Способ диагностики хламидиоза
CHLAMYDIA DIAGNOSIS METHOD

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для дифференциальной диагностики представителей семейства Chlamydiaceae.
Известен способ диагностики генетического риска развития осложненного клинического течения урогенитальной хламидийной инфекции у человека, для чего методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) определяют полиморфные варианты генов IL6 и TGFb1. При определении гомозиготного генотипа СС в позиции -174 гена IL6 у мужчин и женщин, а также гетерозиготного генотипа GC в позиции -915 гена TGFb1 у женщин, прогнозируют высокий риск развития осложненного клинического течения урогенитальной хламидийной инфекции (см. RU 2535724, МПК G01N 33/50, 2014 г.). Изобретение позволяет принимать обоснованные решения о выборе тактики терапии конкретного пациента, больного урогенитальным хламидиозом, чтобы предупредить развитие осложнений урогенитального хламидиоза и нарушений репродуктивной функции.
Недостаток этого решения – только прогноз высокого риска развития осложненного клинического течения урогенитальной хламидийной инфекции, причем этот метод не позволяет оценить конкретную ситуацию состояния локального иммунного гомеостаза слизистой оболочки шейки матки (ШМ) у женщин в постменопаузе, чтобы принять решение о стратегии хирургического вмешательства, т.к. речь идёт о малигнизации или ответной реакции на хроническую и острую микробную контаминацию тканей. Кроме того, невозможно установить хронический и острый период заражения хламидийной инфекции в отсутствие клинической симптоматики.
Известен способ диагностики хронического урогенительного хламидиоза, включающий определение уровня спонтанной и индуцированной зимозаном хемилюминесценции лейкоцитов, для чего используют лизат элементарных телец хламидий, рассчитывают индексы хемилюминесценции по зимозану и специфическому антигену как отношение стимулированной хемилюминесценции к спонтанной, при значениях 21,35≤ИХЛ-3≤31,41 и 0,53≤ИХЛ-aг≤1,00 диагностируют хроническую хламидийную инфекцию (см. RU № 2202787, МПК G01N 33/48, 2003 г.).
Недостаток этого решения – узкий диагностический спектр, т.к. не позволяет определить потребную степень инвазивности хирургического вмешательства, не позволяет показать сроки заражения инфекцией.
Известен также способ диагностики хламидиоза, включающий отбор клинического материала из шейки матки, при выявлении дисплазии эпителия шейки матки и проведение его иммуногистохимических исследований с выявлением диагностических признаков хламидиоза (см. RU № 2241042, МПК C12Q 1/68 G01N 33/569, 2004 г.).
Недостаток этого решения – оно обеспечивает только выявление наличия инфекции, не позволяет показать сроки заражения инфекцией и не обеспечивает возможность проведения дифференциальной диагностики процессов в эпителии, и решение вопроса, о причинах патологического состояния слизистой оболочки.
Задачей, на решение которой направлено предлагаемое решение, является выявление сроков заражения инфекцией, обеспечение возможности проведения дифференциальной диагностики процессов в эпителии.
Технический результат - расширение диагностического спектра, включающее выявление сроков заражения инфекцией, обеспечение возможности проведения дифференциальной диагностики процессов в эпителии, и на фоне отсутствия клинической симптоматики, решение вопроса, с чем патологическое состояние слизистой оболочки связано, с инфекцией, или малигнизацией с уточнением стратегии хирургических вмешательств, касающихся удалять или оставить и сколько удалять. Это позволяет использовать заявленный способ в гинекологии, акушерстве, дерматовенерологии и судебно-медицинской экспертизе не только в возрастной группе женщин в постменопаузе, но и в случае неблагоприятного исхода беременности и вынашивания плода, прогнозирования патологии новорожденного.
