СПОСОБ ИЗВЛЕЧЕНИЯ АЗАТИОПРИНА ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ
METHOD OF EXTRACTING AZATHIOPRINE FROM BIOLOGICAL FLUIDS

Изобретение относится к биологии, токсикологической и аналитической химии, а именно к способам извлечения азатиоприна из биологических жидкостей, и может быть использовано в практике химико-токсикологических и клинических лабораторий для извлечения азатиоприна из биологических жидкостей с целью его последующего определения. Способ относится к числу массовых.
Известен способ извлечения производных пурина (кофеина) из биологической жидкости (раствора альбумина), состоящий в том, что анализируемую пробу обрабатывают раствором пепсина в растворе хлороводородной кислоты, доводят реакцию среды полученной смеси до рН 4, инкубируют при температуре 37°С в течение 1 часа, экстрагируют трижды хлороформом при соотношении объемов водной и органической фаз 1:1, экстракты объединяют, остаток растворяют в фосфатном буфере с рН 7,4, полученный раствор фильтруют и определяют количество извлеченного производного пурина по величине оптической плотности фильтрата, измеренной при длине волны 273 нм (Стрелова О.Ю., Чувина Н.А. Изолирование кофеина из крови с применением ферментативного гидролиза на примере модельного вещества // Судебно-медицинская экспертиза. - 2008. - Т.51, №4. - С.28-31).
Способ отличается трудоемкостью и относительно низкой степенью извлечения.
Известен способ извлечения производных пурина из биожидкостей (крови), заключающийся в том, что анализируемую пробу обрабатывают сульфатом аммония, выдерживают в течение 30 минут при перемешивании, раствор центрифугируют при 3000 оборотах в минуту, центрифугат отделяют, доводят его реакцию до рН 4,0-5,0, экстрагируют трижды хлороформом при соотношении водной и органической фаз на каждой стадии экстракции 1:1, экстракты объединяют, экстрагент испаряют, остаток растворяют в фосфатном буфере с рН 7,4, полученный раствор фильтруют и определяют количество извлеченного вещества по величине оптической плотности, измеренной при длине волны 273 нм (Стрелова О.Ю., Чувина Н.А. Оценка эффективности методов изолирования токсических веществ из крови // Судебно-медицинская экспертиза. - 2008. - Т.51, №4. - С.22-24).
Способ характеризуется недостаточно высокой степенью извлечения.
Наиболее близким является способ извлечения производных пурина (к которым относится и азатиоприн) из плазмы крови, состоящий в том, что анализируемую пробу обрабатывают осаждающим белки реагентом, в качестве которого используется хлорная кислота, извлечение отделяют от выпавшего осадка центрифугированием, центрифугат обрабатывают раствором гидроксида натрия, избыток щелочи нейтрализуют раствором хлороводородной кислоты, полученный раствор экстрагируют смесью органических растворителей хлороформ-пропанол-2, взятых в объемном отношении 1:1, органический экстракт отделяют центрифугированием, экстрагент испаряют до сухого остатка, остаток растворяют в подвижной фазе и определяют количество перешедшего в экстракт анализируемого соединения методом ВЭЖХ по площади хроматографического пика (Dobrocky P., Bennet P.N., Natarianny L.J. Rapid method for the routine determination of caffeini and its metabolites by high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. Biomed. AppL - 1994. - Vol.652, №1. - P.104-108).
Способ характеризуется недостаточно высокой степенью извлечения. Техническим результатом настоящего изобретения является повышение степени извлечения.
3
Технический результат достигается тем, что анализируемую пробу обрабатывают осаждающим белки реагентом, в качестве которого используется ацетон, извлечение отделяют от выпавшего осадка путем фильтрования, ацетон из фильтрата испаряют в токе воздуха при комнатной температуре, водный остаток разбавляют водой, образующийся раствор обрабатывают сульфатом аммония, экстрагируют 0,9 моль/дм раствором диметилфталата в смеси 1,4-диоксан-хлороформ, взятых в объемном отношении 1:1 при соотношении водной и органической фаз 5:1 по объему, органический экстрагент отделяют, а количество перешедшего в экстракт анализируемого соединения определяют по величине оптической плотности экстракта, разбавленного в 10 раз 1,4-диоксаном, проводя измерения при длине волны 279 нм.
