Дезоксиуридинтрифосфаты, маркированные цвитерионными индоцианиновыми красителями
DEOXYURIDINE TRIPHOSPHATES MARKED WITH ZWITTERIONIC INDOCYANINE DYES

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области органической и биоорганической химии, молекулярной биологии, биотехнологии и медицины, а именно, к новым модифицированным нуклеозидтрифосфатам, содержащим цвитерионный цианиновый краситель, присоединенный через транс-алкеновый линкер различного строения. Предлагаемые соединения и материалы на их основе могут быть использованы в качестве флуоресцентных меток для ферментативного маркирования ДНК в ходе ПЦР.
Уровень техники
Современные методы обнаружения и идентификация причин и возбудителей заболеваний все чаще базируются на молекулярно-генетическом анализе. Процедура маркирования с целью визуализации результатов молекулярно-генетического анализа является важным и неотъемлемым этапом процесса (Ranasinghe R.T., Brown Т. Fluorescent based strategies for genetic analysis. Chem. Commun. 2005. P. 5487-5502). Повышение чувствительности и точности молекулярно-генетического анализа относится к основным направлениям развития медицинской диагностики. Чувствительность ограничена собственной, фоновой, флуоресценцией биологического материала.
Нуклеозидтрифосфаты, маркированные цианиновыми красителями ближнего ИК-диапазона, а также переход в область с меньшей фоновой флуоресценцией, в инфракрасную область, в диапазон длин волн 700-900 нм, представляет особый интерес ввиду чрезвычайно высокой чувствительности их регистрации, что позволяет использовать их в качестве инструмента для решения задач молекулярной биологии и медицины. Красители различаются природой и расположением заместителей и функциональных групп, что отражается на эффективности флуоресцентно-меченных нуклеозидтрифосфатов включаться в ДНК, синтезируемую в ходе ПЦР, под действием матрично-зависимых ДНК-полимераз.
Не смотря на разнообразие представленных в литературе цианиновых красителей различного строения, количество предлагаемых флуоресцентно-меченных нуклеозидтрифосфатов в разы меньше. Авторами патента (Fluorescent nucleotides containing a cyanine, merocyanine or styryl dye for the detection of nucleic acid, European patent, 1152008, - 2001, Fuji photo film со., Япония) предложено использовать для маркирования нуклеозидтрифосфатов цианиновые красители с сульфонамидным заместителем в положении 5 индолениниевого фрагмента.
В патенте (Improved process and method for the preparation of asymmetric monofunctionalised indocyanine labelling reagents and obtained compounds, European patent, 1211294, - 2002, Innosense S.r.l, Италия) предложен синтез флуоресцентно-меченного dUTP путем присоединения водорастворимых цианиновых красители с различным количеством сульфогрупп.
В патенте (Modified carbocyanine dyes and their conjugates, European patent, 1801165, - 2007, Molecular Probes Inc., США) фирмой Molecular Probes предложены индодикарбоцианиновые красители с карбоксипентильной группой в положении 3 индоленинового фрагмента и их конъюгаты с нуклеозидтрифосфатами.
В патенте (Cyanine dye labeling reagents with meso-substitution, US patent, 2004186278, - 2004, Amersham Biosciences Corp., США) представлен синтез флуоресцентно-меченного dUTP при использовании цианиновых красителей с заместителем в мезо-положении полиметиновой цепи.
В патенте (New fluorescence cyanine labels containing a sulfamido linker arm, European patent, 1491591, - 2004, Visen medical inc., Италия) представлена серия нуклеозидтрифосфатов, маркированных цианиновыми красителями с карбоксильной группой, присоединенной через сульфамидоалкильную цепь в положении 5.
Индотрикарбоцианиновые красители ИК-диапазона уже достаточно широко используются для медицинских исследований и область их применения непрерывно расширяется. С одной стороны, наблюдается поиск конъюгатов известных красителей с новыми рецепторными группами, с другой - поиск новых красителей с увеличенной фотостабильностью и увеличенной эффективностью флуоресценции. В настоящее время за рубежом фирмами реализуются флуоресцентные красители ИК-диапазона. Следует отметить, что количество предлагаемых красителей в разы меньше коммерчески-доступных красителей видимого диапазона. Кроме того, структура и спектральные характеристики предлагаемых красителей чаще всего не представлены или ограничены значениями длин волн возбуждения и флуоресценции.
Краситель Су7, предлагаемый фирмой General Electric Healthcare Life Sciences, содержит в структуре две сульфогруппы и гептаметиленовую цепь между индолениновыми фрагментами. Данный краситель обладает достаточно низкой фотостабильностью и хемостойкостью.
Авторами патента (Heat development image forming process and heptamethine cyanine dye compound, US patent, 6072059, - 2000, Fuji Photo Film Co., Япония) синтезированы гептаметиновые красители, содержащие в мезо-положении цепи циклогептеновый фрагмент.
Фирмой Li-Cor запатентованы индотрикарбоцианиновые красители с циклогексеновым фрагментом в мезо-положении гептаметиленовой цепи (Cyanine dye compounds and labaling methods, US patent, 6593148, - 2003, Li-Cor Inc., США; Optical fluorescent imaging using cyanine dye, WO 2007/2007136996, Li-Cor Inc., США). Данные красители, благодаря своим спектрально-люминесцентным свойствам, нашли широкое применение для биомедицинских исследований.
В патенте (Fluorescent cyanine labels containing sulfamido linker arm, US patent, 6448008, - 2002, Innosense S.r.l, Италия) представлен синтез ряда индотрикарбоцианиновых красителей, содержащих в мезо-положении циклогексеновый фрагмент и реакционно-способную группу в положении 5, присоединенную через сульфамидоалкильную цепь.
В патенте (Heptamethine cyanine compound, near infrared absorbing ink, near infrared absorbing sheet and silver halide photographic material, US patent, 5973158, - 1999, Fuji Photo Film Co. Ltd., Япония) представлен синтез гептаметиновых красителей, содержащих в мезо-положении цепи 4-пиридил.
Фирмой GE Heakthcare UK Limited предложен синтез индоцианиновых красителей, содержащих в положении 3 индоленинового фрагмента сульфонатобутильную группу (Water-soluble fluoro-substituted cyanine dyes as reactive fluorescence labeling reagents, US patent, 7767829, - 2010, GE Heakthcare UK Limited, Великобритания).
Любые новые подходы, позволяющие управлять люминесцентными свойствами цианинов, представляют несомненный интерес, как для науки, так и для практики. Ограниченность существующих синтетических методов, а также данных о влиянии расположения и природы заместителей на спектральные свойства отчетливо видна в ряду цвитерионных цианиновых красителей, содержащих в своей структуре триметиламмонийалкильный заместитель. Получение новых индоцианиновых красителей, а также их конъюгатов с нуклеозидтрифосфатами может позволить найти новые закономерные связи между их строением, свойствами и способностью эффективно встраиваться в ДНК, синтезируемую в ходе ПЦР, под действием матрично-зависимых ДНК-полимераз.
Раскрытие изобретения
Введение флуоресцентно-меченных нуклеозидтрифосфатов при помощи ДНК-полимераз в ходе ПЦР нашло широкое применение для ферментативного маркирования ДНК. Эффективность процесса маркирования сильно зависит от типа введенного красителя, от строения и длины линкера, связывающего нуклеиновое основание и флуорофор. В качестве меченых субстратов для ДНК-полимераз на основе 2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата хорошим вариантом являются его производные с линкерами на основе Е-этена (транс-изомер этилена).
Целью настоящего изобретения явился синтез новых флуоресцентно-меченных нуклеозидтрифосфатов, содержащих в положении 5 цвитерионный дисульфированный индокарбоцианиновый краситель с триметиламмонийалкильным заместителем, при этом флуорофор присоединен через линкеры различного строения, включающие транс-алкеновую группу, и их применение для ферментативного маркирования ДНК в ходе ПЦР.
Поставленная цель достигается структурой заявляемого нового типа флуоресцентно-меченных нуклеозид трифосфатов общей формулы (А).
где:
2
2
2
5
2
2
5
2
5
X представляет собой -СН-; -CHCONH(CH)-; -CHCONH(CH)CONH(CH)-;
2
3
2
5
2
5
2
3
Y представляет собой -(СН)-; -(СН)-; -(CH)CONH(CH)-;
n=1 -3
+
+
+
+
+
+
3
2
n
(4
m
m
М представляет собой Н, Na, Li, K, [CH(CH)]-)NH (где n=0-5, m=0-4).
Предлагаемые флуоресцентно-меченные трифосфаты общей формулы (А) характеризуются тем, что в структуре цвитерионного индоцианинового красителя общей формулы (В), присоединенного через трансалкеновый линкер различной длины, содержится две отрицательнозаряженные сульфогруппы и положительно заряженный триметиламмонийалкильный заместитель.
где:
2
5
2
5
2
5
R представляет собой -ОН; -NH(CH)COOH; -NH(CH)CONH(CH)COOH;
2
3
2
5
2
5
2
3
Y представляет собой -(СН)-; -(СН)-; -(CH)CONH(CH)-;
n=1-3
В частности, соединения, условно отнесенные к соединениям группы С, соответствующие общей формуле (С)
где:
2
5
2
5
2
5
R представляет собой -ОН; -NH(CH)COOH; -NH(CH)CONH(CH)COOH;
n=1-3
а также соединения, условно отнесенные к соединениям группы D, соответствующие общей формуле (D)
где:
2
5
2
5
2
5
R представляет собой -ОН; -NH(CH)COOH; -NH(CH)CONH(CH)COOH;
m=3-5
n=1-3
Указанные структурные отличия цвитерионных индоцианиновых красителей общих формул (С) и (D), входящих в состав нуклеозидтрифосфатов (А), приводят к ряду отличительных свойств, а именно к электронейтральности молекулы флуорофора за счет наличия в структуре красителя двух отрицательно заряженных сульфогрупп и положительно заряженного триметиламмонийалкильного заместителя, к повышенной водорастворимости, повышенной химической устойчивости и термостойкости. Изменение структуры хромофора и введение линкера различной длины оказывает положительное влияние на эффективность встраивания модифицированных нуклеозидтрифосфатов в растущую цепь ДНК в ходе ПЦР. Для получения линкера, соединяющего молекулу красителя и dUTP, использовали аминокапроновую кислоту.
Были определены спектрально-люминесцентные характеристики красителей общей формулы (В) (m=2) в водном фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) (10 мМ калий фосфатный буфер, 0.9% NaCl, рН 7.4). Значения молярного коэффициента экстинкции красителей в некоторых случаях достигают значения ~250000 (Таблица 1, Таблица 2). Квантовый выход флуоресценции красителей общей формулы (В) (m=2) в PBS превышает 30% (Таблица 1, Таблица 2). Предлагаемые красители структур (В) различаются спектральным диапазоном возбуждения и флуоресценции.
Были определены спектрально-люминесцентные характеристики красителей общей формулы (В) (m=3) в водном фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) (10 мМ калий фосфатный буфер, 0.9% NaCl, рН 7.4). Значения молярного коэффициента экстинкции красителей в некоторых случаях достигают значения ~250000 (Таблица 1, Таблица 2). Квантовый выход флуоресценции красителей общей формулы (В) (m=3) в PBS превышает 35% (Таблица 1, Таблица 2).
На спектрофотометре Jasco V-550 (Япония) записаны спектры поглощения красителей общей формулы (В) (m=2, 3) в растворах PBS при 20°С (Фиг. 1, Фиг. 2). Спектр поглощения синтезированных красителей представлен интенсивной полосой и мало интенсивным плечом, которое расположено с коротковолновой стороны полосы. На спектрофлуориметре Cary Eclips записаны спектры возбуждения и флуоресценции растворов синтезированных красителей общей формулы (В) (m=2, 3) в PBS при 20°С (Фиг. 1, Фиг. 2, Таблица 1, Таблица 2). Введение аммонийной группы в положение 1 практически не оказало воздействия на максимумы возбуждения и флуоресценции по сравнению с коммерчески-доступными красителем Су5 и Су7 соответственно.
Была определена термическая стабильность красителей общей формулы (В) (m=2, 3) (Фиг. 3). Результаты эксперимента в случае с красителями общей формулы (В) (m=3) сравнивали с данными, полученными для красителей (Су7) и (Cy7-monosulfo), поскольку гептаметиновые красители менее термо- и светостойки по сравнению с пентаметиновыми аналогами.
-6
норм
Термическую стабильность красителей исследовали на основании данных оптической плотности их водных растворов с концентрацией 10 моль/л. Предварительно краситель в процессе хроматографической очистки, нанесенный на сорбент RP-18, промывали 0.01 М раствором EDTA. Данная процедура позволила удалить ионы тяжелых металлов, которые могут катализировать процесс термоокислительной деструкции. В качестве растворителя использовали бидистиллированную воду (MQ). Спектры поглощения растворов красителей регистрировали на спектрофотометре Jasco V-550 (Япония). Полученные данные нормировали и далее использовали понятие - нормированное значение поглощения (D).
-6
норм
Растворы красителей в MQ с концентрацией 10 моль/л нагревали в термостате (AccuBlock Digital Dry Bath, Labnet, Швейцария, блок для пробирок Эппендорфа объемом 2 мл) в течение 6 ч при температуре 92°С. Регистрацию оптической плотности проводили через равные промежутки времени. По мере нагревания красителей в MQ происходило уменьшение величины оптической плотности. Таким образом, по изменению величины оптической плотности судили о степени деструкции хромофорной системы красителей. По полученным данным строили график зависимости D от времени (Фиг. 3). На основании полученных экспериментальных данных видно, что краситель общей формулы (С) (m=2) обладает высокой термической стабильностью. Краситель общей формулы (С) (m=3) по сравнению электронейтральным моносульфированным красителем (Су7-monosulfo) обладает повышенной термической стабильностью сопоставимой с данными, полученными для дисульфированного красителя (Су7).
-6
норм
Была определена светостойкость (фотостабильность) красителей общей формулы (С) (m=2, 3). Фотостабильность должна быть достаточной для практического применения синтезированных флуорофоров при исследовании биомолекул. При изучении светостойкости использовали красители, очищенные от следов тяжелых металлов обработкой 0.01 М раствором EDTA. Исследование светостойкости синтезированных красителей проводили путем облучения их растворов в MQ с концентрацией 10 моль/л в изолированном от внешнего света боксе и регистрировали изменение оптической плотности раствора. В качестве источника света использовали лампу накаливания мощностью 60 Вт, расположенную на одном уровне с исследуемыми пробами на расстоянии 30 см. Приготовленные растворы красителей помещали в стеклянные виалы и облучали в течение 6 ч, регистрируя оптическую плотность через равные промежутки времени. Полученные данные нормировали на максимальное значение, полученное для каждого красителя, и строили зависимость D от времени (Фиг. 4).
Наши исследования показали, что введение триметиламмонийалкильного заместителя в положение 1 индотрикарбоцианинового красителя общей формулы (С) (m=3) привело к увеличению фотостойкости по сравнению с красителем (Cy7-monosulfo). По совокупности термо- и светостойкости, яркости флуоресценции (значение коэффициента молярной экстинкции и квантового выхода флуоресценции), а также химической стабильности красители общей формулы (С) (m=3) (на примере красителя С4) с аммонийным заместителем в положении 1 превосходит краситель (Cy7-monosulfo).
Далее представлены результаты использования красителей для получения флуоресцентно-меченных нуклеозид трифосфатов общей формулы (А) с последующим их применением для ферментативного маркирования ДНК в ходе ПЦР.
+
+
Все красители общей формулы (В) в виде их /пара-нитрофениловых эфиров с выходом 60-70% (в зависимости от структуры используемого красителя (В)) маркируют нуклеотиды, содержащие в С5-положении аминоаллильный заместитель. Реакцию можно проводить с последующей заменой анионов в соединениях по изобретению общей формулы (А), обработкой кислотами, солями кислот с иными противоионами (или без замены аниона). Варьирование перечисленных противоионов не оказывает влияния на спектрально-люминесцентные характеристики нуклеотидов общей формулы (А). Поэтому детальное описание свойств модифицированных нуклеотидов общих формул (А, М=Na) представлено на примере их натриевых солей.
