Пребиотический потенциал полисахаридов из бурой водоросли Fucus evanescens и значение для клинического использования

Работа поддержана грантом ДВО РАН по проблеме «Фундаментальные и прикладные исследования в интересах медицины». References

1. Vorobev V.V. Creation of bioactive pharmaceutical substances and drugs from marine aquatic, Vestnik biotehnol. 2009. V. 4, no. 1. P. 33-38.

2. Ermak I.M., Davydova V.N., Aminin D.L. et al. Immunomodulatory activity of carrageenan from the red algae of the Far Eastern seas, Pacific Medical Journal. 2009. No. 3. P. 40-44.

3. Zurochka V.A., Dolgushin I.I., Simbircev A.S. Effect of immunomodulator «Bestim» in vitro on spontaneous and induced production of cytokines IFN-y, IL-1p, IL-4, IL-8, IL-10 immune cells of blood of healthy individuals, Citokiny i vospalenie. 2007. Vol. 6. no.1. P. 31-35.

4. Cytokine and respiratory diseases / eds. B.I. Gelcera, E.V. Proseko-voj. Vladivostok: Dalnauka, 2005. 256 p.

5. Totoljan A.A., Frejdlin I.S. The cells of the immune system, Vol. 1, 2. SPb.: Nauka, 2000.

6. Haitov R.M, Ignateva G.A., Sidorovich I.G. Immunology. M.: Medicina, 2002. 536 p.

7. Hotimchenko M.Ju., Sonina L.N. The effectiveness of calcium alginate in toxic liver damage of rats, Pacific Medical Journal. 2006. No. 4. P. 27-31.

8. Bienvenu J., Doche C., Gutowski M. et. al. Production of proinflammatory cytokines a cytokines involved in the TH1/TH2 balance is modulated by pentoxifylline, J. Cardiovasc. Pharmacol. 1995. Vol. 25. P. 80-84.

9. Kilpatric D.C. Immunological aspects of the potential role of dietary carbohydrates and lectins in human health, Eur. J. Nutr. 1999. Vol. 38. P. 107-117.

10. Lahaye M., Kaeffer B. Seaweed dietary fibres: structure, physico-chemical and biological properties relevant to intestinal physiology, Sciences and Aliments. 1997. Vol. 17. P. 563-584.

11. Rosha de Souza M.C., Marques C.T., Guerra Dore C.M. et al. Antioxidant activities of sulfated polysaccharides from brown and red seaweeds, Journal of Applied Physiology. 2007. Vol. 19. P. 153-160.

Поступила в редакцию 25.03.2011.

EFFECT OF sODIUM ALGINATE ON sPONTANEOUs AND INDUCED CYTOKINE PRODUCTION BY PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLs OF HEALTHY DONORs IN vITRo

N.V. Sergeeva', L.N. Bogdanovich1, Yu.S. Khotimchenko2 1 Medical Association of FEB RAS

Summary - The paper describes effects of sodium alginate on the spontaneous and induced cytokine production (interleukin 2 and 6 and tumour necrosis factor-a) by peripheral blood mononuclear cells of 16 healthy donors. As reported, the sodium alginate appears to have considerable concentration-dependent cytokine-induced action on interleukin 2 and weak action on interleukin 6 and tumour necrosis factor-a.

Key words: sodium alginate, mononuclear cells, cytokines.

Pacific Medical Journal, 2012, No. 1, p. 35-37.

УДК 615.322:577.114:582.272

пребиотический потенциал полисахаридов из бурой водоросли Fucus evanescens и значение для клинического использования

Т.А. Кузнецова1, Т.С. Запорожец1, И.Д.Макаренкова1, Н.Ф. Тимченко1, Н.Н. Беседнова1, Т.Н. Звягинцева2, Н.М. Шевченко2, Н.В. Мандракова3, В.Г. Мельников4

1 НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (690087 г. Владивосток, ул. Сельская, 1),

2 Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН

Ключевые слова: пребиотики, продукты функционального питания, фукоидан, альгинат.

Проведено исследование пребиотического потенциала полисахаридов (ПС) из бурой водоросли Fucus evanescens в экспериментах in vitro и in vivo. Установлено, что сульфатированный полисахарид фукоидан и низкомолекулярная альгиновая кислота способствуют усилению роста и накопления биомассы бифидобактерий, т.е. проявляют пребиотическую активность. На модели экспериментального лекарственного дисбактери-оза у мышей, получавших эти ПС в составе кисломолочного напитка с бифидобактериями, выявлено восстановление количественного и качественного состава кишечной микрофлоры. Наличие пребиотической активности открывает перспективы для включения исследуемых ПС в состав продуктов функционального питания, биологически активных добавок к пище и синбиотических препаратов для коррекции нарушений микробиоценоза у человека.

