Кристаллизация слюны как способ определения оптимального времени вязки сук

ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ

Кристаллизация слюны как способ определения оптимального времени вязки сук

Цель: составить схему особенностей кристаллизации слюны на протяжении проэструса и течки у сук и оценить ее надежность как средства оптимизации времени вязки.

Методы: для исследования было взято шесть сук гончей породы с нормальной репродуктивной активностью. Во время проэструса и течки определяли характер кристаллизации слюны на стекле. Оптимальное время вязки определяли по результатам цитологии мазка из влагалища, анализа на прогестерон (П4) и по поведению. Анализировали характеристические кривые.

Результаты: различные картины кристаллизации оценивали по шкале от 0 до 2. Хотя в фолликулярную фазу течки были отмечены вариации в характере кристаллизации, нам не удалось доказать точность этого метода; его чувствительность была 40,6 %, т. е. слишком низкой для достоверного определения благоприятного для оплодотворения периода, а специфичность составила 86,1 %.

Клиническая значимость: Этот метод можно использовать как дополнение к другим методам определения периода, благоприятного для вязки, однако для этого необходимо продемонстрировать его возможности.

B. Pardo-Carmona, M.R. Moyano, R. Fernândez-Palacios.

C.C. Pérez-Marin

Journal of Small Animal Practice (2010) 51, 437-442 DOI: 10.1111/j.1748-5827.2010.00967.x

ВВЕДЕНИЕ

Тщательное планирование вязки путем определения времени овуляции - ключевой элемент разведения собак, в частности потому, что собаки относятся к моноцикличным животным с половым сезоном; чаще всего у них бывает два репродуктивных цикла в год. Причиной большей части неудачных вязок у здоровых сук с нормальным циклом является неправильное определение периода, благоприятного для оплодотворения [17, 28]. Отсутствие точных непосредственных методов определения овуляции у сук может быть одной из причин неудачи, особенно если сука подпускает кобелей на протяжении доста-

точно длительного времени либо овуляция происходит слишком рано или поздно. Кроме того, у некоторых сук возможны «тихие», фрагментированные или ановуля-торные циклы, что способствует снижению оплодотворяемости.

Кроме того, определение дня овуляции требуется при искусственном осеменении (ИО) свежей, законсервированной или замороженной спермой, когда стоимость каждой процедуры высокая и время критично; при вязке сук, у которых отсутствует рефлекс неподвижности, в прошлом имевших неудачную вязку или малый размер помета; для точного предсказания даты родов; а также в случаях, когда половой цикл мог измениться в результате стресса, об-

условленного перевозкой [11, 18]. Предсказание времени овуляции может оказаться очень полезным при планировании вязки, поможет добиться лучшей оплодотворяемости и увеличить размер помета [18].

Во время проэструса в плазме увеличивается концентрация эстрогена, достигая пика перед течкой. Возможно, что это повышение вызывает высвобождение лютеинизирую-щего гормона (ЛГ), индуцирующего овуляцию примерно через 48 часов. Кроме того, эстроген индуцирует рост и ороговение эпителия влагалища. Незначительное повышение концентрации П4 в плазме наблюдается с начала проэструса до конца течки; она начинает возрастать примерно за два дня до овуляции, во время выброса ЛГ [9]. Овуляция происходит при концентрации П4 от 2 до 10 нг/мл [3, 5, 19]. Во время овуляции первичный ооцит высвобождается примерно через 24-96 часов после предовуляторного пика [27]. На созревание ооцита требуется примерно 48 часов; в результате образуется способный к оплодотворению вторичный ооцит, сохраняющий эту способность от 24 до 36 часов во время нахождения в маточной трубе [18]. Для определения оптимального времени оплодотворения существует ряд диагностических методов, в том числе исследование цитологических препаратов из влагалища [22], определение концентрации П4 и ЛГ

[1], эндоскопия влагалища [15], измерение электрического сопротивления влагалищного секрета [13], УЗИ [14] и исследование характера кристаллизации влагалищной слизи [8]. Кристаллизация слизи из влагалища и шейки матки женщин с образованием древовидных структур впервые описана Papanicolau (1942). Garm and Skjerven (1952) изучали кристаллизацию слизи из влагалища и шейки матки коров; они

-Q-

Journal of Small Animal Practice • Российское издание • сентябрь 2010 • Том 1• № 3

