ИММУНОИНДУЦИРУЮЩЕЕ СРЕДСТВО
IMMUNE-INDUCING AGENT

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0001]
Настоящее изобретение относится к новому иммуноиндуцирующему средству, применимому в качестве терапевтического и/или профилактического средства в случае злокачественных новообразований и т.п.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002]
Злокачественные новообразования являются основной причиной смерти. В настоящее время основной формой лечения злокачественных опухолей является хирургическое лечение, осуществляемое в комбинации с лучевой терапией и химиотерапией. Несмотря на развитие новых способов хирургического лечения и открытия новых противоопухолевых средств за последние годы, исходы лечения злокачественных новообразований все равно не улучшаются, за исключением случаев некоторых типов злокачественных новообразований. В последние годы, например, идентифицированы раковые антигены, распознаваемые цитотоксическими T-клетками, реактивными в отношении злокачественного новообразования, и гены, кодирующие раковые антигены, развивается молекулярная биология и онкоиммунология, и возрастают ожидания от антиген-специфической иммунотерапии.
[0003]
in vivo
Акцессорный белок 2 рецептора меланокортина 2 (MRAP2) является трансмембранным белком типа 1 или типа 2 и участвует в контроле активности и функционирования рецептора меланокортина (MCR) в энергетическом обмене (непатентный источник 1). Кроме того, сообщают, что у мышей с недостаточностью MRAP2 развивается ожирение несмотря на отсутствие переедания, а также сообщают, что некоторые пациенты-люди с тяжелым ожирением имеют мутацию в гене MRAP2 (непатентный источник 2). Однако не сообщают о том, что белок MRAP2 имеет иммуноиндуцирующую активность против злокачественных клеток и, таким образом, применим для лечения и профилактики злокачественных новообразований.
ССЫЛКИ
НЕПАТЕНТНЫЕ ИСТОЧНИКИ
[0004]
Непатентный источник 1: Jackson DS. et al. Front. Neurosci, 9:213(2015)
Непатентный источник 2: Asai M. et al. Science, 341:275-278(2013)
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ЗАДАЧА, ПОДЛЕЖАЩАЯ РЕШЕНИЮ ПОСРЕДСТВОМ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0005]
Целью настоящего изобретения является обнаружение нового полипептида, применимого в качестве терапевтического и/или профилактического средства в случае злокачественных новообразований и т.п., и применение такого полипептида в качестве иммуноиндуцирующего средства.
СРЕДСТВА РЕШЕНИЯ ЗАДАЧИ
[0006]
in vivo
in vivo
Авторы настоящего изобретения осуществляли интенсивные исследования и в результате получали кДНК, кодирующую белок, связывающийся с антителом, присутствующим в сыворотках живых организмов, несущих злокачественные новообразования, способом SEREX с использованием библиотеки кДНК, полученной из яичек собак вместе с сыворотками собак с лейкозом. Основываясь на кДНК, авторы настоящего изобретения получали полипептид акцессорного белка 2 рецептора меланокортина 2 собаки (обозначенного в настоящем описании как MRAP2), имеющего аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 4. Кроме того, основываясь на гомологичных генах человека, кошки и мыши для полученного гена собаки, авторы настоящего изобретения получали полипептиды MRAP2 человека, кошки и мыши, имеющие аминокислотные последовательности, представленные как SEQ ID NO: 2, 6 и 8. Авторы настоящего изобретения обнаруживали, что эти полипептиды MRAP2 экспрессируются при лейкозах, злокачественной лимфоме, раке легких, опухолях головного мозга, раке толстой кишки, меланоме, нейробластоме, раке поджелудочной железы, раке желудка, раке печени, раке яичников, раке пищевода, раке почки, мастоцитоме и перианальной аденокарциноме. Кроме того, авторы настоящего изобретения дополнительно обнаруживали, что иммунные клетки против MRAP2 можно индуцировать  посредством введения этих MRAP2 в живые организмы и можно снижать размер опухоли в живых организмах, в которых экспрессируется MRAP2. Кроме того, они обнаруживали, что рекомбинантный вектор, способный экспрессировать полинуклеотид, кодирующий полипептид MRAP2 или его фрагмент, вызывает противоопухолевый эффект в отношении MRAP2-экспрессирующего злокачественного новообразования .
[0007]
Авторы настоящего изобретения также обнаруживали, что полипептид MRAP2 презентируется антигенпрезентирующими клетками и обладает способностью (также обозначаемой как "иммуноиндуцирующая активность") активировать и способствовать пролиферации цитотоксических T-клеток, специфических для полипептида; что полипептид применим для лечения и/или профилактики злокачественных новообразований из-за этой способности; и что антигенпрезентирующая клетка, находившаяся в контакте с полипептидом, и T-клетка, находившаяся в контакте с антигенпрезентирующей клеткой, применимы для лечения и/или профилактики злокачественных новообразований. Учитывая эти результаты, осуществляли настоящее изобретение.
[0008]
Таким образом, настоящее изобретение включает следующие аспекты:
in vivo
(1) Иммуноиндуцирующее средство содержащее в качестве активного ингредиента по меньшей мере один полипептид, имеющий иммуноиндуцирующую активность и выбранный из группы, состоящей из следующих полипептидов (a)-(d), или рекомбинантный вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий полипептид и способный экспрессировать указанный полипептид :
(a) полипептид, состоящий из 7 последовательных аминокислот или полноразмерной последовательности в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8 в списке последовательностей;
(b) полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, полученной посредством делеции, замены или добавления одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8 в списке последовательностей;
(c) полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей идентичность последовательности 90% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8 в списке последовательностей;
(d) полипептид, содержащий любой из полипептидов (a)-(c) в качестве частичной последовательности.
(2) Иммуноиндуцирующее средство по п. (1), являющееся средством для обработки антигенпрезентирующих клеток.
(3) Иммуноиндуцирующее средство по п. (1), являющееся активным ингредиентом для терапевтического и/или профилактического средства в случае злокачественного новообразования.
(4) Иммуноиндуцирующее средство по п. (3), где злокачественное новообразование является MRAP2-экспрессирующим злокачественным новообразованием.
(5) Иммуноиндуцирующее средство по п. (3) или (4), где злокачественное новообразование является лейкозом, злокачественной лимфомой, раком легких, опухолью головного мозга, раком толстой кишки, меланомой, нейробластомой, раком поджелудочной железы, раком желудка, раком печени, раком яичников, раком пищевода, раком почки, мастоцитомой или перианальной аденокарциномой.
(6) Иммуноиндуцирующее средство по любому из пп. (1)-(5), дополнительно содержащее иммуностимулятор.
(7) Иммуноиндуцирующее средство по п. (6), где иммуностимулятор является по меньшей мере одним иммуностимулятором, выбранным из группы, состоящей из неполного адъюванта Фрейнда, монтанида, поли-IC и его производных, CpG-олигонуклеотидов, интерлейкина-12, интерлейкина-18, интерферона-α, интерферонв-β, интерферона-ω, интерферона-γ и лиганда Flt 3.
ex vivo
in vitro
(8) Способ получения антигенпрезентирующей клетки, содержащей комплекс полипептида по п. (1) и молекулы MHC, включающий приведение полипептида в контакт с антигенпрезентирующей клеткой индивидуума  или .
(9) Способ по п. (8), где антигенпрезентирующая клетка является дендритной клеткой или B-клеткой, имеющей молекулу MHC класса I.
ex vivo
in vitro
(10) Способ получения цитотоксической T-клетки, специфической для полипептида по п. (1), включающий приведение антигенпрезентирующей клетки, полученной способом по п. (8) или (9), в контакт с T-клеткой индивидуума  или  и, таким образом, активацию T-клетки.
in vivo
(11) Способ индуцирования иммунитета, включающий введение индивидууму по меньшей мере одного полипептида, имеющего иммуноиндуцирующую активность и выбранного из следующих полипептидов (a)-(d), или рекомбинантного вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий полипептид, и способного экспрессировать указанный полипептид :
(a) полипептид, состоящий из 7 или более последовательных аминокислот или полноразмерной последовательности в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8 в списке последовательностей;
(b) полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, полученной посредством делеции, замены или добавления одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8 в списке последовательностей;
(c) полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей идентичность последовательности 90% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8 в списке последовательностей;
(d) полипептид, содержащий любой из полипептидов (a)-(c) в качестве частичной последовательности.
По настоящей заявке испрашивается приоритет по патентной заявке JP № 2016-064032, зарегистрированной 28 марта 2016 года, она включает содержимое, представленное в описании патентной заявки.
ПОЛЕЗНЫЕ ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0009]
Настоящее изобретение относится к новому иммуноиндуцирующему средству, применимому для лечения и/или профилактики злокачественных новообразований и т.п. Если полипептид, используемый в изобретении, вводят индивидууму, можно индуцировать иммунные клетки в живом организме и можно снижать размер уже существующего злокачественного новообразования или регрессировать его, как конкретно представлено в описываемых ниже примерах. Таким образом, полипептид применим для лечения и профилактики злокачественных новообразований.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0010]
[Фиг. 1] На фигуре представлен профиль экспрессии идентифицированного гена MRAP2 в опухолевых тканях собак. Под №1 представлен профиль экспрессии гена MRAP2 собаки в отдельных опухолевых тканях собак.
[Фиг. 2] На фигуре представлен профиль экспрессии идентифицированного гена MRAP2 в отдельных тканях и линиях злокачественных клеток человека. Под №2 представлен профиль экспрессии гена MRAP2 человека в отдельных нормальных тканях человека; и под №3 представлен профиль экспрессии гена MRAP2 человека в отдельных линиях злокачественных клеток человека. На фигуре PBMC представляют собой мононуклеарные клетки периферической крови.
[Фиг. 3] На фигуре представлен профиль экспрессии идентифицированного гена MRAP2 в отдельных линиях злокачественных клеток мыши. Под №4 представлен профиль экспрессии гена MRAP2 мыши в отдельных линиях злокачественных клеток мыши.
ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0011]
1.Полипептид
В качестве полипептида, содержащегося в качестве активного ингредиента в иммуноиндуцирующем средстве по настоящему изобретению, включены полипептиды (a)-(d). В настоящем описании термин "полипептид" относится к молекуле, образованной множеством аминокислот, соединенных пептидной связью, и включает не только молекулу полипептида, состоящую из большого количества аминокислот, но также и низкомолекулярную молекулу (т.е. олигопептид), состоящую из небольшого количества аминокислот, или полноразмерный белок.