Большой интерес при разработке лекарственных препаратов и продуктов функционального питания,

Кузнецова Татьяна Алексеевна - д-р мед. наук, зав. лабораторией иммунологии НИИЭМ СО РАМН; тел.: +7 (423) 244-24-46; е-тай: takuznets@mail.ru

предназначенных для коррекции нарушений микробиоценоза у человека, представляют биологически активные вещества, наделенные свойствами преби-отиков. Вещества могут быть классифицированы как пребиотики, если обладают следующими свойствами: не расщепляются пищеварительными ферментами в верхних отделах желудочно-кишечного тракта, в неизмененном виде достигают толстого кишечника, селективно ферментируются его микрофлорой, стимулируя активный рост бифидобактрий, лактобактерий и других полезных микроорганизмов [14, 15].

В качестве пребиотиков выступают растворимые пищевые волокна - углеводоподобные соединения (полисахариды, олигосахариды), обычно связанные с растительными веществами и составляющие клеточные стенки растений (съедобных злаков, корнеплодов, фруктов, водорослей). Значительный интерес представляют бурые водоросли, которые богаты пищевыми волокнами: 25-75 % от сухого веса, при этом

около S0-8S % приходится на растворимые пищевые волокна [7, 13].

В бурых водорослях содержатся ламинараны, аль-гинаты, фукоиданы, которые широко используются в качестве составляющих в продуктах функционального питания и лекарственных препаратах. Именно эти полисахариды (ПС) и их производные обладают огромным пребиотическим потенциалом [7, 13].

Объектом нашего исследования явились ПС фу-коидан и альгиновая кислота, выделенные из бурой водоросли Охотского моря Fucus evanescens. Ранее нами показано, что фукоидан из этой водоросли обладает широким спектром биологической активности, включая антикоагулянтную, иммуномодулирующую, противоопухолевую, антибактериальную, антивирусную, липидемическую и др. [1].

Целью настоящей работы послужил анализ пребио-тической активности фукоидана и альгиновой кислоты из бурой водоросли Fucus evanescens в экспериментах in vitro и in vivo.

Материал и методы. Фукоидан (сульфатированный полисахарид) из бурой водоросли Охотского моря F. evanescens является 1^3;1^4-а^-фуканом с молекулярной массой 20-40 кДа, его моносахаридный состав представлен фукозой, галактозой, ксилозой, глюкозой в соотношении 71:9:10:8. Низкомолекулярная альгино-вая кислота является сополимером ß-D-маннуроновой и a-L-гулуроновой кислот в соотношении 4:1. В качестве пробиотика использованы производственные штаммы Bifidobacterium longum В379М и Bifidobacterium bifidum 791.

Исследование пребиотических свойств биологически активных веществ проводили с использованием кинетических моделей роста микроорганизмов фотометрическим методом [2] путем оценки их влияния на динамику роста и размножения бифидобактерий при культивировании в гидролизатно-молочной (ГМ) среде in vitro. Эксперименты осуществляли в двух вариантах:

1 ) в качестве углеводной основы питательной среды ГМ для культивирования бифидобактерий использовали лактозу с известным составом редуцирующих сахаров, а также дополнительно вносили фукоидан или альги-нат либо их композицию;

2) в качестве углеводной основы питательной среды для культивирования бифидобактерий вместо лактозы использовали фукоидан, альгинат либо их композицию.

В серии предварительных экспериментов были отработаны оптимальные для обогащения среды ГМ концентрации фукоидана и альгиновой кислоты, которые составили 2 и 1 мг/мл соответственно. Во втором варианте концентрация ПС составляла по 8 мг/мл, что соответствует количеству лактозы согласно прописи приготовления среды ГМ. Контролем служила среда с лактозой в качестве источника углеводов. Все среды стерилизовали и параллельно засевали культурой бифи-добактерий в количестве 10 % от общего объема среды.

0,3 -i

2 4 6 8 10 20 24

Время, часы

Рис. 1. Динамика роста штамма B. bifidum 791 на среде ГМ, обогащенной ПС из F. evanescens.

