СИСТЕМА, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ КАТАЛИЗИРУЕМУЮ ПЕРГИДРОЛАЗОЙ РЕАКЦИЮ
SYSTEM PROVIDING REACTION CATALYZED WITH PERHYDROLASE

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
По настоящей заявке испрашивается приоритет заявки США №61/577529, зарегистрированной 19 декабря 2011 года, таким образом, полностью включенной посредством ссылки.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0001] Часто желательным является сохранение состава компонентов, содержащихся раздельно до использования, например, вследствие того, что компоненты могут являться очень нестабильными при длительном хранении, если объединены. В таких случаях желательно иметь возможность смешивать компоненты состава эффективным и простым способом в момент использования.
[0002] Один из примеров состава, где желательным может являться сохранение раздельно компонентов состава, представляет собой составы для отбеливания зубов, содержащие реакционноспособные ингредиенты, такие как пероксиды или пероксикислоты или их предшественники. Например, можно объединять A+B или A+B+C с получением нестабильного отбеливателя X, но хранить A и B раздельно до этого момента. Трудность заключается в том, что во время использования смешивание должно быть быстрым, и распространение отбеливающего средства X по поверхности зубов должно быть эффективным. К сожалению, объединение многих гелей или других умеренно вязких веществ, как правило, не является эффективным способом быстрого смешивания химических веществ, если обычный потребитель смешивает вручную, это приводит к областям хорошо смешанного и плохо смешанного образца. Стоит только мешать вручную две вязкие строительные краски, чтобы просто увидеть проблему: в отличие от эффективного смешивания двух красителей ламинарный поток приводит к тому, что цвета располагаются в соседних полосах. Для непосредственного решения этой проблемы требуется больше времени и усилий при перемешивании, чем обычный пользователь мог бы уделить этой задаче, и этом случае реакционноспособные частицы X начинают разрушаться за минуту, таким образом, способ является непригодным.
[0003] Таким образом, существует потребность в продуктах, которые обеспечивают возможность того, что ингредиенты можно успешно и эффективно объединять в момент использования.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0004] Изобретение относится к многокамерной системе, где одна камера содержит раствор жидкости с низкой вязкостью, а другая содержит жидкость, порошок или смесь порошков, где камеры разделены хрупким или разрываемым барьером, таким образом, что при нажатии на одну камеру барьер разрушается, и компоненты камер могут смешиваться с образованием раствора, эмульсии, суспензии или выдавливаемого геля, которые можно дозировать через отверстие во второй камере, где раствор жидкости с низкой вязкостью содержит белок, обладающий пергидролазной активностью, который содержит опознавательный мотив семейства 7 углеводных эстераз, а другая камера или камеры содержат донор ацила, например, сложный эфир карбоновой кислоты, и источник пероксида, таким образом, что после смешивания содержимого камер обладающий пергидролазной активностью белок катализирует реакцию между пероксидом, выделяемым источником пероксида, и донором ацила с образованием перкислоты. При нанесении на зубы такая перкислота является высокоэффективной для отбеливания зубов, таким образом, что эффективное отбеливающее действие можно получать за более короткий период времени и при более низких уровнях пероксида.
[0005] В конкретном варианте осуществления одна камера содержит водный раствор с низкой вязкостью, содержащий белок, обладающий пергидролитической активностью (т.е. углеводную эстеразу семейства 7), а другая камера содержит гелеобразующее вещество, пероксид и соединение сложного эфира карбоновой кислоты, все в форме порошка, таким образом, что когда разрушают барьер и обеспечивают возможность смешивания содержимого камер, пероксид и сложный эфир карбоновой кислоты могут взаимодействовать, где реакция катализируется пергидролазой, с образованием перкислоты в выдавливаемом геле, образуемым жидкостью и гелеобразующим веществом, где выдавливаемый гель можно затем выдавливать и наносить на зубы, например, с использованием капы или полоски в течение достаточного периода времени, например, 10-30 минут, чтобы обеспечивать отбеливание зубов.
[0006] Дополнительные области применения по настоящему изобретению станут понятны из подробного описания, предоставленного далее в настоящем описании. Следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, несмотря на то, что обозначают предпочтительный вариант осуществления изобретения, предназначены только для целей иллюстрации и не предназначены ограничивать объем изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0007] Следующие ниже последовательности соответствуют 37 C.F.R. §§1.821-1.825 ("Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures - the Sequence Rules") и соответствуют стандарту ST.25 (2009) Всемирной организации по охране интеллектуальной собственности (WIPO) и требованиям к списку последовательностей Европейской патентной конвенции (EPC) и правилам 5.2 и 49.5 (a-bis) договора о патентной кооперации (PCT), и разделу 208 и приложения C административных инструкций. Символы и формат, используемые для данных нуклеотидов и аминокислотных последовательностей соответствуют правилам, указанным в 37 C.F.R. §1.822.
Thermotoga maritima
[0008] SEQ ID NO:  1 представляет собой аминокислотную последовательность пергидролазы варианта C277S .
Thermotoga maritima
[0009] SEQ ID NO: 2 представляет собой аминокислотную последовательность слитого белка, содержащего пергидролазу варианта C277S , связанного с доменом связывания с поверхностью зубов (также известным как "EZ-7" в публикации международной патентной заявки № WO 2012/087970 A2 на имя Butterick et al.).
Bacillus subtilis

