Андроклинный эмбриоидогенез как биотехнологический подход к сохранению биоразнообразия

Сельдимирова О.А., Круглова Н.Н.

Институт биологии УНЦ РАН, г Уфа

АНДРОКЛИННЫЙ ЭМБРИОИДОГЕНЕЗ КАК БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ПОДХОД К СОХРАНЕНИЮ БИОРАЗНООБРАЗИЯ

Проанализированы преимущества андроклинного эмбриоидогенеза как способа клонирования растений в культуре in vitro изолированных пыльников. На основе комплексного подхода разработана биотехнология стабильного получения андроклинных растений-регенерантов. Рассматривается возможность использования разработанной биотехнологии в целях сохранения биоразнообразия.

Ключевые слова: биотехнология, андроклиния, эмбриоидогенез, растения-регенеранты.

Одно из направлений практического применения биотехнологии - микроразмножение и тиражирование в культуре in vitro растений, имеющий ряд преимуществ по сравнению с традиционным вегетативным размножением. Последующая репатриация таких растений в природные экосистемы может способствовать сохранению многообразия растительного мира.

Перспективное направление в этой области - андроклинная гаплоидия. Биологический феномен андроклинии состоит в формировании растения-регенеранта на основе переключения программы развития гаплоидных клеток пыльника с обычного гаметофитного пути, связанного с образованием пыльцевого зерна (мужского гаметофита), на иной путь - спорофитный [8, с. 3]. Полученные гаплоидные растения представляют собой клоны, сохраняющие генотип исходных донорных растений. Перевод гаплоидов в дигаплоидное состояние позволяет получать полноценные семена таких растений.

На протяжении ряда лет в лаборатории экспериментальной эмбриологии растений Института биологии Уфимского НЦ РАН на основе комплексного исследования феномена андроклинии у яровой мягкой пшеницы ведется разработка стабильного массового получения и тиражирования растений-регенерантов в культуре in vitro пыльников.

В работе используются: метод культуры in vitro пыльников яровой мягкой пшеницы [4, с. 430], метод цитологических исследований [1, с. 2667, 185], метод сканирующей электронной микроскопии в собственной модификации, экспресс-метод твердофазного иммуноферментного анализа растительных образцов [5, с. 1222-1224].

Экспериментально выявлено, что путями морфогенеза, приводящими к образованию полноценных гаплоидных регенерантов, в услови-

ях выполненных экспериментов являются эмбриоидогенез и гемморизогенез. Эмбриоидогенез состоит в формировании из сильновакуолизи-рованной микроспоры (инициальной клетки андроклинии [3, с. 43-58]) эмбриоида - зародышеподобной структуры, гемморизогенез - в сопряженном формировании на морфогенном (способным к регенерации растений-регенеран-тов) каллусе множественных почек и корней..

Установлено, что биотехнологически оптимален эмбриоидогенез. Основное преимущество эмбриоидогенеза заключается в том, что единицей репродукции в данном случае является эм-бриоид как зачаток целого организма - зародышеподобная структура со всеми характерными для зародыша пшеницы органами [2, с. 63]. В результате исключается процедура многократных пересадок на питательные среды различного состава, как это происходит в случае регенерации растений через каллусную культуру. Кроме того, одноклеточное происхождение эмбриоидов гарантирует образование гаплоидных растений-клонов, генотип которых идентичен генотипу родительского растения.

Сотрудниками лаборатории разработан методический подход, позволяющий управлять морфогенезом in vitro сильновакуолизирован-ных микроспор [8, с. 48-51]. Сопоставление данных цитоэмбриологического анализа и твердофазного иммуноферментного анализа позволило установить, что индукция конкретного пути морфогенеза in vitro сильновакуолизированных микроспор определяется балансом между концентрацией экзогенного ауксина 2,4-Д в модифицированной индукционной питательной среде Potato II и содержанием эндогенного ауксина ИУК в пыльнике в момент инокуляции. Применение экспресс-метода иммуноферментного анализа позволяет быстро и надежно проводить

ВЕСТНИК ОГУ №6/ИЮНЬ2009 3 35

Сельдимирова О.А. и др. Андроклинный эмбриоидогенез как биотехнологический подход.. Фундаментальные проблемы изучения и сохранения биологического разнообразия

определение количественного содержания эндогенных фитогормонов в большом количестве растительных образцов. Полученные данные дают основание для выбора концентрации 2,4-Д, оптимальной для индукции эмбриоидогене-за у конкретного генотипа яровой мягкой пшеницы, и исключают необходимость эмпирического подбора условий культивирования in vitro.

