Синтез имидазолиниевых соединений с антибактериальной активностью

И. Ю. Голубев, П. С. Фахретдинов, А. Д. Волошина,

И. В. Кулик, Р. Ф. Хамидуллин, Г. В. Романов

СИНТЕЗ ИМИДАЗОЛИНИЕВЫХ СОЕДИНЕНИЙ

С АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Ключевые слова: имидазолиниевые соединения, антибактериальная активность. imidazolinium compounds, antibacterial activity.

Синтезированы новые 2-алкенил-1-[нонилфеноксиполи(этиленокси)-карбонилметил]имидазолиниевые соединения и исследована их

бактериостатическая активность в отношении грамположительных (St. аureus и B. cereus) и грамотрицательных (E. coli, Pseudamonas aeruginosa) бактерий. Установлено, что среди синтезированных имидазолиниевых соединений есть вещества с высокой бактериостатической активностью в отношении грамположительных бактерий (на уровне антибиотика линкомицина).

New 2-alkenyl-1-[nonylpheno-xypoly

Четвертичные аммониевые соединения (ЧАС) различной структуры вызывают постоянный интерес исследователей из-за того, что они обладают широким спектром антимикробного действия [1 - 5]. Целый ряд представителей этого класса соединений стал основой для создания высокоэффективных дезинфицирующих средств разного назначения, выпускаемых промышленностью в значительных масштабах [6 - 9]. ЧАС обычно имеют преимущество перед другими дезинфектантами, так как они, как правило, являются малотоксичными веществами, не имеют ярко выраженного запаха, не вызывают коррозии металлов. Кроме того, они наряду с дезинфицирующими свойствами обладают также и моющим действием, что позволяет сочетать обеззараживание объектов с их очисткой и удалением загрязнений [10].

Используемые для этих целей ЧАС обычно включают в свою структуру аммонийные центры различной природы: алифатические, ароматические или

гетероциклические. При этом имеются примеры того, что введение двух аммонийных центров в молекулу ЧАС может значительно повысить их антимикробные свойства [11]. Исходя из этого, можно предположить, что ЧАС, содержащие аммонийный центр на основе гетероциклической системы с двумя атомами азота в цикле, как, например, имидазолин, позволит повысить антимикробные свойства создаваемых новых имидазолиниевых соединений. Известные в настоящее время некоторые производные имидазолинов, обладающие биологической активностью, имеют ряд недостатков, в том числе, низкую растворимость в воде и необходимость использования высоких дозировок при их применении [12].

Целью данного исследования является синтез и исследование противомикробной активности новых имидазолиниевых соединений.

Для создания новых водорастворимых имидазолиниевых соединений с повышенной антимикробной активностью использована концепция неклассических катионных ПАВ [13]. Согласно этой концепции гидрофобность одного из длиноцепочных углеводородных радикалов создаваемых имидазолиниевых соединений предлагается разрывать (фрагментировать) полярными кислородсодержащими (простыми эфирными, сложноэфирными и полиоксиэтильными) фрагментами (доменами). Ожидается, что аналогично ранее синтезированным четвертичным аммониевым соединениям [14 - 16], введение таких доменов будет способствовать повышению антимикробной активности создаваемых веществ.

Для синтеза новых имидазолиниевых соединений в качестве синтонов с полярными полиоксиэтильными фрагментами использовали промышленно выпускаемые неонолы АФд-п, являющиеся нонилфеноксиполиэтиленгликолями (I), с различной средней степенью оксиэтилирования (п = 0, 4, 6, 9, 10, 12). Для введения сложноэфирной группировки в структуру конструируемых имидазолиниевых соединений эти синтоны подвергали этерификации монохлоруксусной кислотой в условиях кислотного катализа с азеотропным удалением образовавшейся реакционной воды по способу, предложенному в работе [16]: /=\ 0 / \ // ' Т0ЛУ0Л

Н19С9—/)—О—(СН2СН2О)—Н + С1—СН2—с "

\ ОН

I II

Н19С9^\ />-0-(СН2СН20)—С-СН2-С!

III

где п - средняя степень оксиэтилирования, равная 0 (а), 4 (Ь), 6 (с), 9 (ё), 10 (е) и 12 (1).

Полученные при этом нонилфеноксиполи(этиленокси)хлорацетаты Ша - ПК являются функциональнозамещенными галоидными алкилами, используемыми для алкилирования аминосоединений - 2-алкенилимидазолинов.

