Генетические детерминанты патогенности микросимбионта Enterococcus faecalis в ассоциации с простейшими Вlastocystis hominis in vitro

Раздел V ДИСКУССИОННЫЙ РАЗДЕЛ. ПИСЬМА В РЕДАКЦИЮ. РЕЦЕНЗИИ

УДК:529.2:529.68:61:621.6-07

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ ПАТОГЕННОСТИ МИКРОСИМБИОНТА ENTEROCOCCUS FAECALIS В АССОЦИАЦИИ С ПРОСТЕЙШИМИ BLASTOCYSTIS HOMINIS IN VITRO

Н.В. БУГЕРО, Н.И. ПОТАТУРКИНА-НЕСТЕРОВА*

Установлено, что нуклеотидные последовательности генов, детерминирующие синтез факторов патогенности, встречаются у изученных бактерий в различных соотношениях, а частота обнаружения фрагментов искомых генов меняется после совместного культивирования энтерококков с простейшими бластоцистами. Микросимбионт B.hominis вызывал увеличение показателей частоты встречаемости генов cpd и cps у E. faecalis после их совместного культивирования. Увеличение показателей частоты встречаемости искомых ампликонов, специфичных генам cpd и cps приводило к формированию штаммов энтерококков, обладающих более выраженной патогенностью. Ключевые слова: полимеразная церная реакция, праймеры, Entero-coccus faecalis, Blastocystis hominis, «острова» патогенности, ассоциативные симбионты

В последние десятилетия достигнуты большие успехи в изучении микроорганизмов, населяющих кишечник человека [1,2,7]. Для нормального функционирования толстого кишечника важную роль играют не только количественные и качественные изменения микрофлоры, но и «патогенный потенциал» микроорганизмов [3,8]. Патогенность микробов является полидетерми-нантным признаком, который определяется совокупным действием различных факторов патогенности, присущих возбудителю.

В настоящее время все большее внимание привлекают исследователей условнопатогенные бактерии рода Enterococcus, так

как, обладая выраженной биологической и экологической пластичностью, они могут приобретать возможность к длительному существованию в организме человека и являться причиной различных патологических состояний кишечника [3,4,5,6,]. Темпы и масштабы превращений бактерий-симбионтов не укладываются в норму реакции фенотипа на изменение условий среды. Все это обуславливает интенсификацию исследований феномена патогенности на молекулярно-генетическом уровне [2,5].

Установлено, что изменения патогенности у бактерий реализуется на генетическом уровне через мутации и генетические рекомбинации [5,7,9]. Наиболее существенными для изменения патогенности условнопатогенных энтеробактерий, ввиду «скачкообразного» характера и кардинальности происходящих превращений микроорганизма, рассматривают генетические рекомбинации, которые определяют геномную пластичность микробов, реализуемую через несколько конкретных механизмов связанных, в частности с «островами» и «островками» патогенности [1,2].

До настоящего времени мало изученными остаются вопросы направленности межмикробных взаимоотношений ассоциативных микросимбионтов. в инфекционной патологии и определения роли протозойно-бактериальных ассоциаций, в частности энтеробактерий рода Enterococcus и простейших Blastocystis hominis, в патогенезе смешанных инфекций и развитии бактериальных осложнений [7].

Раскрытие механизмов межмикробных взаимодействий ассоциативных симбиозов организма хозяина в норме и при патологических состояниях, открывает перспективы решения фундаментальных проблем микробиологии - выявления причинноследственных связей формирования патогенных вариантов микросимбионтов.

В связи с этим в нашей работе мы использовали праймеры к нескольким генам, обнаруженным в составе «островов» патогенности E. Faecalis.

Цель исследования — выявление нуклеотидных последовательностей генов, контролирующих синтез факторов патогенно-стей, у штаммов E. Faecalis в ассоциации с простейшими Blasto-cystis hominis in vitro.

* ФГБО УВПО Ульяновский государственный университет, ул. Л. Толстого, 42, г. Ульяновск, 432970, e-mail:bugero@mail.ru

Материалы и методы исследования. Для проведения серии экспериментов были отобраны штаммы E. faecalis (n=132), выделенные у обследуемых с заболеваниями ЖКТ, в ассоциативном симбиозе которого участвовали B. hominis с различной степенью вирулентности (первая группа) и штаммы энтерококков (вторая группа), выделенных из консорциумов, где B. hominis не являлись участниками микробного сообщества (n=67). Группа сравнения включала 60 практически здоровых лиц, репрезентативных по полу и возрасту.

