НОСИТЕЛЬ ДЛЯ ОПТИЧЕСКОГО ДЕТЕКТИРОВАНИЯ В МАЛЫХ ОБЪЕМАХ ОБРАЗЦА
CARRIER FOR OPTICAL DETECTION IN SMALL SAMPLE VOLUMES

Данное изобретение относится к носителю и устройству для детектирования в образце в камере для образца (проб). Кроме того, оно касается использования подобного носителя и подобного устройства, а также способа детектирования магнитных частиц.
В заявке US 2005/0048599 A1 раскрыт способ исследования микроорганизмов, помеченных частицами, так чтобы на них могла воздействовать (например, магнитная) сила. В одном варианте осуществления данного способа световой пучок направлен через прозрачный материал к оптическому интерфейсу, определяемому переходом от прозрачной среды в другой, оптически менее плотный материал, где происходит его полное внутреннее отражение. Это световое излучение, проникающее в оптически менее плотную среду, как быстро затухающая волна рассеивается микроорганизмами, молекулами и/или другими компонентами на оптическом интерфейсе, а затем детектируется фотодетектором или используется для подсвечивания микроорганизмов в целях визуального наблюдения.
В международной публикации WO 2004/113886A описана опора, в частности, оптический диск, имеющая поверхностную структуру для детектирования, по меньшей мере, одного оптически-активного вещества в быстро затухающем поле на одной поверхности опоры, при этом поверхностная структура позволяет генерировать быстро затухающее поле в среде, прилегающей к поверхностной структуре. Поверхностная структура содержит одну или несколько секций поверхности опоры, которые являются наклонными по отношению к общей ориентации поверхности опоры. Изобретение также относится к устройству, в котором используется такая опора с поверхностной структурой, в частности оптический диск, и областей применения опоры с поверхностной структурой.
На основе этого, задача настоящего изобретения заключалась в создании средства для оптического детектирования в образце, при этом желательно, чтобы детектирование могло быть ограничено малыми объемами, предпочтительно объемами с протяженностью от 1 до 1000 мкм.
Решение этой задачи достигается носителем по п.1 формулы изобретения, устройством по п.2, устройством по п. 13. Предпочтительные варианты осуществления раскрыты в зависимых пунктах формулы изобретения.
Носитель по настоящему изобретению предназначен для оптического детектирования в образце, расположенном в прилегающей камере для образца, т.е. в пространстве вне носителя. В данном контексте термин «детектирование» может подразумевать любой вид взаимодействия света c образцом. Детектирование может предпочтительно содержать качественное или количественное детектирование (обнаружение) целевых компонентов, содержащих маркирующие частицы, при этом целевые компоненты могут быть, например, биологическими веществами, такими как биомолекулы, комплексные соединения, клеточные фракции или клетки. Носитель обычно выполняется, по меньшей мере, частично из прозрачного материала, например, стекла или полистирола, чтобы обеспечить распространение света заданного (в частности видимого, УФ и/или инфракрасного) спектра. Он содержит на своей поверхности оптическую структуру, которая может преломлять поступающий световой пучок, который сталкивается с упомянутой структурой с внутренней стороны носителя, во внешнее прилегающее пространство, т.е. в камеру для проб. Кроме того, оптическая структура может собирать выходной световой пучок, падающий на нее из внешнего пространства, т.е. из камеры для образца, которая содержит световое излучение, образуемое входным световым пучком. Этот сбор входного светового пучка становится возможным одновременно с преломлением входного светового пучка, т.е. при тех же самых рабочих условиях. Фотоны входного светового пучка могут непосредственно переходить в входной световой пучок; однако они также могут преобразоваться каким-то образом, например, путем поглощения и повторной эмиссии, вынужденной эмиссии или рассеивания, перед тем как они внесут свой вклад в выходной световой пучок.
Вследствие двойного преломления света на оптическом интерфейсе, свет перенаправляется в направлении, откуда он изначально пришел. Основным преимуществом такой геометрии является то, что детектирование светового излучения может быть осуществлено с той же стороны, что и освещение, т.е. детектирование светового излучения не блокируется какими-либо структурами, расположенными поверх носителя (например, конечной толщиной пробного флюида как таковой либо накладной пластиной, необходимой для управления потоком флюида по подложке носителя)
Кроме того, осуществляя повторный сбор дважды преломленного светового пучка для детектирования, равным образом можно использовать оптическую структуру только для возбуждения малого по глубине объема поверх подложки носителя и осуществить детектирование с помощью другого средства детектирования в направлении, отличном от направления преломленного светового пучка (например, используя темнопольное детектирование рассеянного или фотолюминесцентного светового излучения, исходящего из исследуемого объема, которое возбуждено с использованием оптической структуры, например, используя микроскоп, поле обзора которого направлено перпендикулярно подложке носителя, либо с нижней, либо с верхней стороны подложки).
Описанный носитель имеет преимущество в создании поверхностной структуры, которая способна излучать входное световое излучение в прилегающий образец и одновременно осуществлять повторный сбор этого светового излучения после его взаимодействия с образцом. Следует отметить в данном контексте, что входящее или входное световое излучение в действительности испускается (преломляется) в камеру для проб и может распространяться в ней на произвольное расстояние, в зависимости от действительной преломляющей геометрии заявленной подложки носителя. Следовательно, оно может охватывать больший объем, чем затухающие волны, сгенерированные в процессе полного внутреннего отражения светового пучка, и которые экспоненциально затухают на очень коротких расстояниях порядка десятков нанометров. Объемы, зондируемые испускаемым световым пучком, тем не менее, остаются на микроскопическом уровне, поскольку повторный сбор входного светового излучения происходит в самой поверхностной структуре.
Точная глубина (высота), на которой проводятся исследования, или исследуемый объем зависят от размера частиц, введенных в этот объем. Настоящее изобретение в особенности позволяет исследовать лишь монослой молекул или частиц, биохимически связанных с поверхностью. В этой связи глубина (высота) исследуемого объема составляет величину порядка диаметра частиц, которые требуется исследовать. Увеличение размера исследуемого объема приведет к нежелательному детектированию частиц, присутствующих в оптически менее плотной среде, которые биохимически не связаны с поверхностью. Увеличенные по размеру исследуемые объемы могут, однако, быть использованы, если несвязанные частицы удалены до проведения детектирования на этапе (магнитного) смыва.
Изобретение дополнительно касается устройства для оптического детектирования в образце в камере для образца, содержащего:
а) носитель вышеописанного типа, т.е. с оптической структурой на своей поверхности, способной преломлять входной световой пучок в прилегающую камеру для образца и одновременно способной собирать выходной световой пучок из упомянутой камеры для образца;
b) световой источник для излучения светового пучка через носитель в направлении оптической структуры носителя. Световой источник может представлять собой лазер или светоизлучающий диод (СИД), при необходимости обеспеченные некоторой оптикой для формирования и направления входного светового пучка.
Устройство содержит в качестве существенной своей составляющей носитель вышеописанного типа. Таким образом, приводится описание данного носителя для получения большей информации о деталях и преимуществах упомянутого микроэлектронного измерительного устройства.
Уже упоминалось, что преимуществом данного изобретения является создание средства для исследования ограниченных малых объемов образца, расположенных вблизи границы раздела, где, например, может происходить биохимическая реакция. В предпочтительных вариантах осуществления световое излучение, собранное в качестве выходного светового пучка оптической структурой на носителе, прошло расстояние менее 1000 мкм, предпочтительно менее 100 мкм, наиболее предпочтительно менее 10 мкм через внешнее пространство носителя, т.е. через камеру для образца. Таким образом, выходной световой пучок будет содержать информацию о событиях, которые имели место в малом объеме, составляющем обычно долю микролитра, прилегающем к оптической структуре. Предпочтительная глубина исследуемого объема зависит от частиц (молекул, макроскопических меток), подвергаемых исследованию. Для макроскопических детектируемых меток (таких как магнитные или флуоресцентные магнитные гранулы с характерным диаметром от 100 до 2000 нм) глубина исследуемого объема обычно в 1-10 раз превышает диаметр исследуемых частиц.