3
Способ осуществляется следующим образом: плазму крови, содержащую азатиоприн, обрабатывают осаждающим белки реагентом, в качестве которого используется ацетон, извлечение отделяют от выпавшего осадка путем фильтрования, ацетон из фильтрата испаряют в токе воздуха при комнатной температуре, водный остаток разбавляют водой, образующийся раствор обрабатывают сульфатом аммония, экстрагируют 0,9 моль/дм раствором диметилфталата в смеси 1,4-диоксан-хлороформ, взятых в объемном отношении 1:1 при соотношении водной и органической фаз 5:1 по объему, органический экстрагент отделяют, а количество перешедшего в экстракт анализируемого соединения определяют по величине оптической плотности экстракта, разбавленного в 10 раз 1,4-диоксаном, проводя измерения при длине волны 279 нм.
Способ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1
Извлечение азатиоприна из плазмы крови
3
3
3
3
3
В 5 г плазмы крови человека вносят 1 мг азатиоприна в виде 0,5 см 0,1% раствора, тщательно перемешивают биологическую жидкость с веществом. Полученную смесь обрабатывают 10 см осаждающего белки реагента, в качестве которого используют ацетон, и оставляют на 5 минут при перемешивании. По истечении указанного времени жидкое извлечение отделяют от выпавшего осадка путем фильтрования через бумажный фильтр. Фильтр и осадок на фильтре промывают 5 см ацетона. Порции фильтрата объединяют в выпарительной чашке и испаряют ацетон в токе воздуха при комнатной температуре. К водному остатку фильтрата добавляют 5 см воды, в образующийся раствор вводят сульфат аммония до получения насыщенного водно-солевого раствора, который экстрагируют 2 см 0,9 моль/дм раствора диметилфталата в смеси 1,4-диоксан-хлороформ, взятых в объемном отношении 1:1, на вибросмесителе в течение 8 минут, после чего раствор оставляют на 3-5 минут для расслаивания системы, органический экстракт отделяет 0,2 см экстракта вносят в мерную колбу вместимостью 10 см, доводят до метки 1,4-диоксаном и измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре СФ-2000 при длине волны 279 нм в кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм. Измерения проводят на фоне раствора, полученного в контрольном опыте. По величине оптической плотности определяют количество азатиоприна, перешедшее в слой экстрагента, используя уравнение градуировочного графика. Рассчитывают степень извлечения азатиоприна как отношение количества вещества, перешедшего в слой экстрагента, в процентах к его количеству, внесенному в биологическую жидкость.
Построение градуировочного графика
3
3
3
В ряд мерных колб вместимостью 10 мл вносят 0,1, 0,2, 0,4, 1,0, 1,6, 2,0 см 0,01% раствора азатиоприна в хлороформе, по 0,2 см 0,9 моль/дмраствора диметилфталата в смеси 1,4-диоксан-хлороформ, взятых в объемном отношении 1:1, и доводят 1,4-диоксаном до метки. Оптическую плотность образующихся растворов измеряют на спектрофотометре СФ-2000 при 279 нм в кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм. Измерения проводят на фоне раствора, полученного в контрольном опыте.
3
По результатам измерения оптической плотности серии растворов с известными концентрациями азатиоприна строят график зависимости оптической плотности от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 1,0 - 20,0 мкг/см. Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение градуировочного графика, которое в данном случае имеет вид:
А=0,06285-С+0,00124,
3
где А - оптическая плотность; С - концентрация анализируемого вещества (мкг в 1 см фотометрируемого раствора).
Результаты извлечения азатиоприна из плазмы крови представлены в таблице 1.