(a) Полипептид, состоящий из 7 или более последовательных аминокислот или полноразмерной последовательности в полипептиде, имеющем аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8 в списке последовательностей, и имеющем иммуноиндуцирующую активность;
(b) полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, полученной посредством делеции, замены или добавления одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8 в списке последовательностей, и имеющей иммуноиндуцирующую активность;
(c) полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей идентичность последовательности 90% или более по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8 в списке последовательностей, и имеющей иммуноиндуцирующую активность;
(d) полипептид, содержащий любой из полипептидов (a)-(c) в качестве частичной последовательности и имеющий иммуноиндуцирующую активность.
[0012]
В настоящем описании фраза "имеющий аминокислотную последовательность" означает, что аминокислотные остатки выровнены в порядке, представленном в последовательности. Таким образом, например, термин "полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8" относится к полипептиду, имеющему размер 207 аминокислотных остатков и состоящему из аминокислотной последовательности Met, Glu, Met, Ser, Ala. (пропуск). Ile, Asp, Leu и Asp, представленной в SEQ ID NO: 8. "Полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8" иногда просто обозначают как, например, "полипептид SEQ ID NO: 8". То же применимо к выражению "имеющий нуклеотидную последовательность". Во фразе термин "имеющий" можно заменять термином "состоящий из".
[0013]
В настоящем описании термин "иммуноиндуцирующая активность" относится к способности индуцировать иммунные клетки, секретирующие цитокины, такие как интерферон, в живом организме.
[0014]
То, имеет ли указанный выше полипептид иммуноиндуцирующую активность или нет, можно подтверждать с использованием, например, анализа ELISpot, известного в этой области. Более конкретно, иммуноиндуцирующую активность можно оценивать следующим образом: получая клетки, подобные мононуклеарным клеткам периферической крови, из живого организма, в который вводили полипептид, подлежащий оценке на иммуноиндуцирующую активность, сокультивируя клетки с полипептидом и измеряя количество цитокина, продуцируемого клетками, с использованием специфического антитела, таким образом, определяя количество иммунных клеток среди клеток.
[0015]
in vivo
Как описано в примерах ниже, когда каждый из рекомбинантных полипептидов (a)-(d) вводят несущим злокачественные новообразования живым организмам, опухоли также можно регрессировать благодаря иммуноиндуцирующей активности полипептидов. Таким образом, иммуноиндуцирующую активность можно оценивать как способность супрессировать пролиферацию злокачественных клеток или снижать размер злокачественной ткани (опухоли) или устранять злокачественную ткань (опухоль) (далее в настоящем описании эту способность обозначают как "противоопухолевую активность"). Противоопухолевую активность полипептида можно подтверждать конкретно посредством введения полипептида несущим злокачественные новообразования живым организмам и исследования того, например, снижается ли размер опухоли или нет, например, как конкретно описано в примерах ниже. Альтернативно, противоопухолевую активность полипептида можно оценивать посредством исследования того, например, проявляет ли цитотоксическая T-клетка, индуцируемая посредством введения полипептида несущим злокачественные новообразования живым организмам, цитотоксическую активность в отношении опухоли. Цитотоксическую активность клетки можно определять посредством введения антитела, приводящего к удалению T-клетки из живого организма, исследования того, снижается ли размер опухоли таким образом. Однако способ определения цитотоксической активности не ограничен способами, указанными выше.
[0016]
in vitro
51
Альтернативно, противоопухолевую активность полипептидов можно оценивать посредством исследования того, проявляют ли T-клетки, стимулированные полипептидами (более конкретно, T-клетки, приведенные в контакт с антигенпрезентирующими клетками, презентирующими полипептиды) цитотоксическую активность против опухолевых клеток или нет. T-клетки и антигенпрезентирующие клетки можно приводить в контакт друг с другом посредством сокультивирования клеток в жидкой среде, как описано ниже. Цитотоксическую активность можно измерять известным способом, названным анализом высвобождения Cr, например, описанным в Int. J. Cancer, 58: p.317, 1994. Если указанные выше полипептиды используют для лечения и/или профилактики злокачественных новообразований, иммуноиндуцирующую активность, предпочтительно, оценивают с использованием противоопухолевой активности в качестве индикатора, хотя такая оценка, в частности, не ограничена.
[0017]
В настоящем описании аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 2, 4, 6 и 8, соответственно, как описано в списке последовательностей, являются аминокислотными последовательностями MRAP2, выделенными как полипептиды, связывающиеся с антителами, конкретно присутствующими в сыворотках, полученных из несущих злокачественные новообразования собак, способом SEREX с использованием библиотеки кДНК, полученной из яичек собак и сывороток несущих злокачественные новообразования собак, и как гомологи человека, кошки и мыши (см. пример 1). MRAP2 человека, являющийся гомологом MRAP2 собаки у человека, имеет идентичность нуклеотидной последовательности 91% и идентичность аминокислотных последовательностей 94%. MRAP2 кошки, являющийся гомологом у кошки, имеет идентичность нуклеотидной последовательности 95% и идентичность аминокислотных последовательностей 96%. MRAP2 мыши, являющийся гомологом у мыши, имеет идентичность нуклеотидной последовательности 84% и идентичность аминокислотных последовательностей 88%.
[0018]
Полипептид по п. (a) выше является полипептидом, состоящим из 7 или более последовательных аминокислот, предпочтительно - 8, 9 или 10 или более последовательных аминокислот в полипептиде, имеющем аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8, и имеющем иммуноиндуцирующую активность. Особенно предпочтительно, полипептид имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8. Как известно в этой области, если полипептид содержит приблизительно 7 или более аминокислотных остатков, то полипептид может проявлять антигенность и иммуногенность. В связи с этим, если полипептид состоит из 7 или более последовательных аминокислотных остатков или всех аминокислотных остатков (полноразмерная последовательность) в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8, он может обладать иммуноиндуцирующей активностью и, таким образом, его можно использовать для получения иммуноиндуцирующего средства по настоящему изобретению.
[0019]
В качестве принципа индукции иммунитета посредством введения ракового антигенного полипептида известен следующий способ: полипептид встраивают в антигенпрезентирующую клетку, а затем он деградирует до фрагмента меньшего размера под действием пептидазы в клетке с последующей презентацией фрагмента на поверхности клетки. Фрагмент распознается цитотоксической T-клеткой или т.п., селективно уничтожающей клетки, презентирующие антиген. Размер полипептида, презентируемого на поверхности антигенпрезентирующей клетки, является относительно небольшим и составляет приблизительно от 7 до 30 аминокислот. Таким образом, с точки зрения презентирования полипептида на поверхности антигенпрезентирующей клетки, одним из предпочтительных вариантов осуществления описанного выше полипептида (a) является полипептид, состоящий из приблизительно от 7 до 30 последовательных аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, 4, 6 или 8, и более предпочтительно, полипептид, состоящий из приблизительно от 8 до 30 или приблизительно от 9 до 30 аминокислот, является достаточным в качестве полипептида (a). В некоторых случаях эти относительно небольшие полипептиды презентируются непосредственно на поверхности антигенпрезентирующей клетки без встраивания в антигенпрезентирующие клетки.
[0020]
Кроме того, т.к. полипептид, встроенный в антигенпрезентирующую клетку, расщепляется пептидазами в клетке по случайным участкам с образованием различных полипептидных фрагментов, затем презентируемых на поверхности антигенпрезентирующей клетки, введение крупного полипептида, такого как полноразмерная область SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8 неизбежно вызывает продукцию полипептидных фрагментов посредством деградации в антигенпрезентирующих клетках, при этом фрагменты эффективны в индуцировании иммунитета с помощью антигенпрезентирующей клетки. Таким образом, также в случае индуцирования иммунитета с помощью антигенпрезентирующих клеток, предпочтительно, можно использовать крупный полипептид, и полипептид может состоять не менее чем из 30, предпочтительно - не менее 100, более предпочтительно - не менее 200 аминокислот. Полипептид, более предпочтительно, может состоять из полноразмерной области SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8.
[0021]
Полипептид, описанный в (c) выше, является полипептидом, полученным посредством замены, делеции и/или инсерции небольшого количества (предпочтительно, одного или более) аминокислотных остатков в полипептиде, описанном в (a) выше, имеющем идентичность последовательности 90% или более, предпочтительно - 95% или более, более предпочтительно - 98% или более, еще более предпочтительно - 99% или более или 99,5% или более по отношению к исходной последовательности, и имеющем иммуноиндуцирующую активность. Как правило, специалистам в этой области хорошо известно, что белковый антиген, даже если он имеет замену, делецию или инсерцию небольшого количества аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности белка, может иметь, по существу, ту же антигенность, что и исходный белок. Таким образом, полипептид, определенный в (c) выше, может проявлять иммуноиндуцирующую активность, и, таким образом, его можно использовать в получении иммуноиндуцирующего средства по настоящему изобретению. Также предпочтительно, полипептид (b) является полипептидом, полученным посредством замены, делеции и/или инсерции одного или более аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, 4, 6 или 8. В настоящем описании, термин "несколько" относится к целому числу от 2 до 10, предпочтительно - от 2 до 6, и более предпочтительно - от 2 до 4.
[0022]
В настоящем описании термин "идентичность последовательности" аминокислотных последовательностей или нуклеотидных последовательностей означает значение, вычисляемое посредством выравнивания двух аминокислотных последовательностей (или нуклеотидных последовательностей), подлежащих сравнению, таким образом, что количество совпадающих аминокислотных остатков (или нуклеотидов) между аминокислотными последовательностями (или нуклеотидными последовательностями) является настолько большим, насколько это возможно, и деления количества совпадающих аминокислотных остатков (или количества совпадающих нуклеотидов) на общее количество аминокислотных остатков (или общее количество нуклеотидов), при этом значение представляют в виде процентной доли. При осуществлении выравнивания, при необходимости, пропуски включают в одну или обе из двух последовательностей, подлежащих сравнению. Такое выравнивание последовательностей можно осуществлять с использованием хорошо известной программы, такой как BLAST, FASTA или CLUSTAL W. При включении пропусков указанное выше общее количество аминокислотных остатков является количеством остатков, вычисленным посредством принятия одного пропуска за один аминокислотный остаток. Если подсчитанное таким образом общее количество аминокислотных остатков отличается между двумя последовательностями, подлежащими сравнению, идентичность последовательности (%) вычисляют, деля количество совпадающих аминокислотных остатков на общее количество аминокислотных остатков в более длинной последовательности.
