ЛЕЧЕНИЕ ПИЩЕВОДА БАРРЕТТА
BARRETT'S OESOPHAGUS THERAPY

Изобретение относится к области биохимии и медицины. Конкретнее, изобретение относится к лечению изменений эпителия в пищеводе. Еще конкретнее, изобретение относится к лечению пищевода Барретта.
Пищевод Барретта представляет собой заболевание человека, при котором эпителиальная выстилка пищевода изменяется от своей нормальной плоской формы в эпителий, который напоминает эпителий, обнаруживаемый в кишечнике. Пищевод Барретта представляет собой предраковое состояние, которое преимущественно поражает белых мужчин в возрасте старше 50 лет, хотя у других людей также может быть это заболевание.
Изменения эпителия возникают в результате хронической регургитации (рефлюкса) кислотного содержимого желудка назад в пищевод. В состав содержимого желудка входят пищеварительные ферменты и кислота, которые повреждают плоский эпителий пищевода. В процессе заживления аномальные клетки снова разрастаются для восстановления поражений. Этот патогистологический феномен называется «метаплазией». Клетки, которые напоминают кишечный эпителий, замещают нормальные клетки плоского типа, которые выстилают пищевод, феномен, называемый кишечной метаплазией. Это происходит примерно у 10-15% людей, у которых имеется длительный желудочный рефлюкс.
Метапластический эпителий может напоминать кишечный эпителий, но не является нормальным, потому что он локализуется в неправильном анатомическом участке для того, чтобы считаться кишечным эпителием. Более того, метапластический эпителий имеет высокую тенденцию к превращению в злокачественный. У пациентов с пищеводом Барретта риск развития рака пищевода в 30-125 раз выше, чем у общей популяции.
Рак при пищеводе Барретта развивается через последовательность изменений, от не диспластического (метапластического) цилиндрического эпителия, через дисплазию низкой степени и затем высокой степени и, наконец, до инвазивного рака.
Диагностика болезни Барретта обычно выполняется следующим образом. Индивидуумов, у которых в течение нескольких лет имелись симптомы рефлюкса (обычно изжога), подвергают верхней эндоскопии для определения наличия пищевода Барретта, и для оценки предзлокачественных признаков. Это позволяет оценить наличие воспаления (эзофагита) и пищевода Барретта. Диагностику пищевода Барретта проводят тканевой биопсией и последующим гистологическим анализом. Эндоскописты могут использовать специальные нетоксичные красители, такие как метиленовый синий, для идентификации областей с аномальными предраковыми изменениями (дисплазией). Эта методика называется «хромоэндоскопией».
При отсутствии дисплазии пациенты находятся под наблюдением и проводится лечение кислотного рефлюкса. При наличии дисплазии обычно используется более агрессивная стратегия, которая включает разрушение диспластических поражений хирургическим способом, термической, химической или механической эндоскопическими методиками. Не существуют специфические лекарственные средства, которые могут искоренить метапластический или диспластический эпителий, в то же время оставляя нетронутым плоский эпителий.
Примеры современного лечения включают хирургическое лечение дисплазии высокой степени, эндоскопическое деструкционное лечение для удаления ткани с дисплазией высокой степени в пищеводе, химическую деструкцию посредством фотодинамического лечения по поводу дисплазии, термическую деструкцию, механическую деструкцию или комбинированное лечение.
Siersema et al. описывают лечение химиотерапией ифосфамидом для излечения карциномы Барретта. Лечение ифосфамидом получили всего 25 пациентов. У одного пациента была излечена метастатическая аденокарцинома при пищеводе Барретта, и у одного пациента наблюдалась частичная реакция на лечение. Следовательно, лечение ифосфамидом считается по существу неэффективным. Кроме того, лечение ифосфамидом в целом считается связанным с высокой токсичностью.
В документе WO 2005/012275 заявлен способ лечения и профилактики пищевода Барретта, включающий введение нуждающемуся в таком лечении или профилактике млекопитающему эффективной дозы соединения формулы (I). Соединения, определяемые указанной формулой (I), считаются модуляторами ССК2 (холецистокинина).
В документе WO 2005/079778 заявлено применение антагониста ретиноевой кислоты при изготовлении лекарственного препарата для лечения или профилактики пищевода Барретта. В заявке, кроме того, описываются производные диазепинилбензойной кислоты в качестве антагонистов ретиноидного рецептора Х. По определению, антагонист ретиноевой кислоты («витамина А») представляет собой соединение, которое может взаимодействовать с рецептором ретиноевой кислоты или метаболизмом ретиноевой кислоты или блокировать их. По определению, производное диазепина представляет собой соединение, которое содержит структурный каркас диазепина. К этому каркасу может быть присоединено широкое разнообразие боковых цепей/модификаций, которые определяют виды его химической и биологической активности. Так, каждое отдельное соединение из группы диазепина может иметь уникальную биологическую активность. Нет данных о том, что определенные производные диазепина, которые, как известно, блокируют гамма-секретазу, оказывают эффект на ретиноевую кислоту.
