Новый механизм регуляции внутриклеточного распределения противоопухолевых препаратов в клетках с фенотипом множественной лекарственной резистентности, ассоциированной с функцией АВС-транспортеров

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Т. А. Богуш1, А. Б. Равчеева1, Е. А. Богуш2, Е. О. Игнатова1, Е. А. Дудко1,

К. К. Лактионов2, Б. Е. Полоцкий2, М. И. Давыдов2 НОВЫЙ МЕХАНИЗМ РЕГУЛЯЦИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ В КЛЕТКАХ С ФЕНОТИПОМ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ, АССОЦИИРОВАННОЙ С ФУНКЦИЕЙ АВС-ТРАНСПОРТЕРОВ

1 НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва 2 НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва

Авторы сформулировали гипотезу, согласно которой в опухолевых клетках с фенотипом множественной лекарственной резистентности, ассоциированной с функцией АВС-транспортеров (MDRABC), противоопухолевые препараты, как и фармакологические ингибиторы транспортных белков, при высоких внеклеточных концентрациях могут являться регуляторами собственного внутриклеточного распределения с увеличением накопления в ядре по сравнению с цитоплазмой. Правомочность данного представления подтверждена методом проточной цитофлуориметрии при изучении зависимости внутриклеточного накопления и распределения доксорубицина от его внеклеточной концентрации в диапазоне 7,7 х 10-7—7,7 х 10-6 М. Сходные результаты продемонстрированы при исследовании клеток солидных опухолей, полученных из биопсийного хирургического материала, а также в модельных экспериментах на культурах клеток эритроидного лейкоза человека К562 дикого типа и стабильно трансфицированных геном MDR1. Учитывая, что доксорубицин является универсальным субстратом АВС-транспортеров, авторы считают, что описанный феномен отражает общий механизм регуляции внутриклеточной компартментизации цитостатиков и ингибирования MDRABC-фенотипа опухолевых клеток, а также объясняет чрезвычайно важный феномен эффективности высокодозной химиотерапии при клинически подтвержденной множественной лекарственной резистентности.

Ключевые слова: противоопухолевые препараты, регуляция внутриклеточного распределения, множественная лекарственная резистентность, АВС-транспортеры.

Активация выброса противоопухолевых препаратов из клеток при участии АВС-транспортеров является одной из наиболее частых и универсальных причин развития множественной лекарственной резистентности (MultiDrug Resistance — MDR). Чтобы избежать терминологической неопределенности (многие авторы употребляют термин «множественная лекарственная резистентность», имея в виду множество механизмов резистентности) и указать точный механизм, о котором идет речь, мы называем лекарственную резистентность, ассоциированную с функцией АВС-транспортеров, MDRabc. При этом суть определения «множественная»

© Богуш Т. А., Равчеева А. Б., Богуш Е. А., Игнатова Е. О., Дудко Е. А., Лактионов К. К., Полоцкий Б. Е.,

Давыдов М. И., 2008 УДК 615.277.3.015.4

означает, что резистентность одновременно проявляется в отношении лекарств, различающихся по химической структуре и механизму действия. Это так называемые MDRABC-цитостатики. К ним относится большинство противоопухолевых препаратов, которые широко используются в онкологической клинике, например антра-циклины, подофиллотоксины, камптотецины, таксаны, винкаалкалоиды [4; 5; 7]. В последнее время в эту группу включены препараты платины [10], а также препараты из группы ингибиторов тирозинкиназ — иматиниб (Гливек) [9; 11; 12] и гефитиниб (Иресса) [8; 13].

Фармакологические ингибиторы функции АВС-транспортеров позволяют преодолеть фенотип MDRABC, увеличивая внутриклеточное накопление препаратов. При этом в исследованиях, выполненных в последние годы, показано, что ингибирование функции АВС-транспортеров приводит к изменению внутриклеточного

распределения MDRABC^OTOCTaTHKOB с увеличением накопления в ядре по сравнению с цитоплазмой [2].

