УЛУЧШЕННЫЙ СПОСОБ УВЕЛИЧЕНИЯ ЧИСЛА ОПУХОЛЕ-РЕАКТИВНЫХ Т-ЛИМФОЦИТОВ В ИММУНОТЕРАПИИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ
IMPROVED METHOD FOR INCREASING TUMOUR-RESPONSIVE T-LYMPHOCYTE COUNT IN IMMUNOTHERAPY OF ONCOLOGIC PATIENTS

Область техники, к которой относится изобретение
Hi
Изобретение относится к улучшенному способу увеличения числа и активации опухоле-реактивных лимфоцитов, в частности CD4+ хелперов и/или CD8+ Т-лимфоцитов. Т-лимфоциты отличаются от CD4+ CD25+ лимфоцитов, т.е. настоящее изобретение не охватывает регуляторные Т-лимфоциты. Лимфоциты могут быть использованы для лечения и/или профилактики рака.
Уровень техники
Согласно гипотезе иммунологического надзора иммунная система постоянно сенсибилизируется к воздействию прогрессирующих опухолей, причем экспериментальные данные в значительной степени подтверждают данное мнение. Идентификация специфических опухолевых антигенов открыла новые возможности для иммунотерапии опухолей, и многие иммунотерапевтические подходы в настоящее время переходят на стадию клинических испытаний. Среди них особенно перспективным представляется адоптивный перенос лимфоцитов, специфичных к опухолевым антигенам. Попытки сделать это до сих пор, как правило, основывались либо на использовании мононуклеарных клеток периферической крови, либо инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL), выделенных из свежих образцов опухоли. Во время недавно проведенных испытаний, при которых лечение пациентов со злокачественной меланомой осуществляли переносом аутологичных количественно увеличенных TIL, сообщалось о фактических показателях ответной реакции вплоть до 51%. Клетки TIL немногочисленны, часто они являются нереагирующими (анергическими) до появления количественно увеличенных клеток (несколько месяцев) вследствие механизмов иммуносупрессии из-за длительных периодов созревания опухоли. Более того, протоколы были нацелены на размножение CD8+ цитотоксических Т-клеток, и данные клетки вновь были введены пациентам, предварительно получившим химиотерапию, и, кроме того, для обеспечения жизнеспособности CD8+ Т-клеток пациенты получили высокие дозы интерлейкина-2.
Описание изобретения
Авторами настоящего изобретения предварительно было показано, что активация наивных Т-клеток может возникнуть в высоко специализированном микроокружении вторичных лимфоидных органов, таких как сторожевой лимфатический узел. Другими словами, сторожевой узел может считаться первичным сайтом иммунной системы при встрече с опухолевыми антигенами.
Изобретатели предварительно описали общий способ увеличения числа опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, полученных из сторожевых лимфатических узлов, показав возможность культивирования Т-лимфоцитов, полученных из сторожевых лимфатических узлов, для получения культуры опухоле-реактивных Т-лимфоцитов. Опухоле-реактивные Т-лимфоциты могут быть использованы в лечении рака путем введения эффективного количества опухоле-реактивных Т-лимфоцитов пациентам, у которых были удалены сторожевые узлы.
Успех лечения рака, включающего введение опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, определяется факторами, такими как, например, количество опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, полученных после стадии размножения, т.е. количество опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, пригодных для инфузии пациенту, время, требуемое для получения эффективного количества опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, и концентрация и соотношение конкретных субпопуляций опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, полученных способом размножения.
Hi
Соответственно, настоящее изобретение относится к улучшенному способу увеличения числа опухоле-реактивных CD4+ хелперов и/или CD8+ Т-лимфоцитов, в котором были определены и оптимизированы специфические условия культивирования и в котором в продолжение всей фазы размножения наблюдают специфические маркеры на Т-лимфоцитах и в культуральной среде, для получения большого числа опухоле-реактивных Т-лимфоцитов в кратчайший возможный период времени. Более того, изобретение в то же время относится к способу, направленному на развитие опухоле-реактивных CD4+ хелперов и/или CD8+ Т-лимфоцитов в отношении специфических субпопуляций. Т-лимфоциты отличаются от CD4+ CD25+ лимфоцитов, т.е. настоящее изобретение не охватывает регуляторные Т-лимфоциты.
Hi
CD4+ CD25+ Т-лимфоциты, экспрессирующие фактор транскрипции FoxP3, относятся к регуляторным Т-клеткам (Тreg). Treg обладают свойством регулировать Т-хелперы и Т-цитотоксические клетки путем ингибирования активации и пролиферации и, кроме того, Treg ингибируют продукцию и высвобождение полезных Th1-цитокинов, таких как IFN-гамма. Таким образом, представленный в данном документе способ разработан с целью стимуляции размножения Т-хелперных клеток и цитотоксических Т-клеток и предотвращения размножения клеток Treg.
Опухоле-реактивные Т-лимфоциты, чаще всего получаемые по настоящему способу, представляют собой CD4+ хелперные Т-лимфоциты. Одной из целей представленного способа размножения является в некотором смысле имитация естественного пути собственной иммунной системы пациента, и, в некотором отношении вводя компоненты иммунной системы пациента, определяют, образуются ли, прежде всего, CD4+ хелперы или CD8+ Т-лимфоциты в зависимости от того, представляется ли антиген молекулами MCHI или MCHII. В большинстве случаев антигены должны быть представлены молекулой MCH класса II, что приводит к получению CD4+ хелперных Т-лимфоцитов. Однако в некоторых случаях образуются CD8+ Т-лимфоциты. Если образуются CD4+ хелперные Т-лимфоциты, они должны быть дополнительно количественно увеличены, как описано в данном документе, однако способ также может быть использован для размножения CD8+ клеток. Изобретатели обнаружили, что способ размножения, включающий две различные фазы, можно использовать, в частности, для получения большого числа опухоле-реактивных CD4+ хелперов и/или CD8+ Т-лимфоцитов в относительно короткий промежуток времени, причем две фазы представляют собой
i) первую фазу стимуляции опухоле-реактивных Т-лимфоцитов полученным из опухоли антигеном совместно, по меньшей мере, с одним веществом, обладающим агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, для увеличения жизнеспособности опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, и
ii) вторую фазу активации и стимуляции роста опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, где вторую фазу ii) инициируют, когда на Т-лимфоцитах подавляется маркер клеточной поверхности CD25 (маркер IL-2R).
Этот способ размножения также можно осуществить, используя в качестве антиген-специфических клеток моноциты, выделенные у пациентов. Моноциты должны быть введены пациенту, когда дифференцируются в дендритные клетки путем использования зрелых цитокинов, таких как IL-4, GM-CSF и IL-3, с последующей активацией дендритных клеток добавлением Toll-подобного рецептора, стимулируя агенты, такие как липополисахарид. Использование в качестве антиген-специфической популяции зрелых активированных дендритных клеток может стимулировать и усиливать размножение Т-хелперных клеток и цитотоксических Т-клеток.
Конкретные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к нижеследующим объектам.
1. Способ увеличения количества опухоле-реактивных CD4+ Т-хелперов и/или CD8+ Т-лимфоцитов, причем способ содержит
i) первую фазу стимуляции опухоле-реактивных CD4+ Т-хелперов и/или CD8+ Т-лимфоцитов полученным из опухоли антигеном наряду, по меньшей мере, с одним веществом, обладающим агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, для увеличения жизнеспособности опухоле-реактивных CD4+ Т-хелперов и/или CD8+ Т-лимфоцитов; и
ii) вторую фазу активации и усиления роста опухоле-реактивных CD4+ Т-хелперов и/или CD8+ Т-лимфоцитов, где вторую фазу ii) инициируют, когда на CD4+ Т-хелперах и/или CD8+ Т-лимфоцитах подавляется маркер клеточной поверхности CD25 (или маркер IL-2R), где подавление определяют как то, что 5% или менее популяции Т-лимфоцитов экспрессирует CD25, и где фазу ii) инициируют добавлением к Т-лимфоцитам полученного из опухоли антигена для активации опухоле-реактивных CD25-негативных Т-лимфоцитов.
2. Способ по п.1, в котором Т-лимфоциты находятся в культуральной среде.
3. Способ по п.2, в котором культуральная среда является бессывороточной средой, такой как, например, среда AIMV.
4. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором первую фазу i) инициируют добавлением, по меньшей мере, одного вещества, обладающего агонистической активностью в отношении рецептора IL-2.
5. Способ по п.4, в котором веществом, обладающим агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, является IL-2.
6. Способ по п.5, в котором IL-2 добавляют в низкой дозе, такой как, например, от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 700 МЕ/мл культуральной среды, от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 600 МЕ/мл культуральной среды, от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 500 МЕ/мл культуральной среды, от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 400 МЕ/мл культуральной среды, от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 300 МЕ/мл культуральной среды и от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 200 МЕ/мл культуральной среды.
7. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором дополнительное количество, по меньшей мере, одного вещества, обладающего агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, добавляют регулярно на протяжении фазы i), например каждый 2-й, 3-й или 4-й день фазы i).
8. Способ по п.7, в котором веществом, обладающим агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, является IL-2.
9. Способ по п.8, в котором концентрация добавляемого IL-2 составляет от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 700 МЕ/мл культуральной среды, от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 600 МЕ/мл культуральной среды, от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 500 МЕ/мл культуральной среды, от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 400 МЕ/мл культуральной среды, от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 300 МЕ/мл культуральной среды и от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 200 МЕ/мл культуральной среды.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором полученный из опухоли антиген добавляют с дня 2 по день 5 включительно первой фазы i), например в день 2, в день 3, в день 4 или в день 5.
11. Способ по любому из пп.1-9, в котором полученный из опухоли антиген добавляют, по существу, одновременно с инициацией фазы i) или самое большее до 3 дня после этого.
12. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором полученный из опухоли антиген представляет собой денатурированный гомогенат опухоли.
13. Способ по п.12, в котором полученный из опухоли антиген является аутологичным.
14. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором полученный из опухоли антиген представляет собой белок, полипептид или пептид.
15. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором вторую фазу ii) инициируют с дня 17 по день 23 включительно первой фазы i), например, в день 17, в день 18, в день 19, в день 20, в день 21, в день 22 или в день 23.
16. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором полученный из опухоли антиген является аутологичным.
17. Способ по п.16, в котором полученный из опухоли антиген представляет собой денатурированный гомогенат опухоли.
18. Способ по п.16, в котором полученный из опухоли антиген представляет собой белок, полипептид или пептид.
19. Способ по любому из пп.16-18, который дополнительно включает добавление к Т-лимфоцитам антиген-представляющих клеток вместе с полученным из опухоли антигеном.
20. Способ по п.19, в котором антиген-представляющими клетками являются облученные лейкоциты периферической крови, содержащие антиген-представляющие В-клетки и/или моноциты.
21. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором вторая фаза ii) включает введение, по меньшей мере, одного вещества, способного активировать IL-12R на Т-лимфоцитах.
22. Способ по п.21, в котором веществом(ами), способным(и) активировать IL-12R на Т-лимфоцитах, является вещество(а), обладающее(ие) агонистической активностью в отношении рецептора интерферона.
23. Способ по п.22, в котором вещество(а), обладающее агонистической активностью в отношении рецептора интерферона, представляет собой интерферон.
24. Способ по п.23, в котором вещество(а), обладающее агонистической активностью в отношении рецептора интерферона, представляет собой интерферон-α.
25. Способ по любому из пп.21-24, в котором вещество(а), способное активировать IL-12R на Т-лимфоцитах, такое как, например, вещество, обладающее агонистической активностью в отношении рецептора интерферона, добавляют, когда уровень IL-12, по меньшей мере, 1-кратно, например, по меньшей мере, 2-кратно, по меньшей мере, 3-кратно, по меньшей мере, 4-кратно или, по меньшей мере, 5-кратно увеличен по сравнению с уровнем IL-12 в день 1 фазы ii).
