Роль активных форм кислорода и оксида азота в реализации механизмов адаптации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга к гипоксии при культивировании с bFGF

роль активных форм кислорода и оксида азота в реализации механизмов адаптации мультипотентных

МЕЗЕНХИМАЛьныХ СТРОМАЛьНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА К ГИПОКСИИ ПРИ культивировании С bFGF

А.Г. Полешко, И.Д. Волотовский

Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Белоруси, Минск, Белорусь

The role of reactive oxygen species and nitric oxide in the realization of the adaptation mechanisms of bone-derived multipotent mesenchymal stromal cells to hypoxia under cultivation with growth factor bFGF

A.G. Poleshko, I.D. Volotovski

Institute of Biophysics and Cell Engineering, NAS of Belarus, Minsk, Belarus

В качестве одного из возможных путей повышения скорости роста культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) с сохранением их дифферен-цировачного потенциала и поддержанием высокой жизнеспособности рассматривается изменение газового состава среды, а именно понижение содержания О2, а также внесение в нее различных факторов роста, что можно считать имитацией при культивировании условий in vivo . Особый интерес при изучении механизмов влияния этих факторов на пролиферативную активность и жизнеспособность ММСК вызывает участие в данных процессах кислородных метаболитов: активных форм кислорода (АФК) и азота . В этой связи актуально оценить роль АФК и N0 в ММСК при совместном культивировании с фактором роста bFGF в условиях гипоксии

Цель работы — определить влияние 5% гипоксии на содержание Н2О2, О2- и N0 в ММСК костного мозга в условиях культуры в присутствии и отсутствии в ней фактора роста bFGF В результате исследования было выявлено, что как 5% гипоксия, так и фактор bFGF (7 нг/мл) снижают внутриклеточные концентрации Н2О2, О2- и N0 на фоне повышенной экспрессии гена а-субъединицы белка HiFi и сниженной — гена белка р53 . При этом совместное действие гипоксии и bFGF в меньшей степени способствует генерации АФК и N0, максимально увеличивая уровень экспрессии гена белка HiFI-а и, вероятно, с целью защиты генома значительно увеличивает уровень экспрессии гена белка р53 . Учитывая повышение пролиферативной активности и жизнеспособности культуры ММСК в этих условиях, что было продемонстрировано нами ранее, полученные результаты свидетельствуют о регуляторной роли АФК и N0 в долгосрочной адаптации ММСК к гипоксии, имитирующей физиологический уровень О2 in vivo

Ключевые слова: мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, гипоксия, bFGF, активные формы кислорода, оксид азота, HiFi, p53 .

The simulation of conditions in vivo under cultivation the stem cells in vitro as well gas media content (low 02 concentrate) and different growth factors presence is one of the feasible way of growth rate of multipotent mesenchymal stromal cells (MMSC) culture increase when kept differentiation potential and maintained high viability. Oxygen metabolites: reactive oxygen (ROS) and nitrogen species are the most interesting for studying the influence of above characteristics on proliferation activity and viability of MMSC . So it is currently important to identify ROS and NO role in MMsC by cooperative cultivation with growth factor bFGF under hypoxia .

The research was aimed to study an effect of 5% hypoxia on H202, 02- and NO content in MMSC from bone marrow in the cell culture in the presence or absence bFGF it was found out that both 5% hypoxia and bFGF (7 ng/ml) decrease the intracellular H202, 02- and NO concentration on the background of elevated HiFIa gene expression and depressed p53 gene expression . At the same time simultaneous action of hypoxia and bFGF promotes minimal ROS and NO generation, maximizes the effects on HiFIa and p53 genes expression probable for the genome protection Taking into account the increasing the proliferative activity and viability of MMSC culture under these conditions that was shown previously by us, obtained results indicate the regulatory role of ROS and NO in the long-term MMSC adaptation to 5% hypoxia, simulating O2 physiologic content as in vivo

Keywords: multipotent mesenchymal stromal cells, hypoxia, growth factor bFGF, reactive oxygen species, nitric oxide, HiF1, p53.

