Синтетическая летальность фактора [PSI +] и мутаций в гене SUP45 в тетрадном анализе

ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

Сер. 3 2008 Вып. 1

ГЕНЕТИКА

УДК 577.217.563

Д. А. Киктев, Т. С. Галкина, Г. А. Журавлева

СИНТЕТИЧЕСКАЯ ЛЕТАЛЬНОСТЬ ФАКТОРА [PSГ] И МУТАЦИЙ В ГЕНЕ SUP45 В ТЕТРАДНОМ АНАЛИЗЕ

Введение. Основная роль в терминации трансляции у эукариот принадлежит белковым факторам eRFl и eRF3 (см.: [13]). У дрожжей данные белки получили обозначение Sup45 и Sup35, а кодирующие их гены —SUP45 и SUP35 соответственно (см.: [10]). Изучение факторов терминации трансляции приобрело особое значение после того, как была доказана возможность перехода белка Sup35 (eRF3) в альтернативную конформацию, способную передаваться между клеточными поколениями. Такая измененная форма белка Sup35 получила название приона [PSP] (см.: [4, 18]). Изучение приемных форм белков, или прионов, чрезвычайно важно, поскольку прионы млекопитающих, вызывают тяжелейшие нервные заболевания, в том числе и у человека. Прионы дрожжей не опасны для людей, но служат прекрасным модельным объектом для изучения свойств прионов.

На примере фактора [PSI+] было показано, что прионная форма одного и того же белка может находиться в различных устойчивых состояниях. Такие состояния получили название «варианты» или «штаммы» прионов [8]. У фактора [PST] выделяют по меньшей мере два варианта: «сильный» ([PS7+]S от английского strong) и «слабый» ([PSP]W от английского weak). Свойства каждого варианта [Р57+] стабильно наследуются в ряду митотических делений и в мейотическом потомстве. Среди таких свойств основными являются: супрессия нонсенс-кодонов и термочувстительность дрожжевых штаммов, наблюдаемая в присутствии [PS7+], стабильность [Р57+]. Особым свойством [PSF] штаммов является реакция на присутствие мутантных аллелей некоторых генов. Например, присутствие мутантной аллели TPHKSer SUQ5 приводит к нонсенс-супрессии только в [PST] штаммах [6]. Также известно, что совмещение в одном штамме фактора [PSP] и некоторых мутаций sup35 или sup45 вызывает гибель дрожжевого штамма; такая ситуация получила обозначение несовместимости варианта [PSI+] и мутантной аллели (см.: [7]). Ранее нами была проанализирована несовместимость [PSГ] и мутантных аллелей гена SUP45. Показано, что несовместимость зависит как от типа фактора [PSI+], так и от свойств мутантной аллели sup45. В данной работе продолжен анализ несовместимости фактора [PSF] и аллелей sup45. Были изучены клеточная летальность и стабильность фактора [PSP] при переходе от диплоидных гибридов к гаплоидным штаммам в тетрадном анализе.

Материалы и методы. Штаммы. В работе был использован штамм Escherichia coli XLl-Blue recAl endAl g)>rA96 thi-1 hsdR17 supE44 relAl [F' pro AB laclq A(lacZ)M15 TniO(lei)] [16].

© Д. А. Киктев, Т. С. Галкина, Г. А. Журавлева, 2008

Генотипы штаммов S. cerevisiae, использованных в работе, представлены в табл. 1. Также в работе использовали производные штамма 1Б-Д1606, несущие в хромосоме мутантные аллели sup45 [15]. Перечень мутантных аллелей sup45 приведен в табл. 2.

Плазмиды. В работе использовали плазмиды, сконструированные на основе pRS315 и несущие различные аллели гена SUP45 [15]. Для индукции фактора [PSP ] применяли плаз-миду pFL39G AL-SUP35N [3].

Среды и условия культивирования. В работе использовали стандартные среды, применяемые при работе с дрожжами-сахаромицетами: богатую среду (YAPD), минимальную (MD), полную синтетическую среду (SC) и селективные среды, не содержащие отдельных компонентов среды SC, среду для микроманипулирования [1, 17].