26. Способ по любому из пп.21-25, в котором вещество, способное активировать IL-12R на Т-лимфоцитах, такое как, например, вещество, обладающее агонистической активностью в отношении рецептора интерферона, добавляют с дня 2 по день 4 включительно после инициации второй фазы ii), например в день 2, в день 3 или в день 4.
27. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором вторая фаза ii) включает введение одного или более веществ, способных противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2.
28. Способ по п.27, в котором одним или более веществами, способными противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2, являются одно или более веществ, способных нейтрализовать IL-4, IL-5, IL-10 и/или TGF-бета.
29. Способ по п.28, в котором одно или более веществ, способных нейтрализовать IL-4, IL-5, IL-10 и/или TGF-бета, представляют собой антитело против IL-4, антитело против IL-5 и/или антитело против IL-10.
30. Способ по любому из пп.27-29, в котором одно или более веществ, способных противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2, например одно или более веществ, способных нейтрализовать IL-4, IL-5, IL-10 и/или TGF-бета, добавляют в день 1 второй фазы ii).
31. Способ по любому из пп.27-29, в котором одно или более веществ, способных противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2, например одно или более веществ, способных нейтрализовать IL-4, IL-5, IL-10 и/или TGF-бета, добавляют на следующей стадии после добавления вещества, способного активировать IL-12R на Т-лимфоцитах.
32. Способ по п.31, в котором одно или более веществ, способных противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2, например одно или более веществ, способных нейтрализовать IL-4, IL-5, IL-10 и/или TGF-бета, добавляют на следующий день после добавления вещества, способного активировать IL-12R на Т-лимфоцитах.
33. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором дополнительное количество одного или более веществ, способных противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2, например одного или более веществ, способных нейтрализовать IL-4, IL-5, IL-10 и/или TGF-бета, добавляют регулярно на протяжении всей фазы ii).
34. Способ по п.33, в котором дополнительное количество одного или более веществ, способных противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2, например одного или более веществ, способных нейтрализовать IL-4, IL-5, IL-10 и/или TGF-бета, добавляют каждый 2-й, 3-й или 4-й день фазы ii).
35. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором дополнительное количество вещества, обладающего агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, добавляют регулярно на протяжении всей фазы ii).
36. Способ по п.35, в котором вещество, обладающее агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, добавляют каждый 2-й, 3-й или 4-й день фазы ii), например каждый 3-й день.
37. Способ по п.35 или 36, в котором веществом, обладающим агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, является IL-2.
38. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором вторая фаза ii) включает введение одного или более веществ, стимулирующих развитие Т-лимфоцитов типа Th1.
39. Способ по п.38, в котором одним или более веществами, стимулирующими развитие Т-лимфоцитов типа Th1, являются вещества, обладающие агонистической активностью в отношении рецептора IL-7, IL-12, IL-15 и/или IL-21.
40. Способ по п.39, в котором одно или более веществ выбирают из IL-7, IL-12, IL-15 и IL-21.
41. Способ по любому из пп.38-40, в котором одно или более веществ, стимулирующих развитие Т-лимфоцитов типа Th1, например вещества, обладающие агонистической активностью в отношении рецептора IL-7, IL-12, IL-15 и/или IL-21, добавляют, когда уровень IFN-гамма увеличивается по сравнению с уровнем IFN-гамма, наблюдавшимся при инициации второй фазы ii).
42. Способ по п.41, в котором повышенный уровень IFN-гамма определяют как, по меньшей мере, 1-кратное повышение уровня IFN-гамма, например, по меньшей мере, 2-кратное, по меньшей мере, 3-кратное, по меньшей мере, 4-кратное повышение по сравнению с уровнем IFN-гамма, наблюдавшимся при инициации второй фазы ii).
43. Способ по любому из пп.38-42, в котором одно или более веществ, стимулирующих развитие Т-лимфоцитов типа Th1, например вещества, обладающие агонистической активностью в отношении рецептора IL-12, IL-15 и/или IL-21, добавляют при подавлении CD25 и/или CD69.
44. Способ по любому из пп.38-43, в котором концентрация каждого из добавленных одного или более веществ, стимулирующих развитие Т-лимфоцитов типа Th1, например веществ, обладающих агонистической активностью в отношении рецептора IL-7, IL-12, IL-15 и/или IL-21, составляет от приблизительно 150 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 300 МЕ/мл культуральной среды, например, 250 МЕ/мл культуральной среды.
45. Способ по любому из пп.38-44, в котором одно или более веществ, стимулирующих развитие Т-лимфоцитов типа Th1, например вещества, обладающие агонистической активностью в отношении рецептора IL-12, IL-15 и/или IL-21, добавляют с дня 5 по день 8 включительно после инициации второй фазы ii), то есть в день 5, день 6, день 7 или день 8.
46. Способ по любому из предшествующих пунктов, направленный на получение CD4+ хелперных Т-лимфоцитов.
47. Способ по любому из предшествующих пунктов, направленный на получение эффекторных Т-лимфоцитов.
48. Способ по любому из предшествующих пунктов, направленный на получение Т-лимфоцитов памяти.
49. Способ по любому из предшествующих пунктов, направленный на получение Т-лимфоцитов типа Th1.
50. Способ по любому из предшествующих пунктов, который дополнительно включает мониторинг экспрессии маркеров клеточной поверхности, таких как, например, CD25 и/или CD69 на Т-лимфоцитах непрерывно во время первой фазы i) и второй фазы ii).
51. Способ по п.50, в котором Т-лимфоциты собирают при подавлении CD25 на Т-лимфоцитах во второй фазе ii).
52. Способ по п.51, в котором Т-лимфоциты подвергают, по меньшей мере, одному дополнительному циклу фазы ii) при подавлении CD25 на Т-лимфоцитах.
53. Способ по п.51 или 52, в котором подавление определяют так, что 5% или менее популяции CD4-позитивных Т-лимфоцитов экспрессируют CD25.
54. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором опухоле-реактивные Т-лимфоциты собирают с дня 10 по день 14 включительно после инициации второй фазы ii).
55. Способ по п.54, в котором опухоле-реактивные Т-лимфоциты после сбора очищают.
56. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий стадию замораживания опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, полученных во второй фазе ii).
57. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором Т-лимфоциты получают из лимфатических узлов, куда оттекает лимфа от первичной опухоли и/или метастаза, или их получают из крови.
58. Опухоле-реактивный Т-лимфоцит, полученный по способу, определенному в любом из пп.1-57.
59. Опухоле-реактивный Т-лимфоцит по п.58, который представляет собой CD4+ Т-лимфоцит.
60. Опухоле-реактивный Т-лимфоцит по п.58 или 59, который представляет собой эффекторный Т-лимфоцит.
61. Опухоле-реактивный Т-лимфоцит по любому из пп.58-60, который представляет собой Т-лимфоцит памяти.
62. Опухоле-реактивный Т-лимфоцит по любому из пп.58-61, который представляет собой Т-лимфоцит типа Th1.
63. Фармацевтическая композиция, содержащая опухоле-реактивные Т-лимфоциты по любому из пп.58-62.
64. Способ лечения индивида, страдающего заболеванием неопластического происхождения, причем способ включает введение индивиду, нуждающемуся в этом, эффективного количества опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, как они определены в любом из пп.58-63.
65. Способ осуществления регрессии опухоли у индивида, имеющего опухоль, причем способ включает введение индивиду, нуждающемуся в этом, эффективного количества опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, как они определены в любом из пп.58-63.
66. Способ по п.64 или 65, в котором опухоле-реактивные Т-лимфоциты вводят внутривенно, внутриартериально, интратекально или внутрибрюшинно.
67. Способ по любому из пп.64-66, в котором количество вводимых опухоле-реактивных Т-лимфоцитов составляет, по меньшей мере, 10 миллионов, например, по меньшей мере, 20 миллионов, по меньшей мере, 30 миллионов, по меньшей мере, 40 миллионов, по меньшей мере, 50 миллионов, по меньшей мере, 60 миллионов, по меньшей мере, 70 миллионов или, по меньшей мере, 80 миллионов.
68. Способ по любому из пп.64-67, в котором вводимые опухоле-реактивные Т-лимфоциты представляют собой комбинацию эффекторных Т-лимфоцитов и Т-лимфоцитов памяти.
69. Способ по п.68, в котором процентное содержание эффекторных Т-лимфоцитов составляет от приблизительно 10% до приблизительно 65%, например, от приблизительно 20% до приблизительно 50% или от приблизительно 30% до приблизительно 40%.
70. Способ по любому из пп.64-69, в котором опухоле-реактивные Т-лимфоциты являются аутологичными.
71. Способ по любому из пп.64-69, в котором опухоле-реактивные Т-лимфоциты не являются аутологичными.
72. Способ по любому из пп.64-71, в котором неопластическое заболевание выбирают из любой солидной неоплазмы эпителиального, мезенхимального или эмбриологического происхождения в любом анатомическом расположении, таком как для эпителиальных неоплазм, например карцином в молочных железах, толстом кишечнике, поджелудочной железе, мочевом пузыре, тонком кишечнике, простате, шейке матки, вульве, яичниках; для мезенхимальных неоплазм, например сарком в суставах, костях, мышцах и сухожилиях, и некоторых гематологических, таких как лимфомы; для эмбриологических неоплазм, например тератомы.
73. Применение опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, полученных по любому из пп.1-57, для получения лекарственного средства для лечения заболевания неопластического происхождения.
74. Набор для применения в способе по любому из пп.1-57 или 64-72, причем набор содержит среду для культивирования Т-лимфоцитов.
75. Набор по п.74, дополнительно содержащий одно или более веществ для стимуляции, активации и направления опухоле-реактивных Т-лимфоцитов.
76. Набор по п.74 или 75, в котором средой является бессывороточная среда, такая как, например, AIMV, RPMI 1640, DMEM или MEM.
77. Набор по любому из пп.74-76, в котором одно или более веществ для стимуляции, активации и направления опухоле-реактивных Т-лимфоцитов выбирают из полученного из опухоли антигена, веществ, обладающих агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, веществ, способных активировать IL-2R на Т-лимфоцитах, веществ, способных противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2, и веществ, стимулирующих развитие Т-лимфоцитов типа Th1.
78. Набор по любому из пп.74-77, в котором одно или более веществ для стимуляции, активации и направления опухоле-реактивных Т-лимфоцитов выбирают из группы, содержащей IL-2, интерферон-альфа, антитело против IL-4, антитело против IL-5, антитело против IL-10, IL-7, IL-12, IL-15 и IL-21.
79. Набор по любому из пп.74-78, содержащий фармацевтическую композицию, подходящую для внутривенного введения.
80. Набор по любому из пп.74-79, дополнительно содержащий шприц, содержащий локатор лимфатического узла.
81. Набор по любому из пп.74-80, дополнительно содержащий инструкции по применению.
82. Набор по п.81, в котором инструкции представлены в форме компьютерной программы.
Определения
Под термином «опухоле-реактивные Т-лимфоциты» понимают Т-лимфоциты, несущие Т-клеточный рецептор, специфичный к опухолевому антигену и распознающий его.
Под термином «Т-хелперные клетки» понимают Т-лимфоциты, которые при активации стимулируют адаптивные иммунные реакции.
Под термином «клетки Th1» понимают Т-хелперные клетки, которые стимулируют клеточно-опосредованные иммунные реакции при активации, используя цитокины, такие как IFN-гамма.
Под термином «клетки Th2» понимают Т-хелперные клетки, стимулирующие гуморальные иммунные реакции при активации, используя цитокины, такие как IL-4.
Под термином «CD4+ хелперные Т-лимфоциты» понимают Т-лимфоциты, которые экспрессируют CD4, но не экспрессируют фактор транскрипции FoxP3.
Под термином «CD8+ Т-лимфоциты» понимают Т-лимфоциты, которые экспрессируют CD8.