Введение

В последнее время при изучении реализации механизмов жизнедеятельности мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) большое внимание уделяется роли в этих процессах кислородных метаболитов, в частности, активных форм кислорода (АФК) (пероксид водорода Н2О2, супероксид радикал О2-, гидроксил радикал ОН и др . ) и азота (АФА) (оксид азота N0, пероксинитрит 0N00- и др . ) [1]. Доказано, что АФК и АФА в зависимости от концентрации способны оказывать на клетки не только повреждающее воздействие, но и модулировать многие метаболические реакции, выступая в качестве вторичных мессенджеров и оказывая тем самым регуляторный эффект, в т . ч . запускать в ММСК механизмы, связанные с их дифференцировкой [1—6].

e-mail: Renovacio888@yandex. ru

Недавние работы показали наличие определенной связи между изменением содержания АФК/АФА и способностью к пролиферации, дифференцировке стволовых клеток, поддержанию их жизнеспособности при смене условий микроокружения, развитием некоторых патологических состояний [2—5, 7—9]. Среди АФА особый интерес вызывает N0, эффек-торная молекула, имеющая свободнорадикальную природу, потенциальный индуктор адаптивных процессов в клетке, которая при взаимодействии с супероксидом образует пероксинитрит, запускающий свободнорадикальные процессы в клетке [1, 7, 8].

Внутриклеточное содержание АФК и N0 в первую очередь изменяется при колебании содержания О2 вне клетки благодаря работе, главным образом, ее митохондриальной электрон-транспортной цепи

[3—8]. В результате этого происходит активация или подавление активности и направления различных метаболических путей [4].

Важными для ММСК параметрами микроокружения являются газовый состав, в т . ч . содержание О2 [10], и наличие в среде роста клеток различных регуляторных молекул (факторы роста, гормоны и т . д . ) [10—12] Показано, что искусственно созданная гипоксия in vitro, близкая по своим значениям к физиологическим параметрам ниши ММСК in vivo (например, 5% О2 для ММСК костного мозга и др . ) повышает жизнеспособность и пролиферативную активность данного типа клеток с сохранением их мультипотентности [10, 13—15]. Сходные эффекты наблюдаются и в случае внесения в среду культивирования клеток ростовых факторов, особенно bFGF [12, 16, 17]. Однако до настоящего времени остается спорным и недостаточно изученным вопрос о роли и участии АФК и N0 в данных процессах в ММСК при переводе их в гипоксические условия культивирования . Имеющаяся на данный момент информация по содержанию и роли АФК и N0 в ММСК, культивированных при пониженных концентрациях кислорода, неоднозначна и противоречива [1—11, 13, 14].

Исходя из этого целью работы стало исследование влияния 5% гипоксии на содержание Н2О2, О2- и N0 в ММСК костного мозга (КМ) в условиях культуры в присутствии и отсутствии в ней фактора роста bFGF .

Материал и методы

Выделение и культивирование ММСК

ММСК выделяли из бедренных и большебер-цовых костей белых беспородных крыс (возрастом 3—5 мес . ), вымывая костномозговой стержень средой a-MEM (Sigma, США), содержащей 10% фе-тальной телячьей сыворотки (ФТС) (HyClone, США), 2 mM L-глутамина (Sigma, США), 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина . Полученный материал дезагрегировали до клеточной суспензии, которую высевали в культуральные флаконы (Sarstedt, Германия) . Через 24 ч . среду с неадге-зированными клетками удаляли, адгезированные клетки промывали фосфатно-солевым буферным раствором (рН = 7,4) (ФСБ) и заливали свежей питательной средой a-MEM Смену среды проводили каждые 3 сут . При достижении 70—80% кон-флюентности монослоя клетки обрабатывали 0,25— 0,02% раствором трипсин-ЭДТА (invitrogen, США) и пересевали в новые флаконы В экспериментах использовали клетки 2—3 пассажа c фенотипом CD29+/CD44+/CD90 + типичным для ММСК КМ, количество которых среди общей популяции клеток составило 95% Содержание клеток с фенотипом CD34+/CD45 + , характерным для гемопоэтических стволовых клеток, не превышало 2%

Моделирование исследуемых условий

культивирования

Для изучения влияния фактора bFGF в условиях гипоксии спустя сутки после пересева клетки переводили из среды с 10% ФТС в ростовую среду такого же состава, но содержащую 2% ФТС . Затем к ММСК КМ добавляли bFGF (Sigma, США) в концентрации 7 нг/мл [17]. Часть флаконов с клетками переносили в гипоксический СО2-инкубатор для культивирования

в условиях 5% содержания кислорода (5% СО2, 5% О2, 90% N2), вторую часть продолжали культивировать в стандартных условиях (5% СО2, 95% атмосферного воздуха) . Клеточную культуру выдерживали при гипоксии 72 ч . [17], после чего клетки снимали с пластика . В качестве контроля в экспериментах использовали клетки, культивированные в стандартных условиях: 5% СО2 и 95% атмосферного воздуха, содержащего 21% О2 (нормоксия), без добавления фактора bFGF в среду роста .

