СПОСОБ IN VITRO ВЫЯВЛЕНИЯ НЕДОСТАТОЧНОСТИ КИШЕЧНОГО БАРЬЕРА У ЖИВОТНЫХ ПУТЕМ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОВОТРАНСФЕРРИНА
IN VITRO METHOD FOR DETECTING INTESTINAL BARRIER INSUFFICIENCY IN ANIMALS BY DETERMINING OVOTRANSFERRIN

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу in vitro выявления недостаточности кишечного барьера у животных. Говоря более конкретно, настоящее изобретение относится к способу оценки состояния здоровья кишечника на основе белка острой фазы (APP) у отдельного животного и популяции животных соответственно.
Уровень техники изобретения
Состояние здоровья кишечника является крайне важным для здоровья и продуктивности сельскохозяйственных животных. Заболевания кишечника, которые влияют на структурную целостность желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), приводят к высоким экономическим потерям из-за сниженного прироста массы тела, низкой эффективности конверсии кормов, повышенных показателей падежа и более высоких затрат на лечение (M'Sadeq, S.A., Wu, S., Swick, R.A. & Choct, M. (2015). Towards the control of necrotic enteritis in broiler chickens with in-feed antibiotics phasing-out worldwide. Animal Nutrition, 1, 1-11; Timbermont, L., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. & Van Immerseel, F. (2011). Necrotic enteritis in broilers: an updated review on the pathogenesis. Avian Pathol, 40, 341-347).
Интактный кишечный барьер обеспечивает ряд физиологических и функциональных свойств, включающих переваривание и всасывание питательных веществ, метаболизм и выработку энергии у хозяина, устойчивый микробиом, развитие слизистых оболочек, барьерную функцию и иммунные реакции на слизистых оболочках (Kogut, M. H. and R. J. Arsenault (2016). Editorial: Gut health: The new paradigm in food animal production. Frontiers in Veterinary Science 3 (AUG)). Будучи самым крупным органом тела, кишечник служит в качестве селективного барьера для поглощения питательных веществ и жидкостей в организм, при этом исключаются нежелательные молекулы и патогены. Следовательно, надлежащая функция барьера кишечника необходима для поддержания оптимального состояния здоровья и баланса во всем организме, и она представляет собой ключевую линию защиты против чужеродных антигенов окружающей среды.
Кокцидиоз и некротический энтерит (NE), вероятно, являются наиболее распространенными заболеваниями кишечника у домашней птицы (Dalloul, R.A. & Lillehoj, H.S. (2006). Poultry coccidiosis: recent advancements in control measures and vaccine development. Expert Rev Vaccines, 5, 143-163; Williams, R.B. (2005). Intercurrent coccidiosis and necrotic enteritis of chickens: rational, integrated disease management by maintenance of gut integrity. Avian Pathol, 34, 159-180). У домашней птицы кокцидиоз может вызываться множеством видов, принадлежащих к роду Eimeria, из которого Eimeria acervulina, E. maxima и E. tenella являются наиболее распространенными видами у бройлеров с интенсивным разведением. В зависимости от видов поражения могут варьировать в диапазоне от ограниченного мальабсорбционного энтерита (E. acervulina) до более тяжелого воспаления стенки кишечника (E. maxima) и даже до обширного кровоизлияния в слепую кишку и летального исхода (E. tenella) (Chapman, H.D. (2014). Milestones in avian coccidiosis research: a review. Poult Sci, 93, 501-511). Кроме того, присутствие видов Eimeria также может усугубить последствие коинфекции бактериальными патогенами, такими как Clostridium perfringens (Moore, R.J. (2016). Necrotic enteritis predisposing factors in broiler chickens. Avian Pathol, 45, 275-281). Повреждение слизистой оболочки, вызванное этими кокцидийными патогенами, фактически представляет собой важный предрасполагающий фактор для возникновения некротического энтерита. NE является наиболее распространенным заболеванием, вызываемым клостридиями, у домашней птицы, которое, как правило, возникает у цыплят-бройлеров. Заболевание вызывается C. рerfringens,, и оно может проявляться либо в острой клинической или умеренный субклинической формах. Острый NE, как правило, приводит к массовому росту падежа поголовья животных. Субклиническая форма чаще характеризуется мультифокальным некрозом и воспалением тонкой кишки со значительным снижением показателя роста. Снижение этого показателя связано не только с нарушенной скоростью роста и конверсией корма в ходе выращивания, но и также с повышенными уровнями выбраковки бройлеров при их переработке из-за гепатита (Paiva, D. & McElroy, A. (2014). Necrotic enteritis: Applications for the poultry industry. Journal of Applied Poultry Research, 23, 557-566). И кокцидиоз, и некротический энтерит могут присутствовать в поголовье без проявления клинических признаков. Следовательно, многих птиц необходимо подвергнуть макроскопическому исследованию кишечника для диагностики заболевания.
