ДИПЕПТИД, СОДЕРЖАЩИЙ НЕПРОТЕИНОГЕННУЮ АМИНОКИСЛОТУ
DIPEPTIDE, CONTAINING NONPROTEINOGENIC AMINO ACID

Область техники
Изобретение относится к дипептиду, содержащему непротеиногенную аминокислоту, способам получения упомянутого дипептида и способам его применения для производства полипептида или белка, включающего одну или более непротеиногенных аминокислот.
Предшествующий уровень техники
Для применения в медицинской практике было одобрено множество полипептидов и белков. Полипептиды и белки могут быть получены при помощи технологии рекомбинантной ДНК в подходящих клетках-хозяевах или синтетическим путем с помощью хорошо налаженной технологии синтеза пептидов. Тем не менее, нативные полипептиды и белки, как правило, демонстрируют высокий уровень клиренса, который неприемлем при многих клинических состояниях, когда требуется высокая концентрация полипептида в плазме крови в течение длительного периода времени.
Природная форма нативных полипептидов и белков может быть изменена с получением их аналогов и производных для того, чтобы изменить или расширить определенные их характеристики. Например, в полипептиды или белки могут быть добавлены или подвергнуты замене непротеиногенные аминокислоты (т.е. аминокислоты, не являющиеся природными); в частности затем, чтобы придать полипептидам или белкам определенную защиту от гидролиза (например, от гидролиза глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1) с помощью дипептидиламинопептидазы-4 (DPP-IV)).
Полипептиды, содержащие одну или более непротеиногенных аминокислот, такие как модифицированные с N-конца аналоги GLP-1, могут быть получены путем введения непротеиногенной аминокислоты (аминокислот) при помощи ступенчатого химического синтеза, при котором стадию конденсации с последующей стадией снятия защиты применяют к каждой аминокислоте, которая добавляется к полипептиду или белку.
Однако, поскольку ступенчатый синтез отнимает много времени и затруднителен, он может привести к образованию многих побочных продуктов и понадобятся промежуточные стадии очистки, что может вызвать высокую степень рацемизации некоторых аминокислотных остатков, таких как остатки гистидина.
В качестве альтернативы остаточный полипептид или белок может быть конденсирован с пептидным фрагментом, включающим непротеиногенную(ые) аминокислоту(ы), причем в методе используют полностью защищенный фрагмент, такой как, например, защищенный фрагмент N-концевой аминогруппы и аминогрупп боковой цепи.
Такой пептидный фрагмент, однако, может быть нерастворим в водных средах, что ограничивает его применение. Кроме того, если во фрагменте присутствуют ортогональные защитные группы, то потребуется несколько шагов снятия защиты; а также, если между стадиями синтеза будут необходимы промежуточные стадии выделения и очистки, то могут возникнуть проблемы с выделением промежуточных продуктов.
WO 2009/083549 относится к способу приготовления аналогов и производных GLP-1, содержащих непротеиногенные аминокислоты. WO 2007/147816 А1 и WO 2010/125079 А2 относятся к синтетической конденсации пептидных фрагментов. Bourgault, S. и соавт. описывают применение стандартного химического синтеза пептидов в PEPTIDES, vol. 29, no. 6(1), June 2008, pages 919-932.
Таким образом, по-прежнему имеется необходимость в пептидном фрагменте для применения в усовершенствованном способе получения полипептидов, содержащих одну или более непротеиногенную аминокислоту.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к дипептидам с химической структурой согласно Формуле 1:
в которой
1
2
R представляет собой атом водорода Н или аминозащитную группу, Rявляется аминозащитной группой; или
1
2
R представляет собой удаляемую алкильную группу, a R представляет собой атом водорода Н или удаляемую алкильную группу; или
1
2
R и R совместно образуют кольцо;
3
R представляет собой атом водорода Н или вторичный аммоний-катион, третичный аммоний-катион или катион металла, образующий соль с карбоксильной группой; и
4
R отсутствует или представляет собой кислую соль.
Также предлагаемый способ представляет собой способ получения дипептида согласно настоящему изобретению.
Кроме того, изобретение описывает способ получения полипептида или белка, содержащего одну или более непротеиногенную аминокислоту, отличающийся тем, что он включает стадию взаимодействия дипептида по настоящему изобретению с полипептидом или белком.
Изобретение также может решить дополнительные проблемы, которые будут очевидны из описания типичных воплощений изобретения.
Подробное описание изобретения
Изобретение относится к дипептиду, содержащему непротеиногенную аминокислоту, причем дипептид предназначен для проведения реакции конденсации с полипептидом или белком.
Один аспект изобретения состоит в том, что дипептид согласно настоящему изобретению, имеет свободную незащищенную имидазольную группу. Один аспект изобретения заключается в том, что дипептид согласно настоящему изобретению находится в виде соли карбоновой кислоты.
В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения, дипептид представляет собой Формулу 1:
в которой
1
2
R представляет собой атом водорода Н или аминозащитную группу, такую как, без ограничений, бутоксикарбонил (Boc), трифенилметил (Trt), 1-метил-1-(4-бифенил)-этоксикарбонил (Врос), 9-флуоренилметоксикарбонил (Fmoc), β-метилсульфонилэтоксикарбонил (Nsc), бензилоксикарбонил (Cbz), аллилоксикарбонил (Alloc), орто-нитробензолсульфонил (oNBS), пара-нитробензолсульфонил (pNBS), динитробензолсульфонил (dNBS), 1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогексилиден)-3-метилбулил (ivDde) или 4-нитрофенилсульфенил (Nps), a R представляет собой аминозащитную группу, такую как, без ограничений, Boc, Trt, Врос, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde или Nps; или
1
2
R представляет собой удаляемую алкильную группу, такую как, без ограничений, бензил или трет-бутил, a R представляет собой атом водорода Н или удаляемую алкильную группу, такую как, без ограничений, бензил или трет-бутил; или
1
2
R и R совместно образуют кольцо, такое как, без ограничений, фталимидное или 1,3,5-диоксазиновое кольцо;
3
R представляет собой атом водорода Н или вторичный аммоний-катион, третичный аммоний-катион или катион металла, такой как катион щелочного или щелочноземельного металла, образующий соль с карбоксильной группой; и
4
R отсутствует или представляет собой кислую соль, такую как, без ограничений, трифторацетат (TFA), гидрохлорид (HCl), гидробромид (HBr) или гидросульфат.
1
2
1
2
1
В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения, R является атомом водорода Н, a R представляет собой аминозащитную группу, такую как, без ограничений, Boc, Trt, Врос, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde или Nps; или R и R вместе образуют кольцо, такое как, без ограничений, фталимидное или 1,3,5-диоксазиновое кольцо; или R представляет собой удаляемую алкильную группу, такую как, без ограничений, бензил или трет-бутил, a R представляет собой атом водорода Н или удаляемую алкильную группу, такую как, без ограничений, бензил или трет-бутил.
1
2
1
2
В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения, R является атомом водорода Н, a R представляет собой защитную группу, чувствительную к основаниям, такую как, без ограничений, Fmoc. В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения R является атомом водорода Н, a R представляет собой Fmoc.
Используемый в настоящем изобретении термин «аминозащитная группа» следует понимать как известную специалисту в области химии пептидов защитную группу, которую вводят в дипептид путем химической модификации (функциональной) аминогруппы, чтобы предотвратить какие-либо взаимодействия с этой аминогруппой в ходе химической реакции.
1
2
Используемый в настоящем изобретении термин «удаляемая алкильная группа» следует понимать как алкильную группу, такую, без ограничений, которая может быть удалена методом каталитического гидрогенолиза. В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения, R представляет собой бензил, a Rявляется атомом водорода Н.
3
3
R может быть атомом водорода, вторичным аммоний-катионом, третичным аммоний-катионом или катионом металла, причем вторичный аммоний-катион, третичный катион аммония или катион металла образует соль с соседней карбоксильной группой. В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, катион металла представляет собой катион щелочного или щелочноземельного металла. Согласно одному аспекту настоящего изобретения, R выбирают из группы, включающей атом водорода Н, катионы лития, натрия, калия, цезия, кальция, магния; катион, являющийся производным вторичного амина, такого как, без ограничений, N,N-дициклогексил аммония, N,N-дитретбутил-катион аммония или катион, являющийся производным третичного амина, такого как, без ограничений, катион триэтиламмония.
3
3
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения R представляет собой атом водорода Н. Согласно одному аспекту настоящего изобретения, Rобразует с соседней карбоксильной группой соли, такие как, без ограничения, соли одновалентного и двухвалентного металла, или соли, образованные из амина.
3
3
Согласно одному аспекту настоящего изобретения, R может быть вторичным аммоний-катионом, третичным аммоний-катионом или катионом металла, таким как катион щелочного ли щелочноземельного металла, образуя соль с соседней карбоксильной группой. Соль между R и карбоксильной группой может, например, быть солью одновалентного металла, такого как, без ограничения, щелочной металл, включая соли лития, натрия, калия или цезия, солью двухвалентного металла, такой как, без ограничений, соли кальция или магния, солью вторичного амина, такого как, без ограничения, N,N-дициклогексиламин или N,N-дитретбутиламин или солью третичного амина, такого как, без ограничений, триэтиламин.
3
4
Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что дипептид по настоящему изобретению, в котором R представляет собой атом водорода Н или вторичный аммоний-катион, третичный аммоний-катион или катион металла, образующий соль с соседней карбоксильной группой, a R отсутствует или представляет собой кислую соль, особенно пригоден, например, для проведения реакции ацилирования в водной среде, в которой дипептид подвергают взаимодействию с пептидом или полипептидом.
4
4
4
4
В соответствии с одним аспектом изобретения, R отсутствует. Согласно одному аспекту настоящего изобретения, R представляет собой кислотный компонент, образующий соль с дипептидом. Один аспект изобретения состоит в том, что R выбрают из группы, включающей: TFA, HCl, HBr и гидросульфат. В соответствии одним аспектом настоящего изобретения, R представляет собой TFA.
В соответствии одним аспектом настоящего изобретения, дипептид согласно настоящему изобретению является энантиомерным или рацемическим дипептидом Fmoc-His-Aib-OH согласно Формуле 2
4
4
в которой знаком * отмечен хиральный центр дипептида, a R отсутствует или является кислотным компонентом, таким как, без ограничения, TFA, HCl, HBr или гидросульфат; упомянутый кислотный компонент образует соль с дипептидом. Согласно одному аспекту изобретения R представляет собой TFA.
