Комплексный аллерген для диагностики паратуберкулеза
COMPLEX ALLERGEN FOR DIAGNOSING PARATUBERCULOSIS

Изобретение относится к области диагностики микобактериальных инфекций, а именно к аллергической диагностике паратуберкулеза животных, и может быть использовано при проведении оздоровительных мероприятий в неблагополучных по паратуберкулезу хозяйствах, а также при установлении диагноза в благополучных хозяйствах.
Паратуберкулез - хроническая инфекционная болезнь, в основном жвачных животных, чаще всего протекающая латентно, характеризующаяся поражением кишечника и мезентериальных лимфатических узлов и как следствие - сопровождающаяся расстройством работы желудочно-кишечного тракта (диареей), потерей продуктивности, прогрессирующим истощением -вплоть до летального исхода.
Паратуберкулез крупного рогатого скота впервые был описан A. Johne, L. Frothingham в 1895 году, как особая форма туберкулеза кишечника, вызываемая ослабленным возбудителем туберкулеза бычьего или птичьего видов.
В 1902 году Мс. Fadylan назвал эту болезнь в честь первого автора - болезнью Йоне.
В. Bang (1906) после того, как не смог выделить возбудителя болезни и заразить морских свинок и кроликов патологическим материалом от больной коровы, назвал болезнь - хронический псевдотуберкулезный энтерит.
В 1912 году T.W. Twort, Y.Z. Ingram выделили возбудителя из подвздошной кишки больной коровы и назвали его Mycobacterium enteridis chronicae bovis. В дальнейшем - возбудитель заболевания был квалифицирован как Mycobacterium paratuberculosis, а болезнь названа паратуберкулезом. После исследований с применением молекулярно-генетических методов было доказано, что гены M. avium и M. paratuberculosis на 99% гомологичны. Впоследствии, по предложению M.F. Thorel et al. (1990), возбудитель паратуберкулеза стали считать подвидом микобактерий птичьего вида - Micobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP).
В настоящее время паратуберкулез остается одной из недостаточно изученных, сложно контролируемых инфекций. Инкубационный период длится от 6 месяцев до 15 лет, возможны случаи самоизлечения, т.е. клиническая картина может не проявиться в течение всей жизни животного. При этом латентно больные животные могут стать носителями микобактерий, и периодически выделяя возбудителя во внешнюю среду, создавать условия для распространения паратуберкулеза в стаде.
Некоторые авторы сравнивают проблему паратуберкулеза с «верхушкой айсберга» (айсберг-эффект), когда на один клинический случай приходятся десятки случаев инфицированных животных в латентной форме [Н.П. Овдиенко и соавт., 2007; А.И. Завгородный и соавт. 2010; А.Х. Найманов и соавт., 2012, 2014, 2020].
Микобактерий паратуберкулеза «вездесущи» в окружающей внешней среде, их обнаруживают в кишечнике, фекалиях, молоке, крови крупного рогатого скота. Тем не менее выявить MAP у животных и во внешней среде достаточно сложно, так как они не могут быть идентифицированы при бактериоскопии, а только молекулярно-генетическими методами [А. Wiczniewska et. al., 2002; R. Greenstein, 2003; В.И. Литвинов и соавт., 2008].
При паратуберкулезе нет высокоэффективных методов диагностики, лечения и вакцинопрофилактики. Большим препятствием в разработке эффективных методов диагностики является отсутствие биологической модели для воспроизведения болезни. Многочисленные попытки воспроизвести паратуберкулез у мелких животных не увенчались успехом. Тем не менее, в доступной литературе имеется сообщение Завгороднего А.И. и соавт. (2014), что крольчата 1 мес.возраста являются наиболее восприимчивыми к возбудителю паратуберкулеза, по сравнению с мышами и морскими свинками.
По мнению многих исследователей ни один из существующих методов диагностики паратуберкулеза не обладает 100% эффективностью, поэтому рекомендуется применять комплексный подход к диагностике паратуберкулеза крупного рогатого скота [J. Larson, 2002].
В соответствии с «Кодексом здоровья наземных животных МЭБ» в редакции 2019 года при паратуберкулезе нет рекомендуемых тестов, а в качестве альтернативных тестов предлагается внутрикожная туберкулиновая проба и иммуноферментный анализ.
В «скрытости» инфекции, низкой чувствительности и специфичности методов диагностики, сложности выделения, культивирования и идентификации возбудителя в отсутствии возможности воспроизведения болезни на лабораторных животных - заключаются основные сложности в установлении диагноза на паратуберкулез.
