СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ КРИОГЛОБУЛИНЕМИЧЕСКОГО ВАСКУЛИТА У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ГЕПАТИТОМ С
METHOD FOR PREDICTION OF CRYOGLOBULINEMIC VASCULITIS DEVELOPMENT IN PATIENTS WITH CHRONIC HEPATITIS C

Область техники
Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии и медицинской генетики и может быть использовано при определении прогноза течения хронического гепатита C (развитие криоглобулинемического васкулита, КГВ). Предлагается способ, позволяющий установить предрасположенность к развитию криоглобулинемического васкулита при хроническом гепатите C по результатам тестирования ДНК на носительство определенных полиморфизмов генов гемостаза (PAI-I-675 5G/4G) и тромбоцитарных рецепторов (ITGB3 1565 Т/С).
Уровень техники
Индивидуальный прогноз течения гепатита C значительно варьирует у каждого пациента и зависит как от факторов вируса, так и от факторов хозяина [Bochud P.Y., Cai Т., Overbeck К., Bochud М., Dufour J.F., Mullhaupt В., Borovicka J., Heim M., Moradpour D., Cerny A., Malinverni R., Francioli P., Negro F. Genotype 3 is associated with accelerated fibrosis progression in chronic hepatitis С // J Hepatol. - 2009 - №51 - C. 655-66; Probst A., Dang Т., Bochud M., Egger M., Negro F., Bochud P.Y. Role of hepatitis С virus genotype 3 in liver fibrosis progression-a systematic review and meta-analysis // J Viral Hepat. - 2011 - №18 - C. 745-59; Alberti A., Vario A., Ferrari A., Pistis R. Review article: chronic hepatitis C-natural history and cofactors // Aliment Pharmacol Ther. - 2005 - №22 Suppl 2 - C. 74-8]. Несмотря на достигнутые успехи в лечении хронического гепатита C (ХГС), сохраняется необходимость продолжать поиски предикторов неблагоприятного прогноза с целью совершенствования персонифицированной терапии. Ранее было показано, что наличие мутаций генов эндотелиальной дисфункции, ренин-ангиотензиновой системы и воспаления утяжеляет течение ХГС [Rueger S., Bochud P.Y., Dufour J.F., Mullhaupt В., Semela D., Heim M.H, Moradpour D., Cerny A., Malinverni R., Booth D.R., Suppiah V., George J., Argiro L., Halfon P., Bourliere M., Talal A.H., Jacobson I.M., Patin E., Nalpas В., Poynard Т., Pol S., Abel L., Kutalik Z., Negro F. Impact of common risk factors of fibrosis progression in chronic hepatitis С // Gut. - 2014 - № - С; Таратина О.В., Краснова Т.Н., Самоходская Л.М., Лопаткина Т.Н., Ткачук В.А., Мухин Н.А. Значение полиморфизма генов ренинангиотензиновой системы в прогрессировании фиброза печени у больных хроническим гепатитом C // РЖГГК. - 2014 - №24 - С. 69-77; Taratina O.V., Krasnova T.N., Samokhodskaia L.M., Lopatkina T.N., Tkachuk V.A., Mukhina N.A. [Endothelial dysfunction gene polymorphisms and the rate of liver fibrosis in chronic hepatitis C] // Ter Arkh. - 2014 - №86 - C. 45-51; Самоходская Л.М., Игнатова T.M., Абдуллаев С.М., Краснова Т.Н., Некрасова Т.П., Мухин Н.А., Ткачук В.А. Прогностическое значение комбинации аллельных вариантов генов цитокинов и гемохроматоза у больных хроническим гепатитом C // РЖГГК. - 2007 - №17 - С. 50-56]. Среди внепеченочных проявлений хронической инфекции HCV важная роль отводится смешанной криоглобулинемии (КГ), которая может привести к развитию криоглобулинемического васкулита (КГВ). Известно, что появление криоглобулинемических комплексов 2 и 3 типа генетически детерминировано, однако у части пациентов их наличие не сопровождается развитием васкулита или протекает с минимальными клиническими проявлениями [Retamozo S., Diaz-Lagares C, Bosch X., Bove A., Brito-Zeron P., Gomez M.E., Yague J., Forns X., Cid M.C, Ramos-Casals M. Life-Threatening Cryoglobulinemic Patients With Hepatitis C: Clinical Description and Outcome of 279 Patients // Medicine (Baltimore). - 2013 - №5 - C. 273-284]. Поиск предикторов, в том числе генетических, ассоциированных с развитием именно криоглобулинемического васкулита (КГВ), актуален в связи с тяжелым и подчас фатальным течением этого варианта болезни. Ранее показан значимый вклад полиморфизма генов, ответственных за наследственную форму тромбофилии, в развитие и клинические проявления при других васкулитах и иммуновоспалительных заболеваниях. [Борисов Е.Н, Краснова Т.Н., Самоходская Л.М., Иваницкий Л.В., Никифорова Н.В., Мухин Н.А. Прогностическое значение аллельных вариаций генов, влияющих на систему гомеостаза, в развитии антифосфолипидного синдрома и поражения почек у больных системной красной волчанкой // Терапевтический архив. - 2014 - №6 - С. 57-62; Refai Т.М., Al-Salem I.H, Nkansa-Dwamena D., Al-Salem M.H Hyperhomocysteinaemia and risk of thrombosis in systemic lupus erythematosus patients // Clin Rheumatol. - 2002 - №21 - C. 457-61; Von Feldt J.M., Scalzi L.V., Cucchiara A.J., Morthala S., Kealey C, Flagg S.D., Genin A., Van Dyke A.L., Nackos E., Chander A., Gehrie E., Cron R.Q., Whitehead A.S. Homocysteine levels and disease duration independently correlate with coronary artery calcification in patients with systemic lupus erythematosus // Arthritis Rheum. - 2006 - №54 - C. 2220-7]. Однако роль аллельных вариантов генов гемостаза и тромбоцитарных рецепторов в формировании КГВ, ассоциированного с ХГС, изучена недостаточно.
