Гибридный ген, состоящий из рецептора RBD поверхностного белка S коронавируса SARS-CoV-2, эпитопов S14P5 и S21P2, Fc-фрагмента, для получения рекомбинантного антигена и его применения в составе вакцинной композиции против коронавирусной инфекции
HYBRID GENE CONSISTING OF THE RBD RECEPTOR OF THE SURFACE PROTEIN S OF SARS-CoV-2 CORONAVIRUS, S14P5 AND S21P2 EPITOPES, Fc FRAGMENT, FOR OBTAINING A RECOMBINANT ANTIGEN AND ITS USE AS PART OF A VACCINE COMPOSITION AGAINST CORONAVIRUS INFECTION

Область техники, к которой относится изобретение.
Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии, вирусологии и касается создания вакцины против коронавирусной инфекции, способа ее получения, конструкции гибридного гена и конструкции для экспрессии рекомбинантного антигена RBD/S21/S14- Fc, представляющего собой участок S-белка SARS-CoV-2, включающего RBD, часть SD1 и S2, слитого с Fc фрагментом IgG1, клеточной линии, продуцирующей рекомбинантный антиген, способа получения рекомбинантного антигена, который в сочетании с корпускулярным адъювантом на основе бетулина, способен индуцировать у животных и человека длительный гуморальный и клеточный иммунитет против коронавируса.
Уровень техники.
Вакцинация рассматривается в современных условиях как одно из наиболее эффективных средств борьбы с инфекцией. Таким образом, многие страны и фармацевтические компании включились в разработку вакцин и лекарственных препаратов против SARS-CoV-2, нового РНК-содержащего вируса, относящегося к семейству Coronaviridae к линии Beta-CoV.
При традиционной технологии создания вакцин на основе использования полноразмерного патогена резко возрастает сложность производства, обусловленная опасностью работы и необходимостью строгого контроля за полнотой инактивации возбудителя, что делает данный вариант менее экономически выгодным. В связи с этим, проверенная в последние годы технология получения вакцин на основе субъединиц вируса имеет определенные преимущества, такие как безопасность и возможность бустерного введения вакцины. Однако, отдельные вирусные субъединицы имеют низкую иммуногенность, вследствие чего необходимо применение адъювантов.
Вакцины на основе целых инактивированных вирусов, в целом, широко используются для иммунизации, однако имеют серьезные недостатки - от технологических, связанных с трудностью получения больших количеств препарата в сжатые сроки, до проблем, касающихся их эффективности - нежелательные побочные эффекты и проблемы с таргетностью вырабатываемых антител на необходимый эпитоп белков вирусной оболочки, а также примесными белками, остающимися в вакцине после культивирования вируса.
Вакцины на основе нуклеиновых кислот основаны на принципе введения в клетки генетической информации, с которой продуцируются белки патогена, вызывающие иммунную реакцию. В случае использования для доставки вирусных векторов существует опасность интеграции чужеродной ДНК в геном клетки вакцинируемого, возможное развитие аутоиммунных реакций против клеток, экспрессирующих вирусный антиген, или реакция на чужеродную ДНК. Помимо перечисленных недостатков, существуют трудности с доставкой таких препаратов. Стоит отметить, что РНК и ДНК вакцины, а также вакцины на основе аденовирусных векторов вызывают определенную осторожность в использовании, так как неизвестны долговременные последствия их применения.
Субъединичные вакцины представлены, прежде всего, рекомбинантными препаратами, на основе очищенных белков. При создании таких типов вакцин важной частью является поиск новых эффективных адъювантов. Их использование позволяет уменьшить дозу антигена, снизить стоимость конечного препарата, повысить иммуногенность «слабых» или малых антигенов, на которые чрезвычайно сложно выработать иммунитет и получить вакцину к данному классу патогенов. Это позволяет предотвратить конкуренцию антигенов в комбинированных вакцинах, увеличить скорость развития и продолжительность иммунного ответа у привитых, индуцировать защитные свойства слизистых оболочек, а также увеличить силу иммунного ответа. В настоящее время признано невозможным создание эффективных и безопасных субъединичных или эпитопных вакцин без применения адъювантов.
За функцию проникновения коронавируса в клетки хозяина отвечает RBD (рецептор-связывающий домен) S-белка, а также отдельные его эпитопы. В экспериментальных исследованиях установлено, что большинство антител, обладающих вируснейтрализующей активностью в отношении вида коронавирусов (например, MERS или SARS), специфически связываются с различными эпитопами RBD. RBD образует сайт связывания с рецептором АСЕ2, поэтому антитела, способные связываться с RBD доменом, могут блокировать контакт с рецептором и, как следствие, препятствовать проникновению вируса в клетки, что в случае SARS-CoV-2 установлено. На основании этого, в качестве последовательности для создания антигена была выбрана именно последовательность RBD. Стоит отметить, что выбор целого S-белка мог бы привести к выработке не только нейтрализующих антител, но и маскирующих, повышая развитие антитело-зависимого усиления инфекции.
Домен S1 состоит из субдомена NTD (N-концевой домен), RBD (остатки 319-527), и субдоменов SD1 и SD2, которые наиболее близки к домену S2. Таким образом, важнейшей задачей вакцинации является не просто выработка антител к S-белку, а именно нейтрализующих антител к RBD. Однако, простое использование RBD в качестве антигена вакцины не представляется возможным, так как масса белка довольно мала (менее 40 кДа), а также он быстро выводится из организма, поэтому кандидатами в антиген стали RBD, часть SD1 и S2, конъюгированные с Fc фрагментом IgG1.
Добавление адъюванта позволит снизить количество белка на дозу, себестоимость вакцины, а увеличить иммунный ответ на антиген. В настоящее время в экспериментальных и клинических исследованиях применяют: минеральные (гидроксид или фосфат алюминия), растительные (сапонины - QuilA, QS21), микробные (убитые бактерии, липополисахарид, и его производные, CpG-мотивы ДНК) и другие виды адъювантов. Вследствие токсичности или недостаточной эффективности большинства адъювантов для общего использования разрешены только соли алюминия и водно-масляные эмульсии MF-59, AS03, QS 21, VLP (virus-like particles) и ИСКОМы (ImmunoStimulating COMplex). Наиболее перспективными являются корпускулярные адъюванты - сферические аморфные наночастицы (САНЧ). Одна из причин использования - их эффективное поглощение антиген-представляющими клетками иммунной системы, что приводит к усилению иммунного ответа. К таким адъювантам можно отнести бетулиновые адъюванты на основе тритерпеноидов из экстракта бересты (патент RU 2,545,714). Бетулиновые частицы, кроме выраженного спектра биологической активности (противомикробное, противогрибковое, противовирусное действия, гепатопротективное, противовоспалительное, противораковое, противоаллергическое, мембраностабилизирующее, иммуномодулирующее, антиоксидантное), обладают и адъювантными свойствами.
Техническое решение согласно патенту RU 2,749,193 выбрано авторами заявляемого изобретения за прототип. Из данного патента известны варианты использования антигенов, включающие RBD для индукции специфического иммунитета против вируса SARS-CoV-2 в качестве антигенного компонента, вместе с бетулиновыми сферическим аморфными наночастицами (САНЧ) размера 80-160 нм в качестве адъюванта. Данный адъювант производится в промышленных масштабах в соответствии с требованиями опытно-промышленного регламента, а также был протестирован ранее в доклинических исследованиях гриппозных вакцин, которые показали, что наличие корпускулярного адъюванта в составе вакцины приводит к усилению иммунного ответа и не влияет на безопасность применения препарата.
Раскрытие сущности изобретения.
Существенный недостаток известных вакцин против SARS-CoV-2, состоит в сложности их производства, недостаточной иммуногенной активности, нежелательных побочных явлениях, и проблемах с таргетностью вырабатываемых антител к необходимому эпитопу белка вирусной оболочки. Техническая задача настоящего изобретения заключается в создании антигенной композиции, позволяющей вызвать индукцию специфического гуморального и клеточного иммунного ответа к необходимому эпитопу белка вирусной оболочки SARS-CoV-2. Техническим результатом раскрываемого изобретения является создание антигенной композиции с корпускулярным бетулином в качестве адъюванта и рекомбинантным белком в качестве активного компонента. Технический результат достигается за счет создания гибридного гена RBD/S21/S14-Fc, кодирующего рекомбинантный антиген SARS-CoV-2 слитый с Fc-фрагментом иммуноглобулина через линкер, клеточной линии, экспрессирующей рекомбинантный антиген в культуральную жидкость, выделение и очистку - рекомбинантного антигена RBD/S21/S14- Fc, формулирование вакцины с использованием корпускулярного адъюванта на основе природного бетулина, применения вакцины для иммунизации животных и человека с целью получения иммунного ответа против коронавируса.
