КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ Actinidia, И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
COMPOSITION CONTAINING Actinidia AND METHODS OF THEIR APPLICATION

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к Actinidia, в частности к видам морозостойкого растения киви, к его различным фракциям и препаратам, а также содержащим их композициям, обладающим способностью предотвращать и/или лечить различные заболевания, при которых эффективна регуляция иммунного ответа, включая аллергические и неаллергические воспалительные заболевания, вирусную инфекцию и рак. Описаны также способы, относящиеся к получению и применению этих композиций.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Заболевания, включающие воспаление, характеризуются притоком определенных типов клеток и медиаторов, присутствие которых может привести к повреждению ткани и иногда к смерти. Заболевания, включающие воспаление, особенно опасны, если они поражают определенные органы и системы, такие как дыхательная система, что может приводить к обструкции дыхания, гипоксемии, гиперкапнии и повреждению легочной ткани. При других заболеваниях или патологических состояниях развитие определенных типов воспаления может являться важным компонентом регуляции болезни, такой как вирусная инфекция, хотя повреждение тканей в области инфицирования все же является фактором риска.
Аллергические заболевания частично опосредованы иммуноглобулином E (IgE), тогда как показано, что клетки T-хелперы 2-го типа (Th2), тучные клетки и эозинофилы также играют важную роль в процессе болезни (Maggi E., Immunotechnology, 3:233-244, 1998; Pawankar R., Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol., 1:3-6, 2001; Vercelli D., Clin. Allergy Immunol., 16:179-196, 2002). Циркулирующий IgE связывается с двумя изоформами IgE-рецепторов: высокоаффинными IgE-рецепторами (FcεRI), представленные на поверхности тучных клеток и базофилах, и низкоаффинными IgE-рецепторами (FcεRII или CD23), представленными на поверхности лимфоцитов, эозинофилов, тромбоцитов и макрофагов. Полагают, что важным фактором, регулирующим патогенез аллергических нарушений, являются перекрестные связи IgE-рецепторов тучных клеток, после обнаружения аллергена и последующей дегрануляции тучных клеток. Молекулы, выделенные тучными клетками, включают в себя гистамин, гепарин, протеазы и свободные радикалы, которые опосредуют различные биологические эффекты, включая расширение сосудов, интестинальное и/или бронхиальное сокращение гладких мышц, слизистую секрецию и местный протеолиз. После начальной немедленной реакции из тучных клеток, 6-24 часами позднее наблюдается приток эозинофилов, базофилов и лимфоцитов. Этот ответ поздней фазы может приводить к хроническому воспалению в тканях, которые постоянно подвергаются действию антигенов.
Дегрануляция IgE-зависимых тучных клеток и накопление эозинофилов в участках воспаления рассматривается как результат декомпенсации гиперактивации Th2-клеток и, следовательно, Th2-опосредованной гиперпродукции IgE (Abbas et al., 1991, Nature 383:787-93; Vercelli, 2001, Curr Opin Allergy Clin Immunol 2001, 1:61-5). Известно, что характерные цитокины Th2-клеток, такие как IL-4, IL-5, IL-10 и IL-13, играют важную роль в этих реакциях. Кроме того, сообщалось, что Th1-опосредованные цитокины, такие как IFN-γ и IL-12, осуществляют отрицательную регуляцию Th2-путей. Например, IFN-γ вызывает переключение на IgG2a-изотип в B-клетках, тогда как IL-12 в определенных условиях преобразует уже установленный Th2-ответ на доминирование Th1-ответа (Umetsu and DeKruyff, 1997, J Allergy Clin Immunol 100:1-6; Coffman and Carty, 1986, J Immunol 136:949-54; Gavett et al., 1995, J Exp Med 182:1527-36). Различные клеточные факторы транскрипции, такие как GATA3 и T-bet, контролируют дифференцировку Th1- и Th2-клеток и производство цитокинов в этих клетках (Lee et al., 2000, J Exp Med 192:105-15; Ting et al., 1996, Nature 384:474-8; Lighvani et al., 2001, Proc Natl Acad Sci USA 98:15137-42; Szabo et al., 2000, Cell 100:655-69).
Аллергические заболевания, такие как анафилаксия, аллергический ринит, астма, атопический дерматит, пищевая аллергия и крапивница, поражают до 20% населения во многих странах, и частота этих заболеваний увеличивается (Wuthrich B., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 90:3-10, 1989).
Например, астма представляет собой характерную болезнь легкого, которая поражает миллионы людей во всем мире. Астма обычно характеризуется периодическим недостатом потока воздуха и/или гиперчувствительностью к различным стимулам, которые приводят к избыточному сужению дыхательных путей. Другие характеристики могут включать в себя воспаление дыхательных путей, эозинофилию и фиброз дыхательных путей. Полагают, что повышенная восприимчивость дыхательных путей является результатом совокупности воспалительного каскада, вовлекающего некоторые типы клеток, включая T-лимфоциты и эозинофилы. При аллергической астме Th2-цитокины преобладают над Th1-цитокинами.
Атопический дерматит (AD) представляет собой хроническое и рецидивирующее воспалительное кожное заболевание, характеризующееся зудящими и экзематозными повреждениями кожи, вместе с повышением уровня IgE. Распространенность AD, по-видимому, увеличивается во всем мире у младенцев и детей. Повреждения кожи у пациентов с AD характеризуются инфильтрацией воспалительными клетками, включая T-лимфоциты, моноциты/макрофаги, эозинофилы и тучные клетки. Эти клетки участвуют в патогенезе и развитии AD посредством выделения различных цитокинов и хемокинов, таких как IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, эотаксин и TARC. Среди многих типов клеток Th2-клетки, вырабатывающие IL-4, IL-5, IL-10 и IL-13, играют критическую роль в начальной фазе прогрессии болезни (Leung, 1997, Clin Exp Immunol 107 (suppl. l):25-30). IL-4 и IL-13 действуют в качестве основного изотипа индукторов, переключающих на IgE, и IL-5 вызывает активацию эозинофилов, которые секретируют различные хемокины, такие как эотаксин. IL-10, вырабатываемый моноцитами/макрофагами, а также Th2-клетками, увеличивает выработку TARC, который является Th2-специфическим хемокином, и, как известно, гиперэкспрессирован в AD-повреждениях. Хотя цитокины Th1-типа, такие как IFN-γ, также обнаружены в AD-повреждениях кожи во время поздней фазы заболевания, полагают, что развитие AD вызывается главным образом гиперпродукцией Th2-опосредованных цитокинов/хемокинов и IgE, а также и дефектной продукцией IFN-γ и IL-12 (Jonathan et al, 1999, J Clin Invest 103:1103-11; Christian et al., 1999, J Clin Invest 104:1097-105; Tomomi et al., 2001, J Allergy Clin Immunol 107:353-8; Weilie et al., 2002, J Clin Invest 109:621-8). Однако точный механизм, обусловленный гиперпродукцией IgE и дисбалансом Th1/Th2-ответов, пока еще не выяснен.
Так как большая часть доказательств свидетельствует о том, что Th1- и Th2-типы реакций взаимно регулируются in vivo, то предполагают, что изменение Th1/Th2 представляет собой разумную стратегию для развития лечения аллергических заболеваний (Kato et al., 1999, J Immunol 162:7470-9). Например, рекомбинантные цитокины, такие как IL-12 и IFN-γ, или антагонисты цитокинового рецептора к IL-4 и IL-5 были исследованы на предмет их способности контролировать баланс между Th1- и Th2-ответами (Hofstra et al., 1998, J Immunol 161:5054-60; Tomkinson et al., 2001, J Immunol 166:5792-800). Однако непосредственное применение этих агентов часто вызывает нежелательные побочные эффекты.
Лейкотриены также связаны с различными заболеваниями, связанными с воспалением, в частности, с аллергическим воспалением. Лейкотриены образуются из арахидоновой кислоты, предшественника простагландинов. Существует два семейства лейкотриенов. Первая группа действуют главным образом при состояниях, при которых воспаление зависит от нейтрофилов, таких как муковисцидоз, воспалительные заболевания кишечника и псориаз. Вторая группа (цистеинил-лейкотриены) затрагивает главным образом эозинофил- и тучная клетка-вызванный бронхоспазм при астме. Они связываются с высокоселективными рецепторами на бронхиальных гладких мышцах и других тканях дыхательных путей (O'Byrne et al., Annals of Internal Medicine 1997; 127:472-80). Также известно, что лейкотриены важны в патофизиологии аллергических ринитов, хронических крапивниц и атопических дерматитов или экзем. Антагонисты лейкотриенов, включая как ингибиторы лейкотриенового синтеза, так и антагонисты цистеинил-лейкотриенового рецептора, полезны для специфического подавления продукции или эффектов этих воспалительных медиаторов.
Предположение, что, уменьшая уровни сывороточного IgE, может улучшить аллергические симптомы, было продемонстрировано путем клинических исследований с использованием химерного анти-IgE-антитела (CGP-51901) и рекомбинантного гуманизированного моноклонального антитела (rhuMAB-E25) (Fahy et al., Am. J. Respir. Crit. Care. Med., 155:1828-1834, 1997). Аналоги диацилбензимидазола и бактериальные полисахариды, которые подавляют синтез и секрецию IgE, были описаны в патенте США №6369091 и публикации патента США №20020041885, соответственно.
В корейской патентной заявке №92-11752 показан противовоспалительный, противоаллергический и противоревматический лекарственный препарат, содержащий бифлавоноид, такой как 4'-O-метилохнафлавон, выделенный из Lonicera japonica, который проявляет эффективность при лечении различных симптомов, обусловленных аллергией или воспалением. В корейской патентной заявке №100744 показан противовоспалительный, противоаллергический и антиревматический лекарственный препарат, включающий в себя несколько соединений бифлавоноида, выделенных из листьев Ginko biloba. Сообщалось, что несколько азиатских медицинских рецептов, содержащих Siegesbeckia glabrescens, имеют IgE-уменьшенную активность (Kim et al., Phytother. Res., 15:572-576, 2001). Кроме того, было обнаружено, что многие лекарственные растения являются богатыми источниками ингибиторов, высвобождающих гистамин или противовоспалительные соединения.
Другие привычные для лечения аллергических заболеваний лекарственные препараты включают в себя антигистамины, стероидные или нестероидные противовоспалительные лекарственные препараты и лейкотриеновые антагонисты. Эти агенты, однако, обладают серьезным скрытым побочным действием, включая, но ими не ограничиваясь, повышение восприимчивости к инфекции, печеночную токсичность, вызванное лекарством легочное заболевание и подавление деятельности костного мозга. Таким образом, такие лекарственные препараты ограничены в их клиническом применении лечением воспаления, в частности, аллергического воспаления. Использование противовоспалительных и симптоматических ослабляющих агентов представляет собой серьезную проблему, так как их побочное действие или их недостаточное воздействие вызывают воспалительный ответ. Существует настоятельная потребность в менее опасных и более эффективных агентах для лечения воспаления. Таким образом, есть необходимость в новых продуктах с более низкими побочными эффектами, меньшей токсичностью и большей специфичностью в отношении первопричины воспаления.
В заключение, выявление иммунного ответа, который способствует активации T-клеток Th1-типа, продукция IgG2a и продукция связанных с Th1-типом цитокинов (например, IFN-γ, IL-6, IL-12, IL-1), противоречит иммунному ответу, связанному с аллергическим воспалением, рассмотренным выше. Этот тип иммунного ответа может обладать сильными, системными, противоопухолевыми и противовирусными свойствами. В данной области существует давняя необходимость в продуктах с такими свойствами.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу регуляции иммунного ответа у млекопитающих. Способ включает в себя применение млекопитающими препарата морозостойкого растения киви в количестве, достаточном для регуляции иммунного ответа у млекопитающего, где препарат морозостойкого растения киви выбран из свежего плода, толченого плода, вареного плода, приготовленного плода, выдавленного плода, загущенного плода, высушенного плода и концентрата сока морозостойкого растения киви. В этом варианте осуществления препарат морозостойкого растения киви не экстрагируют.
В одном аспекте вышеупомянутого варианта осуществления, препарат морозостойкого растения киви получают способом, который включает этап высушивания плода.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу регуляции иммунного ответа у млекопитающего, включая применение млекопитающим препарата морозостойкого растения киви в количестве, достаточном для регуляции иммунного ответа у млекопитающего, где препарат морозостойкого растения киви выбирают из группы, состоящей из экстракта или концентрата листьев и экстракта или концентрата коры.
Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу регуляции иммунного ответа у млекопитающего. Способ включает в себя применение млекопитающим в количестве, достаточном для регуляции иммунного ответа у млекопитающего, (a) препарат морозостойкого растения киви; и (b) компонент, выбранный из пробиотиков; клеточных стенок и фрагментов бактерий; сывороточного белка; аланина; жирных кислот; сложных эфиров жирных кислот; моноглицеридов; диглицеридов; триглицеридов; инозита; куркумы; куркумина; метилсульфонилметана (MSM); женьшеня; имбиря; и проантоцианидина.
В вышеупомянутом варианте осуществления препарат морозостойкого растения киви может включать в себя, но ими не ограничиваться, экстракт или концентрат плода, экстракт или концентрат листьев, экстракт или концентрат стебля, экстракт или концентрат коры, экстракт или концентрат корня, свежий плод, толченый плод, вареный плод, приготовленный плод, выдавленный плод, загущенный плод, высушенный плод, концентрат сока морозостойкого растения киви, препарат, полученный путем экстракции из плодовой воды, имеющей температуру от 0°C примерно до 80°C; препарат, полученный путем прямой экстракции водорастворимого концентрата морозостойкого растения киви с этилацетатом, препарат, полученный путем экстракции морозостойкого растения киви в дистиллированной воде, и препарат, полученный путем последующей экстракции морозостойкого растения киви в воде, хлороформе и этилацетате.
В одном аспекте вышеупомянутого варианта осуществления препарат морозостойкого растения киви получают способом, который включает в себя этап высушивания плода. В другом аспекте препарат морозостойкого растения киви получают путем экстракции плода в воде, имеющей температуру примерно от 0°C примерно до 25°C. В другом аспекте препарат морозостойкого растения киви получают путем экстракции плода в воде при комнатной температуре. В еще одном аспекте препарат морозостойкого растения киви получают путем прямой экстракции водорастворимого концентрата морозостойкого растения киви с этилацетатом.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу регуляции иммунного ответа у млекопитающего, включая применение млекопитающим в количестве, достаточном для регуляции иммунного ответа у млекопитающего, (a) препарат морозостойкого растения киви; и (b) компонент, выбранный из стероидов, антигистаминных средств, антител, антибиотиков, циклоспоринов, фунгицидов, регуляторов функции внешнего дыхания, анальгетиков, β-агонистов, модификаторов лейкотриенов, цитокинов или антагонистов рецепторов цитокинов, ингибиторов фосфодиэстеразы, натрийхромогликата, недокримила, кофеина, теофиллин, карбобензокси-бета-аланилтаурина и ингибиторов функции T-клеток.
В вышеупомянутом варианте осуществления препарат морозостойкого растения киви может включать в себя, но ими не ограничиваться, экстракт или концентрат плода, экстракт или концентрат листьев, экстракт или концентрат стебля, экстракт или концентрат коры, экстракт или концентрат корня, свежий плод, толченый плод, вареный плод, приготовленный плод, выдавленный плод, загущенный плод, высушенный плод, концентрат сока морозостойкого растения киви, препарат, полученный путем экстракции воды плода (соковой воды), имеющей температуру от 0°C примерно до 80°C; препарат, полученный путем прямой экстракции водорастворимого концентрата морозостойкого растения киви с этилацетатом, препарат, полученный путем экстракции морозостойкого растения киви в дистиллированной воде, и препарат, полученный путем последующей экстракции морозостойкого растения киви в воде, хлороформе и этилацетате.
В одном аспекте вышеупомянутого варианта осуществления препарат морозостойкого растения киви получают способом, который включает в себя этап высушивания плода. В другом аспекте препарат морозостойкого растения киви получают путем экстракции плода в воде, имеющей температуру примерно от 0°C примерно до 25°C. В другом аспекте препарат морозостойкого растения киви получают путем экстракции плода в воде комнатной температуры. В еще одном аспекте препарат морозостойкого растения киви получают путем прямой экстракции водорастворимого концентрата морозостойкого растения киви с этилацетатом.
В любом из вышеописанных вариантов осуществления препарат растения киви можно обеспечить в количестве, достаточном для регуляции иммунного Th2- и Th1-ответа у млекопитающего. В одном аспекте препарат растения киви обеспечивают в количестве, достаточном для регуляции количества изотипа производимых у млекопитающего антител, выбранных из группы, состоящей из IgE, IgG2a и IgG1. В другом аспекте препарат растения киви обеспечивают в количестве, достаточном для уменьшения выработки и/или уровней по меньшей мере одного Th2-цитокина у млекопитающего или уменьшение уровня по меньшей мере одного Th1-цитокина у млекопитающего. В еще одном аспекте препарат растения киви обеспечивают в количестве, достаточном для уменьшения уровня или выработки по меньшей мере одного лейкотриена у млекопитающего. В другом аспекте препарат растения киви обеспечивают в количестве, достаточном для уменьшения уровня экспрессии транскрипционного фактора, выбранного из группы, состоящей из GATA-3, T-bet и NFATc2, у млекопитающего. В другом аспекте млекопитающее имеет патологическое состояние или подвергается риску его развития, при котором ожидается активация Th1-ответа и/или подавление Th2-ответа. Например, млекопитающее имеет или подвергается риску развития аллергического заболевания или неаллергического воспалительного заболевания. Такое аллергическое заболевание может представлять собой заболевание, которое регулируется лейкотриенами. Такие аллергические заболевания включают в себя, но ими не ограничиваются, астму и атопические дерматиты. В качестве другого примера, млекопитающее может иметь или подвергаться риску развития вирусной инфекции или рака.
В любом из вышеописанных вариантов осуществления морозостойкое растение киви может включать в себя, но ими не ограничиваться, Actinidia arguta, Actinidia kolomikta и Actinidia polygama, при этом растение Actinidia arguta ассоциировано с предпочтительным вариантом осуществления.
В любом из вышеописанных вариантов осуществления препарат морозостойкого растения киви может быть представлен в композиции в количестве примерно от 0,01% и примерно до 95% по весу, исходя из общего веса композиции.
В одном аспекте любого из вышеописанных вариантов осуществления этап применения включает в себя применение млекопитающим препарата морозостойкого растения киви с носителем, вспомогательным веществом или растворителем. В другом аспекте этап применения включает в себя применение млекопитающим препарата морозостойкого растения киви в виде таблетки, порошка, шипучей таблетки, шипучего порошка, капсул, раствора, суспензии, гранул или сиропа. В другом аспекте этап применения включает в себя применение препарата морозостойкого растения киви млекопитающим в виде здоровой пищи. Здоровая пища включает в себя, не ограничиваясь ими, тонкие булочные изделия, хлеб, рулеты, зерновой завтрак, плавленый сыр, непереработанный сыр, приправы, молочные продукты, пудинги, сладкое желе, газированный напиток, чаи, порошковые питьевые смеси, обработанные рыбопродукты, напитки на основе плодов, напитки на основе овощей, жевательную резинку, карамель, замороженные молочные продукты, продукты, приготовленные из мяса, ореховые пасты, пасту, обработанные птицепродукты, подливки и соусы, картофельные чипсы, овощные чипсы, хрустящий картофель, шоколад, печенье, конфеты, лакричные конфеты, мороженое, обезвоженные продукты, разрезанные пищевые продукты, обработанные продукты, специи, спиртные напитки, лапшу, ферментированные пищевые продукты, супы, суповые смеси, продукты на основе сои, пасты на основе растительного масла и напитки на основе овощей. В другом аспекте этап применения включает в себя применение млекопитающим косметической композиции, включающей препарат морозостойкого растения киви. Косметические композиции могут применяться в форме, включая, но ими не ограничиваясь, лосьона, крема, эссенции, тоника, эмульсии, маски, мыла, шампуня, моющего средства, очищающего средства, моющего раствора для тела, моющего раствора или в виде лечения. В одном аспекте этап применения включает в себя применение млекопитающим препарата морозостойкого растения киви в составе пищевой добавки.
В другом аспекте любого из вышеописанных вариантов осуществления, способ дополнительно включает в себя применение млекопитающим агента, выбранного из жирных кислот; поликетидов; органических кислот; малых органических соединений; ароматических аминокислот; фенилпропаноидов; терпеноидов; стероидов; алкалоидов; корринов; порфиринов; линейных пептидов; циклических пептидов; депсипептидов; производных аминокислот; нуклеозидов; нуклеотидов; углеводов; белков; клеток; фрагментов клеток; травяных препаратов; специй; минералов; стерилизаторов; приправ; витаминов; и электролитов.
В еще одном аспекте любого из вышеописанных вариантов осуществления, способ в дальнейшем включает в себя применение млекопитающим агента, выбранного из пробиотиков; бактериальной клеточной стенки и фрагментов; сывороточного белка; таурина; аланина; жирных кислот; сложных эфиров жирных кислот; моноглицеридов; диглицеридов; триглицеридов; инозитов; куркумов; куркуминов; розмарина; розмариновой кислоты; метилсульфонилметана (MSM); женьшеня; имбиря; проантоцианидинов; и β-каротина. Жирные кислоты включают в себя, не ограничиваясь ими, конъюгированную линоленовую кислоту, эйкозапентаеновую кислоту, докозагексаеновую кислоту, γ-линоленовую кислоту, α-линоленовую кислоту, дигомо-γ-линоленовую кислоту и стеаридоновую кислоту.
В другом аспекте любого из вышеописанных вариантов осуществления способ дополнительно включает в себя применение млекопитающим препаратов различных видов Actinidia. Различные виды Actinidia могут включать в себя, не ограничиваясь ими, A. chenensis, A. deliciosa, A. arguta, A. polygama и A. kolomikta.
Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к композиции для регуляции иммунного ответа у млекопитающего. Композиция включает в себя препарат морозостойкого растения киви и по меньшей мере одно дополнительное активное соединение для регуляции иммунного ответа у млекопитающего. В одном из аспектов дополнительное активное соединение служит для лечения или профилактики аллергического заболевания у млекопитающего. В одном из аспектов дополнительное активное соединение выбирают из стероидов, антигистаминных средств, антител, антибиотиков, циклоспоринов, фунгицидов, регуляторов функции внешнего дыхания, анальгетиков, β-агонистов, модификаторов лейкотриенов, антагонистов цитокинов или цитокиновых рецепторов, ингибиторов фосфодиэстеразы, натрийхромогликата, недокримила, кофеина, теофиллина, карбобензокси-бета-аланилтаурина и ингибиторов T-клеточной функции. В еще одном аспекте дополнительное активное соединение выбирают из группы, состоящей из пробиотиков; клеточных стенок и фрагментов бактерий; сывороточного белка; аланина; жирных кислот; сложных эфиров жирных кислот; моноглицеридов; диглицеридов; триглицеридов; инозита; куркума; куркумина; метилсульфонилметана (MSM); женьшеня; имбиря; и проантоцианидинов. Жирные кислоты включают в себя, не ограничиваясь ими, конъюгированную линоленовую кислоту, эйкозапентаеновую кислоту, докозагексаеновую кислоту, γ-линоленовую кислоту, α-линоленовую кислоту, дигомо-γ-линоленовую кислоту и стеаридоновую кислоту. Такая композиция может включать в себя, не ограничиваясь ими, лекарственный препарат, здоровую пищу, пищевую добавку или косметическое средство.
В вышеописанной композиции морозостойкое растение киви может включать в себя, не ограничиваясь ими, Actinidia arguta, Actinidia kolomikta и Actinidia polygama. В одном аспекте препарат морозостойкого растения киви представляет собой экстракт или концентрат, полученный из части морозостойкого растения киви, выбранного из плода, листьев, стебля, коры, корня и любого их сочетания. В другом аспекте морозостойкое растение киви выбирают из группы, состоящей из свежего плода, толченого плода, вареного плода, приготовленного плода, выдавленного плода и загущенного плода. В другом аспекте морозостойкое растение киви представляет собой высушенный плод. В еще одном аспекте препарат морозостойкого растения киви получают способом, который включает в себя этап высушивания плода. В другом аспекте препарат морозостойкого растения киви представляет собой концентрат сока морозостойкого растения киви. В другом аспекте препарат морозостойкого растения киви получают путем экстракции плода в воде комнатной температуры. В еще одном аспекте препарат морозостойкого растения киви получают путем прямой экстракции водорастворимого концентрата морозостойкого растения киви с этилацетатом. В другом аспекте экстракт получают путем экстракции морозостойкого растения киви в дистиллированной воде. В другом аспекте экстракт представляет собой этилацетатный экстракт морозостойкого растения киви.
Другой вариант осуществления изобретения относится к применению морозостойкого растения киви или его препарата и агента, выбранных из стероида, антигистамина, антитела, антибиотика, циклоспорина, фунгицида, регуляторов функции внешнего дыхания, анальгетика, β-агонистов, модификатора лейкотриенов, антагониста цитокинов, антогониста рецепторов цитокинов, ингибитора фосфодиэстеразы, натрийхромогликата, недокримила, кофеина, теофиллина, карбобензокси-бета-аланилтаурина и ингибитора функции T-клетки, в препарате композиции для лечения заболевания или патологического состояния, которое связано с нарушением регуляции иммунной функции.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению морозостойкого растения киви или его препарата и агента, выбранных из пробиотиков; клеточных стенок и фрагментов бактерий; сывороточного белка; аланина; жирных кислот; сложных эфиров жирных кислот; моноглицеридов; диглицеридов; триглицеридов; инозита; куркумы; куркумина; метилсульфонилметана (MSM); женьшеня; имбиря; и проантоцианидинов. Жирные кислоты включают в себя, не ограничиваясь ими, конъюгированную линоленовую кислоту, эйкозапентаеновую кислоту, докозагексаеновую кислоту, γ-линоленовую кислоту, α-линоленовую кислоту, дигомо-γ-линоленовую кислоту и стеаридоновую кислоту.
