Стромально-васкулярная фракция жировой ткани как альтернативный источник клеточного материала для регенеративной медицины

стромально-васкулярная фракция жировой ткани как альтернативный источник клеточного материала для регенеративной медицины

А.В. Веремеев 1, Р.Н. Болгарин1, М.А. Петкова 1, Н. Кац 1, В.Г. Нестеренко 2

1 ООО «ДжоинТекСэлл», Москва, Россия

2 Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, Москва, Россия

Adipose-derived stromal vascular fraction as an alternative source of cells for the regenerative medicine

A.V. Veremeev 1, R.N. Bolgarin 1, MA. Petkova 1, N. Katz1, V.G. Nesterenko 2

1 "JoinTechCell" LLC, Moscow, Russia

2 N.F. Gamaleya Federal Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

Жировая ткань является наиболее удобным и богатым источником клеточного материала для регенеративной медицины вследствие высокого содержания прогениторных клеток, число которых многократно превосходит их количество в костном мозге и других тканях . Стромально-ва-скулярная фракция жировой ткани, содержащая различные популяции стволовых клеток-предшественниц, может быть легко выделена ферментативным способом и использована при различных патологических состояниях . Тем не менее, характеристика клеточного состава с выраженным терапевтическим потенциалом остается неясной, практически отсутствуют стандартизированные протоколы выделения и оценки клеточной фракции . В настоящем обзоре проведен анализ литературных данных об использовании стромально-васкулярной фракции жировой ткани для стимулирования процессов регенерации . Представлены основные вехи применения стромально-васкулярной фракции жировой ткани в историческом аспекте, источники и способы ее выделения, характеристика состава, иммунофенотип и направления дифференцировки клеток, входящих в её состав .

Ключевые слова: жировая ткань, стромально-васку-лярная фракция, регенерация, дифференцировка, клеточная терапия

The adipose tissue is considered as the most convenient and abundant source of cells for the regenerative medicine . The number of progenitor cells in the adipose tissue significantly exceeds their amount in the bone marrow and other tissues . Therefore, adipose-derived stromal vascular fraction comprising distinct populations of stem and progenitor cells can be relatively easily isolated from lipoaspirates and may then be used in various pathological conditions . However, the profile of this cell fraction with a significant therapeutic potential remains unclear, and there are no standardized protocols for its isolation and evaluation . in this article, we reviewed the data on the potential use of adipose-derived stromal vascular fraction in the regenerative medicine . We described the main historical milestones and performed a comprehensive analysis of the sources of adipose-derived stromal vascular fraction, techniques of its isolation, features, immunophenotype and differentiation pathways

Keywords: adipose tissue, stromal vascular fraction, regeneration, differentiation, cytotherapy.

Введение

Стремительное развитие науки в области регенеративной медицины и клеточной биологии, фундаментальные исследования и поиск перспективных терапевтических подходов в данном направлении обещают новые захватывающие открытия в ближайшем будущем [1]. Высокий интерес к технологиям применения различных видов стволовых клеток во многом определен их потенциалом в восстановлении поврежденных тканей и органов [1].

В настоящем обзоре рассмотрены основные исторические аспекты развития представлений о стволовых клетках взрослого организма и источниках их получения. Подробно описаны характеристики стромально-васкулярной фракции и направления ее клинического применения, как альтернативы костному мозгу . Отдельное внимание уделено способам выделения клеточного материала и проблемам, связанным с автоматизацией данных процессов и внедрением их в широкую клиническую практику

Считается, что идеальной стволовой клеткой, обладающей тотипотентностью, то есть способностью дифференцироваться в любые типы клеток всех трех зародышевых листков, является оплодотворенная зигота — истинная эмбриональная стволовая клетка (ЭСК) [2, 3]. Однако высокий риск малигнизации, продолжающиеся этические и политические дебаты

e-mail: al . veremeev@gmail . com

значительно ограничивают не только терапевтическое использование ЭСК, но и экспериментальные исследования в данной области [3, 4].

Открытие гемопоэтических стволовых клеток положило начало истории изучения регионарных стволовых клеток взрослого организма [5]. В пионерских работах А. Я . Фриденштейна и его сотрудников из НИИ эпидемиологии и микробиологии им . Н . Ф . Гамалеи (1968, 1974) было показано наличие муль-типотентных мезенхимальных стромальных клеток в костном мозге (ММСК-КМ) [6, 7]. Кроме того, были разработаны методы, являющиеся базовыми для клеточных технологий, включая анализ формирования колоний ММСК-КМ, образование штаммов и трансплантацию клеток in vivo, была доказана дифференцировка ММСК-КМ в клетки костной, хрящевой и жировой тканей, а также в клетки стро-мы костного мозга [6, 7] Описаны характеристики ММСК-КМ, определяющие их принадлежность к мультипотентным клеткам-предшественницам [8, 9]. Работы А . Я . Фриденштейна с соавт . (1968, 1974) во многом опередили свое время [6, 7]. Методы, созданные ими, используются до сих пор, а исследования по применению аутогенных клеток для регенерации тканей являются одним из наиболее развивающихся направлений современной биомедицины [10]. Существующие подходы основаны на

трансплантации клеточного материала как системно, так и непосредственно в зону дефекта тканей и (или) органов [10]. Аутогенная трансплантация характеризуется низким риском отторжения вследствие отсутствия иммунного ответа на клетки собственного организма [10]. В данном направлении использование ММСК-КМ является приемлемой альтернативой ЭСК [11]. ММСК-КМ уже показали свою эффективность в многочисленных доклинических и клинических исследованиях [11, 12]. Тем не менее, использование ММСК-КМ сопряжено со значительными трудностями при получении клеточного материала, включая высокую инвазивность процедуры аспирации костного мозга и небольшое количество получаемых прогениторных клеток [13—15]. Комплекс данных факторов дал толчок к поиску других эффективных источников ММСК [13—15].