В предпочтительном варианте осуществления оптическая структура носителя содержит, по меньшей мере, одну грань, которую в дальнейшем будем называть «гранью возбуждения», через которую световое излучение входного светового пучка может быть излучено в прилегающую камеру для образца, а также, по меньшей мере, одну соответствующую грань, в дальнейшем называемую «гранью сбора», через которую излученное световое излучение может быть повторно собрано (в той мере, в которой оно могло распространяться без искажений через камеру для образца). При такой конструкции пространство между гранью возбуждения и гранью сбора образует объем, зондируемый входным световым пучком. Такие процессы как поглощение и рассеивание, имеющие место в этом объеме, окажут влияние на количество и/или спектр светового излучения входного светового пучка, которое может быть повторно собрано гранью сбора. Упомянутые количество/спектр, таким образом, содержат информацию о подобных событиях и вещества, которые их вызывают. При иной конфигурации, например, с использованием темнопольного детектирования в направлении, перпендикулярном носителю, рассеянное или флуоресцентное световое излучение может быть собрано из исследуемого объема с использованием как грани возбуждения, так и грани сбора.
Выходной световой пучок дополнительно может содержать световое излучение, вызванное фотолюминесценцией (т.е. флуоресценцией и/или фосфоресценцией), стимулированной в образце в камере для образца входным световым пучком. В этом случае оптическая структура предпочтительно выполнена так, что лишь ограниченный (малый) суб-объем камеры для образца возбуждается входным световым пучком и/или только фотолюминесцентное световое излучение из такого ограниченного объема собирается в выходном световом пучке. Выходной световой пучок может содержать дополнительное световое излучение, обусловленное непосредственно входным световым пучком.
Оптическая структура, обладающая требуемыми признаками, может быть выполнена различными путями. В предпочтительном варианте осуществления оптическая структура содержит, по меньшей мере, одно отверстие или канавку на поверхности носителя (при этом материал носителя в этой области должен быть прозрачным). Вместо описания подобной оптической структуры наличием отверстия или канавок, ее можно равным образом охарактеризовать наличием соответствующих гребней, ребер и т.п. Часть поверхности отверстия/канавки, облучаемая входным световым пучком, будет работать как грань возбуждения, через которую входной световой пучок преломляется в прилегающую камеру для образца; оставшаяся поверхность отверстия/канавки обычно будет работать как грань сбора, через которую собирается световое излучение, порожденное в камере образца. Если рассматривать прохождение входного светового пучка через камеру образца, грань сбора обычно будет располагаться противоположно грани возбуждения. При такой схеме оптической структуры обычно будет существовать объем внутри отверстия или канавки, задействованный входным световым пучком. Размер этого объема, таким образом, может произвольно адаптироваться путем выбора соответствующих размеров отверстия/канавки. Отверстия/канавки, в частности, могут представлять собой треугольные или трапецеидальные призматические структуры.
Вышеупомянутые отверстие или канавка предпочтительно имеют глубину около 0,01 мкм и 1000 мкм, предпочтительно от 0,1 мкм до 2 мкм. Такие размеры, например, пригодны для исследования магнитных интерактивных гранул, которые часто используются в биосенсорах для маркировки целевых компонент и обеспечения манипулирования ими с помощью магнитных сил.
Отверстие или канавка на поверхности носителя предпочтительно имеют сечение с двумя противоположно наклоненными противолежащими гранями. Такое сечение, в частности, может быть реализовано треугольным или трапецеидальным сечением. Световое излучение, эмитированное одной из граней, далее может быть повторно собрано противолежащей гранью.
В то время как в приведенных вариантах осуществления содержится случай, когда присутствует лишь одно отверстие или одна канавка, оптическая структура предпочтительно содержит множество таких отверстий или канавок, расположенных по упорядоченной или неупорядоченной схеме. Размеры одиночных отверстий/канавок в этом случае определяют протяженность подверженного оптическим манипуляциям объема образца в направлении, перпендикулярном поверхности носителя, в то время как размер схемы расположения всех отверстий/канавок определяет протяженность этого объема образца в направлениях, параллельных поверхности носителя. Кроме того, все отверстия/канавки могут иметь одинаковую форму, или они могут иметь различную форму. В последнем случае предпочтительно, чтобы форма (например, охарактеризованная наклоном граней канавок) варьировалась непрерывно в одном или двух направлениях вдоль поверхности носителя, создавая, таким образом, квазиконтинуум оптических условий на поверхности.
Носитель может дополнительно содержать контактную поверхность с множеством изолированных областей исследования, имеющих описанные оптические структуры. Детектирование в образце с оптическими структурами в этом случае может происходить одновременно в нескольких отдельных областях исследования.
Согласно дополнительному развитию изобретения оптическая структура имеет покрытие из участков связывания для целевых компонентов образца. Такие участки связывания, например, могут представлять собой биологические молекулы, которые специальным образом связаны с определенными молекулами в образце.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения устройство содержит генератор магнитного поля для генерирования магнитного поля в камере для образца. Посредством такого магнитного поля имеется возможность прикладывать силу к магнитным частицам (например, гранулам) и перемещать их требуемым образом. Сгенерированное магнитное поле может, в частности, быть временно модулировано заданным образом, например, так, чтобы создавать вращающий момент магнитного поля в камере образца. Магнитные частицы с несферическими характеристиками при этом будут перемещаться в соответствии с модулированным полем, например, вращаться, что может быть зарегистрировано в виде характеристических показателей модуляции сигналов датчика.
По другому варианту осуществления вышеупомянутое магнитное поле может быть по существу параллельным поверхности носителя. Цепочки или колонны из множества магнитных частиц, которые часто образуются под влиянием внешнего магнитного поля, при этом будут ориентированы параллельно поверхности носителя. Таким образом, сигнал от одиночной магнитной частицы, связанной с поверхностью носителя, может быть усилен дополнительными магнитными частицами, которые в магнитном отношении связаны с ней в упомянутой цепочке. Особенно при низкой концентрации связанных магнитных частиц этот процесс может существенно повысить чувствительность детектирования.
Эффект преломления оптической структурой входного светового пучка в прилегающую камеру для образца требует наличия соответствующих оптических условий, а именно показатели преломления носителя и прилегающего образца, также как и угол падения входного светового пучка должны лежать в соответствующем диапазоне, при котором преломление может иметь место. Угол падения и показатель преломления для носителя могут быть зафиксированы при создании конструкции устройства; однако показатель преломления образца будет различным при применении устройства в зависимости от материала образца, подвергаемого манипуляциям. Конечная зависимость поведения устройства от показателя преломления материала образца может быть разработана для получения информации о материале в камере для образца. Для этой цели существует возможность разработать устройство (главным образом путем выбора угла падения входящего светового пучка относительно нормали к поверхности преломляющей грани, а также показателя преломления носителя), так чтобы:
а) по меньшей мере, часть входного светового пучка преломлялась в камеру для образца (как предполагается в вышеописанных вариантах осуществления), если камера для образца содержит среду с показателем преломления, лежащим в первом заданном интервале;
b) упомянутая часть входного светового пучка не преломлялась в камеру для образца, а полностью внутренне отражалась оптической структурой, если камера для образца содержит среду с показателем преломления, лежащим во втором интервале (отличном от первого интервала).
