Рекомбинантный ростовой дифференцировочный фактор роста 11 (GDF11), способ его получения, инъекционный препарат для повышения мышечной массы млекопитающих животных и птицы, а также способ использования препарата
RECOMBINANT GROWTH DIFFERENTIATION FACTOR 11 (GDF11), A METHOD FOR ITS PRODUCTION, AN INJECTABLE DRUG FOR INCREASING THE MUSCLE MASS OF MAMMALS AND POULTRY AS WELL AS A METHOD OF USING THE DRUG

Группа изобретений относится к генной инженерии, биотехнологии и ветеринарии, а конкретно к рекомбинантному дифференцировочный фактор роста 11, способу его получения, иммуногенной композиции, содержащей в качестве антигена GDF11, инъекционный препарат для повышения мышечной массы млекопитающих животных и птицы, а также метод использования указанного инъекционного препарата для увеличения мышечной массы животных.
Уровень техники
Белок GDF11, дифференцировочный фактор роста 11 (growth differentiation factor-11), относится к суперсемейству TGF-β трансформирующего фактора роста β (transforming growth factor-β). GDF11 представляет собой белок гомологичный миостатину, который действует как ингибитор роста различных тканей. GDF11 может связываться с теми же рецепторами суперсемейства TGF-бета типа I ACVR1B (ALK4), TGFBR1 (ALK5) и ACVR1C (ALK7) что и миостатин, но преимущественно использует ALK4 и ALK5 для передачи сигнала (Andersson O, Reissmann E, Ibáñez CF 2006 EMBO Reports. 7 (8): 831-7).
Из уровня техники известен патент США № 6096506, в котором раскрыто антитело, которое специфически реагирует с полипептидом миостатина. Также известен способ увеличения мышечной массы у животного путем введения моноклонального антитела против миотатина и блокирования его активности (патент США № 6468535) и способ получения слитого белка с последовательностью миостатина, способного в составе иммуногенной композиции индуцировать синтез специфических аутоантител к миостатину, блокировать его действие и, как следствие, стимулировать рост мышечной ткани (патент РФ № 2613420).
GDF11 тесно связан с миостатином, негативным регулятором роста мышц (McPherron AC, Lee SJ 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94(23):12457-61).  Миостатин и GDF11 участвуют в регуляции пролиферации кардиомиоцитов. Сходство между GDF11 и миостатином подразумевают вероятность того, что используются одни и те же регулирующие механизмы, которые задействованы для регуляции размера ткани как мышечной, так костной и хрящевой. (Egerman MA et al. Cell Metab. 2015 22(1):164-74; Zimmers TA et al. 2017 Basic Res Cardiol. 112(4):48). Следовательно, блокирование активности GDF11 должно приводит к значительному увеличению мышечной массы организма.
Авторы настоящего изобретения получили неожиданный и воспроизводимый результат, демонстрирующий что слитный рекомбинантный белок с GDF11, иммуногенная композиции с этим белком и вакцинация может быть использована для увеличения мышечной массы организма.
Сущность изобретения
Техническая проблема, на решение которой направлена заявляемая группа изобретений, заключается в создании рекомбинантного иммунологически активного GDF11-содержащего белка, легко поддающегося очистке и обладающего достаточной иммуногенностью в отношении GDF11 как антигена, который может быть использован для повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных (крупный рогатый скот, свиньи, лошади, кролики и т.д.) и птицы за счет индукции синтеза специфических аутоантител к GDF11, блокировании его действия и, как следствие, стимуляции роста мышечной ткани. Другая техническая проблема, на решение которой направлена заявляемая группа изобретений, заключается в разработке препарата на основе указанного белка и в создании способа использования этого препарата, решающего задачу повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы при условии несистематического применения препарата. Следует отметить, что аминокислотная последовательность GDF11 идентична у всех млекопитающих животных и птиц. Вследствие этого разработанный препарат является универсальным средством для повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы.
Технический результат, достигаемый при реализации заявляемой группы изобретений, заключается в расширении арсенала средств и методов, обеспечивающих повышение продуктивности скота и птицы.
Streptococcus mutans
Указанный технический результат достигается за счет рекомбинантного белка с молекулярной массой 35,9 кДа, включающего фрагмент белка фактора роста и дифференцировки 11 (GDF11) с последовательностью SEQ ID NO:1, Гли-Сер спейсер с последовательностью SEQ ID NO: 2, альфа-глюкансвязывающий домен (GBD) гена из с последовательностью SEQ ID NO: 3 и последовательность нуклеотидов гена GDF11-GBD SEQ ID NO: 4.
Технический результат также достигается в способе получения рекомбинантного белка GDF11 (GDF11-GBD) на глюкане, который включает:
E. сoli
- выращивание клеток штамма , экспрессирующих ген GDF11-GBD;
E. coli
- связывание белка GDF11-GBD в составе клеточных экстрактов штамма  BL21 [pGDF11-GBD] с глюкансодержащим (альфа-глюкансодержащем) сорбентом за счет аффинного взаимодействия при процедуре инкубации;
- последующую отмывку от несвязавшихся бактериальных белков и выделение целевого продукта.