31

-e-

отметили, что кристаллы в форме ветвей образовывались во время течки и исчезали в лютеиновую фазу цикла. У женщин циклические изменения характера кристаллизации связаны с секрецией экстрогена и П4 [26]; эстроген способствует кристаллизации, тогда как П4 подавляет ее. Zondek and Cooper (1954) отметили, что кристаллизуется не только слизь шейки матки, но и все слизистые секреты и большинство жидкостей тела, в том числе слюна. Обнаружилось, что кристаллы представляют собой обычную соль, а их форма зависела от наличия муцина. По-видимому, процесс кристаллизации зависит также от присутствия электролитов, белка и углеводов. Авторы пришли к заключению, что кристаллические структуры можно получить высушиванием капли солевого раствора, к которому добавлен белок [26]. Чувствительность и специфичность теста с кристаллизацией слюны указывается как 53 и 72 % [4]. На основании этих особенностей были разработаны готовые тест-системы, позволяющие женщинам быстро, просто и недорого определить период, благоприятный для оплодотворения. Хотя кристаллизация слизи шейки матки и влагалища исследовалась у многих видов, включая собак и людей [2, 8, 9, 16, 21], в литературе не описано использование слюны как показателя периода, благоприятного для оплодотворения у сук.

Цель данного исследования -установить характер кристаллизации слюны у сук во время проэст-руса и течки и оценить возможность применения этого метода для определения оптимального времени вязки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные

Для исследования было взято шесть взрослых сук гончей породы в возрасте от 1,5 до 6 лет, массой

20,5 (20,5 ± 3,9) кг и с нормальным половым циклом. Они содержались в Службе исследований на животных Университета Кордовы, а эксперименты проводились в соответ-

ствии с законом о защите животных Испании RD 1201/2005 и Директивой 86/609 Европейского союза о защите животных, использующихся в научных экспериментах.

Определение цикла течки

Для определения оптимального времени вязки в журнале ежедневно регистрировали поведенческие признаки течки, а также брали мазки из влагалища, кровь (для определения П4 в плазме) и пробы слюны.

Наступление проэструса определяли по следующим критериям: истечения с примесью крови, отек и набухание петли, рефлекс вульвы и подпускание кобеля. Для оценки поведения использовали два критерия: рефлекс вульвы и подпускание кобеля, которые классифицировали по шкале от 0 до 2; 0 соответствовал отсутствию обоих критериев, 1 - наличию одного, а 2 - наличию обоих. Для цитологического исследования делали мазки из влагалища и окрашивали их по Романовскому (фиксатор, эозин и метиленовый синий для экспресс-окрашивания, Панреак, Барселона, Испания) [22]. Вычисляли индекс ороговения (процент безъядерных клеток) [24] и процентное соотношение разных клеточных типов в мазках из влагалища на протяжении фолликулярной фазы; мазки классифицировали и оценивали следующим образом: ранний проэст-рус (1), промежуточный проэструс

(2), поздний проэструс (3), течка (4), поздняя течка (5) и диэструс (0).

Слюну собирали во время фолликулярной фазы (проэструс и течка). Для этого матовое стекло прижимали к языку и удерживали несколько секунд или собирали слюну пальцем в мытой и высушенной резиновой перчатке в области подъязычного сосочка, а затем прижимали палец к стеклу. Стекло высушивали 5 минут при комнатной температуре и рассматривали под микроскопом при 100-кратном увеличении. Поскольку ранее исследований кристаллизации слюны у сук как способа определения оптимального времени вязки не проводилось, мы установили следующую класси-

фикацию: тип 0, когда признаки кристаллизации и образования древовидных кристаллов отсутствовали; тип 1, когда наблюдалась частичная кристаллизация, т. е. на части стекла или всем стекле были кристаллы, но не древовидной формы (без длинных структур и видимых разветвлений), или при наличии явных древовидных кристаллов (с длинными стеблями и четко видимым разветвлением) на всей поверхности или части стекла (рис. 1); и, наконец, тип 2, когда стекло было покрыто четко видимыми крупными кристаллами в форме листьев папоротника (рис. 2).

Кровь брали из подкожной латеральной вены или вены сафена в пробирки с гепарином ежедневно, начиная с поздней стадии проэстру-са и до конца течки. Образцы центрифугировали при 2000 g в течение 10 минут, плазму отбирали пастеровской пипеткой и переносили в пробирки «Эппендорф» объемом 1 мл. Образцы немедленно замораживали при -80 °С до анализа. Концентрацию П4 в плазме определяли хемилюминесцентным методом, прошедшим аттестацию для анализа крови собак [5]. Коэффициенты вариации в одной серии анализов и между разными анализами были 6,3 и 5,8 соответственно, а предел обнаружения - 0,2 нг/мл.