Следует отметить, что вышеупомянутые условия а) и b) могут существовать только в заданном месте или в заданной подобласти оптической структуры или для всей оптической структуры в целом.
Наблюдаемые воздействия на входной световой пучок, т.е. либо его преломление в камеру для образца, либо его полное внутреннее отражение, позволяют сделать заключение о показателе преломления материала в камере для образца, т.е. самого материла.
Особенно важное применение такого подхода заключается в возможности детектирования увлажнения, при котором распознается, находятся ли контактная поверхность и оптическая структура в должном контакте с жидким образцом, или они являются сухими (т.е. в контакте с воздухом, заполняющим полностью камеру для образца, либо с пузырьками газа, препятствующими контакту образца с контактной поверхностью). Кроме того, датчик увлажнения может предоставить информацию о скорости заполнения измерительного объема/камеры, что может дать информацию, например, о вязкости, температуре и т.д.
Устройство может дополнительно содержать фотоприемник для определения характеристического параметра светового излучения, порождаемого входным световым пучком, в частности, характеристического параметра выходного светового пучка. Фотоприемник может содержать любой соответствующий датчик или множество датчиков, с помощью которых можно детектировать световое излучение заданного спектра, например 1D- или 2D-матрицу датчиков, одноточечные или многоточечные фотодиоды, фоторезисторы, фотоэлементы, CCD- или CMOS-микросхемы или фотоэлектронный умножитель. Световое излучение, детектируемое фотоприемником, может, в частности, представлять собой входное световое излучение, которое не попадает в камеру для образца, например, в силу своего полного внутреннего отражения на оптической структуре; оно может представлять собой входное световое излучение, поступившее в камеру образца путем преломления, но которое не было повторно собрано оптической структурой; оно может представлять собой световое излучение, вызванное фотолюминесценцией (т.е. флуоресценцией и/или фосфоресценцией), возбуждаемой входным световым пучком в камере для образца, которое далее распространяется через носитель или не распространяется; либо оно может представлять собой входящее световое излучение от выходного светового пучка, которое (по определению) возникает из входного светового пучка, собранное оптической структурой. Кроме того, распознанный характеристический параметр может, в частности, представлять собой интенсивность или профиль распределения интенсивности выходного светового пучка.
Характеристический параметр, определяемый фотоприемником (световым датчиком), может, в частности, содержать количество обнаруженного светового излучения (например, выраженное в виде интенсивности светового пучка в заданном сечении). Другой важный пример характеристического параметра - направление распространения обнаруженного светового излучения. Еще один пример - граница оптической структуры, разделяющая области с различным оптическим воздействием на входной световой пучок, например, область, в которой происходит полное внутреннее отражение из зоны с «нормальным» отражением.
Оптическая структура носителя может иметь пространственно однородные оптические свойства, например, реализуемые регулярной периодической схемой расположения идентичных канавок или отверстий. Однако она также может иметь локально изменяющиеся оптические свойства, например, изменяющуюся форму (наклон, глубину, шаг и прочее) канавок/отверстий, образующих структуру. Свойства, в частности, могут быть связаны с полным внутренним отражением падающего входного светового пучка. В этом случае граница, отделяющая область оптической структуры, где происходит полное внутреннее отражение, от области «нормального» отражения, будет иметь различные направления для среды с различными показателями преломления в камере для образца. Граница, таким образом, косвенным образом предоставляет информацию о показателе преломления упомянутой среды.
Фотоприемник, при необходимости, может быть выполнен с возможностью раздельного детектирования составляющих выходного светового пучка, которые отличаются числом раз преломления и/или отражения носителем. Выходной световой пучок, например, может содержать первичную составляющую, которая распространялась через носитель без дополнительного взаимодействия (кроме возможного преломления при выходе из носителя) с границами раздела, после того как была собрана оптической структурой, и он может дополнительно содержать вторичную составляющую светового излечения, которая подверглась полному внутреннему отражению оптической структурой после ее сбора упомянутой структурой. Характеристические параметры этих составляющих выходного светового пучка обычно содержат информацию об условиях в камере для образца, например, о показателе преломления образца. Для того чтобы обладать возможностью раздельно детектировать различные составляющие исходящего светового пучка, фотоприемник может содержать физически различимые субблоки, например, два фотодиода, расположенные в различных местах, и/или он может перемещаться для произведения замеров в различных местах, разделяя, таким образом, составляющие выходного светового пучка во временном диапазоне.
Согласно дальнейшему развитию варианта осуществления, содержащего фотоприемник, устройство дополнительно содержит блок оценки для оценки сигнала обнаружения, обеспечиваемого фотоприемником в отношении присутствия и/или количества целевого компонента в камере для образца. Увеличение концентрации частиц в образце, например, может привести к большему рассеиванию входного светового излучения после его преломления в камеру для образца, а значит, к снижению интенсивности дважды преломленного выходного светового пучка. Повышение концентрации фотолюминесцентного вещества, напротив, приведет к увеличению количества фотолюминесцентного светового излучения, наблюдается ли это в дважды преломленном выходном световом пучке, или в световом излучении, детектируемом при темнопольной конфигурации в направлении, перпендикулярном поверхности носителя. В любом случае, детектируемое световое излучение будет нести информацию о присутствии и количестве целевого компонента, который представляет интерес.
В дополнение к фотоприемнику устройство может дополнительно содержать блок оценки для оценки сигнала обнаружения фотоприемника в отношения различия между двумя неодинаковыми средами, которые могут присутствовать в камере для образца, и/или в отношении показателя преломления среды в камере для образца. Такой подход основан на том факте, что среда в камере для образца оказывает влияние (например, посредством своего цвета или, в частности, своего показателя преломления) на то, распространяется ли входной световой пучок в образце и каким образом, а значит, оказывает влияние на характеристики получаемого в итоге выходного светового пучка. Такая зависимость может быть использована блоком оценки для дифференциации между возможными средами в камере для образца, в частности, между воздухом и жидкостью, при функционировании в качестве детектора влажности. Поскольку многие эффекты среды в камере для образца непрерывно зависят от ее показателя преломления, возможны даже количественные измерения, позволяющие сделать заключение о величине этого показателя.
Согласно дополнительному аспекту, изобретение касается устройства для детектирования магнитных частиц в образце, обеспечиваемого в камере для образца, при этом упомянутое устройство содержит следующие компоненты:
а) носитель с поверхностью, прилегающей к камере для образца, на которой могут быть обнаружены магнитные частицы;
b) генератор магнитного поля для генерирования магнитного поля в камере для образца, которое по существу параллельно поверхности носителя, и для одновременного прикладывания силы магнитного поля к магнитным частицам в камере для образца, которая вытянет их из упомянутой поверхности. Обычно сила магнитного поля генерируется градиентом магнитного поля, направленным от поверхности.
Вышеупомянутое устройство может, в частности, представлять собой устройство вышеописанного типа, т.е. его носитель может иметь оптическую структуру на поверхности, которая способна отражать входной световой пучок в прилегающей камере для образца, и которая одновременно может осуществлять сбор выходного светового пучка, падающего на нее из камеры для образца, при этом упомянутый выходной световой пучок содержит световое излучение, порожденное входным световым пучком. Кроме того, устройство обычно содержит световой источник для излучения входного светового пучка через носитель в направлении поверхности упомянутого носителя. Благодаря такой взаимосвязи с вышеописанным устройством, можно сделать ссылку на приведенное описание для получения большей информации о деталях, преимуществах и модификациях настоящего устройства. Следует, однако, заметить, что другие конкретные варианты осуществления настоящего устройства также возможны. Например, возможно, чтобы входной световой пучок полностью внутренне отражался на (гладкой) поверхности носителя для обеспечения обнаруженного выходного светового пучка, и чтобы частицы на поверхности обнаруживались, поскольку они вносят возмущение в упомянутое полное внутреннее отражение (порождая «нарушенное полное внутреннее отражение», FTIP). Кроме того, магнитные частицы могут детектироваться оптическим, механическим, акустическим, магнитным или любым другим пригодным способом.
