Способ получения зрелых антиген-активированных дендритных клеток с трансфекцией РНК опухолевых клеток рака молочной железы
METHOD FOR OBTAINING OF MATURE ANTIGEN-ACTIVATED DENDRITIC CELLS WITH TRANSFECTION OF TUMOUR CELLS RNA OF BREAST CANCER

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, а именно к способам получения зрелых антиген-активированных дендритных клеток (ДК) с трансфекцией РНК опухолевых клеток рака молочной железы и может быть использовано впоследствии для стимуляции противоопухолевого цитотоксического иммунного ответа против клеток рака молочной железы.
Способы трансфекции антиген-активированных ДК сами по себе достаточно широко известны.
Известные способы введения векторов, содержащие необходимые нуклеиновые кислоты непосредственно в клетки хозяина, описаны в заявке на изобретение «Полипептиды, композиция, нуклеиновая кислота, клеточная линия, способ получения полипептида, способ лечения, клетка» (RU 94031472, C12Q 1/68, 1996). Как указано в данной заявке, нуклеиновые кислоты могут быть ДНК или РНК. Способы преобразования, которые различны в зависимости от типа клетки хозяина, включают электропорацию, трансфекцию с использованием хлорида кальция, хлорид рубидия, фосфат кальция, ДЭАЭ-декстрана или других веществ, бомбардировку микропулями; липофекцию; заражение (если вектор является инфицирующим агентом) и другие методы. При анализе других способов получения антиген-специфических цитотоксических клеток или иммунного ответа против опухолевых клеток больного анализировались и в данном изобретении описывались только способы получения антиген-активированных зрелых ДК.
Известен способ получения антиген-специфических цитотоксических клеток, при котором сначала получают зрелые ДК, а затем производят магнитную трансфекцию зрелых ДК экспрессионными плазмидами, содержащими ДНК-конструкции (RU 2013135146, C12N 1/00, 2013).
Известен также способ стимуляции цитотоксического иммунного ответа против клеток опухолевой линии аденокарциномы молочной железы, экспрессирующих специфические антигены, с помощью дендритных клеток, трансфицированных полиэпитопной ДНК-конструкцией (RU 2012135124, C07N 5/0784, 2012). Описанный способ включает, в том числе, трансфицирование уже зрелых ДК генетическими ДНК-конструкциями, несущими ЦТЛ- и Тх-эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов рака молочной железы.
В описанных способах применяется магнитная трансфекция ДНК-конструкций в уже зрелые ДК.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому является способ получения антиген-активированных зрелых ДК, описанный как составная часть в заявке на изобретение «Способ индукции противоопухолевого цитотоксического иммунного ответа с помощью дендритных клеток, трансфицированных РНК опухолевых клеток против клеток рака молочной железы» (RU 2013158429, C12N 5/0784, 2013). Способ по заявке включает совместное культивирование аутологичных мононуклеарных клеток (МНК), выделенных из периферической крови с дендритными клетками (ДК), полученными из моноцитов прилипающей фракции МНК, трансфицированными РНК опухолевых клеток рака молочной железы (РМЖ), а затем подвергнутых стимулированному  созреванию, отличающийся тем, что совместное культивирование неприлипающей фракции МНК и ДК, трансфицированных РНК аутологичных опухолевых клеток, проводят в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина-12 и рекомбинантного человеческого интерлейкина-18, а для получения зрелых ДК после двух суток культивирования прилипающей фракции МНК больных РМЖ полученные незрелые ДК, трансфицированные опухолевыми РНК по прошествии суток подвергают стимулированному созреванию еще в течение суток. Способ получения антиген-активированных зрелых ДК в описанном способе включает получение прилипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК), выделенной из периферической крови больного раком молочной железы, получение незрелых ДК, инкубирование ДК со стимуляторами созревания и трансфекцию РНК опухолевых клеток рака молочной железы.
Недостатком описанного способа получения антиген-активированных зрелых ДК является длительный срок их получения. Использованный способ оказывает непрямое токсичное действие на дендритные клетки и значительно снижает процент жизнеспособности (не более 21%) полученных зрелых дендритных клеток, что требует большого количества периферической крови для получения конечной фракции антиген-активированных дендритных клеток и необходимость проведения дополнительного этапа очистки от мертвых дендритных клеток с привлечением реактивов и специализированного оборудования, что также удлиняет процесс получения результата. Описанные недостатки вносят высокие риски и затраты в достижение требуемого результата - получения зрелых антиген-активированных дендритных клеток.
Задача, решаемая изобретением, заключается в сокращении на 1 сутки срока получения антиген-активированных зрелых ДК и повышении жизнеспособности полученных антиген-активированных зрелых ДК.