Мы сформулировали гипотезу о том, что внеклеточная концентрация MDRАВС-цитостатиков, как и фармакологические ингибиторы, является регулятором их ком-партментизации в клетках с фенотипом множественной лекарственной резистентности. В основе этого может лежать блокирование функции АВС-транспортеров при увеличении внеклеточной концентрации препарата до уровня, при котором плазматические транспортеры не способны справиться с его лавинообразным поступлением в клетку. В результате нарастающая концентрация цитостатика в цитоплазме может достичь столь высокого уровня, с которым будут не в силах справиться уже защитные ядерные АВС-транспортеры, и препарат перейдет из цитоплазмы в ядро. А это означает, что произойдет резкое, превышающее ожидаемое от повышения концентрации усиление специфической активности препарата, т. е. преодоление фенотипа множественной лекарственной резистентности.

Для проверки правильности этого предположения в настоящей работе исследована зависимость внутриклеточного накопления и распределения между цитоплазмой и ядром универсального субстрата АВС-транспортеров — противоопухолевого антрациклинового антибиотика до-ксорубицина [6].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования ex vivo проведены на клетках опухолей различной локализации: немелкоклеточного рака легкого, рака толстой кишки, желудка, пищевода и предстательной железы. Клетки инкубировали в течение 5 мин с доксорубицином («Pharmacia & Upjohn», Италия) в диапазоне концентраций от 7,7 х 10-7 до 7,7 х 10-5 М, после чего суспензию фиксировали формалином до конечной концентрации 10%.

Одновременно с этим во всех исследуемых опухолях оценивали функциональную активность АВС-транспортеров (фенотип MDRabc) по реакции внутриклеточного накопления доксорубицина на воздействие специфических ингибиторов транспортных белков Pgp и MRP — верапамила и генистеина соответственно. Для этого в суспензию клеток добавляли верапамил («Knoll», Германия, конечная концентрация 3,3 х 10-5 М), генистеин («Sigma», США, конечная концентрация 3,2 х 10-6 М) или раствор Хенкса («ПанЭко», Россия; контрольная проба). Клетки инкубировали в течение 20 мин при температуре 37 °С, затем во все пробы добавляли раствор доксорубицина до конечной концентрации 7,7 х 10-5 М, инкубировали в течение 5 мин, после чего суспензию фиксировали формалином до конечной концентрации 10%.

Аналогичные исследования проведены в модельной системе на культуре клеток эритроидного лейкоза человека К562 дикого типа и стабильно трансфицированных геном MDR1, кодирующим синтез АВС-транспортера Pgp.

Во всех экспериментах измерение внутриклеточной флуоресценции доксорубицина проводили на проточном цитофлуориметре FACScan («Becton Dickinson») при X = 488 нм, X = 576 нм, при значении шторки 100, в

ex ' ем 11 1 '

области специфических пиков за областью автофлуоресценции, со скоростью 500 клеток/с, число анализируемых событий 10 000. Анализ гистограмм распределения клеток по интенсивности внутриклеточной флуоресценции доксорубицина проводили с помощью программы «WinMDI» по показателям средней флуоресценции клеток в исследованной популяции, а также раздельно по субпопуляциям с высокой и низкой флуоресценцией клеток. Метод получения суспензии клеток из биопсийных образцов опухоли, проведения экспериментов и обработки полученных результатов описан ранее [1].

Не останавливаясь на методических деталях, отметим наиболее важный момент, положенный в основу разработанного нами подхода к дифференцированной оценке активности АВС-транспортеров, контролирующих цитоплазматическое и ядерное накопление MDRABC-препаратов. Это — уникальность доксорубицина как флуоресцентного зонда: при взаимодействии с ДНК интенсивность его флуоресценции значительно уменьшается, а при определенном соотношении концентраций доксорубицина и ДНК тушится полностью. Благодаря этому увеличение внутриклеточной аккумуляции антра-циклина с перераспределением цитостатика в сторону ядра регистрируется на проточном цитофлуориметре как снижение внутриклеточной флуоресценции доксорубицина по сравнению с исходным уровнем. Соответственно повышение содержания препарата преимущественно в цитоплазме приводит к увеличению внутриклеточной флуоресценции.

Следовательно, по характеру изменения внутриклеточной флуоресценции доксорубицина при ингибировании функции АВС-транспортеров и увеличении внутриклеточного накопления противоопухолевого препарата можно судить о функциональной активности разных АВС-транспортеров. В первом случае выявляется активность АВС-транспортеров, контролирующих накопление препарата в ядре, во втором — в цитоплазме. Экспериментальные факты, изложенные в самостоятельном исследовании, подтвердили правомочность такой интерпретации [3].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Перед изучением влияния внеклеточной концентрации доксорубицина на внутриклеточное накопление и распределение антрациклина во всех включенных в работу солидных опухолях был охарактеризован фенотип множественной лекарственной резистентности (рис. 1—3). По характеру изменения средней флуоресценции клеток после воздействия верапамила или ге-нистеина выявлены опухоли, характеризующиеся экспрессией функции Pgp и MRP (см. рис. 1), или одного

400

300

S 200

100

A

Интенсивность внутриклеточной флуоресценции доксорубицина, усл. ед.