Краткое описание чертежей
Рис. 1. Карта вектора P-Pharma-Zeo - RBD/S21 /S14-Fc.
Рис. 2. Электрофореграммы реакций секвенирования для праймера RBD-Rev 1.
Рис. 3. Электрофореграммы реакций секвенирования для праймера RBD-short.
Рис. 4. Электрофореграммы реакций секвенирования для праймера RBD-short (продолжение).
Рис. 5. Электрофореграммы реакций секвенирования для праймера SolR.
Рис. 6. Электрофореграммы реакций секвенирования для праймера SolR (продолжение).
Рис. 7, Электрофореграммы реакций секвенирования для праймера RBD-Fwd3.
Рис. 8. Результаты оценки экспрессии и секреции белка RBD/S21/S14-Fc с помощью Вестерн Блоттинга. 1 - лизат клеток; 2 - культуральная жидкость. Столбец слева - стандарт молекулярных масс.
Рис. 9. Покрытие триптическими пептидами последовательности RBD/S21/S14-Fc.
Рис. 10. Результаты гель-фильтрационной хроматографии на колонке Superdex 200 Increase в Na-фосфатном буфере рН 7.4.
Осуществление изобретения.
Дизайн гибридного гена RBD/S21/S14-Fc. На первом этапе работы был разработан дизайн гибридного гена RBD/S21/S14-Fc для экспрессии и получения антигена-рекомбинантного белка вируса SARS-CoV-2. Последовательность рекомбинантного антигена на основе RBD с дополнительными эпитопами была слита с С-концевой частью RBD, FcIgG1 дикого типа (без модификации), для получения RBD/S21/S14-Fc. Модификации RBD были направлены на увеличение иммуногенности антигена. Было добавлено два пептидных эпитопа. Эпитоп S14P5 находится в области за RBD в SD1 субдомене, по всей видимости антитела к этому участку стерически препятствуют связыванию с рецептором. Эпитоп S21P2 находится в области S2, перекрывается с фьюжн пептидом (FP), причем антитела к этому участку препятствуют слиянию вируса с таргетной клеткой. Порядок эпитопов был изменен для повышения стабильности белка. Его аминокислотная последовательность представлена SEQ ID NO: 1. Расчетный молекулярный вес 107,2 кДа (димер), 53,6 кДа (восстановленный мономер).
Получение экспрессионной конструкции и ее подготовка к трансфекции. На первом этапе получили оптимизированную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 2). Нуклеотидную последовательность гибридного гена оптимизировали для экспрессии в культуре клеток СНО-НР с помощью программы GeneArt GeneOptimizer. В данной последовательности первые 60 нуклеотидов являются лидерным пептидом IL-2 (SEQ ID NO: 3).
Карта плазмиды RBD/S21/S14-Fc представлена на рис. 1. В табл.1 приведены основные характерные кодирующие последовательности плазмиды RBD/S21/S14-Fc. Полная нуклеотидная последовательность вектора представлена SEQ ID NO: 4.
RBD/S21/S14-Fc гибридный ген амплифицируют в реакции ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 и ДНК полимеразой, обладающей корректирующей 3'-5' экзонуклеазной активностью. Продукт реакции очищается с использованием протокола очистки ДНК на спин колонках.
Вектор P-Pharma-Zeo линеаризуют с использованием рестриктаз HindIII и XbaI, очищают продукт методом агарозного гель-электрофореза и выделяют из геля с использованием протокола очистки ДНК на спин колонках. Концы вектора затупляют с использованием ДНК полимеразы, обладающей 3'-5' экзонуклеазной активностью, далее вектор очищают с использованием протокола очистки ДНК на спин колонках. Реакцию лигирования осуществляют с использованием Т4-ДНК полимеразы в соотношении вставка/вектор=1/10 с использованием 5% ПЭГ-4000 в реакции лигирования. Полученную плазмидную ДНК очищают с использованием протокола очистки ДНК на спин колонках. Осуществляют трансформации лигазной смеси в химически-компетентные клетки Е. Coli (штамм 10beta), после трансформации высеивают клетки в LB-агар на чашку петри, содержащую 100 мкг/мл ампициллина. Клетки инкубировали при 37°С в течение 18 часов до появления отдельных колоний (бактериальных клонов).
Далее осуществляли проверку наличия вставки и ориентации с использованием праймеров, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 (для проверки наличия гена в плазмиде) и SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10 (для проверки правильной ориентации гена) в выбранных бактериальных клонах. Объемы реагентов для реакции ПЦР представлены в табл. 2.
После проведения реакции ПЦР продукт реакции анализируют методом агарозного гель-электрофореза (1% агарозы). Бактериальные клоны, ПЦР продукты от которых имеют размер ПЦР продукта ~ 1700 п. н.) и корректно ориентированный (размер ПЦР продукта ~ 400 п. н.), переносят в 50 мл среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, культивируют при перемешивании в течение 24 ч. Полученную суспензию центрифугируют и удаляют супернатант, не затрагивая осадка клеток. Из осадка клеток выделяют плазмидную ДНК с использованием протокола очистки на спин-колонках.
Плазмидную ДНК из выбранных колоний выделяли из бактериальной культуры с помощью набора Plasmid Midiprep 2.0 согласно рекомендациям производителя. 50 мл культуры центрифугировали при скорости 3000 g и температуре 4±2°С в течение 20 минут. Супернатант полностью удаляли, к осадку вносили 5 мл ресуспендирующего раствора с РНКазой А. Смесь тщательно перемешивали на вибромешалке до полного ресуспендирования осадка и вносили 5 мл лизирующего раствора. Содержимое пробирки аккуратно переворачивали 10 раз. Затем вносили 5 мл нейтрализующего раствора, предварительно охлажденного до 4±2°С, и перемешивали переворачиванием. Лизат осаждали при скорости 3000 g в течение 45 мин на центрифуге Allegra 25R. Перед нанесением лизата на мембрану спин-колонки наносили 1,0 мл раствора для удаления эндотоксинов, полностью смачивая всю поверхность сорбента. Инкубировали в течение 1 минуты и наносили на мембрану весь объем бактериального лизата. Центрифугировали спин-колонку при скорости 3000 g в течение 2 минут. Затем на мембрану наносили 1 мл раствора для удаления эндотоксинов и центрифугировали при 3000 g в течение 1 минуты. Вносили 15 мл промывочного раствора с этанолом и центрифугировали при 3000 g в течение 1 минуты, промывку повторяли с тем же объемом промывочного раствора. После второй промывки, спин-колонку центрифугировали при скорости 3000 g в течение 5 минут для удаления остатков жидкости. Спин-колонку помещали в новую пробирку вместимостью 50 мл и оставляли открытой под ламинарным боксом на 5 минут для удаления остатков этанола. После на мембрану наносили 4 мл элюирующего раствора, предварительно подогретого на водяной бане TW-2 до 50±2°С, и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 минут. Центрифугировали спин-колонку при скорости 3000 g в течение 2 минут. Элюат концентрировали с использованием ультрафильтрационных концентраторов VivaSpin6 (предел отсечения 10 кДа) до 500 мкл при скорости 3000 g.
К 500 мкл раствора плазмидной ДНК прибавляли 50 мкл 3 М натрия ацетата. К смеси вносили 1400 мкл этанола, предварительно охлажденного до минус 20°С, перемешивали и инкубировали при минус 20±2°С в течение 20 минут. Полученный раствор центрифугировали при скорости 14000 g в течение 20 минут при температуре 4±2°С, супернатант полностью удаляли, к осадку плазмидной ДНК аккуратно вносили 500 мкл 70% этанола. Образец центрифугировали при скорости 14000 об/мин в течение 10 минут, удаляли супернатант. Осадок высушивали под ламинарным потоком стерильного воздуха в течение 10 минут и растворяли в 20 мкл стерильной воды, не содержащей ДНКаз и РНКаз.
