Онкоиммунология

Медицинская иммунология 2001, Т. 3, №2 © 200!, СПб РО РА АКИ

ОНКОИММУНОЛОГИЯ

ИММУНОЛОГИЯ ОПУХОЛЕЙ: ДОСТИЖЕНИЯ И ПЕРСПЕКТИВЫ

Балдуева И.А.*, Моисеенко В.М., Хансон К.П.

НИИ онкологии им.проф.Н.Н.Петрова М3 РФ, Больница №31,

"Клинический центр передовых медицинских технологий ”*, г.Санкт-Петербург

Цель обзора литературных данных состоит в том, чтобы обобщить достижения в области иммунологии опухолей и определить перспективы на будущее, основываясь на достижениях фундаментальной иммунологии.

Иммунология опухолей находится на пересечении двух больших и сложных дисциплин: онкологии и иммунологии. Это позволяет, с одной стороны, использовать опухоль как модель для исследования принципов фундаментальной иммунологии, а с другой - применять достижения фундаментальной иммунологии для понимания взаимоотношений опухоль-иммунитет и получения инструмента для воздействия на опухоль.

Большинство работ в области иммунологии опухолей “зондируют” фундаментальные иммунологические концепции на мышиных моделях рака. Степень успеха определяется тем, какие концепции тестируются и уточняются, и достигается ли конечный результат - излечение рака у человека.

Базовые принципы современной иммунологии опухолей определены в прошлом десятилетии. 1) Нормальная иммунная система редко является значительным барьером для опухолевого роста, в то же время клетки иммунной системы играют как положительную, так и отрицательную роль в возникновении и развитии опухоли. 2) Большинство опухолей обладает антигенными свойствами. 3) "Манипуляция иммунной системой” может привести к полному излечению от рака.

В эти же годы формируются основные представления о противоопухолевой иммунотерапии. 1) Применение существующих методов иммунотерапии ограничено наличием большой опухолевой массы в организме. 2) Иммуносупрсссирую-щие факторы, продуцируемые опухолью, могут снижать эффективность активной иммунотерапии. 3) Повышение антигенное™ опухоли сопровождается выраженным иммунным ответом.

Таким образом, значительные достижения в области фундаментальной иммунологии и иммунологии опухолей в прошедшие десятилетия являются основой для более глубокого изучения взаимоотношений опухоль-иммунитет и возможностей воздействия на опухоль в настоящее время. В последние годы опубликовано ряд исследований, которые в контролируемых условиях демонстрируют первичный ответ цитотокси-ческих Т-лимфоцитов на “неиммуногенные” опухоли. Излечение от рака у мышей наблюдается при введении донорских цитотоксических лимфоцитов, моноклональных биспецифических антител, иммунокомпетентных антиген - представляющих клеток и др. Индивидуальные Т-клеточные клоны могут опосредовать эффективные противоопухолевые ответы, демонстрируя тем самым, что опухолевая гетерогенность не

является фатальной. Цитокины и другие молекулы, трансфе-цированные в опухолевые клетки ведут к разрушению сформировавшихся опухолей с помощью вакцинотерапии модифицированными линиями аутологичных опухолевых клеток и могут осуществлять это действие через различные механизмы, которые, в общем, на первых этапах более зависимы от цитокинов и антиген представляющих клеток.

БИОТЕРАПИЯ РАКА

Барышников А.Ю.

НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического научного центра им.H.H.Блохина РАМН,

Москва, Россия

Помимо трех основных методов терапии рака - хирургия, химиотерапия и радиотерапия - в арсенале клиницистов появился четвертый - биотерапия. Биотерапия опухолей - это лечение злокачественных новообразований препаратами биологического происхождения. Биотерапия опухолей состоит из иммунотерапии, генотерапии, вакцинотерапии, эндокринотерапии. Полагают, что биотерапия будет одним из основных элементов в программах лечения злокачественных новообразований в XXI веке. Это вызвано тем, что биологические препараты являются продуктами жизнедеятельности нормальных клеток. Поэтому, они, существенным образом влияя на дифференцировку и поведение клеток, в том числе и опухолевых, не оказывают токсического действия на другие клетки, органы, системы, как действуют химиотерапевтические препараты.

Проблемы биотерапии опухолей активно разрабатываются в РОНЦ им.H.H.Блохина РАМН и обсуждению этих вопросов будет посвящен доклад.

ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ МАРКЁРЫ В КЛИНИЧЕСКОЙ ОЦЕНКЕ ДИСГОРМОНАЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И ГОРМОНОЗАВИСИМЫХ ОПУХОЛЕЙ

Безрукавникова Н.В., Коханов A.B., Никулина Д.М., Григорьева Т.А., Сухарев А.Е.

Учебно-научно-диагностический центр Астраханской государственной медицинской академии,

Областной онкодиспансер,

Астрахань, Россия

Известно, что пролиферативные процессы доброкачественные и злокачественные в молочных железах имеют гормонозависимый характер, поскольку клетки этих органов являются мишенями для ряда регуляторных факторов. Механизм эндокринной регуляции процессов клеточной пролиферации в молочных железах объясняется взаимодействием стероидных, гипофизарных гормонов, инсулина, эпидермального ростового фактора с соответствующими рецепторами (Макаренко Н.П., 1996). В последние годы дискутируется мнение

об участии в патогенезе дисгормональных процессов молочных желёз не только нарушений гормонального, но и метаболического гомеостаза (Гилязутдинов И.А., Хамитова Г.В., 2000), а также в патогенезе гормонозависимого онкогенеза отводится важная роль системе иммунитета (Бережная Н.М., Чехун В.Ф., 2000).

Цель исследования. Оценка гомеостатических и ком-пенсаторно-приспособительных метаболических реакций организма на развивающуюся дисгормональную гиперплазию путем изучения продукции сывороточных белков, ассоциированных с воспалением и беременностью, в том числе обладающих иммуномодулирующими свойствами и отражающих состояние некоторых звен ьев гуморального иммунитета (Назаров П.Г., 1999; Никулина Д.М., 1993 и др.).

Задачи исследования динамическое определение уровня белков острой фазы СРБ; а2~макроглобулина (Сх2МГ), связанного с беременностью; а, - гликопротеина (СБАГ); лак-тоферрина (ЛФ); онкомаркёров: а-фетопротеины (АФП) и плацентарной щелочной фосфатазы (ПЩФ), иммуноглобулинов классов 1цА, 1”С, ^М, аутоантител к тканевым антигенам; в сыворотке больных и доноров. Исследуемые группы представлены больными циррозом печени мужчины с различной степенью проявления гинекомастии на фоне снижения эстрогенин - активирующей функции печени, больными с мастопатиями различного генеза и опухолями молочной железы. Всего исследовано 118 образцов сыворотки крови. Количественное определение СРБ и СБАГ проводили иммунодиффузионным титрованием со стандартной тест-системой, а МГ и иммуноглобулинов - реакция иммунодиффузии (РИД3) по Манчиии, АФП, лактоферрина, ПЩФ - методом встречного ИЭФ по Кону, аутоантител - иммунофлю-оресцентным методом.

Результаты исследования. Был выявлен повышенный уровень сывороточных концентраций а2МГ и СБАГ в группе больных циррозом печени (до 1,3 г/л и 20 мг/л соответственно). Больные с выраженной гинекомастией (около 30%) имели максимальные концентрации СБАГ. Однако уровни этих белков в сыворотке крови больных мастопатией сохранялись на относительно низких уровнях (0,96 г/л и 8 мг/л соответственно). Частота выявления этих двух белков в группах больных составила 100%. Уровень ЛФ в крови больных практически не отличался от данных по группе доноров. Результаты определения БОФ в крови больных с онкопатологией подтвердили ранее полученные нами данные об их гиперпродукции при злокачественном процессе. Выявлено достоверно повышенное содержание иммуноглобулинов классов и ^А у больных печёночной недостаточностью по сравнению с группой доноров и больных с мастопатией. Отмечены высокие титры аутоантител у 65% больных циррозом. В других группах больных и доноров аутоантитела практически не выявлялись.

Выявленные нами особенности динамики продукции БОФ и ^ возможно составят первый вклад в формирование скринингового лабораторного перечня для выявления ранних отклонений в гормонозависимых пролиферативных процессах молочной железы. Требуется дальнейшее изучение фактов одновременного выявления повышенного уровня СБАГ и 1«А, так как ранее нами уже отмечалась подобная взаимосвязь в группах больных с воспалительными заболеваниями. Дальнейшее изучение особенностей белкового гомеостаза позволит установить сенситивные периоды гормо-ниндуцированного канцерогенеза и разработать иммунохи-мические критерии оценки компенсаторно - адаптивных реакций организма.

ОСОБЕННОСТИ ИЗМЕНЕНИЯ УРОВНЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ IgM, IgG, IqA У ДЕТЕЙ С ОСТРЫМ ЛИМФОБЛАСТНЫМ ЛЕЙКОЗОМ

Белевцев М.В.

Республиканский научно-практический центр детской онкологии и гематологии,

Минск, Беларусь

В настоящее время общепризнанна ведущая роль клеточного звена в противоопухолевом иммунитете. Мы в своей работе попытались оценить значение изменений концентрации иммуноглобулинов IgM, IgG и IgA как факторов неспецифического иммунитета при остром лейкозе у детей.

Для исследования были использованы образцы крови 58 детей, больных В-линейным острым лимфобластным лейкозом (В-ОЛЛ), и 46 практически здоровых детей. Уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови определяли на момент установления диагноза. Концентрацию иммуноглобулинов IgM, IgG и IgA измеряли турбидиметрическим методом с использованием набора реагентов фирмы Behring, Германия.

Средние значения концентраций иммуноглобулинов в периферической крови больных ОЛЛ и здоровых детей составили соответственно: для IgG - 11,28±0,57 г/л и 9,90±0,31 г/л (р=0,03); IgM - 1,054±0,097 г/л и 1,036±0,068 г/л (р=0,87); IgA - 1,041 ±0,072 г/л и 1,024±0,059 г/л (р=0,88). Корреляционный анализ по Спирмену показал, что в группе детей с ОЛЛ существуют достоверные корреляционные взаимосвязи между IgG и IgM (г=0,559, р<0,0001), между IgG и IgA (R=0,685; р<0,00001) и между IgM и IgA (г=0,486; р<0,001). В группе здоровых детей корреляционной связи между уровнями иммуноглобулинов IgM, IgG, IgA выявлено не было. При анализе распределения уровней иммуноглобулинов в группе детей с В-ОЛЛ, только для IgG, но не для IgM и IgA, были выявлены выраженные отклонения от стандартной пуассоновской кривой, характерной для здоровых детей. Используя метод квартилей, мы выделили три подгруппы больных: IgG-Г - больные с содержанием IgG ниже 1-го квартиля (5,44 - 8,225 г/л), IgG-Il - больные с содержанием IgG в диапазоне от 1-го до 3-го квартиля (8,225

- 13,35 г/л) и IgG-III - больные с содержанием IgG выше 3-го квартиля (13,35 - 22,8 г/л). При этом содержание IgG во второй группе больных (IgG-11) соответствовало содержанию IgG в контрольной группе практически здоровых детей. Дальнейший анализ этих подгрупп детей с ОЛЛ выявил различия между ними по показателям абсолютного содержания лейкозных клеток в периферической крови но не в костном мозге. При этом наименьшее содержание бласт-ных клеток было в подгруппе больных IgG-II (медиана -0,51 (0-67,8) х 109/л ), тогда как в группах больных с низкой и высокой концентрацией IgG содержание бластных клеток было более высоким (медиана - 10,2 (0-73,8) х 109/л и 3,6 (0-73,9) х 10ч/л соответственно).

Выявленная высокая корреляционная зависимость между уровнем иммуноглобулинов IgM, IgG и IgA у больных острым лейкозом свидетельствуют о формировании функциональной напряженности гуморального звена системы иммунитета. При этом наличие определенной связи между уровнем IgG и абсолютным содержанием лейкозных клеток в периферической крови может указывать на возможную роль иммуноглобулинов при активации противоопухолевого иммунитета в процессе развития острого лейкоза у детей.

ВЛИЯНИЕ ОПУХОЛЕВОГО РОСТА НА АКТИВНОСТЬ NK И NS КЛЕТОК

Беляев H.H., !іакпрьннова Г.К., Исмаилов Б.И.*, Тобагабылова J1.T.*

Институт молекулярної/ биологии и биохимии им. М.А.Ашпхожина МОН РК,

*Институт онкологии и радиологии М3 РК,

Алматы, Казахстан

Одной из важнейших проблем современной онкоиммунологин считается снижение противоопухолевого иммунитета в результате роста опухоли, в частности, естественных кил-лсрных клеток (NK). Рассматривается несколько механизмов такого снижения, среди которых большой интерес вызывает отмеченное многими авторами усиление активности, гак называемых. естественных супрессорных клеток (NS) и продукцию ими супрессорных факторов, которые угнетают активность NK клеток. NS клетки представляют собой ранние предшественники миеломоноцитарного ряда, показывающие неспецифические иммуносупрессорные свойства. На основании литературных и собственных данных мы предположили, что существует, по крайней мере, две субпопуляции NS клеток. NS1 клетки активируются IL-2 и IFN-y и еекретируют N0 и какой-то неидентифицированный высокомолекулярный фактор, оказывающие неспецифический супрессорный эффект. NS2 субпопуляция активируется GM-CSF и IL-3 и секретиру-ст TGF-ß. Взаимоотношение между этими субпопуляциями может оказаться очень важным в плане рассматриваемой проблемы. Целыо данной работы явилось изучение влияния опухолевого роста в легких на активності. NK и NS клеток, а также подтверждение существования двух NS субпопуляций.

Для оценки влияния роста опухоли на активность NK и NS клеток в условиях in vivo мы использовали модель мета-стазировапия опухоли в легочной ткани. Опыты проводили на беспородных лабораторных крысах с метастазами в легких. вызванными клетками органотропного штамма рабдо-миосаркомы РА-2, на 7-й и 14-й день после внутривенной инъекции опухолевых клеток. NK активность спленоцитов оценивали в нерадиоактивном цитотоксичееком тесте по выходу из клеток-мишеней (линия К562) фрагментов ДНК с помощью коммерческого набора "DNA Fragmentation Kit” (Boehringer Mannheim, Германия). Спонтанную NS активность спленоцитов и клеток костного мозга (ККМ) оценивали по наличию аитннролифератнвного фактора в супернатанте 48-часовой клеточной культуры ККМ п спленоцитов, тестируемого на культуре миеломы X63Ag8.653 по подавлению включения Н '-тпмидпна в ДНК. Для оценки активности гипотетических NS1 и NS2 субгюпуляций спленоцнты и ККМ в течение 3 ч индуцировали человеческим rlL-2 и супернатантом клеточной культуры WEH I-Зb, содержащим IL-

3, соответственно. В качестве контроля использовали интак-тных животных. Данные представлены на таблице в виде коэффициентов цнтотоксичностн для NK и супрессии для NS клеток.

Как видно из таблицы, по мере роста метастазов опухоли NK активность резко падала почти до полного исчезновения, что согласуется с литературными данными. Спонтанная NS активность в костном мозге отсутствовала совсем. Знак (-) означает, что ККМ секретировали в этих условиях фактор, способный усиливать пролиферацию миеломных клеток, что отличает крыс от мышей. Причем интенсивность такой продукции прогрессивно нарастала. Поскольку спонтанная NS активность отражает интегральную активность обоих субпопуляций, ее отсутствие может свидетельствовать об отсутствии спонтанной продукции клетками КМ в условиях in vitro как 1Г-2, IFN-y, так и IL-3 и GM-CSF, а значит митогенный фактор ККМ, продуцируемый ими, к данным цитокинам не относится. В то же время стимуляция NS1 и NS2 субпопуляций в ККМ соответствующими цитокинами падала по мере роста опухоли также как и NK. Несколько иная картина наблюдалась в клетках селезенки. Во-первых, отмечалась небольшая спонтанная NS активность у интактных животных, которая резко снижалась при росте опухоли. Во-вторых, достаточно высокая активность NS1 клеток в отличие от NS2 слегка повышалась с ростом опухоли. Полученные данные свидетельствуют в целом о глубоком супрессорном влиянии опухолевого роста на активность NK и NS клеток. Повышение IL-2 индуцированной активности и понижение IL-3 индуцированной активности NS клеток в селезенке можно расценивать как доказательство существования двух NS субпо-пуляцнй и их возможных реципрокных взаимовлияний.

ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ БИОМАРКЕРОВ (BCL-2, ВАХ, CD95L) ПРИ УВЕАЛЬНОЙ МЕЛАНОМЕ

Дбар Ж.Н., Степанова Е.В., Лихванцева В.Г., Барышников А.Ю.

РОНЦ им. H.И. Блохина РАМН,

Москва, Россия

Нами было проведено иммуногистохимическое определение белков CD95L, Bcl-2, Вах на 94 парафиновых блоках увеальной меланомы.

Экспрессия про и антиапоптичсских факторов ассоциировалась со стадией увеальной меланомы при ранних стадиях отсутствовала, а на поздних - их экспрессия была максимальна. Количество положительных по Вах клеток коррелировало как со смертностью от метастазпрования, так и рецидивами в культе (р= 0,01). Чем выше было количество положительных по Вс1-2 клеток, тем реже было вероятность развития новых метастазов (р=0,02).

Известно, что важным является соотношение белков семейства Вс1-2: Вах и Вс1-2, так как они могут ингибировать друг друга. При увеальной меланоме имело место повышение индекса Bcl-2/Bax по среднему показателю от 1,5±0,5 на ранних стадиях (Т,) опухолевого роста до 2,0±0,447 на стадии Т„ и в дальнейшем имел тенденцию к

Модель NK (%) NS ККМ NS спленоцитов

Спонт.

Интакт. 95,9 -22,1 69,1 18,0 21,0 54,4 32,0

1 неделя 17,5 -73,7 59,6 9,7 - - -

2 неделя 2,3 -81,2 -0,7 5,8 6,1 61,3 19,8

снижению до 1,756±0,1133 на стадии Т3 и до 1,657±0,242 при Т4.

