Ассоциация штаммов бактерий для получения микробной белковой биомассы (варианты)
ASSOCIATION OF BACTERIAL STRAINS TO OBTAIN MICROBIAL PROTEIN BIOMASS (OPTIONS)

Изобретение относится к области биотехнологии и касается представленной в двух вариантах ассоциации штаммов бактерий для получения микробной белковой биомассы, служащей основой для производства кормового белка, как белково-витаминного комплекса для сельскохозяйственных животных, птиц и рыб.
В качестве продуцентов белковой биомассы могут применяться различные микроорганизмы: бактерии, дрожжи, грибы, водоросли, способные использовать широкий спектр субстратов. Достаточно часто в качестве продуцентов белка в виде микробной биомассы используют бактерии. Эффективность их применения определяется тем, что бактерии образуют до 70-79% белка по массе, что позволяет рассматривать их как наиболее перспективные продуценты.
Для получения качественного белкового кормового продукта часто используют метанокисляющие бактерии. Метанотрофные бактерии активно перерабатывают метан природного газа, быстро размножаются и наращивают биомассу, богатую ценным белком, витаминами и иными биологически активными веществами. Использование метана для получения белка микроорганизмов имеет преимущества, обусловленные большими запасами природного газа и его транспортабельностью.
Известны различные штаммы бактерий, используемые в качестве продуцентов кормового белка, относящиеся к роду Methylococcus, в том числе: Methylococcus capsulatus ВСБ-874 (А.с. СССР №770200, C12N 15/00, 1979 г.), Methylococcus capsulatus ГБС-15 (патент РФ №2613365, C12N 1/20, 2016 г.), Methylococcus capsulatus ВКМ В-3289Д (патент РФ №2706074, C12N 1/20, 2018 г.), Methylococcus capsulatus BF 19-07 (патент РФ №2745093, C12N 1/20, 2020 г.).
Используемые штаммы имеют свои особенности. В качестве единственного источника углерода может использоваться как чистый метан, так и метан в составе природного газа, содержащего также гомологи метана (например, этан, пропан, бутан и т.д.). В ходе процесса ферментации происходит накопление продуктов метаболизма, что негативно сказывается на жизнедеятельности и продуктивности метанотрофа. В результате длительной ферментации происходит зарастание чистой культуры Methylococcus посторонней микрофлорой и формируется ассоциация штамма-продуцента с гетеротрофными бактериями. В таком сообществе метанотроф является продуцентом, а гетеротрофные бактерии консументами. Так как органические вещества в образующейся трофической цепи поступают только за счет деятельности метанотрофа, то он является регулятором численности остальных компонентов ассоциации. Гетеротрофные бактерии в свою очередь, поглощая органические вещества, выделяемые Methylococcus capsulatus, снижают их ингибирующее действие на рост штамма-продуцента.
Известна «Белковая кормовая добавка для сельскохозяйственных животных и рыб» (патент РФ №2717991, A23K 10/10,2019 г.), которая представляет собой высушенную инактивированную биомассу ассоциации метанокисляющих и гетеротрофных бактерий. Добавка содержит биомассу штамма метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15 ВКПМ В-12549 и биомассу штамма гетеротрофных бактерий Cupriavidus gilardii GBS-15-1 ВКМ B-3265D при их соотношении в масс. % (85-99,9):(0,1-15), а также может дополнительно содержать биомассу «ассоциантов» - штамма гетеротрофных бактерий Stenotrophomonas acidaminiphila GBS-15-2 VKM B-3264D и/или биомассу штамма гетеротрофных бактерий Klebsiella pneumonia 1-17 с депозитарным номером Государственной коллекции «ГКПМ-ОБОЛЕНСК» В-8465 при их существенно более низких количествах - не более 1-2 масс. %.
Сочетание и соотношения используемых штаммов в вышеописанной ассоциации микроорганизмов обеспечивают получение продукта, способствующего повышению привесов животных и улучшению их физиологического состояния. Получаемая белковая кормовая добавка применяется для балансирования кормов сельскохозяйственных животных, птицы и выращиваемых в искусственных водоемах рыб, способствует увеличению живой массы животных.
