Использование технологий репрограммирования соматических клеток и редактирования генома для создания модельной системы болезни Штаргардта с целью ее изучения и терапии

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

DOI: 10.23868/201707021

использование технологий репрограммирования соматических клеток и редактирования генома для создания модельной системы болезни штаргардта с целью ее изучения и терапии

М.Ю. Лебедин1, К.С. Майорова 1, В.В. Максимов 2, А.Н. Богомазова 1, М.А. Лагарькова 1, С.Л. Киселев 1

1 Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва, Россия 2Научно-исследовательский центр «Курчатовский институт», Москва, Россия

Somatic cells reprogramming and genome editing for Stargardt disease modeling for investigation and treatment

M.Y. Lebedin 1, K.S. Mayorova 1, V.V. Maximov2, A.N. Bogomazova 1, M.A. Lagarkova 1, S.L. Kiselev1

1 N.I. Vavilov Institute of General Genetics, Moscow, Russia

2 Research Center "Kurchatov Institute", Moscow, Russia

Дегенерация сетчатки глаза происходит как в связи с возрастом, так и вследствие наследственных патологий. Клинически сходная картина часто бывает связана с различными молекулярными механизмами и генными мутациями. Арсенал клинических средств для таких больных очень ограничен. Современные достижения в области репрограммирования клеток и редактирования генома позволяют создавать клеточные модели патологий для их изучения и терапии. В настоящем исследовании нами получены индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) от пациентов с клиническим диагнозом болезнь Штаргардта, определена мутация в гене периферина 2 и показано, что мутация не влияет на эффективность дифференциров-ки в пигментный эпителий сетчатки. Используя CRISPR/ Cas9 систему, проведено редактирование генома в иПСК пациента. В результате получены изогенные линии иПСК с исправленной мутацией для создания модели заболевания in vitro и потенциально пригодные для персонализированной терапии болезни Штаргардта.

Ключевые слова: плюрипотентность, дифференци-ровка, пигментный эпителий сетчатки, органоиды, макуло-дистрофия, периферин-2.

Degeneration of the retina occurs both in relation to age, and as a consequence of hereditary pathologies. A clinically similar pattern is often associated with different molecular pathways and gene mutations. The arsenal of therapeutic approaches for these patients is very limited. Modern advances in cellular reprogramming and genome editing make it possible to establish a model for the disease investigation and treatment. In this study we established induced pluripotent stem cells (iPSCs) from patients with a clinical diagnosis of Stargardt>s disease. Mutation in the peripherin 2 gene was found and it was shown that the mutation does not affect the efficiency of differentiation in the pigment epithelium of the retina. Using the CRISPR/Cas9 system the mutation was corrected in the patient's iPSCs. As a result, isogeneic iPSC lines with a corrected mutation have been generated for establishing of an in vitro model of the disease and potentially suitable for personalized therapy of Stargardt disease.

Keywords: pluripotency, differentiation, retinal pigment epithelia, organoids, macula degeneration, peripherin 2.

введение

Наследственные заболевания сетчатки представляют собой большую группу генетически гетерогенных нарушений, характеризующихся прогрессивным ухудшением центрального и периферийного зрения и дегенеративными изменениями в области сетчатки, в основе которых лежит патология фоторецепторов и пигментного эпителия. Частота заболевания сильно варьирует: пигментный ретинит встречается в одном случае на 3—5 тыс. человек, болезнь Штаргардта — на 10 тыс., а макулодистрофия Беста — на 100 тыс. Дегенерация сетчатки является необратимым процессом, поэтому и медикаментозное, и хирургическое лечение направлено только на замедление прогрессирования заболевания. Результаты генетических исследований последних лет свидетельствуют о том, что, несмотря на явные различия в клинической картине, целый ряд таких заболеваний как пигментный ретинит, болезнь Штаргард-та и возрастная дистрофия сетчатки являются ал-лельными нарушениями локуса ABCA4 (ABCR) [1].

e-mail: kiselev@vigg.ru

Однако, кроме этого наиболее вероятного кандидата, определен еще целый ряд генов, которые приводят к клинически сходной картине патологий. Так мутацию в гене CNGB3, кодирующем бета субъединицу цГМФ-активирумого катионного канала колбочек, выявляли у пациентов с клиническими диагнозами ахроматопсии и макулярной дегенерации [2]. Мутации в гене ELOVL4 [3, 4] ассоциированы с несколькими формами макулярной дегенерации, в том числе и болезни Штаргардта. Нарушения в гене PROM1 приводят к болезни Штаргардта, а также к пигментному ретиниту [5]. Мутации гена peripherin 2/RDS обнаружены для различных фенотипов ретинальных дистрофий. Клиническим проявлением большого количества различных мутаций в гене peripherin 2/RDS являются пигментный ретинит, медленная дегенерация сетчатки (RDS-retina degeneration slow), паттерн-дистрофия и др. [6]. Peripherin 2/RDS является специфическим трансмембранным белком, локализующимся в краевой области дисков наружного сегмента палочковых и колбочковых фоторецепторов. Он состоит из

346 аминокислотных остатков, последовательность которых образует четыре трансмембранные гидрофобные субъединицы и два 1\1-связанных участка гликозилирования. Предполагают, что один из этих участков обеспечивает физическую связь дисков наружного сегмента фоторецепторо в с плазматической мембраной, а также участвуетв формировании сЭМР-регулируемых катионных каналов плазматической мембраны фоторецептров [7]. Мутации в рвпрЬвпп 2/ЯйБ, которые вызывают неправильную укладку белка или неправильную сборку субъединиц приводят к некорректному морфогенезу дисков на-ружнего сегмента и дегенерации фоторецепторов [8]. Известно более 80 различных мутаций в гене периферина, которые являются причиной 3—5% всех случаев аутосомно-доминантной формы дегенеративных заболеваний сетчатки, таких как палоч-ко-колбочковая дистрофия, пигментный ретинит, и дегенерация макулы.

