ПОДАВЛЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ У НАСЕКОМЫХ-ВРЕДИТЕЛЕЙ
GENES EXPRESSION INHIBITION IN INSECT PESTS

Область изобретения
Настоящее изобретение относится в целом к генетическому контролю нападения видов насекомых-вредителей, в частности, предотвращению и/или борьбе с нападением вредителей на растения. Более конкретно, настоящее изобретение относится к подавлению экспрессии генов-мишеней у видов насекомых-вредителей с помощью интерферирующих молекул рибонуклеиновой кислоты (РНК). Также предлагаются композиции и комбинации, содержащие интерферирующие молекулы РНК по настоящему изобретению для использования в местных применениях, например, в форме инсектицидов.
Предпосылки изобретения
Существует множество видов насекомых-вредителей, которые могут поражать или нападать на большое множество местообитаний и организмов-хозяев. Насекомые-вредители включают разнообразные виды из отрядов насекомых Hemiptera (клопы), Coleoptera (жуки), Siphonaptera (блохи), Dichyoptera (тараканы и богомолы), Lepidoptera (моли и бабочки), Orthoptera (например, кузнечики) и Diptera (настоящие мухи). Нападение вредителей может приводить к значительному ущербу. Насекомые-вредители, которые нападают на виды растений, вызывают особые проблемы в сельском хозяйстве, поскольку они могут приводить к серьезному повреждению сельскохозяйственных культур и значительно снижать урожайность растений. Большое разнообразие различных типов растений, включая товарные культуры, такие как рис, хлопчатник, соя, картофель и кукуруза, чувствительны к нападению вредителей.
Традиционно, нападение насекомых-вредителей предотвращают или контролируют посредством применения химических пестицидов. Однако данные химические вещества не всегда пригодны для применения в обработке сельскохозяйственных культур, так как они могут являться токсичными для других видов и могут наносить значительный ущерб окружающей среде. За последние десятилетия исследователи разработали более экологически безопасные способы контроля нападения вредителей. Например, применялись микроорганизмы, такие как бактерии Bacillus thuringiensis, которые в естественных условиях экспрессируют белки, токсичные для насекомых-вредителей. Ученые также выделили гены, кодирующие эти инсектицидные белки, и использовали их для создания трансгенных культур, устойчивых к насекомым-вредителям, например, растения кукурузы и хлопчатника, генетически сконструированные для продуцирования белков семейства Cry.
Хотя бактериальные токсины являлись весьма успешными в борьбе с определенными типами вредителей, они не эффективны против всех видов вредителей. Исследователи, следовательно, искали другие, более целенаправленные подходы к борьбе с вредителями и, в частности, к РНК-интерференции или “сайленсингу генов” в качестве средств для борьбы с вредителями на генетическом уровне.
РНК-интерференция или ʺRNAiʺ является процессом, посредством которого экспрессия генов в отношении клетки или всего организма подавляется последовательность-специфическим образом. RNAi является в настоящее время общепризнанным методом в данной области для ингибирования или подавления экспрессии генов у самых разнообразных организмов, включая организмы-вредители, такие как грибы, нематоды и насекомые. Кроме того, предыдущие исследования показали, что подавление экспрессии генов-мишеней у видов насекомых-вредителей можно использовать в качестве средства для борьбы с нападением вредителей.
WO2007/074405 описывает способы ингибирования экспрессии генов-мишеней у беспозвоночных вредителей, включая колорадского жука. Кроме того, WO2009/091864 описывает композиции и способы подавления генов-мишеней у видов насекомых-вредителей, включая вредителей из рода Lygus.
Хотя применение RNAi для подавления экспрессии генов у видов вредителей в данной области известно, успех данного метода в применении в качестве меры борьбы с вредителями зависит от выбора наиболее подходящих генов-мишеней, а именно тех, у которых потеря функции приводит к значительному нарушению жизненно важного биологического процесса и/или гибели организма. Настоящее изобретение, таким образом, направлено на подавление конкретных генов-мишеней у насекомых-вредителей в качестве средства достижения более эффективного предотвращения и/или борьбы с нападением насекомых-вредителей, в частности на растения.
Краткое описание изобретения
Авторы настоящего изобретения пытались идентифицировать улучшенные средства для предотвращения и/или борьбы с нападением насекомых-вредителей с применением генетических подходов. В частности, они исследовали применение RNAi для подавления генов таким образом, чтобы снизить способность насекомых-вредителей выживать, расти, колонизировать специфические местообитания и/или нападать на организмы-хозяева, и таким образом ограничить ущерб, наносимый вредителем.
Таким образом, в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения предлагается интерферирующая рибонуклеиновая кислота (РНК или двухцепочечная РНК), которая функционирует при поглощении видами насекомых-вредителей с подавлением экспрессии гена-мишени у указанного насекомого-вредителя,
при этом РНК содержит по меньшей мере один сайленсирующий элемент, при этом сайленсирующий элемент является областью двухцепочечной РНК, содержащей соединенные комплементарные цепи, одна цепь из которых содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах гена-мишени, и при этом ген-мишень
(i) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарную ей последовательность, или имеющих нуклеотидную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух последовательностей является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, или
(ii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарную ей последовательность, или
(iii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 или 3000 последовательных нуклеотидов из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, или имеющую такую нуклеотидную последовательность, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении указанного гена, содержащего указанный фрагмент, с любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59 -62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 указанная нуклеотидная последовательность являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, или
(iv) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 или 3000 последовательных нуклеотидов из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, таким образом, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 указанная нуклеотидная последовательность указанного фрагмента являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной соответствующему указанному фрагменту любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, или
(v) у насекомого-вредителя является ортологом гена, имеющего нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарную ей последовательность, при этом два ортологических гена сходны по последовательности до такой степени, что при оптимальном выравнивании и сравнении двух генов ортолог имеет последовательность, которая по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентична любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43- 46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389, или
(vi) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух аминокислотных последовательностей является по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной аминокислотной последовательности, кодируемой любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389.
В конкретном аспекте настоящего изобретения молекулы интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержат по меньшей мере одну двухцепочечную область, как правило, сайленсирующий элемент интерферирующей РНК, содержащий смысловую цепь РНК, соединенную путем комплементарного спаривания оснований с антисмысловой цепью РНК, где смысловая цепь молекулы dsRNA содержит последовательность нуклеотидов, комплементарную последовательности нуклеотидов, расположенной в пределах РНК-транскрипта гена-мишени.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к интерферирующей рибонуклеиновой кислоте (РНК или двухцепочечной РНК), которая функционирует при поглощении видом насекомого-вредителя с подавлением экспрессии гена-мишени у указанного насекомого-вредителя, при этом РНК содержит по меньшей мере один сайленсирующий элемент, причем сайленсирующий элемент является областью двухцепочечной РНК, содержащей соединенные комплементарные цепи, одна цепь из которых содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах гена-мишени, и при этом ген-мишень
(i) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233 или комплементарную ей последовательность, или имеющих нуклеотидную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух последовательностей является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233 или комплементарной ей последовательности, или
(ii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233 или комплементарной ей последовательности, или имеющих такую нуклеотидную последовательность, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении указанного гена, содержащего указанный фрагмент, с любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233 указанная нуклеотидная последовательность являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233 или комплементарной ей последовательности, или
(iii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233 или комплементарной ей последовательности, и при этом при оптимальном выравнивании и сравнении указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233 указанная нуклеотидная последовательность указанного фрагмента является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной указанному соответствующему фрагменту из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233 или комплементарной ей последовательности, или
(iv) у насекомого-вредителя является ортологом гена, имеющего нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233 или комплементарную ей последовательность, при этом два ортологических гена сходны по последовательности до такой степени, что при оптимальном выравнивании и сравнении двух генов ортолог имеет последовательность, которая по меньшей мере на 75% предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентична любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, или
(v) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух аминокислотных последовательностей является по меньшей мере на 85%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 98% или 99% идентичной аминокислотной последовательности, кодируемой любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233.
Эти гены-мишени кодируют белки, входящие в состав комплекса тропонин/миофиламент.
В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к интерферирующей рибонуклеиновой кислоте (РНК или двухцепочечной РНК), которая функционирует при поглощении видом насекомого-вредителя с подавлением экспрессии гена-мишени у указанного насекомого-вредителя, при этом РНК содержит по меньшей мере один сайленсирующий элемент, причем сайленсирующий элемент является областью двухцепочечной РНК, содержащей соединенные комплементарные цепи, одна цепь из которых содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах гена-мишени, и при этом ген-мишень
(i) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273 или комплементарную ей последовательность, или имеющих нуклеотидную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух последовательностей является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273 или комплементарной ей последовательности, или
(ii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273 или комплементарной ей последовательности, или имеющих такую нуклеотидную последовательность, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении указанного гена, содержащего указанный фрагмент, с любой из SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273 указанная нуклеотидная последовательность являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273 или комплементарной ей последовательности, или
(iii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273 или комплементарной ей последовательности, и при этом при оптимальном выравнивании и сравнении указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273 указанная нуклеотидная последовательность указанного фрагмента является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной указанному соответствующему фрагменту из любой из SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273 или комплементарной ей последовательности или
(iv) у насекомого-вредителя является ортологом гена, имеющего нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273 или комплементарную ей последовательность, при этом два ортологических гена сходны по последовательности до такой степени, что при оптимальном выравнивании и сравнении двух генов ортолог имеет последовательность, которая по меньшей мере на 75% предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентична любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, или
(v) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух аминокислотных последовательностей является по меньшей мере на 85%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 98% или 99% идентичной аминокислотной последовательности, кодируемой любой из SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273.
Эти гены-мишени кодируют рибосомальные белки насекомых.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к интерферирующей РНК, которая содержит по меньшей мере одну двухцепочечную область, как правило, сайленсирующий элемент молекулы интерферирующей РНК, содержащий смысловую цепь РНК, соединенную путем комплементарного спаривания оснований с антисмысловой цепью РНК, где смысловая цепь молекулы dsRNA содержит последовательность по меньшей мере из 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 или 3000 последовательных нуклеотидов, которая является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% комплементарной последовательности нуклеотидов, расположенной в пределах РНК-транскрипта гена-мишени из комплекса тропонин/миофиламент.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует белок wings up A (тропонин I) насекомых (например, у насекомых ортолог белка CG7178 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 1, 2, 174, 404, 175, 180, 181, 188 и 189. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с одной или несколькими из SEQ ID NO 79, 349, 405, 352 или 356.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует белок upheld (например, у насекомых ортолог белка CG7107 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 121, 130, 142, 143, 176, 177, 182 и 183. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с одной или несколькими из SEQ ID NO 330, 350 или 353.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует белок тропомиозин 1 (например, у насекомых ортолог белка CG4898 Dm) или белок тропомиозин 2 (например, у насекомых ортолог белка CG4843 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 123 и 132. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 332.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует тяжелую цепь миозина (например, у насекомых ортолог белка CG17927 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 122, 131, 144, 145, 178 и 179. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с одной или несколькими из SEQ ID NO 331 или 351.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует цитоплазматический белок легкой цепи миозина (например, у насекомых ортолог белка CG3201 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 124 и 133. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 333.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует белок spaghetti squash (например, у насекомых ортолог белка CG3595 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 125 и 134. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности с SEQ ID NO 334.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует белок zipper (например, у насекомых ортолог белка CG15792 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 126 и 135. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности с SEQ ID NO 335.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует тропонин C (например, у насекомых ортолог белка CG2981, CG7930, CG9073, CG6514, CG12408, CG9073, CG7930, CG2981, CG12408 или CG6514 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 127 и 136, или 128 и 137, или 184 и 185. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с одной или несколькими из SEQ ID NO 336, 337 и 354.
Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к интерферирующей РНК, которая содержит по меньшей мере одну двухцепочечную область, как правило, сайленсирующий элемент молекулы интерферирующей РНК, содержащий смысловую цепь РНК, соединенную путем комплементарного спаривания оснований с антисмысловой цепью РНК, где смысловая цепь молекулы dsRNA содержит последовательность по меньшей мере из 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 или 3000 последовательных нуклеотидов, которая является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% комплементарной последовательности нуклеотидов, расположенной в пределах РНК-транскрипта гена-мишени, который кодирует рибосомный белок насекомых.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок S3A (например, у насекомых ортолог белка CG2168 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 11, 12 и 141. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с одной или обеими из SEQ ID NO 84 или 328.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок LP1 (например, у насекомых ортолог белка CG4087 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен посредством SEQ ID NO 3 и 4. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 80.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок S3 (например, у насекомых ортолог белка CG6779 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 7 и 8. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 82.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок L10Ab (например, у насекомых ортолог белка CG7283 Dm), представленный с помощью SEQ ID NO 9 и 10. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 83.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок S18 (например, у насекомых ортолог белка CG8900 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 13 и 14. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 85.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок L4 (например, у насекомых ортолог белка CG5502 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 5 и 6. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 81.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок S27 (например, у насекомых ортолог белка CG10423 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 15 и 16, 204 и 205. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с одной или обеими из SEQ ID NO 86 и 359.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок L6 (например, у насекомых ортолог белка CG11522 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 17 и 18. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 87.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок S13 (например, у насекомых ортолог белка CG13389 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 19 и 20. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 88.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок L12 (например, у насекомых ортолог белка CG3195 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 21 и 22. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 89.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок L26 (например, у насекомых ортолог белка CG6846 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 158 и 159. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 343.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок L21 (например, у насекомых ортолог белка CG12775 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 165, 166 и 167. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 347 и 348.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок S12 (например, у насекомых ортолог белка CG11271 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 156 и 157. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 342.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок S28b (например, у насекомых ортолог белка CG2998 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 160 и 161. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 344.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок L13 (например, у насекомых ортолог белка CG4651 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 154 и 155. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 341.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок L10 (например, у насекомых ортолог белка CG17521 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 163 и 164. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 345.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок L5 (например, у насекомых ортолог белка CG17489 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 152 и 153. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 340.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок S15Aa (например, у насекомых ортолог белка CG2033 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 150 и 151. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 339.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок L19 (например, у насекомых ортолог белка CG2746 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 200 и 201. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 357.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок L27 (например, у насекомых ортолог белка CG4759 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 386. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 390.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует белок субъединицы II митохондриальной цитохром с-оксидазы (например, у насекомых ортолог белка CG34069 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 25 и 26. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 91.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует γ-цепь АТФ-синтазы (например, у насекомых ортолог белка CG7610 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 129 и 138. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 338.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует убиквитин-5E (например, у насекомых ортолог белка CG32744 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 186 и 187, 202 и 203. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с одной или обеими из SEQ ID NO 355 и 358.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует протеасомную субъединицу бета-типа (например, у насекомых ортолог белка CG17331 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 387. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 391.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует белок, который у насекомых является ортологом белка CG13704 Dm, при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 388. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 392.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует белок Rpn12 (например, у насекомых ортолог белка CG4157 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 389. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 393.
В соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения предусматривается композиция для предотвращения и/или борьбы с нападением насекомых-вредителей, содержащая по меньшей мере одну интерферирующую рибонуклеиновую кислоту (РНК) и по меньшей мере один подходящий носитель, наполнитель или разбавитель, причем интерферирующая РНК функционирует при поглощении насекомым с подавлением экспрессии гена-мишени у указанного вредителя,
при этом РНК содержит по меньшей мере один сайленсирующий элемент, при этом сайленсирующий элемент является областью двухцепочечной РНК, содержащей соединенные комплементарные цепи, одна цепь из которых содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах гена-мишени, и при этом ген-мишень
(i) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарную ей последовательность, или имеющих такую нуклеотидную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух последовательностей по меньшей мере на 75% идентична любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, или
(ii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, или имеющую такую нуклеотидную последовательность, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении указанного гена, содержащего указанный фрагмент, с любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59 -62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 указанная нуклеотидная последовательность являлась по меньшей мере на 75% идентичной любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, или
(iii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, таким образом, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214- 217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 указанная нуклеотидная последовательность указанного фрагмента являлась по меньшей мере на 75% идентичной любому соответствующему фрагменту из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, или
(iv) у насекомого-вредителя является ортологом гена, имеющего нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарную ей последовательность, при этом два ортологических гена сходны по последовательности до такой степени, что при оптимальном выравнивании и сравнении двух генов ортолог имеет последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389, или
(v) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух аминокислотных последовательностей является по меньшей мере на 85% идентичной аминокислотной последовательности, кодируемой любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389.
Композицию по настоящему изобретению можно применять для предотвращения и/или борьбы с нападением вредителя. В некоторых вариантах осуществления композицию можно применять в качестве пестицида для растения или для материала для размножения или репродуктивного материала растения. В дополнительном аспекте предусматривается комбинация для предотвращения и/или борьбы с нападением насекомых-вредителей, содержащая композицию по настоящему изобретению и по меньшей мере одно активное средство.
В дополнительном аспекте в данном документе предусматривается способ подавления экспрессии гена-мишени у вида насекомого-вредителя с целью предотвращения и/или борьбы с нападением вредителей, включающий приведение в контакт указанного вида вредителя с эффективным количеством по меньшей мере одной интерферирующей рибонуклеиновой кислоты (РНК), причем интерферирующая РНК функционирует при поглощении вредителем с подавлением экспрессии гена-мишени у указанного вредителя, при этом РНК содержит по меньшей мере один сайленсирующий элемент, причем сайленсирующий элемент является областью двухцепочечной РНК, содержащей соединенные комплементарные цепи, одна цепь из которых содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах гена-мишени, и при этом ген-мишень
(i) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарную ей последовательность, или имеющих такую нуклеотидную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух последовательностей по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентична любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, или
(ii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, или имеющих такую нуклеотидную последовательность, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении указанного гена, содержащего указанный фрагмент, с любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 указанная нуклеотидная последовательность являлась бы по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, или
(iii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, таким образом, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274 -277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 указанная нуклеотидная последовательность указанного фрагмента являлась бы по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной указанному соответствующему фрагменту из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, или
(iv) у насекомого-вредителя является ортологом гена, имеющего нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарную ей последовательность, при этом два ортологических гена являются подобными в последовательности до такой степени, что при оптимальном выравнивании и сравнении двух генов ортолог имеет последовательность, которая является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389, или
(v) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух аминокислотных последовательностей является по меньшей мере на 85%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 98% или 99% идентичной аминокислотной последовательности, кодируемой любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389.
В соответствии с дополнительным аспектом настоящего изобретения предусматривается выделенный полинуклеотид, выбранный из группы, состоящей из:
(i) полинуклеотида, который содержит по меньшей мере 21, предпочтительно по меньшей мере 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 или 3000 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности, которая представлена любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательностью, или
(ii) полинуклеотид, который содержит по меньшей мере 21, предпочтительно по меньшей мере 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 или 3000 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности, представленной любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательностью, или
(iii) полинуклеотида, который содержит по меньшей мере 21, предпочтительно по меньшей мере 22, 23 или 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 или 3000 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности, которая представлена в любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, таким образом, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении двух последовательностей указанный полинуклеотид являлся по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичным любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, или
(iv) полинуклеотида, который содержит фрагмент по меньшей мере из 21, предпочтительно по меньшей мере 22, 23 или 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 или 3000 последовательных нуклеотидов нуклеотида, представленного в любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, и при этом указанный фрагмент или указанная комплементарная последовательность обладают такой нуклеотидной последовательностью, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 указанная нуклеотидная последовательность являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной указанному соответствующему фрагменту из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, или
(v) полинуклеотида, который содержит фрагмент по меньшей мере из 21, предпочтительно по меньшей мере 22, 23 или 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 или 3000 последовательных нуклеотидов нуклеотида, представленного в любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, и при этом указанный фрагмент или указанная комплементарная последовательность обладают такой нуклеотидной последовательностью, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 указанная нуклеотидная последовательность являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной указанному соответствующему фрагменту из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, или
(vi) полинуклеотида, кодирующего аминокислотную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух аминокислотных последовательностей является по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной аминокислотной последовательности, кодируемой любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389, и
при этом указанный полинуклеотид составляет не более 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000 или 1500 нуклеотидов в длину.
Аминокислотные последовательности, кодируемые генами-мишенями по настоящему изобретению, представлены SEQ ID NO 79, 349, 405, 352, 356, 80, 326, 81, 327, 82, 83, 328, 84, 329, 85, 86, 359, 87-91, 330, 350, 353, 331, 351, 332-336, 337, 354, 338-344, 346, 345, 347, 348, 357, 355, 358, 390-393, соответственно.
В конкретном аспекте по настоящему изобретению выделенный полинуклеотид является частью молекулы интерферирующей РНК, как правило, частью сайленсирующего элемента, содержащего по меньшей мере одну двухцепочечную область, содержащую смысловую цепь РНК, соединенную путем комплементарного спаривания оснований с антисмысловой цепью РНК, где смысловая цепь молекулы dsRNA содержит последовательность нуклеотидов, комплементарную последовательности нуклеотидов, расположенной в пределах РНК-транскрипта гена-мишени. Более конкретно, выделенный полинуклеотид клонирован в ДНК-конструкцию в смысловой и антисмысловой ориентации так, что при транскрипции смыслового и антисмыслового полинуклеотида формируется молекула dsRNA, которая функционирует при поглощении вредителем с ингибированием или подавлением экспрессии гена-мишени в указанном вредителе.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, который клонирован в ДНК-конструкцию в смысловой и антисмысловой ориентации так, что при транскрипции смыслового и антисмыслового полинуклеотида формируется молекула dsRNA, которая функционирует при поглощении насекомым с ингибированием или подавлением экспрессии гена-мишени в пределах комплекса тропонин/миофиламент.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует белок wings up A (тропонин I) насекомых (например, у насекомых ортолог белка CG7178 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 1, 2, 174, 404, 175, 180, 181, 188 и 189. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с одной или несколькими из SEQ ID NO 79, 349, 405, 352 или 356.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует белок upheld (например, у насекомых ортолог белка CG7107 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 121, 130, 142, 143, 176, 177, 182 и 183. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с одной или несколькими из SEQ ID NO 330, 350 или 353.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует белок тропомиозин 1 (например, у насекомых ортолог белка CG4898 Dm) или белок тропомиозин 2 (например, у насекомых ортолог белка CG4843 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 123 и 132. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 332.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует тяжелую цепь миозина (например, у насекомых ортолог белка CG17927 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 122, 131, 144, 145, 178 и 179. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с одной или несколькими из SEQ ID NO 331 или 351.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует цитоплазматический белок легкой цепи миозина (например, у насекомых ортолог белка CG3201 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 124 и 133. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 333.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует белок spaghetti squash (например, у насекомых ортолог белка CG3595 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 125 и 134. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 334.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует белок zipper (например, у насекомых ортолог белка CG15792 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 126 и 135. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности с SEQ ID NO 335.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует тропонин C (например, у насекомых ортолог белка CG2981, CG7930, CG9073, CG6514, CG12408, CG9073, CG7930, CG2981, CG12408 или CG6514 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 127 и 136, или 128 и 137, или 184 и 185. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с одной или несколькими из SEQ ID NO 336, 337 и 354.
В соответствии с другими вариантами осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, который клонирован в ДНК-конструкцию в смысловой и антисмысловой ориентации так, что при транскрипции смыслового и антисмыслового полинуклеотида формируется молекула dsRNA, которая функционирует при поглощении насекомым с ингибированием или подавлением экспрессии гена-мишени, который кодирует рибосомный белок насекомых.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок S3A (например, у насекомых ортолог белка CG2168 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 11, 12 и 141. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с одной или обеими из SEQ ID NO 84 или 328.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок LP1 (например, у насекомых ортолог белка CG4087 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 3 и 4. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 80.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок S3 (например, у насекомых ортолог белка CG6779 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 7 и 8. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 82.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок L10Ab (например, у насекомых ортолог белка CG7283 Dm), представленный с помощью SEQ ID NO 9 и 10. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 83.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок S18 (например, у насекомых ортолог белка CG8900 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 13 и 14. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 85.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок L4 (например, у насекомых ортолог белка CG5502 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 5 и 6. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 81.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок S27 (например, у насекомых ортолог белка CG10423 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 15 и 16, 204 и 205. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с одной или обеими из SEQ ID NO 86 и 359.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок L6 (например, у насекомых ортолог белка CG11522 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 17 и 18. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 87.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок S13 (например, у насекомых ортолог белка CG13389 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 19 и 20. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 88.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок L12 (например, у насекомых ортолог белка CG3195 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 21 и 22. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 89.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок L26 (например, у насекомых ортолог белка CG6846 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 158 и 159. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 343.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок L21 (например, у насекомых ортолог белка CG12775 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 165, 166 и 167. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 347 и 348.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок S12 (например, у насекомых ортолог белка CG11271 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 156 и 157. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 342.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок S28b (например, у насекомых ортолог белка CG2998 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 160 и 161. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 344.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок L13 (например, у насекомых ортолог белка CG4651 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 154 и 155. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 341.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок L10 (например, у насекомых ортолог белка CG17521 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 163 и 164. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 345.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок L5 (например, у насекомых ортолог белка CG17489 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 152 и 153. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 340.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок S15Aa (например, у насекомых ортолог белка CG2033 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 150 и 151. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 339.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок L19 (например, у насекомых ортолог белка CG2746 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 200 и 201. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 357.
