СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТА АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО

1. Способ получения конъюгата антигенсвязывающий белок-лекарственное средство, где способ включает следующие стадии:
1) иммобилизация антигенсвязывающего белка на ионообменном носителе с получением иммобилизованного антигенсвязывающего белка;
2) приведение иммобилизованного антигенсвязывающего белка в контакт с лекарственным средством с получением конъюгата антигенсвязывающий белок-лекарственное средство;
3) элюирование конъюгата антигенсвязывающий белок-лекарственное средство из ионообменного носителя.
2. Способ по п. 1, где указанный ионообменный носитель выбран из группы, состоящей из ионообменных смол, ионообменных мембран, ионообменных волокон, предпочтительно ионообменных смол.
3. Способ по п. 1 или 2, где ионообменный носитель представляет собой катионообменный носитель, и катионообменный носитель предпочтительно содержит сильнокислотный реакционный лиганд, а сильнокислотный реакционный лиганд предпочтительно представляет собой сульфонат.
4. Способ по любому из пп. 1-3, где на стадии 2) осуществляют связывание иммобилизованного антигенсвязывающего белка с лекарственным средством, и при этом реакция связывания заключается в том, что происходит связывание антигенсвязывающего белка и лекарственного средства посредством взаимодействия между нуклеофильной группой и электрофильной группой;
где нуклеофильная группа необязательно обеспечивается антигенсвязывающим белком или лекарственным средством, предпочтительно антигенсвязывающим белком;
где электрофильная группа необязательно обеспечивается антигенсвязывающим белком или лекарственным средством, предпочтительно лекарственным средством.
5. Способ по любому из пп. 1-4, где нуклеофильная группа выбрана из группы, состоящей из меркаптогруппы, гидроксильной группы, аминогруппы, гидразидной, оксимной, гидразиновой, тиосемикарбазоновой, гидразинкарбоксилатной и арилгидразидной группы, при условии, что:
если нуклеофильная группа обеспечивается лекарственным средством, то нуклеофильная группа предпочтительно представляет собой меркаптогруппу;
если нуклеофильная группа обеспечивается антигенсвязывающим белком, то нуклеофильная группа предпочтительно представляет собой аминогруппу, меркаптогруппу или гидроксильную группу; и аминогруппа более предпочтительно представляет собой N-концевую аминогруппу, аминогруппу боковой цепи или аминогруппу сахарида в подвергнутом гликозилированию антигенсвязывающем белке; гидроксильная группа более предпочтительно представляет собой гидроксильную группу сахарида в подвергнутом гликозилированию антигенсвязывающем белке, и меркаптогруппа более предпочтительно представляет собой тиольную боковую цепь и наиболее предпочтительно тиольную боковую цепь цистеина.
6. Способ по любому из пп. 1-5, где осуществляют связывание с получением конъюгата антигенсвязывающий белок-лекарственное средство посредством линкера, выбранного из расщепляемого линкера или нерасщепляемого линкера.
7. Способ по любому из пп. 1-6, где электрофильная группа выбрана из группы, состоящей из активной сложноэфирной, гидрокарбилгалогенидной, бензилгалогенидной, альдегидной, кетонной, карбоксильной группы и малеимидной группы, при условии, что:
если электрофильная группа обеспечивается антигенсвязывающим белком, то электрофильная группа предпочтительно происходит из альдегидной, кетонной, карбоксильной группы и малеимидной группы, более предпочтительно малеимидной группы;
если электрофильная группа обеспечивается лекарственным средством, то электрофильная группа предпочтительно представляет собой активную сложноэфирную, гидрокарбилгалогенидную, малеимидную группу, более предпочтительно малеимидную группу; при этом активный сложный эфир предпочтительно представляет собой сложный эфир NHS, сложный эфир HOBt, галогенформиат, галогенангидрид, и гидрокарбилгалогенид предпочтительно представляет собой галогенацетамид.
8. Способ по любому из пп. 1-7, где электрофильная группа происходит из самого лекарственного средства или из продукта модификации лекарственного средства.
9. Способ по любому из пп. 1-8, где осуществляют связывание иммобилизованного антигенсвязывающего белка с лекарственным средством, выбранное из группы, состоящей из связывания посредством лизина, связывания посредством восстановления межцепочечных дисульфидных мостиков между легкой и тяжелой цепью, сайт-направленного связывания, предпочтительно связывания посредством лизина, связывания посредством восстановления дисульфидных мостиков между легкой и тяжелой цепью.
