ДОЗИРОВАННАЯ ФОРМА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК

Полезная модель относится к медицине и биологии и предназначена для использования при производстве наборов для выделения ДНК, применяемых при проведении молекулярно-генетических исследований.
Выделение нуклеиновых кислот является основой пробоподготовки биологических образцов для молекулярно-генетических исследований: секвенирования, ПЦР и других.
Чаще всего для выделения нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) используют модификации аналога, предложенного Boom W.R. с соавторами (US 5234809 от 10.08.1993), согласно которому в перечень стадий выделения нуклеиновых входят смешивание исходного материала с хаотропным веществом и твердой фазой, связывающей нуклеиновую кислоту. При этом хаотропное вещество может представлять собой соли гуанидина или мочевину, а в качестве твердой фазы, связывающей нуклеиновую кислоту, можно выбрать частицы диоксида кремния.
Основным недостатком данного аналога являются:
а) многостадийность пробоподготовки, в том числе в связи с дозированием компонентов, предварительным смешиванием подготавливаемой пробы, хаотропного компонента (вещества) и твердой фазы (в том числе диоксида кремния);
б) необходимость доведения до комнатной температуры замороженных или охлажденных растворов соли гуанидина и мочевины перед использованием;
в) ограниченный срок хранения растворов хаотропных компонентов и ограниченное число циклов их замораживания и размораживания при хранении.
Известен набор для выделения ДНК, состоящий из лизирующего буфера на основе 3-10 М раствора мочевины, связывающего буфера на основе 2,5-5 М хлористого натрия, промывочного буфера на основе 80% этанола, элюирующего буфера на основе 10 мМ Трис-HCl и 1 мМ Трилона Б с рН 8 и сорбента, отличающийся тем, что в качестве сорбента ДНК он содержит кристаллический кварцевый песок с размером частиц 10-50 мкм (RU 2539030 от 10.01.2015).
Известно также последовательное использование гуанидина гидрохлорида и диоксида кремния для выделения ДНК (WO 2004108925 от 16.12.2004).
Основными недостатками данных аналогов, согласно их описаниям, являются:
а) многостадийность пробоподготовки, в том числе в связи с дозированием компонентов, последовательным добавлением к биоматериалу хаотропного компонента (мочевины или гуанидина гидрохлорида), связывающего буфера и кремнийсодержащего сорбента (диоксида кремния или кристаллического кварцевого песка);
б) необходимость доведения до комнатной температуры замороженных или охлажденных растворов соли гуанидина и мочевины перед использованием;
в) ограниченный срок хранения растворов хаотропных компонентов и ограниченное число циклов их замораживания и размораживания при хранении;
г) некомпактность жидких компонентов набора.
Наиболее близким аналогом заявляемого технического решения - прототипом - является композиция для выделения и очистки нуклеиновых кислот, представляющая собой смесь твердых веществ, содержащую от 10 до 40 мас. % частиц, состоящих из нерастворимого в воде гидратированного магния силиката (например, талька), имеющего средний размер частиц от 0,8 до 2,5 μm (мкм), и от 20 до 70 мас. % кристаллического забуференного фосфатом солевого раствора, который легко растворим в воде для получения раствора, имеющего рН от 5,5 до 7,0 при температуре от 70 до 95°С. Известная композиция из смеси твердых веществ предпочтительно дозирована в виде таблетки или капсулы, имеющих определенный вес. Известная композиция также предпочтительно дополнительно содержит от 20 до 35 мас. % гидрофильного коллоида, эффективного для диспергирования смеси твердых веществ в воде, и может включать один или несколько нехаотропных лизирующих агентов (WO 2015132216 от 11.09.2015).
Имеются следующие основные недостатки прототипа, согласно его формуле и описанию:
а) ограничен срок хранения композиции за счет возможности использования нестойких нехаотропных лизирующих компоненетов;
б) отсутствие оболочки, как предотвращающей при хранении истирание прототипа в виде таблетки (так как истирание уменьшает дозировку активных компонентов в форме и, соответственно, дополнительно снижает срок ее хранения), так и создающей при выделении ДНК гидрофобный барьер, предотвращающий перекрестную контаминацию реакционных смесей и обеспечивающий их пароизоляцию при нагревании, которое ускоряет растворение хаотропного компонента, лизис клеток и высвобождение ДНК из связей с другими веществами (например, US 5234809 от 10.08.1993, KZ 26391 от 15.11.2012).
