Способ для прогнозирования метастазирования рака яичников на основе группы генов микроРНК
METHOD FOR FORECASTING METASTASIS OF OVARIAN CANCER BASED ON MICRORNA GENE GROUP

Системы маркеров на основе группы генов микроРНК для диагностики рака яичников и прогнозирования метастазирования
Настоящее изобретение относится к области биомедицины, в частности молекулярной и клинической онкологии и молекулярной биологии, и касается системы маркеров для диагностики рака яичников путем оценки статуса метилирования генов микроРНК (miR-124a-3, miR-129-2, miR-193a и miR-107, система №1), а также системы маркеров для прогнозирования метастазирования (miR-137, miR-193a, miR-1258, miR-203 и miR-127, система №2).
Выявление метилирования по крайней мере одного гена из заявленной системы маркеров №1 в предположительно пораженной раком ткани человека, по сравнению со здоровой тканью яичников служит диагностическим признаком рака яичников. Для прогноза метастазирования требуется выявление метилирования, по крайней мере, 3-х генов из заявленной системы маркеров №2 в пораженной раком ткани человека. Заявленная система маркеров на основе генов микроРНК, система №1, позволяет с высокой чувствительность и специфичностью диагностировать рак яичников. Заявленная система маркеров №2 позволяет с высокой чувствительность и специфичностью прогнозировать наличие метастазов в лимфатических узлах и/или других тканях пациентки.
Рак яичников - наиболее летальный среди онкогинекологических злокачественных опухолей женщин [1, 2]. Более 70% случаев рака яичников выявляют на поздних стадиях, и уровень 5-летней выживаемости в среднем составляет 30%. При выявлении опухолей яичников на I-II клинических стадиях уровень 5-летней выживаемости достигает 70-90% [1, 2]. Однако на ранних стадиях этот вид рака выявляются только в 20% случаев. Главная причина этих проблем - отсутствие методов ранней диагностики. Кроме того, рак яичников отличает высокий метастатический и инвазивный потенциал, причем метастазирование повышает множественную лекарственную устойчивость и резко снижает выживаемость пациенток. Эпигенетические маркеры, включая метилирование онко-супрессорных генов и профили экспрессии и метилирования микроРНК перспективны в диагностике и прогнозе течения рака, в частности рака яичников [3, 4]. Изменение уровня экспрессии некоторых генов, кодирующих белки или микроРНК, и метилирование CpG-островков промоторной области таких генов могут служить признаком наличия злокачественной опухоли или предсказания о возникновении рака, а также о возможном метастазировании, которое резко усугубляет заболевание.
Отбор генов микроРНК, связанных с развитием опухолей и ассоциированных с CpG-островками, проводили с привлечением алгоритмов, содержащихся в базе данных miRWalk 2.0 (http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/index.html), и CpGcluster (http://bioinfo2.ugr.es/CpGcluster/).
Оценка статуса метилирования генов: miR-124a-3, miR-129-2, miR-193a и miR-107 в 54 образцах рака яичников и в 18 образцах яичников от пост-мортальных женщин без онкопатологии в анамнезе позволила на их основе составить систему маркеров (система №1) для диагностики этого заболевания. Оценка статуса метилирования генов: miR-137, miR-193a, miR-1258, miR-203 и miR-127, в группе из 17 образцов метастазирующего и 37 образцов неметастазирующего рака яичников позволила составить систему маркеров (система №2) для прогнозирования метастазирования. Сведений о выявлении метилирования 7 генов, вошедших в системы №1 и №2, а именно, miR-124a-3, miR-193a, miR-107, miR-137, miR-1258, miR-203 и miR-127, - при раке яичников в источниках информации не обнаружено. Гиперметилирование miR-129-2 при раке молочной железы и яичников изучено ранее на меньшей выборке образцов и приведено в нашей статье [5].
Ранее в патенте США (U.S. Pat. No. 7,507,536 (2009)) был предложен набор генов (TM4SF11, TNFRSF10B, RUNX3, ACTN1, FANCG) для диагностики и прогноза рака яичников [6]. Выявление метилирования хотя бы в одном маркере этой группы генов рассматривается как идентификация раковой клетки или выявление предрасположенности к возникновению рака яичников. Значения клинической чувствительности и специфичности для данной системы не приведены.
В качестве ближайшего аналога рассмотрим патент США (U.S. Pat. No. 9,410,956 (2016)) [7]. В этом патенте описаны маркеры для идентификации рака яичников и предсказания клинической картины заболевания, основанные на анализе изменений экспрессии группы генов микроРНК. Аберрантная экспрессия 4 микроРНК (miR-214, -199а*, -200а и -100) была детектирована прибл. в половине или более случаев рака яичников, преимущественно на поздних стадиях и при высокой степени анаплазии. Значения клинической чувствительности и специфичности для данной системы не приведены.
