Ферментолизат белка куриного яйца: получение и свойства

ДДИННОВАЦИОННЫ^ЕХНОЛОШИ

УДК 637.4.04.

Ферментолизат белка куриного яйца: получение и свойства

С. Н. Зорин, канд. биол. наук; В. К. Мазо, д-р биол. наук, профессор; И. С. Воробьева, канд. биол. наук; В. М. Воробьева, канд. техн. наук; А. А. Кочеткова, д-р техн. наук, профессор ФИЦ питания, биотехнологии и безопасности пищи, Москва

Одно из направлений модернизации пищевой промышленности России - разработка инновационных технологий, направленных на получение функциональных пищевых ингредиентов, в том числе гидроли-затов белка. Высокая эталонная биологическая ценность белка куриного яйца (БКЯ) определяет перспективы его использования в составе пищевых продуктов массового спроса и специализированных пищевых продуктов [1]. Аминокислотный состав целенаправленно получаемых ферментативных гидролизатов белка куриного яйца (ФГБКЯ) может отличаться от исходного белка незначительно. Преимуществами ФГБКЯ по сравнению с исходным белком являются более высокая растворимость в воде, перевариваемость и всасывание в желудочно-кишечном тракте.

Важным показателем качества и безопасного использования пищевого продукта (особенно для питания детей раннего возраста) является снижение его потенциальных ал-лергизирующих свойств, зависящих в определенной степени от сохранения исходной антигенности белка, входящего в его состав [2]. Снижая исходную антигенность БКЯ, протео-лиз одновременно приводит к образованию широкого спектра биологически активных пептидов. Результаты экспериментальных исследований гиполипидемических свойств [3, 4] свидетельствуют о возможностях эффективного использования ФГБКЯ в качестве функционального пищевого ингредиента диетических профилактических продуктов для лиц с алиментарно-зависимыми заболеваниями, такими как ожирение, сердечно-сосудистые заболевания, диабет 2 типа и метаболический синдром. В настоящее время в нашей стране не налажено производство ФГБКЯ для включения в состав специализированных продуктов профилактической направленности. Сочетание протеолиза и современных мембранных технологий (микро-, ультра-, нанофильтрации) позволяет получать ферментативные гидроли-заты с требуемыми органолептиче-

скими и иммунохимическими свойствами, что обеспечивает их высокое качество и безопасность.

Цель данного исследования - получение в лабораторных условиях ФГБКЯ, изучение физико-химических и иммунохимических характеристик для последующего внедрения его выпуска в промышленных условиях.

В качестве объекта исследования использовали изолят БКЯ (производства «OVOPOL PL», Польша), содержащий 90% белка. Для гидролиза применяли ферментный препарат «Панкреатин» активностью 2,25 Eur. u/ mg, полученный из панкреатической железы свиньи («SICHUAN BIOSYN PHARMACEUTICAL Co», КНР). Одностадийный ферментолиз БКЯ панкреатином проводили в лабораторных условиях, используя 5%-ную водную суспензию исследуемого белка. Для инактивации содержащегося в БКЯ овомукоида, являющегося ингибитором трипсина, суспензию нагревали до 85 °С, выдерживали при этой температуре и постоянном перемешивании в течение 15 мин, затем охлаждали до температуры (50±1) °С и вносили панкреатин при массовых соотношениях белок/фермент 99:1 и 49:1.

Реакционную смесь выдерживали при этой температуре в течение 5 ч при постоянном перемешивании. В процессе гидролиза поддерживали значение рН реакционной среды в диапазоне 7,4-7,6, используя 5,0 %-ный водный раствор смеси KOH/NaOH в соотношении 2:1. Алик-воты ферментолизата для хромато-графического и иммунохимического анализа отбирали через 3 ч после начала гидролиза и по его окончании. Гидролиз прекращали, инакти-вируя фермент нагреванием смеси до 75 °С и выдерживания при этой температуре в течение 15 мин. Оценивали протекание реакции фер-ментолиза для весовых соотношений белок/фермент равных 99:1 и 49:1.