Buttar et al. описывают химиопрофилактику аденокарциномы пищевода ингибиторами СОХ-2 на экспериментальной модели пищевода Барретта. Сделан вывод о том, что селективные и не селективные ингибиторы СОХ-2 могут ингибировать воспаление, активность СОХ-2 и развитие аденокарциномы, вызванной рефлюксом.
Как уже указано выше, в настоящее время нет специфических лекарственных препаратов, которые могут устранить метапластический или диспластический эпителий при пищеводе Барретта.
Настоящее изобретение разрешает эту проблему введением лекарственного препарата, который способен, по меньшей мере, частично удалить метапластический или диспластический эпителий при пищеводе Барретта. Предпочтительно, указанный лекарственный препарат не оказывает (видимого) отрицательного эффекта на (подлежащий) плоский эпителий.
В первом варианте осуществления изобретение предоставляет способ, по меньшей мере, частичного уменьшения имеющихся у животного патологических признаков пищевода Барретта, включающий, по меньшей мере, частичное ингибирование активации пути Notch передачи сигналов у указанного животного.
Путь Notch передачи сигналов контролирует решения пространственного структурирования и участи клеток во всем животном мире (Artavanis-Tsakonas et al. 1999). Гены Notch кодируют крупные, одиночные трансмембранные рецепторы. Взаимодействие между Notch рецепторами и лигандами приводит к протеолитическим расщеплениям рецептора. Полученный свободный Notch внутриклеточный домен (NCID) транслоцируется в ядро, где он связывается с транскрипционным фактором RBP-Jk (CSL или CBF1), таким образом, активируя транскрипцию гена-мишени (Baron 2003, Mumm & Kopan 2000). Лучше всего охарактеризованные Notch гены-мишени представляют собой транскрипционные рецепторы ворсинчатости/усилителя расщепления (HES). Белки HES, в свою очередь, подавляют экспрессию генов ниже по ходу транскрипции (Heitzler et al. 1996, Oellers et al. 1994).
Хотя компоненты пути Notch передачи сигналов экспрессированы в кишечнике мышей (Schroder & Gossler, 2002), в настоящее время нет генетического доказательства участия этих компонентов в контроле участи эпителиальных клеток. Известно, что животные с недостаточностью HES-1, которые, как известно, представляют ген-мишень Notch в других тканях, проявляют относительное увеличение количества секретирующих слизь и энтероэндокринных клеток за счет адсорбционных клеток (Jensen et al. 2000). Предполагаемая, находящаяся ниже по ходу транскрипции мишень подавления HES-1 в кишечнике, Math-1 (Jensen et al. 2000) (Zheng et al. 2000) требуется для коммитирования в направлении секреторной линии дифференцировки, как выявлено выключением гена (Yang et al. 2001). Эти результаты были интерпретированы для указания на то, что путь Notch передачи сигналов искажает участь дифференцирующихся клеток крипт, покидающих проходной амплифицирующий компартмент в направлении энтероцитарного фенотипа. В этой схеме путь Notch передачи сигналов активирует гены транскрипционного фактора, такие как HES1, которые, в свою очередь, подавляют гены, подобные Math1, увлекающие дифференцирующиеся клетки в сторону от секреторной линии дифференциации.
Косвенное подтверждение регуляции участи кишечных клеток Notch исходит из использования ингибиторов гамма-секретазы, как было первоначально разработано по поводу болезни Альцгеймера. Notch представляет собой один из нескольких известных субстратов γ-секретазы. Протеолитическая переработка Notch γ-секретазой представляет собой существенный этап после активации пути. Как следствие, один из эффектов ингибиторов γ-секретазы представляет собой отмену активации пути Notch (De Strooper et al. 1999, Kopan & Goate, 2000). Токсикологические исследования на грызунах с использованием этих ингибиторов выявили увеличение размера и количества секретирующих слизь бокаловидных клеток (Searfoss et al. 2003; Wong et al. 2004; Milano et al. 2004). Благодаря этим видам исследований, была прекращена дальнейшая клиническая разработка множества перспективных ингибиторов γ-секретазы для лечения болезни Альцгеймера, потому что имелись веские подозрения того, что они вызывают кишечные аномалии.
Изобретение раскрывает удивительные данные о том, что ингибиторы активации пути Notch (например, ингибиторы γ-секретазы) исключительно полезны при лечении пищевода Барретта. Лечение пищевода Барретта ингибиторами активации пути Notch приводит (по меньшей мере, частично) к удалению метапластического или диспластического эпителия из пищевода.
