Генетический полиморфизм и фармакокинетика лекарственных средств

ЯВЕННВВ

Генетический полиморфизм и фармакокинетика лекарственных средств

И. И. Мирошниченко 1, С. Н. Птицина 2 1 - НЦПЗ РАМН, г. Москва 2 — ВНЦБАВ, Купавна, Московская область

Взаимосвязь фармакологии и генетики носит двусторонний характер. С одной стороны, в рамках медицинской генетики изучается влияние лекарственных веществ на генетический аппарат. В настоящий момент необходимым этапом при создании новых лекарственных средств является изучение их мутагенности, что значительно повышает безопасность применения лекарств, исключая на доклиническом этапе вероятность нежелательных отдаленных последствий индуцированных мутаций.

С другой стороны, воздействие лекарственных веществ на организм человека зависит от фенотипа эндогенных систем, опосредующих их фармакодина-мику и фармакокинетику [2]. Это направление получило название фармакогенетика. В настоящее время у человека установлены генетические различия практически по всем ферментам, метаболизирующим лекарства. Одной из задач фармакогенетики, имеющей как общебиологическое, так и клиническое значение, является выяснение генетических и внешних причин различной реакции индивидуумов на лекарственные препараты (значения ряда фармакокинетических параметров могут отличаться в 4-40 раз, в зависимости от вида препарата и характера популяционных исследований).

В настоящее время наблюдается устойчивый интерес к генетически обусловленным факторам риска и вариабельности терапевтического эффекта. В перспективе генотипирование пациентов приведет к снижению количества наследственных заболеваний и оптимизации терапии путем выявления генетического полиморфизма изоферментов цитохрома Р450 (СУР) и ^ацетилтрансферазы [1, 5]. При наличии полиморфизма в популяции выделяют группы с нормальным метаболизмом, замедленным метаболизмом (при наличии двух инактивных аллелей) и сверхинтенсивным метаболизмом (повышенная ферментативная экспрессия). Соответственно, возникает опасность неэффективности терапии при сверхинтенсивном метаболизме и, наоборот, возникновения токсических проявлений при замедленном метаболизме.

Большинство реакций I фазы метаболизма лекарственных средств катализируется цитохромом Р450, гемосодержащим белком, связанным с мембранами эндоплазматического ретикулюма. Ферменты семей -ства цитохром Р450 локализованы, преимущественно, в гепатоцитах, хотя известны и другие места их локализации (стенка кишечника, почки, легкие, кожа и кровь). Реакция протекает в несколько этапов, но в конечном результате приводит к переносу атома кислорода субстрату ^-Н) с участием кофермента NADPH:

NADPH+H++O2+R-H^NADP++H2O+R-OH.

У человека обнаружено, по меньшей мере, 12 классов цитохрома Р 450, различающихся по аминокислотной последовательности. Три из них (СУР1, СУР2, СУР3) ответственны за большинство процессов биотрансформации. Эти классы, в свою очередь, подразделяются на подклассы: СУР1А, СУР2В и т. д. Индивидуальные изоферменты подклассов отличаются по арабской цифре в конце аббревиатуры, означающей порядок открытия этой изоформы (СУР1А2). Среди около 30 встречающихся у человека изоферментов, наибольший вклад в метаболизм ксенобиотиков вносят СУР1А2, СУР2С9, СУР2С19, СYP2D6, СУР2Е1, СУР3А4/5 и, в некоторой мере, СУР2А6 и СУР2В6 (табл. 1).

Таблица 1.

Процент от общего числа зарегистрированных препаратов, подвергающихся метаболизму посредством определенной изоформы цитохрома P450

Фермент Процент от общего числа

СУР2Д6 3

СУР2Б6 3

СУР2Е1 4

СУР2С19 8

СУР1Д1/2 11

СУР2С8/9 16

СУР206 19

СУР3Д4/5 36

№2(3)-200Е

35

КЛИНИЧЕСКАЯ ФЯРМЯКОКИНЕТИКЯ

ФАИЙАщМЕНШИШа

Подкласс CYP2B широко распространен и достаточно хорошо изучен у экспериментальных животных, однако его роль в лекарственной биотрансформации у человека ограничена. Наибольшее значение в метаболизме препаратов у человека играет CYP3A4. Эта изоформа, большей частью, локализована в печени, но присутствует также и в ЖКТ. Среди лекарственных средств, подвергающихся биотрансформации, как в печени, так и в ЖКТ, следует упомянуть циклоспорин, верапамил и применяющиеся для лечения ВИЧ ингибиторы протеазы. Все они обладают высокими значениями клиренса и являются субстратом CYP3A4. В одной и той же клетке могут присутствовать разные изоформы цитохрома Р450, но, как правило, метаболизм конкретного препарата катализирует определенный изофермент, хотя наблюдаются и примеры иного рода, например амитриптилин (табл. 2).

