Апоптоз соматических клеток фолликулов в яичниках коров и его взаимосвязь с уровнем стероидных гормонов в фолликулярной жидкости и всв-диагностикой ооцитов

УДК 577.17.087/636.02

Аспирант Л.Н. РОТАРЬ

АПОПТОЗ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК ФОЛЛИКУЛОВ В ЯИЧНИКАХ КОРОВ И ЕГО ВЗАИМОСВЯЗЬ С УРОВНЕМ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ В ФОЛЛИКУЛЯРНОЙ ЖИДКОСТИ И ВСВ-ДИАГНОСТИКОЙ ооцитов

Значительный прогресс, достигнутый в молекулярной биологии, позволил по-новому оценить многие процессы, связанные с поддержанием клеточного гомеостаза в тканях и развитием организма. Одним из таких процессов является апоптоз. Это эволюционно развитый особый вид генетически программируемой самоликвидации клеток, который может наблюдаться в условиях физиологической нормы и патологических процессах жизнедеятельности организма. Исследование апоптотического процесса клеток стало в настоящее время одной из самых актуальных проблем в биологии.

В последние годы у исследователей повысился интерес и к процессу апоптоза клеток в репродуктивных органах самок, в частности, тканях матки и яичников. Яичники являются органом, в котором сосредоточен вес пул примордиальных фолликулов. При рождении телок их насчитывается около 700 тысяч. В месячном возрасте количество фолликулов снижается до 75, а в трехлетнем — 60 тысяч. Одним из естественных путей редукции популяции клеток яичников является апоптоз. Знание и понимание роли апоптоза в функционировании яичников в норме и патологии представляет большое значение для профилактики и предотвращения ряда заболеваний репродуктивной системы [ 1 ].

Интересна роль апоптоза и его интенсивность в развитии фолликулов и их атрезии в течение полового цикла, и какое влияние на него оказывают гормоны. Имеющиеся к настоящему времени сведения немногочисленны, выполнены на разных видах животных и нередко носят противоречивый характер.

Некоторые авторы считают, что апоптоз, как правило, характерен для клеток гранулезы, но не для клеток теки [2]. Предполагается, что клетки теки оказывают антиапоптотическое действие на клетки гранулезы. В подтверждение этой гипотезы клетки гранулезы при совместном культивировании с тека-клетками дольше не подвергались апоптозу, индуцированному дефицитом питательных веществ [3].

На программированную гибель клеток оказывают влияние не только гены-регуляторы, но и различные цитокины и гормоны [4]. Ряд исследований in vitro и in vivo показали, что проапоптотическое действие на клетки гранулезы оказывают различные цитокины, андрогены и ГнРГ. И наоборот, апотоптоз могут ингибировать факторы роста, прогестерон, эстрогены и гонадотропные гормоны [3].

Известно, что в жидкости преантральных фолликулов коров по мере их роста и развития до преовуляторной стадии уровень эстрадиола возрастает. Это показывает, что эстрадиол играет важную роль в процессе фолликулогенеза и овуляции. Стероиды синтезируются в клетках теки и гранулезы. Антральные фолликулы отбираются для овуляции или для атрезии. В процессе фолликулярного роста уровень тестостерона в фолликулярной жидкости снижается. Андрогены синтезируются клетками теки и являются обязательным субстратом для биосинтеза эстрогенов, а также могут играть роль в атрезии фолликула. Критерием, определяющим атрезию фолликула, является уровень стероидов в фолликулярной жидкости [5]. Содержание высоких концентраций прогестерона, тестостерона и андростендиона, по сравнению с более низкой концентрацией эстрадиола, соответствуют большей доле ооцитов, достигших метафазы II и компетентности к оплодотворению in vitro [6]. Популяция донорских ооцитов, выделяемых из яичников

животных, гетерогенна как по морфологическим параметрам (количество слоев, окружающих ооцит клеток кумулюса, структура ооплазмы, степень экспансии клеток кумулюса), так и по функциональному состоянию. В связи с этим представляется интересным исследовать влияние гормонов и стадии роста фолликулов на развитие клеток и их дальнейшую судьбу. Хорошей моделью для этого являются соматические клетки фолликулов яичников. Развитие ооцитов в растущем пуле фолликулов во многом зависит от состава фолликулярной жидкости (ФЖ), поскольку ФЖ формирует микроокружение для ооцита и является источником веществ, необходимых для его правильного развития. Представляется вероятным, что содержание того или иного вещества в ФЖ может свидетельствовать об условиях для развития конкретного ооцита.

Целью исследования является исследование морфологических проявлений апоптоза клеток гранулезы (клетки с пикнотическими ядрами) в растущих или завершивших фазу роста овариальных фолликулах коров, и его взаимосвязь с уровнем тестостерона и эстрадиола в фолликулярной жидкости.

