СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОКРЫТЫХ ЦИТРАТОМ И ЛЕГИРОВАННЫХ ФТОРИДОМ НАНОЧАСТИЦ АМОРФНОГО ФОСФАТА КАЛЬЦИЯ
METHOD OF PRODUCING AMORPHOUS CALCIUM PHOSPHATE NANOPARTICLES COATED WITH CITRATE AND DOPED WITH FLUORIDE

Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Биоматериалы, представляющие интерес в биомедицине (т.е. в области наноносителей для доставки лекарственных средств и в области восстановления костей) и стоматологии.
Настоящее изобретение относится к способу получения наночастиц фосфата кальция, покрытых цитратом (молекулой, которая образует часть органической фазы кости) и легированных фторидом. Этот материал имеет широкий спектр применений в области биомедицины (т.е. в области наноносителей для доставки лекарственных средств и в области восстановления костей) в связи с его отличной биоразлагаемостью и биологической активностью, в дополнение к стимуляции неспецифической адгезии клеток и остеогенерации. Аналогичным образом он имеет множество применений в стоматологии, где он может быть использован в зубных пастах, жидкостях для полоскания рта, фторидных зубных лаках, жевательной резинке и гелях в качестве средства, реминерализующего дентин и эмаль.
В основе этого способа лежат два раствора, образованные с использованием хлорида кальция и цитрата натрия, с одной стороны, и моногидрофосфата натрия и карбоната натрия со фтористым соединением, с другой стороны, которые смешивают при комнатной температуре. В том, что касается известного уровня техники, его преимущества заключаются в том, что этот способ является экологически эффективным и экологически безопасным, так как после него не остается никакого кислотного остатка (сильные кислоты не применяются в ходе синтеза), процесс синтеза проводят в одну стадию (с применением цитрата натрия в качестве реакционноспособного средства в синтезе), и впервые получают покрытый цитратом и легированный фторидом аморфный фосфат кальция, который, в связи с этим, обладает более сильным реминерализующим действием, чем аморфный фосфат кальция.
Уровень техники
Аморфная фаза является более редкой формой минерального фосфата кальция (СаР) в живых организмах. Аморфный фосфат кальция (АСР) был обнаружен в митохондриях эукариотических и прокариотических клеток, и полагают, что он является предшествующей стадией в процессе образования минеральной фазы кости, нанокристаллического карбонат-апатита. Недавно было обнаружено, что поверхность этого костного апатита покрыта цитратом. АСР также выступает в роли промежуточной фазы при получении различных форм СаР с помощью различных способов. Этот материал имеет широкий спектр применений в области биомедицины в связи с его представляющими интерес свойствами, такими как отличная биологическая активность, он способствует неспецифической адгезии клеток, а также содействует остеокондуктивности и остеогенерации. Точно так же он имеет множество применений в стоматологии, где он может быть использован в зубной пасте, жидкостях для полоскания рта, жевательной резинке, гелях и фторидных зубных лаках в качестве средства, реминерализующего дентин и эмаль.
В WO 98/40406 раскрыт продукт, состоящий из аморфного фосфата кальция, стабилизированного казеином, фосфопротеином, который присутствует в молоке. Этот продукт в настоящее время применяют в качестве абразивного материала в зубных пастах, жевательной резинке и средствах для отбеливания зубов после процедур по уходу за зубами. Однако его эффективность в предупреждении кариеса и реминерализации поврежденного зубного лака все еще не была продемонстрирована. АСР также применяют в составных полимерных материалах в качестве материала-наполнителя при приготовлении фрагментов зубов. АСР стимулирует восстановление зубов, особенно благодаря тому факту, что ионы Са и фосфата высвобождаются в ответ на кислые значения рН, достигаемые благодаря бактериальному зубному налету, и осаждаются на структуре зуба в форме гидроксиапатита, восстанавливая эмаль (главным образом состоящую из кристаллического гидроксиапатита). В таблице 1 подытожены основные применения АСР в качестве биоматериала.
Некоторые из таких областей применения описаны в работе J. Zhao et al., Amorphous calcium phosphate and its application in dentistry; Chemistry Central Journal (2011), 5: 40 (doi:10.1186/1752-153X-5-40).
2+
3-
4
2
3
4
3
2
Что касается получения АСР, известно несколько форм, получаемых из растворимых Са- и PO-предшественников при рН, необходимых для осаждения, причем обычно применяют растворимые предшественники, катионы которых не образуют другие соединения, которые моли бы оказывать отрицательное влияние апостериори в композиции конечного продукта, такие как Са(ОН), HPO, фосфат или гидрофосфат аммония. Зачастую применяют Са(NO).