Под термином «регуляторные Т-лимфоциты» понимают Т-лимфоциты, которые подавляют адаптивные иммунные реакции, экспрессируя фактор транскрипции FoxP3.
Под термином «специфическая активация» Т-лимфоцитов понимают антиген-специфическую и ограниченную по МНС активацию, опосредованную Т-клеточным рецептором. Наоборот, термин «неспецифическая активация» Т-лимфоцитов означает общую активацию всех Т-клеток независимо от специфичности Т-клеточного рецептора.
Термин «полученный из опухоли антиген» охватывает опухолевые клетки, гомогенат опухоли, причем гомогенат может быть денатурированным, или белки опухоли, полипептиды или пептиды, например, в форме очищенного, природного, синтетического и/или рекомбинантного белка, полипептида или пептида. Полученный из опухоли антиген может представлять собой интактные молекулы, их фрагменты или мультимеры, или агрегаты интактных молекул и/или фрагментов. Примерами подходящих полипептидов и пептидов являются такие пептиды и полипептиды, которые содержат от приблизительно 5 до приблизительно 30 аминокислот, например, от приблизительно 10 до 25 аминокислот, от приблизительно 10 до 20 аминокислот или от приблизительно 12 до 18 аминокислот. При использовании пептидов может быть использована конечная молярная концентрация в культуре от приблизительно 0,1 до приблизительно 5,0 мкМ, например, от приблизительно 0,1 до приблизительно 4,0 мкМ, от приблизительно 0,2 до приблизительно 3,0 мкМ, от приблизительно 0,3 до приблизительно 2,0 мкМ или от приблизительно 0,3 до приблизительно 1,0 мкМ. Полученный из опухоли антиген может быть аутологичным или гетерологичным, т.е. происходить от пациента, нуждающегося в лечении, или быть полученным от другого субъекта, страдающего раком. В представленных примерах изобретатели используют денатурированный экстракт аутологичной опухоли, однако, как упомянуто выше, также могут быть приемлемы для использования в способе по изобретению другие источники полученного из опухоли антигена.
Под термином «день 1 первой фазы» или, например, «день 5 второй фазы» нужно понимать следующее: под днем 0 (zero) понимают день, когда лимфоциты собирают. День 1 первой фазы определяют как день, когда размножение инициируют добавлением, по меньшей мере, одного вещества, обладающего агонистической активностью по отношению к рецептору IL-2, и, возможно, культуральной среды и/или полученного из опухоли антигена. Фаза размножения i) может быть инициирована в день 0 (zero) или не позднее 2 дней после сбора лимфоцитов. День, когда инициируют вторую фазу добавлением полученного из опухоли антигена, во всем тексте описывается как «день 1 второй фазы».
Под термином «сторожевой лимфатический узел» понимают первый(ые) лимфатический(ие) узел(ы), принимающий(ие) отток лимфы от опухоли. Термин «первый от метастаза лимфатический узел» относится к первому(ым) лимфатическому(им) узлу(ам), принимающему(им) отток лимфы от метастаза.
Фаза i)
in vitro
Целью первой фазы i) является получение культуры, содержащей, по существу, высокий процент опухоле-реактивных CD4+ хелперных и/или CD8+ Т-лимфоцитов. Первую фазу необходимо рассматривать как «фазу кормления», где опухоле-реактивные Т-лимфоциты вынуждены выживать и размножаться. В зависимости от источника Т-лимфоцитов (исходный материал для способа размножения ), их можно фазировать в соответствии с неблагоприятными условиями, такими как, например, супрессия и ингибирование факторами, секретируемыми раковыми клетками.
in vitro
in vivo
Исходный материал для использования в способе размножения по изобретению может представлять собой смесь лимфоцитов, полученных из лимфатических узлов, принимающих отток лимфы от первичной опухоли и/или метастаза, таких как, например, сторожевой лимфатический узел или первый от метастаза лимфатический узел. Их можно идентифицировать в процессе хирургической операции, например, введением локатора лимфатического узла, такого как, например, индикаторное вещество, вокруг или внутрь опухоли или метастаза. Локатор лимфатического узла, такой как, например, индикатор, переносится в лимфатические капилляры и аккумулируется в сторожевом/первом от метастаза узле(ах), таким образом, идентифицируя опухоль или метастаз с оттоком лимфы в лимфатический узел(ы). Изобретатели недавно показали, что первые лимфатические узлы, принимающие отток лимфы от опухоли, представляют собой потенциальный богатый источник природных опухоле-реактивных CD4+ хелперных и/или CD8+ Т-лимфоцитов для размножения , поскольку такие узлы могут содержать значительное количество Т-лимфоцитов, которые обладают повышенной чувствительностью к опухолевым антигенам, и они подверглись размножению  в лимфатических узлах.
Альтернативным источником CD4+ хелперных и/или CD8+ Т-лимфоцитов может быть кровь индивида, страдающего онкологическим заболеванием, такая как, например, периферическая кровь. Индивид может быть пациентом, не получавшим лечения, с длительно протекающим заболеванием, или уже получавшим лечение пациентом, у которого могут быть получены периферические Т-лимфоциты с повышенной чувствительностью к опухоли. Другие подходящие источники CD4+ хелперных и/или CD8+ Т-лимфоцитов включают костный мозг, ткань селезенки и опухоли.
Однако в предпочтительных вариантах осуществления изобретения исходный материал получают из сторожевых или первых от метастаза лимфатических узлов.
Т-лимфоциты для количественного увеличения в культуре могут быть получены от индивида, нуждающегося в лечении, т.е. полученные специфические опухоле-реактивные Т-лимфоциты для введения могут быть аутологичными. Однако Т-лимфоциты также могут быть получены из источника, отличного от индивида, нуждающегося в лечении, такого как, например, другой индивид, страдающий онкологическим заболеванием. В таком случае реципиент и количественно увеличенные опухоле-реактивные Т-лимфоциты предпочтительно являются иммунологически совместимыми (или же реципиента делают иммунотолерантным к количественно увеличенным опухоле-реактивным Т-лимфоцитам).
В зависимости от источника исходного материала, он будет содержать смесь различных лимфоцитов, таких как, например, Т-лимфоциты, В-лимфоциты, антиген-представляющие клетки, опухоле-реактивные Т-лимфоциты и неактивированные/нереактивные Т-лимфоциты. Для стимуляции жизнеспособности конкретно опухоле-реактивных CD4+ хелперов и CD8+ Т-лимфоцитов добавляют опухолевый антиген и одно или несколько веществ, обладающих агонистической активностью в отношении рецептора IL-2.
Как упомянуто выше, первую фазу i) инициируют добавлением, по меньшей мере, одного вещества, обладающего агонистической активностью в отношении рецептора IL-2. Функцией таких веществ является стимуляция Т-лимфоцитов посредством рецептора IL-2 к усилению клеточного деления Т-лимфоцитов, тем самым предотвращая клеточную гибель.
Антиген-специфическая ограниченная по МНС активация Т-лимфоцитов стимулирует размножение клона используемой популяции Т-лимфоцитов, специфичной для распознавания клеток опухоли. Наоборот, неспецифическая активация Т-лимфоцитов будет приводить к размножению клонов Т-лимфоцитов, распознающих пептиды, не имеющих какого-либо отношения к распознаванию клеток опухоли, таким образом, большинство неспецифически количественно увеличенных Т-лимфоцитов не будут распознавать опухоль.
Изобретение относится к стимуляции специфической активации и роста опухоле-реактивных CD4+ хелперов и CD8+ Т-лимфоцитов. Специфическая активация в отношении определенного антигена опухоли дает Т-лимфоцитам возможность обладать терапевтическим эффектом при введении онкологическому больному с тем же типом опухоли, против которого активируются Т-лимфоциты.
Введение неспецифически активированных Т-лимфоцитов не имело бы терапевтического эффекта в отношении какого-либо вида рака или имело крайне низкую вероятность этого благодаря небольшому количеству Т-лимфоцитов, имеющих отношение к опухоли.
В одном из вариантов осуществления изобретения вещества, обладающие агонистической активностью к рецептору IL-2, являются агонистами. Примеры таких веществ включают белки, полипептиды, пептиды, антитела, аффитела и их фрагменты, слитые белки, синтетические и/или органические молекулы, такие как, например, малые молекулы и природные лиганды. В предпочтительном варианте осуществления вещество представляет собой природный лиганд рецептора IL-2, то есть IL-2.
При использовании IL-2 его предпочтительно добавляют в низкой дозе для снижения апоптоза лимфоцитов и возрастания популяции CD4-позитивных хелперных опухоле-реактивных Т-лимфоцитов. В определенном варианте осуществления изобретения низкая доза IL-2 составляет от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 700 МЕ/мл культуральной среды, например, от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 600 МЕ/мл культуральной среды, от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 500 МЕ/мл культуральной среды, от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 400 МЕ/мл культуральной среды, от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 300 МЕ/мл культуральной среды и от приблизительно 100 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 200 МЕ/мл культуральной среды. В конкретном варианте осуществления количество добавляемого IL-2 составляет 240 МЕ/мл.
В случае веществ, отличных от IL-2, обладающих агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, используют их специфические дозы, которые должны быть такими, чтобы приводить к эффекту, соответствующему эффекту, полученному при введении вышеупомянутых доз IL-2.
С целью поддержания оптимальных условий для стимуляции клеточного деления можно регулярно добавлять на протяжении фазы i), например, каждый 2-й, 3-й или 4-й день фазы i) дополнительное количество, по меньшей мере, одного вещества, обладающего агонистической активностью в отношении рецептора IL-2. Под термином «каждый 2-й, 3-й или 4-й» понимают тот факт, что, по меньшей мере, одно вещество, обладающее агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, добавляют на протяжении фазы i) каждый 2-й, 3-й или 4-й день, начиная со 2-го, 3-го или 4-го дня после первого добавления, по меньшей мере, одного вещества, обладающего агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, т.е. после инициации фазы i).
В одном из вариантов осуществления веществом, регулярно добавляемым на протяжении фазы i), является агонист IL-2. В предпочтительном варианте осуществления вещество представляет собой IL-2.
Дополнительная доза веществ, обладающих агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, таких как, например, IL-2, регулярно добавляемых, например, каждый 2-й, 3-й или 4-й день, находится в вышеуказанных диапазонах.
Дополнительной важной стадией первой фазы i) размножения является добавление полученного из опухоли антигена с целью стимуляции клеточного размножения Т-лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы Т-лимфоцитов, распознающие опухолевые антигены, т.е. опухоле-реактивных Т-лимфоцитов.
Оптимальное время добавления опухолевого антигена зависит от источника лимфоцитов. Если лимфоциты происходят из лимфатических узлов, таких как, например, сторожевые лимфатические узлы, или из опухолей, лимфоциты могут подвергнуться влиянию непосредственной близости и иммуносупрессии клетками опухоли, и потребуется инкубация с использованием вещества, обладающего агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, такого как, например, IL-2, в течение нескольких дней для усиления способности Т-лимфоцитов отвечать пролиферацией на представление антигена опухоли. Соответственно, в таком случае полученный из опухоли антиген добавляют предпочтительно со 2 дня до 5 дня включительно первой фазы i), например на 2 день, на 3 день, на 4 день или на 5 день.
Если лимфоциты происходят из крови, полученный из опухоли антиген может быть добавлен уже при инициации первой фазы i), т.е. вместе с веществом, обладающим агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, поскольку Т-лимфоциты не подвергались вышеупомянутой иммуносупрессии клетками опухоли. Соответственно, при использовании крови полученный из опухоли антиген добавляют фактически одновременно с инициацией фазы i) или не позднее 2 дней после этого.
