ХИТОЗАНОВАЯ КОМПОЗИЦИЯ
CHITOSAN COMPOSITION

Данное изобретение относится к хитозановой композиции, и особенно к хитозановым гелям, изготовленным из хитозана с низкой степенью деацетилирования и ковалентно сшитым при pH в диапазоне 6-10.
Предшествующий уровень техники
Настоящее изобретение относится к биосовместимым композициям полисахаридного геля, и в частности композициям хитозана в вакцинах, для доставки лекарственных средств, наращивания ткани, культивирования клеток, инкапсулирования жизнеспособных клеток, косметического использования, ортопедического использования, использования в качестве биоматериалов, устройств для заживления ран, загустителя и добавки в пищевой промышленности, применение в качестве клеев, смазывающих веществ, жидкостей для сверления и вспомогательных жидкостей. Гели получают с помощью ковалентно сшитых хитозановых гелей с низкой степенью деацетилирования. Путем подбора хитозанов с определенными степенями деацетилирования и используя эффективные условия сшивания могут быть получены гели с представляющими интерес и неожиданными биологическими и физическими свойствами. Они отличаются от других сшитых хитозановых гидрогелей, изготовленных из стандартного хитозана и с использованием типичных протоколов сшивания. Можно изготовить гели по изобретению, которые имеют очень низкую токсичность, и они могут быть изготовлены так, чтобы быстро разлагаться. Другая необычная особенность указанных гелей состоит в том, что они не осаждаются при воздействии нейтральных и щелочных условий. Они также обладают жесткостью, что позволяет дополнительную механическую переработку, например в инъецируемые, так называемые "дробленые гели", полезные в большом количестве применений.
Гидрогель можно определить как коллоидный гель, в котором вода представляет собой дисперсионную среду. Гидрогели широко используют во многих сферах и в нескольких областях они превратились в многомиллиардные индустрии. Обычно гидрогели изготовляют из водорастворимых полимеров, которые или были выделены из природных источников, или получены синтезом или химическими модификациями природных полимеров. Такие полимеры выбирают по их физическим и биологическим свойствам и используют самостоятельно или в комбинациях, зависящих от требуемых свойств продукта. Некоторые полимеры имеют физические свойства, которые делают их подходящими для медицинского использования, в то время как другие используются в пищевой промышленности, механической обработке и обрабатывающей промышленности в качестве смазывающих веществ, жидкостей для сверления и вспомогательных жидкостей, в косметических средствах, применениях биоматериалов, в биотехнологии в качестве клеточных каркасов и так далее. Для разных применений требуются разные свойства полимеров и множество технических применений основаны на сортах необработанной массы, доступной с низкой стоимостью, в то время как для медицинского применения требуются высокоочищенные сорта, часто с высокой стоимостью. Иногда физические свойства полимерного раствора, такие как вязкость, являются главным интересующим параметром, в то время как в других применениях становятся более значимыми биологические и токсикологические свойства для их функционирования в предполагаемом применении.
Некоторые полимеры используют для целей наполнения в композициях для наращивания тканей, где гели используют или самостоятельно или вместе с твердыми гранулами. В других применениях, например для заживления ран, доставки лекарственных средств, носителей для вакцин, требуются другие полимеры с другими свойствами для удовлетворения медицинских требований. В общем случае, такие свойства как вязкость, противомикробная активность, адгезивная способность или способность абсорбировать/удерживать воду, все являются свойствами, которые следует принимать во внимание. Способность удерживать воду и набухать имеют обычно большое значение в пищевых применениях, где полимер используют либо в качестве загустителя или в качестве улучшителя растворимости и стабилизатора других агентов. Существует широкий спектр полимеров, встречающихся в медицинских продуктах, как синтетических полимеров, так и полимеров натурального происхождения. Во многих применениях важно, чтобы полимеры распадались и выделялись, не вызывая нежелательных побочных эффектов. Несмотря на то, что способность к биоразложению не всегда является необходимой, хорошая биосовместимость является критической для предупреждения побочных реакций, таких как воспаление, иммунологические реакции или отторжение вещества. Таким образом, неудивительно, что встречающиеся в природе, нетоксичные полисахариды используют в медицинских продуктах, так как они обладают замечательными физическими свойствами в комбинации с представляющими интерес биологическими и медицинскими свойствами и обычно являются доступными с высокой степенью чистоты и по низкой цене. Обычно используемые полисахариды представляют собой, например, целлюлозу, альгинаты, хитозан, гиалуроновую кислоту, крахмал или их производные.
В медицине гели и мази используют, например, для доставки лекарственных средств, косметических целей, или для создания противомикробных барьеров, чтобы избежать инфекции. Гидрогели часто имеют нужную растворимость и биологические свойства и поэтому обнаруживаются в многочисленной группе продуктов. Образующие гель полисахариды, такие как гиалуроновая кислота, производные целлюлозы и подобное, становятся рентабельными промышленными областями. Гиалуроновая кислота является примером полимера, который можно было бы использовать сам по себе, так как он самопроизвольно образует гидрогели при использовании в низкоконцентрированных водных растворах при физиологическом pH. Другие полимеры, подобные целлюлозе, не могут быть использованы в таком качестве и должны быть химически модифицированы для приобретения желательных свойств. При получении гидрогелей из полисахаридов, обычный протокол включает растворение полимера в водном растворе в низких концентрациях, часто от 0,5 и до 3% (масс./масс.). Когда требуются более высокие вязкости, это может быть достигнуто или добавлением большего количества полимера к раствору, если позволяет растворимость, или сшиванием полимеров. Сшивание дает полимеры с более высокой молекулярной массой и, следовательно, более высокой вязкостью. Сшивание можно выполнять различными способами, используя ковалентные, ионные или гидрофобные стратегии, и доступным является большое количество подходов. В общем случае, когда продукт подобной реакции сшивания предназначен для медицинского использования, желательно обеспечить уровень сшивания как можно ниже, так как существует риск включения иммунологических реакций против линкера, и это может также негативно сказаться на биоразложении.
Иммунология и аллергия. Иммунную систему можно разделить на врожденный и адаптивный иммунитет. Врожденный или неспецифический иммунитет представляет собой наследственную устойчивость, проявляемую особями, которые не были иммунизированы инфекцией или вакцинацией. Адаптивный или приобретенный иммунитет представляет собой тип иммунитета, при котором существует измененная реактивность по отношению к антигену, который стимулирует его, и который создает антиген-специфическую иммунологическую память. Иммунитет может быть активным, то есть следствием приобретенной инфекции или вакцинации, или может быть пассивным, то есть приобретенным при переносе антител. Пассивная вакцинация антителами имеет несколько недостатков: инъекция чужеродных веществ может вызывать иммунный ответ против инъецируемых антител. Моноклональные антитела должны быть инъецированы в большом количестве, что делает данную терапию очень дорогой. Лечение должно быть продолжительным, чтобы поддерживать их функцию. Чаще всего предпочтительной является активная вакцинация для индуцирования образования антител и иммунологической памяти. Большинство природных иммуногенов представляют собой белки с молекулярной массой более 5 кДа. Даже иммуногенные молекулы могут не создать нужный уровень иммунитета. Для увеличения интенсивности иммунного ответа иммуногены объединяют с адъювантами. Адъюванты представляют собой агенты, которые усиливают иммунный ответ, не образуя нежелательных антител против адъюванта. Если иммуноген все еще неспособен вызывать приемлемый иммунный ответ, его можно конъюгировать с носителем, который является более иммуногенным. Небольшие молекулы с молекулярной массой в диапазоне от 0,1 до 2 кДа, часто являются слишком маленькими, чтобы распознаваться иммунной системой, и вследствие этого неудобны для использования сами по себе в иммунизациях. Одним способом обойти это является связывание их ковалентно с более крупными молекулами-носителями. Вакцинация может быть пероральной, назальной, подкожной, подслизистой, сублингвальной или внутримышечной.
Распознавание и разрушение чужеродных клеток с помощью Т- и NK-клеток называется клеточно-опосредованным иммунитетом (ТН1 иммунный ответ). Гуморальный иммунитет ассоциирован с В-клетками (ТН2 иммунный ответ). Сообщалось, что гидроксид алюминия избирательно активирует ТН2-клетки, в то время как полный адъювант Фрейнда активирует клетки ТН1. Доказано, что хитозан усиливает как гуморальный, так и клеточно-опосредованный иммунный ответ (Vaccine 3, стр.379-384, 1985).
3
4
Врожденная иммунная система распознает широкий спектр патогенов без необходимости в предварительном тестировании. Главные клетки, ответственные за врожденный иммунитет, моноциты/макрофаги и нейтрофилы, фагоцитируют микробные патогены и инициируют врожденный, воспалительный и приобретенный иммунные ответы. Toll-подобные рецепторы (TLR) представляют собой семейство трансмембранных белков типа 1, вовлеченных в распознавание широкого диапазона микроорганизмов. Они играют главную роль во врожденной иммунной системе. TLR представляют собой тип образраспознающих рецепторов (PRR) и распознают молекулы, которые широко распространены в патогенах, но отличны от хозяйских молекул, в совокупности называемые патоген-ассоциированными молекулярными структурами (РАМР). Рецепторы макрофага также считаются образраспознающими рецепторами. Маннозный рецептор макрофага распознает гексозы с экваториально расположенными гидроксильными группами на атомах углерода С и С, в положениях, дающих возможность распознавать маннозу, фруктозу, N-ацетилглюкозамин и глюкозу (Curr. Opin. Immunol. 10, 50-55, 1998).