В одном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок L27 (например, у насекомых ортолог белка CG4759 Dm), при этом указанный ген-мишень представлен с помощью SEQ ID NO 386. В предпочтительном варианте осуществления ортолог у насекомого обладает по меньшей мере 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO 390.
Предпочтительно способы по настоящему изобретению находят практическое применение в предотвращении и/или борьбе с нападением насекомых-вредителей, в частности, борьбе с нападением вредителей сельскохозяйственных культур, таких как, но без ограничений, хлопчатник, картофель, рис, клубника, люцерна, соя, томат, канола, подсолнечник, сорго, просо, кукуруза, баклажан, перец и табак. В дополнение, интерферирующую РНК по настоящему изобретению можно вводить в растения, подлежащие защите, с помощью обычных методов генной инженерии.
Во всех аспектах настоящего изобретения в предпочтительных вариантах осуществления ген-мишень
(i) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233 или комплементарную ей последовательность, или имеющих такую нуклеотидную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух последовательностей по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентична любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233 или комплементарной ей последовательности, или
(ii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233 или комплементарной ей последовательности, или имеющих такую нуклеотидную последовательность, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении указанного гена, содержащего указанный фрагмент, с любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233 указанная нуклеотидная последовательность являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233 или комплементарной ей последовательности, или
(iii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233 или комплементарной ей последовательности, и при этом при оптимальном выравнивании и сравнении указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233 указанная нуклеотидная последовательность указанного фрагмента является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной указанному соответствующему фрагменту из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233 или комплементарной ей последовательности, или
(iv) у насекомого-вредителя является ортологом гена, имеющего нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233 или комплементарную ей последовательность, при этом два ортологических гена сходны по последовательности до такой степени, что при оптимальном выравнивании и сравнении двух генов ортолог имеет последовательность, которая по меньшей мере на 75% предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентична любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, или
(v) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух аминокислотных последовательностей является по меньшей мере на 85%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 98% или 99% идентичной аминокислотной последовательности, кодируемой любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233.
Эти гены-мишени кодируют белки, входящие в состав комплекса тропонин/миофиламент.
Во всех аспектах настоящего изобретения в предпочтительных вариантах осуществления ген-мишень
(i) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273 или комплементарную ей последовательность, или имеющих нуклеотидную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух последовательностей является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273 или комплементарной ей последовательности, или
(ii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273 или комплементарной ей последовательности, или имеющих такую нуклеотидную последовательность, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении указанного гена, содержащего указанный фрагмент, с любой из SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266 -269, 165, 167, 166, 270-273 указанная нуклеотидная последовательность являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273 или комплементарной ей последовательности, или
(iii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273 или комплементарной ей последовательности, и при этом при оптимальном выравнивании и сравнении указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273 указанная нуклеотидная последовательность указанного фрагмента является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной указанному соответствующему фрагменту из любой из SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273 или комплементарной ей последовательности, или
(iv) у насекомого-вредителя является ортологом гена, имеющего нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273 или комплементарную ей последовательность, при этом два ортологических гена сходны по последовательности до такой степени, что при оптимальном выравнивании и сравнении двух генов ортолог имеет последовательность, которая по меньшей мере на 75% предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентична любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, или
(v) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух аминокислотных последовательностей является по меньшей мере на 85% идентичной аминокислотной последовательности, кодируемой любой из SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273.
Эти гены-мишени кодируют рибосомальные белки насекомых.
Во всех аспектах настоящего изобретения в предпочтительных вариантах осуществления ген-мишень (i) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313 или комплементарную ей последовательность, или имеющих такую нуклеотидную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух последовательностей является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313 или комплементарной ей последовательности, или
(ii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313 или комплементарной ей последовательности, или имеющих такую нуклеотидную последовательность, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении указанного гена, содержащего указанный фрагмент, с любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313 указанная нуклеотидная последовательность являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313 или комплементарной ей последовательности, или
(iii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313 или комплементарной ей последовательности, и при этом при оптимальном выравнивании и сравнении указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313 указанная нуклеотидная последовательность указанного фрагмента являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной указанному соответствующему фрагменту из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313 или комплементарной ей последовательности, или
(iv) у насекомого-вредителя является ортологом гена, имеющего нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313 или комплементарную ей последовательность, при этом два ортологических гена сходны по последовательности до такой степени, что при оптимальном выравнивании и сравнении двух генов ортолог имеет последовательность, которая является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, или
(v) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух аминокислотных последовательностей является по меньшей мере на 85%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 98% или 99% идентичной аминокислотной последовательности, кодируемой любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313.
Краткое описание таблиц и фигур
Таблица 1 Новые мишени Lygus hesperus, идентифицированные из первого анализа.
Таблица 1B Новые мишени Lygus hesperus в пути Lh594.
Таблица 1C Новые мишени Lygus hesperus, идентифицированные из второго цикла анализа.
Таблица 2 Полинуклеотидные последовательности генов-мишеней, идентифицированные у Lygus hesperus.
Таблица 3 Аминокислотные последовательности генов-мишеней, идентифицированные у Lygus hesperus.
Таблица 4 dsRNA (смысловая цепь, представленная эквивалентной последовательностью ДНК), соответствующие генам-мишеням Lygus hesperus и праймерам для продуцирования dsRNA.
Таблица 5 Ранжирование мишеней Lygus hesperus в соответствии с кривыми дозовой зависимости (DRC) и по сравнению с исходными мишенями Lh423 и Lh105.
Таблица 6 Мишени Lygus hesperus из второго цикла анализа-ранжирования в соответствии с DRC и по сравнению с исходными мишенями Lh423 и Lh594.
Таблица 7 Полинуклеотидные последовательности генов-мишеней, идентифицированные у колорадского жука (CPB).
Таблица 8 Аминокислотные последовательности генов-мишеней, идентифицированные у CPB.
Таблица 9 dsRNA (смысловая цепь, представленная эквивалентной последовательностью ДНК), соответствующие CPB генам-мишеням и праймерам для продуцирования dsRNA.
Таблица 10 Полинуклеотидные последовательности генов-мишеней, идентифицированные у коричневого дельфацида (BPH).
Таблица 11 Аминокислотные последовательности генов-мишеней, идентифицированные у BPH.
Таблица 12 dsRNA (смысловая цепь, представленная эквивалентной последовательностью ДНК), соответствующие BPH генам-мишеням и праймерам для продуцирования dsRNA.
Таблица 13 Праймеры, используемые для амплификации cDNA тлей, на основе геномной последовательности гороховой тли.
Таблица 14 Полинуклеотидные последовательности генов-мишеней, идентифицированные у тлей.
Таблица 15 Аминокислотные последовательности генов-мишеней, идентифицированные у тлей.
Таблица 16 dsRNA (смысловая цепь, представленная эквивалентной последовательностью ДНК), соответствующие генам-мишеням тлей и праймерам для продуцирования dsRNA.
Таблица 17 Вырожденные праймеры, используемые для амплификации CPB Ld594 cDNA.
Таблица 18 Вырожденные праймеры, используемые для амплификации BPH cDNA.
Таблица 19: Новые мишени Leptinotarsa decemlineata из данного теста.
Таблица 20: Новые идентифицированные мишени Nilaparvata lugens.
Таблица 21: Новые идентифицированные мишени Acyrthosiphon pisum.
Фигура 1: Полоски Lh001_009 второго подтверждающего анализа. Темные полосы: смертность в день 3-6, светлые полосы: смертность в день 6-8. Кандидатные клоны названы с применением “Lygxxx” скрининговых кодов и “Lhxxx” номенклатурных кодов мишеней.
Фигура 2: Полоски Lh010_020 второго подтверждающего анализа. Темные полосы: смертность в день 3-6, светлые полосы: смертность в день 6-8. Кандидатные клоны названы с применением “Lygxxx” скрининговых кодов и “Lhxxx” номенклатурных кодов мишеней.
Фигура 3: Анализ смертности новых мишеней Lygus из полосок Lh001-Lh009, выражен в % смертности за 10-дневный период. Контроли обозначены пунктирными линиями. Положительный контроль: Lh423 dsRNA (RpL19). Отрицательные контроли: GFP dsRNA и только корм (контроль).
Фигура 4: Анализ смертности новых мишеней Lygus из полосок Lh010-Lh020, выражен в % смертности за 10-дневный период. Контроли обозначены пунктирными линиями. Положительный контроль: Lh423 (RpL19). Отрицательные контроли: GFP и только корм (контроль).
Фигуры 5-9 Новые мишени Lygus hesperus-кривые дозовой зависимости при концентрациях очищенной синтетической dsRNA в диапазоне от 0,4 до 0,025 мкг/мкл (на фигуре единица измерения “мкг/мкл” не отображена). GFP dsRNA и воду milliQ применяли как отрицательные контроли. dsRNA мишеней получали с использованием праймеров, как описано в примерном разделе 1.1.
Фигура 10 Lh594 кривая дозовой зависимости, при концентрациях dsRNA в диапазоне от 0,05 до 0,001 мкг/мкл. GFP dsRNA и воду milliQ применяли как отрицательные контроли.
Фигура 11 A dsRNA активность в биопробе Lygus hesperus в отсутствие tRNA. Lh594 (5 мкг/мкл); положительный контроль: Lh423 (5 мкг/мкл); отрицательные контроли: GFP dsRNA (5 мкг/мкл) и вода milliQ; B Идентификация Lh594 предела активности с использованием уменьшающейся концентрации dsRNA (от 5 мкг до 0,25 мкг). Отрицательные контроли: GFP dsRNA (5 мкг/мкл) и вода milliQ.
Фигура 12 Полоски Lh010-Lh020 второго подтверждающего анализа мишеней второго теста. Темные полосы: смертность в день 4-8, светлые полосы: смертность в день 4-6. Кандидатные клоны названы с применением “Lygxxx” скрининговых кодов и “Lhxxx” номенклатурных кодов мишеней.
Фигура 13 Результаты анализа для мишеней Lygus пути тропонина, тестированных при 0,5 мкг/мкл фиксировано.
Фигура 14 A-B Новые мишени Lygus hesperus из пути тропонина-кривые дозовой зависимости при концентрациях очищенной синтетической dsRNA в диапазоне от 0,4 до 0,025 мкг/мкл (на фигуре единица измерения “мкг/мкл” не всегда отображена). GFP dsRNA и воду milliQ применяли как отрицательные контроли.
Фигура 15 A-D Новые мишени Lygus hesperus из мишеней второго теста-кривые дозовой зависимости при концентрациях очищенной синтетической dsRNA в диапазоне от 0,5 до 0,05 мкг/мкл. GFP dsRNA и воду milliQ применяли как отрицательные контроли.
Фигура 16 Анализ выживаемости личинок CPB, обработанных с помощью 1 мкг dsRNA Ld594, Ld619 и Ld620. Положительные контроли включали 1 мкг dsRNA исходных мишеней Ld513 и Ld049. Отрицательные контроли включали воду milliQ и FP.
-ой
Фигура 17 Эффекты Ld594, Ld619 и Ld620 dsRNA на окукливание CPB 4 возрастной стадии личинок по сравнению с необработанным контролем (UTC). Жукам скармливали 1 мкг dsRNA, распределенной на листовых дисках картофеля, затем предоставляли возможность питаться на необработанных листьях картофеля (A) в течение 4 дней перед помещением на вермикулит. Для оценки эффекта dsRNA мертвых насекомых извлекали из вермикулита (из-за сильных эффектов, индуцированных с помощью Ld594 dsRNA, ни одну куколку невозможно восстановить из вермикулита и, следовательно, никакое изображение не доступно для данной dsRNA-мишени) (B).
Фигура 18 Эффект CPB Ld594, 619 и 620 dsRNA на выживаемость и приспособляемость имаго CPB. Оценки проводили в дни 4, 6, 7, 8, 11 и 13. Контроль MQ: вода milliQ.
Фигура 19 Активность dsRNA из Nl594 пути у коричневого дельфацида. DsRNA тестировали при 0,5 мкг/мкл в присутствии 0,1% CHAPSO. Положительный контроль: Nl537 dsRNA (0,5 мкг/мкл), отрицательные контроли: GFP dsRNA (0,5 мкг/мкл) и только корм.
Фигура 20 Активность dsRNA из Ap594, Ap423, Ap537 и Ap560 на A. pisum. DsRNA тестировали при 0,5 мкг/мкл в присутствии 5 мкг/мкл tRNA. Отрицательный контроль: GFP dsRNA (0,5 мкг/мкл).
Фигура 21 Проценты смертности личинок L. decemlineata на искусственном корме, обработанном с помощью dsRNA. Ld583, Ld584, Ld586 и Ld588 представляют клоны-мишени. Положительный контроль: Ld513; отрицательный контроль: FP.
Подробное описание настоящего изобретения
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что подавление экспрессии конкретных генов-мишеней у видов насекомых-вредителей с помощью RNAi можно применять для эффективного предотвращения и/или борьбы с нападением указанного насекомого-вредителя.
Применяемый в данном документе термин “борьба” с нападением вредителей относится к любому воздействию на вредителя, которое служит для ограничения и/или уменьшения количества организмов вредителей и/или повреждения, вызываемого вредителем. Предпочтительные гены-мишени являются, следовательно, жизненно важными генами, которые контролируют или регулируют одну или более жизненно важные биологические функции у насекомых-вредителей, например, деление клеток, размножение, энергетический обмен, пищеварение, неврологическая функция и тому подобное. Подавление данных жизненно важных генов с помощью RNAi методов может вести к гибели насекомого или иным образом значительно замедлять рост и развитие, или нарушать способность вредителей колонизировать местообитание или нападать на организмы-хозяева.
Авторы настоящего изобретения в настоящее время идентифицировали лучшие гены-мишени видов насекомых-вредителей, принадлежащих к Lygus, Leptinotarsa, Nilaparvata и Acyrthosiphum родам, чьи мишени предусматриваются для применения в отдельности или в комбинации в качестве эффективных средств для RNAi-опосредованной борьбы с нападением насекомых на, например, агрономически важные культуры. Ортологи этих недавно идентифицированных генов-мишеней можно использовать у других видов насекомых для борьбы с нападением насекомых на соответствующие значимые культуры.
Более конкретно, авторы настоящего изобретения описывают в данном документе, что гены, кодирующие белки комплекса тропонин/миофиламент, образуют отличные гены-мишени для подавления с помощью методики РНК-ингибирования. Один из данных генов-мишеней кодировал белок тропонин I (wings up A) насекомых, который является ортологом белка CG7178 дрозофилы. Данный белок участвует в мышечных сокращениях и принадлежит к физиологическому пути, который еще не полностью исследован для борьбы с (насекомыми) вредителями посредством РНК-ингибирования. Кроме того, поскольку данный белковый комплекс является специфичным для животных, не известен ни один гомолог или ортолог генов растений, что снижает риск нетипичных фенотипов растений при экспрессии dsRNA-мишени в растениях. В дополнение, у дрозофилы тропонин I описывается как гаплонедостаточный ген, проявляющий мутантный фенотип в гетерозиготном состоянии. Такие гены особенно восприимчивы к снижению уровней экспрессии mRNA и как таковые могут считаться идеальными мишенями RNAi.
Дополнительные вызывающие интерес гены-мишени в данном комплексе тропонин/миофиламент перечислены ниже.
ID аннотации
Цитология
Dm идентификатор
up
upheld
CG7107
Tm1
тропомиозин 1
CG4898
Tm2
тропомиозин 2
CG4843
Mhc
тяжелая цепь миозина
CG17927
Mlc-c
цитоплазматическая легкая цепь миозина
CG3201
sqh
spaghetti squash
CG3595
zip
zipper
CG15792
Таким образом, в соответствии с одним вариантом осуществления настоящее изобретение относится к интерферирующей рибонуклеиновой кислоте (РНК), которая функционирует при поглощении видом насекомого-вредителя с подавлением экспрессии гена-мишени у указанного насекомого-вредителя, при этом РНК содержит по меньшей мере один сайленсирующий элемент, причем сайленсирующий элемент является областью двухцепочечной РНК, содержащей соединенные комплементарные цепи, одна цепь из которых содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах гена-мишени, и при этом ген-мишень
(i) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233 или комплементарную ей последовательность, или имеющих такую нуклеотидную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух последовательностей по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентична любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233 или комплементарной ей последовательности, или
(ii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233 или комплементарной ей последовательности, или имеющих такую нуклеотидную последовательность, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении указанного гена, содержащего указанный фрагмент, с любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233 указанная нуклеотидная последовательность являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233 или комплементарной ей последовательности, или
(iii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233 или комплементарной ей последовательности, и при этом при оптимальном выравнивании и сравнении указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233 указанная нуклеотидная последовательность указанного фрагмента является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной указанному соответствующему фрагменту из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233 или комплементарной ей последовательности, или
(iv) у насекомого-вредителя является ортологом гена, имеющего нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233 или комплементарную ей последовательность, при этом два ортологических гена сходны по последовательности до такой степени, что при оптимальном выравнивании и сравнении двух генов ортолог имеет последовательность, которая по меньшей мере на 75% предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентична любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, или
(v) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух аминокислотных последовательностей является по меньшей мере на 85%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 98% или 99% идентичной аминокислотной последовательности, кодируемой любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233.
В предпочтительном варианте осуществления ген-мишень кодирует белок насекомых, выбранный из комплекса тропонин/миофиламент, выбранный из группы, включающей тропонин I (например, у насекомых ортолог белка CG7178 Dm), белок upheld (например, у насекомых ортолог белка CG7107 Dm), белок тропомиозин 1 (например, у насекомых ортолог белка CG4898 Dm), белок тропомиозин 2 (например, у насекомых ортолог белка CG4843 Dm), тяжелую цепь миозина (например, у насекомых ортолог белка CG17927 Dm), цитоплазматический белок легкой цепи миозина (например, у насекомых ортолог белка CG3201 Dm), белок spaghetti squash (например, у насекомых ортолог белка CG3595 Dm), белок zipper (например, у насекомых ортолог белка CG15792 Dm), тропонин C (например, у насекомых ортолог белка CG2981, CG7930, CG9073, CG6514, CG12408, CG9073, CG7930, CG2981, CG12408 или CG6514 Dm).
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к интерферирующей рибонуклеиновой кислоте (РНК), которая функционирует при поглощении видом насекомого-вредителя с подавлением экспрессии гена-мишени у указанного насекомого-вредителя, при этом РНК содержит по меньшей мере один сайленсирующий элемент, причем сайленсирующий элемент является областью двухцепочечной РНК, содержащей соединенные комплементарные цепи, одна цепь из которых содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах гена-мишени, и при этом ген-мишень
(i) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273 или комплементарную ей последовательность, или имеющих нуклеотидную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух последовательностей является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273 или комплементарной ей последовательности, или
(ii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273 или комплементарной ей последовательности, или имеющих такую нуклеотидную последовательность, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении указанного гена, содержащего указанный фрагмент, с любой из SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273 указанная нуклеотидная последовательность являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273 или комплементарной ей последовательности, или
(iii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273 или комплементарной ей последовательности, и при этом при оптимальном выравнивании и сравнении указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273 указанная нуклеотидная последовательность указанного фрагмента является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной указанному соответствующему фрагменту из любой из SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273 или комплементарной ей последовательности, или
(iv) у насекомого-вредителя является ортологом гена, имеющего нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273 или комплементарную ей последовательность, при этом два ортологических гена сходны по последовательности до такой степени, что при оптимальном выравнивании и сравнении двух генов ортолог имеет последовательность, которая по меньшей мере на 75% предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентична любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, или
(v) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух аминокислотных последовательностей является по меньшей мере на 85%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 98% или 99% идентичной аминокислотной последовательности, кодируемой любой из SEQ ID NO 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273.
В предпочтительном варианте осуществления ген-мишень кодирует рибосомный белок насекомых, выбранный из группы, содержащей рибосомный белок S3A (например, у насекомых ортолог белка CG2168 Dm), рибосомный белок LP1 (например, у насекомых ортолог белка CG4087 Dm), рибосомный белок S3 (например, у насекомых ортолог белка CG6779 Dm), рибосомный белок L10Ab (например, у насекомых ортолог белка CG7283 Dm), рибосомный белок S18 (например, у насекомых ортолог белка CG8900 Dm), рибосомный белок L4 (например, у насекомых ортолог белка CG5502 Dm), рибосомный белок S27 (например, у насекомых ортолог белка CG10423 Dm), рибосомный белок L6 (например, у насекомых ортолог белка CG11522 Dm), рибосомный белок S13 (например, у насекомых ортолог белка CG13389 Dm), и рибосомный белок L12 (например, у насекомых ортолог белка CG3195 Dm), рибосомный белок L26 (например, у насекомых ортолог белка CG6846 Dm), рибосомный белок L21 (например, у насекомых ортолог белка CG12775 Dm), рибосомный белок S12 (например, у насекомых ортолог белка CG11271 Dm), рибосомный белок S28b (например, у насекомых ортолог белка CG2998 Dm), рибосомный белок L13 (например, у насекомых ортолог белка CG4651 Dm), рибосомный белок L10 (например, у насекомых ортолог белка CG17521 Dm), рибосомный белок L5 (например, у насекомых ортолог белка CG17489 Dm), рибосомный белок S15Aa (например, у насекомых ортолог белка CG2033 Dm), рибосомный белок L19 (например, у насекомых ортолог белка CG2746 Dm), рибосомный белок L27 (например, у насекомых ортолог белка CG4759 Dm).