Главной задачей, решаемой заявляемым техническим решением, является получение компактной твердой дозированной формы для выделения ДНК с увеличенным сроком хранения, обеспечивающей пароизоляцию и предотвращающей перекрестную контаминацию реакционных смесей.
Поставленная задача реализуется за счет того, что дозированная форма для выделения ДНК включает ядро, содержащее совместно спрессованные мочевину, натрия хлорид и диоксид кремния, а также сплошную оболочку, состоящую, по меньшей мере, из одного гидрофобного ингредиента, выбранного из ряда: парафин и воск, и выполнена в виде глобулы или таблетки, при этом глобула имеет предпочтительный диаметр 2,0-4,0 мм, а таблетка имеет предпочтительный диаметр 2,0-4,0 мм и предпочтительную толщину 2,0-4,0 мм, причем содержание мочевины, натрия хлорида и диоксида кремния в ядре составляет, мас. %: мочевина - 67,5-80,0, натрия хлорид - 10,0-25,5 и диоксид кремния - 7,0-10,0.
В основу заявляемой полезной модели положена обеспечивающая решение поставленной задачи новая совокупность оригинальных отличительных признаков. Во-первых, это использование совместно спрессованных мочевины, натрия хлорида и диоксида кремния, выполняющих в заявляемой дозированной форма дополнительные функции, соответственно, как гигроскопичных компонентов (мочевина и натрия хлорид) и нерастворимого разрыхлителя - дезинтегратора (диоксид кремния), что обеспечивает увеличение срока хранения компактной дозированной формы для выделения ДНК, упрощает ее состав, исключая необходимость добавления дополнительного разрыхлителя, а при использовании дозированной формы для выделения ДНК обусловливает увеличение ее распадаемости, уменьшение стадий пробоподготовки и обеспечение оптимальной концентрации и необходимой для молекулярно-генетических исследований очистки ДНК в подготовленной пробе. Во-вторых, это наличие сплошной оболочки, предотвращающей истирание ядра глобулы или таблетки при хранении, в связи с чем дополнительно увеличивающей срок ее хранения, а также создающей гидрофобный барьер при выделении ДНК, предотвращающий перекрестную контаминацию реакционных смесей и обеспечивающий их пароизоляцию. Имеющаяся возможность изменять толщину оболочки в широких пределах обеспечивает полное покрытие реакционных смесей в известных емкостях (в том числе в имеющих различный объем пробирках) гидрофобным слоем из ингредиентов оболочки при дезинтеграции вариантов дозированной формы с эффективным выделением ДНК. Вышеизложенное позволяет при характеристике оболочки заявляемой дозированной формы не указывать предельные значения ее толщины в качестве отличительных признаков. Для облегчения извлечения выделенной ДНК из емкости, в которой проходила реакция, предпочтительно использовать толщину оболочки, минимально необходимую для предотвращения истирания ядра глобулы или таблетки при хранении и испарения воды из емкости при выделении ДНК, что обеспечивается предпочтительными размерами глобул и таблеток заявляемой дозированной формы, соответствующими внутренним диаметрам пробирок, обычно используемых для выделения ДНК.
Из патентно-технической литературы и практики молекулярно-генетических исследований неизвестно о дозированной форме для выделения ДНК, включающей твердые ингредиенты, которая была бы идентична заявляемой.
Отсюда правомерен вывод о соответствия заявляемого решения критерию «новизна».
Указанная выше совокупность существенных признаков необходима и достаточна для достижения технического результата - увеличения срока хранения дозированной формы, предотвращения перекрестной контаминации реакционных смесей и обеспечения их пароизоляции.
Предлагаемая дозированная форма может быть получена многократно, а, значит, заявляемое техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость».
Предлагаемая дозированная форма апробирована в Обществе с ограниченной ответственностью «Микро Тех».