В последние десять лет подкожная жировая клетчатка привлекает все большее внимание исследователей и врачей в качестве альтернативы костному мозгу как источника стволовых и прогениторных клеток для регенеративной медицины [14—18]. Основным преимуществом жировой ткани является малая инвазивность процедуры забора, которую проводят под местной или инфильтрационной анестезией с минимальным болевым синдромом, дискомфортом и риском для пациента [15]. Процедура липо-аспирации широко применяется, стандартизирована, проста в исполнении, может проводиться в условиях процедурного кабинета, занимает не более 90 мин . [18, 19], а клеточные фракции, выделенные из жировой ткани, могут быть использованы в клинической практике без стадии культивирования [18, 20].

Кроме того, подкожная жировая клетчатка является богатым депо стволовых и прогениторных клеток, что показано во многих работах [14—18]. Ранее было описано, что из жировой ткани можно выделить значительно большее количество ММСК по сравнению с костным мозгом [13—16, 18]. Так 100 мл костномозгового трансплантата содержит 6х108 ядросодержащих клеток, из которых на долю ММСК приходится не более 0,001-0,01% [13, 14, 16]. В абсолютном значении данный диапазон составляет 0,006-0,06х106 клеток на 100 мл костного мозга [13, 14, 16]. Для сравнения, число ядросодержащих клеток во фракции жировой ткани составляет примерно 0,5-2,0х106 на грамм ткани, а количество ММСК колеблется в диапазоне от 1 до 10% в зависимости от донора и места забора трансплантата [13, 15, 16]. Таким образом, из 100 граммов жировой ткани может быть получено 0,5-20х106 ММСК [13, 15, 16].

Как и костный мозг, жировая ткань содержит различные типы клеток . Гетерогенную фракцию, отделенную от стромы и адипоцитов с использованием коллагеназ, принято называть стромально-васку-лярной фракцией жировой ткани (adipose-derived stromal vascular fraction, SVF) [13-16, 18]. SVF характеризуется неоднородностью и значительной вариабельностью клеточного состава в зависимости от состояния донора, его возраста и области забора биологического материала [15, 18]. После сортировки из SVF могут быть выделены различные популяции клеток, включая эндотелиальные и гладко-мышечные, перициты, фибробласты, тучные клетки и преадипоциты [13-16, 18]. Особый интерес представляют клетки, так называемой, «регенераторной

фракции», а именно комплекса «стволовых и прогениторных» клеток жировой ткани (adipose-derived stem cells, ADSCs), которые были впервые выделены и охарактеризованы еще в 2001 г . P . A . Zuk с соавт по способности клеток дифференцироваться в нескольких направлениях Проведенные исследования показали потенциал регенераторной фракции к последующему развитию, как минимум, в четырех различных направлениях [21]. В дальнейшем была доказана дифференцировка ADSCs в адипоциты, хондроциты, остеобласты, миоциты, нейрональные клетки, кардиомиоциты и гепатоциты [13-16, 21]. Перспективы терапевтического использования данного свойства ММСК жировой ткани были продемонстрированы в нескольких экспериментальных и клинических исследованиях [22-28].

Первые сообщения о трансплантации жировой ткани появились более ста лет назад [29, 30]. Адипогенные предшественники были выделены из SVF в 1976 г . , а ММСК жировой ткани насчитывают в своей истории более десяти лет [31]. Важно заметить, что в условиях культивирования in vitro ADSCs приобретают фенотип ММСК-КМ и экспрессируют характерные для них антигены, что в значительной степени определило потенциал их использования в различных областях медицины [13-16]. Их исследуют для применения в лечении пациентов с дефектами мягких тканей, костей скелета, хроническими трофическими и лучевыми язвами, ожогами, болезнью Крона, рассеянным склерозом, инфарктом миокарда, инсультами различного генеза и др . [14, 15, 18, 32-34].

Выделение стромально-васкулярной фракции

жировой ткани

Выделение SVF из жировой ткани - многоэтапный лабораторный процесс, требующий квалификации и определенных навыков в работе с клеточными культурами и биологическими объектами [15, 16, 18]. ММСК из жировой ткани были выделены группой P . A . Zuk с соавт . (2001) с использованием ручного метода, долгое время остававшегося единственным [21]. Принцип данного метода и всех его модификаций представлен на рис 1

Метод P . A . Zuk с соавт . (2001) основан на обработке липоаспирата 0,075% раствором коллаге-назы i типа при температуре 37°С в течение 30 мин . с последующим центрифугированием получившейся суспензии при 800 g [21]. После центрифугирования суспензии клеток в супернатанте находятся ади-поциты, а в осадке - SVF с примесью эритроцитов, которые удаляются во время инкубации в лизирую-щем растворе хлорида аммония [21]. Модификации ручного метода упрощали протокол, но не изменяли принципов выделения [20, 36-39]. Сегодня в лабораторных условиях активно применяются инкубаторы, автоматические шейкеры, клеточные фильтры и другие устройства, позволяющие получить более чистую фракцию с минимальным количеством остаточных ферментов, негативно влияющих на дальнейшее использование получившегося клеточного продукта [20, 36-39]. Вводятся дополнительные этапы промывки в буферных растворах [20, 36-39]. Тем не менее, большинство современных методик все равно основаны на применении коллагеназ с последующим осаждением клеточной массы центрифугированием [15, 16, 18].

