Конструирование полимерного препарата для серологической диагностики гепатита C

7. Davies H. W., Appleyard G., Cunningham P. et al. The use of a continuous cell line for the isolation of influenza viruses // Bull. Wld Hlth Org. - 1978. - Vol. 56, N 6. - P. 991-993.

8. Freymuth F., Vabret A., Cuvillon-Nimal D. et al. Comparison ofmultiplex PCR assays and conventional techniques for the diagnostic of respiratory virus infections in children admitted to hospital with an acute respiratory illness // J. Med. Virol. - 2006. -Vol. 78, N 11. - P 1498-1504.

9. Gern J. E. The ABCs of rhinoviruses, wheezing, and asthma //J. Virol. - 2010. - Vol. 84, N 15. - P. 7418-7426.

10. Ruohola A., Waris M., Allander T. et al. Viral etiology of common cold in children, Finland // Emerg. Infect. Dis. - 2009. - Vol. 15, N 2. - P. 344-346.

11. Syrmis M. V, Whiley D. M., Thomas M. et al. A sensitive, specific, and cost-effective multiplex reverse transcriptase-PCR assay for the

detection of seven common respiratory viruses in respiratory samples // J. Mol. Diagn. - 2004. - Vol. 6, N 2. - P. 125-131.

12. Templeton K. E., Scheltinga S. A., Beersma M. F et al. Rapid and sensitive method using multiplex real-time PCR for diagnosis of infections by influenza A and influenza B viruses, respiratory syncytial virus, and parainfluenza viruses 1, 2, 3, and 4 // J. Clin. Microbiol. - 2004. - Vol. 42, N 4. - P. 1564-1569.

13. Tiveljung-Lindell A., Rotzen-OstlundM., GuptaS. et al. Development and implementation of a molecular diagnostic platform for daily rapid detection of 15 respiratory viruses // J. Med. Virol. - 2009. -Vol. 81, N 1. - P. 167-175.

14. Vernet G. Molecular diagnostics in virology // J. Clin. Virol. - 2004. - Vol. 31, N 4. - P. 239-247.

Поступила 24.03.11

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 615.45.03:616.36-002-022.6-078].012

Л. М. Веркина1, Н. Р. Телесманич1, Д. В. Мишин2,

А. Г. Ботиков2, Ю. М. Ломов1, П. Г. Дерябин2,

А. Н. Терентьев1, И. Р. Симонова1, А. Н. Наркевич1, Е. А. Березняк1

Конструирование полимерного препарата для серологической

диагностики гепатита С

'ФГУЗ Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора; 2ФГБУ НИИ вирусологии

им. Д. И. Ивановского Минздравсоцразвития России, Москва

Разработан новый иммунобиологический полимерный препарат для серологической идентификации гепатита С. Препарат позволяет выявлять специфические антитела в сыворотках крови больных гепатитом С, отвечает современным требованиям диагностических тест-систем, характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью. Препарат разработан на основе полиакролеиновых микросфер, в качестве сенситина использована культуральная концентрированная биомасса вируса гепатита С, содержащая полноценный набор антигенов вируса. Предложено использовать новый диагностикум при первичных (скрининговых) лабораторных обследованиях, основанных на серологическом выявлении суммарных антител к антигенам ВгС в реакции объемной агломерации (РАО). РАО может быть как одним из альтернативных методов при серологических исследованиях, так и дополнительным методом при применении комплекса диагностических приемов.

Ключевые слова: гепатит С, суммарные антитела, полимерный диагностикум, реакция объемной агломерации

Design of a polymer drug for serological diagnosis of hepatitis C

L. M. Verkina1, N. R. Telesmanich1, D. V. Mishin2, A. G. Botikov2, Yu. M. Lomov1, P. G. Deryabin2,

A. N. Terentyev1, I. R. Simonova1, A. N. Narkevich1, E. A. Bereznyak1

1Rostov-on-Don Antiplague Research Institute, Russian Inspectorate for the Protection of Consumer Rights and Human Welfare; 2D. I. Ivanovsky Research Institute of Virology, Ministry of Health and Social Development of Russia, Moscow

a new immunobiological polymer drug has been designed for the serological identification of hepatitis C. The drug is able to reveal specific antibodies in the sera of patients with hepatitis C, meets the current requirements of diagnostic test systems, and shows a high sensitivity and specificity. it is based on polyacroleinic microspheres; the concentrated cell culture biomass of hepatitis C virus (HCv), which contains an adequate set of viral antigens, is used as sensitin. A new diagnosticum is proposed to be used during primary (screening) laboratory studies based on the serological detection of total antibodies to HCv antigens in the volume agglomeration test. The latter is both one of the alternative methods during serological studies and an additional procedure when a set of diagnostic techniques is used.