В качестве глюкансодержащего сорбента (глюкана, альфа-глюкана) могут использоваться: пуллулан, гликоген, декстран, крахмал.
Streptococcus mutans
Рекомбинантный белок GDF11-GBD включает в себя белковую последовательность глюкансвязывающего домена, определяющего способность данного белка связываться с глюкансодержащим сорбентом, что позволяет проводить в одну стадию концентрирование, очистку и иммобилизацию белкового продукта на глюкане (альфа-глюкане, глюкансодержащем сорбенте). Иммобилизация на глюкане обеспечивается за счет присутствия в рекомбинантном белке глюкансвязывающего домена из альфа-глюкансвязывающего домена гена из , который обладает высоким сродством к альфа-глюканам и обеспечивает необратимое связывание с глюкансодержащим сорбентом в широком диапазоне значений pH 6,0 - 9,0 и концентраций соли 0 - 3 М NaCl.
E. coli
E. coli
Поскольку в клетках отсутствуют белки, связывающиеся с альфа-глюканом, то синтезируемый в клетках  рекомбинантный белок GDF11-GBD, является единственным белком клеток штамма-продуцента, прочно связывающимся с альфа-глюканом. Это обеспечивает возможность одностадийного получения высокоочищенного препарата рекомбинантного белка, иммобилизованного на глюкансодержащем сорбенте.
Технический результат достигается также за счет инъекционного препарата для повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных и птицы, который содержит рекомбинантный белок GDF11-GBD, охарактеризованный выше, суспендированный в среде из глюкансодержащего (альфа-глюкансодержащего) сорбента в приемлемом для инъекционного использования жидком адьюванте (носителе), а также за счет реализации метода повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных и птицы, который включает проведение подкожных или внутримышечных инъекций препарата, содержащего рекомбинантный белок GDF11-GBD, суспендированный в среде из глюкансодержащего (альфа-глюканового) сорбента в приемлемом для инъекционного использования жидком носителе, в дозе 0,5 - 50 мкг указанного белка на один килограмм массы тела животного или птицы.
Таким образом, создан бифункциональный рекомбинантный белок GDF11-GBD, обладающий способностью самопроизвольно связываться с глюкансодержащим сорбентом, формируя высокоиммуногенную композицию в форме полиантигена, индуцировать синтез специфических аутоантител к GDF11 при введении животным и, как следствие, стимулировать рост мышечной ткани.
Получение рекомбинантного слитного белка GDF11 (GDF11-GBD)
На первом этапе осуществляют получение гена GDF11 с последующим его клонированием.
E.coli
Ген GDF11 получали химико-ферментативным методом. Был спланирован олигонуклеотидный дуплекс, кодирующий соответствующий ген, оптимизированный для экспрессии в . Затем осуществляли получение плазмиды pGDF11-GBD, содержащей последовательности, кодирующие GDF11, cпейсер и глюкансвязывающий домен (GBD).
Получение штамма E. coli-продуцента рекомбинантного антигена GDF-11, соединенного с глюкансвязыващим доменом
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E.coli
Для получения штамма -продуцента рекомбинантного белка GDF11-GBD клетки  BL21 трансформировали плазмидой pGDF11-GBD. В культуру добавляли 3 мкл 0,1 М раствора изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ) и выращивали в течение 3 часов при температуре 37°С. При сравнении спектра белков, синтезированных клетками штамма  BL21 [pGDF11-GBD] обнаруживали появление дополнительной белковой полосы. Молекулярная масса дополнительной полосы соответствовала ожидаемой для рекомбинантного белка GDF11-GBD массе в 35,9 кДа. Уровень синтеза белков в  определяли, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой соответствующего белка - стандарта молекулярной массы. Было показано, что рекомбинантный белок GDF11-GBD синтезируется в клетках  в нерастворимой форме в виде телец-включения.
Получение иммобилизованного на альфа-глюкане рекомбинантного белка (GDF11) GDF11-GBD
Для получения рекомбинантного белка клеточную культуру штамма E.coli BL21 [pGDF11-GBD] выращивали в 1000 мл среды LB с ампициллином (100 мкг/мл) при 37°C до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 550 нм. В среду добавляли 15 мкл 0,1 М раствора ИПТГ и выращивали в течение 3 часов. Клетки осаждали центрифугированием при 5500g в течение 15 минут.
Осадок ресуспендировали в фосфатном буфере с лизоцимом. Дополнительно суспензию обрабатывали ультразвуком. После центрифугирования при 6000g нерастворимый белок GDF11-GBD оставался в осадке. Осадок суспендировали в 8М мочевине, центрифугировали при 12000g 30 минут и отбирали надосадочную жидкость. Для иммобилизации рекомбинантного белка GDF11-GBD на глюкансодержащем сорбенте супернатант разводили физиологическим фосфатным буфером с нейтральным рН в четыре раза, добавляли 1/10 объема суспензии альфа-глюкана (пуллулана или гликогена или декстрана или крахмала), инкубировали при 25°C в течение 2 часов. Центрифугировали при частоте оборотов, равной 8000 об/мин, осадок ресуспендировали в фосфатном буфере; отмывку альфа-глюкана повторяли 3 раза. Иммобилизованный на альфа-глюкане антиген GDF11-GBD представлял собой суспензию сорбента с адсорбированными на нем белком. Степень чистоты препарата составляла не менее 90 %. Консервацию препарата проводили добавляя бензиловый спирт до концентрации 0,1 %.
