СИСТЕМА И СПОСОБ ФИЛЬТРАЦИИ ЧАСТИЦ
SYSTEM AND METHOD FOR PARTICLE FILTRATION

Способы выделения клеток из биологических образцов важны во многих клинических процедурах и методах научных исследований. В области хранения пуповинной крови ее объем могут снижать при помощи процесса сепарации клеток перед передачей на криоконсервацию с целью снижения расходов длительного хранения. В области клеточной терапии определенные типы клеток могут обогащать перед пересадкой пациенту для улучшения приживления. Существующие технологии фильтрации для сепарации клеток часто не способны сохранить жизнеспособность клеток и обычно обеспечивают низкий выход. Например, способы сепарации клеток, основанные на исключении по размеру, подвергают хрупкие клетки сдвиговым напряжениям, приводящим к повреждению или лизису клеток. Скопление отходов клеток ускоряет загрязнение и закупоривание устройства. Часто изолированные с использованием таких способов клетки являются активированными, измененными, поврежденными или убитыми. Микрожидкостные устройства имеют ограничения по объему образца, который они могут обработать. Простое увеличение скорости потока через такие устройства не дает результата, потому что по мере повышения скорости потока также возрастает сдвиговое напряжение на клетки, перемещающиеся через устройство. Таким образом, сдвиговое напряжение ограничивает объемную пропускную способность. Поэтому желательно создать способ и устройство для фильтрации частиц, в котором исключение по размеру не используется в качестве механизма фильтрации. В частности, желательно создать способ и устройство для фильтрации клеток, которое не подвержено простому закупориванию, имеет высокую объемную пропускную способность, имеет компактные размеры и которое не повреждает и не активирует клеток.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Как описано далее, в настоящем раскрытии описывается устройство для фильтрации частиц и способы использования этого устройства для обогащения жизнеспособных клеток. В частности, в настоящем раскрытии описывается использование таких устройств для изоляции клеток крови, снижения объема пуповинной крови и приготовления стромальных васкулярных фракций.
Преимуществом является то, что данное устройство может обеспечить фильтрацию с высокой пропускной способностью больших объемов образца с сохранением жизнеспособности клеток и обеспечением высокого выхода. Некоторые варианты воплощения настоящего изобретения могут включать устройства, подходящие для автоматизации и обработки с высокой пропускной способностью, а некоторые варианты воплощения настоящего изобретения могут включать системы, дающие возможность обрабатывать клинические образцы в замкнутых системах. Кроме того, способ использования устройства может обеспечивать высокую производительность, высокое восстановление и в некоторых случаях высокую степень чистоты. Кроме того, способ использования устройства при применении для клинической обработки образцов, например снижения объема пуповинной крови, обогащения стволовых клеток костного мозга, обработки стволовых клеток периферийной крови и приготовления стромальных васкулярных фракций, может обеспечить сохранение высокой степени жизнеспособности клеток после сепарации, простоту применения, безопасность и экономичность.
В одном варианте воплощения изобретения описывается устройство фильтрации частиц, обеспечивающее сепарацию жизнеспособных клеток с высокой пропускной способностью. Поскольку устройство фильтрации частиц обеспечивает сепарацию частиц с минимальным сдвигающим усилием, не менее 50%, 75%, 85%, 95%, 98%, 99%, 99,5% или более сепарированных клеток являются жизнеспособными и подходящими для исследований и медицинского применения. В разных вариантах воплощения система фильтрации включает один или несколько контейнеров, подходящих для хранения образца и/или текучей среды-носителя для переноса на устройства с одним или несколькими фильтрующими элементами, и один или несколько дополнительных контейнеров, подходящих для хранения ретентата или фильтрата, вытекающего из устройства. В одном варианте воплощения контейнерами являются эластичные мешки, подходящие для хранения жидкостей. В другом варианте воплощения контейнеры присоединяются к фильтрующему элементу при помощи гибкой трубки, подходящей для переноса жидкостей. При желании трубка присоединена к контейнеру и/или корпусу фильтрующего элемента при помощи адаптера.
Аспекты и варианты воплощения изобретения ориентированы на к систему для фильтрации частиц, содержащую картридж, включающий корпус и множество (например, около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 200, 250, 500, 750, 1000, 2000 или 5000) фильтрующих элементов, причем корпус включает вход подачи образца, выход ретентата и выход фильтрата, а каждый фильтрующий элемент включает камеру ретентата с проксимальным и дистальным концом, камеру фильтрата, а также ряд столбиков, расположенных между камерой ретентата и камерой фильтрата, столбики образуют множество пор, обеспечивающих перетекание жидкости между камерой ретентата и камерой фильтрата, причем ширина камеры ретентата снижается с проксимального до дистального конца, а ширина камеры фильтрата увеличивается с проксимального до дистального конца, а фильтрующий элемент имеет такую конфигурацию, что эффективный размер пор меньше, например, 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% физического размера пор; вход подачи образца имеет жидкостное соединение с проксимальным концом камеры ретентата в каждом фильтрующем элементе; выход фильтрата имеет жидкостное соединение с камерой фильтрата в каждом фильтрующем элементе, а выход ретентата имеет жидкостное соединение с дистальным концом камеры ретентата в каждом из множества фильтрующих элементов.
В другом аспекте изобретение предусматривает систему для фильтрации частиц, содержащую корпус и множество фильтрующих элементов, причем корпус включает вход подачи образца, выход ретентата и выход фильтрата, а каждый фильтрующий элемент содержит камеру ретентата, имеющую проксимальный и дистальный конец, камеру фильтрата, имеющую не меньше одного дистального конца, и фильтр, содержащий множество пор, расположенных между камерой ретентата и камерой фильтрата, при этом поры обеспечивают жидкостную связь между камерой ретентата и камерой фильтрата, причем камера фильтрата, фильтр и камера ретентата имеют такую конфигурацию, что эффективный размер пор меньше физического размера пор; вход подачи образца имеет жидкостное соединение с проксимальным концом камеры ретентата в каждом фильтрующем элементе; выход фильтрата имеет жидкостное соединение с камерой фильтрата в каждом фильтрующем элементе, а выход ретентата имеет жидкостное соединение с дистальным концом камеры ретентата в каждом из множества фильтрующих элементов.
В другом аспекте изобретение предусматривает систему для фильтрации частиц, содержащую картридж, включающий корпус и множество фильтрующих элементов, причем корпус включает вход подачи образца, выход ретентата и выход фильтрата, а каждый фильтрующий элемент включает первую проточную камеру, вторую проточную камеру и фильтр, имеющий 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 250, 300, 500, 1000, 2000, 5000 и более пор с физическим размером пор приблизительно от 100 нм до 3 мм (например, около 100 нм, 200 нм, 300 нм, 400 нм, 500 нм, 750 нм, 1 мкм, 2 мкм, 3 мкм, 5 мкм, 7,5 мкм, 10 мкм, 20 мкм, 30 мкм, 50 мкм, 75 мкм, 100 мкм, 200 мкм, 300 мкм, 500 мкм, 1 мм, 2 мм или 3 мм), при этом фильтр располагается между первой проточной камерой и второй проточной камерой; первая проточная камера и вторая проточная камера имеют такую конфигурацию, что частицы ретентата удерживаются фильтром без физического ограничения; вход подачи образца имеет жидкостное соединение с проксимальным концом первой проточной камеры в каждом фильтрующем элементе; выход фильтрата имеет жидкостное соединение с дистальным концом второй камеры в каждом фильтрующем элементе, а выход ретентата имеет жидкостное соединение с дистальным концом первой проточной камеры в каждом из множества фильтрующих элементов.
В другом аспекте изобретение предусматривает систему для фильтрации частиц, содержащую корпус и множество фильтрующих элементов, причем корпус включает вход подачи образца, выход ретентата и выход фильтрата, а каждый фильтрующий элемент содержит первую проточную камеру, имеющую проксимальный и дистальный конец, вторую проточную камеру и фильтр, расположенный между первой проточной камерой и второй проточной камерой, содержащий поры, имеющие физический размер приблизительно от 10 нм до 10 мм, причем первая проточная камера и вторая проточная камера имеют такую конфигурацию, что удерживающий размер фильтра меньше физического размера пор; вход подачи образца имеет жидкостное соединение с проксимальным концом первой проточной камеры в каждом фильтрующем элементе; выход фильтрата имеет жидкостное соединение с дистальным концом второй камеры в каждом фильтрующем элементе; и выход ретентата имеет жидкостное соединение с дистальным концом первой проточной камеры в каждом из множества фильтрующих элементов.
-2
В другом аспекте изобретение предусматривает систему для фильтрации частиц, содержащую картридж, включающий корпус и множество фильтрующих элементов, причем корпус включает вход подачи образца, выход ретентата и выход фильтрата, а также, необязательно, вход для текучей среды-носителя. Каждый фильтрующий элемент может включать первый входной порт, первый выходной порт, второй выходной порт и, необязательно, второй выходной порт, имеющий жидкостное соединение с входом текучей среды-носителя. Каждый фильтрующий элемент может иметь расчетный показатель эффективности больше 0,3 мм. Вход подачи образца может иметь жидкостное соединение с первым входным портом, имеющимся в каждом фильтрующем элементе. Выход фильтрата может иметь жидкостное соединение с первым выходным портом, имеющимся в каждом фильтрующем элементе. Выход ретентата может иметь жидкостное соединение со вторым выходным портом, имеющимся в каждом из множества фильтрующих элементов.
В другом аспекте изобретение предусматривает пробирочную систему фильтрации, включающую центрифужную пробирку, пробирочную вставку и крышку, причем пробирочная вставка содержит по меньшей мере один фильтрующий элемент, согласно любому из предыдущих аспектов, резервуар подачи образца и, необязательно, резервуар текучей среды-носителя, каждый из которых имеет жидкостное соединение с первой проточной камерой или проксимальным концом камеры ретентата, а выходной резервуар имеет жидкостное соединение с дистальным концом камеры ретентата или второй проточной камерой, причем выходной резервуар адаптирован для приема ретентата или фильтрата из фильтрующего элемента.
В другом аспекте изобретение предусматривает планшетную систему фильтрации, включающую один или несколько следующих элементов: лунку образца и, необязательно, лунку текучей среды-носителя с жидкостным соединением с фильтрующим элементом согласно любому предыдущему аспекту или любому другому изложенному здесь аспекту изобретения; лунку фильтрата и лунку ретентата с жидкостной связью с фильтрующим элементом, причем лунка фильтрата и лунка ретентата имеют конфигурацию, рассчитанную на прием фильтрата и ретентата из фильтрующего элемента.
В другом аспекте изобретение предусматривает планшетную систему фильтрации, включающую один или несколько следующих элементов: лунку образца и, необязательно, лунку текучей среды-носителя с жидкостным соединением с фильтрующим элементом согласно любому предыдущему аспекту или любому другому изложенному здесь аспекту изобретения; лунку фильтрата и лунку ретентата с жидкостной связью с фильтрующим элементом, причем лунка фильтрата и лунка ретентата имеют конфигурацию, рассчитанную на прием фильтрата и ретентата из фильтрующего элемента. В одном варианте воплощения изобретения лунка фильтрата или лунка ретентата не находится на одном и том же планшете, что и лунка образца.
В различных вариантах воплощения любого из перечисленных выше аспектов или любых других изложенных здесь аспектов изобретения вход подачи образца имеет проксимальный конец, соединенный с адаптером через трубчатую линию, выход ретентата соединен с мешком сбора ретентата через трубчатую линию, а выход фильтрата соединен с мешком сбора фильтрата через трубчатую линию. В других вариантах воплощения вышеуказанных аспектов вход подачи образца соединен с мешком сбора образца, имеющим проксимальный и дистальный концы, причем на проксимальном конце находится мембрана, адаптированная для приема иглы, а на дистальном конце имеется порт, к которому можно присоединить адаптер. В других вариантах воплощения вышеуказанных аспектов вход подачи образца имеет проксимальный конец, соединенный с мешком сбора образца через трубчатую линию, выход ретентата соединен с мешком сбора ретентата через трубчатую линию, а выход фильтрата соединен с мешком сбора фильтрата через трубчатую линию. В других вариантах воплощения вышеуказанных аспектов мешок сбора образца включает иглу для втягивания образца в мешок сбора образца.
Композиции и изделия, определенные настоящим раскрытием сущности изобретения, были выбраны или иначе изготовлены в соответствии с приведенными ниже примерами. Другие признаки и преимущества изобретения становятся очевидными из детального описания и пунктов формулы изобретения.
В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения предусмотрено устройство фильтрации. Устройство фильтрации включает первую проточную камеру. Первая проточная камера включает по меньшей мере один вход, настроенный на прием подачи, содержащей частицы и жидкость, и по меньшей мере на один выход ретентата. Устройство фильтрации содержит вторую проточную камеру, включающую дистальный конец, имеющий по меньшей мере один выход фильтрата, и фильтр, расположенный между первой проточной камерой и второй проточной камерой. Фильтр включает первый ряд столбиков и множество пор, образующихся промежутками между прилегающими столбиками. Каждая пора из множества пор включает физический размер поры, определяемый расстоянием между прилегающими столбиками, которые образуют пору, и эффективный размер поры, меньший физического размера поры. Устройство фильтрации также включает средство для перемещения подаваемого вещества через устройство фильтрации. Первая проточная камера, вторая проточная камера, фильтр и средство перемещения подаваемого вещества через устройство фильтрации имеют такую конфигурацию, которая обеспечивает удержание значительной фракции частиц, имеющих размер, превышающий эффективный размер пор и меньший, чем физический размер пор, в виде ретентата в первой проточной камере и пропускание значительной фракции жидкости в виде фильтрата во вторую проточную камеру.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения первая проточная камера имеет первую в основном постоянную глубину. В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения вторая проточная камера имеет вторую в основном постоянную глубину. В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения расстояние между фильтром и боковой стенкой первой проточной камеры снижается по длине от по меньшей мере одного входа до по меньшей мере одного выхода ретентата. В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения расстояние между фильтром и боковой стенкой второй проточной камеры увеличивается по длине от проксимального конца второй проточной камеры до дистального конца.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения угол между касательной к боковой стенке второй проточной камеры и касательной к ряду столбиков составляет меньше 5 градусов.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения подмножество пор имеет в основном идентичные физические размеры пор.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения подмножество пор имеет в основном идентичные эффективные размеры пор.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения первый ряд столбиков включает больше 10 процентов всех столбиков, присутствующих в устройстве фильтрации.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения заявленное устройство фильтрации имеет длину, определяемую большим из размеров длины первой проточной камеры и длины второй проточной камеры, и ширину, определяемую суммой ширины первой проточной камеры и ширины второй проточной камеры в точке наибольшей суммы ширины первой проточной камеры и ширины второй проточной камеры; при этом отношение длины устройства к ширине устройства составляет более 6.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения каждая пора имеет эффективный размер поры, которая примерно на 80 процентов меньше физического размера поры.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения первая камера включает по меньшей мере один вход текучей среды-носителя, отличающийся по меньшей мере от одного входа.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения по меньшей мере одна текучая среда-носитель включает по меньшей мере один из красителей нуклеиновых кислот, фиксативов, замораживающих растворов, алкилирующих агентов, антител, магнитных шариков, ферментов, коллагеназы, липазы, ДНКазы, субстратов определенных ферментов, активных производных циклофосфамида, факторов роста, детергентов и лизисных растворов.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения ни в первой проточной камере, ни в фильтре нет никаких передних кромок, радиус скругления которых меньше 1 мкм, в проточном устройстве.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения первое подмножество пор имеет отличающийся эффективный размер пор по сравнению со вторым подмножеством пор. В некоторых вариантах воплощения изобретения по меньшей мере один выход фильтрата второй проточной камеры имеет конфигурацию для сбора фильтрата, проходящего через первое подмножество пор, а вторая проточная камера включает второй выход фильтрата, имеющий конфигурацию для сбора фильтрата, проходящего через второе подмножество пор.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения устройство фильтрации также включает второй фильтр и третью проточную камеру. Второй фильтр может располагаться между первой проточной камерой и третьей проточной камерой. Третья проточная камера может включать проксимальный конец и дистальный конец, при этом дистальный конец имеет по меньшей мере один выход. Третья камера может расширяться по длине от проксимального до дистального конца.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения устройство фильтрации имеет длину, определяемую длиной первой проточной камеры, и ширину, определяемую суммой ширины первой проточной камеры, ширины второй проточной камеры и ширины третьей проточной камеры в точке наибольшей суммы ширины первой проточной камеры, ширины второй проточной камеры и ширины третьей проточной камеры; при этом отношение длины устройства к ширине устройства составляет более 5.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения устройство фильтрации имеет меньше 5000 столбиков.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения первый фильтр и второй фильтр включают больше 15 процентов всех столбиков, присутствующих в устройстве фильтрации.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения устройство фильтрации, по сути, симметрично по отношению к зеркальной плоскости, проходящей через центральную линию первой проточной камеры.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения касательная, образованная первым рядом столбиков, и касательная, образованная вторым рядом столбиков, не являются параллельными.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения устройство фильтрации также включает второй фильтр, третью проточную камеру и четвертую проточную камеру. Второй фильтр может располагаться между третьей проточной камерой и четвертой проточной камерой. Третья проточная камера может включать по меньшей мере один вход и по меньшей мере один выход. Четвертая проточная камера может включать по меньшей мере один выход.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения по меньшей мере один выход третьей проточной камеры имеет конфигурацию для сбора ретентата с первого фильтра. Третья проточная камера может также включать второй выход, отличный по меньшей мере от одного выхода, при этом второй выход третьей проточной камеры имеет конфигурацию для сбора ретентата со второго фильтра.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения по меньшей мере один выход третьей проточной камеры имеет конфигурацию для сбора ретентата с первого фильтра и ретентата со второго фильтра.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения по меньшей мере один выход третьей проточной камеры имеет конфигурацию для сбора ретентата с первого фильтра и ретентата со второго фильтра. Третья проточная камера может также включать второй выход, отличный по меньшей мере от одного выхода, при этом второй выход третьей проточной камеры имеет конфигурацию для сбора фильтрата с первого фильтра.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения заявленное устройство фильтрации имеет длину, определяемую суммой длины первой проточной камеры и длины третьей проточной камеры, и ширину, определяемую большей из следующих величин: сумма ширины первой проточной камеры и ширины второй проточной камеры в точке наибольшей суммы ширины первой проточной камеры и ширины второй проточной камеры либо сумма ширины третьей проточной камеры и ширины четвертой проточной камеры в точке наибольшей суммы ширины третьей проточной камеры и ширины четвертой проточной камеры; при этом отношение длины устройства к ширине устройства составляет более 10.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения первый фильтр и второй фильтр включают не менее 10 процентов всех столбиков, присутствующих в устройстве фильтрации.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения по меньшей мере один вход третьей проточной камеры имеет жидкостное соединение по меньшей мере с одним выходом фильтрата второй проточной камеры.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения по меньшей мере один вход третьей проточной камеры имеет жидкостное соединение по меньшей мере с одним выходом ретентата первой проточной камеры.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения по меньшей мере один вход третьей проточной камеры имеет жидкостное соединение по меньшей мере с одним выходом первой проточной камеры и по меньшей мере с одним выходом второй проточной камеры.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения третья камера также включает по меньшей мере один вход текучей среды-носителя, отличающийся по меньшей мере от одного входа.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения устройство фильтрации имеет конфигурацию, удовлетворяющую "критерий расширения камеры фильтрата".
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения устройство фильтрации имеет конфигурацию, удовлетворяющую "критерий минимального количества пор".
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения устройство фильтрации имеет конфигурацию для протекания жидкости через каждую пору с объемной скоростью потока меньше 3 процентов объемной скорости потока на проксимальном конце первой проточной камеры.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения устройство фильтрации имеет конфигурацию для протекания жидкости через первую камеру в основном с постоянной скоростью потока.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения устройство фильтрации имеет конфигурацию для протекания жидкости через вторую камеру в основном с постоянной скоростью потока.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения устройство фильтрации имеет конфигурацию для протекания жидкости через практически все поры в основном с идентичной скоростью потока.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения столбики имеют поперечное сечение в форме яйца.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения устройство фильтрации также включает второй фильтр, третий фильтр, четвертый фильтр, третью проточную камеру, четвертую проточную камеру, пятую проточную камеру и шестую проточную камеру. Второй фильтр может располагаться между первой проточной камерой и третьей проточной камерой. Третий фильтр может располагаться между четвертой проточной камерой и пятой проточной камерой. Четвертый фильтр может располагаться между четвертой проточной камерой и шестой проточной камерой. Третья проточная камера может включать первый конец и по меньшей мере один выход. Третья проточная камера может расширяться по длине от первого конца третьей проточной камеры в направлении по меньшей мере одного выхода третьей проточной камеры. Пятая проточная камера может включать первый конец и по меньшей мере один выход. Пятая проточная камера может расширяться по длине от первого конца пятой проточной камеры в направлении по меньшей мере одного выхода пятой проточной камеры. Шестая проточная камера может включать первый конец и по меньшей мере один выход. Шестая проточная камера может расширяться по длине от первого конца шестой проточной камеры в направлении по меньшей мере одного выхода шестой проточной камеры. Четвертая проточная камера может включать по меньшей мере один вход и по меньшей мере один выход. По меньшей мере один вход четвертой проточной камеры может быть в жидкостном соединении по меньшей мере с одним выходом ретентата первой проточной камеры, по меньшей мере с одним выходом фильтрата второй проточной камеры и по меньшей мере с одним выходом третьей проточной камеры.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения устройство фильтрации также включает второй фильтр и третью проточную камеру. Второй фильтр может располагаться между второй проточной камерой и третьей проточной камерой. Третья проточная камера может включать по меньшей мере один вход и по меньшей мере один выход.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения устройство, по сути, симметрично по отношению к зеркальной плоскости, проходящей через первую проточную камеру и четвертую проточную камеру.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения четвертая камера также включает вход текучей среды-носителя, отличающийся по меньшей мере от одного входа четвертой проточной камеры.
В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения предусмотрен способ фильтрации частиц. Способ включает обеспечение устройства фильтрации. Устройство фильтрации включает по меньшей мере один фильтрующий элемент. Каждый фильтрующий элемент включает первую проточную камеру, включающую вход подачи и выход ретентата, вторую проточную камеру, включающую выход фильтрата, и фильтр, включающий множество пор с физическими размерами пор, при этом фильтр располагается между первой проточной камерой и второй проточной камерой. Этот способ также включает введение подаваемого вещества, включающего подаваемую жидкость и по меньшей мере одну популяцию частиц с размером меньше физического размера пор, погружение подаваемой жидкости в устройство через вход подачи, прикладывание движущей силы для перемещения подаваемого вещества через устройство фильтрации, пропускание подаваемого вещества через устройство фильтрации так, чтобы значительная фракция частиц по меньшей мере одной популяции была задержана в виде ретентата в первой проточной камере, а значительная фракция подаваемой жидкости была пропущена через фильтр в виде фильтрата во вторую проточную камеру, сбор ретентата на выходе ретентата и сбор фильтрата на выходе фильтрата.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения обеспечение устройства фильтрации включает обеспечение устройства фильтрации, включающего более 10 фильтрующих элементов.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения введение подаваемого вещества в устройство включает введение жидкой суспензии клеток в первую проточную камеру.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения подаваемое вещество включает жизнеспособные клетки, а способ также включает сепарацию клеток из подаваемого вещества, при которой по меньшей мере 90% жизнеспособных клеток остаются жизнеспособными после сепарации.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения способ также включает сепарацию клеток из подаваемого вещества, в котором менее 0,03 процента клеток подвергаются лизису под действием устройства фильтрации.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения менее 0,03% клеток захватываются устройством фильтрации.
5
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения пропускание подаваемого вещества через устройство фильтрации включает пропускание более 10 клеток в секунду через устройство фильтрации.
6
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения пропускание подаваемого вещества через устройство фильтрации включает пропускание более 10 клеток в секунду через устройство фильтрации.
