Роль звездчатых клеток поджелудочной железы в регенерации органа на фоне медь-дефицитной диеты у крыс

Оригинальные исследования

41

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Роль ЗВЕЗДЧАТЫХ КЛЕТОК ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В РЕГЕНЕРАЦИИ ОРГАНА НА ФОНЕ МЕДЬ-ДЕФИЦИТНОЙ ДИЕТЫ

у крыс

А.Р. Абдулхакова 1, А.Р. Галявиева 1, С.Р. Абдулхаков 12, А.А. Трондин 1, Г.О. Певнев 2,

М.А. Титова 2, А.А. Гумерова 2, А.П. Киясов 2

1 Казанский государственный медицинский университет, Казань, Россия

2 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия

The role of pancreatic stellate cells in pancreas regeneration in copper-deficient diet model in rats

A.R. Abdulkhakova 1, A.R. Galyavieva 1, S.R. Abdulkhakov12, AA. Trondin 1, G.O. Pevnev 2,

MA. Titova 2, A.A. Gumerova 2, A.P. Kiassov 2

1 Kazan State Medical University, Kazan, Russia

2 Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia

В ряде исследований была продемонстрирована возможность трансдифференцировки клеток поджелудочной железы в гепатоцитоподобные клетки в модели «истощения-пресыщения медью» у крыс. Предполагается, что звездчатые клетки поджелудочной железы могут быть ее региональными стволовыми клетками, а также способны при определенных условиях образовывать гепатоциты и холангиоциты. Целью исследования стало изучение роли звездчатых клеток поджелудочной железы в её регенерации в данной модели.

Эксперименты проведены на 24 белых лабораторных крысах-самцах линии Вистар весом 80—100 г. Животные получали медь-дефицитную диету с добавлением триэти-лентетрамина тетрагидрохлорида в течение 8 нед., затем были переведены на сбалансированный корм для грызунов в течение 8 нед.

Животные выведены из эксперимента на сроках 4, 6, 8 нед. кормления и 4, 6, 8 нед. отмены медь-дефицитной диеты. Гистологические срезы поджелудочной железы окрашивали иммуногистохимическим методом с использованием антител против маркера звездчатых клеток поджелудочной железы — десмина.

Нарушение структуры ацинарной ткани наблюдали, начиная со срока 4 недели кормления медь-дефицитной диетой. Частичное восстановление ацинусов происходило на сроках 6 и 8 нед. после перехода на сбалансированное питание. На всех сроках эксперимента наблюдали увеличение количества десмин-позитивных звездчатых клеток. На фоне частичного восстановления ацинарной ткани десмин-пози-тивные клетки располагались преимущественно в участках вновь образующейся ткани поджелудочной железы.

Ключевые слова: поджелудочная железа, звёздчатые клетки поджелудочной железы, регенерация, медь-дефицитная диета, десмин.

Одним из актуальных направлений развития клеточной терапии является изучение возможности получения из различных клеточных источников дифференцированных клеток печени, в частности, гепатоцитов. В процессе эмбриогенеза печень и поджелудочная железа развиваются из одного зародышевого листка (энтодермы), поэтому не исключается возможность наличия в этих органах региональных стволовых клеток с универсальными свойствами, из которой могут развиваться клетки как поджелудочной железы, так и печени. Для изучения возможности образования гепатоци-тов в поджелудочной железе используются раз-

е-mail: sayarabdul@yandex.ru

The possibility of pancreatic cells transdifferentiation to hepatocyte-like cells in rat copper depletion-repletion model has been shown in a number of articles. The aim of our research was to study the role of pancreatic stellate cells in pancreas regeneration in the above mentioned model.

24 male Wistar rats were fed a copper-deficient diet, containing triethylenetetramine tetrahydrochloride, for a period of 8 weeks, then animals were returned to the normal rat chow for up to a period of 8 weeks. Animals were killed at the end of 4, 6, 8 weeks of copper-deficient diet and 4, 6, 8 weeks after they were returned to normal diet. Paraffin-embedded sections of pancreas were stained immunohistochemically with antibodies to desmin, the pancreatic stellate cells marker.

The acinar tissue structure destruction was observed starting from the period of 4 weeks of copper-deficient diet. Partial acinar restoration was observed 6 and 8 weeks after rats were returned to the normal balanced rat chaw. An increase in the number of desmin-positive stellate cells both in pancreatic acinar tissue and in islets was observed at all periods of experiment. Along with the partial acinar tissue recovery desmin-positive cells were found mainly in areas of newly formed pancreatic tissue.