Аналогичные соображения применимы к другим заболеваниям кишечника или патологическим состояниям у домашнего скота, которые приводят к повреждению слизистой оболочки, в частности, к тяжелой форме избыточного роста микрофлоры тонкой кишки, ко всем формам избыточного воспаления кишечника, к воздействию микотоксинов и к любому патологическому состоянию, которое приводит к недостаточности кишечного барьера. Кроме того, недостаточность кишечного барьера может позволять проникновение в системный кровоток микроорганизмов, которые в норме населяют ЖКТ, таких как, например, Enterococcus caecorum. Это может приводить к дополнительным заболеваниям, например артриту и остеомиелиту, и, наконец, приводить к пониженной продуктивности животных или поголовья животных соответственно.
Таким образом, крайне необходимы маркер или набор маркеров, которые могут точно выявить недостаточность кишечного барьера или воспаление кишечника и сопутствующее расстройство целостности кишечника на ранней их стадии.
В последнее время наблюдается повышенный интерес к изучению кишечной проницаемости у цыплят, что привело к появлению разных стратегий измерения воспаления кишечника и сопутствующей недостаточности кишечного барьера. Однако ни в одной из предложенных стратегий не был представлен маркер, подходящий для бройлерной промышленности, так как они либо не применимы в полевых условиях (например, пероральное введение маркера, который может быть измерен в крови в более поздний момент времени (Gilani, S., Howarth, G.S., Kitessa, S.M., Tran, C.D., Forder, R.E.A. & Hughes, R.J. (2017). New biomarkers for increased intestinal permeability induced by dextran sodium sulphate and fasting in chickens. J Anim Physiol Anim Nutr (Berl), 101, e237-e245; Vicuna, E.A., Kuttappan, V.A., Tellez, G., Hernandez-Velasco, X., Seeber-Galarza, R., Latorre, J.D., et al. (2015). Dose titration of FITC-D for optimal measurement of enteric inflammation in broiler chicks. Poult Sci, 94, 1353-1359), либо они неспецифичны при недостаточности кишечного барьера, например, сывороточные маркеры, уровень которых может быть повышен при патологических состояниях, отличных от патологических состояний желудочно-кишечного тракта (Chen, J., Tellez, G., Richards, J.D. & Escobar, J. (2015). Identification of Potential Biomarkers for Gut Barrier Failure in Broiler Chickens. Front Vet Sci, 2, 14; O'Reilly, E.L. & Eckersall, P.D. (2014). Acute phase proteins: a review of their function, behaviour and measurement in chickens. Worlds Poultry Science Journal, 70, 27-43; Xie, H., Newberry, L., Clark, F.D., Huff, W.E., Huff, G.R., Balog, J.M., et al. (2002). Changes in serum ovotransferrin levels in chickens with experimentally induced inflammation and diseases. Avian Dis, 46, 122-131).
Таким образом, остается необходимость в обеспечении быстрого и надежного, предпочтительно неинвазивного ante mortem способа определения того, страдает или нет отдельное животное или популяция животных от недостаточности кишечного барьера, который может быть осуществлен в полевых условиях с малыми затратами и с минимальными усилиями.
Краткое описание настоящего изобретения
Соответственно, одной целью настоящего изобретения является обеспечение способа in vitro выявления недостаточности кишечного барьера у животных, при этом способ предусматривает следующие стадии:
a) отбор материала кишечного образца у отдельного животного или популяции животных и
b) определение количества по меньшей мере одного белкового маркера, содержащегося в указанном материале образца,
где по меньшей мере один белковый маркер содержит овотрансферрин или его функциональный фрагмент или состоит из них,
и где повышенное количество указанного по меньшей мере одного белкового маркера, содержащегося в указанном образце, при сравнении с референтным образцом указывает на недостаточность кишечного барьера.
Дополнительным аспектом настоящего изобретения является применение овотрансферрина или его функциональных фрагментов в качестве кишечных маркеров для выявления недостаточности кишечного барьера у субъекта-животного или у популяции животных.
Дополнительной целью настоящего изобретения является обеспечение способа in vitro выявления степени недостаточности кишечного барьера у животных, при этом способ предусматривает следующие стадии:
a) отбор материала кишечного образца у конкретного животного или популяции животных и
b) определение количества по меньшей мере одного белкового маркера, содержащегося в материале образца,
где по меньшей мере один белковый маркер содержит овотрансферрин или его функциональный фрагмент или состоит из них,
и где количество указанного по меньшей мере одного белкового маркера, содержащегося в образце, указывает на степень недостаточности кишечного барьера.
И наконец, в настоящем изобретении представлен способ in vitro контроля состояния кишечного барьера у животных, при этом способ предусматривает следующие стадии:
a) отбор материала кишечного образца у конкретного животного или популяции животных в последовательные моменты времени,
b) определение количества по меньшей мере одного белкового маркера, содержащегося в образцах, полученных на стадии a), и
c) определение отклонений в количествах указанного по меньшей мере одного белкового маркера, содержащегося в образцах, полученных на стадии a),
где по меньшей мере один белковый маркер содержит овотрансферрин или его функциональный фрагмент или состоит из них.
