Современные методы нутриметаболомных и протеомных исследований в биохимии питания

Для корреспонденции

Шаранова Наталья Эдуардовна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории метаболомного и протеомного анализа ФГБУ «НИИ питания» РАМН Адрес: 109240, г. Москва, Устьинский пр., д. 2/14 Телефон: (495) 698-53-26 E-mail: sharanova@ion.ru

Н.В. Кирбаева1, Н.Э. Шаранова1, С.С. Перцов2

Современные методы нутриметаболомных и протеомных исследований в биохимии питания

#

A review of current methods for nutrimetabolomic and proteomic research in biochemistry of nutrition

N.V. Kirbaeva1, N.E. Sharanova1, S.S. Pertsov2

1 ФГБУ «НИИ питания» РАМН, Москва

2 ФГБУ «НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина» РАМН, Москва

1 Institute of Nutrition of Russian Academy of Medical Sciences, Moscow

2 P.K. Anokhin Research Institute of Normal Physiology of Russian Academy of Medical Sciences, Moscow

Нутриметаболомные исследования представляют отдельное направление биохимии питания и дают более глубокое понимание влияния алиментарного фактора на метаболические пути организма. При решении методических задач в нутриметаболомике приоритетное место занимают протеомные исследования влияния макро- и микронут-риентов, заключающиеся в анализе экспрессируемых белков клетки, идентифицируемых в данный момент времени при данных условиях. Разнообразие приборно-технического оснащения, совершенствование биоинформационных методов и возможности тандемного использования различных техник позволяют решать большое количество актуальных задач в области фундаментальных и прикладных исследований. К настоящему времени уже накоплен огромный массив качественных и количественных данных о структуре, функциях, активности белков и их взаимодействиях. Конечными целями протеомики являются установление и характеристика полного набора белков данного организма. Представленная обзорная статья посвящена описанию и сравнительной характеристике методов, наиболее часто используемых в современных нутриметаболомных исследованиях. Рассмотрены преимущества и недостатки наиболее распространенных технологий разделения белков, ионизации пробы и типов масс-анализаторов, описаны основные подходы к идентификации белков и наиболее широко используемые базы данных известных биологических последовательностей. Ключевые слова: нутриметаболомика, протеомика, биохимия питания, методы нутриметаболомных и протеомных исследований, хроматографические методы, электрофоретичес-кие методы, масс-спектрометрия

At present biochemistry of nutrition involves the use of OMICs to investigate food quality, safety, bioactivity and nutrition mechanisms. In this context, nutrime-tabolomics is one of the latest directions of nutrition development and provides

1

a better understanding of the influence of nutritional factors on the metabolic pathways of the organism. Proteomic methods play an important role in nutrime-tabolomics and allow to detect, identify and quantify proteins under different conditions. Variety of technical and methodological advances, improvements in bioinformatics and possibility of tandem use of different methods helps to solve a number of basic and applied science's problems. Currently huge amount of qualitative and quantitative data on the structure, functions and activities of proteins and their interactions is accumulated. Proteomics aims to establish and characterize a complete set of proteins of the organism. This review summarizes the basic applications of proteomics used in nutrimetabolomic researches. The advantages and disadvantages of the most common techniques of protein separation and sample ionization, types of mass analyzers, basic approaches to the identification of proteins and most widely used databases of known biological sequences are overviewed with a critical assessment of challenges and potential applications.

Key words: nutrimetabolomics, proteomics, biochemistry of nutrition, nutrimetabolomic and proteomic methods, chromatographic methods, electrophoretic methods, mass-spectrometry

Нутриметаболомные исследования являются сравнительно молодым направлением биохимии питания и лишь работы последних 5-8 лет, проведенные в единичных научно-исследовательских центрах в мире, позволяют только в общих чертах определить основные направления научных разработок в этой области. В ряде, к сожалению, немногочисленных на сегодняшний день обзоров [65, 66, 103] обобщаются современные проблемы нутриметаболомики, среди которых выделяются 4 принципиальных направления: выбор конкретного нутриента, включенного в состав стандартной диеты или экспериментального рациона, при воздействии которого предполагается выявление специфических биомаркеров; выбор биологического образца - кровь, моча, слюна, ткань (или их комплекс); сочетание методов генотипирования, 2D-электрофореза и последующего TOF-MS анализа (Time-of-flight mass spectrometry - времяпролетная масс-спектромет-рия); биоинформационный анализ на основе адекватных математических моделей с целью выявления группы биомаркеров.

В основе оптимального питания здорового и больного человека лежит принцип баланса потребления пищевых веществ и их свободной энергии и фактических потребностей в них организма. Этот принцип реализуется как устойчивое равенство скоростей поступления макронутриентов и энергии суммарным скоростям окисления глюкозы, жирных кислот и аминокислот в организме [2, 4, 27]. Исследования окислительного метаболизма по эндогенным скоростям окисления глюкозы, аминокислот и жирных кислот с применением непрямой калориметрии в покое и в состоянии физической активности позволяют ориентировочно оценить метаболические нарушения при

мальадаптации и развитии алиментарно-зависимых заболеваний. В настоящее время имеются все основания считать, что скорость окисления основных макронутриентов должна приводиться в расчете на единицу массы тела и ее составляющих, прежде всего жировой и тощей массы [6]. Именно эти удельные величины могут дать наиболее полную информацию о выраженности нарушений энергетического, белкового и жирового обмена и служить основой для детальных нутрипротеом-ных и нутрилипидомных исследований [7, 8].

Одним из самых современных методов определения энергозатрат у экспериментальных животных, который с успехом может использоваться при нутриметаболомных исследованиях, является тестирование с помощью автоматизированной модульной установки «Phenomaster» («TSE», Германия). Данная установка позволяет проводить мониторинг суточных колебаний физиологических показателей у млекопитающих в разных условиях. В состав этого программно-аппаратного комплекса входят метаболические клетки (36x45 см) для индивидуального размещения животных. Непрямую калориметрию проводят с использованием модуля «CaloSys», позволяющего измерять расход энергии с помощью датчиков газов для метаболического фенотипирования. Калориметрические показатели (выделение тепла в единицу времени) рассчитывают по количеству потребляемого крысами кислорода. Установка «Phenomaster» применяется с целью оценки метаболического статуса [37], пищевого поведения [87] и циркадных ритмов физиологических показателей [83] у экспериментальных животных.

Для целенаправленных нутриметаболомных исследований применительно к отдельно взятой алиментарно-зависимой патологии необходимы

5

ОБЗОРЫ

#

исходные эмпирические представления о метаболических группах известных патогенетических маркеров, основанные на существующих клинических, диагностических и биохимических сведениях [3, 5, 13, 14, 25]. При постановке подобных методических задач приоритетное место занимают протеомные исследования влияния макро-и микронутриентов, заключающиеся в анализе экспрессируемых белков клетки, идентифицируемых в данный момент времени при данных условиях, а также их взаимодействия (см. схему).