Рис. 1. Общий принцип выделения стромально-васкулярной фракции и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани

Однако все ручные методы характеризуются высокими временными и организационными затратами и предполагают наличие так называемого «человеческого фактора», который в эпоху повсеместного внедрения стандартов GMP (Good manufacturing practice) и GTP (Good tissue practice) неприемлем [19, 35]. Поэтому технологии выделения эволюционируют в сторону автоматизации процесса Созданы автоматические и полуавтоматические системы выделения SVF: PNC's Multi Station, CHA Biotech Cha-Station, Cytori Celution 800/CRS System, Medi-Khan's Lipokit MaxStem, JTC's miniSTEM и NeoGenesis's UNiStation [20].

Практически все системы выделения состоят из аппаратной стационарной части и одноразовых стерильных блоков [19, 40-44]. Стерильный одноразовый блок, в свою очередь, содержит камеру обработки ткани, где происходят процессы ее отмывки, обработки ферментами и центрифугирования [19, 40-44] В комплектацию одноразового блока производители системы включают шприцы для заливки коллагеназы и отбора готового образца, ферменты, а также соединительные трубки и расходные материалы, формирующие «индивидуальный набор» (kit) [19, 40-44]. В целом, автоматические системы имитируют ручной метод с тем отличием, что все процессы заранее запрограммированы и выполняются аппаратной частью вне зависимости от лаборанта или исследователя [19, 40-44]. Использование подобных устройств позволяет стандартизировать протокол выделения и значительно повысить качество и чистоту конечного продукта, но, несмотря на все достоинства, такие устройства и расходные материалы к ним очень дороги и поэтому недоступны для большинства лабораторий и пациентов [19, 40-44]. Таким образом, вопрос соответствия качества выделенного клеточного материала и доступности подобных технологий остается открытым .

Методы получения стволовых клеток из разных тканей взрослого организма - один из ключевых

драйверов всего комплекса применения аутогенного клеточного материала в регенеративной медицине. В то же время, отсутствие оптимизированных и стандартизированных технологий препаративного выделения аутогенных стволовых клеток является одной из важных причин низкого уровня применения и степени внедрения клеточных технологий в практику

На основании требований к клинической эффективности и безопасности можно сформулировать основные принципы, на которых должен быть выстроен оптимальный протокол получения стволовых клеток в строгом соответствии стандартам GTP: безопасность (отсутствие возможности контаминации образца биологического материала); адекватные критерии эффективности и сохранения регенераторного потенциала клеточной фракции; простота использования (возможность проведения этапа выделения клиническими специалистами, минимальные требования к квалификации персонала в области клеточных технологий и техническому обслуживанию) . Кроме того, необходимо учитывать, что экономические затраты должны быть оптимальными . Решение данной задачи в будущем позволит повысить доверие специалистов к использованию клеточных технологий в более широких масштабах, и они станут доступнее для пациентов

Характеристика клеточного состава

стромально-васкулярной фракции

SVF состоит из нескольких типов клеток, включая циркулирующие клетки крови, фибробласты, перициты, эндотелиальные клетки и ADSCs, которые могут быть выделены из общей фракции путем культивирования на пластике, так как, в отличие от остальных, являются адгезивными [13—18]. Первичная культура ADSCs представляет собой достаточно однородную популяцию клеток по сравнению с гетерогенной SVF и характеризуется высокой экспрессией CD34 и отсутствием CD31 (РЕСАМ) [14-18, 45]. При пасси-

ровании ADSCs несколько меняют свой фенотип и могут быть идентифицированы посредством проточной цитофлюориметрии и сортировки по нескольким конкретным поверхностным маркерам: CD34±, CD45, CD73 + , CD9 + , CD15 + , CD14- или CD11b^ CD79- или CD19- и HLA-DR- [14-18, 45].

SVF определяется по экспрессии CD31 и CD34 (табл . 1) [14-17, 45]. Негемопоэтические эндо-телиальные предшественники, характеризующиеся ко-экспрессией CD31 и CD34 ^31+^34+), находятся в капиллярах, в то время как зрелые эндо-телиальные клетки CD31+/CD34- локализованы на внутренней поверхности просвета мелких сосудов [14, 46-48]. Фенотип эндотелиальных клеток-предшественниц, полученных из жировой ткани, соответствует фенотипу подобных клеток из костного мозга и циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественниц (CD45-/CD34+/VEGFR2 + ) [15, 16, 45-49]. В то же время их количество во фракции SVF на 3-5 порядков выше, что делает SVF перспективным кандидатом для применения в регенеративной медицине [14-16, 18, 45].

Перициты SVF определяются, как правило, как Сй45-/Сй31-/Сй146 + -клетки [14, 15, 46-48]. В различных цитометрических исследованиях была показана ко-экспрессия CD34 и CD90 с CD31/CD146+ [14, 15, 46-48]. Клетки с фенотипом CD31-/ CD146+/CD34+ составляют около 0,5% в популяции ядросодержащих клеток SVF [46-48]. Данный пул содержит переходную популяцию между перицитами и клетками супраадвентициального периваскулярного кольца [46-48] . Клетки с фенотипом CD45-/CD31-/ CD34+/CD146- (>90% CD90 + ), находящиеся в наружном сосудистом кольце, представляют собой су-праадвентициальные стромальные клетки жировой ткани (SA-ASC) (рис . 2) [46-48].

