СПОСОБ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ЙЕРСИНИОЗА ЛОСОСЕВЫХ РЫБ, ВЫЗЫВАЕМОГО Yersinia ruckeri, МЕТОДОМ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА И ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ НАБОР ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ СПОСОБА
METHOD FOR SERUM DIAGNOSIS OF SALMON FISH YERSINIOSIS CAUSED BY Yersinia ruckeri BY ENZYME IMMUNOASSAY AND DIAGNOSTIC SET FOR IMPLEMENTING METHOD

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, микробиологии и может быть использовано для выявления антигена возбудителя йерсиниоза лососевых - Yersinia ruckeri в биологическом материале как для диагностики болезней рыб в ветеринарии, так и для научных исследований методом иммуноферментного анализа.
Рыбоводство, как основное направление современной аквакультуры России - важнейшая отрасль сельского хозяйства. Рыбы при интенсивном выращивании постоянно контактируют с огромным количеством микроорганизмов как непатогенных, так и патогенных, представляющих опасность в развитии эпизоотий. Одна из таких - Yersinia ruckeri, бактерия семейства Enterobacteriaceae, которая вызывает кишечную болезнь йерсиниоз - Enteric Red Month (ERM), известную также под названием «красный рот», хроническую системную инфекцию радужной форели, выращиваемой в пресной воде. За рубежом, в регионах, активно занимающихся форелеводством, йерсиниоз считается опасной инфекцией. Болезнь наносит существенный урон рыбоводческим хозяйствам, приводит к высокому уровню гибели рыбы и к порче ее товарного вида.
В первую очередь заболеванию подвержены разные виды лососевых и сиговых рыб, также известны случаи выявления возбудителя у других пресноводных гидробионтов, что служит вектором передачи бактерий в окружающей среде культивируемой рыбе. Y. ruckeri передается горизонтально, через воду и экскременты зараженной рыбы. У заболевших особей отмечают геморрагии различных тканей и органов, особенно около рта, в мускулатуре, жабрах, брюшной стенке, полостном жире, а также в переднем и заднем отделах кишечника. Наиболее остро болезнь проявляется у мальков, у более крупных рыб протекает хронически.
На территории Российской Федерации йерсиниоз выявлен в 2010 году, количество случаев с каждым годом увеличивается, однако в список карантинных это заболевание не включено, что в виду массовой, но часто бесконтрольной перевозки рыбопосадочного материала способствует его распространению. Следовательно, с развитием контактов между странами, ростом и увеличением интенсивности аквакультуры внутри регионов данное заболевание имеет тенденцию повсеместного распространения в мире, поэтому возникает необходимость своевременной диагностики, а также точной идентификации возбудителя.
Сейчас диагностика йерсиниоза в лаборатории основана на выявлении бактерий в посевах на питательных средах с последующим изучением их культурально-биохимических свойств. Этот метод долгий, а результат анализа часто зависит от таких факторов, как опыт и компетенция специалиста, проводящего работу, качества используемой питательной среды и т.п., поэтому использование современных методов будет, несомненно, востребовано при диагностике [1].
В связи с вышеизложенным проблема диагностики и борьбы с йерсиниозом очень актуальна. Эффективно решить проблему своевременной и точной диагностики заболевания позволит высокочувствительный и строгоспецифичный метод иммуноферментного анализа, широко распространенный для выявления болезней человека и животных, но недостаточно используемый в ихтиопатологии.
Единственным известным набором для проведения серологической диагностики болезней рыб является ТФ ИФА для выявления противогерпетических антител в сыворотке осетровых рыб, разработанный во ВНИИВВиМ в 2012 году, который предлагается использовать в научно-исследовательских и ветеринарных лабораториях для ретроспективной диагностики герпесвирусной болезни сибирского осетра (SbSHV) у различных видов осетровых. Однако ретроспективная диагностика актуальна только для вирусных болезней, т.к. позволяет проводить мониторинговые исследования при подозрении на герпесвирусную инфекцию осетровых рыб в межэпизоотический период, и не пригодна для диагностики бактериальных болезней за счет длительного времени образования антител в живом организме [2] (прототип).
При диагностике бактериальных инфекций важна оперативная информация, на ранних этапах развития заболевания и для быстрого подтверждения диагноза во время эпизоотии, поэтому необходимо анализировать наличие в организме рыб антигена.
