СПОСОБ ОЦЕНКИ ТЯЖЕСТИ ПРЕЭКЛАМПСИИ
METHOD FOR EVALUATING SEVERITY OF PREECLAMPSIA

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, и может быть использовано для определения степени тяжести преэклампсии у женщин, вынашивающих плод мужского пола.
Известен способ оценки тяжести преэклампсии с помощью изучения содержания тромбоцитов в венозной крови, когда по уровню тромбоцитопении судят о степени тяжести преэклампсии (Преэклампсия: руководство. / Под ред. акад. РАМН Г.Т.Сухих, проф. Л.Е.Мурашко. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. С.226-228).
Недостатком данного способа является низкая степень его достоверности из-за наличия многочисленных механизмов тромбоцитопении (аутоимунный, связанный с диссеминированным внутрисосудистым свертыванием крови, анемией, изменением объема циркулирующей крови и другими), в том числе и не характерных для беременности, а также отсутствие четкой зависимости между степенью тяжести преэклампсии и выраженностью тромбоцитопении.
Известен способ диагностики тяжелых форм гестоза путем определения уровня гомоцистеина в плазме венозной крови и при его увеличении более чем в 2,2 раза от нормы диагностируют развитие тяжелой формы гестоза (Патент РФ №2259568, МПК 7 G01N 33/48, 2005 (аналог)).
Известен способ оценки тяжести преэклампсии у беременных путем определения в сыворотке крови беременных женщин содержания циркулирующего иммунного комплекса основного белка миелина с иммуноглобулином класса G в сроки беременности после 20 недели и при его значениях менее 0,1 мкг/мл судят о неосложненной беременности, при уровне от 0,1 до 0,2 мкг/мл - о преэклампсии легкой степени, при уровне от 0,2 до 0,5 мкг/мл - о преэклампсии тяжелой степени. (Патент РФ №2250468, МПК 7 G01N 33/564, 2005 (аналог)).
Недостатком известных способов является низкая степень их достоверности из-за отсутствия прямой связи с процессами, происходящими только при беременности, такими как образование плаценты.
Наиболее близким к заявляемому является способ оценки тяжести преэклампсии, заключающийся в том, что проводят исследование гепаринизированной плазмы крови беременной, при этом в ней определяют активность лейкоцитарной эластазы и при ее значении 0,08-0,1 Ед/мл определяют гестоз легкой степени, при активности лейкоцитарной эластазы 0,02-0,07 Ед/мл определяют гестоз средней степени тяжести, при активности лейкоцитарной эластазы менее 0,02 - тяжелый гестоз (Патент РФ №2209438, МПК 7 G01N 33/68, 2003 (аналог)).
Недостатком известного способа является недостаточная степень его достоверности, связанная с тем, что изменение активности лейкоцитарной эластазы в плазме крови происходит при многочисленных заболеваниях, в том числе у небеременных. Так, повышение уровня/активности данного фермента в плазме крови наблюдается при атеросклерозе, артериальной гипертензии, бронхоэктатической болезни, хронических бронхообструктивных заболеваниях, муковисцидозе, сахарном диабете II типа.
При создании изобретения решалась задача повышения достоверности оценки степени тяжести преэклампсии у беременных, вынашивающих плод мужского пола.
Технический результат - повышение достоверности оценки степени тяжести преэклампсии у беременных, вынашивающих плод мужского пола, по уровню степени нарушения процессов плацентации.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе оценки степени тяжести преэклампсии путем анализа плазмы периферической венозной крови беременных, вынашивающих плод мужского пола, после 20 недель беременности, согласно изобретению определяют концентрацию плодной ДНК в плазме периферической венозной крови и при ее содержании менее 0,9 нг/мл прогнозируют неосложненное течение беременности, при концентрации плодного генетического материала от 1,8 до 2,6 нг/мл прогнозируют преэклампсию средней степени тяжести и при концентрации 2,6 нг/мл и выше - преэклампсию тяжелой степени.
При этом согласно изобретению забор крови из периферической вены производят в количестве 5 мл в пробирку, содержащую этилендиаминтетрауксусную кислоту в качестве антикоагулянта.
При этом согласно изобретению плазму крови получают центрифугированием.
При этом согласно изобретению выделение внеклеточной ДНК проводят из 1000 мкл плазмы крови методом сорбции на магнитных частицах с использованием набора «РеалБест экстракция 1000» (ЗАО «Вектор-Бест», РФ).
