ШТАММЫ BACILLUS SAFENSIS ВКПМ В-12180, BACILLUS LICHENIFORMIS ВКПМ В-1224, BACILLUS PUMILUS ВКПМ В-12182, BACILLUS ENDOPHYTICUS ВКПМ В-12181 - ПРОДУЦЕНТЫ БАКТЕРИОЦИНОВ ПРОТИВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПАТОГЕНОВ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗИНА
STRAINS BACILLUS SAFENSIS VKPM V-12180, BACILLUS LICHENIFORMIS VKPM V-1224, BACILLUS PUMILUS VKPM V-12182, BACILLUS ENDOPHYTICUS VKPM V-12181 - PRODUCERS OF BACTERIOCINS AGAINST BACTERIAL PATHOGENS, METHOD FOR PRODUCING NISIN

Группа изобретений относится к биотехнологии. Штаммы Bacillus safensis ВКПМ B-12180, Bacillus licheniformis ВКПМ В-12224, Bacillus pumilus ВКПМ B-12182, Bacillus endophyticus ВКПМ В-12181 депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика и являются продуцентами бактериоцина низина, который обладает антагонистической активностью против бактериальных патогенов и может быть использован в пищевой промышленности для продления сроков годности минимально обработанных овощей. Группа изобретений также включает способ получения низина, основанный на использовании центрифугирования, фильтрации и добавлении сухого хлористого натрия.
Уровень техники
3
7
Известно, что на свежих фруктах и овощах содержится большое количество микроорганизмов. Плотность микроорганизмов, в основном, зависит от естественной изменчивости продукта, и составляет в среднем от 10-10 КОЕ/г.
Молочнокислые бактерии (например, Lactobacillus), Pseudomonas, Erwinia, Pantoea, Micrococcus, Flavobacterium и грамположительные спорообразующие бактерии (например, Bacillus, Clostridium), как правило, являются доминирующими бактериями в свежих фруктах и овощах. Кроме того, различные типы бактерий, такие как Alternaria, Penicillium, Aspergillus, Fusarium также могут быть найдены в больших количествах. Наконец, Torulopsis, Saccharomyces и Candida являются частью доминирующих микроорганизмов, особенно в тех фруктах, которые имеют высокое содержание сахара.
В отдельную группу выделяют микроорганизмы, вызывающие порчу свежих фруктов и овощей, к которым относятся грибы и бактерии. К микробной порче фруктов и овощей относится гниль, которая характеризуется изменением цвета (черный или серый), потерей текстуры (мягкая гниль), а зачастую и неприятным запахом. Повреждения, возникающие при хранении продуктов, часто в результате уборки и транспортировки, легко открывают доступ к множеству бактерий и грибов, высокое содержание воды в продукте будет способствовать их развитию. Среди наиболее важных послеуборочных грибковых патогенов, вызывающих порчу фруктов, можно выделить Penicillium expansum, Botrytis cinerea, Monilinia laxa и Rhizopus stolonifer, в связи с тем, что они имеют особую значимость при порче фруктов и овощей.
Бактериоцины - это антибактериальные вещества белковой природы, вырабатываемые бактериями и подавляющие жизнедеятельность других штаммов того же вида или родственных видов.
В настоящее время ученые многих лабораторий мира изучают пути и способы направленного синтеза бактериоцинов для создания биологическим путем различных модификаций уже известных бактериоцинов, но с более ценными свойствами.
Так, известен способ получения низина (СССР, патент 707320, опубл. 30.11.1981) путем выращивания продуцента Streptococcus lactis в питательной среде на основе молочной сыворотки, с последующей экстракцией целевого продукта из микробных клеток, отделением экстракта, его концентрированием, высаливанием, фильтрацией и высушиванием, отличающийся тем, что с целью стабилизации активности низина в процессе хранения продуцент выращивают на среде, содержащей молочную сыворотку и экстракт кормовых дрожжей, выращенных на растительных отходах, очищенную культуральную жидкость концентрируют с сорбиталем С-20, фильтрацию осуществляют через фильтр-перлит, полученную пасту низин-перлит растворяют в 0,02 н. растворе HCl, затем проводят повторную фильтрацию и концентрат высушивают в присутствии хлористого натрия напылением на казеинат натрия при их соотношении 1-2:2,3-1,3.
