ВАКЦИНЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ВАРИАНТЫ ПАРВОВИРУСА СОБАК
VACCINES CONTAINING GENETIC VARIANTS OF CANINE PARVOVIRUS

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Настоящая заявка включает в качестве списка последовательностей полное содержание сопроводительного текстового файла «Sequence.txt», созданного 12 июня 2008 г. (объем которого составляет 3780 байтов), включенного в настоящее описание путем ссылки.
ОПИСАНИЕ
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение в целом относится к улучшенным составам вакцины против парвовируса собак (CPV) и к диагностическим тестам. В частности изобретение касается улучшенных композиций вакцины против CPV и диагностических тестов, содержащих недавно обнаруженные доминантные варианты CPV, которые циркулируют в популяциях собак в настоящее время.
Предпосылки изобретения
Парвовирус собак (CPV) преимущественно является желудочно-кишечным патогеном, который поражает собак, особенно щенков. Парвовирусная инфекция характеризуется острой диареей, лихорадкой и лейкопенией у собак и щенков старше 4-5 недель и поражением миокарда у щенков в возрасте меньше 4-5 недель. Уровень смертности у невакцинированных животных крайне высок. Несмотря на существование вакцин против CPV, из-за того что CPV является одноцепочечным ДНК-вирусом и мутирует с очень высокой скоростью, он обладает необыкновенной способностью к антигенной изменчивости, и тем самым уклоняется от воздействия иммунной защиты, которую обеспечивают вакцины. Таким образом, необходим постоянный мониторинг антигенного типа и генотипа возбудителя.
Впервые CPV был выделен в 1978 году и был назван «CPV-2» для отличия его от парвовируса - «минутного вируса» собак (CMV или CPV-1). В целом полагают, что CPV-2 представляет собой генетический вариант вируса панлейкопении кошек (FPV) или вируса энтерита норок (MEV) и он генетически и антигенно очень близок парвовирусам, инфицирующим норок, лис, енотов и других хищников. Капсид CPV содержит одноцепочечный ДНК-геном длиной около 5200 оснований, имеющий только две открытые рамки считывания, хотя они кодируют по меньшей мере четыре белка благодаря альтернативному сплайсингу мРНК. Капсид белка образуют два вирусных белка (VP), VP1 и VP2, причем VP2 является основным иммуногенным белком капсида вируса. Генетический вариант исходного изолята CPV был идентифицирован в 1979-1980 годах и назван CPV, тип 2а. В середине 1980-х годов был идентифицирован еще один вариант, тип 2b, и с этого времени типы 2а и 2b, по-видимому, полностью вытеснили исходный CPV-2. Существующие на сегодняшний день вакцины направлены только на варианты 2а и 2b, хотя вариант 2b больше не встречается в Соединенных Штатах. Обзор открытия и эволюции CPV предложен в статье Parrish and Kawaoka, 2005.
Proceedings National Academy Sciences
CPV-2b отличается от CPV-2a двумя положениями аминокислот: Asn-426 в 2a (кодируется AAT) заменен на Asp в 2b (кодируется GAT), а Ile-555 в 2a заменен на Val в 2b. Замена Ile-555 на Val на самом деле является возвратом к последовательности исходного 2 типа. Антигенные типы CPV-2a и 2b, по-видимому, оставались относительно стабильными в течение ряда лет. Однако в 2000 г. был описан вариант «2с», в котором в положении 426 находится Glu, кодируемый GAA (в положении 555 находится Val). Вариант 2с был обнаружен в Италии (Buonavoglia et al., 2001), Вьетнаме (Nakamura et al., 2001) и других странах, включая Испанию (Nakamura et al., 2004; Decaro et al., 2006), но до сегодняшнего дня не было достоверных данных о существовании варианта 2с в США, а вакцины против CPV не обновлялись с учетом таких вариантов. Это особенно важно, поскольку в отличие от ранее описанных вариантов, которые поражают в основном щенков, CPV2c способен инфицировать взрослых собак. Кроме того, в 2003 г. в базе данных GenBank была депонирована последовательность варианта 2b с вариациями кодонов в положениях 494 и 572 (gi: 54646340), а в 2005 году - опубликована Shackelton et al. ( 102:379-384), но на основании этих последовательностей не было предложено никаких изменений в вакцинах против CPV или в композициях для диагностики CPV.
В отсутствии обновления вакцин возникает ряд проблем. Во-первых, даже вакцинированные собаки могут быть восприимчивы к инфицированию вариантами CPV, которые входят в состав вакцины. Во-вторых, если вакцинированные собаки заболевают, их владельцы часто утверждают, что причиной болезни были вирусные штаммы в вакцине. Это часто приводит к выплате компенсаций владельцам, поскольку на практике компания не может предоставить доказательства, что это не так.
Против CPV было предложено несколько препаратов вакцин:
В патентах США 4193990 и 4193991, авторов Appel et al., описаны гетеротипные и инактивированные («убитые») вакцины соответственно, которые обеспечивают защиту против исходного CPV.
В патенте США 4303645, авторов Carmichael et al., описана вакцина, содержащая ослабленный CPV, получаемый в результате пролонгированных серийных пассажей вируса в неонкогенных клеточных линиях. Эта вакцина также защищает от инфекции исходным изолятом CPV.
В патенте США 4971793, авторов Wood et al., и в патенте США 5882652, авторов Valdes et al., описаны рекомбинантные субъединичные вакцины, содержащие белок VP-2 из CPV, полученный в рекомбинантных бакуловирусах. Белок VP-2 не относится к определенному типу или подтипу.
В патенте США 5885585, авторов Parrish et al., описана вакцина против CPV, содержащая ослабленную форму варианта 2b.
В результате способности CPV мутировать и образовывать новые антигенные варианты существует постоянная необходимость наблюдения за развитием генетической структуры вариантов CPV и разработки вакцин и диагностических тестов, направленные на современные варианты CPV.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к обновленным вакцинам для профилактики CPV-инфекции и способов диагностики для обнаружения новых возникающих вариантов CPV. Вакцины и способы диагностики основаны на открытии ранее неизвестных и ранее недооцененных вариантов CPV и учитывают возникновение мутантных форм вируса, для которых предшествующие составы вакцин и средства диагностики являются неактивными. Вакцины по настоящему изобретению обеспечивают защиту против возникающих форм CPV, а диагностические средства обеспечивают возможность обнаруживать вновь образующиеся формы вируса, причем оба этих качества ранее были недоступны. В частности, в качестве «маркерного» варианта в вакцинах используется один новый редко встречаемый вариант. Использование маркерного варианта обеспечивает возможность исследований в судебной практике: вызваны или нет симптомы болезни у животного, вакцинированного маркерным вариантом, вакциной или другим штаммом CPV.
Новые составы вакцин включают целый ослабленный CPV с одноцепочечной ДНК, имеющей одну или несколько из следующих характеристик:
2bΔ494Δ572 представляет собой вариант CPV, который содержит по меньшей мере следующие замены: кодоном, кодирующим аминокислоту в положении 494 белка VP2, является TGC, а не TGT, а кодоном, кодирующим аминокислоту в положении 572 белка VP2, является GTC, а не GTA. Эти замены не приводят к аминокислотным заменам (оба кодона TGC и TGT кодируют цистеин, а GTC и GTA кодируют валин). Тем не менее этот вариант вызывает болезнь у животных, ранее привитых стандартными, доступными на сегодняшний день вакцинами, и его следует включить в новые составы вакцин. Хотя замены в кодонах аминокислот 494 и 572 были описаны ранее, им не придавали значения. Кроме того, такой американский изолят может содержать другие мутации.