В данном описании термин «энантиомерный» для образца соединений, необходимо понимать как избыток в этом образце одной энантиомерной формы, то есть либо L-, либо D-формы. Используемый в настоящем изобретении термин «рацемический» следует понимать как равное количество L- и D-формы в образце соединений. Как неограничивающий пример, остаток гистидина энантиомерного Fmoc-His-Aib-OH в Формуле 2 может быть в форме L- или D-гистидина.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, дипептид Формулы 1 или Формулы 2 активируют известным специалисту в данной области активирующим агентом. Согласно одному аспекту изобретения, дипептид Формулы 1 или Формулы 2 активируют связующим реагентом на основе фосфония. В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения, связующий реагент на основе фосфония выбирают из группы, включающей: бензотриазол-1-ил-окси-трис-(диметиламино)фосфония гексафлюорофосфат (ВОР), (бензотриазол-1-ил-окси)трипирролидинфосфония гексафторфосфат (РуВОР), (7-азабензотриазол-1-ил-окси)трипирролидинфосфония гексафторфосфат (РуАОР), 6-хлор-бензотриазол-1-ил-окси-трис-пирролидинфосфония гексафторфосфат (PyClocK), O-[(1-циано-2-этокси-2-оксоэтилиден)амино]-окситри(пирролидин-1-ил)фосфония гексафлюорофосфат (РуОхР), O-[(1-циано-2-этокси-2-оксоэтилиден)амино]-окситри-(пирролидин-1-ил)фосфония тетрафторборат (РуОхВ). Согласно одному аспекту изобретения связующим реагентом на основе фосфония является бензотриазол-1-илокси)трипирролидинфосфония гексафторфосфатом (РуВОР).
Термин «связующий реагент на основе фосфония» в контексте данного изобретения следует понимать как связующий реагент, содержащий соль фосфония, которая при реакции in situ с карбоновой кислотой образует активированную карбоновую кислоту, способную взаимодействовать с полипептидом или белком.
Дипептид согласно настоящему изобретению удивительно стабилен и имеет длительный срок хранения.
Используемый в данном изобретении термин «стабилизированный» или «стабильный», когда речь идет о дипептиде по настоящему изобретению, относится к дипептиду с повышенной химической стабильностью, повышенной физической стабильностью, или одновременно повышенной физической и химической стабильностью.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, дипептид по данному изобретению является стабильным в течение более 6 недель использования и в течение более чем 2 лет хранения. Согласно другому аспекту настоящего изобретения дипептид по данному изобретению является стабильным в течение более 4 недель использования и в течение более чем двух лет хранения. Согласно еще одному аспекту изобретения дипептид по настоящему изобретению является стабильным в течение более 4 недель использования и в течение более чем 3 лет хранения. В соответствии с еще одним, отличным от прочих, аспектом изобретения дипептид по данному изобретению является стабильным в течение более 2 недель использования и в течение более 1 года хранения.
Используемый в данном изобретении термин «температура окружающей среды» означает температуру окружающего пространства. В условиях помещения, температура окружающей среды является такой же, как комнатная температура и может, например, составлять 25°С.
Дипептид согласно изобретению прост в обращении и его использование в химии пептидов легче по сравнению с обычным ступенчатым пептидным синтезом в твердой фазе за счет уменьшенного количества стадий химической модификации, таких как стадии снятия защиты и активации.
Согласно одному аспекту изобретения, дипептид по настоящему изобретению может быть использован в способе получения полипептида или белка, содержащего одну или более непротеиногенных аминокислот.
В соответствии с одним аспектом изобретения, дипептид по настоящему изобретению используется в процессе ковалентной конденсации дипептида с полипептидом или белком. Согласно одному аспекту изобретения, дипептид используется в процессе конденсации дипептида с N-концевым амином полипептида или белка. В соответствии с одним аспектом изобретения, дипептид используется в процессе конденсации дипептида с нуклеофилами других молекул, не принадлежащих к химической группе полипептидов и/или белков.
Согласно одному аспекту изобретения, полипептид или белок, к которому присоединяется дипептид, состоит из протеиногенных аминокислот, то есть полипептид или белок, к которому присоединяется дипептид, не содержит никаких непротеиногенных аминокислот.
3
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, дипептид по Формуле 1 или по Формуле 2 используется для упомянутой реакции конденсации дипептида с полипептидом или белком с образованием амидной связи между карбоксильной группой дипептида из Формулы 1, т.е. функциональной группы, содержащей R, или карбоновой кислоты Формулы 2 и свободного амина полипептида или белка. Согласно одному аспекту изобретения, дипептид по Формуле 1 или Формуле 2 подвергают взаимодействию с полипептидом или белком в водной среде с образованием амидной связи между карбоновой кислотой дипептида из Формулы 1 или Формулы 2 и N-концевым амином полипептида или белка.
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, R и/или Rудаляют после завершения реакции с полипептидом или белком. Согласно одному аспекту данного изобретения, R и/или R удаляют в одну химическую стадию. В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, R и/или R удаляют на стадии снятия защитных групп в основных условиях. По одному аспекту данного изобретения, R и/или R удаляют на стадии снятия защитных групп, включающей добавление основания в реакционную среду. Согласно одному аспекту настоящего изобретения, R и/или R удаляют на стадии снятия защитных групп, включающей добавление амина в реакционную среду. В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, R и/или R удаляют на стадии снятия защиты, включающей добавление пиперидина к реакционной среде.
1
2
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, R и/или Rудаляют in situ в одну химическую стадию после завершения реакции ацилирования с полипептидом или белком.
Согласно одному аспекту изобретения, дипептид по изобретению может быть использован в способе получения полипептида или белка, содержащего одну или более непротеиногенных аминокислот. В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, реакцию проводят в растворе. По одному аспекту изобретения, активированный дипептид согласно данному изобретению, подвергают взаимодействию с полипептидом или белком, растворенным в водной среде. Согласно одному аспекту настоящего изобретения, реакцию конденсации проводят путем твердофазного пептидного синтеза, известного специалистам в данной области. Изобретатели установили, что при использовании указанного способа для получения полипептида или белка, содержащего одну или более непротеиногенную аминокислоту и присоединенный к ней N-терминально гистидин, образуется полипептид или белок, в котором остаток гистидина не рацемизируется или незначительно рацемизируется.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, способ получения полипептида или белка, содержащего одну или более непротеиногенную аминокислоту, включает следующие шаги:
1. активация дипептида связующим реагентом на основе фосфония,
2. взаимодействие активированного дипептида с полипептидом или белком,
3. удаление защитной группы (групп) in situ в результате чего получают целевой полипептид или белок.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, способ получения полипептида или белка, содержащего одну или более непротеиногенную аминокислоту, включает следующие стадии:
1. активация дипептида Формулы 1 или Формулы 2 связующим реагентом на основе фосфония,
2. взаимодействие активированного дипептида с полипептидом или белком,
3. удаление защитной группы (групп) in situ в результате чего получают целевой полипептид или белок.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, активированный дипептид подвергают взаимодействию с полипептидом или белком в водной среде. Используемый в изобретении термин «водная среда» или «водные среды» включает любую водосодержащую среду, например воду, физиологический раствор, раствор сахара, трансфузионный раствор, буфер и любые другие легкодоступные водосодержащие среды. Кроме того, водные среды могут содержать один или более растворимый в воде органический растворитель, такой как, без ограничений, диметилформамид (DMF), N-метил-2-пирролидон (NMP), диметилацетамид (DMAC), диметилсульфоксид (DMSO), ацетонитрил, диоксан, водорастворимый ацеталь, такой как, например, диметилацеталь, диэтилацеталь или 1,3-диоксалан и водорастворимый спирт, такой как, например, метанол, этанол, пропанол, 2-пропанол и бутокси-2-этанол.
Согласно одному аспекту изобретения, водная среда, в которой активированный дипептид подвергают взаимодействию с полипептидом или белком, содержит 100-10% воды и, следовательно, 0-90%, дополнительного растворителя(ей), причем неограничивающие примеры дополнительных растворителей могут быть выбраны, например, из группы, включающей DMF, NMP, DMAC, DMSO, ацетонитрил, диоксан, водорастворимый ацеталь, такой как, например, диметилацеталь, диэтилацеталь или 1,3-диоксалан и водорастворимый спирт, такой как, например, метанол, этанол, пропанол, 2-пропанол и бутокси-2-этанол. В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, водная среда содержит 80-20% воды, например 60-30% воды. Согласно одному аспекту настоящего изобретения, водная среда содержит 50-30% воды. В соответствии с одним аспектом изобретения, водная среда содержит около 50% воды. По одному аспекту данного изобретения водная среда содержит около 40% воды. Согласно одному аспекту настоящего изобретения, водная среда содержит около 30% воды.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, дипептид растворяют в апротонном органическом растворителе или смеси таких растворителей, например, без ограничений, DMF, NMP, DMAC, DMSO, ацетонитрил и диоксан, причем перед тем, как этот пептид будет добавлен к водной среде, в которой он взаимодействует с пептидом или полипептидом.
Используемый в данном изобретении термин «апротонный» применяется для растворителей, таких как, например, ацетон или дихлорметан, которые, как правило, имеют большие дипольные моменты, то есть в них существует разделение частичных положительных и отрицательных зарядов в пределах одной и той же молекуле и сольватация положительно заряженных частиц за счет отрицательных зарядов диполей. Примеры апротонных растворителей включают, без ограничений, дихлорметан (DCM), тетрагидрофуран (THF), этилацетат, ацетон, DMF, NMP, DMAC, DMSO, ацетонитрил, диоксан и пропиленкарбонат.
Согласно одному аспекту настоящего изобретения, активированный дипептид подвергают взаимодействию с полипептидом или белком на твердой фазе с использованием процедуры, известной специалистам в области химии пептидов, как, например, описано в ISBN 0-7167-7009-1 "Synthetic Peptides", ed. Gregory A. Grant.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, связующим реагентом на основе фосфония является РуВОР. Согласно одному аспекту изобретения, защитной группой является Fmoc. По одному аспекту изобретения целевой полипептид или белок получают в растворе.
