ПРОФИЛАКТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО ПРОТИВ ВАСКУЛИТА
PROPHYLACTIC DRUG FOR VASCULITIS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение имеет отношение к новому профилактическому и/или терапевтическому средству против васкулита.
Уровень техники
Васкулит является одним из трудноизлечимых патологических состояний, обычно наблюдаемых при аутоиммунных заболеваниях, и многие его случаи трудно поддаются лечению с помощью общепринятых терапевтических способов, таких как применение стероидов и иммунодепрессантов, и поэтому происходил поиск новых терапевтических способов. При васкулитном синдроме возникает воспаление в артериях различных размеров и лихорадка, боль в мышцах и суставах, окклюзия сосудов, язвы кожи, и может развиваться множественный мононеврит. Васкулит включает трудноизлечимый васкулитный синдром, такой как нодозный полиартериит и синдром аортита. Поражения нодозным полиартериитом характеризуются некротическими воспалениями средней оболочки стенки кровеносного сосуда и адвентиции.
Аортит также называют артериитом Такаясу. Предполагают, что патология васкулита связана с IL-6. Например, Noris et al. сообщили, что уровень IL-6 в крови увеличивается у пациентов с артериитом Такаясу в активной стадии патологии по сравнению с нормальными здоровыми людьми (Circulation 1999 Jul 6; 100 (1); 55-60). Однако в этой статье также сообщается, что концентрация в сыворотке крови RANTES, одного из хемокинов, также увеличивается. Noris et al. также предположили возможность того, что эти цитокины отвечают за васкулитные поражения у пациентов с артериитом Такаясу.
Раскрытие изобретения
В статье, однако, не делается никаких упоминаний о возможности того, что артериит Такаясу можно лечить, ингибируя IL-6. Поэтому настоящее изобретение обеспечивает профилактические и/или терапевтические средства против васкулита, включающие антагонист IL-6 в качестве активного ингредиента.
После интенсивного и обширного исследования авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что IL-6 является обязательным участником в патологии васкулита и что антагонист IL-6 обладает терапевтическим эффектом при васкулите. К удивлению, в исследовании, проведенном авторами настоящего изобретения, было обнаружено, что если связывание IL-6 с его рецептором ингибировалось антителом к рецептору IL-6, уровень IL-6 в крови per se уменьшался. Таким образом, было показано, что терапия, основанная на ингибировании IL-6, не только сама по себе обладает противовоспалительным эффектом при васкулите, но также лечит васкулит, действуя на саму суть заболевания.
Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает профилактическое и/или терапевтическое средство против васкулита, указанное средство включает в качестве активного ингредиента антагонист интерлейкина-6 (IL-6).
Настоящее изобретение обеспечивает профилактическое и/или терапевтическое средство против васкулита, устойчивого к стероидам и/или иммунодепрессантам, указанное средство включает в качестве активного ингредиента антагонист интерлейкина-6 (IL-6).
Указанный выше васкулит представляет собой, например, нодозный полиартериит, синдром аортита или васкулит, который ассоциирован с иммунологическими аномалиями. Синдром аортита также называют артериитом Такаясу. В качестве васкулита, ассоциированного с иммунологическими аномалиями, например, можно упомянуть васкулит, ассоциированный с ревматизмом, и васкулит, ассоциированный с системной красной волчанкой (SLE).
Указанный выше антагонист IL-6 представляет собой, например, антитело к IL-6 или антитело к рецептору IL-6, предпочтительно моноклональное антитело к рецептору IL-6. Указанное антитело к рецептору IL-6 наиболее предпочтительно представляет собой моноклональное антитело к человеческому рецептору IL-6, например антитело РМ-1, или моноклональное антитело к мышиному рецептору IL-6, например антитело MR16-1. Указанное выше антитело к рецептору IL-6 предпочтительно является рекомбинантным антителом.
Указанное антитело к рецептору IL-6 может быть химерным антителом, гуманизированным антителом или человеческим антителом. В качестве применяемого здесь антитела наиболее предпочтительным является гуманизированное антитело РМ-1.
Настоящее изобретение может также иметь следующие аспекты.
(1) Применение антагониста интерлейкина-6 (IL-6) для изготовления профилактического и/или терапевтического средства против васкулита.
(2) Применение антагониста интерлейкина-6 (IL-6) для изготовления профилактического и/или терапевтического средства против васкулита, обладающего устойчивостью к стероидам и/или иммунодепрессантам.
(3) Применение по (1) или (2), в которых указанный васкулит является нодозным полиартериитом.
(4) Применение по (1) или (2), в которых указанный васкулит является синдромом аортита.
(5) Применение по (1) или (2), в которых указанный васкулит является васкулитом, ассоциированным с иммунологическими аномалиями.
(6) Применение по любому из (1)-(5), в которых указанный антагонист IL-6 является антителом к рецептору IL-6.
(7) Применение по (6), в котором указанное антитело к рецептору IL-6 является моноклональным антителом к рецептору IL-6.
(8) Применение по (6), в котором указанное антитело к рецептору IL-6 является моноклональным антителом к человеческому рецептору IL-6.
(9) Применение по (6), в котором указанное антитело к рецептору IL-6 является моноклональным антителом к мышиному рецептору IL-6.
(10) Применение по любому из (6)-(9), в которых указанное антитело к рецептору IL-6 является рекомбинантным антителом.
(11) Применение по (8), в котором указанное моноклональное антитело к человеческому рецептору IL-6 является антителом РМ-1.
(12) Применение по (8), в котором указанное моноклональное антитело к мышиному рецептору IL-6 является антителом MR16-1.
(13) Применение по любому из (6)-(12), в которых указанное антитело к рецептору IL-6 является химерным антителом, гуманизированным антителом или человеческим антителом.
(14) Применение по (13), в котором указанное гуманизированное антитело к рецептору IL-6 является гуманизированным антителом РМ-1.
(15) Способ предупреждения и/или лечения васкулита, включающий введение антагониста интерлейкина-6 (IL-6).
(16) Способ предупреждения и/или лечения васкулита, обладающего устойчивостью к стероидам и/или иммунодепрессантам, включающий введение антагониста интерлейкина-6 (IL-6).
(17) Способ по (15) или (16), в которых указанный васкулит является нодозным полиартериитом.
(18) Способ по (15) или (16), в которых указанный васкулит является синдромом аортита.
(19) Способ по (15) или (16), в которых указанный васкулит является васкулитом, ассоциированным с иммунологическими аномалиями.
(20) Способ по любому из (15)-(19), в которых указанный антагонист IL-6 является антителом к рецептору IL-6.
(21) Способ по (20), в котором указанное антитело к рецептору IL-6 является моноклональным антителом к рецептору IL-6.
(22) Способ по (20), в котором указанное антитело к рецептору IL-6 является моноклональным антителом к человеческому рецептору IL-6.
(23) Способ по (20), в котором указанное антитело к рецептору IL-6 является моноклональным антителом к мышиному рецептору IL-6.
(24) Способ по любому из (20)-(23), в которых указанное антитело к рецептору IL-6 является рекомбинантным антителом.
(25) Способ по (22), в котором указанное моноклональное антитело к человеческому рецептору IL-6 является антителом РМ-1.
(26) Способ по (23), в котором указанное моноклональное антитело к мышиному рецептору IL-6 является антителом MR1.
(27) Способ по любому из (20)-(26), в которых указанное антитело к рецептору IL-6 является химерным антителом, гуманизированным антителом или человеческим антителом.
(28) Способ по (27), в котором указанное гуманизированное антитело к рецептору IL-6 является гуманизированным антителом РМ-1.
Краткое описание фигур
Фигура 1 представляет собой фотографию, показывающую результат компьютерной томографии (СТ) при лечении васкулитного синдрома с помощью гуманизированного антитела IL-6R, на которой верхняя стрелка указывает на восходящую часть дуги аорты и нижняя стрелка указывает на нисходящую часть аорты.
Фигура 2 представляет собой фотографию, показывающую результат СТ при лечении васкулитного синдрома с помощью гуманизированного антитела IL-6R, на которой стрелка указывает на арку аорты.
Фигура 3 представляет собой фотографию, показывающую результат СТ при лечении васкулитного синдрома с помощью гуманизированного антитела IL-6R, на которой верхняя стрелка указывает на восходящую часть дуги аорты и нижняя стрелка указывает на нисходящую часть аорты.
Фигура 4 представляет собой фотографию, показывающую результат СТ при лечении васкулитного синдрома с помощью гуманизированного антитела IL-6R, на которой верхняя стрелка указывает на восходящую часть дуги аорты и нижняя стрелка указывает на нисходящую часть аорты.
Фигура 5 представляет собой фотографию, показывающую результат СТ при лечении васкулитного синдрома с помощью гуманизированного антитела IL-6R, на которой стрелка указывает на арку аорты.
Фигура 6 представляет собой фотографию, показывающую результат СТ при лечении васкулитного синдрома с помощью гуманизированного антитела IL-6R, на которой верхняя стрелка указывает на восходящую часть дуги аорты, а нижняя стрелка указывает на нисходящую часть аорты.
