СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕФОРМИРУЕМОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ
METHOD FOR DETERMINING ERYTHROCYTE DEFORMABILITY

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии (гемореологии), и касается способа измерения деформации эритроцитов.
Деформируемость это способность клеток крови изменять свою форму под действием внешних сил. Деформируемость эритроцитов в значительной степени определяет характер микроциркуляции крови, а потому имеет прямое отношение к диагностике и лечению многих заболеваний. При рассмотрении микрореологических параметров в физиологических и патологических условиях в первую очередь оценивается деформируемость эритроцитов. Она в свою очередь определяется: внутренней вязкостью клеток, отношением площадь/объем и мембранными механическими свойствами. Деформируемость эритроцитов является важным фактором, определяющим продолжительность их жизни. Поэтому исследование деформируемости эритроцитов так важно в клинической трансфузиологии.
Особое место занимает метод определения деформируемости эритроцитов, в котором в качестве приложенной нагрузки используется напряжение сдвига, действующее на клетки, движущиеся в сдвиговом потоке. Он относится к "прямым" методам, и обладает рядом преимуществ: бесконтактностью регистрации, физиологичностью силового воздействия. Самым точным из них считается эктацитометр. В нем использован оптический метод регистрации относительного удлинения клетки в искусственном сдвиговом потоке. Проводят видеозапись и обработку дифракционной картины, возникающей при рассеянии лазерного пучка на разбавленной суспензии эритроцитов, деформированных в сдвиговом потоке силами вязкого трения, оцифровку этой дифракционной картины, определение формы линии изоинтенсивности, лежащей в области дифракционной картины.
Этот наиболее распространенный метод измерения деформируемости эритроцитов имеет принципиальный недостаток - все параметры деформируемости, которые возможно получить данным способом, связаны не с непосредственным измерением характеристик самих эритроцитов, а с наблюдением и анализом дифракционных картин, возникающих при рассеянии лазерного пучка на суспензии эритроцитов, деформированных в сдвиговом протоке силами вязкого трения.
Этого недостатка лишен способ определения деформируемости эритроцитов, (AC SU 1377111 А1), включающий помещение их суспензии в зазор между двумя цилиндрами специального прибора, где за счет вращения одного из цилиндров создается напряжение сдвига 190-210 дин/см, при котором деформируются не все эритроциты, через 20 с суспензию вводят 1,0 мл 0,5% ного раствора глютаральдегида, еще через 10 с вращение цилиндра прекращают, а эритроциты помешают в поле зрения светового микроскопа, подсчитывают количество деформированных и недеформированных клеток и при значении процентного содержания деформированных клеток менее 74,5% деформируемость эритроцитов определяют недостаточной.
В этом методе анализируется изображение самих эритроцитов, полученное после их деформации в искусственном сдвиговом потоке, и он принят нами в качестве прототипа.
Однако этот метод имеет ряд существенных недостатков. Во-первых, он весьма субъективен, поскольку объективных критериев отнесения эритроцита к деформированным нет, и каждый исследователь может относить мало деформированный эритроцит или к деформированным, или нет, что снижает точность метода. Во-вторых, он не позволяет судить о деформируемости отдельных эритроцитов, или даже малой группы клеток, относящихся к высоко- или низкодеформируемых эритроцитов, не дает возможности судить о степени неравномерности распределения их по деформируемости, не позволяет оценить конкретные значения числа эритроцитов в каждой отдельной группе, выделенной по степени деформируемости.
Известно, что в крови любого человека разные эритроциты обладают разной способностью к деформации. С этой точки зрения деформируемость следует рассматривать как статистическую характеристику ансамбля эритроцитов и использовать для ее описания такие понятия как среднее значение, дисперсия, функция распределения и т.п. Эти параметры невозможно получить методом прототипа. Предложенный нами способ определения деформируемости эритроцитов лишен указанных недостатков.
Задачей настоящего изобретения является разработка нового способа измерения количественных показателей деформируемости эритроцитов, полученных с использованием устройства для деформации эритроцитов в сдвиговом потоке, путем автоматизированного анализа изображений, используя алгоритмы компьютерного зрения, применимого для образцов крови с произвольным распределением эритроцитов по деформируемости.
