Трансплантированные звёздчатые клетки печени участвуют в регенерации органа после частичной гепатэктомии без риска развития фиброза печени

Трансплантированные звёздчатые клетки печени участвуют в регенерации органа после частичной гепатэктомии без риска развития фиброза печени

А.К. Шафигуллина 1, А.А. Гумерова 12, А.А. Трондин 1, М.А. Титова 12, И.М. Газизов 1, Г.Р. Бурганова 1, М.С. Калигин1, Д.И. Андреева 1, А.А. Ризванов 2,

А.Р. Мухаммедов 1, А.П. Киясов 12

1 Казанский государственный медицинский университет, г. Казань

2 Казанский (Приволжский) федеральный университет, г. Казань

Transplanted Hepatic Stellate Cells participate in liver regeneration after partial hepatectomy without risk of hepatic fibrosis

A.K. Shafigullina 1, A.A. Gumerova 1-2, A.A. Trondin 1, M.A. Titova 1-2, I.M. Gazizov1, G.R. Burganova 1,

MS. Kaligin 1, D.I. Andreeva 1, A.A. Rizvanov12, A.R. Muhamedov1, A.P. Kiassov12

1 Kazan State Medical University, Kazan

2 Kazan Federal (Volga Region) University, Kazan

Звёздчатые клетки печени рассматриваются в качестве одного из потенциальных кандидатов на роль региональных стволовых клеток печени. Целью данной работы стало изучение возможности трансплантации этих клеток крысам, перенёсшим операцию частичной гепатэктомии, исследование дальнейшего хоуминга клеток, путей дифференци-ровки и участия в репопуляции гепатоцитов реципиента. Для этого свежевыделенные звёздчатые клетки печени крысы были введены в воротную вену здоровых крыс (контрольная группа) и крыс сразу после операции частичной гепатэктомии (экспериментальная группа). Перед трансплантацией донорские клетки были мечены рекомбинантным аденовирусом, экспрессирующим зелёный флуоресцентный белок. Результаты исследования показали, что в печени крыс-реципиентов контрольной и экспериментальной групп можно видеть донорские клетки двух видов:

1) клетки с морфологией гепатоцитов в паренхиме печени;

2) мелкие клетки веретеновидной, округлой и треугольной формы в синусоидах печени и портальных зонах. Трансплантация звёздчатых клеток печени крысам с частичной гепатэктомией приводила к существенному повышению приживаемости клеток и стимуляции их дифференцировки в гепатоциты. Ни на одном из изученных сроков не было отмечено трансдифференцировки звёздчатых клеток печени в миофибробласты, что указывает на отсутствие риска развития фиброза печени после трансплантации клеток данного типа. Таким образом, звёздчатые клетки печени после трансплантации могут дифференцироваться в гепатоциты и не способствуют развитию фиброза печени, что подтверждает их роль в восстановлении органа и возможную принадлежность к прогениторным клеткам печени.

Ключевые слова: звёздчатые клетки печени, частичная гепатэктомия, трансплантация, регенерация, гепатоциты, миофибробласты.

Hepatic stellate cells are considered as one of the potential stem cells candidates in the liver. The aim of our work was to study the probability of hepatic stellate cells transplantation to rats after partial hepatectomy, their further homing, the ways of differentiation and hepatocytes repopulation in the recipient liver. For this reason fresh isolated rat's hepatic stellate cells were transplanted into portal vein of intact rats (control group] and rats immediately after partial hepatectomy (experimental group). Before transplantation cells were labeled by adenovirus expressing green fluorescent protein. Our results showed that it was possible to detect 2 types of donor cells in the recipient liver of control and experimental groups: 1] hepatocyte-like cells in liver parenchyma; 2) small, spindle-shaped, rounded and triangular cells in liver sinusoids and portal areas. Transplantation after partial hepatectomy leads to significant increase of transplanted cells homing and stimulation of their differentiation into hepatocytes. Over the whole experiment there was no hepatic stellate cells transdifferentiation into myofibroblasts, thus there is no risk of liver fibrosis development after this cell type transplantation. In summary hepatic stellate cells after being transplanted are able to differentiate into hepatocytes and do not induce liver fibrosis, that confirms their role in organ regeneration and probable belonging to hepatic progenitor cells.

