Изучение характеристик фосфатовкальция, синтезированных из модельных растворов плазмы крови

ХИМИЯ

Вестн. Ом. ун-та. 2016. № 1. С. 56-62.

УДК 546.05.544.77

О.А. Голованова, Ю.А. Кутузова

ИЗУЧЕНИЕ ХАРАКТЕРИСТИК ФОСФАТОВ КАЛЬЦИЯ, СИНТЕЗИРОВАННЫХ ИЗ МОДЕЛЬНЫХ РАСТВОРОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ*

Представлены результаты исследований процессов кристаллизации в растворах, моделирующих состав плазмы крови человека. Осуществлен синтез из прототипов плазмы крови человека в зависимости от пересыщения и времени эксперимента, и установлено, что полученные твердые фазы состоят из октакальцийфосфата, карбо-натгидроксиапатита А-типа, витлокита. Выяснено, что масса осадков растет с увеличением пересыщения и времени синтеза. Химическими методами получено, что с увеличением времени синтеза и пересыщения раствора Са/Р коэффициент изменяется, так как меняется фазовый состав осадка. Изучена биоактивность образцов в трех растворителях и установлены кинетические характеристики. Получено, что более эффективное растворение наблюдается в ацетатном буфере. В результате термической обработки твердых фаз в интервале температур 200-800 °C определены основные фазовые переходы.

Ключевые слова: кристаллизация; пересыщение; фосфат кальция; плазма крови; кинетика растворения; термопревращения.

Введение

Одним из важных направлений современной биоминералогии является изучение процессов кристаллизации малорастворимых соединений, входящих в состав физиогенных (кости, зубы) и патогенных минералов (мочевые, зубные, слюнные и др.) [1-5]. Интерес вызван тем, что данные соединения чаще всего являются причинами болезней организма человека, например артериосклероз - заболевание, связанное с отложением солей кальция в сосудах. Это заболевание - второе по распространенности среди всех склеротических поражений артериальных сосудов после атеросклероза [6-8]. За последние годы увеличился процент патогенного минерало-образования в кровеносных сосудах, сердечных клапанах.

В настоящее время существует несколько гипотез развития кальцифи-катов в сердечных клапанах: структурные изменения в тканях клапана при воспалении, результат жизнедеятельности микроорганизмов и др. [910]. Подобные образования отмечаются рядом авторов на силиконовых грудных имплантатах и биопротезах сердечных клапанов. Известно, что биологические жидкости, из которых происходит образование таких соединений, состоят из множества компонентов как неорганических, так и органических [9]. Появление в биологической жидкости любого нового вещества при патологическом состоянии приводит к изменению химического состава и межмолекулярного взаимодействия, что находит свое отражение в особенностях кристаллических структур. Такие молекулярные изменения наиболее точно характеризуют состояние внутренней среды организма и могут иметь значение для выявления патологического процесса на ранних стадиях [9].

Анализ проведенных ранее рядом авторов [11-17] исследований показал, что главной неорганической фазой патогенной кальцификации колла-геновых и мышечных тканей, так же как в костной и зубной тканях, является фосфат кальция, который с определенной степенью приближения от-

"Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 15-29-04839 офи_м).

© О.А. Голованова, Ю.А. Кутузова, 2016

носят к карбонатсодержащему гидроксила-патиту [18], как правило, слабо окристалли-зованному и нестехиометрическому из-за присутствия значительных количеств посторонних ионов. Некоторые из этих ионов входят в кристаллическую решетку апатита, другие же только адсорбируются на поверхности апатита. Этот апатит является типичным биогенным минералом, тесно связанным пространственно, генетически структурно и морфологически с составляющими тканей организма. Степень дефектности его всегда высока и зависит в большей степени от локальных процессов, чем от состояния организма в целом. Соотношение Са/Р в кальцинатах, по литературным данным, варьируется в значительных пределах. В матричных везикулах это соотношение может быть около 0,66, а в зрелом апатите доходит до 2. Размер кристаллов в процессе созревания биоапатита увеличивается от наноразмерных до 100 и даже более микрон. Патогенный апатит не имеет такой тесной связи с обменными процессами в организме, как физиогенный.

Именно из-за кальцификации сроки функционирования трансплантатов сердечных клапанов ограничены. В связи с этим возникает настоятельная необходимость в исследовании механизма инициации кальци-ноза как коллагеновых и мышечных тканей, так и трансплантатов клапанов сердца с целью разработки на основе полученных представлений способов его предотвращения.

Отсюда можно сделать вывод, что кристаллография природного неорганического апатита невероятно сложна, а структура биоапатита имеет ряд дополнительных особенностей, при этом минерализация тканей изучена недостаточна.