Пробы отбирали через 2, 4, 6, 8, 10, 12, 20 и 24 часа и анализировали по показателям оптической плотности, которую измеряли при 540 нм на МЫШсап ЯС (ЬаЬзу81еш8). Опыт ставили в триплетах. Вычисляли среднюю оптическую плотность для контроля и опыта. Количество живых бифидобактерий в КОЕ/г после культивирования в бифидум-среде определяли методом серийных разведений. Модель экспериментального лекарственного дисбактериоза воспроизводили путем внутрибрюшинного введения антибиотика гентамицина неинбредным белым мышам. С лечебной целью животные опытной группы получали двухкратно перорально в течение 1 месяца (начиная с 1-го дня от введения антибиотика) кисломолочный напиток с бифидобактериями, обогащенный ПС из F. evanescens. У мышей проводили микробиологическое исследование кала с определением видового состава и количественного уровня основных микробных популяций в динамике.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программы 81аИ8Иса 7. Для оценки значимости различий при нормальном распределении количественных признаков использовали ^критерий Стьюдента.

Результаты исследования. Сравнительный анализ показателей оптической плотности, характеризующих процесс культивирования бифидобактерий на контрольной и опытной (обогащенной ПС) средах, свидетельствовал о том, что нарастание биомассы происходило пропорционально времени культивирования при отсутствии выраженной лаг-фазы - периода между посевом культуры бактерий и началом ее размножения (рис. 1). При внесении ПС показатели оптической плотности на сроках исследования от 4 часов и во все последующие сроки были значимо выше по сравнению с контролем. Также значительно возрастал конечный выход биомассы бифидобактерий. Через 24 часа культивирования на среде, обогащенной ПС, содержание бифидобактерий при внесении фукоидана составляло 8,5±0,3х109 КОЕ/г, альгината - 11,5±0,4х109 КОЕ/г;

16

12 -

8 -

4 -

Контроль Фукоидан Альгинат Композиция

II 1-й вариант I 2-й вариант Рис. 2. Содержание бифидобактерий через 24 часа культивирования:

1-й вариант - обогащение ПС среды ГМ; 2-й вариант - использование ПС вместо лактозы. * Разница с 1-м вариантом статистически значима.

0,4 -

0,2 -

е О

т

10

т

20

1 г

2 4 6 8

Время, часы

Рис. 3. Динамика роста штамма В. bifidum 791 на среде ГМ: содержащей разные источники углеводов.

24

Яг

Яг

композиции - 15±0,8х109 КОЕ/г, что было значимо выше, чем в контроле, где содержание бифидобактерий составило 1,66±0,3х109 КОЕ/г (рис. 2).

На рис. 3 представлены кривые роста бифидобактерий на модифицированной среде ГМ, где вместо лактозы использовали фукоидан, альгинат либо их композицию. При внесении ПС динамика роста бифидобактерий несколько изменялась по сравнению с контролем: период постепенного (экспоненциального) роста сменялся значительным усилением роста (через 8 часов от начала культивирования), что проявлялось в виде скачка на кривой. Конечный выход биомассы бифидобактерий увеличивался в 3-5,8 раза. Так, на ГМ среде с лактозой этот показатель составил 1,75±0,25х109 КОЕ/г, на среде с фукоиданом возрастал до 5,3±0,3 х109 КОЕ/г, а на среде с альгинатом - до 6,5±0,3х109 КОЕ/г, при использовании же их композиции он увеличивался до 9,75±0,85х109 КОЕ/г (рис. 2).

Таким образом, в экспериментах in vitro мы показали, что обогащение питательной среды фукоиданом и альгинатом стимулирует рост бифидобактерий. Выход биомассы при этом увеличивался в 5,3-9,4 раза. При использовании в качестве углеводной основы питательной среды для культивирования бифидобактерий фукоидана и альгината вместо лактозы выход биомассы увеличивался в 3,0-5,8 раза.

При экспериментальном дисбактериозе изменения состава кишечной микрофлоры у мышей соответствовали I—II степени дисбактериоза и сопровождались значительным снижением количества бифидо-бактерий (3,6±1,6х106/г) по сравнению с исходным (1,44±0,48х108/г). Также отмечалось снижение количества лактобактерий (5,2±3,4х105/г, исходно -3,8±1,5х106/г) и энтерококков (1,2±0,3х106/г, исходно -6,0±1,5х106/г). Обращало на себя внимание увеличение содержания бактерий рода Clostridium (3,9±0,4х105/г, исходно - 1,3±0,3х104/г) и рода Proteus (7,8±0,3х107/г, у интактных мышей - 2,1±0,3х106/г).

У мышей, получавших с лечебной целью напиток, после месячного курса лечения выявлено

статистически значимое повышение содержания би-фидо- (1,9±0,4х1010/г) и лактобактерий (7,4±0,3х108/г), а также снижение содержания условно-патогенной микрофлоры в кишечнике. В частности, наблюдалась элиминация Staphylococcus saprophyticus, исходно присутствующего в кишечнике, и бактерий рода Proteus, содержание которых в отсутствие лечения, наоборот, возрастало.