Key words: hepatitis C, total antibodies, polymer diagnosticum, volume agglomeration test

Структура эпидемического процесса гепатита С в современный период имеет принципиально новые особенности. Это касается не только соотношения количества регистрируемых клинических форм этой инфекции, но и стадий их развития, а также выявляемых случаев сочетанных вариантов гепатитов с другими вирусными и бактериальными инфекциями. Чрезвычайно высокая интенсивность эпидемического процесса определяет выработку стратегии и тактики эпидемиологического

надзора, основополагающим звеном которого являются лабораторная диагностика и мониторинг с применением наиболее широкого спектра диагностических препаратов и методических приемов [5, 6]. Первичная диагностика гепатита С базируется на вариантах полимеразной цепной реакции, которая стала арбитражным методом диагностики вирусных гепатитов. Из серологических методов применяют только иммуноферментные системы разных поколений. Чувствительность

Контактная информация:

Веркина Людмила Михайловна, канд. мед. наук, зав. лаб.; e-mail: plague@aaanet.tu

45

ИФА-методов различна и может зависеть от множества факторов, в частности от генотипов ВГС, циркулирующих на разных территориях [5]. В то же время профилактические мероприятия для ограничения распространения заболевания связаны в первую очередь со своевременным выявлением инфицированных гепатитом С, особенно среди доноров и сотрудников детских и лечебных учреждений. Необходимость обследования значительного количества клинических образцов в ограниченные сроки требует использования комплекса скрининговых тест-систем для определения антител к вирусу гепатита С (ВГС). В связи с этим остается актуальной разработка новых диагностических препаратов с целью расширения арсенала средств и совершенствования диагностики вирусных гепатитов.

В Ростовском научно-исследовательском противочумном институте при конструировании иммунобиологических диагностических препаратов используют органические носители - полимерные частицы акролеина, дополнительно окрашенные сафронином. Они представляют собой пористые гидрофильные частицы, которые имеют достаточную кинетическую и структурную устойчивость, обладают высокой сорбционной активностью и поэтому являются весьма эффективными носителями сенситинов бактериальной и вирусной природы. Иммунобиологические полимерные препараты, созданные на их основе [1, 2, 7, 8], отвечают современным требованиям диагностических тест-систем, характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью, просты в применении и малозатратны в производстве.

Новое поколение диагностических препаратов, в которых в качестве носителя в реакции агглютинации используют цветные полимерные микросферы, стабилизирующие реакцию и повышающие чувствительность и специфичность метода, в настоящее время может расширить спектр недорогих и эффективных методов серологической диагностики гепатита С.

В НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского впервые реализована возможность получения высоких концентраций ВГС и его антигенов при культивировании вируса в чувствительных клеточных линиях, что позволяет использовать природные антигены вируса для конструирования новых диагностических тест-систем

[3, 4].

Целью данной работы явилось конструирование диагностического препарата нового поколения для выявления антител в сыворотке крови больных гепатитом С.

Материалы и методы

Схема получения антигенного полимерного диагно-стикума для выявления ВГС-антител включала следующие основные этапы: получение сенситина (биомасса вируса гепатита С); синтез цветного полимерного носителя; иммобилизация сенситина на полимерных микросферах; лиофилизация полученного диагности-кума.