Ключевые аспекты настоящего изобретения подробно описаны далее.
Подробное описание изобретения
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что количество маркеров на основе белка острой фазы (APP), содержащихся в материале образца животного происхождения, коррелирует с проявлением недостаточности кишечного барьера. В частности, было установлено, что количество овотрансферрина или его функционального фрагмента в материале кишечного образца животного происхождения коррелирует с недостаточностью кишечного барьера.
Более конкретно авторы настоящего изобретения выявили, что повышение количества овотрансферрина или его функциональных фрагментов, содержащегося в материале кишечного образца животного происхождения, при сравнении с эталонным образцом указывает на недостаточность кишечного барьера.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу in vitro выявления недостаточности кишечного барьера у животных, при этом способ предусматривает следующие стадии:
a) отбор материала кишечного образца у отдельного животного или популяции животных и
b) определение количества по меньшей мере одного белкового маркера, содержащегося в указанном материале образца,
где по меньшей мере один белковый маркер содержит овотрансферрин или его функциональный фрагмент или состоит из них,
и где повышенное количество указанного по меньшей мере одного белкового маркера, содержащегося в указанном образце, при сравнении с референтным образцом указывает на недостаточность кишечного барьера.
Используемый в контексте настоящего изобретения термин «недостаточность кишечного барьера» относится к патологическим состояниям, при которых функция кишечного барьера является в значительной степени нарушенной (например, вследствие оксидативного стресса, недостаточной усвояемости белков, кокцидиоза и т. д.), и включает патологические состояния, представляющие собой дисфункцию кишечного барьера, синдром повышенной проницаемости кишечника/кишечную гиперпроницаемость, и патологические состояния, вызванные гистопатологическими повреждениями. Недостаточность кишечного барьера часто ассоциируется с воспалительными процессами. Термин «недостаточность кишечного барьера» и «недостаточность барьера кишечника» может использоваться взаимозаменяемо.
Референтный образец представляет собой видоспецифический контроль, представляющий интактный кишечный барьер или барьер кишечника. Подходящие референтные образцы являются образцами, полученными от отдельного животного или от популяции животных тех же видов животных или подвидов, при условии, что указанное животное или указанная популяция животных характеризуется подтвержденным интактным кишечным барьером.
В качестве примера референтный образец может быть получен в рамках испытания на животных от контрольного животного, не подвергнутого обработке, которого проверяли с помощью патологических, гистопатологических и/или других анализов в отношении отсутствия признаков недостаточности кишечного барьера.
Овотрансферриновые маркеры можно выявлять и определять количественно с применением общеизвестных традиционных методик, таких как иммуноанализы, например, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), иммунохроматографические анализы, масс-спектрометрические (MS) анализы или любой способ, обеспечивающий возможность выявления белков или их функциональных фрагментов.
В одном конкретном варианте осуществления овотрансферрин или его функциональные фрагменты выявляют и количественно определяют посредством ELISA.
Применение моноклональных антител позволяет проводить специфическое выявление в матрице сложного образца, используемой для анализа.
Способ по настоящему изобретению можно применять для определения того, страдает ли отдельное животное недостаточностью кишечного барьера. В этом случае материал кишечного образца получают от отдельного животного.
Отдельное животное может являться, например, домашним питомцем или домашним животным, выращиваемым на ферме животным, вовлеченным в животноводство, дикоживущим животным или животным зоопарка. Кроме того, отдельных животных, которых транспортируют на убой или к новому месту содержания, можно обследовать с помощью описанного выше способа.
В одном варианте осуществления отдельное животное представляет собой субъекта-птицу.
Субъект-птица, подлежащая тестированию, предпочтительно является домашней птицей. Предпочтительной домашней птицей в соответствии с настоящим изобретением являются куры, индейки, утки и гуси. Домашняя птица может иметь характеристики, оптимальные для получения поголовья молодняка. Данный тип домашней птицы также называется родительскими и прародительскими животными. Предпочтительными родительскими и прародительскими животными, соответственно, являются (пра)родительские бройлеры, (пра)родительские утки, (пра)родительские индейки и (пра)родительские гуси.
Домашняя птица в соответствии с настоящим изобретением также может быть выбрана из декоративной птицы и пернатой дичи. Предпочтительной декоративной птицей или пернатой дичью являются павлины, фазаны, куропатки, цесарки, перепела, глухари, гуси, голуби и лебеди. Кроме того, предпочтительной домашней птицей в соответствии с настоящим изобретением являются страусы и попугаи. Наиболее предпочтительной домашней птицей в соответствии с настоящим изобретением являются бройлеры.
Материал кишечного образца, полученный от отдельного животного, может быть выбран из группы, состоящей из образцов содержимого кишечника, образцов экскрементов организма и их растворов или суспензий; и из материалов, загрязненных экскрементами организма. Термин «содержимое кишечника» следует понимать как содержимое тонкой кишки, содержимое толстой кишки и/или содержимое слепой кишки. Способы получения таких образцов содержимого кишечника известны в данной области техники.