Протеомные технологии на протяжении последних 20 лет используются для решения современных проблем в области фундаментальных и прикладных исследований. Появление и развитие высокотехнологичных методов для многомерного разделения белков и пептидов, идентификации первичной структуры и посттрансляционных модификаций белковых молекул, совершенствование биоинформационных методов позволило накопить огромный массив качественных и количественных данных о структуре, функциях, активности белков и их взаимодействиях [69, 75]. Конечная цель протеомики видится в установлении и характеристике полного набора белков данного организма, что становится возможно благодаря реализации системного подхода, ориентированного на параллельное изучение многих индивидуальных белков, дающих представление об объекте в целом.

Протеомный анализ белков представляет многоступенчатый процесс, включающий этапы про-боподготовки, разделения сложных многокомпонентных смесей, детекции белков и обработки данных. На этапе подготовки образца происходит лизис клеток, экстракция белка и его очистка. Разрушения клеточных стенок можно добиться действием различных факторов (ферментов, химических солюбилизаторов, абразивных веществ, ультразвука, гомогенизации и др.). После экстракции гомогенат центрифугируют на центрифуге с охлаждением и получают экстракт исследуемого белка. Для отделения белков от высокомолекулярных примесей и получения высокоочищенных белковых препаратов в настоящее время существует большое количество стандартизованных методов, позволяющих получать воспроизводимые результаты. К ним относят осаждение белков органическими растворителями, истощение, концентрирование, диализ, твердофазную экстракцию, гель-фильтрацию, а также электрофоретические и хроматографические методы разделения белка.

Одним из наиболее длительно используемых и до сих пор находящих применение в современных исследованиях является метод осаждения белка. Для этого применяют различные подходы: высаливание с последующим растворением белка в меньшем объеме, адсорбцию белков на ионо-обменниках [карбоксиметилцеллюлоза (КМ-цел-

люлоза), диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-цел-люлоза)], гель-фильтрацию с различными типами носителей (сефадекс, сефароза), ультрафильтрацию, диализ и др. [89]. Диализ и ультрафильтрация наряду с некоторыми другими методами позволяют также освободить белок от низкомолекулярных примесей и получить его в очищенном состоянии, однако длительность диализа и возможное влияние на активность анализируемых соединений представляют серьезные ограничения для широкого использования данного метода.

При работе с биологическими жидкостями с широким диапазоном концентраций белков используется метод истощения для удаления мажорных белков с помощью специализированных сорбентов. Однако, несмотря на популярность и повсеместность использования, данная процедура имеет существенный недостаток. Было установлено, что на поверхности мажорных белков плазмы крови сорбируется определенное количество других белков и пептидов, которые при истощении плазмы или сыворотки теряются вместе с ними [17, 53]. Таким образом, теряется важная часть информации о белковом составе биологического образца.

Для подготовки и концентрирования белковых фракций перед их последующим анализом хрома-тографическими, электрофоретическими и масс-спектрометрическими методами применяется также твердофазная экстракция. На сегодняшний день это один из наиболее популярных методов подготовки образцов. Твердофазная экстракция (ТФЭ) представляет сорбционный метод подготовки пробы, позволяющий перевести аналиты из жидкого образца в твердую фазу концентрирующего сорбента. Возможности метода расширяет большой выбор сорбентов, поглощающих различные вещества. Долгое время для ТФЭ преимущественно применялись силикагели с привитыми функциональными группами, однако сейчас лидирующие позиции занимают полимерные адсорбционные материалы [34, 35, 105] и активированные угли [42, 44], также используют селективные сорбенты, такие как иммуносорбенты и полимеры с молекулярными отпечатками (ПМО, MIP) [39, 71, 77], магнитные микрочастицы [55].

ТФЭ может проводиться в онлайн (on-line SPE) и офлайн (off-line SPE) режимах. В офлайн-режиме стадии пробоподготовки и идентификации анали-тов разделены аппаратно и по времени. Подготовленная проба может быть сохранена и впоследствии проанализирована различными методами. Основное преимущество офлайн-метода заключается в возможности увеличения пропускного объема за счет увеличения количества сорбента в предколон-ках до 1-2 г без увеличения объема десорбцион-ного раствора [48]. В онлайн-режиме концентрирующий картридж с сорбентом напрямую соединен

6

Стандартная диета Стандартная диета+БАВ

\ /

Схема выявления патогенетических маркеров алиментарных заболеваний

# LXJ И_Ш

Н.В. Кирбаева, Н.Э. Шаранова, С.С. Перцов

с колонкой жидкостного хроматографа, и образец сразу анализируется методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), что позволяет минимизировать потери аналитов в процессе переноса и введения пробы. Таким образом, достигаются более высокие и воспроизводимые значения степеней извлечения, чем при методе офлайн-концентрирования [56]. Однако онлайн-метод ТФЭ обладает несколькими принципиальными недостатками. Первый заключается в ограничениях по совместимости режимов работы картриджа и аналитической колонки [48]. Вследствие несовместимости их адсорбционных свойств происходят уширение хроматографических зон и падение эффективности разделения. В качестве решения данной проблемы были предложены градиентное элюирование на длинных хроматографических колонках [67, 76] и разработка новых высокоэффективных полимерных [96] и углеродных сорбентов [38]. Вторым недостатком онлайн-ТФЭ является отсутствие стадий комплексной очистки пробы, что затрудняет анализ сложных образцов. Для решения данной задачи используют селективное детектирование [50], или высокоселективные аффинные, или импринтные адсорбционные материалы.

В целом офлайн-адсорбционные методы значительно дешевле, высокопроизводительны и используют простые принципы разработки методик (по сравнению с онлайн-методами), но не всегда целесообразны при малом количестве проводимых анализов и не позволяют проводить анализ без потерь исследуемых компонентов. Указанные выше методы очистки белков можно рассматривать как предварительную обработку белковых экстрактов перед дальнейшим их разделением другими методами.

В современных исследованиях преимущественно используется электрофоретическое разделение

белков в полиакриламидном геле (ПАА , PAGE -polyacrylamide gel electrophoresis), поскольку он обладает рядом преимуществ: максимальной разрешающей способностью, возможностью проведения анализа небольшого количества материала, возможностью изменения размера пор в соответствии с задачами исследования. В ПААГ можно проводить как нативный электрофорез, так и электрофорез в денатурирующих условиях. Нативный электрофорез проводят в случаях, когда необходимо сохранить функциональную активность белков (например, ферментативную), поэтому он широко применяется в различных направлениях биологии и медицины, дает воспроизводимые результаты и позволяет быстро и точно определить кажущуюся молекулярную массу исследуемых белков [10]. В случаях, когда не требуется дальнейшего изучения функциональной активности белков, используется ПААГ-электрофорез в денатурирующих условиях по Лэммли (SDS-PAGE), который позволяет разделять белки исключительно по молекулярной массе [97]. Методом одномерного электрофореза не всегда удается полностью разделить сложную смесь белков вследствие близости молекулярных масс или совпадения значений их электрофоретической подвижности при выбранном pH. В таких случаях используют двумерный электрофорез (2DE), теоретическая разрешающая способность которого достигает 10 000 белков [18]. Двумерный электрофорез основан на использовании двух свойств белков: заряда и массы. Разделение в первом направлении проводят путем изоэлектрофокусирования в градиенте pH на трубках или в иммобилизованном градиенте (IPG-стрипы) с использованием синтетических смесей полиаминополикарбоновых кислот (амфо-литов) в зависимости от заряда белков. Для второго направления используется метод SDS-PAGE,

7

ОБЗОРЫ

#

в котором разделение макромолекул происходит на основании различия их молекулярных масс и пространственных конфигураций. Чувствительность детектирования отдельных белковых пятен зависит от процедуры окрашивания и составляет от десятков нанограмм при окрашивании коллоидным Кумасси G250, нескольких нанограмм при окрашивании нитратом серебра до долей нано-грамм в случае использования радиохимических методов [52]. Использование последних достижений масс-спектрометрии для детектирования позволило увеличить чувствительность до нескольких фемтограмм [61].