Именно эта популяция в оригинальной работе K . Yoshimura с соавт . (2006) была охарактеризована как «жировые стромальные/стволовые клетки (ASC)» [50]. Впоследствии, на 2-й ежегодной конференции iFATS (international Federation for Adipose Therapeutics and Science) было принято новое унифицированное наименование всей мультипотентной популяции - ADSCs .

Таблица 1. Клеточные популяции SVF [по 46, 47, 50, 51]

Фенотип Процентное содержание, % (М±ст) Тип клеток

CD34+CD31-CD146- 34,6±17,8 ADSC-подобные

CD34+CD31+CD146+ 12,2±9,5 Эндотелиальные клетки-предшественники

CD34+CD31-CD146+ 0,5±0,3 Переходные клетки

CD105+CD73+CD90+ CD140a+CD146+ н/д Мезенхимоангиобласты

CD34-CD31-CD146+ 10,3±9,9 Гладкомышечные клетки/Перициты

CD45-CD31+CD34- 2,7±0,8 Эндотелиальные клетки

CD45+CD34- 14,2±2,3 Лейкоциты

CD45+CD34+ 5,2±1,3 HSC-подобные

CD45+CD34+CD117+ 0,75±0,1

CD45+CD34+CD133+ 0,02±0,03

CD45+CD34-CD3+ 4,8±1,9 Т-клетки

CD45+CD34-CD19+ 0,2±0,03 В-клетки

CD45+CD34-CD117+ 0,56±0,2 Тучные клетки

CD45+CD11b+ 6,1±3,2 Гранулоциты

CD45+CD14+ 5,2±4,3 Моноциты

Рис. 2.

Клеточный паттерн стромально-васкулярной фракции жировой ткани

Секреторные характеристики

стволовых клеток жировой ткани

Секреторные и метаболические характеристики стволовых клеток из жировой ткани были подробно описаны в экспериментах и доклинических моделях [52—55]. Было показано, что ADSCs секретирует очень важный для интенсификации восстановительных процессов цитокиновый профиль, включающий ангиогенные, антиоксидантные и иммуносупрес-сивные факторы [52—55]. Секретом SVF содержит сосудистый эндотелиальный фактор роста (vascular endothelial growth factor, VEGF), трансформирующий фактор роста (transforming growth factor, TGF), фактор роста гепатоцитов (hepatocyte growth factor/scatter factor, HGF), тромбоцитарный фактор роста (platelet-derived growth factor, PDGF), фактор роста плаценты (placental growth factor, PlGF) и основной фактор роста фибробластов (base fibroblast growth factor, bFGF) [52] в высоких концентрациях . Данный профиль биологически активных веществ определяет способность ADSCs стимулировать неоваскуляризацию и пролиферацию клеток в зоне повреждения [52].

Кроме того, ADSCs не вызывают неблагоприятных иммунных реакций из-за отсутствия HLA-DR, подавления пролиферации лимфоцитов, ингибиро-вания секреции провоспалительных и стимулирования противовоспалительных цитокинов [14—16]. Иммуномодулирующие свойства SVF были описаны в ряде экспериментальных работ и сейчас перешли в стадию клинических исследований [56, 57].

Иммуномодулирующие и ангиогенные свойства стволовых клеток из жировой ткани определяют их возможную роль в онкогенезе [58, 59]. В последнее время опубликованы противоречивые данные, показывающие, что в одних экспериментах ADSCs могут способствовать росту и прогрессированию опухоли [60, 61], а в других наоборот — подавлять развитие

опухолевого процесса [62, 63]. В любом случае при исследовании терапевтических подходов с применением стволовых клеток требуется тщательная оценка рисков и преимуществ такой терапии

Культивирование и потенциал

дифференцировки стромально-васкулярной

фракции

Культивирование SVF используется, как правило, для отделения фибробластоподобных клеток, так называемой «прилипающей» (адгезивной) фракции, а также увеличения количества ADSCs за счет пролиферации в питательной среде [14-18, 45]. Существующие технологии позволяют успешно реализовать данные цели, однако они занимают много времени, имеют высокую стоимость и экономически неэффективны ввиду необходимости внедрения правил GMP [35]. Кроме того, культивирование может отрицательно сказаться на функциональном состоянии клеточного трансплантата в связи с изменением экспрессии молекул адгезии в процессе культивирования, что в некоторых случаях делает невозможным дальнейшее использование клеток в клинической практике [15, 16]. Также культивирование может оказывать негативное влияние на дифференцировочный потенциал стволовых клеток [15, 16].

Выделенные из жировой ткани стволовые клетки обладают способностью к пролиферации в условиях in vitro и индуцированной дифференцировке в адипоген-ном, остеогенном, хондрогенном и миогенном направлениях [13-18, 21, 35]. Кроме этого, была описана возможность получения гепатоцитов, эндотелиальных клеток, клеток поджелудочной железы с выраженным эндокринным фенотипом, секретирующих инсулин, а также дифференцировка данного типа клеток в ней-рогенном направлении (табл . 2) [15-18, 35].