Согласно одному аспекту настоящего изобретения, защитную группу удаляют в основных условиях. В соответствии с одним аспектом изобретения, защитную группу удаляют при рН, равным, по крайней мере, 7. По одному из аспектов изобретения защитную группу удаляют с помощью пиперидина, 1,8-диазобицикло-ундец-7-ена (ДБУ) или трет-бутиламина.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, рН водной реакционной смеси на стадии ацилирования доводят до уровня между рН7 и рН14. Согласно одному аспекту настоящего изобретения, рН реакционной среды находится в диапазоне между рН8 и рН13. В соответствии с другим аспектом изобретения, уровень рН находится между рН8 и рН12. Согласно другому аспекту изобретения, уровень рН находится в диапазоне между рН8 и рН10. В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, уровень рН находится между рН8,3 и рН9,7.
Термин «реакционная смесь» в контексте настоящего изобретения следует понимать как смесь растворителей и реагентов, используемых при взаимодействии дипептида по настоящему изобретению с полипептидом или белком. Реакционная смесь может быть водной, то есть в этой реакционной смеси присутствует вода.
Уровень рН реакционной смеси можно регулировать с помощью средств, известных специалисту в данной области техники. Например, можно применить тест на простой рН индикаторной бумаге (рН индикаторные полоски), либо для измерения рН может быть использован рН-метр, а для того, чтобы довести рН до нужного уровня, кислота или основание могут быть добавлены вручную; либо может быть использован рН-метр с механизмом обратной связи, с помощью которого можно управлять рН раствора.
Кислоты, пригодные для регулирования рН, включают, без ограничения: хлористоводородную кислоту, серную кислоту, гидросульфат, фосфорную, лимонную и уксусную кислоты.
Основания, пригодные для регулирования рН, включают, без ограничения: третичные амины, такие как, без ограничения, триэтиламин или диизопропилэтиламин, N-метилморфолин, гидроксиды щелочных металлов, такие как, без ограничения, гидроксиды лития, натрия, калия, цезия или карбонаты щелочных металлов, такие как, без ограничения, карбонаты калия, натрия, лития, калия, гидрокарбонат натрия или гидрокарбонат лития.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, реакционная смесь содержит буфер. Согласно одному аспекту изобретения, буфер выбирают из группы, включающей: фосфатный буфер, натрий-карбонатный буфер, буфер бицин N,N-бис(2-гидроксиэтил)глицина, буфер 3-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил]пропансульфоновой кислоты (HEPPS), буфер 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES), буфер 3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты (MOPS) и триэтиламиновый буфер (TEA). Согласно одному аспекту настоящего изобретения, реакционная смесь содержит триэтиламиновый буфер (TEA).
Перед добавлением к реакционной смеси дипептид может быть активирован, то есть функциональная группа карбоновой кислоты дипептида может быть превращена в активированный сложный эфир этой карбоновой кислоты. При активации дипептида согласно настоящему изобретению, температура реакционной смеси во время стадии активации может быть в пределах между -5°С и 50°С, например, в диапазоне между 0°С и 50°С. Согласно одному аспекту настоящего изобретения, температура находится в диапазоне между 5°С и 40°С. Согласно другому аспекту настоящего изобретения, температура находится в диапазоне между 10°С и 35°С. В соответствии с еще одним аспектом изобретения, температура находится в диапазоне между 15°С до 25°С. И в соответствии со следующим аспектом настоящего изобретения, температура в течение стадии активации составляет около 20°С.
Температура реакционной смеси в ходе стадии ацилирования, где активированный дипептид по настоящему изобретению реагирует с полипептидом или белком, может быть в пределах от -5°С и 50°С, например в диапазоне между 0°С и 50°С. Согласно одному аспекту настоящего изобретения, температура находится в диапазоне между 5°С и 40°С. Согласно другому аспекту настоящего изобретения, температура находится в диапазоне между 10°С и 35°С. В соответствии с еще одним аспектом изобретения, температура находится в диапазоне между 15°С до 25°С. И в соответствии со следующим аспектом настоящего изобретения, температура в течение стадии активации составляет около 20°С.
Термин «полипептид или белок», используемый в настоящем изобретении, означает соединение, состоящее, по крайней мере, из двух аминокислот-компонентов, соединенных полипептидными связями. Аминокислоты-компоненты могут быть выбраны из группы аминокислот, кодируемых генетическим кодом (протеиногенные аминокислоты), кроме того, они могут быть природными аминокислотами, которые не кодируются генетическим кодом, а также синтетическими аминокислотами (непротеиногенные аминокислоты). Протеиногенными аминокислотами являются 22 аминокислоты: аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновая кислота, цистеин, цистин, глутамин, глутаминовая кислота, глицин, гистидин, гидроксипролин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серии, треонин, триптофан, тирозин и валин.
Таким образом, непротеиногенная аминокислота представляет собой фрагмент, который может быть включен в полипептид или белок с помощью полипептидных связей, но при этом не является протеиногенной аминокислотой. Примерами являются γ-карбоксиглутамат, орнитин, фосфосерин, D-аминокислоты, такие как D-аланин и D-глутамин. Синтетические непротеиногенные аминокислоты включают аминокислоты, изготовленные путем химического синтеза, т.е. D-изомеры аминокислот, кодируемых генетическим кодом, например D-аланин и D-лейцин, Aib (α-аминоизомасляная кислота), Abu (α-аминомасляная кислота), орнитин, Dap (2,3-диаминопропионовая кислота), Dab (2,4-диаминобутановая кислота), Tle (трет-бутилглицин), 3-аминометилбензойную кислоту, антраниловую кислоту, дезаминогистидин, бета-аналоги аминокислот, такие как β-аланин и т.д., D-гистидин, дезаминогистидин, 2-амино-гистидин, β-гидроксигистидин, гомогистидин, N-ацетилгистидин, α-фторметилгистидин, α-метилгистидин, 3-пиридилаланин, 2-пиридилаланин или 4-пиридилаланин, 1-аминоциклопропилкарбоновую кислоту, 1-аминоциклобутилкарбоновую кислоту, 1-аминоциклопентилкарбоновую кислоту, 1-аминоциклогексилкарбоновую кислоту, 1-аминоциклогептилкарбоновую кислоту или 1-аминоциклооктилкарбоновую кислоту.
8
34
Термин "аналог", используемый в настоящем изобретении в применении к полипептиду или белку, означает модифицированный полипептид или белок, в котором один или более аминокислотных остатков полипептида или белка были замещены другими аминокислотными остатками, и/или в которых один или несколько аминокислотных остатков были удалены из полипептида или белка, и/или в котором один или несколько аминокислотных остатков были добавлены в данный полипептид или белок. Такое добавление или удаление аминокислотных остатков может иметь место на N-конце полипептида или белка и/или на С-конце полипептида или белка. Для описания аналогов часто используется простая система: например [Aib,Arg]GLP-1(7-37) обозначает аналог GLP-1(7-37) аминокислоты GLP-1 (гюкагоноподобный пептид), в котором находящийся обычно в положении 8 аланин замещен на альфа-аминоизомасляную кислоту, а лизин в положении 34 замещен на аргинин. Под всеми аминокислотами, для которых оптический изомер не указан, следует понимать их L-изомеры. В соответствии со всеми аспектами настоящего изобретения, модификации подверглись максимум 17 аминокислот. В соответствии со всеми аспектами настоящего изобретения, модификации подверглись максимум 15 аминокислот. В соответствии со всеми аспектами настоящего изобретения, модификации подверглись максимум 10 аминокислот. В соответствии со всеми аспектами настоящего изобретения, модификации подверглись максимум 8 аминокислот. В соответствии со всеми аспектами настоящего изобретения, модификации подверглись максимум 7 аминокислот. В соответствии со всеми аспектами настоящего изобретения, модификации подверглись максимум 6 аминокислот. В соответствии со всеми аспектами настоящего изобретения, модификации подверглись максимум 5 аминокислот. В соответствии со всеми аспектами настоящего изобретения, модификации подверглись максимум 4 аминокислоты. В соответствии со всеми аспектами настоящего изобретения, модификации подверглись максимум 3 аминокислоты. В соответствии со всеми аспектами настоящего изобретения, модификации подверглись максимум 2 аминокислоты. В соответствии со всеми аспектами настоящего изобретения, модификации подверглась 1 аминокислота.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, С-конец производного соединения по настоящему изобретению может представлять собой или кислоту, или амид. Согласно одному аспекту изобретения, С-конец производного соединения по настоящему изобретению представляет собой амид. Согласно другому аспекту изобретения, С-конец производного соединения согласно настоящему изобретению является кислотой.
Настоящее изобретение особенно пригодно для получения полипептидов или белков, содержащих одну или более непротеиногенную аминокислоту, пригодных для лечения, например, диабета, таких как глюкагоноподобные пептиды и инсулины.
Согласно одному аспекту изобретения, полипептид или белок, который должен реагировать с дипептидом, является глюкагоноподобным пептидом.
Термин «глюкагоноподобный пептид», используемый в настоящем изобретении, означает полипептиды из семейства глюкагонов, эксендинов и их аналоги. Полипептиды семейства глюкагонов, кодируются геном препроглюкагона и включают в себя три небольших полипептида с высокой степенью гомологии, а именно глюкагон (1-29), GLP-1 (1-37) и GLP-2 (1-33). Эксендины представляют собой полипептиды, экспрессируемые в организме ящериц и являющиеся подобно GLP-1 инсулинотропными. Примерами эксендинов являются эксендин-3 и эксендин-4.
34
8
34
8
8
8
22
7
26
34
ε
α
7
26
34
ε
26,34
38
ε
26,34
36
ε
34
26
ε
Термины GLP-1, GLP-2, эксендин-3 и эксендин-4 известны специалистам в данной области. Например, термины «GLP-1 соединение» или «GLP-1 полипептид», используемые в контексте настоящего изобретения, означают человеческий GLP-1 (7-37), его инсулинотропный аналог и его инсулинотропные производные. Неограничивающими примерами аналогов GLP-1 являются амид GLP-1(7-36), Arg-GLP-1(7-37), Aib,Arg-GLP-1(7-37), Gly-GLP-1(7-37), амид Val-GLP-1(7-36) и ValAsp-GLP-1(7-37). Неограничивающими примерами производных GLP-1 являются дезамино-His, Arg, Lys(N-(γ-Glu(N-гексадеканоил)))GLP-1(7-37), дезамино-His, Arg, Lys(N-октаноил)-GLP-1(7-37), Arg, Lys(N-(ω-карбоксипентадеканоил))-GLP-1(7-38), Arg, Lys(N-(γ-Glu (αN-гексадеканоил)))-GLP-1(7-36) и Arg, Lys(N-(γ-Glu(αN-гексадеканоил)))-GLP-1(7-37). По сложившейся практике в данной области номенклатура GLP-1 начинается с гистидин остатка, которому присваивается номер 7, а последующие аминокислотные остатки нумеруются соответственно, заканчиваясь глицином под номером 37. Таким образом, в данном изобретении, как правило, любое упоминание номера аминокислотного остатка или номер позиции в последовательности GLP-1(7-37) относится к этой последовательности начиная с His в положении 7 и заканчивая Gly в положении 37. Аналоги GLP-1 производных, согласно настоящему изобретению, могут быть описаны путем ссылки на
I) номер аминокислотного остатка в нативной последовательности GLP-1(7-37), который соответствует измененному аминокислотному остатку (то есть, на соответствующую позицию в нативном GLP-1), и
II) фактическое изменение.
