Действие препарата Панавир на синтез белков вируса простого герпеса 1 и 2 типа в культуре клеток

Є

Действие препарата Панавир на синтез белков вируса простого герпеса 1 и 2 типа в культуре клеток

Р. Р. КЛИМОВА, А. А. КУЩ, Н. Е. ФЕДОРОВА, А. А. ЛИТВИН*

НИИ Вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН, Москва * Национальная Исследовательская Компания, Москва

Effect of Panavir on Herpes simplex Virus Types 1 and 2 Proteins Synthesis in Cell Culture

R. R. KLIMOVA, A. A. KUSHCH, N. E. FEDOROVA, A. A. LITVIN

D. I. Ivanovsky Research Institute of Virology, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow National Research Company, Moscow

Изучено действие препарата Панавир на синтез сверхранних (а), ранних (?) и поздних (у) белков вируса простого герпеса 1 и 2 типа в культуре клеток Vero. Показано, что степень подавления Панавиром экспрессии изученных белков зависит от инфекционной множественности и сроков внесения препарата в заражённую культуру.

Ключевые слова: Панавир, клетки Vero, герпесвирусная инфекция, вирусные белки.

The effect of Panavir on the synthesis of ultraearly (a), early (0) and late (y) proteins of Herpes simplex virus types 1 and 2 in the culture of Vero cells was studied. It was shown that the level of the proteins suppression depended on the infection multiplicity and the time of the Panavir addition to the culture.

Key words: Panavir, Vero cells, herpes virus infection, virus proteins.

Противовирусный и иммуномодулирующий препарат Панавир был разработан в НИИ Физико-химической медицины Росздрава в конце прошлого века, прошёл полный цикл доклинической экспертизы и клинических исследований и нашёл широкое клиническое применение в лечении различных заболеваний вирусной этиологии [1—5]. Действующим веществом препарата является высокомолекулярный полисахарид сложного состава по моносахарам, принадлежащий к классу гексозных гликозидов и выделяемый из проростков клубней картофеля (Solanum tuberosum).

Ранее нами было показано [6], что препарат Панавир обладает относительно низким цито-токсическим и антипролиферативным действием в отношении перевиваемых клеток линии Vero: 50% цитотоксическая доза (ЦД50) составляет 1000 мкг/мл. Также было показано, что Панавир в концентрации 10 мкг/мл обладал ан-тигерпесвирусной активностью, которая выразилась в предотвращении развития вирусспеци-фического цитопатогенного действия (ЦПД), вызванного вирусами простого герпеса 1 и 2 типов (ВПГ-1 и ВПГ-2), при инфицировании

© Коллектив авторов, 2009

Адрес для корреспонденции: 123098 Москва, ул. Гамалеи, 16. Институт вирусологии им. Д. И. Ивановского

клеток с инфекционной множественностью (ИМ) 0,001 БОЕ/мл.

Настоящее исследование посвящено изучению действия этого препарата на синтез вирус -специфических белков.

Материал и методы

Вирусы. В работе были использованы следующие штаммы ВПГ: ВПГ-1 — штамм F, ВПГ-2 — штамм G, любезно предоставленные проф. Л. Перейра (Медицинский Центр Университета г. Сан-Франциско, Калифорния, США).

Клетки. Для анализа анти-ВПГ активности препарата использовали клетки перевиваемой линии Vero, являющиеся высокочувствительными к ВПГ. Клетки Vero культивировали в среде Игла с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, глутамина и гентамицина.

Препарат Панавир. Препарат Панавир был предоставлен в виде лиофилизированного порошка. Разведения препарата, содержащие различные концентрации Панавира, готовили на питательной среде для выращивания клеток без добавления сыворотки.

Действие препарата Панавир на синтез и накопление вирусных белков было изучено с использованием двух схем анализа противовирусного действия: профилактической и вирулицидной.

Все описанные ниже эксперименты выполнены в трёх повторах.

