СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ХАРАКТЕРА ТЕЧЕНИЯ АУТОИММУННОЙ ПУЗЫРЧАТКИ
METHOD FOR PREDICTION OF CLINICAL COURSE OF AUTOIMMUNE PEMPHIGUS

Изобретение относится к области лабораторных исследований и может быть использовано в дерматологии.
Пузырчатка - это угрожающий жизни аутоиммунный буллезный дерматоз кожи и слизистых оболочек, покрытых многослойным плоским эпителием. Прогноз заболевания серьезный. Без своевременного назначения препаратов глюкокортикостероидного ряда заболевание неуклонно прогрессирует и заканчивается летальным исходом. Правильно диагностируемый дерматоз позволяет своевременно провести лечение и продлить жизнь пациента. Однако течение болезни носит индивидуальный характер. Одним пациентам для достижения клинической ремиссии достаточно назначение препаратов только глюкокортикостероидного ряда (преднизолон), другим пациентам - необходимо присоединение к лечению цитостатики (азатиоприн, метотрексат). В связи с этим встает вопрос об оценке прогнозирования характера течения болезни.
Известен способ оценки характера течения пузырчатки (Патент РФ 2316006, МПК G01N 33/88, публ. 2008), включающий определение в сыворотке крови в момент обострения заболевания и через 2 недели после начала лечения содержания альфа-1 кислого гликопротеина. При уменьшении содержания альфа-1 кислого гликопротеина от 2,1-2,5 г/л до 1,6-1,8 г/л оценивают тяжелый характер течения пузырчатки. При уменьшении содержания альфа-1 кислого гликопротеина от 1,9-2 г/л до 1,4-1,55 г/л оценивают благоприятный характер течения пузырчатки.
Недостатком этого способа является отсутствие его специфичности по отношению к пузырчатке. Пузырчатка является аутоиммунным буллезным дерматозом, протекающим на фоне патологии со стороны желудочно-кишечного тракта (холецистит, панкреатит, гастродуоденит) и/или сердечно-сосудистой системы (гипертоническая болезнь), нередко осложняющимся вторичной инфекцией из-за наличия открытых входных ворот (обширные эрозивные поверхности на коже и слизистых оболочках). Поэтому при сочетанной патологии нельзя дифференцировать острую фазу воспаления и, следовательно, поставить достоверный прогноз течения пузырчатки.
Известен способ прогнозирования течения пузырчатки, включающий исследование биологической ткани. (Carlotti A., Balaton A.J., de Muret A. et al. Autoimmune pemphigus. A distinct staining pattern with an anti-desmoglein antibody// Arch.Dermatol., 1993; 129(5): p.596-9). Исследуют парафиновые срезы биоптата с пораженного или интактного, около поврежденного участка кожи больного методом пероксидазной метки с использованием моноклональных антител к десмоглеину. При выявлении экспрессии десмоглеина в виде тонкой и равномерной сетки вдоль цитоплазматической мембраны кератиноцитов прогнозируют благоприятное течение пузырчатки, оставляя надежду на выздоровление. При наличии грубых гранулярных отложений десмоглеина - прогнозируют тяжелое течение пузырчатки с подбором индивидуальных поддерживающих доз глюкокортикостероидов.
Недостатком этого способа является длительное время проведения исследования и возможность получить ложноположительные реакции, которые могут наблюдаться и при других заболеваниях, в основе которых лежит формирование пузырей (акантолитический дискератоз, болезнь Хейли-Хейли, буллезный пемфигоид, герпес, экзема и транзиторный акантолитический дерматоз). Наличие ложноположительных реакций снижает чувствительность и специфичность данного способа, что осложняет постановку точного прогноза течения пузырчатки, прогнозирование ее течения и проведение адекватной терапии в оптимально ранние сроки.
Задачей предлагаемого изобретения является устранение этих недостатков и повышение точности прогнозирования характера течения заболевания за счет выявления четкой специфической иммунной реакции с тканевым антигеном и минимальной затратой времени, что позволит в процессе лечения подобрать индивидуальную терапию пациенту с сокращением срока лечения преднизолоном до поддерживающей дозы, а в ряде случаев и до полной его отмены.