Таблица 2. Дифференцировочный потенциал ADSCs [по 16, 18]

Клеточная линия

Индуктор дифференцировки

Адипоциты Кардиомиоциты Хондроциты Эндотелиальные клетки Миоциты

Нейрональные клетки Остеобласты

Дексаметазон, изобутилметилксантин, индометацин, инсулин, тиазолидиндион Трансферрин, ^-3, ^-6, VEGF

Аскорбиновая кислота, BMP-6, дексаметазон, инсулин, TGF-p Запатентованная среда, содержащая аскорбат, гидрокортизон, EGF, bFGF Дексаметазон, лошадиная сыворотка Бутилатгидроксианизол, вальпроевая кислота, инсулин Аскорбиновая кислота, BMP-2, дексаметазон, 1,25-дигидроксивитамин D

ADSCs имеют исключительный потенциал дифференцировки в зрелые адипоциты, что открывает большие перспективы в разработке методов для коррекции дефектов мягких тканей [64-66]. В качестве факторов индукции в данном случае могут выступать инсулин, дексаметазон, розиглитазон и индометацин [16, 18]. В процессе дифференцировки ADSCs проходят стадию фибробластоподобных клеток звездчатой или веретеновидной формы, затем их морфология изменяется, что связано с появлением одной или нескольких липидных вакуолей [15, 16]. Клетки начинают экспрессировать некоторые антигены, характерные для зрелых адипоцитов, включая лептин, рецепторы, активируемые пероксисомными пролифераторами (peroxisome praliferator-activated receptors, PPARs), инсулин-зависимый транспортер глюкозы 4 (glucose transporter type 4, GLUT4) и глицерол-3-фосфатдегидрогеназу (glycerol-3-phosphate dehydrogenase, GPDH) [16, 18].

Остеогенная дифференцировка ADSCs может быть вызвана добавлением в среду культивирования дексаметазона, p-глицерофосфата и витамина D3 [16, 18]. Приобретение фенотипа остеобластов сопровождается экспрессией щелочной фосфата-зы, коллагена i типа, остеопонтина, остеокальцина и фактора транскрипции 2 (runt-related transcription factor 2, Runx2) [16, 18]. Кроме того, остеогенную дифференцировку индуцируют трансфекцией определенных генов (bmp2 и runx2) [67]. Данный метод оказался очень эффективным как в условиях культивирования, так и in vivo, что открывает значительные перспективы для создания новых подходов к восстановлению костной ткани [67].

Добавление в культуральную среду инсулинопо-добного фактора роста (insulin-like growth factor, iGF), трансформирующего фактора роста бета (transforming growth factor beta, TGF-p), костных морфогенетических белков (bone morphogenetic proteins, BMPs) вызывает хондрогенную дифференцировку ADSCs [16, 18]. Также хондрогенная диф-ференцировка происходит путем посева ADSCs на искусственный матрикс из полигликолевой кислоты (PGA), что было продемонстрировано на экспериментальной модели [68]

Особый интерес представляет получение из ADSCs терминально дифференцированных миобла-стов ADSCs в условиях in vitro могут образовывать многоядерные миофибриллы [69, 70]. Данное свой-

ство активно изучается на доклинических моделях генетически детерминированной мышечной дистрофии [71, 72]. Другие исследования сосредоточены на способности ADSCs дифференцироваться в кардиомиоциты с возможностью их последующего применения в регенерации сердечной мышцы после ишемического повреждения [73, 74].

Экспериментально была показана дифференцировка ADSCs в эндотелиальном направлении [75]. Данные клетки выделяют ряд проангиогенных факторов, включая VEGF и PDGF [76].

Некоторые авторы сообщают о возможности превращения ADSCs в нейроноподобные клетки со схожей морфологией и экспрессией белков, характерных для фенотипа нейронов, таких, как нейрон-специфическая энолаза и нейрон-специфический ядерный протеин [77]

В ряде исследований показана индукция диф-ференцировки ADSCs в клетки панкреатических островков [78] и гепатоциты [79] с целью развития методов клеточной терапии для лечении таких заболеваний, как сахарный диабет и дисфункция печени [14]. Однако данные результаты имеют предварительный характер [14].

Заключение

За последние десять лет были разработаны многочисленные экспериментальные модели для применения стволовых и прогениторных клеток в регенерации органов и тканей . Регионарные стволовые клетки проявляют свой восстановительный потенциал, как путем направленной дифференци-ровки, так и за счет реализации паракринных механизмов Особый интерес в данном направлении вызывают клетки SVF, которая представляет собой «минимально-манипулированную» фракцию, содержащую как зрелые, так и стволовые клетки . Развитие современных протеомных и биоаналитических инструментов позволило обнаружить и охарактеризовать молекулярные механизмы регенерации поврежденных тканей, однако из всего многообразия проведенных углубленных исследований секретома и дифференцировочного потенциала невозможно сделать окончательного вывода об их клинической эффективности

Кроме того, исследования способности клеток SVF и ADSCs к дифференцировке в естественных

условиях не показали сколько-нибудь убедительных результатов в первую очередь из-за отсутствия стандартов работы с подобным типом клеток . Важным шагом в данном направлении видится создание стандартизированных протоколов выделения и изоляции клеточного материала без использования этапа культивирования и предварительной диффе-ренцировки клеток .

Благодарности

Настоящая работа была поддержана Грантом Фонда Сколково в рамках проекта «Разработка и внедрение закрытой системы экспресс-выделения и обработки фракции стволовых и регенеративных клеток жировой ткани для применения в медицинской практике».

ЛИТЕРАТУРА:

I. Stoltz J . F ., de Isla N ., Li Y . P . et al . Stem Cells and Regenerative Medicine: Myth or Reality of the 21th Century . Stem Cells Int . 2015; 2015: 734731.

