Диск для приготовления жидких питательных сред, содержащих индикаторы pH или редокс-потенциала

Полезная модель относится к области микробиологии и может найти применение для приготовления питательной среды, включающей в свой состав индикаторы рН и/или редокс-потенциала.
Наиболее близким и выбранным за прототип изделием является диск, применяемый в диско-диффузионном методе (Bauer, AW; Kirby, WM; Sherris, JC; Turck, M / Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method // American Journal of Clinical Pathology, 1966). Он состоит из подложки и сорбированного слоя. Подложка выполнена из картона фильтровального, изготовленного из беленой сульфатной целлюлозы, а в качестве сорбированного слоя выступает антимикробный препарат в заданной регламентирующими документами концентрации. Данные изделия широко используются для исследования чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам. Однако основа данного диска, выполненная из фильтровальной бумаги, предназначена для диффузии антимикробного препарата из нее в плотную питательную среду, а не для быстрой десорбции нанесенного вещества в жидкую питательную среду. Таким образом, основа данного диска, выполненная из фильтровальной бумаги, не подходит в качестве матрицы для внесения индикатора в жидкую питательную среду.
Предложенное авторами решение позволяет расширить арсенал используемых средств (дисков, использующихся для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам), а также позволяет приготовить питательные среды для культивирования микроорганизмов, содержащей индикаторы рН или редокс-потенциала.
Актуальность применения данной полезной модели обусловлена следующими причинами:
индикаторы рН и редокс-потенциала в концентрациях около 0,01% часто входят в состав различных питательных сред для культивирования микроорганизмов. Применение данных соединений позволяет визуализировать изменения, связанные с метаболической активностью исследуемого штамма микроорганизмов;
в связи с возрастающей частотой использования микрообъемных методов в лабораторной диагностике, возникает задача разработки быстрого и удобного способа приготовления небольшого объема питательной среды, включающей в свой состав индикаторы рН или редокс-потенциала. Кроме того, обеспечен следующий технический результат:
снижено время приготовления окрашенной питательной среды - реализуется внесением точной дозы индикатора, не требующим приготовления навески или стокового раствора;
остается возможность варьирования концентрации индикатора кратно количеству внесенных в питательную среду дисков;
увеличен срок хранения индикатора, что обеспечивается сорбцией вещества на бумажной матрице, что повышает стабильность при хранении;
уменьшена емкость тары, необходимая для хранения индикатора - реализуется за счет того, что наименьший объем занимает вещество в сухом, нерастворенном виде на компактной подложке;
снижены риски при хранении наборов реагентов, содержащих индикаторы, поскольку порча индикатора не приводит к непригодности тех компонентов набора, в которые он мог быть добавлен.
2
Сущность полезной модели сводится к следующему: полезная модель представляет собой диск, состоящий из подложки и сорбированного слоя, отличающийся тем, что подложка выполнена из высокоплотной каландрированной мелованной бумаги толщиной 150±50 мкм, а сорбированный слой представляет рН-индикатор или индикатор окислительно-восстановительного потенциала. Данный вид бумаги (150±50 мкм, 70-80 г/м), с одной стороны, широко используется в типографии, поэтому является доступным и недорогим сырьем для производства дисков, а с другой стороны обладает оптимальными параметрами для процессов сорбции/десорбции индикаторов с ее поверхности в жидкость.
Использование дисков позволяет приготовить окрашенную питательную среду с индикатором (рН или редокс-потенциала) путем внесения индикаторных дисков с меньшей затратой времени, а также увеличить срок хранения индикаторов, благодаря сорбции на бумажной подложке.
Известны следующие способы приготовления питательных сред, содержащих индикатор рН или индикатор редокс-потенциала.
1) Внесение раствора индикатора в питательную среду в ходе ее приготовления непосредственно перед использованием.
Способ непосредственного внесения раствора индикатора в питательную среду позволяет точно внести необходимое количество индикатора, но только при условии правильного приготовления раствора индикатора [Поляк М.С. Питательные среды для медицинской микробиологии, стр. 10]. Следует отметить, что приготовление растворов индикаторов требует точного взвешивания с использованием аналитических весов, а также дополнительных реактивов для растворения (например, гидроксида натрия), не всегда имеющихся в наличии. Таким образом, приготовление раствора индикатора требует значительного количества времени. Также, многие индикаторы нецелесообразно заготавливать заранее, вследствие их нестабильности при хранении.