Используемые в контексте настоящего изобретения образцы экскрементов организма представляют собой фекалии или экскременты из слепой кишки. Материалы, загрязненные экскрементами организма, представляют собой, например, образцы пыли, мазковые образцы, образцы помета, образцы жидкого навоза, образцы меха, образцы перьев и образцы кожи.
В целом термин «помет» следует понимать как смесь экскрементов животного с материалом подстилки.
Используемый в контексте данного варианта осуществления термин «образцы помета» относится к выделенным экскрементам отдельного животного. Кроме того, в контексте данного варианта осуществления термин «образцы жидкого навоза» относится к образцу экскрементов, содержащему фекалии и мочу отдельного животного.
Образцы от отдельных животных также можно отбирать непосредственно у животного, например, с помощью тампонов. В качестве альтернативы и особенно в случае индивидуального содержания животных материал образца можно собирать с пола загона, клетки или настила. Материал образца должен быть обозначен в соответствии с исследуемым животным.
В одном варианте осуществления материал кишечного образца, используемый для определения того, страдает ли отдельное животное недостаточностью кишечного барьера, представляет собой фекалии.
Для определенных вариантов применения также применим анализ образцов содержимого кишечника, например, образцов из тонкой кишки, образцов из толстой кишки и/или образцов из слепой кишки.
Подходящие значения объема образца составляют, например, от 0,05 мл до 20 мл или от 0,1 до 20 мл, в частности от 0,2 до 10 мл, предпочтительно от 0,5 до 5 мл. Подходящие значения веса образца составляют, например, от 0,05 г до 20 г или от 0,1 до 20 г, в частности от 0,2 до 10 г, предпочтительно от 0,5 до 5 г.
В альтернативном варианте осуществления способ применяют для определения того, страдает ли популяция животных недостаточностью кишечного барьера. В этом случае материал образца получают от группы животных, подлежащих тестированию.
Используемый в данном документе термин «популяция животных» относится к группе отдельных животных одного вида. Популяция животных может, например, представлять собой группу домашних питомцев или домашних животных, вовлеченных в разведение животных, группу выращиваемых на ферме животных, вовлеченных в производстве животноводческой продукции или разведение скота, или группу дикоживущих животных или животных зоопарка.
В одном варианте осуществления популяция животных представляет собой поголовье животных, вовлеченных в процессы производства животноводческой продукции. Например, популяция животных или поголовье животных может представлять собой поголовье птиц; поголовье овец, коз или крупного рогатого скота, поголовье лошадей или поголовье свиней.
В одном конкретном варианте осуществления популяция животных представляет собой популяцию птиц.
Популяция животных предпочтительно представляет собой поголовье птиц. Поголовье птиц в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно представляет собой поголовье домашних птиц. Предпочтительной домашней птицей в соответствии с настоящим изобретением являются куры, индейки, утки и гуси. Домашняя птица может иметь характеристики, оптимальные для получения поголовья молодняка. Данный тип домашней птицы также называется родительскими и прародительскими животными. Предпочтительными родительскими и прародительскими животными, соответственно, являются (пра)родительские бройлеры, (пра)родительские утки, (пра)родительские индейки и (пра)родительские гуси.
Домашняя птица в соответствии с настоящим изобретением также может быть выбрана из декоративной птицы и пернатой дичи. Предпочтительной декоративной птицей или пернатой дичью являются павлины, фазаны, куропатки, цесарки, перепела, глухари, гуси, голуби и лебеди. Кроме того, предпочтительной домашней птицей в соответствии с настоящим изобретением являются страусы и попугаи. Наиболее предпочтительной домашней птицей в соответствии с настоящим изобретением являются бройлеры.
Способ по настоящему изобретению является особенно подходящим для определения состояния здоровья популяции животных посредством массового тестирования. Используемый в данном документе термин «массовое тестирование» относится к способу тестирования, в котором материал образца представляет собой объединенный образец от популяции животных. «Объединенный образец» в контексте данного варианта осуществления следует понимать как смешанный образец из выбранных произвольным образом отдельных образцов, при этом один образец отобран с помощью одного или более увлажненных тканевых тампонов на палочке, или объединенные образцы получены из отдельных свежих образцов, отобранных произвольным образом из ряда мест в помещении или в месте, где содержится популяция животных или поголовье животных. Перед проведением анализа образца может потребоваться гомогенизация материала образца. Подходящие методики гомогенизации известны в данной области техники.
Объединенные образцы отражают количество овотрансферрина, присутствующее в популяции животных.
Материал образца, полученный от отдельного животного, может быть выбран из группы, состоящей из образцов содержимого кишечника, образцов экскрементов организма и их растворов или суспензий; и из материалов, загрязненных экскрементами организма. Материалы, загрязненные экскрементами организма, представляют собой, например, образцы пыли, мазковые образцы, образцы помета, образцы жидкого навоза, образцы меха, образцы перьев и образцы кожи.