Недостатками данного способа являются низкая активность и нестабильность полученного препарата при хранении, а также ограниченный спектр его антимикробного действия.
7
9
Описана смесь бактериоцинов, штамм Streptococcus thermophilus -продуцент бактериоцинов и способ их получения (РФ, патент 2153505, опубл. 27.07.2000). Бактериоцины получены культивированием штамма-продуцента Streptococcus thermophilus CNCM 1-1351, выделенного из ферментированного молочного продукта из Чехословакии, в среде и условиях, благоприятных для его роста, и до содержания микроорганизмов в среде 10-10 КОЕ/мл с последующим центрифугированием культуры, приготовлением экстракта супернатанта, содержащего целевой продукт. Бактериоцины используют для приготовления пищевых продуктов или косметической продукции.
Недостатком данного способа является низкая продуктивность штамма.
3
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению - ближайшим аналогом - является штамм Streptococcus lactis - продуцент бактериоцина низина, обеспечивающий стабильный биосинтез целевого продукта в процессе управляемого непрерывного культивирования (продуктивность на уровне 1440-1680 МЕ/смч) и характеризующийся повышенной протеолитической активностью (РФ, патент 2061042, опубл. 27.05.1996).
Основной недостаток ближайшего аналога заключается в низкой продуктивности и нестабильности биосинтеза бактериоцина.
Техническая задача, решаемая изобретением, заключается в выделении штаммов-продуцентов бактериоцина, являющихся представителями нормальной микрофлоры поверхности фруктов и овощей и обладающих широким спектром антимикробного действия по отношению к патогенным, условно-патогенным микроорганизмам и микроорганизмам, вызывающим порчу фруктов и овощей.
Раскрытие сущности изобретения
Поставленная задача решается тем, что предложены штаммы Bacillus safensis B-12180, Bacillus licheniformis В-12224, Bacillus pumilus B-12182, Bacillus endophyticus B-12181 - продуценты бактериоцина против бактериальных патогенов.
Для выделения штаммов овощи (репчатый лук, помидор, болгарский перец) тщательно промывают, измельчают в стерильных условиях и вносят в пробирки с жидкой питательной средой, либо небольшой кусочек сырья растирают по поверхности чашки с агаризованной питательной средой. Инкубируют чашки и пробирки в течение 1-5 суток.
Из пробирок с видимым ростом микроорганизмов и с суммарных газонов на чашках проводят истощающие рассевы. Выделенные микроорганизмы культивируют на агаризованных средах, клонируют до чистых культур и проводят анализ выделенных штаммов с последующим отбором наиболее активных штаммов микроорганизмов.
Отобранные штаммы исследуют как продуценты бактериоцина, в частности низина, в процессе управляемого культивирования.
Для получения фракции бактериоцина выделенные и сублимированные штаммы восстанавливают путем переноса содержимого ампул в пробирки с питательной средой МПБ. Посевы инкубируют при температуре 30°С. После восстановления культур их выращивают на питательном агаре МПА. Затем инокуляты вносят в ферментационную среду (MRS-бульон) в количестве 5%. Далее осуществляют процесс ферментации в непрерывных условиях при температуре 30°С в течение 12-24 ч.
По окончании культивирования биомассу отделяют от питательной среды центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 мин.
Затем концентрируют культуральную жидкость на полых волокнах, отсекающих вещества с молекулярной массой более 15 кДа; перемешивают с сухим хлористым натрием (0,5 М); центрифугируют при 10000 об/мин в течение 15 мин. Далее осадок промывают последовательно водой и изопропиловым спиртом.
