Способ защиты шмелей от токсического действия митохондриально-направленных пестицидов
METHOD FOR PROTECTION OF BUMBLEBEES FROM TOXIC ACTION OF MITOCHONDRIAL-DIRECTED PESTICIDES

Изобретение относится к области сельского хозяйства и может быть использовано для защиты шмелей от токсического действия митохондриально-направленных пестицидов.
2
2
2
2
2
2
Метиленовый синий (МС) - органический основной тиазиновый краситель, который получил широкое распространение в медицине в качестве лекарства от малярии, метгемоглобинемии и при отравлении цианидом (Schirmer et al., 2011). В последние два десятилетия МС является одним из наиболее перспективных лекарств для терапии нейродегенеративных заболеваний. Это возможно благодаря высокой липофильности МС, которая позволяет ему проникать через гематоэнцефалический барьер и мембраны митохондрий (Rojas JC, Bruchey AK, Gonzalez-Lima F (2012) Neurometabolic mechanisms for memory enhancement and neuroprotection of methylene blue. Prog Neurobiol 96:32-45.). МС проявляет свойства редокс-компонента электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) митохондрий за счет того, что может окислять NADH и переносить электроны на цитохром с. Этот эффект известен как альтернативный транспорт электронов (Wen Y, Li W, Poteet EC, Xie L, Tan C, Yan LJ, Ju X, Liu R, Qian H, Marvin MA, Goldberg MS, She H, Mao Z, Simpkins JW, Yang SH (2011) Alternative mitochondrial electron transfer as a novel strategy for neuroprotection. J Biol Chem 286:16504-16515.). Это позволяет МС оказывать нейропротекторный эффект за счет регулирования митохондриального метаболизма и гомеостаза активных форм кислорода, которые играют ведущую роль в патогенезе нейродегенеративных заболеваний и участвуют в процессах старения (Harman D (2009) Origin and evolution of the free radical theory of aging: a brief personal history, 1954-2009. Biogerontology 10:773-781.). Имеются доказательства того, что МС демонстрирует антиоксидантные свойства в клеточных культурах в присутствии сильных оксидантов, таких как НО или ротенон (Atamna Н, Nguyen A, Schultz С et al (2008) Methylene blue delays cellular senescence and enhances key mitochondrial biochemical pathways. FASEB J 22:703-712; 2008; Wen Y, Li W, Poteet EC, Xie L, Tan C, Yan LJ, Ju X, Liu R, Qian H, Marvin MA, Goldberg MS, She H, Mao Z, Simpkins JW, Yang SH (2011) Alternative mitochondrial electron transfer as a novel strategy for neuroprotection. J Biol Chem 286:16504-16515; Poteet E, Winters A, Yan LJ, Shufelt K, Green KN, Simpkins JW, Wen Y, Yang SH (2012) Neuroprotective actions of methylene blue and its derivatives. PLoS One 7:e48279). Метиленовый синий способен вызывать альтернативный транспорт электронов в митохондриях (Gureev АР, Syromyatnikov MY, Gorbacheva ТМ, Starkov АА, Popov VN. (2016) Methylene blue improves sensorimotor phenotype and decreases anxiety in parallel with activating brain mitochondria biogenesis in mid-age mice. Neurosci Res 113:19-27). Согласно классической теории, МС принимает электроны от NADH и переносит на цитохром с. Подавление МС-индуцированной продукции НОсвязано с тем, что сайт, восстанавливающий МС-Н2, расположен до сайта связывания антимицина, то есть либо в III комплексе, либо на уровне убихинона. Согласно модели, предложенной Tretter et al. (Tretter L, Horvath G,  A, Essek F, Adam-Vizi V (2014) Enhanced hydrogen peroxide generation accompanies the beneficial bioenergetic effects of methylene blue in isolated brain mitochondria. Free Radic Biol Med 77:317-330), МС способен окисляться NADH и FADH2 до MC-H2 и восстанавливаться цитхромом с и молекулярным кислородом с образованием НО. Ранее было неоднократно показано, что МС улучшает митохондриальный метаболизм (Poteet Е, Winters A, Yan LJ, Shufelt K, Green KN, Simpkins JW, Wen Y, Yang SH (2012) Neuroprotective actions of methylene blue and its derivatives. PLoS One 7:e48279; Atamna H, Nguyen A, Schultz С et al (2008) Methylene blue delays cellular senescence and enhances key mitochondrial biochemical pathways. FASEB J 22:703-712). Было высказано предположение, что МС может увеличить скорость митохондриального дыхания за счет стимулирования активности I, III и IV комплекса ЭТЦ (Atamna Н, Nguyen A, Schultz С et al (2008) Methylene blue delays cellular senescence and enhances key mitochondrial biochemical pathways. FASEB J 22:703-712). Кроме того, нами ранее получены данные, которые указывают, что МС может активировать митохондриальный биогенез. Было отмечено также, что in vitro МС не оказывает генотоксичности. Кроме того, МС может частично препятствовать ротенон-индуцируемой нейротоксичности. Таким образом, метиленовый синий может являться потенциальным антидотом от токсического действия пестицидов митохондриальной направленности, таких как ротенон, гидраметилнон, пиридабен, дифеноконазол и феназахин.
