ВАКЦИНА ОТ КОКЦИДИОЗА
COCCIDIOSIS VACCINE

Настоящее изобретение относится к областям ветеринарной паразитологии и вакцинологии; конкретнее настоящее изобретение относится к вакцине от кокцидиоза домашней птицы, содержащей живые ооцисты Eimeria; к способам получения вакцины от кокцидиоза; к набору из частей и к способам введения вакцины от кокцидиоза.
Eimeria являются простейшими-паразитами типа Apicomplexa и класса Coccidia и встречаются во всем мире. При инфицировании домашней птицы они вызывают комплекс кишечных расстройств от среднетяжелых до тяжелых, называемый кокцидиозом. Eimeria имеют сложный жизненный цикл с множеством стадий, некоторые из которых развиваются за пределами хозяина. Инфицирование Eimeria происходит при проглатывании спорулированных ооцист и может произойти с первого дня жизни. В кишечнике высвобождаются спорозоиты, которые затем колонизируют часть кишечника птицы, проникая в эпителиальные клетки кишечника. Репликация приводит к высвобождению мерозоитов в качестве стадий и разрыву эпителиальных клеток кишечника хозяина. Затем мерозоиты повторно инфицируют дополнительные эпителиальные клетки, и это продолжается в течение до еще четырех циклов в 4-6 дней. Наконец, развиваются половые стадии, которые продуцируют ооцисты, которые выделяются с фекалиями. После споруляции в окружающей среде цикл начинается заново (Shirley et al., 2005, Adv. in Paras., vol. 60, p. 285).
Основные виды Eimeria, которые инфицируют домашнюю птицу, можно идентифицировать целым рядом способов, обычно по микроскопическим размерам и появлению кокцидий. Кроме того, различные виды Eimeria, как правило, колонизируют различные области кишечника птиц.
Симптомы инфицирования Eimeria у домашней птицы варьируют от потери аппетита до кровавого поноса и недостаточности функционирования органа из-за накопления некротической ткани в кишечнике. Последствиями являются снижение скорости конверсии корма, снижение скорости роста, уменьшение яйценоскости и восприимчивость к вторичным инфекциям, все из которых вызывают большой дискомфорт у пораженных птиц и серьезный экономический ущерб коммерческому производству птицы.
Защита от инфицирования Eimeria и кокцидиоза может основываться на введении противококцидных средств (кокцидиостатиков) с кормом, но постоянное беспокойство вызывает развитие резистентности и присутствие остатков лекарственных средств в продуктах животноводства. По этой причине с инфицированием Eimeria и последующим заболеванием домашней птицы предпочтительно борются путем вакцинации. После субъединичных и рекомбинантных ДНК-вакцин, самыми применяемыми являются живые вакцины, содержащие спорулированные ооцисты одного или более видов Eimeria. Их естественная репликация в организме птицы индуцирует сильный иммунитет, как гуморальным, так и клеточным путем иммунной системы. Обычно для защиты птиц в течение всей их жизни достаточно одной вакцинации на ранней стадии жизни, чему способствуют случайные бустерные инфицирования диким типом.
Живые кокцидии могут быть дикого типа или аттенуированного патотипа. Особым классом аттенуированных Eimeria являются так называемые рано развивающиеся штаммы, которые являются Eimeria, которые будут завершать свой жизненный цикл в организме птицы меньше чем за обычное количество циклов. Они дают более низкие числа выделения ооцист, а также вызывают меньшее поражение кишечника мишени. В целью краткого обзора кокцидиоза домашней птицы смотрите "The Merck veterinary manual" (10th ed., 2010, C.M. Kahn edt., ISBN: 091191093X), или: Swayne et al., eds.: ʺDiseases of Poultryʺ, 13th ed., Wiley-Blackwell, Ames, IA., USA
Эффективность противоэймериозных вакцин (вакцин на основе Eimeria) обычно определяется путем сравнения основных критериев для инфицирования и заболевания: оценки поражения кишечника, уменьшения выделения ооцист и эффекта на увеличение веса после контрольного заражения вирулентным штаммом Eimeria. Статьей, описывающей актуальность этих критериев для оценки эффективности вакцины на основе Eimeria, является: Williams & Catchpole, (2000, Vaccine, vol. 18, p. 1178-1185).
Как правило, живая противоэймериозная вакцина будет содержать спорулированные ооцисты кокцидий из нескольких видов Eimeria, поскольку иммунитет является видоспецифичным. Например, некоторые коммерческие вакцины от кокцидиоза домашней птицы: от MSD Animal Health, линии вакцин: Coccivac™, Paracox™ или Fortegra™, которые содержат живые спорулированные ооцисты кокцидий из различных штаммов до 8 видов Eimeria. Другими коммерческими противоэймериозными вакцинами являются Immucox™ (Ceva) и Inovocox™ (Zoetis).
Такие вакцины обычно вводят с использованием какого-нибудь способа массовой вакцинации с целью снижения затрат, такого как разбрызгивание на тело или корм или через питьевую воду. Поскольку риск полевой инфекции существует с первого дня жизни, вакцинация предпочтительно осуществляется как можно в раннем возрасте. Это удобно делать с помощью введения разбрызгиванием в инкубаторе, когда цыплята только что вылупились и содержатся в открытых лотках. Этим путем достигается тело птиц, а также их непосредственное окружение. Затем вакцина поглощается птицами через пероральный, назальный и окулярный путь по их склонности к выклевыванию капель и чистке своих перьев клювом.
Основной проблемой при вакцинации с использований живых кокцидий рода Eimeria является оптимизация принятия вакцины, т.е. быстрое и полное поглощение птицами, для допуска быстрого осуществления кокцидиями инфицирования кишечника птиц и, таким образом, индукции защитной иммунной реакции. Таким образом, существует настоятельная потребность в данной области в дальнейшем улучшении поглощения и эффективности вакцин на основе кокцидий рода Eimeria.
Уже сделано несколько улучшений. Например, для стимулирования поглощения спрейерным вакцинам обычно придают яркий цвет, такой как зеленый (хлорофилл) или красный (кармин). Яркий цвет улучшает видимость и привлекает любопытство птиц, что стимулирует выклевывание и чистку клювом.
Одна из проблем спрейерных вакцин на основе Eimeria заключается в том, что кокцидии представляют собой относительно большие и тяжелые микроорганизмы (овальные формы диаметром 15-30 мкм), и поэтому имеют тенденцию к осаждению в жидких носителях под действием силы тяжести. Особенно это является недостатком, когда в применяемой вакцине используются Eimeria различных видов, которые могут иметь кокцидии разных размеров; в таком случае более тяжелые виды, как правило, оседают быстрее и могут не поглощаться в полном требуемом количестве. Для преодоления этого, существующие вакцины могут содержать модификатор реологических свойств в качестве вспомогательного средства при суспендировании. Например, вакцина Paracox™ 8 содержит 0,3% в отношении веса к объему ксантановой камеди в расчете на дозу для животного. Это позволяет сохранять различные кокцидии в суспендированном состоянии и равномерно смешанными во время введения. Однако вязкость этой вакцины является низкой.
X.campestris
th
Ксантановая камедь представляет собой высокомолекулярный полисахарид, который продуцируется бактериями рода Xanthomonas. В наши дни ее получают путем промышленной ферментации с помощью , например, сыворотки. Ксантановая камедь используется в ряде продуктов, таких как фармацевтические препараты и продукты питания, в качестве стабилизатора эмульсий или в качестве загустителя для воздействия на вязкость продукта. Ксантановая камедь является псевдопластичной, т.е. она обладает свойствами уменьшения вязкости при увеличении напряжения сдвига. Она доступна от различных коммерческих поставщиков, например, от Keltrol™ от CP Kelco. Детали и свойства ксантановой камеди описаны, например, в Xanthan book', 8 ed., 2008, cpkelco.com.
Для увеличения поглощения вакцин на основе кокцидий рода Eimeria были применены другие адаптации, такие как приготовление вакцинной композиции в виде высоковязкого геля. Например, в WO 2005/099617 описывается вакцина на основе кокцидий рода Eimeria, которая предоставляется в виде мягкого геля, содержащего приблизительно 1% каррагенина, который является полученным из морских водорослей полисахаридом, который обычно используется в пищевой промышленности из-за его гелеобразующих свойств. Однако для введения этого геля цыплятам требуется специальная система доставки, «гель-дозатор» со специальным распределителем, который образует поток гелевых капелек.
Дальнейшая разработка этого содержащего каррагенин препарата в виде мягкого геля для введения разбрызгиванием вирусных или бактериальных вакцин описано в WO 2011/011.873: при добавлении приблизительно 0,1% в отношении веса к объему ксантановой камеди в расчете на дозу, капли мягкого геля были более липкими. Однако по-прежнему требуется специальное устройство для доставки.
По этой причине целью настоящего изобретения является преодоление недостатка в предшествующем уровне техники и учет потребности в данной области путем предоставления живой спрейерной вакцины на основе кокцидий рода Eimeria, которая обеспечивает увеличенную эффективность вакцины и может быть доставлена с помощью обычного разбрызгивающего устройства.