Привлекательную альтернативу 2D-PAGE (two-dimensional Polyacrylamide gel electrophoresis) для разделения белков и пептидов представляет ВЭЖХ. ВЭЖХ обладает высокой разрешающей способностью и хорошей воспроизводимостью за счет широкого выбора стационарных и подвижных фаз [24].

Необходимость анализа полярных соединений в сложных смесях обусловила интерес к другому типу жидкостной хроматографии - HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography) [64]. HILIC использует немодифицированный силика-гель с полярными элюентами, что значительно расширяет возможности ВЭЖХ. С увеличением полярности пептида возрастает время его удержания и, как следствие, повышается разрешающая способность метода [100].

При работе с многокомпонентными смесями часто используют две и более стадии хромато-графического разделения [49, 74, 85, 104]. Появившийся сравнительно недавно подход MudPIT (Multidimentional Protein Identification Technology) активно используется для инвентаризации пептидов и белков, проведения количественных измерений и выявления посттрансляционных модификаций белковых молекул [28, 45]. Одной из наиболее важных причин использования MudPIT в протеомике является увеличение пиковой емкости, характеризующей эффективность хромато-графического разделения [33]. Стандартный протокол MudPIT использует двумерную жидкостную хроматографию, включающую разделение белков и пептидов в первом направлении по заряду на катионообменной колонке (SCX - strong cation exchange) и во втором направлении - по их гидро-фобности на обращенно-фазовой колонке. Пептидные фрагменты элюируются непосредственно в ионный источник тандемного масс-спектрометра, где происходят их детекция и распознавание [40, 49]. Данная технология позволяет идентифицировать минорные и высокогидрофобные белки, а также белки с крайними значениями изоэлект-рической точки (pI, isoelectric point), высокомолекулярные соединения [49]. Для анализа сложных белковых смесей была разработана стратегия

с использованием ультравысокого (20 000 psi) давления UHP-MudPIT (ultra-highpressure MudPIT). Улучшения разделения пептидов добились увеличением длины колонки С18 и уменьшением размера частиц [11]. Однако увеличение количества стадий разделения белков может снижать воспроизводимость результатов масс-спектромет-рического анализа. Альтернативным способом идентификации многокомпонентных белковых фракций является UHPLC (ultra high performance liquid chromatography). Хроматографическое разделение UHPLC основано на использовании частиц неподвижной фазы размером 1,0-1,7 мкм и сверхвысокого давления для подачи подвижной фазы (50 000 - 100 000 psi). Основными достоинствами метода являются значительное уменьшение времени анализа по сравнению с традиционной ВЭЖХ, высокое разрешение и чувствительность [91]. Дальнейшее развитие методов хроматографического разделения белков направлено на совершенствование технологий изготовления сорбентов и условий проведения анализа.

Благодаря высокой чувствительности, диапазону определяемых масс, экспрессности и возможности анализа сложных многокомпонентных смесей масс-спектрометрия стала неотъемлемой частью протеомных исследований. Резкий скачок в развитии протеомики связан именно с совершенствованием мягких методов ионизации, позволяющих исследовать термолабильные и нелетучие соединения без разрушения ковалентных связей молекул. Для решения приоритетных задач протеомики, таких как определение первичной структуры белков, посттрансляционных и конфор-мационных изменений, идентификации белковых биомаркеров, количественного определения белков и др., используют две технологии ионизации: электроспрейную ионизацию (ESI) и матрично-активированную лазерную десорбцию/ионизацию (MALDI).

В качестве способа быстрого определения низко-и высокомолекулярных соединений применяется сочетание электроспрейной ионизации (ESI) и TOF-MS. Технология ESI более чувствительна по сравнению с MALDI к содержанию примесей в образце, анализирует только растворимые соединения и может приводить к образованию комплексов между аналитом и матрицей, что ухудшает разделяющую способность метода. Но, в отличие от MALDI, ESI может быть соединена с жидкостным хроматографом, кроме того, она позволяет проводить анализ соединений с более низкой молекулярной массой (0-4000 Да) [20, 91]. Для повышения эффективности метода используют модификацию ESI-MS - nanoESI-MS, с помощью которой удается уменьшить количество вводимой пробы и скорость потока за счет использования

8

источников ионизации с малым входным отверстием, а также понизить чувствительность метода к примесям в пробе вследствие снижения процессов испарения и, следовательно, концентрирования. Сравнительно недавно были разработаны мульти-наноэлектроспрейные излучатели (multi-nanoESI emitters), использующие одновременно несколько источников ионизации, что привело к уменьшению скорости потока, приходящейся на каждый источник, и позволило повысить эффективность ионизации молекул образца [19]. В настоящее время метод ESI-TOF-MS и его модификации используются для клинической диагностики, а также для идентификации и характеристики интактных белков в области биофармакологии [88, 98].

Метод MALDI-TOF-MS характеризуется высокой чувствительностью (до 10-21 моль вещества), широким диапазоном определяемых масс (0,6-500 кДа), малым количеством образца, необходимого для анализа, низкой чувствительностью к сопутствующим веществам, возможностью работы со сложными многокомпонентными смесями и возможностью получения структурной информации при проведении тандемного масс-спектрометрического анализа (MS/MS) [20]. Также MALDI-TOF не вызывает образования многозарядных ионов и практически не приводит к комплексообразованию, затрудняющему интерпретацию спектров. Однако при использовании данного метода могут возникать трудности в определении низкомолекулярных веществ (100-400 Да) из-за совпадения их сигналов с фоновыми сигналами матрицы. Также может происходить перекрывание спектров пептидов, близких по молекулярной массе. Эти обстоятельства затрудняют интерпретацию результатов и корректность анализа данных соединений [91]. Перед проведением MALDI требуется разделение компонентов сложных смесей для кристаллизации образца. Для этих целей проводят двумерный электрофорез с последующим вырезанием белковых пятен из геля и их трипси-нолизом. Упростить и мультиплексировать масс-спектрометрический анализ белка стало возможно с помощью иммобилизации антител на твердой фазе MALDI (chip immuno-MALDI-TOF MS), позволяющей совместить обогащение образца и его масс-спектрометрический анализ [59].

