СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ СЕМЕЙСТВА ГЛУТАМАТА ИЛИ L-ВАЛИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia
METHOD OF OBTAINING L-AMINO ACID OF GLUTAMATE FAMILY, OR L-BALINE WITH APPLICATION OF BACTERIUM BELONGING TO GENUS Escherichia

Область техники
Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу получения L-аминокислоты, принадлежащей к семейству глутамата, с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, модифицированной таким образом, что активность глутаматдегидрогеназы в указанной бактерии увеличена.
Описание предшествующего уровня техники
Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе получают методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, полученных из природных источников, или их мутантов. Обычно микроорганизмы модифицируют для увеличения продукции L-аминокислот.
Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, включая трансформацию микроорганизмов рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4278765). Другие методы увеличения продукции включают повышение активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот, и/или уменьшение чувствительности целевого фермента к ингибированию по типу обратной связи продуцируемой L-аминокислотой (см., например, международную заявку WO 95/16042 или патенты США 4346170; 5661012 и 6040160).
Известна последовательность ДНК гена gdhA Escherichia coli K12, кодирующего состоящий из 447 аминокислот полипептид субъединицы НАДФ-специфичной глутаматдегидрогеназы. Соответствующая гену последовательность белка в значительной степени гомологична соответствующему ферменту гриба Neurospora crassa. Последовательность ДНК перед геном включает несколько перекрывающихся типичных промоторных последовательностей. Последовательность ДНК после гена содержит инвертированные повторы, предположительно образующие протяженные стабильные структуры РНК стебель-петля, гомологичные обнаруженным в нескольких межгенных областях энтеробактерий (McPherson M.Y. and Wootton J.C., Nucleic Acids Res.; 11(15):5257-66(1983)).
Глутаматдегидрогеназа (GDH - glutamate dehydrogenase) катализирует синтез L-глутамата из 2-оксоглутарата и аммиака. Представлены данные по GDH-специфичной активности с использованием избыточных и недостаточных концентраций аммиака в качестве источника азота. Доказано, что от концентрации аммиака в питательной среде зависит уровень мРНК для данного фермента. Определен единственный и, видимо, постоянный транскрипт для нескольких условий выращивания. Представлены данные по идентификации функционального промотора и соответствующей точки старта транскрипции при некоторых условиях выращивания. Обсуждены предполагаемые регуляторные последовательности локализованы в области, прилегающей к 5'-концу гена gdhA (Riba L. et al., Gene; 71(2):233-46(1988)).
Опубликованы данные о том, что ген gdhA E.coli, кодирующий НАДФ-специфическую глутаматдегидрогеназу, локализован на карте в 38.6 мин. Данная локализация подтверждена показанным сцеплением с тремя Tn10 вставками, которые сцеплены с локусами aroD, pheS и ansA, комплементацией картированного с использованием рестрикции клона А. и показанным соответствием между рестрикционными картами хромосомы и клонированным и секвенированным геном gdhA (Kim S.Y. et al., J Bacteriol.; 172(10):6127-8(1990)).
В Rhizobium phaseoli отсутствует GDH, и аммиак ассимилируется по глутаминсинтетаза-глутаматсинтазному пути. Сконструирован штамм R. phaseoli, содержащий структурный ген GDH (gdhA) из Е.coli. Активность GDH экспрессировалась в R. phaseoli при свободном состоянии и при симбиозе. В клубеньках с бактероидами, которые экспрессировали активность GDH, фиксация азота была существенно снижена. Кроме того, клетки R. phaseoli, лишенные активности GDH и ассимилировавшие аммиак по глутаминсинтетаза-глутаматсинтазному пути, предпочтительно образовывали клубеньки у Phaseolus vulgaris (Bravo A. et al., J Bacteriol.; 170(2):985-8(1988)).
Структурный ген глутаматдегидрогеназы, gdhA, картирован на генетической карте в положении 38.6 мин и на физической карте - 1860 т.п.н. Представлена подробная карта этой области (Helling R.B., Mol Gen Genet.; 223(3):508-12(1990)).
Показано, что ген nac Е.coli транскрипционно активный и что его экспрессия зависит от NRI (NtrC) и σ-54. Эксперименты с Нозерн-блоттингом показывают наличие моноцистронной nac-специфичной мРНК при выращивании клеток дикого типа в условиях лимита по азоту. Получены данные, свидетельствующие о том, что в условиях лимита по азоту Nac вовлечен в репрессию транскрипции гена gdhA, если только в качестве единственного источника азота не используется L-глутамин. Кроме того, высокий уровень активности GDH, наблюдавшийся в мутантном по гену nас штамме, снижался при экспрессии гена nас дикого типа под контролем lac промотора в условиях лимита по азоту, если только в качестве единственного источника азота не использовался L-глутамин или в условиях избытка азота. Данные результаты позволяют предположить существование дополнительного механизма для преодоления репрессии Nac (Camarena L. et al., FEMS Microbiol Lett; 167(1):51-6 (1998)).
Раскрыт способ получения L-глутамина путем культивирования коринеформной бактерии, способной к продукции L-глутамина, модифицированной таким образом, что ее внутриклеточная глутаминсинтетазная активность увеличена, предпочтительно далее модифицированной с целью усиления внутриклеточной глутаматсинтетазной активности, в среде для продукции и накапливания L-глутамина и выделения L-глутамина (ЕР 1229121 А2).
В настоящее время нет сообщений, описывающих использование увеличения активности глутаматдегидрогеназы для увеличения продукции L-аминокислоты, принадлежащей к семейству глутамата, L-треонина и L-валина.
Описание изобретения
Цели настоящего изобретения включают повышение продуктивности штаммов-продуцентов L-аминокислоты, принадлежащей к семейству глутамата, и предоставление способа получения L-аминокислоты, принадлежащей к семейству глутамата, L-треонина и L-валина с использованием этих штаммов.
Вышеуказанные цели были достигнуты благодаря обнаружению того факта, что увеличение активности глутаматдегидрогеназы может вести к увеличению продукции L-аминокислот, принадлежащих к семейству глутамата, таких как L-глутаминовая кислота, L-глутамин, L-пролин, L-аргинин, орнитин и цитруллин; L-треонина и L-валина.
Настоящее изобретение предоставляет бактерию семейства Enterobacteriaceae, обладающую способностью к повышенной продукции аминокислот, принадлежащих к семейству глутамата, таких как L-глутаминовая кислота, L-глутамин, L-пролин, L-аргинин, орнитин и цитруллин; L-треонина и L-валина.