Высокий процент CD95L клеток ассоциируется со случаями с короткой продолжительностью жизни (до 3 лет). Наиболее высокие показатели были отмечены у больных, находящихся в стадии скрытого или начального метастазирования.

Нами показано, что количественные показатели Вс1-2, Вах, CD95L, а также их соотношение можно использовать при прогнозировании клинического течения увеальной меланомы.

ЛЕЙКОЗ ИЗ БОЛЬШИХ ГРАНУЛИРОВАННЫХ ЛИМФОЦИТОВ. АНАЛИЗ ПОВЕРХНОСТНЫХ МАРКЕРОВ И ОЦЕНКА КЛОНАЛЬНОСТИ

Доронин В.А.

Городской гематологический центр ГКБ им. С.П.Боткина ,

Гематологический Научный Центр РАМН ,

Российская Академия Последипломного Образования , Москва

Введение. Лейкоз из больших гранулированных лимфоцитов (ЛБГЛ) был впервые описан в 1977 году. Его основными клинико-лабораторными проявлениями являются рецидивирующие инфекции, псрсистирующий лимфоцитоз и частая ассоциация с ревматоидным артритом. Выделяют два варианта ЛБГЛ: из NK-клсток и из цитотоксических Т-клеток (Т-ЛБГЛ). Т-ЛБГЛ встречается значительно чаще и характеризуется доброкачественным течением. Опухолевая природа этого заболевания доказывается клональной перестройкой генов гамма цепи Т-клеточного рецептора (ТКР).

Цель и задачи исследования. Исследовать поверхностные маркеры и клональную перестройку генов гамма цепи Т-клеточного рецептора (ТКР) у пациентов с Т-ЛБГЛ.

Материалы и методы. Обследовано 4 пациентов с Т-ЛБГЛ. Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови проводилось методом проточной цитометрии (Partee. Dako) с использованием моноклональных антител с двойной меткой CD4-F1TC/CD8-PE и CD3-F1TC/CD16- РЕ (Caltag, USA). Для определения клональной перестройки генов гамма цепи ТКР использовался метод ПЦР-LIS SSCP (анализ конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК в растворе с низкой ионной силой).

Результаты. Средний возраст пациентов составил 52 года (от 27 до 62 лет). Медиана продолжительности заболевания -30 месяцев (от 6 до 60). Рецидивирующие бактериальные инфекции, как следствие нейтропении, отмечались у 2 из 4 больных. У одного пациента Т-ЛБГЛ ассоциировался с ревматоидным артритом. Сплепомегалия выявлена у 3 из 4 пациентов. Лимфаденопатия и поражение кожи отсутствовали.

У всех пациентов в анализе периферической крови более 80% лимфоцитов имели типичные характеристики БГЛ. Анемия (Hb< 100 г/л) и абсолютная нейтропения (<2000/мкл) наблюдались в 3 случаях. В двух наблюдениях выявлена диффузная лимфоидная инфильтрация костного мозга (>70% лимфоцитов).

У всех пациентов лимфоциты были представлены CD3 CD8 популяцией. Применение двойной метки показало, что все CD3 лимфоциты одновременно экспрессируют CDI6(BHopMeCD3 C.D16 популяция составляет не более 5% от всех лимфоцитов периферической крови).

У всех пациентов выявлена клональная перестройка генов гамма цепи Т-клеточного рецептора.

Заключение. Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови и молекулярно-генетическое определение Т-клеточной клональности являются ключевыми методами диагностики Т-ЛБГЛ на современном этапе.

НОВАЯ СТРАТЕГИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ИММУНОРЕГУЛЯЦИИ: ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА

Евстропов В.М., Балязин В.А., Красулин В.В., Кузнецов В.П., Гольдшмидт П.Р., Санамянц В.А.

Ростовский государственный медицинский университет, Научный центр коррекции иммунологического надзора, городской онкологический диспансер,

Ростов-на-Дону,

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН,

Москва, Россия

Известно, что система естественной цитотоксичности выполняет функции контроля за пролиферацией и дифферен-цировкой клеток различного происхождения. При этом клетки-мишени испытывают на себе не только цитотоксическое, но и регуляторное влияние эффекторов естественной цитотоксичности. В режиме иммунологического надзора (ИН) функционируют многие клетки данной системы: естественные киллеры, естественные супрессоры, нейтрофилы, моноциты (макрофаги), тромбоциты, тимоциты. Кроме того, в реализации ИН принимают участие и T-киллеры. Современные иммунологические технологии позволяют выявлять в крови количественный уровень иммуноцитов, способных осуществлять цитотоксичность. Гораздо сложнее определять их функциональный потенциал. К тому же многочисленность субпопуляций иммуноцитов, реализующих ИН, и ограниченность их представительства в периферической крови делает практически невозможной интегративную клинико-иммунологи-ческую оценку эффективности ИН у пациентов путём исследования функций киллерных клеток. В связи с этим, мы предприняли попытку оценить эффективность ИН по результатам его конечной деятельности, то есть с помощью разработанного ранее способа определения трансформированных клеток (В.М. Евстропов, 1998).

Цель исследования. Исследование эффективности ИН путём использования определения уровня трансформированных клеток (ТК).

Материал и методы. Исследуемый показатель определяли при атопическом дерматите у 39 обследуемых, хроническом рецидивирующем герпесе у 162 больных, гриппе и ОРВИ у 38 пациентов, обострении хронических неспецифических заболеваний лёгких у 47 обследуемых и хронического гастрита у 34 пациента. У 34 больных был фурункулёз. Онкологические пациенты были представлены следующим образом: первичные опухоли головного мозга, рак молочной железы, матки, толстой кишки, желудка у 117 больных различной стадии заболевания; миома, эндометриоз, мастопатия у 576 пациентов, доброкачественная гиперплазия простаты у 36 обследуемых. Контрольные нормативы были получены обследованием 48 практически здоровых лиц в возрасте 18-28 лет. Повторное определение ТК проводилось через 3 недели или после окончания лечения.

Результаты. Высокая чувствительность теста позволила выявить резкое повышение в 2-4 раза фонового уровня ТК у

11% практически здоровых лиц, однако при их повторном обследовании спустя 3 недели этот показатель остался высоким лишь у 4%. Аналогичные данные у 5-10% были получены при обследовании больных атопическим дерматитом, бронхитом и гастритом, герпесом в стадии ремиссии. Причём повторное обследование не выявило существенных изменений. Высокий уровень ТК встречался чаще при доброкачественной гиперплазии простаты (в 14%), миоме, мастопатии, эндо-метриозе, фурункулёзе и ОРВИ (в 65-85%). Наиболее часто высокий уровень ТК выявлялся при обострении хронического рецедивирующего герпеса (в 87%) и в начальных стадиях злокачественных опухолей (90%). Повторное обследование показало, что, спустя 3 недели частота выявления высокого уровня ТК резко снижается при гриппе и ОРВИ. При остальной патологии, за исключением злокачественных опухолей, эта ситуация наблюдалась лишь после клинически эффективного специализированного оперативного или консервативного лечения (в том числе иммунокоррекции). Для иммунокоррекции использовали Лейкинферон и Имунофан . При злокачественных опухолях уровень ТК оставался высоким у 25% пациентов. Обращает на себя внимание тот факт, что степень увеличения этого показателя не всегда коррелирует с тяжестью заболевания. В частности при инфекционной патологии (грипп, фурункулёз, ОРВИ) уровень ТК зачастую существенно превышал фоновый (в 3-4 раза). Однако он быстро снижался в процессе лечения у большинства таких пациентов. При злокачественных опухолях, напротив, даже двукратное увеличение показателя по отношению к фоновому, оставалось неизменным до оперативного удаления новообразования.

Заключение. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о дефекте ИИ при достаточно широком спектре патологических процессов. Снижение эффективности ИИ может быть как умеренным, так и значительным. Иногда дефект ИН носит транзиторный характер. В других случаях он относительно стабилен. В связи с этим, а также учитывая корреляцию уровня ТК с клинической эффективностью лечения у обследованных нами пациентов, рекомендуется определение данного показателя проводить в динамике заболевания.

ОЦЕНКА СПОНТАННОГО И ИНДУЦИРОВАННОГО АП0ПТ03А У БОЛЬНЫХ С ГЕМ0БЛАСТ03АМИ

Заботима Т.Н.,Соколовская A.A.

Российский онкологический научный центр им. H.H.Блохина РАМН,

Москва, Россия

Одной из основных характеристик лейкемических клеток является их низкая способность к программированной клеточной гибели - апоптозу. Исследования последних лет показали, что противоопухолевые агенты, включая цитотоксичес-кие и гормональные средства, вызывают апоптоз, т.е. индуцируют самоубийство опухолевых клеток, используя те же пути, что и физиологические индукторы апоптоза.

С целью углубления представлений о биологических свойствах лейкозных клеток исследовали уровень спонтанного и индуцированного апоптоза клеток периферической крови и/или костного мозга 99 больных до проведения специфической терапии и 31 больного в процессе лечения. Относительное содержание ДНК в клетках анализировали методом проточной цитоф-люориметрии по распределению интенсивности флюоресценции ДНК специфичного зонда пропидиумом иодидом. Уровень апоптоза в популяции лейкозных клеток оценивали по фрагментации ДНК с обнаружением гиподиплоидной популяции клеток.

В исследуемую группу вошли 19 больных с острым лимфобластным лейкозом (OJ1JI), 5-е острым миелобластным лейкозом (OMJ1), 32-е хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ), 43-е миелодиспластическим синдромом (МДС). В бластных клетках 10 детей, больных ОЛЛ, до проведения специфической терапии уровень спонтанной фрагментации ДНК составил 1,42%. На фоне проведения комбинированного лечения доля апоптотических клеток достоверно увеличивалась до 34,6±7,3% и достигала максимальных значений к 21 дню лечения. Необходимо заметить, что наивысшие значения 81,0% и 94,5% определялись у больных с CD95 пре-пре-В вариантом ОЛЛ. У 5 первичных больных с ОМЛ уровень спонтанного апоптоза в бластных клетках составлял 3,7±1,6%, при этом на фоне лечения показатели оставались на том же уровне. Проведен анализ показателей спонтанного апоптоза в 28 образцах лейкозных клеток (21 -кровь, 7-костный мозг) от больных ХЛЛ до лечения и 7 образцах (4-кровь, 3- костный мозг) на фоне индукционной терапии. Установлено, что в дебюте заболевания значения соответствовали 1,38+0,6% в крови и 3,7±1,2% в костном мозге, в дальнейшем эти параметры возрастали до 11,1 ±1,7% и 50,3±20,1% соответственно. При этом экспрессия CD95 (FAS/APO-1) молекулы, опосредующей апоптоз, не превышала 10%), что может указывать на CD95-независимый механизм действия противоопухолевых препаратов, используемых при данной форме лейкоза. У первичных больных с рефрактерной анемией (РА) апоптоз обнаружен в 20,1 ±4,3%) клетках костного мозга, а на фоне терапии происходило двукратное снижение показателей 13,5±4,7%. Аналогичная динамика зафиксирована в группе больных с РА с избытком бластов (РАИБ). Клетки больных РАИБ с трансформацией бластов до лечения имели фоновые показатели, а воздействие ПХТ повысило содержание до 31,2%.

Таким образом, установлено, что при некоторых формах гемобластозов индукционная терапия инициирует каскад апоптотических событий в лейкемических клетках, а фармакологические манипуляции апоптозом открывают новые стратегии лечения онкологических больных.

ПЕРВЫЙ ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ ИММУНОМОДУЛЯТОРА СУПЕРЛИМФА В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ

Златник Е.Ю., Васильева Ю.Я., Закора Г.И., Галковская Л.В.

Научно-исследовательский онкологический институт М3 РФ,

Ростов-на-Дону, Россия,

Российский государственный медицинский университет,

Москва, Россия

Введение. Суперлимф (СЛ) представляет собой естественный комплекс полипептидов, включающих IL-1,2,6, MIF, TGF, TNF и предназначен для наружного применения при раневых процессах, сопровождающихся нарушением репарации и местного иммунитета.

Цель и задачи исследовании. Целью данной работы является изучение возможности применения этого препарата у больных раком вульвы в послеоперационном периоде.

Материалы и методы. У 8 больных раком вульвы в послеоперационном периоде I-III стадией в возрасте от 37 до 72 лет изучали иммунный статус до и после местного применения СЛ в виде курсом из 5 аппликаций по 1 ампуле в день.

ТАБЛИЦА. ВЛИЯНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ СЛ НА ИММУННЫЙ СТАТУС БОЛЬНЫХ РАКОМ ВУЛЬВЫ.

Показатели Фон После лечения

Суперлимф Контроль

Т-лимфоциты,% 47,7±1,6 53,5+1,8 * 49,2+4,2

В-лимфоциты,% 16,9±0,5 18,8+0,54 * 19,2±1,86

CD4+ / CD8+ 1,05±0,079 1,48+0,14 * 1,3+0,28

ИЦ 2,1+0,147 3,0±0,18 * ** 2,3+0,29

ПМТМ,% 43,1 ±1,38 53,0+3,5 * ** 40,0±1,5

Примечания: * - статистически достоверные отличия от фона (р<0,05), ** - отличия от контроля (р <0,05).

Контрольную группу составляли аналогичные больные, получающие стандартное лечение в послеоперационном периоде. Первое исследование проводили после химиотерапии и вульвэктомии, второе - через 2-3 недели. Изучали количественные и функциональные характеристики основных звеньев иммунитета: определения основных популяций Т- и В-клеток, числа NK-клеток и индекса цитотоксичности (ИЦ) с клетками-мишенями К 562, показателя макрофагальной трансформации моноцитов (ПМТМ).

Результаты. Результаты представлены в таблице, из которой видно, что применение CJ1 сопровождалось повышением общего количества Т- и В- клеток, улучшением баланса регуляторных субпопуляций, стимуляцией макрофагального и NK-клеточного звеньев. У 6 из 8 больных, получающих СЛ, послеоперационная рана не инфицировалась и зажила первичным натяжением в течение 7-10 дней; в 2 случаях отмечено более длительное заживление.

Заключение. Представленные данные говорят о целесообразности использования СЛ для стимуляции факторов противоопухолевой защиты и регенерации у больных раком вульвы.

ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА В ОНКОЛОГИИ

Иванов П.К.

НИИ Экспериментальной Диагностики и Терапии Опухолей Российского Онкологического Научного Центра им. H.H. Блохина РАМН

Большие надежды современной онкологии связаны с применением моноклональных антител (МКА) для терапии опухолей. В отличие от традиционных химио- и радиотерапии препараты МКА обладают высокой специфичностью и менее токсичны. Уже первый опыт клинического использования МКА, таких как ОКТЗ, RITUX1MAB, HERCEPTIN, САМРАТН-1Н, показал их эффективность при трансплантации костного мозга, в терапии гемобластозов, рака молочной железы, яичника и других органов. В основе действия МКА лежат механизмы комплемент-зависимой и антитело-зависи-мой цитотоксичности, а главными эффекторными клетками выступают цитотоксические Т-лимфоциты, натуральные киллеры и макрофаги. Показано, что связывание и блокада клеточных рецепторов антителами может приводить к генерации трансмембранного сигнала, который непосредственно контролирует клеточный рост и приводит к апоптозу.

В РОНЦ им.H.H.Блохина РАМН создана уникальная коллекция гибридом-продуцентов МКА к опухоле-ассоциирова-ным антигенам и дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека. Эти антитела общепризнанны в России и за ру-

бежом, аттестованы в рамках международных рабочих совещаний и широко используются в клинике для диагностики солидных опухолей и гематологических заболеваний, определения иммунного статуса, выявления рецидивов и метастазов.

Целью нашего исследования явилось создание противоопухолевых фармпрепаратов на основе МКА. Препарат АТЭМА (МКА ICO-90) является мощным иммуносупрессан-том. Связываясь с СБЗ-рецептором Т-лимфоцитов человека, он приводит к гибели этих клеток и обрывает иммунный ответ организма на трансплантированные органы или ткани. Экспериментальные исследования и клинические испытания у больных с трансплантированной почкой или костным мозгом показали, что по своим качествам и эффективности действия АТЭМА не уступает признанному во всем мире препарату ОКТЗ.

Моноклональные антитела ICO-25 направлены против опухоль-ассоциированного антигена семейства белков, кодируемых геном MUC1. Этот антиген представляет собой мембранный гликолипопротеин с молекулярным весом более 250 кДа. Его уровень резко повышается в цитоплазме злокачественных клеток при раке молочной железы, яичника, толстой кишки. Эти МКА стали основой разработанного совместно с Московским НИИ онкологии им.П.А.Герцена противоопухолевого препарата ИМУТЕРАН. К настоящему времени получено разрешение Фармкомитета и начата I фаза клинических испытаний препарата.

Закончены предклинические исследования препарата АРИСТАТИН 5 на основе МКА aHTH-CD5 (ICO-80) и а-цепи рицина. Антиген CD5 - гликопротеин с молекулярной массой 67 Кда, экспрессируется на всех стадиях диф-ференцировки Т-лимфоцитов, поэтому иммунотоксин, специфически взаимодействуя с этим антигеном, приводит к гибели клеток и может быть использован при трансплантации аллогенного костного мозга для предупреждения реакции “трансплантат против хозяина”, а также для очистки костного мозга от лейкозных Т-клеток при аутотрансплантации.

Совместно с исследователями ряда институтов оборонного комплекса разработана технология получения полистироль-ных магнитоуправляемых микросфер, их конъюгирования с моноклональными антителами, методы и аппаратура для им-муномагнитной сепарации. Проведенные исследования показали, что полученные конъюгаты специфически связываются с клетками-мишенями, при этом эффективность селекции CD34 гемопоэтических стволовых клеток составила 98%. Это открывает перспективу использования метода для аутологичной транплантации гемопоэтических клеток больным, получающим высокодозную химиотерапию.

