СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ИЗ РЫБНОГО СЫРЬЯ
METHOD FOR MAKING ENZYME PREPARATION OF FISH MATERIALS

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам извлечения протеолитических ферментов из рыбного сырья, и может быть использовано в рыбной, мясной и других отраслях пищевой промышленности, а также в ветеринарии, медицине и биохимии.
Отходы от переработки рыб, богатые протеолитическими ферментами, являются доступным и дешевым сырьем для получения ферментных препаратов.
Протеолитические ферменты, полученные из природного сырья, практически не вызывают побочных явлений при их применении, поэтому могут быть использованы в пищевой промышленности для улучшения качества производимых продуктов питания.
Известен способ получения ферментного препарата протеолитического действия из внутренностей свежих или мороженных рыб без половых продуктов, включающий измельчение сырья, консервирование его хлористым натрием, выдерживание сырья при 25°С в течение 2-3 часов при естественном физиологическом значении рН и отделение жидкой фракции фермента центрифугированием (п. РФ №1339917, C12N 9/64, 1994).
Однако протеолитическая активность полученного ферментного препарата низкая и составляет не более 3,5 ед/г. Кроме того, ферментный препарат содержит балластные белки, микрофлору и соли, т.к. способ не предусматривает стадию очистки.
Известен способ получения протеолитического ферментного препарата из внутренних органов рыб. Измельченное сырье подвергают автолизу в присутствии воды при гидромодуле 1:0,5 при рН 6,2±0,2 в течение 1-5 часов. После проведения автолиза жидкий автолизат, содержащий протеолитические ферменты, отделяют центрифугированием и подвергают очистке изопропиловым спиртом при гидромодуле 3:1 в течение 30-40 минут. Полученный в результате очистки жидкий ферментный препарат высушивают при температуре 150-180°С в течение 5-8 секунд (п. РФ №2288951, C12N 9/64, 2006).
Недостатками способа является использование изопропилового спирта, которое приводит к частичной потере ферментами каталитической активности, а высокая температура сушки приводит к частичной инактивации ферментов. В результате протеолитическая активность полученного препарата низкая и составляет не более 2,7 ед/г.
Известен способ получения препарата коллагеназы. В качестве сырья для получения коллагеназы используют гепатопанкреас промысловых видов крабов. Способ включает гомогенизацию гепатопанкреаса крабов в ацетат-аммонийном буфере, содержащем ацетат кальция при рН 6,4-4,7, с последующим осаждением коллагенолитических ферментов сульфатом аммония 60-70% насыщения. Осадок, содержащий коллагеназу, отделяют центрифугированием. Полученный осадок (сульфат-паста) растворяют в воде с добавлением 0,1-1,0 мМ ацетата кальция до получения истинного раствора. Раствор коллагеназы очищают последовательной 2-стадийной ультрафильтрацией на мембранах, отсекающих примесные вещества. На первой стадии ультрафильтрации раствор концентрируют на поливолоконной мембране с задерживающей способностью до 15 кДа. Полученный концентрат разбавляют дистиллированной водой в 5-10 раз и снова концентрируют на мембранном аппарате с размером пор 100 кДа для микрофильтрации с целью удаления высокомолекулярных примесей. В результате 2-стадийной ультрафильтрации происходит концентрирование и обессоливание комплексного препарата коллагеназ. Полученный концентрат снова направляют на ультрафильтрацию, затем промывают водой и отправляют на лиофильную сушку (патент РФ №2265052, C12N 9/48, 9/64, 2005).
К недостаткам способа следует отнести многостадийность очистки и большой расход дистиллированной воды.
Кроме того, на первой стадии ультрафильтрации происходит значительное снижение проницаемости мембраны вследствие концентрационной поляризации, в результате чего в фильтрат переходят стабилизирующие агенты, а также увеличивается время производства. Вдобавок в мембранном аппарате происходит повышение температуры многократно циркулирующей жидкости, что приводит к частичной инактивации фермента.
Наиболее близким по техническому решению к заявленному изобретению является способ получения ферментного препарата, обладающего коллагенолитической активностью. Способ предусматривает выделение фермента экстракцией из гепатопанкреаса краба в присутствии раствора хлорида щелочного металла в течение 14-16 часов. Осадок отделяют через фильтры. Продукт подвергают микрофильтрации для удаления жира, клеточных обломков и микроорганизмов. Далее фильтрат подвергают ультрафильтрации и заканчивают процесс лиофильной сушкой концентрата. При этом микрофильтрацию ведут через фильтры с размером пор 10 мм, 0,5 мм и 0,1 мм, а ультрафильтрацию проводят на мембранных фильтрах с лимитом пропускания 10000 Дальтон (патент РФ №2096456, C12N 9/48, 9/64, опубл. 1997 г.).
Недостатки:
В процессе ультрафильтрации мембранные фильтры «забиваются» балластными веществами и вследствие концентрационной поляризации происходит значительное снижение проницаемости мембраны, поэтому необходимо постоянно промывать мембраны дистиллированной водой для интенсификации процесса, что увеличивает время и затраты производства, а также выход конечного продукта.
Вдобавок в системе для ультрафильтрации происходит повышение температуры циркулирующей жидкости, что приводит к частичной инактивации фермента и, как результат, снижение активности ферментного препарата.
Задачей изобретения является разработка способа получения ферментного препарата с высокой протеолитической активностью, а также повышение выхода ферментного препарата.