400

300

д 200

100

Б

Интенсивность внутриклеточной флуоресценции доксорубицина, усл. ед.

Рисунок 1. Пример фенотипа множественной лекарственной резистентности Pgp MRP солидных опухолей, включенных в исследование. Гистограммы распределения клеток по внутриклеточной флуоресценции доксорубицина (7,7 х 10-5 М): темные гистограммы — интактные клетки; светлые — после инкубации с верапамилом или генистеином.

А. Уменьшение внутриклеточной флуоресценции доксорубицина после воздействия верапамила (в 2,8 раза). Б. Уменьшение внутриклеточной флуоресценции доксорубицина после воздействия генистеина (в 2,4 раза).

из АВС-транспортеров — Pgp либо MRP (см. рис. 1 и 3 соответственно). При этом в ряде случаев на фоне увеличения внутриклеточного накопления доксорубицина отмечено перераспределение антрациклина в сторону

цитоплазмы (см. рис. 2Б и 3А), в других — в сторону ядра (см. рис. 1).

Варианты зависимости внутриклеточной флуоресценции доксорубицина в клетках солидных опухолей от

256

192

5 128

64

256

192

128

64

A

Интенсивность внутриклеточной флуоресценции доксорубицина, усл. ед.

Б

Интенсивность внутриклеточной флуоресценции доксорубицина, усл. ед.

Рисунок 2. Пример фенотипа множественной лекарственной резистентности Pgp- MRP солидных опухолей, включенных в исследование. Гистограммы распределения клеток по внутриклеточной флуоресценции доксорубицина (7,7 х 10-5 М): темные гистограммы — интактные клетки; светлые — после инкубации с верапамилом или генистеином.

А. Отсутствие влияния верапамила на внутриклеточную флуоресценцию доксорубицина. Б. Увеличение внутриклеточной флуоресценции доксорубицина после воздействия генистеина (в 2,3 раза).

0

0

4

0

0

4

600

450

S зоо

150

A

Интенсивность внутриклеточной флуоресценции доксорубицина, усл. ед.

600

450

ед з00

150

Б

Интенсивность внутриклеточной флуоресценции доксорубицина, усл. ед.

Рисунок 3. Пример фенотипа множественной лекарственной резистентности Pgp MRP- солидных опухолей, включенных в исследование. Гистограммы распределения клеток по внутриклеточной флуоресценции доксорубицина (7,7 х 10-5 М): темные гистограммы — интактные клетки; светлые — после инкубации с верапамилом или генистенином.

А. Увеличение внутриклеточной флуоресценции доксорубицина после воздействия верапамила (в 1,9 раза). Б. Отсутствие влияния генистеина на внутриклеточную флуоресценцию доксорубицина.

внеклеточной концентрации антрациклина представлены на рис. 4.

В ряде исследованных опухолей наблюдается прямая зависимость внутриклеточной флуоресценции от внеклеточной концентрации антрациклина, т. е. увеличение средней флуоресценции клеток при увеличении внеклеточной концентрации цитостатика во всем диапазоне (см. рис. 4А и 4Б). В других случаях прямая зависимость флуоресценции клеток от внеклеточной концентрации доксорубицина сохраняется лишь в определенных участках диапазона исследованных концентраций, между которыми выявляется плато — область постоянной внутриклеточной флуоресценции при изменении внеклеточной концентрации доксорубицина в разы (см. рис. 4В—4З). По нашему мнению, этот феномен отражает внутриклеточное перераспределение доксорубицина между цитоплазмой и ядром при определенном уровне его внеклеточных концентраций. При этом, учитывая описанное выше «тушение» флуоресценции доксорубицина при его взаимодействии с ДНК, можно констатировать, что сохранение внутриклеточной флуоресценции доксорубицина при увеличении его внутриклеточного накопления отражает увеличение накопления доксорубицина в ядре. А это значит, что при достижении некой внеклеточной концентрации доксорубицина доступность ядра для цитостатика увеличивается.