Известен способ защиты вегетирующих растений подсолнечника от повреждающего действия 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) (RU 2567515 С1, опубл. 10.11.2015). В данном способе осуществляют обработку подсолнечника антидотом в количестве 200 г/га через 1 сутки после использования 2,4-Д. В качестве антидота используют N-(4-этилфенил)-4-метил-2,6-дихлорникотинамид. Способ применим только для защиты растений от гербицидов.
Известны замещенные изоксазолины, способ их получения, содержащие их средства и их применение в качестве антидота (RU 96107881 А, опубл. 20.07.1998). Данное изобретение применимо только для защиты растений.
Известен способ борьбы с вредными растениями в культурах полезных растений (RU 2420065 С2, опубл. 10.06.2011). В качестве антидота в данном изобретении используются амиды ацилсульфамоилбензойных кислот.Данное изобретение применимо только для защиты растений.
Известна антидотная композиция биологического происхождения для использования в растениеводстве (RU 2518252 С1, опубл. 10.06.2014). В данном изобретении предложена антидотная композиция, состоящая из биомассы Bacillus megaterium, Pseudomonas aureofaciens либо других непатогенных бактерий, содержащих биополимер поли-бета-гидроксимасляную кислоту в количестве не менее 0,4 масс. % в расчете на финальную композицию, гидролизованной с помощью микромицетов рода Cephaliophora при температуре 50-60°С, а также определенного набора макро- и микроэлементов. Изобретение включает также способы эффективного использования данной композиции в практике растениеводства в качестве антидота для защиты сельскохозяйственных растений от стрессового воздействия гербицидов и других химических пестицидов.
Известен способ защиты (RU 2007105988 А, опубл. 27.08.2008). В данном изобретении описывается применение различных веществ для снижения или устранения фитотоксичных побочных эффектов пестицида на полезные растения. Данное изобретение применимо только для защиты растений.
Известен наноразмерный ферментный биокатализатор для детоксификации фосфорорганических соединений in vivo (RU 2525658 С2, опубл. 27.03.2014). В способе предложен ферментный биокатализатор в виде наноразмерных частиц для детоксификации фосфорорганических соединений in vivo. Биокатализатор представляет собой нековалентные полиэлектролитные комплексы. Способ применим только для детоксификации фосфорорганических соединений.
3
Известен способ детоксикации загрязненных пестицидами вод рисовых оросительных систем (RU 94035290 А1, опубл. 27.07.1996). Сущность изобретения: загрязненные пестицидами воды рыбных оросительных систем опрыскивают водной суспензией активированного угля, имеющего микропоры объемом не менее 0,2-0,3 см/г. При этом опрыскивание осуществляют на 4-8 сутки после применения пестицида. Способ не применим для защиты от пестицидов животных.
Известен антидот (RU 2243653 С2, опубл. 10.01.2005). Изобретение относится к рыбоводству и может найти применение в рыбоводных хозяйствах, загрязненных пестицидами. В способе используется лазин в качестве антидота для гидробионтов при отравлениях триазолами и фосфорорганическими соединениями. Способ применим только для защиты рыб от триазолов и фосфорорганических соединений.
Известен способ детоксикации хлорорганических пестицидов в организме животных, взятый за прототип (RU 2458524 С1, опубл. 20.08.2012). Детоксикацию пестицидов в организме животных осуществляют ежедневным в течение не менее 30 дней введением в рацион животных с водой для выпаивания синтетических аналогов аминокислот: метионина и фенилаланина в количестве не менее 50 мг на 1 л воды каждого. Изобретение применимо только для детоксикации хлорорганических пестицидов.
Шмели являются универсальными опылителями энтомофильных культур в теплицах (Morandin LA et al. (2001) Bumble bee (Hymenoptera: Apidae) activity and pollination levels in commercial tomato greenhouses. Journal of Economic Entomology 94(2): 462-467). В ходе проведенных исследований на базе Воронежского государственного университета, было установлено, что метиленовый синий обладает активностью антидота (при его добавлении в сахарный сироп, которым питаются шмели) при интоксикации шмелей митохондриально направленными пестицидами.
Технический результат - снижение смертности и увеличение полетной активности шмелей при интоксикации митохондриально-направленными пестицидами.