Сущность полезной модели поясняется на следующих примерах, показывающих увеличение срока хранения дозированной формы, предотвращение перекрестной контаминации реакционных смесей и обеспечение их пароизоляции. При этом приведенные примеры дозированной формы для выделения ДНК показывают конкретную реализацию заявляемой полезной модели, но не ограничивают объем притязаний формулы заявляемой полезной модели.
Пример 1. Получена дозированная форма для выделения ДНК, включающая ядро, содержащее совместно спрессованные мочевину, натрия хлорид и диоксид кремния, а также сплошную оболочку, состоящую из одного гидрофобного ингредиента - парафина, выполненная в виде глобулы с диаметром 2,0 мм. Соотношение мочевины, натрия хлорида и диоксида кремния составляло 67,5 мас. %, 25,5 мас. % и 7,0 мас. %, соответственно.
Полученный вариант заявляемой дозированной формы перед постановкой реакции хранился в течение 2 лет при комнатной температуре.
Для выделения ДНК использовались различные емкости (пробирки объемом от 1,5 мл до 2,5 мл).
Выделение ДНК проводили во время работы с образцами, полученными от других пациентов.
Для выделения ДНК биологический материал (материал слизистой оболочки цервикального канала шейки матки пациентки, инфицированной Ureaplasma urealyticum) вносили в емкость, содержащую 200 мкл физиологического раствора или известной транспортной среды, описанной, например, в методических указаниях МУ 1.3.1794-03 (http://base.garant.ru/4180235/1a3794674ba91fb6f13d1885dca9f9e1/ или http://www.lytech.ru/data/file/mu_131974_03.pdf). Затем вносили в емкость полученный вариант заявляемой дозированной формы, нагревали смесь до 65°С, взбалтывали смесь в течение 2 минут до полного распадения полученного варианта заявляемой дозированной формы, инкубировали смесь при 65°С 15 минут (при этих условиях объем смеси не уменьшился), центрифугировали при 12100 g в течение 5 секунд и декантировали надосадочную жидкость. К осадку добавляли 500 мкл 70% этилового спирта, полученную смесь взбалтывали, центрифугировали при 12100 g в течение 5 секунд и декантировали надосадочную жидкость. Осадок высушивали и вносили в емкость 60 мкл бидистиллированной воды или известного элюирующего буфера (http://www.nhm.ac.uk/content/dam/nhmwww/our-science/dpts-facilities-staff/Coreresearchlabs/te-buffer.pdf), полученную смесь взбалтывали, центрифугировали при 12100 g в течение 5 секунд. Надосадочную жидкость использовали для исследования методом классической ПЦР.
При использовании полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с использованием обычно используемых аналогичных жидких реагентов отмечено уменьшение в 3 раза числа ручных манипуляций.
В результате проведения классической ПЦР с использованием полученного варианта заявляемой дозированной формы установлен положительный результат ПЦР с праймерами для Ureaplasma urealyticum, что свидетельствует об обеспечении оптимальной концентрации и необходимой для молекулярно-генетических исследований очистки ДНК в подготовленной пробе. Перекрестной контаминации реакционных смесей не выявлено.
Пример 2. Получена дозированная форма для выделения ДНК, включающая ядро, содержащее совместно спрессованные мочевину, натрия хлорид и диоксид кремния, а также сплошную оболочку, состоящую из одного гидрофобного ингредиента - воска, выполненная в виде глобулы с диаметром 3,0 мм. Соотношение мочевины, натрия хлорида и диоксида кремния составляло 76,0 мас. %, 16,0 мас. % и 8,0 мас. %, соответственно.
Полученный вариант заявляемой дозированной формы перед постановкой реакции хранился в течение 2 лет при комнатной температуре.
Для выделения ДНК использовались различные емкости (пробирки объемом от 1,5 мл до 2,5 мл).
Выделение ДНК проводили во время работы с образцами, полученными от других пациентов.
