Детектор катодолюминесценции для сканирующего электронного микроскопа

Предлагаемое устройство относится к аналитической технике и предназначено для изучения катодолюминесценции объектов в медицине, биологии и некоторых разделах минералогии и материаловедения.
Дизайн устройства предполагает его установку на сканирующий электронный микроскоп и использование в качестве самостоятельного детектора, позволяющего получать двумерные изображения катодолюминесценции объектов, размещенных на прозрачных подложках. Предлагаемая конструкция предназначена для изучения образцов, напыленных оптически-непрозрачными токопроводящими материалами, что делает его незаменимым при изучении катодолюминесценции биологических образцов, подготовленных для сканирующей электронной микроскопии классическим способом, а также - прозрачно-полированных шлифов, напыленных благородными металлами.
Явление катодолюминесценции (КЛ) весьма широко применяется для изучения различных материалов (стекла, полупроводники, неорганические продукты химической промышленности) и минералов. Изучение люминесцентных свойств объектов в ряде случаев дает уникальную информацию о микропримесях и дефектах в структуре веществ. На современном уровне широта применения КЛ определяется тем, что это явление удобно изучать одновременно с исследованием образца на электронном микроскопе, где эффект КЛ возникает при бомбардировке поверхности образца электронным пучком. Детекторы КЛ, интегрируемые в электронные микроскопы, конструктивно просты и относительно недороги. Самостоятельные устройства для изучения КЛ (импульсная катодолюминесценция), а также модули электронной эмиссии и вакуумные камеры, устанавливаемые на оптические микроскопы, - распространены недостаточно. При общей популярности этого метода применение катодолюминесценции в биологических и медико-биологических направлениях весьма ограничено. Одна из причин этого - необходимость напыления биологических объектов непрозрачными токопроводящими металлическими покрытиями, используемого в ряде схем подготовки образцов для изучения посредством сканирующего электронного микроскопа (СЭМ). Вторая причина - низкая устойчивость органических люминофоров, применяемых в современных методах специфического окрашивания отдельных структур образца.
В настоящее время известно две принципиальных схемы получения изображений КЛ на базе СЭМ. Получение прямых оптических проекций было популярно на СЭМ первых поколений, снабженных оптическими микроскопами (Локальная катодолюминесценция и ее возможности для исследования зонной структуры твердых тел. В. Спивак, В.И. Петров, М.В. Антошин, 1986, Успехи физ. наук). В дальнейшем, начиная с 80-х годов прошлого столетия, от нее практически отказались. Это было связано с тем, что она имела очевидные недостатки: отсутствие геометрической согласованности сигнала КЛ с разверткой СЭМ и, соответственно, с сигналом других детекторов; отсутствие возможности быстро менять увеличение; необходимость установки оптического микроскопа на СЭМ. На рубеже веков системы первого типа были полностью замещены коллекторными системами, в которых сигнал КЛ, излучаемой образцом, собирается с его поверхности зеркалом (чаще всего с кривизной второго порядка) и отправляется на один из типов детекторов (спектрометр, фотометр, ФЭУ + фотометр, ФЭУ + CCD). При таком способе для построения двумерных изображений координаты, с которыми ассоциирован регистрируемый сигнал, согласуются с координатами развертки СЭМ. Для увеличения светочувствительности подобных детекторов производители стараются максимально увеличивать условную апертуру зеркала, что позволяет собрать максимальное число квантов, вылетающих с поверхности образца при возбуждении КЛ электронным пучком микроскопа. Однако высокая числовая апертура подобных систем определяет низкую условную глубину резкости, что соответственно ограничивает возможность наблюдения люминесцирующих объектов, рассеянных в объеме образца. Последнее также ограничивает возможность применения современных детекторов КЛ в биологии и медицине при наблюдении объемных структур согласно общим принципам световой микроскопии (http://www.microscopyu.com/articles/formulas/formulasfielddepth.html).