2bΔ431 является новым открытым редко встречаемым вариантом CPV2b (например, вариантом 2bΔ494Δ572), в котором кодоном, кодирующим аминокислоту в положении 431 белка VP2, является CTG, а не CTA. Хотя эта замена также не приводит к аминокислотной замене, тем не менее этот вариант вызывает болезнь у вакцинированных животных, и его можно включить в новые составы вакцин. Важно, что вследствие редкой встречаемости 2bΔ431 представляет собой идеальную вакцинную «маркерную» последовательность.
Американский тип 2с (или 2с из Соединенных Штатов) представляет собой первый вариант 2с, выделенный в Соединенных Штатах, и является преобладающим (81%) вариантом 2с. Этот вариант также обозначают как «основной вариант 2с».
2сΔ440 представляет собой новый открытый вариант CPV2c, в котором кодоном, кодирующим аминокислоту в положении 440 белка VP2, является GCA, а не ACA, что приводит к замене треонина (ACA) на аланин (GCA) в этом положении аминокислотной последовательности. Этот вариант вызывает болезнь у вакцинированных животных, и его следует включить в новые составы вакцин. В настоящий момент этот вариант представляет собой минорный (19%) вариант и в настоящем описании обозначается также как «минорный вариант 2с».
2сΔ430Δ440, дополнительный вариант 2сΔ440, который кроме кодона GCA, кодирующего 440 аминокислоту, также отличается от известных последовательностей 2с наличием лейцина в положении 430, кодируемого ТТА, а не обычным кодоном TTG.
Все эти варианты CPV были обнаружены с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и выделены из культуры клеток, полученной от собак, инфицированных CPV, и/или их щенков, которые уже были привиты стандартными коммерческими вакцинами. Таким образом, эти новые возникшие варианты способны уклоняться от воздействия иммунной системы у собак, вакцинированных в соответствии со стандартными протоколами, независимо от того меняется ли вариация (2сΔ440 и 2сΔ430Δ440 частично) или нет (2bΔ494Δ572 и 2bΔ431) в аминокислотной последовательности белка VP2 в указанных положениях. Кроме того, доступные на сегодняшний день в данной области диагностические методики для использования не способны обнаруживать новые варианты CPV или имеют слабую реакцию, что приводит к снижению чувствительности. Настоящее изобретение решает эти проблемы благодаря вакцинам и диагностическим средствам, которые учитывают новые варианты.
Кроме того, изобретение относится к способу размножения парвовируса собак, в частности, описанных в настоящем документе вариантов, которые не вызывают цитопатического эффекта (СРЕ) или вызывают небольшой СРЕ при культивировании только в клетках CRFK. Способ включает стадию культивирования парвовируса собак в смеси клеток почки кошки Крэндол-Риз (CRFK) и клеток Vero в подходящей среде. Стадию культивирования проводят при условиях, которые обеспечивают размножение парвовируса до титра, выше титра, получаемого при культивировании CPV только в клетках CRFK.
Кроме того, изобретение относится к парвовирусной вакцине, содержащей один или несколько вариантов CPV. Степень нейтрализации одного или нескольких вариантов CPV по меньшей мере в 4 раза ниже степени нейтрализации одного или нескольких вариантов CPV, выбранных из группы, состоящей из CPV-2, CPV-2a, CPV-2b и CPV-2c, которые определяют с использованием сыворотки животного, привитого вакциной, содержащей один или несколько вариантов CPV-CPV-2, CPV-2a, CPV-2b и CPV-2c. В некоторых вариантах осуществления изобретения степень нейтрализации определяют методом оценки нейтрализующей способности сыворотки и выражают в виде нейтрализующего титра.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1. Характерная последовательность 2bΔ494Δ572 (последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:1), в которой кодоном в положении 494 является TGC, а кодоном в положении 572 является GTC. Показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая аминокислоты 426-572 белка VP2 (SEQ ID NO:9).
Фиг. 2. Характерная последовательность 2bΔ431 (последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:2), в которой кодоном в положении 431 является CTG. Показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая аминокислоты 426-572 белка VP2 (SEQ ID NO:10).
Фиг. 3. Показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая аминокислоты 426-572 (последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:3) белка VP2 основного американского изолята 2с.
Фиг. 4. Характерная последовательность 2сΔ440 (минорный американский изолят 2с) (последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:4), в которой кодоном в положении 440 является GCA вместо АСА, кодирующий аланин вместо треонина. Показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая аминокислоты 426-572 белка VP2.
Фиг. 5. Характерная последовательность 2сΔ430Δ440 (последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:5).
Фиг. 6. Вероятная вторичная структура, связанная с вариантом 2с (SEQ ID NO:6).
Фиг. 7. Вероятная вторичная структура, связанная с вариантом 2bΔ431 (SEQ ID NO:7).
Фиг. 8. Вероятная вторичная структура, связанная с вариантом 2сΔ430Δ440 (SEQ ID NO:8).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к вакцинам против CPV и диагностическим средствам CPV, композиции которых включают новые открытые варианты, соответствующие эволюционному развитию CPV. Каждый из этих вариантов был выделен у собаки, вакцинированной против CPV, но которая тем не менее заразилась CPV и заболела. Таким образом, для прекращения или сокращения распространения CPV эти новые варианты можно включить в протоколы вакцинации. Кроме того, ниже подробно описано, что идентификация этих вариантов привела к обнаружению гипервариабельной области в геноме CPV.
Открытие этих вариантов, описанных в настоящем документе, привело к идентификации важной гипервариабельной (HPV) области в геноме CPV. Ранее важными считались только нуклеотиды 1276-1277. Однако описанные в настоящем документе эпидемиологические данные показали, что самая важная HPV-область на самом деле находится в практически середине генома CPV (нуклеотиды 1275-1326 в полном гене VP2). Эта область HPV охватывает по меньшей мере два важнейших гипервариабельных кодона - кодоны 426 и 440 в гене VP2. Предпочтительно, гипервариабельная область включает область, начинающуюся за один нуклеотид до кодона 426-440, включительно. Не опираясь на какую-либо теорию, вероятно, что биологическая значимость этой HPV-области связана с термодинамической стабильностью структур, образуемых последовательностью, как подробно описано ниже.
Ниже перечислены соответствующие варианты:
1) 2bΔ494Δ572 представляет собой вариант CPV2b, в котором кодон в положении 494 белка VP2 является TGC, а не TGT, а кодоном в положении 572 белка VP2 является GTC, а не GTA. Ни одна из этих замен не приводит к аминокислотным заменам (Cys в положении 494 и Val в положении 572), и эти последовательности были описаны ранее. Тем не менее ранее не было описано, что такие замены позволяют вирусу уклоняться от распознавания иммунной системой хозяев, вакцинированных доступными на сегодняшний день вакцинами, описанными в настоящем документе. Этот вариант представлен на фиг. 1, где показана часть гена VP2 из 2b (т.е. 426=GAT), кодирующая аминокислоты 426-572. Два мутантных кодона (494 и 572) выделены полужирным шрифтом и подчеркнуты.
2) 2bΔ431 является редко встречаемым вариантом CPV2b, который содержит замену CTA на CTG в кодоне, кодирующим аминокислоту в положении 431. Исходный изолят 2bΔ431 также включает мутации 2bΔ494Δ572 и, следовательно, представляет собой 2bΔ431Δ494Δ572. Однако изобретение включает любую последовательность CPV (2a, 2b или 2c), включающую CTG в кодоне, кодирующем аминокислоту в положении 431 белка VP2. Эта мутация не приводит к аминокислотной замене (CTA и CTG оба кодируют Leu), но благодаря своей редкой встречаемости 2bΔ431 представляет собой идеальную вакцинную «маркерную» последовательность для судебных задач. Этот аспект изобретения подробно описан ниже. Этот вариант представлен на фиг. 2, где показана часть гена VP2 из 2b (т.е. 426=GAT), кодирующая аминокислоты 426-572. Три мутантных кодона (431, 494 и 572) выделены полужирным шрифтом и подчеркнуты.