Изучение микрофлоры кишечника у больных и лиц контрольной группы проводили согласно приказу Минздрава России от 09.06.2003 г. № 231 «Об утверждении отраслевого стандарта «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» (ОСТ 91500.11.0004-2003). Наличие бластоцист выявляли путем микроскопии нативных или окрашенных препаратов, приготовленных из фекалий больных. Культивирование простейших B. hominis проводили с использованием среды Suresh CEM [4,10].

Вирулентность бластоцист определяли путём внутрибрю-шинного введения белым мышам (массой 23,1±2,2 г) 0,5 мл взвеси культуры простейших, выращенной на среде K.Suresh. Через сутки у каждого штамма определяли величину LD50. В соответствии с получаемыми показателями к высоко вирулентным относили штаммы с LD50 от 101 до 103 КОЕ/мл, к умеренно вирулентным

- от 103 до 106 КОЕ/мл, а штаммы с LD50 свыше 106 КОЕ/мл считали слабовирулентными.

Тотальную бактериальную ДНК выделяли из суточной агаровой культуры, 1 мл суспензии клеток осаждали при

12000 об./мин на центрифуге. Осадок ресуспендировали и разводили в буфере, содержащем 50 мМ KCl, 10 мМ трис-НС! (рН 8,4), 2,5 мМ MgCl2, 0,01% желатин, до конечной концентрации 108 КОЕ/мл. Лизирование осуществляли лизоцимом (Германия) в концентрации 1 мг/мл в течение 15 мин при комнатной температуре (22-25°С) с последующим добавлением протеиназы К до конечной концентрции 200 мкг/мл и инкубировали в течение 30 мин при 60°С. Для обнаружения генов, кодирующих факторы патогенности E. faecalis, использовали полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Для этого применяли наборы НПФ «Литех», г. Москва. Хранение образцов перед использованием осуществляли при 4°С.

На этапе анализа патогенного потенциала микроорганизмов в протозойно-бактериальных ассоциациях использовали праймеры к нескольким генам E. faecalis, определяющим их патогенность: 5’ CGCGTGAAGAACAAATGGCCGC 3’ для выявления гена cpd (бактериоцитогенность); 5’ GGCATCGAAGCTAA

TGGGTGGGT 3’ для выявления гена cps (адгезия и колонизация).

Статистическую обработку данных проводили при помощи программы: «Statistica for Windows».

Таблица 1

Определение абсолютной концентрации гена cpd и cps у E. fnecalis после сокультивирования с B. hominis

Номер лунки Идентификатор пробирки Ср, Fam Cp, Hex Концентрация копий/мл гена cpd Концентрация копий/мл гена cps

А1 Образец 1 (ОРЭ Бп $ 17,2 5520 1700

А2 Образец 2 (ОРЭ Бп $ 17,6 6430 6400

A3 Образец 3 (ОРЭ Бп 1Е) 17,4 9500 22400

А4 Образец 4 (ОРЭ Бп 1Е) 12,2 10700 30300

А5 Образец 5 (ОРЭ Бп 1Е) 12,6 15100 35700

А6 Образец 6 (ОРЭ Бп 1Е) 12,7 17340 38900

А7 Образец 7 (ОРЭ Бп $ 13,6 30600 51600

А8 К-

Результаты и их обсуждение. Исследования показали, что частота встречаемости гена cpd у штаммов Е. ГаесаІІБ, выделенных из ассоциации с бластоцистами, составила 61,36% (81 куль-

тура), изолированных без простейших - 31,34% - 21 штамм. Результаты определения концентрации копий cpd и cps гена у энтерококков после сокультивирования in vitro представлена в таблице 2.

Тестирование E. faecalis после сокультивирования с авиру-лентными, с умеренновирулентными и высоковирулентными бластоцистами в течение трех суток выявило достоверное (р<0,05) повышение частоты встречаемости искомых ампликонов у вирулентных штаммов (табл.2). В дальнейшие сроки исследования частота встречаемости изучаемых ампликонов изменялась не значительно (р>0,05).

Рис. 1. Ген cpd Е. ГаесаІІБ после сокультивирования с бластоцистами.

Обращает на себя внимание достоверно более широкая распространенность нуклеотидных последовательностей генов cpd и срБ после 3 суток сокультивирования с бластоцистами по сравнению с данными, полученными до сокультивирования.

