Применение рекомбинантного аналога белка человека SLURP-1 совместно с цитостатиками или препаратами ингибиторами протеасом для торможения роста карцином
APPLICATION OF RECOMBINANT ANALOGUE OF HUMAN PROTEIN SLURP-1 IN COMBINATION WITH CYTOSTATICS OR PROTEASOME INHIBITOR PRODUCTS FOR INHIBITING GROWTH OF CARCINOMAS

Изобретение относится к медицине и биологии, к области экспериментальной онкологии. Способ может быть использован для торможения роста и терапии опухолей.
Онкологические заболевания являются второй по распространенности причиной смерти населения после заболеваний сердечно-сосудистой системы, как в России, так и в мире, поэтому поиск новых эффективных стратегий терапии опухолей входит в список приоритетных проблем современной медицины. Большинство из применяемых в настоящее время противоопухолевых препаратов также действуют и на здоровые клетки организма и обладают высокой токсичностью [Nurgali K, Jagoe RT, Abalo R. (2018). Front. Pharmacol. 9(245):00245. doi: 10.3389/fphar.2018.00245]. Кроме того, клетки опухоли в процессе роста, могут вырабатывать резистентность к применяемым химиотерапевтическим препаратам [Vasan N, Baselga J, HymanDM. A view on drug resistance in cancer. (2019). Nature. 575(7782):299-309. doi: 10.1038/s41586-019-1730-1]. Одним из способов увеличения эффективности противоопухолевого действия, уменьшения токсического действия и ограничения способности клеток к выработке резистентности является использование комбинаций препаратов, действующих на разные молекулярные мишени [Nurgali K, Jagoe RT, Abalo R. (2018). Front. Pharmacol. 9:245. 00245. doi: 10.3389/fphar.2018.00245].
Известно, что в клетках карцином экспрессируются никотиновые ацетилхолиновые рецепторы а7 типа (а7-nAChR), ингибирование которых приводит к торможению роста опухолевых клеток [Grozio A, Paleari L, Catassi A, Servent D, Cilli M, Piccardi F, Paganuzzi M, Cesario A, Granone P, Mourier G, Russo P. (2008) Int. J. Cancer. 122(8):1911-5; Zhang H. (2016) Drug Design, Development and Therapy. 10:3867-72; Trombino S, Cesario A, Margaritora S, Granone P, Motta G, Falugi C, Russo P. (2004) Cancer Res. 64(1):135-45]. Белок SLURP-1 действует на никотиновые ацетилхолиновые рецепторы a7 типа (а7-nAChR) и способен тормозить рост клеток карцином [Shulepko MA, Bychkov ML, Shlepova OV, Shenkarev ZO, Kirpichnikov MP, Lyukmanova EN. (2020) Int Immunopharmacol. 82:106303; Lyukmanova EN, Bychkov ML, Sharonov GV, Efremenko AV, Shulepko MA, Kulbatskii DS, Shenkarev ZO, Feofanov AV, Dolgikh DA, Kirpichnikov MP. (2018). Br J Pharmacol. 175:1973-1986. doi: 10.1111/bph.14194; Е. Н. Люкманова, М. А. Шулепко, М. Л. Бычков, З. О. Шенкарев, А. С. Парамонов, А. О. Чугунов, A. С. Арсеньев, Д. А. Долгих, М. П. Кирпичников. (2014) Acta Naturae, 6(4): 58-65].
Наиболее близким к заявленному является способ торможения роста клеток карцином с использованием ингибитора рецептора эпидермального фактора роста гефитиниба в комбинации с рекомбинантным аналогом белка человека SLURP-1 (SEQ ID NO:1) [Lyukmanova EN, Bychkov ML, Sharonov GV, Efremenko AV, Shulepko MA, Kulbatskii DS, Shenkarev ZO, Feofanov AV, Dolgikh DA, Kirpichnikov MP. (2018). Br J Pharmacol. 175:1973-1986. doi: 10.1111/bph.14194]. Сочетанное применение гефитиниба и SLURP-1 позволяет добиться более эффективного торможения роста клеток карцином. Однако, клетки не всех типов карцином экспрессируют рецептор эпидермального фактора роста и чувствительны к действию ингибиторов этого рецептора [Sigismund S, Avanzato D, Lanzetti L. (2018). Mol Oncol. 12(1):3- 20. doi: 10.1002/1878-0261.12155].
