СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСПЕЦИФИЧЕСКОГО ГИДРОГЕЛЕВОГО СОРБЕНТА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ПРОТЕИНАЗ
METHOD OF OBTAINING BIOSPECIFIC HYDROGEL SORBENT FOR SEPARATION OF PROTEINASES

Изобретение относится к области химии полимеров, биохимии и медицины, а именно к способу получения биоспецифического гидрогелевого сорбента для выделения протеиназ. Сорбент используют для удаления протеолитических ферментов из водных растворов, включая кровь, с целью детоксикации организма при патологических состояниях, сопровождающихся активацией протеолиза и ферментной интоксикацией, включая сепсис, гнойный перитонит, панкреатит, бронхиальную астму и т.п.
Известен способ получения биоспецифического гидрогелевого сорбента для выделения протеиназ путем взаимодействия ингибитора трипсина из сои с активированным сшитым полисахаридом - сефарозой [Gilliam E.B., Kitto G.B., Isolation of starfish trypsin by affinity chromatography, Comparative Biochemistry and Physiology. 1976. V.54. №1. P.21-26].
Недостатком известного способа является невысокая эффективность использования иммобилизованного ингибитора трипсина из сои. Емкость сорбента составляет 0,2 мг фермента на 1 мг химически связанного с полимером ингибитора.
Известен способ получения биоспецифического гидрогелевого сорбента для выделения протеиназ путем радикальной полимеризации при комнатной температуре под действием окислительно-восстановительного катализатора полимеризации водного раствора, содержащего 0.1-0.9% масс. овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты, 7.0-12.0% масс. акриламида и 0.5-1.1% масс. N,N′-метиленбисакриламида, с последующим измельчением образующегося гидрогеля и промыванием его бикарбонатным буфером до полного удаления непрореагировавших соединений [Авторское свидетельство СССР №1137388 A, G01N 33/50, Бюл. №4, 1985].
Этот сорбент под названием «Овосорб» находит практическое применение для удаления протеолитических ферментов из крови, с целью детоксикации организма при патологических состояниях, сопровождающихся активацией протеолиза и ферментной интоксикацией, включая общий гнойный перитонит, острый деструктивный панкреатит, обширные гнойно-некротические процессы мягких тканей, ожоговая болезнь, синдром сдавливания, синдром отторжения после трансплантации органов и тканей, лучевая болезнь, острая печеночная недостаточность, острая и хроническая почечная недостаточность, бронхиальная астма и т.д.
Недостатком известного способа является невысокая эффективность использования иммобилизованного овомукоида - самого дорогого компонента сорбента и длительное время проведения операции сорбции. Емкость сорбента составляет 0.8-1.0 мг фермента на 1 мг связанного с полимером овомукоида при сорбции в течение 90-100 минут. Теоретически возможная емкость сорбента составляет 2.4 мг фермента на 1 мг овомукоида (одна молекула овомукоида с ММ 31000 способна одновременно связать одну молекулу химотрипсина с ММ 25000 и две молекулы трипсина с ММ 25000). Большие времена проведения операции гемосорбции при извлечении ферментов из крови больных требуют дополнительного введения антикоагулянтов крови и их последующую нейтрализацию. Это существенно осложняет проведение операции.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемым результатам является способ получения биоспецифического гидрогелевого сорбента для выделения протеиназ путем радикальной полимеризации при комнатной температуре раствора, содержащего 7.0-12.0% масс. акриламида, 0.1-0.9% масс. овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты, 0.5-1.1% масс. сшивающего агента - N,N′-метиленбисакриламида, 0.01-0.12% масс. модифицирующей добавки - меркаптоуксусной кислоты и дистиллированную воду, под действием окислительно-восстановительного катализатора с последующим измельчением образующегося гидрогеля и промыванием его бикарбонатным буфером до полного удаления непрореагировавших соединений [Патент Российской Федерации №2484475. Бюл. №16. 2013].
Максимальная емкость сорбента при извлечении ферментов из плазмы крови человека составляет 1.72-1.75 мг фермента на 1 мг связанного с полимером овомукоида и достигается при временах проведения операции сорбции 120 минут. Причиной такой емкости сорбента является изменение структуры сорбента под действием меркаптоуксусной кислоты. В сорбенте, полученном в присутствии меркаптоуксусной кислоты, количество пор большого размера, доступных для соединений с ММ 141000, составляет 18-23% от суммарного количества пор. Невысокое количество пор большого размера делает сорбент менее проницаемым для сорбируемых соединений и приводит к необходимости увеличения времени проведения операции сорбции для полного насыщения сорбента до 100-120 минут.
Недостатком известного способа является невысокая емкость сорбента (73% от теоретически возможного) и длительное время проведения операции сорбции.