Аллергия является очень распространенным расстройством, поражающим приблизительно от одной четвертой до одной трети населения в развитых странах, например более 50 миллионов американцев страдает от аллергических заболеваний. Стратегия лечения, в целом чаще всего используемая в настоящее время, ставит целью эффекторные механизмы аллергии, например с помощью перорального приема антигистаминов или с помощью местных кортикостероидов. Лечение антигистаминами и кортикостероидами может быть эффективным в ослаблении симптомов аллергии, но их использование ведет к воздействию фармацевтического продукта на весь организм, и они могут вызывать неприятные или даже опасные побочные эффекты. Аллерген-специфическая иммунотерапия представляет собой единственное используемое лечение, целью которого являются лежащие в основе причины аллергии, и которое обеспечивает продолжительное ослабление симптома. Таким образом, ее можно считать единственным куративным лечением аллергического заболевания. Данное лечение может быть выполнено в виде подкожных инъекций или сублингвально. Проводимое путем инъецирования аллергенных экстрактов подкожно, оно оказывает задокументированный эффект, в то время как эффективность сублингвальной аллерген-специфической иммунотерапии в меньшей степени задокументирована.
Аллергические заболевания, такие как астма и ринит, вызваны неадекватным иммунным ответом на другие безвредные антигены окружающей среды, то есть аллергены. Наиболее общая форма представляет собой иммуноглобулин (Ig) Е-опосредованную аллергию, характеризующуюся присутствием аллерген-специфического IgE. В настоящее время существует две основные стратегии лечения IgE-опосредованных аллергий, фармакологическая терапия и аллерген-специфическая иммунотерапия. Фармакологическое лечение включает обработку местными кортикостероидами, особенно в случае аллергической астмы и экземы. Однако 10-20% пациентов с аллергической астмой не реагируют на стероидное лечение. Другие общепринятые противоаллергические лекарственные средства нацелены на эффекторные механизмы IgE-опосредованной аллергии, например антигистамины, антилейкотриены и хромоны. Единственной радикальной терапией IgE-опосредованной аллергии, то есть единственным лечением, которое обеспечивает продолжительное ослабление симптомов, является аллерген-специфическая иммунотерапия (ASIT). Было доказано, что, в отличие от фармацевтического лечения, ASIT также уменьшает воспаление дыхательных путей и защищает от развития в хроническую астму (J Allergy Clin Immunol. 1998 102(4 Pt 1), 558-62). Лечение основано на повторном введении аллергена для индуцирования аллерген-специфической невосприимчивости. В настоящее время в ASIT широко используют аллергенные экстракты, полученные из природных источников и адсорбированные на гидроксид алюминия (квасцы). Квасцы задерживают высвобождение аллергена и действуют как адъювант. Однако существуют некоторые недостатки, связанные с использованием аллергенных экстрактов и квасцов. Многочисленные инъекции низких доз аллергена требуются в течение 3-5 лет. Чтобы решить такие проблемы как индукция новых сенсибилизаций и вредных побочных эффектов экстрактами, для использования в ASIT были предложены рекомбинантные аллергены (Adv Immunol. 2004; 82: 105-53, Nat Rev Immunol. 2006 Oct; 6(10):761-71). Рекомбинантные аллергены можно модифицировать разными способами с целью достижения более безопасных и более эффективных протоколов для ASIT. Примерами таких новых стратегий является создание так называемых гипоаллергенов, то есть аллергенов с пониженной способностью связывать IgE, но сохраняющих активность Т-клеток, вакцинация пептидами, производными от аллергена, или связывание аллергенов с иммуномодулирующими агентами, такими как иммуностимулирующие олигонуклеотиды, содержащие мотивы CpG (Nat Rev Immunol. 2006 Oct; 6(10): стр.761-71, Curr Opin Immunol. 2002 Dec; 14(6): стр.718-27). Известно, что квасцы вызывают гранулему в месте инъекции и стимулируют в основном Th2-ответы. Таким образом, существует потребность в альтернативных адъювантах для ASIT.
Адъюванты представляют собой вещества, которые усиливают способность антигена вызывать иммунный ответ. Хотя предпринимаются широкомасштабные усилия для разработки новых адъювантов для человеческих вакцин, единственным широко используемым адъювантом по-прежнему является гидроксид алюминия. Было доказано, что алюминиевые адъюванты могут вызывать гибель нейронов. Желательна разработка новых адъювантов с целью максимального повышения эффективности новых вакцин. Идеальный адъювант должен обеспечивать продолжительную экспрессию функционально активных антител, вызывать клеточно-опосредованный иммунитет и усиливать продуцирование Т- и В-лимфоцитов памяти с высокоспецифической иммунореактивностью против антигена. Он должен обеспечивать как немедленную защиту, так и защиту против будущих заражений антигеном. Кроме того, он должен быть биоразлагаемым, нетоксичным и не вызывать иммунный ответ, направленный против самого адъюванта.
Вакцинации должны обеспечивать продолжительный эффект, быстрое продуцирование антител и высокие титры антител.
Использование хитина и хитозана в качестве адъюванта упоминалось в патентах США 4372883 и 4814169. Использование хитозана в вакцинах в форме растворов, дисперсий, порошков или микросфер было описано в патентах США 5554388, 5744166 и WO 98/42374. Сшивание хитозана переключает иммунный ответ с ТН2 на смешанный ТН1/TH2-ответ. Использование хитозановых растворов, смешанных с антигенами для иммунизаций, показывает, что хитозан имеет одинаковую силу с неполным адъювантом Фрейнда и превосходит гидроксид алюминия (Vaccine 11, 2085-2094, 2007).
Доставка лекарственного средства. Доставка лекарственного средства представляет собой очень значительную область исследований, и большие денежные средства расходуются сегодня на поиски новых и улучшенных композиций, которые доставляют фармацевтические активные ингредиенты, такие как низкомолекулярные лекарственные средства, гены и вакцины, и в то же время минимизируют нежелательные побочные эффекты. Более ранние лекарственные средства становятся новыми в новых и улучшенных композициях.
Свойства хитозана, физические и биологические, сделали его наиболее подходящим для доставки фармацевтически активных компонентов и в качестве средства доставки, например, для вакцин, фрагментов генов и микро-РНК. Полезные и важные особенности хитозана заключаются в том, что он соединяется с любой живой тканью, обладает мукоадгезивными свойствами, разлагается и открывает плотные сочленения между клетками. С помощью использования этих свойств доставка лекарственного средства через слизистую мембрану может быть существенно улучшена. Композиции лекарственных средств на основе технологии с использованием хитозана сегодня разрабатывают для различных целей, например в качестве носителей вакцин, гидрогелей, высвобождающих лекарственное средство, мембран, сетчатого материала и так далее. Было доказано, что хитозан полезен, например, при доставке лекарственного средства в толстую кишку (Н.Tozaki, et. al, J. Pharm, ScL, 86, стр.1016-1021, 1997) и интраназальной доставке инсулина (США 5744-166). Кроме того хитозан использовали в качестве носителя в доставке гена (MacLaughlin, et. al, J. Controlled Release, 56, стр.259-272, 1998).
Некоторые композиции разрабатывают для обеспечения замедленного высвобождения с течением времени, в то время как высвобождение из других является более быстрым. При использовании гидрогелей хитозана было обнаружено, что сшивание является предпочтительным, так как гели без сшивающих агентов имеют тенденцию к растворению. Другое преимущество использования сшивания заключается в том, что скорость высвобождения из геля можно изменять посредством использования различных степеней сшивания. Хитозан можно использовать для разработки новых композиций для, например, перорального, кожного, подкожного, буккального, сублингвального, назального, ректального, вагинального и внутримышечного введения.
Большому количеству лекарственных средств, которые вводят в немодифицированной форме общепринятыми системными путями, не удается достичь органов-мишеней в эффективной концентрации, или они не являются эффективными в течение продолжительного промежутка времени вследствие легкости метаболизма. Используя Системы Доставки Лекарственного средства (DDS) можно преодолеть эти проблемы.
Противораковые лекарственные средства часто отличаются коротким временем полужизни в плазме и/или заметными побочными эффектами. Подходом к уменьшению данных проблем может являться очаговое введение, то есть местная доставка лекарственного средства в область рака с помощью имплантации/инъекции DDS, содержащей химиотерапевтический агент. По сравнению с системным введением величина побочных эффектов будет уменьшаться, и общий эффект лекарственного средства будет увеличиваться.
При разработке DDS для очаговой терапии рака, следует принимать во внимание некоторые технические факторы, а именно биосовместимость, биоразлагаемость (важность зависит от заболевания, области применения и количества введений), стерильность/стерилизацию, совместимость с лекарственными средствами и фармацевтическими эксципиентами, удобство введения (предпочтительно с помощью шприца), гибкость в отношении дозирования, нагрузки лекарственного средства, установления дозы, способность контролировать скорость высвобождения лекарственного средства и переносимость пациентом, а также учет регламентных трудностей, CoG (стоимость товара) и IPR.
Благодаря инъекции DDS с лекарственным средством обеспечивается локализация большого количества загруженного лекарственного средства в область опухоли, таким образом, улучшается раковая терапия и снижаются вредные неспецифические побочные эффекты химиотерапии.
