Оценка морфологических параметров нейтрофильных гранулоцитов методом атомно-силовой микроскопии после воздействия фуллерена С60

Биомедицина • № 3, 2014, C. 49-53

Оценка морфологических параметров нейтрофильных гранулоцитов методом атомно-силовой микроскопии после воздействия фуллерена С60

Л.А. Шарафутдинова1, Е.Н. Горшкова2, И.И. Садртдинова1, З.Р. Хисматуллина1, С.А. Башкатов'

1 - ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный университет», Уфа

2 - Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород

Контактная информация: Садртдинова Индира Илдаровна, indira-asp@yandex.ru

В работе представлены результаты исследования влияния фуллерена С60 на морфологические параметры нейтрофилов с целью выявления его возможной токсичности. Проведена оценка морфоме-трических параметров нейтрофилов крови методом атомно-силовой микроскопии. Установлено, что диаметр тела и ядра клеток после воздействия фуллерена С60 существенно изменяется.

Ключевые слова: нейтрофилы, биосовместимость, фуллерены, атомно-силовая микроскопия.

Введение

В настоящее время одним из приоритетных направлений научно-технического прогресса является изучение и применение наноразмерных объектов. Исследования материалов на нанораз-мерном уровне и их использование ведутся несколько десятилетий, однако традиционно считают началом зарождения эпохи нанотехнологий открытие углеродных материалов, построенных исключительно из атомов углерода. Главная особенность этих молекул - это их каркасная форма. Среди множества структурных разновидностей углеродных наноматериалов наибольший интерес представляют фуллерены. Впервые фуллерены были открыты в 1985 г. Х. Крото, Дж. Хит, 0' Брайен и Р. Смол-ли [8, 11], а в 1992 г. их обнаружили в

древних пластах земной коры, шунгите, а позже и в метеоритном веществе. Открытие фуллеренов удостоено Нобелевской премии по химии за 1996 г. и стало одним из ярких научных достижений конца ХХ века.

Наиболее полно изученный представитель семейства фуллеренов - фулле-рен С60. Его иногда называют «бакмин-стер-фуллерен», в котором 60 атомов углерода образуют многогранник из 12 пятиугольников и 20 шестиугольников, что придает такому фуллерену полное сходство с покрышкой футбольного мяча, размер такой молекулы - приблизительно 10 А°. Фуллерены считаются идеальным наноконтейнером, обладающим исключительной избирательностью и высокой биодоступностью. Практически сразу фуллерены привле-

кли внимание многих исследователей, в том числе благодаря возможности их использования в биологии и медицине.

Однако в последнее время в литературе широко обсуждается вопрос о токсичности фуллеренов. Начиная с самых ранних работ [8, 11], в которых были получены данные о низкой острой токсичности фуллеренов, остался открытым вопрос о выраженности их токсичности при длительном применении. Так, были получены данные о его неблагоприятном влиянии на эмбриогенез у мышей [10], а также о его мутагенном действии на дрожжи [9] и дрозофилу [12]. Еще более остро этот вопрос встал в связи с потенциальным широкомасштабным производством фуллеренов и их широким использованием, а также высокой вероятностью загрязнения ими окружающей среды [7]. В связи с этим, начиная с 2005 г., изучению возможной токсичности фуллеренов уделяется все большее внимание.

На значимость проблемы токсичности наноматериалов указывает то, что в России 31 октября 2007 г. была утверждена «Концепция токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериа-лов», разработанная Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека совместно с ведущими научными центрами и НИИ РАМН, Минобрнауки РФ и Роспотребнадзора. Исследования влияния наноматериалов на организм человека, деградации наночастиц при взаимодействии с биологическим материалом, их влиянии на метаболические процессы в живых организмах и разработка методов, позволяющих получать

эту информацию, являются в настоящее время весьма важными и актуальными задачами.

Изучение влияния наночастиц на клетки крови как важного гомеостати-ческого фактора и показателя функционального состояния организма в целом представляется нам весьма актуальной задачей. В связи с этим, изучено влияние фуллерена С60 на морфометриче-ские показатели нейтрофильных гра-нулоцитовов (НГ) с использованием сканирующей зондовой микроскопии. Как объект исследования биосовместимости наночастиц фуллерена нейтрофи-лы нами взяты ввиду того, что любой вариант введения наноматериалов при использовании in vivo предполагает контакт с клетками неспецифической и специфической защиты. НГ периферической крови человека - наиболее чувствительные и мобильные элементы системы неспецифической резистентности организма. Это клетки, характеризующиеся высокой морфологической пластичностью, которые, выполняя свои физиологические функции, подвергаются значительным внешним перестройкам. НГ являются клетками с богатым деструктивным потенциалом, запускают процесс биодеструкции вновь поглощенных частиц, с одной стороны, и, с другой стороны, частицы сами могут оказывать негативное воздействие на различные звенья цитотоксического комплекса нейтрофилов [2].

