СУХАЯ СТЕКЛОВИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ СТАБИЛИЗАЦИИ И ЗАЩИТЫ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО МАТЕРИАЛА И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ
DRY GLASS-LIKE COMPOSITION FOR STABILISATION AND PROTECTION OF BIOLOGICALLY ACTIVE MATERIAL, AND METHOD FOR ITS OBTAINING

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ
[001] Данная заявка имеет приоритет предварительной заявки на патент США №61/299,315, поданной в Ведомство по патентам и товарным знакам США 28 января 2010 года, содержание которой по всем назначениям включено в данное описание посредством ссылки.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Область изобретения
[002] Настоящее изобретение относится к стабилизации и защите биологических материалов в жестких условиях хранения и применения, более конкретно изобретение относится к инкапсулированию биологически активных материалов и биологических препаратов, включающих живые бактерии, в защитную форму аморфной стекловидной матрицы.
Уровень техники в области, к которой относится данная заявка
[003] Сублимационная сушка традиционно была самым распространенным способом защиты чувствительных биологических веществ, таких как живые или мертвые бактерии и вирусы и белки, в то время как другие способы, такие как распылительная сушка, сушка в кипящем слое и обезвоживание, как правило, не пригодны. Высокотемпературная сушка, используемая в этих способах, приводит к значительному повреждению самого биологически активного материала. Кроме того, эти способы могут высушивать материал в недостаточной степени для требований по конкретной остаточной влаге или активности воды для стабильности продукта, и поэтому может требоваться дополнительная стадия сушки другими способами. Общепринятый способ методом сублимационной сушки обычно включает замораживание раствора, содержащего биологически активный материал, и лиофилизацию замороженного биологического материала в полном вакууме, пока он остается замороженным. Низкие температуры процесса сублимационной сушки снижают реакцию разложения биологически активного материала и минимизируют потерю активности в конечной сухой форме. Часто процесс сублимационной сушки приводит к значительной потере активности и повреждению биологически активного материала вследствие образования кристаллов льда в ходе процесса медленной сушки. Более того, сама стадия замораживания, если она выполнена некорректно, может денатурировать или инактивировать биологически активный материал. Повреждения структуры, вызванного образованием кристаллов льда, можно избежать до некоторой степени путем добавления в биологически активный раствор криопротекторов (Morgan et al., 2006). Такие защитные агенты представляют собой хорошо растворимые химические вещества, которые добавляют в композицию для защиты клеточных мембран и белков во время замораживания и для повышения стабильности во время хранения. Обычные стабилизаторы для живых бактерий и вирусов включают высшие сахара, такие как сахароза, глицерин или сорбит, в высоких концентрациях с клеточным материалом или биологически активным материалом (Morgan et al., 2006; Capela et al., 2006). Однако такие защитные агенты могут неадекватно проникать в клетку для защиты активных компонентов внутри внутриклеточного пространства, что может приводить к нестабильности при хранении веществ, подвергнутых сублимационной сушке. По этой причине мембранные биологические материалы, такие как вирусы, бактерии и клетки, не все выживают в процессе сублимационной сушки. Таким образом, остается значительная проблема для разработки оптимального способа сушки композиции, который сводит к минимуму потери при сушке, одновременно обеспечивая достижение адекватной стабильности высушенного материала при хранении.
[004] Некоторые из этих проблем, связанных с сублимационной сушкой, были разрешены за счет использования комбинации некоторых композиций и вакуумной сушки в стекловидном состоянии, в частности сахарных стекол (патент США №6190701). Сухие стабилизированные биологически активные материалы защищены в стекловидной матрице от неблагоприятных условий окружающей среды, таких как высокие температуры и влажность. Обычно стабилизацию посредством стеклообразования инициируют концентрированием сахарного раствора, содержащего биологически активную молекулу, до образования перенасыщенного сиропа. Последующее удаление воды приводит к постепенному затвердеванию сиропа, который в конце возвращается в твердое сахарное стекло с низким содержанием остаточной воды. Химическая диффузия мизерна в стекле, и поэтому химические реакции в сущности прекращаются. Поскольку денатурация или повреждения мембран являются химическими изменениями, они не могут происходить в стекле, и биологически активный материал стабилизируется и защищается. Многие стекла недостаточно стабилизируют, поскольку они реагируют с биологически активным материалом во время хранения. Очевидные проблемы возникают с восстанавливающими сахарами, которые могут образовывать хорошие физические стекла, но затем их альдегидные группы разрушающе воздействуют на аминогруппы на биологически активном материале по типичной реакции Мэйларда, тогда как нереакционно-способные сахара дают стабильные продукты, которые вовсе не требуют замораживания.
[005] Поскольку сахара по своей природе являются гигроскопическими веществами, удаление воды и окончательная сушка перенасыщенного сиропа становятся чрезвычайно трудными. На этот недостаток впервые обратил внимание Annear (Annear, 1962), который разработал композицию, содержащую бактерии в растворе сахаров и аминокислот, и способ вакуумной сушки, включающий кипячение и вспенивание концентрированного сиропа. Roser et al. (патент США №6964771) раскрыли сходный принцип сушки путем вспенивания, включающий стадию концентрирования путем выпаривания большого объема растворителя с последующим кипячением и вспениванием концентрированного сиропа под вакуумом. Для уменьшения окисления и повреждения в результате денатурации, которые происходят во время стадии кипячения, Bronshtein (патенты США №№5766520 и 7153472) ввел улучшенный защитный состав, содержащий углеводы и поверхностно-активные вещества. Сушка защитного раствора также включала поэтапный процесс концентрирования в умеренном вакууме перед применением глубокого вакуума для вызывания вспенивающего кипения остаточной воды с образованием сухой стабильной пены. Чтобы избежать стадии кипячения, Busson и Schroeder (патент США №6534087) ввели способ сушки композиции в жидком состоянии, подходящий для чувствительных биологически активных материалов, и использование вакуумной печи при очень умеренном вакуумметрическом давлении выше 30 Торр (3,999 кПа). После достижения некоторого уровня высушивания без кипячения материала применяли нагрев при температуре выше 20°С, и высушенный материал собирали только через несколько часов.
[006] Этот тип способа сушки, при котором биологически активный раствор поддерживается в жидком состоянии на протяжении всего процесса сушки, имеет преимущество более быстрого осуществления сушки вследствие испарения жидкости во время кипячения и увеличения площади поверхности за счет вспенивания. Однако кипячение и вспенивание требуют подведения значительного количества тепла для обеспечения необходимого всплеска раствора. Такой способ сушки не очень хорошо подходит для сушки чувствительных биологических материалов, таких как живые вирусы, клетки или бактерии, поскольку применяемое тепло ускоряет ферментативное расщепление (например, протеолиз) и химическое окисление (например, окисление и разрушающее воздействие свободных радикалов), которые могут ликвидировать активность или жизнеспособность биологического материала.
[007] Способ сушки, описанный выше, также имеет ограниченные возможности его масштабирования до крупномасштабного производственного процесса. Исключение замораживания требует проведения способа при более низком уровне вакуума (>7 Торр (933,1 Па)), чем при традиционной сублимационной сушке или при способе сушки с циклами распыления-сублимации. Самым значительным недостатком вышеописанных способов является невозможность контролировать и ограничивать увеличение объема пены внутри сосуда, поддона или флакона. Неконтролируемое разбрызгивание и часто избыточное пенообразование делает практически невозможным развитие способа в промышленных масштабах. Природа всплеска и вспенивания на стадии кипячения обуславливает разбрызгивание части материала на стенки сосуда и в сушильную камеру. Для смягчения всплеска во время кипячения Bronshtein (патенты США №№6884866 и 6306345) предложил специальные камеры и протокол контролируемого применения температуры/давления, который снижает перегрев до приемлемого уровня. Другой подход в сдерживании всплеска и избыточного пенообразования описан в публикации патентной заявки США №2008/0229609, где биологически активный раствор заключают в контейнер или баллон, покрытый воздухопроницаемыми мембранами. Опять же, эти протоколы трудны для осуществления в промышленных масштабах, они требуют специального оборудования и трудны для достоверного воспроизведения с разными композициями.
[008] Сухой пенный способ сушки, известный в данной области техники, не особенно хорошо адаптируется для консервации мембранных биологических материалов, таких как липосомы, вирусы или жизнеспособные клетки и бактерии. Липидные мембраны часто препятствуют прониканию защитных агентов в замкнутые пространства или препятствуют адекватному удалению воды из замкнутого пространства. Без адекватного проникания защитных агентов ферментативные процессы, такие как протеолиз, и химические процессы, такие как окисление и разрушающие воздействия свободных радикалов, могут ликвидировать активность или жизнеспособность мембранного биологического материала. Гипоосмотические среды, остающиеся в пространствах, заключенных в мембрану, могут стимулировать нестабильность биологического материала. Truong-le, Vu (патент США №7381425) описывает способ сублимационной сушки, подходящий для мембранных биологически активных материалов. Композиции по данному изобретению содержат полиол и мембранный биологически активный материал. Способ сушки начинается с охлаждения композиции до температуры, равной примерно температуре фазового перехода липидных мембран, снижения давления на композицию для образования стабильной пены, замораживания пены и затем сублимации воды из замороженной пены с получением лиофилизированной сухой пенной композиции. Для дальнейшей сушки пены могут быть использованы условия вторичной сушки.