Используемый в контексте данного варианта осуществления термин «образцы помета» относится к смешанным выделенным экскрементам в загоне, клетке или на настиле. Кроме того, в контексте данного варианта осуществления термин «образцы жидкого навоза» относится к смешанным образцам экскрементов, содержащим фекалии и мочу.
Такие образцы помета могут быть, например, отобраны от популяции животных с помощью методики с использованием бахил или с помощью захватов-щипцов для мусора в различных местах в загоне.
Бахилы для сбора образцов с пола, обладающие достаточными поглощающими свойствами для впитывания влаги, являются особенно подходящими для отбора объединенных образцов у животных. Трубчатые марлевые чулки также приемлемы.
В случае популяции животных, которых содержат в клетках или с напольным содержанием, образцы экскрементов могут быть отобраны с помощью ленточного транспортера.
В одном варианте осуществления материал образца, используемый для определения того, страдает ли популяция животных недостаточностью кишечного барьера, представляет собой фекалии. Предпочтительно материал образца представляет собой объединенный образец фекалий, полученный от поголовья птиц.
В случае конкретных вариантов применения также применим анализ объединенных образцов содержимого кишечника, например, объединенных образцов из тонкой кишки, объединенных образцов из толстой кишки и/или объединенных образцов из слепой кишки.
Подходящие значения объема образца составляют, например, от 0,1 до 20 мл, в частности от 0,2 до 10 мл, предпочтительно от 0,5 до 5 мл. Подходящие значения веса образца составляют, например, от 0,1 до 20 г, в частности от 0,2 до 10 г, предпочтительно от 0,5 до 5 г.
В зависимости от материала образца и условий хранения целесообразной может быть стабилизация полученных образцов, чтобы избежать ферментативного расщепления овотрансферрина, содержащегося в образцах, например, посредством обработки образцов с помощью ингибиторов протеаз. Предпочтительно стабилизирующее средство добавляют к образцу непосредственно после отбора образца.
В соответствии с указанным выше один конкретный вариант осуществления по настоящему изобретению относится к способу in vitro выявления недостаточности кишечного барьера у поголовья птиц, при этом способ предусматривает следующие стадии:
a) отбор и объединение материала образца фекалий, полученного от указанного поголовья птиц;
b) необязательно стабилизацию объединенного материала образца и
c) определение количества овотрансферрина, содержащегося в указанном объединенном материале образца,
где повышенное количество овотрансферрина, содержащегося в образце, при сравнении с референтным образцом указывает на недостаточность кишечного барьера.
В дополнение к указанному выше авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что количество овотрансферрина, содержащегося в материале кишечного образца, полученного от отдельного животного или от популяции животных коррелирует со степенью недостаточности кишечного барьера. Соответственно, в настоящем изобретении представлен способ in vitro выявления степени недостаточности кишечного барьера у животных, при этом способ предусматривает следующие стадии:
a) отбор материала кишечного образца у конкретного животного или популяции животных и
b) определение количества по меньшей мере одного белкового маркера, содержащегося в материале образца,
где по меньшей мере один белковый маркер содержит овотрансферрин или его функциональный фрагмент или состоит из них,
и где количество указанного по меньшей мере одного белкового маркера, содержащегося в образце, указывает на степень недостаточности кишечного барьера.
Подходящие материалы образцов, параметры тестирования и условия указаны выше.
В особенно предпочтительном варианте осуществления материал кишечного образца представляет собой объединенный образец фекалий, полученный от поголовья птиц, и по меньшей мере один белковый маркер представляет собой овотрансферрин или его функциональный фрагмент.
В настоящем изобретении представлены вышеуказанные способы выявления недостаточности кишечного барьера и, соответственно, определения ее степени. Это позволяет фермеру принимать компетентное решение в плане того, следует ли принимать меры по улучшению состояния здоровья кишечника.
Меры, направленные против развития и/или прогрессирования недостаточности кишечного барьера, включают скармливание или введение лечебно-профилактических веществ, таких как зоотехнические кормовые добавки или терапевтические средства. Выражение «введение» или связанные с ним выражения включают пероральное введение. Пероральное введение может осуществляться с помощью питьевой воды, зонда для перорального введения, распыляемого аэрозоля или корма для животных. Термин «зоотехническая кормовая добавка» относится к любой добавке, используемой для положительного воздействия на продуктивность здоровых животных или используемой для положительного воздействия на внутреннюю среду организма. Примерами зоотехнических кормовых добавок являются усилители перевариваемости, т. е. вещества, которые при скармливании животным повышают перевариваемость рациона за счет воздействия на целевые кормовые материалы; стабилизаторы кишечной микрофлоры; микроорганизмы или другие вещества с химически установленным составом, которые при скармливании животным проявляют положительный эффект в отношении микрофлоры кишечника; или вещества, которые положительно воздействуют на внутреннюю среду организма. Предпочтительно лечебно-профилактические вещества выбраны из группы, состоящей из пробиотических средств, пребиотических средств, лекарственных средств на основе растительного сырья, органических/жирных кислот, цеолитов, бактериофагов и бактериолитических ферментов или любых их комбинаций.
