Способ прогнозирования эффективности проводимого лечения цервикальных интраэпителиальных неоплазий I-II степени
METHOD FOR PREDICTING THE EFFECTIVENESS OF THE CONDUCTED TREATMENT OF I-II DEGREE CERVICAL INTRAEPITHELIAL NEOPLASIAS

Изобретение относится к медицине, в частности к гинекологии и предназначено для лечения вируса папилломы индуцированных (ВПЧ) цервикальных интраэпителиальных неоплазий I-II степени (cervical intraepithelial neoplasia, CIN) у пациенток репродуктивного возраста.
Известны методы лечения CIN I-II, ассоциированных с ВПЧ, описанные в RU 2 482 866 C2 - Способ лечения папилломавирусных инфекций, реализуемый через индукцию интерлейкина-18, а также в RU 2 520 746 C1 - Способ использования иммунологических маркеров для прогноза прогрессии цервикальных интраэпителиальных неоплазий, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией. Их недостаток состоит в том, что в них отсутсвует оценки эффективности лечения в зависимости от возраста пациенток, количественным показателем вирусной нагрузки ВПЧ и изначальной степенью интраэпителиального поражения шейки матки.
Задачей нашего изобретения является создание рационального и точного способа прогнозирования эффективности проводимого лечения цервикальных интраэпителиальных неоплазий I-II степени, что позволяет более персонализировано подойти к терапии больных.
Технический результат достигается путем создания математической модели, включающий три достоверных показателя: возраст пациентки, степень цервикальной интраэпителиальной неоплазии (CIN I/CIN II), вирусная нагрузка вируса папилломы человека высокого канцерогенного риска (ВПЧ ВКР). Установлено, что эти показатели являются высоко значимыми критериями для прогнозирования эффективности проводимого лечения цервикальных интраэпителиальных неоплазий I-II степени. Способ является простым, быстровыполнимым, недорогим методом диагностики. Построенная математическая модель позволит персонализировано подходить к назначению обоснованной терапии.
Способ реализуется следующим образом.
Для разработки заявленного способа было проведено обследование 172 женщины с верифицированными цервикальными интраэпителиальными поражениями I-II степени по результатам жидкостной онкоцитологии и обязательно подтвержденные гистологически. Среди исследуемых нами женщин амбулаторно-поликлинического приема ДНК ВПЧ высокого онкогенного риска методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) выявлена у 100 % (n=172). Это являлось критерием отбора данного исследования. Возраст обследованных женщин варьировал от 19 до 49 лет. Далее были сформированы 2 группы:
1 группа в количестве 86 пациенток с CIN I, вызванной вирусами ВПЧ высокого онкогенного риска;
2 группа в количестве 86 пациенток с CIN II, вызванной вирусами ВПЧ высокого онкогенного риска.
Для прогнозирования результатов лечения все пациенты были условно разделены на 2 возрастные группы (до 40 лет и 40 лет и старше). Сравнение данных подгрупп выявило достоверную разницу между группами (р=0,0482).
Следующим шагом было проведение многофакторного анализа, результатом которого стала математическая модель, позволяющая прогнозировать результат лечения (в баллах) в зависимости от возраста пациентки и клинических параметров до проводимого лечения.
С целью оценки клеточного состава и выявления наличия атипичных эпителиальных клеток было проведено цитологическое исследование мазков с шейки матки у обследуемых женщин. Материалом для цитологического исследования являлся соскоб из цервикального канала, зоны трансформации и с поверхности шейки матки, полученный с помощью одноразовой цервикальной щеточки. Оценка результатов цитологического исследования проводилась согласно общим положениям системы информативной классификации Bethesda (The Bethesda System), разработанная в США в 1988 г. (таблица 1).
Таблица 1 - Критерии цитологической оценки образца в соответствии с терминологической системой Bethesda (TBS).
Адекватность образца
- Удовлетворительный (наличие или отсутствие компонента эндоцервикса/ЗТ)- Неудовлетворительный (причина)
Интерпретация/результат исследования
- Негативный в отношении интраэпителиального поражения или злокачественности
- Цитограмма в пределах нормы
-Микроорганизмы: Trichomonas vaginalis; Candida spp.; изменения флоры, соответствующие бактериальному вагинозу; бактерии, морфологически соответствующие Actinomyce ssp.; клеточные изменения, соответствующие герпес-вирусной инфекции - Другие доброкачественные изменения: реактивные клеточные изменения, связанные с воспалением, облучением, внутриматочным средством; железистые клетки при постгистерэктомическом статусе; атрофия, гиперкератоз, паракератоз и др.