Наращивание ткани. Наращивание ткани можно использовать и в медицинских и в косметических целях. Медицинское применение представляет собой, например, наращивание тканей с целью достижения улучшенной функции этой ткани. Примерами тканей, которые могут быть усилены инъекцией увеличивающих объем агентов, являются голосовые связки, пищевод, уретра или прямая кишка. В области косметической хирургии можно использовать наращивание мягких тканей для коррекции дефектов, таких как шрамы и морщины и для увеличения, например, губ или грудных желез. Для наращивания или реставрации мягкой ткани было использовано множество различных веществ, как бионеразлагаемых, так и биоразлагаемых. Примерами веществ, используемых для долговременного наращивания мягких тканей, являются силикон, Gore-Tex и ePTFE (пористый политетрафторэтилен). Примерами биоразлагаемых веществ являются коллаген, аутогенный жир, сшитая гиалуроновая кислота и синтетические полимеры.
Силикон является одним из наиболее часто используемых веществ для долговременного наращивания мягкой ткани. Нежелательные реакции на жидкий инъецируемый силикон включают гранулематозные реакции, воспалительные реакции и смещение. Такие реакции могут происходить спустя годы после первичной обработки. Кроме того, так как инъецируемый силикон является долговременным наполнителем, вышеуказанные осложнения могут стать серьезной проблемой, поскольку вещество не метаболизируется, и реакция может сохраняться несмотря на лечение.
Коллаген представляет собой одно из наиболее часто используемых инъецируемых веществ, как для косметических применений, так и в качестве увеличивающего объем агента, например при недержании мочи. Коллаген, однако, имеет некоторые недостатки. Он быстро распадается, и приблизительно 3% населения показывает реакции гиперчувствительности замедленного типа, что делает необходимым выполнение аллергических тестов в течение времени перед инъекцией. Кроме того, коллаген бычьего происхождения может передавать вирусные заболевания.
Хорошо известны инъекции аутогенного жира. Данные вещества также имеют недостатки. Жир, инъецированный в морщины на лице и складки, вызывал потерю зрения и эмболию у некоторых пациентов. Кроме того, аутогенный жир легко поглощается организмом.
Продукты из сшитой гиалуроновой кислоты используют как для косметических лечений, так и в качестве увеличивающих объем агентов в лечении, например, недержания мочи (UI) и везикоуретерального рефлюкса (VUR).
Общим подходом в создании увеличивающих объем агентов является использование сфер из бионеразлагаемого вещества, распределенного в биологически биоразлагаемом носителе. Примеры включают покрытые углеродом шарики в бета-глюкановом геле, гидроксиапатитовые сферы в карбоксиметилцеллюлозе, частицы политетрафторэтилена и микросферы сополимера молочной и гликолевой кислот (PLGA). Одной опасностью при инъекции частиц является возможная миграция частиц в отдаленные органы, такие как мозг и легкие.
Существующие вещества не являются оптимальными, и происходит постоянный поиск новых веществ для применения в наращивании тканей, веществ, инъецируемых через тонкие иглы, биосовместимых, нетоксичных и с подходящим временем удерживания в ткани.
Были описаны хитозановые гели для наращивания мягкой ткани (WO 97/04012, ЕР 1333869).
Хитозановые гели также использовали в культивировании клеток и для инкорпорации жизнеспособных клеток, подлежащих использованию, например, в тканевой инженерии хрящевой ткани, как описано, например, в Biomaterials. 2000; 21(21): 2165-61, J Biomed Mater Res A. 2007; 83(2): 521-9, и Biochimie. 2006; 88(5): 551-64.
В косметических средствах хитозан использовали, например, в кремах для кожи (US 20060210513, US 20040043963) и для уменьшения раздражения кожи, вызываемого бритьем (US 6719961).
Хитозан также можно использовать в качестве смазывающего вещества (Nature. 2003, 425: 163-165). Использование хитозана в качестве загустителя было описано, например, в Environ Sci Technol. (2002) 36(16): 3446-54 и Nanotechnology (2006) 17 3718-3723. Кроме того, его использовали в качестве клея (Biomacromolecules. 1 (2): 252-8 (2000) и Fertil Steril, 84, 75-81 (2005)) и в качестве пищевой добавки (US 5098733, US 5976550, US 6238720 и US 6428806).
В дополнение к медицинскому применению вязкоупругие хитозановые гидрогели можно использовать в качестве псевдопластических, разжижающихся при сдвиге хитозансодержащих жидкостей, и способ улучшения термической устойчивости таких жидкостей описан, например, в патенте США 6258755.
Хитин представляет собой следующий за целлюлозой наиболее распространенный полисахарид на земле. Он обнаружен в жестких структурах и прочных веществах, в которых он имеет функцию элемента жесткости. Вместе с кальциевыми солями, некоторыми белками и липидами он образует наружные скелеты морских организмов, подобных ракообразным и членистоногим. Он также обнаружен в клеточных стенках некоторых бактерий и губок, и он образует жесткие раковины и крылья насекомых. В промышленных масштабах хитин выделяют из раковин ракообразных, которые представляет собой отход рыбной промышленности. Хитозан представляет собой линейный полисахарид, образованный остатками 1,4-бета-связанного D-глюкозамина и N-ацетил-D-глюкозамина. Хитин по своей природе не является водорастворимым, что сильно ограничивает его использование. Однако в результате обработки хитина сильной щелочью получают частично деацетилированное и водорастворимое производное хитозана, которое может быть переработано в ряд разных физических форм, например пленки, губчатые материалы, бусины, гидрогели, мембраны. Хитозаны в своей основной форме, и в частности высокомолекулярные хитозаны, и/или с высокими степенями N-деацетилирования, являются практически нерастворимыми в воде, однако их соль с одноосновными кислотами обычно бывает водорастворимой. Средняя величина рКа остатков глюкозамина составляет примерно 6,8, и полимер образует водоводорастворимые соли, например, с HCl, уксусной кислотой и гликолевой кислотой. Растворимость хитозана зависит от нескольких факторов, как внутренних, таких как, например, длина цепи, степень деацетилирования, распределение ацетильных групп в цепях, a также внешних условий, таких как ионная сила, pH, температура и растворитель. Из литературы известно, что степень ацетилирования примерно 50% является оптимальной для растворимости. При приготовлении гелей и водных растворов в кислотной среде существует практическое ограничение, накладываемое растворимостью конкретного хитозана, которая зависит от его молекулярной массы и его степени N-деацетилирования. Однако количество хитозана в водной среде обычно находится в интервале 1-10% или 1-5% масс. в пересчете на массу жидкой среды, с количеством, приближающимся к более высокому концу интервала, если используют низкомолекулярные хитозаны (Carbohydr. Polym. 25, 65-70, 1994).
Характерные свойства хитозана, делающие его биоразлагаемым, нетоксичным и противомикробным, вместе с его катионной и гидрофильной природой, делают его привлекательным в фармацевтических композициях. Однако его слабая растворимость в физиологических условиях ограничивала его практическое использование. Учеными был преодолен данный недостаток растворимости путем изготовления химически модифицированных производных хитозана с исключительными свойствами растворимости при физиологическом pH, например сульфатированного хитозана, N-карбоксиметилхитозана, O-карбоксиметилхитозана и N,O-карбоксиметилхитозана (Int J Biol Macromol. (4), 177-80, 1994, Carbohydr Res. 302(1-2): 7-12, 1997).
Результатом введения химических заместителей в хитозан являются измененные биологические свойства, например измененная скорость разложения и риск введения групп, которые будут обладать отрицательным воздействием на биосовместимость и токсичность. На данную проблему обращен US 6344488, где глицерофосфат используется в качестве усилителя растворимости, и таким образом обеспечивается получение хитозановых гидрогелей при физиологическом pH без модификации структуры хитозана.
Хитозановые растворы могут быть сшиты в кислотных условиях, обычно при pH, подходящем для образования основания Шиффа (pH 4-5), с образованием гидрогелей. Было использовано очень большое количество различных сшивающих агентов с различными структурами и реакционными способностями. Некоторые сшивающие агенты были использованы для образования гелей из жидкого хитозана, напримергликозаминогликаны, такие как гиалуроновая кислота и хондроитинсульфат (Ann, Pharm. Fr. 58 47-53, 2000), глутаральдегид 30 (Ind. Eng. Chem. Res. 36: 3631-3638, 1997), глиоксаль (US 5489401), диэтилскварат (Macromolecules 31: 1695-1601, 1998), диэпоксиды, такие как диглицидиловый эфир (US 5770712), триполифосфат (J Appl Polym Sci 74: 1093-1107, 1999), генипин (J Polym Sci A: Polym Chem 38: 2804-2814, 2000, Biomaterials. 23: 181-191, 2002), формальдегид (J. Polym. Sci. Part A: Polym. Chem. 38, 474, 2000, Bull. Mater. Sci., 29, 233-238, 2006). Если требуемым продуктом является гидрогель, нужно чтобы хитозан и его производное оставались в растворе и избегать их осаждения. Попытки отрегулировать pH сшитых хитозановых гидрогелей до физиологически приемлемых уровней приводят к осаждению и нерастворимым веществам ограниченного использования. Желательно поддерживать степень сшивания насколько возможно низкой, как по токсикологическим причинам, так и из-за того, что высокая степень сшивания может полностью изменить поведение хитозана (Eur J Pharm Biopharm. 2004, 57(1): 19-34. Review).
