СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОТНОСИТЕЛЬНОГО СОДЕРЖАНИЯ ПРОТОПОРФИРИНА IХ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЯХ
METHOD OF BIOLOGICAL TISSUES ANALYSIS FOR PROTOPORPHYRIN FRACTION

Изобретение относится к медицине и предназначено определения относительного содержания протопорфирина IX в биологических тканях без использования экзогенных фотосенсибилизаторов и препаратов, индуцирующих аутофлуоресценцию.
Относительное содержание протопорфирина IX в тканях близко пропорционально удельной доле флуоресценции протопорфирина IX в суммарном спектре аутофлуоресценции при длине волны возбуждающего излучения 632.8 нм. Ранее вклад флуоресценции протопорфирина IX в суммарный спектр аутофлуоресценции не оценивался. В ближайшем аналоге относительное содержание протопорфирина IX в биологических тканях также оценивается путем анализа спектра аутофлуоресценции при длине волны возбуждающего излучения 632.8 нм, с тем отличием, что полученный спектр аутофлуоресценции тканей оценивается как полностью определяющийся люминесценцией протопорфиринов без учета вклада в суммарный спектр аутофлуоресценции других эндогенных флуорофоров [http://vrach-aspirant.ru/lib_show/12.html]. Поэтому до настоящего времени не существовало метода определения удельной доли протопорфирина IX в суммарном спектре аутофлуоресценции, основанного только на анализе спектра нативной аутофлуоресценции при длине волны возбуждающего излучения 632.8 нм.
Задачей изобретения является разработка нового способа определения относительного содержания протопорфирина IX в биологических тканях путем анализа спектра нативной аутофлуоресценции без использования экзогенных флуорофоров и препаратов, индуцирующих аутофлуоресценцию.
1
2
2
Ткани человека содержат большое число разнообразных природных флуорофоров, которые имеют различные спектральные области флуоресценции. Некоторые флуорофоры имеют близкие или перекрывающиеся области флуоресценции, в результате чего полученное от тканей излучение флуоресценции имеет сложный спектральный состав. Например, если регистрируются два сигнала флуоресценции: первый - от флуорофора 1 (спектр 1, фиг.1) в диапазоне длин волн Δl и второй - от флуофора 2 (спектр 2, фиг.1) в диапазоне Δl, то часть спектра 1 может перекрываться со спектром 2. В результате в диапазоне Δl будет регистрироваться не сигнал, пропорциональный количеству флуорохрома 2, а суммарный сигнал от спектров 1 и 2 (спектр 3, фиг.1) [Van Dilla M.A., Dean P.N., Laerum O.D., Melamed M.R. (eds.) ”Flow Cytometry: Instrumentation and Data Analysis”, Acad. Press, London, 1985]. Поэтому спектр нативной аутофлуоресценции тканей носит сложный составной характер. Аутофлуоресценция тканей в красной области спектра характеризуется меньшей интенсивностью флуоресценции по сравнению с интенсивностью флуоресценции в УФА и коротковолновой видимой областях. Одним из эндогенных флуорофоров, флуоресцирующих в красной области спектра, является протопорфирин IX. В силу преимущественного накопления протопорфирина IX в опухолевой ткани возникает флуоресцентный контраст между опухолью и окружающей ее здоровой тканью, что может применяться с целью флуоресцентной диагностики новообразований различной локализации. Ранее считалось, что протопорфирин IX полностью формирует спектр аутофлуоресценции при использовании длины волны возбуждающего излучения 632.8 нм [Синичкин Ю.П., Утц С.Р. In vivo отражательная и флуоресцентная спектроскопия кожи человека. - Саратов: 2001].
Техническим результатом предлагаемого способа является возможность определения истинного относительного содержания протопорфирина IX в биологических тканях с исключением ошибок, связанных со сложным составным характером суммарного спектра аутофлуоресценции.
Технический результат достигается за счет того, что относительное содержание протопорфирина IX в биологических тканях оценивают как пропорциональное удельной доле его флуоресценции в суммарном спектре аутофлуоресценции, которую определяют по формуле.
При анализе спектра нативной аутофлуоресценции тканей человека нами были получены данные, что коллаген, кератин и порфирин определяют более 97% суммарного спектра в диапазоне 650-800 нм, при λех=632,8. Одновременно с этим спектр флуоресценции кератина практически неотличим от спектра флуоресценции высокогидратированного коллагена. Из последнего следует, что любой произвольный спектр моделируется суммой двух спектров эталонов, взятых с разными коэффициентами. Первым эталоном может выступать нативный спектр коллагена или кератина, вторым - спектр водного раствора синтетического протопорфирина-IX.
мод
кер
пп
F(λ)=k* F(λ)+m*F(λ),
мод
кер
пп
где F(λ) - модельный суммарный спектр, F(λ) - эталонный спектр кератина, F(λ) - эталонный спектр протопорфиринов при 650≤λ≤800.
При вычислении долевого участия протопорфирина IX в формировании произвольного суммарного спектра критерием оценки может служить максимальная корреляция между произвольным суммарным спектром и модельным. Модельный синтезированный спектр из двух спектров-эталонов коррелирует с наблюдаемым спектром с коэффициентом 0.97-0.99, что является доказательством того, что доля спектра флуоресценции протопорфирина IX в анализируемом суммарном спектре аутофлуоресценции вычислена достоверно (фиг.2).
