ДЕТЕКЦИЯ НУКЛЕИНОВОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ-МИШЕНИ В АНАЛИЗЕ С ГИБРИДИЗАЦИЕЙ СИГНАЛЬНОГО ОЛИГОНУКЛЕОТИДА, ЗАВИСЯЩЕЙ ОТ РАСЩЕПЛЕНИЯ И УДЛИНЕНИЯ ЗОНДИРУЮЩЕГО И МЕТЯЩЕГО ОЛИГОНУКЛЕОТИДА

1. Способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с PCE-SH (гибридизацией сигнального олигонуклеотида, зависящей от расщепления и удлинения РТО), включающий
а) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с располагающимся против хода транскрипции олигонуклеотидом и зондирующим и метящим олигонуклеотидом (РТО); при этом располагающийся против хода транскрипции олигонуклеотид содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РТО содержит (1) 3′-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5′-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3′-концевой узнающий мишень участок РТО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5′-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; причем располагающийся против хода транскрипции олигонуклеотид предшествует РТО;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РТО; при этом располагающийся против хода транскрипции олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5′-концевой тегирующий участок или часть 5′-концевого тегирующего участка РТО;
(c) гибридизацию фрагмента, высвободившегося из РТО, с захватывающим и матричным олигонуклеотидом (СТО); при этом СТО содержит в направлении 3′→5′ (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5′-концевому тегирующему участку или части 5′-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5′-концевому тегирующему участку и 3′-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО;
(d) осуществление реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, содержащей удлиненную последовательность, комплементарную матричному участку СТО, образуя тем самым удлиненный дуплекс;
(e) гибридизацию удлиненной цепи с сигнальным олигонуклеотидом (SO); при этом SO содержит последовательность, комплементарную этой удлиненной цепи, и по меньшей мере одну метку; SO обеспечивает получение детектируемого сигнала посредством гибридизации с удлиненной цепью; и
(f) детекцию сигнала; при этом детекция сигнала указывает на присутствие удлиненной цепи и присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
2. Способ по п. 1, где по меньшей мере часть SO содержит последовательность, комплементарную удлиненной последовательности.
3. Способ по п. 1, где детектируемый сигнал обеспечивается посредством (1) метки, соединенной с SO, (2) комбинации метки, соединенной с SO, и метки, соединенной с фрагментом РТО, (3) комбинации метки, соединенной с SO, и метки, встраиваемой в удлиненную цепь во время реакции удлинения на стадии (d), или (4) комбинации метки, соединенной с SO, и интеркалирующего красителя.
4. Способ по п. 1, где SO помечен с использованием системы двух взаимодействующих меток, содержащей репортерную молекулу и молекулу-гаситель, и гибридизация между SO и удлиненной цепью на стадии (е) индуцирует изменение сигнала от системы двух взаимодействующих меток с получением детектируемого сигнала.
5. Способ по п. 1, где SO помечен одиночной меткой, и гибридизация между SO и удлиненной цепью на стадии (е) индуцирует изменение сигнала от одиночной метки с получением детектируемого сигнала.
6. Способ по п. 5, где одиночная метка представляет собой одиночную флуоресцентную метку.
7. Способ по п. 1, в котором используют дополнительный SO, содержащий последовательность, комплементарную удлиненной цепи, два SO гибридизуются с удлиненной цепью близко друг к другу, каждый из этих двух SO содержит одну метку, выбранную из репортерной молекулы и молекулы-гасителя системы двух взаимодействующих меток; и гибридизация между этими двумя SO и удлиненной цепью индуцирует изменение сигнала от системы двух взаимодействующих меток с получением детектируемого сигнала.
8. Способ по п. 1, где SO содержит одну метку, выбранную из репортерной молекулы и молекулы-гасителя системы двух взаимодействующих меток, фрагмент РТО содержит другую метку, выбранную из репортерной молекулы и молекулы-гасителя; удлиненная цепь содержит метку, происходящую из фрагмента РТО, и при этом гибридизация между SO и удлиненной цепью индуцирует изменение сигнала от системы двух взаимодействующих меток с получением детектируемого сигнала.