Особую группу гидрогелей представляют собой вязкоупругие гели, которые являются вязкими и в то же время проявляют упругие свойства. Вязкоупругий гель деформируется и течет под действием приложенного напряжения сдвига, но если напряжение устраняют, жидкость медленно восстанавливается от некоторой деформации. Это используют, например, в офтальмологии, наращивании ткани и косметической хирургии. Вязкоупругость гелей допускает механическую обработку, которая включает получение дробленых гелей. Вязкоупругие гели гиалуроновой кислоты используют, например, в глазной хирургии, заполнении морщин или в лечении недержания мочи.
Хитозан, природный полиэлектролит. Трехмерная ориентация полиэлектролита в водной среде будет зависеть, например, от его природной/химической композиции, размера, концентрации и плотности заряда, то есть числа зарядов и расстояния между его заряженными группами. Пространственные взаимодействия любого полиэлектролита в растворе контролируются энтальпией, и молекула стремится принять низкое энергетическое состояние, в котором она наиболее устойчива. Такой путь минимизации энергии включает разные типы взаимодействия, или внутримолекулярные(внутри одной и той же молекулы) или межмолекулярные (между молекулами). Примерами внутримолекулярных взаимодействий являются водородные связи, гидрофобные взаимодействия и взаимодействия между заряженными группами в полимере. Типичные межмолекулярные взаимодействия представляют собой взаимодействия растворителя и взаимодействия с другими молекулами. Независимо от типа вовлеченного взаимодействия, движущей силой данных взаимодействий является нахождение энергетически выгодных конформаций полиэлектролита.
Если полиэлектролит содержит заряженные группы, с одним и тем же типом заряда, например положительным, эти группы будут отталкивать друг друга. С целью снижения их внутренней энергии молекула полиэлектролита будет стараться разнести свои внутренние заряды насколько возможно дальше, что будет приводить к растянутой полимерной цепи. Такие растянутые полимеры не только будут более "объемными", они также будут обладать относительно высоким состоянием энергии, скрытой в напряженных связях между атомами.
С другой стороны, если полиэлектролит содержит заряды противоположных знаков, они будут притягивать друг друга и формировать внутренние солевые мостики, которые приведут к другой трехмерной ориентации полимера, то есть разные части полимера будут сведены ближе друг к другу. В полимере без каких-либо зарядов не происходит неионных взаимодействий, и следовательно его трехмерная ориентация будет зависеть от его способности образовывать стабилизирующие водородные связи и гидрофобные взаимодействия внутри молекулы и с окружающими молекулами и средой. В отличие от полиэлектролитов, незаряженные полимеры, которые не содержат никаких высокоэнергетических сил отталкивания, образуют структуру своего рода "статистической спирали", где их внутренняя энергия минимизирована и их относительное энергососдержание ниже, чем у полиэлектролитов.
В физическом смысле, ионные взаимодействия (заряды) являются более сильными и вовлекают больше энергии, чем другие взаимодействия, такие как водородные связи, силы Ван-дер-Ваальса и гидрофобные взаимодействия. Относительное влияние первых на молекулярную ориентацию является, таким образом, значительным и во многих случаях затеняет влияние других видов вовлеченных сил.
Хитозановый полимер с его смесью остатков N-ацетилглюкозамина и глюкозамина теоретически мог быть нейтральным полимером, но в большинстве практически и биологически релевантных ситуаций он протонирован, так как значение рКа для глюкозаминов в хитозане приблизительно равно 6,8. Однако, в отличие от полиэлектролитов, несущих постоянно заряженные группы, плотность заряда хитозанового полимера может варьироваться и быть непосредственно зависимой от pH водного раствора. Практически, большинство имеющихся в продаже и немодифицированных хитозанов являются нерастворимыми в водных растворах, где pH выше чем приблизительно 6, и выше такого pH они будут осаждаться из водного раствора. Осаждение управляется энергетически, так как хитозановая молекула требует большого количества зарядов на ее молекулярной основе для образования энергетически благоприятного состояния сольватизации. Если это не может быть достигнуто; молекулы будут осаждаться из раствора и образовывать более стабильные осадки. В осадке хитозановые цепи сближаются, что обеспечивает возможность оптимизации энергии при помощи молекулярных взаимодействий между хитозановыми молекулами и внутри них.
С целью увеличения вязкости хитозанового раствора можно использовать химическое сшивание. В такой реакции хитозановые цепи соединяются вместе с образованием более крупных сетеобразных агрегатов. В ходе такого взаимодействия вязкость постепенно увеличивается, и раствор становится более гелеобразным по своей структуре. Существует большое число методов сшивания, описанных для хитозана в растворе, и общим в них является то, что хитозан растворяют в подкисленной водной фазе и реакция сшивания происходит при низком pH, обычно 4-5. Используемый низкий pH означает, что хитозановые цепи находятся в их протонированной форме, и они, таким образом, находятся в "растянутой" форме при сшивании. Полученный сшитый гель, таким образом, с технической точки зрения, представляет собой макроструктуру протонированных и растянутых хитозановых цепей. Если такую макросеть перенести в нейтральные или щелочные условия, она постепенно теряет свои заряды, сжимается и в конечном итоге осаждается. Это в некоторой степени ожидаемо, так как когда стандартные хитозаны (степень деацетилирования приблизительно между 80-95%) доводят до pH выше 6, они осаждаются. Сшивание само по себе создает еще более крупные электролитические структуры, для которых будет еще больше требоваться стабилизации в водном растворе с энергетической точки зрения. Это происходит в связи с тем, что положительные заряды стали ближе друг к другу в точках контакта между цепями, и, таким образом, еще более трудно стабилизировать с помощью сольватирующих молекул воды. Таким образом, они еще более склонны к осаждению, чем отдельные цепи, когда условия в растворе изменяются менее энергетически оптимальным образом, например повышается pH. В результате сшивки макрогелевая структура фиксируется в растянутом и энергетически невыгодном состоянии, которое физически не допускает перестройку в спирали и другие конформации, которые могут содействовать энергетически более предпочтительным конформациям, приводящим к более высокой стабильности системы.
Осаждение хитозановых гелей, образованных в кислотных условиях, легко подтвердить экспериментально, подвергая кусок такого сшитого хитозанового геля воздействию pH выше семи или еще более высоких значений, то есть pH 7-14. Сразу же при помещении такого куска в буфер с более высоким pH поверхность куска становится беловатой из-за тонкого слоя осадка, и по мере того как диффузия продолжается, кусок становится более и более беловатым вплоть до его полного осаждения.
Однако неожиданно авторы изобретения обнаружили, что такого сжимания макроструктур сшитого хитозанового геля можно избежать, используя низкодеацетилированный хитозан с конкретными степенями деацетилирования и сшивания хитозановых цепей в энергетически менее напряженной конформации. Гели, полученные согласно данному способу, можно обрабатывать 1 М гидроксидом натрия без образования осадков. Соответствующий несшитый гель при обработке 1 М NaOH будет осаждаться.
Используя более высокую растворимость этих конкретных хитозанов, pH во время реакции сшивания можно доводить до значительно более высокого значения. Преимущества этого многочисленны. Во-первых, протонирование хитозановой цепи становится низким, и хитозановый полимер является почти нейтральным при pH выше восьми, позволяя образоваться менее напряженной и более статистической спирали, подобной сети, в растворе. Если хитозан подвергают сшиванию в таком состоянии, полученная гелевая структура будет создаваться отдельными хитозановыми цепями с более высокой гибкостью, что сделает их более легко реорганизуемыми в энергетически более предпочтительные макроструктуры при изменении условий. Во-вторых, возможность использовать более высокое значение pH является выгодным с точки зрения существенно увеличенной реакционной способности аминогрупп в глюкозаминовых остатках. Это делает соединения более эффективными и делает возможным использование более низких концентраций сшивающих реагентов для достижения определенной степени сшивания. Еще одним преимуществом является то, что побочные реакции сохраняются на низком уровне. Такие сшитые гели имеют некоторые преимущества по сравнению с хитозановыми гелями, полученными при низком pH, и из хитозанов стандартных сортов (степень деацетилирования 80-95%). Тот факт, что они не осаждаются при физиологических условиях означает, что они являются более доступными для разрушающих ферментов, что приводит к быстрому разложению гелей, а также другим свойствам, которые описаны в настоящем описании изобретения.
Краткое изложение сущности изобретения
Таким образом, в настоящем изобретении предлагается сшиваемая хитозановая композиция, содержащая хитозан со степенью деацетилирования от 30 и до 75%, где хитозан деацетилирован случайным образом, и сшивающий агент, где молярное отношение сшивающего агента к хитозану равно 0,2:1 или менее в пересчете на количество функциональных групп в сшивающем агенте и количество доступных аминогрупп в хитозане.
Настоящее изобретение обеспечивает образование сшитого, вязкоупругого хитозанового гидрогеля при физиологическом pH без использования других усилителей растворимости, например глицерофосфата.
Одной целью настоящего изобретения является получение вязкоупругого геля из хитозана, который можно доставлять при физиологическом pH без осаждения.
Одной целью изобретения является получение вязкоупругого геля, которому посредством химического сшивания была придана физическая прочность, что обеспечивает возможность дополнительной переработки в более мелкие, индивидуально разделенные гелевые фрагменты, например дробленый гель.
Другим объектом изобретения является предложение вязкоупругого хитозанового гидрогеля, который можно доставлять посредством тонкой шприцевой иглы, обычно таких игл, которые используют для инъекций, например для вакцинации.
Другим объектом изобретения является предложение дробленого вязкоупругого хитозанового гидрогеля, который экспонирует большую площадь поверхности и, таким образом, становится легко доступным для ферментов и проникающих клеток при использовании in vivo.