Для выделения ДНК биологический материал (материал слизистой оболочки влагалища пациентки, инфицированной Candida albicans) вносили в емкость, содержащую 200 мкл физиологического раствора или известной транспортной среды, описанной, например, в методических указаниях МУ 1.3.1794-03 (http://base.garant.ru/4180235/1a3794674ba91fb6f13d1885dca9f9e1/ или http://www.lytech.ru/data/file/mu_131974_03.pdf). Затем вносили в емкость полученный вариант заявляемой дозированной формы, нагревали смесь до 65°С, взбалтывали смесь в течение 2 минут до полного распадения полученного варианта заявляемой дозированной формы, инкубировали смесь при 65°С 15 минут (при этих условиях объем смеси не уменьшился), центрифугировали при 12100 g в течение 5 секунд и декантировали надосадочную жидкость. К осадку добавляли 500 мкл 70% этилового спирта, полученную смесь взбалтывали, центрифугировали при 12100 g в течение 5 секунд и декантировали надосадочную жидкость. Осадок высушивали и вносили в емкость 60 мкл бидистиллированной воды или известного элюирующего буфера (http://www.nhm.ac.uk/content/dam/nhmwww/our-science/dpts-facilities-staff/Coreresearchlabs/te-buffer.pdf), полученную смесь взбалтывали, центрифугировали при 12100 g в течение 5 секунд. Надосадочную жидкость использовали для исследования методом классической ПЦР.
При использовании полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с использованием обычно используемых аналогичных жидких реагентов отмечено уменьшение в 3 раза числа ручных манипуляций.
В результате проведения классической ПЦР с использованием полученного варианта заявляемой дозированной формы установлен положительный результат ПЦР с праймерами для Candida albicans, что свидетельствует об обеспечении оптимальной концентрации и необходимой для молекулярно-генетических исследований очистки ДНК в подготовленной пробе. Перекрестной контаминации реакционных смесей не выявлено.
Пример 3. Получена дозированная форма для выделения ДНК, включающая ядро, содержащее совместно спрессованные мочевину, натрия хлорид и диоксид кремния, а также сплошную оболочку, состоящую из двух гидрофобных ингредиентов (смеси парафина с воском), выполненная в виде глобулы с диаметром 4,0 мм. Соотношение мочевины, натрия хлорида и диоксида кремния составляло 80,0 мас. %, 10,0 мас. % и 10,0 мас. %, соответственно.
Полученный вариант заявляемой дозированной формы перед постановкой реакции хранился в течение 2 лет при комнатной температуре.
Для выделения ДНК использовались различные емкости (пробирки объемом от 1,5 мл до 2,5 мл).
Выделение ДНК проводили во время работы с образцами, полученными от других пациентов.
Для выделения ДНК биологический материал (материал слизистой оболочки цервикального канала шейки матки пациентки, инфицированной Chlamydia trachomatis) вносили в емкость, содержащую 200 мкл физиологического раствора или известной транспортной среды, описанной, например, в методических указаниях МУ 1.3.1794-03 (http://base.garant.ru/4180235/1a3794674ba91fb6f13d1885dca9f9e1/ или http://www.lytech.ru/data/file/mu_131974_03.pdf). Затем вносили в емкость полученный вариант заявляемой дозированной формы, нагревали смесь до 65°С, взбалтывали смесь в течение 3 минут до полного распадения полученного варианта заявляемой дозированной формы, инкубировали смесь при 60°С 15 минут (при этих условиях объем смеси не уменьшился), центрифугировали при 12100 g в течение 5 секунд и декантировали надосадочную жидкость. К осадку добавляли 500 мкл 70% этилового спирта, полученную смесь взбалтывали, центрифугировали при 12100 g в течение 5 секунд и декантировали надосадочную жидкость. Осадок высушивали и вносили в емкость 60 мкл бидистиллированной воды или известного элюирующего буфера (http://www.nhm.ac.uk/content/dam/nhmwww/our-science/dpts-facilities-staff/Coreresearchlabs/te-buffer.pdf), полученную смесь взбалтывали, центрифугировали при 12100 g в течение 5 секунд. Надосадочную жидкость использовали для исследования методом классической ПЦР.
При использовании полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с использованием обычно используемых аналогичных жидких реагентов отмечено уменьшение в 3 раза числа ручных манипуляций.