[009] Остается потребность в подходящей защитной композиции, которая может быть высушена в стекловидном состоянии без кипячения и избыточного пенообразования. В частности, существует потребность в эффективной с точки зрения затрат композиции и эффективном масштабируемом способе сушки, который пригоден также для применений в других областях техники помимо фармацевтической промышленности, таких как пищевая промышленность и сельскохозяйственная промышленность. Защитные композиции и мягкие способы сушки необходимы для обеспечения адекватной сушки без воздействия высоких температур. Необходима композиция, которая может защищать такие биологические материалы при хранении в условиях высокой температуры и влажности. Согласно настоящему изобретению предложено решение всех этих проблем, которое описано ниже. Способ дегидратации по настоящему изобретению является очень мягким, и не подвергает активный агент воздействию кипячения или пенообразования, и, следовательно, имеет преимущество по сравнению с традиционными методами сублимационной сушки и пенной сушки, которые могут подвергать образец одному или обоим этим стрессам.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0010] Настоящее изобретение охватывает композиции и способы сушки для сохранения чувствительных биологически активных материалов, таких как пептиды, белки, ферменты, гормоны, витамины, каротиноиды, минералы, лекарственные средства, антибиотики, микробиоциды, фунгициды, гербициды, инсектициды, спермициды, нуклеиновые кислоты, антитела, вакцины, бактерии (пробиотические или иные), вирусы и/или клеточные суспензии, при хранении. Способы сушки обеспечивают процесс для сушки композиции, содержащей биологически активные материалы, агент, формирующий матрицу, и стеклообразующий агент. Композицию получают путем диспергирования всех твердых компонентов и биологически активных материалов в растворе. Раствор мгновенно замораживают с помощью средств, известных в данной области техники, таких как жидкий азот или сухой лед, с образованием аморфной композиции в виде небольших гранул, нитей или капельных частиц. Замороженные частицы можно хранить в морозильнике (при температуре от -30°С до -80°С) до сушки, или они сразу могут быть помещены на поддоны в замороженном аморфном состоянии для жидкостной сушки в стандартном сушильном аппарате для сублимационной сушки. Осуществление способа сушки начинают со стадии кратковременной дегазации и стабилизации структуры замороженных частиц под вакуумметрическим давлением ниже 2000 мТорр (266,6 Па) с последующей стадией первичной сушки при вакуумметрическом давлении выше 2000 мТорр и при желаемой температуре. Во время вторичной и окончательной стадии сушки стекловидного аморфного материала применяют полный вакуум и повышенную температуру для достижения конечной желаемой активности воды сухого материала.
[0011] В одном из воплощений композиция содержит достаточные количества агентов, формирующих матрицу, в которую инкапсулируют биологически активный материал. Примеры подходящих агентов, формирующих матрицу, включают, но ими не ограничены, ацетофталат целлюлозы (CAP), карбоксиметилцеллюлозу, пектин, альгинат натрия, соли альгиновой кислоты, гидроксипропилметилцеллюлозу (НРМС), метилцеллюлозу, каррагинан, гуаровую камедь, аравийскую камедь, ксантановую камедь, камедь из плодов рожкового дерева, хитозан и производные хитозана, коллаген, полигликолевую кислоту, крахмалы и модифицированные крахмалы, циклодекстрины и олигосахариды (инулин, мальтодекстрины, декстраны и т.д.); и их комбинации. В одном конкретном воплощении предпочтительным агентом, формирующим матрицу, является альгинат натрия. Предпочтительно, композиция содержит, в массовых процентах от общей массы сухого вещества, 0,1-20% и более предпочтительно 1-12%.
[0012] В дополнительном воплощении агент, формирующий матрицу, содержит смесь альгината натрия и олигосахаридов в массовом соотношении альгинат натрия/олигосахариды 1:1-10, более предпочтительно 1:1-5.
[0013] В еще одном другом воплощении настоящего изобретения агент, формирующий матрицу, поперечно сшит ионами двухвалентных металлов с образованием плотного гидрогеля. Композицию на основе поперечно-сшитого гидрогеля образуют путем распыления или экструдирования суспензии в ванну, содержащую раствор ионов двухвалентных металлов, или путем добавления ионов двухвалентного металла прямо в суспензию и оставления композиции стоять до затвердевания и образования гидрогеля. Композицию гидрогеля затем моментально замораживают и сушат способами сушки по изобретению.
[0014] В еще одном другом воплощении композиция содержит значительные количества стеклообразующих агентов, в которых заключены микроорганизмы. Примеры подходящего агента включают, но ими не ограничены, белки, такие как яичный альбумин, яичный белок, желатин, иммуноглобулин, выделенный соевый белок, пшеничный белок, гороховый белок, хлопковый белок, сухое обезжиренное молоко, казеинат, белок молочной сыворотки и любой гидролизованный белок; углеводы, включая моносахариды (например, галактозу, D-маннозу, сорбозу и т.д.), дисахариды (например, лактозу, трегалозу, сахарозу и т.д.), аминокислоту, такую как лизин, глутамат, глицин, аланин, аргинин или гистидин, а также гидрофобные аминокислоты (триптофан, тирозин, лейцин, фенилаланин, и т.д.); метиламин, такой как бетаин; эксципиент соль, например сульфат магния; полиол, такой как трехатомные спирты или сахарные спирты высшей атомности (например, глицерин, эритрит, глицерол, арабит, ксилит, сорбит и маннит); пропиленгликоль; полиэтиленгликоль; плюроники; поверхностно-активные вещества; и их комбинации.
[0015] В одном предпочтительном воплощении стеклообразующий агент содержит смесь дисахарида и гидролизованного белка. В конкретном воплощении предпочтительный стеклообразующий агент представляет собой смесь трегалозы и гидролизованного белка. Предпочтительно композиция содержит, в массовых процентах от общей массы сухого вещества, 10-90% трегалозы и 0,1-30% гидролизованного белка, более предпочтительно 20-80% трегалозы и 0,1-20% гидролизованного белка, и наиболее предпочтительно 40-80% трегалозы и 0,1-20% гидролизованного белка.
[0016] Способ по изобретению типично включает смешивание в растворе биологически активных материалов (например, пептидов, белков, ферментов, гормонов, витаминов, каротиноидов, минералов, лекарственных средств, антибиотиков, микробиоцидов, фунгицидов, гербицидов, инсектицидов, спермицидов, нуклеиновых кислот, антител, вакцин, бактерий, вирусов и/или клеточных суспензий), по меньшей мере одного агента, формирующего матрицу, и по меньшей мере два стеклообразующих агента в гомогенную суспензию, быстрое замораживание суспензии путем распыления, капельной подачи или экструдирования в ванну с жидким азотом, сбор гранул, микрогранул, нитей или капельных частиц из ванны с жидким азотом и сушку в жидком состоянии в аппарате для сублимационной сушки или, альтернативно, хранение их в морозильнике (при температуре от -30°С до -80°С) до сушки.
[0017] В варианте настоящего изобретения количество агента, формирующего матрицу, в композиции корректируют для достижения желаемой вязкости и желаемой плотности композиции, что обеспечивает эффективную первичную сушку, одновременно исключая кипячение и избыточное пенообразование, которое обычно происходит во время первичной жидкостной стадии сушки. Желаемая плотность жидкой композиции может быть достигнута с помощью любых средств, известных в данной области техники, например взбивание или инжектирование газа, такого как воздух, азот, диоксид углерода, аргон и т.д. Предпочтительно, перед стадией быстрого замораживания в композицию в форме вязкой суспензии инжектируют азот при перемешивании до образования стабильной пористой или сметанообразной суспензии.
[0018] Согласно изобретению способ сушки включает три основные стадии: 1) стадия кратковременной дегазации и стабилизации структуры замороженных частиц под вакуумметрическим давлением менее 2000 мТорр; 2) первичная жидкостная стадия сушки под вакуумметрическим давлением более 2000 мТорр и при желаемой температуре; 3) вторичная и окончательная стадия сушки стекловидного материала под давлением полного вакуума и повышенной температуре в течение периода времени, достаточного для снижения активности воды высушенной композиции до 0,3 Aw или менее.
[0019] В предпочтительных воплощениях способов сушки биологически активный материал смешивают в растворе, содержащем агент, формирующий матрицу, и стеклообразующий агент. В одном конкретном воплощении биологически активный материал содержит живые бактерии (например, пробиотические бактерии). Примеры подходящих микроорганизмов включают, но ими не ограничены, дрожжи, такие как Saccharomyces, Debaromyces, Candida, Pichia и Torulopsis, плесневые грибы, такие как Aspergillus, Rhizopus, Mucor, Penicillium и Torulopsis, и бактерии, такие как бактерии родов Bifidobacterium, Clostridium, Fusobacterium, Melissococcus, Propionibacterium, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Kocuriaw, Staphylococcus, Peptostrepococcus, Bacillus, Pediococcus, Micrococcus, Leuconostoc, Weissella, Aerococcus, Oenococcus и Lactobacillus. Конкретные примеры подходящих пробиотических микроорганизмов могут быть представлены перечисленными ниже видами и включают биологические типы культур в пределах этих видов: Aspergillus niger, A. oryzae, Bacillus coagulans, B. lentus, В. licheniformis, В. mesentericus, В. pumilus, В. subtilis, В. natto, Bacteroides amylophilus, Вас. capillosus, Вас. ruminocola, Вас. suis, Bifidobacterium adolescentis, B. animalis, B. breve, B. bifidum, B. infantis, B. lactis, B. longum, B. pseudolongum, B. thermophilum, Candida pintolepesii, Clostridium butyricum, Enterococcus cremoris, E. diacetylactis, E faecium, E. intermedius, E. lactis, E. muntdi, E. thermophilus, Escherichia coli, Kluyveromyces fragilis, Lactobacillus acidophilus, L. alimentarius, L. amylovorus, L. crispatus, L. brevis, L. case 4 L. curvatus, L. cellobiosus, L. delbrueckii ss. bulgaricus, L. farciminis, L. fermentum, L. gasseri, L. helveticus, L. lactis, L. plantarum, L. johnsonii, L. reuteri, L. Rhamnosus, L. sakei, L. salivarius, Leuconostoc mesenteroides, P. cereviseae (damnosus), Pediococcus acidilactici, P. pentosaceus, Propionibacterium freudenreichii, Prop. shermanii, Saccharomyces cereviseae, Staphylococcus camosus, Staph. xylosus, Streptococcus infantarius, Strep. salivarius ss. thermophilus, Strep. Thermophilus и Strep. lactis.
