СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ БИОДЕГРАДАЦИИ УГЛЕВОДОРОДОВ НЕФТИ В НАТИВНЫХ И ЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВАХ
METHOD TO DETECT EFFICIENCY OF BIODEGRADATION OF OIL HYDROCARBONS IN NATIVE AND CONTAMINATED SOILS

12
13
2
2
2
Способ основан на использовании в качестве количественных параметров вариаций распространснностей стабильных изотопов углерода (С и С) нефтепродуктов, почвенного органического вещества и метаболической углекислоты, образующейся при их микробном окислении. Способ включает: а) отбор образцов почв из мест загрязненных углеводородами нефти и/или мест, для которых существует потенциальная опасность углеводородного загрязнения, б) измерения углеводородокисляющей активности почвенной микробиоты, основанные на количественном и изотопном анализе метаболической углекислоты (СО) до и после внесения в почву тестовых субстратов, в) определение долей углерода, включенного в СО за счет минерализации почвенного органического вещества (ПОВ) и тестовых субстратов на основе материального изотопного баланса, г) сравнение скоростей минерализации ПОВ до и после внесения тестового субстрата в почву и определение микробной прайминг-продукции СО (отрицательной или положительной прайминг-эффект), обусловленной микробным метаболизмом тест-субстрата, д) определение степени антропогенных изменений в почве за счет замещения нативного ПОВ на продукты экзогенного субстрата в случае выявления положительной прайминг-продукции субстрата.
Область техники
Изобретение относится к биотехнологии защиты окружающей среды в нефтедобывающей промышленности и сельском хозяйстве и может быть использовано для определения углеводород-деградирующего потенциала почвенной микробиоты. Загрязнение почв нефтью и нефтепродуктами, которое происходит в процессе нефтедобычи, в результате разрывов нефтепроводов, накопления отходов нефтеперерабатывающих заводов, эксплуатации автозаправочных станций и т.д. является глобальной проблемой при оценке состояния окружающей среды. По имеющимся данным около 5-10 млн. т углеводородов нефти ежегодно загрязняют почвенные и водные экосистемы. Токсическое действие нефтепродуктов на окружающую среду проявляется по нескольким аспектам, в частности, это: а) повышение гидрофобности почв и затруднение водного снабжения растительного покрова, б) проникновение низкомолекулярных антропогенных углеводородов в растительные ткани, нарушающие их биохимический состав и питательную ценность в трофических цепях, в) ингибирующее или активирующее влияние антропогенных поллютантов на микробные процессы, происходящие в почвах и сопровождающиеся изменениями многовековых процессов круговорота углерода в окружающей среде. Последний фактор связан как с вариациями состава микробных популяций в почве, так и с возможным влиянием на процессы формирования и сохранения структуры почвенного органического вещества (ПОВ) и продукции метаболической углекислоты.
Уровень техники
В настоящее время существует большое количество способов для определения микробного потребления нефтепродуктов, в которых использовали показатель остаточного содержания нефтепродуктов в «отбеливающей» земле по отношению к исходному значению. По установившейся практике оценки эффективности биодеградации углеводородов нефти этот показатель определяют весовым (гравиметрическим) методом и/или спектрофотометрической и хромато-масс-спектрометрической детекцией углеводородов в их экстрактах специфическими растворителями.
Согласно способу, представленному в заявке 2005130840/13, 04.10.2005 «Способ рекультивации отбеливающей земли, загрязненной нефтепродуктами», определение остаточного содержания нефтепродуктов проводили спектрофотометрическим и весовым методами. Пробу весом 10 г помещали в патрон из фильтровальной бумаги и переносили в аппарат Сокслета. Экстракцию проводили 120-150 мл гексана в течение 2-3 часов при температуре кипения гексана (69°С). Концентрацию углеводородов в пробе определяли по оптической плотности экстракта на спектрофотометре СФ-46 при длине волны, на которой данная смесь углеводородов имела максимальный пик поглощения. Проэкстрагированные пробы вместе с патронами высушивали в жарочном шкафу при температуре 100-120°С и снова взвешивали на электронных весах. По разнице в весе проб до и после экстракции определяли содержание остаточных нефтепродуктов в тестируемых почвах.
