ГЕНЫ И БЕЛКИ ДЛЯ БИОСИНТЕЗА ЛАНТИБИОТИКА 107891
GENES AND PROTEINS FOR BIOSYNTHESIS OF LANTIBIOTIC 107891

Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к области лантибиотиков и, более конкретно, к выделению молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют ферменты, необходимые для пути биосинтеза лантибиотика 107891 и его гомологов. Раскрыты функции генных продуктов, вовлеченных в продукцию 107891. В настоящем изобретении предложены новые биосинтетические гены, необходимые для продуцирования 107891, кодируемые полипептиды, рекомбинантные векторы, содержащие последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют указанные полипептиды, клетки-хозяева, трансформированные указанными векторами, и способы продуцирования лантибиотиков с использованием указанных трансформированных клеток-хозяев, включающие способы продуцирования 107891, его предшественника, его производного или модифицированного лантибиотика, отличающегося от 107891 или его предшественника.
Предшествующий уровень техники
Постоянное увеличение патогенных бактерий, устойчивых к существующим антибиотикам, представляет собой глобальную опасность для здоровья, и, таким образом, существует острая необходимость в обнаружении и разработке нового соединения, активного против устойчивых бактерий. Последнее приводит к возобновившемуся интересу к природным продуктам, которые в прошлом представляли собой богатый источник антибиотиков, таких как пенициллины, макролиды и гликопептиды. Привлекательными кандидатами также являются противомикробные пептиды и среди них пептиды, обозначаемые как лантибиотики, т.е. лантионин-содержащие антибиотики. Лантибиотики образуют особую группу среди противомикробных пептидов и отличаются несколькими особенностями, такими как характеристика первичной и пространственной структуры, уникальные пути биосинтеза и реакции модификации пептидов, и сильная антибактериальная активность. Они представляют собой группу пептидных противомикробных соединений, секретируемых грамположительными бактериями, и в первую очередь действуют на грамположительные бактерии. Лантибиотики синтезируются на рибосомах в виде препропептидов, которые посттрансляционно модифицируются до их биологически активных форм. Препептид состоит из N-концевой лидерной последовательности, которая не подвергается какой-либо посттрансляционной модификации и отщепляется во время или после секреции из клетки, и С-концевой области (пропептида), которая модифицируется посттрансляционно. Лантибиотики продуцируются различными бактериями: общее свойство этих соединений заключается в присутствии одного или более чем одного остатка лантионина, который состоит из двух остатков аланина, ковалентно сшитых тиоэфирной связью. Тиоэфирный мостик образуется тогда, когда остаток цистеина реагирует с дегидроаланиновой или дегидробутириновой группировкой с образованием соответственно лантионинового или метиллантионинового остатка. Остатки дегидроаминокислоты, в свою очередь, образуются путем дегидратации соответственно серина и треонина. На основе структурных и функциональных свойств лантибиотики обычно разделяются на две группы, тип А и тип В. Лантибиотики тип А представляют собой удлиненные катионные пептиды с длиной, варьирующей от 20 до 34 аминокислотных остатков: низин, субтилин, эпидермин и Рер5 являются членами этой группы. Тип В представляет собой глобулярные пептиды с общим отрицательным зарядом: примерами этой группы лантибиотиков являются мерсацидин, циннамицин, лактицин 481 и актагардин. Эти структурные различия отражаются на механизме действия. Соединения типа А осуществляют свою противомикробную активность путем блокирования биосинтеза клеточной стенки и образования пор в клеточных мембранах посредством механизма, которому может способствовать или не способствовать предшествующее закрепление на клеточном липиде-мишени II. Лантибиотики типа В также проявляют свою противомикробную активность путем ингибирования биосинтеза пептидогликанов, но эти соединения не образуют поры после связывания с липидом II.
2
Показано, что лантибиотики обладают эффективностью и полезны в качестве пищевых добавок и антибактериальных агентов. Низин, являющийся наиболее изученным лантибиотиком, продуцируется Lactococcus lactis и является активным при низких концентрациях (низкие наномольные MIC (минимальные ингибирующие концентрации)) в отношении многих грамположительных бактерий, включающих устойчивые к лекарствам штаммы и пищевые патогены Clostridium botulinum и Listeria monocytogenes. Его широко используют в качестве пищевого консерванта без значительного развития бактериальной устойчивости. Другие лантибиотики демонстрируют интересные биологические активности: например, эпидермин демонстрирует высокую эффективность против Propionibacterium acnes; циннамицин и дурамицин ингибируют фосфолипазу А и ангиотензин-превращающий фермент, обеспечивая потенциальные применения в качестве противовоспалительных агентов и для регуляции кровяного давления, соответственно; и мерсацидин ингибирует множество грамположительных бактерий, включая метициллин-устойчивый Staphylococcus aureus (MRSA).
Гены, ответственные за биосинтез лантибиотиков, организованы в кластеры, обозначенные символом локуса lan, с более специфическим генотипическим обозначением для каждого лантибиотика (например, nis для низина, gdm для галлидермина, cin для циннамицина). Многие гены lan были секвенированы, демонстрируя высокий уровень сходства в организации генов. Каждый кластер включает: структурный ген lanA, кодирующий препептид; и ген(ы), необходимый(е) для дегидратации Ser и Thr остатков в пропептидном участке LanA и для образования тиоэфира. Для лантибиотиков типа A, LanB осуществляет реакции дегидратации, и LanC вовлечен в образование тиоэфирного мостика, тогда как в лантибиотиках типа В единственный фермент LanM катализирует обе реакции. В кластерах лантибиотиков обычно присутствуют дополнительные гены: lanT кодирует АВС-транспортер для секреции лантибиотика, часто в комбинации со второй транспортной системой, кодируемой генами lanEFG; lanP кодирует протеазу для процессинга, но некоторые кластеры лишены такого гена, который может представлять собой часть lanT, или его функция может обеспечиваться клеточной протеазой; а lanI кодирует белок, вовлеченный в самозащиту; и lanKR отвечает за регуляцию экспрессии генов lan.
Существует потенциал и польза для получения улучшенных лантибиотиков путем манипуляции с встречающимися природными соединениями. Однако лантибиотики представляют собой структурно сложные пептиды, и их доступность для химии ограничивается несколькими положениями в молекуле. Одно из основных ограничений для химии состоит в изменении типа или порядка аминокислот, присутствующих в пептидном остове. В свете вышеописанного может быть желательно иметь гены и ферменты, полезные для перенаправления этих стадий в образование лантибиотика с целью получения производных, которые трудно или невозможно получить химическими способами. Таким образом, были бы весьма желательны общие способы создания новых производных лантибиотиков непосредственно с помощью процессов ферментации с использованием точно сконструированных штаммов.
Фактически лишь необычные аминокислоты в лантибиотиках вносят вклад в их биологическую активность, а также усиливают их структурную стабильность. Ферменты, вовлеченные в биосинтез лантибиотиков, представляют высокий потенциал для конструирования пептидов путем введения необычных аминокислот в желаемые пептиды.
1
2
2
Лантибиотик 107891 демонстрирует антибактериальную активность против грамположительных бактерий, включающих метициллин- и ванкомицинустойчивые штаммы, но демонстрирует ограниченную активность против грамотрицательных бактерий (например, некоторых Moraxella, Neisseria и Haemophilus spp.). 107891 выделяли после ферментации Microbispora sp. PTA-5024 (WO 2005/04628 A1). Он состоит из комплекса близкородственных факторов A1 и А2, структура которых может быть превращена в пептидный скелет длиной 24 аминокислоты, содержащий лантионин и метиллантионин в качестве составляющих. В дополнение к этому, в молекуле присутствуют атом хлора и один или два остатка -ОН. Структура компонентов комплекса 107891 представлена формулой 1 на Фиг.3, где R представляет собой [ОН] с фактором A (R=ОН), фактором А (R=-(OH)). 107891, по-видимому, объединяет элементы лантибиотиков типа А и В: кольца А и В в 107891 тесно связаны с эквивалентными кольцами в соединениях типа А; однако как в лантибиотиках типа В, 107891 скорее является глобулярным, он не содержит гибких С-концевых последовательностей и лишен заряженных аминокислотных остатков. Следовательно, нельзя предсказать, кодирует ли кластер lan, вовлеченный в образование 107891, единственный фермент LanM или отдельные белки LanB и LanC. Кроме того, отсутствует предпосылка для хлорсодержащих лантибиотиков, таким образом, гены, ответственные за эту посттрансляционную модификацию, нельзя предсказать по имеющимся данным.