Неожиданно было обнаружено, что эта цель может быть достигнута, и следовательно, один или более недостатков предшествующего уровня техники могут быть преодолены и уменьшены благодаря предоставлению живой вакцины от кокцидиоза на основе кокцидий рода Eimeria, содержащей 0,3-1,5% в отношении веса к объему ксантановой камеди, что обеспечивает вакцину с относительно высокой вязкостью. Новая вакцина продемонстрировала значительно увеличенную эффективность по сравнению с аналогичной вакциной, в которой не было этой концентрации ксантановой камеди.
Полезные результаты заключаются в том, что новая вакцина от кокцидиоза быстро и полностью поглощается птицами, что приводит к увеличению принятия вакцины (уровня репликации кокцидий вакцины в кишечнике). Это обусловлено тем, что время от поглощения до начала первого цикла репликации было значительно сокращено. Кроме того, новая вакцина может доставляться с помощью обычного разбрызгивающего устройства, такого как стандартная распылительная камера для инкубатора или опрыскиватель типа огнетушителя. К тому же, вакцинная композиция не требует постоянного перемешивания во время введения разбрызгиванием. Кроме того, капли, образованные из новой вакцины, не мочат цыплят при вакцинации разбрызгиванием, предотвращая отрицательные побочные эффекты от охлаждения, особенно в случае суточных цыплят.
Хотя автор настоящего изобретения не хочет ограничивать себя какой-либо теорией или моделью, которая могла бы объяснить эти данные, он предполагает, что эта вакцинная композиция имеет вязкость, которая при применении в виде спрея делает возможным образование капель размером, который является привлекательным для выклевывания птицами, благодаря чему поглощение вакцины является более быстрым и полным, чем в случае менее вязких спрейерных вакцин на основе Eimeria из уровня техники. Кроме того, кокцидии продемонстрировали сокращение времени на кишечный транзит и осуществление инфицирования, возможно, в качестве эффекта заключения в оболочки из полисахарида ксантановой камеди, которая помогает проглоченным кокцидиям легче обосноваться в кишечнике птиц и, следовательно, привести к более раннему развитию иммунитета.
Было установлено, что вакцина от кокцидиоза этого состава имеет относительно высокую вязкость от приблизительно 200 до приблизительно 4000 мПз, при введении в виде крупнокапельной струи она идеально подходит для образования капель размером от приблизительно 1 до приблизительно 4 мм в диаметре. Капли такого размера (особенно когда они были хорошо видны из-за красителя) оказались очень привлекательными для птиц и быстро и эффективно поглощались.
Более высокие или более низкие концентрации ксантановой камеди не обеспечивали образование правильных капель при разбрызгивании: при концентрациях ксантановой камеди, превышающих приблизительно 1,5% в отношении веса к объему, отделенные капли не образовывались, а при концентрациях ксантановой камеди ниже приблизительно 0,3% в отношении веса к объему разбрызгиваемый материал был слишком влажным, не давая хороших капель и вызывая увлажнение и охлаждение птиц.
Несмотря на относительно высокую вязкость, новая вакцина не требует использования специализированного оборудования для разбрызгивания. Вероятно, это является результатом псевдопластических свойств ксантановой камеди.
Поэтому в одном аспекте настоящее изобретение относится к вакцине от кокцидиоза домашней птицы, содержащей живые ооцисты по меньшей мере одного вида Eimeria в фармацевтически приемлемом носителе, отличающейся тем, что вакцина содержит 0,3-1,5% в отношении веса к объему ксантановой камеди, что обеспечивает вязкость вакцины от 200 до 4000 мПз.
«Кокцидиоз» хорошо известен как комплекс кишечных расстройств, вызванный паразитами-кокцидиями, такими как Eimeria.
Хорошо известно, что «вакцина» представляет собой композицию, которая обладает неотъемлемым лечебным эффектом. Вакцина содержит иммунологически активный компонент и фармацевтически приемлемый носитель. «Иммунологически активный компонент» представляет собой один или более антигенных молекул, здесь: живые кокцидии рода Eimeria, которые распознаются иммунной системой мишени и индуцируют защитную иммунологическую реакцию. Реакция может происходить из врожденной и/или приобретенной иммунной системы мишени и может быть клеточного и/или гуморального типа.
Вакцина, как правило, эффективна в снижении уровня или степени инфицирования, например, путем уменьшения паразитарной нагрузки или сокращения продолжительности репликации паразита в организме животного-хозяина.
Кроме того, или, возможно, в результате этого, вакцина является, как правило, эффективной в уменьшении или уменьшении интенсивности (клинических) симптомов заболевания, которое может быть вызвано такой инфекцией или репликацией, или реакцией животного на эту инфекцию или репликацию.
Эффектом вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением является предотвращение или уменьшение инфицирования домашней птицы кокцидиями рода Eimeria и/или одного или более признаков кокцидиоза, которые связаны с такой инфекцией или репликацией. Здесь такими (клиническими) признаками являются: поражения кишечника, увеличение веса тела и выделение ооцист.
Такая вакцина от кокцидиоза может в разговорной речи также называться вакциной «против» Eimeria или от кокцидиоза, или «противоэймериозной вакциной.
Детали и преимущества вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением будут описаны ниже.
«Птица» относится к птицам сельскохозяйственного значения, таким как: курица, индейка, утка, гусь, куропатка, павлин, перепелка, голубь, фазан, цесарка или страус.
Используемый здесь термин «содержащий» или «включающий» (а также варианты, такие как «содержат», «содержит» и «содержащий»), как имеется в виду, относится ко всем элементам и в любой возможной комбинации, вероятной в случае настоящего изобретения, которые охватываются или включены в раздел текста, его параграф, пункт формулы изобретения и т.д., в которых этот термин используется, даже если такие элементы или комбинации не указаны в прямой форме; а не к исключению какой-либо из таких элементов(а) или комбинаций.
Поэтому любой такой раздел текста, его параграф, пункт формулы изобретения и т.д. может также относиться к одному или более вариантов осуществления, в которых термин «содержащий» (или его варианты) заменяется такими терминами, как «состоят из», «состоящие из» или «по существу состоят из».
«Ооцисты» представляют собой хорошо известные микроорганизмы, которые являются одной из стадий жизненного цикла паразита Apicomplexan, такого как Eimeria.
Ооцисты являются «живыми», когда они способны инициировать цикл репликации Eimeria при соответствующих условиях, например, в кишечнике птицы.
«Eimeria (эймерия)» хорошо известна в данной области как паразит, относящийся к семейству Eimeriidae. Эти паразиты и вызываемые ими заболевания описаны в известных справочниках (смотрите выше). Eimeria демонстрирует характерные признаки членов своей таксономической группы, такие как морфологические, геномные и биохимические характеристики, а также биологические характеристики, такие как физиологическое, иммунологическое или патологическое поведение.
Как известно в данной области, отнесение микроорганизма к конкретному «виду» основано на сочетании таких признаков. Следовательно, настоящее изобретение также включает Eimeria, которые каким-либо образом подклассифицируются, начиная от них, например, как подвид, штамм, изолят, генотип, вариант, подтип или подгруппа и т.п.
E.acervulina
E.tenella
E.maxima
E.brunetti
E.mitis
E.mivati
E.necatrix
E.praecox
E.hagani
E.meleagrimitis
E.adenoides
E.gallopavonis
E.dispersa
E.innocua
E.subrotunda
E.meleagridis
Eimeria в случае настоящего изобретения может реплицироваться в организме видов домашней птицы и, например, включает, но без ограничения ими, виды Eimeria: , , , , , , , , ,  (типа 1 и типа 2), , , , ,  и .
Специалисту в данной области техники будет очевидно, что, хотя определенная Eimeria в случае настоящего изобретения может в настоящее время относиться к конкретным видам и родам, это таксономическая классификация, которая со временем может изменяться, поскольку новые идеи могут привести к реклассификации в новую или другую таксономическую группу. Однако, поскольку это не меняет сам микроорганизм или его антигенный репертуар, а лишь его научное название или классификацию, такие реклассифированные микроорганизмы остаются в пределах объема настоящего изобретения.
Паразиты рода Eimeria для применения в настоящем изобретении могут быть получены из ряда источников, например, в виде оригинальных полевых изолятов из птицефабрики или в виде эталонных или лабораторных штаммов из различных лабораторий и (депозитарных) учреждений.
«По меньшей мере один вид» относится к практике включения более чем одного вида Eimeria в вакцину на основе кокцидий рода Eimeria для обеспечения широкой иммунной защиты. Кроме того, вакцина может содержать один или более штаммов определенного вида, для охвата различий в распространенности.