Нуклеотиды общей формулы (А), модифицированные красителями с триметиламмонийалкильным заместителем характеризуются интенсивными полосами поглощения и флуоресценции и значениями квантового выхода флуоресценции 30-34% в PBS (Таблица 3).
Установлено, что результаты полимеразной цепной реакции с использованием флуоресцентно-меченных нуклеозидтрифосфатов общей формулы (А) зависят от структуры модифицированных нуклеотидов, используемых в качестве субстратов в ПЦР. Эффективность встраивания модифицированных нуклеотидов общей формулы (А) в условиях ПЦР анализирована при использовании тест-системы «KRAS-биочип» (Биочип-ИМБ, Москва, Россия), предназначенной для определения мутаций, характерных для рака поджелудочной железы (М.А. Емельянова. Определение мутаций в гене KRAS в опухолевых клетках с помощью биологических микрочипов // Молекулярная биология. -2011. - Т. 45, №5. - С. 863-870).
Для оценки степени встраивания модифицированных нуклеотидов Taq-полимеразой в ДНК вычисляли средний флуоресцентный сигнал совершенных дуплексов в ячейках биочипа и затем нормировали его на значение, полученное для коммерчески-доступного продукта (AAdUTP-Cy5 - Jena Bioscience GmbH, Germany, NU-803-CY5-S). Флуоресцентный сигнал оказался максимальным для нуклеотидов А10-А18, содержащих цвитерионный индотрикарбоцианиновый краситель. Для обоих групп модифицированных нуклеозидтрифосфатов А1-А9 и А10-А18 прослеживается зависимость нормированного сигнала флуоресценции от длины линкера, отдаляющего флуорофор от пиримидинового основания, изменяющаяся в рядах: (A3)>(А2)>(A1); (А6)>(А5)>(А4); (А9)>(А8)>(А7); (А12)>(A11)>(А10); (А15)>(А14)>(А13); (А18)>(А17)>(А16). Флуоресцентные сигналы, полученные для нуклеотидов (А) с длинным линкером, содержащих в своей структуре краситель общей формулы (С) и (D, m=3), оказались значительно выше сигналов, полученных при использовании коммерчески-доступного AAdUTP-Cy5.
Установлено, что все красители формул (В) в составе коньюгатов с нуклеотидами не ингибируют полимеразную цепную реакцию. Модифицированные нуклеотиды общей формулы (А) не влияют на стабильность всех остальных компонентов анализа. Установлено, что все соединения формулы (А) обладают стабильностью, достаточной для проведения полного цикла анализа без заметного разложения красителя. Использование флуоресцентно-меченных нуклеотидов общей формулы (А) в ПЦР и регистрация флуоресценции в ИК-области спектра позволяет получить флуоресцентный сигнал в 20-25 раз выше по сравнению с коммерчески-доступным продуктом AAdUTP-Cy5 при определении мутаций рака поджелудочной железы на примере использования тест-системы «KRAS-биочип» (Биочип-ИМБ, Москва, Россия).
По совокупности всех свойств соединения формулы (А) могут успешно использоваться для ферментативного маркирования ДНК в ходе ПЦР, а также в качестве флуоресцентных меток при разработке диагностических тест-систем, основанных на проведении ПЦР.
Краткое описание фигур
Таблица 1. Спектральные характеристики индоцианиновых красителей общей формулы (C) в PBS (+25°С). Квантовые выходы флуоресценции определяли относительно коммерчески-доступного Су5 (Q=28% (PBS), Amersham, GE Healthcare).
Таблица 2. Спектральные характеристики индоцианиновых красителей общей формулы (D) в PBS (+25°С). Квантовые выходы флуоресценции определяли относительно коммерчески-доступного Су5 (Q=28% (PBS), Amersham, GE Healthcare).
+
+
+
+
+
+
3
2
х
(4-y)
y
Таблица 3. Спектральные характеристики флуоресцентно-меченных нуклеозидтрифосфатов общей формулы (А) в PBS (+25°С). Квантовые выходы флуоресценции определяли относительно коммерчески-доступного Cy5-dUTP (Amersham, GE Healthcare PA55022). M - H, Na, Li, K, [СН(СН)]NH(где х=0-5, у=0-4).
Фиг. 1. Нормированные спектры поглощения и флуоресценции индоцианиновых красителей общей формулы (В, n=3).
Фиг. 2. Нормированные спектры поглощения и флуоресценции индоцианиновых красителей общей формулы (В, n=2).
норм
Фиг. 3. График зависимости D от времени при нагревании растворов индоцианиновых красителей общей формулы (С) в MQ при 92°С.
норм
Фиг. 4. График зависимости D от времени при облучении индоцианиновых красителей общей формулы (С).
Фиг. 5. Нормированный сигнал флуоресценции для модифицированных нуклеозидтрифосфатов общей формулы (А) при использовании диагностической тест-системы «KRAS-биочип» (Биочип-ИМБ, Москва, Россия).
Осуществление изобретения
Соединения по изобретению общей формулы (А) синтезировали, согласно схеме 1.
Синтез несимметричных индодикарбоцианиновых красителей общей формулы (D), входящих в состав нуклеозидтрифосфатов (А), основан на реакции конденсации солей индолениния, содержащих активную метиленовую группу, и дианила (схема 2) (В.Е. Кузнецова и др, Изв. АН, Сер. хим., 2007, №11, с. 2186-2190; В.Е. Кузнецова и др., Изв. АН, Сер. хим., 2007, №12, с. 2355-2359; V.E. Kuznetsova et al, Mend. Comm. 2008, №3, pp. 138-140). Проведение реакции с N.N-дифенилформамидином (3, n=1), с гидрохлоридом дианила малонового диальдегида (3, n=2), с гидрохлоридом дианила глутаконового диальдегида (3, n=3) приводит к образованию красителей (D, n=1), (D, n=2) и (D, n=3) соответственно. В ходе реакции кроме целевого соединения образуются еще два побочных симметричных продукта. На первой стадии в реакцию конденсации вводили индоленин, содержащий четвертичную аммонийную группу в положении 1. Вторую стадию получения индодикарбоцианинового красителя осуществляли при использовании безводного ацетата калия в качестве конденсирующего агента. Для полного протекания реакции достаточно нагревания при 118°С в течение 1-3 ч.
Синтез промежуточных соединений, необходимых для получения красителей формулы (В), представлен на схеме 4 (Maksim A. Spitsyn, Viktoriya Е. Kuznetsova, Valeriy Е. Shershov, Marina A. Emelyanova, Teimur O. Guseinov, Sergey A. Lapa, Tatyana V. Nasedkina, Alexander S. Zasedatelev, Alexander V. Chudinov, Synthetic route to novel zwitterionic pentamethine indocyanine fluorophores with various substitutions // Dyes and Pigments, V. 147, P. 199-210). Конденсацией фенилгидразина (6) с метилизопропилкетоном получали соответствующий индоленин (7) (схема 3). N-Алкильное производные (соединение (2)) получали действием (3-бромопропил)триметил-аммоний бромида или (5-бромопентил)триметил-аммоний бромида в бутиронитриле соответственно.
Другой способ получения цвитерионных цианиновых красителей с триметиламмонийалкильным заместителем заключается в модификации симметричного красителя (5), содержащего две карбоксильные группы. Для этого синтезировали симметричный краситель (5) (Схема 3). Индоцианиновый краситель (5, n=1, 2) получают в одну стадию конденсацией индолениниевой соли и дианила (3, n=1, 2). Тогда как синтез индотрикарбоцианинового красителя (5, n=3) осуществляют в две стадии при использовании трехкратного избытка (по отношению к производному глутаконового альдегида (3, n=3)) кватернизованного индоленина (4), который вводили на каждой стадии равными порциями. Реакцию проводили в смеси уксусный ангидрид - уксусная кислота с добавлением ацетата калия в качестве конденсирующего агента.
Для получения активированного эфира красителя (5) использовали несколько способов. Первый способ заключался в активации карбоксильной группы красителя (5) при использовании HBTU и N-гидроксифталимида в DMF с добавлением DIPEA, при этом мы наблюдали неполную конверсию исходной кислоты (5) и образование двух активированных эфиров с преимущественным образованием моно продукта. Следует отметить, что при комнатной температуре время проведения реакция составило 3 суток. Использование вместо HBTU N,N'-карбонилдиимидазола привело к резкому уменьшению скорости образования активированных эфиров до 10 суток. Намного селективнее и быстрее протекала реакция, в которой конденсирующим агентом выступал HBTU, а в качестве активатора - NHS, при этом преимущественно образовывался продукт ди-присоединения. Ход реакции контролировали при помощи ТСХ на пластиках RP-18.
После образования смеси моно - и ди- активированных эфиров (без их выделения) в реакционную массу добавляли раствор 3-(диметиламино)-1-пропиламина дигидрохлорида в карбонат-бикарбонатном буферном растворе (Схема 3). Для полного протекания реакции необходимо перемешивание реакционной массы в течение 24 ч и 72 ч при комнатной температуре (в случае сукцинимидных и фталимидных эфиров соответственно). При использовании сукцинимидных эфиров реакция присоединения амина проходила селективнее с преимущественным образованием продукта моно присоединения (6). В то время как скорость гидролиза фталимидных эфиров оказалась выше скорости образования амидной связи и продукт (6) образовывался с выходом <10%.
3
Кватернизацию продукта (6) проводили при помощи метилиодида (для красителей (С, n=1, 2) и метилового эфира р-толуолсульфокислоты (для красителя (С, n=3) в DMF при комнатной температуре в течение 3 ч. В ходе проведения реакции при использовании метилового эфира р-толуолсульфокислоты происходило преимущественное образование кватернизованного продукта (С, R=ОН, n=3)) и следовые количества метилового эфира красителя. В случае применения метил иодида в качестве алкилирующего агента происходило преимущественное образование метилового эфира (С, R=ОСН,), который переводили в соответствующую кислоту кислотным гидролизом. В случае красителя (С4) проведение кислотного гидролиза невозможно вследствие деструкции хромофорной части флуорофора.
Для изменения длины линкера, отделяющего флуорофор от нуклеозидтрифосфата, получены конъюгаты красителей с аминокапроновой кислотой. Для этого предварительно получали активированные эфиры красителей общей формулы (В) при помощи р-нитрофенола и HBTU в DMF (для красителей (В, n=1, 2) или действием бис-р-нитрофенилкарбоната в DMSO (для красителей (В, n=3). Далее полученный активированный эфир обрабатывали раствором аминокапроновой кислоты в карбонат-бикарбонатном буферном растворе.
1
Все синтезированные красители выделяли обращено-фазовой хроматографией на C18-RP колонке в системе ацетонитрил-0.1 М ТЕАА в линейном градиенте концентраций от 10 до 50% ацетонитрила. Структура и индивидуальность соединения (16) подтверждена методом ТСХ, масс спектрометрии (MALDI-TOF) и данными ЯМР Н спектроскопии.
Для синтеза флуоресцентно-меченого AAdUTP нами предварительно получены активные производные красителей общей формулы (В). Активные производные получали этерификацией красителей общей формулы (В) при помощи р-нитрофенола в присутствии HBTU в DMF. Активированные эфиры выделяли с количественным выходом (~95%) обращено-фазовой хроматографией в нейтральной смеси растворителей (вода -ацетонитрил).
Дальнейшую конденсацию активного производного красителя общей формулы (В) и AAdUTP (1) проводили в 0.1 М карбонат-бикарбонатном водном буферном растворе при охлаждении. Реакцию можно проводить с последующей заменой анионов, обработкой кислотами, солями кислот с иными противоионами (или без замены аниона). Продукт реакции общей формулы (А) выделяли и очищали от примесей в два этапа. Первую очистку осуществляли при помощи ионообменной хроматографии на сорбенте DEAE-целлюлоза в линейном градиенте концентраций от 0 до 0.3 М ТЕАНС (триэтиламмоний гидрокарбонатный буферный раствор) в 20% ацетонитриле. Затем конъюгат общей формулы (А) дополнительно очищали обращено-фазовой хроматографией на C18-RP колонке в системе ацетонитрил-0.05М триэтиламмоний гидрокарбонатный буферный раствор (ТЕАНС) в линейном градиенте концентраций от 0 до 50% ацетонитрил а. Использование триэтиламмоний гидрокарбоната для создания градиента ионной силы обусловлено тем, что его можно легко удалить в вакууме при комнатной температуре. Ионы триэтиламмония ингибируют реакцию ПЦР, поэтому после выделения флуоресцентно-меченого AAdUTP общей формулы (А) в виде триэтиламмониевой соли осуществляли его перевод в другую солевую форму.
Модифицированные нуклеотиды общей формулы (А) получали в разных солевых формах. Использование на последней стадии выделения и очистки перхлората натрия позволило получить нуклеотиды формул А в виде их натриевых солей. Так же нуклеотиды формулы А можно получить в фосфорнокислой форме, в виде солей щелочных металлов и в виде различных аммониевых солей, используя на последнем этапе очистки вместо перхлората натрия соответствующие реагенты:
- 0.1 М KCl - для получения калиевой соли нуклеотида;
- 0.1 М LiCl - для получения литиевой соли нуклеотида;
- 0.1 М ТЕАА - для получения триэтиламмониевой соли нуклеотида;
4
3
- 0.1 М NHHCO - для получения аммониевой соли нуклеотида.
Фракции, содержащие целевое соединение общей формулы (А), объединяли и разбавляли до объема 50 мл деионизованной водой. Концентрацию модифицированного нуклеотида общей формулы (А) определяли, исходя из молярного коэффициента экстинкции цианиновых красителей (В). Поглощение определяли в трех повторах путем разбавления стокового раствора в MQ, таким образом, чтобы оптическая плотность не превышала значение 0.1.
1
31
Строение промежуточных и целевых соединений подтверждено данными УФ-, Н-ЯМР спектроскопии, Р-спектроскопии и масс-спектрометрии.
Нуклеотиды общей формулы (А), модифицированные цвитерионными красителями, характеризуются интенсивными полосами поглощения и флуоресценции и значениями квантового выхода флуоресценции 30-34% в PBS. Максимумы поглощения и флуоресценции модифицированных красителями нуклеотидов располагаются в области 650 и 665 нм в случае нуклеозидтрифосфатов общей формулы А (n=2) и в области 750 и 765 нм в случае нуклеозидтрифосфатов общей формулы А (n=3).
Еще одним объектом изобретения является применение соединений по изобретению общей формулы (А) для энзиматического флуоресцентного маркирования ДНК в ходе ПЦР. Эффективность встраивания модифицированных нуклеотидов (А) в условиях ПЦР анализирована при использовании коммерческой тест-системы «KRAS-биочип» (Биочип-ИМБ, Москва, Россия), предназначенной для определения мутаций, характерных для рака поджелудочной железы (М. А. Емельянова. Определение мутаций в гене KRAS в опухолевых клетках с помощью биологических микрочипов // Молекулярная биология. - 2011. - Т. 45, №5. - С. 863-870). При этом правильно подобранная структура красителя, входящего в состав маркированного трифосфата дезоксинуклеозида, может привести к увеличению чувствительности молекулярно-генетического анализа. Измерения величины флуоресценции проводили на приборе «Чипдетектор-01» («Биочип-ИМБ», Россия) для анализа нуклеозидтрифосфатов общей формулы А (n=2) и на флуоресцентном анализаторе для анализа биочипов с ИК-флуоресцентными метками для исследования нуклеозидтрифосфатов общей формулы А (n=3).
Микрочип представляет собой расположенные на подложке ячейки из гидрогеля с иммобилизованными внутри ячеек олигонуклеотидными зондами. Диаметр ячеек приблизительно 100 микрон. В разных ячейках находятся олигонуклеотидные зонды различного строения. В ячейках, в которых строение зонда соответствует строению ампликона, происходит связывание ампликона в прочный комплекс, дуплекс. В тех ячейках в которых строение зонда не соответствует строению ампликона не происходит связывания ампликона. Результаты анализа оценивают по интенсивности флуоресцентных сигналов в ячейках биочипа. В ячейках, в которых произошло связывание флуоресцентно-меченого ампликона с зондом, наблюдается интенсивный сигнал флуоресценции. Для регистрации сигналов используют флуоресцентный микроскоп, снабженный компьютером со специальным программным обеспечением.