Полученную массу центрифугируют, выпаривают изопропанол при температуре 60°С. Выдерживают раствор с водой и активированным углем в течение 15 мин, центрифугируют при 10000 об/мин в течение 15 мин; фильтруют через мембрану, отсекающую молекулы с молекулярной массой более 10 кДа. Полученные пептидные фракции объединяют и проводят их лиофилизацию при следующих параметрах: температура сушки 30°С, продолжительность сушки 6 ч, толщина слоя сушки 2 мм. Готовый продукт упаковывают и хранят при температуре -18°С в течение 12 месяцев.
Штаммы Bacillus safensis, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus endophyticus депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика и имеют коллекционные номера В-12180, В-12224, В-12182, В-12181, соответственно.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1
Для выделения штаммов репчатый лук тщательно промывают от земли и пыли дистиллированной водой, измельчают в стерильных условиях и вносят в количестве приблизительно 5 г в пробирки с 5 мл жидких питательных сред, либо небольшой кусочек сырья растирают по поверхности чашки с агаризованной питательной средой. Инкубируют чашки и пробирки стационарно в трех температурных режимах (30°С, 37°С и 4°С) в течение 1-5 суток.
Для первичного выделения микроорганизмов используют:
- молочную среду (МС) - стерильное обезжиренное молоко;
- бульон MRS по ISO 13721 (Whatman, Германия);
- сердечно-мозговой бульон (Bio-Rad Laboratories SAS, Франция);
- молочный агар, MA (БиоВитрум, Россия);
- рыбопептонный агар, РПА (БиоВитрум, Россия);
- агар MRS, МРСА (Panreac, Испания).
Из пробирок с видимым ростом микроорганизмов (помутнение или наличие молочного сгустка) и с суммарных газонов на чашках проводят истощающие рассевы. Выделенные микроорганизмы культивируют на агаризованных средах (РПА, МРСА и МА), клонируют до чистых культур и проводят микробиологический анализ культурально-морфологических, физиолого-биохимических и генетических свойств выделенных штаммов с последующим отбором наиболее активных штаммов микроорганизмов.
Штаммы Bacillus safensis B-12180, Bacillus pumilus B-12182, наиболее активные из всех отобранных штаммов, исследуют как продуценты бактериоцина в процессе управляемого культивирования.
Штамм Bacillus safensis B-12180 - продуцент бактериоцина -характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки.
Штамм представляет собой грамположительные подвижные за счет наличия перетрихиальных жгутиков палочки размером 0,5-2,5×1,2-10 мкм, образующие споры. Расположение клеток от одиночных до длинных цепочек.
Культуральные признаки.
Штамм образует плоские матовые однородные колонии округлой формы телесного цвета с бахромчатым краем и шероховатой поверхностью. Биохимические признаки.
Штамм растет в аэробных условиях в молоке, в сердечно-мозговом бульоне при температурах 30°С и 37°С, растет на агаризованных средах: рыбопептонном агаре, молочном агаре, MRS-агаре.
Штамм ферментирует глицерол, L-арабинозу, рибозу, D-ксилозу, L-ксилозу, рибит, D-глюкозу, D-фруктозу, рамнозу, галактит, инозитол,
манитол, сорбитол, α-метил-D-манозид, α-метил-D-глюкозид, амигдалин, арбутин, эскулин, салицин, целлобиозу, мальтозу, сахарозу, трегалозу, D-рафинозу, крахмал, гликоген, ксилит, β-генцибиозу.
Антагонистическая активность.
Штамм проявляет in vitro выраженную антагонистическую активность против некоторых грамположительных патогенов: Leuconostoc mesenteroides, Arthrobacter cumminsii.
Штамм Bacillus pumilus B-12182 - продуцент бактериоцина -характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки.
