оказывал достоверного защитного эффекта (КЭЗ=(45-38)/45×100%=15,6% для дозы 0,05 мг/мл и КЭЗ=(45-42)/45×100%=6,7% для 0,01 мг/мл).
Глициновый буфер, добавленный в постглутаматном периоде, даже несколько (не достоверно) усилил токсичность глутамата.
Суммарно защитный эффект фармкомпозици по сериям экспериментов
Из приведенных выше результатов отдельных экспериментов видно, что защитный эффект фармкомпозици после токсического воздействия глутамата носит стабильный характер, воспроизводясь из опыта в опыт. Сам препарат не оказывал токсического влияния ни в одном опыте. Процент гибели нейронов и коэффициенты защиты: спустя 3 ч после воздействия 25 мкМ глутамата, погибает 41,49+4% нейронов, если же после глутаматного воздействия в сбалансированном солевом растворе присутствовала фармкомпозиция в концентрации 0,5 и 0,1 мг/мл, то процент гибели культивированных нейронов мозжечка снижался до 30,88+4,3 и 21,98+4,37 соответственно. Причем это уменьшение токсичности глутамата при введении фармкомпозици в концентрации 0,05 и 0,01 мг/мл после повреждения было достоверно (n=45, Р<0,05, Anova tow-way тест с посттестом Benferroni), а в концентрации 0,1 мг/мл носил характер выраженной тенденции.
Коэффициенты эффективности защиты (КЭЗ) при действии фармкомпозици в различных концентрациях были:
КЭЗ (0,1 мг/мл)=(41,49-30,88)/41,49×100%=25,57%
КЭЗ (0,05 мг/мл)=(41,49-21,23)/41,49×100%=48,83%
КЭЗ (0,01 мг/мл)=(41,49-21,98)/41,49×100%=47,02%.
Следует отметить, что результаты опытов, где токсичность глутамата превышала 80% или не достигала 30%, в расчет не брались.
Церебролизин в исследованных дозах не оказывал достоверного защитного эффекта (КЭЗ=(45-38)/45×100%=15,6% для дозы 0,05 мг/мл и КЭЗ=(45-42)/45×100%=6,7% для 0,01 мг/мл).
Глициновый буфер, добавленный в постглутаматном периоде, даже несколько (не достоверно) усилил токсичность глутамата.
Пример 10. Исследование механизмов фармакологического действия фармкомпозиции
Проводилось исследование специфической активности фармкомпозиции на динамику концентраций возбуждающих и тормозных нейротрансмиттеров in vitro в межклеточной жидкости 7-дневных культур зернистых нейронов мозжечка при цитотоксическом воздействии глутамата. Известно, что препараты, влияющие на высвобождение глутамата (любелизил, BW619C89), являются эффективными нейропротекторами.
Методика.
4
4
Производился забор 50 мкл среды культивирования клеток-зерен мозжечка до и после токсической обработки глутаматом и внесения фармкомпозиции, глициново-фосфатного буфера или физиологического раствора. Полученные образцы сред замораживались при t -20°C, кодировались и направлялись в лабораторию для последующего измерения концентрации нейротрансмиттеров методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ/ЭД). Использовали электрохимический детектор LC-4B (BAS, США) при ^ потенциале +850 мВ на стеклоуглеродном электроде против электрода сравнения Ag/AgCl. Подвижной фазой служил 0,05 М натрийфосфатный буфер с 0,025 мМ ЭД-ТА и 5% ацетонитрила. К 25 мкл перфузата добавляли 25 мкл 0,01 мг/мл внутреннего стандарта L-гомосерина в 0,2 н NaOH и 10 мкл #-фтальаль-дегидсульфитного реактива в 0,1 М боратном буфере (рН 9,5) для дериватизации аминокислот. В качестве стандарта использовали раствор, содержащий смесь аминокислот в концентрации 0,01 ммоль/л в 0,1 н НСlO глутамат в концентрации 0.2 мг/мл в 0,1 н НСlO. После 15 мин инкубации при температуре 37°С 25 мкл смеси наносили на колонку Agilent Hypersil ODS 5 мкм, 4,6×250 (объем петли 5 мкл) хроматографа Agilent 1100 (США). Концентрацию аминокислот вычисляли при помощи программного обеспечения "Chemstation Agilent" (США); конечный результат выражали в нМ/мг ткани за 2 мин.
Статистический анализ полученных результатов проводили с помощью компьютерной программы Biostat с использованием непараметрических критериев (U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).
2
4
Подвижную фазу в составе: КНРO безводный («Fluka») - 0,069 М, лимонной кислоты моногидрата («Fluka») - 0,27 М, натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты («Sigma») - 0,27 mM и октилсульфонат натрия (ионпарный реагент) («Диафарм») - 1,9 mM готовили следующим образом - навеску разбавляли в 920 мл деионизированной воды, доводили рН до 3,15 (рН-метр рН-340, «ЗИП»), затем добавляли 80 мл, то есть 1,528 М ацетонитрила («Merck»). Раствор фильтровали под вакуумом (микрофильтр 0,2 мкм) при Р=20-40 мм Hg столба. Перед началом биохимических экспериментов подвижную фазу дегазировали под вакуумом с одновременной обработкой на ультразвуковой бане («Серьга», Россия) в течение 40-50 секунд.
Результаты: фармкомпозиция в концентрациях 0,05 мг и 0,1 мг достоверно и дозозависимо повышала экстрацеллюлярное высвобождение глутамата, глицина, гамма-аминомаслянной кислоты и таурина и аспартата (см. табл.7).
Таблица 7.
Серии опытов
Исследуемые нейротрансмиттеры (mkmoll/I)
Asp
Glu
Gly
GABA
Tau
Контроль
<b>0,0008</b>
<b>0,00014</b>
<b>0,011</b>
<b>0,00023</b>
<b>0,038</b>
+0,00015
+0,00067
+0,0048
+0,00013
+0,0091
Фармкомпозиция 0,05 мг
<b>0,0011</b>
<b>0,0003</b>
<b>0,56</b>
<b>0,00047</b>
<b>0,0635</b>
+0,00052
+0,000083
+0,224
+0,0003
+0,029
Фармкомпозиция 0,1 мг
<b>0,0011</b>
<b>0,00034</b>
<b>0,702</b>
<b>0,0004</b>
<b>0,075</b>
+0,0005
+0,00012
+0,39
+0,00022
+0,034
Контроль с глутаматной токсичностью 25 мкМ
<b>0,0009</b>
<b>0,00021</b>
<b>0,0516</b>
<b>0,00021</b>
<b>0,0457</b>
+0,0004
+0,00013
+0,0417
+0,00012
+0,02023
Фармкомпозиция 0,05 мг с глутаматной токсичностью 25 мкМ
<b>0,00075</b>
<b>0,00027</b>
<b>0,43341</b>
<b>0,00037</b>
<b>0,0651</b>
+0,000067
+0,00006
+0,22624
+0,00016
+0,01613
Фармкомпозиция 0,1 мг с глутаматной токсичностью 25 мкМ
<b>0,0007</b>
<b>0,00026</b>
<b>0,7398</b>
<b>0,00056</b>
<b>0,07977</b>
+0,00002
+0,000153
+0,24536
+0,00033
+0.017958
При концентрации фармкомпозиции 0,05 мг уровень высвобождения нейротрансмиттеров был выше на 20% (ρ<0,05), при концентрации 0,1 мг повышение было также достоверным и составляло 28%. После глутаматной токсичности 25 мкМ, при применении фармкомпозиции в концентрациях 0,05 мг и 0,1 мг отмечалось дозозависимое повышение уровня ГАМК, как тормозного нейротрансмиттера, и составило 90% и 160% соответственно по отношению к контрольному (ρ<0,01); концентрации таурина и глицина при глутаматной токсичности дозозависимо повышались до того же уровня, что и без таковой; уровни возбуждающей нейромедиации - аспартата и глутамата при глутаматной токсичности при применении фармкомпозиции снижались к контрольному уровню в случае аспартата (ρ<0,05) и оставались неизменными в случае глутамата, достоверно не отличаясь от контроля его воздействия без глутаматной токсичности.