Key words: hepatic stellate cells, partial hepatectomy, transplantation, regeneration, hepatocytes, myofibroblasts.

Звёздчатые клетки печени (ЗКП) — уникальная популяция клеток, расположенная в перисинусои-дальном пространстве Диссе. Несмотря на то, что клетки были впервые описаны 1876 г. и изучаются уже на протяжении полутора веков, однозначного мнения об их функции нет [1]. Помимо участия в накоплении ретиноидов, данные клетки рассматривают с различных позиций: 1) как источник соединитель-

e-mail: Sh.aygul@gmail.com

ной ткани при развитии фиброза и цирроза печени, поскольку в ответ на неблагоприятное воздействие на печень ЗКП способны активироваться и транс-дифференцироваться в миофибробласты, продуцирующие коллаген [1]; 2) как основной клеточный тип, создающий микроокружение в ходе фетального печёночного гемопоэза и дифференцировки гепатоцитов и холангиоцитов в ходе пренатального развития

крысы и человека [2—6]; 3) как стволовые клетки печени. Последняя точка зрения основана, в первую очередь, на таких свойствах ЗКП, как экспрессия маркёров стволовых клеток С-kit, Oct4, Bcl-2, CD133 [1, 7, В], способность к дифференцировке в гепатоциты in vitro [9], экспрессия смешанного мезенхимально-эпителиального фенотипа в пренатальном онтогенезе [5, 10]. Поскольку гипотеза о звёздчатых клетках как стволовых клетках печени находит всё больше подтверждений, возникает закономерный вопрос о возможности трансплантации этих клеток для восстановления печени после её повреждений различной природы. В связи с этим, целью настоящей работы стало изучение хоуминга и путей дифференцировки ЗКП после трансплантации крысам, перенёсшим операцию частичной гепатэктомии.

Материал и методы

Нами были выделены ЗКП путём последовательной перфузии печени крыс через систему воротной вены растворами проназы и коллагеназы с последующим разделением клеток в градиенте плотности гистоденза (Sigma, США) [11]. Клетки вводили в воротную вену здоровых крыс (контрольная группа) и крыс экспериментальной группы сразу после операции частичной гепатэктомии. Перед трансплантацией донорские ЗКП были мечены рекомбинантным аденовирусом, экспрессирующим зелёный флуоресцентный белок GFP, что позволило оценить распределение и морфологию трансплантированных клеток [12]. Животных выводили из эксперимента через 1, 2, 5, 7 и 14 сут. после введения клеток, кусочки печени фиксировали в формалине и заливали в парафин по стандартной методике. Иммуногистохими-ческое исследование парафиновых срезов было проведено методом меченых полимеров с применением антител к GFP (Santa Cruz, США) для визуализации трансплантированных клеток, десмину (Dako, США) — маркёру ЗКП печени крыс, альфа-гладкомышечному актину (a-SMA, Dako, США) — маркёру миофибро-бластов — и цитокератину 19 (ЦК19, Dako, США) — маркёру гепатобластов/холангиоцитов.

Результаты и обсуждение

Результаты исследования показали, что уже через 2 сут. после трансплантации свежевыделенных ЗКП, трансфицированных геном GFP, в печени крыс-реципиентов контрольной и экспериментальной групп можно видеть единичные GFP+-клетки, идентичные по размерам и форме гепатоцитам, что было подтверждено как флуоресцентной микроскопией, так и иммуногистохимической реакцией с антителами к данному белку (рис. А, Б). GFP+-клетки располагались преимущественно в перипортальных зонах, что подтверждает их миграцию в печень с портальным кровотоком. Отдельные GFP+-клетки имели два ядра (рис. В). Кроме гепатоцитов, в синусоидах печени и в портальных зонах были выявлены единичные GFP+-клетки, имеющие меньшие размеры и более вытянутую (треугольную или близкую к веретенообразной) по сравнению с гепатоцитами форму (рис. Б, Г). Как правило, такие клетки были окрашены более интенсивно, чем гепатоциты. Через 7 сут. после введения ЗКП клеток с морфологией гепатоцитов, экспрессирующих GFP, выявлено не было, однако отмечались многочисленные мелкие округлые и вытянутые клет-