7
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения пропускание подаваемого вещества через устройство фильтрации включает пропускание более 10 клеток в секунду через устройство фильтрации.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения обеспечение устройства фильтрации включает обеспечение устройства фильтрации, включающего по меньшей мере один фильтрующий элемент с объемом удерживания менее 0,8 мкл.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения обеспечение устройства фильтрации включает обеспечение устройства фильтрации, имеющего площадь занимаемой поверхности и в основном постоянную глубину камеры, а пропускание подаваемого вещества через устройство фильтрации включает пропускание клеток через устройство фильтрации с нормализированной скоростью обработки, определяемой количеством клеток, пропускаемых через устройство фильтрации в секунду, разделенным на произведение в основном постоянной глубины камеры на площадь занимаемой поверхности, величина которой превышает 10000 клеток в секунду на кубический миллиметр.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения обеспечение устройства фильтрации включает обеспечение устройства фильтрации, имеющего площадь занимаемой поверхности и в основном постоянную глубину камеры, а пропускание подаваемого вещества через устройство фильтрации включает пропускание клеток через устройство фильтрации с нормализированной скоростью обработки, определяемой количеством клеток, пропускаемых через устройство фильтрации в секунду, разделенным на произведение в основном постоянной глубины камеры на площадь занимаемой поверхности, величина которой превышает 100000 клеток в секунду на кубический миллиметр.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения обеспечение устройства фильтрации включает обеспечение устройства фильтрации, имеющего характерную глубину камеры, площадь занимаемой поверхности и плотность фильтрующих элементов, которые определяются количеством модулей фильтрации, входящих в модуль, разделенным на произведение характерной глубины камеры и площади занимаемой поверхности, причем плотность фильтрующих элементов больше 400 фильтрующих элементов на кубический сантиметр.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения введение подаваемого вещества в устройство включает введение жидкого подаваемого вещества, включая костный мозг, в первую проточную камеру.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения введение подаваемого вещества в устройство включает введение жидкого подаваемого вещества, включая кровь, в первую проточную камеру.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения введение подаваемого вещества в устройство включает введение жидкого подаваемого вещества, включая пуповинную кровь, в первую проточную камеру.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения введение подаваемого вещества в устройство включает введение жидкого подаваемого вещества, включая стволовые клетки, в первую проточную камеру.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения введение подаваемого вещества в устройство включает введение жидкого подаваемого вещества, включая колониеобразующие клетки, в первую проточную камеру.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения введение подаваемого вещества в устройство включает введение жидкого подаваемого вещества, включая иммунные клетки, в первую проточную камеру.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения введение подаваемого вещества в устройство включает введение амниотической жидкости в первую проточную камеру.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения введение подаваемого вещества в устройство включает введение переваренной жировой ткани в первую проточную камеру.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения введение подаваемого вещества в устройство включает введение одного из: клеток, клеток крови, клеток пуповинной крови, клеток костного мозга, эритроцитов, лейкоцитов, лимфоцитов, эпителиальных клеток, стволовых клеток, раковых клеток, опухолевых клеток, циркулирующих опухолевых клеток, клеток-предшественников, предшественников клеток, стволовых клеток пуповинной крови, гематопоэтических стволовых клеток, мезенхимных стволовых клеток, жировых стволовых клеток, плюрипотентных стволовых клеток, индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, эмбриональных стволовых клеток, клеток, полученных из пуповины, клеток, полученных из жировых тканей, клеток в стромальных васкулярных фракциях (СВФ), клеток в амниотических жидкостях, клеток в менструальной крови, клеток в церебральной спинальной жидкости, клеток в моче, стволовых клеток костного мозга, стволовых клеток периферической крови, клеток CD34+, колониеобразующих клеток, Т-клеток, В-клеток, нервных клеток, иммунных клеток, дендровидных клеток, мегакариоцитов, иммобилизованных клеток костного мозга, тромбоцитов, спермы, яиц, ооцитов, микробов, микроорганизмов, бактерий, грибов, дрожжей, простейших, вирусов, органелл, ядер, нуклеиновых кислот, митохондрий, мицелл, липидов, белков, белковых комплексов, клеточного детрита, паразитов, жировых капель, многоклеточных организмов, спор, водорослей, кластеров, совокупностей перечисленного выше, промышленных порошков, полимеров, порошков, эмульсий, капель, пыли, микросфер, частиц и коллоидов в первую проточную камеру.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения подаваемое вещество включает частицы с размером от приблизительно 5 мкм до приблизительно 30 мкм.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения способ также включает сбор частиц ретентата, в том числе одного из: клеток CD34+, стромальной васкулярной фракции, стволовых клеток, клеток-предшественников, колониеобразующих клеток, гематопоэтических стволовых клеток, жировых стволовых клеток, мезенхимных стволовых клеток, амниотических стволовых клеток, ядросодержащих клеток, лейкоцитов, лимфоцитов, раковых клеток, опухолевых клеток, дендровидных клеток, мертвых клеток, живых клеток, делящихся клеток, ретикулоцитов, красных кровяных телец, жировых клеток и жировых капель.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения сбор частиц ретентата включает сбор клеток, причем более 95% клеток в ретентате являются жизнеспособными.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения способ также включает сбор фильтрата, в том числе одного из: клеток CD34+, стромальной васкулярной фракции, стволовых клеток, клеток-предшественников, колониеобразующих клеток, гематопоэтических стволовых клеток, жировых стволовых клеток, мезенхимных стволовых клеток, амниотических стволовых клеток, плазмы, тромбоцитов, красных кровяных телец, ядросодержащих клеток, лейкоцитов, лимфоцитов, раковых клеток, опухолевых клеток, дендровидных клеток, мертвых клеток, живых клеток, делящихся клеток, ретикулоцитов, красных кровяных телец, жировых клеток и жировых капель.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения сбор фильтрата включает сбор клеток, причем более 95% клеток в фильтрате являются жизнеспособными.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения способ также включает обеспечение устройства фильтрации, размер удержания которого значительно меньше, чем физический размер пор.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предусмотрен способ уменьшения объема пуповинной крови. Способ включает получение образца, включающего пуповинную кровь, имеющую по меньшей мере одну популяцию ядросодержащих клеток, при этом образец имеет объем образца. Способ также включает обеспечение устройства фильтрации. Устройство фильтрации включает первую сборную емкость, вторую сборную емкость, средство подачи и по меньшей мере три фильтрующих элемента. Каждый фильтрующий элемент имеет микрожидкостную проточную камеру, включающую вход подачи, выход ретентата и выход фильтрата. Микрожидкостные проточные камеры включают по меньшей мере одну размерность, перпендикулярную ее длине, которая меньше 1 миллиметра. Вход подачи - это жидкостная связь со средством подачи. Выход ретентата - это жидкостное соединение с первой сборной емкостью. Выход фильтрата - это жидкостное соединение со второй сборной емкостью. Способ также включает введение образца во входы подачи фильтрующих элементов с использованием средств подачи, приложение движущей силы к образцу, пропускание образца через микрожидкостные проточные камеры устройства фильтрации, создание условий для ламинарного потока, который направляет значительную фракцию объема образца на выход фильтрата и значительную фракцию по меньшей мере одной популяции ядросодержащих клеток на выход ретентата, сбор выходной жидкости с выхода ретентата в первой сборной емкости и сбор выходной жидкости с выхода фильтрата во второй сборной емкости.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения сбор выходной жидкости с выхода ретентата включает сбор более 70% ядросодержащих клеток из образца в объеме меньше 25% объема образца в первой сборной емкости.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения по меньшей мере одна популяция ядросодержащих клеток включает клетки CD34+, а сбор выходной жидкости с выхода ретентата включает сбор более 75% клеток CD34+ из образца в первую сборную емкость.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения способ также включает сепарацию жизнеспособных клеток от образца, при которой по меньшей мере 95% жизнеспособных клеток остаются жизнеспособными после сепарации.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения получение образца включает получение образца, содержащего ядросодержащие клетки пуповинной крови с жизнеспособностью более 95%, причем сбор выходной жидкости с выхода ретентата включает сбор ядросодержащих клеток с жизнеспособностью более 95%.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения пропускание образца через микрожидкостные проточные камеры включает пропускание более 10000000 клеток крови в секунду через устройство фильтрации.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предусмотрен аппарат фильтрации частиц. Аппарат фильтрации частиц включает общий вход подачи, общий выход фильтрата, общий выход ретентата и по меньшей мере одно устройство с высокой плотностью модулей. По меньшей мере одно устройство с высокой плотностью модулей включает множество фильтрующих элементов. Каждый из фильтрующих элементов включает первую проточную камеру, имеющую по меньшей мере один вход, конфигурация которого позволяет принимать подаваемое вещество, содержащее подаваемые частицы в подаваемой жидкости, и по меньшей мере один выход ретентата, вторую проточную камеру, включающую проксимальный конец, дистальный конец по меньшей мере с одним выходом фильтрата, и первый фильтр, расположенный между первой проточной камерой и второй проточной камерой. Первый фильтр включает первый ряд столбиков и множество пор, образующихся промежутками между прилегающими столбиками ряда столбиков. Каждая пора множества пор включает физический размер пор, определяемый расстоянием между прилегающими столбиками, образующими пору. Аппарат фильтрации частиц также включает средство для перемещения подаваемого вещества через множество фильтрующих элементов. Первая проточная камера, вторая проточная камера, фильтр и средство перемещения подаваемого вещества через множество фильтрующих элементов имеют такую конфигурацию, которая обеспечивает размер удержания, меньший эффективного размера пор, и обеспечивает удержание значительной фракции частиц подаваемого вещества, которые больше по размеру, чем размер удержания, как и ретентат в первой проточной камере, а также обеспечивает пропускание значительной фракции подаваемой жидкости в виде фильтрата во вторую проточную камеру. Каждый выход, которых может быть по меньшей мере один во множестве фильтрующих элементов, является жидкостной связью с общим входом подачи. Каждый выход фильтрата, которых может быть по меньшей мере один во множестве фильтрующих элементов, является жидкостной связью с общим выходом фильтрата. Каждый выход ретентата, которых может быть по меньшей мере один во множестве фильтрующих элементов, является жидкостной связью с общим выходом ретентата.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения аппарат фильтрации частиц также включает пробирку, крышку пробирки и пробирочную вставку. Устройство с высокой плотностью модулей может иметь конфигурацию, предусматривающую установку внутри пробирочной вставки. Пробирка может иметь конфигурацию, предусматривающую размещение пробирочной вставки. Пробирочная вставка может включать резервуар подаваемого вещества, имеющий жидкостное соединение с общим входом подачи. Крышка пробирки может иметь конфигурацию, предусматривающую накрытие пробирки и пробирочной вставки.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения пробирка имеет конфигурацию, предусматривающую прием ретентата из устройства с высокой плотностью модулей. Пробирочная вставка может также включать резервуар фильтрата, имеющий конфигурацию, предусматривающую прием фильтрата из устройства с высокой плотностью модулей.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения пробирка имеет конфигурацию, предусматривающую прием фильтрата из устройства с высокой плотностью модулей. Пробирочная вставка может также включать резервуар ретентата, имеющий конфигурацию, предусматривающую прием ретентата из устройства с высокой плотностью модулей.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения пробирочная вставка также включает резервуар текучей среды-носителя, имеющий конфигурацию, предусматривающую подачу текучей среды-носителя на вход по меньшей мере одной первой проточной камеры.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения аппарат фильтрации частиц также включает мешок сбора ретентата, имеющий жидкостное соединение с общим выходом ретентата, и мешок сбора фильтрата, имеющий жидкостное соединение с общим выходом фильтрата.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения аппарат фильтрации частиц также включает общий вход текучей среды-носителя, имеющий жидкостное соединение со входом по меньшей мере одной первой проточной камеры.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения аппарат фильтрации частиц также включает емкость текучей среды-носителя, имеющую конфигурацию, предусматривающую подачу текучей среды-носителя на общий вход текучей среды-носителя.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения аппарат фильтрации частиц также включает адаптер, имеющий конфигурацию, позволяющую установить жидкостное соединение между мешком сбора подаваемого вещества и общим входом подачи.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения аппарат фильтрации частиц также включает мешок сбора подаваемого вещества, имеющий жидкостное соединение с общим входом подачи.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения мешок сбора подаваемого вещества включает по меньшей мере одну иглу, конфигурация которой предусматривает втягивание подаваемого вещества в мешок сбора подаваемого вещества.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения мешок сбора подаваемого вещества содержит антикоагулянт.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения мешок сбора подаваемого вещества содержит жидкость.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения аппарат фильтрации частиц также включает первую лунку, имеющую жидкостную связь с общим входом подачи и конфигурацию жидкостного резервуара, вторую лунку, имеющую жидкостную связь с общим выходом ретентата и конфигурацию жидкостного резервуара, и третью лунку, имеющую жидкостную связь с общим выходом фильтрата и конфигурацию жидкостного резервуара.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения первая лунка, вторая лунка и третья лунка имеют конфигурацию в формате многолуночного планшета.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения аппарат фильтрации частиц также включает четвертую лунку, имеющую жидкостную связь с входом по меньшей мере одной первой проточной камеры и имеющую конфигурацию, предусматривающую подачу текучей среды-носителя по меньшей мере в одну первую проточную камеру.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения аппарат фильтрации частиц также включает крышку, конфигурация которой предусматривает закрытие по меньшей мере одной из лунок: первой лунки, второй лунки и третьей лунки.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения крышка включает практически воздухо- и паронепроницаемую пленку, конфигурация которой предусматривает плотное закрытие по меньшей мере одной из лунок: первой лунки, второй лунки и третьей лунки.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения по меньшей мере одна из лунок - первая лунка, вторая лунка или третья лунка - содержит жидкость.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения каждый фильтрующий элемент из множества фильтрующих элементов имеет объем удерживания меньше 1 мкл.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения устройство с высокой плотностью модулей имеет плотность фильтрующих элементов более 500 фильтрующих элементов на кубический сантиметр.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения устройство с высокой плотностью модулей включает более 30 фильтрующих элементов.
-2
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения устройство с высокой плотностью модулей имеет расчетный показатель эффективности более 0,5 мм.
-2
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения устройство с высокой плотностью модулей имеет расчетный показатель эффективности более 5 мм.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предусмотрено фильтрующее устройство. Фильтрующее устройство включает первую проточную камеру, имеющую по меньшей мере один вход, конфигурация которого предусматривает введение подаваемого вещества, содержащего частицы, и по меньшей мере один выход ретентата, конфигурация которого предусматривает сбор ретентата из подаваемого вещества. Фильтрующее устройство также включает вторую проточную камеру, имеющую первый конец и по меньшей мере один выход фильтрата, по меньшей мере один выход фильтрата, конфигурация которого предусматривает сбор фильтрата. Фильтрующее устройство также включает первый фильтр. Первый фильтр включает множество пор, имеющих физический размер пор и размер удержания меньше физического размера пор. Первый фильтр располагается между первой проточной камерой и второй проточной камерой. Первая проточная камера, вторая проточная камера и первый фильтр имеют конфигурацию, облегчающую условия потока, что существенно повышает процент удержания частиц, меньших физического размера пор и больших размера удержания.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения фильтрующее устройство имеет конфигурацию, удовлетворяющую "критерий расширения камеры фильтрата".
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения угол между касательной к боковой стенке второй проточной камеры и касательной к первому фильтру составляет меньше 5 градусов.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения размер удержания примерно на 90 процентов меньше физического размера пор.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения фильтрующее устройство имеет конфигурацию для протекания жидкости через каждую пору с объемной скоростью потока меньше 3 процентов объемной скорости потока по меньшей мере на одном входе первой проточной камеры.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения фильтрующее устройство имеет отношение длины к ширине примерно более 10.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения первая проточная камера имеет первую в основном постоянную глубину. Вторая проточная камера может иметь вторую в основном постоянную глубину и вторая проточная камера может расширяться с первого конца второй проточной камеры в направлении по меньшей мере одного выхода фильтрата второй проточной камеры.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения фильтрующее устройство имеет конфигурацию для протекания жидкости через первую камеру в основном с постоянной скоростью потока.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения фильтрующее устройство имеет конфигурацию для протекания жидкости через вторую камеру в основном с постоянной скоростью потока.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения устройство фильтрации имеет конфигурацию для протекания жидкости через практически все поры в основном с идентичной скоростью потока.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения первый фильтр включает ряд столбиков, причем поры первого фильтра представляют собой проходы для жидкости между прилегающими столбиками ряда столбиков, а ряд столбиков содержит не меньше 10 процентов всех столбиков, имеющихся в устройстве.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения первая камера включает по меньшей мере один вход текучей среды-носителя, отличающийся по меньшей мере от одного входа и имеющий конфигурацию, предусматривающую введение текучей среды-носителя в первую проточную камеру.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения в фильтрующем устройстве нет никаких передних кромок, радиус скругления которых меньше 0,5 мкм, вдоль пути движения потока через устройство.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения первое подмножество пор имеет отличающийся физический размер пор по сравнению со вторым подмножеством пор.
В некоторых вариантах воплощения изобретения по меньшей мере один выход фильтрата второй проточной камеры имеет конфигурацию для сбора фильтрата, проходящего через первое подмножество пор, и при этом вторая проточная камера включает второй выход фильтрата, имеющий конфигурацию для сбора фильтрата, проходящего через второе подмножество пор.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения фильтрующее устройство также включает второй фильтр и третью проточную камеру, причем второй фильтр располагается между первой проточной камерой и третьей проточной камерой, а третья проточная камера имеет по меньшей мере один выход.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения фильтрующее устройство имеет отношение длины к ширине примерно более 5.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения первый фильтр имеет первый ряд столбиков. Поры первого фильтра могут включать проходы для жидкости между прилегающими столбиками первого ряда столбиков. Второй фильтр может включать второй ряд столбиков. Поры второго фильтра могут включать проходы для жидкости между прилегающими столбиками второго ряда столбиков. Первый ряд столбиков и второй ряд столбиков могут включать не менее 10 процентов всех пор, имеющихся в фильтрующем устройстве.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения фильтрующее устройство, по сути, симметрично по отношению к зеркальной плоскости, проходящей через центр первой проточной камеры.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения фильтрующее устройство также включает второй фильтр и третью проточную камеру, причем второй фильтр располагается между второй проточной камерой и третьей проточной камерой, а третья проточная камера имеет по меньшей мере один вход и по меньшей мере один выход.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения фильтрующее устройство также включает второй фильтр, третью проточную камеру и четвертую проточную камеру, причем второй фильтр располагается между третьей проточной камерой и четвертой проточной камерой, а третья проточная камера имеет по меньшей мере один вход и по меньшей мере один выход, а четвертая проточная камера имеет по меньшей мере один выход.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения фильтрующее устройство имеет меньше примерно 6000 столбиков.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения первый фильтр и второй фильтр включают не менее 10 процентов пор, присутствующих в устройстве.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения по меньшей мере один вход третьей проточной камеры имеет жидкостное соединение по меньшей мере с одним выходом фильтрата второй проточной камеры.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения по меньшей мере один вход третьей проточной камеры имеет жидкостное соединение по меньшей мере с одним выходом ретентата первой проточной камеры.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения по меньшей мере один вход третьей проточной камеры имеет жидкостное соединение по меньшей мере с одним выходом первой проточной камеры и по меньшей мере с одним выходом второй проточной камеры.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения третья проточная камера дополнительно включает по меньшей мере один вход текучей среды-носителя, отличающийся по меньшей мере от одного входа и имеющий конфигурацию, предусматривающую введение текучей среды-носителя.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения по меньшей мере один выход третьей проточной камеры имеет конфигурацию для сбора ретентата с первого фильтра. Третья проточная камера может также включать второй выход, отличающийся по меньшей мере от одного выхода. Второй выход третьей проточной камеры может иметь конфигурацию, предусматривающую сбор ретентата со второго фильтра.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения по меньшей мере один выход третьей проточной камеры имеет конфигурацию для сбора ретентата с первого фильтра и ретентата со второго фильтра.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения по меньшей мере один выход третьей проточной камеры имеет конфигурацию для сбора ретентата с первого фильтра и ретентата со второго фильтра. Третья проточная камера может также включать второй выход, отличающийся по меньшей мере от одного выхода. Второй выход третьей проточной камеры может иметь конфигурацию, предусматривающую сбор фильтрата с первого фильтра.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Прилагаемые фигуры выполнены не в масштабе, а количество элементов (например, количество столбиков) может быть меньшим, чем в реальном варианте воплощения изобретения, для обеспечения большей ясности. На фигурах каждый идентичный или почти идентичный компонент, иллюстрируемый на различных фигурах, обозначен одним и тем же числом. Для обеспечения большей ясности на фигурах может обозначаться не каждый компонент. Прилагаются следующие фигуры.
Фигуры 1A-1G - это схематические иллюстрации, показывающие различные способы изолирования частиц. На фигуре 1А показано исключение большой частицы малой порой. На фигуре 1В показана деформация большой частицы, которая частично входит в пору, однако, не способна протиснуться через нее. На фигуре 1С показана частица, входящая в сужающееся отверстие и задерживаемая порой. На фигуре 1D показаны частицы, задержанные порами. На фигуре 1Е показано неудачное исключение по размеру. На этой схеме частица проходит через пору, потому что ее размер меньше размера поры. На фигуре 1F показано еще одно неудачное исключение по размеру. В этом случае частица проходит через пору, потому что она деформируется и протискивается через пору. На фигуре 1G проиллюстрировано еще одно неудачное исключение по размеру. В этом случае частицы не отфильтровываются, потому что на их пути не встречаются физически ограничивающие поры.
Фигуры 2А и 2В являются схематическими иллюстрациями. На фигуре 2А показан эффект исключения по потоку, наблюдаемый в микрокапиллярах циркуляции крови. На фигуре 2В показан возможный механизм исключения по потоку.
Фигуры 3А-3С являются схематическими иллюстрациями, показывающими принципы исключения по потоку в варианте воплощения настоящего изобретения.
Фигура 4 - это график, показывающий эффективный размер пор в зависимости от потока через пору. Эффективный размер пор рассчитывался путем компьютерного моделирования жидкостной динамики.
Фигуры 5A-5F являются схематическими иллюстрациями, показывающими варианты воплощения фильтрующего модуля. На фигуре 5А схематически показан вид сверху. На фигуре 5В приведен трехмерный вид в собранном состоянии. На фигуре 5С приведен покомпонентный трехмерный вид. На фигуре 5D приведен трехмерный вид, на котором столбики имеют соотношение размеров меньше единицы. Крышка варианта воплощения фильтрующего модуля не показана. На фигуре 5Е приведен трехмерный вид, на котором столбики имеют соотношение размеров больше единицы. Крышка варианта воплощения не показана. На фигуре 5F приведен трехмерный вид в собранном состоянии, на котором видны конусообразные столбики. Крышка варианта воплощения не показана.
Фигуры 6А и 6В являются схематическими иллюстрациями вида сверху двух вариантов воплощения фильтрующего модуля.
Фигуры 7А и 7В являются схематическими иллюстрациями, показывающими варианты воплощения фильтрующего модуля. На фигуре 7А приведен вид сверху варианта воплощения фильтрующего модуля. На фигуре 7В приведен вид сверху варианта воплощения фильтрующего модуля. Фигура 7С - это график, показывающий эффективный размер пор фильтрующих модулей, показанных на фигуре 7А. Фигура 7D - это график, показывающий эффективный размер пор фильтрующих модулей, показанных на фигуре 7В.
Фигура 8 - это схематическая иллюстрация трехмерного вида варианта воплощения фильтрующего модуля с различным размером пор. Крышка модуля не показана.
Фигуры 9А-9Н являются схематическими иллюстрациями вида сверху частей вариантов воплощения фильтрующего модуля. На фигуре 9А показана волнистая камера фильтрата. На фигурах 9В-9Н показаны различные формы поперечного сечения столбиков.
Фигуры 10А-10С являются схематическими иллюстрациями, показывающими фильтрующий модуль, камера фильтрата которого мельче, чем камера ретентата. Фигуры 10А и 10В - это вид сверху и трехмерный вид, соответственно. Крышка модуля не показана. На фигуре 10С показаны частицы, перемещающиеся в модуле.
Фигуры 11А и 11В - это две схематические иллюстрации, на которых показаны трехмерный вид в собранном состоянии и трехмерный покомпонентный вид фильтрующего модуля, включающего сетчатый фильтр.
Фигуры 11С и 11D - это две схематические иллюстрации, на которых показаны трехмерный вид в собранном состоянии и трехмерный покомпонентный вид фильтрующего модуля, включающего пористый мембранный фильтр.
Фигура 12 - это схематическая иллюстрация вида сверху фильтрующего модуля.
Фигура 13 - это схематическая иллюстрация вида сверху фильтрующего модуля, в котором применяется поток носителя.
Фигуры 14А и 14В являются схематическими иллюстрациями вида сверху двух двойных фильтрующих модулей.
Фигуры 15А и 15В - это вид сверху двух двойных фильтрующих модулей.
Фигуры 16А и 16В - это вид сверху двух множественных фильтрующих модулей.
Фигуры 17A-17D являются схематическими иллюстрациями. На фигуре 17А приведен вид сверху каскадного фильтрующего модуля, включающего два по сути идентичных фильтрующих модуля. На фигуре 17В приведен вид сверху каскадного фильтрующего модуля, включающего два по сути идентичных двойных фильтрующих модуля. Фигуры 17С и 17D - это вид сверху двух каскадных фильтрующих модулей, каждый из которых включает два двойных фильтрующих модуля.
Фигуры 18А-18С являются схематическими иллюстрациями вида сверху каскадных фильтрующих модулей, включающих различные фильтрующие модули.
Фигура 18D - это график, показывающий количественные характеристики фильтрации.
Фигуры 19А и 19В - это вид сверху каскадных фильтрующих модулей, включающих различные двойные фильтрующие модули.
Фигуры 20А и 20В являются схематическими иллюстрациями. На фигуре 20А приведен вид сверху каскадного фильтрующего модуля, включающего два различных фильтрующих модуля. На фигуре 20В приведен вид сверху упрощенного каскадного фильтрующего модуля. Фигура 20С - это график, показывающий количественные характеристики фильтрации.
Фигуры 21А и 21В являются схематическими иллюстрациями вида сверху двух двойных фильтрующих модулей.
Фигуры 22А и 22В являются схематическими иллюстрациями вида сверху конфигураций двух двойных каскадных фильтрующих модулей.
Фигуры 23А-23С являются схематическими иллюстрациями вида сверху конфигураций трех двойных фильтрующих модулей. Фигура 23D - это схематическая иллюстрация множественного фильтрующего модуля. Фигура 23Е - это схематическая иллюстрация каскадных фильтрующих модулей, включающих два двойных фильтрующих модуля, показанных на фигуре 23С.
Фигуры 24A-24F являются схематическими иллюстрациями. Фигуры 24A-24D и 24F - это вид сверху устройств с высокой плотностью модулей. На фигуре 24Е приведен трехмерный вид устройства с высокой плотностью модулей. Крышка устройства не показана.
На фигуре 25 приведена схематическая иллюстрация трехмерного вида в собранном состоянии и трехмерного покомпонентного вида устройства, состоящего из стопки из четырех устройств с высокой плотностью модулей и крышки.
Фигуры 26А-26Е являются схематическими иллюстрациями картриджа. Фигура 26А - это схематическая иллюстрация трехмерного вида картриджа в собранном состоянии. Фигура 26В - это схематическая иллюстрация вида картриджа спереди. Фигура 26С - это схематическая иллюстрация вида картриджа сбоку. Фигура 26D - это схематическая иллюстрация трехмерного покомпонентного вида картриджа. Фигура 26Е - это схематическая иллюстрация покомпонентного вида картриджа сбоку.
Фигуры 27А-27С являются схематическими иллюстрациями системы мешков.
Фигура 28 - это схематическая иллюстрация системы мешков.
Фигуры 29А и 29В - это схематические иллюстрации, на которых показаны, соответственно, трехмерный вид в собранном состоянии и трехмерный покомпонентный вид системы пробирок.
Фигуры 30A-30G являются схематическими иллюстрациями пробирочной вставки. Фигура 30А - это схематическая иллюстрация трехмерного вида пробирочной вставки. Фигура 30В - это схематическая иллюстрация вида пробирочной вставки в разрезе. Фигуры 30С, 30D, 30Е, 30F и 30G - это схематические иллюстрации вида сверху, вида спереди, вида сбоку, вида сзади и вида снизу пробирочной вставки, соответственно.