Схема промышленных способов производства антибиотиков была относительно успешной, приводящей к крупномасштабным ферментациям с титрами антибиотика, достигающими уровней нескольких грамм на литр. Это достигается в основном с помощью следующих эмпирических, экспериментальных и ошибочных подходов и лишено рациональной основы. Таким образом, разработка новых способов и улучшение существующей технологии требует затрат времени и может приводить к получению бактериальных культур, которые являются нестабильными, несовместимыми и накапливают нежелательные побочные продукты. В последние годы рациональные способы успешно применялись для увеличения уровня антибиотика, продуцируемого Streptomyces spp., который часто вовлечен в манипуляцию с ключевыми регуляторными элементами, присутствующими в интересующем генном кластере, или сверхэкспрессию скорость-лимитирующих стадий в этом пути. Таким образом, гены, кодирующие такие кластер-ассоциированные регуляторы или ограничивающие стадии в синтезе, могут представлять собой эффективные средства для улучшения выхода. Однако кластер-ассоциированные регуляторы, идентифицированные до настоящего времени в актиномицетах, относятся к нескольким различным семействам белков. Даже в пределах одного семейства существует значительная вариация идентичности последовательности. Таким образом, существование, природу, количество и последовательность кластер-ассоциированных регуляторов невозможно предсказать путем сравнения с другим кластером, даже кластером, определяющим родственный антибиотик. В качестве примера кластер генов тилозина кодирует четыре различных регулятора, тогда как ни один из регуляторов не обнаружен в кластере, определяющем родственный макролидный антибиотик эритромицин. Аналогично, природа и предпосылка для скорость-ограничивающей стадии в пути биосинтеза не может быть установлена a priori.
Таким образом, средства для увеличения выхода 107891 могут быть весьма желательны. Однако отсутствуют примеры кластеров из других членов рода Microbispora. Таким образом, не может(гут) быть предсказан(ы) механизм(ы), с помощью которого(ых) штамм-продуцент защищает себя от действия 107891, управляет экспрессией других генов lan или координирует экспрессию генов lan с другими клеточными процессами. Информация о них будет весьма полезна для оптимизации способа продуцирования.
Описание изобретения
В настоящем изобретении предложен набор выделенных полинуклеотидных молекул, необходимых для биосинтеза лантибиотика 107891 в микроорганизмах.
Таким образом, в соответствии с одним из своих аспектов настоящее изобретение относится к полинуклеотидным молекулам, которые выбраны из непрерывной последовательности ДНК (SEQ ID NO: 1), которая представляет собой генный кластер mlb, выделенный из Microbispora sp. PTA-5024, и состоит из 17 ORF (открытая рамка считывания), кодирующих полипептиды, необходимые для образования 107891.
Аминокислотные последовательности полипептида, кодируемого указанными 17 ORF, приведены в SEQ ID NO: 2-18.
В настоящем изобретении также предложена выделенная нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
а) генного кластера mlb, кодирующего полипептиды, необходимые для синтеза 107891 и его гомологов (SEQ ID NO: 1);
б) нуклеотидной последовательности, кодирующей такие же полипептиды, кодируемые генным кластером mlb (SEQ ID NO. 1), но отличающейся от нуклеотидной последовательности самого генного кластера mlb;
в) любой из нуклеотидных последовательностей ORF 1-17 mlb, кодирующей полипептиды, кодируемые SEQ ID NO: 2-18;
г) нуклеотидной последовательности, кодирующей такой же полипептид, кодируемый любой из ORF 1-17 mlb (SEQ ID NO: 2-18), но отличающейся от нуклеотидной последовательности указанной ORF.
Еще одна задача изобретения заключается в том, чтобы предложить выделенную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
д) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, который по всей своей длине по меньшей мере на 65%, предпочтительно на 86%, более предпочтительно на 90%, наиболее предпочтительно на 95% или более идентичен по аминокислотной последовательности полипептиду, кодируемому любой из ORF 1-17 mlb (SEQ ID NO: 2-18).
В одном из воплощений выделенные нуклеиновые кислоты по изобретению содержат ORF, выбранную из ORF 1-17 (SEQ ID NO: 2-18), которая кодирует полипептид, необходимый для синтеза препропептида 107891.
В другом воплощении нуклеиновая кислота содержит ORF, выбранную из ORF 1-17 (SEQ ID NO: 2-18), которая кодирует полипептид, необходимый для синтеза фермента дегидратазы 107891. В еще одном воплощении нуклеиновая кислота содержит ORF, выбранную из ORF 1-17 (SEQ ID NO: 2-18), которая кодирует полипептид, необходимый для синтеза лантиониновых и метиллантиониновых остатков 107891.
В соответствии с еще одним воплощением в нуклеиновой кислоте по изобретению предложена ORF, выбранная из ORF 1-17 (SEQ ID NO: 2-18), которая кодирует полипептид, необходимый для хлорирования триптофанового остатка аминокислоты 4 в 107891.
В еще одном воплощении предложена нуклеиновая кислота, содержащая ORF, выбранную из ORF 1-17 (SEQ ID NO: 2-18), которая кодирует полипептид, необходимый для гидроксилирования пролинового остатка аминокислоты 14 в 107891.
В еще одном воплощении предложена нуклеиновая кислота, содержащая ORF, выбранную из ORF 1-17 (SEQ ID NO: 2-18), которая кодирует флавопротеин, необходимый для окислительного декарбоксилирования, которое дает в результате S-[(Z)-2-аминовинил]-(3S)-3-метил-D-цистеиновые (AviMeCys) остатки, присутствующие в положениях 21 и 24 в 107891.
В соответствии с еще одним воплощением в нуклеиновой кислоте по изобретению предложена ORF, выбранная из ORF 1-17 (SEQ ID NO: 2-18), которая кодирует полипептид, необходимый для восстановления флавопротеина.
В соответствии с еще одним воплощением предложены нуклеиновые кислоты, которые содержат комбинации ORF, выбранных из ORF 1-17 (SEQ ID NO: 2-18), кодирующие полипептиды, необходимые для экспорта 107891 и устойчивости к 107891.
В еще одном воплощении предложены нуклеиновые кислоты, которые содержат комбинации ORF, выбранных из ORF 1-17 (SEQ ID NO: 2-18), кодирующие полипептиды, необходимые для регуляции экспрессии генного кластера mlb.
Специалистам в данной области техники понятно, что в настоящем изобретении, в котором предложены нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды из пути биосинтеза 107891, также предложены нуклеотиды, кодирующие фрагменты, происходящие из таких полипептидов. В соответствии с изобретением специалисту в данной области техники понятно, что поскольку генетический код является вырожденным, такие же полипептиды, кодируемые SEQ ID NO: 2-18, могут кодироваться природными или искусственными вариантами ORF 1-17, т.е. нуклеотидными последовательностями, отличающимися от геномных нуклеотидных последовательностей, определяемых ORF 1-17, но которые кодируют такие же полипептиды.
Кроме того, также понятно, что встречающиеся в природе или искусственно полученные варианты могут состоять из полипептидов, кодируемых SEQ ID NO: 2-18, где указанные варианты обладают той(теми) же функцией(ями), что и вышеупомянутые исходные полипептиды, но содержат добавление, делецию или замену аминокислоты, не являющейся незаменимой для фолдинга или каталитической функции, или консервативную замену незаменимых аминокислот.
Специалистам в данной области техники также понятно, что при обеспечении нуклеотидной последовательности всего кластера, необходимого для биосинтеза 107891, в настоящем изобретении также предложены нуклеотидные последовательности, необходимые для экспрессии генов, представленных в указанном кластере. Такие регуляторные последовательности включают, но не ограничиваются этим, промоторные и энхансерные последовательности, антисмысловые последовательности, транскрипционные терминаторные и антитерминаторные последовательности. Эти последовательности полезны для регуляции экспрессии генов, представленных в генном кластере mlb. Клетки, несущие указанные нуклеотидные последовательности, одиночные или слитые с другими нуклеотидными последовательностями, также находятся в объеме настоящего изобретения.
В одном из аспектов настоящего изобретения предложены выделенные нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид ORF6 (SEQ ID NO: 7), или встречающиеся в природе варианты или производные указанного полипептида, кодирующие препропептид 107891.
В другом аспекте настоящего изобретения предложены нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид ORF7 (SEQ ID NO: 8), или встречающиеся в природе варианты или производные указанного полипептида, полезные для дегидратации сериновых и треониновых остатков предшественника лантибиотика.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид ORF8 (SEQ ID NO: 9), или встречающиеся в природе варианты или производные указанного полипептида, полезные для образования лантионина и метиллантионина в предшественнике лантибиотика.