Для этого в способе прогнозирования течения пузырчатки, включающем исследование биоптата интактного участка кожи, предложено биоптат исследовать прямым методом иммунофлюоресценции. При этом определяют характер локализации фиксированного иммуноглобулина класса G, и при выявлении его в виде гранулярных отложений в межклеточных пространствах эпидермиса прогнозируют тяжелое течение пузырчатки, при выявлении иммуноглобулина класса G в межклеточных пространствах в виде «сеточки» прогнозируют благоприятное течение пузырчатки.
На фиг.1 показана фиксация IgG в межклеточной субстанции эпидермиса в виде «сеточки» при пузырчатке с благоприятным течением болезни (пример 1); на фиг.2 показана фиксация IgG в межклеточной субстанции эпидермиса в виде гранулярных отложений у пациента с торпидным течением пузырчатки (пример 2).
К настоящему времени предлагаемым методом обследовано 169 больных разными формами аутоиммунной пузырчатки, из них 126 больных вульгарной пузырчаткой, 7 - вегетирующей пузырчаткой, 4 - листовидной пузырчаткой, 22 - себорейной пузырчаткой, 10 - паранеопластической пузырчаткой. Всем больным была проведена диагностика известным методом прямой иммунофлюоресценции обнаружения фиксированного иммуноглобулина в межклеточных пространствах эпидермиса.
При исследовании срезов кожи больных, страдающих пузырчаткой, выявлена различная иммуногистохимическая картина характера отложения иммуноглобулина класса G в межклеточных пространствах. Характер отложений иммуноглобулина данного класса связан с наличием разных антигенов-мишеней для аутоантител и их особым расположением в десмосоме. Под действием этиологических и патогенетических факторов мишенью для аутоантител могут быть одна или несколько молекул адгезии и гликопротеины, входящих в состав системы межклеточных соединений (десмосома). Вовлечение в патологический процесс несколько мишеней приводит не только к разной иммуноморфологической картине в отношении характера отложений иммуноглобулина класса G в межклеточных пространствах эпидермиса, но и к особенностям течения болезни.
Так, независимо от клинических форм проявления болезни в большинстве случаев (117) иммуноморфологическая картина фиксированного иммуноглобулина класса G имела вид «сеточки» и дальнейшие наблюдения позволили констатировать благоприятное течение пузырчатки, в остальных 52 случаях - вид гранулярных отложений, течение пузырчатки было тяжелое и потребовало дополнительного назначения к основной терапии цитостатика.
Способ осуществляется следующим образом.
Ткань биоптата кожи (клинически интактный участок кожи) больного замораживают при низкой температуре (-20°С). Серийные криостатные срезы помещают на предметное стекло, подсушивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем срезы промывают физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS), рН 7,0-7,4, в течение 3-5 мин с целью удаления не связанных с тканями растворимых белков и обрабатывают люминесцирующей сывороткой (метка изотиоцианатом флюоресцеина) против иммуноглобулинов класса G в течение 30 мин при комнатной температуре. Вновь промывают PBS в течение 3-5 мин и заключают под покровное стекло в 60% нейтральный глицерин. Для контроля одновременно проводят изучение криостатных срезов, окрашенных гематоксилином и эозином в световом микроскопе.
При выявлении характера локализации фиксированного иммуноглобулина класса G в виде гранулярных отложений в межклеточных пространствах эпидермиса прогнозируют тяжелое течение пузырчатки, при выявлении иммуноглобулина класса G в межклеточных пространствах в виде «сеточки» - благоприятное течение пузырчатки.
Пример 1.
Обследован больной X., 54 лет (и/б 13065, 1993). Болен около полугода. Впервые высыпания появились после приема жаропонижающих препаратов по поводу ОРВИ на коже в подключичной области в виде пузырька с серозным содержимым. Пузырек самостоятельно вскрывался и вновь появлялся. Лечение проведено без эффекта, процесс распространился. Пациент госпитализирован в кожное отделение для диагностики и лечения.