Фигуры 31А-31С являются схематическими иллюстрациями планшетной системы. Фигура 31А - это схематическая иллюстрация трехмерного вида планшетной системы. Фигура 31В - это схематическая иллюстрация трехмерного покомпонентного вида планшетной системы. Фигура 31С - это схематическая иллюстрация вида планшетной системы сбоку.
Фигуры 32A-32D являются схематическими иллюстрациями планшетной системы. Фигура 32А - это схематическая иллюстрация трехмерного вида планшетной системы. Фигуры 32В, 32С и 32D - это схематические иллюстрации вида сверху, вида сбоку и вида спереди планшетной системы, соответственно.
Фигура 33 - это таблица, в которой приведены экспериментальные результаты изоляции лейкоцитов из цельной периферийной крови при помощи устройства с высокой плотностью модулей.
Фигуры 34А-34В - это гистограммы, показывающие распределение по размерам лейкоцитов (белых кровяных телец), эритроцитов (красных кровяных телец) и тромбоцитов (кровяных пластинок) в образцах крови и ретентатах, используемых в эксперименте, в котором лимфоциты изолируют из периферической крови. Фигура 34С - это таблица, в которой показано количество различных типов клеток. Фигура 34D -это таблица, в которой показана производительность устройства с высокой плотностью модулей.
Фигуры 35А-35С - это таблицы, в которых показаны экспериментальные результаты снижения объема пуповинной крови с использованием устройства с высокой плотностью модулей.
ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ
Настоящее изобретение не ограничивается в применении деталями конструкции и расположением компонентов, которые приведены в следующем описании или показаны на фигурах. Изобретение может включать другие варианты воплощения, применяться на практике или реализовываться различными способами. Кроме того, фразеология и терминология, используемая ниже, предназначена только для описания и не должна рассматриваться как ограничивающая. Использование таких терминов как "включающий", "имеющий", "содержащий", "подразумевающий" и их вариации в настоящем описании употребляются с целью охвата перечисленных после них элементов и их эквивалентов, а также дополнительных элементов.
Аспекты и варианты воплощения настоящего изобретения касаются систем фильтрации, которые могут быть полезными для фильтрации частиц, и способов работы с такими системами фильтрации.
Аспекты и варианты воплощения настоящего изобретения основаны, по меньшей мере частично, на открытии устройства, в котором используется исключение по потоку и обеспечивается фильтрация частиц и биологических образцов с высокой производительностью, высокой пропускной способностью, низким уровнем повреждения частиц, низким сдвиговым усилием и стойкостью к закупорке. Кроме того, в настоящем раскрытии приведен способ и устройство, которое может быть просто изготовлено в виде компактного устройства с использованием недорогих материалов, в том числе, без ограничения, кремния и пластмассы.
Приведенные здесь диапазоны следует рассматривать как условное обозначение всех величин диапазона. Например, диапазон от 1 до 50 подразумевает включение любого числа, комбинации чисел или поддиапазонов из следующего набора: 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50.
Если иное прямо не указано или очевидно не вытекает из контекста, термин "или" подразумевает не исключающее «или». Если иное прямо не указано или очевидно не вытекает из контекста, слова обозначают единственное или множественное число.
Если иное прямо не указано или очевидно не вытекает из контекста, термин "около"/"примерно"/"приблизительно" подразумевает нахождение в диапазоне обычных допусков, принятых в уровне техники, например, в пределах 2 стандартных отклонений от средней величины. Термин "около"/"примерно"/"приблизительно" может подразумевать нахождение в пределах 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% или 0,01% от указанной величины. Если иное очевидно не вытекает из контекста, все числовые величины, приведенные здесь, дополняются термином "около"/"примерно"/"приблизительно".
Перечисление химических групп в любом определении переменной в настоящем описании включает определения такой переменной как любой единственной группы или комбинации перечисленных групп. Приведение варианта воплощения для переменной или аспекта по настоящему описанию включает такой вариант воплощения в виде любого единичного варианта воплощения или в комбинации с любыми другими вариантами воплощения или их частью.
Любые предусмотренные здесь составы или способы могут комбинироваться с одним или более любых других составов или способов, предусмотренных здесь.
Термин "частицы", используемый здесь, включает (без ограничения) клетки, клетки крови, клетки пуповинной крови, клетки костного мозга, эритроциты, лейкоциты, лимфоциты, эпителиальные клетки, стволовые клетки, раковые клетки, опухолевые клетки, циркулирующие опухолевые клетки, клетки-предшественники, предшественники клеток, стволовые клетки пуповинной крови, гематопоэтические стволовые клетки, мезенхимные стволовые клетки, жировые стволовые клетки, плюрипотентные стволовые клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, эмбриональные стволовые клетки, клетки, полученные из пуповины, клетки, полученные из жировые тканей, клетки в стромальных васкулярных фракциях (СВФ), клетки в амниотических жидкостях, клетки в менструальной крови, клетки в церебральной спинальной жидкости, клетки в моче, стволовые клетки костного мозга, стволовые клетки периферической крови, клетки CD34+, колониеобразующие клетки, Т-клетки, В-клетки, нервные клетки, иммунные клетки, дендровидные клетки, мегакариоциты, иммобилизованные клетки костного мозга, стволовые клетки вартонового студня, эукариотические клетки, прокариотические клетки, животные клетки, тромбоциты, сперму, яйца, ооциты, микробы, микроорганизмы, бактерии, грибы, дрожжи, простейшие, вирусы, органеллы, ядра, нуклеиновые кислоты, митохондрии, мицеллы, липиды, белки, белковые комплексы, клеточный детрит, паразиты, жировые капли, многоклеточные организмы, споры, водоросли, кластеры или совокупности перечисленного выше, а также прочие небиологические частицы, взвешенные в жидкости, такие как промышленные порошки, полимеры, порошки, эмульсии, капли, пыль, микросферы и коллоиды. Частицы могут быть жесткими и деформируемыми, могут иметь различные размеры и формы. Частицы могут варьироваться в размере, например, могут иметь максимальные размеры приблизительно от 50 нм до приблизительно 1 мм. Форма частиц может быть (без ограничения) продолговатой, сферической, дисковой, коробчатой, стержнеобразной, спиральной либо иметь форму цепей или совокупностей перечисленных форм. Варианты воплощения настоящего изобретения могут быть полезными для фильтрации частиц, которые являются деформируемыми, хрупкими или чувствительными к большим напряжениям сдвига.
Термин "механические свойства" включает (без ограничения) физические параметры, размер, форму, деформируемость, гибкость, эластичность, плотность, вязкость, жесткость, а также пространственное распространение или временная характеристика указанных параметров.
Термин "исключение по размеру", используемый здесь, включает предотвращение или ограничение входа или прохода путем физического блокирования. В варианте воплощения исключения по размеру используются малые поры 002 для предотвращения входа больших недеформируемых частиц 001 в поры и прохождения через фильтр 003 (Фиг.1А). В другом варианте воплощения исключения по размеру используется малое отверстие, чтобы помешать деформируемой частице 001 протиснуться через отверстие 002 (Фиг.1В). Еще один вариант воплощения исключения по размеру показан на Фиг.1С, в котором частица 001 может входить в большое отверстие поры 002 и застревать в узкой части поры 002. Еще один вариант воплощения исключения по размеру показан на Фиг.1D. Частица 001 может войти в пору 002 и застрять внутри фильтра 003.
Термин "исключение по размеру", используемый здесь, также включает "физическое ограничение". На Фиг.1E, 1F и 1G показаны примеры, когда частицы не исключаются и физически не ограничиваются фильтром. Частица 001 может быть слишком маленькой, чтобы она была исключена порами 002 (Фиг.1Е). Частица 001 может также быть настолько деформируемой, что протискивается через пору 002 под действием движущей силы (Фиг.1F). На Фиг.1G частицы 001 перемещаются под действием касательной силы 004 так, что они не попадают в узкие части пор 002, которые, иначе, могут захватить частицы. Частицы на Фиг.1Е, 1F и 1G не считаются исключенными по размеру или физически ограниченными фильтром.
Термин "фильтрация", используемый здесь, обычно включает (без ограничения) сепарацию частиц, фракционирование, изолирование частиц, промывку, концентрирование, обогащение, очистку и/или буферный обмен в устройстве сепарации частиц с использованием фильтра или без его использования. Термин "фильтрация" также используется в отношении частичного или полного удаления или удержания одной или нескольких популяций частиц. Термин "фильтрация", используемый здесь, также включает специфические применения, такие как сепарация клеток, изолирование стволовых клеток, лейкоредукция, изолирование лейкоцитов, изолирование раковых клеток, снижение объема пуповинной крови, скимминг плазмы и генерирование стромальных васкулярных фракций (СВФ).
Термин "фильтр", используемый здесь, включает (без ограничения) структуру, включающую множество отверстий и проходов для жидкости, называемых "порами". Термин "пора", используемый здесь, включает отверстие или проход для жидкости, например, на фильтре или в нем. Форма поперечного сечения поры может быть (без ограничения) круговой, прямоугольной, круглой, многоугольной, неправильной, длинной или узкой, или щелевидной. Термин "пора", используемый здесь, включает (без ограничения) пространство между столбиками. Одним из вариантов воплощения поры по настоящему изобретению является пространство между двумя прилегающими столбиками в жидкостном канале. Другим вариантом воплощения "поры" является зазор между плотинной структурой и потолком жидкостного канала.
Фильтр может использоваться для частичного или полного обеспечения прохождения определенных частиц и/или запрета прохода, или снижения потока других частиц. Используемый здесь термин "фильтры" не ограничивается ситами, в которых частицы блокируются или сепарируются при помощи исключения по размеру. Один из вариантов воплощения фильтра по настоящему описанию включает физическую структуру, включающую препятствия и поры. Другой вариант воплощения фильтра включает физическую структуру, разделяющую частицы при помощи бифуркационных потоков и пор, которые больше частиц ретентата. Еще один вариант воплощения фильтра включает физическую структуру, удерживающую частицы, меньшие отверстий пор физической структуры, при помощи гидродинамических сил. Еще одним вариантом воплощения фильтра является гидрофильная структура на гидрофобной поверхности для создания "пор" или путей прохода жидкости для водных растворов.
Термин "фильтровать", используемый здесь, означает выполнение фильтрации при помощи фильтра.
Термин "ретентат", используемый здесь, включает частицы, удерживаемые фильтром или которые не проходят через фильтр. Термин "ретентат", используемый здесь, может также включать текучую среду, содержащую задержанные частицы. Термин "ретентат", используемый здесь, может также касаться текучей среды и выходной фазы частиц, включающей частицы, задержанные фильтром в варианте воплощения по настоящему изобретению. Термин "ретентат", используемый здесь, может также касаться выходной фазы частиц, включающей нужные частицы, полученные с использованием устройства сепарации, которое может включать или не включать фильтрующую структуру.
Термин "фильтрат", используемый здесь, включает частицы, проходящие через фильтр. Термин "фильтрат", используемый здесь, может также включать текучую среду, содержащую частицы, прошедшие через фильтр. Термин "фильтрат", используемый здесь, может также касаться текучей среды и выходной фазы частиц, включающей частицы, прошедшие через фильтр в варианте воплощения по настоящему изобретению. Термин "фильтрат", используемый здесь, может также касаться выходной фазы текучей среды, в которой нужные частицы частично или полностью удалены при помощи устройства сепарации, которое может включать или не включать фильтрующую структуру.
Термин "подаваемое вещество", используемый здесь, включает частицы, которые должны пройти процесс фильтрации, или частицы, поступающие в устройство фильтрации. Термин "подаваемое вещество" может также включать текучую среду, содержащую частицы, которые должны пройти процесс фильтрации. Термин "подаваемое вещество", используемый здесь, может включать (без ограничения) частицы, кровь, пуповинную кровь, сыворотку, жировые ткани, переваренные жировые ткани, стромальные васкулярные фракции, амниотические жидкости, менструальную кровь, церебральные спинальные жидкости, молоко, костный мозг, мочу и прочие жидкости тела.
Термин "процент удержания" частицы, используемый здесь, касается вероятности удержания частицы фильтром, входящим в состав устройства. Термин "процент удержания" популяции частиц, используемый здесь, касается пропорции популяции частиц, собираемой устройством в виде ретентата. Термин "процент удержания" текучей среды, используемый здесь, также касается пропорции текучей среды, собираемой устройством в виде ретентата. Устройство по настоящему описанию может включать фильтр, фильтрующий модуль, фильтрующий элемент или систему фильтрации. Например, "процент удержания" в основном однородной популяции частиц можно рассчитать как отношение количества частиц в полученном в результате ретентате и количества частиц в подаваемом веществе, которые обрабатываются. Процент удержания определенной популяции частиц может касаться пропорции такой популяции в подаваемом веществе, собираемом в виде ретентата в процессе фильтрации. Термин "процент удержания" может также называться "выход восстановления" или "переброс".
Термин "физический размер пор", используемый здесь, обозначает размер физического промежутка поры. На практике "физический размер поры" может быть, по сути, измерен как максимальный диаметр недеформируемой сферы, например, полимерной микросферы, которая может пройти через пору без существенного физического ограничения или исключения по размеру в системах фильтрации с "глухим концом". Например, пора, включающая промежуток между двумя столбиками, находящимися на расстоянии 10 мкм друг от друга в микрожидкостном канале глубиной 50 мкм, имеет физический размер поры 10 мкм. Аналогичным образом пора, включающая круговое отверстие диаметром 5 мкм в мембране, имеет физический размер поры 5 мкм. Если пора включает щель, физический размер поры в основном соответствует ширине щели. Фильтрация с глухим концом подробно описана в следующем литературном источнике: Zeman, L.J. et al. "Microfiltration and Ultrafiltration" Marcel Dekker, Inc., ISBN 0-8247-9735-3, стр.328-331 (1996), раскрытое описание фильтрации с глухим концом по которому включено в настоящий документ путем ссылки.
а
Термин "эффективный размер поры", используемый здесь, обозначает минимальный диаметр недеформируемой сферы, например полимерной микросферы, которая в основном может быть задержана порой в условиях потока. Эффективный размер пор можно измерить и определить экспериментально. Например, исходный процент удержания поры можно установить с использованием небольших недеформируемых сфер, которые в основном отслеживают пути потоков при прохождении через пору в соответствующих условиях потока без исключения по потоку. Большие недеформируемые сферы могут удерживаться за счет исключения по потоку порой с более высоким процентом удержания, чем исходный, в основном при тех же рабочих условиях. Диаметр наименьшей недеформируемой сферы, которая может быть удержана при существенно более высоком проценте удержания, чем исходный, например, на 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 98%, 99% или 100% больше, чем исходный, называется "эффективным размером поры". При измерении эффективного размера поры предпочтительно, чтобы используемые частицы имели следующие характеристики: () частицы в основном сферичны; (b) частицы в основном недеформируемые и твердые; (с) частицы взвешены в суспензиях в основном с одной частицей; (d) суспензия частицы разбавлена, и в основном отсутствует взаимодействие между частицами; (е) частицы в основном не оседают в течение соответствующего периода времени; (f) частицы в основном не прилипают к жидкостному каналу или поверхностям фильтра и не засоряют их; и (g) частицы не взаимодействуют друг с другом или жидкостным каналом, поверхностями фильтра или порами под действием электрического заряда, залипания, сродства или магнитных сил. Подразумевается, что перечисленные выше характеристики частиц не следует рассматривать как ограничивающие.
а
Термин "размер удержания" устройства, используемый здесь, обозначает минимальный диаметр недеформируемой сферы, например полимерной микросферы, процент удержания которой существенно выше, например, на 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 98%, 99% или 100%, чем процент удержания текучей среды, обработанной с использованием устройства в основном в тех же рабочих условиях. Размер удержания устройства можно измерить и определить экспериментально. Например, процент удержания текучей среды можно установить как исходный уровень при помощи небольших недеформируемых сфер, которые в основном отслеживают движение потока при ряде рабочих условий. Большие недеформируемые сферы, смешанные в текучей среде, могут иметь больший процент удержания, чем исходный, в основном при тех же рабочих условиях. Диаметр наименьшей недеформируемой сферы, имеющей существенно более высокий процент удержания, чем исходный, например, примерно на 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 98%, 99% или 100% больше, чем исходный, характеризуется как "размер удержания" устройства. Устройство по настоящему описанию может включать фильтр, фильтрующий модуль, фильтрующий элемент или систему фильтрации. При измерении размера удержания используемые частицы могут иметь следующие характеристики: () частицы в основном сферичны; (b) частицы в основном недеформируемые и твердые; (с) частицы взвешены в суспензиях в основном с одной частицей; (d) суспензия частицы разбавлена, и в основном отсутствует взаимодействие между частицами; (е) частицы в основном не оседают в течение соответствующего периода времени; (f) частицы в основном не пристают к жидкостному каналу или поверхностям фильтра и не засоряют их; и (g) частицы не взаимодействуют друг с другом или жидкостным каналом, поверхностями фильтра или порами под действием электрического заряда, залипания, сродства или магнитных сил. Подразумевается, что перечисленные выше характеристики частиц не следует рассматривать как ограничивающие.
Термин "исключение по потоку", используемый здесь, касается использования условий потока текучей среды вокруг поры для достижения эффективного размера поры, существенно меньшей физического размера поры. Термин "исключение по потоку", используемый здесь, также касается использования конфигураций потока текучей среды вокруг фильтра для достижения размера удержания существенно меньше физического размера пор, образующих фильтр.
Предполагается, что приведенные выше определения будут передавать сущность настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие.
Устройство фильтрации частиц
а
Аспекты и варианты воплощения настоящего изобретения предусматривают устройство для фильтрации частиц, включающее () первую проточную камеру, имеющую по меньшей мере один вход и по меньшей мере один выход; (b) вторую проточную камеру, имеющую по меньшей мере один выход; и (с) фильтр, содержащий множество пор, например по меньшей мере 10 пор. Здесь фильтр располагается между первой проточной камерой и второй проточной камерой и имеет физический размер пор примерно между 10 нм и 10 мм. Первая проточная камера и вторая проточная камера имеют такую конфигурацию, что эффективный размер пор фильтра существенно меньше, например примерно до 95%, чем физический размер пор. Устройство может быть изготовлено из таких материалов как, например, кремний, стекло или пластмасса. Некоторые варианты воплощения могут быть сконструированы так, что частицы не будут встречать на своем пути никаких острых краев, тем самым снижая повреждение.
Устройство фильтрации частиц с аспектами и вариантами воплощения по настоящему изобретению может иметь различную конфигурацию. В некоторых вариантах воплощения первая проточная камера имеет по меньшей мере один вход, который может использоваться для ввода текучей среды-носителя. Другие варианты воплощения также включают второй фильтр и третью проточную камеру, причем второй фильтр располагается между указанной первой проточной камерой и указанной третьей проточной камерой, а указанная третья проточная камера имеет по меньшей мере один выход. Другие варианты воплощения включают второй фильтр и третью проточную камеру, имеющую по меньшей мере один выход, так, что второй фильтр располагается между второй проточной камерой и третьей проточной камерой.
2
3
4
5
6
7
8
10
12
15
В некоторых вариантах воплощения частицы перемещаются через устройство при помощи по меньшей мере одного из следующего: потока текучей среды, гидродинамического потока, падения давления, гидродинамического давления, источника давления, вакуума, высоты напора, силы тяжести, центробежной силы, электрического поля, электрофоретического поля, электрокинетической силы, электроосмотической силы, под действием капилляров или комбинации перечисленного. В некоторых вариантах воплощения частицы (далее - частицы подаваемого вещества) проходят через устройство или обрабатываются устройством на скорости по меньшей мере примерно 100 частиц подаваемого вещества, например, по меньшей мере 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10 или 10 в секунду. В некоторых вариантах воплощения устройство имеет объем удерживания меньше 500 нл, 200 нл, 100 нл, 50 нл, 20 нл или 10 нл. В некоторых вариантах воплощения частицы подвергаются сдвиговому напряжению, не повреждающему частицы.
Варианты воплощения фильтра можно сформировать различными способами. В некоторых вариантах воплощения фильтр имеет один или несколько рядов столбиков или выступов. Столбики или выступы могут иметь различные формы и размеры. В других вариантах воплощения имеется по меньшей мере два ряда столбиков или выступов. В других вариантах воплощения изобретения предусмотрен фильтр, сформированный мембраной, включающей поры. В других вариантах воплощения изобретения предусмотрен фильтр, сформированный из сетчатого фильтра. В некоторых вариантах воплощения фильтр сконструирован так, что частицы не встречают острых кромок, так, что потенциальная опасность повреждения частиц снижена или устранена. Это может быть важно, когда частицы являются живыми или апоптическими клетками.
В некоторых вариантах воплощения фильтр включает поры, эффективный размер которых меньше их физического размера по меньшей мере примерно на 0,5 мкм. В других вариантах воплощения эффективный размер пор на 95% меньше физического размера пор. В других вариантах воплощения эффективный размер пор может быть существенно меньше физического размера пор, например, эффективный размер пор составляет примерно 75%, примерно 60%, примерно 50%, примерно 30%, примерно 10% или примерно 5% физического размера пор. В других вариантах воплощения размер удержания может быть существенно меньше физического размера пор, например, эффективный размер пор может составлять примерно 90%, примерно 75%, примерно 60%, примерно 50%, примерно 30%, примерно 10% или примерно 5% физического размера пор. В других вариантах воплощения частица встречает не более примерно 5000 пор при ее прохождении через устройство.
Аспекты и варианты воплощения настоящего изобретения могут использоваться для фильтрации, сепарации, фракционирования, обработки, обогащения или изолирования многих типов частиц, таких как простые или сложные осадки, поврежденные частицы или загрязняющие тяжелые металлы, которые можно найти в сточных водах и различных загрязняющих веществах, находящихся во встречающихся в природе или синтезированных текучих средах, таких как масла, биотопливо и т.п. Кроме того, некоторые аспекты и варианты воплощения изобретения могут использоваться для клинических целей для фильтрации многих различных типов клеток, таких как здоровые, больные, растущие, умирающие или мертвые. Примерами типов клеток являются клетки крови, стволовые клетки, гематопоэтические стволовые клетки, клетки-предшественницы, мезенхимные стволовые клетки, жировые стволовые клетки, клетки CD34+, опухолевые клетки, клетки костного мозга, клетки пуповинной крови, лимфоциты, лейкоциты, раковые клетки, клетки церебральной спинальной жидкости, клетки амниотической жидкости, стволовые клетки вартонового студня, эукариотические клетки, прокариотические клетки, животные клетки, клетки стромальной васкулярной фракции, производные клетки пуповины, печеночные клетки, нервные клетки и иммунные клетки. К другим типам клеток относятся бактериальные клетки, дрожжевые клетки и идиобласты.
Аспекты и варианты воплощения настоящего изобретения могут использоваться для обработки, фильтрации, сепарации и фракционирования многих типов текучих сред, таких как кровь, пуповинная кровь, сыворотка, жировая ткань, переваренная жировая ткань, стромальные васкулярные фракции, амниотические жидкости, менструальная кровь, церебральные спинальные жидкости, молоко, костный мозг и моча.
Аспекты и варианты воплощения настоящего изобретения также включают способы фильтрации частиц с использованием устройств, одно или несколько из которых описаны выше. В некоторых вариантах воплощения способа частицы подаваемого вещества вводятся в первую проточную камеру устройства через вход(ы), и к частицам прикладывается движущая сила для их перемещения через устройство. Частицы ретентата собирают с выхода(ов) первой проточной камеры, а частицы фильтрата собирают с выходов второй и/или третьей проточной камеры. В некоторых вариантах воплощения текучая среда-носитель вводится в первую проточную камеру устройства по меньшей мере через один вход.
Принципы исключения по потоку
Фильтрация может осуществляться с использованием бифуркации потока вместо исключения по размеру. В частности, малые частицы могут удерживаться большими порами фильтра при определенной организации потока. Поскольку малые частицы исключаются и не поступают в большую пору под действием потока, здесь этот эффект называется "исключение по потоку". Эффект исключения по потоку был обнаружен еще в 1921 году в микроциркуляции, т.е. потоке крови в мелких кровеносных сосудах (Krogh, A. "Studies on the Physiology of Capillaries: II. The Reactions to Local Stimuli of the Blood-vessels in the Skin and Web of the Frog" J. Physiol. 55(5-6): 412-422 (1921); Fahraeus, R. "The Suspension Stability of the Blood" Physiological Reviews 9: 241-274 (1929). Когда малый кровеносный сосуд разветвляется на два сосуда, клетки крови могут предпочтительно входить в сосуд с более высокой скоростью потока, даже если нет физического ограничения или исключения по размеру, которые бы мешали клеткам входить в сосуд с низкой скоростью потока, если бы характер потока был изменен в пользу исключения по размеру (Фиг.2А). Этот эффект возникает из-за сложных гидродинамических взаимодействий и сил между клетками, сосудами и потоком крови. Исключение по потоку наиболее четко выражено, когда скорости потока в двух ответвлениях отличаются существенно. Кроме того, ядросодержащие клетки, кажется, подвергаются более выраженному исключению по потоку, чем энуклеированные клетки, например красные кровяные тельца и тромбоциты.
Были разработаны различные теории в попытке объяснить наблюдаемый в микрокапиллярах эффект исключения по потоку (Krogh, A. "Studies on the Physiology of Capillaries: II. The Reactions to Local Stimuli of the Blood-vessels in the Skin and Web of the Frog" J Physiol 55(5-6): 412-422 (1921); Fahraeus, R. "The Suspension Stability of the Blood" Physiological Reviews 9: 241-274 (1929); Svanes, K. et al. "Variations in Small Blood Vessel Hematocrits Produced in Hypothermic Rats by Micro-Occlusion" Microvasc Res. 1: 210-220 (1968); Yen, R.T. et al. "Model Experiments on Apparent Blood Velocity and Hematocrit in Pulmonary Alveoli" J. Appl. Physiol. 35: 510-517 (1973); Mayrovitz, H.N. et al. "Leukocyte distribution to arteriolar branches: dependence on microvascular blood flow" Microvasc Res. 29(3): 282-294 (1985).
