МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ИЗОЛЯТЫ STREPTOMYCES FUNGICIDICUS И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
MODIFIED STREPTOMYCES FUNGICIDICUS ISOLATES AND THEIR APPLICATIONS

Перекрестная ссылка на родственные заявки
В настоящей заявке в соответствии со ст.35 Кодекса законов США 119(с) испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США рег.№62/430455, поданной 6 декабря 2016 г., содержание которой во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к модифицированным изолятам Streptomyces fungicidicus, к композициям, содержащим эти изоляты, и к способам применения таких изолятов и композиций для биологического синтеза эндурацидина (энрамицина). Настоящее изобретение также относится к модифицированным изолятам Streptomyces fungicidicus, которые биологически синтезируют эндурацидин и способствуют более эффективному продуцированию энрамицина.
Предпосылки создания изобретения
Эндурацидин, также известный как энрамицин и имеющийся в продаже как Энрадин, в соответствии с программой Охраны здоровья животных MSD, представляет собой природный липодепсипептидный антибиотик из 17 аминокислот, который биологически синтезируется и секретируется бактерией Streptomyces fungicidicus, то есть природным продуцентом эндурацидина.
12
13
Эндурацидин представляет собой родовое название аналогов эндурацидина и включает эндурацидины A, B, C и D. Этот пептид может быть выделен из сбраживающего бульона, а в первую очередь, мицелиев в виде смеси эндурацидинов А и В, которые отличаются одним атомом углерода в присоединенной липидной цепи. По своей структуре, эндурацидины отличаются по С или С-2Z,4E- разветвленной молекуле жирной кислоты, связанной амидной связью с остатком аспарагиновой кислоты, и присутствием множества непротеиногенных аминокислотных остатков, таких как эндурацидидин, 4-гидроксифенилглицин, 3,5-дихлор-4-гидроксифенилглицин, цитруллин и орнитин.
Эндурацидин обладает сильной антибактериальной активностью in vitro и in vivo, направленной против грамположительных микроорганизмов широкого спектра, включая Clostridium perfringens, резистентный к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA) и резистентный к ванкомицину Enterococcus (VRE). Эндурацидин ингибирует биосинтез пептидогликана бактериальной клеточной стенки посредством образования комплекса с внеклеточным липидом II, то есть предшественником клеточной стенки бактерий. Сайт образования комплекса липида II с эндурацидином отличается тем, что он распознается ванкомицином и ответственен за действие эндурацидина, направленное против микроорганизмов, резистентных к ванкомицину. В настоящее время не существует какого-либо документального подтверждения перекрестной резистентности эндурацидина с любыми применяемыми в клиниках антибиотиками, а также нет никаких данных о эволюционной, приобретенной или передаваемой резистентности. Благодаря отсутствию какой-либо известной формы механизма передачи резистентности, отсутствию биодоступности при пероральном введении, низкой токсичности, а также значительной антибактериальной активности по отношению к Clostridium spp., эндурацидин является ключевым антибиотиком для борьбы с энтеритом, вызываемым клостридиями у домашней птицы.
В соответствии с этим, эндурацидин, при его введении в корм домашней птицы, ингибирует рост бактерий, которые вызывают некротический энтерит и нарушение роста у домашней птицы. Эндурацидин также не имеет синдрома отмены. Кроме того, эндурацидин является стабильным в корме и в гранулах, может быть введен курам в очень низкой дозе и не остается в мясе и яйцах кур, обработанных этим средством.
В последние годы был получен ряд штаммов Streptomyces fungicidicus, которые были модифицированы для повышения эффективности этих эндурацидин-продуцирующих микроорганизмов, например, Streptomyces fungicidicus В-5477 (IFO-12439, АТСС-21013) и Streptomyces fungicidicus В-5477-m (IFO-12440, АТСС-21014) [см., например, патент США 3577530, патент США 3786142 и патент США 4465771]. Однако необходимость дальнейшего улучшения таких модифицированных изолятов Streptomyces fungicidicus для продуцирования еще более эффективных эндурацидин-продуцирующих микроорганизмов остается актуальной.
Любые цитируемые здесь документы не должны рассматриваться как указание на то, что эти документы относятся к «предшествующему уровню техники».
Сущность изобретения
В соответствии с этим, настоящее изобретение относится к новым модифицированным изолятам Streptomyces fungicidicus, которые более эффективно продуцируют эндурацидин. В некоторых вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus кодирует один или более или все из следующих белков: Orf2798, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 95% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и в которой сохраняется сериновый остаток в положении аминокислоты 2; Orf3866, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 95% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, и в которой сохраняется треониновый остаток в положении аминокислоты 124; Orf5175, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 95% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, и в которой сохраняется сериновый остаток в положении аминокислоты 91; и Orf5387, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 95% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, и в которой сохраняется сериновый остаток в положении аминокислоты 164. В некоторых вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus, кроме того: (i) содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую Orf4755 и включающую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9, вместо нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 23; и/или (ii) не содержит функционального белка Orf682; и/или (iii) не содержит функционального белка Orf4868. В конкретных вариантах этого типа, отсутствие функционального белка Orf682 и/или отсутствие функционального белка Orf4868 обусловлено мутацией со сдвигом рамки считывания в гене, который кодирует белок Orf682 и/или белок Orf4868.
В конкретных вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus кодирует один или более или все из следующих белков: Orf2798, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 98% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и в которой сохраняется сериновый остаток в положении аминокислоты 2; Orf3866, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 98% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, и в которой сохраняется треониновый остаток в положении аминокислоты 124; Orf5175, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 98% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, и в которой сохраняется сериновый остаток в положении аминокислоты 91; и Orf5387, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 98% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, и в которой сохраняется сериновый остаток в положении аминокислоты 164. В некоторых вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus кроме того: (i) содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую Orf4755 и включающую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9, вместо нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 23; и/или (ii) не содержит функционального белка Orf682; и/или (iii) не содержит функционального белка Orf4868. В конкретных вариантах этого типа, отсутствие функционального белка Orf682 и/или отсутствие функционального белка Orf4868 обусловлено мутацией со сдвигом рамки считывания в гене, который кодирует белок Orf682 и/или белок Orf4868.
В других вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus кодирует один или более или все из следующих белков: Orf2798, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 99% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и в которой сохраняется сериновый остаток в положении аминокислоты 2; Orf3866, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 99% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, и в которой сохраняется треониновый остаток в положении аминокислоты 124; Orf5175, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 99% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, и в которой сохраняется сериновый остаток в положении аминокислоты 91; и Orf5387, имеющий аминокислотную последовательность, которая на 99% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, и в которой сохраняется сериновый остаток в положении аминокислоты 164. В некоторых вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus кроме того: (i) содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую Orf4755 и включающую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9, вместо нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 23; и/или (ii) не содержит функционального белка Orf682; и/или (iii) не содержит функционального белка Orf4868. В конкретных вариантах этого типа, отсутствие функционального белка Orf682 и/или отсутствие функционального белка Orf4868 обусловлено мутацией со сдвигом рамки считывания в гене, который кодирует белок Orf682 и/или белок Orf4868.
В других вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus кодирует один или более или все из следующих белков: Orf2798, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; Orf3866, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; Orf5175, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и Orf5387, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus кроме того: (i) содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую Orf4755 и включающую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9, вместо нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 23; и/или (ii) не содержит функционального белка Orf682; и/или (iii) не содержит функционального белка Orf4868. В конкретных вариантах этого типа, отсутствие функционального белка Orf682 и/или отсутствие функционального белка Orf4868 обусловлено мутацией со сдвигом рамки считывания в гене, который кодирует белок Orf682 и/или белок Orf4868.
В родственных вариантах осуществления изобретения, модифицированный Streptomyces fungicidicus: (i) содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую Orf4755 и включающую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9, вместо нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 23; и/или (ii) не содержит функционального белка Orf682; и/или (iii) не содержит функционального белка Orf4868. В конкретных вариантах этого типа, отсутствие функционального белка Orf682 и/или отсутствие функционального белка Orf4868 обусловлено мутацией со сдвигом рамки считывания в гене, который кодирует белок Orf682 и/или белок Orf4868.
В конкретных вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus обладает иммуногенными и/или физическими и/или генетическими свойствами модифицированного изолята Streptomyces fungicidicus, имеющего депозитарный номер ATCC PTA-122342. В более конкретных вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus представляет собой изолят, имеющий депозитарный номер ATCC PTA-122342, или потомство и/или производное изолята, имеющего депозитарный номер ATCC PTA-122342. В родственном аспекте изобретения, все модифицированные Streptomyces fungicidicus согласно изобретению также рассматриваются как выделенные модифицированные изоляты Streptomyces fungicidicus.
В настоящее изобретение также входят наборы праймеров, имеющие нуклеотидные последовательности: SEQ ID NO: 29 и 30; SEQ ID NO: 31 и 32; SEQ ID NO: 33 и 34; SEQ ID NO: 35 и 36; SEQ ID NO: 37 и 38; SEQ ID NO: 39 и 40; SEQ ID NO: 41 и 42; SEQ ID NO: 43 и 44; SEQ ID NO: 45 и 46; SEQ ID NO: 47 и 48; SEQ ID NO: 49 и 50; и/или любые их комбинации. Кроме того, наборы, содержащие один или более из таких наборов праймеров, также являются частью настоящего изобретения. Кроме того, в настоящее изобретение входит применение этих праймеров в анализе на идентификацию генома Streptomyces fungicidicus согласно изобретению.
Эти и другие аспекты настоящего изобретения будут более поняты со ссылкой на Чертежи, Подробное описание и Примеры.
Краткое описание чертежа
На фиг.1 показано положение 11 полиморфизмов на геноме S. fungicidicus BM38, используемых в качестве маркеров мутации для ПЦР-скрининга, описанного ниже в Примерах.
Подробное описание изобретения
Получение вторичных бактериальных метаболитов или натуральных продуктов для их применения в коммерческих целях, например, в медицине или сельском хозяйстве, связано с такими проблемами, как низкие выходы нужного продукта из родительского микроорганизма/микроорганизма дикого типа. В последние десятилетия, благодаря прогрессу в понимании природы биосинтеза натурального продукта стало очевидным, что продуцирование вторичных метаболитов может регулироваться и контролироваться несколькими способами. В большинстве случаев, гены биосинтеза бактериальных природных продуктов, включая гены, ответственные за образование предшественника, структурную сборку, модификацию после сборки, ауторезистентность и регуляцию, образуют кластеры на бактериальной хромосоме. Биосинтез природных продуктов может быть вызван как внеклеточными, так и внутриклеточными сигнальными молекулами, которые взаимодействуют с путь-специфически регуляторами или плейотропными регуляторами, которые регулируют продуцирование более, чем одного продукта. Мутации, происходящие в любом из этих регуляторных генов или систем, могут повышать, снижать или прекращать продуцирование антибиотиков.
Улучшение штамма может играть определенную роль в экономически эффективном промышленном производстве антибиотиков или других вторичных микробных метаболитов. Мутантные штаммы, способные давать повышенные выходы конкретных метаболитов, могут быть созданы посредством случайных мутаций, путем направленной дизрупции специфических генов или путем введения гена(ов), который(е) устраняет(ют) нарушения пути биосинтеза. Было подтверждено, что генетические манипуляции регуляторных генов, а также генов биосинтеза для гиперпродуцирования специфических вторичных метаболитов, представляют собой эффективную и успешную стратегию улучшения штаммов актиномицетов. В конкретном аспекте изобретения были идентифицированы ключевые кодирующие последовательности Streptomyces fungicidicus, которые, при их модификации и/или элиминации дают изоляты с улучшенными свойствами, позволяющими осуществлять биосинтез и/или продуцирование эндурацидина в коммерческих целях.
Последовательность ДНК размером в 116 тысяч пар оснований, происходящая от штамма S. fungicidicus ATCC 21013 дикого типа, который имеет кластер гена биосинтеза эндурацидина и его фланкирующие области, была уже описана в литературе [в патенте США 8188245, который во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки] и имеется в GenBank [рег.No. DQ403252]. Как показано ниже, была определена общая геномная последовательность BM38-2 (ATCC NO. PTA-122342), и эту последовательность сравнивали с геномом дикого типа. Такой сравнительный анализ позволил идентифицировать по меньшей мере 77 полиморфизмов или мутационных различий между геномами, и провести отбор семи (7) ключевых открытых рамок считывания, которые относятся к улучшенным свойствам ATCC NO. PTA-122342, как показано ниже. Однако было неожиданно обнаружено, что ни одна из этих семи ключевых открытых рамок считывания не ассоциируется с кластером гена биосинтеза эндурацидина и его фланкирующими областями хромосомы S. fungicidicus. Однако независимо от этого, модификация этих семи ключевых открытых рамок считывания позволяет облегчить конструирование новых модифицированных изолятов Streptomyces fungicidicus с помощью стандартной рекомбинантной технологии, и эти изоляты будут иметь свойства, сравнимые со свойствами уже известных изолятов, или даже будут обладать гораздо лучшими свойствами.
Использование терминов в единственном числе для удобства описания никоим образом не должно рассматриваться как ограничение объема изобретения. Так, например, термин «изолят» включает один или более таких изолятов, если это не оговорено особо. Использование терминов во множественном числе также не должно рассматриваться как ограничение объема изобретения, если это не оговорено особо.
