СПОСОБ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА В ЗАКРЫТОМ ТОНКОМ СЛОЕ СОРБЕНТА И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
METHOD FOR CHROMATOGRAPHIC ANALYSIS IN CLOSED THIN SORBENT LAYER AND APPARATUS FOR REALISING SAID METHOD

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано при анализе смесей органических и неорганических веществ методом тонкослойной хроматографии в различных научных и практических областях медицины, биологии, химии, пищевой промышленности, охране окружающей среды и других отраслей народного хозяйства.
Известны различные способы и устройства для анализа химических веществ методом тонкослойной хроматографии, включающие нанесение анализируемой пробы на тонкослойные пластины, содержащие плоский (планарный) слой сорбента, которые затем устанавливают в специальные проявительные камеры для контакта с жидкой подвижной фазой, за счет восходящего потока которой по слою сорбента происходит разделение исходной пробы на отдельные зоны, а количественную интерпретацию полученных хроматографических данных на слое сорбента осуществляют с помощью УФ сканирующих детекторов (денситометров) (см. Красиков В.Д. Основы планарной хроматографии. - СПб.: Химиздат, 2005. - 232 с.).
Недостатком известных способов и устройств для их осуществления является низкие воспроизводимость и достоверность результатов качественного и количественного анализа, связанные с влиянием степени насыщения хроматографической камеры парами подвижной фазой и влиянием параметров окружающей среды, включая влажность воздуха и наличие в нем примесей, способных изменять сорбционные характеристики сорбентов.
Наиболее близким к заявленному изобретению по совокупности существенных признаков и достигаемому результату является способ хроматографического разделения смесей веществ в закрытом тонком слое сорбента, состоящий в нанесении разделяемых образцов на свободный от полимерного покрытия сорбционный слой, подаче на сорбционный слой элюента с последующим продвижением фронта элюента вдоль сорбционного слоя, причем после достижения фронтом элюента слоя сорбента, находящегося под полимерным покрытием, обеспечивают понижение давление в сорбционном слое перед фронтом элюента вплоть до момента достижения фронтом длины пробега, необходимой для разделения анализируемой смеси веществ.
Наиболее близким к заявленному изобретению по совокупности существенных признаков и достигаемому результату является устройство для хроматографического разделения смесей веществ в закрытом тонком слое сорбента, содержащее тонкослойную хроматографическую пластину с закрытым тонким слоем сорбента, часть сорбционного слоя, свободную от полимерного покрытия, емкость с элюентом, из которой подают элюент на сорбционный слой, а также побудитель расхода элюента с вакуумным насосом (см. Березкин В.Г., Бузаев В.В., Романов Ф.И. Способ хроматографического разделения в закрытом слое сорбента и устройство для его осуществления. Авт. свид. СССР №1457592 от 27.05.1987. // Бюл. Изобр. от 27.02.95).
Однако в известном способе и устройстве для его осуществления не обеспечивается достаточная эффективность разделения хроматографических зон на слое сорбента и точность результатов анализа.
Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является повышение эффективности разделения и точности результатов анализа.
Указанная задача решается за счет того, что в способе хроматографического анализа в закрытом тонком слое сорбента, который включает нанесение анализируемой пробы на сорбент, разделение пробы на отдельные компоненты под действием восходящего потока фиксированного объема жидкой подвижной фазы, соответствующего длине слоя сорбента и количественное определение содержания разделенных на сорбенте компонентов с использованием УФ сканирования хроматографических зон на слое сорбента, причем хроматографическое разделение проводят на сорбенте, помещенном в капиллярную колонку, а расход подвижной фазы регулируют изменением избыточного давления инертного газа на выходе колонки.
2
Эта задача решается также за счет того, что в устройстве для хроматографического анализа в закрытом тонком слое сорбента, содержащем побудитель расхода жидкой подвижной фазы, узел ввода пробы, плоскую пластину с сорбентом, покрытую пленкой для герметизации тонкого слоя сорбента и УФ сканирующий детектор хроматографических зон на слое сорбента, причем для герметизации тонкого слоя сорбента использую г капиллярную колонку, выполненную виде трубки (круглой или прямоугольной) из материала практически не поглощающего УФ излучение, например плавленый SiO или стекло.