Важно отметить, что в последние годы ведутся острые дискуссии о роли возбудителя паратуберкулеза в болезни Крона у человека, проявляющегося поражением желудочно-кишечного тракта, рвотой и диареей. Так, одни авторы считают M.avium sups. Paratuberculosis причиной болезни Крона у человека. Другие авторы не находят очевидных доказательств и связи между возбудителем паратуберкулеза и болезнью Крона.
Единого мнения о наличии связи между болезнью Крона у человека и паратуберкулеза животных не было достигнуто Европейской комиссией здравоохранения и Научным комитетом по охране здоровья животных (2000 г.), на 10 международном симпозиуме по паратуберкулезу в США (2009 г.) [Thorel et al., 1990; В.И. Литвинов и соавт., 2008; А.И. Завгорордний и соавт., 2010; А.Х. Найманов и соавт., 2014, 2020].
В настоящее время паратуберкулез крупного рогатого скота регистрируют во многих странах мира. По данным ООН, болезнь признана серьезной проблемой современности со значительными экономическими последствиями. Экономический ущерб слагается из снижения продукции животноводства, потери молочной продуктивности, истощения, бесплодия, выбраковки или гибели больных животных.
Паратуберкулез был и остается менее изученной инфекцией, чем другие хронические болезни. До настоящего времени нет единого мнения о диагностической ценности туберкулина для птиц и ионина (паратуберкулина), применяемых в ветеринарной практике. Своевременная диагностика является непременным условием эффективности комплекса профилактических и оздоровительных мероприятий. Основной проблемой аллергической диагностики паратуберкулеза крупного рогатого скота является выявление реагирующих на ионин и туберкулин для птиц животных, сенсибилизированных различными видами микобактерий.
В соответствии «Наставления по диагностике паратуберкулеза животных», утвержденного Департаментом ветеринарии МСХ РФ 05.04.2001 г., исследования на паратуберкулез в благополучных хозяйствах проводят при обнаружении животных, вызывающих подозрение на заболевание, а в неблагополучных хозяйствах - для выявления больных животных. Диагноз на паратуберкулез устанавливают на основании результатов клинического осмотра животных, аллергического, серологического, бактериоскопического, патологоанатомического и гистологического методов исследования с учетом эпизоотологических данных.
В неблагополучных хозяйствах считают больным крупный рогатый скот:
- с выраженными клиническими признаками болезни;
- при слабо выраженных клинических признаках болезни и одновременно положительном результате серологического и бактериоскопического исследования;
- при отсутствии клинических признаков, но совпадающих положительных результатах аллергического и серологического исследований.
В нашей стране аллергические исследования животных на паратуберкулез проводят внутрикожной пробой с ППД-туберкулином для птиц. Учет и оценку реакции проводят через 72 часа после введения аллергена. Реагирующими считают животных с увеличением толщины кожной складки на 6 мм и более.
Уровень техники.
Известны следующие аналоги:
- ППД-туберкулин для птиц - аллерген для диагностики туберкулеза птиц, используется для аллергической диагностики паратуберкулеза и для дифференциации неспецифических реакций на туберкулин у крупного рогатого скота и свиней в симультанной пробе. Производится Курской биофабрикой из М. Avium штамм №22-82 [Наставление по диагностике туберкулеза животных, 1986; 2002].
- ППД-туберкулин для млекопитающих - аллерген для диагностики туберкулеза у животных. Производится Курской биофабрикой из М. bovis шт. AN-5 [Наставление по диагностике туберкулеза животных, 1986; 2002].
Наиболее близким аналогом для, заявляемого, комплексного аллергена для диагностики паратуберкулеза («Параавиум») является комплексный аллерген из атипичных микобактерий (КАМ). (Прототип)
- КАМ - комплексный аллерген из атипичных микобактерий, используется при диагностике туберкулеза для дифференциации неспецифических реакций. Производится Курской биофабрикой из атипичных микобактерий 2 и 3 группы по классификации Раньона (М. scrofblaceum - 2 гр., М. intracellulare - 3 гр.) [А.Н. Шаров, Е.С. Плотников, 1980; А.Н. Шаров, 1989; Наставление по диагностике туберкулеза животных, 1986, 2002].
В ВИЭВ был разработан способ выделения активных протеинов из бактериальной массы микобактерий [А.Г. Малахов, Г.И. Устинова, З.С. Газарх. Способ получения протеинов для изготовления диагностических биопрепаратов. Авторское свидетельство №364321, 1972 г.]. Используя этот метод, были изготовлены и изучены четыре серии ионина из бактериальной массы М. paratuberculosis.
