МОДУЛЯТОРЫ РЕЦЕПТОРА ГОРМОНА РОСТА
MODULATORS OF GROWTH HORMONE RECEPTOR

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящие варианты реализации изобретения относятся к способам, соединениям и композициям для лечения, профилактики или уменьшения интенсивности заболевания, связанного с избытком гормона роста, с применением антисмысловых соединений или олигонуклеотидов, нацеленных на рецептор гормона роста (GHR).
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Настоящая заявка подана вместе с перечнем последовательностей в электронном формате. Перечень последовательностей представлен в виде файла под названием BIOL0226WOSEQ_ST25.txt, созданного 30 июня 2014 года, размером 1028 Кб. Информация о перечне последовательностей в электронном формате включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Гормон роста вырабатывается в гипофизе и секретируется в кровоток, где связывается с рецептором гормона роста (GHR) во многих типах клеток, вызывая выработку инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1). IGF-1 вырабатывается в основном в печени, но также и в жировой ткани, и почках, и секретируется в кровоток. Несколько расстройств, таких как акромегалия и гигантизм, связаны с повышенным уровнем гормона роста и/или повышенным уровнем IGF-1 в плазме и/или тканях.
Чрезмерная выработка гормона роста может привести к таким заболеваниям, как акромегалия или гигантизм. Акромегалия и гигантизм связаны с избытком гормона роста, зачастую вызванным опухолью гипофиза, и встречаются в 40-50 случаях на миллион населения во всем мире, при этом по около 15000 пациентов приходится на США и Европу, и ежегодная частота составляет 4-5 новых случаев на миллион населения. Акромегалия и гигантизм первоначально характеризуются аномальным ростом кистей и стоп, а также костными изменениями черт лица. Многие из результатов, связанных с ростом, опосредованы повышенным уровнем сывороточного IGF-1.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Приведенные в данном документе варианты реализации изобретения относятся к способам, соединениям и композициям для лечения, профилактики или уменьшения интенсивности заболевания, связанного с избытком гормона роста. Несколько приведенных в данном документе вариантов реализации изобретения относятся к антисмысловым соединениям или олигонуклеотидам, нацеленным на рецептор гормона роста (GHR). Несколько вариантов реализации изобретения направлены на лечение, профилактику или уменьшение интенсивности акромегалии с помощью антисмысловых соединений или олигонуклеотидов, нацеленных на рецептор гормона роста (GHR).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Следует понимать, что изложенное выше общее описание и следующее подробное описание являются лишь типовыми и пояснительными, и не являются ограничивающими заявленное изобретение. В данном документе использование единственного числа включает множественное число, если специально не указано иное. При использовании по тексту данного документа, термин "или" означает "и/или", если не указано иное. Кроме того, использование термина "включает", а также других форм, таких как "включает" и "включенный", не является ограничивающим. Также, такие термины как "элемент" или "компонент" охватывают как элементы и компоненты, содержащие одну единицу, так и элементы и компоненты, которые содержат более одной субъединицы, если специально не указано иное.
Заголовки разделов используются в данном документе для организационных целей и не должны быть истолкованы как ограничивающие описанный предмет. Все документы или части документов, цитируемые в данной заявке, в том числе, без ограничения ими, патенты, заявки на патенты, статьи, книги и монографии, в явной форме включены в данный документ посредством ссылки для частей документа, обсуждаемых здесь, а также в полном объеме.
Если не указано иное, следующие термины имеют следующие значения:
2
2
3
"2'-O-метоксиэтил" (также обозначаемый, как 2'-МОЕ и 2'-O(СН)-ОСН) относится к O-метоксиэтильной модификации в 2'-положении фуранозного кольца. Модифицированный сахар представляет собой сахар, модифицированный 2'-O-метоксиэтилом.
Термин "2'-МОЕ нуклеозид" (также обозначаемый, как 2'-O-метоксиэтиловый нуклеозид) означает нуклеозид, содержащий сахарный фрагмент, модифицированный с помощью 2'-МОЕ.
Термин "2'-замещенный нуклеозид" означает нуклеозид, содержащий заместитель в 2'-положении фуранозильного кольца, отличный от Н или ОН. В некоторых вариантах реализации изобретения 2'-замещенные нуклеозиды включают нуклеозиды с модификациями бициклических сахаров.
Термин "3'-сайт-мишень" относится к нуклеотиду нуклеиновой кислоты-мишени, который является комплементарным относительно самого крайнего нуклеотида с 3'-конца определенного антисмыслового соединения.
Термин "5'-сайт-мишень" относится к нуклеотиду нуклеиновой кислоты-мишени, который является комплементарным относительно самого крайнего нуклеотида с 5'-конца определенного антисмыслового соединения.
Термин "5-метилцитозин" означает цитозин, модифицированный метильной группой, присоединенной к положению 5. 5-Метилцитозин представляет собой модифицированное нуклеотидное основание.
Термин "около" означает в пределах ±10% значения. Например, если указано, что "соединения подвергаются по меньшей мере около 70% ингибированию GHR", подразумевается, что уровень GHR ингибируется в пределах от 60% до 80%.
Термин "введение" или "вводить" относится к способам введения субъекту приведенного в данном документе антисмыслового соединения с целью выполнения предусмотренной им функции. Пример способа введения, который может быть применен, включает, без ограничения ими, парентеральное введение, такое как подкожная, внутривенная или внутримышечная инъекция или инфузия.
Термин "уменьшение интенсивности" относится к уменьшению по меньшей мере одного показателя, признака или симптома сопутствующего заболевания, расстройства или состояния. В некоторых вариантах реализации изобретения уменьшение интенсивности включает задержку или замедление в прогрессировании одного или более показателей состояния или заболевания. Выраженность показателей может быть определена по субъективным или объективным критериям, которые известны специалистам в данной области техники.
Термин "животное" относится к человеку или не относящемуся к человеку животному, в том числе, без ограничения ими, мышам, крысам, кроликам, собакам, кошкам, свиньям и нечеловекообразным приматам, в том числе, без ограничения ими, обезьянам и шимпанзе.
Термин "антисмысловая активность" означает любую детектируемую или измеримую активность, свойственную гибридизации антисмыслового соединения с его нуклеиновой кислотой-мишенью. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловая активность представляет собой снижение количества или уровня экспрессии нуклеиновой кислоты-мишени или белка, кодируемого такой нуклеиновой кислотой-мишенью.
Термин "антисмысловое соединение" означает олигомерное соединение, обладающее способностью гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью посредством водородной связи. Примеры антисмысловых соединений включают одноцепочечные и двухцепочечные соединения, такие как, антисмысловые олигонуклеотиды, киРНК, кшРНК, оцРНК, а также соединения исходя из присутствия.
Термин "антисмысловое ингибирование" означает снижение уровня нуклеиновой кислоты-мишени в присутствии антисмыслового соединения, которое является комплементарным относительно нуклеиновой кислоты-мишени, по сравнению с уровнем нуклеиновой кислоты-мишени при отсутствии такого антисмыслового соединения.
Термин "антисмысловые механизмы" включает любые механизмы, предполагающие гибридизацию соединения с нуклеиновой кислотой-мишенью, при этом результатом или эффектом гибридизации является либо целевое разрушение, либо целевое присутствие с сопутствующей остановкой клеточного механизма, предполагающей, например, транскрипцию или сплайсинг.
Термин "антисмысловой олигонуклеотид" означает одноцепочечный олигонуклеотид, имеющий последовательность нуклеотидных оснований, которая позволяет гибридизироваться с соответствующей областью или сегментом нуклеиновой кислоты-мишени.
"Комплементарность оснований" относится к способности к точному спариванию оснований нуклеотидных оснований антисмыслового олигонуклеотида с соответствующими нуклеотидными основаниями в нуклеиновой кислоте-мишени (то есть гибридизация), и опосредована уотсон-криковским, хугстиновским или обратным хугстиновским образованием водородных связей между соответствующими нуклеотидными основаниями.
Термин "бициклический сахарный фрагмент" означает модифицированный сахарный фрагмент, содержащий 4-7-членное кольцо (в том числе, без ограничения им, фуранозильное), содержащее мостик, соединяющий два атома 4-7-членного кольца с образованием второго кольца, что приводит к получению бициклической структуры. В некоторых вариантах реализации изобретения 4-7-членное кольцо представляет собой кольцо сахара. В некоторых вариантах реализации изобретения 4-7-членное кольцо является фуранозильным. В некоторых таких вариантах реализации изобретения мостик соединяет 2'-углерод и 4'-углерод фуранозила.
2
2
2
2
2
2
Термин "бициклическая нуклеиновая кислота" или "БНК", или "нуклеозиды БНК" означает мономеры нуклеиновых кислот, имеющие мостик, соединяющий два атома углерода между 4'- и 2'-положением сахарной части нуклеозида, тем самым образуя бициклический сахар. Примеры такого бициклического сахара включают, без ограничения ими А) α-L-метиленокси (4'-CH-O-2') LNA, (Б) β-D-метиленокси (4'-СН-O-2') LNA, (В) этиленокси (4'-(СН)-O-2') LNA, (Г) аминоокси (4'-СН-O-N(R)-2') LNA и (Д) оксиамино (4'-CH-N(R)-O-2') LNA, как показано ниже.
1
2
n
1
2
1
1
1
2
x
1
1
2
1
12
1
12
2
12
2
12
2
12
2
12
5
20
5
20
5
7
5
7
1
1
2
1
3
1
2
1
1
1
2
1
12
1
12
2
12
2
12
2
12
2
12
5
20
5
20
1
12
1
12
При использовании по тексту данного документа, соединения LNA включают, без ограничения ими, соединения, имеющие по меньшей мере один мостик между 4'- и 2'-положением сахара, при этом каждый из мостиков независимо содержит 1 или от 2 до 4 связанных групп, независимо выбранных из -[C(R)(R)]-, -C(R)=C(R)-, -C(R)=N-, -C(=NR)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R)-, -S(=O)- и -N(R)-; где: х составляет 0, 1 или 2; n составляет 1, 2, 3 или 4; каждый R и R независимо представляет собой Н, защитную группу, гидроксил, C-C алкил, замещенный C-C алкил, С-С алкенил, замещенный С-С алкенил, С-С алкинил, замещенный С-С алкинил, C-C арил, замещенный C-C арил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, гетероарил, замещенный гетероарил, С-С ациклический радикал, замещенный C-C ациклический радикал, галоген, OJ, NJJ, SJ, N, COOJ, ацил (С(=O)-Н), замещенный ацил, CN, сульфонил (S(=O)-J) или сульфоксил (S(=O)-J); и каждый J и J независимо представляет собой Н, C-C алкил, замещенный C-C алкил, С-С алкенил, замещенный С-С алкенил, С-С алкинил, замещенный С-С алкинил, C-C арил, замещенный C-C арил, ацил (С(=O)-Н), замещенный ацил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, C-C аминоалкил, замещенный C-C аминоалкил или защитную группу.
1
2
n
1
2
n
1
2
1
1
2
1
2
2
2
2
3
2
2
2
2
1
2
1
1
2
1
12
Примеры 4'-2'-мостиковых групп, входящих в определение LNA, включают, без ограничения ими, одну из формул: -[C(R)(R)]-, -[C(R)(R)]-O-, -C(RR)-N(R)-O- или -C(RR)-O-N(R)-. Кроме того, другие мостиковые группы, входящие в определение LNA, представляют собой 4'-СН-2', 4'-(СН)-2', 4'-(СН)-2', 4'-СН-O-2', 4'-(СН)-O-2', 4'-CH-O-N(R)-2' и 4'-CH-N(R)-O-2'-мостики, где каждый R и R независимо представляет собой Н, защитную группу или C-C алкил.
2
2
2
2
2
2
2
Также в определение LNA в соответствии с данным изобретением входят LNA, в которых 2'-гидроксильная группа рибозильного кольца сахара соединена с 4'-атомом углерода кольца сахара, тем самым образуя метиленокси (4'-СН-O-2') мостик с образованием бициклического сахарного фрагмента. Мостик также может представлять собой метиленовую (-СН-) группу, соединяющую 2'-атом кислорода и 4'-атом углерода, для которой используется термин (4'-СН-O-2') LNA. Кроме того, в случае, если бициклический сахарный фрагмент имеет этиленовую мостиковую группу в этом положении, используется термин этиленокси (4'-СНСН-O-2') LNA. α-L-метиленокси (4'-СН-O-2'), изомер метиленокси (4'-СН-O-2') LNA, также входит в определение LNA, при использовании по тексту данного документа.
Термин "кэп-структура" или "концевой кэп-фрагмент" означает химические модификации, которые были введены на любом конце антисмыслового соединения.
3
Термин "cEt" или "конформационно ограниченный этил" означает бициклический сахарный фрагмент, содержащий мостик, соединяющий 4'-углерод и 2'-углерод, при этом мостик имеет следующую формулу: 4'-СН(СН)-O-2'.
3
Термин "конформационно ограниченный этил-нуклеозид" (также обозначаемый, как нуклеозид cEt) означает нуклеозид, содержащий бициклический сахарный фрагмент, содержащий 4'-СН(СН)-O-2'мостик.
Термин "химически различная область" относится к области антисмыслового соединения, которая некоторым образом химически отличается от другой области этого же антисмыслового соединения. Например, область, имеющая 2'-O-метоксиэтиловые нуклеотиды, химически отличается от области, имеющей нуклеотиды без 2'-O-метоксиэтильных модификаций.
Термин "химерные антисмысловые соединения" означает антисмысловые соединения, которые имеют по меньшей мере 2 химически различных области, каждое положение которой имеет множество субъединиц.
Термин "комплементарность" означает способность образовывать пары между нуклеотидными основаниями первой нуклеиновой кислоты и второй нуклеиновой кислоты.
Следует понимать, что термин "содержать", "содержит" и "содержащий" предполагает включение указанного этапа или элемента или группы этапов или элементов, но не исключение любого другого этапа или элемента или группы этапов или элементов.
Термин "непрерывные нуклеотидные основания" означает нуклеотидные основания, непосредственно примыкающие друг к другу.
Термин "дезоксирибонуклеотид" означает нуклеотид, имеющий атом водорода в 2'-положении сахарной части нуклеотида. Дезоксирибонуклеотиды могут быть модифицированы любым из множества заместителей.
Термины "конструирование" или "сконструированный с возможностью" относятся к процессу конструирования олигомерного соединения, которое специфически гибридизуется с выбранной молекулой нуклеиновой кислоты.
Термин "эффективное количество" означает количество активного фармацевтического вещества, достаточное для достижения желаемого физиологического результата у индивидуума, нуждающегося в данном веществе. Эффективное количество может отличаться для индивидуумов в зависимости от здоровья и физического состояния подлежащего лечению индивидуума, таксономической группы подлежащих лечению индивидуумов, состава композиции, оценки состояния здоровья индивидуума и других факторов, имеющих отношение к данному вопросу.
Термин "эффективность" означает способность производить желаемый эффект.
Термин "экспрессия" включает все функции, с помощью которых кодируемая информация гена преобразуется в структуры, присутствующие и функционирующие в клетке. Такие структуры включают, без ограничения ими, продукты транскрипции и трансляции.
Термин "полностью комплементарный" или "100% комплементарный" означает, что каждое нуклеотидное основание первой нуклеиновой кислоты имеет комплементарное нуклеотидное основание во второй нуклеиновой кислоте. В некоторых вариантах реализации изобретения первая нуклеиновая кислота представляет собой антисмысловое соединение, а нуклеиновая кислота-мишень представляет собой вторую нуклеиновую кислоту.
Термин "гэпмер" означает химерное антисмысловое соединение, в котором внутренняя область, имеющая множество нуклеозидов, обеспечивающих расщепление РНКазой Н, расположена между внешними областями, имеющими один или более нуклеозидов, при этом нуклеозиды, составляющие внутреннюю область, по своим химическим свойствам отличаются от нуклеозида или нуклеозидов, составляющих внешние области. Внутренняя область может называться "гэп-сегментом", а внешние области могут называться "сегментами-крыльями".
Термин "рецептор гормона роста (GHR)" означает любую нуклеиновую кислоту или белок GHR. Термин "нуклеиновая кислота GHR" означает любую нуклеиновую кислоту, кодирующую GHR. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения, нуклеиновая кислота GHR содержит последовательность ДНК, кодирующую GHR, последовательность РНК, транскрибируемую из ДНК, кодирующей GHR (в том числе геномной ДНК, содержащей интроны и экзоны), в том числе небелковую кодирующую (то есть некодирующую) последовательность РНК, и последовательность мРНК, кодирующую GHR. "мРНК GHR" означает мРНК, кодирующую белок GHR.
Термин "специфический ингибитор GHR" относится к любому веществу, способному специфически ингибировать экспрессию РНК GHR и/или белка GHR или активность на молекулярном уровне. Например, специфические ингибиторы GHR включают нуклеиновые кислоты (в том числе антисмысловые соединения), пептиды, антитела, малые молекулы и другие вещества, способные ингибировать экспрессию РНК GHR и/или белка GHR.
Термин "гибридизация" означает отжиг комплементарных молекул нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения комплементарные молекулы нуклеиновых кислот включают, без ограничения ими, антисмысловое соединение и нуклеиновую кислоту-мишень. В некоторых вариантах реализации изобретения комплементарные молекулы нуклеиновых кислот включают, без ограничения ими, антисмысловой олигонуклеотид и нуклеиновую кислоту-мишень.
Термин "идентификация животного, имеющего или подверженного риску иметь заболевание, расстройство и/или состояние" означает идентификацию животного, у которого было диагностировано заболевание, расстройство и/или состояние, или идентификацию животного, предрасположенного к развитию заболевания, расстройства и/или состояния. Такая идентификация может быть осуществлена любым способом, в том числе посредством оценки истории болезни индивидуума и стандартных клинических испытаний или анализов.
Термин "непосредственно смежный" означает отсутствие промежуточных элементов между непосредственно смежными элементами.
Термин "индивидуум" означает человека или не относящееся к человеку животное, которые отобраны для лечения или терапии.
Термин "ингибирование экспрессии или активности" относится к снижению, блокировке экспрессии или активности и не обязательно указывает на полное устранение экспрессии или активности.
Термин "межнуклеозидная связь" относится к химической связи между нуклеозидами.
"Удлиненные" антисмысловые олигонуклеотиды представляют собой олигонуклеотиды, которые имеют один или более дополнительных нуклеозидов по сравнению с описанным в данном документе антисмысловым олигонуклеотидом.
Термин "связанный дезоксинуклеозид" означает основание нуклеиновой кислоты (A, G, С, Т, U), замещенное дезоксирибозой, связанной сложным эфиром фосфорной кислоты с образованием нуклеотида.
Термин "связанные нуклеозиды" означает смежные нуклеозиды, связанные вместе межнуклеозидной связью.
Термин "ошибочно спаренное" или "некомплементарное нуклеотидное основание" относится к случаю, когда нуклеотидное основание первой нуклеиновой кислоты не способно спариваться с соответствующим нуклеотидным основанием второй нуклеиновой кислоты или нуклеиновой кислоты-мишени.
Термин "модифицированная межнуклеозидная связь" относится к замене или какому-либо изменению относительно природной межнуклеозидной связи (то есть фосфодиэфирной межнуклеозидной связи).
Термин "модифицированное нуклеотидное основание" означает любое нуклеотидное основание, за исключением аденина, цитозина, гуанина, тимидина или урацила. Термин "немодифицированное нуклеотидное основание" означает пуриновые основания, такие как аденин (А) и гуанин (G), и пиримидиновые основания, такие как тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U).
Термин "модифицированный нуклеозид" означает нуклеозид, имеющий, независимо, модифицированный сахарный фрагмент и/или модифицированное нуклеотидное основание.
Термин "модифицированный нуклеотид" означает нуклеотид, имеющий, независимо, модифицированный сахарный фрагмент, модифицированную межнуклеозидную связь или модифицированное нуклеотидное основание.
Термин "модифицированный олигонуклеотид" означает олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь, модифицированный сахар и/или модифицированное нуклеотидное основание.
Термин "модифицированный сахар" означает замену и/или какое-либо изменение относительно натурального сахарного фрагмента.
Термин "модулирование" относится к изменению или корректировке свойств в клетке, ткани, органе или организме. Например, модулирование мРНК GHR может означать повышение или снижение уровня мРНК GHR и/или белка GHR в клетке, ткани, органе или организме. "Модулятор" влияет на изменения в клетке, ткани, органе или организме. Например, антисмысловое соединение GHR может представлять собой модулятор, который уменьшает количество мРНК GHR и/или белка GHR в клетке, ткани, органе или организме.
Термин "мономер" относится к одной единице олигомера. Мономеры включают, без ограничения ими, нуклеозиды и нуклеотиды, или природные, или модифицированные.
Термин "мотив" означает паттерн немодифицированных и модифицированных нуклеозидов в антисмысловом соединении.
Термин "природный сахарный фрагмент" означает сахарный фрагмент, встречающийся в ДНК (2'-Н) или РНК (2'-ОН).
Термин "природная межнуклеозидная связь" означает фосфодиэфирную 3'-5'-связь.
Термин "некомплементарное нуклеотидное основание" относится к паре нуклеотидов, которые не образуют водородные связи друг с другом или иным образом поддерживают гибридизацию.
Термин "нуклеиновая кислота" относится к молекулам, состоящим из мономерных нуклеотидов. Нуклеиновая кислота включает, без ограничения ими, рибонуклеиновые кислоты (РНК), дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК), одноцепочечные нуклеиновые кислоты и двухцепочечные нуклеиновые кислоты.
Термин "нуклеотидное основание" означает гетероциклический фрагмент, способный спариваться с основанием другой нуклеиновой кислоты.
Термин "комплементарность нуклеотидных оснований" относится к нуклеотидному основанию, которое способно к спариванию оснований с другим нуклеотидным основанием. Например, в ДНК аденин (А) является комплементарным относительно тимина (Т). Например, в РНК аденин (А) является комплементарным относительно урацила (U). В некоторых вариантах реализации изобретения комплементарное нуклеотидное основание относится к нуклеотидному основанию антисмыслового соединения, которое способно к спариванию оснований с нуклеотидным основанием его нуклеиновой кислоты-мишени. Например, если нуклеотидное основание в определенном положении антисмыслового соединения способно к водородному связыванию с нуклеотидным основанием в определенном положении нуклеиновой кислоты-мишени, то это положение водородного связывания между олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью считается комплементарным по этой паре нуклеотидных оснований.
Термин "последовательность нуклеотидных оснований" означает порядок непрерывных нуклеотидных оснований, независимый от какой-либо модификации сахара, связи или нуклеотидного основания.
Термин "нуклеозид" означает нуклеотидное основание, связанное с сахаром.
Термин "нуклеозидный миметик" включает структуры, используемые для замены сахара или сахара и основания, и необязательно связи в одном или более положениях олигомерного соединения, такие как, например, нуклеозидные миметики, имеющие морфолино, циклогексенил, циклогексил, тетрагидропиранил, бициклические или трициклические сахарные миметики, например, нефуранозные сахарные звенья. Нуклеотидный миметик включает структуры, используемые для замены нуклеозида и связи в одном или более положениях олигомерного соединения, такие как, например, пептидо-нуклеиновые кислоты или морфолино (морфолино, связанные -N(H)-C(=O)-O- или другой нефосфодиэфирной связью). Заменитель сахара перекрывается несколько более широким термином нуклеозидный миметик, но предназначен для обозначения только замены сахарного звена (фуранозного кольца). Приведенные в данном документе тетрагидропиранильные кольца приводятся в иллюстративных целях в качестве примера заменителя сахара, в котором фуранозная сахарная группа была заменена тетрагидропиранильной кольцевой системой. Термин "миметик" относится к группам, которые замещены сахаром, нуклеотидным основанием и/или межнуклеозидной связью. Как правило, миметик применяют вместо сахара или комбинации сахар-межнуклеозидная связь, и нуклеотидное основание сохраняют для гибридизации с выбранной мишенью.
Термин "нуклеотид" означает нуклеозид, имеющий фосфатную группу, ковалентно связанную с сахарной частью нуклеозида.
Термин "олигомерное соединение" означает полимер связанных мономерных субъединиц, который способен гибридизироватьтся по меньшей мере с участком молекулы нуклеиновой кислоты.
Термин "олигонуклеозид" означает олигонуклеотид, в котором межнуклеозидные связи не содержат атом фосфора.
Термин "олигонуклеотид" означает полимер связанных нуклеозидов, каждый из которых может быть модифицированным или немодифицированным, независимо друг от друга.
Термин "парентеральное введение" означает введение посредством инъекции или инфузии. Парентеральное введение включает подкожное введение, внутривенное введение, внутримышечное введение, внутриартериальное введение, внутрибрюшинное введение или внутричерепное введение, например, интратекальное или интрацеребровентрикулярное введение.
Термин "фармацевтическая композиция" означает смесь веществ, подходящих для введения индивидууму. Например, фармацевтическая композиция может содержать одно или более активных фармацевтических веществ и стерильный водный раствор.
Термин "фармацевтически приемлемые соли" означает физиологически и фармацевтически приемлемые соли антисмысловых соединений, то есть соли, которые сохраняют желаемую биологическую активность исходного олигонуклеотида и не вызывают нежелательное токсикологическое воздействие.
Термин "фосфоротиоатная связь" означает связь между нуклеозидами, где указанную фосфодиэфирную связь модифицируют посредством замены одного из немостиковых атомов кислорода атомом серы. Фосфоротиоатная связь представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь.
Термин "часть" означает определенное количество непрерывных (то есть связанных) нуклеотидных оснований нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения часть представляет собой определенное количество непрерывных нуклеотидных оснований нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения часть представляет собой определенное количество непрерывных нуклеотидных оснований антисмыслового соединения.
Термин "профилактика" относится к задержке или предотвращению начала, развития или прогрессирования заболевания, расстройства или состояния в течение периода времени, составляющего от нескольких минут и до конца жизни. Профилактика также означает снижение риска развития заболевания, расстройства или состояния.
Термин "профилактически эффективное количество" относится к количеству фармацевтического вещества, которое обеспечивает профилактическую или превентивную пользу животному.
Термин "область" означает часть нуклеиновой кислоты-мишени, имеющую по меньшей мере одну идентифицируемую структуру, функцию или характеристику.
Термин "рибонуклеотид" означает нуклеотид, имеющий гидрокси в 2'-положении сахарной части нуклеотида. Рибонуклеотиды могут быть модифицированы любым из множества заместителей.
"Сегменты" означают меньшие фрагменты или субфрагменты областей в нуклеиновой кислоте-мишени.
Термин "побочные эффекты" означает физиологическое заболевание и/или состояния, сопровождающие лечение, отличные от желаемых эффектов. В некоторых вариантах реализации изобретения побочные эффекты включают реакции в месте введения препарата, отклонения в биохимических показателях функции печени, нарушения функции почек, гепатотоксичность, нефротоксичность, нарушения центральной нервной системы, миопатии и чувство дискомфорта. Например, повышенный уровень аминотрансферазы в сыворотке крови может указывать на гепатотоксичность или нарушение функции печени. Например, повышенные уровни билирубина могут указывать на гепатотоксичность или нарушение функции печени.
Термин "сайты", при использовании по тексту данного документа, означает уникальные положения нуклеотидных оснований в нуклеиновой кислоте-мишени.
Термин "замедляет прогрессирование" означает снижение развития указанного заболевания.
Термин "специфически гибридизующийся" относится к антисмысловому соединению, имеющему достаточную степень комплементарности между антисмысловым олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью для достижения желаемого эффекта, но при этом оказывающему минимальное воздействие или вообще не оказывающему какого-либо воздействия на нуклеиновые кислоты, не являющиеся мишенями, в условиях, при которых специфическое связывание является желательным, то есть в физиологических условиях в случае проведения анализов in vivo и терапевтического лечения. Термин "жесткие условия гибридизации" или "жесткие условия" относится к условиям, при которых олигомерное соединение будет гибридизоваться со своей последовательностью-мишенью, но с минимальным количеством других последовательностей.
Термин "субъект" означает человека или не относящееся к человеку животное, которые отобраны для лечения или терапии.
Термин "мишень" относится к белку, модуляция которого является желательной.
Термин "ген-мишень" относится к гену, кодирующему мишень.
Термин "нацеленный" означает процесс разработки и выбора антисмыслового соединения, которое будет специфически гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью и вызывать желаемый эффект.
Термины "нуклеиновая кислота-мишень", "РНК-мишень", "РНК-транскрипт-мишень" и "нуклеиново-кислотная мишень" означают нуклеиновую кислоту, способную быть мишенью антисмысловых соединений.
Термин "область-мишень" означает часть нуклеиновой кислоты-мишени, на которую нацелено одно или более антисмысловых соединений.
Термин "сегмент-мишень" означает последовательность нуклеотидов нуклеиновой кислоты-мишени, на которую нацелено антисмысловое соединение. Термин "5'-сайт-мишень" относится к самому крайнему нуклеотиду с 5'-конца сегмента-мишени. Термин "3'-сайт-мишень" относится к самому крайнему нуклеотиду с 3'-конца сегмента-мишени.
Термин "терапевтически эффективное количество" означает количество фармацевтического вещества, которое обеспечивает терапевтический эффект индивидууму.
Термин "лечить" относится к введению фармацевтической композиции животному для обеспечения изменения или улучшения течения заболевания, расстройства или состояния у животного. В некоторых вариантах реализации изобретения животному могут быть введены одна или более фармацевтических композиций.
Термин "немодифицированные" нуклеотидные основания означает пуриновые основания, такие как аденин (А) и гуанин (G), и пиримидиновые основания, такие как тимин (Т), цитозин (С) и урацил(U).
Термин "немодифицированный нуклеотид" означает нуклеотид, состоящий из встречающихся в природе нуклеотидных оснований, сахарных фрагментов и межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения немодифицированный нуклеотид представляет собой нуклеотид РНК (то есть β-D-рибонуклеозиды) или нуклеотид ДНК (то есть β-D-дезоксирибонуклеозид).
Некоторые варианты реализации изобретения
Некоторые варианты реализации изобретения относятся к способам, соединениям и композициям для ингибирования экспрессии рецептора гормона роста (GHR).