Целью настоящего изобретения является предоставление принадлежащей к семейству Enterobacteriaceae бактерии-продуцента L-аминокислоты, принадлежащей к семейству глутамата, L-треонина или L-валина, модифицированной таким образом, что активность глутаматдегидрогеназы в указанной бактерии увеличена.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой указанная активность увеличена за счет усиления экспрессии гена gdhA.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой экспрессия указанного гена gdhA усилена за счет увеличения числа копий гена или модификации последовательности, контролирующей экспрессию гена, в результате которой экспрессия гена усиливается.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Escherichia.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Pantoea.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная L-аминокислота, принадлежащая к семейству глутамата, выбрана из группы, состоящей из L-глутаминовой кислоты, L-глутамина, L-пролина, L-аргинина, орнитина и цитруллина.
Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения L-аминокислоты, принадлежащей к семейству глутамата, L-треонина или L-валина, включающего:
- выращивание описанной выше бактерии в питательной среде, и
- выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная L-аминокислота, принадлежащая к семейству глутамата, выбрана из группы, состоящей из L-глутаминовой кислоты, L-глутамина, L-пролина, L-аргинина, орнитина и цитруллина.
Настоящее изобретение подробно описано ниже.
Наилучший способ осуществления настоящего изобретения
1. Бактерия согласно настоящему изобретению.
Бактерия согласно настоящему изобретению - это принадлежащая к семейству Enterobacteriaceae бактерия-продуцент L-аминокислоты, принадлежащей к семейству глутамата, модифицированная таким образом, что активность глутаматдегидрогеназы в указанной бактерии увеличена.
Согласно настоящему изобретению «бактерия-продуцент L-аминокислоты» означает бактерию, обладающую способностью к продукции и выделению L-аминокислоты в питательную среду, когда бактерия согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде.
Используемый здесь термин «бактерия-продуцент L-аминокислоты» также означает бактерию, которая способна к продукции и вызывает накопление L-аминокислоты, принадлежащей к семейству глутамата, в ферментационной среде в количествах, больших по сравнению с природным или родительским штаммом E.coli, таким как штамм E.coli K-12, и, предпочтительно, означает, что указанный микроорганизм способен накапливать в среде целевую L-аминокислоту в количестве не менее чем 0.5 г/л, более предпочтительно, не менее чем 1.0 г/л.
Термин «L-аминокислота, принадлежащая к семейству глутамата» включает в себя L-глутаминовую кислоту, L-глутамин, L-пролин, L-аргинин, орнитин и цитруллин.
Семейство Enterobacteriaceae включает в себя бактерии, принадлежащие к родам Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia и т.д. Более конкретно, могут быть использованы бактерии, классифицируемые как принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae в соответствии с таксономией, используемой в базе данных NCB1 (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=l&srchmode=l&unlock). Предпочтительна бактерия, принадлежащая к роду Escherichia или Pantoea.
Термин "бактерия, принадлежащая к роду Escherichia" означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (E.coli).
Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть включены в число бактерий согласно настоящему изобретению.
Термин «бактерия, принадлежащая к роду Pantoea» означает, что бактерия относится к роду Pantoea в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. Недавно несколько видов Enterobacter agglomerans были классифицированы как Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii или подобные им, на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК и т.д. (Int. J. Syst. Bacteriol, 43, 162-173 (1993)).
Термин «бактерия модифицирована таким образом, что активность глутаматдегидрогеназы в указанной бактерии увеличена» означает, что бактерия модифицирована таким образом, что активность глутаматдегидрогеназы в модифицированной бактерии выше, чем в немодифицированной. Термин "усиление экспрессии гена gdhA" означает, что экспрессия гена выше, чем в немодифицированном штамме, например в штамме дикого типа. Примеры таких модификаций включают увеличение числа копий экспрессируемого гена в клетке, увеличение уровня экспрессии гена и т.д.
Количество копий экспрессируемого гена определяют, например, путем рестрикции хромосомной ДНК с последующим блоттингом по Саузерну с использованием зонда, сконструированного на основе последовательности гена, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), и т.п. Уровень экспрессии гена можно определить различными известными методами, включая блоттинг по Нозерну, количественную ОТ-ПЦР, и т.п. Количество кодируемого геном белка может быть определено с использованием известных методов, включая электрофорез в SDS-ПААГ с последующим иммуноблоттингом (Вестерн-блоттинг) и т.п.
Ген gdhA (синонимы: ECK1759, b1761) кодирует глутаматдегидрогеназу (синоним В 1761). Ген gdhA (нуклеотиды с 1,840,395 по 1,841,738 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 16129715) расположен между ОРС ynjH и ОРС ynjI, ориентированных в противоположном к gdhA направлениях, на хромосоме штамма E.coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена gdhA и аминокислотная последовательность GdhA, кодируемого геном gdhA, приведены в Перечне последовательностей под номерами 1 (SEQ ID NO:1) и 2 (SEQ ID NO:2) соответственно.
Поскольку у представителей различных родов или штаммов семейства Enterobacteriaceae возможны некоторые вариации в нуклеотидных последовательностях, понятие гена gdhA не ограничивается геном, последовательность которого приведена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1, но также может включать и гены, гомологичные SEQ ID NO:1, кодирующие вариант белка GdhA.
Термин "вариант белка", используемый в настоящем изобретении, означает белок с изменениями в последовательности, будь то делеции, вставки, добавления или замены аминокислот. Число изменений в варианте белка зависит от положения или типа аминокислотного остатка в третичной структуре белка. Оно может быть от 1 до 30, предпочтительно от 1 до 15, более предпочтительно от 1 до 5 в SEQ ID NO:2. Данные изменения в вариантах могут иметь место в областях, не критичных для функции белка. Данные изменения возможны потому, что некоторые аминокислоты имеют высокую гомологию друг другу, поэтому такие изменения не влияют на третичную структуру или активность. Следовательно, вариант белка, кодируемого геном gdhA, может иметь гомологию не менее 80%, предпочтительно не менее 90% и наиболее предпочтительно не менее 95%, по отношению к полной аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO. 2, при условии сохранения активности глутаматдегидрогеназы.
Гомология между двумя аминокислотыми последовательностями может быть определена с использованием известных методов, например компьютерной программы BLAST 2.0, которая считает три параметра: число аминокислот, идентичность и сходство.