2+
2+
Функция комплексообразователя с катионом Са также известна у лимонной кислоты, которая также является приемлемой с фармацевтической точки зрения, в дополнение, например, к другим поликарбоновым кислотам, таким как винная кислота. По этой причине такие кислоты тоже применяют для стабилизации аморфных композиций с АСР. Это изложено в формуле изобретения патентной заявки WO 03059304, в которой лимонная кислота предложена среди прочих хелатообразователей с катионом Са в содержании 0,1% - 5% по массе в препарате, содержащем АСР в сочетании с фосфопептидом.
В патентном документе JP 2001169121 предложено применение лимонной кислоты в качестве стабилизатора АСР, уже образовавшегося в результате осаждения из фосфорной кислоты и гидроксида кальция, путем его последующего размалывания в присутствии указанной выше лимонной кислоты.
С учетом вышесказанного, ни в одной из этих публикаций не упоминается такой способ получения, как заявляемый настоящим изобретением, который предусматривает, что цитрат добавляют в качестве реакционноспособного средства для осаждения АСР (в одностадийном способе), но не в качестве стабилизатора в фазе после осаждения (двухстадийный способ).
В обзорах, приведенных в работах Dorozhkin S.V. [Nanosized and nanocrystalline calcium orthophsphates, Acta Biomaterialia (2010), No. 6 (3), 715-734]; Combes C. and Rey C. [Amorphous calcium phosphates: synthesis, properties and uses in biomaterials, Acta Biomaterialia (2010), No.6 (9), 3362-3378], и в еще одном обзоре Dorozhkin S.V. [Amorphous calcium phosphates, Acta Biomaterialia (2010), No. 6 (12), 4457-4475, раскрыты несколько способов жидкостной обработки, но в которых не применяются вышеупомянутые условия, стадии способа и реакционноспособные средства способа по настоящему изобретению. Фактически, такие способы получения в качестве диспергирующего средства зачастую предусматривают лимонную кислоту и в некоторых случаях карбонатные анионы со сходными функциями.
В публикации J.М.  et al. Crystallization of bioinspired citrate-functionalized nanoapatite with tailored carbonate content (Acta Biomaterialia (2012) No. 8, page 3491) раскрыт способ осаждения покрытого апатитом и цитратом нанокристаллического карбонат-апатита. Существенные различия в уровне техники между способом по настоящему изобретению и способом, приведенном в этом документе, следующие:
(1) температура осаждения;
(2) осаждение покрытых цитратом и легированных фторидом наночастиц АСР в виде стабильной фазы;
(3) отсутствует процесс созревания осадка;
(4) в осадке не образуется апатит или любая другая кристаллическая фаза фосфата кальция.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Первым объектом настоящего изобретения является способ получения покрытого цитратом и легированного фторидом аморфного фосфата кальция (FACP), включающий:
2
3
6
5
7
- получение раствора CaCl в концентрации, включающей от 0,08 М до 0,12 М, и NaCHO (цитрата натрия) в концентрации, включающей от 0,35 М до 0,50 М;
2
4
2
3
- получение второго раствора, образованного из NaHPO в концентрации, включающей от 0,10 М до 0,15 М, с NaCO, 0,2 М, и фтористым соединением;
- смешивание со встряхиванием двух растворов, полученных на предыдущих стадиях, в пропорции 1:1 объем/объем при рН, составляющем от 8,3 до 8,7 (доведенном, например, с помощью HCl), и при комнатной температуре в течение периода времени менее 2 минут;
- три последующих цикла осаждения с помощью центрифугирования, удаления надосадочной жидкости и промывания осадка с помощью ультрачистой воды и
- лиофилизацию влажного осадка.
2
3
6
5
7
2
2
2
3
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения концентрации реакционноспособных средств, применяемых в первом растворе, составляют 0,1 М для CaCl и 0,4 М для NaCHO, а концентрации, применяемые для второго раствора, составляют 0,12 М для NaHPO и 0,2 М для NaCO.
2
2
Фтористое соединение выбирают из CaF, NaF или KF и добавляют до концентрации, включающей от 0,01 М до 0,1 М. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления фтористым соединением является CaF, и его добавляют до концентрации 0,05 М.
Другой объект настоящего изобретения представлен легированными фторидом наночастицами аморфного фосфата кальция, полученными с помощью описанного выше способа, которые имеют сферическую форму и размер, составляющий от 30 нм до 80 нм, а также следующее содержание Na, Са, Р, цитрата, карбоната, фторида и структурной воды, которое составляет:
- от 3,1% до 3,5% по массе Na;
- от 27,0% до 27,4% по массе Са;
- от 37,0% до 37,8% по массе Р;
- от 3,5% до 5,0% по массе цитрата;
- от 5,4% до 7,0% по массе карбоната;
- от 6% до 10% по массе воды;
- от 2% до 5% по массе фторида.
