Питательная среда для суспензионного культивирования клеток млекопитающих
NUTRIENT MEDIUM FOR SUSPENSION CULTURING OF MAMMAL CELLS

Область техники, к которой относится изобретение
Область биотехнологии, сфера питательных сред, суспензионного культивирования клеток почки сирийского хомячка (ВНК-21).
Уровень техники
Из литературных данных известны прописи питательных сред для суспензионного культивирования клеток:
- среда Купера (Методические рекомендации по работе с клеточными культурами и средами / Под ред. А.А.Сомниной. - Ленинград. - 1975. - С.38-40),
- специальная среда для культивирования клеток ВНК-21 (Голубев Д.Б., Сомнина А.А., Медведева М.Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. - Л.: Медицина, 1976. С.19),
- среда Мак-Коя для суспензионного культивирования RPMI-1640 (Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии) / Под ред. проф. Дьяконова Л.П., проф. Ситькова В.И. - М.: Компания Спутник, 2000. С.53-55).
В состав перечисленных питательных сред входят: неорганические соли, аминокислоты, витамины, углеводы. Из указанных аналогов наиболее близким к заявляемому изобретению (прототипом) является среда RPMI-1640 (табл.1).
Состав и количество ингредиентов основных питательных сред, используемых для суспензионного культивирования перевиваемой линии клеток почки сирийского хомячка в сравнении с патентуемой питательной средой
Табл.1
Ингредиенты гр/л
Состав сред для суспензионного культивирования клеток
патентуемая среда
среда Купера
среда по Голубеву Д.Б.
RPMI-1640
1
2
3
4
5
Соли
Натрий хлористый - (NaCl)
8,0
5,48
6,4
6,0
Калий хлористый - (КСl)
0,4
0,5
0,4
0,4
Магний сернокислый -(MgSO<sub>4</sub>⋅7H<sub>2</sub>O)
0,2
-
0,2
0,1
Магний хлористый
(MgCl<sub>2</sub>⋅6H<sub>2</sub>O)
-
0,2
-
-
Натрий фосфорнокислый
двузамещенный -
(Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>⋅12H<sub>2</sub>O)
0,15
-
0,12
1,0
Калий фосфорнокислый
однозамещенный - (КН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>)
0,06
-
-
-
Кальций хлористый - (СаСl<sub>2</sub>)
0,14
0,2
0,2
-
Натрий двууглекислый -
(NаHCO<sub>3</sub>)
0,35
2,5
2,75
2,0
Нитрат железа
(Fe(NO<sub>3</sub>)<sub>3</sub>⋅7H<sub>2</sub>O)
-
-
0,0001
-
Хлорид аммония (NH<sub>4</sub>Cl)
-
0,05
-
-
Аминокислоты
1-аргинин НСl
-
0,25
-
-
1-аргинин
0,042
-
0,42
0,2
1-цистин
0,032
-
0,024
-
1-цистин 2НСl
-
-
-
0,065
1-глютамин
0,584
0,1
0,292
0,3
глицин
-
-
-
0,01
1-гистидин
-
-
0,016
-
1-изолейцин
-
-
0,052
0,05
1-лейцин
-
-
0,052
0,05
1-лизин НСl
-
-
0,074
0,04
1-метионин
-
0,1
0,015
0,015
1-фенилаланин
-
-
0,033
0,015
1-серин
-
-
-
0,03
1-треонин
-
-
0,048
0,02
1-тирозин
0,02
-
0,036
0,02
1-триптофан
0,015
-
0,008
0,005
1-валин
-
-
0,047
0,02
аспарагиновая кислота
-
-
-
0,02
глютаминовая кислота
-
063
-
0,02
1-гидроксипролин
-
-
-
0,02
1-пролин
-
-
0,02
1-аспарагин Н<sub>2</sub>O
-
-
-
0,0568
глютацин
-
-
-
0,001
Витамины
холин-хлорид
-
0,001
0,002
0,003
пантотенат кальция
(В<sub>3</sub>)
0,0034
0,001
0,002
0,00025
пиридоксаль⋅НСl
0,0034
-
0,002
-
пиридоксаль 5 фосфат
-
0,001
-
тиамин
(B<sub>1</sub>)
0,0034
0,001
0,002
0,001
мезо-инозит
0,0068
0,01
0,0036
0,035
никотинамид
(B<sub>5</sub>)
0,0034
0,001
-
0,001
рибофлавин
(B<sub>2</sub>)
0,00034
0,0001
0,0002
0,0002
фолиевая кислота
(В<sub>9</sub>)
0,0034
0,001
0,002
0,001
D-биотин
-
0,001
-
0,0002
дрожжевой экстракт Дифко
-
0,001
-
-
Витамин В
-
-
-
0,000005
Антибиотики
бензилпенициллина натриевая
соль (ед.)