Вместе с развитием технологий ионизации пробы возможности масс-спектрометрии также совершенствуются за счет модификаций масс-анализаторов. Времяпролетные системы, обладающие высокой чувствительностью, позволяют получить регистрацию максимального количества спектров на данный момент (до 500 спектров в секунду) [86]. Сочетание технологии MALDI с TOF-MS позволяет определить атто- и фемтомоли вещества с точностью до 0,1-0,01% [23]. К недостаткам данного

типа анализаторов можно отнести зависимость их разрешающей способности от дисперсии времени возникновения ионов. Решение данной задачи было недавно предложено в работе Н.Д. Сем-кина и др., где был описан разработанный метод расчета изменяющегося во времени выталкивающего поля, компенсирующего дисперсию времени возникновения ионов [86]. Следует отметить два принципиально важных достижения, позволивших улучшить разрешение MALDI-TOF MS. Первое связано с использованием рефлектрона -времяпролетного анализатора с электростатическими зеркалами, минимизирующими искажения сигнала и, следовательно, повышающими динамический диапазон и чувствительность масс-спектрометров [32]. Второй подход основан на задержке ионов после испарения образца до приложения электрического поля, что повышает разрешение метода, а выбор времени задержки оптимизирует анализ для конкретного диапазона m/z [21].

К 2000-м гг. был реализован новый масс-ана-лизатор по типу ионной ловушки - орбитрэп (orbitrap) [57]. Важнейшими преимуществами анализатора являются его очень высокое разрешение и большой динамический диапазон. Точность определения массы составляет менее 10 ppm [68]. В протеомике орбитрэп используется в сочетании с линейной квадрупольной ловушкой (LTQ - linear trap quadrupole), где ионная ловушка аккумулирует, локализует и фрагментрирует пептидные ионы, сортирует заряженные частицы по удельным зарядам (e/m) и позволяет удерживать их в свободном пространстве продолжительное время, тем самым повышая чувствительность метода [58]. Существует ряд модификаций анализатора. Одной из них является настольный автономный прибор «Exactive» («Thermo Scientific», США), без линейной ионной ловушки, разработанный для анализа небольших молекул. Из-за отсутствия отбора масс (mass selection) его применение в про-теомике ограничивается фрагментацией во всем диапазоне масс (AIF - all ion fragmentation), где эффективная фрагментация достигается за счет использования высокоэнергетичной камеры столкновений (HCD - higher-energy C-trap dissociation) [12, 47, 73]. Также был создан прибор, основанный на совместном использовании квадруполь-ного и орбитрэп анализаторов - «Q Exactive» («Thermo Scientific», США), позволяющий осуществлять быструю фрагментацию и, соответственно, идентифицировать большее количество пептидов, тем самым повышая разрешающую способность метода [26, 72]. Данный прибор характеризуется высоким ионным током, обусловленным наличием S-линз, высокой энергией столкновитель-ной диссоциации и увеличенным разрешением (до 140 000). Сочетание квадрупольного и орбитрэп

9

ОБЗОРЫ

#

анализаторов создает условия для мультиплексирования операций. В новой версии анализатора «Elite» («Thermo Scientific», США) улучшена ионная оптика, увеличена скорость линейной ионной ловушки с двойной камерой давления до 12 Гц, вдвое увеличена разрешающая способность анализатора (до 240 000) [90]. Таким образом, развитие масс-анализаторов должно значительно повысить достоверность и информативность масс-спектрометрического анализа, в частности для модифицированных белков и пептидов.

Для идентификации белков масс-спектромет-рическими методами применяются два основных подхода: анализ отпечатков пептидных масс (PMF - peptid mass fingerprinting) и точной массово-временной метки (AMT - accurate mass and time tags). Первый основан на разделении смеси белков гель-электрофорезом, трипсино-лизе белковых пятен, измерении молекулярных масс полученных пептидов и их сравнении с геномными или протеомными базами данных с учетом сайтов гидролиза и типа фрагментации в масс-спектрометре. Данный подход развивается по пути расширения возможностей метода для идентификации белков в смеси [16]. Второй метод предлагает использовать только точную массу пептида (без учета гидролизующего фермента и фрагментации в MS) и время его элю-ции с хроматографической колонки, полученные с помощью высокопроизводительной идентификации белков на основе хромато-масс-спектро-метрических методов анализа.

Оба подхода направлены на восстановление информации о белках за счет анализа составляющих их пептидов и получили название bottom-up протеомики (BU-протеомика) [22]. BU-протеоми-ка имеет множество неоспоримых преимуществ: процедура легко осуществима за счет того, что трипсин работает в широком диапазоне условий (в присутствии денатурирующих агентов, органических растворителей, относительно экстремальных значениях pH); с использованием источников ионизации MALDI и ESI с высокой чувствительностью удается разделить небольшие пептиды (500-2000 Да); достаточно знать массы лишь нескольких пептидов для идентификации белка; при помощи многомерной идентификации белка или с применением shotgun подхода можно проводить анализ сложных многокомпонентных смесей, таких как сыворотка или лизаты клеток [41, 60]. К настоящему времени уже имеется ряд протоколов для абсолютного и относительного количественного анализа в протеомике, позволяющих получать надежные данные об уровне экспрессии белков, и различные биоинформационные подходы для анализа масс-спектрометрических данных [29, 40]. К недостат-

кам BU-протеомики следует отнести вероятность потери пептидов, например, во время их разделения или из-за генерирования слишком слабого MS-сигнала.

Существует также направление top-down протеомики (TD-протеомика^основанноенамасс-спектро-метрическом анализе интактных белковых молекул и их многозарядных ионов. К недостаткам метода можно отнести невысокую селективность, поскольку можно подобрать большое количество белков, имеющих одинаковую молекулярную массу, трудности в предварительном разделении белков [40]. В ряде работ представлены алгоритмы и программное обеспечение, используемые для анализа спектров TD [46, 79, 84]. В настоящее время оба направления активно используются как по отдельности [54, 70, 101], так и совместно [43]. Интегрированные TD- и BU-подходы нашли широкое применение в исследовании рибосомаль-ных белков, белковых изоформ и модификаций, белков сыворотки крови, идентификации биомаркеров заболеваний, полном протеомном анализе и др. [36, 78, 95].

Значительные успехи протеомики связаны с использованием тандемной масс-спектрометрии. Тандемные масс-спектрометры позволяют снизить уровень шума по отношению к сигналам, улучшить разделение сигналов анализируемых веществ и воспроизводимость масс-спектров, повысить селективность анализа и получить больший объем структурной информации [9, 30, 63]. В отличие от PMF (peptide mass fingerprint) при использовании MS/MS в каждом отдельном масс-спектре отображен набор фрагментов одного пептида, что позволяет более точно установить как аминокислотную последовательность в составе белка, так и конкретные модификации каждой аминокислоты. MS/MS в большинстве случаев позволяет идентифицировать белки без их предварительного разделения (за исключением анализа очень сложных смесей), а полученные в ходе анализа данные являются наиболее достоверными. Однако большое число получаемых фрагментных масс-спектров требует автоматизации обработки данных MS/MS.

Идентификация пептидов и, следовательно, «родительских» белков может быть выполнена путем сопоставления масс-спектрометрических данных и баз данных известных биологических последовательностей. В первую очередь для анализа белков используют базы данных аминокислотных последовательностей белков. Одной из самых надежных считается база данных SWISS-PROT, где собрана верифицированная информация о структуре белков и их вариациях, функциях белка в организме, ссылки на публикации и многое другое. В дополнение к SWISS-PROT, в связи с растущим потоком геномной информации была

10

разработана база данных TREMBL (Translation of EMBL), содержащая информацию о миллионах последовательностей, полученных переводом кодирующих последовательностей в аминокислотные из базы EMBL (European Molecular Biology Laboratory) [15]. Данные, как правило, предоставляются непосредственно исследователями, и часть этих данных могут составлять белки, существование которых является лишь гипотетическим (предсказаны в соответствии с конкретной генетической последовательностью).