Высокая контагиозность и смертность рыб при йерсиниозе обуславливают необходимость разработки экспресс-методов диагностики с целью быстрого и своевременного принятия карантинных мер и профилактических мероприятий. Одним из таких методов является иммуноферментный анализ (ИФА), главными достоинствами которого являются высокая чувствительность и специфичность, коррелирующие с результатами, полученными при использовании других серологических методов, а также широкое распространение специального оборудования, позволяющего почти полностью автоматизировать процесс выявления антигенов.
Задача настоящего изобретения - разработка чувствительного и эффективного способа серодиагностики йерсиниоза рыб, вызываемого Yersinia ruckeri, на ранних этапах развития болезни и создание на его основе диагностического набора. Сведения по использованию ИФА-теста и существованию аналогичных диагностических наборов для выявления йерсиниоза рыб в современной литературе отсутствуют.
Сущность изобретения состоит в использовании диагностического набора, включающего все необходимые компоненты для проведения иммуноферментного анализа, позволяющего выявлять антиген Yersinia ruckeri в образцах биологического материала от рыб на ранней стадии развития болезни с высокой специфичностью и чувствительностью. Принцип способа заключается в следующем: специфические иммуноглобулины, иммобилизованные на поверхности лунок полистиролового микропланшета, связываются с гомологичными антигенами, присутствующими в исследуемом материале, образуя комплекс антиген-антитело. Полученный иммунный комплекс выявляется путем взаимодействия с иммуноферментным конъюгатом, фермент которого, после добавления субстрата, вызывает разложение субстрат-индикаторного раствора и образование окрашенного продукта. Интенсивность окраски в лунке микропланшета пропорциональна содержанию специфического антигена в испытуемом образце, результаты учитывают по общепринятой формуле.
+
-
Диагностический набор для выявления возбудителя йерсиниоза содержит: планшет полистироловый 96-луночный, сенсибилизированный иммуноглобулинами к ERM; положительный контрольный образец, инактивированный (K); отрицательный контрольный образец, инактивированный (K); конъюгат, представляющий собой анти-ERM антитела, меченные пероксидазой хрена; раствор для разведения конъюгата (РК); промыватель - концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином-80 (ФСБ-Т×25); субстрат - раствор тетраметилбензидина (ТМБ); стоп-реагент; ванночка для реагентов. Компоненты набора расфасованы в пластиковые флаконы разного объема с завинчивающимися крышками и упакованы в коробки.
ПРИМЕР 1
1. Подготовка исследуемого материала
5.0
6.0
Для обнаружения антигена Yersinia ruckeri в качестве испытуемого используют биопсийный материал внутренних органов (почка, печень, селезенка), экссудат и бактериальные культуры в концентрации не более 10-10 м.т. Для получения 10%-ной суспензии биоматериал гомогенизируют до получения однородной массы на ФСБ (pH 7,2-7,4). Полученную суспензию сливают в стерильную посуду и используют для исследования.
2. Подготовка компонентов для постановки реакции
Для промывания планшетов, при постановке реакции, готовят содержащий твин-80 фосфатно-солевой буфер: размешивают содержимое флакона с ФСБ-Т*25, при выпадении в концентрате осадка прогревают его до полного растворения солей, и разводят дистиллированной водой до 700 мл. Хранят при 4°C до 5 суток.
Раствор конъюгата в рабочем разведении готовят непосредственно перед использованием, к 0,05 мл концентрированного раствора добавляют 15 мл раствора для разведения конъюгата (РК), тщательно перемешивают.
Раствор ТМБ готов к применению, непосредственно перед использованием отбирают в пластиковую ванночку 12 мл. Остатки раствора ТМБ из ванночки нельзя сливать во флакон с исходным раствором ТМБ. Хранят при 4°C в течение всего срока годности набора.
3. Постановка реакции
Перед началом анализа лунки планшета промывают один раз промывочным раствором. В каждую лунку вносят по 300 мкл раствора, через пять минут после заполнения лунок раствор аккуратно удаляют. Остатки влаги из лунок тщательно удаляют, постукивая перевернутым планшетом по фильтровальной бумаге.
+
В первую лунку первого ряда планшета вносят 100 мкл специфического положительного антигена (K). Во вторую лунку первого ряда вносят 100 мкл отрицательного антигена. Во все остальные лунки по 100 мкл исследуемых образцов (желательно делать 2-3 повторности). Внесение материала в плашку сопровождают тщательным перемешиванием пипетированием в течение 5-7 секунд. Планшет инкубируют при комнатной температуре (21-25°C) 60 минут.
Раствор конъюгата в рабочем разведении готовят за пять-десять минут до окончания инкубации.