- Атипия клеток многослойного плоского эпителия
- Атипичные клетки плоского эпителия неясного значения (ASC-US) или атипичные клетки плоского эпителия, не позволяющие исключить HSIL (ASC-H) - Низкая степень плоскоклеточного интраэпителиального поражения (LSIL): ВПЧ-эффект, легкая дисплазия/CIN I - Высокая степень плоскоклеточного интраэпителиального поражения (HSIL): умеренная дисплазия, тяжелая дисплазия, CIS/CIN II, CIN III - Плоскоклеточный рак
- Атипи яэндоцервикального (высокого цилиндрического) эпителия
- Атипичные железистые клетки (AGC): эндоцервикальные, эндометриальные или неопределенные (NOS) - Атипичные железистые клетки, похожие на неопластические: эндоцервикальные, эндометриальные или неопределенные (NOS) – Эндоцервикальная аденокарцинома insitu (AIS) - Аденокарцинома
- Другое
- Эндометриальные клетки у женщины старше 40 лет
В качестве метода выявления ДНК ВПЧ ВКР использовалась ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени при помощи диагностического комплекта «АмплиСенс ВПЧ ВКР скрин-титр-FL», согласно рекомендациям производителя ФБУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора (г.Москва).
Для обработки взятого клинического материала (клеточный материал и поверхностный эпителий из влагалищной порции шейки матки, области зоны трансформации (ЗТ) и цервикального канала) и выделения ДНК использовался набор реагентов «АмплиПрайм ДНК-сорб-АМ» (ООО «НекстБио», Россия).
Анализ данных осуществлялся автоматически в программном обеспечении, соответствующем используемому оборудованию. Принципы, лежащие в основе автоматического анализа данных таковы, что сигнал в данной пробирке по данному каналу считается положительным, если соответствующая кривая накопления флуоресценции пересекает линию порога. Характеристикой данного сигнала является пороговый цикл - цикл, которому соответствует точка пересечения флуоресцентной кривой и линии порога. Именно значения пороговых циклов, а так же их присутствие или отсутствие анализируются программой автоматического учета результатов «AmpliSens FRT HR HPV GenotypeQuantResults Matrix.xls». В соответсвие с этит значениями автоматически проходило построение калибровочной прямой и расчет концентраций ДНК человека и ДНК ВПЧ.  Конечный результат нормированной концентрации ДНК ВПЧ на количество клеток человека рассчитывали по формуле:
Ig×200000] = Ig(ВПЧ на 100 тыс клеток)
Результаты концентрации ДНК ВПЧ выражались в Ig (ВПЧ. на 100 тыс. клеток) и оценивались следующим образом: менее 3 Ig -малозначимая, от 3 Ig до 5 Ig —клинически значимая и более 5 Ig - повышенная вирусная нагрузка (табл. 2).
Таблица 2 - Клинически значимая вирусная нагрузка во взятых образцах
Результат Ig (копий ДНК ВПЧ. на 100 тыс. клеток)
Трактовка
< 3
Клинически малозначимая
3-5
Клинически значимая. Нельзя исключить дисплазию, существует риск развития дисплазии.
> 5
Клинически значимая, повышенная. Высокая вероятность наличия дисплазии.
Амплификацию и детекцию ВПЧ ВР с определением генотипа и вирусной нагрузки, а также анализ результатов проводили на приборе «CFX96» («BioRad», США).
В модель были включены следующие показатели: возраст пациентки, вирусная нагрузка до лечения, а также категория по TBS до лечения (предварительно данный параметр был закодирован, CIN II – 0, CIN I – 1).
Коэффициенты модели (В) для включенных в модель фактором, а также значимость указанных параметров приведены в таблице 3.
Кроме того, в таблице 3 даны оценки качества модели:
- коэффициент детерминации (R2=0,1171120570), определяющий ее информационную значимость;
- значение F-критерия (F(3,168) = 11,568) и уровень значимости модели (p<0,0000),
определяющие статистическую значимость модели.
Таблица 3 – Результаты множественной регрессии
N=172
Итоги регрессии для зависимой переменной: Результат леченияl=0,10000 R=0 ,41377011 R2=0 ,17120570 Скоррект.R2=0 ,15640580F(3,168)=11,568 p<0,00000 Станд. ошибка оценки: 2,0421
БЕТА
Стандарт. ошибка БЕТА
В
Стандарт. ошибкаВ
t(168)
p-уровень
Свободный член
4,9476
1,0512
4,7065
0,0000
Возраст пациентки
-0,1635
0,0695
-0,0640
0,0272
-2,3522
0,0198
Вирусная нагрузка Ig ВПЧ на 10 *5 копии до лечения
0,1765
0,0703
0,0182
0,0073
2,5104
0,0130
Категория_TBS_код
-0,2829
0,0699
-1,2541
0,3100
-4,0459
0,0001
Степень влияния независимых факторов на результат проводимого лечения (таблица 4) рассчитывался, исходя из величины стандартизированных коэффициентов регрессии ВЕТА (по результатам регрессионного анализа) с помощью формулы:
Таблица 4 – Степень влияния факторов на результат лечения
Фактор
BETA
Степень влияния <img file="00000002.jpg" he="6" wi="6" img-content="undefined" img-format="jpg" />, %
Возраст пациентки
-0,1635
10,37
Вирусная нагрузка Ig ВПЧ на 10 *5 копии до лечения
0,1765
11,20
Категория_TBS_код
-0,2829
17,95
Таким образом, наибольшее влияние на результат лечения оказывает категория по TBS (17,95%), меньше вирусная нагрузка  (11,20%) и возраст (10,37%).
