Влияние питательности рационов на функциональный спектр микрофлоры кишечника перепелок

тока по потенциалу при ступенчатом изменении последнего от - 0,6 В до 0,6 В. Методом добавок аттестованных смесей определяют концентрации элементов по высоте пика в диапазоне потенциала для железа минус 0,15 ± 0,05 В и для меди плюс 0,30 ± 0,05 В.

Анализ реальных объектов проведенный согласно предложенному алгоритму показал, что результаты согласуются с данными, полученными по [6,7].

Выводы. Таким образом, на основании проведенных исследований разработана методика воль-тамперометрического определения железа и меди в кормах и кормовых добавках в диапазоне содержаний для железа от 1,0 до 1000 мг/кг, для меди - от 0,5 до 300 мг/кг (Бг не более 13 %). Она позволяет проводить измерение элементов одновременно в присутствии растворенного кислорода.

Литература.

1. Георгиевский В.И. Физиология сельскохозяйственных животных. - М.: Агропромиздат, 1990. - 512с.

2. СанПиН 2.3.2.1078-01. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы.

3. ГОСТ 27998-88 Корма растительные. Методы определения железа. - М.: ИПК Издательство стандартов, 2002.

4. ГОСТ30692-2000 Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Атомно-абсорбционный метод определения содержания меди, свинца, цинка и кадмия. - М.: ИПК Издательство стандартов, 2002.

5. ГОСТ 27995-88 Корма растительные. Методы определения меди. - М.: ИПК Издательство стандартов, 2002.

6. МУ 08-47/247, ФР.1.31.2011.09196. Зерно и продукты его переработки, силос из зеленых растений, корма, комбикорма, комбикормовое сырье и кормовые добавки. Инверсионно-вольтамперометрическая методика определения содержания железа, йода, кобальта, марганца, мышьяка, никеля, ртути и селена. - Томск.: Изд-во ТПУ, 2010. - 69 с.

7. МУ 08-47/224, ФР.1.29.2010.07103. Зерно и продукты его переработки, корма, комбикорма, комбикормовое сырье и кормовые добавки. Инверсионно-вольтамперометрическая методика определения содержания токсичных элементов (цинка, кадмия, свинца, меди) - Томск.: Изд-во ТПУ, 2010. - 50 с.

SIMULTANEOUS VOLTAMMETRIC DETERMINATION OF IRON AND COPPER

IN FEED AND FEED ADDITIVES V.I. Deryabina, G.B. Slepchenko, Ho Sy Linh, T.V. Lycheva, L.A. Malinovskaya

Summary. The aim of this research was to develop a method for joint voltammetric determination of iron and copper in feed and feed additives. The stripping voltammetric iron and copper measurement method is based on the ability of Fe3+ and Cu2+ to accumulate on the surface of the gold-graphite electrode in the form of marginally soluble compounds at a specific voltage, relative to the silver chloride electrode of the 0.02 mol/dm3 background solution of Trilon B, with the following registration of anodic peaks. The choice of the element accumulation potential (Eel, V) is investigated in the model solutions. It is found that Eel = -1V is the optimal accumulation potential for Fe3+ and Cu2+ for their joint determination. Element's concentrations are determined by adding certified mixtures at the peak in the potential range, which is (0.15 ± 0.05)V for iron, and (0.30 ± 0.05)V for copper. The studies found that the analytical signal of Fe3+ is influenced by slight amounts of mercury and lead, as well as 20-fold excess of nickel and cadmium. The determination of Cu2+ is interfered by insignificant quantity of mercury and the presence of excess zinc, nickel and cobalt 20 times. Based on these studies, we have developed a method for determining iron and copper in feed and feed additives in the range of 0.1 to 1000 mg/kg for iron, and 0.05 to 300 mg/kg for copper (RSD no more than 15%), which allows for simultaneous measurements of elements in the presence of dissolved oxygen.

Keywords: voltammetry, technique, joint determination of iron and copper, feed, feed additives.

УДК636.59.085.2:612.336.3

ВЛИЯНИЕ ПИТАТЕЛЬНОСТИ РАЦИОНОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ СПЕКТР МИКРОФЛОРЫ КИШЕЧНИКА ПЕРЕПЕЛОК

Д.Д. ГОМБОЕВ, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник

О.Г. МЕРЗЛЯКОВА, старший научный сотрудник В.Г. ЧЕГОДАЕВ, кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник

В.А. РОГАЧЕВ, доктор сельскохозяйственных наук, зав. лабораторией

СибНИИЖ Россельхозакадемии А.А. РАСПУТИН, стажер-исследователь Новосибирский ГМУ E-mail: sibniptij@ngs.ru