Осуществление изобретения
IL-6 представляет собой цитокин, который также называют фактором-2, стимулирующим В-клетки (BSF2), или интерлейкином β2. IL-6 был открыт как фактор дифференцировки, вовлеченный в активацию В-лимфатических клеток (Hirano, Т. et al., Nature (1986) 324, 73-76). Впоследствии было обнаружено, что IL-6 является полифункциональным цитокином, который влияет на различные функции клеток (Akira, S. et al., Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78). Было показано, что IL-6 индуцирует созревание Т-лимфатических клеток (Lotz, M. et al., J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258).
IL-6 сообщает клеткам свою биологическую активность через два типа белков клетки. Один из них - рецептор IL-6, лиганд-связывающий белок с молекулярной массой около 80 кДа, к которому присоединяется IL-6 (Taga, Т. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981; Yamasaki, К. et al., Science (1987) 241, 825-828). Рецептор IL-6 встречается не только в мембраносвязанной форме, которая проникает и экспрессируется в клеточной мембране, но также в виде растворимого рецептора IL-6, в основном состоящего из внеклеточной части рецептора.
Другой белок представляет собой мембраносвязанный белок gp130, имеющий молекулярную массу около 130 кДа, который вовлечен в передачу сигнала без связывания лигандов. IL-6 и рецептор IL-6 образуют комплекс IL-6/рецептор IL-6, который после связывания с gp130 передает клетке биологически активный сигнал IL-6 (Taga, Т. et al., Cell (1989) 58, 573-581).
Антагонист IL-6 представляет собой вещество, которое ингибирует передачу биологически активного сигнала IL-6. В качестве антагонистов IL-6 до настоящего времени были известны антитело к IL-6 (анти-IL-6 антитело), антитело к рецептору IL-6 (анти-IL-6-рецепторное антитело), антитело к gp130 (анти-gp130 антитело), измененный IL-6, неполные пептиды IL-6 или неполные пептиды рецептора IL-6 и т.п.
Антитело к рецептору IL-6 описано в нескольких работах (Novick, D. et al., Hybridoma (1991) 10, 137-146, Huang, Y.W. et al., Hybridoma (1993) 12, 621-630, International Patent Publication WO 95-09873, French Patent Application FR 2694767, United States Patent US 521628). Гуманизированное антитело к РМ-1 было получено путем пересадки участка, определяющего комплементарность (CDR), одного из антител такого типа, мышиного антитела РМ-1 (Hirata, Y. et al., Immunology (1989) 143, 2900-2906), в антитело человека (International Patent Publication WO 92-19759).
Указанный антагонист IL-6 предпочтительно является антителом к рецептору IL-6, предпочтительно моноклональным антителом к человеческому рецептору IL-6 или моноклональным антителом к мышиному рецептору IL-6. Указанное выше моноклональное антитело к человеческому рецептору IL-6 можно проиллюстрировать на примере антитела РМ-1, а указанное выше моноклональное антитело к мышиному рецептору IL-6 можно проиллюстрировать на примере антитела MR16-1. Указанное антитело предпочтительно является химерным антителом, гуманизированным антителом или человеческим антителом, например гуманизированным антителом РМ-1.
Антагонисты IL-6 для применения в настоящем изобретении могут быть любого происхождения, любого вида и любой формы, до тех пор, пока они полезны в качестве активного ингредиента для профилактического или терапевтического эффекта при васкулите.
Антагонисты IL-6 блокируют передачу сигнала от IL-6 и ингибируют биологическую активность IL-6. Антагонисты IL-6 предпочтительно являются веществами, обладающими активностью, ингибирующей любой из IL-6, рецептора IL-6 и gp130. В качестве антагонистов IL-6 могут быть упомянуты, например, антитело к IL-6, антитело к рецептору IL-6, антитело к gp130, измененный IL-6, измененный растворимый рецептор IL-6, неполный пептид IL-6 или неполный пептид рецептора IL-6 и вещества с низкой молекулярной массой, обладающие такой же активностью, как и они.
Антитела к IL-6 для применения в настоящем изобретении можно получить в виде поликлональных или моноклональных антител с помощью известного метода. В качестве антител к IL-6 в настоящем изобретении предпочтительно применяются моноклональные антитела, в особенности антитела млекопитающих. Моноклональные антитела млекопитающих включают антитела, продуцируемые гибридомой, и рекомбинатное антитело, продуцируемое «хозяином», который был трансформирован с помощью экспрессионного вектора, включающего генетически сконструированные гены антител. Эти антитела, связываясь с IL-6, блокируют связывание IL-6 с рецептором IL-6 и, таким образом, блокируют передачу биологически активного сигнала IL-6 в клетку.
st
Примеры таких антител включают антитело МН166 (Matsuda Т. et al., Eur. J. Immunol. (1988) 18, 951-956) и антитело SK2 (Sato, К. et al., The 21 Nihon Menekigakkai Soukai (General Meeting of the Japan Immunology Society), Academic Record (1991) 21, 166) и т.п.
Гибридому, продуцирующую антитело к IL-6, можно в основном сконструировать, используя известную процедуру, описанную ниже. Таким образом, в качестве сенсибилизирующего антигена можно применять IL-6 и иммунизировать им с помощью традиционного метода иммунизации. Полученные таким образом иммунные клетки сливают с известными родительскими клетками в обычном процессе клеточного слияния, и затем, для получения требуемой гибридомы, клетки, продуцирующие моноклональное антитело, отбирают с помощью традиционных методов скрининга.
В частности, антитело к IL-6 можно получить следующим способом. Например, человеческий IL-6, применяемый в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антитела, можно получить, используя ген/аминокислотную последовательность IL-6, раскрытую в Eur. J. Biochem. (1987) 168, 543-550, J. Immunol. (1988) 140, 1534-1541 или в Agr. Biol. (1990) 54, 2685-2688.
После трансформации подходящей клетки-хозяина с помощью вставки генной последовательности IL-6 в известную систему экспрессионного вектора интересующий белок IL-6 очищают из клетки-хозяина или супернатанта культуры его клеток, и очищенный белок IL-6 может быть использован в качестве сенсибилизирующего антигена. Альтернативно, в качестве сенсибилизирующего антигена можно использовать белок, образованный слиянием IL-6 и другого белка.
Антитела к рецептору IL-6 для применения в настоящем изобретении могут быть получены в виде поликлональных или моноклональных антител с использованием известного метода. В качестве антител к IL-6 для применения в настоящем изобретении предпочтение имеют моноклональные антитела, в особенности антитела млекопитающих. Моноклональные антитела млекопитающих включают антитела, продуцируемые гибридомой, и антитела, продуцируемые «хозяином», который был трансформирован с помощью экспрессионного вектора, включающего генетически сконструированные гены антитела. Эти антитела, связываясь с рецептором IL-6, блокируют связывание IL-6 с рецептором IL-6 и, таким образом, блокируют передачу биологически активного сигнала IL-6 в клетку.
Примеры таких антител включают антитело MR16-1 (Tamura, Т. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928), антитело РМ-1 (Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906) или антитело AUK12-20, антитело AUK64-7 или антитело AUK146-15 (International Patent Publication WO 92-19759) и т.п. Среди них наиболее предпочтительным является антитело РМ-1.
В этой связи клеточная линия гибридомы РМ-1, которая продуцирует антитело РМ-1, была депонирована для международного признания 12 июля 1989 года в соответствии с условиями Будапештского договора как FERM ВР-2998 в Patent Microorganism Depository of National Institute of Industrial Science and Technology, Chuo 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan. Клеточная линия гибридомы, которая продуцирует антитело MR16-1, была депонирована для международного признания 13 марта 1997 года в соответствии с условиями Будапештского договора как FERM BP-5875 в Patent Microorganism Depository of National Institute of Industrial Science and Technology, Chuo 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan.
Гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело к рецептору IL-6, могут быть получены в основном с помощью известной процедуры, описанной ниже. Таким образом, в качестве сенсибилизирующего антигена применяют рецептор IL-6, и им иммунизируют с помощью обычного метода иммунизации. Полученные таким образом иммунные клетки сливают с известными родительскими клетками в обычном процессе клеточного слияния, и затем для получения требуемой гибридомы клетки, продуцирующие моноклональное антитело, отбирают с помощью традиционного метода скрининга.
В частности, антитело к рецептору IL-6 можно получить следующим способом. Например, человеческий рецептор IL-6, применяемый в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антитела, можно получить, используя ген/аминокислотную последовательность рецептора IL-6, раскрытую в European Patent Application EP 325474, и мышиный рецептор IL-6 можно получить, используя последовательность гена и аминокислотную последовательность рецептора IL-6, раскрытую в Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) 3-155795.
Существует два типа белков рецептора IL-6: рецептор IL-6, экспрессированный на клеточной мембране и рецептор IL-6, отделенный от клеточной мембраны (растворимый рецептор IL-6) (Yasukawa К. et al., J. Biochem. (1990) 108, 673-676). Растворимый рецептор IL-6 формируется в значительной степени из внеклеточного участка рецептора IL-6, связанного с клеточной мембраной, и, таким образом, отличается от мембрано-связанной формы рецептора IL-6 тем, что растворимый рецептор не содержит трансмембранный участок или трансмембранный участок вместе с внутриклеточным участком. В качестве белка рецептора IL-6 можно использовать любой рецептор IL-6 до тех пор, пока его можно применять в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антитела к рецептору IL-6 для применения в настоящем изобретении.
