Оценка воздействия гормональных добавок на органы пищеварительной системы русского осетра

УДК 597-111:597.442

О. В. Ложниченко, В. П. Загрийчук, В. В. Грицишина

ОЦЕНКА ВОЗДЕЙСТВИЯ ГОРМОНАЛЬНЫХ ДОБАВОК НА ОРГАНЫ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ РУССКОГО ОСЕТРА

Введение

В результате направленного формирования популяций, наиболее приспособленных к современным условиям, создается управляемое и рациональное рыбное хозяйство. Одним из существенных направлений при решении этой задачи является разработка методов управления развитием и созреванием половых желез рыб. Для этого используются методы гормональной стимуляции созревания половых желез. Однако применение подобных методов оказывает влияние и на другие системы органов рыб, в частности печень и органы пищеварительной системы.

Материал и методы исследований

Исследования проводились в Астраханском государственном техническом университете на кафедре гидробиологии и общей экологии в течение 2007-2009 гг. Объектом исследования служили личинки и мальки русского осетра (Acipenser guldenstadtii Brandt), полученные заводским методом выращивания. Материал обрабатывали методами классической гистологии [1]. Для изучения строения органов и тканей парафиновые блоки нарезали на стандартном микротоме сагиттально. Серии срезов толщиной 5-6 микрон окрашивали гематоксилин-эозином. Исследовались печень и органы пищеварения (желудок, средняя кишка, спиральный клапан). Концентрация гормональных добавок составляла 0,1 и 0,001 мг/кг.

Результаты исследований и их обсуждение

Печень

Строение печени русского осетра до начала эксперимента. У личинок русского осетра перед началом эксперимента печень представляла собой компактный и довольно крупный орган. Следует отметить, что балочная структура органа была сохранена, а ядра клеток отличались полиморфизмом, хотя клетки оставались обычной - полигональной формы. Цитоплазма отдельных гепатоцитов содержала мелкие жировые пустоты. Ядра в основном были крупными, светлыми. В каждом ядре были ясно видны ядрышки, чаще одно, реже - до 4-5. В печени личинок осетра встречалось несколько видов гепатоцитов: одни имели крупные, светлые ядра, часть гепатоцитов содержала мелкие, темные пикнотические ядра, имелись также безъядерные клетки.

Стенки капилляров печени изнутри выстланы крупными клетками. Как правило, капилляры были заполнены форменными элементами крови. Кроме того, гистологический анализ печени личинок показал, что среди гепатоцитов расположены многочисленные мезенхимные клетки. По периферии органа располагаются кроветворные островки, чаще и более крупные, чем в центре печени; отмечено незначительное количество довольно мелких гранул гемосидерина.

Таким образом, в печени личинок русского осетра отмечаются активно происходящие процессы кроветворения. В целом орган является практически здоровым, но встречаются такие патологические изменения в гепатоцитах, как отсутствие ядер в клетках, незначительная вакуолизация цитоплазмы гепатоцитов.

Строение печени русского осетра через 10 дней кормления гормоносодержащими кормами. Контрольная группа личинок осетра в течение 10 дней эксперимента содержалась на живых кормах. Личинок кормили 12 раз в сутки примерно через каждые 2 часа. Выживаемость рыб в контрольной выборке находилась на уровне 93 %. Из выборки были зафиксированы особи для гистологического анализа. Исследование гистоструктуры печени личинок русского осетра значительных изменений в морфологии органа не выявило. Балочная структура органа была сохранена, среди гепатоцитов отмечались гемопоэтические участки с происходящим процессом кроветворения. Печеночные клетки, как правило, были полигональной формы, которая менялась в зависимости от занимаемого ими положения в печеночной пластинке. Ядра были шаровидной формы, располагались преимущественно в центре гепатоцитов и имели хорошо очерченную оболочку. В ядре хорошо просматривались ядрышки в количестве 2-3. Цитоплазма

некоторых гепатоцитов имела некоторую зернистость, содержала маленькие жировые капельки. У некоторых личинок отмечены незначительные отклонения в количестве жировых накоплений в гепатоцитах - мелкие капли жира сливались и образовывали жировые пустоты, которые зачастую приводили к смещению ядра к периферии клетки. Подобные изменения были крайне редки для печени контрольной группы личинок.

Изменения в печени особей русского осетра, содержавшихся в течение 10 суток на корме с добавками гормонов. При анализе состояния печени исследованных рыб прежде всего было отмечено следующее: как правило, границы клеток были четко очерчены, цитоплазма была светлой. Отмечались незначительные отклонения в количестве жировых капель. Около 1,2 % клеток печени имели два ядра. Ядра крупные, светлые, содержат одно, реже два ядрышка. Встречались и безъядерные клетки, иногда имелись небольшие отеки гепатоцитов. Капилляры печени были расширенны неравномерно, в просветах находились ортохромные эритроциты.

