СПОСОБ ИНДУКЦИИ МИГРАЦИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЖИРОВОЙ ТКАНИ
METHOD FOR INDUCING STEM CELL MIGRATION IN FATTY TISSUE

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способности взрослых стволовых клеток из жировой ткани мигрировать и, в особенности, к новому применению взрослых стволовых клеток из жировой ткани и к их специфическим секреторным продуктам, которые обладают способностью мигрировать к пораженному участку, в котором экспрессируются хемокины или факторы роста, и к способу, позволяющему более эффективно усиливать функцию рецепторов хемокинов или факторов роста.
Уровень техники
Стволовыми клетками называют клетки, обладающие не только способностью к самовоспроизведению, но также способность к дифференцировке, по меньшей мере, в клетки двух типов, и их можно подразделить на тотипотентные стволовые клетки, плюрипотентные стволовые клетки и мультипотентные стволовые клетки.
Тотипотентные стволовые клетки представляют собой клетки, имеющие тотипотентные свойства, способные к развитию в один полноценный организм, и эти свойства сохраняются клетками вплоть до 8-клеточной стадии после оплодотворения ооцита сперматозоидом. Если эти клетки изолируют и пересаживают в матку, они могут развиться в один полноценный организм. Плюрипотентные стволовые клетки, представляющие собой клетки, способные к развитию в разнообразные клетки и ткани, возникающие из эктодермальных, мезодермальных и эндодермальных слоев, происходят из внутренней клеточной массы, локализованной внутри бластоцисты, образовавшейся на 4-5-й день после оплодотворения. Эти клетки называют «эмбриональными стволовыми клетками», и они могут дифференцировать в различные клетки других тканей, но не могут сформировать новые живые организмы. Мультипотентные стволовые клетки, представляющие собой стволовые клетки, способные к дифференциации только в клетки, специфические для тканей и органов, содержащие эти клетки, вовлечены не только в рост и развитие различных тканей и органов во время внутриутробного, неонатального и взрослого периодов, но также в поддержание гомеостаза в тканях у взрослых и функции индукции регенерации при повреждении тканей. Тканеспецифические мультипотентные клетки носят общее название «взрослые стволовые клетки».
Взрослые стволовые клетки получают, извлекая клетки из различных органов человека и превращая эти клетки в стволовые клетки, и для них характерна дифференциация только в специфическую ткань. Однако недавно эксперименты по дифференциации взрослых стволовых клеток в различные ткани, включая клетки печени, были настолько сенсационно удачны, что попали в центр внимания.
Были предприняты усилия в области регенеративной медицины для регенерации биологических тканей и органов и восстановления с помощью клеток их функций, потерянных из-за заболевания или несчастного случая и т.п. Способы, часто применяемые в области регенеративной медицины, включают следующие стадии: получение от пациента стволовых клеток, мононуклеарных клеток из крови или мононуклеарных клеток из костного мозга; индукцию пролиферации и/или дифференциации клеток в пробирке с культурой; и введение отобранных недифференцированных (стволовых клеток и/или клеток-предшественников) и/или дифференцированных клеток в организм пациента с помощью трансплантации. Соответственно, ожидается, что существующие классические способы лечения заболеваний с помощью лекарственных средств или хирургии будут заменены заместительной клеточной/тканевой терапией, с помощью которой поврежденную клетку, ткань или орган заменят здоровыми, и, таким образом, польза от стволовых клеток дополнительно возрастет.
Таким образом, в настоящее время происходит изучение различных функций стволовых клеток. В особенности, развиваются различные исследования по эффективному выделению стволовых клеток, по поддержанию и пролиферации стволовых клеток в недифференцированном состоянии и по дифференциации стволовых клеток в клетки ткани. Существует ряд сообщений по миграции костномозговых стволовых клеток, индуцированной обработкой хемокинами (Adriana Lopez Ponte et al., Stem Cells, 25:1737-1745, 2007; Marek Honczarenko et al., Stem Cells, 24:1031-1041, 2006; Sordi V et al., Blood, 106:419-427, 2005; Fiedler J et al., J Cell Biochem, 87:305-312, 2002; Forte G et al., Stem Cells, 24:23-33, 2006; Wright DE et al., Blood, 87:4100-4108, 1996; Son BR et al., Stem Cells, 24:1254-1264, 2006), но не было сообщений о миграции стволовых клеток жировой ткани.
Соответственно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани обладают способностью к миграции и что миграция мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани под действием специфического хемокина или фактора роста заметно стимулируется, если стволовые клетки примируют различными хемокинами или факторами роста. На основании этих данных, авторы настоящего изобретения обнаружили способ, позволяющий увеличить способность мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани экспрессировать рецепторы хемокинов или факторов роста, таким образом, завершая настоящее изобретение.
Сущность изобретения
Цель настоящего изобретения заключается в обеспечении композиции для индукции миграции стволовых клеток жировой ткани, содержащей в качестве активного ингредиента одну или несколько взрослых стволовых клеток из жировой ткани и секретируемые ими продукты.
Другая цель настоящего изобретения заключается в обеспечении способа индукции миграции взрослых стволовых клеток из жировой ткани к пораженному участку.
Настоящее изобретение направлено на применение и функцию взрослых стволовых клеток из жировой ткани, которые экспрессируют рецепторы для хемокинов или факторов роста, или на продукты, секретируемые этими стволовыми клетками. Для достижения указанных выше целей настоящее изобретение обеспечивает композицию для индукции миграции стволовых клеток жировой ткани, композицию, содержащую в качестве активного ингредиента, взрослые стволовые клетки из жировой ткани и/или секретируемый ими продукт.
Примеры секреторного продукта взрослой стволовой клетки жировой ткани в композиции настоящего изобретения включают рецепторы Rantes, МСР-1 (белок-хемоаттрактант-1 моноцитов), MIP-3β (воспалительный белок-3β моноцитов), SDF-1α (стромальных клеток фактор-1α), ВСА-1 (привлекающий В-клетки хемокин-1), CXCL16 (хемокиновый (С-Х-С-мотив) лиганд 16), EGF (эндотелиальный фактор роста), b-FGF (основной фактор роста фибробластов), HGF (фактор роста гепатоцитов), TGF-β1 (трансформирующий фактор роста бета 1), IGF-1 (инсулиноподобный фактор роста 1), PDGF-AB (фактор роста тромбоцитов АВ), TNF-α (фактор некроза опухолей-α), адипонектин, лептин и проколлаген. Предпочтительно, секреторный продукт может представлять собой адипонектин и/или лептин.
Взрослые стволовые клетки из жировой ткани и/или секретируемые ими продукты могут быть применены в виде бульонной культуры из взрослых стволовых клеток жировой ткани человека, полученной путем выращивания взрослых стволовых клеток жировой ткани человека в среде, содержащей определенные компоненты, сбора культуральной среды и удаления клеточного дебриса из культуральной среды.
Кроме того, композиция может дополнительно содержать FBS. Предпочтительно композиция может содержать примерно 30% FBS.