Согласно способу, представленному в работе (Zucchi et al. 2003, J. Appl. Microbiol. Vol.94. P.248-257), для определения общего содержания экзогенных углеводородов в почве применяли стандартный метод, используемый в США D 3921- 96 ASTM (American Standard and Test Materials), основу которого составляют данные инфракрасной спектроскопии в экстрагируемых углеводородах из почвы с использованием 1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoromethane и Florisil™ (Aldrich). С некоторой модификацией аналогичный метод рекомендован в Германии (DIN 38-409-1118 (1981) Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser- and Schlammuntersuchung Summarische Wirkungs und Stofikenngrossen (Gruooe H). Bestimmung von Kohlenwasserstoffen (1118). Deutsche Institut f. Normung eV, Berlin, Germany).
Известные способы для количественной оценки углеводородных загрязнителей в почвах имеют ряд существенных недостатков и ограничений. Прежде всего, это проблема, связанная с отбором и составлением представительной средней пробы, которая служила бы интегральным показателем для анализируемых почв. Вторая проблема, это степень полноты экстракции углеводородов нефти из почвы, поскольку существует определенное количество сорбированных, неэкстрагируемых углеводородов нефти. Третья проблема, это неконтролируемая возможность дополнительной экстракции нативных углеводородов, присутствующих в почве. Кроме того, при использовании весовых (гравиметрических) методов анализа известна еще одна проблема, которая связана с активацией микробного разрушения нативного почвенного вещества, обусловленного микробным метаболизмом экзогенного субстрата (углеводорода). В результате этого получаемый результат анализа содержит значительные ошибки, в особенности, при оценке эффективности биотехнологических схем деградации загрязнений, поскольку отражает не только убыль углеводородов нефти, но и возможную дополнительную минерализацию нативных почвенных веществ.
В дополнение к вышесказанному следует отметить, что все существующие в настоящее время аналитические методики позволяют получать интегральные данные за длительный период наблюдения (несколько месяцев или лет) и не дают возможности своевременно корректировать биотехнологическую схему проводимых работ. В свете этого крайне важной и технологически значимой характеристикой биоремедиации загрязненной почвенной или водной среды является определение не только содержания поллютантов, но обнаружение и количественная оценка нативной микробной активности в течение сравнительно короткого периода (дни или недели), т.е. определение скорости процесса. Этот показатель имеет большое значение как при составлении технологии биоремедиации, так и при оценке ее экономической эффективности. В ряде случаев при обнаружении активных микробных процессов, которые сопровождают снижение поллютантов, можно ограничиться лишь мониторингом состояния загрязненного участка и представить прогнозы о его очистке. Если нативная микробиота недостаточно интенсивно деградирует загрязнители, то имеется возможность ее активировать путем внесения специальных минеральных и/или органических добавок. В случае крайне низких скоростей биодеградации поллютантов или полного отсутствия микробной активности в анализируемой почвенной системе необходимо осуществить биоагментацию, т.е. внесение специфических микроорганизмов, которые будут способными эффективно деградировать поллютант. Способов, позволяющих в течение короткого периода наблюдения определять скорости микробной деградации углеводородов нефти в почвах, до настоящего времени не существует.
Сущность изобретения
Задачей заявляемого изобретения является создание способа определения скорости деградации углеводородного поллютанта нативной почвенной микробиотой и/или интродуцированными в почву специфическими микроорганизмами, которые способны деградировать соответствующий поллютант, оценки степени минерализации почвенного органического вещества и уровня возможного его замещения поллютантом и/или продуктами его трансформации.
