КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ИНТЕРНАЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТОВ

1. Композиция для применения в медицине, содержащая полинуклеотид, кодирующий мультидоменный терапевтический белок, содержащий домен доставки и ферментативный домен и фармацевтически приемлемый носитель.
2. Композиция по п. 1, где домен доставки представляет собой антигенсвязывающий белок.
3. Композиция по п. 1 или 2, где домен доставки представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).
4. Композиция по любому из пп. 1-3, где домен доставки связывается с эффектором интернализации.
5. Композиция по любому из пп. 1-4, где домен доставки связывается с эффектором интернализации, выбранным из группы, состоящей из CD63, интегрина альфа-7 (ITGA7), MHC-I, Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6, LRP8, рецептора трансферрина, LDL-рецептора, рецептора белка 1, родственного LDL, ASGR1, ASGR2, белка-2, подобного белку-предшественнику амилоида (APLP2), апелинового рецептора (APLNR), MAL (миелинового и лимфоцитарного белка (MAL)), IGF2R, H+ АТФазы вакуолярного типа, рецептора дифтерийного токсина, фолатного рецептора, глутаматных рецепторов, глутатионового рецептора, лептиновых рецепторов, скавенджер-рецептора A1-5 (SCARA1-5), SCARB1-3 и CD36.
6. Композиция по любому из пп. 1-5, где домен доставки связывается с эффектором интернализации CD63.
7. Композиция по любому из пп. 1-6, где домен доставки содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:2 или аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной последовательности HCVR, представленной в таблице 11, аминокислотной последовательности LCVR, представленной в таблице 11, аминокислотной последовательности HCDR1, представленной в таблице 11, аминокислотной последовательности HCDR2, представленной в таблице 11, аминокислотной последовательности HCDR3, представленной в таблице 11, аминокислотной последовательности LCDR1, представленной в таблице 11, аминокислотной последовательности LCDR2, представленной в таблице 11, аминокислотной последовательности LCDR3, представленной в таблице 11, пары из аминокислот HCVR/LCVR, представленной под SEQ ID NO: 14/22, SEQ ID NO: 30/38, SEQ ID NO:46/54 или SEQ ID NO:62/70, где необязательно пара из аминокислот HCVR/LCVR содержит от N-конца до C-конца: HCVR, необязательный линкер и LCVR, и/или где необязательно ферментативный домен присоединен к С-концу LCVR (например, посредством линкера), и любую их комбинацию.
8. Композиция по любому из пп. 1-7, где ферментативный домен предусматривает гидролазу.
9. Композиция по любому из пп. 1-8, где ферментативный домен предусматривает гликозилазу.
10. Композиция по любому из пп. 1-9, где ферментативный домен предусматривает гликозидазу.
11. Композиция по любому из пп. 1-10, где ферментативный домен предусматривает альфа-глюкозидазу.
12. Композиция по любому из пп. 1-11, где ферментативный домен содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:78 или ее фрагмент.
13. Композиция по любому из пп. 1-12, где полинуклеотид дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты вируса.
14. Композиция по любому из пп. 1-13, где полинуклеотид дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты вируса, где последовательность нуклеиновой кислоты вируса представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты аденоассоциированного вируса (AAV).
15. Композиция по любому из пп. 1-14, где полинуклеотид дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты вируса и необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, нацеливающуюся на локус, при этом последовательность нуклеиновой кислоты вируса представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты аденоассоциированного вируса (AAV), и где последовательность нуклеиновой кислоты AAV содержит последовательность внутреннего концевого повтора и необязательно тканеспецифический регуляторный элемент, такой как специфический для печени промотор.
16. Композиция по любому из пп. 1-15, где полинуклеотид дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты вируса и необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, нацеливающуюся на локус, где последовательность нуклеиновой кислоты вируса представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты аденоассоциированного вируса (AAV), содержащую последовательность внутреннего концевого повтора, которая содержит SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 или обе, и необязательно тканеспецифический регуляторный элемент, такой как специфический для печени промотор.
17. Композиция по любому из пп. 1-16, где полинуклеотид дополнительно содержит тканеспецифический регуляторный элемент, содержащий последовательность, представленную под SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или обе.
18. Композиция по любому из пп. 1-17, где полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:11 и/или кодирует аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:78.
19. Вектор для генной терапии, содержащий полинуклеотид по любому из пп. 1-18.
20. Вектор для генной терапии по п. 19, где вектор для генной терапии выбран из группы, состоящей из
вирусного вектора, содержащего полинуклеотид по любому из пп. 1-18, где необязательно вирусный вектор представляет собой природный вирус, сконструированный вирус или химерный вирус,
полинуклеотида без дополнительных средств, предусматривающего полинуклеотид по любому из пп. 1-18,
полинуклеотидного комплекса, где необязательно полинуклеотидный комплекс представляет собой липидную наночастицу, содержащую полинуклеотид по любому из пп. 1-18 и липиды, и любой их комбинации.