В другом аспекте настоящего изобретения предложены нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид ORF9 (SEQ ID NO: 10), или встречающиеся в природе варианты или производные указанного полипептида, полезные для образования AviMeCys в предшественнике антибиотика. В другом аспекте настоящего изобретения предложены нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид ORF15 (SEQ ID NO: 16), или встречающиеся в природе варианты или производные указанного полипептида, полезные для хлорирования триптофанового остатка в предшественнике лантибиотика.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложены нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид ORF2 (SEQ ID NO: 3), или встречающиеся в природе варианты или производные указанного полипептида, полезные для гидроксилирования пролинового остатка в предшественнике лантибиотика.
В другом аспекте настоящего изобретения предложены нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды, определяемые ORF 1, 10-11, 13-14 и 17 (SEQ ID NO: 2, 11-12, 14-15 и 18), или встречающиеся в природе или искусственно полученные варианты или производные указанных полипептидов, полезные для экспорта из клеток 107891 или предшественника 107891.
В другом аспекте настоящего изобретения предложены нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие ORF 3 и 5 полипептидов (SEQ ID NO: 4 и 6), или встречающиеся в природе или искусственно полученные варианты или производные указанных полипептидов, полезные для регуляции продуцирования лантибиотика.
В одном из воплощений настоящего изобретения предложен лантибиотик-продуцирующий штамм, несущий экстракопии нуклеотидных последовательностей, определяющих по меньшей мере одну ORF, выбранную из любой из ORF 1-17 (SEQ ID NO: 2-18).
В одном из предпочтительных воплощений такой лантибиотик-продуцирующий штамм представляет собой любой штамм, относящийся к порядку Actinomycetales.
В еще одном предпочтительном воплощении такой лантибиотик-продуцирующий штамм представляет собой член рода Microbispora.
В одном из предпочтительных воплощений настоящего изобретения предложен штамм Microbispora, содержащий один или более вариантов нуклеотидной последовательности, определенной в SEQ ID NO: 1, причем такой вариант приводит в результате к увеличенной или уменьшенной экспрессии одной или более ORF 1-17 (SEQ ID NO: 2-18).
В одном из предпочтительных воплощений настоящего изобретения предложены нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 1, или ее участок, находящиеся на одном или более векторах, полезные для продуцирования 107891, один или более ее предшественников или ее производное другой клеткой.
В одном из предпочтительных воплощений указанная нуклеотидная последовательность или ее участок находятся в одном векторе. Подходящий вектор представляет собой любую космиду, фосмиду, ВАС, РАС, ESAC вектор, способные нести полный кластер mbl, как определено в данной заявке. Подходящие векторы хорошо известны специалистам в данной области техники и описаны в литературе (Kieser et al., 2000, и описанных в нем ссылках).
В одном из аспектов настоящего изобретения предложен способ увеличения продукции 107891, включающий следующие стадии:
- трансформацию рекомбинантным вектором ДНК микроорганизма, который продуцирует 107891 или его гомологи, или предшественники 107891 или его гомологи биосинтетическим путем, где указанный вектор содержит последовательность ДНК, выбранную из любой из ORF 1-17 (SEQ ID NO: 2-18), которая кодирует активность, которая является скорость-ограничивающей в указанном пути;
- культивирование указанного микроорганизма, трансформированного указанным вектором, в условиях, подходящих для клеточного роста, экспрессирования указанного гена и продуцирования указанного антибиотика или предшественника антибиотика.
Подходящая клетка-хозяин представляет собой Actinomycetales, относится к семействам Streptosporangiaceae, Micromonosporaceae, Pseudonocardiaceae и Streptomycetaceae, к роду Microbispora, Actinoplanes, Planomonospora, Streptomyces и тому подобное.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ продуцирования производных 107891 и его гомологов, включающий следующие стадии:
- клонирование в подходящем векторе сегмента, выбранного из нуклеотидной последовательности, определенной в SEQ ID NO: 1, где указанный сегмент содержит по меньшей мере участок одной из ORF 1-17 (SEQ ID NO: 2-18), где указанная ORF кодирует полипептид, который катализирует стадию биосинтеза, которую желательно обойти;
- инактивацию указанной ORF путем удаления или замены одного или более кодонов, которые специфичны для аминокислот, которые являются незаменимыми для активности указанного полипептида;
- трансформацию указанным рекомбинантным вектором ДНК микроорганизма, который продуцирует 107891 или его гомологи, или предшественник 107891 биосинтетическим путем;
- скрининг полученных трансформантов в отношении тех, у которых указанная последовательность ДНК замещена мутантной копией;
- культивирование мутантных клеток в условиях, подходящих для клеточного роста, экспрессии указанного пути и продуцирования аналога указанного пути.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ продуцирования новых лантибиотиков, включающий следующие стадии:
- трансформацию рекомбинантным вектором ДНК микроорганизма, который продуцирует лантибиотик или его гомологи или предшественник биосинтетическим путем, где указанный вектор содержит одну или более чем одну ORF, выбранную из ORF 1-17 (SEQ ID NO: 2-18), которая кодирует фермент(ы), способный(е) модифицировать указанные лантибиотик или предшественник лантибиотика;
- культивирование указанного микроорганизма, трансформированного указанным вектором в условиях, подходящих для клеточного роста, экспрессии указанного гена и продуцирования указанного лантибиотика, или его гомологов, или предшественника лантибиотика.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ продуцирования новых лантибиотиков, включающий следующие стадии:
- трансформацию рекомбинантным вектором ДНК микроорганизма, где указанный вектор содержит одну или более чем одну ORF, выбранную из ORF 1-17 (SEQ ID NO: 2-18), которая кодирует фермент(ы), способный(е) модифицировать лантибиотик или предшественник лантибиотика;
- культивирование указанного микроорганизма, трансформированного указанным вектором, в условиях, подходящих для клеточного роста, экспрессии указанного гена, в присутствии указанного лантибиотика или предшественника лантибиотик.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ продуцирования новых лантибиотиков, включающий следующие стадии:
- трансформацию рекомбинантным вектором ДНК микроорганизма, где указанный вектор содержит одну или более чем одну ORF, выбранную из ORF 1-17 (SEQ ID NO: 2-18), которая кодирует один или более полипептидов, которые модифицируют лантибиотик или предшественник лантибиотика;
- получение клеточного экстракта или клеточной фракции указанного микроорганизма в условиях, подходящих для присутствия активного(ых) полипептида(ов), где указанный клеточный экстракт или клеточная фракция содержат по меньшей мере указанный(е) полипептид(ы);
- добавление лантибиотика или предшественника лантибиотика к указанному клеточному экстракту или клеточной фракции и инкубацию указанной смеси в условиях, в которых указанный(е) полипептид(ы) может(ут) модифицировать указанный лантибиотик или предшественник лантибиотика.
Еще один аспект по изобретению включает выделенный полипептид, вовлеченный в путь биосинтеза 107891, выбранный из:
- полипептида ORF, кодируемого любой из ORF 1-17 mlb (SEQ ID NO: 2-18) и
- полипептида, который по меньшей мере по всей своей длине на 65%, предпочтительно на 95% или более идентичен по аминокислотной последовательности полипептиду, кодируемому любой из ORF 1-17 mlb (SEQ ID NO: 2-18), предпочтительно любой из ORF 1-3, 5-11, 13-17 mlb (SEQ ID NO: 2-4, 6-12, 14-18).
Предпочтительная группа полипептидов содержит любой полипептид ORF, кодируемый любой из ORF 1-3, 5-11, 13-17 mlb (SEQ ID NO: 2-4, 6-12, 14-18), или любой полипептид, который по меньшей мере по всей своей длине на 65%, предпочтительно на 86%, более предпочтительно на 90%, наиболее предпочтительно на 95% или более идентичен по аминокислотной последовательности полипептиду, кодируемому любой из указанных ORF mlb.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Термин "выделенная нуклеиновая кислота" в данной заявке относится к молекуле ДНК, геномной ДНК или комплементарной ДНК (кДНК), которая может быть одно- или двухцепочечной, имеющей природное или синтетическое происхождение. Этот термин также относится к молекуле РНК, имеющей природное или синтетическое происхождение.
Термин "нуклеотидная последовательность" в данной заявке относится к полноразмерной или частичной последовательностям ORF и раскрытым в данной заявке межгенным областям.
