БИОЧИП ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ КЛЕТОК КРОВИ И КОСТНОГО МОЗГА

Полезная модель относится к области медицины и может быть использована для исследовательских целей в гематологии, онкологии, клинической иммунологии, трансплантологии или ветеринарии. Для диагностики онкогематологических заболеваний необходимо проведение исследований морфологии и иммунофенотипа (то есть, определения поверхностных антигенов) клеток крови и костного мозга больного. Иммунофенотипирование применяют для детектирования на поверхности лейкоцитов крови или костного мозга антигенов кластеров дифференцировки (cluster of differentiation, CD). Набор CD антигенов на поверхности клетки в большинстве случаев позволяет определить принадлежность лейкоцита к той или иной клеточной линии и определить стадию его дифференцировки. Отклонение соотношения клеток с различными иммунофенотипами от нормального может служить указанием на наличие патологии. Морфологическое исследование лейкоцитов позволяет определить такие параметры, как размер клеток, соотношение площадей ядра и цитоплазмы, форму ядра, структуру хроматина, наличие ядрышек, окраска цитоплазмы, наличие в ней вакуолей, гранул или включений. Присутствие в крови или костном мозге клеток с атипичной или патологической патологией, а также появление аномального количества клеток определенного типа (например, присутствие незрелых клеток выше порога нормы) также служит указанием на развитие патологии.
В подавляющем большинстве случаев эти два анализа выполняются раздельно, поскольку наиболее распространенные методы проведения иммунофенотипирования (проточная цитометрия) и морфологического анализа (мазок крови) не позволяют осуществлять их на одних и тех же клетках. Для параллельного проведения упомянутых исследований было предложено использование клеточного биочипа.
Из уровня техники известен клеточный биочип, позволяющий провести одновременное Иммунофенотипирование и морфологический анализ лейкоцитов крови больного на наличие онкогематологических заболеваний, описанный в работе [А.В.Шишкин, И.И.Шмырев, С.А.Кузнецова, Н.Г.Овчинина, А.А.Бутылин, Ф.И.Атауллаханов А.И.Воробьев (2008) Иммунологические биочипы для параллельного определения поверхностных антигенов и морфологического исследования клеток. Биологические мембраны, т.24, №4, 277-288]. Указанный биочип представляет собой прозрачную подложку, содержащую иммобилизованные в заданных участках антитела, специфичные к поверхностным антигенам исследуемых лейкоцитов крови больного.
Причем набор антител, специфичен к следующему ряду антигенов: CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CDIO, CD11a, CD11b, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD27, CD29, CD31, CD36, CD38, CD44, CD45, CD45RA, CD56, CD71, CD72, CD95, CD98, HLA-DR, IgM.
В патенте [RU 2389024, кл. G01N 33/53, опубл. 10.05.2010] описан биочип, на прозрачной подложке которого иммобилизованы в строго заданных участках антитела специфичные к следующему набору антигенов: CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD27, CD29, CD31, CD36, CD38. CD41, CD44, CD45, CD45RA, CD56, CD71, CD72, CD95, CD98, HLA-DR, IgM.
В работе [А.В.Шишкин, Н.Г.Овчинина, С.С.Бессмельцев. Новые конструкции иммунологических биочипов для исследования клеток. Гематология, т.12, 522-35], которая была выбрана в качестве ближайшего аналога, описан биочип, на прозрачной подложке которого иммобилизованы антитела, специфичные к антигенам: CD2, CD3, CD4. CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD27, CD29, CD31, CD36, CD38, CD41, CD44, CD45, CD45RA, CD56, CD71, CD72, CD95, CD98, HLA-DR, IgM.
Недостатком упомянутых биочипов можно назвать то, что набор антител на них предназначен исключительно для исследования периферической крови при диагностике опухолей лимфоидного происхождения. В то же время, для диагностики многих онкогематологических заболеваний определяющим является именно иммунофенотипический и морфологический анализ лейкоцитов костного мозга. Более того, в случае острых лейкозов миелоидного происхождения параллельное исследование иммунофенотипа и морфологии клеток костного мозга может являться исключительно важным для постановки диагноза.
Задачей настоящей полезной модели является создание клеточного биочипа, позволяющего проводить исследования лейкоцитов и периферической крови, и костного мозга, что в свою очередь приведет к существенному увеличению числа диагностируемых с его помощью заболеваний.
Технический результат, который может быть получен в результате использования заявляемой модели заключается в значительном расширении круга диагностируемых заболеваний, таких как хронические В-клеточные опухоли, в том числе волосатоклеточный лейкоз и опухоли из плазматических клеток, хронические Т-клеточные опухоли, острые лимфобластные лейкозы и острые миелобластные лейкозы.
