СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВА, СТИМУЛИРУЮЩЕГО РЕГЕНЕРАЦИЮ ПОВРЕЖДЕННОЙ ПЕЧЕНИ
METHOD FOR PRODUCING SUBSTANCE STIMULATING INJURED LIVER REPAIR

Настоящее изобретение относится к способам получения биологически активных соединений, которые могут найти применение в медицине для инициирования и усиления регенерации печени при тяжелых ее поражениях.
Актуальность данной работы определяется рядом факторов, в том числе увеличением смертности от гепатитов B, C - ежегодно от гепатитов умирают >1 млн человек, через 10 лет заболеваемость гепатитами увеличится в 2 раза, в России эпидемиологический порог заражения людей гепатитами B и C превышен в 5 раз [1].
Известны различные подходы к стимуляции регенерации печени при ее повреждениях или массивных резекциях. Предприняты попытки стимулировать регенерацию посредством введения аминокислот, тканевых гидролизатов, витаминов, гормонов, факторов роста [2], например, таких как фактор роста гепатоцитов (HGF), эпидермальный фактор роста (EGF), сосудисто-эндотелиальный фактор роста (VEGF), стимулирующее вещество из печени (hepatic stimulator substance, HSS) [3, 4].
Задачей изобретения является способ получения вещества, стимулирующего регенерацию печени (ВСРП).
Поставленная задача решается способом получения ВСРП, заключающимся в том, что свежевыделенную печень неонатального поросенка гомогенизируют в дистиллированной воде в соотношении 1:3-5 при +3-5°C, гомогенат центрифугируют для осаждения ядер. Полученный постъядерный супернатант прогревают на водяной бане в течение 7-10 мин при температуре от 20° до 38°C, доводят до 100°C и прогревают 15-20 мин - при 100°C. Образовавшийся осадок термолабильного материала удаляют центрифугированием (5000 об/мин, 15 мин). К супернатанту, охлажденному до +4-6°C, добавляют охлажденный до -18 - -20°C этанол до концентрации 65-70% и оставляют при этой температуре на 15-17 ч при той же температуре, центрифугируют в том же режиме, который указан выше. Затем спирт удаляют на роторном испарителе. Полученный целевой продукт замораживают и хранят при -65 - 70°C до использования.
Отличительными признаками предлагаемого способа являются: гомогенизация ткани печени неонатального поросенка в дистиллированной воде, центрифугирование гомогената ткани печени, прогревание супернатанта при температуре от 20° до 38°C 7-10 мин, доведение температуры до 100° и выдерживание в течение 15-20 мин при этой температуре, центрифугирование после прогревания, обработка этанолом до концентрации 65-70%, выдерживание с этанолом 15-17 ч при - 15-20°C, центрифугирование при +4°C, 5000 об/мин, 15 мин, удаление спирта на роторном испарителе, замораживание при -65 - 70°C.
Испытания заявляемого ВСРП на регенеративную активность были проведены in vivo на модели токсического повреждения печени мышей.
Нижеследующие примеры иллюстрируют способ получения вещества и его биологическую активность.
1. Пример получения ВСРП.
Производят забор печени 2-дневного поросенка при его забое. Вес печени 39,0 г. Ткань печени измельчают, добавляют 117 мл дистиллированной воды, гомогенизируют при +3-5°C, гомогенат центрифугируют для осаждения ядер при 1000 об/мин, в течение 10 мин Полученный постъядерный супернатант прогревают на водяной бане в течение 7-10 мин при температуре от 20° до 38°C, доводят до 100° и прогревают 15-20 мин - при 100°C. Образовавшийся осадок термолабильного материала удаляют центрифугированием при +4°C, 5000 об/мин, в течение 15 мин. К супернатанту, охлажденному до +4 - +6°C, добавляют 252 мл 95% этанола, охлажденного до -18 - -20°C и оставляют при этой температуре на 15-17 ч, центрифугируют при +4°C, 5000 об/мин в течение 15 мин. Спирт из супернатанта удаляют на роторном испарителе. Полученный супернатант (30 мл), представляющий собой водный экстракт печени неонатального поросенка, замораживают и хранят до использования при - 65 - 70°C.
2. Определение активности заявленного ВСРП in vivo на модели токсического повреждения печени мышей.
Для выполнения данной работы белым лабораторным мышам весом 18-20 г моделировали повреждение печени путем внутрибрюшинного введения раствора тиоацетамида (ТАА) в дозе 250 мг/кг (15 мг/мл свежеприготовленного раствора в стерильном физиологическом растворе). Животным контрольной группы вводили только физиологический раствор. Размороженный ВСРП растворяли в 5 мл физиологического раствора.
Внутрибрюшинное введение (0,46 мл на 20 г веса) ВСРП проводили через 2 часа после введения ТАА, забор крови у мышей производили через 48 часов после введения ТАА. Эффект воздействия ВСРП оценивали по изменению активности аминотрансфераз аспарагиновой (ACT) и аланиновой (АЛТ) в сыворотке крови опытных животных по сравнению с контрольными [5]. Показатели активности цитолитических ферментов используются для оценки регенеративной активности [6-8].
Активность аминотрансфераз определяли кинетическим методом с использованием диагностических наборов фирмы «Диакон-ВНЦМДЛ», Москва. В таблице представлены данные о влиянии ВСРП на активность ACT и АЛТ.
Из данных таблицы следует, что ВСРП вызывает достоверное (р<0,01) снижение активности ACT и АЛТ на 48 и 57%, соответственно, в сыворотке крови экспериментальных мышей.
Таким образом, использование заявленного ВСРП при токсическом повреждении печени экспериментальных животных позволяет эффективно снижать активность цитолитических ферментов (ACT и АЛТ) в их крови.
Предлагаемый способ позволяет расширить ассортимент веществ, обладающих регенерирующей активностью.
Список литературы
1. Проблемы учета заболеваемости и смертности от хронического гепатита С в Российской Федерации.
http://www.zdrav.ru/articles/practice/detail.php
2. Michalopoulos G.K., DeFrance M.C. Liver regeneration. Science. 1997; 276(5309): 66-70.
3. La Breque D.R. The role of hepatotrophic factors in liver regeneration-a brief review including a preliminary report of the in vitro effects of hepatic regenerative stimulator substance (SS). Yale J. Bio.l Med. 1979; 52(1): 49-60.
4. Margeli A.P., Skaltsas S.D., Spiliopoulou C.A., Mykoniatis M.G., Theocharis S.E. Hepatic stimulator substance activity in the liver of thioacetamide-intoxicated rats. Liver. 1999; 19(6): 519-525.
5. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник. Под ред. Меньшикова В.А. М.: Медицина. 1987. С.186-190.
6. Margeli A.P., Papadimitriou L., Ninos S., Manolis E., Mykoniatis M.G., Theocharis S.E. Hepatic stimulator substance administration ameliorates liver regeneration in an animal model of fulminant hepatic failure and encephalopathy. Liver Internat. 2003; 23(3): 171-178.
7. An W., Mei M.H. Protective effect of hepatic stimulator substance against experimental acute liver failure in mice. Sheng Li Xue Bao. 1991; 43(5): 415-427.
8. Theocharis S.E., Margeli A.P., Agapitos E.V., Mykoniatis M.G., Kittas C.N., Davaris P.S. Effect of hepatic stimulator substance administration on tissue regeneration due to thioacetamide-induced liver injury in rats. Scand. J. Gastroenterol. 1998; 33(6): 656-663.