Взрослые стволовые клетки из жировой ткани и секретируемые ими продукты экспрессируют рецепторы для одного или нескольких хемокинов или факторов роста, которые выбирают из группы, состоящей из Rantes, МСР-1 (белок-хемоаттрактант-1 моноцитов), MIP-3β (воспалительный белок-3β моноцитов), SDF-1α (стромальных клеток фактор-1α), ВСА-1 (привлекающий В-клетки хемокин-1), CXCL16 (хемокиновый (С-Х-С-мотив) лиганд 16), EGF (эндотелиальный фактор роста), b-FGF (основной фактор роста фибробластов), HGF (фактор роста гепатоцитов), TGF-β1 (трансформирующий фактор роста бета 1), IGF-1 (инсулиноподобный фактор роста 1), PDGF-AB (фактор роста тромбоцитов АВ) и TNF-α (фактор некроза опухолей-α), и мигрируют в ответ на такие хемокины или факторы роста.
Кроме того, взрослые стволовые клетки из жировой ткани в композиции настоящего изобретения предпочтительно могут быть получены от млекопитающего, более предпочтительно от человека. Например, взрослые стволовые клетки из жировой ткани могут представлять собой мезенхимальные стволовые клетки из жировой ткани человека (AdMSCs).
В особенности, взрослые стволовые клетки из жировой ткани, которые применяют в настоящем изобретении, предпочтительно примируют смесью, содержащей хемокин или фактор роста.
Предпочтительно смесь может содержать один или несколько факторов, которые выбирают из группы, состоящей из Rantes, МСР-1 (белок-хемоаттрактант-1 моноцитов), MIP-3P (воспалительный белок-3β моноцитов), SDF-1α (стромальных клеток фактор-1α), ВСА-1 (привлекающий В-клетки хемокин-1), CXCL16 (хемокиновый (С-Х-С-мотив) лиганд 16), EGF (эндотелиальный фактор роста), b-FGF (основной фактор роста фибробластов), HGF (фактор роста гепатоцитов), TGF-β1 (трансформирующий фактор роста бета 1), IGF-1 (инсулиноподобный фактор роста 1), PDGF-AB (фактор роста тромбоцитов АВ) и TNF-α (фактор некроза опухолей-α). В особенности, более предпочтительно смесь может содержать один или несколько факторов, которые выбирают из группы, состоящей из Rantes, SDF-1α (стромальных клеток фактор-1α), HGF (фактор роста гепатоцитов), TNF-α (фактор некроза опухолей-α), PDGF-AB (фактор роста тромбоцитов АВ) и TGF-β1 (трансформирующий фактор роста бета 1).
7
10
8
9
Взрослые стволовые клетки человек предпочтительно включают в количестве, равном примерно от 1×10 клеток до 1×104 клеток и более предпочтительно примерно от 1×10 клеток до 1×10 клетки.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ индукции миграции взрослых стволовых клеток жировой ткани, способ, включающий следующие стадии:
(a) примирование взрослых стволовых клеток из жировой ткани смесью, содержащей хемокин или фактор роста; и
(b) введение композиции, содержащей примированные взрослые стволовые клетки из жировой ткани и секретируемые ими продукты, в участок in vivo, который не находится в прямом контакте с пораженным участком. В этом способе композицию наиболее предпочтительно вводят внутривенно.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 представляет собой график, показывающий результаты индукции миграции мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани под действием различных хемокинов или факторов роста.
Фиг.2 представляет собой набор микрофотографий мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани, сделанных после индукции миграции клеток.
Фиг.3 представляет собой график, показывающий результаты индукции миграции мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани, примированных различными хемокинами или факторами роста, под действием 10% FBS.
Фиг.4 представляет собой график, показывающий результаты индукции миграции мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани, примированных TNF-α, под действием различных хемокинов или факторов роста.
Фиг.5 представляет собой график, показывающий результаты индукции миграции мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани, примированных различными хемокинами или факторами роста, под действием тех же хемокинов или факторов роста, которые были применены для примирования клеток.
Фиг.6 представляет собой набор графиков, показывающих полученные методом FACS результаты экспериментов, проведенных для обнаружения того, экспрессируются ли рецепторы для различных хемокинов или факторов роста в мультипотентных мезенхимальных стволовых клетках жировой ткани и в А549 клетках.
Фиг.7 представляет собой набор фотографий, показывающих полученные методом RT-PCR результаты экспериментов, проведенных для обнаружения того, экспрессируются ли мРНК рецепторов для различных хемокинов или факторов роста в мультипотентных мезенхимальных стволовых клетках жировой ткани. На фиг.7А, линия 1: CCR1 (380 bp), линия 2: CCR2 (474 bp), линия 3: CCR7 (461 bp), линия 4: CXCR4 (489 bp), линия 5: CXCR5 (494 bp), линия 6: CXCR6 (517 bp), и линия 7: GAPDH (362 bp). На фиг.7 В, М: маркер, линия 1: EGFR (419 bp), линия 2: TGFBR2 (498 bp), линия 3: PDGFRA (187 bp), линия 4: PDGFRB (508 bp), линия 5: IGF1R (299 bp), линия 6: с-МЕТ (201 bp), линия 7: TNFRSF1A (218 bp), линия 8: FGFR1 (250 bp), и линия 9: GAPDH (362 bp).
На фиг.8 изображен график и набор микрофотографий, показывающие результаты индукции миграции мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани, примированных адипонектином, в концентрации 1, 10 и 100 нг/мл.
Фиг.9 представляет собой набор микрофотографий, показывающий результаты RT-PCR, проведенной для обнаружения того, экспрессируются ли мРНК рецепторов 1 и 2 адипонектина в мультипотентных мезенхимальных стволовых клетках жировой ткани. На фиг.9, линия 1: ADIPOR1 (337 bp), линия 2: ADIPOR2 (538 bp), линия 3: GAPDH (362 bp).
Раскрытие изобретения
Если не будет указано иное, то все технические и научные термины, примененные в этой заявке, имеют такое же значение, как его обычно понимает средний специалист в этой области техники, к которой это изобретение относится. В общем, терминология, примененная в этой заявке и способы экспериментов, которые будут описаны далее, хорошо известны и обычно применяются в этой области техники.
Стволовые клетки означают клетки, обладающие не только способностью к самовоспроизведению, но также способностью дифференцировать, по меньшей мере, в два типа клеток.
Взрослые стволовые клетки представляют собой стволовые клетки, которые возникают или на стадии, на которой каждый орган эмбриона сформирован в процессе развития, или на стадии взрослого организма. Известно, что взрослые стволовые клетки мультипотентны и способны к дифференциации в ткане- и органоспецифические клетки. Такие мультипотентные стволовые клетки, представляющие собой стволовые клетки, которые способны к дифференциации в клетки, специфические для тканей и органов, содержащих эти клетки, вовлечены не только в рост и развитие различных тканей и органов в зародышевом, неонатальном и взрослом периодах развития организма, но также в поддержание гомеостаза взрослой ткани и функции индукции регенерация при повреждении ткани.