У некоторых личинок границы клеток печени не всегда четко выявлялись, чаще всего это было характерно для клеток, расположенных по периферии. Клетки и их ядра были полиморфными. Встречались и клетки с эксцентрично расположенными ядрами - 24 % от числа всех клеток печени. Крупные светлые ядра содержали 1-2 ядрышка и сеточку хроматина по краям ядра. Размеры клеток варьировали в широких пределах, но форма оставалась в основном полигональной.

Процессы кроветворения в печени исследуемых личинок происходили активно. Ткань печени состояла из гепатоцитов, расположенных группами, зачастую округлой формы, и кроветворной ткани, содержавшей огромное количество развивающихся клеток крови. Вокруг крупных сосудов гепатоциты отсутствовали. В этих местах имелось значительное количество бластных клеток крови и их микроокружения.

Таким образом, активное питание личинок в течение 10 дней кормом, содержавшим тестостерон, не привело к серьезным патологическим изменения паренхимы печени, но вызвало ее незначительные повреждения - неоднородность окраски цитоплазмы гепатоцитов, смещение ядер и их увеличение в диаметре.

Строение печени русского осетра через 20 дней кормления гормоносодержащими кормами. В контрольной группе, несмотря на кормление исключительно живым кормом, в печени рыб наблюдались некоторые изменения, но значительных повреждений тканей отмечено не было. Балочная структура органа сохранена. Ядра клеток печени отличались полиморфизмом, хотя клетки оставались полигональной формы. На некоторых участках печени встречались группы гепатоцитов, цитоплазма которых содержала мелкие жировые пустоты. Ядра в основном были крупными, светлыми, содержали одно, реже два ядрышка. Встречались и безъядерные гепато-циты. Кровеносные капилляры были неравномерно расширены и заполненные форменными элементами крови. В паренхиме органа встречались гранулы гемосидерина различной величины. Процессы кроветворения в этом возрасте у анализируемых рыб происходили активно. Среди гепатоцитов были отмечены участки кроветворной ткани, состоящие из развивающихся клеток крови и их микроокружения.

На основании вышесказанного можно заключить, что у рыб контрольной группы, содержавшихся на живом корме, встречались незначительные изменения гепатоцитов, проявляющиеся в полиморфизме ядер, часть гепатоцитов содержала жировые пустоты, встречались гранулы гемосидерина.

Через 20 дней эксперимента ядра и клетки печени характеризовались полиморфизмом. Ядра встречались различных размеров - от крупных светлоокрашенных, не имеющих ядрышек (около 24 % клеток), и с хроматином, расположенным по периферии ядра, до небольших, темно окрашенных так, что ядрышки не просматриваются (15 % клеток). Цитоплазма гепатоцитов была заполнена жировыми вакуолями различного размера, от мелких до крупных, занимающих всю поверхность гепатоцитов. В результате ядра оказывались смещенными к периферии. Контуры клеток печени имели четкие границы не на всех участках.

Среди клеток печени были обнаружены макрофаги, образующие небольшие скопления и содержавшие в своей цитоплазме глыбки гемосидерина, т. е. их цитоплазма накапливала вещество, имеющее черную окраску. У этих клеток были трудноразличимы контуры и ядра. Подобные скопления макрофагов встречались чаще всего вблизи кровеносных сосудов. Кровеносные капилляры были расширены и переполнены форменными элементами крови. Вокруг капилляров и кровеносных сосудов встречалось значительное количество клеток крови и их микроокружения.

Таким образом, с увеличением сроков экспозиции повреждающее действие гормоносодержащих кормов усиливалось. Токсическое действие кормов проявлялось в жировом перерождении гепатоцитов с одновременно происходившими воспалительно-инфильтрационными процессами и гемосидерозом.

