Способ определения содержания металлов в жидких пробах и устройство для его осуществления
METHOD OF DETERMINING CONTENT OF METALS IN LIQUID SAMPLES AND DEVICE FOR IMPLEMENTATION THEREOF

Изобретение относится к аналитической химии, в частности, к способам и устройствам определения содержания металлов в жидких пробах атомно-эмиссионной спектроскопией и может быть использовано для решения ряда социально значимых задач, например, ранней диагностики некоторых заболеваний и коррекции лечебно-восстановительных процессов в арсенале клинических лабораторий.
Известен способ анализа жидких проб атомно-эмиссионной спектроскопией. Способ основан на термическом возбуждении свободных атомов или одноатомных ионов и регистрации оптического спектра испускания возбужденных атомов. Для атомизации и возбуждения жидкой пробы используются различные типы источников атомизации: пламя, индуктивно связанная плазма [Основы аналитической химии, В 2, кн. Кн 2, Методы химического анализа: Учеб. Для вузов / Под ред. Ю.А. Золотов. - 3-е изд., М.: Высш. Шк., 2004 г., _ 503 с.].
Существенным недостатком используемых источников атомизации и возбуждения является то, что для выполнения анализа необходимы существенные объемы жидкой пробы, как правило, несколько мл. Однако при анализе биологических жидкостей (слюна, пот, раневой экссудат и т.д.) доступный объем жидкости может составлять несколько мкл.
Кроме этого, как правило анализ одной пробы требуют значительных временных затрат и переход от одного образца к другому требует существенный промывки системы ввода пробы для избежание эффекта памяти.
Имеет значение и существенная стоимость выполнения анализа биологических жидкостей, включающая высокую стоимость оборудования и расходные материалы (например, непрерывный расход горючего газа в случае использования пламени и инертный газ в случае применения индуктивно связанной плазмы) во время выполнения анализа.
Известен микропланшетный фотометр для иммуноферментного анализа STAT FAX 4200, включающий корпус с цветным сенсорным экраном для управления прибором, установленные в корпусе планшет с ячейками для исследуемой пробы, механизм его перемещения, размещенную над планшетом вольфрамовую ксеноновую лампу с функцией сохранения, систему линз для фокусировки луча лампы, установленные под ячейками планшета колесо опциональных фильтров от 405 до 700 нм и фотодетектор для преобразования падающего света в электрический сигнал, блоки усиления и обработки сигнала [Awareness Technology, Inc. - Palm City, FL, 34991, USA; www.awareness.ru].
Выполняемые тесты планшетным иммуноферментным анализатором Stat Fax 4200: инфекции, опухолевые маркеры, щитовидная железа, репродуктивная функция, эндокринология, аллергия, беременность, аутоиммунные и системные заболевания.
Однако микропланшетный фотометр обладает следующими существенным недостатком.
Микропланшетный анализатор не может реализовать атомно-эмиссионный способ анализа жидкостей. Поэтому не может проводить прямые определения в жидких пробах на содержания в металлов. Так, как в микропланшетном анализаторе нет источника атомизации и возбуждения для получения эмиссионного спектра излучения анализируемой жидкой пробы.
Наиболее близким техническим решением к предложенному является способ определения содержания металлов в жидких пробах, путем подготовки пробы, помещения ее в микрокювету в виде электроизоляционного стакана с электродом в нижней части, расположения над микрокюветой верхнего электрода, при этом верхний и нижний электроды соединены между собой через балластное сопротивление, подключенное к конденсатору, возбуждения искрового разряда между пробой в микрокювете и верхним электродом, регистрации аналитического сигнала эмиссионного спектра излучения, возникающего в момент разряда, и определения наличия металлов в пробе по длинам волн и их концентраций по интенсивности свечения с использованием калибровочной зависимости [А.А. Жирков, 1, В.В. Ягов, А.А. Власова, Б.К. Зуев, Микроплазменный анализатор для определения щелочных и щелочноземельных металлов в малых объемах проб сложного фазового состава, ж. Аналитической химии, 2015, том 70, №12, с. 1276-1282].