Для индукции споруляции использовали среду с ацетатом натрия [1], содержащую все необходимые для роста гибрида добавки в количестве % от нормы. Для селекции \psi~] клеток Использовали среду YAPD с гидрохлоридом гуанидина (ГГХ) (Sigma) в концентрации 5мМ [5].

Для индукции экспрессии конструкций, находящихся под контролем промотора PGAL1, применяли селективную среду, в которую вместо глюкозы добавляли галактозу (20 г/л) (Sigma) и раффинозу (20 г/л) (ICN Biomedical Inc).

Для выращивания бактерий использовали среду LB [16]. Селекцию устойчивых к ампициллину бактериальных трансформантов проводили на среде LB, содержащей ампициллин (50 мкг/мл).

Штаммы дрожжей инкубировали при 25 °С, штаммы бактерий — при 37 °С.

Молекулярно-генетические методы. В исследовании использовали стандартные методы работы с дрожжами-сахаромицетами [2].

Индукцию фактора [PS7+] проводили согласно ранее описанной методике [8]. Штамм D1628 трансформировали плазмидой pFL39GAL-SUP35NM, содержащей участок дрожжевого гена SUP35, кодирующий NM-домен белка Sup35. Полученных на среде с глюкозой трансформантов дважды пассировали в течение 3 суток на среде, селективной для трансформантов и содержащей галактозу и раффинозу в качестве источников углерода. Затем их клонировали на богатой среде YAPD и у отдельных клонов проверяли способность расти на среде без аденина.

Для элиминации фактора [Р57+] штаммы трижды пассировали на среде YAPD, содержащей 5мМ ГГХ. Далее штаммы клонировали на YAPD и анализировали способность штаммов к росту на среде без аденина.

Таблица 1

Штаммы, использованные в работе

Штамм Генотип штамма Происхождение штамма

1Б-Д1606 МАТг. ade 1-14 his7-l 1еи2-3,112 ura3-52 trpl-289 Iys9-A21 [15]

ОТ55 MATa adel-14 his3A200 leu2-3,112 ura3-52 trpl-289 [PS1T [8]

ОТ56 МАТг adel-14 his3A200 leu2-3,112 ura3-52 trpl-289 [PSPf [8]

D1628 MATal/MATa adel-14//adel-14 his3//his3 Ieu2//leu2 ura3// игаЗ trpl//trpl Iys2//lys2 SUP45//SUP45::HIS3 [14]

1-29В-П2156 MAT& adel-14 his7-l metl3-Al sup45 ПГЛ

5-29В-П2156 МАТг. adel-14 his7-l metl3-Al sup35 ПГЛ

ПГЛ — штамм принадлежит петергофским генетическим линиям.

Тест на определение доминантности или рецессивности признака нонсенс-супрессии проводили следующим образом. В качестве тестерных штаммов использовали штамм, несущий мутацию sup35 (5-29В-П2156) или sup45 (1-29В-П2156) (см. табл. 1). Данные штаммы скрещивали с тестируемыми клонами. Если супрессия наблюдалась у гибридов от скрещивания только с тестером sup45, то тестируемый клон содержал мутацию sup45. Если супрессия наблюдалась у гибридов от скрещивания как с тестером sup45, так и с тестером sup35, то тестируемый клон содержал доминантный супрессор (в данной работе — фактор [PSГ]).

Трансформацию Е. coli проводили в соответствии с методом X. Иноу [11]. Трансформацию дрожжей проводили по методу Р. Д. Гица [9]. Плазмидную ДНК из Е. coli выделяли по методу щелочного лизиса [16].

Статистические методы. Для подсчета доверительного интервала процента

применяли формулу а - л/- [2], где р—доля класса с изучаемым признаком, п — общая

ОТ56 «сильный»

ОТ55 «слабый»

[РЗТТ

ЯиР45

хир45-101

эир45-102 зир45-103 хир45-104

численность выборки.