Кроме того, ген ydbK может быть вариантом, который гибридизуется в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, приведенной в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1, или с зондом, который может быть синтезирован на основе указанной нуклеотидной последовательности, при условии, что до инактивации он кодирует функциональный белок YdbK. «Жесткие условия» включают такие условия, при которых специфические гибриды, например гибриды с гомологией не менее 60%, предпочтительно не менее 70%, более предпочтительно не менее 80%, еще более предпочтительно не менее 90% и наиболее предпочтительно не менее 95%, образуются, а неспецифические гибриды, например гибриды с меньшей гомологией, чем указано выше, - не образуются. Практическим примером жестких условий является однократная или многократная отмывка, предпочтительно двух- или трехкратная, при концентрации солей 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS, при 60°C. Продолжительность отмывки зависит от типа используемой для блоттинга мембраны и, как правило, такова, как рекомендовано производителем. Например, рекомендуемая продолжительность отмывки для нейлоновой мембраны Hybond™ N+ (Amersham) при строгих условиях-15 минут. Предпочтительна двух-, трехкратная отмывка. Длина зонда может быть выбрана в зависимости от условий гибридизации, в данном конкретном случае она может быть около 100-1000 п.н.
Далее раскрывается способ увеличения активности глутаматдегидрогеназы. При использовании гена Escherichia coli ген, кодирующий глутаматдегидрогеназу, можно получить методом ПЦР (полимеразная цепная реакция; White, T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)) с использованием праймеров, сконструированных на основании нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1. Ген, кодирующий глутаматдегидрогеназу из других организмов также можно получить методом ПЦР из библиотек хромосомной или геномной ДНК с использованием в качестве праймеров олигонуклеотидов, сконструированных на основании известных последовательностей гена бактерии или гена бактерии другого рода, или методом гибридизации с использованием в качестве зонда олигонуклеотида, сконструированного на основании последовательности. Хромосомная ДНК может быть получена из бактерии, служащей в качестве донора ДНК, методом Saito and Miura (см. Н. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Experiment Manual for Biotechnology, edited by The Society for Biotechnology, Japan, p97-98, Baifukan Co., Ltd., 1992) и т.п..
Затем конструируют рекомбинантную ДНК путем лигирования гена, амплифицированного с использованием ПЦР, с векторной ДНК, способной функционировать в бактерии-хозяине. Примеры векторов, способных функционировать в бактерии-хозяине, включают векторы, автономно реплицирующиеся в бактерии-хозяине. Примеры вектора, автономно реплицирующегося в Escherichia coli, включают pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184, (pHSG и pACYC доступны в Takara Bio Inc.), RSF1010 (Gene vol. 75(2), p271-288, 1989), pBR322, pMW219, pMW119 (pMW доступен в Nippon Gene Co., Ltd.), pSTV28, and pSTV29 (Takara Bio Inc.). Также может быть использована фаговая векторная ДНК.
4
Для лигирования гена в вышеупомянутый вектор обрабатывают вектор рестриктазой, соответствующей сайту узнавания в концевой области фрагмента ДНК, содержащего ген. Лигирование обычно проводят с использованием лигазы, такой как T - ДНК-лигаза. Методы приготовления плазмидной ДНК, рестрикции и лигирования ДНК, трансформации, выбора нуклеотидов в качестве праймера и т.п. могут быть обычными методами, известными специалисту в этой области. Эти методы описаны, например, в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) и т.п.
Приготовленную таким образом рекомбинантную ДНК вводят в бактерию в соответствии с традиционным методом трансформации. Примеры метода включают электропорацию (Gliesche, C.G., Can. J. Microbiol., 43, 2, 197-201 (1997)). Возможно также увеличить проникающую способность ДНК путем обработки реципиентных клеток хлоридом кальция, как это описано для Escherichia coli K-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970), и ввести ДНК в компетентную клетку, приготовленную из клетки в стадии пролиферации, как это описано для Bacillus subtilis (Duncan, C.H., Wilson, G.A and Young, F.E, Gene, 1, 153 (1977)).
Увеличение числа копий гена также может быть достигнуто путем введения множества копий гена, кодирующего глутаматдегидрогеназу, в хромосомную ДНК бактерии. Для введения множества копий гена в бактериальную хромосому выполняется гомологичная рекомбинация с использованием в качестве целевых последовательностей, присутствующих в хромосоме во множестве копий. Такими последовательностями с множеством копий в хромосомной ДНК могут быть повторяющиеся ДНК или инвертированные повторы на концах транспонируемых элементов. С другой стороны, как раскрыто в заявке JP 2-109985 А, множество копий гена можно ввести в хромосомную ДНК путем вставки гена в транспозон и его перенос, с тем чтобы множество копий гена были интегрированы в хромосомную ДНК. Интеграцию этих генов в хромосому можно подтвердить методом гибридизации по Саузерну с использованием в качестве зонда части гена.
R
L
Кроме того, экспрессию гена можно усилить, как описано в международной заявке WO 00/18935, путем замены регулирующей экспрессию последовательности, такой как промотор, гена на хромосомной ДНК или гена на плазмиде более сильным промотором, амплификации регулятора, усиливающего экспрессию, или делеции, или ослабления регулятора, ослабляющего экспрессию гена. Примеры известных сильных промоторов включают lac промотор, trp промотор, trc промотор, tac промотор, P или P промоторы фага λ и tet промотор.
С другой стороны, действие промотора может быть усилено, например, введением в промотор нуклеотидной замены. Примеры метода увеличения силы промотора и примеры сильных промоторов описаны Goldstein et al. (Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128) or the like. Кроме того, известно, что несколько нуклеотидов в области между сайтом связывания рибосомы (ribosome binding site - RBS) и стартовым кодоном, особенно в последовательности непосредственно перед стартовым кодоном, существенно влияет на эффективность трансляции. Следовательно, можно модифицировать эту последовательность.
Кроме того, для увеличения активности глутаматдегидрогеназы можно ввести в ген мутацию, приводящую к увеличению ферментативной активности. Примеры такой мутации включают мутацию в последовательности промотора с целью увеличения уровня транскрипции гена, кодирующего глутаматдегидрогеназу, и мутацию в кодирующей области этого гена с целью увеличения специфической активности глутаматдегидрогеназы.
Поскольку L-глутамат является предшественником в биосинтезе L-глутамина, цитруллина, L-аргинина, орнитина и L-пролина, увеличение активности глутаматдегидрогеназы приводит к увеличению продукции всех указанных аминокислот. Активность глутаматдегидрогеназы можно определить, например, как описано Meers J. et al., (J.Gen.Microb., 64, 187-94 (1970)).
Бактерия-продуцент L-аминокислоты
В качестве бактерии согласно настоящему изобретению, модифицированной таким образом, что экспрессия гена gdhA усилена (с целью увеличения активности глутаматдегидрогеназы), может быть использована бактерия, способная к продукции L-аминокислоты, принадлежащей к семейству глутамата.
Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем усиления экспрессии гена gdhA в бактерии, уже обладающей способностью к продукции L-аминокислоты, принадлежащей к семейству глутамата. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, в которой экспрессия гена gdhA уже усилена, способности к продукции L-аминокислоты, принадлежащей к семейству глутамата.
Бактерия-продуцент L-глутаминовой кислоты
+
+
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli VL334 thrC (Европейский патент ЕР 1172433). Штамм Е.coli VL334 (ВКПМ В-1641) является ауксотрофом по L-изолейцину и L-треонину с мутациями в генах thrC и ilvA (патент США 4278765). В этот штамм была перенесена природная аллель гена thrC методом общей трансдукции с использованием бактериофага Р1, выращенного на клетках природного штамма Е.coli K12 (ВКПМ В-7). В результате был получен штамм, ауксотроф по L-изолейцину, VL334thrC (ВКПМ В-8961), который обладает способностью к продукции L-глутаминовой кислоты.
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты, согласно настоящему изобретению включают в себя, но не ограничиваются ими, штаммы, дефектные по активности α-кетоглутаратдегидрогеназы, или штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Примеры таких ферментов включают глутаматдегидрогеназу(gdh), глутаминсинтетазу (glnA), глутаматсинтетазу (gltAB), изоцитратдегидрогеназу (icdA), аконитатгидратазу (acnA, acnB), цитратсинтазу (gltA), фосфоенолпируваткарбоксилазу (ррс), пируватдегидрогеназу (aceEF, lpdA), пируваткиназу (pykA, pykF), фосфоенолпируватсинтазу (ppsA), енолазу (eno), фосфоглицеромутазу (pgmA, pgmI), фосфоглицераткиназу (pgk), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (gapA), триозофосфатизомеразу(tpiA), фруктозобифосфатальдолазу (fbp), фосфофруктокиназу (pfkA, pfkB) и глюкозофосфатизомеразу (pgi).
Примеры штаммов, модифицированных таким образом, что усилена экспрессия гена цитратсинтетазы, гена фосфоенолпируваткарбоксилазы и/или гена глутаматдегидрогеназы, включают описанные в европейских заявках ЕР1078989А, ЕР955368А и ЕР952221А.
Примеры родительских штаммов для получения продуцирующих L-глутаминовую кислоту бактерий согласно настоящему исследованию также включают штаммы, в которых снижена или отсутствует активность ферментов, которые катализируют синтез отличных от L-глутаминовой кислоты соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Примеры таких ферментов включают изоцитратлиазу(aceA), α-кетоглутаратдегидрогеназу(sucA), фосфотрансацетилазу(pta), ацетаткиназу(ack), синтазу ацетогидроксикислот(ilvG), ацетолактатсинтазу(ilvI), форматацетилтрансферазу(pfl), лактатдегидрогеназу(ldh) и глутаматдекарбоксилазу(gadAB). Бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, лишенные активности α-кетоглутаратдегидрогеназы или обладающие сниженной активностью α-кетоглутаратдегидрогеназы и способы их получения описаны в патентах США 5378616 и 5573945. Конкретно, примеры таких штаммов включают в себя следующие штаммы:
r
E.coli W3110sucA::Km
Е.coli AJ12624 (PERM BP-3853)
Е.coli AJ12628 (PERM BP-3854)
Е.coli AJ12949 (PERM BP-4881)
r
Е.coli W3110sucA::Km - это штамм, полученный в результате разрушения гена α-кетоглутаратдегидрогеназы (далее называемого "ген sucA") в штамме Е.coli W3110. У этого штамма активность α-кетоглутаратдегидрогеназы отсутствует полностью.
Другие примеры бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты включают в себя бактерии, принадлежащие к роду Escherichia и обладающие устойчивостью к антиметаболитам аспарагиновой кислоты и дефицитные по активности α-кетоглутаратдегидрогеназы, например штамм AJ13199 (FERM BP-5807) (патент США 5908768), или штамм FERM P-12379, дополнительно обладающий низкой активностью по расщеплению L-глутаминовой кислоты (патент США 5393671); штамм Е.coli AJ13138 (FERM BP-5565) (патент США 6110714) и подобные им.
Примеры бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты включают в себя мутантные штаммы, принадлежащие к роду Pantoea, которые лишены активности α-кетоглутаратдегидрогеназы или имеют сниженную активность α-кетоглутаратдегидрогеназы, и могут быть получены описанным выше способом. Примерами таких штаммов являются штамм Pantoea ananatis AJ13356 (патент США 6331419), штамм Pantoea ananatis AJ13356, депонированный в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агенство Промышленной Науки и Технологии, Министерство Международной Торговли и Промышленности (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry) (в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония - National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) 19 февраля, 1998 и получивший инвентарный номер FERM P-16645. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора от 11 января 1999 г., и штамм получил инвентарный номер FERM ВР-6615. Штамм Pantoea ananatis AJ13356 не имеет α-KGDH активности в результате разрушения гена αKGDH-E1 субъединицы (sucA). Вышеупомянутый штамм при выделении был идентифицирован как Enterobacter agglomerans и депонирован как штамм Enterobacter agglomerans AJ13356. Тем не менее, позднее он был классифицирован как Pantoea ananatis на основе нуклеотидной последовательности 16S рРНК и других доказательств. Несмотря на то, что штамм AJ13356, был депонирован в указанный выше депозитарий как Enterobacter agglomerans, для целей данного описания он будет упоминаться как Pantoea ananatis.
Бактерия-продуцент L-пролина
Примеры бактерий-продуцентов L-пролина, используемых в качестве родительского штамма согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 702ilvA (ВКПМ В-8012), дефицитного по гену ilvA и способного к продукции L-пролина (Европейский патент ЕР 1172433). Бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-пролина. Предпочтительно, примеры таких генов для бактерий-продуцентов L-пролина включают ген proB, кодирующий глутаматкиназу с десенсибилизированной регуляцией L-пролином по типу обратной связи (патент Германии 3127361). Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, экскретирующие L-аминокислоту из бактериальной клетки. Примерами таких генов являются гены b2682 и b2683 (ygaZH гены) (Европейская патентная заявка ЕР1239041А2).
th
Примеры бактерий, принадлежащих к роду Escherichia и обладающих способностью к продукции L-пролина, включают следующие штаммы Е.coli: NRRL В-12403 и NRRL В-12404 (патент Великобритании GB 2075056), ВКПМ В-8012 (патентная заявка РФ 2000124295), плазмидные мутанты, описанные в патенте Германии DE 3127361, плазмидные мутанты, описанные у Bloom F.R. et al (The 15 Miami winter symposium, 1983, p.34), и подобные им.