В указанном способе источником эмиссионных спектров служит электрический разряд между верхним мениском капли пробы и нижним мениском жидкой линзы. Пробу в виде капли наносят пипет-дозатором на торец электрода из нержавеющей стали диаметром 1.5 мм, на который плотно насажена фторопластовая трубка. Электрод соединен с заземленным отрицательным полюсом высоковольтного источника, а раствор, образующий жидкую линзу, через удаленный от разряда вспомогательный электрод с положительным полюсом ВС-22. Параметры разрядной цепи: напряжение - 2,2 кВ, емкость - 3 мкФ, балластное сопротивление - 1 кОм. Время разрешенный сигнал - силу тока, напряжение и интенсивность света - регистрировали с помощью платы ввода-вывода L154 (L-Card, Россия). Для регистрации излучения, возникающего в момент разряда, используют оптическую систему, состоящую из кварцевого световода, монохроматора МДР-3 с и фотоприемного модуля Н8249 (Hamamatsu,, Япония).
Главным недостатком указанного способа является сложная регулировка работы жидкой линзы. Необходимо обеспечить заданную скорость жидкости и удалять пузыри, рассеяние света на которых искажает сигнал.
Кроме того, поверхность жидкой линзы легко искажается вследствие вибрации, что усложняет применение способа вне лаборатории. Значительный объем вспомогательного раствора кислоты (20 мл и более), соединенного с электродом под напряжением более 2 кВ, создает проблемы в плане электробезопасности.
Кроме этого, жидкая линза (раствор кислоты) при разряде распыляется в воздух, что приводит к попаданию значительного количества токсичных компонентов в окружающую среду.
Наконец, механические манипуляции с нанесением пробы в непосредственной близости от жидкой линзы достаточно сложны и требуют определенного навыка от оператора.
Наиболее близким техническим решением к предложенному является планшетный анализатор, включающий корпус, расположенные в нем установочный узел для размещения планшета с микрокюветами для исследуемых проб, считывающий узел, выполненный в виде излучателя и измерительного фотоприемника с узлом передачи светового сигнала, каретку для перемещения излучателя и планшета относительно друг друга, блок обработки сигнала и блок регистрации и управления, соединенные с измерительным фотоприемником, при этом узел передачи светового сигнала в фотоприемник выполнен в виде волоконно-оптического жгута [Патент РФ №2442973, кл. G01N 21/59, опубл. 20.02.2012].
Планшетный анализатор используют для иммунотурбидиметрического анализа множества различных образцов, в частности для проведения массового скрининга населения как в крупных, так и в средних и малых лабораториях, а также для контроля сырья и материалов при их производстве.
Известный анализатор обладает рядом недостатков.
Отсутствие эмиссионного источника излучения позволяющего импульсно нагревать анализируюмую жидкую микропробу до температур в несколько тысяч градусов. Такой источник необходим, так как целью является определения металлов в жидкости с использованием атомно - эмиссионной спектроскопии.
Кроме того, система регистрации не позволяет настраиваться на спектральную линии определяемого элемента, по интенсивности которой можно проводить количественный анализ элемента в жидкой пробе.
Задачей изобретения является разработка недорогих экспрессных способа и устройства, пригодных для прямого определения металлов в малых объемах биологических жидкостей сложного состава и технологических растворах.
Кроме того, техническими задачами являются повышение точности анализа, выполнение многоэлементного анализа в одной пробе, существенное уменьшение токсичных реагентов (кислоты) распыляемых в воздух, уменьшение энергозатрат при выполнении анализа и автоматизация выполнения анализа.
