СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОКАЗАНИЯ К ПРОВЕДЕНИЮ ПРОФИЛАКТИЧЕСКОЙ ПРИВИВКИ ПРОТИВ ДИФТЕРИИ
METHOD FOR DETERMINING INDICATIONS FOR DIPHTHERIA PROPHYLACTIC IMMUNISATION

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для отбора контингента лиц, которым показано проведение профилактической прививки против дифтерии: вакцинации или ревакцинации.
Несмотря на резкое снижение заболеваемости дифтерией в последнее десятилетие, циркуляция возбудителя сохранилась как среди привитого, так и не привитого населения (Маркина С.С., Максимова Н.М., Черкасова В.В., Кошкина Н.А. Эпидемиологическая ситуация по дифтерии // Вакцинация. - 2006. - №1. - С.7-9; Харсеева Г.Г., Москаленко Е.П., Трухачев А.П., Митрофанова Т.В. Патогенные свойства C.diphtheriae, циркулирующих в г.Ростове-на-Дону и Ростовской области в межэпидемический период // Журн. микробиол. - 2006. - №6. - С.6-9).
В межэпидемическом периоде особенно важно своевременное проведение вакцинации и ревакцинации, так как дифтерией могут заболевать и привитые ранее, но утратившие специфический иммунитет (Костюкова Н.Н. Уроки дифтерии. // Журн. микробиол. - 1999. - №2. С.92-96; Максимова Н.М., Маркина С.С., Кошкина Н.А. Характеристика антитоксического противодифтерийного иммунитета в различных возрастных группах населения России в последние годы. // Вакцинация. - 2006. - №1. - С.10-11; Кощеева Ю.В., Харит С.М. Вакцинация детей с ревматическими заболеваниями против дифтерии // Российский медицинский журнал. - 2003. - №1. - С.40-43).
В настоящее время вакцинация против дифтерии проводится согласно национальному календарю прививок по возрасту, который рассчитан на вакцинацию практически здоровых людей. У людей с хронической патологией ввиду обострения основного заболевания могут удлиняться сроки между прививками, что может привести к недостаточной эффективности вакцинации против дифтерии, а также возможно развитию побочных реакций на прививку. Таким образом, для определения показаний к проведению профилактической прививки против дифтерии необходим индивидуальный подход. Поэтому актуальным является разработка новых способов определения показаний к проведению профилактической прививки против дифтерии.
Проведенными исследованиями по патентной и научно-медицинской литературе найдены различные способы определения показания к проведению профилактической прививки против дифтерии.
Так, в патенте №2197730 (БИМП №3, 2003 г.) описан способ оценки состояния иммунитета к дифтерии. Полученные данные служат для определения показания к проведению профилактической прививки против дифтерии. Способ заключается в том, что в биологической жидкости - смешанной нестимулированной слюне - пациента определяют индекс уровня антител к корд-фактору как отношение величины оптической плотности (ОП) слюны пациента к ОП отрицательного контроля слюны, сравнивают с отношением величины ОП контроля слюны - слюна реконвалесцента к ОП отрицательного контроля слюны и делают вывод о необходимости проведения профилактической прививки против дифтерии.
Недостатком данного метода является недостаточная точность определения показаний к проведению профилактической прививки против дифтерии, так как учитывается только одна из составляющих противодифтерийного иммунитета, а именно только местный антибактериальный иммунитет.
В статье Магаршака О.О., Костинова М.П., Сергеевой Т.В., Карпочева С.В. Опыт вакцинации детей с заболеваниями почек // Вакцинация. - 1999. - №6. - С.13-15, описан способ определения показания к проведению профилактической прививки против дифтерии. Для этого предварительно проводят определение содержания противодифтерийных антитоксических антител в реакции пассивной гемагглютинации. При значениях титров антител менее 1:160 проведение вакцинации считают показанной.
Недостатком данного метода является недостаточная точность, так как для определения показаний к проведению профилактической прививки против дифтерии учитывается только одна из составляющих иммунитета к дифтерии - антитоксический иммунитет, а, как известно, заболевать дифтерией могут и люди, имеющие высокие уровни антитоксических антител.