ки в синусоидах и портальных зонах. Ещё через неделю распределение клеток было аналогичным, но количество GFP+-клеток заметно снижалось. Таким образом, свежевыделенные ЗКП, трансфицированные геном gfp и трансплантированные в воротную вену интактным крысам, мигрировали в печень реципиента, заселяли её и сохраняли свою жизнеспособность в течение не менее чем двух недель после введения. Более того, они уже в первые 2 сут. после трансплантации дифференцировались в гепатоциты или сливались с ними. Основная часть трансплантированных клеток в неповреждённой печени оказывается невостребованной и, очевидно, занимает место в синусоидах печени, возможно, восполняя резерв региональных стволовых клеток.

Число GFP+-клеток в экспериментальной группе с частичной гепатэктомией было намного выше, чем в контрольной группе (рис. Д). Очевидно, что основным стимулом, усиливающим репопуляцию гепатоци-тов из трансплантированных клеток, служит дефицит паренхиматозных клеток, вызванный операцией. Через 7 сут. число позитивных донорских гепатоцитов снижалось, но все ещё было выше, чем в контроле. Многие клетки были сгруппированы в кластеры, что, возможно, отражает пролиферацию клеток, дифференцирующихся из одной клетки-предшественницы. Постепенное снижение числа гепатоцитов в течение эксперимента, очевидно, связано с тем, что к концу первой недели после ЧГ масса печени у крысы достигает контрольных значений и процесс регенерации, в целом, можно считать завершённым. На этом фоне, так же как и в контроле, отмечается появление отдельных мелких округлых клеток, экспрессирующих GFP, в синусоидах и в портальных трактах.

При иммуногистохимическом окрашивании гистологических срезов печени на ЦК19 в портальных трактах и в паренхиме печени были выявлены мелкие округлые и вытянутые клетки, экспрессирующие ЦК19 (рис. Е). При окрашивании серийных срезов было установлено, что данные ЦК19+-клетки соответствовали по морфологии и локализации трансплантированным GFP+-ЗКП. Первые такие клетки выявлены в отдельных образцах через 7 сут. после введения клеток, а через 14 сут. они определялись во всех образцах и становились более многочисленными. Появление также ЦК19 свидетельствует о дифференцировке введённых клеток в гепатобла-сты, для которых данный цитокератин является характерным фенотипическим признаком. Таким образом, отмеченный факт согласуется с данными о том, что в ходе пренатального онтогенеза ЗКП могут быть клеточным источником развития гепатоцитов [10].

В ответ на трансплантацию ЗКП в печени реципиента происходило увеличение десмин+-ЗКП. Уже через 2 сут. после трансплантации было отмечено значительное увеличение в печени реципиента числа десмин+-позитивных клеток, которые имели выраженные разветвлённые отростки (рис. Ж), через 7 сут. после введения число десмин+-клеток становилось несколько выше, а через 14 сут., когда регенерация печени практически завершалась, их количество несколько снижалось, отростки клеток укорачивались. Ни на одном из изученных сроков не было отмечено трансдифференцировки ЗКП реципиента в миофи-бробласты, о чём свидетельствовало стойкое отсутствие окрашивания срезов печени с антителами к а^МА в синусоидных клетках печени (рис. З).

