Обоснование использования магнитных наночастиц для направленной доставки лекарственных препаратов в ишемизированную скелетную мышцу

2

Бионанотехнологии и нанобиоматериаловедение

УДК 615.45:538.955

Д. В. Королев, канд. техн. наук, М. М. Галагудза, д-р. мед. наук, И. С. Усков, лаборант-исследователь, В. Б. Осташев, канд. техн. наук, И. В. Александров, мл. науч. сотр.,

ФГБУ «Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии им. В. А. Алмазова» М. В. Афонин, мл. науч сотр.,

Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет) Е. А. Уменушкина, студентка,

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова

Обоснование использования магнитных наночастиц для направленной доставки лекарственных препаратов в ишемизированную скелетную мышцу

Ключевые слова: магнитные наночастицы, синтез, физико-химические свойства, острая токсичность, направленная доставка.

Key words: magnetic nanoparticles, synthesis, physical and chemical properties, acute toxicity, targeted drug delivery.

В работе описана методика синтеза биоксид-ных магнитных наночастиц ZrO2 х ЕеО4 и дана характеристика их физико-химических свойств. Показана принципиальная возможность адсорбционной иммобилизации лекарственных веществ на поверхности МНЧ с последующей обработкой поверхностно-активными веществами, продемонстрировано отсутствие острой токсичности МНЧ и их влияния на эритропоэз. Воздействие на периферические ткани внешнего магнитного поля приводит к накоплению МНЧ в ткани, что создает предпосылки для направленной доставки лекарств в ишемизированную мышечную ткань.

Введение

Нанотехнология в последние годы стала одной из наиболее перспективных и динамично развивающихся областей знаний. В настоящее время достигнуты значительные успехи в использовании магнитных наночастиц (МНЧ) в медицине [1]. В частности, синтезирован широкий спектр МНЧ на основе металлов Со, Ее, N1, оксидов и ферритов [2]. Существуют следующие основные области применения МНЧ в биологии и медицине [1]:

1) диагностика и инструменты исследований (биосенсоры, молекулярная визуализация, марке-

ры биомолекул, биосепарация и пробоподготовка, исследования молекулярного взаимодействия);

2) адресное терапевтическое воздействие (целевая доставка лекарственных препаратов, управляемая локальная гипертермия опухолей);

3) методы тканевой инженерии и конструирования.

Наиболее широкое применение в биомедицине получили МНЧ оксида железа, что обусловлено их низкой токсичностью и стабильностью физических характеристик [3].

Целью настоящего исследования являлась отработка методики синтеза МНЧ, исследование их физических и биологических свойств, а также возможности применения в качестве носителей лекарственных препаратов для адресной доставки.

Синтез МНЧ

В работе решено было использовать биоксидные МНЧ ZrÜ2 х Fe3Ü4 ввиду их сферичности и размеров, а также наличия циркония, который может быть использован в качестве маркера. Предполагаемая структура МНЧ показана на рис. 1.

Синтез проводили следующим образом. К раствору, содержащему смесь сульфатов железа (II), железа (III) и нитрат циркония в мольном соотношении 2 : 1 : 1 и объемом 700 мл, при постоянном

15-20 нм

5-10 нм

водой. Для подготовки сухой пробы полученные МНЧ отфильтровывались и подвергались лиофиль-ной сушке при температуре — 48 °С в течение 48 ч.

Для подтверждения химического состава полученных МНЧ проводился рентгенодифракционный анализ, результаты которого (рис. 2) хорошо согласуются с данными, приведенными в работе [4].

Свойства МНЧ

Рис. 1

Схематичное изображение МНЧ ХтО2 X Н - Хт О2;  - Ре3О4

перемешивании со скоростью 4 мл/мин добавляли смесь 25%-ного раствора гидроксида аммония и 1%-ного раствора ацетата аммония. Таким образом, соотношение железа и ацетата аммония составляло 2 : 1 : 0,1. Синтез проводили до фиксации насыщенно-черной окраски и установления значения рН = 8  9. На следующий день полученный коллоидный продукт отделяли центрифугированием и промывали четыре раза дистиллированной

Удельную поверхность МНЧ определяли по упрощенному методу БЭТ на установке Клячко— Гурвича. Удельная поверхность составила около 100 м2/г, что говорит о хорошей адсорбционной емкости МНЧ.