тм
[0010] SEQ ID NO: 3 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую цефалоспорин-C-деацетилазу из  ATCC 31954.
Bacillus subtilis

тм
[0011] SEQ ID NO: 4 представляет собой аминокислотную последовательность цефалоспорин-C-деацетилазы из  ATCC 31954.
subtilis
Bacillus subtilis
[0012] SEQ ID NO: 5 представляет собой аминокислотную последовательность цефалоспорин-C-деацетилазы из штамма 168 подвида.
B. subtilis

тм
[0013] SEQ ID NO: 6 представляет собой аминокислотную последовательность цефалоспорин-C-деацетилазы из  ATCC 6633.
B. licheniformis

[0014] SEQ ID NO: 7 представляет собой аминокислотную последовательность цефалоспорин-C-деацетилазы из  ATCC 14580™.
B. pumilus
[0015] SEQ ID NO: 8 представляет собой аминокислотную последовательность ацетилксиланэстеразы из  PS213.
Clostridium thermocellum

[0016] SEQ ID NO: 9 представляет собой аминокислотную последовательность ацетилксиланэстеразы из  ATCC 27405™.
Thermotoga neapolitana
[0017] SEQ ID NO: 10 представляет собой аминокислотную последовательность ацетилксиланэстеразы из .
Thermotoga maritima
[0018] SEQ ID NO: 11 представляет собой аминокислотную последовательность ацетилксиланэстеразы из  MSB8.
Thermoanaerobacterium sp
[0019] SEQ ID NO: 12 представляет собой аминокислотную последовательность ацетилксиланэстеразы из . JW/SL YS485.
Bacillus halodurans
[0020] SEQ ID NO: 13 представляет собой аминокислотную последовательность цефалоспорин-C-деацетилазы из  C-125.
Bacillus clausii
[0021] SEQ ID NO: 14 представляет собой аминокислотную последовательность цефалоспорин-C-деацетилазы из  KSM-K16.
Thermotoga neapolitana
[0022] SEQ ID NO: 15 представляет собой аминокислотную последовательность варианта ацетилксиланэстеразы  из публикации патентной заявки США № 2010-0087529 (полностью включенной в настоящее описание посредством ссылки), где остаток Xaa в положении 277 представляет собой Ala, Val, Ser или Thr.
Thermotoga maritima
[0023] SEQ ID NO: 16 представляет собой аминокислотную последовательность варианта MSB8 ацетилксиланэстеразы  из публикации патентной заявки США № 2010-0087529, где остаток Xaa в положении 277 представляет собой Ala, Val, Ser или Thr.
Thermotoga lettingae
[0024] SEQ ID NO: 17 представляет собой получаемую аминокислотную последовательность варианта ацетилксиланэстеразы  из публикации патентной заявки США № 2010-0087529, где остаток Xaa в положении 277 представляет собой Ala, Val, Ser или Thr.
Thermotoga petrophila
[0025] SEQ ID NO: 18 представляет собой аминокислотную последовательность варианта ацетилксиланэстеразы  из публикации патентной заявки США № 2010-0087529, где остаток Xaa в положении 277 представляет собой Ala, Val, Ser или Thr.
Thermotoga
[0026] SEQ ID NO: 19 представляет собой аминокислотную последовательность варианта RQ2 ацетилксиланэстеразы  sp., получаемого из "RQ2(a)" из публикации патентной заявки США № 2010-0087529, где остаток Xaa в положении 277 представляет собой Ala, Val, Ser или Thr.
Thermotoga
[0027] SEQ ID NO: 20 представляет собой аминокислотную последовательность варианта RQ2 ацетилксиланэстеразы sp., получаемого из "RQ2(b)" из публикации патентной заявки США № 2010-0087529, где остаток Xaa в положении 278 представляет собой Ala, Val, Ser или Thr.
Thermotoga lettingae
[0028] SEQ ID NO: 21 представляет собой аминокислотную последовательность ацетилксиланэстеразы .
Thermotoga petrophila
[0029] SEQ ID NO: 22 представляет собой аминокислотную последовательность ацетилксиланэстеразы .
Thermotoga
[0030] SEQ ID NO: 23 представляет собой аминокислотную последовательность первой ацетилксиланэстеразы из  sp. RQ2, описанного как "RQ2(a)".
Thermotoga
[0031] SEQ ID NO: 24 представляет собой аминокислотную последовательность второй ацетилксиланэстеразы из  sp. RQ2, описанного как "RQ2(b)".
Thermoanearobacterium saccharolyticum
[0032] SEQ ID NO: 25 представляет собой аминокислотную последовательность цефалоспорин-C-деацетилазы .
Lactococcus lactis