Активация пути Notch обычно происходит наряду со следующими явлениями. Notch представляет собой трансмембранный поверхностный рецептор, который может активироваться посредством множественных протеолитических расщеплений, причем одно из них представляет собой расщепление комплексом белков с протеазной активностью, называемым γ-секретазой. Гамма (γ)-секретаза представляет собой протеазу, которая осуществляет свою активность расщепления внутри мембраны. Гамма (γ)-секретаза представляет собой многокомпонентный фермент и составлен, по меньшей мере, из четырех различных белков, а именно, пресенилинов (пресенилина 1 или 2), никастрина, PEN-2 и APH-1. Пресенилин представляет собой каталитический центр γ-секретазы. После связывания лиганда рецептор Notch подвергается конфармационному изменению, которое обеспечивает возможность сброса эктодомена посредством действия комплекса ADAM (дезинтегрин А и металлопротеаза) протеазы, которая представляет собой металлопротеазу. За этим немедленно следует действие комплекса γ-секретазы, которое приводит к высвобождению внутриклеточного домена Notch (NCID). NCID транслоцируется в ядро, где он взаимодействует с CSL (Фактор, связывающий С-промотер/белок Jk, связывающий рекомбинантную сигнальную последовательность/Супрессор признака отсутствия волос/Lag1). Связывание NCID превращает CSL из транскрипционного ингибитора в активатор, что приводит к экспрессии генов-мишеней Notch.
Заявители описывают способ, который посредством ингибирования активация пути Notch у животного, страдающего пищеводом Барретта, приводит, по меньшей мере, к частичному уменьшению количества метапластического и/или диспластического эпителия у указанного животного.
Посредством введения ингибитора активации пути Notch, по меньшей мере, частично уменьшается пролиферативная способность метапластического и/или диспластического эпителия в пищеводе. Предпочтительно, уменьшение таково, что она видна с помощью эндоскопа или при контрольной операции с последующим гистологическим анализом. Еще предпочтительнее, уменьшение количества метапластического и/или диспластического эпителия является полным, т.е. нет (видимых) остающихся метапластических и/или диспластических эпителиальных клеток. Уменьшение количества метапластического и/или диспластического эпителия является результатом превращения метапластических и/или диспластических клеток в постмитотические клетки (например, бокаловидные клетки). Эти постмитотические клетки имеют относительно короткую продолжительность жизни (5-6 дней), и организм удаляет их после их гибели.
Животное определяется в настоящем документе как животное, отличное от человека, или человек (т.е. пациент или человек, страдающий болезнью Барретта или с риском его развития).
Ингибирование (по меньшей мере, частичное, но предпочтительно полное) активации пути Notch осуществляется различными путями, которые (без ограничения) описаны ниже в настоящем документе. Предпочтительно, ингибирование выполняется местно, т.е. в пищеводе. Заявители продемонстрировали в экспериментальной части, что вмешательство в путь Notch в нормальном (не диспластическом, не метапластическом) плоском эпителии пищевода не оказывает выявляемого эффекта на этот эпителий.
Кроме того, определено, что активация пути Notch включает активацию пути подобных Notch молекул и/или других аллельных вариантов молекул Notch (подобных Notch).
В настоящем документе пищевод Барретта определен не только как включающий метапластический эпителий, но также (при наличии) диспластический эпителий. Следовательно, изобретение используется для лечения не связанных с развитием опухоли фаз, а также фаз с развитием раковых поражений. Кроме того, способ по изобретению можно также использовать в качестве профилактики, т.е. способа предотвращения развития пищевода Барретта.
непосредственное
непрямой
В предпочтительном варианте осуществления изобретение предоставляет способ, по меньшей мере, частичного уменьшения имеющихся у животного патологических признаков пищевода Барретта, включающий, по меньшей мере, частичное ингибирование активации пути Notch у указанного животного, где указанная активация пути Notch, по меньшей мере, частично ингибируется введением указанному животному ингибитора γ-секретазы. Используемый ингибитор γ-секретазы может оказывать непосредственный и непрямой эффект. В одном из предпочтительных вариантов осуществления, указанный ингибитор γ-секретазы оказывает  воздействие на белок γ-секретазы. Т.е. так, что белок γ-секретазы больше не способен активировать путь Notch. Ингибитор γ-секретазы, используемый в способе по настоящему изобретению, предпочтительно непосредственно взаимодействует с белком (активностью) γ-секретазы и/или непосредственно связывается с ним, и/или непосредственно инактивирует, и/или непосредственно блокирует его. Кроме того, ингибитор γ-секретазы, используемый в способе по настоящему изобретению, является предпочтительно специфическим, т.е. такой специфический эффект как эффект лечения химиотерапевтическими средствами или лучевой терапией, не охватывается термином ингибитор γ-секретазы. В другом предпочтительном варианте осуществления, используемый ингибитор γ-секретазы оказывает  эффект на белок γ-секретазы, например, непрямой эффект, который включает модификацию последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок γ-секретазы, или непрямой эффект определенной нуклеиновой кислоты, генный продукт которой оказывает эффект на белок γ-секретазы.
