Судьба пересаженных в костную рану мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток

A.A. Гумерова, А.К. Шафигуллина, С.Р. Абдулхаков,

И.М. Газизов, М.С. Калигин, Д.И. Андреева,

М.А. Титова, Г.Р. Бурганова, A.A. Трондин,

А.Р. Шайхутдинова, А.П. Киясов Перспективы использования различных популяций стволовых/прогениторных клеток в клеточной терапии заболеваний печени

ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», Казань, Россия anissagum@mail.ru

A.A. Gumerova, A.K. Shafigullina, S.R. Abdulkchakov,

I.M. Gazizov, M.S. Kaligin, D.I. Andreeva, M.A. Titova,

G.R. Burganova, A.A. Trondin, A.R. Shaichutdinova,

A.A. Kiassov

Perspectives of different populations of stem/progenitor cells in stem cell therapy of liver diseases

В настоящее время проводится множество исследований, посвященных поиску региональной стволовой клетки печени, изучению возможностей диффе-ренцировки в гепатоциты стволовых/прогениторных клеток различной природы и анализу перспектив их дальнейшего использования в терапии хронических заболеваний печени. Целью комплекса наших экспериментальных и клинических исследований было оценить перспективы применения различных популяций стволовых/прогениторных клеток для лечения хронических гепатитов.

Материал и методы. Аутотрансплантация мобилизованных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) периферической крови проведена 12 больным хроническим алкогольным гепатитом с исходом в тяжелый фиброз/цирроз печени. Биопсия печени проведена больным до трансплантации и через 1, 3 и 12 мес. после трансплантации. В условиях in vitro проведено изучение способности ГСК человека, мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) костного мозга крысы и звёздчатых клеток печени (ЗКП) крысы дифференцироваться в гепатоциты в различных условиях (влияние растворимых и контактных факторов со стороны ЗКП, добавление факторов роста). В экспериментах на белых лабораторных крысах изучена активация стволового компартмента печени после частичной гепатэктомии, а также хоуминг и пути дифференцировки нативных и генетически модифицированных ГСК пуповинной крови человека, транпланти-рованных крысам, перенесшим частичную гепатэктомию. Изучение фенотипов клеток во всех случаях проведено иммуногистохимическими методами.

Результаты клинических испытаний аутотрансплантации ГСК, мобилизованных из периферической крови, больным алкогольным гепатитом с исходом в тяжелый фиброз/цирроз печени показали её безопасность и эффективность. Через 1—3 мес. после однократной инъекции ГСК у больных улучшались клинические, биохимические и морфологические показатели (снижение индекса гистологической активности на 1—2 пункта у всех больных). Иммуногистохимическое исследование позволило установить снижение активности миофиб-робластов, восстановление фенотипа эндотелиальных клеток синусоидов печени и уменьшение их капилляри-зации, снижение напряженности регенераторного процесса (сокращение числа пролиферирующих клеток) и риска опухолевой трансформации (уменьшение числа клеток, экспрессирующих Bcl-2). Однако эффект от лечения сохранялся не более 12 мес.

Результаты экспериментов по культивированию ГСК пуповинной крови человека, ММСК и ЗКП крысы показали, что ГСК сохраняют жизнеспособность только при сокультивировании с ЗКП, но не дифференцируются в гепатоциты ни под воздействием паракринных и контактных влияний со стороны последних, ни под влиянием добавленных в культуральную среду факторов роста. Однако ГСК пуповинной крови человека (как нативные, так и генетически модифицированные) после трансплантации крысам, перенёсшим операцию частичной гепатэктомии, мигрировали в печень и дифференцировались в гепатоциты, холангиоциты и синусоидные клетки печени. Другие же популяции клеток — ММСК и ЗКП — продемонстрировали, в отличие от ГСК, способность к гепатоцитарной дифференцировке уже в условиях in vitro. ММСК начинали экспрессировать гепатоцитарные маркеры (цитокератин 18, —-фето-протеин, специфический антиген гепатоцитов) спонтанно, но при добавлении среды, переработанной ЗКП, этот процесс происходил быстрее и был более выраженным. ЗКП после образования монослоя также начинали экспрессировать гепатоцитарные маркеры. Культивирование ММСК и ЗКП с факторами роста ускоряло их дифференцировку в гепатоциты.