Для синтеза исходного 2-алкенилимидазолина (VI), содержащего непредельный алифатический радикал, использовали способ, описанный в работе [17]. По этому способу осуществляют взаимодействие олеиновой кислоты (IV) с этиленкарбамидом (V) в условиях удаления образующихся летучих продуктов реакции при температуре 300 0С в течении 5 часов по схеме: ___

/ \ 1 = 300 с0 I \11_1

сНз(сн2)7сн=сн(сн2)7соон + нм мн - Н0, _ С0» М^./МН

О С17Н33

IV V VI

Полученный 2-алкенилимидазолин (VI) соответствует литературным данным [18], содержит алифатический радикал СНз(СН2)7СН=СН(СН2)7- с одной двойной связью и является основой для соответствующих имидазолиниевых соединений. В связи с этим представляет интерес исследование того, как влияет на антимикробную активность имидазолиниевых соединений введение в этот углеводородный радикал дополнительных двойных связей.

Для синтеза 2-алкенилимидазолинов с несколькими двойными связями использовали известную реакцию сложных эфиров глицерина непредельных карбоновых кислот (подсолнечного масла) (VII) с этилендиамином (VIII) [18] по схеме:

О

Н2С-О-С^Р ' О

НС-О-С-Р + 3Н21\1-СН2-СН2-1\1Н2

О

Н2О, - глицерин

Н2С-О—С-Р VII

VIII

3 РСО1\1НС2Н41\1Н2

IX

гл

.ЫН

Р

X

где Р - алкилы кислот подсолнечного масла.

В качестве исходного сырья в этом синтезе использовано подсолнечного масло, со следующим составом карбоновых кислот, %: линолевая 48,3 - 77,0; олеиновая 14,0 - 39,4; пальмитиновая 5,0 - 7,6; стеариновая 2,7 - 6,5; линоленовая до 0,3; арахиновая до 0,5; миристиновая до 0,2 [19]. В результате реакции с этилендиамином конечными продуктами являются 2-алкенилимидазолины (X), алкильные радикалы в которых, представляют собой смесь алкилов кислот подсолнечного масла, являющимися преимущественно непредельными СНз(СН2)з-(СН2СН=СН)2(СН2)7- и СНз(СН2)7СН=СН(СН2)7-,

суммарное количество которых составляет 87,1 - 91,0 %.

Синтезированные 2-алкенилимидазолины (VI) и (X) использованы далее в качестве нуклеофилов для создания новых функциональнозамещенных имидазолиниевых соединений. Для этого вещества (VI) и (X) подвергали алкилированию нонилфеноксиполи(этиленокси)хлорацетатами (III), являющимися функционально-замещенными галоидными алкилами, по схеме:

Г

Л

Р

VI, X

ЫН +

Н19С9

О—(СН2СН2О)—С—СН2—С1 О

III

1 = 65 - 75 С0, спирт

О

Ы^^ЫН—СН2—С—(СН2СН2О) Р

XI, XII

О

С9Н19

С1

Реакцию вели в полярном растворителе (изопропиловом спирте) при эквимолярных соотношениях исходных веществ, при эффективном механическом перемешевании и температуре 60 - 75 оС в течение 10 - 12 часов. Контроль за полнотой превращения исходных веществ в имидазолиниевые соединения осуществляли по количеству хлорид-иона, определяемого потенциометрическим титрованием раствором АдЫОз, и по

Н2О

исчезновению в ИК-спектрах полученых веществ полосы колебания органического хлора V(c-ci) = 510 - 541 см-1.

После окончания синтеза растворитель удаляли в вакууме при нагревании не выше 85 оС. Полученные вещества представляют собой вязкие жидкости от желтого до темнокоричневого цвета. Их физико-химические характеристики представлены в табл. 1.

