Способ проведения биологического микроанализа
BIOLOGICAL ANALYSIS METHOD

Изобретение относится к области лабораторной диагностики с использованием реакций биоспецифического связывания типа аналит-лиганд, таких как антиген-антитело, гибридизация нуклеиновых кислот и т.п. и биореагентов, проявляющих реакцию, в виде длительно люминесцирующих лигандов.
Известны способы лабораторной диагностики с использованием длительно люминесцирующих соединений в качестве биореагентов, проявляющих реакцию, имеющих время затухания люминесценции в диапазоне милли- и микросекунд.
Длительно люминесцирующие соединения регистрируют в режиме временного разрешения, что позволяет исключить фоновую люминесценцию примесей и повысить чувствительность и специфичность анализа в целом по сравнению с обычными приемами флуоресцентного биологического микроанализа без выделения временного интервала, эквивалентного постоянной времени затухания люминесценции.
В качестве длительно люминесцирующих соединений используют хелаты (комплексоны) ионов лантаноидов (Eu, Tb, Sm, Dy) и металлопорфирины с центральными атомами платины и палладия, имеющие узкие полосы и высокий квантовый выход люминесценции.
Наибольшее распространение получил способ, основанный на технологии DELFIA™ (диссационно усиленного лантанидного флуоресцентного иммуноанализа), включающий прием перекомплексации ионов лантаноидов в мицеллярный раствор с комплексонами, многократно усиливающими их люминесценцию. Технология DELFIA™ широко используется в мире для неонатального скрининга наследственных болезней обмена у новорожденных. В технологии DELFIA™ в обязательном порядке используют стадию удаления непрореагировавших иммунореагентов многократной промывкой лунок микропланшетов или иных реакционных сосудов.
Известны способы проведения твердофазного иммуноанализа, не требующие перекомплексации ионов лантаноидов. В этом случае сигнал длительной люминесценции от ионов лантаноидов и металлопорфиринов регистрируют с поверхности оптически прозрачных полимерных материалов.
В качестве твердой фазы в этих способах могут быть использованы пробирки, лунки микропланшетов, слайды. Эти способы могут быть выполнены в виде мультиплексных систем (биочипов) для одновременного определения не одного, а сразу нескольких (множества) аналитов в одной пробе.
Так, известен способ иммуноанализа и реагент для обнаружения гормонов в биологическом образце (патент США №5089423, класс НКИ 436-518). Способ предназначен для определения в образце крови альфафетопротеина, хорионического гонадотропина человека, ферритина, тиротропина и других гормонов. В способе используют иммобилизацию иммунореактивных веществ, например, антител на твердой фазе, реагирование комплементарных иммунореактивных веществ с веществами, иммобилизованными на твердой фазе. При этом комплементарные имунореактивные вещества связаны с частью лиганда, образуя с ионами металлов лантанидов флуоресцентные хелатные комплексы (метки). После осуществления реакции иммунологического связывания, иммунорективные вещества, не связавшиеся с иммунореактивными веществами, иммобилизованными на твердой фазе, отмываются, а твердая фаза высушивается. Флуоресценция хелатных меток на дне лунок на комплементарно связанных иммунореактивных веществах измеряется в режиме временного разрешения в присутствии редкоземельных металлов, стабильно связанных с хелатами. В способе исключается необходимость диссоциации меченых комплексов, образовавшихся на твердой фазе, что значительно упрощает процедуру анализа. Высушивание твердой фазы перед измерением флуоресценции исключает проблему поглощения и рассеяния возбуждающего потока и излучения эмиссии остаточным количеством реагентов в лунке.
Для усиления сигнала в качестве лигандов используют длительно люминесцирующие метчики, включенные в состав наночастиц, поверхность которых включает биореагенты для биоспецифического связывания (антитела, днк-зонды, компоненты системы стрептавидин-биотин и т.п.).
Наночастицы обеспечивают увеличение числа длительно люминесцирующих молекул, приходящихся на единичное биомолекулярное взаимодействие, что позволяет более чем в 10-100 раз повысить чувствительность анализа. Однако, применение наночастиц сопровождается увеличением вариабельности результатов анализа, т.к. вариабельность зависит от размера комплекса сорбент-аналит-лиганд и в случае применения наночастиц комплекс существенно больше и чувствительнее к режимам промывки. В процессе удаления непрореагировавших биоспецифических компонентов часть комплексов также может оказаться удаленной с поверхности иммуносорбента.
Известен способ твердофазного иммуноанализа (ФОСФАН™) с использованием в качестве меченых лигандов металлопорфиринов с центральными атомами платины и палладия [патент РФ №2184970, класс МПК G01N 33/5]. Способ используют и для выявления продуктов гибридизации нуклеиновых кислот.