Другим объектом изобретения является предложение быстро разлагаемого вязкоупругого хитозанового гидрогеля.
Другим объектом изобретения является предложение вязкоупругого хитозанового гидрогеля с низкой токсичностью и минимизация или полное предупреждение нежелательных иммунологических или токсикологических реакций при использовании низких концентраций сшивающих агентов, предпочтительно агентов с низкой токсичностью или нетоксичных агентов.
Другим объектом изобретения является предложение вязкоупругого хитозанового гидрогеля, который обеспечивает возможность включения антигенов и иммуногенов в ходе его изготовления, либо ковалентно, либо нековалентно.
Другим объектом изобретения является предложение вязкоупругого хитозанового гидрогеля, имеющего характерные адъювантные свойства.
Другим объектом изобретения является предложение биоразлагаемого, вязкоупругого хитозанового гидрогеля для иммунологического применения.
Другим объектом изобретения является предложение носителя для доставки антигенов и иммуногенов, предназначенных для иммунизаций. В настоящем изобретении предлагается иммунологический агент, содержащий хитозановый гидрогель, как описано в данном описании изобретения, и антиген, где антиген возможно ковалентно связан с хитозаном.
Другим объектом изобретения является предложение вязкоупругого хитозанового гидрогеля, который обеспечивает возможность ковалентного включения молекул, приводящих к иммунологическому ответу. Указанные молекулы могут быть либо низко- либо высокомолекулярными, например небольшими молекулами, такими как пептиды, липиды, стероиды и антибиотики, или крупными молекулами, такими как белки, фрагменты генов, микро-РНК, углеводные полимеры и синтетические полимеры.
Другим объектом изобретения является предложение вязкоупругого хитозанового гидрогеля, содержащего более одного иммуногенного вещества.
Такой гидрогель можно изготовить содержащим две или более антигенные молекулы или смеси антигенов с низкой и/или высокой молекулярной массой.
Другим объектом изобретения является предложение вязкоупругого хитозанового гидрогеля, который обеспечивает возможность включения других агентов, либо ковалентно, либо нековалентно, например консервантов и других полимерных веществ.
Другим объектом изобретения является предложение вязкоупругого хитозанового гидрогеля, высвобождающие свойства которого можно дополнительно менять путем покрытия анионными полимерами. Используя последовательно катионные и анионные полимеры, можно сконструировать многослойные покрытые вязкоупругие гелевые структуры.
Другим объектом изобретения является предложение вязкоупругого хитозанового гидрогеля для использования в адъювантной иммунотерапии с целью неспецифического усиления иммунного ответа.
Другим объектом изобретения является предложение композиции, которая обеспечивает замедленное высвобождение включенных биоактивных агентов или антигенов (например, аллергенов) путем введения их в вязкоупругий хитозановый гидрогель.
Другим объектом изобретения является предложение вязкоупругого хитозанового гидрогеля для использования в наращивании ткани или самостоятельно, или вместе с твердыми гранулами.
Другим объектом изобретения является предложение вязкоупругого хитозанового гидрогеля для лечения, например, недержания мочи (UI) и везикоуретерального рефлюкса (VUR).
Другим объектом изобретения является предложение вязкоупругого хитозанового гидрогеля для использования в качестве увеличивающего объем агента.
Другим объектом изобретения является предложение вязкоупругого хитозанового гидрогеля в качестве каркаса для клеточной культуры.
Другим объектом изобретения является предложение вязкоупругого хитозанового гидрогеля для использования в обеспечении живымиклетками организма-хозяина.
Другим объектом изобретения является предложение вязкоупругого хитозанового гидрогеля для пероральной, назальной, подкожной, подслизистой, сублингвальной, роговичной, ректальной, вагинальной или внутримышечной доставки лекарственного средства. В настоящем изобретении предлагается фармацевтическая композиция, содержащая хитозановый гидрогель, как он описан в данном описании изобретения, и фармацевтически активный ингредиент.
Другим объектом изобретения является предложение вязкоупругого хитозанового гидрогеля, который обеспечивает возможность включения и высвобождения лекарственного средства, например, для очаговой терапии рака, как описано выше в данном описании изобретения.
Другим объектом изобретения является предложение вязкоупругого хитозанового гидрогеля, который обеспечивает возможность включения лекарственных средств в процессе его изготовления, либо ковалентно, либо нековалентно.
Другим объектом изобретения является предложение вязкоупругого хитозанового гидрогеля для использования в качестве устройства для лечения ран.
Другим объектом изобретения является предложение вязкоупругого хитозанового гидрогеля для вискохирургии.
Другим объектом изобретения является предложение вязкоупругого хитозанового гидрогеля для косметического использования.
Другим объектом изобретения является предложение вязкоупругого хитозанового гидрогеля для использования в качестве смазывающего вещества.
Другим объектом изобретения является предложение вязкоупругого хитозанового гидрогеля для использования в качестве клея.
Другим объектом изобретения является предложение вязкоупругого хитозанового гидрогеля для использования в качестве жидкости для сверления и вспомогательной жидкости.
Ниже следует описание настоящего изобретения со ссылкой на прилагаемый графический материал, где на Фиг.1 показаны гистологические срезы участков инъекции мышей через 24 частов после подкожной инъекции вязкоупругим хитозановым гелем по настоящему изобретению и сравнительным гелем.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится в общем случае к гидрогелям, изготовленным из хитозана, предназначенного, например, для использования в лечении людей или в ветеринарии. Более конкретно, настоящее изобретение нацелено на хитозановые гидрогели с вязкоупругими свойствами для использования согласно предшествующему описанию. Таким образом, согласно изобретению предлагается композиция, содержащая хитозан или смеси хитозанов с разными степенями деацетилирования, которые не осаждаются при физиологических условиях и в то же время экспонируют большую площадь поверхности, тем самым облегчая дополнительную биологическую обработку. По сравнению с раствором хитозана из уровня техники, площадь поверхности вязкоупругого гидрогеля по настоящему изобретению больше на несколько порядков. Это свойство вязкоупругого гидрогеля по настоящему изобретению вызывает более быструю клеточную инфильтрацию и более быстрый иммунный ответ при инъецировании гидрогеля подкожно мышам по сравнению с хитозановыми растворами из уровня техники (Vaccine 11, 2085-2094, 2007). Это открывает возможность использования более низких доз иммуногена.
Это достигается получением сшиваемой хитозановой композиции, содержащей хитозан со степенью деацетилирования 30-75%, где хитозан деацетилирован случайным образом, и сшивающий агент, где молярное отношение сшивающего агента к хитозану составляет 0,2:1 или менее в пересчете на количество функциональных групп в сшивающем агенте и количество доступных аминогрупп в хитозане. Хитозановый гидрогель по настоящему изобретению получают путем приготовления данной сшиваемой хитозановой композиции в водном растворе, сшивания композиции и выделения полученного хитозанового гидрогеля. В настоящем изобретении также предлагается гидрогель, получаемый данным способом.
Растворимость хитозана зависит от нескольких факторов, как внутренних, таких как, например, длина цепи, степень деацетилирования, распределение ацетильных групп в пределах цепей, а также от внешних условий, таких как ионная сила, pH, температура и растворитель. Были предприняты многочисленные попытки изготовить физиологические хитозановые растворы и гели для медицинского применения, но чаще всего с неудовлетворительными результатами. Большинство коммерческих хитозанов имеет степень деацетилирования выше 80% и для изготовлении растворов и гелей требуется низкий pH для растворения полимеров, обычно используют кислые растворы уксусной кислоты или соляной кислоты. Попытки повысить pH таких растворов приводят к осаждению хитозанового полимера, когда pH превышает приблизительно 6. Данную проблему можно обойти с помощью использования многочисленных водорастворимых производных хитозана или с помощью использования добавок, подобных глицерофосфату. Авторами изобретения обнаружено, что хитозан с низкой степенью деацетилирования, например 50%, можно использовать для получения гидрогелей в физиологических условиях и что можно приготовить хитозановые концентрации вплоть до нескольких процентов. Имеющиеся в продаже хитозаны с низкими степенями деацетилирования ограничены, но изготовление таких хитозанов описано в литературе. Один из способов изготовления хитозанов с низкой степенью деацетилирования представляет собой реацетилирование хитозана в кислых условиях и затем деацетилирование. Другим подходом является начать деацетилирование с хитина, который взят в растворе в сильно щелочных и холодных условиях. Хитозаны с низкой степенью деацетилирования, например 50%, не являются только более растворимыми, чем хитозаны с более высокими степенями деацетилирования, они также быстрее и легче расщепляются гидролитическими ферментами, для которых требуются N-ацетильные группы для распознавания сайтов расщепления. Менее очевидным, но также важным преимуществом доведения хитозановых гелей и растворов до физиологических уровней pH, является сопутствующее увеличение реакционной способности глюкозаминовых остатков в полимерной цепи. При некоторых обстоятельствах это можно использовать для подавления нежелательных побочных реакций и для минимизации влияния возможных сшивающих агентов, так как их концентрации можно поддерживать на более низком уровне в результате повышенной реакционной способности аминогрупп, что приводит к более эффективному сочетанию. Иллюстративным примером этого является сшивание хитозана с использованием большого избытка диэтилскварата в кислых условиях. В данном взаимодействии, которое выполняют при pH примерно 4,75, почти 50 процентов добавленного реагента гидролизуется в одном из двух реакционных сайтов, с получением хитозановой цепи, замещенной сквариковой кислотой, которая больше не сшивается. Когда такое взаимодействие выполняют при pH выше 7, реакционная способность возрастает на несколько порядков, и конкурирующие побочные реакции подавлены, что приводит к чистым и эффективным взаимодействиям с минимумом реагента для получения требуемой сшитой сети. Это наиболее важно, когда хитозановые гелевые структуры предназначены для иммунологического применения. Для этого существует несколько причин. Во-первых, всегда существует риск нежелательных иммунологических реакций против линкера, во-вторых существует риск измененной кинетики разложения, и, в-третьих, сшивающие линкеры сами по себе обычно обладают высокой реакционной способностью и, если не полностью израсходованы, могут вызывать токсичные побочные реакции, таким образом важно поддерживать уровень таких агентов как можно более низкими. Авторы изобретения предпочитают использовать сшивающие реагенты с низкой токсичностью и использовать сшивающие агенты, которые не ликвидируют группы, которые должны быть удалены до биологического применения вязкоупругого гидрогеля. Дибутилскварат утвержден FDA для использования в качестве местного иммуномодулятора и не является мутагенным в анализе Эймса. Другой распространенной группой сшивающих агентов являются реакционноспособные частицы, основанные на эпоксидной химии. Диглицидиловые эфиры часто используют для различных реакций сшивания, где они взаимодействуют с карбоновыми кислотами, алкилатами и аминами. Если для сшивания хитозана использовали диглицидиловые эфиры или подобное производное, были использованы довольно высокие отношения сшивающего линкера к аминогруппе хитозана. Это проиллюстрировано в Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2005, 75A, 3, 742-753 Eur. J. Pharm. Biopharm. 2004, 57: 19-34, US 5770712, WO 02/40070. Авторы изобретения опробовали другие способы сшивания согласно литературе. Глутаральдегидное сшивание приводило, например, к окрашенным гидрогелям, которые осаждались под действием щелочной среды. Вязкоупругий гидрогель по изобретению можно легко покрыть, например, анионными полимерами с целью изменения скорости биологической обработки. Если вязкоупругий гидрогель по изобретению диализуют против щелочной среды, поверхность геля остается прозрачной, в то время как в результате диализа геля из уровня техники получается осадок хитозана, который виден как мутная гелевая поверхность. Это является значительным отличием в осаждении между несшитым и сшитым гидрогелем. Неожиданно эти гели можно было обработать 1 М NaOH без осаждения.