Ультрафильтрацию образца ферментолизата, полученного после пятичасового гидролиза при соотношении белок/фермент равном 49:1, проводили в тангенциальном потоке

(установка «МИНИТАН», производство Millipor, США) с использованием мембран с диаметром пор 10 кД, отбирали низкомолекулярную фракцию. Полученные в результате гидролиза образцы и низкомолекулярную фракцию лиофилизовали с использованием сушилки ЛС 500 (производства РФ).

Молекулярно-массовое распределение (ММР) пептидов в водорастворимой части полученных образов анализировали методом эксклюзион-ной жидкостной хроматографии высокого давления на колонке Супероза 12 (1,6-50 см) (Pharmacia, Швеция), предварительно откалиброванной по стандартным глобулярным водорастворимым белкам производства SERVA, элюент 0,2 М хлористый натрий, скорость элюирования 2,0 мл/ мин. Оптическую плотность элюируемого раствора определяли на проточном ультрафиолетовом детекторе UV-1 при длине волны 280 нм. Хроматограммы интегрировали весовым методом в диапазоне молекулярных масс от свободного до полного объема хроматографической колонки.

Определение содержания антигенных структур овальбумина (интактного овальбумина) в лиофилизированных образцах ферментолизатов проводили непрямым иммуноферментным методом согласно [5], используя в качестве стандарта интактного оваль-бумина пятикратно перекристаллизованный овальбумин куриного яйца, поликлональные моноспецифические кроличьи антитела против этого белка и автоматический иммунофермент-ный анализатор «ЭФОС 9305» (ОАО «МЗ Сапфир», РФ). Осмоляльность 1%-ных растворов гидролизатов и его фракций определяли по ГОСТ Р 55578-2013 [6] на миллиосмоме-тре - криоскопе термоэлектрическом «МТ-5-01» (производства ОАО НПП «Буревестник», РФ).

На рис. 1 и 2 представлены экс-клюзионные хроматограммы ФГБКЯ, полученные при соотношениях белок / фермент 99:1 и 49:1 через 3 и 5 ч гидролиза, а в табл. 1 приведены результаты интегрирования этих хроматограмм, свидетельствующие о практическом завершении про-теолиза через 3 ч инкубации. Следует отметить, что около 50% ферменто-лизата, полученного при соотношении белок / фермент 99:1, остается в нерастворимой форме.

Содержание интактного куриного овальбумина, характеризующего его потенциальные аллергизирующие свойства, определяли в исходном белке (образец № 1), образцах, полученных после гидролиза в течение

INNOVATIVE TECHNOLOGIES /.

Молекулярная масса, кД Молекулярная масса, кД

3 ч 5 ч

Рис. 1. Эксклюзионные хроматограммы ферментативных гидролизатов БКЯ, полученных после предварительной тепловой денатурации

Молекулярная масса, кД 3 ч

Молекулярная масса, кД 5 ч

Рис. 2. Эксклюзионные хроматограммы ферментативных гидролизатов БКЯ, полученных после предварительной тепловой денатурации

ИННОВАЦИОННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ

Таблица 1

Молекулярно-массовое распределение пептидных фракций в составе ферментативного гидролизата белка куриного яйца

№ фракции Диапазон молекулярных масс, кД Содержание фракции, %

Соотношение белок / фермент 99:1 Соотношение белок / фермент 49:1

3 5 3 5

1 >272 0,8 0,3 0,0 1,0

2 272-72,9 2,0 0,9 0,0 0,6

3 72,9-29,0 3,5 2,7 0,9 0,9

4 29,0-14,6 6,7 5,9 3,9 3,5

5 14,6-8,0 15,9 13,8 12,2 11,5

6 8,0-4,1 22,1 22,0 23,0 20,4

7 4,1-1,6 16,8 21,8 24,2 23,9

8 <1,6 32,1 32,5 35,8 38,2

Таблица 2 Содержание интактного овальбумина в изоляте белков куриного яйца, гидролизатах и ультрафильтрате