Задача решается следующим образом: 1) отбирают представительные образцы тестируемой почвы, определяют содержание органического вещества в почве и количество углеводородокисляющих микроорганизмов; 2) вносят образцы почв в герметично закрывающиеся емкости, где почва занимает не более 15% от общего объема емкости; 3) проводят определение базовых характеристик почв: анализ количества метаболической углекислоты, заменяя газовую фазу в емкости с периодичностью несколько часов, определяют исходные изотопные показатели углекислоты и углерода почвенного органического вещества; 4) после определения базовых характеристик тестируемых образцов почв вносят специфический субстрат (углеводород), изотопный состав углерода которого отличается от почвенного органического вещества (количество углерода вносимого субстрата не должно превышать 20% от содержания органического вещества в почве); 5) контроль активности микробиоты в почве определяют по скорости продукции метаболической углекислоты, по изотопным характеристикам ее углерода и по количеству потребленного кислорода; 6) по материально-изотопному балансу определяют количество углекислоты, образовавшееся в результате микробной минерализации почвенного органического вещества и внесенного субстрата (углеводорода), соответственно; 7) по количеству углекислоты, образовавшейся в результате минерализации ПОВ, судят о степени микробной деградации ПОВ, а по количеству углекислоты, образовавшейся в результате микробной минерализации углеводородов нефти, судят о количестве нефти и/или продуктов ее микробной трансформации, оставшихся в почве; 8) сравнением количеств минерализованного ПОВ и части оставшихся углеводородов нефти судят о степени замены нативного ПОВ углеводородами поллютанта.
Предлагаемый способ оценки микробной способности деградировать поллютанты в почвах позволяет: а) определять скорость биоминерализации тестируемых поллютантов, б) дать количественный прогноз очистки почв с использованием нативной микробиоты, а при необходимости проводить дополнительную ее активацию, в) принимать решения о целесообразности внесения специализированных микроорганизмов, которые способны эффективно использовать в качестве субстрата соответствующий поллютант, г) выяснять степень разрушения почвенного органического вещества микроорганизмами, активируемыми внесенными поллютантами (прайминг-эффект), д) определять степень замены нативного почвенного органического вещества, минерализованного микроорганизмами, за счет поллютанта и/или его продуктов трансформации.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Реализация способа по оценке углеводород-минерализущего потенциала микроорганизмов в сельскохозяйственной почве осуществляется следующим образом.
2
3
2
2
2
-2
Этап 1 (контроль). Образцы сельскохозяйственной почвы помещают в стеклянные сосуды, которые герметично закрывают крышками и предварительно выдерживают в течение 3-х суток при температуре 22°С. Для фиксации метаболической углекислоты, образующейся при микробной минерализации почвенного органического вещества (ПОВ), над поверхностью почв располагают стеклянные чашки, содержащие 1-3 мл водного 1 моль NaOH раствора. Количество СО, зафиксированное NaOH, осаждают в виде ВаСО после добавления раствора BaCl. Общую продукцию СО в ходе экспериментов в каждом из сосудов определяют по количеству раствора 0.1 М HCl, расходуемого на титрование остаточной щелочи в чашках. Карбонаты бария промывают водой, осаждают, высушивают и взвешивают полученные осадки. Затем их используют для количественной оценки продукции метаболической СО и изотопного анализа углерода. Определяют изотопные характеристики углерода ПОВ, для чего навеску в 10 мг ПОВ и 1 г окисленных медных стружек вносят в стеклянные ампулы (стекло марки «Пирекс») диаметром 6 мм и длиной 150 мм, запаянные с одного конца, вакуумируют до 10 мм рт. столба и запаивают с другого конца. Ампулы выдерживают при температуре 560°С в течение 24 ч, а затем образовавшуюся в них углекислоту используют для масс-спектрометрического изотопного анализа углерода. Для количественного анализа потребления кислорода отбирают аликвоты газовоздушной фазы в тестируемых емкостях в количестве 10 мл и определяют относительные содержания основных газовоздушных компонентов (азот, кислород, аргон и углекислота).