При поступлении общее состояние больного было удовлетворительным. Ведущие жалобы: пузыри и эрозии на коже. При осмотре на коже грудины, правой подключичной и межлопаточной областях имеются эрозии с ярко-красным сочным дном размерами до 5-8 мм в диаметре, не сливающиеся между собой, частично покрытые геморрагическими корочками. На коже спины в межлопаточной области - единичные напряженные пузыри до 8 мм в диаметре, расположенные на неизмененном фоне. Симптом Никольского отрицательный. Видимые слизистые, ногти и кожа волосистой части головы свободны от высыпаний. При цитологических исследованиях содержимого пузыря акантолитические клетки не обнаружены. Из анамнеза: сахарный диабет. Наследственность: у матери - рак губы. Пациент обследован на паранеопластический процесс: патологии со стороны внутренних органов и систем не выявлено.
С целью постановки точного прогноза течения заболевания исследован биоптат клинически непораженного участка кожи. Методом прямой иммунофлюоресценции обнаружен фиксированный иммуноглобулин класса G в межклеточной субстанции эпидермиса в виде «сеточки» на всем протяжении исследуемого материала (фиг.1).
На основании полученных данных больному выставлен прогноз благоприятного течения вульгарной пузырчатки.
Спустя неделю после проводимой терапии витамином С (по 0,5 г 2 раза в день) с целью стимуляции функции коры надпочечников и повышения уровня в крови кортикостероидов проведено контрольное иммуноморфологическое исследование по предлагаемому способу с видимо непораженного участка (клинически видимых новых высыпаний не было, эрозии заэпителизировались). При обработке криостатных срезов методом прямой иммунофлюоресценции сывороткой против иммуноглобулина класса G удалось выявить положительную динамику: количество фиксированного в межклеточной субстанции IgG значительно уменьшилось и имело слабую очаговую фиксацию в виде «сеточки». Учитывая положительную динамику клинического состояния и иммуноморфологической картины, больной был выписан в удовлетворительном состоянии с рекомендациями в дальнейшем принимать аскорбиновую кислоту по 1 грамму в день, препараты калия, кальция. От назначения глюкокортикостероидов решено было воздержаться.
При обследовании через 1, 3, 6 месяцев рецидивов заболевания не было.
Пример 2.
Обследована больная А., 21 года (и/б 11337, 2006). Больна около двух лет. Впервые высыпания в виде пузырей и эрозий появились на слизистой оболочке полости рта. Лечилась у стоматолога без эффекта. Высыпания распространились на кожу волосистой части головы и конечностей. Дерматологом по месту жительства заподозрена вульгарная пузырчатка, цитологическим методом исследования обнаружены акантолитические клетки. Проведено лечение преднизолоном в максимальной дозе 40 мг per os в сутки. Достигнута положительная динамика только со стороны кожного покрова, эрозивные дефекты на слизистой оболочке полости рта сохранялись. В дальнейшем пациентка самостоятельно отменила прием преднизолона.
В течение последующего года патологический процесс постепенно распространился на кожу туловища, волосистой части головы, лица и конечностей. Пациентка госпитализирована в кожное отделение МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского для диагностики и лечения.
При поступлении общее состояние больной было удовлетворительным. Ведущие жалобы: пузыри и эрозии на коже и слизистой оболочке полости рта, болезненность при глотании и приеме пищи. При осмотре на коже туловища, ягодиц, верхних и нижних конечностях, волосистой части головы, слизистой оболочке полости рта (твердое небо, слизистая щек) имеются эрозии с ярко-красным сочным дном размерами до 12 мм в диаметре, частично покрытые серозно-гнойными корками. Симптом Никольского положительный. На коже туловища и шеи отмечаются множественные пустулезные элементы. При обследовании выявлено: стрептостафилодермия, пустуллезный фолликулит, нарушение толерантности к глюкозе, нарушение менструального цикла, хронический фарингит, астено-депресссивное состояние на соматически неблагополучной почве. Данных за паранеопластический процесс не выявлено.