Биологическую активность ионинов испытывали в сравнении с ППД-туберкулинами для птиц на сенсибилизированных морских свинках и телятах, на крупном рогатом скоте неблагополучных по паратуберкулезу хозяйств. Результаты исследований не показали преимущества ионина перед ППД-туберкулинами для птиц при диагностике паратуберкулеза крупного рогатого скота. Поэтому дальнейшие исследования были направлены на изучение ППД-туберкулинов для птиц при диагностике паратуберкулеза крупного рогатого скота.
Работу провели на 48 экспериментально сенсибилизированных телятах, на 402 коровах благополучных хозяйств, на 5423 коровах хозяйств, где установлена сенсибилизация животных атипичными микобактериями, на 2961 корове шести неблагополучных по паратуберкулезу хозяйств.
Все экспериментально зараженные различными видами микобактерий телята реагировали на внутрикожное введение ППД для птиц. У телят, сенсибилизированных М. avium и М. intracellularae, аллергические реакции на туберкулин проявлялись интенсивнее, чем у животных, сенсибилизированных другими видами микобактерий.
В благополучных по паратуберкулезу хозяйствах на первое введение ППД-туберкулина для птиц реагировало 2,0-5,0%, на второе введение - 6,0-11,0% животных.
В хозяйствах, где установлена сенсибилизация животных атипичными микобактериями, на ППД-туберкулин для птиц реагировало 9,6-14,3% животных. При сравнительном изучении ППД-туберкулина для птиц и его французского аналога «Авитубер», на «Авитубер» выявлено на 7,7% больше реагирующих коров.
Полученные результаты исследований показали, что при применении всех ППД-туберкулинов для птиц из-за близкого антигенного родства выявляются реагирующие животные, сенсибилизированные атипичными микобактериями.
На основании проведенных исследований сделано заключение, что ионины, изготовленные из М. paratuberculosis, по чувствительности и специфичности равноценны с ППД-туберкулином для птиц.
В последние годы в связи с ввозом в нашу страну значительного количества сельскохозяйственных животных из разных стран мира (в том числе и неблагополучных по паратуберкулезу) вполне возможен ввоз латентно больных животных. Поэтому повышается актуальность совершенствования аллергенов и проведения аллергических исследований при паратуберкулезе животных.
Технической проблемой является необходимость создания комплексного аллергена для эффективной аллергической диагностики, расширения арсенала средств для прижизненной диагностики паратуберкулеза животных.
Раскрытие сущности изобретения.
Техническим результатом изобретения является повышение эффективности аллергической внутрикожной тубрекулиновой пробы у зараженных паратуберкулезом животных, расширения арсенала средств для прижизненной диагностики паратуберкулеза животных.
Повышение эффективности туберкулиновой пробы достигается добавлением в туберкулин для птиц (M.avium №22-82) микобактерий паратуберкулеза (M.avium supspecies paratuberculosis №19698 АТСС), расширяющих антигенный спектр и повышающий чувствительность и специфичность внутрикожной туберкулиновой пробы при аллергической диагностики диагностики паратуберкулеза.
Способ изготовления комплексного аллергена для диагностики паратуберкулеза
Данный комплексный аллерген мы назвали «Параавиум»,
Для приготовления комплексного аллергена для диагностики паратуберкулеза используется туберкулиногенный штамм микобактерий птичьего вида М. Avium №22-82 и штам микобактирий паратуберкулеза М. avium sups, paratuberculosis №19698 АТСС. Каждый из штаммов культивируют на глицериново картофельной среде в пробирках Ру с периодичностью пересевов два - три месяца. Культивирование микобактерий птичьего вида на глицериново картофельной среде проводится при температуре 39-40°С в течение 10-20 суток.
Для получения комплексного аллергена для диагностики паратуберкулеза проводят последовательную адаптацию микобактерий птичьего вида к синтетической питательной среде, следующего состава:
1. Аспарагин - 5,0 гр.
2. Аммоний лимоннокислый двузамещенный - 2,0 гр.
3. Калий фосфорнокислый двузамещенный - 5,0 гр.
4. Магний сернокислый - 0,5 гр.
5. Железо сернокислое закисное - 0,05 гр.
6. Глицерин - 50 мл.
7. Лимонная кислота - 4,0 гр.
8. Цинк сернокислый - 0,1 гр.
9. Дистиллированная вода до 1000 мл.
