СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИЛОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ МИКРОФЛОРЫ В КИШЕЧНИКЕ ПТИЦЫ
METHOD OF POULTRY INTESTINE EXAMINATION FOR AMYLOLYTIC ENZYME MICROFLORA ACTIVITY

Изобретение относится к физиологическим исследованиям пищеварения у животных, в частности к методам определения активности ферментов микрофлоры толстого кишечника у птицы.
Известна сравнительная оценка сахарифицирующего и декстрирующего методов при определении активности амилазы крови у здоровых и больных острым панкреатитом (см. Мерина-Глускина В.М. Лабораторное дело. №3. М.: Медицина, 1965, с.142. Уголев A.M. Приспособление пищеварительных желез к качеству пищи. Дисс. Док. М., 1958. Уголев A.M., Чулкова Т.М. Бюл. Экспер. Биол., 1961. №9, с.45).
2
4
2
4
2
4
2
4
По известной методике для приготовления буферного раствора (рН 7,15-7,2) к 11,876 г NaHPO добавляют дистиллированную воду, доводя объем до 1 литра. Кроме того, к 9,078 г KHPO добавляют дистиллированной воды также до 1 литра. Перед исследованием готовят рабочий буферный раствор из 3 частей раствора KHPO и 7 частей NaHPO.
В 5 мл 5% раствора NaCl, находящегося в центрифужной пробирке, добавляют 1 мл крови, взятой из пальца. Центрифугирование проводят в течение 7-10 минут при 2000 оборотов в мин. К 2 мл 0.15% раствору крахмала добавляют 2 мл буферного раствора и 1 мл центрифугата. Смесь подвергают инкубации в водяной бане при 38°С в течение 60 минут. Затем для прекращения реакции наливают 2 мл НС1, 8 мл дистиллированной воды и по 0,5 мл разведенного йодного реактива. Для контроля берут те же реактивы, но вместо центрифугата (плазма) добавляют 1 мл дистиллированной воды.
Б - оптическая плотность исследуемого раствора;
В - количество субстрата, мг;
(см. Тараканов Б.В., Долгов И.А., Николичева Т.А. Определение амилазной активности крахмалгидролизующих микроорганизмов фотометрическим методом. Методические указания. Изучение микрофлоры преджелудков у жвачных. Боровск, 1977, с.40-41).
Недостатком известных технических решений является сложность проведения исследований, ограниченность применения и использование большого количества компонентов.
Задачей заявляемого предложения является расширение технологических возможностей и упрощение процесса исследования.
3
Поставленная задача достигается тем, что в способе определения амилолитической активности ферментов микрофлоры кишечника птицы, включающем отбор проб из слепых отростков толстого кишечника птицы в количестве не более 1 г, добавление не более 9 мл дистиллированной воды и перемешивание, полученную смесь центрифугируют в течение 3 мин при 4000 об/мин, затем по 1 мл центрифугата и по 2 мл буфера, содержащего 0,8-0,9 г NaCl и 0,3-0,4 г NaHCO, а также не более 2-х мл 0,15% раствора крахмала и не более 8 мл дистиллированной воды добавляют в контрольную и опытную пробирки, в контрольную пробирку сразу доливают соляную кислоту в количестве не более 2 мл для прекращения реакции, а опытную пробирку подвергают инкубированию при температуре 41-42°С в течение 35 мин, после инкубирования в опытную пробирку добавляют такое же количество соляной кислоты, как и в контрольную пробирку, растворы колориметрируют, определяют оптическую плотность исследуемого и контрольного растворов и рассчитывают количество расщепленного крахмала в процентах, по значению которого оценивают амилолитическую активность.
Новизна заявляемого предложения обусловлена тем, что по сравнению с известными техническими решениями в способе определения амилолитической активности значительно упрощается и сокращается процесс определения ферментов микрофлоры толстого кишечника за счет исключения фильтрации, отделения жидкости и сокращения количества используемых компонентов.
Способ определения амилолитической активности ферментов микрофлоры в кишечнике птицы осуществляется следующим образом.
Предварительно пробу отбирают из слепых отростков толстого кишечника в количестве не более 1 г, так как содержимое слепых отростков незначительно и содержит наибольшее количество микрофлоры, вырабатывающей амилолитические ферменты, затем добавляют не более 9 мл дистиллированной воды, перемешивают, центрифугируют в течение 3 мин при 4000 оборотах в мин, затем по 1 мл центрифугата и по 2 мл буфера добавляют в опытные и контрольные пробирки. Также в пробирки добавляют по 2 мл 0,15% раствор крахмала и по 8 мл дистиллированной воды.
3
Для приготовления буферного раствора с рН 7-8 к 100 мл дистиллированной воды добавляют 0,9 г NaCl и 0,3 г NaHCO. Количество химических препаратов определялось экспериментально при получении требуемого рН.