Некоторые варианты реализации изобретения относятся к антисмысловым соединениям, нацеленным на нуклеиновую кислоту GHR. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота GHR имеет последовательность, приведенную под № доступа в GENBANK NM_000163.4 (включенную в данный документ как SEQ ID №: 1), № доступа в GENBANK NT_006576.16, усеченную с нуклеотида 42411001 по 42714000 (включенную в данный документ как SEQ ID №: 2), № доступа в GENBANK X06562.1 (включенную в данный документ как SEQ ID №: 3), № доступа в GENBANK DR006395.1 (включенную в данный документ как SEQ ID №: 4), № доступа в GENBANK DB052048.1 (включенную в данный документ как SEQ ID №: 5), № доступа в GENBANK AF230800.1 (включенную в данный документ как SEQ ID №: 6), комплемент под № доступа в GENBANK AA398260.1 (включенный в данный документ как SEQ ID №: 7), № доступа в GENBANK ВС136496.1 (включенную в данный документ как SEQ ID №: 8), № доступа в GENBANK NM_001242399.2 (включенную в данный документ как SEQ ID №: 9), № доступа в GENBANK NM_001242400.2 (включенную в данный документ как SEQ ID №10), № доступа в GENBANK NM_001242401.3 (включенную в данный документ как SEQ ID №11), № доступа в GENBANK NM_001242402.2 (включенную в данный документ как SEQ ID №12), № доступа в GENBANK NM_001242403.2 (включенную в данный документ как SEQ ID №13), № доступа в GENBANK NM_001242404.2 (включенную в данный документ как SEQ ID №14), № доступа в GENBANK NM_001242405.2 (включенную в данный документ как SEQ ID №15), № доступа в GENBANK NM_001242406.2 (включенную в данный документ как SEQ ID №16), № доступа в GENBANK NM_001242460.1 (включенную в данный документ как SEQ ID №17), № доступа в GENBANK NM_001242461.1 (включенную в данный документ как SEQ ID №: 18) или № доступа в GENBANK NM_001242462.1 (включенную в данный документ как SEQ ID №: 19).
Некоторые варианты реализации изобретения относятся к соединению, содержащему модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 10-30 связанных нуклеозидов и имеющих последовательность нуклеотидных оснований, содержащую по меньшей мере 8 непрерывных нуклеотидных оснований любой из последовательностей нуклеотидных оснований SEQ ID №: 20-2295.
Некоторые варианты реализации изобретения относятся к соединению, содержащему модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 10-30 связанных нуклеозидов, комплементарных в пределах нуклеотидов 30-51, 63-82, 103-118, 143-159, 164-197, 206-259, 361-388, 554-585, 625-700, 736-776, 862-887, 923-973, 978-996, 1127-1142, 1170-1195, 1317-1347, 1360-1383, 1418-1449, 1492-1507, 1524-1548, 1597-1634, 1641-1660, 1683-1698, 1744-1768, 1827-1860, 1949-2002, 2072-2092, 2095-2110, 2306-2321, 2665-2683, 2685-2719, 2739-2770, 2859-2880, 2941-2960, 2963-2978, 3037-3052, 3205-3252, 3306-3332, 3371-3386, 3518-3542, 3975-3990, 4041-4087, 4418-4446, 4528-4546, 7231-7246, 7570-7585, 8395-8410, 9153-9168, 9554-9569, 9931-9946, 10549-10564, 11020-11035, 11793-11808, 12214-12229, 12474-12489, 12905-12920, 13400-13415, 13717-13732, 14149-14164, 14540-14555, 15264-15279, 15849-15864, 16530-16545, 17377-17392, 17581-17596, 17943-17958, 18353-18368, 18636-18651, 19256-19271, 19814-19829, 20365-20380, 20979-20994, 21566-21581, 22150-22165, 22803-22818, 29049-29064, 29554-29569, 30245-30260, 30550-30565, 30915-30930, 31468-31483, 32366-32381, 32897-32912, 33187-33202, 33780-33795, 34407-34422, 34846-34861, 35669-35684, 36312-36327, 36812-36827, 37504-37519, 38841-38856, 40250-40265, 40706-40721, 40922-40937, 41424-41439, 41999-42014, 42481-42496, 42700-42715, 43291-43306, 43500-43515, 43947-43962, 44448-44463, 45162-45177, 46010-46025, 46476-46491, 47447-47462, 47752-47767, 48001-48016, 48423-48438, 50195-50210, 50470-50485, 51104-51119, 51756-51771, 52015-52030, 52230-52245, 52588-52603, 53532-53547 или 54645-54660 последовательности SEQ ID №: 1, при этом указанный модифицированный олигонуклеотид является по меньшей мере на 90% комплементарным относительно SEQ ID №: 1.
Некоторые варианты реализации изобретения относятся к соединению, содержащему модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 10-30 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеотидных оснований, содержащую часть из по меньшей мере 8 непрерывных нуклеотидных оснований, на 100% комплементарную относительно равной по длине части нуклеотидных оснований 30-51, 63-82, 103-118, 143-159, 164-197, 206-259, 361-388, 554-585, 625-700, 736-776, 862-887, 923-973, 978-996, 1127-1142, 1170-1195, 1317-1347, 1360-1383, 1418-1449, 1492-1507, 1524-1548, 1597-1634, 1641-1660, 1683-1698, 1744-1768, 1827-1860, 1949-2002, 2072-2092, 2095-2110, 2306-2321, 2665-2683, 2685-2719, 2739-2770, 2859-2880, 2941-2960, 2963-2978, 3037-3052, 3205-3252, 3306-3332, 3371-3386, 3518-3542, 3975-3990, 4041-4087, 4418-4446, 4528-4546, 7231-7246, 7570-7585, 8395-8410, 9153-9168, 9554-9569, 9931-9946, 10549-10564, 11020-11035, 11793-11808, 12214-12229, 12474-12489, 12905-12920, 13400-13415, 13717-13732, 14149-14164, 14540-14555, 15264-15279, 15849-15864, 16530-16545, 17377-17392, 17581-17596, 17943-17958, 18353-18368, 18636-18651, 19256-19271, 19814-19829, 20365-20380, 20979-20994, 21566-21581, 22150-22165, 22803-22818, 29049-29064, 29554-29569, 30245-30260, 30550-30565, 30915-30930, 31468-31483, 32366-32381, 32897-32912, 33187-33202, 33780-33795, 34407-34422, 34846-34861, 35669-35684, 36312-36327, 36812-36827, 37504-37519, 38841-38856, 40250-40265, 40706-40721, 40922-40937, 41424-41439, 41999-42014, 42481-42496, 42700-42715, 43291-43306, 43500-43515, 43947-43962, 44448-44463, 45162-45177, 46010-46025, 46476-46491, 47447-47462, 47752-47767, 48001-48016, 48423-48438, 50195-50210, 50470-50485, 51104-51119, 51756-51771, 52015-52030, 52230-52245, 52588-52603, 53532-53547 или 54645-54660 последовательности SEQ ID №: 1, при этом последовательность нуклеотидных оснований модифицированного олигонуклеотида комплементарна относительно SEQ ID №: 1.
Некоторые варианты реализации изобретения относятся к соединению, содержащему модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 10-30 связанных нуклеозидов, комплементарных в пределах нуклеотидов 2571-2586, 2867-3059, 3097-3116, 3341-3695, 4024-4039, 4446-4894, 5392-5817, 6128-6265, 6499-6890, 7231-7246, 8395-8410, 9153-9168, 9554-9569, 9931-9946, 10549-10564, 10660-10679, 11020-11035, 11793-12229, 12469-12920, 13351-13415, 13717-13732, 14149-14164, 14361-14555, 14965-15279, 15849-16001, 16253-16272, 16447-16545, 17130-17149, 17377-17669, 17927-17958, 18353-18368, 18636-18773, 19661-19918, 20288-20470, 20979-20994, 21215-21606, 21820-21837, 22150-22165, 22518-22536, 22803-22818, 26494-26522, 29049-29069, 29323-29489, 30550-30565, 30915-31191, 31468-31483, 32363-32382, 32827-33202, 33635-33795, 34138-34157, 34407-34422, 34845-34864, 35466-35485, 35669-35684, 36023-36042, 36266-36327, 36721-36827, 37032-37130, 37276-37295, 37504-37675, 38094-38118, 38841-38856, 39716-40538, 40706-40937, 41164-41183, 41342-41439, 42141-42164, 42700-42760, 43173-43537, 43765-46025, 46476-46532, 48423-48438, 50072-50210, 50470-50485, 50719-51234, 51747-51797, 52015-52143, 52230-52245, 52573-52652, 53466-54660, 54886-54901, 63751-64662, 64882-65099, 65363-65378, 65600-65615, 65988-66183, 66566-66581, 66978-67080, 67251-67270, 67662-67929, 68727-68742, 69203-69242, 69565-69620, 69889-70145, 70352-70584, 70925-71071, 71314-71329, 71617-71769, 72107-72241, 72584-72670, 73061-73076, 73350-73369, 73689-73723, 74107-74131, 74317-74557, 74947-75009, 75192-75207, 75979-76066, 76410-77095, 77292-77307, 77638-77869, 78122-78326, 79006-79021, 79478-79505, 80277-80292, 80575-80939, 81207-81222, 81524-81543, 81761-81776, 82233-82248, 82738-83198, 83330-83416, 83884-84063, 84381-85964, 86220-86392, 86554-86655, 86901-86920, 87181-87262, 88063-88082, 88293-88308, 88605-88967, 89160-89175, 89940-90255, 90473-90528, 91073-91088, 91273-91292, 91647-91662, 91930-92126, 92356-92371, 93190-93443, 93762-94111, 94374-94389, 94581-94653, 94839-94858, 95292-95583, 95829-95844, 96137-96503, 96793-97013, 97539-97554, 97800-97889, 98132-98151, 98624-98672, 98810-99115, 99258-99273, 99478-99503, 99791-99858, 100281-100300, 100406-100421, 100742-100828, 101080-101103, 101242-101320, 101788-101906, 102549-102568, 103566-103625, 104067-104086, 104277-104858, 105255-105274, 106147-106364, 106632-106647, 106964-107735, 108514-108788, 109336-109505, 109849-109864, 110403-110442, 110701-110974, 111203-111322, 112030-112049, 112499-112514, 112842-112861, 113028-113056, 113646-113665, 113896-113911, 114446-114465, 115087-115106, 119269-119284, 119659-119703, 120376-120497, 120738-120845, 121209-121228, 121823-122013, 122180-122199, 122588-122770, 123031-123050, 123152-123167, 123671-124055, 124413-124608, 125178-125197, 125533-125616, 126357-126434, 126736-126751, 126998-127236, 127454-127682, 128467-128482, 128813-129111, 129976-130013, 130308-130323, 131036-131056, 131286-131305, 131676-131691, 132171-132517, 133168-133241, 133522-133877, 134086-134101, 134240-134259, 134441-134617, 135015-135030, 135431-135519, 135818-135874, 136111-136130, 136282-136595, 136996-137152, 137372-137387, 137750-137765, 138048-138067, 138782-139840, 140343-140358, 140593-140701, 141116-141131, 141591-141719, 142113-142342, 143021-143048, 143185-143486, 143836-144109, 144558-144650, 144990-145078, 145428-145525, 145937-145952, 146235-146386, 147028-147043, 147259-147284, 147671-147686, 148059-148154, 148564-148579, 148904-149084, 149491-149506, 149787-149877, 150236-150251, 150588-151139, 151373-151659, 152201-152388, 152549-152771, 153001-153026, 153349-153364, 153831-154112, 154171-154186, 154502-154521, 154724-154828, 155283-155304, 155591-155616, 155889-155992, 156233-156612, 156847-156907, 157198-157223, 157330-157349, 157552-157567, 157927-158029, 158542-158631, 159216-159267, 159539-159793, 160352-160429, 160812-160827, 161248-161267, 161461-161607, 161821-161969, 162064-162083, 162132-162147, 162531-162770, 163019-163557, 164839-165059, 165419-165575, 165856-165875, 166241-166450, 166837-166852, 167107-167122, 168004-168019, 168760-168823, 169062-169092, 169134-169153, 169601-169711, 170081-170291, 170407-170426, 170703-170814, 171021-171036, 171207-171226, 171431-171568, 171926-171945, 172447-172462, 172733-172956, 173045-173756, 174122-174885, 175014-177830, 178895-180539, 181514-187644, 187857-189904, 190109-194159, 194425-195723, 196536-196873, 197326-197961, 198145-198170, 198307-198381, 198715-199007, 199506-199563, 199816-199838, 200249-200635, 201258-201861, 202079-202094, 202382-202717, 203098-203934, 204181-204740, 205549-205915, 206412-206764, 207510-207532, 209999-210014, 210189-210296, 210502-210583, 210920-211418, 211836-212223, 212606-212816, 213025-213044, 213425-213440, 213825-213933, 214479-214498, 214622-214647, 214884-214951, 215446-215508, 215932-215951, 216192-217595, 218132-218248, 218526-218541, 218734-21219037, 219342-219633, 219886-220705, 221044-221059, 221483-221607, 221947-221962, 222569-222584, 222914-222998, 223436-223451, 223948-224122, 224409-224430, 224717-224769, 225133-225148, 225436-225761, 226785-226898, 227025-227040, 227218-227251, 227485-227500, 227914-228837, 229174-229189, 229423-229438, 229615-229640, 230042-230057, 230313-230595, 231218-231345, 231817-232037, 232088-232408, 232823-232848, 232884-232899, 233210-233225, 233623-233646, 234447-234466, 234876-234918, 235258-235328, 235770-235785, 236071-236213, 236684-237196, 237585-237698, 237949-237557, 244873-244897, 245319-245334, 245701-245780, 246152-246523, 246936-247031, 247203-247240, 247431-247450, 247644-247659, 248223-248363, 248694-248762, 249494-249509, 250001-250020, 250693-250708, 251214-251233, 251601-251637, 251950-252060, 252665-252680, 252838-252863, 253140-253166, 253594-253819, 254036-254083, 254246-254345, 254641-254660, 254905-254920, 255397-255422, 255618-255633, 255992-256704, 257018-257092, 257317-257332, 257818-259305, 259500-259515, 261294-261656, 262021-262036, 262453-262779, 263338-266518, 266861-267131, 267375-268051, 268366-269447, 270038-271850, 271950-271969, 272631-274145, 274205-275747, 275808-276636, 276932-277064, 277391-278380, 278932-279063, 279303-281001, 281587-281610, 282229-283668, 290035-290474, 290924-292550, 292860-294408, 295475-297012, 297587-298115, 298161-298418, 298489-298738, 299082-299187, 299276-299669, 299723-299749, 299788-300504 или 300835-301295 последовательности SEQ ID №: 2, при этом указанный модифицированный олигонуклеотид является по меньшей мере на 90% комплементарным относительно SEQ ID №: 2.
Некоторые варианты реализации изобретения относятся к соединению, содержащему модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 10-30 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеотидных оснований, содержащую часть из по меньшей мере 8 непрерывных нуклеотидных оснований, на 100% комплементарную относительно равной по длине части нуклеотидных оснований 2571-2586, 2867-3059, 3097-3116, 3341-3695, 4024-4039, 4446-4894, 5392-5817, 6128-6265, 6499-6890, 7231-7246, 8395-8410, 9153-9168, 9554-9569, 9931-9946, 10549-10564, 10660-10679, 11020-11035, 11793-12229, 12469-12920, 13351-13415, 13717-13732, 14149-14164, 14361-14555, 14965-15279, 15849-16001, 16253-16272, 16447-16545, 17130-17149, 17377-17669, 17927-17958, 18353-18368, 18636-18773, 19661-19918, 20288-20470, 20979-20994, 21215-21606, 21820-21837, 22150-22165, 22518-22536, 22803-22818, 26494-26522, 29049-29069, 29323-29489, 30550-30565, 30915-31191, 31468-31483, 32363-32382, 32827-33202, 33635-33795, 34138-34157, 34407-34422, 34845-34864, 35466-35485, 35669-35684, 36023-36042, 36266-36327, 36721-36827, 37032-37130, 37276-37295, 37504-37675, 38094-38118, 38841-38856, 39716-40538, 40706-40937, 41164-41183, 41342-41439, 42141-42164, 42700-42760, 43173-43537, 43765-46025, 46476-46532, 48423-48438, 50072-50210, 50470-50485, 50719-51234, 51747-51797, 52015-52143, 52230-52245, 52573-52652, 53466-54660, 54886-54901, 63751-64662, 64882-65099, 65363-65378, 65600-65615, 65988-66183, 66566-66581, 66978-67080, 67251-67270, 67662-67929, 68727-68742, 69203-69242, 69565-69620, 69889-70145, 70352-70584, 70925-71071, 71314-71329, 71617-71769, 72107-72241, 72584-72670, 73061-73076, 73350-73369, 73689-73723, 74107-74131, 74317-74557, 74947-75009, 75192-75207, 75979-76066, 76410-77095, 77292-77307, 77638-77869, 78122-78326, 79006-79021, 79478-79505, 80277-80292, 80575-80939, 81207-81222, 81524-81543, 81761-81776, 82233-82248, 82738-83198, 83330-83416, 83884-84063, 84381-85964, 86220-86392, 86554-86655, 86901-86920, 87181-87262, 88063-88082, 88293-88308, 88605-88967, 89160-89175, 89940-90255, 90473-90528, 91073-91088, 91273-91292, 91647-91662, 91930-92126, 92356-92371, 93190-93443, 93762-94111, 94374-94389, 94581-94653, 94839-94858, 95292-95583, 95829-95844, 96137-96503, 96793-97013, 97539-97554, 97800-97889, 98132-98151, 98624-98672, 98810-99115, 99258-99273, 99478-99503, 99791-99858, 100281-100300, 100406-100421, 100742-100828, 101080-101103, 101242-101320, 101788-101906, 102549-102568, 103566-103625, 104067-104086, 104277-104858, 105255-105274, 106147-106364, 106632-106647, 106964-107735, 108514-108788, 109336-109505, 109849-109864, 110403-110442, 110701-110974, 111203-111322, 112030-112049, 112499-112514, 112842-112861, 113028-113056, 113646-113665, 113896-113911, 114446-114465, 115087-115106, 119269-119284, 119659-119703, 120376-120497, 120738-120845, 121209-121228, 121823-122013, 122180-122199, 122588-122770, 123031-123050, 123152-123167, 123671-124055, 124413-124608, 125178-125197, 125533-125616, 126357-126434, 126736-126751, 126998-127236, 127454-127682, 128467-128482, 128813-129111, 129976-130013, 130308-130323, 131036-131056, 131286-131305, 131676-131691, 132171-132517, 133168-133241, 133522-133877, 134086-134101, 134240-134259, 134441-134617, 135015-135030, 135431-135519, 135818-135874, 136111-136130, 136282-136595, 136996-137152, 137372-137387, 137750-137765, 138048-138067, 138782-139840, 140343-140358, 140593-140701, 141116-141131, 141591-141719, 142113-142342, 143021-143048, 143185-143486, 143836-144109, 144558-144650, 144990-145078, 145428-145525, 145937-145952, 146235-146386, 147028-147043, 147259-147284, 147671-147686, 148059-148154, 148564-148579, 148904-149084, 149491-149506, 149787-149877, 150236-150251, 150588-151139, 151373-151659, 152201-152388, 152549-152771, 153001-153026, 153349-153364, 153831-154112, 154171-154186, 154502-154521, 154724-154828, 155283-155304, 155591-155616, 155889-155992, 156233-156612, 156847-156907, 157198-157223, 157330-157349, 157552-157567, 157927-158029, 158542-158631, 159216-159267, 159539-159793, 160352-160429, 160812-160827, 161248-161267, 161461-161607, 161821-161969, 162064-162083, 162132-162147, 162531-162770, 163019-163557, 164839-165059, 165419-165575, 165856-165875, 166241-166450, 166837-166852, 167107-167122, 168004-168019, 168760-168823, 169062-169092, 169134-169153, 169601-169711, 170081-170291, 170407-170426, 170703-170814, 171021-171036, 171207-171226, 171431-171568, 171926-171945, 172447-172462, 172733-172956, 173045-173756, 174122-174885, 175014-177830, 178895-180539, 181514-187644, 187857-189904, 190109-194159, 194425-195723, 196536-196873, 197326-197961, 198145-198170, 198307-198381, 198715-199007, 199506-199563, 199816-199838, 200249-200635, 201258-201861, 202079-202094, 202382-202717, 203098-203934, 204181-204740, 205549-205915, 206412-206764, 207510-207532, 209999-210014, 210189-210296, 210502-210583, 210920-211418, 211836-212223, 212606-212816, 213025-213044, 213425-213440, 213825-213933, 214479-214498, 214622-214647, 214884-214951, 215446-215508, 215932-215951, 216192-217595, 218132-218248, 218526-218541, 218734-21219037, 219342-219633, 219886-220705, 221044-221059, 221483-221607, 221947-221962, 222569-222584, 222914-222998, 223436-223451, 223948-224122, 224409-224430, 224717-224769, 225133-225148, 225436-225761, 226785-226898, 227025-227040, 227218-227251, 227485-227500, 227914-228837, 229174-229189, 229423-229438, 229615-229640, 230042-230057, 230313-230595, 231218-231345, 231817-232037, 232088-232408, 232823-232848, 232884-232899, 233210-233225, 233623-233646, 234447-234466, 234876-234918, 235258-235328, 235770-235785, 236071-236213, 236684-237196, 237585-237698, 237949-237557, 244873-244897, 245319-245334, 245701-245780, 246152-246523, 246936-247031, 247203-247240, 247431-247450, 247644-247659, 248223-248363, 248694-248762, 249494-249509, 250001-250020, 250693-250708, 251214-251233, 251601-251637, 251950-252060, 252665-252680, 252838-252863, 253140-253166, 253594-253819, 254036-254083, 254246-254345, 254641-254660, 254905-254920, 255397-255422, 255618-255633, 255992-256704, 257018-257092, 257317-257332, 257818-259305, 259500-259515, 261294-261656, 262021-262036, 262453-262779, 263338-266518, 266861-267131, 267375-268051, 268366-269447, 270038-271850, 271950-271969, 272631-274145, 274205-275747, 275808-276636, 276932-277064, 277391-278380, 278932-279063, 279303-281001, 281587-281610, 282229-283668, 290035-290474, 290924-292550, 292860-294408, 295475-297012, 297587-298115, 298161-298418, 298489-298738, 299082-299187, 299276-299669, 299723-299749, 299788-300504 или 300835-301295 последовательности SEQ ID №: 2, при этом последовательность нуклеотидных оснований модифицированного олигонуклеотида является комплементарной относительно SEQ ID №: 2. В некоторых аспектах соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 10-30 связанных нуклеозидов, комплементарных в пределах нуклеотидов 155594-155613, 72107-72126, 153921-153940, 159252-159267, 213425-213440, 153004-153019, 155597-155612, 248233-248248 последовательности SEQ ID №: 2.
Некоторые варианты реализации изобретения относятся к соединению, содержащему модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 10-30 связанных нуклеозидов и имеющих последовательность нуклеотидных оснований, содержащую последовательность нуклеотидных оснований любой из SEQ ID №: 20-2295.