Другая универсальная база данных UniProt функционирует на основе совместной деятельности Европейского института биоинформатики (European Bioinformatics Institute (EBI)), Швейцарского института биоинформатики (Swiss Institute of Bioinformatics (SIB)) и Информационного белкового ресурса (Protein Information Resource (PIR)). UniProt содержит информацию о белках с перекрестными ссылками на источники (UniProt Knowledgebase (UniProtKB)), историю всех белковых последовательностей (UniProt Archive (UniParc)), неизбыточную (non-redundant) базу данных белков (UniProt Reference Clusters (UniRef)), метагеномную базу данных (UniProt Metagenomic and Environmental Sequences database (UniMES)) [31, 93]. Создание неизбыточных баз данных позволяет избегать дублирования информации. Также широко используются неизбыточные базы данных NCBInr и база данных белок-пептидных взаимодействий PepX [92].

Для анализа белков также могут использоваться генетические базы данных. Однако неоднозначность процессов биосинтеза белка (открытая рамка считывания, процессинг белка и др.) осложняет идентификацию белковых молекул. Вследствие этого генетические базы данных редко используются для анализа белков. Для создания структурной модели белка используется база данных аннотированных сравнительных белковых моделей ModBase [94]. Для анализа пептидаз и ингибиторов белков используется база данных MEROPS [80, 82], для идентификации посттрансляционных модификаций - PHOSIDA [81], для анализа консервативных

белков создана отдельная база данных Pfam [51] и многие другие. Для проведения сравнительного анализа масс-спектров с базами данных белков с целью идентификации белков используют компьютерные программы, такие как SEQUEST, MASCOT, ProFound, MSFit и др. [62, 102].

При анализе ранее не исследованных полипептидов используют метод de novo секвенирования, которое проводят на основе тандемного масс-спектра (MS/MS), полученного путем фрагментации протонированных молекул интересующего пептида. В работе [99] рассмотрены основные методы стимулирования разрывов химических связей пептидной цепи. Существует множество алгоритмов de novo секвенирования, основанных на различных математических методах, начиная от перебора всех возможных комбинаций аминокислот родительского иона, теоретико-графового подхода и скрытых Марковских моделей (СММ) и заканчивая современными наиболее распространенными алгоритмами: Lutefisk, NovoHMM, PEAKS, PepNovo и AUDENS [1]. Главный недостаток de novo секвенирования состоит в возможности пропусков участков последовательности из-за потерь серий ионов в спектре, что в итоге затрудняет распознавание пептида. Также трудности возникают при выделении сигналов в сильно зашумленных областях спектра.

Базы спектральных данных, поискового и идентификационного программного обеспечения продолжают расширяться и совершенствоваться. Продолжают модернизироваться масс-спектро-метрические методы. Все это обеспечивает успех MS-технологий, обусловливая их широкое применение в протеомике и ее дальнейшее развитие. К настоящему времени накоплен огромный массив данных о структуре и функциях белковых молекул, их модификациях, белок-белковых взаимодействиях и др. Большое разнообразие современного приборно-технического оснащения, высокие темпы его совершенствования и возможности тан-демного использования различных техник открывают путь к дальнейшему изучению молекулярных и клеточных механизмов.

Сведения об авторах

Кирбаева Наталья Викторовна - младший научный сотрудник лаборатории метаболомного и протеом-ного анализа ФГБУ «НИИ питания» РАМН (Москва) E-mail: n.kirbaeva@ion.ru

Шаранова Наталья Эдуардовна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории метаболомного и протеомного анализа ФГБУ «НИИ питания» РАМН (Москва) E-mail: sharanova@ion.ru

Перцов Сергей Сергеевич - доктор медицинских наук, заместитель директора по научной работе ФГБУ «НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина» РАМН, заведующий лабораторией системных механизмов эмоционального стресса (Москва) E-mail: s.pertsov@mail.ru

11

ОБЗОРЫ

Литература

#

1. Артеменко К.А., Самгина Т.Ю., Лебедев А.Т. Масс-спектро-метрическое de novo секвенирование пептидов // Масс-спектрометрия. - 2006. - Т. 3, № 4. - С. 225-254.

2. Богданов А.Р., Васильев А.В., Погожева А.В., Демин А.В. Нутриметаболомное исследование кардиохирургиче-ских больных с ишемической болезнью сердца // Вестн. С.-Петерб. гос. мед. акад. им. И.И. Мечникова. - 2007. -№ 4. - С. 43-48.

3. Васильев А.В., Ивахненко В.И., Мальцев Г.Ю. Изменение кинетических характеристик супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы в печени и эритроцитах крыс с дефицитом белка и дополнительном введении в рацион Си, Zn, Mn и Se // Биомед. химия. - 2006. - Т. 52, № 4. -С. 384-393.

4. Васильев А.В., Хрущёва Ю.В. / Нутриметаболомика инструмент оценки пищевого статуса и стратегии диетотерапии // Вестн. С.-Петерб. гос. мед. акад. им. И.И. Мечникова. -2007. - Т. 2, № 8. - С. 5-12.

5. Васильев А.В., Ивахненко В.И., Хотимченко С.А., Корж В.В. Влияние алиментарного микроэлементоза на активность глутатионпероксидазы и супероксиддисмутазы // Биомед. химия. - 2008. - № 3. - С. 236-243.

6. Васильев А.В., Хрущева Ю.В, Мальцев Г.Ю. и др. Исследование метаболического статуса комплексным методом непрямой калориметрии и биоимпе-дансметрии // Бюл. экспер. биол. - 2008. - Т. 146, № 12. -С. 707-710.

7. Васильев А.В., Шаранова Н.Э. Нутриметаболомика - новый этап развития биохимии питания. Роль нутрипротеомных исследований // Вопр. питания. - 2013. - № 5. - С. 4-9.

8. Васильев А.В., Шаранова Н.Э., Кулакова С.Н. Нутриметаболомика - новый этап развития биохимии питания. Роль нутрилипидомных исследований // Вопр. питания. -2014. - № 1. - C. 4-11.

9. Дайниченко Е.В., Болдырев А.Н., Барылюк К.В. и др. Про-теомный анализ митохондрий сердца Bostaurus II. Идентификация «растворимых белков» митохондрий // Биоорган. химия. - 2009. - Т. 35, № 4. - С. 457-470.

10. Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки / Под ред. Р.С. Незлина: Пер. с англ. А.Н. Маца. - М.: Мир, 1976. - 368 с.

11. Иванов А.С., Згода В.Г., Арчаков А.И. Технологии белковой интерактомики // Биоорган. химия. - 2011. - Т. 37, № 1. -С. 8-21.

12. Конёнков Н.В., Махмудов М.Н., Степанов В.А. Тенденции развития квадрупольной масс-спектрометрии // Вестн. Рязан. гос. ун-та им. С.А. Есенина. - 2007. - № 3. -С. 98-112.

13. Кравченко Ю.В., Мальцев Г.Ю., Васильев А.В. Биохимическое обоснование алиментарной коррекции окислительного стресса // Вестн. Рос. ун-та дружбы народов. -2003. - № 4. - С. 201-205.