После того как последовательность гена рецептора IL-6 включают в известную экспрессионную векторную систему для трансформации подходящей клетки-хозяина, требуемый белок рецептора IL-6 может быть очищен из клетки-хозяина или из его клеточной культуры с помощью известного метода, и очищенный белок рецептора IL-6 может быть использован в качестве сенсибилизирующего антигена. Альтернативно, в качестве сенсибилизирующего антигена можно использовать клетки, экспрессирующие рецептор IL-6, или белок, образованный слиянием белка рецептора IL-6 и другого белка.
Е. coli, которая имеет плазмиду pIBIBSF2R, содержащую кДНК, кодирующую рецептор IL-6 человека, была депонирована для международного признания 9 января 1989 года в соответствии с условиями Будапештского договора как FERM ВР-2232 в Patent Microorganism Depository of National Institute of Industrial Science and Technology, Chuo 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan.
Антитела к gp130 для применения в настоящем изобретении могут быть получены в виде поликлональных или моноклональных антител с использованием известного метода. В качестве антител к gp130 для применения в настоящем изобретении предпочтительно используют моноклональные антитела, в особенности антитела млекопитающих. Моноклональные антитела млекопитающих включают антитела, продуцируемые гибридомой, и антитела, продуцируемые «хозяином», который был трансформирован с помощью экспрессионного вектора, включающего генетически сконструированные гены антитела. Антитела, связываясь с gp130, блокируют связывание комплекса IL-6/рецептор IL-6 с gp130 и, таким образом, блокируют передачу биологически активного сигнала IL-6 в клетку.
Примеры таких антител включают антитело АМ64 (Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) 3-219894), антитело 4В11 и антитело 2Н4 (US 5571513), антитело В-S12 и антитело В-Р8 (Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) 8-291199).
Гибридома, продуцирующая моноклональное антитело к gp130, может быть получена, в основном, с помощью известной процедуры, описанной ниже. Таким образом, gp130 применяют в качестве сенсибилизирующего антигена и используют для иммунизации с помощью обычного метода иммунизации. Полученные таким образом иммунные клетки сливают с известными родительскими клетками в обычном процессе клеточного слияния, и затем для получения желаемой гибридомы клетки, продуцирующие моноклональное антитело, отбирают с помощью традиционного метода скрининга.
В частности, моноклональное антитело можно получить следующим способом. Например, gp130, применяемый в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антитела, можно получить, используя ген/аминокислотную последовательность gp130, раскрытую в European Patent Application EP 411946.
После того как подходящую клетку-хозяина трансформируют путем включения последовательности гена gp130 в известную экспрессионную векторную систему, интересующий белок gp130 очищают из клетки-хозяина или из его клеточной культуры. Очищенный рецепторный белок gp130 может быть использован в качестве сенсибилизирующего антигена. Альтернативно, в качестве сенсибилизирующего антигена можно использовать белок, образованный слиянием белка gp130 и другого белка.
Хотя выбор млекопитающих, применяемых для иммунизации, специально не ограничен, их предпочтительно выбирают из соображений их совместимости с родительскими клетками, используемыми для клеточного слияния. Обычно они включают грызунов, таких как мыши, крысы, хомяки и т.п.
Иммунизацию животных сенсибилизирующим антигеном проводят, используя известный способ. Общий способ, например, включает внутрибрюшинное или подкожное введение млекопитающим сенсибилизирующего антигена. В частности, сенсибилизирующий антиген, который был разведен и суспендирован в подходящем количестве фосфатно-солевого буфера (PBS) или физиологического раствора и т.д., смешивают по желанию с подходящим количеством обычного адъюванта, например полного адъюванта Фрейнда. После эмульгирования он вводится млекопитающему предпочтительно в несколько приемов каждые 4-21 дня. Альтернативно, во время иммунизации сенсибилизирующим антигеном может быть использован подходящий носитель.
После иммунизации и подтверждения того, что в сыворотке крови повысился уровень требуемого антитела, иммунные клетки извлекают из млекопитающего и подвергают клеточному слиянию. Предпочтительными иммунными клетками, подвергавшимися клеточному слиянию, являются, в частности, клетки селезенки.
Клетки миеломы млекопитающих как другой тип родительских клеток, которые сливают с упомянутыми выше иммунными клетками, предпочтительно включают различные известные клеточные линии, такие как P3X63Ag8.653 (Kearney, J. F. et al., J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler, G. and Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies, D.H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (de St. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35; 1-21), S194 (Trowbridge, I.S, J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277; 131-133) и т.п.
Слияние клеток между указанными выше иммунными клетками и клетками миеломы по существу может быть проведено в соответствии с известным способом, таким как способ, описанный в работе Milstein et al. (Kohler, G. and Milstein, С., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) и т.п.
Более конкретно, указанное слияние клеток проводят в подходящем питательном бульоне в присутствии, например, катализатора клеточного слияния. В качестве катализатора клеточного слияния, например, можно использовать полиэтиленгликоль (ПЭГ), вирус Сендай (HVJ) и нечто подобное, и, кроме того, чтобы усилить эффективность слияния, по желанию можно добавлять адъювант, такой как диметилсульфоксид и т.д.
Предпочтительное соотношение используемых иммунных клеток и клеток миеломы составляет, например, от 1- до 10-кратного избытка иммунных клеток по отношению к клеткам миеломы. Примеры культуральных сред, применяемых для указанного выше клеточного слияния, включают среду RPMI1640 и культуральную среду MEM, подходящую для роста указанных выше клеточных линий миеломы, а также обычную культуральную среду, используемую для такого типа клеточной культуры, и, помимо этого, можно вводить сывороточные добавки, такие как фетальная сыворотка теленка (FCS).
При слиянии клеток предварительно определенное количество иммунных клеток и клеток миеломы тщательно смешивают в указанных выше культуральных жидкостях, к которым добавляют предварительно прогретый до 37°С раствор ПЭГ, например раствор ПЭГ с молекулярной массой от 1000 до 6000 в концентрации от 30 до 60% (мас./об.), и перемешивают для образования требуемых слитых клеток (гибридома). Затем, с помощью процедуры повторного последовательного добавления подходящей культуральной среды и центрифугирования для удаления супернатанта, можно удалить вещества, вызывающие клеточное слияние, и т.п., присутствие которых нежелательно для роста гибридомы.
Указанная выше гибридома может быть отобрана с помощью культивирования в обычной селекционной среде, например в культуральной среде HAT (культуральная жидкость, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Культивирование в указанной культуральной среде HAT продолжают обычно в течение времени, достаточного для гибели клеток, не являющихся клетками требуемой гибридомы (неслившиеся клетки), и которое обычно длится от нескольких дней до нескольких недель. Используют обычный метод предельных разведений, с помощью которого отбирают гибридомы, продуцирующие желаемое антитело, и моноклонально клонируют.
Кроме получения указанной выше гибридомы с помощью иммунизации антигеном животного, не являющегося человеком; также можно сенсибилизировать in vitro лимфоциты человека требуемым антигеном или клетками, экспрессирующими требуемый антиген; полученные сенсибилизированные В-лимфоциты сливают с клетками миеломы человека, например с клетками U266, для получения требуемого человеческого антитела, обладающего активностью связывания с требуемым антигеном или клетками, экспрессирующими требуемый антиген (см. Japanese Post-examined Patent Publication (Kokoku) No. 1-59878). Кроме этого, чтобы получить требуемое человеческое антитело с помощью способа, описанного выше (см. International Patent Publication WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735), антигеном или клетками, экспрессирующими антиген, можно иммунизировать трансгенное животное, имеющее набор всех генов антител человека.
Сконструированную таким образом гибридому, продуцирующую моноклональное антитело, можно субкультивировать в обычной культуральной жидкости или можно хранить длительное время в замороженном состоянии при температуре жидкого азота.
Чтобы получить моноклональные антитела из указанной гибридомы, можно использовать способ, в котором гибридому культивируют обычным образом и получают антитела в виде супернатанта, или с помощью способа, в котором гибридому вводят и выращивают в животных-млекопитающих, совместимых с указанной гибридомой, а антитела получают в виде асцита. Первый способ подходит для получения высокоочищенных антител, тогда как последний способ подходит для производства больших количеств антител.
Например, гибридому, продуцирующую антитело к рецептору IL-6, можно сконструировать, используя способ, раскрытый в Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) 3-139293. Ее можно сконструировать с помощью способа, в котором гибридому, продуцирующую антитело РМ-1, которая была депонирована для международного признания 12 июля 1989 года в соответствии с условиями Будапештского договора как FERM ВР-2998 в Patent Microorganism Depository of National Institute of Industrial Science and Technology, Chuo 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan, вводят внутрибрюшинно мышам BALB/c для получения асцитов, из которых очищают антитело РМ-1; или с помощью способа, в котором указанную гибридому культивируют в подходящей культуральной среде, такой как среда RPMI1640, содержащая 10%-ную бычью фетальную сыворотку и 5%-ный MB-Condimed HI (производство фирмы «Boehringer Mannheim»), или гибридомная среда SFM (производство фирмы «GIBCO-BRL»), или среда PFHM (производство фирмы «GIBCO-BRL») и т.п., и затем антитело РМ-1 можно очистить из супернатанта.
Рекомбинантное антитело, которое было получено с помощью технологии рекомбинантных генов, в которой ген антитела был клонирован из гибридомы и интегрирован в подходящий вектор, который затем был введен в хозяина, может быть использовано в настоящем изобретении как моноклональное антитело (см., например, Borrebaeck C.A.K. and Larrick J.W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD., 1990).