В соответствии с одним аспектом изобретения, глюкагоноподобный пептид по настоящему изобретению является дипептидиламинопептидаза IV защищенным. В соответствии с другим аспектом изобретения, глюкагоноподобный пептид согласно изобретению является дипептидиламинопептидаза IV защищенным.
Термин «дипептидиламинопептидаза IV защищенный», используемый в настоящем изобретении, означает глюкагоноподобный пептид, например аналог GLP-1, который более устойчив к дипептидиламинопептидазе IV (DPP-IV), чем нативное соединение, например GLP-1(7-37). Такая защита может быть достигнута, например, путем мутации и/или получением производных нативного соединения. Устойчивость GLP-1 соединения по отношению к деградации дипептидиламинопептидазой IV определяется в ходе следующего анализа деградации:
Аликвоты GLP-1 соединения (5 нмоль) инкубируют при 37°С с 1 мкл очищенной дипептидиламинопептидазы IV, соответствующей ферментативной активности 5 мЕд в течение 10-180 минут в 100 мкл 0,1М триэтиламин-HCl буфера, рН 7,4. Ферментативные реакции останавливают добавлением 5 мкл 10% трифторуксусной кислоты, а продукты разложения полипептида разделяют и количественно определяют с помощью ВЭЖХ-анализа. Один метод проведения этого анализа: смеси наносят на 250×4,6 мм колонку Vydac С18 widepore (30 нм поры, 5 мкм частицы) и элюируют при скорости потока 1 мл/мин с линейным и ступенчатым градиентами ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте (0% ацетонитрила в течение 3 мин, 0-24% ацетонитрила в течение 17 мин, 24-48% ацетонитрила в течение 1 мин) в соответствии с Siegel et al., Regul. Pept. 1999;79: 93-102 and Mentlein et al. Eur. J. Biochem. 1993;214: 829-35. Полипептиды и продукты их распада можно мониторировать по их поглощению при 220 нм (пептидные связи) или 280 нм (ароматические аминокислоты) и количественно определять путем интегрирования площадей их пиков относительно стандартных пиков. Скорость гидролиза GLP-1 соединения под действием дипептидиламинопептидазы IV оценивают по времени инкубации, за которое остается менее чем 10% гидролизованного GLP-1 соединения.
50
50
Термин «инсулинотропный», используемый в настоящем изобретении по отношению к глюкагоноподобному пептиду, означает способность стимулировать секрецию инсулина в ответ на повышенный уровень глюкозы в плазме. Инсулинотропные глюкагоноподобные пептиды являются агонистами рецептора GLP-1. Инсулинотропные свойства соединения могут быть определены путем in vitro или in vivo анализов, известных в данной области. Следующий ниже анализ in vitro может быть использован, чтобы определить инсулинотропную природу соединения, такого как глюкагоноподобный пептид. Предпочтительно, если инсулинотропные соединения проявляют значение ЭК в приведенном ниже анализе пробы менее 5 нМ, более предпочтительно значение ЭК в пробе менее 500 пМ.
Клетки почек детеныша хомячка (ВНК), экспрессирующие клонированный человеческий GLP-1 рецептор (ВНК 467-12А) выращивают в DMEM среде с добавлением 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мкл/мл стрептомицина, 10% фетальной телячьей сыворотки и 1 мг/мл генетицина G-418 (Life Technologies). Цитоплазматические мембраны получают путем гомогенизации в буфере (10 мМ Трис-HCl, 30 мМ NaCl и 1 мМ дитиотреитола, рН 7,4, содержащем, кроме того, 5 мг/мл лейпептина (Sigma), 5 мг/л пепстатина (Sigma), 100 мг/л бацитрацина (Sigma) и 16 мг/л апротинина (Calbiochem-Novabiochem, La Jolla, СА)). Гомогенат центрифугируют поверх слоя 41% масс/об. сахарозы. Белый слой между двумя слоями разбавляют в буфере и центрифугируют. Плазменные мембраны хранят при -80°С до использования.
Функциональный анализ рецептора осуществляется путем измерения цАМФ в ответ на его стимуляцию инсулинотропным полипептидом или инсулинотропным соединением. Инкубацию проводят в титровальных 96-луночных микропланшетах в общем объеме 140 мл и со следующими конечными концентрациями: 50 мМ Трис-HCl, 1 мМ EGTA, 1,5 мМ MgSO4, 1,7 мМ АТФ, 20 мМ ГТФ, 2 мМ 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX), 0,01% масс/об. Tween-20, рН 7,4. Соединения растворяют и разбавляют в буфере. Для каждого эксперимента используют свежеприготовленный ГТФ: по 2,5 мкг мембран добавляют в каждую лунку и смесь инкубируют в течение 90 мин при комнатной температуре в темноте при встряхивании. Реакцию останавливают добавлением 25 мл 0,5М HCl. Образующийся цАМФ измеряют с помощью сцинтилляционного проксимального анализа (RPA 542, Amersham, UK).
50
Строят кривую доза-ответ для соединения и рассчитывают величину ЭК, используя программное обеспечение GraphPad Prism.
Термин «пролекарство инсулинотропного соединения», используемый в настоящем изобретении, означает химически модифицированное соединение, которое после введения пациенту преобразуется в инсулинотропного соединение. Такие пролекарства обычно представляют собой расширенные версии аминокислотных препаратов или эфиры инсулинотропного соединения.
2
3
Термин «соединение эксендина-4», используемый в настоящем изобретении, определяется как инсулинотропный фрагмент эксендина-4(1-39), его инсулинотропные аналоги и его инсулинотропные производные. Инсулинотропные фрагменты эксендина-4 представляют собой инсулинотропные полипептиды, для которых полная последовательность может быть найдена в последовательности эксендина-4, и где, по крайней мере, одна концевая аминокислота была удалена. Примерами инсулинотропных фрагментов экзендина-4(1-39) являются эксендин-4(1-38) и экзендина-4(1-31). Инсулинотропные свойства соединения могут быть определены анализами in vivo или in vitro, хорошо известными в данной области техники. Например, соединение можно ввести в организм животного и контролировать концентрацию инсулина в течение долгого времени. Инсулинотропные аналоги эксендина-4 (1-39) представляют собой соответствующие молекулы, в которых один или более остатков аминокислот был заменен на другие аминокислотные остатки, и/или из которых один или несколько аминокислотных остатков были удалены и/или из которых один или несколько аминокислотных остатков были добавлены, при условии, что указанный аналог либо является инсулинотропным соединением или пролекарством инсулинотропного соединения. Примером инсулинотропного аналога эксендина-4(1-39) является SerAsp-эксендин-4(1-39), где аминокислотные остатки в положении 2 и 3 были заменены на серии и аспарагиновую кислоту, соответственно (именно этот аналог также известен в данной области как эксендин-3). Инсулинотропными производными эксендина-4 (1-39) и его аналогами являются те соединения, которые специалист в данной области техники считает производными этих полипептидов, т.е. имеющими, по крайней мере, один заместитель, который отсутствует в молекуле исходного полипептида при условии, что указанное производное либо является инсулинотропным соединением или пролекарством инсулинотропного соединения. Примерами заместителей являются амиды, углеводы, алкильные группы, сложные эфиры и липофильные заместители. Примером инсулинотропного производного эксендина-4(1-39) и его аналога является Tyr31-эксендина-4(1-31) амид.
Термин «стабильное соединение эксендина-4», используемый в настоящем изобретении, означает химически модифицированный эксендин-4(1-39), то есть его аналог или производное, которое проявляет в плазме в условиях in vivo период полураспада, по крайней мере, 10 часов в организме человека при определении с помощью общепринятых способов.
Термин «дипептидиламинопептидаза IV защищенное соединение эксендина-4», используемый в настоящем изобретении, означает соединение эксендина-4, которое более устойчиво к плазменной дипептидиламинопептидазе IV (DPP-IV), чем эксендин-4, что определяют с помощью анализа, описанного выше при определении дипептидиламинопептидаза IV защищенного GLP-1 соединения.
Аналоги GLP-1 могут быть такими, в которых Lys, встречающийся обычно в положении 34 в GLP-1(7-37), замещен на Arg.
Кроме того, изобретение охватывает производные предшественников или промежуточные соединения инсулинотропных полипептидов.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, глюкагоноподобный пептид является инсулинотропным. В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения, инсулинотропный глюкагоноподобный пептид выбирают из группы, включающей GLP-1, GLP-2, эксендин-4, эксендин-3 и их аналоги и производных.
Конформационная стабильность лекарственных средств на основе белков важна для поддержания их биологической активности и для минимизации необратимой утраты ими структуры за счет денатурации и фибриллообразования. Крупные инсулинотропные полипептиды и белки особенно подвержены конформационным изменениям из-за сложных паттернов их рефолдинга. Кроме того, инсулинотропные полипептиды с установленной способностью к фибриллообразованию, такие как GLP-1, особенно чувствительны к дестабилизации третичной структуры (то есть к образованию расплавленного глобулярного состояния).
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, аминокислоты-компоненты глюкагоноподобного пептида по данному изобретению, могут быть выбраны из группы аминокислот, кодируемых генетическим кодом, и они могут быть природными аминокислотами, которые не кодируются генетическим кодом, а также синтетическими аминокислотами. Природными аминокислотами, которые не кодируются генетическим кодом, являются, например, гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, орнитин, фосфосерин, D-аланин и D-глутамин. Синтетические аминокислоты содержат аминокислоты, произведенные путем химического синтеза, т.е. D-изомеры аминокислот, кодируемых генетическим кодом, такие как D-аланин и D-лейцин, Aib (α-аминоизомасляная кислота), Abu (α-аминомасляная кислота), Tle (трет-бутилглицин), β-аланин, 3-аминометилбензойная кислота, антраниловая кислота.