Для определения размеров МНЧ использовали метод сканирующей электронной растровой микроскопии.

Для сравнения были получены и проанализированы МНЧ чистого магнетита и биоксидного. Микрофотографии наноматериалов показаны на рис. 3, а, б. Как и ожидалось, МНЧ чистого магнетита (рис. 3, а) имеют сложную, угловатую форму и широкое полидисперсное распределение по разме-

1800

§ 1600 и

1400

т1200

н

1000

20

30

40

50

Угол, град.

60

70

80

Рис. 2

Результаты рентгенодифракционного анализа МНЧ ХтО2 X¥езО4~. • - О2;  - ¥езО4

Рис. 3 Микрофотографии МНЧ: а — частицы ¥езО4,; б — частицы ХтО2 X ¥езО4

рам. Для их использования необходимо применять специальные режимы обработки, поверхностно-активные вещества (ПАВ) и способы их введения.

МНЧ ZrO2 х Еез04, напротив, имеют форму, близкую к сферической, и размеры 10—20 нм (рис. 3, б). Такой наноматериал можно использовать без дополнительной обработки для сорбции действующих веществ.

Помимо этого наличие циркония в качестве маркера позволяет определять количественное содержание МНЧ в тканях при проведении лабораторных исследований на токсичность, биосовместимость и биораспределение.

Иммобилизация действующих веществ на поверхности МНЧ и обработка ПАВ

Авторами было показано, что время жизни физиологических растворов выбранных МНЧ двух составов (ZrO2 х Fe3O4 и Fe3O4) в растворах хлорида натрия (0,9 %) после обработки на ультразвуковом диспергаторе УЗД-2 без добавки ПАВ очень коротко. Во избежание агрегации наночастицы обычно покрываются слоем гидрофильного и биологически совместимого полимера, такого, как декстран, дендри-меры, полиэтиленгликоль, полиэтиленоксид [5, 6], олеиновая кислота [7]. Иногда используются природные либо синтетические фосфолипиды [8]. В нашей работе применялись Tween 80 и PEG 400.

Экспериментально было установлено, что оптимальной навеской МНЧ является 20 мг в 20 мл, концентрация ПАВ Tween 80 составляет 0,5 %, а PEG 400 — 1 %.

Растворы МНЧ готовили следующим образом. К 20 мл раствора хлорида натрия добавляли точную навеску 20 мг МНЧ, проводили ультразвуковое воздействие и сразу вносили заранее подготовленный объем ПАВ. Живучесть такого раствора составляла 3—5 ч, после чего наблюдалось образование небольшого количества осадка. Процесс образования осадка полностью обратим, и получение равномерной дисперсии достигалось обычным встряхиванием.

Рис. 4

Схематичное изображение МНЧ Zr О2 х Ее^О^, нагруженной действующим веществом и покрытой ПАВ:

[^Д — ZrO2; I I — ЕезРф | | — действующее вещество; ^^Н — поверхностно-активное вещество

В дальнейшем возможны адсорбционная иммобилизация действующего вещества на поверхности МНЧ и обработка ПАВ. Предположительная схема МНЧ, нагруженной действующим веществом и покрытой ПАВ, показана на рис. 4.

Исследование биосовместимости МНЧ

Проводилась оценка биосовместимости МНЧ в опытах на острую токсичность. Испытания на лабораторных животных показали полную биосовместимость МНЧ, т. е. отсутствие изменения гемо-динамических показателей в ответ на внутривенное введение. При этом частота сердечных сокращений и среднее артериальное давление после введения МНЧ не изменились относительно исходного уровня, который составлял соответственно 398 уд./мин и 102 мм рт. ст.

Влияние МНЧ на показатели красной крови

Препараты МНЧ изначально применялись как контрастные вещества для магнитно-резонансной томографии. Однако впоследствии оказалось, что они обладают хорошей терапевтической эффективностью при железодефицитной анемии [9, 10].