Биомасса ВГС (культуральный инактивированный концентрированный антиген ВГС) была получена в НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского при роллер-ном культивировании инфицированных ВГС культур клеток СПЭВ в дозе 0,1 ТЦИД50. Культуральную жидкость на 5-6-й день после заражения собирали и освобождали от клеточного детрита методом центрифугирования при 10 000 об/мин в течение 10 мин. После этого очищенную культуральную жидкость использовали для осаждения вируса методом ультрацентрифугирования в течение 1,5 ч при 30 000 об/мин при 4°С. Полученный осадок ресуспендировали в неболь-

шом количестве буфера TNF, затем суспензию вируса обрабатывали в аппарате Даунса, после чего для повышения антигенной активности подвергали воздействию ультразвуком в течение 10 с. Далее отбирали пробы для определения концентрации инфекционного вируса и его антигенов. Вируссодержащую суспензию инактивировали в течение 4 мин на ультрафиолетовой установке фирмы «Электронная медицина». После обработки происходила полная инактивация ВГС с сохранением его антигенных свойств.

Полимерный носитель получали методом анионной полимеризации акролеина в водно-щелочной среде в соответствии с Регламентом производства № 978-00 от 20.06.2000 [8]. Дополнительно в полимеризационную смесь в процессе синтеза вводили краситель. Сферические полимерные частицы имели следующие параметры: диаметр 2,5 мкм, содержание альдегидных групп 1,3—1,6 мм/г.

Для иммобилизации сенситина на полимерных микросферах был использован 0,1 М карбонатный буфер с рН 9,2. Сенсибилизирующая доза антигена (ВГС) составила 200 мкг/мл на 25 мг сфер. Полученный диагно-стикум лиофилизировали и изучали его операционные характеристики.

Диагностикум предназначен для выявления и определения уровня антител к ВГС в сыворотке больных и подозрительных на заболевание лиц, в реакции объемной агломерации (РАО).

Постановку РАО осуществляли в U-образных планшетах для 9 иммунологических реакций. В 6 лунок планшета наливали по 50 мкл 1% раствора нормальной кроличьей сыворотки (НКС). Исследуемую сыворотку в разведении 1:5 в количестве 50 мкл вносили в 1-ю лунку и начиная со 2-й делали двукратные последовательные разведения до 6-й лунки включительно, из которой удаляли 50 мкл. Затем во все лунки добавляли по 30 мкл полимерного диагностикума, содержащего антиген гепатита С. После его добавления содержимое лунок перемешивали покачиванием планшета в течение 1 мин и оставляли при 20 ± 2°С на 2 — 2,5 ч. Для контроля диагностикума на отсутствие спонтанной агломерации в 2—3 лунки вносили только НКС (50 мкл) и диагностикум (30 мкл). За положительный результат принимали ярко-розовый агломерат, равномерно выстилающий дно лунки. Разведение сыворотки в последней лунке с полноценной агглютинацией считали титром реакции. Если в исследуемой пробе антитела к ВГС отсутствовали, диагностикум выпадал на дно лунки в виде розовой точки.

Диагностические операционные характеристики препарата оценивали при исследовании крови больных с заведомо известным диагнозом гепатита С, подтвержденным клинически и при помощи ПЦР-диагностики. В качестве препарата сравнения (референтного метода) использовали тест-систему «Бест-анти ВГС» производства ЗАО «Вектор-Бест» для постановки ИФА.

При исследовании сывороток крови соблюдали необходимые меры предосторожности в соответствии с требованиями биологической безопасности при работе с материалом, подозрительным на зараженность микроорганизмами I—II группы патогенности.

Статистическую обработку данных проводили с использованием четырехпольных таблиц Флетчера [9].

Результаты

В рамках договора о взаимодействии и в результате совместных исследований на базе РостНИПЧИ и НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского был сконструирован и испытан на клинических образцах диагностикум