Генетические факторы, влияющие на развитие криоглобулинемии или КГВ, исследованы недостаточно [Gragnani L., Fognani Е., Piluso A., Zignego A.L. Hepatitis С virus-related mixed cryoglobulinemia: is genetics to blame? // World J Gastroenterol. - 2013 - №19 - C. 8910-5]. Ранее в этом направлении активно изучался полиморфизм генов HLA, однако результаты исследований оказались противоречивыми [Ossi Е., Bordin М.С., Businaro М.А., Marson P., Bonadonna P., Chiaramonte M., Boin F., Volenti M.T., Fagiolo U. HLA expression in type II mixed cryoglobulinemia and chronic hepatitis C virus // Clin Exp Rheumatol. - 1995 - №13 Suppl 13 - C. S91-3; Lenzi M., Frisoni M., Mantovani V., Ricci P., Muratori L., Francesconi R., Cuccia M., Ferri S., Bianchi F.B. Haplotype HLA-B8-DR3 confers susceptibility to hepatitis С virus-related mixed cryoglobulinemia // Blood. - 1998 - №91 - C. 2062-6]. Также обсуждалась роль полиморфизма в промоторной области гена BAFF и генов Fey рецепторов в развитии криоглобулинемии и КГВ [Gragnani L., Piluso А., Giannini С., Caini P., Fognani E., Monti M., Petrarca A., Ranieri J., Razzolini G., Froio V., Laffi G., Zignego A.L. Genetic determinants in hepatitis С virus-associated mixed cryoglobulinemia: role of polymorphic variants of BAFF promoter and Fcgamma receptors // Arthritis Rheum. - 2011 - №63 - C. 1446-51; Giannini G., Gragnani L., Piluso A., Caini P., Petrarca A., Monti M., Laffi G., Zignego A.L. Can BAFF promoter polymorphism be a predisposing condition for HCV-related mixed cryoglobulinemia? // Blood. - 2008 - №112 - C. 4353-4].
Хорошо изучена роль полиморфизма гена IL-28B в качестве предиктора ответа при проведении противовирусной терапии, Sansonno D. и соавт. также показали, что генотип ТТ гена IL-28B rsl2979860 чаще встречается у пациентов с ХГС и КГВ, чем без него (17% против 8.1%, р=0,02). Также у пациентов с КГВ и не-СС генотипами данного гена по сравнению с пациентами с СС-генотипами была выше частота клонов В-клеток в циркуляции (84.2% против 55,9%; p=0,005), поражения почек (21% против 2.9%; p=0,03) и развития неходжкинской лимфомы (17,5% против 6,8%; p=0,048) [Sansonno D., Russi S., Serviddio G., Conteduca V., D'andrea G., Sansonno L., Pavone F., Lauletta G., Mariggio M.A., Dammacco F. Interleukin 28B gene polymorphisms in hepatitis С virus-related cryoglobulinemic vasculitis // J Rheumatol. - 2013 - №41 - C. 91-8]. Похожие данные получены и в группе китайских ученых [Fan X.H., Wu С.Н., Zheng Y.Y., Wang L.F., Huo N., Shao С.Р., Lu H.Y., Xu X.Y., Wei L. [The difference of IL-28B polymorphisms between hepatitis С patients with and without cryoglobulinemia] // Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. - №21 - C. 429-33], что, однако, не нашло подтверждения в другой работе [Piluso A., Giannini С., Fognani Е., Gragnani L., Caini P., Monti М., Petrarca A., Ranieri J., Urraro Т., Triboli E., Laffi G., Zignego A.L. Value of IL28B genotyping in patients with HCV-related mixed cryoglobulinemia: results of a large, prospective study // J Viral Hepat. - 2013 - №20 - C. e107-14].
Наиболее крупной генетической работой является исследование Zignego A.L. и соавт., которые изучали 899641 маркеров чипа Illumina HumanOmnil-Quad у 356 пациентов с ХГС и КГВ и 447 ХГС без криоглобулинов из GWAS [Zignego A.L., Wojcik G. L., Cacoub P., Visentini M., Casato M., Mangia A., Latanich R., Charles E.D., Gragnani L., Terrier В., Piazzola V, Dustin L.B., Khakoo S.I., Busch M.P., Lauer G.M., Kim A.Y., Alric L., Thomas D.L., Duggal P. Genome-wide association study of hepatitis С virus- and cryoglobulin-related vasculitis // Genes Immun. - 2014 - №15 - C. 500-5]. Методом логистической регрессии с контролирующими переменными пол и этническая принадлежность показано, что наиболее сильная ассоциация для развития КГВ обнаружена на 6 хромосоме вблизи генов NOTCH4 и МНС II класса. Полногеномный поиск ассоциаций идентифицировал SNP rs9461776 (ОШ=2,16, p=1,16Е-07), расположенный между HLA-DRB1 и DQA1, также ассоциированный с развитием КГВ. Однако патофизиологических выводов о влиянии данных маркеров на течение болезни авторы сделать на данном этапе не смогли.
Fognani Е. и соавт. впервые описали изменение профиля экспрессии микроРНК у пациентов с КГ [Fognani Е., Giannini С., Piluso A., Gragnani L., Monti М., Caini P., Ranieri J., Urraro Т., Triboli E., Laffi G., Zignego A.L. Role of microRNA profile modifications in hepatitis С virus-related mixed cryoglobulinemia // PLoS One. - 2013 - №8 - С. e62965].