Обсуждение полученных данных. Основным компонентом питания бифидо- и лактобактерий являются углеводы (моно-, олиго-, полисахариды). Фермен-тирование углеводов анаэробными микроорганизмами осуществляется с помощью набора гликозидаз (гликозилгидролаз) и лиаз с образованием коротко-цепочечных жирных кислот (преимущественно уксусной и молочной и др). Подавляющее большинство бифидобактерий демонстрируют наличие галакто-зидаз, глюкозаминидаз, ксилозидаз, маннозидаз и др. Ключевым ферментом в метаболизме углеводов бифидобактериями является фруктозо-6-фосфатаза [4, 6]. У некоторых видов бифидобактерий (B. bifidum, B. longum ssp. infantis, B. breve) выявлена продукция фукозидазы - фермента, расщепляющего фу-козу (структурного компонента фукоиданов) [3, 12]. Благодаря наличию этого фермента, олигосахариды фукоидана и альгината ферментируются кишечной микрофлорой in vitro, стимулируют рост бифидо- и лактобактерий, что свидетельствует об их пребиоти-ческих потенциях [8, 10, 11].

Что касается эффектов in vivo (полученных при кормлении животных препаратами или водорослевыми экстрактами, содержащими фукоидан, лами-наран, альгинат), то эти результаты варьируют. Это связано как со структурными характеристиками исследуемых ПС, так и с другими особенностями проведения экспериментов. Если отдельные авторы не выявили положительного эффекта, то в подавляющем большинстве работ показано нормализующее и стимулирующее действие диетических добавок или экстрактов водорослей, содержащих альгинат

или фукоидан, на состав кишечной микрофлоры [5, 8, 9]

Наши исследования показали, что фукоидан и аль-гинат из F. evanescens стимулируют рост и накопление биомассы бифидобактерий при их культивировании на питательной среде, обогащенной фукоиданом, альги-натом либо их композицией, а также на среде, где эти ПС использовали вместо лактозы. Данные, касающиеся второго варианта наших экспериментов, косвенно свидетельствуют об активном усвоении бифидобак-териями исследуемых ПС. Последние, по всей вероятности, служат для них источником углерода и энергии. Таким образом, фукоидан и альгинат из F. evanescens проявляют пребиотическую активность, свойственную пищевым волокнам.

Примечательно, что эффект композиции «фуко-идан-альгинат» на накопление биомассы бифидо-бактерий был значимо выше, чем при обогащении питательной среды только фукоиданом, что свидетельствует о синергизме пребиотического эффекта этих полисахаридов.

Пребиотический потенциал исследуемых ПС, проявляющийся нормализацией состава кишечной микрофлоры, подтвержден нами и в экспериментах in vivo на модели лекарственного дисбактериоза у мышей.

Наличие пребиотической активности у ПС из F. evanescens открывает перспективы для их включения в состав продуктов функционального питания, биологически активных добавок к пище и синбиотиков (препаратов, полученных в результате рациональной комбинации про- и пребиотиков) для коррекции нарушений микробиоценоза у человека.

Работа выполнена в рамках проекта МНТЦ №4000 от 01.05.2010 г. «Клинико-иммунологическая эффективность нового синбиотического продукта категории функционального питания (кисломолочный напиток с B. bifidum, обогащенный полисахаридами из бурой водоросли Fucus evanescens)», а также при поддержке гранта РФФИ 09-04-00761 и программы РАН «Клеточная и молекулярная биология». Литература References

1. Zaporozhec T.S., Kuznecova T.A., Smolina T.P. et.al. Immunotro-pic and anticoagulant properties of fucoidan from the brown alga Fucus evanescens: perspectives of approach in medicine, Zhurn. mikrobiol. 2006. No. 3. P. 54-58.

2. Skala L.Z., Nehorosheva A.G., Vinokurov A.E., Lukin I.N. Up-to-date technology in clinical microbiology and chemotherapy. Automated workplace of microbiologist, epidemiologist and chemotherapist, Klin. lab. diagnostika. 2001. no. 12. P. 25-32.

3. Ashida H., Miyake A., Kiyohara M. et al. Two distinct alpha-L-fucosidases from Bifidobacterium bifidum are essential for the utilization of fucosylated milk oligosaccharides and glycoconju-gates, Glycobiology. 2009. Vol. 19. P. 1010-1017.