Техническим результатом является повышение точности оценки деформируемости эритроцитов, устранение субъективности, получение оценки деформируемости каждого эритроцита.
Технический результат достигается тем, что в способе помещение их суспензии в условия напряжение сдвига 190-210 дин/см, последующую фиксацию, исследование под микроскопом и подсчет количества деформированных и недеформированных клеток, с помощью цифровой камеры получают изображение, которое обрабатывают с применением алгоритмов компьютерного зрения и численных методов, при этом эритроциты, вытянутые в сдвиговом потоке, моделируют как эллипс, рассчитывают для оценки деформируемости каждого эритроцита коэффициент деформируемости - отношение большой оси эллипса к малой оси, коэффициент удлинения - отношение разности большой и малой осей эллипса к их сумме, для изображения в целом рассчитывают среднее значение коэффициента деформируемости, дисперсию, коэффициент асимметрии, распределение эритроцитов по деформируемости, деформируемость эритроцитов в % - как отношение количества эритроцитов, значение коэффициента деформируемости которых больше 1,5 к общему количеству эритроцитов, количество максимально удлиненных клеток в % - отношение числа эритроцитов, коэффициент деформируемости которых больше 4 к общему количеству эритроцитов.
Способ поясняется чертежами, где:
на фиг. 1 - изображен пример изображения, полученного с устройства для деформации эритроцитов в сдвиговом потоке
на фиг. 2 - пример обработки изображения и оценки деформируемости разработанным способом. На изображении красным цветом выделены найденные программой эритроциты. Число, расположенное слева от каждого эритроцита - коэффициент деформируемости данного эритроцита, рассчитанный как отношение большой и малой полуосей эллипса. По полученным значениям коэффициента деформируемости далее рассчитывается среднее значение, дисперсия и строится график функции распределения.
Способ осуществляют следующим образом. В 1,5 мл забуференного физиологического раствора (рН - 7,4) помещают 0,1 мл крови. Полученную суспензию вводят в зазор между двумя цилиндрами специального прибора, где за счет вращения наружного цилиндра создается напряжение сдвига 200 дин/см, при котором деформируются наиболее деформируемые эритроциты. Через 20 с в суспензию через специальное отверстие во внутреннем цилиндре вводят 1,0 мл 0,5%-ного раствора глютаральдегида, еще через 10 с вращение цилиндра прекращают, а эритроциты помещают в поле зрения светового микроскопа.
С помощью цифровой камеры получают изображение, которое обрабатывают с применением алгоритмов компьютерного зрения и численных методов, при этом эритроциты, вытянутые в сдвиговом потоке, моделируют как эллипс, и при оценке деформируемости расчет коэффициента производят по параметрам (полуосям) эллипса.
Сначала выполняют предобработку изображения, включающую применение медианного фильтра для устранения импульсного шума.
Далее выполняют бинаризацию изображения методом Брэдли. При этом изображение разбивают на области со стороной, ширина которой равна 1/8 изображения. Для каждой области вычисляют среднее значение яркости пикселей (Im), и к этому среднему значению прибавляют значение t (10% от среднего значения). Величина Im+t - порог бинаризации данной области. Для скорости обработки используют интегральное изображение (позволяет за один проход вычислить яркость любой группы пикселей изображения).
К полученному изображению применяют морфологические операции: морфологическое закрытие - с целью заполнить разрывы между частями объектов, морфологическое открытие - с целью удаления очень мелких объектов, которые точно не являются эритроцитами.
Затем выделяют объекты, полученные в результате бинаризации. При этом сначала выделяют связные области (связной областью считается такая область изображения, в которой у каждого пикселя имеется минимум один сосед, принадлежащий данному множеству). Затем выполняют поиск контуров связных областей.
На следующем этапе обработки выполняют аппроксимацию каждого объекта эллипсом (при аппроксимации объекта эллипсом множество точек (xi, yi) контура объекта подставляется в уравнение эллипса, в результате чего получается система уравнений, где количество уравнений больше, чем количество неизвестных. Решая систему уравнений методом наименьших квадратов, находим наилучший эллипс, покрывающий набор точек контура рассматриваемого объекта.)