[0033] SEQ ID NO: 26 представляет собой аминокислотную последовательность ацетилксиланэстеразы из  (номер доступа GENBANK ABX75634.1).
Mesorhizobium loti

[0034] SEQ ID NO: 27 представляет собой аминокислотную последовательность ацетилксиланэстеразы из  (номер доступа GENBANK BAB53179.1).
Mesorhizobium loti

[0034] SEQ ID NO: 27 представляет собой аминокислотную последовательность ацетилксиланэстеразы из  (номер доступа GENBANK BAB53179.1).
[0036] SEQ ID NO: 29-163 представляют собой аминокислотные последовательности пептидов, обладающих аффинностью к поверхности ротовой полости.
[0037] SEQ ID NO: 164-177 представляют собой аминокислотные последовательности пептидные линкеры/спейсеры.
[0038] SEQ ID NO: 178-197 представляют собой аминокислотные последовательности различных направленных слитых с пергидролазой конструкций, содержащих пергидролитический фермент, связанный через пептидный линкер со связывающим доменом, с аффинностью к поверхности ротовой полости (см. публикацию международной патентной заявки № WO 2012/087970A2 на имя Butterick et al.).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0039] Настоящее изобретение станет более понятно из подробного описания и сопровождающих чертежей, где:
[0040] на фигуре 1 проиллюстрирован один из вариантов осуществления изобретения, который представляет собой двухкамерную упаковку по изобретению, где упаковку запаивают по периметру (1), и она содержит первую камеру (2), которая содержит жидкий компонент, и вторую камеру (4), содержащую порошкообразный компонент, разделенные хрупкой перегородкой (3), таким образом, что когда надавливают на первую камеру (2), хрупкая перегородка (3) разрывается, и жидкость вливается во вторую камеру (4) и смешивается с порошком, что приводит к тому, что смесь затем можно дозировать, надламывая края с риской (5), чтобы обеспечивать возможность вытекания или выдавливания смеси из выпускного отверстия (6).
[0041] на фигуре 2 проиллюстрирован другой вариант осуществления изобретения, обеспечивающий возможность смешивания компонентов непосредственно перед использованием, как описано для фигуры 1, но в котором используют трехкамерную упаковку с выпускным отверстием, которое пользователь может открывать для дозирования продукта. В этом варианте осуществления упаковка содержит первую камеру (7), вторую камеру (8), третью камеру (9), где камеры разделены хрупкой перегородкой (3), и выпускное отверстие с отламываемым наконечником (6) для дозирования веществ после смешивания.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0042] Следующее ниже описание предпочтительного варианта(ов) осуществления по характеру является только иллюстративным и не предназначено каким-либо образом ограничивать изобретение, его нанесение или применения.
[0043] Как используют в настоящем описании, термины "субстрат", "подходящий субстрат", "донор ацила" и "субстрат сложного эфира карбоновой кислоты" взаимозаменяемо конкретно обозначают:
(a) один или более сложных эфиров со структурой
m
5
[X]R,
где
6
X представляет собой сложноэфирную группу формулы RC(O)O;
6
1
7
1
4
6
6
2
7
R представляет собой линейную, разветвленную или циклическую C-Cгидрокарбильную группу, необязательно замещенную гидроксильной группой или C-Cалкоксигруппой, где R необязательно содержит одну или более простых эфирных связей, где R представляет собой C-C;
5
1
6
5
5
R представляет собой линейную, разветвленную или циклическую C-Cгидрокарбильную группу или циклическую пятичленную гетероароматическую или шестичленную циклическую ароматическую или гетероароматическую группу, необязательно замещенную гидроксильной группой, где каждый атом углерода в R независимо содержит не более одной гидроксильной группы или не более одной сложноэфирной группы, и где R необязательно содержит одну или более простых эфирных связей;
5
m представляет собой целое число в диапазоне от 1 до числа атомов углерода в R,