Поставленная задача решается за счет того, что предлагается биочип для исследования клеток крови и костного мозга, выполненный в виде подложки из, по меньшей мере, одного слоя прозрачного материала, на поверхности которой иммобилизованы в заданных участках молекулы антител, специфичные к поверхностным антигенам клеток, дополнительно содержащий, по меньшей мере. один контрольный участок, причем подложка с иммобилизованными в заданных участках молекулами антител проинкубирована и высушена при температуре 1-5°С, а указанные иммобилизованные молекулы антител образуют набор антител для исследования клеток крови и костного мозга, специфичный, по меньшей мере, к следующему набору антигенов: CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD33, CD34, CD38, CD41, CD45, CD45RA, CD45RO, CD56, CD61, CD64, CD103, CD117, CD138, CD235a, HLA-DR, IgM, к и л легкие цепи Ig. А молекулы антител иммобилизованы на подложке посредством адсорбции, где подложка с иммобилизованными антителами проинкубирована при влажности воздуха 100% в течение, по меньшей мере, 10 часов и высушена при влажности воздуха, по меньшей мере, 30%.
Преимуществом предложенного здесь биочипа, является возможность исследования, помимо клеток крови, клеток костного мозга, что значительно расширяет круг диагностируемых заболеваний.
Заявленная полезная модель поясняется чертежами, на которых изображено:
Фиг.1 - общая модель биочипа (вид сверху).
Фиг.2 - биочип, использованный для диагностики больного на наличие онкогематологических заболеваний из примера 1 (вид сверху).
Фиг.3 а-в - оптическое изображение участка биочипа, содержащего антитело анти-CD-45, при использовании различных способов получения биочипа.
Фиг.4 - морфологическая картина клеток из примера 1.
Фиг.5 - морфологическая картина клеток из примера 2.
На фиг.1 представлен биочип 1, выполненный в виде подложки из прозрачного материала и состоящий, по меньшей мере, из одного слоя. На поверхности подложки иммобилизованы молекулы антител за счет адсорбции в строго заданных участках 2. В разных участках 2 биочипа 1 иммобилизованы молекулы антител, имеющие специфичность к разным антигенам. При этом, в каждом отдельно взятом участке 2 расположены антитела, специфичные к одному антигену. Набор участков 2 с антителами формируется исходя из групп поверхностных антигенов, которые позволяют идентифицировать наличие определенных заболеваний, а именно:
для диагностики хронических В-клеточных опухолей (например, хронический В-клеточный лимфолейкоз, лимфома из клеток мантийной зоны, лимфома из клеток маргинальной зоны) требуется набор: CD5, CD 19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, IgM, к и л легкие цепи Ig.
для диагностики хронических Т-клеточных опухолей (например, лейкоз из больших гранулярных лимфоцитов) CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD16, CD25, CD38. CD56;
для диагностики волосатоклеточного лейкоза требуется набор: CD11c, CD19, CD20, CD22, CD25, CD103, к и л легкие цепи Ig;
для диагностики опухолей из плазматических клеток (например, множественная миелома, макроглобулинемия Вальденстрема) требуется набор: CD38, CD19, CD56, CD138;
для диагностики острых лимфобластных лейкозов требуется набор: CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD33, CD34, CD38;
для диагностики острых миелобластных лейкозов требуется набор: CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD33, CD34, CD41, CD45RA, CD45RO, CD61, CD64, CD117, CD235a, HLA-DR;
для положительного контроля периферической крови используют CD45, с помощью которого определяют общее содержание лейкоцитов в исследуемой крови.
Часть участков может дублироваться для получения более качественного результата, кроме того, могут присутствовать одно или несколько дополнительных участков 3, необходимых, например, для отрицательного или положительного контроля.
Участки 2 биочипа 1 отделены друг от друга фоновыми участками 4, свободными от иммобилизованных антител, однако вместо них иммобилизованы молекулы вещества, блокирующего сайты неспецифического связывания (например, молекулы бычьего сывороточного альбумина, овальбумина или казеина) и ослабляющего прочность неспецифического связывания клеток с подложкой.
Использование заявляемой полезной модели описывается далее не исчерпывающими примерами.
Пример 1.