В одном из аспектов любого из описанных выше применений, композицию можно использовать для лечения заболевания или патологического состояния, которое связано с продукцией или активностью лейкотриенов. В другом аспекте любого из описанных применений, заболевание или патологическое состояние может включать в себя, не ограничиваясь ими, атопический дерматит, астму, пищевую аллергию, аллергические риниты и хроническую крапивницу. В другом аспекте любого из описанных применений, препарат морозостойкого растения киви может включать в себя, не ограничиваясь ими, экстракт или концентрат плода, экстракт или концентрат листьев, экстракт или концентрат стебля, экстракт или концентрат коры, экстракт или концентрат корня, свежий плод, толченый плод, вареный плод, приготовленный плод, выдавленный плод, загущенный плод, высушенный плод, концентрат сока морозостойкого растения киви, препарат, полученный путем экстракции плода в воде комнатной температуры; препарат, полученный путем прямой экстракции водорастворимого концентрата морозостойкого растения киви с этилацетатом, препарат, полученный путем экстракции морозостойкого растения киви в дистиллированной воде, и препарат, полученный путем последующей экстракции в воде, хлороформе и этилацетате.
Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу регуляции иммунного ответа у млекопитающего. Способ включает в себя применение обычного препарата растения киви у млекопитающего в количестве, достаточном для регуляция иммунного ответа у млекопитающего, где обычный препарат растения киви выбирают из экстракта или концентрата плода, экстракта или концентрата листьев, экстракта или концентрата стебля, экстракта или концентрата коры, экстракта или концентрата корня, свежего плода, толченого плода, вареного плода, приготовленного плода, выдавленного плода, загущенного плода, высушенного плода, концентрата сока обычного растения киви, препарата, полученного путем экстракции плода в воде комнатной температуры; препарата, полученного путем прямой экстракции водорастворимого концентрата обычного растения киви с этилацетатом, препарата, полученного путем экстракции обычного растения киви в дистиллированной воде, и препарата, полученного путем последовательной экстракции в воде, хлороформе и этилацетате.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ фигур
На фиг.1 показано ингибирующее действие различных препаратов из A. arguta на продукцию IgE в клетках U266B1. Результаты были посчитаны как процент уровня IgE, продуцируемый клетками U266B1, обработанными только LPS, из трех независимых экспериментов.
50
На фиг.2 показано дозо-зависимое действие PG102T и PG102E на продукцию IL-4 в OVA-стимулированных спленоцитах (OVA-яичный альбумин). Специфическую активность PG102T и PG102E определяли из значения IC.
На фиг.3A-3C изображено влияние PG102T и PG102E на количество IL-4 или IFN-γ-продуцирующих T-клеток (фиг.3A) и IgE-продуцирующих B-клеток (фиг.3B) и биосинтез IgE в B-клетках (фиг.3C). Данные представляют собой средние значения в процентах каждой популяции из трех независимых экспериментов. *, P<0,05 против DW-обработанных мышей.
На фиг.4A-4B показано влияние PG102T и PG102E на экспрессию GATA3, T-bet и NFATc2, с помощью вестерн-блот-анализа (фиг.4A) и количественной PCR в реальном времени (фиг.4B). Результаты представлены как среднее ±SEM из трех независимых экспериментов. *, P<0,05 и **, P<0,01 против DW-обработанных мышей. В качестве контроля нагрузки были использованы β-актин и GAPDH.
На фиг.5A-5B показано влияние PG102T и PG102E на развитие дерматита у мыши NC, с использованием индекса дерматита (фиг.5A) и величины расчесов (фиг.5B). Значения представлены как среднее ±SEM по 5-6 животным. *, P<0,05; **, P<0,01, против DW-обработанных мышей.
На фиг.6A-6C показано влияние PG102T и PG102E на уровни IgE в плазме (фиг.6A), IgG1 (фиг.6B) и IgG2a (фиг.6C) у мышей NC. Значения представлены как среднее ±SEM по 5 животным. *, P<0,05; **, P<0,01, против DW-обработанных мышей.
На фиг.7A-7B показано влияние PG102T и PG102E на количество всех лейкоцитов и эозинофилов (фиг.7A) и продукцию эотаксина и TARC (фиг.7B) в периферической крови. Значения представлены как среднее ±SEM по 5 животным. *, P<0,05; **, P<0,01, против DW-обработанных мышей.
На фиг.8A-8B показано влияние PG102T и PG102E на кожные повреждения у мышей NC кожи спины (фиг.8A) и кожи лицевой области (фиг.8B). *, P<0,05; **, P<0,01, против DW-обработанных мышей.
На фиг.9A-9B показано влияние PG102T и PG102E на экспрессию IL-4, IL-5, эотаксина, TARC, GATA3 и pSTAT6 в кожных повреждениях, измеренное методами ELISA (фиг.9A) и Вестерн-блоттинга (фиг.9B). Значения представлены как среднее ±SEM по 5 животным. *, P<0,05; **, P<0,01, против DW-обработанных мышей. Количество в интервале соответствует проценту активности по сравнению с DW-обработанными мышами.
На фиг.10 представлено схематическое изображение способа, используемого для получения бóльших количеств PG102T; это замороженный или по-другому высушенный концентрат растения киви, также называемый FD001 (FG относится к градации пищевых носителей).
На фиг.11 показано влияние трех доз (0,25, 1,0 и 10 мг/мл) FD001 (PG102T) в отношении относительной степени продуцирования цитокинов IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 и IFN-γ OVA-стимулированными мышиными спленоцитами после 3 дней воздействия in vitro. Уровни цитокинов были измерены методом ELISA. Каждая точка представлена средней величиной, по данным от спленоцитов десяти независимых мышей.
На фиг.12 показано влияние трех доз (0,25, 1,0 и 10 мг/мл) этилацетатного (EtOAc) экстракта из FD001 (PG102T) на относительную степень продуцирования цитокинов IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 и IFN-γ OVA-стимулированными мышиными спленоцитами после 3 дней воздействия in vitro. Уровни цитокина были измерены методом ELISA. Каждая точка представлена средней величиной, по данным от спленоцитов десяти независимых мышей.
На фиг.13 показано влияние трех доз (0,25, 1,0 и 10 мг/мл) концентрата сока плода A. arguta в отношении относительной степени продуцирования цитокинов IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 и IFN-γ OVA-стимулированными мышиными спленоцитами после 3 дней воздействия in vitro. Уровни цитокина были измерены методом ELISA. Каждая точка представлена средней величиной, по данным от спленоцитов десяти независимых мышей.
На фиг.14A и 14B показано влияние трех доз известных иммуносупрессорных соединений на относительную степень продуцирования IL-13 и IFN-γ OVA-стимулированными мышиными спленоцитами после 3 дней воздействия in vitro. Циклоспорин исследовали в концентрации 0,0083, 0,083 и 4,15 мкМ, а дексаметазон исследовали в концентрации 0,01, 0,1 и 1 мкМ (фиг.14A), причем каждая точка соответствует среднему значению по спленоцитам десяти независимых мышей. Кверцетин исследовали в концентрации 1,0, 10 и 25 мкМ, где каждая точка соответствует среднему значению по спленоцитам десяти независимых мышей (фиг.14B). Уровни цитокина измеряли методом ELISA.
На фиг.15A и 15B показано влияние трех доз (1,0, 3,0 и 10 мг/мл) FD001 (PG102T), этилацетатного (EtOAc) экстракта FD001 и водного остатка, образованного в результате этого способа, на относительную степень продуцирования IL-13 (фиг.15A) и IFN-γ (фиг.15B) OVA-стимулированными мышиными спленоцитами после 3 дней воздействия in vitro. Уровни цитокина измеряли методом ELISA. Каждая точка соответствует среднему значению по спленоцитам восьми независимых мышей.
На фиг.16A и 16B показано влияние трех доз (1,0, 3,0 и 10 мг/мл) FD001 (PG102T) и порошковой формы FD001 (полученной для использования в капсулах) на относительную степень продуцирования IL-13 (фиг.16A) и IFN-γ (фиг.16B) OVA-стимулированными мышиными спленоцитами после 3 дней воздействия in vitro. Уровни цитокина измеряли методом ELISA. Каждая точка соответствует среднему значению по спленоцитам восьми независимых мышей.
На фиг.17A и 17B показано влияние альтернативных препаратов A. arguta на относительную степень продуцирования IL-13 (фиг.17A) и IFN-γ (фиг.17B) OVA-стимулированными мышиными спленоцитами после 3 дней воздействия in vitro. Исследовали три дозы (1,0, 3,0 и 10 мг/мл) FD001 (PG102T), концентрат сока плода, экстракт, полученный при варке свежего плода в воде, экстракт плода в воде комнатной температуры. Уровни цитокина измеряли методом ELISA. Каждая точка соответствует среднему значению по спленоцитам восьми независимых мышей.
2
На фиг.18A и 18B показано влияние препаратов альтернативных частей растения A. arguta на относительную степень продуцирования IL-13 (фиг.18A) и IFN-γ (фиг.18B) OVA-стимулированными мышиными спленоцитами после 3 дней воздействия in vitro. Исследовали три дозы (1,0, 3,0 и 10 мг/мл) концентрата сока плода, независимых экстрактов, полученных варкой коры, корня или стебля в HO, и FD001. Уровни цитокина измеряли методом ELISA. Каждая точка соответствует среднему значению по спленоцитам восьми независимых мышей.
На фиг.19A-19C показан сдвиг изменений, которые происходили между 1 и 14 днями клинических испытаний на человеке, в процессе которых испытуемые отвечали положительно на лечение атопических дерматитов (AD), согласно оценкам PGA (Всеобщая врачебная оценка) по AD (критерии классификации показаны на фиг.19C). Испытуемые применяли плацебо или 600 мг FD001 (PG102T) ежедневно (фиг.19A и 19B, соответственно) и одновременно использовали лечение местными стероидами.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Ранее авторами изобретения было обнаружено, что морозостойкое растение киви, и в особенности некоторые полученные из него экстракты/концентраты, обычно называемые в этом документе PG102, увеличивают уровни Th1-цитокинов и IgG2a в сыворотке, уменьшают уровни Th2-цитокинов и IgE в сыворотке, препятствуют выбросу гистамина из тучных клеток и подавляют аллергические воспалительные реакции, имеющие место у аллерген-сенсибилизированной мышиной модели аллергического воспаления и гиперчувствительности дыхательных путей, а также при исследовании отека лапки крысы (смотрите публикацию патента США №2004/0037909, выше). PG102 активен при пероральном введении.
Авторы настоящего изобретения представили здесь новое доказательство, что два специфических экстракта, полученных из Actinidia arguta, обозначенных PG102T и PG102E (описанные подробно в примерах 1 и 2 ниже), ингибируют продукцию IgE, а также способны регулировать селективные Th1- и Th2-цитокины. Наиболее вероятно, что эта регуляция достигается путем регуляции клеточных факторов транскрипции, GATA-3, T-bet и NFATc2. Данные авторов изобретения свидетельствуют о значительном потенциале PG102T и PG102E в качестве иммуномодуляторов Th1- и Th2-путей, и в конечном итоге, в качестве противоаллергических агентов. Эффективность этих экстрактов показана в данном документе in vivo на модели для аллергического воспаления, связанного с респираторными заболеваниями, и на модели атопического дерматита.
Авторы настоящего изобретения описали здесь также другие препараты морозостойкого растения киви, включая препараты из целого плода, стебля, корня, коры, новых экстрактов, концентратов, соков, сухих препаратов и неэкстрагированных препаратов, и показали, что такие препараты морозостойкого растения киви обладают сходными свойствами по их способности регулировать Th1- и Th2-цитокины и, следовательно, как полагают, обладают сходными противоаллергическими свойствами.
Кроме того, авторами изобретения было показано, что препараты морозостойкого растения киви согласно изобретению уменьшают уровни лейкотриенов и ослабляют продукцию лейкотриенов in vivo, и, следовательно, композиции согласно изобретению можно использовать для лечения лейкотриен-опосредованных болезней, включая, не ограничиваясь ими, атопический дерматит, астму, пищевую аллергию, аллергический ринит и хроническую крапивницу.
Идентификация морозостойкого растения киви и его препаратов в качестве усилителей Th1-ответа делает эти агенты особенно привлекательными для лечения заболеваний и патологических состояний, при которых наблюдается положительная реакция на такой ответ, включая, но ими не ограничиваясь, вирусную инфекцию и рак.
Процесс экстракции, используемый для получения суммарного количества водорастворимого экстракта и этилацетатного экстракта морозостойкого растения киви, описан в патентной публикации США №2004/0037909 и в примерах 1 и 2 настоящей заявки. В дополнительных вариантах осуществления авторами изобретения было обнаружено, что из препаратов морозостойкого растения киви, полученных альтернативными способами экстракции, концентрации или обработки, также можно получить композиции с иммунной регуляторной активностью, и в частности, со способностью к подавлению продукции цитокинов в ответ на антиген (например, аллерген). Такие альтернативные препараты включают в себя, но ими не ограничиваются, концентрат плодового сока, концентрат из свежих плодов и препараты из отваренных свежих плодов.
Авторы настоящего изобретения в данном документе также показали, что экстракты или другие препараты из частей растения морозостойкого растения киви, но не самого плода, обладают эквивалентной или большей иммуннорегуляторной активностью по сравнению с водорастворимыми или этилацетатными экстрактами из плода. Например, авторами изобретения теперь была показана эффективность экстрактов из стебля, корня и коры растения морозостойкого растения киви в подавлении продукции цитокинов антиген-стимулированными спленоцитами у аллерген-сенсибилизированных мышах.
Авторы настоящего изобретения также неожиданно обнаружили, что препараты морозостойкого растения киви, как описано в данном документе, могут служить в качестве эффективного дополнения к другим видам терапии при различных атопических состояниях, включая стероидную терапию, но не ограничиваясь ею. Например, авторами изобретения было обнаружено, что применение порошкообразной формы водорастворимого экстракта A. arguta, как описано в данном документе, взрослыми пациентами, страдающими атопическим дерматитом умеренной степени тяжести, значительно уменьшало проявление характерных клинических признаков. Также было достигнуто значительное уменьшение специфического клинического симптома, оцениваемого самим пациентом (покраснение), и тенденция к снижению степени тяжести была отмечена в отношении других клинических симптомов болезни у тех больных, которые одновременно использовали местный стероид, по сравнению с пациентами, использующими стероид, но не получавшие экстракт морозостойкого растения киви. Когда пациент прекращал использование стероидов, эффекты экстракта растения киви уже не были столь значительными в условиях малого экспериментального исследования. Поэтому изобретение в этом варианте осуществления относится к применению препаратов морозостойкого растения киви, описанных в данном документе, в сочетании с (или в дополнение к) другим терапевтическим агентам для лечения атопической болезни или других болезней, связанных с нарушениями иммунодисрегуляцией. Авторы изобретения полагают, что композиции согласно изобретению можно использовать для увеличения эффективности других видов лечебно-оздоровительных и дието-терапий, в особенности у пациентов с атопическими состояниями. Этот вариант осуществления изобретения подробно обсуждается ниже.
В еще одном варианте осуществления авторы изобретения неожиданно обнаружили, что процесс высушивания морозостойкого растения киви представляет собой ранее неоцененный, но важный элемент, связанный с повышением биоактивности морозостойкого растения киви. Кроме того, авторы изобретения показали здесь, что высушенное морозостойкое растение киви, экстрагированное исключительно водой при комнатной температуре, проявляет сходную биоактивность с экстрактами морозостойкого растения киви в горячей воде или органическом растворителе. Сюда можно включить также высушенное морозостойкое растение киви, экстрагированное в прохладной или холодной воде, проводя таким образом экстракцию при любой температуре от 0°C до 80°C. Авторы изобретения предположили также, что высушенное морозостойкое растение киви, которое не экстрагировалось (например, высушенные ломтики морозостойкого растения киви), может обладать биоактивностью экстрактов морозостойкого растения киви. Поэтому настоящее изобретение относится к любой форме высушенного морозостойкого растения киви, включая экстракты, полученные из ранее высушенного морозостойкого растения киви, в качестве агента или для приготовления композиции для регуляции иммунного ответа у млекопитающих. Более специфические применения этого агента или композиции описаны ниже.
В другом варианте осуществления изобретение далее относится к применению любых членов семейства, Actinidiaceae, и особенно любых членов рода Actinidia, включая, но не ограничиваясь ими, простое растение киви, известное как A. chinensis или A. deliciosa, для получения композиций растения киви с иммунорегулирующей активностью. В одном варианте осуществления авторы, не желая связывать себя какой-либо теорией, предположили, что путем высушивания других растений Actinidia можно получить композицию высушенного растения Actinidia, обладающего по меньшей мере несколькими биологическими активностями, которые были выявлены у морозостойкого растения киви, описанного в данном документе. В другом варианте осуществления авторы изобретения предположили, что другие препараты простого растения киви (например, A. chinensis или A. deliciosa), включая, но не ограничиваясь ими, препараты из любой части плода, целого плода, стебля, листвы, коры или корня, включая любой их препарат или экстракт, включая высушенные препараты, неэкстрагированные, но обработанные препараты, свежий плод, сок плода или любой экстракт, концентрат или их часть, могут обладать по меньшей мере несколькими биологическими свойствами, которые были выявлены для морозостойкого растения киви, описанного в данном документе.
A. arguta, A. polygama и A. kolomikta, принадлежащие к Actinidiaceae, в диком виде распространены в Сибири, северной области Китая, Северной и Южной Корее. Сообщали более чем о 30 видах, принадлежащих к Actinidiaceae. К ним относится плод A. chinensis или A. deliciosa, которые были названы "киви" и представляют собой распространенные съедобные плоды. A. arguta и другой плод из того же рода (например, A. polygama и A. kolomikta) использовали в качестве материалов китайской медицины, названных 'mihudo' для лечения заболевания печени, желудочно-кишечного заболевания и урогенитального камнеобразования без признаков токсичности (Seoul National University Natural Products Science, Tradi-Medi Data Base, dongbang media Co. Ltd. 1999). Однако до изобретения, описанного в патентной публикации США №2004/0037909, не существовало никаких ни сообщений, ни предположений о лечении и профилактике аллергической болезни и неаллергической воспалительной болезни с использованием плода Actinidia. Кроме того, до настоящего изобретения не существовало никаких сообщений, рассматривающих эффективность препаратов морозостойкого растения киви, за исключением экстрактов, описанных в патентной публикации США №2004/0037909, рассматривающей эффективность экстрактов, полученных из частей морозостойкого растения киви, за исключением плодов (ягод), рассматривающей важность различных этапов процесса получения, таких как высушивание, или влияние композиций морозостойкого растения киви на эффективность общепринятого лечения атопической болезни или других патологических состояний, связанных с дисрегуляцией иммунной системы млекопитающих (например, стероидной терапии).
Согласно настоящему изобретению ссылка на "морозостойкое растение киви" относится к любому из A. arguta, A. polygama и A. kolomikta или другим родственным им видам рода Actinidia, которые обладают биоактивными свойствами A. arguta, A. polygama и A. kolomikta, как описано в данном документе, особенно в отношении противоаллергенных свойств и иммунный ответ/цитокин/лейкотриен-регуляторных свойств, показанных здесь (например, смотрите примеры).
При получении любой композиции или препарата согласно изобретению, включая любой описанный в данном документе экстракт, можно использовать любую одну или несколько частей морозостойкого растения киви или других видов Actinidia, включая, но не ограничиваясь ими, их плоды (также называемые "ягодами" или "киви-ягодами"), листья, стебли, кору и корень.
В данном документе общая ссылка на экстракт относится к концентрированному препарату из субстрата (например, морозостойкого растения киви), обычно полученного путем извлечения из него активных или нужных компонентов подходящим растворителем, а затем путем испарения части, всего или почти всего растворителя и доведения остаточной массы или порошка до предписанного стандарта. Термин "концентрат" относится к форме субстрата, в котором бóльшая часть его базовых компонентов, или растворитель, удалены. Соответственно, очевидно, что здесь термин "экстракт" может использоваться в некоторых вариантах осуществления как эквивалент термина "концентрат". В данном документе ссылка на неочищенный экстракт в одном варианте осуществления относится к экстракту морозостойкого растения киви, который получают путем экстракции препарата морозостойкого растения киви водой, низшими спиртами (например, метанолом, этанолом и др.) или их смесями, и предпочтительно, дистиллированной водой или 50-90% этанолом, и более предпочтительно, 70% этанолом. Растворимый в неполярном растворителе экстракт можно получить путем дальнейшей экстракции растворимого экстракта с неполярным растворителем, таком как гексан, этилацетат или растворитель дихлорметан. Специфические способы получения неочищенного экстракта и оценка перечисленного ранее описана в патентной публикации США №2004/0037909, выше, и т.п. способы включены в данный документ посредством ссылки. Дополнительные биоисследования регуляции, оценки или утверждения желательных биологических активностей композиции морозостойкого растения киви согласно изобретению предложены в данном документе в примерах и включают в себя как in vitro, так и in vivo исследования.
Согласно настоящему изобретению ссылка на "PG102T" обычно относится к суммарному водорастворимому экстракту (который также может быть обозначен в данном документе как концентрат) из морозостойкого растения киви, описанного в данном документе (например, A. arguta), приготовленного в основном как описано в патентной публикации США №2004/0037909, выше (например, смотрите пример 1 из этой публикации), или как описано в примере 1 данного описания. В предпочтительном варианте осуществления суммарный водорастворимый экстракт получают из A. arguta, хотя, как очевидно специалисту в данной области, эквивалентные суммарные водорастворимые экстракты можно получать из другого морозостойкого растения киви, включая, но ими не ограничиваясь, A. polygama и A. kolomikta. Если суммарный водорастворимый экстракт получают путем макропроцесса, но с использованием в основном таких же основных этапов, как и для получения PG102T, как описано в примере 3, то полученный препарат будет обозначен в данном документе как FD001. Ссылка на "PG102T" в данном документе относится к фракции этилацетата, полученной в результате последовательных экстракций препарата PG102T, описанного выше, в хлороформе, этилацетате и н-бутаноле с использованием способов экстракции, известных в данной области. Специфические способы получения экстрактов, которые представляют собой экстракт PG102T и экстракт PG102E, описаны в примере 1. В другом варианте осуществления изобретения различный этилацетатный экстракт получали путем прямой экстракции FD001 (или PG102T) этилацетатом (то есть не было никакой экстракции хлороформом до фракции этилацетата). И опять в предпочтительном варианте осуществления экстракт этилацетата получали из A. arguta, хотя, как очевидно для специалиста в данной области, эквивалентные экстракты можно получать из другого морозостойкого растения киви, включая, но ими не ограничиваясь, A. polygama и A. kolomikta.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, особенно когда плод высушивают в качестве этапа обработки или получения экстракта или концентрата или другого препарата, экстракты или концентраты или другие препараты согласно изобретению можно получать из любых видов Actinidia. Соответственно, это является целью настоящего изобретения, включая лекарственный препарат, косметическую композицию или композицию, пригодную в качестве или вместе с продуктом здоровой пищи, здоровой пищи или питья, или пищевой добавки (включая человеческие и животные (включая домашних питомцев) пищевые добавки), которые включают, в случае необходимости такие экстракты морозостойкого растения киви или других видов Actinidia. Такие композиции предназначены для использования в любом способе настоящего изобретения, включая селективную регуляцию Th1- и Th2-иммунных ответов у пациента (то есть у млекопитающих), таком как способ профилактики или лечения аллергического и неаллергического воспалительного заболевания или обеспечивая противовирусный или противораковый лекарственный препарат или нутрицевтик путем применения таких композиций. Другие добавки и компоненты из композиций, а также доза и стратегии применения, описанные в данном документе, также относятся к данному объекту изобретения.
В получении любых композиций, описанных в данном документе, вдобавок к описанным здесь экстрактам, включение экстрактов/концентратов, описанных специально выше, включенных в изобретение, представляет собой использование целых плодов морозостойкого растения киви или препаратов плодов, которые обрабатывают, но не экстрагируют, включающих, не ограничиваясь ими, свежий плод, толченый плод (высушенный или свежий), кипяченый плод (высушенный или свежий), вареный плод, высушенный плод, выдавленный плод, замороженный плод и загущенный плод. Соответственно, это и есть цель настоящего изобретения для получения композиции, включая лекарственный препарат, косметическую композицию или композицию, пригодную в качестве или вместе с продуктом здоровой пищи, здоровой пищей или питьем, или пищевой добавкой, которые содержат целые плоды морозостойкого растения киви или препараты плода, которые можно обрабатывать несколькими способами (например, высушенные, вареные и другие), но которые не были обязательно экстрагированы. Поэтому в одном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к препаратам морозостойкого растения киви (и простого растения киви), которые не были экстрагированы. Любые такие композиции, описанные в данном документе, предназначены для использования в любом способе настоящего изобретения, в том числе для селекцивной регуляции Th1- и Th2-иммунных ответов у пациента (то есть у млекопитающего), таком как способ профилактики или лечения аллергического и неаллергического воспалительного заболевания или обеспечение противовирусными или противораковыми фармацевтическими препаратами или нутрицевтиками путем применения таких композиций. Другие добавки и компоненты композиций, а также дозировка и стратегии применения, описанные в данном документе, также используются для целей настоящего изобретения.
Кроме того, при получении любой композиции, описанной в данном документе, в дополнение к экстрактам, описанным в данном документе, настоящее изобретение включает в себя также применение сока морозостойкого растения киви, полученного из любой части морозостойкого растения киви и любым подходящим способом. Сок можно использовать как полученный непосредственно из плода (то есть неразбавленный или концентрированный), сок можно разбавлять или концентрировать до образования концентрата плодового сока. Например, как описано в примере 3, свежее растение киви можно пропускать через обычный прибор для выжимания сока. Прибор для выжимания сока может снимать кожицу с плода, что приводит к смешиванию семян, мякоти и сока. Эту смесь можно обрабатывать (например, центрифугированием и прессованием) для удаления сока из твердой массы и, если нужно, этот сок можно концентрировать (например, выпариванием, перегонкой, ультрафильтрацией и так далее), чтобы получить концентрированный плодовый сок (то есть концентрат плодового сока). Такие композиции предназначены для использования в любом способе настоящего изобретения, и особенно в способе профилактики или лечения аллергического и неаллергического заболевания или получения противовирусных или противораковых фармацевтических препаратов или нутрицевтиков путем применения таких композиций. Другие добавки и компоненты композиций, а также дозировка и стратегии применения, описанные в данном документе, также используются для целей настоящего изобретения.
