СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ВИРУСА ЧУМЫ ПЛОТОЯДНЫХ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА
METHOD FOR OBTAINING CARNIVOUS DISPEST VIRUS ANTIGEN FOR PREPARING ERYTHROCYTE DIAGNOSIS

Данное изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарной вирусологии и может быть использовано в ветеринарных учреждениях для приготовления эритроцитарных диагностикумов для выявления и количественного определения (титрования) антител к вирусу чумы плотоядных для оценки напряженности специфического иммунитета у собак и других животных, восприимчивых к вирусу чумы плотоядных.
Чума плотоядных - высоко контагиозное вирусное заболевание собак и других плотоядных, которое может проявляться поражением респираторной, пищеварительной и нервной системы, и сопровождаться лихорадкой, воспалением слизистых оболочек, поражениями кожи и внутренних органов и приводить к летальному исходу.
К вирусу чумы плотоядных восприимчивы представители различных семейств отряда Carnivora, подотряда Fissepeda: Ailuridae, Canidae, Hyaenidae, Mustelidae, Ursidae, Procyanydae, Viverridae и Felidae. Патогенность вируса для разных видов животных колеблется в широких пределах - от бессимптомного переболевания до 100% летальности.
При постановке диагноза учитывают клиническую картину и данные лабораторной диагностики. Лабораторная диагностика направлена на обнаружение антигена вируса чумы плотоядных методом иммунофлуоресценции (МФА), иммуноферментным методом (ИФА) или иммунохроматографии (ИХА). Кроме того, применяют ПЦР для обнаружения РНК вируса. Определение антител к вирусу чумы плотоядных крайне редко используют для диагностики заболевания, но широко применяют для оценки состояния специфического гуморального иммунитета. Основным методом количественного определения антител к вирусу чумы плотоядных остается реакция нейтрализации (РН). Установлена высокая степень корреляции между титром антител в РН и уровнем защиты, что позволяет оценивать эффективность профилактических мероприятий. Помимо РН в лабораторной практике для определения антител к вирусу чумы плотоядных могут применяться и другие серологические реакции: иммуноферментный анализ (ИФА), реакция непрямой гемагглютинации (ΡΗΓΑ). [Васильев А.В., Колышкин В.М., Елаков A.Л. ΡΗΓΑ для выявления антител к вирусу чумы плотоядных. // Ветеринария. 1996. №11. С. 20-23.]
Уровень техники
В настоящее время известен эритроцитарный диагностикум для определения антител к вирусу чумы плотоядных в ΡΗΓΑ на основе нативных эритроцитов барана, сенсибилизированных культуральной вирусосодержащей жидкостью вируса чумы плотоядных [Небиеридзе В.П. Изучение биологических свойств вируса чумы плотоядных и разработка методов диагностики болезни. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук, Владимир, 1977].
Данный эритроцитарный диагностикум обладал низкой активностью, поскольку для его получения использовали культуральную вируссодержащую жидкость, включающую большое количество невирусных (балластных) белков. Срок хранения эритроцитарного диагностикума составлял всего 3-5 дней, так как он готовился на основе нативных эритроцитов барана. В связи с указанными недостатками эритроцитарный диагностикум не нашел практического применения.
При разработке эритроцитарного диагностикума для выявления антител к вирусу чумы плотоядных Васильевым А.В. [Васильев А.В. Разработка и совершенствование экспресс-методов для серодиагностики вирусных инфекций животных. Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук. Москва. 2000] было проведено сравнение 6 различных способов получения специфических антигенов вируса чумы плотоядных:
- антиген №1 - вируссодержащая культуральная жидкость (ВСЖ);
- антиген №2 - ВСЖ после трехкратного замораживания и оттаивания;
- антиген №3 - клеточный антиген, полученный из клеток, зараженных вирусом чумы плотоядных, после удаления культуральной жидкости с последующим однократным замораживаниеми оттаиванием и ресуспендированием в физрастворе.;
- антиген №4 - вирус очищенный ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы;
- антиген №5 - вирус из ВСЖ, осажденный ПЭГ и обработанный ТВИН-эфиром;
- антиген №6 - культуральный вирус, после обработки клеток, зараженных вирусом чумы плотоядных, Тритоном – X100.