2 . Desai N ., Rambhia P ., Gishto A . Human embryonic stem cell cultivation: historical perspective and evolution of xeno-free culture systems . Reprod . Biol . Endocrinol . 2015; 13: 9 .

3 . Kingham E ., Oreffo R . O . Embryonic and induced pluripotent stem cells: understanding, creating, and exploiting the nano-niche for regenerative medicine . ACS Nano 2013; 7(3): 1867-81.

4 . Simonson O . E ., Domogatskaya A ., Volchkov P . et al . The safety of human pluripotent stem cells in clinical treatment . Ann . Med . 2015; 47(5): 370-80 .

5 . Eaves C . J . Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality . Blood 2015; 125(17): 2605-13 .

6 . Friedenstein A.J ., Petrakova K .V., Kurolesova A. I . et al . Heterotopic of bone marrow . Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues . Transplantation 1968; 6(2): 230-47 .

7 . Friedenstein A.J ., Deriglasova U . F ., Kulagina N . N . et al . Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method . Exp . Hematol . 1974; 2(2): 83-92 .

8 . Mabuchi Y., Houlihan D . D ., Akazawa C . et al . Prospective isolation of murine and human bone marrow mesenchymal stem cells based on surface markers . Stem Cells Int . 2013; 2013: 507301.

9 . Pourrajab F ., Forouzannia S . K ., Tabatabaee S .A. Molecular characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells, source of regenerative medicine . Int. J . Cardiol . 2013; 163(2): 125-31.

10 . Vapniarsky N ., Arzi B . , Hu J . C . et al . Concise Review: Human Dermis as an Autologous Source of Stem Cells for Tissue Engineering and Regenerative Medicine . Stem Cells Transl . Med . 2015; 4(10): 1187-98

II. Ullah I ., Subbarao R . B ., Rho G . J . Human mesenchymal stem cells - current trends and future prospective . Biosci . Rep . 2015; 35(2): e00191

12 . Bara J . J ., Richards R . G ., Alini M . et al . Concise review: Bone marrow-derived mesenchymal stem cells change phenotype following in vitro culture: implications for basic research and the clinic . Stem Cells 2014; 32(7): 1713-23 .

13 . Liao H . T . , Chen C . T . Osteogenic potential: Comparison between bone marrow and adipose-derived mesenchymal stem cells . World J . Stem Cells 2014; 6(3): 288-95 .

14 . Johal K . S ., Lees V . C ., Reid A . J . Adipose-derived stem cells: selecting for translational success . Regen . Med . 2015; 10(1): 79-96 .

15 . Mizuno H ., Tobita M ., Uysal A . C . Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine . Stem Cells 2012; 30(5): 804-10 .

16 . Huang S .J . , Fu R . H ., Shyu W. C . et al . Adipose-derived stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential . Cell Transplant . 2013; 22(4): 701-9 .

17 . Uzbas F ., May I . D ., Parisi A . M . et al . Molecular physiognomies and applications of adipose-derived stem cells . Stem Cell Rev . 2015; 11(2): 298-308 .

18 . Gentile P . , Orlandi A., Scioli M . G . et al . Concise review: adipose-derived stromal vascular fraction cells and platelet-rich plasma: basic and clinical implications for tissue engineering therapies in regenerative surgery . Stem Cells Transl . Med . 2012; 1(3): 230-6 .

19 . Doi K ., Tanaka S ., Iida H . et al . Stromal vascular fraction isolated from lipo-aspirates using an automated processing system: bench and bed analysis . J . Tissue Eng . Regen . Med . 2013; 7(11): 864-70

20 . Zhu M . , Heydarkhan-Hagvall S ., Hedrick M . et al . Manual isolation of adipose-derived stem cells from human lipoaspirates . J . Vis . Exp . 2013; (79): e50585 .

21. Zuk P .A ., Zhu M . , Mizuno H . et al . Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies . Tissue Eng . 2001; 7(2): 211-28 .

22 . Fang X ., Murakami H ., Demura S . et al . A novel method to apply osteogenic potential of adipose derived stem cells in orthopaedic surgery . PLoS One 2014; 9(2): e88874 .

23 . Garcia-Contreras M ., Vera-Donoso C . D . , Hernandez-Andreu J . M . et al . Therapeutic potential of human adipose-derived stem cells (ADSCs) from cancer patients: a pilot study . PLoS One 2014; 9(11): e113288 .

24 . Guan J . J ., Niu X ., Gong F .X . et al . Biological characteristics of human-urine-derived stem cells: potential for cell-based therapy in neurology . Tissue Eng . Part A 2014; 20(13-14): 1794-806 .

25 . Peterson J . R ., Eboda O ., Agarwal S . et al . Targeting of ALK2, a receptor for bone morphogenetic proteins, using the Cre/lox System to enhance osseous regeneration by adipose-derived stem cells Stem Cells Transl . Med . 2014; 3(11): 1375-80 .

26 . Hong S .J . , Jia S .X., Xie P . et al . Topically delivered adipose derived stem cells show an activated-fibroblast phenotype and enhance granulation tissue formation in skin wounds . PLoS One 2013; 8(1): e55640 .

27 . Kim I ., Bang S . I ., Lee S . K . et al . Clinical implication of allogenic implantation of adipogenic differentiated adipose-derived stem cells Stem Cells Transl . Med . 2014; 3(11): 1312-21.