34
22
34
34
37
22,27,30,35
34
37
В соответствии с одним аспектом изобретения, глюкагоноподобный пептид, реагирующий с дипептидом по настоящему изобретению, представляет собой GLP-1 полипептид. Согласно еще одному аспекту изобретения GLP-1, полипептид представляет собой GLP-1 пептид, имеющий боковую цепь, как указано в патентах WO 2006/005667, WO 2005/027978, WO 2011/080103 или WO 2006/097537. В соответствии с одним аспектом изобретения, GLP-1 полипептид представляет собой полипептиды GLP-1(9-37); Arg-GLP-1(9-37); Aib, Arg-GLP-1(9-37); Arg, Pro-GLP-1(9-37) или Aib, Arg, Pro-GLP-1(9-37) амид, имеющие боковую цепь, упомянутую в патентах WO 2006/005667, WO 2005/027978, WO 2011/080103 или WO 2006/097537. Согласно одному аспекту настоящего изобретения, GLP-1 полипептид представляет собой GLP-1 пептид, упомянутый в патенте WO 2011/080103 со страницы 84, строка 24 до страницы 95, строка 2, или аналог GLP-1, упомянутый в патенте WO 2006/097537 со страницы 19, строка 25 до страницы 22, строка 4.
В соответствии с другим аспектом изобретения, глюкагоноподобный пептид, реагирующий с дипептидом согласно изобретению, представляет собой GLP-1 полипептид, который выбирают из группы, включающей:
34
Arg-GLP-1(9-37);
22
34
Aib,Arg-GLP-1(9-37);
34
37
Arg,Pro-GLP-1(9-37);
22,27,30,35
34
37
Aid, Arg, Pro-GLP-1(9-37) амид;
ε26
ε37
34
37
N-[2-(2-{2-[10-(4-карбофенокси)деканоиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-(2-{2-[10-(4-карбофенокси)деканоиламино]этокси}этокси)ацетил]-[Arg,Lys]GLP-1(9-37)-пептид;
ε26
ε37
34
37
N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбофенокси)деканоиламино]-бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбофенокси)деканоиламино]-бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}-[Arg,Lys]GLP-1(9-37)-пептид;
ε26
ε37
34
37
N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил]-[Arg,Lys]GLP-1 (9-37)-пептида амид;
ε26
ε37
34
37
N/-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(11-карбоксиундеканоиламино)-бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(11-карбоксиундеканоиламино)-бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил]-[Arg,Lys]GLP-1(9-37)-пептида амид;
ε26
ε37
34
37
N-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)-бутириламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)-бутириламино]этокси}этокси)ацетил]-[Arg,Lys]GLP-1(9-37)-пептида амид;
ε26
34
N-(17-карбоксигептадеканоил)-[Arg]GLP-1-(9-37)-пептид;
ε26
34
N-(19-кабоксинонадеканоил)-[Arg]GLP-1-(9-37)-пептид;
ε26
34
N-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-4(S)-карбоксибутириламино]этокси)этокси]ацетиламино)этокси]этокси)ацетил]-[Arg]GLP-1-(9-37)пептид; и
ε26
N-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(21-карбоксиунэйкозаноиламино)-4(S)-карбоксибутириламино]этокси)этокси]ацетиламино)этокси]этокси)ацетил]-[Arg34]GLP-1-(9-37)пептид.
В соответствии с еще одним аспектом изобретения, глюкагоноподобный пептид, реагирующий с дипептидом согласно изобретению, представляет собой GLP-1 полипептид, который выбирают из группы, включающей:
34
Arg-GLP-1(9-37);
22
34
Aib,Arg-GLP-1(9-37);
34
37
Arg,Pro-GLP-1(9-37); и
22,27,30,35
34
37
Aib,Arg,Pro-GLP-1(9-37)амид.
В соответствии с еще одним аспектом изобретения, глюкагоноподобный пептид, реагирующий с дипептидом согласно изобретению, представляет собой GLP-1 полипептид, который выбирают из группы, включающей:
ε26
ε37
34
N-[2-(2-{2-[10-(4-карбофенокси)деканоиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-(2-{2-[10-(4-карбофенокси)деканоиламино]этокси}этокси)ацетил]-[Arg,Lys37]CLP-1(9-37)-пептид;
ε26
ε37
34
37
N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбофенокси)деканоиламино]бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбофенокси) деканоиламино] бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино} этокси) этокси] ацетил}-[Arg,Lys]GLP-1(9-37)-пептид;
ε26
ε37
34
37
N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил]-[Arg,Lys]GLP-1(9-37)-пептида амид;
ε26
ε37
34
37
N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(11-карбоксиундеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(11-карбоксиундеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил]-[Arg,Lys]GLP-1(9-37)-пептида амид; и
ε26
ε37
34
37
N-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)-бутириламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)-бутириламино]этокси}этокси)ацетил]-[Arg,Lys]GLP-1(9-37)-пептида амид.
В соответствии с еще одним аспектом изобретения, глюкагоноподобный пептид, реагирующий с дипептидом согласно изобретению, представляет собой GLP-1 полипептид, который выбирают из группы, включающей:
ε26
34
N-(17-карбоксигептадеканоил)-[Arg]CLP-1-(9-37)-пептид;
ε26
34
N-(19-кабоксинонадеканоил)-[Arg]GLP-1-(9-37)-пептид;
ε26
34
N-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-4(S)-карбоксибутириламино]этокси)этокси]ацетиламино)этокси]этокси)ацетил]-[Arg]GLP-1-(9-37)пептид; и
ε26
34
N-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(21-карбоксиунэйкозаноиламино)-4(S)-карбоксибутириламино]этокси)этокси]ацетиламино)этокси]этокси)ацетил]-[Arg]CLP-1-(9-37)пептид.
8
34
8,22
34
8
34
37
8,22,27,30,35
34
37
В соответствии с одним аспектом изобретения, глюкагоноподобный пептид, содержащий одну или более непротеиногенную аминокислоту, получают способом согласно настоящему изобретению. В соответствии с другим аспектом изобретения, глюкагоноподобный пептид, содержащий одну или более непротеиногенную аминокислоту и полученный способом согласно настоящему изобретению, представляет собой GLP-1 пептид, содержащий одну или более непротеиногенную аминокислоту. В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения GLP-1 пептид, содержащий одну или более непротеиногенную аминокислоту, представляет собой GLP-1 пептид, содержащий одну или более непротеиногенную аминокислоту и имеющий боковую цепь, указанную в патентах WO 2006/005667, WO 2005/027978, WO 2011/080103 или WO 2006/097537. В соответствии с одним аспектом изобретения, GLP-1 пептид, содержащий одну или более непротеиногенную аминокислоту, представляет собой Aib, Arg-GLP-1(7-37); Aib, Arg-GLP-1(7-37); Aib, Arg, Pro-GLP-1(7-37) или Aib, Arg,Pro-GLP-1(7-37) амид, имеющие боковую цепь, упомянутую в патентах WO 2006/005667, WO 2005/027978, WO 2011/080103 или WO 2006/097537 В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, GLP-1, пептид, содержащий одну или более непротеиногенную аминокислоту, представляет собой GLP-1, пептид, упомянутый в патентах WO 2011/080103 в разделе со страницы 84, строка 24 до страницы 95, строка 2, или аналог GLP-1, который упоминается в патенте WO 2006/097537 в разделе со страницы 19, строка 25 до страницы 22, строка 4.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, GLP-1 пептид, содержащий одну или более непротеиногенную аминокислоту, выбирают из группы, включающей:
8
34
Aib,Arg-GLP-1(7-37);
8,22
34
Aib,Arg-GLP-1(7-37);
34
Arg-GLP-1(7-37);
8
34
37
Aib,Arg,Pro-GLP-1(7-37);
8,22,27,30,35
34
37
Aib,Arg,Pro-GLP-1(7-37)амид;
ε26
ε37
8
34
37
N-[2-(2-{2-[10-(4-карбофенокси)деканоиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-(2-{2-[10-(4-карбофенокси)деканоиламино]этокси}этокси)ацетил]-[Aib,Arg,Lys]CLP-1(7-37)-пептид;
ε26
ε37
8
34
37
N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбофенокси)деканоиламино]-бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбофенокси)деканоиламино]-бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}-[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид;
ε26
ε37
8
34
37
N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутириламино] этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-{2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил]-[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептида амид;
ε26
ε37
8
34
37
N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(11-карбоксиундеканоиламино)-бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(11-карбоксиундеканоиламино)-бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил]-[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептида амид;
ε26
ε37
8
34
37
N-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)-бутириламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)-бутириламино]этокси}этокси)ацетил]-[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептида амид;
ε26
8
34
N-(17-карбоксигептадеканоил)-[AlbArg]CLP-1-(7-37)-пептид;
ε26
8
34
N-(19-кабоксинонадеканоил)-[Aib,Arg]GLP-1-(7-37)-пептид;
ε26
8
34
N-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-4(S)-карбоксибутириламино]этокси)этокси]ацетиламино)этокси]этокси)ацетил]-[Aib,Arg]GLP-1-(7-37)пептид; и
ε26
8
34
N-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(21-карбоксиунэйкозаноиламино)-4(S)-карбоксибутириламино]этокси)этокси]ацетиламино)этокси]этокси)ацетил]-[Aib,Arg]GLP-1-(7-37)пептид.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, GLP-1 пептид, содержащий одну или более непротеиногенную аминокислоту, выбирают из группы, включающей:
8
34
Aib,Arg-GLP-1(7-37);
8,22
34
Aib,Arg-GLP-1(7-37);
34
Arg-GLP-1(7-37);
8
34
37
Aib,Arg,Pro-GLP-1(7-37); и
8,22,27,30,35
34
37
Aib, Arg,Pro-GLP-1(7-37) амид.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, глюкагоноподобный пептид, содержащий одну или более непротеиногенную аминокислоту, выбирают из группы, включающей:
ε26
ε37
8
34
37
N-[2-(2-{2-[10-(4-карбофенокси)деканоиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-(2-{2-[10-(4-карбофенокси)деканоиламино]этокси}этокси)ацетил]-[Aib,Arg,Lys]CLP-1(7-37)-пептид;
ε26
ε37
8
34
37
N-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбофенокси)деканоиламино]-бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}, N-2-[2-(2-{2-[2-(2-{(S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбофенокси)деканоиламино]-бутириламино}этокси)этокси]ацетиламино}этокси)этокси]ацетил}-[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептид;
ε26
ε37
8
34
37
N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил]-[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептида амид;
ε26
ε37
8
34
37
N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(11-карбоксиундеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(11-карбоксиундеканоиламино)-бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил]-[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептида амид;
ε26
ε37
8
34
37
N-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)-бутириламино]этокси}этокси)ацетил], N-[2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)-бутириламино]этокси}этокси)ацетил]-[Aib,Arg,Lys]GLP-1(7-37)-пептида амид;
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, GLP-1 пептид, содержащий одну или более непротеиногенную аминокислоту, выбирают из группы, включающей:
ε26
8
34
N-(17-карбоксигептадеканоил)-[Aib,Arg]CLP-1-(7-37)-пептид;
ε26
8
34
N-(19-кабоксинонадеканоил)-[Aib,Arg]GLP-1-(7-37)-пептид;
ε26
8
34
N-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-4(S)-карбоксибутириламино]этокси)этокси]ацетиламино)этокси]этокси)ацетил]-[Aib,Arg]GLP-1-(7-37)пептид; и
ε26
8
34
N-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(21-карбоксиунэйкозаноиламино)-4(S)-карбоксибутириламино]этокси)этокси]ацетиламино)этокси]этокси)ацетил]-[Aib,Arg]GLP-1-(7-37)пептид.