[0023]
20 типов аминокислот, составляющих природные белки, можно классифицировать по группам, в каждой из которых аминокислоты обладают общими свойствами, например, нейтральные аминокислоты с боковыми цепями, имеющие низкую полярность (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro), нейтральные аминокислоты, имеющие гидрофильные боковые цепи (Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys), кислые аминокислоты (Asp, Glu), основные аминокислоты (Arg, Lys, His) и ароматические аминокислоты (Phe, Tyr, Trp). Известно, что в большинстве случаев замены аминокислот в одной группе не изменяют свойств полипептида. Таким образом, в случаях, когда аминокислотные остатки в полипептиде (a) по настоящему изобретению заменяют, вероятность того, что иммуноиндуцирующая активность может сохраняться, становится высокой при замене между аминокислотными остатками в каждой группе, и такая замена является предпочтительной.
[0024]
Полипептид (d) содержит любой из полипептидов (a)-c) в качестве частичной последовательности и имеет иммуноиндуцирующую активность. Т.е. полипептид (d) содержит другую аминокислоту или полипептид, добавленный на один конец или оба конца любого из полипептидов (a)-(c), и имеет иммуноиндуцирующую активность. Такой полипептид также можно использовать в получении иммуноиндуцирующего средства по настоящему изобретению.
[0025]
Описанные выше полипептиды можно синтезировать, например, способом химического синтеза, таким как способ Fmoc (фторенилметилоксикарбониловым способом) или способом tBoc (трет-бутилоксикарбониловым способом). Кроме того, их можно синтезировать общепринятыми способами с использованием различных типов коммерчески доступных пептидных синтезаторов. Кроме того, интересующий полипептид можно получать известными способами генетической инженерии, посредством получения полинуклеотида, кодирующего указанный выше полипептид, и встраивания полинуклеотида в экспрессирующий вектор, который затем встраивают в клетку-хозяина с последующей продукцией полипептида в клетке-хозяине.
[0026]
Полинуклеотид, кодирующий указанный выше полипептид, легко можно получать известным способом генетической инженерии или общепринятым способом с использованием коммерчески доступного синтезатора нуклеиновых кислот. Например, ДНК, имеющую нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, можно получать посредством осуществления ПЦР с использованием хромосомной ДНК собаки или библиотеки кДНК в качестве матрицы и пары праймеров, сконструированных таким образом, что нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, можно амплифицировать с использованием праймеров. ДНК, имеющую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, можно получать аналогичным образом с использованием хромосомной ДНК человека или библиотеки кДНК в качестве матрицы. Условия реакции ПЦР можно соответствующим образом устанавливать, и их неограничивающие примеры включают повторение реакции при 94°C в течение 30 секунд (денатурация), 55°C в течение от 30 секунд до 1 минуты (отжиг) и 72°C в течение 1 минут (элонгация) в качестве одного цикла в течение 30 циклов, например, с последующей реакцией при 72°C в течение 7 минут. Кроме того, желаемую ДНК можно выделять, получая подходящие зонды или праймеры с учетом информации о нуклеотидных последовательностях и аминокислотных последовательностях, представленных в SEQ ID NO: 1 и 3 в списке последовательностей, представленном в настоящем описании, и осуществляя скрининг библиотеки кДНК человека, собаки или т.п. с использованием зондов и праймеров. Библиотеку кДНК, предпочтительно, получают из клеток, органов или тканей, экспрессирующих белок SEQ ID NO: 2 или 4. Описанные выше действия, такие как получение зондов или праймеров, конструирование библиотеки кДНК, скрининг библиотеки кДНК и клонирование интересующего гена, известны специалистам в этой области, и их можно осуществлять способами, описанными в Molecular Cloning, Second Edition; Current Protocols in Molecular biology и/или т.п. Из полученной таким образом ДНК можно получать ДНК, кодирующую полипептид (a). Кроме того, т.к. кодоны, кодирующие каждую аминокислоту, известны, легко можно определять нуклеотидную последовательность полинуклеотида, кодирующего конкретную аминокислотную последовательность. Таким образом, т.к. легко можно определять нуклеотидную последовательность полинуклеотида, кодирующего полипептид (b)-(d), такой полинуклеотид также легко можно синтезировать с использованием коммерчески доступного синтезатора нуклеиновой кислоты общепринятым способом.
[0027]
E. coli
Xenopus laevis
Клетки-хозяева не ограничены при условии, что они могут экспрессировать описанный выше полипептид, и их неограничивающие примеры включают прокариотические клетки, такие как ; и эукариотические клетки, такие как культивируемые клетки млекопитающих, включая клетки почки обезьяны COS1 и клетки яичника китайского хомяка CHO; почкующиеся дрожжи; делящиеся дрожжи; клетки тутового шелкопряда и клетки яйца .
[0028]
E. coli
Если в качестве клеток-хозяев используют прокариотические клетки, используют экспрессирующий вектор, содержащий точку начала репликации вектора в прокариотической клетке, промотор, участок связывания рибосомы, участок клонирования ДНК, терминатор и/или т.п. Примеры экспрессирующего вектора для включают систему pUC, pBluescriptII, систему экспрессии pET и систему экспрессии pGEX. Встраивая ДНК, кодирующую указанный выше полипептид в такой экспрессирующий вектор, и трансформируя прокариотические клетки-хозяева с использованием вектора с последующим культивированием полученных трансформантов, можно экспрессировать полипептид, кодируемый ДНК, в прокариотических клетках-хозяевах. В этом случае полипептид можно экспрессировать в качестве слитого белка с другим белком.
[0029]
Если в качестве клеток-хозяев используют эукариотические клетки, в качестве экспрессирующего вектора используют экспрессирующий вектор для эукариотических клеток, содержащий промотор, область сплайсинга, участок полиаденилирования и/или т.п. Примеры такого экспрессирующего вектора включают pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV вектор, pRS, pcDNA3.1, pSecTag (A, B, C), pMSG и pYES2. Аналогично, как описано выше, полипептид, кодируемый ДНК, можно экспрессировать в эукариотических клетках-хозяевах посредством встраивания ДНК, кодирующей указанный выше полипептид, в такой экспрессирующий вектор и трансформации эукариотических клеток-хозяев с использованием вектора с последующим культивированием полученных трансформантов. В случаях, когда в качестве экспрессирующего вектора используют pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 или т.п., указанный выше полипептид можно экспрессировать в качестве слитого белка, в который добавляют метку, такую как His-метка, метка FLAG, метка myc, метка HA или GFP.
[0030]
Для встраивания экспрессирующего вектора в клетки-хозяева можно использовать хорошо известные способы, такие как электропорация, способ с использованием фосфата кальция, липосомный способ и способ с использованием декстрана DEAE.
[0031]
Выделение и очистку интересующего полипептида из клеток-хозяев можно осуществлять посредством комбинирования известных способов разделения. Неограничивающие примеры известных способов разделения включают обработку денатурирующим средством, таким как мочевина или поверхностно-активное вещество; обработку ультразвуком; расщепление ферментами; высаливание или фракционное осаждение растворителем; диализ; центрифугирование; ультрафильтрацию; гель-фильтрацию; электрофорез в ПААГ в присутствие SDS; изоэлектрофокусирование; ионообменную хроматографию; гидрофобную хроматографию; аффинную хроматографию и обращенно-фазовую хроматографию.
[0032]
Полипептиды, полученные указанным выше способом, также включают, как указано выше, полипептиды в форме слитого белка с другим произвольным белком. Их примеры включают слитые белки с глутатион-S-трансферазой (GST) или His-меткой. Такой полипептид, находящийся в форме слитого белка, также попадает в объем настоящего изобретения, как указанный выше полипептид (d). Кроме того, в некоторых случаях полипептид, экспрессирующийся в трансформированной клетке, модифицируют различными способами в клетке после трансляции. Такой посттрансляционно модифицированный полипептид также попадает в объем настоящего изобретения при условии, что он имеет иммуноиндуцирующую активность. Примеры такой посттрансляционной модификации включают: удаление N-концевого метионина; N-концевое ацетилирование; гликозилирование; ограниченную деградацию внутриклеточной протеазой; миристоилирование; изопренилирование и фосфорилирование.
[0033]
2. Иммуноиндуцирующее средство
Как описано более конкретно в примерах ниже, опухоль можно регрессировать посредством введения полипептида, имеющего иммуноиндуцирующую активность, несущему опухоль живому организму. Таким образом, иммуноиндуцирующее средство по настоящему изобретению можно использовать в качестве терапевтического и/или профилактического средства в случае злокачественных новообразований. Кроме того, полипептид, имеющий иммуноиндуцирующую активность, можно использовать в способе лечения и/или профилактики злокачественных новообразований посредством индуцирования иммунитета.
[0034]
В настоящем описании термины "опухоль" и "злокачественное новообразование" означают злокачественную неоплазию, и их используют взаимозаменяемо.
