РЕКОМБИНАНТНЫЕ ДНК, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЕ ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ Р6, Р7, Р8, ОБЛАДАЮЩИХ ПРОТЕКТИВНЫМИ СВОЙСТВАМИ В ОТНОШЕНИИ STREPTOCOCCUS AGALACTIAE И СЕЛЕКТИВНО-СВЯЗЫВАЮЩИХ IgA
RECOMBINANT DNA PROVIDING PRODUCTION OF POLYPEPTIDES P6, P7, P8 EXHIBITING PROTECTIVE PROPERTIES AGAINST STREPTOCOCCUS AGALACTIAE AND SELECTIVELY CONNECTING IgA

Изобретение относится к области микробиологии и молекулярной генетики и может быть использовано в медицинской промышленности при производстве вакцин против Streptococcus agalactiae. Изобретение также может быть использовано для создания диагностикума по детекции уровня иммуноглобулина A (IgA) в биологических жидкостях и может применяться в иммунохимии в качестве доступных иммунохимических реагентов.
Streptococcus agalactiae, представитель стрептококков группы В (СГВ), относится к условно-патогенным микроорганизмам, вызывающим тяжелые заболевания человека: артрит, эндокардит, пиелонефрит, мастит, септицемия, некротический фасцит, офтальмит и другие. СГВ являются одним из ведущих возбудителей в этиологии патологии беременности, тяжелых инфекций новорожденных и детей раннего возраста, вызывая возникновение сепсиса и менингита. Новорожденные приобретают бактерии через родовой канал их матери, являющейся носителем СГВ. Стрептококковая инфекция у детей старшего возраста часто выражена в виде артрита, остеомиелита и поражения кожных покровов. Стрептококки группы В также способны вызывать выкидыши, внутриутробное повреждение плода, послеродовой сепсис и другие патологии у взрослых. Описано распространенное носительство СГВ в урогенитальной области и в прямой кишке. Наиболее тяжело протекают заболевания у лиц с ослабленным иммунитетом. Широкий спектр тяжелых заболеваний, вызываемых СГВ, в основном, среди детей перинатального и раннего детского возраста, а также женщин детородного возраста, рассматривается как существенная медицинская и эпидемиологическая проблема в большинстве стран, в том числе и в развитых, несмотря на профилактические меры. Профилактику инфекционных заболеваний стрептококковой этиологии осуществляют с применением бензатин бензилпенициллина, эритромицина, ампициллина и сульбактама (Бурбелло А.Т. и др., Соврем. Лекар. Средства, СПб: Нева, 323-324, 332, 352 (2003)). Для лечения больных с заболеваниями, вызванными СГВ, используют антибиотики (Страчунский Л.С., Козлов С.Н., Соврем. Антимикроб. Химиотер., М.: Боргес, 1-432 (2002), Поляк М.С. Основы антибиотикотерапии, СПб: НИЦФ, 1-53 (2003)). Наибольшее распространение получили представители группы пенициллинов - бензилпенициллин и ампициллин, а также макролиды: эритромицин, ванкомицин, азитромицин, кларитромицин, рокситромицин ((Семина Н.А., Сидоренко С.В. и др., Клин. Микробиол. Антимикроб. Химиотер. 6(4): 306-359 (2004)), Зуева Л.П., Поляк М.С. и др., Микробиологический мониторинг, СПб: Медицинский информационно-аналитический центр, 1-72 (2004)).
Сложность при лечении и профилактике посредством антибиотикотерапии возникает в связи с многообразием побочных эффектов, проявляющихся у пациентов: негативное действие на центральную нервную и сердечно-сосудистую, иммунную системы организма, нарушение микробиоценоза организма, а также аллергические реакции. Неэффективность терапии с применением антибиотиков в ряде случаев обусловлена появлением антибиотико-резистентных штаммов СГВ.
Отсутствие безопасных и эффективных мер по профилактике и лечению заболеваний, вызываемых СГВ, делает актуальным направление по разработке антибактериальных вакцин, сконструированных, в том числе, на основе белков микробного происхождения.
Разработка вакцин - не единственное актуальное направление использования бактериальных белков. К примеру, белки G и L (поверхностные белки стрептококков С и G), протеин А стафилококков нашли активное применение в качестве иммунохимических реагентов, направленных, в основном, на определение IgG. В настоящее время возрос интерес к молекуле IgA, многообразие функций которой, а также возможность использования в диагностических целях требуют создания высокоселективных реагентов, обладающих IgA-рецепторной активностью.
В качестве существенного фактора вирулентности СГВ рассматривается уникальный поверхностный протеин - Вас белок, или β антиген (130 kDa), не имеющий гомологов среди других бактериальных белков, обладающих IgA-рецепторной активностью. Одной из особенностей Вас белка является наличие в его структуре области гомологии с белками суперсемейства иммуноглобулинов эукариот. Экспрессируемый многими штаммами серотипов Ia, Ib, II и V, Вас протеин практически не представлен в штаммах СГВ III-его серотипа.
Для реализации биологических функций β антиген обладает рядом свойств. Он неиммунно связывается с константным (Fc) участком IgA, основным иммуноглобулином, обеспечивающим защиту слизистых от проникновения микроорганизмов. Также Вас белок взаимодействует с фактором Н (FH) человека - белком плазмы крови, связывание которого приводит к инактивации альтернативного пути комплемента и способствует адгезии микроорганизма к человеческим клеткам. Способность вступать во взаимодействие с двумя указанными компонентами иммунной системы человека позволяет СГВ уклоняться от иммунного ответа (Eur. J.Immunol. - 1985. - №15. - Р.893-899; Adv. in host defense mechanisms. - 1985. - V.4. - P.31-61). Распространенность среди штаммов СГВ, важная роль в обеспечении вирулентности бактерий, консервативность структуры белка обусловили выбор β-антигена как основы для создания потенциальных компонентов вакцинных препаратов.
Впервые IgA-рецепторные свойства Вас белка, экстрагированного детергентами с поверхности бактерий и подвергнутого многоступенчатой очистке, описал Russell-Jones с соавторами в 1984 г. (J. exp.med. - 1984. - V.160. - P.1467-1475).
В 1987 году швейцарскими учеными впервые был проклонирован ген, кодирующий β антиген. Источником ДНК послужил клинический изолят СГВ Ic серотипа, являвшийся причиной менингита у новорожденных. Клонирование осуществлено с использованием плазмидного вектора pUC18 в Е.coli К-12 (Infection and immunity. - 1987. - V.55, №5. - P.1151-1155).
Прототипом изобретения является нуклеотидная последовательность, кодирующая IgA-связывающий сайт А в β антигене СГВ. ДНК штамма LA239 Ibc серотипа СГВ послужила источником такой нуклеотидной последовательности, клонирование которой в Е.coli К-12 537 с использованием экспрессионного плазмидного вектора рЕх31 осуществлено в 1991 году (Mol Microbiol. - 1991. - 5(4). - Р.843-9). В результате этой работы был экспрессирован и очищен рекомбинантный белок IABF (8,5 kDa).
В 1996 году получены укороченные фрагменты протеина IABF, а также идентифицирован гексапептид MLKKIE. Область MLKKIE, локализованная в IgA-связывающем сайте А (73 аминокислоты), предположительно, была ответственна за связывание Вас белком Fc-области IgA (Infection and immunity. - 1996. - V.64, №7. - P.2787-2793). Дериваты IABF, полученные авторами указанного исследования, не обладали IgA-рецепторной активностью, что не позволяет применять их в диагностических целях и в качестве IgA-связывающих агентов.
Задачей данного изобретения стало получение на основе N-терминальной консервативной части поверхностного Вас белка СГВ Ibc серотипа рекомбинантных полипептидов, включающих первый IgA-связывающий сайт А с измененной или нативной последовательностью MLKKIE. Причем полипептиды должны были обладать иммуногенными и протективными свойствами с целью использования их в качестве компонентов вакцины против стрептококков группы В. Помимо указанного, полипептиды должны были высокоселективно связывать IgA с целью создания IgA-рецепторных иммунохимических реагентов. Для определения возможности использования полипептидов в качестве рецепторов частично денатурированной молекулы IgA необходимо было выделить сайты связывания на молекуле IgA ранее описанного полипептида Р6, а также полипептидов, обозначенных как Р7, Р8, и проверить их устойчивость к денатурирующему воздействию. Также задачей изобретения стало создание штаммов-продуцентов рекомбинантных дериватов β антигена.
Результатом изобретения явилось получение обозначенных объектов биотехнологии.
вас
Поставленная задача решалась конструированием пар уникальных праймеров, направленных к участкам гена , кодирующего белок Вас СГВ. Их использование в полимеразной цепной реакции позволило получить искомые фрагменты ДНК, лигированные впоследствии с плазмидным вектором pGEM-T Easy. Полилинкер указанного коммерческого вектора локализован в области, кодирующей β-галактозидазу, что дало возможность отобрать трансформанты Е.coli JM 109 с необходимой конструкцией. В дальнейшем клонирование фрагментов β антигена проведено с помощью системы экспрессионных векторов pQE30/31/ 32, позволяющей облегчить выделение и очистку рекомбинантных дериватов. Создание штаммов-продуцентов, обозначенных как Е.coli JM 109-Р6, Е.coli JM 109-P7 и Е.coli JM 109-P8, осуществлялось путем генетической трансформации штамма на основе штаммов Е.coli JM 109. Полученные штаммы-продуценты Е.coli JM 109-Р6, Е.coli JM 109-P7 и Е.coli JM 109-P8 включают плазмиды, содержащие участок последовательности гена bac опубликованной Pierre G. Jerlstrőm (Infection and immunity. - 1996. - V.64, №7. - P. 2787-2793), ассоциированный с участком ДНК вектора pQE32. Плазмида в штамме Е.coli JM 109-P7 содержит генетическую замену данной последовательности в области, кодирующей участок, описанный Jerlstrőm. Штамм Е.coli JM 109-P6 был идентичен штамму, созданному ранее (Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2005. - №2. - С.35-40), но включает ранее не установленную нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид Р6 с ранее не установленной аминокислотной последовательностью. Трансформация бактерий привела к появлению способности индуцибельной экспрессии рекомбинантных полипептидов Р6, Р7, Р8.
