УСТРОЙСТВО ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Полезная модель относится к области прикладной биотехнологии и может быть использована в медицине, косметологии, ветеринарии, растениеводстве и т.п. для повышения эффективности приготовления липосомальных препаратов.
Существуют разнообразные технологии получения липосом, позволяющие получать везикулы различного размера, состава, структуры и внутреннего объема, а также способы иммобилизации в них веществ (Liposomes, a practical approach. Ed. by R.R.C.New, Oxford etc., IRL Press, 1990).
Наиболее простой метод получения липосом состоит в выпаривании фосфолипидов из органической фазы в виде тонкой пленки на внутренней стенке стеклянной колбы роторного испарителя, после чего в колбу вносят воду или солевой раствор, содержащие лекарственное вещество. Диспергирование фосфолипидов в водной фазе осуществляют путем встряхивания колбы со стеклянными шариками. В результате образуется взвесь, состоящая из замкнутых многослойных липосом с включенным во внутренний объем лекарственным веществом.
Существует также способ получения липосом путем выпаривания и обращения фаз, когда фосфолипиды растворяют в органическом растворителе, который затем приводят в контакт с водной фазой, содержащей лекарственные вещества. После отгонки растворителя под вакуумом, получают взвесь липосом с высокой эффективностью иммобилизации в них материала (Sada E.et.aL, Biotechnol. and Bioeng., 1988, v.32, №6, pp.826-830; Szulc J. et. al., Farm. Pol., 1985, v.41, №6, pp.319-322).
Недостатками описанных и иных известных (Jagava Y., Racker E., J. Biol.Chem., 1971, v.246, pp.5477-5487; Kaye S.B., Richardson V.J., Cancer Chemother. a. Pharm., 1979, v.3, №2, рр.81-85).способов являются: получение водных нестабильных дисперсий липосом с включенным в них лекарственным веществом, которые необходимо стабилизировать с помощью дополнительных процессов лиофилизации или распылительной сушки; сложность в изготовлении, невозможность использовать данные технологии для промышленного производства липосомальных препаратов.
Основные технологии получения липосомальных препаратов направлены на получение их аэрозоля. В частности, известно устройство для получения липосомальных препаратов в виде аэрозольного потока, включающее емкости с водной средой и с липидным компонентом - раствором липидов в водорастворимом органическом растворителе, которые подсоединены к смесителю с распыливающим соплом на выходе, при этом водная средой и/или липидный компонент - раствор липидов в водорастворимом органическом растворителе содержат биологически активное вещество (GB 2145107 A, A61J 3/00, 1985). В данном устройстве оба компонента подаются в смеситель из соответствующих емкостей под давлением, создаваемым в емкостях пропеллантом (нейтральным газом), что не обеспечивает их эффективного смешения и высокой степени распыла образовавшейся смеси.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому техническому решению является устройство для получения липосомальных препаратов содержащее аэрозольную емкость, заполненную водной средой и нейтральным газом под давлением, вторую емкость с липидным компонентом - раствором липидов в водорастворимом органическом растворителе, и эжектор, рабочее сопло которого соединено с аэрозольной емкостью, причем к эжекторной камере смешения подключена вторая емкость с липидным компонентом. (RU 82121, 2009) и емкость для хранения конечного продукта.
Недостатком данной технологии является применение органических растворителей, ограничивающих спектр используемых в качестве активного начала биологически активных веществ (БАВ), а также невозможность получать по данной технологии тонкодисперсные липосомальные препараты с размером частиц порядка нескольким мкм.
Задачей, решаемой авторами, являлась разработка технологии получения липосомальных препаратов с минимальным размером частиц без использования органических растворителей.
При этом оптимальным решением представлялось получение сухих липосомальных препаратов, состоящих из порошка нейтрального физиологичного наполнителя, хорошо растворимого в воде, порошкообразного фосфолипида, покрывающего частицы порошкообразного наполнителя, и биологически активного вещества. После добавления воды к сухому, покрытому фосфолипидом наполнителю (пролипосомам), он быстро растворяется и из фосфолипидов образуются липосомы, которые включают биологически активное вещество в зависимости от его природы во внутренний объем или в бислойную оболочку липосом.
Техническая задача решалась путем создания, устройства, содержащего емкости с сухим исходным материалом, камеру смешения, в качестве которой используют струйную мельницу, и емкости, содержащие конечный продукт, причем между мельницей и емкостью, содержащей конечный продукт, установлены циклонные сепараторы.
Общая схема заявляемого устройства приведена на фиг.1, где используются следующие обозначения:
1 - емкость для хранения исходных компонентов
2 - загрузочная емкость
3 - помольная камера
4 - нагнетательный резервуар
5 - измельчительные сопла
6 - пневмотранспортная система
7 - циклонные сепараторы
8 - емкость для хранения фракций конечного препарата
На фиг.2 приведена микрофотография сухого липосомального интерлейкина - 2 при увеличении ×2000.