При дальнейшем повышении внеклеточной концентрации доксорубицина вновь достигнутое соотношение ядро/цитоплазма, по-видимому, сохраняется на постоянном уровне, так как «восстанавливается» прямая за-

висимость флуоресценции клеток от внеклеточной концентрации доксорубицина, наблюдаемая в диапазоне меньших внеклеточных концентраций антрациклина. Наиболее отчетливо эти рассуждения демонстрируют результаты, представленные на рис. 4Д—4Ж, которые показывают также, что описанный феномен проявляется в новообразованиях разных локализаций.

Возвращаясь к опухолям, в которых была отмечена прямая зависимость флуоресценции клеток от внеклеточной концентрации доксорубицина во всем исследованном диапазоне (см. рис. 4А и 4Б), можно заключить, что в этих опухолях при увеличении внеклеточной концентрации внутриклеточное распределение антрацикли-на между цитоплазмой и ядром оставалось неизменным.

При анализе всей совокупности данных, свидетельствующих об отсутствии прямой зависимости внутриклеточной флуоресценции доксорубицина от внеклеточной концентрации антрациклина, обращает на себя внимание то, что в разных опухолях значения внеклеточной концентрации доксорубицина, при которой отмечается изменение внутриклеточного распределения антрациклина (область плато), значительно различаются. В некоторых случаях это происходит уже при концентрации доксорубицина 7,7 х 10-6 М (на рис. 4В и 4Г соответствует значению 0,1), в других — при концентрации препарата в 2; 5 и 10 раз выше (см. рис. 4Д—4З).

С нашей точки зрения, это отражает разную выраженность MDRАВС-фенотипа в разных опухолях. Чем выше внеклеточная концентрация доксорубицина, при которой выявляется плато внутриклеточной флуорес-

0

0

4

£5

ой сл.

ну

ч,

оа

тн

еи

лц

Концентрация доксорубицина, усл. ед.

Концентрация доксорубицина, усл. ед.

Б

A

Концентрация доксорубицина, усл. ед. Концентрация доксорубицина, усл. ед.

В Г

Рисунок 4. Зависимость накопления и распределения доксорубицина в клетках солидных опухолей разных локализаций от его внеклеточной концентрации. Кружком со стрелкой отмечена внутриклеточная флуоресценция при концентрации доксорубицина, ниже которой показатель не изменяется или увеличивается. За 1 усл. ед. концентрации доксорубицина принята концентрация

7,7 x 10-5М, за 1 усл. ед. интенсивности внутриклеточной флуоресценции доксорубицина — флуоресценция при концентрации антибиотика 7,7 x 10-5 М.

А. Рак толстой кишки: прямая зависимость внутриклеточной флуоресценции от внеклеточной концентрации доксорубицина во всем исследованном диапазоне внеклеточных концентраций антрациклина. Б. Рак пищевода: то же, что на рис. А. В. Рак желудка: отсутствие прямой зависимости внутриклеточной флуоресценции при увеличении внеклеточной концентрации доксорубицина в диапазоне 0,1 —0,2. Г. Рак предстательной железы: то же, что на рис. В.

ценции антрациклина, тем более защищено ядро от поступления в него цитостатика, а значит, тем более устойчива опухоль к повреждающему воздействию препарата. Иными словами, в последнем случае можно диагностировать большую «тяжесть» фенотипа множественной лекарственной резистентности.

Представление о том, что функционально активные АВС-транспортеры регулируют внутриклеточную

компартментизацию MDR^-цитостатиков, подтверждают результаты оценки внутриклеточной флуоресценции доксорубицина при изменении его внеклеточной концентрации в культуре клеток К562 дикого типа и стабильно трансфицированных геном MDR1 (К562/ Pgp). Функциональная активность Pgp в этих клетках подтверждена нами при исследовании реакции внутриклеточного накопления доксорубицина в ответ на

в

Д

Концентрация доксорубицина, усл. ед.

Концентрация доксорубицина, усл. ед.

£5

ой сл.

ну

ч,

оа

тн

еи

лц

утру 1 §

& а

Ж

Концентрация доксорубицина, усл. ед.

З

Концентрация доксорубицина, усл. ед.

Рисунок 4. Окончание.