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к интерферирующей рибонуклеиновой кислоте (РНК), которая функционирует при поглощении видом насекомого-вредителя с подавлением экспрессии гена-мишени у указанного насекомого-вредителя, при этом РНК содержит по меньшей мере один сайленсирующий элемент, причем сайленсирующий элемент является областью двухцепочечной РНК, содержащей соединенные комплементарные цепи, одна цепь из которых содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах гена-мишени, и при этом ген-мишень
(i) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313 или комплементарную ей последовательность, или имеющих такую нуклеотидную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух последовательностей является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313 или комплементарной ей последовательности, или
(ii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313 или комплементарной ей последовательности, или имеющих такую нуклеотидную последовательность, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении указанного гена, содержащего указанный фрагмент, с любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313 указанная нуклеотидная последовательность являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313 или комплементарной ей последовательности, или
(iii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313 или комплементарной ей последовательности, и при этом при оптимальном выравнивании и сравнении указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313 указанная нуклеотидная последовательность указанного фрагмента являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной указанному соответствующему фрагменту из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313 или комплементарной ей последовательности, или
(iv) у насекомого-вредителя является ортологом гена, имеющего нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313 или комплементарную ей последовательность, при этом два ортологических гена сходны по последовательности до такой степени, что при оптимальном выравнивании и сравнении двух генов ортолог имеет последовательность, которая является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, или
(v) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух аминокислотных последовательностей является по меньшей мере на 85%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 98% или 99% идентичной аминокислотной последовательности, кодируемой любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к интерферирующей рибонуклеиновой кислоте (РНК), которая функционирует при поглощении видом насекомого-вредителя с подавлением экспрессии гена-мишени у указанного насекомого-вредителя, при этом РНК содержит по меньшей мере один сайленсирующий элемент, причем сайленсирующий элемент является областью двухцепочечной РНК, содержащей соединенные комплементарные цепи, одна цепь из которых содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах гена-мишени, и при этом ген-мишень
(i) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 141, 11, 12 или комплементарную ей последовательность, или имеющих такую нуклеотидную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух последовательностей является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 141, 11, 12 или комплементарной ей последовательности, или
(ii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 141, 11, 12 или комплементарной ей последовательности, или имеющих такую нуклеотидную последовательность, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении указанного гена, содержащего указанный фрагмент, с любой из SEQ ID NO 141, 11, 12 указанная нуклеотидная последовательность являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 141, 11, 12 или комплементарной ей последовательности, или
(iii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 141, 11, 12 или комплементарной ей последовательности, и при этом при оптимальном выравнивании и сравнении указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO 141, 11, 12 указанная нуклеотидная последовательность указанного фрагмента являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной указанному соответствующему фрагменту из любой из SEQ ID NO 141, 11, 12 или комплементарной ей последовательности, или
(iv) у насекомого-вредителя является ортологом гена, имеющего нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 141, 11, 12 или комплементарную ей последовательность, при этом два ортологических гена сходны по последовательности до такой степени, что при оптимальном выравнивании и сравнении двух генов ортолог имеет последовательность, которая является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO 141, 11, 12, или
(v) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух аминокислотных последовательностей является по меньшей мере на 85%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 98% или 99% идентичной аминокислотной последовательности, кодируемой любой из SEQ ID NO 141, 11, 12.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к интерферирующей рибонуклеиновой кислоте (РНК), которая функционирует при поглощении видом насекомого-вредителя с подавлением экспрессии гена-мишени у указанного насекомого-вредителя, при этом РНК содержит по меньшей мере один сайленсирующий элемент, причем сайленсирующий элемент является областью двухцепочечной РНК, содержащей соединенные комплементарные цепи, одна цепь из которых содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах гена-мишени, и при этом ген-мишень
(i) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 17, 18 или комплементарную ей последовательность, или имеющих нуклеотидную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух последовательностей является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 17, 18 или комплементарной ей последовательности, или
(ii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 17, 18 или комплементарной ей последовательности, или имеющих такую нуклеотидную последовательность, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении указанного гена, содержащего указанный фрагмент, с любой из SEQ ID NO 17, 18 указанная нуклеотидная последовательность являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 17, 18 или комплементарной ей последовательности, или
(iii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 17, 18 или комплементарной ей последовательности, и при этом при оптимальном выравнивании и сравнении указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO 17, 18 указанная нуклеотидная последовательность указанного фрагмента являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной указанному соответствующему фрагменту из любой из SEQ ID NO 17, 18 или комплементарной ей последовательности, или
(iv) у насекомого-вредителя является ортологом гена, имеющего нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 17, 18 или комплементарную ей последовательность, при этом два ортологических гена сходны по последовательности до такой степени, что при оптимальном выравнивании и сравнении двух генов ортолог имеет последовательность, которая является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO 17, 18, или
(v) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух аминокислотных последовательностей является по меньшей мере на 85%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 98% или 99% идентичной аминокислотной последовательности, кодируемой любой из SEQ ID NO 17, 18.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к интерферирующей рибонуклеиновой кислоте (РНК), которая функционирует при поглощении видом насекомого-вредителя с подавлением экспрессии гена-мишени у указанного насекомого-вредителя, при этом РНК содержит по меньшей мере один сайленсирующий элемент, причем сайленсирующий элемент является областью двухцепочечной РНК, содержащей соединенные комплементарные цепи, одна цепь из которых содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах гена-мишени, и при этом ген-мишень
(i) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 19, 20 или комплементарную ей последовательность, или имеющих нуклеотидную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух последовательностей является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 19, 20 или комплементарной ей последовательности, или
(ii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 19, 20 или комплементарной ей последовательности, или имеющих такую нуклеотидную последовательность, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении указанного гена, содержащего указанный фрагмент, с любой из SEQ ID NO 19, 20 указанная нуклеотидная последовательность являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 19, 20 или комплементарной ей последовательности, или
(iii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 19, 20 или комплементарной ей последовательности, и при этом при оптимальном выравнивании и сравнении указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO 19, 20 указанная нуклеотидная последовательность указанного фрагмента являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной указанному соответствующему фрагменту из любой из SEQ ID NO 19, 20 или комплементарной ей последовательности, или
(iv) у насекомого-вредителя является ортологом гена, имеющего нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 19, 20 или комплементарную ей последовательность, при этом два ортологических гена сходны по последовательности до такой степени, что при оптимальном выравнивании и сравнении двух генов ортолог имеет последовательность, которая является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO 19, 20, или
(v) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух аминокислотных последовательностей является по меньшей мере на 85%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 98% или 99% идентичной аминокислотной последовательности, кодируемой любой из SEQ ID NO 19, 20.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к интерферирующей рибонуклеиновой кислоте (РНК), которая функционирует при поглощении видом насекомого-вредителя с подавлением экспрессии гена-мишени у указанного насекомого-вредителя, при этом РНК содержит по меньшей мере один сайленсирующий элемент, причем сайленсирующий элемент является областью двухцепочечной РНК, содержащей соединенные комплементарные цепи, одна цепь из которых содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах гена-мишени, и при этом ген-мишень
(i) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 165, 166, 167 или комплементарную ей последовательность, или имеющих нуклеотидную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух последовательностей является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 165, 166, 167 или комплементарной ей последовательности, или
(ii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 165, 166, 167 или комплементарной ей последовательности, или имеющих такую нуклеотидную последовательность, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении указанного гена, содержащего указанный фрагмент, с любой из SEQ ID NO 165, 166, 167 указанная нуклеотидная последовательность являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 165, 166, 167 или комплементарной ей последовательности, или
(iii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 165, 166, 167 или комплементарной ей последовательности, и при этом при оптимальном выравнивании и сравнении указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO 17, 18 указанная нуклеотидная последовательность указанного фрагмента являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной указанному соответствующему фрагменту из любой из SEQ ID NO 165, 165, 167 или комплементарной ей последовательности, или
(iv) у насекомого-вредителя является ортологом гена, имеющего нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 165, 166, 167 или комплементарную ей последовательность, при этом два ортологических гена сходны по последовательности до такой степени, что при оптимальном выравнивании и сравнении двух генов ортолог имеет последовательность, которая является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO 165, 166, 167, или
(v) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух аминокислотных последовательностей является по меньшей мере на 85%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 98% или 99% идентичной аминокислотной последовательности, кодируемой любой из SEQ ID NO 165, 166, 167.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к интерферирующей рибонуклеиновой кислоте (РНК), которая функционирует при поглощении видом насекомого-вредителя с подавлением экспрессии гена-мишени у указанного насекомого-вредителя, при этом РНК содержит по меньшей мере один сайленсирующий элемент, причем сайленсирующий элемент является областью двухцепочечной РНК, содержащей соединенные комплементарные цепи, одна цепь из которых содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах гена-мишени, и при этом ген-мишень
(i) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183 или комплементарную ей последовательность, или имеющих нуклеотидную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух последовательностей является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183 или комплементарной ей последовательности, или
(ii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183 или комплементарной ей последовательности, или имеющих такую нуклеотидную последовательность, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении указанного гена, содержащего указанный фрагмент, с любой из SEQ ID NO 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183 указанная нуклеотидная последовательность являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183 или комплементарной ей последовательности, или
(iii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183 или комплементарной ей последовательности, и при этом при оптимальном выравнивании и сравнении указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183 указанная нуклеотидная последовательность указанного фрагмента являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной указанному соответствующему фрагменту из любой из SEQ ID NO 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183 или комплементарной ей последовательности, или
(iv) у насекомого-вредителя является ортологом гена, имеющего нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183 или комплементарную ей последовательность, при этом два ортологических гена сходны по последовательности до такой степени, что при оптимальном выравнивании и сравнении двух генов ортолог имеет последовательность, которая является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, или
(v) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух аминокислотных последовательностей является по меньшей мере на 85%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 98% или 99% идентичной аминокислотной последовательности, кодируемой любой из SEQ ID NO 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к интерферирующей рибонуклеиновой кислоте (РНК), которая функционирует при поглощении видом насекомого-вредителя с подавлением экспрессии гена-мишени у указанного насекомого-вредителя, при этом РНК содержит по меньшей мере один сайленсирующий элемент, причем сайленсирующий элемент является областью двухцепочечной РНК, содержащей соединенные комплементарные цепи, одна цепь из которых содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах гена-мишени, и при этом ген-мишень
(i) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 145, 122, 144, 178, 131, 179 или комплементарную ей последовательность, или имеющих нуклеотидную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух последовательностей является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 145, 122, 144, 178, 131, 179 или комплементарной ей последовательности, или
(ii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 145, 122, 144, 178, 131, 179 или комплементарной ей последовательности, или имеющих такую нуклеотидную последовательность, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении указанного гена, содержащего указанный фрагмент, с любой из SEQ ID NO 145, 122, 144, 178, 131, 179 указанная нуклеотидная последовательность являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 145, 122, 144, 178, 131, 179 или комплементарной ей последовательности, или
(iii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 145, 122, 144, 178, 131, 179 или комплементарной ей последовательности, и при этом при оптимальном выравнивании и сравнении указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO 145, 122, 144, 178, 131, 179 указанная нуклеотидная последовательность указанного фрагмента являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной указанному соответствующему фрагменту из любой из SEQ ID NO 145, 122, 144, 178, 131, 179 или комплементарной ей последовательности, или
(iv) у насекомого-вредителя является ортологом гена, имеющего нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 145, 122, 144, 178, 131, 179 или комплементарную ей последовательность, при этом два ортологических гена сходны по последовательности до такой степени, что при оптимальном выравнивании и сравнении двух генов ортолог имеет последовательность, которая является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO 145, 122, 144, 178, 131, 179, или
(v) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух аминокислотных последовательностей является по меньшей мере на 85%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 98% или 99% идентичной аминокислотной последовательности, кодируемой любой из SEQ ID NO 145, 122, 144, 178, 131, 179.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к интерферирующей рибонуклеиновой кислоте (РНК), которая функционирует при поглощении видом насекомого-вредителя с подавлением экспрессии гена-мишени у указанного насекомого-вредителя, при этом РНК содержит по меньшей мере один сайленсирующий элемент, причем сайленсирующий элемент является областью двухцепочечной РНК, содержащей соединенные комплементарные цепи, одна цепь из которых содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах гена-мишени, и при этом ген-мишень
(i) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 128, 149, 184, 137 или комплементарную ей последовательность, или имеющих нуклеотидную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух последовательностей является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 128, 149, 184, 137 или комплементарной ей последовательности, или
(ii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 128, 149, 184, 137 или комплементарной ей последовательности, или имеющих такую нуклеотидную последовательность, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении указанного гена, содержащего указанный фрагмент, с любой из SEQ ID NO 128, 149, 184, 137 указанная нуклеотидная последовательность являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 128, 149, 184, 137 или комплементарной ей последовательности, или
(iii) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 21 последовательного нуклеотида из любой из SEQ ID NO 128, 149, 184, 137 или комплементарной ей последовательности, и при этом при оптимальном выравнивании и сравнении указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO 128, 149, 184, 137 указанная нуклеотидная последовательность указанного фрагмента являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной указанному соответствующему фрагменту из любой из SEQ ID NO 128, 149, 184, 137 или комплементарной ей последовательности, или
(iv) у насекомого-вредителя является ортологом гена, имеющего нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 128, 149, 184, 137 или комплементарную ей последовательность, где два ортологических гена сходны по последовательности до такой степени, что при оптимальном выравнивании и сравнении двух генов ортолог имеет последовательность, которая является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO 128, 149, 184, 137, или
(v) выбран из группы генов, имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух аминокислотных последовательностей является по меньшей мере на 85%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, 95%, 98% или 99% идентичной аминокислотной последовательности, кодируемой любой из SEQ ID NO 128, 149, 184, 137.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к интерферирующей рибонуклеиновой кислоте (РНК или двухцепочечной РНК), которая подавляет экспрессию гена-мишени, кодирующего белок субъединицы II митохондриальной цитохром с-оксидазы (например, у насекомых ортолог белка CG34069 Dm).
Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение предлагает интерферирующую рибонуклеиновую кислоту (РНК), которая функционирует при поглощении видом насекомого-вредителя с подавлением экспрессии гена-мишени у указанного насекомого-вредителя.
Применяемый в данном документе термин “ген-мишень” включает любой ген у насекомого-вредителя, который предполагается подавить. В предпочтительном варианте осуществления ген-мишень подавляется так, чтобы бороться с нападением вредителя, например, путем нарушения жизненно важного биологического процесса, происходящего у вредителя, или путем уменьшения патогенности вредителя. Предпочтительные гены-мишени, следовательно, включают, но без ограничений, те, которые играют ключевую роль в регуляции питания, выживания, роста, развития, размножения, нападения и способности вызывать поражение. В соответствии с одним вариантом осуществления ген-мишень является таковым, что при подавлении или ингибировании его экспрессии насекомое-вредитель погибает. В соответствии с другим вариантом осуществления ген-мишень является таковым, что при подавлении или ингибировании его экспрессии рост вредителя предотвращается или замедляется, или останавливается, или задерживается, или затрудняется, размножение вредителя предотвращается, или предотвращается переход через жизненные циклы вредителя. В соответствии еще с другим вариантом осуществления настоящего изобретения ген-мишень является таковым, что при подавлении или ингибировании его экспрессии повреждение, вызванное вредителем и/или способностью вредителя поражать или нападать на местообитания, поверхности и/или растение, или сельскохозяйственную культуру уменьшается; или вредитель прекращает питаться из своих природных пищевых ресурсов, таких как растения и растительные продукты. Термины “нападать” и “поражать” или “нападение” и “поражение”, как правило, используются взаимозаменяемо повсеместно.
Гены-мишени могут экспрессироваться во всех или некоторых клетках насекомых-вредителей. Кроме того, гены-мишени могут экспрессироваться насекомым-вредителем только на определенной стадии его жизненного цикла, например, зрелой стадии имаго, незрелой нимфы или личиночной стадии, или стадии яйца.
Применяемые в данном документе виды “вредителей” предпочтительно являются видами насекомых, которые вызывают поражение или нападают, предпочтительно на растения. Виды насекомых могут включать и виды, принадлежащие к отрядам Coleoptera, Lepidoptera, Diptera, Dichyoptera, Orthoptera, Hemiptera или Siphonaptera.
Предпочтительными насекомыми, патогенными для растений, в соответствии с настоящим изобретением, являются вредители растений, выбранные из группы, включающей Leptinotarsa spp. (например, L. decemlineata (колорадский жук), L. juncta (ложный картофельный жук), или L. texana (картофельный жук Leptinotarsa texana)); Nilaparvata spp. (например, N. lugens (коричневый дельфацид)); Laodelphax spp. (например, L. striatellus (малый коричневый дельфацид)); Nephotettix spp. (например, N. virescens, или N. cincticeps (зеленая рисовая цикадка), или N.nigropictus (рисовая цикадка)); Sogatella spp. (или S. furcifera (белоспинный рисовый дельфацид)); Chilo spp. (например, C. suppressalis (огневка азиатская стеблевая), C. auricilius (огневка Chilo auricilius), или C. polychrysus (темноголовая рисовая огневка)); Sesamia spp. (например, S. inferens (розовый сверлильщик)); Tryporyza spp. (например, T. innotata (огневка Tryporyza innotata), или T. incertulas (желтый рисовый сверлильщик)); Anthonomus spp. (например, A. grandis (долгоносик хлопковый)); Phaedon spp. (например, P. cochleariae (хреновый листоед)); Epilachna spp. (например, E. varivetis (зерновка бобовая мексиканская)); Tribolium spp. (например, T. castaneum (хрущак каштановый)); Diabrotica spp. (например, D. virgifera virgifera (западный кукурузный жук), D. barberi (северный кукурузный жук), D. undecimpunctata howardi (южный кукурузный жук), D. virgifera zeae (мексиканский кукурузный корнегрыз); Ostrinia spp. (например, O. nubilalis (огневка кукурузная)); Anaphothrips spp. (например, A. obscrurus (трипс злаковый)); Pectinophora spp. (например, P. gossypiella (розовый коробочный червь хлопчатника)); Heliothis spp. (например, H. virescens (табачная листовертка)); Trialeurodes spp. (например, T. abutiloneus (белокрылка Trialeurodes abutiloneus) T. vaporariorum (белокрылка тепличная)); Bemisia spp. (например, B. argentifolii (белокрылка магнолиевая)); Aphis spp. (например, A. gossypii (тля хлопковая)); Lygus spp. (например, L. lineolaris (клоп-слепняк Lygus lineolaris) или L. hesperus (слепняк западный матовый)); Euschistus spp. (например, E. conspersus (клоп Euschistus conspersus)); Chlorochroa spp. (например, C. sayi (клоп Сэя)); Nezara spp. (например, N. viridula (зеленый овощной клоп)); Thrips spp. (например, T. tabaci (трипс луковый)); Frankliniella spp. (например, F. fusca (трипс табачный), или F. occidentalis (западный цветочный трипс)); Acheta spp. (например, A. domesticus (сверчок домовый)); Myzus spp. (например, M. persicae (тля персиковая зеленая)); Macrosiphum spp. (например, M. euphorbiae (тля картофельная большая)); Blissus spp. (например, B. leucopterus leucopterus (клоп-черепашка пшеничный североамериканский)); Acrosternum spp. (например, A. hilare (клоп-щитник Acrosternum hilare)); Chilotraea spp. (например, C. polychrysa (огневка Chilotraea polychrysa)); Lissorhoptrus spp. (например, L. oryzophilus (долгоносик рисовый водяной)); Rhopalosiphum spp. (например, R. maidis (тля кукурузная)); и Anuraphis spp. (например, A. maidiradicis (тля кукурузная корневая)).
В соответствии с более конкретным вариантом осуществления настоящее изобретение применимо к видам, принадлежащим к семейству Chrysomelidae или листоеды. Жуки листоеды, такие как колорадские жуки, блошки, кукурузные корневые жуки, и долгоносики, такие как долгоносик люцерновый, являются особенно важными вредителями. Конкретные виды рода Leptinotarsa, контролируемые в соответствии с настоящим изобретением, включают колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata (Say)) и ложного картофельного жука (Leptinotarsa juncta (Say)). CPB является (серьезным) вредителем нашего домашнего картофеля, других культурных и диких клубненосных и неклубненосных видов картофеля и других видов растений семейства Solanaceous (пасленовых), включая сельскохозяйственные культуры томатов, баклажанов, перцев, табака (виды рода Nicotiana, включая декоративные), физалиса, риса, кукурузы или хлопчатника; и виды сорняков/травянистых растений, паслен каролинский, черный паслен, дурман обыкновенный, белену и паслен клювообразный. Кукурузные корневые жуки включают виды, основывающие род Diabrotica (например, D. undecimpunctata undecimpunctata, D. undecimpunctata howardii, D. longicornis, D. virgifera и D. balteata). Кукурузные корневые жуки причиняют существенный вред кукурузе и тыквенным.
В соответствии с более конкретным вариантом осуществления настоящее изобретение применимо к видам, принадлежащим к отряду Hemipterans (семейство Aphidoidea), таким как Myzus persicae (тля персиковая зеленая), Aphis fabae (тля свекловичная), Acyrthosiphum pisum (тля гороховая), Brevicoryne brassicae (тля капустная), Sitobion avenae (тля большая злаковая), Cavariella aegopodii (тля зонтичная), Aphis craccivora (тля арахисовая), Aphis gossypii (тля хлопковая), Toxoptera aurantii (тля померанцевая), Cavariella spp (тля тминная), Chaitophorus spp (тли рода Chaitophorus), Cinara spp.(тли рода Cinara), Drepanosiphum platanoides (тля яворовая), Elatobium spp (тли рода Elatobium), которые вызывают повреждение растений, таких как деревья рода сливы, в частности, персик, абрикос и слива; деревьев, которые в основном культивируются для производства древесины, таких как ивы и тополя, пропашных культур, таких как кукуруза, хлопчатник, соя, пшеница и рис, овощных культур из семейств Solanaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cruciferae и Cucurbitaceae, включая, но без ограничений, артишок, спаржу, фасоль, свеклу, брокколи, брюссельскую капусту, кочанную капусту, морковь, цветную капусту, мускусную дыню, сельдерей, кукурузу, огурцы, укроп, капусту кормовую, кольраби, репу, баклажан, салат, горчицу, бамию, петрушку, пастернак, горох, перец, картофель, редис, шпинат, тыкву, томат, репу, кресс водяной и арбуз; или полевых культур, таких как, но без ограничений, табак, сахарная свекла и подсолнечник; цветочных культур или других декоративных растений, таких как сосны и хвойные деревья. Другие Hemipterans относятся к Nilaparvata ssp (например N. lugens, Sogatella furcifera) и причиняют вред растениям риса. Другие Hemipterans относятся к Lygus ssp (например, Lygus hesperus, Lygus rugulipennis, Lygus lineolaris, Lygus sully) и другим видам растительноядных насекомых в семействе Miridae, и причиняют вред хлопчатнику, растениям картофеля, клубнике, хлопчатнику, люцерне, канола, персику, сливам, винограду, латуку, баклажану, луку, зеленым бобам. А также некоторым средиземноморским деревьям и некоторым декоративным деревьям, таким как вяз (Ulmus spp.), кедровый орех (Pinus Pinea), платан кленолистный (Platanus Acerifolia), яблоня (Malus alba). Другие Hemipterans относятся к семейству Pentatomoidea, их обычно называют щитники, лесные клопы и клопы-вонючки (например, коричневый мраморный щитник (Halyomorpha halys), клоп-щитник (Euschistus conspersus), зеленый овощной клоп (Nezara viridula), щитник красноногий (Pentatoma rufipes), клоп капустный (Murgantia histrionica), клоп (Oebalus pugnax)), и они наносят ущерб плодам, включая яблоки, персики, инжир, шелковицу, плодам цитрусовых и хурме, ежевике, и овощам, включая сахарную кукурузу, томаты, соевые бобы, фасоль лимскую и паприку, капусту, цветную капусту, репу, хрен, капусту кормовую, горчицу, брюссельскую капусту, картофель, баклажаны, бамию, бобы, спаржу, свеклу, сорняки, фруктовые деревья и полевые культуры, такие как полевая кукуруза и соевые бобы. Щитники также являются вредителями трав, сорго и риса.
Растение для применения в способах по настоящему изобретению или трансгенное растение в соответствии с настоящим изобретением охватывает любое растение, но предпочтительно является растением, которое является восприимчивым к нападению насекомых, патогенных для растения.
Соответственно, настоящее изобретение распространяется на растения и на способы, описываемые в данном документе, где растение выбирают из следующей группы растений (или сельскохозяйственных культур): люцерна, яблоня, абрикос, артишок, спаржа, авокадо, банан, ячмень, бобы, свекла, ежевика, черника, брокколи, брюссельская капуста, капуста, канола, морковь, маниок, цветная капуста, зерновые, сельдерей, вишня, цитрусы, клементины, кофе, кукуруза, хлопчатник, огурцы, баклажаны, эндивий, эвкалипт, инжир, виноград, грейпфрут, арахис, физалис, киви, латук, лук-порей, лимон, лайм, сосна, кукуруза, манго, дыня, просо, грибы, орехи, овес, бамия, лук, апельсин, декоративное растение или цветок, или дерево, папайя, петрушка, горох, персики, арахис, торфяной мох, перец, хурма, ананас, подорожник, слива, гранат, картофель, тыква, красный эндивий, редис, рапсовое семя, малина, рис, рожь, сорго, соя, соевые бобы, шпинат, клубника, сахарная свекла, сахарный тростник, подсолнечник, сладкий картофель, мандарин, чай, табак, томаты, виноград культурный, арбуз, пшеница, ямс и кабачок.
В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает гены-мишени, которые кодируют белки, участвующие в функции белка wings up A (тропонина I), субъединицы II митохондриальной цитохром с-оксидазы или одного из рибосомных белков, как указано в таблице 1.
В предпочтительных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает гены-мишени, которые выбраны из группы генов (i) имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарную ей последовательность, или имеющих нуклеотидную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух последовательностей является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, или (ii) имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарную ей последовательность, или (iii) имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент по меньшей мере из 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 или 3000 последовательных нуклеотидов из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, или имеющих такую нуклеотидную последовательность, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении указанного гена, содержащего указанный фрагмент, с любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 указанная нуклеотидная последовательность являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, или (iv) имеющих нуклеотидную последовательность, содержащую фрагмент из по меньшей мере 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 или 3000 последовательных нуклеотидов из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, таким образом, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 указанная нуклеотидная последовательность указанного фрагмента являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной указанному соответствующему фрагменту из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, или (v) имеющих нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух аминокислотных последовательностей является по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной аминокислотной последовательности, кодируемой любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389, или (vi) ген которой у насекомого-вредителя является ортологом гена, имеющего нуклеотидную последовательность, содержащую любую из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарную ей последовательность, при этом два ортологических гена сходны по последовательности до такой степени, что при оптимальном выравнивании и сравнении двух генов ортолог имеет последовательность, которая по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентична любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389,
и где нуклеотидная последовательность указанного гена составляет не более 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000 или 1500 нуклеотидов в длину.
Аминокислотные последовательности, кодируемые генами-мишенями по настоящему изобретению, представлены SEQ ID NO 79, 349, 405, 352, 356, 80, 326, 81, 327, 82, 83, 328, 84, 329, 85, 86, 359, 87-91, 330, 350, 353, 331, 351, 332-336, 337, 354, 338-344, 346, 345, 347, 348, 357, 355, 358, 390-393.
Применяемый в данном документе термин ʺобладающийʺ имеет такое же значение, как ʺсодержащийʺ.