Цель работы - изучение кристаллизации фосфатов кальция из прототипов плазмы крови человека и исследование их свойств (биоактивность, термическая деградация).

Экспериментальная часть

Для расчета состава модельных растворов использовали значения средней концентрации неорганических ионов, входящих в плазму крови человека (табл. 1). Выбор исходных реагентов и их соотношение в растворе определяли таким образом, чтобы концентрации ионов и ионная сила раствора были максимально приближены к параметрам плазмы крови человека.

В качестве исходных реагентов использовали соли марки ч.д.а. и х.ч. и дистиллированную воду. Для каждой серии экспериментов были приготовлены растворы, содержащие катионы и анионы, при совместном присутствии которых в данных условиях не образуются малорастворимые соединения (отдельно катионы и анионы, которые являются осадкообразующими). В каждом из исходных растворов производили корректи-

ровку значений рН до физиологического значения (7,4 ± 0,01) путем добавления 30 %-ого раствора NaOH или HCl (конц.) и ионной силы до значения 0,146. После смешения эквивалентных объемов растворов получали раствор с заданным пересыщением относительно произведения растворимости гидрофосфата кальция и рассчитанной концентрацией исходных компонентов (табл. 1). Все опыты проводили при температуре 25 °С в отсутствие перемешивания. Время синтеза составляло: 2, 4 (S = 50, 100); 8, 10, 12 (S = 25, 50, 100) недель. По окончанию опыта раствор отфильтровывали и высушивали осадок в сушильном шкафу при температуре ~ 80 °С до полного удаления воды.

Таблица 1

Данные для приготовления модельного раствора

Компонент-ион Среднеезначение концентрации (ммоль/л) Значение концентрации (ммоль/л) для пересыщения 3

Ca2+ 2,35 3,94

Na+ 143 26

K+ 4,35 4,52

Mg2+ 0,95 0,95

NH4+ 0,04 0,04

Cl- 103 4,89

SO42- 0,45 -

CO32- 26 26

PO43- 1,3 2,28

Фазовый состав полученных осадков исследован с помощью РФА (ДРОН-3) и ИК-спек-троскопии (спектрофотометр «ФТ-02»). Идентификация пиков на дифрактограммах проводилась с помощью картотеки JCPDS и программных пакетов DifWin4.0 и Crystallogra-phica Search-Match. Содержание присутствующих фаз в образцах определяли по методу корундовых чисел (метод Чанга, программа Crystallographica Search-Match). Размеры области когерентного рассеяния (ОКР, минимальные размеры кристаллитов) твердых фаз определены по формуле Дебая-Шеррера [22]. Параметры и объем элементарной ячейки кристаллов были вычислены по формулам для гексагональной сингонии ГА [23].

Для изучения энергетики процессов термического разложения полученных твердых фаз проводился термогравиметрический анализ (ТГА). Навеску образца массой 0,2000 ± 0,0005 г помещали в керамические тигли и нагревали в муфельной печи от 200 °С до 1000 °С с шагом 200 °С. Затем пробу с осадком охлаждали до комнатной температуры взвешивали на аналитических весах. Эксперимент проводили в трехкратной повторности.

Изучение резорбции (растворимости) полученных образцов проводилось путем их динамического растворения при постоянном перемешивании в растворе 0,9 %-ного хлорида натрия (рН~7), в ацетатном (pH = 4,75) и трис-буфере (pH = pH = 7,4) при комнатной

температуре (17-20 °С) и 37 °С. Через определенные промежутки времени (1 = 0-90 мин) с помощью прямой потенциометрии фиксировали значение кислотности среды и показателя концентрации ионов кальция в растворе. На заключительном этапе эксперимента проводилось взвешивание высушенной не растворившейся твердой фазы. На основе полученных экспериментальных данных были получены кинетические кривые и проведена их математическая обработка по алгоритму, описанному в работе [24].

Результаты экспериментов и их обсуждение

Результаты РФА показали, что все образцы, синтезируемые в среде модельного раствора плазмы крови человека при варьировании пересыщений и времени синтеза, представляют собой смесь из карбонатгид-роксилапатита, октокальцийфосфата и вит-локита, при этом пики максимальной интенсивности находятся близко и накладываются

друг на друга, что затрудняет расшифровку. Линиям ОКФ соответствуют пики по шкале 20: 28,3; 34,4; 36,7, линиям КГА соответствуют пики по шкале 20: 26,3; 33,9; 34,6, а линиям витлокита соответствуют пики по шкале 20: 17,4; 30,2; 33,7, причем с увеличением пересыщения и времени синтеза содержание КГА увеличивается (рис. 1).