Определение содержания активных форм

кислорода и азота

Содержание АФК и N0 в клетках оценивали с использованием проточного цитофлуориметра FACScanto ii (Becton Dickinson, США). Перед измерением клетки переводили в суспензию c концентрацией 1,5х105 кл/мл, делили на 3 фракции и каждую инкубировали с одним из зондов: СМ-H^CFDA (invitrogen, США) (в конечной концентрации 3 мкМ) в течение 30 мин . в темноте при 37°С; DHE (Sigma, США) (в конечной концентрации 25 мкМ) в течение 20 мин в темноте при 37°С; DAF-FM-DA (invitrogen, США) (в конечной концентрации 5 мкМ) в течение 40 мин в темноте при 37°С Затем образцы 2 раза отмывали в ФСБ от несвязавшихся зондов и инкубировали в темноте при 37°С 2 ч . для СМ-H^CFDA, 1 ч . - DHE и 30 мин . - DAF-FM-DA. Клетки анализировали по стандартной методике на проточном цитофлуориметре FACSCanto ii По интенсивности внутриклеточной флюоресценции окисленных форм зондов СМ-^DCFDA, DHE и DAF-FM-DA судили о содержании в клетках Н2О2, О2- и N0, соответственно [1] .

Определение экспрессии гена белка HIF1a

и р53 с помощью ПЦР в реальном времени

Выделение РНК из клеток проводили с использованием набора RNAqueous-4PCR Kit (Applied Biosystems inc . , США), согласно протоколу производителя Концентрацию РНК определяли спектрофо-тометрическим методом по оптической плотности ее раствора при X = 260 нм .

Для исследований использовали 380 нг очищенной РНК . Синтез кДНК из РНК осуществляли с использованием набора «High Capacity RNA-to-cDNA Kit»

Уровень мРНК анализируемых генов выравнивали по отношению к мРНК референс-гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы «TaqMan Rodent GAPDH Control» (Applied Biosystems inc . , США).

Статистический анализ

Статистическую обработку полученных результатов проводили с применением программы Statistica 6 . 0 . Данные представляли в виде средних величин ±

стандартное отклонение . Для сравнения групп использовали U-критерий Манна — Уитни. Различия считали статистически значимыми при уровне значимости р < 0,05 .

Результаты и обсуждение

Основным транскрипционным фактором, ответственным за запуск адаптивных реакций в клетке при гипоксии, является активирующийся при низких концентрациях кислорода белок HiFi [18—20]. Он состоит из HiFI-a-субъединицы, которая при атмосферном содержании кислорода подвергается протеосомной деградации, и HiFI-ß-субъединицы, конститутивно присутствующей в ядре [18—20]. Учитывая решающую роль в образовании и активности HiFi его a-субъединицы, было проанализировано влияние 5% гипоксии в присутствии bFGF и без него в среде роста на уровень экспрессии гена белка HiFia в ММСК КМ .

Оказалось, что как при гипоксии (5% О2), так и в присутствии в среде роста фактора bFGF (7 нг/мл) экспрессия гена белка HiF1-a достоверно повышается в 1,5 и 1,3 раза, соответственно (рис . 1) . Сходный с гипоксией эффект действия фактора роста на уровень экспрессии гена hifla объясняется способностью bFGF, как и других цитокиновых молекул, усиливать синтез HiF1-a кислород-независимым путем посредством активации каскадов фосфорилирова-ния метаболических путей митоген-активированной протеинкиназы (MAPK) ERK-типа, фосфоинозитол-3-киназы (Pi-3K), протеинкиназы-В (Akt) [20] и др . При этом следует отметить, что совместное воздействие этих факторов максимально стимулирует экспрессию гена hifla, увеличивая его уровень в 1,7 по сравнению с нормоксией. Это указывает на синергичный эффект влияния низких доз кислорода и bFGF на экспрессию a-субъединицы главного транскрипционного фактора гипоксии, демонстрируя

Рис. 1. Влияние гипоксии на экспрессию гена белковой субъединицы HIF1-a в МСМК КМ при их культивировании с фактором bFGF:

1 - нормоксия (21% О2);

2 - гипоксия (5% 02,72 ч.);

3 - нормоксия (21% 02) + bFGF (7 нг/мл, 72 ч.);

4 - гипоксия (5% 02, 72 ч.) + bFGF (7 нг/мл, 72 ч.).