Применяемый в данном документе термин ʺидентичность последовательностейʺ используется для описания сходства последовательностей между двумя или более нуклеотидными или аминокислотными последовательностями. Процент ʺидентичности последовательностейʺ между двумя последовательностями определяется путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения (определенное число положений), при этом часть последовательности в окне сравнения может содержать присоединения или делеции (т.е. пробелы) по сравнению с контрольной последовательностью с целью достижения оптимального выравнивания. Процент идентичности последовательностей рассчитывается путем определения числа положений, в которых идентичное нуклеотидное основание или аминокислотный остаток встречается в обеих последовательностях, с получением числа ʺсовпадающихʺ положений, деления числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения и умножения результата на 100. Способы и программное обеспечение для определения идентичности последовательностей доступны в данной области и включают программное обеспечение Blast и GAP-анализ. Для нуклеиновых кислот процент идентичности рассчитывают предпочтительно с помощью инструмента выравнивания BlastN, посредством чего процент идентичности рассчитывают по всей длине запросной нуклеотидной последовательности.
Специалисту в данной области будет понятно, что гомологи или ортологи (гомологи, существующие у различных видов) генов-мишеней, представленные любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389, могут быть идентифицированы. Данные гомологи и/или ортологи вредителей также находятся в рамках настоящего изобретения. Предпочтительные гомологи и/или ортологи являются генами, подобными в нуклеотидной последовательности до такой степени, что при оптимальном выравнивании и сравнении двух генов гомолог и/или ортолог имеет последовательность, которая является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80% или 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90% или 95%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 99% идентичной любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности. Аналогично, также предпочтительными гомологами и/или ортологами являются белки, которые подобны в аминокислотной последовательности до такой степени, что при оптимальном выравнивании и сравнении двух аминокислотных последовательностей гомолог и/или ортолог имеет последовательность, которая является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80% или 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90% или 95%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 99% идентичной любой из SEQ ID NO 79, 349, 405, 352, 356, 80, 326, 81, 327, 82, 83, 328, 84, 329, 85, 86, 359, 87-91, 330, 350, 353, 331, 351, 332-336, 337, 354, 338-344, 346, 345, 347, 348, 357, 355, 358, 390-393.
Другие гомологи являются генами, которые являются аллелями гена, содержащего последовательность, которая представлена любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389. Дополнительные предпочтительные гомологи являются генами, содержащими по меньшей мере один однонуклеотидный полиморфизм (SNP) по сравнению с геном, содержащим последовательность, которая представлена любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389.
ʺИнтерферирующая рибонуклеиновая кислота (РНК)ʺ по настоящему изобретению охватывает любой тип молекулы РНК, способной подавлять или подвергать ʺсайленсингуʺ экспрессию гена-мишени, включая, но без ограничений, смысловую РНК, антисмысловую РНК, короткую интерферирующую РНК (siRNA), микроРНК (miRNA), двухцепочечную РНК (dsRNA), шпилечную РНК (RNA) и тому подобное. Способы анализа функциональных молекул интерферирующих РНК хорошо известны в данной области и описаны в данном документе в других местах.
Молекулы интерферирующей РНК по настоящему изобретению обеспечивают последовательность-специфическое подавление экспрессии гена-мишени путем связывания с целевой нуклеотидной последовательностью в пределах гена-мишени. Связывание происходит в результате спаривания оснований между комплементарными областями интерферирующей РНК и целевой нуклеотидной последовательности. Применяемый в данном документе термин ʺсайленсирующий элементʺ относится к части или области интерферирующей РНК, содержащей или состоящей из последовательности нуклеотидов, которая комплементарна или по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах гена-мишени, и которая функционирует как активная часть интерферирующей РНК с непосредственным подавлением экспрессии указанного гена-мишени. В одном варианте осуществления настоящего изобретения сайленсирующий элемент содержит или состоит из последовательности по меньшей мере из 17 последовательных нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 18 или 19 последовательных нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 21 последовательного нуклеотида, еще более предпочтительно по меньшей мере 22, 23, 24 или 25 последовательных нуклеотидов, комплементарных целевой нуклеотидной последовательности в пределах гена-мишени.
Применяемое в данном документе выражение ʺэкспрессия гена-мишениʺ относится к транскрипции и накоплению РНК-транскрипта, кодируемого геном-мишенью, и/или трансляции mRNA в белок. Термин ʺподавлятьʺ предназначен для обозначения любого из способов, известных в данной области, с помощью которого молекулы интерферирующей РНК снижают уровень первичных транскриптов РНК, mRNA или белка, полученного из гена-мишени. В определенных вариантах осуществления подавление относится к ситуации, когда уровень РНК или белка, полученного из гена, уменьшается по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 33%, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80%. В особенно предпочтительных вариантах осуществления подавление относится к снижению уровня РНК или белка, полученного из гена, по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% в клетках насекомого-вредителя по сравнению с соответствующим контрольным насекомым-вредителем, которое, например, не подвергалось воздействию интерферирующей РНК или подвергалось воздействию контрольной молекулы интерферирующей РНК. Способы выявления снижения уровней РНК или белка хорошо известны в данной области и включают гибридизацию РНК в растворе, нозерн гибридизацию, обратную транскрипцию (например, количественный анализ ОТ-ПЦР (RT-PCR)), микроматричный анализ, связывание антител, иммуноферментный твердофазный анализ (ELISA) и вестерн-блоттинг. В другом варианте осуществления настоящего изобретения подавление относится к снижению уровней РНК или белка, достаточному для получения выявляемого изменения фенотипа вредителя, по сравнению с соответствующей мерой борьбы с вредителями, например, гибелью клеток, прекращением роста или тому подобное. Подавление, таким образом, можно измерить с помощью фенотипического анализа насекомого-вредителя с использованием методов, обычных в данной области.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения интерферирующая РНК подавляет экспрессию гена с помощью РНК-интерференции или RNAi. RNAi является процессом последовательность-специфической генной регуляции, как правило, опосредованной молекулами двухцепочечной РНК, такими как короткие интерферирующие РНК (siRNA). siRNA содержат смысловую цепь РНК, соединенную путем комплементарного спаривания оснований с антисмысловой цепью РНК. Смысловая цепь или “направляющая цепь” молекулы siRNA содержит последовательность нуклеотидов, комплементарную последовательности нуклеотидов, расположенных в пределах РНК-транскрипта гена-мишени. Смысловая цепь siRNA, следовательно, способна соединяться с РНК-транскриптом посредством спаривания оснований по Уотсон-Крику и направлять РНК на деградацию в пределах клеточного комплекса, известного как индуцируемый RNAi сайленсирующий комплекс или RISC. Таким образом, в отношении предпочтительных молекул интерферирующей РНК по настоящему изобретению сайленсирующий элемент, как изложено в данном документе, может являться двухцепочечной областью, содержащей соединенные комплементарные цепи, из которых по меньшей мере одна цепь содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, комплементарной или по меньшей мере частично комплементарной целевой нуклеотидной последовательности в пределах гена-мишени. В одном варианте осуществления двухцепочечная область составляет в длину по меньшей мере 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 или 3000 пар оснований.
Более длинные двухцепочечные молекулы РНК (dsRNA), содержащие один или более функциональных двухцепочечных сайленсирующих элементов, которые описаны в данном документе в других местах, и способные к сайленсингу генов посредством RNAi, также рассматриваются в рамках настоящего изобретения. Такие более длинные молекулы dsRNA содержат по меньшей мере 80, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 или 3000 пар оснований. Данные молекулы dsRNA могут служить в качестве предшественников активных молекул siRNA, которые направляют РНК-транскрипт к комплексу RISC для последующей деградации. Молекулы dsRNA, присутствующие в среде, окружающей организм или его клетки, могут поглощаться организмом и перерабатываться ферментом, называемым Dicer, с получением молекул siRNA. Альтернативно, dsRNA может быть получена in vivo, т.е. транскрибирована из полинуклеотида или полинуклеотидов, кодирующих dsRNA, присутствующих в клетке, например, бактериальной клетке или растительной клетке, и впоследствии обработана с помощью Dicer, либо в пределах клетки-хозяина, либо предпочтительно в пределах клеток насекомого-вредителя после поглощения более длинной dsRNA-предшественника. dsRNA может образовываться из двух отдельных (смысловой и антисмысловой) цепей РНК, которые соединяются посредством комплементарного спаривания оснований. Альтернативно, dsRNA может являться одной цепью, способной складываться назад на себя с образованием шпилечной РНК (РНК) или структуры стебель-петля. В случае РНК, двухцепочечная область или ʺстебельʺ образована из двух областей или сегментов РНК, которые являются существенно инвертированными повторами друг друга и обладают достаточной комплементарностью для обеспечения образования двухцепочечной области. Один или более функциональных двухцепочечных сайленсирующих элементов могут присутствовать в данной ʺобласти стебляʺ молекулы. Области инвертированных повторов, как правило, разделены областью или сегментом РНК, известным как область ʺпетлиʺ. Данная область может содержать любую нуклеотидную последовательность, придающую достаточную гибкость для обеспечения осуществления самоспаривания между фланкирующими комплементарными областями РНК. В общем, область петли является по существу одноцепочечной и действует как разделительный элемент между инвертированными повторами.
Все молекулы интерферирующей РНК по настоящему изобретению обеспечивают последовательность-специфическое подавление экспрессии гена-мишени путем связывания с целевой нуклеотидной последовательностью в пределах гена-мишени. Связывание происходит в результате комплементарного спаривания оснований между сайленсирующим элементом интерферирующей РНК и целевой нуклеотидной последовательностью. Молекулы интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержат по меньшей мере один или по меньшей мере два сайленсирующих элемента. В одном варианте осуществления настоящего изобретения целевая нуклеотидная последовательность содержит последовательность нуклеотидов, которая представлена РНК-транскриптом гена-мишени или его фрагментом, при этом фрагмент составляет предпочтительно по меньшей мере 17 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 18, 19 или 20 нуклеотидов, или наиболее предпочтительно по меньшей мере 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 или 3000 нуклеотидов. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения целевая нуклеотидная последовательность содержит последовательность нуклеотидов, эквивалентную РНК-транскрипту, кодируемому любым из полинуклеотидов, который выбирают из группы, включающей (i) полинуклеотид, который содержит по меньшей мере 21, предпочтительно по меньшей мере 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности, представленной любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательностью, или (ii) полинуклеотид, который содержит по меньшей мере 21, предпочтительно по меньшей мере 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 или 3000 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности, представленной любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности,
или (iii) полинуклеотида, который содержит по меньшей мере 21, предпочтительно по меньшей мере 22, 23 или 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 или 3000 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности, которая представлена в любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательностью, таким образом, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении двух последовательностей указанный полинуклеотид являлся по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичным любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, или (iv) полинуклеотид, который содержит фрагмент по меньшей мере из 21, предпочтительно по меньшей мере 22, 23 или 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 или 3000 последовательных нуклеотидов нуклеотида, представленного любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательностью, и при этом указанный фрагмент или указанная комплементарная последовательность обладает нуклеотидной последовательностью, таким образом, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 указанная нуклеотидная последовательность являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной указанному соответствующему фрагменту из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности,
или (v) полинуклеотид, который содержит фрагмент по меньшей мере из 21, предпочтительно по меньшей мере 22, 23 или 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 или 3000 последовательных нуклеотидов нуклеотида, представленного в любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательностью, и при этом указанный фрагмент или указанная комплементарная последовательность обладает нуклеотидной последовательностью, таким образом, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 указанная нуклеотидная последовательность являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной указанному соответствующему фрагменту из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, или (vi) полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух аминокислотных последовательностей является по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной аминокислотной последовательности, кодируемой любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389. В более предпочтительном варианте осуществления вышеупомянутого указанный полинуклеотид составляет в длину не более чем 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000 или 1500 нуклеотидов.
Предпочтительно молекулы интерферирующей РНК по настоящему изобретению содержат по меньшей мере одну двухцепочечную область, как правило, сайленсирующий элемент интерферирующей РНК, содержащий смысловую цепь РНК, соединенную путем комплементарного спаривания оснований с антисмысловой цепью РНК, при этом смысловая цепь молекулы dsRNA содержит последовательность нуклеотидов, комплементарную последовательности нуклеотидов, расположенной в пределах РНК-транскрипта гена-мишени.
Сайленсирующий элемент или по меньшей мере одна его цепь, при этом сайленсирующий элемент является двухцепочечным, может являться полностью комплементарным или частично комплементарным целевой нуклеотидной последовательности гена-мишени. Применяемый в данном документе термин ʺполностью комплементарныйʺ означает, что все основания нуклеотидной последовательности сайленсирующего элемента являются комплементарными или ʺсоответствуютʺ основаниям целевой нуклеотидной последовательности. Термин ʺпо меньшей мере частично комплементарныйʺ означает, что существует менее чем 100% совпадения между основаниями сайленсирующего элемента и основаниями целевой нуклеотидной последовательности. Специалисту в данной области будет понятно, что сайленсирующий элемент должен являться лишь по меньшей мере частично комплементарным целевой нуклеотидной последовательности для опосредования подавления экспрессии гена-мишени. Как известно в данной области, последовательности РНК со вставками, делециями и нарушениями комплементарности относительно целевой последовательности все же могут являться эффективными при RNAi. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительно, чтобы сайленсирующий элемент и целевая нуклеотидная последовательность гена-мишени обладали по меньшей мере 80% или 85% идентичности последовательности, предпочтительно по меньшей мере 90% или 95% идентичности последовательности или более предпочтительно по меньшей мере 97% или 98% идентичности последовательности, и еще более предпочтительно по меньшей мере 99% идентичности последовательности. Альтернативно, сайленсирующий элемент может содержать 1, 2 или 3 нарушения комплементарности по сравнению с целевой нуклеотидной последовательностью на каждом отрезке из 24 частично комплементарных нуклеотидов.
Специалисту в данной области будет очевидным, что степень комплементарности между сайленсирующим элементом и целевой нуклеотидной последовательностью может варьировать в зависимости от гена-мишени, подлежащего подавлению, или в зависимости от вида насекомого-вредителя, у которого экспрессия гена подлежит контролю.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения сайленсирующий элемент содержит последовательность нуклеотидов, которая является эквивалентом РНК любого из полинуклеотидов, выбранных из группы, включающей полинуклеотид, который содержит по меньшей мере 21, предпочтительно по меньшей мере 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности, представленной любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательностью, или (ii) полинуклеотид, который содержит по меньшей мере 21, предпочтительно по меньшей мере 22, 23 или 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 или 3000 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности, представленной любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, таким образом, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении двух последовательностей указанный полинуклеотид являлся по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичным любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, или (iii) полинуклеотид, который содержит фрагмент по меньшей мере из 21, предпочтительно по меньшей мере 22, 23 или 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 или 3000 последовательных нуклеотидов нуклеотида, представленного в любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, и при этом указанный фрагмент или указанная комплементарная последовательность обладают такой нуклеотидной последовательностью, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 указанная нуклеотидная последовательность является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной указанному соответствующему фрагменту из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, при этом указанный полинуклеотид составляет не более 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000 или 1500 нуклеотидов в длину. Следует понимать, что в таких вариантах осуществления сайленсирующий элемент может содержать или состоять из области двухцепочечной РНК, содержащей соединенные комплементарные цепи, одна цепь из которых, смысловая цепь, содержит последовательность нуклеотидов по меньшей мере частично комплементарную целевой нуклеотидной последовательности в пределах гена-мишени.
Целевую нуклеотидную последовательность можно выбирать из любой подходящей области или нуклеотидной последовательности гена-мишени или его РНК-транскрипта. Например, целевая нуклеотидная последовательность может располагаться в пределах 5'UTR или 3'UTR гена-мишени или РНК транскрипта или в пределах экзонной или интронной областей гена.
Специалисту в данной области известны способы идентифицирования наиболее подходящих целевых нуклеотидных последовательностей в рамках полноразмерного гена-мишени. Например, множество сайленсирующих элементов, воздействующих на различные области гена-мишени, можно синтезировать и тестировать. Альтернативно, расщепление РНК-транскрипта с помощью ферментов, таких как РНКаза Н, можно использовать для определения сайтов в РНК, которые находятся в конформации, восприимчивой к сайленсингу гена. Сайты-мишени также можно идентифицировать с применением in silico подходов, например, использование компьютерных алгоритмов, предназначенных для прогнозирования эффективности сайленсинга генов на основе воздействия на различные сайты в пределах гена полной длины.
Интерферирующие РНК по настоящему изобретению могут содержать один сайленсирующий элемент или несколько сайленсирующих элементов, при этом каждый сайленсирующий элемент содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах гена-мишени, и которая функционирует при поглощении видом насекомого-вредителя с подавлением экспрессии указанного гена-мишени. Конкатемерные РНК-конструкции данного типа описаны в WO2006/046148, который включен в данном документе в качестве ссылки. В контексте настоящего изобретения термин ʺнесколькоʺ означает по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре и т.д., и по меньшей мере до 10, 15, 20 или по меньшей мере 30. В одном варианте осуществления интерферирующая РНК содержит несколько копий одного сайленсирующего элемента, т.е. повторов сайленсирующего элемента, который связывается с конкретной целевой нуклеотидной последовательностью в пределах определенного гена-мишени. В другом варианте осуществления сайленсирующие элементы в пределах интерферирующей РНК содержат или состоят из различных последовательностей нуклеотидов, комплементарных различным целевым нуклеотидным последовательностям. Должно быть ясно, что комбинации нескольких копий одного и того же сайленсирующего элемента, комбинированные с сайленсирующими элементами, связывающимися с различными целевыми нуклеотидными последовательностями, находятся в рамках настоящего изобретения.
Различные целевые нуклеотидные последовательности могут происходить из одного гена-мишени у вида насекомого-вредителя для достижения улучшения подавления конкретного гена-мишени у вида насекомого-вредителя. В этом случае сайленсирующие элементы можно комбинировать в интерферирующей РНК в исходном порядке, в котором целевые нуклеотидные последовательности встречаются в гене-мишени, или сайленсирующие элементы можно смешивать и комбинировать случайно в любом порядке ранжирования в рамках интерферирующей РНК по сравнению с порядком целевых нуклеотидных последовательностей в гене-мишени.
Альтернативно различные целевые нуклеотидные последовательности представляют один ген-мишень, но происходят из различных видов насекомых-вредителей.
Альтернативно различные целевые нуклеотидные последовательности могут происходить из различных генов-мишеней. Если интерферирующая РНК предназначена для использования для предупреждении и/или борьбы с нападением вредителей, предпочтительно выбирать различные гены-мишени из группы генов, регулирующих жизненно важные биологические функции вида насекомого-вредителя, включая, но без ограничений, выживание, рост, развитие, размножение и патогенность. Гены-мишени могут регулировать одинаковые или различные биологические пути или процессы. В одном варианте осуществления по меньшей мере один из сайленсирующих элементов содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах гена-мишени, при этом ген-мишень выбран из группы генов, которая описана ранее.
В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения различные гены, на которые воздействуют различные сайленсирующие элементы, происходят из одного вида насекомого-вредителя. Данный подход предназначен для достижения усиленного воздействия на один вид насекомого-вредителя. В частности, различные гены-мишени могут экспрессироваться дифференциально на различных стадиях жизненного цикла насекомого, например, зрелого имаго, незрелой личиночной и стадии яйца. Интерферирующую РНК по настоящему изобретению можно использовать для предотвращения и/или борьбы с нападением насекомых-вредителей на более чем одной стадии жизненного цикла насекомого.
В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения различные гены, на которые воздействуют различные сайленсирующие элементы, происходят из различных видов насекомых-вредителей. Интерферирующую РНК по настоящему изобретению можно, таким образом, использовать для предотвращения и/или борьбы с нападением более чем одного вида насекомых-вредителей одновременно.
Сайленсирующие элементы могут располагаться в виде одной непрерывной области интерферирующей РНК или могут разделяться присутствием линкерной последовательности. Линкерная последовательность может содержать короткую случайную нуклеотидную последовательность, которая не комплементарна ни одной из целевых нуклеотидных последовательностей или генов-мишеней. В одном варианте осуществления линкер является при определенных условиях самостоятельно расщепляющейся последовательностью РНК, предпочтительно pH-чувствительным линкером или гидрофобно-чувствительным линкером. В одном варианте осуществления линкер содержит последовательность нуклеотидов, эквивалентную интронной последовательности. Линкерные последовательности по настоящему изобретению могут находиться в диапазоне длины от приблизительно 1 пары оснований до приблизительно 10000 пар оснований, при условии, что линкер не ухудшает способности интерферирующей РНК подавлять экспрессию гена(генов)-мишени.
В дополнение к сайленсирующему элементу(элементам) и любым линкерным последовательностям интерферирующая РНК по настоящему изобретению может содержать по меньшей мере одну дополнительную полинуклеотидную последовательность. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения дополнительную последовательность выбирают из (i) последовательности, способной защитить интерферирующую РНК от РНК процессинга, (ii) последовательности, влияющей на стабильность интерферирующей РНК, (iii) последовательности, обеспечивающей связывание белков, например, для облегчения поглощения интерферирующей РНК клетками вида насекомого-вредителя, (iv) последовательности, облегчающей крупномасштабное производство интерферирующей РНК, (v) последовательности, которая является аптамером, который связывается с рецептором или молекулой на поверхности клеток насекомого-вредителя для облегчения поглощения, или (vi) последовательности, которая катализирует процессинг интерферирующей РНК в клетках насекомого-вредителя и тем самым повышает эффективность интерферирующей РНК. Структуры для повышения стабильности молекулы РНК хорошо известны в данной области и описаны дополнительно в WO2006/046148, который включен в данном документе в качестве ссылки.
Длина интерферирующей РНК по настоящему изобретению должна являться достаточной для поглощения клетками вида насекомого-вредителя и подавления генов-мишеней у вредителя, как описано в данном документе в других местах. Однако верхний предел длины может зависеть от (i) требования к интерферирующей РНК поглощаться клетками вредителя и (ii) требования к интерферирующей РНК подвергаться процессингу в клетках вредителя для опосредования сайленсинга генов путем RNAi. Длина также может зависеть от способа получения и состава для доставки интерферирующей РНК к клеткам. Предпочтительно интерферирующая РНК по настоящему изобретению составляет от 21 до 10000 нуклеотидов в длину, предпочтительно от 50 до 5000 нуклеотидов или от 100 до 2500 нуклеотидов, более предпочтительно от 80 до 2000 нуклеотидов в длину.
Интерферирующая РНК может содержать основания ДНК, неприродные основания или неприродные связи остова, или модификации сахарофосфатного остова, например, для повышения стабильности во время хранения или повышения устойчивости к деградации нуклеазами. Дополнительно, интерферирующая РНК может быть получена химически или ферментативно специалистом в данной области с помощью управляемых вручную или автоматизированных реакций. Альтернативно, интерферирующая РНК может транскрибироваться из полинуклеотида, кодирующего таковую. Таким образом, в настоящем документе предусматривается выделенный полинуклеотид, кодирующий любую из интерферирующих РНК по настоящему изобретению.
Также в настоящем документе предусматривается выделенный полинуклеотид, выбранный из группы, включающей (i) полинуклеотид, который содержит по меньшей мере 21, предпочтительно по меньшей мере 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 или 3000 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности, представленной любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательностью, или (ii) полинуклеотид, который содержит по меньшей мере 21, предпочтительно по меньшей мере 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1115 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности, представленной любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательностью, или (iii) полинуклеотид, который содержит по меньшей мере 21, предпочтительно по меньшей мере 22, 23 или 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 или 3000 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности так, что при оптимальном выравнивании и сравнении двух последовательностей указанный полинуклеотид является по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичным любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, или (iv) полинуклеотид, который содержит фрагмент по меньшей мере из 21, предпочтительно по меньшей мере 22, 23 или 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 или 3000 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, и при этом указанный фрагмент или указанная комплементарная последовательность обладают такой нуклеотидной последовательностью, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 указанная нуклеотидная последовательность являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной указанному соответствующему фрагменту из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, или (v) полинуклеотид, который содержит фрагмент по меньшей мере из 21, предпочтительно по меньшей мере 22, 23 или 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000 или 3000 последовательных нуклеотидов нуклеотида, представленного в любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, и при этом указанный фрагмент или указанная комплементарная последовательность обладают такой нуклеотидной последовательностью, чтобы при оптимальном выравнивании и сравнении указанного фрагмента с соответствующим фрагментом в любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 указанная нуклеотидная последовательность являлась по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной указанному соответствующему фрагменту из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389 или комплементарной ей последовательности, или (vi) полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность, которая при оптимальном выравнивании и сравнении двух аминокислотных последовательностей является по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичной аминокислотной последовательности, кодируемой любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, 310-313, 3, 4, 31-34, 139, 5, 6, 35-38, 140, 7, 8, 39-42, 9, 10, 43-46, 141, 11, 12, 47-50, 13, 14, 51-54, 15, 204, 16, 205, 55-58, 322-325, 17, 18, 59-62, 19, 20, 63-66, 21, 22, 67-70, 23, 24, 71-74, 25, 26, 75-78, 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301, 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293, 123, 132, 214-217, 124, 133, 218-221, 146, 125, 134, 222-225, 147, 126, 135, 226-229, 127, 148, 136, 230-233, 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305, 129, 138, 238-241, 150, 151, 242-245, 152, 153, 246-249, 154, 155, 250-253, 156, 157, 254-257, 158, 159, 258-261, 160, 161, 262-265, 163, 162, 164, 266-269, 165, 167, 166, 270-273, 168, 170, 169, 274-277, 172, 173, 278-281, 200, 201, 314-317, 186, 202, 187, 203, 306-309, 318-321, 386, 387, 388, 389, и при этом указанный полинуклеотид составляет не более 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000 или 1500 нуклеотидов в длину.