Способ ФОСФАН™ включает следующие стадии:
1. Приготовление сорбента для биоспецифического связывания аналитов на твердой фазе (дне) оптически прозрачного сосуда в виде отдельных микрозон.
2. Внесение пробы (клинического образца) в оптически прозрачный сосуд.
3. Внесение в буферном растворе лиганда, меченого длительно люминесцирующими метчиками.
4. Инкубация пробы с встряхиванием на шейкере.
5. Удаление из сосуда промывкой непрореагировавших компонентов пробы и лиганда.
6. Высушивание на твердой фазе образовавшихся комплексов сорбент-аналит-лиганд.
7. Регистрация люминесцентного сигнала в режиме пространственного, временного и спектрального разрешения путем сканирования поверхности дна оптически прозрачного сосуда с иммобилизованными длительно люминесцирующими комплексами сорбент-аналит-лиганд.
В качестве сорбентов для биоспецифического связывания аналитов в этом способе используют иммобилизованные на дне лунок полистироловых микропланшетов антитела, антигены различной природы, биологически активные низкомолекулярные соединения на белковом носителе, а также ДНК-зонды для гибридизационного анализа нуклеиновых кислот.
В качестве исследуемых проб используют сыворотку крови, мочу, другие биологические жидкости, сухие пятна крови и мочи, а также образцы проб из объектов внешней среды, содержащие инфекционный и другой исследуемый материал.
В качестве лигандов используют конъюгаты антител и биологически активных соединений с длительно люминесцирующими соединениями, а также наночастицы, покрытые компонентами для биоспецифического связывания и включающие длительно люминесцирующие соединения. В технологии ФОСФАН™ для двухстадийного анализа используют универсальную систему стрептавидин-биотин.
Регистрацию длительной люминесценции осуществляют при облучении поверхности твердой фазы (полистирола) в диапазоне 365-375 нм в импульсном стробоскопическом режиме с выделением сигнала люминесценции европия с постоянной времени затухания 700 микросекунд на длине волны 615 нм, с выделением сигнала люминесценции платинакопропорфирина с постоянной времени затухания 80 микросекунд на длине волны 653 нм, с выделением сигнала люминесценции палладийкопропорфирина с постоянной времени затухания 1200 микросекунд на длине волны 670 нм, с выделением сигнала люминесценции ионов тербия с постоянной времени затухания 1200 микросекунд на длине волны 495 нм.
Для проведения мультиплексного анализа на дне лунок полистиролового микропланшета формируют микрозоны из сорбентов различной специфичности диаметром 0,3-0,4 мм, что позволяет выявлять одновременно в пробе до 16 аналитов с помощью фосфоресцентного сканера ИФИ-03, ИФИ-04, ИФИ-05 (ЗАО «ИММУНОСКРИН»).
Недостатком данного и других способов с применением промывки твердой фазы при использовании люминесцирующих наночастиц является высокая вариабельность результатов измерений, обусловленная высокой чувствительностью лигандов к режимам промывки твердой фазы. Кроме того, способы с использованием процедуры отмывки (удаления) непрореагировавших реагентов, не могут быть применены для определения опасных инфекционных агентов, т.к. процедура промывки (удаления несвязавшихся компонентов пробы и, в том числе, биопатогенов) не может обеспечить надежный противоэпидемический режим проведения анализа из-за образования аэрозоля, сопровождающего процедуру промывки.
Следует отметить, что перечисленные выше способы с отмывкой твердой фазы используют и при анализе проб в виде дисков фильтровальной бумаги с нанесенными биологическими материалами (цельная кровь, плазма или другие биологические жидкости).
Для реализации способов с использованием стадии промывки и клинических образцов в виде сухих пятен биологических материалов, например, при неонатальном скрининге наследственных болезней обмена у новорожденных, или выявлении наркотических веществ в пробах мочи, высушенных на фильтровальной бумаге, требуется специализированный комплект лабораторного оборудования, включающий не только фосфоресцентный сканер, но и промыватель (вошер), встряхиватель (шейкер), а также удалитель дисков сухих пятен крови, мочи (дискремувер). Процедура промывки и удаления дисков вносят дополнительные ошибки в анализ.
Известны способы, не требующие удаления несвязавшихся люминесцирующих реагентов и, соответственно, не требующие перечисленного выше полного комплекта лабораторного оборудования для его реализации.