Оптимальное время вязки или осеменения

Оптимальное время вязки определяли по результатам планового клинического исследования во время фолликулярной фазы течки, включавшего цитологию мазков из влагалища и наблюдение за половым поведением сук. Четыре суки были повязаны дважды, одна - однократно и одна - трижды. Ретроспективное измерение П4 позволило нам определить, произошла ли вязка в соответствующее время и, следовательно, оценить другие использованные методы.

Статистический анализ

Для вычисления дня овуляции записывали день родов. Полагали, что овуляция должна была произойти

-Q-

Кристаллизация слюны как способ определения оптимального времени вязки сук

-е-

Рис. 2. Типичная картина полной кристаллизации слюны

за 63 дня до родов, а пик ЛГ перед овуляцией - за 65 дней до родов, учитывая 2-дневный интервал между пиком ЛГ и овуляцией [7].

Наиболее благоприятное время для оплодотворения определяли как интервал между днем, когда концентрация П4 достигла 2,5 нг/мл, и диэструсом, определенным по результатам цитологии мазка из влагалища [11]. Это считалось «золотым» стандартом диагностики. Чувствительность выражали как пропорцию образцов, полученных во время благоприятного для оплодотворения периода, результат анализа которых совпадал с результатом анализа методами сравнения, а специфичность - как пропорцию образцов, собранных на протяжении известного благоприятного периода и классифицированных как положительные. Для чувствительности и специфичности использовали 95 % доверительный интервал (ДИ) (биномальное приближение).

Для оценки обоих анализов (кристаллизации слюны и цитологии мазков из влагалища) строили характеристические кривые. Было сделано заключение, что благоприятному для оплодотворения периоду соответствует кристаллизация слюны 2 типа и оценка мазков из влагалища 4-5 (течка и поздняя течка). Корреляцию между кристаллизацией, цитологией мазков из влагалища и концент-

рацией П4 во время проэструса и течки анализировали с использованием коэффициента корреляции Пирсона. Данные выражали как среднее ± СО. Для статистического анализа использовали программный пакет Ме^а1с 11.1.1.0 для Windows (Е 8сЬооп;ап8, Мапакегке, Бельгия).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Четырех сук повязали, одну осеменили свежей спермой на 9-й день после появления течки (но беремен-

ность не наступила); еще одну суку не вязали, так как это была ее вторая течка. Беременность наступила у трех сук (60 %), которые родили всего 20 щенков, т. е. средний размер помета составил 6,6 щенков. Три щенка из одного помета оказались мертворожденными, а семь из другого помета умерли вскоре после рождения. Благоприятный для оплодотворения период был установлен как 6,5 ± 0,9 дня. У щенных сук этот период длился 7,0 ± 0,8 дня, а у остальных - 6,0 ± 0,8 дня. Различие не было статистически значимым. У одной суки пик ЛГ наблюдался в день первой вязки и за 72 часа до второй вязки. У второй суки пик ЛГ произошел через 3 дня после первой вязки и за 2 дня до второй. У третьей суки пик ЛГ отмечен через 24 часа после первой вязки и за 48 часов до следующей.

Результаты показали, что положительный тест на кристаллизацию (типы 1 и 2, частичная или полная кристаллизация) наблюдался за несколько дней до и через несколько дней после оптимального дня вязки. Кристаллизация слюны сохранялась несколько дней (в среднем 6,6), до и после ожидаемой даты овуляции.

Для оценки достоверности теста на кристаллизацию слюны вычисляли относительные показатели

'v ' у і

-Q-

Рис. 1. Типичная картина частичной кристаллизации слюны

-e-

O

О

X

Л

0

m

I—

о

m

>

T

Специфичность

Рис. 3. Характеристические кривые для кристаллизации слюны (прерывистая линия) и цитологии мазков из влагалища (сплошная линия) как способы различения периодов, благоприятных и неблагоприятных для вязки. Диагональная линия - стандартная

диагностической значимости на основании кристаллизации слюны и цитологического исследования мазков из влагалища. Для этого сравнения использовали все полученные образцы. Характеристическая кривая (рис. 3) показала, что цитология влагалища позволяет точнее определить благоприятное для вязки время у сук (100 по сравнению с

40,6 %). Специфичность цитологии и кристаллизации слюны была 67,7 и 86,1 % соответственно. Для цитологии площадь под кривой составила 0,84 (Р = 0,0001), а стандартная погрешность - 0,04; 95 % ДИ соответствовал 0,73-0,92. Для кристаллизации слюны площадь под кривой составила 0,67 (Р = 0,009) со стандартной погрешностью 0,06 и 95 % ДИ 0,54-0,78. Таким образом, оба метода позволяли различать два периода (благоприятный и неблагоприятный) для оплодотворения.