[0020] В предпочтительных способах композицию смешивают при комнатной температуре или слегка подогревают, чтобы способствовать солюбилизации материалов в вязкий раствор (например, при температуре от 20°С до 40°С). После перемешивания до гомогенного состояния вязкую суспензию затем мгновенно замораживают путем распыления, капельной подачи или экструдирования в жидкий азот. Замороженные частицы собирают из ванны с жидким азотом и немедленно сушат или, альтернативно, хранят в морозильнике для последующей сушки. Обычно суспензию, содержащую биологически активный материал, мгновенно замораживают до температуры от -30°С до -180°С; более предпочтительно композицию мгновенно замораживают в жидком азоте.
[0021] В предпочтительном воплощении мгновенно замороженные частицы немедленно сушат или, иначе, хранят в морозильнике предпочтительно при -80°С до сушки. Замороженные частицы затем загружают на поддоны и немедленно переносят в камеру для вакуумной сушки, где их сушат согласно настоящему изобретению. Предпочтительно, сушку начинают путем подвергания замороженных частиц воздействию вакуумметрического давления от 0 до 2000 мТорр. Замороженные частицы дегазируют и оставляют стоять для развития и стабилизации их структуры и объема в течение короткого периода времени. В типичных случаях желаемый период времени для подвергания замороженных частиц воздействию высокого вакуумметрического давления составляет не более 30 минут, более предпочтительно период времени составляет от 1 до 20 мин. После кратковременного начального дегазирования и стабилизации структуры замороженных частиц вакуум доводят до значения от 2000 до 10000 мТорр (1,333 кПа) и применяют нагрев для оттаивания частиц при температуре выше их точки замерзания. В типичных случаях вакуум доводят до значения от 2000 до 4000 мТорр (0,5332 кПа), и температуру частиц увеличивают до температуры от -5°С до +5°С. В этих предпочтительных условиях первичной сушки замороженные частицы быстро оттаивают и плохо сохраняют их первоначальную форму, и в то же время начинается ускоренная дегидратация. Последующую вторичную сушку осуществляют после удаления примерно 60-90% свободной воды, применяют максимальное вакуумметрическое давление и нагрев, при котором температура композиции поднимается до диапазона от 30°С до 60°С. Для максимального повышения стабильности конечного продукта композицию предпочтительно сушат в течение периода времени, достаточного для снижения активности воды композиции до Aw=0,3 или менее. В предпочтительном воплощении данного изобретения вторичная сушка включает удаление связанной воды при давлении менее 1000 мТорр (133,3 Па).
[0022] Высушенная композиция может быть использована непосредственно в виде хлопьев, или ее измельчают в порошок и просеивают до среднего размера частиц от примерно 10 мкм до примерно 1000 мкм. Композицию можно вводить непосредственно животному, включая человека, в виде концентрированного порошка, в виде восстановленной жидкости (например, питья), или она может быть добавлена либо в форме хлопьев, либо в форме порошка, в имеющийся пищевой или кормовой продукт.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0023] Фиг.1 - визуальные и микроскопические наблюдения разных высушенных композиций, содержащих различные матрицы и стеклообразующие агенты, в виде замороженной твердой гранулы согласно способу по настоящему изобретению.
[0024] Фиг.2 - влияние формы культуры L. rhamnosus в виде свежей культуры, в виде замороженных гранул или в виде сухого порошка на количество ее начальных КОЕ (колониеобразующие единицы) в сухой композиции.
[0025] Фиг.3 - влияние температуры замораживания композиции, содержащей L. rhamnosus в виде замороженных твердых гранул в жидком азоте или в морозильнике при -80°С и в виде незамороженной вязкой суспензии при +4°С на количество бактериальных начальных КОЕ в сухой композиции. Результаты показывают только влияние температуры замораживания суспензии без дополнительной стадии дегазации перед сушкой.
[0026] Фиг.4 - влияние температуры замораживания композиции, содержащей Bifidobacterium animalis Bbl2, в виде замороженных твердых гранул в жидком азоте и в виде незамороженной вязкой суспензии при +4°С на количество бактериальных начальных КОЕ в сухой композиции. Результаты показывают только влияние температуры замораживания суспензии без дополнительной стадии дегазации перед сушкой.
[0027] Фиг.5 - влияние продолжительности дегазации под вакуумом замороженных твердых гранул на количество начальных КОЕ L. rhamnosus в сухой композиции.
[0028] Фиг.6 - профиль сушки в сушилке для сублимационной сушки композиции согласно способу по изобретению.
[0029] Фиг.7 - технологические потери и потери при сушке L. rhamnosus в композициях и способы сушки по изобретению.
[0030] Фиг.8 - тенденции в отношении стабильности композиции сухих пробиотических бактерий L. rhamnosus при хранении при 40°С и относительной влажности 33%.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0031] ОПРЕДЕЛЕНИЯ
[0032] Следует иметь в виду, что использованная в данном описании терминология использована только в целях описания конкретных воплощений и не является ограничивающей.
[0033] Использованные в этом описании и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают объекты во множественном числе, если контекст четко не диктует иное. Так, например, ссылка на ″белок″ включает белок в единственном числе или комбинацию двух или более белков; ссылка на ″фермент″, ″витамин″, ″бактерии″ и т.д. включает каждый из них один или смеси нескольких, и т.п.
[0034] ″Биологически активный материал″, ″биологически активная композиция″ или ″биологически активная форма″ относятся к препаратам, которые находятся в такой форме, в которой биологическая активность биологически активных ингредиентов однозначно является эффективной.
[0035] ″Агент, формирующий матрицу″ относится к соединениям или материалам, которые добавляют в композицию для увеличения вязкости и/или плотности влажной композиции или для образования гидрогеля. Примеры подходящего агента, формирующего матрицу, включают, но ими не ограничены, водорастворимые производные целлюлозы, такие как метилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза и гипромеллоза; альгинаты, галактоманнан, геллановая камедь, трагакант, включая любые их производные, ацетофталат целлюлозы (CAP), карбоксиметилцеллюлоза, пектин, альгинат натрия, соли альгиновой кислоты, гидроксипропилметилцеллюлоза (НРМС), метилцеллюлоза, каррагинан, гуаровая камедь, аравийская камедь, ксантановая камедь, камедь из плодов рожкового дерева, хитозан и производные хитозана, коллаген, полигликолевая кислота, крахмалы и модифицированные крахмалы, циклодекстрины и олигосахариды (инулин, мальтодекстрины, декстраны и т.д.) и их комбинации.
[0036] ″Стеклообразующий агент″ или ″сахарный стеклообразующий агент″ обычно относится к соединениям или материалам, которые легко растворяются в растворе и не загущаются или не полимеризуются при контакте с водой. Эти агенты добавляют для обеспечения или увеличения стабильности биологически активного материала в процессе сушки и впоследствии или для стабильности при долговременном хранении сухого порошкового продукта. Полезными стеклообразующими агентами могут быть мономерные, олигомерные или полимерные агенты.
[0037] Согласно одному из предпочтительных воплощений стеклообразующий агент представляет собой сахарид. Сахарид, или углевод, по определению представляет собой соединение, преимущественно состоящее из углерода, водорода и кислорода. Полезные сахариды включают восстанавливающие и невосстанавливающие сахара и сахарные спирты, олигосахариды, водорастворимые полисахариды и их производные. Предпочтительные сахариды согласно изобретению включают глюкозу, фруктозу, лактозу, сахарозу, трегалозу, мальтозу, целлобиозу, галактозу, мальтотриозу, раффинозу, декстрин, декстран, инулин, маннит, сорбит, ксилит. Особенно предпочтительными сахаридами являются глюкоза и трегалоза.
[0038] Другие полезные стеклообразующие агенты могут быть выбраны из других классов химических веществ, таких как водорастворимые аминокислоты, пептиды или белки и гидролизованные белки. Примерами являются лизин, глицин, аланин, аргинин или гистидин, а также гидрофобные аминокислоты (триптофан, тирозин, лейцин, фенилаланин и т.д.); метиламин, такой как бетаин. Полезные белки включают желатин, яичный альбумин, яичный белок, белок молочной сыворотки, казеинат, иммуноглобулины, соевый белок, гороховый белок, хлопковый белок или другие пищевые, молочные или растительные белки.
[0039] ″Гидролизованные белки″ обычно относятся к белкам из животного, молочного или растительного источника, которые были расщеплены в результате ферментативного гидролиза или биологической переработки на более короткие пептидные фрагменты и/или аминокислоты. Полезными гидролизованными белками являются белки, подвергнутые интенсивному гидролизу, который снижает молекулярную массу 99% нативных белков до значения ниже 50000 Да, предпочтительно до значения ниже 10000 Да.