Штамм представляет собой грамположительные подвижные за счет наличия перетрихиальных жгутиков палочки размером 0,5-2,5×1,2-10 мкм, образующие споры. Расположение клеток от одиночных до длинных цепочек.
Культуральные признаки.
Штамм образует выпуклые непрозрачные однородные колонии округлой формы белого цвета с зубчатым краем и гладкой поверхностью. Биохимические признаки.
Штамм растет в аэробных условиях в молоке, в сердечно-мозговом бульоне при температурах 30°С и 37°С, растет на агаризованных средах: рыбопептонном агаре, молочном агаре, MRS-агаре.
Штамм ферментирует L-арабинозу, рибозу, D-глюкозу, D-фруктозу, D-манозу, манитол, арбутин, эскулин, салицин, целлобиозу, сахарозу, трегалозу, β-генцибиозу, D-тагатозу.
Антагонистическая активность.
Штамм проявляет in vitro выраженную антагонистическую активность против некоторых грамположительных патогенов: Leuconostoc mesenteroides, Arthrobacter cumminsii.
В результате проведения генетической идентификации штаммов они депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных
Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика, находящейся по адресу: 117545, Россия, г. Москва, 1-ый Дорожный проезд, д. 1:
- Bacillus safensis, регистрационный номер ВКПМ В-12180 от 18.04.2015;
- Bacillus pumilus, регистрационный номер ВКПМ В-12182 от 18.04.2015.
Данные культуры микроорганизмов хранятся в сублимационно-высушенном состоянии в ампулах при температуре 4±2°С не менее 24 месяцев.
Для получения фракции бактериоцина выделенные и сублимированные штаммы Bacillus safensis ВКПМ B-12180, Bacillus pumilus ВКПМ В-12182 восстанавливают путем переноса содержимого ампул в пробирки с питательной средой МПБ, г/л: панкреатический гидролизат рыбной муки - 12; хлорид натрия - 6; пептон ферментативный - 12. Посевы инкубируют при температуре 30°С. После восстановления культур, их выращивают на питательном агаре МПА. Затем инокуляты вносят в ферментационную среду (MRS-бульон) в количестве 5%.
8
6
Далее осуществляют процесс ферментации в непрерывных условиях при температуре 30°С в течение 12-24 ч до достижения концентраций 1,5⋅10 КОЕ/мл для Bacillus safensis ВКПМ В-12180; 1,5⋅10 КОЕ/мл для Bacillus pumilus ВКПМ В-12182.
3
3
Продуктивность непрерывного процесса при указанных параметрах составляет 2500 МЕ/смч (у ближайшего аналога известный штамм Streptococcus lactis показал продуктивность 1440-1680 МЕ/смч).
По окончании культивирования биомассу отделяют от питательной среды центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 мин.
Затем концентрируют культуральную жидкость на полых волокнах, отсекающих вещества с молекулярной массой более 15 кДа; перемешивают с сухим хлористым натрием (0,5 М) при скорости перемешивания 100 кач/мин в течение 20 мин; центрифугируют при 10000 об/мин в течение 15 мин.
Далее к осадку добавляют воду в объеме 0,1% от начального объема культуральной жидкости, суспендируют; промывают изопропиловым спиртом, взятом в объеме 0,1% от начального объема культуральной жидкости в течение 30 мин при температуре 0°С.
Полученную массу центрифугируют, выпаривают изопропанол на роторном испарителе при температуре 60°С. Далее выдерживают раствор с водой и активированным углем (0,5% w/v) в течение 15 мин, центрифугируют при 10000 об/мин в течение 15 мин; фильтруют через мембрану, отсекающую молекулы с молекулярной массой более 10 кДа. Полученные пептидные фракции объединяют и проводят их лиофилизацию при следующих параметрах: температура сушки 30°С, продолжительность сушки 6 ч, толщина слоя сушки 2 мм. Готовый продукт упаковывают и хранят при температуре -18°С в течение 12 месяцев.