ПРИМЕНЕНИЕ МТТ-ТЕСТА И DISC-МЕТОДА В ОПРЕДЕЛЕНИИ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ХИМИОПРЕПАРАТАМ IN VITRO ПРИ ДЕТСКИХ ОСТРЫХ ЛЕЙКОЗАХ

Иншаков A.H., Логачева Н.П., Кузьмина С.С., Майкова С.А., Барышников А.Ю.

НИИ Экспериментальной Диагностики и Терапии Опухолей Российского Онкологического Научного Центра им. H.H. Блохина РАМН

Цель исследования. Изучить возможности прогнозирования резистентности опухолевых клеток больных к химиотерапевтическим препаратам до их применения in vivo и подбора наиболее эффективных программ лечения, основанных на индивидуальной характеристике опухолевых клеток.

Материалы и методы. Оценка чувствительности опухолевых клеток к химиопрепаратам in vitro была проведена DÍSC-методом и МТТ-тестом у 13 детей в возрасте от 2 до 11 лет с диагнозом острый лейкоз. Из них 8 детей были с острым лим-фоблатеным лейкозом (ОЛЛ) и 5 детей с острым миелобласт-ным лейкозом (ОМЛ). При оценке чувствительности in vitro оценивали препараты, которые входят в программы БФМ-90 (преднизолон, рубомицин, винкристии) для ОЛЛ и БФМ-87 (рубомицин, циторабин, этопозпд) для ОМЛ. Клинический эффект оценивали на 33 день, после выхода больных из гипоплазии.

У 8 больных ОЛЛ на 33 день была достигнута ремиссия. У 7 из 8 больных была получена чувствительность in vitro к преднизолону, рубомицину и впикристипу. У одного больного была получена устойчивость in vitro к преднизолону, при чувствительности к рубомицину и винкристнну (больной с прс-Т клеточным вариантом ОЛЛ). У всех больных процент эффективных препаратов in vitro был 66-100%.

У 3 из 5 больных ОМЛ наблюдалась клиническая резистентность к проводимой химиотерапии и больные умерли от прогрессирования основного заболевания. In vitro у одного из трех больных наблюдалась устойчивост ь ко всем трем препаратам: рубомицину, циторабину, этопознду (М2 с транслокацией t(8:21)); у двух больных наблюдалась чувствительность in vitro только к этопознду (М4, М2 е нормальным кариоти-ном). У двух больных ОМЛ была достигнута ремиссия на 33 день и in vitro эти больные были чувствительны к одному из препаратов, используемых в программе лечения (Ml - к док-сорубицину, М5 - к этопознду). Однако, при дальнейшем наблюдении, через несколько месяцев у этих больных были диагностированы ранние рецидивы и больные погибли. Процент эффективных in vitro препаратов у всех больных в этой группе составил меньше 33%.

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ЦИТОКИНОВ В ОНКОЛОГИИ

Кадагидзе З.Г., Славина Е.Г., Черткова А.И., Абрамов М.E., Гуторов С.Л.

Российский онкологический научный центр РАМИ, Москва, Россия

В современной клинической практике наиболее широкое распространение имеет иммунотерапия е применением цито-кинов в режиме монотерапии пли в сочетании е химиотерапией и другими видами лечения. Показано противоопухолевое действие, по крайней мере на одной опухолевой модели, IL-Ioí, 1L-2, 1L-3, 1L-5, 1L-7, IL-12, 1L-15, 1L-18, G-CSF, GM-CSF. TNF-a. В РОНЦ РАМН при лечении ряда злокачествен-

ных новообразований активно применяется интерферон-а2. Положительный клинический эффект достигнут у ряда больных, особенно при раке почки и меланоме. Результаты иммунологических исследований показали, что по проценту лимфоцитов, экспрессирующих молекулы CD38, HLA-DR и рецептора для интерлейкина-2, эффективно леченные больные существенно отличаются от больных с прогрессированием заболевания, а интерферон изменяет эти показатели. Количество CD 16 лимфоцитов мало различается у больных обеих групп, но их функциональная активность у больных леченных с эффектом исходно достоверно выше и в результате лечения продолжает повышаться.

Некоторый позитивный эффект был также выявлен при использовании человеческого рекомбинантного интерлейки-на-lß (бсталейкина). При исследовании уровня цитокинов в сыворотке крови 39 больных с множественной меланомой, леченных только полихимиотсрапией или в сочетании с бета-лейкином и а-интерфероном (Роферон А), были определены концентрации интерлейкинов 2 и 6, фактора некроза опухо-ли-а и растворимого рецептора для интерлейкина-2 методом ИФА с использованием наборов производства фирм Diaclon или Boehringer Mannheim Со. Интерлейкин-2 не присутствовал в определимых количествах ни в одной исследуемой сыворотке. В сыворотках 26 больных не выявлено также интер-лейкина-6, а у 13 больных он определялся в концентрациях 20-120 pg/ml. У большинства больных с позитивным клиническим эффектом - полная или частичная ремиссия или стабилизация болезни, не выявлен или обнаружен лишь в низких концентрациях фактор некроза опухоли-а, но больные с прогрессирующим заболеванием имели более высокие концентрации этого цитокина. У большинства больных определялся очень высокий уровень растворимого рецептора к 1L-2, однако у 3 больных во время частичной ремиссии он присутствовал в сыворотке крови в значительно более низкой концентрации.

ВЛИЯНИЕ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ СДВИГОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ ПРИ РОСТЕ ПЕРЕВИВАЕМОЙ ГЕПАТОМЫ

Киселева Е.П.

Научно-исследовательский институт эсперчментальной медицины РАМН,

С.-Петербург, Россия

Макрофаги и их продукты играют важную роль в регуляции воспаления, ангиогенеза и тканевого гомеостаза, и поэтому состояние их функциональной активности существенно для выживания и пролиферации опухолевых клеток в организме. В наших предыдущих исследованиях было показано, что при росте гепатомы 22а в организме сингенных мышей наблюдалось три пика усиления функциональной активности перитонеальных макрофагов. При этом происходило увеличение продукции нитроксид и супероксид радикалов, пи-иоцнтоза и разнонаправленные изменения содержания фермента 5’-нуклеотидазы (5’Н), в зависимости от срока после инокуляции опухолевых клеток. Известно, что опухолевый рост в организме сопровождается существенными изменениями тканевого метаболизма. Задачей настоящей работы было изучение корреляций между гуморальными показателями углеводного и липидного обмена, с одной стороны и динамикой изменений функциональной активности макрофагов, с другой. Сопоставления активности макрофагов про-

водили с уровнем содержания лактата и холестерина в сыворотке крови мышей, а также с уровнем содержания TNF-а, который, благодаря свой способности ингибировать ли-попротеид липазу, известен как фактор, вызывающий кахексию.

Мышам СЗНА п/к инокулировали 105 клеток сингенной перевиваемой гепатомы 22а. Через определенные интервалы времени животных забивали и определяли в сыворотке крови уровни содержания лактата, TNF-a, общего и а-хо-лестерина, а также триглицеридов с помощью наборов для спектрофотометрического измерения. Продукцию нитро-ксид анионов определяли по содержанию NO, в супернатантах макрофагов с помощью реактива Грисса; продукцию супероксид анионов - в НСТ-тесте; пиноцитоз - по поглощению красителя нейтрального красного; активность 5’Н - биохимическим методом по образованию неорганического фосфата.

В предварительном исследовании было показано, что TNF-а, лактат, и гиперхолестсринемия оказывают стимулирующее влияние на макрофаги. Так, было установлено, что добавление лактата (6,5 мМ) и TNF-a (100 ед/мл) in vitro в культуры перитонеальных макрофагов интактных мышей усиливает продукцию нитроксид (только лактат) и супероксид анионов, пиноцитоз и снижает содержание 5’Н. У животных с экспериментальной гиперлипопротеидемией (без инокуляции опухоли) наблюдали усиление продукции нитроксид анионов и повышение уровня содержания 5’Н. На основании этого было сделано предположение, что увеличение уровня содержания TNF-a, лактата или липопротеидов в сыворотке крови живот-ных-опухоленосителей может явиться причиной системной активации макрофагов.

Повышение уровня содержания TNF-a в сыворотке крови животных с гепатомой не было обнаружено. Уровень содержания лактата был снижен на 7 сут. и повышен на 35 сут. после инокуляции клеток опухоли, что обратно коррелировало с N0,-продукцией макрофагами. Повышение уровня содержания общего холестерина отмечали у животных, начиная с 21 сут., и a-холестерина - с 28 сут. после инокуляции клеток гепатомы. Показатели липидного обмена коррелировали с повышением активности 5’Н на поздних сроках исследования и не коррелировали с этим же показателем на более ранних этапах опухолевого роста. Гиперхолестеринемия может отражать усиление синтеза холестерина в печени, который при этом активно не поглощается клетками гепатомы, поскольку опухоли этого гистогенеза способны к самостоятельно синтезу необходимых для их роста субстратов. Кроме того, как было показано нами ранее, на поздних сроках роста опухоли большую часть опухолевого узла занимают сформировавшиеся зоны некроза, в которых обнаруживали макрофаги, содержавшие значительное количество жировых включений. Повышение активности 5’Н перитонеальных макрофагов, возможно, отражает утилизацию ими продуктов распада опухоли, и в частности, липидов, поступающих в кровь. Таким образом, гиперлипопротсидемия, может являться одним из факторов, определяющих повышение активности 5’Н на поздних сроках развития гепатомы 22а, что однако не объясняет других изученных нами изменений фенотипа мононуклеарных фагоцитов. Сывороточные уровни лактата и TNF-a не играют существенной роли в системной активации макрофагов при росте гепатомы 22а. Можно предположить, что динамика клеточных показателей определяется поступлением в кровь других продуктов опухолевой ткани.

Работа поддержана грантом РФФИ № 00-04-49430.

МОНИТОРИНГ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИММУННОГО СТАТУСА У БОЛЬНЫХ ЛИМФОПРОЛИФЕРАТИВНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ПОСЛЕ ВЫС0К0Д03Н0Й ПОЛИХИМИОТЕРАПИИ (ВДПХТ) С ПОСЛЕДУЮЩЕЙ ТРАНСПЛАНТАЦИЕЙ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ ГЕМОПОЭЗА

Короткова О.В., Заботина Т.Н., Ларионова В.Б., Кадагидзе З.Г.

Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН,

Москва, Россия

В настоящее время показана высокая эффективность проведения ВДПХТ с восстановлением кроветворения трансплантацией аутологичного гемопоэтического материала при лечении больных лимфопролиферативными заболеваниями с резистентным течением или ранними рецидивами. Для пациентов, переживших ранний посттрансплан-тационный период особо важной является проблема восстановления иммунного гомеостаза. Клинико-иммунологическое обследование было проведено у 24 больных в возрасте от 17 до 42 лег с лимфогранулематозом (ЛГМ) и злокачественными лимфомами. Оценку иммунологического статуса проводили на этапах до ВДПХТ и в период реабилитации через 1,6, 18 месяцев. Состояние клеточного иммунитета изучали по экспрессии поверхностных антигенов лимфоцитов CD3, CD5,CD7, CD4, CD8, CD20, CD16, HLA-DR, CD38, CD25, CDllb, CD45RA, CD71, CD95. Гуморальный иммунитет определяли по синтезу сывороточных IgG, IgA, IgM. Исходно у всех больных были снижены Т-кле-точные маркеры (CD3, CD5,CD7), нарушена субпопуляци-онная структура Т-клеточного звена за счет резко сниженного относительного и абсолютного количества CD4 лимфоцитов. У анализируемой группы больных было повышено число лимфоцитов, экспрессирующих активационные антигены HLA-DR, CD38, CD71. В период реабилитации отмечено, что относительное число Т-лимфоцитов (CD3, CD5, CD7) достигает показателей группы сравнения, но субпопуляции Т-клеток не сбалансированы. Характерно значительное повышение уровня CD8 эффекторных Т-лимфоцитов на фоне явного недостатка CD4 лимфоцитов. Уровень маркера CD50 возрастал до 90,8±2,7%; р<0,05 по сравнению со значением до ВДПХТ и практически не отличался от контроля при достижении ремиссии, в то время как у больных с прогрессированием опухолевого процесса этот показатель оставался на прежнем уровне или значительно снижался. Синтез IgA оставался недостаточным, а концентрация в крови IgG и IgM приближалась к нормальным значениям. Улучшение клинико-иммунологических параметров отмечено у 80% обследуемых пациентов, что отражалось на качестве их жизни.

Мониторинг показателей иммунологического статуса показал зависимость между клиническими признаками иммунологической недостаточности и изменениями в системе Т-лимфоцитов, NK- клеток и гуморального звена иммунитета. В связи с этим необходимо разрабатывать различные схемы иммунокоррегирующей терапии, повышающей резервные возможности организма и нормализующие иммунный гомеостаз, и, следовательно, улучшающие качество жизни больных с данной патологией.

V”: .Ci-- *

HLA БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ МИЕЛОЛЕЙКОЗОМ, ПОДВЕРГШИХСЯ ТРАНСПЛАНТАЦИИ АЛЛОГЕННОГО КОСТНОГО МОЗГА

Кутьина Р,М.. Головкина Л.Л., Красникова H.A., Зотиков Е.А., Любимова Л.С., Кузьмина Л.А.

Гематологический Научный Центр РАМН,

Москва. Россия

При аллогснной трансплантации костного мозга (ТКМ) роль системы HLA является основополагающей. Однако несмотря на идентичность HLA реципиента и донора-сибса у 30% - 40% больных после ТКМ развивается острая реакция траиспланта против хозяина (РТПХ). Ряд авторов связывает РТПХ с несовместимостью по минорным антигенам гистосовместимости (шНА). Показано, что такие нммуногенные минорные антигены как НА-1, -2, -4, -5 обнаруживаются преимущественно у лиц, экспрессирующих HLA-A2, а НА-3 - у лиц с HLA-A1 в фенотипе. В то же время известно, что иосительство определенных HLA является фактором предрасположенности к развитию ряда заболевании или патологических состояний.

Целью нашей работы был анализ данных HLA фенотипа больных хроническим миелолейкозом (ХМЛ) в связи с развитием или отсутствием у них острой РТПХ. В анализ включены сведения о 36 больных, которым в хронической фазе была осуществлена ТКМ от HLA-идентичных сибсов за период с 1990 года по 2000 год. HLA определяли путем серологического типирования общепринятым методом. Кондиционирование больных проводилось циклофосфаном в сочетании с тотальным облучением тела и миелосаном в сочетании с циклофосфаном. В целях профилактики РТПХ больные получали циклоспорин, пред-низолон. Степень РТПХ оценивали согласно стандартным клиническим критериям.

Частоту HLA антигенов локусов А и В (всего 24 антигена) вычисляли в группе из 36 больных, в двух подгруппах, одна из которых включала больных без РТПХ и с острой РТПХ не выше 1 -ой степени (1 8 человек), а другая - 18 больных с острой РТПХ выше 1-ой степени тяжести.

Частота анализируемых HLA у больных ХМЛ соответствовала частоте встречаемости этих антигенов, вычисленных для населения европейской части нашей страны. При сопоставлении частоты HLA у больных в двух подгруппах оказалось, что антигены HLA--A1 и HLA-A2 в два раза чаще были выявлены в фенотипе больных с тяжелой РТПХ (38,9% против 17,6%, р>0,5 и 66,6% против 29,4%; р<0,02 соответственно). Антиген 11LA-A9 напротив реже обнаруживался на лимфоцитах больных, у которых развилась тяжелая РТПХ, чем без нее 11,1% против 35,5%; р=0,2. Частота других HLA в обеих подгруппах не имела существенных отличий.

Можно полагать, что имеется определенная корреляция между антигеном главного комплекса гистосовместимости и острой РТПХ в тяжелой степени. Поэтому кандидаты для ТКМ, имеющие в фенотипе HLA-A2, могут быть подвергнуты дальнейшему обследованию для выяснения их совместимости по минорным антигенам.

fey,-

ЭКСПРЕССИЯ АПОПТОТИЧЕСКИХ БИОМАРКЕРОВ НА ЭТАПАХ В-КЛЕТОЧНОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ

Лмсюк Е.Ю., Логачева Н.П., Бялик Т.Е., Волкова М.А., Кузнецова С.С., Майкова С.А., Заботина Т.Н., Барышников А.Ю.

НИИ Экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН,

Москва, Россия

Целью настоящего исследования было определить экспрессию ответсвенных за апоптоз биомаркеров на различных этапах В-клеточной дифференцировки.

Методом проточной цитометрии на проточном цитофлуо-риметре FACScalibur, Becton Dickinson с помощью моноклональных антител мы анализировали экспрессию белков Вс1-2 (DAKO, Клон 124), мутантной формы р53 (Calbiochem, Клон РаЬ240) и антигенов Ki-67 (DAKO, Клон Ki-67) и CD95 (Мед-БиоСпсктр, ICO-160). Биомаркеры определяли в периферической крови 40 больных хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ), и в костном мозге 12 детей и 16 взрослых, больных различными вариантами острых лейкозов (ОЛ).

Обнаружено, что Bel-2 экспрессировался у 69% больных ХЛЛ - положительная экспрессия этого белка (более 20% положительных клеток) наблюдалась у 78% первичных и у 58%) леченых больных. Была обнаружена зависимость экспрессии этого онкобелка от эффекта проведенной терапии. Так, в группе леченых больных, при низкой экспрессии Вс1-2 наблюдался нормальный лейкоцитоз (до 1 х 109 клеток/мл) и лимфоцитоз (до 39%), что свидетельствует о клиническом ответе на лечение. У леченных больных с повышенной экспрессией Вс1-2 наблюдался повышенный лейкоцитоз (12-128 х 10ч клеток) и лимфоцитоз (45-90%), что говорит о плохом клиническом ответе на лечение или его отсутствии. Положительная экспрессия мутантного р53 выявлялась у всех первичных, и ни у одного из исследованных леченых больных. Экспрессия Ki-67 определялась у 14% первичных, и ни у одного леченого больного ХЛЛ. Наблюдалось некоторое усиление экспрессии CD95 после лечения: у леченых больных ХЛЛ экспрессия CD95 выявлялась у 11 из 15 больных (73%), тогда как до лечения - у 6 из 15 (40%).