Термин «вода» относится в этом аспекте настоящего изобретения как к адсорбированной воде, так и к структурной воде.
В соответствии с третьим аспектом другим объектом настоящего изобретения является применение наночастиц в таких областях применения, как:
- транспорт биомолекул и/или лекарственных средств;
- биоматериалы в ортопедических областях применения;
- в стоматологии, предпочтительно в качестве материала для получения различных видов цемента для заполнения и/или пломбирования корневых каналов и восстановления зубов или в качестве компонента зубных паст, жевательных резинок, жидкостей для полоскания рта, фторидных зубных лаков и гелей для содействия реминерализации эмали в результате постепенного высвобождения ионов кальция, фосфата и фторида.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показаны изображения просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ) покрытых цитратом наночастиц АСР (а) и FACP (b). Также в виде вставок показаны микродифракционные электронограммы (SAED), полученные для каждой из наночастиц. На левой вставке в А показано изображение ТЕМ отдельной наночастицы. На секциях end представлены спектры рентгеновской дисперсионной спектроскопии (EDS) соответственно для АСР и FACP.
На фиг. 2 показаны спектры рентгеновской дисперсионной спектроскопии (а) и спектры Рамана (b) для наночастиц.
На фиг. 3 показаны результаты МТТ-анализов клеточной пролиферации, проведенных на остеобластах человека, инкубированных в течение 1, 3 и 7 дней с наночастицами АСР (100 мкг/мл, 500 мкг/мл, 1000 мкг/мл). *р≤0,05; ***р≤0,001; n=3.
Варианты осуществления настоящего изобретения
Наночастицы АСР получали с помощью способа осаждения посредством смешивания двух растворов, содержавших:
2
3
6
5
7
(i) 0,1 М CaCl + 0,4 М NaCHO и
2
4
2
3
(ii) 0,12 М NaHPO + 0,2М NaCO
в пропорции 1:1 объем/объем, всего 200 мл, и доведения рН до 8,5 с помощью HCl при температуре окружающей среды.
©
При достижении смеси молочного вида (спустя примерно 30 с после смешивания) частицы подвергали трем последовательным циклам осаждения путем центрифугирования, удаления надосадочной жидкости и промывания осадка с помощью ультрачистой воды (MilliQ, Millipore). Затем влажный осадок лиофилизировали, а затем исследовали характеристики частиц.
2
Для получения таких легированных фторидом частиц к раствору (ii) добавляли 0,05 М CaF.
Методики исследования характеристик
Наночастицы анализировали с помощью просвечивающего растрового электронного микроскопа (STEM Philips CM 20), работающего с напряжением 80 кВ. Это оборудование также позволяло получить микродифракционные электронограммы (SAED) и спектры рентгеновской дисперсионной спектроскопии (EDS). Для таких анализов лиофилизированные образцы диспергировали в ультрачистой воде и затем несколько капель такой суспензии наносили на обычные медные решетки.
Количество Са и Р оценивали количественно с помощью оптической эмиссионной спектроскопии (ICP-OES) с применением спектрометра Liberty 200 (Varian, Австралия). С этой целью лиофилизированные образцы растворяли в концентрированной ультрачистой азотной кислоте (1% объем/объем).
-1
-1
С помощью системы SDT Q 600 (ТА Instruments, Нью-Касл, Делавэр, США) осуществляли термогравиметрический анализ (TGA) в условиях постоянного потока азота (100 мл.мин) и с повышением температуры до 1200°C с интервалами 10°C.мин.
Дифракционные рентгенограммы получали с помощью дифрактометра X-Pert PRO (PANalytical), оснащенного детектором PIXcel, работающим с 45 кВ и 40 мА, с падающим Kα Cu излучением (λ=1,5418 ). Использовали изменчивые спектральные ширины полос (противорассеиватель) с радиационной длиной 10 мм. Диапазон 2θ изменяли от 5° до 70° с шагом 2θ в 0,039.
-1
С помощью спектрометра LabRAMHR (Jobin-Yvon, Horiba, Япония) получали спектры Рамана. Этот прибор был оснащен диодным лазером в качестве источника возбуждения (λ=532 нм) и охлаждаемым посредством элемента Пельтье CCD-детектором (1026×256 пикселей). Спектры получали со спектральным разрешением 3 см.