Из общего числа бактерий при инкубации с авирулентными простейшими ампликоны были выявлены у 3,2±0,2% штаммов энтероккоков. Статистическая обработка данных не выявила достоверного увеличения положительных сигналов с фрагментами специфичных генов патогенности у энтерококков после со-культивирования с бластоцистами по сравнению со штаммами до сокультивирования.

Тестирование штаммов Е. ГаесаІІБ на наличие гена срБ, выделенных из ассоциации с авирулентными, умеренно вирулентными и высоко вирулентными бластоцистами, показало (табл.2), что ампликоны, специфичные гену срБ, до сокультивирования встречались у 3,7±0,3%, 15,2 ±0,6% и 62,5±3,6% штаммов, после сокультивирования данные показатели увеличились до 5,4±0,5%, 24,6 ±2,8*% и 98,5±4,3*% соответственно (р<0,05). В дальнейшие сроки исследования частота встречаемости изучаемых амплико-нов не изменялась (р>0,05).

Таблица 2

Частота встречаемости нуклеотидных последовательностей ген cpd и сря у культур Е. Гаесаіія

E. fаecalis в ассоциации с бластоцистами: Совместное культивирование Частота встречаемости фрагмента геи cpd геиа

авирулентными (n=24) до сокультивирования 3,2±0,2 3,7±0,3

после 3-х суток сокультивирования 3,5±0,5 5,4±0,5

умеренновирулентными (n=71) до сокультивирования 14,1±1,7 15,2 ±0,6

после 3-х суток сокультивирования 19,3±2,7* 24,6 ±2,8*

высоковирулентными (n=37) до сокультивирования 54,1 ±2,9 62,5±3,6

после 3-х суток сокультивирования 86,5±3,5* 98,5±4,3*

Выделенные в виде моиокультур(и=67) до сокультивирования 3,1±0,5 3,2±0,2

после 3-х суток сокультивирования 3,2±0,7 4,3±0,6

Примечание: * - показатель достоверности различия между показателями частоты встречаемости нуклеотидных последовательностей срё и срэ гена Б. ГаесаНэ до и после их сокультивирования с бластоцистами

Рис. 2. Ген срБ адгезии и колонизации Е. ГаесаІІБ после сокультивирования с бластоцистами

Сокультивирование Е. ГаесаІІБ с вирулентными бластоцистами вызывало увеличение количества гена срБ, особенно значительным оно было после сокультивирования с высоко вирулентными В. Ьошіпіб (рис.2).

Концентрация копий срБ гена Е. ГаесаІІБ представлена в таблице 1.

Анализ полученных данных выявил зависимость роста числа положительных сигналов с праймерами, специфичными к срБ гену, от вирулентности ассоциантов (г=0,85), как до, так и после сокультивирования (р<0,001).

Далее было изучена частота встречаемости генов cpd и срБ у культур Е. ГаесаІІБ, выделенных из микробных сообществ кишечника, в которых отсутствовали бластоцисты. Содержание этих генов было определено до и после сокультивирования с бластоцистами.

Таблица 3

Частота встречаемости нуклеотидных последовательностей cpd и сря генов культур Е. Гаесаіія, выделенных из микробных сообществ, не содержащих бластоцист

штаммы E. fаecalis выделенные без бластоцист

cpd cps

до сокультивирования 3,1±0,5 3,2±0,2

после 3-х суток сокультивирования 3,2±0,7 4,3±0,6

Примечание: * - показатель достоверности различия между показателями частоты встречаемости нуклеотидных последовательностей cpd и срэ генов Е. ГаесаІІБ до и после сокультивирования с бластоцистами

В группе энтероккоков, выделенных без простейших, частота встречаемости генетических детерминант cpd и срБ после совместного культивирования с бластоцистами достоверно не изменялась (табл. 3).

Выводы. В ходе проделанной работы был произведен подбор праймеров для выявления генов патогенности энтерококков, а также оптимизация условий и режима проведения ПЦР в режиме «реального времени», позволяющего одновременно совмещать амплификацию и детекцию. Для этого использовали праймеры к генам Е. ГаесаІІБ, определяющим их патогенность: cpd (бактериоцитогенность) и срБ (адгезия и колонизация) .

Установлено, что нуклеотидные последовательности генов, детерминирующие синтез факторов патогенности, встречаются у изученных энтероккоков в различных соотношениях, а частота обнаружения фрагментов искомых генов меняется после совместного культивирования энтерококков с бластоцистами, выделенными при заболеваниях ЖКТ.