Данное изобретение по своей технической сущности является наиболее близким аналогом заявляемого изобретения.
Задачей предлагаемого изобретения является создание новой устойчивой ассоциации штаммов бактерий и ее варианта, обеспечивающих повышение выхода микробной белковой биомассы в процессе культивирования продуцента белка, а также расширение арсенала микробных культур, пригодных для объединения их в ассоциации для биосинтеза белковой биомассы.
Техническим результатом, на достижение которого направлены варианты предлагаемого изобретения, является:
1. обеспечение жизнеспособности штамма-продуцента ассоциативными гетеротрофными культурами за счет утилизации органических веществ, образующихся в ходе процесса ферментации; расширение арсенала микробных культур, способных к эффективному биосинтезу микробного белка в составе микробной ассоциации;
2. повышение эффективности предлагаемой ассоциации штаммов бактерий и ее варианта в процессе биосинтеза микробной белковой биомассы, достижение стабильного выхода биомассы за счет формирования устойчивого саморегулируемого сообщества микроорганизмов.
Технический результат предлагаемого изобретения достигается при использовании новой описываемой ассоциации штаммов бактерий и ее варианта, включающих доминирующий штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13764 в качестве продуцента белка и штаммы-ассоцианты гетеротрофных бактерий:
Cupriavidus gilardii ВКПМ В-14232,
Stenotrophomonas acidaminiphila ВКПМ В-14233,
Brevibacillus agri ВКПМ В-14227,
Azospirillum doebereinerae ВКПМ В-14234
в качестве эффективного средства для получения микробной белковой биомассы, при этом количественные соотношения между штаммами в варианте 1 и варианте 2 различны.
В соответствии с первым вариантом изобретения, к использованию для биосинтеза микробной белковой биомассы предлагается описываемая ассоциация штаммов бактерий, полученная добавлением к чистой культуре Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13764 биомассы чистых культур штаммов-ассоциантов и вследствие этого содержащая доминирующий штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13764 - продуцент белка в количестве 88% от общего числа клеток и штаммы-ассоцианты гетеротрофных бактерий: Cupriavidus gilardii ВКПМ B-14232 в количестве 3% от общего числа клеток, Stenotrophomonas acidaminiphila ВКПМ В-14233 в количестве 3% от общего числа клеток, Brevibacillus agri ВКПМ В-14227 в количестве 3% от общего числа клеток и Azospirillum doebereinerae ВКПМ В-14234 в количестве 3% от общего числа клеток.
-1
-1
В соответствии со вторым вариантом изобретения, помимо вышеописанного варианта микробной ассоциации, возможен иной вариант ассоциации, полученный в результате выращивания доминирующего штамма метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13764 в нестерильных условиях при 42°С и рН 5,6-5,8 при коэффициенте скорости протока 0,26 ч - 0,28 ч и содержании данного штамма в количестве 70-85% от общего числа клеток совместно с гетеротрофными ассоциантами: штаммом Cupriavidus gilardii ВКПМ В-14232 при содержании его в количестве 4-6% от общего числа клеток, штаммом Stenotrophomonas acidaminiphila ВКПМ В-14233 при содержании его в количестве 2-6% от общего числа клеток, штаммом Brevibacillus agri ВКПМ В-14227 при содержании его в количестве 2-5% от общего числа клеток, штаммом Azospirillum doebereinerae ВКПМ В-14234 при содержании его в количестве 2-3% от общего числа клеток, а также при содержании прочей микрофлоры (непреднамеренно внесенной вместе с реактивами и водой) в количестве 5-10% от общего числа клеток.
В ходе процесса ферментации происходит накопление органических веществ (продуктов метаболизма, мертвых клеток, полисахаридов), что приводит к ингибированию роста основной культуры и, как следствие, к снижению ее продуктивности. Ферментационный процесс осуществляется в нестерильных условиях в непрерывном режиме, в результате чего происходит заражение посторонней микрофлорой.