растворимость в воде указанных одного или более сложных эфиров составляет по меньшей мере 5 м.д. при 25°C, или
(b) один или более глицеридов со структурой
,
1
1
7
1
4
3
4
1
где R представляет собой C-Cалкил с неразветвленной или разветвленной цепью, необязательно замещенный гидроксилом или C-Cалкоксигруппой, и R и R независимо представляют собой H или RC(O), или
(c) один или более сложных эфиров формулы
,
1
1
7
1
4
2
1
10
1
10
1
10
1
10
1
10
1
10
1
10
2
2
n
2
3
n
где R представляет собой C-Cалкил с неразветвленной или разветвленной цепью, необязательно замещенный гидроксилом или C-Cалкоксигруппой, и R представляет собой C-Cалкил, C-Cалкенил, C-Cалкинил, C-Cарил, C-Cалкиларил, C-Cалкилгетероарил, C-Cгетероарил с неразветвленной или разветвленной цепью, (CHCHO) или (CHCH(CH)-O)H, и n равно от 1 до 10, или
(d) один или более ацетилированных моносахаридов, ацетилированных дисахаридов или ацетилированных полисахаридов, или
(e) любую комбинацию из (a)-(d).
Как используют в настоящем описании, термин "перкислота" является синонимичной с пероксикислотой, пероксикарбоновой кислотой, надкислотой, перкарбоновой кислотой и пероксовой кислотой.
[0044] Как используют в настоящем описании, термин "перуксусная кислота" сокращенно обозначают как "PAA", и он является синонимичным с пероксиуксусной кислотой, надуксусной кислотой и семи другими синонимами регистрационного номера CAS 79-21-0.
[0045] Как используют в настоящем описании, термин "моноацетин" является синонимичным с глицеролмоноацетатом, моноацетатом глицерина и глицерилмоноацетатом.
[0046] Как используют в настоящем описании, термин "диацетин" является синонимичным с глицеролдиацетатом, диацетатом глицерина, глицерилдиацетатом и всеми другими синонимами регистрационного номера CAS 25395-31-7.
[0047] Как используют в настоящем описании, термин "триацетин" является синонимичным с триацетатом глицерина, глицеролтриацетатом, глицерилтриацетатом, 1,2,3-триацетоксипропаном, 1,2,3-пропантриолтриацетатом и всеми другими синонимами регистрационного номера CAS 102-76-1.
[0048] Как используют в настоящем описании, термины "ацетилированный сахар" и "ацетилированный сахарид" относятся к моно-, ди- и полисахаридам, содержащим по меньшей мере одну ацетильную группу. Примеры включают, но не ограничиваются ими, пентаацетат глюкозы, тетраацетат ксилозы, ацетилированный ксилан, фрагменты ацетилированного ксилана, β-D-рибофураноза-1,2,3,5-тетраацетат, три-O-ацетил-D-галактал и три-O-ацетилглюкал.
[0049] Как используют в настоящем описании, термины "гидрокарбил", "гидрокарбильная группа" и "гидрокарбильная функциональная группа" означает расположение атомов углерода с неразветвленной, разветвленной цепью или циклическое, соединенных одинарными, двойными или тройными связями углерод-углерод и/или простыми эфирными связями и замещенными, таким образом, атомами водорода. Такие гидрокарбильные группы могут быть алифатическими и/или ароматическими. Примеры гидрокарбильных групп включают метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, трет-бутил, циклопропил, циклобутил, пентил, циклопентил, метилциклопентил, гексил, циклогексил, бензил и фенил. В предпочтительном варианте осуществления гидрокарбильная группа представляет собой расположение атомов углерода с неразветвленной, разветвленной цепью или циклическое, соединенных одинарными связями углерод-углерод и/или простыми эфирными связями и замещенных, таким образом, атомами водорода.
1
7
[0050] Как используют в настоящем описании, термины "моноэфиры" и "диэфиры" 1,2-этандиола, 1,2-пропандиола, 1,3-пропандиола, 1,2-бутандиола, 1,3-бутандиола, 2,3-бутандиола, 1,4-бутандиола, 1,2-пентандиола, 2,5-пентандиола, 1,5-пентадиола, 1,6-пентандиола, 1,2-гександиола, 2,5-гександиола, 1,6-гександиола и их смесей означают указанные соединения, содержащие по меньшей мере одну сложноэфирную группу формулы RC(O)O, где R представляет собой линейную C-Cгидрокарбильную группу. В одном из вариантов осуществления субстрат сложного эфира карбоновой кислоты выбран из группы, состоящей из диацетата пропиленгликоля (PGDA), диацетата этиленгликоля (EDGA) и их смесей.