Таким образом, физиологическое действие фармкомпозиции проявлялось повышением экстрацеллюлярной концентрации глицина, глутамата, таурина и ГАМК. Выраженность этого эффекта зависела от концентрации фармкомпозиции, он был достоверно выше при концентрации 0,1 мг, чем 0,05 мг.
Действие фармкомпозиции на фоне модели глутаматной токсичности по сравнению с физиологическим действием без таковой проявлялось в:
- снижении экстрацеллюлярного уровня аспартата;
- значительном дозозависимым повышением уровня ГАМК;
- стабилизации концентраций глицина и таурина;
- тенденции к снижению уровня глутамата.
Фармакологический эффект фармкомпозиции (повышение выживаемости зернистых нейронов в культуре клеток мозжечка при цитотоксическом воздействии глутамата) связан с регуляторным воздействием препарата на уровни возбуждающей и тормозной медиации, что обеспечивает необходимую защиту нейронов от повреждения. Наиболее интересным эффектом влияния фармкомпозиции на изменение экстрацеллюлярного пула аминокислот, помимо повышения концентрации ГАМК, является увеличение уровня таурина. Эта аминокислота, являясь донатором SH-групп, усиливает действие глутатион-пероксидазной системы и тем самым повышает антиоксидантную защиту клеточных мембран нейронов. Использованная модель глутаматной токсичности позволяет оценить влияние фармкомпозиции на динамику не только экстрацеллюлярного уровня нейротрансмиттеров, включающий метаболический пул аминокислот, но и синаптического пула (косвенно). Иными словами нейропротективный эффект фармкомпозиции объясняется стабилизацией уровня глутамата с тенденцией к снижению не только за счет активации тормозного звена нейротрансмиссии, но и за счет уменьшения спиловера возбуждающих нейромедиаторов.
В соответствии с обещанием в начале данного описания далее заявитель приводит более подробные сведения, касающиеся способа получения биологически активного комплекса, используемого в заявленном изобретении.
Предлагаемый способ получения биологически активного белково-полипептидного комплекса заключается том, что быстрозамороженный мозг эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных, сроком гестации от середины первой трети, до середины последней трети беременности, размораживают и поэтапно, при режимах температур от 2° до 28°C:
- гомогенизируют в буферном растворе с одновременной экстракцией в присутствии обратимых ингибиторов протеолиза и неионных детергентов при рН не менее 5,2 и не выше 8,5, в объемных соотношениях раствора и ткани не менее 1:0,5;
- отделяют гомогенат от нерастворившихся тканевых и клеточных компонентов центрифугированием при значении g интервале 10000-30000 в течение 90-30 мин соответственно;
- фильтруют супернатант поэтапно, заканчивая фильтрами с величиной пор не более 0,45 мкм;
- фильтрат подвергают анионообменной хроматографии, используя в качестве подвижной фазы солевой буферный раствор, разделяя связавшиеся с сорбентом белки и полипептиды ступенчатым градиентом с помощью элюента, имеющего ионную силу в интервале от 0,08 до 0,26 моль/л и рН от 5,2 до 8,5, повышая ионную силу подвижной фазы с шагом 0,02 моль/л, начиная собор целевых фракций с раствором, ионная сила которого не ниже 0,1;
- собранные целевые фракции обессоливают методом диализа или гельфильтрации и после добавления консервантов с бактериостатическим и фунгицидным действием в общей концентрации не более 0,06 мг/мл и солюбилизатора в общей концентрации не более 0,01 мг/мл проводят ультрафильтрацию с величиной пор не более 0,22 мкм и стерильно упаковывают.
Другой особенностью является сам биологически активный белково-полипептидный комплекс, полученный вышеуказанным способом, обладающий тканеспецифическим репаративным действием на нервную ткань и включающий отрицательно заряженные слабокислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, определяющие его биологическую и фармакологическую активность, с молекулярными массами от 5 до 200 кДа, причем не менее 80% от общей массы белка имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 до 120 кДа, и характеризующийся наличием пика при длине волны 274-284 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значений рI от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле.
При выделении целевого продукта важно, чтобы на стадиях гомогенизации и анионообменной хроматографии рН буферных сред находился в диапазоне 5,2-8,5; обязательное присутствие в буферном растворе на стадии гомогенизации и экстракции детергентов и ингибиторов протеолиза в достаточных концентрациях; на стадии анионообменной хроматографии использовались в качестве подвижной фазы растворы, имеющие ионную силу в интервале от 0,08 до 0,26 моль/л, с шагом 0,02 моль/л, рН от 5,2 до 8,5 и сбор целевых фракций начинался с элюента, ионная сила которого не ниже 0,1; в полученных целевых фракциях содержатся белки и полипептиды с молекулярными массами от 5 кДа до 200 кДа, причем содержание в комплексе белков и полипептидов с молекулярными массами от 10 кДа до 120 кДа было не менее 80% от общего содержания белка; полученный комплекс характеризуется наличием пика при длине волны 274-284 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значений рI от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле, а также наличием протеолитической активности входящих в него протеолитических белков; в качестве сырья использовался быстрозамороженный эмбриональный мозг копытных сельскохозяйственных животных со сроком гестации от конца первой трети до середины последней трети беременности. При других параметрах белково-полипептидный состав комплекса и концентрационные соотношения входящих биологически-активных компонентов будут иными.
Как отмечалось ранее, выделяемая биологически активная субстанция, представляющая собой белково-полипептидный комплекс, отличается от полученных ранее субстанций, выделенных из головного мозга животных, по источнику сырья, взятого на определенных сроках гестации, молекулярным массам входящих в него белково-полипептидных фракций, их качественному составу, по эволюционно закрепленным в онтогенезе концентрационным соотношениям белков роста, факторов дифференцировки и сигнальных молекул, по биологической и фармакологической активности, по специфичности этой активности. Выделенный методом анионообменной хроматографии, позволяющей получать целевые фракции водорастворимых белков и полипептидов, уровень заряда которых зависит от ионной силы элюента, белково-пептидный комплекс состоит из слабокислых и нейтральных протеиновых и полипептидных компонентов за счет эмпирически подобранных условий, описанных выше. Одной из отличительных особенностей в получаемом комплексе является наличие достаточно больших молекул протеинов (до 200 кДа) с отсутствием аллергезирующих и иммунотоксических свойств, что в первую очередь связано с характеристиками органоспецифического сырья (быстрозамороженный эмбриональный мозг на определенных стадиях гестации органа). Именно характеристики сырья, из которого выделяется заявляемый белково-полипептидный комплекс, обуславливают не только наличие необходимых для получения всего спектра биологической активности составляющих - факторов роста, дифференцировки тканей и клеток, сигнальных молекул, но и их концентрационные соотношения. Причем несмотря на то, что на разных стадиях гестации в определенной мере меняется качественный белково-полипептидный состав эмбрионального мозга, как сырья для выделения, при заявленном способе получения целевые компоненты, оставаясь в эволюционно закрепленных концентрационных соотношениях, обеспечивают необходимую биологически активную активность субстанции. Изменение характеристик сырья и параметров получения заявляемого белково-пептидного комплекса не только значительно снижает его биологическую активность, но и может проявится в нежелательных явлениях, таких как канцерогенность, аллергенность, иммунотоксичность и др. Лиофильное высушивание заявляемой биологически активной субстанции также значительно (до 70%) снижает его биологическую, ткане- и органоспецифическую активность.
Способ получения иллюстрируется следующими примерами.
