СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ МУТАЦИИ P369ins В ГЕНЕ CYP1B1
METHOD OF DETECTING MUTATION P369ins IN GENE CYP1B1

Изобретение относится к области молекулярной генетики и медицины, а именно к разработке способов обнаружения мутации P369ins в гене CYP1B1. Изобретение может быть использовано в научно-исследовательской практике при изучении механизмов развития ПВГ.
На сегодняшний день единственным способом профилактики слепоты от глаукомы является ее ранняя диагностика и своевременно начатое лечение. Благодаря достижениям молекулярной генетики последних десятилетий стал возможен прогресс в доклинической диагностике и понимании точных механизмов развития сотен моногенных и мультифакториальных заболеваний.
Предположение о возможной генетической предрасположенности к глаукоме впервые было высказано Benedict T.W в 1842 г. В последующем различными исследователями были описаны родословные, демонстрирующие как аутосомно-рецессивный, так и аутосомно-доминантный тип наследования заболевания со степенью пенетрантности, варьирующей от 60 до 100%. У большинства членов этих родословных заболевание развивалось в раннем возрасте (юношеская ПОУГ).
Известно, что в 1997 году Stoilov I. et al идентифицировал мутации в гене CYP1B1, кодирующем цитохром Р4501 В1 у больных с глаукомой [Stoilov I., Akarsu A.N., Alozie I. et al. Sequence analysis and homology modeling suggest that primary congenital glaucoma on 2p21 results from mutations disrupting either the hinge region or the conserved core structures of cytochrome Р4501 В1 //Am. J. Hum. Genet. - 1998. - Vol.62. - P.573-584].
На настоящий момент идентифицировано 82 мутации гена CYP1B1 у пациентов с первичной врожденной и открытоугольной глаукомами, а также с аномалиями Ригера и Петерса. Среди описанных мутаций 46 миссенс-мутаций, 10 нонсенс-мутаций, 16 делеций и 8 инсерций или дупликаций и 2 молчащие мутации.
Известен способ обнаружения мутаций в гене CYP1B1 путем прямого секвенирования. Этот способ применялся многими исследовательскими группами [Melki R., Colomb E., Lefort N. et al. CYP1B1 mutations in French patients with early-onset primary open-angle glaucoma // J/ Med. Genet. - 2004. - Vol.41. - P.647-651], [Reddy A.B.M., Kaur K., Mandal A.K. et al. Mutation spectrum of the CYP1B1 gene in Indian primary congenital glaucoma patients // Mol. Vision. - 2004. - Vol.10. - P. 696-702].
Спектр описанных мутаций в гене CYP1B1 является этнически и популяционно-специфичным.
В настоящее время не обнаружено работ по исследованию данного гена в российской популяции.
Задача изобретения заключается в исследовании гена CYP1B1.
Техническим результатом изобретения является обнаружение мутации P369ins в гене CYP1B1.
Указанный технический результат достигается тем, что обнаружение мутации P369ins в гене CYP1B1 осуществляют путем амплификации методом ПЦР 349 пар нуклеотидов 3-го экзона гена CYP1B1 с помощью специально подобранных прямого и обратного праймеров
5'-CACCAAACAGGTATCCTGATGTG-3' и
5'-ATCACTCTGCTGGTCAGGTC-3'
с проведением отжига и последующего гетеродуплексного анализа, который включает смешивание ПЦР-продукта с формамидом в отношении 1:3, денатурацию полученной пробы в кипящей воде, последующее охлаждение при комнатной температуре, электрофорез ДНК в 8% вертикальном полиакриламидном геле и визуализацию ДНК-продукта окрашиванием нитратом серебра; о наличии мутации в гетерозиготном состоянии судят по образованию дополнительных полос в геле, имеющих электрофоретическую подвижность, как у фрагментов ДНК длиной 420 и 450 п.н., и отсутствующих у пациентов без мутации P369ins.
Исследования по обнаружению мутации гена цитохром Р450 (CYP1B1) проводились среди жителей Петербурга, из которых 45 человек составляли группу пробандов с первичной врожденной глаукомой, а 100 человек - контрольную группу из 100 доноров без патологии органа зрения.
В результате проведенных исследований у одного пациента при электрофорезе продуктов амплификации в полиакриламидном геле были обнаружены дополнительные фрагменты в амплификате экзона 3А, которые были интерпретированы авторами как гетеродуплексы. Также при SSCP-анализе был получен образец, который значительно отличался от всех остальных образцов. Секвенирование гетерозиготного образца с мутацией выявило наличие инсерции и для однозначного прочтения последовательности потребовало клонирования мутантного аллеля в плазмидном векторе.