Исследование острых лейкозов у детей проводилось на момент дебюта заболевания. При этом положительная экспрессия Вс1-2 выявлялась у 3 из 12 больных (25% случаев). При уточнении варианта лейкоза, у 2 из 3 детей с положительной экспрессией Вс1-2 был выявлен острый миелобластный лейкоз (OMJI). У одного ребенка с высокой экспрессией этого белка был поставлен острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ), но в то же время у него наблюдалась высокая экспрессия миелоидных маркеров CD33 и CD 13. У двух больных ОЛ наблюдалось одновременное повышение экспрессии мутантного р53 и Ki-67. При уточнении варианта ОЛ было выяснено, что оба ребенка находились в рецидиве острого лимфобластного лейкоза.

Исследование ОЛ у взрослых проводилось главным образом на больных ОМЛ. При этом было показано, что положительная экспрессия Вс1-2 не выявлялась ни у одного из 16 обследованных больных. Мутантный р53 экспрессировался в 25% случаев. Положительная экспрессия Ki-67 и CD95 выявлялась у 25% и 42% больных соотвественно.

Таким образом, можно предположить, что экспрессия Вс1-2 при ХЛЛ связана с прогрессированием заболевания. При острых миелобластных лейкозах у детей наблюдается положительная экспрессия Вс1-2, в то время как у взрослых, больных ОМЛ, экспрессия этого белка отрицательна.

ОСОБЕННОСТИ ПАПИЛЛОМАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ У ЗДОРОВЫХ ЖЕНЩИН САНКТ-ПЕТЕРБУРГА

Льицев A.A., Александрова Ю.Н., Имяннгов Е.Н.*, Семенова Е.Д., Сафроннпкова Н.Р.*, Руденко В.И., Хансон К.П.*

Больница №31, Клинический центр передовых медицинскгix технологий,

*ПИИ онкологии им. H.H.Петрова,

Санкт-Петербург, Россия

Введение. К настоящему времени установлена ведущая роль папилломавирусной инфекции (Humanpapillomaviruses, HPV) в патогенезе рака шейки матки. Доказано, что более 95% неоплазм шейки матки содержа! HPV "высокого риска” (HPV16, 18. 31, 33, 45 и др.). Наряду с этим, HPV-инфекция выявляется у 30% здоровых женщин. В этой связи диагностика HPV обладает высокой клинической значимостью, гак как позволяет очертить группу онкологического риска, т.е. выявить среди здоровых женщин тех, кому в первую очередь необходимо проведение активных комплексных мер, направленных на профилактику и раннюю диагностику PLUM. Разработка подобного диагностического алгоритма требует знания локальных особенностей HPV-эпидсмиологин в каждом географическом регионе.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение встречаемости HPV-инфекции в популяции здоровых женщин Санкт-Петербурга. Были поставлены следующие задачи: 1) разработать молекулярно-генетический метод диагностики HPV-инфекции; 2) оценить встречаемость генитальной HPV-инфекцип; 3) изучить распределение HPV по типам среди здоровых женщин Санкт-Петербурга; 4) оценить возможную корреляцию между присутствием HPV и некоторыми особенностями репродуктивного анамнеза женщин - возраст на момент обследования, возраст начала половой жизни, общая продолжительность половой жизни и число абортов.

Материал и методы. Для тестирования были отобраны 309 посетительниц гинекологических консультаций в соответствии со следующими критериями: 1) наличие опыта половой жизни; 2) репродуктивный возраст (интервал 15-45 лет); 3) нормальная цитологическая картина эпителия шейки матки; 4) отсутствие специфических заболеваний урогенитального тракта, ассоциированных с HPV-инфекцией; 5) отсутствие текущей беременности. В качестве материала исследования использовали соскоб из цервикального канала, уретры и стенок влагалища. ДНК из соскоба выделяли на сорбенте. Детекцию ДНК HPV проводили с помощью Г1ЦР, применяя пару праймеров рассчитанных на выявление широкого спектра HPV-генотипов. Процедура генотипирования HPV-после-дователыюстей включала технику обратной дот-блот гибридизации и рестрикционное картирование.

Основные результаты. Присутствие папилломавирусов установлено у 29% (90/309) женщин. Тип удалось идентифицировать в 84% случаев. Среди установленных типов в популяции здоровых женщин Санкт-Петербурга преобладающим является HPV16. Он встречался как моноинфекция у 21% женщин и в сочетании с другими типами HPV у 5% обследованных. HPV31 был определен у 11% инфицированных пациенток. Встречаемость остальных генитальных папилломавирусов варьировала от 1% до 6%. Доля смешанных инфекций составила 5% от общего числа выявленных HPV. Согласно полученным результатам генотипирования 58% образцов содержали HPV “высокого риска” 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 56, 58. 68, ММ7 (PAP 291)/LVX 82 (включая смешанные инфекции), 26% - HPV “низкого риска” 6, 11, 53, 61, 62, 66,

69, LVX100, CP141/LVX 160, СР 8304 (включая смешанные инфекции). 16% соскобов, содержащих ДНК-последователь-ности HPV-генома были охарактеризованы как “неизвестные”. В целом картина встречаемости различных типов папилломавирусов аналогична таковой в большинстве европейских стран. Присутствие HPV не коррелировало с возрастом пациенток, возрастом начала половой жизни или общей продолжительностью последней. Однако установлена ассоциация между высоким числом контрацептивных абортов и HPV-ин-фицированностью с достоверностью Р=0,098.

Заключение. HPV-инфекция довольно часто встречается среди здоровых, репродуктивно-активных женщин Санкт-Петербурга и находится на верхней границе этнико-геога-фических вариаций. Данные работы свидетельствуют о высокой целесообразности включения широкомасштабного HPV-тестирования в программы, направленные на профилактику и раннюю диагностику онкологических заболеваний.

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЛЕТАЛЬНО ОБЛУЧЕННЫМ МЫШАМ C57BL/6 СМЕСИ КОСТНОГО МОЗГА И КЛЕТОК СИНГЕННОЙ ЛИМФОМЫ EL-4, ОБРАБОТАННОЙ ЛИМФОЦИТАМИ, ПОЛУЧЕННЫМИ В СМЕШАННОЙ КУЛЬТУРЕ С ПОМОЩЬЮ ИНТЕРЛЕЙКИНА-2

Мыслицкий В.Ф., Ибрагимова Ж.А., Мицкевич П.Б.*

Научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови М3 РБ г.Минск,

Центр трансплантации костного мозга 9-й ГКБ, г.Минск, РБ*

Основной причиной неудачи пересадки аутологичного костного мозга является рецидив лейкоза. В первую очередь это связано с контаминацией костного мозга резидуальными лей-козными клетками. Применяемые в настоящее время методы не позволяют полностью “очистить” костный мозг от лейкоз-ных клеток и при этом сохранить нормальные клегки-пред-шествениики гемопоэза. Ранее мы показали высокую противоопухолевую активность и специфичность эффекторных клеток, полученных в сингенной смешанной культуре С ПОМОЩЬЮ IL-2.

Цель исследования. Оценить эффективность применения эффекторных клеток, полученных в сингенной смешанной культуре лимфоцитов и лейкозных клеток в присутствии IL-2 (CKJIJI+IL-2), для “очистки” in vitro костного мозга, контаминированного сингенными лейкозными клетками.

Материалы и методы. Селезенки мышей С57В1/6 извлекали асептически, готовили суспензию клеток, затем центрифугировали на градиенте плотности фиколл-верографи-на. Полученные мононуклеарные клетки инкубировали с обработанными митомицином-С сингенными лейкозными клетками линии EL-4 и лимфоцитарным IL-2 (100 ME/мл) в среде RPM1-1640 с 10% ЭТС в атмосфере с 5% С02 в CKJTJ1+IL-2. Костный мозг стерильно вымывали из бедренной кости мышей средой 199 с 5% ЭТС и превращали в одноклеточную взвесь. Клетки лимфомы EL-4 культивировали in vitro, затем смешивали с клетками костного мозга в соотношении 1:100. На 5 сутки эффекторные клетки из CKJUT+1L-2 отмывали и инкубировали со смесью клеток костного мозга и сингенных клеток лимфомы EL-4 в течение 6-24 час. при периодическом встряхивании с последующим мягким цент-

рифугированием. После инкубации смесь клеток вводили в/ в летально облученным мышам, в/бр. необлученным мышам, а также помещали в двухслойный агар для контроля колони-еобразования. При пересадке костного мозга на 1 мышь вводили в среднем 1 - 2 млн. ядросодержащих клеток. Мышей, которым произведена пересадка костного мозга, содержали в стерильном ламинарном боксе, в корм добавляли антибиотики.

В результате проведенных исследований установлено, что обработка в течение 6 часов смеси костного мозга и клеток EL-4 эффекторами, полученными в CKJ1JT+IL-2, предотвращает гибель 80% животных, которым произведена пересадка сингенного костного мозга, период наблюдения

- 35 суток. В то же время введение мышам смеси необработанного костного мозга и клеток EL-4 приводило к 100% гибели животных. Обработка костного мозга без примеси клеток EL-4 эффекторами из CKJ1JI+IL-2 не снижала выживаемость мышей в сравнении с контролем введение необработанного костного мозга. Удлинение сроков инкубации смеси эффекторных клеток с клетками костного мозга и лимфомы с 6 до 24 часов позволило полностью нейтрализовать EL-4, однако, приводило к значительной (около 80%) гибели мышей, которым произведена пересадка костного мозга, что вероятно связано с повреждением клеток костного мозга.

Таким образом, обработка костного мозга клетками-эффекторами, полученными в СКЛЛ + 1L-2, позволяет эффективно удалить из него клетки лимфомы EL-4 и существенно повысить выживаемость мышей, после пересадки им конта-минированного клетками EL-4 сингенного костного мозга. Полнота удаления клеток лимфомы из костного мозга подтверждается данными колонеообразования и лейкозогенно-сти in vivo клеток EL-4. Представленные результаты свидетельствуют о возможности применения полученных таким образом противоопухолевых клеток-эффекторов для удаления остаточных лейкозных клеток из аутологичного костного мозга.

СОСТОЯНИЕ ИММУННОГО СТАТУСА У БОЛЬНЫХ ЛИМФОГРАНУЛЕМАТОЗОМ, ВКЛЮЧЕННЫХ В ПРОТОКОЛ R-4

Новик A.A., Никитин В.Ю., Цыган В.H., Долгополова Е.В.

Военно-Медицинская Академия,

Санкт-Петербург, Россия

В последние десятилетия отмечается значительный рост случаев лимфогранулематоза (ЛГМ) среди населения (заболеваемость 9,9 "/,„„„„) и его омоложение. ЛГМ представляет собой злокачественную лимфоидную опухоль (14% среди неоплазий), встречающуюся в основном в виде нодулярного склероза (75% случаев) или смешанно-клеточного варианта (20 - 30%). Это заболевание сопровождается выраженными изменениями со стороны иммунной системы, которые полностью еще не изучены.

Цель работы. Изучение изменений иммуннологического статуса больных лимфогранулематозом с целью выявления их взаимосвязей с тяжестью заболевания, проводимой терапией, развитием инфекционных осложнений и рецидивов.

Материалы и методы*. Обследовали 15 больных с ЛГМ в возрасте 25±5 лет. Лечение проводили по протоколу R-

4, включающему 6 или 8 курсов полихимиотерапии (ПХТ) и/или лучевую терапию (программа COPP-ABV). Состояние иммуннологического статуса оценивали до начала

ПХТ, в процессе лечения, после лечения. Субпопуляци-онный анализ лимфоцитов проводили на проточном цитометре, исследовали функциональную активность Т-лим-фоцитов; нейтрофильный фагоцитоз и бактерицидность нейтрофилов. В сыворотке крови определяли концентрации основных классов иммуноглобулинов IgA, IgM, IgG и ЦИК.

Результаты. При исследовании Т-клеточного звена иммунитета у больных с ЛГМ до лечения было обнаружено снижение содержания CD3 , CD4 и CD8 лимфоцитов и индекса CD4 /CD8 по сравнению контролем, однако эти различия были недостоверны. В то же время наблюдалось выраженное увеличение натуральных киллеров, содержание которых в 4 раза превышало контрольный уровень. Сравнительный анализ показателей гуморального иммунитета выявил незначительное увеличение субпопуляций В-лимфоцитов, повышение концентраций IgM и IgG, ЦИК в сыворотке крови, и снижение - IgA у 85% пациентов. У 15% больных содержание В-лимфоцитов, IgG и IgM, ЦИК было нормальным, отмечалось лишь незначительное повышение IgA.

В ходе лечения у всех больных на фоне лимфопении и нейтропении наблюдалось резкое падение количества CD3 , CD4 , CD8 , CD 19 , CD20 , CD57 лимфоцитов (в 4-7 раз).

11ри анализе CD4 /CD8 лимфоцитов был выявлен дисбаланс в их соотношении, связанный с уменьшением хелперов/ин-дукторов и увеличением цитотоксических лимфоцитов, что проявилось достоверным снижением иммунорегуляторного индекса. Функциональная активность Т-лимфоцитов, уровни IgA, IgM, IgG и ЦИК в процессе ПХТ снизились у всех больных по сравнению с данными показателями до лечения. Несмотря на низкий уровень нейтрофилов в крови, поглотительная и переваривающая способность фагоцитов была увеличена у 80% пациентов.

После лечения у всех больных наблюдалось постепенное восстановление абсолютного числа лейкоцитов, лимфоцитов и нейтрофилов, достигающее своего максимума между 6 и 9 мес. после лечения. Аналогичные изменения выявлены при анализе субпопуляций лимфоцитов. Величина индекса CD4 / CD8 возрастала, хотя количество цитотоксических клеток по-прежнему превалировало над количеством хелперов/индук-торов. Функциональная активность Т-клеток постепенно восстанавливалась к 9 мес. Концентрации IgG, IgA, IgM и содержание ЦИК у 70% больных постепенно нарастали к 9-12 мес. В этот же период времени наблюдалось восстановление функциональной активности нейтрофилов у 90% больных, поглотительная и переваривающая способность увеличивалась в 1,5 раза, превышая показатели контрольной группы и данные до лечения.

Заключение. Проведенные исследования показали, что ЛГМ сопровождается выраженными комплексными изменениями со стороны иммунной системы. Если у первичных больных, выявленные изменения свидетельствуют о некоторой активации гуморального и фагоцитарного звеньев иммунитета, а также механизмов естественной цитотоксичности, то в дальнейшем в ходе лечения у них развивается выраженный вторичный иммунодефицит. В то же время отмечается изменение соотношения CD4 /CD8 лимфоцитов, с выраженным преобладанием цитотоксических лимфоцитов и активизация процессов фагоцитоза, свидетельствующие об усилении механизмов противоопухолевого иммунитета. После лечения у большинства пациентов наблюдается постепенная нормализация практически всех показателей иммунной системы на б и 9 мес. наблюдения, хотя полного восстановления до исходного уровня достичь не удается.

ТАБЛИЦА. ВЫЯВЛЯЕМОСТЬ ХРОМОСОМНЫХ АБЕРРАЦИЙ У БОЛЬНЫХ ОЛ С ПОМОЩЬЮ ЦГ И МГ МЕТОДА-

Хромосомная аберрация Химерный транскрипт Число обследованных больных Выявляемость хромосомной аберрации

ЦГ метод МГ метод

t

t

t

t

t

t

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РТ-ПЦР ДЛЯ ГЕНОДИАГНОСТИКИ ОСТРОГО ЛЕЙКОЗА

Огородникова Ю.С.', Капустин С.И.2, Подольце-ва Э.И.Белогурова М.Б.!, Петрова Э.М.3, Бойченко Э.Г.3, Перекатова Т.Н.4, Лыщев A.A.1

1 Клинический Центр передовых медицинских технологий,

2 Российский НИИ гематологии и трансфузиологии,

3 Детская городская больница N1,

4 Ленинградская областная клиническая больница, Санкт-Петербург, Россия

Введение. Решение задачи диагностики и прогнозирования течения острого лейкоза (ОЛ) невозможно на современном этапе без использования методов генетического анализа

- цитогенетического (ЦГ) и молекулярно-генетического (МГ), позволяющих выявлять специфические изменения генома лейкозных клеток. ЦГ метод позволяет одномоментно идентифицировать различные хромосомные повреждения. Однако, ввиду недостаточно высокой чувствительности этого метода и невозможности выявления с его помощью субмикрос-копических перестроек, в диагностике ряда генетических вариантов ОЛ требуется использование более современного МГ анализа. Наиболее перспективным в этой связи представляется метод, основанный на технологии РТ-ПЦР.

Цель и задачи. Целью работы явились разработка и апробация РТ-ПЦР тестов для выявления шести наиболее диагностически и прогностически важных генетических перестроек при ОЛ. Были поставлены следующие задачи: 1) Разработать методы РТ-ПЦР диагностики химерных транскрип-тов следующих транслокаций -1(9;22), t( 12,21), t(4; 11), t(8,21), t(15;17), 1(16; 16)/invl6; 2) Определить чувствительность и специфичность предлагаемых тестов; 3) Сравнить частоту выявления указанных хромосомных аберраций с помощью ЦГ и МГ методов.

Материалы и .методы. Материалом исследования явились бластные клетки, полученные от 49 больных с В-линейным острым лимфобластным лейкозом - В-ОЛЛ (16 взрослых и 33 пациента детского возраста) и 22 человек с острым нелимфобластным лейкозом - ОнеЛЛ (19 взрослых и 3 пациента детского возраста), проживающих в г. Санкт-Петербурге и Ленинградской области. Больные проходили обследование в гематологических отделениях КЦПМТ, ДГБ N1 и ЛОКБ. Всем пациентам был проведен стандартный ЦГ анализ. Отбор больных для выполнения РТ-ПЦР тестов осуществляли на основании клинико-гематологических и ЦГ данных. Постановка

РТ-ПЦР включала этапы выделения РНК из бластных клеток, получения на ее основе копии кДНК, амплификации с помощью ПЦР специфической для каждого химерного транскрипта ДНК-матрицы, визуализации продукта ПЦР методом электрофореза.