Результаты исследований и их обсуждение. Мутантные аллели $ир45, находящиеся в гетерозиготном состоянии, различаются по совместимости с «сильным» и «слабым» [РБГ].

Производные штамма 1Б-Д1606, несущие мутантные аллели гена 811Р45 на хромосоме, скрещивали со штаммом ОТ55 [Р57+]ш и ОТ56 [РЗР]8. Формирование жизнеспособных гибридов наблюдали при скрещивании всех использованных мутантов со штаммом ОТ55 [Р&Г]™. При скрещивании со штаммом ОТ56 гибриды бы-

ли получены только в случае мутантов зир45-113, зир45-115 и 8ир45-116 (рис. 1). В остальных комбинациях жизнеспособные гибриды не образовывались. Отсутствие роста гибридных клеток в дальнейшем будет обозначаться как несовместимость фактора [Р57+] и мутантной аллели яир45. Подобный характер формирования диплоидных гибридов ранее наблюдали при скрещивании штаммов ОТ55 и ОТ56 [Р5Р]8 с производными, несущими мутантные аллели гена 817Р45 на плаз-миде [12]. Таким образом, несовместимость мутантных аллелей зир45 не зависит от того, где локализована мутантная аллель эир45— на плазмиде или в хромосоме, а определяется свойствами самой аллели. Несовместимость может зависеть как от уменьшения количества полноразмерного белка 8ир45 (в случае нонсенс-аллелей 8ир45), так и от свойств мутантных форм белка. Следует обратить внимание на то, что в полученных гибридах мутантная аллель зир45 находится в гете-розиготе. То есть в диплоидном штамме присутствует также и ген 81/Р45 дикого типа. Нами были использованы полученные гибриды для анализа возможности образования гаплоидных сегрегантов, несущих мутантную аллель яир45 в присутствии фактора [Р57+].

Сниженная жизнеспособность продуктов мейоза обусловлена гибелью сегрегантов [Р8Г]Ц, несущих мутантную аллель эир45. Гибриды, полученные при скрещивании штамма ОТ55 [Р57+Р' с 1Б-Д1606

Рис. 1. Несовместимость «сильного» и «слабого» [Р57+] с миссенс- и нонсенс-аллелями .чир45, находящихся в гетерозиготном состоянии Приведены результаты скрещивания штаммов ОТ55 [ДЯТ и ОТ56 со штаммом 1Б-Д1606

и его мутантами по гену ЗиР45. Штаммы ОТ55 [РБРУ и ОТ56 [РЯ1+У несли плазмиду рЕЬ38. Для отбора гибридов использовалась синтетическая среда без гистидина и урацила.

Таблица 2 Мутантные аллели гена ЯиР45, использованные в работе

Мутантная аллель

$ир45-101 ьир45-102 ир45-103 зир45-104 зир45-105 вир45-107 $ир45-111 яир45-113 зир45-115 8ир45-116

100 !

Замена нуклеотидного

7960-159Т-62Т — 848Т-1153С  950Т-193С-1440-209С-1850-

>Т

А С

А ->Т

»Т

>т »с

Замена аминокислотного остатка

26601и — (ТАА) 53Туг—»(ТАА) 21 Ьей->8ег 283Ьеи->(ТАА) 38501и— (ТАА) 317Ьеи—>(ТОА) 65Аг§—>СуБ 48Ме1—>11е 70Бег —» РЬе 62Агя -» ТЬг

§ 50-

£

0 01628 [РБГ]  1Б-Д1606 х ОТ55[Р5Г"]

и с некоторыми его производными, несущими мутантные аллели яир45 ($ир45-102, зир45-104, зир45-№, яир45-107, 8ир45-115, зир45-116), клонировали на среде, селективной для гибрида. Все отобранные клоны были прототрофны по аденину, что свидетельствовало о присутствии фактора [Р57+]. По одному из клонов каждого гибрида подвергали тетрадному анализу.