Авторы настоящего изобретения установили, что процедуры тестирования, лежащие в основе настоящего изобретения, также могут использоваться для осуществления контроля состояния здоровья кишечника у животных.
Используемый в контексте данного варианта осуществления термин «состояние здоровья кишечника» относится к состоянию кишечного барьера.
Посредством вышеуказанного способа может быть выявлено развитие или прогрессирование недостаточности кишечного барьера. С другой стороны, эффективность принятых мер, направленных против развития и/или прогрессирования недостаточности кишечного барьера, можно контролировать.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу in vitro контроля состояния кишечного барьера у животных, при этом способ предусматривает следующие стадии:
a) отбор материала кишечного образца у конкретного животного или популяции животных в последовательные моменты времени,
b) определение количества по меньшей мере одного белкового маркера, содержащегося в образцах, полученных на стадии a), и
c) определение отклонений в количествах указанного по меньшей мере одного белкового маркера, содержащегося в образцах, полученных на стадии a),
где по меньшей мере один белковый маркер содержит овотрансферрин или его функциональный фрагмент или состоит из них.
В этом способе повышение количества овотрансферрина в течение некоторого времени указывает на развитие или прогрессирование недостаточности кишечного барьера. В свою очередь, снижение количества овотрансферрина в течение некоторого времени указывает на улучшение состояния здоровья кишечника, которое может быть обусловлено естественными процессами выздоровления или конкретными мерами, принимаемыми против развития или прогрессирования недостаточности кишечного барьера.
«Повышение» или «снижение» количества овотрансферрина, как правило, относится к статистически значимому количеству.
Подходящие материалы образцов, и параметры тестирования, и условия указаны выше. В конкретном варианте осуществления материал кишечного образца представляет собой объединенный образец, полученный от поголовья птиц, и по меньшей мере один белковый маркер представляет собой овотрансферрин или его функциональный фрагмент.
В качестве примера после исходного определения количества овотрансферрина в кишечном образце количество указанного по меньшей мере одного конкретного биомаркера можно отслеживать в тестируемом образце, отбираемом и анализируемом один раз в неделю, один раз день или каждый час. В одном варианте осуществления образцы экскрементов отбирали и анализировали в последовательные дни. Тестируемый образец экскрементов можно отбирать и анализировать ежедневно от рождения до убоя.
В конкретном варианте осуществления для домашней птицы первый тестируемый образец предпочтительно отбирали и анализировали в ходе фазы начального роста (стартерная фаза, с 5 дня по 10 день), второй тестируемый образец отбирали и анализировали в ходе фазы усиленного роста (с 11 дня по 18 день) и необязательно третий тестируемый образец отбирали и анализировали на более поздней стадии.
В альтернативном варианте осуществления первый тестируемый образец отбирали и анализировали в фазе начального роста, а дополнительные тестируемые образцы отбирали и анализировали, например, ежедневно в ходе фазы усиленного роста, необязательно до убоя.
Дополнительным аспектом настоящего изобретения является применение овотрансферрина или его функциональных фрагментов в качестве кишечных маркеров для выявления недостаточности кишечного барьера у субъекта-животного или у популяции животных. Конкретным вариантом осуществления по настоящему изобретению является применение овотрансферрина в качестве фекального маркера для выявления недостаточности кишечного барьера у субъекта-птицы или у популяции птиц.
Вариантами применения способов в соответствии с настоящим изобретением являются, например, (i) содействие диагностированию
и/или прогнозированию недостаточности кишечного барьера, вызванного заболеванием кишечника; (ii) контроль прогрессирования или повторного возникновения недостаточности кишечного барьера или (iii) содействие в оценке эффективности лечения популяции животных, которых подвергают лечению или в отношении которых предполагается проведение лечения.
Варианты применения настоящего изобретения, в частности, помогают избежать снижения показателей продуктивности животных, как, например, прироста массы тела и конверсии корма.
Далее настоящее изобретение проиллюстрировано неограничивающими примерами и иллюстративными вариантами осуществления.
Примеры
Кокцидиоз и некротический энтерит у цыплят-бройлеров использовали в качестве модельных заболеваний для индуцирования недостаточности кишечного барьера. В качестве белкового маркера выступал овотрансферрин.