Для решения поставленной задачи способ диагностики хламидиоза, включающий отбор клинического материала из шейки матки, при выявлении дисплазии эпителия шейки матки и проведение его иммуногистохимических исследований с выявлением диагностических признаков хламидиоза, отличается тем, что клинический материал дополнительно отбирают из полости матки, при этом, клинические материалы оперативно фиксируют для иммуноцитохимического исследования, после чего препарат, полученный из шейки матки, вводят в контакт с первичными антителами к белку Ki-67, инкубируют и после окрашивания используют для выявления пролиферирующего клеточного ядерного антигена Ki-67, после чего, оценивают активность этого антигена в препаратах, полученных из материала, отобранного из шейки матки, по величине которой устанавливают хроническую или острую форму хламидиоза при показателях активности, соответственно, 2,4+0,09 или 5,9+0,25, причем при показателях его активности, соответствующих промежуточным значениям между названными, делают вывод об отсутствии хламидиоза в шейке матки и после этого оценивают активность пролиферирующего клеточного ядерного антигена Ki-67 в препаратах, полученных из материала, отобранного из полости матки, по величине которой устанавливают хроническую или острую форму хламидиоза при показателях активности соответственно 1,3+0,09 или 3,9+0,25, причем при показателях его активности, соответствующих промежуточным значениям между названными, делают заключение об отсутствии хламидиоза у пациентки, кроме того, при наличии диагноза хроническая форма сроки заражения инфекцией принимают как свыше 2 месяцев, а при острой форме заболевания - менее 2 месяцев. Кроме того, при оценке активности пролиферирующего клеточного ядерного антигена Ki-67 для получения общей морфологической картины используют классические гистологические методы исследования с окрашиванием гематоксилином и эозином.
Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками прототипа и аналогов свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна».
Совокупность признаков изобретения обеспечивает возможность проведения дифференциальной диагностики процессов в эпителии, и на фоне отсутствия клинической симптоматики, решение вопроса, с чем патологическое состояние слизистой оболочки связано, с инфекцией, или малигнизацией с уточнением стратегии хирургических вмешательств, касающихся удалять или оставить и сколько удалять.
При этом признаки отличительной части формулы изобретения обеспечивают решение следующих функциональных задач.
Признак «…клинический материал дополнительно отбирают из полости матки…» позволяет уточнить диагноз при отсутствии признаков острой или хронической формы хламидиоза по исследованиям клинического материала из шейки матки.
Признак «…клинические материалы оперативно фиксируют для иммуноцитохимического исследования…» обеспечивает возможность сохранения материала для реализации иммуногистохимических исследований с выявлением индикатора хламидиоза.
Признак, указывающий что, полученный препарат «вводят в контакт с первичными антителами к белку Ki-67» обеспечивает возможность получения индикатора хламидиоза, позволяющего провести дифференциальную диагностику процессов в эпителии матки и в ее шейке.
Признаки указывающие, что препарат, полученный из шейки матки, вводят в контакт с первичными антителами к белку Ki-67, «инкубируют и после окрашивания используют для выявления пролиферирующего клеточного ядерного антигена Ki-67» обеспечивают возможность получения индикатора хламидиоза, позволяющего провести дифференциальную диагностику процессов в эпителии шейки матки.
Признаки указывающие, что после инкубации и окрашивания препарата «оценивают активность этого антигена (пролиферирующего клеточного ядерного антигена Ki-67) в препаратах, полученных из материала, отобранного из шейки матки» позволяют получить количественные значения индикатора хламидиоза и установить его форму, как хроническую или острую и/или срок давности заражения.
Признаки указывающие, что хроническую или острую формы хламидиоза в шейке матки «устанавливают при показателях активности, соответственно, 2,4+0,09 или 5,9+0,25» задают количественные показатели активности антигена соответствующие хронической или острой формам.
Признаки указывающие, что «при показателях активности ядерного антигена Ki-67 соответствующих промежуточным значениям между показатели его активности соответствующими хронической или острой формам, делают вывод об отсутствии хламидиоза в шейке матки» обеспечивают получение промежуточного результата, инициирующего работу с препаратом, полученным из полости матки.
Признаки указывающие, что «оценивают активность пролиферирующего клеточного ядерного антигена Ki-67 в препаратах, полученных из материала, отобранного из полости матки, по величине которой устанавливают хроническую или острую форму хламидиоза при показателях активности, соответственно, 1,3+0,09 или 3,9+0,25» позволяют дополнительно выявить хроническую или острую форму хламидиоза в материале полости матки.
Признаки, указывающие, что при отрицательном диагнозе на хламидиоз, полученном при исследовании материала из шейки матки, и при показателях активности пролиферирующего клеточного ядерного антигена Ki-67 «соответствующих промежуточным значениям между названными, делают заключение об отсутствии хламидиоза у пациентки» описывают вариант диагностического заключения об отсутствии хламидиоза.
Признаки указывающие, что «при наличии диагноза хроническая форма сроки заражения инфекцией принимают как свыше 2 месяцев, а при острой форме заболевания - менее 2 месяцев» обеспечивают временную привязку сроков заражения.