Характеристические кривые для цитологии мазков из влагалища были ближе к верхнему левому углу, чем кривые для кристаллизации слюны, что свидетельствует о большей достоверности цитологии для определения оптимального времени вязки (рис. 3).

Сравнение характеристических кривых для цитологии и кристаллизации слюны показало значимое раз-

личие (Р = 0,024). Исследование продемонстрировало плохую корреляцию между различными диагностическими методами. Обнаружена отрицательная корреляция результатов определения П4 и кристаллизации слюны (г = -0,423; Р < 0,01; п = 70) и цитологией влагалища (г = -0,575; Р < 0,01; п = 75). Корреляция между кристаллизацией слюны и цитологией влагалища также была плохой (г = 0,334; Р < 0,01; п = 75).

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящее время на рынке имеется тест на овуляцию для женщин, основанный на изменениях слюны. Хотя этот метод не исследовался на суках, имеются неопубликованные данные об его использовании для домашних животных (обмен личным опытом). Исследования женщин показали, что приближение овуляции сопровождается изменением характера кристаллизации слюны в результате изменения концентрации электролитов, связанного с гормональными изменениями [4, 26]. Тест с кристаллизацией слюны неинвазивен, довольно прост для интерпретации и не связан со стрессом для животного. Кристаллизация совпадает с максимальным по-

вышением концентрации эстрогена, происходящим за 2 дня до пика ЛГ и за 4 дня до овуляции. Таким образом, кристаллизация слюны в форме ветвей - первый наблюдаемый признак у собак, появляющийся за 4 дня до овуляции и способный сохраняться до 2-3 дней после нее. В настоящем исследовании средняя длительность кристаллизации слюны составила 6,6 дня, что соответствует ожидаемым значениям.

Исследования кристаллизации влагалищной слизи сук показали значительные индивидуальные колебания картины кристаллов [8, 9]; сообщается, что кристаллизация менее интенсивна, чем у других видов. Максимальная кристаллизация влагалищной слизи наблюдается между 1 и 5 днями течки после максимального подъема концентрации эстрогенов, т. е. в период до овуляции, когда начинается лютеиниза-ция фолликулов [9]. Результаты этого исследования подтверждают представление о том, что максимальная кристаллизация слюны происходит до подъема концентрации П4 в крови до 2,5 нг/мл, хотя возможны индивидуальные различия. Вероятность оплодотворения выше всего на пике ороговения клеток влагалища [25]. Однако у некоторых сук бывает два пика ороговения, что осложняет определение оптимального времени вязки. Таким образом, тест с кристаллизацией слизи может быть полезен для исследования сук с длительным проэструсом, так как позволяет определить пик ороговения клеток [9]. Показано, что цитология мазка из влагалища и тест с кристаллизацией слизи из влагалища и шейки матки могут использоваться для определения оптимального времени вязки у сук [8, 9]. В настоящем исследовании кристаллизация слюны наблюдалась во время благоприятного периода и в некоторых случаях до него. Процесс кристаллизации слюны подавляется П4, что может объяснить отсутствие кристаллизации при высокой концентрации П4, т. е. на поздней стадии течки и во время диэструса [26].

Другие авторы [4, 12] предполагают, что у женщин кристаллиза-

-Q-

Кристаллизация слюны как способ определения оптимального времени вязки сук

-е-

Цикл течки

Рис. 4. Период, в который наблюдается кристаллизация слюны (—), максимальная кристаллизация слюны (синий прямоугольник), самый высокий индекс ороговения и возрастание концентрации прогестерона указывают на период способности к оплодотворению у шести исследованных сук (А-Г). Вверху: ожидаемая картина кристаллизации образцов слюны. У суки С беременность не наступила, а суку Г не вязали

ция происходит при высокой концентрации эстрогенов, совпадающей с предовуляторным периодом, и, следовательно, имеется положительная связь концентрации эстрогенов с кристаллизацией, если последняя не подавляется П4.