Термин "нуклеотидная последовательность" в данной заявке также относится к и/или содержит любую из нуклеотидных последовательностей по изобретению, представленную в перечне последовательностей. Любая из нуклеотидных последовательностей из перечня последовательностей представляет собой:
A) кодирующую последовательность,
Б) молекулу РНК, образующуюся в результате транскрипции (А),
B) кодирующую последовательность, в которой используется вырожденность генетического кода для кодирования идентичного полипептида,
Г) межгенную область, содержащую промоторы, энхансеры, терминаторную и антитерминаторную последовательности.
Термины "генный кластер", "кластер" и "биосинтетический кластер" в данной заявке обозначают непрерывный сегмент генома микроорганизма, содержащий все гены, необходимые для синтеза вторичного метаболита.
Термин "mlb" в данной заявке относится к генетическому элементу, ответственному за биосинтез 107891 в Microbispora sp. PTA-5024. Термин является акронимом лантибиотика Microbispora.
Термин "ORF" в данной заявке относится к геномной нуклеотидной последовательности, которая кодирует один полипептид. В контексте настоящего изобретения термин ORF является синонимом "гена".
Термин "ORF полипептида" в данной заявке относится к полипептиду, кодируемому ORF.
Термин "ORF mlb" в данной заявке относится к ORF, содержащей генный кластер mlb.
Термин "вторичный метаболит" в данной заявке относится к биологически активному веществу, продуцируемому микроорганизмом посредством экспрессии набора генов, определенного генным кластером.
Термин "вектор", как определено в данной заявке, включает среди прочего, любую плазмиду, космиду, фаг, которые могут трансформировать прокариотического хозяина путем интегрирования в клеточный геном или существовать вне хромосомы (например, автономно реплицирующаяся плазмида с ориджином реликации).
Термин "хозяин-продуцент", "клетка-хозяин" в данной заявке представляет собой микроорганизм, в котором образование вторичного метаболита управляется генным кластером, происходящим из организма-донора.
Термин "гомолог" в данной заявке относится к полипептиду, кодируемому биосинтетическим генным кластером, который по всей своей длине обладает по меньшей мере 65%-ной идентичностью последовательности с любым из полипептидов, кодируемых кластером mlb.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На Фиг.1 показаны выделенные сегменты ДНК, происходящие из хромосомы Microbispora sp. PTA-5024. Толстая линия обозначает сегмент, описанный в SEQ ID NO: 1. Космиды, несущие указанные выделенные сегменты ДНК, обозначены как 1G6 и 6Н6.
На Фиг.2 показана генетическая организация кластера mlb. Каждая ORF представлена стрелкой и пронумерована как в Таблице 1 (Фиг.4). Ориентация является такой же, как на Фиг.1. Номера на шкалах указывают на координаты последовательности (в т.п.н.).
На Фиг.3 показана структура компонентов комплекса 107891.
На Фиг.4 показаны основные характеристики ORF.
А. ГЕНЫ mlb, ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ Microbispora
107891 представляет собой комплекс близкородственных пептидных антибиотиков, продуцируемых Microbispora sp. PTA-5024. В настоящем изобретении предложены последовательности нуклеиновой кислоты и характеристики генного кластера mlb для биосинтеза 107891. Физическая организация генного кластера mlb вместе с фланкирующими последовательностями ДНК приведена на Фиг.1, которая иллюстрирует физическую карту геномного сегмента 20 т.п.н. из генома Microbispora sp. PTA-5024 вместе с двумя космидами, определяющими такой сегмент. Генетическая организация сегмента ДНК, управляющего биосинтезом 107891, показана на Фиг.2, и его нуклеотидная последовательность приведена в виде SEQ ID NO: 1.
Точная граница кластера может быть определена на основе функций его генных продуктов. Таким образом, на левом конце (Фиг.1) кластер mlb ограничен ORF1 mlb, кодирующей АВС-транспортер (SEQ ID NO: 2), вовлеченный в экспорт 107891. На правом конце кластер mlb ограничен ORF17 mlb, мембранным ионным антипортером (SEQ ID NO: 18). Кластер mlb охватывает приблизительно 20000 пар оснований и содержит 17 ORF, обозначенных ORF1 mlb - ORF17 mlb. Непрерывная нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 1 (20000 пар оснований) кодирует 17 белков, перечисленных в SEQ ID NO: 2-18.
ORF1 (SEQ ID NO: 2) представляет 300 аминокислот, установленных в результате трансляции SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 67 до 969.
ORF2 (SEQ ID NO: 3) представляет 414 аминокислот, установленных в результате трансляции SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 966 до 2210.
ORF3 (SEQ ID NO: 4) представляет 260 аминокислот, установленных в результате трансляции SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 2941 до 3723.
ORF4 (SEQ ID NO: 5) представляет 221 аминокислот, установленных в результате трансляции SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 3948 до 4614.
ORF5 (SEQ ID NO: 6) представляет 220 аминокислот, установленных в результате трансляции SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 5283 до 4621 на комплементарной цепи.
ORF6 (SEQ ID NO: 7) представляет 57 аминокислот, установленных в результате трансляции SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 5414 до 5587.
ORF7 (SEQ ID NO: 8) представляет 1115 аминокислот, установленных в результате трансляции SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 5706 до 9053.
ORF8 (SEQ ID NO: 9) представляет 475 аминокислот, установленных в результате трансляции SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 9080 до 10507.
ORF9 (SEQ ID NO: 10) представляет 215 аминокислот, установленных в результате трансляции SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 10537 до 11184.
ORF10 (SEQ ID NO: 11) представляет 316 аминокислот, установленных в результате трансляции SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 11181 до 12131.
ORF11 (SEQ ID NO: 12) представляет 242 аминокислот, установленных в результате трансляции SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 12253 до 12981.
ORF12 (SEQ ID NO: 13) представляет 211 аминокислот, установленных в результате трансляции SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 13357 до 13992.
ORF13 (SEQ ID NO: 14) представляет 249 аминокислот, установленных в результате трансляции SEQ ID NO: 1 from нуклеотиды 14795 до 15544.
ORF14 (SEQ ID NO: 15) представляет 236 аминокислот, установленных в результате трансляции SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 15546 до 16256.
ORF15 (SEQ ID NO: 16) представляет 541 аминокислот, установленных в результате трансляции SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 16370 до 17995.
ORF16 (SEQ ID NO: 17) представляет 178 аминокислот, установленных в результате трансляции SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 17992 до 18528.
ORF17 (SEQ ID NO: 18) представляет 430 аминокислот, установленных в результате трансляции SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 18525 до 19817.
Геномная организация и первичная последовательность кластера mlb 107891 в лантибиотиках типа А
Сравнение mlb и других кластеров генов лантибиотиков выявило важные различия. Фактически кластер mlb характеризуется присутствием нескольких ORF, которые не обнаруживают гомологов в других кластерах лантибиотиков. Они включают ORF 1-6, 12, 15-18 mlb (SEQ ID NO: 2-7, 13, 16-19). В заключение, описанная в данной заявке организация кластера mlb по существу отличается от организации других кластеров, вовлеченных в синтез другого лантибиотика. Таким образом, он представляет собой первый пример кластера, имеющего такую геномную организацию.
Б. РОЛИ ГЕНОВ mlb
В настоящем изобретении раскрыта последовательность ДНК, ответственная за синтез препропептидного предшественника 107891. Препропептид 107891 состоит из лидерного пептида длиной 33 аминокислоты и пропептида длиной 24 аминокислоты. Упомянутые в данной заявке последовательности нуклеиновых кислот представляют собой последовательности, кодирующие препропептид 107891 или его фрагменты. Препропептид 107891 длиной 57 аминокислот представляет собой новый элемент, который демонстрирует по всей своей длине только 41%-ную идентичность с номером доступа в UniProt P21838, представляющем собой препропептид лантибиотика галлидермина из Staphylococcus gallinarum.
Другие гены, присутствующие в кластере mlb, представляют собой новые генетические элементы, полезные для увеличения продуцирования 107891 или для синтеза новых метаболитов. Среди них ORF 7-8 mlb (SEQ ID NO: 8-9) кодируют белки, вовлеченные в посттрансляционную модификацию продукта трансляции ORF6 mlb, для введения лантиониновых остатков в зрелый 107891. В частности, полипептид ORF7 mlb отвечает за дегидратацию Ser и Thr остатков в препропептидном участке 107891 с образованием дегидроаланиновых и дегибутириновых остатков, соответственно. Полипептид ORF8 mlb катализирует нуклеофильную атаку цистеиновых остатков в препропептиде на дегидроаминокислотные остатки. Эти гены могут быть клонированы и экспрессированы в гетерологичном хозяине с образованием активных ферментов, способных вводить лантиониновый остаток в другие препропептиды.