1 мкл отбирают для оценки концентрации ДНК, а также определения последовательности гена RBD/S21/S14-Fc. Для секвенирования внедренного гена методом Сэнгера используют праймеры SEQ ID N0:11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14.
На рисунках 2-7 приведены электрофореграммы реакций секвенирования. Итоговые результаты секвенирования с использованием праймеров, покрывающих всю последовательность гена RBD/S21/S14-Fc подтвердили идентичность последовательности гибридного гена RBD/S21/S14-Fc с референтной последовательностью.
Трансфекция и селекция трансфектантов. Создание штамма-продуцента.
Для трансфекции клеток СНО получили 8,6 мг/мл чистой ("transfection grade") плазмидной ДНК P-Pharma-Zeo- RBD/S21/S14-Fc. В результате трансфекции экспрессионным вектором Р-Pharma-Zeo- RBD/S21/S14-Fc получили один пул клеток, в котором жизнеспособность культуры клеток через 48 ч после трансфекции составила 92%. Контрольная трансфекция вектором, содержащим ген флуоресцентного зеленого белка GFP, продемонстрировала эффективность трансфекции на уровне 50±20%. Через 72 ч начинали селекцию трансфектантов путем культивирования с добавлением 400 мкг/мл зеоцина и 500 нМ МТХ. В течение 10 суток под селективным давлением жизнеспособность достигала минимума - 55±5%. Восстановление жизнеспособности культуры в пуле до 90±5% произошло на 16-е сутки, после чего часть клеток пула замораживалась, и осуществлялись предельные разведения с плотностью 0,5 клеток на лунку. Общее количество планшетов равнялось 100 шт. Из 96-луночных планшетов со стадии клонирования методом предельных разведений было отобрано 105 клонов и перенесено в 24-луночные планшеты. Все клоны, выросшие в 24-луночных (77) планшетах были перенесены в 6-луночные планшеты с увеличенным до 1,4% содержанием Anti Clumping Agent В для разрушения агрегатов клеток. После масштабирования для адаптации к культивированию при перемешивании в колбах выбрали 10 субклонов, которые имели наилучшие характеристики по параметрам: удельная продуктивность (pcd) ≥20 пг/клетку, содержание жизнеспособных клеток ≥0,9 млн/мл, содержание белка в культуральной жидкости ≥30 мкг/мл. Пересев субклонов осуществляли в течение 2 пассажей (1 пассаж-4 суток), после второго пассажа клетки замораживали с содержанием клеток 10±1,5 млн клеток/криопробирку. В табл.3 приведены данные по продуктивности клонов на втором пассаже, считая от пересева из 96-луночных планшетов.
На основе клеточной линии СНО-НР, трансфицированной вектором P-Pharma-Zeo-RBD/S21/S14-Fc, получены четыре первичные клона-продуцента гибридного белка RBD/S21/S14-Fc не менее 17±2 пг/(клетку*день). В качестве штамма-продуцента выбран клон наибольшей продуктивности (табл. 3, клон номер 10).
Таким образом, была создана клеточная линия СНО-НР, полученная из линии клеток СНО-К1 (вид Cricetulus griseus) путем адаптации к суспензионному культивированию, содержащая ген гибридного белка RBD/S21/S14 домена S-белка из SARS-CoV-2, соединенного с Fc фрагментом IgG1 человека в составе вектора P-Pharma-Zeo. Таким образом, была проведена сборка и апробация RBD/S21/S14-Fc и создан штамм-продуцент для наработки белка RBD/S21/S14-FC.
Анализ секреции и подтверждение подлинности белка. На рис. 8 приведены результаты оценки экспрессии RBD/S21/S14-Fc методом вестерн-блоттинга.
Для масс спектрометрической идентификации белка после проведения SDS-PAGE электрофореза вырезали окрашенные кумасси полосы и проводили трипсинолиз в геле. Разделение триптических пептидов проводили на хроматографической системе Ultimate 3000 Nano LC System (Thermo Fisher Scientific), сопряженной с масс-спектрометром Q Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific) посредством наноэлектроспрейного источника (Thermo Fisher Scientific). Анализ MS/MS-данных проводили при помощи компьютерной программы PEAKS Studio 8. Первичные структуры пептидов, генерируемые программой PEAKS Studio, анализировали против базы данных соответствующих белковых последовательностей. Анализ проводили со следующими настройками: окисление Met, дезамидирование Asn/Gln и карбомидометилирование Cys. На рис. 9 представлено покрытие триптическими пептидами последовательности RBD/S21/S14-Fc. На рис. 10 представлены результаты гель-фильтрационной хроматографии на колонке Superdex 200 Increase в Na-фосфатном буфере рН 7.4.
Способ получения рекомбинантного антигена из клеток штамма-продуцента. Разработанный способ получения рекомбинантного антигена включает следующие этапы: 1) культивирование штамма-продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2; 2) отбор и осветляющая фильтрация культуральной жидкости; 3) хроматограф ическая очистка рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2; 4) подтверждение подлинности полученного рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2.
7
6
6
6
Культивирование. Пробирку из главного банка клеток, содержащую 10 клеток штамма-продуцента рекомбинантного антигена RBD/S21/S14-Fc, размораживали при 37°С в водяной бане в течение 10 минут, добавляли 4 мл среды ActiPro (Hyclone, США), содержащую 4 мМ L-аланин-L-глутамина (Gibco, США) и 0,4% реагента против агрегации клеток, перемешивали и центрифугировали при 200 g в течение 5 минут, супернатант удаляли, пеллету клеток ресуспендировали в 5 мл среды ActiPro (Hyclone, США), содержащую 4 мМ L-аланин-L-глутамина (Gibco, США) и 0,4% реагента против агрегации клеток, и инкубировали в течение суток в инкубаторе при 37°С и влажности не менее 70%. Для культивирования в биореакторе наращивают инокулят в необходимом количестве для начального засева в реактор с клеточной плотностью 0,5×10 кл/мл, т.е. в количестве не менее 400×10 кл в колбах при перемешивании, культуру клеток пересевают с увеличением объема колб. Культуру клеток пересевали в колбу вместимостью 125 мл с 20 мл среды и культивировали в течение 4 суток в шейкере-CO2-инкубаторе при скорости вращения платформы 120±5 об/мин, температуре 37±1°С, содержании CO2 5±1% и относительной влажности 70±5%. Весь объем культуры переносили в колбу вместимостью 500 мл со 125 мл среды и культивировали в течение 3 суток, при тех же условиях. Необходимый объем клеток переносят в биореактор BioFlo 320 с рабочим объемом 1 литр (Eppendorf, Германия) до клеточной плотности 0,5×10 кл/мл с конечноым объемом культуры 800 мл. Культивирование клеток штамма-продуцента проводят в биореакторе BioFlo 320 с рабочим объемом 1 литр (Eppendorf, Германия) на среде ActiPro (Hyclone, США), содержащую 4 мМ L-аланин-L-глутамина (Gibco, США) и 0,4% реагент против агрегации клеток (Lonza, Швейцария). Ежедневно с третьих суток культивирования вносят комплекс добавок: Cell Boost 7А (Cytiva, США) 1,5-3,5% от объема культивирования и смесь аминокислот L-цистин (152 мМ), L-триптофан (90 мМ), L-тирозин (250 мМ) (AppliChem, США для трех аминокислот).
6
3
Количество смеси аминокислот используют в 10 раз меньше относительно объема Cell Boost 7А. В течение всего процесса ежедневно добавляют концентрированный раствор глюкозы 200 г/л (Panreac, США) для поддержания концентрации глюкозы в культуральной жидкости около 5 г/л. Все указанные добавки ежедневно вносят через насос контроллера биореактора таким образом, чтобы рассчитанный объем на сутки не влиял на резкое изменение рН и осмолялыюсти. В первый день культивирования подготовленную биомассу переносят в биореактор для получения начальной концентрации живых клеток 0,5±0,1×10 клеток/мл. Культивирование осуществляют при рН 7,0±0,2 и концентрации растворенного кислорода 40±5%. Регуляцию рН осуществляют подачей CO2 и 0,5 М NaHCO (Sigma-Aldrich, США). Регуляцию концентрации растворенного кислорода в начале процесса осуществляют азотом и воздухом, затем воздухом и кислородом по мере увеличения концентрации жизнеспособных клеток и скорости потребления кислорода. Смесь газов подают через макробарботер со скоростью от 0,2 до 1,5 л/мин. Культивирование осуществляют при скорости вращения мешалки типа «морской винт» от 60 до 100 об/мин (каскадное регулирование) и температуре 37°С с последующим понижением до 35°С в экспоненциальной фазе роста и до 33°С на следующие сутки культивирования.