В настоящем изобретении могут быть применены взрослые стволовые клетки из жировой ткани или эпителиальной ткани, такие как волосяной фолликул или амнион. Предпочтительно применяют взрослые стволовые клетки из жировой ткани человека. Могут быть применены мезенхимальные стволовые клетки (MSC). В особенности, могут быть применены мезенхимальные стволовые клетки из жировой ткани человека (AdMSCs).
Указанную жировую ткань или эпителиальную ткань предпочтительно получают от млекопитающего, более предпочтительно от человека. В одном из примеров настоящего изобретения, применяют мезенхимальные стволовые клетки из жировой ткани человека (AdMSCs).
Как применено в настоящей заявке, «взрослые стволовые клетки из жировой ткани» или «мезенхимальные стволовые клетки из жировой ткани» представляют собой недифференцированные взрослые стволовые клетки, изолированные из жировой ткани и также называемые в этой заявке «стволовые клетки жировой ткани». Эти клетки могут быть получены в соответствии с любым общепринятым способом, известным в этой области техники.
Стволовые клетки жировой ткани могут быть получены с применением любой общепринятой среды, известной в этой области техники, подходящей для культивирования стволовых клеток. Например, в настоящем изобретении применяют DMEM (модифицированную по способу Дульбекко среду Игла).
Среда для выращивания стволовых клеток жировой ткани может быть дополнена добавками, которые стимулируют пролиферацию стволовых клеток жировой ткани с недифференцированным фенотипом, ингибируя в то же время дифференциацию клеток. Также среда, в общем, может содержать нейтральный буфер (такой как фосфат и/или бикарбонат в высокой концентрации) в изотоническом растворе; питательное вещество белковой природы (например, сыворотку, такую как FBS, заместитель сыворотки, альбумин, или незаменимые и заменимые аминокислоты, такие как глутамин). Кроме того, она может содержать липиды (жирные кислоты, холестерол, экстракт HDL или LDL из сыворотки) и другие ингредиенты, обнаруженные в наиболее полной среде этого типа (такие как инсулин или трансферрин, нуклеозиды или нуклеотиды, пируват, источник сахара, такого как глюкоза, селен в любой ионизированной форме или в виде соли, глюкокортикоид, такой как гидрокортизон, и/или восстановитель, такой как Р-меркаптоэтанол).
Кроме того, с целью защиты клеток от слипания друг с другом, прилипания к стенке сосудов или формирования кластеров, которые слишком велики, может быть полезно включить в среду средство, препятствующее образованию комков, такое как те, что поставляет на рынок компания «Invitrogen» (Cat # 0010057АЕ).
В том числе, может быть успешно применена одна или несколько из следующих дополнительных добавок:
- фактор стволовых клеток (SCF, стальной фактор), другие лиганды или антитела, которые димеризуют c-kit, и другие активаторы того же сигнального пути
- лиганды для других рецепторов тирозиновых киназ, такие как рецептор фактор
роста тромбоцитов (PDGF), колониестимулирующий фактор макрофагов, лиганд Flt-3 и васкулярный эндотелиальный фактор роста (VEGF)
- факторы, которые увеличивают уровень циклического AMP, такие как форсколин
- факторы, которые включают gp130, такие как LIF или онкостатин-М
- гемопоэтические факторы роста, такие как тромбопоэтин (ТРО)
- трансформирующий факторы роста, такие как TGFβ1
- другие факторы роста, такие как эпидермальный фактор роста (EGF)
- нейротрофины, такие как CNTF
- N-ацетил-L-цистеин (NAC)
- гидрокортизон
- аскорбиновая кислота
В особенности, среда, которую применяют для культивирования стволовых клеток жировой ткани в одном из воплощений настоящего изобретения, предпочтительно, содержит NAC, аскорбиновую кислоту, кальций, инсулин и гидрокортизон. Более предпочтительно, она содержит FBS, NAC, аскорбиновую кислоту, кальций, rEGF, инсулин и гидрокортизон.
Композиция настоящего изобретения может содержать, в качестве активного ингредиента, секреторный продукт из мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани.
Примеры этого секреторного продукта включают целый ряд цитокинов, аминокислоты, факторы роста и т.п. Специфические примеры секреторного продукта, который может содержаться в композиции настоящего изобретения, включают TGF, bFGF, IGF-1, KGF, HGF, фибронектин, VEGF, адипонектин, лептин и проколлаген, а также их рецепторы. Среди таких секретируемых из взрослых стволовых клеток жировой ткани продуктов адипонектин или лептин происходят специфически из жировой ткани, и они принимают значительное участие в индукции клеточной миграции.
Взрослые стволовые клетки человека и/или секретируемые ими продукты могут быть применены в виде бульонной культуры взрослых стволовых клеток из жировой ткани человека, полученных в виде взрослых стволовых клеток из жировой ткани человека в среде, содержащей определенные компоненты, после сбора культуральной среды и удаления клеточного дебриза из культуральной среды. Альтернативно, экстракты из культурального бульона могут быть применены по одиночке или в комбинации.
Другими словами, композиция настоящего изобретения может представлять собой или композицию, содержащую взрослые стволовые клетки из жировой ткани и секретируемые ими продукты и компоненты среды, или композицию, содержащую секретируемые клетками продукты и компоненты среды, или композицию, содержащую только секретируемые клетками продукты по одиночке или в комбинации с взрослыми стволовыми клетками, или композицию, содержащую только взрослые стволовые клетки из жировой ткани, которые продуцируют секретируемые продукты in vivo.
В одном из аспектов настоящее изобретение направлено на применение взрослых стволовых клеток из жировой ткани и/или секретируемых ими продуктов для индукции миграции стволовых клеток. Точнее, настоящее изобретение основано на обнаружении того, что взрослые стволовые клетки из жировой ткани и их специфические секреторные продукты демонстрируют функцию рецептора хемокина или фактора роста, который экспрессируется в пораженном участке.
Как применено в настоящей заявке, выражение «демонстрируют (демонстрирует) функцию рецептора хемокина или фактора роста» относится к ситуации, в которой взрослые стволовые клетки из жировой ткани экспрессируют на клеточной поверхности рецептор, который специфически связывается со специфическим хемокином или фактором роста, или на которой секреторный продукт из этих клеток представляет собой рецептор или включает рецептор. Другими словами, это означает, что стволовые клетки жировой ткани имеют способность реагировать со специфическим хемокином или фактором роста.
Факторы роста относятся к группе полипептидов, которые стимулируют деление, рост и дифференциацию различных клеток, и известно, что они вовлечены в клеточную сигнализацию. Факторы роста подразделяют на семейства в соответствии со структурным сходством и действием на клетки-мишени с помощью таких механизмов, как аутокринный, паракринный, эндокринный и т.п. Рецепторы фактора роста, в общем, обладают активностью тирозинкиназы во внутриклеточной области, и когда они связываются с лигандом рецептора, то сами рецепторы фактора роста или остатки тирозина внутриклеточных белков фосфорилируются и происходит пролиферация или дифференциация клеток.
