МИКРОБНЫЙ БИОТОПЛИВНЫЙ ЭЛЕМЕНТ НА ОСНОВЕ ШТАММА CLUCONOBACTER OXYDANS ВКМ В-1227

Полезная модель является устройством, непосредственно преобразующим энергию микробного окисления органических соединений в электрическую энергию. Устройство относится к области биотехнологии, а именно, к выработке электрической энергии микроорганизмами, составляющими основу микробного биотопливного элемента (МБТЭ). Источники такого типа относятся к альтернативным источникам энергии. Они могут быть использованы в мероприятиях по охране окружающей среды, поскольку производят электрическую энергию путем окисления загрязняющих среду органических соединений. МБТЭ могут быть использованы в малой энергетике для создания стационарных источников питания с невысокими уровнями отдаваемой энергии; для выполнения научных исследований; для применения в биотехнологических производствах, в которых используется глицерин в качестве одного из компонентов процесса (например, производство дизельного топлива, получение органических кислот); в медицине для оснащения миниатюрных модулей типа насосов для подачи лекарственных соединений.
Известные МБТЭ или их макеты созданы на основе микроорганизмов, относящихся к различным, систематическим группам. Gluconobacter является одним из микроорганизмов, применяемых в МБТЭ [A.Reshetilov, S.Alferov, L.Tomashevskaya, O.Ponamoreva. Testing bacteria Gluconobacter oxydans and electron transport mediators composition for ap-plication in biofuel cell. // Electroanalysis. 2006. 18(19-20), 2030-2034]. Его использование в роли биокатализатора в МБТЭ считается высокоперспективным в связи с обилием дегидрогеназ в периплазме клеток, осуществляющих окисление углеродных субстратов. Это обеспечивает легкий доступ медиатора к активным центрам фермента. В качестве субстратов используют органические вещества, такие как полисахара и высшие спирты. В их число попадают побочные продукты или отходы биотехнологических производств. Одним из таких продуктов является глицерин. В последнее десятилетие этот субстрат привлекает внимание как недорогой побочный продукт промышленного производства биодизеля [Аppanna V. Metabolically engineered microbial systems and the conversion of agricultural biomass into simple sugars for the production of biofuels//Keynote lecture at the Session 3. BIOFUELS of the Int. Conf. MEC-2007, Moscow, Russia, October, 1-3, 2007; Arechederra R., Treu В., Minteer Sh. Development of glycerol | O2 biofuel cell. // J. Power Sources. 2007. 173(1). 156-161]. Способность Gluconobacter окислять субстраты в течение длительного времени без неконтролируемого увеличения биомассы является преимущественным свойством микробных клеток для использования в МБТЭ.
Предложен макет МБТЭ на основе клеток Gluconobacter oxydans BKM В-1280, окислявших глюкозу в присутствии 2,6-дихлорофенолиндофенола [Алферов С.В., Л.Г.Томашевская, Понаморева О.Н., В.А.Богдановская, А.Н.Решетилов. Анод биотопливного элемента на основе бактериальных клеток Gluconobacter oxydans и медиатора электронного транспорта 2,6-дихлорофенолиндофенола.//Электрохимия, 2006. 42(4). 456-457], ферроцена [A.Reshetilov, S.Alferov, L.Tomashevskaya, O.Ponamoreva. Testing bacteria Gluconobacter oxydans and electron transport mediators composition for application in biofuel cell.//Electroanalysis. 2006. 18(19-20), 2030-2034]. В данной модели использовали только потенциометрический метод, генерацию энергии рассматривали только в ограниченном диапазоне внешних нагрузок. В работе [Tomashevskaia L.G., Alferov S.V., Tomashevskii A.A., Reshetilov A.N. Power characteristics of microbial fuel cell based on Gluconobacter cell suspension and 2,6-dichlorophenolindophenol as electron transport mediator.