Отбор и осветляющая фильтрация культуральной жидкости. Начиная с третьих суток культивирования, осуществляют ежедневный отбор пробы культуральной жидкости для определения в ней количества жизнеспособных клеток, концентрации глюкозы и лактата. Культивирование останавливают при снижении жизнеспособности ниже 90%. Культуральную жидкость осветляют методом центрифугирования в две стадии: 1000 g в течение 30 минут и 3270 g в течение 15 минут. Для стерилизации культуральной жидкости используют фильтр с рейтингом 0,22 мкм. Полученный объем стерильной культуральной жидкости составлял 1,05 л. Из полученной культуральной жидкости путем очистки по описанному ниже протоколу было получено 375 мг рекомбинантного антигена RBD/S21/S14-FC.
Хроматографическая очистка белка. Хроматографическая очистка белка из осветленной культуральной жидкости проводится на препаративном хроматографе. Первая стадия очистки -аффиный сорбент Mab Select Shure LX (Cytiva), а также MabSelect Prisma (Cytiva), Mab Select (Cytiva) объемом 4,7 мл. Уравновешивание буфером 20 мМ фосфат натрия, 150 мМ хлорид натрия, рН 7,0 в течение 10 колоночных объемов со скоростью 2,5 мл/мин. Нанесение культуральной жидкости на колонку, время контакта 1 мин. После окончания нанесения, колонку промывают буфером 20 мМ фосфат натрия, 150 мМ хлорид натрия, рН 7,0 в течение 5 колоночных объемов со скоростью 5 мл/мин. После окончания промывки проводят элюцию буфером 20 мМ цитрат натрия, рН 3,0 в течение 4 колоночных объемов со скоростью 1 мл/мин. Доведение рН в полупродукте 1М раствором трис до значения 7,0.Вторая стадия очистки - сорбент смешанного действия НА Ultrogel (Sartorius), а также СНТ Ceramic Hydroxyapatite(Biorad), Ca++Pure-HA (Tosoh Biosciences) объемом 10 мл. Уравновешивание буфером 20 мМ фосфат натрия, 150 мМ хлорид натрия, рН 7,0 в течение 8 колоночных объемов со скоростью 2 мл/мин. Нанесение полупродукта, полученного с первой стадии очистки на колонку происходит в 50% градиенте буфера 20 мМ фосфат натрия, 150 мМ хлорид натрия, рН 7,0, время контакта 5 мин. После окончания нанесения, колонку промывают буфером 20 мМ фосфат натрия, 150 мМ хлорид натрия, рН 7,0 в течение 4 колоночных объемов со скоростью 2 мл/мин. После окончания промывки проводят элюцию буфером 20 мМ фосфат натрия, 1М хлорид натрия, рН 7,0 в течение 4 колоночных объемов со скоростью 1 мл/мин. Добавление в полупродукт NaCl до конечного содержания 2 М. Доведение рН в полупродукте 1М раствором фосфорной кислоты до значения 6,0.Третья стадия очистки -гидрофобный сорбент Butyl Sepharose HP (Cytiva), а также Capto Butyl ImpRes (Cytiva), Phenyl Sepharose HP (Cytiva), Capto Phenyl ImpRes (Cytiva) объемом 5 мл. Уравновешивание буфером 20 мМ фосфат натрия, 2 М хлорид натрия, рН 6,0 в течение 10 колоночных объемов со скоростью 2,5 мл/мин. Нанесение полупродукта, полученного со второй стадии очистки на колонку, время контакта 5 мин. После окончания нанесения колонку промывают буфером 20 мМ фосфат натрия, 2 М хлорид натрия, рН 6,0 в течение 5 колоночных объемов со скоростью 2,5 мл/мин. После окончания промывки проводят элюцию в градиент 100% буфера 20 мМ фосфат натрия, рН 6,0 в течение 3 колоночных объемов со скоростью 2 мл/мин. Четвертая стадия очистки - перевод в буфер ГЛФ, используя сорбент Sephadex G25 объемом 53 мл. Перед нанесением колонка уравновешена буфером 20 мМ фосфат натрия, рН 7,0, нанесение проходит со скоростью 1 мл/мин, после окончания нанесения промывка колонки буфером 20 мМ фосфат натрия, рН 7,0 в течение 3 колоночных объемов на скорости 10 мл/мин. Пятая стадия - нормирование концентрации белка. Концентрацию доводят буфером 20 мМ фосфат натрия, рН 5,0-7,0 до значения 2 мг/мл и стерильно фильтруют через фильтр насадку на флакон Steritop 0,22 mkm (Merck - Millipore, Германия). Получили 180 мл стерильного очищенного рекомбинантного антигена RBD/S21/S14-Fc. Рекомбинантный антиген хранят в холодильнике при температуре +4 С.
Подтверждение подлинности белка. Подтверждение подлинности полученного рекомбинантного антигена RBD/S21/S14-Fc проводят при помощи электрофореза в полиакриламидном геле с последующим иммуноблоттингом. Для проведения электрофореза используют градиентный полиакриламидный гель 4-20% (Bio-Rad, кат №4561093). Анализ образцов методом электрофореза проводят в восстанавливающих условиях. В лунки геля вносят 100 нг раствора белка. Разделение проводят при напряжении 200 В в течение 50 мин. Перенос на PVDF мембрану осуществляют с использованием системы Trans Blot Turbo (Biorad), согласно рекомендациям производителя. После забивки мембраны 3% раствором бычьего сывороточного альбумина, проводят конъюгирование с анти-IgG1 антителом (Abcam, кат №ab6760), меченным щелочной фосфатазой. После отмывки мембраны проведят детектирование конъюгата с использованием раствора BCIP/NBT.
Получение гомогенной дисперсии корпускулярного адъюванта на основе бетулина (КА). С целью получения гомогенных дисперсии корпускулярного адъюванта (КА) на основе бетулина к стерильной смеси 1% раствора бетулина в тетрагидрофуране, которую пропускали через нейлоновую мембрану с диаметром пор 0,22 мкм, в соответствии с технологией, добавляли 25 объемов стерильного 0,01 М трис-буфера рН-9,0±0,1 с помощью перистальтического насоса при постоянном перемешивании в течение 15 минут магнитной мешалкой пропеллерного типа. После добавления буфера содержание ТГФ в растворе составляло 3,85%. Далее полученную суспензию обрабатывали ультразвуком при 35 кГц в течение 10 минут. Для этого стеклянную емкость с полученной суспензией корпускулярного адъюванта помещали в ультразвуковую баню. И обрабатывали в вышеописанном режиме. В результате обработки получали белую равномерную суспензию без конгламератов и включений. За гомогенностью суспензии следили по светорассеянию, последовательно обрабатывая по 30 секунд до получения двух одинаковых спектров распределения частиц в диапазоне 100-150 нанометров. На следующем этапе производили очистку дисперсии КА от тетрагидрофурана. Применяли ультрафильтрацию на полых волокнах с номинальной отсекающей молекулярной массой 100 кДа в режиме фильтрации. Для предотвращения сорбции использовали 2-3 кратное разведение исходной дисперсии КА. При этом скорость ультрафильтрации составляла 1,0-1,2 л/минуту, давление устанавливали в пределах 0,6-0,8 атм. Для диафильтрации использовали 10-кратный объем (25 литров) 0,01 М трис-буфера. Затем дисперсию концентрировали до содержания бетулина 1,0-2,0 мг/мл (4,5 л буфера). Концентрацию бетулина определяли методом ВЭЖХ. Емкость с корпускулярным адъювантом хранили в холодильной камере при температуре около +4 С.