Резюме. В эксперименте длительностью 3 недели изучали влияние уровня питательности рациона на устойчивость микробиоты кишечника перепелок к действию антибиоти-

ков. Схема опыта предусматривала следующие варианты: обычный рацион (контроль), рацион с повышенным (до 24 %) содержанием протеина (рыбной муки), обычный рацион + антибиотик; обогащенный протеином рацион + антибиотик. Антибиотик(тилозина тартрат) вводили в течении 2-й недели эксперимента в дозе 80 мг/гол. в сут. По окончании опыта отбирали пробы содержимого прямой кишки. Функциональный спектр микрофлоры кишечника определяли с помощью муль-тисубстратного теста (МСТ), титр - на среде Кода. Наиболее потребляемые кишечной микрофлорой перепелов пищевые субстраты - маннит, мальтоза, лактоза, глюкоза, ксилоза, галактоза, крахмал, фруктоза (степень утилизации 4,8...5,4 балла); в средней степени - сорбит, сахароза, раффиноза, арабиноза, глицерин (2,8.3,2 балла); в наименьшей - дуль-цит, инозит, рамноза (0,3.0,9баллов). Обогащение рациона белком способствовало повышению титра микрофлоры на 1.2 балла, активности - до 25 %, в сравнении с традиционным его составом. При воздействии антибиотика титр и

активность микрофлоры достоверно изменялись только на фоне обогащенного рациона (снижение примерно на 20 %). Следовательно, повышение количества протеина в рационе перепелов может сопровождаться снижением устойчивости кишечной микрофлоры к антимикробным факторам. Ключевые слова: перепелки, кишечная микрофлора, устойчивость, мультисубстратный тест(МСТ), питательность рациона.

Изменение состояния кишечной микрофлоры может вызывать морфофункциональные нарушения пищеварительного тракта, которые называют дис-биозами (дисбактериозами) [1...5], проявляющиеся диареями и запорами [1, 6, 7]. Постановку диагноза на дисбактериоз проводят с выделением чистых культур. Однако некоторые авторы считают этот этап «диагностическим тупиком» [8], что согласуется с результатами ряда исследователей [2, 6, 9, 10] поскольку множество (не менее 500) видов, длительность работ по изоляции и идентификации хотя бы основных из них занимает время, несопоставимое с разумными пределами, выделяемыми на постановку диагноза, разработку мер борьбы и др.

В 1991 г. был предложен подход к оценке функционального состояния микрофлоры на основе учета активности утилизации спектра субстратов (96 шт.) - мультисубстратиый тест (МСТ) [11]. Интенсивность процесса авторы оценивали при помощи цветной реакции с солями тетразолия. В основу метода положен известный в классической микробиологии тест «пестрый ряд».

О необходимости такого метода писал еще И.В. Давыдовский [12], и на наш взгляд, он может стать одним из подходов к изучению кишечной микрофлоры как своеобразного «пищеварительного органа» в составе организма.

Мы установили информативность упрощенного варианта (с 23 субстратами) этого метода для оценки изменения функционального спектра кишечной микрофлоры мышей при экспериментальном дисбиозе и его коррекции [9].

В то же время на структуру кишечной микрофлоры, ее устойчивость к разным воздействиям существенное влияние оказывает состав рационов [10]. Этот факт основа изучения состояния симбионтной микрофлоры и обменных процессов в организме.

Цель нашего исследования определить характер влияния рациона на устойчивость кишечной микрофлоры перепелок.

Условия, материалы и методы. Эксперимент проводили в физиологическом корпусе СибНИИЖ Россельхозакадемии на перепелах японской селекции. В опыте задействовали 4 группы петушков (по 10 гол. в каждой) 3-месячного возраста (в этот период окончательно стабилизируется микробиота кишечника): I давали обычный рацион для перепелок (17 % рыбной муки) - контроль [15], II - рацион, обогащенный белковым компонентом (рыбная мука до 24 %) [15], III - обычный рацион + антибиотик, IV - рацион с увеличенной долей рыбной мукой + антибиотик. Антибиотик тилозина тартрат в дозе 80 мг/гол. в сут. вводили в течение 2-й недели опыта, на 3-й неделе -прекратили. По окончании 3-й недели эксперимента при забое птиц стерильно отбирали пробы содержимого прямой кишки.

Функциональный спектр кишечной микрофлоры определяли методом мультисубстратного теста (МСТ), в котором задействовали 23 субстрата: дульцит,

инозит, маннит, сорбит, мальтоза, лактоза, глюкоза, сахароза, ксилоза, раффиноза, рамноза, галактоза, крахмал, цитрат калия, мочевина, арабиноза, глицерин, фруктоза, малат калия, тартрат калия, цитрат аммония, целлюлоза, твин-80 [11]. Интенсивность окраски ячеек иммунологических планшетов (активность утилизации субстратов) оценивали визуально в баллах .