Используемый здесь термин «приблизительно» является синонимом термина «около» и обычно означает величину в пределах двадцати пяти процентов от указанной величины, если это не оговорено особо, например, увеличение уровня продуцирования эндурацидина «приблизительно» в 4 раза может означать увеличение продуцирования в 3-5 раз.
Используемая здесь одна аминокислотная последовательность является на 100% «идентичной» второй аминокислотной последовательности, если аминокислотные остатки обеих последовательностей являются идентичными. В соответствии с этим, аминокислотная последовательность является на 50% «идентичной» второй аминокислотной последовательности, если 50% аминокислотных остатков двух аминокислотных последовательностей являются идентичными. Сравнения последовательностей осуществляют по всей непрерывной последовательности аминокислотных остатков, содержащихся в данном белке, например, в сравниваемом белке или в части полипептида. В конкретном варианте осуществления изобретения, во внимание принимаются также выбранные делеции или инсерции, которые могут как-либо иначе влиять на соответствие между двумя аминокислотными последовательностями.
Процент идентичности используемых здесь нуклеотидных и аминокислотных последовательностей может быть определен с помощью алгоритма C, MacVector (MacVector, Inc. Cary, NC 27519), Vector NTI (Informax, Inc. MD), Oxford Molecular Group PLC (1996) и Clustal W, где параметры выравнивания и параметры оценки идентичности используются по умолчанию. Эти коммерчески доступные программы могут быть также применены для определения сходства последовательностей с использованием тех же самых или аналогичных параметров по умолчанию. Альтернативно, может быть проведен поиск с помощью модифицированной программы Blast в условиях фильтрации по умолчанию, например, с использованием программы Pileup GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin) с параметрами по умолчанию.
Используемый здесь микроорганизм, который «не содержит функционального» полипептида, или в котором «отсутствует функциональный» полипептид (например, Orf682), представляет собой микроорганизм, который не экспрессирует этот полипептид и/или экспрессирует модифицированный полипептид, природная биологическая функция которого составляет максимум 10% от природной биологической функции соответствующего полипептида дикого типа, например, усеченного фермента, который обладает ферментативной активностью (например, ферментативной эффективностью, то есть Vmax/Km) по отношению к его природному субстрату, где такая активность составляет максимум 10% от активности соответствующего фермента дикого типа, как было определено путем проведения стандартного анализа в тех же самых условиях. В конкретных вариантах осуществления изобретения, «отсутствие функционального» полипептида в микроорганизме эквивалентно отсутствию конкретной биологической функции этого полипептида.
Используемая здесь открытая рамка считывания, которая является «отключенной», была модифицирована, например, путем введения делеции в рамку считывания, сдвига рамки считывания, инсерции и/или точковой мутации, в результате чего микроорганизм, который содержит «отключенную» открытую рамку считывания, вообще не экспрессирует полипептид, кодируемый соответствующей рамкой считывания дикого типа и/или экспрессирует модифицированный полипептид, природная биологическая функция которого составляет максимум 10% от природной биологической функции соответствующего полипептида дикого типа. В конкретных вариантах осуществления изобретения, в микроорганизме, содержащем «отключенную» открытую рамку считывания, наблюдается отсутствие конкретной биологической функции полипептида, кодируемого открытой рамкой считывания дикого типа.
Используемый здесь термин «генный кластер» означает набор генетических элементов, сгруппированных вместе на хромосоме, где белковые продукты этих кластеров обладают родственной функцией, такой как способность осуществлять природный путь биосинтеза продукта.
Консервативной заменой является аминокислотная замена, которая, по существу, не влияет на активность (специфичность или аффинность связывания) молекулы. Обычно, консервативные аминокислотные замены включают замены одной аминокислоты на другую аминокислоту с теми же самыми химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью). В нижеследующей таблице представлены репрезентативные консервативные аминокислотные замены:
Исходный остаток
Консервативные замены
Исходный остаток
Консервативные замены
Ser
Leu
Ile; Val
Arg
Arg; Gln; Glu
Asn
Gln; His
Met
Leu; Ile
Asp
Glu
Phe
Met; Leu; Tyr
Cys
Ser
Ser
Thr
Gln
Asn
Thr
Ser
Glu
Asp
Trp
Tyr
Gly
Pro
Tyr
Trp; Phe
His
Asn; Gln
Val
Ile; Leu
Получение модифицированного Streptomyces fungicidicus
nd
rd
th
Подходящие методы и материалы для осуществления раскрытых вариантов изобретения описаны ниже. Кроме того, осуществление раскрытых вариантов изобретения может быть проведено с применением любых соответствующих методов или технологий, хорошо известных специалистам. Некоторые стандартные методы и технологии согласно изобретению описаны, например, в руководствах Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 ed., Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (и Дополнение к изданию 2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4 ed., Wiley & Sons, 1999; Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990; Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999; и Kieser, T., Bibb, M.J., Buttner, M.J., Chater, K.F., and Hopwood, D.A.: Practical Streptomyces genetics, John Innes Centre, Norwich Research Park, Colney, Norwich NR4 &UH, England, 2000.
hrdB
tcp830
Рекомбинантные экспрессионные плазмидные векторы Streptomyces fungicidicus могут быть получены для их применения в целях создания модифицированных изолятов Streptomyces fungicidicus согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сконструированный рекомбинантный вектор Streptomyces fungicidicus содержит по меньшей мере одну отобранную открытую рамку считывания Streptomyces fungicidicus. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сконструированный рекомбинантный вектор Streptomyces fungicidicus содержит по меньшей мере одну отобранную открытую рамку считывания Streptomyces fungicidicus, экспрессируемую под контролем промотора. В других вариантах осуществления изобретения, промотором является сильный конститутивный промотор Streptomyces, который способствует усилению продуцирования эндурацидина, если вектор экспрессируется в штамме Streptomyces fungicidicus. В некоторых вариантах осуществления изобретения, открытая рамка считывания, вместо собственного нативного промотора, функционально присоединена к гетерологичному промотору. Так, например, она может быть функционально присоединена к конститутивному промотору, такому как сильный конститутивный экспрессионный промотор или индуцибельный промотор. В конкретных вариантах осуществления изобретения, сильным конститутивным промотором является ermE*p, происходящий от продуцента эритромицина, Saccharopolyspora erythraea. В других вариантах, индуцибельным промотором является индуцибельный промотор тиострептона, tipA. В других вариантах осуществления изобретения используется система P(nitA)-NitR [Herai et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 101(39):14031-14035 (2004)] или промотор стрептомицетов SF14. В других вариантах осуществления изобретения используется нативный промотор гена резистентности к апрамицину amRp.В других вариантах осуществления изобретения используются P, P и/или Pneos. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сконструированный рекомбинантный вектор содержит открытую рамку считывания orf2798, включающую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, и/или открытую рамку считывания orf682, которая была «отключена».
hrdB
tcp830
В соответствии с этим могут быть сконструированы рекомбинантные штаммы Streptomyces fungicidicus, способные давать более высокие выходы эндурацидина по сравнению со штаммом Streptomyces fungicidicus дикого типа. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сконструированный рекомбинантный штамм Streptomyces fungicidicus содержит по меньшей мере одну отобранную открытую рамку считывания Streptomyces fungicidicus, введенную в хромосому и экспрессируемую под контролем промотора, такого как сильный конститутивный экспрессионный промотор Streptomyces, который способствует повышению уровня продуцирования эндурацидина в сконструированном штамме. В других вариантах осуществления изобретения, экспрессия введенной открытой рамки считывания в Streptomyces fungicidicus индуцируется не собственным нативным промотором, а гетерологичным промотором. Так, например, она может быть функционально присоединена к конститутивному промотору, такому как сильный конститутивный экспрессионный промотор или индуцибельный промотор. В некоторых вариантах осуществления изобретения, сильным конститутивным промотором является ermE*p.В других вариантах осуществления изобретения, индуцибельным промотором является tipA. В некоторых примерах используется система P(nitA)-NitR [см. выше] или промотор SF14. В других вариантах осуществления изобретения, конститутивным экспрессионным промотором является amRp.В других вариантах осуществления изобретения используются промоторы P, P и/или Pneos.
hrdB
tcp830
В некоторых вариантах осуществления изобретения, сконструированный штамм содержит открытую рамку считывания orf3866 Streptomyces fungicidicus. В конкретных вариантах этого типа, открытая рамка считывания orf3866 функционально присоединена к гетерологичному промотору. Так, например, она может быть присоединена к сильному конститутивному промотору, такому как ermE*p.В других примерах, открытая рамка считывания orf3866 функционально присоединена к промотору tipA, SF14, amRp, P, P и/или Pneos.
В других вариантах осуществления изобретения, сконструированый штамм кодирует измененную открытую рамку считывания orf4868. Открытая рамка считывания orf4868 может быть отключена посредством инсерционной дизрупции, делеции в рамке считывания, сдвига рамки считывания и/или точковой мутации. В некоторых примерах, открытая рамка считывания orf4868 отключена посредством делеции в рамке считывания. Вообще говоря, любая внутренняя делеция рамки считывания orf4868, из-за ее дефекта, должна приводить к отключению функции orf4868. В родственных вариантах осуществления изобретения, сконструированный штамм включает две, три, четыре, пять, шесть, семь или более открытых рамок считывания Streptomyces fungicidicus.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus происходит от родительского штамма дикого типа, такого как, но не ограничивающегося ими, Streptomyces fungicidicus, имеющийся в Американской коллекции тканевых культур (ATCC) No. 21013. В других вариантах осуществления изобретения, сконструированный штамм Streptomyces fungicidicus происходит от стандартных мутантных штаммов, таких как, но не ограничивающихся ими, штаммы Streptomyces fungicidicus ATCC 31729, Streptomyces fungicidicus ATCC 31730 и Streptomyces fungicidicus ATCC 31731.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, уровень продуцирования эндурацидина по меньшей мере в 1,2 раза, например, по меньшей мере в 1,5 раза, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 2,5 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 3,5 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 4,5 раза, включая, но не ограничиваясь ими, в 1,2-10 раз, 1,2-4,6 раз и приблизительно в 2-5 раз превышает уровень продуцирования эндурацидина по сравнению со штаммом Streptomyces fungicidicus дикого типа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, модифицированный Streptomyces fungicidicus может быть сконструирован путем интеграции рекомбинантной плазмиды, содержащей по меньшей мере одну открытую рамку считывания, усиливающую продуцирование эндурацидина, в хромосому родительского штамма Streptomyces fungicidicus. Интегрированный сопряженный вектор может иметь, или может быть сконструирован так, чтобы он имел сильный конститутивный промотор Streptomyces. В некоторых вариантах осуществления изобретения, плазмида может не содержать репликона стрептомицетов и может быть интегрирована в хромосому посредством гомологичной рекомбинации под действием одного сайт-специфического кроссинговера. В других вариантах осуществления изобретения, плазмида может присутствовать в виде свободной плазмиды. В некоторых вариантах осуществления изобретения, может быть сконструирован сопряженный вектор, в котором плазмидная вставка имеет частично или полностью делетированный представляющий интерес ген и его фланкирующие области, которые могут быть интегрированы в хромосому после двойной гомологичной рекомбинации посредством кроссинговера с образованием мутанта, имеющего делецию в рамке считывания.
Продуцирование эндурацидина из рекомбинантных штаммов Streptomyces fungicidicus
Рекомбинантные штаммы Streptomyces fungicidicus, раскрываемые в настоящей заявке, были использованы для разработки способов получения повышенных уровней эндурацидина. Технический прогресс в данной области позволяет значительно сэкономить затраты, связанные с производством эндурацидина. В некоторых вариантах осуществления изобретения, способ получения эндурацидина включает культивирование раскрытого здесь рекомбинантного штамма Streptomyces fungicidicus в условиях, достаточных для получения эндурацидина. В других вариантах осуществления изобретения, этот способ также включает выделение эндурацидина из культуральной среды после культивирования. В других вариантах осуществления изобретения, способ также содержит определение антибактериальной активности полученного эндурацидина, например, с помощью ВЭЖХ-анализа или биоанализа с использованием S. aureus ATCC 29213 или Bacillis subtilis ATCC 6633 с указанием микроорганизмов.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, эндурацидин получают с использованием раскрытого здесь штамма Streptomyces fungicidicus в условиях ферментации, описанных ранее для получения эндурацидина [Higashide et al., J. Antibiot. 21:126-137 (1968)]. После получения, соединения могут быть очищены и/или проанализированы с помощью ВЭЖХ-анализа. Методы получения эндурацидина и сбора этого соединения из культуральной среды можно найти в патенте США 4465771, который во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.
В конкретных вариантах осуществления изобретения, раскрытый здесь изолят Streptomyces fungicidicus согласно изобретению культивируют в бульоне из триптона и сои (TSB) на шейкере (таком как шейкер, работающий на 225 об/мин и при 30°C в течение 48 часов), а затем переносят в среду для продуцирования эндурацидина (EPM, см. ниже Таблицу 1) на определенный период времени проведения непрерывной ферментации, например, по меньшей мере на пять дней и до одиннадцати дней, включая 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 дней непрерывной ферментации. В более конкретных вариантах осуществления изобретения, получение эндурацидина с использованием штаммов дикого типа и их производных осуществляют в автоматических ферментерах.