Было показано, что антигены 1 - 3 обладают низкой активностью. Антиген №4 оказался более активным, чем первые 3, однако данный метод позволял получить лишь небольшое количество антигена не достаточное для промышленного производства. Эритроцитарные диагностикумы с антигеном №5 проявляли спонтанную агглютинацию, что не позволяло использовать их в работе. Наилучшие результаты были получены с антигеном №6, который и применялся в дальнейшем при приготовлении эритроцитарных диагностикумов для выявления антител к вирусу чумы плотоядных в реакции непрямой гемагглютинации.
Способ получения специфического антигена, который мы взяли за прототип заключается в том, что первичнотрипсинизированную культуру клеток эмбриона перепела заражали вирусом чумы плотоядных, штамм ЭПМ. После проявления цитопатического действия вируса вируссодержащую жидкость сливали, монослой клеток обрабатывали раствором тритона Х-100 в течение 30-60 мин. Полученный клеточный экстракт использовали в качестве антигена. Однако, при данном способе в антигене содержалось некоторое количество клеточных белков, что приводило к спонтанной агглютинации полученных на его основе эритроцитарных диагностикумов. Поэтому кроме специфического эритроцитарного диагностикума при постановке реакции использовали контрольный эритроцитарный диагностикум, который готовили с применением контрольного антигена, полученного экстрагированием белков тритоном Х-100 из не зараженной вирусом культуры клеток.
Предлагаемый Васильевым А.В. способ позволял получать антиген вируса чумы плотоядных, пригодный для изготовления стабильного, активного и специфичного эритроцитарного диагностикума, кторый мог использоваться для быстрого и эффективного выявления антител в крови больных и переболевших животных, постановки ретроспективного диагноза, а также оценки антигенной активности вакцин против чумы плотоядных. Недостатком данного способа получения антигена является:
1. При обработке зараженной культуры клеток Тритоном Х-100 помимо вирусных белков экстрагируется небольшое количество клеточных белков, что приводит в дальнейшем к снижению активности и специфичности эритроцитарных диагностикумов, полученных на основе данного антигена, а также создает необходимость приготовления контрольного антигена;
2. При получении антигена используется первичная культура клеток перепелиных эмбрионов, которые не всегда можно получить в необходимом количестве;
3. Остаточные количества Тритона Х-100 вызывают спонтанную агглютинацию эритроцитов, что также влияет на активность и специфичность реакции.
Данную проблему позволяет решить предлагаемый способ получения антигена, используемого при приготовлении эритроцитарного диагностикума для выявления антител к вирусу чумы плотоядных в реакции непрямой гемагглютинации.
Технической проблемой является необходимость создания дешевого, быстрого способа получения антигена вируса чумы плотоядных для приготовления эритроцитарного диагностикума с повышенной точностью диагностики, расширение арсенала способов получения антигена вируса чумы плотоядных для приготовления эритроцитарного диагностикума.
Раскрытие сущности изобретения
Техническим результатом является создания дешевого, быстрого способа получения антигена вируса чумы плотоядных для приготовления эритроцитарного диагностикума с повышенной точностью диагностики, расширение арсенала способов получения антигена вируса чумы плотоядных для приготовления эритроцитарного диагностикума.
Для приготовления эритроцитарного диагностикума, используемого при количественном определении антител к вирусу чумы плотоядных в ΡΗΓΑ, используется антиген вируса чумы плотоядных. Предлагается способ приготовления антигена вируса чумы плотоядных на основе белков вируса экстрагируемых из зараженной вирусом перевиваемой культуры клеток Vero с помощью глицин-NaOH буфера. При обработке зараженных вирусом чумы плотоядных клеток Vero глицин-NaOH буфером рН 9,0 происходит экстракция поверхностных вирусных белков из клеток. При обработке глицин-NaOH буфером рН 9,0 незараженной культуры клеточные белки не экстрагируются. Данный метод позволяет получить антиген вируса чумы плотоядных, пригодный для изготовления высокоактивного и специфичного эритроцитарного диагностикума, не обладающего спонтанной агглютинацией и не требующего применения дополнительного контрольного эритроцитарного диагностикума.
Способ получения антигена используемого в приготовлении эритроцитарного диагностикума для выявления антител к вирусу чумы плотоядных включает следующие стадии.