Работа выполнена в течение 2016 года на базе ФБГНУ ВНИИГРЖ и в лаборатории кафедры генетики, разведения и биотехнологии животных института биотехнологий СПбГАУ. Материалом для исследований служили ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК), фолликулярная жидкость (ФЖ), клетки гранулезы (КГ). Определяли уровень стероидных гормонов в фолликулярной жидкости коров, содержащих ооциты, растущие и завершившие фазу роста. Для оценки функционального статуса ооцита использовали прижизненный краситель кристаллический бриллиантовый голубой (ВСВ) - индикатор активности фермента глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы [7]. Далее проводили исследование уровня апоптоза соматических клеток овариальных фолликулов коров, содержащих ооциты -растущие (ВСВ-) и завершившие фазу роста (ВСВ+).

Материалы, методы и объекты исследования. Сразу после убоя животного, из теплой туши, проводили извлечение яичников (оварэктомия). Яичники доставляли в лабораторию при температуре 32-36°С в 0,9% растворе NaCl в течение 1 часа. Для экспериментов отбирали яичники на стадии фолликулярного роста и на стадии желтого тела, без видимой патологии. В лаборатории яичники освобождали от остатков яйцеводов и 3-кратно промывали в стерильном физиологическом растворе. Затем помещали в чашку Петри, в небольшом количестве 0,9% раствора NaCl.

Из фолликулов диаметром 3-6 мм с хорошим тургором и обширной васкуляризацией проводили аспирацию фолликулярной жидкости, совместно с ооцит-кумулюсными комплексами. Данная манипуляция осуществлялась при помощи шприца, объемом 1,0 мл с иглой диаметром 0,18 мм. После аспирации капля ФЖ, с предположительно содержащимся в ней ОКК, помещали в 6-луночный планшет, в центр лунки (1 лунка - 1 капля ФЖ). Средний объем ФЖ, выделенный из одного фолликула, крайне невелик, поэтому во избежание ее пересыхания целесообразно выполнять манипуляции очень быстро. После окончания аспирации каждую каплю ФЖ исследовали на наличие ОКК при помощи микроскопа MECIO при увеличении 14x28. Для определения функционального статуса ооцитов выявленные в ФЖ ОКК переносили в 26цМ раствор (Sigma, В-5388) витального красителя бриллиантового кристаллического голубого (ВСВ), с экспозицией 90 минут [8]. Особое внимание уделяется маркировке планшетов (номер лунки с каплей ФЖ должен четко соответствовать номеру лунки с ВСВ красителем). После выявления ВСВ+ и ВСВ- ооцитов проводили идентификацию «ОКК-ФЖ» по маркировке. Затем ФЖ собирали раздельно (+ и - ) в пробирки, объемом 1 мл и центрифугировали при 200 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отбирали, так же раздельно ВСВ+ и ВСВ-, для определения концентрации гормонов. Полученную ФЖ расфасовывали в апирогенные пластиковые пробирки. Объем пробы составлял 160 мкл. Далее образцы маркировали и замораживали при -20°С. Супернатант использовали для приготовления препаратов клеток гранулезы. Уровень эстрадиола и тестостерона в фолликулярной жидкости определяли на иммуноферментном анализаторе Stat Fax 2100 с использованием наборов «Эстрадиол-ИФА» и «Тестостерон-

ИФА» производство «ХЕМА». Количественные исследования проводили путем определения индекса митозов и индекса пикнозов, как долю окрашенных клеток гранулезы овариальных фолликулов с соответствующими морфологическими признаками. Цитологическую оценку соматических клеток фолликулов осуществляли с использованием метода ТагколувЫ (1966).

Результаты исследований. В серии экспериментов (4 повторности) было исследовано 328 фолликулов, аспирированных из 75 яичников коров (50 яичников с желтым телом (лютеиновая фаза), 25 яичников на стадии фолликулярного роста). Выделено 90 ооцит-кумулюсных комплексов, из них 56 (62,3%) ВСВ+, 34 (37,3%) ВСВ-. Результаты, представленные в табл. 1, показывают, что по мере завершения фазы роста ооцитов наблюдается увеличение пикноза соматических клеток фолликулов на 12,7% относительно их доли в фолликулах, содержащих ооциты, находящиеся в фазе роста.

