СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ГЛОБАЛЬНОЙ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА У МЕЛКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
METHOD FOR SIMULATING GLOBAL CEREBRAL ISCHEMIA IN SMALL LABORATORY ANIMALS

Представляемые материалы заявки на изобретение относятся к экспериментальной медицине и биологии и, в частности, могут быть использованы для моделирования и исследования последствий глобального ишемического и реперфузионного повреждения головного мозга, а также для проведения ишемического прекондиционирования (ПреК) и ишемического посткондиционирования (ПостК) всего головного мозга.
Изучение острого нарушения мозгового кровообращения - одна из актуальных задач медицины, т.к. острые нарушения мозгового кровообращения занимают третье место по показателям смертности населения.
Глобальное ишемическое-реперфузионное повреждение головного мозга возникает при выполнении реанимационных мероприятий после внезапной остановки сердца, при перинатальной гипоксии, при проведении операций на голове и шее (эндартерэктомия сонных артерий), а также нередко сопутствует выполнению кардиохирургических операций в условиях искусственного кровообращения.
Исследования, направленные на изучение ишемического и реперфузионного поражения при обратимой глобальной ишемии головного мозга, сдерживаются отсутствием оптимальной экспериментальной модели, позволяющей воспроизводить обратимую ишемию с последующей реперфузией во всех отделах головного мозга подопытного животного.
Известны две модели глобальной ишемии у крыс - это двухсосудистая модель с гипотонией и четырехсосудистая модель.
Изучению фокального ишемическо-реперфузионного повреждения головного мозга посвящено много экспериментальных работ. При этом исследований, направленных на изучение ишемического и реперфузионного поражения при обратимой глобальной ишемии головного мозга, практически нет. Это во многом связано с отсутствием оптимальной экспериментальной модели, позволяющей воспроизводить обратимую ишемию с последующей реперфузией во всех отделах головного мозга животного. Сегодня широко используются только две модели глобальной ишемии у крыс - это двухсосудистая модель с гипотонией и четырехсосудистая модель.
Известна двухсосудистая модель глобальной ишемии с уменьшением артериального давления,
Smith ML, Bendek G, Dahlgren N, Rosén I, Wieloch T, Siesjö BK Models for studying long-term recovery following forebrain ischemia in the rat. 2. A 2-vessel occlusion model. Acta Neurol Scand. 1984 Jun; 69(6): 385-401, в которой в один этап производят окклюзию двух общих сонных артерий с одновременным понижением артериального давления. Однако данная модель имеет существенный недостаток - системная гипотония приводит к генерализованным метаболическим нарушениям в жизненно важных органах, включая мозг.
Известна модель глобальной ишемии головного мозга у крыс, формируемая за счет окклюзии четырех главных артерий, кровоснабжающих головной мозг.
Pulsinelli WA, Brierley JB. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat. Stroke. 1979 May-Jun; 10(3): 267-72,
В данной модели формирование глобальной ишемии проводится в два этапа в течение двух дней. В первый день проводится постоянная окклюзия обеих вертебральных артерий, во второй - окклюзия двух общих сонных артерий. Критерием наличия глобальной ишемии мозга служит потеря установочного рефлекса, которая наблюдается, однако, только у 77% животных.
Недостатками четырехсосудистой модели являются
- необходимость в глубоком и травматическом хирургическом доступе, сопряженном со значительным повреждением мышечной ткани,
- вероятность неполной окклюзии позвоночных артерий,
- возможность массивного кровотечения,
- зависимость от диаметра for alare первого шейного позвонка, имеющего большую вариабельность,
- необходимость выполнения вмешательства в два этапа,
- относительно невысокий процент (77%) животных, демонстрирующих потерю установочного рефлекса.
Известен модифицированный способ
Sugio К, Horigome N, Sakaguchi T, Goto M. A model of bilateral hemispheric ischemia-modified four-vessel occlusion in rats. Stroke. 1988 Jul; 19(7): 922,
в котором предложено коагулировать вертебральные артерии между первым и вторым шейными позвонками. Для контроля возможного коллатерального кровотока после коагуляции вертебральных артерий через 24 часа проводили окклюзию двух общих сонных артерий и затем проводили сжатие передней мышцы шеи и паравертебральных мышц с целью окклюзии коллатеральных сосудов, что позволило увеличить долю животных, демонстрирующих потерю установочного рефлекса, до 90%.
Pulsinelli WA and Buchan AM The four-vessel occlusion rat model: method for complete occlusion of vertebral arteries and control of collateral circulation Stroke 1988; 19; 913-914,
Однако существенный недостаток модифицированного способа - это выраженное кровотечение при коагуляции вертебральных артерий.