Производство пептидов и белков хорошо известно в данной области. Пептиды или белки могут быть получены, например, путем классического синтеза пептидов, в частности путем твердофазного пептидного синтеза с использованием трет-ВОС или Fmoc или другими хорошо разработанными методами, см., например, Greene and Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, 1999, "Organic Synthesis on solid Phase", Florencio Zaragoza Dörwald, Wiley-VCH Verlag GmbH, D-69469 Weinheim, 2000, "Novabiochem Catalog", Merck Biosciences 2006/2007 and "Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis", Edited by W.C. Chan and P.D. White, Oxford University Press, 2000, ISBN 0-19-963724-5. Пептиды или белки могут быть также получены с помощью способа, который включает культивирование клетки-хозяина, содержащей последовательность ДНК, кодирующую пептид или белок, причем клетка-хозяин способна экспрессировать пептид или белок в подходящей питательной среде в условиях, позволяющих провести экспрессию пептида или белка. Для пептидов или белков, содержащих остатки аминокислот, отличных от природных, рекомбинантная клетка должна быть модифицирована таким образом, что упомянутые аминокислоты были включены в пептид или белок, например, путем использования тРНК мутантов.
Термины «примерно» или «приблизительно», используемые в настоящем изобретении, означают величину, находящуюся в разумном приближении к указанному числовому значению, например, плюс или минус 10%, или для значения рН плюс или минус 0,2 или для значений температуры плюс минус 5 градусов по Цельсию.
Ниже приведен неограничивающий список воплощений изобретения:
1. Дипептид по Формуле 1:
отличающийся тем, что
1
2
R представляет собой атом водорода Н или аминозащитную группу, a Rпредставляет собой аминозащитную группу, или
1
2
R представляет собой удаляемую алкильную группу, a R представляет собой атом водорода Н или удаляемую алкильную группу; или
1
2
R и R совместно образуют кольцо;
3
R представляет собой атом водорода Н или вторичный аммоний-катион, третичный аммоний-катион или катион металла, образующий соль с карбоксильной группой; и
4
R отсутствует или представляет собой кислую соль.
2. Дипептид согласно воплощению 1 настоящего изобретения, отличающийся тем, что аминозащитную группу выбирают из группы, включающей: Boc, Trt, Врос, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde и Nps.
3. Дипептид согласно воплощению 1 или 2 настоящего изобретения, отличающийся тем, что удаляемую алкильную группу выбирают из группы, включающей: бензил и трет-бутил.
1
2
4. Дипептид согласно любому из воплощений 1-2 настоящего изобретения, отличающийся тем, что если R и R вместе образуют кольцо, то это кольцо выбирают из группы, включающей: фталимид или 1,3,5-диоксазин.
5. Дипептид согласно любому из воплощений 1-4 настоящего изобретения, отличающийся тем, что
1
2
R представляет собой атом водорода Н или аминозащитную группу, выбранную из группы, включающей: Boc, Trt, Врос, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde и Nps, a R представляет собой аминозащитную группу, выбранную из группы, включающей: Boc, Trt, Врос, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde и Nps; или
1
2
R представляет собой удаляемую алкильную группу, выбранную из группы, включающей бензила и трет-бутил, и R представляет собой атом водорода Н или удаляемую алкильную группу, выбранную из группы, включающей: бензил и трет-бутил; или
1
2
R и R совместно образуют кольцо, выбранное из группы, включающей: фталимид или 1,3,5-диоксазин;
3
R представляет собой атом водорода Н или вторичный аммоний-катион, третичный аммоний-катион или катион щелочного или щелочноземельного металла, образующий соль с карбоксильной группой; и
4
R отсутствует или представляет собой кислую соль, которую выбирают из группы, включающей: соль TFA, соль HCl, соль HBr и соли гидросульфата.
6. Дипептид согласно любому из воплощений 1-5 настоящего изобретения, отличающийся тем, что
1
R представляет собой атом водорода Н или аминозащитную группу, выбранную из группы, включающей: Boc, Trt, Врос, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde и Nps, a
2
R представляет собой аминозащитную группу, выбранную из группы, включающей: Boc, Trt, Врос, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde и Nps; или
1
2
7. Дипептид согласно любому из воплощений 1-5 настоящего изобретения, отличающийся тем, что R представляет собой атом водорода Н, a R представляет собой аминозащитную группу, выбранную из группы, включающей: Boc, Trt, Врос, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde и Nps.
1
2
8. Дипептид согласно любому из воплощений 1-5 настоящего изобретения, отличающийся тем, что R представляет собой атом водорода Н, a R представляет собой Fmoc.
1
9. Дипептид согласно любому из воплощений 1-5 настоящего изобретения, отличающийся тем, что R представляет собой аминозащитную группу, выбранную из группы, включающей: Boc, Trt, Врос, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde и Nps, a
2
R представляет собой аминозащитную группу, выбранную из группы, включающей: Boc, Trt, Врос, Fmoc, Nsc, Cbz, Alloc, oNBS, pNBS, dNBS, ivDde и Nps
10. Дипептид согласно любому из воплощений 1-5 настоящего изобретения, отличающийся тем, что
1
R представляет собой удаляемую алкильную группу, выбранную из группы, включающей: бензил и трет-бутил,
2
R представляет собой атом водорода Н или удаляемую алкильную группу, выбранную из группы, включающей: бензил и трет-бутил,
11. Дипептид согласно любому из воплощений 1-5 настоящего изобретения, отличающийся тем, что
1
R представляет собой удаляемую алкильную группу, которую выбирают из группы, включающей: бензил и трет-бутил, а
2
R представляет собой атом водорода Н.
12. Дипептид согласно любому из воплощений 1-5 настоящего изобретения, отличающийся тем, что
1
R представляет собой удаляемую алкильную группу, которую выбирают из группы, включающей: бензил и трет-бутил, и
2
R представляет собой удаляемую алкильную группу, которую выбирают из группы, включающей: бензил и трет-бутил.
3
13. Дипептид согласно любому из воплощений 1-12 настоящего изобретения, отличающийся тем, что R представляет собой атом водорода Н.
3
14. Дипептид согласно любому из воплощений 1-12 настоящего изобретения, отличающийся тем, что R представляет собой вторичный аммоний-катион, образующий соль с карбоксильной группой.
3
15. Дипептид согласно любому из воплощений 1-12 настоящего изобретения, отличающийся тем, что R представляет собой третичный аммоний-катион, образующий соль с карбоксильной группой.
3
16. Дипептид согласно любому из воплощений 1-12 настоящего изобретения, отличающийся тем, что R представляет собой катион щелочного металла, образующий соль с карбоксильной группой.
3
17. Дипептид согласно любому из воплощений 1-12 настоящего изобретения, отличающийся тем, что R представляет собой катион щелочноземельного металла, образующий соль с карбоксильной группой.
4
18. Дипептид согласно любому из воплощений 1-17 настоящего изобретения, отличающийся тем, что R отсутствует.
4
19. Дипептид согласно любому из воплощений 1-17 настоящего изобретения, отличающийся тем, что R представляет собой кислую соль, которую выбирают из группы, включающей: соль TFA, соль HCl, соли HBr и соли гидросульфата.
20. Дипептид согласно любому из воплощений 1-19 настоящего изобретения, отличающийся тем, что
1
R представляет собой атом водорода Н;
2
R представляет собой атом Fmoc;
3
R представляет собой атом водорода Н; и
4
R отсутствует или представляет собой кислую соль, такую как соль TFA, соль HCl, соль HBr и соли гидросульфата.
21. Дипептид согласно любому из воплощений 1-3 настоящего изобретения, имеющий структуру Fmoc-His-Aib-OH согласно Формуле 2,
4
отличающийся тем, что His представляет собой гистидин, Aib представляет собой синтетическую аминокислоту: 2-аминоизомасляную кислоту, Fmoc является защитной группой 9-флюоренилметилоксикарбонил, a R отсутствует или кислую соль, такую как TFA, HCl, HBr и НОАс.
22. Дипептид согласно любому из воплощений 1-3 настоящего изобретения, являющийся TFA солью Fmoc-His-Aib-OH:
Fmoc-His-Aib-OH,TFA
и отличающийся тем, что His представляет собой гистидин, Aib представляет собой синтетическую аминокислоту: 2-аминоизомасляную кислоту, Fmoc является защитной группой 9-флюоренилметилоксикарбонил и TFA представляет собой трифторуксусную кислоту.
23. Дипептид согласно любому из воплощений 1-22 настоящего изобретения, который активируют при помощи активирующего агента, такого как связующий реагент на основе фосфония, а именно (бензотриазол-1-ил-окси)трипирролидинфосфония гексафторфосфат (РуВОР).
24. Дипептид согласно любому из воплощений 1-23 настоящего изобретения.
25. Способ получения полипептида или белка, содержащего одну или более непротеиногенных аминокислот, отличающийся тем, что этот способ включает стадию взаимодействия дипептида согласно любому из воплощений 1-23 настоящего изобретения с полипептидом или белком.