[0035]
В этом случае целевое злокачественное новообразование, в частности, не ограниченное, является любым злокачественным новообразованием, экспрессирующим MRAP2, предпочтительно, злокачественным новообразованием, значимо больше экспрессирующим MRAP2, чем нормальные клетки, в частности, лейкозом, злокачественной лимфомой, раком легких, опухолью головного мозга, раком толстой кишки, меланомой, нейробластомой, раком поджелудочной железы, раком желудка, раком печени, раком яичников, раком пищевода, раком почки, мастоцитомой или перианальной аденокарциномой. Неограничивающие примеры этих конкретных злокачественных новообразований включают острый нелимфоцитарный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, острый гранулоцитарный лейкоз, хронический гранулоцитарный лейкоз, острый промиелоцитарный лейкоз, T-клеточный лейкоз взрослых, лейкемический лейкоз, лейкоцитарный лейкоз, базофильный лейкоз, бластный лейкоз, лейкоз коров, хронический миелолейкоз, гемодермию, эмбриональный лейкоз, эозинофильный лейкоз, лейкоз Гросса, лейкоз с клетками Ридера, лейкоз Шиллинга, недифференцированный бластный лейкоз, сублейкемический лейкоз, недифференцированный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз, гемобластный лейкоз, гемоцитобластный лейкоз, гистиоцитарный лейкоз, недифференцированный бластный лейкоз, острый моноцитарный лейкоз, лейкопенический лейкоз, лимфолейкоз, лимфобластный лейкоз, лимфоцитарный лейкоз, лимфотропный лейкоз, лимфоидный лейкоз, лейкоз с лимфосаркомными клетками, тучноклеточный лейкоз, мегакариоцитарный лейкоз, микромиелобластный лейкоз, моноцитарный лейкоз, миелобластный лейкоз, миелолейкоз, миелоидный гранулоцитарный лейкоз, миеломоноцитарный лейкоз, лейкоз Негели, плазмоклеточный лейкоз, плазмоцитарный лейкоз, промиелоцитарный лейкоз, неходжкинскую лимфому [лимфому Беркитта (BL), мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому /хронический лимфоцитарный лейкоз(SLL/CLL), лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), фолликулярную лимфому (FL), диффузную крупноклеточную B-клеточную лимфому (DLCL), лимфому из клеток маргинальной зоны (MZL), волосатоклеточный лейкоз (HCL), лимфоплазмоцитарный лейкоз(LPL), экстранодальную лимфому маргинальной зоны слизисто-ассоциированной лимфоидной ткани (MALT), медиастинальную крупноклеточную лимфому, внутрисосудистую крупноклеточную лимфому, первичную эффузионную лимфому, лимфобластный лейкоз/лимфому из B-клеток-предшественников, лимфому из T-клеток- и NK-клеток-предшественников (лимфобластную лимфому из T-клеток-предшественников, NK-клеточную лимфобластную лимфому), неоплазии из зрелых T- и NK-клеток (включая лимфому и лейкоз из периферических T-клеток (PTL)], T-клеточный лейкоз взрослых/T-клеточную лимфому и крупноклеточный гранулярный лимфоцитарный лейкоз, хронический T-клеточный лимфоцитарный лейкоз/пролимфоцитарный лейкоз, T-клеточный крупноклеточный гранулярный лимфоцитарный лейкоз, агрессивный NK-клеточный лейкоз, экстранодальную T-/NK-клеточную лимфому, Т-клеточную лимфому энтеропатического типа, Т-клеточную лимфому печени и селезенки, анапластическую крупноклеточную лимфому(ALCL), ангиоцентрическую и ангиоиммунобластную T-клеточную лимфому, фунгоидный микоз/синдром Сезари, кожную T-клеточную лимфому (CTCL), лимфому Ходжкина, немелкоклеточный рак легких, плоскоклеточную карциному (эпидермоидный рак), аденокарциному легких, крупноклеточный рак легких, мелкоклеточный рак легких, глиому, астроцитому, глиому ствола мозга, эпендимому, олигодендроглиому, неглиальную опухоль, невриному слухового нерва, краниофарингиому, медуллобластому, менингиому, пинеоцитому, пинеобластому, первичную лимфому головного мозга, опухоль половых клеток, поверхностный рак толстой кишки, полипозный рак толстой кишки, язвенный инфильтрирующий рак толстой кишки, диффузный инфильтрирующий рак толстой кишки, базальноклеточный рак, рак из клеток шиповатого слоя, меланому, поверхностную распространенную меланому, узелковую меланому, лентиго-меланому, акральную лентигинозную меланому, нейробластому, ганглионейробластому, ганглиому, инсулиному, гастриному, глюкагоному, ВИПому, соматостатин-секретирующую опухоль, карциноид, аденому островковой ткани, полипозный рак желудка, язвенный локализованный рак желудка, язвенный инфильтрирующий рак желудка, диффузный инфильтрирующий рак желудка, печеночно-клеточный рак и гепатобластому, эпителиальный рак яичников, пограничную опухоль, опухоль половых клеток, стромальную опухоль, серозную аденокарциному, светло-клеточную аденокарциному, эндометриоидную аденокарциному, переходноклеточный рак, аденокарциному слизистой оболочки, смешанный рак яичников, плоскоклеточную карциному, аденокарциному пищевода, почечно-клеточный рак, аденокарциному почек, гипернефрому, почечную фибросаркому, переходноклеточный рак (почечной лоханки и/или мочеточника), мастоцитому, перианальную аденому и перианальную аденокарциному.
[0036]
Интересующий индивидуум (т.е. животное), предпочтительно, является млекопитающим; более предпочтительно - млекопитающим, включая примата, домашнее животное, любое животное, выращенное в зоопарке или т.п., сельскохозяйственное животное и беговое животное; и особенно предпочтительно - человеком, собакой или кошкой.
[0037]
Способ введения иммуноиндуцирующего средства по настоящему изобретению в живой организм может представлять собой пероральное введение или парентеральное введение и, предпочтительно, является парентеральным введением, таким как внутримышечное введение, подкожное введение, внутривенное введение или внутриартериальное введение. Если иммуноиндуцирующее средство используют для лечения злокачественных новообразований, его можно вводить в регионарный лимфоузел вблизи опухоли, подлежащей лечению, для усиления его противоопухолевой активности. Доза может являться любой дозой при условии, что доза является эффективной для индуцирования иммунитета, и, например, в случаях, если средство используют в лечении и/или профилактики злокачественных новообразований, доза может являться дозой, эффективной для лечения и/или профилактики злокачественных новообразований. Дозу, эффективную для лечения и/или профилактики злокачественных новообразований, выбирают соответствующим образом в зависимости от размера и симптомов опухоли и т.п., и эффективная доза, как правило, составляет от 0,0001 мкг до 1000 мкг, предпочтительно - от 0,001 мкг до 1000 мкг на животного-индивидуума в сутки, которую можно вводить один или более раз. Средство, предпочтительно, вводят несколько раз каждые несколько дней, несколько недель, несколько месяцев. Как конкретно указано в примерах ниже, иммуноиндуцирующее средство по настоящему изобретению может вызывать регрессирование опухоли. Таким образом, т.к. средство может проявляться противоопухолевую активность также против небольшого количества злокачественных клеток на ранней стадии, развитие или рецидивирование злокачественного новообразования можно предотвращать с использованием средства до развития злокачественного новообразования или после развития злокачественного новообразования. Таким образом, иммуноиндуцирующее средство по настоящему изобретению является эффективным для лечения и профилактики злокачественных новообразований.
[0038]
Иммуноиндуцирующее средство по настоящему изобретению может состоять из полипептидов в отдельности или может находиться в форме препарата, полученного соответствующим образом посредством примешивания добавок, таких как фармакологически приемлемый носитель, дилюент, эксципиент и т.п., подходящих для лекарственных форм. Способ получения препарата, а также применимые добавки хорошо известны в области фармацевтических препаратов, и можно использовать любые способы и добавки. Неограничивающие примеры добавок включают дилюенты, такие как физиологические буферные растворы; эксципиенты, такие как сахар, лактоза, кукурузный крахмал, фосфат кальция, сорбит и глицин; связывающие средства, такие как сироп, желатин, гуммиарабик, сорбит, поливинилхлорид и трагакантовая камедь; и смазочные средства, такие как стеарат магния, полиэтиленгликоль, тальк и диоксид кремния. Примеры лекарственных форм могут включать пероральные препараты, такие как таблетки, капсулы, гранулы, порошки и сиропы; и парентеральные препараты, такие как ингалянты, инъекции, суппозитории и растворы. Эти препараты можно получать способами, как правило, известными в этой области.
[0039]
Иммуноиндуцирующее средство по настоящему изобретению можно использовать в комбинации с иммуностимулятором, способным усиливать иммунный ответ в живом организме. Иммуностимулятор может содержаться в иммуноиндуцирующем средстве по настоящему изобретению, или его можно вводить пациенту в виде отдельной композиции в комбинации с иммуноиндуцирующим средством по настоящему изобретению.
[0040]
Примеры иммуностимулятора включают адъюванты. Адъюванты могут усиливать иммунный ответ, обеспечивая резервуар антигенов (внеклеточно или в макрофагах), активируя макрофаги и стимулируя конкретные подгруппы лимфоцитов, таким образом, усиливая иммунный ответ и, таким образом, противоопухолевое действие. Таким образом, особенно в случаях, когда иммуноиндуцирующее средство по настоящему изобретению используют для лечения и/или профилактики злокачественных новообразований, иммуноиндуцирующее средство, предпочтительно, содержит адъювант в дополнение к описанному выше полипептиду, являющемуся эффективным ингредиентом. В этой области хорошо известно множество типов адъювантов, и можно использовать любой из этих адъювантов.
[0041]
Salmonella minnesota,
Quilljasaponaria
Конкретные примеры адъювантов включают MPL (SmithKline Beecham), гомологи липополисахарида Re 595 полученные после очистки и кислого гидролиза липополисахарида; QS21 (SmithKline Beecham), чистый сапонин QA-21, выделенный из экстракта ; DQS21, описанный в WO96/33739 (SmithKline Beecham); QS-7, QS-17, QS-18 и QS-L1 (So et al., "Molecules and Cells", 1997, Vol. 7, p. 178-186); неполный адъювант Фрейнда; полный адъювант Фрейнда; витамин E; монтанид; алюминиевые квасцы; CpG-олигонуклеотиды (см., например, Kreig et al., Nature, Vol. 374, p. 546-549); поли-IC и его производные (например, поли-ICLC); и различные эмульсии "вода-в-масле", полученные из биодергадируемых масел, таких как сквален и/или токоферол. Среди них предпочтительными являются неполный адъювант Фрейнда, монтанид, поли-IC и его производные и CpG-олигонуклеотиды. Коэффициент смешивания описанного выше адъюванта и полипептида, как правило, составляет приблизительно от 1:10 до 10:1, предпочтительно - приблизительно от 1:5 до 5:1, более предпочтительно - приблизительно 1:1. Однако адъювант не ограничен описанными выше примерами, и также можно использовать адъюванты, известные в этой области, иные, чем описанные выше, если вводят иммуноиндуцирующее средство по настоящему изобретению (см., например, Goding, "Monoclonal antibodies: Principles and Practice, 2nd edition", 1986). Способы получения смесей или эмульсий полипептида и адъюванта хорошо известны специалистам в области вакцинации.