В настоящее время увеличивается количество данных, указывающих на то, что протромбогенные состояния могут способствовать развитию осложнений при системном васкулите [Борисов Е.Н., Краснова Т.Н., Самоходская Л.М., Иваницкий Л.В., Никифорова H.В., Мухин Н.А. Прогностическое значение аллельных вариаций генов, влияющих на систему гомеостаза, в развитии антифосфолипидного синдрома и поражения почек у больных системной красной волчанкой // Терапевтический архив. - 2014 - №6 - С. 57-62]. Так при системной красной волчанке гипергомоцистеинемия и наличие антител к кардиолипинам повышает риск тромбоэмболических осложнений и ишемической болезни сердца [Refai Т.М., Al-Salem I.H., Nkansa-Dwamena D., Al-Salem M.H. Hyperhomocysteinaemia and risk of thrombosis in systemic lupus erythematosus patients // Clin Rheumatol. - 2002 - №21 - C. 457-61, Von Feldt J.M., Scalzi L.V., Cucchiara A.J., Morthala S., Kealey C, Flagg S.D., Genin A., Van Dyke A.L., Nackos E., Chander A., Gehrie E., Cron R.Q., Whitehead A.S. Homocysteine levels and disease duration independently correlate with coronary artery calcification in patients with systemic lupus erythematosus // Arthritis Rheum. - 2006 - №54 - C. 2220-7, Afeltra A., Vadacca M., Conti L., Galluzzo S., Mitterhofer A.P., Ferri G.M., Del Porto F., Caccavo D., Gandolfo G.M., Amoroso A. Thrombosis in systemic lupus erythematosus: congenital and acquired risk factors // Arthritis Rheum. - 2005 - №53 - C. 452-9], особенно при наличии признаков тромбофилии [Brouwer J.L., Bijl М., Veeger N.J., Kluin-Nelemans НС, Van Der Meer J. The contribution of inherited and acquired thrombophilic defects, alone or combined with antiphospholipid antibodies, to venous and arterial thromboembolism in patients with systemic lupus erythematosus // Blood. - 2004 - №104 - C. 143-8]. При наличии мутации в гене протромбина 20210 G/A [Ricart J.M., Vaya A., Todoli J., Calvo J., Villa P., Estelles A., Espana F., Santaolaria M., Corella D., Aznar J. Thrombophilic risk factors and homocysteine levels in Behcet's disease in eastern Spain and their association with thrombotic events // Thromb Haemost. - 2006 - №95 - C. 618-24] риск тромбозов при болезни Бехчета увеличивается, однако вышесказанное не было подтверждено в других исследованиях [Leiba М., Seligsohn U., Sidi Y., Harats D., Sela В.А., Griffin J.H., Livneh A., Rosenberg N., Gelernter I., Gur H., Ehrenfeld M. Thrombophilic factors are not the leading cause of thrombosis in Behcet's disease // Ann Rheum Dis. - 2004 - №63 - C. 1445-9, Espinosa G, Font J., Tassies D, Vidaller A., Deulofeu R, Lopez-Soto A., Cervera R., Ordinas A., Ingelmo M., Reverter J.C. Vascular involvement in Behcet's disease: relation with thrombophilic factors, coagulation activation, and thrombomodulin // Am J Med. - 2002 - №112 - C. 37-43]. Кроме того, описано, что тромбофилические нарушения ассоциированы с некротизирующими язвенными поражениями кожи при васкулитах [Mekkes J.R., Loots М.А., Van Der Wal A.C., Bos J.D. Increased incidence of hypercoagulability in patients with leg ulcers caused by leukocytoclastic vasculitis // J Am Acad Dermatol. - 2004 - №50 - C. 104-7, Hairston B.R., Davis M.D., Pittelkow M.R., Ahmed I. Livedoid vasculopathy: further evidence for procoagulant pathogenesis // Arch Dermatol. - 2006 - №142 - C. 1413-8]. Однако исследований, посвященных изучению влияния тромбофилических нарушений на манифестацию васкулита при HCV-ассоциированной смешанной криоглобулинемии мало. В своей работе Casato М. и соавт. у больных хроническим гепатитом С со смешанной криоглобулинемией (n=64), без криоглобулинемии (n=49) и у здоровых доноров (n=53) исследовали следующие показатели: антитела к фосфолипидам, волчаночный антикоагулянт, гипергомоцистеинемию, уровень протеина С и S, полиморфизм генов PAI-I, фактора V 1691 G/A и протромбина 20210 G/A и MTHFR (677 С/Т и 1298 А/С) [Casato М., Carlesimo М., Francia A., Timarco С., Antenucci A., Bove М., Martini К., Visentini М., Fiorilli М., Conti L. Influence of inherited and acquired thrombophilic defects on the clinical manifestations of mixed cryoglobulinaemia // Rheumatology (Oxford). - 2008 - №47 - C. 1659-63]. При логистическом регрессионном анализе показано, что гипергомоцистеинемия является фактором риска развития выраженной пурпуры (p<0,0001) и наличия язвенных поражений кожи (p<0,0001). Генетические факторы не влияли на течение и развитие васкулита при смешанной криоглобулинемии. Уровень гомоцистеинемии в данном исследовании у здоровых доноров и больных без смешанной криоглобулинемии не коррелировал с генотипами гена MTHFR. Только у пациентов ХГС с криоглобулинемией высокий уровень гомоцистеинемии ассоциирован с мутантным генотипом MTHFR 677 С/Т.
Исследования, посвященные изучению ассоциации одного полиморфизма с особенностями течения ХГС, имеют ряд недостатков. С одной стороны, результаты работ нередко противоречат друг другу, а с другой - не предоставляют надежных критериев подразделения больных с высоким и низким риском развития криоглобулинемического васкулита. Устранение этих недостатков возможно при исследовании комбинации аллельных вариантов нескольких генов, поскольку при этом происходит суммирование факторов риска, а следовательно, повышается достоверность результатов и предсказательная способность модели. Исследований, посвященных изучению сочетанного влияния генов на развитие КГВ у больных ХГС, в литературе не встречается.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является создание предсказательной модели развития КГВ при ХГС, которая, обладая достаточной степенью надежности, основывалась бы на изучении небольшого числа полиморфизмов.