Ингибитор γ-секретазы является, например, пептидным по природе или не пептидным, или полупептидным, и представляет собой предпочтительно низкомолекулярную молекулу. Ингибиторы гамма-секретазы первоначально были определены для использования по поводу болезни Альцгеймера. Ключевой стадией в патогенезе болезни Альцгеймера является протеолиз АРР (белка-предшественника амилоида), приводящий к образованию пептида амилоида-β (Аβ), основного белкового компонента характерных мозговых бляшек заболевания. АРР (так же, как Notch) сначала расщепляется во внеклеточном домене (в этом случае, β-секретазой), а остающаяся часть АРР расщепляется внутри мембраны γ-секретазой для продукции пептида Аβ. Ингибирование продукции пептида Аβ блокадой активности γ-секретазы является в настоящее время одной из наиболее перспективных терапевтических стратегий для замедления прогрессирования патологии болезни Альцгеймера. Тем временем, несколько компаний разработали ингибиторы γ-секретазы, такие как DAPT (сложный т-бутиловый эфир N-[N-3,5-дифторфенилацетил)-L-аланил]-S-фенилглицина). Также на наличие ингибирующей активности γ-секретазы были испытаны соединения из химических классов AS (арилсульфонамида), DBZ (дибензазепина), BZ (бензодиазепина), LY-411,575 и многих других. Обзор в отношении ингибиторов γ-секретазы представлен, например, в документе Harrison et al. 2004, в котором ингибиторы γ-секретазы были разделены, например, на сульфонамиды/сульфоны и бензодиазепины/бензолактамы. На фиг.2-6 настоящего изобретения представлен обзор деления ингибиторов γ-секретазы, как предложено Harrison et al., а также ссылка на химическую компанию, у которой можно получить указанные ингибиторы γ-секретазы. Несколько из этих ингибиторов γ-секретазы уже проходили I и II фазы клинических испытаний. Особенно предпочтительны полупептидные ингибиторы γ-секретазы, такие как DAPT, LY-411575, DBZ или DZ.
Указанный обзор ингибиторов γ-секретазы ни в коей мере не является ограничивающим. Например, все еще разрабатываются новые ингибиторы γ-секретазы, и такие вновь разработанные ингибиторы γ-секретазы можно применять для лечения пищевода Барретта и, следовательно, их применение для лечения пищевода Барретта находится в пределах объема настоящего изобретения/формулы изобретения.
Для специалиста в данной области ясно, что способ, по меньшей мере, частичного уменьшения имеющихся у животного патологических признаков пищевода Барретта, включающий, по меньшей мере, частичное ингибирование активация пути Notch у указанного животного, где указанная активация пути Notch, по меньшей мере, частично ингибируется введением указанному животному ингибитора γ-секретазы, можно осуществить введением, по меньшей мере, одного или, по меньшей мере, двух или более ингибиторов γ-секретазы, т.е. введением комбинации различных ингибиторов γ-секретазы. Кроме того, эффективное количество (дозы) ингибитора γ-секретазы можно повторно вводить нуждающемуся в нем пациенту. Например, вводится первое количество ингибитора γ-секретазы, и примерно через 1 или 2 недели эффект указанного количества проверяется любым из описанных в настоящем документе способов или средств. Если метапластический или диспластический эпителий еще присутствует, то вводится другое эффективное количество ингибитора γ-секретазы. И в этом случае определяется эффективность, и принимается решение, необходимо ли какое-либо последующее лечение. Ясно, что γ-секретазы обычно способны действовать (по меньшей мере) на два пути: путь АРР и Notch. Тем временем, химические компании разработали γ-секретазы, которые для одного или другого пути, например, путь Notch, которые специфичны для пути АРР, и не препятствуют передаче сигналов по пути Notch. Ясно, что γ-секретазы, которые не препятствуют передаче сигналов по пути Notch, нельзя применять в способе по изобретению. Следовательно, предпочтительной является γ-секретаза, способная препятствовать передаче сигналов по пути Notch, а также по пути АРР, или γ-секретаза, способная специфически препятствовать передаче сигналов по пути Notch. Такие ингибиторы можно, например, обнаружить в документе Harrison et al. 2004, который включен в настоящий документ ввиду ссылки на него (см. фиг.2-6).
В предпочтительном варианте осуществления изобретение предоставляет способ, по меньшей мере, частичного уменьшения имеющихся у животного патологических признаков пищевода Барретта, включающий, по меньшей мере, частичное ингибирование активации пути Notch у указанного животного, где указанная активация пути Notch, по меньшей мере, частично ингибируется введением указанному животному ингибитора γ-секретазы, где указанный ингибитор γ-секретазы представляет собой DAPT или дибензазепин (DBZ), или бензодиазепин (BZ), или LY-411575.