Пример 11. Способ получения биологически активного комплекса
2
Получение белковой фракции из эмбрионального мозга овец. 200 г быстрозамороженного головного мозга эмбрионов ягнят сроком гестации 12-13 недель размораживают и гомогенизируют в 1000 мл 0,05 М ТРИС-глициново-фосфатного буфера рН 8,0, содержащего 1 мМ этилендиаминотетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 0,1% маннит, в течение 5 минут при 4°С. Гомогенат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при 20000 g в течение 60 минут и фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм при 4°С. Фильтрат наносят на уравновешенную 4 объемами 0,05М глициново-фосфатного буфера рН 8,0, содержащего 0,1 мМ ЭДТА, хроматографическую колонку объемом 200 мл с анионообменным носителем Toyopearl DEAE-650M. Разделение связавшихся с носителем белков производят ступенчатым градиентом 0,05 М, глициново-фосфатного буфера рН 8,0, содержащего 0,04 М KСl, повышая концентрацию соли с шагом 0,02 М начиная сбор целевых фракции с концентрации соли 0,06 М. Хроматографический процесс производят при температуре 2-4°С. Целевую фракцию поэтапно подвергают ультрафильтрации на установке при противодавлении не более 8,0 кгс/см через материалы с задерживающей способностью 5 кДа и 200 кДа, обессоливают, разводят 0,05 М раствором глицин-NaOH рН 7,4 до концентрации белка 1,2 мг/мл, добавляя моноолеат полиоксиэтиленсорбита (Твин-80) до его общей концентрации 0,01 мг/мл. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм. Для характеристики полученной белково-полипептидной фракции использовали методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле и аминокислотного анализа. Ультрафиолетовый спектр раствора снимают в области длин волн от 250 до 350 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 280±5 нм. Молекулярную массу белков и полипептидов, входящих в комплекс, определяют следующими методами: - гель-хроматографии на Superdex 75 («GE Healthcare») и методом денатурирующего «SDS-Page» электрофореза в 12%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков. Для калибровки колонки используют белковые стандарты с диапазоном молекулярных масс от 13 кДа до 250 кДа. Перечисленными выше методами установлено, что в состав препарата входят белки и полипептиды с молекулярной массой от 5 кДа до 200 кДа, из которых 82% имеют молекулярную массу в диапазоне от 10 до 120 кДа. Аминокислотный анализ (%): Asp - 10,82+2,5; Thr - 5,4+1,2; Ser - 5,2+1,3; Glu - 16,2+3,1; Pro - 7,045+2,4; Gly - 5,2+2,2; Ala - 5,4+1,2; Val - 7,08+2,7; Met - 2,65+1,3; He - 4,45+1,5; Leu - 9,4+2,2; Tyr - 4,02+1,1; Phe - 4,8+1,3; Orn - 0,48+0,1; Lys - 8,48+2,1; His - 2,8+0,8; Arg - 6,52+2,1.
Пример 12. Способ получения биологически активного комплекса
2
Получение белковой фракции из эмбрионального мозга поросят.200 г быстрозамороженного головного мозга эмбрионов поросят сроком гестации от 3 до 4,5-х недель размораживают и гомогенизируют в 800 мл 50 мМ Трис-малеатного буферного раствора рН 5,8, содержащего 1 мМ (ЭДТА) и 0,1% мальтозу, в течение 5 минут при 25°С. Гомогенат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при 30000 g в течении 30 минут и фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм при 25°С. Фильтрат наносят на уравновешенную 4 объемами малеатного буферного раствора рН 5,8, содержащего 0,1 мМ ЭДТА, хроматографическую колонку объемом 250 мл с анионообменным носителем DEAE-Сефароза. Разделение связавшихся с носителем белков производят ступенчатым градиентом малеатного буферного раствора рН 5,8, содержащего 0,04 М NaCl, повышая концентрацию соли с шагом 0,02 М, начиная сбор целевых фракции с концентрации соли 0,06 М. Хроматографический процесс производят при температуре 2-4°С. Целевую фракцию поэтапно подвергают ультрафильтрации на установке при противодавлении не более 8,0 кгс/см через материалы с задерживающей способностью 5 кДа и 250 кДа, обессоливают, разводят 50 мМ раствором аспартата-NaOH рН 7,4 до концентрации белка 1,0 мг/мл, добавляя моноолеат полиоксиэтиленсорбита (Твин-80) до его общей концентрации 0,005 мг/мл. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм. Для характеристики полученной белково-полипептидной фракции использовали методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле и аминокислотного анализа. Ультрафиолетовый спектр раствора снимают в области длин волн от 250 до 350 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 280±5 нм. Молекулярную массу белков и полипептидов, входящих в комплекс, определяют следующими методами: - гель-хроматографии на Superdex 75 («GE Healthcare») и методом денатурирующего «SDS-Page» электрофореза в 12%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков. Для калибровки колонки используют белковые стандарты с диапазоном молекулярных масс от 13 кДа до 250 кДа. Перечисленными выше методами установлено, что в состав препарата входят белки и полипептиды с молекулярной массой от 5 кДа до 200 кДа, из которых 82% имеют молекулярную массу в диапазоне от 10 до 120 кДа. Аминокислотный анализ полученного комплекса (%): Asp -10,82+1,3; Thr - 5,4+0,9; Ser - 5,2+1,1; Glu - 16,2+1,9; Pro - 7,045+1,7; Gly - 5,2+0,8; Ala - 5,4+1,1; Val - 7,08+2,3; Met - 2,65+0,6; He - 4,45+0,8; Leu - 9,4+2,5; Tyr - 4,02+0,6; Phe - 4,8+1,1; Orn - 0,48+0,1; Lys - 8,48+2,3; His - 2,8+0,7; Arg - 6,52+2,1.
Пример 13. Влияние биологически активного комплекса (препарата) на развитие эксплантатов головного мозга
Эксперименты проведены на 52 фрагментах коры головного мозга и 40 фрагментах спинно-мозговых ганглиев 10-12-суточных эмбрионов цыпленка. Питательная среда для культивирования эксплантатов состояла из 35% раствора Игла, 25% фетальной сыворотки теленка, 35% раствора Хенкса, 5% куриного эмбрионального экстракта, в среду добавляли глюкозу (0,6%), инсулин (0,5 ед./мл), пенициллин (100 ед./мл), глютамин (2 мМ). Фрагменты коры головного мозга или спинно-мозговых ганглиев помещали в эту среду и культивировали на коллагеновой подложке в чашках Петри в термостате при температуре 36,7°С в течение 2 суток. В экспериментальную среду добавляли исследуемый белково-полипептидный комплес и как положительный контроль - церебролизин и кортексин в концентрациях 0,5, 1, 2, 10, 20, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 нг/мл. Критерием биологической активности служил индекс площади (ИП) - соотношение площади всего эксплантата вместе с зоной роста к исходящей площади фрагмента головного мозга. Достоверность различия сравниваемых средних значений ИП оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Значения ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принималось за 100%. Зону роста контрольных эксплантатов головного мозга составляли короткие нейриты, а также выселяющиеся клетки глии и фибробластоподобные клетки. При исследовании непосредственного влияния препаратов на фрагменты головного мозга были поставлены следующие серии опытов. В питательную среду эксплантатов коры головного мозга и спинномозговых ганглиев эмбрионов цыплят добавляли церебролизин и кортексин в различных концентрациях. На 3-и сутки культивирования с добавлением церебролизина при концентрации 100 нг/мл наблюдалось достоверное повышение ИП эксплантатов коры головного мозга на 24±3,5% по сравнению с контрольными значениями ИП. Достоверных значений ИП эксплантатов коры при действии других концентраций церебролизина не наблюдалось. На 3-и сутки культивирования с добавлением кортексина при концентрации 50 нг/мл наблюдалось достоверное повышение ИП эксплантатов коры головного мозга на 32±4% по сравнению с контрольными значениями ИП. Отмечалось достоверное повышение ИП эксплантантов коры головного мозга при концентрации кортексина 100 нг/мл на 28+3,5%, концентрации 200 нг/мл на 23+2%. Достоверных значений ИП эксплантатов коры при действии других концентраций кортексина не наблюдалось. Отчетливая стимуляция развития эксплантатов коры головного мозга выявилась при действии исследуемого комплекса в концентрации 20 нг/мл, когда ИП экспериментальных эксплантатов на 48±4,5% был достоверно выше, чем ИП контрольных эксплантатов и эксплантатов сравнения при действии кортексина и церебролизина. При добавлении церебролизина в среду для культивирования эксплантатов спинно-мозговых ганглиев достоверного увеличения ИП эксплантатов не отмечалось, в то время как при добавлении в среду кортексина наблюдалось увеличение ИП эксплантата на 22±3%. При добавлении исследуемого комплекса в среду для культивирования эксплантатов спинно-мозговых ганглиев наблюдалось увеличение ИП эксплантата на 36±3,5%. При исследовании эксплантатов коры головного мозга и спинно-мозговых ганглиев на более длительных сроках культивирования - 7 дней - выявились те же эффекты нейрит-стимулирующего действия в тех же концентрациях исследуемого комплекса. Таким образом, в отношении тканей головного мозга наблюдалось уменьшение порога эффективных концентраций для исследуемого белково-полипептидного комплекса по сравнению с церебролизином и кортексином. Так, увеличение зоны роста эксплантатов фрагментов коры головного мозга выявлялось при действии церебролизина только в концентрации 100 нг/мл, кортексина только в концентрациях 50 и 100 нг/мл, а при действии исследуемого белково-полипептидного комплекса - в концентрации 20, 10, 50 и 100 нг/мл соответственно. При этом интенсивность стимулирующего действия белково-полипептидного комплекса была достоверно выше, чем кортексина и церебролизина. На увеличение зоны роста эксплантатов спинно-мозговых ганглиев церебролизин достоверного действия не оказывал, кортексин достоверно увеличивал ИП на 24%, в то время как исследуемый белково-полипептидный комплекс способствовал увеличению ИП на 36%. Это свидетельствует о выраженном и направленном стимулирующем действии препарата на нейроны различных отделов головного мозга.