В настоящее время изменение морфологических параметров клеток крови человека часто соотносят с физиологическими свойствами, что наряду с функциональной характеристикой дает полноценную информацию об их участии в поддержании гомеостаза [1, 2, 5].

Материалы и методы

Для достижения поставленной цели была проведена пробоподготовка нейтрофильных гранулоцитов. Выделение НГ проводили по методу И.С. Подосин-никова и соавт. (1981) из венозной крови условно здоровых доноров студентов-добровольцев (n=10). Выделяли нейтро-филы по стандартной методике в градиенте плотности фиколл-урографина.

Поскольку фуллерены нерастворимы в воде, готовили суспензию фуллерена С60, для чего к нанопорошку добавляли физиологический раствор. Конечная концентрация фуллерена С60 составила 0,75мг/мл. Полученную суспензию тщательно перемешивали с использованием Vortex-3 и подвергали диспергированию в ультразвуковой ванне. Для определения размеров наночастиц, находящихся в исследуемой суспензии фуллерена С60, использовали лазерный анализатор размеров частиц SALD-7101 (Shimadzu): спектральное разрешение 1 нм, диапазон от 10 нм до 300 мкм, метод - лазерная дифракция (УФ-лазер, длина волны излучения 375 нм). Показано, что в полученной суспензии присутствовали на-ночастицы фуллерена С60 от 10 до 40 нм.

На базе лаборатории Научно-образовательного центра «Физика твердотельных наноструктур» Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского была создана сертифицированная методика измерений фиксированных нейтрофилов, в основе которой лежит их фиксация глутаровым альдегидом с последующими исследованием на атомно-силовом микроскопе (АСМ) [3]. Методика включает контактный режим измерения как наиболее точно передающий топографические и размерные характеристики фиксированного биоло-

гического объекта. На АСМ-изображе-нии четко визуализируются ядро и гранулы, причем существует возможность определения латеральных размеров нейтрофилов и их высоты. Нейтрофиль-ные гранулоциты (2-10 клеток/мл) инкубировали с фуллереном С60 (0,75 мг/ мл) в течение 30 мин при 37°С. Далее осуществляли фиксацию нейтрофилов 1,5% глутеральдегидом на предметном стекле.

В серии экспериментов изучали нейтрофилы, полученные из крови здоровых доноров, и сравнивали мор-фометрические показатели до и после воздействия фуллерена С60. Сканирование образцов для измерения геометрических параметров нейтрофилов производили с помощью АСМ. Исследования проводились на установке SOLVER BIOT (NT-MDT, г. Зеленоград).

Для исследования морфологических изменений НГ в системе с фуллеренами С60 проводили сканирование топографии НГ в полуконтактном режиме с использованием зондов DNP (Veeco, USA) [3]. Для визуализации сканируемых объектов применялась программа Nova NT-MDT SPM Software (NT-MDT, г. Зеленоград). Дальнейшая обработка изображений проводилась с использованием программного обеспечения SPMLab Analysis Only (Topometrix, США). В программном пакете прикладных программ Statistica (v.6.0) проведен статистический анализ полученных результатов измерений.

Результаты и их обсуждение

На рисунке представлены результаты сканирования нейтрофилов. В контрольных образцах (рис. А) нейтрофил имеет ядро округлой формы, ядерная

мембрана практически ровная, с незначительными выбуханиями. Цитоплазма занимает большой объем и имеет трехлопастную форму.

В таблице представлены замеры высоты нейтрофилов и поперечных размеров (диаметр) клеток.

Таблица Морфометрические параметры нейтрофильных гранулоцитов, полученные методом сканирующей зондовой микроскопии, до и после воздействия фуллерена С60

Параметры Контроль Опыт

Диаметр тела, мкм 18,2±0,72 15,16±0,47*

Высота ядра, мкм 4,34±0,61 5,98±0,71

Диаметр ядра, мкм 4,85±0,69 5,85±0,85*

Примечание: * - различия достоверны при р<0,01.