9. Способ по п. 1, где SO содержит одну метку, выбранную из репортерной молекулы и молекулы-гасителя системы двух взаимодействующих меток, а матричный участок СТО содержит нуклеотид, имеющий первое неприродное основание; при этом реакцию удлинения на стадии (d) осуществляют в присутствии нуклеотида, имеющего как второе неприродное основание с аффинностью специфического связывания с первым неприродным основанием, так и другую молекулу, выбранную из репортерной молекулы и молекулы-гасителя, в результате чего происходит встраивание метки в удлиненную цепь; при этом гибридизация между SO и удлиненной цепью индуцирует изменение сигнала от системы двух взаимодействующих меток с получением детектируемого сигнала.
10. Способ по п. 1, где SO содержит одну метку, выбранную из репортерной молекулы и молекулы-гасителя системы двух взаимодействующих меток, и реакцию удлинения на стадии (d) осуществляют в присутствии нуклеотида, имеющего другую метку, выбранную из репортерной молекулы и молекулы-гасителя, в результате чего происходит встраивание метки в удлиненную цепь; при этом гибридизация между SO и удлиненной цепью индуцирует изменение сигнала от системы двух взаимодействующих меток с получением детектируемого сигнала.
11. Способ по п. 1, где SO содержит акцептор FRET (резонансного переноса энергии флуоресценции), и гибридизацию на стадии (е) осуществляют в присутствии интеркалирующего красителя; при этом гибридизация между SO и удлиненной цепью индуцирует изменение сигнала от акцептора SO с получением детектируемого сигнала.
12. Способ по п. 1, где РТО, СТО и/или SO блокирован по его 3′-концу, чтобы препятствовать его удлинению.
13. Способ по п. 1, где располагающийся против хода транскрипции олигонуклеотид представляет собой прямой праймер или располагающийся против хода транскрипции зонд.
14. Способ по п. 1, где располагающийся против хода транскрипции олигонуклеотид локализован достаточно близко к РТО, чтобы индуцировать расщепление РТО ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью.
15. Способ по п. 13, где прямой праймер индуцирует посредством своей удлиненной цепи расщепление РТО ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью.
16. Способ по п. 1, где захватывающий участок СТО содержит в своей 5′-концевой части нуклеотидную последовательность, комплементарную части 3′-концевого узнающего мишень участка РТО.
17. Способ по п. 16, где длина нуклеотидной последовательности, комплементарной части 3′-концевого узнающего мишень участка РТО, составляет 1-10 нуклеотидов.
18. Способ по п. 1, дополнительно включающий между стадиями (е) и (f) стадию получения детектируемого сигнала посредством плавления продукта гибридизации со стадии (е) или посредством плавления и гибридизации продукта гибридизации со стадии (е); при этом стадию (f) осуществляют, детектируя сигнал с целью определения присутствия удлиненной цепи.
19. Способ по п. 1, дополнительно включающий после стадии (f) стадию получения и обнаружения детектируемого сигнала посредством плавления продукта гибридизации со стадии (е) или посредством плавления и гибридизации продукта гибридизации со стадии (е), при этом присутствие удлиненной цепи определяют более одного раза.
20. Способ по п. 18, где присутствие удлиненной цепи определяют с использованием анализа кривой плавления или анализа кривой гибридизации.
21. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию денатурации между стадиями (d) и (е).
22. Способ по п. 1, дополнительно включающий повторение всех или некоторых из стадий (a)-(f) с денатурацией между повторяющимися циклами.
23. Способ по п. 22, дополнительно включающий повторение стадий (а)-(е) с денатурацией между повторяющимися циклами и плавление продукта гибридизации со стадии (е) или плавление и гибридизацию продукта гибридизации со стадии (е) с получением детектируемого сигнала; при этом стадию (f) осуществляют, детектируя сигнал с целью определения присутствия удлиненной цепи.
24. Способ по п. 1, где стадии (a)-(f) осуществляют в реакционном сосуде или некоторые из стадий (a)-(f) осуществляют в отдельных реакционных сосудах.