21. Вектор для генной терапии по п. 19 или 20, где вектор для генной терапии представляет собой вирусный вектор, выбранный из группы, состоящей из ретровируса, аденовируса, вируса простого герпеса, поксвируса, вируса осповакцины, лентивируса или аденоассоциированного вируса.
22. Вектор для генной терапии по любому из пп. 19-21, где вектор для генной терапии представляет собой химеру AAV2/8 и/или AAV, псевдотипированный для конкретной ткани, например печени.
23. Рекомбинантный мультидоменный терапевтический белок, содержащий домен доставки и ферментативный домен, где белок кодируется полинуклеотидом по любому из пп. 1-18.
24. Рекомбинантный мультидоменный терапевтический белок по п. 23, где домен доставки представляет собой антигенсвязывающий белок.
25. Рекомбинантный мультидоменный терапевтический белок по п. 23 или 24, где домен доставки представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).
26. Рекомбинантный мультидоменный терапевтический белок по любому из пп. 23-25, где домен доставки связывается с эффектором интернализации.
27. Рекомбинантный мультидоменный терапевтический белок по любому из пп. 23-26, где домен доставки связывается с эффектором интернализации, выбранным из группы, состоящей из CD63, интегрина альфа-7 (ITGA7), MHC-I, Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6, LRP8, рецептора трансферрина, LDL-рецептора, рецептора белка 1, родственного LDL, ASGR1, ASGR2, белка-2, подобного белку-предшественнику амилоида (APLP2), апелинового рецептора (APLNR), MAL (миелинового и лимфоцитарного белка (MAL)), IGF2R, H+ АТФазы вакуолярного типа, рецептора дифтерийного токсина, фолатного рецептора, глутаматных рецепторов, глутатионового рецептора, лептиновых рецепторов, скавенджер-рецептора A1-5 (SCARA1-5), SCARB1-3 и CD36.
28. Рекомбинантный мультидоменный терапевтический белок по любому из пп. 23-27, где домен доставки связывается с эффектором интернализации CD63.
29. Рекомбинантный мультидоменный терапевтический белок по любому из пп. 23-28, где домен доставки содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:2 или аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной последовательности HCVR, представленной в таблице 11, аминокислотной последовательности LCVR, представленной в таблице 11, аминокислотной последовательности HCDR1, представленной в таблице 11, аминокислотной последовательности HCDR2, представленной в таблице 11, аминокислотной последовательности HCDR3, представленной в таблице 11, аминокислотной последовательности LCDR1, представленной в таблице 11, аминокислотной последовательности LCDR2, представленной в таблице 11, аминокислотной последовательности LCDR3, представленной в таблице 11, пары из аминокислот HCVR/LCVR, представленной под SEQ ID NO: 14/22, SEQ ID NO: 30/38, SEQ ID NO:46/54 или SEQ ID NO:62/70, где необязательно пара из аминокислот HCVR/LCVR содержит от N-конца до C-конца: HCVR, необязательный линкер и LCVR, и/или где необязательно ферментативный домен присоединен к С-концу LCVR (например, посредством линкера), и любую их комбинацию.
30. Рекомбинантный мультидоменный терапевтический белок по любому из пп. 23-29, где ферментативный домен предусматривает гидролазу.
31. Рекомбинантный мультидоменный терапевтический белок по любому из пп. 23-30, где ферментативный домен предусматривает гликозилазу.
32. Рекомбинантный мультидоменный терапевтический белок по любому из пп. 23-31, где ферментативный домен предусматривает гликозидазу.
33. Рекомбинантный мультидоменный терапевтический белок по любому из пп. 23-32, где ферментативный домен предусматривает альфа-глюкозидазу (GAA) или ее часть.
34. Рекомбинантный мультидоменный терапевтический белок по любому из пп. 23-33, где ферментативный домен содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:78 или ее фрагмент, где необязательно мультидоменный терапевтический белок содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:79.
in vivo
35. Способ экспрессии в клетке  рекомбинантного мультидоменного терапевтического белка, содержащего домен доставки и ферментативный домен, при этом способ включает:
а. приведение клетки в контакт с вектором для генной терапии, содержащим полинуклеотид, кодирующий рекомбинантный мультидоменный терапевтический белок;
b. обеспечение интеграции полинуклеотида в геномный локус клетки; и
c. обеспечение продуцирования клеткой рекомбинантного мультидоменного терапевтического белка,
при этом вектор для генной терапии соответствует любому из пп. 19-22.
36. Способ по п. 35, где вектор для генной терапии представляет собой вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV).