Так, известны гомогенные способы лабораторной диагностики (иммуноанализа) на основе технологии TR-FRET (флуоресцентно-резонансный перенос энергии в комплексах аналит-лиганд с участием донорно-акцепторной пары из двух лигандов, меченых коротко флуоресцирующим и длительно люминесцирующим метчиком). В этих способах используют длительно люминесцирующие криптаты (технология Trace, анализатор Kryptor, компания БРАМС ГмбХ, Германия) и реагенты для технологии Lance (Lanthanide Chelate Excite, компании Перкин-Эльмер, США). При образовании комплексов лиганд-аналит-лиганд и облучении пробы светом наблюдается перенос энергии с молекулы лиганда - донора на молекулу лиганд-акцептор. Эти способы не требуют стадии промывки и других дополнительных операций по освобождению от несвязавшихся иммунореагентов. Однако, эти способы имеют ограничения по чувствительности и динамическому диапазону определения аналитов из-за наличия фонового уровня люминесценции донора и акцептора. Кроме того, TR-FRET имеет ограниченный Ферсторовский радиус резонансного переноса энергии в донорно-акцепторных парах флуорохромов (порядка 20 нм) и не может быть эффективно применен для анализа протяженных объектов (например, микроорганизмов). Кроме того, эти способы не могут обеспечить выявление в пробе сразу нескольких аналитов без дополнительных приемов ее деления на отдельные порции.
Известны и другие способы с использованием длительно люминесцирующих соединений, не требующие удаления свободных реагентов и компонентов пробы. Так, известен твердофазный способ, в котором промывку твердой фазы и удаление несвязанного люминесцирующего лиганда не используют. Исключение стадии промывки твердой фазы обеспечивает конструкция биосенсорного устройства. Оптическая схема биосенсора сформирована таким образом, чтобы свет возбуждения не выходил в объем пробы, а испытывал полное внутреннее отражение на поверхности с иммуносорбентом. В этом случае сигнал регистрируют с поверхности от комплексов сорбент-аналит-лиганд и затрагивают свободные реагенты из очень тонкого слоя пробы, не превышающего половины длины волны возбуждающего света, т.е. около 180-190 нм (при возбуждении на длине волны 360-370 нм).
Для реализации этого способа используют биосенсорные устройства со сложной оптической системой и достаточно дорогими полимерными расходными материалами, обеспечивающими регистрацию сигнала с использованием эффекта полного внутреннего отражения. Кроме того, способ имеет ограничение по использованию для анализа в качестве аналитов достаточно протяженных корпускулярных объектов (микроорганизмов, простейших и т.п.), заметно превышающих по своим размерам половину длины волны возбуждающего света.
Наиболее близким аналогом предлагаемого способа (прототипом) является способ гомогенного флуоресцентного иммуноанализа с использованием светопоглощающего материала [ЕР 019115575,G01N 33/58 Homogeneus fluorescence immunoassay using a light absorbing material]. Способ включает приготовление твердофазного иммуносорбента, проведение реакции биоспецифического связывания иммунореагентов, включая связывание на твердой фазе аналитов с лигандами, мечеными длительно люминесцирующими комплексами ионов лантаноидов и введение в состав буферной смеси светопоглощающего материала. В качестве светопоглощающего материала используют 1,8-анилинонафталеносульфонат (АНС) поглощающий в области возбуждения комплексов ионов лантаноидов. Этот прием позволяет почти в сто раз снизить уровень люминесценции от комплексов ионов лантаноидов, которые не включены в состав иммунных комплексов на твердой фазе и находятся в объеме жидкой пробы.
Указанный способ имеет существенные ограничения по чувствительности, динамическому диапазону выявления аналитов и точности (коэффициент вариации), обусловленные неполным тушением люминесценции свободного лиганда в объеме пробы. Для расширения динамического диапазона выявляемых аналитов в область высоких концентраций для данного способа необходимо пропорционально увеличивать концентрацию меченого флуорохромом лиганда, что сопровождается увеличением люминесценции свободного лиганда и снижает чувствительность при выявлении низких концентраций аналитов. Таким образом, прототип не может обеспечить одновременное достижение высокой чувствительности, широкого динамического диапазона выявления аналитов и точности (коэффициент вариации).
Задачей является создание способа анализа клинических образцов, в том числе потенциально контаминированных возбудителями инфекционных заболеваний, обеспечивающего по сравнению с прототипом повышение чувствительности, точности и многократное (10-100 раз) расширение динамического диапазона выявляемых концентраций аналитов.
Способ может быть использован для одновременного определения в пробе нескольких аналитов, являющихся маркерами инфекционных и соматических заболеваний.
Предлагаемый способ решает задачу проведения твердофазного биологического микроанализа и регистрации сигнала с использованием длительно люминесцирующих реагентов без стадии удаления непрореагировавших реагентов и компонентов пробы, т.е. без стадии промывки твердой фазы.
Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является повышение чувствительности, точности анализа и расширение динамического диапазона выявляемых концентраций при одновременном определении в пробе нескольких (множества) аналитов.
Способ может быть использован при индикации в пробе возбудителей опасных инфекционных заболеваний без риска контаминации окружающей среды опасным инфекционным материалом. Способ исключает отмывку несвязавшихся реагентов и связанное с ней образование биоаэрозоля.
9
10
Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, также является возможность использования одновременно нескольких длительно люминесцирующих метчиков в высоких концентрациях (10-10 наночастиц с комплексонами ионов лантаноидов на пробу или 10-100 нг/мл конъюгата антител с металлопорфиринами) и, соответственно, определение не одного, а нескольких (множество) аналитов в пробе. Предлагаемый способ упрощает процедуру анализа, т.к. позволяет исключить применение комплекта вспомогательного оборудования (вошер, шейкер, дискремувер).
Поставленная задача решается предлагаемым изобретением.
Сущность изобретения заключается в том, что в способе биологического микроанализа, включающем приготовление твердофазного сорбента к одному или нескольким (множеству) искомых аналитов в оптически прозрачном сосуде, приготовление лигандов, включающих реагенты для биоспецифического связывания искомых аналитов и длительно люминесцирующие соединения, внесение лигандов и пробы с аналитами в оптически прозрачный сосуд с твердофазными сорбентами, инкубацию пробы аналитов с сорбентами и лигандами и регистрацию сигнала длительной люминесценции от комплексов лиганд-аналит-сорбент при облучении сорбентов пучком света, не превышающем площадь сорбента, перед регистрацией сигнала люминесценции в сосуд к реакционной смеси добавляют не смешивающийся с ней раствор-тушитель, имеющий плотность выше плотности пробы, и содержащий вещество, поглощающее свет в области возбуждения и эмиссии люминесценции лигандов.
За счет более высокой плотности раствора-тушителя содержимое пробы, включая реагенты, несвязанные на твердой фазе в комплекс сорбент-аналит-лиганд, оттесняются от дна оптически прозрачного сосуда слоем раствора-тушителя и сигнал свободного флуорохрома (несвязанного на твердой фазе) полностью оказывается затушенным при прохождении через этот слой возбуждающего света. Раствор-тушитель образует разделительный слой между свободными и связанными лигандами и обеспечивает возможность регистрации люминесценции только связанного лиганда, что позволяет измерять количество аналита в комплексе с сорбентом.
-2
-3
4
-1
В качестве раствора - тушителя могут быть использованы перфторполиэфиры низкой вязкости, например ПЭФ 40/30 (ТУ 2229-007-54226479-2009), включающие красители (например, гемоглобин или черную тушь), поглощающие в области возбуждения и эмиссии комплексонов ионов лантаноидов (европия, тербия, самария, диспрозия) или металлопорфиринов (с центральными атомами платины и палладия). Красители в составе раствора-тушителя должны иметь концентрацию 10-10 М и молярный коэффициент экстинкции не менее 5×10 Мсм. В качестве раствора-тушителя может быть также использован глицерин, включающий тушитель - тушь черную (артикул 530-р, ТУ 6-15-458-86).
Сущность изобретения заключается в том, что лиганд готовят в виде наночастиц диаметром 50-300 нм, которые содержат на поверхности ковалентно связанные биоспецифические реагенты (например, антитела) и включают длительно люминесцирующие комплексоны с ионами европия.
Сущность изобретения заключается в том, что лиганд готовят в виде конъюгата антител с металлопорфирином.
Сущность изобретения заключается в том, что сорбент готовят в виде микрозоны диаметром 0,3-0,4 мм на дне оптически прозрачного сосуда.
Сущность изобретения заключается в том, что для определения нескольких аналитов на дне оптически прозрачного сосуда готовят сорбенты к каждому аналиту, а в реакционную смесь вносят лиганды к каждому аналиту.
Сущность изобретения заключается в том, что реакционная смесь может включать сухое пятно биологического материала на фильтровальной бумаге с экстрагирующим буфером.
Авторам не известны технические решения, имеющие совокупность признаков, подобную заявляемой, следовательно, заявляемое изобретение соответствует критерию новизны.
Примеры выполнения способа, представленные в составе описания изобретения, демонстрируют повышение чувствительности и точности (снижение коэффициента вариации) при количественном измерении аналита (тиротропина) в образцах сухих пятен крови новорожденных и возможность определения инфекционных биологических агентов в широком диапазоне концентраций без дополнительных процедур промывки и высушивания твердой фазы. Это снижает риск появления биологического аэрозоля и заражения людей при проведении экспериментальных работ.