Пример 14. Изучение токсичности биологически активного комплекса
Общетоксическое действие белково-полипептидного комплекса исследовали в режимах острой токсичности при однократном введении, а также подострой и хронической токсичности при длительном введении комплекса[5]. Исследование по изучению острой токсичности проведено на 72 белых беспородных мышах-самцах с массой тела 20-22 г. Животные были рандомизированно разделены на 6 равных групп. Комплекс вводили животным однократно внутримышечно в дозах 5 мг/кг, 10 мг/кг, 100 мг/кг, 200 мг/кг, 500 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,05 М глицин-NaOH раствора рН 7,5. Животным контрольной группы в том же объеме вводили стерильный 0,05 М глицин-NaOH раствор рН 7,5. Исследования по изучению подострой токсичности проведены на 95 белых беспородных крысах-самцах с массой тела 150-180 г. Ежедневно однократно животным подопытных групп вводили белково-полипептидный комплекс внутримышечно в течение 90 дней в дозах 1 мг/кг, 10 мг/кг, 50 мг/кг, 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,05 М глицин-NaOH раствора рН 7,5. Животным контрольной группы вводили в том же объеме стерильный 0,05 М глицин-NaOH раствор рН 7,5. До введения комплекса и на 30, 60 и 90 сутки после начала введения у животных исследовали морфологический состав и свойства периферической крови. При завершении эксперимента исследовали биохимические и коагулологические показатели крови.
Исследования по изучению хронической токсичности проводили в течение 6 месяцев на 112 морских свинках-самцах с массой тела 250-280 г. Животные подопытных групп получали ежедневно однократно внутримышечно белково-полипептидный комплекс в течение 6 мес. в дозах 1 мг/кг, 10 мг/кг, 50 мг/кг, 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,05 М глицин-NaOH раствора рН 7,5. В контрольной группе животным вводили по аналогичной схеме стерильный 0,05 М глицин-NaOH раствор рН 7,5 в том же объеме. У животных в периферической крови общепринятыми методами определяли: количество эритроцитов, гемоглобина, ретикулоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), резистентность эритроцитов. Наряду с этим определяли содержание в сыворотке крови общего белка по методу Лоури, калия и натрия методом плазменной спектрофотометрии. После завершения эксперимента проводили патоморфологическое исследование головного и спинного мозга, спинномозговых ганглиев, щитовидной железы, паращитовидных желез, надпочечников, семенников, гипофиза, сердца, легких, аорты, печени, почек, мочевого пузыря, поджелудочной железы, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, тимуса, селезенки, лимфатических узлов, костного мозга. При изучении острой токсичности установлено, что однократное введение исследуемого комплекса животным в дозе, превышающей терапевтическую, рекомендованную для клинического применения, более чем в 5000 раз, не вызывает токсических реакций, что свидетельствует о большой терапевтической широте комплекса.
Изучение подострой и хронической токсичности комплекса свидетельствует об отсутствии побочных эффектов при его длительном применении в дозах, превышающих предполагаемую терапевтическую в 3000 раз. При исследовании влияния комплекса на морфологический состав и биохимические показатели периферической крови морских свинок через 3 и 6 месяцев после начала его введения достоверного изменения показателей не выявлено.
При оценке общего состояния животных морфологических и биохимических показателей периферической крови, морфологического состояния внутренних органов, состояния сердечно-сосудистой и дыхательной систем, функции печени и почек патологические изменения в организме не обнаружены. Следовательно, белково-полипептидный комплекс, полученный предлагаемым способом, при длительном введении животным не обладает токсическими свойствами, препятствующими дальнейшему его применению в качестве лекарственного средства, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения.
Пример 15. Мутагенность субстанции
Для оценки мутагенных свойств заявляемого белково-полипептидного комплекса применили набор следующих тестов: - учет генных мутаций в тесте Эймса Salmonella /микросомы с использованием в качестве тест-объектов штаммов Salmonella typhimurium ТА 97, ТА 98 и ТА 100; - учет микроядер в клетках костного мозга мышей. Испытан образец белково-полипептидного комплекса, представляющий собой прозрачную жидкость, стерильно упакованную во флакон темного стекла в количестве 20 мл, содержащую субстанцию в концентрации 2,3 мг/мл.
Оценка мутагенных свойств белково-полипептидного комплекса в тесте Эймса
Мутационный тест на Salmonella typhimurium является бактериальной тест-системой для учета генных мутаций к прототрофности по гистидину при действии химических соединений и (или) их метаболитов, индуцирующих мутации типа замены оснований или сдвига рамки считывания в геноме этого организма. Мутагены, индуцирующие замены пар оснований - агенты, вызывающие мутации замены пар оснований в молекуле ДНК. Мутагены, индуцирующие мутации сдвига считывания генетического кода (фреймшифт мутации), -агенты, вызывающие добавление или нехватку одиночных или множественных пар оснований в молекуле ДНК.
Данный метод предназначен для выявления способности фармакологических веществ или их метаболитов индуцировать генные мутации у индикаторных штаммов Salmonella typhimurium. Бактерии обрабатываются тестируемым соединением с системой метаболической активации (СМ+) или без метаболической активации (СМ-). После инкубации в течение определенного периода времени подсчитывается количество ревертантных колоний у разных тестерных штаммов в сравнении с количеством спонтанных ревертантов в вариантах негативного контроля (необработанные культуры или культуры, обработанные растворителем). Если тестируемое соединение и (или) его метаболиты обладают мутагенной активностью, то они будут индуцировать обратные мутации от ауксотрофности к прототрофности по гистидину у гистидин-зависимых штаммов Salmonella typhimurium.
Для тестирования использовали набор индикаторных штаммов Salmonella typhimurium, позволяющий регистрировать мутации типа сдвига рамки считывания генетического кода (ТА 98 и ТА 97) и замены пар оснований (ТА 100). Штаммы получены из Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИ Генетика.