3) Американский 2с представляет собой первый вариант 2с, выделенный в Соединенных Штатах. Знаменательное появление этого варианта ранее было недооценено (см. фиг. 3).
4) 2сΔ440 является вариантом CPV2с, в котором кодоном в положении 440 белка VP2 является GCA, а не ACA. Эта мутация приводит к аминокислотной замене Thr на Ala в положении 440. Кроме того, этот мутант также был выделен из ранее вакцинированной собаки, которая тем не менее заболела CPV. Поэтому эту вариантную последовательность следует включить в новую вакцину против CPV, а также в диагностические препараты. Этот вариант представлен на фиг. 4, где показана часть гена VP2 из 2с (т.е. 426=GAА), кодирующая аминокислоты 426-572. Мутантный кодон (440) выделен полужирным шрифтом и подчеркнут. Кодоны 494 и 572 подчеркнуты для сравнения.
5) 2сΔ430Δ440, дополнительный вариант 2сΔ440, который кроме GCA в кодоне в положении 440 также отличается от известных последовательностей 2с наличием лейцина в положении 430, кодируемым ТТА, а не обычным ТТG. Этот вариант представлен на фиг. 5.
В таблице 1 представлено общее описание замен в последовательностях указанных вариантов.
Таблица 1
Кодоны, связанные с важнейшими аминокислотами белка VP2 вариантах CPV, обнаруженных в США на сегодняшний день
Вариант
Положение аминокислоты и ассоциированный кодон
426
430
431
440
494
572
2bΔ494Δ572
GAT
TTG
CTA
ACA
TGC*
GTC*
2bΔ431Δ494Δ572
GAT
TTG
CTG*
ACA
TGC*
GTC*
Американский 2с«Основнойамериканский 2с»
GAA
TTG
CAT
ACA
TGT
GTA
2сΔ440«Минорныйамериканский 2с»
GAA
TTG
CAT
GCA*
TGT
GTA
2сΔ430Δ440
GAA
TTA*
CAT
GCA*
TGT
GTA
* указывает мутантный кодон
Хотя замены в положении 494 и 572 были описаны ранее, преобладание и характеристики этого варианта ранее недооценивались. Все описанные в настоящем документе варианты были выделены у собак (или их потомства), которые уже были вакцинированы против CPV, но которые заболели CPV или умерли от него. Хотя варианты впервые были идентифицированы в южно-центральном регионе Соединенных Штатов, полагают, что они отвечают также за спорадические случаи резистентной к вакцинам парвовирусной инфекции у собак в других частях США. Вариант 2с, ранее детектируемый на всех континентах, за исключением Австралии и Африки, на сегодняшний момент зарегистрирован в 14 штатах (в Алабаме, Аризоне, Арканзасе, Калифорнии, Делавэре, Флориде, Иллинойсе, Канзасе, Нью-Джерси, Миссури, Орегоне, Оклахоме, Южной Каролине и Техасе). Учитывая историю быстрого распространения известных ранее вариантов CPV, один или несколько из этих вариантов следует немедленно включить в вакцины для использования во всем мире для прекращения распространения этих наиболее актуальных вариантов вируса. Кроме того, следует изменить состав диагностических тестов и способов для CPV с учетом этих возникающих вариантов.
Как описано в разделе “Примеры”, начало болезни и смерть вакцинированных собак, у которых были выделены варианты CPV по настоящему изобретению, были стремительными, что указывало на присутствие сильных «ускользающих» мутантов, которых не сдерживает иммунный ответ на типы CPV, включенные в текущие вакцины. Это справедливо не только для 2сΔ440, который вызывает изменения в первичной последовательности белка VP, но также и для 2сΔ431, 2bΔ494Δ572, которые не содержат аминокислотных замен в исследуемых областях. Важности изменений в кодонах 2bΔ494Δ572 до сих пор не придавали значения, и, насколько известно авторам изобретения, до сегодняшнего момента не поступало предложений об изменении композиций вакцин против CPV и диагностических средств для включения или для учета этих возникающих вариантов, как описано в настоящем документе. Кроме того, 2сΔ440 и 2bΔ431 представляют собой новых мутантов, которые ранее не были описаны.
Эти вариации, по-видимому, дают вирусу преимущество в выживании. Не опираясь на какую-либо теорию возможно, что мутантные последовательности обеспечивают преимущество вириону или самой ДНК на какой-либо из стадий жизненного цикла вируса (например, обуславливают защиту против нуклеаз хозяина; более быструю или более эффективную транскрипцию и/или трансляцию, что может, например, приводить к различным схемам сворачивания белков; более быструю или более эффективную упаковку в вирусные частицы, и т.д.). Например, мутантные последовательности могут обеспечивать преимущество относительно термодинамики разворачивания цепи при репликации ДНК-полимеразой ДНК CPV. На фиг. 6-8 представлены вторичные (свернутые) структуры гипервариабельной области CPV2c, CPV2bΔ431 и CPV2cΔ430Δ440 соответственно, дополнительно описанные в примере 3.
В одном из вариантов осуществления изобретения эффективный возникающий вариант CPV, такой как CPV2cΔ430Δ440, можно использовать в качестве инфицирующего вируса для оценки качества коммерческих препаратов вакцин в экспериментальных условиях. Более ранние версии CPV2a и CPV2b не являются высоко патогенными для собак, а новый CPV2c еще не исследован. Из-за отсутствия высоковирулентной инфицирующей модели до сих пор у компаний, производящих вакцины, не было возможности качественной оценки способности препаратов вакцин обеспечивать защиту у вакцинированных животных. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способам проведения такой оценки путем контактирования вакцинированных животных с высоковирулентным вариантом CPV2cΔ430Δ440 и оценки того, защищает или нет вакцина от заболевания.