Как уже подчеркивалось выше, γ-секретаза представляет собой комплекс белков. Другой способ, по меньшей мере, частичного ингибирования активации пути Notch осуществляется, по меньшей мере, частичным ингибированием образования указанного комплекса белков, потому что только комплекс считается активным. Это, например, осуществляется предоставлением одного из компонентов в качестве доминантно-негативной молекулы или предоставлением части/молекулы указанного комплекса, причем часть/молекула включает мутацию, предотвращающую дальнейшее образование комплекса, или приводящую к неустойчивому (неактивному) белковому комплексу. Еще один способ, по меньшей мере, частичного ингибирования активации пути Notch представляет собой специфическое ингибирование каталитической части указанного комплекса, т.е. специфическое ингибирование пресенилинов.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение предоставляет способ, по меньшей мере, частичного уменьшения имеющихся у животного патологических признаков пищевода Барретта, включающий, по меньшей мере, частичное ингибирование активации пути Notch у указанного животного, где указанная активация пути Notch, по меньшей мере, частично ингибируется, по меньшей мере, частичным уменьшением опосредованной лигандом активации Notch. Как отмечено выше, активация пути Notch начинается связыванием лиганда, после чего рецептор Notch подвергается конформационному изменению, которое обеспечивает возможность сброса эктодомена посредством действия ADAM протеазы. Специалисту в данной области ясно, что связывание лиганда с Notch может быть, по меньшей мере, частично, но предпочтительно полностью, ингибироваться множественными стратегиями. Предпочтительно, указанная опосредованная лигандом активация Notch, по меньшей мере, частично уменьшается введением указанному животному доминантно-негативного лиганда Notch. Примерами натуральных лигандов Notch являются белки Delta, Jagged и Serrate. Доминантно-негативные лиганды, т.е. лиганды, способные связываться с Notch по существу без дальнейшей активации пути Notch (блокировка активации пути Notch), можно получить из указанных натуральных лигандов, например, получением мелких связывающих молекул, основанных на связывающей части указанного натурального лиганда. В случаях, когда такие доминантно-негативные лиганды вступают в контакт с Notch, связывание указанного доминантно-негативного лиганда с Notch происходит без дальнейшей активации пути Notch. Предпочтительно, указанный доминантно-негативный лиганд прилипает/связывается с Notch в течение более длительных периодов времени, и связывание натурального лиганда частично и предпочтительно полностью блокируется/ингибируется, и, как следствие, (по меньшей мере, частично) ингибируется активация пути Notch. Примерами доминантно-негативного лиганда являются, например, мутанты Delta и Serrate, включающие внутриклеточные делеции (Sun and Artavanis-Tsakonas, 1996).
В другом предпочтительном варианте осуществления указанная опосредованная лигандом активация Notch, по меньшей мере, частично уменьшается введением указанному животному доминантно-негативного Notch. В принципе, каждый тип молекулы Notch можно использовать по этому назначению, т.е. Notch 1, 2, 3 или 4, или его функциональный фрагмент, и/или функциональное производное. Функциональный фрагмент представляет собой любой фрагмент (N-концевой фрагмент, С-концевой фрагмент или внутренний фрагмент, или любую их комбинацию), полученный или из этих молекул (или их эквивалента), который способен связываться с лигандом Notch. Такой функциональный фрагмент может, например, присутствовать в виде связанного с мембраной или не связанного с мембраной соединения. Путем связывания доминантно-негативного Notch с имеющимися лигандами, указанный лиганд не может связываться с натурально/первоначально/функционально имеющимся Notch, и, следовательно, активация пути Notch, по меньшей мере, частично ингибируется. Функциональное производное представляет собой, например, молекулу Notch, которая была мутирована (точечная мутация, вставки) так, что связывание с лигандом еще возможно, но что мутация предотвращает передачу сигнала связывания лиганда. Функциональное производное может быть также получено от другого вида. В еще одном предпочтительном варианте осуществления активация Notch, опосредованная указанным лигандом, по меньшей мере, частично, уменьшается введением нуждающемуся в нем животному антитела или его функциональной части или функционального производного, способного, по меньшей мере, частично, блокировать взаимодействие между лигандом Notch и Notch. Такое антитело, например, направлено на связывающую лиганд часть Notch, или направлено на часть лиганда, которая взаимодействует с Notch. Продукция антител или их функциональной части, и/или функционального производного общеизвестна в данной области и, следовательно, дальнейшие детали, относящиеся к этому предмету, не представлены. Для ингибирования активации пути Notch, например, связыванием с Notch, можно также использовать другие связывающие белки, такие как пептиды. Независимо от типа используемого ингибирования опосредованной лигандом активации Notch, результаты одинаковы: ингибируется (по меньшей мере, частично) образование NICD, что, в конечном счете, приводит к удалению метапластического и/или диспластического эпителия из пищевода.