Поставленная задача решается предлагаемым способом прогнозирования развития криоглобулинемического васкулита у больных хроническим гепатитом C путем анализа комбинации полиморфизмов генов гемостаза и тромбоцитарных рецепторов, включающий: а) получение образца геномной ДНК больного ХГС, б) тестирование указанной ДНК на наличие аллелей, ассоциированных с развитием криоглобулинемического васкулита, в) оценку результатов и составление заключения о вероятности развития КГВ по формуле (1), учитывающей сочетанное влияние полиморфизмов ITGB3 1565 Т/С и PAI-I-675 5G/4G и клинико-демографических-показателей (пол, возраст больного, длительность заболевания).
где е - основание натуральных логарифмов (Число Эйлера) 2,71828…; z - уравнение регрессии, рассчитанное по формуле 2:
где больным мужского пола присваивают значение «0», женского - «1», возраст и длительность заболевания представляют собой числовые значения, выраженные в годах; a S характеризует наличие полиморфизмов в генах, при этом при выявлении двух гомозиготных мажорных аллелей в обоих генах параметру S присваивают значение «0»; при выявлении одной минорной аллели по одному из двух генов присваивают «1», при выявлении одной минорной аллели по обоим генам - «2», при выявлении одной минорной аллели по одному гену - гетерозиготен, а по-другому двух минорных аллелей - «3», при выявлении двух минорных аллелей по обоим генам - «4»;
и при получении 90<p≤100, делают вывод о высоком риске развития криоглобулинемического васкулита у больных хроническим гепатитом C;
при 80≤p≤90,0, пациенту назначают динамическое наблюдение;
при p<80,0 делают вывод о низком риске развития криоглобулинемического васкулита у больного хроническим гепатитом С.
Криоглобулинемический васкулит, ассоциированный с ХГС, с обширным спектром органных поражений часто является доминирующим в течение ХГС и ограничивает возможности противовирусной терапии. Среди ученых до сих пор нет единого мнения, почему у некоторых пациентов ХГС протекает без появления криоглобулинемии, у других развивается бессимптомная криоглобулинемия, а у третьих - васкулит с поражением различных органов и систем, иногда выраженной степени тяжести.
Поскольку КГВ представляет собой лейкоцитокластический васкулит, можно было бы предполагать участие системы гемостаза и тромбоцитарных рецепторов в развитии данного осложнения ХГС. При этом предполагалось включить в группу полиморфизмов, рекомендуемую для исследования при тестировании ДНК больных ХГС с целью оценки сочетанного влияния и прогнозирования развития криоглобулинемического васкулита, те из них, которые предварительно будут определены как функционально значимые для развития криоглобулинемии.
- Ингибитор активатора плазминогена 1 типа (PAI-I). Лизис тромбов осуществляется при помощи основного белка противосвертывающей системы - плазмина. Образование плазмина из предшественника плазминогена запускается активаторами плазминогена.
Одним из основных активаторов плазминогена является тканевой активатор, синтезирующийся в эндотелиальных клетках. Здесь же происходит образование значительной части его главного ингибитора - ингибитора активатора плазминогена 1 типа (PAI-I). Повышенная активность PAI-I приводит к снижению фибринолитической активности крови. Полиморфизм 4G/5G приводит к повышению активности PAI-I и склонности к венозным тромбозам [Kohler Н.Р., Grant P.J. Plasminogen-activator inhibitor type 1 and coronary artery disease // N Engl J Med. - 2000 - №342 - C. 1792-801, Tsantes A.E., Nikolopoulos G.K., Bagos P.G., Bonovas S., Kopterides P., Vaiopoulos G. The effect of the plasminogen activator inhibitor-1 4G/5G polymorphism on the thrombotic risk // Thromb Res. - 2008 - №122 - С. 736-42]. При данном полиморфизме уменьшается фибринолиз в связи с ингибированием тканевого активатора плазминогена, а в дальнейшем блокируется превращения плазминогена в плазмин. Так же как и при лейденовской мутации и мутации протромбина G20210A, генотип гена PAI-I 4G/4G ассоциирован с высоким риском ИБС и венозных тромбоэмболий [Tsantes А.Е., Nikolopoulos G.K., Bagos P.G., Bonovas S., Kopterides P., Vaiopoulos G. The effect of the plasminogen activator inhibitor-1 4G/5G polymorphism on the thrombotic risk // Thromb Res. - 2008 - №122 - C. 736-42].
Функциональная значимость данной мутации при развитии КГВ может быть объяснена тем, что в плазме крови при наличии полиморфизма PAI -675 5G/4G повышенный активный PAI-1 связывается с витронектином - гликопротеином, опосредующим клеточную адгезию и взаимодействующим с белками системы комплемента, свертывания крови и фибринолиза. Возможно, эта связь с компонентом комплемента дополнительно усиливает взаимодействие с cor-белком HCV и способствует формированию криоглобулинов.
- Гликопротеин IIIа (β3-интегрин) является субъединицей рецептора фибриногена - гликопротеина IIb/IIIa (αIIββ3) на поверхности тромбоцитов. Гликопротеин IIb/IIIа - наиболее распространенный трансмембранный рецептор тромбоцитов, а его активация является ключевым процессом, запускающим агрегацию тромбоцитов. При обнажении субэндотелиального матрикса происходит активация тромбоцитов, необратимая агрегация и уплотнение тромба. Предполагается также, что β3-интегрины играют важную роль в миграции и пролиферации гладкомышечных клеток, что ведет к прогрессированию васкулопатий.
Наиболее изучена мутация гена ITGB3 PLA1/PLA2 (1565 Т/С, Leu33Pro, rs5918). Тромбоциты у носителей аллели PLA2 имеют более низкий порог тромбоцитарной агрегации, высвобождения α-гранул, активации гликопротеина IIb/IIIа и связывания фибриногена.