На величину сигналов влияют различные факторы: эффективность встраивания ДНК-полимеразой модифицированных нуклеотидов в амплифицированный продукт, специфическое связывание с образованием совершенных дуплексов с олигонуклеотидными зондами, находящимися в ячейках биочипа, неспецифическое связывание с компонентами ячейки биочипа, яркость флуоресценции флуоресцентной метки, связанной с амплифицированнм продуктом и многое другое.
Для оценки степени встраивания модифицированных нуклеотидов Taq-полимеразой в ДНК вычисляли средний флуоресцентный сигнал совершенных дуплексов в ячейках биочипа (Kuznetsova V. Е., Spitsyn М. A., Shershov V. Е., Guseinov Т. О., Fesenko Е. Е., Lapa S. A., Ikonnikova A. Yu., Avdonina М. A., Nasedkina Т. V., Zasedatelev A. S., А. V. Chudinov. // Mend. Commyn.2016. V. 26. Р. 95-98; Maksim A. Spitsyn, Viktoriya Е. Kuznetsova, Valeriy Е. Shershov, Marina A. Emelyanova, Teimur O. Guseinov, Sergey A. Lapa, Tatyana V. Nasedkina, Alexander S. Zasedatelev, Alexander V. Chudinov, Synthetic route to novel zwitterionic pentamethine indocyanine fluorophores with various substitutions // Dyes and Pigments, V. 147, P. 199-210) и затем нормировали его на значение, полученное для коммерчески-доступного продукта (AAdUTP-Cy5) (Jena Bioscience GmbH, Germany, NU-803-CY5-S).
Флуоресцентный сигнал оказался выше для нуклеотидов А10-А18, содержащих цвитерионный индотрикарбоцианиновый краситель. Для обоих групп модифицированных нуклеозидтрифосфатов А1-А9 и А10-А18 прослеживается зависимость нормированного сигнала флуоресценции от длины линкера, отдаляющего флуорофор от пиримидинового основания, изменяющаяся в рядах: (A3)>(А2)>(A1); (А6)>(А5)>(А4); (А9)>(А8)>(А7); (А12)>(A11)>(А10); (А15)>(А14)>(А13); (А18)>(А17)>(А16). Флуоресцентные сигналы, полученные для нуклеотидов (А) с длинным линкером, содержащих в своей структуре краситель общей формулы (С) и (D, m=3), оказались значительно выше сигналов, полученного при использовании коммерчески-доступного AAdUTP-Cy5, содержащего в своей структуре дисульфированный и додикарбоцианиновый краситель.
Использование флуоресцентно-меченных нуклеотидов общей формулы (А) в ПЦР и регистрация флуоресценции в ИК-области спектра позволяет получить флуоресцентный сигнал в 20-25 раз выше по сравнению с коммерчески-доступным продуктом AAdUTP-Су5 при определении мутаций рака поджелудочной железы при использовании тест систем «KRAS-биочип» (Биочип-ИМБ, Москва, Россия). Исходя из вышеизложенного следует, что заявляемые флуоресцентно-меченные нуклеозидтрифосфаты общей формулы (А) могут успешно использоваться для ферментативного маркирования ДНК в ходе ПЦР.
Следующие примеры иллюстрируют изобретение.
Примеры соединений и их применение
В работе использовали реагенты и растворители марок "ОСЧ", "ХЧ" или "ЧДА" фирм Aldrich, Alfa Aesar, Fluka, Химмед.
DMF очищали перегонкой в вакууме в токе азота над фталевым ангидридом [т. кип. 46°С (10 Торр)]. Диизопропилэтиламин перегоняли над нингидрином, затем над КОН (т. кип. 126-127°С). Уксусный ангидрид кипятили с безводным ацетатом калия, а затем перегоняли (т. кип. 139-140°С).
1 М Триэтиламмоний-ацетатный буферный раствор (ТЕАА) получали следующим образом. К смеси деионизованной воды (700 мл) и триэтиламина (139 мл, 1 моль) при охлаждении на льду и интенсивном перемешивании добавляли по каплям под слой жидкости уксусную кислоту (57 мл, 1 моль) (до рН 7.0) и объем раствора доводили до 1 л.
2
1 М Триэтиламмоний-гидрокарбонатный буферный раствор (ТЕАНС) получали следующим образом. В смесь деионизованной воды (700 мл) и триэтиламина (139 мл, 1 моль) при охлаждении на льду, интенсивном перемешивании и контроле рН пропускали газообразный CO (до рН 7.5) и объем раствора доводили до 1 л.
0.1 М Фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), 0.15 М NaCl, рН 7.4 готовили следующим образом. Смесь калия фосфата двузамещенного (0.87 г, 0.005 моль), калия фосфата однозамещенного (0.68 г, 0.005 моль) и хлорида натрия (9.0 г, 0.15 моль) растворяли в деионизованной воде (700 мл). Подщелачивали 1 М раствором калия фосфата однозамещенного до рН 7.4 и доводили объем полученного раствора до 1 л.
Буферный раствор Трис/ЭДТА («ТЕ-буфер», 10 мМ Трис (рН 8.0), 1 мМ ЭДТА) приобретали в фирме Aldrich.
Пример 1. Получение фенилгидразин-n-сульфокислоты (соединение 6)
Сульфаниловую кислоту (52.0 г, 0.3 моль) и углекислый натрий (16.5 г, 0.06 моль) растворяют при нагревании в воде (200 мл). Полученный раствор отфильтровывают и к нему добавляют по каплям концентрированную серную кислоту (35.0 г, 19.1 мл, 0.36 моль), при этом выпадает белый осадок. К суспензии при охлаждении на льду и перемешивании добавляют раствор нитрита натрия (21.0 г, 0.3 моль) в воде (50 мл) с такой скоростью, чтобы температура реакционной массы не поднималась выше 12°С. Дополнительное перемешивание продолжают еще в течение 15 мин. Выделившийся осадок диазосоединения собирают фильтрацией и промывают небольшим количеством ледяной воды.
К раствору сульфита натрия (85 г, 0.67 моль) в воде (250 мл) при перемешивании и охлаждении на льду с солью добавляют влажное диазосоединение порциями с такой скоростью, чтобы температура реакционной массы была ниже +5°С.Дополнительно перемешивают 1 ч. Затем смесь нагревают до кипения и добавляют по каплям концентрированную соляную кислоту (200 мл), при этом выпадает осадок. Для полного обесцвечивания смеси добавляют цинковую пыль (2.0 г). Реакционную массу выдерживают 12 ч при комнатной температуре. Осадок собирают фильтрацией, промывают холодной водой и сушат на воздухе. Получают фенилгидразин-n-сульфокислоту (соединение 6) с выходом 42 г (74%).
Пример 2. Получение калиевой соли 2,3,3-триметил-5-сульфоиндоленина (соединение 7)
2
5
Смесь фенилгидразин-n-сульфокислоты (соединение 6) (11.0 г, 0.06 моль), 3-метил-2-бутанона (7.7 мл, 0.072 моль) и ледяной уксусной кислоты (34 мл) кипятят в течение 3 ч, а затем выдерживают 12 ч при 0°С. Выпавший осадок отделяют фильтрацией, промывают ацетоном и сушат в вакуум-эксикаторе над РО. Получают 5.1 г (71%) индоленина.
1
2
3
Н
H
ЯМР Н (DO, δ, м.д.): 1.28 (с, 6Н, 2С(3)), 7.47-7.79 (3Н, м, Ar)
2
5
max
11
12
3
-
5-Сульфо-2,3,3-триметилиндоленин (4.8 г, 0.02 моль) растворяют при нагревании в метаноле (25 мл). К полученному раствору добавляют по каплям раствор гидроксида калия (1.4 г, 0.024 моль) в метаноле (16 мл). Затем добавляют изопропиловый спирт (50 мл). Осадок отфильтровывают, сушат в вакуум-эксикаторе над РО. Получают 4.7 г (85%) индоленина (соединение 7) в виде блестящих пластинок светло-бежевого цвета. λ 260 нм. Масс-спектр (MALDI) (CHNOS): найдено m/z 239.0, рассчитано m/z 238.28.
1
2
3
3
Н
Н
H
ЯМР Н (DO, δ, м.д.): 1.19 (6Н, с, 2С(3)), 2.19 (3Н, с, С(2)), 7.41-7.7 (3Н, м, Ar)
Пример 3. Получение 2,3,3-триметил-5-сульфо-N-((3- триметиламмоний)пропил)индолениний бромида (соединение 2).
2
5
max
Смесь калиевой соли 2,3,3-триметил-5-сульфоиндоленина (соединение 7) (0.35 г, 1.26 ммоль), (3-бромопропил)триметил-аммоний бромида (0.4 г, 1.39 ммоль) и бутиронитрила (5 мл) нагревают в атмосфере азота 72 ч при 75°С. По окончанию нагревания добавляют ацетон (30 мл). Образовавшиеся кристаллы отфильтровывают, перекристаллизовывают из метанола и сушат в вакуум-эксикаторе над РО. Получают 0.4 г (86%) индолениниевой соли (соединение 2), т. пл. 248°С. λ 228 нм.
1
+
+
2
2
3
3
2
3
17
27
2
3
Н NMR (DMSO-d6) δ: 8.03, 7.79 (2 м, 3Н, ArH), 4.50 (м, 2Н, С(1)H), 3.66 (м, 2Н, С(3)H), 3.14 [с, 9Н, N(СН)], 2.34 (м, 2Н, С(2)H), 1.57 [с, 6Н, 2CH(3)]. Масс-спектр (MALDI) (CHNOS): найдено m/z 340.2 [М], рассчитано m/z 339.47.
Пример 4. Получение 2,3,3-триметил-5-сульфо-N-((5-триметиламмоний)пентил)индолениний бромида (соединение 2).
max
Соединение 2 получали аналогично соединению 1. Получают 0.46 мг (81%) соединения 3, т. пл. 250°С. λ 228 нм.
1
+
+
2
2
3
3
2
2
3
2
19
31
2
3
Н NMR (DMSO-d6) δ: 8.03, 7.97, 7.84 (3м, 3Н, ArH), 4.52 (м, 2Н, С(1)H), 3.34 (м, 2Н, С(5)H), 3.08 [с, 9Н, N(СН)], 1.92 (м, 2Н, С(4)H), 1.75 (м, 2Н, С(3)H), 1.56 [с, 6Н, 2CH(3)], 1.35 (м, 2Н, С(2)H). Масс-спектр (MALDI) (CHNOS): найдено m/z 368.3 [М], рассчитано m/z 367.53.
Пример 5. Получение 2,3,3-триметил-5-сульфо-N-этилиндолениния (соединение 4)
2
5
max
17
23
5
+
Смесь калиевой соли 2,3,3-триметил-5-сульфоиндоленина (соединение 7) (1.1 г, 4 ммоль), 6-бромгексановой кислоты (2.0 г, 10 ммоль) и 1,2-дихлорбензола нагревают 30 ч при 145°С в атмосфере азота. По окончанию нагревания смесь охлаждают до комнатной температуры, растворитель декантируют, а остаток затирают с диэтиловым эфиром. Образовавшиеся кристаллы отфильтровывают, тщательно промывают ацетоном и сушат в вакуум-эксикаторе над РО. Выход продукта (соединение 4) составил 1 г (75%). УФ-спектр (МеОН), λ/нм: 202, 275 нм. Найдено: m/z 353.9 [М]. CHNOS. Вычислено: М=353.43.
1
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
Н
Н
Н
Н
Н
H
ЯМР Н (DO, δ, м.д., J/Гц): 1.31, 1.49, 1.7, 2.11 (м, 8Н, СНСССССООН), 1.4 (с, 6Н, 2С(3)Н), 4.34 (м, 2Н, ССНСНСНСНСООН), 7.6 (д, 1Н, ArH, J=8.5), 7.73 (д, 1Н, ArH, J=8.5), 7.96 (с, 1Н, Ar)
Пример 6. Получение 1'-(7-аза-10-триметиламмонио-6-оксодек-1-ил)-1-(5-карбоксипентил)-3,3,3',3-тетраметил-5,5'-дисульфоиндодикарбоцианинового красителя (соединение С1).
3
37
45
2
10
2
,
+
-
Смесь N-(5-карбоксипентил)-2,3,3-триметил-5-сульфоиндолениния (соединение 4) (177 мг, 0.5 ммоль), гидрохлорида дианила малонового диальдегида (соединение 3) (78 мг, 0.3 ммоль), уксусного ангидрида (3 мл), уксусной кислоты (1 мл) и безводного ацетата калия (196 мг, 2 ммоль) нагревают 5 ч при +118°С. Растворители удаляют, к остатку добавляют 3 мл 0.5 М HCl и нагревают 4 ч при 90°С. По окончанию нагревания добавляют воду (50 мл) и реакционную массу нейтрализуют раствором NaHCO до рН 7. Продукты реакции выделяют обращенно-фазовой хроматографией на колонке RP-18 в системе ацетонитрил-0.1 М ТЕАА градиентным элюированием от 0 до 50% ацетонитрила. Растворители удаляют, а остаток разбавляют водой, вновь наносят на колонку RP-18, промывают 0.1 М раствором NaCl, водой, затем выделяют обращенно-фазовой хроматографией в системе ацетонитрил-вода. Получали 100 мг (54%) натриевой соли N,N'-ди-(5-карбоксипентил)-3,3,3,3'-тетраметил-5,5'-дисульфоиндодикарбоцианинового красителя (соединение 5, n=2). Найдено: m/z 743.6 [М]. CHNOS. Вычислено: М=741.89.
1
6
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
ЯМР Н (DMSO-d, δ, м.д., J/Гц): 1.37, 1.54, 1.75, 2.16 (4 м, 16Н, СНСНСНСНСНСООН), 1.69 (с, 12Н, С(3,3)Н, С(3',3')Н), 4.09 (м, 4Н, СНСНСНСНСНСООН), 6.31 (м, 2Н, α,α'-CH), 6.60 (т, 1Н, γ-CH, J=12.0), 7.8, 7.63, 7.32 (3м, 6Н, ArH), 8.35 (т, 2Н, β,β'-CH, J=13.0)
Смесь натриевой соли N,N'-ди-(5-карбоксипентил)-3,3,3',3'-тетраметил-5,5'-дисульфоиндодикарбоцианинового красителя (соединение 5) (36 мг, 48 мкмоль), HBTU (74 мг, 0.19 ммоль), N-гидроксисукцинимида (29 мг, 0.24 ммоль) растворяют в DMF (1 мл) и перемешивают 2 ч при ~20°С. Затем в реакционную массу при перемешивании вводят раствор 3-диметиламинопропиламина (8.5 мг, 48 мкмоль) в карбонат-бикарбонатном буферном растворе (1 мл, 0.1 М, рН 9.2). Реакционную массу перемешивают 24 ч при ~20°С, затем разбавляют 0.1 М ТЕАА (5 мл). Целевое соединение выделяют аналогично соединению 5. Получают 20 мг (50%) модифицированного красителя (соединение 6).
1
+
-
6
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
42
57
4
9
2
Н NMR (DMSO-d) δ: 8.35 (т, 2Н, β,β'-СН, J 13.0 Hz), 7.81, 7.65, 7.31 (3м, 6Н, ArH), 6.59 (t, 1Н, γ-СН, J 12.0 Hz), 6.31 (м, 2Н, α,α'-CH), 4.09 (м, 4Н, СНСНСНСНСНСООН, С(1)H), 3.01 (м, 2Н, С(8)H), 2.41 (м, 2Н, С(10)H), 2.29 [с, 6Н, N(CH)], 2.03 (м, 2Н, С(9)H), 1.69 [с, 12Н, С(3,3)H, С(3,3')H], 2.19, 1.75, 1.53, 1.35 (4 м, 16Н, СНСНСНСНСНСООН, С(2)H, С(3)H, С(4)H, С(5)H). Найдено: m/z 828.1 [М]. CHNOS. Вычислено: М=826.06.