Таблица 1 - Физико-химические характеристики имидазолиниевых соединений

Вещество « 70 пд ИК-спектры, -1 см Элементный анализ,

V(C=O) V(C-O ацикл.) V(C-O ацетатн.) V(N-H) V(N=C имидазолин) N, % ^ионный %

XIa 1,4893 1743 1106 1243 3303 1654 4,90/4,65 5,41/5,89

XIb 1,4860 1745 1107 1249 3305 1650 3,84/3,60 4,38/4,56

XIc 1,4837 1747 1109 1250 3303 1639 3,41/3,23 4,21/4,10

XId 1,4782 1754 1110 1250 3299 1640 2,96/2,80 3,61/3,56

XIe 1,4773 1752 1110 1250 3303 1639 2,87/2,69 3,28/3,41

XIf 1,4770 1745 1109 1250 3304 1639 2,61/2,48 3,26/3,14

XIIa 1,4842 1746 1100 1247 3301 1638 6,29/4,65 5,44/5,89

XIIb 1,4800 1755 1123 1249 3299 1638 4,87/3,60 4,36/4,56

XIIc 1,4792 1751 1123 1249 3303 1639 4,37/3,23 4,21/4,10

XIId 1,4770 1747 1110 1249 3303 1640 3,79/2,80 3,61/3,56

XIIe 1,4762 1753 1111 1250 3303 1640 3,63/2,69 3,21/3,41

XIIf 1,4760 1750 1110 1249 3303 1639 3,35/2,48 3,44/3,14

Полученные вещества XIa - XIf и Xa - Xf являются новыми 2-алкенил-1-[нонилфеноксиполи(этиленокси)карбонилметил]имидазолиний хлоридами. Они исследованы в качестве антибактериальных средств.

Антибактериальная активность синтезированных веществ

При изучении противомикробной активности синтезированных веществ в качестве тест-объектов использовали бактериальные культуры представителей грамположительных бактерий: Staphylococcus aureus 209p, Bacillus cereus 8035, грамотрицательных бактерий: Escherichia coli F-50, Pseudamonas aeruginosa 9027.Бактериостатическое действие синтезированных веществ в отношении St. aureus, B. cereus, E. coli, P. aeruginosa исследовали по общепринятой в микробиологической практике методике серийных разведений [20 - 21] в бульоне Хоттингера нагрузке 300000 микробных тел в 1 мл. Результаты опытов учитывали после термостатирования при температуре 37 оС через 18 -20 часов. За минимальную подавляющую концентрацию (МПК) принимали наименьшую концентрацию препарата, задерживающую рост микроорганизмов. В качестве эталона сравнения был взят широко применяемый в медицине антибактериальный препарат -антибиотик линкомицин (из группы линкозамидов).

Результаты испытаний антибактериальной активности имидазолиниевых соединений приведены в табл. 2.

Проведенные исследования показали, что к синтезированным имидазолиниевым соединениям наиболее высокую чуствительность проявляют грамположительные бактерии St. aureus и Bacillus cereus. Для St. aureus минимальные подавляющие концентрации (МПК) наиболее активных веществ (XId, XIe, XIIa) составляет 7,8 мкг/мл и для (XIa, XIb, XIc) -15,6 мкг/мл. Другие имидазолиниевые соединения (XIf, XIIb, XIIc, XIId, XIIe, XIIf) по отношению к St. aureus вещества проявляют меньшую активность (МПК 31,25 - 125 мкг/мл). Для Bacillus cereus наиболее высокую активность проявляют XIIa (МПК составляет 15,6 мкг/мл), а также XId и XIe (МПК составляет 31,25 мкг/мл). Другие вещества проявляют более низкую активность (МПК = 62,5 - 250 мкг/мл). Представленные данные свидетельствуют о том, что имидазолиниевые соединения (ряд XIa, b, c, d, e, f), содержащие одну двойную связь в алкениловом радикале, проявляют в отношении грамположительных бактерий более высокое бактериостатическое действие, чем соответствующие им аналоги с несколькими двойными связями (ряд XIIa, b, c, d, e, f). В ряду синтезированных имидазолиниевых соединений вещества XId, XIe, и XIIa проявляют бактериостатическую активность в отношении грамположительных бактерий St. aureus и B.cereus на уровне эталона сравнения антибиотика линкомицина.

Таблица 2 - Результаты испытаний антибактериальной активности

имидазолиниевых соединений

Вещество МПК вещества

St. aureus штам 2c9p B. cereus штам 8035 E. coli штам F-50 Ps. аeruginosa штам 9027