В мейотическом потомстве гибрида, полученного при скрещивании ОТ55 [РЯгу и 1Б-Д1606, доля выживших аско-спор составила 73,7 % (табл. 3, рис. 2). У гибридов, содержащих нонсенс-мутации (зир45-102, $-ир45-]04, $ир45-105, зир45-107) общая выживаемость аскоспор не превышает 50 %. В большинстве тетрад расщепление по жизнеспособности составило 2:2. Полученные результаты согласуются с теоретически ожидаемым расщеплением по жизнеспособности в случае несовместимости данных мутаций с [Р5У+].

В тетрадном анализе гибридов, несущих одну из двух изученных миссенс-мутаций зир45-115 или яир45-116, было получено свыше 60 % жизнеспособных сегреганов и значительный процент тетрад с расщеплением по жизнеспособности 4:0 и 3:1 (табл. 3).

Все гибриды, полученные при скрещивании ОТ55 [Р57Т с 1Б-Д1606 и с мутантами по гену 811Р45, полученными на данном штамме, были прототрофны по аденину. У полученных в результате тетрадного анализа сегрегантов проявлялась различная степень супрессии мутации ас1е1-14 даже в пределах одной тетрады. При этом значительная часть сегрегантов не проявляла заметной супрессии мутации ас1е1--14. По-видимому, в данном случае происходит изменение или потеря

фактора [Р5Р] в ходе мейоза или последующих митотических делений.

Для оценки характера супрессии сегреганты были подвергнуты тесту на определение доминантности либо рецессивности супрессорного фенотипа с использованием тестеров, несущих мутацию $ир35 или зир45. Данный тест проводился до и после трехкратного пассирования сегрегантов на среде, содержащей 5 мМ ГГХ (табл. 4).

В мейотическом потомстве гибрида, полученного при скрещивании ОТ55 [Р51+]™ и 1Б-Д1606, доминантный характер супрессии проявляли 64% сегрегантов. После

4

лЬ ,су>

^ чч\ ^ ччЬ ^

/ ^ л/ ^ ^ л/ ^

V

«сильные»

-у-

«слабые»

Рис. 2. Совместимость фактора [Р£/+]™ и мутаций зир45, зависящая от супрессорной

способности мутаций 5:ир45 Приведено сравнение доли выживших аскоспор в тетрадном анализе диплоидов несущих

различные аллели гена БиР45 (табл. 3 и 5), которые являются «сильными» или «слабыми» су-прессорами. Указан 95 %-ный доверительный интервал для доли.

Таблица 3

Выживаемость аскосопор гибридов, полученных при скрещивании ОТ55 [ЛИ4]™ и производных штамма 1Б-Д1606

Аллель БУР45 Всего проанализировано тетрад Число тетрад, в которых выжило аскоспор: Доля выживших аскоспор, % *

4 3 2 1 0

ЪиР45 20 6 9 4 0 1 73,75±4,92

,^ир45-102 19 1 1 11 4 2 43,42±5,67

зир45-104 19 0 7 6 4 2 48,68±5,73

Бир45-105 17 0 2 13 1 1 48,53±6,06

эир45-107 20 0 0 7 10 3 30,0±5,12

яир45-115 19 4 6 6 1 2 61,84±5,57

зир45-11б 18 4 7 6 1 0 69,44±5,43

* Приведен 95 %-ный доверительный интервал для доли.

Таблица 4

Результаты теста на определение доминантности или рецессивности признака нонсенс-супрессии у сегрегантов гибридов, полученных при скрещивании ОТ55 [Р57+р и мутантов по гену Б11Р45 штамма 1Б-Д1606 до и после обработки ГГХ

Аллель 511Р45 Тест до обработки ГГХ Тест после обработки ГГХ

Д, % * Р, % * д, % * р,% *

БиР45 64,0 0 0 0

$ир45-102 76,0 15,3 0 15,3

,тр4 5-104 25,0 35,0 0 35,0

зир45-105 61,5 23,3 0 23,3

тр45-107 60,0 30,0 0 30,0

зир45-115 57,8 5,0 0 21,0

зир45-116 78,2 8,0 0 34,7

* Указана доля сегрегантов, проявлявших доминантную (Д) и рецессивную (Р) супрессии.