Смесь модифицированного красителя (соединение 6) (20 мг, 24 мкмоль), метилиодида (300 мкл), DMF (2 мл) и DIPEA (50 мкл) перемешивают 1 ч при ~20°С. Растворители удаляют в вакууме, остаток растворяют в 0.5М HCl (4 мл) и нагревают 1 ч при 85°С. Реакционную массу разбавляют 0.1 М ТЕАА. Продукты реакции выделяют обращенно-фазовой хроматографией на колонке RP-18 в системе ацетонитрил-0.1 М ТЕАА градиентным элюированием от 0 до 50% ацетонитрила. Растворители удаляют, а остаток разбавляют водой, вновь наносят на колонку RP-18, промывают 0.1 М раствором NaCl, водой, затем выделяют обращенно-фазовой хроматографией в системе ацетонитрил-вода. Получали 10 мг (50%) соединения С1.
1
+
6
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
43
60
4
9
2
Н NMR (DMSO-d) δ: 8.35 (т, 2Н, β,β'-СН, J13.0 Hz), 7.82, 7.63, 7.31 (3м, 6Н, ArH), 6.58 (т, 1Н, γ-СН, J 12.0 Hz), 6.32 (м, 2Н, α,α'-CH), 4.09 (м, 4Н, СНСНСНСНСНСООН, С(1)H), 3.23 (м, 2Н, С(8)H), 3.01 [с, 9Н, N(CH)], 2.97 (м, 2Н, С(10)H), 2.04 (м, 2Н, С(9)H), 1.69 [с, 12Н, С(3,3)H, С(3,3')H], 2.2, 1.75, 1.53, 1.35 (4 м, 16Н, СНСНСНСНСНСООН, С(2)H, С(3)H, С(4)H, С(5)H). Найдено: m/z 842.5 [М]. CHNOS. Вычислено: М=841.09.
Пример 7. Получение N-(7-аза-12-карбокси-6-оксододек-1-ил)-3,3,3',3'-тетраметил-N'-(7-аза-10-триметиламмонио-6-оксодек-1-ил)-5,5'-дисульфоиндодикарбоцианинового красителя (соединение С2).
Смесь N'-(7-аза-10-триметиламмонио-6-оксодек-1-ил)-3,3,3',3'-тетраметил-N-(5-карбоксипентил)-5,5'-дисульфоиндодикарбоцианинового красителя (соединение С1) (11 мг, 13 мкмоль), p-нитрофенола (4 мг, 30 мкмоль), HBTU (7.5 мг, 20 мкмоль) растворяют в смеси DMF (0.3 мл) и DIPEA (10 мкл) и перемешивают 2 ч при ~20°С. Затем реакционную массу охлаждают до -18°С и при перемешивании вводят раствор 6-аминокапроновой кислоты (34 мг, 0.26 ммоль) в 0.1 М карбонат-бикарбонатном буферном растворе (0.3 мл). Реакционную массу выдерживают 3 ч при ~20°С, затем разбавляют 0.1 М ТЕАА. Целевое соединение выделяют аналогично соединению С1. Получают 11 мг (89%) соединения С2.
1
+
6
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
49
71
5
10
2
Н NMR (DMSO-d) δ: 8.35 (м, 2Н, β,β'-CH), 7.82, 7.66, 7.31 (3м, 6Н, ArH), 6.58 (т, 1Н, γ-СН, J 12.0 Hz), 6.31 (м, 2Н, α,α'-CH, J 13.5 Hz), 4.10 (м, 4Н, С(1)H, С(1')H), 3.23 (м, 4Н, С(8)H, С(8')H), 3.01 [с, 11Н, N(CH), С(10')H], 2.46 (м, 4Н, С(5)H, С(5')H), 2.17 (м, 2Н, С(12)H), 2.03 (м, 4Н, С(9)H, С(9')H), 1.69 [с, 12Н, С(3,3)H, С(3,3')H], 1.76, 1.54, 1.33 (3 уш. м., 16Н, С(2)H, С(3)H, С(4)H, С(10)H, С(11)H, С(2')H, С(3')H, С(4')H). Найдено: m/z 955.7 [М]. CHNOS. Вычислено: М=954.25.
Пример 8. Получение N-(7,14-диаза-19-карбокси-6,13-диоксононадек-1-ил)-3,3,3',3'-тетраметил-N'-(7-аза-10-триметиламмонио-6-оксодек-1-ил)-5,5'-дисульфоиндодикарбоцианинового красителя (соединение С3).
Смесь N-(7-аза-12-карбокси-6-оксододекан-1-ил)-3,3,3',3'-тетраметил-N'-(1-аза-10-триметиламмонио-6-оксодекан-1-ил)-5,5'-дисульфоиндодикарбоцианинового красителя (соединение С2) (6 мг, 6 мкмоль), p-нитрофенола (3 мг, 20 мкмоль), HBTU (4 мг, 10 мкмоль) растворяют в смеси DMF (0.2 мл) и DIPEA (5 мкл) и перемешивают 3 ч при ~20°С. Затем реакционную массу охлаждают до -18°С и при перемешивании вводят раствор 6-аминокапроновой кислоты (16 мг, 0.12 ммоль) в 0.1 М карбонат-бикарбонатном буферном растворе (0.2 мл). Реакционную массу выдерживают 2 ч при ~20°С, затем разбавляют 0.1 М ТЕАА. Целевое соединение выделяют аналогично соединению С1. Получают 5 мг (78%) соединения С3.
1
+
6
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
55
82
6
11
2
Н NMR (DMSO-d) δ: 8.32 (м, 2Н, β,β'-СН), 7.83, 7.62, 7.35 (3м, 6Н, ArH), 6.56 (т, 1Н, γ-СН, J 12.0 Hz), 6.35 (д, 2Н, α,α'-CH, J 13.5 Hz), 4.08 [м, 4Н, С(1)H, С(1')H], 3.25 [м, 6Н, С(8)H, С(15)H, С(8')H], 3.04 [с, 11Н, N(CH), С(10')H], 2.48 [м, 6Н, С(5)H, С(12)H, С(5')H], 2.15 [м, 2Н, С(19)H], 2.05 [м, 6Н, С(9)H, С(16)H, С(9')H], 1.71 [с, 12Н, С(3,3)H, С(3,3')H], 1.79, 1.52, 1.31 [3 уш. м., 20Н, С(2)H, С(3)H, С(4)H, С(10)H, С(11)H, С(17)H, С(18)H, С(2')H, С(3')H, С(4')H]. Найдено: m/z 1068.9 [М]. CHNOS. Вычислено: М=1067.41.
Пример 9. Получение N-(5-карбоксипентил)-3,3,3',3'-тетраметил-N'-(3-триметиламмониопропил)-5,5'-дисульфоиндодикарбоцианинового красителя (соединение D1).
Смесь N-(5-карбоксипентил)-2,3,3-триметил-5-сульфоиндолениния (соединение 4) (124 мг, 0.35 ммоль), гидрохлорида дианила малонового диальдегида (соединение 3) (78 мг, 0.3 ммоль), уксусного ангидрида (1.5 мл), уксусной кислоты (500 мкл) нагревают 2 ч при 118°С. По окончанию нагревания в реакционную массу добавляют 2,3,3-триметил-5-сульфо-N-(3-триметиламмонийпропил)-индолениний бромид (соединение 2) (210 мг, 0.5 ммоль), безводный ацетат калия (170 мг, 1.75 ммоль), уксусный ангидрид (2 мл), уксусная кислота (1 мл) и нагревают 2 ч при 118°С. Соединение D1 выделяют аналогично соединению С1. Получают 100 мг (46%) соединения D1.
1
+
6
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
3
3
2
2
2
3
3
3
3
2
2
2
2
2
37
49
3
8
2
Н NMR (DMSO-d) δ: 8.36 (м, 2Н, β,β'-CH), 7.80, 7.61, 7.32 (3м, 6Н, ArH), 6.59 (т, 1Н, γ-CH, J 12.0 Hz), 6.29 (м, 2Н, α,α'-CH), 4.05 (м, 4Н, CHCHCHN(СН), СНСНСНСНСНСООН), 3.49 [м, 2Н, CHCHCHN(СН)], 3.04 [s, 9Н, CHCHCHN(CH)], 2.09 [м, 2Н, CHCHCHN(СН)], 1.65 [с, 12Н, CH(3,3), CH(3,3')], 1.96, 1.47, 1.31 (3м, 8Н, СНСНСНСНСНСООН). MS (MALDI-TOF) m/z: calcd. for CHNOS 727.93; found 729.1 [M].
Пример 10. Получение N-(7-аза-12-карбокси-6-оксододек-1-ил)-3,3,3',3'-тетраметил-N'-(3-триметиламмониопропил)-5,5'-дисульфоиндодикарбоцианинового красителя (соединение D2).
Смесь N-(5-карбоксипентил)-3,3,3',3'-тетраметил-N'-(3-триметиламмонийпропил)-5,5'-дисульфоиндодикарбоцианинового красителя (соединение D1) (12 мг, 17.7 мкмоль), р-нитрофенола (6 мг, 42 мкмоль), HBTU (9 мг, 24 мкмоль) растворяют в смеси DMF (0.3 мл) и DIPEA (15 мкл) и перемешивают 3 ч при ~20°С. Затем реакционную массу охлаждают до -18°С и при перемешивании вводят раствор 6-аминокапроновой кислоты (46 мг, 0.35 ммоль) в 0.1 М карбонат-бикарбонатном буферном растворе (0.3 мл). Реакционную массу выдерживают 12 ч при ~20°С, затем разбавляют 0.1 М ТЕАА. Целевое соединение выделяют аналогично соединению С1. Получают 11 мг (70%) соединения D2.
1
+
2
2
2
3
3
2
2
2
2
3
3
2
2
2
3
3
2
2
2
2
3
3
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
43
60
4
9
2
Н NMR (DMSO-d6) δ: 8.41 (м, 2Н, β,β'-CH), 7.86, 7.66, 7.35 (3м, 6Н, ArH), 6.59 (т, 1Н, γ-CH, J 12.0 Hz), 6.33 (м, 2Н, α,α'-CH), 4.13 (м, 4Н, CHCHCHN(СН), С(1)H), 3.45 [м, 2Н, CHCHCHN(СН)], 3.08 [с, 9Н, CHCHCHN(CH)], 2.98 [м, 2Н, С(8)H], 2.44 [м, 2Н, CHCHCHN(СН)], 1.71 [с, 12Н, CH(3,3), CH(3,3')], 2.16, 2.03, 1.50, 1.33, 1.22 (5м, 16Н, С(2)H, С(3)H, С(4)H, С(5)H, С(9)H, С(10)H, С(11)H, С(12)H). Найдено: m/z 842.5 [М]. CHNOS. Вычислено: М=841.09.
Пример 11. Получение N-(7,14-диаза-19-карбокси-6,13-диоксононадек-1-ил)-3,3,3',3'-тетраметил-N'-(3-триметиламмониопропил)-5,5'-дисульфоиндодикарбоцианинового красителя (соединение D3).
Смесь N-7-аза-12-карбокси-6-оксододекан-1-ил)-3,3,3',3'-тетраметил-N'-(3-триметиламмонийпропил)-5,5'-дисульфоиндодикарбоцианинового красителя (соединение D2) (10 мг, 11 мкмоль), p-нитрофенола (5 мг, 33 мкмоль), HBTU (6 мг, 15 мкмоль) растворяют в смеси DMF (0.3 мл) и DIPEA (5 мкл) и перемешивают 3 ч при ~20°С. Затем реакционную массу охлаждают до -18°С и при перемешивании вводят раствор 6-аминокапроновой кислоты (29 мг, 0.22 ммоль) в 0.1 М карбонат-бикарбонатном буферном растворе (0.3 мл). Реакционную массу выдерживают 12 ч при ~20°С, затем разбавляют 0.1 М ТЕАА. Целевое соединение выделяют аналогично соединению С1. Получают 7.5 мг (76%) соединения D3.
1
+
6
2
2
2
3
3
2
2
2
2
3
3
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
3
3
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
49
71
5
10
2
Н NMR (DMSO-d) δ: 8.39 (м, 2Н, β,β'-CH), 7.77, 7.59, 7.32 (3м, 6Н, ArH), 6.58 (т, 1Н, γ-CH, J 12.0 Hz), 6.31 (м, 2Н, α,α'-CH), 4.08 (м, 4Н, CHCHCHN(CH), С(1)H), 3.50 [м, 2Н, CHCHCHN(СН)], 3.05 [с, 9Н, CHCHCHN(CH)], 2.93 [м, 4Н, С(8)H, С(15)H], 2.48 [м, 2Н, CHCHCHN(СН)], 1.67 [с, 12Н, CH(3,3), CH(3,3')], 2.09, 2.0, 1.85, 1.45, 1.31, 1.15 (5м, 16Н, С(2)H, С(3)H, С(4)H, С(5)H, С(9)H, С(10)H, С(11)H, С(12)H, С(16)H, С(17)H, С(18)H, С(19)H). Найдено: m/z 955.6 [М]. CHNOS. Вычислено: М=954.25.
Пример 12. Получение N'-(5-карбоксипентил)-3,3,3',3'-тетраметил-N'-(5- триметиламмониопентил)-5,5'-дисульфоиндодикарбоцианинового красителя (соединение D4).
N-(5-Карбоксипентил)-3,3,3',3'-тетраметил-N'-(3-триметиламмонийпентил)-5,5'-дисульфоиндодикарбоцианиновый краситель (соединение D4) получают аналогично соединению D1 при следующих соотношениях реагентов: (1 стадия) N-(5-карбоксипентил)-2,3,3-триметил-5-сульфоиндолениний (соединение 4) (124 мг, 0.35 ммоль), гидрохлорид дианила малонового диальдегида (соединение 3) (78 мг, 0.3 ммоль), уксусный ангидрид (1.5 мл), уксусная кислота (0.5 мл); (2 стадия) 2,3,3-триметил-5-сульфо-N-(5-триметиламмонийпентил)-индолениний бромид (соединение 2) (224 мг, 0.5 ммоль), безводный ацетат калия (170 мг, 1.75 ммоль), уксусный ангидрид (2 мл), уксусная кислота (1 мл). Получают 184 мг (81%) соединения D4.
1
6
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
3
3
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
39
53
3
8
2
Н NMR (DMSO-d) δ: 8.36 (м, 2Н, β,β'-CH), 7.83, 7.64, 7.34 (3м, 6Н, ArH), 6.58 (т, 1Н, γ-CH, J 12.0 Hz), 6.32 (м, 2Н, α,α'-CH), 4.12 (м, 4Н, CHCHCHCHCHN(CH), СНСНСНСНСНСООН), 3.21 [м, 2Н, CHCHCHCHCHN(CH)], 3.01 [с, 9Н, CHCHCHCHCHN(CH)], 1.69 [с, 12Н, CH(3,3), CH(3,3')], 2.19, 1.76, 1.51, 1.35 [4м, 14Н, СНСНСНСНСНСООН, CHCHCHCHCHN(CH)]. Найдено: m/z 757.1 [М]+. CHNOS. Вычислено: М=755.99.
Пример 13. Получение N-(7-аза-12-карбокси-6-оксододек-1-ил)-3,3,3',3'-тетраметил-N'-(3-триметиламмониопентил)-5,5'-дисульфоиндодикарбоцианинового красителя (соединение D5).
Смесь N-(5-карбоксипентил)-3,3,3',3'-тетраметил-N'-(3-триметиламмонийпропил)-5,5'-дисульфоиндодикарбоцианинового красителя (соединение D4) (20 мг, 26 мкмоль), р-нитрофенола (8 мг, 56 мкмоль), HBTU (13 мг, 35 мкмоль) растворяют в смеси DMF (0.7 мл) и DIPEA (15 мкл) и перемешивают 4 ч при ~20°С. Затем реакционную массу охлаждают до -18°С и при перемешивании вводят раствор 6-аминокапроновой кислоты (68 мг, 0.52 ммоль) в 0.1 М карбонат-бикарбонатном буферном растворе (0.7 мл). Реакционную массу выдерживают 12 ч при ~20°С, затем разбавляют 0.1 М ТЕАА. Целевое соединение выделяют аналогично соединению С1. Получают 19 мг (83%) соединения D5.
