Применение способа введения натриевой соли 2-метилтио-6-нитро-1,2-4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-она, дигидрата, обладающей противовирусной активностью, для лечения коронавирусной инфекции COVID-19
APPLICATION OF METHOD FOR ADMINISTRATION OF SODIUM SALT OF 2-METHYLTHIO-6-NITRO-1,2-4-TRIAZOL[5,1-C] -1,2,4-TRIAZIN-7-ONE, DIHYDRATE WITH ANTIVIRAL ACTIVITY, FOR TREATMENT OF CORONAVIRUS INFECTION COVID-19

Заявляемое изобретение относится к области биологически активных соединений,  предназначенных для лечения заболеваний, вызываемых патогенными для человека и животных вирусами, в том числе коронавирусной инфекции COVID-19.
Актуальной проблемой в настоящее время является расширение арсенала средств терапии новой коронавирусной инфекции COVID-19.
Из предшествующего уровня техники известно биологически активное соединение - натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-она, дигидрат, предназначенная для лечения заболеваний, вызываемых патогенными для человека и животных вирусами. Однако действие данного вещества распространяется на определенный список инфекций, вызываемых, в частности, вирусами лихорадки долины Рифт, вирусами ЗЭЛ, парагриппа, респираторно-синцитиального вируса, вируса болезни Ауески, инфекционного ляринготрахеита птиц, вируса гриппа птиц, всего более 10 РНК и ДНК содержащих вирусов Рифт.
Заявляемое изобретение ранее показало хорошую переносимость и безопасность приема [Э.Г. Деев, О.И. Киселев, Т.И. Мельникова, А.А. Шалджан, П.А. Некрасов, А.С. Киселев, К.А. Загородникова, В.Н. Чарушин, В.Л. Русинов, Е.Н. Уламский, О.Н. Чупахин Новый противовирусный препарат «Триазавирин». Результаты I фазы клинического исследования. Эпидемиология и инфекционные болезни, №5, 2013; Киселев О.И., Деева Э.Г., Мельникова Т.И., Козелецкая К.Н., Киселев А.С., Русинов В.Л., Чарушин В.Н., Чупахин О.Н Новый противовирусный препарат Триазавирин. Результаты II фазы клинического исследования. Вопросы вирусологии. – 2012. – № 6. – С. 9-12; Т.В. Сологуб, И.И. Токин, А.С. Мидикари, В.В. Цветков. Сравнительная эффективность и безопасность применения противовирусных препаратов в терапии больных гриппом / Инфекционные болезни, 2017, т.15, N3, с.40-47].
Известно, что период полувыведения натриевой соли 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она, дигидрата, из организма составляет 1-1,5 часа [https://grls.rosminzdrav.ru/].
Была выдвинута гипотеза, что для поддержания постоянной концентрации натриевой соли 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она, дигидрата в крови пациента необходим прием препарата с небольшим временным промежутком между приемами. Было предложено принимать препарат каждые 3 часа, при этом не учитывалось время, необходимое на сон и в среднем составляющее 10 часов. За вычетом времени на сон пациента, была определена необходимая минимальная дозировка риамиловира, которая составила 1250 мг/сутки, при этом дозировка была разделена и рассчитана на прием одной капсулы, содержащей 250 мг активного вещества - натриевой соли 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она, дигидрата 5 раз в сутки.
Для подтверждения высказанной гипотезы были проведены исследования эффективности приема капсул с содержанием 250 мг натриевой солью 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она, дигидратом,  5 раз в сутки у пациентов с подтвержденным диагнозом коронавирусная инфекция COVID-19 со среднетяжелой формой течения болезни.
Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое к защите изобретение, является расширение области применения натриевой соли 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она, дигидрата, обладающей противовирусной активностью, при лечении заболеваний, вызываемых патогенными для человека и животных вирусами, в частности, новой коронавирусной инфекцией COVID-19.