Целью данного исследования являлась проверка гипотезы о влиянии МНЧ Zr02 х Еез04 на уровень гемоглобина в крови лабораторных животных.

Эксперименты выполнялись на крысах-самцах линии Wistar массой 250—300 г. В качестве наркоза использовался хлоралгидрат в дозировке 480 мг/кг. Животные были разделены на две группы:

1) введение 0,9%-ного раствора NaCl в объеме 1 мл;

2) введение МНЧ в концентрации 1 мг/мл и объеме 1 мл.

Через 21 сутки в подопытных группах в каждой точке осуществляли забор крови у животных для клинического анализа. Результаты анализа на гемоглобин контрольных образцов и образцов крови лабораторных животных после введения МНЧ показаны на рис. 5.

По результатам анализа можно было наблюдать следующую тенденцию:

1) после введения МНЧ число эритроцитов в единице объема крови несколько меньше, чем в контроле;

2) концентрация гемоглобина практически не изменилась;

3) цветовой показатель после введения МНЧ несколько выше, чем в контроле.

Таким образом, дополнительное введение железа в виде МНЧ приводит к увеличению содержания гемоглобина в эритроцитах, но общее количество эритроцитов при этом снижается и кислородтран-спортная функция не меняется, что вполне логично

а) 10

о

х

и

и р

ГО

б) 180

150

120

н и б

60

30

Контроль

МНЧ

в)

90

Контроль

МНЧ

Контроль

МНЧ

Рис. 5

Влияние внутривенного введения МНЧ на показатели красной крови: а — содержание эритроцитов;

б — концентрация гемоглобина; в — цветовой показатель

ввиду отсутствия факторов, прямо или опосредованно стимулирующих эритропоэз.

В этих условиях будет интересен эксперимент по введению разных препаратов железа, в том числе и на основе МНЧ, лабораторным животным в условиях железодефицитной анемии.

Адресная доставка лекарственных препаратов при помощи МНЧ

Для реализации адресной доставки препаратов в скелетную мышцу в работе использовался соленоид (рис. 6) с параметрами, указанными в табл. 1.

Как известно, сила, действующая на частицу ферромагнетика в центре соленоида, равна нулю. Поэтому для определения наиболее эффективного расстояния от центра соленоида до объекта доставки математически исследовали силу магнитного поля кругового тока (Ы витков проволоки радиуса Я и пренебрежимо малой длины по оси х):

(

дВ = д^ дх дх

ц0 цЯ21Ы 2

ц0 цЯ21Ы 2 (Я2 + х2

2х

(я2 + х2

Л

Е = V

ц^Ця2 т (3) ц0 ця2 шх 2 ~

^ 2(Я2 + х2(я 3 (ц-1)ц0 цЯ412 Ы2 х

2 + х2 у

V.

4 (Я2 + х2 )4

При исследовании данной функции на экстремум можно получить расстояние от центра соленоида, на котором сила максимальна:

х =

Я

V?.

Таким образом, оптимальное значение расстояния от центра соленоида до объекта доставки будет равно 7 мм. При проведении эксперимента использовали это значение.

Эксперименты выполнялись на крысах-самцах линии Wistar, массой 250—300 г. В качестве наркоза использовался хлоралгидрат в дозировке 480 мг/кг. Животные были разделены на следующие группы:

1) контроль — в течение 10 мин производили внутривенное введение 0,9 %-ного раствора NaCl в объеме 1 мл (п = 5);

т, ц

Рис. 6

Модельное изображение системы

Таблица 1

Параметры соленоида и электрические параметры

Параметр Значение

Диаметр соленоида Л, мм 35,0

Длина рабочей части соленоида Ь, мм 40,0

Число витков N 800

Диаметр провода 6, мм 0,22

Сопротивление Я, Ом 40

Напряжение питания V, В 20,0

Сила тока I, А 0,5

Zr, %

0,020

0,015

0,010

0,005

0,000

0,022

0,003

ЭМП

Без ЭМП

Контроль

Рис. 7

Результаты анализа по содержанию циркония в образцах тканей

2) внутривенное введение МНЧ в дозировке 1 мг/мл без воздействия электромагнитного поля, (П = 5);

3) введение МНЧ в дозировке 1 мг/мл с воздействием электромагнитного поля на бедро крысы в течение 10 мин (п = 5).