Посредством предложенного в данной полезной модели биочипа проведено одновременное иммунофенотипическое и морфологическое исследование мононуклеарных клеток крови больного волосатоклеточным лейкозом (ВКЛ). Набор антител, представленных на биочипе, был специфичен к следующему набору антигенов:
CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD11c, CD13, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD33, CD34, CD38, CD45, CD45RA, CD45RO, CD56, CD61, CD64, CD103, CD117, CD138, HLA-DR, IgM, кил легкие цепи Ig (Фиг.2).
Получение биочипа проводили следующим образом: на прозрачную подложку наносили молекулы антител объемом 0.5-1 мкл, подложку с нанесенными антителами инкубировали по меньшей мере 10 ч, предпочтительно в течение 12 ч, при температуре 1-5°С, предпочтительно при 4°С, и влажности воздуха 100%. Далее подложку с нанесенными антителами сушили при температуре 1-5°С, предпочтительно при 4°С; и влажности воздуха не менее 40%, предпочтительно при влажности 30%, и промывали водой для удаления избытка антител.
При исследовании клеток на биочипе, суспензию мононуклеарных клеток крови больного ВКЛ наносили на упомянутый биочип и инкубировали в течение 30 минут. Далее производили отмывку биочипа от неспецифически связавшихся клеток, клетки окрашивали по стандартной методике и проводили иммунофенотипирование и морфологический анализ клеток.
Иммунофенотипирование проводили подсчетом количества клеток, связавшихся на определенном участке биочипа с помощью оптического микроскопа. Исходя из чего, рассчитывали процентное содержание клеток, имеющих определяемый антиген, в исследуемой суспензии. Общее количество клеток в исследуемой суспензии определяли путем подсчета количества клеток, связавшихся на участке иммунослайда, содержащего антитело анти-CD45.
Морфологическое исследование клеток, связавшихся на участках биочипа, проводили с помощью оптического микроскопа
Оптическое изображение участка биочипа со связавшимися клетками, содержащего антитело анти-CD45, представлено на фиг.3а. Темные точки представляют собой связавшиеся на биочипе клетки, причем, чем их больше, тем темнее участок биочипа. Как видно, связавшиеся клетки равномерно распределены по всему участку. Если получение биочипа выполнять без стадии сушки при температуре 4°С и влажности 30%, то количество связавшихся клеток на участке (фиг.3б) будет значительно меньше, по сравнению с предложенным способом, что на порядок уменьшает точность иммунофенотипирования и морфологического анализа клеток. Если стадию сушки биочипа проводить при комнатной температуре, вместо 4°С, связавшиеся клетки будут распределены по участку не равномерно (фиг.3-в), что также значительно уменьшает точность и надежность результатов исследования клеток.
Иммунофенотип опухолевых клеток при волосатоклеточном лейкозе, как правило, представляет собой следующий набор: CD11c+, CD19+, CD20+, CD22+, CD25+, CD103+, л+ или к+. Поэтому опухолевые клетки характерной морфологии (ворсинчатые лимфоциты с узкими острыми выростами цитоплазмы) ожидалось встретить именно на антителах к указанным антигенам. Действительно, ворсинчатые клетки были обнаружены на антителах, специфичных к вышеперечисленным антигенам, в то время как, на остальных иммобилизованных на биочипе антителах, клетки данного типа не встречались. Морфология клеток, связавшихся на пятне антител к CD11c, представлена на фиг.4, стрелками 5 обозначены характерные выросты на поверхности ворсинчатых клеток.
Пример 2.
Посредством предложенного в данной полезной модели биочипа проведено одновременное иммунофенотипическое и морфологическое исследование лейкоцитов костного мозга больного острым миеломоноцитарным лейкозом (ОМЛ М4). Набор антител, представленных на биочипе, был специфичен к следующему набору антигенов: CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD33, CD34, CD38, CD41, CD45, CD45RA, CD45RO, CD56, CD61, CD64, CD117, CD138, CD235a, HLA-DR, IgM, кил легкие цепи Ig.
Способ получения биочипа был аналогичен способу, описанному в примере 1.
Суспензию лейкоцитов костного мозга больного ОМЛ М4 наносили на упомянутый биочип и инкубировали в течение 30 минут. Далее производили отмывку биочипа от неспецифически связавшихся клеток, клетки окрашивали по стандартной методике и проводили иммунофенотипирование и морфологический анализ клеток.
Иммунофенотипирование проводили подсчетом общего количества клеток, связавшихся на определенном участке биочипа с помощью оптического микроскопа.
Морфологическое исследование клеток, связавшихся на участках биочипа, проводили с помощью оптического микроскопа.
Морфология клеток, связавшихся на пятне антител к CD45RA, представлена на фиг.5. Стрелками указаны: 6 - монобласты, 7 - промоноциты.