Таблица 1. Уровень апоптоза соматических клеток из фолликулов яичников коров, содержащих растущие и завершившие фазу роста ооциты

Количество Количество митозов Количество пикнозов

ВСВ статус ооцита клеток

гранулезы п Индекс п Индекс

ВСВ+ (п=56) 1821 98 5,4±0,53а 314 17,2 ±0,88а

ВСВ- (п=34) 1414 147 10,4±0,81в 63 4,5±0,55ь

Достоверность различия Р<0.01.111 Р<0.(>1

Митотический индекс высоко достоверно снижается на 5,0%. При этом превышение митотического индекса клеток гранулезы из фоллкулов с ВСВ+ ооцитами в 3,2 раза, в то время как индекс пикноза клеток гранулезы из фолликулов, содержащих ВСВ- ооциты, был 2,3 раза меньше, чем индекс митозов. Приведенные данные согласуются с результатами исследований других авторов [9].

Исследование уровня гормонов в жидкости фолликулов, содержащих ВСВ+ и ВСВ-ооциты (табл. 2), выявило, что уровень эстрадиола в фолликулярной жидкости коров, содержащей ооциты, тестированные как завершившие фазу роста in vivo, на 37,6% превышает таковой в фолликулах, содержащих ооциты, находящиеся в фазе роста, а уровень тестостерона соответственно на 21,8% меньше.

Таблица 2. Концентрация эстрадиола и тестостерона в жидкости овариальных фолликулов, содержащих завершившие фазу роста (ВСВ+) или растущие (ВСВ-) ооциты коров

Результат ВСВ п Концентрация эстрадиола (х ± т), нг/мл Концентрация тестостерона (х ± т), нг/мл

ВСВ + 56 7,39±0,18а 26,17±2,6с

ВСВ- 34 5,37±0,42Ь 33,47±l,7d

Достоверность различия ц| Р<0,05.1,1 Р<().()5 (критерий Стьюдснта).

Сравнение данных табл. 1 и табл. 2 показывает, что концентрация эстрадиола, тестостерона и уровень апоптоза клеток фолликулов, содержащих ВСВ- ооциты, меняются прямо противоположно в сравнении с фолликулами, содержащими ВСВ+ ооциты. Снижение тестостерона в ФЖ по мере завершения роста ооцитов, можно предположить, связано с повышением интенсивности превращения тестостерона в эстрадиол. Это в свою очередь приводит к уменьшению митотического индекса и увеличению пикноза клетки гранулезы, что согласуется с исследовниями других авторов о проапоптотическом действии андрогенов [10].

Выводы. Таким образом, в результате исследований выявлена корреляция между уровнем стероидных гормонов в жидкости овариальных фолликулов коров, количеством

апоптозов в клетках гранулезы и функциональным статусом ооцитов. Установлено, что интенсивность апоптоза в клетках гранулезы овариальных фолликулов коров тесным образом связана с функциональным статусом ооцита.

Полученные данные могут быть использованы при разработке и совершенствовании эффективных моделей созревания донорских ооцитов коров in vitro. Также могут быть использованы при совершенствовании способов и средств стимуляции репродуктивной функции КРС, а также в клинической практике и в учебных целях при подготовке специалистов зооветеринарного профиля.

Литература

1. Боярский К.Ю. Молекулярные основы фолликулогенеза // Проблемы репродукции. - 2006. -№4. - С. 26-37.

2. . Sato Eimei, Kimura Naoko, Yokoo Masaki et al. Morphodynamicsof ovarian follicles during oogenesis in mice // Microsc. Res. and Techn. - 2006. - Vol. 6. - № 69. - P. 427-435.

3. Tilly J.L., Pru J.K., Rueda B.R. Role of apoptosis in development, functioning and function infringement in the ovary // The Ovary, 2004. - Ch. 19. - P. 321-345.

4. Yasuda K., Hagiwara E., Takeuchi A. et al. Changes in the distribution of tenascin and fibronectin in mouse ovaiy during folliculogenesis, atresia, corpus luteum formation and luteolisis. // Endocrinol.-2005-Feb.-v.22(2).-P.237-245.

5. Gordon I. Laboratory production of cattle embryos.- 2003. 548 p.

6. Bousquet D., Goff A., King W.A., Greve T. Fertilization in vitro of bovine oocytes: analysis of some factors affecting the fertilization rates. Vet. Res. - 1988 V. 52(2). 277-279 p.

7. Opiela J., Kijtska-Ksiijzkiewicz L. The utility of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining of mammalian oocytes used for in vitro embryo production (IVP) // Reproductive biology. - 2013. -№13. -P. 177-183.

8. Кузьмина Т.И., Мутиева X.M., Ротарь Л.Н. Митохондриальная активность в ооцитах коров, завершивших фазу роста in vivo или in vitro // Зоотехния/Гродненский государственный аграрный университет. - 2014. - Том 26. - С.148-153.

9. Татарская Д.Н., Кузьмина Т.И., Альм X., Торнер X. Аиоитоз соматических клеток фолликула как предиктор функционального статуса ооцитов животных // Репродуктивные технологии сегодня и завтра: Материалы XXIV Международной конференции Российской Ассоциации Репродукции Человека (3—6 сентября 2014 г.). - Ярославль, 2014. - С. 53-56.