Определенное понимание можно получить, если рассмотреть уравнение Навье-Стокса, описывающее гидродинамическое поведение несжимаемых ньютоновских текучих сред:
<mrow><mi>ρ</mi><mrow><mo>(</mo><mrow><mfrac><mrow><mo>∂</mo><mi>v</mi></mrow><mrow><mo>∂</mo><mi>t</mi></mrow></mfrac><mo>+</mo><mi>v</mi><mo>⋅</mo><mo>∇</mo></mrow><mo>)</mo></mrow><mo>=</mo><mo>−</mo><mo>∇</mo><mi>p</mi><mo>+</mo><mi>μ</mi><msup><mo>∇</mo><mn>2</mn></msup><mi>v</mi><mo>+</mo><mi>f</mi></mrow>
а
где ρ - плотность текучей среды, v - скорость текучей среды, р - давление, µ -вязкость, a f - внешние массовые силы, такие как сила тяжести. Рассмотрим отдельную клетку, перемещающуюся через ответвляющийся сосуд, показанный на Фиг.2А. Для анализа миграционного пути необходимо рассчитать точное распределение потока текучей среды и силы, воздействующие на клетку. Часто это чрезвычайно трудная задача, требующая интенсивных компьютерных расчетов, даже для отдельной клетки. Проблема становится гораздо сложнее, когда множество клеток взаимодействуют друг с другом, как в случае потока циркулирующей крови. Вероятно, самый простой способ понять принцип исключения по потоку - это применить принцип Бернулли, согласно которому рост скорости текучей среды происходит одновременно со снижением давления. Из-за различия в скорости потока между двумя ответвлениями сосудов клетка подвергается воздействию подъемной силы в направлении более высоких скоростей потока (Фиг.2В). Эта подъемная сила мешает или препятствует вхождению клетки в сосуд с меньшей скоростью потока, даже если сосуд может быть физически достаточно большим, чтобы обеспечить прохождение клетки через него. Таким образом, происходит исключение по потоку. Очевидно, что описанная выше теория может быть чрезмерным упрощением по следующим причинам: () задействованные текучие среды, такие как кровь и костный мозг, могут быть не ньютоновскими; (b) концентрации частиц настолько высокие, что взаимодействие между частицами может быть основным фактором, контролирующим перемещение частиц; (с) задействованные частицы являются деформируемыми и гибкими в ответ на гидродинамические силы.
Не придерживаясь никакого конкретного механизма или теории, аспекты и варианты воплощения настоящего изобретения можно понять согласно принципам тангенциальной поточной фильтрации и исключения по потоку. В одном варианте воплощения настоящего изобретения фильтр с большими порами используется для удержания относительно маленьких частиц в отличие от традиционной тангенциальной поточной фильтрации, при которой малые поры используются для удержания больших частиц путем исключения по размеру. Значительным преимуществом некоторых вариантов воплощения настоящего изобретения является существенное снижение или устранение повреждения частиц и закупорки фильтра, что дает возможность обрабатывать деформируемые и/или хрупкие частицы с высокой пропускной способностью. Как показано на Фиг.3, в вариантах воплощения настоящего изобретения может использоваться тангенциальный поток 301, фильтр 306, имеющий расположение столбиков 302 и пор 304, и проточная камера 303 (Фиг.3А). В некоторых вариантах воплощения проточная камера 303 может постепенно расширяться вдоль направления потока текучей среды так, что в рабочих условиях только небольшая фракция тангенциального потока 301 втягивается через поры 304. Скорость, с которой проточная камера 303 расширяется, а также геометрия фильтра определяют объем потока, втягиваемого через каждую пору 304. Чем с меньшей скоростью расширяется камера 303, тем меньший объем потока будет втянут через поры.
В условиях ламинарного потока (Фиг.3А) тангенциальный поток 301 раздваивается вокруг каждого столбика 302, почти как поток крови разделяется вокруг ответвляющихся кровеносных сосудов в микроциркуляции. Если ответвляющийся поток 305, входящий в пору 304, имеет значительно меньшую скорость потока, чем тангенциальный поток 301, может произойти эффект исключения по потоку. Частица 321, протекающая возле столбика 302, может войти или не войти в пору 304, в зависимости от силы исключения по потоку, воздействующей на частицу (Фиг.3В). Поскольку различные типы клеток характеризуются различными эффектами исключения по потоку, и так как исключение по потоку зависит от скорости потока через пору, можно создать условия исключения по потоку, полезные для разделения определенных типов клеток путем управления скоростью потока в порах 304. Например, можно создать постепенно расширяющуюся проточную камеру 303 для создания условия раздваивания потока, оказывающего сильное исключение по потоку на лимфоциты 311 и слабое исключение по потоку на красные кровяные тельца 312 (Фиг.3С). В результате лимфоциты 311 задерживаются фильтром 306, а красные кровяные тельца 312 проходят через фильтр 306. Исключение по потоку используется в качестве основы фильтрации частиц в некоторых аспектах и вариантах воплощения настоящего изобретения.
В некоторых аспектах и вариантах воплощения настоящего изобретения объемная скорость потока через пору значительно ниже скорости тангенциального потока. При помощи компьютерного расчета гидродинамики одной твердой сферической частицы в ламинарном потоке в условиях низкого числа Рейнольдса можно для определенной конструкции оценить эффективный размер пор как функцию объема потока, втягиваемого через пору. На Фиг.4 показаны результаты такого расчета для варианта воплощения, показанного на Фиг.5А, если принять глубину проточной камеры равной 30 мкм, ширину входа подачи равной 110 мкм, диаметр столбика равным 30 мкм, а расстояние между центрами прилегающих столбиков равным 40 мкм, в результате чего физический размер пор составляет примерно 10 мкм. Когда скорость потока через каждую пору составляет около 0,4% скорости тангенциального потока на входе подачи 502, эффективный размер поры равен примерно 3,8 мкм, что значительно меньше физического размера поры 10 мкм. Однако следует отметить, что когда объемная скорость потока через каждую пору составляет около 1,6% тангенциальной объемной скорости потока на входе, эффективный размер пор становится примерно таким же, как и физический размер пор. Когда скорость потока через каждую пору больше 1,6% скорости тангенциального потока на входе, исключение по размеру становится основным фактором сепарации частиц, а устройство становится традиционным устройством фильтрации. В отличие от традиционной тангенциальной поточной фильтрации, в которой применяется трансмембранное давление для достижения сепарации на основе исключения по размеру, в настоящем изобретении применяется распределение скорости потока вокруг пор для достижения сепарации на основе исключения по потоку.
Хотя описанный выше компьютерный расчет дает возможность понять исключение по потоку в идеализированных и сильно упрощенных условиях (одиночная, твердая, сферическая частица в ньютоновском потоке без броуновского движения), процесс фильтрации частиц подаваемого вещества в настоящем раскрытии может быть в основном стохастическим, описываемым вероятностью и может не быть детерминистическим.
Взаимодействия между частицами, деформации частиц и броуновское движение, среди прочих факторов, могут изменять характер потока и силы, воздействующие на частицы, приводя к тому, что исключение по потоку является стохастическим. Этот стохастический характер исключения по потоку может быть заметным и очень существенным, особенно когда частицы подаваемого вещества включают сложные частицы и текучие среды, например кровь, пуповинную кровь, костный мозг, стромальную васкулярную фракцию и т.п. Для оценки сложности таких реальных примеров рассмотрим пуповинную кровь. Типовой образец пуповинной крови содержит около 4 миллиардов красных кровяных телец, 10 миллионов белых кровяных телец и 200 миллионов тромбоцитов на миллилитр. Эти клетки составляют 40% объема крови и деформируются при взаимодействии друг с другом. Кроме того, эти клетки оседают с различной скоростью под действием силы тяжести. Если не провести значительного разбавления образца, например, в соотношении 1 к 1000, 10000, 100000 и более, взаимодействия между частицами могут привести к тому, что клетки крови будут перемещаться стохастически, и это может сделать практически невозможным определение того, будет ли задержана определенная клетка с использованием варианта воплощения настоящего изобретения.
Физический размер пор и эффективный размер пор
Одним из методов описания фильтра и размера его пор является измерение удержания частиц при помощи жестких сфер (Zeman, L.J. et al. "Microfiltration and Ultrafiltration" Marcel Dekker, Inc., ISBN 0-8247-9735-3, p.265-274 (1996)). Примеры измерений удержания частиц, раскрытые в указанной публикации, включены в настоящее описание путем ссылки. Примерами частиц, которые могут использоваться для таких измерений, являются латексные шарики и полимерные микросферы. "Физический размер пор", "эффективный размер пор" и "размер удержания" можно измерить и охарактеризовать с использованием описанных выше методик. При помощи твердых сфер в качестве стандарта можно охарактеризовать и сравнить различные фильтры и устройства независимо от их назначения. Например, традиционное устройство фильтрации для удаления бактерий из воды можно сравнить с устройством фильтрации крови, хотя бактерии могут иметь очень разные размеры, формы, деформируемость, заряд, концентрацию и другие характеристики, отличающиеся от клеток крови.
В традиционной фильтрации с исключением по размеру эффективный размер поры больше или, по сути, равен физическому размеру пор, а размер удержания фильтра также больше или, по сути, равен физическому размеру пор. В отличие от этого в некоторых аспектах и вариантах воплощения настоящего изобретения эффективный размер поры меньше или существенно меньше физического размера поры при использовании исключения по потоку (Фиг.4).
Тогда как устройства можно охарактеризовать и сравнить с использованием стандартных твердых сфер, фактические варианты воплощения настоящего изобретения для биологических образцов могут быть эмпирически оптимизированы для каждого конкретного применения. Частица, которая существенно больше эффективного размера поры, все еще может пройти через фильтр из-за деформирования частицы или стохастического характера этого процесса. Это явление здесь называется "утечкой". В традиционном фильтре, в котором эффективный размер поры больше или, по сути, равен физическому размеру поры, частицы имеют тенденцию засорять и закупоривать фильтр, когда происходит утечка. Когда деформируемые и хрупкие частицы просачиваются через традиционный фильтр, частицы могут подвергаться большим сдвиговым напряжениям и быть повреждены или лизированы, что приводит к загрязнению и закупорке фильтрующего каскада. Это - серьезная проблема приложений, в которых используются биологические образцы и клетки.
Некоторые аспекты и варианты воплощения настоящего изобретения включают способы и устройства, в которых используются поры существенно больше эффективного размера пор, что существенно снижает загрязнение и закупорку фильтра или позволяет избежать их. Кроме того, в вариантах воплощения настоящего изобретения применяются низкие объемные скорости потока через поры как средства создания исключения по потоку. Комбинация больших пор и малой скорости потока снижает сдвиговое напряжение в порах и вокруг них, тем самым дополнительно снижая проблемы с загрязнением, закупоркой, активацией частиц и повреждением частиц.
МОДУЛИ, ЭЛЕМЕНТЫ И УСТРОЙСТВА ФИЛЬТРАЦИИ
Фильтрующий модуль
Еще одним вариантом воплощения настоящего изобретения является фильтрующий модуль, показанный на Фиг.5. Первая проточная камера 501 имеет вход 502 и выход 503. Частицы подаваемого вещества, т.е. частицы, которые должны быть обработаны путем фильтрации, поступают на вход 502 и пропускаются через первую проточную камеру 501 от входа в направлении выхода при помощи движущей силы. Первая проточная камера 501 отделена от второй проточной камеры 504 фильтром 508, состоящим из ряда столбиков 505, и находится с ней в жидкостном соединении. Промежуток между столбиками образует поры 506 фильтра 508. Вторая проточная камера 504 устроена так, что втягивает небольшие объемы потоков через поры 506 фильтра 508, принимает частицы фильтрата и собирает частицы фильтрата через выход фильтрата 507. Скорости потока через каждую пору 506 рассчитаны так, что они составляют малую долю, например 1/10, 1/20, 1/30, 1/50, 1/100, 1/200, 1/300, 1/500, 1/1000, 1/2000, 1/5000, 1/10000, 1/20000, 1/50000 или 1/100000, скоростей потока на входе 502 первой проточной камеры 501 для облегчения исключения по потоку. В некоторых вариантах воплощения поры 506 имеют такой размер, что физический размер пор существенно больше эффективного размера пор. Некоторые варианты воплощения фильтра 508 могут иметь примерно от 10 до 50000 пор 506, например 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 10000 или 50000. Для удобства дальнейшего рассмотрения первая проточная камера 501, куда мигрируют частицы подаваемого вещества и ретентата, называется здесь "камерой ретентата", а вторая проточная камера 504, в которую мигрируют частицы фильтрата, - "камерой фильтрата".
Поток частиц в рамках различных вариантов воплощения может быть создан с использованием потока текучей среды, давления вытеснения, вакуума, высоты напора, силы тяжести, центробежной силы, магнитной силы, капиллярного действия или комбинации перечисленного. Поток частиц может быть также создан с использованием электрического поля, электрофоретического поля, диэлектрофоретического поля, электроосмотической силы, электрокинетической силы или комбинации перечисленных сил. Эти поля или силы могут перемещать частицы и могут перемещать или не перемещать текучие среды, в которых содержатся частицы. В некоторых случаях эти поля или силы могут перемещать частицы без перемещения текучих сред, в которых содержатся частицы. Например, при отсутствии электрокинетического потока электрофоретическое поле может перемещать заряженные частицы через варианты воплощения устройства по настоящему изобретению без создания потока текучей среды. В случае силы тяжести частицы, плотность которых больше плотности текучей среды, могут оседать через текучую среду. В других случаях текучая среда может течь в обратном направлении потоку частиц. Очевидно, что исключения по потоку в этих примерах не происходит. Однако движущие силы внутри устройства могут создать их собственные эффекты исключения, почти как это происходит в потоке текучей среды. Поэтому для перемещения частиц и достижения эффектов фильтрации, не основанных на исключении по размеру или физическом ограничении, могут также использоваться сила тяжести, центробежные силы, электрические поля, электрофоретические поля и электрокинетические силы.
В некоторых вариантах воплощения столбики 505 могут иметь высоту, подобную их ширине, так, что их отношение размеров близко к 1, например 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2 или 1,3, как показано на Фиг.5В и 5С. В качестве альтернативы столбики 505 могут иметь высоту меньше их ширины, так, что их отношение размеров существенно меньше 1, например 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 или 0,6, как показано на Фиг.5D, или высота больше ширины, так, что отношение их размеров существенно больше 1, например 1,5, 2, 3, 5, 8, 10, 20, 100, 500, 2000 или 10000, как показано на Фиг.5Е. Преимуществом конструкции столбиков с высоким отношением размеров является более высокий объем и пропускная способность, тогда как преимуществом столбиков с низким отношением размеров является простота изготовления. Столбики 505 могут становиться постепенно более узкими или конусообразными (Фиг.5Е). Угол конусности может быть ближе к 90 градусам, например 80, 85, 87, 88 или 89 градусов. Конусообразные столбики могут облегчить извлечение из формы и сделать изготовление с использованием инжекционного формования, тиснения, мягкой литографии или других методов репликации менее сложным.
В некоторых вариантах воплощения боковые стенки камеры ретентата 50 и камеры фильтрата 51 приблизительно параллельны друг другу (Фиг.5А). В некоторых вариантах воплощения камера ретентата 501 может иметь в основном постоянную ширину, может постепенно становиться шире или постепенно уже (Фиг.6). Изменение ширины камеры ретентата 501 может изменить скорость потока в камере 501 и результирующее сдвиговое напряжение. В варианте воплощения, показанном на Фиг.6В, поскольку подаваемые жидкости втягиваются в камеру фильтрата 504, скорость потока в камере ретентата 501 постепенно становится меньше по мере перемещения текучих сред в направлении выхода 503. В отличие от этого в варианте воплощения, показанном на Фиг.6А, текучие среды в камере ретентата 501 могут ускоряться в направлении выхода 503, по мере того как площадь поперечного сечения камеры ретентата 501 и камеры фильтрата 504 становится меньше. Степень, с которой камера фильтрата 504 становится шире, может в значительной мере определять объем потока, втягиваемого через поры 506, и может быть оптимизирована к желаемому эффективному размеру пор.
В другом варианте воплощения настоящего изобретения камера ретентата может постепенно сужаться со стороны входа в направлении выхода ретентата, а камера фильтрата может постепенно расширяться в направлении выхода фильтрата. В приложениях, в которых желательно иметь высокую скорость потока и низкое сдвиговое напряжение, может быть предпочтительно, чтобы камера ретентата была широкой на стороне входа и узкой на стороне выхода. Такая конфигурация может поддерживать низкую скорость потока на входе и низкое сдвиговое напряжение по всей камере ретентата. В другом варианте воплощения настоящего изобретения камера ретентата может иметь конфигурацию, в которой она постепенно сужается от стороны входа в направлении выхода ретентата и поддерживает среднюю скорость потока в камере ретентата в основном постоянной, по мере того как текучие среды протекают от входа в направлении выхода. В другом варианте воплощения настоящего изобретения камера ретентата и камера фильтрата могут иметь конфигурацию, в которой средняя скорость потока в камере ретентата остается в основном постоянной, по мере того как текучие среды протекают от входа в направлении выхода.
В другом варианте воплощения настоящего изобретения фильтр состоит из столбиков, расположенных по кривой (Фиг.7). "Искривление" фильтра может придать фильтру специфические характеристики. Иными словами, каждая пора может иметь отличающийся эффективный размер пор для выполнения определенных требований к фильтрации. В варианте воплощения изобретения, показанном на Фиг.7А, фильтр 701 первоначально формирует малый угол с боковой стенкой 710 камеры фильтрата 711, что позволяет камере фильтрата втягивать очень небольшой объем потока через фильтр 701. Угол между фильтром 702 и боковой стенкой 710 затем становится больше для увеличения объема потока, втягиваемого через поры, что дает в результате больший эффективный размер пор. Угол между фильтром 703 и боковой стенкой 710 может становиться меньше в направлении выхода фильтрата 720, тем самым снижая объем потока, втягиваемого через поры. На Фиг.7В фильтр 704 состоит из столбиков, расположенных по кривой, предназначенных для сохранения определенных характеристик фильтра. Эффективный размер каждой поры как функция ее положения со стороны входа 722 к стороне выхода 721 количественно проиллюстрирован на Фиг. 1С и Фиг.7D для вариантов воплощения, показанных на Фиг.7А и 7В, соответственно. Подразумевается, что могут использоваться другие расположения столбиков в зависимости от желаемых характеристик фильтра для определенного рассматриваемого приложения.
В другом варианте воплощения скорости потока через каждую пору могут быть, по сути, идентичными. В еще одном варианте воплощения скорости потока, втягиваемого через каждую пору, меньше или равны максимальной доле х скорости тангенциального потока, где х изменяется примерно от 1/5 примерно до 1/100000. Например, желательное значение х может быть 1/5, 1/10, 1/20, 1/50, 1/100, 1/200, 1/500, 1/1000, 1/2000, 1/5000, 1/10000, 1/20000, 1/50000 или 1/100 000. Пример этого варианта воплощения показан на Фиг.5. Фильтр включает примерно от 10 до 100000 столбиков, например 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 10000, 30000 или 100000 столбиков. Столбики и камера фильтрата имеют конфигурацию, в которой эффективный размер пор существенно меньше физического размера пор.
В еще одном другом варианте воплощения настоящего изобретения фильтр состоит из столбиков, имеющих равные промежутки между собой, как показано на Фиг.5, Фиг.6 и Фиг.7. В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения столбики имеют неодинаковые промежутки, как показано на Фиг.8. Для некоторых приложений можно выгодно изменить физические размеры пор, так, чтобы некоторые частицы могли пройти через физически большие поры. Столбики могут иметь разные формы поперечного сечения. К примерам желательных форм поперечного сечения относятся (без ограничения) те, которые показаны на Фиг.9, например круглая (Фиг.9А и 9В), овальная (Фиг.9С), эллиптическая (Фиг.9D), яйцеобразная (Фиг.9Е и 9F), форма крыла (Фиг.9G) и т.п. Фильтр также может включать столбики разных форм и/или размеров (Фиг.9Н). Для нежной сепарации хрупких частиц может быть предпочтительно, чтобы столбики не имели острых кромок, которые могут вступить в контакт с частицами. Острые кромки могут вскрыть, расколоть или лизировать хрупкие частицы. Хотя неострые поверхности столбиков могут быть предпочтительными во многих приложениях, требующих нежной фильтрации, можно также использовать прямоугольные, квадратные или многоугольные поперечные сечения столбиков, например, в случаях, когда повреждение частиц не является проблемой.
В другом варианте воплощения настоящего изобретения камера фильтрата 901 имеет волнистую боковую стенку 902, состоящую из чередующихся выпуклых и вогнутых частей (Фиг.9А), а период волнистой боковой стенки совпадает с межцентровым расстоянием пор 903. Волнистые боковые стенки могут помочь стабилизировать поток и сохранить низкие эффективные размеры пор.
Подразумевается, что в вариантах воплощения настоящего изобретения фильтр может состоять из столбиков различной формы и размера, расположенных равномерно или неравномерно по прямой линии или по кривой, чтобы добиться определенных характеристик фильтра.
В другом варианте воплощения настоящего изобретения камера фильтрата 504 мельче, чем камера ретентата 501 (Фиг.10). В этом варианте воплощения фильтр 508 включает смежную поверхность 512 и столбики 505. Камера фильтрата 504 может быть мельче, чем некоторые крупные частицы ретентата 321 (Фиг.10С). Однако, поскольку частицы ретентата 321 исключаются потоком от физических пор, по сути, они никогда не входят в мелкую фильтрационную камеру 504 и узкие части 571 пор (Фиг.10С). Следовательно, в этом варианте воплощения редко случаются пагубные явления, связанные с фильтрацией путем исключения по размеру. Этот дизайн снижает отношения размеров столбиков 505 без снижения площади и глубины фильтра и может сделать изготовление устройства простым и надежным.
В еще одном варианте воплощения фильтрующий модуль состоит из камеры ретентата 130, фильтра 131, включающего сетчатый фильтр, и камеры фильтрата 132, контролирующей потоки, проходящие через сетчатый фильтр 131 (Фиг.11А и Фиг.11В). Проточные камеры 130, 132 содержат слои 133, 134, имеющие выемки. Камера фильтрата 132 имеет постепенно углубляющуюся выемку в слое 134, предназначенную для втягивания небольших объемов потока через фильтр 131. Фильтр 131 располагается между слоем камеры ретентата 133 и слоем камеры фильтрата 134. Этот вариант воплощения позволяет иметь большую площадь фильтрации и позволяет добиться очень высокой производительности и пропускной способности. Вариация этого варианта воплощения включает пористый фильтрующий слой 131, расположенный между слоем камеры ретентата 133 и слоем камеры фильтрата 134 (Фиг.11С и 11D). Пористым фильтрующим слоем может быть, например, мембрана с трековым травлением или металлический лист с лазерной обработкой и т.п. Слои могут склеиваться, связываться или просто сжиматься между собой (Фиг.11С и Фиг.11D). Поры на фильтре 131 могут иметь равномерные промежутки, как показано на Фиг.11A-11D, или могут быть распределены в случайном порядке, как в случае с мембранными фильтрами с травлением треков излучения.
Описанные выше варианты воплощения настоящего изобретения могут быть полезны как устройства для концентрации частиц или для удаления популяции частиц ретентата из популяции частиц фильтрата. Тем не менее, в некоторых случаях может быть желательным обеднить популяцию фильтрата от популяции ретентата либо изолировать частицы ретентата в другой текучей среде.
Например, в некоторых случаях может быть желательно изолировать ядросодержащие клетки крови от цельной крови и удалить как можно больше ядросодержащих красных кровяных телец. Текучая среда-носитель 522 может вводиться в камеру ретентата 501 (Фиг.13). В одном варианте воплощения проточная камера ретентата 501 имеет по меньшей мере один вход потока носителя 521 в дополнение по меньшей мере к одному входу подачи 502. Здесь текучая среда-носитель 522 может быть инжектирована в камеру ретентата 501 и может образовать ламинарный поток 522 вдоль потока подаваемого вещества 523. Условия ламинарного потока могут привести к тому, что поток носителя 522 и поток подаваемого вещества 523 будут перемещаться рядом без конвективного перемешивания. Интерфейс между двумя потоками 522, 523 показан в виде пунктирной линии 524 на Фиг.13. Частицы ретентата 531 могут быть задержаны фильтром, состоящим из столбиков 505, и перемещаться от потока подаваемого вещества 523 в поток носителя 522. На выходе ретентата 503 частицы ретентата 531 находятся в потоке носителя 522, тем самым существенно избавляясь от популяции фильтрата. В зависимости от требований к желаемой чистоте скорости потока текучей среды-носителя могут быть меньше, равны или больше скоростей потока текучей среды ретентата. Подразумевается, что поток носителя может применяться аналогичным образом к любому из вариантов воплощения настоящего изобретения и не ограничивается каким-либо конкретным вариантом воплощения. Поток носителя может также вводиться для промывки, обработки или маркировки частиц ретентата. В некоторых вариантах воплощения для обработки частиц ретентата может вводиться больше одного потока носителя. Например, можно использовать некоторые варианты воплощения настоящего изобретения для маркировки и промывки клеток в непрерывном потоке. Вместе с потоком подаваемого вещества в виде первого потока носителя может вводиться раствор, содержащий метки или красители антител к специфичным клетками ретентата, а в качестве второго потока носителя, наряду с первым потоком носителя, может вводиться промывочный раствор. За счет исключения по потоку клетки ретентата могут мигрировать из потока подаваемого вещества в первый поток носителя, в котором клетки окрашены или помечены, а затем могут мигрировать из первого потока носителя во второй поток носителя, где клетки промываются. В камере ретентата может использоваться больше одного входа для ввода потоков носителя по любому из вариантов воплощения настоящего изобретения.