25. Способ по п. 1, который осуществляют для детекции по меньшей мере двух типов нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней; при этом располагающийся против хода транскрипции олигонуклеотид включает по меньшей мере два типа олигонуклеотидов, РТО включает по меньшей мере два типа РТО, СТО включает по меньшей мере два типа СТО, и SO включает по меньшей мере два типа SO.
26. Способ по п. 1, где располагающийся против хода транскрипции олигонуклеотид на стадии (а) представляет собой прямой праймер, и на стадии (b) используют матричную полимеразу нуклеиновых кислот для удлинения прямого праймера.
27. Способ по п. 1, где нуклеиновокислотная последовательность-мишень содержит нуклеотидную вариацию.
28. Способ по любому из пп. 1-27, который осуществляют в присутствии обратного праймера.
29. Способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с PCE-SH (гибридизацией сигнального олигонуклеотида, зависящей от расщепления и удлинения РТО), включающий:
(a) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с парой праймеров, содержащей прямой праймер и обратный праймер, и РТО (зондирующим и метящим олигонуклеотидом); при этом каждый из праймеров, прямой праймер и обратный праймер, содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотным последовательностям-мишеням; РТО содержит (1) 3′-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5′-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3′-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5′-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; РТО локализован между прямым праймером и обратным праймером; при этом РТО блокирован по его 3′-концу, чтобы не допустить его удлинения;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с матричной полимеразой нуклеиновых кислот, обладающей 5′-нуклеазной активностью в условиях, подходящих для удлинения праймеров и для расщепления РТО; при этом, когда РТО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, прямой праймер удлиняется, и удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО матричной полимеразой нуклеиновых кислот, обладающей 5′-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5′-концевой тегирующий участок или часть 5′-концевого тегирующего участка РТО;
(c) гибридизацию фрагмента, высвободившегося из РТО, с захватывающим и матричным олигонуклеотидом (СТО); при этом СТО содержит в направлении 3′→5′ (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5-концевому тегирующему участку или части 5′-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5′-концевому тегирующему участку и 3′-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО;
(d) осуществление реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, содержащей удлиненную последовательность, комплементарную матричному участку СТО, образуя тем самым удлиненный дуплекс;
(e) гибридизацию удлиненной цепи с сигнальным олигонуклеотидом (SO); при этом SO содержит последовательность, комплементарную этой удлиненной цепи, и по меньшей мере одну метку; SO обеспечивает получение детектируемого сигнала посредством гибридизации с удлиненной цепью; и
(f) детекцию сигнала; при этом детекция сигнала указывает на присутствие удлиненной цепи и присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
30. Способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с PCE-SH (гибридизацией сигнального олигонуклеотида, зависящей от расщепления и удлинения РТО), включающий
а) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с зондирующим и метящим олигонуклеотидом (РТО); при этом РТО содержит (1) 3′-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5′-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3′-концевой узнающий мишень участок РТО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5′-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью в условиях, подходящих для расщепления РТО; при этом РТО расщепляется ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5′-концевой тегирующий участок или часть 5′-концевого тегирующего участка РТО;
(c) гибридизацию фрагмента, высвободившегося из РТО, с захватывающим и матричным олигонуклеотидом (СТО); при этом СТО содержит в направлении 3′→5′ (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5′-концевому тегирующему участку или части 5′-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5′-концевому тегирующему участку и 3′-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО;
(d) осуществление реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, содержащей удлиненную последовательность, комплементарную матричному участку СТО, образуя тем самым удлиненный дуплекс;
(e) гибридизацию удлиненной цепи с сигнальным олигонуклеотидом (SO); при этом SO содержит последовательность, комплементарную этой удлиненной цепи, и по меньшей мере одну метку; SO обеспечивает получение детектируемого сигнала посредством гибридизации с удлиненной цепью; и
(f) детекцию сигнала; при этом детекция сигнала указывает на присутствие удлиненной цепи и присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
31. Набор для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с PCE-SH (гибридизацией сигнального олигонуклеотида, зависящей от расщепления и удлинения РТО), содержащий
(а) зондирующий и метящий олигонуклеотиды (РТО); при этом РТО содержит (1) 3′-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5′-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3′-концевой узнающий мишень участок РТО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5′-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью;
(b) располагающийся против хода транскрипции олигонуклеотид, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом располагающийся против хода транскрипции олигонуклеотид предшествует РТО; при этом располагающийся против хода транскрипции олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5′-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5′-концевой тегирующий участок или часть 5′-концевого тегирующего участка РТО;
(c) захватывающий и матричный олигонуклеотиды (СТО); при этом СТО содержит в направлении 3′→5′ (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5′-концевому тегирующему участку или части 5′-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5′-концевому тегирующему участку и 3′-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, содержащей удлиненную последовательность, комплементарную матричному участку СТО, образуя тем самым удлиненный дуплекс; и
(d) сигнальный олигонуклеотид (SO); при этом SO содержит последовательность, комплементарную этой удлиненной цепи, и по меньшей мере одну метку; SO обеспечивает получение детектируемого сигнала посредством гибридизации с удлиненной цепью.