Получение кандидатной вакцины для иммунизации животных и добровольцев. Полученный в соответствии с перечисленными этапами стерильный рекомбинантный антиген RBD/S21/S14-FC, растворенный в Трис-HCl буферном растворе объемом 100 мл добавляли в емкость с предварительно приготовленным стерильным адъювантом объемом 1 литр в 0,05М буферном растворе Трис-HCl с добавлением 0,15М NaCl (рН 7,5) тщательно перемешивали в течение двух часов при +4°С. Полученный полуфабрикат, содержащий RBD/S21/S14-Fc, прошедший все контроли, доводят до концентрации белка 40 мкг/мл и концентрации адъюванта 400 мкг/мл в фосфатном буферном растворе рН 7,5. Компоненты тщательно перемешали и поместили в шейкер в холодильник при температуре от 2 до 8°С на 3 часа. Затем емкости с «балком» кандидатной вакцины разливали по 0,5 мл во флаконы и хранили в холодильнике при 2-8°С. Содержание антигена и адъюванта в одной дозе (0,5 мл) составляло 20 мкг и 200 мкг соответственно. По такой же схеме готовили образец кандидатной вакцины с содержанием антигена и адъюванта в дозе (0,5 мл): 5 мкг рекомбинантного антигена RBD/S21/S14-Fc и 200 мкг корпускулярного адъюванта.
Полученную вакцину применяли в качестве кандидатной вакцины для проведения доклинических и клинических исследований.
Определение содержания корпускулярного адъюванта (КА). Определение проводили методом обращено-фазовой ВЭЖХ. Исследование проводили с использованием жидкостного хроматографа Shimadzu LC-2010 (Япония) и аналитической колонки Kromasil 300-5С8 250 х 4.6 мм с размером частиц 5 мкм, AkzoNobel (Голландия) в изократическом режиме элюирования и детектировании при 210 нм. Результаты представлены в табл. 4.
Оценка специфической активности вакцины. Целью исследования являлось сравнительное изучение иммуногенности вакцины в опытах на животных. В ходе исследования сравнивали выработку антител у иммунизированных опытными вакцинами мышей линии Balb/c массой 12 - 14 г обоего пола. Испытуемые препараты вводили двукратно (по схеме 0-14) внутрибрюшинно по 0,5 мл шприцем вместимостью 1 мл. Аналогично контрольным группам животных вводили натрия хлорид, раствор для инфузий 0,9%. Забор крови осуществляли на 14 день после однократной иммунизации и на 14 день после двукратной иммунизации. Антитела определяли в сыворотках с помощью метода ИФА. Исследовали специфическую активность вакцины, содержащей только RBD (в двух дозировках: 5 и 20 мкг рекомбинантного белка в дозе (0,5 мл), вакцину N+RBD в дозировке 5 мкг антигена в дозе (0,5 мл), а также вакцину без адъюванта. Данные о числе животных, о вакцинах и их дозировке при иммунизации представлены в табл.5.
Полученные из крови мышей сыворотки (индивидуально от каждого животного) контролировали на наличие антител к антигену SARS-CoV-2 методом иммуноферментного анализа с использованием экспериментальной тест-системы (ИФТС). При конструировании ИФТС использовались коммерческие реагенты: a/mouse IgG (H+L) Strong Zyme HRP Conjugate (фирмы «SDT», Германия); хромоген - 3,3,5,5-тетраметилбензидин (фирмы «Хема», Россия); блокатор -белково-солевой раствор, в качестве стоп-реагента применялся 5% раствор серной кислоты. Иммуноферментную реакцию выполняли на полистироловых планшетах фирмы Greiner bio-one, Германия. На подложку наносили 1 мкг антигена SARS-CoV-2 и сорбировали в течение суток. Результаты иммуноферментного анализа регистрировали на спектрофотометре PR 2100 производства фирмы «Sanofi Diagnostiks Pasteur» (Франция) при двух длинах волн 450/620 нм и они представлены в табл.6.
3
2
3
Изучение иммунного ответа (титра антител) кандидатной вакцины на основе рекомбинантного белка RBD/S21/S14-Fc и корпускулярного адъюванта на основе природного бетулина. В исследовании были использованы самки линии BALB/c (Филиал "Столбовая" ФГБУН НЦБМТ ФМБА России). Животных содержали в стандартных условиях (18-22°С и относительной влажности воздуха 50-70%, NH=0,001 мг/м, СО=0,1%, 12 ч темноты/12 ч света), кормили гранулированным полнорационным экструдированным кормом для мышей, крыс, и хомяков (ООО «Лабораторкорм», Москва) ad libitum в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях и в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами СП 2.2.1.3218-14 "Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)" (утв. постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 29 августа 2014 г. №51).
В табл. 7 приведены препараты кандидатной вакцины на основе рекомбинантного белка RBD/S21/S14-Fc с корпускулярным адъювантом для иммунизации животных и дизайн исследования. В качестве препарата плацебо использовали физиологический раствор (0,9% NaCl).
Мышам линии BALB/c массой 18-20 г препараты вводили внутрибрюшинно по 0,5 мл шприцем вместимостью 1 мл, двукратно, 1-й и 14-й день, согласно дизайну исследования. Перед каждым заполнением шприца препарат перемешивали 5-6 раз. Контрольной группе мышей той же партии вводили раствор 0,9% натрия хлорида. Через 28 дней после первой иммунизации у мышей осуществляли забор крови из нижнечелюстной вены. Образцы крови отстаивали при комнатной температуре в течение 2-х часов, центрифугировали 10 мин при 5000 об/мин и отбирали образовавшуюся цельную сыворотку. До момента использования сыворотки хранили при температуре - 20°С. Полученные из крови мышей сыворотки (индивидуально от каждого животного) контролировали на наличие антител методом иммуноферментного анализа (ИФА) и РМН. Статистический анализ первичных данных проводили в GraphPad Prism v9. Для представления данных использовали следующие статистические показатели: среднее геометрическое, стандартное отклонение, среднее арифметическое, ошибка среднего. Для определения значимости различий между групповыми средними использовали однофакторный дисперсионный анализ ANOVA, затем критерий Тьюки для апостериорных попарных сравнений групп между собой. Групповой уровень значимости принимали равным α=0,05. Различия считали достоверными при р<α.
Иммуноферментный анализ. Наличие специфических иммуноглобулинов класса G (IgG) определяли в образцах сывороток мышей после двукратной иммунизации. Сорбцию антигена, разведенного в стерильном DPBS до концентрации 1,0 мкг/мл проводили в течение ночи при +4°С в 96-луночных планшетах Maxisorp (Nunc) (по 100 мкл/лунку). Затем планшеты дважды отмывали раствором 0,1% TWEEN20 (Serva) в PBS с использованием автоматического промывателя ELx50 (BioTek) по 500 мкл/лунку. После отмывки планшеты инкубировали с блокирующим буфером (PBS-T, содержащий 5% сухое молоко, «ТФ Дитол»), в течение 2-х часов при комнатной температуре и повторно отмывали. После чего на планшет вносили серии двукратных разведений сывороток, начиная с разведения 1:400 для групп животных, получивших вакцинные препараты и с разведения 1:50 для группы плацебо. Планшеты с мышиными сыворотками инкубировали 1 ч при комнатной температуре, затем три раза отмывали. В качестве вторичных антител использовали меченые пероксидазой хрена Goat anti mouse IgG (H+L) HRP (Abcam) в разведении 1:7500 по 100 мкл/лунку. После инкубации со вторичными антителами планшеты четыре раза отмывали. В качестве цветного субстрата использовали раствор ТМВ (ООО «Имтек», Россия) по 100 мкл/лунку в течение 10 мин при комнатной температуре, затем реакцию останавливали добавлением IN H2SO4 («Вектон», Россия). Оптическую плотность (ОП) при длине волны 450 нм измеряли на мультипланшетном ридере с LVF монохроматорами CLARIOstar (BMG LABTECH).Для вакцинных препаратов после двукратной иммунизации в дозе 5 мкг и 20 мкг было проведено определение уровня специфических антител IgG к белку RBD/S21/S14-Fc в сыворотках иммунизированных животных с помощью непрямого варианта ИФА с использованием экспериментальной тест системы. Результаты определения уровня специфических антител представлены в таблице. Статистический анализ был выполнен при помощи однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим попарным сравнением групп при помощи критерия Тьюки. В ходе исследования показано формирование выраженного уровня сывороточных антител, специфических к белку RBD/S21/S14-Fc после двукратной иммунизации вакцинными препаратами в обоих использованных дозах. Результаты представлены в табл.8.