Указанная задача решается также за счет того, что в устройстве для хроматографического анализа в закрытом тонком слое сорбента содержится емкость с инертным газом под избыточным давлением соединенная с выходом капиллярной колонки и с помощью регулируемого пневмосопротивления с линией сброса.
При решении поставленной задачи создается технический результат, заключающийся в уменьшении диффузного размытия хроматографических зон сорбатов на слое сорбента.
2
Этот результат достигается за счет проведения хроматографическое разделения на сорбенте, помещенном в капиллярную колонку, выполненную из плавленого кварца (SiO) или стекла, что обеспечивает получение как визуально хроматограммы на слое сорбента, так и в распечатанном виде, после обработки изображения, полученного с помощью УФ сканирующего детектора. При этом размытие хроматографических зон сорбатов происходит только в одном направлении (по направлению движения жидкой подвижной фазы в капиллярной колонке), что увеличивает эффективность хроматографического разделения и точность результатов анализа.
Эффективность разделения увеличивается также за счет возможности выбора оптимальной начальной скорости потока подвижной фазы (меньшей, чем при восходящем потоке за счет капиллярных сил). Это достигается путем варьирования избыточным давлением инертного газа на выходе капиллярной колонки.
В процессе анализа избыточное давление инертного газа будет экспоненциально уменьшатся до нуля, а скорость потока подвижной фазы постепенно увеличиваться за счет регулируемого пневмосопротивления.
Ранее в работе (Березкин В.Г., Онучак Л.А., Евтюгина Е.Н. Капиллярная тонкослойная хроматография антибактериальных производных нитрофурана // Журнал прикл. химии 2009. Т.82. Вып.2. С.317-321) было показано, эффективность разделения методом тонкослойной хроматографии при использовании сорбента в капиллярной колонке, понижается с увеличением скорости потока подвижной фазы.
Кроме того, при решении поставленной задачи повышается прецизионность измерений (сходимость в условиях повторяемости) за счет уменьшения влияния состава газовой фазы на хроматографические характеристики сорбента (влажность, содержание примесей в воздухе и др.). путем использования инертного газа под избыточным давлением на выходе капиллярной колонки.
Это позволяет сделать вывод, что заявляемые изобретения связаны между собой единым изобретательским смыслом.
Пример конкретного выполнения способа и устройство для его осуществления
На фиг.1 схематически изображено устройство для хроматографического анализа в закрытом тонком слое сорбента.
Устройство содержит капиллярную колонку с сорбентом 1, емкость с жидкой подвижной фазой 2, блок подготовки инертного газа 3, емкость с инертным газом под избыточным давлением 4, регулируемое пневмосопротивление 5 и клапан 6.
Предполагаемое устройство работает следующим образом.
Анализируемую пробу дозируют микрошприцем непосредственно на слой сорбента входа капиллярной колонки 1 и погружают вход колонки в емкость с подвижной фазой 2. Разделение компонентов происходит в восходящем потоке подвижной фазы за счет капиллярных сил в порах сорбента. Оптимальную начальную скорость восходящего потока подвижной фазы устанавливают путем изменения избыточного давления инертного газа в емкости 4 после закрытия клапана 6, а общее время анализа, когда избыточное давление инертного газа на выходе колонки равно нулю, задают с помощью регулируемого пневмосопротивления 5 в линии сброса. После завершения процесса хроматографирования (подвижная фаза поднялась по слою сорбента на требуемую высоту), капиллярную колонку 1 переносят в УФ сканирующий детектор для получения хроматограммы с пиками определяемых компонентов.