Указанный технический результат достигается за счет новых средств, а именно -применения раствора-тушителя, создающего оптически непрозрачную среду между твердой фазой и исследуемой пробой с реагентами, следовательно, предлагаемое изобретение соответствует критерию технический уровень.
Изобретение может быть использовано в здравоохранении в лабораторной диагностике широкого спектра инфекционных и соматических заболеваний. В частности, для мониторинга тиреоидной функции щитовидной железы, проведения неонатального скрининга наследственных болезней обмена новорожденных, где в качестве клинического материала используют не только сыворотку или плазму крови, но и микрообразцы пробы в виде сухих пятен крови. Изобретение найдет применение при проведении специфической индикации возбудителей опасных инфекционных заболеваний, т.к. исключает стадии, сопровождающиеся образованием биоаэрозоля, и позволяет кардинально снизить риск заражения персонала при проведении экспериментальных работ.
Для реализации способа используют зарегистрированные в Росздравнадзоре РФ и серийно выпускаемые биочип-анализаторы ИФИ-03, ИФИ-05 (Производитель ЗАО «ИММУНОСКРИН»). Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию промышленной применимости.
В предлагаемом способе заявляемые положительные эффекты связаны с раствором -тушителем и обусловлены отделением материала пробы, который не связан на твердой фазе, от образовавшихся на твердой фазе комплексов сорбент-аналит-лиганд.
Раствор-тушитель, благодаря более высокой плотности и несмешиваемости с материалом пробы, в отличие от способа - прототипа, позволяет кардинально (в 100 раз и более) снизить уровень фоновой люминесценции лигандов, использовать в биологическом микроанализе лиганды в многократно более высоких концентрациях, чем в прототипе и, как следствие, расширить динамический диапазон выявления аналитов, повысить чувствительность и точность измерения.
В отличие от прототипа, где невозможно кардинально снизить фоновую люминесценцию свободного лиганда, т.к. тушитель выполняет функцию экрана в области возбуждения лиганда непосредственно в объеме пробы, в предлагаемом способе тушитель находится в объеме разделительного слоя. Оптическая плотность разделительного слоя на несколько порядков выше, чем в прототипе, и люминесценция свободного лиганда отсутствует. Спектр веществ-тушителей может быть существенно шире, чем у прототипа, т.к. к этим красителям, находящимся в разделительном слое и не взаимодействующими с материалом пробы, не предъявляются дополнительные требования, связанные с необходимостью исключения побочных реакций с аналитами и матриксом пробы.
Последовательность операций предлагаемого способа
1. Приготовление сорбентов для биоспецифического связывания аналитов на твердой фазе (дне) оптически прозрачного сосуда.
2. Внесение пробы (клинического образца) в оптически прозрачный сосуд.
3. Внесение в составе буферного раствора лигандов, меченых длительно люминесцирующими метчиками.
4. Инкубация пробы с лигандами в буферном растворе.
5. Внесение раствора-тушителя перед регистрацией сигнала люминесценции для разделения пробы с буферным раствором от комплексов сорбент-аналит-лиганд на твердой фазе оптически прозрачных сосудов.
6. Регистрация люминесцентного сигнала в режиме пространственного, временного и спектрального разрешения путем сканирования поверхности дна оптически прозрачного сосуда с иммобилизованными длительно люминесцирующими комплексами сорбент-аналит-лиганд.
В общем случае, к раствору-тушителю, обеспечивающему разделение материала пробы от комплексов сорбент-аналит-лиганд и тушение люминесценции несвязанных на твердой фазе флуорохромов, предъявляются следующие требования:
- раствор - тушитель должен иметь плотность выше плотности пробы клинического образца, не смешиваться и не растворять материал пробы, быть химически нейтральным, не иметь собственной длительной люминесценции в области эмиссии лигандов, меченых флуорохромами, и не приводить к десорбции комплексов сорбент-аналит-лиганд;
4
5
- вещество-тушитель в составе раствора-тушителя должно иметь молярный коэффициент экстинкции около 10-10 единиц оптической плотности в слое толщиной 1 см в полосе возбуждения (365-375 нм) и эмиссии флуорохромов (600-700 нм).
Для реализации способа используют люминесцентный сканер, имеющий фокусировку на дно оптически прозрачного сосуда с сорбентом. Сканер должен иметь площадь сканирующего луча, которая не превышает площадь микрозоны сорбента. В этом случае относительный вклад в люминесценцию от материала оптически прозрачного сосуда минимален.
О наличии искомого аналита в пробе судят по превышению люминесцентного сигнала при возбуждении люминесценции в зоне сорбента по сравнению с уровнем сигнала при возбуждении вне зоны сорбента.
