Сенсибилизирующие свойства антигенных препаратов из бруцелл в s- и L-формах

УДК 616.98:579.841.93

Л.М.Михайлов, Л.Е.Токарева, Н.Л.Баранникова, С.В.Балахонов

сенсибилизирующие свойства антигенных препаратов из бруцелл

в S- и l-формах

ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока»,

Иркутск, Российская Федерация

Известно, что бруцеллы в S-форме вызывают аллергическую перестройку макроорганизма, которая проявляется реакцией гиперчувствительности замедленного типа, эта способность у атипичных вариантов (L-формы) изучена недостаточно.

Показано, что корпускулярный антиген из вакцины B. abortus 19BA и термоэкстракт из B. abortus И-206 в S-форме при трехкратной иммунизации вызывают выраженную сенсибилизацию, а корпускулярный антиген и термоэкстракт, приготовленные из бруцелл в L-формах, и термоэкстракт из бруцелл в S-форме при однократном способе введения не оказывают такого действия на лейкоциты белых мышей.

Ключевые слова: бруцеллы, S- и L-форма, термоэкстракт, сенсибилизация лейкоцитов, коэффициент лейкоци-толиза.

L.M.Mikhailov, L.E.Tokareva, N.L.Barannikova, S.V.Balakhonov

Sensitizing Properties of Antigen Preparations Obtained from Brucella in S- and L-Forms

Irkutsk Research Anti-Plague Institute of Siberia and Far East, Irkutsk, Russian Federation

It is known that S-form Brucella causes allergic transformation in a macroorganism, which is manifested as delayed-type hypersensitivity reaction. This capacity in atypical variants (L-forms) is under-investigated. It is demonstrated that corpuscular antigen in B. abortus 19BA vaccine and thermoextract prepared from B. abortus I-206 in S-form when threefold administered cause marked sensibilization; while corpuscular antigen and thermoextract produced from Brucella in L-form, and thermoextract from Brucella in S-form in case of one time administration do not have such an effect on leucocytes of white mice.

Key words: Brucella, S- and L-forms, thermoextract, leukocyte sensibilization, leukocytolysis index.

Сущность аллергических процессов при бруцеллезе изучена недостаточно. Считается, что при бруцеллезе ведущее значение имеет аллергия замедленного типа [3]. Выраженность реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) необходимо учитывать при проведении специфической профилактики бруцеллеза и изучении иммуногенов различного типа, путей и дозы введения [2].

В настоящее время в литературе имеются немногочисленные данные о способности бруцелл в L-форме вызывать аллергизацию организма. Исследование персистенции бруцелл в L-форме и развитие реакции гзт на модели морских свинок в течение 15 месяцев наблюдения показало, что она не способствовала нарастанию реакции ГЗТ. При заражении морских свинок бруцеллами в L-форме, полученными in vitro и in vivo, в дозе 106 м.к. выявлены существенные различия в их вирулентности. Бруцеллы в L-форме, полученные in vivo, инфицировали 86 % животных с развитием в отдельных случаях генерализованной формы инфекции, а in vitro этот показатель снижался до 42 % с развитием только регионарной инфекции, при этом кожная проба Бюрне у животных во всех случаях была отрицательной. Эритроцитарный диагностикум, приготовленный на основе комплекса антигенов, выделенных из стабильных L-культур, использовали для исследования 2000 сывороток крови людей из

неблагополучных по бруцеллезу пунктов некоторых областей Казахстана. В 60 % случаев c использованием L-антигена получен отрицательный результат, сомнительные и положительные результаты составили по 20 %. Из положительно реагирующих сывороток 5 % выявлено с помощью РХ и РА, 15 -РПГА. При этом установлено, что проба Бюрне позволяет выявлять ГЗТ, обусловленную не только S-, но и L-вариантами бруцелл. Изучение влияния бруцелл в L-форме на аллергическую перестройку, учитывая, что они способны длительное время пер-систировать в организме человека [4] и животных [6], является актуальным.

Целью работы является определение сенсибилизирующих свойств корпускулярных и растворимых антигенных препаратов, приготовленных из бруцелл в S- и L-формах, на лейкоцитах белых мышей.