Основные результаты. В ходе данного исследования были разработаны однораундовые РТ-ПЦР тесты, чувствительность которых позволяла детектировать 1 бластную клетку с генетической перестройкой среди 1 ООО нормальных клеток. Сравнительный анализ выявляемое™ хромосомных аберраций у больных ОЛ с помощью ЦГ и МГ метода представлен в таблице.

Использование РТ-ПЦР тестов позволило установить генетический вариант лейкоза у 2/22 (9,1%) больных ОнеЛЛ и в 7/49 (14,3%) случаев ОЛЛ, когда ЦГ анализ был неинформативен.

Заключение. Разработанные РТ-ПЦР тесты обладают достаточно высокой чувствительностью и специфичностью, что позволяет рекомендовать их для использования в клинической практике при решении задачи генодиагностики острого лейкоза.

ЭКСПРЕССИЯ АКТИВАЦИОННЫХ МАРКЕРОВ НА ЛИМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЖЕЛУДКА В КАРЕЛИИ

Олейник Е.К., Шибаев М.И., Олейник В.М.

Институт биологии Карельского НЦ РАН, г. Петрозаводск

Несмотря на большое количество работ по проблеме противоопухолевого иммунитета до сих пор нет четкого представления об особенностях формирования иммунного ответа на раковые клетки. В связи с этим нет единого мнения об изменении иммунологической реактивности в процессе опухолевого роста: происходит ли активация лимфоцитов по мере опухолевой прогрессии или существует иммунологическая толерантность к антигенам опухоли. Поэтому представляет интерес оценка функционального состояния иммунной системы по степени активации лимфоцитов периферической крови при онкологической патологии.

Цель работы - исследование уровня экспрессии активационных маркеров (С071, СБ95 и НЬА-011) на лимфоцитах периферической крови больных раком желудка.

Уровень экспрессии активационных маркеров оценивали методом непрямой иммунофлюоресценции с помощью моноклональных антител. Объектом исследования служили лимфоциты

периферической крови 23 больных раком желудка и 16 здоровых доноров из различных регионов республики Карелия.

В процессе исследования не было выявлено существенных различий в количестве CD3 , CD4 , CD8 и CD16 лимфоцитов у онкологических пациентов по сравнению со здоровыми. В то же время уровень CD 19 клеток оказался выше у больных, чем в контроле: 17,78±2,81% и 10,93±4,04%, соответственно (р<0,05).

При сравнении показателей экспрессии активационных маркеров было обнаружено значительное увеличение CD71 и CD95 лимфоцитов у больных раком желудка, чем у здоровых доноров: 14,59±2,72% и 6,53±3,98%; 14,85±2,78% и 5,67±4,43% (р<0,05), тогда как показатели HLA-DR клеток были приблизительно одинаковыми в обеих группах.

Изучение маркеров Т, В и NK-лимфоцитов в зависимости от стадии заболевания выявило тенденцию к уменьшению числа CD3 лимфоцитов по мере роста опухоли и снижение CD4 /CD8 соотношения меньше 1 при IV стадии онкологического процесса.

Сравнительная оценка уровня экспрессии активационных маркеров на лимфоцитах периферической крови на различных стадиях рака желудка показала незначительное уменьшение CD95 клеток при опухолевой прогрессии. Уровень HLA-DR лимфоцитов был несколько выше при 111 стадии заболевания по сравнению с I-П и IV: 23,80±4,47%, 17,83±6,68% и 16,33±5,68% (р>0.05). Уровень экспрессии CD71 на лимфоцитах периферической крови был приблизительно одинаковым на всех стадиях заболевания.

Таким образом, для больных раком желудка, проживающих в Карелии, характерно усиление экспрессии рецептора трансферрина (CD71) и маркера апоптоза (CD95) на лимфоцитах периферической крови. Уровень CD71 лимфоцитов равномерно повышен на всех стадиях заболевания, тогда как экспрессия CD95 имеет тенденцию к снижению по мере прогрессирования заболевания.

Работа поддержана Российским Фондом Фундаментальных Исследований, проект № 98-04-03521.

ВОЗМОЖНОСТИ КЛИНИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПРОСТАТОСПЕЦИФИЧЕСКОГО АНТИГЕНА ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Панин А.Г., Гранстрем К.О., Ковыршина Л.А., Гайковая Л.Б., Топузов М.Э., Крапивка H.A.

Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия

Введение. В настоящее время надежными методами диагностики заболеваний предстательной железы (ПЖ) считается комбинация пальпаторного исследования через прямую

кишку (ПРИ), определение простатоспецифического антигена (ПСА) в сыворотке крови больных, трансректальное ультразвуковое исследование (ТРУЗИ). Уточняющим приемом диагностики считается пункция ПЖ с морфологическим исследованием биоптата.

ПСА не является опухолеспецифическим антигеном и при разной природе патологического процесса в ПЖ (рак предстательной железы (РПЖ), доброкачественная гиперплазия предстательной железы (ДГПЖ), хронический простатит (ХП) и другие заболевания) наблюдается повышение уровня ПСА в сыворотках больных.

Наиболее актуальным в связи с этим является выявление клинической значимости (чувствительности и специфичности) определения ПСА для диагностики заболеваний ПЖ.

Цели и задачи исследования. Выявлении зависимости между уровнем ПСА и заболеваниями предстательной железы.

Материалы и методы. Обследовано 230 больных с жалобами, указывающими на патологию предстательной железы. Средний возраст обследованных составил 66 лет (более 54,4%). Всем пациентам проводилось ПРИ, ультразвуковое исследование ПЖ, определение ПСА в сыворотке. Для подтверждения диагноза проводилось морфологическое исследование биопсийного и операционного материала. При исследовании уровня ПСА использовалась система иммуноферментного определения ПСА фирмы “VEDA LAB” PSA EIA (Франция). До проведения исследования сыворотки больных хранились при t - 20°С. Ультразвуковое исследование Г1Ж проводили на аппарате ACUSON128XP.

Основные результаты. Представлены в таблице 1.

Из полученных данных следует, что при показателях ПСА превышающих дискриминационный уровень (4,1 нг/мл и выше) с наибольшей частотой у больных обнаруживался рак предстательной железы -41(17,8%). Однако близкие показатели уровня ПСА были зарегистрированы в группах больных ДГПЖ - 55 (23,9%), ДГПЖ + ХП - 84 (36,5%) и у двух больных ХП - 2 (0,9%). Кроме того, при РПЖ один больной имел показатель ПСА соответствующий норме (менее 4,0 нг/мл).

Во всех группах больных отмечается широкий диапазон границ концентраций онкомаркера. Исключение составила лишь группа из двух больных с ХП.

Заключение. Высокие концентрации общего ПСА у больных с доброкачественными заболеваниями ПЖ указывает на невозможность использования данных о количестве этого онкомаркера в качестве надежного критерия при диагностике РПЖ. Для более корректной трактовки полученных результатов лабораторного теста (определение ПСА) продолжается проведение углубленного анализа клинического материала с учетом показателей свободного и связанного ПСА, размеров ПЖ, плотности, гистологической формы опухоли, возраста больных.

ТАБЛИЦА 1. ИЗМЕНЕНИЯ В ПРВДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЕ У ПАЦИЕНТОВ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ УРОВНЯ ПСА

Уровень ПСА, нг/мл ДГПЖ ДГПЖ+ХП РПЖ ХП Всего

Абс. % Абс. % Абс. % Абс. % Абс. %

0 - 4,0 29 12,6% 18 7,8% 1 0,4% 0 0% 48 20,9%

4,1 - 10,0 26 11,3% 33 14,4% 9 3,9% 1 0,4% 69 30,0%

10,1 - 20,0 16 6,9% 28 12,2% 12 5,2% 1 0,4% 57 24,8%

20,1 - 30,0 6 2,6% 18 7,8% 7 3,0% 0 0% 31 13,5%

30,1 и более 7 3,0% 5 2,2% 13 5,7% 0 0% 25 10,8%

Итого: 230

ДЕНДРИТНЫЕ КЛЕТКИ - ПРОИЗВОДНЫЕ КЛЕТОК ЛЕЙК03Н0Г0 КЛОНА ИНДУЦИРУЮТ ПРОТИВОПУХОЛЕВЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ В КУЛЬТУРАХ АУТОЛОГИЧНЫХ ЛИМФОЦИТОВ БОЛЬНЫХ ОМЛ

Садовникова Е.Ю., Паровичиикова Е.Н., Савченко В.Г.

Гематологический Научный Центр РАМН,

Москва, Россия

Успех противоопухолевой иммунизации зависит, во-пер-вых, от пммуногенности применяемой вакцины, и во-вторых, от способности иммунной системы больного отвечать на индукционное воздействие препарата. Исследования последних лет указывают на то, что использование дендритных клеток в качестве адъюванта при создании противоопухолевых вакцин в значительноегь степени повышают иммуногенность опухолевых антигенов. В настоящей работе продемонстрировано, что бластные клетки больных ОМЛ (12/14) под воздействием ростовых факторов (GM-CSF, 1L-4 и TNFa) приобретают иммунофенотип дендритных клеток (CD40 , CD54', CD80’, CD86). Иммуногенность дендритных клеток - производных клеток лейкозного клона - доказана путем индукции специфического иммунного ответа в культурах лимфоцитов, полученных у больных в период ремиссии (3 из 4 случаев). Стимулированные лимфоциты избирательно лизировали бластные клетки, но не нормальные клетки, полученые в период ремиссии, клетки здорового донора или клетки линии К562. Клетки-эффекторы активно пролиферировали в присутствии аутологичных бластов, но не контрольных клеток. Эти данные свидетельствуют о компетентности иммунной системы больных ОМЛ, находящихся в ремиссии, по отношению к используемым клеткам-стимуляторам. Т-клсточный репертуар резистентных больных (в 2-х из 3-х случаев) также был способен отвечать на индукционное воздействие дендритных клеток. Полученные результаты указывают на потенциальную возможность использования дифференцированных под действием цитокинов бластных клеток для разработки противоопухолевых вакцин с целью эрадикации опухолевых клеток при минимальной остаточной болезни, так и для снижения опухолевой массы в случае резистентных форм лейкозов.

ИММУНОПАТОГЕНЕЗ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ В-КПЕТОЧНЫХ ЛИМФОМ

Серебряная Н.Б., Новик A.A., Федоров А.Б., Киселева М.В.

Военно-медицинская академия,

Санкт-Петербург

В-клеточные лимфомы представляют собой обширную группу лимфоидных опухолей, которая в последнее время была расширена за счет отнесения к ней лимфом Ходжкина (лимфогрануломатоза - ЛГМ). Характерные черты В-клеточ-ного лимфомагенеза определяются уникальной молекулярной биологией нормальных ß-лимфоцитов. Для производства большого количества различных антител В-лимфоциты используют стратегию, позволяющую минимизировать количество информации, содержащееся в зародышевой конфигурации генов. Эта стратегия включает рекомбинации сегментов зародышевых генов, кодирующих вариабельные области иммуноглобулинов, на ранних стадиях развития В-лимфоцита. Во вторичных лимфоидных тканях последующие генные реаранжировки обеспечивают переключение изотипа иммуно-

глобулина, а механизм соматических мутаций способствует дальнейшему разнообразию репертуара иммуноглобулинов. В патологических случаях процесс реаранжировки приводит к ошибочному связыванию сегментов иммуноглобулиновых генов с клеточными онкогенами (с-тус, bcl-I, bcl-2 и bcl-6), обеспечивающими клетке преимущественные условия выживания.

При лимфоме Беркитта ген с-тус перестраивается в область одного из локусов генов иммуноглобулинов и чрезмерно экспрессируется, обеспечивая клетке длительный пролиферативный стимул, приводящий к агрессивному заболеванию. При лимфомах из клеток мантийной зоны наблюдается транслокация и гиперэкспрессии гена bcl-I, который кодирует циклин D, вовлекающий клетку в G1 фазу клеточного цикла. Циклин D1 при трансформации может кооперироваться с другими онкогенами и расширяет туморогенную активность онкогенов туе. При фолликулярных лимфомах ген bcl-2 транс-лоцируется в локус гена иммуноглобулина, что приводит к его избыточной экспрессии и повышает продолжительность жизни клеткам за счет антиапоптотического действие. При диффузных крупноклеточных лимфомах выявлена гиперэкспрессия гена bcl-6, нормальная функция которого у человека и роль в лимфомагенезе неизвестна. В развитии опухолевой прогрессии при В-клеточных лимфомах критическая роль принадлежит, по-видимому, гену р53, относящемуся к группе генов, супрессирующих опухоль.

В соответствии с новыми фактами, атипичные клетки Ход-жкина-Рида-Штернберга, наличие которых характерно для ЛГМ, рассматриваются как трансформированные ранние цен-гробласты с неблагоприятными соматическими мутациями в регионе V , которые в физиологической ситуации привели бы В-клетку смерти. Они отличаются от клеток фолликулярных лимфом, представляющих собой поздние центробласты или ценгроциты с такими типами мутаций, которые разрешают выживание клетки при продолжающейся антигенной селекции.

При лимфоцитарном варианте ЛГМ в Уи-генах продолжаются многочисленные соматические мутации, число которых сопоставимо с таковым при фолликулярных лимфомах. При других подтипах ЛГМ (нодулярный склероз и смешанно-клеточный вариант) Ун-гены также имеют значительное количество соматических мутаций, что свидетельствует об активности механизмов антигенной селекции. В тех случаях, когда при реаранжировках Уп-гена формируется нефункциональный стоп-кодон, иммуноглобулиновый ген перестает экспрессироваться, что приводит к формированию атипичных клеток. Неопластические В-клетки зародышевого центра при ЛГМ могут выживать, по крайней мере частично, из-за существования мощного трансформирующего фактора, поддерживающего их рост и экспансию. Предполагают, что таким фактором может быть протеин LMP1, который кодируется вирусом Эпшейна-Барр, и является членом суперсемейства рецептора TNF.

При лимфомах желудка и MALT злокачественная трансформация В-лимфоцитов протекает в условиях массивного антигенного давления при хронической инфекции Helicobacter pylori. Длительная антигенная стимуляция и продукция про-воспалительных цитокинов (наряду с генетическими аномалиями) способствуют инициации лимфомагенеза и последующей трансформации достаточно доброкачественных вариантов опухоли в высоко злокачественные. Терапия, направленная только на уничтожение Н. pylori, приводит к регрессу заболевания примерно у 50% пациентов с лимфомами MALT

Цитокины являются мощными регуляторами апоптоза лимфоцитов. Способность цитокинов стимулировать или подавлять апоптоз зависит от сопутствующего вовлечения генов, регулирующих апоптоз {bcl-2, Fas и другие). Некоторые

2001, T. 3, №2

Он ко им му) í о л о г ия

протеин- и тирозинкиназы, ассоциированные с рецепторами цитокинов, активируют и специфичные онкогены.

В докладе будут представлены собственные результаты и данные других авторов, описывающие события, связанные с изменением сывороточной концентрации ряда цитокинов и их продукции МЫ ПК и стромальными клетками лимфатических узлов при различных неходжкинских лимфомах, а также результаты изучения накопления белка bd-2 при указанной патологии.

ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ЛЕКАРСТВ НА MDR+ И BCL-2+ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ: УСИЛЕНИЕ ЧЕЛОВЕЧЕСКИМ РЕКОМБИНАНТНЫМ а-2 ИНТЕРФЕРОНОМ (РОФЕРОН А, Роф А).

Славина Е.Г., Джгамадзс Н.Т., Заботима Т.Н., Черткова А.И., Лейпунская И.Л., Кадагидзе З.Г.

Российский Онкологический научный центр РАМН, Россия, Москва

Хорошо известно, что некоторые цитокины, особенно, ин-терфероны могут усиливать противоопухолевый эффект химиотерапевтических лекарств. В наших предшествующих исследованиях было продемонстрировано усиление цитотокси-ческого эффекта доксорубицина, винкристина, этопозида, ми-токсантрона и некоторых других противоопухолевых лекарств на различных опухолевых клеточных линиях: эритролейек-мии К-562, аденокарцином толстого кишечника НТ-29 и SW-480 - 20-2000 МЕ/мл Роф А. Целью настоящей работы явилось изучение зависимости такого эффекта интерферона с экспрессией клетками двух генов, связанных с чувствительностью клеток к цитотоксическому действию лекарств - mdr-1 и bel-2.

Опыты проводились на клетках аденокарциномы НТ-29 -исходных и трансфицированных геном mdr-1. Трансфекция была проведена с помощью стабильной ретровирусной конструкции, конъюгированной с плазмидой, включающей ген mdr-1, нами в лаборатории молекулярной генетики (рук. -проф. А.В.Гудков) Университета штата Иллинойс (Чикаго, США) с помощью сотрудника этой лаборатории М.А. Никифорова, после чего клетки были подвергнуты селекции возрастающими дозами винкристина в нашей лаборатории. Клетки HeLa - нативные и трансфицированные геном bel-2 - были получены из той же лаборатории. Опыты по изучению цитотоксичности лекарств и модуляции этой цитотоксичности интерфероном проводились с помощью цитотоксического теста в 96-луночных плоскодонных планшетах: клетки рассева-лись в лунки планшетов и выращивались в течение 24 часов, а затем после удаления ростовой среды к ним вносили ряд концентраций доксорубицина, винкристина или 5-фторураци-ла с или без 20 - 2000 МЕ/мл роферона А. Учет результатов проводили МТТ-тестом. Исследование апоптоза проводили с помощью проточной цитофлюориметрии клеток, окрашенных пропидиумом иодидом после фиксации 70° этиловым алкоголем, на проточном цитофлюориметрс FAC'Scan, Beckton Dickinson, San Jose, California, USA с аргоновым лазером с программным обеспечением LYSIS II.

