Применение 3'-бензоил-4'-гидрокси-1'-(2-гидроксифенил)-6,6-диметил-6,7-дигидро-2Н-спиро-[1-бензофуран-3,2'-пиррол]-2,4,5'(1'H,5H)-триона, в качестве средства, обладающего росторегулирущей активностью в отношении культуры Chlorella vulgaris
APPLICATION OF 3'- BENZOYL-4'-HYDROXY-1'-(2-HYDROXYPHENYL)-6,6-DIMETHYL-6,7-DIHYDRO-2Н-SPIRO-[1-BENZOFURAN-3,2'-PYRROLE]-2,4,5'(1'H,5H)- TRION, AS A MEANS HAVING GROWTH-REGULATING ACTIVITY IN RELATION TO THE CULTURE OF CHLORELLA VULGARIS

Изобретение относится к области сельского хозяйства, биотехнологии и природопользования, а именно к индивидуальному производному - 3'-бензоил-4'-гидрокси-1'-(2-гидроксифенил)-6,6-диметил-6,7-дигидро-2H-спиро[1-бензофуран-3,2'-пиррол]-2,4,5'(1'H,5H)-триону, обладающему росторегулирующей активностью, которое может быть использовано для культивирования микроводорослей Chlorella vulgaris.
Одноклеточные зеленые водоросли Chlorella vulgaris являются достаточно распространенными и широко используется в различных областях деятельности человека: в сельском хозяйстве для подкормки растений, птиц и животных, в пчеловодстве и рыбном хозяйстве; в пищевой промышленности из-за высокого содержания белка, витаминов, железа, незаменимых аминокислот и микроэлементов; в медицине, косметологии и парфюмерии; для очистки сточных вод и реабилитации водоемов; для производства кислорода; для производства биотоплива.
Известен структурный аналог заявленного соединения (1) - 5-[(5,5-диметил-3-оксо-1-циклогексенил)окси]-3-метил-2(5H)-фуранон, проявляющий росторегулирующий эффект в отношении растений и грибов [Zwanenburg B., Blanco-Ania D. // Jornal of Experimental Botany. 2018. Vol. 69 (9). Р. 2205-2218. DOI: 10.1093/jxb/erx487]. Как правило, 5-[(5,5-диметил-3-оксо-1-циклогексенил)окси]-3-метил-2(5H)-фуранон образуется в процессе биосинтеза непосредственно в период жизнедеятельности организма как ответ на стрессовое воздействие внешних факторов среды или в период роста и созревания плодов. Формулы заявленного соединения (1) и структурного аналога представлены на схеме:
Недостаток структурного аналога обусловлен тем, что при его получении синтетическим путем выход составляет около 14%, очистка вещества сопровождается многостадийной обработкой, включающая в себя разделение смеси веществ колоночной хроматографией [Mwakaboko A.S., Zwanenburg B. // Bioorganic & Medicinal Chemistry. 2011. Vol. 19 (16). Р. 5006-5011. DOI: 10.1016/j.bmc.2011.06.057]:
Задача заявляемого изобретения состоит в разработке нового росторегулирующего средства по отношению к культуре Chlorella vulgaris.
Поставленная задача осуществляется в 2 этапа:
1. Получение 3'-бензоил-4'-гидрокси-1'-(2-гидроксифенил)-6,6-диметил-6,7-дигидро-2H-спиро[1-бензофуран-3,2-пиррол]-2,4,5'(1'H,5H)-триона (1) по известной методике [Тутынина Н.М., Рачева Н.Л., Масливец В.А., Алиев З.Г., Масливец А.Н. ЖОрХ. 2013. Т. 49. №1. С. 101-104]. Схема приведена ниже:
2. Применение росторегулирующей активности соединения по отношению к культуре микроводорослей Chlorella vulgaris.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение 3'-бензоил-4'-гидрокси-1'-(2-гидроксифенил)-6,6-диметил-6,7-дигидро-2H-спиро[1-бензофуран-3,2'-пиррол]-2,4,5'(1'H,5H)-триона (1).
К 1.0 ммоль соединения (2) в 10 мл безводного бензола добавляют 1.0 ммоль соединения (3), реакционную массу кипятят с обратным холодильником в течение 50 минут (до исчезновения фиолетовой окраски), выпавший осадок отфильтровывают. Перекристаллизовывают из этилацетата. Выход 94%, т. пл. 208-210°С (разл.).
Соединение (1) - белое высокоплавкое кристаллическое вещество, плавящееся с разложением, легкорастворимое в хлороформе, ДМСО и ДМФА, растворимое в ацетоне, 1,2-дихлорэтане, 1,4-диоксане, труднорастворимое в ароматических углеводородах, четыреххлористом углероде, этилацетате, нерастворимое в алканах и воде. Устойчиво при хранении в обычных условиях.