2+
Хемокины составляют семейство небольших цитокинов, которые продуцируются при воспалении и регулируют рекрутинг лейкоцитов. Такие хемокины способны к селективной индукции хемотаксиса форменных элементы крови (отличных от эритроцитов), включая лейкоциты, таких как нейтрофилы, моноциты, макрофаги, эозинофилы, базофилы, тучные клетки и лимфоциты, такие как Т-клетки и В-клетки. Помимо стимуляции хемотаксиса, другие изменения могут быть селективно индуцированы хемокинами в компетентных клетках, включая изменения в форме клеток, кратковременные повышения во внутриклеточной концентрации свободных ионов кальций (Са), экзоцитоз гранул, интеграцию повышающей регуляции, образование биоактивных липидов (например, лейкотриенов) и окислительный взрыв, связанный с активацией лейкоцитов. Таким образом, хемокины представляют собой ранних инициаторов воспалительного ответа, вызывая выход воспалительных медиаторов, хемотаксис и экстравазацию в места инфекции или воспаления.
В общем, взаимодействия хемокин/рецептор имеют тенденцию быть нерегулярными в том смысле, что один хемокин может связываться со многими рецепторами хемокинов, и, наоборот, единственный рецептор хемокина может взаимодействовать с несколькими хемокинами. Существует много аспектов передачи сигнала через рецептор хемокина и селективности к лигандам, которые не ранее не были ясны.
Основываясь на новых данных о том, что взрослые стволовые клетки из жировой ткани и секретируемые ими продукты демонстрируют функцию таких рецепторов хемокинов, настоящее изобретение ставит своей целью применить функцию взрослых стволовых клеток из жировой ткани, которые мигрируют к месту инфекции или воспаления (т.е. к пораженному участку) в ответ на специфический хемокин, который экспрессируется в пораженном участке (эту миграцию также называют «нацеленной миграцией»). В настоящем изобретении рассматривают ответы не только для хемокинов, но также для специфических факторов роста. Точнее, взрослые стволовые клетки из жировой ткани отлично отвечают на хемокины или факторы роста, выбираемых из группы, состоящей из Rantes, МСР-1 (белок-хемоаттрактант-1 моноцитов), MIP-3β (воспалительный белок-3β моноцитов), SDF-1α (стромальных клеток фактор-1α), ВСА-1 (привлекающий В-клетки хемокин-1), CXCL16 (хемокиновый (С-Х-С-мотив) лиганд 16), EGF (эндотелиальный фактор роста), b-FGF (основной фактор роста фибробластов), HGF (фактор роста гепатоцитов), TGF-β1 (трансформирующий фактор роста бета 1), IGF-1 (инсулиноподобный фактор роста 1), PDGF-AB (фактор роста тромбоцитов АВ) и TNF-α (фактор некроза опухолей-α).
С целью увеличить способность клеток мигрировать путем взаимодействия хемокинов или факторов роста и их рецепторов, композиция настоящего изобретения может дополнительно содержать FBS. Предпочтительно, композиция содержит примерно 30% FBS. Следует понимать, что если даже композиция не содержит FBS, то при введении в организм она может использовать находящийся в организме FBS.
В то же время, с целью увеличить уровень экспрессии или реакцию взрослых стволовых клеток из жировой ткани и/или рецептора секреторного продукта взрослых стволовых клеток из жировой ткани, взрослые стволовые клетки из жировой ткани предпочтительно примируют смесью, содержащей хемокин или фактор роста.
В особенности, смесь предпочтительно может содержать один или несколько факторов, который выбирают из группы, состоящей из Rantes, МСР-1 (белок-хемоаттрактант-1 моноцитов), MIP-3β (воспалительный белок-3β моноцитов), SDF-1α (стромальных клеток фактор-1α), ВСА-1 (привлекающий В-клетки хемокин-1), CXCL16 (хемокиновый (С-Х-С-мотив) лиганд 16), EGF (эндотелиальный фактор роста), b-FGF (основной фактор роста фибробластов), HGF (фактор роста гепатоцитов), TGF-β1 (трансформирующий фактор роста бета 1), IGF-1 (инсулиноподобный фактор роста 1), PDGF-AB (фактор роста тромбоцитов АВ) и TNF-α (фактор некроза опухолей-α). Смесь более предпочтительно может содержать один или несколько факторов, выбираемых из группы, состоящей из Rantes, SDF-1α (стромальных клеток фактор-1α), HGF (фактор роста гепатоцитов), TNF-α (фактор некроза опухолей-α), PDGF-AB (фактор роста тромбоцитов АВ) и TGF-β1 (трансформирующий фактор роста бета 1).
Как можно видеть в примере 5 настоящего изобретения, в случае взрослых стволовых клеток из жировой ткани, примированных специфическим хемокином или фактором роста, и/или в случае секреторного продукта клеток, миграция клеток в ответ на хемокин или фактор роста значительно возрастает.
Таким образом, в другом аспекте настоящее изобретение направлено на способ индукции миграции взрослых стволовых клеток жировой ткани, способ, включающий следующие стадии:
(a) примирование взрослых стволовых клеток жировой ткани смесью, содержащей хемокин или фактор роста; и
(b) введение композиции, содержащей примированные взрослые стволовые клетки жировой ткани и секретируемые ими продукты, в участок in vivo, который не находится в прямом контакте с пораженным участком.
В способе настоящего изобретения, стадия (а) примирования взрослых стволовых клеток смесью, содержащей хемокин или фактор роста, может быть проведена путем выращивания взрослых стволовых клеток в среде, содержащей хемокин или фактор роста. Примирование взрослых стволовых клеток проводят в течение примерно 20-60 часов, предпочтительно примерно 20-50 часов. В одном из воплощений настоящего изобретения, примирование взрослых стволовых клеток проводят в течение примерно 24-х часов. Кроме того, примирование стволовых клеток жировой ткани смесью проводят перед выращиванием, в процессе или после выращивания стволовых клеток жировой ткани. Предпочтительно его проводят после выращивания стволовых клеток жировой ткани.
Смесь предпочтительно может содержать один или несколько факторов, выбираемых из группы, состоящей из Rantes, МСР-1 (белок-хемоаттрактант-1 моноцитов), MIP-3β (воспалительный белок-3β моноцитов), SDF-1α (стромальных клеток фактор-1α), ВСА-1 (привлекающий В-клетки хемокин-1), CXCL16 (хемокиновый (С-Х-С-мотив) лиганд 16), EGF (эндотелиальный фактор роста), b-FGF (основной фактор роста фибробластов), HGF (фактор роста гепатоцитов), TGF-β1 (трансформирующий фактор роста бета 1), IGF-1 (инсулиноподобный фактор роста 1), PDGF-AB (фактор роста тромбоцитов АВ) и TNF-α (фактор некроза опухолей-α). Более предпочтительно, смесь может содержать один или несколько факторов, выбираемых из группы, состоящей из Rantes, SDF-1α (стромальных клеток фактор-1α), HGF (фактор роста гепатоцитов), TNF-α (фактор некроза опухолей-α), PDGF-AB (фактор роста тромбоцитов АВ) и TGF-β1 (трансформирующий фактор роста бета 1).