«Фармацевтически приемлемый носитель» в случае настоящего изобретения представляет собой жидкость с высокой степенью чистоты и стерильности, например воду, физиологический солевой раствор или забуференный фосфатом солевой раствор. В более сложной форме носитель может представлять собой, например, буфер, содержащий дополнительные добавки, такие как стабилизаторы или консерванты. Однако для настоящего изобретения существует предел концентрации соли, которая может быть включена в конечную вакцину. Его причинами его является сохранение композиции с привлекательным вкусом. Подробности описаны в отношении способа приготовления и стерилизации ксантановой камеди, описанной ниже.
«Ксантановая камедь» представляет собой хорошо известный полисахарид, который, как правило, имеется в продаже, в нескольких качествах и степенях чистоты, например, как Keltrol™, Xantural™ или Kelzan™, от CP Kelco.
В случае настоящего изобретения концентрацию ксантановой камеди определяют как «% в отношении веса к объему», т.е. процентное содержание в отношении веса к объему. Это должно определяться на основе конечной вакцинной композиции, так как она находится в готовой для введения птицам дозе для животных.
Это не исключает того, что вакцина в соответствии с настоящим изобретению или ее части могут быть получены, продаваться или храниться в более концентрированной форме, например сконцентрированной в 2 или более раз, которая затем разбавляется до конечной концентрации применения незадолго до введения. Это может быть полезно для стабильности или выгодно по логистическим причинам для уменьшения объема и экономии затрат на упаковку и транспортировку.
Путем включения ксантановой камеди в концентрации от 0,3 до 1,5% в отношении веса к объему, результирующая вакцинная композиция приобретает относительно высокую вязкость от 200 до 4000 мПз, соответственно.
Вязкость может быть измерена с использованием разнообразного подходящего оборудования; в случае настоящего изобретения предпочтительный способ измерения вязкости осуществляют, используя метод с использованием вращающегося шпинделя, в соответствии с которым образцы измеряются после уравновешивания при постоянной температуре, например, 25°C. Подробности описаны в разделе «Примеры».
Предпочтительно, чтобы вакцинная композиция не содержит какого-либо другого модификатора реологических свойств, такого как полисахарид, камедь, гелеобразующий агент или загуститель, который может существенно повышать вязкость водной вакцинной композиции, помимо ксантановой камеди. Очевидно, это не касается каких-либо незначительных эффектов на вязкость, которые могут быть вызваны другими ингредиентами вакцины, такими как соль, буфер, антигенный белок, адъювант и т.д.
Поэтому в одном варианте осуществления вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением ксантановая камедь является единственным модификатором реологических свойств в вакцинной композиции.
В одном варианте осуществления вакцина от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением содержит 0,4-1,2% в отношении веса к объему ксантановой камеди. Предпочтительно вакцина содержит 0,5-1% в отношении веса к объему ксантановой камеди, 0,5-0,9% в отношении веса к объему, 0,5-0,8% в отношении веса к объему или даже 0,5-0,7% в отношении веса к объему ксантановой камеди, в указанном порядке предпочтения.
В одном варианте осуществления вакцина от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением содержит приблизительно 0,6% в отношении веса к объему ксантановой камеди.
В случае настоящего изобретения «приблизительно» означает, что число может варьироваться между ±25% от его указанного значения. Предпочтительно, когда «приблизительно» означает ±20% от его значения, более предпочтительно «приблизительно» означает ±15, 12, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2% от его значения, или даже «приблизительно» означает ±1% от его значения, в этом порядке предпочтения.
В одном варианте осуществления домашнюю птицу-мишень для вакцинации от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением выбирают из группы, состоящей из курицы, индейки, утки и гуся. В предпочтительном варианте осуществления домашней птицей является курица или индейка, потому что для этих видов птицы экономическое влияние Eimeria инфекции на сектор птицеводства является наибольшим. Наиболее предпочтительной является курица.
Птицы-мишени могут быть любого типа, такого как несушки, племенные птицы, бройлеры, комбинированные породы или родительские линии любой из таких пород. Предпочтительным типом являются бройлеры.
Вакцина в соответствии с настоящим изобретением может, в принципе, содержать любые кокцидии рода Eimeria, которые способны инфицировать или реплицировать в организме домашней птицы.
В одном варианте осуществления вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением живые кокцидии рода Eimeria относятся к аттенуированному штамму Eimeria.
Аттенуированные Eimeria могут быть получены путем отбора встречающихся в природе Eimeria, различающихся по патогенности. Альтернативно аттенуированные Eimeria могут быть получены путем in vitro пассажей и отбора или с помощью технологии рекомбинантной ДНК, все из которых хорошо известны в данной области техники.
В предпочтительном варианте осуществления аттенуированные Eimeria являются рано развивающимися.
Предпочтительно, когда вакцина от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением содержит те же самые виды кокцидий, которые присутствуют в существующей коммерческой живой вакцине на основе кокцидий рода Eimeria; более предпочтительные: те же кокцидии, что и в группе, состоящей из линий вакцины: Coccivac, Paracox и Fortegra.
E.acervulina
E.tenella
E.maxima
E.brunetti
E.mitis
E.praecox
E.mivati
E.hagani
E.necatrix
Поэтому в одном варианте осуществления вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением для цыплят по меньшей мере одним видом Eimeria является один или более или все, выбираемый(ые) из группы, состоящей из: , , , , , , ,  и .
E.adenoeides
E.meleagrimitis
E.meleagrimitis
E. gallopavonis
E.dispersa
Аналогично, в одном варианте осуществления вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением для индюшек по меньшей мере одним видом Eimeria является один или более или все, выбираемый(ые) из группы, состоящей из: ,  типа 1,  типа 2,  и .
Точное количество кокцидий рода Eimeria в расчете на дозу вакцины в соответствии с настоящим изобретением не так критично, потому что кокцидии будут легко реплицировать и колонизировать кишечник хозяев. Только необходимо, чтобы доза вакцины была достаточной для инициации такого продуктивного инфицирования. Более высокая доза инокулята вряд ли сократит время, необходимое для достижения оптимальной колонизации в организме хозяина; а очень высокие дозы не привлекательны по экономическим причинам. Кроме того, слишком высокие дозы кокцидий в вакцине могут сами вызывать некоторую патологию. Очевидно, что слишком низкая доза, хотя, возможно, способна осуществить инфицирование Eimeria, может занять слишком много времени для надлежащего возникновения иммунитета.
Λ
Λ
Λ
Λ
По этой причине предпочтительная доза инокулята составляет от приблизительно 1×101 до приблизительно 1×105 спорулированных ооцист вида Eimeria в расчете на дозу для животного, более предпочтительно от 1×102 до 1×104 ооцист в расчете на дозу, от 100 до 5000 или даже от 100 до 1000 ооцист/дозу для животных в этом порядке предпочтения.
Как будет очевидно квалифицированному специалисту, оптимальная доза вакцины будет зависеть, например, от видов животных-мишеней, а также от видов и вирулентности используемого штамма Eimeria и поэтому может быть разной для различных видов Eimeria в одной комбинированной вакцине.
Способы подсчета и количественного определения кокцидий рода Eimeria для применения в вакцине от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением хорошо известны в данной области техники.
Объем в расчете на дозу вакцины от кокцидиоза для животного в соответствии с настоящим изобретением для животного может быть оптимизирован в соответствии с предполагаемым путем применения, например, в случае вакцинации разбрызгиванием на тело доза может составлять от 10 мкл до 1 мл на птицу. Предпочтительно, когда объем спрейерной вакцины на одну птицу составляет от 0,1 до 0,5 мл на птицу, более предпочтительно от 0,2 до 0,3 мл на одну птицу.
Альтернативно, вакцина может вводиться путем разбрызгивания на корм или в виде жидкости в питьевую воду.
Установление оптимального объема и дозы для различных путей введения, путем определения такового, который является иммунологически эффективным количеством кокцидий рода Eimeria в расчете на дозу вакцины в соответствии с настоящим изобретением для животного, находится в пределах обычных возможностей квалифицированного специалиста.
Определение эффективности вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением может быть, например, осуществлено путем мониторинга иммунологической реакции после вакцинации или после контрольного заражения, например, путем мониторинга признаков заболевания, клинических показателей, серологических параметров у мишени или путем повторной изоляции патогена и сравнения этих результатов с ответом на вакцинацию-заражение, наблюдаемым у ложно вакцинированных животных.
Возраст, вес, пол, иммунологический статус и другие параметры домашней птицы-мишени для вакцины от кокцидиоза в соответствии с изобретением не являются критическими, хотя, несомненно, благоприятной является вакцинация здоровых мишеней и как можно более ранняя вакцинация, чтобы предотвратить (последствия) раннее инфицирование патогенной Eimeria.
Поэтому вакцину от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно вводят в день вылупления (т.е. в возрасте 1 дня).
Иногда домашней птице может быть назначена бустерная вакцинация позже в течение жизни.