Полученный из опухоли антиген, такой как, например, гомогенат опухоли, по-видимому, захватывается эндоцитозом и процессируется антиген-представляющими клетками, присутствующими в исходном материале, такими как, например, В-лимфоциты, дендритные клетки и макрофаги. В большинстве случаев полученный из опухоли антиген должен быть представлен молекулами MCH класса II, что приводит к размножению клеток CD4+ хелперных опухоле-реактивных Т-лимфоцитов. Однако посредством перекрестного представления антигены, захваченные эндоцитозом, могут быть процессированы и представлены в «карман» класса I, приводя к активации CD8+ Т-лимфоцитов. Как указано выше, одной из целей способа размножения является в некотором смысле повторение природного пути собственной иммунной системы пациентов, и, в определенном отношении вводя компоненты иммунной системы пациентов, определяют, образуются ли CD4+ или CD8+ лимфоциты, в зависимости от того, представляется ли антиген MCHI или MCHII. В большинстве случаев антигены будут представляться молекулой MCH класса II, приводя к образованию CD4+ Т-лимфоцитов, однако в некоторых случаях образуются CD8+ Т-лимфоциты.
Фаза ii)
Целью второй фазы ii) является активация и увеличение числа опухоле-реактивных CD4+ хелперных и/или CD8+ Т-лимфоцитов, полученных в фазе i), и получение специфической субпопуляции опухоле-реактивных CD4+ хелперных и/или CD8+ Т-лимфоцитов путем направления их на желаемый путь.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что одним из способов определения оптимального времени для инициации фазы ii) является мониторинг экспрессии на Т-лимфоцитах маркера клеточной поверхности CD25 с целью определения, когда конкретно Т-лимфоциты будут восприимчивы к рестимуляции. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что вторая фаза ii) предпочтительно должна быть инициирована, когда экспрессия CD25 на Т-лимфоцитах будет подавлена. CD25 является маркером активации, указывающим, что лимфоциты получили активирующий сигнал. Если бы вторую фазу инициировали при высокой экспрессии CD25 на Т-лимфоцитах, это означало бы, что лимфоциты уже получили сигнал, наблюдалась бы смерть клетки.
Подавление CD25 определяют как тот факт, что существенная часть популяции Т-лимфоцитов экспрессирует очень мало или, по существу, не экспрессирует маркеры CD25. В предпочтительном варианте осуществления подавление CD25 определяют так, что менее 5% популяции Т-лимфоцитов экспрессируют CD25, т.е. 95% или более Т-лимфоцитов в культуре вообще не экспрессируют CD25. 5% или менее Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD25, являются наиболее подходящими регуляторными CD4+ Т-лимфоцитами, которые имеют высокую постоянную экспрессию CD25. Кроме того, популяция Т-лимфоцитов предпочтительно должна экспрессировать очень мало или, по существу, не экспрессировать маркеры Foxp3, которые являются специфическими маркерами регуляторных Т-лимфоцитов. В предпочтительном варианте осуществления подавление Foxp3 определяют как тот факт, что менее 5% популяции Т-лимфоцитов экспрессируют Foxp3, т.е. 95% или более Т-лимфоцитов в культуре вообще не экспрессируют Foxp3.
Помимо CD25 существуют также и другие маркеры, экспрессия которых значима при наблюдении с целью определения оптимального времени для инициации второй фазы. Примерами таких маркеров являются маркер ранней активации CD69 и MCHII, который является маркером активации Т-лимфоцитов. Поскольку экспрессия CD69 и MCHII указывает, что «программа активации» Т-лимфоцитов уже включилась, это означает, что клетки не способны отвечать на дополнительные стимулы, оба этих маркера предпочтительно должны быть подавлены перед инициацией второй фазы. Термин подавление может быть определен как тот факт, что менее 5-10% популяции Т-лимфоцитов экспрессируют CD69 и/или MCHII.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения для отделения Т-хелперных клеток от возможных клеток опухоли в культуре при размножении в фазе ii) способа размножения используют антитела против CD4.
В дополнительном или еще одном варианте осуществления настоящего изобретения для стимуляции размножения в фазе ii) способа размножения используют продукты, такие как Dynabeads c антителами против CD3 и CD28. При использовании Dynabeads CD3/CD28 будут получаться лимфоциты с сигналами активации, что также могло бы использоваться для отделения от возможных клеток опухоли в культуре. Во время фазы i) Dynabeads CD3/CD28 будут связываться с Т-лимфоцитами, количественно увеличенными антиген-специфическим образом, причем эти клетки теперь могут быть обогащены посредством магнита. После того как исходная антиген-специфическая активация инициировала и привела к клональной экспансии Т-лимфоцитов, рестимуляция с помощью Dynabeads CD3/CD28 будет дополнительно стимулировать клональную экспансию, поскольку фаза i) не способствует активации неспецифических клонов Т-лимфоцитов.
Несмотря на то что точная точка начала фазы ii) будет меняться в зависимости от того, когда лимфоциты приобрели предпочтительную экспрессию специфических маркеров, вторую фазу ii) чаще всего инициируют со дня 17 по день 23 включительно первой фазы i), например на день 17, на день 18, на день 19, на день 20, на день 21, на день 22 или на день 23. Другими словами, чаще всего полагают, что время, когда лимфоциты экспрессируют предпочтительное количество и сочетание маркеров, находится между днем 17 и днем 23 первой фазы i).
Увеличение числа Т-лимфоцитов, т.е. фаза i) и ii), чаще всего должно проходить в подходящей культуральной среде. Чтобы избежать риска распространения заболеваний у пациента, предпочтительно используют бессывороточную среду или аутологичную сыворотку. Примеры подходящих стандартных сред включают среду AIMV, RPMI 1640, DMEM и MEM. Однако также могут быть использованы другие среды, содержащие подходящую смесь аминокислот, стероидов, витаминов, факторов роста, цитокинов и минералов.
Во время двух фаз размножения клетки могут быть распределены по нескольким пробиркам для культивирования, чтобы поддержать подходящую плотность клеток в культурах. Плотность Т-лимфоцитов в фазах размножения предпочтительно должна быть от приблизительно 3 до приблизительно 6 миллионов клеток/мл культуральной среды.
В процессе размножения также может понадобиться замена культуральной среды свежей средой, стадия, которая называется установлением требуемого состояния среды. Время распределения культур и установления требуемого состояния среды может быть определено на основании морфологии клеток и плотности клеточной культуры (которая не должна превышать приблизительно 6 миллионов клеток/мл), или среда может содержать подходящий индикатор, такой как, например, феноловый индикатор. В случае, когда индикатор включен в среду, выбор времени распределения культур или установления требуемого состояния среды может быть основан на цвете среды. При использовании фенолового красного индикатора клетки должны быть распределены или приведены к требуемому состоянию, когда среда станет желтой, указывая на то, что рН культуры оказывается кислым. Подходящая схема приведения среды, используемой в настоящем изобретении, к требуемому состоянию может представлять собой замену от 1/4 до 1/2, например 1/3 среды, каждые 3-9 дней, например раз в неделю.
2
Кроме конкретных условий, упомянутых в данном документе, для других параметров должны быть использованы стандартные условия роста культур лимфоцитов, такие как температура 37°С и 5% СО.
Как упомянуто выше, вторую фазу ii) инициируют добавлением полученного из опухоли антигена, определенного выше, к Т-лимфоцитам для активации опухоле-реактивных CD25-негативных Т-лимфоцитов с целью стимулировать клональную экспансию опухоле-реактивных Т-лимфоцитов.
В конкретном варианте осуществления изобретения вместе с полученным из опухоли антигеном к Т-лимфоцитам добавляют антиген-представляющие клетки (АРС). Антиген-представляющие клетки (АРС) включают лейкоциты, такие как, например, моноциты, макрофаги и лимфоциты, такие как, например, В-клетки. Эти несхожие типы клеток обладают общей способностью представлять антиген в форме, которая распознается специфическими рецепторами Т-лимфоцитов. Препарат лейкоцитов выделяют, например, из крови, лимфы, костного мозга, ткани лимфатического органа или жидкости тканевой культуры, полученных от пациента, нуждающегося в лечении. В предпочтительном варианте осуществления клетки АРС представляют собой облученные лейкоциты периферической крови, содержащие антиген-представляющие В-клетки и/или моноциты. Количество добавляемых АРС находится в диапазоне от приблизительно 0,5 миллиона АРС/мл культуры лимфоцитов до приблизительно 5 миллионов АРС/мл культуры лимфоцитов, например, от приблизительно 1 миллиона АРС/мл культуры лимфоцитов до приблизительно 4 миллионов АРС/мл культуры лимфоцитов, от приблизительно 1 миллиона АРС/мл культуры лимфоцитов до приблизительно 3 миллионов АРС/мл культуры лимфоцитов или от приблизительно 1 миллиона АРС/мл культуры лимфоцитов до приблизительно 2 миллионов АРС/мл культуры лимфоцитов.
Помимо добавления полученного из опухоли антигена к Т-лимфоцитам с целью стимуляции клональной экспансии опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, вторая фаза ii) включает добавление специфических компонентов, функцией которых является направлять увеличение числа опухоле-реактивных Т-лимфоцитов в сторону желаемой субпопуляции.
Как упомянуто выше, настоящее изобретение относится к способу получения опухоле-реактивных CD4+ хелперных Т-лимфоцитов. CD4+ хелперные Т-лимфоциты распознают и связывают опухолевый антиген, если антиген связывается с молекулой главного комплекса гистосовместимости класса II. Активированные CD4+ хелперные Т-лимфоциты секретируют цитокины, белки и/или пептиды, которые стимулируют другие клетки иммунной системы, такие как другие лимфоциты. Самым обычным секретируемым цитокином является интерлейкин-2 (IL-2), который представляет собой потенциальный фактор роста Т-лимфоцитов. Активированные, пролиферирующие CD4+ хелперные Т-лимфоциты могут дифференцировать в два главных подтипа клеток, клетки Th1 и Th2, которые определяют на основе продуцируемых специфических цитокинов. Клетки Th1 продуцируют интерферон-гамма и интерлейкин 12 (IL-12), тогда как клетки Th2 продуцируют интерлейкин-4, интерлейкин-5 и интерлейкин-13. Полагают, что Т-лимфоциты Th1 усиливают активацию цитотоксических Т-лимфоцитов (Тс), NK-клеток, макрофагов и моноцитов, все они могут поражать раковые клетки и вообще защищать против опухолей.
Т-хелперные (CD4+) лимфоциты типа Th1 и Th2 могут дифференцироваться в клетки памяти и эффекторные клетки. Т-хелперные (CD4+) лимфоциты памяти специфичны к антигену, они первыми встречаются и могут быть привлечены в процессе вторичного иммунного ответа, вызывая более быстрый и больший ответ на опухолевые антигены. Установлено на людях, что лимфоциты сохраняют жизнеспособность, по меньшей мере, 20 лет, возможно, в течение жизни. Эффекторные CD4+ Т-лимфоциты представляют собой активированные клетки, продуцирующие цитокины и INF-гамма. Для эффективного лечения рака особенно эффективным является введение опухоле-реактивных Т-лимфоцитов типа Th1, поскольку полагают, что этот тип усиливает активацию цитотоксических Т-лимфоцитов (Тс), NK-клеток, макрофагов и моноцитов, все они могут поражать раковые клетки и вообще защищать против опухолей, т.е. в конкретном варианте осуществления изобретения, относящегося к способу получения опухоле-реактивных CD4+ хелперных Т-лимфоцитов, и в дополнительном варианте осуществления процентное содержание Т-лимфоцитов типа Th2, полученных представленным способом, составляет 30% или менее, например 25% или менее, 20% или менее, 15% или менее, 10% или менее, 5% или менее, или 0%, т.е., по меньшей мере, 70% опухоле-реактивных CD4+ Т-лимфоцитов представляют собой тип Th1, например, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95% или 100%.
Соответственно, вторая фаза может включать введение вещества, способного активировать IL-12R на Т-лимфоцитах. Активирование IL-12R будет увеличивать готовность Т-клеток воспринять и оптимизировать активацию цитокином IL-12, что приводит к максимальной передаче сигнала STAT-4 и, таким образом, подталкивает лимфоциты к дифференцировке в клетки Th1 и продукции IFN-γ.