26. Способ получения полипептида или белка согласно воплощению 25 настоящего изобретения, отличающийся тем, что упомянутый дипептид взаимодействует с полипептидом или белком в водной среде.
27. Способ получения полипептида или белка согласно воплощению 25 настоящего изобретения, включающий стадию смешивания дипептида с полипептидом или белком в водной среде.
1
2
28. Способ получения полипептида или белка согласно любому из воплощений 25-27 настоящего изобретения, отличающийся тем, что R и/или R упомянутого дипептида удаляют после проведения реакции с полипептидом или белком.
1
2
29. Способ получения полипептида или белка согласно любому из воплощений 25-28 настоящего изобретения, отличающийся тем, что R и/или R упомянутого дипептида удаляют после проведения реакции с полипептидом или белком в основных условиях.
1
2
30. Способ получения полипептида или белка согласно любому из воплощений 25-29 настоящего изобретения, отличающийся тем, что R и/или R упомянутого дипептида удаляют на стадии снятия защиты, а также отличающийся тем, что в реакционную среду добавляют пиперидин.
1
2
31. Способ получения полипептида или белка согласно любому из воплощений 25-30 настоящего изобретения, отличающийся тем, что R и/или R упомянутого дипептида удаляют in situ в одну химическую стадию после проведения реакции ацилирования с полипептидом или белком.
32. Способ получения полипептида или белка согласно любому из воплощений 25-31 настоящего изобретения, отличающийся тем, что полипептид или белок являются Fmoc-защищенными с N-конца и включающий стадию, которая отличается тем, что Fmoc-защищенный с N-конца полипептид или белок подвергается процессу снятию защиты in situ.
33. Способ получения полипептида или белка согласно любому из воплощений 25-32 настоящего изобретения, отличающийся тем, что упомянутый метод включает стадии
1. активации дипептида Формулы 1 или Формулы 2 связующим реагентом на основе фосфония,
2. взаимодействия активированного дипептида с полипептидом или белком,
3. удаления защитной группы (групп) in situ
в результате чего получают целевой полипептид или белок.
34. Способ получения полипептида или белка согласно воплощению 33 настоящего изобретения, отличающийся тем, что на стадии 2 упомянутый активированный дипептид взаимодействует с полипептидом или белком в водной среде.
35. Способ получения полипептида или белка согласно любому из воплощений 26- 34 настоящего изобретения, отличающийся тем, что упомянутая водная среда содержит один или более водорастворимых органических растворителей, которые выбирают из группы, включающей DMF, NMP, DMAC, DMSO, ацетонитрил, диоксан, бутокси-2-этанол, водорастворимый ацеталь и водорастворимый спирт.
36. Способ получения полипептида или белка согласно воплощению 35 настоящего изобретения, отличающийся тем, что один или более водорастворимых органических растворителей представляет собой NMP.
37. Способ получения полипептида или белка согласно любому из воплощений 26-36 настоящего изобретения, отличающийся тем, что водная среда, в которой упомянутый активированный дипептид взаимодействует с полипептидом или белком, содержит 10-100% воды.
38. Способ получения полипептида или белка согласно любому из воплощений 26-36 настоящего изобретения, отличающийся тем, что водная среда, в которой упомянутый активированный дипептид взаимодействует с полипептидом или белком, содержит примерно 40% воды.
39. Способ получения полипептида или белка согласно любому из воплощений 26-38 настоящего изобретения, отличающийся тем, что рН водной среды находится между рН7 и рН14.
40. Способ получения полипептида или белка согласно любому из воплощений 26-38 настоящего изобретения, отличающийся тем, что рН водной среды находится между рН8,7 и рН9,4.
41. Способ получения полипептида или белка согласно любому из воплощений 26-38 настоящего изобретения, отличающийся тем, что рН водной среды составляет примерно рН9,1.
42. Способ получения полипептида или белка согласно любому из воплощений 26-38 настоящего изобретения, отличающийся тем, что рН водной среды составляет примерно рН9,3.
43. Способ получения полипептида или белка согласно любому из воплощений 26-38 настоящего изобретения, отличающийся тем, что водная среда содержит буфер.
44. Способ получения полипептида или белка согласно любому из воплощений 25-38 настоящего изобретения, отличающийся тем, что полипептид или белок содержит одну или более непротеиногенных аминокислот, полученных в растворе.
45. Способ получения полипептида или белка согласно любому из воплощений 1-23 настоящего изобретения, отличающийся тем, что полипептид или белок взаимодействуют с указанным дипептидом, иммобилизованном на твердой фазе.
46. Способ получения полипептида или белка согласно любому из воплощений 1-23 настоящего изобретения, отличающийся тем, что указанный дипептид взаимодействует с α-N-концом полипептида или белка.
47. Способ получения полипептида или белка согласно любому из воплощений 1-23 настоящего изобретения, отличающийся тем, что полипептид или белок, взаимодействующий с упомянутым дипептидом, представляет собой GLP-1 пептид.
Примеры
Список сокращений:
ADO:8-амино-3,6-диоксаоктановая кислота
Aib: 2-аминоизомасляная кислота
Alloc: аллилоксикарбонил
Boc: трет-бутоксикарбонил
Врос: 2-(р-бифенилил)-2-пропилоксикарбонил
Cbz: бензилоксикарбонил
DCM: дихлорметан
DIC: N,N’-диизопропилкарбонилдимид
DIPEA: N,N-диизопопилэтиламин
DME: диметиловый эфир
dNBS: 2,4-динитробензолсульфонил
EtOH: этанол
Fmoc: 9-флюоренилметилоксикарбонил
HBr: бромоводородная кислота
HCl: хлороводородная кислота
His: гистидин
НОАс: уксусная кислота
HOBt: гдроксибензотриазол
ivDde: 1-(4,4-диметил-2,6-диоксоцикло-гексилиден)-3-метилбутил
Lys: лизин
MeCN: ацетонитрил
Mtt: 4-метилтритил
NMP: N-метил-2-пирролидон
Nps: о- или р-нитрофенилсульфенил
Nsc: 2-(4-нитрофенил)сульфонилэтоксикарбонил
oNBS: о-нитробензолсульфонил
OtBu: трет-бутокси
pNBS: р-нитробензолсульфонил
PyBOP: (бензотриазол-1-илокси)трипирролидинфосфония гексафторфосфат
ТВМЕ: третбутилметиловый эфир
TBTU: O-(бензотриазол-1-ил)-N,N,N’,N’-тетраметилурона тетрафторборат
TEA: триметиламин
TFA: трифторуксусная кислота
TIPS: триизопропилсилан
Trt: трифенилметил
Пример 1: 2-[(S)-2-(9Н-флюорен-9-ил-метоксикарбониламино)-3-(1Н-имидазол-4-ил)-пропаноиламино]-2-метилпропановой кислоты трифторацетат (другое наименование: Fmoc-His-Aib-OH, TFA)
Соединение Fmoc-His (Trt) -Aib-OH (1 мол. экв., исходный материал) суспендировали в DCM (1,5 мл/г) и добавляли TIPS (1,7 мол. экв.). Охлаждали (0-10°С) и добавляли TFA (3 мл/г), перемешивали смесь при комнатной температуре до окончания реакции (степень конверсии определяли при помощи ВЭЖХ). Добавляли DME (1 мл/г исходного материала) и метил-трет-бутиловый эфир ТВМЕ (11 мл/г исходного материала), что приводило к увеличению температуры. Температуру медленно приводили к комнатной температуре, получая в результате осадок белого твердого вещества. Затем смесь перемешивали в течение 3 ч и фильтровали. Осадок дважды промывали ТВМЕ (3 мл/г исходного вещества) и высушивали в течение ночи под вакуумом, получая детритилированный дипептид в виде TFA-соли с выходом 90%.
Исследование его стабильности в замороженном состоянии (ниже -15°С ± 5°С), в холодильнике (5°С ± 3°С) и при комнатной температуре (20°С ± 3°С) свидетельствует о стабильности в течение более 24 месяцев.
Данные ЯМР:
ε26
8
34
ε26
8
34
Пример 2: N-[(S)-(22,40-дикарбокси-10,19,24-триоксо-3,6,12,15-тетраокса-9,18,23-триазатетраконтан-1-оил)][Aib,Arg]GLP-1-(7-37)-пептид (другое наименование: N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбокси-гептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил][Aib,Arg]GLP-1-(7-37)-пептид)
Стадия 1:
In situ активация дипептида Fmoc-His-Aib-OH,TFA (Смесь I):
2
К смеси Fmoc-His-Aib-OH,TFA (4 мол. экв.) и HOBt*HO (4 мол. экв.) добавляли NMP (4,7 мл/г дипептида) при комнатной температуре. К перемешиваемому раствору добавляли TEA до рН 8, поддерживая температуру раствора при температуре окружающей среды с использованием ледяной бани. Раствор РуВОР (3,9 мол. экв.) в NMP (2,4 мл/г дипептида) добавляют к раствору, содержащему дипептид при температуре окружающей среды. Величину рН реакционной смеси доводят до рН8 с помощью рН. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 мин перед добавлением к смеси II.
ε26
34
ε26
34
Приготовление пептида N-[(S)-(22,40-дикарбокси-10,19,24-триоксо-3,6,12,15-тетраокса-9,18,23-триазатетраконтан-1-оил)][Arg]GLP-1-(9-37)-пептид (другое наименование: N-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбокси-гептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил]-[Arg]CLP-1-(9-37)-пептид для ацилирования) (Смесь II).
ε26
34
N-[(S)-(22,40-дикарбокси-10,19,24-триоксо-3,6,12,15-тетраокса-9,18,23-триазатетраконтан-1-оил)][Arg]CLP-1-(9-37)-пептид суспендировали в 40% (% по массе) раствора воды в NMP (37 г пептида/1 л смеси растворителей). К охлажденной смеси прибавляли TEA до величины рН 9,3.
Стадия 2:
ε26
34
Ацилирование пептида N-[(S)-(22,40-дикарбокси-10,19,24-триоксо-3,6,12,15-тетраокса-9,18,23-триазатетраконтан-1-оил)][Arg]CLP-1-(9-37)-пептид (Смесь III):
Смесь I добавляли по каплям к смеси II при комнатной температуре. После добавления величину рН доводили до рН9,3 (при помощи рН-метра). Смесь перемешивали до оптимального взаимодействия (измеряли при помощи ВЭЖХ).