Роферон А в равной степени усиливал цитотоксическое действие доксорубицина и винкристина на нормальные и трансфицированные геном mdr-1 клетки. Более того, цитотоксическое действие mdr-1 -независимого препарата 5-фторура-цила также усиливалось интерфероном. Мы обнаружили также усиление интерфероном цитотоксичности доксорубицина

и 5-фторурацила на нормальных и трансфицированных геном bel-2 клетках HeLa, и это усиление оказалось существенно более выраженным на bel-2* клетках.

Проточная флюориметрия обработанных Роф А и лекарствами культур выявила также повышение пропорции клеток, имеющих признаки апоптоза и сниженное количество ДНК. Усиливающая цитотоксичность лекарств и индукцию ими апоптоза активность а-интерферона проявляется преимущественно в отношении их низких концентраций, убивающих клетки-мишени путем апоптоза, в то время как некротическое действие высоких доз препаратов интерфероном не изменяется или даже несколько снижается. Сам по себе Роф А в использованных концентрациях не токсичен для клеток и не индуцирует в них апоптоз. В настоящее время прроводится дальнейшее изучение влияния а-интерферона на экспрессию в клетках белка Bcl-2.

Работа поддержана грантом РФФИ №00-04-49363.

ЭКСПРЕССИИЯ Fas И Fas-L НА КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА - СВЯЗЬ С УСКОЛЬЗАНИЕМ ОТ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО НАДЗОРА

Сладкова Л.В., Дмитриева Е.В., Москалева Е.Ю., Северин C.E., Северин Е.С.

Московский НИИ Медицинской экологии,

Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова, Москва

Система Fas - FasL играет важную роль в элиминации поврежденных, инфицированных вирусами и опухолевых клеток цитотоксическими лимфоцитами (ЦТЛ) иммунной системы. Взаимодействие Fas-рецептора на поверхности клетки-мишени с Fas-лигандом активированного ЦТЛ вызывает индукцию апоптоза и гибель клетки-мишени. Нарушение передачи сигнала в системе Fas - Fas L приводит к устойчивости клеток к индукции апоптоза. Целью настоящего исследования явилось - изучение уровня экспрессии Fas и Fas L и их влияния на Fas-зависимый апоптоз в случае различных В-кле-точных линий человека, две из которых - Raji и Namalva - ведут свое происхождение от больных лимфомой Беркитта, две

- IM9 и U266BL - от больных миеломной болезнью, а две другие - МК и 35 - были получены при иммортализации лимфоцитов периферической крови человека вирусом Эпштейн-Барр (EBV). Клеточные линии МК, 35, Raji и Namalva характеризовались наличием В-клеточного антигена CD 19, в то время как на клеточных линиях IM9 и U266BL этот антиген отсутствовал. Кроме того, на клеточных линиях МК, IM9 и U266BL не обнаружен HLA DR-антиген. В клеточных линиях МК, 35, Raji и Namalva выявлен геном EBV с помощью метода ПЦР. Для исследования уровня экспрессии Fas и Fas L на поверхности клеток были использованы моноклональные антитела к Fas и Fas L (Pharmingen) и ФИТЦ-меченные вторичные антитела к иммуноглобулинам мыши. Анализ проводили с помощью проточной цитофлуориметрии. Уровень апоптоза в клетках определяли после окрашивания клеток ДНК-интеркалирующим красителем Hoechst 33342 с помощью флуоресцентной микроскопии. Цитотоксическую активность лимфоцитов периферической крови определяли по выходу Н3-тимидина из предварительно меченных клеток-мишеней после инкубации с клетками-эффекторами. Экспрессия Fas и FasL обнаружена на поверхности клеток всех исследованных линий. Наиболее высокий уровень экспрессии Fas наблюдался на клетках линий МК, 35, Raji, в то время как на клетках ми-

еломного происхождения - IM9 и U266BL - отмечался низкий уровень экспрессии этого белка. Уровень экспрессии Fas, как правило, значительно превышал уровень экспрессии Fas L, и соотношение Fas/FasL колебалось от 1,2 до 3 за исключением клеточной линии U266BL, для которой уровень экспрессии FasL превышал уровень экспрессии Fas и соотношение Fas/ FasL составляло 0,2. Несмотря на значительный уровень экспрессии как Fas так и FasL в клетках для большинства клеточных линий, уровень спонтанного апоптоза не превышал 2

- 5%. Для клеточной линии U266BL уровень спонтанного апоптоза достигал 10- 12%. Вероятно низкий уровень спонтанного апоптоза для большинства клеточных линий при наличии как Fas, так и FasL на поверхности клеток может свидетельствовать о нарушении системы передачи сигнала в этих клетках при индукции Fas-зависимого апоптоза или о возможных компенсаторных реакциях, которые, например, могут быть связаны с присутствием генома EBV, так как именно для клеточных линий МК, 35, Raji, и Namalva, в которых обнаружено наличие генома EBV, одновременно наблюдался наиболее высокий уровень экспрессии Fas и FasL. При исследовании действия ЦТЛ на клетки исследуемых линий наблюдался незначительный цитотоксический эффект в отношении клеточных линий МК, 35, Raji, 1М9 и более выраженный эффект на клетках линии Namalva. Устойчивость изученных клеток с высоким уровнем экспрессии Fas к действию активированных ЦТЛ также может быть обусловлена нарушением системы передачи сигнала в этих клетках при индукции Fas-зависимо-го апоптоза наряду с ускользанием от действия ЦТЛ благодаря экспрессии FasL.

CD95 (APO-1/Fas) РЕЦЕПТОР-ЛИГАНДНАЯ СИСТЕМА И ЛЕКАРСТВЕННО-ИНДУЦИРОВАННЫЙ АП0ПТ03 В КЛЕТКАХ JURKAT

Соколовская A.A., Заботина Т.Н., Блохин Д.Ю., Палкина Т.Н., Кадагидзе З.Г., Барышников А.Ю.

НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического научного центра им. H.H.Блохина РАМН, Москва, Россия

Противоопухолевые препараты, используемые в клинической практике, индуцируют общий финальный путь гибели клетки, известный как апоптоз или программированная клеточная смерть. Терапевтические концентрации препаратов индуцируют экспрессию CD95 и CD95L на поверхности опухолевых клеток. Предполагается, что молекулярные процессы специфического клеточного повреждения, вызванные противоопухолевыми агентами, происходят через CD95 рецеп-тор-лигандную систему на пара- или аутокринном уровне.

Цель исследования, работы явилось изучение возможной роли CD95 (APO-1/Fas) рецептор-лигандной системы в лекарственно-индуцированном апоптозе.

Материалы и методы. Исследования выполнены на клетках Т-лимфобластоидной линии клетко человека Jurkat. Клетки

5 х 105 клеток/мл инкубировались в среде RPM1-1640 с 10% ТЭС и антибиотиками в течение 4, 24, 48 часов при 37"С в атмосфере 5% СО, в присутствии различных концентраций доксорубицина и этопозида. В экспериментах по ингибированию лекарственно-индуцированного апоптоза были использованы F(ab’), — 3hth-CD95 фрагменты, полученные из моноклональных антител IPO-4 (IgM). Индукция апоптоза оценивалась по появлению популяции клеток с гиподиплоидным набором ДНК (окраска пропидиумом йодидом). Регистрация

апоптоза проводилась на проточном цитофлюориметре FACSCalibur, Becton Dickinson, США). Поверхностная экспрессия CD95L (NOK-1) была исследована методом проточной цитофлюориметрии. Активация клеток Jurkat форболо-вым эфиром (РМА) в комбинации с кальциевым ионофором (иономицином) использована в качестве положительного контроля.

Результаты. Показано, что доксорубицин и этопозид вызывают апоптоз в зависимости от их концентрации и времени инкубации. Уровень экспрессии CD95L на поверхности клеток Jurkat увеличивался на 60% после 4 часов инкубации с иономицином в комбинации с РМА. После ¡инкубации клеток с этопозидом (1 мкг/мл) уровень экспрессии CD95L на поверхности клеток достигал 30%. Уровень экспрессия CD95L при индукции доксорубицином (0,5 мкг/мл) был незначительным. Наиболее заметный эффект ингибирования этопозид- и доксорубицин-индуцированного апоптоза наблюдался через 24 часа Так, после инкубации клеток с этопозидом в апоптозе находилось в среднем 35% клеток. После инкубации клеток с F(ab’)2 фрагментами и этопозидом процент клеток в апоптозе уменьшался до 10%. Процент клеток в апоптозе после инкубации с доксорубицином составлял в среднем 45%, инкубация F(ab’), фрагментов с препаратом блокировала доксоруби-цин-индуцированный апоптоз на 20-25%о. При дальнейшем увеличении времени ингибирования этопозид- и доксоруби-цин-индуцированного апоптоза практически не наблюдалось.

Заключение. Полученные результаты позволили предположить, что противоопухолевые препараты индуцируют апоптоз через систему CD95/CD95L, но на более ранних сроках индукции апоптоза. Наши данные согласуются с данными литературы, что аутокриные и паракриные CD95/CD95L -опосредованные сигналы могут выступать как ранние события в лекарственно-индуцированном апоптозе.

ВАКЦИНАЦИЯ МЫШЕИ ПРОТИВ МЕЛАНОМЫ И РАКА МОЛОЧНЫХ ЖЕЛЕЗ С ПОМОЩЬЮ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

Сологуб В.К., Котелевиц А.Г., Зыбин Д.В., Северин С.Е., Коромыслова И.А.

Московский научно-исследовательский институт медицинской экологии

Нами установлено, что в инертном геле - “Фармакрил” ПСГ (Косметик Техноложи, Москва, Россия), применяемом для косметической хирургии, возможно длительное культивирование опухолевых клеток человека на грызунах.

В частности, при введении опухолевых клеток человека SK.MEL-28 (меланома) и MCF-7 (рак молочных желез) в дозе 1-5 млн. клеток в соединительнотканную капсулу, образованную 0,5 мл геля под кожей у мышей линии C57BL/6, отторжение трансплантированных клеток наблюдали только через 3-

4 месяца.

Эффект такого длительного контакта мышей с живыми опухолевыми клетками человека выразился в развитии невосприимчивости мышей к сингенным опухолям - В-16 (меланома) и Са-755 (рак молочных желез).

При введении 100 - 1000 летальных доз опухолевых клеток продолжительность жизни иммунизированных мышей увеличилась на 50% на модели SK.MEL-28 - В-16, и на 18% на модели MCF-7 - Са-755. Привитые опухоли не только медленнее росли у иммунизированных мышей, но и, в случае меланомы, некротизировались, достигнув минимальных размеров.

В сыворотках мышей иммунизированных клетками меланомы человека обнаруживали антитела как к клеткам человека (SK.MEL-28) так и к клеткам мыши (В-16).

Обнаруженное нами явление замедленного отторжения чужеродных клеток, помещенных в инертный гель, может быть использовано в разработке методов вакцинации против опухолей человека. При этом вполне перспективным кажется использование для этих целей перевиваемых опухолей животных.

Учитывая, что в последнее время все большее внимание уделяется живым клеткам как вакцинным препаратам, создающим полноценный противоопухолевый иммунитет, наши находки кажутся весьма полезными.

ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ПРИ РАКЕ ТОЛСТОЙ КИШКИ

Степанова Е.В., Дбар Ж.Н., Яковлев В.А., Барышников А.Ю.

РОНЦ им. H.H.Блохина РАМН,

Москва, Россия

В последнее время большое внимание уделяется исследованиям молекулярно-биологическим маркерам, которые могут иметь важное прогностическое значение для многих типов опухолей.

Нами было проведено иммуногистохимическое определение экспрессии р53, Вс1-2, Вах, Ki-67, тимидилат синтетазы, HER-2/neu, шп23, VEGF, bFGF у 95 больных раком толстой кишки и оценена их связь с безрецидивной выживаемостью больных.

В исследовании было показано, что пролиферативная активность опухоли, экспрессия тимидилат синтетазы и HER-2/ncu являются хорошими прогностическими маркерам возникновения метастазов в течение 5 лет. Так, средняя пролиферативная активность у больных без прогрессирования составила 52±27 и 73±29 - у больных с прогрессией (р<0,0005). Экспрессия HER-2/neu показала свою прогностическую значимость только для больных опухолями толстой, но не прямой кишки.

Нами показано, что определение молекулярно-биологических маркеров можно использовать для прогнозирования клинического течения рака толстой кишки.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОДУЛЯТОРА КАЛЬЦИЕВОГО ОБМЕНА ДЛЯ ИНДУКЦИИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ВЛАСТНЫХ КЛЕТОК БОЛЬНЫХ ОСТРЫМИ МИЕЛОБЛАСТНЫМИ ЛЕЙКОЗАМИ

Стрельникова Т.Б., Садовникова Е.Ю., Паровичникова Е.Н., Савченко В.Г.

Гематологический Научный Центр РАМН,

Москва, Россия

Эффективность стандартных методов лечения больных острыми лейкозами (OJI), базирующихся в основном на различных вариантах цигостатического воздействия, достигла своего предела. Нет возможности и далее наращивать мощность химиотерапевтической дозы, так как биологическая переносимость таких воздействий исчерпана. Поэтому в последние годы проводятся исследования по разработке способов биологического воздействия на опухоль. Однако иммунный ответ на антигены опухолевых клеток больных с ОЛ выражен очень слабо, что может

быть обусловлено отсутствием на их поверхности так называемых костимуляторных молекул: CD54, CD40, CD80 и CD86, которые, связываясь с лигандами на поверхности лимфоцитов, индуцируют превращение их в клетки-эффекторы, способные лизировать клетки-мишени в ответ на контакт с антигенами. Цель настоящего исследования - попытка получения из малоимму-ногенных бластов клетки, способные инициировать иммунный ответ , т.е. антиген-презентирующие (в данном случае - дендритные) клетки. В целях дифференцировки миелоидных предшественников в дендритные клетки использовали ростовые факторы (GM-CSF, IL-4 и TNFa), а также ионофор для ионов кальция. В основе механизма действия последнего лежит воздействие на внутриклеточный кальций для дифференцировки бластных клеток, минуя рецепторы ростовых факторов. В исследование было включено 9 больных OJ1: 7 с впервые диагностированным OJT (у 4 пациентов-миеломонобластный вариант, 3-миелобласт-ный, 2-промиелоцитарный) и 2 после проведенной стандартной химиотерапии. Культивирование клеток крови в присутствии ростовых факторов и ионофора для ионов кальция, изначально имеющих низкий уровень костимуляторных молекул, привело к значительному усилению экспрессии этих маркеров. Клетки крови, изначально имевшие низкий уровень экспрессии HLA второго класса, стали более активно экспрессировать данные антигены. Удалось также получить увеличение числа CD83 лимфоцитов - маркера высокодифференцированных дендритных клеток. При использовании ионофора для ионов кальция результаты оказались менее однородными у разных пациентов. Применяя модулятор кальциевого обмена, удалось добиться интенсивной экспрессии CD86, однако повышение числа CD80 клеток оказалось менее выраженным, чем в случае применения ростовых факторов в 7 из 9 случаев. Важным результатом является получение антигенпрезентирующих клеток из бластов первично резистентной больной, который позволяет сделать вывод, что химиорезистентность не коррелирует с иммунологической резистентностью.

Таким образом, в настоящей работе было проведено сравнение двух подходов к модификации лейкозных бластов: использование ростовых факторов и модулятора кальциевого обмена. Эксперименты, проведенные с использованием периферических мононуклеаров больных ОМЛ, показали, что оба индуктора могут быть использованы для получения про-тиволейкозной вакцины в целях иммунотерапии минимальной остаточной болезни или для снижения опухолевой массы в случае резистентных форм лейкозов.

ИФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ КОНСТРУКЦИИ АНТИФЕРРИТИНОВОЕ М И НИ-АНТИТЕЛ О/РИ БОНУКЛ ЕАЗА

Стремовский O.A., Баландин Т.Г., Марцев С.П.*, Плюктун А.**, Деев С.М.

Институт биооргстической химии

им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН,

Москва, Россия;

*Институт биоорганической химии НАН Беларуси, Минск, Беларусь;

**Институт биохимии Цюрихского Университета, Цюрих, Швейцария

Селезеночный ферритин человека является раковоассоциированным антигеном гепатомы человека, гепатоклеточной карциномы, болезни Ходжкина, плоскоклеточного рака головы и шеи. Целью данной работы было конструирование одноцепочечных мини-антител (scFl 1) кферритину, а также их

производных с бацилярной рибонуклеазой барназой. Правильно процесснрованные мини-антитела были получены в клетках E.coli. Растворимые seFIl обладают всего лишь в 8 раз меньшей аффинностью (К =5,1 х 10s М~' в RIA и 1,8 хТО* М~‘ в ИФА) по сравнению с исходными моноклональными антителами. Чтобы получить бифункциональные молекулы, которые, с одной стороны, способны узнавать раковые клетки, а с другой - обладали бы цитотоксичностью, сконструированы слитые белки из антиферритиновых антител и высокоактивной рибонуклеазы барназы. Из нерастворимых телец включения с помощью метода денатурации - ренатурации был получен растворимый бифункциональный белок. Установлено, что стабильность слитого белка scFl 1/барназа существенно выше, чем самих мини-антител scFl 1. Следовательно, барназ-ный домен работает как внутримолекулярный шаперон и улучшает фолдннг химерного белка. Слитый белок scFl 1/барназа сохранил как способность связывать ферритин, так и рибо-нуклеазную активность. Работа поддержана грантами РФФИ №99-04-48836. ГНТПРФ “Новейшие методы биоинженерии” и Швейцарского научного фонда.

ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ УРОВНЕЙ IgE,

TNF-a, IFN-y И IL-4 У БОЛЬНЫХ С ОСТРЫМ МИЕЛОБЛАСТНЫМ ЛЕЙКОЗОМ ДО И ПОСЛЕ ПОЛИХИМИОТЕРАПИИ

Хапфернн Р. Л., Ригер Н. А.