[0042]
Кроме того, в дополнение к описанным выше адъювантам, в качестве описанного выше иммуностимулятора можно использовать факторы, стимулирующие интересующий иммунный ответ. Например, в качестве иммуностимулятора можно использовать различные цитокины, обладающие свойствами стимуляции лимфоцитов и/или антигенпрезентирующих клеток, в комбинации с иммуноиндуцирующим средством по настоящему изобретению. Специалистам в этой области известен ряд таких цитокинов, способных усиливать иммунный ответ, и их неограничивающие примеры включают интерлейкин-12 (ИЛ-12), ГМ-КСФ, ИЛ-18, интерферон-α, интерферон-β, интерферон-ω, интерферон-γ и лиганд Flt3, как сообщают, усиливающие профилактическое действие вакцин. Такие факторы можно использовать в качестве иммуностимулятора и вводить пациенту, добавляя к иммуноиндуцирующему средству по настоящему изобретению, или вводить в виде независимой композиции в комбинации с иммуноиндуцирующим средством по настоящему изобретению.
[0043]
3. Антигенпрезентирующие клетки или цитотоксические T-клетки
ex vivo
in vitro
Приводя описанный выше полипептид в контакт с антигенпрезентирующими клетками (индивидуума)  или , можно заставлять антигенпрезентирующие клетки презентировать полипептид. Т.е. полипептиды (a)-(d), описанные выше, можно использовать в качестве средства для обработки антигенпрезентирующих клеток. Примеры антигенпрезентирующих клеток, которые, предпочтительно, можно использовать, включают дендритные клетки или B-клетки, имеющие молекулу MHC класса I. Идентифицированы и хорошо известны различные молекулы MHC класса I. MHC молекулы у человека называют HLA. Примеры молекул HLA класса I включают HLA-A, HLA-B и HLA-C, более конкретно, HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A0204, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A31, HLA-A6801, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B2705, HLA-B37, HLA-Cw0401 и HLA-Cw0602.
[0044]
Дендритные клетки или B-клетки, имеющие молекулу MHC класса I, можно получать из периферической крови хорошо известным способом. Например, опухолеспецифичные дендритные клетки можно индуцировать посредством индуцирования дендритных клеток из костного мозга, пуповинной крови или периферической крови пациента с использованием гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) и ИЛ-3 (или ИЛ-4), а затем добавляя опухоле-ассоциированный пептид в культуральную систему.
[0045]
2
Вводя эффективное количество таких дендритных клеток, можно индуцировать ответ, желательный для терапии злокачественного новообразования. В качестве клеток для использования можно использовать костный мозг или пуповинную кровь от здоровых доноров или костный мозг, периферическую кровь или т.п. самого пациента. При использовании аутологичных клеток пациента можно достигать высокого уровня безопасности и, как ожидают, избегать серьезных побочных эффектов. Периферическая кровь или костный мозг могут представлять собой любое из свежего образца, хранящегося в холодильнике образца и замороженного образца. Что касается периферической крови, можно культивировать цельную кровь или отделять и культивировать только лейкоцитарные компоненты, и последние являются более эффективными и, таким образом, предпочтительными. Кроме того, среди лейкоцитарных компонентов, можно выделять мононуклеарные клетки. В случаях, когда клетки происходят из костного мозга или пуповинной крови, можно культивировать целые клетки, составляющие костный мозг или из них можно выделять мононуклеарные клетки и культивировать их. Периферическая кровь, ее лейкоцитарные компоненты и клетки костного мозга содержат мононуклеарные клетки, гемопоэтические стволовые клетки и незрелые дендритные клетки, из которых происходят дендритные клетки, а также CD4-положительные клетки и т.п. Что касается цитокина для использования, способ его получения не ограничен, и можно использовать природный или рекомбинантный цитокин или т.п. при условии подтверждения его безопасности и физиологической активности. Предпочтительно, препарат с подтвержденным качеством для медицинского использования используют в минимальном необходимом количестве. Концентрация добавляемых цитокинов не ограничена при условии, что дендритные клетки индуцируют с использованием этой концентрации, и, как правило, общая концентрация цитокинов, предпочтительно, составляет приблизительно 10-1000 нг/мл, более предпочтительно - приблизительно 20-500 нг/мл. Культивирование можно осуществлять с использованием хорошо известной среды, как правило, используемой для культивирования лейкоцитов. Температура культивирования не ограничена при условии, что при этой температуре достигают пролиферации лейкоцитов, и температура приблизительно 37°C, являющаяся температурой тела человека, является наиболее предпочтительной. Атмосферные условия при культивировании не ограничены при условии, что в этих условиях достигают пролиферации лейкоцитов, и предпочтительно используют 5% CO. Время культивирования не ограничено при условии, что в течение такого времени индуцируют необходимое количество клеток, и, как правило, оно составляет от 3 дней до 2 недель. Что касается устройств, используемых для разделения и культивирования клеток, можно использовать подходящие устройства, предпочтительно, те, безопасность которых для медицинского использования подтверждена и операции которых стабильны и просты. В частности, что касается устройства для культивирования клеток, можно использовать не только общий сосуд, такой как чашка Петри, флакон или бутыль, но также и слоистый сосуд, сосуд для многостадийного культивирования, роллерный флакон, роллерную колбу, культуральный сосуд типа мешка, половолоконную колонку или т.п.
[0046]
ex vivo
in vitro
ex vivo
in vitro
3
7
4
6
2
Сам способ приведения полипептида, указанного выше, в контакт с антигенпрезентирующей клеткой  или , можно осуществлять способом, хорошо известным в этой области, например, посредством культивирования антигенпрезентирующей клетки в культуральной жидкости, содержащей полипептид. Концентрация пептида в среде, в частности, не ограниченная, как правило, составляет приблизительно от 1 до 100 мкг/мл и, предпочтительно, приблизительно от 5 до 20 мкг/мл. Плотность клеток при культивировании, в частности, не ограниченная, как правило, составляет приблизительно от 10 до 10 клеток/мл и, предпочтительно, приблизительно от 5×10 до 5×10 клеток/мл. Культивирование, предпочтительно, осуществляют общепринятыми способами при 37°C в атмосфере 5% CO. Длина пептида, который может презентировать антигенпрезентирующая клетка на своей поверхности, как правило, составляет максимум приблизительно 30 аминокислотных остатков. Таким образом, если антигенпрезентирующие клетки приводят в контакт с полипептидом  или , полипептид можно получать таким образом, чтобы они имели длину приблизительно 30 аминокислотных остатков или менее; однако, длина не ограничена.
[0047]
Культивируя антигенпрезентирующую клетку в присутствие указанного выше полипептида, пептид встраивают в молекулу MHC антигенпрезентирующей клетки и он презентируется на поверхности антигенпрезентирующей клетки. Таким образом, можно получать выделенную антигенпрезентирующую клетку, содержащую комплекс полипептида и молекулы MHC.
[0048]
ex vivo
in vitro
Таким образом, настоящее изобретение дополнительно относится к способу получения антигенпрезентирующей клетки, содержащей комплекс полипептида, указанного выше, и молекулы MHC, включающему приведение полипептида в контакт с антигенпрезентирующей клеткой индивидуумаили .
[0049]
Настоящее изобретение также относится к антигенпрезентирующей клетке, отличающейся содержанием комплекса полипептида, указанного выше, и молекулы MHC и тем, что ее получают способом.
[0050]
ex vivo
in vitro
2
Приводя антигенпрезентирующую клетку, полученную указанным выше способом и содержащую комплекс полипептида, указанного выше, и молекулы MHC, в контакт с T-клеткой  или , можно вызывать индуцирование и пролиферацию цитотоксической T-клетки, специфической для полипептида. Контакт можно осуществлять посредством сокультивирования антигенпрезентирующей клетки и T-клетки в жидкой среде; например, суспендируя антигенпрезентирующей клетки в жидкой среде, помещая полученную суспензию в контейнер, такой как лунки микропланшета, добавляя T-клетки в лунки и культивируя их. Коэффициент смешивания антигенпрезентирующей клетки и T-клетки при сокультивировании, в частности, не ограниченный, как правило, составляет приблизительно от 1:1 до 1:100, предпочтительно, приблизительно от 1:5 до 1:20 в терминах соотношения количеств клеток. Плотность антигенпрезентирующих клеток в жидкой среде, в частности, не ограниченная, как правило, составляет приблизительно от 100 до 10000000 клеток/мл и, предпочтительно, приблизительно от 10000 до 1000000 клеток/мл. Сокультивирование, предпочтительно, осуществляют общепринятыми способами при 37°C в атмосфере 5%CO. Время культивирования, в частности, не ограниченное, как правило, составляет от 2 дней до 3 недель и, предпочтительно, приблизительно от 4 дней от 2 недель. Сокультивирование, предпочтительно, осуществляют в присутствие одного или более типов интерлейкинов, таких как ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-7 и ИЛ-12. В этом случае концентрации ИЛ-2 и ИЛ-7, как правило, составляет приблизительно от 5 до 20 Ед./мл, концентрация ИЛ-6, как правило, составляет приблизительно от 500 до 2000 Ед./мл, и концентрация ИЛ-12, как правило, составляет приблизительно от 5 до 20 нг/мл; однако, концентрации не ограничены. Сокультивирование можно повторять однократно или более раз, добавляя свежие антигенпрезентирующие клетки. Например, операцию, включающую изъятие супернатанта культуры после сокультивирования, добавление суспензии свежих антигенпрезентирующих клеток и осуществление сокультивирования, можно повторять однократно или более раз. Условия сокультивирования могут являться такими, как описано выше.
[0051]
Посредством сокультивирования индуцируют цитотоксическую T-клетку, специфическую для полипептида, и способствуют ее пролиферации. Таким образом, указанный выше полипептид можно использовать для получения выделенных T-клеток, селективно связывающих комплекс полипептида и молекулы MHC.
[0052]
ex vivo
in vitro
Таким образом, настоящее изобретение дополнительно относится к способу получения цитотоксической T-клетки, специфической для полипептида, указанного выше, включающему приведение антигенпрезентирующей клетки в контакт с T-клеткой индивидуума или для активации T-клетки.
[0053]
Настоящее изобретение также относится к цитотоксической T-клетке, специфической для полипептида, указанного выше, полученного этим способом.