В частности, мРНК, кодирующую вариабельную (V) область желаемого антитела, выделяют из клеток, продуцирующих антитело, таких как гибридома. Выделение мРНК проводят, получая суммарный препарат РНК, с использованием, например, известного способа, такого как метод ультрацентрифугирования в присутствии гуанидина (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), метода AGPC (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159), и затем мРНК получают из суммарного препарата РНК, используя набор mRNA Purification Kit (фирма «Pharmacia») и сходные наборы. Альтернативно, мРНК можно выделить непосредственно, используя набор QuickPrep mRNA Purification Kit (фирма «Pharmacia»).
кДНК V-области антитела можно синтезировать из полученной таким способом мРНК, используя обратную транскриптазу. кДНК можно синтезировать, используя набор AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit и сходные наборы. Альтернативно, для синтеза и амплификации кДНК можно использовать набор 5'-Ampli FINDER RACE Kit (фирма «Clontech»), и метод 5'-RACE (Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932), в котором используется полимеразная цепная реакция (ПЦР). Требуемый фрагмент ДНК очищают из продукта ПЦР, и его можно лигировать в вектор ДНК. Кроме того, из него конструируют рекомбинантный вектор и вводят его в Е. coli и т.д., из которой отбирают колонии для получения требуемого рекомбинантного вектора. Последовательность оснований требуемой ДНК может быть подтверждена с помощью известного способа, такого как дидезокси-метод секвенирования.
После получения ДНК, кодирующей V-область требуемого антитела, ее можно лигировать в молекулу ДНК, кодирующую константную область (С-область) требуемого антитела, которую затем интегрируют в экспрессионный вектор. Альтернативно, ДНК, кодирующую V-область антитела, можно интегрировать в экспрессионный вектор, содержащий ДНК, кодирующую С-область антитела.
Чтобы продуцировать антитело для применения в настоящем изобретении, ген антитела интегрируют, как описано ниже, в экспрессионный вектор для того, чтобы он экспрессировался под контролем экспрессионного регуляторного участка, например энхансера и/или промотора. Затем экспрессионный вектор может быть трансформирован в клетку-хозяина, и в ней затем может экспрессироваться антитело.
В соответствии с настоящим изобретением в целях снижения гетерологичной антигенности у человека можно применять искусственно измененное рекомбинантное антитело, такое как химерное антитело, гуманизированное антитело и человеческое антитело. Эти модифицированные антитела можно получать, применяя известные методы.
Химерное антитело можно получить с помощью лигирования полученной таким образом ДНК, кодирующей V-область антитела, в ДНК, кодирующую С-область человеческого антитела, которую затем интегрируют в экспрессионный вектор и вводят в «хозяина» для продуцирования в нем антитела (см. European Patent Application EP 125023 и International Patent Publication WO 92-19759). С использованием этого известного способа можно получить химерное антитело, полезное в настоящем изобретении.
Например, плазмида, которая содержит ДНК, кодирующую L-цепь V-области или Н-цепь V-области химерного антитела РМ-1, была обозначена как pPM-k3 или рРМ-h1 соответственно, и штаммы Е. coli, имеющие эти плазмиды, были депонированы для международного признания 12 февраля 19991 года в соответствии с условиями Будапештского договора как NCIMB 40366 и NCIMB 40362 соответственно. National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (23 St Machar Drive, Aberdeen, Scotland, AB2 1RY, United Kingdom of Great Britain and Northern Ireland).
Гуманизированное антитело, которое также называют человеческим антителом с измененной формой, может быть получено с помощью переноса участка, определяющего комплементарность антитела (CDR) млекопитающего, но не человека, например мышиного антитела, в CDR человеческого антитела. Общепринятая технология рекомбинантных ДНК для получения таких антител также известна (см. European Patent Application EP 125023 и International Patent Publication WO 92-19759).
В частности, последовательность ДНК, которая была сконструирована для лигирования CDR мышиного антитела без нарушения рамки считывания (FR) человеческого антитела, синтезируется из отдельных олигонуклеотидов, имеющих на концах перекрывающиеся области. Полученную таким образом ДНК лигируют в ДНК, кодирующую С-область человеческого антитела, и затем объединяют в экспрессионный вектор, который вводят в «хозяина» для продукции антитела (см. European Patent Application EP 239400 и International Patent Publication WO 92-19759).
Чтобы получить FR человеческого антитела, дотированного в CDR-участке, выбирали участок, определяющий комплементарность, формирующий подходящий участок связывания антигена. При желании можно было заменить аминокислоты без нарушения рамки считывания в вариабельном участке антитела, так чтобы участок, определяющий комплементарность человеческого антитела с измененной формой, мог образовать соответствующее место связывания антигена.
Например, для химерного антитела или гуманизированного антитела используют С-область человеческого антитела. В качестве С-области человеческого антитела могут быть использованы Сγ и Сγ1, Сγ2, Сγ3 и Сγ4, которые следует упомянуть в качестве примеров. С-область человеческого антитела можно модифицировать для улучшения стабильности антитела или его продукции.
Химерное антитело состоит из вариабельной области антитела, происходящего из млекопитающих, отличных от человека, и С-области, происходящей из человеческого антитела, тогда как гуманизированное антитело состоит из участка, определяющего комплементарность антитела, происходящего из млекопитающих, отличных от человека, а также каркасной области и С-области, происходящих из человеческого антитела, В соответствии с этим их антигенность в организме человека снижена таким образом, что они полезны в качестве антител для применения в настоящем изобретении.
В качестве предпочтительного воплощения гуманизированного антитела для применения в настоящем изобретении можно упомянуть гуманизированное антитело РМ-1 (см. International Patent Publication WO 92-19759).
Кроме того, в дополнение к способам, описанным выше, для получения человеческого антитела известна технология, использующая пэннинг с помощью библиотеки человеческих антител. Например, чтобы пометить фаг, который связывается с антигеном, вариабельную область человеческого антитела экспрессируют на поверхности фага в виде отдельной цепи антитела (scFv), используя метод фагового дисплея. С помощью анализа гена выделенного фага можно определить последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область человеческого антитела, которое связывается с антигеном. После того как последовательность ДНК цепи scFv, которая связывает антиген, выяснена, можно сконструировать подходящий экспрессионный вектор, который содержит указанную последовательность, и использовать его в дальнейшем для получения человеческого антитела. Эти способы уже известны и их можно найти в WO 92/01047, WO 92/20791, WO 92/06213, WO 92/11236, WO 92/19172, WO 92/01438 и WO 92/15388.
Гены антител, сконструированные, как было описано выше, можно экспрессировать и получить с помощью известного метода. В случае клеток млекопитающих экспрессию можно осуществить, используя вектор, включающий обычно используемый полезный промотор, экспрессируемый ген антитела, ДНК, к 3'-концу которой функционально присоединена сигнальная последовательность поли-А, или вектор, включающий указанную ДНК. Примеры промотора/энхансера включают немедленный ранний промотор/энхансер цитомегаловируса человека.
Кроме того, в качестве промотора/энхансера, которые могут быть использованы для экспрессии антитела для применения в настоящем изобретении, можно использовать вирусные промоторы/энхансеры, такие как промоторы/энхансеры ретровируса, вируса полиомы, аденовируса и обезьяньего вируса 40 (SV40), и промоторы/энхансеры, происходящие из клеток млекопитающих, таких как фактор элонгации человека 1α (НЕF1α).
Например, экспрессию можно легко осуществить с помощью метода Mulligan et al. (Mulligan, R.С. et al., Nature (1979) 277, 108-114), в котором используют промотор/энхансер SV40, или с помощью метода Mizushima et al. (Mizushima, S. and Nagata, S., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), в котором используют промотор/энхансер НЕF1а.
В случае Е. coli экспрессию можно контролировать с помощью функционального присоединения обычно используемого полезного промотора, сигнальной последовательности для секреции антитела и экспрессируемого гена антитела, с последующей их экспрессией. В качестве промотора, например, следует отметить промоторы lacZ и araВ. При использовании промотора lacZ можно применять метод Ward et al. (Ward, E.S. et al., Nature (1989) 341, 544-546; Ward, E.S. et al., FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), а при использовании промотора araВ можно применять метод Better et al. (Better, M. et al., Science (1988) 240, 1041-1043).
В качестве сигнальной последовательности для секреции антитела для продуцирования в периплазме Е. coli можно использовать сигнальную последовательность pelB (Lei, S.P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383). После разделения антител, продуцируемых в периплазме, и перед использованием подходящим образом изменяют пространственную структуру антитела (см., например, WO 96/30394).
В качестве области начала репликации можно использовать области начала репликации SV40, вируса полиомы, аденовируса, вируса бычьей папилломы (BPV) и т.п. Кроме того, для увеличения числа копий гена в клеточной системе «хозяина» экспрессионные векторы могут включать в качестве селективных маркеров ген аминогликозидфосфотрансферазы (АРН), ген тимидинкиназы (ТК), ген ксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы Е. coli (Ecogpt), ген дигидрофолатредуктазы (dhfr) и т.п.
Чтобы получить антитело для применения в настоящем изобретении, можно использовать любую продуцирующую систему. Продуцирующая система для получения антитела включает систему, продуцирующую in vitro или in vivo. В качестве продуцирующей системы in vitro следует упомянуть продуцирующую систему, в которой используют эукариотические клетки, и продуцирующую систему, в которой используют прокариотические клетки.