Реакция микронейтрализации (МНТ). Для проведения реакции нейтрализации сыворотки мышей разводили стерильным DPBS в соотношении 1:4 и прогревали 30 мин при 56°С. Затем готовили разведения сывороток на среде МЕМ+2% FBS в объеме 50 мкл, начиная с 1:10 (в пересчете на цельную сыворотку). К разведениям сывороток добавляли эквивалентный объем вируса SARS-CoV-2 (заражающая доза 25 ТЦИД50) и инкубировали 1 час при 37°С. Затем разведения переносили на клетки Vero в 96-луночных планшетах. Планшеты инкубировали в течение 4 суток при 37°С, после чего проверяли на наличие ЦПД. Нейтрализующим титром считали наибольшее разведение сыворотки, при котором наблюдается отсутствие ЦПД. Все исследования с инфекционным коронавирусом проводили в лаборатории иммунологии и профилактики вирусных инфекций ФГБНУ «ИЭМ» (Санитарно-эпидемиологическое заключение Роспотребнадзора по Санкт-Петербургу №77.ПЧ.01.000.М.000053.08.20 от 05.08.2020 для проведения работ с ПБА II-IV группы патогенности). Результаты определения уровня нейтрализующих антител против коронавируса SARS-CoV-2 в сыворотках крови мышей после двукратной иммунизации показали, что вирус-нейтрализующие антитела в количестве, достоверно отличающимся от группы плацебо, формируются в группе животных, получивших кандидатную вакцину, содержащую рекомбинантный белок как в дозе 5 мкг, так и в дозе 20 мкг. Уровень вируснейтрализующих антител, достоверно не отличался от такового в обеих группах. Статистический анализ был выполнен при помощи однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим попарным сравнением групп при помощи критерия Тьюки. Результаты представлены в табл.8. В ходе исследования показано, что двукратная иммунизация приводила к формированию вируснейтрализующих антител в количестве достоверно отличающемся от группы плацебо только в группе животных, привитых кандидатной вакциной, содержащей рекомбинантный белок в дозе 5 или 20 мкг. Таким образом, установлено, что вакцина, содержащая корпускулярный адъювант на основе природного бетулина, обладает высокой антигенной активностью.
Изучение иммуногенных свойств (оценки клеточного иммунного ответа) кандидатной вакцины на основе рекомбинантного белка RBD/S21/S14-Fc и корпускулярного адъюванта на основе природного бетулина. Для оценки Т-клеточного иммунного ответа, мышам линии C57/black SPF (n=5 на группу) препарат RBD1 вводили внутрибрюшинно по 5 или 20 мкг, двукратно, 1-й и 22-й день. Селезенки были собраны через 28 дней после второй иммунизации. Невакцинированная группа (n=3) служила контролем. Дизайн исследования представлен в табл.9.
Гомогенаты селезенки фильтровали (поры 70 мкм), промывали DPBS, содержащим 2,5% FCS (Gibco), лишали красных кровяных телец буфером для лизиса RBC (BioLegend), промывали DPBS (2,5% FCS). Клетки селезенки высевали на 96-луночные планшеты с плоским дном при плотности 2x106 клеток и стимулировали пулом пептида S-белка SARS-CoV-2 (PepTivator SARS-CoV-2 Prot S) в течение 6 часов в присутствии анти-CD28 (BioLegend) и Брефельдина A (BD Biosciences). Фенотип клеток изучали с с помощью проточной цитометрии и CD8-PE/Cy7, CD4-PerCP/Cy5.5, CD44-BV510, CD62L-APC/Cy7, IFNγ-BV780, TNFα-BV421, IL2-PE (BioLegend). Мертвые клетки обнаруживали с помощью Zombie Red (BioLegend). True Stain, содержащий анти-CD16/CD32 (BioLegend), использовали для блокирования неспецифического связывания. Окрашивание клеток проводили с помощью Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) в соответствии с инструкциями. Определяли относительное соотношение CD8+ и CD4+Т-лимфоцитов с фенотипом эффекторных клеток памяти (CD44+CD62L-). Значительное увеличение S-белок специфических CD4+ и CD8+Tem клеток было измерено после двух иммунизаций по 20 мкг, тогда как иммунизация в количестве 5 мкг антигена привела к статистически значимому увеличению только CD4+Tem (р<0,05). Наблюдалась тенденция к дозозависимому росту клеток, продуцирующих Th1-цитокин (IFNγ, IL-2, TNFα), среди обеих популяций Tem. Эффект достиг значимости для Tem, продуцирующего IL-2 (IFNγ-IL-2+TNFα-), и для многофункциональных CD8+Т-клеток (IFNγ+IL-2+TNFα+) в обеих группах дозирования. В группе с высокими дозами рост IL-2, продуцируемого CD8+Tem, также был значительным.
Изучение иммуногенных свойств (оценки клеточного иммунного ответа) кандидатной вакцины на основе рекомбинантного белка RBD/S21/S14-Fc и корпускулярного адъюванта на основе природного бетулина на добровольцах.
Для строгого контроля за возникновением нежелательных явлений и любых поствакцинальных осложнений, для добровольцев была предусмотрена двукратная госпитализация в стационар на 3-е полных суток (4 дня) для проведения каждого из двух введений вакцины / плацебо. Добровольцы были госпитализированы в стационар за один день до введения вакцины. Через двое суток после первой и второй инъекции вакцины / плацебо, при отсутствии нежелательных явлений (НЯ) и серьезных нежелательных явлений (СНЯ) добровольцев выписали из стационара. Дальнейшее наблюдение осуществлялось амбулаторно. Исследование проводили в два этапа.
Первый этап исследования первой фазы. Первый этап клинического исследования представляет собой открытое рандомизированное исследование безопасности, переносимости (реактогенности) и иммуногенности вакцины при двукратном внутримышечном введении в дозах 20 мкг+5 мкг и 20 мкг+20 мкг. С учетом предполагаемого количества испытуемых, признанных по результатам скрининга не соответствующими критериям включения и/или соответствующими критериям невключения, исследование проведено у 20 здоровых добровольцев в параллельных группах в возрасте от 18 до 60 лет. Группа 1 (10 человек) - получала исследуемый вакцинный препарат по следующей схеме: первая инъекция 20 мкг - 0,5 мл суспензии для внутримышечного введения (40 мкг/мл), вторая инъекция 5 мкг - 0,5 мл суспензии для внутримышечного введения (10 мкг/мл), через 28 дней (далее - «двукратная иммунизация по схеме 20 мкг+5 мкг»). Группа 2 (10 человек) - получала исследуемый препарат по следующей схеме: первая и вторая инъекции по 20 мкг - по 0,5 мл раствора для внутримышечного введения (40 мкг/мл), через 28 дней (далее -«двукратная иммунизация по схеме 20 мкг+20 мкг»). Добровольцы были госпитализированы в стационар за один день до каждого из двух введений вакцины. Длительность пребывания в стационаре составила два периода по 4 дня (4 Визита).
Второй этап исследования первой фазы. Второй этап клинического исследования представляет собой двойное слепое рандомизированное с параллельными группами клиническое исследование безопасности, переносимости и иммуногенности вакцины при двукратном внутримышечном введении в дозах 20 мкг+5 мкг и 20 мкг+20 мкг. С учетом предполагаемого количества испытуемых, признанных по результатам скрининга не соответствующими критериям включения и/или соответствующими критериям невключения, исследование проведено у 96 здоровых добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет. Группа 3 (32 человека) - получала исследуемый препарат по следующей схеме: первая инъекция 20 мкг - 0,5 мл суспензии для внутримышечного введения (40 мкг/мл), вторая инъекция 5 мкг - 0,5 мл суспензии для внутримышечного введения (10 мкг/мл), внутримышечно, через 28 дней; Группа 4 (32 человека) - получала исследуемый препарат по следующей схеме: первая и вторая инъекции по 20 мкг - по 0,5 мл раствора для внутримышечного введения (40 мкг/мл), внутримышечно, через 28 дней; Группа 5 (32 человека) -получала плацебо по следующей схеме: первая и вторая инъекции - по 0,5 мл натрия хлорида, раствора для инъекций 0,9%, внутримышечно, через 28 дней.