[0054]
in vivo,
in vivo
Как описано в примерах ниже, ген MRAP2 специфически экспрессируется при лейкозе, злокачественной лимфоме, раке легких, опухоли головного мозга, раке толстой кишки, меланоме, нейробластоме, раке поджелудочной железы, раке желудка, раке печени, раке яичников, раке пищевода, раке почки, мастоцитоме или перианальной аденокарциноме. Таким образом, считают, что при этих злокачественных новообразованиях MRAP2 присутствует в значимо большем количестве, чем в нормальных клетках. Если цитотоксическую T-клетку, полученную описанным выше способом, вводят часть полипептида MRAP2, существующего в злокачественных клетках презентируется молекулой MHC на поверхности злокачественной клетки, цитотоксическая T-клетка может повреждать злокачественную клетку с использованием части полипептида MRAP2 в качестве маркера. Антигенпрезентирующая клетка, презентирующая часть полипептида MRAP2, может индуцировать цитотоксическую T-клетку, специфическую для полипептида, и способствовать ее пролиферации . Таким образом, злокачественные клетки также можно повреждать посредством введения антигенпрезентирующей клетки живому организму. Более конкретно, цитотоксическая T-клетка и антигенпрезентирующая клетка, полученные с использованием указанного выше полипептида, также применимы для лечения и/или предотвращения злокачественного новообразования аналогично иммуноиндуцирующему средству по настоящему изобретению.
[0055]
В случаях, когда описанные выше выделенные антигенпрезентирующие клетки или выделенные T-клетки вводят индивидууму, их, предпочтительно, получают посредством обработки антигенпрезентирующих клеток или T-клеток, полученных из пациента, подлежащего лечению, полипептидом (a)-(d), как описано выше, во избежание иммунного ответа у живого организма, атакующего эти клетки как чужеродные объекты.
[0056]
Терапевтическое и/или профилактическое средство для злокачественного новообразования, содержащее в качестве эффективного ингредиента выделенные антигенпрезентирующие клетки или T-клетки, предпочтительно, вводят посредством парентерального введения, например, посредством внутривенного или внутриартериального введения. Дозу выбирают соответствующим образом в зависимости от симптомов, цели введения и т.п., и, как правило, она составляет от 1 клетки до 10000000000000 клеток, предпочтительно - от 1000000 клеток до 1000000000 клеток, при этом дозу, предпочтительно, вводят каждые несколько дней, несколько недель, несколько месяцев. Препарат может представлять собой, например, клетки, суспендированные в забуференном физиологическом растворе, и препарат можно использовать в комбинации с другими противоопухолевыми средствами, цитокинами или т.п. Кроме того, также можно добавлять одну или более добавок, хорошо известных в области фармацевтических средств.
[0057]
4. ДНК-вакцина
Кроме того, посредством экспрессии полинуклеотида, кодирующего любой из полипептидов (a)-(d), в организме животного-индивидуума можно индуцировать продукцию антител и цитотоксические T-клетки в живом организме, и можно достигать эффекта, сравнимого с достигаемым в случае введения полипептида. Т.е. иммуноиндуцирующее средство по настоящему изобретению может являться средством, содержащим в качестве активного ингредиента рекомбинантный вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий любой из полипептидов (a)-(d), где рекомбинантный вектор способен экспрессировать полипептид в живом организме. Такой рекомбинантный вектор, способный экспрессировать антигенный полипептид, как показано в примерах, описанных ниже, также называют ДНК-вакциной.
[0058]
Вектор, используемый для получения вакцины, не ограничен при условии, что он является вектором, способным экспрессировать полипептид в клетке животного-индивидуума (предпочтительно, в клетке млекопитающего), может являться плазмидным вектором или вирусным вектором, и можно использовать любой вектор, известный в области ДНК-вакцин. Полинуклеотид, такой как ДНК или РНК, кодирующие описанный выше полипептид, легко можно получать указанным выше общепринятым способом. Встраивание полинуклеотида в вектор можно осуществлять с использованием способа, хорошо известного специалисту в этой области.
[0059]
Способом введения ДНК-вакцин, предпочтительно, является парентеральное введение, такое как внутримышечное, подкожное, внутривенное или внутриартериальное введение, и дозу можно соответствующим образом выбирать в зависимости от типа антигена и т.п., и она, как правило, составляет приблизительно от 0,1 мкг до 100 мг, предпочтительно - приблизительно от 1 мкг до 10 мг в терминах массы ДНК-вакцины на 1 кг массы тела.
[0060]
Примеры способа с использованием вирусного вектора включают способы, в которых полинуклеотид, кодирующий описанный выше полипептид, встраивают в РНК-вирус или ДНК-вирус, такой как ретровирус, аденовирус, аденоассоциированный вирус, вирус герпеса, вирус осповакцины, поксвирус, вирус полиомиелита или вирус Синдбис, а затем животного-индивидуума инфицируют полученным вирусом. Среди этих способов способы с использованием ретровируса, аденовируса, аденоассоциированного вируса, вируса осповакцины или т.п. являются особенно предпочтительными.
[0061]
Примеры других способов включают способ, где экспрессирующую плазмиду вводят напрямую внутримышечно (способ ДНК-вакцины), липосомный способ, способ липофекции, способ микроинъекции, способ с использованием фосфата кальция и способ электропорации, и способ ДНК-вакцины и липосомный способ являются особенно предпочтительными.
[0062]
in vivo
ex vivo,
in vivo
Способы, позволяющие гену, кодирующему описанный выше полипептид, используемый в настоящем изобретении, действовать в качестве лекарственного средства, включают способ , где ген напрямую вводят в организм, и способ где конкретный тип клеток получают из животного-индивидуума ген встраивают в клетки вне организма, с последующим возвращением клеток в организм (Nikkei Science, 1994, April, p.20-45; The Pharmaceutical Monthly, 1994, Vol. 36, No. 1, p. 23-48; Experimental Medicine, Extra Edition, 1994, Vol. 12, No. 15; и ссылки в этих источниках и т.п.). Способ  является более предпочтительным.
[0063]
in vivo
in vivo
Если ген вводят способом , его можно вводить подходящим путем введения в зависимости от заболевания, подлежащего лечению, симптома и т.д. Ген можно вводить, например, внутривенным, внутриартериальным, подкожным или внутримышечным путем. Если ген вводят способом , его можно составлять в препарате, таком как раствор, и, в целом, его составляют в инъекционном растворе или т.п., содержащем ДНК, кодирующую описанный выше полипептид по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, и, при необходимости, в раствор можно дополнительно добавлять общепринятый носитель. В случае липосомы или мембранной слитой липосомы (например, вирус Сендай (HVJ)-липосомы), содержащей ДНК, липосому можно составлять в липосомном препарате, таком как суспензия, замороженном препарате или замороженном препарате, концентрированном посредством центрифугирования.
[0064]
В настоящем изобретении, например, "нуклеотидная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 1" включает не только нуклеотидную последовательность, представленную в самой SEQ ID NO: 1, но также и последовательность, комплементарную ей. Таким образом, например, "полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1" включает одноцепочечный полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную в самой SEQ ID NO: 1, одноцепочечный полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, комплементарную ей, и двухцепочечный полинуклеотид, состоящий из этих одноцепочечных полинуклеотидов. Если получают полинуклеотид, кодирующий полипептид, используемый в настоящем изобретении, любую из этих нуклеотидных последовательностей выбирают соответствующим образом, специалист в этой области легко может осуществлять этот выбор.
ПРИМЕРЫ
[0065]
Далее настоящее изобретение будет более конкретно описано с учетом примеров.
[0066]
(Пример 1)
Получение нового антигенного белка злокачественной опухоли способом SEREX
(1) Препарат библиотеки кДНК
Из яичек собак выделяли тотальную РНК способом с использованием кислого гуанидина, фенола и хлороформа, а затем поли(A)-РНК очищали с использованием набора для очистки мРНК Oligotex-dT30 (Takara Shuzo Co., Ltd.) по инструкциям производителя.
[0067]
6
Используя полученную мРНК (5 мкг), синтезировали фаговую библиотеку кДНК. Для получения фаговой библиотеки кДНК использовали набор для синтеза кДНК, набор для синтеза кДНК Zap или набор для клонирования ZAP-cDnA GigapackIII Gold (STRATAGENE) по инструкциям производителя. Размер полученной фаговой библиотеки кДНК составлял 1×10БОЕ/мл.
[0068]
(2) Скрининг библиотеки кДНК с использованием сыворотки
E. coli-
Используя полученную фаговую библиотеку кДНК, осуществляли иммунологический скрининг. Более конкретно, хозяев(XL1-Blue MRF') инфицировали фагом таким образом, чтобы получать приблизительно 2500 клонов в чашках с агарозой NZY размером 90×15 мм и культивировали при 42°C в течение 3-4 часов для получения бляшек. Планшеты закрывали нитроцеллюлозной мембраной (Hybond C Extra: GE Healthcare Bio-Science), пропитанной IPTG (изопропил-β-D-тиогалактозидом), при 37°C в течение 4 часов для индукции экспрессии белка и переносили белок на мембрану. Затем мембрану собирали, погружали в TBS (10 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, pH7,5), содержащий 0,5% обезжиренного порошкового молока и встряхивали при 4°C в течение ночи для супрессии неспецифической реакции. Этому фильтру позволяли реагировать с 500-кратной разведенной сывороткой собаки при комнатной температуре в течение от 2 до 3 часов.
[0069]
Escherichia coli-
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli/
Escherichia coli
3
В качестве сывороток собак, указанных выше, использовали сыворотки собак с лейкозом. Сыворотки хранили при -80°C и предварительно обрабатывали непосредственно перед использованием. Способ предварительной обработки сывороток являлся следующим. Т.е. сначала хозяев(XL1-Blure MRF') инфицировали фагом λ ZAP Express, в который не встраивали чужеродные гены, а затем культивировали на чашке со средой NZY при 37°C в течение ночи. Затем на чашку добавляли буфер 0,2 M NaHCO(pH 8,3), содержащий 0,5 M NaCl, и чашку оставляли при 4°C в течение 15 часов, затем собирая супернатант в виде экстракта /фага. Затем собранному экстракту /фага позволяли течь через колонку NHS (GE Healthcare Bio-Science) для иммобилизации белков, полученных из фага, на колонке. Сыворотке собаки позволяли протекать и реагировать с колонкой с иммобилизованными белками для удаления антител, адсорбированных на и фаге из сыворотки. Сывороточную фракцию, пропущенную через колонку, разводили в 500 раз TBS, содержащим 0,5% обезжиренного порошкового молока, и полученное разведение использовали в качестве материала для иммунологического скрининга.
