СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ ПРИ АЛКОГОЛЬНОМ ГЕПАТИТЕ
METHOD FOR PREDICTION OF CLINICAL EFFECTIVENESS IN ALCOHOLIC HEPATITIS

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимическим методам клинической диагностики, может быть использовано для прогнозирования эффективности лечения алкогольного поражения печени, основанного на оценке степени активности гамма-глутамилтрансферазы и состояния антиоксидантной системы организма.
В настоящее время в диагностике алкогольных гепатитов и оценке эффективности проводимого лечения широко используется определение активности ферментов: аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, гамма-глутамилтрансфераза, щелочная фосфатаза. Однако активность данных ферментов меняется и при других патологических состояниях и не отражает состояние антиоксидантной системы организма, функционирование которой существенно нарушается при алкогольном поражении печени.
Известно, что для оценки тяжести поражения печени при алкогольном гепатите и эффективности лечения применяется коэффициент Де Ритиса (соотношение аспартатаминотрансфераза /аланинаминотрансфераза). В норме коэффициент де Ритиса близок к 1,0. Развитие патологического процесса в печени ассоциируется со снижением этого показателя до 0,7 и ниже - при хронических активных гепатитах [Хазанов А.И. Функциональная диагностика болезней печени. - М.: Медицина, 1988]. Однако данный коэффициент не отражает степень нарушения функционирования антиоксидантной системы организма.
В последнее время все большее значение в диагностике заболеваний печени и гепато-билиарного тракта приобретает тест по определению активности гамма-глутамилтранспептидазы, который отличается большей чувствительностью, чем применяемые с этой целью тесты на аланинаминотрансферазу и аспартатаминотрансферазу. Определение активности гамма-глутамилтранспептидазы используется в частности для диагностики алкогольного поражения печени, а также для контроля проводимого лечения. Известно, что алкоголь усиливает продукцию гамма-глутамилтранспептидазы, что способствует ее выходу из гепатоцитов и приводит к повышению активности фермента в сыворотке крови даже при отсутствии патологии печени [Голованова Е. В. Диагностика и лечение внутрипеченочного холестаза при хронических заболеваниях печени: дисс. д.м.н., Москва, 2008]. Гамма-глутамилтранспептидаза катализирует перенос гамма-глутамилового остатка с гамма-глутамилового пептида на аминокислоту, другой пептид или иной субстрат. В организме человека фермент участвует в метаболизме глутатиона - пептида, состоящего из остатков глутаминовой кислоты, цистеина, глицина, который играет важную роль в регуляции антиоксидантной системы организма. Восстановленный глутатион относится к ферментативному звену антиоксидантной системы, его основной функцией является защита сульфгидрильных групп белков и мембран клеток от действия активных форм кислорода, генерация которых чрезмерно повышается при алкогольном гепатите. В частности, глутатион является акцептором гидроксильного радикала, а также косубстратом глутатионпероксидазы, инактивирующей гидропероксиды [Биохимия: учеб. для вузов, под ред. Е.С. Северина., 2003, стр.428-432]. Однако детальных сведений об использовании фермента гамма-глутамилтранспептидаза как отдельно взятого показателя или в составе комплекса показателей в качестве инструмента для оценки эффективности лечения алкогольных поражений печени в доступной литературе не обнаружено.
Технический результат - разработка способа прогнозирования эффективности лечения алкогольного гепатита с использованием нового коэффициента, учитывающего активность гамма-глутамилтранспептидазы и уровень восстановленного глутатиона, позволяющего повысить специфичность оценки, более корректно спланировать интенсивность и продолжительность курса лечения. Коэффициент позволяет определить степень поражения гепатобилиарной системы на фоне измененного антиоксидантного статуса организма, что обеспечивает повышение ценности обнаруживаемых изменений в прогнозировании и оценке эффективности проводимой терапии при хроническом алкогольном гепатите.