В нашей работе также обнаружена связь между наличием мутаций в гене ITGB3 1565 Т/С и развитием КГВ. Продукт данного гена - β3-интегрин - играет важную роль в миграции и пролиферации гладкомышечных клеток, что ведет к прогрессированию васкулопатий. При наличии мутации в гене ITGB3 тромбоциты склонны к агрегации и выбросу потенциально активных веществ. Можно предположить, что последние активируют В-клетки и лимфоциты, способствуя синтезу IgM и образованию криоглобулинов. Публикаций по этой теме в литературе не обнаружено.
В настоящее время для выявления полиморфных состояний генов используется большое количество разнообразных способов, таких как аллель-специфичная ПЦР, масс-спектрометрия, метод гибридизации, ПЦР в реальном времени. В одном из конкретных воплощений изобретения нами был использован метод полимеразной цепной реакции с детекцией результатов в реальном времени и анализом кривых плавления, однако при осуществлении предлагаемого способа может быть применен любой из известных ныне методов, обеспечивающий надежное детектирование точечных замен в последовательности ДНК.
Проведенный нами анализ ДНК у 200 больных ХГС без криоглобулинемии (без КГ), с бессимптомной криоглобулинемией (БСКГ), криоглобулинемическим васкулитом (примеры 2-4) показал, что
а) в случае полиморфизма PAI -675 5G/4G мутантная аллель 4G встречалась чаще с в группе больных с КГВ, чем в группе больных с БСКГ (p=0,037, ОШ=2,008, 95%ДИ 1,055-3,823). 5G5G дикий генотип чаще выявляется в группе БСКГ по сравнению с группой КГВ (p=0,007, ОШ=0,202, 95%ДИ 0,059-0,698), в то время как шанс развития КГВ у носителей объединенного генотипа 4G5G+5G5G равен 4,950 по сравнению с больными с БСКГ (95%ДИ 1,434-17,093). В группе с КГВ по сравнению с группой без КГ мажорная аллель 5G на уровне тенденции реже встречается (37,84% против 48,37%). Частота носительства дикого генотипа 5G5G ниже в группе больных ХГС с наличием криоглобулинемического васкулита по сравнению с группой больных без КГ (10,81% против 25,20%, p=10,063).
б) в случае полиморфизма ITGB3 1565 Т/С мутантный генотип СС чаще выявлялся в группе с КГВ, чем в группе без КГ (8,11% против 1,63%, p=0,047, ОШ=5,338, 95%ДИ 0,845-31,725). Объединенный генотип ТТ+ТС являлся протективным и чаще встречался в группе без КГ, чем с КГВ (98,37% против 91,89%, р=0,047, ОШ=0,187, 95%ДИ 0,030-1,183).
в) в случае полиморфизмов других генов системы гемостаза и тромбоцитарных рецепторов частота аллелей и генотипов между анализируемыми группами достоверно не различалась.
На основании полученных данных как значимые для развития КГВ при HCV-инфекции были определены полиморфизмы PAI -675 5G/4G и ITGB3 1565 Т/С, анализ комбинации которых и клинико-демографических факторов и предлагается использовать в новом способе определения предрасположенности больных ХГС к агрессивному течению заболевания. Для оценки прогностического значения сочетания генотипов генов ITGB3 1565 Т/С и PAI-I -675 5G/4G в развитии КГВ был введен специальный суммарный балл, учитывающий количество мутантных аллелей обоих генов. В группе с КГВ по сравнению с группой без КГ чаще выявлялись пациенты с высоким суммарным баллом, учитывающим сочетанное влияние полиморфизма генов ITGB3 1565 Т/С и PAI-I -675 5G/4G. В дальнейшем из модели многофакторной регрессии выведена формула (2), позволяющая определить прогноз вероятности КГВ (p) у пациентов ХГС, учитывая введенный суммарный балл и клинико-демографические данные (пол, возраст больного и длительность инфицирования).
Таким образом, поставленная задача разработки простого в исполнении и сравнительно недорогого (технический результат) способа прогнозирования предрасположенности к развитию криоглобулинемического васкулита при HCV-инфекции была решена за счет использования новой комбинации полиморфизмов, определяемых при проведении ДНК-тестирования у пациентов с ХГС. Предложенный способ включает: а) получение образца геномной ДНК больного ХГС, б) тестирование указанной ДНК на наличие аллелей, ассоциированных с развитием криоглобулинемического васкулита, в) оценку результатов и составление заключения о вероятности развития КГВ по специальной формуле, учитывающей сочетанное влияние полиморфизмов ITGB3 1565 Т/С и PAI-I-675 5G/4G и клинико-демографических-показателей (пол, возраст больного, длительность заболевания).
Краткое описание чертежей.
Фиг. 1. Частота встречаемости аллелей (А) и генотипов (Б) полиморфизма гена PAI -675 5G/4G в группах больных ХГС с криоглобулинемическим васкулитом (КГВ) и с бессимптомной криоглобулинемией (БСКГ).
Фиг. 2. Частота встречаемости аллелей (А) и генотипов (Б) полиморфизма гена PAI -675 5G/4G в группах больных ХГС с и без КГВ
Фиг. 3. Частота встречаемости аллелей (А) и генотипов (Б) полиморфизма гена ITGB3 1565 Т/С в группах больных ХГС с КГВ и без КГ
Фиг. 4. Многофакторный анализ при сравнении групп без и с КГВ с учетом суммарного балла и клинических показателей
Осуществление изобретения
1. Критерии отбора больных ХГС для проведения анализа.
Обследовано 244 больных ХГС и ЦП в его исходе (84 мужчин и 160 женщин), наблюдавшихся в Клинике нефрологии, внутренних и профессиональных болезней ПМГМУ имени М.И. Сеченова в период с января 2004 года по январь 2013 года. Критериями включения были наличие хронического гепатита C или ЦП в его исходе, а также подписанное информированное согласие на участие в исследовании. Критериями исключения больных из исследования были: 1) употребление алкоголя (>20 мл/сут для женщин и >40 мл/сут для мужчин), 2) наличие дополнительных этиологических факторов поражения печени (коинфекция вирусом гепатита B, ВИЧ, болезнь Вильсона-Коновалова, аутоиммунный гепатит, наследственный гемохроматоз), 3) сахарный диабет 1 и 2 типа.