Таким образом, к использованию для биосинтеза микробной белковой биомассы предлагается многокомпонентная ассоциативная культура в виде 2-х вариантов, содержащая в процессе культивирования одновременно вышеуказанные штаммы: штамм метанокисляющих бактерий и четыре штамма-ассоцианта гетеротрофных бактерий, а также по второму варианту изобретения сопутствующие микробные примеси, привносимые извне ввиду нестерильных условий подготовки и ведения процесса.
Штамм-продуцент Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13764 является автотрофным олиготрофным микроорганизмом. Единственным источником углерода для него является метан. Любые другие органические соединения, входящие в состав природного газа, на котором осуществляется культивирование, не только не потребляются Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13764, но и оказывают ингибирующее влияние на рост. Кроме того, продукты промежуточного окисления метана (первичные и вторичные метаболиты), отмершие клетки при культивировании чистой культуры также оказывают ингибирующее действие на рост продуцента, что в конечном итоге приводит к потере жизнеспособности культуры.
Используемые гетеротрофные ассоциативные бактерии потребляют органические вещества, присутствующие в качестве примесей в природном газе и образующиеся в ходе жизнедеятельности штамма-продуцента Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13764, тем самым обеспечивая жизнеспособность продуцента. Это создает условия для высокой продуктивности штамма-продуцента белка. Для того чтобы реализовать эти условия, необходимо учитывать особенности саморегуляции микробной ассоциации.
Культуры метанокисляющих и гетеротрофных бактерий получают раздельно по соответствующим правилам приготовления засевного материала. Первым начинают культивирование штамма-продуцента Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13764, затем, по достижении культурой АСВ 2-2,5 г/л вносят в ферментер одновременно культуры гетеротрофных штаммов-ассоциантов. При этом согласно установившимся методикам, количество засеваемых гетеротрофов обычно выбирают в пределах от 0,1 до 15% от общего числа клеток. В процессе совместного культивирования содержание клеток гетеротрофов в ферментационной среде, независимо от величины начальной посевной дозы, находится на уровне, определяемом количеством используемых продуктов, образующихся в результате жизнедеятельности штамма-продуцента, а также соокисления газообразных гомологов метана, содержащихся в природном газе. В условиях минеральной среды эти продукты являются единственным доступным источником углерода для не использующих метан гетеротрофных компонентов ассоциативной культуры, что является причиной саморегуляции культур микроорганизмов в процессе выращивания. Вследствие саморегуляции культур в процессе культивирования начальное соотношение клеток вносимых культур в засевном материале может быть признано несущественным, но рекомендуется вносить не окисляющих метан микроорганизмов-гетеротрофов в количестве не менее 0,1% и не более 15% от общего числа клеток.
Используемый в качестве продуцента белковой биомассы штамм Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13764 является известным, описан в патенте РФ №2745093, С12N 1/20, 2020 г.
4
2
4
4
2
2
2
4
2
4
4
2
4
2
4
2
2
2
2
4
4
2
4
2
3
3
2
4
2
Для получения биомассы культуры с целью применения ее в описываемом изобретении штамм выращивают на жидкой минеральной среде следующего состава (г/л): (NH)SO - 1; MgSO×7HO - 0,2; CaCl - 0,02; NaHPO - 1,5; KHPO - 0,7; раствор микроэлементов 1 мл. Раствор микроэлементов (мг/100 мл): нитрилтриуксусная кислота (HTA) - 150; MgSO×7HO - 300; MnSO×2HO - 50; NaCl - 100; FeSO×7HO - 10; CoCl - 10; CaCl×2HO - 10; ZnSO - 10; CuSO×5HO - 1; AlK(SO) - 1; HBO - 1; NaMoO×2HO - 1. Состав газовой фазы метан : воздух = 1:3, рН 5,6-5,8, температура культивирования 41-44°С, при постоянном перемешивании 150 оборотов в минуту.