В качестве вещества с высокой оптической плотностью поглощения могут быть использованы различные нейтральные красители и суспензии микро- и наночастиц, включающие сильно поглощающие вещества, например, тушь, гемоглобин, красители метиленовые и т.п.
На фиг. 1 схематично представлен ход выполнения способа на модели пробы в виде сухого пятна крови новорожденного при определении тиреотропного гормона и тироксина.
Стадия - А (до внесения раствора-тушителя)
Стадия - В (после внесения раствора -тушителя)
1.1 - дно лунки полистиролового микропланшета
1.2 - иммобилизованные на дне лунки антитела к тиреотропному гормону
1.3 - иммобилизованные на дне лунки конъюгаты тироксина с бычьим сывороточным альбумином
1.4 - образец сухого пятна крови новорожденного на фильтровальной бумаге №903 (Ватман) диаметром 3,2 мм
1.5 - буфер анализа
1.6 - наночастицы, покрытые антителами к тиреотропному гормону и включающие комплексоны с ионами европия для определения тиреотропного гормона
1.7 - конъюгаты специфических антител с платинокопропорфирином к тироксину
1.8 - тиротропин, экстрагированный из пятна крови буфером анализа
1.9 - тироксин, экстрагированный из пятна крови буфером анализа
1.10 - комплексы наночастиц с тиротропином
1.11 - комплексы конюгатов специфических антител с платинокопропорфирином к тироксину с тироксином
1.12 - комплексы наночастиц с тиротропином, связанные на дне лунки с антителами к тиреотропному гормону
1.13 - комплексы конюгатов специфических антител с платинокопропорфирином к тироксину с тироксином, связанные на дне лунки с конъюгатом тироксина с бычьим сывороточным альбумином
1.14 - раствор-тушитель
1.15 - вещества, поглощающие свет в растворе - тушителе
1.16 - толщина прослойки из раствора - тушителя
На фиг. 2 представлены графики зависимости уровня сигнала люминесценции от концентрации лигандов (наночастиц с ионами европия (IgG-НЧ) и конъюгатов антител с платинокопропорфирином (IgG-PtKJI) в лунках полистиролового прозрачного микропланшета.
(По оси ординат - относительный уровень сигнала люминесценции, по оси абсцисс -концентрация наночастиц (частиц/мл) и конъюгатов антител с платинакопропорфирином (нг/мл).
Объем пробы (буфера анализа) в лунках микропланшета - 60 мкл.
Наночастицы с ионами европия диаметром 50 нм включают до 2000 комплексов ионов европия и до 150 молекул специфического иммуноглобулина. Конъюгаты с платинакопропорфирином включают до 5 молекул платинакопропорфирина на одну молекулу специфического иммуноглобулина.
2 - График зависимости сигнала люминесценции от концентрации лиганда (наночастиц с ионами европия) без добавления раствора - тушителя для смеси из 4-х видов лигандов для выявления 4-х аналитов: антигенов возбудителей чумы, туляремии, сибирской язвы и бруцеллеза.
3 - График зависимости сигнала люминесценции от концентрации лиганда (наночастиц с ионами европия) для смеси из 4-х видов лигандов для выявления аналитов: антигенов возбудителей чумы, туляремии, сибирской язвы и бруцеллеза в присутствии раствора -тушителя.
4 - График зависимости сигнала люминесценции от концентрации конъюгата иммуноглобулина G с платинакопропорфирином без добавления раствора - тушителя.
5 - График зависимости сигнала от концентрации конъюгата иммуноглобулина G с платинакопропорфирином в присутствии раствора - тушителя.
Состав раствора - тушителя: тушь черная (артикул 530-р, ТУ 6-15-458-86) 1/5 часть, глицерин 4/5.
Объем раствора - тушителя в лунках микропланшета - 30 мкл
На фиг. 3 представлены графики зависимости уровней сигналов люминесценции ионов европия от комплексов сорбент-аналит-лиганд при сканировании дна лунок полистироловых микропланшетов при выявлении двух аналитов: фракции Ф1 чумного микроба (Y.pestis) и антигена клеток возбудителя туляремии в различных концентрациях с помощью предлагаемого способа.
6 - График зависимости уровня сигнала в микрозоне для выявления Ф1 чумного микроба от концентрации фракции Ф1 (нг/мл).
7 - График зависимости уровня сигнала в микрозоне для выявления антигена туляремийного микроба от концентрации корпускулярного антигена возбудителя (м.т./мл).
8 - График зависимости уровня сигнала в микрозоне для выявления антигена сибиреязвенного микроба.
9 - График зависимости уровня сигнала в микрозоне для выявления антигена бруцелл.