мкг/мл мкмоль/л мкг/мл мкмоль/л мкг/мл мкг/мл

Xfe 15,6 25,3 62,5 100,9 1000 >1000

Xb 15,6 19,7 62,5 78,5 1000 >1000

Xk 15,6 17,7 62,5 70,6 1000 >1000

Xd 7,8 7,7 31,3 30,8 500 >1000

Xk 7,8 7,4 31,3 29,6 500 >1000

Xf 31,3 27,3 125,0 109,2 1000 >1000

XHa 7,8 13,0 15,6 25,9 >500 >1000

XHb 31,3 40,1 125,0 160,6 1000 >1000

XHc 125,0 144,3 250,0 288,5 >1000 >1000

XHd 62,5 62,6 125,0 125,2 >1000 >1000

XHe 62,5 60,0 125,0 119,9 >1000 >1000

XHf 31,3 27,6 62,5 55,3 >500 >1000

Линкомицин 10,0 500,0 Не активен Не активен

Для более удобного рассмотрения зависимости структура - свойство и учета величины молекулярных масс обсуждаемых веществ, величины МПК для бактерий пересчитаны из массовых концентраций (мкг/мл) в молярные (мкмоль/л) (табл. 2). Для оценки влияния величины полярного полиоксиэтильного фрагмента на антибактериальную активность в отношении этих грамположительных бактерий построены графики в координатах: МПК (мкмоль/л) - степень оксиэтилирования n (рис. 1).

Анализируя зависимости бактериостатической активности (МПК) ряда

имидазолиниевых соединений с одной двойной связью в алкенильном радикале от величины полярного полиоксиэтильного домена, следует отметить, что по отношению St. aureus и B. сегеш они являются однотипными. Этот результат можно объяснить схожестью клеточных мембран St. aureus и B. сегеш. При степенях оксиэтилирования в интервале от n = 0 до n =10 бактериостатическая активность практически мало зависит от степени оксиэтилирования, так как график представляет собой прямую линию, практически параллельную оси абсцисс. Дальнейшее увеличение полярного домена (n = 12) приводит к небольшому снижению активности. Это можно объяснить, тем, что для воздействия на мембрану бактерии необходимо, чтобы действующее вещество имело соответствующее сродство к этой мембране, т. е. определенные значения гидрофобности. Для обсуждаемого ряда имидазолиниевых соединений такие оптимальные значения гидрофобной составляющей достигаются при n = 0 - 10. Повышение длины гидрофильной части молекулы приводит к снижению сродства к мембране, результатом чего является снижение, как адсорбции, так и бактериостатического действия.

Рис. 1 - Зависимость антибактериальной активности имидазолиниевых соединений с одной двойной связью от величины полиоксиэтильного домена

Синтезированные вещества проявляют невысокую бактериостатическую активность в отношении грамотрицательных бактерий E. coli (МПК составляет от 500 до более 1000 мкг/мл) и Ps. aeruginosa (МПК - более 1000 мкг/мл) (табл. 2).

Установлено, что 2-алкенилимидазолиниевые соединения с одной и несколькими двойными связями в углеводородном радикале (в положении 2) проявляют бактериостатическую активность в отношении грамположительных бактерий, в то время как грамотрицательные бактерии к этим веществам являются мало чувствительными.

Таким образом, синтезированы новые 2-алкенил-1-[нонилфеноксиполи-

(этиленокси)карбонилметил]имидазолиниевые соединения с одной и несколькими двойными связями в углеводородном радикале. Установлено наличие в ряду синтезированных имидазолиниевых соединений с высокой бактериостатической активностью на уровне антибиотика линкомицина.

Литература

1. Rahn, O. Quaternary ammonium compounds / O. Rahn, W. P. Van Eseltine // Annu. Rev. Microbiol. -1947. - №1. - P. 173-192.

2. Чернявская, М.А. Противомикробные и поверхностно-активные свойства катионных ПАВ на основе хлоралканов и алкилбензолов / М. А. Чернявская, И. А. Сергеева, А. С. Белова // Химико - фармацевтический журнал. - 1984. - Т. 18. - №11. - С. 1344-1347.

3. Baley, G.J. Bacteriadal properties of quternary ammonium compounds in dispersed systems / G.J. Baley, G. E. Peck, G. S. Banker // j Pharm. Sci. - 2009. - Vol. 66. - №5. - P. 696-699.

4. Wozniak, E. Antimicrobial Activity of N-Alkoxycarbonylmetyl-N-alkyl-piperidinium Chlorides / E. Wazniak [et al.] // Z. Naturforsch. - 2004. - Vol. 59c. - P. 782-786.

5. Joannou, C.J. Action of Disinfectant Quaternary Ammonium Compounds against Staphylococcus aureus / C. J. Joannou, G. W. Hanlon, S.P. Denyer // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - 2007. -Vol. 51. - №1. - P. 296-306.