вас
вас
вас
Сущностью предлагаемого изобретения является создание уникальных фрагментов гена  - с 406 п.н. по 1287 п.н. (обозначен как p6), с 301 п.н. по 1653 п.н. (обозначен как р8) и рекомбинантной ДНК с 301 п.н. по 1653 п.н. (обозначена как р7), полученных в результате полимеразной цепной реакции. Причем создание рекомбинантной ДНК р7 произведено лигированием амплифицированных рекомбинантных ДНК с 301 п.н. по 682 п.н. (обозначена как p71) и с 662 п.н. по 1653 п.н. (обозначена как р72) гена . р71 и р72 включают, в свою очередь, по три нуклеотидные замены по сравнению с последовательностью гена . Амплификация указанных фрагментов осуществлена с использованием хромосомной ДНК штамма 219/4849 Ibc серотипа СГВ (штаммы из коллекции Национального стрептококкового центра России) в качестве матрицы, уникальных праймеров, обозначенных как Pr6 и Pr3 - для создания р6, Pr5 и Pr8 для р8, а также Pr5 и Pr2 для р71, Pr7 и Pr8 для р72 (последовательности праймеров приведены в таблице 1). Причем при создании р6 использованы вновь сконструированные праймеры, отличные от приведенных в ранее опубликованных работах (Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2005. - №2. - С.35-40). Последующее клонирование полученных фрагментов хромосомной ДНК и рекомбинантных ДНК происходило посредством сначала плазмидного вектора pGEM-T Easy (Promega, USA), а затем системы экспрессионных векторов pQE-30/31/32 (The QIAexpress System, Qiagen, США) в E.coli JM 109. Полученные фрагменты хромосомной ДНК и рекомбинантные ДНК кодируют уникальные аминокислотные последовательности рекомбинантных полипептидов Р6, Р7, Р8, причем, в зависимости от используемого экспрессионного вектора, у полипептидов присутствует или отсутствует ковалентная связь с шестью гистидинами, кодируемыми вектором pQE32.
Также сущностью предлагаемого изобретения является создание штаммов-продуцентов E.coli JM 109-Р6′, E.coli JM 109-P7′, E.coli JM 109-P8′, позволяющих при определенных условиях индуцировать синтез рекомбинантных полипептидов Р6, Р7, Р8.
вас
Авторами получены фрагменты гена  размером 882 п.н. (р6), 1353 н.п.(р8), 382 н.п. р71 и 992 н.п. р72 (после лигирования: 1353 н.п., р7) в ходе полимеразной цепной реакции на основе хромосомной ДНК штамма 219/4849 Ibc серотипа СГВ с использованием соответствующих пар праймеров. Также авторами проведено лигирование нуклеотидных последовательностей р6, р7, р8 с плазмидными векторами pGEM-T Easy, первичный отбор бактериальных клонов, содержащих необходимые вставки, и клонирование фрагментов р6, р7, р8 в системы экспрессионных векторов pQE-30/31/32 с дальнейшей трансформацией рекомбинантных плазмидных ДНК в гетерологической системе E.coli JM 109. В результате авторами получены штаммы-продуценты E.coli JM 109-Р6′, E.coli JM 109-P7′, E.coli JM 109-P8′ соответственно рекомбинантных протеинов Р6, Р7, Р8. Также авторами осуществлено выделение и одноступенчатая очистка рекомбинантных дериватов β антигена посредством индуцибельной экспрессии полипептидов Р6, Р7, Р8 и аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе (Qiagen, США).
Кроме того, авторами получена иммунохимическая характеристика взаимодействия различных молекулярных форм IgA с полипептидами Р6, Р7, Р8, определено относительное положение сайта связывания полипептидов на молекуле IgA, его неконсервативность и устойчивость к денатурирующему воздействию.
8
-1
13
-1
Из литературных источников известно, что полипептид Р6, молекулярной массой 35 kDa, вызывает у мышей при внутрибрюшинном введении выработку специфических антител класса G, причем максимальный титр антител составил 1:100 000. Было установлено, что иммунный ответ гетерогенен по аффинитету антител. Значения констант связывания составляли от 10 М до 10 М для Р6 (Медицинская иммунология, 2004, т.6, с.493-498). Полипептид Р6 обладает способностью к синтезу длительно циркулирующих высокоаффинных анти-Р6 антител, обладающих протективными свойствами против СГВ (Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2005. - №2. - С.35-40). Ранее изучены протективные свойства анти-Р6 и анти-ScaAB (поверхностный липопротеин СГВ) антител при совместном и раздельном введении в модельных экспериментах in vitro (опсонофагоцитарный тест с использованием перитонеальных мышиных макрофагов и стрептококков группы В) (Медицинская иммунология, 2006, т.8, с.109-478). Полипептиды Р6 и ScaAB, в связи с возможностью обеспечить протективность при крайне низких титрах антител, обладающих опсонизирующей активностью, в том числе и в отношении СГА, а также штаммов III серотипа СГВ, весьма перспективны в роли компонентов вакцины.
В изобретении показано, что рекомбинантные полипептиды Р6, Р7, Р8 обладают способностью селективно связывать различные молекулярные формы IgA. Полученные и охарактеризованные рекомбинантные полипептиды Р7, Р8 перспективны в качестве компонентов вакцинного препарата, специфичного в отношении широкого круга штаммов СГВ. Протеины Р6 и Р8, обладающие селективной IgA-рецепторной активностью, могут быть полезны для осуществления экспресс диагностики уровня иммуноглобулина А в различных биологических жидкостях для оценки клинического состояния больных или общего иммунного статуса, что может сыграть роль при диагностике заболеваний. Также рекомбинантные дериваты Р6, Р8 обладают широким спектром практического применения в иммунологии: в качестве доступных и удобных IgA-связывающих иммунохимических реагентов на основе белков бактериального происхождения в ИФА (как в адсорбированном состоянии, так и в роли выявляющих молекул), для манипуляций с денатурированной молекулой IgA - иммуноблот, с целью аффинного выделения фрагментов IgA.
Получение рекомбинантных полипептидов Р6, Р7, Р8
вас
Источником хромосомной ДНК послужил штамм 219/4849 Ibc серотипа СГВ. ДНК, выделенная фенольно-хлороформной экстракцией, была использована в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с целью получения фрагментов гена bac: р6 (с 406 п.н. по 1287 п.н., всего 882 п.н.), p7 (с 301 п.н. по 682 п.н., всего 382 п.н. и с 662 п.н. по 1653 п.н., всего 992 п.н., после лигирования двух фрагментов: 1353 п.н.), р8 (с 301 п.н. по 1653 п.н., всего 1353 п.н.), кодирующих соответственно полипептиды Р6, Р7 и Р8. Причем в область потенциальной антигенной детерминанты полипептида Р7 было решено ввести две аминокислотные замены (лизин в позиции 225 замещен на аргинин, а глутамат в позиции 227 на глутамин). В результате, отличительной особенностью полипептида Р7 является наличие измененной (по сравнению с областью MLKKIE белка Вас) последовательности из 6 аминокислот MLKRIQ, локализованной на IgA-связывающем сайте. С целью модификации гексапептида MLKKIE и, соответственно, создания области MLKRIQ, решено было осуществить амплификацию двух перекрывающихся фрагментов гена  301 п.н. - 682 п.н., 662 п.н. - 1653 п.н., захватывающих область, кодирующую MLKKIE. Для этого путем нуклеотидных замен были сконструированы обратный Pr2 и прямой Pr7 праймеры, соответственно участвующие в амплификации первого (382 п.н., p71) и второго (992 п.н., p71) фрагментов ДНК и содержащие сайт EcoRI. Олигонуклеотидные праймеры приведены в Таблице 1.
CG
T
ATT
A
CG
AAT
G
ТС
AA Т
Причем в исходные последовательности праймеров Pr2′ (CTTTTTTCAGCATAG) и Pr7′ (CTATGCTGAAAAAAG) внесены по три нуклеотидные замены таким образом, что это привело к образованию праймеров Pr2 и Pr7, содержащих область , кодирующую сайт EcoRI.
Анализ результатов ПЦР осуществлен путем разделения фрагментов ДНК в 1% агарозном геле при помощи горизонтального электрофореза. Выделение искомых амплифицированных участков ДНК проведено с использованием набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, США).
Выделенные из агарозы фрагменты размером 382 н.п. и 992 н.п. подверглись обработке рестриктазой EcoRI, а затем были лигированы друг с другом, что привело к образованию нуклеотидной последовательности p7 (1353 н.п.), содержащей сайт EcoRI.
Нуклеотидная последовательность р6 представлена на фиг.1.
Нуклеотидная последовательность р7 представлена на фиг.2.
Нуклеотидная последовательность р8 представлена на фиг.3.
вас
Нуклеотидную последовательность р6 лигировали с вектором pGEM-T Easy (Promega, USA, 3018 п.н.), не требующим наличия сайтов рестрикции, согласно инструкции производителя. В результате образовалась рекомбинантная плазмидная ДНК, обозначенная как pGEM-р6 и содержащая фрагмент  гена 882 п.н. - р6, а также плазмиду pGEM-T Easy.