Для каждого из вариантов, описанных в настоящем документе, изобретение охватывает препараты вакцин и диагностические средства, которые включают один или несколько вариантов и способов, в которых они используются. Предпочтительно, такие препараты и диагностические средства включают либо 2cΔ440, либо 2bΔ431, либо оба эти варианта. Такие препараты и диагностические средства могут дополнительно включать 2bΔ494Δ572 и/или американский 2с, и/или другие известные последовательности CPV, такие как последовательности, которые уже введены в текущие вакцины. Кроме того, для введения в новую вакцину могут подходить (или нет) другие недавно выделенные вирусы с новыми последовательностями, в частности с новыми аминокислотными последовательностями. В целом решение о включении нового изолята данного вируса основывается на способности существующих вакцин вызывать нейтрализующий ответ к данному изоляту у вакцинированного животного, и, частично, от преобладания варианта. Если новый вариант распространен повсеместно, необходимо определить его антигенную значимость. Одним из способов является антигенное расстояние. Общее антигенное расстояние конкретного изолята CPV можно определить тестированием изолята с использованием функционального метода анализа, такого как определение нейтрализующего титра сыворотки, и/или реакция гемагглютинации, и/или тестирование методом непрямой иммунофлуоресценции. Если в одном или нескольких анализах изолят слабо нейтрализуется по сравнению с вирусными вариантами, которые уже присутствуют в вакцине (т.е. если степень нейтрализации нового гетерологичного изолята больше чем в 4 раза ниже степени нейтрализации вариантов, уже присутствующих в вакцине), то тогда разработка новой вакцины, включающей новый изолят, обоснована. Например, при выделении нового варианта CPV можно рассчитать общее антигенное расстояние с помощью определения нейтрализующего титра сыворотки и представить результаты в виде нейтрализующего титра. Нейтрализующим титром является величина, обратная наибольшему разведению сыворотки из вакцинированного животного, при котором происходит полная нейтрализация, о чем свидетельствует отсутствие цитопатического эффекта (СРЕ) или наличия вируса. Если сыворотка собак, вакцинированных существующей вакциной против CPV дает, например, нейтрализующий титр (НТ) 1:4000 с гомологичным вирусом и титр 1:200 с новым гетерологичным изолятом CPV, то тогда новый изолят следует включить в CPV-вакцину. Другими словами, если существующая на сегодняшний день вакцина не защищает от часто встречаемого, повсеместно распространенного варианта, который не присутствует в текущей вакцине, тогда вариант (с осторожностью) можно включать в новый препарат вакцины. Если изолят локализован в небольшом географическом пространстве, то тогда больше подходит специальная или аутогенная вакцина, а не коммерческая вакцина, разработанная для широкого применения. Результаты также должны быть подтверждены в экспериментах по защите от инфицирования. В экспериментах по защите от инфицирования животных вакцинируют, а затем вводят умеренные дозы (например, 10000 TCID 50, т.е. среднюю тканевую инфицирующую дозу) варианта, используемого в качестве инфицирующего вируса. Если вакцина обеспечивает защиту против интересующего варианта, тогда вариант не нужно включать в композиции вакцин. Однако если вакцинированное животное не защищено от варианта, то вариант можно включать в препараты вакцин. Кроме того, в процессе вакцинации, не все штаммы или варианты нужно включать в одну инъекцию. Может быть предпочтительно, например, введение щенку вакцины, которая содержит один вариант в возрасте 3 недель, в возрасте 7 недель - вакцину, которая содержит другой вариант, а в возрасте 10 недель - вакцину, которая содержит третий вариант. Этот способ отличается от общепринятой практики, когда одинаковые варианты вводят щенкам при всех вакцинациях. Существующая методика имеет изъян, связанный с тем, что существующий иммунитет, полученный в результате более ранней вакцинации может нейтрализовать CPV, вводимые при более поздних вакцинациях, обесценивая пользу повторных вакцинаций. Примечательно, что хорошо известно о том, что некоторые вирусные патогены могут инфицировать множество видов. В случае CPV известно, что вирусы кошек и норок могут также инфицировать собак. Хотя включение таких вирусов в вакцину против CPV собак не рекомендуется, эти вирусы кошек и норок следует включать в эксперименты по инфицированию на вакцинированных животных.
В частности, вариант 2bΔ431 подходит для получения вакцин судебной оценки и обнаружения. Как описано выше, у существующих на настоящий день вакцин снижается способность защищать вакцинированных животных от возникающих CPV. Владельцы животных, заболевших после вакцинации, обычно связывают это с самой вакциной. Поскольку с помощью существующих способов диагностики нельзя адекватно отличить вакцинные штаммы и проявляющиеся штаммы, то производители вакцин практически лишены защиты против таких обвинений и часто решают такие иски путем выплаты компенсаций владельцам животных. Это приводит к большим расходам производителей вакцин. Кроме того, близость кодона 431 к кодону 426 и его расположение в гипервариабельной области генома CPV также позволяет проводить лишь ограниченное секвенирование для подтверждения источника CPV, вызвавшего болезнь у собаки. Этого можно избежать, включая мутацию 2bΔ431 в один или несколько вакцинных штаммов, используемых в составе вакцины. Распространенность 2bΔ431 очень низкая, например, этот вариант составляет примерно 1,2% вариантов, исследованных на сегодняшний день. Таким образом, если при исследовании на CPV тканей умершего животного, вакцинированного вариантом 2bΔ431, обнаруживают любой штамм, отличающийся от 2bΔ431, то можно с уверенностью заключить, что вакцина не вызвала заболевание, а скорее, причиной являлись другие детектируемые штаммы. Кроме того, мутацию Δ431 легко обнаружить без избыточного секвенирования. Этот тип судебных исследований может значительно сократить расходы компаний-производителей вакцин.
Изобретение относится к препаратам вакцин, которые содержат выделенные последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 и 5 и/или белки, полипептиды или пептиды, кодируемые этими последовательностями, и к способам их применения. Кроме того, изобретение также охватывает вакцины с некоторыми вариациями этих последовательностей. Хотя последовательности представляют одноцепочечную (оц) ДНК, тем не менее изобретение включает соответствующую двухцепочечную (дц) ДНК, комплементарную ДНК и любую форму РНК (например, мРНК, гибриды РНК/ДНК и т.д.), которые основаны на этих последовательностях, получены из них или комплементарны им. Такие последовательности могут быть либо смысловыми, либо антисмысловыми последовательностями. Кроме того, настоящее изобретение также относится к применению в вакцинах последовательностей, которые по меньшей мере на 50%, предпочтительно примерно на 60%, более предпочтительно примерно на 70, 80 или 90%, или даже примерно на 95, 96, 97, 98 или 99% или выше, гомологичны последовательностям SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 и 5. Такие последовательности могут отличаться, например, содержанием альтернативных кодонов, которые кодируют одну и ту же аминокислоту в одном или нескольких положениях. Кроме того, изобретение также относится к частям этих последовательностей, которые кодируют антигенные области белка VP2 CPV, как последовательности, которые на 70% или даже выше, предпочтительно примерно на 80, 90 или 95% или даже выше (например, 96, 97, 98 или 99%), гомологичны таким, аминокислотным последовательностями. Такие последовательности могут различаться, например, содержанием консервативных или неконсервативных аминокислотных замен или делеций (особенно, амино- или карбоксиконцевых делеций), или различными вставками и т.д., при условии что полученный белок/пептид является антигенным, как описано в настоящем документе. Предпочтительно, длина таких антигенных областей по меньшей мере составляет примерно 10 аминокислот и они включают одно или несколько из положений 426, 431, 440, 494, 555 и 572 белка VP. Однако антигенная область может охватывать весь ген VP2.
Кроме того, изобретение также относится к последовательностям нуклеиновой кислоты, которые гибридизуются в жестких условиях (особенно в высоко жестких условиях) с последовательностями, раскрытыми в настоящем описании (или с частями этих последовательностей). Определение “жесткие” относится к условиям гибридизации, которые позволяют гибридизацию последовательности нуклеиновой кислоты с конкретной последовательностью. В общем случае условия “высокой жесткости” относятся к условиям гибридизации, которые обеспечивают гибридизацию последовательности нуклеиновой кислоты, с длиной по меньшей мере 50 нуклеотидов, и, предпочтительно, примерно 200 или больше нуклеотидов с конкретной последовательностью при примерно 65°С в растворе, содержащем 1 М соль, предпочтительно, 6×SSC, или в любом другом растворе, имеющем сопоставимую ионную силу, и отмывку при 65°С в растворе, содержащем примерно 0,1 М соль или меньше, предпочтительно 0,2×SSC, или в любом другом растворе, имеющем сопоставимую ионную силу. Эти условия позволяют обнаруживать последовательности с 90% идентичностью или больше. В целом более слабые условия гибридизации относятся к условиям гибридизации, которые позволяют гибридизацию последовательности нуклеиновой кислоты с длиной по меньшей мере 50 нуклеотидов, и, предпочтительно, примерно 200 или больше нуклеотидов с конкретной последовательностью при примерно 45°С в растворе, содержащим 1 М соль, предпочтительно 6×SSC, или в любом другом растворе, имеющем сопоставимую ионную силу, и отмывку при комнатной температуре в растворе, содержащем примерно 1 М соль или меньше, предпочтительно 6×SSC, или в любом другом растворе, имеющем сопоставимую ионную силу. Эти условия позволяют детектировать последовательности с идентичностью до 50%. Специалист в данной области сможет модифицировать эти условия гибридизации для идентификации последовательностей, идентичность которых изменяется от 50% до 90%.