Этап 2. Готовят модельную почву, загрязненную углеводородами нефти, в герметично закрывающихся емкостях. Для этого аликвоту тестируемой почвы в количестве 10 г высушивают до постоянного веса, смешивают с потенциальным загрязнителем - сырой нефтью - и затем вносят в герметично закрывающуюся емкость и смешивают с увлажненной частью почвы. Количество вносимой нефти определяют из расчета возможного уровня загрязнения почвы. Например, внесение в почву нефти в количество 3,2% или 27,43 мг С нефти на г сухой почвы оценивается величиной разлива нефти около 385 кг нефти на га (при условии, что поверхностный слой загрязненной почвы составляет не более 10 см).
Этап 3. Проводят определение микробной минерализации углеводородов нефти, внесенных в почвы в опытах по сравнению с контролем (почва до внесения нефти). Минерализующую активность микроорганизмов определяют в опытах с нативными почвенными микроорганизмами (опыт 1) и с дополнительно внесенными лабораторными культурами (опыт 2).
2
3
2
2
2
Образцы почвы, загрязненные сырой нефтью (опыты), и нативные почвы (контроль без нефти), которые находятся в герметично закрытых стеклянных сосудах, выдерживают при температуре 22°С. Периодически один раз после экспозиции от 1 до 3 суток определяют продукцию метаболической углекислоты, образующейся при микробной минерализации почвенного органического вещества (ПОВ). Для этого над поверхностью почв располагают стеклянные чашки, содержащие от 1 до 3 мл водного 1 моль NaOH раствора. Количество СО, зафиксированное NaOH, осаждают в виде ВаСО после добавления раствора BaCl. Общую продукцию CO в ходе экспериментов в каждом из сосудов определяют по количеству раствора 0.1 М HCl, расходуемого на титрование остаточной щелочи в чашках. Карбонаты бария промывают водой, осаждают, высушивают и взвешивают полученные осадки. Затем их используют для количественной оценки продукции метаболической CO и изотопного анализа углерода.
13
12
2
3
2
3
2
2
Этап 4. Определяют отношения распространенностей изотопов углерода С/С в ПОВ, сырой нефти и метаболической СО (в виде ВаСО) с использованием изотопного масс-спектрометра. Для изотопного анализа метаболической СО используют около 3-4 мг полученного ВаСО [М.в.=197,34], который затем разлагают до CO с помощью ортофосфорной кислоты в 10 мл контейнере в присутствии воздуха. Для анализа изотопного состава углерода органического вещества образцы ПОВ и сырой нефти сжигают до СО в ампулах при температуре 560°С в присутствии окиси меди.
2
2
2
13
16
12
16
13
Отношения интенсивностей пиков в масс-спектре CO с m/z 45 (CO) и 44 (СO) используют для количественной характеристики содержания изотопов С
12
13
13
и С в анализируемых образцах. Согласно выражению (1), количество С изотопа определяют в относительных единицах δС (‰):
sa
st
2
13
12
13
12
13
12
где R=(C)/(C) представляет отношения распространенностей изотопов С/С в образце, а R=(C)/(C) - отношения этих изотопов в международном стандарте PDB (Pee Dee Belemnite). Каждый образец CO анализируют в трех повторах, стандартная ошибка может достигать около ±0.1‰.
2
ср
13
Средневзвешенный изотопный состав углерода метаболической CO (δС), которую получают на отдельных временных i-интервалах, определяют, используя выражение (2):
i
i
2
13
где q и δC - скорость продукции СО и характеристика ее изотопного состава углерода на i-интервалах, соответственно.
2
cyv
2
2
нефть
2
13
13
13
13
Используя изотопные характеристики углерода суммарной CO, образующейся при микробной минерализации ПОВ и нефти (δ C) (опыты), CO - при минерализации только ПОВ δ(Спов) (контроль) и полагая, что CO, продуцируемая при минерализации нефти, наследует ее изотопный состав (δ С), то с помощью выражения (3) вычисляют долю CO (F), которая образовалась в при минерализации ПОВ и сырой нефти, соответственно.