14. Кравченко Ю.В, Мальцев Г.Ю, Васильев А.В. Исследование системы антиокислительной защиты в условиях алиментарно индуцированного окислительного стресса // Биомед. химия. - 2004. - Т. 50, № 5. - С. 32-35.

15. Краснов И.А. Разработка методик и систем ввода наноко-личеств образцов в масс-спектрометр для решения задач поиска и идентификации аддуктов фосфорорганичес-ких соединений с сывороточным альбумином: Автореф. дис. ... канд. техн. наук. - СПб., 2010.

16. Краснов Н.В., Лютвинский Я.И, Подольская Е.П. Масс-спектрометрия с мягкими методами ионизации в про-теомном анализе (обзор) // Науч. приборостроение. -2010. - Т. 20, № 4. - С. 5-20.

17. Оришака О.В., Вовчук И.Л., Петров С.А. Выделение и очистка тиаминпирофосфокиназы немалигнизирован-ного миометрия и при наличии в нем опухолей // Вестн. Харьков. нац. ун-та им. В.Н. Каразина. - 2012. - Вып. 15, № 1008. - С. 23-40.

18. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). - М.: Наука, 1981. - 288 с.

19. Писарев Д.И., Новиков О.О., Фадеева Д.А. и др. Масс-спектрометрия: история и перспективы использования // Молодой ученый. - 2012. - № 10. - С. 99-104.

20. Подольская Е.П., Бабаков В.Н. Масс-спектрометрия с мягкими методами ионизации в токсикологическом анализе (обзор) // Науч. приборостроение. - 2008. - Т. 18, № 4. -С. 5-12.

21. Помозов Т.В., Явор М.И., Веренчиков А.Н. Рефлектроны с ортогональным ускорением ионов на основе планарных бессеточных зеркал // Журн. технической физики. -2012. - Т. 82, № 4. - С. 130-136.

22. Придатченко М.Л., Тарасова И.А., Масселон К. и др. Единый подход к созданию универсальных баз данных точных масс и времен удерживания пептидных маркеров белков на основе модели критической хроматографии биомакромолекул // Тр. МФТИ. - 2009. - Т. 1, № 1. -С. 94-103.

23. Семкин Н.Д., Родин Д.В., Пияков И.В., Помельников Р.А. Метод компенсации временного разброса ионов во вре-мяпролетном масс-спектрометре // Науч. приборостроение. - 2012. - Т. 22, № 4. - С. 102-110.

24. Сердюк И.Н. Физические методы в структурной молекулярной биологии в начале XXI века // Успехи биол. химии. -2002. - Т. 42. - С. 3-28.

25. Хачатурова В.Р., Супрун И.В., Васильев А.В. Сравнительная оценка антиоксидантного и антиатерогенного действия препаратов природного и селенорганического происхождения // Биомед. химия. - 2003. - Т. 49, № 2. - С. 201-207.

26. Чернова Е.Н., Русских Я.В., Подольская Е.П. и др. Оптимизация параметров масс-спектрометрического анализа цианотоксинов на гибридном хромато-масс-спектромет-ре LTQ ORBITRAP XL (ЛжтоРттдап) // Науч. приборостроение. - 2013. - Т. 23, № 1. - С. 20-29.

27. Шабров А.В., Тутельян В.А., Васильев А.В. и др. Современные аспекты фундаментальных и прикладных проблем питания // Мед. академический журн. - 2007. - № 4. -С. 125-130.

28. Anderson D.C., Campbell E.L., Meeks J.C. A solubte 3D LC/MS/MS р|Шоте of Ме filamentous суапоЬа^епит

12

Nostoc Punctiforme // J. Proteome Res. - 2006. - Vol. 5, N 11. - P. 3096-3104.

29. Armirotti A, Damonte G. Achievements and perspectives of top-down proteomics // Proteomics. - 2010. - Vol. 10. -P. 3566-3576.

30. Asara J.M., Christofk H.R., Freimark L.M. et al. A label-free quantification method by MS/MS TIC compared to SILAC and spectral counting in a proteomics screen // Proteomics. -2008. - Vol. 8, N 5. - P. 994-999.

31. Bairoch A, Boeckmann B., Ferro S., Gasteiger. E. Swiss-Prot: Juggling between evolution and stability // Briefings in Bioinformatics. - 2004. - Vol. 5, N 1. - P. 39-55.

32. Balcerzak M. An overview of analytical applications of time of flight-mass spectrometric (TOF-MS) analyzers and an inductively coupled plasma-TOF-MS technique // Anal. Sci. - 2003. - Vol. 19, N 7. - P. 979-989.

33. Banks C.A., Kong S.E., Washburn M.P. Affinity purification of protein complexes for analysis by multidimensional protein identification technology // Protein Expr. Purif. - 2012. -Vol. 86, N 2. - P. 105-119.

34. Bacos C.E., Silva M. / Comparison of several sorbents for continuous in situ derivatization and preconcentration of low-molecular mass aldehydes prior to liquid chromatography-tandem mass spectrometric determination in water samples // J. Chromatogr. A. - 2009. - Vol. 1216, N 38. - P. 6554-6559.

35. Bratkowska D., Fontanals N., Borrull F. et al. Hydrophilic hypercrosslinked polymeric sorbents for the solid-phase extraction of polar contaminants from water // J. Chromatogr. A. -2010. - Vol. 1217, N 19. - P. 3238-3243.

36. Chalmers M.J., Mackay C.L., Hendrickson C.L. et al. Combined top-down and bottom-up mass spectrometric approach to characterization of biomarkers for renal disease // Anal. Chem. - 2005. - Vol. 77, N 22- P. 7163-7171.

37. Clemens L.E., Jansson E.K., Portal E. et al. A behavioral comparison of the common laboratory rat strains Lister Hooded, Lewis, Fischer 344 and Wistarin an automated homecage system // Genes Brain Behav. - 2013. - Vol. 12, N 8. - P. 821-829.

38. Davankov V., Tsyurupa M., Ilyin M. et al. Hypercross-linked polystyrene and its potentials for liquid chromatography: a mini-review // J. Chromatogr. A. - 2002. - Vol. 965, N 1-2. - P. 65-73.

39. De Volder M.F., Tawfick S.H., Baughman R.H., Hart J. Carbon Nanotubes: Present and Future Commercial Applications // Science. - 2013. - Vol. 339, N 6119. - P. 535-539.

40. Delahunty C.M., Yates J.R. 3rd. MudPIT: multidimensional protein identification technology// Biotechniques. -2007. - Vol. 43, N 5. - P. 563, 565, 567.

41. Di Silvestre D., Brambilla F., Mauri P.L. Multidimensional protein identification technology for direct-tissue proteomics of heart // Methods Mol. Biol. - 2013. - Vol. 1005. -P. 25-38.

42. Du Z., Yu Y.L., Chen X.W., Wang J.H. The isolation of basic proteins by solid-phase extraction with multiwalle d carbon nanotubes // Chemistry. - 2007. - Vol. 13, N 34. -P. 9679-9685.