Escherichia coli
Lactobacillus
Pichia
Изобретение также относится к различным типам рекомбинантных и/или экспрессионных векторов, которые содержат или экспрессируют раскрытые в настоящем описании последовательности нуклеиновой кислоты (или их части, кодирующие антигенные пептиды и/или полипептиды). Примеры таких векторов и экспрессионных систем включают, но ими не ограничиваются: различные бактериальные (например, для экспрессии в ) или пробиотические (например, для экспрессии в ) экспрессионные векторы; аденовирусные векторы, бакуловирусы, системы экспрессии в  и дрожжевые системы экспрессии, и т.д. Такие рекомбинантные векторы и экспрессионные системы можно использовать, например, для получения вакцин или в качестве альтернативы для других целей, таких как лабораторные манипуляции с последовательностями, или для исследовательских или диагностических целей.
Изобретение относится к иммуногенным и/или вакцинным композициям против парвовируса собак. Композиции включают одну или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:1, 2, 3, 4 и 5, или их части, которые кодируют антигенные пептиды или полипептиды (антигенные области), например, части последовательности, включающие один или несколько кодонов в положениях 426, 430, 431, 440, 494, 555 и 572. Предпочтительно, включены по меньшей мере последовательности, содержащие SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4, или SEQ ID NO:5, или их части, кодирующие антигенные области.
Для специалистов в данной области будет понятно, что вакцинные композиции могут изменяться в зависимости от предполагаемого применения. Другими словами, включенные в вакцину конкретные компоненты (варианты) можно изменять в соответствии с любым из нескольких параметров для создания специально разрабатываемого препарата вакцины. Например, вакцины могут быть разработаны для включения только тех вариантов, которые были обнаружены в данном географическом местоположении. Например, вариант 2а больше не детектируется в Соединенных Штатах, и поэтому производители вакцин могут не включать этот вариант в составы вакцин для применения на территории США. Вакцины для США могут содержать, например, только варианты CPV 2c и CPV 2b. В отличие от этого в настоящее время на территории Австралии единственным вариантом CPV является 2а. Поэтому композиция вакцины, разработанная для применения в Австралии, может включать только вариант 2а. Вакцины, рекомендуемые для Европы, могут включать, например, варианты 2c и 2b, в то время как композиция вакцины для Азии может включать 2а и 2b. Все такие привязанные к географическому местоположению вакцины включены в объем настоящего изобретения, и могут со временем изменяться в зависимости от схемы распространения вариантов. Дополнительно для таких привязанных к географическому местоположению вакцин необходимо учитывать то, что модифицированные живые вакцины содержат высокий уровень вакцинного вирусного антигена. Поэтому, если собаку, вакцинированную вариантом, перевозят в место, где этот вариант не существует, предпочтительно прохождение животным карантина в течение по меньшей мере одного месяца перед его контактом с новым окружением. В противном случае вариант может появиться в новом местоположении. Например, собаки, вакцинированные вариантом 2с, должны проходить карантин до въезда, например, в Австралию. Через месяц выделение вируса должно прекратиться. Если даже выделяющийся вирус является ослабленным, то его присутствие может отрицательно влиять на контроль вирусной эпидемиологической обстановки и может обеспечить рекомбинацию нативных вирусов с выделяемым вирусом, что приводит к внесению более вирулентной мутации в локальную популяцию.
4
Кроме того, вакцинные композиции могут быть привязаны к использованию у конкретного хозяина. Например, некоторые породы собак могут быть более восприимчивы к одним вариантам, чем к другим; или к одному или нескольким вариантам могут быть предрасположены животные на определенной стадии развития (например, щенки относительно взрослых животных); или когда другие животные, кроме собак, должны быть вакцинированы (например, дикие животные, животные в зоопарках или в охотничьих угодьях и т.д.), то в таких случаях композиции вакцин могут быть изменены с учетом восприимчивости конкретного животного-хозяина, которое будет вакцинировано. Например, при разработке инфицирующей модели породы Чихуа-хуа и Лабрадор-ретривер, по-видимому, являются более восприимчивыми к CPV. Поэтому примерно 10 высоковирулентного варианта CPV-2c должно быть достаточно, чтобы вызвать диарею и рвоту в контролируемом эксперименте. Все такие хозяин-специфичные или хозяин-селективные вакцины находятся в рамках настоящего изобретения.
В других вариантах осуществления изобретения композиция вакцины может быть изменена в соответствии с локальным окружением вакцинируемого животного. Например, в коммерческих собачьих питомниках на более чем на 100 собак, где высок риск заразных инфекций, может быть предпочтительна вакцинация с использованием относительно дорогих препаратов, содержащих вариант 2bΔ431Δ494Δ572 в комбинации с основным и минорным американскими вариантами CPV 2c. Однако в питомниках меньшего размера (например, в которых содержится меньше 25 собак) или в домах с одной или несколькими собаками, где риск заражения меньше, может быть достаточно вакцинации менее дорогими вакцинами, содержащими или 2bΔ431Δ494Δ572, или 2bΔ494Δ572 вместе с только одним основным американским вариантом 2с. При выборе используемых композиций вакцин следует взвешивать риск заражения животных болезнью относительно стоимости и возможности мониторинга на молекулярной уровне и оценки присутствия вариантов CPV в будущем.
В еще одном аспекте изобретение касается стратегии вакцинации для исключения нарушения материнскими антителами индукции вакциной иммунитета у щенков. Вместо использования одного препарата вакцины у взрослых собак и у щенков, щенков можно вакцинировать сериями вакцин, различающихся антигенами. Другими словами, первичная вакцина щенков может содержать варианты, которые могут отличаться от тех, которые вводят их матери, а последующие ревакцинации щенков будут включать еще один вариант вакцины. Таким образом, постепенно формируется широкий спектр антител. Путь вакцинации можно модифицировать, для того чтобы преодолеть некоторые ограничения при вакцинации, как выделение вируса после иммунизации родителей. Например, применение пероральной вакцинации с использованием безигловой методики обеспечивает иммунитет, но может предупреждать выделение вируса с фекалиями.
В данной области известны несколько способов получения вакцин, подходящих для вакцинации против CPV. См., например, патенты Соединенных Штатов 4193990 и 4193991, авторов Appel et al., патент Соединенных Штатов 4303645, авторов Carmichael et al., патент Соединенных Штатов 4971793, авторов Wood et al., патент Соединенных Штатов 5882652, авторов Valdes et al., и патент Соединенных Штатов 5885585, авторов Parrish et al., в каждом из которых предложены вариации подходящих стратегий получения вакцин. Полное содержание каждого из этих патентов включено в настоящее описание путем ссылки. В целом для получения вакцины используют вирусный вектор, содержащий описанные последовательности нуклеиновой кислоты (например, оцДНК, встречающуюся в природном вирусе, или оцДНК или другую эквивалентную форму, помещенную с помощью методов генной инженерии в неприродный вирусный вектор (например, дцДНК, оц или дцРНК, ДНК/РНК-гибриды и т.д.)). Примеры включают CPV (или другие) вирусы, которые «убиты», инактивированы или каким-либо еще образом ослаблены, так что они не вызывают острых симптомов болезни у животного, которому их вводят, вместе с подходящим физиологическим носителем. Предпочтительно, при введении не возникает никаких симптомов заболевания. Однако для специалистов в данной области ясно, что многие эффективные композиции вакцин вызывают некоторый дискомфорт или относительно небольшое недомогание при введении или после него. Однако польза от получения защиты против резко выраженного заболевания намного перевешивают эту возможность. В качестве альтернативы можно использовать гетеротипный вирус, который в природе не инфицирует вакцинируемое животное или который обычно не вызывает заболевание.