С целью постановки точного прогноза течения заболевания исследован биоптат клинически непораженного участка кожи. По предлагаемому способу проведено исследование и обнаружен фиксированный иммуноглобулин класса G в межклеточной субстанции эпидермиса в виде гранулярных отложений (фиг.2).
На основании полученных данных больной поставлен прогноз тяжелого, торпидного течения вульгарной пузырчатки.
Проведено лечение: преднизолон в максимальной дозе 100 мг per os. В течение 14 дней достигнута положительная динамика (отсутствие свежих буллезных элементов, боли при глотании, активная эпителизация эрозий), доза преднизолона постепенно снижена до 60 мг.
В дальнейшем патологический процесс принял торпидное течение, сохранялись единичные эрозивные дефекты на коже лица и ягодиц без тенденции к эпителизации. К лечению присоединен метотрексат 25 мг в/м 1 раз в неделю (2 тура). По семейным обстоятельствам больная выписана под наблюдение дерматолога по месту жительства. Даны рекомендации. Спустя два месяца развитие болезни закончилось летальным исходом.
Пример 3.
Обследована больная Р., 56 лет (и/б 25765, 2010). Больна около полугода. Впервые высыпания появились в виде пузыря на слизистой оболочке полости рта спустя 2 дня после приема ципрофлоксацина по поводу пиодермии волосистой части головы, возникшей после механической травмы головы и окрашивания волос. Со слов пациентки пузырь самостоятельно регрессировал и вновь появлялся. Патологический процесс на коже волосистой части головы сохранялся. По поводу пиодермии продолжена терапия без эффекта. Высыпания распространились на кожу туловища и верхних конечностей. Заподозрена вульгарная пузырчатка. В мазках-отпечатках с поверхности эрозий обнаружены акантолитические клетки.
Больная госпитализирована в кожную клинику МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского для уточнения диагноза и лечения.
При поступлении общее состояние больной было удовлетворительным. Ведущие жалобы: высыпания на коже и слизистой оболочке полости рта, болезненность при глотании и незначительный зуд кожи. При осмотре на коже груди отмечаются множественные рассеянные папулы с четкими границами ярко-розового цвета. На коже волосистой части головы в проекции теменной области - обширный эрозивный дефект, покрытый рыхлой массивной коркой желтого цвета. На слизистой оболочке полости рта (твердое небо, слизистая щек) - множественные эрозии до 5 мм в диаметре, частично покрытые фибринозным налетом. Симптом Никольского положительный.
При обследовании выявлено: первичный гипотиреоз средней степени тяжести, сахарный диабет 2 типа компенсированный, диабетическая нефропатия по нестабильному типу, гипертоническая болезнь. Данных за неоплазию не выявлено.
По предлагаемому способу проведено исследование биоптата интактного участка кожи. Выявлена фиксация иммуноглобулина класса G в межклеточных пространствах эпидермиса в виде гранулярных отложений (аналогично фиг.2).
По полученным данным прогноз - тяжелое течение пузырчатки. Проведено лечение: преднизолон в максимальной дозе 100 мг per os. В связи с отсутствием положительной динамики от проводимой глюкокортикостероидной терапии (в течение 20 дней) к лечению присоединен метотрексат 25 мг в/м 1 раз в неделю (2 тура). Это позволило достичь клинической ремиссии заболевания и продолжить дальнейшее снижение дозы преднизолона. Больная выписана под наблюдение дерматолога по месту жительства. Даны рекомендации.
Таким образом, использование данного способа позволяет проводить адекватную терапию с учетом поставленного прогноза. Исследование позволяет выявить степень выраженности процесса и провести ряд индивидуальных лечебных мероприятий. Кроме того, применение способа позволяет сократить сроки пребывания пациента в стационаре, снизить стоимость лечения, уменьшить вероятность осложнений, при тяжелом течении пузырчатки повысить вероятность положительного исхода за счет проведения своевременной терапии.