Аутогенная клеточная терапия самый безопасный и перспективный подход к лечению дегенеративных заболеваний сетчатки в будущем. В 2012 г. ЭСК человека, дифференцированные в пигментный эпителий сетчатки, впервые были использованы для клинических исследований, которые показали высокую эффективность в терапии наследственной макулодистрофии [9], доказав возможность клеточной терапии болезни Штаргардта. Индуцированные плюрипотентные клетки (иПСК) человека — соматические клетки взрослого человека, репрограмиро-ванные до состояния, сходного с эмбриональными стволовыми клетками, — также были использованы в клинических испытаниях при возрастной макулодистрофии. Японские исследователи провели пересадку клеток пигментного эпителия, дифференцированных из иПСК пациента [10]. Однако в случае с наследственными заболеваниями сетчатки, аутогенные иПСК пациента будут нести специфическую патогенетическую мутацию, поэтому для их применения необходимо провести редактирование генома.

Целью данной работы являлось получение пациент-специфичных иПСК от пациентов с клиническим диагнозом болезни Штаргардта, определение генетических причин патологии, изучение особенностей дифференцировки иПСК в пигментный эпителий сетчатки и проведение в иПСК пациентов геномного редактирования обнаруженной мутации.

Материал и методы

Определение генетической мутации

в гене рвпрЬвпп 2

ДНК пациентов была выделена из пробы бук-кального эпителия с помощью наборов фирмы «Изоген» (Россия) для выделения ДНК из пятен крови. Все пациенты подписывали информированное согласие. Для проведения ПЦР использовались праймеры на 2 экзон гена рвпрЬвпп 2 прямой 5'ЗЗАЗТТСАТЗАЗЗСТ0СТЗТ3' и обратный 5'СТСААЗЗТСЗДЗЗАДЗЗСДЗ3'. Секвенирование проводили с праймера 5'АТАССААЗТЗТЗСЗАЗТЗААТЗ3'.

Получение первичных фибробластов человека

из биоптата кожи и их культивирование

Биоптаты кожи были взяты из предплечья пациентов с болезнью Штаргардта после получения информированного согласия. Биоптаты помещали в питательную среду РМБМ с 2 мМ1_-глутамина,15%

фетальной бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина для транспортировки в лабораторию (реактивы фирмы Invitrogen, США).Биоптаты измельчали скальпелем до кусочков с линейным размером около 0,5 мм, переносили в чашки Петри диаметром 35 мм (Corning, США), закрывали покровным стекломи заливали питательной средой. Приблизительно через 3 нед.первичные фи-бробласты пересевали с помощью 0,25% раствора трипсина. Дальнейшее культивирование проводили в среде DMEM с 2 мМ L-глутамина, 10% фетальной бычьей сыворотки, 50 ЕД/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина.

Репрограммирование фибробластов

человека

Репрограммирование фибробластов проводили методом трансдукции лентивирусами hOCT3/4, hSOX2, hKLF4, hc-MYC с множественностью инфекции 10 в присутствии полибрена (8 мкг/мл). Фибробласты рассевали в 6-луночный планшет в количестве 5х104кпеток на лунку в среде DMEM, содержащей 2мМ L-глутамина, 5% фетальной бычьей сыворотки, инактивированной прогреванием, 50 ЕД/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина, на следующий день добавляли полибрен и лентиви-русы. Через 1 сут. после трансдукции среду заменяли на DMEM с 10% фетальной бычьей сыворотки, инактивированной прогреванием, 2 мМ L-глутамина, 50 ЕД/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина. Через 5 сут. после трансдукции фибробласты пересевали в чашки Петри диаметром 60 мм с фидером из обработанных митомицином C мышиных эмбриональных фибробластов и заливали средой DMEM/F12 с 20% заменителя сыворотки Knockout Serum Replacement (KO SR, Invitrogen, США), 2 мМ L-глутамина, 100 мкМß-меркаптоэтанола, 1х NEAA, 6 нг/мл bFGF, 50 ЕД/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина, содержащей 1 мкМ ингибитора-метилтрансферазы гистонов — BIX-01294 (Sigma, США) и 1 мМ ингибитора деацетилазы гистонов — вальпроевую кислоту (Sigma, США). Смену среды осуществляли ежедневно. BIX-01294 и вальпроевую кислоту добавляли в среду в течение 7 дней. Клоны иПСК отбирали с 23 по 35 сут. после трансдукции.

Культивирование иПСК человека

ИПСК человека культивировали в среде mTeSR1 (STEMCELLTechnologies, Канада) с 50 ЕД/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина в чашках Петри, покрытых матригелем (BDBiosciences, США), в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Клетки пересевали с помощью 0,05% трипсина (LifeTechnologies, США). Трансфекцию проводили реагентом TransIT-LT1 (Mirus, USA) согласно инструкции фирмы-производителя. За день до транс-фекции 6,5х105иПСК высевалина 60 мм чашку Петри, покрытую Matrigel (BDBiosciences, США). Для трансфекции использовали 5 мкг плазмидной ДНК: по 2,5 мкг pHRD-HyTK и pX458-g12. Через 3 сут. начинали селекцию антибиотиком гигроми-цин Б (Invitrogen, США) в концентрации 20 мкг/мл. Через 10 сут. устойчивые клоны были отобраны и проанализированы на наличие корректной вставки и исправление мутации с помощью секвенирования.