Указанный технический результат достигается за счет применения натриевой соли 2-метилтио-6-нитро-1,2-4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-она, дигидрата, обладающей противовирусной активностью, при лечении новой коронавирусной инфекции COVID-19 путем пятикратного приема в сутки по одной капсуле препарата риамиловир, содержащей 250 мг натриевой соли 2-метилтио-6-нитро-1,2-4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-она, дигидрата с общей дозировкой 1250 мг/сутки, при этом временной интервал между приемами препарата составляет 3 часа.
Известно, что натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она, дигидрат является основным компонентом (активным веществом) лекарственного средства - препарата риамиловир (торговое наименование «Триазавирин»), которое промышленно выпускается с содержанием по 250 мг в капсуле.
По результатам проведенных исследований была установлена не только высокая эффективность и хорошая переносимость 5-кратного приема препарата риамиловир в сутки, но и существенное сокращение сроков лечения COVID-19 до 5 суток, что при лечении в условиях пандемической инфекции имеет большое значение.
Благодаря предложенной схеме лечения препаратом с активным веществом натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она, дигидрат, обладающей противовирусной инфекцией, также было достигнуто увеличение скорости элиминации вируса SARS CoV-2. У подавляющего большинства пациентов, участвовавших в исследовании,  уже к 7-ому дню проведения терапии вирус не был обнаружен, а к 14-ому дню значительная часть пациентов со среднетяжелым течением заболевания была выписана из медицинского учреждения.
При этом курс сопутствующей терапии пациентов со среднетяжелым течением заболевания проводился с меньшим объемом применения жаропонижающих и противокашлевых препаратов.
На первом этапе исследования была образована группа, состоящая из 59 пациентов мужского и женского пола, поступивших на стационарное лечение в клинику инфекционных болезней с подтвержденным диагнозом новой коронавирусной инфекцией COVID-19. Средний возраст пациентов составил 34,2 года. Степень тяжести заболевания на момент госпитализации была сопоставимой и соответствовала среднетяжелому состоянию.
Включение пациентов в группу исследования осуществлялось на основании следующих критериев:
- наличие инфекции, вызванной SARS-CoV-2 и подтвержденной методом ПЦР;
- наличие изменений в органах грудной клетки (ОГК), подтвержденных результатами обследования с помощью компьютерной томографии (КТ) и  соответствующих вирусному поражению легких минимального или среднего объема (КТ 1-2);
- наличие у пациентов на момент госпитализации признаков общей инфекционной интоксикации, синдромов поражения респираторного тракта, аносмии и/или агевзии, лихорадки >37°С;
- длительность симптомов протекания болезни на момент включения в группу исследования не превышающая 72 часов (трех суток);
- подписанное информированное согласие на проведение исследования.
Исключением из группы исследования являлось:
- участие пациента в течение последних трех месяцев с даты поступления в инфекционную клинику в других исследованиях, в которых были применены иные лекарственные препараты;
- наличие у пациентов в течение последних трех месяцев острых и/или  хронических заболеваний почек, печени и сердца, подтвержденных результатами анамнеза жизни и скрининговых результатов исследований, проведенных перед началом терапии против COVID-19;
- наличие у пациента аллергии на компоненты применяемого в исследовании лекарственного препарата риамиловир с активным веществом натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она, дигидрат.
Все участники исследований были разделены на две группы: опытную - в количестве 29 пациентов, и контрольную (группа сравнения) - в количестве 30 пациентов.
Для опытной группы из 29 пациентов дополнительно к стандартной терапии, патогенетической и симптоматической терапии установленным порядком по решению врачебной комиссии был назначен этиотропный противовирусный препарат риамиловир в режиме «off-label» в дозировке 1250 мг в сутки путем приема по 250 мг 5 раз в сутки в течение 5 дней, при этом временной интервал между приемами единичной дозы препарата составлял 3 часа.
Контрольной группе из 30 пациентов к стандартной терапии дополнительно было назначено применение комбинации препаратов, состоящей из  умифеновира и рибавирина. Применение комбинации осуществлялось по схеме:  по 200 мг каждого из препаратов 4 раза в сутки в течение 5 дней.
