СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НЕФРОТИЧЕСКОГО СИНДРОМА С МИНИМАЛЬНЫМИ ИЗМЕНЕНИЯМИ У ДЕТЕЙ
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR NEPHROTIC SYNDROME WITH MINIMAL CHANGES IN CHILDREN

Изобретение относится к медицине, а именно к области биохимических исследований в нефрологии, и может быть использовано для диагностики нефротического синдрома с минимальными изменениями (НСМИ).
2
2
Нефротический синдром (НС) - современное обозначение группы поражений почек - был введен в номенклатуру болезней в 1968 году. НС - клинико-лабораторный симптомокомплекс, включающий массивную протеинурию (40 мг/м/час или 1,0 г /м в сутки или более 50 мг /кг в сутки) и гипоальбуминемию (менее 25 г/л). Важнейшее клиническое проявление НС - отеки, вначале на лице, затем распространяющиеся на всю подкожную клетчатку. В связи с потерей белка с мочой и обменными нарушениями концентрация белка в крови снижается, развивается мышечная слабость, падает сопротивляемость инфекции. Резко возрастает содержание липидов в крови. Морфологической основой НС являются: нефротический синдром с минимальными изменениями (НСМИ), фокальный сегментарный гломерулосклероз, мембранозная нефропатия, мембранопролиферативный гломерулонефрит. Первоначальное лечение проводят глюкокортикоидными гормонами, причем преднизолон и метилпреднизолон являются первыми препаратами выбора при иммуносупрессивном лечении НС. В более тяжелых случаях назначают цитостатические препараты, ингибиторы кальциневрина. Варианты ответа на глюкокортикоидную терапию: стероидчувствительный НС или стероидрезистентный НС.
Нефротический синдром с минимальными изменениями (НСМИ) у детей и подростков характеризуется: стероидчувствительностью (нормализация анализов мочи в среднем через 2 недели после начала приема глюкокортикоидов и наступление полной клинико-лабораторной ремиссии).
Известен гистологический способ диагностики морфологических форм на основании исследования почечной ткани, полученной при нефробиопсии (Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) Glomerulonephritis Work Group.KDIGO Clinical Practice Guideline for Glomerulonephritis. Kidney inter., Suppl. 2012; 2: 139-274).
Недостатком этого способа является его инвазивность. Часто бывает трудно различить НСМИ и начальные стадии фокально-сегментарного гломерулосклероза и мембранозной нефропатии (Грене Г.-И., Кисс Е. Нефротический синдром: гистопатологическая дифференциальная диагностика. Часть 2: Болезнь минимальных изменений, фокально-сегментарный гломерулосклероз, мембранозный гломерулонефрит. Нефрология. - 2007. - Т. 11, №4. - С.88-94).
Диагностика основывается на выявленных изменениях в анализах крови и мочи (протеинурия, гипопротеинемия, гиперлипидемия) и на клинических данных.
Известен способ диагностики НСМИ у детей по стероидчувствительности, т.е. ответу на терапию преднизолоном. Максимальная доза преднизолона при стандартном курсе первоначальной терапии составляет для детей 2 мг/кг/сут, но не более 60-80 мг/сут, для подростков не более 80-100 мг/сут. Исследуют общий анализ мочи с определением содержания в ней белка. Стероидрезистентность устанавливают при отсутствии ответа на терапию через 6-8 недель, т.е. сохранении протеинурии (Habib R., Kleinknecht С. The primary nephrotic syndrome of childhood. Classification and clinicopathologic study of 406 cases // Pathol. Annu. - 1971. - Vol.6. - P.417-474).
К недостаткам этого метода относится длительный прием препарата, который может приводить к побочным эффектам терапии. Кроме того, часть пациентов с НСМИ стероидрезистентны.
Способ выбран нами в качестве прототипа.
Задачей изобретения является создание надежного и неинвазивного способа диагностики НСМИ.
Техническим результатом является создание экспресс-метода диагностики НСМИ.
Поставленная задача решается тем, что у больного с первичной гломерулопатией, проявляющейся нефротическим синдромом без нарушения функций почек, определяют содержания в моче уровня ИЛ-18.
Сущность изобретения состоит в том, что в моче определяют содержание ИЛ-18 у детей с нефротическим синдромом без нарушения функций почек и при его уровне от 74,7 до 540 пг на 1 мг креатинина диагностируют НСМИ у детей.
Интерлейкин 18 (англ. interleukin 18, IL-18) - провоспалительный цитокин, структурно подобный IL-1, оказывающий сильный эффект на активацию Т-клеток. Синтезируется макрофагами и другими клетками организма. Играет значительную роль в инфекционных и аутоиммунных заболеваниях.