Адаптированную к питательной среде культуру микобактерий птичьего вида выращивают при температуре 39-40°С в течение 50-55 суток на биобутылях. Для приготовления аллергена используют посевы с характерным типичным ростом, которые стерилизуют при температуре 120°С в течение 30 минут. После этого посевы охлажденные до температуры 18-20°С фильтруют через фильтр-полотно, получая таким образом культуральный фильтрат. Культуральный фильтрат обрабатывают 50% раствором трихлоруксусной кислоты, перемешивают на мешалке в течение 5-10 минут, после чего отстаивают в течение 16-18 часов при 4-6°С. Удаляют надосадочную жидкость, осадок центрифугируют при 2500-3000 об/мин. в течение 20-25 минут, с последующим удалением надосадочной жидкости. Осадок туберкулопротеина растворяют дистиллированной водой из расчета 1:5 и подщелачивают 10% раствором нашатырного спирта до рН 7,2-7,4. Раствор туберкулопротеина подкисляют 10% раствором уксусной кислоты до рН 4,0-5,0 и смешивают с равным количеством насыщенного раствора сернокислого аммония, перемешивают три раза с интервалом 10-15 минут, отстаивают 16-18 часов при 4-6°С. Центрифугируют при 3000 об/мин. в течение 20-30 минут, надосадок удаляют, а осадок растворяют в дистиллированной воде в соотношении 1:5, подщелачивают 10% раствором нашатырного спирта до рН 7,4-7,6. Диализуют в проточной водопроводной воде в течение 4 суток, после этого подщелачивают до рН 7,2-7,4 10% раствором аммиака, центрифугируют при 3000 об/мин. в течение 30 минут и фильтруют через стерилизующий фильтр. В полученном растворе определяют концентрацию белка и приготавливают разведение туберкулопротеина на растворителе микобактериальных аллергенов из расчета содержания 1 мг белка в 2 мл. раствора.
Определяют содержание Международных единиц в растворе аллергена для по Международному (или региональному эквивалентному) стандарту ППД для птиц, на морских свинках сенсибилизированных микобактериями птичьего вида (номинальная биологическая активность должна соответствовать 25000 МЕ/мл).
«Параавиум», в состав которого включены М. avim №22-82 и М. avium sups, paratuberculosis №19698 АТСС в равных объемах (50:50) в эквивалентной активности с суммарным содержанием белка - 1 мг белка в 2 мл растворителя, то есть при изготовлении комплексного аллергена Параавиум были использованы М. Avim №22-82 и М. avium sups, paratuberculosis №19698 АТСС в эквивалентной активности с суммарным содержанием белка: 1 мг белка в 2 мл. раствора.
Учитывая высокую степень гомологии микобактерий паратуберкулеза и микобактерий птичьего вида, активность паратуберкулина была определена в отношении регионального эквивалента стандарта активности ГШД для птиц (номинальная биологическая активность должна соответствовать 25000 МЕ/мл).
Осуществление изобретения
Пример 1. Исследование сенсибилизированных различными видами микобактерий морских свинок.
3
В лаборатории хронических инфекций были выращены на среде Левенштейна-Йенсена 5 культур микобактерий: М. bovis, М. avium, М. fbrtuitum, М. scrofulaceum, М. paratuberculosis, в течение 35 суток, при температуре 37°С. По истечении указанного времени с поверхности питательной среды культуры микобактерий в количестве по 5 мг из расчета на одну морскую свинку поместили в отдельные стерильные пластиковые пробирки. В пробирки внесли адъювант (15 частей ланолина и 85 частей вазелинового масла) из расчета 0,5 см адъюванта на 5 мг микобактерий. Полученные варианты культур микобактерий и адъюванта гомогенизировали и инъецировали подкожно в два места (область холки и крестца) морским свинкам, массой 300-350 гр. Через 30 суток после введения микобактерий в составе адъюванта морским свинкам на боковых поверхностях справа и слева депелировали шерсть размером 90×40 мм. и внутрикожно инъецировали справа 5 ME ППД для млекопитающих, а слева 5 ME ППД для птиц и 5 ЕД комплексного аллергена параавиум. Результаты исследования через 24 часа после введения аллергенов указаны в таблице 1.
Из данных таблицы видно, что в первой группе морских свинок, которые были сенсибилизированы М. avium, максимальная интенсивность кожной реакции ГЗТ у всех животных выявлена на ППД-туберкулин для птиц у всех животных, что свидетельствует о большей сенсибилизации М. avium. Во второй группе морских свинок, которым инъецировали М. bovis, максимальная интенсивность кожной реакции ГЗТ у всех животных выявлена на ППД-туберкулин для млекопитающих, что свидетельствует о большей сенсибилизации М. bovis.