Регламент работы с бактериальными культурами, проверка генотипов штаммов, правила их музейного хранения, необходимые для проведения экспериментов оборудование, посуда, реактивы и питательные среды и растворы, проведение работ по получению гомогената печени крыс и составление активирующей смеси, а также методы статистического анализа полученных результатов соответствовали стандартным, подробно описанным в соответствующей литературе.
Для метаболической активации использовали фракцию S9 печени самцов крыс Вистар, которым за 5 дней до забоя вводили индуктор микросомальных ферментов - совол (300 мг/кг, однократно, внутрибрюшинно). Для контроля активности системы метаболической активации использовали бромид этидия (10 мкг/чашку) на штамме ТА 98 при СМ+.
Белково-полипептидный комплекс в виде стерильного раствора с содержанием белка 2,3 мг/мл исследовали 0,3 и 0,1 мл исходного раствора на чашку и три 10-кратных разведения в физиологическом растворе (по 0,1 мл/ч). Тестируемые дозы субстанции составили 690; 230; 23; 2,3 и 0,23 мкг на чашку.
Эксперимент сопровождали положительными контролями, в качестве которых использовали вещества, индуцирующие мутации у соответствующих штаммов-тестеров при наличии или отсутствии условий активации. Для вариантов без активации использовали азид натрия в количестве 10 мкг на чашку для штамма ТА 100 при СМ-; 2,7-диамино-4,9-диокси-5,10-диоксо-4,5,9,10-тетрагидро-4,9-диазопирен (ДИАМ) - 10 мкг на чашку для штамма ТА 98 при СМ-; 9-аминоакридин (9АА) - 50 мкг/чашку для штамма ТА 97 при СМ-. Для контроля активности системы метаболической активации использовали этидиум бромид - 10 мкг на чашку на штамме ТА 98 при СМ+. В качестве негативного контроля использовали физиологический раствор (0,1 мл на чашку).
Селективный полуобогащенный агар (0,7%) в пробирках плавили в водяной бане при 100°С и помещали в термостатируемую водяную баню с температурой 45-46°С.
Сначала в пробирки с агаром вносили 0,1 мл образца в необходимых разведениях, затем - 0,1 мл суспензии бактерий и 0,5 мл микросомальной активирующей смеси (для варианта с метаболической активацией). Затем содержимое пробирки быстро перемешивали и выливали на слой нижнего минимального агара в чашки Петри. Продолжительность времени внесения микросомальной активирующей смеси и розлива полужидкого агара на чашку не превышала 10-15 секунд. Чашки оставляли при комнатной температуре на 30-40 минут и после полного застывания агара переносили в термостат при 37°C. Учет результатов проводили через 48 часов инкубации.
Параллельно в опыт включали варианты без системы метаболической активации (СМ-) и в присутствии системы метаболической активации (СМ+). В варианте СМ- может быть зарегистрировано действие прямых мутагенов, то есть препаратов, проявляющих мутагенный эффект за счет активности исходной структуры вещества. Действие же промутагенов, то есть соединений, эффект которых связан с образованием мутагенных метаболитов, может быть учтено при сравнении результатов, полученных при анализе данных испытаний вещества в вариантах СМ- и СМ+. В каждом контрольном и опытном вариантах использовали по 2 чашки. Мутагенный эффект считали значимым, если среднее количество колоний ревертантов на чашку в опытном варианте превышало таковое в контрольном варианте в 2 и более раз. Результаты эксперимента учитывали при наличии стандартного ответа во всех вариантах позитивного и негативного контроля. Количество колоний ревертантов в контроле с растворителем в вариантах СМ- и СМ+ было в пределах колебаний спонтанного уровня для данных штаммов. Ответ штаммов на стандартные мутагены был в пределах обычных уровней.
Исследованный белково-полипептидный комплекс во всех тестируемых концентрациях не показал мутагенного эффекта на штаммах ТА 100, ТА 98 и ТА 97 в вариантах без- и в присутствии системы метаболической активации.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ: белково-полипептидный комплекс не обладает способностью индуцировать генные мутации на тестерных штаммах Salmonella typhimurium во всем диапазоне испытанных концентраций.
Оценка мутагенных свойств белково-полипептидного комплекса микроядерным методом в клетках млекопитающих
Цитогенетическая активность - способность вещества вызывать структурные и численные хромосомные нарушения в соматических и зародышевых клетках.
Микроядра - небольшие ДНК-содержащие образования, состоящие из ацентрических фрагментов хромосом или отставших на стадии анателофазы хромосом. На стадии телофазы эти фрагменты могут включаться в ядра дочерних клеток или образовывать одиночные или множественные микроядра в цитоплазме.
Цель исследования - выявление и количественная оценка цитогенетической (мутагенной) активности фармакологических средств в полихроматофильных эритроцитах (ПХЭ) костного мозга млекопитающих. Метод основан на микроскопической регистрации клеток с микроядрами.
Эксперименты проводили на самцах и самках мышей-гибридов F1(CBAx C57B 16/J) двухмесячного возраста массой 18-20 г. В состав каждой группы входило по 6 особей. Животных содержали при 12-часовом световом режиме в условиях свободного доступа к воде и пище. Эксперименты на животных по оценке мутагенных свойств белково-полипептидного комплекса при однократном и пятикратном введении осуществляли в соответствии с официальными протоколами. Проведено 3 серии экспериментов с соответствующими контролями: терапевтическая доза испытана на самцах при однократном введении; субтоксическая доза испытана на самцах при однократном введении; терапевтическая доза испытана на самцах и самках при пятикратном введении.
Учитывая, что возможным предполагаемым способом применения биологически активного белково-полипептидного комплекса в клинике - внутривенный или эндолюмбальный в данном исследовании использовали внутрибрюшинное введение субстанции мышам. Дозу белково-полипептидного комплекса для оценки мутагенной активности рассчитывали исходя из наибольшей рекомендованной суточной терапевтической дозы (ТД) для человека. Рекомендовано внутривенное введение белково-полипептидного комплекса в количестве 2 мл при концентрации 0,5 мг/мл. При этом терапевтическая доза (ТД) для человека, в том числе для ребенка, может составить 0,05 мг/кг/сутки. Для расчета дозы в экспериментах на мышах рекомендуется использовать коэффициент пересчета, учитывающий соотношение площади поверхности тела и массы тела человека и мыши. В нашем исследовании он составил 8,33. Поэтому в качестве ТД для мышей использовали дозу, приблизительно равную 8,33 ТД для человека (0,42 мг/кг).
В качестве субтоксической использовали максимально возможную в условиях данного эксперимента дозу 23 мг/кг, поскольку вещество было предоставлено в концентрации 2,3 мг/мл, а общепринятое количество вещества, вводимое мышам, составляет 0,1 мл на 10 г веса. Соответственно в пересчете для человека максимальная испытанная доза составляет 2,76 мг/кг.
Было сформировано 7 групп животных (табл.№2): четыре опытных и три соответствующих контрольных. Субстанцию в дозе 0,42 мг/кг вводили пятикратно с интервалом 24 часа самцам и самкам. Забой во всех группах проводили через 6 часов после последнего введения белково-полипептидного комплекса.
В двух других опытных группах белково-полипептидный комплекс вводили однократно самцам в дозах 0,42 мг/кг и 23 мг/кг.
В качестве негативного контроля использовали растворитель - физраствор. Его вводили внутрибрюшинно самцам и самкам двух контрольных групп в те же сроки и в тех же объемах, что и животным опытных серий. В качестве позитивного контроля использовали циклофосфамид в дозе 20 мг/кг, растворенный ex tempore в физрастворе при однократном внутрибрюшинном введении за 24 часа до забоя.