Испытания с использованием модели некротического энтерита – отбор образцов
8
Группам из 27 суточных цыплят-бройлеров Ross 308 скармливали рацион, богатый белками и некрахмальными полисахаридами, что провоцирует развитие некротического энтерита. Подробно состав рациона был описан Gholamiandehkordi et al. (Gholamiandehkordi, A.R., Timbermont, L., Lanckriet, A., Van Den Broeck, W., Pedersen, K., Dewulf, J., et al. (2007). Quantification of gut lesions in a subclinical necrotic enteritis model. Avian Pathol, 36, 375-382). Другие провоцирующие факторы включали введение вакцины Гамборо для индуцирования умеренной иммунодепрессии и десятикратной дозы вакцины против кокцидиоза (либо Paracox-8, либо Hipracox в зависимости от испытания) для индуцирования провоцирующего кишечного повреждения. Для индуцирования некротических поражений животных заражали с использованием примерно 4,10 КОЕ netB-положительного штамма CP56 C. рerfringens в течение трех последовательных дней, а затем животных подвергали эвтаназии. При вскрытии проводили балльную оценку поражения в тонком кишечнике (двенадцатиперстной кишке, тощей кишке и подвздошной кишке, как это описано в Keyburn et al.) (Keyburn, A.L., Sheedy, S.A., Ford, M.E., Williamson, M.M., Awad, M.M., Rood, J.I., et al. (2006). Alpha-toxin of Clostridium perfringens is not an essential virulence factor in necrotic enteritis in chickens. Infect Immun, 74, 6496-6500) следующим образом: 0 баллов = поражения отсутствуют, 1 балл = гиперемия слизистой оболочки кишечника, 2 балла = точечный некроз или изъязвления (1–5 очагов), 3 балла = точечный некроз или изъязвления (6–15 очагов), 4 балла = точечный некроз или изъязвления (≥ 16 очагов), 5 баллов = некротические пятна длиной 2–3 см, 6 баллов = диффузный некроз. Птиц с поражением, соответствующим 2 баллам или выше относят к положительным по некротическому энтериту. Свежие образцы из клоаки отбирали у всех птиц и замораживали при –70°C. Кроме того, смешанный помет отбирали в каждом загоне и замораживали при –70°C.
После балльной оценки поражений образцы распределяли в группы в соответствии с тяжестью заболевания у животного, что дало следующие группы по тяжести заболевания: птицы, которые получили все провоцирующие факторы, но которых не заражали с использованием C. perfringens: отрицательный контроль; птицы, которых заражали с использованием C. рerfringens,, но у которых отсутствовал некроз: 0 баллов, или которых заражали с использованием C. рerfringens и с разными степенями тяжести: 2 балла (умеренная), 3–4 балла (средней тяжести) или 5–6 баллов (тяжелая).
Испытания с использованием модели кокцидиоза – отбор образцов
Пятнадцатидневных кур-бройлеров Ross 308 перорально заражали с использованием E. acervulina и E. tenella. Один смешанный образец помета из каждого загона и образцы из клоаки от всех птиц отбирали через 7 дней после заражения птиц, при этом цыплят подвергали эвтаназии для балльной оценки поражения с использованием способа Джонсона и Рида (Johnson, J. & Reid, W.M. (1970). Anticoccidial drugs: lesion scoring techniques in battery and floor-pen experiments with chickens. Exp Parasitol, 28, 30-36). В тот же день смешанный помет и образцы содержимого клоаки отбирали у контрольных животных соответствующей возрастной группы. У всех зараженных птиц проявлялись макроскопически видимые поражения, вызванные инфекцией Eimeria, со средним баллом кокцидиоза, составившим 5,11 ± 0,51, при этом только одна из птиц в незараженной контрольной группе была положительной по кокцидиозу (балл кокцидиоза = 1). Все образцы хранили при –70°C.
Выявление овотрансферрина с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA)
Отбирали восемь образцов из группы птиц отрицательного контроля (которых не заражали с использованием C. perfringens) и восемь образцов из группы балльной оценки некроза у зараженных птиц. Также включали образцы помета, отобранные в день вскрытия (один образец помета на загон, всего 3 образца из загонов с птицами, не подвергнутых заражению, и 3 образца из загонов с птицами, подвергнутых заражению). Дополнительно определяли концентрацию овотрансферрина как в образцах из клоаки, так и в образцах помета из испытания с использованием модели кокцидиоза. Таким образом, использовали 1 образец помета на загон с в общей сложности 5 образцами из загонов с не подвергнутыми заражению птицами, и 6 образцами из загонов с птицами, зараженными Eimeria. Дополнительно отбирали 20 образцов из клоаки у птиц, которые либо заражали с использованием Eimeria(n = 10), либо контрольных птиц, которых не заражали (n = 10).
Необработанный клоакальный материал или гомогенизированный материал помета размораживали при комнатной температуре. 150 мг содержимого клоаки или материала помета разбавляли в 1500 мкл TBS (50 мМ трис, 150 мМ NaCl, pH = 7,2) со смесью ингибиторов протеаз (P2714, Sigma-Aldrich). Образцы смешивали посредством вихревого смесителя (2x, 1 мин). Белки (супернатанты) собирали после центрифугирования (13000 x g, 10’, 4°C) и использовали в двух параллелях (разбавление 1/50) в ELISA (Chicken Ovotransferrin ELISA, KT-530, Kamiya Biomedical Company, Теквила, США). ELISA проводили в соответствии с инструкцией производителя.
Статистический анализ
Нормальность распределения данных проверяли с помощью критерия нормальности распределения Д'Агостино-Пирсона.
Отличия в уровнях овотрансферрина между группами тяжести поражения некротическим энтеритом (измеренные с помощью ELISA) рассчитывали с использованием критерия Крускала-Уоллиса с последующим апостериорным критерием Данна.