Диагноз ХГС устанавливался на основании наличия антител к HCV и положительных тестов на HCV RNA более 6 мес, диагноз криоглобулинемического васкулита - согласно общепринятым критериям.
Для решения этой задачи были сформированы 3 группы: без криоглобулинемии (без КГ, N=123), с бессимптомной криоглобулинемией (БСКГ, N=40) и с криглобулинемическим васкулитом (КГВ, N=37).
2. Выделение ДНК
Забор венозной крови в объеме 5 мл проводили в пробирки, содержащие ЭДТА в качестве антикоагулянта (1 объем раствора 0,5 М Na2-3flTA, pH 8,0+9 объемов крови). Образцы тщательно перемешивали, затем хранили при -700°С в морозильной камере.
Выделение геномной ДНК проводили из периферической венозной крови, стабилизированной ЭДТА, с помощью коммерческого набора QIAmp DNA Blood Mini Kit и автоматической станции QIAcube™ (QIAGEN). В прибор QIAcube™ помещали 200 мкл образцов крови в пробирках объемом 2 мл, комплект адапторов с колонками и 1,5 мл пробирками, наконечники и необходимые реагенты (QIAGEN), после чего запускали автоматизированный протокол для выделения ДНК из крови с объемом элюции раствора ДНК 100 мкл. Для лизиса к образцам крови добавлялось 20 мкл свободной от ДНКаз протеазы QUAGEN (или протеиназа К) и 200 мкл буфера AL, полученная смесь перемешивалась и инкубировалась при 56°C в течение 10 минут. Далее в пробирки добавлялось 200 мкл 96% этилового спирта с последующим перемешиванием на встроенном в прибор шейкере. Для связывания ДНК с сорбентом весь объем полученной смеси переносился в колонки и центрифугировался в течение 1 минуты при 6000 g. Фильтрат оказывался на дне адаптера, в который изначально была помещена колонка. Далее автоматически последовательно проводилось 2 шага промывки колонок буферами AW1 и AW2 объемом 500 мкл с центрифугированием в течение 1 и 3 минут при 6000 g и 20000 g соответственно. Промытая колонка переносилась прибором в отдельную чистую пробирку, после чего ДНК элюировали с сорбента колонки добавлением 100 мкл буфера АЕ и инкубацией при комнатной температуре в течение 1 мин с последующим центрифугированием при 6000 g в течение 1 минуты. Для получения отрицательного контроля все шаги выделения проходил раствор антикоагулянта ЭДТА из пробирок для забора крови.
Концентрацию ДНК определяли по поглощению раствора ДНК при длине волны 260 нм (А260) с помощью прибора NanoDrop200. Чистота ДНК определялась по соотношению поглощений при 260 и 280 нм соответственно (А260/А280). Полученное отношение находилось в пределах 1,7-1,9, что свидетельствовало об отсутствии контаминации. Выделенная ДНК помещалась в морозильную камеру и хранилась при -200°C до проведения ПЦР.
3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Определение полиморфизма исследуемых генов проводили методом полимеразной цепной реакции с детекцией результатов в режиме «реального» времени и анализом кривых плавления с использованием коммерческих наборов реагентов фирмы ДНК-технология на детектирующем амплификаторе DTprime (ООО «ДНК-технология») согласно методике, описанной в инструкции по применению к наборам. Технология ПЦР с анализом кривых плавления дает возможность идентифицировать фрагменты ДНК путем детекции изменений в уровне флуоресценции комплекса фрагмент-проба (меченный флуорофором олигонуклеотидный зонд) на этапе его денатурации и последующего построения графика кривой плавления. Для определения нуклеотидной последовательности, образовавшейся в процессе амплификации, используется метод примыкающих проб (kissing probes или резонансный перенос энергии). В его основе лежит использование двух типов олигонуклеотидов (проб), гибридизующихся на матрицу при низкой температуре в непосредственной близости друг от друга. Один из олигонуклеотидов метят флуоресцентным донором, другой - акцептором (гасителем). Идентификация нуклеотидной последовательности образца осуществляется в процессе плавления дуплексов (результат гибридизации фрагментов ДНК и олигонуклеотидных зондов), который происходит при последовательном увеличении температуры реакционной смеси. Преимуществом данного подхода является использование специфических флуорофоров, снижающих риск детектирования неспецифических продуктов амплификации, как при использовании интеркалирующих красителей. Для исключения ошибок генотипирования и оценки качества выделенной ДНК при получении результатов учитываются данные внутреннего контроля.
Технология проведения ПЦР включает следующие этапы:
- амплификация искомой последовательности ДНК;
- гибридизация ампликонов с олигонуклеотидами (пробами), меченными флуорофорами;
- образование комплементарных и частично комплементарных дуплексов;
- плавление (денатурация) дуплексов;
- детекция флуоресценции с последующим построением и анализом кривых плавления.
В промаркированные пробирки вносили по 20 мкл соответствующей смеси для амплификации из набора (для каждого полиморфизма отдельным наконечником). В отдельной пробирке готовили смесь ПЦР-буфера и Taq-AT-полимеразы из расчета:
- 10×(N+1) мкл ПЦР-буфера,
- 0,5×(N+1) мкл Taq-AT-полимеразы,
где N - количество промаркированных пробирок с учетом отрицательных контролей.
После встряхивания и центрифугирования полученной смеси в каждую пробирку со смесью для амплификации добавляли по 10 мкл смеси ПЦР-буфера и Taq-AT-полимеразы, блокированной специфическими антителами, а сверху по 1 капле (около 20 мкл) минерального масла. Использование Taq-полимеразы, блокированной специфическими антителами, на этапе амплификации искомого участка ДНК с праймерами, общими для обоих вариантов последовательности, имеет следующие преимущества:
- реализация «горячего старта» без применения парафина;
- предотвращение неспецифического отжига праймеров;
- повышение чувствительности комплектов реагентов.