Key words: pancreas, pancreatic stellate cells,

regeneration, copper-deficient diet, desmin.

личные модели (воздействие стимулятором пролиферации пероксисом, гиперэкспрессия фактора роста кератиноцитов в островках поджелудочной железы, модель «истощения-пресыщения медью» и др.) [1, 2].

В исследованиях, проведенных M.S Rao и D.G. Scarpelli в конце 80-х годов прошлого века, была продемонстрирована возможность транс-дифференцировки клеток поджелудочной железы в гепатоцитоподобные клетки на фоне дистрофии органа на модели «истощения-пресыщения медью» у крыс [3—8]. Однако в этих работах не уделялось внимание тому, за счёт каких клеток происходит

Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014

42

Оригинальные исследования

восстановление ткани самой поджелудочной железы после отмены медь-дефицитного состояния.

Как известно, в состав поджелудочной железы входят клетки различных дифферонов. Наиболее изученными из них являются ацинарные гландуло-циты, секретирующие пищеварительные ферменты (амилазу, липазу, эластазу, др.); клетки островков Лангерганса, образующие эндокринную часть органа и продуцирующие гормоны, и дуктулярные клетки, формирующие систему выводных протоков. Наименее изученными являются звёздчатые клетки поджелудочной железы (ЗКПЖ). В здоровой поджелудочной железе ЗКПЖ расположены в непосредственной близости к базальной части ацинарных клеток. При окрашивании с антителами к десмину покоящиеся ЗКПЖ представляют собой клетки с центрально расположенным ядром и длинными цитоплазматическими отростками, располагающимися вдоль оснований соседних ацинарных клеток. В норме ЗКПЖ содержат в своей цитоплазме капли жира, богатые витамином А, и сохраняют неизменный фенотип, составляя около 4—7% всех клеток паренхимы поджелудочной железы [9, 10]. При повреждении поджелудочной железы резидентные ЗКПЖ способны изменять фенотип и дифференцироваться в миофибробластоподобные клетки, которые секретируют большое количество белков внеклеточного матрикса, формирующих соединительную ткань, продуцируют а-гладкомышечный актин, глиальный фибриллярный белок, коллагены I и II типа, десмин, виментин, протеогликаны, ги-алуроновую кислоту, металлопротеиназы (MMP-1, MMP-2) и их ингибиторы (TIMP-1, TIMP-2) [11]. Пролиферация активированных ЗКПЖ происходит по типу ауторегуляции под действием синтезируемых ими же цитокинов и факторов роста. В то же время было показано, что небольшое количество активированных ЗКПЖ может происходить из циркулирующих клеток костномозгового происхождения, которые заселяют поджелудочную железу при ее повреждении [12].

Нельзя исключить, что ЗКПЖ могут экспрессировать маркеры, специфичные для стволовых клеток, однако убедительных данных, показывающих возможность трансдифференцировки ЗКПЖ в другие типы клеток поджелудочной железы, пока нет. Вопрос о том, способствуют ли ЗКПЖ регенерации поджелудочной железы способом, аналогичным участию звездчатых клеток печени в ее регенерации, создавая необходимое микроокружение для развития эпителиальных клеток и дифференцируясь в эпителиальные клетки [13], требует дальнейшего анализа.

Учитывая все характеристики ЗКПЖ, о которых было сказано выше, не исключено, что они играют важную роль в восстановлении органа в различных экспериментальных моделях повреждения поджелудочной железы. Целью исследования было изучение роли ЗКПЖ в её регенерации в модели «истощения-пресыщения медью» у крыс.

Материал и методы

Эксперименты были проведены на 24 белых лабораторных крысах-самцах линии Вистар весом 80—100 г. Животные получали медь-дефицитную диету (MP Biomedicals, США) с добавлением медь-связывающего нетоксичного вещества — триэти-

лентетрамина тетрагидрохлорида (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Japan) в конечной концентрации 0,6% и имели свободный доступ к воде в течение 8 нед. [7]. Затем животные были переведены на сбалансированный корм для грызунов в течение 8 нед. Контрольные животные находились на сбалансированном рационе питания для грызунов в течение всего срока эксперимента и имели свободный доступ к воде.

Группы из 3 животных были выведены из эксперимента на сроках 4, 6, 8 нед. кормления и 4, 6, 8 нед. отмены медь-дефицитной диеты. Гистологические срезы поджелудочной железы окрашивали иммуногистохимически с использованием антител против маркера ЗКПЖ — десмина (Novocastra, 1:30) и системы визуализации Novolink (Novocastra, Великобритания).