Вне зависимости от способа обнаружения магнитных частиц на поверхности носителя, устройство по следующему аспекту имеет преимущество в том, что магнитные частицы на поверхности подвержены воздействию как магнитного поля, параллельного поверхности, так и сил, которые отрывают их от поверхности.
Таким образом, несвязанные магнитные частицы могут быть удалены с поверхности, оставляя лишь связанные магнитные частицы, представляющие интерес. Кроме того, магнитные частицы, которые закреплены на связанных магнитных частицах посредством магнитной связи, также могут оставаться на поверхности, при этом соответствующие цепочки или колонны магнитных частиц становятся ориентированными параллельно поверхности. Все магнитные частицы этих цепочек, следовательно, будут находиться в некотором объеме вблизи поверхности, где их можно обнаружить. Таким образом, множество магнитных частиц становятся ассоциированными с (единственным) событием связывания на поверхности носителя, что усиливает сигналы, соответственно проистекающие из такого события связывания.
Камера для образца вышеописанного устройства часто имеет удлиненную форму с длинными и короткими сторонами и некоторым продолжением по оси параллельно длинным сторонам. Это, например, имеет место тогда, когда камера для образца (проб) представляет собой канал для флюида, через который жидкий образец может протекать контролируемым образом. По предпочтительному варианту осуществления изобретения устройство с подобной удлиненной камерой для проб содержит, по меньшей мере, один генератор магнитного поля, полюса (северный и южный) которого расположены на противоположных длинных сторонах камеры для проб. Таким способом можно создать весьма однородные магнитные условия в значительной области, содержащей осевое удлинение камеры для проб.
Изобретение дополнительно касается использования вышеописанных носителя и устройства в целях молекулярной диагностики, анализа биологических образцов или химического анализа образцов, анализа продуктов питания и/или криминалистического анализа. Молекулярная диагностика, например, может выполняться с помощью магнитных гранул или фотолюминесцентных частиц, которые непосредственно или опосредованно закреплены на целевых компонентах.
Эти и другие аспекты изобретения станут ясны и будут освещены со ссылкой на варианты осуществления, описанные ниже. Эти варианты осуществления будут описаны на примерах с помощью прилагаемых чертежей, где:
на Фиг. 1 схематично показано устройство с носителем по настоящему изобретению;
на Фиг. 2 показан увеличенный вид оптической структуры носителя, представленной на Фиг. 1;
на Фиг. 3 показано несколько возможностей объединить участки связывания с оптической структурой;
на Фиг. 4 показано на виде, подобном Фиг. 2, (a) полное внутреннее отражение входного светового пучка, когда камера для образца заполнена воздухом, и (b) преломление входного светового пучка в камеру для образца и генерирование различных вторичных пучков, когда камера для образца заполнена жидкостью;
на Фиг. 5-9 показана зависимость различных параметров от угла клина и показателя преломления соответственно;
на Фиг. 10 показано для оптической структуры на Фиг. 2 образование цепочек или колонн из нескольких магнитных частиц;
на Фиг. 11 показаны результаты измерений, представляющие различия в конечных сигналах, когда используется магнитный смыв и жидкостный смыв соответственно;
на Фиг. 12 показан вид в перспективе оптической структуры, представленной на Фиг. 1, с цепочками магнитных частиц, расположенными параллельно поверхности;
на Фиг. 13 показан вид в разрезе по прямой XIII-XIII на Фиг. 2, где дополнительно показан генератор магнитного поля;
на Фиг. 14 показаны результаты измерений, полученные по схеме, представленной на Фиг. 13, когда магнитный смыв выполнен с помощью магнитных полей, параллельного и перпендикулярного поверхности соответственно.
на Фиг. 15 показаны кривые дозовой зависимости для анализа на тропонин, полученные с помощью нарушенного полного внутреннего отражения;
на Фиг. 16 показан схематичный вид в перспективе устройства по настоящему изобретению, в котором магнитные полюса расположены на противоположных сторонах удлиненного канала.
Одинаковые номера позиций на Фигурах относятся к идентичным или схожим компонентам.
С использованием (нарушенного) полного внутреннего отражения весьма малые объемы, близкие к отражающей поверхности, могут быть исследованы с помощью соответствующих быстро затухающих волн (характерная величина длины затухания быстро затухающих волн составляет от 10 до 500 нм, при этом точное значение зависит от показателей преломления окружающих сред и угла вхождения поступающего светового пучка относительно нормали к поверхности). Однако, учитывая, что во многих биологических анализах используются магнитные гранулы диаметром от нескольких сот нанометров до нескольких микрон, в этих случаях лишь малая часть поверхности гранулы взаимодействует с оптическим полем быстро затухающей волны, что приводит к относительно малым сечениям рассеяния/поглощения.
Здесь, таким образом, предложен альтернативный подход, который позволяет исследовать малый по глубине объем вблизи оптической поверхности, однако с глубиной объема (микроны), превышающей ту, что используется по технологии быстро затухающего поля (обычно 100 нм). Технология предпочтительно используется в сочетании с большими (диаметром от нескольких сот нанометров до микрон) рассеивающими и/или поглощающими гранулами, которые могут быть удалены с поверхности с использованием внешних сил, например, с суперпарамагнитными гранулами.
на Фиг. 1 показан пример реализации такого подхода с устройством 100 по настоящему изобретению. Центральным компонентом данного устройства является носитель 11, который, например, может быть выполнен из стекла или прозрачного пластика, такого как полистирол. Носитель 11 расположен рядом с камерой 2 для образца (проб), в которой может обеспечиваться пробная жидкость с целевыми компонентами, которые следует распознать (например, лекарственные препараты, антитела, ДНК и т.д.). Образец дополнительно содержит магнитные частицы, например, суперпарамагнитные гранулы, при этом данные частицы обычно связаны в качестве меток с вышеупомянутыми целевыми компонентами. Для простоты, на Фигуре показано только сочетание целевых компонентов с магнитными частицами, которое далее будем называть «целевой частицей» 1. Следует отметить, что вместо магнитных частиц могут быть также использованы другие частицы-метки, например, электрически заряженные или фотолюминесцентные частицы. Граница раздела между носителем 11 и камерой 2 для проб образована поверхностью, называемой «контактной поверхностью» 12. Эта контактная поверхность 12 при необходимости имеет покрытие из захватывающих элементов (не показаны), например, антител или протеинов, которые способны определенным образом связывать целевые частицы. Кроме того, контактная поверхность содержит в «области исследования» 13 оптическую структуру 50, которая объясняется ниже.
Для манипулирования магнитными целевыми частицами устройство 100 может содержать генератор 41 магнитного поля, например, электромагнит, имеющий катушку и сердечник, для контролируемого генерирования магнитного поля на контактной поверхности 12 и в прилегающем пространстве камеры 2 для образца. С помощью этого магнитного поля целевые частицы 1 могут подвергаться манипулированию, т.е. намагничиваться и, в частности, перемещаться (при использовании градиентных магнитных полей). Таким образом, например, можно притягивать целевые частицы 1 к контактной поверхности 12 с целью ускорения их связывания с упомянутой поверхностью, либо смывать несвязанные целевые частицы с контактной поверхности перед проведением измерений. В то время как на Фигуре показана единственная магнитная катушка под носителем, следует отметить, что одна или несколько магнитных катушек могут быть также расположены в других местах.