Биологическое действие рекомбинантного белков GDF11-GBD
В предпочтительном варианте осуществления изобретения препарат содержит раствор рекомбинантного белка GDF-11-GBD в буфере с нейтральным рН, суспендированный в адъювантах: смеси раствора глюкана и водно-масляной суспензии MONTANIDE ISA 206 VG (50% на 50% по массе); MONTANIDE ISA 70 VG (30% на 70% по массе), 2, 3 или 6%-ной суспензии гидроокиси алюминия (от 5 до 30 % от общего объёма), либо в других коммерческих адъювантах, в соответствии с инструкцией производителя по их применению, и используется путем подкожных или внутримышечных инъекций препарата однократно или дважды с межинъекционным интервалом 20 - 30 суток в дозе 0,5-150 мкг рекомбинантного белка на один килограмм массы тела животного или птицы. Механизм действия препарата основан на временном блокировании активности эндогенного GDF11 с помощью аутоантител.
Эффективность применения препарата для повышения мышечной массы тела у сельскохозяйственных животных иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Влияние препарата с рекомбинантным белком GDF11-GBD на увеличение массы тела поросят
В условиях промышленного свиноводческого комплекса поросятам породы крупная белая в возрасте 90-120 суток с массой тела 20 - 25 кг был введен препарат, содержащий рекомбинантный белок GDF11-GBD, суспендированный в среде адъюванта: смеси из альфа-глюкана (50% по массе) и водно-масляной суспензии MONTANIDE ISA 206 VG (50% по массе) двукратно с интервалом 21 суток из расчета 0,10-150 мкг рекомбинантного белка на 1 кг живой массы тела животных. Препарат вводили подкожно. В каждой опытной и контрольной группе было по 10 животных. Животным контрольной группы препарат не вводился. Результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1
Удельная доза реком-бинантно-го белка, мкг/кг
Средняя масса тела животных, при первой инъекции препарата, кг
Средняя масса тела животных через 30 суток после первой инъекции препарата, кг
% привеса к контрольной группе через 30 суток
Средняя масса тела животных через 90 суток после второй инъекции препарата, кг
% привеса к контрольной группе через 90 суток
0,1
19,7
39,9
-0,3
92,9
-0,3
0,3
20,5
41,1
2,8
96,3
3,3
0,5
20,2
<b>42,2</b>
<b>5,5</b>
<b>105,7</b>
<b>13,4</b>
5,0
21,0
<b>44,3</b>
<b>10,8</b>
<b>114,3</b>
<b>22,6</b>
50
20,5
<b>46,9</b>
<b>17,3</b>
<b>120</b>
<b>28,8</b>
100
20,7
<b>47,1</b>
<b>17,8</b>
<b>119,9</b>
<b>28,6</b>
110
20,5
<b>47,3</b>
<b>18,3</b>
<b>119,8</b>
<b>28,5</b>
130
21,0
<b>47,4</b>
<b>18,5</b>
<b>120,1</b>
<b>28,9</b>
150
20,2
<b>47,3</b>
<b>18,3</b>
<b>119,9</b>
<b>28,6</b>
Контроль
21,0
40
-
93,2
-
Как видно из представленных данных, двукратное (с интервалом 21 сутки) введение препарата, содержащего рекомбинантный белок GDF11-GBD, привело к увеличению массы тела поросят через 90 суток после второй инъекции препарата при применении в дозе 0,5 мкг/кг рекомбинантного белка на 13,4% по отношению к этому показателю в контрольной группе; при применении препарата в дозе 50 мкг/кг рекомбинантного белка - на 28,8%; при применении препарата в дозе 100 мкг/кг рекомбинантного белка - на 28,6%. Таким образом, при введении препарата в дозах, лежащих в диапазоне от 0,5 до 150 мкг/кг наблюдался значимый прирост массы тела поросят относительно величины прироста в контрольной группе.
Кроме того, также было обнаружено, что даже однократное введение препарата, содержащего рекомбинантный белок GDF11-GBD, обеспечивает значительный прирост массы тела поросят.
Важно отметить, что при введении препарата в дозах, лежащих вне диапазона доз 0,5-150 мкг/кг наблюдался существенный спад прироста массы тела поросят относительно величины прироста в контрольной группе.
В таблице 2 представлены уровни аутоантител к миостатину в сыворотках поросят после иммунизации препаратом, содержащим рекомбинантный белок GDF11-GBD (метод ИФА).
Таблица 2.