6
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
3
3
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
45
64
4
9
2
+
'Н NMR (DMSO-d) δ: 8.38 (м, 2Н, β,β'-CH), 7.84, 7.62, 7.33 (3м, 6Н, ArH), 6.57 (т, 1H, γ-CH, J 12.0 Hz), 6.31 (м, 2Н, α,α'-CH), 4.11 (м, 4Н, CHCHCHCHCHN(СН), С(1)H), 3.25 [м, 2Н, CHCHCHCHCHN(СН)], 3.04 [с, 9Н, CHCHCHCHCHN(CH)], 2.95 [м, 2Н, С(8)H], 1.68 [с, 12Н, CH(3,3), CH(3,3')], 2.46, 2.18, 1.52, 1.33, 1.22 [4 м, 22Н, С(2)H, С(3)H, С(4)H, С(5)H, С(9)H, С(10)H, С(11)H, С(12)H, СНСНСНСНСНН(СН)]. Найдено: m/z 870.3 [М]. CHNOS. Вычислено: М=869.14.
Пример 14. Получение N-(7,14-диаза-19-карбокси-6,13-диоксононадек-1-ил)-3,3,3',3'-тетраметил-N'-(3-триметиламмониопентил)-5,5'-дисульфоиндодикарбоцианинового красителя (соединение D6).
Смесь N-(7-аза-12-карбокси-6-оксододек-1-ил)-3,3,3',3'-тетраметил-N'-(3-триметиламмонийпропил)-5,5'-дисульфоиндодикарбоцианинового красителя (соединение D5) (6 мг, 6.7 мкмоль), p-нитрофенола (3 мг, 20 мкмоль), HBTU (6 мг, 15 мкмоль) растворяют в смеси DMF (0.3 мл) и DIPEA (10 мкл) и перемешивают 3 ч при ~20°С.Затем реакционную массу охлаждают до -18°С и при перемешивании вводят раствор 6-аминокапроновой кислоты (18 мг, 0.13 ммоль) в 0.1 М карбонат-бикарбонатном буферном растворе (0.3 мл). Реакционную массу выдерживают 12 ч при ~20°С, затем разбавляют 0.1 М ТЕАА. Целевое соединение выделяют аналогично соединению С1. Получают 5 мг (77%) соединения D6.
1
+
6
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
3
3
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
51
75
5
10
2
Н NMR (DMSO-d) δ: 8.39 (м, 2Н, β,β'-CH), 7.81, 7.62, 7.31 (3м, 6Н, ArH), 6.58 (т, 1Н, γ-CH, J 12.0 Hz), 6.32 (м, 2Н, α,α'-CH), 4.11 (м, 4Н, CHCHCHCHCHN(CH), С(1)H), 3.25 [м, 2Н, CHCHCHCHCHN(СН)], 3.02 [с, 9Н, CHCHCHCHCHN(CH)], 2.95 [м, 4Н, С(8)H, С(15)H], 1.72 [с, 12Н, CH(3,3), CH(3,3')], 2.48, 2.11, 2.02, 1.81, 1.42, 1.34, 1.17 [7м, 30H, С(2)H, С(3)H, С(4)H, С(5)H, С(9)H, С(10)H, С(11)H, С(12)H, С(16)H, С(17)H, С(18)H, С(19)H, CHCHCHCHCHN(СН)]. Найдено: m/z 983.2 [М]. CHNOS. Вычислено: М=982.30.
Пример 15. Получение 1'-(7-аза-10-триметиламмонио-6-оксодек-1-ил)-1-(5-карбоксипентил)-3,3,3',3'-тетраметил-5,5'-дисульфоиндотрикарбоцианинового красителя (соединение С4).
Смесь N-(5-карбоксипентил)-2,3,3-триметил-5-сульфоиндолениния (соединение 4) (71 мг, 0.2 ммоль), гидрохлорида дианила глутаконового диальдегида (соединение 3) (86 мг, 0.3 ммоль), уксусного ангидрида (2 мл) и уксусной кислоты (0.7 мл) нагревают 3 ч при 118°С. По окончанию нагревания в реакционную массу добавляют N-(5-карбоксипентил)-2,3,3-триметил-5-сульфоиндолениний (соединение 4) (107 мг, 0.3 ммоль), уксусный ангидрид (2 мл), уксусную кислоту (1 мл), безводный ацетат калия (200 мг, 2 ммоль) и нагревают 5 ч при 80°С. Растворитель удаляют, а продукт реакции выделяют обращенно-фазовой хроматографией на колонке RP-18 в системе ацетонитрил-0.1 М ТЕАА градиентным элюированием от 0 до 50% ацетонитрила. Растворители удаляют, а остаток разбавляют водой, вновь наносят на колонку RP-18, промывают 0.1 М раствором NaCl, водой, затем выделяют обращенно-фазовой хроматографией в системе ацетонитрил-вода. Получали 68 мг (43%) соединения 5 (n=3).
1
+
-
6
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
39
47
2
10
2
Н NMR (DMSO-d) δ: 7.86 (т, 2Н, β,β'-СН, J 12.0 Hz), 7.71 (м, 1Н, δ-СН), 7.17-7.52 (м, 6Н, ArH), 6.54 (т, 2Н, γ,γ'-CH, J 12.0 Hz), 6.32 (м, 2Н, α,α'-CH), 4.1 (м, 4Н, СНСНСНСНСНСООН), 1.63 [с, 12Н, CH(3,3), CH(3,3')], 2.13, 1.74, 1.52, 1.36 (4м, 16Н, СНСНСНСНСНСООН). Найдено: m/z 161А [М]. CHNOS. Вычислено: М=767.93.
Смесь натриевой соли N,N'-ди-(5-карбоксипентил)-3,3,3',3'-тетраметил-5,5'-дисульфоиндотрикарбоцианинового красителя (31 мг, 41 мкмоль), HBTU (61 мг, 0.16 ммоль), N-гидроксисукцинимида (29 мг, 0.24 ммоль) растворяют в DMF (0.6 мл) и перемешивают 2 ч при ~20°С. Затем в реакционную массу при перемешивании вводят раствор 3-диметиламинопропиламина (14 мг, 82 мкмоль) в карбонат-бикарбонатном буферном растворе (0.5 мл, 0.1 М, рН 9.2). Реакционную массу перемешивают 24 ч при ~20°С, затем разбавляют 0.1 М ТЕАА (5 мл). Целевое соединение выделяют аналогично соединению 5. Получают 16 мг (44%) модифицированного красителя 6.
1
+
-
6
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
44
59
4
9
2
Н NMR (DMSO-d) δ: 1.3, 1.58, 1.68, 1.78, 2.03 (5м, 18Н, СНСНСНСНСНСООН, С(2)H, С(3)H, С(4)H, С(5)H, С(9)H), 1.63 [с, 12Н, С(3,3)H, С(3',3')H], 2.24 (с, 6Н, N(CH)), 2.41 (м, 2Н, С(10)H), 3.01 (м, 2Н, С(8)H), 4.08 (м, 4Н, С(1)H, СНСНСНСНСНСООН), 6.34 (м, 2Н, α,α'-CH), 6.52 (м, 2Н, γ,γ'-СН), 7.29, 7.63, 7.74 (3m, 6Н, ArH), 7.87 (м, 3Н, δ-CH, β,β'-CH). Найдено: m/z 854.9 1 [М]. CHNOS. Вычислено: М=852.09.
Смесь модифицированного красителя (30 мг, 34 мкмоль), метил р-толуолсульфоната (19 мг, 0.1 ммоль) и DMF (1.4 мл) перемешивают 3 ч при ~20°С. Реакционную массу разбавляют 0.1 М ТЕАА и выделяют аналогично соединению С1. Получали 22 мг (73%) соединения С4.
1
+
6
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
45
62
4
9
2
Н NMR (DMSO-d) δ: 1.35, 1.53, 1.68, 1.75, 2.03 (5м, 16Н, СНСНСНСНСНСООН, С(2)H, С(3)H, С(4)H, С(5)H), 1.63 [с, 12Н, С(3,3)H, С(3',3')H], 3.02 [s, 10Н, С(10)H, N(CH)], 3.25 (м, 4Н, С(8)H, С(9)H), 4.07 (м, 4Н, С(1)H, СНСНСНСНСНСООН), 6.38 (м, 2Н, α,α'-CH), 6.51 (м, 2Н, γ,γ'-CH), 7.27, 7.65, 7.78 (3м, 6Н, ArH), 7.85 (м, 3Н, δ-CH, β,β'-CH). Найдено: m/z 868.5 [М]. CHNOS. Вычислено: М=867.13.
Пример 16. Получение N-(7-аза-12-карбокси-6-оксододек-1-ил)-3,3,3',3'-тетраметил-N'-(7-аза-10-триметиламмонио-6-оксодек-1-ил)-5,5'-дисульфоиндотрикарбоцианинового красителя (соединение С5).
Смесь 1'-(7-аза-10-триметиламмонио-6-оксодек-1 -ил)-1 -(5-карбоксипентил)-3,3,3',3'-тетраметил-5,5'-дисульфоиндотрикарбоцианинового красителя (соединение С4) (22 мг, 25 мкмоль) и бис-р-нитрофенилкарбоната (13 мг, 43 мкмоль) растворяют в DMSO (0.35 мл) и перемешивают 1 ч при ~20°С. Затем реакционную массу охлаждают до -18°С и при перемешивании вводят раствор 6-аминокапроновой кислоты (34 мг, 0.26 ммоль) в 0.1 М карбонат-бикарбонатном буферном растворе (0.35 мл). Реакционную массу выдерживают 2 ч при ~+5°С, затем разбавляют 0.1 М ТЕАА. Целевое соединение выделяют аналогично соединению С1. Получают 19 мг (89%) соединения С5.
1
+
6
2
2
2
2
2
3
3
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
51
73
5
10
2
Н NMR (DMSO-d) δ: 7.82 (м, 3Н, δ-CH, β,β'-CH), 7.21, 7.62, 7.74 (3м, 6Н, ArH), 6.55 (м, 2Н, γ,γ'-CH), 6.34 (м, 2Н, α,α'-CH), 4.09 (м, 4Н, С(1)H, С(1')H), 3.25 (м, 4Н, С(8')H, С(9')H), 3.02 [s, 10Н, С(10')H, N(CH)], 2.95 [м, 2Н, С(8)H], 1.65 [с, 12Н, С(3,3)H, C(3',3')H], 1.32, 1.51, 1.69, 1.78, 2.08 (5м, 24Н, С(2)H, С(3)H, С(4)H, С(5)H, С(9)H, С(10)H, С(11)H, С(12)H, С(2')H, С(3')H, С(4')H, С(5')H). Найдено: m/z 981.4 [М]. CHNOS. Вычислено: М=980.29.
Пример 17. Получение N-(7,14-диаза-19-карбокси-6,13-диоксононадек-1-ил)-3,3,3',3'-тетраметил-N'-(7-аза-10-триметиламмонио-6-оксодек-1-ил)-5,5'-дисульфоиндотрикарбоцианинового красителя (соединение С6).
Смесь N-(7-аза-12-карбокси-6-оксододек-1-ил)-3,3,3',3'-тетраметил-N'-(7-аза-10-триметиламмонио-6-оксодек-1-ил)-5,5'-дисульфоиндотрикарбоцианинового красителя (соединение С5) (25 мг, 25 мкмоль) и бис-p-нитрофенилкарбоната (13 мг, 43 мкмоль) растворяют в DMSO (0.35 мл) и перемешивают 1 ч при ~20°С. Затем реакционную массу охлаждают до -18°С и при перемешивании вводят раствор 6-аминокапроновой кислоты (34 мг, 0.26 ммоль) в 0.1 М карбонат-бикарбонатном буферном растворе (0.35 мл). Реакционную массу выдерживают 2 ч при ~+5°С, затем разбавляют 0.1 М ТЕАА. Целевое соединение выделяют аналогично соединению С1. Получают 19 мг (68%) соединения С6.
1
+
2
2
2
2
2
3
3
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
57
84
6
11
2
Н NMR (DMSO-d6) δ: 7.87 (м, 3Н, δ-CH, β,β'-CH), 7.17, 7.57, 7.71 (3м, 6Н, ArH), 6.59 (м, 2Н, γ,γ'-СН), 6.32 (м, 2Н, α,α'-CH), 4.03 (м, 4Н, С(1)H, С(1')H), 3.21 (м, 4Н, С(8')H, С(9')H), 3.05 [s, 10Н, С(10')H, N(CH)], 2.97 [м, 2Н, С(8)H, С(15)H], 1.61 [с, 12Н, С(3,3)H, С(3',3')H], 1.35, 1.54, 1.65, 1.74, 2.14 (5 уш.м., 32Н, С(2)H, С(3)H, С(4)H, С(5)H, С(9)H, С(10)H, С(11)H, С(12)H, С(16)H, С(17)H, С(18)H, С(19)H, С(2')H, С(3')H, С(4')H, С(5')H). Найдено: m/z 1094.6 [М]. CHNOS. Вычислено: М=1093.44.
Пример 18. Получение N-(5-карбоксипентил)-3,3,3',3'-тетраметил-N'-(3-триметиламмониопропил)-5,5'-дисульфоиндотрикарбоцианинового красителя (соединение D7).
Смесь 2,3,3-триметил-5-сульфо-N-((3-триметиламмоний)пропил)индолениний бромида (соединение 2, m-3) (153 мг, 0.36 ммоль), гидрохлорида дианила глутаконового диальдегида (соединение 3) (114 мг, 0.4 ммоль), уксусного ангидрида (2.2 мл) и уксусной кислоты (1.6 мл) нагревают 2.5 ч при 105°С. По окончанию нагревания в реакционную массу добавляют N-(5-карбоксипентил)-2,3,3-триметил-5-сульфоиндолениний (соединение 4) (142 мг, 0.4 ммоль), уксусный ангидрид (2.6 мл), уксусную кислоту (1.3 мл), безводный ацетат калия (120 мг, 1.2 ммоль) и нагревают 4.5 ч при 85°С. Растворитель удаляют, а продукт реакции выделяют аналогично соединению С1. Получают 107 мг (39%) соединения D7.
1
+
6
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
3
3
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
39
51
3
8
2
Н NMR (DMSO-d) δ: 7.77 (м, 3Н, δ-CH, β,β'-CH), 7.24, 7.39, 7.73 (3м, 6Н, ArH), 6.53 (м, 2Н, γ,γ'-CH), 6.36 (м, 2Н, α,α'-CH), 4.05 (м, 4Н, CHCHCHN(СН), СНСНСНСНСНСООН), 3.5 [м, 2Н, CHCHCHN(СН)], 3.04 [s, 9Н, CHCHCHN(CH)], 1.63 [2 с, 12Н, CH(3,3), CH(3,3')], 2.05, 1.47, 1.31 (3м, 10Н, СНСНСНСНСНСООН, CHCHCHN(СН)). Найдено: m/z 755.1 [М]. CHNOS. Вычислено: М=753.97.
Пример 19. Получение N-(7-аза-12-карбокси-6-оксододек-1-ил)-3,3,3',3'-тетраметил-N'-(3-триметиламмониопропил)-5,5'-дисульфоиндотрикарбоцианинового красителя (соединение D8).
,
Смесь N-(5-карбоксипентил)-3,3,3,3'-тетраметил-N'-(3-триметиламмонийпропил)-5,5'-дисульфоиндотрикарбоцианинового красителя (соединение D7) (15 мг, 17.3 мкмоль) и бис-р-нитрофенилкарбоната (13 мг, 43 мкмоль) растворяют в DMSO (0.35 мл) и перемешивают 1 ч при ~20°С. Затем реакционную массу охлаждают до -18°С и при перемешивании вводят раствор 6-аминокапроновой кислоты (34 мг, 0.26 ммоль) в 0.1 М карбонат-бикарбонатном буферном растворе (0.35 мл). Реакционную массу выдерживают 2 ч при ~+5°С, затем разбавляют 0.1 М ТЕАА. Целевое соединение выделяют аналогично соединению С1. Получают 19 мг (84%) соединения D8.