Клиническая эффективность терапии в обеих группах оценивалась по следующим критериям:
- длительность синдрома общей инфекционной интоксикации;
- длительность лихорадки;
- длительность синдромов и симптомов поражения респираторного тракта в виде ринита, фарингита, трахеита, бронхита, кашля;
- длительность аносмии и агевзии;
- уровень насыщения крови кислородом (SpO2%) в динамике;
- значения параметров общеклинического анализа крови (количество эритроцитов, уровень гемоглобина, абсолютное число лейкоцитов, лимфоцитов, количество тромбоцитов, СОЭ) на контрольных точках;
- некоторые показатели биохимического статуса пациента, в частности, уровень СРБ, ферритина, прокальцитонина на контрольных точках;
- скорость элиминации вируса по результатам ПЦР назофаринегеальных и орофарингеальных мазков.
В качестве критериев безопасности регистрировались нежелательные явления – любые неблагоприятные с медицинской точки зрения события, возникающие во время или после приема используемых препаратов, при этом степень тяжести таких неблагоприятных событий оценивалась по стандартизированной шкале CTCAE и динамике уровней аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) в сыворотке крови.
Длительность общеинфекционных синдромов, продолжительность синдромов и симптомов поражения респираторного тракта оценивались в размерности «сутки».
Уровень насыщения крови кислородом оценивался ежедневно в течение всего периода пребывания пациента в клинике.
Общеклинические и биохимические исследования крови выполняли на двух контрольных точках: при поступлении пациента на стационарное лечение в инфекционную клинику и на 7-е сутки его пребывания в ней. Молекулярно-генетическое исследование (ПЦР) выполнялось в период с 6-ого по 14-й день госпитализации.
Анализ собранных данных осуществлен с использованием статистических методов.
Выбор t-критерия Стьюдента обоснован тем, что исследование было проведено в двух независимых группах со статистическими показателями, распределенными по нормальному закону. Уровнем статистической значимости теста выбрана вероятность ошибки первого рода, меньшая или равная 0.05 (p≤0.05).
Обработка полученных результатов проведена на персональном компьютере с использованием библиотеки SсiPy из состава дистрибутива для научных исследований Anaconda 3.
Результаты исследования представлены в Таблицах.
Длительность основных клинических синдромов и симптомов заболевания в зависимости от проведенного лечения, сутки (M±SD), представлена в Таблице 1.
Таблица 1
Клинический синдром (симптом)
Прием риамиловира(опытная группа из n=29 пациентов)
Прием умифеновира+рибавирина(контрольная группа изn=30 пациентов)
Общая длительность лихорадки
5.88±1.71*
7.75±1.68*
Фебрильная лихорадка
2.6±1.05*
5.82±1.11*
СОИИ
6.72±2.37
7.84±2.67
Кашель
3.08±1.78*
6.46±2.83*
Ринит
3.66±0.44
4.5±1.21
Фарингит
3.75±0.22
6.01±1.87
Трахеит
-
1.5±0.4
Аносмия
3.28±1.66*
10.0±2.14*
Агевзия
-
8.5±3.5
Элиминация вируса(день)
7.11±2.26*
12.92±3.95*
* – p<0.05.
Из приведенных в Таблице 1 результатов следует, что в опытной группе наблюдалось статистически значимое уменьшение общей длительности лихорадки - 5.88±1.71 сут., длительности фебрильной лихорадки (2.6±1.05 сут.), кашля (3.08±1.78 сут.), аносмии (3.28±1.66 сут.), а также более быстрая элиминация вируса из верхних отделов респираторного тракта по результатам ПЦР (7.11±2.26 сут., 12.92±3.95 сут. соответственно).
Необходимо отметить, что средние значения уровня насыщения артериальной крови кислородом на контрольных точках, в качестве которых были определены 0-й и 7-й дни терапии, у пациентов из обеих групп практически не различались и соответствовали нормальному уровню содержания кислорода в крови: 97.36±0.59%  - для опытной группы и 96.44±0.18% - для контрольной группы соответственно.