Результаты определения в ИФА уровня аутоантител к GDF11 в образцах сывороток поросят иммунизированных препаратом, содержащим рекомбинантный белок GDF11-GBD
2-кратная иммунизация с 21-суточным интервалом между иммунизациями
Доза рекомбинантного белка GDF11-GBD на1кгмассы тела
№ поросенка
Результаты ИФА сывороток поросят, полученных через n недель после иммунизации, ед/мл
<i>n = 1</i>
<i>n = 3</i>
<i>n = 7</i>
0,3 мкг
1
4 000
73 000
95 000
2
4 000
76 000
93 000
3
5 000
73000
94 000
4
4 000
72 000
96 000
5
4 000
69 000
94 000
6
3 000
77000
96 000
Ср. значение
<b>4 000</b>
<b>73 333</b>
<b>94 666</b>
0,5 мкг
1
4 000
95 000
139 000
2
3 000
109 000
135 000
3
5 000
102 000
146 000
4
4 000
98 000
133 000
5
3 000
101 000
142 000
6
4 000
104 000
139 000
Ср. значение
<b>3 833</b>
<b>101 500</b>
<b>139 000</b>
5,0 мкг
1
4 000
185 000
257 000
2
3 000
207 000
304 000
3
5 000
169 000
256 000
4
4 000
178 000
267 000
5
3 000
196 000
289 000
6
4 000
201 000
273 000
Ср. значение
<b>3 833</b>
<b>189 333</b>
<b>274 333</b>
50 мкг
1
4 000
309 000
443 000
2
5 000
344 000
437 000
3
5 000
303 000
396 000
4
4 000
301 700
417 000
5
4 000
329 000
448 000
6
5000
333 000
407 000
Ср. значение
<b>4 500</b>
<b>319 950</b>
<b>424 667</b>
100 мкг
1
6 000
339 000
412 000
2
5 000
314 000
417 000
3
5 000
323 000
406 000
4
5 000
354 000
438 000
5
5 000
337 000
451 000
6
5 000
341 000
427 000
Ср. значение
<b>5 167</b>
<b>334 667</b>
<b>425 167</b>
150 мкг
1
3 000
329 000
423 000
2
5 000
327 000
414 000
3
4 000
331 000
413 000
4
5 000
348 000
429 000
5
5 000
347 000
448 000
6
4 000
339 000
437 000
Ср. значение
<b>4 333</b>
<b>336 833</b>
<b>427 333</b>
Из данных таблицы 1 и 2 следует, что оптимальной дозой препарата, содержащего рекомбинантный белок GDF11-GBD, для индукции аутоантител у животных является доза, равная 0,5-150 мг/кг массы тела животного.
Пример 2. Влияние препарата с рекомбинантным белком GDF11-GBD на увеличение массы тела быков холмогорской породы
В условиях откормочного комплекса бычкам холмогорской породы в возрасте 3-х месяцев был введен препарат, содержащий рекомбинантный белок GDF11-GBD, суспендированный в среде адъюванта: смеси из альфа-гликана (50% по массе) и водно-масляной суспензии MONTANIDE ISA 206 VG (50% по массе) двукратно с интервалом 25 сутки из расчета 0,1 - 150 мкг рекомбинантного белка на 1 кг живой массы тела животных. Препарат вводили подкожно в область нижней трети шеи. В каждой опытной и контрольной группе было по 10 животных. Животным контрольной группы препарат не вводился.
Результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3
Удельная доза рекомбинан-тного белка, мкг/кг
Средняя масса тела животных, при первой инъекции препарата, кг
Средняя масса тела животных через 30 суток после первой инъекции препарата, кг
% привеса к контроль-ной группе через 30 суток
Средняя масса тела животных через 90 суток после второй инъекции препарата, кг
% привеса к контрольной группе через 90 суток
0,1
91,8
114,1
0,8
176,4
0,1
0,3
91,1
115,9
2,4
182,5
3,6
<b>0,5</b>
<b>90,9</b>
<b>119,5</b>
<b>5,6</b>
<b>187,5</b>
<b>6,4</b>
<b>5</b>
<b>90,3</b>
<b>120,5</b>
<b>6,4</b>
<b>201,1</b>
<b>14,1</b>
<b>50</b>
<b>91,4</b>
<b>122,1</b>
<b>7,9</b>
<b>214,7</b>
<b>21,9</b>
<b>100</b>
<b>91,2</b>
<b>122,4</b>
<b>8,1</b>
<b>215,1</b>
<b>22,1</b>
<b>110</b>
<b>90,9</b>
<b>122,9</b>
<b>8,6</b>
<b>214,9</b>
<b>22,0</b>
<b>130</b>
<b>91,5</b>
<b>123,1</b>
<b>8,7</b>
<b>215</b>
<b>22,0</b>
<b>150</b>
<b>90,2</b>
<b>123,2</b>
<b>8,8</b>
<b>215,1</b>
<b>22,1</b>
Контроль
91,7
113,2
-
176,2
-
Из представленных данных видно, что двукратное (с интервалом 25 суток) введение препарата, содержащего рекомбинантный белок GDF11-GBD, привело к увеличению массы тела бычков через 90 суток после второй инъекции препарата при применении в дозе 0,5 мкг/кг рекомбинантного белка на 6,4% по отношению к этому показателю в контрольной группе; при применении препарата в дозе 5 мкг/кг рекомбинантного белка - на 14,1%; при применении препарата в дозе 50 мкг/кг рекомбинантного белка - на 10,8%, при увеличении дозы в двое до 100 или 150 мкг/кг привесы увеличиваются на 22,1%.