10. Erickson G., Shimasaki S. The physiology of folliculogenesis: the role of novel growth factors |// Eertil. Steril. - 2001. - Vol. 76. -P. 943-949

Literatura

1. Bojarskij K.U. Molekuljarnye osnovy follikulogeneza // Problemy reprodukcii. - 2006. - №4. - S. 26-37.

2. Sato Eimei, Kimura Naoko, Yokoo Masaki et al. Morphodynamicsof ovarian follicles during oogenesis in mice // Microsc. Res. and Techn. - 2006. - Vol. 6, № 69. - P. 427-435.

3. Tilly J.L., Pru J.K., Rueda B.R. Role of apoptosis in development, functioning and function infringement in the ovary // The Ovary, 2004. - Ch. 19. - P. 321-345.

4. Yasuda K, Hagiwara E., Takeuchi A. et al. Changes in the distribution of tenascin and fibronectin in mouse ovaiy during folliculogenesis, atresia, corpus luteum formation and luteolisis. // Endocrinol.-2005-Feb.-v.22(2).-P.237-245.

5. Gordon I. Laboratory production of cattle embryos.- 2003. 548 p.

6. Bousquet D., Goff A., King W.A., Greve T. Fertilization in vitro of bovine oocytes: analysis of some factors affecting the fertilization rates. Vet. Res. -1988 V. 52(2). 277-279 p.

7. Opiela J., Kijtska-Ksiijzkiewicz L. The utility of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining of mammalian oocytes used for in vitro embryo production (IVP) // reproductive biology. - 2013. -№13. -P 177-183.

8. Kuz'mina T.I., Mutieva H.M., Rotar' L.N. Mitohondrial'naja aktivnost' v oocitah korov, zavershivshih fazu rosta in vivo ili in vitro // Zootehnija/Grodnenskij gosudarstvennyj agrarnyj universitet. - 2014. - torn 26. - S.148-153.

9. Tatarskaja D.N., Kuz'mina T.I., Al'm H., Torner H. Apoptoz somaticheskih kletok follikula kak prediktor funkcional'nogo statusa oocitov zhivotnyh // Reproduktivnye tehnologii segodnja i zavtra: Materialy XXIV Mezhdunarodnoj konferencii Rossijskoj Associacii Reprodukcii CHeloveka (3—6 centjabija2014 g.) JAroslavl',- 2014,- S. 53-56.

10. Erickson G.,Shimasaki S. The physiology of folliculogenesis: the role of novel growth factors // Eertil. Steril. - 2001. - Vol. 76. -P. 943-949.

УДК 636.2

Доктор с.-х. наук А.Ф. ШЕВХУЖЕВ

КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ СТАТУС БЫЧКОВ ПРИ ОТГОННО-ГОРНОМ СОДЕРЖАНИИ

В Российской Федерации крупный рогатый скот является одним из приоритетных источников производства мясного сырья. С целью увеличения поголовья мясного скота целесообразно наряду с разведением специализированных мясных пород идти по пути создания помесных стад на основе промышленного скрещивания коров молочного и комбинированного направлений продуктивности с быками-производителями мясных пород [1,2].

Проблема устойчивости и приспособления организма к действию различных факторов среды является одной из наиболее значимых на современном этапе развития животноводства [3, 4].

Адаптация животных в значительной степени определяется естественной резистентностью и защитными приспособлениями организма к различным неблагоприятным факторам внешней среды [5-7].

Уровень естественной резистентности животных связан с наследственностью и зависит как от функционального состояния нервной системы и эндокринной регуляции, так и от возраста, породы, типа и уровня кормления, условий содержания, сезона года, физиологического состояния [8-10].

Несмотря на имеющиеся сведения о влиянии возраста и генотипа животных на иммунобиологические особенности, единого мнения до сих пор среди ученых нет, что обусловлено природно-климатическими, кормовыми, организационно-технологическими и другими условиями.

В этой связи проведение комплексных исследований иммунологической реактивности животных в конкретных условиях среды, в нашем случае при отгонно-горном содержании бычков на пастбищах, актуально, представляет интерес для зоотехнической науки и практики с целью более полной реализации продуктивных качеств.

Цель исследования. Провести анализ показателей крови бычков разного происхождения в период их выращивания и откорма.

Материалы, методы и объекты исследований. Исследования по изучению клинического статуса, морфобиохимических показателей крови и резистентности организма бычков провели на чистопородном молодняке бурой швицкой (I группа), абердин-ангусской (II группа) пород и помесях, полученных от промышленного скрещивания бурой швицкой и