* - различия при сравнении с группой 1 статистически значимы

эффективность совмещения кислородзависимой и кислороднезависимой регуляции белка HiF1 и объясняя закономерности протекания некоторых метаболических процессов при гипоксии [15], которые им регулируются . Также имеются данные, что HiF1 участвует в реализации метаболических путей, связанных с синтезом клеткой bFGF [21], а молекулы bFGF, в свою очередь, способны влиять на ответ HiF1 на низкие концентрации кислорода, усиливая трансляцию его генов-мишеней и используя посттрансляционный контроль [21]. В результате можно предположить, что ростовой фактор bFGF и транскрипционный фактор Hi F1 могут на разных уровнях перекрестно стимулировать друг друга

В норме в результате жизнедеятельности клеткой в низких концентрациях постоянно генерируются АФК и АФА . Они принимают непосредственное участие в функционировании клеточных систем и оказывают на клетку регуляторное воздействие, выступая в роли внутриклеточных медиаторов и информационных молекул, участвуя в энергетических и анаболитических процессах, регуляции клеточного роста, метаболизме ксенобиотиков и др . [1, 3—5]. В стрессовом состоянии в результате компенсаторных реакций клетка продуцирует большое количество АФК и АФА, что вызывает токсический эффект, запуск патогенетических механизмов и провоцирует, в конечном счете, ее сбои в функционировании и повреждение клеточных структур [1, 3—5]. Выявлено, что АФК и АФА, в частности N0, в зависимости от концентрации могут индуцировать или ингибировать процессы дифференцировки гемопоэтических и нейральных стволовых клеток, опухолевых клеток, некоторых типов клеточных линий в определенных направлениях, участвовать в регуляции апоптоза, синтезе цитокинов, влиять на пролиферативную активность этих клеток [3, 7—9, 22].

Основная роль в продукции АФК и АФА в клетках отводится митохондриям [3, 4, 7, 23, 24]. Некоторые исследования показывают, что гипоксия либо не изменяет количество функционирующих митохондрий, либо значительно подавляет митохон-дриальный биогенез [25], причем их функциональная активность в клетках возрастает [15, 24]. На данный момент часть работ, посвященных изучению метаболитов кислорода, демонстрирует накопление АФК и АФА в клетках при гипоксических условиях культивирования — так называемый положительный оксидативный стресс [4—6, 23, 24]; другая часть показывает, что низкие концентрации кислорода провоцируют снижение содержания этих молекул в клетках [14].

При исследовании влияния гипоксии (5% О2), поддерживаемой в среде роста клеток при их культивировании, на образование АФК и АФА в ММСК КМ нами обнаружено достоверное снижение содержание Н2О2, О2-, N0 в 1,8, 2,0 и 2,25 раз, соответственно, по сравнению с контролем (рис . 2). Тенденция к снижению содержания изучаемых молекул наблюдается и при культивировании ММСК КМ с фактором bFGF в 1,3 раза для Н2О2, в 1,3 - для О2- и в 1,7 - для N0 . В случае совместного воздействия этих факторов фиксируется наиболее низкий уровень содержания исследуемых метаболитов в ММСК КМ: он снижается в 2,3, 2,7 и 3,2 раза для Н2О2, О2-, N0, соответственно . Известно, что высокие концентрации N0 могут влиять на образование АФК, поэтому, учитывая тенденцию к положительной корреляции между