Таким образом, при введении препарата в дозах, лежащих в диапазоне от 0,5 до 150 мкг/кг наблюдался значимый прирост массы тела поросят относительно величины прироста в контрольной группе.
Кроме того, также было обнаружено, что даже однократное введение препарата, содержащего рекомбинантный белок GDF11-GBD, обеспечивает значительный прирост массы тела бычков.
Важно отметить, что при введении препарата в дозах, лежащих вне диапазона доз 0,5-150 мкг/кг наблюдался существенный спад прироста массы тела бычков относительно величины прироста в контрольной группе.
Пример 3. Влияние препарата с рекомбинантным белком GDF11-GBD на увеличение массы тела ягнят
Ягнятам романовской породы в возрасте 2 - 3 месяцев был введен препарат, содержащий рекомбинантный белок GDF11-GBD, суспендированный в среде адъюванта: смеси из альфа-гликана (50% по массе) и суспензии 3%-ной гидроокиси алюминия (15% по объему), двукратно с интервалом 30 суток из расчета 0,1 - 150 мкг рекомбинантного белка на 1 кг живой массы тела животных. Препарат вводили внутримышечно. В каждой опытной и контрольной группе было по 10 животных. Животным контрольной группы препарат не вводился. Результаты представлены в таблице 4.
Таблица 4
Удельная доза реком-бинантно-го белка, мкг/кг
Средняя масса тела животных, при первой инъекции препарата, кг
Средняя масса тела животных через 30 суток после первой инъекции препарата, кг
% к контрольной группе через 30 суток
Средняя масса тела животных через 90 суток после второй инъекции препарата, кг
% к контрольной группе через 90 суток
0,1
18,0
24,6
-0,8
37,1
1,1
0,3
18,2
25,1
1,2
38,2
4,1
0,5
18,1
<b>26,3</b>
<b>6,0</b>
<b>40,9</b>
<b>11,4</b>
5
17,8
<b>27,9</b>
<b>12,5</b>
<b>42,8</b>
<b>16,6</b>
50
17,9
<b>29,2</b>
<b>17,7</b>
<b>45,1</b>
<b>22,9</b>
<b>100</b>
<b>18,2</b>
<b>28,9</b>
<b>16,5</b>
<b>45,2</b>
<b>23,2</b>
<b>110</b>
<b>17,9</b>
<b>29,1</b>
<b>17,3</b>
<b>45,0</b>
<b>22,6</b>
<b>130</b>
<b>18,0</b>
<b>29</b>
<b>16,9</b>
<b>45,1</b>
<b>22,9</b>
<b>150</b>
<b>17,6</b>
<b>29,3</b>
<b>18,1</b>
<b>45,3</b>
<b>23,4</b>
Контроль
17,7
24,8
-
36,7
-
Как видно из представленных данных, двукратное (с интервалом 30 суток) введение ягнятам романовской породы препарата, содержащего рекомбинантный белок GDF11-GBD, привело к увеличению массы тела животных через 90 суток после второй инъекции препарата при применении в дозе 0,5 мкг/кг рекомбинантного белка на 11,4% по отношению к этому показателю в контрольной группе; при применении препарата в дозе 5 мкг/кг рекомбинантного белка - на 16,6%; при применении препарата в дозе 50 мкг/кг рекомбинантного белка - на 22,9%; при применении препарата в дозе 100 мкг/кг рекомбинантного белка - на 23,2%; при применении препарата в дозе 150 мкг/кг рекомбинантного белка - на 23,4%.
Кроме того, также было обнаружено, что даже однократное введение препарата, содержащего рекомбинантный белок GDF11-GBD, обеспечивает значительный прирост массы тела ягнят.
Важно отметить, что при введении препарата в дозах, лежащих вне диапазона доз 0,5-150 мкг/кг наблюдался существенный спад прироста массы тела ягнят относительно величины прироста в контрольной группе.
Пример 4. Влияние препарата с рекомбинантным белком GDF11-GBD на увеличение массы тела кроликов
Кроликам породы Белый великан в возрасте 2 - 3 месяцев был введен препарат, содержащий рекомбинантный белок GDF11-GBD, суспендированный в среде адъюванта: смеси из альфа-гликана (50% по массе) и суспензии 3%-ной гидроокиси алюминия (10% по объему), двукратно с интервалом 28 суток из расчета 0,1 - 150 мкг рекомбинантного белка на 1 кг живой массы тела животных. Препарат вводили внутримышечно. В каждой опытной и контрольной группе было по 10 животных. Животным контрольной группы препарат не вводился. Результаты представлены в таблице 5.