Технический результат достигнут путем десятидневного наблюдения группы больных с хроническим алкогольным гепатитом в стадии обострения в количестве 28 человек, получавших базисную терапию: полный отказ от приема алкоголя, стол №5, раствор NaCl 0,9% и раствор витамина В1 10 мл внутривенно, раствор рибоксина 10 мл внутривенно, раствор витамина В6 4 мл внутримышечно, раствор реланиума 4 мл внутривенно, эссливер форте (эссенциальные фосфолипиды 300 мг) по 2 таблетки 3 раза в день в течение 10 дней.
Контрольную группу составили 65 практически здоровых доноров.
Для определения активности ферментов у всех обследованных проводили забор сыворотки крови.
Активность гамма-глутамилтранспептидазы оценивали по скорости реакции переноса глутамилового остатка с гамма-L-(+)-глутамил- 4-нитроанилида на глицилглицин (Био-тест, PLIVA - Lachema Diagnostika). Гамма-глутамилтранспептидаза (К.Ф.2.3.2.1., гамма-глутамилтрансфераза) переносит глутамиловый остаток с гамма-L-(+)-глутамил-4-нитроанилида на дипептидный акцептор, которым является глицилглицин, служащий одновременно и буфером. Концентрацию освобожденного 4-нитроанилина измеряют фотометрически после остановки ферментативной реакции подкислением. Получают эталонный раствор: в пробирке в десяти миллилитрах дистиллированной воды измельчают стеклянной палочкой одну таблетку субстрата гамма-L-глутамил-4-нитроанилида и растворяют содержимое при перемешивании и нагревании на кипящей водяной бане. После охлаждения к раствору добавляют 2,50 мл буферного раствора глицилглицина 0,55 моль/л, перемешивают и держат на водяной бане при 37°C [Dimov, D. M., Kulhánek, V.: Clin. Chim. Acta 16, 271 (1967); Kulhánek, V., Dimov, D.M.: Ergb. exp. Med. 12, 161 (1673)]. Перемешивают и измеряют оптическую плотность пробы (А1) и контрольного раствора (А2) против воды и вычисляют разность оптических плотностей (А1-А2).
Проведение анализа. Образцы: негемолизированная сыворотка, ЭДТА плазма; длина волны: (400 - 430) нм; кювета: 1 см; температура: (37±0,1)°C.
Компоненты
Проба (мл)
Контрольный раствор (мл)
Рабочий раствор
0,25
0,25
Предварительно инкубируют 5 мин при 37°С и добавляют
Сыворотка крови
0,025
-
Инкубируют точно 15 мин при 37°С и добавляют
Раствор уксусной кислоты
1,50
1,50
Сыворотки крови
-
0,025
Калибровка
Из эталонного раствора 4-нитроанилина 6 ммоль/л приготавливают разбавлением калибровочные растворы согласно таблице:
Калибровачный раствор №
Эталонный раствор 4-нитроанилин 6 ммоль/л (мл)
Дистиллированная вода (мл)
Результирующая каталитическая активность (мккат/л)
1
0,30
3,70
0,50
2
0,60
3,40
1,00
3
1,20
2,80
2,00
4
2,40
1,60
4,00
5
1,80
0,20
6,00
В пробирках отмеряют по 0,025 мл калибровочного раствора, добавляют по 1,75 мл раствора уксусной кислоты, растворы перемешивают и измеряют оптическую плотность против воды при длине волны, при которой измерялась проба. Строят калибровочный график зависимости оптической плотности от каталитической активности. Расчет проводят по разности оптической плотности пробы (А1) и контрольного раствора (А2), на калибровочном графике находят каталитическую активность гамма-глутамилтранспептидазы в испытуемой пробе. Референтные величины активности гамма-глутамилтранспептидазы у мужчин 0,25-1,77 мккат/л.
Концентрацию восстановленного глутатиона (GSH) определят с помощью реакции с 5,5-дитио-бис-(2-нитробензойной) кислотой, в результате которой образуется тионитрофенильный анион (ТНФА), имеющий максимум поглощения при 412 нм. В пробирку наливают 0,5 мл исследуемой жидкости, затем 3,5 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4) и перемешивают. Затем к 2 мл разведенной в восемь раз дистиллированной водой суспензии приливают 1 мл 20% трихлоруксусной кислоты, перемешивают и оставляют в холодильнике на 15-20 мин. После центрифугирования при 3000g в течение 15 мин 1 мл надосадочной жидкости прибавляют к 0,5 мл фосфатного буфера (рН 7,4). В опытную пробу приливают 0,05 мл реактива Эллмана, а в контрольную пробу - 0,05 мл метанола, после чего измеряют оптическую плотность опытной и контрольной проб против фосфатного буфера (рН 7,4) [Бузлама В.С. Методическое пособие по изучению процессов перекисного окисления липидов и систем антиоксидантной защиты организма у животных /В.С. Бузлама. - Воронеж. - 1997].