обработки ГГХ сегрегаиты давали отрицательный тест на «доминантность-рецессивность», что позволяет утверждать, что сегрегаиты несли фактор [Р57+], который был элиминирован под действием ГГХ. Фактор [Р57+] наследуется не всеми сегрегантами.

Полагаем, что происходит потеря фактора [Р£/+] в ходе мейоза или последующих митотических делений. Таким образом, можно говорить о мейотической нестабильности фактора [Р^Р]1*', содержащегося в штамме ОТ55.

У гибридов, содержащих нонсенс-мутации (гибриды, полученные при скрещивании ОТ55 [Р5Р]* и штамма 1Б-Д1606, несущего мутации тр45-102, зир45-104, 8ир45-105, зир45-10Т), доминантный характер супрессии проявляли до 76 % жизнеспособных сегрегантов и до 35 % сегрегантов несли мутацию зир45. Все сегрегаиты с доминантной супрессией после потери фактора [Р5Г] на среде с ГГХ теряли су-прессорный фенотип. Характер супрессии у сегрегантов, несущих мутацию яир45, не менялся после обработки клеток ГГХ. Полученные результаты можно объяснить тем, что все сегрегаиты с доминантным характером супрессии содержали фактор [Р£Г], но не несли мутацию зир45. В то же время сегрегаиты, которые несли мутацию в гене Б11Р45, не содержали фактора [Р57+].

Среди выживших сегрегантов, несущих миссенсс-мутации (,$ир45-115, тр45~116), доля сегрегантов, проявлявших доминантный характер супрессии, достигла 78,2 %. До 8 % сегрегантов несли мутацию, аллельную хир45. После обработки ГГХ сегрегаиты

не проявляли доминантной супрессии. После обработки ГГХ увеличивалась доля се-грегантов с тестом на аллелизм зир45. Исходя из полученных результатов, можно предположить, что среди сегрегантов с доминантной супрессией были как сегреганты, содержащие фактор [Р57+] и ген БиР45 дикого типа, так и сегреганты, содержащие «слабый» фактор и мутацию в гене БиР45.

Гибель сегрегантов /РЯГнесущих мутантную аллель $ир45, не является штаммоспецифичной. Чтобы убедиться в том, что наблюдаемый эффект не является штаммоспецифичным, нами был проведен анализ, аналогичный описанному выше, у независимо полученного диплоидного штамма. Для проведения тетрадного

анализа был выбран штамм В1628, гетерозиготный по дизрупции гена 811Р45. Нами был получен штамм 01628 [Р57+]ху путем сверхпродукции в аналогичном [ряг] штамме М-концевого фрагмента 8ир35. Для этой цели 01628 [ряг] был трансформирован плазмидой рРЬ390АЬ-БиР35ЫМ. После двух пассажей на селективной для плазмиды среде с галактозой трансформантов клонировали на богатой среде с глюкозой и отбирали прототрофные по аденину клоны, проявляющие умеренный рост на среде без аденина. Супрессорный фенотип клонов стабильно передавался в ходе митотических делений, но терялся при культивировании клеток на среде, содержащей ГГХ. На основании этих данных можно утверждать, что данные клоны содержали фактор

Один из полученных \PSPf4 клонов трансформировали плазмидами р!18315, несущими аллель БиР45 дикого типа или мутантную аллель яир45. Все трансформанты были жизнеспособны и прототрофны по аденину. Один из клонов каждого трансформанта подвергали тетрадному анализу. Результаты тетрадного анализа представлены в табл. 5.