37. Способ по п. 35 или 36, где геномный локус клетки представляет собой локус «безопасной гавани».
alb
38. Способ по любому из пп. 35-37, где геномный локус находится внутри или поблизости локуса, выбранного из группы, состоящей из локуса EESYR, локуса SARS, положения 188083272 на хромосоме 1 человека или его ортолога у млекопитающего, отличного от человека, положения 3046320 на хромосоме 10 человека или его ортолога у млекопитающего, отличного от человека, положения 67328980 на хромосоме 17 человека или его ортолога у млекопитающего, отличного от человека, сайта 1 аденоассоциированного вируса (AAVS1) на хромосоме, имеющегося в норме сайта интеграции вируса AAV на хромосоме 19 человека или его ортолога у млекопитающего, отличного от человека, гена рецептора хемокина 5 (CCR5), гена рецептора хемокина, кодирующего корецептор HIV-1, локуса Rosa26 у мыши или его ортолога у млекопитающего, отличного от мыши, и локуса альбумина () у человека.
39. Способ по любому из пп. 35-38, где домен доставки представляет собой антигенсвязывающий белок.
40. Способ по любому из пп. 35-39, где домен доставки представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).
41. Способ по любому из пп. 35-40, где домен доставки связывается с эффектором интернализации.
42. Способ по любому из пп. 35-41, где домен доставки связывается с эффектором интернализации, выбранным из группы, состоящей из CD63, интегрина альфа-7 (ITGA7), MHC-I, Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6, LRP8, рецептора трансферрина, LDL-рецептора, рецептора белка 1, родственного LDL, ASGR1, ASGR2, белка-2, подобного белку-предшественнику амилоида (APLP2), апелинового рецептора (APLNR), MAL (миелинового и лимфоцитарного белка (MAL)), IGF2R, H+ АТФазы вакуолярного типа, рецептора дифтерийного токсина, фолатного рецептора, глутаматных рецепторов, глутатионового рецептора, лептиновых рецепторов, скавенджер-рецептора A1-5 (SCARA1-5), SCARB1-3 и CD36.
43. Способ по любому из пп. 35-42, где домен доставки связывается с эффектором интернализации CD63.
44. Способ по любому из пп. 35-43, где домен доставки содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:2 или аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной последовательности HCVR, представленной в таблице 11, аминокислотной последовательности LCVR, представленной в таблице 11, аминокислотной последовательности HCDR1, представленной в таблице 11, аминокислотной последовательности HCDR2, представленной в таблице 11, аминокислотной последовательности HCDR3, представленной в таблице 11, аминокислотной последовательности LCDR1, представленной в таблице 11, аминокислотной последовательности LCDR2, представленной в таблице 11, аминокислотной последовательности LCDR3, представленной в таблице 11, пары из аминокислот HCVR/LCVR, представленной под SEQ ID NO: 14/22, SEQ ID NO: 30/38, SEQ ID NO:46/54 или SEQ ID NO:62/70, где необязательно пара из аминокислот HCVR/LCVR содержит от N-конца до C-конца: HCVR, необязательный линкер и LCVR, и/или где необязательно ферментативный домен присоединен к С-концу LCVR (например, посредством линкера), и любую их комбинацию.
45. Способ по любому из пп. 35-44, где ферментативный домен предусматривает гидролазу.
46. Способ по любому из пп. 35-45, где ферментативный домен предусматривает гликозилазу.
47. Способ по любому из пп. 35-46, где ферментативный домен предусматривает гликозидазу.
48. Способ по любому из пп. 35-47, где ферментативный домен предусматривает альфа-глюкозидазу.
49. Способ по любому из пп. 35-48, где ферментативный домен содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:78 или любой ее фрагмент.
50. Способ по любому из пп. 35-49, где полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:11.
51. Способ по любому из пп. 35-50, где клетка находится ex vivo.
52. Способ по любому из пп. 35-51, где клетка представляет собой клетку человека.
53. Способ по любому из пп. 35-51, где клетка представляет собой клетку мыши.
54. Способ по любому из пп. 35-53, где клетка представляет собой клетку печени.
55. Способ уменьшения накопления гликогена в ткани пациента, нуждающегося в этом, включающий введение пациенту композиции по любому из пп. 1-18 или вектора для генной терапии по любому из пп. 19-21.
56. Способ по п. 55, где ткань выбрана из группы, состоящей из сердца, печени и скелетной мышцы.
57. Способ по п. 55 или 56, где мультидоменный терапевтический белок содержит комплекс из scFv к CD63 и GAA, где необязательно scFv к CD63 содержит пару из аминокислот HCVR/LCVR, представленную под SEQ ID NO: 14/22, SEQ ID NO: 30/38, SEQ ID NO:46/54 или SEQ ID NO:62/70, где необязательно пара из аминокислот HCVR/LCVR содержит от N-конца до C-конца: HCVR, необязательный линкер и LCVR, где необязательно ферментативный домен присоединен к С-концу LCVR, например, посредством линкера, при этом необязательно GAA содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:78, и/или при этом необязательно комплекс из scFv к CD63 и GAA содержит последовательность, представленную под SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:79.