Наиболее близким техническим решением, принятым за прототип, является способ определения показаний к проведению профилактической прививки против дифтерии, описанный в Санитарно-эпидемиологических правилах СП 3.1.2.1108-02 «Профилактика дифтерии» (утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 20 февраля 2002 года). Он заключается в том, что для определения показаний к проведению профилактических прививок против дифтерии исследуют сыворотку венозной крови обследуемого, в которой определяют уровень дифтерийных антитоксических антител. Если титр дифтерийных антитоксических антител у детей составляет 1:20 и более, то считают, что ребенку показано проведение профилактической прививки против дифтерии согласно календарю прививок. В том случае, если титр дифтерийных антитоксических антител менее 1:20, то ребенку показана вакцинация против дифтерии, его прививают и через 1-1,5 месяца вновь проверяют состояние иммунитета. Если титр дифтерийных антитоксических антител не превышает 1:80, то первую прививку считают началом иммунизации и дальнейшее введение вакцины проводят по календарю. У взрослых проведения профилактической прививки против дифтерии показано при уровне антитоксических антител менее 1:20, их прививают и через 1-1,5 месяца проверяют состояние иммунного ответа. Если уровень дифтерийных антитоксических антител не превышает титр 1:80, то показано проведение второй прививки и через 6-9 месяца ревакцинации.
Недостатками данного метода являются недостаточная точность и достоверность, так как определение показания к проведению профилактической прививки против дифтерии определяется на основании оценки только уровня антитоксического иммунитета и не учитывается антибактериальный противодифтерийный иммунитет, а также возникновение поствакцинальных реакций и осложнений.
Целью настоящего изобретения является повышение достоверность оценки показания к проведению профилактической прививки против дифтерии и снижение частоты поствакцинальных реакций и осложнений.
о
к
о
к
о
к
о
к
о
к
о
к
ДА
ДА
ДДА
ДДА
ДДА
ДДА
ДА
ДА
ДА
ДА
ДДА
ДДА
Указанная цель достигается тем, что в дополнение к исследованию сыворотки венозной крови обследуемого исследуют слюну, а также контрольный образец сыворотки венозной крови и контрольный образец слюны. В сыворотке венозной крови обследуемого и контрольном образце сыворотке венозной крови определяют уровни специфических IgG к дифтерийному анатоксину, соответственно IgG  и IgG . В слюне обследуемого и контрольном образце слюны определяют уровни специфических секреторных IgA к дифтерийному диализатному антигену, соответственно sIgA  и sIgA . Полученные значения sIgA  и sIgA  сравнивают между собой, полученные значения IgG  и IgG  также сравнивают между собой. При выполнении условий IgG ≤IgG  и sIgA ≤sIgA  проведение профилактической прививки против дифтерии считают показанной.
Наиболее восприимчивы к дифтерии лица, имеющие низкий уровень антитоксических противодифтерийных антител в крови и дефекты местного антибактериального иммунитета, являющегося первой линией защиты от возбудителя дифтерии (Борисова И.Э., Батаева С.Е., Шабалина С.В. Эпидемиологическая ситуация по дифтерии на современном этапе. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2008. - №5. - С.15-21; Шмелева Е.А., Вартанян Р.В., Алешкин В.А. с соавт. Перспективы использования препарата из коринебактерий для профилактики и лечения респираторных инфекций // Вестник РАМН. - 2008. - №3. - С.12-15).
В настоящее время уровень антитоксических противодифтерийных антител считают основным фактором невосприимчивости населения к дифтерии (Костюкова Н.Н. Уроки дифтерии // ЖМЭИ. - 1999. - №2. - С.92-96). Реакция пассивной гемагглютинации, которая наиболее часто используется для определения антитоксических противодифтерийных антител, позволяет выявлять совокупность специфических антител разных классов. Однако основную роль в защите против дифтерии играют специфические противодифтерийные IgG к дифтерийному анатоксину, постоянный ресинтез которых в организме человека обеспечивает длительный гуморальный иммунитет.