По окончании инкубации планшет отмывают четыре раза ФСБ-Т от несвязавшихся антигенов, после чего удаляют влагу, постукивая перевернутым планшетом по фильтровальной бумаге.
Во все лунки планшета вносят по 100 мкл раствора конъюгата в рабочем разведении. Планшет инкубируют при комнатной температуре (21-25°C) 60 минут. По окончании инкубации планшет отмывают четыре раза ФСБ-Т, после чего удаляют влагу постукиванием.
Во все лунки вносят по 100 мкл раствора ТМБ. Для внесения раствора ТМБ используют пластиковую ванночку, входящую в состав набора. Планшет инкубируют при комнатной температуре, в защищенном от света месте, 25-30 минут.
Реакцию заканчивают добавлением во все лунки 100 мкл стоп-реагента.
4. Учет результатов
Результаты реакции учитывают через 2-3 минуты после добавления стоп-реагента, проводя измерение оптической плотности (ОП) в каждой лунке на спектрофотометре с вертикальным лучом света при длине волны 450 нм или визуально. Результаты исследований учитывают только при соблюдении следующих условий:
- значение ОП в лунке с отрицательным контролем не более 0,30 о.е.
- значение ОП в лунке с положительным контролем не менее 0,62 о.е.
Реакцию оценивают по формуле и выражают в виде процента реактивности:
-
+
-
процент реактивности (%)=(ОП-ОПК)/(ОПК-ОПК)Х100%,
+
-
где ОП - оптическая плотность образца, ОПК - оптическая плотность положительного контроля, ОПК - оптическая плотность отрицательного контроля.
Границы пороговых значений: при величине %>22% реакция считается положительной, значение %<10% - реакция отрицательная, а диапазон % от 10% до 22% - сомнительные результаты реакции.
ПРИМЕР 2
Подготовку исследуемого материала, подготовку компонентов для постановки реакции, постановку реакции осуществляют аналогично описанному в примере 1, но инкубацию планшета после внесения положительных, отрицательных и исследуемых образцов проводят в течение 4-6 часов при температуре 4°C (в холодильнике), после чего работу и учет результатов продолжают по стандартной схеме. Получают результаты, аналогичные таковым в примере 1.
Предложенный способ и набор не имеют отечественных и зарубежных аналогов. Позволяет в течение трех часов с достоверностью 98% определять в образцах биологического материала наличие Y. ruckeri, возбудителя йерсиниоза лососевых рыб. Использование «холодной инкубации» (в течение 4-6 часов при температуре 4°C, в холодильнике) позволяет получать достоверные, аналогичные результаты в течение одного дня, с перерывом для оператора в ходе работы, что по разным причинам также может быть удобно.
Диагностикум разработан и апробирован с положительным результатом в лаборатории ихтиопатологии ФГБНУ ВИЭВ имени Я.Р. Коваленко в период октябрь 2013 - декабрь 2014 года.
Предложенный способ найдет применение в системе мониторинга, проводимого органами ветеринарной службы страны, что позволит контролировать заболеваемость йерсиниозом и сохранять здоровье культивируемых рыб, а также в научных исследованиях для получения информации о закономерностях циркуляции йерсиний вида Yersinia ruckeri в аквакультуре. Высокая чувствительность, специфичность, простота постановки реакции и возможность автоматизации процессов, за счет использования приборов, таких как промыватель, планшет и спектрофотометр с вертикальным лучом (ИФА-ридер), позволят в короткие сроки проводить массовые обследования в рыбоводческих хозяйствах с целью определения распространения заболевания. Оперативность анализа при данной инфекции имеет принципиальное значение, так как ускоренная диагностика позволяет максимально быстро приступить к лечению, тем самым оздоравливая и сохраняя поголовье.
Источники информации
1. Временные методические указания по диагностике йерсиниоза лососевых рыб // Сборник инструкций по борьбе с болезнями рыб (часть 2). Москва, отдел маркетинга АМБ-агро, 1999, с. 66-68.
2. Further virus characterization, diagnostics and prevention of Siberian sturgeon herpesvirus disease / Igor Shchelkunov, Andor Doszpoly, Tatiana Shchelkunova, Inna Prokaeva, Fatima Kalabekova, Ismail Kalabekov, Dmitry Kurenkov // USA-Russia Bilateral Workshop On Aquaculture and FishHealth USGS Western Fisheries Research Center, Seattle, WA, USA October, 2012, pp. 1-5 (прототип).