Д. Рак толстой кишки: то же, что на рис. В. Е. Немелкоклеточный рак легкого: то же, что на рис. В. Ж. Отсутствие прямой зависимости внутриклеточной флуоресценции в клетках рака толстой кишки при увеличении внеклеточной концентрации доксорубицина в диапазоне 0,2—0,5. З. Отсутствие прямой зависимости внутриклеточной флуоресценции в клетках немелкоклеточного рака легкого при увеличении внеклеточной концентрации доксорубицина в диапазоне 0,5—1,0.

Е

воздействие верапамила. При высоких концентрациях ингибитора увеличение накопления доксорубицина в клетках K562/Pgp сопровождалось перераспределением антрациклина в сторону ядра, что привело к уменьшению средней флуоресценции клеток в 1,8 раза (рис. 5А). При меньших концентрациях верапамила выявлены увеличение преимущественно цитоплазматического накопления доксорубицина и увеличение средней флуоресценции клеток в 2,5 раза (рис. 5Б). Это указывает на то, что в исследованных в настоящей работе клетках K562/Pgp экспрессирована функция транспортных белков, контро-

лирующих цитоплазматическое и ядерное накопление MDR^-препаратов.

Результаты оценки внутриклеточной флуоресценции доксорубицина в зависимости от внеклеточной концентрации антибиотика в чувствительных клетках К562 дикого типа и резистентных клетках К562, трансфицированных геном MDRI(K562/Pgp), представлены на рис. 6 и 7. Сравнение средней внутриклеточной флуоресценции доксорубицина суммарно по всей популяции клеток К562 при разном содержании антрациклина в среде инкубации позволило выявить прямую пропорциональную зависи-

400

300

£ 200

^ 100

400

300

200

100

Интенсивность внутриклеточной флуоресценции доксорубицина, усл. ед.

Интенсивность внутриклеточной флуоресценции доксорубицина, усл. ед.

Рисунок 5. Характеристика фенотипа множественной лекарственной резистентности клеток эритроидного лейкоза К562/ Pgp, трансфицированных геном MDR1. Гистограммы распределения клеток по внутриклеточной флуоресценции доксорубицина (7,7 х 10-5 М): темные гистограммы — интактные клетки; светлые — после инкубации с верапамилом.

А. Концентрация верапамила 3,3 х 10-4 М: уменьшение внутриклеточной флуоресценции доксорубицина в 1,8 раза. Б. Концентрация верапамила 1,7 х 10-5 М: увеличение внутриклеточной флуоресценции доксорубицина в 2,5 раза.

мость: при увеличении внеклеточной концентрации доксорубицина в исследованном диапазоне флуоресценция клеток постоянно увеличивается, что свидетельствует о постоянстве внутриклеточного распределения антраци-клина между цитоплазмой и ядром (см. рис. 6А).

В то же время в резистентных клетках К562/Рдр (см. рис. 7А) прямая зависимость между этими показателями, т. е. увеличение средней внутриклеточной флуоресценции при увеличении внеклеточной концентрации антра-циклина, выявляется только в диапазоне внеклеточных концентраций доксорубицина от 7,7 х 10-7 до 7,7 х 10-6 М (на рис. 7А — диапазон концентраций от 0,01 до 0,1). При концентрациях антибиотика, превышающих 7,7 х 10-6М вплоть до 7,7 х 10-5М (на рис. 7А — диапазон концентраций от 0,1 до 1), зависимость становится обратной: чем больше концентрация доксорубицина в среде инкубации, тем меньше средняя внутриклеточная флуоресценция суммарно по всей популяции клеток.

Поскольку по внутриклеточной флуоресценции док-сорубицина популяция клеток К562 представляет собой совокупность двух субпопуляций, различающихся по интенсивности внутриклеточной флуоресценции доксо-рубицина (см. рис. 5), мы попытались разобраться в причинах этого феномена, проанализировав «поведение» клеток в субпопуляциях с высокой и низкой флуоресценцией в ответ на изменение внеклеточной концентрации доксорубицина.

Данные, представленные на рис. 6 и 7, свидетельствуют, что для субпопуляций клеток с высокой и низ-

кой флуоресценцией, в случае как резистентных, так и чувствительных клеток К562, характерна прямая зависимость средней внутриклеточной флуоресценции док-сорубицина от его внеклеточной концентрации во всем исследованном диапазоне антрациклина (см. рис. 6Б и 6В; см. рис. 7Б и 7В).