6. Sundheim, G. Bacterial resistsnce to disinfectants containing quaternary ammonium compounds / G. Sundheim [et. al.] // International Biodeteriozation & Biodegradation. - 1998. - Vol. 41. - №3 - 4. -P. 235-239

7. Крейнгольд, С.У. Сравнение эффективности средств для дезинфекции поверхностей на основе четвертичных солей аммония / С. У. Крейнгольд // Дезинфекционное дело. -1999. -№1. - С. 26-32.

8. Masaadeh, H.A. Determination of the Antibacterial Efficacy of Common Chemical Agents in Cleaning and Disinfection in Hospitals of North Jordan / H. A. Masaadeh, A. S. Jaran // American Journal of Applied Sciences. - 2009. - Vol. 6. - №5. - P. 811-815.

9. Baley, G.J. Bactericidal properties of quaternary ammonium compounds in dispersed systems / G.J. Baley, G. E. Peck // Journal of Pharmaceutical and Medicinal Chemistry. - 2009. - Vol. 66. - №5. -P. 696-699.

10. Merianos, J.J. Quaternary ammonium antimicrobial sterilization and preservation. / J. J. Merianos // Philadelphia: Lea & Febiger. - 1991. - P. 225 - 255.

11. Zhang, D. Bactericidal Action of Bis-quaternary Ammonium Compounds against Vegetative Cells and Spores of Bacillus subtilis / D. Zhang [et al.] // Biocontrol Sci. - 2003. - Vol. 8. - №3. - P. 101-110.

12. International patent WO 98/49898 IPC A01№ 43/50. Novel biocidal agents comprising quaternary bisimidazoline surfactants. Publ. Novemb. 12, 1998.

13. Фахретдинов, П.С. Конценпция неклассических катионных поверхностно-активных веществ / П. С. Фахретдинов // Материалы XVIII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии. -М. 2007.- С. 483.

14. Пат. 2216535 Российская Федерация, МПК7 С 07 С 229/10. ^[Алоксиполи(этилен-окси)карбонолметил] аммоний хлориды, обладающие фунгистатической и бактериостатической активностью и способ их получения / П.С. Фахретдинов [и др.] // Бюлл. изобр. -2004. - №. 32.

15. Угрюмова, В. С. Четвертичные аммониевые соединения - перспективное направление в ветеринарной дезинфектологии / В. С. Угрюмова [и др.] // Ветеринарный врач. - 2005. - №1. -С. 59-63.

16. Фахретдинов, П.С. Функциональнозамещенные ^[поли(алкиленокси)карбонил-метил] аммониевые соединения. Синтез, свойства и применение в нефтяной промышленности: дис. ... канд. хим. наук: 02.00.13. / Павел Сагитович Фахретдинов. - Казань, 1997. - 290 с.

17. Patent 2210588 USA. Cl 260 - 309. Process of preparing imidazolines. / G. Kranzlein, H. Bestian. Patented Aug / 6, 1940.

18. Абрамзон, А.А. Поверхностно-активные вещества. Синтез, анализ, свойства, применение: учебное пособие для вузов / А.А. Абрамзон, Л.П. Зайченко, С.И. Файнгольд. - Л.: Химия, 1988. -200с.

19. ГОСТ Р 52465-2005. Масло подсолнечное. Технические условия. - Введ. 2005-29-12. - М.: Стандартинформ, 2007. - 19 с.

20. Ведьмина, Е.А. Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных болезней / Е. А. Ведьмина, Н. М. Фурер. - М.:Медицина,1964. Т.1. - С. 670-675.

21. Методы экспериментальной химиотерапии / Под ред. Г. Н. Першина. - М. 1971.

© П. С. Фахретдинов - канд. хим. наук, доц., ст. научн. сотр. лаб. химии и геохимии нефти Учреждения Российской академии наук института органической и физической химии им. А.Е. Арбузова Казанского научного центра РАН; Г. В. Романов - д-р хим. наук, проф. зав. зав. лаб. химии и геохимии нефти ИОФХ КНЦ РАН, v-ing@mail.ru; А. Д. Волошина - мл. научн. сотр. лаб. химии биологич. иссл. того же института, microbe@iopc.knc.ru; И. В. Кулик - мл. научн. сотр. той же лаборатории; И. Ю. Голубев - асп. каф. химической технологии переработки нефти и газа КГТУ; Р. Ф. Хамидуллин - д-р техн. наук, проф., зав. каф. химической технологии переработки нефти и газа КГТУ, xamidi@mail.ru.