Двойной фильтрующий модуль
В некоторых вариантах воплощения можно комбинировать в основном идентичные фильтрующие модули в один "двойной фильтрующий модуль". В одном варианте воплощения два фильтрующих модуля могут образовывать зеркальные изображения по отношению друг к другу и совместно использовать одну камеру ретентата, образуя "двойной фильтрующий модуль" (Фиг.14А). Камера ретентата 501 может иметь по меньшей мере один вход 502 и один выход 503. Частицы подаваемого вещества могут поступить на вход 502 и могут быть перемещены через проточную камеру 501 в направлении выхода 503 при помощи, например, потока текучей среды, падения давления, гидродинамического давления, источника давления, вакуума, высоты напора, силы тяжести, центробежной силы, электрического поля, электрофоретического поля, электрокинетической силы, электроосмотической силы, под действием капилляров или комбинации перечисленного. Проточная камера ретентата 501 может быть отделена от каждой из двух проточных камер фильтрата 504 фильтром 508 и может располагаться симметрично по отношению к центральной линии 514. Варианты воплощения фильтра 508 могут иметь примерно от 10 до 100000 столбиков 505, например 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 10000, 20000 или 100000 столбиков. Промежутки между столбиками могут образовывать поры 506 фильтра 508. Проточные камеры фильтрата 504 могут иметь конструкцию, позволяющую втягивать небольшой объем потока через каждую пору 506 и удалять частицы фильтрата через выходы фильтрата 507. Скорость потока через каждую пору 506 может быть рассчитана так, что она составляет малую долю, например 1/10, 1/20, 1/30, 1/50, 1/100, 1/200, 1/300, 1/500, 1/1000, 1/2000, 1/5000, 1/10000, 1/20000, 1/50000 или 1/100000 скоростей потока, в проточной камере ретентата 501 для облегчения исключения по потоку.
В любом из вариантов воплощения двойного фильтрующего модуля камера ретентата может дополнительно включать вход потока носителя 521 (Фиг.14В). Поток носителя 522 может вводиться между двумя потоками подаваемого вещества 523 так, что частицы ретентата собираются в потоке носителя 522 на выходе ретентата 503. Этот вариант воплощения может обеспечить выход частиц ретентата высокой степени чистоты.
Другой вариант воплощения двойного фильтрующего модуля показан на Фиг.15, на которой два фильтрующих модуля образуют зеркальные изображения и совместно используют одну камеру фильтрата. Камера фильтрата 504, имеющая выход фильтрата 507, может располагаться между двумя камерами ретентата 501. Камера фильтрата 504 может втягивать небольшой объем потока через каждую пору 506 фильтров 508 для облегчения исключения по потоку. Поток подаваемого вещества может входить в камеру ретентата 501 через вход 502. Частицы ретентата могут собираться на выходах ретентата 503, а частицы фильтрата могут собираться на выходе фильтрата 507. Этот вариант воплощения может дополнительно включать по меньшей мере один вход потока носителя 521 (Фиг.15В). Потоки носителя 522 могут быть установлены вдоль потока подаваемого вещества 523 так, что частицы ретентата будут собираться в потоках носителя 522. Опять же, поток носителя увеличивает чистоту частиц ретентата.
Множественный фильтрующий модуль
Два двойных фильтрующих модуля могут дополнительно совместно использовать одну камеру ретентата или камеру фильтрата, образуя множественные фильтрующие модули (Фиг.16). В варианте воплощения, показанном на Фиг.16А, два двойных фильтрующих модуля (Фиг.14А) совместно используют камеру фильтрата и образуют множественный фильтрующий модуль, имеющий четыре фильтра в модуле. Кроме того, более двух двойных фильтрующих модулей также могут совместно использовать камеры ретентата или камеры фильтрата, образуя множественные фильтрующие модули (Фиг.16В). Конструкция двойного фильтрующего модуля может также комбинироваться с фильтрующим модулем, образуя множественный фильтрующий модуль, включающий три фильтра. Конструкция множественного фильтрующего модуля может также аналогичным образом комбинироваться с фильтрующим модулем.
Каскадный фильтрующий модуль
В некоторых вариантах воплощения можно последовательно соединить два и более фильтрующих модуля, двойных фильтрующих модуля или множественных фильтрующих модуля, образуя тем самым "каскадный фильтрующий модуль". В варианте воплощения, показанном на Фиг.17А, два, по сути, идентичных фильтрующих модуля 171, 172 соединены последовательно. Вход 177 второго модуля 172 имеет жидкостное соединение с выходами 503, 507 первого модуля 171. Частицы подаваемого вещества могут поступать на вход 502 первого модуля 171 и могут разделяться на ретентат и фильтрат первым фильтром 173. Когда устройство работает в условиях ламинарного потока, ретентат и фильтрат могут образовывать два расположенных рядом ламинарных потока без конвективного смешивания после сепарации. Когда два потока частиц поступают во второй модуль 172, фильтрат из первого модуля 171 может встретить второй фильтр 174, которым могут быть задержаны некоторые частицы. Ретентат каскадного фильтрующего модуля 170 может собираться на выходе 503. Фильтрат каскадного фильтрующего модуля 170 в целом может пройти через оба фильтра 173, 174 и может быть собран на выходе 507. Этот вариант воплощения увеличивает выход частиц ретентата, так как частицы, которые не могут быть задержаны первым фильтром 173, могут быть задержаны вторым фильтром 174. Аналогичным образом два и более двойных фильтрующих модуля могут быть расположены в последовательной комбинации, образуя каскадный фильтрующий модуль (Фиг.17В). Вход 177 второго модуля 172 имеет жидкостное соединение с выходами 503, 507 первого модуля 171. Подобным образом можно соединить больше двух двойных фильтрующих модулей. Можно создать последовательную комбинацию других конфигураций фильтров, таких как множественные фильтрующие модули, для образования каскадного фильтрующего модуля.
Подразумевается, что фильтрующие модули, двойные фильтрующие модули или множественные фильтрующие модули, соединенные последовательно для образования каскадного фильтрующего модуля, могут быть в основном идентичными или не быть таковыми, а также могут иметь или не иметь в основном идентичные эффективные размеры пор или размеры удержания. В любом из вариантов воплощения каскадного фильтрующего модуля камера ретентата может дополнительно включать вход потока носителя. На Фиг.17С показан вариант воплощения каскадного фильтрующего модуля, включающий два двойных фильтрующих модуля 171, 172. Двойной фильтрующий модуль 172 содержит вход потока носителя 175, который может включать канал и сквозное отверстие 176. На Фиг.17D показан вариант воплощения каскадного фильтрующего модуля, включающий два двойных фильтрующих модуля, содержащих два входа текучей среды-носителя 521, 175.
Могут комбинироваться различные фильтрующие модули, двойные фильтрующие модули или множественные фильтрующие модули с существенно отличным эффективным размером пор или размером удержания для образования каскадного фильтрующего фильтра, который может фракционировать подаваемое вещество на несколько фракций. В одном варианте воплощения, показанном на Фиг.18А, каскадный модуль 180 содержит первый фильтрующий модуль 181 и второй модуль 182. Первый модуль 181 включает первую камеру 501, имеющую вход 502 для подаваемого вещества и выход 503 для первого ретентата, далее именуемого "фракция 1". Первый фильтр 508 располагается между первой камерой 501 и второй камерой 504. Вторая камера может иметь конструкцию для втягивания небольшого объема потока через поры на первом фильтре 508 для облегчения исключения по потоку, и может получить фильтрат с первого фильтра в виде первого фильтрата. Выход фильтрата 183 первого модуля 181 имеет жидкостное соединение со входом 184 второго модуля 182. Второй модуль 182 содержит фильтр 509, который может удерживать субпопуляцию первого фильтрата, обозначаемую "фракция 2", которая собирается на выходе 510. Может использоваться третья камера 511 для приема фильтрата второго фильтра 509, которая также может втягивать небольшой объем потока через поры второго фильтра для облегчения исключения по потоку. Фильтрат второго фильтра 509 может выходить через выход 507 и далее в тексте именуется "фракция 3". Второй модуль 182 может иметь меньший размер удержания, чем первый модуль 181. Два модуля 181, 182 могут быть расположены так, чтобы снизить длину второй камеры 504 (Фиг.18В). В другом варианте воплощения настоящего изобретения, показанном на Фиг.18С, каскадный модуль 180 содержит первый фильтрующий модуль 181 и второй модуль 182. Вход 184 второго модуля 182 соединен с выходами 183, 186 первого модуля 181. Когда модуль 180 работает в условиях ламинарного потока, фильтрат и ретентат из первого модуля 181 могут протекать рядом в виде двух отдельных потоков без конвективного смешивания. Интерфейс между двумя потоками показан пунктирной линией 185. Каскадный модуль 180 может фракционировать частицы подаваемого вещества на три разные фракции - фракцию 1, фракцию 2 и фракцию 3, которые могут собираться на выходах 503, 510 и 507, соответственно. Для повышения чистоты фракции 1 через вход 521 может быть введена текучая среда-носитель.
На Фиг.18D показан качественный результат распределения по размеру, которого может достичь каскадный модуль при разделении разбавленных твердых сферических частиц на три фракции. Сложные подаваемые вещества, такие как кровь, могут быть разделены на три и более фракции. Сепарация может быть основана на нескольких факторах, в том числе взаимодействии между частицами, деформации частиц и/или неньютоновском поведении текучей среды.
Двойные фильтрующие модули и множественные фильтрующие модули могут объединяться в каскад для образования каскадных фильтрующих модулей аналогично тому, как это можно делать с фильтрующими модулями. На Фиг.19 показаны два таких варианта воплощения. На Фиг.19А показан вариант воплощения, представляющий собой зеркальное расположение двух каскадных фильтрующих модулей, показанных на Фиг.18С, которые совместно используют камеру ретентата 501. Частицы фракционируют и собирают на выходах 503, 510, 507. Аналогичным образом два каскадных фильтрующих модуля на Фиг.18С могут совместно использовать камеры 504 для образования варианта воплощения, показанного на Фиг.19В.
Каскадные фильтрующие модули могут быть полезны для сепарации частиц в три или более фракции в соответствии с механическими свойствами частиц, например размером, формой, деформируемостью, эластичностью и/или вязкостью. Например, каскадный фильтрующий модуль может фракционировать цельную кровь на популяции лимфоцитов, гранулоцитов и эритроцитов. В другом варианте воплощения каскадного фильтрующего модуля могут фракционироваться переваренные ферментами жировые ткани в жировые клетки, стромальную васкулярную фракцию, включающую адипозные стволовые клетки и клетки крови.
Другой вариант воплощения каскадного фильтрующего модуля показан на Фиг.20А. Камера ретентата 501 может получать подаваемую текучую среду на входе 502. Подаваемое вещество может пропускаться через первый фильтр 508. Первая камера фильтрата 504 может иметь конфигурацию для втягивания небольшого объема потоков через поры первого фильтра 508 для облегчения исключения по потоку и собирать фильтрат с первого фильтра 508. Ретентат первого фильтра 508 может входить во второй фильтрующий модуль через второй фильтр 509. Вторая камера фильтрата 516 может иметь конфигурацию для втягивания небольшого объема потоков через поры второго фильтра 509 и сбора фильтрата со второго фильтра 509 через выход 513. Эффективный размер пор первого фильтра 508 может иметь конфигурацию, в которой они меньше эффективного размера пор второго фильтра 509. Ретентат второго фильтра может собираться через выход 503 в камере ретентата 501.
Вариант воплощения на Фиг.20А может быть упрощен до варианта, показанного на Фиг.20В, из-за рабочих условий в ламинарном потоке. Фильтраты двух фильтров 508, 509 с различными размерами удержания могут собираться одной и той же камерой фильтрата 504. Два фильтрата могут не смешиваться конвективно и, таким образом, могут собираться отдельно через два выхода 541, 542.
В вариантах воплощения, показанных на Фиг.20А и Фиг.20В, частицы подаваемого вещества могут фракционироваться на три фракции: фильтрат первого фильтра 508 (фракция 3), фильтрат второго фильтра 509 (фракция 2) и ретентат второго фильтра 509 (фракция 1). В случае подаваемого вещества, включающего твердые сферические частицы, пример распределения трех фракций по размеру качественно показан на Фиг.20С. Следует понимать, что каскадные фильтрующие модули могут формировать двойные каскадные фильтрующие модули (Фиг.21) подобно тому, как два фильтрующих модуля могут образовывать двойной фильтрующий модуль (Фиг.14, 15). Двойные фильтрующие модули на Фиг.20А и Фиг.20В могут дополнительно каскадироваться для образования каскадных модулей так же, как два двойных фильтрующих модуля на Фиг.14А могут образовывать каскадный модуль, показанный на Фиг.17В.
Следует понимать, что каскадные фильтрующие модули могут включать каскады из двух и более фильтрующих модулей, двойных фильтрующих модулей или множественных фильтрующих модулей.
В вышеуказанных вариантах воплощения каскадных фильтрующих модулей может также использоваться поток носителя или множество потоков носителя для повышения чистоты ретентатов, для промывки частиц, для обработки частиц другими реагентами, такими как поток носителя, или для маркировки частиц.
Следует понимать, что двойной каскадный фильтрующий модуль может включать фильтр больше двух размеров удержания для сепарации подаваемого вещества более чем на три фракции. Следует понимать, что, хотя варианты воплощения двойных каскадных фильтрующих модулей, описанных выше, симметричны по отношению к центральным линиям, двойные каскадные фильтрующие модули могут быть несимметричными или могут даже включать фильтр с различными эффективными размерами пор с противоположных сторон от центральной линии.
Другие конфигурации модулей
В другом варианте воплощения настоящего изобретения фильтрующий модуль, содержащий камеру ретентата, фильтр и камеру фильтрата, может быть изогнут по кривой. Преимуществом такого варианта воплощения фильтрующего модуля может быть сниженная площадь основания, если нужно иметь длинный фильтр. В качестве альтернативы фильтрующие модули и каскадные фильтрующие модули могут быть размещены в форме серпантина.
Модули можно комбинировать так, чтобы добиться различных характеристик фильтра. Например, на Фиг.22А показан вариант воплощения настоящего изобретения для эффективной концентрации частиц ретентата. Подаваемое вещество может поступать в первый модуль 221 через вход 220. Первый модуль может концентрировать целевые частицы в подаваемом веществе в качестве его ретентата.
Ретентат может поступать во второй модуль 222 в качестве подаваемого вещества и может быть снова концентрирован, прежде чем он выйдет через выход 225. Если каждый модуль концентрирует свое подаваемое вещество в 5 раз, тогда два модуля вместе могут снизить объем в 25 раз. Можно соединить вместе большее количество модулей подобным образом, например 3, 4 или 5, для получения более концентрированного выхода. Если три модуля каскадируются подобным образом и если каждый модуль имеет коэффициент снижения объема 4, то три модуля вместе могут снизить объем в 64 раза. Следует понимать, что модули не должны концентрировать частицы в одинаковое количество раз.
На Фиг.22В показан вариант воплощения по настоящему изобретению, в котором можно эффективно промыть частицы ретентата. Подаваемое вещество поступает в первый модуль 223 через вход 227. Текучая среда-носитель может вводиться через вход 226. Ретентат первого модуля может "промываться" потоком носителя и может поступать во второй модуль 224. Второй модуль может включать вход 228 для второго потока носителя. Вход 228 может включать сквозное отверстие в варианте воплощения. Второй поток носителя может быть идентичным или неидентичным первому потоку носителя. Ретентат первого модуля 223 может промываться вторым потоком носителя во втором модуле 224. Этот вариант воплощения может использоваться для более полного обеднения популяции частиц фильтрата и достижения более высокой степени чистоты популяции частиц ретентата. Он также может использоваться для обработки, промывки и маркировки частиц ретентата при помощи потоков носителя. Например, поток носителя может включать антитело к целевому антигену на популяции ретентата. Когда частицы ретентата перемещаются в поток носителя, целевые частицы могут помечаться антителом. Следует понимать, что более двух модулей может каскадироваться аналогичным образом.
На Фиг.23А, 23В и 23С показаны варианты воплощения двойных фильтрующих модулей, в которых соответствующие модули смещены друг от друга. В варианте воплощения, показанном на Фиг.23В, частицы подаваемого вещества могут поступать в камеру ретентата 236 через вход 230. Частицы могут отделяться от фракции ретентата и фракции фильтрата фильтром 237. Фильтрат может протекать через камеру фильтрата 231 и может поступать в другую камеру 232. Хотя эта камера 232 может пропускать фильтрат с первого фильтра 237, камера 232 также может служить в качестве камеры ретентата для второго фильтра 238. Из-за наличия условий ламинарного потока ретентат и фильтрат могут не смешиваться конвективно и могут собираться после того, как они протекут через камеру ретентата 232. Фракции фильтрата из первого фильтра 237 и второго фильтра 238 могут выходить через первый выход 235 и второй выход 234, соответственно, тогда как фракции ретентата обоих фильтров 237, 238 могут собираться через выход 233. Аналогичным образом в варианте воплощения, показанном на Фиг.23С, ретентат из первой камеры ретентата 236 и фильтрат из первой камеры фильтрата 231 могут протекать рядом через вторую камеру ретентата 232. В условиях ламинарного потока ретентат и фильтрат не смешиваются конвективно. Пунктирной линией 239 показан интерфейс текучей среды между ретентатом и фильтратом, которые могут выходить через два разных выхода 233, 235, соответственно.
На Фиг.23D показан вариант воплощения множественного фильтрующего модуля. Этот модуль включает два модуля, показанные на Фиг.23С в виде зеркальных изображений по отношению друг к другу. Камеры фильтрата 231 и камеры ретентата 232 могут использоваться совместно. Поскольку поток ламинарный, потоки фильтрата и ретентата могут не смешиваться конвективно. Интерфейс между потоками показан пунктирными линиями 239. Потоки фильтрата могут собираться через выходы 234, 235, а потоки ретентата могут собираться через выходы 233.
На Фиг.23Е показан вариант воплощения каскадного фильтрующего модуля. Этот каскадный фильтрующий модуль включает два модуля 2310, 2311, каждый из которых включает модуль, показанный на Фиг.23С.
Подразумевается, что различные дизайны и конфигурации фильтрующих модулей, описанные выше, приведены только в качестве примера и не должны восприниматься как ограничивающие. В духе настоящего изобретения фильтр может включать столбики различного поперечного сечения, как показано на Фиг.9. Модули можно комбинировать и/или каскадировать различными способами для образования двойных фильтрующих модулей, множественных фильтрующих модулей, различных каскадных фильтрующих модулей и т.д. Поток носителя или несколько потоков носителя могут вводиться в различные модули для облегчения обеднения популяции фильтрата, удаления популяции фильтрата, промывки частиц, маркировки частиц, обработки частиц и т.д.
Конструктивные условия исключения по потоку
Чтобы эффективный размер пор был существенно меньше физического размера пор, камера фильтрата устройства фильтрации может иметь постепенно расширяющуюся конфигурацию. Специалист в данной области техники может рассмотреть условия, при которых может происходить исключение по потоку в вариантах воплощения настоящего изобретения.
Без привязки к каким-либо определенным математическим формулам, уравнениям, выводам и теориям условия способствования исключению по потоку описаны ниже. В качестве примера рассмотрим вариант воплощения, показанный на Фиг.12. Поскольку поток через пору регулируется расширением и сжатием камер, например расширением камеры фильтрата и/или сужением камеры ретентата, введем определение переменной "пропорциональная площадь поперечного сечения камеры фильтрата" w как отношение между площадью поперечного сечения камеры фильтрата и площадью поперечного сечения всех камер, в которых поперечные сечения берутся, по сути, перпендикулярно среднему направлению потока. Когда модуль фильтрации имеет камеры в основном постоянной глубины, как в варианте воплощения, показанном на Фиг.12, "пропорциональная площадь поперечного сечения камеры фильтрата" w равна:
<mrow><mi>w</mi><mo>=</mo><mfrac><mi>b</mi><mrow><mi>a</mi><mo>+</mo><mi>b</mi></mrow></mfrac></mrow>
,
где а - ширина камеры ретентата, b - ширина камеры фильтрата на уровне соответствующего поперечного сечения. Поток через пору как часть общего потока в камерах в основном зависит от приращения "пропорциональных площадей поперечного сечения камеры фильтрата" вокруг поры. В варианте воплощения, показанном на Фиг.12, это приращение выражается следующим образом:
<mrow><mi>w</mi><mo>'</mo><mo>−</mo><mi>w</mi><mo>=</mo><mfrac><mrow><mi>b</mi><mo>'</mo></mrow><mrow><mi>a</mi><mo>'</mo><mo>+</mo><mi>b</mi><mo>'</mo></mrow></mfrac><mo>−</mo><mfrac><mi>b</mi><mrow><mi>a</mi><mo>+</mo><mi>b</mi></mrow></mfrac></mrow>
С другой стороны, поскольку объем потока, втягиваемый через пору, примерно пропорционален площади отверстия поры и средней скорости потока через пору и поскольку объем потока, проходящего вниз по камерам, примерно пропорционален общей площади поперечного сечения камер и средней скорости потока в камерах, можно ожидать, что поток через пору как часть потока в камере будет в основном пропорционален квадрату физического размера пор, разделенному на общую площадь поперечного сечения камер.
Поскольку исключение по потоку происходит, когда поток через пору слабее того, который может позволить физический размер поры (Фиг.4), одним из условий возникновения существенного исключения по потоку может быть:
<mrow><mi>w</mi><mo>'</mo><mo>−</mo><mi>w</mi><mo>=</mo><mo><</mo><mfrac><mrow><msup><mrow><mo stretchy="false">(</mo><mi>Ф</mi><mi>и</mi><mi>з</mi><mi>и</mi><mi>ч</mi><mi>е</mi><mi>с</mi><mi>к</mi><mi>и</mi><mi>й</mi><mtext> </mtext><mi>р</mi><mi>а</mi><mi>з</mi><mi>м</mi><mi>е</mi><mi>р</mi><mtext> </mtext><mi>п</mi><mi>о</mi><mi>р</mi><mo stretchy="false">)</mo></mrow><mn>2</mn></msup></mrow><mrow><mtext>3</mtext><mo>×</mo><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>О</mi><mi>б</mi><mi>щ</mi><mi>а</mi><mi>я</mi><mtext> </mtext><mi>п</mi><mi>л</mi><mi>о</mi><mi>щ</mi><mi>а</mi><mi>д</mi><mi>ь</mi><mtext> поперечного сечения</mtext></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow></mfrac></mrow>
Коэффициент 3 в знаменателе - это коэффициент пропорциональности, оцениваемый по результатам компьютерного моделирования (Фиг.4). Этот критерий далее именуется как "критерий расширения камеры фильтрата". В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения модуль фильтрации включает камеру ретентата, камеру фильтрата и фильтр, состоящий из столбиков и пор, имеющих физический размер пор, при этом камера фильтрата расширяется со скоростью, удовлетворяющей "критерий расширения камеры фильтрата". В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения угол (углы), под которым расширяется камера фильтрата, т.е. изменяющийся или фиксированный угол (углы) между фильтром и боковой стенкой камеры фильтрата, очень маленький, например, составляет примерно 0,1 градуса, 0,2 градуса, 0,3 градуса, 0,5 градуса, 0,7 градуса, 1 градус, 1,5 градуса, 2 градуса, 2,5 градуса, 3 градуса или 5 градусов.
Другим условием, которое может поспособствовать исключению по потоку, является включение большого числа пор в модуль фильтрации, потому что при большом количестве пор может быть снижен поток через каждую пору и может произойти исключение по потоку. Аналогично предыдущему выводу ожидается, что количество пор, которое может понадобиться для исключения по потоку, существенно зависит от объема потока, собранного в камере фильтрата, и объема потока, допускаемого порой, имеющей физический размер поры. Следовательно, минимальное количество пор, которое может понадобиться для исключения по потоку, может быть, по сути, пропорционально отношению площади поперечного сечения выхода камеры фильтрата и квадрата физического размера пор. Таким образом, другое условие существенного исключения по потоку имеет следующий вид:
<mrow><mi>N</mi><mo>≥</mo><mn>3</mn><mi>k</mi><mfrac><mrow><mo stretchy="false">(</mo><mi>п</mi><mi>л</mi><mi>о</mi><mi>щ</mi><mi>а</mi><mi>д</mi><mi>ь</mi><mtext> </mtext><mi>п</mi><mi>о</mi><mi>п</mi><mi>е</mi><mi>р</mi><mi>е</mi><mi>ч</mi><mi>н</mi><mi>о</mi><mi>г</mi><mi>о</mi><mtext> </mtext><mi>с</mi><mi>е</mi><mi>ч</mi><mi>е</mi><mi>н</mi><mi>и</mi><mi>я</mi><mtext> </mtext><mi>в</mi><mi>ы</mi><mi>х</mi><mi>о</mi><mi>д</mi><mi>а</mi><mtext> </mtext><mi>к</mi><mi>а</mi><mi>м</mi><mi>е</mi><mi>р</mi><mi>ы</mi><mtext> </mtext><mi>р</mi><mi>е</mi><mi>т</mi><mi>е</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>а</mi><mi>т</mi><mi>а</mi><mo stretchy="false">)</mo></mrow><mrow><msup><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><mtext>Физический размер пор</mtext></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mn>2</mn></msup></mrow></mfrac></mrow>
где N - количество пор в модуле, k - "пропорциональная площадь поперечного сечения камеры фильтрата" на выходной стороне модуля фильтрации. Коэффициент пропорциональности "3" оценивается при помощи компьютерного моделирования. Этот критерий далее именуется как "критерий минимального количества пор". Для варианта воплощения, показанного на Фиг.12, условием существенного исключения по потоку может быть:
<mrow><mi>N</mi><mo>≥</mo><mn>3</mn><mrow><mo>(</mo><mrow><mfrac><mrow><msub><mi>W</mi><mn>2</mn></msub></mrow><mrow><msub><mi>W</mi><mn>1</mn></msub><mo>+</mo><msub><mi>W</mi><mn>2</mn></msub></mrow></mfrac></mrow><mo>)</mo></mrow><mfrac><mrow><mo stretchy="false">(</mo><msub><mi>W</mi><mn>0</mn></msub><mi>D</mi><mo stretchy="false">)</mo></mrow><mrow><mtext>3</mtext><mo>×</mo><msup><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><mtext>Физический размер пор</mtext></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mn>2</mn></msup></mrow></mfrac></mrow>
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения модуль фильтрации включает камеру ретентата, камеру фильтрата и фильтр, состоящий из столбиков и пор, имеющих физический размер пор, при этом количество пор удовлетворяет "критерий минимального количества пор".
Подразумевается, что описанная выше теория, формулы, уравнения и выводы не являются ограничивающими. Следует понимать, что "критерий расширения камеры фильтрата" и "критерий минимального количества пор" может применяться к различным вариантам воплощения модулей фильтрации в соответствии с настоящим изобретением, в том числе (без ограничения) фильтрующих модулей, двойных фильтрующих модулуй, множественных фильтрующих модулей и каскадных фильтрующих модулуй.