Таблица 5

Выживаемость в тетрадном анализе аскоспор трансформантов штамма Б1628 [Р.57+]™, несущих плазмиду рК£>315 с аллелью ЯиР45 дикого типа или мутантные аллели $ир45

Аллель БиР45 Проанализировано тетрад Число тетрад, в которых выжило аскоспор: Доля выживших аскоспор,% *

4 3 2 1 0

БиР45 20 4 5 11 0 0 66,25±5,29

зир45-101 20 0 1 13 3 3 40,0±5,48

Бир45-102 20 0 1 17 0 2 46,25±5,57

$ир45-103 20 0 3 12 1 4 42,5±5,53

.чир45-104 20 0 1 16 3 0 47,5±5,58

вир45-105 . 20 0 0 19 1 0 48,75±5,59

эир45-107 20 0 0 15 4 1 42,5±5,53

$ир45-111 20 0 5 14 1 0 55,0±5,56

вир45-113 21 2 5 13 1 0 59,5±5,49

.чир45-115 20 2 6 9 3 0 58,75±5,50

^цр45-116 20 0 6 12 2 0 55,0±5,56

* Приведен 95 %-ный доверительный интервал для доли.

Выживаемость аскоспор производных штамма 01628 [Р57+]№ аналогична той, что получена в тетрадном анализе гибридов ОТ55 [РБГ]^ и производных 1Б-Д1606 (см. рис. 2). Выживаемость аскоспор трансформантов, несущих любую из нонсенс-аллелей зир45 или миссенс-аллель яир45-103, не превышает 50 % от теоретически ожидаемого (табл. 6, рис. 2). Полученные данные позволяют предположить, что в гаплоидном штамме ни одна из указанных аллелей $ир45 не совместима со «слабым» фактором [РБР]™. Вместе с тем выживаемость в мейотическом потомстве трансформантов, несущих миссенс-аллели $ир45-111,

зир45-113, зир45~115 и $ир45-116, превышает 50 %, что позволяет предположить совместимость со «слабым» [Р57+^ сла-босупрессирующих миссенс-аллелей эир45. Результаты тетрадного анализа как мис-сенс-мутантов (яир4 5-115, 5ир45-116), так и нонсенс-мутантов (.чир45-102, хир45-104, 8ир45-105, кир45-107), проведенного на двух независимо полученных [Р5Р] штаммах, сходны. Основываясь на полученных данных, предполагаем, что несовместимость не является штаммоспецифичной и определяется свойствами мутантной аллели $ир45 и характером фактора [РБГ].

Фактор [РБГ^ вызывает гибель аскоспор, несущих «слабые» миссенс-аллели вир45. Для того чтобы изучить совместимость мутантных аллелей Бир45 и «сильного» [Р5Г]5, был проведен тетрадный анализ гибридов, полученных при скрещивании штамма ОТ56 [Р57+]8 и 1Б-Д1606, а также его производных, несущих слабосупрессирующие миссенс-аллели $ир45-113, зир45-П5, 8ир45~116. Анализ остальных мутантных аллелей был невозможен, поскольку гибриды [Р57+]я, содержащие эти аллели, нежизнеспособны.

Все гибриды являлись прототрофными по аденину, что свидетельствует о присутствии в них фактора [Р£Р]8. Выживаемость аскоспор гибрида, полученного при скрещивании ОТ56 [Р5Р]5 со штаммом 1Б-Д1606, составила 72,5 %. Тест на определение доминантного или рецессивного характера супрессии показал, что в данных гибридах фактор [Р5!Р]8 стабилен, сохраняется в ходе мейоза и последующих мито-тических делений (данные не приведены).

У гибридов, полученных при скрещивании ОТ56 [РБР]5 и мутантов штамма 1Б-Д1606 $ир45-113, хир45-115, ¿ир45-116, выживаемость аскоспор не превышает 50 % (см. табл. 6). Полученные результаты соответствуют предположению о несовместимости данных мутаций с фактором [Р5Р]8.

