влияние диэлектрической проницаемости растворителя и концентрации ДНК на процесс ее термической денатурации в водно-органических растворах

УДК 577.323

ВЛИЯНИЕ ДИЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ РАСТВОРИТЕЛЯ И КОНЦЕНТРАЦИИ ДНК НА ПРОЦЕСС ЕЕ ТЕРМИЧЕСКОЙ ДЕНАТУРАЦИИ В ВОДНО-ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРАХ

О. В. Давыдова, С. И. Каргов

Методами кондуктометрии и спектрофотометрии исследован процесс термической денатурации ДНК в интервале концентраций Ср = 1.2-10-4 - 2.6-10-3 М в водно-этанольных и водно-диоксановых растворах. Показано, что температура плавления ДНК зависит от природы добавляемого органического растворителя и является нелинейной функцией диэлектрической проницаемости раствора. Первоначальное добавление органического растворителя приводит к значительному уменьшению температуры плавления ДНК, причем этот эффект нивелируется с увеличением концентрации ДНК. Дальнейшее уменьшение диэлектрической проницаемости раствора сопровождается плавным и практически линейным изменением температуры плавления ДНК.

Известно, что гидрофобные эффекты играют важную роль в биологических системах [1]. В частности, гидрофобные взаимодействия являются одним из главных факторов, контролирующих создание и поддержание необходимой конформации природных макромолекул, а также их взаимодействие с другими (макро)молекулами, и, таким образом, способствуют поддержанию их нормальной биологической активности. Сложность биологических систем приводит к необходимости изучения подобных эффектов в более простых модельных системах.

В качестве одной из таких модельных систем можно рассматривать раствор ДНК в водно-органических смесях. Исследование процесса термической денатурации ДНК в таких системах может пролить свет на многие аспекты гидрофобных взаимодействий с участием этой важнейшей биомакромолекулы.

В данной работе методами кондуктометрии и спектро-фотометрии исследован процесс термической денатурации ДНК в водно-этанольных и водно-диоксановых растворах с различными значениями диэлектрической проницаемости.

Экспериментальная часть

Использовали препарат Ка-ДНК из эритроцитов цыплят (Квапа!) без дополнительной очистки.

Для приготовления исходного раствора навеску ДНК растворяли в 1-10 3 М растворе КаС1. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически.

Во всех экспериментах использовали бидистиллирован-ную воду, дополнительно очищенную на установке «МИИ-Р» (ЫПИрвгв), с удельной электропроводностью не более

110 6 Ом .см . Использовали этанол и диоксан квалификации «х.ч.».

Спектрофотометрические измерения проводили на спектрофотометре «Lambda 2» (Perkin Elmer). Для получения кривых плавления образцы нагревали со скоростью 1 град/мин с помощью термоэлемента PTP-1. Значения температуры и оптического поглощения регистрировали с помощью персонального компьютера.

Сопротивление растворов измеряли на прецизионном кондуктометре «Conductolyzer 5300 В» (LKB) с точностью ± 0.25% при частоте переменного тока 2 кГц. Использовали термостатированную проточную ячейку с постоянной, равной 0.73 см 1 при 25°.

Для расчета структурных характеристик ДНК из кон-дуктометрических данных использовали подход, основанный на теории Маннинга [2] для растворов полиэлектролитов, который подробно описан нами в предыдущих работах этой серии [3-6].

В расчетах учитывали зависимость от температуры вязкости и диэлектрической проницаемости воды, а также предельной подвижности низкомолекулярных коионов и противоионов [7, 8]. Для этого использовали аппроксимации соответствующих температурных зависимостей полиномами третьей степени, позволяющие в выбранном температурном интервале достичь совпадения аппроксимирующих значений с экспериментальными с точностью более 0.1%.

Для расчета значений диэлектрической проницаемости раствора с разными концентрациями этанола и диоксана при разных температурах соответствующие литературные данные [9] аппроксимировали полиномами 4-й степени.

Для определения температуры плавления ДНК спект-рофотометрические и кондуктометрические кривые плавления дифференцировали по температуре и находили максимум на дифференциальной кривой.

Расчеты проводили на компьютере IBM-PC/AT с помощью программ, написанных на языке BASIC.

Обсуждение результатов

При спектрофотометрическом исследовании процесса термической денатурации ДНК (Ср = 0.6-10-4 М) в смешанных растворах вода - диоксан и вода - этиленгликоль было показано [10], что температура плавления ДНК линейно уменьшается с уменьшением диэлектрической проницаемости раствора независимо от природы органического растворителя. В дальнейшем, проведя исследования в растворах с более высокими концентрациями диоксана и этиленгликоля, авторы установили [11], что такая линейная зависимость имеет место только при уменьшении диэлектрической проницаемости раствора до определенного предельного значения (e » 58 для этиленгликоля и e » 50 для диоксана). При этом значении на зависимостях Тпл от e наблюдаются изломы, и при более низких значениях диэлектрической проницаемости раствора кривые перестают совпадать между собой. Показано, что совпадения кривых можно добиться и при значениях e ниже критических,

Рис. 1. Зависимость температуры плавления ДНК в водно-диоксано-вых растворах от диэлектрической проницаемости раствора в точке плавления при различных концентрациях ДНК

если строить график зависимости температуры плавления ДНК не от диэлектрической проницаемости, а от объемной доли воды в растворе. На основании этого факта авторы пришли к выводу, что при высоких концентрациях органического растворителя в растворе определяющим фактором температуры плавления ДНК является не диэлектрическая проницаемость, а объемная доля воды.