Подобный мультисубстратный метаболизм вносит определенный вклад в межлекарственное взаимодействие.

Среди факторов, влияющих на ферментативную активность семейства цитохромов Р450, следует выде-

Характеристики основных изоферментов

лить генетический полиморфизм (экспрессия признака выражена несколькими генами), лекарственное взаимодействие при совместном применении, заболевания и возраст человека [14]. Различные аллели генов этого семейства приводят к значительной вариабельности экспрессии и, как следствие, к «фармакогенетическо-му полиморфизму» популяции. Показано, что имеются значительные отличия в исследованных выборках между CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 и CYP3A5, ответственных за метаболизм большинства лекарственных веществ, элиминируемых через печень.

В качестве примера можно привести работу. Y. Hashimoto и соавт. [8] по изучению индивидуальной чувствительности к факторам, вызывающим коронарные заболевания сердца в зависимости от потребления алкоголя. Исследовали взаимосвязь между клиническими характеристиками (кровяное давление, содержание триглицеридов и мочевой кислоты) и генетическим полиморфизмом алкогольдегидрогенезы (ADH)2 и альдегиддегидрогеназы (ALDH)2. Генотип ADH2 определяли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующей обработкой рестрик-

Таблица 2.

тохрома Р450 печени человека [4, 7, 18]

Изофермент Субстраты Индукторы Ингибиторы

CYP1A2 Амитриптилин, ацетаминофен, кофеин, клозапин, имипрамин,оланзапин, ондасетрон, пропранолол, теофиллин, такрин, (Я)-варфарин Сигаретный дым, древесный уголь, жареная пища, инсулин, омепразол Амиодарон, мибефрадил, норфлоксацин, тиклопидин, ципрофлоксацин, эноксацин,

CYP2A6 Бетадеин, кумарин, никотин Барбитураты

CYP2B6 Бупропион, изофосфамид, метадон, эфавиренц Рифампин, фенобарбитал Тиклодипин

CYP2C9 Амитриптилин, диклофенак, ибупрофен, пироксикам, фенитоин, (Б)-варфарин. Рифампин Амиодарон, ритонавир

CYP2C19 Амитриптилин, дапсон, диазепам, омепразол, циталопрам Дексаметазон, фенобарбитал Ритонавир

CYP2D6 ß-адреноблокаторы, дебризоквин, декстрометорфан, омепразол, трициклические антидепрессанты Беременность, дексаметазон, рифампин Дезипрамин, кломипрамин, пароксетин, сертралин, тиоридазин, флуоксетин, хинидин

CYP2E1 Ацетаминофен, венлафаксин, галотан, этанол Этанол, изониазид Дисульфирам, циметидин

КЛИНИЧЕСКАЯ Ф-ЛРМ-ПКОКИШИК-П ^^

36

№2сз)-200Е

тазой МаеШ; генотип ALDH2 определяли на основе анализа полиморфизма длин амплифицированных продуктов с использованием трех олигонуклеотид-ных праймеров. Полученные результаты позволили разделить исследуемую популяцию из 133 человек, потребляющих>300 г алкоголя в неделю, на три группы с генотипами АОН 21/21, АОН 21/22 и ADH 22/22. С помощью регрессионного анализа выявили корреляцию между частотой коронарных заболеваний сердца и генотипом ADH 22/22 и пришли к заключению, что индивидуумы с генотипом ADH 21/21 могут легче переносить отрицательные последствия алкоголя.

Популяция в США насчитывает около 50 % лиц со сниженной активностью ^ацетилтрансферазы — фермента, ацетилирующего ряд препаратов (изониа-зида, гидралазина, сульфалазина) [22].

Примерно у 1 из 1500 человек выявлен дефицит псевдохолинэстеразы, фермента ответственного за гидролиз эфирных связей [17].