Дифференцировка иПСК человека в пигментный

эпителий сетчатки и фоторецепторы

ИПСК человека инкубировали в 35 мм чашках Петри, покрытых матригелем, в среде mTeSRI до образования 50% монослоя. Для дифференциров-ки использовали среду DMEM/F12 с 2% заменителя сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 1х NEAA, 1х N2 добавкой (реактивы фирмы Invitrogen, США),100 нг/мл Noggin (Sigma, США), 50 ЕД/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина. Смену среды проводили ежедневно в течение 25 дней. На 8—10 сут. наблюдали появление первых нервных розеток. На 26 сут. после начала дифференцировки среду меняли на DMEM/F12 с 10% заменителя сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 1х NEAA, 1х ITS, 25 нг/мл Dkk1 (Peprotech, США), 50 ЕД/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина. Дифференцировку продолжали в новой среде до 40 сут. с ежедневной заменой среды. На 41 сут. после начала дифференцировки среду меняли на DMEM/F12 с 10% заменителя сыворотки, 3% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 1х NEAA, 1х ITS, 100 мкМ тау-рина, 100 нМ транс-ретиноевой кислоты, 50 ЕД/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (реактивы фирмы «Invitrogen», США). Инкубацию продолжали до 150 сут.после начала дифференцировки.

Иммунофлуоресцентное окрашивание

Иммунофлуоресцентное окрашивание колоний иПСК на маркеры плюрипотентности OCT4A, SOX2, NANOG, TRA-1-60, TRA-1-81 и SSEA4 проводили согласно стандартному протоколу с использованием набора Stem Lite TM Pluripotency Antibody Kit (кат. № 9656, Cel ISignaling, США). Клетки фиксировали в 4% параформальдегиде в PBS в течение 20 мин. Пермеабилизацию проводили в 0,3% Тритон Х-100 в PBS в течение 20 мин. В качестве блокирующего буфера использовали 3% козью сыворотку с 5% фе-тальной бычьей сывороткой и 0,1% Tween-20 в PBS. Инкубацию с первичными антителами проводили в блокирующем буфере при +4°С в течение 16—20 ч. Использовали разведения первичных антител, рекомендованные производителем (1:200), за исключением антитела к NANOG. Антитело к NANOG брали в разведении 1:100. В качестве вторичных антител использовали антитела козы против мышиных иммуноглобулинов, конъюгированные с флуо-рохромом AlexaFIuor 488, (LifeTechnologies, США) и антитела козы против кроличьих иммуноглобулинов, конъюгированные с флуорохромом AlexaFluor 546, (LifeTechnologies, США). Вторичные антитела использовали в разведении 1:1000 и инкубацию с вторичными антителами проводили в блокирующем буфере в течение 1 ч. при комнатной температуре. Ядра визуализировали пятиминутной инкубацией с раствором DAPI (250 нг/мл) в буфере PBS.

Surveyor-анализ

Клетки линии HEK 293 трансфицировали конструкциями, несущими последовательности, кодирующие выбранные gRNA. Через четыре дня из клеток, обработанных gRNA, и из интактных клеток выделяли геномную ДНК. На матрице геномной ДНК проводили амплификацию фрагмента гена peripherin2/RDS, внутри которого располагаются сайты разрезания

Cas9, с помощью праймеров phrpF 5'GAT GAG GTT GGT GAG GGA GC и phrpR 5'GTA GTA GCT CAG CAG GGC AG. Далее гибридизацию и анализ проводили с помощью набора SURVEYOR Mutation Detection Kit (Transgenomics, США) в соответствии с предоставленной инструкцией. Продукты амплификации смешивали эквимолярно, нагревали в течение 5 мин. до 95°С и охлаждали со скоростью 5°С в мин. К реакционной смеси добавляли десятую часть 0, 25 М раствора хлорида магния, 1 мкл Surveyor-нуклеазы и 1 мкл энхансера. Раствор инкубировали при 42°С в течение 1 ч., затем в смесь добавляли десятую часть стоп-реагента и шестую часть загрузочного буфера для электрофореза. Фрагменты разделяли в 2% агарозном геле на протяжении 1 ч. при напряжении 5 В/см.

Выделение РНК, обратная транскрипция и ПЦР

Тотальную РНК выделяли с помощью наборов RNeasyMiniKit или RNeasyMicroKit (QIAGEN, Германия) согласно инструкциям фирмы-производителя. Первую цепь кДНК синтезировали с использованием вырожденных гексамерных праймеров и обратной транскриптазы M-MLV (Promega, США) согласно стандартному протоколу. Для реакции обратной транскрипции использовали 1 мкг тотальной РНК на 25 мкл реакционной смеси. Денатурацию РНК проводили при 70°С в течение 5 мин. Отжиг вырожденных гексамерных праймеров осуществляли во льду в течение 2 мин. Синтез первой цепи кДНК проводили при 25°С в течение 10 мин. и, далее, при 42°С в течение 60 мин. РНК-зависимая ДНК полимера-за M-MLV была инактивирована прогреванием при 95°С в течение 5 мин. По окончании обратной транскрипции объём ДНК доводили до 50 мкл водой, свободной от нуклеаз, и использовали 1—2 мкл на один ПЦР. ПЦР проводили с использованием Taq ДНК полимеразы (лаборатория Медиген, Россия). Для элонгации использовали температуру 68°C. Прай-меры, температуры отжига и концентрации MgCl2 указаны в табл. 1.