Задачей изобретения и техническим результатом, достигаемым при его использовании, являются повышение емкости сорбента и сокращение времени проведения операции сорбции.
Технический результат достигается тем, что в способе получения биоспецифического гидрогелевого сорбента для выделения протеиназ путем радикальной полимеризации при комнатной температуре водного раствора, содержащего акриламид, овомукоид из белка утиных яиц, ацилированный хлорангидридом акриловой кислоты, сшивающий агент, модифицирующую добавку и водную среду, под действием окислительно-восстановительного катализатора с последующим измельчением образующегося гидрогеля и промыванием его бикарбонатным буфером до полного удаления непрореагировавших соединений, в качестве сшивающего агента используют смесь, состоящую из 45-65% масс. диметакрилата этиленгликоля и 35-55% масс. диметакрилата тридекаэтиленгликоля, в качестве модифицирующей добавки используют водорастворимый полимер, в качестве водной среды - бикарбонатный буфер, а водный раствор содержит, % масс.: акриламид - 7.0-10.0, указанный ацилированный овомукоид - 0.1-0.9, указанный сшивающий агент - 0.5-1.0, водорастворимый полимер - 0.5-1.5, бикарбонатный буфер - остальное. В качестве водорастворимого полимера используют полиакриламид, поли-N-винилпирролидон, поливиниловый спирт.
Используемый овомукоид является ингибитором протеолитических ферментов и относится к классу гликопротеинов. Он имеет молекулярную массу 31000 и содержит 12.5% глюкозамина и 7.8% других сахаров. Его выделяют из белка утиных яиц по методике [Шульгин М.Н., Валуева Т.А., Кестере А.Я., Мосолов В.В. Свойства утиного овомукоида, очищенного методом аффинной хроматографии на трипсин-сефарозе. Биохимия, 1981. Т.46. №3. С.473-480].
Ацилирование овомукоида проводят растворением 100 мг овомукоида в 20 мл раствора бикарбоната аммония с pH 8.0, добавлением к полученному раствору при 0-5°C 0.01 мл хлорангидрида акриловой кислоты и перемешиванием смеси в течение 15 минут. Ацилированный овомукоид выделяют путем лиофильного высушивания.
Пример 1. В 87 мл бикарбонатного буфера (pH 8.0) растворяют 0.1 г овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты, 10.0 г акриламида, 1.0 г полиакриламида и 1.0 г смеси сшивающих агентов, состоящей из 0.65 г диметакрилата этиленгликоля (ДМЭГ) и 0.35 г диметакрилата тридекаэтиленгликоля (ТГМ) (т.е. 65% масс. ДМЭГ и 35% масс. ТГМ). В полученный раствор добавляют окислительно-восстановительный катализатор полимеризации: 0.01 г персульфата аммония и 0.2 мл 0.4%-ного водного раствора N,N,N′,N′-тетраметилэтилендиамина. Раствор вакуумируют при давлении 10-14 мм рт.ст. и полимеризацию проводят выдерживанием реакционной смеси при 15-20°C в течение 1 часа. Образующийся гидрогель измельчают и промывают бикарбонатным буфером (pH 8.0) до полного удаления непрореагировавших соединений (до тех пор, пока показатель преломления промывных вод не становится равным показателю преломления исходного бикарбонатного буфера).
Для изучения емкости сорбента его помещают в колонку объемом 25 мл и через колонку пропускают плазму крови человека, содержащие 2,0 мг трипсина и 1,1 мг α-химотрипсина в 1 мл, до полного насыщения сорбента. Количество сорбированных ферментов определяют путем смывания их с колонки водным раствором с pH 1,5.
Примеры 2-8. Процесс проводят по примеру 1, используя различные компоненты реакционной смеси (таблица 1).
Примеры 9-12 (контрольные). Процесс проводят по примеру 1, используя компоненты реакционной смеси в количествах, лежащих вне заявленных пределов (таблица 1).
В примерах 13-14 гидрогелевый сорбент получают по прототипу.
Полученные сорбенты характеризуют следующими свойствами:
1. Содержание химически связанного овомукоида в сорбенте (определяют как разность количества овомукоида в исходном растворе и в промывных водах).
2. Емкость сорбента по протеолитическим ферментам (определяют путем выдерживания набухшего сорбента в плазме крови человека, содержащей 2.0 мг трипсина и 1.1 мг α-химотрипсина в 1 мл, в течение 30, 60 и 120 минут при перемешивании и измерением количества поглощенных ферментов).