Кроме того, при получении любой композиции, описанной в данном документе, как альтернативы экстрактам, описанным в патентной публикации США №2004/0037909, в данное изобретение входит также применение других продуктов обработки морозостойкого растения киви, включая, но не ограничиваясь ими, экстракт плодов в воде при комнатной температуре, включая высушенный плод; водный экстракт морозостойкого растения киви, полученный в воде при температуре, более низкой, чем комнатная температура; водный экстракт или другой экстракт корня, листьев, стебля или коры; или водный экстракт или концентрат или другой экстракт любого плода, листьев, стебля или коры, которые не высушивают до экстракции (например, экстрагируемый свежий плод). Авторы данного изобретения предполагают в данном документе, что морозостойкое растение киви можно экстрагировать при любой температуре воды, от 0°C до 80°C, включая комнатную температуру и более прохладную (например, примерно от 0°C примерно до 25°C).
Согласно настоящему изобретению общая ссылка на "высушенное морозостойкое растение киви" или "высушенное растение киви" включает в себя любую форму морозостойкого растения киви или другого растения киви (например, обычного киви), который высушивают любым способом. Термин "растение киви" может использоваться в данном документе, чтобы относиться к любому члену рода Actinidia в общем, и включает в себя члены морозостойкого растения киви, как обсуждалось выше, а также члены обычного киви, также как обсуждалось выше. Следовательно, высушенное растение киви включает в себя любую высушенную часть растения киви (плод, листья, стебель, корень и др.) и включает в себя высушенные целые плоды, высушенный нарезанный плод, высушенный измельченный плод, высушенный измельченный плод и высушенный конденсированный плод, а также любые экстракты растения киви, где экстрагируемый материал сначала высушен, а потом подвергнут экстрагированию. Экстракты не нужно было высушивать или подвергать дальнейшей обработке, несмотря на то, что это обычно самая полезная форма экстрактов для составления композиций и для хранения. Предпочтительные способы дальнейшей концентрации экстрактов для дальнейшего использования включают в себя, но ими не ограничиваются, сгущение, дистилляцию, ультрафильтрацию, обратный осмос, преципитацию, адсорбцию и элюирование из стационарной фазы, и экстракцию в альтернативных растворителях. Предпочтительные способы высушивания экстрактов или концентратов для дальнейшего использования включают в себя, но ими не ограничиваются, высушивание в лотках, аэрозольное высушивание и высушивание заморозкой, и с или без использования высушивающих аппаратов или наполнителей, таких как мальтодекстрин, микрокристаллическая целлюлоза и крахмал. В одном варианте осуществления, предпочтительное высушенное растение киви для использования в настоящем изобретении представляло собой препарат высушенного растения киви, которое в дальнейшем не экстрагировали.
Таким образом, композиции и способы, описанные в данном документе, применяются для использования любого морозостойкого растения киви, включая использование любой части плода, стебля, листьев, коры или корня морозостойкого растения киви, или любого экстракта или концентрата или их фракции, любой формы целого плода или обработанного, но не экстрагированного плода, сока плода, или любого экстракта или концентрата или их фракции, и далее включая части растения морозостойкого растения киви (части растения, включая плод, стебель, листья, кору и/или корень) и препараты частей растения, который получали с использованием способа, который включает в себя стадию высушивания.
Таким образом, целью настоящего изобретения является обеспечение композиции, включающей лекарственный препарат, нутрицевтик, пищевую добавку, здоровую пищу (включая питье или питательное вещество), или косметическую композицию, включающую в основном состоящую или состоящую из морозостойкого растения киви, описанного здесь (то есть включая любую часть плода, целого плода, стебля, листьев, коры или корня, и включая любой препарат или экстракт, или их концентрат, включая высушенные препараты, неэкстрагированные, но обработанные препараты, свежий плод, сок плода или любой экстракт, концентрат или их фракцию). В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к сырому экстракту, общему водорастворимому экстракту или этилацетатному экстракту морозостойкого растения киви. Во всех случаях препарат морозостойкого растения киви представляет собой активный компонент для использования, чтобы селективно регулировать Th1- и Th2-иммунные ответы у пациента (то есть у млекопитающего). В частности, композиция обладает биологической активностью, выбранной по меньшей мере из одной из следующих активностей: (a) уменьшает количество IgE-продуцирующих B-клеток у пациента; (b) уменьшает количество IgE, продуцируемого у пациента (например, в сыворотке или плазме); (c) уменьшает продукцию и/или уровни по меньшей мере одного Th2-цитокина (например, IL-4, IL-5, IL-10); (d) увеличивает уровень по меньшей мере одного Th1-цитокина (например, IL-12, IFN-γ); (e) уменьшает уровень экспрессии транскрипционного фактора, GATA-3; (f) увеличивает уровень экспрессии транскрипционного фактора T-bet; (g) увеличивает уровень экспрессии транскрипционного фактора NFATc2; (h) увеличивает количество IgG2a-продуцирующих B-клеток у пациента; (i) увеличивает количество IgG2a, продуцированного у пациента; (j) увеличивает продукцию или активность Th1 T-лимфоцитов (например, CD4+, IFN-γ+), в особенности в области воспаления; (k) уменьшает продукцию или активность Th2 T-лимфоцитов (например, CD4+, IL-4+), в особенности в области воспаления; (l) уменьшает количество IgG1-продуцирующих B-клеток у пациента; (m) уменьшает количество IgG1, продуцируемого у пациента; и/или (n) уменьшает уровень продукции по меньшей мере одного лейкотриена у пациента.
Вышеописанные композиции, которые можно использовать для профилактики и/или лечения любого заболевания или состояния, при котором регуляция иммунного ответа описанным здесь способом была бы или предположительно могла бы быть благоприятна для пациента.
Здесь фраза "защищенный от заболевания" относится к уменьшению симптомов заболевания; уменьшению случаев заболевания и/или уменьшению опасности заболевания. Защита пациента может относиться к способности композиции согласно изобретению, при введении ее пациенту, предотвратить проявление заболевания и/или вылечить или облегчить по меньшей мере один, а предпочтительно, более одного симптома заболевания, признака или причины. Собственно, защита пациента от заболевания включает в себя профилактику заболевания (профилактическое лечение), и лечение пациента, имеющего заболевание (терапевтическое лечение), для уменьшения симптомов заболевания. В частности, защита пациента от заболевания или усиление другого вида лечения осуществляется путем регуляции данной активности, с получением положительного эффекта. Положительный эффект может быть легко оценен рядовым специалистом в данной области и/или опытным клиницистом, который лечит пациента. Термин "заболевание" относится к любому отклонению от нормального состояния здоровья млекопитающего и включает в себя состояние, при котором присутствуют симптомы заболевания, а также состояния, при которых имеют место отклонения (например, инфекция, генная мутация, генетический дефект и т.п.), но симптомы все еще не проявляются.
Обычно биологическая активность или биологическое действие описанного здесь агента, включая композицию морозостойкого растения киви, экстракт морозостойкого растения киви или любые другие его препараты, относится к любой функции, проявляемой или выполняемой агентом, которому приписывается природное происхождение, как определено in vivo (то есть в природном физиологическом окружении, где используется агент) или in vitro (то есть в лабораторных условиях). Модификации агента, такие как изменение обработки или получения агента или очистка агента, могут привести к образованию агентов, имеющих сходную биологическую активность в качестве агента природного происхождения, или агентов, имеющих уменьшенную или увеличенную биологическую активность по сравнению с агентом природного происхождения.
Соответственно, целью настоящего изобретения является обеспечение композиции, включающей лекарственный препарат или нутрицевтической (диетологической) композиции, включая морозостойкое растение киви, описанное в данном документе (то есть включая любую часть плода, целый плод, стебель, листья, кору или корень, и включая любой препарат или экстракт или их концентрат, включая высушенные препараты, не экстрагированные, но обработанные препараты, свежие плоды, сок плода или любой экстракт или концентрат или их фракция), и в одном варианте осуществления сырой экстракт, суммарный водорастворимый экстракт или этилацетатный экстракт морозостойкого растения киви (который может быть отнесен как к активным компонентам согласно изобретению, так и к препаратам морозостойкого растения киви согласно изобретению), в качестве активного компонента для регуляции иммунного ответа у млекопитающего, и более конкретно, для регуляции иммунного Th2- и/или Th1-ответа у млекопитающего, и еще более конкретно, для увеличения Th1-ответа у млекопитающего и/или подавления Th2-ответа у млекопитающего. Такие активные компоненты полезны для лечения и/или профилактики различных патологических состояний и заболеваний, включая, но ими не ограничиваясь, аллергическое заболевание, неаллергическое воспалительное заболевание, вирусную инфекцию и рак. Композиция может далее включать в себя или использоваться в сочетании с дополнительными терапевтическими или нутрицевтическими агентами для профилактики, лечения и/или улучшения любого из вышеописанных состояний или заболеваний. Согласно настоящему изобретению диетологические применения включают в себя любые применения изобретения, направленные на обеспечение питательными веществами и диетологическими агентами для сохранения, стабилизации, увеличения, усиления или улучшения здоровья индивида или органического процесса, посредством которого организм приспосабливается и использует пищу и жидкости для функционирования, роста и поддержания, и которые включают в себя применение нутрицевтиков. Терапевтические применения включают в себя любые применения изобретения, направленные на профилактику, лечение, управление, излечение, облегчение и/или исцеление от заболевания или состояния, то есть отклонения в состоянии здоровья индивида. Другие применения изобретения включают в себя, например, косметическое применение.
Также целью настоящего изобретения является обеспечение морозостойкого растения киви, описанного в данном документе (то есть препарат морозостойкого растения киви, содержащий любую часть плода, целого плода, стебля, листьев, коры или корня, и включая любой препарат или экстракт или их концентрат, включая высушенные препараты, неэкстрагированные, но обработанные препараты, свежие плоды, сок плода или любой экстракт или концентрат или их фракции), и в одном варианте осуществления сырой экстракт, суммарный водорастворимый экстракт или этилацетатный экстракт морозостойкого растение киви, для получения терапевтического или нутрицевтического агента для регуляции иммунного ответа у млекопитающего, в частности, для регуляции иммунного Th2- и/или Th1-ответа у млекопитающего, и еще более конкретно, для повышения Th1-ответа у млекопитающего и/или подавления Th2-ответа у млекопитающего. Такие активные компоненты полезны для лечения и/или предотвращения разнообразных состояний и заболеваний, включая, но не ограничиваясь ими, аллергическое заболевание, неаллергическое воспалительное заболевание, вирусную инфекцию и рак. Агент может использоваться в сочетании с дополнительными терапевтическими или нутрицевтическими агентами для профилактики, лечения и/или улучшения любого из вышеописанных состояний или заболеваний.
Другой целью настоящего изобретения является обеспечение диетическими пищевыми продукты или пищевыми добавками, содержащими морозостойкое растение киви, описанное в данном документе (то есть препарат морозостойкого растения киви, включая любую часть плода, целого плода, стебля, листьев, кору или корень и включая любой препарат или экстракт или их концентрат, включая высушенные препараты, не экстрагированные, но обработанные препараты, свежие плоды, сок плода или любой экстракт или концентрат, или их фракцию), и в одном варианте осуществления сырой экстракт, общий водорастворимый экстракт или этилацетатный экстракт морозостойкого растения киви, вместе с любой подходящей добавкой для регуляции иммунного ответа у млекопитающего, и, более конкретно, для регуляции иммунного Th2- и/или Th1-ответа у млекопитающего, и еще более конкретно, для увеличения Th1 ответа у млекопитающего и/или подавления Th2 ответа у млекопитающего. Такие диетические пищевые продукты или диетические пищевые продуктовые добавки полезны для лечения и/или профилактики различных патологических состояний и заболеваний, включая, но ими не ограничиваясь, аллергическое заболевание, неаллергическое воспалительное заболевание, вирусную инфекцию и рак.
Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение животной пищей или кормовой добавкой, включающих в себя морозостойкое растение киви, описанное в данном документе (то есть препарат морозостойкого растения киви, включающий любую часть плода, целый плод, стебель, листья, кору, или корень, включая любой препарат или экстракт или их концентрат, включая высушенные препараты, не экстрагированные, но обработанные препараты, свежие плоды, сок плода, или любой экстракт или концентрат, или их фракцию), а в одном варианте осуществления сырой экстракт, суммарный водорастворимый экстракт или этилацетатный экстракт морозостойкого растения киви, в качестве существенного компонента для регуляции иммунного ответа у млекопитающего, в особенности для регуляции Th2- и/или Th1-иммунного ответа у млекопитающего, более конкретно, для увеличения Th1-ответа у млекопитающего и/или подавления Th2-ответа у млекопитающего. Такая животная пища или животные кормовые добавки полезны для лечения и/или профилактики различных патологических состояний и заболеваний, включая, но ими не ограничиваясь, аллергическое заболевание, неаллергическое воспалительное заболевание, вирусную инфекцию и рак.
Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение местной или косметической композиции, включающей в себя описанное здесь морозостойкое растение киви (то есть препарат морозостойкого растения киви, включая любую часть плода, целый плод, стебель, листья, кору или корень, и включая любой препарат или экстракт или их концентрат, включая высушенные препараты, не экстрагированные, но обработанные препараты, свежие плоды, сок плода или любой экстракт или концентрат или их фракцию), и в одном варианте осуществления сырой экстракт, суммарный водорастворимый экстракт или этилацетатный экстракт морозостойкого растения киви, для регуляции иммунного ответа у млекопитающего, в частности, для регуляции Th2- и/или Th1-иммунного ответа у млекопитающего, в особенности для увеличения Th1-ответа у млекопитающего и/или подавление Th2-ответа у млекопитающего. Такие косметические композиции полезны для лечения и/или профилактики различных патологических состояний и заболеваний, включая, но ими не ограничиваясь, аллергическое заболевание (включая аллергические заболевания или поражения кожи), неаллергическое воспалительное заболевание, вирусную инфекцию и рак.
Любые композиции, добавки или агенты, описанные в данном документе, могут дополнительно включать в себя по меньшей мере один обычный носитель, вспомогательное вещество или растворитель. Например, композиция согласно изобретению может включать в себя фармацевтически подходящие носители, вспомогательные вещества или растворители, например, лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, акациевый каучук, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло. Рецептуры могут дополнительно включать в себя наполнители, противосклеивающие агенты, смазывающие агенты, увлажняющие агенты, ароматизирующие агенты, эмульгаторы, консервирующее вещество и т.п. Композиции согласно изобретению могут быть составлены таким образом, чтобы обеспечивать быстрое, поддерживающее или отсроченное высвобождение активного компонента после их введения пациенту.
Например, композиции согласно изобретению могут быть растворены в маслах, пропиленгликоле или других растворителях, которые обычно используют для получения раствора для инъекций. Соответствующие примеры носителей включают в себя физиологический раствор, полиэтиленгликоль, этанол, растительные масла, изопропилмиристат и т.п., но не ограничиваются этими носителями. Для местного применения соединения согласно изобретению могут быть составлены в форме мазей и кремов.
Композиции или рецептуры согласно изобретению можно получить в любой форме, такой как лекарственная форма для перорального применения (шипучая таблетка, шипучий порошок, порошок, таблетка, капсула, безвредная капсула, водное лекарство, сироп, эликсирная пилюля, порошок, саше, гранула) или местный препарат (крем, мазь, лосьон, гель, бальзам, пластырь, паста, раствор для опрыскивания, аэрозоль и т.п.), или инъецируемый препарат (раствор, суспензия, эмульсия).
Композиции согласно изобретению в виде фармацевтических препаратов могут быть использованы отдельно или в подходящем сочетании с другими фармацевтически активными соединениями, включая противовоспалительные соединения, противоаллергические соединения или любые другие соединения или композиции, которые могут регулировать иммунный ответ или могут оказывать благотворное действие на пациента. Соединения, которые особенно желательны для использования в композициях и рецептурах настоящего изобретения, подробно описываются в данном документе.
Композиция согласно изобретению может также обеспечивать как диетические пищевые продукты, которые включают в себя препарат морозостойкого растения киви согласно изобретению (например, различная пища, питье, жвачка, витаминный комплекс, здоровая улучшенная пища и т.п.). Диетические пищевые продукты могут обеспечивать как компонент пищи, порошок, гранула, таблетка, жевательные таблетки, капсулы или питье и так далее. Детское или младенческое питание также включается в композиции согласно изобретению, такие как модифицированный молочный порошок, детская смесь и модифицированная детская или младенческая пища.
Соответственные пищевые продукты, в которых композиция или агент изобретения могут включаться для получения диетического пищевого продукта, включают в себя, но ими не ограничиваются, тонкие булочные изделия, хлеб и рулеты, зерновой завтрак, обработанного и необработанного сыра, приправы (кетчуп, майонез, и т.п.), молочные продукты (молоко, йогурт), пудинги и желатиновые десерты, газированные напитки, чаи, порошковые питьевые смеси, обработанные рыбные продукты, напитки на основе плодов (включая соки плодов), напитки на основе овощей (включая овощные соки), жевательную резинку, жесткие кондитерские изделия, замороженные молочные продукты, обработанные мясные продукты, орех и ореховые пасты, пасту, обработанные птицепродукты, подливы и соусы, картофельные чипсы и другие чипсы или хрустящий картофель, шоколад и другие кондитерские изделия (печенье, конфеты, лакричные конфеты), мороженое, обезвоженные продукты, нарезанные или обработанные пищевые продукты (например, плоды, зелень), специи, спиртные напитки, лапшу, ферментированные пищевые продукты, супы и суповые смеси, соевые продукты (молоко, напитки, кремы, осветлитель), пасты на основе растительного масла и напитки на основе овощей. Композиция согласно изобретению может также быть использована в пищу в виде внутренних добавок к пище, внешних покрытий или смешиваемых с едой добавок непосредственно во время сервировки.
Вышеописанные композиции, в частности, косметические композиции, содержащие указанные композиции, могут быть приготовлены в любой форме, такой как покрытие, лосьон, крем, эссенция, тоник, эмульсия, маска, мыло, шампунь, моющее средство, очищающее средство, моющие растворы для тела, моющие растворы, лечение, гель, бальзам, раствор в виде спрея и т.п.
Любые указанные композиции согласно изобретению могут далее включать в себя один или более таких компонентов, как лактоза, казеин, декстроза, глюкоза, сахароза и сорбит.
Любые композиции, препараты, добавки или агенты, описанные в данном документе, могут дополнительно включать в себя по меньшей мере один активный агент (то есть активное соединение, активный компонент). Дополнительный активный агент может быть фармакологически активным агентом и/или диетологически активным агентом. Активные агенты в основном содействуют по меньшей мере одному дополнительному желательному, диетологическому и/или терапевтическому, и/или фармакологическому свойству композиции, в дополнение к препарату растения киви, описанного в данном документе. Активные агенты могут быть включены в смесь, препарат, добавку или другую композицию согласно изобретению в любом эффективном количестве. Эффективное количество представляет собой количество, достаточное для осуществления требуемого эффекта, придаваемого агентом, такого как влияние на здоровье или питание индивида (например, терапевтический или диетологический эффект), вкусового эффекта, ароматизирующего эффекта, визуального эффекта и т.п. Специалист в данной области способен определить подходящее количество дополнительных агентов для добавления в композицию согласно изобретению.
Например, любые композиции, относящиеся к настоящему изобретению или используемые в нем, могут включать в себя один или более натуральных продуктов в качестве активного агента, включая, но ими не ограничиваясь, жирные кислоты и поликетиды; органические кислоты и смешанные малые органические соединения; ароматические аминокислоты и фенилпропаноиды; терпеноиды и стероиды; алкалоиды; коррины и порфирины; линейные и циклические пептиды, депсипептиды и другие производные аминокислот; нуклеозиды и нуклеотиды; углеводы; белки, клетки и клеточные фрагменты; травяные препараты и специи; минералы; стерилизаторы; приправы; витамины; электролиты и другие натуральные агенты.
Другие компоненты (соединения или агенты), которые могут быть добавлены к композиции согласно изобретению, включают в себя синтетические ароматизирующие агенты, окрашивающий агент, обрабатывающий агент, альгиновую кислоту или ее соль, органические кислоты, защитные коллоидные связующие вещества, pH-контролирующий агент, стабилизатор, консервирующее вещество, глицерин, спирт, газированный агент или любой другой необходимый пищевой или питьевой агент композиции (для диетологического или терапевтического применения любого способа введения).
В особенности предпочтительные компоненты (активные агенты) для объединения с препаратом морозостойкого растения киви согласно изобретению или добавления к композиции, содержащей такой препарат, включают в себя, не ограничиваясь ими, пробиотики; клеточные стенки и фрагменты бактерий; сывороточный белок; таурин; аланин; жирные кислоты (например, сопряженную линоленовую кислоту, эйкозапентаеновую кислоту, докозагексаеновую кислоту, γ-линоленовую кислоту, α-линоленовую кислоту, дигомо-γ-линоленовую кислоту, стеаридоновую кислоту); моно-, ди- и триглицериды (составляющие любое соединение указанных жирных кислот); инозит; куркуму; куркумин; розмарин; розмариновую кислоту; метилсульфонилметан (MSM); женьшень; имбирь; проантоцианидины; β-каротин; и любой другой препарат различных видов растения киви при их использовании в качестве первого биоактивного компонента, включая любую часть Actinidiaceae, особенно любые части растения рода Actinidia, включая обычные виды киви (например, A. chinensis или A. deliciosa) и виды морозостойкого растения киви (например, A. arguta, A. polygama и A. kolomikta).
Жирные кислоты и поликетиды включают в себя, не ограничиваясь ими, насыщенные жирные кислоты (например, α-липоевую кислоту (R, S или R, S); ненасыщенные жирные кислоты (например, сопряженную линоленовую кислоту, эйкозапентаеновую кислоту, докозагексаеновую кислоту, γ-линоленовую кислоту, α-линоленовую кислоту, дигомо-γ-линоленовую кислоту, стеаридоновую кислоту); сложные эфиры жирных кислот; моноглицериды, диглицериды и триглицериды (составленные из любой комбинации вышеописанных жирных кислот); ацетиленовые жирные кислоты; жирные кислоты с разветвленной цепью; простагландины; тромбоксаны; лейкотриены; ароматические поликетиды; макролиды и полиэфиры; липоидные экстракты (например, морские липиды, Echium масло, масло бораго, оливковое масло); и лецитин.
Органические кислоты и смешанные малые органические соединения включают в себя, но ими не ограничиваются, лимонную кислоту; фумаровую кислоту; гваякол; метилсульфонилметан (MSM); и аскорбиновую кислоту.
Ароматические аминокислоты и фенилпропаноиды включают в себя, не ограничиваясь ими, ароматические аминокислоты и бензойные кислоты (например, бензойная кислота, галлиевая кислота, гентизиновая кислота, п-гидроксибензойная кислота, протокатеховая кислота, ванилиновая кислота, салициловая кислота, сиреневая кислота); коричные кислоты (например, гидрокситирозол, куркумин, розмариновая кислота, αr-турмерон, кофеиновая кислота, эвгенол, хлорогеновая кислота, неохлорогеновая кислота, коричная кислота, фераликовая кислота, o-кумаровая кислота, п-кумаровая кислота); лигнаны и лигнин; фенилпропилены; кумарины; стирилпироны; флавоноиды (например, антоцианидины, такие как дельфинидин; проантоцианидины; катехины, такие как катехин, эпикатехин и теафлавин; флавонолы, такие как авикулярия, гиперозиды, кверцитрин, изокверцитрин, каемпферол, мирицетин, рутин; флаваноны, такие как нарингенин; халконы, такие как флоретин; изофлавоны, такие как витексин); стильбены; флавонолигнаны; изофлавоноиды; и терпеноидхинины (например, витамины K и токоферолы (витамин E) такие как токотриенолы).
Терпеноиды и стероиды включают в себя, не ограничиваясь ими, монотерпены (например, β-пинен, борнеол, карваквол, гераниол, тимол, 1,8-цинеол, терпинеол); иридоиды (например, монотропеин); β-ионон (например, тринадцатиуглеродный предшественник для витаминов A); сесквитерпены (например, кариофиллен, фарнезол); дитерпены (например, витамины A); сестертерпены; тритерпены (например, α-амирин, липеол, урсоловая кислота); тетратерпены; каротиноиды (например, ликопен, β-каротин, лютеин, астаксантин, кантаксантин); и стероиды (например, витамины D, β-ситостерол).
Алкалоиды включают в себя, не ограничиваясь ими, пирролидиновые алкалоиды, тропановые алкалоиды, пирролизидиновые алкалоиды, пиперидиновые алкалоиды, гуинолизидиновые алкалоиды, индолизидиновые алкалоиды, пиридиновые алкалоиды, фенилэтиламины, тетрагидроизохинолиновые алкалоиды, галантамины, индоловые алкалоиды, β-карболиновые алкалоиды, терпеноидиндоловые алкалоиды, хинолиновые алкалоиды, пирролоиндоловые алкалоиды, алкалоиды спорыньи, хиназолиновые алкалоиды, хинолиновые и акридиновые алкалоиды, имизадоловые алкалоиды, пиперидиновые алкалоиды, эфедрины, капсайсины, пиридинмонотерпеновые алкалоиды, аконитины, стероидные алкалоиды, пуриновые алкалоиды (например, аллантоин, кофеин, теофиллин).
Коррины и порфирины включают в себя витамины B, но ими не ограничиваются.
Линейные и циклические белки, депсипептиды и другие производные аминокислот включают в себя простые аминокислоты и их производные (например, L-aцетилкарнитин, холин, таурин, аланин), линейные пептиды, циклические пептиды (например, циклоспорины), циклические депсипептиды, β-лактамы, цианогенные гликозиды, глюкозинолаты, цистеин сульфоксиды, но ими не ограничиваются.
Карбоксилаты включают в себя, но ими не ограничиваются, моносахариды (например, инозит), полисахариды (например, плодовые олигосахариды, такие как инулин (любой длины цепи); галакто-олигосахариды; хитин и хитозан).
Другие натуральные вещества включают в себя, не ограничиваясь ими, белки (например, сывороточный белок и супероксиддисмутазу); клетки и клеточные фрагменты (например, пробиотики, означая живые, нетронутые микроорганизмы, такие как, например, Lactobacillus spp., бактериальные клетки и фрагменты клеточной стенки, клетки грибов/дрожжей и фрагменты клеточной стенки); травяные препараты и специи (например, женьшень, huang, куркума, розмарин, имбирь); минералы (например, K, Mg, Ca, Mn, Fe, Cu, Zn, B, Si, Se). Метаболиты и производные любого из этих соединений также включены в настоящее изобретение.