Признаки, указывающие, что «при оценке активности пролиферирующего клеточного ядерного антигена Ki-67 для получения общей морфологической картины используют классические гистологические методы исследования с окрашиванием гематоксилином и эозином» обеспечивают возможность подсчета активности пролиферирующего клеточного ядерного антигена Ki-67.
Изобретение иллюстрируется чертежами, где на фиг. 1 и фиг. 2 показано состояние слизистой оболочки при хламидийной инфекции (Микрофото. Иммунная гистохимия с докраской гематоксилином. Ув. х 400), при этом на фиг. 1, показано состояние слизистой оболочки шейки матки; на фиг. 2, показано состояние слизистой оболочки полости матки; на фиг. 3 и 4 показано состояние слизистой оболочки в зоне перехода многослойного плоского эпителия шейки матки в однослойный цилиндрический эпителий полости матки женщин в постменопаузе (локализация белка гена в норме) (Микрофото. Иммунная гистохимия с докраской гематоксилином. Фиг. 3 - Ув. х200, фиг. 4 - Ув. х100); на фиг. 5 показана локализация белка гена Ki -67 в слизистой оболочке в зоне перехода многослойного плоского эпителия шейки матки в однослойный цилиндрический эпителий полости матки женщин в постменопаузе при наличии полипов. (Микрофото. Иммунная гистохимия с докраской гематоксилином Ув. х400); на фиг. 6 показана локализация белка гена Ki-67 в слизистой оболочке однослойного цилиндрического эпителия полости матки женщин в постменопаузе при наличии полипов. (Микрофото. Иммунная гистохимия с докраской гематоксилином Ув. х200); на фиг. 7 и 8 показана локализация белка гена Ki-67 в слизистой оболочке шейки матки в зоне перехода многослойного плоского эпителия шейки матки в однослойный цилиндрический эпителий полости матки женщин в постменопаузе при хламидийной инфекции. (Микрофото. Иммунная гистохимия с докраской гематоксилином Ув. х400); на фиг. 9 и 10 показана локализация белка гена Ki-67 в слизистой оболочке полости матки в зоне перехода многослойного плоского эпителия шейки матки в однослойный цилиндрический эпителий полости матки женщин в постменопаузе, при хламидийной инфекции. (Микрофото. Иммунная гистохимия с докраской гематоксилином. Ув. х400).
Ежегодно во всем мире рак шейки матки выявляется у 600 000 женщин в возрасте от 35 до 55 лет, при этом у половины пациенток онкологический процесс выявляется уже на поздних стадиях. Инфицированность папиломавирусной инфекцией (ПВИ) увеличивает риск развития дисплазии в 10 раз.
Полученные нами данные свидетельствуют о невысокой диагностической значимости данных о пролиферативной активности в диагностике канцерогенеза, но дают исчерпывающее представление о состоянии регенераторного потенциала эпителия шейки матки в физиологической и репаративной регенерации. В случае папилломавирусной инфекции утрата клетками способности к реституции и нарушение пролиферативной активности является более значимым признаком ранней малигнизации ткани шейки матки.
Реализации заявленного способа предшествует диагностика изменений на шейке матки известными способами (осмотр в зеркалах, простая и расширенная кольпоскопия, оценка влагалищного микробиоценоза, цитологическое исследование мазков-отпечатков (так называемые ПАП-мазки) и прицельная биопсия с последующим гистологическим исследованием.
Учитывая, что воспаление экзо- и эндоцервикса может симулировать картину клеточной атипии при проведении цитологического исследования, все морфологические исследования проводили после санации влагалища. Нами было отмечено, что эктопия наблюдается у 7,3% женщин в возрасте 46 лет и старше.
Кольпоскопические картины при эктопии отличались многообразием. Разнообразие клинических проявлений эктопии определяет врачебную тактику. Неосложненная эктопия относится не к болезням и проблемам здоровья, а к гистофизиологическим особенностям шейки матки и не нуждается в терапевтических местных мероприятиях. Морфологические изменения на шейке матки однозначно трактуются как патологические и требуют лечения. Осложненная эктопия на фоне нарушения эпителиально-стромальных взаимоотношений, инфекционного процесса или в сочетании с другими фоновыми и предраковыми процессами (полип, лейкоплакия, дисплазия) подлежит лечению с целью профилактики восходящих воспалительных процессов и рака шейки матки.