Воздушно-капельный путь передачи дифтерийной инфекции определяет попадание возбудителя на слизистую оболочку верхних дыхательных путей, в результате чего формируется специфический местный иммунитет, создающий барьер, способный дополнять системный иммунитет и увеличивать вероятность защиты (Карамов Э.В., Гарманова А.В., Хаитов P.M. Мукозный иммунитет и его особенности//Иммунология. - 2008. - №6. - С.377-384). Важнейшим показателем интенсивности местного иммунитета является определение уровня специфических IgA в секретах (Ляшенко В.А. Мукозный иммунитет и мукозные вакцины //Медицинская иммунология. - 2003. - Т.5. - №1-2. - С.5-10; Vancikova Z. Mucosal immunity - basic principles, ontogeny, cystic fibrosis and mucosal vaccination //Immune, endocrine and metabolic disorders. - 2002. - №2. - P.83-95). Молекулы секреторного IgA могут связывать микроорганизмы, находящиеся как на поверхности эпителия, так и внутри эпителиальных клеток. Оптимальное количество sIgA в секретах устанавливается к 2-4 годам (Стефани Д.В., Вельтищев Ю.Е. Иммунология и иммунопатология детского возраста. - М. - 1996. - С.83-84). Токсигенные и нетоксигенные штаммы C.diphtheriae имеют между собой глубокие различия в антигенном строении и в иммунитете против дифтерии играют роль только антитела к бактериальным антигенам, выделенным из токсигенных штаммов C.diphtheriae (Костюкова Н.Н. Возбудитель дифтерии и условно-патогенные коринебактерии // Клин. лаб. диагност. - 2001. - №6. - С.25-31).
Таким образом, для определения показания к проведению профилактической прививки против дифтерии необходимо учитывать не только уровни специфических антитоксических противодифтерийных IgG в сыворотке венозной крови, но и уровни специфических противодифтерийных антибактериальных секреторных IgA в слюне.
Материалом для исследования служат: сыворотка венозной крови обследуемого и контрольный образец сыворотки венозной крови, а также слюна обследуемого и контрольный образец слюны.
Контрольный образец сыворотки венозной крови представляет собой пул сывороток людей, никогда не болевших дифтерией и не привитых против дифтерии. Контрольный образец слюны представляет собой пул слюны детей до 3 лет.
Предлагаемый способ определения показания к проведению профилактической прививки против дифтерии осуществляется следующим образом.
о
к
о
к
ДА
ДА
ДДА
ДДА
У обследуемого кровь отбирают из вены в объеме 3,0-5,0 мл с соблюдением обычных правил асептики. Слюну в количестве 1-2 мл берут натощак после тщательного полоскания полости рта кипяченой водой, помещают в чистую сухую пробирку и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 20 мин. Супернатант отделяют и используют для исследования. В сыворотке венозной крови обследуемого и контрольном образце сыворотки венозной крови определяют уровень специфических IgG к дифтерийному анатоксину, соответственно IgG  и IgG . Дифтерийный анатоксин (ДА) представляет собой коммерческий препарат производства НПО «Биомед» г.Пермь. В слюне обследуемого и контрольном образце слюны определяют уровень специфических секреторных IgA к дифтерийному диализатному антигену, соответственно sIgA  и sIgA . Дифтерийный диализатный антиген (ДДА) получен по методике Е.П.Москаленко с соавт. (патент РФ на изобретение №2188666, БИМП №25, 2002 г.). ДДА представляет собой липополисахаридо-полипептидный комплекс, в состав которого входят элементы поверхностных структур и пептидогликана клеточных стенок токсигенных C.diphtheriae.
о
к
ДА
ДА
1. Уровни IgG  и IgG  определяют в иммуноферментном анализе (ИФА) с использованием пула сывороток венозной крови реконвалесцентов дифтерии по следующей методике:
- внесение в лунки полистиролового планшета по 100 микролитров (мкл) ДА в концентрации 10-15 мкг/мл;
- инкубация 18 час при t=(37±1)°C;
- промывание рабочим буферным раствором;
- внесение по 100 мкл в лунки пула сывороток венозной крови реконвалесцентов дифтерии, контрольного образца сыворотки венозной крови и исследуемой сыворотки венозной крови в разведении 1:100;
- инкубация 1 час при температуре (37±1)°С;
- промывание рабочим буферным раствором;
- внесение во все лунки по 100 мкл забуференного раствора конъюгата к IgG;
- инкубация 1 час при температуре (37±1)°С;
- промывание рабочим буферным раствором;
- внесение во все лунки по 100 мкл раствора тетраметилбензидина (ТМБ);
- инкубация 15-20 мин при температуре (22±4)°С;
- внесение во все лунки по 50 мкл стоп-реагента;
- регистрация результатов реакции проводится фотометрически при длине волны 450 нм с помощью мультискана или ридера.