Поставленные задачи решаются способом определения содержания металлов в жидких пробах, путем подготовки пробы, помещения ее в микрокювету в виде электроизоляционного стакана с электродом в нижней части, расположения над микрокюветой верхнего электрода, при этом верхний и нижний электроды соединены между собой через балластное сопротивление, подключенное к конденсатору, возбуждения искрового разряда между пробой в микрокювете и верхним электродом, регистрации аналитического сигнала эмиссионного спектра излучения, возникающего в момент разряда, и определения наличия металлов в пробе по длинам волн и их концентраций по интенсивности свечения с использованием калибровочной зависимости, верхний электрод выполнен в виде стержня из тугоплавкого металла с заостренном концом, возбуждение искрового разряда проводят путем предварительной подачи на электроды постоянного высокого напряжения и последующего сближения конца верхнего электрода и верхнего мениска капли пробы, непрерывное сближение осуществляют в процессе разряда до полной разрядки конденсатора, запись спектра начинают после броска тока, регистрируют эмиссионный спектр разряда в диапазоне 200-1100 нм, одновременно дополнительно регистрируют интенсивность свечения и ток в разрядной цепи, при этом аналитическим сигналом служит интегральная интенсивность свечения при соответствующей длине волны электромагнитного излучения за первые 10-50 мс разряда с отступом 0,1-2 мс от момента возникновения пробоя или интегральная интенсивность, разделенная на прошедшее через разряд количество электричества, зарегистрированное за время регистрации интенсивности свечения.
Кроме того, поставленные задачи решаются тем, что в планшетном анализаторе, включающем корпус, расположенные в нем установочный узел для размещения планшета с микрокюветами для исследуемых проб, считывающий узел, выполненный в виде излучателя и измерительного фотоприемника с узлом передачи светового сигнала, каретку для перемещения излучателя и планшета относительно друг друга, блок обработки сигнала и блок регистрации и управления, соединенные с измерительным фотоприемником, при этом узел передачи светового сигнала в фотоприемник выполнен в виде волоконно-оптического жгута, микрокюветы представляют из себя стаканы в виде изолирующих оболочек, в дно которых вставлены направленные вверх металлические стержни, излучатель представляет из себя электрод в виде стержня, выполненного из тугоплавкого металла с заостренном концом, закрепленным на держателе каретки, стрежень излучателя и металлические стержни микрокювет соединены друг с другом через балластное сопротивление, подключенное к высоковольтному конденсатору, волоконно-оптический жгут фотоприемника закреплен на держателе каретки, а его конец расположен около конца электрода излучателя, при этом каретка выполнена с возможностью вертикального и горизонтального перемещения относительно планшета с микрокюветами
Целесообразно чтобы металлические стержни выступали из дна стаканов микрокювет на 2-20 мм и были выполнены диаметром от 1 до 10 мм, а изолирующие оболочки выступали на 1-5 мм выше проводящих торцов стержней.
Предпочтительно чтобы высоковольтный конденсатор через размыкатель был соединен с высоковольтным блоком, позволяющим осуществлять зарядку конденсатора
Целесообразно чтобы стержень излучателя был соединен с конденсатором гибким экранированным проводом через балластное сопротивление, а перед концом волоконно-оптического жгута уставлена оптическая система.
На фиг. 1 представлена общая схема планшетного анализатора для анализа жидкой пробы.
На фиг. 2 - типичный спектр шестикомпонентной системы, на котором видны наиболее интенсивные линии элементов
На фиг. 3 - градуировочные графики для определения 6 элементов, линейные в координатах интегральная интенсивность в относительных едн. - концентрация элемента в жидкой микропробе.
На фиг. 4 - градуировочные графики для определения 6 элементов, линейные в координатах интегральная интенсивность, деленная на количество электричества за время регистрации в относительных едн. - концентрация элемента в жидкой микропробе.
Планшетный анализатор содержит корпус, расположенные в нем установочный узел для размещения планшета 1 с микрокюветами 2 для исследуемых проб, считывающий узел, выполненный в виде излучателя 3 и измерительного фотоприемника 4 с узлом передачи светового сигнала, каретку 5, выполненную с возможностью вертикального и горизонтального перемещения относительно планшета 1 с микрокюветами 2, блок обработки сигнала и блок регистрации и управления, соединенные с измерительным фотоприемником 4.
Узел передачи светового сигнала в фотоприемник 4 выполнен в виде волоконно-оптического жгута 6.
Микрокюветы 2 представляют из себя стаканы в виде изолирующих оболочек, в дно которых вставлены направленные вверх металлические стержни.
Излучатель 3 представляет из себя электрод в виде стержня, выполненного из тугоплавкого металла с заостренном концом, закрепленным на держателе каретки 5.