Как уже указывалось, (по меньшей мере, частичное, но предпочтительно, полное) ингибирование активации пути Notch осуществляется различными путями. В еще одном предпочтительном варианте осуществления, изобретение предоставляет способ, по меньшей мере, частичного уменьшения имеющихся у животного патологических признаков пищевода Барретта, включающий, по меньшей мере, частичное ингибирование активации пути Notch у указанного животного, где указанная активация пути Notch, по меньшей мере, частично ингибируется введением указанному животному ингибитора ADAM протеазы. После связывания лиганда Notch с Notch, рецептор Notch подвергается конформационному изменению, которое обеспечивает возможность сброса эктодомена посредством действия ADAM протеазы. ADAM обозначает дезинтегрин и металлопротеазу. Путем предоставления вещества, способного ингибировать протеазу, которая осуществляет сброс эктодомена, по меньшей мере, частично, но предпочтительно, полностью ингибируется активация пути Notch, т.е. не происходит образование NICD. И в этом случае, предпочтительно местное ингибирование активации пути Notch во избежание, в максимально возможной степени, потенциальных нежелательных побочных эффектов.
Специалисту в данной области ясно, что можно комбинировать различные пути, по меньшей мере, частичного ингибирования Notch, например, для увеличения эффективности.
В предпочтительном варианте осуществления изобретение предоставляет использование ингибитора пути Notch при изготовлении лекарственного средства для лечения пищевода Барретта. Как уже отмечалось выше, для способов в соответствии с изобретением можно использовать множественные ингибиторы для, по меньшей мере, частичного уменьшения образования NCID, и, следовательно, по меньшей мере, частичного предотвращения активации пути Notch. Примерами предпочтительных ингибиторов Notch являются: ингибиторы γ-секретазы, такие как DAPT или дибензазепин (DBZ), или бензодиазепин (BZ), или LY-411575, ингибитор, способный уменьшить опосредованную лигандом активацию Notch (например, через доминантно-негативный лиганд Notch или через доминантно-негативный Notch, или через антитело, способное, по меньшей мере, частично, блокировать взаимодействие между лигандом Notch и Notch), или ингибитор ADAM протеаз. Кроме того, такой ингибитор можно комбинировать с уже имеющимся лечением, таким как химиотерапия, хирургическое лечение или облучение.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, включающую, по меньшей мере, 2 ингибитора активации пути Notch.
Фармацевтические композиции в соответствии с изобретением могут быть предоставлены в форме порошка, раствора или суспензии в (не)водной жидкости или в виде эмульсии. Указанное фармацевтическое средство может, кроме того, включать фармацевтически приемлемые эксципиенты, носители и/или разбавители. Фармацевтические композиции можно вводить перорально, парентерально, внутримышечно, внутривенно, парентерально, внутрибрюшинно или колоректально (например, в виде суппозитории).
Пероральная доставка предпочтительна, потому что подлежащие лечению области легко достигаются через этот путь доставки. Кроме того, доставка предпочтительна местно во избежание каких-либо нежелательных побочных эффектов. Предпочтительно, активация пути Notch, по меньшей мере, частично ингибируется введением нуждающемуся в лечении животному, например, сиропа, который прилипает к пищеводу. В еще одном варианте осуществления лекарственное средство, по меньшей мере, для частичного ингибирования активации пути Notch вводится посредством эндоскопии для обеспечения того, что лекарственное средство доставляется местно, т.е. доставляется в место, которое нуждается в лечении. Например, возможна доставка лекарственного средства посредством инъекции в ткань слизистой оболочки через эндоскоп/гастроскоп. В еще одном варианте осуществления, лекарственное средство, включающее ингибитор активации пути Notch, получают так, что он разрушается в желудке после прохождения через пищевод. В таком случае лекарственное средство неспособно пройти через кислотную/пищеварительную среду желудка без разрушения кислотами и ферментами, присутствующими в желудке.
В отношении доз, отмечается, что специалист в данной области способен на основании, например, уже известной фармакокинетики определить эффективную дозировку DAPT и/или DBZ, и/или BZ, и/или LY-411575. Кроме того, путем использования одного из множественных хорошо известных экспериментов по поиску доз, специалист в данной области может определить эффективную дозу. Как уже описано, при необходимости, можно вводить повторные дозы эффективного количества ингибитора γ-секретазы, не вызывая отрицательного воздействия на нормальную ткань.
Кроме применения фармацевтического средства в любом из описанных способов, фармацевтическое средство в соответствии с изобретением можно также применять в качестве дополнения (остаточного) к другим видам лечения. Как указано в настоящем документе, современные методы лечения включают хирургическое лечение дисплазии высокой степени, эндоскопическое деструкционное лечение для удаления ткани в пищеводе, пораженной дисплазией высокой степени, химическую деструкцию посредством фотодинамической терапии по поводу дисплазии, термическую деструкцию, механическую деструкцию или комбинированное лечение. Ясно, что лечение в соответствии с настоящим изобретением можно комбинировать с любым из этих более традиционных способов.
Изобретение будет более детально объяснено в следующем описании, которое не ограничивает изобретение.