Устройство 100 дополнительно содержит световой источник 21, генерирующий входной световой пучок L1, который поступает в носитель 11 через «входное окно» 14. В качестве светового источника 21 можно использовать лазер или светоизлучающий диод, в частности, промышленный лазерный диод для DVD (λ=658 нм). Может использоваться коллиматорная линза, чтобы сделать входной световой пучок L1 параллельным, а также может использоваться отверстие малого диаметра, например диаметром 1 мм, чтобы уменьшить диаметр пучка. В общем, предпочтительно используемый световой пучок должен быть (квази-) монохромным и (квази-) коллимированным, поскольку поведение светового пучка на различных преломляющих границах раздела существенно зависит от угла падения.
Входящий (входной) световой пучок L1 сталкивается с областью 13 исследования носителя 11, где он преломляется в камеру 2 для образца оптической структурой 50. Световое излучение входящего светового пучка, которое повторно собирается из камеры для образца оптической структурой 50, образует выходной световой пучок L2.
Выходной световой пучок L2 распространяется через носитель 11, покидает его через другую поверхность («выходное окно» 15) и детектируется фотоприемником (световым датчиком) 31. Фотоприемник 31 определяет количество светового излучения выходного светового пучка L2 (например, выраженное интенсивностью светового излучения этого светового пучка во всем спектре или в определенной части спектра). Измеренные сигналы от фотоприемника оцениваются и при необходимости регистрируются на отрезке времени исследования посредством модуля 32 оценки и регистрации, который соединен с фотоприемником 31. Может использоваться дополнительная линза между выходным окном 15 и фотоприемником 31 для отображения области 13 исследования на фотоприемнике 31, который может представлять собой двумерный датчик CCD или CMOS.
Следует отметить, что носитель не обязательно должен иметь наклонное входное окно 14 и/или выходное окно 15, поскольку эти грани, например, могут являться частью внешней (считывающей) оптики. Согласующая текучая среда может быть, например, использована для введения светового излучения из внешнего считывающего устройства в одноразовый картридж.
Можно использовать фотоприемник 31 также для замеров фотолюминесцентного светового излучения, эмитированного фотолюминесцентными частицами 1 (целевые частицы), которые были возбуждены входным световым пучком L1, при этом фотолюминесценция может быть, например, спектрально выделена из остального светового излучения, например, светового излучения входного светового пучка, который не был рассеян в камере для образца. Хотя последующее описание сосредоточено на измерении нерассеянного света, принципы, обсуждаемые в настоящем описании, могут также применяться с соответствующими поправками к детектированию фотолюминесценции. Заметим, что в случае фотолюминесценции или детектирования рассеяния в прямом направлении, фотоприемник 31 может также располагаться в направлении, отличном от направления выходного светового пучка L2, например, в направлении, перпендикулярном границе раздела 12 подложки.
Кроме того, существует возможность использования генератора 41 магнитного поля для более совершенного детектирования, по меньшей мере, одного магнитного объекта (например, целевых частиц 1 и/или кластеров таких частиц) с «несферическими» физическими и/или химическими свойствами в камере 2 для образца. Электромагнит 41 в этом случае приводится в действие так, что он генерирует модулированное магнитное поле, предпочтительно ротационное поле. Это модулированное магнитное поле вызовет модуляцию ориентации магнитного объекта, что приведет к модуляции сигнала обнаружения (выходного светового пучка L2) в силу несферических характеристик объекта. Зависящие от времени характеристики сигнала обнаружения далее могут использоваться для детектирования, по меньшей мере, одного магнитного объекта, чтобы установить различие между различными типами или размерами магнитных объектов и/или установить различие между различными типами биологических связей.
Преимущество описанной технологии модуляции заключается в том, что может быть повышена конкретность и чувствительность детектирования. Например, ориентация частиц может модулироваться с частотой f. Сигнал обнаружения может в этом случае иметь соответствующие компоненты на нескольких частотах (например, 2f), которые могут детектироваться с использованием технологий обработки сигналов. Кроме того, частота вращения магнитного объекта может быть значительно ниже частоты возбуждения, например, в силу характеристик релаксации магнитных зерен внутри частицы.
Примером несферической физической характеристики служит эллипсоидальная форма магнитного объекта, показанного на Фигуре с помощью состоящего из двух частиц кластера 1', вращающегося вокруг z-оси. Разумеется, возможны также вращения вокруг других осей кластера.
Примером несферической химической характеристики служит частица, которая имеет несферическое покрытие из химического вещества. Например, частица может иметь несферическое покрытие из оптически-активного вещества, например, хемилюминесцентного фермента или субстрата. Когда становится возможной реакция хемилюминесценции при модуляции ориентации частицы в приповерхностном оптическом поле, получаемый в результате оптический сигнал также будет модулирован.
Пример конструкции оптической структуры 50 на поверхности прозрачного носителя 11 более подробно показан на Фиг. 2. Данная оптическая структура состоит из клиньев 51 с треугольным сечением, продолжающихся в y-направлении, т.е. перпендикулярно плоскости чертежа. Клинья повторяются регулярным образом в x-направлении и заключают между собой треугольные канавки 52.
Когда входной световой пучок L1 (или, точнее, подпучок полного входного светового пучка L1) соударяется со стороны носителя с «гранью возбуждения» 53 клина 51, он будет преломлен в прилегающую канавку 52 камеры 2 для образца. В пределах канавки 52 свет распространяется (по существу параллельно плоскости контактной поверхности 12), пока он не упадет на противоположно наклоненную «грань сбора» 54 соседнего клина. Здесь входящее (входное) световое излучение, которое не было поглощено, рассеяно или потеряно иным образом на своем пути через камеру 2 для образца, повторно собирается в выходной световой пучок L2. Очевидно, что количество светового излучения в выходном световом пучке L2 находится в обратной зависимости от концентрации целевых частиц 1 в канавке 52 камеры для образца.
В результате тонкий слой света распространяется вдоль контактной поверхности, при этом толщина этого слоя определяется геометрией клина и шагом p (расстоянием в x-направлении) расположения клиньев 51. Дополнительное преимущество такой конструкции заключается в том, что и подсвечивание, и детектирование могут выполняться со стороны носителя, не контактирующей с текучей средой.
1
2
При заданных показателе n преломления носителя (например, выполненного из пластика), показателе n преломления (биологической) жидкости в камере для образца и угле i вхождения входного светового пучка L1 геометрия клина может быть оптимизирована так, чтобы (i) максимальное количество светового излучения преломлялось обратно в направлении фотоприемника (светового датчика); а также (ii) максимальная площадь поверхности исследовалась «отраженным» световым пучком с целью получения оптимальных статистических данных по связыванию (биохимии).
2
В случае симметричной конструкции клина отраженный луч в канавке 52 между двумя клиньями 51, с учетом показателя n преломления, должен быть параллелен оптическому интерфейсу. В отношении переменных, определенных на Фиг. 2, это означает, что
о=α.
Кроме того, чтобы иметь максимальную «свободную» апертуру для поступающего входного светового пучка, угол α конструкции клина должен быть равен углу i вхождения входящего светового пучка:
i=α.
Введя эти два условия в закон преломления
после некоторых вычислений получим
1
2
Для пластиковой подложки с показателем преломления n=1,6 и водообразной жидкости с показателем преломления n, составляющим величину от 1,3 до 1,4, оптимальный угол клина α лежит в пределах примерно от 70° до 74°. Соответствующая величина шага p расположения клиньев равна около 10 мкм, если объем образца по высоте составляет около 1,5 мкм.