Рис. Печень крысы после трансплантации GFP+-ЗКП: А, В, Д - GFP+-гепатоциты, 2 сут. после трансплантации ЗПК;

Б - GFPt-гепатоциты и мелкие GFPt-клетки в синусоидах печени, 2 сут. после трансплантации; Г - GFPt-клетки в портальной зоне, 2 сут. после трансплантации; Е - СК19+-клетки в портальной зоне, 7 сут. после трансплантации;

Ж - десмин+-ЗКП, 7 сут. после трансплантации; З - экспрессия a-SMA, миофибробласты в синусоидах печени отсутствуют, 14 сут. после трансплантации. А-Г, Е-З - контрольная группа, ув.: х400; Д - экспериментальная группа. Ув.: х200

При этом гладкомышечные клетки внутрипечёноч-ных сосудов всегда экспрессировали данный антиген (внутренний положительный контроль, рис., З). Отсутствие трансдифференцировки ЗКП в миофибробласты свидетельствует о низком риске развития фиброза печени в ответ на трансплантацию ЗКП.

Таким образом, ЗКП, трансплантированные ин-тактным крысам и крысам после ЧГ, могут дифференцироваться в гепатоциты и не способствуют развитию фиброза печени, что подтверждает их роль в регенерации печени и возможную принадлежность к прогениторным клеткам печени. Следовательно, значение звёздчатых клеток печени не ограничено

ЛИТЕРАТУРА:

1. Friedman S.L. Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver. Physiol. Rev. 2ВДВ; ВВ: 125—172.

2. Vassy J., Rigaut J.P., Briane D., Kraemer M. Confocal microscopy immunofluorescence localization of desmin and other intermediate filament proteins in fetal rat livers. Hepatology. 1993; 17: 293-3Ш.

3. Kiassov A.P., van Eyken P., van Pelt J.F. et al. Desmin expressing nonhematopoietic liver cells during rat liver development: an immunohistochemical and morphometric study. Differentiation. 1995; 59: 253-25В.

4. Киясов А.П., Гумерова А.А., Билалов M.M. Экспрессия цитокератинов в пре- и постнатальном онтогенезе печени крыс. Онтогенез. 1997; 28(5): 3В9-393.

5. Гумерова А.А., Киясов А.П., Калигин M.O. и др. Участие клеток Ито в гистогенезе и регенерации печени. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2ВД7; 4: 39-4B.

B. Гумерова А.А., Шафигуллина А.К., Трондин А.А. и др. Звёздчатые клетки печени стимулируют дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток костного мозга крысы в гепатоциты in vitro. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2Ш1; VK4): 72-81.

только накоплением ретиноидов, синтезом межклеточного вещества и участием в ремоделировании матрикса печени. Это важнейший клеточный тип, участвующий в регенерации печени и необходимый для дифференцировки её эпителиальных клеток, что открывает перспективы их применения для целей клеточной терапии заболеваний печени.

Благодарности

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов Российского Фонда Фундаментальных Исследований 09-04-97013-р_поволжье_а и 12-04-97088-р_поволжье_а.

7. Geerts A. History, heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Semin. Liver Dis. 2001; 21: 311-35.

8. Tomanovic N., Boricic I., Brasanac D. Immunohistochemical analysis of alpha-SMA and GFAP expression in liver stellate cells. Vojnosanit. Pregl. 2006; 63: 553-557.

9. Киясов А.П., Гумерова А.А., Титова М.А. Мезенхимальноэпителиальная трансформация клеток Ито in vitro. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2006; 3: 150-153.

10. Гумерова А.А., Киясов А.П. Могут ли перисинусоидальные клетки быть региональными стволовыми (прогениторными) клетками печени? Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2010; V(1): 33-40.

11. Knook D.L., Seffelaar A.M., de Leeuw A.M. Fat-storing cells of the rat liver. Exp. Cell Res. 1982; 132: 468-71.

12. Ризванов А.А., Измайлов А.А., Сафиуллов З.З. и др. Генно-клеточная терапия бокового амиотрофического склероза мононуклеарными клетками пуповинной крови человека, генетически модифицированными рекомбинантными аденовирусами. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2012;VII (2): 44.

Поступила 02.08.2012