Разница между чувствительными и резистентными клетками четко выявляется при анализе распределения клеток между этими субпопуляциями в зависимости от концентрации доксорубицина в среде инкубации. С увеличением внеклеточной концентрации антрациклина в культуре клеток К562 дикого типа соотношение числа клеток в субпопуляциях с низкой и высокой флуоресценцией сохраняется на постоянном уровне (см. рис. 6Г), тогда как в культуре клеток К562/Рдр все большую часть популяции составляют клетки с низкой внутриклеточной флуоресценцией доксорубицина (см. рис. 7Г). Результатом этого является снижение показателя средней флуоресценции, рассчитанного для всей популяции клеток К562/Рдр, при увеличении концентрации доксо-рубицина в среде инкубации.

Что означает переход клеток из области высокой в область низкой внутриклеточной флуоресценции доксо-рубицина при увеличении внеклеточной концентрации антибиотика, т. е. в условиях, когда внутриклеточное накопление доксорубицина повышается? По существу этот феномен совпадает с описанным ранее уменьшением внутриклеточной флуоресценции доксорубицина в клетках некоторых солидных опухолей человека после

0

0

A

Б

5 ^ ф о

’1 5

I >, т ,

о <я

I- I о S

Н

fc О.

£ °

Концентрация доксорубицина, усл. ед.

Концентрация доксорубицина, усл. ед.

В

Концентрация доксорубицина, усл. ед.

Г

Концентрация доксорубицина, усл. ед.

Рисунок 6. Зависимость параметров флуоресценции клеток эритроидного лейкоза К562 дикого типа от внеклеточной концентрации доксорубицина. За 1 усл. ед концентрации доксорубицина принята концентрация 7,7 х 10-5 М, за 1 усл. ед. интенсивности внутриклеточной флуоресценции доксорубицина — флуоресценция при концентрации антибиотика 7,7 х 10-5 М.

А. Средняя внутриклеточная флуоресценция доксорубицина во всей популяции исследованных клеток. Б. Средняя внутриклеточная флуоресценция доксорубицина в субпопуляции клеток с высокой флуоресценцией. В. Средняя внутриклеточная флуоресценция доксорубицина в субпопуляции клеток с низкой флуоресценцией. Г. Процентное содержание клеток с высокой флуоресценцией.

A

Б

воздействия фармакологических ингибиторов MDRABC-фенотипа, что указывает на экспрессию функциональной активности АВС-транспортеров, контролирующих накопление препарата в ядре [2; 3].

Следовательно, выявленное в настоящем исследовании уменьшение внутриклеточной флуоресценции при увеличении накопления доксорубицина в клетках К562/ Pgp в присутствии высоких концентраций доксорубицина свидетельствует о внутриклеточном перераспределении препарата, а именно о его переходе из цитоплазмы в ядро. Наблюдаемое же с увеличением концентрации

антрациклина возрастание количества клеток в менее интенсивно флуоресцирующей субпопуляции отражает то, что все большее число клеток накапливает препарат в ядре и, следовательно, суммарно флуоресцирует с меньшей интенсивностью. Так как единственным переменным параметром в данном эксперименте является концентрация доксорубицина, совершенно естественно заключить, что стимулирует переход препарата из цитоплазмы в ядро, подобно фармакологическим ингибиторам функции АВС-транспортеров, нарастающая внеклеточная концентрация антрациклина.

Концентрация доксорубицина, усл. ед.

Концентрация доксорубицина, усл. ед.

Концентрация доксорубицина, усл. ед.

Концентрация доксорубицина, усл. ед.

A

Б

В

Г

Рисунок 7. Зависимость параметров флуоресценции клеток эритроидного лейкоза К562/Pgp, трансфицированных геном Мйй1, от внеклеточной концентрации доксорубицина. За 1 усл. ед. концентрации доксорубицина принята концентрация

7,7 х 10-5М, за 1 усл. ед. интенсивности внутриклеточной флуоресценции доксорубицина — флуоресценция при концентрации антибиотика 7,7 х 10-5 М.

А. Средняя внутриклеточная флуоресценция доксорубицина во всей популяции исследованных клеток. Б. Средняя внутриклеточная флуоресценция доксорубицина в субпопуляции клеток с высокой флуоресценцией. В. Средняя внутриклеточная флуоресценция доксорубицина в субпопуляции клеток с низкой флуоресценцией. Г. Процентное содержание клеток с высокой флуоресценцией.