В одном варианте осуществления изобретения композицию согласно изобретению применяют в качестве дополнительной терапии для обычной терапии патологического состояния или заболевания. Например, авторами изобретения было показано, что препарат морозостойкого растения киви в соответствии с настоящим изобретением улучшает исход болезни у пациентов с атопическими дерматитами при его использовании в качестве дополнения к местной стероидной терапии. Таким образом, композиции согласно изобретению могут включать один или несколько терапевтических агентов (например, лекарства), которые могут также отнесенены в данный документ в качестве активных агентов, используемых для лечения патологического состояния или заболевания, которое может быть вылечено или улучшено регуляцией иммунных ответов. Такие терапевтические агенты включают в себя, но ими не ограничиваются, стероиды (включая кортикостероиды, включая пероральные, ингаляционные и инъецируемые), антигистаминные средства (любого типа, включая системные, местные, ингаляционные, и включая H1- и H2-блокаторы), антитела (например, анти-IgE, анти-IL-10), антибиотики, циклоспорины, антимикотики, регуляторы функции внешнего дыхания, анальгетики, β-агонисты (длительного или краткосрочного действия), модификаторы лейкотриена (ингибиторы или антагонисты рецептора), антагонисты цитокина или цитокинового рецептора, ингибиторы фосфодиэстеразы, натрий хромогликат, недокримил, теофиллин, кофеин, карбобензокси-бета-аланил-таурин, ингибиторы T-клеточной функции и другие противовоспалительные агенты.
Любые вышеописанные композиции могут дополнительно включать в себя одну или две, или более органических кислот (например, лимонную кислоту, фумаровую кислоту, адипиновую кислоту, молочную кислоту, яблочную кислоту, аскорбиновую кислоту), фосфат (например, фосфат, фосфат натрия, фосфат калия, кислотный пирофосфат, полифосфат) и/или натуральные антиоксиданты (например, полифенол, катехин, α-токоферол, экстракт розмарина, витамин C, экстракт зеленого чая, экстракт корня лакричника, хитозан, дубильную кислоту, фитиновую кислоту и т.п.).
Композиции согласно изобретению, в частности, косметические композиции или композиции, которые составлены для местного введения, включая терапевтические композиции (не ограничиваясь ими, косметические или другие местные композиции) могут включать в себя дополнительные добавки, включая, не ограничиваясь ими, водорастворимый витамин, жирорастворимый витамин, пептидный полимер, полисахаридный полимер, сфинголипид, гликозаминогликаны, B-гликан и экстракт морской водоросли. Кроме того, можно добавлять композиции и агенты согласно изобретению к имеющейся косметике и растворам для умывания. Такие композиции можно использовать в качестве кремов, лосьонов, массажных масок или масел и растворов для мытья тела, мыла, шампуней и т.п.
Предпочтительные водорастворимые витамины представляют собой любые витамины, которые могут быть смешаны с косметикой или другими местными рецептурами, однако различные витамины, такие как витамин B1, B2, B6, пиридоксин, пиридоксин HCl, витамин B12, пантотеновая кислота, никотиновая кислота, никотинамид, фолиевая кислота, витамин C, витамин H и т.п., их соли, такие как тиамин HCl соль, аскорбиновая кислота Na-соль и т.п., или их производные, такие как Na-соль аскорбиновой кислоты-2-фосфоновой кислоты, Mg-соль аскорбиновой кислоты-2-фосфоновой кислоты являются предпочтительными, и их можно получить обычными способами, такими как способы превращения микроорганизмами трансформирования, способы очищения из культуры микроорганизмов, ферментативные способы или способы химического синтеза.
Предпочтительные жирорастворимые витамины представляют собой любые витамины, которые могут быть смешаны с косметикой или другими местными рецептурами, однако различные витамины, такие как витамин A, D2, D3, E (dl-α-токоферол, d-α-токоферол, d-δ-токоферол) и их производные, такие как аскорбат пальмитиновой кислоты, аскорбат стеариновой кислоты, аскорбат дипальмитиновой кислоты, уксусная кислота-dl-α-токоферол, никотиновая кислота-dl-α-токоферол витамин E, dl-пантотениловый спирт, d-пантотениловый спирт, пантотениловый этилэфир и т.п., содержащие жирорастворимый витамин, используемый в примерах настоящего изобретения, являются предпочтительными, и они могут быть получены обычными способами, такими как способы превращения микроорганизмами, способы очищения из культуры микроорганизмов, ферментативные способы или способы химического синтеза.
Предпочтительные пептидные полимеры представляют собой любой полимер, который может быть смешан с косметической или другими композициями для местного применения, однако коллаген, гидролизуемые коллагены, желатин, эластин, гидролизуемый желатин или кератин и т.п., содержащий пептидный полимер, используемый в примерах настоящего изобретения, являются предпочтительными.
Предпочтительные полисахаридные полимеры представляют собой любой полимер, который может быть смешан с косметической или другими композициями для местного применения, однако предпочтительны гидроксиэтилцеллюлоза, ксантиновая смола, гиалуроновая кислота Na, хондроитинсульфат или их соли (соль Na и т.п.) и т.п. Например, хондроитинсульфат или подобные соли могут использоваться путем очистки из млекопитающих или рыб.
Предпочтительные сфинголипиды представляют собой любой сфинголипид, который может быть смешан с косметическими или другими композициями местного применения, однако предпочтительны сквалан, церамид, pit-сфингозин, сфинголипополисахарид и т.п. Сфинголипиды могут быть получены путем очистки из млекопитающих, рыб, моллюсков, дрожжей или растений и т.п. с использованием обычных способов.
Предпочтительные экстракты морской водоросли представляют собой любой экстракт, который может быть смешан с косметическими или другими композициями местного применения, однако предпочтителен экстракт из бурых водорослей, красных водорослей, зеленых водорослей и т.п. или очищенный каррагенин, альгиновая кислота, аргининовая кислота, Na, K, или глюкозаминогликаны, выделенные из них. Водорослевые экстракты могут быть получены путем очистки из морской водоросли с использованием обычных способов.
Косметические и другие местные композиции согласно изобретению можно объединять с другими компонентами или объединять с обычными косметическими и местными композициями, если необходимо, вместе с вышеописанными препаратами морозостойкого растения киви. Такие другие компоненты включают в себя, но ими не ограничиваются, компоненты масла, увлажнители, смягчающее средство, поверхностно-активные вещества, органические или неорганические красители, органические порошки, вещество, абсорбирующее ультрафиолетовое излучение, консервирующее вещество, антисептики, антиоксиданты, экстракт растения, регулятор pH, спирт, пигменты, ароматизаторы, жаропонижающие средства, антигидротик, дистиллированная вода и т.п. Предпочтительные компоненты масла могут включать в себя сложноэфирное синтетическое масло, минеральное масло, силиконовое масло, фторидное масло, животное масло, масло растения и т.п.
Предпочтительные сложноэфирные синтетические масла включают в себя, но ими не ограничиваются, глицерилтри-2-этилкапроевую кислоту, цетил-2-этилкапроевую кислоту, изопропилмиристиновую кислоту, бутилмиристиновую кислоту, изопропилпальмитиновую кислоту, этилстеариновую кислоту, октилпальмитиновую кислоту, изоцетилизостеариновую кислоту, бутилстеариновую кислоту, этиллинолевую кислоту, изопропиллинолевую кислоту, этилолеиновую кислоту, изоцетилмиристиновую кислоту, изостеарилмиристиновую кислоту, изостеарилпальмитиновую кислоту, октилдодецилмиристиновую кислоту, изоцетилизостеариновую кислоту, диэтилсебациновую кислоту, изопропиладипиновую кислоту, изоалкилнеопетановую кислоту, глицерилтри(каприл, каприловая кислота), триметилoпропантри-2-этилкапроевую кислоту, триметилoпропантриизостеариновую кислоту, пентаеритритолтетра-2-этилкапроевую кислоту, цетилкаприловую кислоту, дециллауриновую кислоту, гексиллауриновую кислоту, децилмиристиновую кислоту, миристилмиристиновую кислоту, цетилмиристиновую кислоту, стеарилстеариновую кислоту, децилолеиновую кислоту, цетиллицинолеиновую кислоту, изостеариллауриновую кислоту, изотридецилмиристиновую кислоту, изоцетилпальмитиновую кислоту, октилстеариновую кислоту, изоцетилстеариновую кислоту, изодецилолеиновую кислоту, октилдодецилолеиновую кислоту, октилдодециллинолевую кислоту, изопропилизостеариновую кислоту, цетостеарил-2-этилкапроевую кислоту, стеарил-2-этилкапроевую кислоту, гексилизостеариновую кислоту, этиленгликольдиоктановую кислоту, этиленгликольдиолеиновую кислоту, пропиленгликольдикаприновую кислоту, пропиленгликольди(каприл, каприновую кислоту), пропиленгликольдикаприновую кислоту, неопентилгликольдикаприновую кислоту, неопентилгликольдиоктановую кислоту, глицерилтрикаприловую кислоту, глицерилтриундекановую кислоту, глицерилтриизопальмитиновую кислоту, глицерилтриизостеариновую кислоту, октилдодецилнеопентановую кислоту, изостеарилоктановую кислоту, октилизононановую кислоту, гексилдецилнеодекановую кислоту, октилдодецилнеодекановую кислоту, изоцетилизостеариновую кислоту, изостеарилизостеариновую кислоту, октилдецилизостеариновую кислоту, полиглицериновый эфир оленоиковой кислоты, полиглицериновый эфир изостеариновой кислоты, триизоцетиллимонную кислоту, триизоалкиллимонную кислоту, триизооктиллимонную кислоту, лаурилмолочную кислоту, миристилмолочную кислоту, цетилмолочную кислоту, октилдецилмолочную кислоту, триэтиллимонную кислоту, aцетилтриэтиллимонную кислоту, aцетилтрибутиллимонную кислоту, триоктиллимонную кислоту, диизостеарилмалеиновую кислоту, ди-2-этилгексилгидроксистеариновую кислоту, 2-этилгексилянтарную кислоту, диизобутиладипиновую кислоту, диизопропилсебасиновую кислоту, диоктилсебациновую кислоту, холестерилстеариновую кислоту, холестерилизостеариновую кислоту, холестерилгидроксистеариновую кислоту, холестерилгидроксистеариновую кислоту, холестерилолеиновую кислоту, дигидрохолестерилолеиновую кислоту, питстерилизостеариновую кислоту, питстерилолеиновую кислоту, изоцетил-12-стеалоилгидроксистеариновую кислоту, стеарил-12-стеалоилгидроксистеариновую кислоту, изостеарил-12-стеалоилгидроксистеариновую кислоту.
Предпочтительное минеральное масло, описанное выше, может включать в себя раствор парафина, α-олефиновые олигомеры, изопарафин, церезин, парафин, раствор изопарафина, полибуден, микрокристаллический воск, вазелин и т.п.
Предпочтительные силиконовые масла могут включать в себя полиметилсиликон, метилфенилсиликон, метилциклополисилоксан, октаметилполисилоксан, декаметилполисилоксан, додекаметилциклосилоксан, сополимер диметилсилоксан-метилцетилоксисилоксан, сополимер диметилсилоксан-метилстеаллоксисилоксан, алкил-модифицированное силиконовое масло, амино-модифицированное силиконовое масло и т.п.
Предпочтительное фторидное масло может включать в себя перфторполиэфир и т.п.
Предпочтительные животные или растительные масла могут включать в себя масло авакадо, миндальное масло, оливковое масло, кунжутовое масло, масло рисовой шелухи, сафлоровое масло, соевое масло, кукурузное масло, рапсовое масло, масло канолы, масло кокосового ядра, пальмомое масло, подсолнечное масло, масло семени хлопчатника, масло кокосовой пальмы, cucui ореховое масло, масло зародышевой почки пшеницы, масло зародышевой почки риса, масло из масляного дерева, масло ослинника двухлетнего, масло ореха макадамия, масло менхаден и иные масла тела рыбы, масло яичного желтка, ланолин, масло конопляного семени, масло норки, масло хоплостет, масло жожоба, карнаубский воск, раствор ланолина и т.п.
Предпочтительные увлажнители могут включать в себя водорастворимые низкомолекулярные увлажнители, липофильные низкомолекулярные увлажнители, водорастворимый полимер и низкомолекулярный полимер.
В частности, предпочтительные водорастворимые низкомолекулярные увлажнители могут включать в себя церин, глутамин, сорбит, маннит, пирролидонкарбоновую кислоту Na, глицерин, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, этиленгликоль, полиэтиленгликоль (индекс полимеризации >2), полипропиленгликоль (индекс полимеризации >2), молочную кислоту, соль молочной кислоты и т.п.
Предпочтительные жирорастворимые низкомолекулярные увлажнители могут включать в себя холестерин, сложный холестериловый эфир и т.п.
Предпочтительные водорастворимые полимеры могут включать в себя карбоксивиниловый полимер, соль полиаспарагиновой кислоты, трагакант, ксантиновую смолу, HMC (гидроксиметилцеллюлоза), HEC (гидроксиэтилцеллюлоза), HPC (гидроксипропилцеллюлоза), карбоксиметилцеллюлоза, водорастворимый хитин, хитозан, декстрин и т.п.
Предпочтительные жирорастворимые полимеры могут включать в себя сополимер поливинилпирролидона-эйкоцена, сополимер поливинилпирролидона-гексадецена, нитроцеллюлозу, декстриновый эфир жирной кислоты, силиконовый полимер и т.п.
Предпочтительные смягчающие средства могут включать в себя длинноцепочечный холестериловый эфир ацилглютаминовой кислоты, холестерилгидроксистеариновую кислоту, 12-гидроксистеариновую кислоту, рогиевую кислоту, холестериловый эфир ланолин жирной кислоты и т.п.
Предпочтительные поверхностно-активные вещества могут включать в себя неионные поверхностно-активные вещества, анионные поверхностно-активные вещества, катионогенные поверхностно-активные вещества, амфивалентные поверхностно-активные вещества и т.п.
В частности, предпочтительные неионогенные поверхностно-активные вещества могут включать в себя самоэмульгируемый глицерин моностеариновой кислоты, пропиленгликолевый эфир жирной кислоты, глицериновый эфир жирной кислоты, полиглицериновый эфир жирной кислоты, сорбитановый эфир жирной кислоты, полиоксиэтилен (POE), сорбитановый эфир жирной кислоты, POE-сорбитановый эфир жирной кислоты, POE-глицериновый эфир жирной кислоты, POE-алкиловый эфир, POE-эфир жирной кислоты, POE твердое pimaja масло, POE pimaja масло, POE-POP-сополимер, POE-POP-алкиловый эфир, полиэфир-модифицированный силикон, алканоламид лауриновой кислоты, алкиламиноксиды, водородприсоединенный соевый фосфолипид и т.п.
Предпочтительные анионные поверхностно-активные вещества могут включать в себя мыльные жирные кислоты, соль α-ацилсульфоновой кислоты, алкиловую соль сульфоновой кислоты, алкилаллилсульфоновую кислоту, алкилнафталиновую соль сульфоновой кислоты, алкиловую соль сульфоновой кислоты, POE-алкилэфир сульфатную соль, алкиламидсульфатную соль, алкилфосфатную соль, POE-алкилфосфатную соль, алкиламидфосфатную соль, алкилоалкилтауриновую соль, N-ациламинокислую соль, POE-соль алкилового эфира карбоновой кислоты, соль алкилсульфоянтарной кислоты, соль алкилсульфоуксусной кислоты, пептидную соль ацилированного гидролизуемого коллагена, перфторалкилфосфатный эфир и т.п.
Предпочтительные катионогенные поверхностно-активные вещества могут включать в себя алкилтриметилхлорид аммония, стеарилтриметилхлорид аммония, стеарилтриметилбромид аммония, сетостеарилтриметилхлорид аммония, дистеарилдиметилхлорид аммония, стеарилдиметилбензилхлорид аммония, фенилтриметилбромид аммония, бензалконийхлорид, диэтиламиноэтиламид стеариновой кислоты, диметиламинопропиламид стеариновой кислоты, производное ланолина четвертичного аммония и т.п.
Предпочтительные амбивалентные поверхностно-активные вещества могут включать в себя карбоксибетаиновый тип, амидбетаиновый тип, гидроксисульфобетаиновый тип, фосфобетаиновый тип, аминокарбоновые кислоты, имидазолинпроизводный тип, амидаминовый тип и т.п.
Предпочтительные органические и неорганические красители могут включать в себя кремниевую кислоту, безводную кремниевую кислоту, магнийкремниевую кислоту, тальк, кератит, слюду, каолин, бенгала, глину, бентонит, титановую тонкослойную слюду, оксихлорин висмута, оксид циркония, оксид магния, оксид цинка, оксид титана, оксид алюминия, сульфат кальция, сульфат бария, сульфат магния, карбонат кальция, карбонат магния, оксид железа, оксид хрома, гидроксид хрома, каламин, углеродную сажу и их комбинации как неорганические красители; полиамид, сложный полиэфир, полипропилен, полистирол, полиуретан, виниловая смола, мочевинная смола, фенольная смола, фтористая смола, кремниевая смола, акриловая смола, меламиновая смола, эпоксидная смола, поликарбонатовая смола, сополимер дивинилбензола-стирола, шелковый порошок, целлюлоза, желтый CI-пигмент, оранжевый CI-пигмент как органические красители; и их комплекс и так далее.
Предпочтительные органические порошки могут включать в себя металлическое мыло, такое как стеарат кальция; алкилметаллическую соль фосфиновой кислоты, такую как натрийцинкцетиловая кислота, цинклауриловая кислота, кальцийлауриловая кислота; поливалентная соль металла ациламиновой кислоты, такие как N-лауроил-β-аланин кальция, N-лауроил-β-аланин цинка, N-лауроилглицин кальция и так далее; амид сульфоновой кислоты поливалентной соли металла, такие как N-лауроилтаурин кальция, N-пальмитоилтаурин кальция; N-ацилосновную аминокислоту, такую как Nε-лауроил-L-лизин, Nε-пальмитоиллизин, Nα-пальмитоилорнитин, Nα-лауроиларгинин, укрепленный ланолин жирной кислоты ациларгинина и т.п.; N-ацилполипептид, такой как N-лауроилглицилглицин; α-аминожирная кислота, такая как α-аминокаприловая кислота, α-аминолауриновая кислота и т.п.; полиэтилен, полипропилен, нейлон, полиметилметакрилат, полистирол, сополимер дивинилбензола-стирола, этилентетрафторид и такие же.
Предпочтительные ультрафиолет-абсорбирующие агенты могут включать в себя парааминобензойную кислоту, парааминоэтилбензоат, парааминоамилбензоат, парааминооктилбензоат, этиленгликольсалицилат, фенилсалицилат, октилсалицилат, бензилсалицилат, бутилфенилсалицилат, гомоментилсалицилат, бензилкоричная кислота, параметокси-2-этоксиэтилкоричная кислота, параметоксиоктилкоричная кислота, дипараметокси-моно-2-этилгексанглицерилкоричная кислота, параметоксиизопропилкоричная кислота, диизопропилдиизопропилциннаматэфирная смесь, урокановая кислота, этилурокановая кислота, гидроксиметоксибензофенон, гидроксиметоксибензофенонсульфоновая кислота и их соли, дигидроксиметоксибензофенон, дигидроксиметоксибензофенон дисульфонат Na, дигидроксибензофенон, тетрагидроксибензофенон, 4-трет-бутил-4'-метоксидибензоилметан, 2,4,6-трианилино-п-(карбо-2'-этилгексил-1'-окси)-1,3,5-триазин, 2-(2-гидрокси-5-метилфенил)бензотриазол и т.п.
Предпочтительные консервирующие вещества могут включать в себя хинокитиол, трихлоровую кислоту, трихлоргидроксидифенилэфир, хлоргексидинглюкуронат, феноксиэтанол, резорцин, изопропилметилфенол, азулен, салициловую кислоту, цинкпилитион, бензалконий HCl, фотосенсибилизатор 301, мононитрогуаиакол Na, ундециленовая кислота и так далее.
Предпочтительные антиоксиданты могут включать в себя бутилгидроксианизол, пропилгаллат, эллисорбат и т.п.
Предпочтительные pH регуляторы могут включать в себя лимонную кислоту, цитрат натрия, яблочную кислоту, яблочнокислый натрий, фумаровую кислоту, натрийфумаровую кислоту, янтарную кислоту, натрийянтарную кислоту, гидроксид натрия, гидрофосфат натрия и т.п.
Предпочтительные спирты могут включать в себя цетиловый спирт и так далее.
Кроме того, другие компоненты могут добавляться к любым вышеописанным композициям. В одном варианте осуществления количество других компонентов варьирует от 0,01 до 5%, более предпочтительно, от 0,01 до 3% в этой общей композиции.
st
Вышеописанные компоненты, такие как водорастворимый витамин, жирорастворимый витамин, пептидный полимер, полисахаридный полимер, сфинголипид, экстракт из морских водорослей и другие компоненты, могут быть получены обычными способами, раскрытыми в литературе (смотрите, например, Matsumoto Mithio, Manual for the development of transdermal applied preparations. Seisi Press, 1 Ed., 1985).
Использование препаратов морозостойкого растения киви согласно изобретению безопасно. Они нетоксичны для животных и не вызывают никакого значимого отрицательного эффекта.
В соответствии с настоящим изобретением, любые вышеизложенные композиции могут быть совмещены с препаратом морозостойкого растения киви согласно изобретению (включая любую часть плода, целый плод, стебель, листья, кору или корень и включая любой препарат или его экстракт, включая высушенные препараты, неэкстрагированные, но обработанные препараты, свежие плоды, плодовый сок или любой экстракт или его фракцию), использование любой подходящей дозы или количества препарата морозостойкого растения киви, который в достаточной степени осуществляет требуемую биологическую активность для препарата морозостойкого растения киви, как описано выше, если применяется один или несколько раз в течение соответствующего интервала времени. Соответственные количества или дозы могут меняться в зависимости от задачи введения или патологического состояния или лечения заболевания, а также от веса субъекта, степени тяжести состояния, формы лекарственного препарата, курса и времени введения и могут быть выбраны специалистом в данной области.
Соответственное количество или доза препарата морозостойкого растения киви согласно изобретению может включать, в одном варианте осуществления, количество примерно от 0,1 г примерно до 10 г на кг массы тела пациента, и предпочтительно, примерно от 1 до 3 г на кг массы/день исследуемого морозостойкого растения киви или экстракта согласно изобретению. Доза может быть введена раз в день, несколько раз в день или через более продолжительные промежутки времени (например, каждые несколько дней, еженедельно, ежемесячно и т.п.), как требуется. В композициях, описанных в данном документе, количество препарата морозостойкого растения киви согласно изобретению может составлять примерно от 0,01% до 100% веса, и предпочтительно, примерно от 0,01% и примерно до 95% веса, и, более предпочтительно, от 0,5 до 80% веса на основе общего веса композиции, включая любое количество от 0,01% до 100%, с 0,01% увеличением. В одном варианте осуществления лекарственный препарат согласно изобретению может содержать примерно 0,01-50% веса препарата морозостойкого растения киви согласно изобретению на основе общего веса композиции.
В одном варианте осуществления экстракт или иной препарат морозостойкого растения киви согласно изобретению может присутствовать в составе любой композицию примерно от 20% до 90% высококонцентрированного раствора, порошка или гранулы, включая любое увеличение между 20% и 90%, в 1% коэффициент увеличения.
Соотношение дополнительных компонентов в композиции может, как правило, варьировать примерно от 0 до 20% вес./вес. на 100% вес./вес. композиции, включая любое увеличение между 0 и 100% вес./вес., в 1% коэффициент увеличения.
В одном варианте осуществления косметические композиции включают в себя препарат морозостойкого растения киви согласно изобретению в количестве примерно от 0,01 до 30%, более предпочтительно, от 0,01 до 5% по весу на основе общего веса композиции, включая любое увеличение между 0,01% и 30%, в 0,01% коэффициент увеличения.
В другом варианте осуществления, когда композиция, включающая в себя препарат морозостойкого растения киви согласно изобретению, который добавлен в пищу, пищевую добавку или напиток, может обеспечиваться в количестве, варьирующем примерно от 0,1 до 95% вес./вес., предпочтительно от 1 до 80% вес./вес. общего веса еды, добавки или напитка, включая любое увеличение от 0,1 до 95% вес./вес., в 0,1% вес./вес. увеличения, или примерно от 1 до 30 г на 100 мл, и предпочтительно, от 3 до 10 г на 100 мл, включая любое увеличение от 1 г на 100 мл и до 30 г на 100 мл, в 1 г коэффициент увеличения, композиции здорового напитка.
В одном варианте осуществления диетические пищевые продукты согласно изобретению включают в себя препарат морозостойкого растения киви согласно изобретению как 0,01 к 80%, предпочтительно 1 к 50% основного веса на общий вес композиции, включая любое увеличение 0,01% и 80%, с инкрементом в 0,1%.
В одном варианте осуществления напиток из диетических пищевых продуктов включает в себя препарат морозостойкого растения киви согласно изобретению в количестве примерно от 0,01 примерно до 20% веса от общего веса композиции, включая любое увеличение между 0,01% и 20%, с инкрементом в 0,01%. Дополнительные компоненты могут включать в себя аминокислоты от 0,001 до 5% веса, витамины от 0,001 до 2% веса, сахара от 0,001 до 20% веса, органические кислоты от 0,001 до 10% веса, подсластители и ароматизаторы - до необходимого количества. Обеспечивая, чтоб композиция здорового напитка согласно изобретению содержала в себе вышеописанный препарат морозостойкого растения киви согласно изобретению в качестве существенного компонента, не существует никакого ограничения на другие жидкие компоненты, где другой компонент может быть различными подсластителями и/или интенсификаторами вкуса и аромата, такие которые могут быть добавлены в обычный напиток. Примеры таких подсластителей или интенсификаторы вкуса и аромата включают, но ими не ограничиваются, обычные или низкокалорийные подсластители, включая моносахариды, такие как глюкоза, фруктоза и т.п.; дисахариды, такие как мальтоза, сахароза и т.п.; обычные сахара, такие как декстрин, циклодекстрин; и сахарные спирты, такие как ксилит и эритрит и т.п. Дополнительные подсластители включают натуральные подсластители, такие как тауматин, экстракт посконника крапиволистного, леваудиозид A, глицирризин и их производные, и низкоколарийные подсластители, такие как сахарин, сукралоза, аспартам и их производные. Количество указанных подсластителей или усилителей вкуса и аромата, как правило, варьирует примерно от 1 до 20 г и, предпочтительно, от 5 до 12 г в соотношении на 100 мл композиции напитка, включая любое увеличение между 1 г и 20 г на 100 мл, в 1 г увеличения.