Материалы и методы

в работе использовали инактивированные корпускулярные антигены, полученные из вакцины Brucella abortus 19 BA и B. abortus И-206 в L-форме, водорастворимые препараты (термоэкстракты) из B. abortus И-206 в S- и L-формах. В качестве биологических моделей использовали 100 белых мышей массой 18-20 г, которых разделили на 8 опытных и 2 контрольные группы по 10 особей в каждой.

БИОТЕХНОЛОГИЯ, ИММУНОЛОГИЯ

Иммунизацию проводили по двум схемам: корпускулярные препараты в дозе 5-109 м.к. в 0,5 мл 0,9 % раствора натрия хлорида (1, 2, 3, 4 группы), термоэкстракты (ТЭ) - 0,1 мкг в 0,5 мл 0,9 % раствора натрия хлорида (5, 6, 7, 8 группы) вводили внутри-брюшинно однократно и трехкратно с интервалом в 7 сут между инъекциями. Контрольным животным вводили только 0,9 % раствор натрия хлорида по той же схеме (9, 10 группа). Животных гуманным способом выводили из эксперимента в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» 2003 г., Приложением к приказу МЗ СССР № 775 от 12.08.1977 г. Забор материала (селезенку) для получения лейкоцитов проводили через семь дней после последней иммунизации. Сенсибилизирующие свойства препаратов изучали в реакции лейкоцитолиза [5]. Коэффициент лейкоци-толиза (КЛ) вычисляли по формуле:

кл = ж-мо 100, мк

где КЛ - коэффициент лейкоцитолиза, МК - количество лимфоцитов в контрольной лунке, МО - количество лимфоцитов в опытной лунке. Полученные результаты оценивали: Кл до 15 - результат отрицательный или сомнительный, от 16 до 20 - слабоположительный, от 21 до 30 - положительный, КЛ > 30 -резкоположительный. ошибку репрезентативности при статистической обработке результатов определяли по И.П.Ашмарину и соавт. [1]:

т =

pq

где m - ошибка репрезентативности; р - соответствующая величина (в %); q - 100-p; n - численность выборки.

Результаты и обсуждение

Результаты, полученные в ходе эксперимента и вычисления КЛ, представлены на рисунке.

При однократном введении инактивированной корпускулярной вакцины B. abortus 19 BA первой группе экспериментальных животных среднее зна-

чение КЛ составило 48,0±15,8, реакция оценена как резкоположительная. Во второй группе при трехкратной иммунизации этим препаратом КЛ оставался положительным (28,1±14,2), однако отмечалось его снижение в 1,7 раза по сравнению с первой группой. Корпускулярный препарат из B. abortus И-206 в L-форме не вызывает сенсибилизации лимфоцитов белых мышей, которая выражается низкими показателями КЛ при однократном (3-я группа) - 10,9±9,9, при трехкратном введении антигена (4-я группа) -4,9±6,8, но несколько превышающими таковые у интактных (контрольных) животных - 3,3±5,6 (9-я группа) и 2,7±5,1 (10-я группа) соответственно и оцениваемыми как отрицательные.

при однократной или трехкратной иммунизации термоэкстрактом, приготовленным из B. abortus И-206 в S-форме, сенсибилизация лейкоцитов, выраженная определением КЛ, составила 13,3±10,7 (5-я группа), 28,6±14,3 (6-я группа) соответственно с оценкой результата как отрицательный и положительный. При иммунизации ТЭ из бруцелл этого же штамма в L-форме КЛ определялся 6,7±7,9 (7-я группа) - 14,5±11,1 (8-я группа) и оценивался как отрицательный или сомнительный.

из полученных результатов следует, что инак-тивированный корпускулярный антиген, приготовленный из вакцины B. abortus 19BA (1, 2 группы), и ТЭ бруцелл в S-форме (6 группа) вызывают выраженную сенсибилизацию лейкоцитов селезенки белых мышей, о чем свидетельствует уровень КЛ, оцениваемый как положительный и резко положительный. Однократное применение ТЭ (5-я группа) приводит к слабой сенсибилизации и сомнительному результату КЛ. Корпускулярный антиген и ТЭ из бруцелл в L-форме при обеих схемах иммунизации (однократная или трехкратная) в целом не вызывает существенной аллергической перестройки у белых мышей (3, 4, 7, 8 группы), о чем свидетельствует низкий уровень КЛ в пределах 6,7±7,9 - 14,5±11,1, что оценивается как отрицательный или сомнительный результат.