Таблица 1
Состав среды для получения эндурацидина (EPM) (pH 6,7)
Растворимый крахмал
1,5
KH<sub>2</sub>PO4
0,05
Глюкоза
1,0
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
0,15
Кукурузная мука
2,5
CaCO<sub>3</sub>
0,5
Мука из кукурузного глютена
2,0
Лактоза
0,5
Кукурузный жидкий сироп
0,25
ZnCl<sub>2</sub>
0,005
Хлорид натрия
0,25
Куриный жир
0,7
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
1,3
Таблица 2
Список последовательностей
SEQ ID NO:
Открытая рамка считывания
Тип
SEQ ID NO:
Открытая рамка считывания
Тип
ATCC No. PTA-122342
WT B 5477
1
Orf2798
NA
15
Orf2798
NA
2
Orf2798
AA
16
Orf2798
AA
3
Orf3866
NA
17
Orf3866
NA
4
Orf3866
AA
18
Orf3866
AA
5
Orf 5175
NA
19
Orf 5175
NA
6
Orf 5175
AA
20
Orf 5175
AA
7
Orf5387
NA
21
Orf5387
NA
8
Orf5387
AA
22
Orf5387
AA
9
Orf4755
NA
23
Orf4755
NA
10
Orf4755
AA
24
Orf4755
AA
11
Orf682
NA
25
Orf682
NA
12
Orf682
AA
26
Orf682
AA
13
Orf4868
NA
27
Orf4868
NA
14
Orf4868
AA
28
Orf4868
AA
AA означает аминокислотную последовательность; NA означает последовательность нуклеиновой кислоты.
Биологический депозит
Культуры нижеследующего биологического материала были депонированы в нижеследующем Международном депозитарии: Американской коллекции типовых культур (ATCC) 10801, University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, U.S.A., в условиях, удовлетворяющих требованиям Будапештского договора.
Организм
Регистрационный No.
Дата депонирования
Streptomyces fungicidicus(BM38-2)
PTA-122342
5 августа 2015
Настоящее изобретение будет более очевидным со ссылкой на нижеследующие неограничивающие примеры, которые представлены как репрезентативные. Нижеследующие примеры приводятся для более полной иллюстрации предпочтительных вариантов осуществления изобретения. Однако эти примеры никоим образом не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения.
Примеры
Пример 1
Модифицированный изолят Streptomyces fungicidicus
Получение биомассы Streptomyces fungicidicus для ее применения в целях биосинтеза эндурацидина
Ферментация Streptomyces fungicidicus может быть проведена в глубоких промышленных ферментерах резервуарного типа, прошедших санитарную обработку и снабженных системами мониторинга и контроля рН, температуры, кислорода, аэрации и встряхивания. Каждую ферментированную партию S. fungicidicus берут из охарактеризованной и регулируемой рабочей посевной маточной культуры для продуцирования, хранящейся в охраняемом помещении в условиях низких температур. Процесс ферментации осуществляют в три стадии с последующим проведением дополнительной обработки, описанной ниже:
Стадия I:
7
10
Рабочие посевные культуры, содержащие 10-10 спор/мл, могут быть использованы для инициации продуцирования партий ферментации. 1-5 сосудов с замороженнй посевной культурой, хранящейся при низкой температуре, вынимают и либо оттаивают на лабораторном столике, либо помещают на водяную баню при 28-32°C до оттаивания содержимого сосудов. Оттаянную(ые) культуру(ы) асептически переносят в 800-1000 мл стерильной воды, хранящейся при комнатной температуре, и осторожно перемешивают для ресуспендирования культуры.
Стадия II:
2
3
Ресуспендированную культуру асептически переносят в посевную среду. Посевная среда состоит из глюкозы (0,5 г/л), декстрина (2,5 г/л), жидкого кукурузного сиропа (1,0-4,0 мл/л), соевого порошка (3,0 г/л), сульфата аммония (0,25 г/л), монофосфата калия (0,13-0,54 г/л), сульфата железа (0,00-0,5 г/л), гидроксида калия (0,13 мл/л), осажденного карбоната кальция (1,5 г/л), противовспенивающего агента на основе кремния (0,1 мл/л) и воды, добавляемой в достаточном количестве. Среду стерилизуют при 125°С в течение 45 минут, а затем охлаждают до 28°С.Объем среды регулируют с использованием стерильной воды до получения нужного рабочего объема. рН доводят до 6,6-6,8. Рабочие параметры промышленного посевного цикла включают: температуру инкубирования 28°С±2°С, внутреннее давление 0,5-1,5 кг/см, скорость аэрации 2-4 Нм/мин, и скорость перемешивания приблизительно 80 оборотов в минуту, в зависимости от размера и конфигурации сосуда. Затем проводят мониторинг рН и потребления кислорода и мониторинг вязкости, но эти параметры не регулируют. Культивирование осуществляют в течение 50-60 часов, а затем переносят в основной ферментер для получения культуры. Вязкость в момент переноса должна составлять в пределах 350-600 сП, а рН должен составлять ≤6,0, при этом, потребление кислорода должно увеличиваться. Посевную культуру асептически переносят в основную среду для ферментации в целях завершения цикла ферментации.
Стадия III:
Состав среды в основном ферментере для получения культуры включает: кукурузную муку (13,0-15,0 мас./об.%), кукурузную глютеновую муку (3,0-6,0% мас./об.), муку из семян хлопчатника (0,3 мас./об.%), жидкий кукурузный сироп (0-0,6 об./об.%), хлорид натрия (0,3% мас./об.), сульфат аммония (0,25-0,6 мас./об.%), молочную кислоту (0-0,5 об./об.%), хлорид цинка (0,01% мас./об.), сульфат железа (0,0-0,02% мас./об.), гидроксид калия (0,20-0,5 об./об.%), сульфат кальция (0,0-0,5% мас./об.), осажденный карбонат кальция (0,5% мас./об.), альфа-амилазу (0,056% мас./об.), гидроксид калия (0,05 об./об.%), соевое масло (0,5-2,0 об./об.%), противовспенивающий агент и достаточное количество воды. Ингредиенты добавляют в указанном порядке. Воду добавляют к ингредиентам вплоть до введения альфа-амилазы, а затем полученную композицию нагревают до 80°С в течение 15 минут для того, чтобы фермент разлагал сложные углеводы. После этого добавляют остальные ингредиенты, рН доводят до pH 6,6-6,8, и добавляют достаточное количество воды. Среду стерилизуют при 125°С в течение 45 минут, охлаждают до 28°C, и добавляют воду в количестве, достаточном для достижения желаемого рабочего объема.
3
2
3
3
2
2
Содержимое ферментера для посева переносят в основную среду для ферментации, и в ферментере создают следующие условия: температуру 28°С, скорость аэрации 40 Нм/мин, внутреннее давление 0,5 кг/см, и скорость аэрации, эквивалентную скорости, установленной приблизительно на 1,85 кВт/м. Рабочие условия изменяют через два часа после начала цикла ферментации путем доведения уровня растворенного кислорода до 12,75 м.д., повышения скорости аэрации до 50 Нм/мин, и увеличения внутреннего давления до 0,7 кг/см. После этого, скорость аэрации, внутреннее давление и скорость перемешивания корректируют для гарантии того, что уровень растворенного кислорода не будет скорость-ограничивающим. В культуру добавляют стерильную воду, если вязкость повышается до точки, при которой наблюдается ограничение уровня растворенного кислорода. В течение всего цикла, тщательно регулируют пенообразование для предотвращения загрязнения или оттока культуры. Приблизительно через 3 часа после увеличения подаваемого кислорода начинают осуществлять регуляцию рН. В течение всего цикла ферментации осуществляют регуляцию и/или мониторинг следующих параметров: рН, аэрации, растворенного кислорода, CО, вязкости, чистоты, скорости перемешивания, внутреннего давления и остаточного сахара. До прекращения роста бактерий, рН поддерживают на уровне 6,8, а затем его можно изменять вплоть до сбора. Типичный цикл ферментации составляет 220-300 часов. Культура считается готовой для сбора, если активность при биоанализе превышает 5000 мкг/л, рН повышается до рН 7,5 или более, вязкость уменьшается, а потребление кислорода прекращается. Культуру после ферментации собирают путем нагревания культуры до 70°С в течение 30 минут для инактивации бактерий, а затем собранную жидкость охлаждают до 25°-28°С.
Последующая обработка:
Из биомассы удаляют воду, после чего биомассу сушат, а затем формуют в предварительную смесь.
Пример 2
Эффект оптимизации продуцирования эндурацидина штаммом Streptomyces fungicidicus
В последние годы было достигнуто увеличение выходов путем обработки родительского штамма (как указано в Таблице 3). Штамм BM38-2 (РОТ-122342) дает самые высокие выходы эндурацидина. Штамм был оптимизирован путем обработки GAB-453 (ATCC 31729) с использованием ряда обработок с использованием методов культивирования и физических методов.
Таблица 3
Увеличение выхода Streptomyces fungicidicus B-54577
ATCC No.
Штамм
Обработка
Выход мкг/мл
ATCC 21013(Ранее раскрытый)
B-5477
Родительский штамм дикого типа
730
ATCC 21014(Ранее раскрытый)
B-5477m
γ-облучение
-
ATCC 31729(Ранее раскрытый)
GAB-453
УФ-облучение
1290
ATCC 31730(Ранее раскрытый)
Emt 36-3
м-фтор-DL-тирозин
2560
ATCC 31731(Ранее раскрытый)
Emt 2-140
N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин+м-фтор-DL-тирозин
4360
PTA-122342 (Ранее не раскрытый)
BM38-2
Множество обработок с использованием методов культивирования и физических методов
9690
Ссылка: Патент 4465771; APR 14, 1984, Nogami, et.al. Takeda Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan.
Ссылка: Патент 3577530, 4 мая 1971, для ATCC 21388.
1. ATCC 21013: Исходный штамм Streptomyces fungicidicus B-5477 дикого типа, депонированный Takeda.
2. ATCC 21014: мутант, полученный путем γ-облучения штамма B-5477 и обозначенный как B-5477m, депонированный Takeda.
3. ATCC 31729: мутант, полученный путем УФ-облучения штамма B-5477 и обозначенный как GAB-453, депонированный Takeda.
4. ATCC 31730: мутант, полученный путем культивирования B-5477 на агаровых планшетах, содержащих м-фтор-DL-тирозин (MFT); мутант, обозначенный как Emt-36-3, депонированный Takeda.
5. ATCC 31731: двойной мутант, полученный путем обработки GAB-453 сначала N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанилином, а затем м-фтор-DL-тирозином (MFT) с получением мутантного штамма, обозначенного как Emt 2-140 и депонированного Takeda.
6. ATCC 21388: штамм, близкородственный штамму Streptomyces fungicidicus (S. macrosporeus) и депонированный Squibb & Sons.
Ниже представлены энрамицины в порядке снижения выхода биосинтеза от самого высокого до самого низкого:
ATCC No. PTA-122342>ATCC 31731>ATCC 31730>ATCC 31729>ATCC 21013 и ATCC 21014.
Примечательно то, что количество полученного эндурацидина ATCC PTA-122342 более чем в два раза превышает количество следующего по продуктивности изолята, и более, чем в 12 раз превышает количество эндурацидина по сравнению с родительским штаммом дикого типа.
Пример 3
Геномный анализ изолятов Streptomyces fungicidicus
Был проведен сравнительный геномный анализ штамма Streptomyces fungicidicus дикого типа, АТСС 21013 (В-5477), и производного штамма согласно изобретению, BM38-2, который включал области вокруг кластера гена биосинтеза эндурацидина (энрамицина).
Было идентифицировано всего 77 вариантов последовательностей ДНК, отличающихся по эффектам модификации физическими методами и методами культивирования родительского штамма В-5477. Информация, полученная в результате геномного анализа, позволила провести быстрое и окончательное сравнение штаммов путем отбора 11 репрезентативных вариантов, расположенных по всему геному BM38-2, как маркеров мутации (см. фиг. 1). Для каждого из маркеров мутации были сконструированы ПЦР-праймеры, которые амплифицируют фрагменты ДНК, содержащие сайты мутации, для последующего секвенирования и сравнения (см. Таблицу 4).
ПЦР-праймеры, нацеленные на маркерные области, были использованы для анализа пяти (5) штаммов, продуцирующих энрамицин, и одного (1) близкородственного штамма, имеющегося в АТСС, включая штаммы дикого типа и мутанты, депонированные Takeda, и эти штаммы сравнивали со штаммом BM38-2. В Таблице 5 систематизированы результаты и представлены ДНК-сигнатуры для 11 маркеров мутации.
Таблица 4
Наборы ПЦР-праймеров (с их соответствующими SEQ ID NN:), используемых для амплификации 11 маркеров мутации, расположенных на геноме S. fungicidicus BM38
Марк. мут.No.<sup>#</sup>
SEQ ID №
Последовательность WT<sup>†</sup>
ПоследовательностьBM38-2
Праймер
SEQ праймеров
Размер продукта<sup>*</sup> (п.о.)