В предпочтительных вариантах осуществления выделенный полинуклеотид является частью молекулы интерферирующей РНК, как правило, частью сайленсирующего элемента, содержащего по меньшей мере одну двухцепочечную область, содержащую смысловую цепь РНК, соединенную путем комплементарного спаривания оснований с антисмысловой цепью РНК, при этом смысловая цепь молекулы dsRNA содержит последовательность нуклеотидов, комплементарную последовательности нуклеотидов, расположенной в пределах РНК-транскрипта гена-мишени. Смысловая цепь dsRNA, следовательно, способна соединяться с РНК-транскриптом и воздействовать на РНК для деградации в пределах RNAi-индуцируемого сайленсирующего комплекса или RISC.
Полинуклеотиды по настоящему изобретению можно вставлять с помощью рутинных методов молекулярного клонирования в ДНК-конструкции или векторы, известные в данной области. Следовательно, в соответствии с одним вариантом осуществления предусматривается ДНК-конструкция, содержащая любые из полинуклеотидов по настоящему изобретению. Предпочтительно в данном документе предусматривается ДНК-конструкция, содержащая полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере одну из интерферирующих РНК по настоящему изобретению. ДНК-Конструкция может являться рекомбинантным ДНК-вектором, например, бактериальным, вирусным или дрожжевым вектором. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ДНК-конструкция является экспрессирующей конструкцией, и полинуклеотид функционально связан с по меньшей мере одной регуляторной последовательностью, способной управлять экспрессией полинуклеотидной последовательности. Термин ʺрегуляторная последовательностьʺ следует рассматривать в широком контексте, и он предназначен для обозначения любой нуклеотидной последовательности, способной воздействовать на экспрессию полинуклеотидов, с которыми она функционально связана, включая, но без ограничений, промоторы, энхансеры и другие природные или синтетические элементы-активаторы транскрипции. Регуляторная последовательность может располагаться на 5'-или 3'-конце полинуклеотидной последовательности. Термин ʺфункционально связанныйʺ относится к функциональной связи между регуляторной последовательностью и полинуклеотидной последовательностью, такой, что регуляторная последовательность управляет экспрессией полинуклеотида. Функционально связанные элементы могут являться смежными или несмежными.
Предпочтительно регуляторная последовательность является промотором, выбранным из группы, включающей, но без ограничений, конститутивные промоторы, индуцируемые промоторы, тканеспецифические промоторы и промоторы, специфичные для стадии роста/развития. В одном варианте осуществления полинуклеотид находится под контролем сильного конститутивного промотора, такого как любой, выбранный из группы, включающей CaMV35S промотор, двойной CaMV35S промотор, убиквитиновый промотор, актиновый промотор, rubisco промотор, GOS2 промотор, промотор 34S вируса мозаики норичника.
Необязательно одну или более последовательностей терминации транскрипции можно включать в экспрессирующую конструкцию по настоящему изобретению. Термин ʺпоследовательность терминации транскрипцииʺ охватывает управляющую последовательность в конце транскрипционной единицы, которая сигнализирует о терминации транскрипции, 3' процессинге и полиаденилировании первичного транскрипта. Дополнительные регуляторные последовательности, включая, но без ограничений, энхансеры транскрипции или трансляции, можно включать в экспрессионную конструкцию, например, как с усиленным двойным промотором CaMV35S.
Настоящее изобретение также охватывает способ создания любой из интерферирующих РНК по настоящему изобретению, включающий этапы: (i) контакта полинуклеотида, кодирующего указанную интерферирующую РНК, или ДНК-конструкции, содержащей полинуклеотид, с бесклеточными компонентами; или (ii) введения в клетку (например, путем трансформации, трансфекции или инъекции) полинуклеотида, кодирующего указанную интерферирующую РНК, или ДНК-конструкции, содержащей полинуклеотид.
Настоящее изобретение, таким образом, также относится к любому двухцепочечному рибонуклеотиду, полученному при экспрессии полинуклеотида, описанного в данном документе.
Соответственно, также в данном документе предусматривается клетка-хозяин, трансформированная любым из полинуклеотидов, описанных в данном документе. Дополнительно настоящим изобретением охватываются клетки-хозяева, содержащие любую из интерферирующих РНК по настоящему изобретению, любой из полинуклеотидов по настоящему изобретению или ДНК-конструкцию, содержащую любой из полинуклеотидов. Клетка-хозяин может являться прокариотической клеткой, включая, но без ограничений, грамположительные и грамотрицательные бактериальные клетки, или эукариотической клеткой, включая, но без ограничений, клетки дрожжей или клетки растений. Предпочтительно указанная клетка-хозяин является бактериальной клеткой или растительной клеткой. Бактериальную клетку можно выбирать из группы, включающей, но без ограничений, грамположительные и грамотрицательные клетки, включающие Escherichia spp. (например, E. coli), Bacillus spp. (например, B. thuringiensis), Rhizobium spp., Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Pseudomonas spp. и Agrobacterium spp. Полинуклеотид или ДНК-конструкция по настоящему изобретению может существовать или поддерживаться в клетке-хозяине как внехромосомный элемент, или может являться стабильно включенным в геном клетки-хозяина. Характеристики, представляющие особый интерес при выборе клетки-хозяина для целей настоящего изобретения, включают простоту, с которой полинуклеотид или ДНК-конструкцию, кодирующую интерферирующую РНК, можно ввести в хозяина, доступность совместимых экспрессионных систем, эффективность экспрессии и стабильность интерферирующей РНК в хозяине.
Предпочтительно интерферирующие РНК по настоящему изобретению экспрессируются в растительных клетках-хозяевах. Предпочтительные растения, представляющие интерес, включают, но без ограничений, хлопчатник, картофель, рис, томат, канолу, сою, подсолнечник, сорго, просо, кукурузу, люцерну, землянику, баклажаны, перец и табак.
В ситуациях, где интерферирующая РНК экспрессируется в клетке-хозяине и/или применяется для предотвращения и/или борьбы с нападением вредителя на организм-хозяин, предпочтительно, чтобы интерферирующая РНК не демонстрировала значительных ʺнецелевыхʺ эффектов, т.е. интерферирующая РНК не влияла на экспрессию генов в хозяине. Предпочтительно сайленсирующий элемент не демонстрирует значительной комплементарности с нуклеотидными последовательностями, кроме заданной целевой нуклеотидной последовательности гена-мишени. В одном варианте осуществления настоящего изобретения сайленсирующий элемент демонстрирует менее 30%, более предпочтительно менее 20%, более предпочтительно менее 10% и еще более предпочтительно менее 5% идентичности последовательности с любым геном клетки-хозяина или организма. Если известны данные геномной последовательности для организма-хозяина, можно перепроверить идентичность с сайленсирующим элементом, применяя стандартные инструменты биоинформатики. В одном варианте осуществления отсутствует идентичность последовательности между сайленсирующим элементом и геном из клетки-хозяина или организма-хозяина в области из 17, более предпочтительно в области из 18 или 19 и наиболее предпочтительно в области из 20 или 21 последовательных нуклеотидов.
При практическом применении настоящего изобретения интерферирующие РНК по настоящему изобретению можно использовать для предотвращения и/или борьбы с любым насекомым вредителем, принадлежащим к отрядам Coleoptera, Lepidoptera, Diptera, Dichyoptera, Orthoptera, Hemiptera и Siphonaptera.
Кроме того, в соответствии с другим аспектом настоящего изобретения в настоящем документе предусматривается композиция для предотвращения и/или борьбы с нападением насекомых-вредителей, содержащая по меньшей мере одну интерферирующую рибонуклеиновую кислоту (РНК) и необязательно по меньшей мере один подходящий носитель, наполнитель или разбавитель, причем интерферирующая РНК функционирует при поглощении насекомым с подавлением экспрессии гена-мишени у указанного вредителя. Интерферирующей РНК может являться любая из тех, которые раскрыты в других разделах данного документа. Предпочтительно интерферирующая РНК содержит или состоит по меньшей мере из одного сайленсирующего элемента, при этом указанный сайленсирующий элемент является областью двухцепочечной РНК, содержащей соединенные комплементарные цепи, одна цепь из которых (смысловая цепь) содержит последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере частично комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в пределах гена-мишени. ʺГеном-мишеньюʺ может являться любой ген-мишень, раскрываемый в разделах настоящего документа, включая, но без ограничений, гены, участвующие в регуляции выживания, росте, развитии, размножении и патогенности вредителя. Альтернативно, композиция содержит по меньшей мере одну клетку-хозяина, содержащую по меньшей мере одну интерферирующую молекулу РНК или конструкцию ДНК, кодирующую тот же самый и необязательно по меньшей мере один подходящий носитель, наполнитель или разбавитель, причем интерферирующая РНК функционирует при поглощении клетки-хозяина насекомым с подавлением экспрессии гена-мишени у указанного вредителя.
При практическом применении настоящего изобретения композицию можно использовать для предотвращения и/или борьбы с любым насекомым вредителем, принадлежащим к отрядам Coleoptera, Lepidoptera, Diptera, Dichyoptera, Orthoptera, Hemiptera и Siphonaptera. Таким образом, композиция может быть представлена в любой форме, подходящей для применения по отношению к насекомым-вредителям или для применения к субстратам и/или организмам, в частности растений, чувствительных к нападению указанного насекомого-вредителя. В одном варианте осуществления композиция предназначена для применения в целях предотвращения и/или борьбы с нападением вредителей растений, или материала для размножения, или репродуктивного материала растения и, таким образом, направлена на виды насекомых-вредителей, которые нападают на растения. Композиция по настоящему изобретению особенно эффективна, если насекомое-вредитель относится к категории “грызущих” насекомых, которые наносят значительное повреждение растениям, поедая растительные ткани, такие как корни, листья, цветы, почки, ветки и т.п. Примеры из этой большой категории насекомых включают жуков и их личинок.
Композицию по настоящему изобретению можно применять для борьбы с насекомыми-вредителями на всех этапах их жизненного цикла, например, этапе половозрелой особи, этапах личинки и яйца.
В контексте композиции по настоящему изобретению интерферирующая РНК может быть получена из ДНК-конструкции, в частности экспрессионной конструкции, которые описаны в других разделах данного документа, содержащей полинуклеотид, который ее кодирует. В предпочтительных вариантах осуществления интерферирующая РНК может быть произведена внутри клетки-хозяина или организма, сконструированного для экспрессии указанной интерферирующей РНК с полинуклеотидом, который ее кодирует.
Подходящие организмы-хозяева для применения в композициях по настоящему изобретению включают, но без ограничений, композиции, которые известны как колонизирующие среду на и/или вокруг вызывающих интерес растений или культурных растений, т.е. растений или культурных растений, чувствительных к нападению видов насекомых-вредителей. Такие микроорганизмы включают, но без ограничений, микроорганизмы, которые заселяют филлоплану (поверхность листьев растений) и/или ризосферу (почву, окружающую корни растений). Эти микроорганизмы отбирают так, чтобы они были способны успешно конкурировать с организмами дикого типа, присутствующими в среде растения. Подходящие микроорганизмы для применения в качестве хозяев включают различные виды бактерий, дрожжей и грибов. Понятно, что выбираемые микроорганизмы не должны быть токсичными для растений. Такие композиции, применяемые по отношению к растениям, чувствительным к нападению видов насекомых-вредителей, будут поглощаться насекомыми-вредителями при кормлении на обработанных растениях.
Организмы-хозяева, которые в естественных условиях не заселяют растение и/или их среду, также находятся в рамках настоящего изобретения. Такие организмы могут служить лишь в качестве средства для получения интерферирующей РНК композиции. Например, в одном варианте осуществления интерферирующая РНК ферментируется/продуцируется в бактериальном хозяине и бактерии после этого инактивируются/погибают. Полученные бактерии могут быть обработаны и использованы в качестве инсектицидного спрея таким же способом, как были использованы штаммы Bacillus thuringiensis в качестве инсектицида для нанесения распылением. В некоторых вариантах осуществления бактериальный экстракт или лизат может быть подходящим образом очищен с тем, чтобы оставить экстракт, содержащий, по сути, чистую интерферирующую РНК, который затем составляют в одну из композиций по настоящему изобретению. Стандартные методики экстракции/очистки будут известны специалисту в данной области.
Композиции по настоящему изобретению могут находиться в любой подходящей физической форме для применения по отношению к насекомым. Например, композиция может быть в твердой форме (порошок, таблетка или приманка), жидкой форме (в том числе форма, вводимая в качестве распыляемого инсектицида) или форме геля. В конкретном варианте осуществления композиция может представлять собой покрытие, пасту или порошок, который можно нанести на субстрат с целью защиты указанного субстрата от нападения насекомых. В данном варианте осуществления композицию можно применять для защиты любого субстрата или материала, который чувствителен к нападению насекомых или повреждению, наносимому насекомыми.
Природа наполнителей и физической формы композиции может варьировать в зависимости от природы субстрата, который необходимо обрабатывать. Например, композиция может представлять собой жидкость, которую наносят кистью или распыляют на подлежащий обработке материал или субстрат или впечатывают в него, или покрытие или порошок, который наносят на подлежащий обработке материал или субстрат.
В одном варианте осуществления композиция находится в форме приманки. Приманка предназначена для привлечения насекомого войти в контакт с композицией. После вхождения в контакт с нею композиция поглощается насекомым путем, например, переваривания, и опосредует RNAi, таким образом убивая насекомое. Указанная приманка может содержать пищевой продукт, такой как белковый продукт питания, например, рыбную муку. В качестве приманки также можно применять борную кислоту. Приманка может зависеть от вида, являющегося мишенью. Также можно применять аттрактант. Аттрактантом может быть феромон, такой как, например, феромон самца или самки. Как, например, в настоящем изобретении можно применять феромоны, приведенные в книге ʺInsect Pheremones and their use in Pest Managementʺ (Howse et al, Chapman and Hall, 1998). Аттрактант действует как привлекающий насекомого к приманке и может быть направлен на конкретное насекомое или может привлекать целый спектр насекомых. Приманка может быть в любой подходящей форме, такой как твердая, пастообразная форма, форма таблетки или порошковая форма.
Приманка также может быть принесена насекомым обратно в колонию. Затем приманка может играть роль источника питания для других членов колонии, обеспечивая, таким образом, эффективную борьбу с большим количеством насекомых и, потенциально, всей колонией насекомых-вредителей. Это является преимуществом, связанным с применением двухцепочечной РНК по настоящему изобретению, поскольку замедленное действие RNAi-опосредованных эффектов на вредителей делает возможным перенос приманки обратно в колонию, таким образом доставляя максимальный эффект в смысле воздействия на насекомых.
Кроме того, композиции, которые контактируют с насекомыми, могут оставаться на кутикуле насекомого. При очистке, независимо от того, чистится ли отдельное насекомое самостоятельно, или насекомые чистят друг друга, композиции могут быть поглощены и, таким образом, могут опосредовать свои эффекты на насекомых. Для этого необходимо, чтобы композиция была достаточно стабильной с тем, чтобы интерферирующая РНК оставалась интактной и была способна опосредовать RNAi даже при воздействии внешних условий среды в течение длительного периода времени, который может представлять собой, например, период длительностью несколько дней.
Приманки могут быть представлены в подходящем ʺкорпусеʺ или ʺловушкеʺ. Такие корпуса и ловушки коммерчески доступны, а существующие ловушки могут быть адаптированы для включения композиций по настоящему изобретению. Любой корпус или ловушка, которые могут заманивать насекомого зайти, включены в объем настоящего изобретения. Корпус или ловушка могут иметь форму, например, коробки, и могут быть представлены в заранее сформированном состоянии или могут быть, например, в форме складываемого картона. Подходящие материалы для корпуса или ловушки включают пластмассу и картон, в частности, гофрированный картон. Подходящими размерами для такого корпуса или ловушки являются, например, ширина 7-15 см, длина 15-20 см и высота 1-5 см. Внутренние поверхности ловушек могут быть оклеены липким веществом с тем, чтобы ограничить движение насекомого после попадания в ловушку. Корпус или ловушка могут иметь внутри подходящее углубление, которое может удерживать на месте приманку. Ловушка отличается от корпуса, поскольку насекомое после входа не может легко покинуть ловушку, в то время как корпус играет роль ʺкормушкиʺ, которая обеспечивает насекомому предпочтительную среду, в которой они могут кормиться и чувствовать себя в безопасности от хищников.
Соответственно, в дополнительном аспекте настоящее изобретение предлагает корпус или ловушку для насекомых, которые содержат композицию по настоящему изобретению, которая может включать любой из признаков описываемой в данном документе композиции.
В дополнительном альтернативном варианте осуществления композиция может быть представлена в форме спрея. Таким образом, человек-пользователь может непосредственно опрыскивать композицией вредителя. Композиция затем усваивается насекомым, откуда она может опосредовать РНК-интерференцию, таким образом борясь с насекомым. Предпочтительно спрей представляет собой распыляемый под давлением спрей/спрей в виде аэрозоля или спрей для пульверизатора. Частицы могут иметь подходящий размер так, чтобы они прикреплялись к насекомому, например к экоскелету, и могли поглощаться оттуда. Размер частиц может быть измерен известными способами, такими как применение Mastersizer, который является коммерчески доступным устройством.
В еще одном дополнительном варианте осуществления носитель представляет собой электростатически заряженный порошок или частицу, которая прикрепляется к насекомому. Подходящие порошки и частицы, которые могут прикрепляться к насекомому и, таким образом, доставлять РНК-конструкции по настоящему изобретению, описаны подробно в WO 94/00980 и WO 97/33472, обе из которых включены в данный документ в качестве ссылки.
Альтернативно, носитель может содержать магнитные частицы, которые прикрепляются к кутикуле насекомого. Подходящие магнитные частицы, которые могут прикрепляться к насекомому и, таким образом, доставлять РНК-конструкции по настоящему изобретению, описаны подробно в WO 00/01236, ссылка на которую включена в данный документ.
В еще одном дополнительном варианте осуществления носитель композиции содержит металлические частицы, которые изначально не намагничены, но которые могут стать магнитно поляризованными под воздействием электрического поля, производимым организмом насекомого. Этот механизм действия подробно описан в WO 2004/049807 и включен в данный документ в качестве ссылки.
Предпочтительно композиция включает носитель, который увеличивает поглощение интерферирующей РНК насекомым-вредителем. Такой носитель может представлять собой липидный носитель, предпочтительно содержащий одно или несколько из следующего: эмульсии типа масла в воде, мицеллы, холестерин, липополиамины и липосомы. Другие средства, которые способствуют поглощению конструкций по настоящему изобретению, хорошо известны специалистам в данной области и включают поликатионы, декстраны и (трис)-катионные липиды, такие как CS096, CS102 и т.п. Коммерчески доступные липосомы включают LIPOFECTIN и CELLFECTIN и т.п. Ряд подходящих носителей перечислены под заголовком ʺУсиливающее трансфекцию средствоʺ в патентной заявке WO 03/004644, а каждый из приведенных примеров, таким образом, включен в качестве ссылки.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления носитель представляет собой конденсирующее нуклеиновую кислоту средство. Предпочтительно конденсирующее нуклеиновую кислоту средство включает спермидин или протамина сульфат или его производное.
Если композиция по настоящему изобретению предназначена для применения в предотвращении и/или борьбе с нападением насекомых на растение, то композиция может содержать подходящий с точки зрения сельского хозяйства носитель. Таким носителем может быть любой материал, который переносит подлежащее обработке растение, который не причиняет ненадлежащий вред для среды или других находящихся в ней организмов и который позволяет интерферирующей РНК оставаться эффективной по отношению к видам насекомых-вредителей. В частности, композиции по настоящему изобретению могут быть составлены для доставки растениям согласно установившимся сельскохозяйственным методикам, применяемым в биоинсектицидной промышленности. Композиция может содержать дополнительные компоненты, способные осуществлять другие функции, включая, но без ограничений, (i) усиление или повышение поглощения интерферирующей РНК клетками вредителя и (ii) стабилизацию активных компонентов композиции. Конкретными примерами таких дополнительных компонентов, содержащихся в композиции, включающей интерферирующую РНК, являются tRNA дрожжей или общая РНК дрожжей.
Композиции могут быть составлены для непосредственного применения или в виде концентрата основной композиции, который необходимо разбавить перед применением. Альтернативно, композиция может поставляться в виде набора, содержащего интерферирующую РНК или клетку-хозяина, ее содержащую или экспрессирующую, в одной емкости и подходящий разбавитель или носитель для РНК или клетки-хозяина в отдельной емкости. При конкретном применении настоящего изобретения композицию можно применять по отношению к растению или любой части растения на любом этапе развития растения. В одном варианте осуществления композицию применяют по отношению к надземным частям растения, например, при культивировании растительных культур в полевых условиях. В дополнительном варианте осуществления композицию применяют по отношению к семенам растения либо пока они находятся в хранилище, либо сразу после высадки в почву. Обычно важно хорошо осуществлять борьбу с вредителями на ранних стадиях роста растения, поскольку это время, когда растение может быть наиболее тяжело повреждено видами вредителей.
Композицию можно вносить в среду насекомых-вредителей при помощи различных методик, включая, но без ограничений, опрыскивание, распыление, опыление, рассеивание, полив, нанесение покрытия на семена, обработка семян, внесение в почву и введение в поливную воду. При обработке растений, чувствительных к нападению вредителей, композиция может быть доставлена на растение или часть растения до появления вредителя (с целью предотвращения) или после начала появления признаков нападения вредителя (с целью борьбы с вредителем).
В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения композиции по настоящему изобретению могут быть составлены так, чтобы они содержали по меньшей мере одно дополнительное активное средство. Таким образом, композиция может быть представлена в виде ʺнабора частейʺ, включающего композицию, содержащую интерферирующую РНК, в одной емкости и один или несколько подходящих активных ингредиентов, например химический или биологический пестицид, в отдельной емкости. Альтернативно, композиции могут быть представлены в виде смесей, которые стабильны и подлежат применению в сочетании друг с другом.
Подходящие активные ингредиенты, которые могут действовать дополняющим образом по отношению к интерферирующим молекулам РНК по настоящему изобретению, включают, но без ограничений, следующие: хлорпирофос, аллетрин, ресметрин, тетрабромэтил, диметол-циклопропанкарбоновая кислота (которую обычно включают в жидкие композиции); и гидраметилнон, авермектин, хлорпирофос, сульфурамид, гидропрен, фипронил (рецептор GABA), изопропилфенилметилкарбамат, индоксакарб (PARA), новифлумурон (ингибитор синтеза хитина), имипротрин (PARA), абамектин (глутамат-зависимый канал для ионов хлора), имидаклоприд (ацетилхолиновый рецептор) (которые включены в композиции приманок).
В предпочтительном варианте осуществления активный ингредиент известен как предпочтительный инсектицид в плане проблем, связанных со здравоохранением и окружающей средой, такой как, например, гидраметилнон и авермектин.
В следующем варианте осуществления настоящего изобретения композицию составляют так, чтобы она содержала по меньшей мере одно агрономическое средство, например, гербицид или дополнительный пестицид. Применяемое в данном документе выражение ʺвторой пестицидʺ или ʺдополнительный пестицидʺ относится к пестициду, отличному от первой или изначальной интерферирующей молекулы РНК композиции. Альтернативно, композиция по настоящему изобретению может быть доставлена в комбинации по меньшей мере с одним другим агрономическим средством, например, гербицидом или вторым пестицидом. В одном варианте осуществления композиция представлена в комбинации с гербицидом, выбранным из любого известного из уровня техники, например, глифосатом, имидазолиноном, сульфонилмочевиной и бромоксинилом. В следующем варианте осуществления композиция представлена в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным пестицидом. Дополнительный пестицид может быть выбран из любых известных из уровня техники пестицидов и/или может включать интерферирующую рибонуклеиновую кислоту, которая функционирует при поглощении вредителем с подавлением экспрессии гена-мишени указанного вида вредителя. В одном варианте осуществления целевым вредителем является вид насекомого-вредителя, а интерферирующая РНК выбрана из любой из описанных в данном документе интерферирующих РНК. В следующем варианте осуществления дополнительный пестицид включает интерферирующую РНК, которая функционирует с подавлением экспрессии известного гена у любого целевого вида вредителя, но не ограничиваясь вредителями-насекомыми. Изначальная интерферирующая молекула РНК композиции и второй или дополнительный пестицид(ы) могут целенаправленно воздействовать на один вид насекомого-вредителя или могут быть направлены на воздействие на различные виды насекомых-вредителей. Например, изначальная интерферирующая РНК и второй пестицид могут целенаправленно воздействовать на различные виды насекомых-вредителей или может целенаправленно воздействовать на различные семейства или классы организмов-вредителей, например, грибы, или нематоды, или насекомые. Специалисту в данной области будет понятно, как протестировать комбинации интерферирующих молекул РНК и других агрономических средств в отношении синергических эффектов. В предпочтительном варианте осуществления композиция содержит первую интерферирующую молекулу РНК, описанную в других разделах данного документа, и один или несколько дополнительных пестицидов, каждый из которых токсичен для одного и того же насекомого-вредителя, причем один или несколько дополнительных пестицидов выбраны из пататина, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous, инсектицидного белка Bacillus spaericus и лигнина, и при этом указанный инсектицидный белок Bacillus thuringiensis выбран из группы, состоящей из Cry1Ab, Cry1C, Cry2Aa, Cry3, TIC851, CryET70, Cry22, VIP, TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417, бинарного инсектицидного белка, выбранного из CryET33 и CryET34, CryET80 и CryET76, TIC100 и TIC101 и PS149B1, и инсектицидных химер любого из перечисленных инсектицидных белков.