32. Набор по п. 31, где по меньшей мере часть SO содержит последовательность, комплементарную удлиненной последовательности.
33. Набор по п. 31, содержащий (1) метку, соединенную с SO, (2) комбинацию метки, соединенной с SO, и метки, соединенной с фрагментом РТО, (3) комбинацию метки, соединенной с SO, и метки, встраиваемой в удлиненную цепь, или (4) комбинацию метки, соединенной с SO, и интеркалирующего красителя.
34. Набор по п. 31, где SO помечен с использованием системы двух взаимодействующих меток, содержащей репортерную молекулу и молекулу-гаситель.
35. Набор по п. 31, где SO помечен одиночной меткой.
36. Набор по п. 31, дополнительно включающий дополнительный SO, содержащий последовательность, комплементарную удлиненной цепи, при этом два SO гибридизуются с удлиненной цепью близко друг к другу, каждый из этих двух SO содержит одну метку, выбранную из репортерной молекулы и молекулы-гасителя системы двух взаимодействующих меток.
37. Набор по п. 31, где SO содержит одну метку, выбранную из репортерной молекулы и молекулы-гасителя системы двух взаимодействующих меток, а фрагмент РТО содержит другую метку, выбранную из репортерной молекулы и молекулы-гасителя.
38. Набор по п. 31, где SO содержит одну метку, выбранную из репортерной молекулы и молекулы-гасителя системы двух взаимодействующих меток, а матричный участок СТО содержит нуклеотид, имеющий первое неприродное основание; при этом набор дополнительно содержит нуклеотид, имеющий как второе неприродное основание с аффинностью специфического связывания с первым неприродным основанием, так и другую молекулу, выбранную из репортерной молекулы и молекулы-гасителя.
39. Набор по п. 31, где SO содержит одну метку, выбранную из репортерной молекулы и молекулы-гасителя системы двух взаимодействующих меток, и набор дополнительно содержит нуклеотид, имеющий другую молекулу, выбранную из репортерной молекулы и молекулы-гасителя.
40. Способ по п. 31, где SO содержит акцептор FRET (резонансного переноса энергии флуоресценции), и набор дополнительно содержит интеркалирующий краситель.
41. Набор по п. 31, где РТО, СТО и/или SO блокирован по его 3′-концу, чтобы препятствовать его удлинению.
42. Набор по п. 31, где располагающийся против хода транскрипции олигонуклеотид представляет собой прямой праймер или располагающийся против хода транскрипции зонд.
43. Набор по п. 31, дополнительно содержащий фермент, обладающий 5′-нуклеазной активностью.
44. Набор по п. 31, представляющий собой набор для детекции по меньшей мере двух типов нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней;
при этом располагающийся против хода транскрипции олигонуклеотид включает по меньшей мере два типа олигонуклеотидов, РТО включает по меньшей мере два типа РТО, СТО включает по меньшей мере два типа СТО, и SO включает по меньшей мере два типа SO.
45. Набор по любому из пп. 31-44, дополнительно содержащий обратный праймер.
46. Способ по п. 19, где присутствие удлиненной цепи определяют с использованием анализа кривой плавления или анализа кривой гибридизации.