При использовании эукариотических клеток существуют продуцирующие системы, в которых используют клетки животных, растительные клетки или клетки грибов. Известные клетки животных включают (1) клетки млекопитающих, такие как клетки СНО, клетки COS, клетки миеломы, клетки почек детенышей хомяка (ВНК), клетки HeLa и клетки Vero, (2) клетки амфибий, такие как ооциты Xenopus, или (3) клетки насекомых, такие как sf9, sf21 и Tn5. Известные клетки растений включают, например, те, которые происходят из Nicotiana tabacum, которые могут быть переведены в каллусную культуру. Известные клетки грибов включают дрожжи, такие как род Saccharomyces, в частности Saccharomyces cerevisae, или нитчатые грибы, такие как грибы рода Aspergillus, в частности Aspergillus niger.
Если используют прокариотические клетки, существуют продуцирующие системы, в которых применяют бактериальные клетки. Известные бактериальные клетки включают Escherichia coli (E. coli) и Bacillus subtilis.
Антитело можно получить путем введения гена требуемого антитела в эти клетки с помощью трансформации и культивирования трансформированных клеток in vitro. Культивирование проводят с помощью известных методов. Например, в качестве культуральной жидкости можно использовать DMEM, MEM, RPMI1640 и IMDM и вместе с ними можно использовать сывороточные добавки, такие как фетальная сыворотка теленка (FCS). Кроме этого, антитела можно получать in vivo, с помощью имплантирования клеток, в которые был введен ген антитела, в брюшную полость животного и т.п.
В качестве систем, продуцирующих in vivo, следует отметить те, в которых используются животные, и те, в которых используются растения. При использовании животных существуют продуцирующие системы, в которых применяют млекопитающих и насекомых.
В качестве млекопитающих могут быть использованы козы, свиньи, овцы, мыши и крупный рогатый скот (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Application, 1993). Также в качестве насекомых может быть использован тутовый шелкопряд. При использовании растений можно применять, например, табак.
Гены антител вводят в эти животные или растения, и в таких животных или растениях продуцируются антитела, которые затем выделяют. Например, чтобы получить слитые гены, ген антитела вставляют в середину гена, кодирующего белок, который наследственно продуцируется в молоке, например, в такой как козий β-казеин. Фрагменты ДНК, содержащие слитые гены, в которые был вставлен ген антитела, вводят с помощью инъекции в эмбрион козы, и эмбрион вводят в самку козы. Требуемое антитело получают из молока, производимого трансгенной козой, рожденной от козы, которой был подсажен эмбрион, или их потомством. Чтобы увеличить количество молока, содержащего требуемое антитело и производимого трансгенной козой, при необходимости трансгенной козе можно давать гормоны (Ebert, К.М. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).
Если используют тутового шелкопряда, его инфицируют бакуловирусом, в который вставили ген требуемого антитела, и требуемое антитело можно получить из жидкости, получаемой из тела шелкопряда (Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594). Кроме этого, если используют табак, ген требуемого антитела вставляют в растительный экспрессионный вектор, например в pMON 530, и затем этот вектор вводят в бактерии, такие как Agrobacterium tumefaciens. Чтобы получить требуемое антитело из листьев табака, этими бактериями затем инфицируют табак, например Nicotiana tabacum (Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).
Если антитело получают с помощью продуцирующих систем in vitro или in vivo, как описано выше, ДНК, кодирующие тяжелую цепь (Н-цепь) или легкую цепь (L-цепь) антитела, можно интегрировать в экспрессионный вектор по отдельности и одновременно трансформировать ими «хозяев», или ДНК, кодирующую Н- и L-цепи, можно интегрировать в один и тот же экспрессионный вектор и трансформировать им «хозяина» (см. International Patent Publication WO 94-11523).
2
Антитела для применения в настоящем изобретении могут быть фрагментами антител или их модифицированными вариантами до тех пор, пока они предпочтительно используются. Например, в качестве фрагментов антитела можно упомянуть Fab, F(ab'), Fv или одноцепочечный Fv (scFv), в которых фрагменты Fv Н-цепи и L-цепи были дотированы через подходящий линкер.
В частности, чтобы получить фрагменты антитела, антитела обрабатывают с помощью фермента, например папаина или пепсина, или конструируют гены, кодирующие эти фрагменты антитела, и затем вставляют их в экспрессионный вектор, который экспрессируется в подходящей клетке-хозяине (см., например, Со, М. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, М. and Horwitz, A.N., Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496; Plueckthun, A. and Scerra, A., Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496; Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-666; Bird, R.E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137).
Фрагмент scFv можно получить дотированием V-области Н-цепи и V-области L-цепи антитела. В фрагменте scFv V-область Н-цепи и V-область L-цепи предпочтительно дотируют через линкер, предпочтительно пептидный линкер (Huston, J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883). V-область Н-цепи и V-область L-цепи в scFv могут происходить из любых упомянутых выше антител. В качестве пептидного линкера для лигирования V-областей может быть использован любой одноцепочечный пептид, включающий, например, 12-19 аминокислотных остатков.
ДНК, кодирующую scFv, можно получить, используя в качестве матрицы ДНК, кодирующую Н-цепь или Н-цепь V-области указанного выше антитела, и ДНК, кодирующую L-цепь или L-цепь V-области указанного выше антитела; с помощью амплификации участка ДНК, кодирующего требуемую аминокислотную последовательность между указанными выше последовательностями, применяя метод ПЦР с использованием пары праймеров, определяющих оба их конца, и с помощью последующей амплификации комбинации ДНК, кодирующей участок пептидного линкера, и пары праймеров, которые определяют, чтобы оба конца указанной ДНК были лигированы в Н-цепь и L-цепь соответственно.
После конструирования молекул ДНК, кодирующих scFv, с помощью общепринятых методов можно получить экспрессионный вектор, содержащий эти ДНК, и трансформировать указанным экспрессионным вектором клетки-хозяина, и с помощью общепринятых методов, используя полученного хозяина, можно получить scFv.
Эти фрагменты антитела можно продуцировать путем получения их гена указанным выше способом и после его экспрессии в хозяине. Применяемый здесь термин «антитело» также включает эти фрагменты антитела.
В качестве модифицированных антител можно использовать антитела, связанные с различными молекулами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Применяемый здесь термин «антитело» также включает эти модифицированные антитела. Эти модифицированные антитела могут быть получены с помощью химической модификации антител, полученных таким образом. Эти методы являются уже устоявшимися в этой области техники.
Произведенные и экспрессированные, как описано выше, антитела можно отделить от внешних и внутренних компонентов клетки-хозяина и затем очистить до гомогенного состояния. Разделение и очистка антитела для применения в настоящем изобретении могут быть выполнены с помощью аффинной хроматографии. В качестве колонок, используемых для такого рода аффинной хроматографии, можно упомянуть Протеин А- и Протеин G-колонку. Примеры носителей, используемых в Протеин А-колонке, включают Hyper D, POROS, Sepharose F.F. и т.п. Альтернативно, без каких-либо ограничений могут быть использованы любые подходящие общепринятые методы разделения и очистки белков.
Разделение и очистка антитела для применения в настоящем изобретении по обстановке могут быть выполнены с помощью комбинирования хроматографии, отличной от указанной выше аффинной хроматографии, фильтрации, ультрафильтрации, обессоливания, диализа и т.п. Хроматография включает в себя, например, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гель-фильтрацию и т.п. Эти разновидности хроматографии можно применять в высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Альтернативно, можно использовать обращенно-фазовую ВЭЖХ.
Концентрацию антитела, полученного, как описано выше, можно определить, измеряя оптическое поглощение или с помощью иммуноферментного анализа (ELISA) и т.п. Таким образом, если проводят измерение оптического поглощения, образец разводят подходящим образом с помощью забуференного фосфатом солевого раствора PBS (-) и затем измеряют оптическое поглощение при 280 нм, затем производят расчеты, используя коэффициент поглощения, равный 1,35 OD при 1 мг/мл. При использовании метода ELISA измерение проводят следующим образом. Итак, 100 мкл козьих антител к иммуноглобулинам IgG человека (производство фирмы «TAG»), разведенных до концентрации 1 мкг/мл в 0,1 М бикарбонатном буфере, рН 9,6, вносят в 96-луночный планшет (производство фирмы «NUNC») и инкубируют в течение ночи при 4°С для иммобилизации антител. После блокировки вносят по 100 мкл каждого разведенного подходящим образом антитела, применяемого в настоящем изобретении, или образца, включающего антитело, или 100 мкл человеческого IgG (производство фирмы «CAPPEL») в качестве стандарта и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа.
После промывания вносят 100 мкл разведенных в 5000 раз антител к иммуноглобулинам IgG человека, меченных щелочной фосфатазой (производство фирмы «ВIO SOURCE»), и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч. После промывания добавляют и инкубируют раствор субстрата, а затем, чтобы рассчитать концентрацию требуемого антитела, измеряют поглощение при 405 нм с помощью фотометра MICROPLATE READER Model 3550 (производство фирмы «Bio-Rad»).
Измененный IL-6 для применения в настоящем изобретении обладает биологической активностью связывания с IL-6-рецептором и не передает биологически активный сигнал IL-6. Таким образом, измененный IL-6, так как он конкурирует с IL-6 за связывание с IL-6-рецептором, не передает биологически активный сигнал IL-6, и, в связи с этим, он блокирует передачу сигнала IL-6.