Ослабленным вирусом может быть CPV, который содержит свою природную последовательность нуклеиновой кислоты (последовательности нуклеиновой кислоты), или вирус (CPV или другой вирус) может быть рекомбинантным, в котором последовательность нуклеиновой кислоты встроена в вирус методами генной инженерии. В случае рекомбинантных вакцин для получения гетеротипных рекомбинантных вакцин последовательности нуклеиновой кислоты могут быть встроены в вирусы, отличные от CPV. Примеры таких вирусов включают, но ими не ограничены, FPV, различные герпесвирусы, непатогенные вирусы-«сиротки», желудочно-кишечные вирусы, такие как энтеровирусы, и т.д. В предпочтительном варианте осуществления изобретения вирусом является живой, ослабленный (модифицированный) CPV с высоким титром, а нуклеиновой кислотой является оцДНК.
Предпочтительно, такой препарат также содержит последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие антигенные области других вариантов CPV, например, вариантов 2, 2a, 2b и/или 2c, или любых других вариантов CPV, которые впоследствии могут быть идентифицированы и сочтены полезными. Однако в условиях широкого распространения композиций вакцин, содержащий только варианты 2а и 2b, также может быть полезно получить композиции вакцин, содержащие только один или несколько из раскрытых в настоящем описании вариантов, для использования совместно с вакцинами 2а-2b или в качестве дополнения к их действию. Кроме того, такие вакцины можно вводить вместе с вакцинами против других возбудителей, или в отдельных композициях, или совместно - в одной композиции.
Конкретная форма вакцины может изменяться. В одном из вариантов осуществления изобретения вакцина состоит из ослабленных CPV, которые содержат последовательности нуклеиновой кислоты, раскрытые в настоящем описании. Предпочтительно, вакцина является мультивалентной и также включает ослабленные типы вирусов CPV 2, 2a, 2b и/или 2c. В качестве альтернативы с помощью генной инженерии можно получить единственный вирус, который будет содержать нуклеиновые кислоты, кодирующие белки (например белки VP2 или их антигенные части) из двух или нескольких вариантных типов; т.е. с помощью рекомбинантных методов можно сконструировать рекомбинантные химерные CPV, имеющие геномные области из двух или более областей VP2, посредством обмена областей ДНК из двух или нескольких CPV, как известно опытным специалистам в данной области.
Изобретение также относится к другим формам вакцин. Например, изобретение также относится к вакцинам с «пустыми» частицами вирионов (без нуклеиновой кислоты), а также к вакцинам, содержащим антигенный вирион или другие белки CPV, которые не упакованы в капсид. В этих случаях белки в препарате вакцины кодируются SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:4, или двумя этими последовательностями, или в качестве альтернативы более короткие антигенные области кодируются частями SEQ ID NO:2, и/или SEQ ID NO:4, и/или SEQ ID NO:5. Также можно включить белки, кодируемые SEQ ID NO:1 и/или SEQ ID NO:3, и/или антигенными областями, кодируемыми частями SEQ ID NO:1 и/или SEQ ID NO:3.
Другие подходящие компоненты вакцин, например, фармакологически приемлемые носители, хорошо известны специалистам в данной области, так же, как и получение таких композиций для использования в качестве вакцин. Обычно, такие композиции получают в виде или жидких растворов, или суспензий, хотя также предусмотрены твердые формы, такие как таблетки, пилюли, порошки и т.п. Также можно получить твердые формы, подходящие для растворения или ресуспендирования в жидкости перед введением. Также препарат можно получить в виде эмульсии. Активные ингредиенты можно смешать с наполнителями, которые являются фармацевтически приемлемыми и совместимыми с активными ингредиентами. Подходящими наполнителями являются, например, вода, солевой раствор, декстроза, глицерин, этиловый спирт и т.п. или их комбинации. Дополнительно композиция может содержать минорные количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющие агенты или эмульгаторы, рН-буферные агенты и т.п. Если желательно введение композиции в пероральной форме, то можно добавить различные загустители, ароматизаторы, разбавители, эмульгаторы, диспергирующие агенты или связующие вещества и т.п. Для того чтобы получить композицию в подходящей для введения форме, композиция по настоящему изобретению может содержать любые такие дополнительные ингредиенты. Конечное количество в составах транслируемой нуклеиновой кислоты может варьировать. Однако, в общем, количество будет составлять примерно 1-99%. Композиции могут дополнительно содержать адъювант, подходящие примеры которого включают, но не ограничены, Seppic, Quil A, Alhydrogel и т.д.
Иммуногенные/вакцинные препараты по настоящему изобретению можно вводить любым из множества подходящих способов (которые хорошо известны специалистам в данной области), включая, но ими не ограничиваясь: введение с помощью инъекции, пероральное введение, интраназальное введение, введение посредством приема пищевого продукта, содержащего антиген, и т.д. Однако в предпочтительном варианте осуществления изобретения способом введения является инъекция. Кроме того, композиции можно вводить сами по себе или в комбинации с другими лекарственными препаратами или иммуногенными композициями, например, как часть многокомпонентной вакцины. Кроме того, вакцину можно вводить однократно или можно проводить несколько повторных вакцинаций с различными интервалами для усиления иммунного ответа. В дополнение, вакцину можно вводить для профилактики (т.е. перед заражением вирусом, или если есть подозрение, что заражение произойдет) или постфактум (т.е. после известного или подозреваемого заражения или в терапевтических целях, например, после возникновения симптомов болезни, ассоциированных с вирусной инфекцией).
После введения препарата последовательности нуклеиновой кислоты по изобретению экспрессируются в животном-хозяине, которому ввели вакцину, и у животного-хозяина возникает иммунный ответ на антигенные белки (или их части), кодируемые нуклеиновой кислотой. Предпочтительно, вызываемый иммунный ответ представляет собой защитный иммунный ответ. В некоторых вариантах осуществления изобретения у ослабленного вируса сохраняется способность к репликации в хозяине, хотя это не является жестко необходимым.
Изобретение относится к способам профилактики симптомов инфекции CPV у животных. В общем, вакцины против CPV вводят для обеспечения активного иммунитета у щенков и/или взрослых собак. Способ включает введение млекопитающему иммуногенной и/или вакцинной композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, которая включает последовательность, представленную по меньшей мере одной из последовательности SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4, или SEQ ID NO:5, или их частей, которые кодируют антигенные области VP2, и, предпочтительно, содержащей последовательности, представленные одной или несколькими из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, или их частей, которые кодируют антигенные области VP2. В предпочтительном варианте осуществления изобретения препарат также включает нуклеиновые кислоты, кодирующие клинически значимые варианты CPV, предпочтительно варианты 2а и 2b, и, необязательно, исходный CPV2. Результатом введения композиции является возникновение иммунного ответа у реципиента. Предпочтительно, иммунный ответ защищает от последующих инфекций CPV и либо устраняет симптомы заболевания полностью, либо ослабляет симптомы болезни по сравнению с симптомами, наблюдаемыми в отсутствие вакцинации.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения животные, вакцинацию которых проводят вакцинами по изобретению, являются домашними собаками, как взрослыми собаками, так и щенками. Однако предусмотрена вакцинация других возможных хозяев CPV. Другие хозяева включают других представителей семейства псовых, таких как дикие псовые (например, волки, виды диких собак и т.д.), представителей семейств кошачьих (включая домашних кошек и котят, и крупные виды кошек, одомашненных или диких), норок, красную панду, лис, львов и тигров и т.д. Хотя вакцины будут, несомненно, использоваться у домашних животных, вакцинация с помощью таких вакцин может быть эффективна для диких или частично одомашненных животных, например для животных в зоопарках или закрытых пространствах, парках, в исследовательских центрах и т.д. Вакцинация препаратами вакцин, описанными в настоящем документе, может быть эффективна для любого животного, которое может быть хозяином CPV и вариантов CPV, вне зависимости от того, вызывает ли вирус симптомы заболевания у животного или нет. Вакцинация животных, у которых не проявляются симптомы заражения вирусом (т.е. «молчащие» носители) может быть эффективна для предотвращения распространения вируса в более восприимчивых популяциях.