Таким образом, результаты тетрадного анализа позволяют сделать заключение, что все изученные мутации в гетерозиготном состоянии совместимы со «слабым» [РУР]4'. В гаплоидных сегрегантах с тем же [Р£Р]™ несовместимы все нонсенс-мутации и некоторые миссенс-мутации зир45, но слабо супрессирующие миссенс-мутации зир45 остаются совместимыми. То есть несовместимость фактора [РХР] с мутациями $ир45 более выражена в гаплоидных штаммах, нежели в диплоидных, в которых мутация находится в гетерозиготном состоянии. С «сильным» фактором [Р5У+]5 в гетерозиготном состоянии совместимы только слабосупрессирующие миссенс-аллели гена 5ЬТР45. В гаплоидных сегрегантах совмещение «сильного» [Р5Р] и мутаций $ир45 приводит к гибели дрожжевых клеток (табл. 7).

Заключение. Диплоидные гибриды (как содержащие так и содержащие

[Р5Р]й) не имеют выраженных отличий в характере роста при сравнении штаммов, несущих различные мутации $ир45, между собой или со штаммом, содержащим только аллели 56Р45 дикого типа. Также не было выявлено заметных отличий в способности гибридов к споруляции. Тем не менее при переходе в гаплоидное состояние в ходе мейотического деления наблюдались значительные различия в выживаемости продуктов мейоза. Сходные результаты были получены в других лабораториях (1леЬ-тап апс! АП-ЯоЬуп, 1984, Опо е! а!., 1984), однако в этих работах не была известна

Таблица б

Выживаемость аскоспор гибридов, полученных при скрещивании ОТ56 [Р57+]5 и миссенс-мутантов по гену БиР45 штамма 1Б-Д1606

Аллель БЦР45 Ожидаемое число аскоспор Выживших аскоспор Доля выживших, %*

БиР45 40 29 72,5 ±8,24

зир45-113 40 15 37,5 ±7,65

вир45-115 40 15 37,5 ±7,65

$ир45-116 40 17 42,5 ±7,82

* Приведен 95 %-ный доверительный интервал для доли.

Таблица 7

Эффект взаимодействия фактора [Р57+] и мутаций .чир45 в диплоидных и гаплоидных штаммах

Аллель гена SUP45 Гетерозиготный штамм Гаплоидный штамм

[flS7+]s [PS7+]W [PSPf [AS7T

WT + + + +

Нонсенс-аллели sup45-101,102,104,105,107 - + - -

Миссенс-аллель sup45-103 «сильный» супрессор - + - -

Миссенс-аллели sup45-lll, 113,115,116 «слабые» супрессоры + + - +

WT—аллель SUP45 дикого типа; «+»— штамм жизнеспособен, [Р5Т] совместим с аллелью гена SUP45; «-» — штамм нежизнеспособен, [Р£7+] несовместим с аллелью гена SUP45.

природа мутаций sup45, в связи с чем оставался необъясненным механизм, лежащий в основе наблюдаемых различий. Но в тех же работах авторы отмечали, что жизнеспособность мутантов sup45 в тетрадном анализе зависит от свойств фактора [PSI+],

На основании полученных нами данных сделан вывод, что гибель [PS7] клеток, несущих мутацию sup45, зависит от варианта фактора [Р£7+] («сильный» или «слабый») и присутствия гена SUP45 дикого типа. Полученные данные полностью согласуются с нашими предыдущими результатами [12]. Жизнеспособность [PSP] клеток, несущих мутацию в гене SUP45, находится в зависимости как от количества полноразмерного белка Sup45, так и от его «качества», т. е. способности мутантного белка выполнять функции, присущие Sup45. Пока что остается открытым вопрос, является ли в данном случае роль Sup45 как фактора терминации трансляции определяющей для жизнеспособности на [PSP] фоне. Известно, что белок Sup45 взаимодействует с компонентами других клеточных процессов, в том числе вовлеченными в формирование цитоскелета. Нельзя исключить возможность того, что наблюдаемый летальный эффект мутаций sup45 на [PSI1] фоне связан с нетрансляционной ролью белка Sup45.

Summary

Kiktev D. A., GalkinaT.S., Zhouravleva G. A. Synthetic lethality of [PST] and mutations in SUP45 gene in tetrad analysis.