На фиг.3 приведена микрофотография регидратированного липосомального препарата интерлейкина - 2 при увеличении ×10000
Устройство работает следующим образом. Исходные компоненты из емкостей 1 поступают в заданном соотношении в загрузочную емкость струйной мельницы 2, а оттуда в помольную камеру 3, где под действием турбулентных воздушных потоков, поступающих из нагнетательного резервуара 4 через измельчительные сопла 5, происходит одновременное измельчение и смешение исходных компонентов. Затем с помощью пневмотранспортной системы 6 продукт поступает в циклонные сепараторы 7, где происходит отбор целевых фракций, которые затем поступают в емкость для хранения фракций конечного препарата 8.
В результате одновременного измельчения биологически активного вещества, фосфолипида и наполнителя, получают композицию, содержащую относительно крупные частицы наполнителя (20-40 мкм) и высокодисперсные частицы (менее 10 мкм) биологически активного вещества и фосфолипида. В результате аутогезии, возникающей в условиях сочетания процессов измельчения наполнителя и образования при измельчении заряженных частиц с развитой поверхностью, а также интенсивного перемешивания всех компонентов, полученные высокодисперсные частицы биологически активного вещества и фосфолипидов прилипают к поверхности крупных частиц наполнителя, образуя сухой липосомальный препарат, состоящий из частиц сложной формы с развитой внешней поверхностью (см. фиг.2). После растворения препарата в водной среде или биологической жидкости наполнитель быстро растворяется, а из фосфолипидов образуются высокодисперсные липосомы, в которые включается биологически активное вещество, (см. фиг.3).
ПРИМЕР 1. Приготовление липосомального интерферона-альфа 2 b (ИФН-альфа 2 b).
В загрузочный бункер струйной мельницы засыпали 10 г полиглюкинаи 1,0 г сухого порошкообразного фосфолипида витол. Помол осуществляли потоком осушенного и фильтрованного сжатого воздуха под давлением 2,5±0,1 атм и расходе газа 234 л/мин.
6
6
В результате получали 10 г сухого липосомального препарата с диаметром частиц менее 40 мкм. Полученный порошок дисперговали в 10 мл воды, нагретой до (38±2)°C и растворяли в ней 2,5 мг рекомбинантного ИФН - альфа 2 b с активностью 200×10 ME/мг. Полученную суспензию липосом, в которые включается ИФН-альфа 2 b, озвучивали ультразвуком на частоте 40 кГц в течение 1 минуты, а затем подвергали лиофильному высушиванию. В результате получали сухой липосомальный препарат с концентрацией ИНФ-альфа 2 b 250 мкг/г и активностью 50×10 ME /г.
С помощью метода гельфильтрации разделяли препарат на липосомальную и нелипосомальную фракции, в которых определяли содержание ИФН-альфа 2 методом ИФА. Результаты исследования показали, что с липосомами связано около 45% ИФН-альфа 2, использовавшегося для приготовления препарата.
ПРИМЕР 2. Приготовление липосомальной супероксиддисмутазы (СОД). В загрузочную емкость струйной мельницы помещали 20,0 г порошкообразного сорбита, 2,0 г сухих фосфолипидов лецитина ПРО и 0,01 г лиофилизированной СОД.
Помол осуществляют струйным потоком сжатого воздуха под давлением 2,5±0,1 атм и расходе газа 100 л/мин.
В результате получили 20,0 г сухого высокодисперсного порошка белого цвета с диаметром частиц менее 30 мкм, содержащего СОД в концентрации 500 мкг/г. Полученный сухой липосомальный препарат СОД характеризовался равномерным распределением СОД по всему объему порошка. Результаты спектрофотометрического исследования содержания СОД в навесках, взятых на разных уровнях объема препарата показали 500±10 мкг/г. Результаты исследований показали, что с липосомами связано 42% СОД.
После растворения порошка в 50 мл нагретой до (38±2)°C воды образуется устойчивая в течение по крайней мере шести недель высокодисперсная суспензия липосом с включенной в них СОД.
6
6
ПРИМЕР 3. Приготовление липосомального интерлейкина-2 (ИЛ-2). В емкость помещали 5,0 г полиглюкина, 0,5 г сухого гранулированного фосфолипида лецитин ПРО и содержимое 1 ампулы с лиофилизированным рекомбинантным ИЛ-2 (Proleukin, 18×10 МЕ/ампула), тщательно перемешивали и помещали в герметически закрытый бункер струйной мельницы. Помол осуществляли струйным потоком осушенного и фильтрованного сжатого воздуха под давлением 3,5±0,1 атм и расходе газа 235 л/мин. В результате получили 5,0 г сухого высокодисперсного порошка белого цвета с диаметром частиц менее 40 мкм, содержащего 3,6×10 ME ИЛ-2/г. Результаты исследования показали, что с липосомами связано 33% ИЛ-2, используемого для приготовления препарата.
Как показали проведенные эксперименты, в результате использования заявляемого устройства удается получить высокодисперсные активные липосомальные препараты с высоким выходом и по относительно простой технологии.