Некоторые варианты реализации изобретения относятся к соединению, содержащему модифицированный олигонуклеотид, состоящий из последовательности нуклеотидных оснований любой из SEQ ID №: 20-2295.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение или олигонуклеотид, нацеленные на нуклеиновую кислоту рецептора гормона роста, комплементарны в пределах следующих нуклеотидных областей SEQ ID №: 1: 30-51, 63-82, 103-118, 143-159, 164-197, 206-259, 361-388, 554-585, 625-700, 736-776, 862-887, 923-973, 978-996, 1127-1142, 1170-1195, 1317-1347, 1360-1383, 1418-1449, 1492-1507, 1524-1548, 1597-1634, 1641-1660, 1683-1698, 1744-1768, 1827-1860, 1949-2002, 2072-2092, 2095-2110, 2306-2321, 2665-2683, 2685-2719, 2739-2770, 2859-2880, 2941-2960, 2963-2978, 3037-3052, 3205-3252, 3306-3332, 3371-3386, 3518-3542, 3975-3990, 4041-4087, 4418-4446, 4528-4546, 7231-7246, 7570-7585, 8395-8410, 9153-9168, 9554-9569, 9931-9946, 10549-10564, 11020-11035, 11793-11808, 12214-12229, 12474-12489, 12905-12920, 13400-13415, 13717-13732, 14149-14164, 14540-14555, 15264-15279, 15849-15864, 16530-16545, 17377-17392, 17581-17596, 17943-17958, 18353-18368, 18636-18651, 19256-19271, 19814-19829, 20365-20380, 20979-20994, 21566-21581, 22150-22165, 22803-22818, 29049-29064, 29554-29569, 30245-30260, 30550-30565, 30915-30930, 31468-31483, 32366-32381, 32897-32912, 33187-33202, 33780-33795, 34407-34422, 34846-34861, 35669-35684, 36312-36327, 36812-36827, 37504-37519, 38841-38856, 40250-40265, 40706-40721, 40922-40937, 41424-41439, 41999-42014, 42481-42496, 42700-42715, 43291-43306, 43500-43515, 43947-43962, 44448-44463, 45162-45177, 46010-46025, 46476-46491, 47447-47462, 47752-47767, 48001-48016, 48423-48438, 50195-50210, 50470-50485, 51104-51119, 51756-51771, 52015-52030, 52230-52245, 52588-52603, 53532-53547 или 54645-54660.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение или олигонуклеотид, нацеленные на нуклеиновую кислоту рецептора гормона роста, нацелены на следующие нуклеотидные области SEQ ID №: 1: 30-51, 63-82, 103-118, 143-159, 164-197, 206-259, 361-388, 554-585, 625-700, 736-776, 862-887, 923-973, 978-996, 1127-1142, 1170-1195, 1317-1347, 1360-1383, 1418-1449, 1492-1507, 1524-1548, 1597-1634, 1641-1660, 1683-1698, 1744-1768, 1827-1860, 1949-2002, 2072-2092, 2095-2110, 2306-2321, 2665-2683, 2685-2719, 2739-2770, 2859-2880, 2941-2960, 2963-2978, 3037-3052, 3205-3252, 3306-3332, 3371-3386, 3518-3542, 3975-3990, 4041-4087, 4418-4446, 4528-4546, 7231-7246, 7570-7585, 8395-8410, 9153-9168, 9554-9569, 9931-9946, 10549-10564, 11020-11035, 11793-11808, 12214-12229, 12474-12489, 12905-12920, 13400-13415, 13717-13732, 14149-14164, 14540-14555, 15264-15279,15849-15864, 16530-16545, 17377-17392, 17581-17596, 17943-17958,18353-18368, 18636-18651, 19256-19271, 19814-19829, 20365-20380, 20979-20994, 21566-21581, 22150-22165, 22803-22818, 29049-29064, 29554-29569, 30245-30260, 30550-30565, 30915-30930, 31468-31483, 32366-32381, 32897-32912, 33187-33202, 33780-33795, 34407-34422, 34846-34861, 35669-35684, 36312-36327, 36812-36827, 37504-37519, 38841-38856, 40250-40265, 40706-40721, 40922-40937, 41424-41439, 41999-42014, 42481-42496, 42700-42715, 43291-43306, 43500-43515, 43947-43962, 44448-44463, 45162-45177, 46010-46025, 46476-46491, 47447-47462, 47752-47767, 48001-48016, 48423-48438, 50195-50210, 50470-50485, 51104-51119, 51756-51771, 52015-52030, 52230-52245, 52588-52603, 53532-53547 или 54645-54660.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены на область нуклеиновой кислоты рецептора гормона роста. В некоторых вариантах реализации изобретения такие соединения или олигонуклеотиды, нацеленные на область нуклеиновой кислоты GHR, имеют непрерывную часть нуклеотидных оснований, которая является комплементарной относительно равной по длине части нуклеотидных оснований области. Например, часть может представлять собой часть из по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 непрерывных нуклеотидных оснований, комплементарную относительно равной по длине части области, приведенной в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения такие соединения или олигонуклеотиды нацелены на следующие нуклеотидные области SEQ ID №: 1: 30-51, 63-82, 103-118, 143-159, 164-197, 206-259, 361-388, 554-585, 625-700, 736-776, 862-887, 923-973, 978-996, 1127-1142, 1170-1195, 1317-1347, 1360-1383, 1418-1449, 1492-1507, 1524-1548, 1597-1634, 1641-1660, 1683-1698, 1744-1768, 1827-1860, 1949-2002, 2072-2092, 2095-2110, 2306-2321, 2665-2683, 2685-2719, 2739-2770, 2859-2880, 2941-2960, 2963-2978, 3037-3052, 3205-3252, 3306-3332, 3371-3386, 3518-3542, 3975-3990, 4041-4087, 4418-4446, 4528-4546, 7231-7246, 7570-7585, 8395-8410, 9153-9168, 9554-9569, 9931-9946, 10549-10564, 11020-11035, 11793-11808, 12214-12229, 12474-12489, 12905-12920, 13400-13415, 13717-13732, 14149-14164, 14540-14555, 15264-15279, 15849-15864, 16530-16545, 17377-17392, 17581-17596, 17943-17958, 18353-18368, 18636-18651, 19256-19271, 19814-19829,20365-20380, 20979-20994, 21566-21581, 22150-22165, 22803-22818, 29049-29064, 29554-29569, 30245-30260, 30550-30565, 30915-30930, 31468-31483, 32366-32381, 32897-32912, 33187-33202, 33780-33795, 34407-34422, 34846-34861, 35669-35684, 36312-36327, 36812-36827, 37504-37519, 38841-38856, 40250-40265, 40706-40721, 40922-40937, 41424-41439, 41999-42014, 42481-42496, 42700-42715, 43291-43306, 43500-43515, 43947-43962, 44448-44463, 45162-45177, 46010-46025, 46476-46491, 47447-47462, 47752-47767, 48001-48016, 48423-48438, 50195-50210, 50470-50485, 51104-51119, 51756-51771, 52015-52030, 52230-52245, 52588-52603, 53532-53547 или 54645-54660.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение или олигонуклеотид, нацеленные на нуклеиновую кислоту рецептора гормона роста, комплементарны в пределах следующих нуклеотидных областей SEQ ID №: 2: 2571-2586, 2867-3059, 3097-3116, 3341-3695, 4024-4039, 4446-4894, 5392-5817, 6128-6265, 6499-6890, 7231-7246, 8395-8410, 9153-9168, 9554-9569, 9931-9946, 10549-10564, 10660-10679, 11020-11035, 11793-12229, 12469-12920, 13351-13415, 13717-13732, 14149-14164, 14361-14555, 14965-15279, 15849-16001, 16253-16272, 16447-16545, 17130-17149, 17377-17669, 17927-17958, 18353-18368, 18636-18773, 19661-19918, 20288-20470, 20979-20994, 21215-21606, 21820-21837, 22150-22165, 22518-22536, 22803-22818, 26494-26522, 29049-29069, 29323-29489, 30550-30565, 30915-31191, 31468-31483, 32363-32382, 32827-33202, 33635-33795, 34138-34157, 34407-34422, 34845-34864, 35466-35485, 35669-35684, 36023-36042, 36266-36327, 36721-36827, 37032-37130, 37276-37295, 37504-37675, 38094-38118, 38841-38856, 39716-40538, 40706-40937, 41164-41183, 41342-41439, 42141-42164, 42700-42760, 43173-43537, 43765-46025, 46476-46532, 48423-48438, 50072-50210, 50470-50485, 50719-51234, 51747-51797, 52015-52143, 52230-52245, 52573-52652, 53466-54660, 54886-54901, 63751-64662, 64882-65099, 65363-65378, 65600-65615, 65988-66183, 66566-66581, 66978-67080, 67251-67270, 67662-67929, 68727-68742, 69203-69242, 69565-69620, 69889-70145, 70352-70584, 70925-71071, 71314-71329, 71617-71769, 72107-72241, 72584-72670, 73061-73076, 73350-73369, 73689-73723, 74107-74131, 74317-74557, 74947-75009, 75192-75207, 75979-76066, 76410-77095, 77292-77307, 77638-77869, 78122-78326, 79006-79021, 79478-79505, 80277-80292, 80575-80939, 81207-81222, 81524-81543, 81761-81776, 82233-82248, 82738-83198, 83330-83416, 83884-84063, 84381-85964, 86220-86392, 86554-86655, 86901-86920, 87181-87262, 88063-88082, 88293-88308, 88605-88967, 89160-89175, 89940-90255, 90473-90528, 91073-91088, 91273-91292, 91647-91662, 91930-92126, 92356-92371, 93190-93443, 93762-94111, 94374-94389, 94581-94653, 94839-94858, 95292-95583, 95829-95844, 96137-96503, 96793-97013, 97539-97554, 97800-97889, 98132-98151, 98624-98672, 98810-99115, 99258-99273, 99478-99503, 99791-99858, 100281-100300, 100406-100421, 100742-100828, 101080-101103, 101242-101320, 101788-101906, 102549-102568, 103566-103625, 104067-104086, 104277-104858, 105255-105274, 106147-106364, 106632-106647, 106964-107735, 108514-108788, 109336-109505, 109849-109864, 110403-110442, 110701-110974, 111203-111322, 112030-112049, 112499-112514, 112842-112861, 113028-113056, 113646-113665, 113896-113911, 114446-114465, 115087-115106, 119269-119284, 119659-119703, 120376-120497, 120738-120845, 121209-121228, 121823-122013, 122180-122199, 122588-122770, 123031-123050, 123152-123167, 123671-124055, 124413-124608, 125178-125197, 125533-125616, 126357-126434, 126736-126751, 126998-127236, 127454-127682, 128467-128482, 128813-129111, 129976-130013, 130308-130323, 131036-131056, 131286-131305, 131676-131691, 132171-132517, 133168-133241, 133522-133877, 134086-134101, 134240-134259, 134441-134617, 135015-135030, 135431-135519, 135818-135874, 136111-136130, 136282-136595, 136996-137152, 137372-137387, 137750-137765, 138048-138067, 138782-139840, 140343-140358, 140593-140701, 141116-141131, 141591-141719, 142113-142342, 143021-143048, 143185-143486, 143836-144109, 144558-144650, 144990-145078, 145428-145525, 145937-145952, 146235-146386, 147028-147043, 147259-147284, 147671-147686, 148059-148154, 148564-148579, 148904-149084, 149491-149506, 149787-149877, 150236-150251, 150588-151139, 151373-151659, 152201-152388, 152549-152771, 153001-153026, 153349-153364, 153831-154112, 154171-154186, 154502-154521, 154724-154828, 155283-155304, 155591-155616, 155889-155992, 156233-156612, 156847-156907, 157198-157223, 157330-157349, 157552-157567, 157927-158029, 158542-158631, 159216-159267, 159539-159793, 160352-160429, 160812-160827, 161248-161267, 161461-161607, 161821-161969, 162064-162083, 162132-162147, 162531-162770, 163019-163557, 164839-165059, 165419-165575, 165856-165875, 166241-166450, 166837-166852, 167107-167122, 168004-168019, 168760-168823, 169062-169092, 169134-169153, 169601-169711, 170081-170291, 170407-170426, 170703-170814, 171021-171036, 171207-171226, 171431-171568, 171926-171945, 172447-172462, 172733-172956, 173045-173756, 174122-174885, 175014-177830, 178895-180539, 181514-187644, 187857-189904, 190109-194159, 194425-195723, 196536-196873, 197326-197961, 198145-198170, 198307-198381, 198715-199007, 199506-199563, 199816-199838, 200249-200635, 201258-201861, 202079-202094, 202382-202717, 203098-203934, 204181-204740, 205549-205915, 206412-206764, 207510-207532, 209999-210014, 210189-210296, 210502-210583, 210920-211418, 211836-212223, 212606-212816, 213025-213044, 213425-213440, 213825-213933, 214479-214498, 214622-214647, 214884-214951, 215446-215508, 215932-215951, 216192-217595, 218132-218248, 218526-218541, 218734-21219037, 219342-219633, 219886-220705, 221044-221059, 221483-221607, 221947-221962, 222569-222584, 222914-222998, 223436-223451, 223948-224122, 224409-224430, 224717-224769, 225133-225148, 225436-225761, 226785-226898, 227025-227040, 227218-227251, 227485-227500, 227914-228837, 229174-229189, 229423-229438, 229615-229640, 230042-230057, 230313-230595, 231218-231345, 231817-232037, 232088-232408, 232823-232848, 232884-232899, 233210-233225, 233623-233646, 234447-234466, 234876-234918, 235258-235328, 235770-235785, 236071-236213, 236684-237196, 237585-237698, 237949-237557, 244873-244897, 245319-245334, 245701-245780, 246152-246523, 246936-247031, 247203-247240, 247431-247450, 247644-247659, 248223-248363, 248694-248762, 249494-249509, 250001-250020, 250693-250708, 251214-251233, 251601-251637, 251950-252060, 252665-252680, 252838-252863, 253140-253166, 253594-253819, 254036-254083, 254246-254345, 254641-254660, 254905-254920, 255397-255422, 255618-255633, 255992-256704, 257018-257092, 257317-257332, 257818-259305, 259500-259515, 261294-261656, 262021-262036, 262453-262779, 263338-266518, 266861-267131, 267375-268051, 268366-269447, 270038-271850, 271950-271969, 272631-274145, 274205-275747, 275808-276636, 276932-277064, 277391-278380, 278932-279063, 279303-281001, 281587-281610, 282229-283668, 290035-290474, 290924-292550, 292860-294408, 295475-297012, 297587-298115, 298161-298418, 298489-298738, 299082-299187, 299276-299669, 299723-299749, 299788-300504 или 300835-301295.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение или олигонуклеотид, нацеленные на нуклеиновую кислоту рецептора гормона роста, нацелены на следующие нуклеотидные области SEQ ID №: 2: 2571-2586, 2867-3059, 3097-3116, 3341-3695, 4024-4039, 4446-4894, 5392-5817, 6128-6265, 6499-6890, 7231-7246, 8395-8410, 9153-9168, 9554-9569, 9931-9946, 10549-10564, 10660-10679, 11020-11035, 11793-12229, 12469-12920, 13351-13415, 13717-13732, 14149-14164, 14361-14555, 14965-15279, 15849-16001, 16253-16272, 16447-16545, 17130-17149, 17377-17669, 17927-17958, 18353-18368, 18636-18773, 19661-19918, 20288-20470, 20979-20994, 21215-21606, 21820-21837, 22150-22165, 22518-22536, 22803-22818, 26494-26522, 29049-29069, 29323-29489, 30550-30565, 30915-31191, 31468-31483, 32363-32382, 32827-33202, 33635-33795, 34138-34157, 34407-34422, 34845-34864, 35466-35485, 35669-35684, 36023-36042, 36266-36327, 36721-36827, 37032-37130, 37276-37295, 37504-37675, 38094-38118, 38841-38856, 39716-40538, 40706-40937, 41164-41183, 41342-41439, 42141-42164, 42700-42760, 43173-43537, 43765-46025, 46476-46532, 48423-48438, 50072-50210, 50470-50485, 50719-51234, 51747-51797, 52015-52143, 52230-52245, 52573-52652, 53466-54660, 54886-54901, 63751-64662, 64882-65099, 65363-65378, 65600-65615, 65988-66183, 66566-66581, 66978-67080, 67251-67270, 67662-67929, 68727-68742, 69203-69242, 69565-69620, 69889-70145, 70352-70584, 70925-71071, 71314-71329, 71617-71769, 72107-72241, 72584-72670, 73061-73076, 73350-73369, 73689-73723, 74107-74131, 74317-74557, 74947-75009, 75192-75207, 75979-76066, 76410-77095, 77292-77307, 77638-77869, 78122-78326, 79006-79021, 79478-79505, 80277-80292, 80575-80939, 81207-81222, 81524-81543, 81761-81776, 82233-82248, 82738-83198, 83330-83416, 83884-84063, 84381-85964, 86220-86392, 86554-86655, 86901-86920, 87181-87262, 88063-88082, 88293-88308, 88605-88967, 89160-89175, 89940-90255, 90473-90528, 91073-91088, 91273-91292, 91647-91662, 91930-92126, 92356-92371, 93190-93443, 93762-94111, 94374-94389, 94581-94653, 94839-94858, 95292-95583, 95829-95844, 96137-96503, 96793-97013, 97539-97554, 97800-97889, 98132-98151, 98624-98672, 98810-99115, 99258-99273, 99478-99503, 99791-99858, 100281-100300, 100406-100421, 100742-100828, 101080-101103, 101242-101320, 101788-101906, 102549-102568, 103566-103625, 104067-104086, 104277-104858, 105255-105274, 106147-106364, 106632-106647, 106964-107735, 108514-108788, 109336-109505, 109849-109864, 110403-110442, 110701-110974, 111203-111322, 112030-112049, 112499-112514, 112842-112861, 113028-113056, 113646-113665,113896-113911, 114446-114465, 115087-115106, 119269-119284,119659-119703, 120376-120497, 120738-120845, 121209-121228, 121823-122013, 122180-122199, 122588-122770, 123031-123050,123152-123167, 123671-124055, 124413-124608, 125178-125197,125533-125616, 126357-126434, 126736-126751, 126998-127236, 127454-127682, 128467-128482, 128813-129111, 129976-130013, 130308-130323, 131036-131056, 131286-131305, 131676-131691, 132171-132517, 133168-133241,133522-133877, 134086-134101, 134240-134259, 134441-134617, 135015-135030, 135431-135519, 135818-135874, 136111-136130, 136282-136595, 136996-137152, 137372-137387, 137750-137765, 138048-138067, 138782-139840, 140343-140358, 140593-140701, 141116-141131, 141591-141719, 142113-142342, 143021-143048, 143185-143486, 143836-144109, 144558-144650, 144990-145078, 145428-145525, 145937-145952, 146235-146386, 147028-147043, 147259-147284, 147671-147686, 148059-148154, 148564-148579, 148904-149084, 149491-149506, 149787-149877, 150236-150251, 150588-151139, 151373-151659, 152201-152388, 152549-152771, 153001-153026, 153349-153364,153831-154112, 154171-154186, 154502-154521, 154724-154828,155283-155304, 155591-155616, 155889-155992, 156233-156612, 156847-156907, 157198-157223,157330-157349, 157552-157567, 157927-158029, 158542-158631, 159216-159267, 159539-159793, 160352-160429, 160812-160827, 161248-161267, 161461-161607, 161821-161969, 162064-162083, 162132-162147, 162531-162770, 163019-163557, 164839-165059, 165419-165575, 165856-165875, 166241-166450, 166837-166852, 167107-167122, 168004-168019, 168760-168823, 169062-169092, 169134-169153, 169601-169711, 170081-170291, 170407-170426, 170703-170814, 171021-171036, 171207-171226, 171431-171568, 171926-171945, 172447-172462, 172733-172956, 173045-173756, 174122-174885, 175014-177830, 178895-180539, 181514-187644, 187857-189904, 190109-194159, 194425-195723, 196536-196873, 197326-197961, 198145-198170, 198307-198381, 198715-199007, 199506-199563, 199816-199838, 200249-200635, 201258-201861, 202079-202094, 202382-202717, 203098-203934, 204181-204740, 205549-205915, 206412-206764, 207510-207532, 209999-210014, 210189-210296, 210502-210583, 210920-211418, 211836-212223, 212606-212816, 213025-213044, 213425-213440, 213825-213933, 214479-214498, 214622-214647, 214884-214951, 215446-215508, 215932-215951, 216192-217595, 218132-218248, 218526-218541, 218734-21219037, 219342-219633, 219886-220705, 221044-221059, 221483-221607, 221947-221962, 222569-222584, 222914-222998, 223436-223451, 223948-224122, 224409-224430, 224717-224769, 225133-225148, 225436-225761, 226785-226898, 227025-227040, 227218-227251, 227485-227500, 227914-228837, 229174-229189, 229423-229438, 229615-229640, 230042-230057, 230313-230595, 231218-231345, 231817-232037, 232088-232408, 232823-232848, 232884-232899, 233210-233225, 233623-233646, 234447-234466, 234876-234918, 235258-235328, 235770-235785, 236071-236213, 236684-237196, 237585-237698, 237949-237557, 244873-244897, 245319-245334, 245701-245780, 246152-246523, 246936-247031, 247203-247240, 247431-247450, 247644-247659, 248223-248363, 248694-248762, 249494-249509, 250001-250020, 250693-250708, 251214-251233, 251601-251637, 251950-252060, 252665-252680, 252838-252863, 253140-253166, 253594-253819, 254036-254083, 254246-254345, 254641-254660, 254905-254920, 255397-255422, 255618-255633, 255992-256704, 257018-257092, 257317-257332, 257818-259305, 259500-259515, 261294-261656, 262021-262036, 262453-262779, 263338-266518, 266861-267131, 267375-268051, 268366-269447, 270038-271850, 271950-271969, 272631-274145, 274205-275747, 275808-276636, 276932-277064, 277391-278380, 278932-279063, 279303-281001, 281587-281610, 282229-283668, 290035-290474, 290924-292550, 292860-294408, 295475-297012, 297587-298115, 298161-298418, 298489-298738, 299082-299187, 299276-299669, 299723-299749, 299788-300504 или 300835-301295.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены на область нуклеиновой кислоты рецептора гормона роста. В некоторых вариантах реализации изобретения такие соединения или олигонуклеотиды, нацеленные на область нуклеиновой кислоты GHR, имеют непрерывную часть нуклеотидных оснований, которая является комплементарной относительно равной по длине части нуклеотидных оснований области. Например, часть может представлять собой часть из по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 непрерывных нуклеотидных оснований, комплементарную относительно равной по длине части области, приведенной в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения такие соединения или олигонуклеотиды нацелены на следующие нуклеотидные области SEQ ID №: 2: 2571-2586, 2867-3059, 3097-3116, 3341-3695, 4024-4039, 4446-4894, 5392-5817, 6128-6265, 6499-6890, 7231-7246, 8395-8410, 9153-9168, 9554-9569, 9931-9946, 10549-10564, 10660-10679, 11020-11035, 11793-12229, 12469-12920, 13351-13415, 13717-13732, 14149-14164, 14361-14555, 14965-15279, 15849-16001, 16253-16272, 16447-16545, 17130-17149, 17377-17669, 17927-17958, 18353-18368, 18636-18773, 19661-19918, 20288-20470, 20979-20994, 21215-21606, 21820-21837, 22150-22165, 22518-22536, 22803-22818, 26494-26522, 29049-29069, 29323-29489, 30550-30565, 30915-31191, 31468-31483, 32363-32382, 32827-33202, 33635-33795, 34138-34157, 34407-34422, 34845-34864, 35466-35485, 35669-35684, 36023-36042, 36266-36327, 36721-36827, 37032-37130, 37276-37295, 37504-37675, 38094-38118, 38841-38856, 39716-40538, 40706-40937, 41164-41183, 41342-41439, 42141-42164, 42700-42760, 43173-43537, 43765-46025, 46476-46532, 48423-48438, 50072-50210, 50470-50485, 50719-51234, 51747-51797, 52015-52143, 52230-52245, 52573-52652, 53466-54660, 54886-54901, 63751-64662, 64882-65099, 65363-65378, 65600-65615, 65988-66183, 66566-66581, 66978-67080, 67251-67270, 67662-67929, 68727-68742, 69203-69242, 69565-69620, 69889-70145, 70352-70584, 70925-71071, 71314-71329, 71617-71769, 72107-72241, 72584-72670, 73061-73076, 73350-73369, 73689-73723, 74107-74131, 74317-74557, 74947-75009, 75192-75207, 75979-76066, 76410-77095, 77292-77307, 77638-77869, 78122-78326, 79006-79021, 79478-79505, 80277-80292, 80575-80939, 81207-81222, 81524-81543, 81761-81776, 82233-82248, 82738-83198, 83330-83416, 83884-84063, 84381-85964, 86220-86392, 86554-86655, 86901-86920, 87181-87262, 88063-88082, 88293-88308, 88605-88967, 89160-89175, 89940-90255, 90473-90528, 91073-91088, 91273-91292, 91647-91662, 91930-92126, 92356-92371, 93190-93443, 93762-94111, 94374-94389, 94581-94653, 94839-94858, 95292-95583, 95829-95844, 96137-96503, 96793-97013, 97539-97554, 97800-97889, 98132-98151, 98624-98672, 98810-99115, 99258-99273, 99478-99503, 99791-99858, 100281-100300, 100406-100421, 100742-100828, 101080-101103, 101242-101320, 101788-101906, 102549-102568, 103566-103625, 104067-104086, 104277-104858, 105255-105274, 106147-106364, 106632-106647, 106964-107735, 108514-108788, 109336-109505, 109849-109864, 110403-110442, 110701-110974, 111203-111322, 112030-112049, 112499-112514, 112842-112861, 113028-113056, 113646-113665, 113896-113911, 114446-114465, 115087-115106, 119269-119284, 119659-119703, 120376-120497, 120738-120845, 121209-121228, 121823-122013, 122180-122199, 122588-122770, 123031-123050, 123152-123167, 123671-124055, 124413-124608, 125178-125197, 125533-125616, 126357-126434, 126736-126751, 126998-127236, 127454-127682, 128467-128482, 128813-129111, 129976-130013, 130308-130323, 131036-131056, 131286-131305, 131676-131691, 132171-132517, 133168-133241, 133522-133877, 134086-134101, 134240-134259,134441-134617,135015-135030, 135431-135519, 135818-135874,136111-136130, 136282-136595, 136996-137152, 137372-137387, 137750-137765, 138048-138067, 138782-139840, 140343-140358, 140593-140701, 141116-141131, 141591-141719, 142113-142342, 143021-143048, 143185-143486, 143836-144109, 144558-144650, 144990-145078, 145428-145525, 145937-145952, 146235-146386, 147028-147043, 147259-147284, 147671-147686, 148059-148154, 148564-148579, 148904-149084, 149491-149506, 149787-149877, 150236-150251, 150588-151139, 151373-151659, 152201-152388, 152549-152771, 153001-153026, 153349-153364, 153831-154112, 154171-154186, 154502-154521, 154724-154828, 155283-155304, 155591-155616, 155889-155992, 156233-156612, 156847-156907, 157198-157223, 157330-157349, 157552-157567, 157927-158029, 158542-158631, 159216-159267, 159539-159793, 160352-160429, 160812-160827, 161248-161267, 161461-161607, 161821-161969, 162064-162083, 162132-162147, 162531-162770, 163019-163557, 164839-165059, 165419-165575, 165856-165875, 166241-166450, 166837-166852, 167107-167122, 168004-168019, 168760-168823, 169062-169092, 169134-169153, 169601-169711, 170081-170291, 170407-170426, 170703-170814, 171021-171036, 171207-171226, 171431-171568, 171926-171945, 172447-172462, 172733-172956, 173045-173756, 174122-174885, 175014-177830, 178895-180539, 181514-187644, 187857-189904, 190109-194159, 194425-195723, 196536-196873, 197326-197961, 198145-198170, 198307-198381, 198715-199007, 199506-199563, 199816-199838, 200249-200635, 201258-201861, 202079-202094, 202382-202717, 203098-203934, 204181-204740, 205549-205915, 206412-206764, 207510-207532, 209999-210014, 210189-210296, 210502-210583, 210920-211418, 211836-212223, 212606-212816, 213025-213044, 213425-213440, 213825-213933, 214479-214498, 214622-214647, 214884-214951, 215446-215508, 215932-215951, 216192-217595, 218132-218248, 218526-218541, 218734-21219037, 219342-219633, 219886-220705, 221044-221059, 221483-221607, 221947-221962, 222569-222584, 222914-222998, 223436-223451, 223948-224122, 224409-224430, 224717-224769, 225133-225148, 225436-225761, 226785-226898, 227025-227040, 227218-227251, 227485-227500, 227914-228837, 229174-229189, 229423-229438, 229615-229640, 230042-230057, 230313-230595, 231218-231345, 231817-232037, 232088-232408, 232823-232848, 232884-232899, 233210-233225, 233623-233646, 234447-234466, 234876-234918, 235258-235328, 235770-235785, 236071-236213, 236684-237196, 237585-237698, 237949-237557, 244873-244897, 245319-245334, 245701-245780, 246152-246523, 246936-247031, 247203-247240, 247431-247450, 247644-247659, 248223-248363, 248694-248762, 249494-249509, 250001-250020, 250693-250708, 251214-251233, 251601-251637, 251950-252060, 252665-252680, 252838-252863, 253140-253166, 253594-253819, 254036-254083, 254246-254345, 254641-254660, 254905-254920, 255397-255422, 255618-255633, 255992-256704, 257018-257092, 257317-257332, 257818-259305, 259500-259515, 261294-261656, 262021-262036, 262453-262779, 263338-266518, 266861-267131, 267375-268051, 268366-269447, 270038-271850, 271950-271969, 272631-274145, 274205-275747, 275808-276636, 276932-277064, 277391-278380, 278932-279063, 279303-281001, 281587-281610, 282229-283668, 290035-290474, 290924-292550, 292860-294408, 295475-297012, 297587-298115, 298161-298418, 298489-298738, 299082-299187, 299276-299669, 299723-299749, 299788-300504 или 300835-301295.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены на интрон 1 нуклеиновой кислоты рецептора гормона роста. В некоторых аспектах антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены в пределах нуклеотидов 3058-144965 (интрон 1) нуклеиновой кислоты рецептора гормона роста, имеющей последовательность нуклеотидных оснований SEQ ID №: 2 (№ доступа в GENBANK NT_006576.16, усеченная с нуклеотида 42411001 по 42714000).
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены на интрон 2 нуклеиновой кислоты рецептора гормона роста. В некоторых аспектах антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены в пределах нуклеотидов 145047-208139 (интрон 2) нуклеиновой кислоты рецептора гормона роста, имеющей последовательность нуклеотидных оснований SEQ ID №: 2 (№ доступа в GENBANK NT_006576.16, усеченная с нуклеотида 42411001 по 42714000).
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены на интрон 3 нуклеиновой кислоты рецептора гормона роста. В некоторых аспектах антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены в пределах нуклеотидов 208206-267991 (интрон 3) нуклеиновой кислоты рецептора гормона роста, имеющей последовательность нуклеотидных оснований SEQ ID №: 2 (№ доступа в GENBANK NT_006576.16, усеченная с нуклеотида 42411001 по 42714000).
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены на интрон 4 нуклеиновой кислоты рецептора гормона роста. В некоторых аспектах антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены в пределах нуклеотидов 268122-274018 (интрон 4) нуклеиновой кислоты рецептора гормона роста, имеющей последовательность нуклеотидных оснований SEQ ID №: 2 (№ доступа в GENBANK NT_006576.16, усеченная с нуклеотида 42411001 по 42714000).
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены на интрон 5 нуклеиновой кислоты рецептора гормона роста. В некоторых аспектах антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены в пределах нуклеотидов 274192-278925 (интрон 5) нуклеиновой кислоты рецептора гормона роста, имеющей последовательность нуклеотидных оснований SEQ ID №: 2 (№ доступа в GENBANK NT_006576.16, усеченная с нуклеотида 42411001 по 42714000).
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены на интрон 6 нуклеиновой кислоты рецептора гормона роста. В некоторых аспектах антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены в пределах нуклеотидов 279105-290308 (интрон 6) нуклеиновой кислоты рецептора гормона роста, имеющей последовательность нуклеотидных оснований SEQ ID №: 2 (№ доступа в GENBANK NT_006576.16, усеченная с нуклеотида 42411001 по 42714000).
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены на интрон 7 нуклеиновой кислоты рецептора гормона роста. В некоторых аспектах антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены в пределах нуклеотидов 290475-292530 (интрон 7) нуклеиновой кислоты рецептора гормона роста, имеющей последовательность нуклеотидных оснований SEQ ID №: 2 (№ доступа в GENBANK NT_006576.16, усеченная с нуклеотида 42411001 по 42714000).
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены на интрон 8 нуклеиновой кислоты рецептора гормона роста. В некоторых аспектах антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены в пределах нуклеотидов 292622-297153 (интрон 8) нуклеиновой кислоты рецептора гормона роста, имеющей последовательность нуклеотидных оснований SEQ ID №: 2 (№ доступа в GENBANK NT_006576.16, усеченная с нуклеотида 42411001 по 42714000).
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены на интрон 9 нуклеиновой кислоты рецептора гормона роста. В некоторых аспектах антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены в пределах нуклеотидов 297224-297554 (интрон 9) нуклеиновой кислоты рецептора гормона роста, имеющей последовательность нуклеотидных оснований SEQ ID №: 2 (№ доступа в GENBANK NT_006576.16, усеченная с нуклеотида 42411001 по 42714000).
В некоторых вариантах реализации изобретения любое из указанных выше соединений или олигонуклеотидов содержит по меньшей мере один модифицированный сахар. В некоторых аспектах по меньшей мере один модифицированный сахар содержит 2'-O-метоксиэтильную группу. В некоторых аспектах по меньшей мере один модифицированный сахар представляет собой бициклический сахар, такой как 4'-СН(СН3)-O-2' группа, 4'-СН2-O-2' группа или 4'-(СН2)2-O-2' группа. В некоторых аспектах модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь, такую как фосфоротиоатная межнуклеозидная связь.
В некоторых вариантах реализации изобретения любое из указанных выше соединений или олигонуклеотидов содержит по меньшей мере одно модифицированное нуклеотидное основание, такое как 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации изобретения любое из указанных выше соединений или олигонуклеотидов содержит:
гэп-сегмент, состоящий из связанных дезоксинуклеозидов;
5'-крыльевой сегмент, состоящий из связанных нуклеозидов; и
3'-крыльевой сегмент, состоящий из связанных нуклеозидов;
при этом гэп-сегмент расположен между 5'-крыльевым сегментом и 3'-крыльевым сегментом, и при этом каждый нуклеозид каждого крыльевого сегмента содержит модифицированный сахар.
Некоторые варианты реализации изобретения относятся к соединению, содержащему модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 10-30 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеотидных оснований, включающую последовательность, приведенную в SEQ ID №: 918, 479, 703, 1800, 1904, 2122, 2127 или 2194.
В некоторых аспектах модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеотидных оснований, включающую последовательность, приведенную в SEQ ID №: 918, 479 или 703, при этом модифицированный олигонуклеотид содержит
гэп-сегмент, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов;
5'-крыльевой сегмент, состоящий из пяти связанных нуклеозидов; и
3'-крыльевой сегмент, состоящий из пяти связанных нуклеозидов;
при этом гэп-сегмент расположен между 5'-крыльевым сегментом и 3'-крыльевым сегментом, при этом каждый нуклеозид каждого крыльевого сегмента содержит 2'-O-метоксиэтиловый сахар; при этом каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфоротиоатную связь и при этом каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых аспектах модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеотидных оснований, включающую последовательность, приведенную в SEQ ID №: 1800, 1904, 2122, 2127 или 2194, при этом модифицированный олигонуклеотид содержит:
гэп-сегмент, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов;
5'-крыльевой сегмент, состоящий из 3 связанных нуклеозидов; и
3'-крыльевой сегмент, состоящий из 3 связанных нуклеозидов;
при этом гэп-сегмент расположен между 5'-крыльевым сегментом и 3'-крыльевым сегментом, при этом каждый нуклеозид каждого крыльевого сегмента содержит 2'-O-метоксиэтиловый сахар или конформационно ограниченный этиловый сахар; и при этом каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфоротиоатную связь.
Некоторые варианты реализации изобретения относятся к соединению, содержащему модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеотидных оснований, состоящую из последовательности, приведенной в SEQ ID №: 703. В некоторых аспектах модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере один модифицированный сахар. В некоторых аспектах по меньшей мере один модифицированный сахар содержит 2'-O-метоксиэтильную группу. В некоторых аспектах по меньшей мере один модифицированный сахар представляет собой бициклический сахар, такой как 4'-СН(СН3)-O-2' группа, 4'-СН2-O-2' группа или 4'-(СН2)2-O-2' группа. В некоторых аспектах модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь, такую как фосфоротиоатная межнуклеозидная связь. В некоторых аспектах модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одно модифицированное нуклеотидное основание, такое как 5-метилцитозин. В некоторых аспектах модифицированный олигонуклеотид содержит:
гэп-сегмент, состоящий из связанных дезоксинуклеозидов;
5'-крыльевой сегмент, состоящий из связанных нуклеозидов; и
3'-крыльевой сегмент, состоящий из связанных нуклеозидов;
при этом гэп-сегмент расположен между 5'-крыльевым сегментом и 3'-крыльевым сегментом, и при этом каждый нуклеозид каждого крыльевого сегмента содержит модифицированный сахар.
Некоторые варианты реализации изобретения относятся к соединению, содержащему модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеотидных оснований, состоящую из последовательности, приведенной в SEQ ID №: 703, при этом модифицированный олигонуклеотид содержит:
гэп-сегмент, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов;
5'-крыльевой сегмент, состоящий из пяти связанных нуклеозидов; и
3'-крыльевой сегмент, состоящий из пяти связанных нуклеозидов;
при этом гэп-сегмент расположен между 5'-крыльевым сегментом и 3'-крыльевым сегментом; при этом каждый нуклеозид каждого крыльевого сегмента содержит 2'-O-метоксиэтиловый сахар; при этом каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфоротиоатную связь; и при этом каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В любом из приведенных выше вариантов реализации изобретения соединение или олигонуклеотид могут быть по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или 100% комплементарными относительно нуклеиновой кислоты, кодирующей рецептор гормона роста.
В любом из приведенных выше вариантов реализации изобретения нуклеиновая кислота, кодирующая рецептор гормона роста, может содержать нуклеотидную последовательность любой из SEQ ID №: 1-19.
В любом из приведенных выше вариантов реализации изобретения соединение или олигонуклеотид может быть одноцепочечным.