Для установления качественного состава твердых фаз использовали ИК-спектроско-пию (рис. 2).

На спектрах всех исследованных образцов регистрируются полосы поглощения в спектральных областях 1400-1500 и 150300 см-1, относящихся соответственно к валентным и деформационным колебаниям связей С-О карбонат-ионов. Можно отметить, что интенсивность, характерная для гидроксилапатита, полос колебания ОН- в области 3500 см-1 очень мала.

Таким образом, из результатов следует, что в составе полученных твердых фаз обнаружена смесь карбонатгидроксилапатита А-типа, витлокита и октакальцийфосфата.

Рис. 1. Дифрактограмма образцов: а) 8 недель S = 10; б) 8 недель S = 100

Вохиоеое 1испо, см"

Рис. 2. ИК-спектры образцов: 1 - 1 месяц, Б = 50; 2 - 2 месяца, Б = 50

Методами химического анализа надоса-дочной жидкости установлено, что соотношение Са/ Р в синтезируемых осадках меняется в зависимости от времени синтеза и пересыщения (рис. 3).

Сложный характер зависимости свидетельствует об изменении состава осадков в зависимости от времени синтеза и пересыщения. Из литературных данных известно, что Са/Р соотношение для КГА-1,67, ОКФ-1,33, витлокита-1,28. С увеличением пересыщения Са/Р соотношение увеличивается. Повышение Са/ Р свидетельствует об увеличении доли КГА в осадке. Для полученных твердых фаз была проведена оценка массы рис. 4.

Видно, что с увеличением пересыщения синтеза масса твердой фазы растет, при

этом время не оказывает заметного влияния на массу осадков.

Далее было изучено растворение синтезированных порошков с разным пересыщением (8 = 10, 20, 30, 40, 50, 100) и временем синтеза 8 недель. Растворение проводилось в трех растворителях.

По кинетическим кривым С(Са2+) = Цт) растворения в 0,9 % растворе МаС1 видно, что насыщения ионами кальция происходит за 5 минут. Далее по полученным кривым рассчитали кинетические закономерности (табл. 2). Получили, что порядок реакций растворения нулевой, при этом в зависимости от пересыщения скорость монотонно не изменяется.

1,6 т

1,2 ::

CL _

"¡5 0 8 Т

о '

0,4 :: 0

2 месяца

X х

+

Пересыщения

ч-1-1-1-1-1-1-1-1-1

0

50

пересыщение а

100

2

1,5 ::

CL _

"¡5 1 }

О

0,5 0

♦ S=5

• S=10

W -  • S=20

•

Л S=30

♦  м S=50

♦ S=100

♦ щ

♦ S=40

Н-1-1-1-1-1-1-1-1-1

0

5

недели б

10

5 4,5 4

3,5 j;

3 j;

ч. 2,5 ii

Е 2 Ü

1,5 Ц

0,51: "

Рис. 3. Зависимость Са/Р от времени синтеза и пересыщения: а) 8 недель; б) пересыщения

масса осадков

*

ж

♦

ж

Л

ж

♦

ж

Л

ж

♦ 4 недели 8 недель

2 недели

3 недели ж 1 неделя

0 —I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I

0 20 40 „ 60 80 100 120

Пересыщение

Рис. 4. Зависимость массы от времени синтеза и пересыщения

Кинетические параметры растворения твердых фаз в 0,9 % растворе NaCl

Таблица 2

Время синтеза Пересыщение Порядок Уравнение R^pac v, мкмоль/л*мин

10 C=0,1448x+9,3282 0,4891 0,1448

20 C=0,0825x+7,8891 0,4487 0,0825

8 недель 30 0 C=0,2852x+3,608 0,6654 0,2852

40 C=0,028x+2,7053 0,6571 0,0280

50 C=0,0557x+4,0013 0,4970 0,0557

100 C=0,1518x+4,7436 0,6994 0,1518

Аналогичные закономерности были получены при изучении биоактивности в растворах в трис-буфере и в ацетатном буфере. Далее для исследуемых проб провели растворение при температуре до 40 °С, для расчёта энергии активации.

Выявили, что для раствора 0,9 % МаС1 (табл. 3) характерно снижение энергии активации с уменьшением пересыщения. Это связано с тем, что для пересыщения 100 требуется меньше энергии для осуществления процесса растворения, так как происходит увеличение ионной силы раствора, т. е. проявляется солевой эффект. Сравнивая растворение при одинаковых пересыщениях (50) в ацетатном и трис-буфере можно отметить, что для трис-буфера энергия активации горазда выше.