[0070]
4
Указанную выше мембрану, на которой обработанную таким образом сыворотку и белки подвергали блоттингу, промывали 4 раза TBS-T (0,05% Tween 20/TBS) и позволяли ей реагировать с IgG козы против собаки (конъюгированный IgG-h+LHRP козы против собаки; BETHYL Laboratories), разведенное в 5000 раз TBS, содержащим 0,5% обезжиренного порошкового молока, в качестве вторичного антитела при комнатной температуре в течение 1 часа с последующей детекцией посредством ферментативной цветной реакции с использованием реакционного раствора NBT/BCIP (Roche). Колонии в положениях с положительной цветной реакцией выделяли из чашки с агарозой NZY размером 90×15 мм и растворяли в 500 мкл буфера SM (100 мМ NaCl, 10 мМ MgClSO, 50 мМ Трис-HCl, 0,01% желатина; pH 7,5). Скрининг повторяли в виде второго и третьего скрининга тем же образом, как описано выше, до получения единственной колонии с положительной цветной реакцией, таким образом, выделяя один положительный клон после скрининга приблизительно 10000 фаговых клонов, реагирующих с IgG в сыворотке.
[0071]
(3) Поиск идентичности последовательности выделенного гена антигена
Escherichia coli-
Escherichia coli-
600
600
Для подвергания отдельного положительного клона, выделенного описанным выше способом, анализу нуклеотидной последовательности осуществляли преобразование фагового вектора в плазмидный вектор. Конкретно, смешивали раствор (200 мкл), содержащий хозяев(XL1-Blue MRF'), полученных при плотности OD 1,0, очищенный раствор фагов (100 мкл) и дополнительный 1 мкл хелперного фага ExAssist (STRATAGENE) и позволяли им реагировать при 37°C в течение 15 минут. Добавляли среду LB (3 мл) и осуществляли культивирование при 37°C в течение 2,5-3 часов. Полученную культуру незамедлительно помещали на водяную баню при 70°C в течение 20 минут, а затем центрифугировали при 4°C и 1000×g в течение 15 минут для сбора супернатанта в виде раствора фагмид. Затем смешивали раствор (200 мкл), содержащий хозяев с фагмидой(SOLR), полученных при плотности OD 1,0, и очищенный раствор фагов (10 мкл) и позволяли им реагировать при 37°C в течение 15 минут. Полученный раствор (50 мкл) высевали на агаровую среду LB, содержащую ампициллин (конечная концентрация: 50 мкг/мл), и культивировали при 37°C в течение ночи. Выбирали отдельную трансформированную колонию SOLR, культивировали в среде LB, содержащей ампициллин (конечная концентрация: 50 мкг/мл), при 37°C, а затем очищали с помощью набора QIAGEN Plasmid Miniprep Kit (QIAGEN) для получения плазмидной ДНК с желаемой вставкой.
[0072]
На очищенную плазмиду воздействовали "блуждающим праймером" с использованием праймера T3, представленного в SEQ ID NO: 9, и праймера T7, представленного в SEQ ID NO: 10, для анализа полноразмерной последовательности вставки. Последовательность гена, представленную в SEQ ID NO: 3, получали посредством секвенирования. Используя нуклеотидную последовательность гена и соответствующую аминокислотную последовательность, осуществляли поиск идентичной последовательности, представляющий собой поиск идентичной последовательности среди известных генов, с помощью программы для поиска идентичной последовательности BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). В результате обнаруживали, что ген, полученный, как описано выше, является геном MRAP2. В MRAP2 человека, являющемся человеческим гомологом MRAP2 собаки, идентичность нуклеотидной последовательности составляла 91%, и идентичность аминокислотных последовательностей составляла 94%. В гомологе кошки, т.е. MRAP2 кошки, идентичность нуклеотидной последовательности составляла 95%, и идентичность аминокислотных последовательностей составляла 96%. В гомологе мыши, т.е. MRAP2 мыши, идентичность нуклеотидной последовательности составляла 84%, и идентичность аминокислотных последовательностей составляла 88%. Нуклеотидные последовательности MRAP2 человека представлены в SEQ ID NO: 1, и его аминокислотные последовательности представлены в SEQ ID NO: 2. Нуклеотидная последовательность MRAP2 кошки представлена в SEQ ID NO: 5, и его аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 6. Нуклеотидная последовательность MRAP2 мыши представлена в SEQ ID NO: 7, и его аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 8.
[0073]
(4) Анализ экспрессии генов в различных тканях
6
Экспрессию генов, полученных описанным выше способом, в нормальных тканях, опухолевых тканях и линиях злокачественных клеток собак, людей и мышей исследовали способом RT-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией). Реакцию обратной транскрипции осуществляли следующим образом. Сначала выделяли тотальную РНК из отдельных тканей (50-100 мг) и отдельных линий клеток (5-10× 10 клеток) с использованием реагента TRIZOL (Life Technology) по инструкциям производителя. Используя тотальную РНК, синтезировали кДНК с использованием системы Superscript First-Strand Synthesis System для RT-ПЦР (Life Technology) по инструкциям производителя. В качестве кДНК нормальных тканей человека (из головного мозга, яичек, толстого кишечника и плаценты) использовали совокупность кДНК гена (Life Technology), кДНК QUICK-Clone (Clontech) и библиотеку кДНК Large-Insert (Clontech). Реакцию ПЦР осуществляли с использованием гено-специфических праймеров (праймеры для собак представлены в SEQ ID NO: 11 и 12, праймеры для человека представлены в SEQ ID NO: 13 и 14, праймеры для мыши представлены в SEQ ID NO: 15 и 16), полученных следующим образом. Т.е. реагенты добавляли в прилагающийся буфер, где реагенты содержат 0,25 мкл образца, полученного посредством реакции обратной транскрипции, указанные выше праймеры (2 мкМ каждого), dNTP (0,2 мМ каждого) и 0,65 ед. полимеразы ExTaq (Takara Shuzo Co., Ltd.). Всего 25 мкл реакционной смеси подвергали ПЦР с использованием термоциклера (BIO RAD). При ПЦР повторяли 30 циклов, где один цикл состоит из следующего: 94°C в течение 30 секунд; 55°C в течение 30 секунд и 72°C в течение одной минуты. В результате, как показано на фиг. 1, ген MRAP2 собаки сильно экспрессировался в опухолевых тканях собаки, т.е. тканях мастоцитомы и перианальной аденокарциномы (фиг.1). Ген MRAP2 человека не экспрессировался в большинстве нормальных тканей человека, но сильно экспрессировался в злокачественных клетках человека, т.е. линиях клеток лейкоза, злокачественной лимфомы, рака легких, опухоли головного мозга, рака толстой кишки, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака печени, рака яичников, рака пищевода и рака почки (фиг.2). Кроме того, экспрессию гена MRAP2 мыши определяли в линиях клеток лейкоза, меланомы и нейробластомы (фиг.3).
[0074]
(Пример 2)
in vivo
Анализ антигенности MRAP2 при злокачественном новообразовании
in vivo
(1) Получение рекомбинантного вектора, экспрессирующего MRAP2 мыши
in vivo,
Получали рекомбинантный вектор, экспрессирующий MRAP2 мыши  на основе нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 7 следующим способом. ПЦР осуществляли следующим образом. Реакционную смесь получали, добавляя реагенты: кДНК (1 мкл), получаемую из линии лейкозных клеток мыши EL4 (приобретенной в ATCC), экспрессию которой наблюдали в примере 1, два типа праймеров (0,4 мкМ каждого), имеющих участки рестрикции EcoRI и NotI (представленные в SEQ ID NO: 17 и 18), 0,2 мМ dNTP и 1,25 ед. полимеразы PrimeSTAR HS (Takara Shuzo Co., Ltd.) и сопутствующий буфера так, чтобы получать общее количество 50 мкл; и подвергали ПЦР с использованием термоциклера (BIO RAD). При ПЦР повторяли 30 циклов, где один цикл состоял из следующего: 98°C в течение 10 секунд; 55°C в течение 15 секунд и 72°C в течение 1 минуты. Указанные выше два типа праймеров использовали для амплификации области, кодирующей полноразмерную аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8. После ПЦР амплифицированную ДНК подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле и фрагмент ДНК размером приблизительно 600 п.н. очищали с использованием набора QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN).
[0075]
E. coli
Очищенный фрагмент ДНК лигировали в клонирующий вектор pCR-Blunt (Life Technology), с помощью которого затем трансформировали клетки , затем собирая плазмидный вектор. С помощью его секвенирования подтверждали, что последовательность амплифицированного фрагмента гена являлась идентичной желаемой последовательности. Плазмиду, последовательность которой являлась идентичной желаемой последовательности, обрабатывали ферментами рестрикции EcoRI и NotI. После очистки с использованием набора QIAquick Gel Extraction Kit желаемую последовательность гена встраивали в экспрессирующий вектор млекопитающего pcDNA3.1 (Invitrogen), обработанный ферментами рестрикции EcoRI и NotI (далее в настоящем описании обозначаемый как MRAP2 мыши/pcDNA3.1). Благодаря использованию вектора белок MRAP2 мыши продуцируется в клетке млекопитающего.
[0076]
2
К плазмидной ДНК (100 мкг), полученной, как описано выше, добавляли 50 мкг частиц золота (Bio Rad), спермидин (100 мкл) (SIGMA) и 1 M CaCl (100 мкл (SIGMA)). Смесь перемешивали на центрифуге типа вортекс и позволяли ей отстаиваться в течение 10 минут при комнатной температуре (далее в настоящем описании ее обозначали как "частицы золото-ДНК"). После центрифугирования при 3000 об./мин. в течение одной минуты супернатант выбрасывали, затем осадок три раза промывали 100% этанолом (WAKO). К частицам золото-ДНК добавляли 100% этанол (6 мл) и смесь перемешивали в достаточной степени на центрифуге типа вортекс. Частицы золото-ДНК наливали в тюбинг Tefzel (Bio Rad) для их осаждения на его стенках. Тюбинг Tefzel с прикрепленными частицами золото-ДНК сушили воздухом, удаляя этанол, а затем нарезали на куски длиной, подходящей для использования генной пушке (далее в настоящем описании обозначаемых как MRAP2 мыши/трубка).