4. Goderska K., Nowak J., Czarnecki Z. Cоmparison of the growth of Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium bifidum species in media supplement with selected saccharides including prebiotics, Acta. Sci. Pol., Technol. Aliment. 2008. Vol. 7, No. 2. P. 5-20.

5. Janczyk P., Pieper R., Smidt H., Souffrant W.B. Effect of alginate and inulin on intestinal microbial ecology of weanling pigs reared under different husbandry conditions, FEMS Microbiol. Ecol. 2010. Vol. 72. P. 132-142.

6. Jedrzejas M.J. Structural and functional comparison of polysac-charide-degrading enzymes, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 2000. Vol.35, No. 3. P. 221-251.

7. Jimenez-Escrig A., Sanchez-Muniz F.J. Dietary fiber from edible seaweeds: chemical structure, physicochemical properties and effects on cholesterol metabolism, Nut. Res. 2000. Vol. 20. P. 585-598.

8. Kuda T., Yano T., Matsuda N., Nishizawa M. Inhibitory effects of laminaran and low molecular alginate against the putrefactive compounds produced by intestinal microflora in vitro and in rats, Food Chem. 2005. Vol. 91. P. 745-749.

9. Lynch M.B., Sweeney T., Callan J.J. et al. The effect of dietary Laminaria-derived laminarin and fucoidan on nutrient digestibility, nitrogen utilisation, intestinal microflora and volatile fatty acid concentration in pigs, Journal of the Science of Food and Agriculture. 2010. Vol. 90, No. 3. P. 430-437.

10. Marzorati M., Verhelst A., Luta G. et all. In vitro modulation of the human gastrointestinal microbial community by plant-derived polysaccharide-rich dietary supplements, Int. J. Food Microbiol. 2010. Vol. 139. P. 168-176.

11. Michel C., Benard C., Lahaye M. et al. Algal oligosaccharides as functional foods: in vitro study of their cellular and fermentative effects, Food Sci. 1999. Vol. 19. P. 311-332.

12. Nagae M., Tsuchiya A., Katayama T. et all. Structural basis of the catalytic reaction mechanism of novel 1,2-alpha-L-fucosidase from Bifidobacterium bifidum, J. Biol. Chem. 2007. Vol. 282. P. 18497-18509.

13. O'Sullivan L., Murphy B., McLoughlin P. et all. Prebiotics from Marine Macroalgae for Human and Animal Health Applications, Mar. Drugs. 2010. Vol. 8. P. 2038-2064.

14. Roberfroid M.B. Prebiotics and probiotics: are they functional foods? American Journal of Clinical Nutrition. 2000. Vol. 71, No. 6. P. 1682-1687.

15. Tungland B.C., Meuer D. Nondigestible oligo- and polysaccharides (dietary fiber): their physiology and role in human health and food, Comp. Rev. Food Sci. Food Safety. 2002. Vol., No. 3. P. 73-92.

Поступила в редакцию 27.05.2011.

prebiotic properties of polysaccharides from brown seaweed fucus evanescens and perspectives

FOR CLINICAL UsiNG

T.A. Kuznetsova1, T.S. Zaporozhetz1, N.N. Besednova1, I.D. Makarenkova1, N.F. Timchenko1, T.N. Zvyagintseva2, N.M. Shevchenko2, N.V. Mandrakova3, V.G. Melnikov4 1 Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Siberian Branch of Russian Academy of Medical Sciences (1 Selskaya St. Vladivostok 690087 Russia), 2 Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far East Branch of the Russian Academy of Science (159 100 Ann. of Vladivostok Av. Vladivostok 690022 Russia), 3 Vladivostok State Medical University (2 Ostryakova Av. Vladivostok 690950 Russia), 4 International Science and Technology Center (20 box 32-34 Krasnoproletarskaya St. Moscow 127473 Russia) Summary - The prebiotic potential of polysаcсharides (PS) from brown seaweed Fucus evanescens were studied in vitro and in vivo experiments. We established that fucoidan and alginic acid stimulate the growth and accumulation of bifidobacteria biomass, i.e. these PS possess prebiotic activity. We revealed the restoration of quantitative and qualitative composition of intestinal microflora (increasing content of bifido- and laсtobacteria, typical Escherichia coli and reduction of opportunistic microflora) in mice with antibiotic-induced dysbiosis, treated with fermented by bifidobacteria and enriched with these PS milk. The presence of prebiotic activity opens the perspectives for inclusion of this PS to products of functional food, dietary supplements and sinbiotic preparations for the correction of human's microbiota disorders.

Key words: prebiotics, products of functional food, fucoidan, alginate.

Pacific Medical Journal, 2012, No. 1, p. 37-40.