В настоящее время для торможения роста опухолей также применяются препараты более широкого действия, например, цитостатики (доксорубицин, [Ingle JN, Pfeifle DM, Green SJ, Kvols LK, Brunk SF, Reuter NF, Krook JE, Laurie JA, Everson LK, Marschke RF. (1985). Am J Clin Oncol. 8(4):275-282]) и ингибиторы протеасом (бортезомиб, [Kouroukis TC, Baldassarre FG, Haynes AE, Imrie K, Reece DE, Cheung MC. (2014). Current Oncology. 21(4):e573-e603]). Однако, препараты этих семейств обладают значительной токсичностью и при высоких концентрациях способны вызывать множество побочных эффектов [Schirrmacher V. (2019). Int J Oncol. 54(2):407-419. doi: 10.3892/ijo.2018.4661].
Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является увеличение эффективности действия препаратов из групп цитостатиков и ингибиторов протеасом при снижении их концентраций. Достигаемый технический результат – высокая эффективность торможения роста клеток карцином, снижение эффективных концентраций действующих веществ препаратов, необходимых для подавления роста опухоли.
Поставленная техническая проблема и заявленный технический результат достигается за счет сочетанного применения препаратов цитостатиков или ингибиторов протеасом с рекомбинантным аналогом белка SLURP-1 (SEQ ID NO:1) для торможения роста клеток карцином. В этом случае остановка роста опухолевых клеток достигается за счет комбинированного действия противоопухолевых препаратов (либо цитостатических, либо действующих на протеасомы) и рекомбинантного аналога белка SLURP-1 (SEQ № 1), действующего на а7-nAChR. В качестве ингибитора протеасом может быть использован, например, ингибитор 26S субъединицы протеасом бортезомиб, а в качестве цитостатика может быть использован интеркалирующий ДНК антибиотик антрациклинового ряда доксорубицин. Рекомбинантный аналог белка человека SLURP-1 (SEQ ID NO:1) получают в бактериальной системе экспрессии, при которой белок ренатурируют из цитоплазматических
телец включения E. coli (патент РФ № 2453602, C12N 15/11, опубл. 27.02.2012г.).
Изобретение иллюстрируют графические материалы:
На фиг. 1 представлены данные по влиянию рекомбинантного аналога SLURP-1 (SEQ ID NO:1), ингибитора протеасом бортезомиба и комбинации препаратов на рост клеток карциномы легкого линии А549. Клетки инкубируют в течение 24 часов или с 1 мкМ SLURP-1, или с бортезомибом (10 или 1 мкМ), или с 1 мкМ SLURP-1 в комбинации с 10 нМ бортезомиба. Жизнеспособность клеток определяют с помощью МТТ-теста. Данные показаны как среднее ± S.E.M. (n = 6). (*) означает статистически значимые (p < 0.05) отличия групп согласно двухфакторному дисперсионному анализу (two-way ANOVA) и апостериорному критерию Туки.
На фиг. 2 представлены данные по влиянию рекомбинантного аналога SLURP-1 (SEQ ID NO:1), ингибитора протеасом бортезомиба, цитостатика доксорубицина и комбинаций препаратов на рост объемных опухолей из клеток эпидермальной карциномы линии А431. Объемные опухоли инкубируют или с рекомбинантным аналогом SLURP-1 (1 нМ), или с ингибитором протеасом бортезомибом (10 нМ), или с цитостатиком доксорубицином (1 мкМ) по-отдельности, или в комбинации в течение 48 часов. Жизнеспособность опухолевых клеток определяют с помощью МТТ-теста. Данные показаны как среднее ± S.E.M. (n = 6).
Изобретение иллюстрируют следующие примеры.
Пример 1. Изобретение раскрывается на примере клеток карциномы легкого A549. Клетки культивируются в питательной среде DMEM c добавлением 10% (по объему) эмбриональной бычьей сыворотки и 2мМ глутамина и 25 мМ HEPES. Клетки культивируют в культуральных флаконах объемом 75 мл и пересаживают минимум 2 раза в неделю. Клетки высевают в лунки культурального 96-луночного планшета (5000 клеток на лунку), через сутки добавляют или 1 мкМ рекомбинантного аналога SLURP-1 (SEQ ID NO:1), или бортезомиб (10 нМ или 1 мкМ), или SLURP-1 (1 мкМ) в комбинации с бортезомибом (10 нМ). После этого клетки A549 инкубируют с препаратами в течение 24 часов. Затем определяют число жизнеспособных клеток А549 при помощи теста на активность митохондриальной сукцинатдегидрогеназы (МТТ-тест). Для этого, к клеткам добавляют субстрат митохондриальной сукцинатдегидрогеназы МТТ (конечная концентрация составляет 0,25 мг/мл) и инкубируют в течение 2 часов. МТТ при этом восстанавливается митохондриальной сукцинатдегидрогеназой до формазана. После инкубации нерастворимые кристаллы формазана растворяют в изопропаноле с добавлением 75 мМ соляной кислоты в течение 4 часов при периодическом помешивании и затем определяют поглощение в лунках при 540 нМ с выравниванием на фон при 655 нМ.