1
29
G
A
SF1F
GGACGATGCCATCAAAACCG
737
30
SF1R
ACTGCTTGATCACCGAGGTG
2
31
AC
TT
SF2F
CTGTTCAACCTGACCGGGAA
954
32
SF2R
GAAGACCACGACCTCGATGG
3
33
G
A
SF3F
GGGCAGGAGTTCTTGAGGAC
864
34
SF3R
CCACGTCAAGAACCTGGTGA
4
35
GA
AT
SF4F
GGCAAGTCGACCCTCATCAA
428
36
SF4R
ATGACCGAGAACAGCGTCTC
5
37
A
G
SF5F
CGCATCTGTTCCAGGCAATG
459
38
SF5R
TCATCGTGGCGCATAGGTAC
6
39
G
A
SF6F
TGTGGGGATGTCCTTCGGAA
173
40
SF6R
CGACGATGCCAAGAGACTGT
7
41
AGGGCG
CGGGCC
SF7F
GGACGATGCCATCAAAACCG
685
42
SF7R
ACTGCTTGATCACCGAGGTG
8
43
AT
GA
SF8F
TGCTGCTGTCGATCATGGAG
686
44
SF8R
AGGAAGGGCTGGTAGGTCAT
9
45
G
C
SF9F
CGAGTCCGAAGCAGAAGGAG
745
46
SF9R
GGGTCGGCAACATCTTCCTC
10
47
C
T
SF10F
GAGCACACGAGGACTGAGAG
976
48
SF10R
GTACCCCCTCATAGCGCTTC
11
49
C
T
SF11F
AGAAGTACGGGATTCGGGGA
1000
50
SF11R
ACTGCTTGATCACCGAGGTG
<sup># </sup>Маркер мутации No.; <sup>* </sup>Ожидаемый размер ПЦР-продукта;
<sup>† </sup>Штамм дикого типа (WT): ATCC 21013.
Таблица 5A
Анализ с использованием маркеров мутации для депонированных штаммов Streptomyces fungicidicus по сравнению с ATCC NO. PTA-122342
Маркер мутации No.
Родительский ATCC 21013 B-5477
ATCC 21014B-5477m
ATCC21388*
ATCC31729
ATCC31730
ATCC31731
PTA-122342
1
WT
WT
WT
WT
WT
WT
M
2
WT
WT
WT
WT
WT
WT
M
3
WT
WT
WT
M
WT
M
M
4
WT
WT
WT
WT
WT
WT
M
5
WT
WT
WT
M
M
M
M
6
WT
WT
WT
M
M
M
M
7
WT
WT
WT
WT
WT
WT
M
8
WT
WT
WT
WT
WT
WT
M
9
WT
WT
WT
WT
WT
WT
M
10
WT
M
M
M
M
WT
M
11
WT
WT
WT
WT
WT
WT
M
WT=Соответствует родительскому штамму дикого типа.
M=соответствует мутированной последовательности PTA-122342.
* Штамм S. macrosporeus, близкородственный штамму S. Fungicidicus.
Таблица 5B
Мутации, объединенные с BM38-2 или используемые в качестве маркеров для сравнения с помощью ПЦР
Нуклеотид No.
21013
31729
31730
31731
BM38-2
Маркер мутации No.
565,966
WT
M
WT
M
M
4
607,443
WT
M
M
M
M
608,938
WT
M
M
M
M
890,965
WT
M
WT
M
M
2,285,216
WT
WT
WT
WT
M
2,387,796
WT
WT
WT
WT
M
7
2,387,801
WT
WT
WT
WT
M
7
2,659,327
WT
M
M
M
M
2,900,485
WT
M
M
M
M
2,963,171
WT
WT
WT
WT
M
1
3,147,522
WT
M
M
M
M
3,164,639
WT
WT
WT
WT
M
8
3,358,400
WT
M
M
M
M
3,391,492
WT
M
M
M
M
3,428,632
WT
WT
WT
M
M
3,556,837
WT
M
M
M
M
3,607,398
WT
M
M
M
M
3,651,914
WT
M
M
M
M
3,743,503
WT
M
M
M
M
3,823,662
WT
M
M
M
M
4,046,322
WT
WT
WT
M
M
4,158,534
WT
M
M
M
M
4,225,769
WT
M
M
M
M
4,281,871
WT
M
M
M
M
4,294,357
WT
M
M
M
M
4,310,521
WT
M
M
M
M
10
4,449,891
WT
WT
WT
WT
M
6
4,450,937
WT
M
M
M
M
4,458,773
WT
M
M
M
M
4,462,128
WT
M
M
M
M
4,478,416
WT
M
M
M
M
4,954,366
WT
WT
WT
M
M
4,989,329
WT
M
M
M
M
5,259,346
WT
WT
WT
WT
M
5,340,994
WT
M
M
M
M
5
5,349,716
WT
M
WT
M
M
3
5,757,177
WT
WT
WT
WT
M
11
5,906,501
WT
WT
WT
WT
M
2
5,947,737
WT
M
M
M
M
6,140,913
WT
M
M
M
M
6,260,317
WT
M
M
M
M
6,703,003
WT
M
M
M
M
6,706,989
WT
M
M
M
M
7,321,611
WT
WT
WT
WT
M
9
WT=Соответствует родительскому штамму дикого типа.
M=соответствует мутированной последовательности PTA-122342.
В таблицах 5A-5B идентифицированы генетические различия между родительским штаммом (ATCC 21013 B-5477) и уже описанными штаммами. Большинство из этих уже описанных штаммов представляют собой производные штаммов ATCC 21013 B-5477, которые были получены путем модификации методом культивирования и/или физическим методом. Наиболее явные генетические различия были обнаружены для BM38-2 (ATCC No. PTA-122342). Очевидно, что праймеры, представленные в Таблице 4, могут быть также использованы для точной идентификации отличий BM38-2 (PTA-122342) от других штаммов Streptomyces fungicidicus и/или близкородственных штаммов Streptomyces sp.
Пример 4
Анализ отобранных мутаций в S. fungicidicus BM38-2
Промышленный штамм S. fungicidicus ATCC No. PTA-122342 был получен путем проведения повторных раундов мутагенеза с последующим отбором мутантов, продуцирующих высокие уровни энрамицина. Для получения информации о мутациях, введенных в штамм ATCC No. PTA-122342, который может давать повышенные уровни энрамицина, была определена общая геномная последовательность ATCC No. PTA-122342, и эту последовательность сравнивали с ее предшественником S. fungicidicus дикого типа. Этот сравнительный анализ позволяет идентифицировать по меньшей мере 77 полиморфизмов или мутационных отличий между двумя геномами. Неожиданно было обнаружено только одно различие в области хромосомы, несущей кластер гена биосинтеза энрамицина. Такое различие заключалось в замене одного нуклеотида в гене endC. Мутация нуклеотида C на T 6,260,317 в гене endC приводила к замене кодона CTC на кодон CTT, при условии, что молчащая мутация находится в кодонах для лейцина. Поэтому, маловероятно, что эта мутация играет значимую роль в явном увеличении выхода энрамицина, продуцируемого BM38-2. Отсутствие других мутаций в кластере гена энрамицина указывает на то, что хромосомные замены, ответственные за увеличение выхода энрамицина, продуцируемого BM38-2, могут сохраняться в плейотропных (не специфичных к определенному пути) регуляторных элементах или в общих регуляторных генах, расположенных в любом участке генома.
Было обнаружено, что несколько регуляторов ответа в актиномицетах влияют на биосинтез природного продукта более чем по одному пути. Ключевым примером является локус absA1A2, присутствующий в кластере гена CDA S. coelicolor, который кодирует двухкомпонентную систему передачи сигнала, аналогичную системе, присутствующей в кластере гена биосинтеза энрамицина на S. fungicidicus. Было показано, что фосфорилированная форма AbsA2 ингибирует продуцирование антибиотика благодаря непосредственному нарушению экспрессии путь-специфических регуляторов кластеров гена биосинтеза CDA, актинородина и ундецилпродигиозина. Мутации, которые ингибируют киназную активность AbsA2, повышают уровни продуцирования антибиотика. Другой пример плейотропной регуляции наблюдается в S. clavuligerus, где ген ccaR, присутствующий в кластере цефамицина С, кодирует регуляторный белок, регулирующий продуцирование цефамицина С и клавулановой кислоты.
Мутации в геноме ATCC No. PTA-122342, которые могут с наибольшей вероятностью повышать выходы энрамицина, могут присутствовать в генах, которые, как было предсказано с помощью биоинформационного анализа, кодируют регуляторные продукты, включая продукты, которые могут обладать плейотропными регуляторными свойствами. Ниже представлены примеры предполагаемых регуляторных генов, идентифицированных в геноме S. fungicidicus BM38-2, который имеет мутационные различия по сравнению со штаммом S. fungicidicus дикого типа [Мутационные различия в каждом из нижеследующих примеров показаны отсутствием звездочки, а отличающиеся/пропущенные/встроенные нуклеотиды показаны жирным шрифтом].
Сравнение последовательностей
orf682: Было предсказано, что этот ген кодирует регуляторный белок в семействе TetR, содержащем домен, связывающийся с ДНК, имеющей спираль-виток-спираль (HTH). Дополнительный G встроен в гомополимерную цепь, индуцирующую сдвиг рамки считывания.
>WT_682 транслированный генный продукт
VVSLTDKMSANAISDVWTAGGRRPLVMLRGGAEDGDGGASVRQTPVEALRQGTTGA GGLSLVERRKAALRFEIACAAVHLFTSQGVAATTGEQIAQSVGISSRTLWRHFPTKESCVLPLL TAALDFAVDRLRHWPAETSLLDFFAETCRKGDLPAATPEILDLIRMTSTEPALRAVWLQAHD DALPVLGGLLARRSGADAGDLRVTVHAATLNGALRAAVEDFARRYADRPDAADAELARCL DAALRAASEGLPY [SEQ ID NO: 26]
>BM38.2_682 транслированный генный продукт
VVSLTDKMSANAISDVWTAGGRRPLVMLRGGGRGRGRWSERAPDAG [SEQ ID NO: 12]
orf2798: Было предсказано, что этот ген кодирует ДНК-связывающийся регулятор транскрипции в семействе MurR/RpiR. Этот ген содержит домены спираль-виток-спираль (HTH) и сахар-изомеразы (SIS). Мутация G на A приводит к замене Gly на Ser.
>WT_2798 транслированный генный продукт
MGGTGSPAARLQALFEGHRLTPTQRRIAHSMVRRAADVPFLSSVELAELAGVSQPSVT RFAVALGFDGYPALRRHLR
EVAPAEPAPETGSSNEYQQAVEAEIENLRHLAEVLADPRPVRQAGRMLAGSRPLPVLG LRAAAAQAHGFAYFAAKVH
PDVRLLNEGGTMLHDRIDAAARAGASALLCFALPRHPREVVDALIHAKETGLTVVTV ADSPFAPVAGLSDLLLPAAV
GTGLAFDTACAPMLLGRVLLEAMCDDLPDAQARLEEFDVRAAARGLFVD [SEQ ID NO: 16]
>BM38.2_2798 транслированный генный продукт
MSGTGSPAARLQALFEGHRLTPTQRRIAHSMVRRAADVPFLSSVELAELAGVSQPSVT RFAVALGFDGYPALRRHLREVAPAEPAPETGSSNEYQQAVEAEIENLRHLAEVLADPRPVRQ AGRMLAGSRPLPVLGLRAAAAQAHGFAYFAAKVHPDVRLLNEGGTMLHDRIDAAARAGAS ALLCFALPRHPREVVDALIHAKETGLTVVTVADSPFAPVAGLSDLLLPAAVGTGLAFDTACAP MLLGRVLLEAMCDDLPDAQARLEEFDVRAAARGLFVD [SEQ ID NO: 2]
orf3866: Было предсказано, что этот ген кодирует ДНК-связывающийся регулятор ответа в семействе OmpR. Этот ген содержит домен REC, который принимает сигнал от сенсорного партнера в двухкомпонентных системах, и домен «крыло-спираль» (wHTH), характерный для регуляторных белков-антибиотиков Streptomyces (SARP). Мутация G на A приводит к замене Ala на Thr.
>WT_3866 транслированный генный продукт
LPARQAQARTDREHTRTESTGMADQTHVLFVEDDDVIREATQLALERDGFAVTAKPD GLSGLEAFHTDRPDIALLDVMVPGLDGVSLCRRIRDESMVPVIMLSARADAIDVVLGLEAGAD DYVAKPFDGAVLVARIRAVLRRFGRANGGREEPAADAGGVLAFGELEIDTGGMEVRRAGQP VALTPTEMRLLLEFSAAPGTVLSRDKLLERVWEYGWGGDTRVVDVHVQRLRTKIGQDRIETV RGFGYKLKA [SEQ ID NO: 18]
>BM38.2_3866 транслированный генный продукт
LPARQAQARTDREHTRTESTGMADQTHVLFVEDDDVIREATQLALERDGFAVTAKPD GLSGLEAFHTDRPDIALLDVMVPGLDGVSLCRRIRDESMVPVIMLSARADAIDVVLGLEAGAD DYVTKPFDGAVLVARIRAVLRRFGRANGGREEPAADAGGVLAFGELEIDTGGMEVRRAGQP VALTPTEMRLLLEFSAAPGTVLSRDKLLERVWEYGWGGDTRVVDVHVQRLRTKIGQDRIETV RGFGYKLKA
[SEQ ID NO: 4]
orf4755: Было предсказано, что этот ген кодирует фактор РНК-полимеразы сигма-70 семейства сигма-E. Мутация T на G в кодоне Arg (CGT (CGG) представляет собой молчащую мутацию.