[0040] Комнатные температуры ″окружающей среды″ или условия ″окружающей среды″ представляют собой температуры или условия в любое данное время в данной окружающей среде. Обычно комнатная температура окружающей среды составляет 22-25°С, атмосферное давление окружающей среды и влажность окружающей среды без труда могут быть измерены и будут варьировать в зависимости от времени года, погоды и климатических условий, высоты над уровнем моря и т.д.
[0041] ″Дегазация″ или ″удаление газа″ в контексте настоящего изобретения относится к высвобождению газа из твердой или жидкой композиции, где парциальное давление газа больше, чем внешнее давление. Это не кипение раствора в жидкой форме, и это часто может происходить при давлениях выше давления, которое могло бы вызвать кипение раствора.
[0042] ″Кипение″ относится к быстрому фазовому переходу из жидкости в газ, который происходит при температуре жидкости выше ее температуры кипения. Температурой кипения является температура, при которой давление пара жидкости равно внешнему давлению. Кипение может быть особенно бурным, когда добавляют нагрев жидкости, которая уже находится при ее точке кипения.
[0043] ″Активность воды″, или ″Aw″, в контексте высушенных форм композиций относится к присутствию воды и отражает энергетическое состояние воды в системе. Ее определяют как давление пара воды над образцом, деленное на давление пара чистой воды при одинаковой температуре. Чистая дистиллированная вода имеет активность воды, равную точно единице, т.е. Aw=1,0.
[0044] ″Относительная влажность″ или ″OB″ в контексте стабильности при хранении относится к количеству водяного пара в воздухе при данной температуре. Относительная влажность обычно меньше, чем влажность, которая требуется для насыщения воздуха, и выражается в процентах от влажности насыщения.
[0045] ″Сухой″ и его варианты относятся к физическому состоянию, которое представляет собой лиофилизированный, дегидратированный или безводный, т.е. по существу не содержащий жидкость. Сушка включает, например, распылительную сушку, сушку в кипящем слое, лиофилизацию и вакуумную сушку.
[0046] ″Лиофилизация″ или ″сублимационная сушка″ относится к получению композиции в сухой форме путем быстрого замораживания и дегидратации в замороженном состоянии (иногда называется сублимацией). Этот процесс может протекать под вакуумом при давлении, достаточном для поддерживания продукта в замороженном состоянии, предпочтительно ниже примерно <2000 мТорр.
[0047] ″Первичная сушка″ или ″жидкостная сушка″, что касается описанных здесь способов, относится к сушке дегидратацией, которая происходит от момента времени таяния замороженных частиц до точки, когда начинается вторичная сушка. В типичных случаях первичная сушка в основном происходит в результате интенсивного испарения, в то время как температура продукта остается значительно ниже, чем температура источника тепла. Этот процесс может протекать под вакуумом при давлении, достаточном для поддерживания таяния продукта, предпочтительно выше примерно >2000 мТорр.
[0048] ″Вторичная сушка″, что касается описанных здесь способов, относится к стадии сушки, которая происходит при температурах, выше температур замерзания композиций и близких к температуре источника тепла. Этот процесс может протекать под вакуумом при давлении, достаточном для снижения активности воды композиции, предпочтительно менее примерно <1000 мТорр. В типичном способе сушки композиции стадия вторичной сушки снижает активность воды композиции до Aw 0,3 или менее.
[0049] ″Вспенивание″ относится к методике сушки чувствительных биологических материалов путем кипячения под вакуумом в условиях, при которых биологические материалы сохраняют активность или жизнеспособность в течение длительных периодов времени при температуре окружающей среды или при более высокой температуре. Конкретная методика формирования механически стабильной пористой структуры, протекающего в две стадии: (1) первичная сушка вспениванием и при кипячении под вакуумом, и (2) сушка для стабилизации/остекловывание, описана в патенте США №5766520, Bronshtein.
[0050] ″Стабильная″ форма или композиция представляет собой композицию, в которой биологически активное вещество по существу сохраняет его физическую стабильность, химическую стабильность и/или биологическую активность при хранении. Стабильность может быть измерена при выбранных температурных условиях и условиях влажности в течение выбранного периода времени. Анализ тенденции изменения может быть использован для оценки ожидаемого срока годности до того, как материал фактически находился на хранении в течение этого периода времени. Для живых бактерий, например, стабильность определяют как время, которое требуется для потери 1 log KOE/г сухой композиции при заданных условиях температуры, влажности и периода времени.
[0051] ″Жизнеспособность″ в отношении бактерий относится к способности образовывать колонию (КОЕ, или колониеобразующая единица) на питательной среде, подходящей для роста бактерий. Жизнеспособность в отношении вирусов относится к способности инфицировать подходящую клетку-хозяина и репродуцироваться в подходящей клетке-хозяине, вызывая образование пятна на газоне клеток-хозяев.
[0052] Композиции и способы по настоящему изобретению решают задачу создания экономически эффективных и промышленно применимых способов сушки композиций, содержащих чувствительные биологически активные вещества, такие как пептиды, белки, ферменты, гормоны, витамины, каротиноиды, минералы, лекарственные средства, антибиотики, микробиоциды, фунгициды, гербициды, инсектициды, спермициды, нуклеиновые кислоты, антитела, вакцины, бактерии, вирусы и/или клеточные суспензии, со значительно увеличенной продолжительностью жизни в сухом состоянии.
[0053] Согласно изобретению предложена композиция, содержащая биологически активное вещество, и матрицу, и стеклообразующие агенты в смеси растворов, и предложен способ сушки, включающий мгновенное замораживание указанной композиции в жидком азоте с образованием аморфной твердой структуры в форме капельных частиц, нитей, гранул или микрогранул и дегазацию замороженных частиц в глубоком вакууме с последующей стабилизацией биологически активного вещества в форме сахарного стекла путем лиофилизации или выпаривания влаги в режиме пониженного давления с одновременным нагреванием композиции.
[0054] Основную потерю жизнеспособности микроорганизма во время осуществления способов сушки можно объяснить сочетанием образования кристаллов льда, высоких осмотических и оксидативных стрессов, сдвиговых усилий и высвобождения энергии во время пузырьковых кавитаций, ассоциированных с ″кипением″ и вспениванием раствора при сушке при низком давлении и высокой температуре. Настоящее изобретение исключает такие негативные эффекты и предоставляет композиции и способы сушки с минимальными потерями, которые обеспечивают защиту биологически активного вещества в матрице из сахарного стекла в жестких условиях хранения и транспортировки после этого.
[0055] КОМПОЗИЦИИ ПО ИЗОБРЕТЕНИЮ
[0056] Настоящее изобретение охватывает композиции биологически активного материала, агента, формирующего матрицу, и стеклообразующих агентов в вязком растворе. Было обнаружено, что композиции по изобретению существенно отличаются по их физической структуре и функции от невязких или концентрированных композиций, которые сушили с или без мгновенного замораживания и дегазации. Например, композиции предшествующего уровня техники вначале ″вспенивали″ путем кипячения для облегчения эффективной сушки. Стадия вспенивания, как правило, приводит к бурному кипению и разбрызгиванию раствора, что является неизбежным следствием сушки в жидком состоянии, и, в результате, может быть достигнута только очень низкая допустимая нагрузка материала в виалу или сосуд (смотри, например, патент США №6534087, в котором указано, что толщина конечного вспененного продукта составляет менее 2 мм).
[0057] Композиции и способы сушки по настоящему изобретению исключают кипячение и интенсивное вспенивание композиции, что позволяет загружать больше материала на площадь сушки и, в результате, дает возможность увеличивать масштабы производства до больших количеств материала, не используя специально сконструированные сосуды, поддоны или оборудование.
[0058] Было показано, что пробиотические бактерии особенно полезны благодаря композициям и способам сушки по настоящему изобретению. Композицию получают согласно композициям и способам по изобретению, включающим смешивание свежих, замороженных или сухих культур пробиотических бактерий с по меньшей мере одним агентом, формирующим матрицу, и по меньшей мере двумя стеклообразующими агентами, мгновенное замораживание вязкой композиции в жидком азоте с образованием аморфной структуры замороженных твердых капельных частиц, нитей или гранул. Для первичной сушки применяют достаточное вакуумметрическое давление для дегазации и стабилизации структуры замороженных частиц, и затем замороженные частицы лиофилизируют или выпаривают при пониженном вакуумметрическом давлении и повышенной температуре выше температуры замерзания композиции. Поддерживание температуры композиции выше точки замерзания может быть осуществлено путем отведения тепла из композиции и/или за счет потери скрытой теплоты вследствие испарения воды. Для завершения процесса сушки и дальнейшего снижения активности воды в композиции может быть проведена стадия вторичной сушки при более высоком вакуумметрическом давлении 1000 мТорр и ниже и при повышенной температуре вплоть до 70°С с получением конечной композиции с активностью воды Aw 0,3 или ниже. Такая композиция может оставаться стабильной в условиях хранения 40°С и 33% OB в течение 30 суток или более, как показано на Фиг.8.