Веществом(ами), способным(и) активировать IL-12R на Т-лимфоцитах, может быть вещество(а), обладающее(ие) агонистической активностью в отношении рецептора интерферона. В одном из вариантов осуществления изобретения вещества, обладающие агонистической активностью в отношении рецептора интерферона, являются агонистами. Примеры таких веществ включают белки, полипептиды, пептиды, антитела, аффитела и их фрагменты, слитые белки, синтетические и/или органические молекулы, такие как, например, малые молекулы и природные лиганды. В конкретном варианте осуществления это вещество представляет собой природный лиганд рецептора интерферона, а именно интерферон, такой как интерферон-α.
Оптимальное время добавления вещества(в), способного активировать IL-12R на Т-лимфоцитах, такого как, например, вещество, обладающее агонистической активностью в отношении рецептора интерферона, может быть определено измерением уровня IL-12 в культуральной среде. Вещество(а) предпочтительно нужно добавлять, когда уровень IL-12 увеличивается, по меньшей мере, 1-кратно, например, по меньшей мере, 2-кратно, по меньшей мере, 3-кратно, по меньшей мере, 4-кратно или, по меньшей мере, 5-кратно по сравнению с уровнем IL-12 на день 1 фазы ii). В большинстве случаев такое увеличение уровня IL-12 будет заметно со дня 2 до дня 4 включительно после инициации второй фазы ii), например на день 2, на день 3 или на день 4.
Для того чтобы в значительной степени избежать образования опухоле-реактивных Т-лимфоцитов типа Th2, вторая фаза может дополнительно включать введение одного или более веществ, способных противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2. Примерами таких веществ являются вещества, способные нейтрализовать интерлейкины IL-4, IL-5, IL-10 и/или TGF-бета (последний не является интерлейкином), все четверо из которых необходимы для установления цитокинового профиля Th2 и для снижения продукции цитокинов клетками Th1.
Примеры таких веществ включают белки, полипептиды, пептиды, растворимые рецепторы, антитела, аффитела и их фрагменты, слитые белки, синтетические и/или органические молекулы, такие как, например, малые молекулы и природные лиганды. В конкретном варианте осуществления вещества выбирают из антител, которые связываются с интерлейкинами, таким образом, нейтрализуя их, таких как, например, антитела против IL-4, антитела против IL-5 и/или антитела против IL-10, наряду с растворимыми рецепторами (такими как, например, рецептор TGF-бета I и II) и связывающими белками для TGF-бета (такими как, например, LAP и/или LTBP).
Одно или более веществ, способных противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2, таких как, например, одно или более веществ, способных нейтрализовать IL-4, IL-5, IL-10 и/или TGF-бета, могут быть добавлены на день 1 второй фазы ii). Однако поскольку антитела стоят дорого, добавление антител также можно осуществлять на следующей стадии после добавления вещества, способного активировать IL-12R на Т-лимфоцитах, например, в первый день, второй день или третий день после добавления вещества, способного активировать IL-12R на Т-лимфоцитах.
Нейтрализующие вещества должны быть добавлены в количестве, достаточном для нейтрализации интерлейкинов, таком как, например, 10-100-кратный (по молям) избыток количества нейтрализуемого интерлейкина. При использовании антител обычно потребуется конечная концентрация от приблизительно 2 до приблизительно 4 нг/мл культуральной среды. Для других типов нейтрализующих веществ должна быть использована конечная концентрация, дающая тот же эффект, что и концентрация, указанная для антител.
Для поддержания супрессии развития Т-лимфоцитов типа Th2 дополнительное количество одного или более веществ, способных противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2, таких как, например, одно или более веществ, способных нейтрализовать IL-4, IL-5, IL-10 и/или TGF-бета, можно регулярно добавлять на протяжении всей фазы ii), например каждый 2-й, 3-й или 4-й день фазы ii). Должно быть понятно, что термин каждый 2-й, 3-й или 4-й день означает, что, по меньшей мере, одно вещество, способное противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2, добавляют на протяжении всей фазы i) каждый 2-й, 3-й или 4-й день, начиная со 2-го, 3-го или 4-го дня после первого добавления, по меньшей мере, одного вещества, способного противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2.
Более того, относительно фазы i) дополнительное количество вещества, обладающего агонистической активностью в отношении рецептора IL-2, такого как, например, агонист, можно регулярно добавлять на протяжении всей фазы ii), например, каждый день со 2-го по 4-й фазы ii), т.е. на 2-й, 3-й или 4-й день, с целью поддержания оптимальных условий, стимулирующих размножение клеток. Доза регулярно добавляемого вещества лежит в оптимальных диапазонах, указанных для фазы i) в отношении добавления веществ, обладающих агонистической активностью к рецептору IL-2, таких как, например, IL-2.
Для преимущественного получения опухоле-реактивных Т-лимфоцитов типа Th1 вторая фаза ii) может включать добавление одного или более веществ, стимулирующих развитие Т-лимфоцитов типа Th1. Примерами таких веществ являются вещества, обладающие агонистической активностью в отношении рецептора IL-7, IL-12, IL-15 и/или IL-21. Более конкретно, эти вещества могут быть агонистами рецептора IL-7, IL-12, IL-15 и/или IL-21. Примеры таких агонистов включают белки, полипептиды, пептиды, антитела, аффитела и их фрагменты, слитые белки, синтетические и/или органические молекулы, такие как, например, малые молекулы и природные лиганды. В конкретном варианте осуществления эти вещества представляют собой природные лиганды рецептора IL-7, IL-12, IL-15 и/или IL-21, соответственно, такие как IL-7, IL-12, IL-15 и/или IL-21.
Влияние IL-12 активирует IFN-гамма, индуцируя путь STAT путем стимуляции IL-12R, тем самым усиливая активацию лимфоцитов Th1. Функцией IL-21 является усиление пролиферации, активации и развития в направлении Т-лимфоцитов типа Th1.
Как IL-7, так и IL-15 действуют путем стимуляции увеличения числа Т-лимфоцитов для обеспечения гомеостаза, увеличивая регистрацию активированных Т-лимфоцитов, запрограммированных на путь Th1.
Оптимальным временем добавления одного или более веществ, стимулирующих развитие Т-лимфоцитов типа Th1, является время, когда Т-лимфоциты восприимчивы к модификации. При добавлении веществ, когда Т-лимфоциты не восприимчивы к модификации, добавление не будет эффективным, т.е. не будет преимущественного развития Т-лимфоцитов типа Th1. Для определения оптимального времени добавления веществ, стимулирующих развитие Т-лимфоцитов типа Th1, таких как, например, вещества, обладающие агонистической активностью в отношении рецептора IL-7, IL-12, IL-15 и/или IL-21, можно наблюдать за продукцией IFN-γ Т-лимфоцитами. В предпочтительном варианте осуществления одно или более веществ, стимулирующих развитие Т-лимфоцитов типа Th1, таких как, например, вещества, обладающие агонистической активностью к рецептору IL-7, IL-12, IL-15 и/или IL-21, должны быть добавлены, когда уровень IFN-гамма увеличивается по сравнению с уровнем IFN-гамма при инициации второй фазы ii).
В конкретном варианте осуществления увеличение уровня IFN-гамма может быть определено как, по меньшей мере, 1-кратное увеличение уровня IFN-гамма, такое как, например, по меньшей мере, 2-кратное, по меньшей мере, 3-кратное, по меньшей мере, 4-кратное увеличение по сравнению с уровнем IFN-гамма при инициации второй фазы ii). Часто стремление к такому увеличению может коррелировать с тем, что содержание IFN-гамма в культуральной среде должно быть, по меньшей мере, 100 пг/мл культуральной среды, например, по меньшей мере, 150 пг/мл культуральной среды, по меньшей мере, 200 пг/мл культуральной среды или, по меньшей мере, 250 пг/мл культуральной среды.
При определении оптимального времени добавления веществ, стимулирующих развитие Т-лимфоцитов типа Th1, таких как, например, вещества, обладающие агонистической активностью в отношении рецептора IL-7, IL-12, IL-15 и/или IL-21, можно дополнительно рассмотреть экспрессию маркеров активации CD25 и CD69 на CD4+ Т-лимфоцитах, причем маркеры предпочтительно должны быть активированы. Под активированием понимают тот факт, что, по меньшей мере, от приблизительно 40% до приблизительно 60% или более CD4+ Т-лимфоцитов должны экспрессировать CD25 и CD69 по сравнению с экспрессией CD25 и CD69 на Т-лимфоцитах в день 1 фазы ii), показывая, что Т-лимфоциты получили сигнал активации.
Обычно оптимальное время добавления веществ, стимулирующих развитие Т-лимфоцитов типа Th1, будет последовательно снижаться для стадии добавления веществ, способных активировать IL-12R на Т-лимфоцитах, и веществ, способных противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2. Более конкретно, оптимальное время добавления веществ, стимулирующих развитие Т-лимфоцитов типа Th1, будет снижаться в промежутке между днем 5 и днем 8 после инициации второй фазы ii), например на день 5, день 6, день 7 или день 8.
В случае добавления IL-7, IL-12, IL-15 и/или IL-21, концентрация каждого из этих веществ в культуральной среде должна лежать в диапазоне от приблизительно 150 МЕ/мл культуральной среды до приблизительно 300 МЕ/мл культуральной среды, например 250 МЕ/мл культуральной среды. При использовании веществ, отличных от упомянутых конкретных веществ, их нужно добавлять в культуру в конечной концентрации, которая приводит к тому же эффекту, который будет давать добавление IL-7, IL-12, IL-15 и/или IL-21 в упомянутых конкретных диапазонах.
Как указано выше, представленный способ предпочтительно используют для увеличения числа Т-лимфоцитов, чтобы получить CD4+ опухоле-реактивные Т-лимфоциты типа Th1. Один из дополнительных аспектов изобретения заключается в том, что, используя описанный в данном документе способ увеличения числа опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, будут получать относительно большое количество Т-лимфоцитов памяти. В лечении рака, конечно, важно, чтобы пациент, нуждающийся в лечении, получал значительное количество эффекторных опухоле-реактивных CD4+ Т-лимфоцитов, подобных лимфоцитам, как указано выше, усиливающим активацию цитотоксических Т-лимфоцитов (Тс), NK-клеток, макрофагов и моноцитов, все они могут противодействовать раковым клеткам и, в целом, защищать против опухолей.
Однако вводя в то же время значительное количество опухоле-реактивных CD4+ Т-лимфоцитов памяти, пациент до конца жизни получает длительную защиту против рецидива опухоли или метастаза первичной опухоли.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу получения Т-лимфоцитов памяти. Как правило, при количественном увеличении культуры опухоле-реактивных Т-лимфоцитов по настоящему изобретению будет получаться от приблизительно 35% до приблизительно 90% опухоле-реактивных Т-лимфоцитов типа клеток памяти, например, от приблизительно 40% до приблизительно 90%, от приблизительно 50% до приблизительно 80% или от приблизительно 60% до приблизительно 70%. Авторы настоящего изобретения делают предположение, что тот факт, что лимфоцитам в фазе i) дают возможность регенерировать перед добавлением опухолевого антигена, наряду с относительно медленной фазой размножения, приводит к получению большого значения отношения лимфоцитов памяти к эффекторным лимфоцитам.
Как указано выше, экспрессия маркеров активации клеточной поверхности CD25 и CD69 на Т-лимфоцитах может быть использована для определения, когда инициировать важные стадии представленного способа, например когда инициировать вторую фазу ii). Соответственно, может быть полезно непрерывно наблюдать за экспрессией CD25 и CD69 на протяжении всей фазы i) и фазы ii), например, каждый 2-й, каждый 3-й или каждый 4-й день.