Измененный IL-6 может быть сконструирован путем ввода мутации с помощью замены аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности IL-6. IL-6, являющийся источником измененного IL-6, может быть любого происхождения, но если принимать во внимание антигенность, то предпочтительно он должен быть человеческим IL-6.
В частности, с использованием известной программы молекулярного моделирования аминокислотной последовательности, например программы WHATIF (Vriend et al., J. Mol. Graphics (1990), 8, 52-56), предсказана вторичная структура IL-6 и оценены полные эффекты замены отдельных аминокислотных остатков. После того как был сделан выбор подходящего аминокислотного остатка, вводят мутацию для аминокислотной замены с помощью обычно применяемого метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием в качестве матрицы вектора, включающего последовательность оснований, кодирующую человеческий ген IL-6, чтобы таким образом получить ген, кодирующий измененный IL-6. Этот ген затем по желанию вставляют в подходящий экспрессионный вектор, из которого можно получить измененный IL-6 в соответствии со способами экспрессии, продукции и очистки упомянутого выше рекомбинантного антитела.
Специальные примеры измененного IL-6 раскрыты в работе Brakenhoff et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 86-93, и Savino et al., EMBO J. (1994) 13, 1357-1367, WO 96-18648 и WO 96-17869.
Неполный пептид IL-6 или неполный пептид рецептора IL-6 для применения в настоящем изобретении обладают активностью связывания с рецептором IL-6 или с IL-6 соответственно, но не передают биологически активный сигнал IL-6. В связи с этим неполный пептид IL-6 или неполный пептид рецептора IL-6 специфически ингибируют связывание IL-6 с рецептором IL-6, связываясь с рецептором IL-6 или с IL-6 соответственно, и, таким образом, улавливая их. В результате они не передают биологически активный сигнал IL-6 и, таким образом, блокируют трансдукцию сигнала IL-6.
Неполный пептид IL-6 или неполный пептид рецептора IL-6 являются пептидом, включающим некоторую часть или полную аминокислотную последовательность участка, вовлеченного в связывание с IL-6 или рецептором IL-6, в аминокислотной последовательности IL-6 или рецептора IL-6. Такие пептиды обычно включают 10-80, предпочтительно 20-50, еще более предпочтительно 20-40 аминокислотных остатков.
Неполный пептид IL-6 или неполный пептид рецептора IL-6 могут быть сконструированы путем точного определения участка, вовлеченного в связывание с IL-6 или рецептором IL-6 в аминокислотной последовательности IL-6 или рецептора IL-6, и с помощью продукции некоторой части или всей аминокислотной последовательности с помощью общепринятого метода, такого как генная инженерия или метод пептидного синтеза.
Чтобы получить неполный пептид IL-6 или неполный пептид рецептора IL-6 с помощью генной инженерии, последовательность ДНК, кодирующую требуемый пептид, вводят в экспрессионный вектор, из которого можно получить пептид, используя способы экспрессии, продукции и очистки упомянутого выше рекомбинантного антитела.
Получение неполного пептида IL-6 или неполного пептида рецептора IL-6 с помощью пептидного синтеза можно осуществить, используя метод, обычно применяемый в пептидном синтезе, например твердофазный синтез или жидкофазный синтез.
В частности, можно использовать метод, описанный в работе Zoku-Iyakuhin no Kaihatsu (Sequel to Development of Pharmaceuticals), Vol.14, Peptido Gousei (Peptide Synthesis), edited by Haruaki Yajima, Hirokawa Shoten, 1991. Твердофазный метод синтеза включает, например, реакцию, в которой аминокислоту, соответствующую С-концу синтезируемого пептида, присоединяют к подложке, которая нерастворима в органических растворителях, и затем аминокислоту, у которых α-аминогруппа или функциональная группа боковой цепи защищены с помощью подходящих защищающих групп, по одной аминокислоте за раз конденсируют в направлении от С- к N-концу и реакцию, в которой указанную защищающую группу α-аминогруппы аминокислоты удаляют из аминокислот или пептида, присоединенных к смоле, которые поочередно повторяют для элонгации пептидной цепи. Методы твердофазного пептидного синтеза в общих чертах классифицируются как Вос-метод и Fmoc-метод, в зависимости от типа применяемой защищающей группы.
После завершения синтеза требуемого пептида проводят реакцию снятия защиты и реакцию отщепления пептидной цепи от носителя. Для отщепления от пептидной цепи обычно используют фтористый водород или трифторметансульфоновую кислоту в Boc-методе и TFA в Fmoc-методе. В Boc-методе, например, упомянутый выше пептидный носитель обрабатывают фтористым водородом в присутствии анизола. Затем убирают защищающую группу и получают пептид, отщепляя его от подложки. С помощью лиофилизации можно получить неочищенный препарат пептида. С другой стороны, в Fmoc-методе реакцию снятия защиты и реакцию отщепления пептида с подложки можно проводить в TFA, например, с помощью процедуры, сходной с описанной выше.
Неочищенный пептид, полученный таким образом, может быть нанесен на колонку ВЭЖХ для разделения и очистки. Его элюцию можно проводить в системе растворителей вода-ацетонитрил, которую обычно используют для очистки белков в оптимальных условиях. Фракцию, соответствующую полученному пику хроматографического профиля, собирают и лиофилизируют. Очищенную таким образом пептидную фракцию идентифицируют, анализируя молекулярную массу с помощью масс-спектроскопического анализа, анализа аминокислотного состава или анализа аминокислотной последовательности и т.п.
Специальные примеры неполного пептида IL-6 или неполного пептида рецептора IL-6 раскрыты в Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) 2-188600, Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) 7-324097, Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) 8-311098 и United States Patent Publication US 5210075.
3
Активность антагониста IL-6 для применения в настоящем изобретении, проявляющаяся в блокировании передачи сигнала IL-6, может быть оценена с использованием общепринятого метода. В частности, IL-6-зависимую линию клеток человеческой миеломы (S6B45, КРММ2), линию клеток человеческой Т-лимфомы Леннерта КТ3 или IL-6-зависимую клетку MH60.BSF2 культивируют в присутствии добавленного IL-6, и активность может быть оценена с помощью включения H-тимидина в IL-6-зависимую клетку, сосуществующую с антагонистом IL-6.
125
125
Альтернативно, можно культивировать клетку U266, экспрессирующую рецептор IL-6, к которой добавляют I-меченый IL-6 и одновременно добавляют антагонист IL-6, и затем определяют I-меченый IL-6, связанный с клеткой, экспрессирующей рецептор IL-6. В описанной выше системе анализа в дополнение к группе, в которой присутствует антагонист рецептора IL-6, набирается отрицательная контрольная группа, не содержащая антагонисты IL-6, и результаты, полученные для этих групп, сравнивают, чтобы оценить IL-6-ингибирующую активность антагониста IL-6.
Как описано в Примере, приведенном ниже, антитело к рецептору IL-6 демонстрирует терапевтический эффект при васкулите, что означает, что антагонисты IL-6, такие как антитело к рецептору IL-6, эффективны в качестве терапевтического средства при васкулите.
Субъект, который подвергается лечению в настоящем изобретении, является млекопитающим. Млекопитающее, которое подвергается лечению в настоящем изобретении, предпочтительно является человеком.
Профилактические или терапевтические средства настоящего изобретения могут быть введены как перорально, так и парэнтерально, системно или локально. Например, можно выбрать внутривенную инъекцию, такую как капельное вливание, внутримышечную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию, подкожную инъекцию, суппозитории, орошение кишечника, принимаемые перорально таблетки, покрытые кишечно-растворимой оболочкой, и т.п., способ введения может быть при необходимости выбран в зависимости от возраста и состояния пациента. Эффективная дозировка выбирается в диапазоне от 0,01 мг до 100 мг на кг веса тела на прием. Альтернативно, можно выбрать дозировку в диапазоне от 1 до 20 мг, предпочтительно от 2 до 8 мг на одного пациента.
Предпочтительные дозировки и предпочтительные способы приема таковы, что в случае применения антител к рецептору IL-6 эффективными дозировками являются такие количества, при которых в крови присутствует свободное антитело. В типичных примерах принимают внутрь от 1 мг до 20 мг на кг веса тела, предпочтительно от 2 мг до 8 мг, в месяц (4 недели) в виде одной или нескольких доз, например, два раза в неделю, один раз в неделю, один раз каждые две недели, один раз каждые четыре недели и т.п. с помощью внутривенной инъекции, такой как капельное вливание, или с помощью подкожной инъекции. Схему приема средства можно регулировать путем наблюдения за состоянием заболевания и с помощью лабораторных тестов на содержание средства в крови, например, увеличивая интервал приема с двух раз в неделю или одного раза в неделю до одного раза в две недели, одного раза в три недели, одного раза в четыре недели и т.п.
Профилактические и терапевтические средства при васкулите в настоящем изобретении могут включать фармацевтически приемлемые носители или добавки, в зависимости от пути введения. Примеры таких носителей или добавок включают воду, фармацевтически приемлемый органический растворитель, коллаген, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, карбоксивиниловый полимер, натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы, полиакрилат натрия, альгинат натрия, водорастворимый декстран, натриевую соль карбоксиметилированного крахмала, пектин, метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, ксантановую камедь, гуммиарабик, казеин, желатин, агар, диглицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, вазелин, парафин, стеариловый спирт, стеариновую кислоту, человеческий сывороточный альбумин (HSA), маннит, сорбит, лактозу, фармацевтически приемлемое поверхностно-активное вещество и т.п. В зависимости от дозировочной формы применяемые добавки выбирают из перечисленных выше соединений или из их смесей, но ими не ограничиваются.