Задача заявляемой группы изобретений - расширить арсенал маркеров на основе генов микроРНК для диагностики рака яичников и предсказания наличия метастазирования.
Задача решена путем:
- разработки системы маркеров №1 на основе группы 4 генов микроРНК: miR-124-3, miR-129-2, miR-193a и miR-107 - для диагностики рака яичников, путем выявления метилирования, по крайней мере, у одного гена из этой группы.
- разработки системы маркеров №2 на основе группы из 5 генов микроРНК: miR-137, miR-193а, miR-1258, miR-203 и miR-127 - для прогнозирования метастазирования рака яичников, путем выявления метилирования у каких-либо трех генов из этой группы.
Диагностику рака яичников и прогноз метастазирования осуществляют по методу:
Берут образцы ткани яичников у лиц, обследуемых для выявления онкологического заболевания или с установленным диагнозом. Выделение и очистку ДНК из образцов ткани яичников проводят методом фенол-хлороформенной экстракции. Качество и точную концентрацию ДНК определяют спектрофотометрически по соотношению оптической плотности при длинах волн 260 и 280 нм. Далее проводят бисульфитную конверсию ДНК с последующей метилспецифичной ПЦР (МС-ПЦР) [5]. Для анализа метилирования каждой микроРНК методом МС-ПЦР используют две пары праймеров, специфичных как к метилированному, так и к неметилированному аллелю (Таблица 1). Продукты МС-ПЦР, представляющие собой фрагменты ДНК, разделяют электрофорезом в 2% агарозном геле, либо в 10% полиакриламидном геле (при длине продукта ПЦР менее 160 н.п.). Далее анализируют на наличие или отсутствие продуктов МС-ПЦР для праймеров, специфичных к метилированному и неметилированному аллелю. В качестве контролей для неметилированных аллелей используют коммерческий препарат ДНК #G1471 (Promega, США). В качестве позитивного контроля 100%-ого метилирования используют коммерческий препарат ДНК #SD1131 (Thermo Scientific, США) Соответствие фрагментов МС-ПЦР исследуемым генам проверяют прямым секвенированием обеих цепей продуктов МС-ПЦР. Диагностику рака яичников осуществляют по наличию метилирования по крайней мере у одного маркера системы №1. Прогноз метастазирования рака яичников осуществляют по наличию метилирования по крайней мере у трех маркеров системы №2.
Пример 1. Анализ метилирования генов микроРНК, используемых в заявляемой системе №1 для диагностики рака яичников и в заявляемой системе №2 для прогноза рака яичников, в образцах опухолей и онкологически здоровых тканях яичников.
4
2
4
2
отж
Для диагностики отобраны 4 гена (система №1), для прогноза метастазирования - 5 генов (система №2), в сумме отобраны 8 маркеров. Для 8 исследуемых генов микроРНК метил-специфичную ПЦР (МС-ПЦР) проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 67 мМ Трис-HCl, рН 8.8, 16,7 мМ (NH)SO, 0.01% Tween-20; 1,5 мМ MgCl, 0.25 мМ каждого dNTP; 10-20 нг ДНК; 25 пмолей каждого праймера; 0,5 ед. Hot Start Taq ДНК полимеразы («СибЭнзим», Новосибирск). Амплификацию проводили по программе: 95°С, 5 мин; 35 циклов {95°С, 10 с; Т (см. Табл. 1), 20 с; 72°С, 30 с}; 72°С, 3 мин. ПЦР проводили на амплификаторе DNA Engine Dyad Cycler фирмы Bio-Rad (США). Праймеры, температура отжига и размер продуктов МС-ПЦР приведены в Таблице 1.
Для 54 пациентов с морфологически установленным диагнозом - эпителиальные опухоли яичников и 18 доноров, онкологически здоровых в анамнезе, проведен анализ метилирования заявляемой системы маркеров №1. Данные по клинико-гистологической характеристики образцов рака яичников и по метилированию маркеров: miR-124a-3, miR-129-2, miR-193a и miR-107 (система №1) и miR-137, miR-193a, miR-1258, miR-203 и miR-127 (система №2) приведены в качестве примера для 14 образцов опухолей (Таблица 2). Данные по метилированию 4 маркеров заявляемой системы 1 для диагностики рака яичников приведены для 18 доноров в Таблице 3. Сопоставление данных по метилированию маркеров системы №1 в образцах опухолей и доноров позволило показать применимость этой системы для диагностики рака яичников с высокой чувствительностью и специфичностью (см. пример 2).