10. Способ по любому из пп. 1-9, где антигенсвязывающий белок из стадии 1) необязательно выбран из модифицированного антигенсвязывающего белка или немодифицированного антигенсвязывающего белка, предпочтительно модифицированного антигенсвязывающего белка; при этом модифицированный антигенсвязывающий белок необязательно представляет собой антигенсвязывающий белок, который связывает химический реагент или сшивающее средство, предпочтительно модифицированный антигенсвязывающий белок, который связывается со сшивающим средством;
где лекарственное средство из стадии 2) необязательно модифицировано или немодифицировано, предпочтительно модифицировано.
2
11. Способ по п. 10, где указанное сшивающее средство предпочтительно предусматривает соединение следующей формулы (L):
,
2
(L)
при этом Т выбран из Н, трет-бутила, ацетила, н-пропионила, изопропионила, трифенилметила, метоксиметила, 2-(триметилсилил)этоксиметила, предпочтительно Н или ацетила;
15
R выбран из группы, состоящей из атома водорода, галогена, гидроксильной группы, цианогруппы, алкильной группы, алкоксигруппы и циклоалкильной группы;
16
R выбран из группы, состоящей из алкила, циклоалкила и гетероциклила;
m составляет 0-5, предпочтительно 1-3.
3
12. Способ по п. 10, где указанное сшивающее средство, представленное формулой (L2), представляет собой соединение формулы (L):
13. Способ по п. 10, где сшивающее средство имеет малеимидную группу или галогенацетильный фрагмент;
где сшивающее средство, имеющее малеимидную группу, предпочтительно выбрано из группы, состоящей из SMCC, LC-SMCC, KMUA, GMBS, EMCS, MBS, AMAS, SMPH, SMPB и PMPI, более предпочтительно SMCC;
сшивающее средство, несущее галогенацетильный фрагмент, предпочтительно выбрано из группы, состоящей из SIAB, SIA, SBA и SBAP, более предпочтительно SIAB.
14. Способ по любому из пп. 1-13, где лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из токсина, химиотерапевтического средства, ингибитора роста, ингибитора тубулина, антибиотика, радиоактивного изотопа и цитотоксического средства.
15. Способ по любому из пп. 1-14, где лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из производного майтансиноида, производного ауристатина, камптотецинового алкалоида; где производное майтансиноида предпочтительно выбрано из DM1, DM3, DM4; производное ауристатина предпочтительно выбрано из MMAE, MMAF; камптотециновый алкалоид предпочтительно выбран из СРТ, 10-гидрокси-СРТ, СРТ-11, SN-38 и топотекана, более предпочтительно SN-38.
16. Способ по любому из пп. 1-15, где лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из соединения, представленного следующей формулой (Dr):
или его таутомера, мезомера, рацемата, энантиомера, диастереомера, или смеси на его основе, или его фармацевтически приемлемой соли, где:
1
7
R, R-R выбраны из группы, состоящей из атома водорода, галогена, гидроксильной группы, цианогруппы, алкильной группы, алкоксигруппы и циклоалкильной группы;
8
11
по меньшей мере один из R-R выбран из группы, состоящей из галогена, алкенила, алкила и циклоалкила, при этом остальные представляют собой атомы водорода;
8
11
или любые два из R-R образуют циклоалкильные группы, а оставшиеся две группы выбраны из атома водорода, алкильной группы и циклоалкильной группы;
14
R выбран из арила или гетероарила, а арил или гетероарил необязательно дополнительно замещены заместителем, выбранным из группы, состоящей из атома водорода, галогена, гидроксильной группы, алкильной группы, алкоксигруппы и циклоалкильной группы;
12
13
R-R выбраны из атома водорода, алкильной группы или галогена;
где формула (Dr) предпочтительно представляет собой соединение следующей формулы (I):
.