Стрежень излучателя 3 и металлические стержни микрокювет 2 соединены друг с другом через балластное сопротивление, подключенное к высоковольтному конденсатору 7. Высоковольтный конденсатор 7 через размыкатель соединен с высоковольтным блоком, позволяющим осуществлять зарядку конденсатора до 5 кВ. Стержень излучателя 3 соединен с конденсатором 7 емкостью от 0,1 до 10 мкф. гибким экранированным проводом через балластное сопротивление.
Волоконно-оптический жгут 6 фотоприемника закреплен на держателе каретки 5, а его конец расположен около конца электрода излучателя 3. Перед концом волоконно-оптического жгута уставлена оптическая система 8. Оптическая система собирает электромагнитное излучение (свет) из пространства около конца электрода и по волоконно-оптическому жгуту 6 передает это излучение в спектральный прибор (например, Ocean Optics).
Металлические стержни, размещенные в кюветах 2 выступают от дна стаканов микрокювет 2 на 2-20 мм. и выполнены диаметром от 1 до 10 мм, а изолирующие оболочки выступают на 1-5 мм выше проводящих торцов стержней.
Планшетный анализатор работает следующим образом.
Анализируемые жидкие пробы небольшого объема и градуировочные растворы такого же объема помещают в микрокюветы 2. Микрокюветы 2 находятся на поверхности планшета 1 анализатора. Планшет 1 располагается в горизонтальной плоскости параллельно поверхности Земли. Затем к металлическим стержням микрокювет 2 подключают один конец обкладки высоковольтного конденсатора 7. Другой конец конденсатора 7 подсоединяют через балластное сопротивление к электроду в виде стержня, выполненному из тугоплавкого материала и имеющему форму с заостренным наконечником. Предварительно электрод закрепляют в держателе каретки 5, позволяющим проводить 3D перемещения электрода относительно поверхности планшета 1. Рядом с концом электрода опущенного вниз устанавливают оптическую систему 8, которая позволяет собирать излучения в пространстве около конца электрода (фиг. 1). Эта оптическая система 8 при движении электрода перемещается вместе с электродом.
С помощью программного обеспечения, первоначально перемещают электрод с оптической системой 8 в точку (координату), расположенную в углу планшета 1 на высоте нескольких сантиметров от поверхности дна микрокювет 2, в которых залиты анализируемые растворы. Это делается для того, чтобы в начальный момент измерений в пространстве зафиксировать начальное положение конца электрода закрепленного в держателе каретки 5. Затем подают высокое постоянное напряжение (например до 2 кВ) на конденсатор 7. Фиксируют полную зарядку конденсатора 7. Далее с помощью программы, управляющей анализатором, подводят нижний конец электрода к вертикали, идущей от мениска жидкости налитый в микрокювету. Затем с помощью программы вертикально опускают конец электрода так, чтобы уменьшалось расстояния между мениском жидкости и концом электрода.
В определенный момент расстояние становится таким, что происходит разряд между жидкостью и концом двигающегося к ней электрода (разряд между электродами с меняющимся разрядным промежутком в процессе разряда). Этот импульсный разряд является источником атомизации и возбуждения металлов, находящихся в растворе анализируемой жидкости. Эмиссионный спектр в процессе разряда с помощью измерительного фотоприемника 4 с узлом передачи светового сигнала направляют в спектральный прибор, где по длинам волн фиксируется наличие элемента в пробе, а по интенсивности с использованием калибровочной зависимости определяется концентрация.
После полной разрядки конденсатора 7 держатель каретки 5 с электродом и оптической системой поднимается вверх и находится в верхним положении, относительно микрокювет 2 до полной зарядке конденсаторной батареи. Затем процесс измерения повторяется для следующего специального гнезда с анализируемой жидкостью и так далее до тех пор, пока не будет выполнен анализ жидкости во всех микрокювете 2 планшета 1. Растворы со стандартным значением концентрации используются для построения калибровочного графика, с помощью которого определяют концентрацию элементов в анализируемых растворах.
