СПОСОБ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ООЦИТОВ КОРОВ
METHOD FOR EXTRACORPOREAL CULTIVATING BOVINE OOCYTES

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам культивирования животных клеток, и может быть применено для получения in vitro зрелых яйцеклеток, способных к дальнейшему развитию, с целью их использования в технологиях получения нормальных, трансгенных или реконструированных эмбрионов, а также для выделения линий эмбриональных стволовых клеток.
2
Известен способ культивирования ооцитов коров в присутствии пролактина (Кузьмина Т.И., Лебедева И.Ю., Торнер X., Альм X. Эффекты пролактина в различных системах культивирования на созревание ооцитов коров и их способность к дальнейшему развитию. Онтогенез. 2001. 32 (2): 140-147). Яичники коров, полученные на мясокомбинате, доставляют в лабораторию при температуре 30-35°С. Ооцит-кумулюсные комплексы выделяют путем аспирации жидкости фолликулов диаметром 2-6 мм и промывают в среде ТС-199, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки. Перед инкубацией проводят селекцию комплексов на основании общепринятых критериев. Ооцит-кумулюсные комплексы культивируют группами по 15-20 штук в каплях среды объемом 200 мкл, покрытых минеральным маслом, в течение 24 ч при температуре 38.5°С в атмосфере с 5% CO и 90%-ной влажностью. Для культивирования используют среду ТС-199 (с L-глутамином), содержащую 20% бычьей сыворотки, 50 нг/мл бычьего пролактина, 0.55 мг/мл лактата кальция, 0.23 мг/мл пирувата натрия, 1.27 мг/мл HEPES и 50 мкг/мл гентамицина. Описанный способ позволяет получить до 78% созревших ооцитов. Однако наличие у него ряда недостатков препятствует достижению требуемого технического результата. Основной недостаток метода заключается в том, что необходимым условием получения высокого выхода эмбрионов на стадии морулы и бластоцисты (до 38%) после оплодотворения ооцитов является их созревание в присутствии клеток гранулезы (1 млн клеток на 1 мл среды). Таким образом, не представляется возможным стандартизировать условия культивирования, поскольку в каждом эксперименте используются гранулезные клетки от разных коров и, вдобавок, эти клетки подвергаются спонтанному апоптозу in vivo (Yang M.Y., Rajamahendran R. Morphological and biochemical identification of apoptosis in small, medium, and large bovine follicles and the effects of follicle-stimulating hormone and insulin-like growth factor-I on spontaneous apoptosis in cultured bovine granulosa cells. Biol. Reprod. 2000. 62: 1209-1217). Следовательно, воспроизводимость указанного метода зависит от дополнительных факторов, связанных с физиологическим состоянием животных и качеством фолликулов. Кроме того, процедура выделения и подготовки клеток гранулезы к совместному культивированию с ооцитами удлиняет общую продолжительность времени между овариэктомией коров и началом культивирования, что является неблагоприятным фактором для жизнеспособности ооцитов. Другим недостатком метода является высокое содержание сыворотки в среде созревания ооцитов, что приводит к увеличению концентрации некоторых компонентов, негативно влияющих на ооциты (Merten O.W. Safety issues of animal products used in serum-free media. Dev. Biol. Stand. 1999. 99: 167-180), а также повышает риск последующего аберрантного фетального роста (Sinclair K.D., McEvoy T.G., Maxfield E.K. et al. Aberrant fetal growth and development after in vitro culture of sheep zygotes. J. Reprod. Fertil. 1999. 116: 177-186). Использование минерального масла при культивировании ооцитов также является нежелательным, поскольку оно адсорбирует стероидные гормоны, секретируемые клетками кумулюса, и в некоторых условиях может выделять токсины, понижая качество яйцеклеток (Shimada M., Kawano N., Terada T. Delay of nuclear maturation and reduction in developmental competence of pig oocytes after mineral oil overlay of in vitro maturation media. Reproduction. 2002. 124: 557-564).