Секвенирование мутантного аллеля выявило инсерцию тринуклеотида СТС и появление дополнительного остатка пролина в 369-ом положении белка цитохрома. По правилам номенклатуры эту мутацию следует называть с.1508ins3 или
c.1508insCTC при нумерации по канонической последовательности кДНК NM_000104.3, или g.7942ins3 при нумерации по канонической последовательности U56438 гена CYP1B1, или же p.P369ins при нумерации по последовательности белка человека NP_000095.1.
Мутация P369ins была найдена только у одного из 45 пробандов с ПВГ и не обнаружена ни у одного из 100 доноров без патологии органа зрения, составляющих группу контроля.
Лейциновый остаток в 369-ом положении входит в состав последовательности RLP (аминокислотные остатки 368-370, нумерация по последовательности белка человека NP_000095.1), идентичной между белком человека и его гомологами у шимпанзе, собаки, быка, мыши, крысы, курицы и рыбы Danio rerio.
В результате мутации в белке цитохрома CYP1B1 возникает последовательность RPLP с двумя близко расположенными остатками пролина. Остатки пролина образуют другой валентный угол в полипептидной цепи, чем остатки других аминокислот, и вставка дополнительного пролина должна существенно изменить пространственную укладку полипептидной цепи цитохрома, что скажется на его функции. Описанная нами мутация не индексирована в Human Genome Mutation Database и в обзоре, обобщающем результаты поиска мутаций в CYP1B1 в разных популяциях мира [Vasiliou V., Gonzalez F.J. Role of CYP1B1 in glaucoma //Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. - 2008. - Vol.48. - P.333-358].
В РФ исследования гена CYP1B1 ранее не проводились. В настоящем исследовании была идентифицирована первая специфичная для России мутация гена CYP1B1, что может быть использовано в научно-исследовательской практике при изучении механизмов развития ПВГ. Сущность изобретения поясняется чертежом, на котором представлена детекция мутации P369ins (c.1508ins3) в гетерозиготном состоянии в гене CYP1B1 с помощью гетеродуплексного анализа.
На чертеже следующие обозначения:
Дорожки: 1 - маркер молекулярного веса с шагом 100 п.н.; 2 - образец гетерозиготный по мутации P369ins; 3 - образец без мутации P369ins; электрофорез в 8% ПААГ, окрашивание ДНК нитратом серебра.
Способ осуществляют следующим образом.
Исследуют ген цитохрома Р450 (CYP1B1). Обнаружение мутации проводят методом (ПЦР) ДНК с использованием специально подобранных прямого и обратного праймеров:
5'-CACCAAACAGGTATCCTGATGTG-3' и
5'-ATCACTCTGCTGGTCAGGTC-3'
Размеры фракционированных фрагментов ДНК: 3 экзон площадка 3А - 349 п.н. (размер ампликона).
ДНК в пробу добавляют в количестве 50-100 нг. В качестве контроля используют пробу, не содержащую геномной ДНК. ПЦР проводят в 0.5 мл центрифужных пробирках на аппарате «Терцик» (ДНК-Технология, Москва, Россия) с набором программ, определяющих температурный режим ПЦР.
Составляют смесь для ПЦР с указанными ниже конечными концентрациями реагентов:
1.5 мМ
МgСl<sub>2</sub>
50 мМ
KCl
10 мМ
Трис-НСl рН 8.4 при комнатной температуре
200 мкМ
dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)
0.3 мкМ
фланкирующие праймеры (каждый)
1 единица
Taq-полимераза («Медиген», Новосибирск)
Используют следующий температурный режим:
5 минут
95°С
1 минута
95°С (денатурация)
1 минута
60°С отжига ←30 циклов
1 минута
72°С (достройка)
9 минут
72°С
x
Для оценки количества и специфичности полученного в результате проведения ПЦР амплификата проводят одномерный электрофорез в вертикальных пластинах полиакриламидного геля (80×100×1 мм) в 8% ПААГ (соотношение акриламид: бисакриламид =29:1) в 1ТВЕ.
Соответствие молекулярных весов амплификатов оценивают с помощью маркера молекулярного веса от 100 до 1000 пар нуклеотидов фирмы «Медиген» (Новосибирск). После электрофореза ДНК-продукт окрашивают серебром или бромистым этидием.
Полученный ПЦР-продукт размером 349 п.н. подвергают гетеродуплексному анализу для поиска мутации. Для этого пробы ДНК от пациентов смешивают с формамидом в соотношении 1:3, денатурируют в кипящей воде в течение 5 минут, затем охлаждают пробы до комнатной температуры в течение 10 минут и проводят вертикальный электрофорез в 8% ПААГ. Визуализацию ДНК-продукта проводят путем окрашивания нитратом серебра. Соответствие молекулярных весов амплификатов оценивают с помощью маркера молекулярного веса от 100 до 1000 пар нуклеотидов фирмы «Медиген» (Новосибирск). О наличии мутации в гетерозиготном состоянии судят по образованию дополнительных полос в геле, имеющих электрофоретическую подвижность как двунитевые фрагменты ДНК длиной 420 и 450 п.н. и отсутствующих у пациентов без мутации P369ins.