В настоящей работе исследовали процесс термической денатурации ДНК в водно-органических смесях при нескольких концентрациях ДНК в интервале Ср = 1.2-10-4 -2.6-10 М. Использование наряду с традиционным спект-рофотометрическим метода кондуктометрии, который, как было показано ранее [3-6], является удобным и информативным при изучении конформационных превращений в концентрированных растворах биополимеров, позволило провести исследования в широком интервале концентраций ДНК.

На рис. 1, 2 представлены полученные нами экспериментальные данные по зависимости температуры плавления ДНК в водно-этанольных и водно-диоксановых растворах от диэлектрической проницаемости раствора в точке плавления при различных концентрациях ДНК.

Из рисунков видно, что в отличие от данных [11] излом на зависимости для сопоставимых концентраций ДНК наблюдается сразу при добавлении даже небольших количеств органического растворителя. После первоначального резкого падения Тпл наблюдается ее плавный рост, причем ход кривых Тпл для водно-этанольных и водно-диокса-новых растворов различен, т.е. зависит от природы добавляемого органического растворителя.

Авторы [11] объясняют линейную зависимость Тпл от е тем, что при уменьшении е среды усиливается электростатическое отталкивание отрицательно заряженных фосфатных групп ДНК, что облегчает процесс денатурации.

На рис. 3 представлены данные по изменению среднего расстояния Ь между заряженными группами полииона ДНК в процессе термической денатурации в присутствии разных добавок органического растворителя, рассчитанные из кондуктометрических данных. Аналогичные результаты получены нами и при других концентрациях ДНК. Из рисунка видно, что величина Ь изменяется монотонно в зависимости от содержания органического растворителя. Таким образом, начальное резкое падение Тпл нельзя объяснить изменением структуры ДНК при добавлении органического растворителя.

Вероятно, начальное резкое падение Тпл ДНК объясняется изменением структуры раствора (воды) уже при небольших добавках органического растворителя, что приводит к облегчению образования новых водородных связей между расплетенными после денатурации цепями ДНК и водным окружением. Дальнейшее добавление органического растворителя не приводит к кардинальным изменениям этой структуры, что выражается в плавном измене-

5 ВМУ, Химия, № 3

50 г

45 -

40 -

35 -

35 45 55 65 75

£(7пл>

Рис. 2. Зависимость температуры плавления ДНК в водно-этаноль-ных растворах от диэлектрической проницаемости раствора в точке плавления. Обозначения те же, что и на рис. 1.

нии Тпл ДНК. Интересно, что эффект резкого уменьшения Тпл при первом добавлении органического растворителя нивелируется с ростом концентрации ДНК, и при Ср =2.6-10-3 М кривая зависимости Тпл от е не содержит изломов (рис. 1, 2). Одним из вероятных объяснений может служить так называемый «эффект самозащиты» ДНК, проявляющийся с ростом ее концентрации [12].

Остается неясной причина расхождения полученных нами данных с данными работ [10, 11]. Отсутствие начального излома нельзя объяснить влиянием концентрации ДНК, поскольку концентрация ДНК в работах [10, 11] была близка (6-10 5 М) к таковой в наших спектрофото-метрических экспериментах (1.2-10-4 М). Более того, поскольку этот эффект усиливается с уменьшением концентрации ДНК, то резкий начальный излом должен был проявиться в работах [10, 11] еще более ярко. Возможно, отсутствие начального излома объясняется тем, что авторы работ [10, 11] проводили исследования в 1.5-10-3 М цитратном буфере, в то время как в наших экспериментах буфер отсутствовал. По-видимому, действие буфера аналогично повышению концентрации ДНК и также сглаживает начальный излом. Тем не менее этот факт заслуживает дальнейшего изучения.

Работа выполнена при финансовой поддержке российского фонда фундаментальных исследований (грант № 97-03-32302а).

Рис. 3. Зависимость среднего расстояния между зарядами вдоль оси полииона ДНК (Ср = 1.75.10 3 М) от температуры при различных добавках диоксана, %: 1 - 0, 2 - 5, 3 - 10, 4 - 20, 5 - 30

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Кесслер Ю.М., Зайцев А.Л. // Сольвофобные эффекты. Теория,

эксперимент, практика. Л., 1989.

2. Manning G.S. // J. Phys. Chem. 1981. 85. P. 1506.

3. Давыдова O.B., Каргов С.И. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2, Хи-

мия. 1997. 38. С. 38.

4. Давыдова O.B., Каргов С.И., Козлов А.Г. // ЖФХ. 1996. 70.

С. 330.

5. Козлов А.Г., Давыдова O.B., Каргов С.И. // ЖФХ. 1993. 67. С. 1692.

6. Козлов А.Г., Давыдова O.B., Каргов С.И. // ЖФХ. 1993. 67. С. 1697.

7. Харнед Г., Оуэн Б. // Физическая химия растворов электроли-

тов. М., 1952.

8. Справочник по электрохимии / Под ред. А. М. Сухотина. Л.,

1981.

9. Timmermans J. // The Physico-Chemical Constants of Binary Systems in Concentrated Solutions. N.Y., 1960.

10. De Xammar Oro J.R., Grigera J.R. // Stud. Biophys. 1987. 120. Р. 51.

11. De Xammar Oro J.R., Grigera J.R. // J. Biol. Phys. 1995. 21. С. 151.

12. Auer H.E., Alexandrowicz Z. // Biopolymers. 1969. 8. P. 1.

Поступила в редакцию 08.01.98