Таблица 3 Изменение энергии активации для разных растворителей

Растворитель Пересыщение Ea, Дж / моль

NaCl, 0,9 % 10 226,52

100 32,33

Ацетатный буфер 50 84,97

Трис-буфер 50 382,63

Анализ данных табл. 3 показал, что наибольшая скорость растворения синтезированных образцов характерна для ацетатного буфера (наименьшее значение энергии

активации), это, по нашему мнению, связано с кислой средой ацетатного буфера.

На следующем этапе проводилось исследование полученных осадков путем изотермического термогравиметрического анализа (ТГА) для проб с временем синтеза 4 и 8 недель и пересыщением 100. Анализ образца методом ТГА показал непрерывную потерю массы (рис. 5).

По полученным результатам (рис. 5) видно, что наибольшее уменьшение массы относится к интервалу температур 200400 °С, что связано с удалением адсорбционной и кристаллизационной воды. В интервале 600-800 происходит удаление карбонат-ионов из структуры карбонатгидрокси-лапатита, кроме того на каждом изменении температуры ОКФ претерпевает структурные изменения (табл. 4).

Данные, представленные в табл. 4, подтверждены методом РФА (рис. 6, 7). При температуре 200 °С образуются фазы ГА и ди-кальцийфосфата, основным интенсивным линиям ГА соответствуют пики на шкале 20: 31,3; 34,9; 38,5. Для температуры 400-600 °С образуются фазы ГА и пирофосфата кальция, линиям ГА соответствуют пики по шкале 20: 28,1; 31,4; 34,3, линиям пирофос-фата кальция соответствуют пики по шкале 20: 18,2; 23,2; 25,3. При температуре 800 °С образуется в-трикальций фосфат, его линиям соответствуют пики по шкале 20: 31,8; 33,6; 35,7.

0,1920 0,1900 0,1880 g- 0,1860 0,1840 0,1820 0,1800

0

1 месяц S=100

2 месяца S=100

200

400

600

800

1000

Т,оС

Рис. 5. Термогравиметрические кривые для пробы с временем синтеза 4, 8 недель и пересыщение 100

Таблица 4

Фазовые превращения продуктов кристализации при термообработке

аТ,°С Процессы вызывающие убыль образца

200 Удалением адсорбционной и кристаллизационной воды: Саб(НРО4)2(РО4)4-5Н2О ^ У2 Са1о(РО4)б(ОН)2 + 3СаНРО4

400 Плавка монетита с образованием пирофосфата кальция: Л Саю(РО4)б(ОН)2 + 3СаНРО4 Саю(РО4)е(ОН)2 + 3/2у-Са2Р2От

600 У2 Саю(РО4)б(ОН)2 + 3/2у-Са2Р2От ^ 2Саа(РОф + Р-Са2Р2От.

800 Удаление карбонат-ионов из структуры КГА: Сад(РО4)б-х-у(НРО4)у(СОа)х(ОН)2-у ^30- Саа(РОф+ хСО2 +2 Н2О

ч

Ч.

V

\

Л Л

V4 /

"АЧ,

„у 'И

Рис. 6. Дифрактограммы образца 4 недели, S = 100: 1 - Т = 200 °С; 2 - Т = 400 °С; 3 - Т = 600 °С; 4 - Т = 800 °С

iw

Ч \ V чл ч

X \ \ ч »

\\Мл

VyCVi Ы

ч у

VI

ч Г vAv

\ У \

Vv/

V

» Л, Л

..i J

Рис. 7. Дифрактограммы образца 8 недель S = 100: 1 - Т = 200 °С; 2 - Т = 400 °С; 3 - Т = 600 °С; 4 - Т = 800 °С

Выводы

Осуществлен синтез из прототипов плазмы крови человека в зависимости от пересыщения и времени синтеза. Получены твердые фазы состоящие из октакальций-фосфата, карбонатгидроксиапатита А-типа, витлокита.

Показано, что масса твердой фазы растет с увеличением пересыщения и времени синтеза. Выявлено, что с увеличением времени синтеза и пересыщения раствора Са/Р коэффициент изменяется.

Изучено растворение в трех растворителях. Выяснено, что порядок растворения для всех трех растворителей равен нулю. Скорость реакции растворения изменяется не монотонно. Установлено, что более эффективное растворение наблюдается в ацетатном буфере.

Определены процессы, протекающие при термической обработке образцов в интервале температур 200-800°C.

ЛИТЕРАТУРА

[1] Golovanova O. A., Frank-Kamenetskaya O. V., Pu-nin Y. O. Specific features of pathogenic mineral formation in the human body // Russian Journal of General Chemistry. 2011. № 81 (6). P. 1392-1406.