Примеры
Настоящее изобретение теперь будет детально описано, со ссылками на рабочие примеры и ссылочные примеры. Следует отметить, однако, что объем настоящего изобретения в любом случае не ограничен этими примерами.
Рабочий пример 1
Метод:
Пациенты с трудноизлечимым васкулитным синдромом (нодозный полиартериит, синдром аортита), не поддающимся общепринятой терапии, были подвергнуты лечению гуманизированным антителом к рецептору IL-6. По разрешению Комитета по новым способам медицинского лечения госпиталя при университете г. Осака (the Advanced Medical Committee of the Osaka University Hospital) два пациента получали гуманизированное антитело РМ-1 (MRA), которое является гуманизированным антителом к рецептору IL-6. Окончанием приема было улучшение по оценке магнитно-резонансных изображений (MRI) и компьютерной томографии (СТ), улучшение состояния кожи, улучшение маркеров воспаления, таких как С-реактивный белок (CRP), и улучшение в QOL (боль, артралгия, недомогание). Также была проведена оценка количества клеток периферической крови, общей биохимии, гомостатической функции, IL-6, растворимого рецептора IL-6, концентрации гуманизированного антитела к рецептору IL-6 в крови, фактора некроза опухолей α (TNFα), интерлейкина-1b (IL-1b) и васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF).
Результат:
Случай 1
Женщина 19 лет. Диагностирована как пациент с синдромом аортита в 1996 г. Имела осложнение в виде язвенного колита. Начала получать преднизолон (PSL) 60 мг/сутки. Даже комбинированное применение циклоспорина не смогло снизить PSL до 20 мг/сутки и ниже. В 1998 г. в ответ на ухудшение состояния в дополнение к пульсовой терапии метилпреднизолоном (mPSL) был применен циклофосфамид в дозировке 150 мг/сутки, который не смог снизить дозировку до 30 мг/сутки и ниже. Был добавлен бетаметазон 1 мг/сутки и затем семь раз проводили лейкоферез, но без эффекта. В 2000 г. и после с перерывами применяли пульсовую mPSL-терапию и комбинированное лечение с помощью азатиоприна 100 мг/сутки, микофенолята мофетила 2 г/сутки и метотрексата 17,5 мг/неделю, но без эффекта.
Как показано на Фиг.1-6, СТ обнаружила заметную гипертрофию стенки кровеносного сосуда в восходящем участке аорты, трифуркации арки аорты и в нисходящем участке аорты. Был отмечен стеноз в левой подключичной артерии (It. SCA). Было отмечено тяжело протекающее воспаление с содержанием CRP 12,6 мг/дл, и из-за тяжелой непроходящей боли в груди, потери веса тела около 5 кг в месяц и возникающих непроизвольных приступов применяли капельное вливание MRA в количестве 200 мг/неделю. Спустя примерно 2 недели анализ CRP показал отрицательные результаты. Спустя месяц боль в груди уменьшилась и, как показано на Фиг.1-6, наблюдали улучшение симптомов гипертрофии стенки кровеносного сосуда в восходящем участке аорты, трифуркации арки аорты и в нисходящем участке аорты, расширение просвета кровеносных сосудов, и затем улучшился поток крови в сонной артерии. Также анализ на фекальный гемоглобин стал отрицательным, и исчезли симптомы язвенного колита. Во время терапии с помощью MRA снизился уровень TNFα в крови, но без обострения симптомов. Улучшение симптомов гипертрофии стенки аорты и увеличение просвета кровеносных сосудов сохранялись даже два года спустя после терапии с помощью MRA. Артериит Такаясу определяют также как болезнь отсутствия пульса, и у пациентов с этим заболеванием также не прощупывается пульс, но после лечения на запястье можно было прощупать пульсирование лучевой и локтевой артерий. Из-за продолжительного применения уровень IL-6 в крови снизился с 1720 пг/мл до 100 пг/мл.
Случай 2
Мужчина 42 лет. В 1986 г. развился нодозный артериит (кожный тип), и, несмотря на лечение с помощью PSL, азатиопурина, колхицина и антикоагулянтов, повторялись ремиссии и обострение. В 1995 г. и позже применяли циклофосфамид в комбинации с пульсовой терапией с помощью PSL, но без эффекта. С 1997 г. начали болюсное введение азатиопурина, циклофосфамида и γ-глобулина, а с 2000 г. начали пульсовую терапию с помощью циклофосфамида и лейкоферез, но без эффекта, была проведена пересадка кожи на участок язвы кожи, возникшей из-за васкулита, но без эффекта, и из-за обострения заболевания было проведено удаление правой малоберцовой кости и В-К ампутация (ампутация ноги ниже колена). Некротический васкулит в дальнейшем прогрессировал, и язва нижних конечностей увеличивалась в размере. После начала лечения с помощью гуманизированного антитела к рецептору IL-6 в дозировке 200 мг/неделю ранее наблюдаемые симптомы, включающие лихорадку и эритему кожи и мышечные боли, улучшились. Хотя удаления правого бедра избежать не смогли, количество лейкоцитов нормализовалось вместе с уменьшением уровня IL-6 в крови, и после этого не было отмечено обострения кожной язвы.
Обсуждение результатов
Так как MRA было эффективно в случае пациентов с трудноизлечимьм васкулитом, который не смогли контролировать с помощью общепринятых способов лечения, было предположено, что лечение, заключающееся в ингибировании IL-6, может обеспечить новый способ лечения васкулита. Это означает, что IL-6 является необходимым участником при возникновении патологии васкулита. Кроме того, так как во всех случаях было отмечено снижение уровня IL-6 per se, это продемонстрировало, что лечение, направленное на ингибирование IL-6, не только обладает противовоспалительным эффектом, но также действует на саму природу васкулита.
Ссылочный пример 1. Получение растворимого человеческого рецептора IL-6
Растворимый рецептор IL-6 получали с помощью метода ПЦР с использованием плазмиды pBSF2R.236, содержащей кДНК, которая кодирует рецептор IL-6, полученный согласно методу Yamasaki et al. (Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825-828). Плазмиду pBSF2R.236 расщепляли с помощью рестриктирующего фермента Sph I, чтобы получить кДНК для рецептора IL-6, которую затем вставили в mp18 (производство фирмы «Amersham»). Используя синтетический олигонуклеотидный праймер, сконструированный для ввода стоп-кодона в кДНК рецептора IL-6, с помощью метода ПЦР с использованием in vitro Mutagenesis System (производство фирмы «Amersham») ввели мутацию в кДНК рецептора IL-6. В результате этой процедуры произошел ввод стоп-кодона в 345-ое положение аминокислотной цепи, что привело к получению кДНК, кодирующей растворимый рецептор IL-6.
Для того чтобы экспрессировать кДНК растворимого рецептора IL-6 в клетках СНО, ее лигировали в плазмиду pSV (производство фирмы «Pharmacia»), чтобы получить плазмиду pSVL344. кДНК растворимого рецептора IL-6, которую расщепляли с помощью Hind Ill-Sail, вставляли в плазмиду pECEdhfr, содержащую кДНК dhfr, чтобы получить плазмиду pECEdhfr344, которую можно экспрессировать в клетках СНО.
Десятью мкг плазмиды pECEdhfr344 трансфицировали dhfr-CHO-линию клеток DXB-11 (Uriaub G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220) осаждением с фосфатом кальция (Chen С.et al., Mol. Cell. Biol. (1987) 7, 2745-2751). Трансфицированные клетки СНО выращивали в течение 3 недель в селективной среде а MEM, не содержавшей нуклеозиды и содержавшей 1 мМ глутамин, 10%-ную диализованную FCS, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.
Отобранные клетки СНО подвергали скринингу с помощью метода предельного разведения, чтобы получить единственный клон клетки СНО. Клон клетки СНО был размножен в 20 нМ - 200 нМ метотрексате (МТХ) для получения линии СНО-клеток 5Е27, которая продуцирует человеческий растворимый рецептор IL-6. Линию СНО-клеток 5Е27 культивировали в среде Дюльбекко в модификации Искова (IMDM, произведено фирмой «Gibco»), содержащей 5%-ный FBS. Супернатант культуры клеток собирали и с помощью метода ELISA в супернатанте клеточной культуры определяли концентрацию растворимого рецептора IL-6. Результаты подтвердили, что растворимый рецептор IL-6 присутствует в супернатанте клеточной культуры.
Ссылочный пример 2. Получение антитела к человеческому IL-6
Для иммунизации мышей BALB/c использовали десять мкг рекомбинантного IL-6 (Hirano et al., Immunol. Lett., (1988) 17, 41) вместе с полным адъювантом Фрейнда, и эту процедуру повторяли каждую неделю до тех пор, пока в сыворотке не было обнаружено антитело к IL-6. Иммунные клетки извлекали из локальных лимфатических узлов и затем их сливали с линией клеток миеломы P3U1, используя при этом полиэтиленгликоль 1500. Клетки гибридомы отбирали согласно методу Oi et al. (Selective Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Co., San Francisco, 351, 1980), в котором используют среду HAT, и убеждались в получении гибридомы, которая продуцирует антитело к человеческому IL-6.