[0059] Получение композиций
[0060] Материалы, которые смешивают в растворе с предпочтительным биологически активным материалом для получения сухих порошковых композиций согласно изобретению, включают по меньшей мере один агент, формирующий матрицу, и по меньшей мере два стеклообразующих агента. Такие материалы при смешивании с предпочтительным биологически активным материалом образуют гранулы, микрогранулы, нити или капельные частицы в жидком азоте и могут быть эффективно лиофилизированы или дегидратированы в аморфном стекловидном состоянии способами по изобретению с получением больших количеств стабильных сухих композиций для хранения и введения указанного биологически активного вещества (смотри Фиг.1А и В, на которых представлены результаты визуальных и микроскопических наблюдений и активность воды (Aw) разных композиций после сушки). Агент, формирующий матрицу, обеспечивает структурную стабильность композиции, улучшенный профиль сушки и/или физические и химические преимущества биологически активных веществ. Агент, формирующий матрицу, также обеспечивает повышение вязкости композиции и лучший контроль над свойствами композиции под вакуумметрическим давлением и увеличение структурной прочности высушенных композиций по изобретению (смотри Фиг.1В, изображения 4, 4b, 4с для стекловидной структуры и сухости конкретной композиции). Агент, формирующий матрицу, включает смесь полисахаридов и олигосахаридов. Предпочтительными полисахаридами, в частности для живых микроорганизмов, являются водорастворимые камеди, благодаря их особой характеристике образовывать вязкий гель при умеренных температурах. Было также установлено, что камеди в определенной концентрации эффективно стабилизируют композицию и способствуют образованию аморфной стекловидной структуры, а также улучшают профиль сушки под вакуумом (смотри Фиг.1А, изображения 3а, 3b, 3с, 4; Фиг.1В, изображение 4с, и Фиг.6).
[0061] Из изображений, представленных на Фиг.1А, в сочетании с результатами, приведенными в Таблице 1, ясно видно, что образцы 3b, 3с, 4, 5 и 6 все были высушены в достаточной степени для обеспечения некоторой пористости в аморфных стекловидных структурах.
[0062] Стеклообразующие агенты по изобретению могут включать различные сахара, невосстанавливающие сахара, сахарные спирты, аминокислоты, белки, гидролизованные белки и пептиды. Стеклообразующее соединение предпочтительно представляет собой соединение, которое не кристаллизует и/или не дестабилизирует биологически активный материал в композиции при температурах замораживания (например, ниже -20°С). Например, биологически активный материал может быть физически заключен в структурах аморфного сахарного стекла, такого как сахарозного или трегалозного, для способствования сохранению молекулярной структуры на протяжении всего процесса сушки и придания структурной жесткости аморфной матрице в сухом состоянии. Стеклообразующий агент замещает гидратную воду, теряемую в процессе сушки, предотвращая повреждение клеточных мембран и денатурацию ферментов (смотри обзор Crowe et al., 1998). Другие функции стеклообразующего агента могут включать защиту биологически активного материала от разрушающего воздействия света, кислорода, окислителей и влаги. Большая часть стеклообразующих агентов должна легко растворяться в растворе в количествах в пределах от примерно 0,1 массового процента до примерно 80 массовых процентов. Полезно включать два или более разных стеклообразующих агентов для ингибирования образования кристаллов и повышения стабильности высушенной композиции биологически активного материала в условиях хранения в течение длительных периодов времени (смотри влияние сахаров и смесей белков на Фиг.1А, изображения 4, 5 и 6).
[0063] Предварительно высушенные композиции имеют значительное общее содержание твердых веществ (компоненты минус растворитель, такой как вода). Основная часть всего твердого вещества состоит из биологически активного материала, агентов, формирующих матрицу, и стеклообразующих агентов. Например, биологически активный материал присутствует в композиции в концентрации в пределах примерно от 5 до 60 массовых процентов, агент, формирующий матрицу, составляет примерно от 1 до 20 массовых процентов, и стеклообразующий агент составляет примерно от 5 до 80 массовых процентов. В другом примере агент, формирующий матрицу, может присутствовать в композиции в концентрации в пределах примерно от 0,5 до 10 массовых процентов, и стеклообразующий агент составляет примерно от 10 до 50 массовых процентов. Предпочтительно, влажная композиция должна иметь содержание твердых веществ от примерно 5% до 80%; более предпочтительно от 30% до 60%. Вязкость композиций по изобретению в типичных случаях составляет более 1000 сантипуаз (сПз); более предпочтительно более 5000 сПз; и наиболее предпочтительно более 10000 сПз. Плотность композиций по изобретению предпочтительно составляет от 0,9 до 1,2 г/мл.
[0064] СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ СТАБИЛЬНЫХ СУХИХ КОМПОЗИЦИЙ
[0065] Способы получения стабильных сухих композиций, содержащих биологически активные материалы, включают: (1) приготовление композиции путем смешивания биологически активного материала с матрицей и стеклообразующими агентами в растворе, (2) мгновенное замораживание композиции с образованием твердых замороженных частиц, (3) подвергание замороженных частиц воздействию высокого вакуумметрического давления в течение короткого периода времени для дегазации частиц и стабилизации их структуры, (4) удаление воды лиофилизацией и/или выпариванием влаги при пониженном давлении и одновременном нагреве композиции при температуре выше температуры замерзания композиции, предпочтительно выше -10°С, (5) дополнительное снижение активности воды композиции до значения менее 0,3 Aw в условиях полного вакуума и повышенной температуры.
[0066] В одном из воплощений, например, композиции по изобретению содержат биологически активный материал в форме раствора или суспензии, содержащего(ей) матрицу и стеклообразующие агенты. Агент, формирующий матрицу, и/или стеклообразующие агенты в высокой концентрации растворяются и обеззараживаются в горячем водном растворе при перемешивании, после чего его охлаждают и смешивают с биологически активным материалом. Биологически активный материал, такой как культивированный вирус или бактерия, концентрируют и выделяют из культуральной среды центрифугированием или фильтрованием, а затем ресуспендируют в композицию.
[0067] В одном из воплощений настоящего изобретения все количество воды в композиции находится в жидкости концентрированной суспензии живого микроорганизма, и суспензию живого микроорганизма поддерживают при температуре, слегка выше комнатной температуры. Сухие компоненты смешивают вместе, а затем медленно добавляют в теплую (от 25°С до 40°С) суспензию живого микроорганизма. Суспензию композиции мягко перемешивают в планетарном смесителе до тех пор, пока все компоненты полностью не диспергируются и пока не будет получена однородная суспензия.
[0068] Вязкий раствор затем мгновенно замораживают распылением, капельной подачей или экструзией в ванну с жидким азотом с образованием небольших твердых капельных частиц, нитей или гранул. Замороженные твердые частицы можно хранить в морозильнике при температуре от -30°С до -80°С до сушки или их можно немедленно поместить на поддоны и лиофилизировать или сушить способами по изобретению. Твердые замороженные частицы дегазируют в течение короткого периода времени, обычно от 1 до 20 минут, под достаточным вакуумом (например, ниже 2000 мТорр). Как правило, во время проведения стадии дегазации частицы остаются в твердой замороженной форме при температуре ниже -20°С. После первоначальной стадии дегазации вакуумметрическое давление увеличивают до значения от 2000 до 10000 мТорр и обеспечивают нагрев, позволяющий быстро увеличить температуру композиции до значения от -5°С до +5°С, и частицы начинают таять. Как только температура композиции доходит до желаемой температуры, нагрев регулируют так, чтобы поддерживать эту температуру и осуществлять стадию первичной сушки. На этой стадии композиция уже оттаивает и происходит ускоренное испарение воды без какого-либо кипения или вспенивания.
[0069] Типичные способы предшествующего уровня техники включают интенсивное вспенивание и/или разбрызгивание и сильное кипение, что может приводить к разрушению чувствительных биологических веществ и создавать трудности при производстве в промышленных масштабах с высокой допустимой нагрузкой (смотри, например, патент США №6534087, где применяемое вакуумметрическое давление вызывает сильное кипение и вспенивание), тогда как композиции и способы по настоящему изобретению исключают кипение или избыточное вспенивание композиции при одновременном достижении значительного ускорения сушки и делают возможной высокую допустимую нагрузку композиции. Кроме того, полная и эффективная дегазация вязких жидких суспензий является трудоемкой и может требовать продолжительного периода времени. Эти трудности все были решены настоящим изобретением за счет использования подходящей композиции, которая дает возможность осуществлять эффективную первичную жидкостную сушку с образованием аморфной стекловидной структуры без кипения и чрезмерного вспенивания. Неожиданным и существенным является то, что это достигается путем мгновенного замораживания подходящей композиции и за счет введения стадии кратковременной дегазации перед началом первичной жидкостной стадии сушки. Загрузка твердых замороженных частиц на поддон, в отличие от суспензии или вязкого сиропа, обеспечивает намного более высокую допустимую нагрузку на площадь сушки на поддонах, чем в предшествующем уровне техники. После окончания стадии первичной жидкостной сушки стабилизированную аморфную стекловидную композицию выдерживают при повышенных температурах вторичной сушки (от 20°С до 70°С) и вакуумметрических давлениях менее 1000 мТорр для дополнительного снижения активности воды композиции за очень короткое время.
[0070] В другом воплощении данного изобретения предложены способы получения композиций в форме гидрогеля для сохранения биологически активных материалов. Например, композицию, содержащую биологически активный материал, и матрицу, и стеклообразующие агенты смешивают в растворе и подвергают поперечной сшивке с образованием прочных гидрогелевых частиц путем распыления или экструзии в ванну, содержащую ионы двухвалентного металла, или путем добавления ионов двухвалентного металла непосредственно в суспензию и разрезания затвердевшего гидрогелевого блока на небольшие нити или кусочки. Гидрогелевые частицы затем сушат способами сушки по изобретению, как описано выше.