>WT_4755 транслированный генный продукт
LHGKTETPVEGMTEEEFDAFYAAAFPRLTGQLYVFTGDLGEAQDVVQEAFVRAWDR RGRLIADEAPEAWVRTVAMRLAVSRWRRAKRWLELVRHSPPPETTPGPGPDRTALVAALRQ LPEHQRMAVVLHHLCDLSVEQVASETGAPVGTVKARLSRGRAALARHLAVDEADESAWRE GGRVG [SEQ ID NO: 24]
>BM38.2_4755 транслированный генный продукт
LHGKTETPVEGMTEEEFDAFYAAAFPRLTGQLYVFTGDLGEAQDVVQEAFVRAWDR RGRLIADEAPEAWVRTVAMRLAVSRWRRAKRWLELVRHSPPPETTPGPGPDRTALVAALRQ LPEHQRMAVVLHHLCDLSVEQVASETGAPVGTVKARLSRGRAALARHLAVDEADESAWRE GGRVG [SEQ ID NO: 10]
orf4868: Было предсказано, что этот ген кодирует белок регуляции транскрипции. Этот ген содержит домен приема сигнала REC, который принимает сигнал от сенсорного партнера в двухкомпонентных системах. Делеция (удаление C) в последовательности тандемных повторов приводит к мутации со сдвигом рамки считывания.
>WT_4868 транслированный генный продукт
MRPPVTHHHPAGGAARRPYRLLIVEDEKRLALSLAKGLTAEGYAVDVVHDGREGLHR ATEGTYDLLILDIMLPGLNGYRVCAALRAAGHDVPILMLTAKDGEYDEAEGLDTGADDYLTK PFSYVVLVARIKALLRRRPAGASPIHVHGDLKVDTAARRVFLGEDEVAL [SEQ ID NO: 28]
>BM38.2_4868 транслированный генный продукт
MRPPVTHHHPAGGAARRPYRLLIVEDEKRLALSLAKGLTAEGYAVDVVHDGREGLHR ATEGTYDLLILDIMLPGLNGYRVCAALRAAGHDVPILMLTAKDGEYDEAEGLDTGADDYLTK PFSYVVLVARIKALLRRRPAGASPSMSTATSRWTPPPAASS WARTKWR [SEQ ID NO: 14]
orf5175: Было предсказано, что этот ген кодирует белок регуляции транскрипции гистидин-киназы. Этот ген содержит домен приема сигнала REC, который принимает сигнал от сенсорного партнера в двухкомпонентных системах. Мутация C на T приводит к замене Pro на Ser.
>WT_5175 транслированный генный продукт
MVQKAKILLVDDRPENLLALEAILSALDQTLVRASSGEEALKALLTDDFAVILLDVQM PGMDGFETAAHIKRRERTRDIPIIFLTAINHGPHHTFRGYAAGAVDYISKPFDPWVLRAKVSVF VELYMKNCQLREQAALLRLQLDGGEKDDAEAGDSAGLLAELSARLAAVEEQAEALTKQLND ESTDAAAVATAAHLERKLTGLRRALDALEPGTGSASSVPSQN [SEQ ID NO: 20]
>BM38.2_5175 транслированный генный продукт
MVQKAKILLVDDRPENLLALEAILSALDQTLVRASSGEEALKALLTDDFAVILLDVQM PGMDGFETAAHIKRRERTRDIPIIFLTAINHGSHHTFRGYAAGAVDYISKPFDPWVLRAKVSVF VELYMKNCQLREQAALLRLQLDGGEKDDAEAGDSAGLLAELSARLAAVEEQAEALTKQLND ESTDAAAVATAAHLERKLTGLRRALDALEPGTGSASSVPSQN [SEQ ID NO: 6]
orf5387: Было предсказано, что этот ген кодирует регулятор транскрипции в семействе MerR. Этот ген содержит ДНК-связывающийся домен HTH и домен REC, который принимает сигнал от сенсорного партнера в двухкомпонентной системе. Мутация A на C приводит к замене Tyr на Ser.
>WT_5387 транслированный генный продукт
MVREALAALLELEDDIRVVAEVGSGEDVLDAARGTRPDLVIVDVNMPGLDGLTAAER LREQLPDSRILVLTVLDAPNVLRRAQDVRVDGYLVKNAPVEHLVKAVRQIMAGERVISPELA LAAWEGKASPLTAREADVLRIAAAGAETAEIAEYLHLSPGTVRNYMTTIIAKLDARNRLDAIR IARDAGWLLNS [SEQ ID NO: 22]
>BM38.2_5387 транслированный генный продукт
MVREALAALLELEDDIRVVAEVGSGEDVLDAARGTRPDLVIVDVNMPGLDGLTAAER LREQLPDSRILVLTVLDAPNVLRRAQDVRVDGYLVKNAPVEHLVKAVRQIMAGERVISPELA LAAWEGKASPLTAREADVLRIAAAGAETAEIAEYLHLSPGTVRNSMTTIIAKLDARNRLDAIRI ARDAGWLLNS [SEQ ID NO: 8]
Очевидно, что все размеры оснований или аминокислот и все величины молекулярного веса или молекулярной массы приводятся здесь для описания нуклеиновых кислот и полипептидов согласно изобретению и имеют приближенные значения для стандартных вариантов измерения.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Intervet International B.V.
Intervet Inc.
Zabriskie, T. Mark
<120>  Модифицированные изоляты Streptomyces Fungicidicus и их применение
<130>  24130
<150>  62/430,455
<151>  2016-12-06
<160>  50
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  843
<212>  ДНК
<213>  streptomyces fungicidicus
<400>  1
atgagcggca ccgggagccc tgcggcgcgc ctgcaggcgc tcttcgaggg gcatcggctg       60
acgccgaccc agcggcgcat cgcgcacagc atggtccggc gcgccgccga cgtgccgttc      120
ctgtccagcg tggagctggc cgagctggcc ggggtcagcc agccgtcggt gacccggttc      180
gccgtcgccc tcggcttcga cggctatccg gcgctgcgcc ggcacctgcg cgaggtcgcg      240
cccgccgaac cggcgccgga gaccggctcc tccaacgagt accagcaggc cgtcgaggcc      300
gagatcgaga acctgcggca tctggcggag gtgctggccg acccccggcc ggtgcggcag      360
gccgggcgca tgctggcggg gagccggccg ctgcccgtgc tgggactgcg ggcggcggcg      420
gcccaggcgc acggcttcgc gtacttcgcc gccaaggtcc atcccgacgt acggctgctc      480
aacgagggcg gcaccatgct ccacgaccgg atcgacgccg ccgcgcgggc cggggcgagc      540
gccctgctgt gcttcgcgct gccccgccat ccccgggagg tcgtcgacgc cctcatccac      600
gccaaggaga cggggctgac cgtggtcacc gtcgccgact cgccgttcgc gccggtcgcc      660
gggctgtccg acctgctgct gcccgcggcc gtcgggaccg gcctcgcctt cgacacggcg      720
tgcgcgccga tgctgctggg ccgggtgctg ctggaggcga tgtgcgacga cctgcccgac      780
gcgcaggcac ggctggagga gttcgacgtg agggcggcgg cgcgcggact gttcgtggac      840
tga                                                                    843
<210>  2
<211>  280
<212>  БЕЛОК
<213>  streptomyces fungicidicus
<400>  2
Met Ser Gly Thr Gly Ser Pro Ala Ala Arg Leu Gln Ala Leu Phe Glu
1               5                   10                  15
Gly His Arg Leu Thr Pro Thr Gln Arg Arg Ile Ala His Ser Met Val
20                  25                  30
Arg Arg Ala Ala Asp Val Pro Phe Leu Ser Ser Val Glu Leu Ala Glu
35                  40                  45
Leu Ala Gly Val Ser Gln Pro Ser Val Thr Arg Phe Ala Val Ala Leu
50                  55                  60
Gly Phe Asp Gly Tyr Pro Ala Leu Arg Arg His Leu Arg Glu Val Ala
65                  70                  75                  80
Pro Ala Glu Pro Ala Pro Glu Thr Gly Ser Ser Asn Glu Tyr Gln Gln
85                  90                  95
Ala Val Glu Ala Glu Ile Glu Asn Leu Arg His Leu Ala Glu Val Leu
100                 105                 110
Ala Asp Pro Arg Pro Val Arg Gln Ala Gly Arg Met Leu Ala Gly Ser
115                 120                 125
Arg Pro Leu Pro Val Leu Gly Leu Arg Ala Ala Ala Ala Gln Ala His
130                 135                 140
Gly Phe Ala Tyr Phe Ala Ala Lys Val His Pro Asp Val Arg Leu Leu
145                 150                 155                 160
Asn Glu Gly Gly Thr Met Leu His Asp Arg Ile Asp Ala Ala Ala Arg
165                 170                 175
Ala Gly Ala Ser Ala Leu Leu Cys Phe Ala Leu Pro Arg His Pro Arg
180                 185                 190
Glu Val Val Asp Ala Leu Ile His Ala Lys Glu Thr Gly Leu Thr Val
195                 200                 205
Val Thr Val Ala Asp Ser Pro Phe Ala Pro Val Ala Gly Leu Ser Asp
210                 215                 220
Leu Leu Leu Pro Ala Ala Val Gly Thr Gly Leu Ala Phe Asp Thr Ala
225                 230                 235                 240
Cys Ala Pro Met Leu Leu Gly Arg Val Leu Leu Glu Ala Met Cys Asp
245                 250                 255
Asp Leu Pro Asp Ala Gln Ala Arg Leu Glu Glu Phe Asp Val Arg Ala
260                 265                 270
Ala Ala Arg Gly Leu Phe Val Asp
275                 280
<210>  3
<211>  759
<212>  ДНК
<213>  streptomyces fungicidicus
<400>  3
ttgccggccc gccaggcgca ggcgcgcacc gaccgagagc acacgaggac tgagagcacc       60
gggatggcag accagaccca cgtcctgttc gtcgaggacg acgacgtcat ccgcgaggcc      120
acccagctgg ccctggagcg ggacggcttc gcggtcaccg cgaagcccga cgggctgtcg      180
ggcctggagg cgttccacac cgaccgtccc gacatcgcgc tgctggacgt catggtcccc      240
ggtctggacg gggtgagcct gtgccggcgc atacgggacg agtcgatggt gccggtgatc      300
atgctgtcgg cgcgggccga cgccatcgac gtggtgctgg gcctggaggc gggcgccgac      360
gactatgtga ccaagccgtt cgacggcgcc gtgctggtgg cccggatccg cgcggtgctg      420
cgccgcttcg ggcgggcgaa cggcggccgg gaggaaccgg cggcggacgc cgggggtgtg      480
ctggcgttcg gcgaactgga gatcgacacc gggggcatgg aggtgcgccg ggcggggcag      540
ccggtggcgc tgacgccgac cgagatgcgg ctgctgctgg agttctcggc ggcgccgggc      600
acggtgctct cccgcgacaa gctgctcgaa cgggtgtggg agtacggctg gggcggtgac      660
acccgggtcg tcgacgtcca tgtgcagcgg ctgcgcacga agatcggcca ggaccgcatc      720
gagacggtcc gcggtttcgg ttacaagctg aaggcctga                             759
<210>  4
<211>  252
<212>  БЕЛОК
<213>  streptomyces fungicidicus
<400>  4
Leu Pro Ala Arg Gln Ala Gln Ala Arg Thr Asp Arg Glu His Thr Arg
1               5                   10                  15
Thr Glu Ser Thr Gly Met Ala Asp Gln Thr His Val Leu Phe Val Glu
20                  25                  30
Asp Asp Asp Val Ile Arg Glu Ala Thr Gln Leu Ala Leu Glu Arg Asp
35                  40                  45
Gly Phe Ala Val Thr Ala Lys Pro Asp Gly Leu Ser Gly Leu Glu Ala
50                  55                  60
Phe His Thr Asp Arg Pro Asp Ile Ala Leu Leu Asp Val Met Val Pro
65                  70                  75                  80
Gly Leu Asp Gly Val Ser Leu Cys Arg Arg Ile Arg Asp Glu Ser Met
85                  90                  95
Val Pro Val Ile Met Leu Ser Ala Arg Ala Asp Ala Ile Asp Val Val
100                 105                 110
Leu Gly Leu Glu Ala Gly Ala Asp Asp Tyr Val Thr Lys Pro Phe Asp
115                 120                 125
Gly Ala Val Leu Val Ala Arg Ile Arg Ala Val Leu Arg Arg Phe Gly
130                 135                 140
Arg Ala Asn Gly Gly Arg Glu Glu Pro Ala Ala Asp Ala Gly Gly Val
145                 150                 155                 160
Leu Ala Phe Gly Glu Leu Glu Ile Asp Thr Gly Gly Met Glu Val Arg
165                 170                 175
Arg Ala Gly Gln Pro Val Ala Leu Thr Pro Thr Glu Met Arg Leu Leu
180                 185                 190
Leu Glu Phe Ser Ala Ala Pro Gly Thr Val Leu Ser Arg Asp Lys Leu
195                 200                 205
Leu Glu Arg Val Trp Glu Tyr Gly Trp Gly Gly Asp Thr Arg Val Val
210                 215                 220
Asp Val His Val Gln Arg Leu Arg Thr Lys Ile Gly Gln Asp Arg Ile
225                 230                 235                 240
Glu Thr Val Arg Gly Phe Gly Tyr Lys Leu Lys Ala
245                 250
<210>  5
<211>  678
<212>  ДНК
<213>  streptomyces fungicidicus
<400>  5
atggtgcaga aggccaagat cctcctggtc gatgaccggc cggagaatct gctcgcgctg       60
gaggcgatcc tctcggcgct cgatcagacg ctggtgcggg catcgtccgg ggaggaagcg      120
ctcaaagcgc tgctgacgga cgacttcgcg gtcattctgc tggacgtcca gatgccgggc      180
atggacggtt tcgagaccgc ggcccacatc aagcggcggg aacgcacccg ggacatcccg      240
atcatcttcc tcaccgcgat caaccacggt tcgcaccaca cgttccgggg ctacgcggcg      300
ggtgcggtcg actacatctc gaagccgttc gacccgtggg tgctgcgcgc gaaggtctcg      360
gtcttcgtcg agctgtacat gaagaactgc cagctgcggg agcaggcggc gctgctgcgg      420
ctccagttgg acggcggcga gaaggacgat gccgaggcag gcgactcggc ggggctgctc      480
gccgagctgt cggcgcggct cgcggccgtc gaggagcagg ccgaggcgct gaccaagcag      540