Отличия в уровнях овотрансферрина между контрольными группами, зараженными с использованием Eimeria и не подвергнутыми заражению, рассчитывали с применением критерия Манна-Уитни.
Коэффициент ранговой корреляции Спирмена использовали для оценки взаимосвязи концентрации овотрансферрина в образцах из клоаки и либо балльной оценкой поражения некротическим энтеритом, либо балльной оценкой поражения кокцидиозом. Результаты привели в виде среднего значения и среднеквадратической погрешности среднего значения (SEM).
Корреляция концентрации овотрансферрина в фекалиях с тяжестью некротического энтерита
В большинстве образцов от птиц, страдающих либо умеренным некротическим энтеритом (2 балла), либо у которых отсутствовало поражение кишечника (группа и подвергнутых заражению, и группа животных отрицательного контроля) проявлялся слабый сигнал. В образцах от птиц с более тяжелой степенью некротического энтерита (балльная оценка некроза ≥ 3) определяли в значительной степени более высокую концентрацию овотрансферрина, чем в образцах от зараженных птиц, которые не демонстрировали заболевания кишечника (0 баллов), см. таблицу 1. Кроме того, наблюдали положительную корреляцию между тяжестью заболевания некротическим энтеритом и концентрацией овотрансферрина в фекальных образцах из in vivo испытания с NE (p = 0,0004).
В таблице 1 представлены данные по концентрации овотрансферрина (среднее значение ± среднеквадратическая погрешность среднего значения) в фекалиях птиц, которых подвергали воздействию всех провоцирующих факторов, но не заражали с использованием C. perfringens (отр. контр.; n = 8), или от птиц, которых заражали C. perfringens, что привело к некротическому энтериту разных степеней тяжести: без некротического поражения (0 баллов; n = 8); умеренный кишечный некроз (2 балла; n = 8); некротический энтерит средней тяжести (3–4 балла; n = 8) или тяжелый некроз (5–6 баллов; n = 8). * p < 0,05.
Корреляция концентрации овотрансферрина в фекалиях с тяжестью кокцидиоза
Птиц, которых заражали E. acervulina и E. tenella,, использовали в качестве второй модели недостаточности кишечного барьера. Уровни овотрансферрина в образцах от птиц, положительных по кокцидиозу, были повышены по сравнению с контролем, который не заражали (p = 0,0029). Кроме того, наблюдали положительную корреляцию между балльной оценкой кокцидиоза и концентрацией овотрансферрина в фекалиях (p = 0,0082). Данная разница в уровнях овотрансферрина также проявлялась в образцах помета, при этом в значительной степени более высокие уровни овотрансферрина выявляли в помете птиц, зараженных Eimeria, чем в образцах помета контрольных групп, не подвергнутых заражению (p = 0,0043), см. таблицу 2.
В таблице 2 представлены данные о концентрации овотрансферрина (среднее значение ± среднеквадратическая погрешность среднего значения) в фекалиях (серым) или смешанном помете (белым) от птиц, инфицированных кокцидиозом в ходе эксперимента (кокцидиоз; отдельные образцы фекалий: n = 10 или смешанные образцы помета: n = 6), или контрольных птиц, не подвергнутых заражению (отр. контр.; отдельные образцы фекалий: n = 10 или смешанные образцы помета: n = 5). Значимые отличия между группой, положительной по кокцидиозу, и контрольной группой, не подвергнутой заражению, обозначены с помощью ** p < 0,01.
Результаты
Как показано выше, повышенные уровни овотрансферрина в фекалиях измеряли с применением разных подходов у птиц, либо с экспериментально индуцированным кокцидиозом, либо с некротическим энтеритом, которые обуславливают недостаточность кишечного барьера. В образцах для анализа ELISA из разных in vivo испытаний с NE выявили, что овотрансферрин был более широко распространен в образцах от птиц, страдающих некротическим энтеритом, по сравнению с незараженными птицами. Дополнительно повышенные концентрации овотрансферрина определили в образцах птиц, положительных по кокцидиозу, по сравнению с их незараженным контролем.
Уровни овотрансферрина в фекалиях значимо коррелировали с тяжестью недостаточности кишечного барьера, обусловленного либо кокцидиозом, либо некротическим энтеритом.
Степень недостаточности кишечного барьера может быть классифицирована в зависимости от тяжести симптома в пораженных участках (например, некроза обусловленного некротическим энтеритом, индуцированного C. рerfringens) и величины площади пораженной поверхности. Степень недостаточности барьера кишечника является более тяжелой при NE, поскольку она связана с некрозом, при этом данная степень (исходя из площади поражения поверхности) более выражена при кокцидиозе.
Как показано выше с помощью экспериментов, измерение конкретного APP (овотрансферрина) представляет собой важное средство для оценки воспаления и сопутствующей недостаточности кишечного барьера, поскольку это может обеспечивать информацией о конкретных биологических процессах при заболеваниях, и представляет собой полезное средство для оценки эффективности молекул, которые снижают частоту возникновения расстройств желудочно-кишечного тракта.