Препараты клеток костного мозга для учета микроядер готовили общепринятым способом в соответствии с методическими рекомендациями «Оценка мутагенной активности факторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих микроядерным методом». Животных умерщвляли методом цервикальной дислокации через 6 часов после последнего введения препарата. Выделяли обе бедренные кости и очищали их от мышц. Для вымывания костного мозга использовали эмбриональную телячью сыворотку (НПП ПанЭ-КО). Костный мозг из обеих бедренных костей вымывали шприцем в микропробирку. Суспензию центрифугировали при 1000 об/мин, в течение 5 минут, супернатант удаляли, осадок осторожно ресуспендировали. Из капли суспензии готовили мазок, высушивали его на воздухе. Фиксировали метанолом 3 минуты. Окрашивали по методу Романовского-Гимза. Анализировали на зашифрованных препаратах по 2000 полихроматофильных эритроцитов от каждого животного. При подсчете 500 эритроцитов определяли соотношение полихроматофильных и нормохромных эритроцитов. Препараты расшифровывали по окончании анализа.
Критерием позитивного результата является воспроизводимое и статистически значимое увеличение числа полихроматофильных эритроцитов с микроядрами по крайней мере в одной из опытных групп по сравнению с контрольной. Полученный положительный результат свидетельствует, что вещество индуцирует хромосомные повреждения и/или нарушения митотического аппарата клеток у экспериментальных животных.
Статистическую обработку результатов по учету микроядер проводили путем сравнения опытных серий с контрольными по критерию Х2; межгрупповое сравнение доли полихроматофильных эритроцитов проводили с помощью критерия Манна-Уитни.
Результаты учета микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей: во всех вариантах опыта белково-полипептидный комплекс не вызывал увеличения частоты клеток с микроядрами в костном мозге мышей при сравнении опытных и соответствующих контрольных серий. Циклофосфамид (позитивный контроль) при внутрибрюшинном введении самцам мышей в дозе 20 мг/кг вызывал повышение частоты клеток с микроядрами в 19,6 раза (62,1‰ против 3,16‰ в контроле, Р<0,001). Доля ПХЭ от общего числа эритроцитов костного мозга была приблизительно на одном уровне в группах опытных и контрольных серий, что свидетельствует об отсутствии токсического действия субстанции в испытанных дозах на кроветворение. При действии позитивного контроля (циклофосфамида) отмечен сдвиг соотношения полихроматофильных и нормохромных эритроцитов в сторону последних (при сравнении с контролем Р<0,005).
Таким образом, мутагенная активность белково-полипептидного комплекса не выявлена в тесте на индукцию микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей при условии однократного и пятикратного введения самцам и самкам внутрибрюшинно в дозе 0,42 мг/кг массы тела, что в пересчете соответствует суточной терапевтической дозе для человека. Мутагенная активность не выявлена также в условиях однократного введения белково-полипептидного комплекса самцам в максимально возможной дозе 23 мг/кг. Белково-полипептидный комплекс не проявил токсического действия по показателю «доля полихроматофильных эритроцитов».
Заключение по оценки мутагенных свойств белково-полипептидного комплекса
Белково-полипептидный комплекс не обладает мутагенной активностью в тесте Эймса Salmonella / микросомы и в тесте на индукцию микроядер в клетках костного мозга мышей в условиях экспериментов, проведенных в соответствии с Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ.
Пример 16. Специфическая активность субстанции [6,7]. Местнораздражающее действие
Проведенные исследования показали, что при подкожном, внутривенном и интраназальном введении субстанции биологически активного белково-полипептидного комплекса не оказывает местнораздражающего действия. При быстром внутривенном введении возможны эффекты гипертермии. Не обнаружено местнораздражающего действия на слизистую носа и горла при интраназальном введении кроликам в течение 1 месяца.
Исследование иммуннотоксических и аллергизирующих
свойств
Активная кожная анафилаксия
Опыт проводили на морских свинках в количестве по 10 голов в группе, всего 3 группы. Сенсибилизировали животных по схеме: первая инъекция подкожно, две последующие внутримышечно через день в область бедра. На 14 день на выстриженных участках спины морским свинкам вводили субстанцию внутрикожно в двукратных разведениях. Для контроля реактивности кожи вводили физиологический раствор тому же животному на другой выстриженный участок кожи. Контрольным животным вводили разрешающую инъекцию субстанции (равную сенсибилизирующей дозе). Затем животным вводили внутривенно по 0,5 мл 1% раствора синего Эванса. Через 30 минут животных умерщвляли эфиром и определяли размер синего пятна на внутренней стороне кожи в месте введения. Положительной считается реакция при размере пятна выше 6 мм, не более 3 мм в контроле. В трех случаях отмечена положительная реакция в группе животных, получавшей препарат в дозе 10-кратно превышающей терапевтическую. Количество реакций свидетельствует о возможности индивидуальных реакций.
Реакция гиперчувствительности замедленного типа на мышах
Опыты проводили на нелинейных мышах массой 18-20 г, по 10 животных в группе. Общее количество животных в опыте - 30. Животных однократно сенсибилизировали внутрикожно в основании хвоста эмульсией препарата в НАФ (1:1). Доза введения составила 60 мкл. Контрольных животных сенсибилизировали эмульсией ПАФ с раствором Хенкса (1:1). Для выявления сенсибилизации через 5 суток мышам в подушечку задней лапы ввели 40 мкл раствора тест-препарата в растворе Хенкса. Через 24 часа после тестирования измеряли величину отека с помощью инженерного микрометра МК-0-25. При статистической обработке полученных результатов не обнаружена достоверная разница в толщине лапок опытных групп и контрольной (Р>0,05). Введение субстанции не вызывает реакции гиперчувствительности замедленного типа.
Исследование фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов
3
Постановку реакции проводили на белых крысах массой 180-200 г. Общее число животных в опыте - 30, по 10 в каждой группе. Исследовали две дозы препарата: терапевтическую и десятикратно ее превышающую, треть группы - контроль. Метод основан на определении оптической плотности лизирующего раствора после разрушения фагоцитов, поглотивших частицы нейтрального красного. Крыс, подвергнутых воздействию исследуемого препарата, забивали методом декапитации. Асептически внутрибрюшинно вводили 5 мл среды 199, содержащей 20% ЭТС (эмбриональная телячья сыворотка). После массажа брюшной полости среду отсасывали шприцем. Порции клеточной суспензии, полученные от всей группы животных, объединяли в общий пул. Концентрацию живых клеток доводили до 1,5×10 клеток/мл. Суспензию клеток стерильно разливали по 2 мл в пластиковые чашки Петри диаметром 40 мм. Чашки инкубировали 2 часа при 37°C. Надосадок, содержащий не прилипшие клетки, сливали, а фиксированный на пластике монослой дважды промывали средой 199. В слегка подсушенные чашки наливали раствор, содержащий нейтральный красный, и выдерживали при 37°C в течение 1 часа. Раствор сливали. Клетки промывали средой 199. В каждую чашку вносили по 3 мл лизирующего раствора. Клетки тщательно обрабатывали вращательным движением чашки. Раствор сливали в пробирки и на спектрофотометре при длине волны 540 нм измеряли оптическую плотность.
При введении субстанции фагоцитарная активность магрофагов не снижается. Статистически достоверных различий между показателями в опытных группах и контрольной нет.
Реакция дегрануляции тучных клеток
Постановку реакции проводили на крысах массой 180-200 г, самках.
Общее количество животных в опыте - 30. Раствор субстанции внутрибрюшинно в терапевтической дозе и десятикратно ее превышающей, контролем служила интактная группа. Для получения взвеси тучных клеток животных забивали декапитацией, в брюшную полость вводили буфер; после массажа передней брюшной стенки взвесь тучных клеток собирали в центрифужные пробирки. Препараты готовили на предметных стеклах, окрашенных 0,3% спиртовым раствором нейтрального красного. К 0,03 мл взвеси тучных клеток добавляли 0,03 мл сыворотки опытного животного и 0,03 мл исследуемого препарата в разведении 1:100. В контроле дегрануляция не превышала 5%. Препараты накрывали покровным стеклом, края которого герметизировали парафином. Затем инкубировали 15 минут в термостате при 37°C. Препараты микроскопировали под увеличением Х40, подсчитывая тучные клетки, подвергшиеся дегрануляции и нормальные, в сумме 100. Реакцию считали положительной, если степень дегрануляции превышала 20%.