Изучение активации стволового компартмента в печени после частичной гепатэктомии показало наиболее выраженные свойства стволовых/прогениторных клеток (экспрессию маркера стволовых клеток C-kit) у ЗКП и гепатоцитов. Аналогичные результаты были получены нами ранее при изучении онтогенеза человека и крысы.

Выводы: поскольку в условиях in vivo ЗКП проявляют признаки стволовых/прогениторных клеток в онтогенезе и при регенерации, в условиях in vitro ММСК и ЗКП демонстрируют значительно более выраженные, по сравнению с ГСК, потенции к гепатоцитарной дифференцировке, а терапевтический эффект от аутотрансплантации ГСК больным хроническим алкогольным гепатитом не является длительным, мы считаем более перспективными для разработки методов клеточной терапии заболеваний печени ЗКП и ММСК.

Р.В. Деев 1 а, И.Я. Бозо 3, Н.В. Цупкина 4,

И.В. Честков 5, М.С. Калигин 6, Г.П. Пинаев 4 Судьба пересаженных в костную рану мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток

1 ОАО «Институт стволовых клеток человека»,

Москва, Россия

2 ФГУ «Российский НИИ травматологии и ортопедии им. P.P. Вредена Росмедтехнологий»,

Санкт-Петербург, Россия

3 Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург, Россия

4 УРАН «Институт цитологии РАН», Санкт-Петербург, Россия

5 УРАН «НИИ общей генетики РАН им. Н.И. Вавилова», Москва, Россия

Б ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», Россия romdey@gmail.com

R.V. Deev, I.Ya. Bozo, N.V. Tsupkina, I.V. Thestkov,

M.S. Kaligin, G.P. Pinaev

Differentiations of transplanted in bone defect multipotent mesenchymal stromal cells

Многочисленными исследованиями показан диф-ференцировочный потенциал мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК). Подтверждающие это данные были получены в экспериментах

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, hl< 3, 2010

как in vitro, так и in vivo — в диффузионных камерах, то есть в условиях, лишенных всего многообразия факторов микроокружения в тканях и тем более — в костной ране (про- и противовоспалительные цитокины и др.). Ранее нами было показано, что в случае пересадки в дефект длинной трубчатой кости культивированных на остеоиндуктивном носителе ММСК, последние в первые недели локализуются прежде всего в реактивно измененной соединительной ткани межбалочных пространств в области формирования костного регенерата (Р.В. Деев и др., 2008), что дало основания считать одним из основных факторов воздействия на репаративный процесс индукционные влияния со стороны пересаженных клеток. Вместе с тем, требуется более детальное исследование непосредственной дифференцировки пересаженных ММСК в костной ране и их продуктивного участия в регенерационном гистогенезе.

Цель исследования — выявить пересаженные ММСК и их дифференцировочную судьбу в составе костного регенерата через 30 и 60 сут. после пересадки.

Материал и методы. Эксперименты выполнены на кроликах. ММСК получали из костного мозга по известной методике. После 3 нед. культивирования клетки подвергали трансфекции лентивирусной конструкцией GPur, кодирующей GFP под CMV промотером. Еще через 4 сут. культивирования, визуально констатировали результативность трансфекци. В дальнейшем по оригинальной запатентованной методике совмещали меченые клетки с деминерализованным костным матриксом из расчета 10 млн клеток на 1 см3 материала. Всем животным осуществляли резекцию 2 см средней трети диафиза большеберцовой кости, выполняли интрамедуллярную фиксацию с монтажом импровизированного дистрактора для предотвращения самостоятельного совмещения костных опилов. Полученный таким образом танеинженерный эквивалент кости помещали в диастаз, рану ушивали послойно. Животных выводили из эксперимента через 30 и 60 сут. выпиливали костные фрагменты из области дефекта, фиксировали, осуществляли рутинную бескислотную декальцинацию, изготавливали гистологические препараты по общепринятой методике. Срезы исследовали в люминесцентном микроскопе. Для более достоверного выявления пересаженных клеток ставили иммуноги-стохимическую реакцию с антителами к GFP (Abeam, Великобритания).