Гибридому, которая продуцирует антитело к человеческому IL-6, использовали в измерении связывания IL-6, которое проводили следующим образом. Итак, 96-луночный микротитровальный планшет, сделанный из гибкого поливинила (производство фирмы «Dynatech Laboratories, Inc.», Alexandria, VA), сенсибилизировали 100 мкл козьих антител к мышиным иммуноглобулинам IgG (10 мкл/мл, производство фирмы «Cooper Biomedical, Inc.», Malvem, PA) в течение ночи при 4°С. Затем планшет обрабатывали 100 мкл PBS, содержащим 1%-ный бычий сывороточный альбумин (BSA) при комнатной температуре в течение 2 часов.
После промывания планшета в PBS в каждую лунку вносили по 100 мкл супернатанта гибридомной культуры и затем планшет инкубировали в течение ночи при 4°С. Планшет промывали, в каждую лунку вносили 1-меченый рекомбинантный IL-6 до концентрации 2000 имп. в мин/0,5 нг/лунку, и затем после промывания в каждой лунке измеряли радиоактивность с помощью гамма-счетчика (Beckman Gamma 9000, Beckman Instruments, Fullerton, CA). Из 216 клонов гибридомы 32 клона были позитивными при измерении связывания IL-6. Из этих клонов в конечном итоге был получен стабильный клон MH166.BSF2. Антитело к IL-6 МН166, продуцируемое указанной гибридомой, относилось к субтипу IgGI κ.
4
3
Затем клон MH166.BSF2 IL-6-зависимой мышиной гибридомы использовали для изучения нейтрализирующей активности антител МН166 по отношению к росту гибридомы. Клетки MH166.BSF2 вносили в количестве 1×10/200 мкл/лунку и туда же вносили образцы, содержащие антитело МН166, инкубировали в течение 48 часов, добавляли 0,5 мкКи/лунку H-тимидина (фирма «New England Nuclear», Boston, MA) и инкубацию продолжали следующие 6 часов. Клетки помещали на стекловолоконный фильтр и обрабатывали с помощью автоматического устройства «Харвестер» (Labo Mash Science Co., Tokyo, Japan). В качестве контроля использовали кроличье антитело к IL-6.
3
В результате антитело МН166 ингибировало дозозависимым способом включение Н-тимидина в клетки MH60.BSF2, индуцированные IL-6. Это показало, что антитело МН166 нейтрализует активность IL-6.
Ссылочный пример 3. Получение антитела к человеческому рецептору IL-6
Антитело МТ18 к рецептору IL-6, полученное по методу Hirata et al. (Hirata, Y. et al. J. Immunol., (1989) 143, 2900-2906), пришивали к CNBr-активированой Сефарозе 4В (производство фирмы «Pharmacia Fine Chemicals», Piskataway, NJ) в соответствии с прилагаемым протоколом и очищали рецептор IL-6 (Yamasaki, К. et al., Science (1988) 241, 825-828). Линию клеток человеческой миеломы U266 солюбилизировали с помощью 1 мМ пара-аминофенилметансульфонилфторидгидрохлорида (производство фирмы «Wako Chemicals») (дигитониновый буфер), содержащего 1%-ный дигитонин (производство фирмы «Wako Chemicals»), 10 мМ триэтаноламин (рН 7,8) и 0,15 М NaCl, и смешивали с антителом МТ18, связанным на шариках Сефарозы 4В. Затем шарики промывали шесть раз дигитониновым буфером, чтобы получить частично очищенный препарат рецептора IL-6 для использования в иммунизации.
9
7
35
35
Мыши BALB/c были иммунизированы четыре раза каждые десять дней указанным выше частично очищенным рецептором IL-6, полученным из 3×10 клеток U266, и затем с помощью стандартного метода получали гибридому. Супернатант гибридомной культуры из положительных по росту лунок анализировали на активность его связывания с рецептором IL-6 в соответствии со способом, описанным ниже. 5×10 Клеток U266 метили S-метионином (2,5 мКи) и солюбилизировали с помощью указанного выше дигитонинового буфера. Солюбилизированные клетки U266 смешивали с 0,04 мл объема антитела МТ18, связанного на шариках сефарозы 4В, и затем промывали шесть раз дигитониновым буфером. S-метионин-меченый рецептор IL-6 элюировали 0,25 мл дигитонинового буфера (рН 3,4) и нейтрализовали в 0,025 мл 1 М триса (рН 7,4).
35
0,05 мл супернатанта культуры клеток гибридомы смешивали с 0,01 мл Протеин G-Сефарозы (производство фирмы «Pharmacia»). После промывания Сефарозу инкубировали с 0,005 мл раствора S-меченого рецептора IL-6, полученного, как было описано выше. Иммунопреципитат анализировали с помощью ПААГ-электрофореза в присутствии DS-Na, чтобы выяснить, какие супернатанты культуры клеток гибридомы реагируют с рецептором IL-6. В результате был выявлен реакционно-позитивный клон гибридомы РМ-1 (FERM ВР-2998). Антитело, продуцируемое клетками гибридомы РМ-1, относится к подтипу IgG1 κ.
125
С помощью линии клеток человеческой миеломы U266 изучали ингибирующую активность антитела, продуцируемого клетками гибридомы РМ-1, направленную на связывание IL-6 с человеческим рецептором IL-6. Человеческий рекомбинантный IL-6 был получен из Е. coli (Hirano et al., Immunol. Lett., (1988) 17, 41-45) и помечен I с использованием реагента Болтона-Хантера (фирма «New England Nuclear», Boston, MA) (Taga, T. et al., J. Exp.Med. (1987) 166, 967-981).
5
125
4×10 клеток U266 выращивали в 70%-ном (об./об.) супернатанте культуры клеток гибридомы РМ-1 вместе с IL-6, меченным I (14000 имп. в мин), в течение 1 час. Семьдесят мкл образца наслаивали на 300 мл FCS в микроцентрифужной полиэтиленовой пробирке на 400 мкл. После центрифугирования определяли радиоактивность клетки.
Полученные результаты показали, что антитело, продуцируемое гибридомой РМ-1, ингибирует связывание IL-6 с рецептором IL-6.
Ссылочный пример 4. Получение мышиного антитела к рецептору IL-6
Моноклональное антитело, направленное против мышиного рецептора IL-6, было получено по методу, описанному в работе Saito, et al., J. Immunol. (1991) 147, 168-173.
Клетки СНО, которые продуцируют растворимый мышиный рецептор IL-6, выращивали в культуральной жидкости IMDM, содержащей 10%-ную FCS. Растворимый мышиный рецептор IL-6 очищали из супернатанта культуры клеток с помощью аффинной колонки, в которой антитела RS12 (см. выше Saito, et al.) к мышиному рецептору IL-6 были пришиты к гелю Affigel 10 (производство фирмы «Biorad»).
8
7
Полученный таким образом растворимый мышиный рецептор IL-6 смешивали с полным адъювантом Фрейнда и вводили его с помощью инъекции в брюшную полость крыс Wistar. Спустя две недели после введения животным вводили поддерживающую дозу неполного адъюванта Фрейнда. На 45 день отбирали клетки селезенки крыс и около 2×10 этих клеток сливали с 1×10 клеток мышиной миеломы P3U1, используя 50%-ный ПЭГ 1500 (производство фирмы «Boehringer Mannheim»), в соответствии с общепринятым методом, а затем отбирали клетки с помощью культуральной среды HAT.
После добавления супернатанта культуры клеток гибридомы в планшет, сенсибилизированный кроличьим антителом к крысиным иммуноглобулинам IgG (производство фирмы «Cappel»), мышиный растворимый рецептор IL-6 вступал в реакцию. Затем, используя кроличье антитело к мышиному рецептору IL-6 и бараньи антитела к кроличьим иммуноглобулинам IgG, меченные щелочной фосфатазой, с помощью метода ELISA отбирали гибридомы, продуцирующие антитело к растворимому мышиному рецептору IL-6. Клоны гибридом, для которых было показано продуцирование антитела, дважды подвергали скринингу для того, чтобы получить единственный клон гибридомы. Клон был обозначен как MR16-1.
3
4
3
3
3
2
Нейтрализующую активность антитела, продуцированного гибридомой, в отношении трансдукции сигнала мышиного IL-6 изучали по включению H-тимидина с использованием клеток MH60.BSF2 (Matsuda, Т. et al., J. Immunol. (1988) 18, 951-956). Клетки MH60.BSF2 засевали в 96-луночный планшет из расчета 1×10 клеток/200 мкл/лунку. В планшет вносили 10 пг/мл мышиного IL-6 и антитела MR16-1 или антитела RS12 в количестве 12,3-1000 нг/мл, затем клетки выращивали при температуре 37°С при 5%-ном содержании СО в течение 44 часов, после чего вносили 1 мкКи/лунку H-тимидина. Спустя 4 часа измеряли включение H-тимидина. В результате было обнаружено, что антитела MR16-1 подавляли включение Н-тимидина в клетки MH60.BSF2.
Таким образом, было показано, что антитело, продуцируемое гибридомой MR16-1 (FERM ВР-5875,) ингибирует связывание IL-6 с рецептором IL-6.