Диагностика экзо- и эндоцервицита с верификацией инфекционного агента, чаще при наличии эктопии, очень важна, так как в этом случае нередко, особенно при вирусной и хламидийной инфекции, возникают предраковые процессы и рак. Это связано с тем, что хронический воспалительный процесс в шейке матки влияет на процессы метаплазии при эктопиях (пролиферации и дифференцировки резервных клеток) и в ряде случаев может привести к развитию дисплазии. Многими авторами дисплазия шейки матки рассматривается как предрак. Она сопровождается патологическим процессом, начинающимся в переходном метапластическом эпителии, который выражается в появлении атипичных клеток на фоне повышенной пролиферации базальных и парабазальных клеток. Различают дисплазию легкой, средней и тяжелой степени. Кольпоскопические маркеры дисплазии — аномальные кольпоскопические картины. Особенно важным для диагностики дисплазии является наличие ацетобелого эпителия. По мнению различных исследователей, частота эпителиальных дисплазий неодинакова. При профилактических осмотрах шейки матки дисплазия выявляется в 0,2—2,2% случаев (Прилепская В.Н. 1997, 2001). По нашим данным, частота эпителиальной дисплазии на фоне эктопии зависит от возраста: максимальное число дисплазии (8,5%) отмечено в возрастной группе 35—49 лет. По данным ряда авторов, при дисплазии средней и тяжелой степени тяжести в 62% случаев диагностируется вирусное поражение (Новиков А.И. и др. 2002). Известно, что инфицированность папиломавирусной инфекцией (ПВИ) увеличивает риск развития дисплазии в 10 раз. Анализ результатов показал, что при эктопиях дисплазия чаше выявляется на фоне хламидийной и вирусной инфекции.
Заявленный способ диагностики хламидиоза включает отбор клинического материала из шейки и полости матки после выявлении дисплазии эпителия шейки матки, при этом клинические материалы оперативно фиксируют для иммуноцитохимического исследования. Далее препарат, полученный из шейки матки, вводят в контакт с первичными антителами к белку Ki-67, инкубируют и окрашивают гематоксилином и эозином. После этого препарат используют для выявления пролиферирующего клеточного ядерного антигена Ki-67 и оценивают активность этого антигена в данном препарате. При этом по величине активности антигена устанавливают хроническую форму хламидиоза (если активность антигена равна 2,4+0,09) или острую его форму (при показателях активности, равных 5,9+0,25), причем при показателях его активности, соответствующих промежуточным значениям между названными, делают вывод об отсутствии хламидиоза в шейке матки. В последнем случае начинают (вышеописанным образом) оценку активности пролиферирующего клеточного ядерного антигена Ki-67 в препаратах, полученных из материала, отобранного из полости матки, по величине которой устанавливают хроническую или острую форму хламидиоза при показателях активности соответственно 1,3+0,09 или 3,9+0,25, причем при показателях его активности, соответствующих промежуточным значениям между названными, делают заключение об отсутствии хламидиоза у пациентки. При наличии диагноза хроническая форма, сроки заражения инфекцией принимают - свыше 2 месяцев, а при острой форме заболевания - менее 2 месяцев.
Пример реализации способа
Биоптаты слизистой оболочки шейки матки и ее полости были получены в соответствии с приказом Минздравмедпрома РФ от 29.04.94 N 82 «О порядке проведения патологоанатомических вскрытий» и в соответствии с номенклатурой клинических лабораторных исследований МЗ РФ (приказ 21 февраля 2000 г. № 64).
Биопсийный материал фиксировался по прописи для подготовки к иммуногистохимическим исследованиям сразу после забора. Использованы классические гистологические методы исследования с окрашиванием гематоксилином и эозином для получения общей морфологической картины, а также иммуногистохимический метод выявления маркера пролиферации клеток - пролиферирующий клеточный ядерный антиген Ki-67.