Очень эффективным является приготовление вакцины в соответствии с настоящим изобретением в виде комбинированной вакцины, поскольку таким образом сразу можно вводить сразу множество иммунологических агентов, обеспечивая уменьшение дискомфорта у вакцинируемых птиц-мишеней, а также затрат времени и рабочей силы. Комбинированная вакцина содержит, помимо вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением, другое иммунологически активное соединение. В принципе, им может быть любой живой или убитый микроорганизм или субъединичный продукт, при условии, что он не уменьшает стабильность или способность к репликации кокцидий рода Eimeria. Кроме того, дополнительный иммуноактивный компонент(ы) должен быть совместим с предполагаемым пероральным путем применения вакцины от кокцидиоза. Дополнительным иммунологически активным соединением может быть антиген, иммуномодулирующее вещество, цитокин и/или вакцина.
Альтернативно, вакцина от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением может быть сама добавлена к вакцине.
В зависимости от характеристик конкретной формы вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением необходимо тщательно выбрать способ создания еще одной комбинации. Такой выбор находится в пределах обычных возможностей квалифицированного специалиста.
Поэтому в одном варианте осуществления вакцина в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что вакцина содержит один или более дополнительных иммуноактивных компонентов.
В одном варианте осуществления вакцина в соответствии с настоящим изобретением представляет собой комбинированную вакцину, содержащую по меньшей мере один дополнительный антиген, происходящий из микроорганизма, который является патогенным для домашней птицы. Дополнительным антигеном может быть живой, живой аттенуированный или убитый микроорганизм, или его часть или субъединичный антиген.
Предпочтительно дополнительным антигеном из микроорганизма, который является патогенным для домашней птицы, является один или более, выбираемый(ые) из групп, состоящих из:
- Вирусов: вируса инфекционного бронхита (IBV), вируса псевдочумы птиц (NDV), аденовируса, вируса синдрома снижения несучести, вируса инфекционного бурсита (IBDV) (например, гумборовируса), вируса куриной анемии, вируса птичьего энцефаломиелита, вируса оспы птиц, вируса ринотрахеита индеек (TRT), вируса чумы уток (вирусного энтерита у уток), вируса оспы голубей, вируса нейролимфоматоза птиц (MDV), вируса птичьего лейкоза, вируса инфекционного ларинготрахеита ILTV), пневмовируса птиц, вируса птичьего гриппа (AIV) и реовируса;
Escherichia coli
Ornitobacterium rhinotracheale
Haemophilis paragallinarum
Pasteurella multocida
Erysipelothrix rhusiopathiae
- Бактерий: , Salmonella, , , , , Erysipelas, Mycoplasma, Campylobacter, Shigella и Clostridium;
- Паразитов: Histomonas, Isospora, Cryptosporidium и Dermanyssus; и
- Грибов: Aspergillus.
Наиболее предпочтительный дополнительный антиген выбирают из: IBV, NDV, IBDV, ILTV, TRT, AIV, MDV, Mycoplasma и Salmonella.
В одном варианте осуществления вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением дополнительным иммуноактивным компонентом является адъювант.
«Адъювант» представляет собой хорошо известный ингредиент вакцины, который, в общем, является веществом, которое стимулирует иммунный ответ птицы-мишени неспецифическим образом. В данной области техники известно много различных адъювантов. Очевидно, адъювант должен быть достаточно слабым, чтобы не влиять на стабильность или репликационный потенциал живых кокцидий рода Eimeria.
В предпочтительном варианте осуществления адъювант представляет собой цитокин.
Вакцину от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением можно выгодно объединить с фармацевтическим компонентом, таким как антибиотик, гормон и/или противовоспалительное лекарственное средство.
Применение противококцидного соединения также возможно при условии, что кокцидии рода Eimeria в вакцине не чувствительны к этому конкретному лекарственному средству.
Вакцина от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением может содержать один или более компонентов, которые способствуют жизнеспособности и качеству живых кокцидий рода Eimeria для применения в настоящем изобретении, тем самым способствуя продуктивной репликации и осуществлению колонизации в кишечнике домашней птицы-мишени.
Добавка может быть стабилизатором для стабилизации количества и качества кокцидий рода Eimeria для настоящего изобретения при хранении, манипулировании, введении или проглатывании. Как правило, стабилизаторами являются крупные молекулы с высокой молекулярной массой, такие как липиды, углеводы или белки; например молочный порошок, желатин, сывороточный альбумин, сорбит, трегалоза, спермидин, декстран или поливинилпирролидон.
Также могут быть добавлены подходящие консерванты, такие как тимеросал, мертиолат, фенольные соединения или гентамицин.
Вакцину от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением можно использовать либо как профилактическое, либо как терапевтическое лечение, либо и то, и другое, поскольку она препятствует как осуществлению, так и прогрессированию инфицирования кокцидиями рода Eimeria.
Как подробно описано ниже: в результате определенных вариантов в процессе производства вакцины от кокцидиоза в соответствии с изобретением вакцинная композиция может содержать соль металла в определенной концентрации. Вкратце: это может потребоваться для стабилизации ксантановой камеди, когда ее необходимо стерилизовать путем нагревания. Однако для сохранения вкусовой привлекательности капель вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением концентрация соли не должна превышать 0,4% в отношении веса к объему в конечной вакцинной композиции.
Поэтому в одном варианте осуществления вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением, вакцина содержит менее приблизительно 0,4% в отношении веса к объему соли металла.
В одном варианте осуществления вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением применяется одно или более или все условия, выбираемое(ые) из группы, состоящей из:
- вакцина содержит адъювант, предпочтительно иммуностимулирующий олигодезоксинуклеотид;
- вакцина содержит дополнительный антиген из микроорганизма, который является патогенным для домашней птицы, предпочтительно одного или более, выбираемого(ых) из: IBV, NDV, IBDV, ILTV, TRT, AIV, MDV, Mycoplasma и Salmonella;
E.acervulina
E.tenella
E.maxima
E.brunetti
E.mitis
E.praecox
E.hagani
E.necatrix
- по меньшей мере одним видом Eimeria является один или более или все, выбираемый(ые) из группы, состоящей из: , , , , , ,  и ;
- Eimeria является аттенуированной;
- Eimeria является рано развивающейся;
- вакцина предназначена для курицы;
- домашняя птица является суточной;
- вакцина содержит менее приблизительно 0,4% в отношении веса к объему соли металла; и
- вакцина содержит приблизительно 0,6% в отношении веса к объему ксантановой камеди.
Вакцина от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением может быть приготовлена из живых кокцидий рода Eimeria способами, хорошо известными и легко применимыми специалистом в данной области техники. Например: паразиты рода Eimeria продуцируются в промышленных масштабах в организмах животных-доноров в виде домашней птицы и выделяются из их фекалий с помощью известных методов, таких как центрифугирование и соляная флотация, с последующей споруляцией и стерилизацией и, наконец, подсчетом с помощью световой микроскопии. Споруляция может быть выполнена, например, с использованием дихромата калия, а стерилизация может быть выполнена с использованием гипохлорита натрия или бета-пропиолактона. Затем спорулированные ооцисты Eimeria вводят вместе с фармацевтическим носителем в вакцину, и конечный продукт распределяют по контейнерам соответствующего размера и упаковывают.
Различные стадии производственного процесса контролируются соответствующими тестами, например, иммунологическими тестами на качество и количество кокцидий или других антигенов; микробиологическими тестами на инактивацию (если применимо), стерильность и отсутствие посторонних веществ; и, в конечном итоге, с помощью in vitro или in vivo экспериментов для определения эффективности и безопасности вакцины. Все они хорошо известны квалифицированному специалисту и установлены в актах государственного регулирования, таких как Фармакопея, и в справочниках, таких как: ʺRemington: the science and practice of pharmacyʺ (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472), и: ʺVeterinary vaccinologyʺ (P. Pastoret et al. ed., 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681).
Поэтому в следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу приготовления вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением, отличающемуся тем, что способ включает стадию смешивания живых ооцист по меньшей мере одного вида Eimeria в фармацевтически приемлемом носителе, вместе с ксантановой камедью до 0,3-1,5% в отношении веса к объему.
Ксантановую камедь можно смешивать с кокцидиями в виде порошка. Однако предпочтительно ксантановую камедь смешивают в виде раствора. Это позволяет готовить композицию с ксантановой камедью отдельно от композиции, содержащей кокцидии рода Eimeria. Аналогично, композиция, содержащая кокцидии, может быть приготовлена и храниться отдельно в концентрированной форме, для смешивания с ксантановой камедью незадолго до применения. Это обеспечивает гибкость в планировании производства и его логистике и может способствовать сохранению стабильности кокцидий.
Эффективно, когда композиция, содержащая ксантановую камедь, затем служит в качестве разбавителя для концентрированной композиции с кокцидиями. Однако, как будет ясно квалифицированному специалисту, при смешивании двух композиций, таких как одна с кокцидиями и одна с ксантановой камедью, происходит разведение обеих этих композиций. Следовательно, чтобы получить конкретную конечную концентрацию кокцидий и ксантановой камеди в результирующей вакцине от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением, необходимо, чтобы смешиваемые композиции имели концентрации, превышающие конечную концентрацию, для обеспечения этого разведения.