Бактерия-продуцент L-аргинина
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-аргинина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 237 (ВКПМ В-7925) (патентная заявка США 2002/058315 A1) и его производные, содержащие мутантную N-ацетилглутаматсинтазу (патентная заявка РФ 2001112869), штамм Е.coli 382 (ВКПМ В-7926) (Европейская патентная заявка ЕР1170358А1), штамм-продуцент аргинина, в который введен ген argA, кодирующий N-ацетилглутаматсинтетазу (Европейская патентная заявка ЕР1170361А1), и подобные им.
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-аргинина согласно настоящему изобретению также включают в себя штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L- аргинина. Примеры ферментов биосинтеза L-аргинина включают N-ацетилглутамилфосфатредуктазу (argC), орнитинацетилтрансферазу (argJ), N-ацетилглутаматкиназу (argB), ацетилорнитинтрансаминазу (argD), орнитинкарбамоилтрансферазу (argF), синтетазу аргининсукциниловой кислоты (argG), лиазу аргининсукциниловой кислоты (argH), и карбамоилфосфатсинтетазу(carAB).
Бактерия-продуцент цитруллина
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента цитруллина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются ими, штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как мутантные по N-ацетилглутаматсинтазе штаммы Е.coli 237/pMADS11, 237/pMADS12 и 237/pMADS13 (RU2215783, ЕР1170361В1, US6790647B2).
Также бактерию-продуцент цитруллина можно легко получить из любой бактерии-продуцента аргинина, например из штамма Е.coli 382 (ВКПМ В-7926), путем инактивации аргининсукцинатсинтазы, кодируемой геном argG.
Фраза "инактивация аргининсукцинатсинтазы" означает, что бактерия модифицирована таким образом, что модифицированная бактерия содержит неактивную аргининсукцинатсинтазу или также она может означать, что бактерия не способна синтезировать аргининсукцинатсинтазу. Инактивация аргининсукцинатсинтазы может быть осуществлена путем инактивации гена argG.
Фраза "инактивация гена argG " означает, что модифицированный ген кодирует полностью нефункциональный белок. Также возможно, что область модифицированной ДНК не способна к естественной экспрессии гена из-за делеции части гена или всего гена, сдвига рамки считывания гена, введения миссенс/нонсенс мутации(-ий) или модификации прилегающих к гену областей, включая последовательности, контролирующие экспрессию гена, такие как промотор, энхансер, аттенюатор, сайт связывания рибосомы и т.д.
Наличие или отсутствие гена argG на хромосоме бактерии может быть определено хорошо известными методами, включая ПЦР, блоттинг по Саузерну и т.п. Кроме того, уровень экспрессии гена можно оценить определением количества транскрибируемой с гена РНК с использованием различных известных методов, включая блоттинг по Нозерну, количественную ОТ-ПЦР, и т.п. Количество белка, кодируемого геном argG, можно определить известными методами, включая электрофорез в SDS-ПААГ с последующим иммуноблоттингом (Вестерн-блоттинг) и т.д.
Экспрессия гена argG может быть ослаблена введением в ген на хромосоме такой мутации, что внуктриклеточная активность кодируемого геном белка уменьшена по сравнению с таковой в немодифицированном штамме. Такой мутацией гена может быть замена одного или более оснований для аминокислотной замены в кодируемом геном белке («миссенс»-мутация), введение стоп-кодона («нонсенс»-мутация), делеция одного или более оснований для сдвига рамки считывания, вставка гена устойчивости к антибиотику, или делеция гена или его части (Qiu, Z. and Goodman, M.F., J. Biol. Chem., 272, 8611-8617 (1997); Kwon, D.H. et al, J. Antimicrob. Chemother., 46, 793-796 (2000)). Экспрессия гена argG также может быть ослаблена путем модификации экспрессии регуляторных последовательостей, таких как промотор, последовательность Shine-Dalgarno (SD) и т.д. (заявка РСТ WO95/34672; Carrier, T.A. and Keasling, J.D., Biotechnol Prog 15, 58-64 (1999)).
Например, следующие методы могут применяться для введения мутаций путем генной рекомбинации. Конструируется мутантный ген, кодирующий мутантный белок со сниженной активностью, и бактерия для ее модификации трансформируется фрагментом ДНК, содержащим мутантный ген. Затем нативный ген на хромосоме замещается гомологичной рекомбинацией мутантным геном, отбирается полученный штамм. Такое замещение гена с использованием гомологичной рекомбинации может быть проведено методом с использованием линейной ДНК, известным как "Red-зависимая интеграция" или "интеграция посредством Red-системы" (Datsenko, K.A., Wanner, B.L, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 97, 12, 6640-6645(2000), заявка РСТ WO 2005/010175) или методом с использованием плазмиды, репликация которой чувствительна к температуре (патент США 6303383 или патентная заявка Японии JP 05-007491 А). Далее, введение сайт-специфической мутации путем замещения гена с использованием вышеупомянутой гомологичной рекомбинации может также быть осуществлено с использованием плазмиды с пониженной способностью к репликации в клетке хозяина.
Экспрессия гена также может быть ослаблена вставкой транспозона или IS фактора в кодирующую область гена (патент США 5175107) или традиционными методами, такими как мутагенез с использованием УФ излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин).
Бактерия-продуцент орнитина
Бактерия-продуцент орнитина может быть легко получена из любой бактерии-продуцента аргинина, например штамма Е.coli 382 (ВКПМ В-7926), путем инактивации орнитинкарбамоилтрансферазы, кодируемой генами argF и argI. Методы для инактивации орнитинкарбамоилтрансферазы описаны выше.
Бактерия-продуцент L-треонина
Примеры родительского штамма для получения бактерии-продуцента L-треонина согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli TDH-6/pVIC40 (ВКПМ В-3996) (патенты США 5175107 и 5705371), штамм Е.coli NRRL-21593 (патент США 5939307), штамм Е.coli FERM ВР-3756 (патент США 5474918), штаммы Е.coli FERM ВР-3519 и FERM ВР-3520 (патент США 5376538), штамм Е.coli MG442 (Гусятинер и др., Генетика, 14, 947-956 (1978)), штаммы Е.coli VL643 и VL2055 (Европейская патентная заявка ЕР 1149911 А) и подобные им.
Штамм TDH-6 является дефицитным по гену thrC, способен ассимилировать сахарозу и содержит ген ilvA с мутацией типа "leaky". Указанный штамм содержит мутацию в гене rhtA, которая обуславливает устойчивость к высоким концентрациям треонина и гомосерина. Штамм В-3996 содержит плазмиду pVIC40, которая была получена путем введения в вектор, производный от вектора RSF1010, оперона thrA*BC, включающего мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу 1, у которой существенно снижена чувствительность к ингибированию треонином по типу обратной связи. Штамм В-3996 был депонирован 19 ноября 1987 года во Всесоюзном научном центре антибиотиков (РФ, 117105 Москва, Нагатинская ул., 3-А) с инвентарным номером РИА 1867. Указанный штамм также был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 7 апреля 1987 г. с инвентарным номером В-3996.