2
Наиболее близким аналогом, взятым в качестве прототипа, является способ культивирования ооцитов коров с использованием сывороточного гонадотропина жеребых кобыл (PMSG) и хорионического гонадотропина человека (hCG) (Avery В., Str⌀bech L., Jacobsen T. et al. In vitro maturation of bovine cumulus-oocyte complexes in undiluted follicular fluid: effect on nuclear maturation, pronucleus formation and embryo development. Theriogenology. 2003. 59: 987-999). После овариэктомии коров и половозрелых телок на мясокомбинате яичники транспортируют в лабораторию в термосе в стерильном физиологическом растворе при температуре 32-35°С. Ооцит-кумулюсные комплексы получают методом аспирации антральных фолликулов диаметром 3-15 мм и собирают в пластиковую пробирку объемом 50 мл, содержащую 1 мл среды ТСМ-199 (с HEPES) и 20 U/мл гепарина. Комплексы промывают несколько раз в этой же среде и один раз - в среде культивирования. В качестве культуральной используют среду ТСМ-199, содержащую 2 U/мл препарата PMSG-hCG, 50 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF), 0.2 мМ пирувата натрия, 5% эстральной сыворотки коров и 50 мкг/мл гентамицина. Ооцит-кумулюсные комплексы (50-60 штук) инкубируют в 700 мкл среды в течение 22.5-24 ч при температуре 38.8°С в увлажненном воздухе, содержащем 5% CO. При культивировании в этих условиях 69% ооцитов дозревали до стадии метафазы II. После оплодотворения доля раздробившихся клеток составляла 64%, при этом стадии бластоцисты достигало 19% клеток. Преимуществами указанного способа являются возможность стандартизировать условия культивирования, низкое содержание сыворотки в среде и отсутствие минерального масла. Вместе с тем его эффективность несколько ниже, чем у вышеописанного способа культивирования с пролактином, что препятствует получению требуемого технического результата. Другим недостатком данного метода является высокая стоимость препарата EGF. Следует также указать на отсутствие предварительной селекции ооцитов, которое может приводить к более низкому качеству созревших яйцеклеток, и на аспирацию фолликулов диаметром более 8 мм, что повышает вероятность использования ооцитов, уже реинициировавших мейоз in vivo.
Задача, на решение которой направлено заявленное изобретение, заключается в создании способа экстракорпорального культивирования ооцитов, обеспечивающего их высокое качество и компетенцию к дальнейшему развитию на основе применения новых компонентов, модифицирующих среду промывания и среду культивирования ооцит-кумулюсных комплексов.
Технический результат изобретения выражается в повышении доли ооцитов, созревших in vitro до стадий телофазы I и метафазы II мейоза, и их способности к развитию до стадии бластоцисты после оплодотворения in vitro, а также в снижении общей стоимости необходимых реагентов за счет замены EGF на менее дорогостоящий препарат пролактин.
Технический результат изобретения достигается тем, что предложен способ экстракорпорального культивирования ооцитов коров, включающий овариэктомию животных после убоя, транспортировку яичников, извлечение ооцит-кумулюсных комплексов путем аспирации содержимого фолликулов, промывание комплексов и их культивирование в среде, не покрытой маслом, в присутствии сывороточного гонадотропина жеребых кобыл, хорионического гонадотропина человека и 5% астральной сыворотки крупного рогатого скота, отличающийся тем, что для получения ооцитов используют фолликулы диаметром от 2 до 8 мм; после извлечения ооцит-кумулюсные комплексы немедленно помещают в промывную среду, содержащую 0.5 мМ изобутилметилксантина, для синхронизации реинициации мейоза; перед культивированием проводят селекцию ооцитов на основании их морфологической оценки; все процедуры изоляции, промывания и селекции комплексов выполняют в среде, содержащей 0.5 мМ изобутилметилксантина; ооцит-кумулюсные комплексы культивируют в среде, модифицированной введением 50 нг/мл бычьего пролактина.
Теоретическим основанием для использования ингибитора фосфодиэстераз изобутилметилксантина являются данные о том, что предотвращение преждевременного снижения уровня цАМФ в ооцит-кумулюсных комплексах до начала культивирования повышает потенцию ооцитов к дальнейшему развитию (Guixue Z., Luciano A.M., Coenen K. et al. The influence of cAMP before or during bovine oocyte maturation on embryonic developmental competence. Theriogenology. 2001. 55: 1733-1743).
Пример
Была проведена оценка эффективности модернизированного способа экстракорпорального культивирования ооцитов коров на основании выхода ооцитов, достигших стадий телофазы I и метафазы II мейоза, и мониторинга развития яйцеклеток до стадии бластоцисты после их оплодотворения in vitro.
2
Яичники коров и половозрелых телок, полученные на мясокомбинате, доставляли в лабораторию в термосе в стерильном физиологическом растворе при температуре 32-35°С. Для исследований отбирали яичники без видимых признаков патологии и 3 раза промывали их в теплом физиологическом растворе (37°С) с антибиотиками (50 мкг/мл стрептомицина и 100 ед./мл пенициллина). Ооцит-кумулюсные комплексы выделяли путем аспирации содержимого фолликулов диаметром 2-8 мм и помещали в пластиковую пробирку объемом 50 мл, содержащую 3 мл среды ТСМ-199 (с HEPES), модифицированную внесением 0.5 мМ изобутилметилксантина, 1 мМ глутамина, 20 U/мл гепарина и 50 мкг/мл гентамицина. Осадок клеток, содержащий ооцит-кумулюсные комплексы, переносили в чашку Петри в 2.5 мл вышеуказанной среды, в которую вместо гепарина было добавлено 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина. После извлечения из суспензии клеток комплексы три раза промывали в свежей среде, затем проводили их селекцию на основании общепринятых критериев. Для экспериментов отбирали ооциты округлой формы, с гомогенной цитоплазмой, равномерной по ширине зоной пеллюцида, окруженные многослойным компактным кумулюсом. Все манипуляции с ооцит-кумулюсными комплексами и их морфологическую оценку выполняли под стереомикроскопом в асептических условиях при температуре 37°С. Перед инкубацией ооцит-кумулюсные комплексы один раз промывали в среде культивирования. В качестве культуральной использовали среду DMEM, содержащую 1 мг/мл глюкозы, 1 мМ пирувата натрия, 4 мМ глутамина, 5% эстральной сыворотки коров, 50 мкг/мл гентамицина, 10 МЕ/мл PMSG, 5 МЕ/мл hCG и 50 нг/мл бычьего пролактина. Ооцит-кумулюсные комплексы (40-50 штук) культивировали в течение 24 ч в 700 мкл среды, не покрытой маслом, при температуре 38.5°С в увлажненном воздухе, содержащем 5% СО. Ядерное созревание ооцитов оценивали цитогенетическим методом.