Различные компоненты описанных в данном документе комбинаций можно вводить, например, организму-хозяину, чувствительному к нападению вредителя, в любом порядке. Компоненты на подлежащую обработке территорию или организм можно доставлять одновременно или последовательно.
Также в данном документе предусматривается способ предотвращения и/или борьбы с нападением вредителей, при котором вид насекомого-вредителя контактирует с эффективным количеством по меньшей мере одной интерферирующей РНК, при этом РНК функционирует при поглощении указанным вредителем с подавлением экспрессии жизненно важного гена-мишени вредителя. Жизненно важным геном-мишенью может являться любой ген вредителя, участвующий в регуляции жизненно важного биологического процесса, необходимого вредителю для инициирования или поддержания нападения, включая, но без ограничений, выживание, рост, развитие, размножение и патогенность. В частности, ген-мишень может являться любым из генов вредителя, как описано в данном документе в других местах.
В способах, описанных в данном документе, для подавления экспрессии гена-мишени у вида насекомого-вредителя, молекулы двухцепочечной РНК, содержащей по меньшей мере 21 пару оснований, одна цепь которой содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, комплементарной по меньшей мере 21 последовательному нуклеотиду из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, или 310-313, или комплементарной ей последовательности, можно применять для подавления экспрессии ортологического гена-мишени у жесткокрылых, полужесткокрылых, чешуекрылых или двукрылых насекомых, выбранных из группы, включающей, но без ограничений, Leptinotarsa spp. (например, L. decemlineata (колорадский жук), L. juncta (ложный картофельный жук) или L. texana (картофельный жук Leptinotarsa texana)); Nilaparvata spp. (например, N. lugens (коричневый дельфацид)); Lygus spp. (например, L. lineolaris (клоп-слепняк Lygus lineolaris) или L. hesperus (слепняк западный матовый)); Myzus spp. (например, M. persicae (тля персиковая зеленая)); Diabrotica spp. (например, D. virgifera virgifera (западный кукурузный жук), D. barberi (северный кукурузный жук), D. undecimpunctata howardi (южный кукурузный жук) или D. virgifera zeae (мексиканский кукурузный жук).
В способах, описанных в данном документе, для подавления экспрессии гена-мишени у вида насекомого-вредителя, молекулы двухцепочечной РНК, содержащей по меньшей мере 21 пару оснований, одна цепь которой содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, комплементарной по меньшей мере 21 последовательному нуклеотиду из любой из SEQ ID NO 1, 174, 404, 180, 188, 2, 175, 181, 189, 27-30, 282-285, 294-297, или 310-313, или комплементарной ей последовательности, можно применять для подавления экспрессии ортологического гена-мишени у жесткокрылых, полужесткокрылых, чешуекрылых или двукрылых насекомых, выбранных из группы, включающей, но без ограничений, Leptinotarsa spp. (например, L. decemlineata (колорадский жук), L. juncta (ложный картофельный жук) или L. texana (картофельный жук Leptinotarsa texana)); Nilaparvata spp. (например, N. lugens (коричневый дельфацид)); Lygus spp. (например, L. lineolaris (клоп-слепняк Lygus lineolaris) или L. hesperus (слепняк западный матовый)); Myzus spp. (например, M. persicae (тля персиковая зеленая)); Diabrotica spp. (например, D. virgifera virgifera (западный кукурузный жук), D. barberi (северный кукурузный жук), D. undecimpunctata howardi (южный кукурузный жук) или D. virgifera zeae (мексиканский кукурузный жук),
где ортологические гены кодируют белок, обладающий аминокислотной последовательностью, которая является по меньшей мере на 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% идентичной аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO 79, 349, 405, 352 или 356 (при оптимальном выравнивании указанных кодируемых белков).
В способах, описанных в данном документе, для подавления экспрессии гена-мишени у вида насекомого-вредителя, молекулы двухцепочечной РНК, содержащей по меньшей мере 21 пару оснований, одна цепь которой содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, комплементарной по меньшей мере 21 последовательному нуклеотиду из любой из SEQ ID NO 141, 11, 12, 47-50 или комплементарной ей последовательности, можно применять для подавления экспрессии ортологического гена-мишени у жесткокрылых, полужесткокрылых, чешуекрылых или двукрылых насекомых, выбранных из группы, включающей, но без ограничений, Leptinotarsa spp. (например, L. decemlineata (колорадский жук), L. juncta (ложный картофельный жук) или L. texana (картофельный жук Leptinotarsa texana)); Nilaparvata spp. (например, N. lugens (коричневый дельфацид)); Lygus spp. (например, L. lineolaris (клоп-слепняк Lygus lineolaris) или L. hesperus (слепняк западный матовый)); Myzus spp. (например, M. persicae (тля персиковая зеленая)); Diabrotica spp. (например, D. virgifera virgifera (западный кукурузный жук), D. barberi (северный кукурузный жук), D. undecimpunctata howardi (южный кукурузный жук) или D. virgifera zeae (мексиканский кукурузный жук).
В способах, описанных в данном документе, для подавления экспрессии гена-мишени у вида насекомого-вредителя, молекулы двухцепочечной РНК, содержащей по меньшей мере 21 пару оснований, одна цепь которой содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, комплементарной по меньшей мере 21 последовательному нуклеотиду из любой из SEQ ID NO 141, 11, 12, 47-50 или комплементарной ей последовательности, можно применять для подавления экспрессии ортологического гена-мишени у жесткокрылых, полужесткокрылых, чешуекрылых или двукрылых насекомых, выбранных из группы, включающей, но без ограничений, Leptinotarsa spp. (например, L. decemlineata (колорадский жук), L. juncta (ложный картофельный жук) или L. texana (картофельный жук Leptinotarsa texana)); Nilaparvata spp. (например, N. lugens (коричневый дельфацид)); Lygus spp. (например, L. lineolaris (клоп-слепняк Lygus lineolaris) или L. hesperus (слепняк западный матовый)); Myzus spp. (например, M. persicae (тля персиковая зеленая)); Diabrotica spp. (например, D. virgifera virgifera (западный кукурузный жук), D. barberi (северный кукурузный жук), D. undecimpunctata howardi (южный кукурузный жук) или D. virgifera zeae (мексиканский кукурузный жук), при этом ортологические гены кодируют белок, обладающий аминокислотной последовательностью, которая является по меньшей мере на 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% идентичной аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO 328 или 84 (при оптимальном выравнивании указанных кодируемых белков).
В способах, описанных в данном документе, для подавления экспрессии гена-мишени у вида насекомого-вредителя, молекулы двухцепочечной РНК, содержащей по меньшей мере 21 пару оснований, одна цепь которой содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, комплементарный по меньшей мере 21 последовательному нуклеотиду в любой из SEQ ID NO 17, 18, 59-62 или комплементарной ей последовательности, можно применять для подавления экспрессии ортологического гена-мишени у жесткокрылых, полужесткокрылых, чешуекрылых или двукрылых насекомых, выбранных из группы, включающей, но без ограничений, Leptinotarsa spp. (например, L. decemlineata (колорадский жук), L. juncta (ложный картофельный жук) или L. texana (картофельный жук Leptinotarsa texana)); Nilaparvata spp. (например, N. lugens (коричневый дельфацид)); Lygus spp. (например, L. lineolaris (клоп-слепняк Lygus lineolaris) или L. hesperus (слепняк западный матовый)); Myzus spp. (например, M. persicae (тля персиковая зеленая)); Diabrotica spp. (например, D. virgifera virgifera (западный кукурузный жук), D. barberi (северный кукурузный жук), D. undecimpunctata howardi (южный кукурузный жук) или D. virgifera zeae (мексиканский кукурузный жук).
В способах, описанных в данном документе, для подавления экспрессии гена-мишени у вида насекомого-вредителя, молекулы двухцепочечной РНК, содержащей по меньшей мере 21 пару оснований, одна цепь которой содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, комплементарной по меньшей мере 21 последовательному нуклеотиду из любой из SEQ ID NO 17, 18, 59-62 или комплементарной ей последовательности, можно применять для подавления экспрессии ортологического гена-мишени у жесткокрылых, полужесткокрылых, чешуекрылых или двукрылых насекомых, выбранных из группы, включающей, но без ограничений, Leptinotarsa spp. (например, L. decemlineata (колорадский жук), L. juncta (ложный картофельный жук) или L. texana (картофельный жук Leptinotarsa texana)); Nilaparvata spp. (например, N. lugens (коричневый дельфацид)); Lygus spp. (например, L. lineolaris (клоп-слепняк Lygus lineolaris) или L. hesperus (слепняк западный матовый)); Myzus spp. (например, M. persicae (тля персиковая зеленая)); Diabrotica spp. (например, D. virgifera virgifera (западный кукурузный жук), D. barberi (северный кукурузный жук), D. undecimpunctata howardi (южный кукурузный жук) или D. virgifera zeae (мексиканский кукурузный жук), при этом ортологические гены кодируют белок, обладающий аминокислотной последовательностью, которая является по меньшей мере на 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO 87 (при оптимальном выравнивании указанных кодируемых белков).
В способах, описанных в данном документе, для подавления экспрессии гена-мишени у вида насекомого-вредителя, молекулы двухцепочечной РНК, содержащей по меньшей мере 21 пару оснований, одна цепь которой содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, комплементарной по меньшей мере 21 последовательному нуклеотиду из любой из SEQ ID NO 19, 20, 63-66 или комплементарной ей последовательности, можно применять для подавления экспрессии ортологического гена-мишени у жесткокрылых, полужесткокрылых, чешуекрылых или двукрылых насекомых, выбранных из группы, включающей, но без ограничений, Leptinotarsa spp. (например, L. decemlineata (колорадский жук), L. juncta (ложный картофельный жук) или L. texana (картофельный жук Leptinotarsa texana)); Nilaparvata spp. (например, N. lugens (коричневый дельфацид)); Lygus spp. (например, L. lineolaris (клоп-слепняк Lygus lineolaris) или L. hesperus (слепняк западный матовый)); Myzus spp. (например, M. persicae (тля персиковая зеленая)); Diabrotica spp. (например, D. virgifera virgifera (западный кукурузный жук), D. barberi (северный кукурузный жук), D. undecimpunctata howardi (южный кукурузный жук) или D. virgifera zeae (мексиканский кукурузный жук).
В способах, описанных в данном документе, для подавления экспрессии гена-мишени у вида насекомого-вредителя, молекулы двухцепочечной РНК, содержащей по меньшей мере 21 пару оснований, одна цепь которой содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, комплементарный по меньшей мере 21 последовательному нуклеотиду в любой из SEQ ID NO 19, 20, 63-66 или комплементарной ей последовательности, можно применять для подавления экспрессии ортологического гена-мишени у жесткокрылых, полужесткокрылых, чешуекрылых или двукрылых насекомых, выбранных из группы, включающей, но без ограничений, Leptinotarsa spp. (например, L. decemlineata (колорадский жук), L. juncta (ложный картофельный жук) или L. texana (картофельный жук Leptinotarsa texana)); Nilaparvata spp. (например, N. lugens (коричневый дельфацид)); Lygus spp. (например, L. lineolaris (клоп-слепняк Lygus lineolaris) или L. hesperus (слепняк западный матовый)); Myzus spp. (например, M. persicae (тля персиковая зеленая)); Diabrotica spp. (например, D. virgifera virgifera (западный кукурузный жук), D. barberi (северный кукурузный жук), D. undecimpunctata howardi (южный кукурузный жук) или D. virgifera zeae (мексиканский кукурузный жук), при этом ортологические гены кодируют белок, обладающий аминокислотной последовательностью, которая является по меньшей мере на 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO 88 (при оптимальном выравнивании указанных кодируемых белков).
В способах, описанных в данном документе, для подавления экспрессии гена-мишени у вида насекомого-вредителя, молекулы двухцепочечной РНК, содержащей по меньшей мере 21 пару оснований, одна цепь которой содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, комплементарной по меньшей мере 21 последовательному нуклеотиду из любой из SEQ ID NO 165, 167, 166, 270-273 или комплементарной ей последовательности, можно применять для подавления экспрессии ортологического гена-мишени у жесткокрылых, полужесткокрылых, чешуекрылых или двукрылых насекомых, выбранных из группы, включающей, но без ограничений, Leptinotarsa spp. (например, L. decemlineata (колорадский жук), L. juncta (ложный картофельный жук) или L. texana (картофельный жук Leptinotarsa texana)); Nilaparvata spp. (например, N. lugens (коричневый дельфацид)); Lygus spp. (например, L. lineolaris (клоп-слепняк Lygus lineolaris) или L. hesperus (слепняк западный матовый)); Myzus spp. (например, M. persicae (тля персиковая зеленая)); Diabrotica spp. (например, D. virgifera virgifera (западный кукурузный жук), D. barberi (северный кукурузный жук), D. undecimpunctata howardi (южный кукурузный жук) или D. virgifera zeae (мексиканский кукурузный жук). В способах, описанных в данном документе, для подавления экспрессии гена-мишени у вида насекомого-вредителя, молекулы двухцепочечной РНК, содержащей по меньшей мере 21 пару оснований, одна цепь которой содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, комплементарной по меньшей мере 21 последовательному нуклеотиду из любой из SEQ ID NO 165, 167, 166, 270-273 или комплементарной ей последовательности, можно применять для подавления экспрессии ортологического гена-мишени у жесткокрылых, полужесткокрылых, чешуекрылых или двукрылых насекомых, выбранных из группы, включающей, но без ограничений, Leptinotarsa spp. (например, L. decemlineata (колорадский жук), L. juncta (ложный картофельный жук) или L. texana (картофельный жук Leptinotarsa texana)); Nilaparvata spp. (например, N. lugens (коричневый дельфацид)); Lygus spp. (например, L. lineolaris (клоп-слепняк Lygus lineolaris) или L. hesperus (слепняк западный матовый)); Myzus spp. (например, M. persicae (тля персиковая зеленая)); Diabrotica spp. (например, D. virgifera virgifera (западный кукурузный жук), D. barberi (северный кукурузный жук), D. undecimpunctata howardi (южный кукурузный жук) или D. virgifera zeae (мексиканский кукурузный жук), при этом ортологические гены кодируют белок, обладающий аминокислотной последовательностью, которая является по меньшей мере на 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% идентичной аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO 347 или 348 (при оптимальном выравнивании указанных кодируемых белков).
В способах, описанных в данном документе, для подавления экспрессии гена-мишени у вида насекомого-вредителя, молекулы двухцепочечной РНК, содержащей по меньшей мере 21 пару оснований, одна цепь которой содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, комплементарный по меньшей мере 21 последовательному нуклеотиду в любой из SEQ ID NO 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301 или комплементарной ей последовательности, можно применять для подавления экспрессии ортологического гена-мишени у жесткокрылых, полужесткокрылых, чешуекрылых или двукрылых насекомых, выбранных из группы, включающей, но без ограничений, Leptinotarsa spp. (например, L. decemlineata (колорадский жук), L. juncta (ложный картофельный жук) или L. texana (картофельный жук Leptinotarsa texana)); Nilaparvata spp. (например, N. lugens (коричневый дельфацид)); Lygus spp. (например, L. lineolaris (клоп-слепняк Lygus lineolaris) или L. hesperus (слепняк западный матовый)); Myzus spp. (например, M. persicae (тля персиковая зеленая)); Diabrotica spp. (например, D. virgifera virgifera (западный кукурузный жук), D. barberi (северный кукурузный жук), D. undecimpunctata howardi (южный кукурузный жук) или D. virgifera zeae (мексиканский кукурузный жук).
В способах, описанных в данном документе, для подавления экспрессии гена-мишени у вида насекомого-вредителя, молекулы двухцепочечной РНК, содержащей по меньшей мере 21 пару оснований, одна цепь которой содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, комплементарной по меньшей мере 21 последовательному нуклеотиду из любой из SEQ ID NO 143, 121, 142, 176, 182, 130, 177, 183, 206-209, 286-289, 298-301 или комплементарной ей последовательности, можно применять для подавления экспрессии ортологического гена-мишени у жесткокрылых, полужесткокрылых, чешуекрылых или двукрылых насекомых, выбранных из группы, включающей, но без ограничений, Leptinotarsa spp. (например, L. decemlineata (колорадский жук), L. juncta (ложный картофельный жук) или L. texana (картофельный жук Leptinotarsa texana)); Nilaparvata spp. (например, N. lugens (коричневый дельфацид)); Lygus spp. (например, L. lineolaris (клоп-слепняк Lygus lineolaris) или L. hesperus (слепняк западный матовый)); Myzus spp. (например, M. persicae (тля персиковая зеленая)); Diabrotica spp. (например, D. virgifera virgifera (западный кукурузный жук), D. barberi (северный кукурузный жук), D. undecimpunctata howardi (южный кукурузный жук) или D. virgifera zeae (мексиканский кукурузный жук),
при этом ортологические гены кодируют белок, обладающий аминокислотной последовательностью, которая является по меньшей мере на 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% идентичной аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO 330, 350 или 353 (при оптимальном выравнивании указанных кодируемых белков).
В способах, описанных в данном документе, для подавления экспрессии гена-мишени у вида насекомого-вредителя, молекулы двухцепочечной РНК, содержащей по меньшей мере 21 пару оснований, одна цепь которой содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, комплементарной по меньшей мере 21 последовательному нуклеотиду из любой из SEQ ID NO 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293 или комплементарной ей последовательности, можно применять для подавления экспрессии ортологического гена-мишени у жесткокрылых, полужесткокрылых, чешуекрылых или двукрылых насекомых, выбранных из группы включающей, но без ограничений, Leptinotarsa spp. (например, L. decemlineata (колорадский жук), L. juncta (ложный картофельный жук) или L. texana (картофельный жук Leptinotarsa texana)); Nilaparvata spp. (например, N. lugens (коричневый дельфацид)); Lygus spp. (например, L. lineolaris (клоп-слепняк Lygus lineolaris) или L. hesperus (слепняк западный матовый)); Myzus spp. (например, M. persicae (тля персиковая зеленая)); Diabrotica spp. (например, D. virgifera virgifera (западный кукурузный жук), D. barberi (северный кукурузный жук), D. undecimpunctata howardi (южный кукурузный жук) или D. virgifera zeae (мексиканский кукурузный жук).
В способах, описанных в данном документе, для подавления экспрессии гена-мишени у вида насекомого-вредителя, молекулы двухцепочечной РНК, содержащей по меньшей мере 21 пару оснований, одна цепь которой содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, комплементарной по меньшей мере 21 последовательному нуклеотиду в любой из SEQ ID NO 145, 122, 144, 178, 131, 179, 210-213, 290-293 или комплементарной ей последовательности, можно применять для подавления экспрессии ортологического гена-мишени у жесткокрылых, полужесткокрылых, чешуекрылых или двукрылых насекомых, выбранных из группы, включающей, но без ограничений, Leptinotarsa spp. (например, L. decemlineata (колорадский жук), L. juncta (ложный картофельный жук) или L. texana (картофельный жук Leptinotarsa texana)); Nilaparvata spp. (например, N. lugens (коричневый дельфацид)); Lygus spp. (например, L. lineolaris (клоп-слепняк Lygus lineolaris) или L. hesperus (слепняк западный матовый)); Myzus spp. (например, M. persicae (тля персиковая зеленая)); Diabrotica spp. (например, D. virgifera virgifera (западный кукурузный жук), D. barberi (северный кукурузный жук), D. undecimpunctata howardi (южный кукурузный жук) или D. virgifera zeae (мексиканский кукурузный жук), при этом ортологические гены кодируют белок, обладающий аминокислотной последовательностью, которая является по меньшей мере на 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO 331 или 351(при оптимальном выравнивании указанных кодируемых белков).
В способах, описанных в данном документе, для подавления экспрессии гена-мишени у вида насекомого-вредителя, молекулы двухцепочечной РНК, содержащей по меньшей мере 21 пару оснований, одна цепь которой содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, комплементарной по меньшей мере 21 последовательному нуклеотиду из любой из SEQ ID NO 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305 или комплементарной ей последовательности, можно применять для подавления экспрессии ортологического гена-мишени у жесткокрылых, полужесткокрылых, чешуекрылых или двукрылых насекомых, выбранных из группы, включающей, но без ограничений, Leptinotarsa spp. (например, L. decemlineata (колорадский жук), L. juncta (ложный картофельный жук) или L. texana (картофельный жук Leptinotarsa texana)); Nilaparvata spp. (например, N. lugens (коричневый дельфацид)); Lygus spp. (например, L. lineolaris (клоп-слепняк Lygus lineolaris) или L. hesperus (слепняк западный матовый)); Myzus spp. (например, M. persicae (тля персиковая зеленая)); Diabrotica spp. (например, D. virgifera virgifera (западный кукурузный жук), D. barberi (северный кукурузный жук), D. undecimpunctata howardi (южный кукурузный жук) или D. virgifera zeae (мексиканский кукурузный жук).
В способах, описанных в данном документе, для подавления экспрессии гена-мишени у вида насекомого-вредителя, молекулы двухцепочечной РНК, содержащей по меньшей мере 21 пару оснований, одна цепь которой содержит или состоит из последовательности нуклеотидов, комплементарной по меньшей мере 21 последовательному нуклеотиду из любой из SEQ ID NO 128, 149, 184, 137, 185, 234-237, 302-305 или комплементарной ей последовательности, можно применять для подавления экспрессии ортологического гена-мишени у жесткокрылых, полужесткокрылых, чешуекрылых или двукрылых насекомых, выбранных из группы, включающей, но без ограничений, Leptinotarsa spp. (например, L. decemlineata (колорадский жук), L. juncta (ложный картофельный жук) или L. texana (картофельный жук Leptinotarsa texana)); Nilaparvata spp. (например, N. lugens (коричневый дельфацид)); Lygus spp. (например, L. lineolaris (клоп-слепняк Lygus lineolaris) или L. hesperus (слепняк западный матовый)); Myzus spp. (например, M. persicae (тля персиковая зеленая)); Diabrotica spp. (например, D. virgifera virgifera (западный кукурузный жук), D. barberi (северный кукурузный жук), D. undecimpunctata howardi (южный кукурузный жук) или D. virgifera zeae (мексиканский кукурузный жук), при этом ортологические гены кодируют белок, обладающий аминокислотной последовательностью, которая является по меньшей мере на 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% идентичной аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO 337 или 354 (при оптимальном выравнивании указанных кодируемых белков).
Кроме того, в данном документе предусматривается способ предотвращения и/или борьбы с нападением вредителей в поле культурных растений, при этом указанный способ включает экспрессию в указанных растениях эффективного количества интерферирующей РНК, описываемой в данном документе.
В способе, предназначенном для борьбы с нападением вредителя, фраза ʺэффективное количествоʺ распространяется на количество или концентрацию интерферирующей РНК, необходимые для получения фенотипического эффекта у вредителя таким образом, чтобы уменьшались количества организмов-вредителей, поражающих организм-хозяин, и/или уменьшалось количество повреждений, вызванных вредителем. В одном варианте осуществления фенотипическим эффектом является гибель вредителя, и интерферирующая РНК используется для достижения по меньшей мере 20%, 30%, 40%, предпочтительно по меньшей мере 50%, 60%, 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80% или 90% смертности вредителей по сравнению с контрольными насекомыми-вредителями. В дополнительном варианте осуществления фенотипические эффекты включают, но без ограничений, остановку роста вредителя, прекращение питания и уменьшение яйцекладки. Общее количество организмов-вредителей, поражающих организм-хозяин, можно таким образом уменьшить по меньшей мере на 20%, 30%, 40%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 80% или 90% по сравнению с контрольными вредителями. Альтернативно, ущерб, наносимый насекомыми-вредителями, можно уменьшить по меньшей мере на 20%, 30%, 40%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 80% или 90% по сравнению с контрольными насекомыми-вредителями. Таким образом, способ по настоящему изобретению можно применять для достижения по меньшей мере 20%, 30%, 40%, предпочтительно по меньшей мере 50%, 60%, 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80% или 90% эффективности при борьбе с вредителями.