Фильтрующие элементы
Одним из вариантов воплощения настоящего изобретения является фильтрующий элемент, включающий описанный выше модуль фильтрации, жидкостные каналы и порты. Конфигурация жидкостных каналов обеспечивает жидкостное соединение между портами и модулем. Жидкостные каналы могут также иметь конфигурацию, обеспечивающую соответствующее жидкостное сопротивление для установления желаемого распределения потоков в модуле, например правильной пропорции подаваемого вещества и текучей среды-носителя в модуле и/или правильных пропорций текучих сред, собираемых в виде ретентата и фильтрата в желаемых рабочих условиях.
Устройства с высокой плотностью модулей
Одним из существенных преимуществ некоторых вариантов воплощения настоящего изобретения является обеспечение устройств с высокой пропускной способностью и высокой производительностью для фильтрации на основе принципа исключения по потоку при сохранении компактных размеров основания и низкого сдвигового напряжения. Описанные выше конфигурации модулей и элементов являются компактными и могут быть легко оформлены в устройства с высокой плотностью модулей. Такие устройства могут обладать возможностью масштабирования производительности и пропускной способности обработки и могут быть чрезвычайно полезны для многих приложений, таких как снижение объема пуповинной крови, промывка клеток, изолирование стволовых клеток, подготовка стромальных васкулярных фракций, скимминг плазмы и фильтрация стволовых клеток костного мозга. Штабелирование многих из этих компактных устройств вместе в виде одного устройства может обеспечить даже большую производительность и пропускную способность.
В другом варианте воплощения настоящего изобретения устройство включает множество фильтрующих элементов, причем каждый фильтрующий элемент содержит описанный выше модуль и жидкостные каналы, имеющие жидкостное соединение с модулем. Еще в одном варианте воплощения настоящего изобретения в одном устройстве используется множество фильтрующих элементов, например примерно 3, 5, 8, 10, 15, 20, 30, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 500, 800 и более фильтрующих элементов, в конфигурации высокой плотности. Такое устройство далее по тексту именуется "устройство с высокой плотностью устройств".
На Фиг.24A-24F показано несколько вариантов воплощения устройств с высокой плотностью модулей, в которых фильтрующие элементы 249 повторяются для увеличения пропускной способности и производительности. На Фиг.24А показано восемь фильтрующих элементов, каждый из которых включает двойной фильтрующий модуль. Входы подачи 502, выходы ретентата 503 и выходы фильтрата 507 модулей присоединены к входным портам 241 и выходным портам 242, 243 при помощи входных каналов 244 и выходных каналов 245, 246, соответственно.
Сопротивления потоку в каналах 244, 245, 246 могут быть устроены для установления соответствующих объемов потоков, поступающих на входы 502 и выходящих из выходов 503, 507 в рабочих условиях, и для облегчения работы отдельных модулей. Сопротивления потоку в каналах 244, 245, 246 могут быть устроены так, чтобы они были меньше, сравнимы или больше сопротивления потока модулей, в зависимости от рабочих условий, для которых предназначено устройство. В некоторых вариантах воплощения сопротивления потоку через входные и выходные каналы 245, 246 могут примерно в 0,01-0,99 раз отличаться от сопротивления двойного фильтрующего модуля.
В другом варианте воплощения настоящего изобретения (Фиг.24В) каждый двойной фильтрующий модуль может включать вход потока носителя 521, который может быть соединен с входным портом 247 через канал 248. Сопротивления потоку каналов могут быть рассчитаны для облегчения надлежащей работы отдельных модулей. В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения (Фиг.24С) множественный фильтрующий модуль соединен с входными и выходными портами при помощи каналов. В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения (Фиг.24D) несколько модулей могут совместно использовать входной порт 241 и выходной порт 242. Каналы, присоединяющие модули к портам, могут иметь, по сути, одинаковые сопротивления. В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения (Фиг.24Е) модули могут располагаться на круглом диске. В варианте воплощения на Фиг.24Е диск может вращаться вокруг центральной оси для создания центробежной силы, движущей текучую среду через модули, расположенные на диске.
По поводу размещения модулей только в один ряд ограничений нет. Два и более рядов модулей могут располагаться в виде одного устройства. При наличии двух и более рядов модулей существует больше возможных расположений для совместного использования портов и снижения площади основания устройств. На Фиг.24F показан набор из 20 двойных фильтрующих модулей, расположенных в два ряда, использующих общие порты входов подачи. Кроме того, устройства могут штабелироваться для достижения большей производительности и пропускной способности (Фиг.25).
Следует понимать, что множество фильтрующих модулей, двойных фильтрующих модулей, каскадных фильтрующих модулей, двойных каскадных фильтрующих модулей, множественных фильтрующих модулей, множественных каскадных фильтрующих модулей, других конфигураций или любых комбинаций перечисленных выше модулей может располагаться в любом возможном двухмерном или трехмерном отношении по отношению друг к другу.
Технология изготовления устройства фильтрации
Для изготовления вариантов воплощения устройств в соответствии с настоящим изобретением могут использоваться разнообразные методы. В одном варианте воплощения настоящего изобретения устройство может подвергаться микромеханической обработке. Методы микромеханической обработки можно выбрать из известных в данной области техники (без ограничения), например: методы, традиционно используемые для изготовления кремниевых печатных плат, тиснение, мягкое тиснение, литье, печать, формование, инжекционное формование, экструзия, стереолазерная литография, селективное лазерное спекание, фотолитография на стекле и влажное травление, обработка при помощи систем компьютерного цифрового управления (CNC), мягкая литография на полидиметилсилоксане (ПДМС), ультразвуковое микрофрезерование, литография на толстом фоторезисте, комбинации перечисленных методов и т.п. Примерами подходящих методов изготовления являются фотолитография, глубокое реактивное ионное травление, влажное травление, формование, тиснение, печать, лазерная абляция, литография на толстом фоторезисте, мягкая литография, трековое травление и прочие методы. Некоторые аспекты и варианты воплощения устройств фильтрации могут быть изготовлены из материалов, совместимых с условиями в определенном приложении. Такими условиями могут быть (без ограничения) рН, температура, органические растворители, биосовместимость, ионная сила, давление, прикладывание электрических полей, прилипаемость, поверхностный заряд, функционализация, обработка поверхности, угол смачивания, гидрофильность, гидрофобность, механическая прочность и тепловое расширение. Материлы для устройства могут также выбираться по их оптическим свойствам, механическим свойствам, химическим свойствам, химической стойкости к растворителям, свойствам плавления и по их инертности к компонентам приложения, которые будут использоваться в устройстве. К таким материалам могут относиться (без ограничения) стекло, плавленый кварц, силиконовый каучук, кремний, керамика, фотостекло, пластмасса, полимерные материалы, фоточувствительные полимеры, толстый фоторезист, резист SU-8, полидиметилсилоксан (ПДМС), циклический олефиновый сополимер (ЦОС), циклический олефиновый полимер (ЦОП), поликарбонат, полиэтилен, полипропилен, полиметилметакрилат (ПММА), самоприклеивающиеся материалы, тефлон, акриловая смола, полиэфирсульфон, политетрафторэтилен и т.д. Устройства могут стерилизоваться с использованием стандартных методов стерилизации, например гамма-излучения, стерилизации оксидом этилена, ультрафиолетового облучения, автоклавирования и т.п.
Показатели эффективности для описания микрожидкостных фильтрующих модулей, элементов и устройств
По сравнению с другими микрожидкостными устройствами некоторые аспекты и варианты воплощения настоящего изобретения создают условия для гораздо более эффективного исключения по потоку. Варианты воплощения фильтрующего модуля в соответствии с настоящим изобретением могут быть выполнены в виде физически компактного устройства, например устройства с высокой плотностью модулей, имеющего желаемую производительность и/или пропускную способность. Варианты воплощения настоящего изобретения могут иметь множество существенных преимуществ. Например, варианты воплощения настоящего изобретения могут быть не восприимчивы к закупорке. Во-вторых, некоторые аспекты и варианты воплощения настоящего изобретения могут быть относительно просты в изготовлении, потому что эти аспекты и варианты воплощения могут иметь очень маленькую площадь основания и относительно небольшое количество столбиков. В-третьих, некоторые аспекты и варианты воплощения настоящего изобретения могут быть "нежными" к фильтруемым частицам. В некоторых вариантах воплощения частица фильтрата может проходить только через одну пору на модуль во время процесса фильтрации. В-четвертых, некоторые аспекты и варианты воплощения настоящего изобретения вносят малую диффузию, потому что частицы не подвержены постоянным столкновениям и рассеиванию, характерным для других конструкций. Слабая диффузия может обеспечить высокоэффективную сепарацию.
Аспекты и варианты воплощения настоящего изобретения могут включать высокую пропускную способность и компактные устройства фильтрации, которые просты и экономны в изготовлении. Можно определить показатели для количественной оценки эффективности дизайна устройства и потенциальных усилий, которые могут понадобиться для изготовления. Одним из показателей, отражающим потенциальные усилия, необходимые для изготовления микрожидкостного устройства фильтрации, является объем удерживания устройства. Объем удерживания - это объем пустоты внутри устройства; он также может представлять собой количество материала, которое удаляется или смещается во время процесса изготовления устройства. Например, одним из методов для изготовления микрожидкостных устройств фильтрации в кремнии является фотолитография, за которой следует реактивное ионное травление. Количество устройств, которые могут быть изготовлены на подложке, зависит от размера травленой площади в устройстве, тогда как время механической обработки для реактивного ионного травления зависит от глубины травления. Объем удерживания устройства может быть примерно равен размеру травленой площади, умноженной на глубину травления, поэтому может выражать усилия и расходы, необходимые для изготовления устройства. Например, в случае устройств фильтрации, изготавливаемых в кремнии при помощи микротехнологии, чем больший объем удерживания имеет устройство, тем больше понадобится материала подложки, усилий по фотолитографии и времени работы травильной машины. Другие методы изготовления устройства, такие как инжекционное формование, также дают подобные корреляции между объемом удерживания и усилиями, необходимыми для изготовления устройства.
В случае микрожидкостных устройств фильтрации, включающих один или более модулей фильтрации, например фильтрующий модуль, двойной фильтрующий модуль, каскадный фильтрующий модуль или множественный фильтрующий модуль, объем удерживания модуля фильтрации может служить хорошим показателем для описания модуля фильтрации и/или устройства. Некоторые аспекты и варианты воплощения настоящего изобретения включают модули фильтрации с малым объемом удерживания, например, модуль фильтрации может иметь объем фильтрации <1 мкл, <0,3 мкл, <0,1 мкл, <0,03 мкл, <0,01 мкл и меньше. Объемы удерживания некоторых приведенных в качестве образца вариантов воплощения настоящего изобретения рассчитываются и описываются в разделе примеров ниже.
Другим показателем, который может быть определен для оценки усилий, необходимых для изготовления модуля, является "плотность фильтрующих элементов", определяемая здесь как количество фильтрующих элементов на объем. В частности, "плотность фильтрующих элементов" может быть рассчитана следующим образом:
<mrow><mi>П</mi><mi>л</mi><mi>о</mi><mi>т</mi><mi>н</mi><mi>о</mi><mi>с</mi><mi>т</mi><mi>ь</mi><mtext> фильтрующих элементов</mtext><mo>=</mo><mfrac><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>К</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>и</mi><mi>ч</mi><mi>е</mi><mi>с</mi><mi>т</mi><mi>в</mi><mi>о</mi><mtext> </mtext><mi>м</mi><mi>о</mi><mi>д</mi><mi>у</mi><mi>л</mi><mi>е</mi><mi>й</mi><mtext> </mtext><mi>н</mi><mi>а</mi><mtext> </mtext><mi>у</mi><mi>с</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>й</mi><mi>с</mi><mi>т</mi><mi>в</mi><mi>о</mi></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><mtext>Опорная поверхность устройства</mtext></mrow><mo>)</mo></mrow><mo>×</mo><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>Г</mi><mi>л</mi><mi>у</mi><mi>б</mi><mi>и</mi><mi>н</mi><mi>а</mi><mtext> канала</mtext></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow></mfrac></mrow>
-3
Например, рассмотрим устройство с высокой плотностью модулей, имеющее 100 идентичных фильтрующих элементов, площадь основания 2 см × 2 см и среднюю характеристическую глубину канала 50 мкм. "Плотность фильтрующих элементов" равна 100/[(2 см×2 см)×50 мкм], т.е. 5000 см. Такая "плотность фильтрующих элементов" означает, что, в принципе, в устройстве с высокой плотностью модулей в объеме один кубический сантиметр может быть упаковано до 5000 фильтрующих элементов. Для повышения полезности и снижения стоимости микрожидкостного устройства фильтрации может быть желательным максимизировать "плотность фильтрующих элементов" устройства, потому что пропускная способность устройства зависит от количества модулей в устройстве, а стоимость имеет тенденцию к масштабированию с объемным количеством жидкостных элементом в устройстве. Некоторые аспекты и варианты воплощения настоящего изобретения дают возможность создать устройства, имеющие высокую "плотность фильтрующих элементов". "Плотность фильтрующих элементов" некоторых приведенных в качестве образца вариантов воплощения настоящего изобретения рассчитываются и описываются в разделе примеров ниже.
Наряду с площадью основания устройства и глубиной канала важной характеристикой эффективности микрожидкостного устройства сепарации является скорость обработки частиц, определяемая как количество обрабатываемых подаваемых частиц за единицу времени. Для описания скорости обработки частиц устройства может быть важным учитывать площадь основания устройства и глубину жидкостного канала, что коррелирует со сложностью изготовления и стоимостью устройства. "Нормализованная скорость обработки" для микрожидкостного устройства сепарации может быть определена по следующей формуле:
<mrow><mi>Н</mi><mi>о</mi><mi>р</mi><mi>м</mi><mi>а</mi><mi>л</mi><mi>и</mi><mi>з</mi><mi>о</mi><mi>в</mi><mi>а</mi><mi>н</mi><mi>н</mi><mi>а</mi><mi>я</mi><mtext> скорость обработки</mtext><mo>=</mo><mfrac><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>с</mi><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>с</mi><mi>т</mi><mi>ь</mi><mtext> </mtext><mi>о</mi><mi>б</mi><mi>р</mi><mi>а</mi><mi>б</mi><mi>о</mi><mi>т</mi><mi>к</mi><mi>и</mi><mtext> </mtext><mi>ч</mi><mi>а</mi><mi>с</mi><mi>т</mi><mi>и</mi><mi>ц</mi></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>п</mi><mi>л</mi><mi>о</mi><mi>щ</mi><mi>а</mi><mi>д</mi><mi>ь</mi><mtext> </mtext><mi>о</mi><mi>п</mi><mi>о</mi><mi>р</mi><mi>н</mi><mi>о</mi><mi>й</mi><mtext> </mtext><mi>п</mi><mi>о</mi><mi>в</mi><mi>е</mi><mi>р</mi><mi>х</mi><mi>н</mi><mi>о</mi><mi>с</mi><mi>т</mi><mi>и</mi></mrow><mo>)</mo></mrow><mo>×</mo><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>г</mi><mi>л</mi><mi>у</mi><mi>б</mi><mi>и</mi><mi>н</mi><mi>а</mi><mtext> </mtext><mi>к</mi><mi>а</mi><mi>н</mi><mi>а</mi><mi>л</mi><mi>а</mi></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow></mfrac></mrow>
Может быть желательно, чтобы устройство имело высокую нормализованную скорость обработки. Многие аспекты и варианты воплощения настоящего изобретения дают возможность создать устройства сепарации, имеющие высокие "показатели скорости обработки". Показатели скорости обработки некоторых приведенных в качестве образца вариантов воплощения настоящего изобретения рассчитываются и описываются в разделе примеров ниже.
Другим важным фактором, связанным с эффективностью и стоимостью изготовления микрожидкостного устройства сепарации, может быть рабочая скорость потока. Повышение скорости потока во многих случаях повышает пропускную способность устройства без повышения стоимости изготовления. Однако такой подход может иметь значительные ограничения для приложений, в которых проблемой является сдвиговое напряжение. Повышенные скорости потока могут создавать условия большого сдвигового напряжения, приводя к потенциальному повреждению частиц и/или загрязнению фильтра. Для приложений, связанных с фильтрацией клеток, может быть желательным ограничить сдвиговую деформацию. Клетки могут быть уязвимы к высоким сдвиговым напряжениям и под их влиянием могут быть активированы, повреждены, изменены или даже лизированы. Многие аспекты и варианты воплощения настоящего изобретения обеспечивают максимизацию скорости потока при одновременном ограничении сдвиговой деформации.
При сравнении пропускной способности различных микрожидкостных устройств проточной сепарации может быть желательным нормализовать пропускную способность в соответствии с площадью основания устройства, глубинами каналов и рабочими сдвиговыми условиями. Кроме того, пропускная способность может быть нормализована в соответствии с квадратом характеристического размера удержания устройств фильтрации, потому что устройство с большим размером удержания может иметь более высокую пропускную способность. Здесь "коэффициент эффективности конструкции" (D.E.I.), представляющий собой нормализованную пропускную способность микрожидкостного устройства сепарации, определяется следующим образом:
<mrow><mi>D</mi><mo>.</mo><mi>E</mi><mo>.</mo><mi>I</mi><mo>.</mo><mo>=</mo><mfrac><mi>Q</mi><mrow><mi>A</mi><mi>D</mi><mi>S</mi><msup><mi>R</mi><mn>2</mn></msup></mrow></mfrac></mrow>
2
где Q - объемная пропускная способность, с которой устройство обрабатывает поток, S - максимальная скорость сдвига, воздействующего на частицу при протекании через устройство, А - площадь основания устройства, D - характеристическая глубина каналов устройства, a R - размер удержания устройства. Скорость сдвига здесь определяется как градиент скорости текучей среды в направлении, перпендикулярном скорости, имеющей размерность 1/время. Коэффициент эффективности конструкции имеет размерность 1/длину и может считаться внутренним свойством устройства, независимо от размера устройства, глубины каналов, рабочих сдвиговых условий и размера удержания.
"Коэффициент эффективности конструкции" может быть хорошим показателем полезности конструкции устройства. Устройства с высокой эффективностью конструкции могут иметь высокую пропускную способность, могут быть компактными, мягкими и простыми в изготовлении. Коэффициенты эффективности конструкции могут быть чрезвычайно полезны для описания собственных показателей пропускной способности микрожидкостных проточных устройств для фильтрации частиц, в которых рабочие условия таковы, что поток является ламинарным, число Рейнольдса Re низкое, например <0,01, <0,1, <1, <10, <100 или <500, а размеры частиц лежат в диапазоне примерно от 50 нм примерно до 300 мкм.
Аспекты и варианты воплощения настоящего изобретения могут обеспечить устройства с высокими показателями эффективности конструкции. "Показатели эффективности конструкции" некоторых приведенных в качестве образца вариантов воплощения настоящего изобретения рассчитываются и описываются в разделе примеров ниже.
Следует понимать, что аспекты и варианты воплощения настоящего изобретения могут позволить создать устройства фильтрации, особенно микрожидкостные устройства сепарации, включив в них конструкторские особенности, которые существенно улучшают производительность устройства и эффективность затрат, которые характеризуются такими показателями как объем удерживания, плотность фильтрующих элементов, нормализованная скорость обработки и/или коэффициент эффективности конструкции.
СИСТЕМЫ
Система мешков для фильтрации частиц
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения устройства с высокой плотностью модулей располагаются в картридже фильтра и соединяются с трубчатыми линиями и мешками, образуя замкнутую систему. Такие системы могут быть особенно полезны для клинических приложений, например снижения объема пуповинной крови, сепарации компонента периферической крови, изолирования стволовых клеток от амниотической жидкости, фильтрации костного мозга, лейкоредукции, скимминга плазмы, генерирования стромальных васкулярных фракций (СВФ) и т.п. Обрабатываемый образец частиц не должен подвергаться воздействию внешних загрязнителей. Кроме того, образец частиц может быть заключен в системе, тем самым снижая биологическую опасность для оператора.
На Фиг.26А-26Е показан вариант воплощения картриджа фильтра, содержащего корпус 260 и несколько устройств с высокой плотностью модулей 261. Корпус 260 может содержать канал подачи 262, канал сбора ретентата 263 и канал сбора фильтрата 264. Каналы могут быть присоединены к муфтам 265, 266, 267 так, что картридж может быть присоединен к трубкам, образуя систему мешков. Картридж 260 может распределять подаваемое вещество через устройства с высокой плотностью модулей 261 так, что эти устройства могут обрабатывать подаваемое вещество параллельно для достижения высокой объемной пропускной способности. Картридж 260 может также собирать ретентат и фильтрат с устройств с высокой плотностью модулей 261. Как показано на Фиг.26D и 26Е, может быть уложено в стопку несколько устройств с высокой плотностью модулей 261 при помощи прокладок 268 для обеспечения должной герметизации, чтобы не допустить перекрестного загрязнения подаваемого вещества, ретентата и фильтрата. В качестве альтернативы устройства с высокой плотностью модулей 261 могут склеиваться или связываться.
Различные части картриджа фильтра могут склеиваться, связываться, соединяться ультразвуком, скрепляться или соединяться винтами. Корпус картриджа может быть изготовлен из пластмассы с использованием стандартных методов изготовления, таких как инжекционное формование, тиснение, формование, горячее тиснение, стереолитография, механическая обработка и т.п. К платсмассам для корпуса могут относиться (без ограничения) циклический олефиновый сополимер (ЦОС), циклический олефиновый полимер (ЦОП), поликарбонат, полиэтилен, полипропилен, полиметилметакрилат (ПММА), самоприклеивающиеся материалы, тефлон, акриловая смола, полиэфирсульфон, политетрафторэтилен и т.д. Прокладки могут быть изготовлены из резиновых материалов, таких как силикон, латекс, неопрен, виниловая резина, с использованием стандартных методов, таких как резка, формование, водоструйная обработки и т.п.
На Фиг.27А-27С показана система мешков, состоящая из картриджа 270, содержащего устройства с высокой плотностью модулей, мешок сбора фильтрата 273 и мешок сбора ретентата 272. Мешки 272, 273 могут соединяться с картриджем 270 при помощи трубок 275, 276. Вход подачи картриджа 270 может соединяться с адаптером 271 при помощи трубки 274. Адаптер 271 может иметь шип, предназначенный для прокалывания мешка сбора образца 278 в порту 279 (Фиг.27В) и пропускания частиц подаваемого вещества в мешке сбора образца 278 в картридж для фильтрации. Подаваемым веществом может быть описанное выше подаваемое вещество или частицы, например кровь, пуповинная кровь, стволовые клетки периферической крови, костный мозг и т.п. После присоединения адаптера 271 к мешку сбора образца 278 систему мешков можно подвесить, и под действием силы тяжести (Фиг.27С) подаваемое вещество будет перемещаться через устройства с высокой плотностью модулей. В качестве альтернативы можно приложить давление для сжатия мешка с образом 278 для перемещения образца через картридж фильтра 270. В качестве альтернативы может применяться перистальтический насос для перекачивания текучих сред. Мешок сбора образца 278 может также включать иглу 2710 для облегчения сбора образца из источника образца, такого как пациент или пуповина.
Объемная производительность мешков может зависеть от конкретного приложения, для которого предназначена система. Для целей хранения пуповинной крови последняя может собираться из пуповины. Мешок с образцом 278 может иметь возможность вмещать примерно 20-250 мл пуповинной крови плюс примерно 0-400 мл антикоагулянта и добавок. В качестве антикоагулянтов для сбора пуповинной крови могут использоваться цитрат фосфат декстроза (ЦФД) и гепарин. Добавками могут быть буферный фосфатно-солевой раствор, сбалансированный солевой раствор Хэнкса, расширитель объема крови, среда роста стволовых клеток, факторы роста и т.п. Антикоагулянт или добавки могут быть предварительно загружены в мешок сбора образца 278. В одном варианте воплощения настоящего изобретения мешок сбора образца для пуповинной крови может содержать примерно 25-35 мл ЦФД и иметь емкость для сбора примерно до 200 мл пуповинной крови.
Для целей хранения пуповинной крови последняя может обрабатываться для снижения объема крови перед замораживанием. Эта практика может снизить стоимость долговременного хранения. Вариант воплощения системы мешков по настоящему изобретению может использоваться для снижения объема пуповинной крови, в котором система мешков включает устройства с высокой плотностью модулей, предназначенные для отделения красных кровяных телец и плазмы от ретентата. Ретентатом могут быть гематопоэтические стволовые клетки, клетки-предшественницы, колониеобразующие клетки и клетки CD34+. Ретентат может смешиваться с замораживающей средой, например диметилсульфоксидом (ДМСО), и может замораживаться в условиях криоконсервации для терапевтического использования в будущем. Мешок сбора ретентата 272 может включать мешок замораживания для криоконсервации. В другом варианте воплощения настоящего изобретения мешок сбора ретентата может включать мешок замораживания для криоконсервации, имеющий по меньшей мере 2 отделения. В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения мешок сбора ретентата может включать мешок замораживания для криоконсервации, емкостью по меньшей мере 25 мл.
Система мешков может также включать зажим трубки 277 на подающей трубке, трубке ретентата или трубке фильтрата для регулирования потока текучей среды в системе мешков (Фиг.27).
В другом варианте воплощения настоящего изобретения мешок сбора образца 281 может быть соединен с картриджем фильтра 280 при помощи трубки 285 (Фиг.28). Система может также включать зажим трубки 287, который первоначально может быть в закрытом положении. Образец, например кровь, пуповинная кровь, костный мозг и т.д., может собираться при помощи иглы 284 из источника, например пациента, пуповины и т.п. Необязательно система включает вторую иглу, которая может использоваться в случае закупорки первой иглы. После завершения сбора образца зажим трубки 287 можно перевести в открытое положение, чтобы обеспечить жидкостное соединение между мешком образца 281 и картриджем фильтра 280. Образец может перемещаться под действием движущей силы, такой как сила тяжести, давление или перистальтический насос.