28 . Tomita K ., Madura T ., Sakai Y. et al . Glial differentiation of human adipose-derived stem cells: implications for cell-based transplantation therapy . Neuroscience 2013; 236: 55-65 .

29 Neuber F Fetttransplantation Bericht uber die verhandlungen der deutschen gesellschaft fur chirurgie . Zbl . Chir. 1893; 22: 66 .

30 Tran T T , Kahn C R Transplantation of adipose tissue and stem cells: role in metabolism and disease Nat Rev Endocrinol 2010; 6(4): 195-213 .

31. Mazzola R . F ., Mazzola I . C . History of fat grafting: from ram fat to stem cells . Clin . Plast . Surg . 2015; 42(2): 147-53 .

32 . De Francesco F . , Ricci G ., D'Andrea F . et al . Human Adipose Stem Cells: From Bench to Bedside . Tissue Eng . Part B Rev . 2015; 21(6): 572-84

33 . Minteer D . M ., Marra K . G ., Rubin J . P . Adipose stem cells: biology, safety, regulation, and regenerative potential Clin Plast Surg . 2015; 42(2): 169-79 .

34 . Lim M . H ., Ong W . K ., Sugii S . The current landscape of adipose-derived stem cells in clinical applications Expert Rev Mol Med 2014; 16: e8

35 Gir P , Oni G , Brown S A et al Human adipose stem cells: current clinical applications . Plast . Reconstr. Surg . 2012; 129(6): 1277-90

36 . Qureshi A. T ., Chen C . , Shah F . et al . Human adipose-derived stromal/stem cell isolation, culture, and osteogenic differentiation Methods Enzymol . 2014; 538: 67-88 .

37 Doi K , Kuno S , Kobayashi A et al Enrichment isolation of adipose-derived stem/stromal cells from the liquid portion of liposuction aspirates with the use of an adherent column Cytotherapy 2014; 16(3): 381-91.

38 Buehrer B M , Cheatham B Isolation and characterization of human adipose-derived stem cells for use in tissue engineering Methods Mol . Biol . 2013; 1001: 1-11.

39 Yu G , Floyd Z E , Wu X et al Isolation of human adipose-derived stem cells from lipoaspirates . Methods Mol . Biol . 2011; 702: 17-27 .

40 . Güven S . , Karagianni M ., Schwalbe M . et al . Validation of an automated procedure to isolate human adipose tissue-derived cells by using the Sepax technology . Tissue Eng . Part C Methods 2012; 18(8): 575-82 .

41 Williams S K , Kosnik P E , Kleinert L B et al Adipose stromal vascular fraction cells isolated using an automated point of care system improve the patency of expanded polytetrafluoroethylene vascular grafts . Tissue Eng . Part A 2013; 19(11-12): 1295-302 .

42 Fraser J K , Hicok K C , Shanahan R et al The Celution System: automated processing of adipose-derived regenerative cells in a functionally closed system . Adv . Wound Care (New Rochelle) 2014; 3(1): 38-45 .

43 . SundarRaj S ., Deshmukh A ., Priya N . et al . Development of a system and method for automated isolation of stromal vascular fraction from adipose tissue lipoaspirate . Stem Cells Int . 2015; 2015: 109353

44 . Cleveland E . C ., Albano N . J ., Hazen A . Roll, spin, wash, or filter? Processing of lipoaspirate for autologous fat grafting: an updated, evidence-based review of the literature . Plast . Reconstr . Surg . 2015; 136(4): 706-13 .

45 Bourin P , Bunnell B A , Casteilla L et al Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT) . Cytotherapy 2013; 15(6): 641-8 .

46 . Zimmerlin L ., Donnenberg V . S ., Rubin J . P . et al . Mesenchymal markers on human adipose stem/progenitor cells . Cytometry A 2013; 83(1): 134-40 .

47 . Zimmerlin L., Donnenberg V. S ., Pfeifer M . E . et al . Stromal vascular progenitors in adult human adipose tissue . Cytometry A 2010; 77(1): 22-30 .

48 . Mitchell J . B ., Mcintosh K ., Zvonic S . et al . Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers . Stem Cells 2006; 24(2): 376-85 .

49 . Navarro A ., Marin S ., Riol N . et al . Human adipose tissue-resident monocytes exhibit an endothelial-like phenotype and display angiogenic properties . Stem Cell Res . Ther . 2014; 5(2): 50 .

50 . Yoshimura K ., Shigeura T ., Matsumoto D . et al . Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates . J . Cell . Physiol . 2006; 208(1): 64-76 .

51. Varma M . J . , Breuls R . G ., Schouten T . E . et al . Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells . Stem Cells Dev . 2007; 16(1): 91-104 .

52 . Kapur S . K ., Katz A. J . Review of the adipose derived stem cell secretome . Biochimie 2013; 95(12): 2222-8 .

53 . Chiellini C ., Cochet O ., Negroni L . et al . Characterization of human mesenchymal stem cell secretome at early steps of adipocyte and osteoblast differentiation BMC Mol Biol 2008; 9: 26

54 . Tajiri N ., Acosta S .A ., Shahaduzzaman M . et al . Intravenous transplants of human adipose-derived stem cell protect the brain from traumatic brain injury-induced neurodegeneration and motor and cognitive impairments: cell graft biodistribution and soluble factors in young and aged rats . J . Neurosci . 2014; 34(1): 313-26 .