Культуры штаммов-ассоциантов были получены выделением из лабораторного реактора в ходе длительного (30 сут.) непрерывного культивирования штамма Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13764. Это позволило получить новые естественные непатогенные штаммы микроорганизмов: Cupriavidus gilardii, Stenotrophomonas acidaminiphila, Brevibacillus agri, Azospirillum doebereinerae. Искусственное воссоздание сообщества способствует формированию стабильной саморегулирующейся ассоциации в условиях непостоянства биолого-физико-химического равновесия среды и повышению устойчивости и продуктивности основного продуцента.
Полученные штаммы ассоциации микроорганизмов депонированы в Национальном Биоресурсном центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИГенетика, где им присвоены номера:
Cupriavidus gilardii ВКПМ В-14232,
Stenotrophomonas acidaminiphila ВКПМ В-14233,
Brevibacillus agri ВКПМ В-14227,
Azospirillum doebereinerae ВКПМ В-14234.
Определены таксономический статус и основные характеристики новых штаммов бактерий.
Характеристика штамма Cupriavidus gilardii ВКПМ В-14232
Культура грамотрицательна. Клетки имеют форму палочек, размером 0,3-0,5×0,9-1,2 мкм, неспорообразующие, подвижны. На питательном агаре (рН 7,0-7,2) формирует непрозрачные округлые колонии, светло-кремовые, с ровным краем, ∅ 2-4 мм, консистенция мягкая, легко снимаются с агара. Нитраты до нитритов восстанавливает. Оксидазо- и каталазоположительна. Использует малат. Не гидролизует желатин, эскулин и мочевину. Гидролизует Tween 80. Рост в присутствии NaCl (0,5-1,5%). Облигатный аэроб, хемогетеротроф. Усваивает капрат, фенилацетат, гликолат, D-α-аланин, L-треонин. Рост в диапазоне температур 30-47°С (оптимум 32-35°С) и рН 5,0-7,2 (оптимум 6,8-7,0). В клетках синтезируется убихинон (преимущественно Q-8).
Последовательность гена 16S рРНК депонирована в NCBI под номером MW642184. По нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК наиболее близок к штамму Cupriavidus cauae MKL-01 (уровень сходства 99.77%). Геномная последовательность депонирована в NCBI под номером JAKOAS000000000. Непатогенен. Хранится при -20°С в жидкой органической среде (LB) с добавлением глицерина в количестве 30% в качестве криопротектора и в лиофилизированном состоянии при температуре +4°С.
Для получения биомассы культуры ее выращивают на жидкой питательной среде следующего состава (г/л): триптон 10,0 г; дрожжевой экстракт 5,0 г; NaCl 10,0 г; водопроводная вода 1000,0 мл, рН 7,5, температура 42°С, при постоянном перемешивании 150 оборотов в минуту.
Характеристика штамма Stenotrophomonas acidaminiphila ВКПМ В-14233
Культура грамотрицательна, спор не образует, строго аэробна. Клетки от прямых до изогнутых палочек, размером 0,5×1,5-2,5 мкм. Подвижны, имеют один полярный жгутик. На питательной агаре образуют бледно-желтые колонии. Нитраты до нитритов восстанавливает. Каталазо- и оксидазоположительна. Гидролизует эскулин, Tween 80. Использует для роста аминокислоты: аланин, аргинин, аспарагин, аспартат, цистеин, глутамат, глутамин, гистидин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, пролин, серии, треонин, тирозин, валин. Использует казаминовую кислоту, пептон из казеина. Использует сахара: ацетилглюкозамин, мальтоза, фруктоза, манноза, глюкоза. Использует органические кислоты: ацетат, кротонат, фумарат, лактат, пируват, сукцинат. Не использует спирты и ароматические соединения. Диапазон рН для роста составляет 5,0-9,0 (оптимум 6,0±7,0). Температурный диапазон роста 20-42°С (оптимум 30-35°С). Чувствительность к антибиотикам: амикацин, цефтазидим, ципрооксацин, колистин, гентамицин, нетилмицин, оксацин, пиперациллин, тикарциллин, триметропим, сульфаметоксазол и тобрамицин.