-1
ИК спектр соединения (1) снят в виде пасты в вазелиновом масле: 3380, 1830, 1753, 1698, 1613 см.
1
6
Спектр ЯМР Н соединения (1) снят в растворе ДМСО-d при частоте 400 МГц: δ=11.80 (уш. с, 1Н), 10.12 (с, 1H), 6.78-7.71 (м, 9Н), 2.52 (д.д, 2Н, J=70.0, 18.3 Гц), 2.06 (д.д, 2Н, J=52.2, 16.1 Гц), 0.89 (с, 3Н), 0.66 (с, 3Н) м.д.
13
6
arom
Спектр ЯМР С соединения (1) снят в растворе ДМСО-d при частоте 100 МГц: δ=191.54, 188.78, 174.28, 171.26, 165.93, 154.01 (4С), 136.93-111.73 (C.), 67.26, 50.24, 35.86, 33.40, 27.91, 26.57 м.д.
26
21
7
Соединение (1) CHNO. Найдено, %: С 67.90; Н 4.65; N 3.08. Вычислено, %: С 67.97; Н 4.61; N 3.05.
Пример 2. Исследование росторегулирующей активности 3'-бензоил-4'-гидрокси-1'-(2-гидроксифенил)-6,6-диметил-6,7-дигидро-2H-спиро[1-бензофуран-3,2'-пиррол]-2,4,5'(1'H,5H)-триона (1) на культуре Chlorella vulgaris (штамм IMBR-19).
-4
-6
-8
-10
-12
Для изучения росторегулирующей активности заявляемого соединения (1) в отношении микроводорослей культуру Chlorella vulgaris (штамм IMBR-19, Институт морских биологических исследований имени А.О. Ковалевского Российской Академии Наук, г. Севастополь) выращивали стерильно на среде BG-11 [Гайсина Л.А., Фазлутдинова А.И., Кабиров Р.Р. Уфа: Изд-во БГПУ. 2008. 152 с.]. Свежую (недельную) культуру (объем 1 мл) засевали в заранее приготовленные склянки со средой (объем 40 мл) с добавлением вещества (1) в концентрациях 1×10 М, 1×10 М, 1×10 М, 1×10 М, 1×10 М. Вещество (1) растворяли в этаноле. Дополнительно засевали культуры в контрольную среду, содержащую 0,1%-ый раствор этанола.
4
Стартовая концентрация хлореллы в склянках составляла 15-30×10 клеток/мл (контролировали подсчетом клеток в камере Горяева).
Инкубация засеянных культур проходила в термостате при 28°С, интенсивность освещения 1000-1200 лк в режиме 12 ч света /12 ч темноты.
Через 1, 3, 5 и 7 дней инкубации измеряли оптическую плотность культур (длина волны 560 нм) на спектрофотометре Cary Series UV-Vis (Agilent Technologies) для изучения динамики роста культуры.
В 7-дневных культурах вели подсчет клеток микроводорослей Chlorella vulgaris в камере Горяева в 5 больших исчерченных квадратах (микроскоп Carl Zeiss, Axioastar Plus с окуляр-микрометром). Отмечали количество живых и мертвых клеток. Для выявления мертвых клеток каждый образец жидкой культуры перед подсчетом окрашивали 1%-м раствором метиленового синего.
В 7-дневных культурах анализировали пигменты (хлорофилл a, b и каротиноиды) стандартным спектрофотометрическим методом в 90%-ом ацетоновом экстракте [SCOR-UNESCO Working Group №17. Determination of photosyntheric pigments in sea water // Monographs on Oceanographic Methodology. Paris: UNESCO. 1966. Р. 9-18.]. Оптическую плотность экстрактов измеряли при длинах волн 750, 430, 480, 630, 645 и 664 нм. Концентрацию хлорофилла a и b, каротиноидов рассчитывали по уравнениям [Jeffrey S.W., Humphrey G.F. // Biochem. Physiol. Pflanz. 1975. Bd. 167. S. 191-194. Parsons T.R., Srickland J.D.H. // J. Mar. Res. 1963. Vol. 21. №3. Р. 155-168].
Содержание общего белка [Bradford M.M. // Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. Р. 248-254. DOI: 10.1006/abio.1976.9999] и углеводов [Herbert D., Phipps P.J., Strange R.E. Chemical Analysis of Microbail Cells. Methods in Microbiology. Chapter 3. Р. 209-344. DOI: 10.1016/S0580-9517(08)70641-X] анализировали путем осаждения биомассы центрифугированием.
Полученные данные приведены в Таблице.
-4
-10
-12
По результатам исследования установлено, что соединение (1) проявляет ингибирующий эффект в отношении культуры Chlorella vulgaris (штамм IMBR-19) в концентрации 1×10 М и значительный ростостимулирующий эффект в концентрациях 1×10 - 1×10 М в сравнении с контрольным экспериментом.