Некоторые варианты реализации изобретения относятся к композиции, содержащей соединение по любому из приведенных выше вариантов реализации изобретения или его соль и по меньшей мере одно из фармацевтически приемлемого носителя или разбавителя. В некоторых аспектах композиция имеет вязкость, составляющую менее чем около 40 сантипуаз (сП), менее чем около 30 сантипуаз (сП), менее чем около 20 сантипуаз (сП), менее чем около 15 сантипуаз (сП) или менее чем около 10 сантипуаз (сП). В некоторых аспектах композиция, имеющая любую из приведенных выше вязкостей, содержит приведенное в данном документе соединение в концентрации, составляющей около 100 мг/мл, около 125 мг/мл, около 150 мг/мл, около 175 мг/мл, около 200 мг/мл, около 225 мг/мл, около 250 мг/мл, около 275 мг/мл или около 300 мг/мл. В некоторых аспектах композиция, имеющая любую из приведенных выше вязкостей и/или концентраций соединения, имеет температуру, равную комнатной температуре или около 20°С, около 21°С, около 22°С, около 23°С, около 24°С, около 25°С, около 26°С, около 27°С, около 28°С, около 29°С или около 30°С.
Некоторые варианты реализации изобретения относятся к способу лечения заболевания, связанного с избытком гормона роста у человека, включающему введение человеку терапевтически эффективного количества соединения или композиции по любому из приведенных выше вариантов реализации изобретения, тем самым осуществляя лечение заболевания, связанного с избытком гормона роста. В некоторых аспектах заболевание, связанное с избытком гормона роста, представляет собой акромегалию. В некоторых аспектах лечение снижает уровень IGF-1.
Некоторые варианты реализации изобретения относятся к способу профилактики заболевания, связанного с избытком гормона роста у человека, включающему введение человеку терапевтически эффективного количества соединения или композиции по любому из приведенных выше вариантов реализации изобретения, тем самым осуществляя профилактику заболевания, связанного с избытком гормона роста. В некоторых вариантах реализации изобретения заболевание, связанное с избытком гормона роста, представляет собой акромегалию.
Некоторые варианты реализации изобретения относятся к способу снижения уровня рецептора гормона роста (GHR) у человека, включающему введение человеку терапевтически эффективного количества соединения или композиции по любому из приведенных выше вариантов реализации изобретения, тем самым снижая уровень GHR у человека. В некоторых аспектах человек имеет заболевание, связанное с избытком гормона роста. В некоторых аспектах заболевание, связанное с избытком гормона роста, представляет собой акромегалию.
В некоторых аспектах приведенные выше способы включают совместное введение соединения или композиции и второго вещества. В некоторых аспектах соединение или композицию и второе вещество вводят одновременно.
Антисмысловые соединения
Олигомерные соединения включают, без ограничения ими, олигонуклеотиды, олигонуклеозиды, аналоги олигонуклеотидов, миметики олигонуклеотидов, антисмысловые соединения, антисмысловые олигонуклеотиды и киРНК. Олигомерное соединение может быть "антисмысловым" по отношению к нуклеиновой кислоте-мишени, то есть может быть способным подвергаться гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью через образование водородных связей.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение имеет последовательность нуклеотидных оснований, которая, при записи в направлении от 5' к 3', содержит обратный комплемент сегмента-мишени нуклеиновой кислоты-мишени, на которую нацелено данное соединение. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловой олигонуклеотид имеет последовательность нуклеотидных оснований, которая, при записи в направлении от 5' к 3', содержит обратный комплемент сегмента-мишени нуклеиновой кислоты-мишени, на которую нацелен данный олигонуклеотид.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение составляет 10-30 субъединиц в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение составляет 12-30 субъединиц в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение составляет 12-22 субъединиц в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение составляет 14-30 субъединиц в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение составляет 14-20 субъединиц в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение составляет 15-30 субъединиц в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение составляет 15-20 субъединиц в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение составляет 16-30 субъединиц в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение составляет 16-20 субъединиц в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение составляет 17-30 субъединиц в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение составляет 17-20 субъединиц в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение составляет 18-30 субъединиц в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение составляет 18-21 субъединиц в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение составляет 18-20 субъединиц в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение составляет 20-30 субъединиц в длину. Иными словами, такие антисмысловые соединения представляют собой от 12 до 30 связанных субъединиц, 14-30 связанных субъединиц, 14-20 субъединиц, 15-30 субъединиц, 15-20 субъединиц, 16-30 субъединиц, 16- 20 субъединиц, 17-30 субъединиц, 17-20 субъединиц, 18-30 субъединиц, 18-20 субъединиц, 18-21 субъединиц, 20-30 субъединиц или 12-22 связанных субъединиц, соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение составляет 14 субъединиц в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение составляет 16 субъединиц в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение составляет 17 субъединиц в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение составляет 18 субъединиц в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение составляет 19 субъединиц в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение составляет 20 субъединиц в длину. В других вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение представляет собой 8-80, 12-50, 13-30, 13-50, 14-30, 14-50, 15-30, 15-50, 16-30, 16-50, 17-30, 17-50, 18-22, 18-24, 18-30, 18-50, 19-22, 19-30, 19-50 или 20-30 связанных субъединиц. В некоторых таких вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения составляют 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 связанных субъединиц в длину или имеют длину в диапазоне, определенном любыми двумя из приведенных выше значений. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, а связанные субъединицы представляют собой нуклеотиды.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые олигонуклеотиды могут быть укороченными или усеченными. Например, одна субъединица может быть делегирована у 5'-конца (усечение по 5'-концу) или, в альтернативном варианте, у 3'-конца (усечение по 3'-концу). У укороченного или усеченного антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту GHR, может быть делетировано две субъединицы у 5'-конца или, в альтернативном варианте, может быть делегировано две субъединицы у 3'-конца антисмыслового соединения. В альтернативном варианте делегированные нуклеозиды могут быть распределены по всему антисмысловому соединению, например, в антисмысловом соединении, в котором один нуклеозид делетирован у 5-'конца и один нуклеозид делегирован у 3'-конца.
В случае присутствия одной дополнительной субъединицы в удлиненном антисмысловом соединении, эта дополнительная субъединица может быть расположена на 5'- или 3'-конце антисмыслового соединения. В случае присутствия двух или более дополнительных субъединиц, добавленные субъединицы могут примыкать друг к другу, например, в антисмысловом соединении, в котором две субъединицы добавлены у 5-'конца (5'-добавление) или, в альтернативном варианте, у 3'-конца (3'-добавление) антисмыслового соединения. В альтернативном варианте добавленные субъединицы могут быть распределены по всему антисмысловому соединению, например, в антисмысловом соединении, в котором одна субъединица добавлена у 5'-конца и одна субъединица добавлена у 3'-конца.
Можно увеличивать или уменьшать длину антисмыслового соединения, такого как антисмысловой олигонуклеотид, и/или вводить ошибочно спаренные основания с сохранением активности. Например, в публикации Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7305-7309, 1992) серию антисмысловых олигонуклеотидов, составляющих 13-25 нуклеотидных оснований в длину, испытывали на способность индуцировать расщепление РНК-мишени в модели с инъекцией в ооцит. Антисмысловые олигонуклеотиды, составляющие 25 нуклеотидных оснований в длину, с 8 или 11 ошибочно спаренными основаниями вблизи концов антисмысловых олигонуклеотидов, обладали способностью направлять специфическое расщепление мРНК-мишени, хотя и в меньшей степени, чем антисмысловые олигонуклеотиды без ошибочно спаренных оснований. Аналогичным образом, специфическое расщепление мишени достигали с применением антисмысловых олигонуклеотидов, составляющих 13 нуклеотидных оснований в длину, в том числе с 1 или 3 ошибочно спаренными основаниями.
В публикации Gautschi и др. (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, March 2001) продемонстрирована способность олигонуклеотида, являющегося на 100% комплементарным относительно мРНК bcl-2 и имеющего 3 ошибочно спаренных основания с мРНК bcl-xL, снижать уровень экспрессии как bcl-2, так и bcl-xL in vitro и in vivo. Кроме того, этот олигонуклеотид продемонстрировал сильную противоопухолевую активность in vivo.
В публикации Maher и Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16: 3341-3358, 1988) описано испытание серии тандемных антисмысловых олигонуклеотидов, составляющих 14 нуклеотидных оснований в длину, и антисмысловых олигонуклеотидов, составляющих 28 и 42 нуклеотидных оснований в длину, состоящей из последовательности двух или трех тандемных антисмысловых олигонуклеотидов, соответственно, на их способность подавлять трансляцию DHFR (дигидрофолатредуктаза) человека в анализе с применением ретикулоцитов кролика. Каждый из трех отдельно взятых антисмысловых олигонуклеотидов, составляющих 14 нуклеотидных оснований в длину, обладал способностью ингибировать трансляцию, хотя и в несколько меньшей степени, чем антисмысловые олигонуклеотиды, составляющие 28 или 42 нуклеотидных оснований в длину.
Мотивы и механизмы некоторых антисмысловых соединений
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения имеют химически модифицированные субъединицы, организованные в паттерны или мотивы, для придания указанным антисмысловым соединениям таких свойств, как повышенная ингибирующая активность, повышенная аффинность связывания по отношению к нуклеиновой кислоте-мишени или устойчивость к разрушению под действием нуклеаз in vivo.
Химерные антисмысловые соединения, как правило, содержат по меньшей мере одну область, модифицированную так, чтобы она придавала повышенную устойчивость к разрушению нуклеазами, повышенное клеточное поглощение, повышенную аффинность связывания по отношению к нуклеиновой кислоте-мишени и/или повышенную ингибирующую активность. Вторая область химерного антисмыслового соединения может придавать другое желаемое свойство, например, служить в качестве субстрата для клеточной эндонуклеазы РНКазы Н, которая расщепляет РНК-цепь дуплекса РНК:ДНК.
Антисмысловая активность может являться результатом любого механизма, связанного с гибридизацией антисмыслового соединения (например, олигонуклеотида) с нуклеиновой кислотой-мишенью, при этом гибридизация в конечном итоге приводит к биологическому эффекту. В некоторых вариантах реализации изобретения модулируется количество и/или активность нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения снижается количество и/или активность нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения гибридизация антисмыслового соединения с нуклеиновой кислотой-мишенью в конечном итоге приводит к разрушению нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения гибридизация антисмыслового соединения с нуклеиновой кислотой-мишенью не приводит к разрушению нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых таких вариантах реализации изобретения наличие антисмыслового соединения, гибридизующегося с нуклеиновой кислотой-мишенью (присутствие), приводит к модуляции антисмысловой активности. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, имеющие определенный химический мотив или паттерн химических модификаций, особенно подходят для применения одного или более механизмов. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения функционируют посредством применения более чем одного механизма и/или посредством применения механизмов, которые еще не изучены. Соответственно, антисмысловые соединения, описанные в данном документе, не ограничены определенным механизмом.
Антисмысловые механизмы включают, без ограничения ими, опосредованный РНКазой Н антисенс; механизмы RNAi, которые используют путь RISC и включают, без ограничения ими, механизмы киРНК, оцРНК и микроРНК; и механизмы в зависимости от присутствия. Некоторые антисмысловые соединения могут функционировать посредством применения более чем одного такого механизма и/или посредством применения дополнительных механизмов.
Опосредованный РНКазой Н антисенс
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловая активность является результатом, по меньшей мере частично, разрушения РНК-мишени РНКазой Н. РНКаза Н представляет собой клеточную эндонуклеазу, которая расщепляет РНК-цепь дуплекса РНК:ДНК. В данной области техники известно, что одноцепочечные антисмысловые соединения, которые являются "ДНК-подобными", вызывают активность РНКазы Н в клетках млекопитающих. Соответственно, антисмысловые соединения, содержащие по меньшей мере часть нуклеозид ДНК или ДНК-подобных нуклеозид, могут активировать РНКазу Н, приводя в результате к расщеплению нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, которые используют РНКазу Н, содержат один или более модифицированных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения такие антисмысловые соединения содержат по меньшей мере один блок из 1-8 модифицированных нуклеозидов. В некоторых таких вариантах реализации изобретения модифицированные нуклеозиды не поддерживают активность РНКазы Н. В некоторых вариантах реализации изобретения такие антисмысловые соединения представляют собой гэпмеры, описанные в данном документе. В некоторых таких вариантах реализации изобретения гэп-сегмент гэпмера содержит нуклеозиды ДНК. В некоторых таких вариантах реализации изобретения гэп-сегмент гэпмера содержит ДНК-подобные нуклеозиды. В некоторых таких вариантах реализации изобретения гэп-сегмент гэпмера содержит нуклеозиды ДНК и ДНК-подобные нуклеозиды.
3
Некоторые антисмысловые соединения, имеющие гэпмерный мотив, считаются химерными антисмысловыми соединениями. В гэпмере внутренняя область, имеющая множество нуклеотидов, которые поддерживают расщепление РНКазы Н, расположена между внешними областями, имеющими множество нуклеотидов, которые по своим химическим свойствам отличаются от нуклеозидов внутренней области. В случае антисмыслового олигонуклеотида, имеющего гэпмерный мотив, гэп-сегмент, как правило, служит в качестве субстрата для расщепления эндонуклеазой, тогда как крыльевые сегменты содержат модифицированные нуклеозиды. В некоторых вариантах реализации изобретения области гэпмера отличаются по типам сахарных фрагментов, составляющих каждую отличающуюся область. Типы сахарных фрагментов, которые применяются для дифференциации областей гэпмера, могут в некоторых вариантах реализации изобретения включать β-D-рибонуклеозиды, β-D-дезоксирибонуклеозиды, 2'-модифицированные нуклеозиды (такие 2'-модифицированные нуклеозиды могут включать 2'-МОЕ и 2'-O-СН, наряду с некоторыми другими) и нуклеозиды с модифицированным бициклическим сахаром (такие модифицированные бициклическим сахаром нуклеозиды могут включать нуклеозиды, имеющие конформационно ограниченный этил). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеозиды в крыльевых сегментах могут содержать несколько модифицированных сахарных фрагментов, в том числе, например, фрагменты 2'-МОЕ и бициклическго сахара, такие как конформационно ограниченный этил или LNA. В некоторых вариантах реализации изобретения крыльевые сегменты могут содержать несколько модифицированных и немодифицированных сахарных фрагментов. В некоторых вариантах реализации изобретения крыльевые сегменты могут содержать различные комбинации 2'-МОЕ нуклеозидов, бициклических сахарных фрагментов, такие как конформационно ограниченный этил-нуклеозид или нуклеозиды LNA и 2'-дезоксинуклеозиды.
Каждая отдельная область может содержать постоянные сахарные фрагменты, вариантные или переменные сахарные фрагменты. Мотив "крыло-гэп-крыло" зачастую называют "X-Y-Z", где "X" означает длину 5'-крыльевого сегмента, "Y" означает длину гэп-сегмента, a "Z" означает длину 3'-крыльевого сегмента. "X" и "Z" может содержать постоянные, вариантные или переменные сахарные фрагменты. В некоторых вариантах реализации изобретения "X" и " Y " могут содержать один или более 2'-дезоксинуклеозидов. "Y" может содержать 2'-дезоксинуклеозида. При использовании по тексту данного документа, гэпмер, обозначенный как "X-Y-Z", имеет такую конфигурацию, при которой гэп-сегмент расположен в непосредственной близости к каждому из 5'-крыльевого сегмента и 3'-крыльевого сегмента. Таким образом, между 5'-крыльевым сегментом и гэп-сегментом или гэп-сегментом и 3'-крыльевым сегментом отсутствуют промежуточные нуклеотиды. Любое из антисмысловых соединений, описанных в данном документе, может иметь гэпмерный мотив. В некоторых вариантах реализации изобретения "X" и "Z" являются одинаковыми; в других вариантах реализации изобретения они являются различными. В некоторых вариантах реализации изобретения "Y" составляет 8-15 нуклеозидов в длину. X, Y или Z могут представлять собой любые области из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 или более нуклеозидов.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту GHR, имеют гэпмерный мотив, в котором гэп-сегмент состоит из 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 связанных нуклеозидов.
m
n
p
r
t
g
v
w
x
y
z
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловой олигонуклеотид имеет сахарный мотив, описанный приведенной ниже Формулой A: (J)-(B)-(J)-(B)-(A)-(D)-(A)-(B)-(J)-(B)-(J)
где:
каждый А независимо представляет собой 2'-замещенный нуклеозид;
каждый В независимо представляет собой бициклический нуклеозид;
каждый J независимо представляет собой либо 2'-замещенный нуклеозид, либо 2'-дезоксинуклеозид;
каждый D представляет собой 2'-дезоксинуклеозид;
m составляет 0-4; n составляет 0-2; р составляет 0-2; r составляет 0-2; t составляет 0-2; v составляет 0-2; w составляет 0-4; х составляет 0-2; y составляет 0-2; z составляет 0-4; g составляет 6-14;
при условии, что:
по меньшей мере один из m, n и r является отличным от 0;
по меньшей мере один из w и y является отличным от 0;
сумма m, n, р, r и t составляет от 2 до 5; и
сумма v, w, х, y и z составляет от 2 до 5.
Соединения RNAi
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения представляют собой соединения интерферирующих РНК (RNAi), которые включают соединения двухцепочечных РНК (также называемых короткими интерферирующими РНК или киРНК) и соединения одноцепочечных RNAi (или оцРНК). Такие соединения по меньшей мере частично используют путь RISC для разрушения и/или секвестирования нуклеиновой кислоты-мишени (таким образом, включают микроРНК/микроРНК-мимические соединения). В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения содержат модификации, которые делают их особенно пригодными для таких механизмов.
i. Соединения оцРНК
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, в том числе соединения, которые особенно подходят для применения в качестве соединений одноцепочечных RNAi (оцРНК), содержат модифицированную 5'-концевую область. В некоторых таких вариантах реализации изобретения 5'-концевая область содержит модифицированный фосфатный фрагмент. В некоторых вариантах реализации изобретения такой модифицированный фосфат является стабилизированным (например, устойчивым к разрушению/расщеплению по сравнению с немодифицированным 5'-фосфатом). В некоторых вариантах реализации изобретения такие 5'-концевые нуклеозиды стабилизируют 5'-фосфорный фрагмент. Некоторые модифицированные 5'-концевые нуклеозиды могут встречаться в данной области техники, например, в WO/2011/139702.
В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-нуклеозид соединения оцРНК имеет Формулу IIc:
где:
1
T представляет собой необязательно защищенный фосфорный фрагмент;
2
T представляет собой межнуклеозидную связывающую группу, связывающую соединение Формулы IIc с олигомерным соединением;
А имеет одну из формул:
, , ,  или
1
2
1
6
1
6
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
3
4
Q и Q каждый независимо представляют собой Н, галоген, C-C алкил, замещенный C-C алкил, C-C алкокси, замещенный C-C алкокси, C-C алкенил, замещенный C-C алкенил, C-C алкинил, замещенный C-C алкинил или N(R)(R);
3
5
6
7
Q представляет собой О, S, N(R) или C(R)(R);
3
4
5
6
7
1
6
1
6
1
6
каждый R, R R, R и R независимо представляет собой H, C-C алкил, замещенный C-C алкил или C-C алкокси;
3
14
15
16
15
16
17
18
15
17
15
16
15
2
М представляет собой О, S, NR, C(R)(R), C(R)(R)C(R)(R), C(R)=C(R), OC(R)(R) или OC(R)(Bx);
14
1
6
1
6
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
R представляет собой Н, C-C алкил, замещенный C-C алкил, C-C алкокси, замещенный C-C алкокси, C-C алкенил, замещенный C-C алкенил, C-C алкинил или замещенный C-C алкинил;
15
16
17
18
1
6
1
6
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
R, R, R и R каждый независимо представляют собой H, галоген, C-C алкил, замещенный C-C алкил, C-C алкокси, замещенный C-C алкокси, C-C алкенил, замещенный C-C алкенил, C-C алкинил или замещенный C-C алкинил;
1
Bx представляет собой гетероциклический основный фрагмент;
2
2
1
1
6
1
6
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
или если присутствует Вх, то Bx представляет собой гетероциклический основный фрагмент, a Bx представляет собой Н, галоген, C-C алкил, замещенный C-C алкил, C-C алкокси, замещенный C-C алкокси, C-C алкенил, замещенный C-C алкенил, C-C алкинил или замещенный C-C алкинил;
4
5
6
7
1
6
1
6
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
J, J, J и J каждый независимо представляют собой H, галоген, C-C алкил, замещенный C-C алкил, C-C алкокси, замещенный C-C алкокси, C-C алкенил, замещенный C-C алкенил, C-C алкинил или замещенный C-C алкинил;
4
5
7
19
20
21
20
21
20
21
5
6
7
1
6
1
6
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
или J образует мостик с одним из J или J, при этом указанный мостик содержит от 1 до 3 связанных бирадикальных групп, выбранных из О, S, NR, C(R)(R), C(R)=C(R), C[=C(R)(R)] и С(=O), а другие два из J, J и J каждый независимо представляют собой, H, галоген, C-C алкил, замещенный C-C алкил, C-C алкокси, замещенный C-C алкокси, C-C алкенил, замещенный C-C алкенил, C-C алкинил или замещенный C-C алкинил;
19
20
21
1
6
1
6
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
каждый R, R и R независимо представляет собой H, C-C алкил, замещенный C-C алкил, C-C алкокси, замещенный C-C алкокси, C-C алкенил, замещенный C-C алкенил, C-C алкинил или замещенный C-C алкинил;
8
9
n
m
1
j
G представляет собой Н, ОН, галоген или O-[C(R)(R)]-[(C=O)-X]-Z;
8
9
1
6
1
6
каждый R and R независимо представляет собой, Н, галоген, C-C алкил или замещенный C-C алкил;
1
1
X представляет собой О, S или N(E);
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
2
3
Z представляет собой Н, галоген, C-C алкил, замещенный C-C алкил, C-C алкенил, замещенный C-C алкенил, C-C алкинил, замещенный C-C алкинил или N(E)(E);
1
2
3
1
6
1
6
E, E и Е каждый независимо представляют собой Н, C-C алкил или замещенный C-C алкил;
n составляет от 1 до около 6;
m составляет 0 или 1;
j составляет 0 или 1;
1
1
2
1
1
3
2
1
2
1
2
2
1
2
каждая замещенная группа включает одну или более необязательно защищенных замещающих групп, независимо выбранных из галогена, OJ, N(J)(J), =NJ, SJ, N, CN, OC(=X)J, OC(=X)N(J)(J) и C(=X)N(J)(J);
2
3
X представляет собой О, S или NJ;
1
2
3
1
6
каждый J, J и J независимо представляет собой Н или C-C алкил;
2
3
если j составляет 1, то Z является отличным от галогена или N(E)(E); и
при этом указанное олигомерное соединение содержит от 8 до 40 мономерных субъединиц и гибридизуется по меньшей мере с частью нуклеиновой кислоты-мишени.
3
2
2
3
В некоторых вариантах реализации изобретения М представляет собой О, СН=СН, ОСН или ОС(Н)(Вх). В некоторых вариантах реализации изобретения М представляет собой О.
4
5
6
7
4
5
7
В некоторых вариантах реализации изобретения J, J, J и J каждый независимо представляют собой Н. В некоторых вариантах реализации изобретения J образует мостик с одним из J или J.
В некоторых вариантах реализации изобретения А имеет одну из формул:
или
где:
1
2
1
6
1
6
1
6
1
6
1
2
1
2
1
2
1
2
3
3
Q и Q каждый независимо представляют собой Н, галоген, C-C алкил, замещенный C-C алкил, C-C алкокси или замещенный C-C алкокси. В некоторых вариантах реализации изобретения Q и Q каждый представляют собой Н. В некоторых вариантах реализации изобретения Q and Q каждый независимо представляют собой Н или галоген. В некоторых вариантах реализации изобретения Q и Q представляют собой Н, а другие из Q и Q представляют собой F, СН или ОСН.
1
В некоторых вариантах реализации изобретения T имеет формулу:
где:
a
c
1
6
1
6
1
6
1
6
R и R каждый независимо представляют собой защищенный гидроксил, защищенный тиол, C-C алкил, замещенный C-C алкил, C-C алкокси, замещенный C-C алкокси, защищенный амино или замещенный амино; и
b
b
a
c
3
2
3
3
2
R представляет собой О или S. В некоторых вариантах реализации изобретения R представляет собой О, а R и R каждый независимо представляют собой ОСН, ОСНСН или СН(СН).
3
2
2
3
2
3
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
3
2
2
3
2
2
3
2
3
10
11
2
2
10
11
2
2
2
2
10
11
2
10
11
2
12
2
2
10
11
2
2
12
13
10
11
10
11
12
13
1
6
3
3
2
3
2
3
2
2
2
2
3
2
2
2
2
3
2
2
3
2
2
2
3
2
2
2
3
2
2
3
2
2
3
В некоторых вариантах реализации изобретения G представляет собой галоген, ОСН, OCHF, OCHF, OCF, ОСНСН, O(CH)F, OCHCHF, OCHCF, OCH-CH=CH, O(СН)-ОСН, O(CH)-SCH, O(СН)-OCF, O(CH)-N(R)(R), O(CH)-ON(R)(R), O(CH)-O(CH)-N(R)(R), OCHC(=O)-N(R)(R), OCHC(=O)-N(R)-(CH)-N(R)(R) или O(CH)-N(R)-C(=NR)[N(R)(R)], где R, R, R и R каждый независимо представляют собой Н или C-C алкил. В некоторых вариантах реализации изобретения G представляет собой галоген, ОСН, OCF, ОСНСН, OCHCF, ОСН-СН=СН, O(СН)-ОСН, O(CH)-O(CH)-N(CH), OCHC(=O)-N(H)CH, ОСНС(=O)-N(Н)-(СН)-N(СН) или OCH-N(H)-C(=NH)NH. В некоторых вариантах реализации изобретения G представляет собой F, ОСН или O(СН)-ОСН. В некоторых вариантах реализации изобретения G представляет собой O(СН)-ОСН.
В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-концевой нуклеозид имеет Формулу IIe:
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, в том числе соединения, которые особенно подходят для оцРНК, содержат один или более типов модифицированных сахарных фрагментов и/или природных сахарных фрагментов, расположенных вдоль олигонуклеотида или его области в определенном паттерне или мотиве модификации сахара. Такие мотивы могут содержать любые модификации сахара, рассмотренные в данном документе, и/или другие известные модификации сахара.
В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды содержат или состоят из области, имеющей одинаковые модификации сахара. В некоторых таких вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид области содержит ту же РНК-подобную модификацию сахара. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид области представляет собой 2'-F нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид области представляет собой 2'-ОМе нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид области представляет собой 2'-МОЕ нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид области представляет собой нуклеозид cEt. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид области представляет собой нуклеозид LNA. В некоторых вариантах реализации изобретения постоянная область представляет собой весь или по сути весь олигонуклеотид. В некоторых вариантах реализации изобретения область представляет собой весь олигонуклеотид, за исключением 1-4-концевых нуклеозидов.
В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды содержат одну или более областей переменных модификаций сахара, при этом нуклеозиды чередуется между нуклеотидами, имеющими сахарную модификацию первого типа, и нуклеотидами, имеющими сахарную модификацию второго типа. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеозиды обоих типов представляют собой РНК-подобные нуклеозиды. В некоторых вариантах реализации изобретения переменные нуклеозиды выбирают из: 2'-ОМе, 2'-F, 2'-МОЕ, LNA и cEt. В некоторых вариантах реализации изобретения переменные модификации представляют собой 2'-F и 2'-ОМе. Такие области могут быть непрерывными или могут быть прерваны по-разному модифицированными нуклеозидами или сопряженными нуклеозидами.
x
y
В некоторых вариантах реализации изобретения каждая переменная область переменных модификаций состоит из одного нуклеозида (то есть паттерн представляет собой (АВ)A, где А представляет собой нуклеозид, имеющий сахарную модификацию первого типа, а В представляет собой нуклеозид, имеющий сахарную модификацию второго типа; х составляет 1-20, а y составляет 0 или 1). В некоторых вариантах реализации изобретения одна или более переменных областей в переменном мотиве содержит более одного нуклеозида типа. Например, олигонуклеотиды могут содержать одну или более областей любого из следующих мотивов нуклеозидов:
ААВВАА;
АВВАВВ;
ААВААВ;
АВВАВААВВ;
ABABAA;
AABABAB;
ABABAA;
ABBAABBABABAA;
BABBAABBABABAA; или
ABABBAABBABABAA;
где А представляет собой нуклеозид первого типа, а В представляет собой нуклеозид второго типа. В некоторых вариантах реализации изобретения А и В каждый выбирают из 2'-F, 2'-OMe, БНК и МОЕ.
В некоторых вариантах реализации изобретенияолигонуклеотиды, имеющие такой переменный мотив, также содержат модифицированный 5-'концевой нуклеозид, такой как нуклеозид формулы IIc или IIe.
В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды содержат область, имеющую мотив 2-2-3. Такие области содержат следующий мотив:
2
x
2
y
3
-(А)-(В)-(А)-(С)-(А)-
где: А представляет собой первый тип модифицированного нуклеозида;
В и С представляют собой нуклеозиды, которые модифицированы иначе, чем А, тем не менее, В и С могут иметь одинаковые или различные модификации друг друга;
x и y составляют от 1 до 15.
В некоторых вариантах реализации изобретения А представляет собой 2'-OMe модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения оба В и С представляют собой 2'-F модифицированные нуклеозиды. В некоторых вариантах реализации изобретения А представляет собой 2'-OMe модифицированный нуклеозид, а оба В и С представляют собой 2'-F модифицированные нуклеозиды.
В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеозиды имеют следующий сахарный мотив:
x
y
z
5'-(Q)-(AB)A-(D)
где:
Q представляет собой нуклеозид, содержащий стабилизированный фосфатный фрагмент. В некоторых вариантах реализации изобретения Q представляет собой нуклеозид, имеющий Формулу IIc или IIe;
А представляет собой первый тип модифицированного нуклеозида;
В представляет собой второй тип модифицированного нуклеозида;
D представляет собой модифицированный нуклеозид, включающий модификацию, отличную от модификации нуклеозида, смежного с ним. Таким образом, если у составляет 0, то D должен быть модифицирован иначе, чем В, и если у составляет 1, то D должен быть модифицирован иначе, чем А. В некоторых вариантах реализации изобретения D отличается как от А, так и от В.
Х составляет 5-15;
Y составляет 0 или 1;
Z составляет 0-4
В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеозиды имеют следующий сахарный мотив:
x
z
5'-(Q)-(A)-(D)
где:
Q представляет собой нуклеозид, содержащий стабилизированный фосфатный фрагмент. В некоторых вариантах реализации изобретения Q представляет собой нуклеозид, имеющий Формулу IIc или IIe;
А представляет собой первый тип модифицированного нуклеозида;
D представляет собой модифицированный нуклеозид, включающий модификацию, отличную от А.