В результате проведения классической ПЦР с использованием полученного варианта заявляемой дозированной формы установлен положительный результат ПЦР с праймерами для Chlamydia trachomatis, что свидетельствует об обеспечении оптимальной концентрации и необходимой для молекулярно-генетических исследований очистки ДНК в подготовленной пробе. Перекрестной контаминации реакционных смесей не выявлено.
Пример 4. Получена дозированная форма для выделения ДНК, включающая ядро, содержащее совместно спрессованные мочевину, натрия хлорид и диоксид кремния, а также сплошную оболочку, состоящую из одного гидрофобного ингредиента - парафина, выполненная в виде таблетки с диаметром 2,0 мм и толщиной 2,0 мм. Соотношение мочевины, натрия хлорида и диоксида кремния составляло 67,5 мас. %, 25,5 мас. %) и 7,0 мас. %, соответственно.
Полученный вариант заявляемой дозированной формы перед постановкой реакции хранился в течение 2 лет при комнатной температуре.
Для выделения ДНК использовались различные емкости (пробирки объемом от 1,5 мл до 2,5 мл).
Выделение ДНК проводили во время работы с образцами, полученными от других пациентов.
Для выделения ДНК биологический материал (кал больного, инфицированного Trichiuris trichiuria) вносили в емкость, содержащую 200 мкл физиологического раствора или известной транспортной среды, описанной, например, в методических указаниях МУ 1.3.1794-03 (http://base.garant.ru/4180235/1a3794674ba91fb6f13d1885dca9f9e1/ или http://www.lytech.ru/data/file/mu_131974_03.pdf). Затем вносили в емкость полученный вариант заявляемой дозированной формы, нагревали смесь до 60°С, взбалтывали смесь в течение 3 минут до полного распадения полученного варианта заявляемой дозированной формы, инкубировали смесь при 60°С 15 минут (при этих условиях объем смеси не уменьшился), центрифугировали при 12100 g в течение 5 секунд и декантировали надосадочную жидкость. К осадку добавляли 500 мкл 70% этилового спирта, полученную смесь взбалтывали, центрифугировали при 12100 g в течение 5 секунд и декантировали надосадочную жидкость. Осадок высушивали и вносили в емкость 60 мкл бидистиллированной воды или известного элюирующего буфера (http://www.nhm.ac.uk/content/dam/nhmwww/our-science/dpts-facilities-staff/Coreresearchlabs/te-buffer.pdf), полученную смесь взбалтывали, центрифугировали при 12100 g в течение 5 секунд. Надосадочную жидкость использовали для исследования методом классической ПЦР.
При использовании полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с использованием обычно используемых аналогичных жидких реагентов отмечено уменьшение в 3 раза числа ручных манипуляций.
В результате проведения классической ПЦР с использованием полученного варианта заявляемой дозированной формы установлен положительный результат ПЦР с праймерами для Trichiuris trichiuria, что свидетельствует об обеспечении оптимальной концентрации и необходимой для молекулярно-генетических исследований очистки ДНК в подготовленной пробе. Перекрестной контаминации реакционных смесей не выявлено.
Пример 5. Получена дозированная форма для выделения ДНК, включающая ядро, содержащее совместно спрессованные мочевину, натрия хлорид и диоксид кремния, а также сплошную оболочку, состоящую из одного гидрофобного ингредиента - воска, выполненная в виде таблетки с диаметром 3,0 мм и толщиной 3,0 мм. Соотношение мочевины, натрия хлорида и диоксида кремния составляло 76,0 мас. %, 16,0 мас. % и 8,0 мас. %, соответственно.
Полученный вариант заявляемой дозированной формы перед постановкой реакции хранился в течение 2 лет при комнатной температуре.
Для выделения ДНК использовались различные емкости (пробирки объемом от 1,5 мл до 2,5 мл).