[0071] Например, в одном конкретном воплощении данного изобретения композиция содержит живые пробиотические бактерии в растворе 1-4% альгината натрия и 10-40% трегалозы. Белки и, в частности, гидролизованные белки, такие как казеин, сывороточные, гороховые, соевые или хлопковые, добавляют в композицию в концентрации 5-10% для усиления процесса сушки и формирования аморфной стекловидной стабильной структуры композиции (смотри Фиг.1А, изображения 4, 5 и 6). Пробиотическая культура может быть свежей, замороженной или уже высушенной в форме сухого порошка (смотри Фиг.2 в отношении КОЕ для разных культуральных форм пробиотических бактерий в сухой композиции). Раствор смешивают при температуре, слегка выше комнатной температуры (обычно от 25°С до 37°С) до тех пор, пока все компоненты полностью не растворятся. Суспензию композиции распыляют, экструдируют или подают капельным методом в жидкий азот с образованием небольших капельных частиц или гранул, которые затем извлекают из жидкого азота, упаковывают в пакеты и затем хранят в морозильнике при -80°С до сушки.
[0072] Типичный способ сушки живых пробиотических бактерий включает распределение твердых замороженных гранул на поддонах в равномерный слой при допустимой нагрузке 100-1000 г/кв. фут, и поддоны сразу размещают в сушилке для сублимационной сушки. Затем прикладывают вакуумметрическое давление примерно 1000 мТорр, и в зависимости от размера сушилки для сублимационной сушки и типа источника тепла температуру на полке доводят до +20°С или до температуры, достаточной для поддерживания температуры частиц примерно -20°С. Твердые замороженные гранулы дегазируют в течение примерно 5-30 минут, и вакуум доводят до 2000-10000 мТорр, и подачу тепла увеличивают до подъема температуры композиции до значения от -5°С до +5°С. Эти условия температуры и вакуумметрического давления поддерживают во время первичной жидкостной стадии сушки, которая может быть осуществлена за период времени от нескольких часов до 24 часов в зависимости от загрузки поддона, предпочтительно за период времени от примерно 3 до 10 часов. В определенный момент во время процесса первичной сушки скорость выпаривания растворителя замедляется, и температура композиции начинает увеличиваться благодаря избыточной подаче тепла в сушильную камеру. Эта точка указывает на окончание стадии первичной сушки. По мере удаления растворителя из композиции стеклообразующие агенты в растворе концентрируются и сгущаются до такой степени, что раствор прекращает течь как жидкость, и происходит образование аморфных и/или стабильных стекловидных структур.
[0073] Затем следует стадия вторичной сушки при полном вакууме и температуре композиции от 30°С до 50°С. Назначение стадии вторичной сушки заключается в удалении остаточной поглощенной или связанной влаги и обеспечении получения композиции, которая стабильна при хранении в течение длительного периода времени при температуре окружающей среды. Стадия вторичной сушки может протекать несколько часов и заканчивается в тот момент, когда композиция становится полностью сухой и ее активность воды ниже 0,3 Aw.
[0074] Способы сушки по изобретению дают в результате биологически активный материал, который инкапсулирован внутри аморфной стекловидной матрицы, что предотвращает развертывание белков и значительно замедляет молекулярные взаимодействия или перекрестную реактивность благодаря значительному снижению подвижности соединения и других молекул внутри аморфной стекловидной композиции. Поскольку аморфное твердое вещество находится при температуре ниже его температуры стеклования, и содержание остаточной влаги остается относительно низким (т.е. ниже Aw 0,3), биологически активный материал остается относительно стабильным (смотри Фиг.8). Следует иметь в виду, что достижение стекловидного состояния не является необходимым предварительным условием для долговременной стабильности, так как некоторые биологически активные ингредиенты могут жить лучше в кристаллическом состоянии.
[0075] Приготовление сухого порошка
[0076] Высушенная композиция может быть использована целиком, может быть разрезана на куски желаемой формы и размера, или может быть раздроблена и измельчена в тонкий сыпучий порошок, что обеспечивает удобную дальнейшую переработку, такую как влажное или сухое агломерирование, гранулирование, таблетирование, прессование, дражирование, или может быть добавлена в пищевые или кормовые продукты или в любой другой вид способа доставки. Способы дробления, измельчения, размалывания или распыления общеизвестны в данной области техники. Например, может быть использована молотковая мельница, воздушная мельница, ударная мельница, струйная мельница, шаровая мельница, мельница Уайли или подобное мелющее устройство. Предпочтительный размер частиц измельченных частиц составляет менее примерно 1000 мкм и предпочтительно менее 500 мкм.
[0077] Описанные здесь композиции и способы сохраняют биологическую активность инкапсулированного биологически активного материала. Например, композиции тестируют в отношении стабильности, подвергая их воздействию повышенной температуры (например, 40°С) и высокой влажности (например, 33% OB) и измеряя биологическую активность композиций. В качестве примера для живых пробиотических бактерий, результаты этих исследований демонстрируют, что бактерии в составе этих композиций стабильны в течение по меньшей мере 20 суток (смотри Фиг.8). Стабильность определяют как время, которое требуется для потери эффективности один log КОЕ/г. Такие композиции стабильны даже при высоких концентрациях биологически активного материала. Поэтому эти композиции имеют преимущество в том, что их можно транспортировать и хранить при комнатной температуре или при температуре выше комнатной температуры в течение длительных периодов времени.
[0078] ПРИМЕРЫ
[0079] Приведенные ниже примеры представлены для иллюстрации заявленного изобретения, но они не ограничивают его.
[0080] ПРИМЕР 1
[0081] Получение сухого и стабильного пробиотического вещества
[0082] Исходная композиция
[0083] 75 г трегалозы (Cargill Minneapolis, MN) и 22 г сильно гидролизованного казеина (Marcor, Carlstadt, NJ) смешивали до однородного состояния с 3 г альгината натрия (ISP Corp., Wayne, NJ) в сухой форме. Свежий концентрат Lactobacillus acidophilus (100 мл, содержащий по меньшей мере 10% твердого вещества, сразу после сбора после ферментации) добавляли в блендер и поддерживали при 35°С. Сухую смесь камеди, сахара и гидролизованного белка медленно добавляли к пробиотической культуре и проводили смешивание при 35°С в течение 10 минут. Вязкую суспензию затем переносили в сосуд с перфорированным дном и оставляли для капельной подачи в ванну, содержащую жидкий азот. Гранулы затем извлекали из жидкого азота и сразу направляли на сушку.
[0084] Сушка замороженных гранул исходной композиции
[0085] Замороженные гранулы равномерно распределяли на поддоне при допустимой нагрузке 100 г/кв. фут и сразу помещали на полку в сушилке для сублимационной сушки (Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). Затем прикладывали вакуумметрическое давление 1000 мТорр, и твердые замороженные гранулы дегазировали в течение 10 минут. Вакуум затем доводили до 2700 мТорр (359,91 Па) и температуру на полке поднимали до +30°С. Эти температура и вакуумметрическое давление поддерживали в течение 3 часов. Затем осуществляли стадию вторичной сушки при полном вакууме (150-200 мТорр (19,995-26,660 Па)), и температуру на полке поднимали до 30°С в течение еще 2 часов. Композиция была полностью высушена, и ее активность воды, измеренная с помощью прибора Hygropalm Aw1 (Rotonic Instrument Corp., Huntington, NY), составляла Aw=0,23.
[0086] ПРИМЕР 2
[0087] Стабильная сухая композиция, содержащая пробиотические бактерии Lactobacillus rhamnosus LGG
[0088] Lactobacillus rhamnosus LGG (500 г замороженного концентрата из коммерческого источника) оттаивали при 37°С в двойном планетарном смесителе с рубашкой (DPM, Iqt, Ross Engineering, Inc. Savannah, GA,). Два стеклообразующих агента, трегалозу (387 г, Cargill Minneapolis, MN) и сильно гидролизованный казеин (83 г, Marcor, Carlstadt, NJ) гомогенно смешивали в сухой форме с двумя агентами, формирующими матрицу, альгинатом натрия (15 г, ISP Corp., Wayne, NJ) и растворимым Инулином (25 г, Cargill Minneapolis, MN). Сухую смесь медленно добавляли к оттаявшим пробиотическим бактериям, и смешивание проводили при 40 об/мин и 37°С в течение 10 минут. Вязкость суспензии доводили до 12000 сПз путем добавления 50-200 мл воды. Суспензию затем переносили в сосуд с перфорированным дном и оставляли для капельной подачи в сосуд, содержащий жидкий азот. Гранулы затем извлекали из жидкого азота, помещали в герметичный фольгированный алюминиевой фольгой пакет и хранили в морозильнике при -80°С в течение нескольких недель.
[0089] Для сушки замороженные гранулы равномерно распределяли на поддонах при допустимой нагрузке в пределах от 100 до 500 г/кв. фут, и поддоны помещали на полки в сушилке для сублимационной сушки (Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). Прикладывали вакуумметрическое давление 1000 мТорр, и температуру на полке доводили до +20°С. Твердые замороженные гранулы дегазировали в течение периода времени в пределах от 1 до 30 минут. После стадии дегазации проводили стадию первичной сушки после доведения вакуумметрического давления до 2700 мТорр (359,91 Па), и температуру на полках поднимали до +30°С. Эти температуру и вакуумметрическое давление поддерживали в течение 12 часов. Стадию вторичной сушки затем проводили при полном вакууме (150-200 мТорр), и поддерживали температуру на полках 30°С в течение еще 4 часов. Композиция была полностью высушена, и ее измеренная активность воды составила 0,23 Aw. На Фиг.6 представлен профиль сушки пробиотической композиции.