Титр кишечной микрофлоры учитывали на среде Кода.

Результаты опыта обрабатывали при помощи методов многомерной статистики с использованием пакета программ 81а11в1юа 6.0.

Анализ функционального спектра кишечной микрофлоры проводили по двум основным критериям: сумма баллов активности по всем субстратам (суммарная активность) и степень выровненности спектра, то есть доля утилизации каждого субстрата в суммарной активности. Чем выше величина второго показателя, тем равномернее потребляются субстраты и, следовательно, разнообразнее функциональный спектр. Количественно она определяется по формуле:

Е = 1/Е

где Е - критерий Симпсона, - доля балла активности по каждому отдельному субстрату в общей сумме баллов.

Результаты и обсуждение. Определение пищевых предпочтений микрофлоры кишечника перепелов при стандартном рационе методом кластерного анализа показало, что в группу наиболее потребляемых (в среднем от 4,8 до 5,4 баллов ) входят маннит, мальтоза, лактоза, глюкоза, ксилоза, галактоза, крахмал, фруктоза; умеренно потребляемых (от 2,8 до 3,2) - сорбит, сахароза, раффиноза, арабиноза, глицерин; наименее потребляемых (от 0,3 до 0,9) - дульцит, инозит, рамноза, цитрат калия, мочевина, калия малат, калия тартрат, аммония цитрат, целлюлоза, твин-80.

Титр кишечной микрофлоры на фоне рациона с увеличенной долей рыбной муки был выше, чем при стандартном. Под воздействием антибиотика при обоих типах рационов он снизился в одинаковой степени (см. табл.).

Таблица. Численность и активность микрофлоры кишечника по вариантам опыта

Группа Суммарная активность, баллы Критерий Е Титр Lg N

I 55 13 7

II 66 16 8

III 60 14 6

IV 54 13 7

Доверительный

интервал 5 1 1

Введение в рацион рыбной муки способствовало повышению суммарной активности микрофлоры. Под воздействием антибиотика в этом варианте она снизилась до уровня контроля. В условиях кормления стандартным рационом действия антибиотика на величину суммарной активности микрофлоры не установлено. Оценка выровненности спектра по критерию Е показала достоверно более высокую степень функционального разнообразия микробного сообщества кишечника птиц в варианте с повышенной долей рыбной муки без антибиотика, остальные группы по величине этого показателя различались не существенно.

Наибольшие различия в функциональных спектрах кишечной микрофлоры птиц отмечены между груп-

Контроль Мука + антибиотик Контроль+антибиотик Мука рыбная  1  1  1  1  1

2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 3,4 Относительное расстояние сходства

Рисунок. Группировка вариантов опыта по результатам кластерного анализа.

пами I и II (см. рисунок). При этом под воздействием антибиотика они практически нивелировались. Судя по относительному расстоянию сходства, степень изменения спектра под его влиянием оказалась выше на фоне рыбной муки.

Таким образом, более многочисленная и функционально разнообразная, в сравнении с контролем, микрофлора кишечника перепелов в условиях ра-

циона с увеличенной долей рыбной муки оказалась менее устойчивой к стрессу, в виде воздействия антибиотика. На наш взгляд, в опыте проявилась обычная реакция самосохранения популяции при действии неблагоприятного фактора внешней среды [5, 9, 10]. То есть улучшение условий для развития и существования индигенной микрофлоры - в нашем случае повышение количества питательных веществ (протеина) - может привести к снижению уровня ее устойчивости к антимикробным факторам. Такие предположения вполне согласуется с известными в литературе сведениями [10, 14, 15]. То есть направленным регулированием состава рационов можно контролировать функциональную активность микрофлоры кишечника

Выводы. К наиболее потребляемым кишечной микрофлорой перепелов пищевым субстратам относятся маннит, мальтоза, лактоза, глюкоза, ксилоза, галактоза, крахмал, фруктоза.

Увеличение в рационе доли рыбной муки от 17 до 24 % сопровождалось повышением титра (на 1...2) и активности (на 25 %) кишечной микрофлоры птиц

Под воздействием антибиотика функциональный спектр микробного сообщества наиболее значительно изменялся на фоне рациона с повышенным содержанием рыбной муки.

Литература.

1. Циммерман Я.С. Дисбиоз (дисбактериоз) кишечника и (или) синдром избыточного бактериального роста//Клиническая медицина, 2005. - т.83. - № 4. - с.14 - 22.