вас
Аналогично получена рекомбинантная плазмидная ДНК, обозначенная как pGEM-p7 и содержащая фрагмент  гена 1353 п.н. с тремя нуклеотидными заменами - р7, а также плазмиду pGEM-T Easy.
вас
Аналогично получена рекомбинантная плазмидная ДНК, обозначенная как pGEM-p8 и содержащая фрагмент  гена 1353 п.н. - р8, а также плазмиду pGEM-T Easy.
вас
Продуктами лигирования проводили кальциевую трансформацию штамма E.coli JM109, после чего высевали трансформанты на чашки Петри с добавлением ампициллина (Ар), 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галактопиранозида (X-gal) и изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (IPTG). В векторной плазмиде pGEM-T полилинкер локализован в области, кодирующей β-галактозидазу. При росте на среде, содержащей Ар, X-gal и IPTG колонии, содержащие плазмиду без вставки, имеют голубой цвет, а колонии, содержащие рекомбинантную плазмиду, - белого цвета, что позволило провести отбор трансформантов со вставкой по цвету бактериальных колоний. Бактериальные клоны проверяли на наличие вставки из гена  нужного размера методом ПЦР с использованием праймеров Pr6 и Pr3, Pr5 и Pr8 и последующим электрофоретическим анализом полученных фрагментов ДНК в 1,5% агарозном геле.
Из отобранных трансформантов, обозначенных как E.coli JM109-P6, E.coli JM109-P7, E.coli JM109-P8, с помощью Mini-prep plasmid DNA purification kit (Qiagen, USA), были выделены плазмиды, включающие фрагменты β антигена.
вас
вас
вас
Для выделения фрагментов ДНК, кодирующих полипептиды Р6, Р7, Р8, полученные плазмидные ДНК (обозначенные как pGEM-p6, pGEM-p7, pGEM-р8) были рестрицированы. Рестрикция проведена по сайтам SphI-PstI, поскольку сайты рестрикции ферментами SphI и PstI были изначально заложены в последовательность вектора pGEM-T Easy. Система экспрессионных векторов pQE30/31/32 (The QIAexpress System, Qiagen, США), в которую будет клонирована каждая из трех вырезанных полноразмерных вставок, также предварительно была обработана ферментами SphI и PstI. Продукты рестрикции разделяли с помощью горизонтального электрофореза в 1% агарозном геле. Рестрицированную плазмиду pGEM-T и р6, р7, р8, фланкированные сайтами рестрикции SphI и PstI, выделяли из агарозы с помощью набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, США). В результате проведенного клонирования в систему векторов pQE30/31/32 были получены рекомбинантные плазмидные ДНК (обозначенные pQE-p6, pQE-p7, pQE-p8), несущие рекомбинантные ДНК соответственно р6′ (состоит из р6 - 882 п.н. участка гена  и 44 п.н. фрагмента плазмиды pQE-32), р7′ (состоит из р7 - 1353 п.н. модифицированного участка гена  и 44 п.н. фрагмента плазмиды pQE-32), р8′ (состоит из р8-1353 п.н. участка гена  и 44 п.н. фрагмента плазмиды pQE-32).
2
Рекомбинантные плазмидные ДНК pQE-p6, pQE-p7, pQE-p8 были трансформированы в Е.coli JM109 с помощью кальциевого метода и реактивов The QIAexpress System фирмы Qiagen, США. Трансформацию клеток Е coli JM 109 проводили рекомбинантными плазмидными ДНК pQE-p6, pQE-p7, pQE-p8 с использованием положительного (Е coli JM 109, трансформированная исходной плазмидной ДНК pQE30/31/32) и отрицательного (культура клеток Е coli JM 109, не трансформированная) контролей. Процесс трансформации осуществляли по методике трансформации кишечной палочки, предполагающей инкубацию культуры Е coli JM 109, суспендированной в растворе CaCl, с плазмидной ДНК при разных температурах (Maniatis Т, Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. - Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982. - 867 p.). Селективные среды для отбора трансформантов содержали 50 мкг/мл ампициллина, 25 мкг/мл канамицина.
В каждом из трех вариантов бактериальных клонов, содержащих модифицированные плазмиды pQE, несущие гены устойчивости к указанным антибиотикам, были отбраны ампициллин- и канамицинустойчивые трансформанты. Наличие рекомбинантных плазмид pQE-p6, pQE-p7, pQE-p8 у трансформированных штаммов Е.coli JM109 определено при помощи ПЦР с использованием исходных праймеров Pr6 и Pr3, Pr5 и Pr8 и последующим электрофоретическим анализом полученных фрагментов ДНК в 1,5% агарозном геле, на основании чего был проведен отбор соответствующих клонов.
Q
С целью выявить трансформанты, содержащие один из трех вариантов рекомбинантных плазмид pQE-30, pQE-31, pQE-32, у которых рамка трансляции гена E.coli совпала с рамкой трансляции встроенного гена, необходимо было проверить бактериальные клоны на способность к индуцибельной экспрессии рекомбинантных полипептидов Р6, Р7, Р8. Культуры штамма Е.coli JM109 культивировали в жидкой среде Terrific Broth с добавлением ампициллина и канамицина (во избежание кантоминации). Экспрессионные векторы pQE содержат гены устойчивости к ампицилину и канамицину, а также промотор для индукции транскрипции рекомбинантного белка путем добавления в среду IPTG, причем в качестве хозяина плазмид pQE использовали штаммы Е.coli с мутацией lacI, конститутивно продуцирующей lac-репрессор, препятствующий экспрессии протеина. Культуры продолжали выращивать с целью увеличения количества полипептидов, затем клетки E.coli осаждали центрифугированием, отмывали и суспендировали в связывающем буфере А, рН 7.9 и разрушали клеточную стенку ультразвуком на ультразвуковом дезинтеграторе. Лизат освобождали от клеточных обломков центрифугированием. Полипептиды очищали методом аффинной хроматографии, на Ni-NTA агарозе (Qiagen, США). Высокая степень очистки белка достигается за счет сильного аффинного взаимодействия между Ni и цепи из шести гистидинов, связанной с рекомбинантным полипептидом и кодируемой областью, предшествующей полилинкеру в плазмидах pQE. Неспецифически связавшиеся белки удаляли буфером А, элюция рекомбинантных дериватов Вас белка проходила с использованием элюирующего буфера Б рН 7.9, содержащего 400 mM EDTA. Полученные препараты полипептидов очищены от элюирующего буфера диализом против фосфатного буферного раствора, рН 7,4 (PBS).
Выделенные рекомбинантные протеины анализировали методом SDS-электрофореза в полиакриламидном геле, который позволил сделать заключение об удовлетворительном качестве очистки полипептидов, а также об их молекулярной массе: у Р6 - (35±0,5) кДа, у Р7 и Р8 - (52±0,5) кДа по сравнению с пробегом белков известной молекулярной массы (Precision Plus Protein standards (161-0373), Bio-Rad, США).
Экспрессия полипептидов Р6, Р7, Р8 реализована только у трансформированной культуры E.coli, включающей рекомбинантную плазмиду pQE32. Это свидетельствует о совпадении рамки трансляции гена E.coli с рамкой трансляции встроенного гена.
Чертежи иллюстрируют эксперимент.
Фиг.1 (Нуклеотидная последовательность фрагмента хромосомной ДНК р6) представляет нуклеотидную последовательность фрагмента хромосомной ДНК р6 - 882 п.н., кодирующую аминокислотную последовательность рекомбинантного полипептида Р6.
Фиг.2 (Нуклеотидная последовательность рекомбинантной ДНК р7) представляет нуклеотидную последовательность рекомбинантной ДНК р7 - 1353 п.н., кодирующую аминокислотную последовательность рекомбинантного полипептида Р7.
Фиг.3 (Нуклеотидная последовательность фрагмента хромосомной ДНК р8) представляет нуклеотидную последовательность фрагмента хромосомной ДНК р8 - 1353 п.н., кодирующую аминокислотную последовательность рекомбинантного полипептида Р8.
Фиг.4 (Аминокислотная последовательность рекомбинантного полипептида Р6) представляет аминокислотную последовательность рекомбинантного полипептида Р6, Р6 состоит из 294 аминокислотных остатков.
Фиг.5 (Аминокислотная последовательность рекомбинантного полипептида Р7) представляет аминокислотную последовательность рекомбинантного полипептида Р7, Р7 состоит из 451 аминокислотного остатка.
Фиг.6 (Аминокислотная последовательность рекомбинантного полипептида Р8) представляет аминокислотную последовательность рекомбинантного полипептида Р8, Р8 состоит из 451 аминокислотного остатка.
Таким образом, рекомбинантный полипептид Р6 является фрагментом аминокислотной последовательности поверхностного Вас белка СГВ штамма 219/4849 Ibc серотипа со 136 по 429 аминокислотный остаток. Рекомбинантный полипептид Р7 является фрагментом аминокислотной последовательности поверхностного Вас белка СГВ штамма 219/4849 Ibc серотипа со 101 по 551 аминокислотный остаток с двумя аминокислотными заменами. Рекомбинантный полипептид Р8 является фрагментом аминокислотной последовательности поверхностного Вас белка СГВ штамма 219/4849 Ibc серотипа со 101 по 551 аминокислотный остаток.
Аминокислотные последовательности трех указанных дериватов β антигена ковалентно связаны с шестью гистидинами, кодируемыми вектором pQE32 (The QIAexpress System, Qiagen, США). Полипептиды Р6 и Р8 сконструированы таким образом, что наряду с Вас белком содержат IgA-связывающий сайт, включая гексапептид MLKKIE. Полипептид Р7 также содержит сайт, отвечающий за реализацию IgA-рецепторной активности протеином, однако в области из шести аминокислот произведена замена двух из них - лизина 225 на аргинин, а глутамата 227 на глутамин, что значительно ухудшает связывание производного β антигена с IgA по данным авторов.