Одной из целей представленного способа является получение большого числа специфических CD4+ опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, которые могут быть использованы для введения пациенту, причем опухоле-реактивные Т-лимфоциты могут быть собраны в некоторой временной точке, что приведет к окончанию стадии размножения. Оптимальным временем сбора опухоле-реактивных Т-лимфоцитов является время, когда экспрессия CD25 на Т-лимфоцитах подавляется, причем подавление определяется как такое, когда 5% или менее популяции CD4+ Т-лимфоцитов экспрессирует CD25. Оптимальное время сбора также можно определить на основании измерения количества продуцированного IFN-гамма. Продукция IFN-гамма должна быть увеличена, по меньшей мере, в 2 раза, например, по меньшей мере, в 3 раза, по меньшей мере, в 4 раза или, по меньшей мере, в 5 раз по сравнению с исходной продукцией IFN-гамма, которая обычно соответствует уровню IFN-гамма, по меньшей мере, 100 пг/мл культуральной среды.
Как правило, это событие произойдет со дня 10 по день 14 включительно после инициации второй фазы ii), т.е. обычно клетки должны быть собраны со дня 10 по день 14 включительно после инициации второй фазы ii).
Соответственно, полный процесс увеличения числа опухоле-реактивных Т-лимфоцитов по изобретению может в целом занять от приблизительно 25 дней до приблизительно 45 дней включительно, например, от приблизительно 26 дней до приблизительно 44 дней включительно, от приблизительно 27 дней до приблизительно 43 дней включительно, от приблизительно 27 дней до приблизительно 42 дней включительно, от приблизительно 27 дней до приблизительно 41 дня включительно и от приблизительно 27 дней до приблизительно 40 дней включительно.
При подавлении маркера CD25 вместо того, чтобы собирать опухоле-реактивные Т-лимфоциты, их можно подвергнуть одному или более дополнительным циклам фазы ii). Это может быть полезно сделать, если количество опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, полученных способом размножения, не считают эффективным количеством для введения пациенту, страдающему онкологическим заболеванием, или, если пациент получает химиотерапию, может быть лучше отложить введение Т-лимфоцитов до окончания химиотерапии. Чтобы определить, нужно ли подвергать опухоле-реактивные Т-лимфоциты одному или более дополнительным циклам фазы ii), можно посмотреть на уровень продуцируемого IFN-гамма и/или общее количество полученных опухоле-реактивных Т-лимфоцитов и/или экспрессию CD25. В случае, если уровни IFN-γ составляют 30 пг/мл культуральной среды или менее, например 20 пг/мл культуральной среды или менее, и/или общее количество Т-клеток является недостаточным, можно инициировать дополнительные циклы фазы ii), начиная, когда большинство Т-клеток являются CD25-негативными (т.е. менее 5% популяции Т-лимфоцитов экспрессирует CD25) и поэтому восприимчивыми к рестимуляции.
После сбора опухоле-реактивные Т-лимфоциты могут быть очищены любыми общепринятыми способами, такими как, например, способы с использованием градиента плотности, например, среды с фиколлом. Часть опухоле-реактивных Т-лимфоцитов после сбора и очистки можно сохранять замораживанием в подходящей для заморозки среде.
Способ лечения
Опухоле-реактивные Т-лимфоциты, полученные улучшенным способом размножения, описанным выше, могут использоваться в способе лечения индивида, страдающего неопластическим заболеванием, или эффективной регрессии опухоли у индивида, имеющего опухоль, причем способ включает введение индивиду, нуждающемуся в этом, эффективного количества опухоле-реактивных Т-лимфоцитов по изобретению.
Способ, описанный в данном документе, может быть использован в лечении любой солидной неоплазмы эпителиального, мезенхимального или эмбриологического происхождения любой анатомической локализации, такой как, например, для эпителиальных неоплазм, например карцином в молочной железе, ободочной кишке, поджелудочной железе, мочевом пузыре, тонком кишечнике, простате, шейке матки, вульве, яичниках; для мезенхимальных неоплазм, например сарком в суставах, костях, мышцах и сухожилиях, и некоторых гематологических неоплазм, таких как лимфомы; для эмбриологических неоплазм, например тератомы.
Определение эффективного количества опухоле-реактивных Т-лимфоцитов зависит от конкретного типа лимфоцитов, отношения клеток памяти к эффекторным Т-лимфоцитам и от тяжести заболевания. Однако в среднем можно вводить как минимум, по меньшей мере, 10 миллионов, например, по меньшей мере, 20 миллионов, по меньшей мере, 30 миллионов, по меньшей мере, 40 миллионов, по меньшей мере, 50 миллионов, по меньшей мере, 60 миллионов, по меньшей мере, 70 миллионов или, по меньшей мере, 80 миллионов опухоле-реактивных Т-лимфоцитов. Авторы представленного изобретения не нашли никакой верхней границы в отношении количества опухоле-реактивных Т-лимфоцитов, вводимых в одной дозе.
В предпочтительном варианте осуществления вводимые опухоле-реактивные Т-лимфоциты содержат комбинацию эффекторных Т-лимфоцитов и Т-лимфоцитов памяти. Более конкретно, количество опухоле-реактивных Т-лимфоцитов типа клеток памяти может составлять от приблизительно 35% до приблизительно 90%, например, от приблизительно 40% до приблизительно 90%, от приблизительно 50% до приблизительно 80% или от приблизительно 60% до приблизительно 70%, а процентное содержание эффекторных Т-лимфоцитов - от приблизительно 10% до приблизительно 65%, например, от приблизительно 20% до приблизительно 50% или от приблизительно 30% до приблизительно 40%.
Опухоле-реактивные Т-лимфоциты могут быть составлены в виде фармацевтической композиции, подходящей для парентерального введения пациенту, такого как, например, внутривенное, внутриартериальное, интратекальное или внутрибрюшинное введение.
При парентеральном введении опухоле-реактивных Т-лимфоцитов они могут быть составлены в изотонической среде, т.е. в среде, имеющей такую же тоничность, как и кровь, и содержащей одно или более веществ, предотвращающих агрегацию клеток. Конкретным примером подходящей среды является 0,9% раствор NaCl, содержащий до 3% сывороточного альбумина человека, например, до 2% сывороточного альбумина человека или до 1% сывороточного альбумина человека. Для внутривенного введения концентрация опухоле-реактивных Т-лимфоцитов во вводимой композиции обычно находится в диапазоне от приблизительно 0,5 миллионов лимфоцитов/мл среды до приблизительно 4 миллионов лимфоцитов/мл среды, например, от приблизительно 0,5 миллионов лимфоцитов/мл среды до приблизительно 3 миллионов лимфоцитов/мл среды, от приблизительно 0,5 миллионов лимфоцитов/мл среды до приблизительно 2 миллионов лимфоцитов/мл среды или от приблизительно 1 миллиона лимфоцитов/мл среды до приблизительно 2 миллионов лимфоцитов/мл среды.
Композиция, содержащая опухоле-реактивные Т-лимфоциты, может быть введена в виде разовой дозы или многократных доз. Ее можно вливать в течение от 1 до 2 часов.
Способ лечения можно осуществить один раз или повторить в зависимости от тяжести заболевания. Кроме того, лечение можно повторить при рецидиве заболевания.
Лечение по настоящему изобретению может быть дополнено любым другим подходящим способом лечения рака. Такой дополнительный способ лечения можно провести перед, одновременно или после введения лимфоцитов и его можно провести с периодичностью, обычно используемой для таких способов лечения. Подходящим примером дополнительного способа лечения является химиотерапия и тому подобное.
Наборы
Изобретение дополнительно относится к наборам, используемым в способе по изобретению, причем набор содержит среду для культивирования Т-лимфоцитов. Средой может быть любая подходящая бессывороточная среда, такая как, например, AIMV, RPMI 1640, DMEM или MEM.
Набор может дополнительно содержать одно или более веществ для стимуляции, активации и направления опухоле-реактивных Т-лимфоцитов. Примерами таких веществ могут быть полученный из опухоли антиген, вещества, обладающие агонистической активностью по отношению к рецептору IL-2, вещества, способные активировать IL-12R на Т-лимфоцитах, вещества, способные противодействовать развитию Т-лимфоцитов типа Th2, и/или вещества, стимулирующие развитие Т-лимфоцитов типа Th1.
Более конкретно, такими веществами могут быть IL-2, интерферон-альфа, антитело против IL-4, антитело против IL-5, антитело против IL-10, IL-7, IL-12, IL-15 и/или IL-21.
Набор также может содержать фармацевтическую композицию, подходящую для внутривенного введения. Фармацевтическая композиция перед введением может быть смешана с популяцией опухоле-реактивных Т-лимфоцитов.
Набор также может содержать один или более шприцов, содержащих локализатор лимфатических узлов, такой как, например, упоминаемый выше.
Наборы также могут содержать инструкции по применению, например инструкции в форме компьютерной программы.
Описание чертежей
На фиг.1 показано, что сторожевой узел является природным первичным сайтом представления и активации реактивности Т-клеток в отношении опухолевого антигена.
На фиг.2 показано, что сначала лимфоциты сторожевого узла активируют опухолевым антигеном и низкой дозой IL-2, что приводит к активации и экспрессии маркера активации CD25 (верхний рисунок). Конец фазы I, фазы активации, определяют по снижению количества CD4+ Т-клеток, экспрессирующих CD25 (нижний рисунок). Если менее 5% CD4+ Т-клеток экспрессирует CD25, то фазу II инициируют повторной стимуляцией антигеном.
На фиг.3 показано, что активация фазы I и фазы II приводит к увеличению количества и обогащению CD4+ Т-хелперных клеток.
На фиг.4 показано, что в фазе I большинство клеток представляют собой наивные CD62L+ клетки или активированные CD69+ CD62L+ клетки. После фазы II большинство клеток представляют собой CD62L- и составлены из CD4+ Т-хелперных клеток памяти и эффекторных CD4+ Т-хелперных клеток. CD62L- Т-клетки не экспрессируют предпочтительную молекулу возврата в лимфатический узел, таким образом, они отыскивают зоны воспаления в нелимфатических органах.
На фиг.5 показано, что основные клетки, стимулированные в фазе I, происходящие из опухоли (лимфоциты, инфильтрирующие опухоль), сторожевых узлов (SN) и отличного от них лимфатического узла (LN), приводят к немалой продукции IFN-γ.
На фиг.6 показано, что после размножения после фазы ii) существует дозозависимое увеличение антиген-зависимой продукции IFN-γ.
На фиг.7 показано, что протокол размножения и активации стимулирует размножение антиген-специфических клонов Т-клеток, как изучено путем селективного обогащения экспрессии Vβ TCR.
На фиг.8 А-D представлены данные КТ сканирования пациента #5. После трансфузии опухоле-реактивных лимфоцитов у пациента наблюдалась полная регрессия метастазов в печень, локализованных в обеих долях (которые посчитали неоперабельными), нормализация уровней СЕА, исчезновение асцита, и он был в хорошем физическом состоянии, тренируясь постоянно.
На фиг.9 А-F представлены данные КТ сканирования пациента #10. После трансфузии у пациента наблюдалась регрессия метастазов в печень и асцитической жидкости. В известной мере он хорошо себя чувствовал, и дальнейшее сканирование показало стабилизацию заболевания.
На фиг.10 А-Н представлены данные КТ сканирования пациента #12. Через три месяца после трансфузии у него наблюдалась регрессия метастазов в печень и легкие с почти полностью нормализованным уровнем СЕА 5,9 (норма <4,0), исчезновение асцита, и он выглядел клинически здоровым.
На фиг.11 показаны Т-лимфоциты, дающие сигнал выше порогового значения в отношении экспрессии CD4+, которые окрашивали в отношении экспрессии CD25 и фактора транскрипции FoxP3 в начале (А) и в конце (В) размножения. Исходно (рисунок А) FoxP3 и высокие уровни CD25 экспрессировали 4,8% CD4+ Т-лимфоцитов, таким образом, их идентифицировали как Treg. В конце размножения присутствовало крайне незначительное количество Treg 0,3% (рисунок В).