58. Способ по любому из пп. 55-57, где высокие уровни содержания GAA в сыворотке крови поддерживаются в течение по меньшей мере 12 недель.
59. Способ по любому из пп. 55-58, где уровни содержания GAA в сыворотке крови через 12 недель в приблизительно 2,5-3 раза выше, чем уровни содержания GAA в сыворотке крови субъекта, которому вводят вектор для генной терапии, содержащий полинуклеотид, кодирующий GAA без домена доставки, представляющего собой scFv к CD63.
60. Способ по любому из пп. 55-59, где уровни содержания гликогена в ткани сердца, скелетной мышцы и печени снижаются до уровней, характерных для дикого типа.
61. Способ по любому из пп. 55-60, где уровни содержания гликогена в ткани поддерживаются соответствующими уровням, характерным для дикого типа, спустя 3 месяца после введения вектора для генной терапии.
62. Способ лечения дефицита фермента у пациента, нуждающегося в этом, и/или индуцирования толерантности у пациента к ферменту, дефицит которого у него наблюдается, включающий введение пациенту вектора для генной терапии по любому из пп. 19-22, где вектор для генной терапии кодирует мультидоменный терапевтический белок, содержащий ферментативный домен и домен доставки.
63. Способ по п. 62, где дефицит фермента представляет собой дефицит фермента гликозидазы.
64. Способ по п. 62 или 63, где дефицит фермента представляет собой дефицит альфа-глюкозидазы.
65. Способ по любому из пп. 62-64, где мультидоменный терапевтический белок представляет собой комплекс из scFv к CD63 и GAA, где необязательно комплекс из scFv к CD63 и GAA содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:79.
66. Способ по любому из пп. 62-65, где высокие уровни содержания GAA в сыворотке крови поддерживаются у пациента в течение по меньшей мере 12 недель после введения вектора для генной терапии.
67. Способ по любому из пп. 62-66, где уровни содержания GAA в сыворотке крови пациента через 12 недель после введения вектора для генной терапии примерно в 2,5-3 раза выше, чем уровни содержания GAA в сыворотке крови субъекта, которому вводят вектор для генной терапии, содержащий полинуклеотид, кодирующий GAA без домена доставки, представляющего собой scFv к CD63.
68. Способ по любому из пп. 62-67, где уровни содержания гликогена в ткани сердца, скелетной мышцы и печени у пациента снижаются до уровней, характерных для дикого типа.
69. Способ по любому из пп. 62-68, где уровни содержания гликогена в ткани сердца, скелетной мышцы и печени у пациента поддерживаются соответствующими уровням, характерным для дикого типа, спустя 3 месяца после введения вектора для генной терапии.
70. Способ по любому из пп. 62-69, где мышечная сила пациента после лечения восстанавливается до уровней, характерных для дикого типа.
71. Способ по любому из пп. 62-70, где у пациента имеется болезнь Помпе.
72. Способ по любому из пп. 62-71, где у пациента снижено содержание антител к ферменту по сравнению с контрольным пациентом, который получил ферментативный домен в отсутствие домена доставки.
73. Способ по любому из пп. 62-71, дополнительно включающий подавление иммунитета у пациента с помощью одного или более иммуносупрессоров.
74. Способ по любому из пп. 62-73, дополнительно включающий в качестве последнего этапа введение пациенту фермента, дефицит которого у него наблюдается.
75. Способ по п. 74, где пациенту вводят фермент, дефицит которого у него наблюдается, посредством мультидоменного терапевтического белка, при этом мультидоменное терапевтическое средство необязательно содержит антитело к CD63 или его антигенсвязывающую часть.
76. Способ по любому из пп. 35-75, где пациенту вводят терапевтически эффективное количество полинуклеотида, которое делает ненужным любое дополнительное введение GAA, его части или мультидоменного терапевтического полипептида, содержащего GAA или его часть, пациенту.
77. Выделенное антитело к CD63 или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент конкурируют за связывание с CD63 человека с эталонным антителом, содержащим пару аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, представленную в таблице 11.
78. Антитело к CD63 или антигенсвязывающий фрагмент по п. 77, где эталонное антитело содержит пару аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, выбранную из группы, состоящей из представленных под SEQ ID NO: 14/22, SEQ ID NO: 30/38, SEQ ID NO:46/54 или SEQ ID NO: 62/70.
79. Антитело к CD63 или антигенсвязывающий фрагмент по п. 77 или 78, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с тем же эпитопом на CD63 человека, что и эталонное антитело, содержащее пару аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, представленную в таблице 11.
80. Фармацевтическая композиция, содержащая вектор для генной терапии по любому из пп. 19-22 и фармацевтически приемлемый носитель.