Сущность способа подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Больной И. 1981 г.р. Страдает первичной врожденной глаукомой с 1981 года, которая была обнаружена при рождении в роддоме. При проведении гониоскопии угол передней камеры закрыт мезодермальной тканью. ВГД 31 мм рт.ст. на обоих глазах. Было выполнено множество оперативных вмешательств на обоих глазах для компенсации глаукомного процесса. Величина Э/Д (экскавация диска) составила 0,9 на обоих глазах. По данным кинетической периметрии на ПРП-60 с белым объектом величиной 1,0 см и яркостью 0/0 было выявлено сужение поля зрения на правом глазу до 25° от точки фиксации с носовой, нижне-носовой, верхне-носовой и нижней сторон, сужение до 35° с нижней стороны и сужение до 50° со всех остальных сторон. Поле зрения на левом глазу невозможно было определить из-за очень низкой остроты зрения (светоощущение с неправильной светопроекцией). Передне-задний размер правого глаза 27,26 мм. Диаметр роговицы - 15 мм.
В 2007 г. больному были проведены исследования ДНК, заключающиеся в амплификации методом ПЦР 349 пар нуклеотидов 3-го экзона гена CYP1B1 с помощью специально подобранных прямого и обратного праймеров
5'-CACCAAACAGGTATCCTGATGTG-3'и
5'-ATCACTCTGCTGGTCAGGTC-3'
при температуре отжига 60°С и проведении последующего гетеродуплексного анализа, который включает смешивание ПЦР-продукта с формамидом в отношении 1:3, денатурацию полученной пробы в кипящей воде в течение 5 мин, последующее охлаждение до комнатной температуры в течение 10 мин, электрофорез ДНК в 8% вертикальном полиакриламидном геле и визуализацию ДНК-продукта окрашиванием нитратом серебра. В результате проведенных исследований была обнаружена мутация в гетерозиготном состоянии, о наличии которой судили по образованию дополнительных полос в геле, имеющих электрофоретическую подвижность, как у фрагментов ДНК длиной 420 и 450 п.н., и отсутствующих у пациентов без мутации P369ins (см. чертеж).
Пример 2. Обследуемая И. является матерью пробанда. 1955 г.р. (53 года). На момент обследования клинические признаки заболевания глаукомой отсутствовали. ВГД на обоих глазах было 20 мм рт.ст. При проведении гониоскопии угол передней камеры открыт, средней ширины. Величина Э/Д (экскавация диска) составила 0,3 на обоих глазах. В полях зрения имеются небольшие отклонения неспецифического характера на правом глазу, но, учитывая большой процент ошибки при выполнении данного исследования пациенткой, нельзя опираться только на этот показатель при выставлении диагноза какого-либо глазного заболевания. При выполнении ретинальной томографии зрительного нерва на Гейдельбергском ретинальном томографе HRT III отклонений в показателях, применяемых для оценки диска зрительного нерва от среднестатистических значений, не выявлено.
В 2007 г. обследуемой были проведены исследования ДНК, заключающиеся в амплификации методом ПЦР 349 пар нуклеотидов 3-го экзона гена CYP1B1 с помощью специально подобранных прямого и обратного праймеров
5'-CACCAAACAGGTATCCTGATGTG-3' и
5'-ATCACTCTGCTGGTCAGGTC-3'
при температуре отжига 60°С и проведении последующего гетеродуплексного анализа, который включает смешивание ПЦР-продукта с формамидом в отношении 1:3, денатурацию полученной пробы в кипящей воде в течение 5 мин, последующее охлаждение до комнатной температуры в течение 10 мин, электрофорез ДНК в 8% вертикальном полиакриламидном геле и визуализацию ДНК-продукта окрашиванием нитратом серебра. В результате проведенных исследований была обнаружена мутация в гетерозиготном состоянии, о наличии которой судили по образованию дополнительных полос в геле, имеющих электрофоретическую подвижность, как у фрагментов ДНК длиной 420 и 450 п.н., и отсутствующих у пациентов без мутации P369ins (см. чертеж).
Предлагаемый способ позволяет идентифицировать мутацию P369ins (с.1508ins3) в гене CYP1B1. Исследования проводились среди жителей г.Санкт-Петербурга. Способ может быть использован в научно-исследовательской практике при изучении механизмов развития ПВГ.