Результаты. Установлено, что пересаженные клетки сохраняли жизнеспособность через 30—60 сут. Они интегрировались в состав мультитканевого костного регенерата и претерпевали дивергентную дифферен-цировку на месте в трех ортодоксальных направлениях. Получены данные, свидетельствующие о фибро-, хондро- и остеогенной дифференцировке пересаженных в составе тканеинженерного эквивалента ММСК. Следует отметить, что значительная их часть локализовалась в периваскулярных тканевых нишах.

Таким образом, клеточная культура не только индуцирует восстановительный процесс в костной ране, но и продуктивно участвует в строительстве регенерата.

Р.В. Деев 1, С.Л. Киселев а, A.A. Исаев \

A.B. Приходько 1, И.В. Потапов 1, С.В. Грязнов 3,

P.E. Калинин 3, П.Г. Швальб 3 Опыт создания и применения (1-2 фаза клинических испытаний) препарата на основе гена VEGF

1 ОАО «Институт стволовых клеток человека»,

Москва, Россия

2 УРАН «Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН», Москва, Россия

3 ГОУ ВПО Рязанский государственный медицинский университет, Рязань, Россия

R.V. Deev, S.L. Kiselev, A.A. Isaev, A.V. Prichodko, I.V. Potapov,

S.V. Griasnov, R.E. Kalinin, G.G. Schvalb

Experience of creating and applying

(1-2 phase of clinical trials) of the drug on the basis

of VEGF gene

В соответствии с действующим законодательством и на основании официально выполненных доклинических исследований проведена l-lla фаза клинических исследований на базе трех лечебных учреждений. В простое открытое рандомизированное многоцентровое исследование было включено 45 пациентов, 10 из которых составили группу сравнения. Исследование проведено в строгом соответствии с национальными правилами этики и достоверности клинических исследований. Назначение исследуемого препарата производилось на фоне стандартной терапии в соответствии с протоколами ведения больных, используемыми в клинике, участвующей в исследовании. Пациенты группы испытуемых получали гентерапевтический препарат на основе высокоочищенной сверхскручен-ной формы плазмиды pCMV-VEGF165, кодирующей эндотелиальный фактор роста сосудов (VEGF). Производитель: ОАО «Институт Стволовых Клеток Человека» (Москва, Россия).

Цель исследования: определить безопасность и переносимость введения препарата у пациентов с ишемией нижних конечностей (Па-Ill стадии по A.B. Покровскому — Фонтейну).

Препарат вводили внутримышечно дважды, в дозе 1,2 мг с интервалом в 7 или 14 сут.

Активный период наблюдения составил 30 сут. Общее наблюдение за пациентами осуществлялось в течение 3 мес. В ходе наблюдения оценивали: жалобы, жизненно-важные функции, дистанцию безболевой ходьбы, общий и биохимический анализы крови, мочи, коагулограмму, результаты ультразвукового дуплексного сканирования сосудов нижних конечностей, лодыжечно-плечевой индекс, транскутанное напряжение кислорода (ТсР02).

Установлено, что препарат безопасен для пациентов, имеет хорошую переносимость, не оказывает значимого влияния на общеклинические, биохимические показатели, а также показатели гемостаза. Результаты обработаны статистически (р<0,05). У пациентов группы испытуемых в сравнении с исходным уровнем статистически достоверно увеличивались лодыжечноплечевой индекс (на 18,8—22,9%), уровень ТсР02 (на 15,4—17,8%), безболезненно проходимое расстояние (на 260,8-290,3%).

Полученные результаты позволяют реализовывать следующую фазу клинических испытаний с участием больших групп пациентов.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, 1У< 3, 2010