Профилактическая схема. Для определения профилактического противовирусного эффекта препарат Панавир вводили в культуральную жидкость за 24 часа до инфицирования клеток. Использовали следующие концентрации препарата: от 2,5 мкг/мл до 1000 мкг/мл. Клетки инфицировали ВПГ-1 и ВПГ-2 с ИМ от 0,01 БОЕ/мл до 0,00001 БОЕ/мл.

Є

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Таблица 1. Профилактическое действие препарата Панавир на клетки Vero, заражённые ВПГ 1 типа и ВПГ 2 типа

Показатель ВПГ-1 ВПГ-2

множественность инфицирования, БОЕ/мл

0,1 0,01 0,001 0,0001 0,1 0,01 0,001 0,0001

ИД50, мкг/мл* ИД95, мкг/мл ХТИ — — 10 5 — — 10 — — 5 2,5 — — 5 — — 100 200 — — 100 5 2,5 200

Примечание. Химиотерапевтический индекс (ХТИ) вычислялся как отношение ЦД50 к ИД50. ЦД50=1000 мкг/мл. * — концентрация Панавира. Таблица 2. Экспрессия белков ВПГ-1 и ВПГ-2 в клетках Vero в присутствии препарата Панавир

Белки ВПГ ВПГ-1 ВПГ-2

множественность инфицирования, БОЕ/мл

0,001 0,0001 0,001 0,0001 0,001 0,0001 0,001 0,0001

сроки инфицирования, часы

24 48 48 72

Сверхранние (а) Ранние (3) Поздние (у) ++ + +++ +++ + — ++ ++ + +++ +++ + — + — — +++ + — — + + +

Примечание. «+» - менее 10% окрашенных клеток; «++» — менее 50% окрашенных клеток; «+++» - более 50%

окрашенных клеток; «—» - нет окрашенных клеток.

Определение действия на инфекционную активность вируса. Для анализа действия препарата Панавир на инфекционную активность ВПГ-1 и ВПГ-2 препарат вносили в культуру клеток Vero, заражённых ВПГ-1 и ВПГ-2 с ИМ 0,001 БОЕ/кл и 0,0001 БОЕ/кл и культивировали до развития полного ЦПД в контроле (без препарата), которое наблюдалось через 4 дня. Вируссодержащую культуральную жидкость, отобранную на 4-й день, вносили в свежие неинфицированные клетки без добавления препарата Панавир. Об инфекционной активности вируса в опытных и контрольных образцах судили по развитию ЦПД.

Влияние препарата Панавир на синтез белков ВПГ в ви-рулицидной схеме. Для оценки влияния препарата Панавир на синтез белков ВПГ, клетки Vero, выращенные на покровных стёклах, заражали ВПГ-1 и ВПГ-2 с ИМ 0,001 и 0,0001 БОЕ/кл. Препарат Панавир в концентрации 10 мкг/мл вносили в момент заражения. Клетки, инфицированные ВПГ-1, фиксировали через 24 и 48 часов. Ранее было показано, что развитие инфекционного процесса, вызванного ВПГ-2, происходит медленнее, чем вызванного ВПГ-1 (данные не приведены). В связи с этим клетки, инфицированные ВПГ-2, фиксировали через 48 и 72 часа. Фиксированные препараты клеток окрашивали моноклональными антителами (МКА) к сверхранним, ранним и поздним белкам ВПГ методом непрямой иммунофлуоресценции (нИФ). В качестве антивидового конъюгата использовали кроличьи антитела, меченные ФИТЦ.

Результаты и обсуждение

Изучение профилактического действия препарата показало, что при концентрации 5,0 мкг/мл препарат Панавир подавлял развитие ЦПД как ВПГ-1, так и ВПГ-2 с ИМ 0,001 БОЕ/кл на 90%, а при концентрации 10 мкг/мл — на 50% (табл. 1).

