СПОСОБ ОЦЕНКИ НАРУШЕНИЯ ОКСИГЕНАЦИИ ГЕМОГЛОБИНА В ЭРИТРОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БЕРЕМЕННЫХ НА ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ
METHOD FOR ASSESSING DISTURBED HAEMOGLOBIN OXYGENATION IN PERIPHERAL BLOOD ERYTHROCYTES OF PREGNANT WOMEN ON THEIR THIRD TRIMESTER OF PREGNANCY SUFFERING AGGRAVATED CYTOMEGALOVIRAL INFECTION

Расщепление глюкозы в пентозном цикле, характерном для эритроцитов, начинается с глюкозо-6-фосфата. Путь окисления глюкозо-6-фосфата называется прямым, поскольку не происходит предварительного расщепления на 2 молекулы триозы [1, 6].
Дальнейший путь утилизации глюкозо-6-фосфата протекает в эритроцитах с участием кофактора фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы - НАДФ, при этом НАДФ восстанавливается в НАДФ·Н [7]. В реакциях пентозного цикла происходит образование 2 молекул НАДФ·Н, которые в различных клетках могут участвовать в синтезе жирных кислот, холестерина и т.д.
Однако в эритроцитах важнейшая роль на долю НАДФ·Н выпадает в процессе регуляции оксигенации гемоглобина, поскольку от него зависит восстановительная функция метгемоглобина с помощью фермента метгемоглобин-редуктазы. В этом процессе НАДФ·Н выступает как переносчик электронов [2, 4].
Снижение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы подавляет выработку НАДФ·Н и опосредованный процесс восстановления метгемоглобина, снижая тем самым процесс оксигенации гемоглобина, что создает угрозу развития гемической анемии. В доступной литературе не освещается угнетающее действие цитомегаловирусной инфекции на подавление активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах периферической крови, приводящей к снижению НАДФ·Н, от чего угнетается оксигенация гемоглобина.
Цель, поставленная в данной работе, - показать, что обострение цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации резко снижает содержание в эритроцитах активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, что приводит к повышению уровня метгемоглобина и снижает его оксигенацию, создавая угрозу развития гемической анемии.
Заявленный способ имеет следующие приемы:
1. Обследовано 45 беременных на сроке гестации 20-22 недели в возрасте 18-25 лет с хронической цитомегаловирусной инфекцией (ЦМВИ) в стадии обострения (основная группа) и 15 беременных на тех же сроках гестации без патологии (контрольная группа). У беременных симптоматически ЦМВИ проявлялась в виде острого респираторного заболевания, сопровождающегося ринофарингитом. Клинический диагноз - обострение ЦМВИ - устанавливался при комплексном исследовании периферической крови на наличие IgM или четырехкратного и более нарастания титра антител IgG в парных сыворотках в динамике через 10 дней, индекса авидности - более 65%, а также ДНК ЦМВ. Исследования проводились с учетом требований Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с учетом человека» с поправками 2000 г. и правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г.
Верификация ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекса авидности осуществлялись методами ИФА на спектрофотометре «Stat Fax 2100» (USA) с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск); выявление ДНК ЦМВ методами ПЦР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).
2. Содержание метгемоглобина в эритроцитах периферической крови определяли спектрофотометрическим методом по Кушаковскому М.С. [2].
3. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах периферической крови беременных определялась следующим образом: гепаринизированную кровь, взятую у беременной в третьем триместре на фоне обострения цитомегаловирусной инфекции до титра 1:1600 в количестве 0,5 мл, помещали в 0,5 мл инкубационного раствора (1М глюкозо-6-фосфат - 0,4 мл; НАДФ - 4 мг/2 мл; pH - 7,5) [3]. Смешивали и помещали на 15 минут в термостат при 37°C. Затем каплю взвеси помещали на предметное стекло, слегка покачивая, чтобы она растеклась и слегка подсохла, после чего наносили глицерин-желатину и накрывали покровным стеклом.
4. Полученный препарат изучали с помощью цифрового микроскопа МТ (Япония) и по компьютерной программе «Scion Image» выполняли подсчет интенсивность реакции на глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу приходящуюся на 1 эритроцит (как среднюю на 100 обработанных эритроцитов).
5. Содержание оксигемоглобина определяли по методу Эвелина и Мэллой [5].
На основании полученных данных было установлено, что при обострении цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре беременности в эритроцитах периферической крови резко снижается до 15,0±0,8 усл.ед. активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Фиг.1), контроль - 55,0±0,75 усл.ед. (Фиг.2). Одновременно отмечено нарастание в эритроцитах периферической крови содержания метгемоглобина до 1,7±0,09% (контроль - 0,6±0,03%). На этом фоне отчетливо нарушается процесс оксигенации гемоглобина и составляет 90,0±1,3% (контроль - 96,5±1,5%), что создает угрозу формирования у беременных гипоксии.
На фигуре 1 изображена гистохимическая реакция на активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах периферической крови беременной на третьем триместре гестации при обострении цитомегаловирусной инфекции при титре антител к цитомегаловирусу 1:1600. Интенсивность реакции снижена до 15,0±0,8 усл.ед. Увеличение 10×90.
В эритроците в силу снижения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы подавляется восстановление НАДФ.
На фигуре 2 изображена гистохимическая реакция в эритроцитах периферической крови беременной на третьем триместре, не болевшей на протяжении всего периода гестации. Интенсивность реакции глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы - 55,0±0,75 усл.ед. Увеличение 10×90.
Литература
1. Воробьев А.И. Руководство по гематологии // М.: Изд. «Ньюдиамед», 2007. - С.1275.
2. Кушаковский М.С. Клинические формы повреждения гемоглобина // Лен. Отделение. - «Медицина». - 1968. - С.324.
3. Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов // Лабораторные методы. М.: Изд. «Ньюдиамед», - 2007. - С.259.
4. Новицкий В.В., Сопрыкина Э.В. и др. Механизмы повреждения эритроцитов при токсическом действии метгемоглобинообразователей // Бюллетень Сибирской медицины. - 2006. - №1. - С.32-37.
5. Покровский А.А. Биохимические методы исследования // справочник М.: «Медицина», 1969. - С.337.
6. Федоров Н.А. Нормальное кроветворение и его регуляция // М.: - «Медицина». - 1976. - С.543.
7. Энгельгардт В.А., Саков Н.Е. О механизме пастеровского эффекта // «Биохимия». - 1943. - Т.8. - С.9-12.