На Фиг. 3 показан вид сверху схемы практической реализации картриджа или носителя 11 с различной конструкцией контактной поверхности 12. На нижнем левом чертеже показан вариант, по которому картридж оборудован одной однородной клиновидной структурой 50, поверх которой размещены дискретные области 13а исследования с биозахватом с использованием технологии впечатывания. По альтернативному варианту отдельные области 13b, 13c исследования с биозахватом могут определяться отдельными клиновидными структурами 50, при этом каждая клиновидная структура 50 не обязательно имеет один и тот же шаг p, встроенными в оптически плоскую окружающую среду (например, с использованием процесса инжекционного формования), в результате чего получают (геометрически) четко определенные области исследования с захватом (по сравнению с нижними средним и правым чертежами).
Для того чтобы получить надежные и точные результаты с применением биосенсора такого типа, как на Фиг. 1, и/или биосенсора, использующего нарушенное полное внутреннее отражение (FTIR) на гладкой границе раздела, важно, чтобы камера для образца соответствующего картриджа была должным образом заполнена (жидким) образцом. Это особенно относится к случаю, когда отсутствуют активные средства перемещения, так что перемещение жидкости через картридж всецело зависит от наполнения капилляров. Следовательно, желательно иметь датчик увлажнения для распознавания, заполнен ли картридж должным образом и/или полностью. Предпочтительно такой датчик увлажнения должен быть бесконтактным, так чтобы не требовалась проводка внутри картриджа/к картриджу/от картриджа, что повышает надежность и снижает стоимость.
Для решения указанных проблем предложена и далее разъясняется технология детектирования присутствия текучей среды в камере для образца в картридже, в которой может использоваться главная «ветвь» отражения в оптической схеме биосенсора для детектирования увлажнения. Таким образом, та же самая оптика, что используется для исследования биопробы, может использоваться для детектирования увлажнения (например, оптика, измеряющая FTIR (нарушенное полное внутреннее отражение) на гладкой контактной поверхности, или оптика, измеряющая выходной световой пучок на оптических структурах, описанных выше). Главная идея такой технологии заключается в использовании различия в критическом угле, при котором происходит полное внутреннее отражение (TIR) для границ раздела полистирол-вода (в случае увлажнения) и полистирол-воздух (при отсутствии увлажнения). Преломляющая оптическая структура 50, таким образом, может быть выполнена так, что в случае отсутствия увлажнения, TIR на преломляющей границе раздела имеет место, в то время как в случае увлажнения, TIR не происходит. В последнем случае световое излучение пропускается границей раздела полистирол-вода, (частично) захватывается оптической структурой и перенаправляется («отражается назад») в картридж. Путем тщательного подбора геометрии оптической структуры можно изготовить своего рода «зеркально отражающие ретроотражатели» (использующие, однако, преломление вместо отражения), в которых свет преломляется дважды на границах раздела носитель-жидкость и жидкость-носитель. Данная конструкция также может использоваться для получения более выраженных количественных результатов, когда измеренный сигнал является прямым замером показателя преломления текучей среды поверх носителя. Клиновидная структура 50, например, может быть рельефно выдавлена в пластиковой подложке носителя.
a
w
На Фиг. 4 представлены (не в масштабе) вышеупомянутые модели более подробно на чертеже, схожем с Фиг. 2. На Фиг. 4а показана ситуация, при которой камера 2 для образца является сухой, т.е. заполнена воздухом, имеющим показатель преломления n=1. На Фиг. 4b показана ситуация, при которой камера 2 для образца заполнена водообразной жидкостью, имеющей показатель преломления n.
с
1
2
с
2
1.
1
2
w
с
са
Критический угол θ для полного внутреннего отражения (TIR) на оптическом интерфейсе при переходе от высокого показателя преломления n к низкому показателю преломления n задается соотношением sin(θ)=n/nВ случае носителя 11 из полистирола с показателем преломления n=1,58 и водообразной текучей среды, обладающей показателем преломления n=n=1,33, критический угол θ=57,3°, если камера для образца заполнена текучей средой. Однако если камера для образца заполнена воздухом, критический угол θ становится равным 39,3°.
са
На Фиг. 4а угол падения входного светового пучка L1 (по отношению к грани возбуждения 53) больше критического угла θдля воздуха в камере 2 для образца. Таким образом, входной световой пучок L1 полностью внутренне отражается на грани 53 возбуждения оптической структуры 50 с образованием TIR-светового пучка L3, распространяющегося под существенно другим углом в отношении нормали к поверхности, чем входной световой пучок L1.
w
На Фиг. 4b камера 2 для образца заполнена водообразной жидкостью с показателем преломления n. Критический угол TIR теперь таков, что полного внутреннего отражения на грани 53 излучения не происходит, но будет иметь место нормальное преломление входного светового пучка L1 в камеру 2 для образца. В представленной ситуации можно выделить три различных случая:
2
2
1. Входное световое излучение, покидая грань 53 возбуждения между точками A и B, проходит за следующий клин и попадает в образец в качестве светового пучка L1'. Как показано стрелкой с индексом «(n)», наклон этого светового пучка L1' становится более крутым, а количество светового излучения в нем повышается, если показатель преломления n увеличивается.
2
2. Входное световое излучение, покидая грань 53 возбуждения между точками B и C, собирается между точками B' и C' грани 54 сбора соседнего клина; в этом случае оно полностью внутренне отражается между точками B' и C” грани излучения этого клина и покидает носитель 11 в качестве вторичной составляющей L2' полного исходящего светового излучения. Наклон этой вторичной составляющей L2' становится более крутым, а количество ее светового излучения повышается, если показатель преломления n увеличивается.
2
3. Входное световое излучение, покидая грань 53 возбуждения между точками C и D, собирается между точками C' и D грани 54 сбора соседнего клина; далее оно распространяется, не испытывая влияния оптической структуры 50, через носитель 11 в качестве первичной составляющей L2 полного выходного светового излучения. Наклон этой первичной составляющей L2 становится менее крутым (более пологим), а количество ее светового излучения более низким с увеличением показателя преломления n.
На фигуре показано, что лишь часть светового излучения будет преломляться обратно в носитель 11 в случае увлажнения, в результате чего эффективность обратного «отражения» становится явно ниже 100%. Следует отметить, что как первичный выходной световой пучок L2, так и/или вторичный выходной световой пучок L2' могут использоваться в качестве сигналов увлажнения.
На фигуре не показана ситуация, при которой угол i вхождения отличен от угла α клина, и часть светового излучения заслоняется восходящим краем оптической структуры. Это световое излучение либо распространяется в текучую среду, либо полностью внутренне отражается, падая на поверхность AD под незначительно смещенным углом вхождения.
Описанный подход к детектированию увлажнения может использоваться в биосенсорах, работающих подобно устройству 100 на Фиг. 1. Однако он может также применяться в альтернативных конструкциях биосенсоров, имеющих гладкую поверхность в области исследования; в таком биосенсоре может иметь место нарушенное полное внутреннее отражение (FTIR) на контактной поверхности, при этом степень нарушения является мерой связывания целевых компонентов в области исследования.
При типичной реализации вышеупомянутого FTIR-биосенсора угол вхождения входящего светового пучка по отношению к нормали к контактной поверхности зафиксирован на уровне 70°, т.е. существенно больше критического угла как для заполненного, так и для пустого картриджа. Принцип FTIR содержит мониторинг снижения интенсивности главного TIR-отраженного пучка в силу рассеивания и/или поглощения светового излучения на связанных целевых частицах; следовательно, угол «ветви детектирования» также составляет 70є по отношению к нормали к поверхности. При такой геометрии полное внутреннее отражение будет иметь место вне зависимости от условий увлажнения.