Применяемый в данном документе термин ʺрастениеʺ может содержать любой репродуктивный материал или материал для размножения растения. Ссылка на растение также может включать клетки растений, протопласты растений, культуры тканей растений, растительные каллусы, маточные корневища растений и растительные клетки, которые являются интактными в растениях или частях растений, такие как зародыши, пыльца, семяпочки, семена, листья, цветы, ветки, фрукты, ядра, колосья, початки, шелуха, стебли, корни, кончики корней и тому подобное.
Также в данном документе предусматривается применение интерферирующей рибонуклеиновой кислоты (РНК), описываемой в данном документе, или ДНК-конструкции, описываемой в данном документе, для предотвращения и/или борьбы с нападением насекомых-вредителей, предпочтительно нападением насекомых-вредителей на растения.
Настоящее изобретение будет дополнительно понятно со ссылкой на следующие неограничивающие примеры.
Примеры
Пример 1 Идентификация генов-мишеней у видов насекомых вредителей
1.1. Нормализованная cDNA-библиотека Lygus hesperus и получение dsRNA в многолуночных планшетах для скрининговых исследований
Нуклеиновые кислоты выделили из нимф Lygus hesperus различных стадий жизни, включая только что вылупившихся нимф 2, 4, 6 и 9 дневных нимф и взрослых. Библиотеку cDNA получали с использованием ПЦР-набора для синтеза cDNA SMARTer™, следуя инструкциям производителя (Clontech кат. № 634925). Библиотеку cDNA нормализовали с использованием Trimmer kit (Evrogen кат. № NK001) и клонировали в векторе PCR4-TOPO (Invitrogen). Нормализация введенных в клоны адаптеров M2 (Trimmer Kit, Evrogen, SEQ ID NO 92: AAGCAGTGGTATCAACGCAG), противоположно ориентированных на каждом конце клонов. Рекомбинантные конструкции векторов трансформировали в клетки Escherichia coli, штамм TOP10 (Invitrogen). Трансформированные клетки затем разбавляли и высевали с целью получения отдельных колоний или клонов. Клоны проверяли для подтверждения того, что избыточность клонов для библиотеки не превышает 5%. Отдельные клоны отбирали в жидкую LB (бульон Лурия) среду, в 96-луночные планшеты с глубокими лунками, и выращивали в течение ночи при 37°C. Планшеты также включали положительные (Lh423) и отрицательные (FP) контрольные клоны.
Для создания dsRNA с помощью ПЦР создали смысловой и антисмысловой фрагменты ДНК, содержащие последовательность промотора T7. Вкратце, помещали по 1 мкл бактериальной суспензии на клон в многолуночные ПЦР-планшеты, содержащие REDTaq (Sigma кат. № D4309) и праймеры oGCC2738 (SEQ ID NO 93: AAGCAGTGGTATCAACGCAG) и oGCC2739 (SEQ ID NO 94: GCGTAATACGACTCACTATAGGAAGCAGTGGTATCAACGCAG) на основе M2 и T7-M2 последовательностей, соответственно. За ПЦР-реакцией следовала in vitro транскрипция, где добавляли 6 мкл продукта ПЦР на клон к 9 мкл RiboMAX™ Large Scale RNA Production System-T7 (Promega кат. № P1300) и инкубировали в течение ночи при 37°C. Конечный раствор dsRNA разбавляли в 2 раза в L. hesperus сахарозной пище, содержащей 15% сахарозы и 5 мкг/мкл дрожжевой tRNA (Invitrogen кат. № 15401-029) и использовали для скрининга. dsRNA, соответствующей положительному контрольному клону Lh423, является SEQ ID NO 101, и отрицательному FP контрольному клону является SEQ ID NO 104 (см. таблицу 4).
1.2. Скрининг на новые и эффективные гены-мишени Lygus hesperus с использованием cDNA-библиотеки экспрессируемых dsRNA
Разработали новое скрининговое исследование на эффективные мишени Lygus hesperus. Постановка анализа являлась следующей: каждая лунка 96-луночного планшета содержит однодневную L. hesperus нимфу под действием саше из парафильма, содержащего сахарозную пищу, которая включает либо тестируемую dsRNA, либо контрольную dsRNA в присутствии tRNA. Каждый планшет содержал dsRNA из 90 различных клонов, 3×Lh423 (положительный контроль) и 3×FP (флуоресцентный белок; отрицательный контроль). Каждый клон (тестируемая dsRNA) реплицировали на трех планшетах. После трех дней воздействия зарегистрировали число выживших нимф и заменили пищу на свежую пищу (комплексной) для выращивания, не содержащую dsRNA. Смертность оценивали в дни 4, 6 и 8. Идентичную постановку использовали для подтверждающих анализов первого и второго цикла, соответственно с 8 и 20 насекомыми, с одной нимфой на лунку.
Систему анализа проверяли с использованием dsRNA, соответствующей мишени Lh423, в качестве положительного контроля и dsRNA флуоресцентного белка в качестве отрицательного контроля: более 90% являлись истинно положительными и менее 5% являлись ложноположительными, соответственно.
Протестировали двадцать 96-луночных планшетов, поименованных Lh001-Lh020 (см. нижнюю линию на фигурах 1 и 2), содержащих 1800 отдельных клонов. 205 кандидатов идентифицировали и протестировали в первом подтверждающем анализе. Устанавливая пороговую величину на показателе ≥50% смертности, 41 отдельный клон идентифицировали и продвинули во второй цикл подтверждения. В анализе клоны сравнивали с положительными контролями Lh423 (RpL19) и Lh105.2 (Sec23) и отрицательным контролем Pt (кодирующим флуоресцентный белок коралла). dsRNA, соответствующей положительному контрольному клону(Lh423), является SEQ ID NO 101, соответствующей положительному контрольному клону Lh105.2 является SEQ ID NO 102 и отрицательному контрольному клону (Pt), является SEQ ID NO 104 (см. таблицу 4).
Подтверждающие анализы второго цикла, тестирующие 20 насекомых/тестируемых dsRNA, начали для всех тестируемых dsRNA, показывающих ≥50% смертности в первом подтверждении (фигуры 1 и 2). Подходящие мишени, соответствующие подтвержденным тестируемым dsRNA, обозначили с помощью ʺLhxxx числоʺ (см. таблицу 1). Применяя то же пороговое значение при ≥50% смертности, в первом скрининге подтвердили 15 мишеней.
Выполнили второй скрининг для идентификации новых мишеней Lygus hesperus. Результаты подтверждающих анализов второго цикла представлены на фигуре 12. Применяя то же пороговое значение при ≥50% смертности, несколько мишеней подтвердили во втором скрининге (см. таблицу 1 С).
1.3. Идентификация мишеней Lygus
Одновременно с подтверждающими анализами на насекомых, вставки, соответствующие положительным клонам, секвенировали и для подтверждения идентичности мишеней использовали BlastX поиски по сравнению с базами данных белков Drosophila и Triboliu. В таблице 1 приводится краткое изложение биоинформационного анализа и текущая аннотация новых идентифицированных целевых последовательностей L. hesperus.
Пятнадцать новых мишеней L. hesperus идентифицировали в первом скрининге и 11 новых мишеней L. Hesperus идентифицировали во втором скрининге. Все мишени проявляют высокую эффективность против нимф L. hesperus, указывая на то, что cDNA, кодирующие двухцепочечные РНК, содержащиеся в них, являются существенно важными для выживания вредителя и, таким образом, представляют гены-мишени, представляющие интерес в целях борьбы с вредителями. Последовательности ДНК и предсказанные аминокислотные последовательности данных генов-мишеней, следовательно, определили и представили в таблицах 2 и 3, соответственно.
Lh594, ортолог Lygus hesperus к тропонину I Drosophila, участвующему в сокращении мышц и, следовательно, отсутствующему у растений, представляет новый класс мишеней, относящихся к специфическому для животных физиологическому пути, еще не изученному на GM-RNAi. У плодовой мушки тропонин I описан как гаплонедостаточный ген, проявляющий мутантный фенотип в гетерозиготном состоянии. Такие гены могут являться особенно восприимчивыми к снижению уровней экспрессии mRNA и, таким образом, могут рассматриваться как идеальные мишени для RNAi.
В данном пути Lh594 отобрали восемь мишеней (см. таблицу 1B). Для каждой мишени до 4 пар вырожденных праймеров ПЦР сконструировали на основе выравнивания последовательностей различных насекомых, включая пчелу, Tribolium и тлю. Данные праймеры применяют для амплификации фрагментов из мишеней Lygus hesperus. Последовательности ДНК и предсказанные аминокислотные последовательности данных генов-мишеней определили и представили в таблицах 2 и 3, соответственно.
Таблица 1Новые мишени Lygus hesperus, ранжированные по % смертности в соответствии с результатами второго подтверждающего анализа (первый скрининг)
ID мишени
позиция во 2-м подтвер-ждении
Лучшие попадания Drosophila
НАЗВАНИЕ
ОБОЗНАЧЕНИЕ
Lh594
1
CG7178
wings up A (тропонин I)
wupA
Lh618
2
CG2168
рибосомный белок S3A
RpS3A
Lh609
3
CG4087
рибосомный белок LP1
RpLP1
Lh595
4
-
не обнаружено попаданий для Drosophila, специфическая мишень/последовательность Lygus
Lh611
5
CG6779
рибосомный белок S3
RpS3
Lh560
6
CG10423
рибосомный белок S27
RpS27
Lh596
7
-
не обнаружено попаданий для Drosophila, специфическая мишень/последовательность Lygus
RpL34b
Lh615
8
CG11522
рибосомный белок L6
RpL6
Lh617
9
CG7283
рибосомный белок L10Ab
RpL10Ab
Lh612
10
CG13389
рибосомный белок S13
RpS13
Lh246
11
CG3195
рибосомный белок L12
RpL12
Lh429
12
CG8900
рибосомный белок S18
RpS18
Lh610
13
CG5502
рибосомный белок L4
RpL4
Lh597
14
не обнаружено попаданий
Lh598
15
CG34069
субъединица II митохондриальной цитохром с-оксидазы
mt:CoII
Lh614
-
CG7610
γ-цепь ATP синтазы
ATPsyn-γ
Таблица 1BНовые мишени Lygus hesperus в пути Lh594
ID мишени
Лучшее попадание (попадания)
НАЗВАНИЕ
ОБОЗНАЧЕНИЕ
Lh619
CG7107
тропонин T (upheld)
up
Lh620
CG17927
тяжелая цепь миозина
Mhc
Lh621
CG4843
Тропомиозин2 (Tm2)
Tm2
Lh622
CG3201
цитоплазматическая легкая цепь миозина
Mlc-c
Lh623
CG3595
spaghetti squash
sqh
Lh624
CG15792
zipper
zip
Lh625
*CG2981,CG7930,CG9073,CG6514,CG12408
тропонин C
Lh626
*CG9073,CG7930,CG2981,CG12408,CG6514
тропонин C
* неясно: несколько попаданий в семействе ранжированы в соответствии с собственным значением
Таблица 1CНовые мишени Lygus hesperus, ранжированные по % смертности в соответствии с результатами второго подтверждающего анализа (второй скрининг)
ID мишени
Позицияво 2-м подтверждении
Лучшие попадания Drosophila
НАЗВАНИЕ
ОБОЗНАЧЕНИЕ
Lh631
1
CG6846
Рибосомный белок L26
RpL26
Lh634.2
2
CG12775
Рибосомный белок L21
RpL21
Lh634.1
3
CG12775
Рибосомный белок L21
RpL21
Lh630
4
CG11271
Рибосомный белок S12
RpS12
Lh632
5
CG2998
Рибосомный белок S28b
RpS28b
Lh618.2
6
CG2168
Рибосомный белок S3A
RpS3A
Lh629
7
CG4651
Рибосомный белок L13
RpL13
Lh633.2
8
CG17521
Рибосомный белок L10
RpL10
Lh628
9
CG17489
Рибосомный белок L5
RpL5
Lh633
10
CG17521
Рибосомный белок L10
RpL10
Lh627
11
CG2033
Рибосомный белок S15Aa
RpS15A
1.4. Клонирование полноразмерной cDNA с помощью RACE (быстрая амплификация концов cDNA)
Для клонирования полноразмерной cDNA, начиная от известного клона внутреннего фрагмента из самых эффективных мишеней, использовали набор 5'/3' RACE (Roche, кат. № 1734792; на основе Sambrook, J. & Russell, D.M). Следовали стандартному протоколу, описанному в руководстве по эксплуатации. Вкратце, для 5' RACE сконструировали антисмысловой праймер, специфический для целевой последовательности, на известной последовательности и применяли для синтеза первой цепи cDNA, применяя РНК Lygus в качестве матрицы. К первой цепи cDNA добавили хвост и использовали в качестве якоря для синтеза второй цепи и амплификации неизвестной концевой части транскрипта. Для 3' RACE применяли якорный олиго-dT праймер для синтеза первой цепи cDNA. Для 5' и 3' RACE во второй реакции ПЦР применяли вложенные праймеры, специфические для целевой последовательности. Фрагменты ПЦР анализировали на агарозном геле, очищали, клонировали и секвенировали для подтверждения.
Последовательности полноразмерной cDNA, соответствующие мишеням, собрали в VectorNTi, полностью интегрированном пакете программного обеспечения для анализа последовательности, с целью анализа последовательности ДНК (Invitrogen).
Пример 2. In vitro получение двухцепочечных РНК для сайленсинга генов
2.2. Получение dsRNA, соответствующих частичным последовательностям генов-мишеней Lygus hesperus
Двухцепочечную РНК синтезировали в миллиграммовых количествах. Сначала две отдельные матрицы 5' T7 РНК-полимеразного промотора (смысловая матрица и антисмысловая матрица) создали с помощью ПЦР. ПЦР разрабатывали и проводили таким образом, чтобы получить смысловой и антисмысловой матричные полинуклеотиды, каждый из которых обладает T7 промотором в различной ориентации по отношению к целевой последовательности, подлежащей транскрибированию.
Для каждого из генов-мишеней создали смысловую матрицу, применяя мишень-специфический T7 прямой праймер и мишень-специфический обратный праймер. Антисмысловые матрицы создали, применяя мишень-специфический прямой праймер и мишень-специфический T7 обратный праймер. Последовательности соответствующих праймеров для амплификации смысловой и антисмысловой матриц посредством ПЦР для каждого из генов-мишеней приведены в таблице 4. ПЦР-продукты анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле и очистили. Полученные смысловую и антисмысловую T7 матрицы смешали и транскрибировали путем добавления T7 РНК-полимеразы. Одноцепочечным РНК, полученным путем транскрипции с матриц, предоставили возможность соединиться, обработали с помощью ДНКазы и РНКазы и очистили осаждением. Смысловая цепь образующейся в результате dsRNA, полученная от каждого из генов-мишеней, приведена в таблице 4.
2.2. Испытания анализа выживаемости для новых мишеней Lygus hesperus
Для создания возможности ранжирования в соответствии с эффективностью, in vitro dsRNA, соответствующие новым мишеням, синтезировали и применили к L. hesperus в 10-дневных биопробах анализа выживаемости. Вкратце, однодневных нимф L. hesperus поместили в 96-луночные планшеты с сахарозными пленками, содержащими 0,5 мкг/мкл dsRNA-мишени, с добавлением 5 мкг/мкл дрожжевой tRNA. Планшеты инкубировали в течение 3 дней в стандартных условиях выращивания Lygus. В дни 3, 6 и 8 пищевые пленки обновляли пленками, содержащими только пищу Lygus. Lh423 (RpL19) использовали в качестве положительного контроля, а GFP dsRNA и сахарозную пищу использовали в качестве отрицательного контроля.
Результаты анализа выживаемости подтвердили данные первого и второго подтверждающих анализов. Lh594 установили в качестве высокоэффективной мишени с активностью и скоростью поражения, более сильной, чем сильный контроль Lh423.
До сих пор скрининг Lygus на новые мишени идентифицировал новые мишени с активностями более высокими или находящимися в диапазоне положительного контроля Lh423, которые включают Lh429, Lh594, Lh609, Lh610, Lh611, Lh617 и Lh618. Смертность, вызванная данными мишенями, показана на фигурах 3 и 4.
Для обеспечения более точного ранжирования мишеней в соответствии с их активностью выполнили анализы концентрации в зависимости от дозы. Новые мишени тестировали в in vitro анализах при концентрации в диапазоне от 0,4 до 0,025 мкг/мкл. Согласно условию, 24-дневных нимф тестировали в постановке с 96-луночным планшетом, в сахарозной пище с добавлением dsRNA и носителя tRNA. Результаты представлены в виде % выживаемости в течение 10-дневного эксперимента (фигуры 5-9) и суммированы в таблице 5.
На основе анализа кривой концентрации мишени ранжировали путем сравнения с исходными контролями Lh423 и Lh105 (таблица 5).
Таблица 5Ранжирование новых мишеней Lygus в соответствии с DRC и по сравнению с исходными мишенями Lh423 и Lh105
IDмишени
Эффективность, выраженная в мкг/мкл dsRNA, необходимая для достижения 90% уничтожения в день 7
Lh594
0,025 (в день 6)
Lh618
0,05-0,1
Lh612
0,05
Lh615
0,05
Lh423
0,1
Lh595
0,1
Lh560
0,1
Lh610
0,1
Lh617
0,1
Lh105
0,2
Lh614
0,2 (в день 6)
Lh611
0,2
Lh596
0,3
Lh609
Не определено
Lh429
Не определено
Эффективность Lh594 подтвердили дополнительно. Эффект данной мишени отчетливо наблюдается по меньшей мере за один день до эффекта других мишеней и исходного положительного контроля Lh105 и Lh423. Так как Lh594 являлась высокоэффективной, в стандартном DRC эксперименте с концентрацией в диапазоне от 0,4 до 0,025 мкг/мкл dsRNA LD50 не достигли (фигура 6), следовательно, Lh594 эксперимент повторили, включая более низкие концентрации в диапазоне от 0,05 до 0,001 мкг/мкл dsRNA (фигура 10). В заключение, активность Lh594 наблюдали при такой низкой концентрации, как 0,0025 мкг/мкл, и получили примерно 90% уничтожение (что соответствует примерно 10% выживаемости) в день 6 при 0,025 мкг dsRNA.
Для дополнительного изучения эффективности Lh594 и роли носителя tRNA в ответе на RNAi у Lygus hesperus дополнительные in vitro анализы питания подготовили в отсутствие носителя tRNA. Lh594, Lh423 (исходный контроль) и GFP (отрицательный контроль) dsRNA получили in vitro, применяя стандартный способ. dsRNA очистили и тестировали при 5 мкг/мкл в отсутствие tRNA (фигура 11 A).
В отсутствие tRNA, мишени Lh594 и Lh423 индуцировали высокую летальность у нимф Lygus. Результаты данного эксперимента были воспроизведены позднее. dsRNA-мишень обладала способностью индуцировать эффекты RNAi-путем-кормления у нимф Lygus в отсутствие tRNA.
Для исследования активности dsRNA при более низких концентрациях в отсутствие носителя tRNA, поставили дополнительные эксперименты, применяя уменьшение количеств dsRNA (фигура 11 B).
Аналогичный подход применялся для мишеней Lygus, которые идентифицировали во втором скрининге. Для обеспечения ранжирования мишеней в соответствии с их активностью выполнили анализы концентрации в зависимости от дозы. Новые мишени тестировали в in vitro анализах при концентрациях в диапазоне от 0,5 до 0,05 мкг/мкл. Согласно условию, 24-дневных нимф тестировали в постановке с 96-луночным планшетом, в сахарозной пище с добавлением dsRNA и носителя tRNA. Результаты представлены в виде % выживаемости в течение 9-дневного эксперимента (фигуры 15 A-D). Lh594 и Lh423 включили в анализ в качестве эталонных мишеней. Результаты суммированы в таблице 6. На основе анализа кривой концентрации мишени ранжировали путем сравнения с исходным контролем Lh423.
Таблица 6Новые мишени Lygus из второго скрининга, ранжирование в соответствии с DRC и по сравнению с исходными мишенями Lh423 и Lh594
ID мишени
Эффективность, выраженная в мкг/мкл dsRNA, необходимой для достижения 90% уничтожения в день 7
Lh594
0,025 (в день 6)
Lh634
0,1
Lh423
0,1
Lh631
0,4
Lh633
0,4
Lh627
0,5
Lh628
0,5
Lh630
0,5
Lh632
0,5
Lh629
Не определено
Пример 3. Скрининг пути тропонина
Для создания возможности тестирования мишеней пути тропонина, in vitro полученные dsRNA, соответствующие Lh619, Lh620, Lh621, Lh622, Lh622, Lh623, Lh624, Lh625 и Lh626, синтезировали и применили к L. hesperus в 10-дневных биопробах анализа выживаемости. Вкратце, однодневных нимф L. hesperus поместили в 96-луночные планшеты с сахарозными пленками, содержащими 0,5 мкг/мкл dsRNA-мишени, с добавлением 5 мкг/мкл дрожжевой tRNA. Планшеты инкубировали в течение 3 дней в стандартных условиях выращивания Lygus. В дни 3, 6 и 8 пищевые пленки обновляли пленками, содержащими только пищу Lygus. Lh594 (тропонин I) использовали в качестве положительного контроля и GFP dsRNA и сахарозную пищу использовали в качестве отрицательных контролей (фигура 13). Четыре мишени затем включили в анализы кривой дозовой зависимости в in vitro анализе, с концентрациями в диапазоне от 0,4 до 0,025 мкг/мкл. Согласно условию, 24-дневных нимф тестировали в постановке с 96-луночным планшетом, в сахарозной пище с добавлением dsRNA и носителя tRNA. Результаты представлены в виде % выживаемости в течение 10-дневного эксперимента (фигуры 14 A-B).
Пример 4. Идентификация генов-мишеней у Leptinotarsa decemlineata
4.1. Нормализованная cDNA-библиотека Leptinotarsa decemlineata и получение dsRNA в многолуночных планшетах для скрининговых исследований
Нуклеиновые кислоты выделили из личинок Leptinotarsa decemlineata различных стадий. Библиотеку cDNA получали с использованием ПЦР-набора для синтеза cDNA SMARTer™, следуя инструкциям производителя (Clontech кат. № 634925). Библиотеку cDNA нормализовали, применяя набор Trimmer kit (Evrogen кат. № NK001), и клонировали в PCR-BLUNTII-TOPO вектор (Invitrogen). При нормализации клонов вводили M2 адаптеры (Trimmer Kit, Evrogen, SEQ ID NO 92: AAGCAGTGGTATCAACGCAG), противоположно ориентированных на каждом конце клонов. Рекомбинантные конструкции векторов трансформировали в клетки Escherichia coli, штамм TOP10 (Invitrogen). Трансформированные клетки затем разбавляли и высевали с целью получения отдельных колоний или клонов. Клоны проверяли для подтверждения того, что избыточность клонов для библиотеки не превышает 5%. Отдельные клоны инокулировали в жидкую LB (бульон Лурия) среду, в 96-луночные планшеты, и выращивали в течение ночи при 37°C. Планшеты также включали положительный (Ld513) и отрицательный (FP) контрольные клоны.
Для создания dsRNA с помощью ПЦР создали смысловой и антисмысловой фрагменты ДНК, содержащие последовательность T7 промотора. Вкратце, на клон, 1 мкл бактериальной суспензии помещали в многолуночные ПЦР-планшеты, содержащие REDTaq (Sigma кат. № D4309) и праймеры oGCC2738 (SEQ ID NO 93: AAGCAGTGGTATCAACGCAG) и oGCC2739 (SEQ ID NO 94: GCGTAATACGACTCACTATAGGAAGCAGTGGTATCAACGCAG) на основе последовательностей M2 и T7-M2, соответственно. За ПЦР реакцией следовала in vitro транскрипция, при этом на клон использовали 6 мкл ПЦР-продукта в 20 мкл реакционного объема, содержащего реагенты для транскрипции, обеспеченные набором RiboMAX™ Large Scale RNA Production System-T7 kit (Promega кат. № P1300), и инкубировали в течение ночи при 37°C. Конечный раствор dsRNA разбавляли стерильной водой Milli-Q и использовали для скрининга. dsRNA, соответствующей положительному Ld513 контрольному клону, является SEQ ID NO 400 (см. таблицу 9), и отрицательному FP контрольному клону, является SEQ ID NO 104 (см. таблицу 4).
4.2. Скрининг на новые и эффективные гены мишени Leptinotarsa decemlineata с использованием cDNA-библиотеки экспрессируемых dsRNA
Каждая лунка 48-луночного планшета содержала 0,5 мл искусственной пищи, предварительно обработанной с помощью наружного покрытия 25 мкл (или 1 мкг) тестируемой или контрольной dsRNA. Одну L2 личинку помещали в каждую лунку и на клон тестировали 3 личинки. Количества выживших CPB оценивали в дни 4, 7 и 10.