3. Количество пор, доступных для белка с молекулярной массой 141000 (алкогольдегидрогеназа из дрожжей), определяют путем выдерживания измельченных сорбентов в водном растворе белка; затем из равновесных степеней набухания сорбента в воде находят общий объем пор в сорбенте и, измеряя равновесную концентрацию белка после инкубирования с сорбентом, находят долю пор, проницаемых для этого белка. Полученные результаты приведены в таблице 2.
Таблица 1
Составы водных растворов для получения гидрогелевого сорбента.
№ примера
Кол-во ацилированного овомукоида, % масс.
Кол-во акриламида, % масс.
Полимер и его кол-во, % масс.
Общее кол-во сшивающего агента, % масс.
ДМЭГ, г
ТГМ, г
ДМГ/ТМГ, % масс.
Водная среда, % масс.
1
0.1
10.0
Полиакриламид, 1.0
1.0
0.65
0.35
65/35
87.9
2
0.3
10.0
Полиакриламид, 1.0
1.0
0.45
0.55
45/55
87.7
3
0.5
10.0
Полиакриламид, 1.0
0.5
0.25
0.25
50/50
88
4
0.8
8.0
Полиакриловая кислота, 1.0
0.7
0.35
0.35
50/50
89.5
5
0.9
7.0
Поли-N-винил-пирролидон, 1.5
1.0
0.5
0.5
50/50
89.6
6
0.7
7.0
Полиакриламид, 0.5
1.0
0.6
0.4
60/40
90.8
7
0.4
10.0
Полиакриламид, 1.5
0.8
0.4
0.4
50/50
87.3
8
0.5
9.0
Поливиниловый спирт, 1.0
0.5
0.25
0.25
50/50
89
9к
0.7
10.0
нет
1.0
0.6
0.4
60/40
88.3
10к
0.7
10.0
Полиакриламид, 0.5
1.0
нет
1.0
-
87.8
11к
0.7
10.0
Полиакриламид, 0.5
1.0
1.0
нет
-
87.8
12к
0.7
10.0
Полиакриламид, 2.0
1.0
0.5
0.5
50/50
86.3
13 (прототип)
0.1
8.0
Нет
N,N-метиленбисакриламид, 1.0
нет
нет
Дистиллированная вода, 90.9
14 (прототип)
0.8
10.0
Нет
N,N-метиленбисакриламид, 0.5
нет
нет
Дистиллированная вода, 88.7
Таблица 2
Свойства полученных сорбентов.
№ примера
Кол-во овомукоида в сорбенте,мг/мл
Емкость по ферментам, мг/ мг овомукоида
Кол-во пор, доступных для соединений с ММ 141000
Через 30 минут сорбции
Через 60 минут сорбции
Через 120 минут сорбции
1
0.6
2.14
2.22
2.27
44
2
2.0
2.00
2.06
2.10
40
3
2.7
1.96
2.00
2.05
51
4
5.4
1.90
1.93
2.00
50
5
6.2
1.84
1.93
1.97
46
6
4.8
1.98
2.10
2.14
45
7
2.7
2.00
2.10
2.11
50
8
2.4
2.02
2.12
2.13
40
9к
5.1
0.45
0.87
1.08
22
10к
4.8
0.48
0.80
0.96
31
11к
4.5
0.44
0.90
1.05
28
12к
6.2
0.84
1.52
1.66
20
13 прототип
0.6
0.77
1.30
1.75
18
14 прототип
1.8
0.83
1.42
1.72
23
Из табл.2 видно, что использование предложенного способа позволяет получать биоспецифический гидрогелевый сорбент с повышенной эффективностью использования овомукоида (до 2.27 мг фермента на 1 мг иммобилизованного овомукоида вместо 1.75 мг фермента на 1 мг иммобилизованного овомукоида по способу-прототипу) и повышенной скоростью сорбции ферментов (за первые 30 минут сорбент сорбирует до 95% от предельно возможного количества сорбированных ферментов, достигаемого за 120 минут; в то время как в способе-прототипе эта величина не превышает 48%). Причина повышенной скорости сорбции обусловлена особенностями структуры сорбента. Получаемый сорбент содержит до 50% пор, проницаемых для высокомолекулярных белков. Сорбент, получаемый по способу-прототипу, содержит 18-23% пор аналогичного размера. В контрольных примерах, в которых компоненты используют в количествах, лежащих вне заявленных пределах, эффективность использования овомукоида не превышает 1.66 мг фермента на 1 мг иммобилизованного овомукоида, а за первые 30 минут сорбции сорбируется не более 30% от предельно возможного количества сорбируемых ферментов.
Таким образом, предложенный способ позволяет получать биоспецифический гидрогелевый сорбент, обладающий лучшими эксплуатационными характеристиками, по сравнению с сорбентом, полученным по способу-прототипу.