ctcaacgacg agtcgacgga cgcggccgcg gtggccacgg cggctcatct ggagcgcaag      600
ctcacggggt tgcggcgggc gctggacgcc ctggagcccg ggaccggcag cgcgtcgtcg      660
gtgccgtcgc agaactga                                                    678
<210>  6
<211>  225
<212>  БЕЛОК
<213>  streptomyces fungicidicus
<400>  6
Met Val Gln Lys Ala Lys Ile Leu Leu Val Asp Asp Arg Pro Glu Asn
1               5                   10                  15
Leu Leu Ala Leu Glu Ala Ile Leu Ser Ala Leu Asp Gln Thr Leu Val
20                  25                  30
Arg Ala Ser Ser Gly Glu Glu Ala Leu Lys Ala Leu Leu Thr Asp Asp
35                  40                  45
Phe Ala Val Ile Leu Leu Asp Val Gln Met Pro Gly Met Asp Gly Phe
50                  55                  60
Glu Thr Ala Ala His Ile Lys Arg Arg Glu Arg Thr Arg Asp Ile Pro
65                  70                  75                  80
Ile Ile Phe Leu Thr Ala Ile Asn His Gly Ser His His Thr Phe Arg
85                  90                  95
Gly Tyr Ala Ala Gly Ala Val Asp Tyr Ile Ser Lys Pro Phe Asp Pro
100                 105                 110
Trp Val Leu Arg Ala Lys Val Ser Val Phe Val Glu Leu Tyr Met Lys
115                 120                 125
Asn Cys Gln Leu Arg Glu Gln Ala Ala Leu Leu Arg Leu Gln Leu Asp
130                 135                 140
Gly Gly Glu Lys Asp Asp Ala Glu Ala Gly Asp Ser Ala Gly Leu Leu
145                 150                 155                 160
Ala Glu Leu Ser Ala Arg Leu Ala Ala Val Glu Glu Gln Ala Glu Ala
165                 170                 175
Leu Thr Lys Gln Leu Asn Asp Glu Ser Thr Asp Ala Ala Ala Val Ala
180                 185                 190
Thr Ala Ala His Leu Glu Arg Lys Leu Thr Gly Leu Arg Arg Ala Leu
195                 200                 205
Asp Ala Leu Glu Pro Gly Thr Gly Ser Ala Ser Ser Val Pro Ser Gln
210                 215                 220
Asn
225
<210>  7
<211>  582
<212>  ДНК
<213>  streptomyces fungicidicus
<400>  7
atggtgcggg aagcgctggc cgcactgctc gaactcgagg acgacatccg ggtggtggca       60
gaagtcggct ccggtgagga cgtactcgac gcggccaggg gaacacgtcc cgacctcgtg      120
atcgtggacg tcaacatgcc gggactcgac gggctcaccg cggccgagcg gctgcgcgag      180
cagctgcccg actcccgcat cctggtgctg accgtcctgg acgcgcccaa cgtcctgcgc      240
cgggcgcagg acgtccgggt cgacggctac ctcgtcaaga acgctccggt ggagcacctc      300
gtcaaggccg tgcgccagat catggccggg gaacgcgtca tctcaccgga gctggcgctg      360
gccgcctggg agggcaaggc cagcccgctc accgcgcggg aggccgatgt gctccggatc      420
gcggcggccg gcgcggagac cgccgagatc gccgagtacc tgcatctttc accgggcacg      480
gtgcggaact ccatgaccac catcatcgcc aagctcgacg cgcgcaaccg gctcgacgcc      540
atccgcatcg cacgcgacgc cgggtggctc ctcaactcct ga                         582
<210>  8
<211>  193
<212>  БЕЛОК
<213>  streptomyces fungicidicus
<400>  8
Met Val Arg Glu Ala Leu Ala Ala Leu Leu Glu Leu Glu Asp Asp Ile
1               5                   10                  15
Arg Val Val Ala Glu Val Gly Ser Gly Glu Asp Val Leu Asp Ala Ala
20                  25                  30
Arg Gly Thr Arg Pro Asp Leu Val Ile Val Asp Val Asn Met Pro Gly
35                  40                  45
Leu Asp Gly Leu Thr Ala Ala Glu Arg Leu Arg Glu Gln Leu Pro Asp
50                  55                  60
Ser Arg Ile Leu Val Leu Thr Val Leu Asp Ala Pro Asn Val Leu Arg
65                  70                  75                  80
Arg Ala Gln Asp Val Arg Val Asp Gly Tyr Leu Val Lys Asn Ala Pro
85                  90                  95
Val Glu His Leu Val Lys Ala Val Arg Gln Ile Met Ala Gly Glu Arg
100                 105                 110
Val Ile Ser Pro Glu Leu Ala Leu Ala Ala Trp Glu Gly Lys Ala Ser
115                 120                 125
Pro Leu Thr Ala Arg Glu Ala Asp Val Leu Arg Ile Ala Ala Ala Gly
130                 135                 140
Ala Glu Thr Ala Glu Ile Ala Glu Tyr Leu His Leu Ser Pro Gly Thr
145                 150                 155                 160
Val Arg Asn Ser Met Thr Thr Ile Ile Ala Lys Leu Asp Ala Arg Asn
165                 170                 175
Arg Leu Asp Ala Ile Arg Ile Ala Arg Asp Ala Gly Trp Leu Leu Asn
180                 185                 190
Ser
<210>  9
<211>  549
<212>  ДНК
<213>  streptomyces fungicidicus
<400>  9
ttgcacggga agaccgagac accggtggag ggcatgaccg aggaagagtt cgacgctttc       60
tacgcggccg cgttcccccg cctgaccgga cagttgtacg tcttcaccgg tgacctcggc      120
gaggcccagg acgtcgtcca ggaggcgttc gtacgggcct gggaccggcg cgggaggctg      180
atcgccgacg aggcgcccga ggcgtgggtg cgcaccgtcg ccatgcggct cgcggtgagc      240
cgctggcgcc gcgcgaaacg ctggctggaa ctcgtacggc actccccgcc cccggagacg      300
acccccggcc cgggccccga ccgcaccgcc ctggtcgccg cgctgcgcca actgcccgag      360
caccagcgca tggccgtcgt cctccatcac ctgtgcgacc tcagcgtcga acaggtagcc      420
tccgagaccg gcgcacccgt gggcacggtc aaggccaggc tctcccgcgg acgggcggca      480
ctggccagac atctggcggt ggacgaggcc gacgagtcgg cctggaggga gggcggccgg      540
gtcggatga                                                              549
<210>  10
<211>  182
<212>  БЕЛОК
<213>  streptomyces fungicidicus
<400>  10
Leu His Gly Lys Thr Glu Thr Pro Val Glu Gly Met Thr Glu Glu Glu
1               5                   10                  15
Phe Asp Ala Phe Tyr Ala Ala Ala Phe Pro Arg Leu Thr Gly Gln Leu
20                  25                  30
Tyr Val Phe Thr Gly Asp Leu Gly Glu Ala Gln Asp Val Val Gln Glu
35                  40                  45
Ala Phe Val Arg Ala Trp Asp Arg Arg Gly Arg Leu Ile Ala Asp Glu
50                  55                  60
Ala Pro Glu Ala Trp Val Arg Thr Val Ala Met Arg Leu Ala Val Ser
65                  70                  75                  80
Arg Trp Arg Arg Ala Lys Arg Trp Leu Glu Leu Val Arg His Ser Pro
85                  90                  95
Pro Pro Glu Thr Thr Pro Gly Pro Gly Pro Asp Arg Thr Ala Leu Val
100                 105                 110
Ala Ala Leu Arg Gln Leu Pro Glu His Gln Arg Met Ala Val Val Leu
115                 120                 125
His His Leu Cys Asp Leu Ser Val Glu Gln Val Ala Ser Glu Thr Gly
130                 135                 140
Ala Pro Val Gly Thr Val Lys Ala Arg Leu Ser Arg Gly Arg Ala Ala
145                 150                 155                 160
Leu Ala Arg His Leu Ala Val Asp Glu Ala Asp Glu Ser Ala Trp Arg
165                 170                 175
Glu Gly Gly Arg Val Gly
180
<210>  11
<211>  769
<212>  ДНК
<213>  streptomyces fungicidicus
<400>  11
gtggtgtcac tgactgacaa gatgtcggcg aacgccattt cggatgtgtg gacggcgggc       60
ggacggcggc ccctcgttat gctgcggggg gggggcagag gacggggacg gtggagcgag      120
cgtgcgccag acgccggttg aggcactgcg gcaggggacg acgggggccg ggggcctgtc      180
cctcgtcgag cgccgcaagg cggcactgcg cttcgagatc gcctgcgcgg cggtgcactt      240
gttcacctcg cagggggtcg ccgccacgac gggcgaacag atcgcgcagt ccgtggggat      300
ctcctcccgc accctgtggc gccatttccc cacgaaggag agctgcgtcc ttcccctgct      360
gacggcggcg ctcgacttcg ccgtggaccg cctgcgtcac tggccggcgg agacgagcct      420
gctggacttc ttcgccgaga cctgccgcaa gggtgacctg cccgccgcca ccccggagat      480
cctcgacctg atccgcatga cctccaccga accggccctg cgcgccgtgt ggctccaggc      540
ccacgacgac gcgcttcccg tcctcggcgg gcttctcgcg cggcgctccg gcgccgatgc      600
cggcgacctg agggtgacgg tgcacgcggc gacgctgaac ggcgccctgc gggcggcggt      660
ggaggacttc gcccggcggt acgcggaccg gccggacgcc gcggacgccg aactcgcccg      720
ctgtctcgac gccgccctgc gcgcggcctc ggagggactc ccctactga                  769
<210>  12
<211>  46
<212>  БЕЛОК
<213>  streptomyces fungicidicus
<400>  12
Val Val Ser Leu Thr Asp Lys Met Ser Ala Asn Ala Ile Ser Asp Val
1               5                   10                  15
Trp Thr Ala Gly Gly Arg Arg Pro Leu Val Met Leu Arg Gly Gly Gly
20                  25                  30
Arg Gly Arg Gly Arg Trp Ser Glu Arg Ala Pro Asp Ala Gly
35                  40                  45
<210>  13
<211>  504
<212>  ДНК
<213>  streptomyces fungicidicus
<400>  13
atgcgcccgc ccgtcaccca ccaccaccct gccggaggcg ctgcgcgccg cccctatcga       60
ctcttgatcg tggaggacga gaaacgcctc gctctctccc tcgccaaggg actcaccgcc      120
gagggctacg ccgtggacgt cgtccacgac ggccgggagg gcctgcaccg ggccacggag      180
gggacgtacg acctcctcat cctggacatc atgctgcccg gtctcaacgg ctaccgggtc      240
tgcgccgcgc tccgcgccgc cggacacgac gtgccgatcc tgatgctcac ggccaaggac      300
ggcgagtacg acgaggcgga gggcctggac accggcgccg acgactacct caccaagccg      360
ttctcgtacg tcgtcctcgt cgccaggatc aaggcgctgc tgcgccgccg gccggccggg      420
gcctccccat ccatgtccac ggcgacctca aggtggacac cgccgcccgc cgcgtcttcc      480
tgggcgagga cgaagtggcg ctga                                             504
<210>  14
<211>  167
<212>  БЕЛОК
<213>  streptomyces fungicidicus
<400>  14
Met Arg Pro Pro Val Thr His His His Pro Ala Gly Gly Ala Ala Arg
1               5                   10                  15
Arg Pro Tyr Arg Leu Leu Ile Val Glu Asp Glu Lys Arg Leu Ala Leu
20                  25                  30
Ser Leu Ala Lys Gly Leu Thr Ala Glu Gly Tyr Ala Val Asp Val Val
35                  40                  45
His Asp Gly Arg Glu Gly Leu His Arg Ala Thr Glu Gly Thr Tyr Asp
50                  55                  60
Leu Leu Ile Leu Asp Ile Met Leu Pro Gly Leu Asn Gly Tyr Arg Val
65                  70                  75                  80
Cys Ala Ala Leu Arg Ala Ala Gly His Asp Val Pro Ile Leu Met Leu
85                  90                  95
Thr Ala Lys Asp Gly Glu Tyr Asp Glu Ala Glu Gly Leu Asp Thr Gly
100                 105                 110
Ala Asp Asp Tyr Leu Thr Lys Pro Phe Ser Tyr Val Val Leu Val Ala
115                 120                 125
Arg Ile Lys Ala Leu Leu Arg Arg Arg Pro Ala Gly Ala Ser Pro Ser
130                 135                 140
Met Ser Thr Ala Thr Ser Arg Trp Thr Pro Pro Pro Ala Ala Ser Ser
145                 150                 155                 160
Trp Ala Arg Thr Lys Trp Arg
165
<210>  15
<211>  843
<212>  ДНК
<213>  streptomyces fungicidicus
<400>  15
atgggcggca ccgggagccc tgcggcgcgc ctgcaggcgc tcttcgaggg gcatcggctg       60
acgccgaccc agcggcgcat cgcgcacagc atggtccggc gcgccgccga cgtgccgttc      120
ctgtccagcg tggagctggc cgagctggcc ggggtcagcc agccgtcggt gacccggttc      180
gccgtcgccc tcggcttcga cggctatccg gcgctgcgcc ggcacctgcg cgaggtcgcg      240
cccgccgaac cggcgccgga gaccggctcc tccaacgagt accagcaggc cgtcgaggcc      300
gagatcgaga acctgcggca tctggcggag gtgctggccg acccccggcc ggtgcggcag      360
gccgggcgca tgctggcggg gagccggccg ctgcccgtgc tgggactgcg ggcggcggcg      420