АФК и N0, можно говорить о том, что в ММСК КМ N0 способен индуцировать АФК . Есть сообщения в отношении способности АФК и N0 стабилизировать и повышать активность HiFi через Pi-3K/ Akt опосредованный метаболический путь, влияя на запуск транскрипции зависимых от него генов [3, 4, 23, 24, 26, 27], определенный уровень которых необходим клетке в условиях атмосферного содержания кислорода в среде для поддержания нормальной жизнедеятельности [4—6]. Это дает возможность интерпретировать полученный нами высокий уровень содержания АФК и N0 в условиях нормоксии как адаптивную реакцию ММСК . При сопоставлении этих данных с ранее полученными нами результатами по жизнеспособности и пролиферативной активности ММСК КМ в данных условиях культивирования [1517] можно говорить о наличии прямой связи между этими показателями . Высокой пролиферативной активности и жизнеспособности культуры ММСК КМ при гипоксии и (или) присутствии в среде роста bFGF соответствует низкое содержание в этих клетках АФК и N0 . Последние, по-видимому, в этом случае играют регуляторную роль в реализации механизмов адаптации ММСК КМ при переводе их из нормок-сических условий культивирования (21%) в гипок-сические (5%) Эти данные подтверждают возможность независимой от гипоксии регуляции активации белка HiFi [20] и могут служить доказательством того, что условия гипоксии и фактор роста bFGF оказывают благотворное действие на культуру ММСК КМ, причем их сочетанное использование при культивировании этого типа клеток позволяет ММСК КМ максимально проявить пролиферативный потенциал и поддержать жизнеспособность на высоком уровне, сохранив мультипотентность .

Белок р53 выступает в роли фактора транскрипции и отвечает за контроль перехода клеточного цикла из фазы G1 в фазу S, т . е . контролирует ре-гуляторную точку фазы G1 [28]. При фиксировании в клетке аномальной ДНК быстро деградируемый

р53 стабилизируется, фосфорилируется белком АТМ (atoxia telangiectasia mutated — белок, мутированный при комплексном заболевании, которое включает симптомы атаксии и телеангиоэктезии), запуская экспрессию таргетных генов, в т . ч . белка р21, ингибирующего киназу Cdk2, отвечающую за инициацию синтеза ДНК в ранней фазе S, задерживая клетку в G1 фазе до завершения репарации [28]. На фоне изучения изменения содержания АФК и N0 в данном исследовании интересным оказалось проследить динамику экспрессии белка р53, главного транскрипционного фактора, отвечающего за корректное прохождение клеточного цикла

При действии низких концентраций кислорода (5%) и в присутствии в среде фактора роста bFGF уровень экспрессии гена белка р53 снижается (рис . 3) на фоне снижения концентрации АФК и N0, что дает основание полагать о снижении в этих условиях токсического воздействия кислородных продуктов на структуру клеточного генома и стабилизации культуры ММСК КМ, что проявляется в увеличении пролиферативной активности клеток [16] и сохранении их мультипотентности [13].

По литературным данным, гипоксия может вызывать рост экспрессии р53 [13], но это, судя по всему, характерно для более жестких гипоксических условий (1—2%), чем 5% О2, которые по сути являются физиологичными и имитируют нишу ММСК КМ, в отличие от атмосферных 21% О2, чаще всего используемых при культивировании . В этом случае гипоксия выступает скорее в качестве физиологической нормы, по сравнению с действительно стрессовыми 1—2% О2 и нефизиологическими 21% О2 . Этим можно объяснить и зафиксированные нами низкие концентрации АФК и N0 в ММСК КМ .

Также в результате измерений выявлена интересная закономерность При одновременном действии белка bFGF и низких концентраций О2 на культуру ММСК КМ, несмотря на низкий уровень АФК и N0, уровень экспрессии гена белка р53 значительно

Рис. 2. Влияние гипоксии на генерацию активных форм кислорода и оксида азота в МСМК КМ при их культивировании с фактором bFGF: А - Н2О2, Б - О2-, В - N0;

1 - нормоксия (21% О2);

2 - гипоксия (5% О2, 722 ч.);

3 - нормоксия (21% О2) + bFGF (7 нг/мл, 72 ч.);

4 - гипоксия (5% О2, 72 ч.) + bFGF (7 нг/мл, 72 ч.).

* - различия при сравнении с группой 1 статистически значимы

12 3 4

Рис. 3. Влияние гипоксии на экспрессию гена белка р53 в ММСК КМ при их культивировании с фактором bFGF:

1 - нормоксия (21% О2);

2 - гипоксия (5% О2, 72 ч.);

3 - нормоксия (21% О2) + bFGF (7 нг/мл, 72 ч.);

4 - гипоксия (5% О2, 72 ч.) + bFGF (7 нг/мл, 72 ч.).