6
2
Оплодотворение ооцитов выполняли в соответствии с методом, описанным в аналоге изобретения, взятого в качестве прототипа (Avery В., Strobech L., Jacobsen Т. et al. In vitro maturation of bovine cumulus-oocyte complexes in undiluted follicular fluid: effect on nuclear maturation, pronucleus formation and embryo development. Theriogenology. 2003. 59: 987-999). После созревания ооцит-кумулюсные комплексы отмывали 2 раза в среде IVF-TALP и переносили группами по 20-25 штук в лунки 4-луночных планшетов, содержащие 500 мкл среды IVF-TALP, модифицированной добавлением 6 мг/мл БСА, 0.25 мМ пирувата натрия, 30 мкг/мл гепарина, 10 мМ лактата натрия, 20 мкМ пенициламина, 10 мкМ гипотаурина и 1 мкМ эпинефрина. Все ооциты оплодотворяли криоконсервированной спермой одного быка. Сперму размораживали при температуре 38°С и дважды отмывали путем центрифугирования в среде TALP при 300 g в течение 5 мин. Для оплодотворения использовали суспензию спермиев с подвижностью не ниже 6-7 баллов, конечная концентрация которых в среде оплодотворения составляла 2.5×10 спермиев на 1 мл. Ооциты культивировали совместно со спермиями при температуре 38.5°С в атмосфере с 5% СО и 90%-ной влажностью.
2
2
2
Через 20-22 ч после осеменения яйцеклетки отмывали в промывочной среде и встряхивали на вортексе при 2500 об/мин в течение 1 мин для удаления клеток кумулюса и избытка сперматозоидов. Затем яйцеклетки отмывали в синтетической жидкости яйцевода и переносили в капли этой же среды, содержащей 5% эстральной сыворотки коров и 0.3 мМ пирувата натрия. В каплю объемом 100 мкл, покрытую минеральным маслом, помещали по 20-25 предполагаемых зигот и культивировали до 2-го или 8-го дня после осеменения при температуре 38.5°С в атмосфере с 5% СО, 5% O и 90% N. Через 48 ч после осеменения подсчитывали число раздробившихся яйцеклеток и оценивали качество эмбрионов на основе общепринятых критериев. Для мониторинга за развитием эмбрионов на 5-й и 8-й день после осеменения оценивали, соответственно, выход морул и бластоцист.
Сравнительные данные ядерного созревания ооцитов, их оплодотворяемости и развития эмбрионов при использовании заявленного изобретения и его прототипа представлены в таблице.
Ядерное созревание ооцитов коров и их способность к дальнейшему развитию
Стадии развития
Общее число использованных ооцитов
Число клеток, достигших данной стадии развития
Доля клеток на данной стадии развития (%)
Результаты прототипа(по Avery et al. 2003)
Различия между способами (критерий χ<sup>2</sup>)
Телофаза I+ метафаза II
87
83
95.4
69%
Р<0,001
Оплодотвор. яйцеклетки
121
99
81.8
70%
Р<0,05
2-х кл. эмбрионы
177
143
80.8
64%
Р<0,001
Морулы (5-й день после осеменения)
177
94
53.1
не определяли
Бластоцисты (8- й день после осеменения)
177
70
39.5
19%
Р<0,001
Таким образом, предложенный способ позволяет значительно повысить in vitro выход созревших ооцитов (до 95.4%) и их компетенцию к оплодотворению (до 81.8%), дроблению (до 80.8%) и последующему развитию до стадии бластоцисты (до 39.5%) по сравнению с прототипом. Заявленный способ также является менее затратным.
Изобретение может быть использовано в области биотехнологии, в том числе в репродуктивных клеточных технологиях при получении трансгенных и реконструированных эмбрионов и создании линий эмбриональных стволовых клеток, а также в практике воспроизводства крупного рогатого скота методом трансплантации эмбрионов.