Сравнительный анализ влияния проводимых схем лечения с применением противовирусных препаратов на динамику исследуемых показателей крови показал, что в опытной группе, принимавшей риамиловир, среднее значение СОЭ 15.95±13.71 мм/ч нормализовалось на 7-й день госпитализации и было статистически значительно ниже, чем в контрольной группе - 32.89±14.32 мм/ч, принимавшей комбинацию умифеновира+рибавирина, соответственно. В тоже время, в момент поступления в клинику исходный уровень СОЭ изначально был выше у пациентов контрольной группы 24.86±12.67 мм/ч против 14.03±5.61 мм/ч - в опытной.
Оценка результатов биохимического исследования крови приведена в Таблице 2.
Таблица 2Значения биохимических показателей анализа крови у больных инфекцией COVID-19 в зависимости от проводимого лечения (M±SD)
Показатель
0 день
7 день
Прием риамиловира(опытная группа, количество пациентов n=29)
Прием умифеновира+рибавирина(контрольная группа, количество пациентов n=30)
Прием риамиловира(опытная группа, количество пациентов n=29)
Прием умифеновира+рибавирина(контрольная группа, количество пациентов n=30)
Ферритин (нг/мл)
271.58±149.31
247.78±198.95
40.21±12.82*
149.12±68.27*
Прокальцитонин (нг/мл)
0.09±0.01
0.08±0.03
0.06±0.03
0.03±0.02
С-реактивный белок (мг/л)
32.45±15.81
43.24±33.64
21.58±1.66
17.46±2.04
АЛТ (Ед/л)
30.82±12.09
25.27±23.06
48.91±11.47*
163.03±45.47*
АСТ (Ед/л)
27.81±7.43
30.21±13.65
28.08±2.12*
86.65±25.55*
* – p<0.05
По результатам статистического анализа было установлено, что значение ферритина в крови пациентов опытной группы на 7-е сутки госпитализации статистически значительно ниже, чем у пациентов в контрольной группе, соответственно, 40.21±12.82 против 149.12±68.27. При этом на момент поступления пациентов обеих групп в инфекционную клинику значения данного показателя были сопоставимы и превышали значения нормы (до 150 мкг/л).
Изучение динамики показателей трансаминаз на протяжении всего периода терапии пациентов в клинике показало, что активность АЛТ в контрольной группе на 7-е сутки госпитализации была статистически значительно выше, чем на момент назначения лечении: 25.27±23.06 Ед/л против 163.03±45.47 Ед/л и превышала границы нормы - референсные значения, равные 8-20 Ед/л.
Активность АСТ также статистически отличалась в сравниваемых группах на 7-й день пребывания в клинике и составила для опытной и контрольной группы 28.08±2.12 Ед/л и 86.65±25.55 Ед/л соответственно, при этом референсные границы для данного показателя составляли 8-20 Ед/л.
Нежелательных проявлений в опытной группе пациентов во время приема противовирусного препарата риамиловир выявлено не было. В группе сравнения дополнительных жалоб также отмечалось. Основным результатом проведенного этапа исследований являлось установление связи между применением риамиловира и сроками получения отрицательного результата ПЦР-тестирования. Так, в опытной группе такая зависимость определяется как 7.11±2.26/сутки, в контрольной - 12.92±3.95/ сутки.
Проведенные исследования анализа биохимических показателей крови пациентов выявили статистически значимое снижение уровня ферритина в сыворотке пациентов, которые принимали риамиловир  в дозе 271.58±149.31 нг/мл при поступлении и 40.21±12.82 нг/мл на 7-е сутки госпитализации. Полученные данные выполненных исследований свидетельствуют о том, что повышение уровня сывороточного ферритина коррелируется с выраженностью воспалительного ответа, и при неконтролируемом течении инфекции он превращается из звена защитной реакции в мощный противоспалительный фактор. Контроль уровня ферритина в этих условиях может выполнять  важнейшую функцию для предотвращения развития цитокинового шторма.