Кроме того, композиция, содержащая примированные взрослые стволовые клетки жировой ткани и/или секретируемые ими продукты, которые применяют на стадии (b), может представлять собой или композицию, содержащую все примированные стволовые клетки жировой ткани, секретируемые продукты и среду, или композицию, содержащую секретируемые продукты и среда без примированных стволовых клеток жировой ткани, или композицию, содержащую примированные стволовые клетки жировой ткани без секретируемых продуктов и среды. Таким образом, примированные стволовые клетки жировой ткани, секретируемые продукты и среда могут быть применены различными путями, но особо не ограничиваются.
Кроме того, как применено в настоящей заявке, выражение «введение композиции в участок in vivo, который не находится в прямом контакте с пораженным участком» означает размещение стволовых клеток в субъекте способами или путями, индуцирующими, по меньшей мере, частичную локализацию стволовых клеток в участках, отличных от пораженного участка, исключая способ трансплантации стволовых клеток в пораженный участок. Композиция настоящего изобретения может быть введена субъекту любым подходящим способом, таким чтобы она была доставлена в желаемое место в субъекте, в котором некоторые компоненты клеток по-прежнему жизнеспособны. Как применено в настоящей заявке, термин «введение» может быть применен взаимозаменяемо с термином «введение», «доставка», «размещение» или т.п. Для клинического введения, композиция настоящего изобретения может быть введена парентерально, например, с помощью внутримышечной или внутривенной инъекции. Наиболее предпочтительно, композиция настоящего изобретения вводят путем внутривенной инъекции.
Таким образом, настоящее изобретение направлено на способ индукции миграции взрослых стволовых клеток жировой ткани, способ, включающий внутривенное введение композиции, содержащей взрослые стволовые клетки жировой ткани, примированные хемокином или фактором роста, и/или секретируемый ими продукт.
В еще одном аспекте настоящее изобретение направлено на способ индукции нацеленной миграции взрослых стволовых клеток жировой ткани, позволяющей клеткам достичь пораженного участка, воздействуя, таким образом, на пораженный участок. Таким образом, настоящее изобретение направлено на клеточное терапевтическое средство, содержащее, в качестве активных ингредиентов, взрослые стволовые клетки жировой ткани и секретируемые ими продукты, и способ применения клеточного терапевтического средства для лечения пораженного участка.
Если не указано иначе, термин «лечить», как применен в настоящей заявке, означает обращение, снижение, торможение прогресса или предупреждение нарушения или состояния, к которому применим такой термин, или одного или нескольких симптомов такого нарушения или состояния. Термин «лечение», как применено в настоящей заявке, относится к акту воздействия, такому как «лечить», определенному непосредственно выше. Таким образом, как применено в настоящей заявке, «лечить» или «лечение» заболевания у млекопитающего включает одно или несколько из следующего:
(1) торможение роста заболевания, т.е. остановка его развития;
(2) предупреждение распространения заболевания, т.е. предупреждение метастазов;
(3) ослабление заболевание, т.е. вызывает регрессию рака;
(4) предупреждение рецидива заболевания; и
(5) смягчение симптомов заболевания.
Для того чтобы лечить пораженный участок, позволяя стволовым клеткам мигрировать в пораженный участок, композицию настоящего изобретения вводят в фармацевтически эффективном количестве.
Как применено в настоящей заявке, термин «терапевтически эффективное количество» означает, такое количество соединения, которое после введения, смягчает до некоторой степени один или несколько симптомов заболевания, которое лечат. Следовательно, терапевтически эффективное количество относится к такому количеству, которое производит следующий эффект: (1) обращение скорости прогрессирования заболевания; (2) торможение прогрессирования заболевания до некоторой степени; или (3) облегчение (предпочтительно, устранение) до некоторой степени одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием.
Композиция (клеточное терапевтическое средство) настоящего изобретения в клинической практике может быть введено парентерально, например внутримышечно или внутривенно. Наиболее предпочтительно композицию настоящего изобретения вводят с помощью внутривенной инъекции.
Для инъекции композиция настоящего изобретения предпочтительно может находиться в составе фармакологически приемлемого буфера, такого как раствор Хенкса, раствор Рингера или физиологический солевой буфер. Для чресслизистого введения в композиции применяют неинвазивные средства, подходящие для преодоления барьера, через который композиция буде проходить. Такие неинвазивные средства, в общем, известны в этой области техники.
Композиции для парентерального введения включают стерилизованные водные растворы, неводные растворители, суспендирующие средства, эмульгаторы. Суспендирующие средства и эмульгаторы, которые могут быть применены в настоящем изобретении, включают растительные масла, такие как пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и оливковое масло, и сложный эфир, применяемый для инъекций, такой как этилолеат.
4
10
6
8
8
9
Для людей клеточное терапевтическое средство настоящего изобретения обычно может быть введено один или несколько раз в дозе, равной 10-10 клеток/организм и предпочтительно 10-10 клетки/организм. В особенности, композиция настоящего изобретения предпочтительно содержит взрослые стволовые клетки в концентрации, равной от 1×10 клеток/100 мкл до 1×10 клеток/100 мкл.
Однако следует понимать, что фактическую дозу активного ингредиента композиции следует устанавливать в соответствии с различными имеющими отношение факторами, включая заболевание, которое предстоит лечить, способ введения, возраст, пол и массу тела пациента, и тяжесть заболевания. Таким образом, вышеуказанная доза не ограничивает каким-либо образом объем настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
В дальнейшем в этом документе, настоящее изобретение будет описано подробнее с отсылкой к примерам. Специалистам в этой области техники понятно, что эти примеры даны только для иллюстративных целей и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Источники сред и реагентов, примененные в приведенных ниже примерах, показаны в представленной ниже таблице 1.
Таблица 1
Наименование
Компания
Аскорбиновая кислота
«Sigma»
США
СаСl<sub>2</sub>
«Sigma»
США
Коллагеназа типа I
«Gibco»
США
DMEM
«Gibco»
США
DPBS
«Welgene»
Корея
EGF
«Gibco»
США
FBS
«Gibco»
США
Гидрокортизон
«Sigma»
США
Инсулин
«Gibco»
США
K-SFM
«Gibco»
США
NAC
«Sigma»
США
Пример 1: Выделение мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани человека
Жировую ткань человека изолируют из абдоминального жира путем липосакции и промывают в PBS. Изолированную ткань мелко нарезают и затем переваривают в среде DMEM, дополненной коллагеназой типа 1 (1 мг/мл) при 37°С в течение 2-х часов. После промывания в PBS переваренную ткань центрифугируют при 1000 rpm в течение 5-ти минут. Супернатант отсасывают и осадки, остающиеся на дне, промывают PBS и затем центрифугируют при 1000 rpm в течение 5-ти минут. Полученные клетки фильтруют через 100-мкм сетчатый фильтр для удаления дебриса, после чего клетки промывают PBS и затем растят в течение ночи в DMEM (10% FBS, 2 мМ NAC, 0,2 мМ аскорбиновая кислота).