По некоторым авторам, благоприятное для оплодотворения время у сук соответствует периоду между 4-м и 8-м днями после предовулятор-ного выброса ЛГ [6, 8, 23, 27], т. е. совпадает с интервалом от подъема концентрации П4 до 2,5 нг/мл до начала диэструса. Это исследование показало, что чувствительность теста с кристаллизацией слюны составляет 40,6 %, а специфичность 81,6 % по сравнению с 100,0 и 67,6 % для цитологии мазков из влагалища.

Как показывают характеристические кривые, тест с кристаллизацией слюны не имеет достаточной диагностической значимости по сравнению с цитологией мазков из влагалища. Отмечена отрицательная корреляция между концентрацией П4 и кристаллизацией слюны и цитологией мазков из влагалища, хотя полученные значения не показывают сильной зависимости между переменными. Положительная корреляция между кристаллизаци-

ей слюны и цитологией влагалищных мазков показывает некоторую степень зависимости, хотя это значение близко к 0. Результаты позволяют предположить, что оценка кристаллизации слюны в баллах возрастает в ходе фолликулярной фазы до достижения максимальной кристаллизации, а в последующем снижается. Таким образом, можно повторить вязку дважды через интер-

вал 48 часов, когда кристаллизация в форме древовидных кристаллов исчезнет. Наблюдения показывают, что этот способ позволяет определить оптимальный период для вязки в большинстве случаев.

Как показано на рис. 4, результаты определения оптимального времени вязки сильно варьировали, в основном из-за того, что кристаллизация слюны наблюдалась во время охоты. Цитология мазков из влагалища и высокая концентрация П4 сужают границы определения оптимального времени вязки. Пик ороговения эпителия влагалища был ближе к оптимальному времени вязки

с;

*

х

о

Q.

0

I—

о

0

о

Q.

С

Дней с начала течки

Рис. 5. Плазменные концентрации прогестерона у сук Д-Р в стадии проэструса и течки. Красная линия соответствует среднему значению

-Q-

-e-

и полной (2) кристаллизации. Образование древовидных кристаллов слюны не наблюдалось во время ди-эструса, но совпадало с периодом, близким к овуляции. Этот метод оказался недостаточно эффективным для определения оптимального времени вязки у сук; цитология мазков из влагалища и высокая концентрация П4 являются лучшими показателями для этой цели (рис. 5). Возможно, сочетание этого теста с другими сможет стать более точным средством диагностики оптимального времени оплодотворения у сук, хотя для подтверждения этого необходимы дальнейшие исследования.

Благодарности

Авторы благодарят Центральную службу исследований на животных Университета Кордобы за сотрудничество, сделавшее возможным это исследование.

Литература

1. Badinant F, Fontbonne A., Maurel M.C. & Siliart B. Fertilization time in the bitch in relation to plasma concentration of oestradiol, progesterone and luteinizing hormone and vaginal smears // Journal of Reproduction and Fertility, 1993, 47, 63-67.

2. Betteridge K.J. & Raeside J.I. Investigation of cervical mucus as an indicator of ovarian activity in pigs // Journal of Reproduction and Fertility, 1962, 3, 410-421.

3. Bouchard G.F., Solorzano N., Concannon P.W., Youngquist R.S. & Bierschwal C.J. Determination of ovulation time in bitches based on teasing, vaginal cytology, and elisa for progesterone // Theri-ogenology, 1991, 35, 603-611.

4. Braat D., Smeenk J., Manger A., Thomas C., Veerse-ma S. & Merkus J. Saliva test as ovulator predictor // Lancet, 1998, 352, 1283-1284.

5. Chapwanya A., Clegg T, Stanley P & Vaughan L. Com-

parison of the Immulite and RIA assay methods for measuring peripheral blood progesterone levels in Greyhound bitches // Theriogenology, 2008, 70, 795-799.

6. Concannon RW., Hansel W. & McEntee K. Changes in LH, progesterone and sexual behavior associated with preovulatory luteinization in the bitch // Biology of Reproduction, 1977, 17, 604-613.

7. Concannon R.W., Whaley S., Lein D. & Wissler R. Canine gestation length; variation related to time of mating and fertile life of sperm // American Journal of Veterinary Research, 1983, 44, 1819-1821.

8. England G. Vaginal cytology and cervicovaginal mucus arborisation in the breeding management of bitches // Journal of Small Animal Practice, 1992, 33, 577-582.