№ образца Образец Содержание антигенных структур, % Осмоляльность, ммоль / кг

1 Исходный БКЯ 86,4+9,8 -

2 ФГБКЯ (соотношение белок / фермент 99:1) 1,09+0,09 24

3 ФГБКЯ (соотношение белок/ фермент 49:1) 0,659+0,031 32

4 Ультрафильтрат ФГБКЯ (соотношение белок / фермент 49:1) 0,00168+0,00006 47

5 ч при соотношении белок/фермент 99:1 и 49:1 (образцы № 2 и № 3 соответственно) и ультрафильтрате образца № 3 (образец № 4). Исходная антигенность стандарта интактного овальбумина была принята за 100%. Результаты исследования (табл. 2) показывают, что проведение фер-ментолиза при обоих соотношениях белок / фермент снизило антигенность получаемых пептидных смесей на два порядка, что в сочетании с данными о молекулярно-массовом распределении пептидных фракций свидетельствует о возможности получения ингредиентов с заданными функциональными свойствами, которые могут быть использованы при создании специализированных пищевых продуктов. В результате ультрафильтрации антигенность гидролизата снизилась почти в 400 раз, что позволяет использовать такие пептидные смеси в составе гипоал-лергенных пищевых продуктов.

Лиофильно высушенные образцы № 2 и № 3 хорошо растворялись в воде при температуре 50 °С, при этом образец № 2 представлял собой вязкий непрозрачный раствор бледно-желтого цвета. Образец № 3 был более прозрачным и менее вязким. Образцы имели солоноватый вкус, без горечи, запах свойственный гидролизатам белков. Ультрафильтрат (образец № 4) представлял собой порошок бледно-желтого цвета различной степени дисперсности, обладающий высокой гигроскопич-

ностью, быстро, но не полностью растворялся в воде, образуя небольшой хлопьевидный осадок. Цвет раствора - бледно-желтый, запах свойственный гидролизатам белков, вкус соленый с ярко выраженной горечью.

Следует отметить, что с увеличением степени гидролиза улучшалась растворимость ферментолизатов и вместе с тем возрастала осмо-ляльность полученных растворов, о чем свидетельствуют данные табл. 2. Наибольшую осмоляльность имел исследуемый ультрафильтрат, так как является относительно низкомолекулярной пептидо-аминокислотной смесью. Значение показателя осмо-ляльности ингредиентов необходимо учитывать при разработке специализированных пищевых продуктов, в том числе для лечебного, профилактического, детского и спортивного питания.

Таким образом, в результате проведенных исследований изучено молекулярно-массовое распределение пептидных фракций в составе ферментативных гидролизатов белка куриного яйца, полученных в течение трех и пяти часов протеолиза при соотношениях белок/ фермент 99:1 и 49:1. В качестве оптимального принято соотношение 49:1. Про-теолиз БКЯ снизил его исходную антигенность на два порядка. Ультрафильтрационная обработка гидролизата привела к дополнительной элиминации его антигенных структур. Полученные результаты могут быть

использованы при создании специализированных пищевых продуктов различного назначения.

ЛИТЕРАТУРА

1. Стефанова,И. Л. Перспективы использования яичного белка в составе функциональных пищевых продуктов/И. Л. Стефанова [и др.] // Птица и птицепродук-ты. - 2017. - № 1. - С. 43-45.

2. Ногаллер, А. М. Пищевая аллергия и непереносимость пищевых продуктов/А. М. Ногаллер [и др.]. - М.: Медицина, 2008. - 336 с.

3. Garces-Rimon, M. Egg white hydrolysa-tes with in vitro biological multiactivities to control complications associated with the metabolic syndrome/М. Garces-Rimon [et al] // Eur. Food Res. Technol. - 2016. -V. 242. - P. 61-69.