Другие предпочтительные молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включают ORF9 mlb (SEQ ID NO: 10), которая кодирует белок, вовлеченный в окислительное декарбоксилирование с получением S-[(Z)-2-аминовинил]-(3S)-3-метил-D-цистеинового остатка (Формула I).
Другие предпочтительные молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включают ORF16 mlb (SEQ ID NO: 17), которая кодирует триптофангалогеназу, ответственную за добавление атома хлора к аминокислоте 4 в 107891. ORF16 mlb представляет собой новый и уникальный генетический элемент, о котором ранее не сообщалось в других кластерах лантибиотиков. Действительно, хлорирование представляет собой скорее уникальное свойство 107891 среди известных лантибиотиков. Этот ген может быть клонирован и экспрессирован в гетерологичном хозяине с получением активного фермента, способного хлорировать триптофановые остатки молекул лантибиотиков. Альтернативно, mlb ORF16 может быть инактивирован в штамме-продуценте, приводя в результате к образованию производных 107891, лишенных хлора, присоединенного к аминокислоте 4.
Другие предпочтительные молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включают ORF2 mlb (SEQ ID NO: 3, которая кодирует цитохром Р450 гидроксилазу, ответственную за посттрансляционную модификацию препропептида 107891 путем добавления одного или двух атомов кислорода к пролиновому остатку в положении 14. ORF2 mlb представляет собой новый и уникальный генетический элемент, о котором никогда не сообщалось в других кластерах лантибиотиков. Действительно, профиль пролинового гидроксилирования 107891 скорее уникален среди лантибиотиков. Этот ген может быть клонирован и экспрессирован в гетерологичном хозяине с получением активного фермента, способного окислять пролиновые остатки, присутствующие в молекуле лантибиотика. Альтернативно, ORF2 mlb может быть инактивирован в продуцирующем штамме, приводя в результате к образованию производных 107891, лишенных атома кислорода в аминокислоте 14.
Кластер mlb также включает множество регуляторных генов, ответственных за прямую или непрямую активацию экспрессии генов биосинтеза и устойчивости во время продуцирования 107891. Эти гены включают ORF 3 и 5 mlb (SEQ ID NO: 4 и 6): ORF3 mlb (SEQ ID NO: 4) представляет собой отдельный кворум-зависимый (quorum-sensing) пептид, ответственный частично за регуляцию продуцирования 107891; и ORF5 mlb (SEQ ID NO: 6) тесно связан с Sigma-70, представляющим собой внецитоплазматическое функциональное семейство сигма-факторов РНК-полимеразы, которые действуют в качестве положительного регулятора транскрипции. ORF 3 и 5 mlb представляют собой новые генетические элементы, отсутствующие в других кластерах лантибиотиков. Два гена ORF 3 и 5 mlb могут быть клонированы и экспрессированы индивидуально или в любой их комбинации в других штаммах, продуцирующих лантибиотик, для увеличения выхода образующегося продукта.
Штаммы-хозяева включают, но не ограничиваются этим, штаммы, относящиеся к порядку Actinomycetales, к семействам Streptosporangiaceae, Micromonosporaceae, Pseudonocardiaceae и Streptomycetaceae, к родам Microbispora, Actinoplanes, Planomonospora, Streptomyces и тому подобное. Альтернативно, эти гены могут быть сверхэкспрессированы индивидуально или в любой их комбинации в штамме, продуцирующем 107891, для увеличения выхода 107891.
Кластер mlb также включает множество генов, ответственных за экспорт промежуточных соединений лантибиотика или конечных продуктов из цитоплазмы и для придания устойчивости клетке-продуценту. Эти гены включают ORF 1, 10-11, 13-14 и 17 mlb (SEQ ID NOS: 2, 11-12, 14-15 и 18). ORF mlb 1, 10-11, 13-14 кодируют транспортеры класса АВС, ответственные за АТР-зависимую экскрецию 107891 или его промежуточных соединений, mlb ORF17 кодирует Na/K ион-антипортер, ответственный за экспорт 107891 или его промежуточных соединений против протонного градиента. Эти гены могут быть клонированы и экспрессированы либо индивидуально, либо в любой их комбинации в другом штамме-продуценте лантибиотика для увеличения выхода образующегося продукта. Штаммы-хозяева включают, но не ограничиваются этим, штаммы, относящиеся к порядку Actinomycetales, к семействам Streptosporangiaceae, Micromonosporaceae, Pseudonocardiaceae и Streptomycetaceae, к роду Microbispora, Actinoplanes, Planomonospora, Streptomyces и тому подобное Альтернативно, эти гены могут быть сверхэкспресированы, индивидуально или в любой их комбинации, в штамме, продуцирующем 107891, для увеличения выхода 107891.
В. ПРИМЕНЕНИЯ КЛАСТЕРА mlb
В настоящем изобретении также предложены нуклеиновые кислоты для экспрессии полноразмерной молекулы 107891, любого из ее предшественников или ее производного. Такие нуклеиновые кислоты включают выделенный(е) генный(е) кластер(ы), содержащий(е) ORF, кодирующие полипептиды, достаточные для управления сборки 107891. В одном из примеров полный кластер mlb (SEQ ID NO: 1) может быть введен в подходящий вектор и использован для трансформации желаемого хозяина-продуцента. В другом аспекте кластер mlb клонируют в виде двух отдельных сегментов в двух различных векторах, которые могут быть совместимы в желаемом хозяине-продуценте. В еще одном аспекте кластер mlb может быть разделен на три сегмента, каждый из которых клонирован в отдельном совместимом векторе. Примеры применения одно-, двух- или трехвекторных систем описаны в литературе.
После того, как кластер mlb подходящим образом клонирован в один или более векторов, его можно вводить в различные подходящие хозяева-продуценты, в которых продукция лантибиотиков может осуществляться с большей эффективностью, чем в нативном хозяине. Предпочтительные клетки-хозяева представляют собой клетки видов или штаммов, которые могут эффективно экспрессировать гены актиномицетов. Такой хозяин включает, но не ограничивается этим, Actinomycetales, Streptosporangiaceae, Micromonosporaceae, Pseudonocardiaceae и Streptomycetaceae, Microbispora, Actinoplanes, Planomonospora и Streptomyces и тому подобное. Альтернативно, вторая копия кластера mlb, клонированная в один или более подходящих векторов, может быть введена в штамм, продуцирующий 107891, где вторая копия генов mlb увеличивает выход 107891.
Перенос продуцирующей способности хорошо охарактеризованному хозяину может значительно улучшить несколько стадий процесса оптимизации и разработки: титр природного продукта в продуцирующем штамме может быть увеличен более эффективно; очистка природного продукта может быть осуществлена при известном фоне возможных взаимодействующих активностей; композицию комплекса можно более эффективно контролировать; измененные производные природного продукта могут быть более эффективно продуцированы путем манипуляции с условиями ферментации или путем конструирования пути.
Альтернативно, кластер биосинтетических генов может быть модифицирован, встроен в клетку-хозяина и использован для синтеза или химической модификации широкого спектра метаболитов: например, открытые рамки считывания могут быть повторно упорядочены, модифицированы и скомбинированы с другим кластером генов биосинтеза лантибиотика.
Используя приведенную в данной заявке информацию, клонирование и экспрессию нуклеиновых кислот 107891 можно осуществить с использованием стандартных и хорошо известных способов.
В другом возможном применении выбранные ORF из генного кластера mlb выделяют и инактивируют путем применения стандартных способов молекулярной биологии. Мутантную ORF, клонированную в подходящем векторе, содержащем сегменты ДНК, которые фланкируют указанную ORF в хромосоме РТА-5024 Microbispora sp., вводят в указанный штамм Microbispora, где два двойных перекрестных события гомологичной рекомбинации приводят в результате к инактивации указанной ORF в штамме-продуценте. Эта методика полезна для продуцирования предшественников или производных 107891 эффективным образом.