При использовании заражения клеток ВПГ 1 и 2 типа с ИМ 0,0001 БОЕ/мл было показано, что препарат Панавир вызывает 50% подавление инфекционной активности вируса при концентрации 2,5 мкг/мл.

Изучение продукции инфекционно активного вируса в динамике показало, что под действи-

ем панавира происходит торможение развития вирусспецифического ЦПД на 2—3 суток.

Результаты анализа экспрессии вирусных белков в клетках Vero, обработанных препаратом Панавир в момент заражения, представлены в табл. 2. Было показано, что через 24 и 48 часов после инфицирования клеток ВПГ-1 с ИМ 0,001 БОЕ/мл препарат Панавир не влиял на экспрессию 3-х исследованных белков, характеризующих “С 3“

сверхраннюю, раннюю и позднюю стадии вирусной инфекции. В то же время после заражения ВПГ-1 с ИМ 0,0001 БОЕ/мл синтез позднего белка gB ВПГ через 48 часов был подавлен, о чем свидетельствует незначительное количество клеток, содержавших этот белок, не превышающее 10% от всех клеток популяции. Для сравнения: при ИМ 0,001 БОЕ/Кл количество клеток, содержавших поздний белок, составляло более 50%.

Изучение белков ВПГ-2 в клетках, зараженных с ИМ 0,001 БОЕ/Кл, не выявило действия Панавира через 48 и 72 час после заражения. При внесении ВПГ-2 в концентрации 0,0001 БОЕ/мл действие препарата Панавир на сверхранний и ранний белки не было обнаружено, тогда как синтез позднего белка был полностью подавлен.

Этот эффект был установлен через 72 часа после заражения.

Выводы

1. Препарат Панавир полностью подавляет экспрессию поздних белков ВПГ 1 через 24 часа после заражения с ИМ 0,001—0,0001 БОЕ/мл.

2. Препарат Панавир полностью подавляет экспрессию поздних белков ВПГ 2 через 48 часов после заражения с ИМ 0,001 БОЕ/мл и через 72 часа после заражения с ИМ 0,0001 БОЕ/мл.

Є

3. Препарат Панавир полностью подавляет экспрессию всех изученных (сверхран-них-а, ранних-в и поздних-у) белков ВПГ 2 типа через 48 часов после заражения с ИМ 0,0001 БОЕ/мл.

4. Химиотерапевтический индекс для препарата Панавир, рассчитанный как отношение ЦД50/ИД50, в условиях наших опытов равен 100—200 для ВПГ 1 и 2 типа в профилактической схеме исследований.

ЛИТЕРАТУРА

1. Лепехин А. В., Ратников Л. И., Литвин А. А. и др. Опыт применения 4. Панавира в терапии клещевого энцефалита. Инфекционные болезни, 2007; 1: 41—46.

2. Кузовкова Т. В., Герасимова Н. М., Кунгуров Н. В. Опыт примене- 5. ния препарата панавир при лечении больных генитальной герпесвирусной инфекцией. Вест последипломного мед образ 2004;

3—4: 76—78. 6.

3. Мелехова Н. Ю, Иванян А. М., Осадчев В. Б., Подзолкова Н. М. и др. Лечение цитомегаловирусной инфекции. Вопросы гинекол акушерства перинатол 2006; 3: 5: 56—59.

Сергеева И. Г., Криницына Ю. М., Феоктистова Е. А., Емельянова О. О. Опоясывающий лишай: возрастные особенности и варианты терапии. Клин дерматол венерол 2005; 4: 57—58.

Кунгуров Н. В., Герасимова Н. М., Кузнецова Ю. Н. и др. Клиническая эффективность Панавира в терапии папилломавирусной инфекции. Там же; 2006; 1: 24—26

Климова Р. Р., Федорова Н. Е., Козлов А. Ю., Меджидова М. Г. и др. Влияние препарата Панавир на течение герпесвирусных инфекций in vitro. Вест дерматол венерол 2004; 6: 52—56.