Пример 1
Стержни микрокювет 2 соединяют с заземленным отрицательным полюсом источника высокого напряжения (напряжение - 2.5 кВ, емкость - 6 мкФ, балластное сопротивление - 6 кОм). Излучатель 3, изготовленный из вольфрамового стержня с диаметром 2 мм, закрепляют на держателе каретки 5 и соединяют гибким изолированным кабелем с положительным полюсом указанного выше источника высокого напряжения. На том же держателе на расстоянии 15 мм закрепляют волоконно-оптический жгут с оптической системой спектрометра Maya 2000 Pro, ориентированный на точку, находящуюся на 1 мм ниже обреза стержня излучателя 3 на его оси. Спектрометр работает в режиме внешней синхронизации, то есть запись спектра начинается после броска тока.
В течение программно заданного времени (40 мс) Maya 2000 Pro собирает свет и регистрирует эмиссионный спектр разряда в диапазоне 200-1100 нм с оптической шириной щели около 0.5 нм.
Используют свежеприготовленную дистиллированную воду. Кальций, магний, литий, натрий, калий, рубидий (все растворы 1 мг/мл в 0.1 М HCl, ГСО, «Экоаналитика», Россия); соляная кислоты, ос. ч. (Химмед, Россия). Растворы готовят непосредственно перед проведением эксперимента. Аликвотные части (40 мкл) отбирают при помощи набора микропипеток ThermoScience (20-200 мкл) и помещают в микрокюветы, закрепленные в планшете. Микрокюветы представляют собой стержни из нержавеющей стали диаметром 4 мм, на которые плотно насажена фторопластовая трубка, образующая «бортики» высотой 5 мм. Используют планшет из 36 гнезд, размещенных в узлах квадратной решетки с шагом 40 мм.
Аналитическим сигналом служила интегральная интенсивность свечения при соответствующей длине волны за первые 40 мс разряда с отступом 1 мс от момента пробоя.
Для работы прибора используют специальные программы. Первая управляет перемещением каретки, обеспечивая позиционирование стержня излучателя и волоконно-оптического жгута согласно предварительно заданному маршруту обхода микрокювет с пробами. Вторая программа управляет работой спектрометра Maya 2000 Pro в режиме внешней синхронизации, запуская измерения спектра после того, как сближение стержня излучателя с очередной микрокюветой с пробой вызывало пробой и зажигание разряда. Одновременно с регистрацией эмиссионного спектра регистрируется ток разряда и вычисляется количества электричества за время регистрации спектра.
На фиг. 2 показан спектр шестикомпонентной системы, на котором видны наиболее интенсивные линии элементов.
В микрокюветах первых двух рядов помещают растворы, содержащие различные концентрации указанных металлов в диапазоне 0.1-40 мг/л. По результатам измерений получили градуировочные графики для определения 6 элементов, линейные в интегральная интенсивность (ось Y) концентрация в жидкой пробе определяемого элемента (ось X) (Фиг. 3).
Пример 2
Способ осуществляют аналогично примеру 1.
В качестве аналитического сигнала служит интегральная интенсивность, разделенная на прошедшее через разряд количество электричества, зарегистрированное за время регистрации интенсивности свечения.
Для этого регистрируется ток разряда и вычисляется количества электричества за время регистрации спектра.
В результате получили градуировочный график с учетом количества электричества (Q) затраченного на разряд при регистрации эмиссионного спектра. Ось Y интегральная интенсивность деленная на Q, ось X концентрация в жидкой пробе определяемого элемента (Фиг. 4).
Таким образом, была проверена работоспособность предлагаемого подхода к анализу жидких проб объемом 40 мкл.
Предлагаемые способ и устройство позволяют проводить автоматизируемый анализ жидких микропроб без участия человека. Это исключает влияние субъективного фактора на конечные результаты анализа.
Устройство может быть использовано в полевых условиях, поскольку применение импульсного разряда существенно снижает требование к используемой мощности источника питания для работы прибора.
Изменение геометрии разрядного промежутка в процессе разряда (задание алгоритма изменения разрядного промежутка) позволит существенно влиять на условия (процессы) атомизации и возбуждения анализируемой пробы и тем самым появится возможность оптимального определения элементов в жидкой пробе.