Для предотвращения контаминации закрывали крышки пробирок. В дальнейшем по очереди в каждую пробирку вносили наконечником с аэрозольным барьером по 5,0 мкл ДНК (50-100 нг) или 5,0 мкл отрицательного контрольного образца, прошедшего этап выделения ДНК. После центрифугирования на вортексе пробирки устанавливали в блок детектирующего амплификатора и запускали программное обеспечение RealTime PCR (ООО «ДНК-Технология») в режиме «Работа с прибором». Для проведения реакции использовали протокол амплификации, предоставляемый ООО «ДНК-технология».
Регистрация и учет результатов ПЦР проводились автоматически программным обеспечением по анализу кривых плавления полученных продуктов.
4. Статистическая обработка результатов
Статистическую обработку данных проводили с помощью пакетов ((Microsoft Office Excel 2007» и «Statistica 10.0» с использованием двустороннего точного критерия Фишера и критерия χ2 Пирсона (для качественных признаков), критерия Манни-Уитни и Краскела-Уолиса (для количественных признаков с распределением, отличающимся от нормального). Также использовался критерий отношения шансов (ОШ). Достоверными считались различия при p<0,05 и 95% доверительном интервале (ДИ) для ОШ, не включающем «1». Прогностическое значение сочетанного влияния полиморфных генотипов и клинико-демографических факторов на развитие КГВ оценивалось с помощью многофакторного анализа методом логистической регрессии.
Пример 1. Характеристика группы пациентов, отобранных для ДНК-тестирования
Из 244 обследованных диагноз криоглобулинемического васкулита (КГВ) установлен у 37 (15,16%) больных (табл. 1). Криоглобулины выявлялись у всех больных из этой группы, а также у 40 пациентов (19,32%) из группы больных ХГС без проявлений васкулита (бессимптомная криоглобулинемия, БСКГ). При КГВ чаще присутствовало повышение активности РФ по сравнению с больными с и без БСКГ (p=0,000). Уровень комплемента статистически достоверно был снижен в группах с КГВ и БСКГ по сравнению с группой без КГ (p=0,000 и p=0,016 соответственно, а между группами с БСКГ и КГВ отмечалась тенденция к снижению (p=0,070).
У 23 пациентов с криоглобулинемическим васкулитом отмечалось поражение кожи в виде характерной пурпуры или язвенных дефектов (n=1), у 19 и 12 - суставные проявления в рамках триады Мельтцера и поражение почек соответственно, у 8 больных выявлено поражение периферической нервной системы в виде сенсорной полинейропатии и мышц в виде мышечной слабости (триада Мельтцера), в 2 случаях диагностирован легочный васкулит. Изменений со стороны ЖКТ, связанных с криоглобулинемическим васкулитом, не отмечено. Средний возраст больных в группе с КГВ составил 57 лет по медиане с интерквартильным размахом 50-63 лет и отличался от возраста больных с БСКГ (44 года с интерквартильным размахом 34-55 года, p=0,000) и без БСКГ (43 года с интерквартильным размахом 32-54 лет, p=0,000). В группе больных ХГС с КГВ преобладали женщины в сравнении с группой больных ХГС с БСКГ (86,49% против 60,00%, p=0,011, ОШ=4,267, 95%ДИ 1,346-13,526) и без БСКГ (86,49% против 63,41%, p=0,008, ОШ=3,692, 95%ДИ 1,332-10,231). В группе с КГВ по сравнению с группой без БСКГ достоверно чаще наблюдалась стадия цирроза печени p=0,000), при этом между группами с БСКГ и КГВ, и БСКГ и без БСКГ различия были статистически недостоверны. При сравнении уровней иммуноглобулинов выявлено, что в группе с КГВ уровень IgM был достоверно выше по сравнению с группой без БСКГ (186 против 142 Ед/мл, p=0,002). Других различий в уровнях иммуноглобулинов не выявлено. Больные в трех группах не различались по скорости прогрессирования фиброза в печени, возрасту инфицирования, активности трансаминаз.
Пример 2. Полиморфизм гена PAI -675 5G/4G
Частоты встречаемости аллелей и генотипов гена PAI -675 5G/4G в группах с БСКГ и без КГ, КГВ представлены в таблице 2 и фиг. 1-2.
Мутантная аллель 4G встречалась с частотой 62,16% в группе больных с КГВ и 45,00% в группе больных с БСКГ (фиг. 1). Выявленные различия были статистически значимыми (p=0,037, ОШ=2,008, 95%ДИ 1,055-3,823). При анализе распространенности генотипов в этих группах выявлено, что 5G5G генотип чаще выявляется в группе БСКГ по сравнению с группой КГВ (p=0,007, ОШ=0,202, 95%ДИ 0,059-0,698), в то время как шанс развития КГВ у носителей объединенного генотипа 4G5G+5G5G равен 4,950 по сравнению с больными с БСКГ (95%ДИ 1,434-17,093).
При анализе встречаемости полиморфных генетических маркеров гена PAI -675 5G/4G показано, что мажорная аллель 5G на уровне тенденции реже встречается в группе с КГВ по сравнению с группой без БСКГ (37,84% против 48,37%, p=0,143, фиг. 2). Мутантная аллель 4G встречалась с частотой 62,16% и 51,62% в группе больных ХГС с КГВ и без БСКГ соответственно (p=0,143). Распространенность генотипов данного гена в группах с КГВ и без БСКГ имела тенденцию к статистической значимости (p=0,177). При объединении генотипов с 4G-аллелью в одну группу различия становились более выраженными. Частота носительства дикого генотипа 5G5G ниже в группе больных ХГС с наличием криоглобулинемического васкулита по сравнению с группой больных без КГ (10,81% против 25,20%, p=0,063).