46

Таблица 1

Результаты, полученные при исследовании сывороток крови с помощью ИФА и РАО

№ сыворотки ИФА РАО Соотношение результатов ИФА и РАО

1-10, 12-19, 22-25, 37-39, 40-45, 53-57, 61-69 + + ++ ИП

11, 20, 21, 26, 27, 46, 47 - + - + ЛИ

28, 29, 30, 48 + - + - ЛО

31, 32, 33, 34, 35, 36, 48, 49 50, 51, 52, 58, 59, 60,70 - - - ИО

Таблица 2

Оценка диагностических операционных характеристик полимерного препарата для РАО

ИФА

РАО положительный результат отрицательный результат Всего

Положительный результат ИП = 45 С-'- ll С ИП + ЛП = 52

Отрицательный результат II О К О II £ ЛО + ИО = 18

Всего ИП + ЛО = 49 ЛП + ИО = 21 70

полимерный антигенный для выявления антител к ВГС. Всего было протестировано 70 сывороток от больных гепатитом С и здоровых лиц. Эти же сыворотки были исследованы в ИФА с двумя тест-системами - коммерческой «Бест-анти ВГС», взятой в качестве референтного метода, и экспериментальной, разработанной в НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского. Для определения специфичности препарата (отрицательный контроль) исследовали 14 образцов сывороток крови от здоровых лиц, не содержащих анти-ВГС-антитела. В качестве положительного контроля использовали пул высокотитражных сывороток больных гепатитом С из коммерческого набора для ИФА «Вектор-Бест».

При тестировании сывороток здоровых лиц (отрицательный контроль) в РАО и ИФА в 100% случаев были получены совпадающие отрицательные результаты. В ходе проведенных методом РАО серологических исследований сывороток больных гепатитом С установлено, что в подавляющем большинстве случаев уровень специфических иммуноглобулинов был невысоким. Титры антител находились в диапазоне от 1:20 до 1:80 и только в 3,5% случаев (3 сыворотки) достигали 1: 160. При скрининге сывороток в ИФА результаты оценивали с использованием значений критической оптической плотности (ОП). ОП специфического компонента нулевого калибровочного раствора для набора «Бест-анти ВГС» не должна превышать 0,2. Среднее значение ОП положительного контроля не менее 0,8. ОП исследуемых сывороток от больных гепатитом С колебалась в широких пределах - от 0,876 до 4,0. При этом преобладали сыворотки крови с минимальными значениями ОП от 0,876 до 1,617 (31 сыворотка). Сравнительный анализ результатов выявления антител в сыворотках крови больных гепатитом С в РАО и ИФА показал сопоставимость данных по специфичности и чувствительности препарата на полиакролеиновых носителях и тест-систем для проведения ИФА. В подавляющем большинстве случаев отмечено совпадение результатов. Отрицательные ответы в ИФА были получены в 21 случае, в РАО - в 18, что составляет 86% совпадений. Вирусспецифические антитела были обнаружены в 52 сыворотках методом РАО и 49 сыворотках в ИФА (94% совпадений). На основании полученных данных была проведена оценка диагностической эффективности сконструированного препарата по Флетчеру с использованием показателей чувствительности, специфичности, точности метода. Результат метода считали истинно положительным (ИП), если выявляли антитела в РАО и это совпадало с результатом ИФА. Если в РАО результат был отрицательный, а в ИФА - положительный, то итоговый результат оценивали как ложноотрицательный (ЛО). Также были рассчитаны истинно отрицательные (ИО) и ложноположительные (ЛП) результаты. Полученные данные представлены в табл. 1 и 2.

Чувствительность (Se) сконструированного диагно-стикума определяли как отношение числа ИП результатов к числу всех положительных (ИП и ЛО):

_ ИП

ип + ло

100% = 45  100% =92%. 45 + 4

Специфичность (Sp) диагностикума определяли как отношение числа ИО результатов к числу всех отрицательных (ИО и ЛП):

"^ИОИ+ОЛП-100%Й4 + 7 1000/-67%-

Диагностическую эффективность (De) (точность) диагностикума рассчитывали по формуле:

ИП + ИО 45+14

De =ИП + ЛП + ЛО + ИО' 1°0%=45 + 7+4+14- Ю0% =80%.

Результаты оценки РАО препарата показали его достаточно высокую чувствительность - 92% и специфичность - 67%, диагностическая эффективность препарата составила 80%.

Таким образом, проведенный анализ свидетельствует о том, что сконструированный препарат для выявления антител к гепатиту С в РАО является достаточно чувствительным и специфичным, что позволяет использовать его наряду с ИФА при серологической диагностике гепатита С.

Обсуждение

У лиц с острым и хроническим гепатитом С формируется специфический гуморальный иммунный ответ. Особенностью течения гепатита С является то, что анти-ВГС IgM-антитела, появляющиеся в ранние сроки заболевания, сохраняются в течение нескольких лет после элиминации вируса и присутствуют одновременно с анти-ВГС IgG-антителами, сопровождающими хроническое течение инфекции. Таким образом, определение суммарных анти-ВГС в сыворотке крови является доказательным признаком заболевания гепатитом С.