Снижение дебризохин гидроксилазной активности обусловлено изменением активности CYP2D6. Индоевропейская популяция насчитывает от 5 до 10 % лиц с дефицитом данного фермента (табл. 3). Большое количество препаратов ф-адреноблокаторы, анти-аритмики, трициклические антидепрессанты, нейролептики) являются субстратами CYP2D6 и наблюдаемое 10-20—кратное различие в метаболизме этих веществ у человека также объясняется полиморфизмом. Обнаружен также полиморфизм стереоселектив-ного гидроксилирования S-мефенитоина. Медленный метаболизм, опосредованный CYP2C19, наблюдается у 3 % европейцев и 15 % жителей Азиатско-Тихоокеанского региона (табл. 3). Дефицит изоферментов группы CYP2C наблюдается у 2-5 % европейцев, 18-23 % японцев и у 5-17 % китайцев [18].

У примерно 50 % японцев и китайцев, и практически поголовно у малых северных народов наблюдается дефицит альдегиддегидрогеназы-2, фермента, ответственного за утилизацию алкоголя в организме человека. Дефицит другого фермента, вовлеченного в метаболизм алкоголя, алкогольдегидрогеназы, обнаружен у 85 % азиатской популяции, 5-10 % англичан, 9-14 % жителей Германии и 20 % швейцарцев. Низкая ферментативная активность глюкозо-6-фосфат деги-дрогеназы выявлена у африканцев и жителей Среди-

земноморья. Данное обстоятельство приводит к риску возникновения гемолитической анемии при приеме препаратов с антиоксидантными свойствами [22].

Широкий диапазон ответной реакции на лекарственные препараты может быть связан с генетическим полиморфизмом транспортных белков, например, Р-гликопротеинов [13], полипептидов-транспортеров анионов, действующих в I фазу абсорбции, цитох-ромов Р450 или ферментов II фазы метаболизма — N-ацетилтрансфераз и тиопурин S-метилтрансфераз.

Генетический полиморфизм CYP2C9 обусловливает разницу в метаболизме глипизида (резко выраженная гипогликемия) и фенитоина (табл. 4). Генотипиро-вание пациента, не способного эффективно метабо-лизировать глипизид, выявило, что данный субъект был гомозиготен по CYP2C9*3 аллели, то есть показана очевидная связь между генотипом CYP2C9*3*3 и вызываемой данным препаратом гипогликемией. Необходимость в генотипировании, и, как следствие, в корректировке лечащим врачом терапевтической дозы, показана и для препаратов с узкими границами терапевтической дозы, например, противоэпилепти-ческого препарата фенитоина и варфарина, при введении стандартной дозы которого у пациентов с медленным метаболизмом возрастал риск геморрагических осложнений. Установили [20], что у данных пациентов наблюдается гомозиготность CYP2C9*3 аллеля цитох-рома Р450.

Показано, что у лиц с медленным метаболизмом омепразола (субстрат CYP2C19) наблюдается значительно лучший терапевтический эффект по отношению к Helicobacter pylori, чем у субъектов с интенсивным (нормальным) метаболизмом [21]. Кодеин является пролекарством, которое подвергается метаболизму посредством изофермента CYP2D6, с образованием активной формы морфина. Вследствие этого у пациентов с медленным метаболизмом, обусловленным CYP2D6, кодеин в качестве анальгетика неэффективен [21].

В связи с вышесказанным встает вопрос о возможности лабораторной и, особенно клинической генодиагностики с целью оптимизации терапевтической эффективности лекарств. Генотипирование включает идентификацию определенных генетических мутаций, приводящих к специфическому фенотипу метаболиз-

Таблица 3.

Количество лиц с замедленным метаболизмом и сверхинтенсивным метаболизмом (UEM) в процентах от всей популяции

у различных расовых и этнических групп

Фермент Индоевропейцы Монголоиды Негроиды Арабы

PM UEM PM UEM PM UEM PM UEM

CYP2D6 5-10 1-10 1 0-2 0-20 2 1,8-2 10-29

CYP2C9 0,2-1 НД 2-3 НД НД НД НД НД

CYP2C19 2-4 НД 10-25 НД 1-5 НД 2* НД

Примечание: НД- нет данных, * - данные по Саудовской Аравии.

Ип2о)-200Е1 ^^ 37 ^^ КЛИНИЧЕСКАЯ ФНРМНКОКИНЕТИКН

ФАЙЙАщМЕНШЯШа

ма препаратов. К мутациям относятся генетические изменения, вызывающие повышенную экспрессию фермента (генные дупликации), отсутствие активного генного продукта (нуль аллели) или продукция мутант-ного белка с ослабленной каталитической способностью (инактивированные аллели).