96 добровольцев (Групп 3, 4 и 5) госпитализированы в стационар за 1 день до первого введения исследуемого препарата / плацебо. Длительность пребывания в стационаре составила 4 дня (3-е суток). Все добровольцы Групп 3, 4 и 5 наблюдались у врача-исследователя в течение 6-ти месяцев (180±5 дней) после первого введения исследуемого препарата / плацебо с целью выявления возможных поздних нежелательных реакций, оценки иммуногенности. Итоговая оценка безопасности и переносимости проводилась на Визите 20 (180±5 дней от момента первого введения исследуемого препарата / плацебо).
Анализ данных показал, что по всем изучаемым системам НЯ в анализируемых группах значимо не различались между собой. У одного добровольца с рандомизационным порядковым номером R004 (из Г1) на Визите 4 была зарегистрирована Коронавирусная инфекция COVID-19 на основании подтверждения наличия РНК вируса SARS-CoV-2 методом ГЩР и клинических проявлений (лихорадка, кашель), что являлось критерием исключения из исследования. Данное НЯ было легкой степени тяжести, продолжалось на момент проведения промежуточного анализа данных. Оценка различий между Г1 и Г2 с применением Fisher exact test показала отсутствие статистической значимости (р=1.000) по критерию «Доля добровольцев с симптомами COVID-19 и подтвержденным методом ШДР заражением SARS-CoV-2 инфекцией». Сравнительная характеристика первичных и вторичных критериев безопасности и переносимости показала отсутствие статистически значимых различий между исследуемыми группами.
Помимо безопасности кандидатной вакцины у добровольцев Группы 1-4 выявляли в крови специфические антитела к вирусу SARS-CoV-2. Результаты определения специфических антител у привитых добровольцев приведены в табл.10.
Результаты определения специфических антител после иммунизации добровольцев двумя дозами вакцины Betuvax-CoV-2 показали, что при внутримышечном введении вакцины с интервалом 28 дней и использовании испытуемых схем введения (20 мкг+5 мкг и 20 мкг+20 мкг) у большинства добровольцев наблюдается синтез специфических антител в высоком титре.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
--->
<110>  Betuvaks LLC
Krasilnikov, Igor V
Isaev, Artur A
Kudriavtsev, Aleksandr V
Frolova, Maria E
Vakhrusheva, Anna V
Ivanov, Aleksandr V
Djonovic, Milana
Ivanishin, Taras V
Askretkov, Aleksandr D
Voronina, Yekaterina V
Zyryanov, Dmitry A
Serogin, Yuriy A
Stukova, Marina A
Romanovskaya-Romanko, Yekaterina A
Smirnov, Ivan V
Mokrushina, Yuliana A
Kryuchkov, Nikolay A
Blagodatskikh, Konstantin A
<120>  Генная композиция для экспрессии рекомбинантного антигена,
клеточная линия, продуцирующая рекомбинантный антиген, способ
получения рекомбинантного антигена, вакцина против коронавирусной
инфекции, способ ее получения
<130>  KF
<160>  14
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  479
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Recombinant fusion protein
<400>  1
Ala Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala
1               5                   10                  15
Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn
20                  25                  30
Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr
35                  40                  45
Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe
50                  55                  60
Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg
65                  70                  75                  80
Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys
85                  90                  95
Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn
100                 105                 110
Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe
115                 120                 125
Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile
130                 135                 140
Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys
145                 150                 155                 160
Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly
165                 170                 175
Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala
180                 185                 190
Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Gln Ile Leu Pro Asp
195                 200                 205
Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn
210                 215                 220
Lys Val Thr Leu Ala Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln
225                 230                 235                 240
Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
245                 250                 255
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
260                 265                 270
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
275                 280                 285
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
290                 295                 300
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
305                 310                 315                 320
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
325                 330                 335
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
340                 345                 350
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
355                 360                 365
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
370                 375                 380
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
385                 390                 395                 400
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
405                 410                 415
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
420                 425                 430
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
435                 440                 445
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
450                 455                 460
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465                 470                 475
<210>  2
<211>  1500
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Hybrid RBD-Fc codon-optimized sequence
<400>  2
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcc       60
gcacccaata tcaccaatct gtgccccttc ggcgaggtgt tcaatgccac cagattcgcc      120
tctgtgtacg cctggaaccg gaagcggatc agcaattgcg tggccgacta ctccgtgctg      180
tacaactccg ccagcttcag caccttcaag tgctacggcg tgtcccctac caagctgaac      240
gacctgtgct tcacaaacgt gtacgccgac agcttcgtga tccggggaga tgaagtgcgg      300
cagattgccc ctggacagac aggcaagatc gccgactaca actacaagct gcccgacgac      360
ttcaccggct gtgtgattgc ctggaacagc aacaacctgg actccaaagt cggcggcaac      420
tacaattacc tgtaccggct gttccggaag tccaatctga agcccttcga gcgggacatc      480
tccaccgaga tctatcaggc cggcagcacc ccttgtaacg gcgtggaagg cttcaactgc      540
tacttcccac tgcagtccta cggctttcag cccacaaatg gcgtgggcta tcagccctac      600
agagtggtgg tgctgagctt cgaactgctg catgcccctg ccacagtgtg cggccctaag      660
aaaagcaccc agattctgcc cgatcctagc aagcccagca agcggagctt catcgaggac      720
ctgctgttca acaaagtgac actggccaca gagagcaaca agaagttcct gccattccag      780
cagtttggcc gggatatcgc cgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg      840
tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag      900
gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac      960
gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag     1020
acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc     1080
ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc     1140
ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg     1200
tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg     1260
gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag     1320
aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc     1380
aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg     1440
catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga     1500
<210>  3
<211>  60
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  3
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcc       60
<210>  4
<211>  9290
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Plasmid DNA
<400>  4
ctagagtcgg ggcggccggc cgctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag       60
ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact      120
gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt      180
ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat      240
gctggggatt aattaagatc gcatgcttct atattatttt ctaaaagatt taaagttttg      300
ccttctccat ttagacttat aattcactgg aatttttttg tgtgtatggt atgacatatg      360
ggttcccttt tattttttac atataaatat atttccctgt ttttctaaaa aagaaaaaga      420
tcgcatgctt ctatattatt ttctaaaaga tttaaagttt tgccttctcc atttagactt      480
ataattcact ggaatttttt tgtgtgtatg gtatgacata tgggttccct tttatttttt      540
acatataaat atatttccct gtttttctaa aaaagaaaaa gatccgtacg catttaattc      600
taccgggtag gggaggcgct tttcccaagg cagtctggag catgcgcttt agcagccccg      660
ctgggcactt ggcgctacac aagtggcctc tggcctcgca cacattccac atccaccggt      720
aggcgccaac cggctccgtt ctttggtggc cccttcgcgc caccttctac tcctccccta      780
gtcaggaagt tcccccccgc cccgcagctc gcgtcgtgca ggacgtgaca aatggaagta      840
gcacgtctca ctagtctcgt gcagatggac agcaccgctg agcaatggaa gcgggtaggc      900
ctttggggca gcggccaata gcagctttgc tccttcgctt tctgggctca gaggctggga      960
aggggtgggt ccgggggcgg gctcaggggc gggctcaggg gcggggcggg cgcccgaagg     1020
tcctccggag gcccggcatt ctgcacgctt caaaagcgca cgtctgccgc gctgttctcc     1080
tcttcctcat ctccgggcct ttctcgagct caggcttggg gggggggaca gctcagggct     1140
gcgatttcgc gccaaacttg acggcaatcc tagcgtgaag gctggtagga ttttatcccc     1200
gctgccatca tggttcgacc gctgaactgc atcgtcgccg tgtcccagaa tatgggcatc     1260
ggcaagaacg gagattttcc ctggccaatg ctcaggaacg aattcaagta cttccaaaga     1320
atgaccacca cctcctcagt ggaaggtaaa cagaacctgg tgattatggg ccggaaaacc     1380
tggttctcca ttcctgagaa gaatcgacct ttaaaggaca gaattaatat agttctcagt     1440
agagagctca aggaaccacc acaaggagct cattttcttg ccaaaagttt ggatgatgcc     1500
ttaagactta ttgaacaacc ggaattggca agtaaagtag acatggtttg gatagtcgga     1560
ggcagttctg tttaccagga agccatgaat caaccaggcc acctcagact ctttgtgaca     1620
aggatcatgc aggaatttga aagtgacacg tttttcccag aaattgattt ggggaaatat     1680
aaacttctcc cagaataccc aggcgtcctc tctgaggtcc aggaggaaaa aggcatcaag     1740
tataagtttg aagtctacga gaagaaagac taacaggaag atgctttcaa gttctctgct     1800
cccctcctaa agctatgcat ttttataaga ccatgggact tttgctggct ttagatcgta     1860
caagtaaagc ggccgcgacg ttcgatcata atcagccata ccacatttgt agaggtttta     1920