таблица 1. Праймеры, использованные

в ПЦр-реакциях

Название праймера

Последовательность нуклеотидов

Recovf2 AGCAGTTCCAGAGCATCTAC

Recov r2 GTCGCAGAATTTCCTTATTG

ABCA4-RT- PCR- Dir CAATGATGAAACTCAGCTCACC

ABCA4-RT- PCR- Rev ATCTGCTGGAGGTAGATTCCAA

RPE65 f1 GTGACCGATTCAAGCCATCT

RPE65 r1 GTCACTGCACAGAATTGCAG

GAPDH Forward GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA

GAPDH Reverse TTCACACCCATGACGAACAT

Конструирование векторов с gRNA

Олигонуклеотиды, перечисленные в табл. 2, и комплементарные им, смешивали попарно в соотношении 1:1 в концентрации 10 мкМ. В реакционную смесь вносили буфер для Т4-лигазы и Т4-полинуклеотид киназы. Смесь нагревали до 95°С в течение 10 мин.,

после чего охлаждали со скоростью 5°С в мин. до комнатной температуры. Полученный двуцепочеч-ный продукт разбавляли в 200 раз и смешивали с обработанной рестриктазой BbsI плазмидой рх330 в молярном соотношении 3:1 (вставка: вектор). После лигирования и трансформации выделенные плазмиды проверялись на наличие вставки с помощью секвенирования.

Конструирование вектора для рекомбинации

Гомологичные плечи (по 500 п.н.) были ампли-фицированы на матрице геномной ДНК HEK 293 Phoenix с помощью праймеров, включающих инвертированные повторы piggyback. Между повторами piggyback был встроен фрагмент, содержащий CMV-промотор, бифункциональный ген HyTK и сигнал по-лиаденилирования.

Результаты

Изучение молекулярно-генетических причин

клинического случая болезни Штаргардта

Клинический диагноз наследственная болезнь Штаргардта был ранее поставлен в семье из 5 человек: отец (болен), мать (здорова), две дочери и один сын (больны). Для выяснения генетических причин наследственной патологии гены, ассоциированные с болезнью Штаргардта и похожими наследственными дистрофиями сетчатки, были исследованы

на наличие мутаций (табл. 2). В первую очередь был изучен наиболее вероятный кандидат — ген ABCA4, но поскольку тщательная генетическая диагностика не выявила мутации в гене, то был проведен поиск возможных нарушений в других генах. Макулодистрофия Штатгардта наследуется, главным образом, по аутосомно-рецессивному типу, хотя мутации в генах ELOVL4 и PROM1 ведут к аутосомно-доминантному типу наследования [3—5]. Мутации в гене peripherin 2/RDS приводят к одной из форм пигментного ретинита, неизлечимой слепоты, а также связаны с другими формами дегенерации сетчатки [8]. Они также являются ау-тосомно-доминантными. Для поиска генетического нарушения была использована ДНК, выделенная из буккального эпителия одного из детей, и наработаны продукты ПЦР со специфических праймеров к экзонам генов ELOVL4, CNGB3, PROM1, peripherin 2/RDS. Секвенирование первых трех генов не дало результатов, а в кодирующей части гена peripherin 2/RDS была обнаружена замена T599A в гетерозиготном состоянии во 2 экзоне (рис. 1). В результате замены кодон GTG меняется на GAG, что приводит к замене консервативного валина на глутаминовую кислоту V200E. Секвенирование ДНК остальных членов семьи подтвердило наличие аналогичной мутации в гене peripherin 2/RDSв гетерозиготном состоянии у отца и сиблингов пробанда с клиническим диагнозом болезни Штаргардта. Мать не являлась носителем мутации.

Таблица 2. Поиск мутаций, вызывающих болезнь Штаргардта, у исследуемых пациентов

Ген экзонов Число известных мутаций Метод скрининга на мутации

ABCA4 ELOVL4

PROM1

CNGB3

Peripherin 2/RDS

50 >600

6 3 мутации в 6-м экзоне

26 6 мутаций в 5 экзонах

18 Опубликованы 2 мутации у пациента с болезнью Штаргардта

3 Опубликовано более 100 мутаций, связанных с широким спектром наследственных патологий зрения

АВСА4 микроэррэй

Прямое секвенирование всех кодирующих экзонов

Прямое секвенирование 5 экзонов, в которых ранее находили мутации

Прямое секвенирование 2 экзонов, в которых ранее находили мутации

Прямое секвенирование всех кодирующих экзонов

А

Б

В

Рис. 1. Хроматограмма результатов секвенирования второгоэкзона гена peripherin 2/RDS\ А — дочь, наличие мутации; Б — отец прабанд; В — мать, отсутствие мутации. Стрелкой указана мутация в гетерозиготном состоянии Т599А