Стадия 3:
Снятие защитной группы (Fmoc)
К смеси III добавляли пиперидин (20 мол. экв. /дипептид) и смесь перемешивали в течение 40 минут при комнатной температуре.
Результаты масс-спектрометрического анализа (с орбитальной ионной ловушкой Orbitrap): отношение масса/заряд составляет m/z 1028,7 (4+) 1371,4 (3+).
ε26
ε37
8
34
37
Пример 3: Приготовление N,N-бис[(S)-(22-карбокси-33-(4-карбоксифенокси)-10,19,24-триоксо-3,6,12,15-тетраокса-9,18,23-триазатритриаконтан-1-оил)][Aib, Arg,Lys]GLP-1-(7-37)-пептида (другое наименование:
ε26
ε37
8
34
37
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]amino]этокси]этокси]ацетил], N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]amino]этокси]этокси]ацетил][Aib,Arg,Lys]-GLP-1-(7-37)-пептид)
Стадия 1:
Ацилирование побочной цепи
34
37
34
37
[Arg,Lys]-GLP-1-(9-37)-пептид в форме изоэлектрически осажденных гранул (15 г, содержание пептида примерно 13% по массе, чистота ~ 93%) суспендировали в воде (50 мл) и для растворения пептида добавили водный раствор NaOH (1М; 1150 мкл). Полученный раствор (57 мл) перенесли в реакционную камеру на 150 мл тировальной установки. рН раствора была измерена и составила 10,6. Значение рН доводили в титраторе до рН11,3 с помощью разбавленного водного раствора NaOH (0,5М, 0,67 мл) и объем доводили водой до 60 мл, что позволило получить конечную концентрацию пептида около 33 мг/мл. Оценка содержания [Arg,Lys]-GLP-1-(9-37)-пептидом по стандартной кривой дала точное значение содержания пептида 1,71 г. Используя 1,71 г пептида, получили точную концентрацию раствора 28,5 мг/мл. Активированную боковую цепь 2,5-диоксопирролидин-1-илокси-(S)-(22-крбокси-33-(4-карбоксифенокси)-10,19,24-триоксо-3,6,12,15-тетраокса-9,18,23-триазатритриаконтната (другое название: (4-[9-((S)-1-карбокси-3-{2-[2-({2-[2-(2-гидрокси-5-оксопирролидин-1-илоксикарбонилметокси)-этоксил]-этилкарбамоил}-метокси)-этокси]-этилкарбамоил}-пропилкарбамоил)-нонилокси]-бензойная кислота), в форме 83% активированного сложного эфира, 1,73 г 3,3 г-экв), растворяли в NMP (4,8 мл) с получением 5,20 мл раствора (0,63 г-экв/мл). Раствор боковой цепи в NMP добавляли медленно с помощью шприца с постоянной скоростью, поддерживая постоянное значение рН 11,3 с помощью добавления титратором водного раствора NaOH (0,5М). 3,90 мл (2,4 г-экв) боковой цепи добавляли в течение 1 ч 10 мин (~2 г-экв/ч). Сверхпроизводительный жидкостный хроматографический анализ (UPLC) показал, что ацилирование было почти полным, при этом добавление боковой цепи продолжали до общего количества 2,8 экв (4,43 мл). За время добавления боковой цепи количество прибавленного титратором водного раствора 0,5N NaOH составило 16,71 мл 8,4 ммоль.
Стадия 2: Изоэлектрическое осаждение.
Затем реакционную смесь переносили водой в четыре центрифужных флакона по 50 мл (22 мл в каждый) и рН в каждом из них доводили до значения 4,8 добавлением концентрированной уксусной кислоты до получения белого осадка.
Добавляли EtOH (2,2 мл с общим содержанием 10% по объему). Осадок центрифугировали и использовали без дальнейшей очистки на следующей стадии.
Стадия 3: лигирование дипептида.
Изопреципитат суспендировали в NMP (48 мл, 50 мг пептида/мл) и DIPEA (656 мкл). Измеренное значение рН полученного раствора составило рН9,6 в образце смеси объемом 100 мкл, разбавленном 900 мкл воды.
Измеренное путем титрования по Карлу Фишеру содержание воды в суспензии составило 1,4%. Добавляли воду (9,12 мл) до получения 20%-го содержания воды в суспензии.
Fmoc-His-Aib-OH,TFA; 1058 мг, 3,5 г-экв активировали добавлением HOBt (248 мг, 3,5 г-экв), РуВОР (907 мг, 3,325 г-экв) и триэтиламина (545 мкл) в NMP в течение 15 минут. Измеренное с помощью увлажненной индикаторной рН полоски значение рН составило 4-5. Смесь добавляли к раствору пептида и значение рН доводили триэтиламином до рН9,3 (при измерении образец реакционной смеси (100 мкл) добавляли в воду (900 мкл). Через 1 ч UPLC анализ показал почти полное превращение целевого продукта.
Стадия 4: Снятие защитной группы Fmoc
К реакционной смеси добавляли пиперидин (3,35 мл, 5% по объему) и полученную смесь перемешивали в течение 25 минут, после чего анализ UPLC показал полное превращение продукта. Добавляли воду к NMP до получения раствора 1:1, затем рН доводили до 8,5 с помощью уксусной кислоты и продукт очищали при помощи стандартной хроматографии.
Анализ:
Сверхэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой (RP-UPLC): на колонке ВЕН С18, 150*1 мм при температуре 45°С и скорости потока 0,1 мл/мин; градиент от 30 до 60% 0,04% TFA в MeCN (В элюент) в течение 30 мин, затем до 90% В; общее время анализа 38 мин. Детекция в УФ диапазоне при 215 нм, 5 Гц.
Прибор Synapt High Definition Mass Spectrometry (HDMS): положительный ES-MS режим с отношением массы к заряду m/z 200-2500 (1 Гц). Напряжение на крышке V: 3 кВ; напряжение на конусе V: 28 В. Режим подачи газа для десольватации: тепература 250°С, скорость потока 750 л/ч; конус газа 50 л/ч и температура 110°С
t
Время удерживания R=15,18 мин.
Точная масса: 4885,4477 Da; Обнаружено: М/4: 1222,35; М/3: 1629,45.
ε26
8
34
37
ε26
8
34
37
Пример 4: Получение N-[(S)-(22-карбокси-33-(4-карбоксифенокси)-10,19,24-триоксо-3,6,12,15-тетраокса-9,18,23-триазатритриаконтан-1-оил)]-[Aib,Arg, Lys] GLP-1-(7-37)-пептида (другое наименование: N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[10-(4-карбоксифенокси)деканоиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино] этокси] этокси]ацетил]-[Alb, Arg, Lys]-GLP-1(7-37)-пептид)
Пептид синтезировали с использованием твердофазного пептидного синтеза:
К 1,04 г смолы Fmoc-Lys(Boc)-LL-Wang (экв. 0,24 ммоль/г) добавляли постадийно 4 мол. экв. защищенных по стандартному протоколу Fmoc/OtBu аминокислот или Ser-Ser псевдопролин или Fmoc-L-Lys(Mtt)-OH. Активацию аминокислот (4 мол. экв.) проводили в картридже в течение 7 минут с 4 мол. экв. DIC и 4 мол. экв. HOBt в NMP. Полученный пептид переносили в реакционный сосуд со смолой и реакцию проводили в течение 30 мин. Добавляли DIPEA (4 мол. экв.) и продолжали реакцию в течение 30 мин. Смолу промывали с помощью NMP и затем проводили снятие защитных групп с помощью 20% пиперидина (10 мл, 20 мин). Затем смолу снова промывали NMP.
Снятие защитных групп МТТ:
Смолу промывали DCM. Добавляли 1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропанол (10 мл в течение 10 мин) и сливали раствор со смолы. Процедуру снятия защитных групп повторяли в целом четыре раза. Смолу промывают DCM, а затем NMP.
К смеси (S)-22-(трет-бутоксикарбонил)-33-(4-(трет-бутоксикарбонил) фенокси)-10,19,24-триоксо-3,6,12,15-тетраокса-9,18,23-триазатритриаконтан-1-оевой кислоты, HOBt (4 мол. экв.) добавили DIPEA (4 мол. экв.) в NMP (10 мл), затем добавили TBTU (3,8 мол. экв.) в виде твердого вещества и смесь перемешивали в течение 15 мин перед тем, как добавить ее к смоле. Спустя 2 часов смолу осушали и промывали NMP и DCM.
Пептидил в виде смолы подвергали набуханию в NMP (10 мл) в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем удаляли жидкость из сосуда. Добавляли к смоле 20% по объему пиперидина в NMP (20 мл). Смесь подвергали набуханию в течение 20 мин при комнатной температуре. Дипептиды Fmoc-L-His-Aib-OH.TFA (580 мг) и HOBt. H2O (153 мг) помещали в пробирку на 20 мл. Добавляли NMP (4 мл). К смеси добавляли TEA (650 мкл) до рН 8 (по индикаторной РН-полоске). К реакционной смеси добавляли раствор РуВОР (500 мг) в NMP (4 мл). К реакционной смеси снова добавляли TEA (200 мкл) до рН8 (по индикаторной рН-полоске). Смесь перемешивали в течение 35 мин при температуре окружающей среды. Удаляли жидкость из сосуда. Снова добавляли к смоле 20% по объему пиперидин в NMP (20 мл) для повторного снятия защитной группы. Смесь подвергали набуханию в течение 20 мин при комнатной температуре и удаляли жидкость со смолы. Полимер промывали NMP (50 мл), DCM (50 мл) и 3 раза NMP (50 мл). Наконец смолу промывали DCM и удаляли с нее жидкость. Пептид отщепляли со смолы с помощью смеси TFA, воды и TIPS (в соотношении 95%, 2,5%, 2,5%) в течение 3 часов. Полученный пептид осаждали диэтиловым эфиром и выделяли фильтрованием.
Результаты масс-спектрометрического анализа (TOF MS ES+): отношение масс/заряд m/z, обнаруженное значение: m/4 (1045.54), расчитанное значение: m/4 (1045,5)
Хотя некоторые признаки изобретения были проиллюстрированы и описаны в данном документе, многие модификации, замены, изменения и эквиваленты изобретения могут быть также выполнены с использованием любых существующих и известных из уровня техники методик. Таким образом, следует понимать, что прилагаемая формула изобретения охватывает всех модификации и изменения изобретения в пределах его сущности и объема.