Введение субстанции в концентрации 0,01 мг/кг не вызывает дегрануляции тучных клеток, не отличается от контроля, и не превысило порогового значения 5%. Реакция в группе с введением в дозе десятикратного превышения терапевтической - слабоположительная, однако эти значения не выходят за статистический процент ошибки.
Исследование на прионы
Пробы брали из 4-х флаконов. Реакцию проводили методом иммуноферментного анализа на 96-луночном полистироловом планшете. Диагностическая тест-система - PrionScreen. Спектрофотометр Digiscan. Каждую пробу ставили в 4-х повторениях. Контроли: К-: 8 лунок, К+: 8 лунок. Полученные оптические плотности контролей и исследуемых образцов соответствовали условиям проведения реакции. Результаты: инфекционные белки, прионы в исследуемой субстанции не обнаружены.
Общее заключение
Проведены исследования токсичности в остром и субхроническом эксперименте оригинальной субстанции биологически активного белково-полипептидного комплекса, а также изучение его местнораздражающего, иммунотоксического действия, аллергизирующих свойств и выявление наличия прионовых инфекций.
Острую токсичность препарата изучали в эксперименте на мышах линии BALB/C. Препарат вводили тремя способами: подкожно, внутрибрюшинно и перорально. Максимально возможная для введения мышам доза составляет 0,2 мл, что составило 10 мг/кг. Было выявлено, что в указанной дозе во всех трех способах введения препарат не вызывал гибели животных, симптомов острого отравления получено не было.
Исследования в субхроническом эксперименте проводили на половозрелых и отдельно на неполовозрелых крысах линии Вистар. Исследуемый препарат вводили подкожно в терапевтической дозе 0,01 мг/кг и десятикратно превышающей 0,1 мг/кг; внутривенно в дозе 0,0025 мг/кг и ×10-0,025 мг/кг. Интраназально по 1 впрыску 1 раз в день, что составило 1,5 мг/мл 0,2 мл, изучали на кроликах породы Шиншилла. При исследовании токсичности использовали общепринятые методы исследования гематологических, биохимических показателей крови, а также гистологических исследований внутренних органов.
Было получено, что введение субстанции различными способами как в терапевтической дозе, так и в десятикратно превышающих в течение 1 месяца не вызывало изменений внутренних органов, не оказывало токсического действия на систему крови. Не оказывало местнораздражающего действия при различных способах введения.
Исследование аллергизирующих свойств проводили на морских свинках при внутрикожных аппликациях. Было обнаружено, что субстанция не вызывала аллергических реакций в терапевтических дозах. Отмечено 3 случая повышенной чувствительности животных к препарату в дозе, в 10 раз превышающую терапевтическую. Исследование иммуннотоксичности проведено на макрофагах крыс линии Вистар и не обнаружило данного эффекта. Проведены исследования препарата на наличие прионовых инфекций методом иммунноферментного анализа. Препарат оказался свободным от искомых возбудителей.
Пример 17. Действие на цитокинетические параметры клеточной популяции
Материалы и методы. Мышиные фибробласты 3Т3 культивировали на среде ДМЕМ (ПанЭко, Москва) с добавлением 584 мг/л глютамина, противогрибково-противомикробного препарата (Sigma, США) согласно инструкции производителя и 10% по объему стандартизованной эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США). Для проведения экспериментов клетки высаживали на 24-х луночные планшеты (Coming) в концентрации 3000 клеток на мл (на лунку). Для морфологических исследований в лунки планшета помещали покровные стекла диаметром 12 мм (Ted Pella, США) и высаживали клетки на них.
Внесение тестируемых веществ. По достижении клеточной культурой требуемой плотности заменяли среду культивирования на свежую того же состава (контроль), на ДМЕМ без сыворотки с добавлением 2 мг/мл БСА (Sigma) (отрицательный контроль), ДМЕМ без сыворотки с добавлением 10% по объему биологически активной субстанции (опыт 1) и ДМЕМ с добавлением 10% сыворотки и 10% биологически активной субстанции (опыт 2).
Экспериментальные процедуры. Клетки анализировали через 8, 24 и 48 часов после внесения тестируемых реактивов. Состояние культуры in vivo анализировали и фотографировали клетки с помощью фазово-контрастного инвертированного микроскопа Axiovert 200M (Carl Zeiss, Германия), оснащеного объективом ЕС Plan-Nefluar 10x NA 0,5 и цифровой камерой ORCA II Erg-2 (Hamamatsu Photonics, Япония). Для определения количества клеток диссоциировали клеточный пласт смесью р-ра Версена (ПанЭко) и 0,025% р-ра трипсина (ПанЭко) в отношении 3:1. Полученную суспензию центрифугировали при 300g, осадок ресуспендировали в растворе Хэнкса (ПанЭко) и считали в камере Горяева. Для анализа цитокинетических параметров популяции клетки, выращенные на покровных стеклах, фиксировали 1% глютаровым альдегидом на 0,1М фосфатном буфере при +4С, пермеабилизировали 0,5% р-ром Тритона Х-100 на PBS 10 минут, промывали дистиллированной водой и окрашивали гематоксилином Майера (90 секунд) (Sigma), обезвоживали и заключали в DePeX. После пермеабилизации также окрашивали клетки DAPI (0,1 мкг/мл) и заключали в Moviol. Полученные препараты изучали с помощью флуоресцентного микроскопа Axioskop II (Carl Zeiss), используя объективы Plan-Neofluar 40x NA 1,2 и 100х NA 1,3.
Результаты. Цитокинетические параметры популяций
Контроль.
8 часов. Митотический индекс - 8%. Апоптоз и некроз - 0%.
24 часа. Митотический индекс - 11,9%. Апоптоз и некроз - 0%.
Количество клеток в лунке - 265000.
48 часов. Митотический индекс - 9%. Апоптоз и некроз - 0%.
Количество клеток в лунке - 780000.
БСА. 8 часов. Митотический индекс - 5%. Апоптоз и некроз - 0%.
24 часа. Митотический индекс - 5,5%. Апоптоз и некроз - 0%.
Количество клеток в лунке - 167500.
48 часов. Митотический индекс - 3%. Апоптоз и некроз - 0%.
Количество клеток в лунке - 625000.
Биологически активная субстанция.
8 часов. Митотический индекс - 6%. Апоптоз и некроз - 0%.
24 часа. Митотический индекс - 7,1%. Апоптоз и некроз - 0%.
Количество клеток в лунке - 250000.
48 часов. Митотический индекс - 6%. Апоптоз и некроз - 0%.
Количество клеток в лунке: посчитано 187000, реально ≈ 400000 (выброс).
Сыворотка + биологически активная субстанция.
8 часов. Митотический индекс - 8%. Апоптоз и некроз - 0%.
24 часа. Митотический индекс - 4,5% (выброс). Апоптоз и некроз - 0%. Количество клеток в лунке - 317500.
48 часов. Митотический индекс - 9%. Апоптоз и некроз - 1%.
Количество клеток в лунке - 680000.
Все экспериментальные линии демонстрируют прирост биомассы, не наблюдается цитотоксического действия ни в одном из случаев. В отрицательном контроле эффективность пролиферации минимальна, в присутствии белково-полипептидного комплекса наблюдается стимуляция пролиферации по сравнению с отрицательным контролем. Положительный контроль и среда с добавлением субстанции и сыворотки показывают одинаковый уровень пролиферации.