Получение пациент-специфичныхлиний иПСК

Линии иПСК были получены из фибробластов кожи двух пациентов с болезнью Штаргардта мужского и женского пола по ранее разработанным протоколам. Фибробласты были трансдуцированы лентивирусными векторами, несущими факторы репрограммирования (Ь0СТ3/4, ЬБОХ2, ЬК1_Г4 и Ьо-МУС), сформировавшиеся клоны были пересеяны на тТЕэП и культивировались как описано в [11]. Для подтверждения репрограммирования клеток до плю-рипотентного состояния был проведен анализ экспрессии маркеров плюрипотентности 0СТ4А и ТПА-1-81, ЫАМОЗ и ТПА-1-60, Б0Х2 и 88ЕА4 методом иммунофлюоресцентного окрашивания (рис. 2). Им-муноцитохимическая характеристика подтвердила наличие экспрессии маркеров плюрипотентности во всех проанализированных клонах. Для линийиПСК, отобранных для дальнейшей работы, было проведено кариотипирование и функциональный анализ на плюрипотентность (данные не приводятся).

Получение пигментного эпителия сетчатки и фоторецепторов из плюрипотентных стволовых клеток

Для изучения влияния мутации на особенности дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток (ПСК) в пигментный эпителий сетчатки была проведена дифференцировка линий эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и пациент-специфичных иПСК. Дифференцировку проводили, как описано ранее [12], с некоторыми модификациями. Для сравнительного анализа были использованы линия ЭСК человека ЬЕЭМ01 [13], линии иПСК, полученные на основе материала от пациентов с болезнью Штаргардта (линии iPSStG01 и iPSStM06). На 8-10 сут. наблюдали появление первых нейроэпителиальных розеток (рис. 3а).Первые колонии пигментированных клеток нейроэпителия сетчатки, а также, предположительно, предшественников фоторецепторов, наблюдали на 30-35 сут. после начала дифференцировки. Если в среду добавляли 5 нг/мл ВМР4, то баланс между

А

Рис. 2.

Характеристика репрограммированных клеток:

А — морфология колониии ПСК линии iPSStG01;

Б — экспрессия маркеров плюрипотентности. А - фазовый контраст; Б — флуоресцентная микроскопия. Докраска ядер йАР!

Б

№N06

0ст4а

шлмш

Л., чЖ

Б0Х2

ббеа4

ш '

« яейР

нейральной и пигментированной составляющей сетчатки смещался в сторону пигментного эпителия. Примерно после 50 сут. дифференцировки клетки пигментного эпителия становились хорошо видны из-за своей характерной гексагональной формы и специфической пигментации (рис. 3б). Дополнительно они были охарактеризованы с помощью антитела к специфическому маркеру гре65.Дифференцировку продолжали до 150 сут. после начала. Следует отметить, что ни морфологически, ни по результатам иммуногистохимического анализа мы не выявили различий в дифференцировке между иПСК из нормальных и мутантных клеток. Наличие фоторецепторов в культуре было детектировано с помощью ОТ-ПЦР и иммуногистохимически. В полученных культурах нам удалось детектировать экспрессию рековерина (recoverin), родопсина (rhodopsin) и ABCA4 (рис. 4). В наружном сегменте фоторецептора (палочки) находится столбик, состоящий из боль-

шого количества мембранных дисков, содержащих родопсин. Наличие родопсина говорит о том, что в полученной культуре присутствуют фоторецепторы, полученные in vitro.

Предшественники сетчатки могут культивироваться в суспензии, в виде так называемых «retinoidbodies», то есть органоидов, имитирующих развитие сетчатки [14]. Для этого на стадии нейро-эпителиальных предшественников розетки снимали с чашки Петри с помощью диспазы (1мг/мл), отмывали дважды в ДМЕМ/Р12 центрифугированием при 100g в течение 3мин. и переносили в среду для дифференцировки в биореактор спинерного типа, который помещался в СО2-инкубатор на магнитной мешалке. Перемешивание не позволяет ретиноид-ным органоидам слипаться. Выращивание органоидов проводили при перемешивании со скоростью около 30 об/мин.Для частичной замены среды перемешивание останавливали, давая тельцам осесть, отбирали

Рис. 3. Дифференцировка иПСК в пигментный эпителий сетчатки и фоторецепторы в двумерной культуре: А — нейроэпителиальная розетка; Б — гексагональные пигментированные клетки; В — иммуногистохимическая окраска пигментного эпителия антителами к РРЕ 65. А, Б — фазовый контраст; В — флуоресцентная микроскопия

Б

J* v'v * *

Y .л* V

- ? ; я ,V *.

' ч » < V ,

Recoverirr », > *

Рис. 4.

Анализ дифференцированных в нейроэпителий сетчатки глаза иПСК человека:

А — пигментированные клетки сетчатки (слева внизу) и, предположительно, предшественники фоторецепторов (справа вверху); Б — экспрессия рековерина; В — экспрессия родопсина;

Г — ОТ-ПЦР на экспрессию маркеров фоторецепторов Recoverin, ABCA4 и маркера пигментированного нейроэпителия сетчатки RPE65;

1 — культура пигментированного нейроэпителия сетчатки и фоторецепторов на 120 сут.дифференцировки ЭСК человека;

2 — культура пигментированного эпителия сетчатки

и фоторецепторов на 70 сут. дифференцировки иПСК, полученных из клеток пациента с болезнью Штаргардта;

3 — недифференцированные иПСК, полученные из клеток того же пациента;

4 — фибробласты кожи того же пациента с болезнью Штаргардта.