Х составляет 11-30;
Z составляет 0-4
В некоторых вариантах реализации изобретения А, В, С и D в приведенных выше мотивах выбирают из: 2'-ОМе, 2'-F, 2'-MOE, LNA и cEt. В некоторых вариантах реализации изобретения D представляет собой концевые нуклеозиды. В некоторых вариантах реализации изобретения такие концевые нуклеозиды не сконструированы с возможностью гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью (хотя один или более могут гибридизоваться случайно). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидное основание каждого нуклеозида D представляет собой аденин, независимо от идентификации нуклеотидного основания в соответствующем положении нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидное основание каждого нуклеозида D представляет собой тимин.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, в том числе соединения, которые особенно подходят для применения в качестве оцРНК, содержат модифицированные межнуклеозидные связи, расположенные вдоль олигонуклеотида или его области в определенном паттерне или мотиве модифицированной межнуклеозидной связи. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды содержат область, имеющую мотив переменных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды содержат область равномерно модифицированных межнуклеозидных связей. В некоторых таких вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит область, которая равномерно связана фосфоротиоатными межнуклеозидными связями. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид равномерно связан фосфоротиоатными межнуклеозидными связями. В некоторых вариантах реализации изобретения каждую межнуклеозидную связь олигонуклеотида выбирают из фосфодиэфирной и фосфоротиоатной. В некоторых вариантах реализации изобретения каждую межнуклеозидную связь олигонуклеотида выбирают из фосфодиэфирной и фосфоротиоатной, и по меньшей мере одна межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной.
В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит по меньшей мере 6 фосфоротиоатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 фосфоротиоатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит по меньшей мере 10 фосфоротиоатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит по меньшей мере один блок по меньшей мере из 6 последовательных фосфоротиоатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит по меньшей мере один блок по меньшей мере из 8 последовательных фосфоротиоатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит по меньшей мере один блок по меньшей мере из 10 последовательных фосфоротиоатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит по меньшей мере один блок по меньшей мере из 12 последовательных фосфоротиоатных межнуклеозидных связей. В некоторых таких вариантах реализации изобретения по меньшей мере один такой блок расположен у 3'-конца олигонуклеотида. В некоторых таких вариантах реализации изобретения по меньшей мере один такой блок расположен в пределах 3 нуклеозидов 3'-конца олигонуклеотида.
Олигонуклеотиды, имеющие любой из различных сахарных мотивов, описанных в данном документе, могут иметь любой мотив связей. Например, олигонуклеотиды, в том числе, без ограничения теми, что описаны выше, могут иметь мотив связей, выбранный из неограничивающих мотивов приведенной ниже таблицы:
ii. Соединения киРНК.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения представляют собой соединения двухцепочечных RNAi (киРНК). В таких вариантах реализации изобретения одна или обе цепи могут содержать любой мотив модификации, описанный выше для оцРНК. В некоторых вариантах реализации изобретения соединения оцРНК могут представлять собой немодифицированные РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения соединения киРНК могут содержать немодифицированные нуклеозиды РНК, но модифицированные межнуклеозидные связи.
Несколько вариантов реализации изобретения относятся к двухцепочечным композициям, в которых каждая цепь содержит мотив, определенный положением одного или более модифицированных или немодифицированных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются композиции, содержащие первое и второе олигомерное соединение, которые полностью или по меньшей мере частично гибридизованы с образованием области дуплекса, и дополнительно содержащие область, которая является комплементарной относительно нуклеиновой кислоты-мишени и гибридизуется с нею. Целесообразно, что такая композиция содержит первое олигомерное соединение, которое представляет собой антисмысловую цепь, имеющую полную или частичную комплементарность относительно нуклеиновой кислоты-мишени, и второе олигомерное соединение, которое представляет собой смысловую цепь, имеющую одну или более областей комплементарности относительно первого олигомерного соединения и образующую по меньшей мере одну область дуплекса с ним.
Композиции по нескольким вариантам реализации изобретения модулируют экспрессию генов посредством гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью, что приводит к потере ее нормальной функции. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота-мишень представляет собой GHR. В некоторых вариантах реализации изобретения разрушению GHR-мишени способствует активированный комплекс RISC, который образуется с композициями по данному изобретению.
Несколько вариантов реализации изобретения направлено на двухцепочечные композиции, в которых одну из цепей применяют, например, в оказании воздействия на предпочтительную загрузку противоположной цепи в комплекс RISC (или расщепление). Указанные композиции применяют для направленного воздействия на выбранные молекулы нуклеиновых кислот и модуляции экспрессии одного или более генов. В некоторых вариантах реализации изобретения композиции по данному изобретению гибридизуются с частью РНК-мишени, приводя к потере нормальной функции РНК-мишени.
Некоторые варианты реализации изобретения относятся к двухцепочечным композициям, в которых обе цепи содержат гемимерный мотив, полностью модифицированный мотив, позиционно модифицированный мотив или переменный мотив. Каждая цепь композиций по данному изобретению может быть модифицирована для выполнения определенной роли, например, в пути киРНК. Применение разного мотива в каждой цепи или того же мотива с разными химическими модификациями в каждой цепи обеспечивает возможность направленного воздействия на антисмысловую цепь для комплекса RISC, при этом ингибируя включение смысловой цепи. В рамках этой модели, каждая цепь может быть независимо модифицирована таким образом, что ее активность в определенной роли повышается. Антисмысловая цепь может быть модифицирована у 5'-конца для повышения своей роли в одной области RISC, тогда как 3'-конец может быть иначе модифицирован для повышения своей роли в другой области RISC.
Двухцепочечные молекулы олигонуклеотида могут представлять собой двухцепочечную молекулу полинуклеотида, содержащую самокомплементарные смысловые и антисмысловые области, при этом антисмысловая область содержит нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной относительно нуклеотидной последовательности в молекуле нуклеиновой кислоты-мишени или ее части, а смысловая область имеет нуклеотидную последовательность, соответствующей последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или ее части. Двухцепочечные молекулы олигонуклеотида могут быть собраны из двух отдельных олигонуклеотидов, где одна цепь представляет собой смысловую цепь, а другая представляет собой антисмысловую цепь, при этом антисмысловые и смысловые цепи являются самокомплементарными (то есть каждая цепь содержит нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной относительно нуклеотидной последовательности в другой цепи, такая, в которой антисмысловая цепь и смысловая цепь образуют дуплекс или двухцепочечную структуру, например, в которой двухцепочечная область составляет от около 15 до около 30, например, около 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 пар оснований; антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной относительно нуклеотидной последовательности в молекуле нуклеиновой кислоты-мишени или ее части, а смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или ее части (например, от около 15 до около 25 или более нуклеотидов двухцепочечной молекулы олигонуклеотида являются комплементарными относительно нуклеиновой кислоты-мишени или ее части). В альтернативном варианте двухцепочечный олигонуклеотид собирают из одного олигонуклеотида, в котором самокомплементарные смысловые и антисмысловые области киРНК связаны посредством связи (связей) на основе нуклеиновых кислот или не на основе нуклеиновых кислот.
Двухцепочечный олигонуклеотид может представлять собой полинуклеотид с дуплексной, асимметричной дуплексной, шпилечной или асимметричной шпилечной вторичной структурой, имеющей самокомплементарные смысловые и антисмысловые области, при этом антисмысловая область содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности в отдельной молекуле нуклеиновой кислоты-мишени или ее части, а смысловая область имеет нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или ее части. Двухцепочечный олигонуклеотид может представлять собой кольцевой одноцепочечный полинуклеотид, имеющий две или более петлеобразные структуры и "стебель", содержащие самокомплементарные смысловые и антисмысловые области, при этом антисмысловая область содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности в молекуле нуклеиновой кислоты-мишени или ее части, а смысловая область имеет нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или ее части, и при этом кольцевой полинуклеотид может быть обработан либо in vivo, либо in vitro для получения активной молекулы киРНК, способной опосредовать RNAi.
В некоторых вариантах реализации изобретения двухцепочечный олигонуклеотид содержит отдельные смысловые и антисмысловые последовательности или области, при этом смысловые и антисмысловые области ковалентно связаны нуклеотидными или ненуклеотидных молекулами-линкерами, известными в данной области техники, или наоборот нековалентно связаны ионными взаимодействиями, водородными связями, ван-дер-ваальсовыми взаимодействиями, гидрофобными взаимодействиями и/или стэкинг-взаимодействиями. В некоторых вариантах реализации изобретения двухцепочечный олигонуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной относительно нуклеотидной последовательности гена-мишени. В другом варианте реализации изобретения двухцепочечный олигонуклеотид взаимодействует с нуклеотидной последовательностью гена-мишени таким образом, что вызывает ингибирование экспрессии гена-мишени.
При использовании по тексту данного документа, двухцепочечные олигонуклеотиды не должны ограничиваться теми молекулами, содержащими только РНК, а дополнительно охватывают химически модифицированные нуклеотиды и ненуклеотиды. В некоторых вариантах реализации изобретения короткие интерферирующие молекулы нуклеиновых кислот не имеют нуклеотидов, содержащих 2'-гидрокси (2'-ОН). В некоторых вариантах реализации изобретения короткие интерферирующие нуклеиновые кислоты необязательно не содержат рибонуклеотиды (например, нуклеотиды, имеющие группу 2'-ОН). Такие двухцепочечные олигонуклеотиды, которые не требуют присутствия рибонуклеотидов в молекуле для поддержания RNAi, тем не менее могут иметь прикрепленный линкер или линкеры, или другие прикрепленные или связанные группы, фрагменты или цепи, содержащие один или более нуклеотидов с группами 2'-ОН. Необязательно, двухцепочечные олигонуклеотиды могут содержать рибонуклеотиды в около 5, 10, 20, 30, 40 или 50% нуклеотидных положений. При использовании по тексту данного документа, термин киРНК предназначен являться эквивалентом другим терминам, используемым для описания молекул нуклеиновых кислот, которые способны опосредовать RNAi, специфичную к последовательности, например, короткой интерферирующей РНК (киРНК), двухцепочечной РНК (дцРНК), микро-РНК (микроРНК), короткой шпилечной РНК (кшРНК), короткому интерферирующему олигонуклеотиду, короткой интерферирующей нуклеиновой кислоте, короткому интерферирующему модифицированному олигонуклеотиду, химически модифицированной киРНК, РНК посттранскрипционного сайленсинга гена (ptgsRNA) и другим. Кроме того, при использовании по тексту данного документа, термин RNAi предназначен являться эквивалентом другим терминам, используемым для описания РНК-интерференции, специфичной к последовательности, например, посттранскрипционному сайленсингу гена, трансляционному ингибированию или эпигенетике. Например, двухцепочечные олигонуклеотиды могут применяться для эпигенетического сайленсинга генов как на посттранскрипционном уровне, так и на претранскрипционном уровне. В неограничивающем примере эпигенетическая регуляция экспрессии генов молекулами киРНК по данному изобретению может являться результатом киРНК-опосредованной модификации структуры хроматина или паттерна метилирования для изменения экспрессии генов (смотри, например, публикации Verdel et al., 2004, Science, 303, 672-676; Pal-Bhadra et al., 2004, Science, 303, 669-672; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; и Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237).
Предполагается, что соединения и композиции по нескольким вариантам реализации изобретения, приведенным в данном документе, могут нацеливать GHR с помощью дцРНК-опосредованного сайленсинга гена или механизма RNAi, в том числе, например, эффекторных молекул "шпилечной" или стебле-петлевой двухцепочечной РНК, в которых одна цепь РНК с самокомплементарными последовательностями способна принимать на себя двухцепочечную конформацию, или эффекторных молекул дуплексной дцРНК, содержащих две отдельные цепи РНК. В различных вариантах реализации изобретения дцРНК полностью состоит из рибонуклеотидов или состоит из смеси рибонуклеотидов и дезоксинуклеотидов, таких как гибриды РНК/ДНК, описанные, например, в заявке WO 00/63364, поданной 19 апреля 2000 года, или заявке на патент США под серийным №60/130,377, поданной 21 апреля 1999 года. ДцРНК или эффекторная молекула дцРНК может представлять собой одну молекулу с областью самокомплементарности, такой что нуклеотиды в одном сегменте молекулы образуют пару с нуклеотидами в другом сегменте молекулы. В различных вариантах реализации изобретения дцРНК, которая состоит из одной молекулы, полностью состоит из рибонуклеотидов или содержит область рибонуклеотидов, является комплементарной относительно области дезоксирибонуклеотидов. В альтернативном варианте дцРНК может содержать две различные цепи, которые имеют область комплементарности друг к другу.
В различных вариантах реализации изобретения обе цепи полностью состоят из рибонуклеотидов, одна цепь полностью состоит из рибонуклеотидов и одна цепь полностью состоит из дезоксирибонуклеотидов или одна или обе цепи содержат смесь рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов. В некоторых вариантах реализации изобретения области комплементарности являются по меньшей мере на 70, 80, 90, 95, 98 или 100% комплементарными относительно друг друга и относительно последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения область дцРНК, которая присутствует в двухцепочечной конформации, содержит по меньшей мере 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 50, 75, 100, 200, 500, 1000, 2000 или 5000 нуклеотидов или содержит все нуклеотиды в кДНК или другой последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, представленной в дцРНК. В некоторых вариантах реализации изобретения дцРНК не содержит никаких одноцепочечных областей, таких как одноцепочечные концы, или дцРНК является шпилечной. В других вариантах реализации изобретения дцРНК имеет одну или более одноцепочечных областей или свисающих концов. В некоторых вариантах реализации изобретения гибриды РНК/ДНК содержат цепь ДНК или область, которая представляет собой антисмысловую цепь или область (например, имеет по меньшей мере 70, 80, 90, 95, 98 или 100% комплементарность относительно нуклеиновой кислоты-мишени), и цепь РНК или область, которая представляет собой смысловую цепь или область (например, имеет по меньшей мере 70, 80, 90, 95, 98 или 100% идентичность относительно нуклеиновой кислоты-мишени), и наоборот.
В различных вариантах реализации изобретения гибрид РНК/ДНК получают in vitro с применением ферментативных или химических способов синтеза, таких как способы, описанные в данном документе, или способы, описанные в заявке WO 00/63364, поданной 19 апреля 2000 года, или заявке на патент США под серийным №60/130,377, поданной 21 апреля 1999 года. В других вариантах реализации изобретения цепь ДНК, синтезированная in vitro, образует комплекс с цепью РНК, полученной in vivo или in vitro, до, после или одновременно с трансформацией цепи ДНК в клетку. В еще одних вариантах реализации изобретения дцРНК представляет собой отдельную кольцевую нуклеиновую кислоту, содержащую смысловую и антисмысловую область, или дцРНК включает кольцевую нуклеиновую кислоту и либо вторую кольцевую нуклеиновую кислоту, либо линейную нуклеиновую кислоту (смотри, например, заявку WO 00/63364, поданную 19 апреля 2000 года, или заявку на патент США под серийным №60/130,377, поданной 21 апреля 1999 года). Типовые кольцевые нуклеиновые кислоты включают лассо-структуры, в которых свободная 5'-фосфорильная группа нуклеотида становится связанной с 2'-гидроксильной группой другого нуклеотида в режиме закольцовывания.
В других вариантах реализации изобретения дцРНК содержит один или более модифицированных нуклеотидов, в которых положение 2' в сахаре содержит галоген (такой как группа фтора) или содержит алкоксигруппу (такую как метоксигруппа), которая увеличивает период полужизни дцРНК in vitro или in vivo в сравнении с соответствующей дцРНК, в которой соответствующее положение 2' содержит водород или гидроксильную группу. В еще одних вариантах реализации изобретения дцРНК содержит одну или более связей между смежными нуклеотидами, отличных от природной фосфодиэфирной связи. Примеры таких связей включают фосфорамидные, фосфоротиоатные и фосфородитиоатные связи. ДцРНК также могут представлять собой химически модифицированные молекулы нуклеиновых кислот, о которых сообщается в патенте США №6,673,661. В других вариантах реализации изобретения дцРНК содержит одну или две кэпированные цепи, описанные, например, в заявке WO 00/63364, поданной 19 апреля 2000 года, или заявке на патент США под серийным №60/130,377, поданной 21 апреля 1999 года.
В других вариантах реализации изобретения дцРНК может представлять собой любую из по меньшей мере частично молекул дцРНК, описанных в заявке WO 00/63364, а также любую из молекул дцРНК, описанных в предварительной заявке на патент США №60/399,998; и предварительной заявке на патент США №60/419,532 и PCT/US2003/033466, принцип которых тем самым включен посредством ссылки. Любая из дцРНК может экспрессироваться in vitro или in vivo с применением описанных в данном документе способов или стандартных способов, таких как способы, описанные в заявке WO 00/63364.
Присутствие
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения не должны приводить к расщеплению или нуклеиновой кислоте-мишени с помощью РНКазы Н, или приводить к расщеплению или секвестрации посредством пути RISC. В некоторых таких вариантах реализации изобретения антисмысловая активность может являться результатом присутствия, при этом наличие гибридного антисмыслового соединения разрушает активность нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых таких вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение может быть равномерно модифицировано или может содержать смесь модификаций и/или модифицированных и немодифицированных нуклеозидов.
Нуклеиновые кислоты-мишени, области-мишени и нуклеотидные последовательности
Нуклеотидные последовательности, которые кодируют рецептор гормона роста (GHR) с наведением на цель с помощью приведенных в данном документе соединений, включают, без ограничения ими, следующие: № доступа в GENBANK NM_000163.4 (включенную в данный документ как SEQ ID №: 1), № доступа в GENBANK NT_006576.16, усеченную с нуклеотида 42411001 по 42714000 (включенную в данный документ как SEQ ID №: 2), № доступа в GENBANK Х06562.1 (включенную в данный документ как SEQ ID №: 3), № доступа в GENBANK DR006395.1 (включенную в данный документ как SEQ ID №: 4), № доступа в GENBANK DB052048.1 (включенную в данный документ как SEQ ID №: 5), № доступа в GENBANK AF230800.1 (включенную в данный документ как SEQ ID №: 6), комплемент под № доступа в GENBANK АА398260.1 (включенный в данный документ как SEQ ID №: 7), № доступа в GENBANK ВС136496.1 (включенную в данный документ как SEQ ID №: 8), № доступа в GENBANK NM_001242399.2 (включенную в данный документ как SEQ ID №: 9), № доступа в GENBANK NM_001242400.2 (включенную в данный документ как SEQ ID №10), № доступа в GENBANK NM_001242401.3 (включенную в данный документ как SEQ ID №11), № доступа в GENBANK NM_001242402.2 (включенную в данный документ как SEQ ID №12), № доступа в GENBANK NM_001242403.2 (включенную в данный документ как SEQ ID №13), № доступа в GENBANK NM_001242404.2 (включенную в данный документ как SEQ ID №14), № доступа в GENBANK NM_001242405.2 (включенную в данный документ как SEQ ID №15), № доступа в GENBANK NM_001242406.2 (включенную в данный документ как SEQ ID №16), № доступа в GENBANK NM_001242460.1 (включенную в данный документ как SEQ ID №17), № доступа в GENBANK NM_001242461.1 (включенную в данный документ как SEQ ID №: 18), № доступа в GENBANK №. NM_001242462.1 (включенную в данный документ как SEQ ID №: 19) или № доступа в GENBANK NW_001120958.1, усеченную с нуклеотида 4410000 по 4720000 (включенную в данный документ как SEQ ID №: 2296).
Гибридизация
В некоторых вариантах реализации изобретения гибридизация происходит между описанным в данном документе антисмысловым соединением и нуклеиновой кислотой GHR. Наиболее распространенный механизм гибридизации включает образование водородных связей (например, уотсон-криковское, хугстиновское или обратное хугстиновское образование водородных связей) между комплементарными нуклеотидными основаниями молекул нуклеиновых кислот.
Гибридизация может происходить в различных условиях. Жесткие условия зависят от последовательности и определяются природой и составом молекул нуклеиновых кислот, которые будут гибридизоваться.
В данной области техники хорошо известны способы определения того, является ли последовательность специфически гибридизующейся с нуклеиновой кислотой-мишенью. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, приведенные в данном документе, специфически гибридизуются с нуклеиновой кислотой GHR.
Комплементарность
Антисмысловое соединение и нуклеиновая кислота-мишень являются комплементарными относительно друг друга в том случае, когда достаточное количество нуклеотидных оснований антисмыслового соединения может образовывать водородную связь с соответствующими нуклеотидными основаниями нуклеиновой кислоты-мишени в результате чего будет достигаться желаемый эффект (например, антисмысловое ингибирование нуклеиновой кислоты-мишени, такой как нуклеиновая кислота GHR).
При этом допускается присутствие некомплементарных нуклеотидных оснований между антисмысловым соединением и нуклеиновой кислотой GHR, при условии, что антисмысловое соединение будет сохранять свою способность специфически гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью. Кроме того, антисмысловое соединение может гибридизироваться по одному или более сегментам нуклеиновой кислоты GHR, таким образом, что промежуточные или смежные сегменты не принимают участия в процессе гибридизации (например, петлеобразная структура, структура ошибочного спаривания или шпилечная структура).
В некоторых вариантах реализации изобретения приведенные в данном документе антисмысловые соединения или определенная их часть являются комплементарными или являются по меньшей мере на 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% комплементарными относительно нуклеиновой кислоты GHR, области-мишени, сегмента-мишени или определенной их части. Процент комплементарности антисмыслового соединения с нуклеиновой кислотой-мишенью может быть определен с помощью стандартных способов.
Например, антисмысловое соединение, в котором 18 из 20 нуклеотидных оснований антисмыслового соединения являются комплементарными относительно области-мишени и, следовательно, могут специфически гибридизоваться, рассматривается как соединение с 90 процентной комплементарностью. В этом примере остальные некомплементарные нуклеотидные основания могут быть сгруппированы или рассеяны между комплементарными нуклеотидными основаниями, и необязательно должны быть смежными друг с другом или с комплементарными нуклеотидными основаниями. В связи с этим, антисмысловое соединение, которое составляет 18 нуклеотидных оснований в длину, имеющее четыре некомплементарных нуклеотидных основания, которые фланкированы двумя областями полной комплементарности нуклеиновой кислоте-мишени, будет иметь 77,8% общей комплементарности нуклеиновой кислоте-мишени и, таким образом, находится в пределах объема настоящего изобретения. Процент комплементарности антисмыслового соединения относительно области нуклеиновой кислоты-мишени может быть определен в установленном порядке с помощью пакета программ BLAST (основные инструменты поиска локальных совпадений) и пакета программ PowerBLAST, известных в данной области техники (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang and Madden, Ge№me Res., 1997, 7, 649 656). Процент гомологии, идентичность последовательности или комплементарность могут быть определены, например, с помощью программы Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, версия 8 для Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.) с применением настроек по умолчанию, которая использует алгоритм Смита и Уотермана (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489).
В некоторых вариантах реализации изобретения приведенные в данном документе антисмысловые соединения или их определенные части являются полностью комплементарными (то есть на 100% комплементарными) относительно нуклеиновой кислоты-мишени или их определенной части. Например, антисмысловое соединение может быть полностью комплементарным относительно нуклеиновой кислоты GHR или ее области-мишени, или сегмента-мишени, или последовательности-мишени. При использовании по тексту данного документа, термин "полностью комплементарный" означает, что каждое нуклеотидное основание антисмыслового соединения обладает способностью точно спариваться с соответствующими нуклеотидными основаниями нуклеиновой кислоты-мишени. Например, 20 нуклеотидных оснований антисмыслового соединения полностью комплементарны последовательности-мишени, длина которой составляет 400 нуклеотидных оснований, поскольку существует соответствующая часть нуклеиновой кислоты-мишени из 20 нуклеотидных оснований, которая полностью комплементарна антисмысловому соединению. Термин "полностью комплементарный" также может употребляться по отношению к определенной части первой и/или второй нуклеиновой кислоты. Например, 20 нуклеотидных оснований, являющихся частью антисмыслового соединения из 30 нуклеотидных оснований, могут быть "полностью комплементарными" относительно последовательности-мишени, длина которой составляет 400 нуклеотидных оснований. 20 нуклеотидных оснований, являющихся частью олигонуклеотида из 30 нуклеотидных оснований, являются полностью комплементарными относительно последовательности-мишени, если указанная последовательность-мишень имеет соответствующую часть из 20 нуклеотидных оснований, при этом каждое нуклеотидное основание является комплементарным относительно 20 нуклеотидных оснований, являющихся частью антисмыслового соединения. В то же время, полноразмерное антисмысловое соединение из 30 нуклеотидных оснований может быть, а может и не быть, полностью комплементарным относительно последовательности-мишени, в зависимости от того, являются ли остальные 10 нуклеотидных оснований антисмыслового соединения также комплементарными относительно последовательности-мишени.
Некомплементарное нуклеотидное основание может присутствовать на 5'-конце или 3'-конце антисмыслового соединения. В альтернативном варианте некомплементарное нуклеотидное основание или некомплементарные нуклеотидные основания могут присутствовать во внутреннем положении антисмыслового соединения. Если присутствуют два или более некомплементарных нуклеотидных основания, то они могут быть смежными (то есть связанными) или несмежными. В одном варианте реализации изобретения некомплементарное нуклеотидное основание присутствует в крыльевом сегменте антисмыслового олигонуклеотида-гэпмера.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, составляющие 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидных оснований в длину или менее, содержат не более чем 4, не более чем 3, не более чем 2 или не более чем 1 нуклеотидное основание, которое не является комплементарным относительно нуклеиновой кислоты-мишени, такой как нуклеиновая кислота GHR или ее определенная часть.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, составляющие 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидных оснований в длину или менее, содержат не более чем 6, не более чем 5, не более чем 4, не более чем 3, не более чем 2 или не более чем 1 нуклеотидное основание, которое не является комплементарным нуклеиновой кислоте-мишени, такой как нуклеиновая кислота GHR или ее определенная часть.
Предлагаемые антисмысловые соединения также включают антисмысловые соединения, которые являются комплементарными относительно части нуклеиновой кислоты-мишени. При использовании по тексту данного документа, термин "часть" относится к определенному количеству непрерывных (то есть связанных) нуклеотидных оснований в области или сегменте нуклеиновой кислоты-мишени. Термин "часть" может также означать определенное количество непрерывных нуклеотидных оснований антисмыслового соединения. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения являются комплементарными относительно по меньшей мере части сегмента-мишени из 8 нуклеотидных оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения являются комплементарными относительно по меньшей мере части сегмента-мишени из 9 нуклеотидных оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения являются комплементарными относительно по меньшей мере части сегмента-мишени из 10 нуклеотидных оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения являются комплементарными относительно по меньшей мере части сегмента-мишени из 11 нуклеотидных оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения являются комплементарными относительно по меньшей мере части сегмента-мишени из 12 нуклеотидных оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения являются комплементарными относительно по меньшей мере части сегмента-мишени из 13 нуклеотидных оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения являются комплементарными относительно по меньшей мере части сегмента-мишени из 14 нуклеотидных оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения являются комплементарными относительно по меньшей мере части сегмента-мишени из 15 нуклеотидных оснований. Также рассматриваются антисмысловые соединения, которые являются комплементарными относительно по меньшей мере 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более нуклеотидных оснований, являющихся частью сегмента-мишени, или любого количества нуклеотидных оснований, входящего диапазон, определенный любыми двумя из этих значений.
Идентичность
Приведенные в данном документе антисмысловые соединения могут также иметь определенный процент идентичности относительно конкретной нуклеотидной последовательности, SEQ ID № или соединения, имеющего определенный номер по Isis, или его части. При использовании по тексту данного документа антисмысловое соединение является идентичным относительно описанной в данном документе последовательности, если это соединение обладает такой же способностью спариваться с нуклеотидными основаниями. Например, РНК, которая содержит урацил вместо тимидина в описанной последовательности ДНК, должна рассматриваться как идентичная относительно последовательности ДНК, поскольку как урацил, так и тимидин спариваются с аденином. Также рассматриваются укороченные и удлиненные варианты антисмысловых соединений, описанных в данном документе, а также соединений, имеющих основания, не идентичные по отношению к приведенным в данном документе антисмысловым соединениям. Неидентичные основания могут быть смежными друг с другом или распределены по всему антисмысловому соединению. Процент идентичности антисмыслового соединения рассчитывают в соответствии с количеством оснований, которые имеют идентичное спаривание оснований по отношению к сравниваемой последовательности.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения или их части идентичны или по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны относительно одного или более антисмысловых соединений или SEQ ID №, или их частей, описанных в данном документе.
В некоторых вариантах реализации изобретения часть антисмыслового соединения сравнивают с равной по длине частью нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения часть, имеющую 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеотидных оснований, сравнивают с равной по длине частью нуклеиновой кислоты-мишени.
В некоторых вариантах реализации изобретения часть антисмыслового олигонуклеотида сравнивают с равной по длине частью нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения часть, имеющую 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеотидных оснований, сравнивают с равной по длине частью нуклеиновой кислоты-мишени.
Модификации
Нуклеозид представляет собой комбинацию основания и сахара. Нуклеотидной частью (также известной как основание) нуклеозида обычно является фрагмент гетероциклического основания. Нуклеотидами также являются нуклеозиды, которые дополнительно содержат фосфатную группу, ковалентно связанную с сахарной частью нуклеозида. В нуклеозидах, которые содержат пентофуранозильный сахар, фосфатная группа может быть связана с 2'-, 3'- или 5'-гидроксильным фрагментом сахара. Олигонуклеотиды образуются посредством ковалентной связи смежных нуклеозидов друг с другом, образуя линейный полимерный олигонуклеотид. В олигонуклеотидной структуре фосфатные группы, как правило, рассматриваются как образующие межнуклеозидные связи олигонуклеотида.
Модификации антисмысловых соединений охватывают замены или изменения в межнуклеозидных связях, сахарных фрагментах или нуклеотидных основаниях. Модифицированные антисмысловые соединения зачастую являются предпочтительней нативных форм, так как они обладают желаемыми свойствами, такими как, например, повышенное клеточное поглощение, повышенная аффинность по отношению к нуклеиновой кислоте-мишени, повышенная устойчивость в присутствии нуклеаз или повышенная ингибирующая активность.
Химически модифицированные нуклеозиды могут также применяться для повышения аффинности связывания укороченного или усеченного антисмыслового олигонуклеотида с его нуклеиновой кислотой-мишенью. Следовательно, сопоставимые результаты зачастую могут быть получены с применением более коротких антисмысловых соединений, которые содержат такие химически модифицированные нуклеозиды.
Модифицированные межнуклеозидные связи
Природная межнуклеозидная связь РНК и ДНК представляет собой 3'-5'-фосфодиэфирную связь. Антисмысловые соединения, имеющие одну или более модифицированных, то есть, неприродных межнуклеозидных связей, зачастую являются более предпочтительными по сравнению с антисмысловыми соединениями, имеющими природные межнуклеозидные связи, так как они обладают желаемыми свойствами, такими как, например, повышенное клеточное поглощение, повышенная аффинность по отношению к нуклеиновым кислотам-мишеням и повышенная устойчивость в присутствии нуклеаз.