43. Dwivedi R.C., Spicer V., Harder M., Antonovici M. et al. Practical implementation of 2D HPLC scheme with

accurate peptide retention prediction in both dimensions for high-throughput bottom-up proteomics // Anal. Chem. -

2008. - Vol. 80, N 18. - P. 7036-7042.

44. Fontanals N., Galia M., Marce R.M. et al. Solid-phase extraction of polar compounds with a hydrophilic copolymeric sorbent // J. Chromatogr. A. - 2004. - Vol. 1030, N 1-2. -P. 63-68.

45. Fonslow B.R., Niessen S.M., Singh M. et al. Single-Step Inline Hydroxyapatite Enrichment Facilitates Identification and Quantitation of Phosphopeptides from Mass-Limited Proteomes with MudPIT // J. Proteome Res. - 2012. -Vol. 11, N 5. - P. 2697-2709.

46. Frank A.M., Pesavento J.J., Mizzen C.A. et al. Interpreting top-down mass spectra using spectral alignment // Anal. Chem. - 2008. - Vol. 80, N 7. - P. 2499-2505.

47. Geiger T., Cox J., Mann M. Proteomics on an Orbitrap benchtop mass spectrometer using all-ion fragmentation// Mol. Cell Proteomics. - 2010. - Vol. 9. - P. 2252-2261.

48. Giakisikli G., Anthemidis A.N. Magnetic materials as sorbents for metal/metalloid preconcentration and/or separation // Anal. Chim. Acta. - 2013. - Vol. 789. - P. 1-16.

49. Gilar M., Olivova P., Daly A.E. et al. Orthogonality of separation in two-dimensional liquid chromatography // Anal. Chem. - 2005. - Vol. 77, N 19. - P. 6426-6434.

50. Gilbert M.T., Knox J.H., Kaur B. Porous glassy carbon, a new columns packing material for gas chromatography and highperformance liquid chromatography // Chromatographia. -1982. - Vol. 16, Is. 1. - P. 138-146.

51. Gnad F., Gunawardena J, Mann M. PHOSIDA 2011: the posttranslational modification database // Nucleic Acids Res. -2011. - Vol. 39 (Database issue). - P. D253-D260.

52. Godovac-Zimmermann J., Brown L.R. Perspectives for mass spectrometry and functional proteomics // Mass Spectrom. Rev. - 2001. - Vol. 20, N 1. - P. 1-57.

53. Gundry R. L., Fu Q., Jelinek C.A. et al. Investigation of an albumin-enriched fraction of human serum and its albuminome // Proteomics. - 2007. - Vol. 1, N 1. - P. 73-88.

54. Gundry R.L., White M.Y., Murray C.I. et al. Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow // Curr. Protoc. Mol. Biol. -

2009. - Ch. 10. - Unit 10.25.

55. He Z., Liu D., Zhou Z. et al. Ionic-liquid-functionalized magnetic particles as an adsorbent for the magnetic SPE of sulfonylurea herbicides in environmental water samples // J. Sep. Sci. - 2013. - Vol. 36, N 19. - P. 3226-3233.

56. Hennion M.C. Solid-phase extraction: method development, sorbents, and coupling with liquid chromatography // J. Chromatogr. A. - 1999. - Vol. 856, N 1-2. - P. 3-54.

57. Hortin G.L. The MALDI-TOF Mass Spectrometric View of the Plasma Proteome and Peptidome // Clin. Chem. - 2006. - Vol. 52, N 7. - P. 1223-1237.

58. Hu Q., Noll R.J., Li H. et al. The Orbitrap: a new mass spectrometer // J. Mass Spectrom. - 2005. - Vol. 40, N 4. -P. 430-443.

59. Kim Y.E., Yi S.Y., Lee C.S. et al. Gold patterned biochips for on-chip immuno-MALDI-TOF MS: SPRimaging coupled multi-protein MS analysis // Analyst. - 2012. - Vol. 137. -P. 386-392.

13

ОБЗОРЫ

#

60. Kislinger T, Gramolini A.O., MacLennan D.H. et al. Multidimensional protein identification technology (MudPIT): technical overview of a profiling method optimized for the comprehensive proteomic investigation of normal and diseased heart tissue // J. Am. Soc. Mass Spectrom. -2005. - Vol. 16, N 8. - P. 1207-1220.

61. Klose J., Kobalz U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome // Electrophoresis. - 1995. - Vol. 16, N 6. - P. 1034-1059.

62. Koenig T, Menze B.H., Kirchner M. et al. Robust prediction of the MASCOT score for an improved quality assessment in mass spectrometric proteomics // J. Proteome Res. -2008. - Vol. 7, № 9. - P. 3708-3717.

63. Lam H, Deutsch E.W., Eddes J.S. et al. Development and validation of a spectra library searching method for peptide identification from MS/MS // Proteomics. - 2007. - Vol. 7, N 5. - P. 655-667.

64. Leinweber F.C., Schmid D.G., Lubda D. et al. Rapid Communications in Mass Spectrometry // Rapid Commun. Mass Spectrom. - 2003. - Vol. 17, N 11. - P. 1180-1188.

65. LeMieux M, Al-Jawadi A, Wang S., Moustaid-Moussa N. Metabolic profiling in nutrition and metabolic disorders // Adv. Nutr. - 2013. - Vol. 4, N 5. - P. 548-550.

66. Llorach R., Garcia-Aloy M, Tulipani S. et al. Nutrimetabolomic strategies to develop new biomarkers of intake and health effects // J Agric. Food Chem. - 2012. - Vol. 60, N 36. -P. 8797-8808.

67. Lypez de Alda M.J., D. Barcely. Use of solid-phase extraction in various of its modalities for sample preparation in the determination of estrogens and progestogens in sediment and water // J. Chromatogr. A. - 2001. - Vol. 938, N 1-2. -P. 145-153.

68. Makarov A. Electrostatic axially harmonic orbital trapping: a high-performance technique of mass analysis // Anal. Chem. - 2000. - Vol. 72, N 6. - P. 1156-1162.

69. Mayer B. Bioinformatics for Omics Data: Methods and Protocols. - New York: Humana Press, 2011. - P. 3-30.

70. McLafferty F.W., Breuker K, Jin M. et al. Top-down MS, a powerful complement to the high capabilities of proteolysis proteomics // FEBS J. - 2007. - Vol. 274, N 24. - P. 62566268.

71. Medina-Casanellas S., Benavente F., Barbosa J. et al. Preparation and evaluation of an immunoaffinity sorbent for the analysis of opioid peptides by on-lineimmunoaffinity solid-phase extraction capillary electrophoresis-mass spectrometry // Anal. Chim. Acta. - 2012. - Vol. 717. -P. 134-142.

72. Nagaraj N, Kulak N.A., Cox J. et al. System-wide perturbation analysis with nearly complete coverage of the yeast proteome by single-shot ultra HPLC runs on a bench top Orbitrap // Mol. Cell. Proteomics. - 2012. - Vol. 11, N 3 - P. M111.

73. Olsen J.V., Macek B., Lange O. et al. Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis// Nat. Methods. - 2007. - Vol. 4, N 9. - P. 709-712.

74. Ouyang H., Luo Y., Zhang L. et al. Proteome analysis of Aspergillus Fumigatus total membrane proteins identifies proteins associated with the glycoconjugates and cell wall

biosynthesis using 2D LC-MS/MS // Mol. Biotechnol. -2010. - Vol. 44, N 3. - P. 177-189.