( + ) — проводилась обратная транскрипция; (-) — не проводилась обратная транскрипция

половину среды, и добавляли такое же количество свежей. Через 30 сут. среду заменяли на дифферен-цировочную с добавлением 5 нг/мл Вй1\1Г. Трехмерные структуры, образующиеся из иПСК, показаны на рис. 5. Пигментные клетки в этом случае развиваются исключительно в верхушечной части органоидов, образуя отдельный домен. Трехмерные структуры состоят из пигментированных эпителиальных клеток, нервных клеток и клеток, экспрессирующих рековерин, которые представляют собой развивающиеся клетки предшественников фоторецепторов, о чем говорят данные ПЦР-анализа (данные не приводятся). Таким образом, иПСК человека имеют способность к самоорганизации в пигментный эпителий сетчатки и фоторецепторные клетки сетчатки, демонстрируя, что структура похожая на глазной бокал может быть сформирована ¡п у^го, независимо от взаимодействия нейроэпителиальных клеток с мезо-дермальными тканями.

Рис. 5. Органоиды, содержащие ткани развивающейся сетчатки глаза, дифференцированные из иПСК человека

Исправление мутации в гене PRPH2 с помощью

системы эндонуклеазы CRISPR/Cas9

В настоящее время широкое распостранение приобрела система редактирования генома на основе CRISPR/Cas9 [15-17]. Для исправления мутации в гене per¡pher¡n2/RDS с помощью системы эндонуклеазы CRISPR/Cas9 были подобраны 7 вариантов gRNA, комплементарных геномной последовательности периферина на расстоянии до 100 нукле-отидов от точки мутации (табл. 3). Подбор gRNA осуществляли с помощью онлайн-сервиса CRISPR Designe (http://crispr.mit.edu/). Анализировали последовательность гена per¡pher¡n2/RDS (координаты на шестой хромосоме: 42672207 - 42672456), окружающую мутацию. Из 40 предложенных gRNA были выбраны семь наиболее специфичных последовательностей, две из которых полностью комплементарны только мутантной последовательности, то есть должны быть неактивны по отношению к нормальной последовательности. Все первые ну-клеотиды в последовательностях gRNA заменены на гуанозин, что является условием транскрипции с U6 промотора. Последовательности, кодирующие отобранные gRNA, были клонировали в вектор pX330. Для экспериментального подтверждения правильности выбора gRNA был проведен Surveyor-анализ на клетках НЕК293 (рис. 6).

Проведенный анализ показал, что нуклеаза Cas9, направляемая gRNA 19, 39, 11, 34 и 35, вносит двуцепочечный разрыв в целевом регионе гена peripherin 2/RDS, а Cas9, направляемая мутант-специфичными gRNA 12 и 13, не разрезает последовательность гена peripherin 2/RDS клеток HEK 293 Phoenix, так как данные gRNA комплементарны только мутантной последовательности.

таблица 3. Последовательности использованных gRNA и их целевых последовательностей

Номер gRNA Последовательность gRNA Целевая последовательность дикого типа

19 GTACAGTTACGACCACCAGA CTACAGTTACGACCACCAGACGG

39 GCTGTAGTGTGCTGAGTTGT ACTGTAGTGTGCTGAGTTGTTGG

12 GGAATCAAGAGCAACGAGGA CGAATCAAGAGCAACGTGGATGG

11 GAGTCGAATCAAGAGCAACG AAGTCGAATCAAGAGCAACGTGG

34 GTGCAGGGCCGTGGCGAGCT ATGCAGGGCCGTGGCGAGCTAGG

35 GGATACTGGATGCAGGGCCG TGATACTGGATGCAGGGCCGTGG

13 GAATCAAGAGCAACGAGGAT GAATCAAGAGCAACGTGGATGGG

Жирным шрифтом в дРЫД выделены нуклеотиды, комплементарные мутантной последовательности. Жирным шрифтом в последовательности дикого типа выделен тимидин, заменённый на аденозин в мутантной последовательности. Нижним подчёркиванием выделены РАМ.

М

19 39 12

11 34 35 13

1500 1000 750

500

Рис. 6.

Бигуеуог-анализ выбранных дРЫА: М — маркер;

19, 39, 12, 11, 34, 35, 13 - результаты анализа геномной ДНК клеток, трансфицированных соответствующими дРЫД. На дорожках 19, 39, 11, 34 и 35 наблюдаются дополнительные полосы (обозначены «+»), соответствующие фрагментам продукта амплификации, образовавшимся в результате обработки Бигуеуог-нуклеазой

Донор для гомологичной рекомбинации содержал в себе правое и левое плечи рекомбинации, бифункциональный ген HyTK, и инвертированные piggybac повторы, окаймляющие кассету для селекции. Бифункциональный ген HyTK кодирует слитый белок гигромицин-фосфотрансферазы (HygR) и тимидин-киназы (ТК). Таким образом, клетки, несущие данный ген, устойчивы к гигромицину и чувствительны к таким аналогам нуклеотидов, как ганцикловир. Устойчивость к гигромицину позволит отобрать клон иПСК, в геном которого встроилась кассета и произошла коррекция мутации. Если в будущем эти клетки использовать для терапии, то для обеспечения целостности генома с помощью транспозазы piggyBac возможно удаление всех вспомогательных последовательностей, используя селекцию с помощью ганцикловира. Клеточная линия iPSStM06 была трансфицирована gRNA-g12 и нелиниаризированной плазмидой — донором. Из девяти отобранных клонов по результатам секвенирования в шести гомологичная рекомбинация завершилась исправлением мутации и специфичной вставкой селективной кассеты, определенной с помощью секвенирования (рис. 7). Полученные клоны по своей морфологии и особенностям культивирования не отличались от изогенной линии иПСК пациента.