Пример 2. Оценка чувствительности и специфичности заявляемой системы маркеров №1 (miR-124a-3, miR-129-2, miR-193a и miR-107) для диагностики рака яичников.
Важным свойством заявляемой системы маркеров №1 является высокая клиническая чувствительность и специфичность при диагностике рака яичников. Так как метилирование 4 маркеров системы №1 не выявлено ни в одном из 18 исследованных образцов доноров (таблица 3), можно утверждать о возможности использовать заявляемую систему маркеров №1 для диагностики рака яичников со 100%-специфичностью. Наличие метилирования по крайней мере у одного маркера системы №1 выявлено у 47 из 54 пациенток с раком яичников (87%» случаев). В соответствии с этими данными клиническая чувствительность и специфичность заявляемой системы маркеров №1 (для диагностики рака яичников), рассчитанная методом ROC-анализа, составляют 87% и 100%, соответственно, AUC - 0,936. Таким образом, заявляемая система маркеров позволяет диагностировать рак яичников у пациенток истинно больных данным онкологическим заболеванием с высокой (в 87% случаев) клинической чувствительностью и строго специфично. Анализ системы №1 (для диагностики рака яичников) методом ROC-анализа показан на Фигуре 1. Согласно параметрам, оценивающим систему, достаточно выявления метилирования хотя бы одного из 4 маркеров данной системы для диагностирования злокачественных опухолей яичников у пациентки.
Пример 3. Оценка чувствительности и специфичности заявляемой системы маркеров №2 (miR-137, miR-193a, miR-1258, miR-203 и miR-127) для предсказания метастазирования рака яичников.
В соответствии с данными по клинико-гистологической характеристике 54 образца рака яичников разбили на две группы: без метастазирования - 37 образцов, с выявленным метастазированием в региональных лимфатических узлах или удаленных органах - 17 образцов. В табл. 2 в качестве примеров приведены данные по метилированию для 7 образцов без метастазирования и 7 образцов с метастазированием. Система маркеров №2 (miR-137, miR-193a, miR-1258, miR-203 и miR-127) позволяет различить уровень метилирования в этих двух группах и прогнозировать метастазирование у пациентки с высокой клинической чувствительностью 94% и специфичностью 81%, AUC - 0,892. Надежность системы определена методом ROC-анализа (Фигура 2). Согласно характеристикам данной системы, для предсказания метастазирования необходимо установление метилирования 3 из 5 маркеров (miR-137, miR-193a, miR-1258, miR-203 и miR-127) данной системы.
Заявляемые системы маркеров для диагностики рака яичников (система №1) и для прогноза метастазирования рака яичников (система №2) характеризуются тем, что
1. Система №1 позволяет диагностировать рак яичников с высокой клинической чувствительностью 87% и 100%-специфичностью; в источниках информации не обнаружено аналогичных систем с охарактеризованной чувствительностью и специфичностью.
2. Система №2 позволяет прогнозировать наличие или развитие метастазов у пациентов с раком яичников с высокой клинической чувствительностью 94% и специфичностью 81%; в источниках информации не обнаружено аналогичных систем с охарактеризованной чувствительностью и специфичностью.
Литература
1. Engelberth, S.A., Hempel, N., and Bergkvist, M. (2014) Development of nanoscale approaches for ovarian cancer therapeutics and diagnostics, Crit. Rev. Oncog., 19, 281-315.
2. Coward, J.I., Middleton, K. and Murphy, F. (2015) New perspectives on targeted therapy in ovarian cancer, Int. J. Womens Health, 7,189-203.
3. Kinose, Y., Sawada, K., Nakamura, K., and Kimura, T. (2014) The role of microRNAs in ovarian cancer, Biomed. Res. Int., 2014: 249393.
4. Dong, A., Lu, Y., Lu, B. (2016) Genomic/Epigenomic Alterations in ovarian carcinoma: translational insight into clinical practice, J. Cancer, 7, 1441-1451.
5. Pronina I.V., Loginov V.I., Burdennyy A.M., Fridman M.V., Kazubskaya T.P., Dmitriev A.A., Braga E.A. (2016) Expression and DNA methylation alterations of seven cancer-associated 3p genes and their predicted regulator miRNAs (miR-129-2, miR-9-1) in breast and ovarian cancers. Gene. 576(1 Pt 3): 483-491.
6. U.S. Pat. No. 7,507,536 (2009) Van Criekinge et al. Methylation markers for diagnosis and treatment of ovarian cancer.
7. U.S. Pat. No. 9,410,956 (2016) Cheng; Jin Q. Micro-RNA profiling in ovarian cancer.