На структуру вязкоупругого геля влияет концентрация хитозанового раствора и количество используемого сшивающего реагента. Авторы изобретения предпочитают иметь более высокие концентрации хитозана и более низкие концентрации сшивающего агента для получения геля требуемого качества. Сшивающая молекула в данном контексте имеет по меньшей мере два реакционноспособных сайта, которые представляют собой электрофилы, сконструированные, чтобы легко взаимодействовать с аминами в нейтральных или слабощелочных условиях. Если сшивающий агент имеет два реакционноспособных сайта, он является бифункциональным и, таким образом, может взаимодействовать с двумя аминогруппами, например двумя глюкозаминовыми единицами в разных хитозановых цепях. Существует ряд имеющихся в продаже сшивающих реагентов такой природы и иногда расстояния между реакционноспособными группами были увеличены с помощью "спейсерной молекулы". Такой спейсер часто представляет собой алифатическую цепь или полиэфирную конструкцию, подобную поли- или олигоэтиленгликолям. Предпочтительно сшивающий агент является би-, три- или тетрафункциональным, хотя предпочтительными являются би- или трифункциональные и бифункциональные являются наиболее предпочтительными. Авторы изобретения предпочитают использовать бифункциональные сшивающие линкеры, которые легко взаимодействуют при условиях от нейтральных до слабощелочных с высокими выходами взаимодействий и в которых сшивающая молекула расходуется в высокой степени. Также авторы изобретения предпочитают, чтобы сшивающие молекулы не образовывали побочные продукты, которые подлежат удалению до применения. Множество сшивающих агентов конструируют для отщепления уходящей группы при взаимодействии. В некоторых случаях авторы изобретения предпочитают сшивающие агенты, которые исключают нетоксичные компоненты. Типичные примеры таких сшивающих функциональных групп представляют собой реакционноспособные эфиры, акцепторы Михаэля и эпоксиды. Предпочтительные сшивающие молекулы представляют собой эфирные производные сквариковой кислоты, диэпоксиды и производные акриламидов. Наиболее предпочтительным является диэтилскварат (3,4-диэтокси-3-циклобутен-1,2-дион) и его структурно близкородственные аналоги. Другие предпочтительные сшивающие линкеры представляют собой 1,4-бутандиол-диглицидиловый эфир, производные акриламида и их структурно близкородственные аналоги.
Также важно минимизировать количество сшивающего реагента и достичь эффективной и чистой реакции сочетания, с образованием небольшого количества, или без образования каких-либо побочных продуктов. Авторы изобретения предпочитают использовать низкое молярное отношение сшивающего агента к числу функциональных аминогрупп в хитозане. Авторы изобретения предпочитают молярное отношение 0,2:1 или менее, более предпочтительно использовать отношение 0,16:1 или менее и наиболее предпочтительно использовать отношение 0,1:1 или менее. Молярное отношение основано на количестве групп, доступных для сшивания на сшивающем линкере и на хитозане. Для сшивающего линкера оно будет зависеть от функциональности (би-, три-, тетрафункциональные и так далее) и, на хитозане, от доступности аминогрупп (только деацетилированные аминогруппы будут реакционноспособны). Очевидно, что количество доступных аминогрупп будет определяться степенью деацетилирования хитозана.
Авторы изобретения предпочитают, чтобы хитозан имел степень деацетилирования ниже 75%, более предпочтительно имел степень деацетилирования ниже 70%, еще более предпочтительно имел степень деацетилирования ниже 65% и еще более предпочтительно имел степень деацетилирования менее 60% и наиболее предпочтительно имел степень деацетилирования менее 55%. Хитин абсолютно нерастворим в водных растворах и становится в некоторой степени растворимым, если степень деацетилирования равна 30% или более. Авторы изобретения предпочитают иметь степень деацетилирования выше 35%, предпочтительной является степень деацетилирования выше 40% и наиболее предпочтительной является степень деацетилирования выше 45%. Растворимость хитозанов также зависит от таких параметров, как молекулярная масса, распределение ацетильных групп в цепи и противоионы. Хитозан является полидисперсным по своей природе, то есть содержит смесь разных длин цепи. В промышленном масштабе хитозаны характеризуются своей вязкостью, и приводят среднюю молекулярную массу. Авторы изобретения предпочитают иметь вязкость вплоть до 15000 мПа·с, предпочтительно от 2 до 10000 мПа·с, более предпочтительно от 5 до 2000 мПа·с и наиболее предпочтительно от 10 до 1000 мПа·с при измерении в виде 1% масс./об. раствора в 1% водной уксусной кислоте при температуре 25°С с использованием ротационного вискозиметра со стержнем, вращающимся при 20 об/мин. Вязкость раствора является показателем средней молекулярной массы хитозана, при этом понимают, что хитозан является полимерным веществом, имеющим некоторое распределение молекул с варьирующейся длиной цепи. Авторы изобретения предпочитают использовать хитозановые растворы с концентрацией 3% или менее. Более предпочтительно использовать концентрацию 2% или менее. Авторы изобретения предпочитают иметь концентрацию выше 0,3% (масс./масс.).
Схема деацетилирования хитозана также является важной для его свойств. Хитозан по настоящему изобретению должен быть деацетилирован случайным образом. То есть, следует избегать больших блоков хитиноподобного полимера, поскольку такие вещества склонны к меньшей растворимости. Вместо этого, хитозан по настоящему изобретению обладает случайной схемой ацетилированных и деацетилированных моносахаридных единиц. Одним способом определения природы моносахаридов является определение частот ближайших соседей, используя ЯМР, и сравнение частот, полученных с помощью статистических моделей, смотри WO 03/011912.
Имеющийся в продаже хитозан обычно имеет неслучайную блочную структуру. Причиной этого является то, что хитин выделяют в твердофазных процессах из раковин ракообразных. В таких процессах, когда раковины остаются нерастворенными на протяжении процесса, раковины обрабатывают сильной щелочью с получением частично деацетилированного хитозана. Однако, так как хитин изначально находится в форме раковины ракообразного, гидроксидные ионы из щелочи стремятся воздействовать преимущественно на моносахаридные единицы на поверхности раковины; моносахаридные единицы в центре относительно толстой раковины обычно не встречают гидроксидные ионы и таким образом сохраняют схему с замещением N-ацетилом.
Чтобы избежать таких хитиноподобных блоков, хитин/хитозановые полисахаридные цепи следует обрабатывать в растворе. Это позволяет полисахаридным перейти в раствор, и структура раковины теряется. Это обеспечивает схему случайного деацетилирования. Ее можно достичь обработкой хитина в растворе при строго контролируемых условиях, или с помощью полного деацетилирования хитина и затем реацетилирования в растворе с получением требующейся степени деацетилирования. Смотри Т.Sannan et al. Makromol. Chem. 177, 3589-3600, 1976, X.F.Guo et al. Journal of Carbohydrate Chemistry 2002, 21, 149-61 и K.М.Varum et al. Carbohydrate Polymers 25, 1994, 65-70. Хитозан по настоящему изобретению предпочтительно получают ацетилированием и/или деацетилированием хитозана в фазе раствора с получением схемы случайного деацетилирования.