обсуждение

Периферин-2 — гликопротеин, содержащийся в мембранах дисков фоторецепторных клеток и участвующий в поддержании структуры изгибов по краям дисков. Val200Glu мутация, предположительно, нарушает взаимодействие белков ободка дисков периферина-2 и rom-1, что приводит к расформированию дисков фоторецепторных клеток. Наличие мутации приводит к постепенной потере зрения в результате дегенерации фоторецепторных клеток и наследуется по аутосомно-доминантному принципу [18]. Точный механизм дегенерации до сих пор неизвестен, но предполагается, что расформирование дисков влечёт за собой их избыточное слущивание и, как следствие, наблюдаются метаболические и структурные изменения в клетках пигментного эпителия [19]. Такую форму дистрофии сетчатки не относят к болезни Штаргардта из-за различий в некоторых симптомах. Таким образом, у пациентки с клиническим диагнозом макулодистрофия Штар-гардта и членов ее семьи была выявлена мутация во 2 экзоне гена peripherin 2/RDS в гетерозиготном состоянии, описанная ранее в семье с наследственной аутосомно-доминантной палочко-колбочковой дистрофией [18]. Одним из возможных подходов,

который сегодня активно исследуется в офтальмологии, является проведение генной терапии [20]. Наличие доминантной мутации делает в данном случае этот вид терапии невозможным. В целом, дегенерации сетчатки представляют собой большую группу генетически гетерогенных нарушений и это, несомненно, затрудняет поиск молекулярно-генетических причин патологии для их исправления и последующей терапии.

Технология репрограммирования соматических клеток уже на протяжении 10 лет активно применяется как для изучения молекулярных особенностей патологий, так и как средство терапии [21]. Особенность плюрипотентного состояния заключается в том, что клетки, сохраняя высокую пролифератив-ную активность, обладают способностью при изменении условий внешней среды дифференцироваться в любые специализированные типы клеток. Модели на основе иПСК активно используются для изучения заболеваний зрения. Так, с помощью иПСК, полученных от пациентов с синдромом Беста, было показано влияние мутации в гене бестрофин 1 на слущивание внешних дисков фоторецепторов in vitro и нарушение регуляции кальция, что также приводит к неправильному процессингу белков [22]. Разработанная модель позволила предложить ряд фармакологических средств, которые способствовали активной деградации дисков [23]. Однако, далеко не всегда возможно обнаружить молекулярные особенности патологии in vitro. Так нам не удалось найти значимых отличий в особенностях дифференцировки в пигментный эпителий сетчатки между иПСК здоровых доноров и пациентов с мутацией в гене peripherin 2/RDS. Проявление патологии у пациентов наблюдалось уже в достаточно зрелом возрасте, а максимальный срок культивирования клеток пигментного эпителия составил всего треть года. Например, в случае созданной нами модели болезни Гентингтона, гибель нейронов наблюдалась только при моделировании ускоренного старения за счет ингибирования протеасомного аппарата [24, 25]. Таким образом, в дальнейшем будет необходимо найти определенные условия, при которых будет возможно изучать патологию in vitro. Однако, не исключено, что мы не смогли обнаружить разницу у дифференцированных в пигментный эпителий сетчатки клеток нормы и мутантного типа в связи с тем, что эти клетки не изогенны, а отличия в индивидуальном развитии могут быть значимее, чем влияние в этот период мутации. Например, при изучении болезни Беста, в качестве сравнения использовались иПСК от сиблинга [22]. В связи с этим, а также с целью возможной клеточной терапии заболевания, нами было решено создать изогенную

Рис. 7. Хромотограмма результатов секвенирования второго экзона гена рвпрЬвпп 2/ЙОБ в линии иПСК после геномного редактирования. Стрелкой указана исправленная мутация

линиюи ПСК с исправленной мутацией во втором эк-зоне гена peripherin 2/RDS. Редактирование генома является одной из наиболее быстро развивающихся технологий, а ее сочетание с репрограммированием клеток может в ближайшем будущем изменить парадигму медицины [26]. Среди систем редактирования наиболее привлекательной кажется система СП^РП/ Саэ9, которая сегодня получила наибольшее распространение, в том числе и области офтальмологии [27, 28]. Выбранный нами подход позволил эффективно отбирать клоны иПСК, в которых прошла рекомбинация, а наличие в рекомбинируемом фрагменте сайта узнавания транспозазы piggyBac делает возможным получить этот геномный район в своем

нативном виде. Для изучения тонких механизмов патологии и сравнения изогенных дифференцированных производных иПСК можно использовать линию, содержащую селективный антибиотик, что даст дополнительную возможность сокультивирования клеток разных линий для изучения взаимовлияния. В случае терапевтического применения производных иПСК как биомедицинского клеточного продукта, ген устойчивости к антибиотику может быть удален для полной сингении с пациентом. Таким образом, в результате проведенного исследования нами создана изогенная система для изучения механизмов патогенеза заболевания зрения, связанная с мутацией в гене peripherin 2/RDS

ЛИТЕРАТУРА:

1. Allikmets R., Singh N., Sun H. et al. A photoreceptor cell-specific ATP-binding transporter gene tABCR) is mutated in recessive Stargardt macular dystrophy. Nat. Genet. 1997; 15(3): 236-46.