Результаты и обсуждение

Через 4 нед. содержания на медь-дефицитной диете мы наблюдали признаки нарушения структуры ацинарного компонента железы, на 6 и 8 нед. кормления на фоне разрушения ацинусов сохранялись отдельные протоковые структуры и островки поджелудочной железы; аналогичная картина сохранялась через 4 нед. после возвращения на стандартный рацион питания. Частичное восстановление ацинусов наблюдали на сроках 6 и 8 нед. после перехода на сбалансированное питание.

В контрольной группе животных на всех исследуемых сроках выявляли единичные отростчатые десмин-позитивные клетки, локализованные преимущественно вокруг сосудов. Через 4 нед. медь-дефицитной диеты обнаружили увеличение числа десмин-позитивных отростчатых клеток как в паренхиме органа, так и в островках. Внутренним положительным контролем при окрашивании антителами к десмину было позитивное окрашивание гладкомышечных клеток кровеносных сосудов (рис. 1).

Через 6 нед. медь-дефицитной диеты на фоне прогрессирующего разрушения ацинарной части железы продолжалось увеличение количества десмин-позитивных отростчатых клеток преимущественно в периацинарном пространстве (рис. 2А).

Рис. 1. Поджелудочная железа крысы через 4 нед. нахождения на медь-дефицитной диете: десмин-позитивные отростчатые клетки в островках (А) и ацинусах (Б). Иммуногистохимическая реакция с антителами к десмину; продукт реакции коричневого цвета; докраска гематоксилином.

Ув. х200

Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014

Оригинальные исследования

43

На 8 нед. эксперимента в поджелудочной железе крыс наблюдали практически полное разрушение экзокринной части железы. На фоне относительно сохранных островков в незатронутых патологическим процессом ацинусах выявляли большое количество десмин-позитивных отростчатых клеток (рис. 2Б).

После отмены медь-дефицитной диеты наблюдали продолжающееся разрушение ацинусов, в островках поджелудочной железы обнаруживали десмин-позитивные отростчатые клетки, расположенные по периферии островка (рис. 3).

Через 6 нед. после возвращения на стандартный рацион питания в поджелудочной железе крыс вокруг сохранившихся островков обнаруживали участки вновь формирующихся ацинусов, еще не имеющих характерной структуры; десмин-позитивные отростчатые клетки располагались преимущественно в участках вновь образующейся ткани поджелудочной железы (рис. 4А).

Рис. 2. Поджелудочная железа крысы на фоне медь-дефицитной диеты:

А — 6 нед. нахождения на медь-дефицитной диете; Б — 8 нед. нахождения на медь-дефицитной диете. Иммуногистохимическая реакция с антителами к десмину; продукт реакции коричневого цвета; докраска гематоксилином.

Ув. А х200, Б х400

Рис. 3. Поджелудочная железа крысы через 4 нед. после отмены медь-дефицитной диеты: десмин-позитивные отростчатые клетки в участках вновь образующейся ткани вблизи островков. Иммуногистохимическая реакция с антителами к десмину; продукт реакции коричневого цвета; докраска гематоксилином.

Ув. А х200, Б х400

Рис. 4. Поджелудочная железа крысы после отмены медь-дефицитной диеты, десмин-позитивные отростчатые клетки в участках вновь образующейся ткани:

А — 6 нед. после отмены медь-дефицитной диеты; Б — 8 нед. после отмены медь-дефицитной диеты. Иммуногистохимическая реакция с антителами к десмину; продукт реакции коричневого цвета; докраска гематоксилином.

Ув. А х200, Б х400

На 8 нед. после отмены медь-дефицитной диеты наблюдали увеличение количества вновь образованных ацинарных клеток, которые все еще не имели типичной структуры ацинуса, а также большое количество десмин-позитивных отростчатых клеток в участках образующейся ткани (рис. 4Б).

Имеющиеся на сегодняшний день данные позволяют говорить о важной роли ЗКПЖ в процессах фиброгенеза и разрушения соединительной ткани [9, 10, 14—17]. На фоне повреждения поджелудочной железы под действием ряда факторов (окислительный стресс, цитокины, факторы роста, токсины, в частности, алкоголь и ацетальдегид) покоящиеся ЗКПЖ способны к изменению фенотипа в направлении миофибробла-стоподобных клеток, которые секретируют избыточное количество белков внеклеточного матрикса, способствуя, таким образом, усилению фиброгенеза. Так, например, активированные ЗКПЖ обнаруживаются уже на ранних этапах развития хронического алкогольного и аутоиммунного панкреатита [18—20].