Совместно с лабораторией эмбриологии и репродуктивной биологии Ботанического института им. В.Л.Комарова РAН (г. Санкт-Петербург) в лаборатории разработан методический подход, позволяющий методом световой микроскопии исследовать объекты, ранее изученные методом сканирующей электронной микроскопии. Данный подход позволяет совмещать детали внешнего и внутреннего строения, и тем самым получать четкое представление о структуре изучаемого объекта. Использование данного подхода позволяет убедительно доказать факт индукции именно эмбриоидогенеза, как пути морфогенеза in vitro сильновакуоли-зированных микроспор.

Также с использованием этого подхода были детально изучены этапы развития эмб-риоидов от инициальных клеток до растений-регенерантов [6, с. 9-14]. Показано, что развитие эмбриоидов in vitro принципиально сходно с развитием зиготических зародышей донорных растений пшеницы в естественных условиях, что является еще одной веской причиной использования для получения полно-

ценных растений-регенерантов именно эмб-риоидов.

Кроме того, выявлен особый тип эмбриои-дов - полиэмбриоиды [7, с. 105-106]. Основное отличие полиэмбриоидов от биполярных эмб-риоидов, схожих с зиготическими зародышами, - наличие множественных симметрично расположенных в апикальной части полиэмбриоида апикальных меристем побега. Несмотря на такое отличие, формирование и развитие органов у полиэмбриоидов происходит также как и у зиготических зародышей. При прорастании полиэмбриоидов образуются растения-регене-ранты с увеличенным количеством побегов. Это позволяет значительно увеличивать выход гаплоидных растений-регенерантов, что существенно при массовом тиражировании растений в культуре in vitro.

Таким образом, комплексный подход позволил выявить особенности андроклинного эмбри-оидогенеза, разработать способ управления морфогенезом in vitro и, тем самым, создать биотехнологию стабильного получения и тиражирования растений-регенерантов в культуре in vitro пыльников яровой мягкой пшеницы на основе андроклинного эмбриоидогенеза. Применение разработанной биотехнологии для получения и тиражирования андроклинных регенерантов различных видов злаковых и последующая репатриация таких растений «эмбриоидогенного» происхождения в природные экосистемы может способствовать сохранению биоразнообразия.

Список использованной литературы:

1. Барыкина Р.П., Веселова Т.Д., Девятов А.Г. и др. Справочник по ботанической микротехнике. - М.: Изд-во МГУ, 2004. - 312 с.

2. Батыгина Т.Б. Хлебное зерно: атлас. - Л.: Наука, 1987. - 103 с.

3.Круглова Н.Н. Морфогенез в культуре пыльников пшеницы: эмбриологический подход. - Уфа: Гилем, 2001б. - 175 с.

4. Круглова Н.Н., Батыгина Т.Б. Методические рекомендации по использованию морфогенетического потенциала пыльника в биотехнологических исследованиях яровой мягкой пшеницы. - Уфа: ИБ УНЦ РАН, 2002. - 39 с.

5. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Еркеев М.И. Иммуноферментное определение содержания индолилуксусной кислоты в семенах кукурузы с использованием меченых антител // Физиология растений. - 1986. - Т. 33. - № 6. - С. 1221-1227.

6. Сельдимирова О.А. Морфогенез эмбриоида in vitro и зародыша in vivo у пшеницы: Автореф. дисс....кандидата биол. наук. - Уфа, 2002. - 23 с.

7. Сельдимирова О.А., Титова Г.Е. Особенности развития микроспориальных эмбриоидов в культуре in vitro пыльников яровой мягкой пшеницы // Материалы II Междунар. школы «Эмбриология, генетика и биотехнология». - Уфа, 2007. - С. 105-106.

8. Эмбриологические основы андроклинии пшеницы: атлас / Круглова Н.Н., Батыгина Т.Б., Горбунова В.Ю., Титова Г.Е., Сельдимирова О.А. - М.: Наука, 2005. - 101 с.

Исследования поддержаны Российским фондом фундаментальных исследований (проекты № 05-04-97911, № 05-04-08114, № 08-04-97045), Академией наук Республики Башкортостан (проект № 40/40-П), а также программой «Ведущие научные школы Российской Федерации» (проекты НШ 4834.2006.4, НШ 2096.2008.4, лидер Школы - член-корр. РАН Т.Б. Батыгина).

336 ВЕСТНИК 0ГУ№6/ИЮНЬ2009