[0090] Потери жизнеспособности после замораживания суспензии при разных температурах (+4°С, -80°С и -180°С) и после осуществления способа сушки, включая получение замороженных гранул и сушку в сушилке для сублимационной сушки, представлены на Фиг.3, 4 и 7. Потери жизнеспособности в течение всего процесса были, как правило, ниже <1 log в зависимости от типа бактериальной культуры (замороженные или сухие культуры) и от температуры замораживания вязкой суспензии. Результаты показывают, что мгновенное замораживание пробиотических бактерий в жидком азоте (-180°С) было менее разрушающим процессом, чем замораживание при -80°С.
[0091] Фиг.5 и 8 демонстрируют влияние различных периодов времени дегазации в пределах от 0 мин (без дегазации) до 30 мин на начальное число пробиотических бактерий в сухой композиции и на стабильность при хранении в условиях ускоренного хранения 40°С и 33% OB. Результаты свидетельствуют о том, что более длительная дегазация, как правило, повышает начальное число бактерий в сухой композиции, но не влияет на стабильность при хранении пробиотической композиции.
[0092] ПРИМЕР 3
[0093] Трегалозу (752 г, Cargill Minneapolis, MN), сильно гидролизованный гороховый белок (167 г, Marcor, Carlstadt, NJ), альгинат натрия (30 г, ISP Corp., Wayne, NJ) и растворимый Инулин (50 г, Cargill Minneapolis, MN) смешивали до гомогенного состояния в сухой форме. Сухую смесь медленно добавляли к 1000 мл горячей деионизированной воды при 80°С в двойном планетарном смесителе с рубашкой (DPM, Iqt, Ross Engineering, Inc. Savannah, GA), и смешивание проводили при 40 об/мин в течение 10 минут. Температуру смеси снижали до 37°С и медленно добавляли 100 г сухого порошка Lactobacillus rhamnosus LGG, полученного из коммерческого источника, и смешивание продолжали в течение 20 минут. Суспензию затем экструдировали через иглу с отверстием 2 мм в ванну, содержащую жидкий азот. Нити/гранулы затем извлекали из жидкого азота, помещали их в герметичные фольгированные алюминиевой фольгой пакеты и хранили в морозильнике при -80°С в течение нескольких недель. Для сушки замороженные нити/гранулы равномерно распределяли на поддонах при нагрузке в пределах от 100 до 500 г/кв. фут, и поддоны помещали на полки в сушилке для сублимационной сушки (Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY) и сушили, как описано в Примере 2. Все композиции оставались на поддонах в удовлетворительном состоянии, и никакого разбрызгивания или вспенивания не наблюдалось при всех уровнях нагрузки. Композиция была полностью высушена даже при более высокой нагрузке, и измеренная активность воды составляла 0,26 Aw и ниже для всех образцов.
[0094] ПРИМЕР 4
[0095] Получение гидрогелевой композиции, содержащей пробиотические бактерии Bifidobacterium lactis (Bbl2)
[0096] Концентрированную пробиотическую суспензию Bifidobacterium lactis (Bbl2) готовили согласно Примеру 1. К исходной композиции добавляли 0,5 г двухосновного фосфата кальция, затем добавляли 0,5 г глюконолактона. Суспензию оставляли затвердевать при комнатной температуре в течение следующих 2 часов до образования твердого гидрогеля. Прочный гель нарезали на тонкие и длинные нити, используя коммерчески доступный слайсер/шредер. Тонкие нити мгновенно замораживали в жидком азоте и загружали на поддон при допустимой нагрузке 700 г/кв. фут и размещали в сушилке для сублимационной сушки, как описано в Примере 2. Активность воды (Aw) композиции составляла 0,05 (измерена с помощью HygroPalm Aw1, Rotonic Huntington, NY). Сухую композицию дополнительно измельчали в тонкий порошок с использованием стандартного молоткового измельчающего оборудования и просеивали через сита 50-250 микрон.
[0097] ПРИМЕР 5
[0098] Не содержащая аллергенов композиция, содержащая пробиотические бактерии Lactobacillus acidophilus
[0099] Трегалозу (752 г, Cargill Minneapolis, MN), сильно гидролизованный гороховый белок (167 г, Marcor, Carlstadt, NJ), альгинат натрия (30 г, ISP Corp., Wayne, NJ) и растворимый Инулин (50 г, Cargill Minneapolis, MN) смешивали до гомогенного состояния в сухой форме. Сухую смесь стерилизовали медленным добавлением к 1000 мл горячей деионизированной воды при 80°С в двойном планетарном смесителе с рубашкой (DPM, Iqt, Ross Engineering, Inc. Savannah, GA), и смешивание проводили при 40 об/мин в течение 10 минут до образования однородной и светлой суспензии. Температуру смеси снижали до 37°С, и медленно добавляли 1000 г замороженных гранул, содержащих Lactobacillus acidophilus, полученных из коммерческого источника, и смешивание продолжали в течение 10 минут. Суспензию затем экструдировали через иглу с отверстием 2 мм в ванну, содержащую жидкий азот. Нити/гранулы затем извлекали из жидкого азота, помещали в герметичные фольгированные алюминиевой фольгой пакеты и хранили в морозильнике при -80°С в течение нескольких недель. Для сушки замороженные нити/гранулы равномерно распределяли на поддонах при допустимой нагрузке 1000 г/кв. фут, и поддоны помещали на полки в сушилке для сублимационной сушки (Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY) и сушили, как описано в Примере 2. Число начальных КОЕ пробиотических бактерий в сухой композиции составляло 10,53 log/г, и потеря жизнеспособности после 42 суток хранения в условиях ускоренного хранения при 40°С и 33% OB составляла 0,69 log KOE/г.
[00100] ПРИМЕР 6
[00101] Детская молочная смесь, содержащая сухую композицию по настоящему изобретению
8
[00102] Стабильную сухую композицию, содержащую Lactobacillus GG (Valio Corp, Finland), готовили согласно Примеру 2, после чего ее просеивали в две группы размеров частиц (более 50 мкм и менее 150 мкм). Детскую молочную смесь готовили путем смешивания 99,9 г Nutramigen (Mead Johnson; Evansville, IL) с 0,1 г частиц сухой композиции, имеющих размер от 50 мкм до 150 мкм. Конечный продукт содержит примерно 10 КОЕ Lactobacillus GG на 100 г молочной смеси.
[00103] ПРИМЕР 7
[00104] Пробиотическая добавка, содержащая стабильную сухую композицию по настоящему изобретению
8
3
6
[00105] Стабильную сухую композицию, содержащую Lactobacillus acidophilus, готовили в двух пероральных лекарственных формах, таких как таблетки, каплетки или капсулы. Оранжевые корригированные таблетки, содержащие 99,9 г агента для прессования (декстроза) и 0,1 г частиц сухой композиции, имеющих размер от 50 мкм до 150 мкм, изготавливали путем прямого прессования на роторной машине с использованием ½-дюймового круглого стандартного изогнутого инструментария. Конечный продукт содержал примерно 10 КОЕ на стандартную дозу. Твердость таблеток составляла 8-10 kp (твердость по Кнупу), и время разрыхления составляло приблизительно 20 секунд. Прессованные таблетки упаковывали во флаконы из HDPE (полиэтилен высокой плотности) вместимостью 180 см по 100 таблеток в каждом и помещали в условия контролируемой температуры/влажности 40°С/33% OB. Продукт ежемесячно тестировали на микробиологическую стабильность в течение 12 месяцев или до снижения числа бактерий при анализе ниже 1×10на стандартную дозу.
[00106] ПРИМЕР 8
[00107] Функциональный готовый к употреблению напиток, содержащий стабильную сухую композицию по настоящему изобретению
9
7
[00108] Готовят сухую смесь, содержащую (в мас.%) 71% сахарозы, 14% мальтодекстрина, 10% инулина, 2% декстрозы, 1% безводной лимонной кислоты, 0,3% аравийской камеди, 0,3% корригентов, 0,3% трикальцийфосфата и 0,1% частиц сухой пробиотической композиции (L. acidophilus), имеющих размер от 50 мкм до 250 мкм. Конечный продукт содержит примерно 10 КОЕ на стандартную дозу (30 г сухой смеси). Продукт упаковывают в небольшие пакеты из алюминиевой фольги (30 г стандартной дозы на пакет) для приготовления напитка путем перемешивания в 340 мл воды. Стабильность пробиотических бактерий в сухой смеси для приготовления напитка тестируют ежемесячно в течение 12 месяцев на микробиологическую стабильность или до тех пор, пока не будет достигнуто снижение числа бактерий ниже 1×10 на стандартную дозу.
[00109] ПРИМЕР 9
[00110] Приготовление пробиотического корма для домашних животных
8
[00111] Коммерчески доступный гранулированный корм для собак сушат в конвекционной печи до активности воды 0,1, а затем покрывают стабильной пробиотической сухой композицией, полученной, как описано в Примере 3. На сухие гранулы распыляют примерно 5% влагонепроницаемого барьера на жировой основе (смесь, содержащая 40% жира цыпленка, 40% масла какао и 20% пчелиного воска), перемешивают в галтовочном барабане с сухой порошковой композицией (обычно 0,1-0,5% от общей массы корма для домашних животных, что обеспечивает дозировку 10 КОЕ/г), и в конце распылением наносят дополнительное покрытие из влагонепроницаемого барьера на жировой основе. Общее количество покрытия составляет примерно 15% (от массы корма для домашних животных). Время нанесения покрытия составляет примерно 30 мин.