Пробирочная система для фильтрации частиц
В другом варианте воплощения настоящего изобретения устройство с высокой плотностью модулей может вставляться в пробирочную систему для фильтрации образца. Пробирочная система может включать центрифужную пробирку 290, пробирочную вставку 291 и крышку 292 (Фиг.29). Пробирочная вставка 291 может включать устройство с высокой скоростью модулей 293, резервуар для подаваемого образца 294, выходной резервуар 295 и, необязательно, резервуар текучей среды-носителя 296 (Фиг.30). Выходной резервуар может иметь конструкцию для сбора фильтрата или ретентата из устройства с высокой плотностью модулей 293.
Для использования пробирочной системы можно добавить образец подаваемого вещества в резервуар образца подаваемого вещества. Необязательно в резервуар текучей среды-носителя может быть добавлена текучая среда-носитель. Текучая среда-носитель может продаваться вместе с пробирочной системой в одном комплекте. Текучая среда-носитель может быть дегазирована для снижения риска образования пузырей в устройстве с высокой плотностью модулей или предварительно упакована в бутылке в условиях вакуума, т.е. под давлением в диапазоне примерно от 0,05 атм примерно до 0,95 атм. В качестве альтернативы текучая среда-носитель может быть предварительно загружена в пробирочную вставку, герметично закрываемую при помощи фольги, например алюминиевой фольги.
Устройство с высокой плотностью модулей может разделять образец подаваемого вещества на две фракции. Одна фракция может собираться в пробирке (290 на Фиг.29), а другая фракция может собираться в пробирочной вставке. В одном варианте воплощения в пробирке может собираться ретентат. В другом варианте воплощения в пробирке может собираться фильтрат. Еще в одном варианте воплощения образцы подаваемого вещества могут фракционироваться на три и более фракции. Две и более выходные фракции могут собираться при помощи вставки.
Для работы пробирочной системы (Фиг.29) в пробирку 290 можно вставить пробирочную вставку 291. В резервуары текучей среды и образца могут добавляться, соответственно, текучая среда-носитель и образец подаваемого вещества. Для закрывания пробирки затем можно надеть крышку 292. Пробирочная система может работать под действием силы тяжести. В качестве альтернативы пробирочная система может работать под действием центробежной силы, т.е. собранная пробирочная система может раскручиваться в центрифуге. Пробиркой в системе может быть стандартная готовая к применению центрифужная пробирка, например, на 50 мл, 15 мл или 10 мл, стандартная готовая к применению центрифужная микропробирка, например, на 2 мл, 1,5 мл или 1 мл или нестандартная специально изготовленная пробирка любого желаемого размера.
Картриджная система и планшетная система для фильтрации частиц
В другом варианте воплощения настоящего изобретения устройство фильтрации может быть подключено к лункам для образования картриджа для фильтрации образца. Картридж может включать устройство фильтрации и лунки или резервуары для размещения подаваемого образца, ретентата, фильтрата или текучей среды-носителя. Картридж может включать несколько устройств фильтрации и несколько наборов резервуаров для облегчения фильтрации нескольких образцов. Резервуары в картридже могут быть запечатаны в пленку, например пластиковую пленку, алюминиевую пленку и т.п.
В других вариантах воплощения настоящего изобретения устройство фильтрации может быть подключено к лункам для образования планшетной системы для фильтрации образца. Система может включать устройство фильтрации и лунки для размещения входной и выходной текучей среды. Устройство фильтрации может включать фильтрующий модуль, двойной фильтрующий модуль, каскадный фильтрующий модуль, множественный фильтрующий модуль, устройство с высокой плотностью модулей или любую конфигурацию фильтров, описанную в настоящем раскрытии сущности изобретения.
На Фиг.31А-31С показан вариант воплощения планшетной системы по настоящему изобретению, включающий устройство с высокой плотностью модулей 3105, лунку образца 3101, лунку текучей среды-носителя 3102, лунку фильтрата 3103 и лунку ретентата 3104. Для использования системы подаваемый образец и текучая среда-носитель могут загружаться в лунку образца 3101 и лунку текучей среды-носителя 3102, соответственно. После этого может прикладываться давление к лунке образца 3101 и лунке текучей среды-носителя 3102 для пропускания текучих сред через устройства фильтрации 3105. В качестве альтернативы в лунке фильтрата 3103 и лунке ретентата 3104 может создаваться небольшой вакуум для перемещения текучих сред. Фильтрат и ретентат могут собираться в лунке фильтрата 3103 и лунке ретентата 3104, соответственно.
Большинство планшетных систем, описанных выше, может быть выполнено параллельно в виде одного планшета. На Фиг.32A-32D показан вариант воплощения 96-лунковой системы по настоящему изобретению, включающий несколько устройств с высокой плотностью модулей и 96 лунок в 96-лунковом формате планшета. Преимуществом этой системы может быть использование стандартного 96-лункового планшета, а также ее включение в стандартный рабочий поток при помощи стандартных роботов или рабочих станций пипетирования и обработки. Еще одним преимуществом этой системы может быть обработка нескольких образцов в одной системе одновременно или последовательно. В качестве альтернативы планшетная система может быть спроектирована и изготовлена в других стандартных планшетных форматах, например в формате 6-лункового планшета, 384-лункового планшета и т.п. Кроме того, планшетная система может быть спроектирована и изготовлена в виде других нестандартных форматов без отклонения от духа настоящего изобретения.
Частицы и текучие среды, используемые в картриджной системе или планшетной системе, могут переноситься вручную или с использованием автоматизированного инструмента, такого как робот пипетирования.
Другие форматы системы для фильтрации частиц
Могут проектироваться и изготавливаться другие системы различных форматов без отклонения от духа настоящего изобретения. Например, устройства фильтрации могут интегрироваться в резервуары и дозировочные наконечники для дозированной выдачи фильтрата, ретентата и, необязательно, других фракций в испытательные пробирки или многолуночные планшеты. В другом варианте воплощения настоящего изобретения устройство может подключаться к вакуумным контейнерам.
Методы изготовления системы
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения описанные выше системы могут изготавливаться из пластмассы с использованием стандартных методов изготовления, таких как инжекционное формование, тиснение, формование, горячее тиснение, стереолитография и т.п. К платсмассам для корпуса могут относиться, например, полидиметилсилоксан (ПДМС), циклический олефиновый сополимер (ЦОС), циклический олефиновый полимер (ЦОП), поликарбонат, полиэтилен, полипропилен, полиметилметакрилат (ПММА), самоприклеивающиеся материалы, тефлон, акриловая смола, полиэфирсульфон, политетрафторэтилен и т.д. Системы могут стерилизоваться с использованием стандартных методов стерилизации, например гамма-излучения, стерилизации оксидом этилена, ультрафиолетового облучения, автоклавирования и т.п.
Работа устройств и систем
В различных аспектах и вариантах воплощения настоящего изобретения частицы и текучие среды могут пропускаться через устройство или систему при помощи потока текучей среды, давления вытеснения, вакуума, высоты напора, силы тяжести, центробежной силы, магнитной силы, капиллярного действия, электрического поля, электрофоретического поля, диэлектрофоретического поля, электроосмотической силы, электрокинетической силы или комбинации перечисленных сил. Кроме того, для устройства или системы, включающей гибкий мешок, давление вытеснения может создаваться путем приложения давления к мешку. Например, мешок может располагаться между двумя жесткими плитами. Давление внутри мешка может создаваться и регулироваться путем регулировки промежутка между плитами или давления, прикладываемого к плитам.
Частицы и текучие среды также могут перемещаться или передвигаться при помощи одного или нескольких насосов, перистальтических насосов, шприцевых насосов, центрифуги или комбинации перечисленного и регулироваться при помощи одного или нескольких клапанов или зажимов трубок, например запорных клапанов, обратных клапанов, выпускных клапанов, зажимов трубок и т.п. Кроме того, частицы и жидкости могут также перемещаться внутри замкнутой системы, в открытой системе с использованием пипеток, с использованием роботов пипетирования, с использованием всасывания одного или нескольких вакуумных контейнеров или комбинации перечисленного.
Аспекты и варианты воплощения устройств и систем настоящего изобретения могут также реализовываться с температурным регулированием. Температурное регулирование, например, нагревательные элементы, охлаждающие элементы и компоненты термометра, могут включаться в устройство или систему с целью увеличения воспроизводимости процесса фильтрации или оптимизации процесса фильтрации. Например, в препаратах стромальных васкулярных фракций (СВФ) может быть полезным установить температуру устройства примерно между 25°С и примерно 37°С для снижения вязкости обрабатываемых текучих сред.
Упаковка и комплекты
В другом варианте воплощения настоящего изобретения устройство или система могут быть предварительно загружены или заполнены реагентами, например текучими средами-носителями. Еще в одном варианте воплощения настоящего изобретения устройство или система могут быть упакованы с реагентами, руководством пользователя, инструкциями, этикетками, рабочими протоколами, рабочими таблицами данных, одноразовыми деталями, сборными пробирками, наконечниками пипеток, пипетками без градуировки, вакуумными контейнерами, индикаторными полосками, биочипами, индикаторными полосками бокового потока, камерами подсчета клеток, гемацитометрами и/или другими устройствами, образующими комплект. Некоторые устройства или системы могут упаковываться и продаваться в виде одного комплекта. В другом варианте воплощения настоящего изобретения s-устройство, система или комплект могут стерилизоваться. В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения s-устройство или система могут упаковываться отдельно для достижения дополнительной стерильности.
Подразумевается, что различные описанные здесь варианты воплощения приведены только в качестве примера и никак не ограничивают область действия изобретения. Различные модификации, комбинации и вариации описанного метода или устройства по настоящему изобретению будут очевидны опытным специалистам в данной области техники без отступления от области действия и духа настоящего изобретения. Например, многие описанные здесь материалы и конструкции могут быть заменены другими материалами и конструкциями без отклонения от духа настоящего изобретения. Кроме того, описанный здесь поток текучей среды может быть заменен электрическим полем, электрофоретическим полем, электрокинетическим потоком, силой тяжести или центробежной силой. Подразумевается также, что различные описанные здесь теории и пояснения не являются ограничивающими. Например, приведенные здесь варианты воплощения могут использовать поток текучей среды, падение давления, гидродинамическое давление, источник давления, вакуум, высоту напора, силу тяжести, центробежную силу, электрическое поле, электрофоретическое поле, электрокинетическую силу, электроосмотическую силу или комбинацию перечисленного для перемещения частиц без отклонения от духа настоящего изобретения.
Следует понимать, что, хотя описанные во многих вариантах воплощения фильтры включают столбики и поры, могут применяться другие конструкции фильтров, включающих поры, в которых используется исключение по потоку, и другие механизмы фильтрации, отличающиеся от исключения по потоку, без отклонения от духа настоящего изобретения. Следует также понимать, что варианты воплощения настоящего изобретения могут комбинироваться с другими компонентами или процессами для создания более сложного устройства, системы или инструмента.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Сепарация полимерных микросфер и измерение размера удержания
Флуоресцентные полимерные микросферы диаметром 3,0 мкм и 6,9 мкм подвергались сепарации с использованием устройства, включающего двойной фильтрующий модуль, такой, как показан на Фиг.14В. Двойной фильтрующий модуль включал каналы и камеры глубиной 30 мкм и два фильтра, имеющих по 165 столбиков. Столбики имели 30 мкм в высоту и были расположены на расстоянии 12 мкм друг от друга, тем самым создавая поры с физическим размером пор 12 мкм. Камера ретентата и камера фильтрата имели такую конструкцию, что скорость потока через пору находилась в диапазоне примерно от 0,22% до 0,28% скорости потока на входе в камеру ретентата. Двойной фильтрующий модуль имел примерно 4 мм в длину и 0,25 мм в ширину.
Устройство было изготовлено из кремния с использованием стандартных методов микротехнологии. Для создания жидкостных каналов, камер и фильтрующих структур использовались фотолитография и глубокое кремниевое реактивное травление. Глубина травления составляла 30 мкм. Кремниевая подложка при помощи анодного склеивания герметично присоединялась на лицевой поверхности протравленного канала к стеклянной пластине, образуя закрытые жидкостные каналы. Приклеенная пластина затем разрезалась на отдельные устройства. Устройство механически сопрягалось с пластмассовым корпусом с внешними жидкостными резервуарами для доставки текучих сред-образцов.
3
Текучая среда-образец включала флуоресцентные полимерные микросферы диаметром 3,0 мкм и 6,9 мкм, взвешенные в фосфатно-буферном солевом растворе Дульбекко, содержащем 1% альбумин бычьей сыворотки. Плотность микросфер составляла 1,05 г/см. Объемная концентрация микросфер диаметром 3,0 мкм и 6,9 мкм в текучей среде-образце составляла 0,00004% и 0,00048%, соответственно, т.е. 28 микросфер на каждый мкл. При таких концентрациях взаимодействием между частицами можно пренебречь.
Устройство было установлено на флуоресцентный микроскоп для визуализации флуоресцентных полимерных микросфер. В резервуар текучей среды-носителя в пластиковом корпусе была добавлена текучая среда-носитель для заправки устройства. Текучая среда-носитель включала фосфатно-буферный солевой раствор Дульбекко, содержащий 1% альбумин бычьей сыворотки. Затем в резервуар образца добавили текучую среду-образец. Затем оба резервуара подняли выше уровня резервуаров ретентата и фильтрата для создания высоты напора около 30 см. Текучие среды пропускались через устройство под действием силы тяжести и высоты напора. Средняя скорость потока в двойном фильтрующем модуле составляла около 1,5 см/с, что соответствует числу Рейнольдса в камерах около 0,45. Глубина канала использовалась как характеристическая длина в расчете числа Рейнольдса. При таком числе 5 Рейнольдса поток является ламинарным.
Флуоресцентные полимерные микросферы, протекающие через устройство, подвергались ручному подсчету при выходе из двойного фильтрующего модуля. Результаты показаны в следующей таблице:
Диаметр
Количество
Количество
Процент
микросферы
удержанных
неудержанных
удержания
3,0 мкм
0
20
0%
6,9 мкм
258
3
99%
Микросферы размером 3,0 мкм представляют собой исходный уровень, в котором почти не происходит задержания, и характеризуются уровнем удержания около 0%. Уровень удержания микросфер размером 6,9 мкм составляет около 99%, что существенно выше исходного уровня, установленного микросферами размером 3,0 мкм. Таким образом, установлено, что "размер удержания" двойного фильтрующего модуля лежит в диапазоне от 3,0 мкм до 6,9 мкм, что на 58% меньше физического 5 размера пор 12 мкм. Чтобы двойной фильтрующий модуль имел такой размер удержания, "эффективный размер пор" соответствующих пор не должен превышать 6,9 мкм. Приведенное здесь в качестве примера устройство имеет эффективный размер пор на 58% меньше физического размера пор.
Следует понимать, что приведенный в качестве примера способ использования полимерных микросфер для измерения размера удержания и эффективного размера пор может применяться к другим устройствам фильтрации в качестве стандартного текста для описания размеров удержания, независимо от предполагаемого назначения устройств фильтрации. Например, устройства, используемые в примерах 2, 3, 4 и 5 ниже, могут быть охарактеризованы с использованием полимерных микросфер, хотя эти устройства предназначены для обработки клеток.
Пример 2. Изолирование лейкоцитов из цельной периферической крови
Лейкоциты изолировали из цельной периферической крови при помощи устройства с высокой плотностью модулей.
Используемым в качестве примера устройством было устройство с высокой плотностью модулей, как показано на Фиг.24В, состоящее из 72 фильтрующих элементов (249 на Фиг.24В), каждый из которых состоял из двойного фильтрующего модуля, входного порта текучей среды-носителя (247 на Фиг.24В), входного порта образца, выходного порта ретентата, двух выходных портов фильтрата и каналов, соединяющих двойной фильтрующий модуль с портами. Каналы и камеры в устройстве имели 30 мкм в глубину. Каждый двойной фильтрующий модуль включал 2 фильтра по 240 пор каждый. Каждая пора имела поперечное сечение 30 мкм × 12 мкм, таким образом, физический размер пор составил 12 мкм. Камеры ретентата и камеры фильтрата двойных фильтрующих модулей имели такую конструкцию, что скорость потока через пору находилась в диапазоне примерно от 0,12% до 0,18% скорости потока на входе в камеру ретентата. Устройство имело 25 мм в длину, 24 мм в ширину, 0,6 мм в толщину и площадь основания 600 мм (25 мм×24 мм).
При помощи способа, описанного в примере 1, измерялись эффективный размер пор и размер удержания. По результатам оценки размер удержания устройства составил около 4 мкм, что существенно меньше физического размера пор 12 мкм.
Устройство было изготовлено из кремния с использованием стандартных методов микротехнологии. Для создания жидкостных каналов, камер и фильтрующих структур использовались фотолитография и глубокое кремниевое реактивное травление. Глубина травления составляла 30 мкм. Кремниевая подложка при помощи анодного склеивания герметично присоединялась на лицевой поверхности протравленного канала к стеклянной пластине, образуя закрытые жидкостные каналы. Приклеенная пластина затем разрезалась на отдельные устройства. Устройство механически сопрягалось с пластмассовым корпусом с внешними резервуарами образца, текучей среды-носителя, ретентата и фильтрата.
2
2
В этом примере для образцов использовалась человеческая цельная периферическая кровь. Кровь брали у согласившихся взрослых доноров при помощи вакуумных контейнеров, используя ЭДТА-K, АЦД или гепарин (Becton Dickinson, Франклин-Лейке, Нью-Джерси). Уровень гематокрита образцов крови составлял около 40%. В образцах крови содержалось более 4 млрд эритроцитов на мл. Гематокрит - это пропорция объема крови, занятая красными кровяными тельцами. Кровь обрабатывалась при комнатной температуре в течение шести часов после взятия. В качестве текучей среды-носителя использовался фосфатно-буферный солевой раствор Дульбекко, содержащий 0,5% альбумин бычьей сыворотки и 2 мМ ЭДТА-K.
В резервуар текучей среды-носителя в пластиковом корпусе было добавлено 8 мл текучей среды-носителя для заправки устройства. Затем в резервуар образца было добавлено 4 мл цельной крови. Затем оба резервуара подняли выше уровня резервуаров ретентата и фильтрата для создания высоты напора около 40 см. Кровь и текучая среда-носитель пропускались через устройство под действием силы тяжести и высоты напора. Фильтрат и ретентат собирали в резервуары фильтрата и ретентата, соответственно. Через примерно 40 минут кровь была полностью обработана пропусканием через устройство. Затем выполнялось измерение и анализ фильтрата и ретентата при помощи автоматического счетчика клеток (гематологический анализатор Coulter АсТ cliff, Beckman Coulter, Фуллертон, Калифорния). Жизнеспособность изолированных лейкоцитов измеряли сразу же после рабочего цикла при помощи пропидиум иодида, штамма, проникающего в клетки с поврежденными мембранами, гематоцитометра и флуоресцентного микроскопа.
Полученные в результате объемы ретентата и фильтрата составили примерно 3,5 мл и 7,6 мл, соответственно. Лейкоциты собирали в текучей среде-носителе в виде ретентата. Этот эксперимент был проведен дважды с использованием образцов крови от двух разных доноров. Результаты показаны на Фиг.33. В среднем общая производительность обработки цельной крови составила около 5,4 мл/ч. Устройство продемонстрировало способность обрабатывать свыше 6 миллионов клеток в секунду. Удержание лейкоцитов составило около 94%, перенос эритроцитов составил около 2%, а перенос тромбоцитов <1%. Здесь перенос эритроцитов и перенос тромбоцитов касается процента удержания эритроцитов и тромбоцитов, соответственно. Жизнеспособность лейкоцитов после обработки не отличалась в пределах погрешности от их жизнеспособности до обработки. Измерения показали, что устройство и процесс изолирования не снижают жизнеспособности лейкоцитов и что устройство способно изолировать лейкоциты с жизнеспособностью >99%.
2
2
<mrow><mi>П</mi><mi>л</mi><mi>о</mi><mi>т</mi><mi>н</mi><mi>о</mi><mi>с</mi><mi>т</mi><mi>ь</mi><mtext> фильтрующих элементов</mtext><mo>=</mo><mfrac><mrow><mn>72</mn></mrow><mrow><mn>600</mn><mtext> </mtext><msup><mi>м</mi><mn>2</mn></msup><mo>×</mo><mn>0</mn><mo>,</mo><mn>03</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><msup><mi>м</mi><mn>2</mn></msup></mrow></mfrac><mo>=</mo><mn>4</mn><msup><mrow><mtext> фильтрующих элемента на см</mtext></mrow><mtext>3</mtext></msup></mrow>
Показатели производительности и экономической эффективности приведены ниже. Объем удержания модуля фильтрации в приведенном в качестве примера устройстве составил примерно 0,03 мкл. Каждый фильтрующий элемент состоял из 480 столбиков и занимал площадь основания менее 8,4 мм (т.е. площадь основания устройства 25 мм × 24 мм, разделенная на 72 фильтрующих элемента). При глубине канала 30 мкм, площади основания устройства 600 мм (25 мм × 24 мм) и 72 фильтрующих элементах "плотность фильтрующих элементов" устройства составила: Плотность фильтрующих элементов
"Нормализованная скорость обработки" приведенного в качестве примера устройства рассчитывается по следующей формуле:
<mrow><mi>Н</mi><mi>о</mi><mi>р</mi><mi>м</mi><mi>а</mi><mi>л</mi><mi>и</mi><mi>з</mi><mi>о</mi><mi>в</mi><mi>а</mi><mi>н</mi><mi>н</mi><mi>а</mi><mi>я</mi><mtext> скорость обработки</mtext><mo>=</mo><mfrac><mrow><mn>6</mn><mo>×</mo><msup><mrow><mn>10</mn></mrow><mn>6</mn></msup><msup><mi>с</mi><mrow><mo>−</mo><mn>1</mn></mrow></msup></mrow><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><mn>25</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><mi>м</mi><mo>×</mo><mn>24</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><mi>м</mi></mrow><mo>)</mo></mrow><mo>×</mo><mrow><mo>(</mo><mrow><mn>0</mn><mo>,</mo><mn>03</mn></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow></mfrac><mo>=</mo><mn>0</mn><mo>,</mo><mn>33</mn><mo>×</mo><msup><mrow><mn>10</mn></mrow><mn>6</mn></msup><msup><mi>с</mi><mrow><mo>−</mo><mn>1</mn></mrow></msup><mi>м</mi><msup><mi>м</mi><mrow><mo>−</mo><mn>3</mn></mrow></msup></mrow>
6
Такая "нормализованная скорость обработки" означает, что каждый кубический миллиметр канала и фильтрующей структуры на этом устройстве обеспечивает обработку 0,33×10 клеток в секунду.
Показатель эффективности конструкции приведенного в качестве примера устройства рассчитывается ниже
Производительность обработки подачи
Q=5,4 мл/ч=1,5 мм<sup>3</sup>/с
Характеристическая глубина канала
D=30 мкм=0,03 мм
Площадь основания устройства
А=25 мм × 24 мм=600 мм
Размер удержания
R=4 мкм=0,004 мм
Скорость сдвига
S=1900 с<sup>-1</sup> (расчет приведен ниже).
Максимальная скорость сдвига, которая может воздействовать на подаваемые клетки крови в устройстве, имеет место на поверхности входного канала подаваемого вещества в соответствии с компьютерным моделированием. Максимальную скорость сдвига можно рассчитать при помощи компьютерной жидкостной динамики или оценить аналитически, как описано ниже, приняв допущение, что профиль потока является параболическим во входном канале подаваемого вещества. Учитывая, что устройство содержит 144 входных канала подаваемого вещества (2 на модуль, 72 модуля) и что каждый входной канал имеет известное поперечное сечение 70 мкм × 30 мкм, средняя скорость потока <v> во входном канале подаваемого вещества рассчитывается по следующей формуле:
<mrow><mrow><mo>〈</mo><mi>v</mi><mo>〉</mo></mrow><mo>=</mo><mfrac><mrow><mn>1</mn><mo>,</mo><mn>5</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><msup><mi>м</mi><mn>3</mn></msup><mi>с</mi></mrow><mrow><mn>144</mn><mo>×</mo><mrow><mo>(</mo><mrow><mn>70</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><mi>м</mi><mo>×</mo><mn>30</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><mi>м</mi></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow></mfrac><mo>=</mo><mn>5</mn><mo>,</mo><mn>0</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><mi>м</mi><mo>/</mo><mi>c</mi></mrow>
Таким образом, скорость сдвига на поверхности входного канала подаваемого вещества, если предположить наличие параболического профиля, составляет
<mrow><mi>S</mi><mo>≈</mo><mn>6</mn><mo>×</mo><mfrac><mrow><mrow><mo>〈</mo><mi>v</mi><mo>〉</mo></mrow></mrow><mrow><mn>30</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><mi>к</mi><mi>м</mi></mrow></mfrac><mo>≅</mo><mn>1000</mn><mtext> </mtext><msup><mi>с</mi><mrow><mo>−</mo><mn>1</mn></mrow></msup></mrow>
Показатель эффективности конструкции (D.E.I.) приведенного в качестве примера устройства определяется следующим образом:
<mrow><mi>D</mi><mo>.</mo><mi>Е</mi><mo>.</mo><mi>I</mi><mo>.</mo><mo>=</mo><mfrac><mi>Q</mi><mrow><mi>A</mi><mi>D</mi><mi>S</mi><msup><mi>R</mi><mn>2</mn></msup></mrow></mfrac><mo>≈</mo><mfrac><mrow><mn>1</mn><mo>,</mo><mn>5</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><msup><mi>м</mi><mn>3</mn></msup><mo>/</mo><mi>с</mi></mrow><mrow><mn>600</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><msup><mi>м</mi><mn>2</mn></msup><mo>×</mo><mn>0</mn><mo>,</mo><mn>03</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><mi>м</mi><mo>×</mo><mn>1000</mn><mtext> </mtext><msup><mi>с</mi><mrow><mo>−</mo><mn>1</mn></mrow></msup><mo>×</mo><msup><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><mn>0</mn><mo>,</mo><mn>004</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><mi>м</mi></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mn>2</mn></msup></mrow></mfrac><mo>=</mo><mn>5</mn><mo>,</mo><mn>2</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><msup><mi>м</mi><mrow><mo>−</mo><mn>2</mn></mrow></msup></mrow>
3
3
2
Аналогичным образом можно рассчитать показатель эффективности конструкции (D.E.I.) фильтрующего элемента приведенного в качестве примера устройства. Так как в устройстве было 72 фильтрующих элемента, каждый фильтрующий элемент обеспечил производительность обработки подаваемого вещества на уровне 0,0208 мм/с (1,5 мм/с, разделенные на 72). Средняя площадь основания фильтрующего элемента составляет 8,33 мм (25 мм×24 мм÷72 мм).