Результаты определения антимикробной активности, физико-химических и биологических свойств полученной фракции представлены в таблицах 1-2.
Пример 2
Для выделения штаммов помидор тщательно промывают от земли и пыли дистиллированной водой, измельчают в стерильных условиях и вносят в количестве приблизительно 5 г в пробирки с 5 мл жидких питательных сред, либо небольшой кусочек сырья растирают по поверхности чашки с агаризованной питательной средой. Инкубируют чашки и пробирки стационарно в трех температурных режимах (30°С, 37°С и 4°С) в течение 1-5 суток.
Для первичного выделения микроорганизмов используют:
- молочную среду (МС) - стерильное обезжиренное молоко;
- бульон MRS по ISO 13721 (Whatman, Германия);
- сердечно-мозговой бульон (Bio-Rad Laboratories SAS, Франция);
- молочный агар, МА (БиоВитрум, Россия);
- рыбопептонный агар, РПА (БиоВитрум, Россия);
- агар MRS, МРСА (Panreac, Испания).
Из пробирок с видимым ростом микроорганизмов (помутнение или наличие молочного сгустка) и с суммарных газонов на чашках проводят истощающие рассевы. Выделенные микроорганизмы культивируют на агаризованных средах (РПА, МРСА и МА), клонируют до чистых культур и проводят микробиологический анализ культурально-морфологических, физиолого-биохимических и генетических свойств выделенных штаммов с последующим отбором наиболее активных штаммов микроорганизмов.
Штамм Bacillus endophyticus В-12181, наиболее активный из всех отобранных штаммов, исследуют как продуцент бактериоцина в процессе управляемого культивирования.
Штамм Bacillus endophyticus В-12181 - продуцент бактериоцина -характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки.
Штамм представляет собой грамположительные подвижные за счет наличия перетрихиальных жгутиков палочки размером 0,5-2,5×1,2-10 мкм, образующие споры. Расположение клеток от одиночных до длинных цепочек.
Культуральные признаки.
Штамм образует плоские матовые мелкозернистые колонии округлой формы белого цвета с ровным краем и гладкой поверхностью. Биохимические признаки.
Штамм растет в аэробных условиях в молоке при температурах 30°С, 37°С и 45°С, в бульоне MRS при температуре 37°С, растет на агаризованных средах: молочном агаре, MRS-агаре.
Антагонистическая активность.
Штамм проявляет in vitro выраженную антагонистическую активность против некоторых грамположительных патогенов: Leuconostoc mesenteroides, Arthrobacter cumminsii.
В результате проведения генетической идентификации штамма он депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика, находящейся по адресу: 117545, Россия, г. Москва, 1-ый Дорожный проезд, д. 1: Bacillus endophyticus, регистрационный номер ВКПМ В-12181 от 18.04.2015.
Данная культура микроорганизмов хранится в сублимационно-высушенном состоянии в ампулах при температуре 4±2°С не менее 24 месяцев.
Для получения фракции бактериоцина выделенный и сублимированный штамм Bacillus endophyticus ВКПМ В-12181 восстанавливают путем переноса содержимого ампул в пробирки с питательной средой МПБ, г/л: панкреатический гидролизат рыбной муки - 12; хлорид натрия - 6; пептон ферментативный - 12. Посевы инкубируют при температуре 30°С. После восстановления культуры ее выращивают на питательном агаре МПА. Затем инокулят вносят в ферментационную среду (MRS-бульон) в количестве 5%.
7
Далее осуществляют процесс ферментации в непрерывных условиях при температуре 30°С в течение 12-24 ч до достижения концентраций 1,5⋅10 КОЕ/мл.
3
3
Продуктивность непрерывного процесса при указанных параметрах составляет 2500 МЕ/смч (у ближайшего аналога известный штамм Streptococcus lactis показал продуктивность 1440-1680 МЕ/смч).