* - различия при сравнении с группой 1 статистически значимы

оригинальные исследования

53

повышается . Скорее всего, это может быть обусловлено тем, что в данных условиях наблюдается максимальная пролиферативная активность культуры, поэтому, вероятно, требуется контроль за качеством передаваемого при делении клеток генетического материала . В то же время имеется информация, что фактор bFGF способен повышать экспрессию белка Mdm2 (mouse double minute chromosome amplified oncogene — онкоген, амплифицированный на хромосоме типа «double minute») [29, 30], который связывает свободный р53 в неактивный комплекс с дальнейшей убиквитинзависимой деградацией . Это дает основание предположить, что с помощью вышеописанных взаимодействий уже на белковом уровне с участием р53 [19] сохраняется способность ММСК КМ к высокой пролиферативной активности . Следует отметить, что белок АТМ, имеющий большое значение для активации р53, также способен подавлять как экспрессию генов обеих субъединиц белка HiFi, так и их трансляцию на белковом уровне [28].

Заключение

Исходя из полученных ранее нами данных [16, 17] и результатов этого исследования, становится понятным, что при 5% гипоксии, которая по сути яв-

ляется физиологичной концентрацией О2 для ММСК КМ, происходит тонкая регуляция метаболических процессов с участием таких биологических молекул как транскрипционные факторы Hi F1 и p53, которые в результате сложных взаимосвязанных сигналинго-вых путей способны перекрестно регулировать друг друга на различных этапах [18, 28]. Эти факторы можно расценивать как биологические маркеры, свидетельствующие о прохождении редокс-сигнали-зации в клетке Кроме того, в этих процессах явное участие принимают активные формы кислородных метаболитов: АФК и N0 . Как и следовало ожидать, их содержание в клетках более высокое при нормок-сии, чем при 5% гипоксии, а bFGF позволяет уменьшить образование кислородных продуктов в обоих случаях Можно предполагать, что внутриклеточное содержание АФК и N0 — важный показатель состояния ММСК КМ, реагирующий на изменение, как ее генетической программы, так и условий микроокружения . Это может служить прогностическим индикатором жизнеспособности культуры клеток . Наши данные также показывают, что использование bFGF на фоне 5% гипоксии при культивировании ММСК КМ способствует экспрессному наращиванию клеток, которые находят в дальнейшем применение в регенеративной медицине и клеточной биологии

ЛИТЕРАТУРА:

I. Gomes A ., Fernandes E . , Lima J . L . F . C . Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species . J . Biochem . Biophys . Methods 2005; (65): 45-80 .

2 . Kim H-R ., Won S . J. , Fabian C . et al . Mitochondrial DNA aberrations and pathophysiological implications in hematopoietic diseases, chronic inflammatory diseases, and cancers Ann Lab Med 2015; (35): 1-14 .

3 . Hamanaka R . B ., Chandel N . S . Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes Trends Biochem . Sci . 2010; 35(9): 505-13 .

4 . Hamanaka R . B ., Chandel N . S . Mitochondrial reactive oxygen species regulate hypoxic signaling . Current Opinion in Cell Biology 2009; 21(6): 894-9 .

5 . Bartosz G . Reactive oxygen species: destroyers or messengers? Biochemical Pharmacology 2009; 77(8): 1303-15 .

6 . Yan L-J . Positive oxidative stress in aging and aging-related disease tolerance . Redox Biology 2014; (2): 165-9 .

7 . Chen C-T . , Shih Y-R .V ., Kuo T . K . et al . Coordinated changes of mitochondrial biogenesis and antioxidant enzymes during osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells Stem cells 2008; (26): 960-8 .

8 . Carreira B . P ., Morte M . I ., Santos A . I . et al . Nitric oxide from inflammatory origin impairs neural stem cell proliferation by inhibiting epidermal growth factor receptor signaling . Front. Cell Neurosci . 2014; (8): Art . 343 .

9 . Li L. , Guo Y., Zhai H . et al . Aging increases the susceptivity of MSCs to reactive oxygen species and impairs their therapeutic potency for myocardial infarction . PLoS ONE 2014; 9(11): e111850 .

10 . Lin Q ., Lee Y-J ., Yun Z . Differentiation arrest by hypoxia . J . Biol . Chem . 2006; 281(31): 30678-83 .

II. Kolf C . M ., Cho E ., Tuan R . S . Mesenchymal stromal cells . Biology of adult mesenchymal stem cells: regulation of niche, self-renewal and differentiation . Arthritis Res . Ther . 2007; (9): Art . 204 .