Как следует из данных табл. и заметно на рис. Б, после воздействия фуллерена С60 морфология нейтрофила изменяется: ядро приобретает овально-вытянутую форму, что отражается на его размере. Так, если до воздействия диаметр ядра составлял 4,85±0,69 мкм, то после инкубации с фуллереном С60 этот показатель достоверно увеличивается и составляет 5,85±0,85 мкм. Ядерная мембрана приобретает пористый, разрыхленный вид. Объем цитоплазмы уменьшается, в некоторых областях имеет опустошенный вид, что может свидетельствовать о гибели органелл. Следует отметить, что при сравнении на АСМ-изображении контрольного образца определяется нежная зернистость, тогда как в опытном образце в цитоплазме видны грубые гранулы, что можно определить как патологическую зернистость. Также отмечается истончение мембраны на периферии клетки.

На сегодняшний день общепринято, что изменение формы клеточного ядра

является существенным диагностическим признаком: деформация ядер цито-плазматическими включениями при дистрофических процессах, полиморфизм ядер при воспалении (гранулематоз) и опухолевом росте (клеточный атипизм) свидетельствует о дифункциональных изменениях клетках крови в ответ на токсическое воздействие.

Выводы

Таким образом, сравнение морфоме-трических показателей нейтрофильных гранулоцитов показало, что воздействие фуллерена С60 приводит к значительному снижению диаметра тела клетки и увеличению диаметра ядра (р<0.01). Наблюдаемый нами сдвиг морфометрических параметров нейтрофилов является маркером изменения их функциональной активности и может свидетельствовать о потенциальной цитотоксичности фуллерена С60.

Список литературы

1. Гущина Ю.Ю., Плескова С.Н., Звонкова М.Б.

Исследование различий морфологических параметров клеток крови человека методом сканирующей зондовой микроскопии // Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования. 2005. № 1. С. 48-53.

2. Маянский А.Н., Пикуза О.И. Клинические аспекты фагоцитоза. Казань: Магариф. 1993. 192 с.

3. Плескова С.Н. Атомносиловая микроскопия в биологических и медицинских исследованиях. Уч. пособие. Интеллект-групп. 2011. 184 с.

4. Плескова С.Н., Горшкова Е.Н., Михеева Э.Р., Шушунов А.Н. Исследование биосовместимости нанопорошка с флюоресцирующим центром Er/Yb в системе с нейтрофильными гранулоцитами // Цитология. 2011. Т. 53. № 5. С. 444-449.

5. Сапрыкин В.П. Морфологические варианты нейтрофильных гранулоцитов крови практически здоровых людей // Морфология. 2001. Т. 120. № 6. С. 37-41.

6. Kroto H.W., Heath J.R., O'Brien S.C. C60: Buckminsterfullerene // Nature. 1985. T. 318. P. 62-63.

7. Kulkarni P.P., Jafvert C. T Solubility of C60 in solvent mixtures // Environ. Sci. Technol. 2008. T. 42 . P. 845-851.

8. Nelson M.A., Domann F.E., Bowden G.T., Hooser S.B., Fernando Q., Carter D.E. Effects of acute and subchronic exposure of topically applied fullerene extracts on the mouse skin // Toxicol. Ind. Health. 1993. T. 9. P. 623-630.

9. Sera N., Tokiwa H., Miyata N. Mutagenicity of the fullerene C60-generated singlet oxygen dependent formation of lipid peroxides // Carcinogenesis. 1996. Т. 17. Р. 2163-2169.

10. Tsuchiya T., Oguri I., Yamakoshi Y.N., Miyata N. Novel harmful effects of fullerene on mouse embryos in vitro and in vivo // FEBS Lett. 1996. T. 393. P. 139-145.

11. YamagoS., TokuyamaH., NakamuraE., Kikuchi K., Kananishi S. In vivo biological behavior of a water-miscible fullerene: 14C labeling,absorption, distribution, excretion and acute toxicity // Chem. Biol. 1995. T. 2. P. 385-389.

12. Zakharenko L.P., Zakharov I.K., Vasiunina E.A., Karamysheva T.V., Danilenko A.M., Nikiforov A.A. Determination of the genotoxicity of fullerene C60 and fullerol using the method of somatic mosaics on cells of Drosophilla melanogaster wing and SOS-chromotest // Genetika. 1997. T. 33. P. 405-409.

Neutrophiles morphological parameters estimation by nuclear and power microscopy after fullerene C60 influence

L.A. Sharafutdinova, E.N. Gorshkova, I.I. Sadrtdinova, Z.R. Khismatullina

Fullerene C60 possible toxicity upon morphological parameters of human neutrophiles influence was investigated. Blood neutrophiles morphological parameters by nuclear and power microscopy were estimated. It was disappeared that cell soma and nuclei diameters after fullerene C60 exposure were changed significantly.

Key words: neutrophils, biocompatibility, fullerenes, atomic force microscopy.