1
2
3
n
1
2
3
n
1
2
3
n
ППIX
Способ осуществляют следующим образом. Проводят спектроскопию анализируемого участка кожи или слизистой оболочки с помощью флуоресцентно-спектроскопической установки, например ЛЭСА-01 (ГОСТ Р 50460-92)(гелий-неоновый лазер, 632.8 нм). Регистрацию полученного суммарного спектра аутофлуоресценции проводят с помощью компьютерной программы LESA-Soft '9” для MS Windows 1998-2000. Запись спектра аутофлуоресценции производят в виде массива данных, состоящего из значений интенсивности флуоресценции для последовательности длин волн от 649 нм до 850 нм с шагом 0.43 нм {Z, Z, Z…Z}. Эталонный спектр кератина записывают в виде массива данных, состоящего из интенсивностей флуоресценции кератина для последовательности длин волн от 649 нм до 850 нм с шагом 0.43 нм {Y, Y, Y…Y} и для протопорфирина IX для тех же значений длин волн {X, X, X…X}. Относительное содержание протопорфирина IX (I%) в суммарном спектре аутофлуоресценции вычисляют по формуле
,
1
2
n
1
2
n
где {k k…k} и {ll…l} вычисляют по формулам
; ,
где α и β вычисляют по формулам
,
1
2
n
1
2
n
1
2
n
1
2
n
1
2
n
1
2
n
где {a а…a}, {b b…b}, {ab аb…ab}, {f f…f}, {fa fa…fa}, {fb fb…fb} вычисляют по формулам
где Хср, Ycp и Zcp вычисляют по формулам
cp
1
2
3
n
X=(X+X+X…X)/n;
cp
1
2
3
n
Y=(Y+Y+Y…Y)/n;
cp
1
2
3
n
Z=(Z+Z+Z…Z)/n;,
где n - количество записей в массивах данных, состоящего из значений интенсивности флуоресценции;
Полученное значение доли флуоресценции протопорфирина IX в анализируемом спектре аутофлуоресценции является пропорциональным относительному содержанию протопорфирина IX в биологических тканях.
Пример 1
Пациент И., 30 лет.
Клинический диагноз: каппилярная гемангиома кожи груди.
1
2
3
n
1
2
3
n
1
2
3
n
ППIX
С помощью флуоресцентно-спектроскопической установки (гелий-неоновый лазер 632.8 нм) проводят спектроскопию зоны гемангиомы и окружающей ее здоровой кожи груди. Регистрацию полученных суммарных спектров аутофлуоресценции проводят с помощью компьютерной программы LESA-Soft '9” для MS Windows 1998-2000. Запись спектра аутофлуоресценции производят в виде массива данных, состоящего из значений интенсивности флуоресценции для последовательности длин волн от 649 нм до 850 нм с шагом 0.43 нм {Z, Z, Z…Z}. Эталонный спектр кератина записывают в виде массива данных, состоящего из интенсивностей флуоресценции кератина для последовательности длин волн от 649 нм до 850 нм с шагом 0.43 нм {Y, Y, Y…Y} и для протопорфирина IX для тех же значений длин волн {X, X, X…X}. Относительное содержание протопорфирина IX (I%) в суммарном спектре аутофлуоресценции вычисляют по указанной в описании формуле.
Доля флуоресценции протопорфирина IX в спектре аутофлуоресценции капиллярной гемангиомы составила 27.8%, удельная доля флуоресценции протопорфирина IX в спектре аутофлуоресценции кожи груди составила 29.4%. Полученные значения пропорциональны относительному содержанию протопорфирина IX в ткани гемангиомы и в окружающей его коже груди.
Пример 2
Пациентка Ф., 65 лет.
Клинический диагноз: Базально-клеточный рак (БКР) кожи нижнего века левого глаза.
1
2
3
n
1
2
3
n
1
2
3
n
ППIX
С помощью флуоресцентно-спектроскопической установки (гелий-неоновый лазер 632.8 нм) проводят спектроскопию зоны БКР и окружающей ее здоровой кожи нижнего века. Регистрацию полученных суммарных спектров аутофлуоресценции проводят с помощью компьютерной программы LESA-Soft '9” для MS Windows 1998-2000. Запись спектра аутофлуоресценции производят в виде массива данных, состоящего из значений интенсивности флуоресценции для последовательности длин волн от 649 нм до 850 нм с шагом 0.43 нм {Z, Z, Z…Z}. Эталонный спектр кератина записывают в виде массива данных, состоящего из интенсивностей флуоресценции кератина для последовательности длин волн от 649 нм до 850 нм с шагом 0.43 нм {Y, Y, Y…Y} и для протопорфирина IX для тех же значений длин волн {X, X, X…X}. Относительное содержание протопорфирина IX (I%) в суммарном спектре аутофлуоресценции вычисляют по указанной в описании формуле.
Доля флуоресценции протопорфирина IX в спектре аутофлуоресценции БКР составила 36.8±2.6%, в то же время удельная доля флуоресценции протопорфирина IX в спектре аутофлуоресценции кожи нижнего века составила 26.4±3.0%. Полученные значения пропорциональны относительному содержанию протопорфирина IX в ткани БКР и в окружающей его коже нижнего века.
Таким образом, предложенный способ позволяет определить относительное содержание протопорфирина IX в биологических тканях с исключением погрешностей, связанных с включением в суммарный спектр аутофлуоресценции спектров флуоресценции других эндогенных флуорофоров, что в дальнейшем может использоваться для диагностики новообразований.