Пример показывает, что рекомбинантный аналог SLURP-1 (SEQ ID NO:1) в концентрации 1 мкМ ингибирует рост клеток карциномы легкого А549 до 68,7 ± 1,5 % от контроля при 24-часовой инкубации (фиг. 1). Бортезомиб в концентрации 10 нМ или 1 мкМ ингибирует рост клеток карциномы легкого А549 до 82,5 ± 1,8 %и 29,8 ± 1,5 %, соответственно (фиг. 1). Сочетанное применение 1 мкМ SLURP-1 и 10 нМ бортезомиба ингибирует рост клеток карциномы легкого А549 до 35,0 ± 2,2 % (фиг. 1). Таким образом, совместное применение бортезомиба с рекомбинантным аналогом SLURP-1 (SEQ ID NO:1) эффективнее тормозит рост клеток карциномы легкого А549. При этом действующая концентрация бортезомиба уменьшается в 100 раз.
Пример 2. Изобретение раскрывается на примере объемных опухолей, полученных из клеток эпидермальной карциномы A431. Клетки культивируются в питательной среде DMEM c добавлением 10% (по объему) эмбриональной бычьей сыворотки и 2мМ глутамина и 25 мМ HEPES. Клетки А431 культивируют в культуральных флаконах объемом 75 мл и пересаживают минимум 2 раза в неделю. Объемные опухоли получают при культивировании клеток (15000 клеток на лунку культурального планшета) на полигидроксиметилакрилатной матрице в течение 48 часов. Затем, к объемным опухолям добавляют или 1 нМ рекомбинантного аналога SLURP-1 (SEQ ID NO:1), или 10 нМ ингибитора протеасом бортезомиба, или 1 мкМ цитостатика доксорубицина, или комбинацию SLURP-1 с бортезомибом, или комбинацию SLURP-1 с доксорубицином, в тех же концентрациях. Объемные опухоли из клеток A431 инкубируют с препаратами в течение 48 часов с заменой среды каждые сутки. Жизнеспособность клеток опухоли определяют с помощью МТТ-теста.
Пример показывает, что рекомбинантный аналог SLURP-1 в концентрации 1 нМ, бортезомиб в концентрации 10 нМ и доксорубицин в концентрации 1 мкМ по-отдельности ингибируют рост клеток эпидермальной карциномы А431 до 80,0 ± 2,0 %; 83,6 ± 6,25 % и 84,4 ± 6,8 % от контроля при 48-часовой инкубации, соответственно (фиг. 2). Совместное применение бортезомиба или доксорубицина с рекомбинантным аналогом SLURP-1 эффективнее тормозит рост объемных опухолей из клеток эпидермальной карциномы А431 со снижением числа жизнеспособных клеток до 71,2 ± 7,3 % и 72,7 ± 4,2 % от контроля при 48-часовой инкубации, соответственно (фиг. 2).
--->
Перечень последовательностей
SEQ ID NO:1
Met Leu Lys Cys Tyr Thr Cys Lys Glu Pro Met Thr Ser Ala Ser Cys
1               5                   10                  15
Arg Thr Ile Thr Arg Cys Lys Pro Glu Asp Thr Ala Cys Met Thr Thr
20                  25                  30
Leu Val Thr Val Glu Ala Glu Tyr Pro Phe Asn Gln Ser Pro Val Val
35                  40                  45
Thr Arg Ser Cys Ser Ser Ser Cys Val Ala Thr Asp Pro Asp Ser Ile
50                  55                  60
Gly Ala Ala His Leu Ile Phe Cys Cys Phe Arg Asp Leu Cys Asn Ser
65                  70                  75                  80
Glu Leu
<---