Пищевая добавка может быть добавлена в пищу путем нанесения, распыления или смешивания. Количество добавки по сравнению с общим количеством композиции может, как правило, варьировать примерно от 0,01 до 20% вес./вес. на 100% вес./вес. настоящей композиции, включая любое увеличение приблизительно от 20% вес./вес. и до 100% вес/вес, с инкрементом в 1% вес/вес.Пищевые добавки могут также смешиваться с пищей, такой как животная пища, в количестве примерно от 5 до 100 г на каждый 1 кг веса, исходя из общей сухой массы пищи, включая любое увеличение от 5 г и 100 г на каждый 1 кг веса, с инкрементом в 1 г.
Соответственно, целью настоящего изобретения является обеспечение способа селективной регуляции Th1- и Th2-иммунного ответа у пациента путем введения или обеспечения композиции, включая лекарственный препарат, нутрицевтическую композицию, пищевую добавку, диетические пищевые продукты (включая напиток или питательное вещество), или косметическую композицию, включающую в себя, состоящую по существу из или состоящую из любого препарата морозостойкого растения киви, описанного в данном документе (включая любую часть плода, целый плод, стебель, листья, кору или корень и включая любой препарат или экстракт, или их концентрат, включая высушенные препараты, неэкстрагированные, но обработанные, препараты, свежие плоды, плодовый сок или любой экстракт, или концентрат, или их фракцию), и в одном варианте осуществления общий экстракт, общий водорастворимый экстракт или этилацетатный экстракт морозостойкого растения киви в качестве активного компонента. Композиции согласно изобретению подробно описаны выше. В частности, введение или обеспечение композиции приводит по меньшей мере к одной из следующих биологических активностей: (a) уменьшению количества IgE-продуцирующих B-клеток у пациента; (b) уменьшению количества IgE, продуцируемого у пациента (например, в сыворотке или плазме); (c) уменьшению продукции и/или уровней по меньшей мере одного Th2-цитокина (например, IL-4, IL-5, IL-10); (d) увеличению уровня по меньшей мере одного Th1-цитокина (например, IL-12, IFN-γ); (e) уменьшению уровня экспрессии фактора транскрипции GATA-3; (f) увеличению уровня экспрессии фактора транскрипции T-bet; (g) увеличению уровня экспрессии фактора транскрипции NFATc2; (h) увеличению количества IgG2a-продуцирующих B-клеток у пациента; (i) увеличению количества IgG2a, продуцируемого пациентом; (j) увеличению производства или активности Th1-T-лимфоцитов (например, CD4+, IFN-γ+), в особенности в сайте воспаления; (k) уменьшению производства или активности Th2-T-лимфоцитов (например, CD4+, IL-4+), в особенности в сайте воспаления; (1) уменьшению количества IgG1-продущирующих B-клеток у пациента; (m) уменьшению количества IgG1, продуцируемого у пациента; и/или (n) уменьшению уровня или продуцирования по меньшей мере одного лейкотриена у пациента.
Предпочтительный способ согласно изобретению включает в себя способ уменьшения производства лейкотриена у пациента, приводящий, таким образом, к улучшению по меньшей мере одного симптома состояния или заболевания, связанного с лейкотриенами, у пациента. Способ включает в себя применение вышеуказанным млекопитающим эффективного количества любого препарата морозостойкого растения киви, описанного в данном документе (включая любую часть плода, целый плод, стебель, листья, кору или корень и включая любой препарат, или экстракт, или их концентрат, включая высушенные препараты, неэкстрагированные, но обработанные, препараты, свежие плоды, плодовый сок, или любой экстракт, или концентрат, или их фракцию), и в одном варианте осуществления общий экстракт суммарного водорастворимого экстракта или этилацетатный экстракт морозостойкого растения киви, вместе с их фармакологически подходящим носителем. Предпочтительно, применение композиции согласно изобретению приводит к уменьшению производства или уровня лейкотриенов у пациента. Заболевания и патологические состояния, связанные с лейкотриенами, включают в себя, ими не ограничиваясь, астму, пищевую аллергию, аллергические риниты, хроническую крапивницу и аллергические дерматиты. В этом варианте осуществления предпочтительные пути введения включают в себя пероральное, дыхательное и местное введение, в дополнение к системным путям введения.
Описанный выше способ может использоваться для предотвращения и/или лечения любого заболевания или состояния, при котором регуляция иммунного ответа описанным в данном документе способом была бы благоприятной для пациента или могла бы оказаться благоприятной согласно прогнозам.
Таким образом, целью настоящего изобретения является обеспечение способа обработки и/или предотвращения аллергического заболевания и неаллергического воспалительного заболевания у млекопитающего, включающее в себя применение вышеупомянутого млекопитающим эффективного количества любого препарата морозостойкого растения киви, описанного в данном документе (включая любую часть плода, целый плод, стебель, листья, кору или корень и включая любой препарат, или экстракт, или их концентрат, включая высушенные препараты, не экстрагированные, но обработанные, препараты, свежие плоды, сок плода или любой экстракт, или концентрат, или их фракцию), и в одном варианте осуществления сырой экстракт, суммарный водорастворимый экстракт или этилацетатный экстракт морозостойкого растения киви, вместе с фармакологически подходящим носителем.
Согласно настоящему изобретению аллергические заболевания могут включать в себя, не ограничиваясь ими, астму, аллергический бронхолегочный аспергиллез, аллергический бронхиальный бронхоэктаз, гиперчувствительный пневмонит, аллергический синусит, анафилаксию, аллергические риниты, аллергический конъюнктивит, аллергические дерматиты, атопические дерматиты, инфекционный дерматит, хронические крапивницы, аллергия на насекомых, пищевую аллергию и лекарственную аллергию.
В одном варианте осуществления аллергическое заболевание представляет собой атопический дерматит. В одном аспекте этого варианта осуществления, в дополнение к применению композиции, включающей в себя, состоящей в основном или состоящей из препарата морозостойкого растения киви согласно изобретению, пациенту одновременно проводят обычную терапию для атопических дерматитов, включая, но ими не ограничиваясь, лечение местным стероидом. В этом варианте осуществления изобретения препарат морозостойкого растения киви используют наиболее предпочтительно перорально или местно, хотя изобретение и не ограничено указанными путями введения.
В ином варианте осуществления аллергическое заболевание представляет собой астму. В одном аспекте этого варианта осуществления, в дополнение к применению композиции, включающего в себя, состоящего в основном или состоящего из препарата морозостойкого растения киви изобретения, пациенту одновременно проводят обычную для случаев астмы терапию, включая, но ими не ограничиваясь, вдыхание лечебного стероида или иного регулятора астмы. В этом варианте осуществления изобретения препарат морозостойкого растения киви наиболее предпочтительно используют путем перорального или местного введения, хотя изобретение не ограничивается указанными путями введения.
Согласно настоящему изобретению заболевания неаллергической реакции воспаления кожи могут включать в себя, но не ограничиваться ими, различные кожные заболевания, вызванные воспалением, такие как прыщи, угри и т.п. Вышеописанные косметические композиции включают в себя любой препарат морозостойкого растения киви, описанного в данном документе (включая любую часть плода, целый плод, стебель, листья, кору или корень и включая любой препарат, или экстракт, или их концентрат, включая высушенные препараты, не экстрагированные, но обработанные, препараты, свежие плоды, сок плода или любой экстракт, или концентрат, или их фракцию), и в одном варианте осуществления сырой экстракт, суммарный водорастворимый экстракт или этилацетатный экстракт морозостойкого растения киви, полезного для профилактики, лечения и/или улучшения кожного воспаления у пациента.
Другие неаллергические воспалительные заболевания, которые можно предотвращать или лечить, используя композиции и способы, описанные в данном документе, включают в себя, но ими не ограничиваются, различные дерматиты, системную красную волчанку (SLE), воспаление сетчатки, гастрит, ретинопатию, гепатит, энтерит, панкреатит, нефрит и пр. состояния, ослабление иммунного ответа Th2-типа и/или усиление иммунного ответа Th1-типа является благоприятным.
Другой целью настоящего изобретения является обеспечение способа лечения и/или предотвращения вирусной инфекции у млекопитающего, включающего в себя введение указанному млекопитающему эффективного количества любого описанного здесь препарата морозостойкого растения киви (включая любую часть плода, целый плод, стебель, листья, кору или корень и включая любой препарат, или экстракт, или их концентрат, включая высушенные препараты, неэкстрагированные, но обработанные, препараты, свежие плоды, сок плода или любой экстракт, или концентрат, или их фракцию), и, в одном варианте осуществления, сырой экстракт, суммарный водорастворимый экстракт или этилацетатный экстракт морозостойкого растения киви, вместе с фармакологически подходящим носителем.
Предпочтительные вирусы, от которых защищают млекопитающее путем профилактики или лечения вирусной инфекции, включают в себя, но ими не ограничиваются, вирусы Коксаки, цитомегаловирусы, вирусы Эпштейна-Барр, флавивирусы, вирусы гепатита, вирусы герпеса, вирусы гриппа, вирусы гриппа, вирус свинки, вирусы папилломы, вирусы парагриппа, парвовирус, вирусы бешенства, респираторные синцитиальные вирусы, ретровирусы и вирусы ветряной оспы.
Среди этих вирусов наиболее предпочтительны ретровирусы, вирусы герпеса и вирусы гепатита, причем вирусы, вызывающие лейкемию, лимфотропные вирусы, вирусы саркомы и лентивирусы, как другие вирусы иммунодефицита или опухолевые вирусы, являются даже более предпочтительными. Особенно предпочтительны лимфотропные вирусы, от которых защищают млекопитающее путем профилактики или лечения вирусной инфекции, включают в себя T-лимфотропные вирусы, такие как человеческие T-клеточные лимфотропные вирусы (HTLV, такие как HTLV-I и HTLV-II), бычьи вирусы лейкемии (BLV) и кошачие вирусы лейкемии (FLV). Особенно предпочтительные лентивирусы включают человеческий (HIV), обезьяний (SIV), кошачий (FIV) и собачий (CIV) вирусы иммунодефицита, причем HIV-I и HIV-2 являются более предпочтительными.
Другой целью настоящего изобретения является обеспечение способа лечения и/или профилактики рака у млекопитающего, включающего в себя введение указанному млекопитающему эффективного количества любого препарата морозостойкого растения киви, описанного в данном документе (включая любую часть плода, целый плод, стебель, листья, кору или корень и включая любой препарат или их экстракт, включая высушенные препараты, не экстрагированные, но обработанные, препараты, свежие плоды, сок плода, или любой экстракт, или их фракцию), и в одном варианте осуществления сырой экстракт, суммарный водорастворимый экстракт или этилацетатный экстракт морозостойкого растения киви, вместе с фармакологически подходящим носителем.
Раковые опухоли, для лечения и профилактики с использованием способов и композиций согласно изобретению, включают в себя, ими не ограничивясь, меланомы, плоскоклеточную карциному, рак молочной железы, карциному головы и шеи, рак щитовидной железы, саркому мягких тканей, саркому костей, тестикулярные опухоли, рак предстательной железы, рак яичников, рак мочевого пузыря, опухоли кожи, раковые опухоли мозга, ангиосаркому, гемангиосаркому, опухоль тучных клеток, первичные опухоли печени, легочные опухоли, опухоли поджелудочной железы, желудочно-кишечные опухоли, клеточную карциному почки, гематопоэтическую неоплазию и их метастатические опухоли.
В любом из описанных выше способов лечения или предотвращения заболевания или состояния препарат морозостойкого растения киви может применяться в сочетании с другим видом терапии или композиции, которые благотворны для лечения конкретного состояния. В этих вариантах осуществления морозостойкое растение киви может рассматриваться как дополнение к обычному лечению, повышающие возможности улучшения лечения или облегчения симптомов у пациента. Особенно предпочтительные типы обычно используемых агентов или вариантов терапии, которые могут использоваться вместе с препаратом морозостойкого растения киви согласно изобретению, включают в себя, но ими не ограничиваются, стероиды (включая кортикостероиды и включая пероральные агенты, ингаляции и инъекции), антигистаминные средства (любого типа, включая системные, местные, ингалируемые), антитела (например, анти-IgE, анти-IL-10), антибиотики, циклоспорины, антимикотики, регуляторы функции внешнего дыхания, анальгетики, β-агонисты (длительного или кратковременного действия), модификаторы лейкотриена (ингибиторы или антагонисты рецептора), цитокин или антагонисты рецептора цитокина, ингибиторы фосфодиэстеразы, натрий-хромогликат, недокримил, кофеин, теофиллин, карбобензокси-бета-аланилтаурин, ингибиторы T-клеточной функции и другие противовоспалительные агенты.
В способе согласно изобретению композиции можно вводить любому представителю класса позвоночных, млекопитающим, включая, помимо прочего, приматов, грызунов, домашний скот, лошадей и домашних питомцев. Предпочтительными для защиты пациентами являются домашние питомцы (например, собаки, кошки) и человек, причем человек особенно предпочтителен. Все способы введения приемлемы. Согласно настоящему изобретению, термины "пациент", "объект" и " индивид " могут использоваться взаимозаменяемо.
Пути введения включают пути in vivo, in vitro и ex vivo. Путь еx vivo относится к реализации части регуляторной стадии вне организма пациента. Пути in vivo включают в себя, ими не ограничиваясь, внутривенное введение, внутрибрюшинное введение, внутримышечное введение, внутриузловое введение, внутрикоронарное введение, внутриартериальное введение (например, в сонную артерию), подкожное введение, трансдермальную доставку, внутритрахеальное введение, внутрисуставное введение, внутрижелудочковое введение, ингаляцию (например, аэрозоля), внутричерепное, интраспинальное, внутриглазное, ушное, внутриносовое, оральное, легочное введение, импрегнацию из катетера, внутрикожную, подоболочечную, эпидуральную, интрацеребровентрикулярную инъекцию и прямую инъекцию в ткань. В одном варианте осуществления настоящего изобретения композицию вводят парентеральным путем (например, подкожным, внутрикожным, внутривенным, внутримышечным и внутрибрюшинным путями). Внутривенное, внутрибрюшинное, внутрикожное, подкожное и внутримышечное введения могут выполняться с использованием стандартных в данной области методов. Ушное введение может включать ушные капли, внутриносовое введение может включать носовые капли или внутриносовые инъекции и внутриглазное введение доставка может включать глазные капли. Аэрозольное введение (путем ингаляции) может также выполняться с использованием способов, стандартных в данной области (см., например, публикацию Stribling et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 189:11277-11281, 1992, которая включена в данный документ посредством ссылки). Например, в одном варианте осуществления композиция или вакцина согласно изобретению может быть включена в состав композиции, подходящей для распыляемой доставки с использованием соответствующего ингаляционного устройства или небулайзера. Оральное введение может быть выполнено комплексно с использованием композиции согласно изобретению с носителем, способным противостоять деградации пищеварительными ферментами в желудке животных, например, в составе таблеток или капсул, а также в составе пищевых и питьевых продуктов. Примеры таких носителей включают в себя известные в данной области синтетические капсулы или таблетки. Способы прямого инъецирования особенно полезны для местного введения соединения. Пероральное введение или местное введение являются особенно предпочтительными путями введения или применения согласно изобретению. Пути введения, которые модулируют иммунитет слизистых оболочек, полезны в лечении вирусных инфекций и некоторых аллергических патологических состояний. Такие пути включают в себя бронхиальный, внутрикожный, внутримышечный, внутриносовой, а также и другие - ингаляторный, ректальный, подкожный, местный, трансдермальный, вагинальный и уретральный пути.
Настоящее изобретение более конкретно разъясняется на следующих примерах. Однако следует понимать, что настоящее изобретение никоим образом не ограничено этими примерами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
В следующих примерах показано, что по меньшей мере два специфических экстракта, полученных из A. arguta, обозначенных PG102T и PG102E, обладают ингибирующей активностью в отношении продукции IgE, а также способность регулировать селективные Th1- и Th2-цитокины.
Материалы и методы
Мыши. Самок мышей BALB/c (6-недельного возраста) получали от Daehan Biolink, Co. Ltd. (Korea), содержали в кондиционируемой воздухом и не содержащей патогенов комнате и акклиматизировали по меньшей мере 1 неделю. Все упомянутые ниже экспериментальные методики осуществляли в соответствии с установленными правилами ухода за животными, в соответствии с методическими указаниями Animal Experimental Center в Seoul National University.
Получение различных экстрактов из A. arguta. Морозостойкие растения киви, использованные в этом исследовании, были получены с фермы, специализирующейся на разведении этого плода (Hurstberry Co. Ltd., Oregon, USA) и их идентичность была любезно подтверждена Dr. Ella I. Kolbasina (Moscow Branch of Vavilov Plant Cultivation Research Institute, Russia). Высушенный плод (10 г) экстрагировали 3 раза путем нагревания в дистиллированной воде (DW). Затем его концентрировали, лиофилизировали и растворяли в DW, с получением PG102T в количестве 100 мг/мл. PG102T, растворенный в DW, экстрагировали последовательно с хлороформом, этилацетатом и н-бутанолом, приводя к образованию PG102C, PG102E и PG102B, соответственно. Оставшийся водный слой был назван PG102W. Каждая растворимая в растворителе фракция и готовый водный осадок фильтровали, концентрировали, лиофилизовали и растворяли в концентрациях 100 мг/мл. Все препараты до их использования хранили при -80°C.
Биоанализ в клетках U266B1. Ингибиторные эффекты IgE в LPS-стимулированных В-клетках лимфобластомы человека, U266B1 (ATCC, Manassas, VA), измеряли, как описано Kim и другими с незначительным изменением (Kim et al, Phytother Res 2001; 15:572-6). Уровень человеческого IgE в культуральном супернатанте определяли путем ELISA для человеческого IgE (общий человеческий IgE; AlerChek, Portland, Maine), и жизнеспособность клеток оценивали, используя набор для определения LDH (Takara Bio, Japan).
6
In vitro эффект PG102 на продукцию цитокинов при повторном ответе в OVA-стимулированных спленоцитах. Мыши (7-недельного возраста) были независимо иммунизированы и позднее стимулированы внутрибрюшинными (i.p.) инъекциями 20 мкг яичного альбумина (OVA; класса V; Sigma, St. Louis, Mo), эмульгированного в 2,25 мг гидроксида алюминия (ImjectAlum; Pierce, Rockford, IL), в 0 и 14 дни, соответственно. Несенсибилизированные (интактные) мыши не получали никакого реактива. В 24 день, и OVA-сенсибилизированных, и интактных мышей умерщвляли (n=5/группу) и затем выделяли каждую селезенку для исследования продукции цитокинов в спленоцитах, с использованием повторного ответа, как описано Shibata et al. (Yoshimi et al., J Immunol 2000;164;1314-21). Кратко, выделенные спленоциты были высеяны в 24-луночный культуральный планшет, с конечной концентрацией 5×10 клеток/мл/лунку. Спленоциты инкубировали с OVA в количестве 100 мкг/мл в присутствии PG102T (1 мг/мл), PG102C, PG102E, PG102B, PG102W (все в 0,1 мг/мл) или среды в качестве контроля в течение 3 дней. После инкубации культуральные супернатанты отбирали для определения уровня цитокинов (IL-4, IL-5, IL-12 и IFN-γ) с использованием наборов ELISA (Endogen, Cambridge, MA). Фактически идентичная методика была использована для определения специфической активности PG102T и PG102E.
6
Количественное определение цитокинов и иммуноглобулинов у OVA-сенсибизированных мышей. Мышей иммунизировали и стимулировали, как описано выше. Для оценки эффектов in vivo препаратов PG102 на OVA-вызываемые аллергические ответы, OVA-сенсибилизированным мышам (n=10/группу) перорально вводили PG102T (15 мг/кг/день) или PG102E (1,5 мг/кг/день) с дексаметазоном (DEX, 0,5 мг/кг/день) или DW (100 мкл/мышь/день) в качестве контроля, один раз в день, от 14 дня до 24 дня. Интактным мышам перорально вводили DW. В 21 день брали кровь от каждой мыши, вызвав глазное кровотечение, и образцы выделенной плазмы хранили при -80°C вплоть до использования. Уровень общего IgE определяли с помощью набора для определения мышиного IgE (Shibayagi, Gunma, Japan). Уровни субтипов общего IgG и изотипов OVA-специфического Ig были определены методом сэндвич-ELISA (Hirano et al., J Immunol Methods 1989; 119:145-50). Для количественного определения продукции цитокинов спленоциты были получены от животных на 24 день, ресуспендированы в культуральной среде (RPMI-1640, содержащей 10% FBS), высеяны в 24-луночный планшет (5×10 клеток/мл/лунку), и их инкубировали только с OVA в количестве 100 мкг/мл в течение 3 дней. Спленоциты, выделенные из интактных мышей, культивировали в отсутствии OVA. Уровни IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13 и IFN-γ в супернатантах были определены методом ELISA (Endogen and R&D Systems, Minneapolis, MN).
Анализ иммуноокрашивания. Спленоциты подвергали действию GolgiStop (PharMingen, San Diego, CA) в качестве ингибитора внутриклеточного белкового транспорта в течение 4 часов и подготавливали для определения IL-4 или IFN-γ-продуцирующих клеток. Клетки фиксированы, пермеабилизовали, затем их инкубировали с PE- или FITC-конъюгированными антителами, специфичными в отношении мышиных CD4, IL-4 или IFN-γ, как описано Kyoko et al. (Kyoko et al., J Derm Science 2002;29: 19-25). Для анализа IgE-продуктов клетки инкубировали с PE-конъюгированными антимышиными CD19, а затем - с FITC-конъюгированными антимышиными IgE (все от PharMingen). Затем клетки были исследованы путем анализа селективных лимфоцитов в спленоцитах с использованием клеточного сортера FACSort-анализатора и программы Cell Quest (Becton Dickinson, San Jose, CA). Для анализа методом конфокальной микроскопии спленоциты культивировали с OVA на покровных стеклах в течение 2 дней, фиксировали, пермеабилизовали и окрашивали с использованием FITC-конъюгированного антимышиного IgE и PE-конъюгированного антимышиного CD19, и в конце производили наблюдения на лазерной сканирующей системе MRC-1024 конфокального лазерного изображения (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA), как описано Semper et al. (Semper et al., J Allergy Clin Immunol 2003; 112:141-9).
7
Вестерн-блоттинг. Спленоциты из независимых групп мышей культивировали с OVA в течение 2 дней, собирали (10 клеток/группу), и затем лизировали для получения образцов белка. Иммуноблоттинг проводили с использованием специфических мышиных антител против GATA-3, T-bet, NFATc2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) или β-актина (Sigma) в качестве контроля нагрузки.
Получение РНК и количественная PCR в реальном времени. Суммарную РНК выделяли из спленоцитов, культивированных с OVA в течение 2 дней с использованием TRIzol Reagent (GIBCOBRL, Carlsbad, CA). Выделенную суммарную РНК использовали для PCR с обратной транкрипцией (RT)-PCR в системе AMV RT System (Roche, Mannheim, Germany), затем проводили количественную PCR в реальном времени с использованием системы ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Наборы прямых и обратных праймеров для генов мышей были сконструированы с использованием помощью компьютерной программы Primer Express Software (Applied Biosystems), с получением следующих нуклеотидных последовательностей:
GATA3
прямой 5'-CCTCGGCCATTCGTACATG-3' (SEQ ID NO:1)
обратный 5'-CGTAGTAGGACGGGACGTGG-3' (SEQ ID NO:2)
T-bet
прямой 5'-TGTGGATGTGGTCTTGGTGG-3' (SEQ ID NO:3)
обратный 5'-ATAAGCGGTTCCCTGGCAT-3' (SEQ ID NO:4)
NFATc2
прямой 5'-GCACATAAGGCCATCAGCTCA-3' (SEQ ID NO:5)
обратный 5'-TCGCCAGAGAGACTGGCAA-3' (SEQ ID NO:6)
GAPDH
прямой 5'-TGCAGTGGCAAAGTGGAGATT-3' (SEQ ID NO:7)
обратный 5'-TTGAATTTGCCGTGAGTGGA-3' (SEQ ID NO:8)
Различия в уровнях мРНК клеточных генов между всеми группами мышей были вычислены из пересчета количественного значения ΔCt.
Статистика. Данные выражали как среднее ±SEM, и различия между средними значениями анализировали, используя непарный критерий Стьюдента. Значение P, меньшее, чем 0,05 или 0,01, которое было вычмслено как одностороннее значение P, считали статистически достоверным.
Результаты
50
50
Эффекты различных препаратов из A. arguta в LPS-стимулированных клетках B-клеточной линии U266B1 человека и OVA-стимулированных мышиных спленоцитов. Авторы изобретения исходно получали суммарный водорастворимый экстракт (PG102T) из A. arguta, и последовательно экстрагировали его хлороформом (PG102C), этилацетатом (PG102E), н-бутанолом (PG102B) и водой (PG102W), с получением четырех фракций различной полярности. Влияние PG102T и этих четырех фракций на продукцию IgE было исследовано с помощью линии клеток U266B1 B-лимфобластов человека (фиг.1). Было обнаружено, что четыре препарата, за исключением PG102W, ингибируют продукцию IgE из LPS-стимулированных U266B1 клеток. PG102E проявил самую высокую ингибиторную активность, оказывая 50% ингибиторный эффект при 25 мкг/мл (IC). PG102T также был активным, его количественное значение ICбыло 126 мкг/мл. Во всех концентрациях, испытанных в этом исследовании, ни PG102T, ни PG102E не показывали никаких цитотоксических эффектов на U266B1 клетках.