Микросимбионт В.Ьошіпіб вызывал увеличение показателей частоты встречаемости генов cpd и срБ у энтерококков после их совместного культивирования, что является свидетельством их влияния на способность реализации патогенного потенциала ассоциативных симбионтов.

Следовательно, можно предположить, что механизмы взаимоадаптации штаммов Е. ГаесаІІБ в условиях макроорганизма и на искусственных питательных средах в консорциуме с различными по вирулентности бластоцистами, включают в себя увели-

чение численности особей, в генотипе которых локализованы cpd и cps гены.

Литература

1. Бондаренко, В.М. «Острова» патогенности бактерий /

B. М. Бондаренко // Микробиология.- 2001.- №4.- С. 67-74.

2. Бондаренко, В.М. Мавзютов А.Р., Golkocheva E. Секрети-руемые факторы патогенности энтеробактерий / В. М. Бондаренко, А.Р. Мавзютов, E. Golkocheva // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.- 2002.- №1.- С.84-90.

3. Мамбетова, Э.Ф. Сравнительная характеристика некоторых биологических свойств монокультур и сокультивируемых вариаций бактерий рода Serratia и Staphylococcus aureus: автореф. Дис. ... канд. мед. наук. / Э.Ф. Мамбетова.- Челябинск, 2007.- 21 с.

4. Простейшие Blastocystis hominis и их воздействие на макроорганизм / Н.И. Потатуркина-Нестерова [и др].- СПб.: Наука, 2009.- С. 25-30.

5. Фиалкина, С.В. Обнаружение маркеров островов патогенности, известных для уропатогенных эшерихий, у клинических штаммов клебсиелл / С.В. Фиалкина // Материалы VIII съезда всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов.- М., 2002.- Т.3.- С. 357-358.

6. Поздеев, О.К. Энтеробактерии: руководство для врачей. / О.К. Поздеев, Р.В. Федоров.- М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007.-

C. 322-349.

7. Некоторые особенности микрофлоры миндалин и меж-микробного взаимодействия (в норме и при патологии) / О.В. Бухарин [и др.] // Микробиология.- 2000.- №4.- С. 82-85.

8. See. K. Multiplex PCR for detection of Enterobacteriaceae in blood / K. See, D.M. Asher // Transfusion.- 2001.- Vol. 41- №1.-P. 1356-64.

9. Farthing, M.G. Bacterial Overgrowth of the Small Intestine., Gastroenterology, Misiewicz G (ed) / M.G. Farthing // New York-1993.- №2.- P. 45.

10. Suresh, K. Tubulovesicular elements in Blastocystis homi-nis from the caecum of experimentally-infected rats / K. Suresh, S.Y. Chong, J. Howe, L.C. Ho, E.H. Yap // International Journal for Parasitology.- 1995.- Vol. 25.- P. 123-126.

THE GENETIC DETERMINANTS OF PATHOGENICITY OF ENTEROCOCCUS FAECALIS MICROSYMBIONT IN ASSOCIATION WITH PROTOZOA BLASTOCYSTIS HOMINIS IN VITRO

N.V. BUGERO, N.I. POTATURKINA-NESTEROVA

State Educational Institution of Higher Professional Education « Ulyanovsk State University»

It is established that nucleotide sequences of the genes which determine synthesis of pathogenicity factors, take place in the studied bacteria with various ratios, and the frequency of detection of the fragments of required genes changes after joint cultivation of entero-cocci and protozoan blastocystes. The microsymbiont B.hominis has caused an increase in parameters of frequency of occurrence on cpd and cps genes in Е. faecalis after their joint cultivation. An increase in the frequency of occurrence of required amplicons, specific for cpd and cps genes has resulted in formation of enterococci strains with more intense pathogenicity.

Key words: polymerase chain reaction, primers, Enterococcus faecalis, Blastocystis hominis, pathogenicity "islands", associative symbionts.