Затем неприкрепившиеся клетки удаляют промыванием с PBS и оставшиеся клетки пересевают, заменяя с 2-дневными интервалами среду средой Keratinocyte-SFM (содержащей 5% FBS, 2 мМ NAC, 0,2 мМ аскорбиновую кислоту, 0,09 мМ кальций, 5 нг/мл rEGF, 5 мкг/мл инсулина и 74 нг/мл гидрокортизона), изолируя, таким образом, мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани.
4
Пример 2: Индукция миграции стволовых клеток жировой ткани 2-1: Индукция клеточной миграции хемокинами или факторами роста, приведенными в таблице 2. Мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани, изолированные по примеру 1, высевают в каждую лунку в концентрации, равной 2×10 клетки/200 мкл, и индуцируют миграцию хемокинами или факторами роста, приведенными в представленной ниже таблице 2. В качестве группы позитивного контроля применяют 30% FBS.
Таблица 2
30% FBS
ВСА-1
TGF-β1
Rantes
CXCL16
IGF-1
MCP-1
EGF
PDGF-AB
MIP-3β
b-FGF
TNF-α
SDF-1α
HGF
Фиг.1 показывает результаты индукции миграции клеток. В качестве группы негативного контроля применяют клетки, миграцию которых индуцировали средой, и в качестве группы позитивного контроля применяют клетки, миграцию которых индуцировали 30% FBS. Результаты индукции миграции клеток рассчитывают как процент по отношению к группе отрицательного контроля, которую принимают за 100%, и результаты расчетов графически показаны на фиг.1. Как можно видеть на фиг.1, мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани (AdMSC) активно мигрируют в ответ на стимуляцию хемокинами или факторами роста, таким же образом, как в ответ на стимуляцию 30%-ной FBS. В особенности, клетки активно индуцируются к миграции в ответ на Rantes, SDF-1α, HGF, TGF-β1, IGF-1, PDGF-AB или TNF-α.
2-2: Получение изображения клеток, индуцируемых к миграции другими хемокинами или факторами роста
Мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани, изолированные по примеру 1, примируют свободной от FBS средой (фиг.2а), TNF-a (фиг.2b и 2С) или хемотаксическим фактором (фиг.2d) в течение 24-х часов и культивируют. Затем клетки изолируют, обрабатывая смесью 0,25% трипсин/1 мМ EDTA, после чего эти клетки промывают PBS и собирают центрифугированием при 1500 rpm в течение 5-ти минут.
4
2
2
Затем вкладыши Трансвелл (Costar, 3422) покрывают 0,1% желатином («Sigma-Aldrich») в течение 2-х часов и помещают в содержащий среду 24-луночный планшет. Собранные стволовые клетки жировой ткани высевают в каждый вкладыш в концентрации, равной 2×10 клетки /200 мкл, и выращивают в инкубаторе с 5%-ным СО при 37°С в течение 2-х часов. Затем засеянный вкладыш переносят в 24-луночный планшет, содержащий каждое из следующего: среда, хемокины и факторы роста в концентрации, равной 100 нг/мл. Затем клетки выращивают в инкубаторе с 5%-ным СO при 37°С в течение 24-х часов. Затем немигрировавшие стволовые клетки жировой ткани, присутствующие в верхней части вкладыша, удаляют ватной палочкой, и оставшиеся клетки промывают и затем иммобилизуют 70% метанолом в течение 1-го часа.
Затем клетки окрашивают 0,5%-ным раствором кристаллического фиолетового в течение 1-го часа. Затем клетки промывают и затем получают их изображения под микроскопом при увеличении XI00.
В результате, как можно видеть на фиг.2a-2d, скорость миграции примированных стволовых клеток жировой ткани (фиг.2c и 2d) была выше, чем скорость миграции непримированных стволовых клеток жировой ткани (фиг.2a и 2b), указывая на то, примированные клетки были плотными.
Пример 3: Миграция стволовых клеток жировой ткани, примированных хемокинами или факторами роста
4
Мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани, изолированные по примеру 1, примированные в течение 24-х часов хемокинами или факторами роста, представленными в приведенной ниже таблице 3. Примированные клетки высевают в каждую лунку в концентрации, равной 2×10 клеток/200 мкл, и миграцию клеток индуцируют 10%-ной FBS с целью установить различие с индукцией миграции клеток под действием 30%-ной FBS. Кроме того, в качестве группы негативного контроля применяют непримированные мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани (необработанные клетки).
Таблица 3
Rantes
TNF-α
SDF-1α
PDGF-AB
HGF
TGF-β1
Фиг.3 показывает результаты индукции миграции клеток. Исходя из числа мигрировавших клеток, как показано на фиг.3, можно видеть, что среди мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани (AdMSC), примированных различными хемокинами или факторами роста, те клетки, которые были примированы PDGF-AB или TNF-α, были более активно индуцированы к миграции под действием 10%-ной FBS. В особенности, клетки, примированные TNF-α, были наиболее активно индуцированы к миграции.
Пример 4: Миграция стволовых клеток жировой ткани, примированных TNF-α
4
С отсылкой к результатам опыта, полученным в примере 3, мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани, изолированные по примеру 1, примируют TNF-α в течение 24-х часов. Примированные клетки высевают в каждую лунку в концентрации, равной 2×10 клеток/200 мкл, и индуцируют к миграции под действием различных хемокинов или факторов роста, показанных в приведенной ниже таблице 4.
Таблица 4
FBS (нет)
ВСА-1
TGF-β1
Rantes
CXCL16
IGF-1
МСР-1
EGF
PDGF-AB
МГР-3β
b-FGF
TNF-α
SDF-1α
HGF
Фиг.4 показывает результаты индукции миграции клеток. Как можно видеть на фиг.4, Rantes, SDF-1α, EGF, β-FGF, TGF-β1, PDGF-AB и т.п. активно индуцируют к миграции мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани (AdMSC), примированные TNF-α. В особенности, если результаты, приведенные на фиг.4, сравнить с результатами, приведенными на фиг.1, относящейся к результатам по примеру 1, то можно продемонстрировать эффект примирования под действием TNF-α. Точнее говоря, можно видеть, что если клетки примируют TNF-α, то миграция клеток становится активной.
Пример 5: Примирование стволовых клеток жировой ткани различными хемокинами или факторами роста и способность хемокинов или факторов роста индуцировать миграцию клеток
4
Мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани, изолированные по примеру 1, примируют хемокинами или факторами роста, показанными в приведенной ниже таблице 5, в течение примерно 24-х часов. Примированные клетки высевают в каждую лунку в концентрации, равной 2×10 клеток/200 мкл, и индуцируют к миграции, применяя те же хемокины или факторы роста, которые применяли при примировании.