ЗКПЖ приписывается участие и в развитии опухолевого процесса в поджелудочной железе. Считается, что микроокружение опухоли вносит существенный вклад в формирование злокачественного фенотипа образования. Так, в поджелудочной железе ЗКПЖ обнаружены среди клеток, формирующих микроокружение панкреатической протоковой аденокарциномы. Результаты проведенных экспериментальных исследований позволяют предположить, что ЗКПЖ могут стимулировать локальный рост опухоли и ее метастатическое распространение, а также способны повышать устойчивость к химио- и лучевой терапии [14, 17, 21—25].

Таким образом, ЗКПЖ рассматриваются в основном с позиции их участия в процессах фиброгенеза в поджелудочной железе, прогрессирования панкреатических опухолей и их метастазирования.

Вместе с тем, профиль генов, экспрессируемых ЗКПЖ и звездчатыми клетками печени, включая гены, ответственные за синтез компонентов

Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014

44

Оригинальные исследования

межклеточного матрикса, сократимость, метаболизм ретиноидов (несмотря на меньшее содержание ретиноидов в ЗКПЖ по сравнению со звездчатыми клетками печени) и ростовых факторов, практически идентичен [26]. Эти два типа клеток имеют больше сходств, нежели различий [27], что не только не исключает возможности их происхождения из одного клеточного источника, а, учитывая морфологическую и функциональную схожесть ЗКПЖ со звездчатыми клетками печени, позволяет предполагать, что ЗКПЖ принимают участие в регенерации поджелудочной железы аналогично звездчатым клеткам печени, участвующим в восстановлении печени после ее повреждения [12]. Нельзя исключить, что ЗКПЖ и сами могут быть источником отдельных клеточных линий поджелудочной железы и, возможно, печени. Так, E. Mato и соавт. (2009) показали наличие клеток с маркерами ЗКПЖ, способных к дифференцировке при культивировании в определенных условиях в инсулин-продуцирующие Р-кпетки [28]. В исследованиях C. Kordes с соавт. (2012) было показано, что культивированные ЗКПЖ могут быть источником развития гепатоци-

ЛИТЕРАТУРА:

1. Shen C.-N., Horb M.E., Slack J.M.W. et al. Transdifferentiation of pancreas to liver. Mech. Dev. 2003; 120: 107-16.

2. Абдулхакова А.Р., Абдулхаков С.Р., Титова М. А. и др. Может ли поджелудочная железа быть источником развития гепатоцитов? Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2012; 3: 21-4.

3. Scarpelli D.G., Rao M.S. Differentiation of regenerating pancreatic cells into hepatocyte-like cells. PNAS USA. 1981; 78: 2577-81.

4. Rao S., Dwivedi R.S., Yeldandi A.V. et al. Role of periductal and ductular epithelial cells of the adult rat pancreas in pancreatic hepatocyte lineage. Am. J. Pathol. 1989; 134(5): 1069-85.

5. Scarpelli D.G. Multipotent developmental capacity of cells in the adult animal. Lab. Invest. 1985; 52: 331-3.

6. Reddy J.K., Rao M.S., Yeldandi A.V. et al. Pancreatic hepatocytes. An in vivo model for cell lineage in pancreas of adult rat. Dig. Dis. Sci. 1991; 36: 502-6.

7. Rao M.S., Subbarao V., Reddy J.K. Induction of hepatocytes in the pancreas of copper-depleted rats following copper repletion. Cell Differ. 1986; 18: 109-17.

8. Rao M.S., Dwivedi R.S., Subbarao V. et al. Almost total conversion of pancreas to liver in the adult rat: a reliable model to study transdifferentiation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988; 156: 131-6.

9. Apte M.V., Haber P.S., Applegate T.L. et al. Periacinar stellate shaped cells in rat pancreas: identification, isolation, and culture. Gut. 1998; 43: 128-33.

10. Bachem M.G., Schneider E., Gross H. et al. Identification, culture, and characterization of pancreatic stellate cells in rats and humans. Gastroenterology 1998; 115: 421-32.

11. Ничитайло М.Е., Кравченко Д.А., Медвецкий Е.Б. и др. Ингибирование активированных панкреатических звёздчатых клеток [витаминами А и Е) для предупреждения фиброза поджелудочной железы в модели хронического алкогольного панкреатита. Морфолопя. 2012; VI (2): 34-42.