Таблица 5
Удельная доза реком-бинантн-ого белка, мкг/кг
Средняя масса тела животных, при первой инъекции препарата, кг
Средняя масса тела животных через 30 суток после первой инъекции препарата, кг
% к контрольной группе через 30 суток
Средняя масса тела животных через 90 суток после второй инъекции препарата, кг
% к контрольной группе через 90 суток
0,1
1,66
2,49
0,4
3,44
0,3
0,3
1,70
2,51
1,2
3,49
1,7
0,5
1,59
<b>2,56</b>
<b>3,2</b>
<b>3,63</b>
5,8
5
1,71
<b>2,74</b>
<b>10,5</b>
<b>3,79</b>
10,5
50
1,68
<b>2,83</b>
<b>14,1</b>
<b>3,95</b>
15,2
<b>100</b>
<b>1,70</b>
<b>2,84</b>
<b>14,5</b>
<b>3,95</b>
<b>15,2</b>
<b>110</b>
<b>1,72</b>
<b>2,83</b>
<b>14,1</b>
<b>3,96</b>
<b>15,5</b>
<b>130</b>
<b>1,71</b>
<b>2,84</b>
<b>14,5</b>
<b>3,95</b>
<b>15,2</b>
<b>150</b>
<b>1,65</b>
<b>2,84</b>
<b>14,5</b>
<b>3,96</b>
<b>15,5</b>
Контроль
1,67
2,48
-
3,43
-
Двукратное (с интервалом 28 суток) введение кроликам породы Белый великан препарата, содержащего рекомбинантный белок GDF11-GBD, привело к увеличению массы тела животных через 90 суток после второй инъекции препарата при применении в дозе 0,5 мкг/кг рекомбинантного белка на 5,8% по отношению к этому показателю в контрольной группе; при применении препарата в дозе 5 мкг/кг рекомбинантного белка - на 10,5%; при применении препарата в дозе 50-150 мкг/кг рекомбинантного белка - на 15,2%.
Кроме того, также было обнаружено, что даже однократное введение препарата, содержащего рекомбинантный белок GDF11-GBD, обеспечивает значительный прирост массы тела кроликов.
Важно отметить, что при введении препарата в дозах, лежащих вне диапазона доз 0,5-150 мкг/кг наблюдался существенный спад прироста массы тела кроликов относительно величины прироста в контрольной группе.
Пример 5. Влияние препарата с рекомбинантным белком GDF11-GBD на увеличение массы тела индеек
Препарат, содержащий рекомбинантный белок, был применен на индейках (самцах) породы белая широкогрудая (тяжелый кросс) в возрасте 50 - 60 суток. Препарат применяли в дозе 0,1; 0,3; 0,5; 5; 50; 100; 110; 130; 150 мкг/кг рекомбинантного белка на 1 кг живой массы тела индюков, содержащий рекомбинантный белок GDF11-GBD, суспендированный в среде адъюванта: смеси из альфа-гликана (30% по массе) и водно-масляной суспензии MONTANIDE ISA 70 VG (70% по массе), двукратно с интервалом 21 сутки. Препарат вводили внутримышечно. В каждой опытной и контрольной группе было по 10 животных. Птице контрольной группы препарат не вводился. Результаты представлены в табл. 6.
Таблица 6
Удельная доза рекомбинан-тного белка, мкг/кг
Средняя масса тела индюков при первой инъекции препарата, кг
Средняя масса тела индюков через 30 суток после первой инъекции препарата, кг
% к контрольной группе через 30 суток
Средняя масса тела индюков через 90 суток после второй инъекции препарата, кг
% к контрольной группе через 90 суток
0,1
1,66
10,09
0,1
14,58
1,7
0,3
1,70
10,45
3,7
14,97
4,4
0,5
<b>1,59</b>
<b>10,76</b>
<b>6,7</b>
<b>15,54</b>
<b>8,4</b>
5
<b>1,71</b>
<b>11,03</b>
<b>9,4</b>
<b>15,97</b>
<b>11,4</b>
50
<b>1,68</b>
<b>11,34</b>
<b>12,5</b>
<b>17,37</b>
<b>21,1</b>
100
<b>1,70</b>
<b>11,35</b>
<b>12,6</b>
<b>17,41</b>
<b>21,4</b>
110
<b>1,72</b>
<b>11,34</b>
<b>12,5</b>
<b>17,42</b>
<b>21,5</b>
130
<b>1,71</b>
<b>11,37</b>
<b>12,8</b>
<b>17,43</b>
<b>21,5</b>
150
<b>1,65</b>
<b>11,38</b>
<b>12,9</b>
<b>17,44</b>
<b>21,6</b>
Контроль
5,07
10,08
-
14,34
-
Как видно из представленных данных, двукратное (с интервалом 21 суток) введение индюкам препарата, содержащего рекомбинантный белок GDF11-GBD, суспендированный в среде адъюванта: смеси из альфа-гликана (30% по массе) и водно-масляной суспензии MONTANIDE ISA 70 VG (70% по массе), привело к увеличению массы тела животных через 90 суток после второй инъекции препарата при применении в дозе 0,5 мкг/кг рекомбинантного белка на 8,4% по отношению к этому показателю в контрольной группе; при применении препарата в дозе 5 мкг/кг рекомбинантного белка - на 11,4%; при применении препарата в дозе 50 мкг/кг рекомбинантного белка - на 21.1%; при применении препарата в дозе 150 мкг/кг рекомбинантного белка - на 21.6%.
Кроме того, также было обнаружено, что даже однократное введение препарата, содержащего рекомбинантный белок GDF11-GBD, обеспечивает значительный прирост массы тела индюков.
Важно отметить, что при введении препарата в дозах, лежащих вне диапазона доз 0,5-150 мкг/кг наблюдался существенный спад прироста массы тела индюков относительно величины прироста в контрольной группе.