Способ осуществляют следующим способом. Для исследования производится забор второй утренней порции мочи. Мочу центрифугируют при 10.000 об/мин в течение 15 мин для получения супернатанта, который затем замораживают при -70°С. ИЛ-18 определяют в моче методом твердофазного энзим-связанного иммуносорбентного анализа (ELISA) с использованием иммуноферментного набора (Bender MedSystems GmbH, Vienna, Austria). Для устранения влияния разведения оценивают соотношение уровня ИЛ-18 к креатинину в той же порции мочи. ИЛ-18, присутствующий в образцах, при внесении в ячейки планшета связывается с антителами к ИЛ-18, адсорбированными в ячейках. Затем в лунки добавляют конъюгат моноклональных анти-ИЛ-18 антител с биотином, который связывается с молекулами ИЛ-18, захваченными первыми антителами. После инкубации и промывки из ячеек удаляют не связавшийся конъюгат биотин-ИЛ-18, и в ячейки добавляется конъюгат стрептавидин-HRP, который связывается с биотином, конъюгированным с ИЛ-18, реакцию останавливают добавлением кислоты. Интенсивность окраски, измеренная на длине волны 450 нм, прямо пропорциональна концентрации ИЛ-18, присутствующего в образцах. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочной кривой рассчитывают концентрацию ИЛ-18 в определяемых образцах.
Предлагаемым способом диагностики НСМИ обследовано 32 ребенка с нефротическим синдромом в активной стадии без нарушения функций почек.
Данные обследования были использованы для построения графиков зависимости чувствительности и специфичности способа от содержания ИЛ-18. Было выявлено, что точка оптимального порога отсечения (optimal cut-off value), т.н. «точка баланса» между специфичностью и чувствительностью способа, соответствует значению уровня ИЛ-18, равному 74,7 пг/мг креатинина у детей с нефротическим синдромом без нарушения функций почек (Рис.1). Специфичность и чувствительность диагностического теста составляет 81%.
При уровне ИЛ-18 в моче от 74,7 до 540 пг на 1 мг креатинина диагностируют НСМИ, при более низком уровне этот диагноз исключают. Качество диагностической модели по данным ROC анализа оценивают как отличное (AUC=0,91).
Клинические примеры
Пример 1. Больная В., 6 лет. Поступила в нефрологическое отделение с отеками на лице, стопах и голенях. При обследовании протеинурия - более 6 г/л, гипоальбуминемия 21 г/л. Уровни сывороточных креатинина и мочевины были в пределах нормы (47 мкмоль/л и 3,0 ммоль/л, соответственно), максимальный удельный вес в пробе по Зимницкому составил 1025, клубочковая фильтрация 109 мл/мин (формула Шварца), что свидетельствовало об отсутствии нарушений функций почек. На основании клинико-лабораторных данных был установлен диагноз: нефротический синдром, хроническая болезнь почек 1 стадия. Назначен ежедневный прием преднизолона в дозе 2 мг/кг/сут (40 мг/сут). До наступления ремиссии у больной был исследован ИЛ-18 в моче. Для исследования производился забор 2-й утренней порции мочи. ИЛ-18 определялся в моче методом твердофазного энзим-связанного иммуносорбентного анализа (ELISA). Для устранения влияния разведения (концентрирования) оценивалось соотношение уровня ИЛ-18 к креатинину в той же порции мочи. Уровень ИЛ-18 у больной составил 420 пг на 1 мг креатинина. Что позволило предположить у ребенка морфологический диагноз «нефротический синдром с минимальными изменениями». Была продолжена терапия преднизолоном в дозе 2 мг/кг/сут (40 мг/сут) до достижения ремиссии. При проведении нефробиопсии диагноз НСМИ подтвердился.
Пример 2. Больная К., 11 лет. Поступила в нефрологическое отделение по поводу рецидива нефротического синдрома. При обследовании протеинурия - 2,4 г/л (3,3 г/сут), гипопротеинемия 50 г/л, гипоальбуминемия 24 г/л. Креатинин в сыворотке крови 60 мкмоль/л, клубочковая фильтрация 119 мл/мин (формула Шварца). На основании клинико-лабораторных данных был установлен диагноз: нефротический синдром, хроническая болезнь почек 1 стадия. Назначен ежедневный прием преднизолона в дозе 60 мг/сут. До наступления ремиссии у больной был исследован ИЛ-18 во 2-й утренней порции мочи методом ELISA. Оценивалось соотношение уровня ИЛ-18 к креатинину в той же порции мочи. Уровень ИЛ-18 у больной составил 133 пг на 1 мг креатинина. Предположен морфологический диагноз: «нефротический синдром с минимальными изменениями». Была продолжена терапия преднизолоном в дозе 60 мг/сут до достижения ремиссии. При проведении нефробиопсии диагноз НСМИ подтвердился.
Изобретение является новым, т.к. способ диагностики НСМИ на основании определения уровня ИЛ-18 в моче в мировой медицинской литературе неизвестен.
Изобретение носит изобретательский уровень, так как для врача-нефролога данный способ явным образом не следует из известного уровня техники в области биохимических исследований в нефрологии.
Быстрая дифференциальная диагностика НСМИ с другими морфологическими формами гломерулопатий позволит сразу проводить терапевтическое назначение более сильных, чем преднизолон, иммуносупрессивных препаратов, например циклоспорина А.