Определив для каждого объекта его контуры и аппроксимирующий его эллипс, проверяют, являются ли найденные объекты эритроцитами. Для этого ограничивают исходный объект выпуклым многоугольником и находят отношение площади эллипса (для данного объекта) к площади многоугольника. Если отношение площадей отличается от единицы меньше чем на 5% - считают, что объект является эритроцитом. Для построения выпуклого многоугольника используют метод построения минимальных выпуклых оболочек Грэхема. При этом выполняют обход контура против часовой стрелки, и отбрасывают точки, в которых выполняется правый поворот.
Поскольку на изображении есть/могут быть цветовые неоднородности внутри объектов интереса, убирают из рассмотрения мелкие объекты, которые находятся внутри других объектов.
По имеющимся данным рассчитывают показатели, для оценки деформируемости каждого эритроцита: коэффициент деформируемости - отношение большой оси эллипса к малой оси, коэффициент удлинения - отношение разности большой и малой осей эллипса к их сумме.
Используя полученную информацию о значениях коэффициента деформируемости каждого эритроцита, для изображения в целом рассчитывают: среднее значение коэффициента деформируемости, дисперсию, коэффициент асимметрии, распределение эритроцитов по деформируемости (диапазон возможных значений коэффициента деформируемости [1, 10] делят на интервалы с шагом 0,5, рассчитывают распределение эритроцитов по интервалам значений деформируемости в %, строят гистограмму распределения). Также рассчитывают деформируемость эритроцитов в % - как отношение количества эритроцитов, значение коэффициента деформируемости которых больше 1,5 к общему количеству эритроцитов; количество максимально удлиненных клеток в % - отношение числа эритроцитов, коэффициент деформируемости которых больше 4 к общему количеству эритроцитов.
Работоспособность способа проверена в экспериментах с образцами крови здорового человека и больного в острый период ожоговой болезни. Особенностью способа является возможность автоматизированного распознавания эритроцитов на изображении (или множестве изображений), расчет коэффициента деформируемости для каждого эритроцита в пуле (а не только усредненных показателей или показателей, характеризующих пул в целом), расчет статистических показателей.
Способ дает возможность оценить распределение эритроцитов по деформируемости и дает дополнительную диагностическую и научную информацию.
Пример 1.
Донор. Возраст - 27 лет.
Пример 2. Больной А. Возраст 2 года 9 месяцев, ожог 1-3 ст. площадью 45% поверхности тела. Определение деформируемости по предложенному способу.
Распределение эритроцитов по коэффициенту деформируемости
Таким образом, у данного больного отмечено значительное ухудшение всех параметров деформируемости эритроцитов в период ожоговой токсемии. Наиболее значимыми является снижение количества наиболее вытянутых (деформированных) эритроцитов, что отражается и на коэффициентах деформируемости и удлинении, а также на числе максимально вытянутых эритроцитов. Это нельзя оценить в способе прототипа. Важное значение имеют данные, полученные и при выписке больного. Удается выяснить, что в данном случае даже при выписке больного остаются значимыми данные о сниженной деформируемости эритроцитов даже после проведенного лечения, при полностью закрытых ожоговых ранах. Прежде всего это характеризуют коэффициенты деформируемости и удлинения эритроцитов. Нарушенная деформируемость эритроцитов при выписке может являться причиной анемии, нарушения микроциркуляции, а отсюда - сохранения органной недостаточности. В то же время отмечается некоторое улучшение деформируемости эритроцитов при выписке больного, о чем свидетельствуют практически все исследованные ее показатели, кроме числа максимально деформированных эритроцитов. Хотя разница этого показателя до и после лечения крайне незначительна.
Таким образом, предложенный способ позволяет не только избежать субъективности при оценке количества вытянутых (деформированных) клеток, но и провести анализ количественных характеристик деформируемости, что позволяет значительно повысить точность метода и получить дополнительную информацию процесса деформируемости красных клеток крови. Это имеет не только важное практическое значение, позволяет оценить особенности патогенеза заболевания, эффективность лечения, но и имеет важное научное значение. Конечной целью познания ключевых универсальных механизмов повреждения мембран, которую характеризует деформируемость эритроцитов, может явиться разработка патогенетически обоснованной стратегии восстановления функциональных свойств клеток при патологии.