Желудок

Особенности строения желудка русского осетра до начала эксперимента. Желудок выполняет секреторную, механическую и эндокринную функции. Его стенка построена из слизистой, мышечной и серозной оболочек. Слизистая оболочка состоит из эпителиального слоя, основной пластинки, мышечной пластинки, подслизистой оболочки, слизистая оболочка формирует складки поля и ямки. В образовании складок принимают участие все слои слизистой, в образовании полей - эпителиальный слой и основная пластинка, в которой железы располагаются группами, разграниченными соединительной тканью. Желудочные ямочки образуются в результате погружения эпителия в толщу основной пластинки. Мышечная оболочка состоит из трех слоев гладкомышечных клеток: внутреннего, наружного, среднего. Внутренний слой косой, средний - циркулярный, наружный - продольный. Серозная оболочка построена из рыхлой соединительной ткани и снаружи покрыта мезотелием. Анализ гистотсруктуры желудка осетра особых патоморфологических изменений не выявил. Тем не менее можно выделить следующие особенности. В желудочные ямки открываются обычно одна-две желудочные железы. Эти простые неразветвленные трубчатые железы выстланы кубическим эпителием, там же располагаются светлые клетки, выделяющие слизь. Собственная пластинка слизистой оболочки состоит из рыхлой волокнистой соединительной ткани. Мышечная оболочка состоит из внутреннего слоя - очень тонкого косого, среднего - широкого, циркулярного, наружного - узкого продольного слоя гладких мышечных клеток. От внутреннего слоя отходят промежутки между желудочными железами - гладкомышечные клетки.

Таким образом, морфологический анализ желудка исследуемых рыб не выявил изменений, связанных с антропогенным воздействием внешней среды.

Особенности строения желудка русского осетра при использовании гормоносодержащих добавок. Слизистая оболочка желудка состоит из эпителиального слоя, основной пластинки, мышечной пластинки, подслизистой оболочки, слизистая оболочка формирует складки поля и ямки. В образовании складок принимают участие все слои слизистой, в образовании полей -эпителиальный слой и основная пластинка, в которой железы располагаются группами, разграниченными соединительной тканью. Желудочные ямочки образуются в результате погружения эпителия в толщу основной пластинки. Мышечная оболочка состоит из трех слоев гладкомышечных клеток: внутреннего, наружного, среднего. Внутренний слой косой, средний циркулярный, наружный - продольный. Серозная оболочка построена из рыхлой соединительной ткани и снаружи покрыта мезотелием. Анализ гистоструктуры желудка особых патоморфологических отличий между исследуемыми группами не выявил. Тем не менее можно выделить следующие особенности. В желудочные ямки открываются обычно одна-две желудочные железы. Эти простые неразветвленные трубчатые железы выстланы кубическим эпителием, там же располагаются светлые клетки, выделяющие слизь. Собственная пластинка слизистой оболочки состоит из рыхлой волокнистой соединительной ткани. Мышечная оболочка состоит из внутреннего слоя - очень тонкого косого, среднего - широкого, циркулярного и наружного - узкого продольного слоя гладких мышечных клеток. От внутреннего слоя отходят промежутки между желудочными железами - гладкомышечные клетки.

Таким образом, морфологический анализ желудка исследуемых рыб не выявил изменений, связанных с воздействием гормональных добавок.

Средняя кишка

Особенности строения кишки русского осетра до начала эксперимента. В среднем отделе кишечника происходит окончательное переваривание пищи и всасывание питательных веществ. Стенка этого отдела представлена тремя оболочками: слизистой, мышечной и серозной. Слизистая оболочка имеет большое количество складок. Внутренняя выстилка представлена однослойным призматическим эпителием с ярко выраженной каемкой. Эпителиальный пласт представлен

двумя основными клеточными типами: всасывающие призматические клетки и слизевыделяющие -бокаловидные клетки. Каемка состоит из большого количества микроворсинок, которые являются как бы выступами кутикулы, в которых имеются канальцы. На рассмотренных препаратах кишечные ворсинки средней кишки разной длины, толщины и формы. Одни из них имеют на себе вторичные и третичные складки, другие соединяются своими верхушками. В связи с этим верхушки ворсинок становились наиболее широкими отделами этих образований.

На верхушках наблюдается масса вторичных и третичных складочек - ветвистых разрастаний или «гребешков». Ворсинки покрыты каемчатым эпителием, в котором имеются крупные, переполненные секретом слизистые клетки. На самых верхушках кишечных ворсинок эпителий как бы разрыхлен, в отдельных местах слущен. Основания желез кишечника доходят почти до границы с мышечной оболочкой, но клетки Панета отсутствуют.

Ворсинки кишки иногда срастаются «гребешками», образуя в полости кишки сплошные кольца. Соединительнотканная основа ворсинок состоит из различных клеточных элементов, в том числе из скоплений ретикулярных клеток. Сосуды ворсинок расширены, заполнены элементами крови. Вся соединительнотканная основа ворсинок инфильтрована лейкоцитами.

В средней мышечной оболочке имеется три слоя: внутренний - косой, средний - самый мощный, циркулярный и наружный - узкий, продольный.