Последовательность гена 16S рРНК депонирована в NCBI под номером MW642185. По нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК наиболее близок к штамму Stenotrophomonas acidaminiphila Т0-18 (уровень сходства 99.87%). Непатогенен. Хранится при -20°С в жидкой органической среде (LB) с добавлением глицерина в количестве 30% в качестве криопротектора и в лиофилизированном состоянии при температуре +4°С.
Для получения биомассы культуры ее выращивают на жидкой питательной среде следующего состава (г/л): триптон 10,0 г; дрожжевой экстракт 5,0 г; NaCl 10,0 г; водопроводная вода 1000,0 мл, рН 7,5, температура 42°С, при постоянном перемешивании 150 оборотов в минуту.
Характеристика штамма Brevibacillus agri ВКПМ В-14227
Культура грамположительна. Клетки имеют форму палочек с заостренными концами размером 0,5-0,9×2,0-5,0 мкм, образуют споры, неподвижны. На питательном агаре (рН 7,0-7,2) формирует непрозрачные округлые колонии, светло-кремовые, с ровным краем, диаметром 2-4 мм, консистенция мягкая, легко снимаются с агара. Нитраты до нитритов не восстанавливает. Каталазоположительна. Использует глюкозу, маннит. Гидролизует казеин. Рост в присутствии NaCl (0,5-1,5%). Облигатный аэроб, гетеротроф. Рост в диапазоне температур 30-47°С (оптимум 35-42°С), рН 5,0-7,5 (оптимум 6,8-7,0).
Последовательность гена 16S рРНК депонирована в NCBI под номером ОМ865855. По нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК наиболее близок к штамму Brevibacillus agri DSM 6348 (уровень сходства 99.87%). Геномная последовательность депонирована в NCBI под номером JAKOAQ000000000. Непатогенен. Хранится при -20°С в жидкой органической среде (LB) с добавлением глицерина в количестве 30% в качестве криопротектора и в лиофилизированном состоянии при температуре +4°С.
Для получения биомассы культуры ее выращивают на жидкой питательной среде следующего состава (г/л): триптон 10,0 г; дрожжевой экстракт 5,0 г; NaCl 10,0 г; водопроводная вода 1000,0 мл, рН 7,5, температура 42°С, при постоянном перемешивании 150 оборотов в минуту.
Характеристика штамма Azospirillum doebereinerae ВКПМ В-14234
Клетки представляют собой изогнутые палочки, длиной 1,0-1,5 и шириной 2,0×3,0 мкм. Подвижны, имеют один полярный жгутик. Стареющие клетки содержат внутриклеточные гранулы. На плотной агаризованной среде NFb с добавлением 20 мг дрожжевого экстракта в течение 2 суток образуются плоские светло-бежевые колонии 0,5-1,0 мм в диаметре. При добавлении в среду Конго красного колонии окрашиваются в алый цвет. В полужидкой безазотной минеральной среде с малатом культура образует вуалевидную пленку, которая сначала развивается на несколько миллиметров ниже поверхности среды, а затем приближается к поверхности. Нитраты до нитритов восстанавливает. Способна фиксировать атмосферный азот в микроаэрофильных условиях. Каталазо- и оксидазо- уреазоположительна. Гидролизует эскулин, Tween 80. Использует в качестве источника углерода арабинозу, D-фруктозу, глюконат, глицерин, малат, маннит, сорбит, метанол. Диапазон рН для роста составляет 5,5-8,5, (оптимум 6,0-7,0). Температурный диапазон роста 20-42°С (оптимум 30-35°С). Не нуждается в факторах роста.
Последовательность гена 16S рРНК депонирована в NCBI под номером MZ962380. По нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК наиболее близок к штамму Azospirillum doebereinerae GSF71 (уровень сходства 99.87%). Геномная последовательность депонирована в NCBI под номером JAKOAR000000000. Непатогенен. Хранится при -20°С в жидкой минеральной среде с добавлением глицерина в количестве 30% в качестве криопротектора и в лиофилизированном состоянии при температуре +4°С.