В третьей группе морских свинок, которым инъецировали М. paratuberculosis, максимальная интенсивность кожной реакции ГЗТ у всех животных выявлена на комплексный аллерген Параавиум, что свидетельствует о большей сенсибилизации М. paratuberculosis.
В четвертой и пятой группах морских свинок, которым подкожно вводили атипичные микобактерий М. scrofulaceum и М. fbrtuitum, максимальная интенсивность кожной реакции ГЗТ не выявлена ни на один аллерген, что свидетельствует о гетерологичности используемых аллергенов в отношении исследуемых культур микобактерий.
Представленные данные таблицы доказывают, что группа морских свинок, сенсибилизированная М. paratuberculosis, реагировала на комплексный аллерген Параавиум реакцией 15-18 мм (в среднем 16,8 мм), на ППД для птиц 8-11 мм (в среднем 9,5 мм), на ППД для млекопитающих 7-9,5 мм (в среднем 8,1 мм), то есть Параавиум обладает большей специфичностью, чем ППД туберкулин для птиц при исследовании сенсибилизированных М. paratuberculosis морских свинок.
Пример 2. Исследования крупного рогатого скота из неблагополучного по паратуберкулезу хозяйства.
Исследования неблагополучного поголовья крупного рогатого скота проводили в СПК «Нива» Юкаменского района Удмуртской республики.
На одной ферме этого неблагополучного по паратуберкулезу хозяйства были временно изолированы 51 корова, давшие раннее неоднократно положительные реакции по РСК. В соответствии Наставления по диагностике паратуберкулеза животных от 2021 года от этих коров были взяты пробы крови для повторных серологических исследований методом РСК. Также их исследовали аллергической внутрикожной пробой с ППД-туберкулином для птиц и Параавиумом. Проведен диагностический убой реагирующих коров.
При патологоанатомическом осмотре убитых животных установили:
1. Корова №2911: РСК - 3 раза положительная проба в течение 2020-2021 гг., аллергическая проба - отрицательная, при патологоанатомическом осмотре характерных для паратуберкулеза изменений не обнаружено.
2. Корова №341: РСК - положительная 16.04.2021 г., аллергическая проба - отрицательная, характерных патизменений не обнаружено.
3. Корова №2614: РСК - 3 раза положительная проба в течение 2020-2021 гг.Реакция на ППД для птиц - 6 мм, на Параавиум - 6 мм. При патологоанатомическом осмотре характерные для паратуберкулеза изменения в подвздошной кишке.
4. Корова №2552: РСК - 3 раза положительная проба в течение 2020-2021 гг., реакция на аллергены - отрицательная, характерные для паратуберкулеза патизменения не обнаружены.
5. Корова №696: РСК - 2 раза положительная проба в течение 2020-2021 гг., реакция на аллергены - отрицательная, характерных для паратуберкулеза изменений не обнаружено.
6. Корова №2737: РСК - 2 раза положительная проба в течение 2020-2021 гг., отрицательная реакция на аллергены, характерных для паратуберкулеза изменений не обнаружено.
7. Корова №84: РСК - 4 раза положительная проба в течение 2020-2021 гг., отрицательная реакция на аллергены, характерных для паратуберкулеза патизменений не обнаружено.
8. Корова №2093: РСК - 4 раза положительная проба в течение 2020-2021 гг., 25.01.2020 г. реакция на ППД для птиц - 8 мм, на Параавиум - 9 мм, 20.04.2020 г. реакция на ППД для птиц - 6 мм, на Параавиум - 6 мм. При патологоанатомическом осмотре обнаружены характерные для паратуберкулеза изменения в подвздошной кишке и илеоцекальном клапане.
Анализ проведенных серологических, аллергических и патологоанатомических исследований показывает, что из 51 положительно реагировавших на серологические исследования методом РСК коровы только в двух (3,9%) случаях получен положительный результат на внутрикожную пробу с ППД-туберкулином для птиц и Параавиумом. Тем не менее, при диагностическом убое и патологоанатомическом осмотре 8 убитых коров, неоднократно положительно реагировавших на серологические исследования, характерные для паратуберкулеза изменения обнаружены только у двух коров - №2911 и №2093, реагировавших на 6 мм и более на внутрикожную пробу с ППД-туберкулином для птиц и Параавиум.
В данном случае подтверждается ценность аллергических исследований в сравнении с серологическими исследованиями. Тем более что проводить аллергические исследования гораздо легче, быстрее, показательнее и более доступнее для практических ветеринарных специалистов.