Поставленная задача решается тем, что в способе получения ферментного препарата из рыбного сырья, включающем измельчение сырья, выделение фермента экстракцией в присутствии раствора хлорида щелочного металла, отделение осадка, ультрафильтрацию и лиофильную сушку концентрата, ультрафильтрацию осуществляют в две стадии с добавлением в жидкую фракцию дробленого льда: на первой стадии ультрафильтрацию осуществляют на мембране с лимитом пропускания 50 кДа, а на второй стадии на мембране с лимитом пропускания 15 кДа.
При этом выделение фермента экстракцией ведут в присутствии раствора или соляной, или уксусной, или лимонной кислоты.
Технический результат - повышение протеолитической активности ферментного препарата и повышение его выхода.
Заявленный технический результат достигается за счет того, что ультрафильтрацию осуществляют в две стадии на мембранах с пониженной сорбцией белка, а также за счет добавления в жидкую фракцию дробленого льда.
Двухстадийная ультрафильтрация исходного раствора на мембранах с разной задерживающей способностью позволяет с высокой степенью очистить ферментный препарат от балластных веществ и повысить его активность, а также увеличить выход ферментного препарата. Для достижения заявленного технического результата существенно использование мембран с пониженной сорбцией белка, т.к. в процессе ультрафильтрации на таких мембранах не происходит осаждение белка, что позволяет увеличить выход ферментного препарата и решить поставленную задачу.
Причем на 2-й стадии ультрафильтрации осуществляют концентрацию ферментов на мембране, что снижает время на получение ферментного препарата.
Очистка на 1-й стадии ультрафильтрации на мембране с лимитом пропускания 50 кДа позволяет пропускать в фильтрат комплекс протеолитических ферментов, задерживая при этом высокомолекулярные соединения и липиды, что позволяет увеличить степень очистки ферментного препарата.
2-я стадии ультрафильтрации на мембране с лимитом пропускания 15 кДа позволяет сконцентрировать ферментный комплекс, выводя из него низкомолекулярные соединения (соли, пептиды), что также способствует увеличению степени очистки ферментного препарата и увеличить его протеолитическую активность.
Таблица 1
Объем, мл
Общее кол-во белка, г
Протеолитическая активность (ПА)
Степень очистки
Масса ферментов, %
общая, ед.
удельная, ед/г
Исходный гомогенат (сырье + р-р NaCl
10000
1695,6
3730408
2,2
1
100
Отделение осадка
4930
856,1
3510035
4,1
1,8
94,1
1-я стадия ультрафильтрации
4870
240,6
2598610
10,8
4,9
69,7
2-я стадия ультрафильтрации
974
201,9
2301683
11,4
5,2
61,7
Данные таблицы 1 показывают, что полученный ферментный препарат имеет высокую протеолитическую активность (11,4 ед/г), т.е. в сравнении с аналогами этот показатель в 3-5 раз выше и большой выход ферментного препарата (61,7%).
Выделение фермента экстракцией ведут в присутствии раствора кислот, в частности, или соляной, или уксусной, или лимонной. Это также позволяет получить комплекс протеолитических ферментов (ферментный препарат) с высокой протеолитической активностью и большим выходом препарата (таблица 2).
Таблица 2
Ферментный препарат
протеолитическая активность, ед/г
масса ферментов, %
Исходный гомогенат (сырье + р-р соляной кислоты)
10,8
50,9
Исходный гомогенат (сырье + р-р уксусной кислоты)
10,1
45,3
Исходный гомогенат (сырье + р-р лимонной кислоты)
9,7
40,2
Для интенсификации процесса выделения ферментной составляющей на мембранах в дистиллированную воду добавляют дробленый лед в количестве отводимого фильтрата, что способствует повышению проницаемости мембраны. В процессе ультрафильтрации на поверхности мембраны образуется гелевый слой, который забивает поры мембраны и тем самым снижает ее проницаемость. Добавляемый дробленый лед предотвращает забивание пор, повышая тем самым пропускную способность мембраны, позволяя увеличить выход ферментов.
Кроме того, дробленый лед понижает температуру фильтруемой смеси (гомогената), в результате не происходит инактивации ферментов, что способствует сохранению активности ферментов.
Результаты экспериментальных исследований показали, что активность ферментного препарата, полученного заявленным способом, в 3-5 раз выше аналогов.
Пример 1.
50 кг внутренностей горбуши измельчают, добавляют 3% раствор NaCl при гидромодуле 1:2,5 и температуре 35°С и гомогенизируют с одновременной экстракцией в течение 1,5 часов. Гомогенат центрифугируют на центрифуге с принудительным охлаждением. Жидкую фракцию, содержащую протеолитические ферменты, на 1-й стадии ультрафильтрации осветляют и стерилизуют, пропуская через мембрану с лимитом пропускания 50 кДа. Предварительно в жидкую фракцию добавляют 2 кг мелко дробленного льда, что позволяет ускорить процесс ультрафильтрации. Далее фильтрат проходит 2-ю стадию очистки (ультрафильтрацию) на мембране с лимитом пропускания 15 кДа, где концентрируется ферментный препарат (концентрат). Полученный жидкий концентрат фасуют в ампулы или флаконы и подают в камеру для замораживания и высушивают на сублимационной сушке.
Время производства ферментного препарата не более 4 часов.
Выход ферментного препарата 65,2%, протеолитическая активность 11,21 ед/г.
Пример 2.
Выполняют как в примере 1, но берут 1 кг замороженных внутренностей горбуши и измельчают до состояния стружки. В измельченное сырье добавляют 0,04 М HCl-буфер до рН 5,0 в количестве 2,5 литров с температурой 2-5°С. Смесь гомогенизируют с одновременной экстракцией в течение 4 часов.
Время производства ферментного препарата - 6 часов.
Выход ферментного препарата 50,9%, протеолитическая активность 10,8 ед/г.