9. England G. & Allen W.E. Crystallization patterns in anterior vaginal fluid from bitches in oestrus // Journal of Reproduction and Fertility, 1989, 86, 335-339.

10. Garm O. & Skjerven O. Undersokelse av cervikalslim for diagnose av tidlig drektighet og endokrint betingede forstyrrelser av seksual cycles hos husdyr // Nordisk veterinaermedicin, 1952, 4, 1098-1103 [Norwegian].

11. Goodman M. Desmystifyng ovulation timing // Clinical Techniques in Small Animal Practice, 2002, 17, 97-103.

12. Guida M., Barbato M., Bruno R, Lauro G. & Lam-pariello C. Salivary ferning and the menstrual cycle in women // Clinical and Experimental Obstetrics & Gynecology, 1993, 20, 48-54.

13. Gunzel A.R., Koivisto R & Cougner J.A. Electrical resistance of vaginal secretion in the bitch // Theriogenology, 1986, 25, 559-570.

14. Hewitt D. & England G. Assessment of optimal mating time in the bitch // In Practice, 2000, 22, 24-32.

15. Jeffcoate I.A. & Lindsay FE.F Ovulation detection and timing of insemination based on hormone concentrations, vaginal cytology and the endoscopic appearance of the vagina of domestic bitches // Journal of Reproduction and Fertility, 1989, (Suppl 39), 277-287.

16. Jezkova A., Stadnik L., Vacek M. & Louda F. Factors affecting the cervical mucus crystallization, the sperm survival in cervical mucus, and pregnancy rates of Holstein cows // Journal of Central European Agriculture, 2008, 9, 377-384.

17. Johnston S.D., Olson RN. & Root M.V Clinical approach

to infertility In bitches // Seminars in Veterinary Medicine and Surgery (Small Animal), 1994, 9, 2-6.

18. Johnston S.D., Root Kustritz M.V & Olson RN. Breeding management and artificial insemination of the bitch. In: Canine and feline theriogenology. Ed. R. Kersey. W.B Saunders, London, UK. 2001, pp 41-65.

19. Kutzler M.A., Mohammed H.O., Lamb S.V & Meyerswallen VN. Accuracy of canine parturition date prediction from the initial rise in preovulatory progesterone concentration // Theriogenology, 2003, 60, 1187-1196.

20. Rapanicolau G.N. A new procedure for staining vaginal smears // Science, 1942, 95, 438-439.

21. Rattanasuttinont S., Sereepapong W. & SuwajanakornS. The salivary ferning test and ovulation in clomiphene citrate-stimulated cycles // Journal of the Medical Association of Thailand, 2007, 90, 876-883.

22. Rerez C.C., Rodriguez I., Dorado J. & Hidalgo M. Use of ultrafast Rapanicolau stain for exfoliative vaginal cytology in bitches // Veterinary Record, 2005, 156, 648-650.

23. Smith M.S. & McDonald L.E. Serum levels of lutheiniz-ing hormones and progesterone during the estrous cycle, pseudopregnancy and pregnancy in the dog // Endocrinology, 1971, 94, 404-412.

24. Soost H.J. & Baur S. (Eds) Células que se encuentran en los frotis vaginales y cervicales normales. In: Diagnóstico Citológico en Ginecología. Toray S.A. Barcelona, Spain. 1983, pp 22-45 [Spanish].

25. Van Der Holst W. & Best A.R Een beschouwing over het meest geschikre tijdstip voor de decking van de teef // Tijdschr, Diergeneesk, 1976, 19, 125-133 [Dutch].

26. Wearing M.R The crystallization of cervical mucus: a critical analysis based on clinical research // Canadian Medical Association Journal, 1959, 81, 82-87.

27. Wildt D.E., Chakraborty RK., Ranko W.B. & Seager

S.W.J. Relationship of reproductive behaviour, serum luteinizing hormone and time of ovulation in the bitch // Biology of Reproduction, 1978, 17, 561-570.

28. Zoldag L., Kecskemethyl S. & Nagy R Heat progesterone profiles of bitches with ovulation failure // Journal of Reproduction and Fertility, 1993 (Suppl 47), 562-563.

29. Zondek B. & Cooper K. Cervical mucus in pregnancy: inability of estrogen to produce arborisation in pregnancy and its clinical significance // Obstetrics and Gynecology, 1954, 4, 484-491.

-Q-

36

Journal of Small Animal Practice • Российское издание • сентябрь 2010 • Том 1• № 3