//Proceedings of the International Conference MEC-2007, Moscow, Russia, October, 1-3, 2007] авторы исследовали мощностные характеристики макета МБТЭ, работа которого базируется на использовании суспензии клеток Gluconobacter oxydans BKM В-1280. В работе [Китова А., Томашевская Л., Решетилов А.Н. Перспективы создания микробного биотопливного элемента (БТЭ) на основе метаболизма глицерина у Gluconobacter oxydans. // Сб. тез. Второго м/н конгресса «ЕвразияБио-2010» Москва, 13-15 апреля 2010 г. / Под ред. Р.Г.Василова. - М.: Изд. «Копиринг», 2010 - 436 с., с.92] рассмотрены перспективы создания МБТЭ на основе метаболизма глицерина клетками Gluconobacter. Использовали штамм G. oxydans BKM В-1280. В работах [А.Е.Китова, Л.Г.Томашевская, С.Ю.Поздина, А.А.Баринова, А.Н.Решетилов. Исследование окислительной активности Gluconobacter для применения в глицериновом биотопливном элементе // Тезисы VI молодежной школы с м/н участием «Актуальные аспекты современной микробиологии», 25-27 октября 2010, стр.135-138; П.Р.Минайчева, А.Е.Китова, Л.Г.Томашевская, А.Н.Решетилов. Межштаммовые различия Gluconobacter при окислении глицерина в микробном биотопливном элементе. // Тезисы VI молодежной школы с м/н участием «Актуальные аспекты современной микробиологии», 25-27 окт. 2010, стр.43-45] использовали 3 штамма Gluconobacter. Все штаммы проявляли биоэлектрокаталитическую активность.
Полученные данные свидетельствуют о том, что клетки Gluconobacter могут быть успешно применены в качестве дешевого биоматериала, отвечающего требованиям МБТЭ.
Некоторые из известных МБТЭ представлены в Таблице 1.
Таблица 1.
Биотопливные элементы, функционирующие с использованием медиаторов.
Микроорганизм
Субстрат
Медиатор
Потенциал
Ток или плотность тока.
Анод
Pseudomona s methanica
СН<sub>4</sub>
1-нафтол-2-сульфонат 2,6 дихлорфенолиндофенол
0.5-0.6 В (р/з/цепь)
2.8 мА см<sup>-2</sup> (при 0.35 В)
Pt-чернь,12.6 см<sup>2</sup>
Escherichia соli
Глюкоза
Метиленовый синий
0.625 В (р/з/цепь)
-
Pt, 390 см<sup>2</sup>
Proteus vulgaris Bacillus subtilis Escherichia coil
Глюкоза
Тионин
0.64 В (р/з/цепь)
0.8 мА (при 560 Ом)
Сетчатый уголь800 см<sup>2</sup>
Proteus vulgaris
Глюкоза
Тионин
350 мВ (при 100 Ом)
3.5 мА (при 100 Ом)
Сетчатый уголь 800 см<sup>2</sup>
Proteus vulgaris
Сахароза
Тионин
350 мВ (при 100 Ом)
3.5 мА (при 100 Ом)
Уголь
Escherichia coli
Глюкоза
Тионин
390 мВ (при 560 Ом)
0.7 мА (при 560 Ом)
-
Lactobacillus plantarum Streptococcus lactis
Глюкоза
Fe(III) ЭДТА
0.2 В(р/з/цепь)
90 µA (при 560 Ом)
-
Erwinia dissolvens
Глюкоза
Fe(III) ЭДТА
0.5 В (р/з/цепь)
0.7 мА (при 560 Ом)
-
Proteus vulgaris
Глюкоза
2-гидрокси-1,4-нафтохинон
0.75 В (р/з/цепь)
0.45 мА (при 1 кОм)
Граффитовый фетр, 1 г (0.47 м<sup>2 </sup>г<sup>-1</sup>)
Escherichia coli
Ацетат
Нейтральный красный
0.25 В (р/з/цепь)
1.4 µA∗ см<sup>-2 </sup>(к/з/цепь)<sup>e</sup>
Графит 100 см<sup>2</sup>
Escherichia coli
Глюкоза
Нейтральный красный
0.85 В (р/з/цепь)
17.7 мА (к/з/цепь)
граффитовый фетр 12 г (0.47 м<sup>2</sup>г<sup>-1</sup>)
Расчет параметра мощности МБТЭ можно производить по формуле:
БТЭ
БТЭ
Р=I·Е, где I· - ток, протекающий через нагрузку, Е напряжение на нагрузке. В случае анализа вольт-амперных характеристик (ВАХ) за показатель условной мощности МБТЭ принимается произведение величины тока на значение потенциала (по абсолютной величине), при котором данный ток регистрируется.