При этом согласно изобретению концентрацию плодной ДНК в крови матери определяют по скорости накопления продуктов копирования участка хромосомы Y, в котором находится ген SRY.
При этом согласно изобретению для определения концентрации внеклеточной плодной ДНК используют тест-систему «Quantifiler Y» («Applied Biosystems», США).
Способ осуществляется следующим образом.
У беременной, вынашивающей плод мужского пола, после 20 недель беременности из периферической вены производят забор крови в количестве 5 мл в пробирку, содержащую этилендиаминтетрауксусную кислоту в качестве антикоагулянта. Традиционным способом, в частности центрифугированием, отделяют плазму крови. Выделение внеклеточной ДНК проводят из 1000 мкл плазмы крови методом сорбции на магнитных частицах с использованием набора «РеалБест экстракция 1000» (ЗАО «Вектор-Бест», РФ). Извлечение сорбированной на магнитных частицах внеклеточной ДНК осуществляется в 40 мкл элюирующего раствора. Для определения концентрации внеклеточной плодной ДНК используется тест-система «Quantifiler Y» («Applied Biosystems», США), с помощью которой на основе технологии полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени оценивают скорость накопления продуктов выборочного копирования участка хромосомы Y, в котором находится ген SRY. В каждую реакцию вносят по 4 мкл раствора ДНК, что по содержанию генетического материала соответствует 100 мкл плазмы крови; полимеразную цепную реакцию проводят в смеси объемом 50 мкл. Выборочное копирование фрагмента гена SRY используют для того, чтобы дифференцированно определить уровень ДНК плода в крови матери, т.к. данный ген связан с хромосомой Y, специфичной только для мужского пола.
Для выяснения клинической значимости способа заявителями обследовано 88 беременных со сроками беременности в 20-24 недели, у которых развилась преэклампсия (основная группа) и 102 пациентки без последующего присоединения преэклампсии (контрольная группа). В группе пациенток с присоединившейся преэклампсией средний уровень плодной ДНК составил 2,3 нг/мл и колебался в пределах 1,8-2,6 нг/мл при преэклампсии средней тяжести; средний уровень данного показателя при тяжелой форме преэклампсии составил 2,9 нг/мл и колебался в пределах 2,6-4,0 нг/мл. В контрольной группе средний уровень плодной ДНК составил 0,51 нг/мл с колебаниями 0,3-0,9 нг/мл. Различия показателей в группах были статистически значимы (р<0,05). Таким образом, можно сказать, что в способе оценки степени тяжести преэклампсии путем анализа плазмы периферической венозной крови беременной, вынашивающей мужской плод, после 20 недель беременности определяют уровень степени нарушения процессов плацентации по концентрации плодного генетического материала в плазме периферической венозной крови беременной и при его количестве менее 0,9 нг/мл диагностируют неосложненное течение беременности, при концентрации плодного генетического материала от 1,8 до 2,6 нг/мл диагностируют преэклампсию средней степени тяжести и при концентрации 2,6 нг/мл и выше - преэклампсию тяжелой степени.
Примеры конкретного применения.
Пример 1.
Беременная П., 32 года. Беременность первая, страдала бесплодием в течение 10 лет. Беременность протекает без осложнений. В сроке беременности 20-21 неделя объективно: АД 110/70 - 120/80 мм рт.ст., отеки и белок в моче отсутствуют, прибавка массы тела 320 г за 1 неделю. Жалоб при осмотре не предъявляет. По данным ультразвукового исследования: размеры плода соответствуют 20-21 недели беременности. У беременной произведен забор периферической венозной крови в количестве 5 мл в пробирку, содержащую этилендиаминтетрауксусную кислоту в качестве антикоагулянта. Традиционным способом, в частности центрифугированием, отделили плазму крови. Выделение внеклеточной ДНК проводили из 1000 мкл плазмы крови методом сорбции на магнитных частицах с использованием набора «РеалБест экстракция 1000» (ЗАО «Вектор-Бест», РФ). Извлечение сорбированной на магнитных частицах внеклеточной ДНК осуществлялось в 40 мкл элюирующего раствора. Для определения концентрации внеклеточной плодной ДНК использовалась тест-система «Quantifiler Y» («Applied Biosystems», США), с помощью которой на основе технологии полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени оценивают скорость накопления продуктов выборочного копирования участка хромосомы Y, в котором находится ген SRY.