Таким образом, получено подтверждение правомочности сформулированной нами гипотезы о возможности концентрационной регуляции MDRABC-цитостатиками не только собственного внутриклеточного накопления, но и компартментизации.

Анализируя представленные данные в свете их возможной клинической значимости, нам бы хотелось высказать следующие соображения. По существу, описан один из механизмов, позволяющих объяснить важный

клинический феномен — эффективность высокодозной химиотерапии у ряда больных с распространенной стадией заболевания, в том числе с клинически диагностированной устойчивостью к химиотерапии. Получено экспериментальное обоснование целесообразности применения высокодозной химиотерапии, несмотря на все сложности ее проведения. Выявленное регуляторное воздействие внеклеточного MDRABC-препарата на смещение его внутриклеточного распределения в сторону

ядра показывает, что у больных, в опухолях которых экспрессирован механизм множественной лекарственной резистентности, опосредованный функциональной активностью АВС-транспортеров, рефрактерность к химиотерапии может быть преодолена при увеличении дозы MDRABC-цитостатика(ов) выше терапевтического диапазона. При этом выраженность специфического эффекта высокодозной химиотерапии и принципиальная возможность его реализации у разных пациентов могут варьировать.

В настоящем исследовании показано, что значение внеклеточной концентрации MDRABC-цитостатика, начиная с которой меняется внутриклеточное распределение препарата в сторону ядра, зависит от выраженности функциональной активности АВС-транспортеров, которая, безусловно, различна в опухолях разных больных. Тем не менее, по крайней мере в ряде случаев, при вы-сокодозной химиотерапии может быть достигнута такая внеклеточная концентрация MDRABC-цитостатика, при которой препарат начнет преимущественно накапливаться в ядре. Результатом этого должна явиться реализация специфического противоопухолевого эффекта препарата, т. е. преодоление множественной лекарственной резистентности, связанной с экспрессией АВС-транспортеров. При этом важно подчеркнуть, что, поскольку доксорубицин является универсальным субстратом всех известных к настоящему времени АВС-транспортеров [6], описанный феномен отражает некий общий механизм регуляции и ингибирования MDRABC-фенотипа опухолевых клеток.

Мы делаем заключение о том, что в опухолевых клетках с множественной лекарственной резистентностью, опосредованной выбросом противоопухолевых препаратов из клеток (MDRABC-фенотип), внеклеточная концентрация MDRABC-цитостатиков является регулятором не только их накопления в клетке, но и внутриклеточного распределения и связывания с ДНК. Иными словами, в определенном диапазоне концентраций препарат может являться не только количественным, но и качественным регулятором собственной биологической активности. Применительно к клинической ситуации это является четким экспериментальным доказательством того, как важна доза введенного цитостатика и как даже минимальное снижение дозы лекарства может привести к неожиданно резкому снижению его терапевтической активности, и наоборот.

Авторы выражают, огромную и самую искреннюю благодарность д-ру мед. наук А. А. Штилю не только за

предоставленные для работы клетки К562 и R562/Pgp, но и за доброжелательное обсуждение полученных результатов.

Исследования поддержаны Российским, фондом, фундаментальных исследований (грант. № 07-04-00082-а).

ЛИТЕРАТУРА

1. Богуш Т. А., Заботина Т. Н., Богуш Е. А. и др. Новый подход к прижизненной оценке функциональной активности АВС-транспортеров (маркеров множественной лекарственной резистентности) в солидных опухолях методом проточной цитофлюори-метрии // Бюл. эксперимен. биол. и мед. — 2003. — Т. 135, № 5. — С. 566—574.

2. Богуш Т. А., Равчеева А. Б., Богуш Е. А. и др. Внеклеточная концентрация противоопухолевых препаратов является регулятором их внутриклеточного распределения и связывания с ДНК в клетках с фенотипом множественной лекарственной резистентности // Докл. АН. — 2006. — Т. 410, № 3. — С. 406—410.

3. Богуш Т. А., Равчеева А. Б., Конухова А. В. и др. Новый подход к оценке функциональной активности АВС-транс-портеров, контролирующих внутриклеточное распределение противоопухолевых препаратов, методом проточной цитофлюори-метрии // Докл. АН. — 2005. — Т. 405, № 5. — С. 682—685.