По окончании культивирования биомассу отделяют от питательной среды центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 мин.
Затем концентрируют культуральную жидкость на полых волокнах, отсекающих вещества с молекулярной массой более 15 кДа; перемешивают с сухим хлористым натрием (0,5 М) при скорости перемешивания 100 кач/мин в течение 20 мин; центрифугируют при 10000 об/мин в течение 15 мин.
Далее к осадку добавляют воду в объеме 0,1% от начального объема культуральной жидкости, суспендируют; промывают изопропиловым спиртом, взятом в объеме 0,1% от начального объема культуральной жидкости в течение 30 мин при температуре 0°С.
Полученную массу центрифугируют, выпаривают изопропанол на роторном испарителе при температуре 60°С. Далее выдерживают раствор с водой и активированным углем (0,5% w/v) в течение 15 мин, центрифугируют при 10000 об/мин в течение 15 мин; фильтруют через мембрану, отсекающую молекулы с молекулярной массой более 10 кДа. Проводят лиофилизацию полученной пептидной фракции при следующих параметрах: температура сушки 30°С, продолжительность сушки 6 ч, толщина слоя сушки 2 мм. Готовый продукт упаковывают и хранят при температуре -18°С в течение 12 месяцев.
Результаты определения антимикробной активности, физико-химических и биологических свойств полученной фракции представлены в таблицах 1-2.
Пример 3
Для выделения штаммов болгарский перец тщательно промывают от земли и пыли дистиллированной водой, измельчают в стерильных условиях и вносят в количестве приблизительно 5 г в пробирки с 5 мл жидких питательных сред, либо небольшой кусочек сырья растирают по поверхности чашки с агаризованной питательной средой. Инкубируют чашки и пробирки стационарно в трех температурных режимах (30°С, 37°С и 4°С) в течение 1-5 суток.
Для первичного выделения микроорганизмов используют:
- молочную среду (МС) - стерильное обезжиренное молоко;
- бульон MRS по ISO 13721 (Whatman, Германия);
- сердечно-мозговой бульон (Bio-Rad Laboratories SAS, Франция);
- молочный агар, МА (БиоВитрум, Россия);
- рыбопептонный агар, РПА (БиоВитрум, Россия);
- агар MRS, МРСА (Panreac, Испания).
Из пробирок с видимым ростом микроорганизмов (помутнение или наличие молочного сгустка) и с суммарных газонов на чашках проводят истощающие рассевы. Выделенные микроорганизмы культивируют на агаризованных средах (РПА, МРСА и МА), клонируют до чистых культур и проводят микробиологический анализ культурально-морфологических, физиолого-биохимических и генетических свойств выделенных штаммов с последующим отбором наиболее активных штаммов микроорганизмов.
Штамм Bacillus licheniformis В-12224, наиболее активный из всех отобранных штаммов, исследуют как продуцент бактериоцина в процессе управляемого культивирования.
Штамм Bacillus licheniformis В-12224 - продуцент бактериоцина -характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки.
Штамм представляет собой грамположительные подвижные за счет наличия перетрихиальных жгутиков палочки размером 0,5-2,5×1,2-10 мкм, образующие споры. Расположение клеток от одиночных до длинных цепочек.
Культуральные признаки.
Штамм образует плоские матовые однородные колонии округлой формы телесного цвета с волнистым краем и гладкой поверхностью. Биохимические признаки.
Штамм растет в аэробных условиях в молоке, в бульоне MRS, в сердечно-мозговом бульоне при температурах 30°С и 37°С, растет на агаризованных средах: рыбопептонном агаре, молочном агаре, MRS-агаре.
Штамм ферментирует глицерол, L-арабинозу, рибозу, D-ксилозу, галактозу, D-глюкоза, D-фруктозу, D-манозу, рамнозу, манитол, N-ацетил-глюкозоамин, амигдалин, арбутин, эскулин, салицин, целлобиоза, мальтозу, лактозу, сахарозу, трегалозу, β-генцибиозу, глюконат.