В дополнение, авторы изобретения исследовали действие различных препаратов из A. arguta на продукцию цитокинов, участвующих в Th1- и Th2-путях, на модели повторного ответа. Мышей иммунизировали OVA на 0 день и стимулировали на 14 день. Спустя 10 дней мышей умерщвляли и извлекали селезенку для выделения спленоцитов. Спленоциты, полученные от OVA-сенсибилизированных мышей, стимулировали OVA и культивировали в течение 3 дней в присутствии пяти препаратов PG102. Как показано в таблице 1, если клетки были выращены в присутствии OVA, то уровни IFN-γ, IL-4 и IL-5 увеличивались до сотни пикограммов или нанограммов. В случае IL-12 был высокий фоновый уровень, но стимуляция OVA увеличивала уровень приблизительно в 3 раза, до 415±48 пг/мл. Обработка PG102T приводила к почти 150% увеличению уровня IL-12. IFN-γ вел себя иначе. Спленоциты не зараженных животных вырабатывали невыявляемые уровни IFN-γ, но OVA- стимулированные спленоциты секретировали почти 2,5 нг/мл. Обработка PG102T уменьшала уровень IFN-γ на 40%. Если OVA-стимулированные спленоциты были выращены в присутствии PG102T, уровни IL-4 и IL-5 уменьшались на 62% и 39%, соответственно.
Таблица I
In vitro эффекты PG102 на продукцию цитокинов спленоцитами
Обработка
IL-12
IFN-γ
IL-4
IL-5
Интактные
1277±275 (308)
ND
8±1(2)
15±3(2)
Ova-сенсибилизированные
Среда
415±48 (100)
2525±1474 (100)
324±15 (100)
847±137 (100)
PG102T
622±56 (150)*
1478±1214 (59)
124±34 (38)**
523±30 (61)
PG102C
342±12 (82)
ND
90±57 (28)*
84±26 (10)*
PG102E
927±218 (223)*
703±406 (28)
70±5 (22)**
345±166 (41)*
PG102B
575±136 (139)
666±366 (26)
290±44 (90)
623±20 (74)
PG102W
501±128 (121)
897±592 (36)
280±73 (87)
676±61 (80)
Все спленоциты из OVA-сенсибилизированных мышей были стимулированы повторно OVA во время культивирования. Количественные значения выражали в виде средних ±SEM для пяти животных. *, P<0,05 и **, P<0,01, против OVA-стимулированных спленоцитов, обработанных только средой (T-критерий Стьюдента). ND=необнаруживаемые.
PG102E, который оказывал наиболее высокое ингибиторное действие на продукцию IgE в указанном эксперименте, также уменьшал уровни IL-4 и IL-5 на 78% и 59%, хотя индуцировал уровень IL-12 на 220%. В отличие от этого, PG102C уменьшал уровень всех цитокинов, определяемых в этом исследовании, вследствие их цитотоксического действия на спленоциты. И PG102B, и PG102W увеличивали уровень IL-12 и уменьшали уровень IFN-γ, IL-4 и IL-5, но не статистически значимым образом. Взятые вместе, эти результаты показали, что PG102T и PG102E могут содержать соединения(е), которые ингибируют продукцию IgE и контролируют экспрессию селективных Th1- и Th2-итокинов. Основываясь на указанных выше данных, авторы изобретения выбрали для использования в дальнейших in vivo исследованиях два препарата, PG102T и PG102E.
50
50
Определение специфической активности PG102T и PG102E. Основываясь на их плейотропном действии иммунную систему, полагают, что PG102T и PG102E, поскольку они получены из растительного источника, содержат более одного активного соединения. Следовательно, для количественного представления дальнейшего проведения экспериментов авторы изобретения разработали надежный биоанализ на основе ингибиторного действия PG102 на продукцию IL-4 в OVA-стимулированных спленоцитах, как описано выше. Когда клетки стимулировали OVA, уровень IL-4 повышался от невыявляемого уровня до нескольких сотен пикограммов. В присутствии PG102T и PG102E продукция IL-4 ингибировалась дозозависимым образом (фиг.2). Во всех концентрациях, испытанных в этом исследовании, ни PG102T, ни PG102E не оказывали никаких цитотоксических эффектов. Концентрация PG102T, соответствующая 50% ингибиторной активности (IC), составляла 806,9 мкг/мл, а концентрация PG102E составляла 91,8 мкг/мл. Значение IC каждого препарата было определено как одна единица активности и получали сумму единиц. При подсчете специфической активности PG102T и PG102E с использованием суммы единиц и выхода оказалось, что специфическая активность PG102T и PG102E составляет 1,2 единиц/мг и 10,9 единиц/мг, соответственно. Этот способ использовали для контроля качества экспериментальных образцов из A arguta.
Эффекты PG102T и PG102E в отношении продукции Th1- и Th2-цитокинов в OVA-сенсибилизированной мышиной модели. Чтобы подтвердить вышеупомянутые in vitro данные на животной модели, эффекты PG102T и PG102E были исследованы в отношении продукции различных цитокинов, участвующих в изменении Th1- и Th2-путей, с использованием OVA-сенсибилизированной мышиной модели. Мыши были иммунизированы OVA в 0 день и стимулированы на 14 день. После стимуляции животные перорально получали дозу PG102T (15 мг/кг/день=18 единиц/кг/день) или PG102E (1,5 мг/кг/день=16,4 единиц/кг/день), а в качестве контроля - DEX (0,5 мг/кг/день) или DW, каждый день, с 14 дня до 24 день. Интактные мыши, не обработанные OVA, перорально получали DW. Концентрации PG102T и PG102E, использованные в этих экспериментах, соответствуют минимальной дозировке, имеющей максимальную активность, согласно предварительным экспериментам доза-эффект. На 24 день мышей умерщвляли и селезенки выделяли для получения спленоцитов. Спленоциты из каждой группы мышей инкубировали в присутствии OVA в течение 3 дней и культуральные супернатанты отбирали для измерения уровня цитокинов (таблица II). При сравнении с интактными спленоцитами оказалось, что уровень IL-12 был снижен у DW-обработанных мышей. Однако пероральное применение PG102T и PG102E увеличивало их уровень в 1,7 и в 2,6 раз, соответственно. В отличие от IL-12 уровень IFN-γ усиливался OVA-стимуляцией, и PG102T или PG102E далее увеличивали уровень IFN-γ. В отличие от PG102T и PG102E DEX подавлял уровень и IL-12, и IFN-γ.
Таблица II
In vivo эффекты PG102 на продукцию Th1- и Th2-цитокинов спленоцитами
Источники
IL-12
IFN-γ
IL-4
IL-5
IL-10
IL- 13
интактные
1353±201 (394)
ND
ND
ND
77±54(2)
23±17 (1,5)
OVA-сенсетизированные
DW
343±33 (100)
1023±19 (100)
460±42 (100)
1345±68 (100)
3254±298 (100)
1564±132 (100)
PG102T
584±136 (170)*
1970±142 (193)**
258±31 (56)*
913±79 (68)*
1812±296 (56)**
1220±96 (78)
PG102E
889±68 (259)**
1778±237 (174)*
164±4 (36)*
412±45 (31)**
1591±114 (49)**
976±304 (62)
DEX
227±44 (66)
224±118 (22)
28±21 (6)*
160±159 (12)*
392±157 (12)**
912±371 (58)
Все спленоциты из OVA-сенсибилизированных мышей были стимулированы повторно OVA. Количественные значения выражали в виде среднего ±SEM для десяти животных. *, P<0,05 и **, P<0,01, против DW-обработанные мыши (T-критерий Стьюдента). ND=необнаруживаемые.
Уровень всех цитокинов Th2, определяемых в этом исследовании, сильно увеличивался в OVA-стимулированных спленоцитах. Однако обработка PG102T подавляла OVA-опосредованную гиперпродукцию IL-4, IL-5 и IL-10 на 44%, 32% и 44%, соответственно. PG102E также ингибировал уровень этих трех цитокинов на 64%, 69% и 51%, соответственно. DEX также понижал концентрацию всех трех цитокинов. IL-13 уменьшался под действием или PG102, или DEX, но не статистически значимым образом. Взятые вместе, эти результаты показали, что и PG102T, и PG102E могут контролировать продукцию селективных Th1- и Th2-цитокинов. В отличие от DEX, который подавлял фактически все цитокины неотличимым образом, PG102T и PG102E, по-видимому, обладают отличающимися биологическими активностями, которые могут по-разному модулировать продукцию Th1- и Th2-цитокинов.
Эффекты PG102T и PG102E на плазматические уровни изотипов иммуноглобулина. Вышеупомянутые результаты показали, что PG102T и PG102E могут подавлять Th2-опосредованную гиперпродукцию IgE in vivo. Следовательно, определяли то, может ли пероральное введение PG102T и PG102E OVA-сенсибилизированным мышам контролировать плазматические уровни IgE и других иммуноглобулинов. На 21 день такого же эксперимента, какой был описан выше, интактные мыши продуцировали примерно 140 нг/мл общего IgE, но сенсибилизация OVA увеличивала его уровень приблизительно в 20 раз. Когда животных обрабатывали PG102T и PG102E, плазматический уровень общего IgE уменьшался примерно в 2 раза. Способность PG102T или PG102E к подавлению уровня общего IgE в плазме была сравнима с таковой DEX. При измерении уровня различных субтипов IgG оказалось, что как PG102T, так и PG102E уменьшали уровень Th2-опосредованного IgG1, тогда как уровень Th1-опосредованного IgG2a был сильно повышен статистически значимый образом. Во всех случаях уровень IgG2b значительно не изменялся (таблица IIIA).
Практически идентичный результат был получен при определении уровней OVA-специфических субтипов IgE и IgG (таблица IIIB). Пероральная обработка PG102T или PG102E уменьшала уровень OVA-специфических IgE и IgG1, тогда как увеличение уровня OVA-специфического IgG2a более чем в 2 раза. Эти результаты, вместе с данными по различным Th1- и Th2-цитокинам, показали, что PG102T и PG102E содержат соединения, которые могут регулировать баланс Th1 и Th2, в конечном итоге приводя к увеличению уровня IgG2a и уменьшению уровней IgE и IgG1.
Таблица III
Эффекты PG102 в отношении плазматических уровней суммарных и OVA-специфических изотипов иммуноглобулина
A.
Источники
Общий Ig
IgE (нг/мл)
IgGl (мкг/мл)
IgG2a (мкг/мл)
IgG2b (мкг/мл)
Интактный
139±23 (5)
450±81 (26)
46±1 (159)
229±52 (85)
OVA-сенсибилизированные
DW
2783±485 (100)
1700±21 (100)
29±3 (100)
270±36 (100)
PG102T
1669±319 (60)*
1009±443 (59)*
67±4 (231)*
325±17 (120)
PG102E
1271±247 (46)*
1446±288 (85)
44±4 (152)*
220±65 (81)
DEX
1190±317 (43)*
1614±36 (95)
41±7 (141)
313±82 (116)
B.
Источники
OVA-специфический Ig (% контроля от OD)
IgE
IgGl
IgG2a
IgG2b
Интактный
13±1
5±1
17±1
51±13
OVA-сенсибилизированные
DW
100
100
100
100
PG102T
29±7**
76±7*
217±54*
104±12
PG102E
27±8**
69±9*
304±53**
84±9
DEX
27±8**
79±11*
89±25
84±9
Значения соответствуют среднему ±SEM для десяти животных. *, P<0,05 и **, P<0,01 против DW-отработанных мышей (T-критерий Стьюдента). Поскольку OVA-специфических антител не было в наличии, относительный уровень антител подсчитывали как процент от конроля OD. OD=оптическая плотность.
Эффекты PG102T и PG102E на популяцию T- и B-клеток в спленоцитах. Для понимания клеточных основ описанных выше активностей PG102T и PG102E авторы изобретения исследовали вопрос о том, как применение PG102 действует на популяции T-клеток и B-клеток, представленных в спленоцитах. Спленоциты были выделены из OVA-сенсибилизированных и интактных мышей и выращены в присутствии OVA в течение 2 дней, с последующим FACS-анализом и анализом методом конфокальной микроскопии. Как описано на фиг.3A, OVA-стимуляция увеличивала соотношение CD4+IL-4+ клеток от 4,7% до 9,3%. Применение PG102T или PG102E уменьшало количество более чем на 30%. В отличие от этого, клетки CD4+IFN-γ+ были незначительно повышены, от 7,2% до 9,2 или 9,6%, когда животных обрабатывали PG102T или PG102E, хоть статистически и незначимым образом. Было незначительное изменение в количестве обоих типов клеток у DEX-обработанных животных. Эти результаты показали, что PG102T и PG102E способны регулировать соотношение IL-4- и IFN-γ-продуцирующих T-клеток.
Затем авторы изобретения анализировали эффекты PG102T и PG102E в отношении IgE-продуцирующих B-клеток. При сравнении с обработкой DW, пероральное введение PG102T или PG102E приводило примерно к 40% уменьшению количества CD19+IgE+ B-клеток. DEX уменьшало количество таких B-клеток более чем на 60% (фиг.3B). Анализом конфокальной микроскопии дополнительно обнаружили, что происходит значительное уменьшение уровня продукции IgE в любой взятой B-клетке. Интенсивность сигнала IgE в B-клетках резко увеличивалась у OVA-сенсибилизированных мышей, но значительно снижалась, если животных обрабатывали PG102T. Оказалось, что эффекты PG102E является более сильнодействующим, чем PG102T, так как уровень интенсивности флуоресценции в дальнейшем уменьшался. Эти результаты показывают, что PG102T и PG102E не только уменьшают количество IgE-продуцирующих B-клеток, но и подавляют продукцию IgE в самих B-клетках.
Влияние PG102T и PG102E на клеточные факторы транскрипции. Для понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе биологических активностей PG102T и PG102E, было исследовано то, обладают ли эти два препарата какими-либо эффектами в отношении клеточных факторов транскрипции, вовлеченных в Th1- и Th2-пути. Это было сделано потому, что эффекты PG102T или PG102E в отношении столь многочисленных цитокинов и IgE можно было бы более просто объяснить, если PG102 прямо или косвенно регулирует факторы транскрипции. Хорошо известно, что факторы транскрипции, включая GATA-3, T-bet и NFATc2, играют главную роль в уравновешивании Th1/Th2-ответов (Lee et al., J Exp Med 2000;192:105-15; Ting et al, Nature 1996;384:474-8; Lighvani et al., Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98:15137-42; Szabo et al., Cell 2000; 100:655-69; Kiani et al., Blood 2001; 98: 1480-8.). Спленоциты, выделенные из OVA-сенсибилизированных мышей, культивировали в течение 2 дней, как описано выше, и подготавливали для иммуноблоттинга. Уровень белка GATA-3 был сильно снижен и в PG102T, и PG102E, в то время как уровень T-bet и NFATc2 был повышен (фиг.4A). DEX подавлял все эти факторы транскрипции, тестируемые так, как сообщалось ранее (Adcock, Pulm Pharmacol Ther 2001; 14:211-9).
Чтобы проверить, на каком уровне происходит эта регуляция, определяли уровни мРНК соответствующих факторов транскрипции с использованием количественной PCR в реальном времени (фиг.4B). PG102T-обработка уменьшала уровень мРНК GATA-3 почти в 3 раза, в то же время увеличивая уровни мРНК T-bet и NFATc2 приблизительно в 14 раз и в 2 раза, соответственно. Интересно отметить, что PG102E, который проявлял более высокую биологическую активность в отношении ингибирования IgE, изменял уровни GATA-3, T-bet и NFATc2 в меньшей степени, чем PG102T. DEX снижал уровни и GATA-3, и NFATc2, и незначительно повышал уровень T-bet. Эти результаты показали, что PG102T и PG102E могут контролировать продукцию цитокинов Th1/Th2 путем регуляции уровня факторов транскрипции, таких как GATA-3 и T-bet, на уровне РНК.
Обсуждение
Биологические активности PG102T и PG102E, обнаруженные в этом исследовании, убедительно доказывают, что экстракты из A. arguta являются превосходными кандидатами в качестве мощного и специфического противоаллергического агента. И PG102T, и PG102E снижали количество IgE-продуцирующих B-клеток, а также количество IgE, продуцируемое B-клетками, приводя в конечном итоге к уменьшению уровня плазматического IgE. Оказалось, что PG102 обладает такой биологической активностью, изменяя баланс Th1 и Th2 путем уменьшения уровня селективных Th2-цитокинов и увеличения уровня Th1-цитокинов.
Эффекты, оказываемые PG102T и PG102E на клеточные факторы транскрипции, могут объяснить как два препарата работают на молекулярном уровне. И PG102T, и PG102E уменьшали уровень GATA-3, повышая при этом уровень T-bet и NFATc2. GATA-3 известен как сильный трансактиватор промотора IL-5 и энхансерного элемента IL-4 (Lee et al., J Exp Med 2000;192:105-15; Ting et al., Nature 1996;384:474-8). T-bet вовлекается в коммитирование Th1-клеток путем индукции синтеза IFN-γ в Th1-клетках (Lighvani et al., Proc Natl Acad Sci USA 2001;98:15137-42; Szabo et al., Cell 2000; 100:655-69). В недавних исследованиях также сообщалось, что T-bet регулирует переключение на IgG2a-изотип и продукцию IFN-γ в B-клетках (Gerth et al., Int Immunol 2003;15:937-44). Данные авторов изобретения согласуются с такими известными функциями соответствующих факторов транскрипции, как отрицательная регуляция эффекта GATA-3-зависимой экспрессии IL-4 и IL-5 и положительная регуляция T-bet-зависимой продукции IFN-γ и IgG2a в спленоцитах.
В отличие от T-bet и GATA-3, NFATc2 является не селективно экспрессируемым антиген-индуцированным фактором транскрипции. Хотя этот белок связывается с энхансером IL-4 и промотором IFN-γ в стимулированных Th-клетках, предполагается, что NFATc2 играет более важную роль на пути продвижения интактных T-клеток до эффекторных Th1 клеток. В самом деле, T-клетки мышей NFATc2-/- секретировали намного более высокие уровни IL-4, чем T-клетки дикого типа (Kiani et al., Blood 2001; 98:1480-8; Erb et al., Infect Immun. 2003; 71(11):6641-7). В настоящем исследовании показано, что PG102T или PG102E увеличивают уровень экспрессии NFATc2.
Действительный молекулярный механизм, согласно которому PG102T или PG102E способствуют Th1-ответам и подавляют биосинтез IgE, находится все еще в стадии исследования. Один из возможных вариантов состоит в том, что PG102T или PG102E действуют на антигенпредставляющие клетки, которые играют ключевую роль в Th-дифференцировке путем секреции растворимых факторов, включая IL-12, и экспрессии молекул-костимуляторов, таких как B7-1 (Th1) и B7-2 (Th2) (Kuchroo et al., Cell 1995;80:707-18). Другой возможный вариант состоит в непосредственном воздействии на процесс дифференцировки Th-клеток-предшественников или регуляции IgE-продуцирующих B-клеток.
Регуляторное действие PG102T или PG102E на Th1- и Th2-системы может быть обусловлено многочисленными биологически активными соединениями. Чтобы получить различные препараты PG102 надежным образом, авторы изобретения разработали систему биоанализа, основанную на их действии на продукцию IL-4, главного индуктора переключения на IgE-изотип, в OVA-стимулированных спленоцитах. Это исследование было достаточно чувствительным и воспроизводимым для подсчета специфической активности PG102 и ее использовали его для изучения различных факторов, влияющих на биологические активности PG102, такие как время сбора урожая и разные географические местоположения A. arguta. Это исследование на основе IL-4 в настоящее время используется для очистки активных компонентов, а также контроля качества реагентов PG102, используемых в различных экспериментах.
Данные авторов изобретения о токсичности показывают, что PG102T безвреден. В испытаниях токсичности повторной дозы пероральное применение PG102T (500, 1000, 2000 мг/кг/день) в течение 4-12 недель не вызывало никаких неблагоприятных эффектов у крыс. Эти результаты находятся в полном контрасте с данными, полученными на мышах, которым вводили DEX (0,5 мг/кг/день), у которых резко сократились вес тела и масса селезенки (данные не приведены). Эти данные, описывающие различные биологические активности PG102T и PG102E, показывают, что экстракты A. arguta представляют собой безвредные натуральные препараты с минимальным риском побочных эффектов и могут быть использованы при лечении различных аллергических нарушений.
Пример 2
Следующий пример показывает, что по меньшей мере два специфических экстракта из A. arguta, обозначенных PG102T и PG102E, обладают лечебным эффектом в отношении атопического дерматита.
Мыши NC/Nga были выведены как инбредная линия в 1957 на основе японских декоративных мышей (Nishiki-Nezumi). Мыши оставались нормальными и здоровыми, когда находились в состоянии, свободном от особых патогенов (SPF). Однако, когда их помещали в обычные условия, клинические проявления начинались с инициации поведения расчесывания с 8-недельного возраста, с последующим появлением экзематозного состояния. Своевременно развивающаяся экзема в основном локализована на морде, ушах, шее и в области спины. Пораженные мыши показали каждый из клинических признаков в отдельности, включая кровоизлияние, поверхностную эрозию, сильное сдирание кожи, шелушение, сухость на коже и замедление роста (Hiroshi et al., Int Immunol 1997; 9(3):461-466). В кожных повреждениях наблюдалась инфильтрация многочисленных CD4+ T-клеток и эозинофилов и повышение количества тучных клеток с дегрануляцией. Кроме того, уровень плазматического IgE заметно повышался с 8-недельного возраста, совпадая с появлением кожных повреждений. Инфильтрирующие клетки в кожных повреждениях экспрессировали IL-4, IL-5 и TARC, но мало или не экспрессировали IFN-γ, приводя к проявлению Th2-доминантных иммунных реакций (Masayuki et al., Int Ach Allergy Immunol 2003; 132:355-63; Christian et al., Mol Med Today 2000; 5:209-10). Эти полученные данные, похожие на отдельные признаки, присущи для AD пациентов, предполагая, что NC/Nga мышь может быть превосходной животной моделью для человеческого AD, и также что модуляция Th1/Th2 и подавление биосинтеза IgE может быть терапевтической стратегией, которая может коренным образом улучшить клинические симптомы AD и у людей и у мышей.
Материалы и методы
Животные. Свободные от специфических патогенов (SPF) самки NC/Nga (NC) мышей были куплены в SLC (Tokyo, Japan). Мыши (5-6 недельного возраста) поддерживались в SPF окружении (SPF NC мыши) и обеспечивались автоклавированным питанием и водой в течение по меньшей мере 1 недели перед использованием. Семинедельные, SPF NC мыши были перемещены в воздухо-неконтролируемую обычную комнату (обычные NC мыши). Опыты на животных, соответствующие стандартам, изложены University Animal Care и Use Committee guidelines в Seoul National University.
Пероральное применение PG102T или PG102E. Использованные в этом исследовании PG102T и PG102E были получены из A. Arguta, как описывалось предварительно (Park et al., J. Allergy Clin. Immunol., 116:1151-1157, 2005 и пример 1). Обычных NC мышей делили на три группы (n=6-8/группу) и перорально обрабатывали PG102T (50 мг/кг/день), PG102E (5 мг/кг/день), DEX (2,5 мг/кг/день) или дистиллированной водой (DW; 100 мкл/мышь/день) раз в день от 7 недель до 14 недель. SPF NC мыши, в качестве отрицательного контроля, получали DW.
Эффекты PG102T или PGl02E на развитие дерматита у NC/Nga мышей. Тяжесть дерматита каждой группы мышей оценивалась один раз в неделю от 7-недельного до 14-недельного возраста двумя людьми, не обращавших внимание на варианты распределения, в соответствии с незначительным изменением критерия, описанного Leung et al. (Leung et al., J Allergy Clin Immunol 1990; 85:927-33). Клинические признаки и симптомы, наблюдаемые у обычных NC мышей, начинались с зуда, эритемы и кровоизлияний, с последующим отеком, поверхностной эрозией, сильного сдирания кожи, шелушения и сухости кожи, и задержка развития. До кожных заболеваний делалась отметка, характер изменения царапины наблюдали в течение 20 минут на каждой мыши и индекс зуда оценивали измерением общего времени нанесения царапины для 20 минут. Общая клиническая тяжесть нанесенной отметки AD-похожих повреждений определяли как сумму из индивидуальных сделанных отметок, дифференцированных как 0 (нет), 1 (слабый), 2 (умеренный) и 3 (сильный) для каждого из пяти сигналов и симптомов (зуд, эритема/кровоизлияние, отек, сдирание кожи/эрозия и шелушение/сухость).
Измерение уровня плазматических иммуноглобулинов, цитокинов и хемокинов. Спонтанно индуцированную аллергическую реакцию наблюдали измерением уровня плазматических иммуноглобулинов, включающих IgE и IgG2a, цитокины и хемокины. Кровь собирали из ретро-глазного сплетения с стеклянной капиллярной трубкой при возрасте 7, 10, 12, и 14 недель и разделяли образцы плазмы, хранили при -80°C до использования. Уровень IgE определяли по мышиному IgE набору для обнаружения (Shibayagi, Gunma, Japan) и этот IgG2a измеряли сэндвич- ELISA способом как описано у Hirano et al. (Hirano et al., J Immunol Methods 1989; 119: 145-50). Предел обнаружения составлял 1 нг/мл IgE. Уровни мышиного плазматического IL-4, IL-12, эотаксина и TARC также измеряли набором для ELISA (Endogen, Cambridge, MA and R&D Systems, Minneapolis, MN) согласно заводской инструкции.
6
Выработка Th1/Th2-цитокинов из спленоцитов, полученных из NC/Nga мышей. В возрасте 14 недель обычным NC мышам парентерально вводили PG102T, PG102E, DEX или DW, и SPF NC мышей умерщвляли декапитацией. Для исследования выработки цитокинов из спленоцитов селезенки каждой группы получали, и спленоциты, выделенные из селезенки, ресуспендировали в среде культивирования (RPMI-1640 включает в себя 10% инактивированной нагревом FBS). Суспензию спленоцитов отобрали для 24-луночного культурального планшета, и конечная концентрация составляла 5×10 клетки/мл/лунку. Эти клетки затем инкубировали в отсутствии или присутствии ConA при 2 мг/мл в течение 3 дней. Концентрацию ConA оптимизировали из предварительных эффект-доза экспериментов и не было обнаружено цитотоксичности при концентрации, использованной в этом эксперименте. Следующая инкубация, культуры супернатантов собирали для определения уровня цитокинов (IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13 и IFN-γ) ELISA как описывалось выше.
Анализы общих лейкоцитов и эозинофилов в периферической крови. При 14-недельном возрасте, кровь собирали из каждой группы мышей. Количество общих лейкоцитов и эозинофилов в гепаринизированной крови считали, используя Celldyn hemocytometer (Abbott; Santa Clara, CA).