При выборе конструктивной схемы предлагаемого нами детектора мы решили вернуться к использованию встраиваемого в СЭМ оптического микроскопа для формирования прямой оптической проекции люминесцирующего объекта. При этом предположили, что использование оптического микроскопа с низкой числовой апертурой будет существенно улучшать возможности визуализации объектов, рассеянных в объеме биологических тканей и клеток.
Однако в отличие от конструктивных схем, применяемых в КЛ-детекторах первых поколений, нами была предложена инвертированная компоновка оптического микроскопа, что принципиально отличает наше решение от первых систем «интегральной КЛ». Такая компоновка, в отличие от известных схем, позволяет наблюдать оптический сигнал КЛ прозрачных и просвечивающих объектов, размещенных на прозрачной подложке оппозитно электронному пучку СЭМ. Кроме того, в предлагаемой схеме предложено использовать объектив-рефрактор, при том, что у большинства систем «интегральной катодолюминесценции» в прошлом использовалась система сферических и плоских зеркал в качестве объектива для формирования оптической проекции светового микроскопа, встраиваемого в СЭМ. Последнее - не является принципиальным отличием, а вытекает из удобства геометрической компоновки оптических компонентов.
Предлагаемое устройство идеологически наследует схемы, применявшиеся на электронных микроскопах и микрозондах первых поколений. Эти устройства устанавливали на оптический микроскоп сканирующего электронного микроскопа (Физический энциклопедический словарь, 1984, М.: "Советская энциклопедия", статья «Электронный микроскоп», рис. 4).
Использование оптической схемы встроенного оптического микроскопа, позволяющей наблюдать объект сверху, со стороны электронного пучка, исключало возможность регистрации КЛ объектов, напыленных непрозрачными токопроводящими материалами.
В настоящее время есть единичные попытки применять подобную схему и с нижним положением оптического микроскопа при решении узких задач материаловедения для получения КЛ изображения наноструктур плоских объектов.
Ближайшим аналогом предлагаемого изобретения является устройство того же назначения (Cathodoluminescence Microscopy of nanostructures on glass substrates Angela C. , I. Gerward C. Weppelman, Robert J. Moerland, Nalan Liv, A. Christiaan Zonnevylle, Pieter Kruit, and Jacob P. Hoogenboom, OSA 2013, Vol. 21, No. 24 | DOI:10.1364/OE.21.029968).
Однако устройство, описываемое в этой работе, имеет ограничения при наблюдении КЛ биологических объектов. Прежде всего это ограничение связано с высокой числовой апертурой применяемого объектива, что препятствует наблюдению люминесцирующих объектов в объеме объекта в связи с низкой глубиной резкости высокоапертурных схем. Кроме того, используемые в ближайшем аналоге дополнительные системы позиционирования предметного столика делают систему громоздкой и при установке требуют значительной модификации электронного микроскопа.
Задачей предлагаемой полезной модели является усовершенствование детектора катодолюминесценции, расширяющее возможности его применимости в медицине, биологии и некоторых разделах минералогии и материаловедения.
Техническим результатом предлагаемой полезной модели является возможность регистрации явления катодолюминесценции на базе сканирующего электронного микроскопа в толще объемных объектов, напыленных оптически-непрозрачными токопроводящими материалами с использованием для оптической фокусировки привода предметного столика микроскопа.
Технический результат достигается за счет сочетания U-образной конструкции предметного столика сканирующего электронного микроскопа, подвижного соединения предметного столика и зеркала, и использования оптического объектива с низкой числовой апертурой, увеличивающего глубину резкости при наблюдении биологических объектов, напыленных оптически-непрозрачными токопроводящими материалами.
U-образная конструкция предметного столика сканирующего электронного микроскопа допускает нижнее положение зеркала встраиваемого оптического микроскопа относительно образца. Подвижное соединение предметного столика и зеркала позволяет производить фокусировку на объект при помощи системы позиционирования микроскопа. Использование оптического объектива с низкой числовой апертурой увеличивает глубину резкости. Все это позволяет регистрировать явления катодолюминесценции на базе сканирующего электронного микроскопа в толще объемных объектов, напыленных оптически-непрозрачными токопроводящими материалами.