R
В качестве родительского штамма для получения бактерии-продуцента L-треонина согласно настоящему изобретению также может быть использован штамм Е.coli ВКПМ В-5318 (Европейская заявка 0593792 В). Штамм В-5318 является прототрофным относительно изолейцина, и чувствительный к температуре С1 репрессор фага λ и P-промотор замещает регуляторную область в треониновом опероне на плазмиде pVIC40. Штамм ВКПМ В-5318 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 3 мая 1990 г. с инвентарным номером В-5318.
Предпочтительно, чтобы бактерия согласно настоящему изобретению была далее модифицирована таким образом, чтобы иметь повышенную экспрессию одного или нескольких следующих генов:
- мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу 1, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;
- гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;
- гена thrC, кодирующего треонинсинтазу;
- гена rhtA, предположительно кодирующего трансмембранный белок;
- гена asd, кодирующего аспартат-β-семиальдегиддегидрогеназу, и
- гена aspC, кодирующего аспартатаминотрансферазу (аспартаттрансаминазу).
Нуклеотидная последовательность гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 337 по 2799 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrA расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между генами thrL и thrB. Нуклеотидная последовательность гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 2801 по 3733 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrB расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между генами thrA и thrC. Нуклеотидная последовательность гена thrC, кодирующего треонинсинтазу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 3734 по 5020 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrC расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между геном thrB и открытой рамкой считывания уааХ. Все три указанных гена функционируют как один треониновый оперон. Для усиления экспрессии треонинового оперона желательно удалить из оперона область аттенюатора, который влияет на транскрипцию (заявка РСТ WO2005/049808, заявка РСТ WO2003/097839).
Мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназу-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи, так же как и гены thrB и thrC могут быть получены в виде единого оперона из хорошо известной плазмиды pVIC40, которая представлена в штамме-продуценте Е.coli ВКПМ В-3996. Плазмида pVIC40 подробно описана в патенте США 5705371.
th
Ген rhtA расположен на 18 минуте хромосомы Е.coli около оперона glnHPQ, который кодирует компоненты транспортной системы глутамина, ген rhtA идентичен ORF1 (ген ybiF, номера нуклеотидов с 764 по 1651 в последовательности с инвентарным номером ААА218541 в базе данных GenBank, gi:440181), расположен между генами pexB и ompX. Участок ДНК, экспрессирующийся с образованием белка, кодируемого рамкой считывания ORF1, был назван геном rhtA (rht: resistance to homoserine and threonine). Также было показано, что мутация rhtA23 представляет собой замену А-на-G в положении -1 по отношению к старт кодону ATG (тезисы 17 International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, тезисы 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457; Европейская заявка ЕР 1013765 A).
Нуклеотидная последовательность гена asd из E.coli известна (номера нуклеотидов с 3572511 по 3571408 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank, gi: 16131307) и может быть получена с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция; ссылка на White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) с использованием праймеров, синтезированных на основе нуклеотидной последовательности указанного гена. Гены asd из других микроорганизмов могут быть получены сходным образом.
Также нуклеотидная последовательность гена aspC из E.coli известна (номера нуклеотидов с 983742 по 984932 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank, gi: 16128895) и может быть получена с помощью ПЦР. Гены aspC из других микроорганизмов могут быть получены сходным образом.
Бактерия-продуцент L-валина
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-валина, согласно настоящему изобретению включают в себя, но не ограничиваются ими, штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как Н-81 (VKPM В-8066), NRRL В-12287 и NRRL В-12288 (патент США No. 4391907). ВКПМ В-4411 (патент США No. 5658766), ВКПМ В-7707 (Европейская патентная заявка ЕР1016710А2), и т.п.
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-валина, согласно настоящему изобретению включают в себя, но не ограничиваются ими, штаммы, модифицированные с целью сверхэкспрессии оперона ilvGMEDA (патент США 5998178). Желательно удалить область оперона ilvGMEDA, которая необходима для ослабления экспрессии, с тем чтобы экспрессия оперона не ослаблялась образующимся L-валином. Далее, желательно разрушить в опероне ген ilvA с тем чтобы снизить активность треониндеаминазы.
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-валина, согласно настоящему изобретению также включают в себя мутантные штаммы, имеющие мутацию аминоацил-тРНК-синтетазы (патент США 5658766). Например, может использоваться штамм E.coli VL1970, который имеет мутацию в гене ileS, кодирующем изолейцин-тРНК-синтетазу. Штамм E.coli VL1970 депонирован в Российской Национальной Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 24 июня 1988 г. с инвентарным номером ВКПМ В-4411.
+
Далее, в качестве родительских штаммов также могут использоваться мутантные штаммы, для роста которых требуется липоевая кислота, и/или с недостаточным количеством H-АТФазы (заявка РСТ WO96/06926).
2. Способ согласно настоящему изобретению.
Способом согласно настоящему изобретению является способ получения L-аминокислоты, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-аминокислоты в питательной среде, и выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости.
Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка L-аминокислоты из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием бактерии.
Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. В качестве источника углерода используют этанол. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин, дрожжевой экстракт и т.п.
Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание культуральной жидкости на качалке, взбалтывание с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°C, предпочтительно в пределах от 30 до 38°C. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно, выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной среде.
После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем L-аминокислота может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и/или кристаллизации.
Краткое описание чертежа
На чертеже показано конструирование плазмиды pMgdh4.
Примеры
Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.
Пример 1. Конструирование штамма с усиленной экспрессией гена gdhA
На первой стадии фрагмент ДНК, содержащий ген gdhA, получили методом ПЦР с использованием праймеров P1 (SEQ ID NO:3) и P2 (SEQ ID NO:4) и хромосомной ДНК E.coli MG1655 (ATCC 700926) в качестве матрицы. Полученный продукт ПЦР размером ≈1,6 т.п.н. очищали в агарозном геле и затем клонировали по сайтам BamHI и SalI в плазмиде pMW119. Таким образом была получена плазмида pMgdh4 (см. чертеж). Для подтверждения экспрессии гена gdhA в штамме, содержащем плазмиду pMgdh4, компетентные клетки штамма НВ101 (АТСС 33694) трансформировали плазмидой pMgdh4 и плазмидой pMW119 (в качестве контроля). Определяли активность глутаматдегидрогеназы в штаммах HB101/pMW119 и HB101/pMgdh4. Результаты представлены в Таблице 1. Как следует из Таблицы 1, активность глутаматдегидрогеназы в штамме HB101/pMgdh4 была значительно выше, чем в штамме HB101/pMW119.