1⋅10<sup>5</sup>
-
-
-
канамицина сульфат (ед.)
1⋅10<sup>5</sup>
-
-
-
амфотерицин (ед.)
2⋅10<sup>3</sup>
-
-
-
глюкоза
3,6
6,0
4,5
2,2
гидролизат мышечных белков
ферментативный сухой
ТУ 46. 12.20-80
1,25
-
-
-
гидролизат лактальбумина
ферментативный
N L 0375 по кат.Sigma-
Aldridh Chemie CMBH
1,25
5,0
-
-
сыворотка кр. рог. скота
70,0
100,0
-
-
феноловый красный
-
0,01
0,015
0,053
дистиллированная вода
остальн.
остальн.
остальн.
остальн.
В представленной таблице к существенным отличительным признакам патентуемой питательной среды относится то, что среда дополнительно содержит гидролизат мышечных белков ферментативный сухой и гидролизат лактальбумина ферментативный и только пять аминокислот вместо 20 аминокислот в прототипе.
Раскрытие изобретения
(1) Сведения, раскрывающие сущность изобретения
6
3
(1.1) Сущность изобретения: подобран состав компонентов питательной среды, включающий: гидролизат мышечных белков ферментативный сухой и гидролизат лактальбумина ферментативный; аминокислоты - аргинин, глутамин, тирозин, триптофан и цистин, обеспечивающий накопление клеток при суспензионном культивировании перевиваемой линии ВНК-21 до 3,5⋅10 кл./см.
(1.2.) Техническим результатом заявляемого изобретения является создание экономически выгодной питательной среды для суспензионного культивирования клеток ВНК-21 в условиях массового биопроизводства при изготовлении культуральных вакцин.
Технический результат достигнут введением в состав питательной среды оптимального количественного соотношения компонентов, представленных в таблице 2.
Состав и количество ингредиентов питательной среды для суспензионного культивирования клеток почки сирийского хомячка (ВНК-21) (патентуемая)
Табл.2
N п/п
Наименование компонентов
Количество (гр/л)
Фирма, N серии
Соли
1
Натрий хлористый - (NaCl)
8,0
Россия
1
2
Калий хлористый - (КСl)
0,4
-“-
23
3
Магний сернокислый -(MgSO<sub>4</sub>⋅7H<sub>2</sub>O)
0,2
-“-
9
4
Натрий фосфорнокислыйдвузамещенный -(Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>⋅12Н<sub>2</sub>О)
0,15
-“-
43
5
Калий фосфорнокислыйоднозамещенный - (КН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>)
0,06
-“-
8
6
Кальций хлористый - (СаСl<sub>2</sub>)
0,14
7
Натрий двууглекислый -(NaHCO<sub>3</sub>)
0,35
-“-
7
Аминокислоты
8
1-аргинин
0,042
Sigma
102K0070
9
1-глютамин
0,584
-“-
42K0889
10
1-тирозин
0,02
-“-
78H06822
11
1-триптофан
0,015
-“-
77H13631
12
1-цистин
0,032
-“-
39H1091
Витамины
13
пантотенат кальция (В<sub>3</sub>)
0,0034
-“-
57H11053
14
пиридоксаль⋅НСl
0,0034
-“-
22K16425
15
тиамин (B<sub>1</sub>)
0,0034
-“-
20K09406
16
мезо-инозит
0,0068
-“-
12K0110
17
никотинамид (B<sub>5</sub>)
0,0034
-“-
119H8057
18
рибофлавин (В<sub>2</sub>)
0,00034
-“-
97H0433
19
фолиевая кислота (В<sub>9</sub>)
0,0034
Индия
Антибиотики
20
Бензилпенициллина натриеваясоль (ед)
1⋅10<sup>5</sup>
Россия
318
21
Канамицина сульфат (ед.)