Экспериментальная часть
Эксперимент 1
Материал и методы
Получение образца ткани, иммуногистохимия
2
4
3
2
2
Пищевод иссекали целиком и осторожно промывали формалином и затем фиксировали в формалине в течение 16 часов. Получали срезы ткани (2-6 мкм). После депарафинизации и гидратации, срезы предварительно обрабатывали буфером, блокирующим пероксидазу (120 мМ NaHPO, 43 мМ лимонной кислоты, 30 мМ NaN, 0,2% HO; рН 5,8) в течение 15 минут при комнатной температуре. Извлечение антигена выполняли кипячением образцов в Na-цитратном буфере (10 мМ, рН 6,0). Через 20 минут, кювете с кипящим содержимым давали возможность медленно охладиться до комнатной температуры.
+
Использовали следующие антитела. Мышиное анти-Ki67 антитело (1:100; Novocastra), мышиное антитело против β-катенина (1:50; Transduction Labs), мышиное анти-BrdU антитело (1:500; Beckton Dickinson), кроличье анти-Math1 антитело (1:50; щедрый дар д-ра Jane Johnson). Инкубацию антител выполняли в BSA (бычьем сывороточном альбумине) в PBS (солевом растворе с фосфатным буфером) в течение ночи при 4ºС для антител, направленных против Caspase-3 и Math1 и при комнатной температуре в течение 1 часа для антител, направленных против Ki67, BrdU, синаптофизина и β-катенина. Во всех случаях использовали набор Envision (DAKO) в качестве вторичного реагента. Окрашивания проявляли с использованием DAB (4-диметиламинобензола). Предметные стекла повергали контрокрашиванию гематоксилином и устанавливали в микроскоп.
Бокаловидные клетки окрашивали алцианом синим и окрашиванием PAS (периодической кислотой Шиффа). Для окрашивания бокаловидных клеток алцианом синим, после депарафинизации и гидратации, ткани инкубировали в течение 5 мин в алциане синем (1% в 0,5% уксусной кислоте). В последующем промывали в воде, 1 мин инкубировали в нейтральном красном. Быстро обезвоживали, промывали в ксилоле и заделывали в ткань «пертекс». Для окрашивания бокаловидных клеток PAS, после депарафинизации и гидратации, ткани окисляли в 0,5% растворе кислоты в течение 5 мин. В последующем промывали в воде, 15 мин инкубировали в реагенте Шиффа, промывали слегка нагретой водой в течение 5 мин, подвергали контр окрашиванию в растворе гематоксилина в течение 1 мин, промывали в воде в течение 5 мин, обезвоживали и фиксировали.
Фармакологическое ингибирование пути Notch передачи сигналов у мышей APC
min
min
8-недельных мышей APC лечили 2 различными, вводимыми перорально ингибиторами γ-секретазы в течение 10 дней, после чего пищевод и кишечники исследовали гистологически. Вводимые ингибиторы γ-секретазы представляли собой бензодиазепин (BZ) и дибензазепин (DBZ) в концентрации 15 мкмоль/кг. Получали суспензию измельченного DBZ в 0,5% (мас./об.) гидроксипропилметилцеллюлозе (Methocel E4M) и 0,1% (мас./об.) Tween 80 в воде, тогда как измельченный BZ суспендировали в 6% (об./об.) Labrafil M 1944 CS.
Результаты
После перорального лечения животных умерщвляли. Весь пищевод и кишечник удаляли и подвергали гистологическому анализу.
Как ожидалось, У животных развилось почти полное превращение пролиферативных клеток крипт в постмитотические бокаловидные клетки, как описано van Es et al., Nature 2005. Это указывало на то, что пероральные дозы эффективно ингибировали гамма-секретазу по всей тонкой кишке. Тем временем, тщательное исследование всех гистологических данных, полученных по пищеводу тех же мышей, не выявило никаких изменений гистологии и пролиферативной активности. Это показывает, что в данных условиях на здоровый пищевод нет воздействий, и он эффективно нечувствителен к ингибированию гамма-секретазы.
Эксперимент 2
Заявители планировали исследовать эффекты лечения GSI (ингибитором гамма-секретазы) на достаточно обоснованной крысиной модели болезни Барретта, при которой хирургический анастомоз между пищеводом и тощей кишкой создает хронический рефлюкс. Через 4-6 месяцев у этих крыс согласованно развивается цилиндрическая метаплазия эпителия дистальной части пищевода, неотличимая от пищевода Барретта у человека (Buskens et al., 2006).
Материалы и методы
Операция
2
2
Все хирургические процедуры были описаны в документе Buskens et al. 2006. Крыс повергали эзофагоеюностомии конец-в-конец с гастрэктомией. Вызывали ингаляционную анестезию (изофлюран, NO, O). Через лапаротомию по средней линии, пищевод пересекали у соединения пищевода с желудком и накладывали анастомоз конец-в-конец с тощей кишкой однослойным, непрерывным швом (пролен 7-О). Предпринимали предосторожность для включения слизистой оболочки пищевода для обеспечения адекватного примыкания между слизистыми оболочками. Проводили резекцию желудка, поскольку предыдущее исследование показало, что пролиферация слизистой желудка часто происходит, когда желудок оставлен in situ. Таким образом, был создан рефлюкс из 12-перстной кишки в пищевод (без желудочной кислоты). Сразу после операции крысы получали 2 мл 10% глюкозы подкожно и 1 мг FE+++. Через 5-6 месяцев у всех оперированных крыс развился пищевод Барретта.