[0077]
(2) Противоопухолевый эффект MRAP2 мыши в случае ДНК-вакцины, способ 1
Использовали пять мышей A/J (возрастом 7 недель, самцы, приобретенные в Japan SLC, Inc.). Трубку (MRAP2 мыши/трубку), полученную, как указано выше, иммобилизовали в генной пушке. ДНК-вакцину вводили подкожно в область брюшной полости мышей с помощью чистого газообразного гелия под давлением 2,758e+6 Па три раза каждые 7 дней (количество инокулируемой плазмидной ДНК: 2 мкг/животное). После подкожного введения линию лейкозных клеток мыши EL4, как обнаружено в примере 1, экспрессирующую ген MRAP2, пересаживали каждой мыши для оценки противоопухолевого эффекта (обозначенной как модель профилактики). Для контроля 5 мышам в модели профилактики вводили плазмидную ДНК без вставки гена MRAP2 мыши.
[0078]
2
3
3
Противоопухолевый эффект оценивали по размеру опухоли (длинный диаметр×(короткий диаметр)/2) и доле выживших мышей. В результате в модели профилактики размеры опухолей через 28 дней в контрольной группе и группе, которой вводили плазмиду с MRAP2 мыши, составляли 1359 мм и 601 мм, соответственно. Таким образом, обнаруживали, что размер опухоли значимо снижался в группе, которой вводили плазмиду с MRAP2 мыши. В результате, что касается выживаемости в модели профилактики, все животные из контрольной группы умирали к 61 дню после введения; в то время как в группе, которой вводили плазмиду с MRAP2 мыши, 60% мышей оставались живыми. Учитывая эти результаты, подтверждали значимый противоопухолевый эффект в группе, которой вводили плазмиду с MRAP2 мыши, по сравнению с контрольной группой.
[0079]
(3) Противоопухолевый эффект MRAP2 мыши в случае ДНК-вакцины, способ 2
Использовали пять мышей A/J (возрастом 7 недель, самцы, приобретенные в Japan SLC, Inc.). Трубку (MRAP2 мыши/трубку), полученную, как указано выше, иммобилизовали в генной пушке. ДНК-вакцину вводили подкожно в область брюшной полости мышей с помощью чистого газообразного гелия под давлением 2,758e+6 Па три раза каждые 7 дней (количество инокулируемой плазмидной ДНК: 2 мкг/животное). После подкожного введения линию меланомных клеток мыши B16, как обнаружено в примере 1, экспрессирующую ген MRAP2, пересаживали каждой мыши для оценки противоопухолевого эффекта (обозначенной как модель профилактики). Для контроля 5 мышам в группе модели профилактики вводили плазмидную ДНК без вставки гена MRAP2 мыши.
2
3
3
Противоопухолевый эффект оценивали по размеру опухоли (длинный диаметр×(короткий диаметр)/2) и доле выживших мышей. В результате в модели профилактики размеры опухолей через 28 дней в контрольной группе и группе, которой вводили плазмиду с MRAP2 мыши, составляли 936 мми 483 мм, соответственно. Таким образом, обнаруживали, что размер опухоли значимо снижался в группе, которой вводили плазмиду с MRAP2 мыши. В результате, что касается выживаемости в модели профилактики, все животные из контрольной группы умирали к 68 дню после введения; в то время как в группе, которой вводили плазмиду с MRAP2 мыши, 60% мышей оставались живыми. Учитывая эти результаты, подтверждали значимый противоопухолевый эффект в группе, которой вводили плазмиду с MRAP2 мыши, по сравнению с контрольной группой.
[0080]
in vivo
(4) Получение рекомбинантного вектора, экспрессирующего MRAP2 человека
in vivo,
Рекомбинантный вектор, экспрессирующий MRAP2 человека получали на основе нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, следующим способом. ПЦР осуществляли следующим способом. Реакционную смесь получали, добавляя следующие реагенты: кДНК (1 мкл), полученную из линии лейкозных клеток человека K562 (приобретенной в ATCC), экспрессию которой наблюдали в примере 1, два типа праймеров (0,4 мкМ каждого), имеющих участки рестрикции EcoRI и NotI (представленные в SEQ ID NO: 19 и 20), 0,2 мМ dNTP и 1,25 ед. полимеразы PrimeSTAR HS (Takara Shuzo Co.,Ltd.) и сопутствующий буфера так, чтобы получать общее количество 50 мкл; и подвергали ПЦР с использованием термоциклера (BIO RAD). При ПЦР повторяли 30 циклов, где один цикл состоял из следующего: 98°C в течение 10 секунд; 55°C в течение 15 секунд и 72°C в течение 1 минуты. Указанные выше два типа праймеров использовали для амплификации области, кодирующей полноразмерную аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. После ПЦР амплифицированную ДНК подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле и фрагмент ДНК размером приблизительно 600 п.н. очищали с использованием набора QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN).
[0081]
E. coli
Очищенный фрагмент ДНК лигировали в клонирующий вектор pCR-Blunt (Life Technology), с помощью которого затем трансформировали клетки , затем собирая плазмидный вектор. С помощью его секвенирования подтверждали, что последовательность амплифицированного фрагмента гена являлась идентичной желаемой последовательности. Плазмиду, последовательность которой являлась идентичной желаемой последовательности, обрабатывали ферментами рестрикции EcoRI и NotI. После очистки с использованием набора QIAquick Gel Extraction Kit желаемую последовательность гена встраивали в экспрессирующий вектор млекопитающего pcDNA3.1 (Invitrogen), обработанный ферментами рестрикции EcoRI и NotI (далее в настоящем описании обозначаемый как MRAP2 мыши/pcDNA3.1). Благодаря использованию вектора белок MRAP2 человека продуцируется в клетке млекопитающего.
[0082]
2
К плазмидной ДНК (100 мкг), полученной, как описано выше, добавляли 50 мкг частиц золота (Bio Rad), спермидин (100 мкл) (SIGMA) и 1 M CaCl (100 мкл (SIGMA)). Смесь перемешивали на центрифуге типа вортекс и позволяли ей отстаиваться в течение 10 минут при комнатной температуре (далее в настоящем описании ее обозначали как "частицы золото-ДНК"). После центрифугирования при 3000 об./мин. в течение одной минуты супернатант выбрасывали, затем осадок три раза промывали 100% этанолом (WAKO). К частицам золото-ДНК добавляли 100% этанол (6 мл) и смесь перемешивали в достаточной степени на центрифуге типа вортекс. Частицы золото-ДНК наливали в тюбинг Tefzel (Bio Rad) для их осаждения на его стенках. Тюбинг Tefzel с прикрепленными частицами золото-ДНК сушили воздухом, удаляя этанол, а затем нарезали на куски длиной, подходящей для использования генной пушке (далее в настоящем описании обозначаемых как MRAP2 человека/трубка).
[0083]
(5) Получение клеток, стабильно экспрессирующих полноразмерный MRAP2 человека
MRAP2 человека/pcDNA3.1, полученную, как указано выше, встраивали способом липофекции в линию клеток нейробластомы мыши N2 (ATCC), а затем осуществляли селекцию с использованием 500 мкг/мл G418 (Nacalai Tesque, Inc.) для получения линии клеток N2, стабильно экспрессирующих полноразмерный MRAP2 человека (N2a-MRAP2 человека). Клетки, полученные посредством встраивания экспрессирующего вектора (обозначаемого в настоящем описании как emp/pcDNA3.1) без вставки кДНК, кодирующей MRAP2 человека, а затем осуществления селекции, как описано выше, использовали в качестве контрольных клеток (обозначаемых в настоящем описании как N2a-emp).
[0084]
(6) Противоопухолевый эффект MRAP2 человека в случае ДНК-вакцины
Использовали пять мышей A/J (возрастом 7 недель, самцы, приобретенные в Japan SLC, Inc.). Трубку (MRAP2 человека/трубку), полученную, как указано выше, иммобилизовали в генной пушке. НК-вакцину вводили подкожно в область брюшной полости мышей с помощью чистого газообразного гелия под давлением 2,758e+6 Па три раза каждые 7 дней (количество инокулируемой плазмидной ДНК: 2 мкг/животное). После подкожного введения N2a-MRAP2 человека или N2a-emp в качестве контрольных клеток, полученных, как описано выше, пересаживали каждой мыши для оценки противоопухолевого эффекта (обозначенной как модель профилактики). Для контроля 5 мышам в модели профилактики вводили плазмидную ДНК без вставки гена MRAP2 человека.
[0085]
2
3
3
Противоопухолевый эффект оценивали по размеру опухоли (длинный диаметр ×(короткий диаметр)/2) и доле выживших мышей. В результате в модели профилактики с использованием N2a-MRAP2 человека размеры опухолей через 28 дней в контрольной группе и группе, которой вводили плазмиду с MRAP2 человека, составляли 1379 мми 513 мм, соответственно. Таким образом, обнаруживали, что размер опухоли значимо снижался в группе, которой вводили плазмиду с MRAP2 человека. В результате, что касается выживаемости в модели профилактики, все животные из контрольной группы умирали к 61 дню после введения; в то время как в группе, которой вводили плазмиду с MRAP2 человека, 60% мышей оставались живыми. Учитывая эти результаты, подтверждали значимый противоопухолевый эффект в группе, которой вводили плазмиду с MRAP2 человека, по сравнению с контрольной группой в модели профилактики с использованием N2a-MRAP2 человека. С другой стороны, не наблюдали значимого противоопухолевого эффекта в группе, которой вводили плазмиду с MRAP2 человека, по сравнению с контрольной группой в модели профилактики с использованием N2a-emp.
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
[0086]
Настоящее изобретение относится к иммуноиндуцирующему средству, содержащему полипептид, проявляющий противоопухолевую активность в отношении злокачественных новообразований, и, таким образом, применимому для лечения и/или профилактики злокачественных новообразований.
Все публикации, патенты и патентные заявки, процитированные в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.