Для получения биомассы культуры ее выращивают на жидкой питательной среде следующего состава (г/л): триптон 10,0 г; дрожжевой экстракт 5,0 г; NaCl 10,0 г; водопроводная вода 1000,0 мл, рН 6,8-7,2, температура 37°С, при постоянном перемешивании 150 оборотов в минуту.
Изобретение характеризуется следующими примерами.
Пример 1.
По первому варианту изобретения.
Лабораторный ферментер асептически засевают чистой культурой Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13764, выращенной в колбах. Для этого в ферментер с магнитной мешалкой объемом, например, в 30 л (рабочий объем в этом случае - 22 л) помещают 12 л минеральной среды, содержащей следующие компоненты (на 1 л среды):
в непрерывном режиме в ферментере с магнитной мешалкой объемом,
3
4
HPO (87%) - 2,0 мл;
2
4
KSO - 0,24 г;
4
2
MgSO×7HO - 0,24 г;
4
2
FeSO×7HO - 0,02 г;
4
2
CuSO×5HO - 0,02 г;
4
2
MnSO×5HO - 0,014 г;
4
2
ZnSO×7HO - 0,003 г;
3 В
3
НО - 0,012 мг;
4
2
CoSO×7HO - 0,0005 мг;
2
4
2
NaMoO×2HO - 0,0005 мг;
Вода - до 1 л.
Выставляют рабочие параметры: температура 42°С и рН 5,6-5,8. Значение рН регулируют 5% раствором аммиачной воды или раствором 70% ортофосфорной кислоты. Регулирование температуры процесса осуществляют подачей охлаждающей воды в теплообменник аппарата.
600
После приведения параметров к нужным величинам добавляют посевной материал - чистую культуру Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13764 (6 л 24-часовой культуры с оптической плотностью ОД равной 2). Расход природного газа и воздуха на 1 л культуральной среды составляет 15 и 45 л/час соответственно.
600
10
В качестве единственного источника углерода используют метан. Процесс культивирования осуществляют при температуре 42°С и рН 5,6-5,8 в аэробных условиях. Процесс идет в накопительном режиме до достижения оптической плотности ОД 10 (7×10кл/мл).
10
Добавляют биомассу культур Cupriavidus gilardii ВКПМ В-14232, Stenotrophomonas acidaminiphila ВКПМ В-14233, Brevibacillus agri ВКПМ В-14227, Azospirillum doebereinerae ВКПМ В-14234. Для этого каждый штамм выращивают в 200 мл питательной среды в качалочных колбах при 42°С и 150 об/мин. в течение 48 часов. Концентрация клеток каждой культуры составляет примерно 1×10кл/мл. Для удаления компонентов среды клетки осаждают центрифугированием (10000 об/мин в течение 10 мин) и ресуспендируют в 200 мл физраствора. Суспензию клеток ассоциативных культур асептически добавляют в ферментер.
Через 2-4 часа переходят на проточный режим культивирования.
Осуществляют выращивание ассоциации штаммов бактерий, полученной, как описано выше, включающей штамм Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13764 (88% от общего числа клеток) со штаммами-ассоциантами: Cupriavidus gilardii ВКПМ В-14232 (3% от общего числа клеток), Stenotrophomonas acidaminiphila ВКПМ В-14233 (3% от общего числа клеток), Brevibacillus agri ВКПМ В-14227 (3% от общего числа клеток) и Azospirillum doebereinerae ВКПМ В-14234 (3% от общего числа клеток).
По окончании выращивания концентрация биомассы в ферментере составляла 16-18 г/л, продуктивность сообщества составляла 16-18 г/л.
Пример 2.
По второму варианту изобретения.