gcccaggcgc acggcttcgc gtacttcgcc gccaaggtcc atcccgacgt acggctgctc      480
aacgagggcg gcaccatgct ccacgaccgg atcgacgccg ccgcgcgggc cggggcgagc      540
gccctgctgt gcttcgcgct gccccgccat ccccgggagg tcgtcgacgc cctcatccac      600
gccaaggaga cggggctgac cgtggtcacc gtcgccgact cgccgttcgc gccggtcgcc      660
gggctgtccg acctgctgct gcccgcggcc gtcgggaccg gcctcgcctt cgacacggcg      720
tgcgcgccga tgctgctggg ccgggtgctg ctggaggcga tgtgcgacga cctgcccgac      780
gcgcaggcac ggctggagga gttcgacgtg agggcggcgg cgcgcggact gttcgtggac      840
tga                                                                    843
<210>  16
<211>  280
<212>  БЕЛОК
<213>  streptomyces fungicidicus
<400>  16
Met Gly Gly Thr Gly Ser Pro Ala Ala Arg Leu Gln Ala Leu Phe Glu
1               5                   10                  15
Gly His Arg Leu Thr Pro Thr Gln Arg Arg Ile Ala His Ser Met Val
20                  25                  30
Arg Arg Ala Ala Asp Val Pro Phe Leu Ser Ser Val Glu Leu Ala Glu
35                  40                  45
Leu Ala Gly Val Ser Gln Pro Ser Val Thr Arg Phe Ala Val Ala Leu
50                  55                  60
Gly Phe Asp Gly Tyr Pro Ala Leu Arg Arg His Leu Arg Glu Val Ala
65                  70                  75                  80
Pro Ala Glu Pro Ala Pro Glu Thr Gly Ser Ser Asn Glu Tyr Gln Gln
85                  90                  95
Ala Val Glu Ala Glu Ile Glu Asn Leu Arg His Leu Ala Glu Val Leu
100                 105                 110
Ala Asp Pro Arg Pro Val Arg Gln Ala Gly Arg Met Leu Ala Gly Ser
115                 120                 125
Arg Pro Leu Pro Val Leu Gly Leu Arg Ala Ala Ala Ala Gln Ala His
130                 135                 140
Gly Phe Ala Tyr Phe Ala Ala Lys Val His Pro Asp Val Arg Leu Leu
145                 150                 155                 160
Asn Glu Gly Gly Thr Met Leu His Asp Arg Ile Asp Ala Ala Ala Arg
165                 170                 175
Ala Gly Ala Ser Ala Leu Leu Cys Phe Ala Leu Pro Arg His Pro Arg
180                 185                 190
Glu Val Val Asp Ala Leu Ile His Ala Lys Glu Thr Gly Leu Thr Val
195                 200                 205
Val Thr Val Ala Asp Ser Pro Phe Ala Pro Val Ala Gly Leu Ser Asp
210                 215                 220
Leu Leu Leu Pro Ala Ala Val Gly Thr Gly Leu Ala Phe Asp Thr Ala
225                 230                 235                 240
Cys Ala Pro Met Leu Leu Gly Arg Val Leu Leu Glu Ala Met Cys Asp
245                 250                 255
Asp Leu Pro Asp Ala Gln Ala Arg Leu Glu Glu Phe Asp Val Arg Ala
260                 265                 270
Ala Ala Arg Gly Leu Phe Val Asp
275                 280
<210>  17
<211>  759
<212>  ДНК
<213>  streptomyces fungicidicus
<400>  17
ttgccggccc gccaggcgca ggcgcgcacc gaccgagagc acacgaggac tgagagcacc       60
gggatggcag accagaccca cgtcctgttc gtcgaggacg acgacgtcat ccgcgaggcc      120
acccagctgg ccctggagcg ggacggcttc gcggtcaccg cgaagcccga cgggctgtcg      180
ggcctggagg cgttccacac cgaccgtccc gacatcgcgc tgctggacgt catggtcccc      240
ggtctggacg gggtgagcct gtgccggcgc atacgggacg agtcgatggt gccggtgatc      300
atgctgtcgg cgcgggccga cgccatcgac gtggtgctgg gcctggaggc gggcgccgac      360
gactatgtgg ccaagccgtt cgacggcgcc gtgctggtgg cccggatccg cgcggtgctg      420
cgccgcttcg ggcgggcgaa cggcggccgg gaggaaccgg cggcggacgc cgggggtgtg      480
ctggcgttcg gcgaactgga gatcgacacc gggggcatgg aggtgcgccg ggcggggcag      540
ccggtggcgc tgacgccgac cgagatgcgg ctgctgctgg agttctcggc ggcgccgggc      600
acggtgctct cccgcgacaa gctgctcgaa cgggtgtggg agtacggctg gggcggtgac      660
acccgggtcg tcgacgtcca tgtgcagcgg ctgcgcacga agatcggcca ggaccgcatc      720
gagacggtcc gcggtttcgg ttacaagctg aaggcctga                             759
<210>  18
<211>  252
<212>  БЕЛОК
<213>  streptomyces fungicidicus
<400>  18
Leu Pro Ala Arg Gln Ala Gln Ala Arg Thr Asp Arg Glu His Thr Arg
1               5                   10                  15
Thr Glu Ser Thr Gly Met Ala Asp Gln Thr His Val Leu Phe Val Glu
20                  25                  30
Asp Asp Asp Val Ile Arg Glu Ala Thr Gln Leu Ala Leu Glu Arg Asp
35                  40                  45
Gly Phe Ala Val Thr Ala Lys Pro Asp Gly Leu Ser Gly Leu Glu Ala
50                  55                  60
Phe His Thr Asp Arg Pro Asp Ile Ala Leu Leu Asp Val Met Val Pro
65                  70                  75                  80
Gly Leu Asp Gly Val Ser Leu Cys Arg Arg Ile Arg Asp Glu Ser Met
85                  90                  95
Val Pro Val Ile Met Leu Ser Ala Arg Ala Asp Ala Ile Asp Val Val
100                 105                 110
Leu Gly Leu Glu Ala Gly Ala Asp Asp Tyr Val Ala Lys Pro Phe Asp
115                 120                 125
Gly Ala Val Leu Val Ala Arg Ile Arg Ala Val Leu Arg Arg Phe Gly
130                 135                 140
Arg Ala Asn Gly Gly Arg Glu Glu Pro Ala Ala Asp Ala Gly Gly Val
145                 150                 155                 160
Leu Ala Phe Gly Glu Leu Glu Ile Asp Thr Gly Gly Met Glu Val Arg
165                 170                 175
Arg Ala Gly Gln Pro Val Ala Leu Thr Pro Thr Glu Met Arg Leu Leu
180                 185                 190
Leu Glu Phe Ser Ala Ala Pro Gly Thr Val Leu Ser Arg Asp Lys Leu
195                 200                 205
Leu Glu Arg Val Trp Glu Tyr Gly Trp Gly Gly Asp Thr Arg Val Val
210                 215                 220
Asp Val His Val Gln Arg Leu Arg Thr Lys Ile Gly Gln Asp Arg Ile
225                 230                 235                 240
Glu Thr Val Arg Gly Phe Gly Tyr Lys Leu Lys Ala
245                 250
<210>  19
<211>  678
<212>  ДНК
<213>  streptomyces fungicidicus
<400>  19
atggtgcaga aggccaagat cctcctggtc gatgaccggc cggagaatct gctcgcgctg       60
gaggcgatcc tctcggcgct cgatcagacg ctggtgcggg catcgtccgg ggaggaagcg      120
ctcaaagcgc tgctgacgga cgacttcgcg gtcattctgc tggacgtcca gatgccgggc      180
atggacggtt tcgagaccgc ggcccacatc aagcggcggg aacgcacccg ggacatcccg      240
atcatcttcc tcaccgcgat caaccacggt ccgcaccaca cgttccgggg ctacgcggcg      300
ggtgcggtcg actacatctc gaagccgttc gacccgtggg tgctgcgcgc gaaggtctcg      360
gtcttcgtcg agctgtacat gaagaactgc cagctgcggg agcaggcggc gctgctgcgg      420
ctccagttgg acggcggcga gaaggacgat gccgaggcag gcgactcggc ggggctgctc      480
gccgagctgt cggcgcggct cgcggccgtc gaggagcagg ccgaggcgct gaccaagcag      540
ctcaacgacg agtcgacgga cgcggccgcg gtggccacgg cggctcatct ggagcgcaag      600
ctcacggggt tgcggcgggc gctggacgcc ctggagcccg ggaccggcag cgcgtcgtcg      660
gtgccgtcgc agaactga                                                    678
<210>  20
<211>  225
<212>  БЕЛОК
<213>  streptomyces fungicidicus
<400>  20
Met Val Gln Lys Ala Lys Ile Leu Leu Val Asp Asp Arg Pro Glu Asn
1               5                   10                  15
Leu Leu Ala Leu Glu Ala Ile Leu Ser Ala Leu Asp Gln Thr Leu Val
20                  25                  30
Arg Ala Ser Ser Gly Glu Glu Ala Leu Lys Ala Leu Leu Thr Asp Asp
35                  40                  45
Phe Ala Val Ile Leu Leu Asp Val Gln Met Pro Gly Met Asp Gly Phe
50                  55                  60
Glu Thr Ala Ala His Ile Lys Arg Arg Glu Arg Thr Arg Asp Ile Pro
65                  70                  75                  80
Ile Ile Phe Leu Thr Ala Ile Asn His Gly Pro His His Thr Phe Arg
85                  90                  95
Gly Tyr Ala Ala Gly Ala Val Asp Tyr Ile Ser Lys Pro Phe Asp Pro
100                 105                 110
Trp Val Leu Arg Ala Lys Val Ser Val Phe Val Glu Leu Tyr Met Lys
115                 120                 125
Asn Cys Gln Leu Arg Glu Gln Ala Ala Leu Leu Arg Leu Gln Leu Asp
130                 135                 140
Gly Gly Glu Lys Asp Asp Ala Glu Ala Gly Asp Ser Ala Gly Leu Leu
145                 150                 155                 160
Ala Glu Leu Ser Ala Arg Leu Ala Ala Val Glu Glu Gln Ala Glu Ala
165                 170                 175
Leu Thr Lys Gln Leu Asn Asp Glu Ser Thr Asp Ala Ala Ala Val Ala
180                 185                 190
Thr Ala Ala His Leu Glu Arg Lys Leu Thr Gly Leu Arg Arg Ala Leu
195                 200                 205
Asp Ala Leu Glu Pro Gly Thr Gly Ser Ala Ser Ser Val Pro Ser Gln
210                 215                 220
Asn
225
<210>  21
<211>  582
<212>  ДНК
<213>  streptomyces fungicidicus
<400>  21
atggtgcggg aagcgctggc cgcactgctc gaactcgagg acgacatccg ggtggtggca       60
gaagtcggct ccggtgagga cgtactcgac gcggccaggg gaacacgtcc cgacctcgtg      120
atcgtggacg tcaacatgcc gggactcgac gggctcaccg cggccgagcg gctgcgcgag      180
cagctgcccg actcccgcat cctggtgctg accgtcctgg acgcgcccaa cgtcctgcgc      240
cgggcgcagg acgtccgggt cgacggctac ctcgtcaaga acgctccggt ggagcacctc      300
gtcaaggccg tgcgccagat catggccggg gaacgcgtca tctcaccgga gctggcgctg      360
gccgcctggg agggcaaggc cagcccgctc accgcgcggg aggccgatgt gctccggatc      420
gcggcggccg gcgcggagac cgccgagatc gccgagtacc tgcatctttc accgggcacg      480
gtgcggaact acatgaccac catcatcgcc aagctcgacg cgcgcaaccg gctcgacgcc      540
atccgcatcg cacgcgacgc cgggtggctc ctcaactcct ga                         582
<210>  22
<211>  193
<212>  БЕЛОК
<213>  streptomyces fungicidicus
<400>  22
Met Val Arg Glu Ala Leu Ala Ala Leu Leu Glu Leu Glu Asp Asp Ile
1               5                   10                  15
Arg Val Val Ala Glu Val Gly Ser Gly Glu Asp Val Leu Asp Ala Ala
20                  25                  30
Arg Gly Thr Arg Pro Asp Leu Val Ile Val Asp Val Asn Met Pro Gly
35                  40                  45
Leu Asp Gly Leu Thr Ala Ala Glu Arg Leu Arg Glu Gln Leu Pro Asp
50                  55                  60
Ser Arg Ile Leu Val Leu Thr Val Leu Asp Ala Pro Asn Val Leu Arg
65                  70                  75                  80
Arg Ala Gln Asp Val Arg Val Asp Gly Tyr Leu Val Lys Asn Ala Pro
85                  90                  95
Val Glu His Leu Val Lys Ala Val Arg Gln Ile Met Ala Gly Glu Arg
100                 105                 110
Val Ile Ser Pro Glu Leu Ala Leu Ala Ala Trp Glu Gly Lys Ala Ser
115                 120                 125
Pro Leu Thr Ala Arg Glu Ala Asp Val Leu Arg Ile Ala Ala Ala Gly
130                 135                 140
Ala Glu Thr Ala Glu Ile Ala Glu Tyr Leu His Leu Ser Pro Gly Thr
145                 150                 155                 160
Val Arg Asn Tyr Met Thr Thr Ile Ile Ala Lys Leu Asp Ala Arg Asn
165                 170                 175
Arg Leu Asp Ala Ile Arg Ile Ala Arg Asp Ala Gly Trp Leu Leu Asn