75. Pandey A, Mann M. Proteomics to study genes and genomes // Nature. - 2000. -Vol. 405. - P. 837-846.

76. Patsias J., Papadopoulou-Mourkidou E. Development of an automated on-line solid-phase extraction-high-performance liquid chromatographic method for the analysis of aniline, phenol, caffeine and various selected substituted aniline and phenolcompounds in aqueous matrices // J. Chromatogr. A. - 2000. - Vol. 904, N 2. - P. 171-188.

77. Pengo P., Veggiani G, Rattanamanee K. et al. Solid-phase preparation of protein complexes // J. Mol. Recognit. -2010. - Vol. 23, N 6. - P. 551-558.

78. Pflieger D, Przybylski C, Gonnet F. et al. Analysis of human C1 q by combined bottom-up and top-down mass spectrometry. Detailed mapping of post-translational modifications and insights into the C1r/C1s binding sites // Mol. Cell. Proteom. -2010. - Vol. 9. - P. 593-610.

79. Pichler P., K^her T, Holzmann J. et al. Peptide Labeling with Isobaric Tags Yields Higher Identification Rates Using iTRAQ 4-Plex Compared to TMT 6-Plex and iTRAQ 8-Plex on LTQ Orbitrap // Anal. Chem. - 2010. - Vol. 82, N 15. -P. 6549-6558.

80. Pieper U, Webb B.M., Barkan D.T. et al. ModBase, a database of annotated comparative protein structure models, and associated resources // Nucleic Acids Res. - 2011. - Vol. 39 (Database issue). - P. D465-D474.

81. Rawlings N.D., Barrett A.J., Bateman A. MEROPS: the peptidase database // Nucleic Acids Res. - 2010. - Vol. 38 (Database issue). - P. D227-D233.

82. Rawlings N.D., Barrett A.J., Bateman A. MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors // Nucleic Acids Res. - 2012. - Vol. 40 (Database issue). -P. D343-D350.

83. Robinson L, Plano A., Cobb S, Riedel G. Long-term home cage activity scans reveal lowered exploratory behaviour in symptomatic female rett mice // Behav. Brain. Res. - 2013. -Vol. 250. - P. 148-156.

84. Shen Y, Hixson K.K., Tolic N. et al. De novo sequencing of unique sequence tags for discovery of post-translational modifications of proteins // Anal. Chem. - 2008. - Vol. 80, N 15. - P. 5819-5828.

85. Sommella E, Cacciola F, Donato P. et al. Development of an online capillary comprehensive 2D-LC system for the analysis of proteome samples // J. Sep. Sci. - 2012. - Vol. 35, N 4. - P. 530-533.

86. Sparbier K, Wenzel T, Dihazi H. et al. Immuno-MALDI-TOF MS: New perspectives for clinical applications of mass spectrometry // Proteomics. - 2009. - Vol. 9, N 6. - P. 1442-1450.

87. Sudakov S.K., Bashkatova V.G., Kolpakov A.A, Chernya-eva N.N. Loperamide effects on anxiety level and feeding behavior in rats. Roleofvagalafferentation // Bull. Exp. Biol. Med. - 2012. - Vol. 153, N 5. - P. 717-719.

88. Taichrib A, Pioch M, Neususs C. Toward a screening method for the analysis of small intact proteins by CE-ESI-TOF MS // Electrophoresis. - 2012. - Vol. 33, N 9-10. - P. 1356-1366.

89. Tian G.T., Zhang G.Q., Wang H.X. et al. Purification and characterization of a novel laccase from the mushroom

14

Pleurotusnebrodensis // Acta Biochimica Polonica. -2012. - Vol. 59, N 3. - P. 407-412.

90. Uhlmann T., Geoghegan V.L., Thomas B. et al. A method for large-scale identification of protein arginine methylation // Mol. Cell. Proteomics. - 2012. - Vol. 11. - P. 1489-1499.

91. Ultra-High Performance Liquid Chromatography and Its Applications / Ed. Q. Alan Xu. - USA: John Wiley and Sons Inc., 2013 - 294 p.

92. UniProt Consortium // Nucleic Acids Res. - 2010. - Vol. 38 (Database issue). - P. D142-D148.

93. UniProt Consortium // Nucleic Acids Res. - 2011. - Vol. 39 (Database issue). - P. D214-D219.

94. Vanhee P., Reumers J., Stricher F. et al. PepX: a structural database of non-redundant protein-peptide complexes // Nucleic Acids Res. - 2010. - Vol. 38 (Database issue). -P. D545-D551.

95. VerBerkmoes N.C., Bundy J.L., Hauser L. et al. Integrating «top-down» and «bottom-up» mass spectrometric approaches for proteomic analysis of Shewanella oneidensis // J. Proteom. Res. - 2002. - Vol. 1, N 3. - P. 239-252.

96. Wissiack R., Rosenberg E., Grasserbauer M. Comparison of different sorbent materials for on-line solid-phase extraction with liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry of phenols // J. Chromatogr. A. - 2000. - Vol. 896, N 1-2. - P. 159-170.

97. Wittig I., Braun H.P., Schagger H. Blue native PAGE // Nat. Protoc. - 2006. - Vol. 1, N 1. - P. 418-428.

98. Wittke S., Fliserb D., Haubitz M. et al. Determination of peptides and proteins in human urine with capillary electrophoresis-mass spectrometry, a suitable tool for the establishment

of new diagnostic markers // J. Chromatogr. A. - 2003. -Vol. 1013, N 1-2. - P. 173-181.

99. Yanagida M, Miura Y., Yagasaki K. et al. Matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry analysis of proteins detected by anti-phosphotyrosine antibody on two-dimensional-gels of fibrolast cell lysates after tumor necrosis factor-a stimulation // Electrophoresis. -2000. - Vol. 21, N 9. - P. 1890-1898.

100. Yoshida T., Okada T. Peptide separation in normal-phase liquid chromatography: study of selectivity and mobile phase effects on various columns // J. Chromatogr. A. - 1999. -Vol. 840, N 1. - P. 1-9.

101. Zabrouskov V., Giacomelli L., Wijk K.J., McLafferty F.W. A new approach for plant proteomics. Characterization of chloroplast proteins of Arabidopsis thaliana by top-down mass spectrometry // Mol. Cell. Proteom. - 2003. - Vol. 2. -P. 1253-1260.

102. Zhang W., Chai B.T. ProFound: An Expert System for Protein Identification Using Mass Spectrometric Peptide Mapping Information // Anal. Chem. - 2000. - Vol. 72, N 11. -P. 2482-2489.

103. Zhang X., Yap Y., Wei D. et al. Novel omics technologies in nutrition research // Biotechnol. Adv. - 2008. - Vol. 26, N 2. -P. 169-176.

104. Zhao L., Liu L., Leng W. et al. A proteogenomic analysis of Shigella flexneri using 2D LC-MALDI TOF/TOF // BMC Genomics. - 2011. - Vol. 12. - P. 528.

105. Zhou M., Lucas D.A., Chan K.C. et al. An investigation into the human serum «interactome» // Electrophoresis. - 2004. -Vol. 25, Is. 9. - P. 1289-1298.

15