Также указанный способ, предполагающий коагуляцию вертебральных артерий, не дает возможности исследовать обратимое ишемическое и реперфузионное повреждение задних отделов мозга, тогда как в реальной клинической ситуации имеет место именно глобальная ишемия головного мозга, затрагивающая все его отделы с последующей реперфузией.
В модифицированном способе при выполнении ишемического посткондиционирования защите от реперфузионного повреждения подвергаются только передние отделы головного мозга. Это не позволяет оценить защитное влияние ишемического посткондиционирования, формирующееся в головном мозге как в целом органе, подвергшемся глобальной ишемии. Кроме того, при использовании этой модели головной мозг в течение суток снабжается кровью только за счет общих сонных артерий, находится в состоянии гипоперфузии, что может влиять на интерпретацию результатов.
Известна модификация четырехсосудистой модели с наложением хирургических микрозажимов на вертебральные артерии между вторым и третьим шейными позвонками в один этап при одномоментной окклюзии общих сонных артерий,
Yamaguchi М, Calvert JW, Kusaka G, Zhang JH. One-stage anterior approach for four-vessel occlusion in rat. Stroke. 2005 Oct; 36(10): 2212-4. Epub 2005 Sep 15.
Однако, т.к. вертебральные артерии имеют очень тонкую стенку, все манипуляции с ними затруднены и могут с высокой долей вероятности сопровождаться разрывом стенки артерии, формированием пристеночных и окклюзирующих тромбов и т.д. Кроме того, мозговой кровоток при реализации данного способа удается уменьшить только до 12% и 14% от контрольного уровня, т.е. не исключается коллатеральное кровоснабжение головного мозга.
Задачей данной разработки является создание модели глобальной ишемии головного мозга, проводимой в один этап и позволяющей моделировать ишемическое и реперфузионное повреждение всего головного мозга заданной продолжительности с наименьшими травматическими последствиями и высоким процентом достижения состояния глобальной ишемии.
Для решения поставленной задачи предлагается способ моделирования глобальной ишемии головного мозга, включающий проведение обратимой экстракраниальной окклюзии сосудов, кровоснабжающих головной мозг, а именно плечеголовного ствола, левой подключичной артерии и левой общей сонной артерии (tr.brachiocephalicus, a.subclavia sin., a.carotis communis sin), позволяющий проводить операцию одноэтапно за счет создания полной ишемии головного мозга в рамках единственного оперативного вмешательства. Продолжительность ишемического эпизода может быть четко задана и определяется временем окклюзии вышеуказанных сосудов микрососудистыми зажимами. Предложенный способ позволяет уменьшить травматичность вмешательства за счет отсутствия необходимости выполнять сложный и глубокий доступ к вертебральным артериям. Предложенный способ позволяет увеличить количество подопытных животных, введенных в состояние глобальной ишемии, практически до 100% результата за счет выполнения легко контролируемой процедуры обратимого наложения микрососудистых зажимов на основные артерии, кровоснабжающие головной мозг.
Данный способ был проверен в экспериментах с животными.
Материал исследования. Все эксперименты были проведены в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных» (публикация Национального Института Здоровья США №85-23) и были одобрены этическим комитетом Федерального Центра сердца, крови и эндокринологии им. В.А.Алмазова.
Эксперименты выполнялись на крысах самцах линии Wistar массой 220-250 грамм (питомник «Рапполово»), содержащихся в условиях 12/12 часового светового режима и получавших стандартный корм и питьевую воду ad libitum. Животных наркотизировали хлоралгидратом (450 мг/кг, внутрибрюшинно). Крысу интубировали и подключали к аппарату искусственной вентиляции легких для мелких лабораторных животных («SAR 830», USA). Животное, лежащее на спине, фиксировалось за конечности. На коже производился L-образный разрез, по средней линии груди, а затем в подмышечную область, после чего кожа отделялась по линиям разреза. Аналогичным образом, отступя 1 мм от сагиттальной линии, отделялись большая и малая мышцы груди. Затем производился разрез по нижнему краю III ребра, через который осуществлялся доступ в грудную клетку. Производилось выделение дуги аорты и отходящих от нее магистральных сосудов: плечеголовного ствола, левой подключичной артерии и левой общей сонной артерии (tr.brachiocephalicus, a.subclavia sin., a.carotis communis sin). Под выделенные сосуды подводились лигатуры и затем накладывались микрохирургические зажимы, что приводило к прекращению кровоснабжения головного мозга. Снятие зажимов через 5, 10 и 15 минут позволяло восстановить перфузию головного мозга. Для анализа выживаемости животных в ходе моделирования глобальной ишемии головного мозга проводили ложную операцию, т.е. без наложения зажимов. Далее ликвидировали пневмоторакс и послойно ушивали операционные раны. Герметизация грудной полости производилась за счет наложения межреберных швов и закрытия раны отделенными ранее пластами мышц и кожи. Затем сшивали произведенные в начале операции L-образные разрезы. Швы обрабатывали иодинолом. Заключающий этап операции предполагал восстановление самостоятельного дыхания. Из ротовой полости и трахеи удаляли слизь, после чего производили отключение аппарата искусственной вентиляции легких. Через 3 минуты после возникновения самостоятельного дыхания животное экстубировали. Все манипуляции проводились на термостатируемом операционном столике при температуре 37°C. В послеоперационном периоде до момента выхода животных из наркоза их температура также поддерживалась на постоянном уровне за счет внешнего источника тепла. Через 48 часов наркотизированное животное подвергалось декапитации. Проводилось гистологическое исследование с окраской фронтальных срезов головного мозга гематоксилином и эозином.