В процессе конструирования полимерного диагно-стикума сенсибилизацию микросфер осуществляли культуральным концентрированным антигеном вируса гепатита С, содержащим полноценный набор антигенов вируса. Антигенная полноценность сенситина позволяет выявлять суммарные анти-ВГС, что является несомненным достоинством нового препарата. При изучении диагностических операционных характеристик была продемонстрирована его высокая чувствительность (92%) и специфичность (67%).

Анализ данных, полученных при скрининге сывороток больных гепатитом С двумя методами (РАО и ИФА), показал сопоставимость титров специфических антител в РАО и ОП в ИФА. В исследуемых сыворотках, имеющих ОП в диапазоне от 0,876 до1,617 (поло-

47

жительный результат), в РАО регистрировали титры от 1:20 до 1:40. Таким образом, обнаружение анти-ВГС в РАО в титре 1:20 свидетельствует о чувствительности сконструированного полимерного диагностикума. В связи с этим использование РАО при проведении первичных (скрининговых) лабораторных исследований, основанных на серологическом выявлении суммарных антител к антигенам ВГС, может быть как одним из альтернативных методов, так и дополнительным методом при применении комплекса диагностических приемов. Кроме того, РАО обладает рядом преимуществ как в процессе диагностического анализа, отличающегося малокомпонентностью и простотой постановки, так и с позиции быстрого и малозатратного производства препарата.

Полученные данные по выявлению анти-ВГС позволяют сделать заключение, что полимерный антигенный препарат перспективен для использования в диагностике гепатита С, а РАО, имея потенциал быстрого и простого метода анализа, расширяет спектр доступных скрининговых тестов для диагностики этого заболевания.

ЛИТЕРАТУРА

1. Веркина Л. М., Пичурина Н. Л., Водяницкая С. Ю. и др. Использование серологических методов (ИФА, РАО) для изучения инфи-цированности переносчиков возбудителя крымской геморрагиче-

ской лихорадки // Актуальные вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и тест-систем: Материалы 3-й науч.-практ. конф. - Махачкала, 2001. - С. 91-92.

2. Веркина Л. М., Пичурина Н. Л., Ломов Ю. М. и др. Использование нового диагностического препарата на цветных полимерных носителях при эпидемиологическом надзоре в природных очагах крымской геморрагической лихорадки // Журн. микроби-ол. - 2009. - № 5. - С. 70-74.

3. Дерябин П. Г., Львов Д. К., Исаева Е. И., Вязов С. О. Штамм Virus hepatits c, Д-1 для приготовления диагностических и профилактических препаратов. Российский патент на изобретение № 2130969, 1999 г. Приоритет установлен по дате 07.10.97.

4. Дерябин П. Г., Львов Д. К. Высокопродуктивный вариант вируса гепатита С. Выделение, характеристика, идентификация // Докл. АН РФ. - 1998. - Т. 358, № 5. - С. 688-691.

5. Львов Д. К., Самохвалов Е. И., Миширо С. А. и др. Закономерности распространения вируса гепатита С и его генотипов в России и странах СНГ // Вопр. вирусол. - 1997. - №4. - С. 157-161.

6. Медицинская вирусология / Под ред. акад. Д. К. Львова. - М., 2008.

7. Наркевич, А. Н., Безуглова Е. В., Кочеткова А. П. и др. Чумной иммуноглобулиновый полимерный диагностикум для РАО / Регламент производства № 978-00 от 20.06.2000.

8. Телесманич Н. Р., Ломов Ю. М., Агафонова В. В. Конструирование антилипазного иммуноглобулинового полимерного диагно-стикума для выявления штаммов холерных вибрионов Эль-Тор, обладающих гемолитической и липазной активностью // Журн. микробиол. - 2006. - № 1. - С. 57-60.

9. Флетчер Р., Флетчер С., Вагнер Э. Клиническая эпидемиология. Основы доказательной медицины. - М., 1998.

Поступила 22.04.11

Журнал "Вопросы вирусологии" входит в Перечень ведущих научных журналов и изданий ВАК, в которых должны быть опубликованы значимые результаты диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук.

48