Для выделения ДНК биологический материал (материал слизистой оболочки влагалища пациентки, инфицированной Candida albicans) вносили в емкость, содержащую 200 мкл физиологического раствора или известной транспортной среды, описанной, например, в методических указаниях МУ 1.3.1794-03 (http://base.garant.ru/4180235/1a3794674ba91fb6f13d1885dca9f9e1/ или http://www.lytech.ru/data/file/mu_131974_03.pdf). Затем вносили в емкость полученный вариант заявляемой дозированной формы, нагревали смесь до 60°С, взбалтывали смесь в течение 3 минут до полного распадения полученного варианта заявляемой дозированной формы, инкубировали смесь при 65°С 15 минут (при этих условиях объем смеси не уменьшился), центрифугировали при 12100 g в течение 5 секунд и декантировали надосадочную жидкость. К осадку добавляли 500 мкл 70% этилового спирта, полученную смесь взбалтывали, центрифугировали при 12100 g в течение 5 секунд и декантировали надосадочную жидкость. Осадок высушивали и вносили в емкость 60 мкл бидистиллированной воды или известного элюирующего буфера (http://www.nhm.ac.uk/content/dam/nhmwww/our-science/dpts-facilities-staff/Coreresearchlabs/te-buffer.pdf), полученную смесь взбалтывали, центрифугировали при 12100 g в течение 5 секунд. Надосадочную жидкость использовали для исследования методом классической ПЦР.
При использовании полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с использованием обычно используемых аналогичных жидких реагентов отмечено уменьшение в 3 раза числа ручных манипуляций.
В результате проведения классической ПЦР с использованием полученного варианта заявляемой дозированной формы установлен положительный результат ПЦР с праймерами для Candida albicans, что свидетельствует об обеспечении оптимальной концентрации и необходимой для молекулярно-генетических исследований очистки ДНК в подготовленной пробе. Перекрестной контаминации реакционных смесей не выявлено.
Пример 6. Получена дозированная форма для выделения ДНК, включающая ядро, содержащее совместно спрессованные мочевину, натрия хлорид и диоксид кремния, а также сплошную оболочку, состоящую из двух гидрофобных ингредиентов (смеси парафина с воском), выполненная в виде таблетки с диаметром 4,0 мм и толщиной 4,0 мм. Соотношение мочевины, натрия хлорида и диоксида кремния составляло 80,0 мас. %, 10,0 мас. % и 10,0 мас. %, соответственно.
Полученный вариант заявляемой дозированной формы перед постановкой реакции хранился в течение 2 лет при комнатной температуре.
Для выделения ДНК использовались различные емкости (пробирки объемом от 1,5 мл до 2,5 мл).
Выделение ДНК проводили во время работы с образцами, полученными от других пациентов.
Для выделения ДНК биологический материал (кровь больного гепатитом В) вносили в емкость, содержащую 200 мкл физиологического раствора или известной транспортной среды, описанной, например, в методических указаниях МУ 1.3.1794-03 (http://base.garant.ru/4180235/1a3794674ba91fb6f13d1885dca9f9e1/ или http://www.lytech.ru/data/file/mu_131974_03.pdf). Затем вносили в емкость полученный вариант заявляемой дозированной формы, нагревали смесь до 62°С, взбалтывали смесь в течение 3 минут до полного распадения полученного варианта заявляемой дозированной формы, инкубировали смесь при 62°С 15 минут (при этих условиях объем смеси не уменьшился), центрифугировали при 12100 g в течение 5 секунд и декантировали надосадочную жидкость. К осадку добавляли 500 мкл 70% этилового спирта, полученную смесь взбалтывали, центрифугировали при 12100 g в течение 5 секунд и декантировали надосадочную жидкость. Осадок высушивали и вносили в емкость 60 мкл бидистиллированной воды или известного элюирующего буфера (http://www.nhm.ac.uk/content/dam/nhmwww/our-science/dpts-facilities-staff/Coreresearchlabs/te-buffer.pdf), полученную смесь взбалтывали, центрифугировали при 12100 g в течение 5 секунд. Надосадочную жидкость использовали для исследования методом классической ПЦР.
При использовании полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с использованием обычно используемых аналогичных жидких реагентов отмечено уменьшение в 3 раза числа ручных манипуляций.
В результате проведения классической ПЦР с использованием полученного варианта заявляемой дозированной формы установлен положительный результат ПЦР с праймерами для вируса гепатита В, что свидетельствует об обеспечении оптимальной концентрации и необходимой для молекулярно-генетических исследований очистки ДНК в подготовленной пробе. Перекрестной контаминации реакционных смесей не выявлено.