Олигонуклеотиды, имеющие модифицированные межнуклеозидные связи, содержат межнуклеозидные связи, в которых сохраняется атом фосфора, а также межнуклеозидные связи, в которых нет атома фосфора. Типичные фосфорсодержащие межнуклеозидные связи включают, без ограничения ими, фосфодиэфиры, фосфотриэфиры, метилфосфонаты, фосфорамидаты и фосфоротиоаты. Способы получения связей, содержащих и не содержащих фосфор, являются хорошо известными.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту GHR, содержат одну или более модифицированных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированные межнуклеозидные связи представляют собой фосфоротиоатные связи. В некоторых вариантах реализации изобретения каждая межнуклеозидная связь антисмыслового соединения представляет собой фосфоротиоатную межнуклеозидную связь.
Модифицированные сахарные фрагменты
1
2
1
2
1
12
Антисмысловые соединения необязательно могут содержать один или более нуклеозидов, в которых сахарная группа была модифицирована. Такие нуклеозиды с модифицированным сахаром могут придавать антисмысловым соединениям повышенную устойчивость к нуклеазам, повышенную аффинность связывания или некоторое другое полезное биологическое свойство. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеозиды содержат химически модифицированные рибофуранозные кольцевые фрагменты. Примеры химически модифицированных рибофуранозных колец включают, без ограничения ими, присоединение групп-заместителей (в том числе 5'- и 2'-групп-заместителей, образование мостиковой связи негеминальных кольцевых атомов с образованием бициклических нуклеиновых кислот (BNA), замену атома кислорода рибозильного кольца на S, N(R) или С(R)(R) (R, R и R каждый независимо представляет собой Н, C-C алкил или защитную группу) и их комбинации. Примеры химически модифицированных сахаров включают 2'-F-5'-метил-замещенный нуклеозид (описание других 5',2'-бис-замещенных нуклеозидов смотри в международной заявке РСТ WO 2008/101157, опубликованной 21 августа 2008 года) или замену атома кислорода рибозильного кольца атомом S с дополнительной заменой в 2'-положении (смотри опубликованную заявку на патент США US 2005-0130923, опубликованную 16 июня 2005 года) или, в альтернативном варианте, 5'-замену БНК (смотри международную заявку РСТ WO 2007/134181, опубликованную 22 ноября 2007 года, где LNA замещена, например, 5'-метильной или 5'-винильной группой).
3
2
3
2
2
2
2
3
1
10
3
2
2
2
3
2
2
m
n
2
m
n
2
1
2
2
m
n
1
m
n
1
10
Примеры нуклеозидов, имеющих модифицированные сахарные фрагменты, включают, без ограничения ими, нуклеозиды, содержащие 5'-винильную, 5'-метильную (R или S), 4'-S, 2'-F, 2'-ОСН, 2'-ОСНСН, 2'-OCHCHF и 2'-O(СН)OCH группы заместителей. Заместитель в 2'-положении также может быть выбран из аллила, амино, азидо, тио, O-аллила, O-C-С алкила, OCF, OCHF, O(СН)SCH, O(CH)-O-N(R)(R), O-CH-C(=O)-N(R)(R) и O-CH-C(=O)-N(R)-(CH)-N(R)(R), где каждый R, R и R независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный C-С алкил.
2
2
2
2
3
2
3
3
3
2
3
2
3
2
1
12
2
3
2
2
При использовании по тексту данного документа, термин "бициклические нуклеозиды" относится к модифицированным нуклеозидам, содержащим бициклический сахарный фрагмент. Примеры бициклических нуклеозидов включают, без ограничения ими, нуклеозиды, содержащие мостик между 4'- и 2'-рибозильными кольцевыми атомами. В некоторых вариантах реализации изобретения приведенные в данном документе антисмысловые соединения включают один или более бициклических нуклеозидов, содержащих 4'-2'-мостик. Примеры таких 4'-2'-мостиковых бициклических нуклеозидов, включают, без ограничения ими, одну из формул: 4'-(СН)-O-2' (LNA); 4'-(CH)-S-2'; 4'-(CH)-O-2' (ENA); 4'-СН(СН)-O-2' (также называемый конформационно ограниченный этил или cEt) и 4'-СН(CHOCH)-O-2' (и его аналоги смотри в патенте США №7,399,845, выданном 15 июля 2008 года); 4'-С(СН)(СН)-O-2' (и его аналоги смотри в опубликованной международной заявке WO/2009/006478, опубликованной 8 января 2009 года); 4'-СН-N(ОСН)-2' (и его аналоги смотри в опубликованной международной заявке WO/2008/150729, опубликованной 11 декабря 2008 года); 4'-СН-O-N(СН)-2' (смотри опубликованную заявку на патент США № US 2004-0171570, опубликованную 2 сентября 2004 года); 4'-CH-N(R)-O-2', где R представляет собой Н, C-C алкил или защитную группу (смотри патент США №7,427,672, выданный 23 сентября 2008 года); 4'-СН-С(Н)(СН)-2' (смотри публикацию Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); и 4'-СН-С(=СН)-2' (и его аналоги смотри в опубликованной международной заявке WO 2008/154401, опубликованной 8 декабря 2008 года).
Дополнительные отчеты, связанные с бициклическими нуклеозидами также можно найти в опубликованной литературе (смотри, например, публикации Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invest. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; и Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; патенты США №№6,268,490; 6,525,191; 6,670,461; 6,770,748; 6,794,499; 7,034,133; 7,053,207; 7,399,845; 7,547,684; и 7,696,345; публикацию патента США № US 2008-0039618; US 2009-0012281; патенты США с серийными №№60/989,574; 61/026,995; 61/026,998; 61/056,564; 61/086,231; 61/097,787; и 61/099,844; опубликованные международные заявки PCT WO 1994/014226; WO 2004/106356; WO 2005/021570; WO 2007/134181; WO 2008/150729; WO 2008/154401; и WO 2009/006478. Каждый из указанных выше бициклических нуклеозидов может быть получен таким образом, чтобы иметь одну или более стереохимических конфигураций сахара, в том числе, например, α-L-рибофуранозу и β-D-рибофуранозу (смотри международную заявку PCT № PCT/DK98/00393, опубликованную 25 марта 1999 года как WO 99/14226).
a
b
n
a
b
a
a
a
2
x
a
В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические сахарные фрагменты нуклеозидов БНК включают, без ограничения ими, соединения, имеющие по меньшей мере один мостик между 4'- и 2'-положением пентофуранозильного сахарного фрагмента, при этом такие мостики независимо содержат 1 или от 2 до 4 связанных групп, независимо выбранных из -[C(R)(R)]-, -С(R)=С(R)-, -C(R)=N-, -C(=O)-, -C(=NR)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R)-, -S(=O)- и -N(R)-;
где:
x составляет 0, 1 или 2;
n составляет 1, 2, 3 или 4;
a
b
1
12
1
12
2
12
2
12
2
12
2
12
5
20
5
20
5
7
5
7
1
1
2
1
3
1
2
1
1
каждый R и R независимо представляет собой Н, защитную группу, гидроксил, C-C алкил, замещенный C-C алкил, С-С алкенил, замещенный С-С алкенил, С-С алкинил, замещенный С-С алкинил, C-C арил, замещенный С-С арил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, гетероарил, замещенный гетероарил, C-C алициклический радикал, замещенный C-C алициклический радикал, галоген, OJ, NJJ, SJ, N, COOJ, ацил (С(=O)-Н), замещенный ацил, CN, сульфонил (S(=O)-J) или сульфоксил (S(=O)-J); и
1
2
1
12
1
12
2
12
2
12
2
12
2
12
5
20
5
20
1
12
1
12
каждый J и J независимо представляет собой Н, C-C алкил, замещенный C-C алкил, С-С алкенил, замещенный С-С алкенил, С-С алкинил, замещенный С-С алкинил, C-C арил, замещенный C-C арил, ацил (С(=O)-Н), замещенный ацил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, C-C аминоалкил, замещенный C-C аминоалкил или защитную группу.
a
b
n
a
b
n
a
b
a
b
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
1
12
В некоторых вариантах реализации изобретения мостик бициклического сахарного фрагмента представляет собой -[C(R)(R)]-, -[C(R)(R)]-O-, -C(RR)-N(R)-O- или -C(RR)-O-N(R)-. В некоторых вариантах реализации изобретения мостик представляет собой 4'-СН-2', 4'-(СН)-2', 4'-(СН)-2', 4'-СН-O-2', 4'-(СН)-O-2', 4'-CH-O-N(R)-2' и 4'-CH-N(R)-O-2'-, где каждый R независимо представляет собой Н, защитную группу или C-C алкил.
2
В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды дополнительно определяются изомерной конфигурацией. Например, нуклеозид, содержащий мостик 4'-2'-метиленокси, может быть в конфигурации α-L или в конфигурации β-D. Ранее α-L-метиленокси (4'-СН-O-2') БНК были включены в антисмысловые олигонуклеотиды, которые продемонстрировали антисмысловую активность (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
3
2
3
В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды включают, без ограничения ими, (А) α-L-метиленокси (4'-СН-O-2') БНК, (Б) β-D-метиленокси (4'-СН-O-2') БНК, (В) этиленокси (4'-(СН)-O-2') БНК, (Г) аминоокси (4'-CH-O-N(R)-2') БНК, (Д) оксиамино (4'-СН-N(R)-O-2') БНК и (Е) метил(метиленокси) (4'-СН(СН)-O-2') БНК, (Ё) метилен-тио (4'-CH-S-2') БНК, (Ж) метилен-амино (4'-CH-N(R)-2') БНК, (З) метил карбоциклическую (4'-СН-СН(СН)-2') БНК, (И) пропилен карбоциклическую (4'-(СН)-2') БНК и (Й) винильную БНК, как показано ниже:
1
12
1
12
где Вх представляет собой фрагмент основания и R независимо представляет собой Н, защитную группу, C-C алкил или C-C алкокси.
В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются бициклические нуклеозиды, имеющие Формулу I:
где:
Вх представляет собой гетероциклический фрагмент основания;
a
b
c
2
c
2
c
2
2
c
2
c
c
2
-Q-Q-Q- представляет собой -CH-N(R)-CH-, -C(=O)-N(R)-CH-, -CH-O-N(R)-, -СН-N(R)-O- или -N(R)-O-CH;
c
1
12
R is C-C алкил или защитную аминогруппу; и
а
b
Т и T каждый независимо представляют собой H, гидроксильную защитную группу, сопряженную группу, реакционноспособную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковалентное связывание с субстратом.
В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются бициклические нуклеозиды, имеющие Формулу II:
где:
Вх представляет собой гетероциклический фрагмент основания;
а
b
Т и T каждый независимо представляют собой Н, гидроксильную защитную группу, сопряженную группу, реакционноспособную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковалентное связывание с субстратом;
a
1
6
2
6
2
6
1
6
2
6
2
6
Z представляет собой C-C алкил, C-C алкенил, C-C алкинил, замещенный C-C алкил, замещенный C-C алкенил, замещенный C-C алкинил, ацил, замещенный ацил, замещенный амид, тиол или замещенный тио.
c
c
d
c
3
c
e
c
d
c
d
e
1
6
1
6
c
В одном варианте реализации изобретения каждая из замещенных групп независимо моно- или полизамещена группами заместителей, независимо выбранными из галогена, оксо, гидроксила, OJ, NJJ, SJ, N, OC(=X)J, и NJC(=X)NJJ, где каждый J, J и J независимо представляет собой H, C-C алкил или замещенный C-C алкил и Х представляет собой О или NJ.
В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются бициклические нуклеозиды, имеющие Формулу III:
где:
Вх представляет собой гетероциклический фрагмент основания;
а
b
Т и T каждый независимо представляют собой Н, гидроксильную защитную группу, сопряженную группу, реакционноспособную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковалентное связывание с субстратом;
b
1
6
2
6
2
6
1
6
2
6
1
6
Z представляет собой C-C алкил, C-C алкенил, C-C алкинил, замещенный C-C алкил, замещенный C-C алкенил, замещенный C-C алкинил или замещенный ацил (С(=O)-).
В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются бициклические нуклеозиды, имеющие Формулу IV:
где:
Вх представляет собой гетероциклический фрагмент основания;
а
b
Т и T каждый независимо представляют собой Н, гидроксильную защитную группу, сопряженную группу, реакционноспособную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковалентное связывание с субстратом;
d
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
R представляет собой C-C алкил, замещенный C-C алкил, C-C алкенил, замещенный C-C алкенил, C-C алкинил или замещенный C-C алкинил;
a
b
c
d
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
1
6
1
6
1
6
1
6
кажый q, q, q и q независимо представляет собой Н, галоген, C-C алкил, замещенный C-C алкил, C-C алкенил, замещенный C-C алкенил, C-C алкинил или замещенный C-C алкинил, C-C алкоксил, замещенный C-C алкоксил, ацил, замещенный ацил, C-C аминоалкил или замещенный C-C аминоалкил;
В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются бициклические нуклеозиды, имеющие Формулу V:
где:
Вх представляет собой гетероциклический фрагмент основания;
a
b
T и T каждый независимо представляют собой Н, гидроксильную защитную группу, сопряженную группу, реакционноспособную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковалентное связывание с субстратом;
a
b
e
f
1
12
1
12
2
12
2
12
2
12
2
12
1
12
1
12
j
j
j
2
j
j
k
3
j
j
k
j
j
k
j
k
j
k
j
k
q, q, q и q каждый независимо представляют собой водород, галоген, C-C алкил, замещенный C-C алкил, С-С алкенил, замещенный С-С алкенил, С-С алкинил, замещенный С-С алкинил, C-C алкокси, замещенный C-C алкокси, OJ, SJ, SOJ, SOJ, NJJ, N, CN, C(=O)OJ, C(=O)NJJ, C(=O)J, O-C(=O)NJJ, N(H)C(=NH)NJJ, N(H)C(=O)NJJ или N(H)C(=S)NJJ;
e
f
g
h
или q и q вместе представляют собой =C(q)(q);
g
h
1
12
1
12
q и q каждый независимо представляют собой Н, галоген, C-C алкил или замещенный C-C алкил.
2
Были описаны синтез и получение метиленокси (4'-СН-O-2') БНК-мономеров аденина, цитозина, гуанина, 5-метил-цитозина, тимина и урацила, наряду с их олигомеризацией и способностью к распознаванию нуклеиновых кислот (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). БНК и их получение также описаны в WO 98/39352 и WO 99/14226.
2
Были также получены аналоги метиленокси (4'-СН-O-2') БНК и 2'-тио-БНК (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). Было также описано получение запертых нуклеозидных аналогов, содержащих олигодезоксирибонуклеотидные дуплексы в качестве подложек для полимераз нуклеиновых кислот (Wengel et al., WO 99/14226). Кроме того, в данной области техники был описан синтез 2'-амино-БНК, нового конформационно ограниченного олигонуклеотидного аналога с высокой аффинностью (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Кроме того, были получены 2'-амино- и 2'-метиламино-БНК и ранее сообщалось о термической устойчивости их дуплексов с комплементарными цепями РНК и ДНК.
В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются бициклические нуклеозиды, имеющие Формулу VI:
где:
Вх представляет собой гетероциклический фрагмент основания;
а
b
Т и T каждый независимо представляют собой Н, гидроксильную защитную группу, сопряженную группу, реакционноспособную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковалентное связывание с субстратом;
i
j
k
l
1
12
1
12
2
12
2
12
2
12
2
12
1
12
1
12
j
j
j
2
j
j
k
3
j
j
k
j
j
k
j
k
j
k
j
k
каждый q, q, q и q независимо представляет собой Н, галоген, C-C алкил, замещенный C-C алкил, С-С алкенил, замещенный С-С алкенил, С-С алкинил, замещенный С-С алкинил, C-C алкоксил, замещенный C-C алкоксил, OJ, SJ, SOJ, SOJ, NJJ, N, CN, C(=O)OJ, C(=O)NJJ, C(=O)J, O-C(=O)NJJ, N(H)C(=NH)NJJ, N(H)C(=O)NJJ или N(H)C(=S)NJJ; и
i
j
l
k
g
h
g
h
1
12
1
12
q и q или q и q вместе представляют собой =C(q)(q), где q и q каждый независимо представляют собой Н, галоген, C-C алкил или замещенный C-C алкил.
2
3
2
Был описан один карбоциклический бициклический нуклеозид, имеющий 4'-(СН)-2' мостик и алкениловый аналоговый мостик 4'-СН=СН-СН-2' (Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 и Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 77, 7731-7740). Также были описаны синтез и получение карбоциклических бициклических нуклеозидов наряду с их олигомеризацией и биохимическими исследованиями (Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26), 8362-8379).
При использовании по тексту данного документа, термин "4'-2'-бициклический нуклеозид" или "от 4' к 2' бициклический нуклеозид "относится к бициклическому нуклеозиду, содержащему фуранозное кольцо, содержащее мостик, соединяющий два атома углерода фуранозного кольца, соединяющий 2'-атом углерода и 4'-атом углерода кольца сахара.
При использовании по тексту данного документа, термин "моноциклические нуклеозиды" относится к нуклеозидам, содержащим модифицированные сахарные фрагменты, которые не являются бициклическими сахарными фрагментами. В некоторых вариантах реализации изобретения сахарный фрагмент, или аналог сахарного фрагмента, нуклеозида могут быть модифицированы или замещены в любом положении.
2
n
m
3
2
n
2
2
n
3
2
n
2
n
2
2
3
2
n
2
n
3
2
1
12
3
3
3
3
2
3
2
2
3
2
При использовании по тексту данного документа, термин "2'-модифицированный сахар" означает фуранозильный сахар, модифицированный в 2'-положении. В некоторых вариантах реализации изобретения такие модификации включают заместители, выбранные из: галогенида, в том числе, без ограничения ими, замещенного и незамещенного алкокси, замещенного и незамещенного тиоалкила, замещенного и незамещенного аминоалкила, замещенного и незамещенного алкила, замещенного и незамещенного аллила и замещенного и незамещенного алкинила. В некоторых вариантах реализации изобретения 2'-модификации выбирают из заместителей, в том числе, без ограничения ими: O[(СН)O]CH, O(CH)NH, O(СН)CH, O(CH)F, O(CH)ONH, ОСНС(=O)N(Н)СН и O(СН)ON[(СН)CH], где n и m составляют от 1 до около 10. Другие 2'-группы заместителей также могут быть выбраны из: C-C алкила, замещенного алкила, алкенила, алкинила, алкарила, аралкила, O-алкарила или O-аралкила, SH, SCH, OCN, Cl, Br, CN, F, CF, OCF, SOCH, SOCH, ONO, NO, N, NH, гетероциклоалкила, гетероциклоалкарила, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенного силила, группы расщепления РНК, репортерной группы, интеркалятора, группы улучшения фармакокинетических свойств или группы улучшения фармакодинамических свойств антисмыслового соединения, а также других заместителей, имеющих подобные свойства. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированные нуклеозиды содержат боковую цепь 2'-МОЕ (Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272 11944-12000). Было описано, что такое замещение 2'-МОЕ обладает улучшенной аффинностью связывания по сравнению с немодифицированными нуклеозидами и другими модифицированными нуклеозидами, такими как 2'-O-метил, O-пропил и O-аминопропил. Также было показано, что олигонуклеотиды, имеющие заместитель 2'-МОЕ, представляют собой антисмысловые ингибиторы экспрессии генов с перспективными возможностями для применениям vivo (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; и Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
При использовании по тексту данного документа, термин "модифицированный тетрагидропирановый нуклеозид" или "модифицированный ТГП нуклеозид" означает нуклеозид, имеющий шестичленный тетрагидропирановый "сахар", замещенный на пентофуранозильный остаток в нормальных нуклеозидах (заменитель сахара). Модифицированные ТГП нуклеозиды включают, без ограничения ими, те, что в данной области техники называют гекситоловая нуклеиновая кислота (HNA), аннитоловая нуклеиновая кислота (ANA), маннитоловая нуклеиновая кислота (MNA) (смотри публикацию Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854) или фтор HNA (F-HNA), имеющую тетрагидропирановую кольцевую систему, как показано ниже:
В некоторых вариантах реализации изобретения выбирают заменители сахара, имеющие Формулу VII:
где независимо для каждого из указанного по меньшей мере одного тетрагидропиранового нуклеозидного аналога Формулы VII:
Вх представляет собой гетероциклический фрагмент основания;
a
b
a
b
a
b
T и T каждый независимо представляют собой межнуклеозидную связывающую группу, связывающую тетрагидропирановый нуклеозидный аналог с антисмысловым соединением, или один из T и T представляет собой межнуклеозидную связывающую группу, связывающую тетрагидропирановый нуклеозидный аналог с антисмысловым соединением, а другой из T и T представляет собой H, гидроксильную защитную группу, связанную сопряженную группу или 5'- или 3'-концевую группу;
1
2
3
4
5
6
7
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
1
2
1
2
1
3
1
1
2
3
1
2
1
1
2
3
1
6
q, q, q, q, q, q и q каждый независимо представляют собой Н, C-C алкил, замещенный C-C алкил, C-C алкенил, замещенный C-C алкенил, C-C алкинил или замещенный C-C алкинил; и каждый из R и R выбирают из водорода, гидроксила, галогена, замещенного или незамещенного алкокси, NJJ, SJ, N, OC(=X)J, OC(=X)NJJ, NJC(=X)NJJ и CN, где Х представляет собой О, S или NJ и каждый J, J и J независимо представляет собой Н или C-C алкил.
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
1
2
1
2
1
2
1
2
В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются модифицированные ТГП нуклеозиды Формулы VII, где q, q, q, q, q, q и q каждый представляет собой Н. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один из q, q, q, q, q, q и q является отличным от Н. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один из q, q, q, q, q, q и q представляет собой метил. В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются ТГП нуклеозиды Формулы VII, где один из R и R представляет собой фтор. В некоторых вариантах реализации изобретения R представляет собой фтор и R представляет собой Н; R представляет собой метокси и R представляет собой Н, a R представляет собой метоксиэтокси и R представляет собой Н.
В некоторых вариантах реализации изобретения заменители сахара содержат кольца, имеющие более 5 атомов и более одного гетероатома. Например, были описаны нуклеозиды, содержащие морфолино сахарные фрагменты, и их применение в олигомерных соединениях (смотри, например: Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510; и патенты США 5,698,685; 5,166,315; 5,185,444; и 5,034,506). При использовании по тексту данного документа, термин "морфолино" означает заменитель сахара, имеющий следующую формулу:
.
В некоторых вариантах реализации изобретения морфолино могут быть модифицированы, например, посредством добавления или изменения различных групп заместителей в указанной выше структуре морфолино. Такие заменители сахара в данном документе называют "модифицированные морфолино".
2
Без ограничения, также представлены комбинации модификаций, такие как 2'-F-5'-метил-замещенные нуклеозиды (смотри международную заявку РСТ WO 2008/101157, опубликованную 21 августа 2008 года, в которой описаны другие 5', 2'-бис-замещенные нуклеозиды) и замена атома кислорода рибозильного кольца на S, и дополнительная замена в 2'-положении (смотри опубликованную заявку на патент США US2005-0130923, опубликованную 16 июня 2005 года) или, в альтернативном варианте, 5'-замена бициклической нуклеиновой кислоты (смотри международную заявку РСТ WO 2007/134181, опубликованную 22 ноября 2007 года, в которой 4'-СН-O-2' бициклический нуклеозид дополнительно замещен в 5'-положении 5'-метильной или 5'-винильной группой). Также был описан синтез и получение карбоциклических бициклических нуклеозидов наряду с их олигомеризацией и биохимическими исследованиями (смотри, например, публикацию Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379).
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения содержат один или более модифицированных циклогексенильных нуклеозидов, которые представляют собой нуклеозид, имеющий шестичленный циклогексенил вместо пентофуранозильного остатка в природных нуклеозидах. Модифицированные циклогексенильные нуклеозиды включают, без ограничения ими, нуклеозиды, которые описаны в данной области техники (смотри, например, одновременно находящуюся на рассмотрении того же заявителя опубликованную заявку РСТ WO 2010/036696, опубликованную 10 апреля 2010 года, публикации Robeyns et al., J. Am. Chem. Soc., 2008, 130(6), 1979-1984;  et al., Tetrahedron Letters, 2007, 48, 3621-3623; Nauwelaerts et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(30), 9340-9348; Gu et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2005, 24(5-7), 993-998; Nauwelaerts et al., Nucleic Acids Research, 2005, 33(8), 2452-2463; Robeyns et al., Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, F61(6), 585-586; Gu et al., Tetrahedron, 2004, 60(9), 2111-2123; Gu et al., Oligonucleotides, 2003, 13(6), 479-489; Wang et al., J. Org. Chem., 2003, 68, 4499-4505; Verbeure et al., Nucleic Acids Research, 2001, 29(24), 4941-4947; Wang et al., J. Org. Chem., 2001, 66, 8478-82; Wang et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2001, 20(4-7), 785-788; Wang et al., J. Am. Chem., 2000, 122, 8595-8602; опубликованную заявку РСТ WO 06/047842; и опубликованную заявку РСТ WO 01/049687; текст каждой из них включен в данный документ посредством ссылки в полном объеме). Некоторые модифицированные циклогексенильные нуклеозиды имеют Формулу X.
где независимо для каждого из указанного по меньшей мере одного циклогексенильного нуклеозидного аналога Формулы X:
Вх представляет собой гетероциклический фрагмент основания;
3
4
3
4
3
4
Т и Т каждый независимо представляют собой межнуклеозидную связывающую группу, связывающую циклогексенильный нуклеозидный аналог с антисмысловым соединением, или один из Т и Т представляет собой межнуклеозидную связывающую группу, связывающую тетрагидропирановый нуклеозидный аналог с антисмысловым соединением, а другой из Т и Тпредставляет собой Н, гидроксильную защитную группу, связанную сопряженную группу или 5'- или 3'-концевую группу; и
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
q, q, q, q, q, q, q, q и q каждый независимо представляют собой Н, C-C алкил, замещенный C-C алкил, С-C алкенил, замещенный C-С алкенилl, C-C алкинил, замещенный C-С алкинил или другую сахарную группу заместителей.
1
10
3
2
2
3
2
2
3
2
2
m
n
2
m
n
m
n
1
10
При использовании по тексту данного документа, термин "2'-модифицированный" или "2'-замещенный" относится к нуклеозиду, содержащему сахар, содержащий заместитель в 2'-положении, отличный от Н или ОН. 2'-модифицированные нуклеозиды включают, без ограничения ими, бициклические нуклеозиды, в которых мостик, соединяющий два атома углерода кольца сахара, соединяет 2'-углерод и другой углерод кольца сахара; и нуклеозиды с немостиковыми 2'-заместителями, такими как аллил, амино, азидо, тио, O-аллил, O-C-С alkyl, -OCF, O-(СН)-O-СН, 2'-O(CH)SCH, O-(CH)-O-N(R)(R) или O-CH-C(=O)-N(R)(R), где каждый R и R независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный C-С алкил. 2'-модифицированные нуклеозиды могут дополнительно содержать другие модификации, например, в других положениях сахара и/или в нуклеотидном основании.
При использовании по тексту данного документа, термин "2'-F" относится к нуклеозиду, содержащему сахар, содержащий группу фтора в 2'-положении кольца сахара.
3
3
При использовании по тексту данного документа, термин "2'-ОМе" или "2'-ОСН, или "2'-O-метилl" каждый относится к нуклеозиду, содержащему сахар, содержащий группу -ОСН в 2'-положении кольца сахара.
2
2
3
2
2
3
При использовании по тексту данного документа, термин "МОЕ" или "2'-МОЕ", или "2'-ОСНСНОСН", или "2'-O-метоксиэтил" каждый относится к нуклеозиду, содержащему сахар, содержащий группу -ОСНСНОСН в 2'-положении кольца сахара.
При использовании по тексту данного документа, термин "олигонуклеотид" относится к соединению, содержащему множество связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения один или более из множества нуклеозидов являются модифицированными. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит один или более рибонуклеозидов (РНК) и/или дезоксирибонуклеозидов (ДНК).
В данной области техники также известны многие другие бициклические и трициклические кольцевые системы заменителей сахара, которые могут применяться для модификации нуклеозидов для внедрения в антисмысловые соединения (смотри, например, обзорную статью: Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854). Такие кольцевые системы могут подвергаться различным дополнительным заменам для повышения активности.
Способы получения модифицированных сахаров хорошо известны специалистам в данной области техники. Некоторые типичные патенты США, которые описывают получение таких модифицированных сахаров, включают, без ограничения ими: 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,670,633; 5,700,920; 5,792,847 и 6,600,032 и международную заявку PCT/US2005/019219, поданную 2 июня 2005 года, и опубликованную как WO 2005/121371 22 декабря 2005 года, и каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
В нуклеотидах, имеющих модифицированные сахарные фрагменты, фрагменты нуклеотидных оснований в (природные, модифицированные или их комбинации) сохраняют для гибридизации с соответствующей нуклеиновой кислотой-мишенью.
3
3
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения содержат один или более нуклеозидов, имеющих модифицированные сахарные фрагменты. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный сахарный фрагмент представляет собой 2'-МОЕ. В некоторых вариантах реализации изобретения 2'-МОЕ-модифицированные нуклеозиды расположены в гэпмерном мотиве. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный сахарный фрагмент представляет собой бициклический нуклеозид, имеющий мостиковую группу (4'-СН(СН)-O-2'). В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированные нуклеозиды (4'-СН(СН)-O-2') расположены по всем крыльевым сегментам гэпмерного мотива.
Модифицированные нуклеотидные основания
Модификации или замены нуклеотидного основания (или основания) по своей структуре отличаются от природных или синтетических немодифицированных нуклеотидных оснований, хотя функционально они эквивалентны им. И природные, и модифицированные нуклеотидные основания способны участвовать в образовании водородных связей. Такие модификации нуклеотидного основания могут придавать антисмысловым соединениям устойчивость к нуклеазам, аффинность связывания или некоторое другое полезное биологическое свойство. Модифицированные нуклеотидные основания включают синтетические и природные нуклеотидные основания, такие как, например, 5-метилцитозин (5-me-С). Некоторые замены нуклеотидного основания, в том числе замены 5-метилцитозином, особенно применимы для повышения аффинности связывания антисмыслового соединения с нуклеиновой кислотой-мишенью. Например, было показано, что замены 5-метилцитозином повышают устойчивость дуплекса нуклеиновой кислоты на 0,6-1,2°С (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, В., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278).
Дополнительные модифицированные нуклеотидные основания включают 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и цитозин, 5-пропинил(-С≡С-СН3) урацил и цитозин, а также другие алкинильные производные пиримидиновых оснований, 6-азоурацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген, в частности, 5-бром, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 2-F-аденин, 2-аминоаденин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин, а также 3-деазагуанин и 3-деазааденин.