Приготовленная смесь в опытных пробирках подвергалась инкубированию на водяной бане при температуре 41°С, в течение 35 минут. Температура 41°С соответствует температуре тела птицы. Контрольные пробирки не инкубируют, в них сразу добавляют соляную кислоту в количестве не более 2 мл, достаточном для прекращения реакции гидролизации крахмала. Затем растворы колориметрируют, определяют оптическую плотность исследуемого и контрольного растворов и рассчитывают количество расщепленного крахмала в процентах, по значению которого оценивают амилолитическую активность.
Пример конкретного осуществления способа определения амилолитической активности ферментов микрофлоры в кишечнике птицы.
Растворы калориметрируют в фотоэлектрокалориметре при красном светофильтре против дистиллированной воды, в кюветах с 5 мм между рабочими гранями. И полученные результаты сравнивают с показателями контроля, принимаемого за 100. Расчет производится в процентах расщепления крахмала.
Например:
0,75 - 100%
0,25-х;
х=25:0,75=33,3% - крахмала осталось негидролизированным в пробе.
100-33,3=66,7%.
Наиболее близким техническим решением является способ определения амилолитической активности рубцового содержимого, в котором готовят
фосфатный буфер, состоящий из 2-х растворов:
раствор 1 - натрий фосфорнокислый двухзамещенный 11,876 г/л;
раствор 2 - калий фосфорнокислый однозамещенный 9.078 г/л.
Перед опытом готовят рабочий буферный раствор из 7 частей раствора 1 и 3-х частей раствора 2, затем готовят субстрат 0,4%-ный раствор растворимого крахмала на фосфатном буфере (рН - 7,1)
К 20 мл 0,4%-ного раствора крахмала на фосфатном буфере (39°С) добавляют 1 мл рубцовой жидкости и инкубируют при 39°С в течение 30 мин. Затем для прекращения реакции добавляют 0,5 мл 1 нормального раствора соляной кислоты и хорошо взбалтывают. Для определения количества расщепленного крахмала 0,2 мл инкубационной смеси переносят в пробирки, доливают 5 мл дистиллированной воды и 0,5 мл раствора йода, смешивают и калориметрируют при длине волны 620 ммк. Полученные результаты сравнивают с показателями контроля, который ставят с рубцовой жидкостью (1 мл), прокипяченной для инактивации фермента и 20 мл 0,4%-ного раствора крахмала. Расчет расщепленного крахмала производят по формуле:
(А-Б)×В:А = количество расщепленного крахмала (мг), где
А - оптическая плотность контрольного раствора.
Для проведения лабораторных исследований использованы следующие реактивы:
1) Для приготовления 0,15% раствора крахмала к 0,15 г растворимого крахмала добавляют дистиллированную воду в количестве 50 мл, доводят до кипения и доливают до 100 мл дистиллированную воду. Раствор готовят за день до исследований с целью отстаивания.
3
2) Для приготовления буферного раствора (рН 7-8) к 100 мл дистиллированной воды добавляют 0,9 г NaCl и 0,3 г NaHCO.
3) Для приготовления йодного реактива, необходимого для определения оптической плотности, 0,3 г кристаллического йода и 3 г йодистого калия растворяют в дистиллированной воде и доливают до 100 мл. Из этого раствора готовят рабочий раствор, доливая к 2 мл его 6 мл дистиллированной воды.
4) Соляная кислота 5% (5 мл HCl до 100 мл дистиллированной водой).
Ход анализа.
В пробирки помещают по 1 г содержимого слепых отростков толстого кишечника, добавляют до 9 мл дистиллированную воду, перемешивают. Центрифугируют 3 мин при 4000 оборотов в минуту. Для опыта в пробирки вводят 2 мл 0,15% раствор крахмала, добавляют 2 мл буферного раствора и 1 мл центрифугата. Смесь подвергают инкубированию в водяной бане при 41°С в течение 35 мин. Затем для прекращения реакции наливают 2 мл HCl 5%. Для контроля берут те же реактивы, но не инкубируют, а сразу наливают 2 мл HCl 5%. В опыт и контроль наливают 8 мл дистиллированной воды. Непосредственно перед калориметрированием в опыт и контроль наливают рабочий раствор йода по 0,5 мл, перемешивают.
Растворы калориметрируют в фотоэлектрокалориметре при красном светофильтре против дистиллированной воды, в кюветах с 5 мм между рабочими гранями, и полученные результаты, в качестве которых используют оптическую плотность исследуемого раствора, сравнивают с показателями оптической плотности контрольного раствора, которые принимают за 100.
Расчет производится в процентах расщепления крахмала.
Пример расчета:
1-й показатель фотоэлектрокалориметра - оптическая плотность исследуемого раствора - 0,35;
2-й показатель фотоэлектрокалориметра - оптическая плотность контрольного раствора - 0,85.
Согласно пропорции
0,85 - 100%
0,35-х;
х=35:0,85=41,2% - крахмала осталось негидролизированным в пробе, следовательно, гидролизовалось амилазой 100-41,2=58,8%. Полученный процент гидролизованного крахмала указывает на активность ферментов микрофлоры в химусе слепых отростков толстого кишечника.