2
2
Прайминг-эффект (ПЭ), т.е. активация дополнительной минерализации ПОВ за счет внесенного поллютанта, вычисляют путем сравнения количества СО в смеси при микробной минерализации ПОВ и нефтепродуктов (опыты) и количества СО в контроле, образовавшегося за соответствующие периоды наблюдения (выражение 4):
CYM
2
ПОВ
2
где Q - суммарное количество СО при минерализации ПОВ и нефти (опыты), a Q - количество СО при минерализации только ПОВ (контроль).
2
4
Пример. Образцы пахотной почвы, отобранные на поле после выращивания кукурузы (С4-растение), внесят по 100 г почвы по сухому весу в каждую из 6-ти стеклянных 700 мл емкостей: почва в 2-х емкостях служила контролем (контроль 1 - нативная микробиота, контроль 2 - нативная микробиота + интродуцированные бактерии), почва в остальных 4-х емкостях (опыты) была загрязнена нефтью: опыт 1 - нативная почвенная микробиота, опыт 2 - нативная почвенная микробиота + интродуцированные бактерии. Исходная влажность почвы составляла 40% потенциальной влагоемкости. До внесения нефти в почву в течение 10 суток с периодичностью в 2-е суток определяли скорость продукции СО и ее изотопные характеристики углерода (исходные количественные характеристики). В качестве интродуцируемой лабораторной бактерии использовали Pseudomonas aureofaciens BS1393(pBS216), (коллекция лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН), которая способна расти на углеводородах. Кроме того, бактерии Р. aureofaciens BS1393(pBS216), содержащие плазмиду pBS216 с Naph опероном, обеспечивают биодеградацию нафталина и салицилата. Внесенные бактерии рассматриваются как потенциальные потребители ароматических углеводородов нефти. Выбор штамма Р. aureofaciens BS1393(pBS216) обусловлен тем, что благодаря синтезу антибиотиков феназинового ряда колонии штамма окрашиваются в ярко-оранжевый цвет. Это позволяет использовать данный признак в качестве маркерного показателя при скрининге внесенных микроорганизмов в почву в присутствии аборигенной микрофлоры. Бактерии Р. aureofaciens BS1393(pBS216) предварительно выращивают до стационарной фазы (18 часов) и затем вносят в почвы. Количество внесенных бактерий составляет около 10 кл/г почвы. Забор проб почвы для анализа количества клеток в каждом из сосудов (контейнеров) проводят путем отбора образцов почвы в трех точках, затем пробы объединяют. Навеску (1 г почвы) суспендируют в 10 мл физиологического раствора на "Vortex", оставляют на 30 мин для осаждения почвенных частиц. Отбирают 1 мл надосадочной жидкости и проводят соответствующие разведения (10×-10000×). Суспензию клеток в двух разведениях высевают на чашки Петри с LB средой. Проводят подсчет колоний и рассчитывают средние их значения в контроле и опытах. Анализ микробной минерализации ПОВ и внесенной в почву сырой нефти проводили в 4-х вариантах (2 контроля и 2 опыта). Через сутки во всех вариантах опытов наблюдают некоторое понижение КОЕ (ориентировочно это может достигать до 10/г почвы).
В таблице 1 приведены скорости продукции углекислоты, которая выделялась из образцов тестируемой почвы в результате минерализующей активности нативной почвенной микробиоты и специализированной углеводородокисляющей культуры, которые в контрольных опытах использовали в качестве субстрата только почвенное органическое вещество (контроль 1 и 2) и в случае загрязнения почвы углеводородами нефти (опыт 1 и 2).
Таблица 1.