Фрагменты гетероциклического основания также могут включать такие, в которых пуриновое или пиримидиновое основание заменено другими гетероциклами, например, 7-деазааденин, 7-деазагуанозин, 2-аминопиридин и 2-пиридон. Нуклеотидные основания, которые особенно применимы для повышения аффинности связывания антисмысловых соединений, включают 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2, N-6 и O-6-замещенные пурины, в том числе 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту GHR, содержат одно или более модифицированных нуклеотидных оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения укороченные антисмысловые олигонуклеотиды или антисмысловые олигонуклеотиды с уширенным гэпом, нацеленные на нуклеиновую кислоту GHR, содержат одно или более модифицированных нуклеотидных оснований. В некоторых вариантах реализации модифицированное нуклеотидное основание представляет собой 5-метилцитозин. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
Сопряженные антисмысловые соединения
Антисмысловые соединения могут быть ковалентно связаны с одним или более фрагментами или конъюгатами, которые повышают активность, клеточное распределение или клеточное поглощение полученных в результате антисмысловых олигонуклеотидов. Типичные сопряженные группы включают холестериновые фрагменты и липидные фрагменты. Дополнительные сопряженные группы включают углеводы, фосфолипиды, биотин, феназин, фолат, фенантридин, антрахинон, акридин, флуоресцеины, родамины, кумарины и красители.
Антисмысловые соединения также могут быть модифицированы с включением одной или более стабилизирующих групп, которые, как правило, присоединяются к одному или обоим концам антисмысловых соединений для улучшения свойств, таких как, например, устойчивость к нуклеазам. В стабилизирующие группы также входят кэп-структуры. Такие концевые модификации защищают антисмысловое соединение, имеющее концевую нуклеиновую кислоту, от разрушения экзонуклеазой и могут способствовать доставке и/или локализации в клетке. Кэп может присутствовать на 5'-конце (5'-кэп) или на 3'-конце (3'-кэп), или может присутствовать на обоих концах. Кэп-структуры хорошо известны в данной области техники и включают, например, инвертированные дезокси-кэпы с удаленными азотистыми основаниями. Дополнительные 3'- и 5'-стабилизирующие группы, которые могут применяться для кэпирования одного или обоих концов антисмыслового соединения с целью придания устойчивости к нуклеазам, включают группы, описанные в заявке WO 03/004602, опубликованной 16 января 2003 года.
В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, в том числе, без ограничения ими, антисмысловые соединения, которые особенно подходят для применения в качестве оцРНК, модифицируют посредством присоединения одной или более сопряженных групп. В целом, сопряженные группы модифицируют одно или более свойств прикрепленного олигонуклеотида, в том числе, без ограничения ими, фармакодинамику, фармакокинетику, устойчивость, связывание, абсорбцию, распределение в клетке, клеточное поглощение, заряд и клиренс. Сопряженные группы обычно применяются в области химии и связаны с исходным соединением, таким как олигонуклеотид, напрямую или через необязательный сопряженный связывающий фрагмент или сопряженную связывающую группу. Сопряженные группы включают, без ограничения ими, интеркаляторы, репортерные молекулы, полиамины, полиамиды, полиэтиленгликоли, тиоэфиры, полиэфиры, холестерины, тиохолестерины, фрагменты холевой кислоты, фолат, липиды, фосфолипиды, биотин, феназин, фенантридин, антрахинон, адамантан, акридин, флуоресцеины, родамины, кумарины и красители. Некоторые сопряженные группы были описаны ранее, например: фрагмент холестерина (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), холевая кислота (Ма№haran et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), тиоэфир, например, гексил-S-тритилтиол (Ма№haran et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Ма№haran et al., Bioorg. Med. Chem. Let, 1993, 3, 2765-2770), тиохолестерин (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), алифатическая цепь, например, додекандиоловые или ундециловые остатки (Saison-Behmoaras et al., ЕМВО J, 1991, 10, 1111-1118; Kaba№v et al., FEBS Lett, 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), фосфолипид, например, ди-гексадецил-рац-глицерин или 1,2-ди-О-гексадецил-рац-глицеро-3-Н-фосфонат триэтиламмония (Ма№haran et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), полиамин или полиэтиленгликолевая цепь (Ма№haran et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973) или адамантануксусная кислота (Ма№haran et al.. Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), пальмитиловый фрагмент (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237) или фрагмент октадециламина или гексиламино-карбонил-оксихолестерина (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937).
Для дополнительных конъюгатов, в том числе тех, которые применяют для оцРНК, и их размещения в антисмысловых соединениях смотри, например, заявку на патент США №61/583,963.
Испытание антисмысловых олигонуклеотидов in vitro
В данном документе описаны способы обработки клеток антисмысловыми олигонуклеотидами, которые могут быть соответствующим образом модифицированы для обработки другими антисмысловыми соединениями.
Клетки могут быть обработаны антисмысловыми олигонуклеотидами по мере достижения клетками конфлюэнтности, составляющей около 60-80%, в культуре.
Один из реагентов, обычно применяемых для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивированные клетки, включает реагент для трансфекции катионного липида липофектина (LIPOFECTIN) (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния). Антисмысловые олигонуклеотиды могут быть смешаны с липофектином в среде OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния) для достижения желаемой конечной концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации липофектина, которая может составлять от 2 до 12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.
Другой реагент, применяемый для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивированные клетки, включает липофектамин (LIPOFECTAMINE) (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния). Антисмысловой олигонуклеотид смешивают с липофектамином в среде OPTI-MEM 1 с пониженным содержанием сыворотки (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния) для достижения желаемой конечной концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации липофектамина, которая может составлять от 2 до 12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.
Другой метод, применяемый для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивированные клетки, включает электропорацию.
Еще один метод, применяемый для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивируемые клетки, включает свободное поглощение олигонуклеотидов клетками.
Клетки обрабатывают антисмысловыми олигонуклеотидами с помощью стандартных способов. Клетки могут быть собраны через 16-24 часа после обработки антисмысловым олигонуклеотидом, в это время уровни РНК или белка нуклеиновых кислот-мишеней измеряют способами, известными в данной области техники и описанными в данном документе. В целом, когда обработку выполняют в нескольких повторностях, данные представляют как среднее повторных обработок.
В различных клеточных линиях концентрация применяемого антисмыслового олигонуклеотида варьирует. Способы определения оптимальной концентрации антисмыслового олигонуклеотида для определенной клеточной линии хорошо известны в данной области техники. При трансфекции липофектамином антисмысловые олигонуклеотиды, как правило, применяют в концентрации, составляющей от 1 нМ до 300 нМ. При трансфекции методом электропорации антисмысловые олигонуклеотиды применяют в более высокой концентрации, находящейся в пределах от 625 до 20000 нМ.
Выделение РНК
Анализ РНК может быть выполнен на полноразмерной клеточной РНК или поли(А)+ мРНК. Способы выделения РНК хорошо известны в данной области техники. РНК получают с помощью методов, хорошо известных в данной области техники, например, с применением реагента TRIZOL (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния) в соответствии с инструкциями, рекомендованными производителем.
Некоторые показания к применению
Некоторые приведенные в данном документе варианты реализации изобретения относятся к способам лечения, профилактики или уменьшения интенсивности заболевания, связанного с избытком гормона роста у субъекта, посредством введения специфического ингибитора GHR, такого как антисмысловое соединение или олигонуклеотид, нацеленного на GHR. В некоторых аспектах заболевание, связанное с избытком гормона роста, представляет собой акромегалию. В некоторых аспектах заболевание, связанное с избытком гормона роста, представляет собой гигантизм.
Некоторые варианты реализации изобретения относятся к способу лечения, профилактики или уменьшения интенсивности акромегалии у субъекта посредством введения специфического ингибитора GHR, такого как антисмысловое соединение или олигонуклеотид, нацеленного на GHR. Акромегалия представляет собой заболевание, связанное с избытком гормона роста (GH). У более чем 90 процентов пациентов с акромегалией избыточная выработка гормонов роста вызвана доброкачественной опухолью питуитарной железы, называемой аденомой, которая вырабатывает избыточный гормон роста и сжимает окружающие ткани мозга. Рост аденомы может вызвать головные боли и нарушения зрения, которые зачастую сопровождают акромегалию. В некоторых случаях акромегалия обусловлена опухолями поджелудочной железы, легких или надпочечной железы, которые приводят к избытку GH либо за счет выработки GH, либо за счет выработки гормона, высвобождающего гормон роста (GHRH), гормона, который стимулирует гипофиз для выработки GH.
Акромегалия наиболее часто поражает взрослых в среднем возрасте и может приводить к серьезному уродству, осложнениям и преждевременной смерти. В связи с патогенезом и медленным прогрессированием акромегалия зачастую не диагностируется до тех пор, пока изменения внешних признаков не станут заметными, такие как изменения в лице. Акромегалия зачастую ассоциируется с гигантизмом.
Признаки акромегалии включают отек мягких тканей, приводящий к гипертрофии кистей, стоп, носа, губ и ушей, и общее утолщение кожи; отек мягких тканей внутренних органов, таких как сердце и почки; отек голосовых связок, приводящий к тихому голосу и медленной речи; увеличение черепа; выраженное выступание надбровных дуг, зачастую с увеличением размера глаз; выраженное выступание нижней челюсти и гипертрофия языка; расхождение зубов; и синдром запястного канала. В некоторых вариантах реализации изобретения один или сочетание этих признаков акромегалии можно лечить, предотвратить или уменьшить их интенсивность посредством введения соединения или композиции, нацеленной на приведенный в данном документе GHR.
ПРИМЕРЫ
Неограничивающее описание и включение посредством ссылки
Несмотря на то, что некоторые соединения, композиции и способы, описанные в данном документе, были подробно описаны в соответствии с некоторыми вариантами реализации изобретения, следующие примеры служат лишь для иллюстрации соединений, описанных в данном документе, и не предназначены для их ограничения. Каждая из ссылок, изложенных в данной заявке, включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
Пример 1: Антисмысловое ингибирование рецептора гормона роста в клетках Нер3В МОЕ-гэпмерами

Антисмысловые олигонуклеотиды конструировали так, чтобы они были нацелены на нуклеиновую кислоту рецептора гормона роста (GHR), и испытывали на предмет их воздействия на мРНК GHR in vitro. Антисмысловые олигонуклеотиды испытывали в серии экспериментов с подобными условиями культивирования. Результаты каждого эксперимента представлены в отдельных таблицах, приведенных ниже. Культивируемые клетки Нер3В при плотности, составляющей 20000 клеток на лунку, трансфицировали с помощью электропорации с применением 4500 нМ антисмыслового олигонуклеотида. После периода обработки, составляющего около 24 часов, РНК выделяли из клеток и измеряли уровни мРНК GHR посредством количественной ПЦР в реальном времени. Набор праймерных зондов человека RTS3437_MGB (прямую последовательность CGAGTTCAGTGAGGTGCTCTATGT, обозначенную в данном документе как SEQ ID №: 2297; обратную последовательность AAGAGCCATGGAAAGTAGAAATCTTC, обозначенную в данном документе как SEQ ID №: 2298; последовательность зондов TTCCTCAGATGAGCCAATT, обозначенную в данном документе как SEQ ID №: 2299) применяли для измерения уровня мРНК. Уровень мРНК GHR корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, которое измеряли с помощью RIBOGREEN. Результаты представлены в виде процента ингибирования GHR по отношению к необработанным контрольным клеткам.
Недавно сконструированные химерные антисмысловые олигонуклеотиды в Таблицах ниже были сконструированы в виде 5-10-5 МОЕ- или 3-10-4 МОЕ-гэпмеров. 5-10-5 МОЕ-гэпмеры составляют 20 нуклеозидов в длину, при этом центральный гэп-сегмент состоит из десяти 2'-дезоксинуклеотидов и фланкирован крыльевыми сегментами в 5'-направлении и 3'-направлении, каждый из которых содержит 5 нуклеозидов. 3-10-4 МОЕ-гэпмеры составляют 17 нуклеозидов в длину, при этом центральный гэп-сегмент состоит из десяти 2'-дезоксинуклеотидов и фланкирован крыльевыми сегментами в 5'-направлении и 3'-направлении, которые содержат три и четыре нуклеозида, соответственно. Каждый нуклеозид в 5'-крыльевом сегменте и каждый нуклеозид в 3'-крыльевом сегменте имеет 2'-МОЕ-модификацию. Межнуклеозидными связями в каждом гэпмере являются фосфоротиоатные (P=S) связи. Все остатки цитозина в каждом гэпмере представляют собой 5-метилцитозины. Термин "сайт инициации" означает самый крайний с 5'-конца нуклеозид в генной последовательности человека, на который нацелен гэпмер. Термин "сайт терминации" означает самый крайний с 3'-конца нуклеозид в генной последовательности человека, на который нацелен гэпмер. Каждый гэпмер, приведенный в Таблицах ниже, нацелен либо на мРНК GHR человека, обозначенную в данном документе как SEQ ID №: 1 (№ доступа в GENBANK. NM_000163.4), либо на геномную последовательность GHR человека, обозначенную в данном документе как SEQ ID №: 2 (№ доступа в GENBANK NT_006576.16, усеченная с нуклеотида 42411001 по 42714000). 'н.д.' означает, что антисмысловой олигонуклеотид не нацелен на эту определенную генную последовательность с 100% комплементарностью. В случае, если выравнивание последовательностей для гена-мишени в определенной таблице не показано, следует понимать, что ни один из олигонуклеотидов, приведенных в этой таблице, не совпадает с 100% комплементарностью с этим геном-мишенью.
Пример 2: Дозозависимое антисмысловое ингибирование GHR человека в клетках Нер3В МОЕ-гэпмерами

Гэпмеры из Примера 1, обладающие значительным ингибированием мРНК GHR in vitro, выбирали и испытывали при различных дозах в клетках Нер3В. Антисмысловые олигонуклеотиды испытывали в серии экспериментов с подобными условиями культивирования. Результаты каждого эксперимента представлены в отдельных таблицах, приведенных ниже. Клетки высевали при плотности, составляющей 20000 клеток на лунку, и трансфицировали с помощью электропорации при концентрациях антисмыслового олигонуклеотида, составляющих 0,625 мкМ, 1,25 мкМ, 2,50 мкМ, 5,00 мкМ и 10,00 мкМ, как указано в Таблицах ниже. После периода обработки, составляющего около 16 часов, РНК выделяли из клеток и измеряли уровни мРНК GHR посредством количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровня мРНК применяли набор праймерных зондов человека RTS3437_MGB. Уровень мРНК GHR корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, которое измеряли с помощью RIBOGREEN. Результаты представлены в виде процента ингибирования GHR по отношению к необработанным контрольным клеткам.
50
Также представлена полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC) каждого олигонуклеотида. В клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом, дозозависимым образом значительно снижали уровень мРНК GHR.
Пример 3: Дозозависимое антисмысловое ингибирование GHR человека в клетках Нер3В МОЕ-гэпмерами

Гэпмеры из описанных выше исследований, обладающие значительным ингибированием мРНК GHR in vitro, выбирали и испытывали при различных дозах в клетках Нер3В. Антисмысловые олигонуклеотиды испытывали в серии экспериментов с подобными условиями культивирования. Результаты каждого эксперимента представлены в отдельных таблицах, приведенных ниже. Клетки высевали при плотности, составляющей 20000 клеток на лунку, и трансфицировали с помощью электропорации при концентрациях антисмыслового олигонуклеотида, составляющих 0,3125 мкМ, 0,625 мкМ, 1,25 мкМ, 2,50 мкМ, 5,00 мкМ и 10,00 мкМ, как указано в Таблицах ниже. После периода обработки, составляющего около 16 часов, РНК выделяли из клеток и измеряли уровни мРНК GHR посредством количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровня мРНК применяли набор праймерных зондов человека RTS3437_MGB. Уровень мРНК GHR корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, которое измеряли с помощью RIBOGREEN. Результаты представлены в виде процента ингибирования GHR по отношению к необработанным контрольным клеткам.
50
Также представлена полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC) каждого олигонуклеотида. В клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом, дозозависимым образом значительно снижали уровень мРНК GHR.
Пример 4: Дозозависимое антисмысловое ингибирование GHR человека в клетках Нер3В МОЕ-гэпмерами

Гэпмеры из описанных выше исследований, обладающие значительным ингибированием мРНК GHR in vitro, выбирали и испытывали при различных дозах в клетках Нер3В. Антисмысловые олигонуклеотиды испытывали в серии экспериментов с подобными условиями культивирования. Результаты каждого эксперимента представлены в отдельных таблицах, приведенных ниже. Клетки высевали при плотности, составляющей 20000 клеток на лунку, и трансфицировали с помощью электропорации при концентрациях антисмыслового олигонуклеотида, составляющих 0,625 мкМ, 1,25 мкМ, 2,50 мкМ, 5,00 мкМ и 10,00 мкМ, как указано в Таблицах ниже. После периода обработки, составляющего около 16 часов, РНК выделяли из клеток и измеряли уровни мРНК GHR посредством количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровня мРНК применяли набор праймерных зондов человека RTS3437_MGB. Уровень мРНК GHR корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, которое измеряли с помощью RIBOGREEN. Результаты представлены в виде процента ингибирования GHR по отношению к необработанным контрольным клеткам.
50
Также представлена полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC) каждого олигонуклеотида. В клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом, дозозависимым образом значительно снижали уровень мРНК GHR.
Пример 5: Дозозависимое антисмысловое ингибирование GHR человека в клетках Нер3В МОЕ-гэпмерами

Гэпмеры из описанных выше исследований, обладающие значительным ингибированием мРНК GHR in vitro, выбирали и испытывали при различных дозах в клетках Нер3В. Антисмысловые олигонуклеотиды испытывали в серии экспериментов с подобными условиями культивирования. Результаты каждого эксперимента представлены в отдельных таблицах, приведенных ниже. Клетки высевали при плотности, составляющей 20000 клеток на лунку, и трансфицировали с помощью электропорации при концентрациях антисмыслового олигонуклеотида, составляющих 0,3125 мкМ, 0,625 мкМ, 1,25 мкМ, 2,50 мкМ, 5,00 мкМ и 10,00 мкМ, как указано в Таблицах ниже. После периода обработки, составляющего около 16 часов, РНК выделяли из клеток и измеряли уровни мРНК GHR посредством количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровня мРНК применяли набор праймерных зондов человека RTS3437_MGB. Уровень мРНК GHR корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, которое измеряли с помощью RIBOGREEN. Результаты представлены в виде процента ингибирования GHR по отношению к необработанным контрольным клеткам.
50
Также представлена полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC) каждого олигонуклеотида. В клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом, дозозависимым образом значительно снижали уровень мРНК GHR.
Пример 6: Антисмысловое ингибирование рецептора гормона роста человека в клетках Нер3В дезокси-, МОЕ- и cEt-гэпмерами
Дополнительные антисмысловые олигонуклеотиды конструировали так, чтобы они были нацелены на нуклеиновую кислоту рецептора гормона роста (GHR), и испытывали на предмет их воздействия на мРНК GHR in vitro. Антисмысловые олигонуклеотиды испытывали в серии экспериментов с подобными условиями культивирования. Результаты каждого эксперимента представлены в отдельных таблицах, приведенных ниже. Культивируемые клетки Нер3В при плотности, составляющей 20000 клеток на лунку, трансфицировали с помощью электропорации с применением 5000 нМ антисмыслового олигонуклеотида. После периода обработки, составляющего около 24 часов, РНК выделяли из клеток и измеряли уровни мРНК GHR посредством количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровня мРНК применяли набор праймерных зондов человека RTS3437_MGB. Уровень мРНК GHR корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, которое измеряли с помощью RIBOGREEN. Результаты представлены в виде процента ингибирования GHR по отношению к необработанным контрольным клеткам.
Недавно сконструированные химерные антисмысловые олигонуклеотиды в Таблицах ниже были сконструированы в виде дезокси-, МОЕ- и cEt-гэпмеров. Дезокси-, МОЕ- и cEt-олигонуклеотиды составляют 16 нуклеозидов в длину, при этом нуклеозид имеет либо МОЕ-модификацию сахара, cEt-модификацию сахара, либо дезокси-модификацию. Столбец 'Химизм' описывает модификации сахара каждого олигонуклеотида. 'k' означает cEt-модификацию сахара; 'd' означает дезоксирибозу; и 'е' означает МОЕ-модификацию. Межнуклеозидными связями в каждом гэпмере являются фосфоротиоатные (P=S) связи. Все остатки цитозина в каждом гэпмере представляют собой 5-метилцитозины. Термин "сайт инициации" означает самый крайний с 5'-конца нуклеозид в генной последовательности человека, на который нацелен гэпмер. Термин "сайт терминации" означает самый крайний с 3'-конца нуклеозид в генной последовательности человека, на который нацелен гэпмер. Каждый гэпмер, приведенный в Таблицах ниже, нацелен либо на мРНК GHR человека, обозначенную в данном документе как SEQ ID №: 1 (№ доступа в GENBANK NM_000163.4), либо на геномную последовательность GHR человека, обозначенную в данном документе как SEQ ID №: 2 (№ доступа в GENBANK NT_006576.16, усеченная с нуклеотида 42411001 по 42714000). 'н.д.' означает, что антисмысловой олигонуклеотид не нацелен на эту определенную генную последовательность с 100% комплементарностью. В случае, если выравнивание последовательностей для гена-мишени в определенной таблице не показано, следует понимать, что ни один из олигонуклеотидов, приведенных в этой таблице, не совпадает с 100% комплементарностью с этим геном-мишенью.
Пример 7: Антисмысловое ингибирование рецептора гормона роста человека в клетках Нер3В дезокси-, МОЕ- и cEt-гэпмерами
Дополнительные антисмысловые олигонуклеотиды конструировали так, чтобы они были нацелены на нуклеиновую кислоту рецептора гормона роста (GHR), и испытывали на предмет их воздействия на мРНК GHR in vitro. Антисмысловые олигонуклеотиды испытывали в серии экспериментов с подобными условиями культивирования. Результаты каждого эксперимента представлены в отдельных таблицах, приведенных ниже. Культивируемые клетки Нер3В при плотности, составляющей 20000 клеток на лунку, трансфицировали с помощью электропорации с применением 4500 нМ антисмыслового олигонуклеотида. После периода обработки, составляющего около 24 часов, РНК выделяли из клеток и измеряли уровни мРНК GHR посредством количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровня мРНК применяли набор праймерных зондов человека RTS3437_MGB. Уровень мРНК GHR корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, которое измеряли с помощью RIBOGREEN. Результаты представлены в виде процента ингибирования GHR по отношению к необработанным контрольным клеткам.
Недавно сконструированные химерные антисмысловые олигонуклеотиды в Таблицах ниже были сконструированы в виде дезокси-, МОЕ- и cEt-гэпмеров. Дезокси-, МОЕ- и cEt-олигонуклеотиды составляют 16 нуклеозидов в длину, при этом нуклеозид имеет либо МОЕ-модификацию сахара, cEt-модификацию сахара, либо дезокси-модификацию. Столбец 'Химизм' описывает модификации сахара каждого олигонуклеотида. 'k' означает cEt-модификацию сахара; 'd' означает дезоксирибозу; и 'е' означает МОЕ-модификацию. Межнуклеозидными связями в каждом гэпмере являются фосфоротиоатные (P=S) связи. Все остатки цитозина в каждом гэпмере представляют собой 5-метилцитозины. Термин "сайт инициации" означает самый крайний с 5'-конца нуклеозид в генной последовательности человека, на который нацелен гэпмер. Термин "сайт терминации" означает самый крайний с 3'-конца нуклеозид в генной последовательности человека, на который нацелен гэпмер. Каждый гэпмер, приведенный в Таблицах ниже, нацелен либо на мРНК GHR человека, обозначенную в данном документе как SEQ ID №: 1 (№ доступа в GENBANK NM_000163.4), либо на геномную последовательность GHR человека, обозначенную в данном документе как SEQ ID №: 2 (№ доступа в GENBANK NT_006576.16, усеченная с нуклеотида 42411001 по 42714000). 'н.д.' означает, что антисмысловой олигонуклеотид не нацелен на эту определенную генную последовательность с 100% комплементарностью. В случае, если выравнивание последовательностей для гена-мишени в определенной таблице не показано, следует понимать, что ни один из олигонуклеотидов, приведенных в этой таблице, не совпадает с 100% комплементарностью с этим геном-мишенью. Олигонуклеотиды Таблицы 54 не нацелены на SEQ ID №: 1 или 2, но вместо этого нацелены на вариантные последовательности генов SEQ ID №: 4 (№ доступа в GENBANK DR006395.1) или SEQ ID №: 7 (комплемент под № доступа в GENBANK АА398260.1).
Пример 8: Дозозависимое антисмысловое ингибирование GHR человека в клетках Нер3В дезокси-, МОЕ- и cEt-гэпмерами

Гэпмеры из описанных выше исследований, обладающие значительным ингибированием мРНК GHR in vitro, выбирали и испытывали при различных дозах в клетках Нер3В. Антисмысловые олигонуклеотиды испытывали в серии экспериментов с подобными условиями культивирования. Результаты каждого эксперимента представлены в отдельных таблицах, приведенных ниже. Клетки высевали при плотности, составляющей 20000 клеток на лунку, и трансфицировали с помощью электропорации при концентрациях антисмыслового олигонуклеотида, составляющих 0,625 мкМ, 1,25 мкМ, 2,50 мкМ, 5,00 мкМ и 10,00 мкМ. После периода обработки, составляющего около 16 часов, РНК выделяли из клеток и измеряли уровни мРНК GHR посредством количественной ПНР в реальном времени. Для измерения уровня мРНК применяли набор праймерных зондов человека RTS3437_MGB. Уровень мРНК GHR корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, которое измеряли с помощью RIBOGREEN. Результаты представлены в виде процента ингибирования GHR по отношению к необработанным контрольным клеткам.
50
Также представлена полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC) каждого олигонуклеотида. В клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом, дозозависимым образом значительно снижали уровень мРНК GHR.
Пример 9: Дозозависимое антисмысловое ингибирование GHR человека в клетках Нер3В дезокси-, МОЕ- и cEt-гэпмерами

Гэпмеры из описанных выше исследований, обладающие значительным ингибированием мРНК GHR in vitro, выбирали и испытывали при различных дозах в клетках Нер3В. Антисмысловые олигонуклеотиды испытывали в серии экспериментов с подобными условиями культивирования. Результаты каждого эксперимента представлены в отдельных таблицах, приведенных ниже. Клетки высевали при плотности, составляющей 20000 клеток на лунку, и трансфицировали с помощью электропорации при концентрациях антисмыслового олигонуклеотида, составляющих 0,04 мкМ, 0,11 мкМ, 0,33 мкМ, 1,00 мкМ и 3,00 мкМ. После периода обработки, составляющего около 16 часов, РНК выделяли из клеток и измеряли уровни мРНК GHR посредством количественной ПНР в реальном времени. Для измерения уровня мРНК применяли набор праймерных зондов человека RTS3437_MGB. Уровень мРНК GHR корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, которое измеряли с помощью RIBOGREEN. Результаты представлены в виде процента ингибирования GHR по отношению к необработанным контрольным клеткам.
50
Также представлена полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC) каждого олигонуклеотида. В клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом, дозозависимым образом значительно снижали уровень мРНК GHR.
Пример 10: Дозозависимое антисмысловое ингибирование GHR макака-резуса в клетках LLC-МК2

Гэпмеры из описанных выше исследований, обладающие значительным ингибированием мРНК GHRin vitro, выбирали и испытывали в отношении их эффективности на мРНК GHR резуса в клетках LLC-MK2. Клетки высевали при плотности, составляющей 20000 клеток на лунку, и трансфицировали с помощью электропорации при концентрациях антисмыслового олигонуклеотида, составляющих 0,12 мкМ, 0,37 мкМ, 1,11 мкМ, 3,33 мкМ и 10,00 мкМ. После периода обработки, составляющего около 16 часов, РНК выделяли из клеток и измеряли уровни мРНК GHR посредством количественной ПНР в реальном времени. Для измерения уровня мРНК применяли набор праймерных зондов RTS3437_MGB. Уровень мРНК GHR корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, которое измеряли с помощью RIBOGREEN. Результаты представлены в виде процента ингибирования GHR по отношению к необработанным контрольным клеткам.
50
Также представлена полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC) каждого олигонуклеотида. В клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом, дозозависимым образом значительно снижали уровень мРНК GHR.
Пример 11: Дозозависимое антисмысловое ингибирование GHR в первичных гепатоцитах яванского макака

Гэпмеры из описанных выше исследований, обладающие значительным ингибированием мРНК GHR in vitro, выбирали и испытывали в отношении их эффективности на мРНК GHR в первичных гепатоцитах яванского макака. Клетки высевали при плотности, составляющей 20000 клеток на лунку, и трансфицировали с помощью электропорации при концентрациях антисмыслового олигонуклеотида, составляющих 0,12 мкМ, 0,37 мкМ, 1,11 мкМ, 3,33 мкМ и 10,00 мкМ. После периода обработки, составляющего около 16 часов, РНК выделяли из клеток и измеряли уровни мРНК GHR посредством количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровня мРНК применяли набор праймерных зондов RTS3437_MGB. Уровень мРНК GHR корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, которое измеряли с помощью RIBOGREEN. Результаты представлены в виде процента ингибирования GHR по отношению к необработанным контрольным клеткам.
50
Также представлена полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC) каждого олигонуклеотида. В клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом, дозозависимым образом значительно снижали уровень мРНК GHR.
Пример 12: Дозозависимое антисмысловое ингибирование GHR в клетках Нер3В

Гэпмеры из описанных выше исследований, обладающие значительным ингибированием мРНК GHR in vitro, выбирали и испытывали в отношении их эффективности на мРНК в клетках Нер3В при различных дозировках. Клетки высевали при плотности, составляющей 20000 клеток на лунку, и трансфицировали с помощью электропорации при концентрациях антисмыслового олигонуклеотида, составляющих 0,12 мкМ, 0,37 мкМ, 1,11 мкМ, 3,33 мкМ и 10,00 мкМ. После периода обработки, составляющего около 16 часов, РНК выделяли из клеток и измеряли уровни мРНК GHR посредством количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровня мРНК применяли набор праймерных зондов человека RTS3437_MGB. Уровень мРНК GHR корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, которое измеряли с помощью RIBOGREEN. Результаты представлены в виде процента ингибирования GHR по отношению к необработанным контрольным клеткам.
50
Также представлена полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC) каждого олигонуклеотида. В клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом, дозозависимым образом значительно снижали уровень мРНК GHR.