Институт "Аллергии и Астмы’’, Краснодар, Россия

Доминирование того иди иного фенотипа лейксмнчсских клеток ведет к избыточной продукции соответствующих цитокинов и вызывает изменение продукции IgE у больных. Механизмы цитокиновой регуляции IgE при гемобластозах остаются ие изученными. В настоящей работе исследованы уровни IgE, TNF-a, IFN-y и IL-4 у больных с острым миелоб-ластным лейкозом (AML) до и после полихимиотерапии (ПХТ). Обследовано 38 человек. Контрольную группу составили 20 здоровых доноров. 2-я группа - 18 впервые выявленных больных AML (варианты в соответствии с FAB-класси-фикацией AML: AML-M1 (вариант без вызревания) 6 больных; AML-M2 (вариант с частичным созреванием) 8 больных; AML-M3 (промиелоцитарный) 1 больной; AML-M4 (миело-монобластный) 1 больной; AML-M6 (эритремия острая) 2 больных). Уровни IgE, IL-4, TNF-a и y-IFN в сыворотках определяли с использованием стандартных тест-наборов имму-ноферментным методом. Уровень IgE у 18 больных до назначения специфической терапии составил в среднем 160,83 KU/ 1 (min-4,19KU/1; шах-827,42 KU/1). Уровень IgE у здоровых доноров составил в среднем 24,04 KU/1 (min-1,00 KU/1; гпах-89,703 KU/I). Уровень 1L-4 у больных AML составил в среднем 8,7 pg/nil (min-2,39 pg/ml; max-17,39 pg/ml). Уровень IL-4 в контроле составил 6,38 pg/ml (min-1,08 pg/ml; max-16,03 pg/ ml). В среднем у больных AML в сыворотке обнаружено 80,77 pg/ml IFN-y (min-16,09 pg/ml; max-169,35 pg/ml). У здоровых доноров обнаружен средний уровень IFN-y равным 104,81 pg/ ml (min-9,27 pg/ml; max-230,71 pg/ml). Уровень TNF-a у больных оказался достоверно выше (среднее значение -141,16 pg/ ml, min-24,84 pg/ml; max-333,53 pg/ml), чем у здоровых доноров (Р<0,05). Уровень TNF-a у здоровых в среднем составил 13,61 pg/ml (min-0,80 pg/ml; max-36,54 pg/ml). Медианы уровней IgE, TNF-a и IL-4 у больных больше, а медиана IFN-y -соответственно меньше, чем у здоровых доноров. Минимальные концентрации IgE, TNF-a и IL-4 обнаружены у больных с вариантом AML-M1, IFN-y - при AML-M2. Максимальное

содержание IgE обнаружено при AML-M6, самые высокие уровни TNF-a, IFN-y и IL-4 - у больных с вариантом AML-М2. При сравнение медиан уровней IgE, TNF-a, IFN-y и IL-4 оказалось, что при наиболее высоком содержании IgE у больных AML-M6 медиана 1L-4 выше, а уровни TNF-a и IFN-y -ниже, чем у больных с иными вариантами лейкоза. При отсутствии ответа на ПХТ уровень IgE к моменту гибели больных возрастает в 2,0 - 2,5 раза (Р<0,05), при частичном ответе - практически не изменяется, а при достижении полной ремиссии заболевания - снижается на 30-40% (Р<0,05) по срав-нению с уровнем IgE до начала терапии. Уровни TNF-a, IFN-у и IL-4 у больных в период ремиссии также уменьшаются на 30-50% по сравнению с уровнями до начала терапии (Р<0,05). При отсутствии эффекта или частичном ответе на ПХТ уровень IL-4 может возрастать. Содержание TNF-a снижается, уровень IFN-y возрастает при отсутствии эффекта; уровень TNF-a возрастает, содержание IFN-y соответственно снижается при частичном ответе на ПХТ. Таким образом уровни IgE, TNF-a и IL-4 у больных AML до ПХТ могут быть выше, а уровень IFN-y - ниже, чем у здоровых доноров. Продукция IgE, TNF-a, IFN-y и IL-4 у больных может зависеть от морфологического варианта AML и изменяется в связи с эффективностью ПХТ (полная или частичная ремиссия, отсутствие ответа). У больных AML механизмы регуляции синтеза IgE и лейксмическая пролиферация могут оказывать взаимное влияние и находится под контролем одних и тех же цитокинов.

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ РАЗЛИЧНЫХ СПОСОБОВ ИММУНОТЕРАПИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РЕКОМБИНАНТНЫХ ЦИТОКИНОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ

Хомяков Ю.Н., Любимов И.И.*, Хомякова Т.И. **, Борзенков В.М.*, Северин С.Е.

Московский НИИ медицинской экологии,

* Государственный центр прикладной микробиологии, **Центр медико-биологических и экологических проблем РАЕН

В работе проанализированы результаты иммунотерапии рекомбинантными цитокинами и их производными различных экспериментальных опухолей.

Исследовали действие следующих продуктов микробного синтеза: фактор некроза опухоли-a (TNF-a), фактор некроза опухоли-ß (TNF-ß), слитные белки на основе TNF-a: фактор некроза опухоли-а-а1-тимозин (TNF-a-alT); al-тимозин-фактор некроза опухоли-a (alT-TNF-a); фактор некроза опу-холи-а-ингерферон-у (TNF-a-IFN-y). Диапазон доз изученных субстанций находился в пределах от 100 до 100000 Ед/кг. Препараты растворяли в физиологическом растворе и вводили животным тремя основными способами: внутрибрюшинно, внутривенно и внутриопухолево курсами по 4-7 суток.

Было изучено влияние иммуномодуляторов на рост таких экспериментальных мышиных опухолей как асцитно-солид-ной опухоли МХ-11; меланомы В-16; рака легких РЛ-67; эпидермальной карциномы легких Лыоиса LLC, лимфоидной лейкемии L-1210. Эксперименты проводили на мышах линии С57В1/6 обоего пола общим числом 460 шт.

В зависимости от природы опухоли, вида субстанции, ее дозы и способа введения в экспериментах наблюдали разнообразные эффекты цитокинов и их производных. В среднем в дозах около 1000 Ед/кг обнаруживался выраженный противоопухолевое влияние препаратов. Вместе с тем, были найде-

ны и противоположные эффекты изучаемых веществ, выражавшиеся в стимуляции роста опухоли. Наиболее часто такая инверсия противоопухолевого влияния обнаруживалась при минимальных концентрациях препаратов (особенно alT-TNF-a) и при использовании внутриопухолевого способа их введения. В некоторых случаях зависимость противоопухолевого эффекта от концентрации веществ носила U-образный характер.

Таким образом, иммунотерапия экспериментальных опухолей с использованием рекомбинантных факторов некроза опухоли и их производных может привести к разнообразным биологическим последствиям в зависимости от типа опухоли, ее исходного состояния и дозы препарата.

ЧАСТОТА ДЕЛЕЦИИ 32 П.Н. В ГЕНЕ ХЕМОКИНОВОГО РЕЦЕПТОРА CCR5 У БОЛЬНЫХ СО ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ НОВООБРАЗОВАНИЯМИ

Чсрдынцева Н.В., Исаева Т.М., Юдин Н.С.,* Белявская В.А.**, Ромащенко А.Г.*, Слонимская Е.М., Воевода М.И.***, Чойнзонов Е.Л., Севостьянова Н.В., Уразова Л.H., Коломиец С.А.

НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН, Томск,

*Институт цитологии и генетики СО РАМН,

**ГНЦ ВБ “Вектор ”,

***Институт терапии СО РАМН,

Новосибирск

Введение. Появляется все больше доказательств важной роли хемокинов в прогрессировании злокачественного роста посредством влияния на ангиогенез, гемопоэз, процессы апоп-тоза и др. Белок, кодируемый геном CCR5, является членом семейства трансмембрапных хсмокиновых рецепторов, экспрессируется на макрофагах, Т-хелперах и других клетках и селективно связывает MIP-la, MIP-lß и RANTES, которые определяют инфильтрацию Т хелперов 1 типа, активированных Т-лимфоцитов и клеток памяти в очаги воспаления. Показано, что CCR5 фенотип лимфоцитов ассоциирован с их рекрутированием в очаги воспаления и в опухоль (Yoong et al., 1999). Описана деления 32 п.н. в кодирующей области гена CCR5 (CCR5del32), приводящая к трансляции укороченного варианта белка, не экспрессирующегося на поверхности клеток. Лимфоциты таких индивидуумов не передают CCR5 опосредованный сигнал, хотя на другие цитокины отвечают нормал ьно.

Цель исследовании. Провести сравнительную оценку частоты аллеля гена хемокпнового рецептора CCR5del32 у больных с доброкачественными и злокачественными опухолями. Исследовать иммунологические показатели у больных с патологией молочной железы в зависимости от наличия CCR5del32.

Материал и методы. Обследовано 169 больных с опухолевой патологией, раками молочной железы - 67 человек, фиброадсномом - 47 больных, рак легкого - 27 больных, опухоли головы и шеи - 28 пациентов, а также 18 женщин с фиб-розно-кистозной мастопатией. Генотипирование аллелей гена CCR5 проводили методом ПЦР-амплификации фрагмента размером 276 п.н., несущего потенциальную делению в 32 п.н., с использованием фланкирующих праймеров (Н.Юдин и со-авт., 1998).

Результаты. У пациентов с фиброаденомой распределение аллелей гена CCR5 не отличалось от популяционного кон-

троля - 10,6% и 10,7% соответственно). У больных раком молочной железы частота аллеля CCR5del32 превышает сред-нспопуляционную (15,7%), как и у больных с фиброзно-кистозной мастопатией (17,5%). Наиболее высокая частота аллеля с делецией отмечена в общей группе больных опухолями головы и шеи (рак гортани, рак слизистой полости рта ), она составила 21,5%. У больных раком легкого делеционный вариант гена хемокинового рецептора CCR5 встречается в 18,5%.

Мы не обнаружили различий в субпопуляионном составе лимфоцитов крови у больных фиброаденомой в зависимости от наличия CCR5del32. У пациентов с фиброзно-кистозной мастопатией, несущих делеционный вариант CCR5, выявлено существенное уменьшение спонтанной и ФГА-индуциро-ванной пролиферации лимфоцитов наряду с уменьшением числа CD38 лимфоцитов и увеличением CD8 -лимфоцитов. У больных РМЖ с редким аллелем гена хемокинового рецептора CCR5del32 показано значительное снижение числа лимфоцитов, Т-лимфоцитов и Т-хелперов по сравнению с пациентами без делеций.

Заключение. Полученные данные позволяют предполагать, что редкий аллель гена хемокинового рецептора CCR5del32 может играть существенную роль в формировании предрасположенности к развитию опухолей определенного типа, а также выступать в качестве одного из критериев формирования групп повышенного риска, что делает актуальным дальнейшие исследования в этом направлении.

СЛУЧАЙ ХРОНИЧЕСКОГО CD37CD16+/CD56+ ЛИМФ0ЦИТ03А: ДОБРОКАЧЕСТВЕННАЯ ПОЛИКЛОНАЛЬНАЯ ЭКСПАНСИЯ ИЛИ NK-ВАРИАНТ ЛЕЙКОЗА ИЗ БОЛЬШИХ ГРАНУЛЯРНЫХ ЛИМФОЦИТОВ?

Черепнев Г.В., Велижинская Т.А., Макарова И.М.

Республиканская клиническая больница № 2 М3 РТ, Казань, Россия

Больной Г., мужчина 75 лет, имевший в прошлом профессиональный контакт с компонентами ракетного топлива, с 1990 года наблюдался с диагнозом “Хронический лимфолейкоз, доброкачественный вариант, 1-11 стадии”. Пациент не получал химиотерапию, так как при относительном и абсолютном лимфоцитозе максимальный уровень лейкоцитов в периферической крови не превышал 15-18 х 10Ч /л. Для определения линейной принадлежности лейкоза мы исследовали иммунологический фенотип лимфоцитов методом проточной цитометрии. Анализ выполняли на 2-лазерном проточном цитометре FacsCalibur (BD) в программе CellQuest с применением стандартных панелей моноклональных антител “IMK Plus kit” (BD) и “Acute Leukemia Phenotyping kit” (BD) в соответствии с рекомендациями производителя. В популяции лимфоцитов периферической крови 84%) клеток имели CD3 /CD 16 /CD56 / CD87CD47CD57CD77TCRa(37TCRY§ /CD45'/CD14 /CD 10 / CD 19 /CD20 /CD33 /HLA-DR- фенотип. В периферической крови количество лейкоцитов составляло 9,7 х 10Ч /л, в лейкоцитарной формуле регистрировали лимфоцитоз 63% и нейт-ропению 32%. Среди лимфоцитов преобладали крупные ши-рокоцитоплазменные формы, содержащие азурофильную зернистость; отмечали единичные тени Боткина-Гумпрехта. Следовательно, субстрат лимфопролиферативного заболевания составляли NK. большие гранулярные лимфоциты (БГЛ). В отличие от Т- и В-лимфопролиферативных заболеваний, данные литературы по прогнозу и лечению БГЛ-лимфоцитоза весьма скудные. Известны три основные нозологические фор-

мы, при которых пролиферируют БГЛ: на одном конце спектра очень агрессивный NK-БГЛ лейкоз, на другом - хронический доброкачественный ЫК.-лимфоцитоз, а между ними - относительно медленно прогрессирующая CD3 Т-клеточная БГЛ лейкемия. Длительное доброкачественное течение заболевания, отсутствие лимфоаденопатии, гепатоспленомегалии, анемии, тромбоцитопении, гипогаммаглобулииемии, аутоиммунного синдрома и результаты иммунофенотнпирования свидетельствуют в пользу хронического поликлонального NK-лимфоцптоза. Для верификации поли- или моноклонального характера наблюдаемой NK-пролифсрации показан анализ реаранжировки генов Т-клеточного рецептора. Однако, в данном случае он может быть неинформативным, потому что клетки не экспрессируют мембранных TCR, и поэтому, вероятно, принадлежат к зародышевой линии. Альтернативным подходом к определению клоналыюсти могут быть кариоти-пирование и генотинирование методом ПЦР. Таким образом, во всех случаях хронического лимфоцитоза неизвестного происхождения необходимо иммунофенотинирование лимфоцитов, содействующее установлению правильного диагноза, прогноза и лечения.

ЗНАЧЕНИЕ СИМПАТИЧЕСКОГО ОТДЕЛА ВЕГЕТАТИВНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ В ФОРМИРОВАНИИ ИММУНОДЕПРЕССИИ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ЖЕЛУДКА

Черных Е.Р., Соловьева И.Г., Лсплина О.Ю., Хоннна H.A., Останин A.A., Егоров Д.Н., Абрамов В.В., Шкурат Г.А.

Институт клинической иммунологии СО РАМН. Институт клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН.

Новосибирск, Россия

Угнетение иммунитета у больных со злокачественными опухолями, в том числе после проведения объемных оперативных вмешательств, имеет большое значение, являясь причиной прогрессии опухолевого процесса и развития инфекционно-воспалительных осложнений в послеоперационном периоде. Среди причин иммунной недостаточности существенное внимание уделяется факторам стресса, опосредованным медиаторами симпатической нервной системы.

Цель исследования. Изучение проявлений иммунодепрес-син н зависимости от особенностей функционирования вегетативной нервной системы (ВИС) у больных раком желудка.

Материалы п методы. Исследования были проведены в группе 40 здоровых доноров н 49 пациентов с раком желудка I (n=25), II (n=3), III (n=I3) и IV (п=8) стадией. У всех больных оценивали тип центрального тонуса ВИС методом вариационной пульсометрии по P.M. Баевскому и состояние иммунной системы. Активность симпатической нервной системы определяли с помощью индекса напряжения (ИИ). Исследование иммунитета включало оценку субпопуляцнонного состава, пролиферативной активности и уровня апоптоза моно-нуклеарных клеток (МИК) периферической крови и региональных лимфоузлов.

Результаты. В предоперационном периоде больные раком желудка отличались от здоровых доноров достоверным снижением в периферической крови относительного содержания CD4 Т-клегок (36,0±1,3 против 42,2 ±1,4; р<0,()1), экспрессии HLA-DR молекул на моноцитах (412±22 против 642±49; р<0,01) и пролиферативной активности Т-клеток при стимуляции Кон А или анти-СйЗ антителами (19.257±1.718 vs

59.897±4.204; р<0,01 и 12.243±1.513 против 28.558±1829; р<0,01, соответственно). Иммуносупрессия проявлялась также выраженным угнетением КонА-стимулированного пролиферативного ответа МИК региональных лимфоузлов (13.383Ü762 против 34847±6716) и существенным сокращением в лимфатических узлах относительной площади пара-кортикальной в 2,87 раза ив 1,76 раза межфолликулярной зоны. Чтобы проанализировать возможное влияние симпатического отдела ВИС на состояние иммунитета все больные были разделены на 2 группы - с высоким ИИ более 125; п=28, (группа 1) и низким ИН<75; n= 17, (группа 2) тонусом симпатической нервной системы. В предоперационном периоде достоверное снижение относительного содержания CD4 Т-клеток регистрировалось только в 1-ой группе. Снижение HLA-DR экспрессии на моноцитах было выражено в равной степени в обеих группах. В то же время угнетение пролиферативного ответа Т-клеток, было более выражено у больных 1-ой группы (17.784±1.958 vs 30.924±4.260 р<0,05). В послеоперационном периоде показатели клеточного иммунитета у больных 2 группы значимо не менялись, в то время как у больных

1 группы отмечалось достоверное снижение HLA-DR экспрессии и более чем двукратное усиление спонтанного и активационно-индуцированного апоптоза. Так, относительное содержание апоптотических клеток среди свежевыделенных лимфоцитов возрастало с 8,2±2,3 до 27,0±10,1% (р<0,05), а в культурах КонА-стимулированных МНК с 13,3±3,5 до 26,7±9,9% (р<0,05). В результате больные, огтпозитные по функциональной активности ВНС, достоверно различались в послеоперационном периоде по величине пролиферативной активности Т-клсток, а также уровню спонтанного и активаци-онно-индуцированного апоптоза. Анализ течения послеоперационного периода у больных анализируемых групп показал, что особенности функционирования ВНС сказывались не только на выраженности иммунодепрессии, но и частоте развития инфекционно-воспалительных осложнений. Так, у больных раком желудка с высокой активностью симпатической нервной системы инфекционные осложнения регистрировались в 3 раза чаще, чем у больных с низкой активностью симпатической нервной системы.