4. Fisher G. A., Lum B. L., Hausdorff J., Sikic B. L. Pharmacological considerations in the modulation of multidrug resistance // Eur. J. Cancer. — 1996. — Vol. 32 А, N 6. — P. 1082—1088.

5. German U. V. P-glycoprotein — a mediator of multidrug resistance in tumour cells // Eur. J. Cancer. — 1996. — Vol. 32 А, N 6. — P. 927—944.

6. Litman T., Brangi M., Hudson E. et al. The multidrug-resistant phenotype associated with overexpression of the new ABC half-transporter, MXR (ABCG2) // J. Cell. Sci. — 2000. — Vol. 113, N 11. — P. 2011—2021.

7. Maliepaard M., van Gastelen M. A., de Jong L. A. et al. Overexpression of the BCRP/MXR/ABCP gene in a topotecan-selected ovarian tumor cell line // Cancer Res. — 1999. — N 59. — P. 4559—4563.

8. Nagashima S. BCRP/ABCG2 levels account for the resistance to topoisomerase Iinhibitors and reversal effects by gefitinib in non-small celllung cancer // Cancer Chemother. Pharmacol. — 2006. — Vol. 58, N 5. — P. 594—600.

9. Nakanishi T. Complex interaction of BCRP/ABCG2 and imatinib in BCR-ABL-expressing cells: BCRP-mediated resistance to imatinibis attenuated by imatinib-induced reduction of BCRP expression // Blood. — 2006. — Vol. 108, N 2. — P. 678—684.

10. Oguri T., Isobe T., Suzuki T. et al. Increased expression of the MRP5 gene is associated with exposure to platinum drugs in lung cancer // Int. J. Cancer. — 1996. — Vol. 86, N 1. — P. 95—100.

11. Radujkovic A. Synergistic activity of imatinib and 17-AAG in ima-tinib-resistant CML cells overexpressing BCR-ABL-Inhibition of P-gly-coprotein function by 17-AAG // Leukemia. — 2005. — Vol. 19, N 7. — P. 1198—1206.

12. Widmer N. Functional consequence of MDR1 expression on ima-tinib intracellular concentrations // Blood. — 2003. — Vol. 102, N 3. — P. 1142—1144.

13. Yang Ch-H., Huang Ch-Ju, Chao-Shun Yang Ch-Sh. et al. Gefi-tinib Reverses Chemotherapy Resistance in Gefitinib-Insensitive Multidrug Resistant Cancer Cells Expressing ATP-Binding Cassette Family Protein // Cancer Res. — 2005. — N 65. — P. 6943—6949.

Поступила 16.07.2007

T. A. Bogush1, A. B. Ravcheyeva1, E. A. Bogush2, E. O. Ignatova1, E. A. Dudko1,

K. K. Laktionov2, B. E. Polotsky2, M. I. Davydov2 A NEW REGULATION MECHANISM FOR INTRACELLULAR DISTRIBUTION OF ANTICANCER AGENTS IN CELLS WITH MULTIPLE DRUG RESISTANCE PHENOTYPE ASSOCIATED WITH ABC-TRANSPORTER FUNCTION 1 Experimental Tumor Diagnosis and Therapy Research Institute,

N. N. Blokhin RCRC RAMS, Moscow

2 Clinical Oncology Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS, Moscow

The authors hypothesize that anticancer agents, like pharmaceutical transport protein inhibitors, can act at high extracellular concentrations as regulators of their own intracellular distribution with increased accumulation in the nucleus as compared to cytoplasm in tumor cells with multiple drug resistance phenotype associated with ABC-transporter function (MDRABC). This hypothesis was confirmed by flow cytometry study of doxorubicin intracellular accumulation and distribution in relation to its extracellular concentrations within a range of 7.7 x 10-7—7.7 x 10-6 M. Similar results were obtained in study of solid tumor cells from biopsy specimens and in model experiments on wild and MDR1-transfected human erythroid leukemia K562 cell cultures. Since doxorubicin is a universal ABC-transporter substrate, this phenomenon may be a reflection of a general regulation mechanism for intracellular compartamentalization of cytostatics and inhibition of tumor cell MDRABC phenotype, and may also explain the very important phenomenon of response to high-dose chemotherapy in cases with clinically confirmed multiple drug resistance.

Key words: anticancer drugs, intracellular distribution regulation, multiple drug resistance, ABC-transporters.