Пример 13: Дозозависимое антисмысловое ингибирование GHR в первичных гепатоцитах яванского макака

Гэпмеры из описанных выше исследований, обладающие значительным ингибированием мРНК GHR in vitro, выбирали и испытывали в первичных гепатоцитах яванского макака при различных дозировках. Клетки высевали при плотности, составляющей 35000 клеток на лунку, и трансфицировали с помощью электропорации при концентрациях антисмыслового олигонуклеотида, составляющих 0,04 мкМ, 0,12 мкМ, 0,37 мкМ, 1,11 мкМ, 3,33 мкМ и 10,00 мкМ. После периода обработки, составляющего около 16 часов, РНК выделяли из клеток и измеряли уровни мРНК GHR посредством количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровня мРНК применяли набор праймерных зондов RTS3437_MGB. Уровень мРНК GHR корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, которое измеряли с помощью RIBOGREEN. Результаты представлены в виде процента ингибирования GHR по отношению к необработанным контрольным клеткам.
50
Также представлена полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC) каждого олигонуклеотида. В клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом, дозозависимым образом значительно снижали уровень мРНК GHR.
Пример 14: Сравнительный анализ дозозависимого антисмыслового ингибирования GHR в клетках Нер3В

ISIS 532401 сравнивали с определенными антисмысловыми олигонуклеотидами, описанными в патенте США №2006/0178325, посредством испытания в клетках Нер3В при различных дозировах. Олигонуклеотиды выбирали на основе их эффективности, продемонстрированной в исследованиях, описанных в данной заявке. Клетки высевали при плотности, составляющей 20000 клеток на лунку, и трансфицировали с помощью электропорации при концентрациях антисмыслового олигонуклеотида, составляющих 0,11 мкМ, 0,33 мкМ, 1,00 мкМ, 1,11 мкМ, 3,00 мкМ и 9,00 мкМ. После периода обработки, составляющего около 16 часов, РНК выделяли из клеток и измеряли уровни мРНК GHR посредством количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровня мРНК применяли набор праймерных зондов человека RTS3437_MGB. Уровень мРНК GHR корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, которое измеряли с помощью RIBOGREEN. Результаты представлены в виде процента ингибирования GHR по отношению к необработанным контрольным клеткам.
50
Также представлена полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC) каждого олигонуклеотида. Результаты показывают, что ISIS 532401 был заметно более эффективным, чем наиболее эффективные олигонуклеотиды патента США №2006/0178325.
Пример 15: Переносимость 5-10-5 МОЕ-гэпмеров, нацеленных на GHR человека, у мышей CD1
Мыши CD1 (Чарльз Ривер, штат Массачусетс) представляют собой многофункциональную мышиную модель, наиболее часто применяемую для испытания безопасности и эффективности. Мышей обрабатывали антисмысловыми олигонуклеотидами ISIS, выбранными из описанных выше исследований, и оценивали на предмет изменения уровня различных плазмохимических маркеров.
Обработка
Группам из самцов мышей CD1 в возрасте от восьми до десяти недель в течение 6 недель два раза в неделю подкожно вводили 50 мг/кг олигонуклеотидов ISIS (100 мг/кг/недельная доза). Одной группе из самцов мышей CD1 в течение 6 недель два раза в неделю подкожно вводили PBS. Мышей умерщвляли через 48 часов после последней дозы, а органы и плазму собирали для дальнейшего анализа.
Плазмохимические маркеры
Для оценки воздействия олигонуклеотидов ISIS на функцию печени и почек измеряли уровень трансаминаз, билирубина, креатинина и АМК (BUN) в плазме с применением автоматического клинико-химического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, штат Нью-Йорк). Результаты представлены в Таблице 92. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызвали изменения в уровне любого из маркеров функции печени или почек вне ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали в дальнейших исследованиях.
Анализы крови
Кровь, полученную у всех групп мышей, отправляли в Antech Diag№stics для измерения и анализа гематокрита (НСТ), а также измерения различных клеток крови, таких как лейкоциты (WBC), эритроциты (RBC) и тромбоциты, а также общего содержания гемоглобина. Результаты представлены в Таблице 93. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызвали изменения в уровне любого из гематологических маркеров вне ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали в дальнейших исследованиях.
Пример 16: Переносимость 5-10-5 МОЕ-гэпмеров, нацеленных на GHR человека, у мышеи CD1
Мышей CD1 обрабатывали антисмысловыми олигонуклеотидами ISIS, выбранными из описанных выше исследований, и оценивали на предмет изменения уровня различных плазмохимических маркеров.
Обработка
Группам из самцов мышей CD1 в возрасте от восьми до десяти недель в течение 6 недель два раза в неделю подкожно вводили 50 мг/кг олигонуклеотида ISIS (100 мг/кг/недельная доза). Одной группе из самцов мышей CD1 в течение 6 недель два раза в неделю подкожно вводили PBS. Мышей умерщвляли через 48 часов после последней дозы, а органы и плазму собирали для дальнейшего анализа.
Плазмохимические маркеры
Для оценки воздействия олигонуклеотидов ISIS на функцию печени и почек измеряли уровень трансаминаз, билирубина, креатинина и АМК (BUN) в плазме с применением автоматического клинико-химического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, штат Нью-Йорк). Результаты представлены в Таблице 94. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызвали изменения в уровне любого из маркеров функции печени или почек вне ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали в дальнейших исследованиях.
Анализы крови
Кровь, полученную у всех групп мышей, отправляли в Antech Diag№stics для измерения и анализа гематокрита (НСТ), а также измерения различных клеток крови, таких как лейкоциты (WBC), эритроциты (RBC) и тромбоциты, а также общего содержания гемоглобина. Результаты представлены в Таблице 95. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызвали изменения в уровне любого из гематологических маркеров вне ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали в дальнейших исследованиях.
Пример 17: Переносимость 3-10-4 МОЕ-гэпмеров, нацеленных на GHR человека, у мышей CD1
Мышей CD1 обрабатывали антисмысловыми олигонуклеотидами ISIS, выбранными из описанных выше исследований, и оценивали на предмет изменения уровня различных плазмохимических маркеров.
Обработка
Группам из самцов мышей CD 1 в возрасте от восьми до десяти недель в течение 6 недель два раза в неделю подкожно вводили 50 мг/кг олигонуклеотида ISIS (100 мг/кг/недельная доза). Одной группе из самцов мышей CD1 в течение 6 недель два раза в неделю подкожно вводили PBS. Мышей умерщвляли через 48 часов после последней дозы, а органы и плазму собирали для дальнейшего анализа.
Плазмохимические маркеры
Для оценки воздействия олигонуклеотидов ISIS на функцию печени и почек измеряли уровень трансаминаз, билирубина, креатинина и АМК (BUN) в плазме с применением автоматического клинико-химического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, штат Нью-Йорк). Результаты представлены в Таблице 96. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызвали изменения в уровне любого из маркеров функции печени или почек вне ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали в дальнейших исследованиях.
Анализы крови
Кровь, полученную у всех групп мышей, отправляли в Antech Diag№stics для измерения и анализа гематокрита (НСТ), а также измерения различных клеток крови, таких как лейкоциты (WBC), эритроциты (RBC) и тромбоциты, а также общего содержания гемоглобина. Результаты представлены в Таблице 97. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызвали изменения в уровне любого из гематологических маркеров вне ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали в дальнейших исследованиях.
Пример 18: Переносимость дезокси-, МОЕ- и cEt-гэпмеров, нацеленных на GHR человека, у мышей CD1
Мышей CD1 обрабатывали антисмысловыми олигонуклеотидами ISIS, выбранными из описанных выше исследований, и оценивали на предмет изменения уровня различных плазмохимических маркеров.
Обработка
Группам из самцов мышей CD1 в возрасте от восьми до десяти недель в течение 6 недель два раза в неделю подкожно вводили 25 мг/кг олигонуклеотида ISIS (50 мг/кг/недельная доза). Одной группе из самцов мышей CD1 в течение 6 недель два раза в неделю подкожно вводили PBS. Мышей умерщвляли через 48 часов после последней дозы, а органы и плазму собирали для дальнейшего анализа.
Плазмохгшические маркеры
Для оценки воздействия олигонуклеотидов ISIS на функцию печени и почек измеряли уровень трансаминаз, билирубина, креатинина и АМК (BUN) в плазме с применением автоматического клинико-химического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, штат Нью-Йорк). Результаты представлены в Таблице 98. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызвали изменения в уровне любого из маркеров функции печени или почек вне ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали в дальнейших исследованиях.
Анализы крови
Кровь, полученную у всех групп мышей, отправляли в Antech Diag№stics для измерения и анализа гематокрита (НСТ), а также измерения различных клеток крови, таких как лейкоциты (WBC), эритроциты (RBC) и тромбоциты, а также общего содержания гемоглобина. Результаты представлены в Таблице 99. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызвали изменения в уровне любого из гематологических маркеров вне ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали в дальнейших исследованиях.
Пример 19: Переносимость дезокси-, МОЕ- и cEt-гэпмеров, нацеленных на GHR человека, у мышей CD1
Мышей CD1 обрабатывали антисмысловыми олигонуклеотидами ISIS, выбранными из описанных выше исследований, и оценивали на предмет изменения уровня различных плазмохимических маркеров. 3-10-4 МОЕ-гэпмер ISIS 539376 также был включен в данное исследование.
Обработка
Группам из самцов мышей CD1 в возрасте от восьми до десяти недель в течение 6 недель два раза в неделю подкожно вводили 25 мг/кг олигонуклеотида ISIS (50 мг/кг/недельная доза). Одной группе из самцов мышей CD1 в течение 6 недель два раза в неделю подкожно вводили PBS. Мышей умерщвляли через 48 часов после последней дозы, а органы и плазму собирали для дальнейшего анализа.
Плазмохимические маркеры
Для оценки воздействия олигонуклеотидов ISIS на функцию печени и почек измеряли уровень трансаминаз, билирубина, креатинина и АМК (BUN) в плазме с применением автоматического клинико-химического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, штат Нью-Йорк). Результаты представлены в Таблице 100. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызвали изменения в уровне любого из маркеров функции печени или почек вне ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали в дальнейших исследованиях.
Анализы крови
Кровь, полученную у всех групп мышей, отправляли в Antech Diag№stics для измерения и анализа гематокрита (НСТ), а также измерения различных клеток крови, таких как лейкоциты (WBC), эритроциты (RBC), а также общего содержания гемоглобина. Результаты представлены в Таблице 101. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызвали изменения в уровне любого из гематологических маркеров вне ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали в дальнейших исследованиях.
Пример 20: Переносимость дезокси-, МОЕ- и cEt-гэпмеров, нацеленных на GHR человека, у мышей CD1
Мышей CD1 обрабатывали антисмысловыми олигонуклеотидами ISIS, выбранными из описанных выше исследований, и оценивали на предмет изменения уровня различных плазмохимических маркеров.
Обработка
Группам из самцов мышей CD1 в возрасте от восьми до десяти недель в течение 6 недель два раза в неделю подкожно вводили 25 мг/кг олигонуклеотида ISIS (50 мг/кг/недельная доза). Одной группе из самцов мышей CD1 в течение 6 недель два раза в неделю подкожно вводили PBS. Мышей умерщвляли через 48 часов после последней дозы, а органы и плазму собирали для дальнейшего анализа.
Плазмохимические маркеры
Для оценки воздействия олигонуклеотидов ISIS на функцию печени и почек измеряли уровень трансаминаз, билирубина, креатинина и АМК (BUN) в плазме с применением автоматического клинико-химического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, штат Нью-Йорк). Результаты представлены в Таблице 102. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызвали изменения в уровне любого из маркеров функции печени или почек вне ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали в дальнейших исследованиях.
Анализы крови
Кровь, полученную у всех групп мышей, отправляли в Antech Diag№stics для измерения и анализа гематокрита (НСТ), а также измерения различных клеток крови, таких как лейкоциты (WBC), эритроциты (RBC), а также общего содержания гемоглобина. Результаты представлены в Таблице 103. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызвали изменения в уровне любого из гематологических маркеров вне ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали в дальнейших исследованиях.
Пример 21: Переносимость МОЕ-гэпмеров, нацеленных на GHR человека, у крыс линии Спрег-Доули
Крысы линии Спрег-Доули представляют собой многофункциональную модель, применяемую для оценки безопасности и эффективности. Крыс обрабатывали антисмысловыми олигонуклеотидами ISIS из исследований, описанных в приведенных выше Примерах, и оценивали на предмет изменения уровня различных плазмохимических маркеров.
Обработка
Самцов крыс линии Спрег-Доули содержали в условиях 12-часового цикла дня и ночи и кормили вволю кормом Purina №rmal rat chow, диета 5001. Каждой группе из 4 крыс линии Спрег-Доули в течение 6 недель два раза в неделю подкожно вводили 50 мг/кг олигонуклеотида ISIS (100 мг/кг недельная доза). Через сорок восемь часов после последней дозы крыс умерщвляли, а органы и плазму собирали для дальнейшего анализа.
Функция печени
Для оценки воздействия олигонуклеотидов ISIS на функцию печени измеряли уровень трансаминаз в плазме с применением автоматического клинико-химического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, штат Нью-Йорк). Измеряли уровень ALT (аланинтрансаминазы) и AST (аспартаттрансаминазы), и результаты, выраженные в МЕ/л, представлены в Таблице 104. Уровень билирубина в плазме также измеряли с применением того же автоматического клинико-химического анализатора, и результаты, выраженные в мг/дл, также представлены в Таблице 104. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызвали изменения в уровне любого из маркеров функции печени вне ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали в дальнейших исследованиях.
Функция почек
Для оценки воздействия олигонуклеотидов ISIS на функцию почек измеряли уровень азота мочевины крови (АМК) и креатинина в плазме с применением автоматического клинико-химического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, штат Нью-Йорк). Результаты представлены в Таблице 105, выражены в мг/дл. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызвали изменения в уровне любого из маркеров функции почек вне ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали в дальнейших исследованиях.
Анализы крови
Кровь, полученную у всех групп крыс, отправляли в Antech Diag№stics для измерения и анализа гематокрита (НСТ), а также измерения различных клеток крови, таких как лейкоциты (WBC), эритроциты (RBC), а также общего содержания гемоглобина. Результаты представлены в Таблице 106. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызвали изменения в уровне любого из гематологических маркеров вне ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали в дальнейших исследованиях.
Масса органа
По окончании исследования измеряли массу печени, сердца, селезенки и почек, и эти данные представлены в Таблице 107. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызвали какие-либо изменения в массе органов вне ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Пример 22: Переносимость дезокси-, МОЕ- и cEt-гэпмеров, нацеленных на GHR человека, у крыс линии Спрег-Доули
Крыс линии Спрег-Доули обрабатывали антисмысловыми олигонуклеотидами ISIS из исследований, описанных в приведенных выше Примерах, и оценивали на предмет изменения уровня различных плазмохимических маркеров.
Обработка
Самцов крыс линии Спрег-Доули содержали в условиях 12-часового цикла дня и ночи и кормили вволю кормом Purina №rmal rat chow, диета 5001. Каждой группе из 4 крыс линии Спрег-Доули в течение 6 недель раз в неделю подкожно вводили 50 мг/кг олигонуклеотида ISIS (50 мг/кг недельная доза). Двум группам крыс в течение 6 недель раз в неделю подкожно вводили PBS. Через сорок восемь часов после последней дозы крыс умерщвляли, а органы и плазму собирали для дальнейшего анализа.
Функция печени
Для оценки воздействия олигонуклеотидов ISIS на функцию печени измеряли уровень трансаминаз в плазме с применением автоматического клинико-химического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, штат Нью-Йорк). Измеряли уровень ALT и AST в плазме, и результаты, выраженные в МЕ/л, представлены в Таблице 108. Уровень билирубина в плазме также измеряли с применением того же автоматического клинико-химического анализатора, и результаты, выраженные в мг/дл, также представлены в Таблице 108. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызвали изменения в уровне любого из маркеров функции печени вне ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали в дальнейших исследованиях.
Функция почек
Для оценки воздействия олигонуклеотидов ISIS на функцию почек измеряли уровень азота мочевины крови (АМК) и креатинина в плазме с применением автоматического клинико-химического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, штат Нью-Йорк). Результаты представлены в Таблице 109, выражены в мг/дл. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызвали изменения в уровне любого из маркеров функции почек вне ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали в дальнейших исследованиях.
Анализы крови
Кровь, полученную у всех групп крыс, отправляли в Antech Diag№stics для измерения и анализа гематокрита (НСТ), а также измерения различных клеток крови, таких как лейкоциты (WBC), эритроциты (RBC), а также общего содержания гемоглобина. Результаты представлены в Таблице 110. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызвали изменения в уровне любого из гематологических маркеров вне ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали в дальнейших исследованиях.
Масса органа
По окончании исследования измеряли массу печени, сердца, селезенки и почек, и эти данные представлены в Таблице 111. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызвали какие-либо изменения в массе органов вне ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Пример 23: Воздействие антисмысловых олигонуклеотидов ISIS, нацеленных на GHR человека, у яванских макаков
Яванских макаков обрабатывали антисмысловыми олигонуклеотидами ISIS, выбранными из исследований, описанных в приведенных выше Примерах. Оценивали эффективность и переносимость антисмысловых олигонуклеотидов, а также их фармакокинетический профиль в печени и почках.
Во время проведения данного исследования геномной последовательности яванских макаков не было в наличии в базе данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI); в силу этих обстоятельств, перекрестная реактивность с генной последовательностью яванских макаков не могла быть подтверждена. Вместо этого, последовательности антисмысловых олигонуклеотидов ISIS, применяемые у яванских макаков, сравнивали с последовательностью макака-резуса на предмет гомологии. Ожидается, что олигонуклеотиды ISIS с гомологией к последовательности макака-резуса также полностью перекрестие реагируют с последовательностью яванского макака. Испытанные антисмысловые олигонуклеотиды человека перекрестие реагируют с геномной последовательностью резуса (№ доступа в GENBANK NW_001120958.1, усеченной с нуклеотида 4410000 по 4720000, обозначенной в данном документе как SEQ ID №: 2296). Чем больше комплементарность между олигонуклеотидом человека и последовательностью макака-резуса, тем более вероятно, что олигонуклеотид человека может давать перекрестную реакцию с последовательностью макака-резуса. Сайты инициации и терминации каждого олигонуклеотида к SEQ ID №: 2296 представлены в Таблице 112. Термин "сайт инициации" означает самый крайний с 5'-конца нуклеотид в генной последовательности макака-резуса, на который нацелен гэпмер.
Исследование 1
До начала исследования обезьян держали на карантине, во время которого ежедневно вели наблюдение за общим состоянием здоровья животных. Возраст обезьян составлял 2-4 года, а вес был в диапазоне 2-4 кг. Девяти группам из 5 рандомизированно разделенных самцов яванских макаков в каждой во внутрисуставную область и внешнюю часть бедра обезьян подкожно вводили олигонуклеотид ISIS или PBS с помощью дозирующей иглы из нержавеющей стали и шприца подходящего размера. Обезьянам три раза (на 1, 4 и 7 день) в течение первой недели дозами вводили лекарство с последующим введением в дальнейшем 40 мг/кг олигонуклеотида ISIS один раз в неделю в течение 12 недель. Контрольной группе из 5 яванских макаков аналогичным образом вводили PBS, и она выступала в качестве контрольной группы.
В течение периода исследования два раза в день вели наблюдение за признаками болезни или расстройства у обезьян. После согласования с руководителем исследования любое животное, испытывающее более чем кратковременную или легкую боль или расстройство, вызванные лечением, повреждением или болезнью, ветеринарный персонал лечил утвержденными анальгетиками или веществами для облегчения боли. Предусматривали дальнейший мониторинг и возможное умерщвление любого животного с неудовлетворительным состоянием здоровья или в возможной агонии. Запланированное умерщвление животных осуществляли на 86 день посредством обескровливания после кетамин/ксилазин-индуцированной анестезии и введения пентобарбитала натрия. Процедуры, описанные в данном Примере, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC).
Целевое снижение
Анализ РНК

На 86 день РНК экстрагировали из печени, белой жировой ткани (WAT) и почек для анализа ПЦР в реальном времени измерения экспрессии мРНК GHR. Результаты представлены в виде процента ингибирования мРНК, по отношению к контрольной группе PBS, нормализованного с помощью RIBOGREEN. 'н.о.' означает, что данные для этого определенного олигонуклеотида не измеряли. Как показано в Таблице 113, обработка антисмысловыми олигонуклеотидами ISIS привела к значительному снижению мРНК GHR по сравнению с контрольной группой PBS. В частности, обработка ISIS 532401 привела к значительному снижению экспрессии мРНК во всех тканях.
Также в печени, почках и жировой ткани измеряли экспрессию БАС (ALS), чувствительного к гормону роста гена. Обработка ISIS 532401 привела к снижению экспрессии РНК БАС в печени на 44±9%, находясь в соответствии с уровнем GHR. Снижения в жировой ткани не наблюдалось. Также измеряли экспрессию IGF-1 в печени. Обработка ISIS 532401 привела к снижению экспрессии РНК IGF-1 в печени на 71±10%, находясь в соответствии с уровнем GHR.
Анализ белков
У всех доступных животных на 85 день собирали около 1 мл крови и помещали в пробирки, содержащие калиевую соль ЭДТК. Пробирки центрифугировали (3000 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре) для получения плазмы. В плазме измеряли уровень IGF-1 и GH в плазме. Результаты представлены в Таблице 114. Результаты показывают, что обработка олигонуклеотидами ISIS привела к снижению уровня белка IGF-1.
Уровень IGF-1 в плазме после обработки ISIS 532401 также представлен в Таблице 115 и демонстрирует воздействие антисмыслового ингибирования GHR на снижение уровня IGF-1 на 7 день и 85 день.
Исследования переносимости
Измерения массы тела и органов
Для оценки воздействия олигонуклеотидов ISIS на общее состояние здоровья животных измеряли массу тела и органов. Массу тела измеряли на 84 день, и эти данные представлены в Таблице 115. Массу органов измеряли на 86 день, и эти данные также представлены в Таблице 115. Результаты показывают, что воздействие обработки антисмысловыми олигонуклеотидами на массу тела и органов находилось в пределах ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов. В частности, обработка ISIS 532401 хорошо переносилась в части, касающейся массы тела и органов обезьян.
Функция печени
2
Для оценки воздействия олигонуклеотидов ISIS на функцию печени собирали образцы крови у всех исследуемых групп. Образцы крови собирали посредством бедренной венепункции, спустя 48 часов после введения дозы. Обезьяны воздерживались от приема пищи на протяжении ночи до взятия крови. Кровь собирали в пробирки, содержащие антикоагулянт ЭДТК-К, который центрифугировали для получения плазмы. Уровень различных маркеров функции печени измеряли с применением химического анализатора Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Япония). Измеряли уровень ALT и AST, и билирубина в плазме. В Таблицах ниже представлены результаты для уровня ALT и AST в разные моменты времени. Результаты показывают, что антисмысловые олигонуклеотиды не оказывали никакого воздействия на функцию печени вне ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов. В частности, обработка ISIS 532401 хорошо переносилась в части, касающейся функции печени у обезьян.
Функция почек
2
Для оценки воздействия олигонуклеотидов ISIS на функцию почек собирали образцы крови у всех исследуемых групп. Образцы крови собирали посредством бедренной венепункции, спустя 48 часов после введения дозы. Обезьяны воздерживались от приема пищи на протяжении ночи до взятия крови. Кровь собирали в пробирки, содержащие антикоагулянт ЭДТК-К, который центрифугировали для получения плазмы. Уровень АМК и креатинина измеряли с применением химического анализатора Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Япония). В Таблицах ниже представлены результаты для уровня АМК и креатинина в разные моменты времени.
Плазмохимические данные показывают, что большинство олигонуклеотидов ISIS не оказывали никакого воздействия на функцию почек вне ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов. В частности, обработка ISIS 532401 хорошо переносилась в части, касающейся функции почек обезьян.
Гематология
2
Для оценки какого-либо воздействия олигонуклеотидов ISIS у яванских макаков на гематологические параметры, в пробирки, содержащие антикоагулянт ЭДТК-К, у каждого из имеющихся для исследования животных собирали образцы крови из около 1,3 мл крови. <С Образцы анализировали на уровень красных кровяных телец (эритроцитов), уровень белых кровяных телец (лейкоцитов), уровень отдельных лейкоцитов в крови, таких как моноциты, нейтрофилы, лимфоциты, а также на уровень тромбоцитов, содержание гемоглобина и гематокрит с применением гематологического анализатора ADVIA120 (Bayer, США). В Таблице ниже представлены результаты уровня тромбоцитов в разные моменты времени, 'н.д.' означает, что данные для этого момента времени отсутствуют.
Эти данные показывают, что олигонуклеотиды не вызывали каких-либо изменений в гематологических параметрах вне ожидаемого диапазона для антисмысловых олигонуклеотидов при этой дозе. В частности, обработка ISIS 532401 хорошо переносилась в части, касающейся гематологических параметров обезьян.
Анализ уровня С-реактивного белка и комплемента С3
Для оценки любого воспалительного действия олигонуклеотидов ISIS у яванских макаков, брали образцы крови для анализа. Обезьяны воздерживались от приема пищи на протяжении ночи до взятия крови. У каждого животного собирали около 1,5 мл крови и помещали в пробирки без антикоагулянта для отделения сыворотки. Пробирки выдерживали при комнатной температуре в течение как минимум 90 мин с последующим центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре с получением сыворотки. С-реактивный белок (CRP), который синтезируется в печени и который служит в качестве маркера воспаления, измеряли с применением химического анализатора Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Япония). В Таблицах ниже представлены результаты уровня CRP и С3 в разные моменты времени. Результаты показывают, что обработка ISIS 532401 не вызывала воспаление у обезьян.
Измерение концентрации олигонуклеотидов
Измеряли концентрацию полноразмерного олигонуклеотида в печени и почках обезьян. Применяемый метод представляет собой модификацию ранее опубликованных методов (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999), которые заключаются в фенол-хлороформной (жидкость-жидкость) экстракции с последующей твердофазной экстракцией. Внутренний стандарт (ISIS 355868, 27-мерный модифицированный 2'-O-метоксиэтилом тиофосфатный олигонуклеотид, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, обозначенный в данном документе как SEQ ID №: 2300) добавляли перед экстракцией. Концентрации образца ткани считали с помощью калибровочных кривых, с нижним пределом количественного определения (LLOQ), составляющим около 1,14 мкг/г.Затем считали периоды полужизни с помощью программного обеспечения Wia№nlin (PHARSIGHT).
В Таблице 123 представлены результаты, выраженные в мкг/г ткани, а также соотношение концентрации в почках по сравнению с печенью.
Исследование 2
Одной группе из 5 рандомизированно разделенных самцов яванских макаков во внутрисуставную область и внешнюю часть бедра обезьян подкожно вводили ISIS 532401 или PBS с помощью дозирующей иглы из нержавеющей стали и шприца подходящего размера. Обезьянам в неделю (на 1, 3, 5 и 7 день) в течение первой недели вводили ударную дозу с последующим введением в дальнейшем 40 мг/кг олигонуклеотида ISIS 532401 один раз в неделю (на 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84 и 91 день). Контрольной группе из 5 яванских макаков аналогичным образом вводили PBS, и она выступала в качестве контрольной группы.
Целевое снижение
Анализ РНК
На 93 день РНК экстрагировали из печени, белой жировой ткани (WAT) и мышц для анализа ПЦР в реальном времени измерения экспрессии мРНК GHR. Обработка ISIS 532401 привела к значительному снижению мРНК GHR в печени и белой жировой ткани.
Также в печени измеряли экспрессию ALS, чувствительного к гормону роста гена. Обработка ISIS 532401 привела к снижению экспрессии РНК ALS в печени на 38%, находясь в соответствии с уровнем GHR. 'н.о.' означает, что уровень в этой определенной ткани не проверяли. Также измеряли экспрессию IGF-1 в печени, мышцах и жировых тканях. Обработка ISIS 532401 привела к снижению экспрессии РНК IGF-1 в печени и в WAT, находясь в соответствии с уровнем GHR.
Анализ белков
В плазме измеряли уровень IGF-1 и GH в плазме. Результаты представлены в Таблице ниже. Результаты показывают, что обработка ISIS 532401 привела к снижению уровня белка IGF-1. Повышения уровня гормона роста в плазме не наблюдалось.
Пример 24: Измерени вязкости антисмысловых олигонуклеотидов ISIS, нацеленных на GHR человека
Вязкость некоторых антисмысловых олигонуклеотидов из исследования, описанного в приведенных выше Примерах, измеряли с целью отсеивания антисмысловых олигонуклеотидов, вязкость которых составляла более 40 сП. Олигонуклеотиды с вязкостью, составляющей более 40 сП, были бы слишком вязкими для введения любому субъекту.
Олигонуклеотиды ISIS (32-35 мг) засыпали в стеклянную виалу, добавляли 120 мкл воды и растворяли антисмысловой олигонуклеотид в растворе посредством нагревания виалы при 50°С. Часть (75 мкл) предварительно нагретого образца пипетировали в микровискозиметр (Cambridge). Температуру микровискозиметра устанавливали на 25°С, и измеряли вязкость образца. Другую часть (20 мкл) предварительно нагретого образца пипетировали в 10 мл воды для УФ считывания при 260 нМ при 85°С (Cary UV instrument). Результаты представлены в Таблице 127 и показывают, что все растворы антисмысловых олигонуклеотидов являются оптимальными по своей вязкости согласно указанному выше критерию.
Пример 25: Эффект антисмыслового ингибирования GHR у мышей
Для того чтобы подтвердить воздействие антисмыслового ингибирования GHR в модели приматов, применяли олигонуклеотид ISIS, нацеленный на мышиный GHR, для повторения результата в мышиной модели.
ISIS 563223 (GAGACTTTTCCTTGTACACA, обозначенная в данном документе как SEQ ID №: 2301) представляет собой 5-10-5 МОЕ-гэпмерный мышиный антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на мышиный GHR (№ доступа в GENBANK NM_010284.2, обозначенный в данном документе как SEQ ID №: 2302) в сайте инициации-мишени 3230. Группе самцов и самок мышей CD1 на первой неделе вводили ударную дозу (на 1, 3, 5 и 7 день) с последующим введением один раз в неделю (на 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84 и 91 день) дозы, составляющей 40 мг/кг олигонуклеотида ISIS 563223. Одной группе мышей CD1 подобным образом вводили PBS. Мышей умерщвляли через 48 часов после последней дозы, а органы и плазму собирали для дальнейшего анализа.
Экспрессия мРНК
Измеряли экспрессию в печени мРНК генов GHR, GHBP, IGF-1 и ALS. Результаты представлены в Таблице 128. Антисмысловое ингибирование GHR привело к ингибированию уровня экспрессии генов GHBP, IGF-1 и ALS.
Экспрессия белка
Измеряли уровень IGF-1 и гормона роста в плазме. Результаты представлены в Таблице 129. Антисмысловое ингибирование GHR привело к снижению уровня IGF-1 и не оказало воздействия на уровень гормона роста.