Расположение аминокислотных последовательностей, кодируемых р6, р7, р8, относительно аминокислотной последовательности поверхностного Вас белка СГВ показано на фиг.7.
На фиг.7 (Схема аминокислотных последовательностей Вас белка СГВ, рекомбинантных полипептидов Р6, Р7, Р8):
1 - сигнальная последовательность;
2 - участок, ответственный за связывание IgA;
3 - область, схожая с последовательностями белков суперсемейства иммуноглобулинов эукариот (IgSF);
4 - участок, ответственный за связывание фактора Н человека (FH);
5 - XPZ участок, обладает структурой полипролин-II, состоит из повторяющихся триплетов, богат пролином;
6 - С-терминальная якорная область (содержит LPYTG motif).
Изучение особенностей взаимодействия рекомбинантных полипептидов Р6, Р7, Р8 с различными молекулярными формами IgA
Авторами получена иммунохимическая характеристика рекомбинантных молекул Р6, Р7, Р8, представляющих собой фрагменты бактериального IgA-рецептора Вас. Результаты работы позволяют расширить область применения полипептидов Р6, Р7, Р8, дополнив ее использованием при создании диагностикумов и для аффинного выделения фрагментов IgA.
Проведено сопоставление рецепторной активности рекомбинантных дериватов Р6, Р7, Р8 в отношении молекулярных форм IgA, представленных следующими образцами: сывороточный IgA (mIgA) - поликлональный сывороточный IgA человека, меченный пероксидазой хрена; поликлональный сывороточный немеченый IgA; IgA1 и IgA2 - сыворотки крови пациентов с миеломной болезнью, а также секреторный IgA (SIgA) - выделенный из молозива секреторный поликлональный IgA; чигаин.
Установлено, что Р6, Р7, Р8 обладают способностью к селективному (в условиях непрямого ИФА подтверждено отсутствие взаимодействия с поликлональным IgG, а также с моноклональными образцами IgG с 1 по 4 подкласс) связыванию всех исследованных форм IgA в любом из использованных вариантов постановки ИФА (прямой ИФА, непрямой ИФА, ингибиторный ИФА, конкурентное ингибирование). Такой результат закономерен, если распространить свойства β антигена на его рекомбинантные дериваты. Несмотря на это, структурные различия между тремя полипептидами, реализованные, как указано выше, методами молекулярной генетики, способствуют существенной дифференцировке рекомбинантных протеинов Р6, Р7, Р8 по IgA-связывающим свойствам. Протеин Р7, содержащий измененную последовательность MLKRIQ, а в остальном полностью идентичный рекомбинантному протеину Р8, обладает более слабо выраженной способностью к связыванию всех рассмотренных молекулярных форм IgA. Последнее свидетельствует о важном значении гексапептида MLKKIE в реализации IgA-рецепторной активности белками. Минимальная эффективность связывания с иммуноглобулином класса А в ряду исследованных белков позволяет рассматривать Р7 в качестве одного из наиболее приемлемых вариантов для создания вакцины против СГВ. Показано, что структура рекомбинантного деривата Р6 оптимальна для реализации IgA-рецепторной активности среди полипептидов Р6, Р7, Р8. Преимущество протеина Р6 в связывании иммуноглобулина класса А перед Р8 можно объяснить отсутствием у последнего оптимальной конформации или генерацией стерических затруднений, вызванных взаимодействием с лигандом молекулы большого размера (Р6 укорочен по сравнению с Р8 с обоих концов). Данные по IgA-рецепторной активности трех белков приведены в Таблице 2.
Влияние молекулярной формы IgA на распознавание лиганда рецепторными молекулами Р6, Р7, Р8, оценивали с использованием непрямого ИФА. Полученные в ходе работы данные указывают на весьма слабое проявление IgA-рецепторной активности белками Р6, Р7, Р8 в отношении секреторного IgA (SIgA), по сравнению со связыванием сывороточного IgA. Сывороточный IgA и SIgA уравнены по концентрации (уравнены по массе).
Таблица 2
Сравнение эффективности связывания белками Р6, Р7, Р8 различных молекулярных форм IgA
Метод исследования
Молекулярые формы IgA
Отношение оптических плотностей, отражающих эффективность связывания IgA одним полипептидом по сравнению с другим
Р6 по сравнению с Р8
Р6 по сравнению с Р7
Р8 по сравнению с Р7
прямой ИФА
mIgA
П
lgA человека, меченный пероксидазой хрена
1,33
3,36
2,62
непрямой ИФА
П
Немеченый IgA человека
1,49
3,34
2,74
непрямой ИФА
П
IgA1 (к+λ)
1,02
2,03
2,01
П
IgA2 (к+λ)
1,09
1,82
1,87
М
IgA1, 10 индивидуальных миеломных образцов
1,13
3,74
3,31
М
IgA2, 2 индивидуальных миеломных образца
1,17
4,07
3,18
SIgA
1,89
3,45
1,87
Примечание. mIgA - сывороточный IgA;
П - поликлональный препарат;
М - моноклональный препарат.
На фиг.8 показана гистограмма, отражающая сопоставление IgA-рецепторной способности полипептидов Р6, Р7, Р8, а также сравнение связывания протеинами секреторной и сывороточной формы IgA.
На фиг.8 (Сравнение эффективности связывания полипротеинов Р6, Р7, Р8 с сывороточным IgA и секреторным IgA):
А - mIgA;
Б - SIgA;
По оси абсцисс - полипептиды Р6, Р7, Р8;
492
По оси ординат - оптическая плотность (OD).
При изучении особенностей взаимодействия миеломных сывороточных образцов IgA1 и IgA2, в каждом случае смесь сывороток, содержащих парапротеины κ- и λ-типов, с рекомбинантными белками, был использован непрямой ИФА на адсорбированных Р6, Р7, Р8. Показано, что миеломные парапротеины иммуноглобулина А первого подкласса взаимодействуют с дериватами Вас протеина достоверно более эффективно, чем иммуноглобулин А второго подкласса.
Отмечены особенности в поведении протеинов в условиях ИФА. Полипептиды Р6 и Р8 способны вступать во взаимодействие с IgA как в растворе (ингибиторный ИФА), так и в адсорбированном состоянии (прямой, непрямой ИФА). Последнее свойство позволяет использовать их в качестве иммунохимических реагентов в ИФА, причем как в иммобилизованном виде, так и в роли выявляющих молекул при наличии ферментной метки.
Также рассмотрены некоторые структурные аспекты связывания иммуноглобулина А фрагментами β антигена: определено относительное положение сайта связывания на молекуле IgA (посредством непрямого и ингибиторного ИФА) - участок топографически приближен к эпитопам трех МкАт (из коллекции лаборатории гибридомной технологии ФГУ "РНЦРХТ Росмедтехнологий") 3В4, 1Н9, 1В12, установлена изменчивость сайта связывания полипептидов на молекуле IgA при анализе 10 индивидуалных миеломных парапротеинов IgA1 (непрямой ИФА), определена устойчивость этого участка к частичному изменению третичной структуры IgA. Последнее осуществлялось путем исследования влияния частичного восстановления дисульфидных связей в молекуле IgA на взаимодействие полипептидов Р6, Р8 с иммуноглобулинами этого класса. Проверка проведена под контролем МкАт. Денатурирующая обработка сывороточного IgA и чигаина дитиотреитолом привела к разрыву дисульфидных связей между α цепями молекулы IgA, в результате чего отмечено снижение связывания антителами эпитопов МкАт 1Н9 и 1В12, на выявление эпитопа ЗВ4 денатурация IgA не оказала влияния (конкурентное ингибирование). В то же время полипептиды Р6 и Р8 проявляют более выраженную IgA-рецепторную активность при взаимодействии с препаратом лиганда, обработанным дитиотреитолом, по сравнению с необработанным IgA (фиг.9). Это свидетельствует о сохранности сайта связывания после частичной денатурации, однако он претерпевает некоторые изменения. Способность протеинов Р6, Р8 связывать частично восстановленный лиганд может быть полезна для манипуляций с денатурированным IgA, в том числе для аффинного выделения самой молекулы иммуноглобулина и ее фрагментов.
На фиг.9 (Влияние восстановления дисульфидных связей в молекуле IgA на ее взаимодействие с рекомбинантными полипептидами Р6 и Р8):
В - связывание Р6, Р8 с обработанным IgA;
Г - связывание Р6, Р8 с необработанным IgA;
По оси абсцисс - полипептиды Р6, Р8;
По оси ординат - ингибирование, %.
Таким образом, исследована способность рекомбинантных дериватов Вас белка СГВ Р6, Р7, Р8 связывать IgA. Полипептиды Р6, Р7, Р8 селективно связывают все рассмотренные молекулярные формы IgA. IgA-рецепторные свойства исследуемых производных белка СГВ коррелируют со свойствами, характерными для полноразмерного Вас белка. В то же время особенности структуры каждого из трех полипептидов определяют различия между ними по IgA-связывающей активности.
Результатом изобретения являются рекомбинантные ДНК р6, р7, р8, нуклеотидные последовательности которых представлены на фиг.1, 2, 3 соответственно; рекомбинантные плазмидные ДНК pQE-p6, pQE-p7, pQE-p8, представляющие собой плазмиды pQE-32, несущие рекомбинантные ДНК р6, р7, р8 соответственно; штаммы Е.coli JM109, трансформированные рекомбинантными плазмидными ДНК pQE-p6, pQE-p7, pQE-p8, и экспрессирующие рекомбинантные полипептиды Р6, Р7, Р8 соответственно; рекомбинантные полипептиды Р6, Р7, Р8, имеющие аминокислотные последовательности, представленные на фиг.4, 5, 6 соответственно.