Изобретение также относится к антителам, которые специфически или селективно связывают антигенные детерминанты или антигенные области белков следующих типов CPV: 2bΔ494Δ572, 2bΔ431, 2cΔ440 или американского варианта 2c. Такие дифференциальные антитела могут быть поликлональными или моноклональными, хотя обычно более предпочтительны моноклональные антитела. Моноклональные антитела получают путем инъекции вариантов (или в виде белков, или в виде нуклеиновых кислот, кодирующих белки) мышам. После 3 ревакцинаций, собирают селезенки и сливают с клетками миеломы. Проводят скрининг продуцирующих моноклональные антитела клонов с помощью ELISA, ингибирования гемагглютинации и тестирования методом непрямой иммунофлуоресценции. Клоны, реагирующие с генотипами 2bΔ494Δ572, 2bΔ431, 2cΔ440 и/или американским 2с, сохраняют для разработки диагностических методов анализа CPV. Поликлональные антитела можно получить инъекцией, например, кроликам одного или нескольких пептидов, содержащих аминокислотные остатки, которые являются предпочтительными антигенными мишенями вариантов 2bΔ494Δ572, 2bΔ431, 2cΔ440 и/или американского 2с.
Изобретение также относится к диагностическим наборам для обнаружения описанных в настоящем документе вариантов CPV и, необязательно, также других вариантов CPV (например, CPV2, 2a и 2b). Такие наборы включают олигонуклеотидные праймеры, специфичные для амплификации (например, полимеразной цепной реакцией) последовательностей нуклеиновой кислоты, раскрытых в настоящем описании. В качестве альтернативы такие наборы могут включать антитела (например, моноклональные или поликлональные), которые селективно или специфично связываются с уникальными антигенными детерминантами, представляемыми этими вариантами, и, необязательно, также другими вариантами CPV (например, CPV2, 2a и 2b).
in vitro
В дополнительном аспекте изобретение касается нового способа культивирования CPV . Способ включает культивирование вируса в смешанной культуре (1) клеток, которые, как известно, восприимчивы к инфекции CPV, и (2) клеток Vero в подходящей среде. В предпочтительном варианте осуществления изобретения клетками, восприимчивыми к инфекции CPV, являются клетки CRFK. Однако также можно использовать другие типы таких клеток, включая, но не ограничиваясь: клетки А72 (фиброма собак); клетки, полученные из клеток CRFK, например клетки почки кошки, полученные в лаборатории Нордиск (NLFK); клетки языка кошки, такие как клетки Fe3Tg; клетки легких кошки, такие как клетки AK-D; клеточные линии лимфомы кошек, такие как 3201; Т-клеточные линии собак, такие как СТ45-S; линии эпителиальных клеток тимуса собак, такие как Cf2Th, и т.д. Более того, разнообразные линии клеток кошек и собак, а также инструкции по их культивированию, можно получить от Американской Коллекции Типовых Культур в Манассасе, Вирджиния.
Деление этих клеток можно проводить совместно с клетками Vero в различных средах, известных специалисту в данной области. Например, клетки CT 45-S можно культивировать в среде RPMI 1640; клетки AK-D, Fe2lu и Cf2Ths можно культивировать в минимальной необходимой среде Дульбекко (MEM) с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS); для клеток 3201, NLFK, CRFL, A72 и Fc3Tg используют среды McCoy's 5A и Leibowitz L15 с 5% FCS. Обычно клеточные линии инкубируют совместно в течение 4-5 дней при 37°С.
ПРИМЕРЫ
Введение
Парвовирусная (CPV) инфекция собак является наиболее серьезным и распространенным заболеванием у собак и наиболее часто встречающейся причиной диареи у щенков. Хотя вакцины против CPV доступны и широко применяются, недавно были зарегистрированы несколько вспышек CPV у вакцинированных собак. Например, владельцы питомников в центрально-южном районе США наблюдали высокий уровень смертности у щенков вследствие инфекции CPV несмотря на вакцинацию.
CPV представляет собой одноцепочечный ДНК-вирус, мутирующий с высокой скоростью и обладающий способностью менять круг хозяев и тропизм. Доступные на сегодняшний день коммерческие вакцины обычно содержат только варианты CPV2, CPV2a и CPV2b. В ходе проведенного авторами анализа образцов от вакцинированных против CPV собак с явными симптомами парвовирусной инфекции, заявители наблюдали функциональные изменения в детекции CPV существующими диагностическими тестами на CPV и неспособность существующих диагностических наборов детектировать данный вирус, что указывало на возможную эволюцию CPV за пределы подтипов 2а и 2b. Дальнейшие исследования привели к идентификации двух вариантов CPV, а именно - 2bΔ494Δ572 и американского 2с. Изоляты ассоциировались с усиленной вирулентностью и более широким тканевым тропизмом по сравнению с наблюдаемыми до сегодняшнего момента у культивируемых изолятов CPV. Кроме того, судя по всему новые изоляты CPV вызывают желтую слизистую диарею вместо геморрагической диареи, вызываемой генотипами CPV-2 в прошлом. В соответствии с другими данными у варианта 2bΔ494Δ572 присутствуют две замены кодонов. Американский вариант 2с ранее детектировался в Италии, Испании и Вьетнаме, но в США до этого не обнаруживался.
Материалы и методы
В диагностической лаборатории болезней животных штата Оклахома получали образцы фекалий с помощью почтовой службы Federal Express на льду (примерно 4-5°С). Как минимум получали 2-5 г фекалий или 2-5 мл жидкого диарейного стула. Образцы фекалий обычно тестировали на CPV в тот же день с помощью коммерческого набора (наборов) для твердофазного иммуносорбентного анализа (ELISA). Для проведения иммунофлуоресцентных анализов (FAT) или иммуногистохимических анализов (IHC) заявители получали петли кишечника (примерно 2-3 кусочка) из различных областей кишечника. Иногда заявители получали кусочки языка для проверки на CPV с помощью FAT, IHC или полимеразной цепной реакции (ПЦР). Эти образцы получали охлажденными на льду с помощью Federal Express. Во многих случаях CPV имелась история отрицательных результатов тестирования на CPV с помощью «полевых» диагностических наборов (Assure, Synbiotics, CA; или IDEXX, Bar Harbor, Maine).
Гистопатологические исследования проводили на кишечнике щенков и взрослых собак с историей болезни, совместимой с инфекцией CPV. История включала кровавую или слизистую диарею и смерть. Свежие и фиксированные в формалине ткани кишечника исследовались на наличие язв, соответствующих CPV: расширение и некроз крипт и потеря кишечных ворсинок.