6
2
2
2
3
3
2
2
2
2
3
3
2
2
2
3
3
2
2
2
2
3
3
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
45
62
4
9
2
+
'Н NMR (DMSO-d) δ: 7.98 (м, 3Н, δ-CH, β,β'-СН), 7.85, 7.61, 7.38 (3м, 6Н, ArH), 6.56 (м, 2Н, γ,γ'-CH), 6.35 (м, 2Н, α,α'-CH), 4.08 (м, 4Н, CHCHCHN(СН), С(1)H), 3.25 [м, 2Н, CHCHCHN(СН)], 3.02 [с, 9Н, CHCHCHN(CH)], 2.99 [м, 2Н, С(8)H], 2.44 [м, 2Н, CHCHCHN(СН)], 1.63 [с, 12Н, CH(3,3), CH(3,3')], 2.02, 1.69, 1.49, 1.32, 1.15 (5м, 16Н, С(2)H, С(3)H, С(4)H, С(5)H, С(9)H, С(10)H, С(11)H, С(12)H). Найдено: m/z 868.3 [М]. CHNOS. Вычислено: М=867.13.
Пример 20. Получение N-(7,14-диаза-19-карбокси-6,13-диоксононадек-1-ил)-3,3,3',3'-тетраметил-N'-(3-триметиламмониопропил)-5,5'-дисульфоиндотрикарбоцианинового красителя (соединение D9).
Смесь N-7-аза-12-карбокси-6-оксододекан-1-ил)-3,3,3',3'-тетраметил-N'-(3-триметиламмонийпропил)-5,5'-дисульфоиндотрикарбоцианинового красителя (соединение D8) (15 мг, 17 мкмоль), бис-p-нитрофенилкарбоната (13 мг, 43 мкмоль) растворяют в DMSO (0.35 мл) и перемешивают 1 ч при ~20°С. Затем реакционную массу охлаждают до -18°С и при перемешивании вводят раствор 6-аминокапроновой кислоты (34 мг, 0.26 ммоль) в 0.1 М карбонат-бикарбонатном буферном растворе (0.35 мл). Реакционную массу выдерживают 2 ч при ~+5°С, затем разбавляют 0.1 М ТЕАА. Целевое соединение выделяют аналогично соединению С1. Получают 15 мг (90%) соединения D9.
6
2
2
2
3
3
2
2
2
2
3
3
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
3
3
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
51
73
5
10
2
+
'Н NMR (DMSO-d) δ: 8.05 (м, 3Н, δ-CH, β,β'-CH), 7.81, 7.57, 7.41 (3м, 6Н, ArH), 6.52 (м, 2Н, γ,γ'-CH), 6.31 (м, 2Н, α,α'-CH), 4.03 (м, 4Н, CHCHCHN(CH), С(1)H), 3.55 [м, 2Н, СНСНСНН(СН)], 3.08 [с, 9Н, CHCHCHN(CH)], 2.91 [м, 4Н, С(8)H, С(15)H], 2.45 [м, 2Н, CHCHCHN(СН)], 1.63 [с, 12Н, CH(3,3), CH(3,3')], 2.08, 1.87, 1.43, 1.33, 1.17 (5м, 24Н, С(2)H, С(3)H, С(4)H, С(5)H, С(9)H, С(10)H, С(11)H, С(12)H, С(16)H, С(17)H, С(18)H, С(19)H). Найдено: m/z 981.3 [М]. CHNOS. Вычислено: М=980.29.
Пример 21. Получение N-(5-карбоксипентил)-3,3,3',3'-тетраметил-N'-(5-триметиламмониопентил)-5,5'-дисульфоиндотрикарбоцианинового красителя (соединение D10).
Смесь 2,3,3-триметил-5-сульфо-N-((5-триметиламмоний)пентил)индолениний бромида (соединение 2, m=5) (161 мг, 0.36 ммоль), гидрохлорида дианила глутаконового диальдегида (соединение 3) (114 мг, 0.4 ммоль), уксусного ангидрида (2.2 мл) и уксусной кислоты (1.6 мл) нагревают 2.5 ч при 105°С. По окончанию нагревания в реакционную массу добавляют М-(5-карбоксипентил)-2,3,3-триметил-5-сульфоиндолениний (соединение 4) (142 мг, 0.4 ммоль), уксусный ангидрид (2.6 мл), уксусную кислоту (1.3 мл), безводный ацетат калия (120 мг, 1.2 ммоль) и нагревают 4.5 ч при 85°С. Растворитель удаляют, а продукт реакции выделяют аналогично соединению C1. Получают 121 мг (43%) соединения D10.
6
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
3
3
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
41
55
3
8
2
+
'Н NMR (DMSO-d) δ: 7.87 (м, 3Н, δ-CH, β,β'-CH), 7.29, 7.41, 7.71 (3м, 6Н, ArH), 6.51 (м, 2Н, γ,γ'-CH), 6.38 (м, 2Н, α,α'-CH), 4.06 (м, 4Н, CHCHCHCHCHN(CH), СНСНСНСНСНСООН), 3.24 [м, 2Н, CHCHCHCHCHN(CH)], 2.99 [с, 9Н, CHCHCHCHCHN(CH)], 1.63 [с, 12Н, CH(3,3), CH(3,3')], 2.02, 1.74, 1.49, 1.35 [4 м, 14Н, СНСНСНСНСНСООН, CHCHCHCHCHN(CH)]. Найдено: m/z 783.2 [М]. CHNOS. Вычислено: М=782.02.
Пример 22. Получение N-(7-аза-12-карбокси-6-оксододек-1-ил)-3,3,3',3'-тетраметил-N'-(3-триметиламмониопентил)-5,5'-дисульфоиндотрикарбоцианинового красителя (соединение D11).
Смесь N-(5-карбоксипентил)-3,3,3',3'-тетраметил-N'-(5-триметиламмонийпентил)-5,5'-дисульфоиндотрикарбоцианинового красителя (соединение D10) (12 мг, 15 мкмоль) и бис-p-нитрофенилкарбоната (13 мг, 43 мкмоль) растворяют в DMSO (0.35 мл) и перемешивают 1 ч при ~20°С. Затем реакционную массу охлаждают до -18°С и при перемешивании вводят раствор 6-аминокапроновой кислоты (34 мг, 0.26 ммоль) в 0.1 М карбонат-бикарбонатном буферном растворе (0.35 мл). Реакционную массу выдерживают 2 ч при ~+5°С, затем разбавляют 0.1 М ТЕАА. Целевое соединение выделяют аналогично соединению С1. Получают 19 мг (78%) соединения D11.
1
+
2
2
2
2
3
3
3
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
47
66
4
9
2
Н NMR (DMSO-d6) δ: 8.03 (м, 3Н, δ-CH, β,β'-CH), 7.82, 7.65, 7.41 (3м, 6Н, ArH), 6.52 (м, 2Н, γ,γ'-СН), 6.37 (м, 2Н, α,α'-CH), 4.03 (м, 4Н, CHCHCHCHCHN(CH), С(1)H), 3.26 [м, 2Н, CHCHCHCHCHN(CH)], 2.97 [м, 4Н, С(8)H, CHCHCHCHCHN(CH)], 1.66 [с, 12Н, CH(3,3), CH(3,3')], 2.05, 1.66, 1.43, 1.36, 1.19 (5м, 22Н, С(2)H, С(3)H, С(4)H, С(5)H, С(9)H, С(10)H, С(11)H, С(12)H, CHCHCHCHCHN(CH)). Найдено: m/z 896.3 [М]. CHNOS. Вычислено: М=895.18.
Пример 23. Получение N-(7,14-диаза-19-карбокси-6,13-диоксононадек-1-ил)-3,3,3',3'-тетраметил-N'-(3-триметиламмониопентил)-5,5'-дисульфоиндотрикарбоцианинового красителя (соединение D12).
Смесь N-(7-аза-12-карбокси-6-оксододекан-1-ил)-3,3,3',3'-тетраметил-N'-(5-триметиламмонийпентал)-5,5'-дисульфоиндотрикарбоцианинового красителя (соединение D11) (18 мг, 20 мкмоль), бис-р-нитрофенилкарбоната (13 мг, 43 мкмоль) растворяют в DMSO (0.35 мл) и перемешивают 1 ч при ~20°С. Затем реакционную массу охлаждают до -18°С и при перемешивании вводят раствор 6-аминокапроновой кислоты (34 мг, 0.26 ммоль) в 0.1 М карбонат-бикарбонатном буферном растворе (0.35 мл). Реакционную массу выдерживают 2 ч при ~+5°С, затем разбавляют 0.1 М ТЕАА. Целевое соединение выделяют аналогично соединению С1. Получают 15 мг (78%) соединения D12.
1
+
6
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
3
3
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
53
77
5
10
2
Н NMR (DMSO-d) δ: 7.96 (м, 3Н, δ-CH, β,β'-CH), 7.79, 7.52, 7.39 (3м, 6Н, ArH), 6.51 (м, 2Н, у,γ'-CH), 6.36 (м, 2Н, α,α'-CH), 4.07 (м, 4Н, CHCHCHN(СН), С(1)H), 3.22 [м, 2Н, СНСНСНСНСН]N(CH)], 3.05 [с, 9Н, CHCHCHCHCHN(CH)], 2.93 [м, 4Н, С(8)H, С(15)H], 2.48 [м, 2Н, CHCHCHN(CH)], 1.65 [с, 12Н, CH(3,3), CH(3,3')], 2.05, 1.83, 1.47, 1.31, 1.23 (5м, 30H, С(2)H, С(3)H, С(4)H, С(5)H, С(9)H, С(10)H, С(11)H, С(12)H, С(16)H, С(17)H, С(18)H, С(19)H, CHCHCHCHCHN(CH)). Найдено: m/z 1009.5 [М]. CHNOS. Вычислено: М=1008.34.
8.03 (м, 3Н, δ-CH, β,β'-CH), 7.82, 7.65, 7.41 (3м, 6Н, ArH), 6.52 (м, 2Н, γ,γ'-CH), 6.37 (м, 2Н, α,α'-CH),
Пример 24. p-Нитрофениловые эфиры красителей общей формулы (В).
Смесь красителя (7.5 мкмоль), HBTU (8.5 мг, 22.5 мкмоль) и p-нитрофенола (5 мг, 37.5 мкмоль) растворяли в DMF (0.6 мл) и перемешивали 1.5 ч при комнатной температуре. Затем реакционную массу разбавляли водой (10 мл). Фильтрат очищали при помощи обращенно-фазовой хроматографии (C18-RP) с использованием в качестве элюента смеси ацетонитрил - вода. Получали активированные эфиры красителей с количественным выходом (около 90%).
Пример 25. Синтез флуоресцентно-меченных 5-(3-аминоаллил)-2'-деоксиуридин-5'-трифосфатов общей формулы (А).
3
2
3
4
К раствору тетранатриевой соли 5-(3-аминоаллил)-2'-деоксиуридин-5'-трифосфата (AAdUTP) (1) (1 мг, 1.6 мкмоль) в NaHCO/NaCO буферном растворе (0.2 мл, 0.1 М, рН 8.5) добавили р-нитрофениловый эфир красителя общей формулы (В) (2 мкмоль) в DMF (0.2 мл) и смесь перемешивали 12 ч при +5°С. Конъюгаты общей формулы (А) очищали от избытка красителя (В) осаждением при помощи 2% раствора NaClO в ацетоне (1.6 мл). Осадок собирали центрифугированием при 13000 rpm в течение 1 мин, промывали ацетоном (0.2 мл) и растворяли в 1 мл смеси 30% ацетонитрила в воде.
Раствор модифицированного нуклеотида общей формулы (А) в 1 мл смеси 30% ацетонитрила в воде наносили на колонку (2×8 см), заполненную DEAE-целлюлозой (DE-52, Whatman), и элюировали в линейном градиенте концентраций от 0.025М до 0.3М ТЕАНС (триэтиламмоний гидрокарбонатный буферный раствор) (рН 7.5) в 30% ацетонитриле со скоростью 58 мл/час. Целевое вещество собирали с колонки в диапазоне концентраций ТЕАНС от 0.2 до 0.3М.
4
Далее получали натриевую соль нуклеотида общей формулы (А). Для этого фракцию, содержащую модифицированный нуклеотид общей формулы (А) собирали, разбавляли до объема 50 мл 0.1 М ТЕАНС буферным раствором (рН 8.5) и наносили на хроматографическую колонку (2×8 cm) (Analtech, Newark, DE), заполненную C18-RP (40-63 мкм), промывали 0.1 М NaClO, 0.1 М EDTA (рН 8.0) и деионизованной водой, и элюировали смесью ацетонитрил - вода.
4
Модифицированные нуклеотиды общей формулы (А) получали в разных солевых формах. Для этого выполняли процедуру, представленную выше, но на этапе использования 0.1 М NaClO применяли следующие реагенты:
- 0.1М KCl - для получения калиевой соли нуклеотида;
- 0.1М LiCl; - для получения литиевой соли нуклеотида;
- 0.1М ТЕАА - для получения триэтиламмониевой соли нуклеотида;
4
3
- 0.1М NHHCO - для получения аммониевой соли нуклеотида.
Фракции, содержащие целевое соединение общей формулы (А), объединяли и разбавляли до объема 50 мл деионизованной водой. Концентрацию модифицированного нуклеотида общей формулы (А) определяли, исходя из молярного коэффициента экстинкции цианиновых красителей (В). Поглощение определяли в трех повторах путем разбавления стокового раствора в MQ, таким образом, чтобы оптическая плотность не превышала значение 0.1.
Растворители удаляли в вакууме, полученный осадок растворяли в «ТЕ-буфере» (рН 8.0), получая раствор флуоресцентно-меченого нуклеотида общей формулы (А) с концентрацией 1 мкмоль/мл. Полученный раствор хранили при температуре -20°С.
Пример 26. Получение тетранатриевой соли 5-[4-аза-5-оксо-10-(1'-(7-аза-10-триметиламмонио-6-оксодек-1-ил)-3,3,3',3'-тетраметил-5,5'-дисульфоиндодикарбоцианин-1-ил)-дек-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (соединение А1).
+
4-
55
74
7
22
3
2
Получают 1.2 μмоль, выход 75% соединения А1. Найдено: m/z 1347,4 [М]. CHNOPS. Вычислено: М=1342.26.
1
31
β
α
γ
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
ЯМР Н (DO, 5, м.д., J/Гц): 1.35, 1.54, 1.79 (3 уш. м., 14Н, краситель С(7)H, С(8)H, С(9)H, С(2')H, С(3')H, С(4')H, С(9')H), 1.67 (с, краситель 12Н, С(3,3)H, С(3',3')H), 2.24 (м, 6Н, С(2')H, краситель С(6)H, краситель С(5')H), 3.02 (с, 11Н, N(CH), краситель С(10')H), 3.23 (м, 2Н, краситель С(8')H), 3.81 (м, 2Н, краситель С(3)H), 4.06 (уш.м, 7Н, С(3')H, С(5')H, краситель С(10)H, краситель С(1')H), 4.57 (м, 1Н, С(4')H), 6.26 (м, 5Н, С(1')H, краситель С(1)H, краситель α,α'-CH, краситель С(2)H), 6.59 (т, 1Н, краситель γ-CH, J 12.0 Hz), 7.33, 7.77 (2 м., 7Н, С(6)H, краситель ArH),8.05 (м, 2Н, краситель β,β'-CH). ЯМР Р (DO, 6, м.д.): -21.60 (т, Р), -10.76 (д, Р), -5.45 (д, P)
Пример 27. Получение тетранатриевой соли 5-[4,11-диаза-5,12-диоксо-17-(1'-(7-аза-10-триметиламмонио-6-оксодек-1-ил)-3,3,3',3'-тетраметил-5,5'-дисульфоиндодикарбоцианин-1-ил)-гептадек-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (соединение А2).
+
4-
61
85
8
23
3
2
Получают 1.02 μмоль, выход 64% соединения А2. Найдено: m/z 1460.5 [М]. CHNOPS. Вычислено: М=1455.42.