Рекомбинантные полипептиды Р6, Р7, Р8 обладают следующими свойствами:
а) Р6, Р7, Р8 обладают способностью селективно связывать различные молекулярные формы IgA;
б) Р6, Р7, Р8 взаимодействуют с частично денатурированным IgA, причем восстановление дисульфидных связей между α-цепями молекулы не приводит к изменению взаимодействия с рекомбинантными полипептидами;
в) Р6 при введении в организм млекопитающим (мышам и кроликам) вызывает синтез длительно циркулирующих анти-Р6 антител;
г) синтезируемые анти-Р6 антитела обладают протективными свойствами в отношении Streptococcus agalactiae.
Ниже приводятся конкретные примеры, иллюстрирующие некоторые варианты изобретения, но не ограничивающие его.
вас
Пример 1. Получение фрагмента ДНК р6 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) на основе гена , кодирующего поверхностный Вас белок СГВ
ДНК-фрагмент р6 амплифицировали с использованием пары праймеров Pr6-Pr3, фланкирующей эту нуклеотидную последовательность. В ходе работы к 0,25 мкг геномной ДНК, выделенной фенольно-хлороформной экстракцией из штамма СГВ 219/4849 Ibc серотипа, добавляли по 10 пикомолей каждого из специфических праймеров (Pr3, Pr6), буфер для полимеразы с содержанием магния, по 2 мМ каждого из 4 дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, объем доводили водой до 50 мкл. Добавляли по 1 мкл теромостабильной ДНК полимеразы. На поверхность жидкости наслаивали 40 мкл минерального масла. Смесь инкубировали 3 минуты при +94°С. Пробирки помещали в амплификатор «Терцик» (Россия). Прибор программировали на цикл денатурации +94°С на 1 минуту, цикл отжига - от 42°С до 44°С (в зависимости от Г-Ц состава праймеров), цикл синтеза ДНК +72°С на 1 минуту. Последовательность таких циклов повторялась 30 раз. Олигонуклеотидные праймеры приведены в Таблице 1.
Анализ результатов ПЦР осуществлен при помощи электрофореза в агарозном геле.
вас
Пример 2. Получение фрагмента ДНК p7 методом полимеразной цепной реакции на основе гена , кодирующего поверхностный Вас белок СГВ
ДНК-фрагменты р71, р72 амплифицировали с использованием соответствующих пар праймеров Pr5-Pr2, Pr7-Pr8, фланкирующих указанные нуклеотидные последовательности по методике, описанной в примере 1.
Анализ результатов ПЦР осуществлен при помощи электрофореза в агарозном геле.
Выделенные из агарозы фрагменты р71 и р72 размером 382 н.п. и 992 н.п. подверглись обработке рестриктазой ЕсоМ, а затем были лигированы друг с другом, что привело к образованию нуклеотидной последовательности р7 (1353 н.п.), содержащей сайт EcoRI и кодирующей полипептид с измененной областью MLKRIQ.
вас
Пример 3. Получение фрагмента ДНК p8 методом полимеразной цепной реакции на основе гена , кодирующего поверхностный Вас белок СГВ
ДНК-фрагмент р8 амплифицировали с использованием пары праймеров Pr5-Pr8, фланкирующей эту нуклеотидную последовательность, по методике, описанной в примере 1.
Анализ результатов ПЦР осуществлен при помощи электрофореза в агарозном геле.
Помимо EcoRI сайта в последовательности праймеров, приведенных в таблице 1, не были заложены участки распознавания других рестриктаз, поскольку в дальнейшем нуклеотидные последовательности р6, р7, р8 лигировали с коммерческими векторами pGEM-T Easy (Promega, USA), не требующими наличия сайтов рестрикции.
Пример 4. Анализ результатов ПЦР при помощи электрофореза в агарозном геле
Анализ результатов ПЦР осуществлен путем разделения фрагментов ДНК в 1% агарозном геле при помощи горизонтального электрофореза (фиг.10, 11, 12). Выделение искомых амплифицированных участков ДНК проведено с использованием набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, США).
Анализ размеров полученных фрагментов ДНК проводили исходя из сравнения их электрофоретической подвижности с электрофоретической подвижностью маркера молекулярных весов (фрагменты ДНК Sph I - Pst I фага лямбда дикого типа).
На фиг.10 (Электрофореграмма амплифицированных ДНК-фрагментов р6):
1 - маркер, ДНК фага дикого типа + Sph I + Pst I;
2 - р6 + Sph I + Pst I.
вас
В результате полимеразной цепной реакции с праймерами Pr6-Pr3 ожидаемый размер ДНК-фрагмента гена  с 406 п.н. по 1287 п.н. составил 882 п.н., что продемонстрировано на фиг.10.
На фиг.11 (Электрофореграмма амплифицированных ДНК-фрагментов р7):
1 - маркер, ДНК фага дикого типа + Sph I + Pst I;
2 - р71 + Sph I + Pst I, p72 + Sph I + Pst I.
вас
В результате полимеразной цепной реакции с праймерами Pr5-Pr2 и Pr7-Pr8 ожидаемые размеры ДНК-фрагментов гена  с 301 п.н. по 682 п.н. и с 662 п.н. по 1653 п.н. составили 382 п.н. и 992 п.н. соответственно, что продемонстрировано на фиг.11.
На фиг.12 (Электрофореграмма амплифицированных ДНК-фрагментов р8):
1 - маркер, ДНК фага дикого типа + Sph I + Pst I;
2 - р8 + Sph I + Pst I.
вас
В результате полимеразной цепной реакции с праймерами Pr5-Pr8 размер ДНК-фрагмента гена  с 301 п.н. по 1653 п.н. составил 1353 п.н., что продемонстрировано на фиг.12.
Пример 5. Клонирование ДНК-фрагмента р6 в систему экспрессионных векторов pQE30/31/32
2
Плазмиды pQE30/31/32 (3462 п.н., 3462 п.н., 3463 п.н., The QIAexpress System, Qiagen, США), в которые будет клонирована выделенная из агарозы вставка р6 (882 п.н.), предварительно были обработаны наряду с фрагментом р6 ферментами SphI и PstI, что привело к образованию липких концов (0.25 мкг ДНК растворяли в 16 мкл HO, добавляли 2 мкл соответствующего буфера и 1 ед. рестриктазы). Продукты рестрикции разделяли с помощью горизонтального электрофореза в 1% агарозном геле, а затем выделяли из агарозы с помощью набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, США).
Смешивали в соотношении 4:1 по 30 мкл подготовленного ДНК-фрагмента р6 и по 2 мкл одной из подготовленных плазмид pQE30/31/32, добавляли 5 мкл десятикратного лигазного буфера и 1 мкл лигазы фага Т4. Далее инкубировали при 4°С в течение 12 часов, предварительно доведя объем смеси водой до 50 мкл.
В результате лигирования были получены три варианта рекомбинантных плазмидных ДНК, несущих нуклеотидную последовательность р6 и один из векторов pQE30/31/32.
Пример 6. Клонирование ДНК-фрагмента р7 в систему экспрессионных векторов pQE30/31/32
Выделенный из агарозы фрагмента p7 (1353 н.п.) клонировали в систему экспрессионных векторов pQE30/31/32, как это описано в примере 5.
В результате лигирования ДНК-фрагмента р7 и pQE30/31/32 были получены три варианта рекомбинантных плазмидных ДНК, несущих нуклеотидную последовательность p6 и один из векторов pQE30/31/32.
Пример 7. Клонирование ДНК-фрагмента р8 в систему экспрессионных векторов pQE30/31/32
Выделенный из агарозы фрагмент р8 (1353 н.п.) клонировали в систему экспрессионных векторов pQE30/31/32, как это описано в примере 5.
В результате лигирования ДНК-фрагмента р8 и pQE30/31/32 были получены три варианта рекомбинантных плазмидных ДНК, несущих нуклеотидную последовательность p6 и один из векторов pQE30/31/32.
Пример 8. Выделение и очистка рекомбинантного полипептида Р6
600
280
2
4
2
4
Культуры штамма Escherichia coli JM109, способные синтезировать рекомбинантный полипептид Р6, выращивали в небольшом объеме стерильной среды (по 10 мл) Terrific broth с добавлением ампициллина (до конечной концентрации 100 мкг/мл) и канамицина (до конечной концентрации 25 мкг/мл) в течение 16-18 часов при сильном встряхивании в термостате, 37°С. Затем полученную культуру добавили в соотношении 1:50 к свежей стерильной среде с содержанием ампициллина (100 мкг/мл) и канамицина (25 мкг/мл). Выращивали в тех же условиях в течение 3-4 часов до достижения жидкостью оптической плотности OD 0,6-0,8. Для индукции экспрессии протеина добавляли 1М раствор IPTG до конечной концентрации 1 мМ и выращивали при тех же условиях 4 часа. После - клетки осаждали центрифугированием (3000 об/мин, 15-20 мин, 4°С) и ресуспендировали в однократном связывающем буфере А (8Х=4М NaCl; 160 mM Tris-HCl pH 7.9; 40 mM Imidazole, pH 7.9). Лизис клеток был осуществлен на ультразвуковом дезинтеграторе (УЗДН-1У4.2, СССР). Ультразвуковой импульс воздействовал на культуры три раза в течение 10-15 секунд. Между импульсами культуры помещали в лед на 1-2 минуты. Обломки клеток отделяли от лизата культуры в течение 15 минут центрифугированием при 20000 об/мин, 4°С. Далее выделение и очистка рекомбинантного полипептида производилась с помощью аффинной хроматографии. Отфильтрованный лизат наносили на колонку с предварительно восстановленным сорбентом Ni-NTA-агарозой, промытой буфером А до тех пор, пока значения OD выходящего раствора не были меньше, чем 0,01. Полипептид элюировали однократным буфером Б, pH 7.9 (4Х=2М NaCl; 400 mM EDTA; 80 mM Tris-HCl pH 7.9), содержащим 400 тМ EDTA. Отобрали 4 фракции элюатов, по 500 мкл каждая. Анализ проб на содержание протеина проведен методом SDS-электрофореза в полиакриламидном геле. Фракции с полипептидом очищены от элюирующего буфера диализом против фосфатного буферного раствора, рН 7,4 (PBS-8g NaCl, 0.2g KCl, 1,44g NaHPO, 0.24g KHPO растворяют в 800 мл дистиллированной воды, доводят рН до 7.4 с помощью HCl, добавляют воду до 1 л).