4. Udenigwe, C. C. The Role of Food Peptides in Lipid Metabolism during Dyslipidemia and Associated Health Conditions/C. С. Udenigwe, K. Rouvinen-Watt // Int. J. Mol. Sci. - 2015. - V. 16. -Р. 9303-9313.

5. Патент РФ № 2375910 C1 Способ получения ферментативного гидролизата сывороточных белков со средней степенью гидролиза/В. И. Круглик [и др.]; Опубл. 20.12.2009, Бюл. № 35.

6. ГОСТ Р 55578-2013. Продукты пищевые специализированные. Метод определения осмоляльности. - М: Стан-дартинформ, 2014. - 8 с.

REFERENCES

1. Stefanova I.L. et al. [Prospects for the use of egg white in functional foo]. Ptitsa i ptitseprodukty, 2017, no. 1, pp. 43-45.

2. Nogaller A.M. et al. Pishchevaya allergiya i neperenosimost' pishchevykh produktov [Food allergy and intolerance to food]. Moscow, Meditsina Publ., 2008. 336 p.

3. Garces-Rimon M. et al. Egg white hydrolysates with in vitro biological multiactivities to control complications associated with the metabolic syndrome. Eur. Food Res. Technol., 2016, vol. 242, pp. 61-69.

4. Udenigwe C.C., Rouvinen-Watt K. The Role of Food Peptides in Lipid Metabolism during Dyslipidemia and Associated Health Conditions. Int. J. Mol. Sci., 2015, vol. 16, pp. 9303-9313.

5. Kruglik V.I. et al. Sposob polucheniya fermentativnogo gidrolizata syvorotoch-nykh belkov so srednei stepen'yu gidroliza [The method of obtaining enzymatic hydrolyzate of whey proteins with an average degree of hydrolysis]. Patent RF № 2375910 S1; 20.12.2009.

6. GOST R 55578-2013. Specialized food products. Method for determining osmolality. Мoscow, Стандартинформ, 2014. 8 p.

INNOVATIVE TECHNOLOGIES

Ферментолизат белка куриного яйца: получение и свойства Ключевые слова

антигенность; белок куриного яйца; осмоляльность; ультрафильтрация; ферментативный гидролиз

Реферат

Ферментативные гидролизаты белков куриного яйца, обладающие высокой биологической ценностью и клинической эффективностью при ряде метаболических нарушений, имеют широкие перспективы использования в составе специализированных пищевых продуктов лечебного и профилактического назначения. Использованы изолят белков куриного яйца (ИБКЯ) и фермент панкреатин из поджелудочной железы свиньи. Гидролиз осуществлен при соотношениях белок/фермент 99:1 и 49:1 с проведением предварительной тепловой денатурации субстрата. Проведен иммунохимический, физико-химический и органолептический анализ образцов, полученных в результате гидролиза в течение 5 ч. Показано, что при обоих соотношениях белок/фермент анти-генность получаемых пептидных смесей снизилась на два порядка в сравнении с антигенностью стандарта интактного овальбумина. Для масштабирования процесса получения гидролизата оптимальным принято соотношение белок/фермент 49:1. В результате проведенной ультрафильтрации гидролизата его антигенность снизилась почти в 400 раз, однако при этом появился горький вкус и увеличилась осмоляльность. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о возможности получения ингредиентов с заданными функциональными свойствами для включения в состав специализированных пищевых продуктов. Разработанный способ получения ферментативного гидролизата белка куриного яйца может использоваться при масштабировании процесса в промышленных условиях.