Для скрининга кишечника на присутствие CPV-антигена использовали иммунофлуоресцентный анализ (FAT). Кишечные срезы толщиной 6-8 микрон фиксировали в ацетоне и высушивали на воздухе. К срезам добавляли антитела к CPV, конъюгированные с FITC, и инкубировали 30 мин при 37°С. После промывания срезы контрастно окрашивали трипановым синим. Срезы исследовали с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии: клетки, имеющие положительное окрашивание на CPV, были яблочно-зеленого цвета, а клетки, не дающие окрашивание на CPV, были кирпично-красного цвета.
Фиксированные в формалине срезы, присланные для гистопатологического анализа, исследовали с помощью иммуногистохимического анализа на присутствие CPV-антигена.
На образцах фекалий и соскобах образцов кишечника, которые давали положительную реакцию на CPV или которые предположительно были инфицированы CPV, проводили ПЦР с последующим секвенированием, как описано у Desario et al., 2005. Часть гена вирусного белка амплифицировали с помощью ПЦР. Амплифицированный продукт ПЦР детектировали с помощью электрофореза в агарозном геле и элюировали из геля для секвенирования.
Последовательности анализировали с помощью программы BLAST, которая сравнивает результаты с обширной коллекцией последовательностей, помещенных в базу данных GenBank. Все последовательности были идентифицированы, как гомологичные парвовирусу собак.
ПРИМЕР 1.
Неэффективность существующих диагностических тестов на CPV.
Анализ образцов фекалий проводили, как описано выше, и все образцы были положительными по стандартным критериям: характерные язвы, определяемые гистопатологическими исследованиями, результаты иммунофлуоресцентного анализа и результаты иммуногистохимического анализа. Тем не менее при тестировании этих же образцов с использованием коммерческих диагностических тестов результаты показали, что для полевой диагностики CPV в этих образцах тесты были недостоверны, так как не были способны детектировать 33-50% положительных случаев CPV.
Большинство этих изолятов CPV были получены из питомников, которые в настоящий момент используют коммерческие вакцины против CPV в соответствии с маркировкой на вакцине, но в которых все еще возникают вспышки CPV и смертность от CPV. Отсутствие защиты весьма вероятно обусловлено антигенной вариацией в недавно появившихся изолятах CPV. Эти эпидемиологические полевые наблюдения за многими случаями CPV (n~500) сигнализируют о необходимости включить эти новые варианты CPV в коммерческие вакцины от CPV.
ПРИМЕР 2.
Определение последовательности нуклеиновой кислоты (секвенирование) изолятов CPV: идентификация варианта 2bΔ494Δ572 и американского изолята CPV2c.
Неэффективность вакцин и диагностических наборов обычно рассматривается как эпидемиологический признак вирусной эволюции. Поэтому в исследуемых образцах предполагали наличие новых вариантов CPV. Для подтверждения проводили ПЦР-секвенирование части вирусного белка VP2 для вирусов, выделенных из образцов фекалий, и сравнивали результаты с известными последовательностями VP2 с использованием компьютерного программного обеспечения и/или ручного выравнивания.
Результаты подтвердили присутствие в образцах двух новых возникших типов CPV: 1) варианта 2b, который был назван 2bΔ494Δ572; и 2) американского 2с, который ранее не детектировался на территории Соединенных Штатов. Последовательности ДНК, кодирующие части белка VP2 этих двух вариантов представлены на фиг. 1 (2bΔ494Δ572, SEQ ID NO:1) и фиг. 3 (американский 2c, SEQ ID NO:3). Сравнение этих последовательностей с известной референсной последовательностью CPV2 выявило, что в 2bΔ494Δ572 произошли изменения в кодонах 494 и 572. Обычным кодоном CPV2 в положении 494 является TGT, а в 2bΔ494Δ572 494-м кодоном является TGC. Аналогично, обычным кодоном в положении 572 в изолятах CPV2 является GTA, а в 2bΔ494Δ572 этим кодоном является GTC. Эти изменения не приводят к заменам в аминокислотной последовательности белка VP2. Однако, вероятно, что изменения придают преимущество варианту 2bΔ494Δ572 на одной или нескольких стадиях жизненного цикла вируса, например в эффективности репликации, транскрипции или трансляции. Замечательно, что присутствие в образцах американского варианта 2с является первым случаем появления этого варианта CPV в Соединенных Штатах и, вероятно, является предвестником его появления в качестве доминирующего варианта. В примерно 50% случаях причиной неэффективности вакцин было присутствие CPV2bΔ494Δ572 и в 50% случаев причину можно было отнести к CPV2c или CPV2cΔ430Δ440.
Эти открытия демонстрируют появление 2bΔ494Δ572 и американского 2с в качестве доминирующих вариантов CPV и сигнализируют о необходимости включения этих вариантов в препараты вакцин от CPV.
Другие варианты были идентифицированы аналогичным образом.
ПРИМЕР 3.
Определение вторичной структуры и связанной энергии вариантов.
Известно, что вирулентность вирусных патогенов связана с вторичными структурными элементами в вирусном геноме (Pellerin et al., 1994. Virology 203: 260-268). Оценку схем связывания гипервариабельных областей вариантов 2с, 2bΔ431 и 2cΔ430Δ440 проводили с использованием программы определения вторичной структуры ДНК «mfold» на веб-сайте, расположенном по адресу mfold.burnet.edu.au во всемирной сети интернет. Результаты показаны на фиг. 6-8, на которых представлены вторичная структура и уровень связанной энергии для каждого варианта. Можно увидеть, что вторичная структура области сохраняется, а уровень энергии для разворачивания цепи может меняться.
ПРИМЕР 4.
Разработка и тестирование новой мультивалентной вакцины против CPV.
Разработана новая мультивалентная вакцина, защищающая от новых появляющихся вариантов CPV. Вакцина включает один или несколько ослабленных вирусов CPV типов CPV2a, 2bΔ494Δ572, 2bΔ431, американский 2c, 2cΔ440 и, необязательно, CPV2. Другими словами, в этой новой вакцине CPV2b замещен 2bΔ494Δ572, вариантом, который недавно был идентифицирован появляющимся в качестве доминирующего генотипа. Присутствие CPV2, который, по-видимому, больше не является угрозой, необязательно.
Животные, вакцинированные мультивалентной вакциной, защищены от развивающихся симптомов парвовирусной инфекции вариантами, используемыми для получения вакцины.
ПРИМЕР 5.
Новый метод размножения CPV на смешанной популяции клеток.
Обычно CPV выращивают в клеточных культурах, содержащих только один тип клеток, таких как линия клеток почки кошки Крэндола (CRFK).
Был разработан улучшенный способ культивирования CPV. В соответствии с новым способом CPV культивируют в смеси равного количества клеток CRFK и Vero в минимальной необходимой среде (МЕМ). Высевают обе клеточные линии, и образцы инокулируют через один час после посева клеток. На этой стадии клетки прикреплены, но все еще находятся на ранних стадиях деления. Новый способ культивирования клеток дает детектируемые цитопатические эффекты более быстро, чем при совместном культивировании CPV только с клетками CRFK. Более того, в смешанной клеточной популяции сохранялся высокий титр продукции CPV на протяжении 3 серийных пассажей.
Хотя описание изобретения основано на предпочтительных вариантах осуществления, для специалистов в данной области будет понятно, что на практике изобретение можно модифицировать, не изменяя сущность заявленного и не выходя за рамки формулы изобретения. Соответственно, настоящее изобретение не следует ограничивать описанными выше вариантами осуществления, оно должно дополнительно включать все его модификации и эквиваленты, входящие в суть и объем приведенного в настоящем документе описания. Все цитируемые в настоящем описании патенты, патентные заявки Соединенных Штатов и другие ссылки включены в настоящее описание путем ссылки.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