Для подтверждения отсутствия кровообращения головного мозга при пережатии магистральных сосудов, отходящих от сердца, проводились специальные дополнительные эксперименты. У животных вскрывали обе сонные артерии и проводили прокалывание a.vertebralis через for.alare первого шейного позвонка. В то время как были наложены зажимы на магистральные сосуды, кровь не вытекала, при снятии зажимов наблюдалось сильное кровотечение из сонных и вертебральных артерий. Второй дополнительный эксперимент заключался во введении 1,5 мл 1% синего Эванса в бедренную артерию крысы на протяжении всего периода глобальной ишемии головного мозга. При наложенных зажимах на магистральные сосуды головной мозг и ткани, выстилающие внутреннюю поверхность черепа, не окрашивались синим Эванса в отличие от эксперимента с неналоженными зажимами.
При гистологическом анализе фронтальных срезов головного мозга животных с 5-, 10-, 15-минутной глобальной ишемией были обнаружены в 100% случаев морфологические изменения тканей головного мозга. Степень ишемического повреждения зависела от области головного мозга и длительности ишемии. Обнаруженная закономерность характерна для ишемического повреждения различных структур головного мозга.
Технический результат предлагаемого для рассмотрения способа заключается в возможности моделировать обратимое ишемическое и реперфузионное повреждение всех отделов головного мозга и воспроизводить эпизоды ишемии и реперфузии головного мозга заданной продолжительности.
Предлагаемый для рассмотрения способ моделирования был разработан и опробован в ФГУ «Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии им. В.А.Алмазова Росмедтехнологии» в г.Санкт-Петербурге. Проведенные эксперименты показали хорошую воспроизводимость результатов модели ишемии и реперфузии головного мозга. Модель позволяет моделировать ишемическое и реперфузионное повреждение тканей головного мозга, подтвержденное при применении различных красителей как в эксперименте in vivo, так и в гистологических образцах тканей. Модель характеризуется воспроизводимостью, достаточно высокой выживаемостью животных после хирургического вмешательства, дает возможность проводить эксперименты на различных линиях крыс, животные в эксперимент могут браться с большим весовым разбросом, а также возможно применение данного способа на других видах животных - морских свинках, мышах, монгольских песчанках.
Преимущества данного способа заключаются в том, что он позволяет
- производить эпизоды ишемии и реперфузии различной длительности, стандартизированные с учетом протокола эксперимента,
- моделирование глобальной ишемии проводить в один день,
- головной мозг не находится в состоянии гипоперфузии в течение суток из-за коагуляции вертебральных артерий,
- исключить вероятность коллатерального кровоснабжения головного мозга за счет ветвей подключичных и плечевых артерий, проходящих в мышцах шеи,
- в организме не возникает генерализованных метаболических нарушений в жизненно важных органах, включая мозг.
Таким образом, предлагаемый способ моделирования позволяет моделировать ишемическое и реперфузионное повреждение головного мозга как целого органа в условиях всего организма, и, таким образом, данная модель позволяет моделировать патологию, наблюдаемую в клинической практике при остановке сердца и при последующих реанимационных действиях, при асфиксии, при хирургических операциях с применением искусственного кровообращения, при проведении хирургических вмешательств на крупных сосудах. Предложенный способ позволяет расширить представления о патофизиологических механизмах глобальной ишемии головного мозга, определить зоны и структуры головного мозга, подвергающиеся наибольшему повреждению при глобальной ишемии, зоны гипоперфузии, формирующиеся при восстановлении кровотока после периода глобальной ишемии головного мозга. Модель позволяет изучить механизмы экзогенной (фармакологической) и эндогенной нейропротекции, включая ишемическое прекондиционирование и посткондиционирование и дать рекомендации для применения данных подходов в клинической практике.