Количество фторида в образцах количественно оценивали с помощью рентгеновской флюоресцентной спектроскопии (XRF) с применением спектрометра PHILIPS Magix Pro (PW-2440). Кроме того, содержание фторида также определяли с помощью спектрофотометрии в комплексе с хлористым цирконилом и эриохрома цианином R и измерения поглощающей способности комплекса на 570 мм.
Анализ культуры клеток in vitro
2
2
3
Биологический ответ на наночастицы оценивали с помощью клеточных линий остеобластов человека (MG-63, Lonza, Италия). Клетки культивировали в среде DMEM/F12 (РАА, Австрия), содержавшей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и стрептомицин-пенициллин (100 ед/мл - 100 мкг/мл), при 37°С и в атмосфере СО (5%). После этого клетки оделяли от их среды путем обработки трипсином, а затем центрифугировали и ресуспендировали. Для подсчета живых клеток применяли тест на вытеснение трипанового синего (тест на жизнеспособность клеток). Клетки размещали на 96-луночных планшетах с плотностью 3,0×10 клеток на лунку. Двадцать четыре часа спустя три различные концентрации покрытых цитратом наночастиц АСР вносили в клеточную культуру (100 мкг/мл, 500 мкг/мл, 1000 мкг/мл), предварительно стерилизованную с помощью 25 кГр . Клетки инкубировали в стандартных условиях (37°С, 5% СО) в течение 1,3 и 7 дней. Культуральную среду обновляли каждые три дня. Все эти анализы осуществляли в шкафу с ламинарным потоком воздуха.
МТТ-цитотоксичность и жизнеспособность клеток
Для определения возможного токсического влияния наночастиц применяли способ с использованием МТТ [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида]. В основе этого анализа лежит метаболическое восстановление 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ) митохондриальным ферментом сукцинатдегидрогеназа в соединение с синим цветом (формазан), концентрацию которого можно определить колориметрически, что делает возможным определение митохондриальной функциональности обработанных клеток.
-1
Клетки, после контакта с наночастицами на протяжении 1, 3 и 7 дней, инкубировали в МТТ, растворенном в PBS (5 мг мл) в пропорции 1:10, в течение 2 часов при 37°С. Затем клетки инкубировали с 200 мкл диметилсульфоксида (Sigma) в течение 15 мин. для растворения кристаллов формазана. Спектрометр Multiskan FC Microplate (Thermo Scientific) применяли для измерения поглощающей способности, которая прямо пропорциональна числу метаболически активных клеток, на 570 нм. Для каждого исследуемого интервала времени (1, 3 и 7 дней) анализировали три образца.
Результаты
-1
-1
На изображениях ТЕМ (фиг. 1) видно, что как образцы без легирования, АСР (А), так и легированные образцы, FCAP (В), представляли собой сферические наночастицы с размерами, составлявшими от 30 нм до 80 нм. К тому же отсутствие точек дифракции в SAED-электронограммах подтверждало их аморфную природу. В свою очередь, спектры EDS подтверждали, что они состояли только из Са и Р. Не наблюдали пик F в спектре легированных частиц, который должен появляться около 0,68 кэВ, возможно потому что он перекрывался кислородным пиком (0,2 кэВ), который имеет намного более высокую интенсивность. Отсутствие пиков в дифракционных рентгенограммах подтверждает аморфную природу этих материалов (фиг. 2А). Спектры Рамана также были характерными для аморфных фосфатов кальция, поскольку основной пик виден на 952 см, незначительно смещен относительно основного пика кристаллического гидроксиапатита (961 см). Химический состав АСР- и FACP-материалов, полученный с помощью TGA, ICP и рентгеновской флуоресценции, уже был описан ранее.
Биологический ответ на наночастицы исследовали с помощью остеобластов (MG-63). Три различные концентрации наночастиц (100, 500 и 1000 мкг/мл) добавляли в культуральную среду и, после некоторого периода инкубации (1, 3 или 7 дней), с помощью МТТ-анализов количественно оценивали число метаболически активных клеток (фиг. 3). Во всех случаях наблюдали повышение клеточной пролиферации (даже для наиболее высокой концентрации) спустя 1-7 дней инкубации. Кроме того, для наиболее низкой исследуемой концентрации рост клеток был сравним с наблюдаемым у клеток в условиях отсутствия наночастиц (контроль). Однако при повышении концентрации рост клеток был гораздо менее значительным, чем у контроля, вероятно в связи с тем фактом, что это были чрезмерно высокие концентрации наночастиц. Несмотря на это, в анализах жизнеспособности и морфологии клеток (не показаны) были получены очень сходные результаты для всех исследуемых концентраций. Такие результаты четко указывают на то, что наночастицы являются полностью биосовместимыми при контакте с такой клеточной линией остеобластов человека.