Chicken egg protein enzymolysis: production and properties Key words

antigenic power to the maximum; egg protein; the osmolality of; ultrafiltration; enzymatic hydrolysis

Abstracts

Enzymatic hydrolysates of chicken eggs proteins with high biological value and clinical efficacy in a number of metabolic disorders, have broad prospects for use in the composition of specialized food products of therapeutic and preventive purpose. The chicken egg protein isolate (CEPI) and the enzyme Pancreatin from swine pancreas were used. The hydrolysis was carried out with ratios of protein/enzyme 99:1 and 49:1 with preliminary heat denaturation of the substrate. The immunochemical, physico-chemical and organoleptic analyzes of samples obtained by 5h hydrolysis were conducted. It is shown that antigenic power of obtained peptide mixtures had a two-order reduction in both ratios protein/enzyme in comparison with antigenic power of intact ovalbumin standard. To scale the process of obtaining the hydrolysate an optimal ratio of protein/enzyme 49:1 was accepted. As a result of hydrolysate ultrafiltration its antigenic power decreased by almost 400 times, but in this case it had a bitter taste and increased osmolality. The results of these studies indicate the possibility of obtaining ingredients with desired functional properties for inclusion in the composition of specialized food products. The developed method of producing an enzymatic hydrolysate of chicken eggs protein can be used in the scaling of process to industrial conditions.

Авторы

Зорин Сергей Николаевич, канд. биол. наук, Мазо Владимир Кимович, д-р биол. наук, профессор, Воробьева Ирина Сергеевна, канд. биол. наук, Воробьева Валентина Матвеевна, канд. техн. наук, Кочеткова Алла Алексеевна, д-р техн. наук, профессор Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи, 109240, Москва, Устьинский проезд, д. 2/14, zorin@ion.ru; mazo@ion.ru; vorobiova@ion.ru; vorobiova_vm@ion.ru; kochetkova@ion.ru

Authors

Zorin Sergey Nikolaevich, Candidate of Biological Sciences, Mazo Vladimir Kimovich, Doctor of Biological Sciences, Professor, Vorobyova Irina Sergeevna, Candidate of Biological Sciences, Vorobyova Valentina Matveevna, Candidate of Technical Sciences, Kochetkova Alla Alekseevna, Doctor of Technical Sciences, Professor Federal Research Center for Nutrition, Biotechnology and Food Safety, 109240, Moscow, Ustinsky proezd, 2/14, zorin@ion.ru; mazo@ion.ru; vorobiova@ion.ru; vorobiova_vm@ion.ru; kochetkova@ion.ru

Минсельхоз России расширяет экспортные возможности

для отечественных производителей

В феврале 2018 г. в рамках выставки «Галфуд-2018» в Дубае министр сельского хозяйства России Александром Ткачевым и министр по продовольственной безопасности ОАЭ Мерьям Аль-Мейри провели переговоры по вопросам расширения взаимного сотрудничества. Также стороны обсудили создание дополнительных условий для качественного расширения российского экспорта в страны Персидского залива и Северной Африки. Одним из результатов этих переговоров стало мероприятие по презентации кластера KIZAD в России.

В ходе встречи вице-президент по коммерческой деятельности компа-

нии Abu Dhabi Ports Эдвин Ламмерс представил участникам мероприятия возможности кластера KIZAD и обозначил основные преимущества участия в нем российских экспортеров. Главной задачей реализации проекта KIZAD в ОАЭ является построение современной промышленной зоны, удовлетворяющей запросам потенциальных партнеров и инвесторов, а также международным стандартам качества. Система отраслевых кластеров позволяет выстроить цепочку сырьевых поставок и последующей переработки. Инвесторам СЭЗ предлагается аренда недвижимости, как коммерческой, так и жилой, и срав-

23 апреля на площадке «Российского экспортного центра» состоялась презентация проекта кластера пищевой промышленности KIZAD, расположенного в городе Абу-Даби. Кластер может стать удобной логистической, инфраструктурной платформой для российских производителей и экспортеров сельхозпродукции. Организатором мероприятия выступил Минсельхоз России при поддержке АО «Российский экспортный центр».

нительно низкие тарифы на коммунальные услуги и энергетические ресурсы.