Антагонистическая активность.
Штамм проявляет in vitro выраженную антагонистическую активность против некоторых грамположительных патогенов: Leuconostoc mesenteroides, Arthrobacter cumminsii.
В результате проведения генетической идентификации штамма он депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика, находящейся по адресу: 117545, Россия, г. Москва, 1-ый Дорожный проезд, д. 1: Bacillus licheniformis, регистрационный номер В-12224 от 17.06.2015.
Данная культура микроорганизмов хранится в сублимационно-высушенном состоянии в ампулах при температуре 4±2°С не менее 24 месяцев.
Для получения фракции бактериоцина выделенный и сублимированный штамм Bacillus licheniformis ВКПМ В-12224 восстанавливают путем переноса содержимого ампул в пробирки с питательной средой МПБ, г/л: панкреатический гидролизат рыбной муки - 12; хлорид натрия - 6; пептон ферментативный - 12. Посевы инкубируют при температуре 30°С. После восстановления культуры, ее выращивают на питательном агаре МПА. Затем инокулят вносят в ферментационную среду (MRS-бульон) в количестве 5%.
7
Далее осуществляют процесс ферментации в непрерывных условиях при температуре 30°С в течение 12-24 ч до достижения концентраций 1,5⋅10 КОЕ/мл.
3
3
Продуктивность непрерывного процесса при указанных параметрах составляет 2500 МЕ/смч (у ближайшего аналога известный штамм Streptococcus lactis показал продуктивность 1440-1680 МЕ/смч).
По окончании культивирования биомассу отделяют от питательной среды центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 мин.
Затем концентрируют культуральную жидкость на полых волокнах, отсекающих вещества с молекулярной массой более 15 кДа; перемешивают с сухим хлористым натрием (0,5 М) при скорости перемешивания 100 кач/мин в течение 20 мин; центрифугируют при 10000 об/мин в течение 15 мин. Далее к осадку добавляют воду в объеме 0,1% от начального объема культуральной жидкости, суспендируют; промывают изопропиловым спиртом, взятом в объеме 0,1% от начального объема культуральной жидкости в течение 30 мин при температуре 0°С.
Полученную массу центрифугируют, выпаривают изопропанол на роторном испарителе при температуре 60°С. Далее выдерживают раствор с водой и активированным углем (0,5% w/v) в течение 15 мин, центрифугируют при 10000 об/мин в течение 15 мин; фильтруют через мембрану, отсекающую молекулы с молекулярной массой более 10 кДа. Проводят лиофилизацию полученной пептидной фракции при следующих параметрах: температура сушки 30°С, продолжительность сушки 6 ч, толщина слоя сушки 2 мм. Готовый продукт упаковывают и хранят при температуре -18°С в течение 12 месяцев.
Результаты определения антимикробной активности, физико-химических и биологических свойств полученной фракции представлены в таблицах 1-2.
Из таблицы 1 следует, что метаболиты фракции обладают антимикробными свойствами. Данные таблицы 1 также свидетельствуют о том, что фракция активна только в отношении грамположительных бактерий.
Исходя из данных таблицы 2, выделенная фракция представляет собой пептид, состоящий из 33 аминокислот, имеющий молекулярную массу 3353 Да, хорошо растворимый в воде и мало растворимый в этаноле и эфире, проявляющий антимикробное действие только по отношению к грамположительным бактериям. Данная совокупность свойств свидетельствует о принадлежности выделенной фракции к низину.
Таким образом, использование штаммов (Bacillus safensis ВКПМ В-12180, Bacillus licheniformis ВКПМ В-12224, Bacillus pumilus ВКПМ В-12182, Bacillus endophyticus ВКПМ В-12181), выделенных с поверхности овощей, позволяет получать бактериоцины, в частности низин, с высокой продуктивностью и с широким спектром антимикробного действия.