Лечение DZB
Через 6 месяцев после операции DBZ вводили ежедневными внутрибрюшинными инъекциями, как описано в эксперименте 1 в дозе 30 мкмоль/кг массы тела в течение 5 дней, после чего крыс умерщвляли.
Получение образцов ткани, иммуногистохимия
Получали срезы пищевода в целом, как описано в эксперименте 1. Все гистологические анализы выполняли, как описано для мышей в эксперименте 1 (см. выше).
Результаты
Через 4-6 месяцев после наложения хирургического анастомоза между пищеводом и тощей кишкой, у крыс согласованно развивалась цилиндрическая метаплазия эпителия дистальной части пищевода, не отличаемая от пищевода Барретта у человека (фиг.1А/В; Buskens et al., 2006).
Исследования поиска дозы выявили, что внутрибрюшинная инъекция DBZ, GSI, который заявители ранее использовали у мышей, вызывала эффективное превращение бокаловидных клеток в тонкой кишке крыс после 5-дневных внутрибрюшинных инъекций в дозе 30 мкмоль/кг (результаты не показаны). Через 6 месяцев после хирургического наложения анастомоза трех крыс подвергли 5-дневной схеме лечения в дозе 30 мкмоль/кг, и умерщвляли для биологических анализов тонкой кишки, ободочной кишки и пищевода. Для сравнения, аналогичные гистологические анализы были выполнены на девяти контрольных крысах, имеющих такой же хирургический анастомоз.
Как проиллюстрировано на фиг.1C/D, лечение GSI оказывало выраженный эффект на крипты эпителия Барретта у всех трех получавших лечение крыс, по сравнению с контролями. Циклические изменения в клетках, считываемые окрашивание Ki67, резко уменьшились, тогда как в криптах Барретта проявлялось интенсивное окрашивание PAS, указывающее на превращение клеток в бокаловидные, и массивная секреция слизи. Воздействия на соседний, нормальный плоский эпителий пищевода не были отмечены. Заявители ранее показали, что ингибирование Notch ведет к снятию подавления Math 1, кодирующего транскрипционный фактор, который индуцирует участь бокаловидных клеток (van Es et al., 2005). Действительно, экспрессия Math 1 вызывала сильную стимулирующую регуляцию в эпителии Барретта, обработанного GSI (не показано).
Этот эксперимент показывает, что ингибирование Notch GSI, таким как DBZ при пищеводе Барретта фенокопирует воздействия на нормальный кишечный эпителий. Местная доставка GSI нанесением на слизистую оболочку или инъекцией под слизистую у пациентов с болезнью Барретта используется в настоящее время для индукции конечной дифференциации и слущивания пролиферативных клеток пищевода Барретта, в то же время избегая эффектов системной доставки на здоровый кишечник.
Эксперимент 3
Отбор пациентов
Пациентов с болезнью Барретта отбирают на основании методик, описанных в настоящем документе.
Лечение пациентов
Как указано в деталях в описании, имеется множество подходящих путей введения. Предпочтительно, введение осуществляется местно с ингибитором γ-секретазы инъекцией указанного ингибитора γ-секретазы через эндоскоп/гастроскоп в ткань слизистой оболочки указанных пациентов. Используемая дозировка ингибитора γ-секретазы зависит от используемого конкретного ингибитора γ-секретазы и его фармакокинетики. Кроме того, лечение повторяют как можно чаще (в зависимости от стадии пищевода Барретта).
Описание чертежей
Фиг.1A/B: Гистологический анализ на границе нормального пищеводного плоского эпителия (слева от пунктирной черной линии) и эпителия Барретта (справа от пунктирной линии).
Фиг.1А: Краситель К167 выявляет ядра всех пролиферативных клеток (базальные клетки в плоском эпителии; большинство эпителиальных клеток в эпителии Барретта).
Фиг.1В: Окрашивание PAS выявляет рассеянное присутствие зрелых бокаловидных клеток в эпителии Барретта, окрашенных в красный цвет.
Фиг.1C/D: Гистологический анализ эпителия Барретта крыс после 5 дней обработки DBZ.
Фиг.1С: окрашивание КI67 выявляет, что большинство клеток в эпителии Барретта больше не являются пролиферирующими.
Фиг.1D: Окрашивание PAS выявляет по существу полное превращение эпителия Барретта в продуцирующие слизь бокаловидные клетки и секрецию массивных количеств слизи (красное окрашивание).
Фиг.2-6: Примеры ингибиторов γ-секретазы.
Ссылки