Однако путем обеспечения носителя (предпочтительно за или рядом с FTIR-зоной зондирования биопробы) оптической структурой 50, такой как на Фиг. 4, можно прийти к ситуации, при которой свет «отражается» в направлении основного фотоприемника (например, CCD-датчика) только при наличии условий увлажнения (сравни пучки L2, L2' на Фиг. 4b). В условиях отсутствия увлажнения полное внутреннее отражение (сравни пучок L3 на Фиг. 4а) происходит в направлении, по существу отличном от направления основного FTIR-пучка, и в направлении основного фотоприемника свет не отражается.
ca
cw
Например, когда угол α клина и угол i между входным световым пучком L1 и нормалью к контактной поверхности равны 70°, входной световой пучок L1 образует угол 50° относительно грани 53 возбуждения. Эта величина примерно является средней между двумя значениями критических углов θ=39,3° и θ=57,3°. Когда увлажнение отсутствует (Фиг. 4a), поступающий (входной) световой пучок L1, таким образом, полностью внутренне отражается, образуя световой пучок L3 в таком направлении, что FTIR-световой датчик (фотоприемник) не воспринимает какой-либо свет (в силу ограниченного диафрагменного числа NA) оптической системы обнаружения), что приводит к нулевому (погашенному) сигналу. Когда имеет место увлажнение, входной световой пучок L1 проходит в текучую среду, и часть прошедших лучей снова преломляются на восходящей кромке преломляющей оптической структуры (Фиг. 4b).
1
2
При заданных показателях преломления n и n геометрия может быть подобрана так, что угол i вхождения входного светового пучка L1 строго равен углу e выхода первичной составляющей L2 выходного светового пучка (сравни с заключениями в отношении Фиг. 2), что имитирует принцип работы ретроотражателя и увеличивает сигнал (яркость) FTIR-светового датчика (фотоприемника). Для типичной конфигурации с использованием носителя из полистирола и границы раздела с водой это приводит к тому, что угол α клина равен 74°.
Носитель с оптической структурой 50 вышеописанного типа, например, может быть изготовлен с помощью включений алюминия или NiP, используемых в процессе инжекционного формования для производства полистирольных картриджей. Необходимые структуры могут быть сформированы во включениях путем алмазного фрезерования или травления 3d фокусированным ионным пучком (FIB).
Количество светового излучения в первичном выходном световом пучке L2, преломленном в направлении датчика в любом выбранном направлении, может оптимизироваться соответствующим выбором клиновидной структуры 50. График на Фиг. 5 показывает результат моделирования для увлажняемой структуры с границей раздела полистирол-вода при угле i вхождения, равном 70є, когда угол α клина изменяется от 65є до 75є (по вертикальной оси: нормированная интенсивность I основного отраженного излучения (L2)). На Фиг. 6 показан соответствующий угол e выхода первичного выходного светового пучка L2.
2
2
Поскольку в описанном датчике увлажнения используются углы вхождения, близкие к критическому углу, углы преломления весьма чувствительны к изменениям показателя преломления. Следовательно, датчик также может использоваться в качестве датчика показателя преломления. На Фиг. 7-9 показаны результаты моделирования, где показатель преломления n водообразной жидкости изменяется от 1,3 до 1,4. Для выделения показателя преломления nиз измеренных сигналов может использоваться несколько количественных величин, например:
- интенсивность I(L2) первичного выходного светового пучка L2 (Фиг. 7, по вертикальной оси отложены нормированные единицы).
- Угол e «отражения» первичного выходного светового пучка L2 с использованием, например, позиционно-чувствительного диода (Фиг. 8).
- Отношение I(L2)/I(L2') интенсивностей первичного выходного светового пучка L2 и вторичного выходного светового пучка L2' (Фиг. 9).
1
2
В другом варианте осуществления оптическая структура 50 может быть образована регулярным массивом скошенных/наклоненных структур, где угол наклона структур (а значит и шаг канавок) линейно возрастает/убывает как функция их x-координаты, т.е. вдоль поверхности. Если теперь структура отображается на 2D-датчике или линейном массиве, прерывание детектирования светового излучения возникает в тех местах, где происходит полное внутреннее отражение. При заданных показателе преломления n носителя и геометрии оптической структуры 50, местоположение таких разрывов (в мм или пикселях датчика) является непосредственной мерой показателя преломления n среды в камере для образца.
Чтобы иметь возможность определить низкие концентрации исследуемого вещества, важно получить как можно больше сигналов для одного события связывания. Далее описывается подход, позволяющий распознать большее количество магнитных целевых частиц (гранул) для единичного события связывания. Вкратце, это можно осуществить, когда магнитное поле, силовые линии которого перпендикулярны сенсорной поверхности, прикладывается в процессе детектирования, при этом используется технология детектирования, при которой глубина зондирования превышает один диаметр гранулы. По альтернативному варианту может использоваться магнитное поле, силовые линии которого параллельны сенсорной поверхности, в этом случае можно использовать любую поверхностно-чувствительную технологию детектирования.
На Фиг. 10 представлены вышеупомянутые концепции, которые являются примером детектирования с помощью оптической структуры 50, показанной на Фиг. 1 и 2. Одно из основных преимуществ использования магнитных целевых частиц 1 заключается в уменьшении времени, необходимого для выполнения биологического анализа, что становится возможным благодаря магнитному возбуждению. При стандартной процедуре магнитные частицы приводятся в движение к чувствительной поверхности 12, где число частиц, которые связываются с поверхностью, зависит от концентрации исследуемого вещества. После этого этапа связывания обычно участвует этап магнитного «смыва» для удаления несвязанных частиц с сенсорной поверхности. Связанные частицы далее могут детектироваться с использованием технологии, чувствительной лишь к частицам, расположенным вблизи поверхности.
При детектировании весьма малых концентраций исследуемого вещества, на чувствительной поверхности оказывается лишь очень малое число гранул; таким образом, желательно получить сигнал, который был бы как можно большим для единичного события связывания. Вместо попытки повысить сигнал на одну гранулу, предлагаемый подход нацелен на получение большего числа гранул 1 на единичное событие связывания. Это основывается на наблюдении, что при выполнении магнитного «смыва» магнитная сила, сгенерированная расположенной поблизости гранулой (в силу высокого градиента локального поля), значительно больше магнитной силы, сгенерированной «смывающим» магнитом. Если для магнитного «смыва» используется (нормальная) одновитковая катушка, то из связанных гранул образуются малые колонны 1', направленные к верхнему магниту 42, вместо того чтобы все гранулы перемещались к магниту.
В схеме биосенсора, использующей детектирование при нарушенном полном внутреннем отражении (FTIR), дополнительные гранулы в колоннах 1' не могут быть распознаны, поскольку быстро затухающее поле обычно имеет глубину порядка 100 нм, в то время как диаметр гранулы является величиной порядка 500 нм. Однако, применяя приведенное выше детектирование с двойным преломлением (DRD) с использованием оптической структуры 50, глубина зондирования может быть увеличена для детектирования этих дополнительных гранул в колоннах 1', что приводит к усилению сигнала.
Это усиление сигнала S становится также очевидным из Фиг. 11, где стандартное проведение сэндвич-анализа на тропонин, которое завершается этапом магнитного «смыва» (MW), имеет продолжение с использованием этапа жидкостного смыва (FW). Показаны две кривые, соответствующие измерениям с использованием нарушенного полного внутреннего отражения (FTIR) и детектирования с двойным преломлением (DRD) соответственно. В процессе магнитного «смыва» MW гранулы образуют колонны, как показано на Фиг. 10, и порождают дополнительный сигнал в DRD-способе. В процессе жидкостного смыва FW, однако, эти дополнительные гранулы удаляются и остаются лишь гранулы, связанные с поверхностью, в результате чего сигнал снижается. Коэффициент усиления сигнала в этом конкретном примере составляет 1,3, т.е. сигнал, получаемый на одну гранулу, повышается на 30%.