Если осуществляют сшивание низкодеацетилированного хитозана, авторы изобретения предпочитают иметь условия взаимодействия, где pH выше 6 и где хитозан не осаждается. Еще более предпочтительно использовать pH выше 6,5 и наиболее предпочтительно использовать pH выше 7,0. Также предпочтительно использовать pH, который не уничтожает в существенной степени сшивающий реагент посредством гидролиза или посредством реакции элиминации. Типичными условиями для указанной реакции являются щелочные условия, и авторы изобретения предпочитают использовать pH ниже 10, более предпочтительно использовать pH ниже 9,5 и еще более предпочтительно использовать pH ниже 9,0. Предпочтительно вода присутствует в количестве 97-99,7%. Также можно использовать дополнительный растворитель, такой как этанол, например, в количестве 0,2% (об./об.). Концентрация сшивающего агента, используемого в реакциях сшивания, предпочтительно составляет 0,01-0,2% (об./об.), более конкретно, выше 0,02% (об./об.).
Вязкоупругий гидрогель по изобретению получают в виде блока, который может быть выделен без дополнительной обработки. Затем гидрогель перерабатывают с получением меньших блоков или фрагментов, используя обычные методики, известные в данной области техники. Такой полученный "дробленый гель" инъецируют через тонкую иглу. Вязкости геля можно измерить с помощью реометра, как описано в Примере 16.
Далее настоящее изобретение проиллюстрировано, но не ограничено, следующими примерами.
Примеры
Если не указано иное, в Примерах использовали следующие вещества:
Хитозаны с низкой степенью N-деацетилирования получали, в основном следуя принципам, изложенным в: Sannan Т, Kurita K, Iwakura Y. Studies on Chitin, 1. Die Makromolekulare Chemie 1975; 0:1191-5, Sannan Т, Kurita К, Iwakura Y. Studies on Chitin, 2. Makromol. Chem. 177, 3589-3600, 1976, Guo X, Kikuch, Matahira Y, Sakai K, Ogawa K. Water soluble chitin of low degree of deacetylation. Journal of Carbohydrate Chemistry 2002; 21: 149-61 и WO 03/011912.
Пример 1
Хитозан (1,11 г, степень N-деацетилирования 50%, MM (молекулярная масса) 145 кДа) суспендировали в 70 мл дистиллированной воды и добавляли по каплям 2 М HCl (водн.) для растворения хитозана. pH раствора доводили до 7,4 с помощью 1М гидроксида натрия. Объем доводили до 100 мл дистиллированной водой. Добавляли 3,4-диэтокси-3-циклобутен-1,2-дион (122 мкл 20% (об./об.) раствор в этаноле), и раствор перемешивали в течение 3 ч. pH раствора доводили до 8,3, и объем доводили до 111 мл. Раствор помещали в термостат при 40°С на 3 суток. Отвердевший гель обозначили как 1-1. Методику повторяли, но не добавляли 3,4-диэтокси-3-циклобутен-1,2-дион. Этот гель обозначили как 1-2.
Пример 2
Хитозан (0,50 г, степень N-деацетилирования 72%, MM 145 кДа) суспендировали в 35 мл дистиллированной воды, и добавляли по каплям 2 М HCl (водн.) для растворения хитозана. pH раствора доводили до 6,2 1 М гидроксидом натрия. Объем доводили до 50 мл дистиллированной водой. Данный гель обозначили как 2-1. К 20 мл указанного выше раствора добавляли 3,4-диэтокси-3-циклобутен-1,2-дион (40 мкл 12% (об./об.) раствор в этаноле), и раствор интенсивно перемешивали в течение 10 минут. pH раствора доводили до 7.5. Раствор помещали в термостат при 40°С в течение 3 суток. Отвердевший гель обозначили как 2-2.
Пример 3
Хитозан (0,50 г, степень N-деацетилирования 72%, MM 145 кДа)сшивали глутаральдегидом (6 г) в 50 мл 1 М НОАс (водн.) при 100°С. Условия взаимодействия такие, как описано в J. Control. Release 111 (2006), 281-289.
Пример 4
1 г каждого из гелей из Примеров 1-4 подвергали действию 1 М NaOH (водн.). Хитозан гелей 1-2, 2-1 и 3 (сравнительный) осаждался, в то время как сшитые гели 1-1 и 2-2 (изобретение) оставались прозрачными.
Пример 5
Гидрохлорид хитозана (0,50 г, степень N-деацетилирования 55%, MM 145 кДа) растворяли в 45 мл воды. pH раствора доводили до 7,3 разбавленным гидроксидом натрия. Добавляли 3,4-диэтокси-3-циклобутен-1,2-дион (102 мкл 12% (об./об.) раствор в этаноле), и раствор перемешивали в течение 3 ч. pH раствора доводили до 8,3, и объем доводили до 50 мл. Главный кошачий аллерген, Fel d 1 (5,9 мг) добавляли к 3 г указанного выше раствора, и смесь переносили в 5 мл флакон и оставляли на 6 суток при 40°С. Полученный гель обрабатывали механически и переносили в 1 мл шприц.
Пример 6
Гиалуроновую кислоту (50 мг) растворяли в MES(2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота) буфере (20 мл, 20 мМ, pH 6,5). Вязкоупругий гидрогель из Примера 5 (4 мл) добавляли к раствору гиалуроновой кислоты и помещали на панель орбитального шейкера на 90 минут. Покрытый гель центрифугировали при 2300 об/мин в течение 2×10 минут, промывали буфером PBS (фосфатно-солевой раствор) и переносили в шприц. Данный хитозановый гель, покрытый гиалуроновой кислотой, может быть лиофилизирован и регидратирован с получением вязкоупругого геля. При добавлении гидрогеля из Примера 5 к буферу PBS в отсутствие гиалуроновой кислоты нитеподобные фрагменты становились беловатыми и клейкими и не могли быть легко выделены, и следовательно не могли быть регидратированы.
Пример 7
Хитозана гидрохлорид (0,30 г, степень N-деацетилирования 55%, MM 145 кДа) растворяли в 25 мл воды. pH раствора доводили до 8,3 разбавленным гидроксидом натрия, и объем доводили до 3,0 г. Добавляли 3,4-диэтокси-3-циклобутен-1,2-дион (61 мкл 12% (об./об.) раствор в этаноле), и раствор перемешивали в течение 3 ч, и затем смесь оставляли на 6 суток при 40°C.6 мг Fel d 1 добавляли к данному раствору, и смесь перемешивали. Затем смесь переносили в 1 мл шприц.
Пример 8 (сравнительный)
Хитозана гидрохлорид (0,90 г, степень N-деацетилирования 81%, MM 145 кДа) суспендировали в 27 г дистиллированной воды. pH раствора составлял 3,6. Добавляли PBS (2,0 мл, 25 мМ, pH 7,4). pH доводили до 5,8 разбавленным гидроксидом натрия, и объем доводили до 60 мл. Смешивали 2,27 мг Fel d 1 с 1,1 мл вышеуказанного раствора и переносили в 1 мл шприц.
Пример 9
2
Группам мышей BALB/c инъецировали подкожно, в область шеи, 100 мкл растворов из Примеров 5, 7 и 8. Затем мышей умерщвляли в разные моменты времени, через 1, 7 и 21 суток. Мышей умерщвляли посредством ингаляции CO. Кожу в месте инъекции собирали и помещали в Histocon на лед, и затем образцы кожи замораживали в ацетоновой бане. Замороженные биопсийные образцы кожи хранили при -80°С до гистологического среза. Затем гистологические срезы анализировали на клеточную инфильтрацию. Гистологическое исследование показало обширную инфильтрацию клеток уже в первые сутки после инъекции для гелей по Примерам 5 и 7. Гистологическое исследование геля по Примеру 8 показало двояковыпуклый гель с поверхностью, покрытой клетками, но без клеток внутри геля. В гелях 5 и 7 клетки были инфильтрованы во все вещество через 24 ч. Через 7 суток количество хитозана снижалось в гелях из Примеров 5 и 7. Две недели спустя, на 21 сутки, фактически отсутствовали следы инъецированного вещества, в то время как гель из Примера 8 показал гораздо более медленную колонизацию клеток и также гораздо более медленное разложение.
Фиг.1 демонстрирует гистологические срезы участков инъекции мышей через 24 часа после подкожной инъекции вязкоупругим хитозановым гелем из Примера 5 (Фиг.1(а)) и сравнительным хитозаном из Примера 8 (Фиг.1(б)) соответственно. Результаты свидетельствуют, что гель по настоящему изобретению инфильтруется иммунными клетками быстрее и в большей степени, чем сравнительный гель. Даже через три недели сравнительный хитозан еще не был инфильтрован полностью, и наблюдалась более медленная скорость разложения для сравнительного хитозанового геля по сравнению с гелем по изобретению.
Пример 10
1
1
Группы из трех мышей BALB/c инъецировали подкожно, в область шеи, 100 мкл геля по Примерам 5, 7 и 8. Бустерную инъекцию осуществляли в 64 сутки, через 9 недель после первой инъекции. Затем отбирали образцы крови из хвостовой артерии в 1, 2, 3, 9 и 10 недели после инъекции. Уровни IgG и IgE специфической сыворотки к Fel d 1 измеряли с помощью ELISA (ИФА). Все гели вызывали IgG антительный ответ.