180                 185                 190
Ser
<210>  23
<211>  549
<212>  ДНК
<213>  streptomyces fungicidicus
<400>  23
ttgcacggga agaccgagac accggtggag ggcatgaccg aggaagagtt cgacgctttc       60
tacgcggccg cgttcccccg cctgaccgga cagttgtacg tcttcaccgg tgacctcggc      120
gaggcccagg acgtcgtcca ggaggcgttc gtacgggcct gggaccggcg cgggaggctg      180
atcgccgacg aggcgcccga ggcgtgggtg cgcaccgtcg ccatgcggct cgcggtgagc      240
cgctggcgcc gcgcgaaacg ctggctggaa ctcgtacggc actccccgcc cccggagacg      300
acccccggcc cgggccccga ccgcaccgcc ctggtcgccg cgctgcgcca actgcccgag      360
caccagcgca tggccgtcgt cctccatcac ctgtgcgacc tcagcgtcga acaggtagcc      420
tccgagaccg gcgcacccgt gggcacggtc aaggccaggc tctcccgcgg acgggcggca      480
ctggccagac atctggcggt ggacgaggcc gacgagtcgg cctggaggga gggcggccgt      540
gtcggatga                                                              549
<210>  24
<211>  182
<212>  БЕЛОК
<213>  streptomyces fungicidicus
<400>  24
Leu His Gly Lys Thr Glu Thr Pro Val Glu Gly Met Thr Glu Glu Glu
1               5                   10                  15
Phe Asp Ala Phe Tyr Ala Ala Ala Phe Pro Arg Leu Thr Gly Gln Leu
20                  25                  30
Tyr Val Phe Thr Gly Asp Leu Gly Glu Ala Gln Asp Val Val Gln Glu
35                  40                  45
Ala Phe Val Arg Ala Trp Asp Arg Arg Gly Arg Leu Ile Ala Asp Glu
50                  55                  60
Ala Pro Glu Ala Trp Val Arg Thr Val Ala Met Arg Leu Ala Val Ser
65                  70                  75                  80
Arg Trp Arg Arg Ala Lys Arg Trp Leu Glu Leu Val Arg His Ser Pro
85                  90                  95
Pro Pro Glu Thr Thr Pro Gly Pro Gly Pro Asp Arg Thr Ala Leu Val
100                 105                 110
Ala Ala Leu Arg Gln Leu Pro Glu His Gln Arg Met Ala Val Val Leu
115                 120                 125
His His Leu Cys Asp Leu Ser Val Glu Gln Val Ala Ser Glu Thr Gly
130                 135                 140
Ala Pro Val Gly Thr Val Lys Ala Arg Leu Ser Arg Gly Arg Ala Ala
145                 150                 155                 160
Leu Ala Arg His Leu Ala Val Asp Glu Ala Asp Glu Ser Ala Trp Arg
165                 170                 175
Glu Gly Gly Arg Val Gly
180
<210>  25
<211>  768
<212>  ДНК
<213>  streptomyces fungicidicus
<400>  25
gtggtgtcac tgactgacaa gatgtcggcg aacgccattt cggatgtgtg gacggcgggc       60
ggacggcggc ccctcgttat gctgcggggg ggggcagagg acggggacgg tggagcgagc      120
gtgcgccaga cgccggttga ggcactgcgg caggggacga cgggggccgg gggcctgtcc      180
ctcgtcgagc gccgcaaggc ggcactgcgc ttcgagatcg cctgcgcggc ggtgcacttg      240
ttcacctcgc agggggtcgc cgccacgacg ggcgaacaga tcgcgcagtc cgtggggatc      300
tcctcccgca ccctgtggcg ccatttcccc acgaaggaga gctgcgtcct tcccctgctg      360
acggcggcgc tcgacttcgc cgtggaccgc ctgcgtcact ggccggcgga gacgagcctg      420
ctggacttct tcgccgagac ctgccgcaag ggtgacctgc ccgccgccac cccggagatc      480
ctcgacctga tccgcatgac ctccaccgaa ccggccctgc gcgccgtgtg gctccaggcc      540
cacgacgacg cgcttcccgt cctcggcggg cttctcgcgc ggcgctccgg cgccgatgcc      600
ggcgacctga gggtgacggt gcacgcggcg acgctgaacg gcgccctgcg ggcggcggtg      660
gaggacttcg cccggcggta cgcggaccgg ccggacgccg cggacgccga actcgcccgc      720
tgtctcgacg ccgccctgcg cgcggcctcg gagggactcc cctactga                   768
<210>  26
<211>  255
<212>  БЕЛОК
<213>  streptomyces fungicidicus
<400>  26
Val Val Ser Leu Thr Asp Lys Met Ser Ala Asn Ala Ile Ser Asp Val
1               5                   10                  15
Trp Thr Ala Gly Gly Arg Arg Pro Leu Val Met Leu Arg Gly Gly Ala
20                  25                  30
Glu Asp Gly Asp Gly Gly Ala Ser Val Arg Gln Thr Pro Val Glu Ala
35                  40                  45
Leu Arg Gln Gly Thr Thr Gly Ala Gly Gly Leu Ser Leu Val Glu Arg
50                  55                  60
Arg Lys Ala Ala Leu Arg Phe Glu Ile Ala Cys Ala Ala Val His Leu
65                  70                  75                  80
Phe Thr Ser Gln Gly Val Ala Ala Thr Thr Gly Glu Gln Ile Ala Gln
85                  90                  95
Ser Val Gly Ile Ser Ser Arg Thr Leu Trp Arg His Phe Pro Thr Lys
100                 105                 110
Glu Ser Cys Val Leu Pro Leu Leu Thr Ala Ala Leu Asp Phe Ala Val
115                 120                 125
Asp Arg Leu Arg His Trp Pro Ala Glu Thr Ser Leu Leu Asp Phe Phe
130                 135                 140
Ala Glu Thr Cys Arg Lys Gly Asp Leu Pro Ala Ala Thr Pro Glu Ile
145                 150                 155                 160
Leu Asp Leu Ile Arg Met Thr Ser Thr Glu Pro Ala Leu Arg Ala Val
165                 170                 175
Trp Leu Gln Ala His Asp Asp Ala Leu Pro Val Leu Gly Gly Leu Leu
180                 185                 190
Ala Arg Arg Ser Gly Ala Asp Ala Gly Asp Leu Arg Val Thr Val His
195                 200                 205
Ala Ala Thr Leu Asn Gly Ala Leu Arg Ala Ala Val Glu Asp Phe Ala
210                 215                 220
Arg Arg Tyr Ala Asp Arg Pro Asp Ala Ala Asp Ala Glu Leu Ala Arg
225                 230                 235                 240
Cys Leu Asp Ala Ala Leu Arg Ala Ala Ser Glu Gly Leu Pro Tyr
245                 250                 255
<210>  27
<211>  505
<212>  ДНК
<213>  streptomyces fungicidicus
<400>  27
atgcgcccgc ccgtcaccca ccaccaccct gccggaggcg ctgcgcgccg cccctatcga       60
ctcttgatcg tggaggacga gaaacgcctc gctctctccc tcgccaaggg actcaccgcc      120
gagggctacg ccgtggacgt cgtccacgac ggccgggagg gcctgcaccg ggccacggag      180
gggacgtacg acctcctcat cctggacatc atgctgcccg gtctcaacgg ctaccgggtc      240
tgcgccgcgc tccgcgccgc cggacacgac gtgccgatcc tgatgctcac ggccaaggac      300
ggcgagtacg acgaggcgga gggcctggac accggcgccg acgactacct caccaagccg      360
ttctcgtacg tcgtcctcgt cgccaggatc aaggcgctgc tgcgccgccg gccggccggg      420
gcctccccca tccatgtcca cggcgacctc aaggtggaca ccgccgcccg ccgcgtcttc      480
ctgggcgagg acgaagtggc gctga                                            505
<210>  28
<211>  168
<212>  БЕЛОК
<213>  streptomyces fungicidicus
<400>  28
Met Arg Pro Pro Val Thr His His His Pro Ala Gly Gly Ala Ala Arg
1               5                   10                  15
Arg Pro Tyr Arg Leu Leu Ile Val Glu Asp Glu Lys Arg Leu Ala Leu
20                  25                  30
Ser Leu Ala Lys Gly Leu Thr Ala Glu Gly Tyr Ala Val Asp Val Val
35                  40                  45
His Asp Gly Arg Glu Gly Leu His Arg Ala Thr Glu Gly Thr Tyr Asp
50                  55                  60
Leu Leu Ile Leu Asp Ile Met Leu Pro Gly Leu Asn Gly Tyr Arg Val
65                  70                  75                  80
Cys Ala Ala Leu Arg Ala Ala Gly His Asp Val Pro Ile Leu Met Leu
85                  90                  95
Thr Ala Lys Asp Gly Glu Tyr Asp Glu Ala Glu Gly Leu Asp Thr Gly
100                 105                 110
Ala Asp Asp Tyr Leu Thr Lys Pro Phe Ser Tyr Val Val Leu Val Ala
115                 120                 125
Arg Ile Lys Ala Leu Leu Arg Arg Arg Pro Ala Gly Ala Ser Pro Ile
130                 135                 140
His Val His Gly Asp Leu Lys Val Asp Thr Ala Ala Arg Arg Val Phe
145                 150                 155                 160
Leu Gly Glu Asp Glu Val Ala Leu
165
<210>  29
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  29
ggacgatgcc atcaaaaccg                                                   20
<210>  30
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  30
actgcttgat caccgaggtg                                                   20
<210>  31
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  31
ctgttcaacc tgaccgggaa                                                   20
<210>  32
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  32
gaagaccacg acctcgatgg                                                   20
<210>  33
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  33
gggcaggagt tcttgaggac                                                   20
<210>  34
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  34
ccacgtcaag aacctggtga                                                   20
<210>  35
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  35
ggcaagtcga ccctcatcaa                                                   20
<210>  36
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  36
atgaccgaga acagcgtctc                                                   20
<210>  37
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  37
cgcatctgtt ccaggcaatg                                                   20
<210>  38
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  38
tcatcgtggc gcataggtac                                                   20
<210>  39
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  39
tgtggggatg tccttcggaa                                                   20
<210>  40
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  40
cgacgatgcc aagagactgt                                                   20
<210>  41
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  41
ggacgatgcc atcaaaaccg                                                   20
<210>  42
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  42
actgcttgat caccgaggtg                                                   20
<210>  43
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  43
tgctgctgtc gatcatggag                                                   20
<210>  44
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  44
aggaagggct ggtaggtcat                                                   20
<210>  45
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  45
cgagtccgaa gcagaaggag                                                   20
<210>  46
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  46
gggtcggcaa catcttcctc                                                   20
<210>  47
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  47
gagcacacga ggactgagag                                                   20
<210>  48
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  48
gtaccccctc atagcgcttc                                                   20
<210>  49
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  49
agaagtacgg gattcgggga                                                   20
<210>  50
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  50
actgcttgat caccgaggtg                                                   2
<---