Приведенные примеры осуществления изобретения не являются исчерпывающими. Возможные иные примеры осуществления, соответствующие объему патентных притязаний.
--->
Перечень последовательностей
<110>                 Limited Liability Company "SCIENTIFIC AND PRODUCTION CORPORATION IN-VET"
<120>                 Growth Differentiation Factor 11 (GDF11), Injectable Preparation for Muscle Mass Increase in Mammals and Poultry, a Method for the Production Thereof, and a Method for the Application Thereof
Последовательности аминокислот GDF11
SEQ ID NO 1
<160>
<210>      1
<211>      107
<212>     PRT
<213>     Artifical Sequence
<400>      1
Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr    1               5                  10                  15
Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala
20                  25                  30
Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Gln Cys Glu Tyr Met
35                  40                  45
Phe Met Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val Gln Gln Ala Asn Pro
50                  55                  60
Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile
65                 70                  75                  80
Asn Met Leu Tyr Phe Asn Asp Lys Gln Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile
85                  90                  95
Pro Gly Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
100                 105
Последовательность аминокислот спейсера
SEQ ID NO 2
<160>
<210>     2
<211>     15
<212>     PRT
<213>     Artifical Sequence
<400>      2
Gly Ser Pro Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala
1               5                  10                  15
Последовательность аминокислот альфа-глюкансвязывающего домена из
Streptococcus mutans
SEQ ID NO 3
<160>
<210>     3
<211>     180
<212>     PRT
<213>     Streptococcus mutans
<400>     3
Glu Leu Asn Arg Lys Asn Tyr His Tyr Gln Gln Phe Ile Thr Ala Tyr
1               5                  10                  15
Glu Asn Leu Leu Arg Asp Lys Val Glu Asn Asp Ser Ala Glu Pro Gln
20                  25                  30
Thr Phe Thr Ala Asn Gly Arg Gln Leu Ser Gln Asp Ala Leu Gly Ile
35                  40                  45
Asn Gly Asp Gln Val Trp Thr Tyr Ala Lys Lys Gly Asn Asp Phe Arg
50                  55                  60
Thr Ile Gln Leu Leu Asn Leu Met Gly Ile Thr Ser Asp Trp Lys Asn
65                 70                   75                  80
Glu Asp Gly Tyr Glu Asn Asn Lys Thr Pro Asp Glu Gln Thr Asn Leu
85                  90                  95
Leu Val Thr Tyr Pro Leu Thr Gly Val Ser Met Ala Glu Ala Asp Arg
100                 105                 110
Ile Ala Lys Gln Val Tyr Leu Thr Ser Pro Asp Asp Trp Leu Gln Ser
115                120                 125
Ser Met Ile Ser Leu Ala Thr Gln Val Lys Thr Asn Glu Asn Gly Asp
130                 135                 140
Pro Val Leu Tyr Ile Gln Val Pro Arg Leu Thr Leu Trp Asp Met Ile 145                 150                 155                 160
Tyr Ile Asn Glu Thr Ile Lys Pro Glu Thr Pro Lys Val Pro Glu Gln
165                 170                 175
Pro Gln His Pro
180
Последовательность нуклеотидов гена GDF11-GBD
SEQ ID NO 4
<160>
<210>     4
<211> 1080
<212> DNA
<213> Artifical Sequence
<400> 4
CTCGAGAAAT CATAAAAAAT TTATTTGCTT TGTGAGCGGA TAACAATTAT AATAGATTCA  60
ATTGTGAGCG GATAACAATT TCACACAGAA TTCATTAAAG AGGAGAAATT AACT        114
ATG AGA GGA TCG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GGA TCC CCG GGT TCT GGC    162
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Pro Gly Ser Gly
1               5                  10                  15
TCC GGC TCT GGT TCC GGT TCT GGC GCC AGA TCC GAA CTG AAC CGC AAA    210
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Arg Ser Glu Leu Asn Arg Lys
20                  25                  30
AAC TAT CAT TAT CAG CAG TTT ATT ACC GCG TAT GAA AAC CTG CTG CGC   258
Asn Tyr His Tyr Gln Gln Phe Ile Thr Ala Tyr Glu Asn Leu Leu Arg
35                  40                  45
GAC AAA GTG GAA AAC GAT AGC GCG GAA CCG CAG ACC TTT ACC GCG AAC   306
Asp Lys Val Glu Asn Asp Ser Ala Glu Pro Gln Thr Phe Thr Ala Asn
50                  55                  60
GGC CGC CAG CTG AGC CAG GAT GCT CTG GGC ATT AAC GGC GAT CAG GTG    354
Gly Arg Gln Leu Ser Gln Asp Ala Leu Gly Ile Asn Gly Asp Gln Val
65                 70                  75                  80
TGG ACC TAC GCT AAA AAA GGC AAC GAT TTT CGC ACC ATT CAG CTG CTG    402
Trp Thr Tyr Ala Lys Lys Gly Asn Asp Phe Arg Thr Ile Gln Leu Leu
85                  90                 95
AAC CTG ATG GGC ATT ACC AGC GAC TGG AAA AAC GAA GAT GGC TAT GAA    450
Asn Leu Met Gly Ile Thr Ser Asp Trp Lys Asn Glu Asp Gly Tyr Glu
100                 105                 110
AAC AAC AAA ACT CCA GAT GAA CAG ACC AAC CTG CTG GTG ACC TAC CCG    498