Примеры
Пример 1
Увеличение числа опухоле-реактивных Т-лимфоцитов
Идентификацию сторожевых узлов осуществляли во время операции, используя методику сторожевого узла. Кратко, вводили 1 мл красителя патентованного синего (Guerbet, Paris) и распределяли по поверхности серозной оболочки вокруг опухоли. За пять-десять минут в синий цвет окрашивались от одного до трех лимфатических узлов брыжейки, эти сторожевые узлы отмечали шовным материалом и удаляли (см. фиг.1). В качестве контрольного также идентифицировали и удаляли один отличный от сторожевого лимфатический узел брыжейки, удаленный от опухоли.
Сторожевые и отличные от сторожевых лимфатические узлы разрезали пополам и срезы толщиной 1 мм брали из центра и с периферии. Остальную часть лимфатических узлов отправляли для гистологического исследования согласно принятой методике. Часть опухоли, включающую образец инвазивного края, также оставляли для научных целей.
Культура клеток
Фаза I, начальная активация
Материал сторожевого узла помещали на лед и обращались с осторожностью, все время используя среду AIM V (Invitrogen). Суспензии единичных клеток лимфоцитов сторожевого узла получали путем осторожной гомогенизации в стеклянном гомогенизаторе с неплотным соединением, а затем гомогенизированные клетки дважды отмывали в среде. Лимфоциты сторожевого узла помещали во флаконы для культивирования клеток в концентрации 4 миллиона клеток/мл и добавляли интерлейкин-2 (IL-2) (Proleukin, Chiron) до концентрации 240 МЕ/мл среды.
2
Экстракт аутологичной опухоли получали гомогенизацией с Ultra Turrax в 5 объемах (масса/объем) 2×PBS c последующей денатурацией в течение 5 минут при 97°С. Через три-четыре дня после инициации культуры клеток добавляли экстракт аутологичной опухоли в концентрации 1/100. Для длительного культивирования клетки помещали в инкубатор клеток при 37°С и 5% СО и каждые 3-4 дня добавляли 240 МЕ IL-2/мл среды.
Фаза II, активация и размножение
Через 18-22 дня клеточные культуры наблюдали в отношении экспрессии CD25. Если количество клеток, экспрессирующих CD25, снижалось ниже 5%, клетки вновь стимулировали в фазе II (фиг.2) добавлением экстракта аутологичной опухоли при концентрации 1/100. Для эффективного представления антигена собирали аутологичные PBMC, используя Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences, GE Healthcare), облучали дозой 2500 рад и добавляли к клеточным культурам. Через три дня после рестимуляции добавляли интерферон-α (Introna) в концентрации 100-500 МЕ/мл и антитело против IL-4 до концентрации 2 мкг/мл. Через 5-8 дней добавляли IL-12 (4 нг/мл) для размножения с целью усилить индукцию клеток Th1, продуцирующих IFN-γ.
За день до трансфузии пациенту клеточные культуры подвергали очистке, используя Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences, GE Healthcare), чтобы возвратить жизнеспособные клетки в культуру. В день трансфузии клетки дважды отмывали в физиологическом растворе (Natriumklorid Baxter Viaflo 9 мг/мл, Baxter) и затем переносили в емкость для переноса, содержащую 100-200 мл физиологического раствора и 1% сывороточного альбумина человека (Baxter). Перед трансфузией проводили исследования на наличие микроорганизмов. Вливания клеток осуществляли в течение 1-2 часов под наблюдением медицинского работника.
Иммунологическая оценка
Дополнительную иммунологическую оценку осуществляли, используя анализы пролиферации со встроенным тимидином, меченным тритием. С этой целью оставляли аликвоту лимфоцитов сторожевого узла, получали суспензию единичных клеток лимфоцитов узла, отличного от сторожевого, посредством осторожного давления в стеклянном гомогенизаторе с неплотным соединением, а лейкоциты периферической крови очищали с помощью Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences, GE Healthcare).
5
3
Клетки ресуспендировали и отмывали дважды в RPMI 1640 (Life technologies), содержащей 2,5% фетальной телячьей сыворотки (FCS) (Life technologies). В заключение клетки ресуспендировали в среде RPMI 1640, стимулирующей пролиферацию, содержащей 10% АВ сыворотку человека (Sigma), 1% пенициллин-стрептомицин (Sigma) и 1% глутамин (Sigma). Клетки лимфатического узла и очищенные PBL использовали при плотности 3×10 клеток/лунка в 96-луночном планшете и стимулировали гомогенатом опухоли, разбавленным 1/100, 1/10 или Con A 10 мкг/мл (Sigma), в трех повторах. Пролиферацию измеряли на 5, 6 и 7 день добавлением 1 мкКи Н-тимидина/лунка (Amersham) за 18 часов до сбора. Образцы подвергали подсчету количества сцинтилляций.
5
В начале культивирования клеток для измерения секреции IFN-γ осуществляли стимуляцию клеток лимфатического узла и PBL, помещенных в 96-луночные планшеты при плотности 3×10 клеток/лунка, в трех повторах гомогенатом опухоли, разбавленным 1/100, 1/10 или Con A 10 мкг/мл (Sigma). Количество секретируемого IFN-γ измеряли посредством ELISA (Human IFN-γ Duoset, R&D Systems) в культуральных супернатантах в объединенных образцах тройных повторов (фиг.5). В конце культивирования клеток образцы супернатанта удаляли и измеряли секрецию IFN-γ и IL-4 в трех повторах посредством ELISA (Human IFN-γ Duoset и Human IL-4 Duoset, R&D Systems) (фиг.6A и 6B).
Анализы проточной цитометрии
3
Характеристику клеток осуществляли, используя проточную цитометрию сначала клеток сторожевого узла, узла, отличного от сторожевого, РВМС и опухоли. Для проведения анализа проточной цитометрии каждые две-три недели брали образцы культуры лимфоцитов, полученных из сторожевого узла. Клетки инкубировали в течение 30 минут в PBS, дополненной 2% FCS и 0,05% NaN (буфер FACS) с антителами против маркеров субпопуляций иммунных клеток и активации лимфоцитов (фиг.3, 4 и 5). Были использованы антитела, конъюгированные с флуоресцеин-изотиацианатом (FITC), против следующих маркеров: CD69, HLA-DR, CD45RA, CD25, конъюгированные с фикоэритрином (РЕ): CD62L, CD19, CD45RO, CD56, конъюгированные с перидинин-хлорофилл-протеином (PerCP): CD8, CD3, конъюгированные с аллофикоцианином (АРС): CD4, CD14, CD8.
5
Vβ-репертуар оценивали, используя набор Beta mark (Beckman Coulter), 5×10 клеток/пробирка окрашивали, помещая в 8 различных флаконов, содержащих в объеме 10 мкл смеси FITC, PE и двухцветного FITC-РЕ, конъюгированных с антителами Vβ TCR и с добавлением в каждую пробирку CD8 PerCP и CD4 APC (фиг.7).
Пример 2
Способ лечения колоректального рака введением опухоле-реактивных Т-лимфоцитов
Идентификация и иссечение сторожевого и первого от метастаза лимфатических узлов у пациентов, страдающих колоректальным раком:
Были изучены шестнадцать пациентов с диагнозом колоректальный рак, шесть женщин и десять мужчин, средний возраст которых составлял 62 года. Пациентов классифицировали на основании гистопатологического анализа как Duke's C или D. Также было 5 пациентов, классифицированных как Duke's В, с агрессивными характеристиками опухоли, такими как язвы, сосудистая или периневральная инвазия. Однако пациентам 7 и 14 ранее проводили хирургическое лечение колоректального рака и в настоящее время у них наблюдался рецидив заболевания с метастазами в печень. Местный этический комитет одобрил исследование, и каждый пациент дал информированное согласие.
Идентификация сторожевых и первых от метастаза узлов была проведена во время хирургического вмешательства. С целью облегчения осмотра опухоли и брыжейки осуществляли мобилизацию сайта опухоли толстой кишки путем отделения перитонеальных спаек. Инъекции красителя патентованного синего (Guerbet, Paris) распределяли поверхностно на серозной оболочке вокруг опухоли. В течение пяти минут в синий цвет окрашивались от одного до трех лимфатических узлов брыжейки, эти сторожевые узлы отмечали шовным материалом и удаляли по окончании резекции. Так же поступали с одним отличным от сторожевого лимфатическим узлом брыжейки, удаленным от опухоли.
Сторожевые и отличные от сторожевых лимфатические узлы разрезали пополам и брали срез 1 мм в толщину из центра и с периферии. Оставшуюся часть лимфатических узлов отправляли для проведения гистопатологического исследования согласно стандартной методике. Часть опухоли, включающую участок инвазивного края, использовали для получения антигена.
Лимфоциты, полученные из лимфатических узлов, затем количественно увеличивали, как описано в примере 1.
Введение опухоле-реактивных Т-лимфоцитов:
16 пациентов подвергали инфузии аутологичных лимфоцитов, количественно увеличенных, как описано в примере 1. В среднем 74,7 миллиона активированных и подвергнутых клональной экспансии Т-клеток вводили в виде трансфузии. Токсических побочных эффектов, подобных лихорадке, ознобу, чувству дискомфорта, задержке жидкости тяжелой степени, отеку легкого или дыхательной недостаточности, обнаружено не было.
Последующие анализы
1
2
Последующие мероприятия включали клиническую оценку каждые три-шесть месяцев и контроль уровней СЕА. Всех пациентов, имеющих III и IV стадии заболевания, в дополнение исследовали с помощью компьютерной томографии грудной клетки и брюшной полости. Пациентов обследовали во время регулярных посещений в среднем через 13 месяцев (диапазон 5-20), в среднем через 13/ месяцев. Из 16 пациентов, которые были пролечены инфузией аутологичных лимфоцитов, восемь узнали при диагностике об отдаленных метастазах. Четверо пациентов получили трансфузии по поводу известных рецидивов, а у троих из них еще не было признаков рецидивов. Одного пациента оперировали по поводу солитарных метастазов в печень, и с тех пор у него не было рецидивов. Как понятно из фиг.8A-D, у одного пациента с метастазами в печень, локализованными в обеих долях (которые посчитали неоперабельными), после трансфузии опухоле-реактивных Т-лимфоцитов наблюдалась полная регрессия метастазов в печень и, более того, нормализация уровней СЕА, исчезновение асцита и хорошее физическое самочувствие и регулярные тренировки. У одного дополнительного пациента с метастазами в печень после трансфузии наблюдалась регрессия метастазов в печень и асцитической жидкости (см. фиг.9A-F). У одного пациента через три месяца после трансфузии наблюдалась регрессия метастазов в печень и легкие (см. фиг.10A-H) с почти нормализовавшимся уровнем СЕА 5,9 (норма <4,0), исчезновение асцита, и он выглядел клинически здоровым.
Результаты
Было прооперировано в госпитале South Stockholm General Hospital и включено в исследование шестнадцать пациентов с колоректальным раком или солитарными метастазами колоректального рака в печень. Первичной локализацией опухолей являлись в трех случаях слепая кишка, в 4 - восходящая ободочная кишка, в 1 - нисходящая ободочная кишка, в 7 - сигмовидная кишка и в 1 - прямая кишка. Было проведено семь операций правосторонней гемиколэктомии, 1 левосторонняя гемиколэктомия, 7 операций резекции сигмовидной кишки и 1 ампутация прямой кишки. Двоих пациентов ранее оперировали по поводу ампутации прямой кишки и резекции сигмовидной кишки; в настоящий момент они перенесли частичную резекцию печени по поводу метастазов в печень. У одного пациента наблюдались рецидивы в два участка брюшной полости, а ранее он был оперирован по поводу опухоли слепой кишки. Во время операции были идентифицированы два сторожевых узла с оттоком от метастаза, один в брыжейке кишечника и один в брыжейке тонкого кишечника. Была проведена расширенная резекция области соединения тонкого и толстого кишечника с брыжейкой.