Заключение. Таким образом, степень иммуносупрессии у больных раком желудка существенно различается в зависимости от функциональной активности ВНС и наиболее выражена в послеоперационном периоде у больных с преобладанием тонуса симпатической нервной системы. Поскольку развитие иммунной недостаточности в раннем послеоперационном периоде во многом обусловлено факторами оперативного стресса, можно полагать, что высокая активность симпатической нервной системы способс твует избыточной продукции катехоламинов, индуцирующих состояние иммуносупрсссии.

ПОЛУЧЕНИЕ ЗРЕЛЫХ ПОПУЛЯЦИЙ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

Чкадуа Г.З., Заботима Т.Н., Буркова A.A., Огородникова Е.В., Кадагидзе З.Г., Барышников А.Ю.

НИН экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического научного центра им. H.H.Блохина РАМН,

Москва, Россия

Дендритные клетки (ДК) являются наиболее мощными антиген-презентируютцими клетками, способными активировать “наивные” CD8+ Т-лимфоциты. После открытия и изу-

2001, T. 3, №2

Он ко им му н ология

чения функциональной роли дендритных клеток на них стали возлагать огромные надежды в отношении терапии онкологических заболеваний. Зрелые ДК (зДК) отличаются от незрелых форм высокой экспрессией HLA-DR и ко-стимулятор-ных молекул (CD80, CD86), экспрессией de novo молекул адгезии (CD54) и CD83 (маркер зрелых ДК). Недавние клинические исследования показали неэффективность использования незрелых ДК (нДК) по сравнению со зрелыми формами, более того, при введение “нагруженных” антигеном нДК происходило угнетение иммунного ответа на данный антиген, тогда как, введение "нагруженных” зДК усиливало иммунный ответ.

Целью исследования. Культивирование зДК из моноцитов периферической крови человека.

Материалы и методы. Клетки культивировали при 37°С и 5% СО, в RPMI-1640, содержащей 2% человеческой плазмы группы АВ, L-глутамин, HEPES, антибиотики, витамины, пируват, гепарин, [3-меркаптоэтанол, составляющие полная среда (ПС). Периферические мононуклеары крови (ПМК) выделяли из цельной крови с помощью центрифугирования в градиенте Ficoll-Paque (Pharmacia, Швеция) (р=1,077). Интерфазные кольца, содержащие ПМК, собирали и интенсивно отмывали от примесей фиколла и тромбоцитов. Клетки ре-суспендировали в ПС и наносили на чашки Петри d=90 мм (Linbro, Великобритания) в количестве 50 х 10й клеток в 10 мл среды. Через 1 час после инкубации при 37°С и 5% СО, отбирали не прилипшие клетки (лимфоциты), а к адгезиро-ванным на пластике моноцитам добавили 10 мл ПС, содержащей 80 нг/мл GM-CSF (Leucomax, Shering-Plough) и 20 нг/мл IL-4 (Falcon, США). На 2-ые и 4-ые сутки культивирования к клеткам добавляли по 2 мл ПС, содержащей 800 нг GM-CSF и 200 нг IL-4. На 6-ые сутки культивирования собирали свободно плавающие клетки, осаждали центрифугированием и ресуспендировали осадок в 10 мл свежей ПС, содержащей GM-CSF и IL-4, после чего клетки наносили на туже чашку Петри. На 7-ые сутки культивирования к клеткам добавляли по 5 мл культуральной среды моноцитов (КСМ), что составило 33 объемных0/). На 10-ые сутки культивирования клетки собирали и определяли их иммунофенотип с помощью прямой реакции иммунофлуоресценции. В работе использовали антитела, коиыогированные с F1TC, к антигенам CD86 (DAKO, Дания), CD14, HLA-DR, HLA-ABC (Becton-Dickinson, США), CDUb, CD54, CD83 (Caltag, США). Анализ иммунофенотипа ДК проводили на проточном цитофлуоримстре FACSCalibur (Becton-Dickinson, США).

Результаты и обсуждение. В процессе культивирования клетки откреплялись от пластика, увеличивались в размере, приобретали отростчатую форму. При светорассеянии на проточном цитофлуориметре ДК выявляли как крупные гранулированные клетки, которые составляли не менее 91%, тогда как, контаминация лимфоцитами была не более 7% от всей популяции. Анализ иммунофенотипа нДК на 7-ыс сутки культивирования выявил: 1) высокий процент антиген положительных клеток по HLA-DR (98%), при этом уровень экспрессии антигена (значение mean) было средним - 291; 2) отсутствие экспрессии маркера зДК- CD83 (1%); 3) низкую экспрессию маркера моноцитов - CD14 (5%).

При добавлении к нДК культуральной среды моноцитов в течение нескольких дней происходит дифференцировка дендритных клеток, что проявляется в увеличении уровня экспрессии HLA-DR и HLA-ABC, экспрессии de novo CD83 и отсутствии экспрессии CD 14, также увеличивается экспрессия молекул адгезии (CD54) и ко-стимуляторных молекул (CD86).

Заключение. Полученные результаты соответствуют данным литературы, однако, следует отметить, что слабым звеном в данной методике получения зрелых дендритных клеток является культуральная среда моноцитов. КСМ полученные от разных доноров отличаются друг от друга, что проявляется в варьировании процента CD83 ДК. В связи с этим нами отрабатываются условия культивирования ДК, способные нивелировать разнородность КСМ, полученную от разных доноров.

СА125: ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В РАННЕЙ ДИАГНОСТИКЕ РЕЦИДИВОВ РАКА ЯИЧНИКОВ

Шелепова В.М., Жорданиа К.И.

Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН,

Москва, Россия

Рецидивы рака яичников отличаются быстрым и агрессивным, часто бессимптомным развитием. Ранняя диагностика рецидивов затруднена, т.к. в большинстве случаев они представляют собой микроскопические образования, размеры которых находятся за пределами чувствительности современных инструментальных методов исследования, таких как компьютерная томография, ультразвуковое сканирование. По причине позднего распознавания, лишь 18 - 20% больных с рецидивами доживает до 2 лет. Возможность ранней диагностики рецидивов могла бы существенно улучшить результаты лечения. “Золотым стандартом” в диагностике рецидивов рака яичников считаются ревизионные хирургические процедуры - лапаротомия и лапароскопия. Однако, их использование связано с частыми осложнениями и увеличением числа койкодней при госпитализации. Надёжных неинвазивных методов ранней диагностики рака яичников на сегодняшний день нет.

Цель исследования. Изучение целесообразности использования опухоль-ассоциированного маркёра СА 125 в диагностике и прогнозировании рецидивов рака яичников.

Материалы и методы. Ретроспективно проводилось определение концентрации СА 125 в образцах сывороток крови пациенток, находившихся на лечении в ОНЦ РАМН с 1989 по 1999 гг. по поводу рака яичников 1-Ш стадий (классификация FIGO), по гистологическому типу опухоли представляли серозные цистаденокарциномы. У всех включенных в исследование пациенток (п = 72) после проведенной операции по поводу рака яичников была зарегистрирована клиническая ремиссия. У 37 из них через 4-60 месяцев после начала ремиссии был диагностирован рецидив заболевания, у остальных больных за время наблюдения рецидива не отмечалось.

Для определения СА 125 в сыворотке крови использовали диагностические ИФА-системы производства Hoffmann La

ТАБЛИУД. ИММУНОФЕНОТИП ЗРЕЛЫХ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК

антигены CD14 HLA-ABC HLA-DR CD11b CD54 CD86 CD83

% 0,9 99 CD CD CO CO 90 93 78

mean - 196 593 - 151 116 20

Roche (Швейцария). Концентрация маркера 35 Е/мл была принята за дискриминационную (ДК). Уровень СА 125 в сыворотке измеряли до лечения, а после того, как была зарегистрирована ремиссия, с частотой 1 раз в 3 месяца. Чтобы исключить влияние скрытых рецидивов на уровень маркёра у пациенток в ремиссии, сыворотки отбирались, как минимум, за 10 месяцев до момента клинического диагностирования рецидива, или же за 10 месяцев до последнего проводившегося исследования у пациенток без рецидива.

Результаты исследования У всех пациенток значения СА 125 до лечения были повышенными (в среднем 178,5 Е/мл), отражая существование опухоли. После операции и адъювантной химиотерапии значение маркёра снижалось, и во время ремиссии устанавливалось на соответствующем базальном уровне, индивидуальном для каждой пациентки, и в той или иной степени приближающемся к нулевой отметке. В среднем уровень маркёра составлял 8,2±7,9 (от 0,0 до 20,0) и был относительно стабильным в период объективной ремиссии. Появление рецидивной опухоли сопровождалось повышением значений СА 125 и при рецидиве СА 125 превышало ДК (от 35,2 до 2400,0) у 36/37 больных. Чувствительность теста, а у всех 36 “положительных” больных отмечался рецидив заболевания, составила 100%. У 76% пациенток уровень СА 125, превышающий ДК, наблюдался за 1 - 10 месяцев до диагностирования рецидива. Субклпническим индикатором рецидива являлось не столько “положительное” (выше ДК) значение СА 125, сколько его положительная динамика, которая чётко прослеживалась уже в пределах ДК. Динамику маркёра мы использовали для прогнозирования течения рецидива у пациенток, находящихся в клинической ремиссии. При этом учитывались 2 фактора: абсолютная величина СА 125 в конкретный момент времени, а также прирост маркёра в единицу времени. Показано, что у пациенток с СА 125 менее 1/2 ДК и ежемесячным приростом, не превышающим 20% от предыдущего значения маркера, в ближайшие 6 месяцев рецидива не наблюдалось; если прирост превышал 20%, рецидив диагностировался через 4-6 мес.; у пациенток с СА 125 от 1/2 ДК до ДК и приростом выше 20% рецидив диагностировался в ближайшие 2-4 мес. Если значение маркёра превышало ДК, а его прирост был выше 20%, то, в случае локального образования, его размеры уже находились в пределах чувствительности УЗИ, а в случае дисссминацин рецидив обнаруживался спустя 1 - 3 мес.

Заключение. Серийное определение СА 125 является чувствительным и надёжным методом раннего диагностирования и прогнозирования рецидивов рака яичников.

Очевидно, что успехи иммунотерапии злокачественных опухолей, аутоиммунных и инфекционных заболеваний могут быть достигнуты только при условии использования единых универсальных подходов в современной фундаментальной иммунологии.

ВЛИЯНИЕ РЕАФЕРОНА НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ

Шкапова Е.А., Савченко А.А., Суховсрхов А.О., Кургасова Л.М., Рачкова Н.В., Тоначева О.Г.

Институт медицинских проблем Севера СО РАМН, Красноярская государственная медицинская академия, Красноярск, Россия

Как известно, все типы интерферонов, в том числе и Реа-ферон, который является рекомбинантной формой интерфе-

рона-а2а, обладают ярко выраженными иммуномодулирующими и противоопухолевыми свойствами. Объектом действия интерферонов являются чужеродные нуклеиновые кислоты, блокировка трансляции которых приводит к деградации чужеродной генетической информации вирусных агентов или собственных мутировавших клеток организма. Что же касается иммуномодулирующих эффектов, то препараты интерферона стимулируют фагоцитоз и активность естественных киллерных клеток, которые играют важную роль в системе противоопухолевой защите организма. Терапия интерферона-ми достаточно широко распространена и используется в разных областях клинической медицины: в онкологической практике в настоящее время широко применяется высокодозовая интерферонотерапия натуральными и рекомбинантными препаратами. К сожалению, не всегда такое лечение дает положительный эффект, а причиной тому могут служить различные факторы, в том числе и состояние внутренней среды организма. Поскольку клетки гранулоцитарно-макрофагального ряда способны к быстрому и точному отражению разнообразных изменений гомеостаза, то хемилюминесцентная оценка их функциональной активности, при взаимодействии с определенными дозами Реаферона in vitro, может служить индивидуальным критерием целесообразности применения данного препарата для лечения. Таким образом, целью данного исследования явилась хемилюминесцентная оценка влияния Реаферона in vitro на функциональную активность лейкоцитов крови больных почечноклеточным раком.

Обследованы больные 3 стадия заболевания почечнокле-точпым раком с инвазией в капсулу без метастазов в возрасте 35-65 лет. Диагноз устанавливался врачом-онкологом. Функциональная активность лейкоцитов крови определялась с помощью люминол-зависимой хемилюминесцентной реакции. В качестве индуктора дыхательного взрыва использовали оп-сонизированный зимозан. В опытные пробы добавляли Реа-ферон в концентрации 4 х 103 ME.

При исследовании особенностей функциональной активности лейкоцитов крови у больных почечноклеточным раком обнаружено снижение времени выхода на максимум и площади кривой спонтанной хемилюминесценции, но при увеличении времени выхода на максимум и интенсивности зи-мозан-индуцированной хемилюминесценции лейкоцитов крови. Анализ спонтанной хемилюминесценции лейкоцитов у больных почечноклеточным раком при воздействии Реаферона in vitro позволил установить снижение максимального значения интенсивности хемилюминесцентной кривой по сравнению с контролем. Это свидетельствует о том, что в отсутствии Реаферона в реакционной среде “респираторный взрыв” протекает более интенсивно. Время выхода на максимум ХЛ кривой и площадь ХЛ кривой контрольной и опытной проб достоверных различий не имеют. Следовательно, время, за которое происходит наработка максимального количества активных форм кислорода как и общее количество активных форм кислорода в случае спонтанной хемилюминесценции, не зависит от присутствия Реаферона в реакционной среде.

Анализ зимозан-индуцированной хемилюминесценции лейкоцитов крови больных почечноклеточным раком при воздействии Реаферона in vitro показал увеличение максимального значения интенсивности ответа относительно контроля. По-вндимому, присутствие в реакционной среде Реаферона способствует более интенсивному протеканию “респираторного взрыва”, поскольку этот препарат активирует метаболические процессы в клетках гранулоцитарно-макрофагально-го ряда.

Необходимо отметить, что не у всех больных лейкоциты однонаправленно реагировали на воздействие Реаферона in

vitro. Были обнаружены лица, лейкоциты крови которых обратным образом реагировали на воздействие. В связи с этим нами анализируется особенности ответа лейкоцитов крови на воздействие Реаферона in vitro во взаимосвязи с параметрами иммунного статуса и выявляемым эффектом на терапию.

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ AHTH-HER-2/NEU-МИНИ-АНТИТЕЛ С КЛЕТКАМИ АДЕНОКАРЦИНОМЫ ЯИЧНИКА SK0V-3

Юдина Г.Ф., Гусарова Г.А., Баландин Т.Г., Стремовский O.A., Лукаш С.В., Лебеденко Е.Н., Плюкгун А.*, Сапожников А.М., Деев С.М.

И нети тут биоорганич еско й

химии им.М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, Россия,

*Институт биохимии Цюрихского Университета, Цюрих, Швейцария

Прогрессия опухолей, в частности карцином, связана с экспрессией онкогенов, среди которых одним из наиболее распространенных является с-егЬВ-2, называемый также HER-

2 или HER-2//i<?i/. Он амплифицирован и гипсрэкспрессиро-ван в опухолевых тканях грудной железы, яичников, желудка, простаты. Ген с-егЬВ-2 кодирует мембраносвязанный рецептор HER-2/ik'!< (185 кДа), активирующийся EGF-подобными лигандами и имеющий цитоплазматический домен с тирозин-киназной активностью. В раковых клетках число молекул HER-2/;;ei/ варьирует от 1.5 х 105 до 1.8 х 106 молекул на клетку, в то время как их число в нормальных тканях не превышает 1.6 х 10' молекул на клетку. Таким образом, этот белок является характерным маркером распространенной группы злокачественных новообразований. Применение антител, специфически связывающих HER-2/i?e!/, дает возможность достав-

лять к раковым клеткам токсины, радиоактивные изотопы, а также молекулы, вызывающие адаптивный иммунный ответ и активацию комплемента, то есть предполагает создание высокоэффективных диагностических и терапевтических препаратов. Однако полноразмерные мышиные моноклональные антитела вызывают в человеческом организме иммунный ответ и этой проблемы удается избежать, используя “мини-ан-титело”, содержащее представляющее собой только фрагмент иммуноглобулиновой молекулы, непосредственно отвечающий за связывание антигена. Получение таких неприродных антител и их последующее оснащение действующими агентами является целью настоящего исследования.

Нами были созданы антитела, которые представляют собой слитые белки, состоящие из вариабельных участков тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, соединенных пептидным линкером (собственно мини-антитело), и домена бактериальной рибонуклеазы барназы. Белки, содержащие 5 ги-стидиновых остатков на N- или С-концах, получали в E. coli и очищали с помощью аффинной хроматографии на Ni-cop-бенте, а затем на белке А. Свойства полученных рекомбинантных антител изучали иммунохимически (ELISA) и методом проточной цитофлюрометрии. В качестве клеточной модели выбрали линию клеток SKOV-3, полученную из человеческой аденокарциномы яичника. На поверхности клетки SKOV-

3 содержится 2.6 х 105 молекул HER-2//;eu.

Иммунохимически доказано высокоаффинное связывание рекомбинантных анти-НЕК-2/«ем-антител с антигеном HER-2/пей. Методом проточной цитофлуориметрии показано специфическое связывание полученных неприродных мини-антител с клетками SKOV-3. Исследуется способность этих слитых белков проникать внутрь клеток, их цитотоксические и цитостатические свойства.

Работа поддержана грантами РФФИ №99-04-48836 и №01-04-49450, ГНТПРФ “Новейшие методы биоинженерии” и Швейцарского научного фонда.