Например, когда два типа композиций смешивают в равных объемах, необходимо, чтобы обе композиции имели концентрацию, превышающую в два раза требуемую конечную концентрацию их компонентов; например, необходимо, чтобы композиция, содержащая ксантановую камедь в этом случае, содержала от 0,6 до 3,0% в отношении веса к объему ксантановой камеди.
Поэтому в одном варианте осуществления способ приготовления вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что в композиции представлена ксантановая камедь, концентрация которой такова, что после смешивания результирующая вакцина содержит 0,3-1,5% в отношении веса к объему ксантановой камеди.
В предпочтительном применении это позволяет поставлять вакцину в соответствии с настоящим изобретением в виде набора из частей для приготовления вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением, причем набор включает отдельные контейнеры, один с живыми кокцидиями и один с ксантановой камедью, который предназначен для использования в качестве разбавителя для кокцидий, и в результате чего контейнеры совместно могут использоваться для приготовления вакцины в соответствии с настоящим изобретением.
Следовательно, в следующем аспекте настоящее изобретение относится к набору из частей для приготовления вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением, отличающемуся тем, что набор включает по меньшей мере два контейнера: один контейнер, включающий композицию, содержащую живые ооцисты по меньшей мере одного вида Eimeria в фармацевтически приемлемом носителе, и один контейнер, включающий композицию, содержащую ксантановую камедь, в результате чего концентрация композиции, содержащей ксантановую камедь, такова, что после объединения композиций из обоих контейнеров результирующая вакцина содержит 0,3-1,5% в отношении веса к объему ксантановой камеди.
В предпочтительном варианте осуществления набор из частей в соответствии с настоящим изобретением включает инструкции по применению указанного набора и/или приготовлению вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением.
Инструкции по применению, входящие в набор из частей в соответствии с настоящим изобретением, могут быть, например, предоставлены посредством информации, записанной на или прикрепленной к одному(ом) или ко всем (всех) из контейнеров, или к коробке, содержащей один или все из контейнеров. Также инструкции могут содержаться в листке, упакованном вместе с одним или всеми из контейнеров, таком как листок с информацией для пациента или листовка-вкладыш в упаковке. Кроме того, инструкции по применению могут быть предоставлены путем ссылки на инструкции в электронной форме, такие как информация, просматриваемая на веб-сайте в интернете или загружаемая с него дистрибьютора набора и т.п.
Набор из частей в соответствии с настоящим изобретением может также представлять собой предложение упомянутых частей (относящееся к коммерческой продаже), например, на веб-сайте в интернете, для совместного применения в способе приготовления вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением.
В практике приготовления коммерческой формы вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением была еще одна проблема, которая должна быть разрешена. Она была связана с тем, что для получения разрешения на продажу коммерческие вакцины обычно должны быть приготовлены стерильными.
Существует несколько возможностей для широкомасштабной стерилизации компонентов вакцины (очевидно, за исключением любого живого микроорганизма вакцины), и они обычно проверяются путем отбора образцов вакцины с различными индикаторными микроорганизмами и обнаружения их полной инактивации после метода стерилизации.
Обычными методами являются микрофильтрация или гамма-облучение. В случае настоящего изобретения разделение компонентов вакцины в наборе из частей позволяет проводить отдельную стерилизацию композиции, содержащей ксантановую камедь.
Однако фильтрация и облучение являются относительно дорогими методами, что является серьезным недостатком для вакцины для домашней птицы. Поэтому предпочтительным является другой общий метод стерилизации компонентов вакцины: термическая стерилизация (автоклавирование). Он является эффективным и дешевым в широком масштабе. Однако при приготовлении вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением автор настоящего изобретения в начале был огорчен, обнаружив, что ксантановая камедь подвергалась инактивации после термической стерилизации как таковой: как описано в разделе «Примеры», после подвергания протоколу термической стерилизации, который является стандартным при производстве вакцины, 0,6% в отношении веса к объему раствор ксантановой камеди в воде продемонстрировал резкую и необратимую потерю своей вязкости: от приблизительно 600 мПз до 25 мПз. Вакцина от кокцидиоза, приготовленная с использованием этого подвергнутого автоклавированию раствора ксантановой камеди с низкой вязкостью, больше не могла приводить к образованию требуемых капель вакцины после введения разбрызгиванием.
Благодаря этому открытию теперь можно понять, почему коммерческая вакцина Paracox 8 имеет низкую вязкость, несмотря на то, что она содержит 0,3% в отношении веса к объему ксантановой камеди в расчете на дозу для животного: компоненты этой вакцины (кроме кокцидий) подвергаются термической стерилизации перед их окончательным объединением. Это вызывает непреднамеренную, и ранее незамеченную, инактивацию ксантановой камеди. Ретроспективно это также объясняет, почему применение вакцины Paracox 8 в виде разбрызгиваемого на тело материала не приводит к образованию капель вакцины, подходящих для эффективного поглощения, и вызывает увлажнение птиц.
Затем автор настоящего изобретения нашел способ допуска термической стерилизации композиции, содержащей ксантановую камедь, без уничтожения ее вязкости. Неожиданно было обнаружено, что эта цель может быть достигнута, и, следовательно, один или более недостатков предшествующего уровня техники могут быть преодолены путем обеспечения композиции, содержащей ксантановую камедь вместе с солью металла в концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно 0,1% в отношении веса к объему; % в отношении веса к объему в этом случае рассчитывают по объему композиции, содержащей ксантановую камедь и соль металла.
Обнаружено, что соль металла способна эффективно защищать композицию, содержащую ксантановую камедь, во время термической стерилизации от сильной (более 15%) и необратимой потери вязкости.
Поэтому в еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу термической стерилизации композиции, содержащей ксантановую камедь, отличающемуся тем, что способ включает смешивание указанной композиции с по меньшей мере 0,1% в отношении веса к объему соли металла.
В случае настоящего изобретения «термическая стерилизация» включает инкубацию в течение по меньшей мере 15 минут при по меньшей мере 100°C. В принципе, соль металла может представлять собой любую соль металла, но предпочтительно соль металла представляет собой соль из катиона одно- или двухвалентного металла. Более предпочтительно, катион представляет собой щелочной металл.
Анион соли металла предпочтительно представляет собой галоген, сульфат, фосфат, нитрат или ацетат. Более предпочтительно хлорид.
Еще более предпочтительно, соль металла представляет собой галогенсодержащую соль щелочного металла; еще более предпочтительно таковую натрия или калия; еще более предпочтительно соль металла представляет собой: хлорид натрия или хлорид калия.
Для стабилизации ксантановой камеди во время термической стерилизации с помощью соли металла не существует определенного верхнего предела концентрации соли металла, за исключением того, что концентрации выше приблизительно 5% в отношении веса к объему могут быть непрактичными для работы из-за образования кристаллов и коррозионных свойств.
К тому же было обнаружено, что применительно к препарату вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением образуемые при введении разбрызгиванием капли, которые имели относительно высокую концентрацию соли, переставали легко поглощаться птицами; вероятно, из-за отсутствия вкусовой привлекательности. Было установлено, что допустимый предел для содержания соли металла в каплях вакцины составляет приблизительно 0,4% в отношении веса к объему конечной вакцинной композиции.
Поэтому в одном варианте осуществления способ приготовления вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что композиция, содержащая ксантановую камедь, дополнительно содержит соль металла в концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно 0,1% в отношении веса к объему.
Предпочтительно, когда концентрация соли металла в композиции, содержащей ксантановую камедь, такова, что результирующая вакцина содержит менее приблизительно 0,4% в отношении веса к объему соли металла.
В одном варианте осуществления способа приготовления вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением применяется одно или более или все из условий, выбираемое(ые) из группы, состоящей из:
- соль металла представляет собой хлорид натрия или хлорид калия;
- в композиции, содержащей ксантановую камедь и соль металла, концентрация соли металла такова, что после смешивания результирующая вакцина содержит менее приблизительно 0,4% в отношении веса к объему соли металла;
- вакцина содержит адъювант, предпочтительно иммуностимулирующий олигодезоксинуклеотид;
- вакцина содержит дополнительный антиген из микроорганизма, который является патогенным для домашней птицы, предпочтительно одного или более из: IBV, NDV, IBDV, ILTV, TRT, AIV, MDV, Mycoplasma и Salmonella;
E.acervulina
E.tenella
E.maxima
E.brunetti
E.mitis
E.praecox
E.hagani
E.necatrix
- по меньшей мере одним видом Eimeria является один или более или все, выбираемый(ые) из группы, состоящей из: , , , , , ,  и ;
- Eimeria является аттенуированной;
- Eimeria является рано развивающейся;
- вакцина предназначена для курицы;
- домашняя птица является суточной; и
- результирующая вакцина содержит приблизительно 0,6% в отношении веса к объему ксантановой камеди.