1⋅10<sup>5</sup>
-“-
01-02
22
Амфотерицин (ед.)
2⋅10<sup>3</sup>
-“-
140601
23
глюкоза
3,6
Франция
24
гидролизат мышечных белковферментативный сухойТУ 46. 12.20-80
1,25
ФГУП ЩБК
2-02
25
гидролизат лактальбуминаферментативный
1,25
Sigma 11K1259
26
сыворотка крупного рогатогоскота (мл)
70,0
ФГУП ЩБК 2-04
27
дистиллированная вода
остальное
Осуществление изобретения
Изобретение относится к композиции, в которую входят ингредиенты в соотношениях количества граммов на 1 литр дистиллированной воды, указанных в таблице 2.
Способ получения композиции следующий: навески отдельных компонентов берут, соблюдая правила взвешивания для весов соответствующего класса. Учитывая объем приготавливаемой смеси, допускается взвешивание солей, гидролизатов, глюкозы на весах 3-го класса; навески отдельных аминокислот, витаминов и антибиотиков - на аналитических весах 2-го класса с соблюдением точности до второго знака после запятой.
Процесс приготовления питательной среды заключается в приготовлении солевой основы среды, которой является раствор Хенкса, и растворении в нем антибиотиков, солей, глюкозы, гидролизата мышечных белков ферментативного сухого и гидролизата лактальбумина ферментативного по 1,25 г/л с конечной концентрацией суммы гидролизатов в питательной среде, равной 0,25%, пяти аминокислот, сыворотки, витаминов, бикарбоната натрия.
4
2
2
4
2
2
4
2
Растворение компонентов питательной среды ведут в дистиллированной воде, имеющей температуру 35-40°С, при непрерывном перемешивании. В начале растворяют антибиотики и навески солей поочередно NaCl, KCl, MgSO 7HO, NaHPO 12HO (развести в горячей воде), KHPO до полного растворения предыдущей навески, вносят навеску глюкозы 3,6 гр/л среды. Дополнительно к механическому перемешиванию осуществляют перемешивание сжатым воздухом, т.е. барботированием в течение 10 минут. После растворения навесок убирают барботирование. В глюкозо-солевой раствор осторожно тонкой струйкой при механическом перемешивании вносят хлористый кальций (CaCl) в виде 40%-ного раствора и вновь барботируют. Из указанного в табл.2 количества гидролизата мышечных белков ферментативного сухого и гидролизата лактальбумина ферментативного готовят 10%-ный раствор и вносят его в полученный глюкозо-солевой раствор и растворяют в течение 10 минут перемешиванием и барботированием.
Отдельно растворяют аминокислоты. Растворение навесок проводят последовательно согласно прописи питательной среды в таблице 2. L-цистин и l-тирозин растворяют отдельно в небольшом количестве дистиллированной воды при нагревании до кипения с добавлением по каплям концентрированной соляной кислоты (d=1,19) до полного просветления раствора. Сначала растворяют l-цистин, затем l-тирозин. Если при внесении l-тирозина раствор помутнел, необходимо вновь вносить по каплям концентрированную НСl, до полного растворения навески. Вместо l-цистина можно использовать l-цистин НСl и растворять l-цистин НСl просто в кипящей воде.
Все витамины, кроме рибофлавина и фолиевой кислоты, последовательно растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды комнатной температуры. При этом каждую последующую навеску растворяют только после полного растворения предыдущей. Рибофлавин и фолиевую кислоту растворяют отдельно в небольшом количестве дистиллированной воды комнатной температуры с добавлением по каплям 20%-ного раствора NaOH до полного растворения навесок. Сначала растворяют рибофлавин, затем фолиевую кислоту, при растворении которой необходимо вновь по каплям вносить 20%-ный р-р NaOH до полного просветления раствора.
В глюкозо-солевой раствор вносят растворы аминокислот, витаминов, сыворотку, натрий двууглекислый и перемешивают. После внесения в среду всех необходимых компонентов добавляют дистиллированную воду до необходимого объема, перемешивают, стерилизуют фильтрацией в реактор для культивирования клеток.