Состав раствора - тушителя: тушь черная (артикул 530-р, ТУ 6-15-458-86) 1/5 часть, глицерин 4/5.
Объем раствора - тушителя в лунках микропланшета - 30 мкл.
9
Концентрация наночастиц с характеристикой, указанной на фиг. 1 для каждого из 4-х видов лигандов -10частиц/лунка.
На фиг. 4 представлены калибровочные графики определения тиреотропного гормона в сухих пятнах крови новорожденных предлагаемым способом (график 10) и способом -прототипом (график 11).
8
(По оси ординат - относительный уровень сигнала люминесценции, по оси абсцисс -концентрация гормона тиротропина мкМЕ/мл крови). Концентрация наночастиц -10 частиц/лунка.
Состав раствора - тушителя: тушь черная (артикул 530-р, ТУ 6-15-458-86) 1/5 часть, глицерин 4/5.
График 10 получен при использовании раствора - тушителя по предлагаемому способу (состав раствора - тушителя: тушь черная (артикул 530-р, ТУ 6-15-458-86) 1/5 часть, глицерин 4/5.)
-3
График 11 получен при использовании способа-прототипа, где в качестве вещества -тушителя используется АНС (1,8 -анилиннафталенсульфонат в концентрации 5 10 М).
Объем раствора - тушителя в лунках микропланшета - 30 мкл.
На фиг. 5 представлен калибровочный график определения тироксина в сухих пятнах крови новорожденных предлагаемым способом (график 12) и прототипом (график 13).
(По оси ординат - относительный уровень сигнала люминесценции, по оси абсцисс -концентрация гормона тироксина нг/мл крови).
Объем пробы (буфера анализа) в лунках микропланшета - 60 мкл
8
Концентрация конъюгата наночастиц, покрытых моноклональными антителами к тиротропину-10 частиц/лунка.
График 12 получен при использовании раствора - тушителя по предлагаемому способу (состав раствора - тушителя: гемоглобин из крови человека 10 мг/мл, перфторполиэфир ПЭФ 40/30 (ТУ 2229-007-54226479-2009))
-3
График 13 (прототип) получен при использовании в качестве вещества - тушителя АНС (1,8 -анилиннафталенсульфонат в концентрации 5 10М)
Ход проведения анализа поясняется фиг. 1.
В оптически прозрачный сосуд (фиг. 1, стадия А) - на дно лунки полистиролового микропланшета - 1.1 с иммобилизованными сорбентами (микрозонами) из антител к тиреотропному гормону -1.2 и конъюгата тироксина с бычьим сывороточным альбумином 1.3 вносят пробу в виде образца сухого пятна крови новорожденного на фильтровальной бумаге №903 (Ватман) диаметром 3,2 мм - 1.4, вносят буфер анализа - 1.5, включающий компоненты для экстракции аналитов из пятна крови и лиганды в виде наночастиц, покрытых антителами к тиреотропному гормону и включающих комплексоны с ионами европия для определения тиреотропного гормона - 1.6 и конъюгаты специфических антител с платинокопропорфирином к тироксину - 1.7.
В результате биоспецифических взаимодействий происходит связывание аналитов (тиротропина - 1.8 и тироксина - 1.9) с соответствующими лигандами (1.6 и 1.7) с образованием соответствующих комплексов аналит-лиганд к тиротропину - 1.10 и тироксину - 1.11 и последующей иммуносорбции в соответствующих микрозонах к тиротропину - 1.2 и тироксину - 1.3 конъюгатов с образованием в сэндвич анализе комплексов сорбент-аналит-лиганд (комплексы для тиротропина - 1.12), и в конкурентном анализе комплексы сорбент-лиганд (для тироксина - 1.13).
После инкубации пробы в течение 4-х часов перед измерением сигнала люминесценции в лунку микропланшета добавляют раствор - тушитель - 1.14 (фиг. 1, стадия В), не смешивающийся с материалом пробы, имеющий плотность выше плотности пробы и включающий вещества, поглощающие в области возбуждения и эмиссии флуорохрома - 1.15. При этом, за счет разности в плотностях между водной фазой анализируемой пробы и раствора-тушителя, происходит образование прослойки - 1.16 (стрелкой указана толщина слоя раствора - тушителя) между твердой фазой - 1.1 и пробой с ее компонентами и свободными лигандами 1.4 -1.7. При этом происходит оттеснение от дна материала пробы, содержащей буфер анализа - 1.5, пятна крови - 1.4, свободные лиганды - 1.6, 1.7 и их конъюгаты - 1.10 и 1.11.