Аналогично, компоненты набора из частей в соответствии с настоящим изобретением могут быть адаптированы к этому варианту осуществления.
Поэтому в одном варианте осуществления набор из частей в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что композиция, содержащая ксантановую камедь, дополнительно содержит соль металла в концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно 0,1% в отношении веса к объему, и концентрация соли металла в указанной композиции такова, что результирующая вакцина содержит менее приблизительно 0,4% в отношении веса к объему соли металла.
В одном варианте осуществления набора из частей в соответствии с настоящим изобретением применяется одно или более или все из условий, выбираемое(ые) из группы, состоящей из:
- соль металла представляет собой хлорид натрия или хлорид калия;
- в композиции, содержащей ксантановую камедь и соль металла, концентрация соли металла такова, что после объединения компонентов набора результирующая вакцина содержит менее приблизительно 0,4% в отношении веса к объему соли металла;
- вакцина содержит адъювант, предпочтительно иммуностимулирующий олигодезоксинуклеотид;
- вакцина содержит дополнительный антиген из микроорганизма, который является патогенным для домашней птицы, предпочтительно одного или более из: IBV, NDV, IBDV, ILTV, TRT, AIV, MDV, Mycoplasma и Salmonella;
E.acervulina
E.tenella
E.maxima
E.brunetti
E.mitis
E.praecox
E.hagani
E.necatrix
- по меньшей мере одним видом Eimeria является один или более или все, выбираемый(ые) из группы, состоящей из: , , , , , ,  и ;
- Eimeria является аттенуированной;
- Eimeria является рано развивающейся;
- вакцина предназначена для курицы;
- домашняя птица является суточной; и
- результирующая вакцина содержит приблизительно 0,6% в отношении веса к объему ксантановой камеди.
В зависимости от обстоятельств введения вакцины в соответствии с настоящим изобретением, например, пути и видов домашней птицы-мишени, может быть необходимой дополнительная адаптация вакцинной композиции. Это находится полностью в пределах обычных возможностей квалифицированного специалиста и, как правило, включает «тонкую настройку» эффективности или безопасности вакцины. Это можно сделать, адаптируя дозу, количество, частоту или путь введения вакцины, используя вакцину в другой форме или препарате или адаптируя другие компоненты вакцины (например, стабилизаторы, носители, адъюванты, разбавители и т.п.). Как правило, при применении в виде крупнокапельной струи вакцину на основе кокцидий рода Eimeria можно смешивать с красителем.
По соображениям стабильности или экономии вакцина от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением может быть приготовлена в лиофилизированной форме. В общем, это позволит обеспечить длительное хранение при температурах выше нуля °C, например, при 4°C. Специалистам в данной области известны процедуры лиофилизации, а оборудование для лиофилизации в различных масштабах доступно на коммерческой основе. Очевидно, что паразит рода Eimeria должен быть в относительно устойчивой форме, чтобы выдержать периоды замораживания, сушки, хранения и оттаивания. Поэтому предпочтительным вариантом осуществления является лиофилизация формы в виде спорозоитов Eimeria для применения в настоящем изобретении.
Поэтому в одном варианте осуществления способа приготовления вакцины в соответствии с настоящим изобретением вакцина готовится в лиофилизированной форме.
Вакцина от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением и способы ее приготовления в соответствии с настоящим изобретением, во всех их выгодных значениях, также могут быть описаны в альтернативной формулировке, фокусируясь на неожиданных и выгодных медицинских применениях вакцинной композиции:
Поэтому в дальнейшем аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей живые ооцисты по меньшей мере одного вида Eimeria в фармацевтически приемлемом носителе, для применения в качестве вакцины от кокцидиоза домашней птицы, отличающейся тем, что композиция содержит 0,3-1,5% в отношении веса к объему ксантановой камеди который придает указанной композиции вязкость от 200 до 4000 мПз.
Также:
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции, содержащей живые ооцисты по меньшей мере одного вида Eimeria в фармацевтически приемлемом носителе, для производства вакцины от кокцидиоза домашней птицы, отличающейся тем, что композиция содержит 0,3-1,5% в отношении веса к объему ксантановой камеди, которая придает указанной композиции вязкость от 200 до 4000 мПз.
Вакцину от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно вводят птицам-мишеням оптимальным образом в отношении ее дозы, объема, пути введения и препарата, а также оптимальным образом в отношении возраста, пола или состояния здоровья мишени. Квалифицированный специалист вполне способен определить такие оптимальные условия для введения вакцины.
В одном варианте осуществления вакцину от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением применяют способом массового применения, например, разбрызгиванием, на тело или корм, или через питьевую воду. Это уменьшает как дискомфорт от вакцинации у птиц-мишеней, так и затраты на рабочую силу.
Подходящие способы для массового введения вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением должны, конечно, быть совместимы с живыми кокцидиями рода Emeria и нацелены на достижение кишечника. Предпочтительными способами являются: с использованием разбрызгивания или питьевой воды, или (автоматической) инъекции в яйца, так называемой in ovo вакцинация. Подходящее оборудование для массового введения вакцины для домашней птицы доступно на коммерческой основе.
Поэтому в еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу вакцинации домашней птицы от кокцидиоза, отличающемуся тем, что способ включает введение вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением указанной домашней птице в виде разбрызгиваемого на тело материала.
Указание на то, что вакцина является «разбрызгиваемым на тело материалом», не требует покрытия всего тела птиц, а просто означает, что специальной мишенью не должна быть какая-либо конкретная часть тела. Кроме того, значительная часть доставляемой таким образом вакцины не будет попадать или оставаться на теле птиц, но может оказаться на полу. Это прекрасно, поскольку птицы быстро начнут выклевывать такие капли и проглатывать их.
Преимущественные свойства вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением, при доставке на тело птиц, наиболее заметны при применении в виде крупнокапельной струи. В этом случае образуются капли вакцины, которые быстро попадают внутрь тела птиц с перьев или пола.
Поэтому в одном варианте осуществления способ вакцинации домашней птицы в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что разбрызгивание осуществляют в виде крупнокапельной струи.
Как правило, в крупнокапельной струе применяется капля размером более 50 мкм. В случае настоящего изобретения размер капель предпочтительно составляют от 1 до 4 мм. Выбирая используемое оборудование, такое как используемое сопло и давление, квалифицированный специалист может легко получить капли таких размеров.
Такую крупнокапельную струю можно подавать, например, с помощью разбрызгивателя для инкубатора при иммунизации суточных цыплят в выводных лотках или можно подавать, например, с использованием опрыскивателя типа огнетушителя при иммунизации пожилых птиц при напольной установке загона.
Схема введения для применения вакцины в соответствии с настоящим изобретением для птицы-мишени может осуществляться в виде однократных или многократных доз, способом, совместимым с составом вакцины и с практическими аспектами животноводства.
Предпочтительно, когда схема для способа вакцинации домашней птицы в соответствии с настоящим изобретением интегрирована в существующие схемы вакцинации для других вакцин, которые могут потребоваться птицам-мишеням, чтобы уменьшить стресс у животных и снизить затраты на рабочую силу. Эти другие вакцины могут вводиться одновременно, параллельно или последовательно способом, совместимым с их зарегистрированным применением.
Поэтому в одном варианте осуществления способа вакцинации домашней птицы в соответствии с настоящим изобретением вакцина вводится в комбинации с другой вакциной для домашней птицы.
Описанные здесь полезные лечебные эффекты вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением также могут быть охвачены с использованием другой формулировки:
В дальнейшем аспекте настоящее изобретение относится к способу предотвращения или уменьшения инфицирования Eimeria или связанных с ним признаков заболевания у домашней птицы, отличающемуся тем, что способ включает введение указанной домашней птице вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением.
Далее изобретение будет дополнительно описано с помощью следующих неограничивающих примеров.
Примеры
Пример 1: Сравнение вязкости содержащих ксантановую камедь композиций
Вязкость раствора ксантановой камеди в воде определяли в разных условиях, проверяя эффект термической стерилизации с включением концентрации соли металла или без нее.
Некоторые образцы были подвергнуты автоклавированию путем инкубации в течение 30 минут при температуре 115°С.
Измерения вязкости выполняли с помощью ротационного вискозиметра Brookfield™ в соответствии с инструкциями производителя. Это оборудование определяет вязкость жидкости, исходя от вращающегося момента на шпинделе, вращающегося с определенным числом оборотов в минуту, в определенном объеме этой жидкости. Все образцы измеряли при уравновешивании в водяной бане при 25°С.
Таблица 1: Вязкость раствора ксантановой камеди в воде
% в отношении веса к объему ксантановой камеди
Предварительная обработка
Добавка
Вязкость (мПз)
0,6
подвергание автоклавированию
ничто
25,5
0,6
подвергание автоклавированию
0,15% в отношении веса к объему NaCl
593
0,6
подвергание автоклавированию
0,15% в отношении веса к объему NaCl и 0,1% кармина
586
0,6
ничто
0,15% в отношении веса к объему NaCl и 0,2% кармина
660
2,4
подвергание автоклавированию
0,15% в отношении веса к объему NaCl
8061
Эти результаты показывают, что добавление специфической концентрации соли металла может почти полностью предотвратить в противном случае резкое снижение вязкости, которое возникает при термической стерилизации разбавления ксантановой камеди в воде. Разница в вязкости между образцами, подвергшимися автоклавированию+соль и не подвергшимися автоклавированию+соль (здесь: приблизительно 11%), считается нерезкой.