Пример 2
Извлечение азатиоприна из мочи
3
3
3
3
3
3
3
В 5 г мочи человека вносят 1 мг азатиоприна в виде 0,5 см 0,1% раствора, тщательно перемешивают биологическую жидкость с веществом. Полученную смесь обрабатывают 10 см осаждающего белки реагента, в качестве которого используют ацетон, и оставляют на 5 минут при перемешивании. По истечении указанного времени жидкое извлечение отделяют от выпавшего осадка путем фильтрования через бумажный фильтр. Фильтр и осадок на фильтре промывают 5 см ацетона. Порции фильтрата объединяют в выпарительной чашке и испаряют ацетон в токе воздуха при комнатой температуре. К водному остатку фильтрата добавляют 5 см воды, в образующийся раствор вводят сульфат аммония до получения насыщенного водно-солевого раствора, который экстрагируют 2 см 0,9 моль/дм раствора диметилфталата в смеси 1,4-диоксан-хлороформ, взятых в объемном отношении 1:1, на вибросмесителе в течение 8 минут, после чего раствор оставляют на 3-5 минут для расслаивания системы, органический экстракт отделяют, 0,2 см экстракта вносят в мерную колбу вместимостью 10 см, доводят до метки 1,4-диоксаном и измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре СФ-2000 при длине волны 279 нм в кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм. Измерения проводят на фоне раствора положенного в контрольном опыте. По величине оптической плотности определяют количество азатиоприна, перешедшее в слой экстрагента, используя уравнение градуировочного графика. Рассчитывают степень извлечения азатиоприна как отношение количества вещества, перешедшего в слой экстрагента, в процентах к его количеству, внесенному в биологическую жидкость.
Схема построения градуировочного графика для определения азатиоприна и уравнение этого графика представлены выше в примере 1.
Результаты извлечения азатиоприна из мочи представлены в таблице 2.
Предлагаемый способ по сравнению с прототипом на 7-8% повышает степень извлечения азатиоприна из биологических жидкостей.
Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов представлена в таблице 3.
Таблица 1
Результаты извлечения азатиоприна из плазмы крови (n=5; Р=0,95)
Внесено азатиоприна в плазму крови, мг
Найдено
Метрологические характеристики
мг
Степень извлечения R, %
1,00
0,9810
98,10
<maths num="1"><math display="block"><mover accent="true"><mi>x</mi><mo>¯</mo></mover></math><img file="00000001.tif" he="4" wi="3" img-content="undefined" img-format="tif" /></maths>
=97,33
1,00
0,9621
96,21
S=1,06
1,00
0,9812
98,12
<maths num="2"><math display="block"><mrow><msub><mi>S</mi><mover accent="true"><mi>x</mi><mo>¯</mo></mover></msub></mrow></math><img file="00000002.tif" he="6" wi="5" img-content="undefined" img-format="tif" /></maths>
=0,47
1,00
0,9808
98,08
<maths num="3"><math display="block"><mrow><mi>Δ</mi><mover accent="true"><mi>x</mi><mo>¯</mo></mover></mrow></math><img file="00000003.tif" he="4" wi="7" img-content="undefined" img-format="tif" /></maths>
=1,32
1,00
0,9613
96,13
ε=1,35
Таблица 2
Результаты извлечения азатиоприна из мочи (n=5; Р=0,95)
Внесоно азатиоприна в мочу, мг
Найдено
Метрологические характеристики
мг
Степень извлечения R, %
1,00
0,9792
97,92
<maths num="4"><math display="block"><mover accent="true"><mi>x</mi><mo>¯</mo></mover></math><img file="00000001.tif" he="4" wi="3" img-content="undefined" img-format="tif" /></maths>
=98,11
1,00
0,9811
98,11
S=0,66
1,00
0,9849
98,99
<maths num="5"><math display="block"><mrow><msub><mi>S</mi><mover accent="true"><mi>x</mi><mo>¯</mo></mover></msub></mrow></math><img file="00000002.tif" he="6" wi="5" img-content="undefined" img-format="tif" /></maths>
=0,29
1,00
0,9833
98,33
<maths num="6"><math display="block"><mrow><mi>Δ</mi><mover accent="true"><mi>x</mi><mo>¯</mo></mover></mrow></math><img file="00000003.tif" he="4" wi="7" img-content="undefined" img-format="tif" /></maths>
=0,82
1,00
0,9768
97,18
ε=0,83
Таблица 3
Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов (n=5; P=0,95)
Сравниваемые показатели
Предлагаемый способ
Известный способ
1. Степень извлечения из плазмы крови
97,33%
90,26%
2. Степень извлечения из мочи
98,11%
90,43%