Экспериментальная оценка выполнения предлагаемого и известного способов хроматографического анализа в закрытом тонком слое сорбента проводилась на примере разделения некоторых лекарственных препаратов группы нитрофурана. Для этого использовали градуировочную смесь, приготовленную гравиметрическим методом, содержащую фурацилин - 48,0% масс., фурагин - 24,0% масс. и фуразолидон - 28,0% масс. В качестве жидкой подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила и хлороформа 1:1. Распечатку хроматограммы на слое сорбента получали с использованием видеоденситометра «Сорбфил» производства ЗАО «Сорбполимер», г.Краснодар.
Из полученных хроматограмм (выборка из n≥5 анализов) рассчитывали следующие хроматографические характеристики сорбатов:
<mrow><msub><mrow><mover accent="true"><mi>C</mi><mo stretchy="true">¯</mo></mover></mrow><mi>i</mi></msub></mrow>
1. Концентрацию анализируемых веществ, измеренную методом внутренней нормализации,
<mrow><msub><mrow><mover accent="true"><mi>C</mi><mo stretchy="true">¯</mo></mover></mrow><mi>i</mi></msub><mo>=</mo><mfrac><mrow><mstyle displaystyle="true"><munderover><mo>∑</mo><mn>1</mn><mi>n</mi></munderover><mrow><msub><mi>C</mi><mi>i</mi></msub></mrow></mstyle></mrow><mi>n</mi></mfrac></mrow>
,
<mrow><msub><mi>C</mi><mi>i</mi></msub><mo>=</mo><mfrac><mrow><msub><mi>Q</mi><mi>i</mi></msub></mrow><mrow><mstyle displaystyle="true"><munderover><mo>∑</mo><mn>1</mn><mi>N</mi></munderover><mrow><msub><mi>Q</mi><mi>i</mi></msub></mrow></mstyle></mrow></mfrac><mo>⋅</mo><mn>1</mn><mn>0</mn><mn>0</mn></mrow>
i
где
- единичное измерение концентрации i-го компонента в выборке; Q - площадь хроматографического пика i-го компонента пробы; N - общее число пиков на хроматограмме (N=3).
2. Правильность измерения, δ
<mrow><mi>δ</mi><mo>=</mo><mfrac><mrow><mover accent="true"><mrow><msub><mi>C</mi><mi>i</mi></msub></mrow><mo stretchy="true">¯</mo></mover><mo>−</mo><msub><mi>C</mi><mrow><mi>i</mi><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>и</mi><mi>с</mi><mi>т</mi></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow></msub></mrow><mrow><msub><mi>C</mi><mrow><mi>i</mi><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>и</mi><mi>с</mi><mi>т</mi></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow></msub></mrow></mfrac><mo>⋅</mo><mn>1</mn><mn>0</mn><mn>0</mn></mrow>
,
i(ист)
<mrow><msub><mrow><mover accent="true"><mi>C</mi><mo stretchy="true">¯</mo></mover></mrow><mi>i</mi></msub></mrow>
где C - истинная концентрация i-го компонента в градуировочной смеси;
- измеренная концентрация.
r
3. Прецизионность измерения в виде относительной случайной составляющей погрешности измерения, S
<mrow><msub><mi>S</mi><mi>r</mi></msub><mo>=</mo><mfrac><mn>1</mn><mrow><mover accent="true"><mrow><msub><mi>C</mi><mi>i</mi></msub></mrow><mo stretchy="true">¯</mo></mover></mrow></mfrac><msqrt><mrow><mfrac><mrow><mstyle displaystyle="true"><munderover><mo>∑</mo><mn>1</mn><mi>n</mi></munderover><mrow><msup><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><msub><mi>C</mi><mi>i</mi></msub><mo>−</mo><mover accent="true"><mrow><msub><mi>C</mi><mi>i</mi></msub></mrow><mo stretchy="true">¯</mo></mover></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mn>2</mn></msup></mrow></mstyle></mrow><mrow><mi>n</mi><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>n</mi><mo>−</mo><mn>1</mn></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow></mfrac></mrow></msqrt></mrow>
,
r
где S - относительное среднее квадратичное отклонение (СКО) среднего арифметического результата измерения.