Осуществляют выращивание ассоциации штаммов Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13764, Cupriavidus gilardii ВКПМ В-14232, Stenotrophomonas acidaminiphila ВКПМ В-14233, Brevibacillus agri ВКПМ В-14227, Azospirillum doebereinerae ВКПМ В-14234, в непрерывном режиме в ферментере с магнитной мешалкой объемом, например, в 30 л (рабочий объем в этом случае - 22 л) с непрерывной подачей отработанной культуральной жидкости и минеральной среды. После отделения клеток партию отработанной культуральной жидкости анализируют на содержание основных элементов. Состав минеральной среды варьируют в зависимости от состава отработанной культуральной жидкости, в среднем содержание компонентов составляет (на 1 л среды):
3
4
HPO(87%) - 2,0-1,5 мл;
2
4
KSO - 0,24-0,16 г;
4
2
MgSO×7HO - 0,24-0,14 г;
4
2
FeSO×7HO - 0,02-0,018 г;
4
2
CuSO×5HO - 0,02-0,013 г;
4
2
MnSO×5HO - 0,014-0,009 г;
4
2
ZnSO×7HO - 0,003-0,002 г;
3
3
НВО - 0,012-0,008 мг;
4
2
CoSO×7HO - 0,0005-0,0003 мг;
2
4
2
NaMoO×2HO - 0,0005-0,0003 мг;
Вода - до 1 л.
-1
-1
Процесс выращивания осуществляют в нестерильных условиях с подачей отработанной культуральной жидкости и минеральной среды при 42°С и рН 5,6-5,8 и при коэффициенте скорости протока 0,26 ч - 0,28 ч.
Значение рН регулируют 5% раствором аммиачной воды или раствором 70% ортофосфорной кислоты.
Для регулирования температуры процесса осуществляют подачу охлаждающей воды в теплообменник аппарата. Расход природного газа и воздуха на 1 л культуральной среды составляет 15 и 45 л/час соответственно.
Осуществляют выращивание, как описано выше, ассоциации штаммов бактерий, включающей согласно изобретению:
- штамм Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13764 в количестве, укладывающимся в диапазон значений от 70% до 85% от общего числа клеток, например, в количестве, порядка 77% от общего числа клеток;
- штамм-ассоциант Cupriavidus gilardii ВКПМ В-14232 в количестве, укладывающимся в диапазон значений от 4% до 6% от общего числа клеток, например, в количестве, порядка 5% от общего числа клеток;
- штамм-ассоциант Stenotrophomonas acidaminiphila ВКПМ В-14233 в количестве, укладывающимся в диапазон значений от 2% до 6% от общего числа клеток, например, в количестве, порядка 4% от общего числа клеток;
- штамм-ассоциант Brevibacillus agri ВКПМ В-14227 в количестве, укладывающимся в диапазон значений от 2% до 5% от общего числа клеток, например, в количестве, порядка 4% от общего числа клеток;
- и штамм-ассоциант Azospirillum doebereinerae ВКПМ В-14234 в количестве, укладывающимся в диапазон значений от 2% до 3% от общего числа клеток, например, в количестве, порядка 2% от общего числа клеток,
а также содержащую прочую микрофлору в количестве, укладывающимся в диапазон значений от 5% до 10% от общего числа клеток, например, в количестве, порядка 8% от общего числа клеток.
При доминировании штамма Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13764 не менее 70% от общего числа клеток, т.е. не ниже нижней границы диапазона значений в 70-85% от общего числа клеток содержания этого штамма в патентуемой по второму варианту изобретения ассоциации штаммов бактерий, продуктивность ассоциации остается стабильной в течение длительного времени, а концентрация биомассы в ферментере - 20 г/л.
Варьирование количества микробных компонентов сообщества в приведенных по второму варианту изобретения диапазонах значений является нормой и является свойством саморегулирования системы.
Штамм Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13764 является в системе первичным продуцентом, поэтому численность и физиологическое состояние этих клеток является определяющим для всего остального сообщества.
Снижение количества клеток Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13764 ниже 70% от общего числа клеток, т.е. ниже значений указанного диапазона значений в 70-85% от общего числа клеток в соответствии со вторым вариантом изобретения, приводит к дестабилизации ассоциации, что, как правило, приводит, например, к увеличению доли прочей микрофлоры свыше 10% от общего числа клеток, т.е., приводит к превышению содержания прочей микрофлоры вне диапазона значений в 5-10% от общего числа клеток в соответствии со вторым вариантом изобретения.