2. Nishiguchi K.M., Sandberg M.A., Gorji N. et al. Cone cGMP-gated channel mutations and clinical findings in patients with achromatopsia, macular degeneration, and other hereditary cone diseases. Hum.Mutat. 2005; 25(3): 248-58.

3. Zhang K., Kniazeva M., Han M. et al. A 5-bp deletion in ELOVL4 is associated with two related forms of autosomal dominant macular dystrophy. Nat. Genet. 2001; 27(1): 89-93.

4. Edwards A.O., Donoso L.A., Ritter R. 3rd. A novel gene for autosomal dominant Stargardt-like macular dystrophy with homology to the SUR4 protein family. Invest.Ophthalmol. Vis. Sci. 2001; 42(11): 2652-63.

5. Yang Z., Chen Y., Lillo C. et al. Mutant prominin 1 found in patients with macular degeneration disrupts photoreceptor disk morphogenesis in mice. J.Clin. Invest. 2008; 118(8): 2908-16.

6. Stuck M.W., Conley S.M., Naash M.I. RDS Functional Domains and Dysfunction in Disease. Adv. Exp. Med. Biol. 2016;854:217-22.

7. Connell G.J., Molday R.S. Molecular cloning, primary structure, and orientation of the vertebrate photoreceptor cell protein peripherin in the rod outer segment disk membrane. Biochemistry 1990; 29(19):4691-8.

8. Stuck M.W., Conley S.M., Naash M.J. Retinal Degeneration Slow (RDS) Glycosylation Plays a Role in Cone Function and in the Regulation of RDS^ROM-1 Protein Complex Formation. J. Biol. Chem. 2015; 290(46):27901-13.

9. Schwartz S.D., Tan G., Hosseini H. et al. Subretinal transplantation of embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium for the treatment of macular degeneration: an assessment at 4 Years. Invest.Ophthalmol. Vis. Sci. 2016;57(5):1-9.

10. Mandai M., Watanabe A., Kurimoto Y. et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. N. Engl. J. Med. 2017;376(11):1038-46.

11. Честков И.В., Васильева Е.А., Иллариошкин С.Н. и др. Система для изучения бокового амиотрофического склероза на основе пациент-специфичных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток ActaNaturae 2014; 6(1): 58-65.

12. Лагарькова М.А., Шилов A.T., Губанова Н.И. и др. Гистогенез эмбриональных стволовых клеток человека invitro в компоненты сетчатки глаза. Клеточные технологии в биологии и медицине 2011; 4: 203-6.

13. Shutova M.V., Surdina A.V., Ischenko D.S. et al. Anintegrati veanalysisofreprogramminginhuman isogenic system identified a clone selection criterion. Cell Cycle 2016;15(7):986-97.

14. Eiraku M., Takata N., Ishibashi H. et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature 2011; 472(7341): 51-6.

15. Vora S., Tuttle M., Cheng J. et al. Next stop for the CRISPR revolution: RNA-guided epigenetic regulators. FEBS J. 2016; 283(17):3181-93.

16. Cowan P.J. The use of CRISPR/Cas associated technologies for cell transplant applications. Curr.Opin. Organ Transplant. 2016; 5:461-6.

17. Xie F., Ye L., Chang J.C.et al. Seamless gene correction of ß-thalassemia mutations in patient-specific iPSCs using CRISPR/Cas9 and piggyBac. Genome Res. 2014;24(9):1526-33.

18. Nakazawa M., Naoi N., Wada Y.et al. Autosomal dominant cone-rod dystrophy associated with a Val200Glu mutation of the peripherin/RDS gene. Retina 1996; 16(5): 405-10.

19. vanSoest S., Westerveld A., de Jong P.T. et al. Retinitis pigmentosa: defined from a molecular point of view. Surv.Ophthalmol. 1999; 43(4): 321-34.

20. Максимов В.В., Лагарькова М.А., Киселев С.Л. Генная и клеточная терапия заболеваний сетчатки глаза. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2012, 7(3):12-20.

21. Богомазова А.Н., Васина Е.М., Киселев С.Л.и др. Генетиче-скоерепрограммирование клеток: новая технология для фундаментальных исследований и практического использования. Генетика 2015;51(4): 466-78.

22. Singh R., Shen W., Kuai D. et al. iPS cell modeling of Bestdisease: insightsintothepathophysiology of an inherited macular degeneration. Hum. Mol. Genet. 2013;22(3):593-607.

23. Singh R., Kuai D., Guziewicz K.E.et al. Pharmacological modulation of photoreceptor outer segment degradation in a human iPS cell model of inherited macular degeneration. Mol. Ther. 2015;23(11):1700-11.

24. Bezprozvanny I., Kiselev S.L. Neurons from skin mimic brain holes. Oncotarget 2017;8(6):8997-8.

25. Nekrasov E.D., Vigont V.A., Klyushnikov S.A.et al. Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Mol.Neurodegener. 2016;11(1):27-32.

26. Shi Y., Inoue H., Wu J.C.et al.Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nat. Rev. Drug Discov. 2017;16(2):115-30.

27. Gasiunas G., Barrangou R., Horvath P. et al. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci.2012; 109:2579-86.

28. Cabral T., DiCarlo J.E., Justus S.et al. CRISPR applications in ophthalmologic genome surgery. Curr.Opin.Ophthalmol. 2017;28(3):252-9.

Поступила: 12.05.2017