о
к
ДА
ДА
Уровни IgG  и IgG  определяют в единицах оптической плотности (ОП).
о
к
ДДА
ДДА
2. Уровни sIgA  и sIgA  определяют в ИФА с использованием пула слюны реконвалесцентов дифтерии по следующей методике:
- внесение в лунки полистиролового планшета по 100 мкл ДДА в концентрации 10-15 мкг/мл
- инкубация 18 час при температуре (37±1)°С;
- промывание рабочим буферным раствором;
- внесение по 100 мкл в лунки пула слюны реконвалесцентов дифтерии, контрольного образца слюны и исследуемой слюны в разведении 1:10;
- инкубация 1 час при температуре (37±1)°С;
- промывание рабочим буферным раствором;
- внесение во все лунки по 100 мкл рабочего раствора конъюгата к sIgA;
- инкубация 1 час при температуре (37±1)°С;
- промывание рабочим буферным раствором;
- внесение во все лунки по 100 мкл раствора ТМБ;
- инкубация 15-20 мин при температуре (22±4)°С;
- внесение во все лунки по 50 мкл стоп-реагента;
- регистрация результатов реакции проводится фотометрически при длине волны 450 нм с помощью мультискана или ридера.
о
к
ДДА
ДДА
Уровни sIgA  и sIgA  определяют в единицах ОП.
о
к
о
к
о
к
о
к
ДДА
ДДА
ДА
ДА
ДА
ДА
ДДА
ДДА
Полученные значения sIgA  и sIgA  сравнивают между собой, полученные значения IgG  и IgG  также сравнивают между собой. При выполнении условий IgG ≤IgG  и sIgA ≤sIgA  проведение профилактической прививки против дифтерии считают показанной.
Практическая реализуемость предлагаемого способа определения показания к проведению профилактической прививки против дифтерии подтверждена примером из клинической практики.
Пример.
Для определения показания к проведению профилактической прививки против дифтерии в условиях муниципального лечебно-профилактического учреждения здравоохранения «Консультативно-диагностический центр» г.Ростова-на-Дону с согласия родителей был обследован ребенок О.И. 8 лет, ревакцинированный АКДС-вакциной 6 лет назад. Ребенку было проведено исследование согласно заявленному способу.
о
к
о
к
ДА
ДА
ДДА
ДДА
Кровь отобрали из вены в объеме 5,0 мл с соблюдением обычных правил асептики. Слюну в количестве 2 мл взяли натощак после тщательного полоскания полости рта кипяченой водой, поместили в чистую сухую пробирку и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 20 мин. Супернатант отделили и использовали для исследования. В сыворотке венозной крови обследуемого и контрольном образце сыворотки венозной крови определили уровни IgG  и IgG  соответственно. В слюне обследуемого и контрольном образце слюны определили уровни sIgA  и sIgA  соответственно.
о
к
ДА
ДА
1. Уровни IgG  и IgG  определили в ИФА по следующей методике:
- внесли в лунки полистиролового планшета по 100 мкл ДА в концентрации 10-15 мкг/мл;
- инкубировали 18 час при t=(37±1)°C;
- промыли рабочим буферным раствором;
- внесли в лунки по 100 мкл пула сывороток венозной крови реконвалесцентов дифтерии, контрольного образца сыворотки венозной крови и сыворотки венозной крови обследуемого О.И. в разведении 1:100;
- инкубировали 1 час при температуре (37±1)°С;
- промыли рабочим буферным раствором;
- внесли во все лунки по 100 мкл забуференного раствора конъюгата IgG;
- инкубировали 1 час при температуре (37±1)°С;
- промыли рабочим буферным раствором;
- внесли во все лунки по 100 мкл раствора ТМБ;
- инкубировали 15-20 мин при температуре (22±4)°С;
- внесли во все лунки по 50 мкл стоп-реагента;
- регистрацию результатов реакции провели фотометрически при длине волны 450 нм с помощью мультискана фирмы «Labsystem».