Таким образом, корпускулярный антиген и термоэкстракт, приготовленные из бруцелл в L-форме,

Коэффициент лейкоцитолиза при иммунизации антигенными препаратами, приготовленными из бруцелл в S- и L-формах:

1-я группа - однократная иммунизация корпускулярным антигеном B. abortus 19 BA; 2-я группа -трехкратная иммунизация корпускулярным антигеном B. abortus 19 BA; 3-я группа - однократная иммунизация корпускулярным антигеном B. abortus И-206 в L-форме; 4-я группа - трехкратная иммунизация корпускулярным антигеном B. abortus И-206 в L-форме; 5-я группа - однократная иммунизация ТЭ из B. abortus И-206 в S-форме; 6-я группа - трехкратная иммунизация ТЭ из B. abortus И-206 в S-форме; 7-я группа -однократная иммунизация ТЭ из B. abortus И-206 в L-форме; 8-я группа - трехкратная иммунизация ТЭ из B. abortus И-206 в L-форме; 9-я группа - однократное введение физиологического раствора

термоэкстракт из бруцелл в S-форме при однократном введении не оказывают сенсибилизирующего действия на лейкоциты селезенки белых мышей, что свидетельствует о перспективности дальнейшего изучения их влияния на организм экспериментальных животных с целью подбора антигенов, обладающих слабым аллергизующим действием.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз; 1962. 180 с.

2. Бронников В.С. Сенсибилизирующая активность проти-вобруцеллезных химических вакцин. В кн.: Актуальные проблемы бруцеллеза и туберкулеза животных.

3. Вершилова П.А. Бруцеллез. М.: Медицина; 1972. 439 с.

4. Михайлов Л.М., Калиновский А.И., Балахонов С.В., Шестопалов М.Ю., Андреевская Н.М., Михайлова В.А., Борисов В.А., Ходус Ф.И., Гордиенко Л.Н., Ощепков В.Г. Персистенция L-форм бруцелл у человека с хронической формой бруцеллеза. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2009; 5:114-5.

5. Таран И.Ф., Цыбин Б.П., Крылова А.А., Аболина Т.А. Изучение L-форм бруцелл, их реверГантов и исходных культур. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1981; 6:39-43.

6. Триленко П.А. Бруцеллез сельскохозяйственных животных. Л.: Колос; 1976. 279 с.

References

1. Ashmarin I.P., Vorobiev A.A. [Statistical Methods in Microbiological Investigations]. L.: Medgis; 1962. 180 p.

2. Bronnikov V. S. [Sensibilizing activity of anti-Brucella chemical vaccines]. In: [Actual problems of animal brucellosis and tuberculosis]. Omsk; 2000. P. 164-7.

3. Vershilova P.A. [Brucellosis]. M.: Medicine; 1972. 439 p.

4. Mikhailov L.M., Kalinovsky A.I., Balakhonov S.V. Shestopalov M.Yu., Andreevskaya N.M., Mikhailova V.A., Borisov V.A., Khodus F.I., Gordienko L.N., Oshchepkov V.G. [Persistence of Brucella L-forms in a person with the chronic brucellosis]. Zh. Mikrobiol., Epidemiol. Immunobiol. 2009; 5:114-5.

5. Taran I.F., Tsybin B.P., Krylova A.A., Abolina T.A. [Studying of a role of Brucella L-forms, its revertants and stock cultures]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 1981; 6:39-43.

6. Trilenko P.A. [Brucellosis in agricultural animals]. L.: Kolos; 1976.

279 p.

Authors:

Mikhailov L.M., Tokareva L.E., Barannikova N.L., Balakhonov S.V. Irkutsk Research Anti-Plague Institute of Siberia and Far East. 78, Trilissera St., Irkutsk, 664047, Russian Federation. E-mail: adm@chumin.irkutsk.ru

об авторах:

Михайлов Л.М., Токарева Л.Е., Баранникова Н.Л., Балахонов С.В. Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока. Российская Федерация, 664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78. E-mail: adm@chumin.irkutsk.ru

Поступила 22.05.14.