12. Erkan M., Adler G., Apte M.V. et al. StellaTUM: current consensus and discussion on pancreatic stellate cell research. Gut. 2012; 61(2): 172-8.

13. Roskams T. Relationships among stellate cell activation, progenitor cells, and hepatic regeneration. Clin Liver Dis. 2008; 12: 853-60.

14. Bachem M.G., Schunemann M., Ramadani M. et al. Pancreatic carcinoma cells induce fibrosis by stimulating proliferation and matrix synthesis of stellate cells. Gastroenterology 2005; 128: 907-21.

15. Kloppel G., Detlefsen S., Feyerabend B. Fibrosis of the pancreas: the initial tissue damage and the resulting pattern. Virchows Arch. 2004; 445: 1-8.

тов и (или) холангиоцитов при трансплантации крысам после частичной гепатэктомии на фоне введения 2-ацетаминофлуорена [29].

Таким образом, обнаруженная в эксперименте на модели «истощения-пресыщения медью» динамика увеличения количества десмин-позитивных ЗКПЖ, а также их характерная локализация преимущественно в участках вновь формирующихся ацинусов, по-видимому, является отражением участия этого типа клеток в процессах восстановления ткани поджелудочной железы в данной экспериментальной модели.

Благодарности

Работа выполнена в рамках государственной программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета среди ведущих мировых научно-образовательных центров и финансировалась субсидией, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности.

16. Phillips P.A., McCarroll J.A., Park S. et al. Rat pancreatic stellate cells secrete matrix metalloproteinases: implications for extracellular matrix turnover. Gut. 2003; 52: 275-82.

17. Vonlaufen A., Joshi S., Qu C. et al. Pancreatic stellate cells: partners in crime with pancreatic cancer cells. Cancer Res. 2008; 68: 2085-93.

18. Ammann R.W., Heitz P.U., Kloppel G. Course of alcoholic chronic pancreatitis: a prospective clinicomorphological long-term study. Gastroenterology 1996; 111: 224-31.

19. Detlefsen S., Sipos B., Feyerabend B. et al. Fibrogenesis in alcoholic chronic pancreatitis: the role of tissue necrosis, macrophages, myofibroblasts and cytokines. Mod. Pathol. 2006; 19: 1019-26.

20. Vonlaufen A., Phillips P.A., Xu Z. et al. Withdrawal of alcohol promotes regression while continued alcohol intake promotes persistence of LPS-induced pancreatic injury in alcohol-fed rats. Gut. 2011; 60: 238-46.

21. Hwang R.F., Moore T., Arumugam T. et al. Cancer associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Cancer Res. 2008; 68: 918-26.

22. Erkan M., Kleeff J., Gorbachevski A. et al. Periostin creates a tumor-supportive microenvironment in the pancreas by sustaining fibrogenic stellate cell activity. Gastroenterology 2007; 132: 1447-64.

23. Erkan M., Reiser-Erkan C., Michalski C.W. et al. Cancer stellate cell interactions perpetuate the hypoxia-fibrosis cycle in pancreatic ductal adenocarcinoma. Neoplasia 2009; 11: 497-508.

24. Masamune A., Kikuta K., Watanabe T. et al. Hypoxia stimulates pancreatic stellate cells to induce fibrosis and angiogenesis in pancreatic cancer. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2008; 295: G709-17.

25. Xu Z., Vonlaufen A., Phillips P.A. et al. Role of pancreatic stellate cells in pancreatic cancer metastasis. Am. J. Pathol. 2010; 177: 2585-96.

26. Buchholz M., Kestler H.A., Holzmann K. et al. Transcriptome analysis of human hepatic and pancreatic stellate cells: organ-specific variations of a common transcriptional phenotype. J. Mol. Med. 2005; 83: 795-805.

27. Erkan M., Weis N., Pan Z. et al. Organ-, inflammation and cancer specific transcriptional fingerprints of pancreatic and hepatic stellate cells. Mol. Cancer. 2010; 9: 88.

28. Mato E., Lucas M., Petriz J. et al. Identification of a pancreatic stellate cell population with properties of progenitor cells: new role for stellate cells in the pancreas. Biochem. J. 2009; 421: 181-91.

29. Kordes C., Sawitza I., Gotze S. et al. Stellate Cells from Rat

Pancreas Are Stem Cells and Can Contribute to Liver Regeneration. PLoS ONE 2012; 7: e51878. doi:10.1371/ journal. pone.

0051878.

Поступила: 12.07.2014

Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014