о
к
ДА
ДА
Уровни IgG  и IgG  определили в единицах ОП.
Были получены следующие результаты: пул сывороток венозной крови реконвалесцентов дифтерии =1,500;
о
ДА
IgG =0,066;
к
ДА
IgG =0,069.
о
к
ДДА
ДДА
2. Уровни sIgA  и sIgA  определили в ИФА по следующей методике:
- внесли в лунки полистиролового планшета по 100 мкл ДДА в концентрации 10-15 мкг/мл;
- инкубировали 18 час при температуре (37±1)°С;
- промыли рабочим буферным раствором;
- внесли по 100 мкл в лунки пула слюны реконвалесцентов дифтерии, контрольного образца слюны и слюны обследуемого О.И. в разведении 1:10;
- инкубировали 1 час при температуре (37±1)°С;
- промыли рабочим буферным раствором;
- внесли во все лунки по 100 мкл рабочего раствора конъюгата к sIgA;
- инкубировали 1 час при температуре (37±1)°С;
- промыли рабочим буферным раствором;
- внесли во все лунки по 100 мкл раствора ТМБ;
- инкубировали 15-20 мин при температуре (22±4)°С;
- внесли во все лунки по 50 мкл стоп-реагента;
- регистрацию результатов реакции провели фотометрически при длине волны 450 нм с помощью мультискана фирмы «Labsystem».
о
к
ДДА
ДДА
Уровни sIgA  и sIgA  определили в единицах ОП.
Были получены следующие результаты: пул слюны реконвалесцентов дифтерии =2,250;
о
ДДА
sIgA =0,267;
к
ДДА
sIgA =0,278.
о
к
о
к
о
к
о
к
ДДА
ДДА
ДА
ДА
ДА
ДА
ДА
ДА
Полученные значения sIgA  и sIgA  сравнили между собой, полученные значения IgG  и IgG  также сравнили между собой. Поскольку IgG =0,066<IgG =0,069 и IgG =0,267<IgG =0,278, проведение профилактической прививки против дифтерии согласно заявленному способу посчитали показанной.
Обследуемому О.И. была сделана прививка против дифтерии. Наблюдение в поствакцинальном периоде показало достоверность заявленного способа - ребенок не заболел, не было поствакцинальных реакций и осложнений.
С помощью предлагаемого технического решения на базе муниципального лечебно-профилактического учреждения здравоохранения «Консультативно-диагностический центр» г.Ростова-на-Дону было проведено обследование пятидесяти человек. Одиннадцати из них было показано проведение и была сделана профилактическая прививка против дифтерии. Результаты наблюдения в поствакцинальном периоде этих одиннадцати детей подтвердили высокую достоверность заявленного способа, у всех привитых сформировался напряженный противодифтерийный иммунитет, ни один из детей не заболел дифтерией и ни у одного из них не было зарегистрировано поствакцинальных реакций и осложнений.
На базе муниципального лечебно-профилактического учреждения здравоохранения «Консультативно-диагностический центр» г.Ростова-на-Дону был проведен ретроспективный анализ результатов вакцинации 115 детей. Вакцинация их проводилась согласно способу, заявленному в прототипе. Результаты наблюдения, проведенного в поствакцинальном периоде, показали, что у шести привитых были зарегистрированы поствакцинальные реакции и осложнения, такие как выраженная местная реакция, отек Квинке, обострение дисбактериоза кишечника.
Таким образом, по сравнению с прототипом предлагаемый способ определения показания к проведению профилактической прививки против дифтерии позволяет более достоверно определить показание к проведению профилактической прививки против дифтерии, снизить частоту поствакцинальных реакций и осложнений и имеет выраженный клинический и социально-экономический эффект.