Таблица 5
FBS 30%
ВСА-1
TGF-β1
Rantes
CXCL16
IGF-1
МСР-1
EGF
PDGF-AB
МГР-3β
b-FGF
TNF-α
SDF-1α
HGF
Фиг.5 показывает результаты индукции миграции клеток. На фиг.5, белые столбики означают непримированные клетки, и черные столбики означают число клеток, которые мигрируют в результате примирования хемокинами или факторами роста. Как можно видеть на фиг.5, миграция стволовых клеток жировой ткани, примированных Rantes, МГР-3β, SDF-1α, BCA-1, CXCL16, EGF, PDGF-AB или им подобными, была улучшена по сравнению с миграцией непримированных стволовых клеток жировой ткани. В особенности, способность клеток к миграции значительно увеличилась при примировании Rantes, SDF-1α, BCA-1, CXCL16 или PDGF-AB.
Пример 6: Экспрессия рецепторов хемокинов или факторов роста в стволовых клетках жировой ткани
Экспрессируют ли мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани, полученные по примеру 1, соответствующие рецепторы хемокинов или факторов роста, исследовали с помощью антител на соответствующие рецепторы методом проточной цитометрии (FACS).
Названия рецепторов и лигандов для хемокинов или факторов роста показаны в представленной ниже таблице 6.
Таблица 6
Рецепторы
Хемокины или факторы роста
Лиганды
CCR1
RANTES
CCL5
CCR2
МСР-1
CCL2
CCR7
Mip-3β
CCL19
CXCR4
SDF-1α
CXCL 12
CXCR5
BCA-1
CXCL13
CXCR6
CXCL 16
CXCL 16
EGF
EGFR
b-FGF
FGFR1
HGF
c-MET
TGF-β1
TGFBR2
IGF-1
IGF1R
PDGF-AB
PDGFRA, PDGFRB
TNF-α
TNFRSF1A
Стволовые клетки жировой ткани выращивают во флаконе Т75. После того как степень смыкания монослоя достигает 90%, клетки изолируют, обрабатывая их смесью 0,25% трипсин/1 мМ ЭДТА, после чего клетки промывают PBS и собирают центрифугированием при 1500 rpm в течение 5-ти минут. Собранные клетки иммобилизуют 10%-ным раствором FBS в холодильнике при 4°С в течение 1-го часа или более и затем промывают. Затем клетки инкубируют с антителами, перечисленными в приведенной ниже таблице 7, и анализируют с помощью FACS.
Таблица 7
Антитела
Компания
Серийный номер
анти-CCRl человека
«R&D Systems»
MAB145
aHTH-CCR2 человека
«R&D Systems»
MAB150
анти-ССК7 человека
«R&D Systems»
MAB197
aHTH-CXCR4 человека
«R&D Systems»
MAB170
aHTH-CXCR5 человека
«R&D Systems»
MAB190
aHTH-CXCR6 человека
«R&D Systems»
MAB699
анти-ЕОР-рецептор человека
«BD Pharmingen»
555997
TGFp RII (D-2)
«Santa Cruz Biotechnology»
sc-1779949
CD140a-PDGFRA
«BD Pharmingen»
556002
CD 140b-PDGFRB
«BD Pharmingen»
558821
CD221-IGF1R
«BD Pharmingen»
555999
анти-HGF R/c-MET человека
«R&D Systems»
FAB3582F
CD 120a-TNFRSF 1A
«BD Pharmingen»
550514
FGFR1 антитело [M19B2]
« Abeam »
ab823
Фиг.6 показывает результаты анализа. На фиг.6, темные области обозначают тестируемую группу, и черные линии обозначают контрольную группу. Рецепторы для IGF-1 и HGF не были подтверждены, и, таким образом, для того чтобы подтвердить функцию антител, культивируют клеточную линию А549 рака легких, приобретенную в Банке клеточных линий, и затем анализируют с помощью проточной цитометрии (FACS).
Как можно видеть из результатов, полученных с помощью FACS, приведенных на фиг.6, примированные мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани экспрессируют рецепторы для Rantes (CCR1), МГР-3β (CCR7), SDF-1α (CXCR1), ВСА-1 (CXCR5), CXCL16, EGF, TGF, PDGF-AB, IGF-1, TNF-α и FGF.
Вышеуказанные результаты подтвердили то, что в мультипотентных мезенхимальных стволовых клетках жировой ткани экспрессируются рецепторы для специфических хемокинов или факторов роста и что эти рецепторы отвечают на соответствующие хемокины или факторы роста, а также то, что уровень экспрессии рецепторов увеличивается путем примирования соответствующими хемокинами или факторами роста. Это означает, что направленная миграция мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани к пораженному участку in vivo может быть включена путем взаимодействия между хемокинами или факторами роста и их рецепторами, осуществляя тем самым эффективное лечение заболевания, относящегося к пораженному участку.
Пример 7: Определение мРНК хемокинов или рецепторов фактора роста в стволовых клетках жировой ткани
Экспрессируют ли мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани, полученные по примеру 1, мРНК соответствующего хемокина или рецепторов фактора роста, определяют с помощью RT-PCR.
Стволовые клетки жировой ткани, выращенные во флаконе Т75, изолируют, обрабатывая их смесью 0,25% трипсин/1 мМ ЭДТА, и затем промывают PBS, после этого клетки собирают центрифугированием при 1500 rpm в течение 5-ти минут. Общую РНК экстрагируют из собранных клеток, применяя набор для экстракции общей РНК («iNtRON Biotechnology »).
2 мкг РНК синтезируют в кДНК с помощью набора «Maxime RT Pre-mix kit» («iNtRON Biotechnology»). 1 мкл кДНК денатурируют в буфере IX h-Taq, 0,2 мМ dNTP, 0,4 пМ прямой праймер, 0,4 пМ обратный праймер и 0,25 Ед./мкл h-Taq ДНК-полимеразы («Solgent») при 95°С в течение 20-ти секунд, после этого праймеры нагревают при каждой температуре отжига, показанной в таблице 8, в течение 40 секунд и PCR-продукт наращивают при 72°С в течение 1 минуты, таким образом осуществляя амплификацию кДНК. PCR-амплификацию проводят в течение 40 циклов. Температуры нагрева праймеров рецепторов, примененных в PCR-амплификацию, показаны в приведенной ниже таблице 8.