Средние скорости продукции углекислоты (мкг C-CO<sub>2</sub> /г СП в ч) и общая продукция С-СО<sub>2</sub> за время 47-суточного эксперимента (мг С-СO<sub>2 </sub>на 100 г СП)
Опыты
Скорость продукции СО<sub>2</sub>, мкг С-CO<sub>2</sub>/г СП ч
*Общая продукция CO<sub>2</sub>, мг C-CO<sub>2</sub>
Контроль 1
0,228 (0,013)**
25,72 (0,6)
Контроль 2
0,213 (0,0126)
24,03 (0,59)
Опыт 1
1,480 (0,122)
166,94 (5,7)
Опыт 2
1,546 (0,100)
174,4 (4,7)
* Продукция С-CO<sub>2</sub> из расчета на 100 г сухой почвы (СП) в течение 47-суточной экспозиции
** В скобках приведены стандартные ошибки трех параллельных определений.
Так как в опытах метаболическая углекислота могла образоваться в результате использования микроорганизмами в качестве субстрата ПОВ и нефть, то, использовав различие в изотопном составе углерода ПОВ и нефти, с помощью материально- изотопного баланса были рассчитаны количества углекислоты за счет потребления ПОВ и нефти, соответственно (табл.2).
Таблица 2.
Средневзвешенный изотопный состав углерода и доля СО<sub>2</sub>, которая образовалась за счет минерализации ПОВ, и прайминг-эффект (ПЭ) в опытах 1 и 2.
Опыты
*δ<sup>13</sup>C<sub>cp</sub>,‰
**F, %
[CO<sub>2</sub>] (ПОВ), мг С-CO<sub>2</sub>
ПЭ, %
Контроль 1
-23,70 (0,1)
100
25,72 (0,6)
0
Контроль 2
-23,77 (0,1)
100
24,03 0,59)
0
Опыт 1
-26,59 (0,2)
38,5(1,7)
64,3 (3)
150 (13)
Опыт 2
-26,63 (0,2)
38,2 (1,6)
66,6 (3)
177 (15)
* δ<sup>13</sup>C<sub>cp</sub> - средневзвешенный изотопный состав углерода метаболической СO<sub>2</sub>.
** F - доля метаболической CO<sub>2</sub>, образующейся при микробной минерализации ПОВ
Как следует из табл.2, около 40% углекислоты в опытах образуется в результате микробного окисления ПОВ и только 60% за счет использования углерода нефтепродуктов. При более чем в 1.5 раза отмечено увеличение минерализации ПОВ в загрязненной почве по сравнению с нативной.
Таблица 3.
Балансовые расчеты минерализации ПОВ и сырой нефти почвенной микробиотой в течение 47-суточной экспозиции из расчета на 1 кг сухой почвы
Опыт
Исходное С<sub>орг</sub>, г/кгСП
Количество С-СО<sub>2</sub>, г/кг СП
Потребленная нефть, г/кг СП
ПОВ
нефть
ПОВ
нефть
нефть
Контроль 1
49.00
0
0.2572 (0,006)
0
0
Контроль 2
49.00
0
0.2403 (0,006)
0
0
Опыт 1
49.00
27.43 (0.5)
0.643 (0.003)
1.03 (0.09)
2.3 (0.3)
Опыт 2
49.00
27.43 (0.5)
0.666 (0.003)
1.08 (0.08)
2.5 (0.3)
В скобках приведены отклонения 3-х параллельных определений
2
Принимая во внимание, что выход СО при микробном росте на углеводородах нефти составляет около 40-50%, то согласно табл.3 общее потребление нефти в опытах за 47 суток составит 2.3-2.5 г С нефти/кг почвы.
Оценочный прогноз микробной деградации нефти.
Полагая, что средняя скорость потребления нефти почвенной микробиотой сохранится в течение положительных температур в течение 6 месяцев года, находим, что количество потребленной нефти составит около 9 (0.5) г С нефти на кг СП или 32% от всего количества нефти, поступившей в почву.