1. Заражение культуры клеток. Вирус чумы плотоядных получают в пластиковых матрасах в культуре клеток Vero. Матрасы с культурой клеток инкубируют при 37°С. После формирования 80-100% ЦПД в культуре клеток (5-6 день после заражения) матрасы используют для приготовления антигена.
2. Промывка и заморозка. Из матрасов с зараженной культурой клеток сливают культуральную среду, вносят в матрасы физраствор осторожно промывают монослой, сливают физраствор и вносят новую порцию физрасора 30 мл, после чего матрасы помещают в холодильник при минус 20°С на 3-5 суток.
3. Обработка клеток с вирусом гли-NaOH буфером. Матрасы с зараженной культурой клеток извлекают из морозильника, размораживают, собирают клеточный монослой и центрифугируют суспензию клеток при 3000 об/мин 10 минут. Надосадочную жидкость сливают, а осадок клеток ресуспендируют в 2 мл гли-NaOH буфере рН 9,0 и помещают при 4-6°С на 16-18 часов. Затем суспензию клеток центрифугируют 10 мин 3000 об/мин. Надосадочную жидкость (вирусный антиген) используют для приготовления эритроцитарного диагностикума. Вирусный антиген можно хранить при минус 20°С до года. Предлагаемый простой способ позволяет получить специфичный антиген вируса чумы плотоядных свободный от балластных белков, пригодный для изготовления стабильного, специфичного и высокоактивного эритроцитарного диагностикума для выявления антител к вирусу чумы плотоядных в ΡΗΓΑ, который может применяться для количественной оценки (титрования) специфичных к вирусу чумы плотоядных антител в сыворотках и препаратах имммуноглобулинов, эффективности вакцинации собак и пушных зверей против чумы плотоядных, антигенной активности выпускаемых вакцин против чумы плотоядных, а также может использоваться при прогнозировании течения заболевания чумой плотоядных у собак и других восприимчивых к данному заболеванию видов животных.
Осуществление изобретения
Пример 1. Приготовление антигена вируса чумы плотоядных.
2
2
50
В 3 культуральных матраса площадью 175 см внесли суспензию клеток Vero из расчета 100 тыс. кл./см, по 60 мл среды RPMI-1640 и по 2 мл вируса чумы плотоядных с активностью 4,0 lg ТЦД/МЛ. Матрасы с зараженной культурой клеток поместили в термостат при 37°С на 5 суток. В матрасах наблюдали проявление цитопатического действия вируса с поражением 80-90% монослоя клеток Vero.
2
Из матрасов с зараженной культурой клеток слили культуральную среду. Ввнесли в матрасы по 30 мл физраствора (0,9% раствор NaCl рН 7,2-7,4), осторожно промыли монослой клеток, слили физраствор и внесли новую порцию физрасора по 30 мл в каждый матрас. Матрасы с физраствором поместили в холодильник при минус 20°С на 3-е суток. Матрасы с зараженной культурой клеток достали из морозильника, разморозили при комнатной температуре (20-24°С), встряхнули для полного отслоения клеток от поверхности матраса. Суспензию клеток слили в центрифужные пробирки объемом 50 мл и осадили центрифугированием 10 минут при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость слили, а осадок клеток в каждой пробирке ресуспендировали в 2 мл гли-NaOH буфере рН 9,0 (25 мл 0,2 Μ глицин+0,1 Μ NaOH до рН 9,0+НО до 100 мл), объединили (общий объем 6 мл) в одну пробирку и поместили в холодильник при 4-6°С на 18 часов. Затем суспензию клеток осаждили центрифугированием 10 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость (вирусный антиген) отобрали при помощи пипетки в пенициллиновый флакон и использовали для приготовления эритроцитарного диагностикума.
Пример 2. Приготовление эритроцитрарного диагностикума.
Кровь от баранов в объеме 50 мл отобрали в стерильную стеклянную посуду со 100 мл цитрата Na для предотвращения свертывания. Эритроциты дважды отмыли физраствором и оставили при температуре 4-6°С на одни сутки.