На фиг.13 показана электрофореграмма рекомбинантного полипептида Р6 на различных стадиях выделения и очистки.
На фиг.13 (Электрофореграмма рекомбинантного полипептида Р6):
1 - маркер молекулярных весов;
2 - фракция чистого рекомбинантного полипептида Р6;
3 - проба после промывки сорбента буфером А рН 7.9 от несвязавшихся с ним белков;
4 - лизат клеток Escherichia coli JM109 до нанесения на колонку;
5 - лизат после прохождения через колонку.
Результаты электрофореза позволили сделать заключение об удовлетворительном качестве очистки полипептида, а также об его молекулярной массе: Р6 - (35±0,5) кДа по сравнению с пробегом белков известной молекулярной массы (Precision Plus Protein standards (161-0373), Bio-Rad, США).
Пример 9. Выделение и очистка рекомбинантного полипептида Р7
Методика выделения и очистки рекомбинантного полипептида Р7 аналогична описанной в примере 8.
На фиг.14 показана электрофореграмма рекомбинантного полипептида Р7 на различных стадиях выделения и очистки.
На фиг.14 (Электрофореграмма рекомбинантного полипептида Р7):
1 - лизат после прохождения через колонку;
2 - лизат клеток Escherichia coli JM109 до нанесения на колонку;
3 - проба после промывки сорбента буфером А рН 7.9 от несвязавшихся с ним белков;
4 - фракция чистого рекомбинантного полипептида Р7;
5 - маркер молекулярных весов.
Результаты электрофореза позволили сделать заключение об удовлетворительном качестве очистки полипептида, а также об его молекулярной массе: Р7 - (52±0,5) кДа по сравнению с пробегом белков известной молекулярной массы (Precision Plus Protein standards (161-0373), Bio-Rad, США).
Пример 10. Выделение и очистка рекомбинантного полипептида Р8
Методика выделения и очистки рекомбинантного полипептида Р8 аналогична описанной в примере 8.
На фиг.15 показана электрофореграмма рекомбинантного полипептида Р8 на различных стадиях выделения и очистки.
На фиг.15 (Электрофореграмма рекомбинантного полипептида Р8):
1 - маркер молекулярных весов;
2 - фракция чистого рекомбинантного полипептида Р8;
3 - проба после промывки сорбента буфером А рН 7.9 от несвязавшихся с ним белков;
4 - лизат после прохождения через колонку;
5 - лизат клеток Escherichia coli JM109 до нанесения на колонку.
Результаты электрофореза позволили сделать заключение об удовлетворительном качестве очистки полипептида, а также об его молекулярной массе: Р8 - (52±0,5) кДа по сравнению с пробегом белков известной молекулярной массы (Precision Plus Protein standards (161-0373), Bio-Rad, США).
Пример 11. Сравнение эффективности связывания полипептидов Р6, Р7, Р8 с сывороточным IgA и секреторным IgA
Анализ IgA-рецепторной способности полипептидов по отношению к различным молекулярным формам IgA был проведен посредством непрямого ИФА при условии равенства концентраций препаратов IgA (уравнены по массе). Для проведения ИФА использовали планшеты NUNC MaxiSorb (Danemark) с повышенной сорбционной активностью.
Приготовление разведенных препаратов иммуноглобулинов (сывороточный иммуноглобулин А, разведение: 1/100; очищенного секреторного IgA из молозива, разведение: 1/50) и выявляющих антител осуществляли с применением 10% раствора эмбриональной коровьей сыворотки в однократном в промывочном трис-буферном растворе с содержанием 0,05% твин-20 (РП), рН 7,4-7,5.
Удаление несвязавшихся реагентов проводили трехкратным промыванием планшетов РП, рН 7,4-7,5.
Полипептиды Р6, Р7, Р8, разведенные в PBS, рН 7,4 до 5 мкг/мл, адсорбировали на планшет в течение 18 часов при 4°С. После трехкратного отмывания в планшеты вносили разведенные препараты IgA. Инкубацию проводили при 37°С в течение 1 часа. Далее планшеты трижды отмывали от несвязавшихся реагентов, вносили конъюгат антител против легких цепей (λ+κ) с пероксидазой хрена и инкубировали в течение часа при 37°С. Отмывали от несвязавшихся реагентов 4 раза.
Активность фермента-метки пероксидазы хрена определяли на субстрате, состоящем из ортофенилендиамина и цитрат-фосфатного буферного раствора с перекисью рН 5,0, реакцию останавливали добавлением 2N серной кислоты. Оптическую плотность определяли при длине волны 492 нм на спектрофотометре.
Полученные в ходе работы данные указывают на весьма слабое проявление IgA-рецепторной активности полипептидами Р6, Р7, Р8 в отношении секреторного IgA (фиг.8, Б), по сравнению со связыванием сывороточного IgA (фиг.8, А), соответственно в 2.2, 2.9 и 2.4 раза. Вероятно, секреторный компонент в SIgA экранирует часть поверхности α-цепей IgA.
Пример 12. Сравнение эффективности связывания полипептидов Р6, Р7, Р8 с IgA1 и IgA2
При изучении особенностей взаимодействия рекомбинантных полипептидов с миеломными сывороточными образцами IgAl и IgA2, в каждом случае смесь сывороток, содержащих парапротеины κ- и λ-типов, был использован непрямой ИФА на адсорбированных Р6, Р7, Р8.
Сывороточный миеломный IgA1(λ+κ) (1:1=IgA1λ:IgA1κ) использовали в разведениях 1:1000, 1:10000, 1:100000, 1:500000, 1:1000000.
Сывороточный миеломный IgA2(λ+κ) (1:1=IgA2λ:IgA2κ) использовали в разведениях 1:1000, 1:10000, 1:100000, 1:500000, 1:1000000.
Методика проведения опыта аналогична описанной в примере 11.
Показано, что миеломные парапротеины иммуноглобулина А первого подкласса (фиг.16, Д) взаимодействуют с полипептидами достоверно более эффективно, чем иммуноглобулин А второго подкласса (фиг.16, Е).
На фиг.16 (Взаимодействие полипептидов Р6, Р7, Р8 с IgA1 и IgA2):
Д - связывание полипептидов с IgA1;
Е - связывание полипептидов с IgA2;
По оси абсцисс - полипептиды Р6, Р7, Р8;
492
По оси ординат - оптическая плотность (OD).
Пример 13. Связывание сывороточного меченного IgA адсорбированными полипептидами Р6, Р7, Р8.
Анализ IgA-рецепторной способности проведен методом прямого ИФА. Для проведения ИФА использовали планшеты NUNC MaxiSorb (Danemark) с повышенной сорбционной активностью.
Приготовление разведенных препаратов иммуноглобулинов и выявляющих антител осуществляли с применением 10% раствора эмбриональной коровьей сыворотки в однократном РП, рН 7,4-7,5.
Удаление несвязавшихся реагентов проводили трехкратным промыванием планшетов РП, рН 7,4-7,5.
Полипептиды Р6, Р7, Р8, разведенные в PBS, рН 7,4 до 5 мкг/мл, адсорбировали на планшет в течение 18 часов при 4°С. После трехкратного отмывания в планшеты вносили разведенный меченый IgA. Инкубацию проводили при 37°С в течение 1 часа. Далее планшеты 4 раза отмывали от несвязавшихся реагентов.
Активность фермента-метки пероксидазы хрена определяли на субстрате, состоящем из ортофенилендиамина и цитрат-фосфатного буферного раствора с перекисью рН 5,0, реакцию останавливали добавлением 2N серной кислоты. Оптическую плотность определяли при длине волны 492 нм на спектрофотометре.
Исследуемые полипептиды обладают IgA-рецепторной активностью в отношении меченного сывороточного IgA, причем количество лиганда, связанного протеином Р6, выше, чем у Р8 (табл.2, статистическая достоверность различий отмечена при разведении препарата IgA в 3000 раз). Возможно, причина кроется в размере белков - по сравнению с Р8 протеин Р6 укорочен с обоих концов, что, вероятно, дает последнему преимущество с точки зрения пространственной доступности. Эффективность взаимодействия Р7 с молекулой антитела минимальна (табл.2), что может быть следствием аминокислотных замен в IgA-связывающей области.
Пример 14. Связывание сывороточного меченного IgA полипептидами Р6, Р7, Р8 в растворе
Для проведения ИФА использовали планшеты NUNC MaxiSorb (Danemark) с повышенной сорбционной активностью.
Приготовление разведенных препаратов иммуноглобулинов и выявляющих антител осуществляли с применением 10% раствора эмбриональной коровьей сыворотки в однократном РП, рН 7,4-7,5.
Удаление несвязавшихся реагентов проводили трехкратным промыванием планшетов РП, рН 7,4-7,5.
Полипептиды в концентрации 5 мкг/мл инкубировали с меченым IgA, разведенным в 3, 6 и 12 тысяч раз, в течение 2 часов при комнатной температуре на шейкере. Эту смесь вносили в планшеты с иммобилизованными рекомбинантными полипептидами (иммобилизация проводилась по стандартной схеме, описанной в примере 11), час инкубации при 37°С. Производили четырехкратную отмывку планшетов и определяли активность фермента-метки пероксидазы хрена (как описано в примере 11).