(I)
1
17. Способ по любому из пп. 1-16, где лекарственное средство представляет собой модифицированное соединение, предпочтительно представляет собой соединение следующей формулы (L-Dr):
,
1
(L-Dr)
где
1
структура L представляет собой следующее:
; предпочтительно MC;
n составляет 2-6, предпочтительно 2-5;
2
7
R, R-R выбраны из группы, состоящей из атома водорода, галогена, гидроксильной группы, цианогруппы, алкильной группы, алкоксигруппы и циклоалкильной группы;
8
11
по меньшей мере один из R-R выбран из группы, состоящей из галогена, алкенила, алкила и циклоалкила, при этом остальные представляют собой атомы водорода;
8
11
или любые два из R-R образуют циклоалкильную группу, а оставшиеся две группы выбраны из атома водорода, алкильной группы и циклоалкильной группы;
12
13
R-R выбраны из атома водорода, алкильной группы или галогена;
14
R выбран из арила или гетероарила, а арил или гетероарил необязательно дополнительно замещены заместителем, выбранным из группы, состоящей из атома водорода, галогена, гидроксильной группы, алкильной группы, алкоксигруппы и циклоалкильной группы;
1
где формула (L-Dr) более предпочтительно представляет собой соединение, представленное формулой (II):
18. Способ по п. 1, где антигенсвязывающий белок выбран из группы, состоящей из гуманизированного антитела, мышиного антитела, человеческого антитела, химерного антитела, одноцепочечного антитела, биспецифического антитела, предпочтительно гуманизированного антитела.
19. Способ по п. 1, где антигенсвязывающий белок представляет собой моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, выбранный из группы, состоящей из фрагментов Fab, F(ab')2, scFv.
20. Способ по любому из пп. 1-19, где антигенсвязывающий белок связывается с одним или более полипептидами, выбранными из группы, состоящей из HER2, HER3, CD33, VEGF, VEGFR, VEGFR-2, CD152, CD40, TNF, IL-1, IL-5, IL-17, IL-6R, IL-1, IL-2R, BLYS, OX40L, CTLA4, PCSK9, EGFR, c-Met, CD2, CD3, CD11a, CD19, CD30, CD38, CD20, CD52, CD60, CD80, CD86, TNF-α, IL-12, IL-17, IL-23, IL-6, IL-1β, RSVF, IgE, RANK, BLyS, α4β7, PD-1, CCR4, SLAMF7, GD2, CD21, CD79b, IL20Rα, шортенина, CD22, CD79a, CD72, IGF-1R и RANKL или их антигенсвязывающих фрагментов; предпочтительно EGFR, c-Met или их антигенсвязывающих фрагментов.
21. Способ по любому из пп. 1, 2, где антигенсвязывающий белок выбран из группы, состоящей из Хумиры (адалимумаб), Авастина (бевацизумаб), Эрбитукса (цетуксимаб), Герцептина (трастузумаб), Perjeta (пертузумаб), Вектибикса (панибизумаб), Theraloc (нетузумаб), Ервоя (ипилимумаб), Опдиво (наволумаб), Луцентис (ранибизумаб), Энбрела (энасепт), Myoscint (имциромаба пентетат), ProstaScint (капромаба пендетид), Ремикейда (инфликсимаб), РеоПро (Абциксимаб), Rituxan (ритуксимаб), Симулекта (базиликсимаб), Синагиса (паливизумаб), Verluma (нофетумомаб), Ксолара (омализумаб), Зенапакса (даклизумаб), Симзии (цертолизумаб), Зевалина (ибритумомаб), Orthoclone (мороммонаб), Panorex (эдреколомаб), Mylotarg (гемтузумаб), Солириса (экулизумаб), CNTO1275 (устекинумаб), Amevive (алефасепт), Raptiva (эфализумаб), Tysabri (натализумаб), Acternra (тоцилизумаб), Оренсии (абатацепт), Arcalyst (рилонацеп), Стелары (устекинумаб), Ремоваба (катумаксомаб), Симпони (голимумаб), Илариса (канакинумаб), Арзерры (офатумумаб), Пролии (деносумаб), Бенлисты (белимумаб), Нулоджикса (белатасепт), Эйлеи (афлиберцепт), Campath (алемтузумаб), CEA-Scan на основе арцитумомаба (fab-фрагмент), Potelige (могамулизумаб), Abthrax (раксибакумаб), Газивы (обинутузумаб), Lang Mu (конберцепт), Цирамзы (рамуцирумаб), Sylvant (сильтуксимаб), Энтивио (ведолизумаб), Keytruda (пембролизумаб), Блинцито (блинатумонаб), Козэнтикса (секукинумаб), Unituxin (динутуксимаб), Дарзалекса (даратумумаб), Пралуэнта (алирокумаб), Репаты (эволокумаб), Portrazza (нецитумумаб), Эмплисити (элотузумаб), Нукалы (меполизумаб), Праксбайнда (идаруцизумаб), Bexxar (тоситумомаб и I131-тоситумомаб) или их антигенсвязывающих фрагментов.