Пример 2. Продукция L-аргинина штаммом Е.coli 382/pMgdh4
Для анализа влияния увеличения активности глутаматдегидрогеназы на продукцию L-аргинина штамм-продуцент L-аргинина Е.coli 382 трансформировали плазмидой pMgdh4 с получением штамма 382/pMgdh4. Штамм 382 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 10 апреля 2000 года с инвентарным номером ВКПМ В-7926, затем 18 мая 2001 г. было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора.
Оба штамма, 382 и 382/pMgdh4, выращивали с перемешиванием при 37°C в течение 18 часов в 3 мл питательного бульона, по 0.3 мл полученных культур вносили в 2 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры выращивали при 32°C в течение 48 часов на роторной качалке.
2
После выращивания количество накопленного в среде L-аргинина определяли с помощью бумажной хроматографии, при этом использовали следующий состав подвижной фазы: бутанол: уксусная кислота: вода=4:1:1 (v/v). Раствор нингидрина (2%) в ацетоне использовали для визуализации. Пятно, содержащее L-аргинин, вырезали; L-аргинин элюировали 0.5% водным раствором CdCl, после чего количество L-аргинина определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм. Результаты десяти независимых пробирочных ферментации представлены в Таблице 2. Как следует из Таблицы 2, 382/pMgdh4 накапливал большее количество L-аргинина чем 382.
Состав использованной ферментационной среды (г/л):
Глюкоза
48.0
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
35.0
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
2.0
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
1.0
Тиамин HCl
0.0002
Дрожжевой экстракт
1.0
L-изолейцин
0.1
СаСО<sub>3</sub>
5.0
3
Глюкозу и сульфат магния стерилизовали раздельно. CaCO стерилизовали сухим жаром при 180°C в течение 2 часов. рН доводили до 7.0.
+
Пример 3. Продукция L-глутаминовой кислоты штаммом Е.coli VL334thrC/pMgdh4
+
+
+
Для анализа влияния увеличения активности глутаматдегидрогеназы на продукцию L-глутаминовой кислоты штамм-продуцент L-глутаминовой кислоты Е.coli VL334thrC(ЕР 1172433) может быть трансформирован плазмидой pMgdh4 с целью получения штамма VL334thrC/pMgdh4. Штамм VL334thrC депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 6 декабря 2004 г. с инвентарным номером ВКПМ В-8961, затем 8 декабря 2004 г.было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора.
+
2
4
4
2
Оба штамма Е.coli, VL334thrC+ и VL334thrC/pMgdh4, могут быть выращены на чашках с L-агаром при 37°C в течение 18-24 часов. Далее, одна петля клеток может быть перенесена в пробирки, содержащие 2 мл ферментационной среды. Ферментационная среда содержит глюкозу - 60 г/л, сульфат аммония - 25 г/л, KHPO - 2 г/л, MgSO - 1 г/л, тиамин - 0.1 мг/мл, L-изолейцин - 70 мкг/мл и мел - 25 г/л, значение рН доводят до 7.2. Глюкозу и мел стерилизуют отдельно. Выращивание может производиться при 30°C в течение 3 дней с перемешиванием. После выращивания количество полученной L-глутаминовой кислоты может быть определено с помощью бумажной хроматографии (состав подвижной фазы: бутанол-уксусная кислота-вода=4:1:1) с последующим окрашиванием нингидрином (1% раствор в ацетоне) и дальнейшим элюированием полученных соединений в 50% этаноле с 0.5% CdCl.
Пример 4. Продукция L-пролина штаммом Е.coli 702ilvA/pMgdh4
Для оценки влияния увеличения активности глутаматдегидрогеназы на продукцию L-пролина штамм-продуцент L-пролина Е.coli 702ilvA может быть трансформирован плазмидой pMgdh4c целью получения штамма 702ilvA/pMgdh4. Штамм 702ilvA депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером ВКПМ В-8012, затем 18 мая 2001 г. было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора.
Оба штамма Е.coli, 702ilvA и 702ilvA/pMgdh4, могут быть выращены в течение 18-24 часов при температуре 37°C на чашках с L-агаром. Затем ферментация с использованием этих штаммов может производиться в тех же условиях, как описано в Примере 3.
Пример 5. Продукция цитруллина штаммом Е.coli 382ΔargG/pMgdh4
Для оценки влияния увеличения активности глутаматдегидрогеназы на продукцию цитруллина штамм-продуцент цитруллина Е.coli 382ΔargG может быть трансформирован плазмидой pMgdh4 с целью получения штамма 382ΔargG/pMgdh4. Штамм 382ΔargG может быть получен в результате делеции гена argG на хромосоме штамма 382 (ВКПМ В-7926) с использованием метода, предложенного Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645), называемого "Red-зависимая интеграция". В соответствии с этой процедурой могут быть сконструированы ПЦР-праймеры, гомологичные как области, прилегающей к гену argG, так и гену, отвечающему за устойчивость к антибиотику. В качестве матрицы в ПЦР может быть использована плазмида pMW118-attL-Cm-attR (WO 05/010175).
Оба штамма Е.coli, 382ΔargG и 382ΔargG/pMgdh4, могут быть выращены с перемешиванием при 37°C в течение 18 часов в 3 мл питательной среды, и 0.3 мл полученных культур могут быть перенесены в 2 мл ферментационной среды в пробирках 20×200-мм и могут быть культивированы при 32°C в течение 48 часов на роторной качалке.
2
После выращивания количество полученного цитруллина может быть определено с помощью бумажной хроматографии с использованием подвижной фазы следующего состава: бутанол-уксусная кислота-вода=4:1:1. Последующее окрашивание может быть выполнено нингидрином (2% раствор в ацетоне). Содержащее цитруллин пятно может быть вырезано, цитруллин может быть элюирован с использованием 0.5% водного раствора CdCl, и количество цитруллина может быть определено спектрофотометрически при длине волны 540 нм.
Возможный состав ферментационной среды (г/л):
Глюкоза
48.0
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
35.0
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
2.0
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
1.0
Тиамин HCl
0.0002
Дрожжевой экстракт
1.0
L-изолейцин
0.1
L-аргинин
0.1
CaCO<sub>3</sub>
5.0
3
Глюкозу и сульфат магния стерилизуют отдельно. CaCO стерилизуют сухим жаром при 180°C в течение 2 часов. Значение рН доводят до 7.0.