В ходе эксперимента происходит ингибирование полипептидами Р6, Р7, Р8, находящимися в растворе (предварительно проинкубированными в течение двух часов при комнатной температуре с меченным IgA), взаимодействия меченного IgA с адсорбированными рекомбинантными молекулами.
В наибольшей степени это выражено у Р6 и Р8 (фиг.17) - ингибиторный эффект в пределах 70-90%. Слабая IgA-рецепторная активность адсорбированного полипептида Р7 не позволила сделать однозначное заключение об ингибиторной способности протеина в растворе. Возможно, причина - особенность пространственной конфигурации белка Р7, обусловленная наличием двух аминокислотных замен. Таким образом, рекомбинантные молекулы Р6 и Р8 обладают IgA-рецепторной способностью как в адсорбированном состоянии, так и в растворе.
На фиг.17 (Сопоставление эффективности связывания IgA адсорбированными полипептидами Р6, Р7, Р8 и полипептидами Р6, Р7, Р8 в растворе):
Треугольник - Р6;
Ромб - Р8;
Квадрат - Р7;
По оси абсцисс - разведение меченного сывороточного IgA, тыс. раз;
По оси ординат - ингибирование, %.
Пример 15. Изучение положения сайта связывания полипептидов Р6, Р7, Р8 на молекуле IgA с помощью моноклональных антител (МкАт)
Для проведения ИФА использовали планшеты NUNC MaxiSorb (Danemark) с повышенной сорбционной активностью.
Приготовление разведенных препаратов иммуноглобулинов и выявляющих антител осуществляли с применением 10% раствора эмбриональной коровьей сыворотки в однократном РП, рН 7,4-7,5.
Удаление несвязавшихся реагентов проводили трехкратным промыванием планшетов РП, рН 7,4-7,5.
С целью определения положения сайта связывания была использована коллекция из 9 меченных пероксидазой хрена МкАт (предоставлены лабораторией гибридомной технологии ФГУ «РНЦРХТ Росмедтехнологий»). МкАт связывают различные высококонсервативные антигенные детерминанты тяжелой цепи IgA. Положение сайта связывания с полипептидами оценивали относительно эпитопов МкАт, в том числе решено было установить: есть ли среди МкАт реагенты, конкурирующие с белками за связывание с IgA.
В связи с этим осуществлено два варианта постановки ИФА:
1. Предварительное связывание меченного IgA с МкАт с последующим переносом на адсорбированные полипептиды Р6, Р7, Р8 (ингибиторный ИФА).
2. Связывание сывороточного IgA (пул сывороток здоровых доноров) с адсорбированными протеинами Р6, Р7, Р8 и последующее взаимодействие с МкАт (непрямой ИФА).
Постановка ингибиторного ИФА проходила следующим образом: полипептиды в концентрации 5 мкг/мл были адсорбированы на планшет (иммобилизация проводилась по стандартной схеме, описанной в примере 11), а затем к ним добавлена (по 100 мкл в каждую ячейку) заранее проинкубированная смесь (в соотношении 1:1, инкубация при комнатной температуре (22°С) на шейкере в течение двух часов) из меченного пероксидазой хрена IgA (рабочее разведение 1/3000) и одного из МкАт (каждый образец МкАт взят в двух концентрациях 10 мкг/мл и 50 мкг/мл). Инкубацию иммобилизованных полипептидов со смесью МкАт и меченого IgA проводили в течение 20 минут при 37°С. В ходе работы проведена проверка влияния моноклональных антител на взаимодействие меченного IgA с протеинами Р6, Р7, Р8. О результате судили по наличию пероксидазной активности фермента-метки IgA, который связался с адсорбированными молекулами белков (как описано в примере 11).
Ингибиторный ИФА позволил выявить среди МкАт реагенты, интерферирующие с полипептидами за связывание с IgA - это МкАт 1В12, 1Н9, 3В4, способные снижать на 60-90% IgA-рецепторную активность производных Вас белка Р6, Р7, Р8 (фиг.18).
На фиг.18 (Ингибирование МкАт связывания сывороточного меченного IgA с Р6, Р7, Р8):
Треугольник - Р6;
Ромб - Р8;
Квадрат - Р7;
По оси абсцисс - шифры МкАт (использованы в двух концентрациях 10 и 50 мкг/мл);
По оси ординат - ингибирование, %.
На основе полученных результатов были высказаны следующие предположения (относительно МкАт 1В12, 1Н9, 3В4).
Во-первых, МкАт могут распознавать тот же участок IgA, который связывают рекомбинантные протеины Р6, Р7, Р8, препятствуя таким образом взаимодействию рекомбинантных белков с их антигенными детерминантами на молекуле иммуноглобулина.
Во-вторых, существует вероятность, что МкАт распознают участок лиганда, топографически приближенный к сайту связывания Р6, Р7, Р8. При реализации такого варианта образование комплекса одного из антител с меченным IgA могло бы привести к возникновению стерических трудностей для реализации фрагментами белка Вас IgA-рецептроной активности.
В-третьих, МкАт, возможно, при взаимодействии с лигандом вызывают конформационные изменения молекулы IgA, которые изменяют сайт связывания. Эти модификации препятствуют в дальнейшем взаимодействию белков Р6, Р7, Р8 с иммуноглобулином.
С целью подтверждения одного из высказанных выше предположений был поставлен непрямой ИФА. Выявление немеченных МкАт (концентрация 1 мкг/мл) проводили меченными поликлональными антителами кролика. Методика проведения опыта аналогична описанной в примере 11. Этот вариант постановки ИФА продемонстрировал, что предварительное связывание IgA с Р6, Р7, Р8 в основном не препятствовало связыванию МкАт с IgA - ингибирование было незначительным и составляло не более 30-40% (фиг.19).
На фиг.19 (Ингибирование взаимодействием меченого IgA с адсорбированными полипептидами Р6, Р7, Р8 связывания МкАт с IgA):
Треугольник - Р6;
Ромб - Р8;
Квадрат - Р7;
По оси абсцисс - шифры МкАт;
По оси ординат - ингибирование, %.
Результаты ингибиторного ИФА, на первый взгляд, противоречат результатам, полученным после постановки непрямого ИФА - предварительное связывание IgA полипептидами не препятствовало последующему взаимодействию иммуноглобулина с МкАт.
Одной из гипотез, объясняющих такое несоответствие, может быть ранее высказанное предположение о близком расположении эпитопов, связывающих МкАт (3В4, 1Н9, 1В12), и участков связывания полипептидов на IgA. Основанием послужили результаты непрямого ИФА, свидетельствующие о принципиальной возможности одновременного связывания любого из трех МкАт 1В12, 1Н9, 3В4 и любого из полипептидов Р6, Р7, Р8 с молекулой IgA.
Таким образом, показана топографическая близость областей на молекуле IgA, взаимодействующих с полипептидами Р6, Р7, Р8 и тремя МкАт.
Пример 16. Исследование консервативности структуры сайта связывания полипептидов Р6, Р7, Р8 на молекуле IgA
Вследствие возможных мутаций в генах опухолевых плазматических клеток их продукты могут значительно отличаться от молекул иммуноглобулинов, продуцируемых клетками, не затронутыми опухолью. Есть вероятность того, что при наличии мутации в генах, кодирующих тяжелые цепи IgA, будет затронут и сайт связывания рекомбинантных белков Р6, Р7, Р8.
В качестве основного метода исследования был выбран непрямой ИФА на адсорбированных рекомбинантных полипептидах Р6, Р7, Р8, выявление иммуноглобулинов, связавшихся с антигенами осуществлялось с помощью меченных МкАт против легких цепей. Использована панель из 12 индивидуальных миеломных образцов: 10 IgA1 и 2 IgA2. Контроль размера М-пика (интенсивность окраски полосы, соответствующей парапротеину) был проведен с помощью нативного электрофореза в агарозном геле. Электрофорез IgA1- и IgA2-миеломных сывороток показал наличие М-пиков во всех сыворотках и различия по физико-химическим свойствам между парапротеинами. Поскольку точная концентрация парапротеинов в индивидуальных миеломных сыворотках не известна, в ходе работы было использовано по два разведения каждого образца: в 10 тысяч раз и в 100 тысяч раз. Методика проведения опыта аналогична описанной в примере 11.
У 10 представленных индивидуальных миеломных IgA1 связывание с рекомбинантными белками прослеживается достаточно четко, за исключением двух образцов под номерами 9 и 10, у которых взаимодействие с Р6, Р7, Р8 более слабое (фиг.20) (доверительная вероятность различий более 0.95). Таким образом, сайт связывания с Р6, Р7, Р8 не столь консервативен и может отсутствовать или быть измененным в индивидуальных парапротеинах.
На фиг.20 (Взаимодействие рекомбинантных белков Р6, Р7, Р8 с миеломными IgA1 и IgA2):
По оси абсцисс - миеломные IgA (1-10 образцы IgA1, 11-12 образцы IgA2), использовано по два разведения: 1:10000, 1:100000.
492
По оси ординат - оптическая плотность (OD).
Пример 17. Изучение влияния восстановления дисульфидных связей в молекуле IgA на ее взаимодействие с полипептидами Р6, Р8
Для проведения ИФА использовали планшеты NUNC MaxiSorb (Danemark) с повышенной сорбционной активностью.
Приготовление разведенных препаратов иммуноглобулинов осуществляли с применением 10% раствора эмбриональной коровьей сыворотки в однократном РП, рН 7,4-7,5.