12 . Yun Y . R ., Won J . E ., Jeon E . et al . fibroblast growth factors: biology, function, and application for tissue regeneration J Tissue Eng 2010; Art . 218142 .

13 Holzwarth C , Vaegler M , Gieseke F et al Low physiologic oxygen tensions reduce proliferation and differentiation of human multipotent mesenchymal stromal cells . BMC Cell Biology 2010; (11): Art . 11.

14 . Lavrentieva A. , Majore I ., Kasper C . et al . Effects of hypoxic culture conditions on umbilical cord-derived human mesenchymal stem cells . Cell Communication and Signaling 2010; (8): Art . 18 .

15 . Полешко А . Г ., Лобанок Е . С ., Волотовский И .Д . Влияние гипоксии на порфириновый метаболизм в МСК костного мозга . Клеточные технологии в биологии и медицине 2014; (1): 57-62 .

16 . Полешко А . Г . , Лобанок Е . С ., Межевикина Л . М . и др . Процесс гемообразования в мезенхимальных стволовых клетках костного мозга при их культивировании с фактором роста bFGF в условиях гипоксии . Биофизика 2014; 59(6): 1125-30 .

17 Полешко А Г , Лобанок Е С , Волотовский И Д Влияние фактора роста bFGF на процесс гемообразования в МСК костного мозга крыс . Вести НАН . Серия биологических наук 2014; (2): 77-81.

18 . Schmid T., Zhou J ., Köhl R . et al . p300 relieves p53-evoked transcriptional repression of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) . Biochem . J . 2004; 380(1): 289-95 .

19 Goda N , Ryan H E , Khadivi B et al Hypoxia-inducible factor 1 is essential for cell cycle arrest during hypoxia Mol Cell Biol 2003; 23(1): 359-69 .

20 . Лукьянова Л .Д . , Кирова Ю . И ., Сукоян Г . В . Сигнальные механизмы адаптации к гипоксии и их роль в системной регуляции Биологические мембраны 2012; 29(4): 238-52 .

21. Shi Y-H ., Wang Y-X ., You J-F . et al . Activation of HIF-1 by bFGF in breast cancer: role of PI-3K and MEK1/ERK pathways . Zhonghua Yi Xue Za Zhi 2004; 84(22): 1899-903 .

22 . Zhang L ., Dang R-J ., Li H . et al . SOCS1 regulates the immune modulatory properties of mesenchymal stem cells by inhibiting nitric oxide production . PLoS ONE 2014; 9(5): e97256 .

23 Hwang A B , Lee S-J Regulation of life span by mitochondrial respiration: the HIF-1 and ROS connection . Aging 2011; 3(3): 304-10 .

24 . Ударцева О . О ., Андреева Е . Р ., Рылова Ю . В . и др . Влияние фотодинамически индуцированной генерации АФК на состояние митохондрий и лизосом культивируемых мезенхимных стромаль-ных клеток человека Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2010; Y(4): 38-42 .

25 Basciano L , Nemos C , Foliguet B et al Long term culture of mesenchymal stem cells in hypoxia promotes a genetic program maintaining their undifferentiated and multipotent status BMC Cell Biol . 2011; (12): Art . 12 .

26 Серебряковская Т В Гипоксия-индуцибельный фактор: роль в патофизиологии дыхания Украинский пульмонологический журнал 2005; (3): 77-81.

27 Le Belle J E , Orozco N M , Paucar A A et al Proliferative neural stem cells have high endogenous ROS levels that regulate self-renewal and neurogenesis in a PI3K/Akt-dependant manner. Cell Stem Cell 2011; 8(1): 59-71.

28 Obacz J , Pastorekova S , Vojtesek B et al Cross-talk between HIF and p53 as mediators of molecular responses to physiological and genotoxic stresses . Mol . Cancer 2013; (12): Art . 93 .

29 Hubert A , Paris S , Piret J-P et al Casein kinase 2 inhibition decreases hypoxia-inducible factor-1 activity under hypoxia through elevated p53 protein level . J . Cell Sci . 2006; 119(16): 3351-62 .

30 Jin X , Beck S , Sohn Y-W et al Human telomerase catalytic subunit (hTERT) suppresses p53-mediated anti-apoptotic response via induction of basic fibroblast growth factor Exp Mol Med 2010; 42(8): 574-82

Поступила: 03.02.2015