[00112] ПРИМЕР 10
[00113] Приготовление корма для рыбы с несколькими пробиотическими микроорганизмами
7
[00114] Гранулированный корм для рыбы согласно настоящему изобретению готовят со смесью нескольких пробиотиков. Стабильную сухую пробиотическую композицию, содержащую смесь L. rhamnosus, L. acidophilus и Bifidobacterium lactis, получают, как описано в Примере 1. Коммерчески доступный стартовый корм для лосося (Zeigler Bros., Gardners, PA) сначала сушат в конвекционной печи до активности воды 0,1, а затем покрывают пробиотическими композициями в галтовочном барабане. На гранулы (1000 г) сначала распыляют примерно 5 мас.% влагонепроницаемого барьера на жировой основе (смесь 40% рыбьего жира, 40% масла какао и 20% пчелиного воска), затем смешивают с 1 г стабильной сухой пробиотической композиции (для достижения дозировки 10 КОЕ/г корма), и в конце распыляют дополнительное покрытие влагонепроницаемого барьера на жировой основе. Общее количество покрытия составляет примерно 10% (от корма для рыбы).
[00115] ПРИМЕР 11
[00116] Стабильный сухой порошок, содержащий фермент
[00117] Гидрогелевую композицию, содержащую 40 массовых процентов савиназы (Novozymes, Denmark), получают путем смешивания 600 г композиции, описанной в Примере 4, и 400 г савиназы в 1000 г водного раствора. Нарезанную гидрогелевую композицию мгновенно замораживают в жидком азоте и сушат в вакуумной печи при температуре сушки композиции 50°С. Для определения нагрузки и стабильности при хранении сухой композиции сухой образец точно взвешивают (<100 мг) в микроцентрифужной пробирке. Добавляют 200 мкл диметилсульфоксида (DMSO). Композицию растворяют в DMSO-буфере путем встряхивания на вортексе. К этому образцу добавляют 0,8 мл раствора, содержащего 0,05 н. NaOH, 0,5% SDS (додецилсульфат натрия) и 0,075 М лимонной кислоты (тринатриевой соли). Пробирки обрабатывают ультразвуком в течение 10 мин при 45°С, затем центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 мин. Аликвоты чистого DMSO/NaOH/SDS/цитратного раствора переносят в лунки микропланшета и анализируют на содержание белка с использованием метода анализа Брэдфорда. Стабильность при хранении фермента в стабильной композиции значительно выше, чем сухого фермента без композиции по настоящему изобретению.
[00118] ПРИМЕР 12
[00119] Стабильный сухой порошок, содержащий витамин А
[00120] Композицию, содержащую 30 массовых процентов витамина А, получают путем смешивания 320 г растворимого инулина, 320 г мальтодекстрина DE-1 (Tate&Lyle, London, UK), 50 г натрий-карбоксиметилцеллюлозы (Ashland Aqualon Functional Ingredients, Wilmington, DE), 10 г аскорбата натрия и 300 г витамина А кристаллического (BASF Corp., Florham Park, N.J) в 1000 г воды. Влажную композицию сушат распылением в распылительной сушилке Mobile-Minor (GEA Process Engineering Inc., Columbia MD) при температуре на входе и выходе 180°С и 80°С соответственно или мгновенным замораживанием в жидком азоте, затем распределяют на поддонах при допустимой нагрузке 1000 г/кв. фут и сушат, как описано в Примере 2. Композиция с витамином А является стабильной (>80%) при 40°С и 75% OB в течение 3 месяцев.
[00121] ПРИМЕР 13
[00122] Получение каротинов в защищенной композиции, имеющей повышенную биодоступность
[00123] Композицию, которая защищает и повышает биодоступность каротинов, которые в противном случае могут подвергаться окислению другими ингредиентами в корме во время хранения или после кормления организма, получают в соответствии с композицией и способом по настоящему изобретению. Композицию, содержащую 6 г водорастворимого хитозана (LSK BioPartners, Inc. Salt Lake City, Utah), растворяют в 200 г воды. К этому раствору добавляют 90 г натурального астаксантина (Naturose™, Cyanotech Corp., Kailua-Kona, HI), и суспензию распыляют или экструдируют в ванну, содержащую 5% триполифосфата натрия. Гидрогелевые микрочастицы или нити оставляют затвердевать при комнатной температуре в течение 4 часов. Частицы извлекают из ванны для поперечной сшивки, промывают водой и смешивают с сухой смесью 90 г сахарозы и 10 г сильно гидролизованного казеина. Частицы, нагруженные сахаром/белком, мгновенно замораживают и сразу помещают на поддоны при 500 г/кв. фут и лиофилизируют в сушилке для сублимационной сушки до снижения активности воды до менее 0,3. Сухую композицию дополнительно измельчают до желаемого распределения частиц по размерам и упаковывают.
[00124] ПРИМЕР 14
[00125] Приготовление приманки для инвазивных видов
[00126] Гранулированную приманку для конкретно намеченных инвазивных видов готовят согласно настоящему изобретению. 200 г композиции, содержащей пестицид, как описано в Примере 1, получают и добавляют к 200 г воды. К этому раствору добавляют 90 г ротенона и 0,5 г двухосновного фосфата кальция, затем добавляют 0,5 г глюконолактона. Суспензию оставляют затвердевать при комнатной температуре в течение 2 часов. Прочный гель нарезают на тонкие и длинные нити через слайсер/шредер. Тонкие нити загружают на поддон и помещают в сушилку для сублимационной сушки. Температуру на полке устанавливают -30°С, и композицию оставляют замораживаться, после чего применяют полный вакуум, и температуру на полке поднимают до +60°С для сушки в течение ночи. Сухую композицию измельчают до соответствующего распределения частиц по размерам с целью классификации по крупности для конкретных видов-мишеней.
[00127] ПРИМЕР 15
[00128] Получение защищенного пестицида в композиции, нерастворимой в воде
[00129] Защищенную гранулированную композицию пестицида, который в противном случае может подвергаться разложению другими ингредиентами в композиции во время хранения или после применения в окружающей среде, получают с использованием композиции и способа по настоящему изобретению. Композицию, содержащую 6 г пектина и 102 г сахарозы, добавляют к 200 г воды. К этому раствору добавляют 90 г сухой композиции чувствительного пестицида и смесь, содержащую 1,5 г двухосновного фосфата кальция и 0,5 г хлорида кальция, затем добавляют 0,85 г глюконолактона. Суспензию оставляют затвердевать при комнатной температуре в течение 4 часов, а затем нарезают на тонкие, длинные нити через слайсер/шредер. Тонкие нити загружают на поддон и помещают в сушилку для сублимационной сушки до достижения активности воды 0,1. Сухую композицию измельчают до соответствующего распределения частиц по размерам и упаковывают.
[00130] ПРИМЕР 16
[00131] Получение защищенной растительной пробиотической композиции
[00132] Агент биологического контроля, такой как Rhizobacteria, получают в форме сухой композиции согласно Примеру 4. Эффективность сухой композиции Rhizobacteria оценивают по росту салата-латука в гнотобиотических условиях. Дозы 100 мг сухой композиции Rhizobacteria на одно растение инокулируют в банки с песком и засаживают предварительно пророщенными (24 ч) семенами латука. Питательную дозу 5 мл стерилизованного раствора Хоглэнда наносят на растения в банке. Банки устанавливают случайным образом в ростовую камеру, в которой поддерживается температура 28°С с 12-часовым световым периодом. В течение каждого 7-суточного интервала времени после инокуляции растения и прилипший песок осторожно извлекают из банок. Корни промывают в стерильном фосфатном буфере (рН 7,0), и результаты измерения длины корней записывают.
[00133] ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
[00134] Указанные ниже источники информации и все процитированные в данном описании документы включены в данное описание для всех целей посредством ссылки на них.
[00135] Ссылки на патенты США:
[00136] 6190701 Composition and method for stable liquids, March 1999, Roser et al.
[00137] 6964771 Method for stably incorporating substances within dry, foamed glass matrices, September 1997, Roser et al.
[00138] 5766520 Preservation by formulation formation, June 1998, Bronshtein.
[00139] 6534087 Process for preparing a pharmaceutical composition, June 2001, Busson and Schroeder.
[00140] 6884866 Bulk drying and the effects of inducing bubble nucleation, April 2005, Bronshtein.
[00141] 7153472 Preservation and formulation of bioactive materials for storage and delivery in hydrophobiс carriers, December, 2006, Bronshtein.
[00142] 20080229609 Preservation by Vaporization, June 2005, Bronshtein.
[00143] 6306345 Industrial scale barrier technology for preservation of sensitive biological materials at ambient temperatures, October 2001, Bronshtein et al.
[00144] 7381425 Preservation of bioactive materials by freeze dried foam, September 2006, Truong-le, Vu.
[00145] Другие ссылки:
[00146] Morgan, C.A., Herman, N., White, P.A., Vesey, G. 2006. Preservation of micro-organisms by drying; a review. J. Microbiol. Methods. 66(2): 183-93.
[00147] Capela, P., Hay, Т. К. С, & Shah, N. P. 2006. Effect of cryoprotectants, prebiotics and microencapsulation on survival of probiotic organisms in yoghurt and freeze-dried yoghurt. Food Research International, 39(3) 203-211).
[00148] Annear, 1962. The Preservation of Leptospires by Drying From the Liquid State, J. Gen. Microbiol., 27:341-343.
[00149] Crowe, J.F., Carpenter, J.F. and Crowe, L.M. 1998. THE ROLE OF VITRIFICATION IN ANHYDROBIOSIS. Annu. Rev. Physiol. 60:73-103.