Yeast [PSP] factor is the best characterized prion determinant. There are different variants of the [PSP] factor that differ in their properties and are denoted as "weak" and "strong" [PSP] variants. We demonstrated that the lethal effect of the [PSP] factor in the presence of the mutations in SUP45 gene depends on the properties of [PSP] as well as on the properties of sup45 mutations.

E-mail: den-yea@yandex.ru Литература

1. Захаров И. А., Кожин С. А., Кожина Т.Н., Федорова И. В. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. Л., 1984. 2. Урбах В. Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях. М., 1957. 3. Borchsenius A.S., MullerS., Newnam G.P., Inge-Vech-tomovS.G., ChemoffY.O. Prion variant maintained only at high levels of the Hspl04 disaggre-gase // Curr. Genet. 2006. Vol. 49. N 1. P. 21-29. 4. ChemoffY.O. Mutation processes at the protein level: is Lamarck back?//Mutat. Res. 2001. Vol. 488. N 1. P. 39-64. 5. ChemoffY.O., UptainS.M., Lindquist S. L. Analysis of prion factors in yeast//Methods Enzymol. 2002. Vol. 351. P. 499-538. 6. CoxB.S. PSI+, a cytoplasmic suppressor of supersuppressor in yeast//Heredity. 1965. Vol. 20. P. 505-521. 7. CoxB.S., TuiteM.F., McLaughlin C. S. The psi factor of yeast: a problem in inheritance // Yeast. 1988. Vol. 4. N 3. P. 159-178. 8. Derkatch I.L., ChemoffY.O., Kushnirov V.V.,

Inge-VechtomovS.G., Liebman S. W. Genesis and variability of [P57] prion factors in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1996. Vol. 144. N 4. P. 1375-1386. 9. GietzR.D., Schiestl R. H., WillemsA.R., Woods R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedures'/Yeast. 1995. Vol. 11. N 4. P. 355-360. 10. Inge-Vechtomov S„ Zhouravleva G„ Philippe M. Eukaryotic release factors (eRFs) history // Biol. Cell. 2003. Vol. 95. N 3-A. P. 195-209. 11. InoueH., NojimaH., OkayamaH. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids//Gene. 1990. Vol. 96. N 1. P. 23-28. 12. KiktevD.A., Inge-Vechtomov S., Zhouravleva G. Prion-Dependent Lethality of sup45 Mutants in Saccharomyces cerevisiae I I Prion. 2007. Vol. 1. N 2. P. 136-143. 13. Kisselev L., Ehrenberg M„ FrolovaL. Termination of translation: interplay of mRNA, rRNAs and release factors?//EMBO J. 2003. Vol. 22. N 2. P. 175-182. 14. LeGoffC., Zemlyanko 0., Moskalenko S., BerkovaN., Inge-Vechtomov S., Philippe M., Zhouravleva G. Mouse GSPT2, but not GSPT1, can substitute for yeast eRF3 in vivo//Genes Cells. 2002. Vol. 7. N 10. P. 1043-1057. 15. Moskalenko S. E., Chabelskaya S. V, Inge-Vechtomov S. G., Philippe M., Zhouravleva G.A. Viable nonsense mutants for the essential gene SUP45 of Saccharomyces cerevisiae I I BMC. Mol. Biol. 2003. Vol. 4. P. 2. 16. SambrookJ., FritschE.F., Maniatis T. Molecular cloning a laboratory manual. 1989. Vol. 2nd ed. Cold Spring Harbor, 1989. 17. Sherman F., FinkG.R., Hicks J. B., Laboratory course manual for methods in yeast genetics. Cold Spring Harbor, 1986. 18. Zhouravleva G.. AleninV., Inge-Vechtomov S., ChernoffY. To stick or not to stick: Prion domains from yeast to mammals//Recent. Res. Devel. Mol. Cell. Biol. 2002. N 3. P. 185-218.

Статья принята к печати 27 сентября 2007 г.