2) Внесение раствора индикатора в питательную среду в ходе ее приготовления с последующей сублимационной сушкой. Таким способом пользуются производители коммерческих питательных сред. Например, MERCK (Бульонная основа с феноловым красным) [справочник по микробиологии стр. 386], HiMedia (Бульон лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью) [http//www.himedialabs.ru/]. Данный способ позволяет максимально снизить трудозатраты потребителя, но обладает следующими недостатками: невозможно добавить другой индикатор или варьировать содержание его в питательной среде; в ходе хранения питательной среды индикатор может потерять свои свойства, что сделает невозможным использование данной питательной среды.
3) Сорбция индикатора на поверхности емкости, в которую далее будет внесен растворитель или питательная среда. Недостатком данного способа является то, что в ходе хранения питательной среды вероятность потери свойств индикатора при использовании данного способа внесения выше, чем в способе №2 [Лабинская А.С. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований, стр. 373].
Полезная модель реализуется следующим образом:
Пример 1. Приготовление растворов индикаторов для нанесения на подложку.
I. Приготовление раствора комбинированного рН-индикатора.
Состав (на 1 литр):
1. Феноловый красный - 0,8% раствор в 0,05 Н натрия гидроксиде - 333 мл.
2. Бриллиантовый синий - 0,6% раствор в 0,05 Н натрия гидроксиде - 333 мл.
3. Бромтимоловый синий - 0,8% раствор в 0,05 Н натрия гидроксиде - 333 мл.
Для приготовления раствора комбинированного рН-индикатора растворы смешивают в пропорции 1:1:1 и доводят дистиллированной водой до 1 л.
Выбор рН-индикатора обусловлен определенным интервалом изменения окраски, необходимым для регистрации жизнедеятельности микроорганизмов (точка перехода фенолового красного около 7,5, а бромтимолового синего - около 6,5).
II. Приготовление раствора окислительно-восстановительного индикатора.
Состав (на 1 литр):
1. Резазурина натриевая соль (резазурин) - 10 г
2. Диметилсульфоксид (ДМСО) - 500 мл
3. Спирт этиловый 70% - 500 мл
Для приготовления раствора окислительно-восстановительного индикатора к 10 г резазурина добавить 500 мл ДМСО, перемешать. Полученную смесь довести 70% этиловым спиртом до объема 1 л и тщательно перемешать. Благодаря сорбции раствора окислительно-восстановительного индикатора на бумажной матрице, повышается стабильность вещества при хранении, а соответственно и срок годности индикатора.
Пример 2. Нанесение раствора индикатора на подложку и изготовление бумажных дисков из высокоплотной каландрированной мелованной бумаги.
Диски производятся методом штамповки на вырубном штампе из предварительно нарезанных под размер матрицы штампа заготовок высокоплотной каландрированной мелованной бумаги.
Приготовленный раствор окислительно-восстановительного или рН-индикатора наносят на подложку из высокоплотной каландрированной мелованной бумаги в количестве 10 мкл раствора индикатора на диск. Диски с раствором индикатора помещают в термостат на 18 ч, затем вынимают и герметично укупоривают во флаконы, содержащие влагопоглотитель в количестве 1 г на 100 дисков.
Пример 3. Изготовление бумажных дисков из фильтровальной бумаги.
Был исследован способ изготовления дисков из двух видов бумаги, которые впоследствии пропитывали растворами индикаторов. В четыре пробирки типа «Эппендорф» добавили по 1 мл жидкой питательной среды. В две пробирки добавили по одному диску, изготовленному из высокоплотной каландрированной мелованной бумаги (с рН-индикатором и индикатором редокс-потенциала), а в оставшиеся - диски, изготовленные из фильтровальной бумаги. Встряхивание пробирок, содержащих индикаторные диски, осуществляли на встряхивателе V-3 plus типа Vortex. Результаты определения времени десорбции индикаторов с дисков, подложка которых выполнена из различных материалов, представлены в таблице 1.
Как видно из вышеприведенной таблицы, при использовании в качестве подложки фильтровальной бумаги, замедляется десорбция нанесенного на диск вещества в питательную среду.
Пример 4. Приготовление питательной среды, включающей в свой состав индикаторы рН или редокс-потенциала.
Для получения окрашенной питательной среды в пробирку внести индикаторные диски из расчета 1 диск на 1 мл среды. Содержимое пробирки тщательно перемешать на Vortex. Диски с индикатором рН следует вносить при анализе ферментирующих бактерий, а диски с индикатором окислительно-восстановительного потенциала - при анализе неферментирующих бактерий.