1
31
β
α
γ
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
ЯМР Н (DO, 8, м.д., J/Гц): 1.27, 1.39, 1.56, 1.79 (4 уш.м., 20Н, краситель С(7)H, С(8)H, С(9)H, С(14)H, С(15)H, С(16)H, краситель С(2')H, С(3')H, С(4')H, С(9')H), 1.67 (с, краситель 12Н, С(3,3)H, С(3',3')H), 2.19 (м, 6Н, краситель С(6)H, С(13)H, С(5')H), 2.31 (м, 2Н, С(2')H), 3.04 (с, 11Н, NCH) краситель С(10')H), 3.22 (м, 4Н, краситель С(10)H, краситель С(8')H,), 3.82 (м, 2Н, краситель С(3)H), 4.06 (уш. м, 8Н, С(3')H, С(4')H, С(5')H, краситель С(1')H, краситель С(17)H), 6.25 (м, 5Н, С(1')H, краситель α,α'-CH, краситель С(1)H, С(2)H), 6.58 (м, 1Н, краситель γ-CH), 7.30, 7.84 (2 м., 7Н, С(6)H, краситель ArH), 8.06 (м, 2Н, краситель β,β'-CH). ЯМР Р (DO, 8, м.д.): -21.54 (т, Р), -10.79 (д, Р), -5.53 (д, P)
Пример 28. Получение тетранатриевой соли 5-[4,11,18-триаза-5,12,19-триоксо-24-(1'-(7-аза-10-триметиламмонио-6-оксодек-1-ил)-3,3,3',3'-тетраметил-5,5'- дисульфоиндодикарбоцианин-1-ил)-тетракоз-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (соединение A3).
+
4-
67
96
9
24
3
2
Получают 1.25 μмоль, выход 78% соединения A3 Найдено: m/z 1573.8 [М]. CHNOPS. Вычислено: М=1568.58.
1
31
β
α
γ
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
ЯМР Н (DO, 5, м.д., J/Гц): 1.23, 1.38, 1.54, 1.78 (4 уш. м., 26Н, краситель С(7)H, С(8)H, С(9)H, С(14)H, С(15)H, С(16)H, С(21)H, С(22)H, С(23)H, С(2')H, С(3')H, С(4')H, С(9')H), 1.65 (с, краситель 12Н, С(3,3)H, С(3',3')H), 2.22 (м, 8Н, краситель С(6)H, С(13)H, С(20)H, краситель С(5')H), 2.34 (м, 2Н, С(2')H), 3.08 (с, 11Н, N(CH), краситель С(10')H), 3.22 (м, 6Н, краситель С(10)H, С(17)H, краситель С(8')H), 3.84 (м, 2Н, краситель С(3)H), 4.09 (уш. м, 8Н, С(3')H, С(4')H, С(5')H, краситель С(1')H, краситель С(24)H), 6.27 (м, 5Н, С(1')H, краситель α,α'-CH, краситель С(1)H, С(2)H), 6.56 (м, 1Н, краситель γ-CH), 7.30, 7.88 (2 м., 7Н, С(6)H, краситель ArH), 8.09 (м, 2Н, краситель β,β'-CH). ЯМР Р (DO, δ, м.д.): -21.51 (т, Р), -10.82 (д, Р), -5.59 (д, P)
Пример 29. Получение тетранатриевой соли 5-[4-аза-5-оксо-10-(1'-(3-триметиламмонио)пропил)-3,3,3',3'-тетраметил-5,5'-дисульфоиндодикарбоцианин-1-ил)-дек-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (соединение А4).
+
4-
49
63
6
21
3
2
Получают 1.3 мкмоль (81%) соединения А4. Найдено: m/z 1234.3 [М]. CHNOPS. Вычислено: М=1229.11.
1
31
β
α
γ
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
3
3
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
3
3
2
2
ЯМР Н (DO, 5, м.д., J/Гц): 1.32, 1.57, 1.75 (3 м, 6Н, краситель С(7)H, С(8)H, С(9)H), 1.63 (с, краситель 12Н, С(3,3)H, С(3',3')H), 2.29 (м, 6Н, С(2')H, краситель С(6)H, CHCHCHN(СН)), 3.05 (с, 9Н, CHCHCHN(CH)), 3.48 (с, 2Н, CHCHCHN(СН)), 3.83 (м, 2Н, краситель С(3)H), 3.91-4.28 (уш.м, 8Н, С(3')H, С(4')H, С(5')H, CHCHCHN(СН), краситель С(10)H), 6.12 (м, 3Н, краситель α,α'-CH, С(1')H), 6.31 (м, 2Н, краситель С(1)H, С(2)H), 6.47 (м, 1Н, краситель γ-CH), 7.11, 7.23, 7.39, 7.68, 7.74 (5м., 7Н, С(6)H, ArH), 7.99 (м, 2Н, краситель β,β'-CH). ЯМР Р (DO, 8, м.д.): -22.94 (т, Р),-11.38 (д, Р), -8.94 (д, P)
Пример 30. Получение тетранатриевой соли 5-[4,11-диаза-5,12-диоксо-17-(1'-(3-триметиламмонио)пропил)-3,3,3',3'-тетраметил-5,5'-дисульфоиндодикарбоцианин-1-ил)-гептадек-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (соединение А5).
+
4-
55
74
7
22
3
2
Получают 1.1 мкмоль (69%) соединения А5. Найдено: m/z 1347.4 [М]. CHNOPS. Вычислено: М=1342.26.
1
31
β
α
γ
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
3
3
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
3
3
2
2
ЯМР Н (DO, 5, м.д., J/Гц): 1.29, 1.52, 1.74 (3 уш. м., 12Н, краситель С(7)H, С(8)H, С(9)H, С(14)H, С(15)H, С(16)H), 1.65 (с, краситель 12Н, С(3,3)H, С(3',3')H), 2.29 (м, 8Н, С(2')H, краситель С(6)H, С(13)H, CHCHCHN(СН)), 2.99 (м., 2Н, краситель С(10)H), 3.08 (с, 9Н, CHCHCHN(CH)), 3.48 (с, 2Н, CHCHCHN(СН)), 3.83 (м, 2Н, краситель С(3)H), 4.08 (уш. м, 8Н, С(3')H, С(4')H, С(5')H, CHCHCHN(СН), краситель С(17)H), 6.16 (м, 3Н, краситель α,α'-CH, С(1')H), 6.34 (м, 2Н, краситель С(1)H, С(2)H), 6.49 (м, 1Н, краситель γ-CH), 7.19, 7.25, 7.44, 7.68, 7.79 (5м., 7Н, С(6)H, ArH), 8.05 (м, 2Н, краситель β,β'-CH). ЯМР Р (DO, 5, м.д.): -21.64 (т, Р), -10.76 (д, Р), -7.64 (д, P)
Пример 31. Получение тетранатриевой соли 5-[4,11,18-триаза-5,12,19-триоксо-24-(1'-(3-триметиламмонио)пропил)-3,3,3',3'-тетраметил-5,5'-дисульфоиндодикарбоцианин-1-ил)-тетракоз-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (соединение А6).
+
4-
61
85
8
23
3
2
Получают 1 мкмоль (63%) соединения А6. Найдено: m/z 1460.5 [М]. CHNOPS. Вычислено: М=1455.42.
1
31
β
α
γ
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
3
3
2
2
Н
ЯМР Н (DO, δ, м.д., J/Гц): 1.21, 1.48, 1.76 (3 уш.м., 18Н, краситель С(7)H, С(8)H, С(9)H, С(14)H, С(15)H, С(16)H,С(21)H, С(22)H, С(23)H), 1.66 (с, краситель 12Н, С(3,3)H, С(3',3')H), 2.29 (м, 10Н, С(2')H, краситель С(6)H, С(13)H, С(20)H, CHCHCHN(СН)), 3.01 (м., 4Н, краситель С(10)H, С(17)H), 3.12 (с, 9Н, CHCHCHN(CH)), 3.51 (с, 2Н, CHCHCHN(СН)), 3.83 (м, 2Н, краситель С(3)H), 4.08 (уш. м, 8Н, С(3')H, С(4')H, С(5')H, CHCHCHN(СН), краситель С(24)H), 6.19 (м, 3Н, краситель α,α'-С, С(1')H), 6.37 (м, 2Н, краситель С(1)H, С(2)H), 6.51 (м, 1Н, краситель γ-CH), 7.21, 7.28, 7.39, 7.62, 7.74 (5м., 7Н, С(6)H, ArH), 8.01 (м, 2Н, краситель β,β'-CH). ЯМР Р (DO, 8, м.д.): -21.14 (т, Р), -10.05 (д, Р), -7.86 (д, P).
Пример 32. Получение тетранатриевой соли 5-[4-аза-5-оксо-10-(1'-(5-триметиламмонио)пентил)-3,3,3',3'-тетраметил-5,5'-дисульфоиндодикарбоцианин-1-ил)- дек-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (соединение А7).
+
4-
51
67
6
21
3
2
Получают 1.2 мкмоль (76%) соединения А7. Найдено: m/z 1258.4 [М]. CHNOPS. Вычислено: М=1257.16.
1
31
β
α
γ
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
ЯМР Н (DO, 5, м.д., J/Гц): 1.29, 1.53, 1.72 (3 уш.м., 10Н, краситель С(7)H, С(8)H, С(9)H, CHCHCHCHCHN(СН)), 1.61 (с, краситель 12Н, С(3,3)H, С(3',3')H), 2.29 (м, 4Н, С(2')H, краситель С(6)H), 3.01 (с, 9Н, CHCHCHCHCHN(CH)), 3.25 (с, 2Н, CHCHCHCHCHN(СН)), 3.79 (м, 2Н, краситель С(3)H), 4.13 (уш. м, 8Н, С(3')H, С(4')H, С(5')H, CHCHCHCHCHN(СН), краситель С(10)H), 6.15 (м, 3Н, краситель α,α'-CH, С(1')H), 6.31 (м, 2Н, краситель С(1)H, С(2)H), 6.49 (м, 1Н, краситель γ-CH), 7.15, 7.23, 7.34, 7.63, 7.71(5м., 7Н, С(6)H, ArH), 7.95 (м, 2Н, краситель β,β'-CH). ЯМР Р (DO, δ, м.д.): -20.84 (т, Р), -10.13 (д, Р), -7.03 (д, Р).
Пример 33. Получение тетранатриевой соли 5-[4,11-диаза-5,12-диоксо-17-(1'-(5-триметиламмонио)пентил)-3,3,3',3'-тетраметил-5,5'-дисульфоиндодикарбоцианин-1-ил)-гептадек-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (соединение А8).
+
4-
57
78
7
22
3
2
Получают 1 мкмоль (64%) соединения А8. Найдено: m/z 1375.4 [М]. CHNOPS. Вычислено: М=1370.32.
1
31
β
α
γ
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
ЯМР Н (DO, δ, м.д., J/Гц): 1.24, 1.51, 1.69 (3 уш. м., 14Н, краситель С(7)H, С(8)H, С(9)H, С(14)H, С(15)H, С(16)H, CHCHCHCHCHN(СН)), 1.64 (с, краситель 12Н, С(3,3)H, С(3',3')H), 2.23 (м, 6Н, С(2')H, краситель С(6)H, С(13)H), 2.99 (м., 2Н, краситель С(10)H), 3.11 (с, 9Н, CHCHCHCHCHN(CH)), 3.25 (с, 2Н, CHCHCHCHCHN(СН)), 3.75 (м, 2Н, краситель С(3)H), 4.12 (уш.м, 8Н, С(3')H, С(4')H, С(5')H, CHCHCHCHCHN(СН), краситель С(17)H), 6.15 (м, 3Н, краситель α,α'-CH, С(1')H), 6.33 (м, 2Н, краситель С(1)H, С(2)H), 6.51 (м, 1Н, краситель γ-CH), 7.13, 7.21, 7.32, 7.61, 7.69 (5м., 7Н, С(6)H, ArH), 7.98 (м, 2Н, краситель β,β'-CH). ЯМР Р (DO, δ, м.д.): -20.34 (т, Р), -10.89 (д, Р), -7.73 (д, P).
Пример 34. Получение тетранатриевой соли 5-[4,11,18-триаза-5,12,19-триоксо-24-(1'-(5-триметиламмонио)пентил)-3,3,3',3'-тетраметил-5,5'-дисульфоиндодикарбоцианин-1-ил)-тетракоз-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (соединение А9).
+
4-
63
89
8
23
3
2
Получают 1.3 мкмоль (82%) соединения А9. Найдено: m/z 1488.6 [М]. CHNOPS. Вычислено: М=1483.47.
1
31
β
α
γ
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
ЯМР Н (DO, 5, м.д., J/Гц): 1.21, 1.48, 1.63 (3 уш. м., 20Н, краситель С(7)H, С(8)H, С(9)H, С(14)H, С(15)H, С(16)H, С(21)H, С(22)H, С(23)H, CHCHCHCHCHN(СН)), 1.59 (с, краситель 12Н, С(3,3)H, С(3',3')Н), 2.21 (м, 6Н, С(2')H, краситель С(6)H, С(13)H, С(20)H), 2.99 (м., 4Н, краситель С(10)H, С(17)H), 3.08 (с, 9Н, CHCHCHCHCHN(CH)), 3.27 (с, 2Н, CHCHCHCHCHN(СН)), 3.71 (м, 2Н, краситель С(3)H), 4.08 (уш. м, 8Н, С(3')H, С(4')H, С(5')H, CHCHCHCHCHN(СН), краситель С(24)H), 6.11 (м, 3Н, краситель α,α'-CH, С(1')H), 6.35 (м, 2Н, краситель С(1)H, С(2)H), 6.54 (м, 1Н, краситель γ-CH), 7.11, 7.25, 7.36, 7.59, 7.74 (5м., 7Н, С(6)H, ArH), 8.08 (м, 2Н, краситель β,β'-CH). ЯМР Р (DO, δ, м.д.): -20.86 (т, Р),-11.63 (д,Р), -7.08 (д, Р).
Пример 35. Получение тетранатриевой соли 5-[4-аза-5-оксо-10-(1'-(7-аза-10-триметиламмонио-6-оксодек-1-ил)-3,3,3',3'-тетраметил-5,5'-дисульфоиндотрикарбоцианин-1-ил)-дек-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (соединение А10).
+
4-
57
76
7
22
3
2
Получают 0.93 μмоль, выход 58% соединения А10. Найдено: m/z 1373.4 [М]. CHNOPS. Вычислено: М=1368.3.
1
31
β
α
γ
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
ЯМР Н (DO, δ, м.д., J/Гц): 1.35, 1.54, 1.68, 1.79, 2.03 (5 уш.м., 12Н, краситель С(7)H, С(8)H, С(9)H, С(2')H, С(3')H, С(4')H), 1.64 (с, краситель 12Н, С(3,3)H, С(3',3')H), 2.24 (м, 6Н, С(2')H, краситель С(6)H, краситель С(5')H), 3.02 (с, 11Н, N(CH), краситель С(10')H), 3.23 (м, 4Н, краситель С(8')H, С(9')H), 3.81 (м, 2Н, краситель С(3)H), 4.06 (уш.м, 7Н, С(3')H, С(5')H, краситель С(10)H, краситель С(1')H), 4.57 (м, 1Н, С(4')H), 6.32 (м, 5Н, С(1')H, краситель С(1)H, краситель α,α'-CH, краситель С(2)H), 6.53 (м, 2Н, краситель γ,γ'-СН), 7.31, 7.48, 7.79 (3м, 7Н, С(6)H, краситель ArH),7.89 (м, 4Н, краситель β,β'-CH, краситель δ-CH). ЯМР Р (DO, 6, м.д.): -21.85 (т, Р), -10.54 (д, Р), -5.32 (д, Р)
Пример 36. Получение тетранатриевой соли 5-[4,11-диаза-5,12-диоксо-17-(1'-(7-аза-10-триметиламмонио-6-оксодек-1-ил)-3,3,3',3'-тетраметил-5,5'-дисульфоиндотрикарбоцианин-1-ил)-гептадек-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (соединение А11).
+
4-
63
87
8
23
3
2
Получают 1.17 μмоль, выход 73% соединения А11. Найдено: m/z 146.6 [М]. CHNOPS. Вычислено: М=1481.46.