В еще одном возможном применении выбранные ORF из генного кластера mlb выделяют и помещают под контроль желаемого промотора. Сконструированную ORF, клонированную в подходящем векторе, затем вводят в Microbispora sp. РТА-5024, путем замены первоначальной ORF, как описано выше, или в виде дополнительной копии указанной ORF. Эта методика полезна для увеличения или уменьшения уровня экспрессии ORF, которые являются критичными для продуцирования молекулы 107891, ее предшественников или производных.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ РАЗДЕЛ
Следующие примеры служат для иллюстрации принципов и методов, с помощью которых идентифицируют кластер генов 107891, и принципов и способов, с помощью которых идентифицируют и анализируют все гены mlb. Эти примеры служат для иллюстрации принципов и способов по настоящему изобретению, но не для ограничения его объема.
Общие способы
Если не указано иное, то бактериальные штаммы и клонирующие векторы все могут быть получены из общедоступных коллекций или коммерческих источников. Для молекулярной биологии используют стандартные способы. Microbispora выращивали в агаре НТ и в среде V6 (20 г/л глюкозы, 5 г/л дрожжевого экстракта, 3 г/л казеинового гидролизата, 5 г/л мясного экстракта, 5 г/л пептона, 1,5 г/л NaCl, 0,5% глицерина). Лантибиотики выделяют в соответствии с опубликованными способами. Анализы последовательности осуществляют с использованием стандартных программ. Поиски по базам данных осуществляют с использованием программ Blast или Fasta на общедоступных сайтах.
Пример 1 - Выделение генов биосинтеза 107891
Геномную библиотеку готовят с использованием ДНК из Microbispora sp. РТА-5024 в конъюгативном космидном векторе Supercos 3. Его конструируют путем вставки кассеты aaclV-oriT-intФС31 из pSET152 в Supercos 1 (Stratagene, La Jolla, CA 92037) в соответствии со следующим: кассету aaclV-oriT-intФС31 получали с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции) в виде фрагмента Nrul длиной 3,8 т.п.н. из вектора рSЕТ152 и встраивали в такой же сайт supercosl. Тотальную ДНК из Microbispora sp. РТА-5024 частично расщепляют с помощью Sau3AI для оптимизации размеров фрагментов в диапазоне 40 т.п.н. Частично расщепленную ДНК обрабатывают щелочной фосфатазой и лигируют в Supercos3, ранее расщепленную с помощью BamHI. Лигирующую смесь упаковывают in vitro и используют для трансфекции клеток E.coli XL1Blue. Полученную в результате космидную библиотеку подвергают скринингу путем гибридизации с олигонуклеотидным зондом 5'-GTSACSWSSTGGWSSYTSWSSACSGGSCCSTGCACSWSSCCSGGSGGSWSSAACWSSWSSTCCWSSTG-3' (SEQ ID NO: 19). Олигонуклеотид конструируют на основе аминокислотной последовательности, выведенной из структуры 107891. Две космиды, положительные в отношении этого зонда, выделяют и физически картируют рестриктазами. На основе таких экспериментов идентифицируют космиды, представленные на Фиг.1. Сегмент, таким образом идентифицированный из генома Microbispora sp. PTA-5024, содержит генный кластер mlb, ответственный за синтез антибиотика 107891.
Вышеприведенный пример служит для иллюстрации принципа и методологий, с помощью которых кластер mlb может быть выделен. Специалистам в данной области техники очевидно, что кластер mlb может быть клонирован в различных векторах. Однако специалистам в данной области техники понятно, что имея кластер mlb размером 20 т.п.н., предпочтительные векторы представляют собой векторы, способные нести крупные вставки, такие как лямбда, космида и ВАС векторы. Специалистам в данной области техники понятно, что для идентификации кластера mlb из такой библиотеки могут быть использованы другие зонды. Из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, любой фрагмент может быть подвергнут амплификации с помощью ПЦР из ДНК Microbispora sp. PTA-5024 и использован для скрининга библиотеки, полученной из такой ДНК. Из указанной библиотеки могут быть идентифицированы один или более клонов, которые включают любой сегмент, охватываемый SEQ ID NO: 1. Кроме того, также можно идентифицировать кластер mlb путем применения гетерологичных зондов, таких как зонды, полученные из другого кластера lan с использованием информации, представленной в Таблице 1. Альтернативно, другие генные кластеры, направляющие синтез вторичных метаболитов, содержат гены, достаточно родственные генам mlb для того, чтобы сделать возможной гетерологичную гибридизацию. Все эти вариации находятся в объеме настоящего изобретения.
Пример 2 - Анализ последовательности кластера генов 107891
Кластер mlb, идентифицированный, как описано в Примере 1, секвенируют с помощью метода "дробовика" (shotgun). Последовательность кластера mlb в данной заявке приведена, как SEQ ID NO: 1. Полученную в результате последовательность ДНК анализируют для идентификации наиболее вероятных кодирующих последовательностей, которые сравнивают в отношении других кластеров lan или осуществляют поиск в GenBank. Точный стартовый кодон для каждой ORF определяют путем множественного выравнивания родственных последовательностей или путем поиска находящегося выше в последовательности сайта связывания с рибосомой. В общей сложности идентифицировано 17 ORF, обозначенных ORF1 - ORF17 mlb. Результаты этих анализов обобщены в Таблице 1 и приведены в данной заявке в перечне последовательностей как SEQ ID NO: 2 - SEQ ID NO: 18. Подробная информация приведена ниже.
2А. Синтез препропептида 107891
ORF 6 mlb отвечает за синтез препропептида. Препропептид содержит 49-а.к. лидерную последовательность и 24-а.к. пропептид (SEQ ID NO: 7), которые подвергаются посттрансляционной модификации с образованием зрелого лантибиотика. Два общих свойства лидерных пептидов лантибиотика сохраняются в 107891: консервативная последовательность лантибиотиков типа А (например, мотив F-D/N-L-D/E) и пролиновый остаток в положении - 2. С-концевая часть препропептида (SEQ ID NO: 7) согласуется с опубликованной первичной структурой 107891 и его предполагаемой пропептидной последовательностью.
2Б. Посттрансляционная модификация пропептида 107891
Четыре белка, кодируемых ORF 7-9 mlb (SEQ ID NO: 8-10) и ORF 17 mlb (SEQ ID NO: 18), вовлечены в посттрансляционную модификацию препропептида 107891. Гомологи этих генных продуктов обнаружены во многих кластерах лантибиотиков. На основе идентичностей последовательностей с дегидратазами и циклазами, обнаруженными в других кластерах лантибиотиков, и их ролей могут быть выдвинуты следующие предположения. Полипептид ORF7 mlb отвечает за дегидратацию сериновых остатков в положениях 3, 5, 13, 18 и 21 и треонинового остатка в положении 2 и 8 пропептида 107891 с образованием соответствующих дегидратированных остатков. Полипептид ORF8 mlb катализирует регио- и стереоспецифическое добавление конъюгата цистеиновых остатков, присутствующих в пропептиде 107891, к четырем дегидроаланиновым и одному дегидробутириновому остатку с образованием соответствующих пяти тиоэфиров. Конкретно, полипептид ORF8 mlb вовлечен в образование 3-7, 13-20, 18-23 и 21-24 лантионинов и 8-11 метилантионина.
На основе идентичностей последовательностей, обнаруженных с декарбоксилазами, кодируемыми эпидерминовым и мерсацидиновым кластерами, ORF9 mlb кодирует фермент, ответственный за декарбоксилирование 21-24 лантиониновой группировки. На основе идентичностей последовательностей, обнаруженных с флавинредуктазой, кодируемой другими кластерами антибиотиков, ORF16 mlb кодирует флавопротеинредуктазу. Учитывая роли, предполагаемые для окислительного декарбоксилирования во время образования эпидермина и мерсацидина, полипептиды ORF 9 и 16 mlb катализируют образование S-[(Z)-2-аминовинил]-D-цистеинового остатка, присутствующего в 107891 (Формула I).
2В. Образование β-гидроксипролина и хлорирование триптофана
Два белка, кодируемые ORF 2 и 15 mlb (SEQ ID NO: 3 и 16), вовлечены в добавление одной или двух β-гидроксильных групп к пролиновому остатку в положении 14 и в хлорирование триптофанового остатка в положении 4 пропептида 107891. Полипептид ORF2 mlb демонстрирует значительную идентичность с Р450 моноксигеназами (Таблица 1) и вовлечен в гидроксилирование пролинового остатка. Никаких гомологов ORF2 mlb не обнаружено в других кластерах лантибиотиков, таким образом, этот ген представляет собой уникальный пример Р450 моноксигеназы, вовлеченной в гидроксилирование молекулы лантибиотика. Дополнительно, на основе уровня идентичностей с другими галогеназами, полипептид ORF15 mlb вовлечен в хлорирование триптофана и представляет собой уникальный пример галогеназы, вовлеченной в модификацию молекулы лантибиотика.