Пример 6. Продукция орнитина штаммом Е.coli 382ΔargFΔargI/pMgdh4
Для оценки влияния увеличения активности глутаматдегидрогеназы на продукцию орнитина штамм-продуцент орнитина Е.coli 382ΔargFΔargI может быть трансформирован плазмидой pMgdh4 с целью получения штамма 382ΔargFΔargI/pMgdh4. Штамм 382ΔargFΔargI может быть получен в результате последовательных делеций генов argF и argI на хромосоме штамма 382 (ВКПМ В-7926) с использованием метода, предложенного Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645), называемого "Red-зависимая интеграция". В соответствии с этой процедурой могут быть сконструированы две пары ПЦР-праймеров, гомологичных как областям, прилегающим к генам argF и argI, так и гену, отвечающему за устойчивость к антибиотику. В качестве матрицы в ПЦР может быть использована плазмида pMW118-attL-Cm-attR (WO 05/010175).
Оба штамма Е.coli, 382ΔargFΔargI и 382ΔargFΔargI/pMgdh4, могут быть выращены с перемешиванием при 37°C в течение 18 часов в 3 мл питательной среды, и 0.3 мл полученных культур могут быть перенесены в 2 мл ферментационной среды в пробирках 20×200-мм и могут быть культивированы при 32°C в течение 48 часов на роторной качалке.
2
После выращивания количество полученного орнитина может быть определено с помощью бумажной хроматографии с использованием подвижной фазы следующего состава: бутанол-уксусная кислота-вода=4:1:1. Последующее окрашивание может быть выполнено нингидрином (2% раствор в ацетоне). Содержащее цитруллин пятно может быть вырезано, цитруллин может быть элюирован с использованием 0.5% водного раствора CdCl, и количество цитруллина может быть определено спектрофотометрически при длине волны 540 нм.
Возможный состав ферментационной среды (г/л):
Глюкоза
48.0
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
35.0
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
2.0
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
1.0
Тиамин HCl
0.0002
Дрожжевой экстракт
1.0
L-изолейцин
0.1
L-аргинин
0.1
CaCO<sub>3</sub>
5.0
3
Глюкозу и сульфат магния стерилизуют отдельно. CaCO стерилизуют сухим жаром при 180°C в течение 2 часов. Значение рН доводят до 7.0.
Пример 7. Продукция L-треонина штаммом Е.coli 3996/pMgdh4
Для оценки влияния увеличения активности глутаматдегидрогеназы на продукцию L-треонина штамм-продуцент L-треонина Е.coli B-3996 может быть трансформирован плазмидой pMgdh4 с целью получения штамма B-3996/pMgdh4. Штамм B-3996 был депонирован 19 ноября 1987 года во Всесоюзном научном центре антибиотиков (РФ, 117105 Москва, Нагатинская ул., 3-А) с инвентарным номером РИА 1867. Указанный штамм также был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 7 апреля 1987 г. с инвентарным номером B-3996.
Оба штамма Е.coli, B-3996 и B-3996/pMgdh4, могут быть выращены в течение 18-24 часов при температуре 37°C на чашках с L-агаром. Для получения посевной культуры указанные штаммы могут быть выращены при 32°C в течение 18 часов на роторной качалке (250 об/мин) в пробирках размером 20×200 мм, содержащих 2 мл L-бульона с 4% сахарозой. Затем в ферментационную среду может быть внесено по 0.21 мл (10%) посевной культуры. Ферментация может быть проведена в 2 мл минимальной ферментационной среды в пробирках размером 20×200 мм. Клетки могут быть выращены в течение 65 часов при 32°C с перемешиванием (250 об/мин).
2
После выращивания количество накопленного в среде L-треонина может быть определено с помощью бумажной хроматографии с использованием подвижной фазы следующего состава: бутанол: уксусная кислота: вода=4:1:1 (v/v). Для визуализации может быть использован раствор (2%) нингидрина в ацетоне. Пятно, содержащее L-треонин, может быть вырезано; L-треонин может быть элюирован 0.5% водным раствором CdCl, после чего количество L-треонина может быть оценено спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм.
Состав ферментационной среды (г/л):
Глюкоза
80.0
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
22.0
NaCl
0.8
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
2.0
MgSO<sub>4·</sub>7H<sub>2</sub>O
0.8
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
0.02
MnSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O
0.02
Тиамин гидрохлорид
0.0002
Дрожжевой экстракт
1.0
CaCO<sub>3</sub>
30.0
3
Глюкозу и сульфат магния стерилизуют отдельно. CaCO стерилизуют сухим жаром при 180°C в течение 2 часов. рН доводят до 7.0.
Пример 8. Продукция L-валина штаммом Е.coli H-81/pMgdh4
Для анализа влияния увеличения активности глутаматдегидрогеназы на продукцию L-валина сначала получили штамм-продуцент L-валина Н-81 может быть трансформирован плазмидой pMgdh4.
Штаммы Н-81 и H-81/pMgdh4 могут быть культивированы при 37° в течение 18 часов в питательном бульоне, и по 0.1 мл каждой из полученных культур может быть инокулировано в 2 мл ферментационной среды в пробирках 20×200 мм и может быть проведено культивирование при 32°C в течение 72 часов на роторной качалке. После культивирования в течение 48 часов и 72 часов количество накопленного L-валина может быть определено методом ТСХ. Для этой цели могут быть использованы TLC-пластинки размером 10×15 см, покрытые 0.11-мм слоем силикагеля Сорбфил без флуоресцентного индикатора (Акционерное Общество Сорбполимер, Краснодар, Россия). Пластинки Сорбфил могут быть экспонированы в подвижной фазе следующего состава: пропан-2-ол: этилацетат: 25% водного аммиака: вода=40:40:7:16 (v/v). Раствор (2%) нингидрина в ацетоне может быть использован для визуализации.
Состав ферментационной среды (г/л):
Глюкоза
48
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
15
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
1.5
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
1
Мамено (общий N)
0.4
CaCO<sub>3</sub>
25
3
CaCO стерилизуют сухим жаром при 180°C в течение 2 часов. рН доводят до 7.0.
Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на наилучший способ осуществления изобретения, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.
Каждому из упомянутых выше документов соответствует ссылка, и все цитируемые документы являются частью описания настоящего изобретения.
Таблица 1.
Штамм
Глутаматдегидрогеназа, нмоль/мин·мг белка
HB101/pMW119
399
HB101/pMgdh4
3971
Таблица 2.
Штамм
OD<sub>540</sub>
Arg, г/л
382LW
15.3±0.6
11.0±1.1
382LW/pMW-gdh4
15.3±0.7
15.5±0.6