Прогресс в этом направлении стал возможен с разработкой метода, позволяющего проводить успешный скрининг генетических мутаций, связанных с изменением метаболизма лекарств и чувствительности к канцерогенам, и заключающийся в амплификации специфического района гена с помощью ПЦР с последующей обработкой амплифицированного генного продукта рестрикционными эндонуклеазами, разрезающими ДНК с высокой специфичностью. По характеру возникающих рестрикционных фрагментов и их полиморфизму можно судить о возникающих внутри определенной последовательности ДНК точковых мутациях. Различия в размере фрагментов в сравнении с контрольными образцами ДНК определяются с помощью электрофореза в агарозном геле с последующим окрашиванием фрагментов ДНК бромистым эти-дием. Данный метод RFLP (ПДРФ — полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) часто упоминается в публикациях [9, 11, 19].

Второй метод, применяемый для определения мутаций внутри гена, заключается в аллель-специфичной ПЦР-амплификации, когда в параллельных реакциях амплификации используются олигонукле-отиды, специфичные для гибридизации с основными или вариантными аллелями. При этом амплифи-цированный продукт дают только последовательности-мишени, гибридизующиеся с зондами, анализ осуществляется также методом электрофореза в ага-розном геле. Примером применения этого метода является идентификация аллельных вариантов А и Б CYP2D6. [15]. Этот метод генотипирования хорош тем, что требует малых количеств крови или ткани и обеспечивает результаты через 48-72 ч, позволяя провести быструю коррекцию дозы и введение препарата. Для уточнения генотипа используют метод гибридизации по Саузерну, но для клинических целей это не является необходимым.

Следует отметить постоянное усовершенствование и разнообразие методов ПЦР-детекции, разработку новых специфичных праймеров и микрочипов ДНК,

позволяющих как усилить возможности идентификации генов, так и ускорить проведение генотипирования в клинических условиях на сравнительно недорогом и удобном оборудовании.

Примером может служить выявление нового аллеля *14В CYP2D6, а также шести дуплицированных аллелей CYP2D6 при анализе китайской популяции [10]. Полиморфизм по данному гену имеет большое клиническое значение для ряда антидепрессантов, нейролептиков и антиаритмиков [3]. В обзоре [16] схематично представлена структурная организация хромосомы 22, включающей локусы CYP2D6, CYP2D7 и CYP 2D8P, и картированной с помощью рестриктазы ХЬа1. Идентифицированы мутации, связанные с наличием двух псевдогенов CYP2D7Р и CYP2D8Р, делеций и дупликаций генов. Первым доказательством генетического полиморфизма гена CYP2D6 было выявление гомозиготной генной делеции CYP2D6, связанной с ослабленным лекарственным метаболизмом [3].

При интерпретации данных генотипирования следует уточнить, что гомозиготность по генным делециям встречается очень редко и составляет<4 % РМ (0,4 % от всей популяции).

В заключение хотелось бы подчеркнуть важное значение сочетания генотипирования с терапевтическим лекарственным мониторингом, позволяющим предсказывать РМ и иЕМ фенотипы и индивидуализировать терапевтический подход к человеку. Интенсивные разработки технологии микрочипов ДНК в совокупности с успешной реализацией Международной программы «Геном человека» позволят в будущем снизить расходы на проведение скрининга и поднять медицинское обслуживание на качественно новую ступень.

Таким образом, имеющийся в настоящее время объем информации трансформирует фармакогенетику из теоретической науки в практическую дисциплину, вписывающуюся в рамки клинической фармакологии, поскольку появилась возможность типировать пациентов по признакам, прогнозирующим индивидуальные эффекты лекарств, что, безусловно, открывает новые возможности рационализации фармакотерапии.

Расшифровка генома человека ведет к дальнейшему продвижению фармакогенетики и решению задач, описываемых вновь введенным термином «фармакоге-номика» [6].

Таблица 4.

Различия в показателях фармакокинетики глипизида и фенитоина у 24 здоровых добровольцев с замедленным метаболизмом и интенсивным (нормальным) метаболизмом после однократного приема в терапевтических дозах [12]

Параметр Глипизид Фенитоин

EM

V ч 5±2 11 14±4 47

Cmax, мкг/мл 252±81 1270 2±1 2

AUC, мкгхч/мл 4712±707 25686 47±14 200

КЛИНИЧЕСКАЯ ФНРМНКОКИНШКП ^^

38

№2(3)-200Е

ЛИТЕРАТУРА

1. Евгеньев М. И., Гармонов С. Ю, Погорельцев В. И. и др. Определение фенотипа ацетилирования для терапевтического мониторинга лекарственных средств. Клин лаб диагностика 1996; 5: 24-27.