Поставленная задача решается тем, что в способе получения зрелых антиген-активированных дендритных клеток (ДК) с трансфекцией РНК опухолевых клеток рака молочной железы (РМЖ), включающем получение прилипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК), выделенных из периферической крови больного, получение незрелых ДК, инкубирование ДК со стимуляторами созревания и трансфекцию РНК опухолевых клеток, причем получение зрелых антиген-активированных ДК производят в течение 24 часов сочетанием магнитной трансфекции РНК опухолевых клеток рака молочной железы в соотношении 0,3 мкг РНК к 0,3 мкл взвеси магнитных частиц со стимуляторами созревания, выбранными из ряда:
, ИЛ-1β, ЛПС или их любым сочетанием.
Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что антигенную активацию незрелых ДК проводят с помощью магнитной трансфекции РНК аутологичных опухолевых клеток рака молочной железы, а для досозревания ДК используют, например, рекомбинантный человеческий провоспалительный цитокин - фактор некроза опухоли (рчФНО-α) или ИЛ-1β, ЛПС или их любым сочетанием.
Принципиальным отличием разработанного способа является применение протоколов активации и созревания ДК, включающих магнитную трансфекцию с РНК, полученных из аутологичных незрелых опухолевых клеток рака молочной железы, что активирует ДК против собственных опухолевых антигенов, тем самым увеличивая цитотоксический ответ, а также сокращает стадию получения зрелых антиген-активированных ДК до 3 суток.
Во всех известных способах трансфицируют РНК в зрелые ДК и отличными от заявляемого способа (магнитная трансфекция).
Например, при применении химической трансфекции незрелых дендритных клеток сам трансфицирующий агент (соли кальция, липосомы, липоконъюгаты) оказывает негативное влияние на дендритные клетки, взаимодействуя с мембраной клеток, нарушая ее целостность, что приводит к гибели клеток.
Например, при применении электропорации незрелых дендритных клеток сам трансфицирующий агент доставляется посредством разряда электрического импульса, что оказывает негативное влияние на дендритные клетки, приводя к критическим повреждениям мембран клеток.
Особенностью применения магнитной трансфекции на стадии незрелых ДК заключается в том, что на этой стадии дифференцировки (созревания) дендритные клетки активно сами способны захватывать антигенный материал посредством эндоцитоза, помимо трансфекции, и на этой стадии активно работают механизмы процессинга антигена. На стадии зрелых дендритных клеток сами клетки практически не способны захватывать антигенный материал, на первый план выходит функция дендритных клеток - презентация антигенов опухолевых клеток основным эффекторным клеткам иммунной защиты (CD4+ и CD8+лимфоциты).
Изобретение осуществляется следующим образом.
-5
2
2
Выделенная из периферической крови больных раком молочной железы прилипающая фракция мононуклеарных клеток культивируется в концентрации 1 млн/мл в полной среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES, 5×10 мМ 2 -меркаптоэтанола, 80 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл ампициллина в атмосфере 5% CO при 37°C с добавлением рчГМ-КСФ (50 нг/мл) и рчИЛ-4 (100 нг/мл). Через 48 часов культивирования полученные незрелые ДК трансфицируют РНК аутологичных опухолевых клеток рака молочной железы методом магнитной трансфекции. Процедура магнитной трансфекции РНК в дендритные клетки составляет в среднем 45 минут и включает в себя смену питательной среды, приготовление реактива для трансфекции, содержащей РНК аутологичных опухолевых клеток рака молочной железы и магнитные частицы в соотношении 0,3 мкг РНК к 0,3 мкл взвеси магнитных частиц и инкубацию на универсальной магнитной плате. Далее для досозревания незрелых дендритных клеток вносится рчФНО-α в дозе 25 нг/мл в культуру клеток и инкубируют в течение 24 часов в условиях CO-инкубатора. Чтобы оценить жизнеспособность полученных зрелых антиген-активированных дендритных клеток использовали краситель эритрозин. Жизнеспособность полученных зрелых антиген-активированных дендритных клеток составляла не менее 85%.
Для того, чтобы показать функциональную зрелость полученных антиген-активированных дендритных клеток, полученные ДК совместно культивировали с неприлипшей фракцией МНК. Далее оценивали влияние полученных зрелых антиген-активированных дендритных клеток на активацию лимфоцитов в культуре МНК, а именно пролиферативную активность CD4+ и CD8+лимфоцитов с помощью специфического красителя (CFSE) методом проточной цитофлуориметрии.
Показано достоверное повышение пролиферативной активности CD4+ и CD8+лимфоцитов, что служит показателем функциональной зрелости антиген-активированных дендритных клеток, полученных предложенным способом (см. таблицу).
Указанная проверка в объем защиты изобретения не входит. Предлагаемое изобретение позволяет в более короткие сроки получать зрелые антиген-активированные дендритные клетки, имеющие высокую жизнеспособность (не менее 85%), способные стимулировать пролиферативную активность CD4+ и CD8+ лимфоцитов в культуре мононуклеарных клеток.
Проведенные исследования показали, что разработанный способ получения зрелых антиген-активированных дендритных клеток с трансфекцией РНК аутологичных опухолевых клеток является эффективным и перспективным для дальнейшего его использования для стимуляции противоопухолевого цитотоксического иммунного ответа против клеток рака молочной железы.