Гистологические анализы и измерение из эпидермальных и кожных слоев в AD-похожих кожных повреждениях. Для гистологического исследования, малые биопсии получали из кожи головы, шеи и спины обычных и SPF NC мышей при возрасте 14 недель. Кожные срезы фиксировали в 10% фосфатно-буферном формалине (pH 7,2), фиксировали в парафине, резали на 4 мкМ и пропитывали с H&E для обнаружения различных клеток воспалительного инфильтрата. Клетки между эпителием и роговым слоем наблюдали на микроскопе при увеличении 400X. Потом поле зрения микроскопа фотографировали, оба слоя эпидермис и дерму измеряли как расстояние из рогового слоя эпидермиса до базальной мембраны из дермы. Расстояние выражали как среднее из трех случайных полей, для которых были усреднены 5 измерений.
Определение цитокина и хемокина, экспрессирующихся в биопсиях кожи. Уровни IL-4, IL-5, эотаксина и TARC в биопсиях кожи из морды измерялись ELISA. Кратко, ткань из поврежденной кожы морды вырезали, гомогенизировали в лизирующем буфере и затем замораживали/размораживали, повторяя трижды. После центрифугирования в супернатантах, содержавших общий клеточный белок, количественно определяли и использовали для определения уровня цитокинов и хемокинов. Результаты приводили к общей сумме белков, приготовленной из лизата ткани. Образцы белкового лизата приготавливали из кожи лицевой ткани как описывалось выше, так же подвергали вестерн-блоттингу, используя специфические мышиные антитела GATA-3, pSTAT6 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) или β-актин (Sigma) в качестве контроля нагрузки.
Статистика. Данные выражали как среднее ±SEM, и различия между средними количественными значениями анализировали путем непарного критерия Стьюдента. Количественное значение P меньшее, чем 0,05 или 0,01, которая была посчитана как односторонняя количественное значение P, считали статистически достоверным.
Результаты
Пероральное введение PGl02T и PGl02E ингибиторов развития самопроизвольных дерматитов у обычной мыши NC. Для рассмотрения возможных эффектов PGl02 при атопических дерматитах авторы изобретения использовали мышей NC в качестве модели человеческих атопических дерматитов, которая показала атопические дерматито-подобные кожные повреждения с возрастом при обычных заболеваниях. Обычным мышам NC перорально вводили PG102T (50 мг (60 единиц)/кг/день), PG102E (5 мг (54,5 единиц)/кг/день), DEX (2,5 мг/кг/день) или DW (100 мкл/мышь/день), исходя из потребностей на 7 недель и развития атопических дерматитов. Дозировка PG102T и PG102E основана на концентрации, которая вызывает терапевтические эффекты в OVA-сенсибилизированной мышиной модели, используемой в предыдущих экспериментах (смотрите пример 1 и Park et al., J. Allergy Clin. Immunol., 116:1151-1157, 2005). Увеличение в дерматитах оценки тяжести обычных NC мышей, обработанных с DW, показало, что развитие дерматитов прогрессирует возраст-зависимым образом (фиг.5A). Однако пероральное введение PG102T или PGl02E значительно уменьшало сделанную оценку от 9 недели жизни. Улучшение тяжести дерматитов сопровождалось уменьшением в размер нанесенной царапины. Лечение с PGl02T значительно понижало время нанесения царапины на 9 недели жизни. Сходные результаты наблюдались при лечении животных с PG102E (фиг.5B). Кроме того, эти результаты сопоставимы с наблюдениями, сделанными прямым анализом полного клинического зрительного признака мыши (данные не показаны). DEX также уменьшал тяжесть дерматитов и характер измерения нанесения царапин. Эти данные показывают, что PG102T и PG102E могут подавлять спонтанно индуцированные дерматиты в этой модели на животных.
PG102T и PG102E уменьшают выработку IgE и IgG1, тогда как они увеличивают выработку IgG2a в плазме. В дополнение к визуальным клиническим признакам, имитирующим человеческие атопические дерматиты, обычные NC мыши также показывают повышение уровня IgE в плазме после появления дерматитов. Следовательно, было исследовано, может ли пероральное введение PG102T или PG102E контролировать уровень плазматического Th2-опосредованного IgE и IgG1 и Th1-опосредованного IgG2a. От 7 недель, животные перорально питались с PG102T, PG102E, DEX или DW, исходя из потребностей, и образец крови получали на 7, 10, 12 и 14 неделе жизни. На SPF заболевания, NC мыши нормально производили приблизительно 150 нг/мл общего IgE, но когда животные помещались на обычные заболевания, IgE уровень постепенно повышался с возрастом, до почти 17 мг/мл в 14-недельном возрасте. Введение PG102T или PG102E уменьшало уровень плазматического IgE на 10-недельный возраст статистически значимым образом, приводящим к 5-кратному нижнему уровню IgE до конца эксперимента. IgE-пониженный эффект PG102T и PG102E сопоставим с DEX использованием как позитивного контроля (фиг.6A). На 12-недельном, измеряли уровень IgGl, иначе Th2-опосредованного Ig класса. На обычные заболевания, DW-обработанные мыши производили уровень IgG1 больше 5 мг/мл. Однако введение PG102T и PG102E уменьшало этот уровень на 75% и 90%, соответственно. Уровень IgG2a, который относиться к Thl-медиаторам Ig класса, увеличивается приблизительно на 180% у обычных NC мышей, обработанных с PG102T. PG102E также индуцирует уровень IgG2a в плазме (фиг.6B). Эти данные показывают, что PG102T и PG102E могут удерживать развитие дерматитов, понижая уровни IgE и IgG1 и повышая IgG2a.
PG102T или PG102E может регулировать баланс Th1/Th2-цитокинов, вырабатываемых в плазме и спленоцитах. Вышеописанные данные показывают, что PG102T и PG102E эффекты выработки Th1- и Th2-цитокинов. Для понимания активности PG102T и PG102E на молекулярном и клеточном уровнях, уровни IL-4 и IL-12, отображающие Th2- и Th1-метаболический путь, соответственно, измеряется в плазме на 12-недельном возрасте. Сравнение с обычными NC мышами, обработанными с DW, уровень IL-4 понижен в мышах, обработанных с PG102T или PG102E на 60% и 76%, соответственно (таблица IVA). Пероральное введение PG102T или PG102E повышает уровень IL-12 статистически значимым образом.
Авторы изобретения также анализировали эффекты PG102T и PG102E в выработке Th1- и Th2-цитокинов в спленоцитах, выделенных из NC мышей. Мыши были умерщвлены в 14-неделельном возрасте и из их селезенок получали выделенные спленоциты. Спленоциты из каждой группы мышей стимулировали специфическим в отношении T-клеток митогеном, ConA, на 3 день, и определяли уровни различных цитокинов. В присутствии ConA уровень всех Th2-цитокинов сильно повышался, но обработка PG102T или PG102E уменьшала уровни IL-4, IL-5 и IL-10 с 24% до 78% (таблица IVB). DEX также ингибировал уровни всех трех Th2-цитокинов, хотя уменьшение IL-5 под действием DEX было статистически незначимым. На уровень IL-13 не влияли ни PG102, ни DEX.
Таблица IV
Влияние PG102T и PG102E на уровень Th1- и Th2-цитокинов в плазме и культуре спленоцитов
А. Уровни плазмы
Источник
IL-4
IL-12
Обычные NC мыши
DW
474±31 (100)
859±17 (100)
PG102T
189±64 (40)**
1217±140 (142)*
PG102E
113±69 (24)**
1106±77 (129)*
DEX
80±56 (17)**
236±140 (27)
SPF NC мыши
13±5 (3)
1708±116 (199)
В. Селезеночные уровни
Источник
IL-4
IL-5
IL-10
IL-13
IL-12
IFN-γ
Обычные NC мыши
DW
134±17 (100)
680±98 (100)
782+21 (100)
448±1 (100)
656±71 (100)
10407±160 (100)
PG102T
30±6 (22)**
357±52 (53)*
621±1 (79)*
348±7 (78)
957±68 (146)*
15848±2074 (152)*
PG102E
54±7 (40)**
203±6 (30)**
594±19 (76)*
406±11 (91)
1636±42 (249)**
18050±1380(173)**
DEX
54±11 (40)**
531±283 (78)
416±30 (53)**
417±2 (93)
149±22 (23)
10096±236 (97)
SPF NC мыши
12±2 (9)
33±8 (5)
37±3 (5)
ND
166±1 (25)
390±88 (4)
Образцы плазмы были выделены из каждой группы мышей 12-недельного возраста. Все спленоциты из NC мышей стимулироли ConA во время выращивания. Значения выражаются как среднее ±SEM для пяти жывотных. *, P<0,05 и **, P<0,01, против DW-обработанных мышей (T-критерий Стьюдента). ND=необнаруживаемые.
Когда клетки из обычных NC мышей выращивали в присутствии ConA, уровни IL-12 и IFN-γ увеличивались. В SPF NC мышей, уровень IL-12 составлял 166 пкг/мл, но стимуляция ConA повышало уровень 4-кратно. Обработка PG102T или PG102E далее индуцировала уровень IL-12 приблизительно 150% или 250%, соответственно. Уровень IFN-γ также драматично увеличивался в присутствии ConA почти на 11 нг/мл. PG102T введение повышало уровень этого цитокина приблизительно 150%. Оказалось, что PG102E более мощный, чем PG102T. DEX потенциально подавлял уровень IL-12, тогда как это не давал такого эффекта, как IFN-γ. В заключение, PG102T и PG102E увеличивали уровень Th1-цитокинов, тогда как уменьшение этих селективных Th2-цитокинов, в отличие от DEX, который беспорядочно ингибирует экспрессию почти всех цитокинов, измеренных в этом иследовании.
PG102 не только препятствует эозинофилам, но также уменьшает уровень эотаксина и TARC. Кожная инфильтрация воспалительных клеток включает в себя эозинофилы - это важная особенность атопических дерматитов в NC мышах. Потому, что присутствие воспалительных клеток в кожном повреждении может быть результатом их мобилизации из костного мозга в кровь, авторы изобретения первые анализируют количество общих лейкоцитов и эозинофилов в переферической крови 12-недельного возраста. Как показано на фиг.7A, количество общих лейкоцитов обычных NC мышей увеличилось на появление дерматитов. В особенности, the количество эозинофилов значительно увеличилось в DW-обработанных мышах на обычные заболевания, полученные в результате в эозинофилах. Однако PG102T или PG102E введение малого количества обоих общих лейкоцитов и эозинофилов, возможно, способствует для предотвращения эозинофилии.
Изменения в количестве циркулирующих эозинофилов может быть проявлением выработки хемокинов, приводящих к хемоатракции в реакции воспаления (3-6). Следовательно, определяются уровни плазменных эотаксинов и TARC, которые характерны хемоаттрактантам из эозинофилов и Th2-клеток. В обычном окружении, DW-обработанные мыши вызывают увеличение уровня эотаксина и TARC, но их уровни уменьшаться в мышах, обработанных PG102T или PG102E, приблизительно на 25% по 50% (фиг.7B). Имеется небольшое изменение в животных с применением DEX. Эти результаты показывают, что PG102T и PG102E ингибировали выработку эотаксина и TARC, приводя к предотвращению Th2-опосредованной эозинофилии, которая как правило совпадает с появлением дерматитов у NC мышей.
Введение PG102T или PG102E ингибирует инфильтрацию воспалительных клеток в дерму и утолщение эпидермиса и дермы. Улучшение клиники кожного заболевания и ингибирование Th2-ответной реакции PG102T и PG102E также подтверждалась анализами H&E покрашенных срезов 14-недельного возраста. Мыши, питающиеся с DW, показали обозначенное утолщение эпидермиса и дермы, выделяющимся гиперкератозом, инфильтрацией воспалительной клетки и кровоизлияние. Морфологическое изучение показало, что эти инфильтрированные клетки в дерме являются эозинофилами, тучными клетками и лимфоцитами. Однако лечение с PG102T или PG102E в течение 7 недель ингибировало утолщение эпидермиса и дермы и инфильтрацию воспалительных клеток в дерму, приводящее к гистологическому окружению, очень похожему на SPF NC мышей (фиг.8A). Введение DEX также дает похожие результаты, но значительно расширяет адипоциты области. Измерение эпидермальных и дермальных слоев на коже морды и спины также показали, что оба PG102T и PG102E предотвращали гиперплазию эпидермиса и дермы статистически значимым образом (фиг.8B). Эти результаты показали, что пероральный прием PG102T или PG102E может эффективно пресекать развитие дерматитов у NC мышей с маленькими или непобочными эффектами.
PG102 или PG102E уменьшают экспрессию Th2-опосредованных цитокинов и хемокинов, прямо супрессирующих эффект GATAS. Для исследования эффектов PG102T или PG102E в Th2-опосредованных выработкой цитокинов и хемокинов в коже мыши, уровни IL-4, IL-5, эотаксина и TARC измеряли ELISA на 14 неделю рождения. В коже из SPF NC мыши, все четыре протеина слабо выражены, но их уровни were значительно увеличивались в обычных NC мышах. Введение PG102T или PG102E понижало уровни IL-4, эотаксина и TARC на больше чем 30%. Эффект при выраженном IL-5 более выступающий, с его уровнем было увеличение почти на 90%. И наоборот, DEX ингибирует уровни IL-5 и TARC, но не IL-4 и эотаксина (фиг.9A).
Эти находки базируются на выражение транскрипционного фактора, включающего в себя STAT6 и GATA3, определенного иммуноблоттингом. STAT6 и GATA3 хорошо известны как играющие критическую роль в дифференцировке Th2-клеток и выработке Th2-специфических цитокинов и хемокинов (Arakawa et al., Clin Exp Immunol 2004;135(3):505-10; Gunther et al., J Allergy CHn Immunol 2004; 113:987-94; Konishi et al., Proc Natl Acad Sci 2002; 99(17): 11340-5). Как показано на фиг.9B, уровень GATA-3 протеина понижен для обоих PG102T и PG102E. Экспрессия фосфорилированного STAT6 (pSTAT6) также уменьшается в обычных NC мышах, обработанных с PG102T, тогда как это может не быть верным с PG102E. DEX подавлял уровень обоих GATA3 и pSTAT6. Эти результаты демонстрируют, что PG102T и PG102E могут подавлять уровень Th2-специфических цитокинов и хемокинов, ингибирующих экспрессию GATA3.
Обсуждение
AD - это большое аллергическое заболевание, которое обычно начинается во время раннее детства. Характерная фракция пораженных индивидуальное развитие астмы и/или аллергических ринитов в дальнейшей жизни (Leung, Clin Exp Immunol 1997; 107 (suppl. l):25-30). AD возникает в результате дермального воспаления, обусловленного ненормальной иммунной реакцией, в особенности, сверхактивацией Th2-метаболического пути. Авторы изобретения обнаружили, что PG102T и PG102E, водорастворимые фракции, полученные из A. arguta, регулирующие выработку из селективных Th1- и Th2-опосредованных цитокинов и также, что IgE в OVA-сенсибилизированной мышиной модели (смотрите пример 1). Эти данные базируются, на рассуждениях, что экстракты растений могут быть полезными для лечения различных аллергических заболеваний (Mayaumi et al., J Allergy Clin Immunol 2000; 106:159-66; Hisae et al., Phytother Res 2001; 15:506-10). В этом примере, авторы изобретения исследовали любой из двух PG102, который может давать любой действительный терапевтический эффект(-ы) при атопических дерматитах с использованием NC/Nga мышей как системная модель. Результаты показывают, что PG102T и PG102E пресекают развитие спонтанно индуцированных дерматитов, которые, не будучи связаны теоретически, в будущем верится прямо контролируют различные Th1- и Th2-обусловленные факторы, а именно деактивацию IL-4, IL-5, IL-10 и IgE, а также и повышение регуляции IL-12 и IFN-γ. Биологическое последствие такого рода биохимических изменений в NC/Nga мышиной модели включает сильное уменьшение количества эозинофилов в переферической крови, а также и в кожных повреждениях, подавление утолщение эпидермиса и дермы и ингибирование инфильтрации различных воспалительных клеток. Особый интерес представляет собой уменьшение в в местной экспрессии уровней эотаксина, TARC, IL-4 и IL-5. Уровни этих протеинов чрезмерно высокие в кожных повреждениях NC/Nga мышиный рост ниже обычного окружения. Когда животным перорально применяют PG102, однако, эти хемокины и цитокины находятся в действительности на нормальном уровне. Эотаксин, вместе с IL-5, поскольку известно, что мощный хемоаттрактант для эозинофилов, тогда как TARC производится кератиноцитами (и также Th2-клетками) думается для вызывания Th2-клеток, и индуцирования патологической ответной реакции, в основном обусловленной атопическими дерматитами. В этом отношении, имеет смысл отметить, что рецепторами для эотаксина и TARC являются CCR3 и CCR4, соответственно, которые сильно выражены в Th2-клетках (Christian et al., J Clin Invest 1999; 104: 1097-105; Tomomi et al., J Allergy Clin Immunol 2110;107:353-8; Weilie et al., J Clin Invest 2002; 109:621-8; Masayuki et al., IntAch Allergy Immunol 2003; 132:355-63).
Подробный молекулярный механизм(-ы) и точная последовательность нижележащих терапевтических эффектов PG102 наблюдается в NC/Nga мышиной модели, до сих пор исследуется. Возможно, что PG102 первый влияет на клеточные транскрипционные факторы, например GAT A-3, и впоследствии на выражение ключевых цитокиновых игроков, участвующих в Th1- и Th2-системах, таких как IL-4 и IFN-γ, вызывающих каскадную реакцию, приводящей к уменьшению уровня IgE и соответствующих хемокинов (Zhu et al., Nat Immunol. 2004; 1 1:1157-65). Альтернативно, PG102 может первично работать на местном уровне; например, уменьшение уровня эотаксина и TARC, ингибирование их хемоатрактантных функций, понижение количества эозинофилов в системном и местном уровнях и пресечение гистопатологического развития, наблюдаемое у обычной растущей NC/Nga мыши. Активность PG102 может быть связана с многочисленными соединениями, влияющих на различные уровни аллергически связанный биохимический метаболический путь. Полный, оказывается, что PG102 работает в ключе биологических факторов, связанных с атопическим дерматитом в этой животной модели, лечение заболевания из расчета его предпочтительного агента, кроме легко обеспечивающих ослабление симптомов.
PG102T и PG102E получают из съедобных плодов. Никакой токсичности не было обнаружено в экспериментах повторяющейся токсичности дозы, в которых 2000 мг/кг/день, 40-кратно повышен, чем концентрация, используемая в этом исследовании, применяли исходя из ежедневной потребности в течение 12 недель. Вместе с данными из предыдущих экспериментов, включающих OVA-сенсибилизированных мышей, результаты из NC/Nga мышей демонстрируют, что PG102 является невредимым и результативным реагентом для лечения различных аллергических заболеваний, включающих в себя атопические дерматиты. При условии частоты заболеваний атопическими дерматитами, которые увеличиваются во всех больших развитых странах и в действительности не имеют в наличие реагент для основного лечения атопических дерматитов, препараты, такие как описываемые здесь, представляют достижение в данной области.
Пример 3
Следующий пример показывает препарат различных средств, включающих в себя A. arguta, которые используются в следующих примерах.
Растительное сырье
Стебели (состоящие из камыша и плодоносных шпор), корни и кора Actinidia arguta (Sieb. Et Zucc.) Planch, ex Miq. (Actinidaceae) культуральная 'Ananasnaya' собранные в Hurst Berry Farm, Sheridan, OR. Контрольные образцы (#518640), заверенные Mr. Tim Hogan, Collection Manager, University of Colorado Herbarium, The University of Colorado, Boulder, CO и отложенные в одном месте. Растительное сырье высушили воздухом в течение 48 часов и хранили при комнатной температуре до экстракциий или других обработок.
Спелые, готовые к употреблению в пищу плоды A. arguta, были собрали Hurst Berry Farm, немедленно заморозили, погрузили и хранили замороженными (-20°C) до экстракции или других обработок.
Экстракты и другие подготовительные работы
Порошкообразный стебель (126,6 г), порошкообразные корни (79,0 г) и мелкоизмельченная кора (126,2 г) каждый был экстрагирован с дистиллированной водой (1 л) при 94°C в течение 4 часов. Смеси затем фильтровали и фильтрат концентрировали до высушивания роторным выпариванием для получения экстракта стебля (9,9 г), экстракта корня (8,6 г) и экстракта коры (2,4 г).
Двадцать замороженных A. arguta ягод (154,4 г) размораживали при комнатной температуре, раздавливали и экстрагировали с дистиллированной водой (1 л) 91°C в течение 5 часов. Смесь фильтровали, и фильтрат концентрировали для получения 'отвара' экстракта свежих плодов (12,8 г).
Дополнительно свежезамороженное растение киви (341,6 г) размораживали и прогоняли соковыжималкой. Соковыжималкой удаляли кожуру с плода, получали смеси из семян, мякоти плода, и сока. Эту смесь центрифугировали (30 минут, -3500 об/мин) для получения 150 мл сока. Этот сок концентрировали высушивания роторным выпариванием для получения экстракта плодового сока (24,2 г).
Для того чтобы произвести большое количество экстракта эквивалента PG102T (как описано в примере 1), выполняли процесс масштабной экстракции растения киви (Sungil Bioex Co., Ltd., Bibong, Korea). Замороженное растение киви (1242 кг) делили на части (1/4" до 3/8" толщены) и сушили в конвекционной сушилке (65-80°C) до количества влаги 5-20%. Однократную экстракцию (фиг.10) сухого плода (239 кг) выполняли в заключенном в кожух реакторе из нержавеющей стали с внутренним сетчатым фильтром с поддержкой экстракционного груза. Внешний охладитель служил препятствием потери воды во время экстракции. Количество экстракционного раствора (воды) базировалось на экстракции 5-10 раз массы сухих плодов. Емкость экстракционного аппарата нагревали от 0 до 90°C в течение 2 часов путем введения пара в рубашку реактора. Вода (90°C) затем рециркулировала через биомассу с использованием во внешнем контуре рециркуляции в течение 4-12 часов. Впоследствии, использованную биомассу удаляли на продажу и водный экстракт профильтровали через 10-микронный фильтр. Фильтрат затем концентрировали под действием вакуума (-600 mmHg) при 55-65°C в перемешивающем реакторе из нержавеющей стали, оборудованном внешним охладителем и приемным дистиллятом. Как только материал сконцентрировали, его поддерживали при 80°C дополнительно 30 минут для стерилизации экстракта. Полученный материал (101 кг), эквивалентный PG102T, обозначали как FD001. Из этого материала, 3 кг откладывались для дальнейшего исследования. Правила организации производства и контроля качества лекарственных средств использовали во всем процессе.
Создание порошкообразного материала, подходящего для заключения в капсулу и пригодного в клиническом применении, описываемом здесь, FD001 концентрат, произведенный как описано выше, (98 кг) выкачивали с горизонтальной лопастной мешалкой и мешали с уравненным весом, базирующимся на рассчитанном сухом остатке, из микрокристаллической целлюлозы (MCC). Следующие это, однородная смесь переносится на поднос из нержавеющей стали, который располагается в принудительной сушилке с обогревом горячим воздухом (70-80°C) в течение 24 часов. Сухое, комковатое твердое вещество затем притирали в молотковой мельнице Fitzmill типа для производства 40 меш порошка (118 кг). Этот материал инкапсулировали (GMP Laboratories of America, Inc., Anaheim, CA) в капсулы, имеющие размер 300 мг или 600 мг, каждая содержит 1:1 смеси FD001 и MCC, для использования в собачьих и человеческих клинических испытаниях.
Сухой плод A. arguta (7,0 г) из обрабатанного-взвешенного материала делили на части и сушили, как и в вышеописанном начальном шаге (но не подвергали однократному экстрагированию), превращали в порошок и материал выделяли с водой (250 мл) 25°C в течение 4 часов. Смесь фильтровали и фильтрат концентрировали до суха роторным выпариванием обеспеченного водной вытяжкой комнатной температуры из сухого плода (4,2 г).
2
FD001 (79,9 г) смешивали с 1,5 л дистиллированной HO и этот раствор последовательно выделяли с четырьмя 500 мл частями этилацетата (EtOAc). Объединенные органические слои и водный слой концентрировали досуха в вакууме, получали в результате экстракт EtOAc (7,4 г) и водосодержащий остаток (41,5 г).
Пример 4
Следующий пример описывает in vitro тестирование иммуномодулирующей активности в A. arguta препаратах.
Назначением этого исследования является сравнение относительной способности различных экстрактов и препаратов, производящихся из A. arguta для изменения выработки цитокинами (IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 и IFNγ) в культуре спленоцитов, полученной из яичного альбумина (OVA, класс V, Sigma)-сенсибилизированных мышей с использованием ELISA (Quantikine kits, R&D systems) анализа. Следующие образцы (приготовленные как описано в примере 3 выше) были исследованы: FD001 (PG102T), концентрат сока плода, и экстракт EtOAc.
Выделение и культивирование спленоцитов
6
6
Самок мышей Balb/c (Harlan, Indianapolis, IN) сенсибилизировали инъекцией IP 20 мкг OVA на 0 и 14 день. На 24 день, после умерщвления путем дислокации шейных позвонков, селезенки асептически выделяли из каждой мыши и немедленно обрабатывали для получения культуры спленоцитов стерильным способом. Селезенку разобщали в присутствии 10 мМ HEPES забуференной среды RPMI-1640, мягко выжимали ткани через отверстия 70-микронного нейлонового сита, используя поршень 3 cc шприца. Агрегаты крупных клеток удаляли из полученной суспензии, используя FCS-градиент. Затем спленоциты центрифугировали (1500 об/мин, 5 минут) и полученный дебрис обрабатывали лизирующим буфером RBC (10 минут, RT) для удаления контаминирующих эритроцитов. Бульшая часть лизирующего буфера RBC удалялась центрифугированием (1500 об/мин, 5 минут) и осажденные спленоциты затем промывали 3×10 мМ HEPES забуференной средой RPMI-1640. После конечной отмывки осажденные спленоциты ресуспендировали в объеме RPMI-1640, содержащей 10% FCS и Penn/Strep (полная среда), предназначенном для получения конечной плотности клеток 5×10 клеток/мл. Для каждого анализа 5×10 спленоцитов высевали в отдельные лунки 24-луночного планшета. На 3 день супернатанты из этих лунок собирались и замораживались в препарате для определения экспериментальных результатов.