Парафиновые срезы толщиной 5 мкм монтировали на стекла, предварительно обработанные в течение 5 минут 0,01 %-ным раствором поли-л-лизина (Poly-l-Lizinesolution 0/01%, SigmaUSA) и высушенные в термостате при 56˚С в течение часа. После стандартной процедуры депарафинирования в толуолах и спиртах срезы для восстановления антигенной структуры подвергали термической обработке в специальном растворе (TargetRetrievalSolution, DAKO, Denmark) на водяной бане при температуре 95 – 97С˚ в течение 30 минут. Затем стекла охлаждали до комнатной температуры, промывали 5 минут 3%-ным раствором перекиси водорода для подавления эндогенной пероксидазы, после чего промывали в 3 сменах 0,02 М фосфатного буфера рН 7,5 по 5 минут в каждой. После этого наносили первичные антитела к белку Ki-67 (DAKO, Denmark), инкубировали в течение 30 минут во влажной камере в термостате при 37оС, промывали в 3 сменах 0,02 М фосфатного буфера рН 7,5 по 5 минут в каждой. Наносили стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена (StreptavidinPeroxidaseConjugated, DAKO, Denmark). Интенсивность окрашивания контролировали под микроскопом (инкубировали с диаминобензидином (ДАБ) в течение 3 – 5 минут). После появления коричневого окрашивания ядер срезы промывали в дистиллированной воде 5 минут, докрашивали гематоксилином, заключали в бальзам. В результате обработки препаратов выявляются ядра пролиферирующих клеток, находящихся в S-периоде, когда наблюдается максимум синтеза белка гена Ki-67, коррелирующего с концентрацией ДНК.
Анализ материала проведён с помощью микроскопа Olympus – Bx82 и цифровой камеры CDх82 с фирменным программным обеспечением.
В случае хронического течения заболевания нами отмечены нарушения структуры эпителиальной и собственной пластинок слизистой оболочки (СО), дезорганизация базальной мембраны, при этом дочерние клетки выступают на поверхности слизистой оболочки (см. фиг. 1 и фиг. 2).
Данные по пролиферативной активности в структурах слизистой оболочки ШМ и ПМ представлены в табл. 1.
Таблица 1
Пролиферативная активность в норме и при патологии слизистой оболочки шейки и полости матки
№
Контроль
Локализация инфекции
Хламидийная инфекция
Острая
Хроническая
1
<u>3,2+0,12</u>
Слизистая оболочка шейки матки
5,9<u>+</u>0,25
2,4<u>+</u>0,09
2
<u>2,2+0,12</u>
Слизистая оболочка полости матки 1
3,9<u>+</u>0,25
1,3<u>+</u>0,09
*P<0,05
При остром воспалительном процессе пролиферативная активность эпителия увеличивается почти в 2 раза (р<0,05), что связано с повреждением эпителия, утратой контактов между эпителиоцитами, свойством эпителия в случае повреждения к реституции (закрытию дефекта путём наползания дочерних клеток на дефект). Более низкая пролиферативная активность в структуре эпителиальной пластинки при хламидийной инфекции находится в соответствии с данными литературы о воспалительных процессах и эрозиях, не поддающихся лечению на фоне этой патологии, а также свидетельствует о наличии хронической запущенной инфекции, при которой повреждаются камбиальные клетки, соответственно, снижается регенераторный потенциал.
Анализ пролиферативной активности эпителия слизистой шейки матки позволил установить, что, несмотря на продолжительность постменопаузы, в этот период могут наблюдаться слабые пролиферативные явления в многослойном плоском и цилиндрическом эпителии шейки матки и, соответственно, в первый год постменопаузы пролиферативные типы мазков составляют 75% (фиг. 3-4).
При наличии полипов и воспалительных процессов вследствие хламидийной инфекции в слизистой оболочке шейки матки пролиферативная активность возрастает не только в эпителиальной пластинке, но и регистрируется в собственной пластинке (фиг. 5-6).
Нами были отмечены нарушения структуры эпителиальной и собственной пластинок слизистой оболочки, дезорганизация базальной мембраны, при этом дочерние клетки выступают на поверхности слизистой оболочки.
Отмечено, что при хламидийной инфекции наиболее выражена атрофия цилиндрического эпителия, при этом наблюдается самая низкая его пролиферативная активность (фиг. 7-10).
На фоне возрастного дефицита эстрогенов и присоединения хламидийной и других инфекций, происходят более выраженные морфологические изменения, связанные с повреждением эпителия, проявляющиеся по типу атрофических кольпитов (вагинитов) и неспецифических цервицитов. Одновременно развиваются дистрофические изменения в подлежащей строме, связанные с ухудшением трофики, снижением микроциркуляции кровотока и процессов транссудации стромы и всех слоев слизистых оболочек репродуктивного тракта женщин в постменопаузе.