Таблица 8
Рецепторы
SEQ ID№: 1-34(F: прямой, R: обратный)
Продукты
Температура отжига
CCR1
F: 5'-CATCTTGGCTTCCATGCCAGGCT-3' R: 5'-CCTCCGTCACTTGCACAGCCAGGT-3'
380bp
62°C
CCR2
F: 5'-CCTCCTGACAATCGATAGATACCT-3' R: 5'-GTCACCTGCGTGGCTTGGTCCAGT-3'
474bp
56°C
CCR7
F: 5'-ATCTCCAAGACCAGAGATAGTG-3' R: 5'-AAATGTTGCTCTCTTAACGAAT-3'
461 bp
62°C
CXCR4
F: 5'-GAGGAGTTAGCCAAGATGTG-3' R: 5'-TTCTTCTGGTAACCCATGAC-3'
489bp
62°C
CXCR5
F: 5'-CATCCTAATCATCCAATGCT-3' R: 5'-AGCTCTTTTCTTCCCTCTGT-3'
494bp
62°C
CXCR6
F: 5'-CCTTAACCCTGTGCTCTATG-3' R: 5'-CTCACCTCTTCAACCTTCAG-3'
517bp
62°C
EGFR
F: 5'-GCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCA-3' R: 5 '-GATTCCGTCATATGGCTTGGATCCA-3'
419bp
64°C
FGFR1
F: 5'-CCTGACCACAGAATTGGAGGCTACA-3' R: 5'-AGTTCATGTGTAAGGTGTACAGTG-3'
250bp
58°C
TGFBR2
F: 5'-CCACGTGTGCCAACAACATCAACCA-3' R: 5'-TGAAGAACGACCTAACCTGCTGCC-3'
498bp
58°C
CD 120а -
F: 5'-GAGAGGCCATAGCTGTCTGG-3'
218bp
58°C
TNFRSF1A
R: 5'-GTTCCTTTGTGGCACTTGGT-3'
CD 140a -PDGFRA
F: 5'-GAAGCTGTCAACCTGCATGA-3' R: 5'-CTTCTTTAGCACGGATCAGC-3'
187bp
58°C
CD 140b -PDGFRB
F: 5'-GCGGCTGGTGGAGCCGGTGACTGA-3' R: 5'-CTCACTTAGCTCCAGCACTCGGACA-3'
508bp
68°C
CD221 -IGF1R
F: 5'-GTGAACGAGGCCGCAAGCATGCGT-3' R: 5' -CTGTGGACGAACTTATTGGCGTTGA-3'
299bp
58°C
c-MET
F: 5' -CAGGCAGTGCAGCATGTAGT-3' R: 5'-GATGATTCCCTCGGTCAGAA-3'
201 bp
58°C
ADIPOR1
F: 5' -GCTGACACGGTGGAACTGGCTGAACT-3' R: 5- CTGTATGAATGCGGAAGATGCTCTTGA-3'
337bp
60°C
ADIPOR2
F: 5' -GGCAACATTTGGACACATCTCTTAGGT-3' R: 5- CAGCTCCTGTGATGTAGAGGCTGGCCA-3'
538bp
60°C
GAPDH
F: 5'-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3' R: 5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTCT-3'
362bp
55°C
PCR продукты разделяют с помощью электрофореза с маркерами молекулярных масс ДНК из набора « Sizer DNA Marker-50» («iNtRON») в 2,0%-ном агарозном геле и IX ТАЕ-реагенте при 110 В в течение 1 часа и 30 минут и затем визуализируют с помощью программного обеспечения «Fuji molecular imaging». В качестве контрольного гена применяют GAPDH. Все PCR-продукты секвенируют с помощью компании «Solgent Co., Ltd.», и в результате было определено, что PCR-продукты имеют идентичность последовательностей, равную 99% или выше.
Как можно видеть из результатов, представленных на фиг.7, мРНК рецепторов для хемокинов или факторов роста экспрессируются в стволовых клетках жировой ткани. На фиг.7А, линия 1: CCR1 (380 bp), линия 2: CCR2 (474 bp), линия 3: CCR7 (461 bp), линия 4: CXCR4 (489 bp), линия 5: CXCR5 (494 bp), линия 6: CXCR6 (517 bp) и линия 7: GAPDH (362 bp). На фиг.7В, линия М: маркер, линия 1: EGFR (419 bp), линия 2: TGFBR2 (498 bp), линия 3: PDGFRA (187 bp), линия 4: PDGFRB (508 bp), линия 5: IGF1R (299 bp; не экспрессируется), 6: c-MET (201 bp), линия 7: TNFRSF1A (218 bp), линия 8: FGFR1 (250 bp) и линия 9: GAPDH (362 bp). В этом примере, GAPDH применяют в качестве группы позитивного контроля.
Вышеуказанные результаты подтвердили то, что мРНК рецепторов специфических хемокинов или факторов роста экспрессируются в стволовых клетках жировой ткани. Это означает, что направленная миграция стволовых клеток жировой ткани к пораженному участку in vivo может быть включена путем взаимодействия между хемокинами или факторами роста и их рецепторами, осуществляя тем самым эффективное лечение заболевания, относящегося к пораженному участку.
Пример 8: Примирование стволовых клеток жировой ткани адипонектином и исследование способности адипонектина в различных концентрациях индуцировать миграцию клеток
8-1: Исследование способности адипонектина в различных концентрациях индуцировать миграцию клеток
Мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани, изолированные по примеру 1, примируют адипонектином в течение 24-х часов. Примированные клетки индуцируют к миграции, обрабатывая их адипонектином в различных концентрациях (1 нг/мл, 10 нг/мл и 100 нг/мл).
Фиг.8 показывает результаты индукции миграции клеток. Как можно видеть на фигуре 8, миграция клеток, обработанных 100 нг/мл адипонектина, была примерно в два раза выше, чем миграция клеток, обработанных 10 нг/мл адипонектина. Это означает, что способность адипонектина индуцировать миграцию клеток возрастает с ростом его концентрации.
8-2: Экспрессия рецептора адипонектина в стволовых клетках жировой ткани
Экспрессируется ли рецептор адипонектина в стволовых клетках жировой ткани, устанавливали с помощью RT-PCR, таким же способом, как описан в примере 7, применяя праймеры и температуры отжига, показанные в вышеприведенной таблице 8.
В результате, как можно видеть на фиг.9, в стволовых клетках жировой ткани экспрессируются два типа рецепторов адипонектина (1: ADIPOR1 (337 bp) и 2: ADIPOR2 (538 bp)). Таким образом, было подтверждено, что примирование клеток жировой ткани адипонектином приводит к такому увеличению уровня экспрессии рецептора адипонектина в клетках, что взаимодействие между адипонектином и рецептором адипонектина может быть применено для лечения заболевания.
Хотя настоящее изобретение было описано подробно с отсылкой к специфическим признакам, специалистам в этой области техники ясно, что это описание дано только для предпочтительного воплощения и не ограничивает объем настоящего изобретения. Таким образом, фактический объем настоящего изобретения будет определяться прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.
Промышленная применимость
Настоящее изобретение относится к способности взрослых стволовых клеток жировой ткани и секретируемых ими продуктов мигрировать. В соответствии с настоящим изобретением взрослые стволовые клетки жировой ткани, примированные специфическим хемокином или фактором роста, или секретируемые ими продукты могут быть введены с помощью простого способа, такого как внутривенное введение, и могут быть нацелены на пораженный участок, который нуждается в трансплантации стволовых клеток, и мигрируют к пораженному участку. Таким образом, взрослые стволовые клетки жировой ткани или секретируемые ими продукты в соответствии с настоящим изобретением очень полезны в качестве клеточного терапевтического средства, которое надежно мигрирует к пораженному участку без сложной хирургической операции и демонстрирует лечебный эффект в пораженном участке.