Показатель эффективности конструкции (D.E.I.) фильтрующего элемента определяется
следующим образом:
<mrow><mi>D</mi><mo>.</mo><mi>Е</mi><mo>.</mo><mi>I</mi><mo>.</mo><mo>=</mo><mfrac><mi>Q</mi><mrow><mi>A</mi><mi>D</mi><mi>S</mi><msup><mi>R</mi><mn>2</mn></msup></mrow></mfrac><mo>≈</mo><mfrac><mrow><mn>1</mn><mo>,</mo><mn>5</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><msup><mi>м</mi><mn>3</mn></msup><mo>/</mo><mi>с</mi></mrow><mrow><mn>600</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><msup><mi>м</mi><mn>2</mn></msup><mo>×</mo><mn>0</mn><mo>,</mo><mn>03</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><mi>м</mi><mo>×</mo><mn>1000</mn><mtext> </mtext><msup><mi>с</mi><mrow><mo>−</mo><mn>1</mn></mrow></msup><mo>×</mo><msup><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><mn>0</mn><mo>,</mo><mn>004</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><mi>м</mi></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mn>2</mn></msup></mrow></mfrac><mo>=</mo><mn>5</mn><mo>,</mo><mn>2</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><msup><mi>м</mi><mrow><mo>−</mo><mn>2</mn></mrow></msup></mrow>
Несмотря на то, что устройство имеет значительно более высокую производительность обработки, чем один фильтрующий элемент, показатель эффективности конструкции фильтрующего элемента точно такой же, как и всего устройства. Следует понимать, что почти как полимерные микросферы могут использоваться в качестве стандартного текста для измерения размера удержания устройства независимо от применения по назначению, показатель эффективности конструкции может использоваться в качестве стандартной характеристики устройства независимо от размеров его канала, рабочих скоростей потока и размеров удержания.
Пример 3. Снижение лейкоцитов в цельной крови
Используемое в качестве примера устройство в Примере 2 может служить фильтром лейкоредукции. Фильтрат устройства содержал только 6% или меньше лейкоцитов, поступающих в устройство. В примере 2 показано, что устройства по настоящему изобретению могут использоваться для снижения количества лейкоцитов в цельной крови. В качестве фильтров лейкоредукции могут также использоваться другие конфигурации устройства как с текучими средами-носителями, так и без них.
Пример 4. Изолирование лимфоцитов из периферической крови
Лимфоциты изолировали из периферической крови при помощи устройства с высокой плотностью модулей.
Используемым в качестве примера устройством было устройство с высокой плотностью модулей, состоящее из 87 фильтрующих элементов, каждый из которых содержал каскадный фильтрующий модуль, как показано на Фиг.17С. Каждый каскадный фильтрующий модуль включал первый двойной фильтрующий модуль (элемент 171 на Фиг.17С) и второй двойной фильтрующий модуль (элемент 172 на Фиг.17С), содержащий вход текучей среды-носителя (элемент 175 на Фиг.17С). Каналы и камеры в устройстве имели 30 мкм в глубину. Первый двойной фильтрующий модуль включал 2 фильтра по 116 пор каждый. Каждая пора имела поперечное сечение 30 мкм × 12 мкм, таким образом, физический размер пор составил 12 мкм. Камеры ретентата и камеры фильтрата первого двойного фильтрующего модуля имели такую конструкцию, что скорость потока через пору составляла примерно 0,29% скорости потока на входе в камеру ретентата первого двойного фильтрующего модуля. Второй двойной фильтрующий модуль включал 2 фильтра по 120 пор каждый. Каждая пора имела поперечное сечение 30 мкм × 12 мкм, таким образом, физический размер пор составил 12 мкм. Камеры ретентата и камеры фильтрата второго двойного фильтрующего модуля имели такую конструкцию, что скорость потока через пору составляла примерно 0,34% скорости потока на входе в камеру ретентата второго двойного фильтрующего модуля. Устройство имело 21 мм в длину, 24 мм в ширину, 0,6 мм в толщину и площадь основания 504 мм (21 мм×24 мм).
Устройство было изготовлено из кремния с использованием стандартных методов микротехнологии. Для создания жидкостных каналов, камер и фильтрующих структур использовались фотолитография и глубокое кремниевое реактивное травление. Глубина травления составляла 30 мкм. Кремниевая подложка при помощи анодного склеивания герметично присоединялась на лицевой поверхности протравленного канала к стеклянной пластине, образуя закрытые жидкостные каналы. Приклеенная пластина затем разрезалась на отдельные устройства. Устройство механически сопрягалось с пластмассовым корпусом с внешними резервуарами образца, текучей среды-носителя, ретентата и фильтрата.
2
2
В этом примере для образцов использовалась человеческая периферическая кровь. Кровь брали у согласившихся взрослых доноров при помощи вакуумных контейнеров с ЭДТА-K (Becton Dickinson, Франклин-Лейке, Нью-Джерси). Кровь разбавляли в соотношении 1:1 сбалансированным солевым раствором Хэнкса и обрабатывали при комнатной температуре в течение 8 часов после взятия. В качестве текучей среды-носителя использовался сбалансированный солевой раствор Хэнкса, содержащий 0,5% альбумин бычьей сыворотки и 2 мМ ЭДТА-К.
В резервуар текучей среды-носителя в пластиковом корпусе было добавлено 10 мл текучей среды-носителя для заправки устройства. Затем в резервуар образца было добавлено 8 мл цельной крови. Затем оба резервуара подняли выше уровня резервуаров ретентата и фильтрата для создания высоты напора около 45 см. Кровь и текучая среда-носитель пропускались через устройство под действием силы тяжести и высоты напора. Фильтрат и ретентат собирали в резервуары фильтрата и ретентата, соответственно. Через примерно 40 минут кровь была полностью обработана пропусканием через устройство. Затем выполнялось измерение и анализ фильтрата и ретентата при помощи автоматического счетчика клеток (гематологический анализатор Coulter АсТ diff, Beckman Coulter, Фуллертон, Калифорния), в котором проводился дифференцированный подсчет лимфоцитов, моноцитов, гранулоцитов, эритроцитов и тромбоцитов.
Используемые на входе 8 мл образца крови и 10 мл текучей среды-носителя дали в результате примерно 5 мл ретентата и примерно 13 мл фильтрата. Лимфоциты собирали в текучей среде-носителе в виде ретентата. Этот эксперимент был проведен дважды с использованием образцов крови от двух разных доноров. Результаты показаны на Фиг.34A-34D. Средняя производительность обработки составила 9,2 мл/ч, а чистота изолированных лимфоцитов составила >90%, т.е. из всех лейкоцитов в ретентате >90% были лимфоцитами. Перенос эритроцитов составил 0,5%, а перенос тромбоцитов <1%. Используемая в этом примере разбавленная кровь содержала более 2 млрд эритроцитов на мл. Таким образом, устройство продемонстрировало способность обрабатывать свыше 5 миллионов клеток в секунду.
2
2
Используемое в качестве примера устройство показало, что каждый модуль может изолировать лимфоциты с высокой эффективностью и производительностью и что многие такие модули могут работать параллельно в качестве устройства с высокой плотностью модулей. В частности, каждый фильтрующий элемент состоял из 472 столбиков и занимал площадь основания менее 5,8 мм (т.е. площадь основания устройства 21 мм × 24 мм, разделенная на 87 модулей фильтрации). Объем удержания модуля фильтрации в приведенном в качестве примера устройстве составил примерно 0,015 мкл. При глубине канала 30 мкм, площади основания устройства 504 мм (21 мм × 24 мм) и 87 фильтрующих элементах "плотность фильтрующих элементов устройства составила:
<mrow><mo>=</mo><mfrac><mrow><mn>87</mn></mrow><mrow><mn>504</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><msup><mi>м</mi><mn>2</mn></msup><mo>×</mo><mn>0</mn><mo>,</mo><mn>03</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><msup><mi>м</mi><mn>2</mn></msup></mrow></mfrac><mo>=</mo><mn>5750</mn></mrow>
3
Плотность фильтрующих элементов
фильтрующих элементов на см
"Нормализованная скорость обработки" приведенного в качестве примера устройства рассчитывается по следующей формуле:
<mrow><mo>=</mo><mfrac><mrow><mn>5</mn><mo>×</mo><msup><mrow><mn>10</mn></mrow><mn>6</mn></msup><msup><mi>с</mi><mrow><mo>−</mo><mn>1</mn></mrow></msup></mrow><mrow><mo stretchy="false">(</mo><mn>21</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><msup><mi>м</mi><mn>2</mn></msup><mo>×</mo><mn>0</mn><mo>,</mo><mn>03</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><msup><mi>м</mi><mn>2</mn></msup><mo stretchy="false">)</mo><mo>×</mo><mo stretchy="false">(</mo><mn>0</mn><mo>,</mo><mn>03</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><mi>м</mi><mo stretchy="false">)</mo></mrow></mfrac><mo>=</mo><mn>0</mn><mo>,</mo><mn>33</mn><mo>×</mo><msup><mrow><mn>10</mn></mrow><mn>6</mn></msup><msup><mi>с</mi><mrow><mo>−</mo><mn>1</mn></mrow></msup><mi>м</mi><msup><mi>м</mi><mrow><mo>−</mo><mn>3</mn></mrow></msup></mrow>
Нормализованная скорость обработки
Такая "нормализованная скорость обработки" означает, что каждый кубический миллиметр канала и фильтрующей структуры на этом устройстве обеспечивает обработку 0,33 миллионов клеток в секунду.
Этот пример характеризует сложный характер исключения по потоку в некоторых аспектах и вариантах воплощения настоящего изобретения и то, как исключение по потоку может использоваться для изолирования компонентов из комплексной текучей среды, например изолирования лимфоцитов из крови, так как это не ожидалось или не было очевидным в свете предыдущих изобретений на сегодняшний день. В частности, все основные типы клеток в крови, т.е. эритроциты, гранулоциты, моноциты и лимфоциты, были существенно меньше физического размера пор устройства. Средний диаметр клеток эритроцитов, гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов составлял примерно 7 мкм, 8 мкм, 6 мкм и 5 мкм, соответственно. Кроме того, лимфоциты являются наименьшими компонентами среди основных типов клеток, имеют средний объем клеток около 60 фл по сравнению с 90 фл, 250 фл и 120 фл у эритроцитов, гранулоцитов и моноцитов, соответственно. Тем не менее, лимфоциты были единственным типом клеток, которые были в основном задержаны фильтрами в приведенном в качестве примера устройстве, с процентом удержания около 60% по сравнению с процентом удержания около 0% для всех других типов клеток (Фиг.34С).
Этот пример отчетливо демонстрирует, что процесс сепарации в описанном в качестве примера приложении является стохастическим, а задержание частиц лучше всего описывается с использованием вероятности, т.е. вероятности удержания или уровня удержания. В частности, путь миграции клетки крови не может быть предопределен, по меньшей мере предопределен не только в соответствии с критическим размером. К возможным факторам, которые могли повлиять на вероятность удержания, относятся взаимодействие между клетками, броуновское движение, деформация клеток и возмущение картин потока.
Пример 5. Снижение объема человеческой пуповинной крови и обогащение гематопоэтических стволовых клеток с высокой жизнеспособностью клеток
При помощи устройства с высокой плотностью модулей был снижен объем пуповинной крови и были восстановлены лейкоциты, клетки CD34+ и колониеобразующие стволовые клетки, и клетки-предшественницы, в том числе КОЕ-ГМ, с высокой жизнеспособностью клеток.
Используемым в качестве примера устройством было устройство с высокой плотностью модулей, состоящее из 87 фильтрующих элементов, каждый из которых содержал каскадный фильтрующий модуль, как показано на Фиг.17С. Каждый каскадный фильтрующий модуль включал первый двойной фильтрующий модуль (элемент 171 на Фиг.17С) и второй двойной фильтрующий модуль (элемент 172 на Фиг.17С). Каналы и камеры в устройстве имели 30 мкм в глубину. Первый двойной фильтрующий модуль включал 2 фильтра по 120 пор каждый. Каждая пора имела поперечное сечение 30 мкм × 12 мкм, таким образом, физический размер пор составил 12 мкм. Камеры ретентата и камеры фильтрата первого двойного фильтрующего модуля имели такую конструкцию, что скорость потока через пору составляла примерно 0,28% скорости потока на входе в камеру ретентата первого двойного фильтрующего модуля. Второй двойной фильтрующий модуль включал 2 фильтра по 320 пор каждый. Каждая пора имела поперечное сечение 30 мкм × 12 мкм, таким образом, физический размер пор составил 12 мкм. Камеры ретентата и камеры фильтрата второго двойного фильтрующего модуля имели такую конструкцию, что скорость потока через пору находилась в диапазоне примерно от 0,10% примерно до 0,14% скорости потока на входе в камеру ретентата второго двойного фильтрующего модуля. Устройство имело 23 мм в длину, 24 мм в ширину, 0,6 мм в толщину и площадь основания 552 мм (23 мм × 24 мм).
По результатам оценки размер удержания устройства составил около 4 мкм, что существенно меньше физического размера пор 12 мкм.
Устройство было изготовлено из кремния с использованием стандартных методов микротехнологии. Для создания жидкостных каналов, камер и фильтрующих структур использовались фотолитография и глубокое кремниевое реактивное травление. Глубина травления составляла 30 мкм. Кремниевая подложка при помощи анодного склеивания герметично присоединялась на лицевой поверхности протравленного канала к стеклянной пластине, образуя закрытые жидкостные каналы. Приклеенная пластина затем разрезалась на отдельные устройства. Устройство механически сопрягалось с пластмассовым корпусом с внешними резервуарами образца, ретентата и фильтрата.
В этом примере для образцов использовалась человеческая пуповинная кровь. Кровь брали у согласных взрослых женщин с использованием мешков сбора пуповинной крови (Fenwal Inc., Раунд-Лейк, Иллинойс). В качестве антикоагулянта в мешках сбора пуповинной крови содержалась цитрат фосфат декстроза (ЦФД). Кровь обрабатывалась при комнатной температуре в течение 6 часов после взятия.
2
В устройство добавили 12 мл пуповинной крови без дополнительного разбавления. Гематокрит подаваемой пуповинной крови находился в диапазоне от 19% до 45%, и в среднем в мл крови содержалось 2,8 млрд красных кровяных телец. Гематокрит - это пропорция объема крови, занятая красными кровяными тельцами. Кровь пропускалась через устройство под действием силы тяжести и высоты напора около 40 см. Фильтрат и ретентат собирали в резервуар фильтрата и резервуар ретентата, соответственно. Ожидалось, что лейкоциты, клетки CD34+ и колониеобразующие стволовые клетки, а также клетки-предшественницы будут восстановлены в виде ретентата. Через примерно 1 час кровь была полностью обработана пропусканием через устройство. Затем выполнялось измерение и анализ фильтрата и ретентата при помощи автоматического счетчика клеток (гематологический анализатор Coulter АсТ diff, Beckman Coulter, Фуллертон, Калифорния). Жизнеспособность восстановленных клеток измеряли сразу же после рабочего цикла при помощи пропидиум иодида, штамма, проникающего в клетки с поврежденными мембранами, гематоцитометра и флуоресцентного микроскопа. Восстановление клеток CD34+ измеряли с использованием проточной цитометрии. Для подсчета колониеобразующих клеток смешивали пуповинную кровь и ретентат с лизисным раствором хлористого аммония (Stemcell Technologies, Ванкувер, Британская Колумбия, Канада) для лизиса красных кровяных телец, промывали, а затем выращивали в метилцеллюлозной питательной среде (Stemcell Technologies, Ванкувер, Британская Колумбия, Канада) в течение 14 дней при помощи инкубатора с установкой температуры 37 градусов Цельсия, 5% CO и высокой влажностью. Через 14 дней колонии КОЕ-ГМ подсчитывали вручную при помощи инвертированного микроскопа.
Результаты экспериментов показаны на Фиг.35А-35С. Лейкоциты, клетки CD34+ и колониеобразующие клетки (например, КОЕ-ГМ) восстанавливали в ретентаты с результатом восстановления 88%, 87% и 92%, соответственно. Устройство снижало объем пуповинной крови примерно в 5,4 раза, т.е. объемы ретентата были примерно 18,5% объема подаваемой пуповинной крови. При таком коэффициенте снижения объема 100 мл пуповинной крови будет снижено до 18,5 мл. Жизнеспособность клеток до и после обработки была в основном идентичной в пределах погрешности измерения и составляла >99%. Производительность обработки в среднем составляла около 11,4 мл/ч. Эта производительность эквивалентна обработке около 9 миллионов клеток в секунду.
"Нормализованная скорость обработки" приведенного в качестве примера устройства рассчитывается по следующей формуле:
<mrow><mo>=</mo><mfrac><mrow><mn>9</mn><mo>×</mo><msup><mrow><mn>10</mn></mrow><mn>6</mn></msup><msup><mi>с</mi><mrow><mo>−</mo><mn>1</mn></mrow></msup></mrow><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><mn>23</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><mi>м</mi><mo>×</mo><mn>24</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><mi>м</mi></mrow><mo>)</mo></mrow><mo>×</mo><mrow><mo>(</mo><mrow><mn>0</mn><mo>,</mo><mn>03</mn></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow></mfrac><mo>=</mo><mn>0</mn><mo>,</mo><mn>54</mn><mo>×</mo><msup><mrow><mn>10</mn></mrow><mn>6</mn></msup><msup><mi>с</mi><mrow><mo>−</mo><mn>1</mn></mrow></msup><mi>м</mi><msup><mi>м</mi><mrow><mo>−</mo><mn>3</mn></mrow></msup></mrow>
Нормализованная скорость обработки
Каждый кубический миллиметр канала и фильтрующей структуры в этом приведенном в качестве примера устройстве обеспечивал обработку 0,54 миллионов клеток в секунду.
2
2
Этот пример показал, что используемое устройство может концентрировать стволовые клетки пуповинной крови и клетки-предшественницы с очень хорошим результатом восстановления и жизнеспособностью клеток. В частности, каждый фильтрующий элемент состоял из 880 столбиков и занимал площадь основания менее 6,4 мм (т.е. площадь основания устройства 23 мм × 24 мм, разделенная на 87 фильтрующих элементов). Объем удержания модуля фильтрации в приведенном в качестве примера устройстве составил примерно 0,04 мкл. При глубине канала 30 мкм, площади основания устройства 552 мм (23 мм × 24 мм) и 87 фильтрующих элементах "плотность фильтрующих элементов" устройства составила:
<mrow><mo>=</mo><mfrac><mrow><mn>87</mn></mrow><mrow><mn>552</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><msup><mi>м</mi><mn>2</mn></msup><mo>×</mo><mn>0</mn><mo>,</mo><mn>03</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><msup><mi>м</mi><mn>2</mn></msup></mrow></mfrac><mo>≅</mo><mn>5250</mn></mrow>
3
Плотность фильтрующих элементов
фильтрующих элементов на см
Показатель эффективности конструкции используемого устройства рассчитывается ниже:
Производительность обработки подачи
Q=11,4 мл/ч=3,17 мм<sup>3</sup>/с
Характеристическая глубина канала
D=30 мкм=0,03 мм
Площадь основания устройства
А=23 мм × 24 мм=552 мм<sup>2</sup>
Размер удержания
R=4 мкм=0,004 мм
Скорость сдвига
S=1900 с<sup>-1</sup> (расчет приведен ниже)
Максимальная скорость сдвига в устройстве имеет место на поверхности камеры ретентата возле ее входа. Максимальную скорость сдвига можно рассчитать при помощи компьютерной жидкостной динамики или оценить аналитически, как описано ниже, приняв допущение, что профиль потока является параболическим в камере ретентата. Учитывая, что устройство содержит 87 модулей фильтрации и что каждый входной канал имеет известное поперечное сечение 130 мкм × 30 мкм на входе, средняя скорость потока <v> в камере ретентата на входе рассчитывается по следующей формуле:
<mrow><mrow><mo>〈</mo><mi>v</mi><mo>〉</mo></mrow><mo>=</mo><mfrac><mrow><mn>3</mn><mo>,</mo><mn>17</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><msup><mi>м</mi><mn>3</mn></msup><mi>с</mi></mrow><mrow><mn>87</mn><mo>×</mo><mrow><mo>(</mo><mrow><mn>130</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><mi>м</mi><mo>×</mo><mn>30</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><mi>м</mi></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow></mfrac><mo>=</mo><mn>9</mn><mo>,</mo><mn>34</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><mi>м</mi><mo>/</mo><mi>c</mi></mrow>
Таким образом, скорость сдвига на поверхности камеры ретентата, если предположить наличие параболического профиля, составляет
<mrow><mi>S</mi><mo>≈</mo><mn>6</mn><mo>×</mo><mfrac><mrow><mrow><mo>〈</mo><mi>v</mi><mo>〉</mo></mrow></mrow><mrow><mn>30</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><mi>к</mi><mi>м</mi></mrow></mfrac><mo>≅</mo><mn>1900</mn><mtext> </mtext><msup><mi>с</mi><mrow><mo>−</mo><mn>1</mn></mrow></msup></mrow>
Показатель эффективности конструкции (D.E.I.) приведенного в качестве примера устройства определяется следующим образом:
<mrow><mi>D</mi><mo>.</mo><mi>Е</mi><mo>.</mo><mi>I</mi><mo>.</mo><mo>=</mo><mfrac><mi>Q</mi><mrow><mi>A</mi><mi>D</mi><mi>S</mi><msup><mi>R</mi><mn>2</mn></msup></mrow></mfrac><mo>≈</mo><mfrac><mrow><mn>3</mn><mo>,</mo><mn>17</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><msup><mi>м</mi><mn>3</mn></msup><mo>/</mo><mi>с</mi></mrow><mrow><mn>552</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><msup><mi>м</mi><mn>2</mn></msup><mo>×</mo><mn>0</mn><mo>,</mo><mn>03</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><mi>м</mi><mo>×</mo><mn>1900</mn><mtext> </mtext><msup><mi>с</mi><mrow><mo>−</mo><mn>1</mn></mrow></msup><mo>×</mo><msup><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><mn>0</mn><mo>,</mo><mn>004</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><mi>м</mi></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mn>2</mn></msup></mrow></mfrac><mo>=</mo><mn>6</mn><mo>,</mo><mn>3</mn><mtext> </mtext><mi>м</mi><msup><mi>м</mi><mrow><mo>−</mo><mn>2</mn></mrow></msup></mrow>
Используемое в качестве примера устройство в Примере 2 может служить для маркировки субпопуляций клеток, имеющих по меньшей мере один специфический антиген, с использованием текучей среды-носителя, включающей антитела по меньшей мере к одному специфическому антигену. Антитело может быть конъюгировано к флуорофору или магнитному шарику для флуоресцентного или магнитного маркировки целевых клеток. Во время процесса сепарации клетки ретентата направляются из потока подаваемого вещества в поток текучей среды-носителя и смешиваются с антителами. Клетки ретентата, имеющие специфический антиген, помечаются и собираются в виде ретентата. Необязательно в модули фильтрации устройства может вводиться промывочный раствор, так же, как и поток носителя, для промывки клеток при их прохождении через модули. Процесс сепарации может быть выполнен при температуре, благоприятной для маркировки специфического антитела. После этого флуоресцентно меченные клетки могут подсчитываться и охарактеризовываться при помощи проточного цитометра, а магнитно меченные клетки могут изолироваться при помощи магнита. К антителам, которые могут использоваться для маркировки субпопуляций лейкоцитов и других клеток, присутствующих в крови, относятся антитела к CD45, CD34, CD71, CD138, CD14, CD15, CD3, CD4, CD8, CD19, HLA, GPA, CD271, CD43, CD 10, CD33, CD66 и CD105. Текучая среда-носитель может включать другие реагенты, кроме антител, для маркировки, обработки, изменения, окрашивания, промывки или даже лизиса клеток ретентата, которые выполняются подобным образом. К возможным реагентам, которые могут использоваться в качестве потока носителя, могут относиться красители из нуклеиновых кислот, фиксативы, замораживающие растворы, алкилирующие агенты, антитела, магнитные шарики, ферменты, коллагеназа, липаза, ДНКаза, субстраты определенных ферментов, активные производные циклофосфамида, факторы роста, детергенты и лизисные растворы. В этом примере иллюстрируется использование устройства фильтрации по настоящему изобретению для выполнения сепарации и маркировки, обработки, изменения, окрашивания, промывки или лизиса клеток за один шаг. Такой способ, как ожидается, очень полезен во многих приложениях, в том числе для изолирования стволовых клеток CD34+, изолирования циркулирующих опухолевых клеток, приготовления стромальных васкулярных фракций, подсчета клеток CD4+, изолирования злокачественных клеток плазмы, определения активности дегидрогеназы альдегида, сепарации специфических клеток, исходя из ферментной активности, изолирования специфических клеток по поверхностным антигенам.
Другие варианты воплощения
Из предыдущего описания очевидно, что в описанное здесь изобретение могут вноситься вариации и модификации для приспособления к различным применениям и условиям. Такие варианты воплощения также входят в область действия следующих пунктов формулы изобретения.
Перечисление элементов в любом определении переменной здесь включает определения такой переменной как любого отдельного элемента или комбинации (либо подкомбинации) перечисленных элементов. Приведение варианта воплощения по настоящему описанию включает такой вариант воплощения в виде любого единичного варианта воплощения или в комбинации с любыми другими вариантами воплощения или их частью.
Все упомянутые патенты и публикации включаются в настоящее описание путем ссылки в такой же мере, как если бы каждый независимый патент и публикация прямо и отдельно указывались как включенные путем ссылки.
Описав несколько аспектов по меньшей мере одного варианта воплощения настоящего изобретения, следует понимать, что специалисты в данной области техники могут реализовать различные изменения, модификации и улучшения. Предполагается, что такие изменения, модификации и улучшения являются частью настоящего изобретения и соответствуют духу и области действия настоящего изобретения. Следовательно, предыдущее описание и чертежи приведены только в качестве примера.