Способ прогнозирования результатов лечения CIN I и СIN II, включающий обследование больных, отличающийся тем, что с помощью математической модели на основании трех достоверных информативных показателей: возраст пациентки, вирусная нагрузка ВПЧ ВКР и категория по TBS (CIN I – CIN II) осуществляют комплексную математическую оценку.
Модель для диагностики характера течения заболевания и прогноза эффективности лечения имеет вид математической формулы:
1
2
3
у = 4,9476-0,064×х+0,0182×х–1,2541×х, (2)
1
2
3
где у – результат лечения (в баллах), х – возраст пациентки, х– вирусная нагрузка Ig ВПЧ на 10*5 копии до лечения, х– Категория_TBS_код.
Результат лечения оценивался в виде изменения бальных оценок (таблица 5).
Таблица 5–Бальная оценка изменения категории по TBS в результате лечения CIN I/CIN II
CIN I
СIN II
y
Изменение категории по TBS в результате лечения
y
Изменение категории по TBS в результате лечения
(0 баллов)
CIN I
(0 баллов)
CIN I/CIN II
(1 балл)
Ascus
(1 балл)
CIN I
(2 балла)
Цитограмма воспаления
(2 балла)
Ascus
(3 балла)
метаплазия
(3 балла)
цитограмма воспаления
(4 балла)
NILM
(4 балла)
метаплазия
(-1 балл)
СINI/CIN II
(5 баллов)
NILM
В таблице 6 приведены данные дисперсионного анализа полученной регрессионной модели и оценки ее информативности. Вклад факторов, включенных в модель (Регресс. = 144,7166), составляет 17,12% от общей суммы квадратичных отклонений параметра у, а часть вклада (82,88%) вносят неучтенные (случайные) факторы (Остатки = 700,5625), что свидетельствует о степени информационной способности модели. По величине F-критерия, F = 11,568 с уровнем значимости p=0,0000 модель можно считать значимой и достоверной.
Таблица 6 – Результаты дисперсионного анализа
Сумма квадратов
Степень свободы
Среднее квадратичное
F
p-уровень
Регресс.
144,7166
3
48,23887
11,56803
0,000001
Остатки
700,5625
168
4,17001
Итого
845,2791
Полученная модель прогнозирования результатов лечения позволяет путем подстановки в указанную формулу значений параметров «возраст», «вирусная нагрузка» и «категория по TBS» получить бальную оценку проводимого лечения.
Реализация предложенного способа иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
Пациентка Л., 22 лет с диагнозом: CIN I, ВПЧ ВКР (+) 52, 56 типы. Вирусная нагрузка  4 Ig ВПЧ на 10 *5 копии до лечения.
1
2
3
Модель для диагностики характера течения заболевания в данном случае имеет вид (х = 22, х= 4, х= 1):
у = 4,9476 – 0,064×22+0,0182×4 – 1,2541×1 = 2,3583  (2 балла)
Прогнозируемая категория по TBS – Цитограмма воспаления
Пример 2
Пациентка Ю., 43 лет с диагнозом: CIN II, ВПЧ ВКР (+) 51 тип. Вирусная нагрузка  4,9 Ig ВПЧ на 10 *5 копии до лечения.
1
2
3
Модель для диагностики характера течения заболевания в данном случае имеет вид (х = 43, х= 4,9, х= 0):
у = 4,9476 – 0,064×43+0,0182×4,9 – 1,2541×0 = 2,28478 (2 балла)
Прогнозируемая категория по TBS – ASCUS
Пример 3.
Пациентка А., 31 лет с диагнозом: CIN II, ВПЧ ВКР (+) 31 тип. Вирусная нагрузка  3,3 Ig ВПЧ на 10 *5 копии до лечения.
1
2
3
Модель для диагностики характера течения заболевания в данном случае имеет вид (х = 31, х= 3,3, х= 0):
у = 4,9476 – 0,064×31+0,0182×3,3 – 1,2541×0 = 3,02366 (3 балла)
Прогнозируемая категория по TBS – Цитограмма воспаления
В новые признаки изобретения входят: возраст пациентки, степень цервикальной интраэпителиальной неоплазии (CIN I/CIN II), вирусная нагрузка вируса папилломы человека высокого канцерогенного риска (ВПЧ ВКР). Установлено, что эти показатели являются высоко значимыми критериями для прогнозирования эффективности проводимого лечения цервикальных интраэпителиальных неоплазий I-II степени.
Таким образом, предложенный способ объективен, достоверен и может быть использован для прогноза развития прогрессирования цервикальных интраэпителиальных неоплазий, что позволяет, персонализировано подходить к терапии пациентов в разной возрастной группе. Поэтому назначение пациентам дополнительно к стандартной терапии иммунотерапии будет способствовать повышению эффективности лечения, а также минимизировать риск развития рака шейки матки.