22. Способ по любому из пп. 1-21, где антигенсвязывающий белок выбран из группы, состоящей из антитела к EGFR или его антигенсвязывающего фрагмента или антитела к c-Met или его антигенсвязывающего фрагмента;
где антитело к EGFR или его антигенсвязывающий фрагмент содержит участки LCDR1, LCDR2, LCDR3 под SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 и их варианты, участки HCDR1, HCDR2, HCDR3 под SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 и их варианты, предпочтительно последовательности легкой цепи под SEQ ID NO:1 и тяжелой цепи под SEQ ID NO:2;
где в альтернативном варианте антитело к c-Met или его антигенсвязывающий фрагмент содержит участки LCDR1, LCDR2, LCDR3 под SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 и их варианты, предпочтительно LCDR1 представляет собой SEQ ID NO:17, и участки HCDR1, HCDR2, HCDR3 под SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 и их варианты; при этом антитело к c-Met или его антигенсвязывающий фрагмент предпочтительно содержит последовательности легкой цепи под SEQ ID NO:3 и тяжелой цепи под SEQ ID NO:4.
23. Способ по любому из пп. 1-22, где проводимость антигенсвязывающего белка из стадии 1) доводят до значения менее чем 5 мСм/см перед приведением в контакт с ионообменным носителем.
24. Способ по любому из пп. 1-23, где осуществляют иммобилизацию антигенсвязывающего белка, указанного на стадии 1), на ионообменном носителе в буфере со значением рН от 5,5 до 7,0, предпочтительно 6,3.
25. Способ по п. 24, где указанный буфер выбран из группы, состоящей из фосфатного буфера, ацетатного буфера, цитратного буфера, сукцинатного буфера, предпочтительно фосфатного буфера.
26. Способ по любому из пп. 1-25, где на стадии 2) осуществляют связывание иммобилизованного антигенсвязывающего белка с лекарственным средством, и при этом реакцию связывания проводят путем медленного пропускания лекарственного средства через ионообменный носитель с обеспечением контроля молярного соотношения лекарственного средства и антигенсвязывающего белка на уровне менее 6:1 и со скоростью потока 0,2-2 мл/мин.
27. Способ по любому из пп. 1-26, где элюирование полученного на стадии 2) предусматривает ступенчатое элюирование с использованием буферов с различными концентрациями соли, при этом рН буфера составляет 5,0-6,5, предпочтительно 5,5.
28. Способ по п. 27, где буфер выбран из группы, состоящей из фосфатного буфера, ацетатного буфера, цитратного буфера, сукцинатного буфера, предпочтительно цитратного буфера.
29. Способ по любому из пп. 1-28, где ступенчатое элюирование предусматривает первую стадию элюирования и вторую стадию элюирования, где концентрация соли при первом элюировании составляет 100-140 мМ, предпочтительно 110 мМ, концентрация соли при втором элюировании составляет 150-200 мМ, предпочтительно 180 мМ.
30. Способ по любому из пп. 1-29, где указанная стадия 1) предусматривает:
а) связывание антигенсвязывающего белка со сшивающим средством с получением модифицированного антигенсвязывающего белка;
b) иммобилизацию модифицированного антигенсвязывающего белка на ионообменном носителе с получением иммобилизованного антигенсвязывающего белка;
2
c) добавление средства для снятия защиты, и при этом средство для снятия защиты предпочтительно представляет собой NHOH·HCL.
31. Способ по п. 30, где связывание антигенсвязывающего белка со сшивающим средством осуществляют при температуре от 20 до 40°С.
32. Способ по п. 30, где связывание антигенсвязывающего белка со сшивающим средством осуществляют в буфере со значением рН от 4,0 до 5,5, предпочтительно при рН 4,3; при этом буфер предпочтительно представляет собой ацетатный буфер, более предпочтительно ацетатный буфер, содержащий ацетонитрил.
33. Способ по любому из пп. 1-29, где указанная стадия 1) предусматривает:
A) иммобилизацию антигенсвязывающего белка на ионообменном носителе с получением иммобилизованного антигенсвязывающего белка;
В) добавление восстановителя для восстановления дисульфидных мостиков иммобилизованного антигенсвязывающего белка;
где восстановитель предпочтительно выбран из группы, состоящей из TCEP, DTT, меркаптоэтиламина, Ac-Cys, более предпочтительно TCEP.
34. Способ по п. 33, где реакцию восстановления на стадии В проводят при температуре от 25 до 45°С, предпочтительно 40°С.