Пример 3. Полиморфизм гена ITGB3 1565 Т/С
Частоты встречаемости аллелей и генотипов гена ITGB3 1565 Т/С в группах с БСКГ и без КГ, КГВ представлены в таблице 3 и на фиг. 3.
Нами выявлена тенденция к статистической значимости при анализе распределения частот генотипов гена ITGB3 1565 Т/С в группах КГВ и без КГ (p=0,137). При объединении генотипов с мажорной аллелью T в одну группу различия стали более выраженными. Так мутантный генотип СС чаще выявлялся в группе с КГВ, чем в группе без КГ (8,11% против 1,63%, р=0,047, ОШ=5,338, 95%ДИ 0,845-31,725, фиг. 3). Встречаемость генотипов ТТ и СТ, а также аллелей Т и С гена ITGB3 1565 Т/С не различалась между группами. Объединенный генотип ТТ+ТС являлся протективным и чаще встречался в группе без КГ, чем с КГВ (98,37% против 91,89%, p=0,047, ОШ=0,187, 95%ДИ 0,030-1,183).
При сравнении встречаемости аллелей и генотипов гена ITGB3 1565 Т/С в группах с КГВ и БСКГ статистически значимых различий не выявлено, однако наблюдалась тенденция к более частому выявлению мутантного генотипа СС в группе с КГВ по сравнению с группой БСКГ (8,11% против 0,00%, p=0,066).
Пример 4. Анализ частоты встречаемости комбинации аллелей и прогнозирование возможности агрессивного течения заболевания
Для оценки прогностического значения сочетания генотипов генов ITGB3 1565 Т/С и PAI-I -675 5G/4G в развитии КГВ был введен специальный суммарный балл в зависимости от наличия мутантных аллелей исследуемых генов (Табл. 4).
В группе с КГВ по сравнению с группой без КГ чаще выявлялись пациенты с высоким суммарным баллом, учитывающим сочетанное влияние полиморфизма генов ITGB3 1565 Т/С и PAI-I -675 5G/4G (p=0,047, табл. 5). При сравнении групп КГВ и БСКГ отмечалась тенденция к более частому выявлению высокого суммарного балла у пациентов с КГВ (p=0,092, табл. 5). Отличий в распределении пациентов в группах с БСКГ и без КГ по суммарному баллу не выявлено (p=0,895).
В дальнейшем нами проводились однофакторный и многофакторный анализ методом логистической регрессии с включением следующих переменных - возраст и пол пациента, длительность заболевания и суммарный балл, учитывающий полиморфизм генов ITGB3 1565 Т/С и PAI-I -675 5G/4G (табл. 5).
При однофакторном анализе при сравнении групп с КГВ и без КГ наиболее значимыми для развития васкулита были возраст, женский пол, длительность заболевания (табл. 6), а влияние суммарного балла носило пограничный характер. При многофакторном анализе независимыми факторами развития КГВ оказались суммарный балл (ОШ 1,62, 95% ДИ 1,01-2,61) и длительность заболевания (ОШ 1,05, 95% ДИ 1,00-1,09), на фоне которых влияние пола и возраста больного нивелировалось (табл. 6).
Прогноз вероятности КГВ (p) у пациентов ХГС, исходя из данной модели, можно рассчитать по формуле 1:
где е - основание натуральных логарифмов (Число Эйлера) 2,71828…; z - уравнение регрессии. В нашей модели с учетом коэффициентов из многофакторного анализа (Фиг. 4)
где пол может принимать значения 0 (мужской) или 1 (женский), суммарный балл (S) - от 0 до 4, возраст и длительность заболевания выражены в годах. Статистическая значимость полученной модели p=0,00001.
При сравнении групп больных с КГВ и БСКГ при многофакторном анализе показано, что независимым предиктором развития КГВ является суммарный балл (ОШ 2,04, 95% ДИ 1,02-4,09), на фоне которого влияние других клинических показателей не существенно (табл. 7).
Предлагаемая модель, основанная на анализе комбинации полиморфизмов генов цитокинов, позволяет выделить среди больных ХГС группу высокого риска развития криоглобулинемического васкулита и с большей уверенностью рекомендовать этим больным интенсивную противовирусную терапию.
Пример 5
Пациент А., 30 лет, поступил с диагнозом: Хронический гепатит C (3 генотип). Из анамнеза известно, что вероятным моментом инфицирования является переливание крови в 16 лет по поводу кровопотери во время ДТП, т.е. длительность инфицирования на момент осмотра равна 14 годам. Проведен анализ ДНК на определение полиморфизма генов ITGB3 1565 Т/С и PAI-I -675 5G/4G, были получены следующие данные ITGB3 1565 СС и РАI-I -675 5G4G, т.е. суммарный балл равен 3.
Риск развития криоглобулинемического васкулита был рассчитан по формулам 1 и 2 следующим образом: z=-5,16+0,99*1+0,33*30+0,05*14+0,48*3=7,87. Далее при подстановке z в формулу 1 получаем вероятность развития криоглобулинемического васкулита у данного пациента, равную 99,97%
Полученные данные свидетельствуют о высоком риске и пациенту назначена интенсивная противовирусная терапия.
Пример 6
Пациент В., 18 лет, поступил с диагнозом: Хронический гепатит C (1 генотип). Из анамнеза известно, что вероятным моментом инфицирования является злоупотребление внутривенными наркотиками 2 года назад. Проведен анализ ДНК на определение полиморфизма генов ITGB3 1565 Т/С и PAI-I -675 5G/4G, были получены следующие данные ITGB3 1565 ТТ и PAI-I -675 5G5G, т.е. суммарный балл равен 0.
Риск развития криоглобулинемического васкулита был рассчитан по формулам 1 и 2 следующим образом: z=-5,16+0,99*0+0,33*18+0,05*2+0,48*0=0,88. Далее при подстановке z в формулу 1 получаем вероятность развития криоглобулинемического васкулита у данного пациента, равную 70,7%.
Полученные данные свидетельствуют о низком риске развития криоглобулинемического васкулита.