Клетки, инкубированные в присутствие субстанции, формируют тонкие длинные отростки. Особенно хорошо заметно на первые сутки эксперимента. В присутствие сыворотки на фоне субстанции эффект сохраняется.
Выводы:
1) Биологически активная субстанция, состоящая из белково-полипептидного комплекса, не является цитотоксичным препаратом.
2) Субстанция содержит ростовые факторы, однако не так эффективна в качестве стимулятора пролиферации, как эмбриональная сыворотка крови.
3) Субстанция вызывает изменение формы клеток с хорошо заметным формированием отростков.
Пример 18. Влияние на кровоснабжение мозга и выживаемость крыс в условиях его ишемического поражения
Исследование проводили на крысах-самцах линии Вистар массой 180-250 г в условиях необратимой двусторонней окклюзии общих сонных артерий по общеизвестной методике [8-10]. Все ветеринарные манипуляции проводились в асептических условиях, позволяющие сохранить статус экспериментальных животных. Для содержания экспериментальных животных использовали стандартные условия [11].
У крыс под эфирным наркозом (эфир диэтиловый х/ч, ОАО «Медхимпром») в области шеи по средней линии делали небольшой разрез кожи длиной 8-10 мм для обеспечения доступа к сонным артериям. Выделяли обе сонные артерии, отделяя блуждающий и симпатический нервы, проходящие вместе с артериями. Под сосуды подводили шелковые лигатуры (Silk blk 17×45 CM/M3/USP2/ Non needled/ «Ethicon Johnson & Johnson», кат. №W203) и вместе с ассистентом производили одномоментную перевязку обеих сонных артерий тройным хирургическим узлом. Кожный разрез зашивали хирургическим шелком (Silk blk 100 см/M5/Sgle armed KP-3USP2/ Non needled/ «Ethicon Johnson & Johnson», кат. №W794), накладывая один или два хирургических кожных шва, с последующей обработкой раны 5% раствором настойки йода. Физиологический раствор или целлекс вводили внутрибрюшинно. Продолжительность всех манипуляций составляет 8-10 минут, затем животных помещают в клетку.
Выживаемость животных отслеживали сразу после проведения процедуры перевязки и в течение первых суток, т.е. конечную выживаемость, фиксировали через 24 часа. Биологическая активность препарата в виде защиты головного мозга в условиях неполной глобальной ишемии при одномоментной перевязке сонных артерий оценивалась следующим образом:
- выраженная - при выживании более 80% крыс,
- средневыраженная - при выживании 70-80% крыс,
- невыраженная - при выживании менее 70% крыс.
Статистическую обработку данных проводили с использованием точного критерия Фишера с учетом множественности сравнений.
Опыт 1
Для исследования использовали три группы животных:
- группа 1 - контрольные животные после перевязки сонных артерий, получавшие физиологический раствор стерильным одноразовым инсулиновым шприцем 0,5 мл на крысу через 1 час и 0,5 мл на крысу через 5 часов после перевязки сонных артерий;
- группа 2 - ложнооперированные животные, у которых проводились те же манипуляции, что и у контрольных, только без перевязки сонных артерий, которым вводили физиологический раствор 0,5 мл на крысу через 1 час и 0,5 мл на крысу через 5 часов;
- группа 3 - животные после перевязки сонных артерий, которым вводили биологически активную субстанцию в дозе 0,5 мл 0,1% раствора (0,2 мг/кг) на крысу через 1 час и 0,5 мл на крысу через 5 часов.
Проведенные опыты показали, что в контрольных опытах после перевязки обеих сонных артерий в первый час погибает наибольшее количество животных, т.е. 11 из 24, а через сутки еще 4 животных, всего погибло 15 крыс из 24 (63%, табл.1). Среди ложнооперированных животных погибло 2 крысы сразу после операции (17%). Биологически активная субстанция при введении крысам через 1 час и 5 часов по 0,2 мг/кг (0,5 мл 0,1% раствора) внутрибрюшинно вызывал гибель только двух животных, а 34 из 36 крыс выжило. Увеличение выживаемости животных по сравнению с контролем составляет 95%. Полученные данные представлены в таблице 8.
Таблица 8
Влияние биологически активной субстанции на выживаемость крыс в условиях перевязки обеих сонных артерий
Группы животных
Выраженная биоактивность
выжившие
умершие
1 группаКонтроль - 24 крысы
9 из 24
15 из 24
(37%)
(63%)
2 группаЛожно оперированные - 12 крыс
10 из 12*
2 из 12
(83%)
(17%)
3 группа Субстанция 0,2 мг/кг - 36 крыс
34 из 36*
2 из 36
(95%)
(5%)
*-Р≤0,01 по сравнению с контролем
Таким образом, биологически активная субстанция, представляющая собой белково-полипептидный комплекс, оказывает статистически значимое увеличение выживаемости животных по сравнению с контролем в условиях неполной глобальной ишемии мозга, вызываемой одномоментной перевязки обеих сонных артерий.
Опыт 2
Для исследования использовали три группы животных:
- группа 1 - контрольные животные после перевязки сонных артерий, получавшие физиологический раствор стерильным одноразовым инсулиновым шприцем 0,5 мл на крысу через 1 час и 0,5 мл на крысу через 5 часов после перевязки сонных артерий;
- группа 2 - животные после перевязки сонных артерий, которым вводили биологически активную субстанцию в дозе 0,5 мл 0,1% раствора (0,2 мг/кг) на крысу через 1 час и 0,5 мл на крысу через 5 часов;
- группа 3 - животные после перевязки сонных артерий, которым вводили лиофилизированную биологически активную субстанцию в дозе 0,2 мг/кг, сухую навеску 0,1 мг разводили 1,0 мл физиологическим раствором и вводили на крысу 0,5 мл через 1 час и 0,5 мл на крысу через 5 часов.
Проведенные опыты показали, что в контрольной группе после перевязки обеих сонных артерий в первый час погибает наибольшее количество животных, т.е. 11 из 24, а через сутки еще 4 животных, всего погибло 15 крыс из 24 (63%, табл.1). Разведенная лиофилизированная биологически активная субстанция при введении крысам через 1 час и 5 часов по 0,2 мг/кг (0,5 мл 0,1% раствора) внутрибрюшинно вызывал гибель четырех животных, а 8 из 12 крыс выжило. Биологически активная субстанция при введении крысам через 1 час и 5 часов по 0,2 мг/кг (0,5 мл 0,1% раствора) внутрибрюшинно вызывал гибель только двух животных, а 34 из 36 крыс выжило. Увеличение выживаемости животных по сравнению с контролем составляет 95%. Полученные данные представлены в таблице 9.
Таблица 9
Влияние биологически активной субстанции на выживаемость крыс в условиях перевязки обеих сонных артерий
Группы животных
Выраженная биоактивность
Выжившие
умершие
1 группаКонтроль - 24 крысы
9 из 24
15 из 24
(37%)
(63%)
2 группа
8 из 12*
4 из 12
Лиофилизат 12 крыс
(66,7%)
(33,3%)
3 группаСубстанция 0,2 мг/кг - 36 крыс
34 из 36*
2 из 36
(95%)
(5%)
*-Р≤0,01 по сравнению с контролем
Таким образом, биологически активная субстанция, представляющая собой белково-полипептидный комплекс, оказывает статистически значимое увеличение выживаемости животных по сравнению с контролем в условиях неполной глобальной ишемии мозга, вызываемой одномоментной перевязки обеих сонных артерий.
Биологическая активность в условиях неполной глобальной ишемии мозга, вызываемой одномоментной перевязки обеих сонных артерий лиофильной фракции белково-полипептидного комплекса, значительно ниже по сравнению с жидкой субстанцией.
Источники информации
1. Энциклопедия лекарств. 2006 г., с.970.
2. Патент РФ №2128511(1999).
3. Патент РФ №2104702(1999).
4. Патент РФ №2049472(1999).
5. Патент СССР 939440, кл. С07С 103/52, 1981.