Технический результат достигается тем, что в способе защиты шмелей от токсического действия митохондриально-направленных пестицидов, включающем кормление шмелей сахарным сиропом, согласно изобретению, шмелей, подвергшихся контактному действию с раствором митохондриально-направленного пестицида в его концентрации в растворе не более 0,0005% в виде жидкости или аэрозоля, кормят сахарным сиропом с метиленовым синим в его концентрации 0,002% и количестве не менее 1 мл в пересчета на одного шмеля на 1 сутки, начинают кормление либо сразу после контакта с пестицидом, но не позднее чем через один час после контакта продолжительностью в течение 1 суток, либо не ранее чем за 2 суток до контакта шмелей с пестицидом и прекращают кормление через 1 сутки после контакта с пестицидом.
Способ реализуется следующим образом:
1. Приготавливают концентрированный раствор метиленового синего (концентрация не менее 0,01%).
2. Приготавливают сахарный сироп (концентрация сахарозы от 40 до 65%) либо инвертированный сахарный сироп, либо используют коммерчески доступный сахарный сироп.
3. В сахарный сироп добавляют метиленовый синий из предварительно приготовленного концентрированного раствора (см. п. 1) до его концентрации в сахарном сиропе 0,002%. Хорошо перемешивают сироп.
4. Сахарный сироп с метиленовым синим помещают в кормушки для кормления шмелей. Сироп добавляют из расчета не менее 1 мл на 1 шмеля на 1 сутки.
5. В садок со шмелями, которые подверглись действию митохондриально-направленных пестицидов в виде жидкости или аэрозоля в концентрации не более 0,0005%, помещают кормушку, содержащую сахарный сироп с метиленовым синим так, чтобы кормление началось сразу после контакта с пестицидом или не позднее 1 часа после контакта с пестицидом, а также, чтобы насекомые могли легко потреблять этот сироп в течение 1 суток.
В садок со шмелями, которые неизбежно будут контактировать с митохондриально-направленным пестицидом в концентрации не более 0,0005% в виде аэрозоля или жидкости, не ранее чем за двое суток помещают кормушку, содержащую сахарный сироп с метиленовым синим так, чтобы насекомые могли легко потреблять этот сироп. Кормление сиропом с добавлением метиленового синего прекращают через 1 сутки после контакта с пестицидом.
Предлагаемый способ защиты шмелей от токсического действия митохондриально-направленных пестицидов применим как в лабораторных, так и в полевых условиях.
Пример 1.
Лабораторные популяции шмелей (Bombus terrestris) подверглись контакту с водным раствором пестицида дифеноконазол в концентрации 0,0001% в течение 1 секунды. В садках со шмелями - 5 садков по 10 шмелей, которые сразу после контакта с пестицидом питались 60% сахарным сиропом с добавлением метиленового синего в концентрации 0,002% в 300 мл сиропа, смертность в следующие 3 суток после контакта с пестицидом не повысилась относительно шмелей, которые не контактировали с пестицидом; в садках со шмелями (5 садков по 10 шмелей), которые питались сахарным сиропом без добавления метиленового синего, смертность составила 44%. Кроме того, полетная активность у шмелей, которые питались сахарным сиропом без добавления метиленового синего после контакта с дифеноконазолом, снизилась на 86% относительно шмелей, которые питались сахарным сиропом с добавлением метиленового синего. При этом полетная активность шмелей, которые питались сиропом с добавлением метиленового синего и без него, достоверно не отличалась.
Пример 2.
В садок со шмелями (Bombus terrestris) - 30 шмелей за двое суток до их контакта с митохондриально-направленным пестицидом ротенон в концентрации 0,0005% в течение 1 секунды в виде аэрозоля, помещали кормушку, содержащую 100 мл 60% сахарного сиропа с метиленовым синим в концентрации 0,002% так, чтобы насекомые могли легко потреблять этот сироп. Кормление сиропом с добавлением метиленового синего прекращали через 1 сутки после контакта с пестицидом.
В садках со шмелями, которые контактировали с пестицидом, питались 60% сахарным сиропом с добавлением метиленового синего в концентрации 0,002% в сиропе до и после контакта с пестицидом, смертность в следующие сутки после контакта с пестицидом не повысилась относительно шмелей, которые не контактировали с пестицидом; в садках со шмелями, которые питались сахарным сиропом без добавления метиленового синего, смертность составила 10%. Кроме того, полетная активность у шмелей, которые питались сахарным сиропом без добавления метиленового синего после контакта с ротеноном, снизилась на 24% относительно шмелей, которые питались сахарным сиропом с добавлением метиленового синего. При этом полетная активность шмелей, которые питались сиропом с добавлением метиленового синего и без него, достоверно не отличалась.