Пример 2: Эффект ксантановой камеди на эффективность живой вакцины на основе множества видов кокцидий рода Eimeria
2.1. Введение
:
С целью улучшения доставки крупнокапельной струи на тело суточных цыплят - введения живой вакцины от кокцидиоза, автор настоящего изобретения исследовал препарат вакцины с ксантановой камедью, наряду с более традиционной вакциной, в которой кокцидии были разведены в воде. Он исследовался, если вакцина образовывала капли на птицах, увеличивая видимость вакцины и приводя к лучшему поглощению вакцины и минимальному увлажнению птиц.
2.2. План эксперимента
Сто двадцать суточных цыплят были разделены на три группы по 40 цыплят. Все птицы в группе 1 были вакцинированы кокцидиями, соответствующими таковым в вакцине Paracox™ 8, в воде; птицы в группе 2 были вакцинированы тем же типом кокцидий, но в 0,6% в отношении веса к объему ксантановой камеди/0,2% в отношении веса к объему NaCl и с 0,1% в отношении веса к объему кармина (E120); и те и другие с помощью крупнокапельной струи. Птицы в группе 3 не были вакцинированы (смотрите таблицу 2). Все птицы содержались в группах в отдельных напольных загонах в течение 21 дня после вакцинации. Для мониторинга выделения ооцист (вакцины) собирали образцы фекалий из напольных загонов: в случае вакцинированных птиц (группы 1 и 2) ежедневно с дня 4 по день 14 и в день 20 после вакцинации (pv); в случае контрольных птиц (группа 3) в дни 7, 14 и 20.
E.tenella
В день 21 после вакцинации (pv) по тридцать птиц на группу были однозначно идентифицированы по бирке с номером, затем каждую птицу заражали с использованием 15000 ооцист вирулентного штамма  дикого типа. Затем зараженных птиц переносили в клетки для сбора (3 клетки по 10 птиц на группу) в камеры для изоляции. Оставшиеся птицы в группах 1 и 2 были подвергнуты эвтаназии и отброшены. Оставшиеся птицы в группе 3 были оставлены в напольном загоне для взвешивания в дни 21, 28 и 35. Две птицы не были вакцинированы и не подвергались заражению, чтобы выявить любую неэкспериментальную инфекцию.
E.tenella
В день 5 после заражения (pc) в общей сложности 10 зараженных птиц (3 из каждой клетки первых двух групп и 4 из третьей группы) были подвергнуты эвтаназии и исследованы после вскрытия (без знания о группе лечения) в отношении поражений, связанных с  инфекцией.
В день 7 pc все оставшиеся птицы были взвешены, и сбор сваленных в кучу фекалий забирали из всех клеток, для подсчета выделения ооцист. В день 14 pc все птицы были взвешены до того, как они были подвергнуты эвтаназии.
На протяжении всего исследования за всеми птицами вели ежедневные наблюдения в отношении клинических признаков, связанных с инфицированием Eimeria, таких как диарея или кровавые фекалии, депрессия или неадекватность; не наблюдалось никаких неэкспериментальных инфекций.
2.3. Материалы и методы
2.3.1. Подопытные животные
В начале эксперимента используемыми цыплятами были SPF, смешанного пола и суточные. Все птицы были проверены на предмет наличия хорошего здоровья и размера перед вакцинацией. Птицы были распределены по группам рандомизированно, на основе первой пойманной. Водопроводная вода и стандартный корм были доступны без ограничения. Контрольное заражение осуществляли через пероральный зонд.
2.3.2. Исследуемые материалы
E.tenella
Кокцидии вакцины (как в Paracox 8) и материалы для заражения (стерильные спорулированные ооцисты ) сохраняли при 2-8°C до использования и находились в пределах срока годности во время эксперимента.
Кокцидии вакцины Paracox 8 разбавляли, чтобы получить одну дозу для животного в 0,21 мл; вакцину для групп 1 и 2 составляли так, чтобы она содержала 3000 доз. В отдельных стерильных стеклянных бутылках Duran содержались разбавители, либо 315 мл стерильной воды для группы 1, либо для группы 2: 315 мл (с термической стерилизацией) 1,2% в отношении веса к объему ксантановой камеди (Xantural 11K, CP Kelco) и 0,4% в отношении веса к объему NaCl, оба содержат 0,2% в отношении веса к объему кармина. Два пакета-саше на 5000 доз энергично встряхивали и массировали в течение 1 минуты для обеспечения ресуспендирования ооцист. Содержимое этих пакетов-саше объединяли. Из объединенной вакцины 315 мл отбирали и добавляли к каждому из разбавителей. Оба препарата затем тщательно смешивали с использованием мешалки и магнитной мешалки для группы 1 или встряхивали вручную для группы 2 в течение по меньшей мере 10 минут перед использованием.
Концентрацию ооцист в материале для заражения определяли с использованием модифицированной счетной камеры Fuchs-Rosenthal. Исходя из этого, делали разведение для обеспечения 15000 ооцист на 0,5 мл дозу для животного.
2.3.3. Спрейерная вакцинация
Машина Spraycox™ II использовалась в соответствии с инструкциями производителя для набрызгивания крупнокапельной спрейерной вакцины на только что вылупившихся цыплят. Поскольку машина предназначена для вакцинации 100 цыплят на лоток, для 40 цыплят на группы, используемые здесь, область лотка была уменьшена на 60%. Бумажные выстилки для лотков использовались для обеспечения хорошей поверхности, которая позволяла птицам свободно перемещаться и чистить себя и друг друга клювом.
Целью было нанесение 0,21 мл вакцины на одну птицу, поэтому на каждый лоток использовали 21 мл вакцины. До вакцинации установки машины Spraycox были откалиброваны с помощью нескольких имитаций выполнения вакцинации, чтобы обеспечить распределение правильной дозировки (21 мл) по всей внутренней площади поверхности лотка, перед вакцинацией групп в эксперименте. Приготовленные вакцины встряхивали в течение 10 минут перед переносом в машину Spraycox, чтобы обеспечить тщательное смешивание вакцины. После вакцинации птиц держали в течение не менее 30 минут в лотках, в которых их вакцинировали, в хорошо освещенной и теплой зоне, прежде чем их перенесли в напольные загоны. В это время наблюдали за птицами, чтобы узнать, как быстро была поглощена вакцина. Между каждой вакцинацией подтверждали установки машины для разбрызгивания, и машину тщательно промывали теплой водой. Группы вакцинировали по порядку, т.е. группу 1 перед 2.
2.3.4. Образцы фекалий
После заражения, образцы сваленных в кучу фекалий собирали из зараженных клеток между днями 4 и 7 после заражения. Образец из каждой клетки отдельно собирали на пластиковых листах, чтобы определить общее выделение ооцист после заражения. Фекалии опрыскивали водой, по меньшей мере, ежедневно для обеспечения их влажности. Каждый образец дважды помещали в мешки, маркировали для идентификации содержимого и хранили при температуре 2-8°C до обработки. Ооцисты выделяли в соответствии со стандартными методами, и количества рассчитывали, используя метод подсчета McMaster.
2.3.5. Анализ данных
Данные по оценкам поражений, увеличению веса тела и выделению ооцист из загонов вакцинированных зараженных птиц (группы 1 и 2) сравнивали друг с другом и с контрольной группой (невакцинированной зараженной группой 3), используя статистические критерии. Все анализы проводил статистик с использованием SAS™ 9.3 со значением уровня значимости=5%.
2.4. Результаты
2.4.1. Оценки поражений
E.tenella
Поражения, связанные с , определяли с помощью исследования после вскрытия в день 5 pc. Результаты суммированы по группе (n=10) в таблице 2. Оценку проводили, как описано в монография 2326 Европейской Фармакопеи. Вкратце: оценка 0 означает отсутствие макроскопических поражений, а оценки 1-4 означают увеличение степени утолщения стенки кишечника, увеличение количества крови и уменьшение количества нормальных фекалий. При оценке поражения=4 может даже быть какая-то смертность.
Результаты показывают, что оценки поражений в группах 1 и 3 были значительно выше, чем в группе 2 (Р<0,0001), только перекрывались с оценкой 2. Хотя у птиц в группах 1 и 3 были только высокие оценки (2 или более), оценки для птиц в группе 1 обычно были ниже, чем у птиц в группе 3, однако они не сильно отличаются друг от друга (P=0,6917).