Расчет концентрации GSH производят по формуле:
Еоп - Ек
3
С=________×72,6×10,
3
13,1×10
3
где С - содержание GSH, ммоль/л; Еоп - оптическая плотность опытной пробы; Ек - оптическая плотность контрольной пробы; 13,1×10 - коэффициент молярной экстинкции ТНФА при 412 нм; 72,6 - фактор разведения.
Глутатион-гамма-глутамилтранспептидазный (GγГ) коэффициент рассчитывают по формуле:
Еггп
GγГ=------
СGSH
где Еггп - активность гамма-глутамилтранспептидазы (мккат/л), а СGSH - концентрация восстановленного глутатиона (ммоль/л).
Проведенные нами исследования показали, что динамика величины предложенного коэффициента GγГ является высокочувствительным показателем, реагирующим на изменение клинически подтвержденного функционального состояния печени (см. табл.).
Таблица
Изменение активности гамма-глутамилтранспептидазы (ГГП) и концентрации глутатиона (GSH) у больных хроническим алкогольным гепатитом в стадии обострения
Показатель
контрольная группа
хронический алкогольный гепатит
до лечения
после лечения
ГГП
0,882±0,031
3,429±0,147*
1,151±0,081**
GSH (ммоль/л)
0,873±0,045
0,418±0,043*
0,719±0,088**
Коэффициент GγГ
1,01±0,09
8,20±0,40*
1,60±0,12**
Примечание: * различия статистически значимы по сравнению с контрольной группой при p<0,05; ** различия статистически значимы по сравнению с состоянием до лечения при p<0,05.
Из данных таблицы следует, что при хроническом алкогольном гепатите происходит повышение активности гамма-глутамилпранспептидазы в силу токсического влияния алкоголя на клетки печени. При этом концентрация глутатиона снижается по сравнению с контрольной группой, что связано со значительным возрастанием расходования данного метаболита при интенсификации свободнорадикальных процессов, так как он играет роль перехватчика свободных радикалов. Динамика предложенного нами коэффициента GγГ в разы отличается от показателя здоровых людей. В процессе проведения курса лечения пациентов с хроническим алкогольным гепатитом уже в первые дни после терапии коэффициент GγГ существенно снижается, через 10 дней от начала лечения, величина коэффициента сопоставима со значениями для практически здоровых и составляет 1,60 (p<0,05).
Таким образом, повышение величины предложенного коэффициента GγГ выше 1,1 свидетельствует о наличии патологического процесса, поражении печени на фоне разрушения гепатоцитов и снижения антиоксидантного потенциала организма. Значение коэффициента 7,80 соответствует обострению течения хронического алкогольного гепатита, требует экстренной госпитализации и назначения комплексной терапии. В процессе адекватного лечения предложенный нами коэффициент снижается до 1,72, что отражает нормализацию функционирования антиоксидантной системы и уменьшение гибели клеток печени. При таком значении коэффициента можно дать рекомендации к продолжению лечения и наблюдения пациента в условиях поликлиники.
Клинические примеры:
Больной А., 1980 года рождения. Диагноз: Синдром алкогольной зависимости, средней степени тяжести. Хронический алкогольный гепатит, стадия обострения.
Поступил в отделение №5 Воронежского областного клинического психоневрологического диспансера 17.09.2010 года с жалобами на выраженную общую слабость, боли в правом подреберье, тревогу, плохой аппетит и сон. Пациент на протяжении 5 лет злоупотреблял алкоголем. Печеночные пробы: общий билирубин - 33,4 мкмоль/л, аланинаминотрансфераза - 256,9 нмоль (с.л.), аспартатаминотрансфераза- 147,2 нмоль (с.л.), тимоловая проба - 4,3 ед., гамма-глутамилтрансфераза - 3,51 мккат/л. Концентрация восстановленного глутатиона - 0,399 ммоль/л. Коэффициент GγГ 8,80 - обострение течения хронического алкогольного гепатита.