4. Число теоретических тарелок, N
<mrow><msub><mi>N</mi><mi>i</mi></msub><mo>=</mo><mn>1</mn><mn>6</mn><msup><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><mfrac><mrow><msub><mi>l</mi><mi>i</mi></msub></mrow><mrow><msub><mi>w</mi><mrow><msub><mi>b</mi><mi>i</mi></msub></mrow></msub></mrow></mfrac></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mn>2</mn></msup></mrow>
,
i
b
где l, - расстояние, пройденное сорбатом от начала анализа до максимума пика, w - ширина хроматографического пика у основания.
p
Хроматографическое разделение известным способом проводили на ТСХ пластине Soibfil ПТСХ-АФ-А-УФ с диаметром зерна сорбента d 5-7 мкм.
Анализируемую пробу объемом окало 2 мкл наносили на свободный от полимерного покрытия сорбционный слой. Затем ТСХ пластину устанавливали в хроматографическую камеру с элюентом. После того как фронт элюента поднимается вдоль слоя до сорбента, находящегося под полимерным покрытием, которое герметизирует тонкий слой сорбента. включают побудитель расхода с вакуумным насосом. Элюент принудительно под некоторым разряжением движется по слою сорбента и происходит разделение смеси на отдельные хроматографические зоны на слое сорбента. Затем ТСХ пластину помещают в денситометр «Сорбфил» и получают распечатанную хроматограмму.
c
Хроматографическое разделение предлагаемым способом проводила на сорбенте, идентичном в известном способе. Сорбент помещали в кварцевый капилляр с внутренним диаметром d=0,5 мм. Длина капилляра не превышала 60 мм. Анализируемую пробу объемом около 2 мкл дозировали на сорбент входа колонки.
Результаты экспериментов представлены в таблице «Сравнительные данные экспериментальной проверки известного и предлагаемого способов».
Сравнительные данные экспериментальной проверки известного и предлагаемого способов
Сорбаты
C<sub>i(ист)</sub>
Известный способ
Предлагаемый способ
<maths num="8"><math display="block"><mrow><msub><mrow><mover accent="true"><mi>C</mi><mo stretchy="true">¯</mo></mover></mrow><mi>i</mi></msub></mrow></math><img file="00000008.tif" he="6" wi="5" img-content="undefined" img-format="tif" /></maths>
δ
S<sub>r</sub>
N
<maths num="9"><math display="block"><mrow><msub><mrow><mover accent="true"><mi>C</mi><mo stretchy="true">¯</mo></mover></mrow><mi>i</mi></msub></mrow></math><img file="00000008.tif" he="6" wi="5" img-content="undefined" img-format="tif" /></maths>
δ
S<sub>r</sub>
N
Фурацилин
48,0
52,0
8,3
0,37
48
45,0
6,3
0,22
98
Фурагин
24,0
31,0
29,2
0,20
145
21,0
12,5
0,13
1292
Фуразолидон
28,0
17,0
39,3
0,05
353
34,0
21,4
0,03
6340
r
Как видно из приведенных в таблице данных в предлагаемой способе по сравнению с известным значительно увеличивается эффективность разделения. Например, для фуразолидона число теоретических тарелок N увеличилось почти в 18 раз. Точность предлагаемого способа выше известного. Так правильность и прецизионность результатов хроматографического анализа, например, для фурагина, увеличилась в 2,3 и в 1,5 раза соответственно (δ и S имеют меньшие значения).
Использование предлагаемого способа хроматографического анализа в закрытом тонком слое сорбента и устройства для его осуществления позволяет:
1. Упростить конструкцию хроматографического устройства для разделения в закрытом тонком слое за счет исключения из хроматографического процесса операции проявления хроматограммы в специальной камере.
2. Значительно уменьшить количество жидкой подвижной фазы, необходимой для анализа.
3. Улучшить метрологические характеристики хроматографического анализа.