Таблица 2: Эффект вакцинации и заражения на оценки поражений
Группа - признак
Оценка поражений (количество птиц)
0
1
2
3
4
1 - вакцина в воде
-
-
1
6
3
2 - вакцина в ксантановой камеди
3
5
2
-
-
3- без вакцинации
-
-
2
3
5
2.4.2. Увеличение веса тела
Индивидуальный вес тела регистрировали в день 21 до заражения и в дни 7 и 14 pc, до эвтаназии. Сводная таблица результатов измерения веса на группу (n=20) представлена в таблице 3.
Данные показывают, что птицы в обеих группах вакцинации (1 и 2) увеличивали значительно больше в весе, чем птицы в группе 3, в день 7 pc (P<0,001 - обе группы) и в день 14 pc (P<0,001 - обе группы). При этом группа 2 также увеличивала значительно больше в весе, чем группа 1 в оба момента времени (заражение+7 дней: P=0,017, заражение+14 дней: P=0,034).
Таблица 3: Эффект вакцинации и заражения на вес тела
Группа - признак
Средний вес тела (г)
Среднее увеличение веса тела
День 21 pv
День 7 pc
День 14 pc
День 0-7 pc
День 0-14 pc
1 - вакцина в воде
191,23
274,43
375,45
83,20
184,22
2 - вакцина в ксантановой камеди
203,37
300,80
406,75
97,43
203,38
3- без вакцинации
176,74
208,49
312,35
31,75
135,62
2.4.3. Выделение ооцист
Количество ооцист, обнаруженных в сборах фекалий, суммировано в таблицах 4 (после вакцинации) и 5 (после заражения). После вакцинации наблюдается хорошее выделение ооцист, свидетельствующее об успешной вакцинации. Кроме того, картина выделения ооцист являются таковой, как ожидалось: начальный пик выделения ооцист, возникающий непосредственно в результате вакцинации, с последующим падением выделения, а затем второй пик через шесть дней после первого, поскольку ооцисты проходят через свой второй цикл. В группе 2 начальный пик выделения ооцист, хотя и меньше, чем в группе 1, отмечается раньше на три дня и приводит к большему второму пику.
Поскольку иммунитет к вакцинам на основе кокцидий рода Eimeria сильно связан с повторением циклов ооцист, птицы в группе 2 (вакцина в ксантановой камеди) имели более сильный иммунитет во время контрольного заражения по сравнению с группой 1 (вакцина в воде). Увеличение первоначального поглощения вакцины и сокращение времени кишечного транзита в случае содержащей ксантановую камедь вакцины, таким образом, приводит к лучшему и более раннему развитию иммунитета против кокцидиоза.
Таблица 4: Эффект вакцинации на выделение ооцист после вакцинации
Группа - признак
Количество ооцист/грамм фекалий (x10<sup>Λ</sup>3) в день X дней pv
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
20
1 - вакцина в воде
0
0
0
2
5
0
1
0,5
1
1,5
12
5,5
2 - вакцина в ксантановой камеди
0
3
0
0
0
4
5
33
8
15
1
3
3- без вакцинации
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
После заражения существуют четкие количественные различия в выделении ооцист между группами, эти различия являются статистически значимыми, при этом группа 2 выбрасывает значительно меньше ооцист, чем две другие группы (P<0,0001). Статистически значимой разницы между выбросом группами 1 и 3 нет (P=0,0651).
Таблица 5: Эффект вакцинации и заражения на выделение ооцист после заражения
Группа-признак
Количество ооцист/грамм фекалий (x10<sup>Λ</sup>6)
1 - вакцина в воде
23,0
2 - вакцина в ксантановой камеди
0,43
3- без вакцинации
35,9
2.5. Выводы
Данные подтверждают вывод о том, что использование ксантановой камеди значительно повышает эффективность существующей живой вакцины на основе множества видов кокцидий рода Eimeria. Вакцина, доставляемая в препарате с ксантановой камедью, обеспечивала птицам более сильный иммунитет против заражения через 21 день после вакцинации по сравнению с той же самой вакциной, но доставляемой в воде. Все три параметра, используемые для оценки эффективности вакцинации: оценки поражения, увеличение прироста веса тела и снижение выделения ооцист, были значительно улучшены для группы, получавшей вакцину в ксантановой камеди, по сравнению с традиционной вакциной в группе вакцины в воде и невакцинированной контрольной группе.
Хотя вакцина была приготовлена с использованием повергнутой термической стерилизации ксантановой камеди, это было обеспечено с помощью концентрации соли металла, чтобы стабилизировать ее во время нагревания.
Сильно увеличенная эффективность вакцины обусловлена увеличенным потреблением вакцины, доставляемой в ксантановой камеди, демонстрируемым более ранним выделением ооцист вакцины и улучшением рециркуляции. Это приводит к впечатляющему снижению оценок поражения и выделения ооцист, а также к экономически значимому увеличению веса тела после заражения.
Пример 3: Увеличение поглощение вакцины
В эксперименте меньшего масштаба, но в остальном очень схожем по планированию и выполнению с экспериментом, описанным в примере 2, эффективность поглощения вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением сравнивали со стандартной вакциной без ксантановой камеди.
Для такого эксперимента «поглощение вакцины» определяют через 5-7 дней после вакцинации, после вскрытия, путем микроскопического исследования соскобов с кишечной стенки. Для обнаружения различных видов Eimeria, необходимо контролировать различные области кишечника.
При сравнении вакцины от кокцидиоза в соответствии с настоящим изобретением с использованием 0,6% в отношении веса к объему ксантановой камеди и вакцины на основе Paracox 8 (т.е. кокцидий в воде) наблюдалось увеличение поглощения вакцины: от составляющего приблизительно 40-60% поглощения в случае кокцидий в воде до составляющего почти 80% поглощения в случае кокцидий в ксантановой камеди.
Пример 4. Эффект различных спрейерных препаратов
В ранних экспериментах были исследованы различные гелевые препараты для доставки суточным цыплятам крупнокапельной струи живых вакцин от кокцидиоза. В экспериментах сравнивались растворы, содержащие либо 3% поливинилпирролидона (PVP) типа К-90, либо 0,6% ксантановой камеди в воде. Отрицательный контроль имел кокцидии в простой воде. Все три препарата содержали краситель Carmine (E120) в конечной концентрации 0,1% в отношении веса к объему. Препараты не подвергались термической стерилизации, поэтому соль не добавлялась.
4.1. Схема эксперимента
E.tenella
E.tenella
Схема эксперимента была очень схожа по планированию и выполнению с экспериментом, описанным в примере 2. Вкратце: 75 суточных цыплят SPF были случайным образом распределены по трем группам из 25 птиц. Каждая группа была вакцинирована  с помощью крупнокапельного разбрызгивания, назначаемого на уровне дозы 0,21 мл, т.е. приблизительно 500 кокцидий на птицу, используя коммерческую машину Spraycox II. Используемыми кокцидиями вакцины был штамм , который присутствует в продукте Paracox.
После вакцинации птиц оставляли для чистки клювом и поглощения вакцины; затем их переносили в изоляторы по 1 группе на изолятор и выдерживали в течение 7 дней. За птицами осуществляли ежедневное наблюдение. Через 7 дней p.v. птицы были подвергнуты эвтаназии и исследованы после вскрытия на наличие ооцист или стадии развития в их кишечнике.
Поглощение вакцины определяли с помощью микроскопического исследования влажных мазков с обоих карманов в области слепой кишки. Оценки были либо положительными, либо отрицательными в зависимости от присутствия или отсутствия паразитных стадий, смотрите таблицу 6.
4.2. Результаты
Полученные результаты продемонстрировали явное преимущество в случае препаратов с ксантановой камедью над двумя другими исследуемыми препаратами.
Таблица 6: Эффект гелеобразования на поглощение вакцины:
Группа
Позитивные птицы
Негативные птицы
% Поглощения вакцины
1: Вода
12
10
54,5
2: 0,6% ксантановая камедь
17
7
70,8
3: 3% PVP K-90
10
13
43,5
4.3. Выводы
Поглощение вакцины, подтверждаемое наличием паразитных стадий, наблюдаемых во влажных мазках со стенок слепой кишки, зависит от препарата, в котором она применяется. Использование 0,6% ксантановой камеди (группа 2) увеличило поглощение вакцины на 30%, а именно, с 54,5% в случае традиционной водной среды (группа 1) до 70,8%. И наоборот, использование 3% PVP (группа 3) фактически уменьшило поглощение вакцины на 20% по сравнению с группой вакцины в воде, а именно с 54,5 до 43,5%.
Следовательно, использование 0,6% ксантановой камеди в составе спрейерной вакцины на основе ооцист рода Eimeria оказывает явный положительный эффект на поглощение ооцист по сравнению с использованием 3% PVP или использование обычной простой воды в качестве среды.
Поскольку все исследуемые препараты содержали кармин, этот эксперимент также продемонстрировал, что положительный эффект ксантановой камеди четко отличается от такового красителя.
Аналогичным образом, поскольку соль не добавлялась, это доказывает, что присутствие соли не требуется, когда нет термической стерилизации.