Назначено лечение: полный отказ от приема алкоголя, стол №5, раствор NaCl 0,9% и раствор витамина В1 10 мл внутривенно, раствор рибоксина 10 мл внутривенно, раствор витамина В6 4 мл внутримышечно, раствор реланиума 4 мл внутривенно, эссливер форте (эссенциальные фосфолипиды 300 мг) по 2 таблетке 3 раза в день в течение 10 дней.
Через 10 дней от начала лечения отмечено улучшение состояния (аппетита, сна, работоспособности), спокоен, во времени и месте ориентирован верно, наблюдается значительное уменьшение болей в правом подреберье при пальпации, тремора пальцев рук и языка. Печеночные пробы: общий билирубин - 27,6 мкмоль/л, аланинаминотрансфераза - 154,3 нмоль (с.л.), аспартатаминотрансфераза - 99,5 нмоль (с.л.), тимоловая проба - 3,8 ед., гамма-глутамилтрансфераза - 1,15 мккат/л. Концентрация восстановленного глутатиона - 0,729 ммоль/л. Коэффициент GγГ - 1,58.
Рекомендации: продолжить лечение в условиях поликлиники, под контролем клинических и лабораторных показателей.
Больной Б., 1977 года рождения. Диагноз: Синдром алкогольной зависимости, средней степени тяжести. Хронический алкогольный гепатит, стадия обострения.
Поступил в отделение №5 Воронежского областного клинического психоневрологического диспансера 10.06.2010 года с жалобами на выраженную общую слабость, боли в правом подреберье, тревогу, плохой аппетит и сон. Пациент на протяжении 4 лет злоупотреблял алкоголем.
Биохимический анализ крови: Печеночные пробы: билирубин - 36,6 мкмоль/л, аланинаминотрансфераза - 267 нмоль (с.л.), аспартатаминотрансфераза - 138,0 нмоль (с.л.), тимоловая проба - 4,8 ед., гамма-глутамилтрансфераза - 3,46 мккат/л. Концентрация восстановленного глутатиона - 0,402 ммоль/л. Коэффициент GγГ 8,61 - обострение течения хронического алкогольного гепатита.
Назначено лечение: полный отказ от приема алкоголя, стол №5, раствор NaCl 0,9% и раствор витамина В1 10 мл внутривенно, раствор рибоксина 10 мл внутривенно, раствор витамина В6 4 мл внутримышечно, раствор реланиума 4 мл внутривенно, эссливер форте (эссенциальные фосфолипиды 300 мг) по 2 таблетке 3 раза в день в течение 10 дней.
Через 10 дней от начала лечения отмечено улучшение состояния (аппетита, сна, работоспособности), спокоен, во времени и месте ориентирован верно, наблюдается уменьшение болей в правом подреберье при пальпации, тремора пальцев рук и языка. Печеночные пробы: билирубин - 27,9 мкмоль/л, аланинаминотрансфераза - 163,7 нмоль (с.л.), аспартатаминотрансфераза - 119,5 нмоль (с.л.), тимоловая проба - 3,7 ед., гамма-глутамилтрансфераза - 1,25 мккат/л. Концентрация восстановленного глутатиона - 0,623 ммоль/л. Коэффициент GγГ - 2,01. Рекомендации: продолжить лечение в условиях стационарна, под строгим контролем клинических и лабораторных показателей.
Таким образом, предлагаемый способ отражает новый подход при прогнозировании и оценке эффективности проводимой терапии у пациентов с алкогольным поражением печени. Метод надежен, обладает высокой информативностью, позволяет более точно оценить длительность и необходимость лечения пациента с хроническим алкогольным гепатитом в условиях стационара. Предлагаемый способ может быть применен в любой клинической лаборатории, оснащенной спектрофотометром, отличается простотой, не требует существенных затрат времени и реактивов.