55 Lee S C , Jeong H J , Lee S K et al Lipopolysaccharide preconditioning of adipose-derived stem cells improves liver-regenerating activity of the secretome Stem Cell Res Ther 2015; 6: 75

56 Crop M J , Baan C C , Korevaar S S et al Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells induce explosive T-cell proliferation . Stem Cells Dev . 2010; 19(12): 1843-53 .

57 . Cohen C .A ., Shea A .A ., Heffron C . L . et al . Intra-abdominal fat depots represent distinct immunomodulatory microenvironments: a murine model . PLoS One 2013; 8(6): e66477 .

58 . Schweizer R . , Tsuji W ., Gorantla V . S . et al . The role of adipose-derived stem cells in breast cancer progression and metastasis Stem Cells Int . 2015; 2015: 120949 .

59 . Freese K . E . , Kokai L ., Edwards R . P . et al . Adipose-derived stems cells and their role in human cancer development, growth, progression, and metastasis: a systematic review . Cancer Res . 2015; 75(7): 1161-8 .

60 . Wei H . J ., Zeng R ., Lu J . H . et al . Adipose-derived stem cells promote tumor initiation and accelerate tumor growth by interleukin-6 production . Oncotarget 2015; 6(10): 7713-26 .

61 Chu Y , Tang H , Guo Y et al Adipose-derived mesenchymal stem cells promote cell proliferation and invasion of epithelial ovarian cancer . Exp . Cell Res . 2015; 337(1): 16-27 .

62 . Yu X ., Su B ., Ge P . et al . Human adipose derived stem cells induced cell apoptosis and s phase arrest in bladder tumor Stem Cells Int . 2015; 2015: 619290 .

63 Ning H , Lei H E , Xu Y D et al Conversion of adipose-derived stem cells into natural killer-like cells with anti-tumor activities in nude mice . PLoS One 2014; 9(8): e106246 .

64 . Philips В . J ., Marra K . G . , Rubin J . P . Adipose stem cell-based soft tissue regeneration . Expert Opin . Biol . Ther. 2012; 12(2): 155-63 .

65 . Griffin M ., Kalaskar D . M ., Butler P . E . et al . The use of adipose stem cells in cranial facial surgery. Stem Cell Rev. 2014; 10(5): 671-85 .

66 . Philips В . J ., Marra K . G ., Rubin J . P . Healing of grafted adipose tissue: current clinical applications of adipose-derived stem cells for breast and face reconstruction . Wound Repair Regen . 2014; 22 Suppl 1: 11-3 .

67 . Lee S .J ., Kang S .W ., Do H .J . et al . Enhancement of bone regeneration by gene delivery of BMP2/Runx2 bicistronic vector intoadipose-derived stromal cells. Biomaterials 2010; 31(21): 5652-9 .

68 . Lv X ., Zhou G ., Liu X . et al . Chondrogenesis by co-culture of adipose-derived stromal cells and chondrocytes in vitro Connect Tissue Res . 2012; 53(6): 492-7 .

69 . Sung M . S ., Mun J .Y., Kwon O . et al . Efficient myogenic differentiation of human adipose-derived stem cells by the transduction of engineered MyoD protein . Biochem . Biophys . Res . Commun . 2013; 437(1): 156-61.

70 . Bayati V ., Sadeghi Y ., Shokrgozar M .A . et al . The evaluation of cyclic uniaxial strain on myogenic differentiation of adipose-derived stem cells . Tissue Cell 2011; 43(6): 359-66 .

71. Vieira N . M ., Brandalise V ., Zucconi E . et al . Human multipotent adipose-derived stem cells restore dystrophin expression of Duchenne skeletal-muscle cells in vitro . Biol . Cell 2008; 100(4): 231-41.

72 . Goudenege S ., Pisani D . F ., Wdziekonski B . et al . Enhancement of myogenic and muscle repair capacities of human adipose-derived stem cells with forced expression of MyoD . Mol . Ther . 2009; 17(6): 1064-72 .

73 Wang H , Shi J , Wang Y et al Promotion of cardiac differentiation of brown adipose derived stem cells by chitosan hydrogel for repair after myocardial infarction . Biomaterials 2014; 35(13): 3986-98 .

74 . Song K ., Wang Z . , Li W . et al . In vitro culture, determination, and directed differentiation of adult adipose-derived stem cells towards cardiomyocyte-like cells induced by angiotensin II Appl Biochem Biotechnol . 2013; 170(2): 459-70 .

75 Deng M , Gu Y , Liu Z et al Endothelial Differentiation of Human Adipose-Derived Stem Cells on Polyglycolic Acid/Polylactic Acid Mesh . Stem Cells Int . 2015; 2015: 350718 .

76 Pallua N , Serin M , Wolter T P Characterisation of angiogenetic growth factor production in adipose tissue-derived mesenchymal cells . J . Plast . Surg . Hand Surg . 2014; 48(6): 412-6 .

77 Pavlova G , Lopatina T , Kalinina N et al In vitro neuronal induction of adipose-derived stem cells and their fate after transplantation into injured mouse brain . Curr. Med . Chem . 2012; 19(30): 5170-7 .

78 Nam J S , Kang H M , Kim J et al Transplantation of insulin-secreting cells differentiated from human adipose tissue-derived stem cells into type 2 diabetes mice Biochem Biophys Res Commun 2014; 443(2): 775-81.

79 Zhang X , Dong J Direct comparison of different coating matrix on the hepatic differentiation from adipose-derived stem cells Biochem . Biophys . Res . Commun . 2015; 456(4): 938-44 .

Поступила: 05.10.2015