При анализе хронопотенциограмм разрядки МБТЭ на нагрузке ток, получаемый в МБТЭ рассчитывается с помощью измеренного потенциала на внешнем сопротивлении
Задача, на решение которой направлена заявляемая полезная модель, состоит в создании устройства биотопливного типа для выработки электрической энергии на основе штамма Gluconobacter oxydans ВКМ В-1227, не использовавшегося ранее в аналогичных устройствах.
На фиг.1 представлена схематическая конструкция МБТЭ.
Бактериальные ферменты окисляют субстрат с образованием продукта (в случае глицерина образуется диоксиацетон, ДОА) и протонов. Медиатор транспорта электронов (2,6-дихлорофенолиндофенол, ДХФИФ) перехватывает образовавшиеся электроны с донорного сайта фермента или с одного из звеньев дыхательной цепи и переносит на анод. По внешней цепи электроны переходят с анода на катод и восстанавливают конечный акцептор электронов (гексацианоферрат(III) калия, ГЦФ в нашем случае). Протоны, образовавшиеся в анодной камере, переходят через мембрану в катодное отделение МБТЭ и замыкают цепь.
Внешний вид ячейки биотопливного элемента, используемой в работе, показан на фиг.2.
В кюветах размещаются реакционные электрохимические смеси - анолит и католит, в которые погружают электроды - анод и катод соответственно. Ионообменная мембрана разделяет кюветы, обеспечивая избирательную проницаемость.
Эквивалентная электрическая схема ячейки биотопливного элемента приведена на фиг.3.
МБТЭ представляет собой двухкамерную двухэлектродную электрохимическую ячейку. Цилиндрические камеры (анодная и катодная) содержат равные объемы рабочих растворов. В анодной камере размещают реакционную смесь, составленную из суспензии клеток Gluconobacter в 30 мМ натрий-фосфатном буферном растворе с рН 6.0. Раствор содержит бактериальные клетки в концентрации 2.5 мг биомассы (сырой вес) в I мл, 75 мкМ 2,6-дихлорофенолиндофенол (ДХФИФ) и 5 мМ глицерин. В катодной камере ячейки содержится такой же буфер с добавлением 30 мМ гексацианоферрата(III) калия (ГЦФ). Содержимое анодной и катодной камер называют анолитом и католитом соответственно. В обе камеры биотопливной ячейки вносят буферный раствор в необходимом объеме (3000 мкл) и производят электрохимические оценки. Буферные и/или солевые растворы выполняют функцию базового электролита в БТЭ. Измеряют ЭДС системы, регистрируют вольтамперную характеристику. Для получения циклической вольтамперограммы задают величину потенциала анода относительно катода и измеряют ток. В результате проведения расчетов получают характеристики биотопливного элемента.
Электродами служат графитовые стержни, диаметром 6 мм, которые погружаются в раствор на глубину 6 мм. Анодная и катодная камеры соединяются посредством окна, закрытого катионообменной мембраной МФ-4СК («Пластполимер», С.-Петербург). Исследования проводят при температуре 28°С. Во внешнюю цепь включают гальванопотенциостат (IPCMicro, «Кронас», РФ), с помощью которого выполняют измерение электрических показателей МБТЭ.
На Фиг.4 и 5 показан порядок проведения экспериментов.
Расчет мощности проводили по данным ВАХ для полного анолита (реакционной смеси, включающей клетки, глицерин и ДХФИФ). Максимальная мощность, рассчитанная при регистрации циклической ВАХ (скорость развертки составляла 10 мВ/с, «условная максимальная мощность») составляет 2.3 мкВт.