[2] Tetsuo Kodaka et al. Fine structure and mineral components of fibrous stonelike masses obtained from the human mesenteries // The Clinical Electron Microscopy Society of Japan. 2003. № 36. Р. 272.

[3] Becker А. et al. A comparative study of clinically well-characterized human atherosclerotic plaques with histological, chemical, and ultrastructural methods // Journal of Inorganic Biochemistry. 2004. № 98. Р. 2032-2038.

[4] Kazuyuki Yahagi, Frank D. Kolodgie, Fumiyuki Otsuka. Pathophysiology of native coronary, vein graft, and in-stent atherosclerosis // Nature Reviews Cardiology. 2015. № 10. Р.1038.

[5] Титов А. Т. и др. Механизм минерализации сердечных клапанов // Поверхность, рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования. 2001. № 3. С. 74.

[6] Kazuyuki Yahagi, Frank D. Kolodgie, Fumiyuki Otsuka. Op. cit. P. 1038.

[7] Lars-Fride Olsson et al. In Vitro Formation of Nano-crystalline Carbonate Apatite - A Structural and Morphological Analogue of Atherosclerotic Plaques // Eur. J. Inorg. Chem. 2007. P. 41234127.

[8] Титов А. Т. и др. Гидроксилапатит в крови человека. // Поверхность, рентгеновские, синхро-тронные и нейронные исследования. 2000. № 7. С. 66.

[9] Ламанова Л. М. Тканевая кальцификация в сердечно-сосудистой системе. Вестник тГу. 2010. № 337. С. 194-197.

[10] Росеева Е. В. и др. Биоапатит кальцификатов сердечных клапанов // Материалы докладов годичного собрания РМО и Федоровской сессии. 2012. С. 306-308.

[11] Grazielle V. Nogueira et al. Pacheco Raman spectroscopy study of atherosclerosis in human carotid artery Journal of Biomedical Optics. 2005. № 10(3).

[12] Pigozzi F. et al. Endothelial (dys)function: the target of physical exercise for prevention and treatment of cardiovascular disease // J. Sports Med. Phys. Fitness. 2011. № 51. Р. 260-267.

[13] Гилинская Л. Г. и др. Исследование минеральных патогенных образований на сердечных клапанах человека. I. Химический и фазовый состав // Журнал структурной химии. 2003. Т. 44, № 4. С. 678.

[14] Гилинская Л.Г., Окунева Г.Н., Власов Ю.А. Исследование минеральных патогенных образований на сердечных клапанах человека. II. ЭПР спектроскопия. // Журнал структурной химии. 2003. Т. 44, № 5. С. 882.

[15] Гилинская Л. Г. и др. Исследование минеральных патогенных образований на сердечных клапанах человека. III. Электронная микроскопия // Журнал структурной химии. 2003. Т. 44, № 6. С. 1122.

[16] Gibson I.R., Bonfield W. Novel synthesis and characterization of an AB-type carbonate-substituted hydroxyapatite // Sayer M. J. Biomed. 2002. P. 697-708.

[17] Frank-Kamenetskaya O., Kol'tsov A. Ion substitutions and non-stoichiometry of carbonated apatite-(CaOH)synthesised by precipitation and hydrothermal methods // J. of Molecular Structure. 2011. Vol. 9. P. 9.

[18] Golovanova O. A., Chikanova E. S., Punin Y. O. Мain features of nucleation in model solutions of

oral cavity // Crystallography Reports. 2015. Т. 60, № 3. С. 438-445.

[19] Peters F., Epple M. Simulating arterial wall calcification in vitro: biomimetic crystallization of calcium phosphates under controlled conditions // Zeitschrift f.r. Kardiologie. 2001.

[20] Dorozhkina E. I., Dorozhkin S. V. In vitro crystallization of carbonateapatite on cholesterol from a modified simulated body fluid // Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects. 2003. № 223. Р. 231-237.

[21] Березов Т. Т., Коровин М. А. Биологическая химия. М. : Медицина, 2002. 704 с.

[22] Петракова Н. В. Влияние условий синтеза и спекания нанопорошков гидроксилапатита на формирование микроструктуры и свойств керамики : дис. ... канд. техн. наук. М., 2014.

[23] Шаскольская М. П. Кристаллография. М. : Высшая школа, 1976. 391 с.

[24] Измайлов Р. Р., Голованова О. А. Растворимость гидроксилапатита и карбонатгидроксила-патита, полученных из модельного раствора синовиальной жидкости // Вестн. Ом. ун-та. 2012. № 4. С. 109-113.