cttgctttaa aaaacctccc acacctcccc ctgaacctga aacataaaat gaatgcaatt     1980
gttgttgtta acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca     2040
aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc     2100
aatgtatctt aaggcgtaaa ttgtaagcgt taataggatc cgtcgatcga ccgatgccct     2160
tgagagcctt caacccagtc agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg     2220
cacttatgac tgtcttcttt atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca gcgctcttcc     2280
gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct     2340
cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg     2400
tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc     2460
cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga     2520
aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct     2580
cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg     2640
gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag     2700
ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat     2760
cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac     2820
aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac     2880
tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc     2940
ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt     3000
tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc     3060
ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg     3120
agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca     3180
atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca     3240
cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag     3300
ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagaa     3360
ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc     3420
agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct     3480
agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc     3540
gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg     3600
cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc     3660
gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat     3720
tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag     3780
tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat     3840
aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg     3900
cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca     3960
cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga     4020
aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc     4080
ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata     4140
tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg     4200
ccacctgacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc     4260
gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt     4320
ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc     4380
cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt     4440
agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt     4500
aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt     4560
gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa     4620
aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgcttacaa tttgccattc gccattcagg     4680
ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtc gacgatccac tagttctagc tagaatggtg     4740
gggttgcgcc ttttccaagg cagccctggg tttgcgcagg gacgcggctg ctctgggcgt     4800
ggttccggga aacgcagcgg cgccgaccct gggtctcgca cattcttcac gtccgttcgc     4860
agcgtcaccc ggatcttcgc cgctaccctt gtgggccccc cggcgacgct tcctgctccg     4920
cccctaagtc gggaaggttc cttgcggttc gcggcgtgcc ggacgtgaca aacggaagcc     4980
gcacgtctca ctagtaccct cgcagacgga cagcgccagg gagcaatggc agcgcgccga     5040
ccgcgatggg ctgtggccaa tagcggctgc tcagcagggc gcgccgagag cagcggccgg     5100
gaaggggcgg tgcgggaggc ggggtgtggg gcggtagtgt gggccctgtt cctgcccgcg     5160
cggtgttccg cattctgcaa gcctccggag cgcacgtcgg cagtcggctc cctcgttctc     5220
gagttgagac gaccttccat ggccaagttg accagtgccg ttccggtgct caccgcgcgc     5280
gacgtcgccg gagcggtcga gttctggacc gaccggctcg ggttctcccg ggacttcgtg     5340
gaggacgact tcgccggtgt ggtccgggac gacgtgaccc tgttcatcag cgcggtccag     5400
gaccaggtgg tgccggacaa caccctggcc tgggtgtggg tgcgcggcct ggacgagctg     5460
tacgccgagt ggtcggaggt cgtgtccacg aacttccggg acgcctccgg gccggccatg     5520
accgagatcg gcgagcagcc gtgggggcgg gagttcgccc tgcgcgaccc ggccggcaac     5580
tgcgtgcact tcgtggccga ggagcaggac tgagcggccg caataaaata tctttatttt     5640
cattacatct gtgtgttggt tttttgtgtg aatcgatagt actaacatac gctctccatc     5700
aaaacaaaac gaaacaaaac aaactagcaa aataggctgt ccccagtgca agtgcaggtg     5760
ccagaacatt tctctatcga taacgcgtct catcacggtc acgcatggct gcgcccgcgc     5820
agcgcccccc gacccccccc cgatccccgg aacgccagcc gccatccacc gcccgcagcc     5880
cccggagccc gcggaccccg accccccgcc gctcgcccgc cgttgcgccg ctctctgcgg     5940
gggggctagg gggccgcggg gggaaggcca cgccccctcc actttttcca ggaatgcgcg     6000
gcatgacccg ccccccccat gacccgccaa cacccccccg atgccccccg ggggtctttc     6060
ctggggggcc tttgtcaggg ttgcctgtgt cacccacggg ccccttggcc acgcttgcct     6120
gggtcacccc ggagccccgg gtcacgtttg ccggggtcag ccctggggcg cttcttcacg     6180
ctccattgcc ggtacctagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc     6240
catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca     6300
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga     6360
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc     6420
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct     6480
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat     6540
tagtcatcgc tattaccatg ggtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc     6600
gcccacagtc cccgagaagt tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag     6660
gtggcgcggg gtaaactggg aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg     6720
tgggggagaa ccgtatataa gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt     6780
tgccgccaga acacaggtaa gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg     6840
ttatggccct tgcgtgcctt gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc     6900
cgagcttcgg gttggaagtg ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc     6960
gcctcgtgct tgagttgagg cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg     7020
gcaccttcgc gcctgtctcg ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg     7080
acctgctgcg acgctttttt tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca     7140
cactggtatt tcggtttttg gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac     7200
atgttcggcg aggcggggcc tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca     7260
agctggccgg cctgctctgg tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc     7320
ggcaaggctg gcccggtcgg caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc     7380
tgctgcaggg agctcaaaat ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc     7440
cacacaaagg aaaagggcct ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccacggagta     7500
ccgggcgccg tccaggcacc tcgattagtt ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg     7560
ttggggggag gggttttatg cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt     7620
taggccagct tggcacttga tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc     7680
ttggttcatt ctcaagcctc agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc     7740
gtgaggaatt agcttggtac taatacgact cacaagctgc cgccaccatg tacaggatgc     7800
aactcctgtc ttgcattgca ctaagtcttg cacttgtcac gaattccgca cccaatatca     7860
ccaatctgtg ccccttcggc gaggtgttca atgccaccag attcgcctct gtgtacgcct     7920
ggaaccggaa gcggatcagc aattgcgtgg ccgactactc cgtgctgtac aactccgcca     7980
gcttcagcac cttcaagtgc tacggcgtgt cccctaccaa gctgaacgac ctgtgcttca     8040
caaacgtgta cgccgacagc ttcgtgatcc ggggagatga agtgcggcag attgcccctg     8100
gacagacagg caagatcgcc gactacaact acaagctgcc cgacgacttc accggctgtg     8160
tgattgcctg gaacagcaac aacctggact ccaaagtcgg cggcaactac aattacctgt     8220
accggctgtt ccggaagtcc aatctgaagc ccttcgagcg ggacatctcc accgagatct     8280
atcaggccgg cagcacccct tgtaacggcg tggaaggctt caactgctac ttcccactgc     8340
agtcctacgg ctttcagccc acaaatggcg tgggctatca gccctacaga gtggtggtgc     8400
tgagcttcga actgctgcat gcccctgcca cagtgtgcgg ccctaagaaa agcacccaga     8460
ttctgcccga tcctagcaag cccagcaagc ggagcttcat cgaggacctg ctgttcaaca     8520
aagtgacact ggccacagag agcaacaaga agttcctgcc attccagcag tttggccggg     8580
atatcgccga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg     8640
aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga     8700
tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg     8760
tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg     8820
aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact     8880
ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg     8940
agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc     9000
catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct     9060
atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga     9120
ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg     9180
acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc     9240
acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatgataa                9290
<210>  5
<211>  28
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer
<400>  5
gccgccacca tgtacaggat gcaactcc                                          28
<210>  6
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer
<400>  6
ttatcattta cccggagaca g                                                 21
<210>  7
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer
<400>  7
ctttttgagt ttggatcttg gt                                                22
<210>  8
<211>  18
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer
<400>  8
caaacaacag atggctgg                                                     18
<210>  9
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer
<400>  9
ctttttgagt ttggatcttg gt                                                22
<210>  10
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer
<400>  10
acttcatctc cccggatcac                                                   20
<210>  11
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer
<400>  11
acttcatctc cccggatcac                                                   20
<210>  12
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer
<400>  12
aattgcgtgg ccgactactc c                                                 21
<210>  13
<211>  18
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer
<400>  13
caaacaacag atggctgg                                                     18
<210>  14
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Primer
<400>  14
cagcacgtac cgtgtggtca gc                                                22
<---