2Г. Экспорт и устойчивость
Пять белков, кодируемых ORF 1, 10, 11, 13, 14 и 17 (SEQ ID NO: 2, 11, 12, 14, 15 и 18), вовлечены в экспорт 107891 или его предшественника за пределы цитоплазмы и в придание устойчивости продуцирующему штамму. Их предполагаемые роли являются следующими.
Гомологи ORF1 (SEQ ID NO: 2) не обнаружены в других кластерах лантибиотиков. Этот ген кодирует дополнительные транспортеры АВС-типа (Таблица 1), и таким образом вовлечен в придание устойчивости к 107891 продуцирующему штамму Microbispora sp. РТА. Гомологи ORF 10, 13-14 и 17 (SEQ ID NO: 11, 14-15 и 18) представлены в других кластерах лантибиотиков (Таблица 1). Они кодируют соответственно трансмембранные транспортеры АВС-типа и ион-зависимые трансмембранные транспортеры. Таким образом, они вовлечены в экспорт и/или компартментализацию 107891 или его предшественников. ORF17 mlb кодирует Na/K ионный антипортер, ответственный за экспорт 107891 или его промежуточных соединений против протонного градиента.
2Д. Регуляция
Два белка, кодируемых ORF 3 и 5 (SEQ ID NO: 4 и 6), вовлечены в регуляцию экспрессии одного или более генов mlb. Полипептид ORF5 mlb (SEQ ID NO: 6) представляет собой новый генетический элемент, гомологи которого не обнаружены в других кластерах лантибиотиков. Этот белок относится к обладающему экстрацитоплазматической функцией семейству сигма-факторов, которые действуют в качестве положительных регуляторов транскрипции. Полипептид ORF3 (SEQ ID NO: 4) относится к семейству регуляторов транскрипции LuxR-типа. Таким образом, ORF 3 (SEQ ID NO: 4), вероятно, требуется для экспрессии одного или более генов mlb.
2Е. Дополнительные функции
Две дополнительные ORF присутствуют в кластере mlb: ORF4 (SEQ ID NO: 5) и ORF12 (SEQ ID NO: 13). Обе ORF родственны белкам с неизвестной функцией, присутствующим в Salinispora tropica и Streptomyces ambofaciens, соответственно (Таблица 1). Однако их точную роль в биосинтезе 107891 до сих пор невозможно определить.
Пример 3 - Манипуляция с 107891 путем генной замены
Используя информацию, приведенную в Примере 2, делецию внутри рамки считывания в ORF 2 конструируют следующим образом. Фрагмент А получают посредством амплификации с олигонуклеотидами 5'-AAGCTTGCATCTGCGTGGGCGTCCTGC-3' (SEQ ID NO: 20) и 5'-TCTAGACGGTCCGAAGATCATGGCCGCGG-3' (SEQ ID NO: 21); а фрагмент В получают посредством амплификации с олигонуклеотидами 5'-TCTAGATCCATGTGAACCGGCGGGTGGCCG-3' (SEQ ID NO: 22) и 5'-GAATTCCGGTCGCTCTCCTCGTCCTTTGCC-3' (SEQ ID NO: 23).
8
7
Затем фрагмент А расщепляют с помощью EcoRI и Xbal, фрагмент В с помощью Xbal и HindIII, и оба фрагмента лигируют в pSET152, ранее расщепленную с помощью EcoRI и HindIII. После трансформации Е.coli DH5α полученную плазмиду, обозначенную pDM1, распознают по присутствию фрагментов длиной 4 т.п.н. и 1,5 т.п.н. после расщепления с помощью EcoRI и HindIII. Аликвоту pDM1 переносят в клетки Е.coli ET12567 (pUB307), получая штамм DM1. Затем примерно 10 КОЕ (колониеобразующих единиц) клеток DM1 из ночной культуры в LB смешивают с примерно 10 КОЕ Microbispora РТА5024, выращенными в среде Rare3 в течение приблизительно 80 ч. Полученную смесь наносят на планшеты НТ, которые затем инкубируют при 28°С в течение примерно 20 ч. После удаления избытка клеток Е.coli осторожной промывкой водой планшеты покрывают 3 мл мягкого агара, содержащего 200 мкг налидиксовой кислоты и 15 мкг/мл апрамицина. После дополнительной инкубации при 28°С в течение 3-5 недель эксконъюганты Microbispora наносят полосками на свежую среду, содержащую апрамицин. Один такой эксконъюгант, названный штаммом Mb-DM1, подвергают дополнительной обработке. Штамм Mb-DM1 затем выращивают в процессе нескольких пассажей в среде НТ без апрамицина, и соответствующие разведения наносят на агар НТ без апрамицина. Индивидуальные колонии затем анализируют с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидов 5'-CGCGCTGCTCGGGGCCAAC-3' (SEQ ID NO: 24) и 5'-AGGAAACGGCCAGCCCGTGG-3' (SEQ ID NO: 25).
Колонии, содержащие делетированную аллель ORF2, распознают по присутствию полосы 1,5 т.п.н. Одну из таких колоний, обозначенную Mb-DM2, выращивают в среде НТ, и образование дегидроксил-107891 подтверждают путем сравнения с достоверным стандартом.
Вышеприведенный пример служит для иллюстрации принципа и способов, с помощью которых ORF, выбранная из любой из определяемых SEQ ID NO: 2-18, может быть замещена мутантной копией в штамме Microbispora sp. РТА5024, продуцирующем 107891. Специалистам в данной области техники очевидно, что ORF2 (SEQ ID NO: 3) представляет собой всего лишь пример способов конструирования внутрирамочных делеций в кластере, определяемом SEQ ID NO: 1.
Специалистам в данной области техники также понятно, что внутрирамочные делеций представляют собой всего лишь один из способов создания мутаций, и что другие способы, включающие, но не ограничивающиеся мутациями со сдвигом рамки считывания, вставками и сайт-направленными мутациями, также могут быть использованы для получения нуль-мутантов в любой из ORF, определяемой SEQ ID NO: 2-18.
Специалистам в данной области техники также понятно, что, имея общепринятый способ создания мутаций в любой из ORF, определяемых SEQ ID NOS: 1, эти способы могут быть использованы для изменения уровней экспрессии тех же ORF. Примеры того, как этого можно достичь, включают, но не ограничиваются этим, интеграцию множества копий указанных ORF в любое место в геноме Microbispora sp. РТА 5024, изменение промоторов, контролирующих экспрессию указанных ORF, удаление антисмысловых РНК или транскрипцию терминаторов, влияющих на их экспрессию.
Наконец, вариации векторов, используемых для встраивания мутантных аллелей в Microbispora sp. PTA 5024, в условиях конъюгирования и культивирования донорного и реципиентного штамма, в способе селекции и скрининга эксконъюгантов и их производных, все оказываются в объеме настоящего изобретения.
Пример 4 - Галогенирование лантибиотика in vitro
Используя информацию, приведенную в Примере 2, ORF15 mlb (SEQ ID NO: 16) сверхэкспрессируют в E.coli следующим образом. Фрагмент длиной 1,6 т.п.н., полученный путем амплификации с олигонуклеотидами 5'-TTTTTCATATGGGTGGGAGTGATCGGCGGCG-3' (SEQ ID NO: 26) и 5'-TTTTTGTCGACCTACTGCTGGCCGCGGTCCGGACT-3' (SEQ ID NO: 27), расщепляют с помощью Ncol и Sall и лигируют в pET22b, ранее расщепленную с помощью Ncol и Xhol. После трансформации клеток E.coli DH5α полученную плазмиду pHAL, распознаваемую по присутствию фрагментов длиной 5,5 т.п.н. и 1,6 т.п.н. после расщепления с помощью Ndel и Xhol, вводят в клетки E.coli BL21(DE3). Культуры клеток Е. coli BL21(DE3), несущих pHAL, выращивают при 20°С в LB до OD600 0,6. Затем IPTG (изопропил-бета-D-1-тиогалактопиранозид) добавляют до 1 мМ и клетки выращивают в течение еще 6 ч. Клетки собирают, разрушают ультразвуковой обработкой и несущий His-концевые последовательности полипептид ORF15 снимают с Ni-агарозной колонки. Осуществляют галогенирование in vitro субстратов, таких как лактицин 481 или 97518, и образование хлорированного производного лантибиотика подтверждают с помощью MS (масс-спектрометрия) анализа.