2. Камалова А.А., Удачина Э.И., Зинкевич О.Д., Сафина Н.А. Функциональное состояние желудка и протеолитическая активность копрофильтратов у детей с хронической гастродуоденальной патологией // Педиатрия. - 2011. - т.90. - № 2. -с. 14 - 18.

3. Killian M., Reinhold J., Lomholdt H. e.a. Biological significans of the Ig-proteases in bacterial colonization and pathogenesis: critical evalution of experimental evidence //ARMIS. - 1996. - vol.104. - p.321 - 338.

4. Mistry D, Stockley R.A. Ig A-protease//Int. J.Biochem. Cell. Biol. - 2006. - vol.38. - N8. - p.1244 - 1248.

5. Gibbson S.A., MacFarlan C., Hay. S., MacFarlan C.T. Significance of microflora in proteolisys in the colon//Appl. Environ. Microbiol. - 1989. - vol.55. - N3. - p.679 - 683.

6. Gianfrilli P.M. Normal intestinal flora in children and their change in

7. pathological conditions //Ann. Ist Super Sanita. - 1986. - vol.22. - N3. - p.783 - 789.

8. Perdigon G. G., Fuller R., Rayo R. Lactic acid bacteria and their effect on the immune system // Cur. Issues Intest Microbiol. -2001. - vol.2. - N1. - p. 27 - 42.

9. Маянский А.Н. Дисбактериоз: иллюзии и реальность // Нижегородский медицинский журнал. - 1999. - N 3. - С. 80 - 91.

10. Гомбоев Д.Д., Данилова А.А. Пребиотическое действие католита ЭХАР при экспериментальном дисбиозе // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. - 2008. - № 4. С.85 - 90.

11. Королев А.А., Богданова Е.А., Несвижский Ю.В., Никитенко Е.И., Фетисов Р.Н. Влияние различных пищевых рационов на особенности формирования фекального микробиоценоза //Вопросы питания. - 2007. - т.76. - № 5. - с. 35 - 38.

12. Garland J.L., Mills A.L. Classification and characterization of heterotropic microbial communities on the basis of patterns of community level sole-carbon-sourse utilization //Appl. Environ. Microbiol. - 1991. -Vol.57. - P.2351-2359.

13. Давыдовский И.В. Проблемы причинности в медицине (Этиология). - М.: Медицина, 1962 - 175 с.

14. Рекомендации по кормлению сельскохозяйственной птицы. - г. Сергиев Посад Московской области.: Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства (ВНИТИП), 2003 г. - 143 с.

15. Богданова Е.А., Фетисов Р.П., Несвижский Ю.В., Королев А.А., Зверев В.В. Роль пищевого фактора в формировании разнообразия характеристик фекального микробиоценоза крыс // Вестник РАМН. - 2008. - № 1. - с.23 - 27.

16. Богданова Е.А., Несвижский Ю.В., Королев А.А., Зверев В.В. Влияние различных пищевых рационов на состав пристеночной микрофлоры крыс//Вестник РАМН. - 2008. - № 4. - с.23 - 26.

THE IMPACT OF NUTRITIONAL RATIONS OF THE FUNCTIONAL RANGE OF THE INTESTINAL MICROFLORA QUAIL D.D. Gomboev, O.G. Merzlyakov8, V.G. Chegodaev, V-А. Rogatchev, A-А. Rasputin

Summary. In the experience of a duration of 3 weeks studied the effect of the level of nutritional value of the diet on the sustainability of the intestinal microbiota quail to the action of antibiotics. Variants of the experiment : 1. usual diet (control), 2. the diet with high (up to 24%) protein (fish meal), 3. usual diet + within 2 weeks of experience provided in the feed Thiloziny tartrate in the dose of 80 mg/day on a goal; 4. group with enriched protein diet provided an antibiotic in the course of the whole experience. At the end of the experience've got a sample of the contents of the rectum. Functional range of the intestinal microflora were determined with CLPP, the title - in the nutrient medium of Code. Installed the most consumed intestinal microflora quail food substrates: mannitol, maltose, lactose, glucose, galactose, xylose, starch, fructose (degree of utilization of a 4.8 - 5,4 points); in the middle consumed sorbitol, sucrose, раффиноза, arabinose, glycerin ( a 2.8 - 3.2 points); the least - dulcitol, инозит, rhamnose (of 0.3 - 0.9 points). The enrichment of the diet protein contributed to increasing the title microflora on 1-2 points, activity - up to 25% in comparison with the traditional his composition. When exposed to an antibiotic, the title and the activity of microflora reliably changed only on the background of enriched diet (decrease approximately by 20%). Thus, the increase in the number of protein in the diet of the quails can be accompanied by a decrease of stability of the intestinal microflora to antimicrobial factors.

Key words: quails, intestinal microorganisms, resistance, CLPP. nutritiousness of the diet.