В результате анализа особых патоморфологических изменений средней кишки не выявлено.

Особенности строения средней кишки русского осетра при использовании гормоносодержащих добавок. Внутренняя поверхность слизистой оболочки средней кишки покрыта многочисленными мелкими сосочками, вдающимися в просвет. Эти сосочки представляют собой высокие узкие складки, называемые кишечными ворсинками. Всасывающие клетки ворсинок имеют хорошо развитый аппарат микроворсинок. Бокаловидные клетки находились среди каемчатых. Строение бокаловидных клеток сходно со строением бокаловидных клеток высших позвоночных животных. Бокаловидные клетки представлены несколькими разновидностями, различающимися по характеру синтезируемого секрета. Таким образом, для кишечного эпителия характерен высокий уровень морфобиохимической дифференцировки.

Внутренняя часть кишечных ворсинок содержит узкую прослойку рыхлой волокнистой неоформленной соединительной ткани, которая вместе с тонким слоем под основанием ворсинок образуется собственной пластинкой слизистой оболочки кишечника; в ней имеются кровеносные и лимфатические капилляры. Ворсинки имеют непостоянную форму, могут быть разной высоты и глубины, могут ветвиться или соединяться друг с другом. Подслизистая основа средней кишки богато снабжена коллагеновыми волокнами. Волокна расположены частично циркулярно, частично продольно, образуя систему из четырех-пяти сетевидных мембран. Одна из этих мембран, создающая толстый непрерывный слой на границе между собственной пластинкой слизистой оболочки и подслизистой основой, получила название компактного слоя. Мышечная оболочка средней кишки состоит из двух слоев гладкой мышечной ткани - внутреннего циркулярного и наружного продольного.

На основании гистологического анализа препаратов средней кишки серьезных патологических изменений при использовании гормональных добавок в течение 10 и 20 дней не выявлено. В качестве нарушений морфологической структуры средней кишки можно отметить инфильтрацию лимфоцитами собственной пластинки слизистой оболочки и небольшие участки слущенного эпителия на верхушках некоторых кишечных ворсинок.

Спиральный клапан

Особенности строения стирального клапана русского осетра до начала эксперимента. У осетровых рыб имеется вырост стенки кишки - спиральный клапан, располагающийся в конце кишечника. Он имеет 7-8 оборотов. Задний нисходящий отдел кишечника осетровых рыб имеет толстые мышечные стенки, и именно в них располагается спиральный клапан. Внутри этой части кишечника образуется закручивание высокой складки слизистой оболочки, свисающей в полость кишки. Всего имеется 7-8 таких витков. Кишка как бы разделена на 7-8 отдельных камер, сообщающихся друг с другом. Помимо этой, высокой закрученной складки внутри на стенке кишечника имеются мелкие складки слизистой оболочки или кишечной ворсинки, которые в каудальном направлении уменьшаются в размерах, сглаживаются, переходя в гладкие складки анальной зоны задней кишки. Кишечные ворсинки внутренней поверхности кишки

обычно не образуют вторичной складчатости. Спиральная складка, вдающаяся в просвет кишечника, покрыта многочисленными вторичными складочками. Выстилает поверхность всех кишечных ворсинок однослойный призматический каемчатый эпителий; слизистые бокаловидные клетки встречаются в этом отделе кишечника осетровых в большом количестве. Достаточно крупные сосуды расположены внутри спиральной складки, там проходят крупные артерии и вены. Основу складки составляет соединительная ткань, богато снабженная коллагеновыми волокнами.

У внешнего края ануса кишечный эпителий переходит непосредственно в эпидермис кожи. На разных сторонах спирального клапана заметны различия в строении: внешняя сторона спирального клапана покрыта кишечными ворсинками, внутренняя сторона имеет лишь неглубокие складочки. Высокие кишечные ворсинки одной стороны выстланы каемчатым эпителием с незначительным количеством слизистых клеток. Другая сторона спирального клапана имеет отдельные каемчатые клетки, но основную массу здесь составляют слизистые клетки, переполненные секретом. На этой стороне спирального клапана, где располагаются кишечные ворсинки, наблюдается значительное количество кишечных желез. Концевые отделы кишечных желез доходят до мышечной оболочки спирального клапана. В мышечной оболочке спирального клапана два слоя: мощный внутренний циркулярный и более тонкий наружный продольный. В соединительнотканной основе самой спиральной складки обнаружены значительные скопления ретикулярной ткани, окруженные собственной капсулой.