Концентрация плодной ДНК составила 2,1 нг/мл, что позволило прогнозировать развитие преэклампсии средней тяжести. При обследовании в сроке 34-35 недель у беременной П. объективно: АД - 160/110 мм рт.ст., ночной диурез снижен на 100 мл, выраженные отеки, суточная протеинурия 3,0 г/л. Беременная П. помещена в стационар с диагнозом: беременность 34-35 недель. Преэклампсия средней степени тяжести. Проведено интенсивное лечение. Беременность удалось пролонгировать в течение трех дней, проведено программированное родоразрешение. Родился новорожденный с массой тела 2800 г, ростом 49 см, оценкой по шкале Апгар 7-8 баллов.
Пример 2.
Беременная С., 22 года. Беременность первая, страдает ожирением II степени. Беременность протекает без осложнений. В сроке 20-21 неделя объективно: АД 100/70-110/80 мм рт.ст., отеки и белок в моче отсутствуют, прибавка массы тела 280 г за 1 неделю. Жалоб при осмотре не предъявляет. По данным ультразвукового исследования: размеры плода соответствуют 20-21 недели беременности.
Так же, как это описано в примере 1, проведено исследование уровня концентрации плодной ДНК в плазме крови матери.
Концентрация плодной ДНК составила 3,3 нг/мл, что позволило прогнозировать развитие тяжелой преэклампсии. При обследовании в сроке 32-33 недели у беременной С. жалобы на головную боль, ухудшение зрения. Объективно: АД - 180/110 мм рт.ст., выраженные отеки, суточный диурез снижен до 300 мл, суточная протеинурия 5,2 г/л. Беременная С. помещена в стационар с диагнозом: беременность 32-33 недели. Тяжелая преэклампсия. Проведено интенсивное лечение и родоразрешение путем операции кесарево сечение в течение 12 часов. Родился новорожденный с массой тела 2230 г, ростом 48 см, оценкой по шкале Апгар 7-8 баллов.
Пример 3.
Беременная М., 26 лет. Беременность вторая. Первая беременность закончилась самопроизвольным выкидышем 2 года назад. При осмотре жалоб не предъявляет. Обследование в сроке беременности 22 недели показало: АД 110/70-120/80 мм рт.ст., белка в моче нет, прибавка массы тела 350 г в 1 неделю. По данным УЗИ: беременность 22 недели, состояние плода соответствует гестационному сроку.
Так же, как это описано в примере 1, проведено исследование уровня плодной ДНК в плазме крови матери. Концентрация плодной ДНК составила 0,52 нг/мл, что позволило исключить возможность развития преэклампсии. При последующем наблюдении за беременной М. признаков преэклампсии не отмечалось. Роды произошли в срок 39-40 недель беременности и закончились рождением доношенного новорожденного с массой тела 3620 г и оценкой по шкале Апгар 8-9 баллов.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить достоверность оценки степени тяжести преэклампсии у беременных, вынашивающих плод мужского пола, по уровню степени нарушения процессов плацентации, т.е. прогнозировать степень тяжести преэклампсии у беременных до появления развернутой клинической картины этого осложнения беременности. Это связано со способностью используемого метода количественно оценивать процессы нарушения плацентации до реализации их в процессы усугубления артериальной гипертензии и нарушения функции почек с помощью использования показателя, уровень которого непосредственно отражает степень нарушения процессов плацентации, лежащих в основе развития преэклампсии, и не зависит от влияния сопутствующей патологии, так как при нарушении развития плаценты происходит выброс в материнский кровоток частей плацентарной ткани, содержащих ДНК плодного происхождения. Все это позволяет осуществлять прогнозирование преэклампсии, когда обычно используемые способы не позволяют своевременно и точно осуществить прогноз этого осложнения беременности.
Прогностическая ценность метода относительно развития тяжелой преэклампсии: чувствительность 85%, специфичность 68%. Диагностическая эффективность теста 12,04.
Прогностическая ценность метода относительно развития преэклампсии средней степени тяжести: чувствительность 80%, специфичность 62%. Диагностическая эффективность теста 6,54. Высокая достоверность заявленного способа оценки тяжести преэклампсии позволяет провести необходимые профилактические и лечебные мероприятия и своевременно скорректировать план ведения беременной женщины, что позволяет предотвратить развитие осложнений и нарушений развития плода.