Кроме того, прием риамиловира впервые был реализован в режиме дозирования 1250 мг в сутки  - 5 капсул препарата, каждая из которых содержит по 250 мг натриевой соли 2-метилтио-6-нитро-1,2-4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-она, дигидрата, в сутки, принимаемый с промежутком в 3 часа. При этом в опытной группе показатели печеночных трансаминаз после терапии сохранялись на низком уровне и на 7-е сутки госпитализации незначительно превышали верхнюю границу нормы: 48.91±11.47 Ед/л для АЛТ и 28.08±2.12 для АЛТ соответственно, что указывает на низкую гепатотоксичность риамиловира.
На втором этапе наблюдений было проведено дополнительное исследование влияния противовирусной терапии риамиловиром на скорость элиминации SARS-CoV-2 и длительность госпитализации пациентов со среднетяжелым течением заболевания COVID-19, при этом были проанализированы данные 69 историй болезни пациентов мужского и женского пола с инфекцией, вызванной SARS-CoV-2.
Опытную группу составили 34 пациента, которым дополнительно к стандартной терапии установленным порядком по решению врачебной комиссии был назначен препарат риамиловир в режиме «off-label» в дозировке 1250 мг в сутки (250 мг 5 раз в день) в течение 5 дней.
Контрольную группу (группу сравнения) составили 35 пациентов, получавших в дополнение к стандартной терапии комбинацию препаратов умифеновира с рибавирином по 800 мг в сутки для каждого из препаратов в течение 5 дней. Сравниваемые группы пациентов были сопоставимы по основным антропометрическим показателям и возрасту.
Забор орофарингеального и назофарингеального отделяемого для ПЦР-исследования выполняли ежедневно в период с 6-ого по 14-й день госпитализации пациента до получения отрицательного результата.
Клиническим улучшением, которое характеризовалось купированием лихорадки, нормализацией лабораторных показателей крови, отсутствием дыхательной недостаточности, считали выписку пациента к 14-м суткам нахождения в мед. учреждении. Другим конечным показателем являлась санация от вируса SARS-CoV-2 по результатам ПЦР отделяемого со слизистой носоглотки и ротоглотки к 7-м суткам госпитализации.
При сравнении двух исследуемых групп был использован метод анализа рисков. Статистические гипотезы были сформулированы следующим образом:
1) применение риамиловира по сравнению с терапией комбинацией умифеновиром с рибавирином повышает вероятность клинического улучшения пациента к 14-м суткам госпитализации;
2) применение риамиловира по сравнению с терапией с умифеновиром с Рибавирином повышает вероятность получения первого отрицательного ПЦР теста на 7-й день госпитализации.
Обработка полученных результатов была проведена на персональном компьютере с использованием дистрибутива языка Python для научных исследований Anaconda 3. Визуализация данных осуществлялась с использованием библиотеки Matplotlib.
Средний возраст пациентов, включенных в исследование, составил 35,5 лет, при этом 79,7% из них были лицами мужского пола. У всех пациентов перед началом терапии отмечалась лихорадка ≥37,5°С. Статистически значимых различий между сравниваемыми параметрами на момент поступления пациентов в клинику не было.
Полученные данные наблюдений приведены в  Таблице 3.
