СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ TLR 2, TLR 3, TLR 4 У БОЛЬНЫХ КОЛОРЕКТАЛЬНЫМ РАКОМ В ПОСЛЕОПЕРАЦИОННОМ ПЕРИОДЕ
METHOD OF POSTOPERATIVE TLR 2, TLR 3, TLR 4 DETECTION IN PATIENTS SUFFERING COLORECTAL CANCER

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, патологической анатомии, и может быть использовано для прогнозирования воспалительных осложнений после операции по поводу колоректального рака.
Толл-подобные рецепторы активируются различными лигандами, которые являются структурными компонентами бактерий, вирусов и грибков. Например, толл-подобный рецептор 4 типа узнает и связывается со структурой клеточной стенки грамотрицательных бактерий- липополисахаридом, а толл-подобный рецептор 2 типа связывается с гликолипидами и липопротеинами стенки грамположительных бактерий, толл-подобный рецептор 3 типа связывается с компонентом вирусной стенки. Рецепторы локализуются на клеточной мембране и играют ключевую роль во врожденном иммунитете.
Известен способ прогнозирования воспалительных осложнений, основанный на выявлении TLR-4 путем иммуногистохимического исследования [Cammarota R, Bertolini V, Pennesi G et al. The tumor microenvironment ofcolorectal cancer: stromal TLR-4 expression a potential prognostic marker. J Transi Med. 2010 Nov 8; 8:112].
Недостатками способа являются: 1) сложность получения материала для исследования (рецепторы определяются в перитуморозных тканях) -инвазивность процедуры; 2) длительность подготовки препарата для исследования, не менее 2-х суток, так как используются гистологические срезы, а в этом случае рецепторы - антигены - оказываются менее доступными для взаимодействия с моноклональными антителами.
Известен способ прогнозирования воспалительных осложнений, основанный на выявлении TLR-4 путем иммунофлюоресцентого исследования, при котором TLR рецепторы определяются на моноцитах периферической крови [Оnо S, Tsujimoto H, Hiraki S. et al. Preoperative Toll-like receptor expression in monocytes is associated with host immunological responses following gastrointestinal surgery. World J Surg. 2011 Feb; 35(2):365-71].
К недостатку данного способа относят отсутствие точной локализации воспалительного процесса, так как положительная реакция на TLR говорит о том, что это может быть как интраабдоминальная инфекция, так и пневмония.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является возможность прогнозирования воспалительных осложнений в зоне оперативного вмешательства после операции по поводу колоректального рака.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе прогнозирования воспалительных осложнений после операции по поводу колоректального рака, согласно изобретению на 3-5 сутки после операции проводят иммуноцитохимическое исследование с целью выявления TLR2, TLR3, TLR4 на лейкоцитах в перитонеальном выпоте; при этом, исследование выполняют иммуноцитохимическим методом с разведением антител к данным рецепторам - 1/200 и инкубацией в течение 12 часов в холодильной камере при температуре +4-+8°С, и в случае выявления позитивной реакции на TLR2 и/или TLR 3 и/или TLR 4 прогнозируют воспалительные осложнения в зоне оперативного вмешательства, а в случае негативной реакции - отсутствие данных осложнений.
Проведенные исследования показали, что из 17 больных с положительными TLR 2, 4 у 8 больных развились осложнения (1 перитонит, 6 нагноений послеоперационной раны, у одного пациента - нагноение послеоперационной раны и пневмония). У 8 пациентов TLR 2, 3, 4 не были обнаружены.
Всего было обследовано 25 пациентов после операции по поводу колоректального рака.
При положительной реакции - вероятность развития гнойно-воспалительных осложнений составляет 47%.
При отрицательной реакции - вероятность развития гнойно-воспалительных осложнений составляет 0%.
Способ осуществляют следующим образом.
Перитонеальный выпот собирают на 3-е - 5-е сутки послеоперационного периода, в зависимости от времени нахождения дренажа в брюшной полости, что в свою очередь зависит от его функциональной активности. К полученным 20-40 мл жидкости добавляется равное количество раствора Хенкса (глюкозо-солевой раствор для хранения и транспортировки клеток) и доставляется в лабораторию. В случае отсутствия выпота выполняется смыв с брюшины раствором Хенкса в количестве 40 мл.
Выпотные жидкости центрифугируют с образованием осадка, который в дальнейшем обрабатывают на цитоцентрифуге Cytospin 4 при среднем ускорении, 800 оборотах в минуту в течение 4-х минут. Для приготовления одного цито-препарата используют 200 мкл осадка, который вносится при помощи микропипетки Biohit до 1000 мкл в собранную пробирку Cytophanel (состоящей из цитоклипа, cytophanel, белого фильтра Cytospin и предметного стекла толщиной 1 мм со шлифованным полем для записи). Полученные цито-препараты высушивают и окрашивают по стандартной методике Романовского и гематоксилин-эозином.
Окрашенный препарат подвергают микроскопическому исследованию. Врач-цитолог оценивает цитологическую картину, клеточную концентрацию, после чего выбирается нужное количество осадка для образования одного мазка при помощи Cytospin 4. Цитологический препарат фиксируются в холодном ацетоне в течение 10 минут и обрабатывается раствором для ингибирования эндогенной пероксидазы в течение 5 минут. После промывки трис-буфере осуществляется инкубация первых антител к TLR2 (abeam, клон ab9100, разведение 1:200), TLR3 (abeam, клон abl3915, разведение 1:200), TLR4 (abeam, клон ab47093-100, разведение 1:200) в течение ночи в условиях холодильной камеры (+4-+8°С). Выявление реакции осуществляется при помощи системы визуализации EnVision в течение 30 минут, в качестве хромогена используется диаминобензидин. Окрашенный препарат оценивается врачом-цитологом. Оценивается мембранная и цитоплазматическая реакция.
Оценивают процент позитивных лейкоцитов, положительной считается реакция, если количество окрашенных лейкоцитов более 10%. В данном случае у пациента прогнозируют развитие воспалительных осложнений.
Сущность способа подтверждается следующими клиническими примерами.
Пример 1. Больная А. 51 года, поступила с диагнозом: рак прямой кишки. В перитонеальной жидкости на 5-е сутки после операции определили положительную реакцию на TLR 4. На 8-е сутки послеоперационного периода у пациентки обнаружилось обширное нагноение послеоперационной раны.
Пример 2. Больная Э. 54 лет, поступила с диагнозом: рак прямой кишки. На 5-е сутки послеоперационного периода в выпоте из брюшной полости определили положительную реакцию на TLR 2 и TLR 4. В последующем у пациентки возникло обширное нагноение послеоперационной раны.
Пример 3. Больной Т. 64 лет, поступил с диагнозом: рак прямой кишки. На 3-е сутки после низкой передней резекции прямой кишки в выпоте из брюшной полости реакция на TLR 2, 3, 4 была отрицательная. На 5-е сутки дренаж из брюшной полости был удален и дальнейший послеоперационный период протекал без воспалительных осложнений.
Пример 4. Больная П. 65 лет, поступила с диагнозом: рак прямой кишки. На 3-е сутки после видеоассистированной передней резекции прямой кишки в выпоте из брюшной полости реакция на TLR 2, 3, 4 была отрицательная. В послеоперационном периоде воспалительных осложнений не было отмечено.
Предлагаемый способ позволяет прогнозировать развитие воспалительных осложнений в зоне оперативного вмешательства. Способ обладает простотой, доступностью, информативностью и надежностью.