Использование такой инвертированной схемы оптического микроскопа, встраиваемого в СЭМ, позволяет наблюдать образец снизу через прозрачную подложку (например, предметное стекло или лабораторный пластик). В этом случае - непрозрачное напыление образца сверху перестает мешать наблюдению КЛ. При этом низкая числовая апертура оптической системы предлагаемого детектора позволяет улучшить качество проекции на детектор единовременно люминесцирующих объектов, занимающих сложные объемные позиции в образце. В некоторых ситуациях, когда верхняя оптическая поверхность образца носит иррегулярный характер (например, поверхность клеток на лабораторном пластике) - нижнее положение оптического микроскопа, позволяющее наблюдать объем образца через плоское стекло, также значительно улучшает качество КЛ-изображения объектов. Увеличение глубины резкости оптической схемы детектора за счет применения объектива с числовой апертурой менее 0,5, кроме того, заставляет использовать в качестве внешнего регистратора цифровую камеру, основанную на охлаждаемых CCD матрицах, для улучшения соотношения сигнал/шум и компенсации уменьшенной светосилы.
На фиг. 1 представлена конструкция предлагаемого устройства:
1 - предметный столик сканирующего электронного микроскопа;
2 - анализируемый образец на прозрачной подложке;
3 - пучок электронов;
4 - зеркало;
5 - объектив;
6 - цифровая камера с охлаждаемой CCD-матрицей;
7 - подвижное соединение предметного столика с зеркалом.
Устройство работает следующим образом.
Поверх предметного столика сканирующего электронного микроскопа (1) размещают анализируемый образец на прозрачной подложке (2), затем пучок электронов (3) сканирующего электронного микроскопа вызывает в веществе образца катодолюминесценцию, которая посредством расположенного оппозитно пучку зеркала (4) проецируется через объектив (5) на цифровую камеру с охлаждаемой CCD-матрицей (6), при этом оптический фокус наводится изменением взаимного положения зеркала и предметного столика, сочлененных посредством подвижного соединения (7), приводимого системой позиционирования сканирующего электронного микроскопа.
Пример
2
Для изучения структуры коллагенового матрикса стромы роговицы при предполагаемом развитии кератоконуса посредством криотома изготовили тонкий продольный срез стромального вещества. Затем расправили его на поверхности кварцевого стекла, зафиксировали и высушили в обход критической точки в CO-сушилке. Поверхность образца напылили сплавом PdAu. Образец вместе с кварцевым стеклом разместили на предметном столике сканирующего электронного микроскопа. Проведя необходимую для электронной микроскопии откачку воздуха, включили высокое напряжение и при помощи растровой развертки пучка электронов, обегающего поверхность образца, получили изображение его микротопографии во вторичных электронах. Одновременно с этим, на цифровую камеру с охлаждаемой CCD-матрицей осуществили захват изображения катодолюминесценции нижней поверхности образца, визуализируемой через его прозрачную подложку из кварцевого стекла, и встроенные в микроскоп - зеркало и объектив. Для получения резкого изображения выбрали оптимальную позицию U-образного предметного столика с размещенным на нем объектом наблюдения на прозрачной подложке, с использованием штатной системы Z-позиционирования предметного столика микроскопа. Полученная микротопография не выявила особенностей в укладке коллагена, однако распределение яркости катодолюминесценции структурных белков в объеме образца позволило говорить о возникших в ткани зонах разрежения волокон коллагена, что характерно для кератоконуса.
Таким образом, использование предлагаемого устройства позволило подтвердить диагноз кератоконуса на основании изучения структуры ткани по пространственной картине катодолюминесценции структурных белков.
Устройство можно также использовать в минералогии и материаловедении для изучения катодолюминесценции разнообразных веществ в прозрачно-полированных шлифах. В том числе, в шлифах без покровных стекол, напыленных непрозрачными пленками.