Таблица 3Демографические и некоторые клинические характеристики пациентов, включенных в исследование на момент поступления в клинику
Характеристика
Всего пациентовn=69
Показатели  пациентов, принимавших риамиловир(опытная группа, количество (n) пациентов =34
Показатели  пациентов, принимавших умифеновир+рибавирин(контрольная группа, количество пациентов (n)=35
Возраст, лет (M±SD)
35,54±2,91
39,33±2,76
31,75±3,23
Мужской пол, случаев (%)
55 (79,7)
25 (73,5)
30 (85,7)
Температура тела, °С (M±SD)
37,96±0,75
38,01±0,59
37,92±0,87
Лейкоциты (х10<sup>9</sup>/л), (M±SD)
7,28±1,35
5,76±0,85
8,81±1,54
Лимфоциты (х10<sup>9</sup>/л), (M±SD)
1,6±0,04
1,3±0,02
2,08±0,01
Тромбоциты (х10<sup>9</sup>/л), (M±SD)
224±13,45
228,39±15,01
219,61±11,74
АСТ (ЕД/л), (M±SD)
29,26±4,27
28,36±3,12
30,21±5,41
АЛТ (ЕД/л), (M±SD)
29,37±3,24
32,19±4,34
26,54±2,14
Для проверки гипотез из данных, полученных из историй болезней пациентов, были сформированы Таблицы сопряженности 4, 5.
Таблица 4Влияние противовирусной терапии риамиловиром и Умифеновиром+Рибавирином на срок выписки со среднетяжелым течением заболевания COVID-19
Выписан к 14 дню госпитализации (количество пациентов)
Не выписан к 14 дню госпитализации (количество пациентов)
Всего
Риамиловир
21
13
34
Умифеновир + Рибавирин
11
24
35
Всего
32
37
69
Таблица 5Влияние противовирусной терапии риамиловиром и  умифеновиром+рибавирином на частоту появления отрицательного результата ПЦР отделяемого со слизистой носоглотки и ротоглотки к 7 суткам госпитализации
Отрицательный результат к 7 суткам госпитализации
Положительный результат к 7 суткам госпитализации
Всего
Риамиловир
26
8
34
Умифеновир + Рибавирин
10
25
35
Всего
36
33
69
По данным, приведенным в Таблицах 4, 5, был произведен расчет коэффициента относительных рисков и 95%-ного доверительного интервала.
hyp1
Для гипотезы 1 коэффициент относительного риска равен RR=1.93,
hyp1
с доверительным интервалом CI = [1.11, 3.37].
hyp2
hyp1
Для гиптотезы 2 коэффициент относительного риска равен RR=2.53 c доверительным интервалом CI = [1.4, 4.6].
Для обеих гипотез коэффициент относительного риска оказался больше 1, а верхние и нижние границы доверительных интервалов принадлежат интервалу от 1 до +∞. Рассчитанные статистические параметры позволяют утверждать, что обе статистические гипотезы являются достоверными с вероятностью ошибки p<0.05.
У пациентов опытной группы, получавших риамиловир, клиническое улучшение наступало статистически значительно быстрее, чем в контрольной группе. Средний срок госпитализации для опытной группы составил 13,7±4,72 дней против 19,8±6,82 дней для контрольной группы.
Кроме того, в опытной группе наблюдалась более быстрая элиминация вируса из верхних дыхательных путей по результатам ПЦР - 8±3,39 дней против 14,8±4,14 дней в контрольной группе.
Проведенное исследование показало, что раннее начало терапии (до 72 часов от момента появления первых клинических симптомов заболевания COVID-19)  противовирусной терапии пациентов с применением риамиловира по сравнению с терапией, при которой применяют комбинацию умифеновира с рибавирином, в дополнение к стандартной терапии было ассоциировано со статистически значимым клиническим улучшением и ускорением сроков элиминации вируса со слизистых оболочек верхних дыхательных путей, что было подтверждено полученными данными молекулярно-генетического исследования.
Таким образом, в результате выполненных исследований были получены клинические, лабораторные, рентгенологические данные об эффективности применения противовирусного препарата риамиловир при лечении новой коронавирусной инфекции COVID-19. Полученные данные подтвердили гипотезу об отсутствии нежелательных побочных явлений при лечении риамиловиром  пациентов с Covid-19, что свидетельствует о хорошей переносимости данного препарата.
Применение натриевой соли 2-метилтио-6-нитро-1,2-4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-она, дигидрата, обладающей противовирусной активностью, эффективно при терапии новой коронавирусной инфекции COVID-19, при этом сроки лечения  значительно сокращаются.