Вышеприведенный пример служит для иллюстрации принципа и способов, с помощью которых ORF, выбранная из любой из ORF, обозначенных SEQ ID NO: 2-18, может быть сверхэкспрессирована в удобном хозяине, полученный фермент сверхпродуцируют и используют для трансформации природного продукта лантибиотика в другое соединение. Специалистам в данной области техники понятно, что ORF15 (SEQ ID NO: 16) используют всего лишь в качестве примера способов сверхпродуцирования любого полипептида, кодируемого SEQ ID NO: 1. Специалистам в данной области техники также понятно, что другие способы сверхпродуцирования белков, включающие, но не ограничивающиеся этим, применение различных аффинных концевых последовательностей, применение различных векторов, различных штаммов-хозяев и способов индукции также могут быть использованы для сверхпродуцирования полипептидов, определяемых ORF 1-17 (SEQ ID NO: 2-18).
Специалистам в данной области техники понятно, что другие субстраты лантибиотики, содержащие или не содержащие триптофановый остаток, могут быть использованы для добавления атомов хлора к ORF15 (SEQ ID NO: 16). Специалистам в данной области техники также понятно, что другие полипептиды ORF, определяемые кластером mlb (SEQ ID NO: 1), могут быть использованы для посттрансляционной модификации других препропептидов лантибиотиков. Полипептиды ORF, которые могут быть использованы для этой задачи, включают ORF2 (SEQ ID NO 3), но не ограничиваются этим. Конкретно, ORF 7 и 8 (SEQ ID NO 8 и 9) могут быть использованы для дегидратации и введения тиоэфирных мостиков в другие препропептиды лантибиотиков; ORF 9 и 16 (SEQ ID NO 10 и 17) могут быть использованы для декарбоксилирования другого лантибиотика, содержащего С-концевой остаток Cys; и ORF 2 (SEQ ID NO 3) может быть использован для гидроксилирования другого лантибиотика, содержащего пролин.
Пример 5 - Экспрессия кластера mlb в гетерологичном хозяине
Используя информацию, приведенную в Примерах 1 и 2, космиду 1G6 (Фиг.1), содержащую целый кластер mlb (SEQ ID NO: 1), вводят в Streptomyces albus путем конъюгирования, как описано Kieser et al., 2000. Устойчивые к апрамицину эксконъюганты выращивают в подходящих условиях и 107891 очищают, как описано.
Специалистам в данной области техники также понятно, что S. albus представляет собой всего лишь один из штаммов-продуцентов, и что другие штаммы также могут быть использованы для введения целого кластера mlb (SEQ ID NO: 1) и для продуцирования 107891. Предпочтительные клетки-хозяева представляют собой клетки-хозяева видов или штаммов, которые могут эффективно экспрессировать гены актиномицета. Такой хозяин включает Actinomycetales, Streptosporangiaceae, Micromonosporaceae, Pseudonocardiaceae и Streptomycetaceae, Microbispora, Actinoplanes, Planomonospora и Streptomyces и тому подобное, но не ограничивается этим. Специалистам в данной области техники понятно, что при условии того, что подходящие промоторы помещают перед оперонами mlb, хозяева-продуценты не обязательно должны ограничиваться клетками, которые могут эффективно экспрессировать гены актиномицетов. Подходящие хозяева-продуценты этой последней категории могут быть найдены среди хозяев-продуцентов, которыми легко манипулировать генетически, или среди хозяев-продуцентов, которые в природе продуцируют другие лантибиотики. Примеры таких хозяев-продуцентов включают Escherichia coli и родственные виды, Bacillus spp., Streptococcus spp, Lactobacillus spp., Staphylococcus spp. и тому подобное, но не ограничиваются этим.
Специалистам в данной области техники также понятно, что с использованием способов, описанных в этом примере, кластер mlb может быть введен в виде второй копии в исходный штамм-продуцент 107891 Microbispora sp. РТА 5024 представлял собой вторую копию генов mlb, которая увеличивает выход 107891.
Специалистам в данной области техники также понятно, что различные векторы, различные способы введения кластера mlb, различные способы селекции рекомбинантных клонов, несущих кластер mlb, различные способы и условия выращивания указанных рекомбинантных клонов и различные способы обнаружения продуцирования 107891 могут быть эффективны для экспрессии кластера mlb в гетерологичном хозяине.
Пример 6 - Формирование библиотеки вариантов 107891
Используя информацию, приведенную в Примерах 2, 3 и 5, ORF 6 mlb (SEQ ID NO: 7) модифицируют для продукции вариантов 107891 следующим образом. Во-первых, вектор, несущий внутрирамочную делецию ORF 6 (SEQ ID NO: 7), конструируют в соответствии со способами, приведенными в Примере 3 с использованием олигонуклеотидов 5'-GCAGCCAGGCTCGCACCGGC-3' и CGCCCGTAACGAGCGA (SEQ ID NO 28 и 29) для фрагмента А и олигонуклеотидов 5'-GCAGCTTCTGCTGCTGA-3' и 5'-TCCCGGCCAGCCACTT-3' (SEQ ID NO 30 и 31) для фрагмента В для амплификации ORF 6. Полученную конструкцию используют для замещения ORF 6 в штамме S. albus, полученном, как описано в Примере 5, согласно способам из Примера 3 и получению штамма SA-D6. Затем препептидный участок ORF 6 mlb (SEQ ID NO: 7), полученный путем амплификации с олигонуклеотидами 5'-CCGGAAAGGAGCGAGCATATG-3' (SEQ ID NO: 32) и 5'-CAGATCTGCCAATACAGT-3' (SEQ ID NO: 33), расщепляют с помощью Ndel и BgIII и лигируют в pIJ8600 (Kieser et al., 2000), ранее расщепленную с помощью Ndel и BgIII, с получением плазмиды pPRE1. В параллельном эксперименте олигонуклеотиды А 5'-CGGTGTCGAGGAGATCACCGCCGGGCCGGCGNNNNNNAGCNNNNNNNNNTGCACCNNNNNNTGCNNNAGCNNNNNNNNNNNNAGCNNNTGCAGCNNNTGCTGCTGAAGATCT-3' и олигонуклеотид В 5'-TTCAGCAGCANNNGCTGCANNNGCTNNNNNNNNNNNNGCTNNNGCANNNNNNGGTGCANNNNNNNNNGCTNNNNNNCGCCGGCCCGGCGGTGATCTCCTCGACACCGATCGA-3' (SEQ ID 34 и 35) денатурируют и отжигают с образованием смеси сегментов ДНК (SEQ ID NO: 36), которые кодируют полипептиды со всеми возможными изменениями аминокислотной последовательности пропептидной области полипептида ORF 6, за исключением тех, которые вовлечены в образование тиоэфира (конкретно, аминокислота 3, 7, 8, 11, 13, 18, 20, 21, 23 и 24). Эту смесь сегментов ДНК лигируют с плазмидой pPRE1, ранее расщепленной с помощью BSA O1 и BgIII, с образованием библиотеки плазмид, несущих все возможные вариантные формы (за исключением (метил)лантиониновых мостиков) сегмента ORF 6, кодирующего пропептид, слитый с сегментом ORF 6, кодирующим лидерный пептид. Эту плазмидную библиотеку вводят в штамм SA-D6, и образующиеся в результате эксконъюганты, выращенные в присутствии мкг/мл тиострептона, подвергают скринингу в отношении продуцирования вариантов 107891 с помощью биологических анализов или HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография) анализа. Интересующие варианты дополнительно характеризуют путем секвенирования пропептидного участка варианта ORF 6 и идентификации структуры.
Специалистам в данной области техники понятно, что лидерный пептидный участок полипептида ORF 6 также может быть модифицирован таким образом, что ферменты, вовлеченные в посттрансляционные модификации (SEQ ID NO: 8 и 9), могут распознавать указанные различные лидерные пептиды. Вариации лидерного пептидного участка полипептида ORF 6 подпадают под объем изобретения.
Специалистам в данной области техники понятно, что другой способ может быть использован для конструирования библиотеки вариантов ORF 6, включающий, но не ограничивающийся этим, применение различных олигонуклеотидов, векторов, индуцирующих систем и штаммов-хозяев. Кроме того, специалистам в данной области техники понятно, что метиллантиониновые остатки могут быть замещены лантиониновыми остатками и наоборот для образования дополнительных вариантов ORF 6. Специалистам в данной области техники также понятно, что сайт-направленный мутагенез может быть использован для образования селектированных вариантов ORF 6, приводя в результате к продуцированию определенных производных 107891.