2. Середенин С. Б., Вальдман Е.А. Фармакология и генетика. Новые перспективы и возможности. Вестник РГМУ 2003; 4: 30: 75-77.

3. Brosen K, Gram L. F. Clinical significance of the sparteine/debrisoquine oxidation polymorphism. Eur J Clin Pharmacol 1989; 36: 537—547.

4. Buck M. L. The cytochrome P450 enzyme system and its effect on drug metabolism. Pediatr Pharmacother 1997; 3: 5: 211-216.

5. DahlM. L. Cytochrome P450 phenotyping in patients receiving antipsychotics. Useful aid to prescribing? Clin Pharmacokin 2002; 41: 453-470.

6. Flexner C. W. Advances in HIV pharmacology: protein binding, pharmacogenomics, and therapeutic drug monitoring. Top HIV Med 2003; 11: 2: 40-44.

7. Gunaratna C. Drug metabolism and pharmacokinetics in drug discovery: a primer for bioanalytical chemists, part I. Current Separations BAS 2000; 19: 1: 17-23.

8. Hashimoto Y, Nakayama T. Futamura A. et al. Relationship between genetic polymorphisms of alcohol-metabolizing enzymes and changes in risk factors for coronary heart disease associated with alcohol consumption. Clin Chem 2002; 48: 7: 1043-1048.

9. Harris C. C. Interindividual variation among humans in carcinogen metabolism, DNA adduct formation and DNA repair. Carcinogenesis 1989; 10: 1563—1566.

10. Ji L, Pan S, Marti-Jaun J. et al. Single-step assays to analyze CYP2D6 gene polymorphisms in Asians: allele frequencies and a novel *14B allele in mainland Chinese. Clin Chem 2002; 48: 7: 983-988.

11. Kawajiri K, Nakachi K.., Imai K. et al. Identification of genetically high risk individuals to lung cancer by DNA polymorphisms of the cytochrome P450IA1 gene. FEBS Lett 1990; 263: 131—133.

12. Kidd R S, Straughn A. B, Meyer M. C. et al. Pharmacokinetics of chlorpheniramine, phenytoin, glipizide and nifedipine in an individual homozygous for the CYP2C9*3 allele. Pharmacogenetics 1999; 9: 1: 71-80.

13. Kurata Y, Ieiri I., Kimura M. et al. Role of human MDR1 gene polymorphism in bioavailability and interaction of digoxin, a substrate of P-glycoprotein. Clin Pharmacol Ther 2002; 72: 209-219.

14. Kwan K. C. Oral bioavailability and first-pass effects. Drug Metab Dispos 1997; 25: 12: 1329-1336.

15. Linder M. W, Prough R. A., Valdes R Jr. Pharmacogenetics: a laboratory tool for optimizing therapeutic efficiency. Clin Chem 1997; 43: 2: 254-266.

16. Linder M. W, Valdes R Jr. Genetic mechanisms for variability in drug response and toxicity. J Anal Toxicol 2001; 25: 5: 405-413.

17. Maiorana A., Roach R B. Jr. Heterozygous pseudocholinesterase deficiency: a case report and review of the literature. J Oral Maxillofac Surg. 2003; 61: 7: 845-847.

18. Meyer J. M, Rodvold K. A. Drug biotransformation by the cytochrome P-450 enzyme system. Infect Med 1996; 13: 6: 452, 459, 463-464, 523.

19. Nakachi K, Imai K, Hayashi S, Watanabe J. Genetic susceptibility to squamous cell carcinoma of the lung in relation to cigarette smoking dose. Cancer Res 1991; 51: 5177—5180.

20. Rettie A. E, Wienkers L. C., Gonzalez F. J. et al. Impaired (S) -warfarin metabolism catalysed by the R144C allelic variant of CYP2C9. Pharmacogenetics 1994: 4: 39—42.

21. Rogers J. F, Nafziger A. N, Bertino J. S. Jr. Pharmacogenetics affects dosing, efficacy, and toxicity of cytochrome P450-metabolized drugs. Am J Med 2002; 113: 9: 746-750.

22. Weber W. W. Populations and genetic polymorphisms. Mol Diagn - 1999; 4: 4: 299-307.

№2(3)-200E

39

КЛИНИЧЕСКАЯ ФНРМНКОКИНЕТИКН