УДК 614.76+614.78

ОЦЕНКА ЭКОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ТЕРРИТОРИЙ Г. ВЛАДИКАВКАЗА

О.С.ПОЛОВЕЦКАЯ*, В.В. ПЛАТОНОВ*, А.А. ХАДАРЦЕВ**, В.А.СУББОТИН*, А.Г.ХРУПАЧЕВ**

В статье представлены результаты изучения образцов почв различных территорий г. Владикавказа с привлечением комплекса современных физико-химических методов анализа; биологического тестирования гуминовых кислот, важной составляющей органического

Тульский государственный педагогический университет им. л.Н.Толстого, просп. Ленина, 125, г. Тула, 300026

Тульский государственный университет, медицинский институт, ул. Болдина, 128, г. Тула, 300028

вещества почв, подвергшихся наибольшему загрязнению тяжелыми металлами. Установлено, что экологическая обстановка в большинстве территорий г. Владикавказа, в особенности расположенных вблизи предприятия ОАО «Электроцинк», крайне неблагоприятная. Ключевые слова: почва, экология, гуминовые вещества, биологическая активность.

Окружающая среда г. Владикавказа испытывает повышенную техногенную нагрузку, основной составляющей которой является химическое загрязнение территории тяжелыми металлами. При этом количество выбросов вредных веществ в воздушный бассейн и сбросов в речную сеть значительно превысили природные возможности окружающей среды города к самоочищению, что приводит к высокому уровню заболеваемости населения (аллергии, экземы, дерматиты, бронхиальная астма, заболевания сердечно-сосудистой системы, онкопатология) [1].

Индустриальный ареал загрязнения тяжелыми металлами сформировался главным образом в результате деятельности предприятий цветной металлургии, причем уровень комплексного показателя загрязнения окружающей среды многократно превышает ПДК. Это связано с расположением на территории г. Владикавказа предприятий по производству цинка и кадмия, а также изделий на их основе. Исходным сырьем для производства являются минералы сфалерит (7п8) и гринокит (CdS). Особый вред экологии наносят уносы окислительного обжига последних, включающие 7пО, CdO, SO2, ZnS, CdS, АІ2О3 и др.

Высокий уровень загрязнения обусловлен значительным износом основного технологического оборудования, практически полным отсутствием очистных сооружений.

С учетом высокой вредности технологических выбросов спровоцирована неблагоприятная экологическая обстановка, что ставит крайне необходимым проведение исследований по оценке экологического состояния различных территорий г. Владикавказа.

Цель исследования — оценка экологического состояния отдельных территорий г. Владикавказа.

Для достижения поставленной цели необходимо: получить подробную характеристику почв отдельных территорий г. Владикавказа с учетом их минеральной и органической составляющих; выполнить биологическое тестирование гуминовых веществ (ГВ); провести оценку экологического состояния изученных территорий.

Материалы и методы исследования. Объектами исследования являлись 15 проб почв, отобранных на различных территориях г. Владикавказа.

Список территорий отбора проб почв: (1) - ул. Заводская (возле конюшни), (2) - Черноморская ТПП № 1, (3) - стадион «Металлург», (4) - Комсомольский парк, (5) - парк Жуковского, (6) - северо-восточное кладбище, (7) - садовое товарищество «Весна», (8) - банк Москвы, (9) - ул. Гадиева, 34, (10) - перекресток Московское шоссе/ул. Чкалова, (11) - Архонское шоссе, (12) - микрорайон «Вишневый сад», (13) - Осетинский театр, (14) - детский сад ОАО «Кавтрансстрой», (15) - перекресток улиц Заводская-Чкалова.

Для решения поставленных выше задач потребовалось:

- выполнить отбор проб почв и получить подробную их характеристику с привлечением технического, элементного, рент-гено-флуоресцентного, химического, количественного функционального анализов, ИК-Фурье-спектроскопии;

- выделить гуминовые (ГК) и фульвокислоты (ФК), охарактеризовать их комплексом физико-химических методов с последующим биотестированием;

- получить сравнительную характеристику экологического состояния отдельных территорий г. Владикавказа.

Результаты и их обсуждение. Образцы почв характеризовались техническим и химическим анализами с определением влажности, зольности, рН (КС1 вытяжки), содержания гуминовых и фульвокислот, состава минеральной части, ИК-Фурье спектроскопией, биологическим тестированием.

Результаты исследований приведены в табл. 1, из которой видно, что образцы почв различных территорий г. Владикавказа характеризуются достаточно высокой влажностью и зольностью. Значение влажности ^а, масс. %) варьирует от 16,33 (Архонское шоссе) до 43,00 (Комсомольский парк). Повышенное содержание влаги (масс. %) отмечено для территории парка Жуковского (37,33), Осетинского театра (33,00), ул. Гадиева, 34 (31,33). Содержание минеральной части (масс. % от воздушно-сухого образца) изменяется от 65,29 (Комсомольский парк) до 91,24 (Ар-