Asn Asn Lys Thr Pro Asp Glu Gln Thr Asn Leu Leu Val Thr Tyr Pro
115                 120                 125
CTG ACC GGT GTT TCT ATG GCT GAA GCT GAT CGC ATT GCG AAA CAG GTG    546
Leu Thr Gly Val Ser Met Ala Glu Ala Asp Arg Ile Ala Lys Gln Val
130                 135                 140
TAT CTG ACC AGC CCG GAT GAT TGG CTG CAG AGC AGC ATG ATT AGC CTG     594
Tyr Leu Thr Ser Pro Asp Asp Trp Leu Gln Ser Ser Met Ile Ser Leu
145                 150                 155              160
GCG ACC CAG GTG AAA ACC AAC GAA AAC GGC GAT CCG GTG CTG TAT ATT     642
Ala Thr Gln Val Lys Thr Asn Glu Asn Gly Asp Pro Val Leu Tyr Ile
165                 170                 175
CAG GTG CCG CGC CTG ACC CTG TGG GAT ATG ATT TAT ATT AAC GAA ACC     690
Gln Val Pro Arg Leu Thr Leu Trp Asp Met Ile Tyr Ile Asn Glu Thr
180                 185                 190
ATT AAA CCG GAA ACC CCG AAA GTG CCG GAA CAG CCG CAG CAT CCG AGA     738
Ile Lys Pro Glu Thr Pro Lys Val Pro Glu Gln Pro Gln His Pro Arg
195                 200                 205
TCC GGC TCT GGT TCT GGT CTG GAC TGC GAC GAA CAC TCT ACC GAA TCT     786
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser
210                 215                 220
CGT TGC TGC CGT TAC CCG CTG ACC GTT GAC TTC GAA GCG TTC GGT TGG     834
Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp
225                 230                 235                 240
GAC TGG ATC ATC GCT CCG AAA CGT TAC AAA GCT AAC TAC TGC TCT GGA     882
Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly
245                 250                 255
CAG TGC GAA TAC ATG TTC ATG CAG AAA TAC CCG CAC ACC CAC CTG GTT      930
Gln Cys Glu Tyr Met Phe Met Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val
260                 265                 270
CAG CAG GCT AAC CCG CGT GGT TCT GCT GGT CCG TGC TGC ACC CCG ACC      978
Gln Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr
275                 280                 285
AAA ATG TCT CCG ATC AAC ATG CTG TAC TTC AAC GAC AAA CAG CAG ATC      1026
Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Asp Lys Gln Gln Ile
290                 295                 300
ATC TAC GGT AAA ATC CCG GGT ATG GTT GTT GAC CGC TGC GGT TGC TCT      1074
Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Gly Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
305                 310                 315                 320
TAA  CCG                                                             1080
<210>     5<211>     320<212>     PRT
<213>     Artifical Sequence
<400>     5
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Pro Gly Ser Gly
1               5                  10                  15
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Arg Ser Glu Leu Asn Arg Lys
20                  25                  30
Asn Tyr His Tyr Gln Gln Phe Ile Thr Ala Tyr Glu Asn Leu Leu Arg
35                  40                  45
Asp Lys Val Glu Asn Asp Ser Ala Glu Pro Gln Thr Phe Thr Ala Asn
50                  55                  60
Gly Arg Gln Leu Ser Gln Asp Ala Leu Gly Ile Asn Gly Asp Gln Val
65                 70                  75                  80
Trp Thr Tyr Ala Lys Lys Gly Asn Asp Phe Arg Thr Ile Gln Leu Leu
85                  90                 95
Asn Leu Met Gly Ile Thr Ser Asp Trp Lys Asn Glu Asp Gly Tyr Glu
100                 105                 110
Asn Asn Lys Thr Pro Asp Glu Gln Thr Asn Leu Leu Val Thr Tyr Pro
115                 120                 125
Leu Thr Gly Val Ser Met Ala Glu Ala Asp Arg Ile Ala Lys Gln Val
130                 135                 140
Tyr Leu Thr Ser Pro Asp Asp Trp Leu Gln Ser Ser Met Ile Ser Leu
145                 150                 155              160
Ala Thr Gln Val Lys Thr Asn Glu Asn Gly Asp Pro Val Leu Tyr Ile
165                 170                 175
Gln Val Pro Arg Leu Thr Leu Trp Asp Met Ile Tyr Ile Asn Glu Thr
180                 185                 190
Ile Lys Pro Glu Thr Pro Lys Val Pro Glu Gln Pro Gln His Pro Arg
195                 200                 205
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser
210                 215                 220
Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp
225                 230                 235                 240
Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly
245                 250                 255
Gln Cys Glu Tyr Met Phe Met Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val
260                 265                 270
Gln Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr
275                 280                 285
Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Asp Lys Gln Gln Ile
290                 295                 300
Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Gly Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser
305                 310                 315                 320
<---