Удаление несвязавшихся реагентов проводили трехкратным промыванием планшетов РП, рН 7,4-7,5.
Для получения данных об относительной стабильности структуры сайта связывания белков Р6, Р8, локализованного на молекуле IgA, использована коллекция МкАт. Проведено сопоставление устойчивости эпитопов МкАт на молекуле IgA и сайта связывания полипептидов в условиях восстановления дисульфидных связей между α цепями IgA.
Чигаин и сывороточный поликлональный IgA подвергались обработке 0,01М ДТТ в 0,4М Tris-HCl, pH 8,3 при 24°С в течение 2,5 часов с последующим алкилированием образующихся SH-групп 0,022 М йодоацетамидом при 0°С в течение 30 минут.
Денатурирующая обработка иммуноглобулинов привела к частичному изменению третичной структуры молекул IgA, что повлекло за собой снижение способности некоторых конформационных эпитопов МкАт связывать МкАт. Для эпитопов МкАт 1Н9 и 1В12 было отмечено снижение связывания антителами после частичного восстановления дисульфидных связей на IgA. На выявление эпитопа 3В4 денатурация IgA не оказала влияния.
Способность нативного или восстановленного IgA конкурировать с меченным IgA, ингибируя связывание последнего с адсорбированными полипептидами Р6, Р8, определяли в конкурентном ингибиторном ИФА. На планшеты адсорбировали рекомбинантные полипептиды в концентрации 5 мкг/мл, в течение 1,5 часов при 37°С. После двукратной отмывки вносили смесь из обработанного или необработанного IgA в концентрации 40 мкг/мл и меченого IgA, конечное разведение 1:10 тыс. Инкубацию проводили в течение 2 ч при комнатной температуре или 18 ч при 4°С. Производили четырехкратную отмывку планшетов и определяли активность фермента-метки пероксидазы хрена (как описано в примере 11).
Восстановление дисульфидных связей на молекуле IgA не ухудшило связывание лиганда с изучаемыми антигенами Р6, Р7, Р8, а привело к незначительному усилению способности белков Р6 и Р8 связывать антитела с измененной конформацией (фиг.9 - данные для сывороточного IgA, ананлогичные результаты для SIgA, но не указаны). Указанный результат демонстрирует устойчивость сайта связывания с рекомбинантными полипептидами на молекуле IgA к восстановлению дисульфидных связей.
Пример 18. Изучение протективных свойств Р6-специфических антител на "мышиной" модели
Для изучения протективной активности Р6-специфических антител в отношении инфекции, вызванной штаммом 219/4849 СГВ Ibc серотипа, была использована модель генерализованной инфекции у четырех групп лабораторных мышей.
-5
6
7
50
Двум конторольным группам вводили физиологический раствор, а двух других иммунизировали полипептидом Р6 (10 мкг/животное). На 60 день после начала иммунизации при титре анти-Р6 антител 1×10 проводили внутрибрюшинное заражение мышей стрептококками в сублетальной (3,5×10КОЕ/мышь) и летальной (ЛД) для 50% лабораторных животных (3,5×10КОЕ/мышь) дозах.
С целью контроля динамики развития инфекционного процесса и для определения скорости гибели патогенных бактерий (через 1, 6, 24 и 48 часов после инфицирования) проводили высевы из перитонеального экссудата (получали промыванием перитонеальной полости 5 мл PBS), крови и селезенки (извлекали, гомогенизировали, суспендировали в 1 мл PBS, рН 7,2) лабораторных животных.
Концентрации микроорганизмов на разных этапах инфекционного процесса выражены в КОЕ/мл и представлены в Таблице 3 (средние значения по пяти повторностям).
Спустя час после инфицирования у всех четырех групп лабораторных животных выявлено одинаково высокое содержание стрептококков. При заражении сублетальной дозой у конторольных мышей стрептококки не были высеяны только к пятым суткам, в то время как у иммунных мышей бактерии не наблюдались уже через 6 часов.
50
В группе контрольных животных после введения ЛД уже ко вторым суткам гибло порядка 50% лабораторных животных. У мышей, иммунизированных полипептидом Р6, элиминация стрептококков происходила после 5 суток с момента заражения, причем до этого момента патогенные микроорганизмы были обнаружены в селезенке и в крови в незначительных количествах.
Таким образом, показано, что рекомбинантный дериват Вас белка Р6 способен индуцировать протективный иммунный ответ, ускоряя выведение СГВ из макроорганизма.
Таблица 3
Изменение концентрации стрептококков в селезенке мышей на разных сроках инфекции
Срок послезаражения, ч
При заражении иммунных мышей дозами (КОЕ/мышь)
При заражении интактных мышей дозами (КОЕ/мышь)
3,5×10<sup>7</sup>
3,5×10<sup>6</sup>
3,5×10<sup>7</sup>
3,5×10<sup>6</sup>
1
3,5×10<sup>7</sup>
3,5×10<sup>6</sup>
3,5×10<sup>7</sup>
3,5×10<sup>6</sup>
6
1×10<sup>2</sup>
0
6,2×10<sup>6</sup>
1,7×10<sup>5</sup>
24
3,5×10<sup>3</sup>
0,2×10<sup>2</sup>
>10<sup>8</sup>
7×10<sup>5</sup>
48
1,4×10<sup>3</sup>
0
пало 50%
7×10<sup>2</sup>
120
0
0
пало 50%
0
Пример 19. Изучение опсонизирующей активности анти-Р6 и анти-ScaAB антител
7
2
Опсонофагоцитарная реакция является ведущим защитным механизмом млекопитающих от инфекции, вызываемой бактериями, в том числе СГВ. Поскольку Вас белок, на основе которого получен полипептид Р6, не встречается у штаммов СГВ серотипа III, то для расширения протективного спектра вакцины был выбран еще один компонент - липопротеин ScaAB, широко распространенный среди СГВ и обеспечивающий адгезию бактерий к клеткам. Изучение опсонизирующей активности анти-Р6 и анти-ScaAB антител осуществлялось на модели культивируемых перитонеальных макрофагов. Индукцию монослоя мышиных перитонеальных макрофагов проводили заранее введением животным 0,5 мл 10% пептона внутрибрюшинно. Полученный перитонеальный экссудат суспендировали в среде RPMI (БиолоТ, Россия) в концентрации 1 млн/мл, а затем вносили на 24-луночные платы для культуры тканей с покровными стеклами (Sarstedt, Германия) в объеме 1,0 мл и на 96-луночные платы для культуры тканей в объеме 0,2 мл. Инкубировали 1 час при 37°С. Далее, после удаления неприкрепившихся клеток, в среде RPMI с содержанием 10% ЭТС (эмбриональная телячья сыворотка, БиолоТ, Россия) и антибиотиков - стрептомицина (100 мкг/мл) и пенициллина (100 ЕД/мл) платы инкубировали 24 часа. Наносили суспензию СГВ и СГА в среде RPMI на предварительно отмытый монослой в концентрации 1×10 КОЕ/мл. Бактерии предварительно инкубировали в течение 30 минут с нормальной и гипериммунной мышиной сывороткой, разведенной в 20 раз в среде RPMI. Контакт бактерий с макрофагами продолжался 30 мин, после чего монослой отмывали от не прикрепившихся к поверхности клеток стрептококков. К некоторым образцам добавляли свежую среду RPMI с 10% ЭТС и инкубировали до 180 минут. Все описанные выше этапы проводились при 37°С в атмосфере 5% СО. Далее препараты фиксировали 30 мин спиртом и окрашивали азидом и азуром в течение 30 мин. Монослой тщательно отмывали от остатков краски. При микроскопии на покровных стеклах исследовали не менее 100 клеток в трех параллельных пробах, подсчитывая процентную долю макрофагов, инфицированных стрептококками, и среднее число кокков на одну клетку. Степень инфицированности оценивали по индексу инфицирования (ИИ), который представляет собой произведение обоих показателей.
Микроскопическая оценка показала, что гипериммунные сыворотки к исследуемым полипептидам обладают опсонизирующей активностью. ИИ при обработке СГВ и СГА иммунной сывороткой превысил контрольное значение в 2,5-4 раза (на стадии адгезии). По истечении 180 минут наблюдалась массированная элиминация стрептококков анти-Р6 и анти-ScaAB антителами.
Показано, что оба типа антител обладают опсонизирующей активностью в отношении штамма СГВ 219/4849 Ibc серотипа, кроме того, ScaAB-специфические антитела обладали способностью опсонизировать СГА, что связано, вероятно, с наличием белка-гомолога ScaAB - так называемого PsaA.
Отмечено резкое снижение опсонизирующей активности анти-Р6 антител в отношении штамма СГВ, подвергнутого пятикратному пассированию на мышах, по сравнению с исходным штаммом СГВ. Установлено, что защитная эффективность антител зависит не только от их опсонизирующих свойств, но и от экспрессии полисахаридной капсулы, которая резко возрасла в условиях пассирования и привела к экранированию Вас белка, блокируя опсонизацию.
Таблица 4
Результат оценки опсонизирующей активности анти-Р6 и анти-ScaAB антител (по индексу инфицирования) в отношении СГВ
Время контакта с монослоем
Индекс инфицирования макрофагов*
HCM**
Анти-Р6, титр 1:12500
Анти-scaAB, титр 1:1600
30 мин
238
890
523
180 мин
29
180
22,4
* произведение среднего числа кокков на одну клетку и относительной доли инфицированных макрофагов (в %)** НСМ - сыворотка от мышей контрольной группы
Таким образом, полипептиды Р6 и ScaAB, в связи с возможностью обеспечить протективность при крайне низких титрах антител, обладающие опсонизирующей активностью, в том числе и в отношении СГА, а также штаммов III серотипа СГВ, весьма перспективны в роли компонентов вакцины.