Через 20 мин после начала введения физиологического раствора или суспензии МНЧ осуществляли выведение животного из эксперимента и забирали мышцы бедра для анализа. Забранные образцы тканей сушились в сухожировом шкафу при температуре 90 °С в течение 24 ч, затем измельчались до порошкообразного состояния и растворялись в серной кислоте. Анализ полученного сернокислого раствора на содержание циркония проводился атом-но-эмиссионным методом с индуктивно связанной плазмой (АЭСИСП) по стандартной методике.

Результаты анализа показаны на рис. 7. Как видно из приведенных данных, в контроле циркония не обнаружено. В эксперименте с введением МНЧ

и воздействием ЭМП наблюдается максимальный уровень циркония, что может свидетельствовать о накоплении МНЧ в зоне воздействия и возможности таргетной доставки лекарственных препаратов в ишемизированную нижнюю конечность.

Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ по государственной поддержке ведущих научных школ (НШ-2359.2012.7).

1. Ito A., Shincai M., Honda H., Kobayashi T. Medical application of functionalized magnetic nanoparticles // J. Bioscience and Bioengineering. 2005. Vol. 100. P. 1-11.

2. Biofunctional magnetic nanoparticles for protein separation and pathogen detection / Gu H., Xu K., Xu C. et al. // J. American Chemical Society Chem. Commun. 2006. P. 941-949.

3. Lu A.-H., Salabas E. L., Schuth F. Magnetic nanoparticles: synthesis, protection, functionalization, and application // Angew. Chem. Int. Ed. 2007. Vol. 46. P. 1222-1244.

4. Room-Temperature Soft Magnetic Iron Oxide Nanocrystals: Synthesis, Characterization, and Size-Dependent Magnetic Properties / Y. Tan, Z. Zhuang, Q. Peng, Y. Li // Chem. Mater. Vol. 20. 2008. N. 15. P. 5029-5034.

5. Xu C., Sun S. Superparamagnetic nanoparticles as targeted probes for diagnostic and therapeutic applications // NIH Public Access. Dalton Trans. Author manuscript. 2009. August 7. (29): 5583-5591.

6. Berry C., Curtis A. Functionalisation of magnetic nanoparticles for applications in biomedicine // J. Phys. D. Appl. Phys. 2003. Vol. 36. P. 198-206.

7. Silicon nanocrystals dispersed in water: Photosensitizers for molecular oxygen / B. Goller, S. Polisski, H. Wiggers, D. Kovalev // Applied Physics Letters 96, 211901 (2010).

8. Synthesis and antitumor efficacy of daunorubicin-loaded magnetic nanoparticles / J. Wang, B. Chen, J. Chen et al. // International Journal of Nanomedicine. 2011. N 6. P. 203-211.

9. Superparamagnetic iron oxide: pharmacokinetics and toxicity/ R. Weissleder, D. D. Stark, B. L. Engelstad et al. // AJR Am J Roentgenol. 1989. Vol. 152. N 1. P. 167-73.

10. Coyne D. Ferumoxytol for treatment of iron deficiency anemia in patients with chronic kidney disease// Expert Opin. Pharmacother. 2009. 10(15). P. 2563-2568.

0

Редакция журнала «БИОТЕХНОСФЕРА» объявляет итоги конкурса на лучшую статью номера, опубликованную в выпуске № 5—6/2011

Победителем признана статья Л. Ю. Кривоногова и А. Ю. Тычкова «Перспективы применения преобразования Гильберта—Хуанга для автоматизированной обработки электрокардиосигналов» как лучше других удовлетворяющая следующим критериям: актуальность, постановка задачи, описание методики эксперимента, описание эксперимента,

анализ результатов эксперимента

Приз авторам: годовая подписка на журнал «БИОТЕХНОСФЕРА» за 2012 год