1
31
β
α
γ
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
ЯМР Н (DO, 5, м.д., J/Гц): 1.29, 1.52, 1.75 (3 уш. м., 18Н, краситель С(7)H, С(8)H, С(9)H, С(14)H, С(15)H, С(16)H, краситель С(2')H, С(3')H, С(4')H), 1.62 (с, краситель 12Н, С(3,3)H, С(3',3')H), 2.17 (м, 6Н, краситель С(6)H, С(13)H, С(5')H), 2.31 (м, 2Н, С(2')H), 3.01 (с, 11Н, N(CH) краситель С(10')H), 3.25 (м, 6Н, краситель С(10)H, краситель С(8')H, краситель С(9')H), 3.81 (м, 2Н, краситель С(3)H), 4.02 (уш. м, 8Н, С(3')H, С(4')H, С(5')H, краситель С(1')H, краситель С(17)H), 6.27 (м, 5Н, С(1')H, краситель α,α'-CH, краситель С(1)H, С(2)H), 6.55 (м, 2Н, краситель γ,γ'-CH), 7.36, 7.84 (2 уш.м., 7Н, С(6)H, краситель ArH), 7.82 (м, 3Н, краситель δ-CH, β,β'-CH). ЯМР Р (DO, 5, м.д.): -21.39 (т, Р), -10.46 (д, Р), -5.14 (д, P).
Пример 37. Получение тетранатриевой соли 5-[4,11,18-триаза-5,12,19-триоксо-24-(1'-(7-аза-10-триметиламмонио-6-оксодек-1-ил)-3,3,3',3'-тетраметил-5,5'-дисульфоиндотрикарбоцианин-1-ил)-тетракоз-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (соединение А12).
+
4-
69
98
9
24
3
2
Получают 0.98 μмоль, выход 61% соединения А12. Найдено: m/z 1599.8 [М]. CHNOPS. Вычислено: М=1594.62.
1
31
β
α
γ
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
ЯМР Н (DO, δ, м.д., J/Гц): 1.28, 1.34, 1.51, 1.76 (4 уш.м., 26Н, краситель С(7)H, С(8)H, С(9)H, С(14)H, С(15)H, С(16)H, С(21)H, С(22)H, С(23)H, С(2')H, С(3')H, С(4')H, С(9')H), 1.62 (с, краситель 12Н, С(3,3)H, С(3',3')H), 2.16 (м, 8Н, краситель С(6)H, С(13)H, С(20)H, краситель С(5')H), 2.31 (м, 2Н, С(2')H), 3.12 (с, 11Н, N(СН), краситель С(10')H), 3.25 (м, 6Н, краситель С(10)H, С(17)H, краситель С(8')H), 3.82 (м, 2Н, краситель С(3)H), 4.03 (уш. м, 8Н, С(3')H, С(4')H, С(5')H, краситель С(1')H, краситель С(24)H), 6.32 (м, 5Н, С(1')H, краситель α,α'-CH, краситель С(1)H, С(2)H), 6.52 (м, 2Н, краситель γ,γ'-CH), 7.25, 7.64 (2 уш. м., 7Н, С(6)H, краситель ArH), 8.09 (м, 3Н, краситель δ-CH, β,β'-CH). ЯМР Р (DO, δ, м.д.): -21.13 (т, Р), -10.64 (д, Р), -5.53 (д, Р)
Пример 38. Получение тетранатриевой соли 5-[4-аза-5-оксо-10-(1'-(3-триметиламмонио)пропил)-3,3,3',3'-тетраметил-5,5'-дисульфоиндотрикарбоцианин-1-ил)-дек-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (соединение А13).
+
4-
51
65
6
21
3
2
Получают 1.18 мкмоль (74%) соединения А13. Найдено: m/z 1260.2 [М]. CHNOPS. Вычислено: М=1255.14.
1
31
β
α
γ
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
3
3
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
3
3
2
2
ЯМР Н (DO, 5, м.д., J/Гц): 1.38, 1.54, 1.71 (3 уш.м, 6Н, краситель С(7)H, С(8)H, С(9)H), 1.66 (с, краситель 12Н, С(3,3)H, С(3',3')H), 2.15 (м, 6Н, С(2')H, краситель С(6)H, CHCHCHN(СН)), 3.08 (с, 9Н, CHCHCHN(CH)), 3.42 (с, 2Н, CHCHCHN(СН)), 3.81 (м, 2Н, краситель С(3)H), 4.15 (уш. м, 8Н, С(3')H, С(4')H, С(5')H, CHCHCHN(СН), краситель С(10)H), 6.23 (м, 3Н, краситель α,α'-CH, С(1')H), 6.31 (м, 2Н, краситель С(1)H, С(2)H), 6.55 (м, 2Н, краситель γ,γ'-CH), 7.28, 7.32, 7.61, 7.77 (5м, 7Н, С(6)H, ArH), 7.99 (м, 3Н, краситель δ-CH, β,β'-CH). ЯМР Р (DO, 5, м.д.): -22.14 (т, Р), -11.57 (д, Р), -8.73 (д, Р).
Пример 39. Получение тетранатриевой соли 5-[4,11-диаза-5,12-диоксо-17-(1'-(3-триметиламмонио)пропил)-3,3,3',3'-тетраметил-5,5'-дисульфоиндотрикарбоцианин-1-ил)-гептадек-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (соединение А14).
+
4-
57
76
7
22
3
2
Получают 0.98 мкмоль (61%) соединения А14. Найдено: m/z 1373.4 [М]. CHNOPS. Вычислено: М=1368.3.
1
31
β
α
γ
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
3
3
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
3
3
2
2
ЯМР Н (DO, δ, м.д., J/Гц): 1.24, 1.58, 1.71 (3 уш.м., 12Н, краситель С(7)H, С(8)H, С(9)H, С(14)H, С(15)H, С(16)H), 1.58 (с, краситель 12Н, С(3,3)H, С(3',3')H), 2.25 (м, 8Н, С(2')H, краситель С(6)H, С(13)H, CHCHCHN(CH)), 3.05 (м., 2Н, краситель С(10)H), 3.13 (с, 9Н, CHCHCHN(CH)), 3.42 (с, 2Н, CHCHCHN(СН)), 3.87 (м, 2Н, краситель С(3)H), 4.13 (уш.м, 8Н, С(3')H, С(4')H, С(5')H, CHCHCHN(СН), краситель С(17)H), 6.25 (м, 3Н, краситель α,α'-CH, С(1')H), 6.46 (м, 5Н, краситель С(1)H, С(2)H), краситель γ,γ'-CH), 7.25, 7.41, 7.62, 7.71 (4м, 7Н, С(6)H, ArH), 8.05 (м, 3Н, краситель δ-CH, β,β'-CH). ЯМР Р (DO, δ, м.д.): -21.66 (т, Р), -10.62 (д, Р), -7.53 (д, P).
Пример 40. Получение тетранатриевой соли 5-[4,11,18-триаза-5,12,19-триоксо-24-(1'-(3-триметиламмонио)пропил)-3,3,3',3'-тетраметил-5,5'-дисульфоиндотрикарбоцианин-1 -ил)-тетракоз-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (соединение А15).
+
4-
63
87
8
23
3
2
Получают 1.1 мкмоль (69%) соединения А15. Найдено: m/z 1486.6 [М]. CHNOPS. Вычислено: М=1481.46.
1
31
β
α
γ
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
3
3
2
2
Н
ЯМР H (DO, 6, м.д., J/Гц): 1.23, 1.42, 1.79 (3 уш. м., 18Н, краситель С(7)H, С(8)H, С(9)H, С(14)H, С(15)H, С(16)H,С(21)H, С(22)H, С(23)H), 1.63 (с, краситель 12Н, С(3,3)H, C(3',3')H), 2.23 (м, 10Н, С(2')H, краситель С(6)H, С(13)H, С(20)H, CHCHCHN(СН)), 3.07 (м., 4Н, краситель С(10)H, С(17)H), 3.18 (с, 9Н, CHCHCHN(CH)), 3.49 (с, 2Н, CHCHCHN(СН)), 3.81 (м, 2Н, краситель С(3)H), 4.02 (уш. м, 8Н, С(3')H, С(4')H, С(5')H, CHCHCHN(СН), краситель С(24)H), 6.26 (м, 3Н, краситель α,α'-С, С(1')H), 6.48 (м, 4Н, краситель С(1)H, С(2)H, краситель γ,γ'-СН), 7.23, 7.31, 7.54 (3м, 7Н, С(6)H, ArH), 7.99 (м, 3Н, краситель δ-CH, β,β'-С). ЯМР Р (DO, 5, м.д.): -21.68 (т, Р), -10.32 (д, Р), -7.45 (д, P).
Пример 41. Получение тетранатриевой соли 5-[4-аза-5-оксо-10-(1'-(5-триметиламмонио)пентил)-3,3,3',3'-тетраметил-5,5'-дисульфоиндотрикарбоцианин-1-ил)- дек-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (соединение А16).
+
4-
53
69
6
3
2
Получают 1.15 мкмоль (72%) соединения А16. Найдено: m/z 1288.3 [М]. CHNO21PS. Вычислено: М=1283.20.
1
31
β
γ
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
ЯМР Н (DO, 5, м.д., J/Гц): 1.25, 1.46, 1.72 (3 уш. м., 10Н, краситель С(7)H, С(8)H, С(9)H, CHCHCHCHCHN(СН)), 1.65 (с, краситель 12Н, С(3,3)H, С(3',3')H), 2.25 (м, 4Н, С(2')H, краситель С(6)H), 3.06 (с, 9Н, CHCHCHCHCHN(CH)), 3.22 (с, 2Н, CHCHCHCHCHN(СН)), 3.71 (м, 2Н, краситель С(3)H), 4.09 (уш. м, 8Н, С(3')H, С(4')H, С(5')H, CHCHCHCHCHN(СН), краситель С(10)H), 6.31 (м, 3Н, краситель α,α'-CH, С(1')H), 6.49 (м, 4Н, краситель С(1)H, С(2)H, краситель γ,γ'-CH), 7.21, 7.32, 7.68 (4 м., 7Н, С(6)H, ArH), 7.95 (м, 3Н, краситель δ-CH, β,β'-CH). ЯМР Р (DO, δ, м.д.): -21.34 (т, Р), -10.27 (д,°Р), -7.93 (дР).
Пример 42. Получение тетранатриевой соли 5-[4,11-диаза-5,12-диоксо-17-(1'-(5-триметиламмонио)пентил)-3,3,3',3'-тетраметил-5,5'-дисульфоиндотрикарбоцианин-1-ил)-гептадек-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (соединение А17).
+
4-
59
80
7
22
3
2
Получают 1.09 мкмоль (68%) соединения А17. Найдено: m/z 1401.5 [М]. CHNOPS. Вычислено: М=1396.35.
1
31
β
α
β
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
ЯМР Н (DO, δ м.д., J/Гц): 1.28, 1.41, 1.56 (3 уш. м., 14Н, краситель С(7)H, С(8)H, С(9)H, С(14)H, С(15)H, С(16)H, CHCHCHCHCHN(СН)), 1.68 (с, краситель 12Н, С(3,3)H, С(3',3')H), 2.27 (м, 6Н, С(2')H, краситель С(6)H, С(13)H), 2.84 (м., 2Н, краситель С(10)H), 3.05 (с, 9Н, CHCHCHCHCHN(CH)), 3.18 (с, 2Н, CHCHCHCHCHN(СН)), 3.72 (м, 2Н, краситель С(3)H), 4.03 (уш. м, 8Н, С(3')H, С(4')H, С(5')H, CHCHCHCHCHN(СН), краситель С(17)H), 6.32 (м, 3Н, краситель α,α'-CH, С(1')H), 6.46 (м, 4Н, краситель С(1)H, С(2)H, краситель γ,γ'-CH), 7.25, 7.31, 7.65 (3м., 7Н, С(6)H, ArH), 7.98 (м, 3Н, краситель δ-CH, β,β'-CH). ЯМР Р (DO, 6, м.д.): -20.94 (т, Р),-10.12 (д, Р), -7.64 (д, Р).
Пример 43. Получение тетранатриевой соли 5-[4,11,18-триаза-5,12,19-триоксо-24-(1'-(5-триметиламмонио)пентил)-3,3,3',3'-тетраметил-5,5'-дисульфоиндотрикарбоцианин-1-ил)-тетракоз-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (соединение А18).
+
4-
65
91
8
23
3
2
Получают 1.2 мкмоль (75%) соединения А18. Найдено: m/z 1514.7 [М]. CHNOPS. Вычислено: М=1509.51.
1
31
β
α
γ
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
2
ЯМР Н (DO, δ, м.д., J/Гц): 1.27, 1.42, 1.61 (3 уш. м., 20Н, краситель С(7)H, С(8)H, С(9)H, С(14)H, С(15)H, С(16)H, С(21)H, С(22)H, С(23)H, CHCHCHCHCHN(СН)), 1.57 (с, краситель 12Н, С(3,3)H, С(3',3')H), 2.18 (м, 6Н, С(2')H, краситель С(6)H, С(13)H, С(20)H), 2.95 (м., 4Н, краситель С(10)H, С(17)H), 3.12 (с, 9Н, СНСНСНСНСНН(CH)), 3.21 (с, 2Н, CHCHCHCHCHN(СН)), 3.69 (м, 2Н, краситель С(3)H), 4.02 (уш. м, 8Н, С(3')H, С(4')H, С(5')H, CHCHCHCHCHN(СН), краситель С(24)H), 6.32 (м, 3Н, краситель α,α'-CH, С(1')H), 6.46 (м, 2Н, краситель С(1)H, С(2)H, краситель γ,γ'-CH), 7.29, 7.38, 7.64 (3м., 7Н, С(6)H, ArH), 8.02 (м, 3Н, краситель δ-CH, β,β'-CH). ЯМР Р (DO, δ, м.д.): -21.15 (т, Р), -10.94 (д, Р), -7.86 (д, Р).
Пример 44. Использование флуоресцентно-меченных нуклеозидтрифосфатов общей формулы (А) на примере тест-системы «KRAS-биочип» (Биочип-ИМБ, Москва, Россия).
ДНК образцы анализировали в соответствии с рекомендациями производителя (Биочип-ИМБ, Москва, Россия) (М. А. Емельянова. Определение мутаций в гене KRAS в опухолевых клетках с помощью биологических микрочипов // Молекулярная биология. -2011. - Т. 45, №5. - С. 863-870). Обнаружение продуктов ПЦР после каждой стадии подтверждали при помощи агарозного гель электрофореза.
2
На первой стадии мультиплексной ПЦР проводили амплификацию геномной ДНК в конечном объеме 25 мкл. Реакционная смесь (конечный объем 25 мкл) содержала 3 мкл Taq буфера, 1.5 мМ MgCl, 2.5 ед. Taq полимеразы, по 0.2 мкМ каждого дезоксинуклеозид трифосфата, 0.2 мкМ праймеров, 0.03 мкМ LNA-олигонуклеотида and 25 нг ДНК. Температурный режим был следующим: денатурация 95°С - 3.5 мин, затем 35 циклов амплификации (94°С - 30 сек, 60°С - 20 сек, 72°С - 10 сек), заключительная стадия инкубации 72°С - 3 мин. В качестве матрицы для проведения 2 стадии использовали 2.5 мкл реакционной смеси, полученной на 1 стадии. Вторую стадию проводили методом асимметричной мультиплексной ПЦР для получения преимущественного флуоресцентно-меченного продукта, необходимого для гибридизации с олигонуклеотидными зондами. Реакционная смесь 2-ой стадии содержала 0.2 нмоль флуоресцентно-меченного нуклеотида общей формулы (А) и избыток одного праймера. Температурный режим был следующим: денатурация 95°С - 3.5 мин, затем 35 циклов амплификации (94°С - 30 сек, 60°С - 20 сек, 72°С - 10 сек), заключительная стадия инкубации 72°С - 3 мин. К 12 мкл реакционной смеси, полученной на 2 стадии мультиплексной ПЦР и содержащей преимущественно одноцепочечную флуоресцентно-меченую ДНК, добавляли 24 мкл концентрированного раствора гибридизационного буфера. Полученную смесь помещали в гибридизационную камеру биочипа. Гибридизацию проводили при 37°С в течение 18 ч. По окончании гибридизации микрочип отмывали дистиллированной водой и высушивали на воздухе. Регистрацию результатов гибридизации выполняли на портативном анализаторе флуоресценции «Чипдетектор» (Биочип-ИМБ, Москва, Россия) с использованием специализированного программного обеспечения Imageware.