Особенности строения стирального клапана при использовании гормоносодержащих добавок. В спиральной складке находятся кишечные ворсинки разной величины. Кишечные ворсинки -главные структуры, обеспечивающие пристеночное пищеварение (расщепление пищевых веществ под действием ферментов) и всасывание этих веществ. Ворсинки вдаются в просвет в виде пальцевидных выростов, покрытых однослойным цилиндрическим каемчатым эпителием. Обращают на себя внимание различия по длине (высоте) ворсинок. Эпителий соседних ворсинок образует многочисленные сращения верхушек, боковых стенок. Иногда на верхушках ворсинок имелись слущивания каемчатого эпителия или разъединения его клеток, кроме того, на некоторых участках отмечалось отслоение эпителиальных клеток от базальной мембраны. Эти многочисленные смещения резко изменяли архитектонику самих ворсинок.

В выстилке ворсинок различались три типа клеток: цилиндрические (столбчатые) эпите-лиоциты или всасывающие энтероциты, составляющие основную массу эпителия. Среди всасывающих цилиндрических энтероцитов распределены слизеобразующие бокаловидные клетки, их соотношение с каемчатыми клетками 4 : 1, там же расположены немногочисленные эндокринные клетки. В местах сращений эпителиальных выстилок отдельных ворсинок находятся мелкие кубической (овальной) формы недифференцированные энтероциты. Следует отметить, что каемка из микроворсинок несколько толще.

Эпителий находится на собственной пластинке слизистой оболочки из рыхлой волокнистой неоформленной соединительной ткани, содержащей множество мелких кровеносных сосудов, которые, разветвляясь, входят в середину ворсинки. У основания ворсинки сосуд образовывал треугольную лакуну. Как правило, сосуды ворсинок были заполнены элементами крови, в основном эритроцитами. В основании ворсинок находятся треугольные образования из кроветворной (ретикулярной) ткани.

Таким образом, на основании результатов исследования можно заключить, что применение гормональных добавок в концентрации 0,1 и 0,001 мг/кг к серьезным патологическим изменениям гистоструктуры органов пищеварительной системы (желудок, средняя кишка, спиральный клапан) не приводит. Неспецифические незначительные изменения слизистой оболочки были выявлены в средней кишке и спиральном клапане. Эти изменения проявлялись в инфильтрации лимфоцитами собственной пластинки слизистой оболочки и слущивании эпителия на верхушках кишечных ворсинок.

Выводы

1. Использование гормоносодержащих кормов приводит к патологическим изменениям в печени. Наибольший повреждающий эффект гормональные препараты оказывали при увеличении сроков их использования.

2. Максимальные патологические нарушения гистоструктуры печени выявлены у особей русского осетра, содержавшихся на корме с гормональными добавками в течение 20 суток.

В печени преобладали нарушения, обусловленные как дистрофическими изменениями, так и нарушениями микроциркуляции крови.

3. Морфофункциональными особенностями органов пищеварения в период использования кормов с добавками гормона являлись нарушения слизистой оболочки в средней кишке и спиральном клапане, которые проявлялись в инфильтрации лимфоцитами собственной пластинки слизистой оболочки, слущивании эпителия на верхушках кишечных ворсинок, отслоении каемчатого эпителия от базальной мембраны и вариабельности кишечных ворсин.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Волкова О. В., Елецкий Ю. К. Основы гистологии с гистологической техникой. - М.: Медицина. -1989. - 234 с.

Статья поступила в редакцию 16.09.2009

ASSESSMENT OF HORMONE ADDITIVES INFLUENCE ON ORGANS OF DIGESTIVE SYSTEM OF RUSSIAN STURGEON

O. V. Lozhnichenko, V. P. Zagriychuk, V. V. Gritsischina

The liver and organs of digestive system of Russian sturgeon have been examined. It has been proved that the use of hormones has the most harmful effect in increasing the terms of their usage. It has been revealed that the species fed with hormone additives during 20 days have the maximum pathological disturbance in liver histostructure. Changes caused both by dystrophic abnormalities and abnormalities of blood microcirculation prevailed. Disturbances of mucous membrane exhibited in the infiltration of mucous membrane blade by lymphocytes, epithelium desquamation on the top of intestinal fibre, exfoliation of epithelium with a border from basal membrane and variability of intestinal fibre are considered as morphofunctional peculiarities of midgut and spiral valve during the period of the use of hormone-contained feed. The morphological analysis of stomach hasn’t shown any changes caused by the influence of hormone additives.

Key words: hormone additives, liver, hepatocytes, stomach, gastric glands, spiral valve, midgut, intestinal fibre.