Во второй биопробе личинок CPB кормили пищей, обработанной наружно наносимой тестируемой dsRNA, полученной из клонов, полученных из нормализованной библиотеки cDNA. Одну личинку помещали в лунку 48-луночного мультипланшета, содержащего 0,5 мл пищи, предварительно обработанной с помощью наружного покрытия 25 мкл 40 нг/мкл dsRNA раствора. Всего на обработку (клон) тестировали двадцать четыре личинки. Количество выживших насекомых оценивали в дни 4, 5, 6, 7, 8 и 11. Процент смертности личинок рассчитывали относительно дня 0 (начало исследования) (см. фигуру 21).
4.3. Идентификация мишеней у L. decemlineata жуков
Новые целевые последовательности из скрининга в 5.2. и целевые последовательности, соответствующие мишеням пути тропонина, ортологическим Lygus Lh594, Lh619 и Lh620 последовательностям, идентифицировали у L. decemlineata. Праймеры, которые обеспечили соответствующие фрагменты cDNA для Ld594, перечислены в таблице 17. Последовательности cDNA и предсказанные аминокислотные последовательности данных генов-мишеней определили и представили в таблицах 7 и 9, соответственно.
4.4. Получение dsRNA, соответствующих частичным последовательностям L. decemlineata генов-мишеней
dsRNA синтезировали с использованием праймеров, которые указаны в таблице 9. Смысловая цепь полученной в результате dsRNA, полученная из генов-мишеней, приведена в таблице 9.
4.5. Испытания анализа выживаемости для новых L. decemlineata мишеней
Ранний личиночный анализ
Синтетические dsRNA получили для 3 мишеней, Ld594, Ld619 и Ld620, и тестировали в анализе с питанием на личинках CPB (см. фигуру 16). 10-дневный анализ проводили в 48-луночных планшетах, на искусственной пище (на основе Gelman et al, J Ins Sc,1:7, 1-10: Artificial diets for rearing the Colorado Potato Beetle), с добавлением 1 мкг dsRNA/лунку с 12 личинками согласно условиям.
Наблюдали четкий эффект на развитие личинок. Второй анализ поставили для изучения эффекта данных dsRNA в течение окукливания и метаморфоза (см. анализ окукливания ниже).
Анализ окукливания
Анализ окукливания CPB поставили для изучения эффекта RNAi нокдауна Ld594, Ld619 и Ld620 в течение окукливания и метаморфоза. Личинок четвертой возрастной стадии кормили 1 мкг in vitro синтезированной dsRNA, распределенной на листовых дисках картофеля, и затем переносили в коробку с необработанными свежими листьями картофеля. Через четыре дня выживших насекомых помещали на вермикулит для обеспечения окукливания. Обработанные с помощью Lh594 насекомые были медленными, более мелкими и, в основном, не способными пройти окукливание. Вылупление куколки оценивали в конце эксперимента. Для необработанного контроля 24 личинки окуклились и все вылупились в здоровых имаго. Для Ld620 наблюдали снижение численности личинок, прогрессирующих в окукливание. Для трех протестированных мишеней отсутствовали личинки, развившиеся в здоровые куколки, и ни одна не вылупилась в имаго. Мертвые насекомые, извлеченные из вермикулита, демонстрировали различную степень пороков развития (фиг. 17).
Ld594, Ld619 и Ld620 вначале предстали в качестве несмертельных мишеней в анализе личинок CPB, хотя снижение жизнеспособности отчетливо наблюдалось у насекомых, обработанных dsRNA. С другой стороны, в анализе окукливания все 3 мишени индуцировали сильные эффекты и ингибировали вхождение в окукливание и/или метаморфоз.
Анализ имаго
Для оценки активности Ld594, Ld619 и Ld620 у имаго CPB поставили анализ листовых дисков. Листовые диски картофеля (1,7 см в диаметре) покрыли dsRNA или контролями и поместили в 3,5 см чашки Петри с одним взрослым жуком. На следующий день насекомым предоставили свежий обработанный листовой диск. На третий день имаго перенесли в коробку, содержащую достаточно свежих, необработанных листьев картофеля для поддержания выживания необработанных контролей. На обработку тестировали 6 имаго и подсчитывали количества выживших и умирающих насекомых с регулярными интервалами от дня 6 до дня 13. Насекомые считались умирающими, если они не могли перевернуться после укладывания на спину.
Несмотря на относительно высокий уровень фона в отрицательном контроле в данном конкретном анализе, наблюдали четкие эффекты на насекомых, которых подвергли воздействию Ld594 или Ld619 dsRNA (фиг. 18).
Пример 5. Идентификация генов-мишеней у Nilaparvata lugens
5.1. Идентификация мишеней Nilaparvata lugens
Новые целевые последовательности, соответствующие мишеням пути тропонина и названные Nl594 (тропонин I), Nl619 (тропонин T) и Nl626 (тропонин C), идентифицировали у коричневого дельфацида, Nilaparvata lugens. Ортологические последовательности генов Lygus, названные Nl594 (тропонин I), Nl619 (тропонин T) и Nl625/626 (тропонин C), клонировали посредством ПЦР с вырожденными праймерами с использованием BPH cDNA в качестве матрицы. В дополнение, полноразмерную cDNA идентифицировали для Nl594, применяя RACE (см. способ выше). ПЦР-систему AmpliTaq Gold (Applied Biosystems) применяли, следуя инструкциям производителя и в стандартных условиях для реакции ПЦР с вырожденными праймерами, как правило, следующим образом: 1 цикл в 10 минут при 95°C, с последующими 40 циклами по 30 секунд при 95°C, 1 минуту при 50°C и 1 минуту при 72°C, с последующими 10 минутами при 72°C. Для увеличения степени успеха до 10 различных вырожденных праймеров, прямых и обратных, разработали на основе выравниваний ортологических последовательностей у других видов и использовали в различных комбинациях. Полученные ПЦР-фрагменты очищали из геля с помощью набора для экстракции геля (Qiagen Cat. No 28706) и клонировали в TOPO TA вектор (Invitrogen). Клоны секвенировали и консенсусные последовательности использовали в Blast поисках в отношении различных доступных баз данных последовательностей насекомых для подтверждения значимости вставки. Вырожденные праймеры, которые привели к успешной амплификации, перечислены в таблице 18.
Последовательности ДНК и предсказанные аминокислотные последовательности данных генов-мишеней и еще одного гена-мишени (Nl537) определили и представили в таблицах 10 и 11, соответственно.
5.2 Получение dsRNA, соответствующих частичным последовательностям генов-мишеней Nilaparvata lugens
dsRNA синтезировали с использованием праймеров, которые указаны в таблице 12. Смысловая цепь образующейся в результате dsRNA, полученная от каждого из генов-мишеней, приведена в таблице 12.
5.3. Испытания анализа выживаемости для новых мишеней Nilaparvata lugens
dsRNA синтезировали и тестировали в предварительно оптимизированных анализах RNAi-путем-кормления у BPH, в присутствии цвиттерионного детергента, CHAPSO, при 0,1% конечной концентрации. dsRNA тестировали при 0,5 мкг/мкл конечной концентрации. Nl537, эффективную мишень в анализах BPH, использовали в качестве исходной мишени в данном анализе. Выживаемость насекомых оценивали на протяжении 9 дней.
Результаты биопробы показали, что у BPH Nl594, Nl619 и Nl626 также являлись эффективными мишенями RNAi у BPH (фиг. 19).
Пример 6. Идентификация генов-мишеней у Acyrthosiphon pisum
6.1 Идентификация мишеней Acyrthosiphon pisum
http://www.aphidbase.com/
Новые целевые последовательности идентифицировали у тлей и назвали Ap423, Ap537, Ap560 и Ap594, следуя той же номенклатуре: “Apxxx”, где “Ap” соответствует Acyrthosiphon pisum и “xxx” соответствует ID мишени. Праймеры разрабатывали на основе открытого источника предсказания генов в AphidBase (ref: ) (таблица 13).
Последовательности ДНК и предсказанные аминокислотные последовательности данных генов-мишеней определили и представили в таблицах 14 и 15, соответственно.
6.2 Получение dsRNA, соответствующих частичным последовательностям генов-мишеней тли
dsRNA синтезировали с использованием праймеров, которые указаны в таблице 16. Смысловая цепь образующейся в результате dsRNA, полученная от каждого из генов-мишеней, приведена в таблице 16.
6.3 Испытания анализа выживаемости для новых мишеней у тлей
RNAi-путем-кормления тестировали у Acyrthosiphon pisum (гороховая тля) с 4 мишенями Ap594, Ap423, Ap560, Ap537. Последовательности амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров, разработанных на основе открытого источника информации о последовательностях (http://www.aphidbase.com), и cDNA, полученной из тлей. Синтетические dsRNA получали и тестировали в конечной концентрации 0,5 мкг/мкл в присутствии 5 мкг/мкл дрожжевой tRNA в сахарозной пище. Десять новорожденных нимф гороховой тли поместили в маленькую чашку Петри (32 мм). Пятьдесят мкл пищи (с tRNA и dsRNA) наносили пипеткой на верхнюю часть первого слоя парафильма. Второй слой парафильма покрывал пищу и создавал пакетик для кормления, где тли могли питаться. На каждую мишень подготовили пять повторов 10 новорожденных нимф. GFP dsRNA использовали в качестве отрицательного контроля. Пищу обновляли в дни 4 и 7 анализов и оценивали выживаемость (фиг. 20).
Таблица 2
ID мишени
Последовательность cDNA (смысловая цепь) 5'→3'
Lh594
SEQ ID NO 1
Lh609
SEQ ID NO 3
Lh610
SEQ ID NO 5
Lh610 (b)
SEQ ID NO 139
Lh611
SEQ ID NO 7
Lh611 (b)
SEQ ID NO 140
Lh617
SEQ ID NO 9
Lh618
SEQ ID NO 11
Lh618 (b)
SEQ ID NO 141
Lh429
SEQ ID NO 13
Lh423
SEQ ID NO 95
Lh105.2
SEQ ID NO 96
Lh560
SEQ ID NO 15
Lh615
SEQ ID NO 17
Lh612
SEQ ID NO 19
Lh246
SEQ ID NO 21
Lh597
SEQ ID NO 23
Lh598
SEQ ID NO 25
Lh619
SEQ ID NO 121
Lh619 (b)
SEQ ID NO 142
Lh619 (c)
SEQ ID NO 143
Lh620
SEQ ID NO 122
Lh620 (b)
SEQ ID NO 144
Lh620 (c)
SEQ ID NO 145
Lh621
SEQ ID NO 123
Lh622
SEQ ID NO 124
Lh623
SEQ ID NO 125
Lh623 (b)
SEQ ID NO 146
Lh624
SEQ ID NO 126
Lh624 (b)
SEQ ID NO 147
Lh625
SEQ ID NO 127
Lh625 (b)
SEQ ID NO 148
Lh626
SEQ ID NO 128
Lh626 (b)
SEQ ID NO 149
Lh614
SEQ ID NO 129
Lh627
SEQ ID NO 150
Lh628
SEQ ID NO 152
Lh629
SEQ ID NO 154
Lh630
SEQ ID NO 156
Lh631
SEQ ID NO 158
Lh632
SEQ ID NO 160
Lh633.1
SEQ ID NO 162
Lh633.2
SEQ ID NO 163
Lh634.1
SEQ ID NO 165
Lh634.2
SEQ ID NO 167
Lh595.1
SEQ ID NO 168
Lh595.2
SEQ ID NO 170
Lh596
SEQ ID NO 172
Таблица 3
ID мишени
Соответствующая аминокислотная последовательностьcDNA клона, представленного в таблице 2
Lh594
SEQ ID NO 79
Lh609
SEQ ID NO 80
Lh610
SEQ ID NO 81
Lh610 (b)
SEQ ID NO 326
Lh611
SEQ ID NO 82
Lh611 (b)
SEQ ID NO 327
Lh617
SEQ ID NO 83
Lh618
SEQ ID NO 84
Lh618 (b)
SEQ ID NO 328
Lh429
SEQ ID NO 85
Lh429 (b)
SEQ ID NO 329
Lh423
SEQ ID NO 99
Lh105.2
SEQ ID NO 100
Lh560
SEQ ID NO 86
Lh615
SEQ ID NO 87
Lh612
SEQ ID NO 88
Lh246
SEQ ID NO 89
Lh597
SEQ ID NO 90
Lh598
SEQ ID NO 91
Lh619
SEQ ID NO 330
Lh620
SEQ ID NO 331
Lh621
SEQ ID NO 332
Lh622
SEQ ID NO 333
Lh623
SEQ ID NO 334
Lh624
SEQ ID NO 335
Lh625
SEQ ID NO 336
Lh626
SEQ ID NO 337
Lh614
SEQ ID NO 338
Lh627
SEQ ID NO 339
Lh628
SEQ ID NO 340
Lh629
SEQ ID NO 341
Lh630
SEQ ID NO 342
Lh631
SEQ ID NO 343
Lh632
SEQ ID NO 344
Lh633.1
SEQ ID NO 345
Lh633.2
SEQ ID NO 346
Lh634.1
SEQ ID NO 347
Lh634.2
SEQ ID NO 348
Таблица 4
ID мишени
Прямые праймеры5'→3'
Обратные праймеры5'→3'
dsRNA: смысловая цепь, представленная эквивалентной последовательностью ДНК5'→3'
Lh594
SEQ ID NO 27SEQ ID NO 29
SEQ ID NO 28SEQ ID NO 30
SEQ ID NO 2
Lh609
SEQ ID NO 31SEQ ID NO 33
SEQ ID NO 32SEQ ID NO 34
SEQ ID NO 4
Lh610
SEQ ID NO 35SEQ ID NO 37
SEQ ID NO 36SEQ ID NO 38
SEQ ID NO 6
Lh611
SEQ ID NO 39SEQ ID NO 41
SEQ ID NO 40SEQ ID NO 42
SEQ ID NO 8
Lh617
SEQ ID NO 43SEQ ID NO 45
SEQ ID NO 44SEQ ID NO 46
SEQ ID NO 10
Lh618
SEQ ID NO 47SEQ ID NO 49
SEQ ID NO 48SEQ ID NO 50
SEQ ID NO 12
Lh429
SEQ ID NO 51SEQ ID NO 53
SEQ ID NO 52SEQ ID NO 54
SEQ ID NO 14
Lh423
SEQ ID NO 105SEQ ID NO 107
SEQ ID NO 106SEQ ID NO 108
SEQ ID NO 101
Lh105.2
SEQ ID NO 109SEQ ID NO 111
SEQ ID NO 110SEQ ID NO 112
SEQ ID NO 102
GFP
SEQ ID NO 113SEQ ID NO 115
SEQ ID NO 114SEQ ID NO 116
SEQ ID NO 103
Pt
SEQ ID NO 117SEQ ID NO 119
SEQ ID NO 118SEQ ID NO 120
SEQ ID NO 104
Lh560
SEQ ID NO 55SEQ ID NO 57
SEQ ID NO 56SEQ ID NO 58
SEQ ID NO 16
Lh615
SEQ ID NO 59SEQ ID NO 61
SEQ ID NO 60SEQ ID NO 62
SEQ ID NO 18
Lh612
SEQ ID NO 63SEQ ID NO 65
SEQ ID NO 64SEQ ID NO 66
SEQ ID NO 20
Lh246
SEQ ID NO 67SEQ ID NO 69
SEQ ID NO 68SEQ ID NO 70
SEQ ID NO 22
Lh597
SEQ ID NO 71SEQ ID NO 73
SEQ ID NO 72SEQ ID NO 74
SEQ ID NO 24
Lh598
SEQ ID NO 75SEQ ID NO 77
SEQ ID NO 76SEQ ID NO 78
SEQ ID NO 26
Lh619
SEQ ID NO 206SEQ ID NO 208
SEQ ID NO 207SEQ ID NO 209
SEQ ID NO 130
Lh620
SEQ ID NO 210SEQ ID NO 212
SEQ ID NO 211SEQ ID NO 213
SEQ ID NO 131
Lh621
SEQ ID NO 214SEQ ID NO 216
SEQ ID NO 215SEQ ID NO 217
SEQ ID NO 132
Lh622
SEQ ID NO 218SEQ ID NO 220
SEQ ID NO 219SEQ ID NO 221
SEQ ID NO 133
Lh623
SEQ ID NO 222SEQ ID NO 224
SEQ ID NO 223SEQ ID NO 225
SEQ ID NO 134
Lh624
SEQ ID NO 226SEQ ID NO 228
SEQ ID NO 227SEQ ID NO 229
SEQ ID NO 135
Lh625
SEQ ID NO 230SEQ ID NO 232
SEQ ID NO 231SEQ ID NO 233
SEQ ID NO 136
Lh626
SEQ ID NO 234SEQ ID NO 236
SEQ ID NO 235SEQ ID NO 237
SEQ ID NO 137
Lh614
SEQ ID NO 238SEQ ID NO 240
SEQ ID NO 239SEQ ID NO 241
SEQ ID NO 138
Lh627
SEQ ID NO 242SEQ ID NO 244
SEQ ID NO 243SEQ ID NO 245
SEQ ID NO 151
Lh628
SEQ ID NO 246SEQ ID NO 248
SEQ ID NO 247SEQ ID NO 249
SEQ ID NO 153
Lh629
SEQ ID NO 250SEQ ID NO 25
SEQ ID NO 251SEQ ID NO 253
SEQ ID NO 155
Lh630
SEQ ID NO 254SEQ ID NO 256
SEQ ID NO 255SEQ ID NO 257
SEQ ID NO 157
Lh631
SEQ ID NO 258SEQ ID NO 260
SEQ ID NO 259SEQ ID NO 261
SEQ ID NO 159
Lh632
SEQ ID NO 262SEQ ID NO 264
SEQ ID NO 263SEQ ID NO 265
SEQ ID NO 161
Lh633.2
SEQ ID NO 266SEQ ID NO 268
SEQ ID NO 267SEQ ID NO 269
SEQ ID NO 164
Lh634.1
SEQ ID NO 270SEQ ID NO 272
SEQ ID NO 271SEQ ID NO 273
SEQ ID NO 166
Lh595
SEQ ID NO 274SEQ ID NO 276
SEQ ID NO 275SEQ ID NO 277
SEQ ID NO 169
Lh596
SEQ ID NO 278SEQ ID NO 280
SEQ ID NO 279SEQ ID NO 281
SEQ ID NO 173
Таблица 7
ID мишени
Последовательность cDNA (смысловая цепь)5'→3'
Ld594
SEQ ID NO 174
Ld594(b)
SEQ ID NO 404
Ld619
SEQ ID NO 176
Ld620
SEQ ID NO 178
Ld583
SEQ ID NO 386
Ld584
SEQ ID NO 387
Ld586
SEQ ID NO 388
Ld588
SEQ ID NO 389
Ld513
SEQ ID NO 394
Таблица 8
ID мишени
Соответствующая аминокислотная последовательность cDNA клона, представленного в таблице 9
Ld594
SEQ ID NO 349
Ld594(b)
SEQ ID NO 405
Ld619
SEQ ID NO 350
Ld620
SEQ ID NO 351
Ld583
SEQ ID NO 390
Ld584
SEQ ID NO 391
Ld586
SEQ ID NO 392
Ld588
SEQ ID NO 393
Ld513
SEQ ID NO 395
Таблица 9
ID мишени
Прямые праймеры5'→3'
Обратные праймеры5'→3'
dsRNA: смысловая цепь, представленная эквивалентной последовательностьюДНК 5'→3'
Ld594
SEQ ID NO 282SEQ ID NO 284
SEQ ID NO 283SEQ ID NO 285
SEQ ID NO 175
Ld619
SEQ ID NO 286SEQ ID NO 288
SEQ ID NO 287SEQ ID NO 289
SEQ ID NO 177
Ld620
SEQ ID NO 290SEQ ID NO 292
SEQ ID NO 291SEQ ID NO 293
SEQ ID NO 179
Ld513
SEQ ID NO 396SEQ ID NO 398
SEQ ID NO 397SEQ ID NO 399
SEQ ID NO 400
Таблица 10
ID мишени
Последовательность cDNA (смысловая цепь)5'→3'
Nl594
SEQ ID NO 180
Nl619
SEQ ID NO 182
Nl626
SEQ ID NO 184
Nl537
SEQ ID NO 186
Таблица 11
ID мишени
Соответствующая аминокислотная последовательность cDNA клона, представленного в таблице 12
Nl594
SEQ ID NO 352
Nl619
SEQ ID NO 353
Nl626
SEQ ID NO 354
Nl537
SEQ ID NO 355
Таблица 12
ID мишени
Прямые праймеры5'→3'
Обратные праймеры5'→3'
dsRNA: смысловая цепь, представленная эквивалентной последовательностью ДНК5'→3'
Nl594
SEQ ID NO 294SEQ ID NO 296
SEQ ID NO 295SEQ ID NO 297
SEQ ID NO 181
Nl619
SEQ ID NO 298SEQ ID NO 300
SEQ ID NO 299SEQ ID NO 301
SEQ ID NO 183
Nl626
SEQ ID NO 302SEQ ID NO 304
SEQ ID NO 303SEQ ID NO 305
SEQ ID NO 185
Nl537
SEQ ID NO 306SEQ ID NO 308
SEQ ID NO 307SEQ ID NO 309
SEQ ID NO 187
Таблица 13
Мишень
Прямой праймер
Обратный праймер
Ap594
SEQ ID NO 369
SEQ ID NO 370
Ap423
SEQ ID NO 371
SEQ ID NO 372
Ap537
SEQ ID NO 373
SEQ ID NO 374
Ap560
SEQ ID NO 375
SEQ ID NO 376
Таблица 14
ID мишени
Последовательность cDNA (смысловая цепь) 5'→3'
Ap594
SEQ ID NO 188
Ap423
SEQ ID NO 200
Ap537
SEQ ID NO 202
Ap560
SEQ ID NO 204
Таблица 15
ID мишени
Соответствующая аминокислотная последовательность cDNA клона, представленного в таблице 16
Ap594
SEQ ID NO 356
Ap423
SEQ ID NO 357
Ap537
SEQ ID NO 358
Ap560
SEQ ID NO 359
Таблица 16
ID мишени
Прямые праймеры5'→3'
Обратные праймеры5'→3'
dsRNA: смысловая цепь, представленная эквивалентной последовательностью ДНК5'→3'
Ap594
SEQ ID NO 310SEQ ID NO 312
SEQ ID NO 311SEQ ID NO 313
SEQ ID NO 189
Ap423
SEQ ID NO 314SEQ ID NO 316
SEQ ID NO 315SEQ ID NO 317
SEQ ID NO 201
Ap537
SEQ ID NO 318SEQ ID NO 320
SEQ ID NO 319SEQ ID NO 321
SEQ ID NO 203
Ap560
SEQ ID NO 322SEQ ID NO 324
SEQ ID NO 323SEQ ID NO 325
SEQ ID NO 205
Таблица 17
Мишень
Прямой праймер
Обратный праймер
Ld594
SEQ ID NO 377
SEQ ID NO 378
Таблица 18
Мишень
Прямой праймер
Обратный праймер
Nl594
seq id no 379
seq id no 380
Nl619
seq id no 381
seq id no 382
Nl626
seq id no 383
seq id no 384
Таблица 19
ID мишени
Лучшие попадания Drosophila
НАЗВАНИЕ
ОБОЗНАЧЕНИЕ
Ld583
CG4759
Рибосомный белок L27
RpL27
Ld584
CG 17331
Протеасома, субъединица бета-типа
Ld586
CG13704
неизвестный
Ld588
CG4157
Rpn12
Таблица 20
ID мишени
Лучшие попадания Drosophila
НАЗВАНИЕ
ОБОЗНАЧЕНИЕ
Nl594
CG7178
wings up A (тропонин I)
wupA
Nl619
CG7107
тропонин T (upheld)
up
Nl626
*CG9073, CG7930, CG2981, CG12408, CG6514, CG2981, CG7930, CG9073, CG6514, CG12408
тропонин C
Nl537
CG32744
Убиквитин-5E; способ модификации белка
*неясно: несколько попаданий в семействе
Таблица 21
ID мишени
Лучшие попадания Drosophila
НАЗВАНИЕ
ОБОЗНАЧЕНИЕ
Ap594
CG7178
wings up A (тропонин I)
wupA
Ap423
CG2746
рибосомный белок L19
RpL19
Ap537
CG32744
Убиквитин-5E; способ модификации белка
Ap560
CG10423
рибосомный белок S27
RpS27
Специалистам в данной области будет очевидно, что многочисленные изменения и/или модификации можно внести в вышеупомянутые анализы без отступления от сущности или объема данного анализа, который описан в общем. Специалисты в данной области обнаружат или смогут установить, применяя не более чем обычное экспериментирование, многие эквиваленты конкретных примеров, и такие эквиваленты охватываются настоящим изобретением. Настоящий пример, таким образом, следует рассматривать во всех отношениях как иллюстративный, а не ограничительный.