Путем оптимизации рабочего протокола и DRD-структур можно получить еще более высокие коэффициенты усиления. Например, структура большей глубины (т.е. с канавками глубже 2 мкм) позволит детектировать большее число гранул (более длинные колонны). Кроме того, рабочий протокол может быть оптимизирован для минимизации числа гранул в окрестности поверхности.
На Фиг. 12 показан другой способ увеличения усиления сигнала путем выстраивания цепочек 1' гранул параллельно поверхности, а не перпендикулярно. Одним из способов это осуществить является использование подковообразной схемы в качестве верхнего магнита 42, как показано на Фиг. 13 (не в масштабе). Когда концы магнита имеют противоположную полярность (север N/юг S), силовые линии B магнитного поля проходят по существу параллельно чувствительной поверхности 12 между обоими концами, и цепочки 1' гранул выстроятся в этом направлении.
-par
-ort
На Фиг. 14 показано различие в изменении сигнала между параллельно ориентированными цепочками и перпендикулярно ориентированными цепочками на DRD-структуре. После выполнения анализа, в котором гранулы связаны с антителом, введенным в DRD-структуру, верхний подковообразный магнит 42 был использован в конфигурации север-юг в качестве этапа смыва MW. На этом этапе силовые линии магнитного поля ориентированы параллельно поверхности, но градиент магнитного поля grad B обеспечивает перемещение вверх массы гранул (как показано на Фиг. 12 и 13). После этого первого этапа смыва подковообразный магнит 42 был использован в конфигурации север-север, при которой силовые линии поля ориентированы ортогонально сенсорной поверхности (сравни с индексом MW). Это привело к значительному уменьшению сигнала, поскольку некоторые гранулы, которые первоначально были ориентированы вдоль DRD-структур, теперь выстроились в цепочки, направленные от структур.
-par
-ort
Поскольку в вышеупомянутом подходе множество гранул выстроено параллельно чувствительной поверхности и близко к ней, эти дополнительные гранулы не могут быть обнаружены не только DRD, но также и другими технологиями детектирования на поверхности, например, FTIR-детектирования. На Фиг. 15 показаны кривые дозовой зависимости для анализа на тропонин, замеренные путем FTIR с использованием верхнего подковообразного магнита (по вертикальной оси: сигнал S в относительных единицах; по горизонтальной оси: концентрация c тропонина). При каждом замере сигнал определяли с использованием этапа магнитного смыва либо с параллельными силовыми линиями поля (MW), либо с перпендикулярными силовыми линиями поля (MW, сопоставимым с нормальным магнитным смывом с использованием единичной верхней катушки). В процессе детектирования цепочки магнитных гранул, таким образом, были ориентированы параллельно поверхности (верхняя кривая) или перпендикулярно поверхности (нижняя кривая). Как видно из диаграммы, магнитное усиление сигнала при параллельной схеме приводит к трехкратному увеличению сигнала по сравнению с детектированием по нормальной схеме. Сплошные горизонтальные прямые, к которым стремятся пунктирные линии, обозначают замеренную величину для 0 pM тропонина.
На Фиг. 16 показан схематичный вид в перспективе устройства 100 (не в масштабе) по одному варианту осуществления изобретения, которое, в частности, пригодно к использованию в сочетании с камерой 2 для образца, имеющей удлиненную форму. В представленном примере удлиненная форма связана с тем, что камера 2 для образца представляет собой канал флюида, по которому может протекать образец жидкости (сравни со стрелкой) в x-направлении. Камера 2 для образца содержит нижнюю (чувствительную) поверхность 12, на которой целевые частицы могут быть обнаружены, например, оптическим или иным способом.
Принципиально важным аспектом показанной конструкции является то, что имеется, по меньшей мере, один генератор 42, 43 магнитного поля, полюса N, S которого расположены на противоположных длинных сторонах камеры 2 для образца. Таким образом, можно гарантировать, что получаемое в результате магнитное поле B является большей частью регулярным (т.е. параллельным) в пределах большой области.
На фигуре, в частности, показаны нижний магнит 43 и верхний магнит 42, имеющие конструкцию подковообразных магнитов, при этом дуга, соединяющая их полюса, проходит под и над камерой 2 для проб соответственно. Хотя оба магнита генерируют магнитные поля, которые по существу параллельны поверхности 12 в пределах камеры для проб, градиенты этих полей будут иметь противоположные направления. В частности, нижний магнит 43 будет генерировать магнитное поле, которое притягивает магнитные частицы к поверхности 12, в то время как градиент верхнего магнита 42 будет оттягивать магнитные частицы от поверхности 12.
Хотя изобретение было описано выше со ссылкой на конкретные варианты осуществления, возможны различные модификации и дополнения, например:
- молекулярные мишени часто определяют концентрацию и/или присутствие более крупных частиц, например, клеток, вирусов, либо фракций клеток или вирусов, экстракта ткани и т.д.
- В дополнение к анализу молекул с помощью измерительного устройства по изобретению можно также детектировать более крупные частицы, например, клетки, вирусы, либо фракции клеток или вирусов, экстракт ткани и т.д.
- Детектирование может происходить со сканированием или без сканирования чувствительным элементом в отношении чувствительной поверхности.
- Измерительные данные могут быть получены как в качестве замеров по конечной точке, так и путем регистрации сигналов кинетически или с некоторой периодичностью.
- Частицы, служащие метками, могут детектироваться непосредственно способом обнаружения. Помимо этого, частицы могут быть дополнительно обработаны перед детектированием. Пример дополнительной обработки - добавление материалов или модификация (био)химических или физических характеристик для содействия детектированию.
- Устройство и способ могут быть использованы при биохимических анализах нескольких типов, например, анализе связывания/освобождения, сэндвич-анализе, конкурентном анализе, анализе перестроек (displacement assay), ферментном анализе, анализе кластеров и т.д. Они, в частности, пригодны для экпресс-анализов с магнитным возбуждением и для детектирования ДНК, поскольку легко выполнить масштабное мультиплексирование и могут быть обнаружены различные олиго-вещества посредством струйной печати на подложке.
- Устройство и способ пригодны для мультиплексирования датчиков (т.е. для параллельного использования различных датчиков и чувствительных поверхностей), мультиплексирования меток (т.е. параллельного использования меток различного типа), а также мультиплексирования камер (т.е. параллельного использования различных реакционных камер).
- Устройство и способ могут быть использованы в качестве быстродействующих, надежных в эксплуатации и легко применимых биосенсоров, работающих в месте наблюдения, предназначенных для малых объемов проб. Реакционная камера может быть изделием одноразового применения для использования с компактным считывающим блоком, которое содержит одно или несколько средств для генерирования поля, а также одно или несколько средств для детектирования. Кроме того, устройство, способы и системы настоящего изобретения могут использоваться в автоматизированном высокопроизводительном тестировании. В этом случае реакционная камера представляет собой, например, плашку с лунками или кювету, встраиваемую в автоматизированный прибор.
- Под наночастицами понимаются частицы, имеющие, по меньшей мере, одно измерение в диапазоне от 2 нм до 5000 нм, предпочтительно от 10 нм до 3000 нм, более предпочтительно от 50 нм до 1000 нм.
Наконец, следует отметить, что в настоящем описании термин «содержащий» не исключает наличие других элементов или этапов, использования элементов в единственном числе не исключают их наличия во множественном числе, а единичный процессор или иной блок могут выполнять функции нескольких средств. Изобретению принадлежит каждый без исключения отличительный признак и каждое без исключения сочетание отличительных признаков. Кроме того, ссылочные знаки в формуле изобретения не следует истолковывать как ограничивающие объем притязаний формулы изобретения.