В дестабилизированном сообществе появляются агрегаты клеток, погруженные в полисахаридный матрикс, увеличивается доля разрушенных клеток, снижается продуктивность процесса. В этом случае велика вероятность заражения ассоциации патогенными микроорганизмами, грибами, простейшими.
В случае, если доля Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13764 в сообществе превышает 85% от общего числа клеток, т.е. находится выше значений указанного диапазона значений в 70-85% от общего числа клеток в соответствии со вторым вариантом изобретения, то происходит образование большого количества продуктов метаболизма, которые не могут эффективно потребляться ассоциативной микрофлорой. Следствием является ингибирование роста штамма-продуцента, либо отмирание клеток, что влечет за собой спонтанное развитие гетеротрофных компонентов сообщества.
Штаммы-ассоцианты Cupriavidus gilardii ВКПМ В-14232, Stenotrophomonas acidaminiphila ВКПМ В-14233, Brevibacillus agri ВКПМ В-14227 и Azospirillum doebereinerae ВКПМ В-14234 в приведенных диапазонах значений в соответствии со вторым вариантом изобретения обеспечивают стабильную жизнедеятельность основного продуцента Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13764 посредством утилизации продуктов его метаболизма.
В случае снижения доли в сообществе какого-либо из штаммов-ассоциантов ниже указанных норм в соответствии со вторым вариантом изобретения:
- штамма-ассоцианта Cupriavidus gilardii ВКПМ В-14232 в количестве, ниже значения в 4% от общего числа клеток, т.е., не укладывающимся в диапазон значений от 4% до 6% от общего числа клеток;
и/или
- штамма-ассоцианта Stenotrophomonas acidaminiphila ВКПМ В-14233 в количестве, ниже значения в 2% от общего числа клеток, т.е., не укладывающимся в диапазон значений от 2% до 6% от общего числа клеток;
и/или
- штамма-ассоцианта Brevibacillus agri ВКПМ В-14227 в количестве, ниже значения в 2% от общего числа клеток, т.е., не укладывающимся в диапазон значений от 2% до 5% от общего числа клеток;
и/или
- штамма-ассоцианта Azospirillum doebereinerae ВКПМ В-14234 в количестве, ниже значения в 2% от общего числа клеток, т.е., не укладывающимся в диапазон значений от 2% до 3% от общего числа клеток,
происходит накопление в среде органических веществ (продуктов жизнедеятельности Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13764), что негативно сказывается на состоянии клеток продуцента и может привести к его гибели.
В случае если количество штаммов-ассоциантов выше указанных норм в соответствии со вторым вариантом изобретения:
- штамма-ассоцианта Cupriavidus gilardii ВКПМ В-14232 в количестве, выше значения в 6% от общего числа клеток, т.е., не укладывающимся в диапазон значений от 4% до 6% от общего числа клеток;
и/или
- штамма-ассоцианта Stenotrophomonas acidaminiphila ВКПМ В-14233 в количестве, выше значения в 6% от общего числа клеток, т.е., не укладывающимся в диапазон значений от 2% до 6% от общего числа клеток;
и/или
- штамма-ассоцианта Brevibacillus agri ВКПМ В-14227 в количестве, выше значения в 5% от общего числа клеток, т.е., не укладывающимся в диапазон значений от 2% до 5% от общего числа клеток;
и/или
- штамма-ассоцианта Azospirillum doebereinerae ВКПМ В-14234 в количестве, выше значения в 3% от общего числа клеток, т.е., не укладывающимся в диапазон значений от 2% до 3% от общего числа клеток,
снижается количество производимого белка (т.к. количество клеток продуцента уменьшается, снижается потребление метана), что снижает рентабельность производства.
Во всех вышеперечисленных случаях для восстановления дестабилизированного сообщества необходима корректировка параметров ферментации. При отсутствии вмешательства происходит гибель продуцента Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13764.
Предлагаемая ассоциация штаммов бактерий обеспечивает стабильный высокий выход микробной белковой биомассы.