6
Контрольные культуры спленоцитов также получали от интактных (несенсибилизированных) мышей описанным выше способом и высевали в отдельные лунки 24-луночного планшета для достижения конечной плотности клеток 5×10 клеток/мл. Эти спленоциты адаптировались в среде RPMI-1640, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, Penn/Strep, и их дополнительно обрабатывали. На 3 день супернатанты из этих лунок собирали и замораживали, используя в дальнейшем в эксперименте в качестве отрицательного контроля.
Стимуляция культур спленоцитов препаратами A. arguta
6
Десять OVA-сенсибилизированных мышей использовали для каждого исследуемого препарата. Спленоциты каждой мыши высеивали (5×10клеток/мл) на 8 отдельных лунок 24-луночного планшета в полной RPMI-1640 среде, содержащей 100 мкг/мл OVA, 0,5% DMSO и или без, или выбранную концентрацию каждого из специфических исследованных препаратов. 6 из 8 лунок были разделены на 2 набора по 3 лунки. Каждую лунку в наборах из 3 обрабатывали препаратами A. arguta в концентрации или 0,25, 1,0 или 10 мг/мл. Чтобы служить в качестве положительного контроля, 7-е лунки обрабатывали 2 мкМ дексаметазоном (DEX), сильным противовоспалительным глюкокортикоидом. 8-е лунки не получали никакой дополнительной обработки и служили в качестве только OVA экспериментального контроля. После 3 дней культивирования супернатанты каждой из 8 лунок на каждую OVA-сенсибилизированную мышь собирали и замораживали. Эти супернатанты использовали для определения уровней цитокинов IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 и IFN-γ, присутствующих в культуральной среде.
Определение уровней цитокинов в культуральных супернатантах
Уровни цитокинов в культуральных супернатантах, полученные из спленоцитов, обработанных препаратом A. arguta, спленоцитов, обработанных DEX, спленоцитов, обработанных только OVA, и необработанных спленоцитов из не сенсибилизированных контрольных мышей, были определены с помощью ELISA. Две повторяющиеся ELISA планшетные лунки использовали для определения уровня каждого цитокина.
Результаты
Эта in vitro работа подтвердила активность PG102T- эквивалентного FD001 (фиг.11), экстракта EtOAc (фиг.12), и концентрата плодового сока (фиг.13) A. arguta. Наблюдали что три препарата (10 мг/мг) вызывали значительное подавление, в различной степени, цитокинов IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, и IFNγ. Большинство определенных эффектов наблюдали на IL-13 и IFNγ для всех исследованных образцов сопоставимых с предыдущей работой in vitro (таблица I; пример 1). Поскольку наблюдали активность в EtOAc экстракте, очевидно, что активный компонент, представленный в FD001, экстрагируют в органических растворителях и далее могут очищать традиционными хроматографическими способами. Значительно, концентрат сока плода также подавлял продукцию цитокинов спленоцитами, показывая, что экстракция растения киви, как показано в примерах 1 и 2, не представляет собой исключительное условие для получения активных препаратов морозостойкого растения киви. Констатировали, что было выявлено относительно низкое подавление цитокинов в концентрате сока плода, предполагая, что процесс высушивания или нагревания, используемый при приготовлении FD001, может быть важен для усиления активности.
Пример 5
Следующий пример описывает сравнение in vitro активности экстрактов неплодовых частей A. arguta, а также альтернативных препаратов плода A. arguta.
Целью этого исследования являлась оценка способности экстрактов A. Arguta, которые получали из других, чем плод, частей растения или из альтернативных препаратов плода (то есть, другие чем экстракты, описанные в примерах 1 и 2), для снижения продукции цитокинов (IL-13 и IFNγ) в культурах спленоцитов, полученных из овальбумин-сенсибилизированных мышей, используя ELISA. Следующие примеры (приготовленные как описано выше) были исследованы: водные экстракты стебля, корня, коры A. arguta, приготовленные как описано в примере 3; препараты "вареных" свежих плодов; концентрат сока плода, приготовленного как описано в примере 3; FD001 (распространенный эквивалент PG102T), полученный как описано в примере 3; порошок FD001, приготовленный как описано в примере 3 (использовали для клинических исследований, описанных ниже); экстракт комнатной температуры высушенного плода A. arguta; EtOAc экстракт, приготовленный как описано в примере 3; и водный остаток, также описанный в примере 3. Кроме того, активность трех известных иммуноподавляющих соединений, циклоспорина, дексаметазона и кверцетина оценивали в качестве контролей.
Выделение и культивирование спленоцитов
Получение спленоцитов осуществлялось идентичным образом с вышеописанными в примере 4.
Стимуляция культур спленоцитов экстрактами A. arguta
6
Клетки спленоцитов из 8 OVA-сенсибилизированных мышей (8 репликантов) использовали для анализа каждого экстракта или исследуемого препарата. 5×10клеток спленоцитов от каждой мыши были высеяны на отдельные лунки 24-луночного планшета в полной RPMI-1640 среде, содержащей 100 мкг/мл OVA и 25 мМ HEPES (pH 7,3), 1 мл на лунку. Препараты растения киви исследовали в концентрации 1,0, 3,0 и 10 мг/мл.
Анализ циклоспорина, кверцетина и дексаметазона
6
Спленоциты из 8 OVA-сенсибилизированных мышей (8 репликантов) использовали для анализа каждого исследуемого соединения, за исключением кверцетина, где исследовались спленоциты, полученные из 2 только OVA-сенсибилизированных мышей. 5×10спленоциты от каждой мыши были высеяны на отдельные лунки 24-луночного планшета в полной RPMI-1640 среде, содержащей 100 мкг/мл OVA и 25 мМ HEPES (pH 7,3), 1 мл на лунку. Циклоспорин исследовали в концентрации 0,0083, 0,083 и 4,15 мкМ. Дексаметазон исследовали в концентрации 0,01, 0,1 и 1 мкМ. Кверцетин исследовали в концентрации 1, 10 и 25 мкМ. Лунки обрабатывали 1 мкМ дексаметазоном, сильным противовоспалительным глюкокортикоидом, служащим в качестве положительных экспериментальных контролей. Лунки, получающие только полную RPMI-1640 среду, содержащей 100 мкг/мл OVA и 25 мМ HEPES (pH 7,3), служили в качестве только OVA экспериментальных контролей. После 3 дней культивирования супернатанты собирали и замораживали. Эти супернатанты использовались для определения уровней IL-13 и IFN-γ, представленных в различной культуральной среде, в исследуемых экспериментальных состояниях.
Определение уровней цитокинов в культуральных супернатантах
Уровни цитокинов в культуральных супернатантах из всех обработанных и контрольных лунок были определены ELISA. Две повторяющиеся ELISA планшетные лунки использовали для определения уровня каждого цитокина.
Основанное на результатах исследования in vitro описанного в примере 4, была проанализирована только экспрессия IL-13 и IFN-γ для назначения оценки уровней активности, представленной в исследуемых материалах.
Результаты
Как показано раньше, более сильное подавление исследованных цитокинов наблюдалось, так как концентрации исследуемых материалов A. arguta увеличились. Обычно, подавление более выражено против IFN-γ. Активность предписанных иммуноподавляющих соединений была сходна с препаратами A. arguta в этом исследовании. Пептид циклоспорин и глюкокортикоидный стероид дексаметазон показал мощную активность (<1 мкМ), как показано на фиг.14A. Флавоноид кверцетин показал мощную активность в незначительно более высоком диапазоне концентрации (1-25 мкМ, фиг.14B). Дальнейшее подтверждение способности EtOAc экстракта к активности FD001 показано на фиг.15A и 15B. Интересно, активность также наблюдалась присутствующей в водных остатках, показывая, что и полярные и неполярные компоненты могут отвечать за in vitro иммуноподавляющий эффект. Порошок FD001, который представлял собой используемый и в собачьих, и человеческих клинических исследованиях (описанных ниже) материал, подтвердили, что являются активными в этом исследовании, как показано на фиг.16A и 16B.
Как описано в примере 4, альтернативные способы получения экстрактов растения киви, но не способы, описанные в примерах 1 и 2, были исследованы. Все полученные из плодов экстракты, которые высушены или свежие, или экстригарованы в воде горячей или комнатной температуры, проявляющие сходную активность в этом исследовании, как показано на фиг.17A и 17B. Основанные на этом анализе, авторы настоящего изобретению предполагают, что существуют несколько конкурентных альтернативных способов приготовления растения киви для терапевтических целей.
Интересно, экстракты горячей воды, приготовленные из коры, корня и ствола A. Arguta, показывали равную или более высокую активность в этом исследовании (фиг.18A и 18B), если сравнивались с FD001 (PG102T) и концентратом сока плода. Эти результаты показывают, что эти другие части растения могут представлять альтернативные источники соединений терапевтически интересных по отношению к регулированию иммунных маркеров или подавления провоспалительных цитокинов.
Пример 6
Следующий пример описывает результаты двойного слепого, плацебо контролированного, амбулаторного исследования эффективности FD001 (PG102T) у взрослых индивидов с атопическим дерматитом умеренной тяжести.
Целью этого исследования является получение предварительного доказательства эффективности FD001 (PG102T), применяемого перорально в период 42 дней, у малого количества взрослых добровольцев с атопическим дерматитом (AD) умеренной тяжести. Дополнительные задачи исследования оценивали толерантность и вариабельность ответа на FD001.
План исследования
Индивиды употребляли FD001 порошок (полученный как описано в примере 3) в двух 600 мг капсулах (600 мг общей дозы FD001) по утрам, или двух капсул плацебо, состоящего из MCC, в течение периода 42 дня, начиная на 1 день исследования. Индивиды были проинструктированы принимать половину стероидных лекарств после 14 дня. Кровь была использована для рутинной биохимии и гематологии в четырех временных точках: на скрининговом осмотре на пригодность, и на 1, 14 и 42 день исследования. Уровни IgE и C-реактивного белка были измерены в крови на 1, 14 и 42 дни. Мочу собирали во все 4 дня для рутинного анализа мочи. Оценки эффективности были сделаны в каждое посещение после скрининга. Индивиды были либо мужчинами, либо женщинами, от 19 до 65 лет возраста, и обычно с хорошим здоровьем. Индивиды имели активный атопический дерматит умеренной тяжести, определенный Physician's Global Assessment (Feldman and Krueger, Annals of the Rheumatic Diseases, 64:ii65-ii68, 2005) оценкой из трех в шкале тяжести от 0 до 4. Индивиды имели AD, включающий минимум 10% площади поверхности тела (BSA). Индивиды применяли в то время местный стероид для лечения AD и не являлись кормящими и беременными. Безопасность и толерантность были оценены с использованием отчета о побочных реакциях и стандартной биохимии крови, гематологии и анализа мочи.
Статистические способы
th
Переменная первичной эффективности представляла собой изменение от исходного уровня в Physician's Global Assessment на 42 день, анализом с использованием критерия Cochran Mantel-Haenszel (Armitage et al, Statistical Methods in Medical Research, 4 Ed., Blackwell, Oxford, 2002). Вторичные переменные представляли собой изменения на 42 день от исходного уровня в симптомах AD (оценки тяжести эритемы, уплотнения, выделений/струпьев и зуда), и общая BSA, как проанализировано с использованием двухвыборочного t-теста. Описательная статистика была представлена для всех исходных и последующих данных лечебной группы на 1, 14, 28 и 42 день. Эти статистические данные включают в себя объем выборки, средние значения, стандартные отклонения, повторяемости, процентные отношения и доверительные интервалы в соответствующих случаях. Результаты из анкет самооценки индивидов были посчитаны и сообщены лечебной группе. Любые неблагоприятные события, наблюдающиеся в течение исследования, регистрировались. Описания неблагоприятный событий включали в себя данные вспышки, данные оконченного или неоконченного события, тяжесть события, определение, принятые меры, принятая терапия и исход. Эти данные были распределены по категориям количеством индивидов, сообщающих о неблагоприятных событиях, системе тела, тяжести, серьезности и взаимосвязь с исследуемым образцом. Сравнения между лечебными группами были сделаны путем сведения в таблицы повторяемость индивидов с одним или более неблагоприятными событиями, классифицированных в терминах MedDRA (Medical Dictionary for Regulatory Activities, http://www.meddramsso.com) во время исследования.
Описательные сводные статистические данные лабораторных значений и связанное с ними изменение от исходного уровня (день 1) были определены для всех клинико-лабораторных оценок. Значения вне нормального интервала были помечены в списках данных. В дополнение, были составлены "таблицы сдвигов", показывающие количество или процент индивидов, которые испытывали изменения лабораторных параметров во время курса исследования (например, изменение от нормального до высокого, основанное на лабораторной нормированной области значений).
Таблица V
группа*
Количество индивидов
отвечающие
% от общего
неотвечающие
% от общего
A
FD001
25
16
64,0
9
36,0
Плацебо
26
11
42,3
14
53,8
B
FD001
18
11
61,1
7
38,9
Плацебо
24
11
45,8
13
54,2
C
FD001
14
8
57,1
6
42,9
Плацебо
17
6
35,3
11
64,7
*A = все индивиды, B = удалены потребители clobestasol & ultravate, C = только потребители HDRCRT-кортикоида или триамцинолона.
Результаты эффективности
В предварительном анализе, проведенном на первых 17 индивидах для осуществления исследования, получили в результате эффективные статистические тренды в двух вторичных конечных точках эффективности: эритема (p=0,13, ITT 17) и уплотнение (p=0,09, ITT 17). Во время предварительного анализа, не обнаружили никаких статистических расхождений в первичных конечных точках эффективности в этой выборке малого размера.
В окончательном анализе на 42 день не было никакой статистической значимости, показанной группой пациентов в переменной первичной эффективности (Physician's Global Assessment) или переменных вторичной эффективности (изменение от исходного уровня в симптомах AD и процентное изменение в BSA). Однако на 14 день наблюдали значительный распределительный сдвиг в первичных конечных точках эффективности. Этот сдвиг, наблюдаемый между 1 и 14 днями, можно увидеть на фиг.19A и 19B для ответов реципиентов плацебо и исследуемого образца, соответственно (обозначенный PGA критерий классификации). Когда индивидов разделили на отвечающие и неотвечающие группы во время анализа на 14 день (Table V, группа A), значительный процент отвечающих наблюдали в группе лечения FD001, тогда как неотвечающие показали значительный процент в группе плацебо. Эти сохраненные результаты относительно не противоречат, если исключаются индивиды с более сильными стероидами (группа B), а также для индивидов только с ослаблением до умеренного стероидного лечения (группа C). Дополнительный анализ после этого выявил статистическую значимость (p=0,02) для первичной конечной точки PGA и самооценки пациента для красноты (p=0,03) на 14 день. Вдобавок, были обнаружены эффективные статистические тренды в самостоятельных оценках на 14 день для зуда и для оценок клинических симптомов для выделений/струпьев (p=0,08 и p=0,07, соответственно). Наблюдаемая эффективность лечебной группы по сравнению с группой плацебо на 14 день посредством PGA конечной точки, распределенной на 42 день. Эти результаты показывают, что использование FD001 (PG102T) в качестве дополнения к местной кортикостероидной терапии может быть благотворным при лечении AD. Результаты лабораторного исследования в течение 1, 14 и 42 дней не показали никакой безвредности, соотнесенной с трендами для любого представленного исследования, включая клиническую биохимию, клинический анализ крови с вариациями, свертывание крови, непрямой билирубин и макроскопию мочи. Никакой разницы не было обнаружено между лечебной группой для IgE, C-реактивного белка или количества эозинофилов.
Результаты безвредности
Ни о каких серьезных побочных событиях не сообщалось для или лечения FD001 или плацебо. Для FD001 сообщалось о 12 несерьезных событиях и 13 для плацебо. Из них, для FD001 были 10 от слабых до умеренных и 2 тяжелых событий, и 13 от слабых до умеренных событий для плацебо. Ни одно из событий не рассматривалось как вероятное или имеющее отношение к исследованию исследуемого образца или плацебо.
Заключения
Запланированные результаты анализа не показали никакой статистической значимости между группами пациентов в первичной и вторичной конечных точках на 42 день. Однако эффективный распределительный сдвиг был обнаружен в первичной конечной точке (PGA) на 14 день. По этой причине проводился последующий анализ для этой временной точки, которая показала статистически значимое различие между группами пациентов на 14-дневную временную точку. Вдобавок несколько вторичных конечных точек показали либо статистически значимые (эритема p=0,03 при самооценке), либо статистически эффективные тренды (улучшение зуда p=0,08 при самооценке и выделения/струпьев p=0,07 в симптомах оценки AD). В исследованиях не сообщалось ни о каких тяжелых побочных событиях. Количество побочных событий, сообщенные для группы и исследуемого образца, и плацебо, были сопоставимы и не связаны с исследуемым образцом. В клинико-лабораторных значениях не обнаружили никаких факторов опасности. Эти данные подтверждают предклинические исследования мелких млекопитающих и построенные на отдельных примерах исследования человека, показывающих, что экстракт плода A. arguta является безвредным и хорошо переносится реципиентами.
Пример 7
В следующем примере описано отобранное случайно, двойное слепое, контролирумое плацебо исследование для оценки использования экстракта морозостойкого растения киви, чтобы уменьшить оценку CADESI (Olivry et al, Vet. Dermatol, 13:77-87, 2002; Hanifm et al, Exp.Dermatol, 10:11-18, 2001; Kunz et al., Dermatology, 1997, 195, 10-19) атопических собак.
Целью этого исследования было оценить эффективность A. arguta экстракта плода FD001 (PG102T) в качестве дополнительной терапии стандартного стероидного лечения атопического дерматита (AD) у собак. Отвечаемость на лечение была оценена с использованием всемирной испытательной оценки, которая включает шкалу CADESI и оценки производителя Pruritis. Дополнительные цели исследования представлены для оценки эффективности исследования эффективности экстракта растения киви в качестве монотерапии, чтобы уменьшить необходимость использования стероидов в управлении клиническими симптомами AD, для оценки безвредности.
План исследования
Был проведен двухнедельный период с низкой дозой (0,2 мг/кг) только стероидов (преднизолон) для определения стероидной чувствительности у собак, по мере сохранения остаточных симптомов AD. Все собаки были здоровы, исключая несезонную AD кожную болезнь. Диагноз AD включал по меньшей мере три положительные реакции на анутрикожный тест кожной аллергии. Собаки получали контрольное лечение от блох (Advantage), и исследовано диетологическое исследование для исключения пищевых аллергий, как главной причины симптомологии. Собаки были свободны от сопутствующих медикаментов, таких как антигистамины и пролонгированно действующие стероиды и свободные от любой вторичной инфекции. Минимальная базовая (день 1) оценка 25 по шкале CADESI потребовалась для включения.
Во время дополнительного лечебного мероприятия (дни 14-42) собаки, перорально получавшие преднизолон (0,2 мг/кг) через день в дополнение к исследуемому образцу. Исследуемые индивиды (направленная запись из 60) съели FD001 порошка (полученного как описано в примере 4) в дозе 30 мг/кг раз в день, или плацебо (MCC), в течение периода 28 дней. Индивиды были отобраны случайно в группы исследуемого образца или плацебо, в соотношении 1:1. Индивиды были оценены с использованием шкалы CADESI и оценки производителя в еженедельных дневниках. Пробы крови собирали для оценки безвредности и вторичных критических точке на первый день периода приема только стероидов и на 1 и 28 день исследования. Анализы этих образцов включали в себя измерение клинического анализа крови, клинической химии, общего IgE, аллергенспецифического IgE и хемокина TARC.
В конце периода дополнительного лечения любые собаки, показывающие улучшение их общей оценки, будут передвинуты на 28 день, открытый помеченный второй период исследования, состоящий из FD001 исследуемого образца (30 мг/кг/день) в качестве монотерапии для AD. У индивидов, испытавших рецидив в симптомах AD или требующих спасательного лечения, будут признаны расстройства лечения второй стадии и прервано исследование. Индивиды, сохраняющие свои улучшения в стадии два, будут признаны отвечающими на лечение. Оценка шкалой CADESI и оценки Pruritis будут проводиться каждые семь дней. Пробы крови были собраны в течение стадии два в 14 и 28 дни. Группа лабораторных исследований крови будет идентична таковой на первой стадии исследования.
Статистические способы
Анализ первичной эффективности будет представлять собой соотношение индивидов с положительным ответом на лечение, основанном на всемирной испытательной оценке с использованием критерия хи-квадрат.Временной анализ может проводиться, когда первая половина направленных по записи закончит исследование. p<0,05 представляется достоверным.
Заключения
th
th
Атопический дерматит представляет собой вторичные наиболее обычную аллергию у собак, случающейся в приблизительно 10% популяции собак (Scott et al., Small Animal Dermatology, 5 Ed., WB Saunders, 500-518, 1995). Обычно, AD у собак имеет склонность к ухудшению с возрастом. Больные животные страдают от повторных кожных и ушных инфекций, которые сильно уменьшают их качество жизни. Несмотря на факт, что AD очень обычное заболевание, возможные терапевтические варианты ограничены. Системные лечения подобно глюкокортикоидам и циклоспорином могут быть эффективными, но обладает возможностью побочных эффектов (Olivry et al., Vet. Dermatol, 13:77-87, 2002; Ryffel, et al., Arch. Toxicol., 53:107-141, 1983). Глюкокортикоиды, имеющие тенденцию к уменьшению эффективности при хроническом использовании, пероральный циклоспорин может быть непомерно высокозатраточным в большинстве выращиваемых собак, и доля успешных попыток антигистаминов часто снижена (Scott et al., Small Animal Dermatology, 5 Ed., WB Saunders, 500-518, 1995). Установление безвредности и эффективности лечения для уменьшения симптомов собачьего AD вероятно представляет собой огромную выгоду. Эффективность FD001, или в качестве дополнительного лечения, или в качестве монотерапии, может уменьшать необходимость использования стероидов в управлении AD у собак. Также предусмотрено, что экстракты растения киви будут использоваться в качестве дополнительной терапии, чтобы уменьшить активность использованных стероидов. Можно допустить, что экстракт мог бы применяться в виде капсулы, порошка, смешанного с едой, или компонента пищи. Диетическая добавка препаратов растения киви может быть эффективной в поддержании здоровой кожи у собак с атопией, при использовании в одиночку или в сочетании с низкой дозой стероидов.
Пример 8
В следующем примере описывается применение A. arguta и его экстракта для регуляции иммунного ответа аллергического и неаллергического воспалительного заболевания.
Целью этого исследования является получение предварительного доказательства эффективности FD001 (PG102T), примененного перорально за период 28 дней, у взрослых добровольцев с аллергическим заболеванием, таким как атопический дерматит (AD), астма или аллергический ринит умеренной тяжести. Второй целью исследования является измерение биологической доступности продукта с использованием альтернативных форм продукции (например, капсулы, концентрат, добавленный к напитку, эмульсия или пищевой компонент). Другой целью исследования является определение эффекта FD001 на уровни провоспалительных маркеров крови, таких как цитокины, хемокины, лейкотриены или антитела, на пролиферацию миелоидных клеток (например, лейкоцитов, макрофагов, тучных клеток и так далее) и на регулируемую экспрессию генов и транскрипционных факторов.
Двойное слепое, контролируемое плацебо, амбулаторное исследование проводится, в котором человек применял FD001, в качестве исследуемого образца или плацебо. Группа в исследовании может включать в себя FD001 как например монотерапию или как например вспомогательную терапию пероральными стероидами умеренных для изменения активности. Альтернативно, лечение стероидами людей с AD может быть местным. Использование стероидов может быть в виде интраназального спрея или ингалятора для людей с астмой и аллергическим ринитом, соответственно. Критерий включения человека, эффективность оценок, безопасность и толерантность и статистические анализы оцениваются с использованием способов, сходных с описанными в примере 6.
Одно проявление аллергии, атопического дерматита представляет собой кожное нарушение у детей и обычно наблюдаются в течение первых 6 месяцев жизни (Spergel and Paller, J. Allergy Clin. Immunol., 112:S128-S139, 2003). Оказывается, распространение AD увеличивается во всем мире, а также других атопических нарушений, включая астму (Larsen and Hanikin, Immunology and Allergy Clinics of North America, 22:1-25, 2002; Wollenberg et al., Clin. Exp.Dermatol, 25:530-534, 2000; Mannino et al., Mor Mortal WkIy Rep CDC Surveill Summ., 47:1-27, 1998; Linneberg et al., Allergy, 55:767-772, 2000). Серьезные негативные эффекты испытуемых пациентов с AD на качество жизни и существующие варианты лечения могут быть источником неблагоприятных побочных эффектов и финансовым бременем и для семьи, и для социума. Кожные проявления атопии часто представляют начало развития атопии. На основе нескольких длительных повторных исследований, приблизительно у половины пациентов AD развивается астма, особенно с серьезным AD, и у двух третей развивается аллергический ринит (Leung et al., J. Clin. Invest., 113:651-657, 2004; Spergel et al., J. Clin. Invest., 101:1614-1622, 1998). Идентификация безопасного и эффективного лечения AD вероятно значительно приветствуется. Эффективность FD001 также может уменьшать количество или активность стероидов или других лекарств, использованных в тактике лечения AD, астмы или аллергического ринита.
В качестве субъекта более позднего рассмотрения дела можно также представить использование экстрактов растения киви, концентратов, других препаратов, или экстрактов других частей растения (например, коры, стебля, корней, листьев), для дополнительного лечения или в качестве монотерапии AD, астмы, аллергических ринитов, или других лейкотриен-опосредованных патологических состояний, таких пищевые аллергии и хронические крапивницы. В качестве логического расширения этой работы в дальнейшем можно исследовать использование продуктов растения киви в качестве терапии аллергических патологических состояний у мелких млекопитающих (например, собак, смотрите также пример 7).
Каждая ссылка или публикация, описанные в данном документе, включены сюда посредством ссылки полностью.
Тогда как различные варианты осуществления согласно изобретению были описаны детально, ясно, что изменения и адаптации этих вариантов осуществления могут придти в голову специалистам в данной области. Следует понимать, однако, что такие изменения и адаптации охватываются настоящим изобретением, в объеме, предусмотренном последующей формулой изобретения.