Регистрацию сигнала люминесценции осуществляют на приборе ИФИ-05 (ЗАО ИММУНОСКРИН) путем сканирования дна лунок микропланшета лучом света диаметром 120 мкм, не превышающим размер микрозон с сорбентами (0,3-0,4 мм).
d
g
Сигнал люминесценции от комплексонов ионов европия регистрируют в стробоскопическом режиме с длительностью импульсов возбуждения 100 мкс, временем задержки между актом возбуждения и приемом сигнала люминесценции t - 300 мкс, длительностью строба регистрации t - 400 мкс на длине волны 613-615 нм при возбуждении на длине волны 365-375 нм.
d
g
Сигнал люминесценции от платинакопропорфирина регистрируют в стробоскопическом режиме с длительностью импульсов возбуждения 10 мкс, временем задержки между актом возбуждения и приемом сигнала люминесценции t- 5 мкс, длительностью строба регистрации t - 50 мкс на длине волны 645-655 нм при возбуждении на длине волны 365-375 нм.
Фиг. 2 иллюстрирует зависимость сигнала люминесценции наночастиц с ионами европия (IgG-НЧ) -2 и конъюгатов антител с платинакопропорфирином (IgG-PtKTI) - 4 от их концентрации в пробе и эффективность тушения люминесценции IgG-НЧ - 3 и IgG-PtKTI - 5 при добавлении раствора- тушителя во всем диапазоне используемых концентраций IgG-НЧ и IgG-PtKTI при толшине слоя раствора тушителя 1 мм. Из представленных графиков следует, что раствор - тушитель практически полностью тушит люминесценцию комплексов ионов европия и платинакопропорфирина, находяшихся в объеме пробы.
Фиг. 3 иллюстрирует выявление предлагаемым способом одновременно двух аналитов: фракции Ф1 чумного микроба (Y.pestis) и антигена клеток возбудителя туляремии при их различном содержании в исследуемых пробах.
Специфичность выявления предлагаемым способом искомых аналитов подтверждается тем, что сигналы люминесценции (при отсутствии в пробе антигенов клеток возбудителей сибирской язвы и бруцеллеза) наблюдаются только в зонах специфической сорбции фракции Ф1 чумного микроба и антигена клеток туляремийного микроба.
Сигналы люминесценции в микрозонах для сорбции антигенов клеток сибирской язвы и антигенов бруцелл остаются на низком уровне, эквивалентном уровню фона. Наличие в пробе фракции Ф1 чумного микроба (Y.pestis) и антигенов клеток возбудителя туляремии сопровождается ростом сигнала в соответствующих микрозонах пропорционально концентрации этих аналитов.
Фиг. 4 иллюстрирует определение тиреотропного гормона в сухих пятнах крови новорожденных предлагаемым способом (график 10) и способом- прототипом (график 11). Из представленных на фиг. 4 данных следует, что предлагаемый способ обеспечивает близкую к линейной зависимость между сигналом люминесценции и концентрацией искомого аналита. Для прототипа уровень сигнала люминесценции меняется только в 2,6 раза при изменении концентрации более чем на 4 порядка. Предлагаемый способ позволяет кардинально снизить уровень фона по сравнению с прототипом и за счет использования более высоких концентраций лиганда существенно увеличить чувствительность.
Результаты, полученные при анализе клинических образцов предлагаемым способом и прототипом, представлены в сводной таблице. Коэффициент вариации рассчитан для пяти повторных измерений каждой анализируемой пробы. Из данных таблицы следует, что предлагаемый способ позволяет расширить диапазон выявляемых концентраций и значительно снизить вариабельность результатов измерений по сравнению с прототипом.
Фиг. 5 иллюстрирует возможность существенного повышения чувствительности и точности определения гормона предлагаемым способом по сравнению с прототипом при использовании в качестве раствора-тушителя раствора перфторполиэфира ПЭФ 40/30 (ТУ 2229-007-54226479-2009) с добавлением тушителя гемоглобина из крови человека. Из представленных данных (график 12 для предлагаемого способа и график 13 для прототипа) следует, что определение тироксина в конкурентном анализе предлагаемым способом существенно точнее, чем прототипом, т.к. уровень фоновой люминесценции, обусловленный свободным лигандом в пробах с высокой концентрацией тироксина (более 200 нг/мл), ниже не менее чем в 10-20 раз. При этом сигнал люминесценции в заявляемом способе меняется от 120000 отн.ед. при нулевой концентрации аналита до 150 отн.ед. при концентрации тироксина 200 нг/мл, в то время как для прототипа изменение сигнала происходит от 11000 отн.ед. до 9000 отн.ед., что связано с фоновой люминесценцией свободного лиганда, которая не может быть полностью затушена.