У всех пациентов во время операции было идентифицировано путем инъекций патентованного синего около опухолей от одного до трех (в среднем 2,1) сторожевых узлов. Среди пациентов с первичной резекцией кишечника было извлечено у каждого индивида в среднем 15,8 лимфатических узлов. После гистопатологического изучения этих лимфатических узлов пятерых пациентов классифицировали как Duke's C и 5 пациентов как Duke's В, все они при патологоанатомическом исследовании были отнесены к группе с высоким риском развития опухолей вследствие роста опухолевых клеток вдоль нервов и в сосуды. У пяти пациентов имелись отдаленные метастазы, и во время резекции метастазов их классифицировали как Duke's D. У двоих из этих пациентов имелись солитарные метастазы в печень. Кроме того, с целью детекции микрометастазов сторожевые узлы также анализировали с помощью FACS (клеточный сортер с активацией флуоресценции) и антител против цитокератина 20, который экспрессируется колоректальными раковыми опухолями. Анализы на наличие в лимфатических узлах цитокератина 20 посредством проточной цитометрии соответствовали патологоанатомическому диагнозу (не показан), за исключением одного случая, когда ложноотрицательный сторожевой узел (в соответствии с гистопатологическим анализом) оказался положительным в анализе с использованием FACS и цитокератина 20.
in vivo
in vitro
Сторожевой узел является первым лимфатическим узлом при оттоке лимфы от опухоли и поэтому является первым сайтом метастаза в лимфатический узел (Dahl et al.), но сторожевой узел является также первичным сайтом активации иммунной системы. В сторожевом узле аккумулируются клетки опухоли, дебрис, некротические клетки и антиген-представляющие клетки, здесь происходит представление, активация и клональная экспансия Т-клеток, направленных против возникновения опухоли. Авторы настоящего изобретения показали преимущество этой популяции среди  увеличенной Т-клеточной популяции лимфоцитов, полученных в сторожевом узле, для  культивирования клеток, увеличения количества и трансфузии.
in vitro
in vivo
In vitro
Полученные в сторожевом узле лимфоциты представляют собой популяцию Т-клеток, активированных и подвергнутых клональной экспансии против антигенов опухоли, которые могут быть эффективным образом собраны в процессе хирургической операции. В противовес последним испытаниям в области иммунотерапии, сфокусированным на цитотоксических Т-клетках, целью авторов настоящего изобретения являлось создание протокола для  усиления  инициированной клональной экспансии Т-хелперных клеток. Т-хелперные клетки оказались необходимыми для эффективного функционирования цитотоксических Т-клеток и для создания клеток памяти. Более того, в трансгенной системе Т-клеточного рецептора, нацеливающего антиген островковых клеток, было обнаружено, что трансфузии клеток Th1 должно быть достаточно для разрушения β-клеток и развития сахарного диабета.  культивирование лимфоцитов, полученных из сторожевого узла, приводит к активации Th1 и клональной экспансии Т-хелперных клеток, на что указывает преобладающая продукция цитокина IFN-γ, являющегося отличительным признаком Th1, и обогащение ограниченного набора Vβ-цепей TCR. Гомогенат опухоли, используемый для увеличения количества Т-клеток, подходит для эндоцитоза и процессирования антиген-представляющими клетками для представления классу II, приводя к активации CD4+ Т-хелперных клеток, что приводит к увеличению количества предпочтительных Т-хелперных клеток. Путем перекрестной презентации антигены, захваченные эпдоцитозом, могут быть процессированы и представлены в «карман» класса I, что приводит к активации CD8+ цитотоксических Т-клеток. Интересно, что в некоторых случаях изобретатели обнаружили клональную экспансию как CD4+, так и CD8+ Т-клеток.
in vitro
Среднее количество лимфоцитов, полученных из сторожевого узла, в начале увеличения количества составляло 107,4 миллиона клеток (диапазон 3,6-509 миллионов, медиана 70 миллионов). Клетки были охарактеризованы путем проточной цитометрии. Соотношение между CD4+ и CD8+ клетками в начале составляло в среднем 4,9 (диапазон 0,36-10, медиана 5,4), указывая на увеличение количества CD4+ Т-хелперных клеток в сторожевых узлах по сравнению с соотношением CD4/CD8 в периферической крови (обычный диапазон 1,0-2,5) (фиг.2А). Кроме того, в сторожевых узлах присутствовали В-лимфоциты (CD 19) и природные киллеры (NK-клетки) (CD 56) (данные не представлены). Клетки оставляли в культуре в среднем на 36,1 день (диапазон 23-58 дней), медиана 33 дня. Клетки тщательно наблюдали с помощью проточной цитометрии, по меньшей мере, еженедельно. Сначала общее количество клеток снизилось. В-клетки и NK-клетки почти полностью исчезли, а количество CD8+ Т-киллеров уменьшилось. Используемая методика культивирования стимулировала главным образом, увеличение количества Т-хелперных клеток, поскольку среднее соотношение CD4/CD8 составило 92,5. Рестимуляция аутологичным опухолевым антигеном привела к клональной экспансии опухоле-реактивных Т-клеток, что оценивали, изучая Vβ-репертуар Т-клеточного рецептора лимфоцитов, полученных из сторожевого узла, перед и после культивирования .
In vitro
Перед трансфузией количественно увеличенные Т-клетки тестировали в отношении функций против аутологичных опухолевых антигенов путем измерения активации и продукции цитокинов клетками Th1 (цитокин IFN-γ) и Th2 (цитокин IL-4).  количественно увеличенные лимфоциты, полученные из сторожевого узла, отвечали на рестимуляцию опухолевым антигеном продукцией IFN-γ и отсутствием или незначительным количеством IL-4, указывая, что количественно увеличенные Т-клетки оказались эффективными и отвечающими подобно клеткам Th1.
В исследовании лечению подвергали шесть пациентов, относившихся по классификации Duke к группе D. У двух пациентов, отнесенных во время операции к группе D по Duke с метастазами в печень и легкие, соответственно наблюдали характерную регрессию заболевания (пациент 5 и 12). После трансфузии лимфоцитов у первого пациента наблюдали полную регрессию метастазов в печень, локализованных в обеих долях (которые посчитали не поддающимися хирургическому вмешательству в печень) (фиг.3), нормализацию уровней СЕА, исчезновение асцита, и он выглядел здоровым. У пациента 12 показана регрессия метастазов в печень и легкие с почти нормальным уровнем СЕА 5,9 (норма <4,0), исчезновение асцита, и он выглядел клинически здоровым. У пациента 1 наблюдали уменьшение размера метастаза в печень и исходно снижение уровней СЕА, исчезновение асцита, и он был в отличной форме, когда внезапно умер (на 191 день), как оказалось, по причине легочного эмбола. У двух пациентов, по классификации Duke относящихся к группе D, наблюдали стабилизацию заболевания без прогрессирования метастаза или увеличения уровней СЕА. У самого пожилого пациента, в исследовании имевшего № 7, наблюдали стабилизацию заболевания в течение пяти месяцев, но затем уровни СЕА начали повышаться, и он умер в возрасте 83 лет. Аутопсию не проводили. Одного пациента во время операции отнесли к группе С по классификации Duke, но вскоре у него появились метастазы в печень и легкие (по классификации Duke группа D), но благодаря последующей трансфузии и химиотерапии наблюдали регрессию метастазов в печень и легкие лишь с незначительно повышенными уровнями СЕА. Все пациенты, отнесенные по Duke к группе С, имели нормальные уровни СЕА, и у них не наблюдали каких-либо радиологических или клинических признаков рецидива заболевания. Четверо пациентов, относящихся по Duke к группе В, являются здоровыми с нормальными уровнями СЕА и у них нет признаков рецидивирующего заболевания. У пациента № 9, отнесенного к группе В по классификации Duke, но с активно растущей опухолью, показаны признаки рецидивирующего заболевания с повышенными уровнями СЕА (67) и признаками метастазов в печень.
Для изучения пути внутривенно влитых Т-клеток авторы настоящего изобретения проанализировали в периферической крови пролиферацию Т-клеток против экстракта опухоли. Как указано выше, перед трансфузией они не смогли показать в периферической крови никакой реактивности Т-клеток против аутологичных опухолевых антигенов у какого-либо пациента. Однако можно было определить пролиферацию Т-клеток против аутологичных опухолевых антигенов в периферической крови у всех исследованных пациентов вплоть до 10 месяцев после трансфузии, что указывает на наличие подвергнутых клональной экспансии циркулирующих опухоле-реактивных Т-клеток.
Краткое содержание характеристик пациентов
Ниже представлена таблица всех пациентов, принимавших участие в исследовании, распределенных во время операции по классификации Duke:
Характеристики участников исследования
Возраст/пол
Классификация Duke
Количество влитых клеток (х10<sup>6</sup>)
CD4/CD8∗
IFN-γ (пг/мл)
Cуммарная выживаемость (месяцы)
Ответ
67/М
B
4
92/0,2
ND
31
SD
67/F
B
8
15/51
ND
30
SD
71/M
B
50
74/15
2091
29
SD
74/M
B
63
64/22
ND
29
SD
66/M
B
152
82/1,5
1411
27
SD
64/F
C
110
64/25
ND
34
SD
58/F
C
16
77/18
417
23
SD
61/F
D
1
3,7/35
ND
6
SD
47/M
D
80
24/16
ND
36
CR
54/M
D
40
37/24
ND
36
SD
65/M
D
270
82/15
ND
36
CR
42/F
D
80
66/11
ND
33
CR
82/F
D
40
98/0,1
ND
6
SD
74/M
D
130
73/22
142
30
CR
33/M
D
72
72/1,5
908
12
PR
66/M
D
25
37/27
764
26
PR
<sup>а</sup>) Количество, выражающее процентное содержание CD4 и CD8-позитивных клеток, определенных с помощью FACS.
Обсуждение
in vitro
По данным авторов настоящего изобретения пациентам с колоректальным раком ранее никогда не предлагали иммунотерапии, основанной на сторожевых или первых от метастаза узлах. Таким образом, это первая попытка использовать в лечении лимфоциты, полученные из сторожевых или первых от метастаза узлов. Существует несколько важных различий между настоящим исследованием и, например, лечением высокими дозами IL-2 (Rosenberg). Во-первых, использование лимфоцитов, полученных из сторожевых узлов, которые были стимулированы  гомогенатом аутологичной опухоли и АРС, вызывает высоко специфичный клеточный иммунный ответ на опухоль. До трансфузии будут доживать лишь Т-клетки с высоким сродством к первичной опухоли. При системном генерализованном лечении высокими дозами IL-2, вводимыми пациентам внутривенно, будут стимулироваться в равной степени все лимфоциты, а опухоле-специфичной будет лишь очень небольшая их фракция. Авторы настоящего изобретения полагают, что поскольку сторожевой узел(ы) являются первыми лимфатическими узлами, принимающими отток лимфы от опухоли, там будет иметь место избыточная аккумуляция опухоле-специфичных лимфоцитов. Пролиферация и трансфузия Т-клеток, точно распознающих опухоль, должна создать массивную опухолеспецифическую реакцию. Во-вторых, схема лечения высокими дозами IL-2 приводит к высокой токсичности и тяжелым осложнениям, длительному лечению и высокой стоимости. Трансфузии по настоящему способу не давали осложнений в течение примерно одного часа, и пациентов часто отпускали из больницы в тот же день. В-третьих, настоящий протокол нацелен на увеличение числа Т-хелперов из сторожевых узлов, в отличие от увеличения числа цитотоксических Т-клеток, собираемых в виде лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль.
in vitro
Настоящее исследование показывает, что свежевыделенные лимфоциты, полученные из сторожевого узла, обладают способностью к  пролиферации против гомогената аутологической опухоли и могут быть влиты пациенту без осложнений в качестве адоптивной иммунотерапии. Существует определенное показание к тому, чтобы лечение количественно увеличенными лимфоцитами, полученными из сторожевого узла, могло улучшить исход болезни пациентов с высоким риском диссеминации или диссеминированным колоректальным раком, а также пациентов, страдающих различными типами солидного рака.