2
4
На следующий день в коническую 2-х литровую колбу Эрленмейера на магнитной мешалке внесли 975 мл физраствора, 10 мл 0,15 Μ NaHPO и добавили 20 мл свежеотмытого осадка эритроцитов, затем при интенсивном перемешивании внесли по каплям 5 мл акролеина (работу проводили в вытяжном шкафу). Смесь эритроцитов с акролеином инкубировали 30 минут при комнатной температуре, а затем перенесли в закрывающиеся центрифужные стаканы и центрифугировали 15 минут при 2000 об/мин. Осадок эритроцитов ресуспендировали в 200 мл физраствора и снова осадили центрифугированием 15 минут при 2000 об/мин (цикл ресуспендирования- осаждения повторили 10 раз). Полученный после 10-ой промывки осадок эритроцитов ресуспендировали в 50 мл физраствора (30% суспензия эритроцитов) и поместили в холодильник при 4-6°С до использования.
Суспензию эритроцитов перемешали, отобрали 2 мл и добавили 18 мл физраствора, осадили центрифугированием 15 минут при 2000 об/мин и ресуспендировали в 20 мл 0,075 Μ фосфатного буфера рН 7,2-7,4 в виде 3% суспензии. 100 мг танина растворили в 10 мл дистиллированной воды, отобрали 0,1 мл раствора танина и перенесли в пробирку с 20 мл 0,075 Μ фосфатного буфера рН 7,2-7,4 (получив разведение танина 1:20000).
Равные объемы рабочего разведения танина и эритроцитов (по 20 мл) нагрели в водяной бане до 37°С в течение 10 минут, смешали и выдержали при 37°С 15 минут, после чего эритроциты осаждили центрифугированием 10 минут при 2000 об/мин. Осадок эритрцитов дважды промыли 0,075 Μ фосфатным буфером рН 7,2-7,4 и ресуспендировали в 0,15 Μ фосфатном буфере рН 6,4 в виде 3% суспензии, которую поместили в холодильник на 16 часов при 4-6°С.
Равные объемы (по 20 мл) 3% суспензии танизированных эритроцитов и раствора антигена в оптимальной концентрации (оптическая плотность 0,4-0,5 при 280 нм) 10 минут нагрели в водяной бане до температуры 52-54°С, смешали и выдержали 1 час при 52-54°С. Осаждили центрифугированием 10 минут 2000 об/мин, дважды промыли разбавителем (0,15 Μ фосфатный буфер рН 7,2-7,4 с 1% нормальной сыворотки кролика) и ресуспендировали в 20 мл разбавителя. Полученный эритроцитарный диагностикум поместили в холодильник при температуре 4-6 С в виде 3% суспензии до использования.
Пример 3. Постановка ΡΗΓΑ с сыворотками крови собак.
7 сывороток крови щенков собак в возрасте 3-4 месяца прогрели в водяной бане 30 минут при 56°С. В 7 рядов лунок (A-G) планшета для серологических реакций внесли по 50 мкл разбавителя (0,15 Μ фосфатный буфер рН 7,2-7,4 с 1% нормальной сыворотки кролика). В лунки A1-G1 внесли по 50 мкл сыворотки крови собак, после чего сделали ряд последовательных разведений от 1:2 до 1:4096. Из последней 12-ой лунки (рядов A-G) удалили 50 мкл разведения сыворотки. Во все лунки планшета рядов A-G с разведениями сывороток добавили по 25 мкл эритроцитарного диагностикума, аккуратно перемешали (не встряхивая) и поместили планшет в холодильник на один час при температуре 4-6°С. Затем планшет достали из холодильника и провели визуальный учет реакции. За титр сыворотки принимали последнее разведение, в котором эритроциты оседали в виде зонтика. В трех сыворотках крови результат был отрицательным, титр антител 1:8. С остальными 4 сыворотками крови реакция была положительной (титр антител выше 1:16). Титры антител составили: в двух сыворотках крови 1:32, в одной сыворотке крови 1:64, в одной - 1:256.
Все 7 щенков были привиты вакциной против чумы плотоядных и сыворотки крови от них исследовали повторно через две недели после иммунизации. Постановку реакции осуществляли как уже описано выше. У всех щенков реакция была положительной, отмечали прирост титров антител к вирусу чумы плотоядных в 4 и более раз (кроме одного, имевшего до вакцинации титр 1:256). Титры антител в сыворотках крови щенков собак составили от 1:256 до 1:512.
Таким образом, приготовленный из нашего антигена эритроцитарный диагностикум использовать на практике для оценки титров антител к вирусу чумы плотоядных.