Пример 11
Хитозан (2,05 г, степень N-деацетилирования 50%, MM 145 кДа) суспендировали в 160 мл дистиллированной воды и добавляли 2 М HCl (водн.) вплоть до растворения хитозана. pH доводили до 7,9, добавляя по каплям 1 М NaOH (водн.). Объем доводили до 200 мл дистиллированной водой. Добавляли 1,4-бутандиола диглицидиловый эфир (166 мкл 5% (об./об.) раствора в этаноле) по каплям к 50 мл вышеуказанного раствора. Смесь интенсивно перемешивали в течение 10 минут при комнатной температуре и затем помещали в термостат (50°С) на ночь.
Пример 12
Хитозан (2,25 г, степень N-деацетилирования 55%, MM 145 кДа) суспендировали в 130 мл дистиллированной воды, и добавляли 2 М водную соляную кислоту до растворения хитозана. pH доводили до 6,75 с помощью 1 М гидроксида натрия, и объем доводили до 160 мл. К 50 мл вышеуказанного раствора добавляли 3,4-диэтокси-3-циклобутен-1,2-дион (120 мкл, 12% раствор в этаноле), и раствор перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре. Диклофенак (773 мг) растворяли в 25 мл дистиллированной воды и добавляли к вышеуказанному раствору. pH раствора доводили до 8,1 с помощью 1 М гидроксида натрия, и раствор обрабатывали ультразвуком в течение 1 ч и затем нагревали при 40°С в течение ночи. Полученный гель (1 г) смешивали с гиалуроновой кислотой (4 г, 0,25% в дистилированной воде). Гель помещали в ячейку Франца, оснащенную фильтром Spectra/For с порогом отсечения молекулярной массы 2000 Да и наполненной с буфером PBS. 38% диклофенака высвобождалось через 2 ч, 60% через 5 ч и 72% через 24ч.
Пример 13
75
75
Методику по Примеру 5 повторяли с rFel d 1, радиоактивно меченным Se. Получение rFel d 1, меченного Se, выполняли, используя мечение in situ селеноцистеинового остатка в Sel-меченом rFel d 1, по существу как описано ранее для Der p 2 (Febs J 2005; 272: 3449-60), но с помощью конструкций, условий получения и очистки для Sel-меченого rFel d 1 (Chembiochem 2006; 7: 1976-81).
Пример 14
75
75
75
Отслеживание in vivo 100 мкг радиоактивно меченого [Se]rFel d 1 (2 мкКu), связанного с хитозаном или адсорбированного на гидроксид алюминия выполняли, как описано ранее (Febs J 2005; 272: 3449-60, Methods Enzymol 1981; 77: 64-80). Кратко, мышей (n=2/группа) инъецировали подкожно Хитозаном-[Se]rFel d 1 или алюминиевыми квасцами-[Se]rFel d 1 и умерщвляли через 24 часа или 1 неделю. Мышей замораживали и подвергали процессу ленточной секционной радиоавтографии. Срезы (60 мкм) прижимали к рентгеновской пленке (Structurix, Agfa, Mortsel, Belgium) и проявляли, используя D19 (Kodak, Rochester, USA).
Результаты: Через 24 ч радиоактивность была метаболизирована и определялась, например, в печени и селезенке. Картина была подобна гидроксиду алюминия. Через 1 и 2 недели соответственно можно было обнаружить только следовые количества радиоактивности.
Пример 15
Хитозан (3,6 г, степень N-деацетилирования 52%) суспендировали в 250 мл дистиллированной воды и добавляли 2 М HCl (водн.) вплоть до растворения хитозана. pH доводили до 7,0 добавлением по каплям 1 М NaOH (водн.). Объем доводили до 300 мл дистиллированной водой. Данный раствор обозначали как раствор Х (1,2% хитозан). К 100 мл раствора Х добавляли 50 мл воды, данный раствор обозначали как раствор Y (0,8% хитозан). 16 мл раствора Х и раствора Y соответственно добавляли в два лабораторных стакана для каждого раствора. В каждый добавляли разные количества 3,4-диэтокси-3-циклобутен-1,2-диона (10% (об./об.) раствор в этаноле) согласно списку ниже.
Х-1 20 мкл
Х-2 59 мкл
Х-3 118 мкл
Y-1 29 мкл
Y-2 88 мкл
Y-3 176 мкл
Смеси интенсивно перемешивали в течение 10 минут при комнатной температуре, и затем 4 г каждого раствора переносили в чашки Петри (d=35 мм), герметично закрывали и помещали в термостат (40°С) на 4 суток.
Цилиндры диаметром 6 мм и высотой 2,65±0,55 мм извлекали из чашек Петри и гелевые диски сжимали, используя Instron 3345, оснащенный датчиком нагрузки на 100 Н. Образцы подвергали сжатию 1 мм/мин.
Следует упомянуть, что гели на основе 0,8% хитозанового раствора (Y-1, Y-2, Y-3) являлись технически более трудными для обработки из-за их менее жесткой структуры, и, таким образом, аналитическая точность снижалась по сравнению с гелями на основе 1,2% раствора хитозана (Х-1, Х-2, Х-3). Хотя это следует учитывать при сравнении аналитических данных, на гель не оказывалось неблагоприятного воздействия (действительно менее жесткая структура может сделать гель более податливым для дробления). Аналитические данные на основе измерений 1,2% гелей (Х-1, Х-2, Х-3) показали, что среднее значение модуля Е возрастало от 4,7 до 14,1 МПа, когда количество сшивающего агента увеличивалось от 2 до 12% (рассчитанное как соотношение между сшивающим агентом и моносахаридными единицами).
Пример 16
Хитозан (4 г, степень N-деацетилирования 55%) суспендировали в 350 мл дистиллированной воды, и добавляли 2 М HCl (водн.) до растворения хитозана. pH доводили до 7,0 добавлением по каплям 1 М NaOH (водн.). Объем доводили до 400 мл дистиллированной водой. Два разных объема 3,4-диэтокси-3-циклобутен-1,2-диона (60 (образец 1) и 185 мкл (образец 2) 12% (об./об.) раствор в этаноле) добавляли по каплям в два разных мерных стакана, содержащих 50 мл раствора хитозана. Смеси интенсивно перемешивали в течение 5 минут при комнатной температуре и затем 8 мл переносили в пластиковые шприцы (10 мл). Шприцы герметически закрывали и помещали в термостат (40°С) на 72 ч. Затем образовавшиеся гели переносили в новый шприц (5 мл шприцы), выдавливая их через силиконовую трубку (d=3 мм). Шприцы хранили при 4°С перед измерением. Для реологических исследований применяли прибор Bohlin Gemini VOR, используя для измерительной ячейки геометрию с конусом и пластинкой диаметром 40 мм и углом конуса 4 градуса. Все измерения выполняли при 25°С.
Хранение и коэффициенты потерь G' и G'' исследовали в экспериментах с пульсирующим сдвигом. Реологические параметры отражали вязкоупругие свойства твердого тела и жидкости соответственно.
Оба гелевых образца показали свойства вязкоупругого пластичного твердого вещества в измерении диапазона напряжений с G'>G'', то есть эластичный компонент больше, чем жидкостная составляющая. В пределах стабильного линейного участка G' (1 Гц) составлял приблизительно 450 Па с углом сдвига фаз приблизительно 1° для образца 1. Для образца 2 соответствующие данные представляли собой G' приблизительно 900 Па и угол сдвига фаз 1°.
Второй тип осцилляционных измерений, выполненных на тех же самых препаратах, представляли собой качания частоты для постоянной деформации 0,5. Были сделаны следующие наблюдения: гель образца 2 имеет более высокую прочность геля с увеличенным модулем упругости G', чем гель образца 1, и оба образца показывают кажущуюся частоту независимого модуля упругости в изучаемом интервале 0,1-20 Гц.
Можно выполнить воспроизводимые измерения вязкоупругих свойств на раздробленных вариантах гелевых образцов. Два гелевых образца демонстрируют по существу одинаковые вязкоупругие свойства в раздробленном состоянии. Гелевый образец 2 имеет большую прочность геля по сравнению с образцом 1.
Пример 17
Хитозан (1 г, степень N-деацетилирования 55%) суспендировали в 80 мл дистиллированной воды, и добавляли 2 М HCl (водн.) вплоть до растворения хитозана. pH доводили до 6,8, добавляя по каплям 1 М NaOH (водн.). Объем доводили до 100 мл дистиллированной водой. PEGl 600 (2,5 г, 40% растворенный в воде) и 3,4-диэтокси-3-циклобутен-1,2-дион (183 мкл 1% (об./об.) раствора в этаноле) добавляли по каплям при перемешивании к 7,5 г раствора хитозана. Раствор помещали в термостат при 40°С на 3 суток с получением прозрачного вязкоупругого геля.
Пример 18
Хитозан (1,5 г, степень N-деацетилирования 55%) суспендировали в 80 мл дистиллированной воды и добавляли 2 М HCl (водн.) вплоть до растворения хитозана. pH доводили до 6,5, добавляя по каплям 1 М NaOH (водн.). Объем доводили до 100 мл дистиллированной водой. Метагин (0,2 г) и пропагин (0,03 г), растворенные в 23 г воды, добавляли к 67 г раствора хитозана и перемешивали в течение 18 ч при комнатной температуре. 3,4-Диэтокси-3-циклобутен-1,2-дион (24,6 мкл 11%(об./об.) раствор в этаноле) добавляли по каплям к указанному выше раствору. Раствор помещали в термостат, как описано в Примере 17.