[0051] Как используют в настоящем описании, термин "диацетат пропиленгликоля" является синонимичным с 1,2-диацетоксипропаном, диацетатом пропилена, 1,2-пропандиолдиацетатом и всеми другими синонимами регистрационного номера CAS 623-84-7.
[0052] Как используют в настоящем описании, термин "диацетат этиленгликоля" является синонимичным с 1,2-диацетоксиэтаном, диацетатом этилена, гликольдиацетатом и всеми другими синонимами регистрационного номера CAS 111-55-7.
[0053] Как используют в настоящем описании, термины "подходящая смесь для ферментативной реакции", "подходящие для реакции компоненты", "подходящая водная реакционная смесь", "реакционная смесь" и "образующие перкислоту компоненты" относятся к веществам и воде, в которой контактируют реагенты и катализатор на основе пергидролитического фермента. Образующие перкислоту компоненты включают по меньшей мере фермент, обладающий пергидролитической активностью, где пергидролитический фермент представляет собой по меньшей мере одну пергидролазу CE-7 (необязательно в форме слитого белка, направленного на поверхность организма), по меньшей мере один подходящий субстрат сложного эфира карбоновой кислоты, источник пероксида и воду.
[0054] Как используют в настоящем описании, термин "пергидролиз" определяют как реакцию выбранного субстрата с пероксидом с образованием перкислоты. Как правило, неорганический пероксид подвергают взаимодействию с выбранным субстратом в присутствии катализатора с получением пероксикарбоновой кислоты. Как используют в настоящем описании, термин "химический пергидролиз" включает реакции пергидролиза, в которых субстрат (предшественник пероксикарбоновой кислоты) объединяют с источником пероксида водорода, где пероксикарбоновая кислота образуется в отсутствии ферментативного катализатора. Как используют в настоящем описании, термин "ферментативный пергидролиз" включает реакции пергидролиза, в которых субстрат сложного эфира карбоновой кислоты (предшественник перкислоты, "донор ацила") объединяют с источником пероксида водорода и воды, таким образом, чтобы ферментативный катализатор катализировал образование перкислоты.
[0055] Как используют в настоящем описании, термин "пергидролазная активность" относится к активности катализатора на единицу массы (например, миллиграмм) белка, сухой массы клеток или массы иммобилизованного катализатора.
[0056] Как используют в настоящем описании, "одну единицу ферментативной активности" или "одну единицу активности" или "Ед." определяют, как количество пергидролазной активности, необходимое для получения 1 мкмоль продукта пероксикарбоновой кислоты в минуту при конкретной температуре.
[0057] Как используют в настоящем описании, термины "ферментативный катализатор" и "катализатор на основе пергидролазы" относятся к катализатору, содержащему фермент, обладающий пергидролизной активностью, и который может находиться в форме целой бактериальной клетки, пермеабилизованной бактериальной клетки(ок), одного или более компонентов клетки экстракта бактериальных клеток, частично очищенного фермента или очищенного фермента. Ферментативный катализатор также может являться химически модифицированным (таким как посредством пегилирования или в результате взаимодействия с поперечно-сшитыми реагентами). Катализатор на основе пергидролазы также может иммобилизовать на растворимой или нерастворимой подложке способами, хорошо известными специалистам в данной области, см. например, Immobilization of Enzymes and Cells, Gordon F. Bickerstaff, Editor, Humana Press, Totowa, NJ, USA, 1997.
[0058] Как используют в настоящем описании, "ацетилксиланэстеразы" относятся к ферменту (E.C. 3.1.1.72, AXE), который катализирует деацетилирование ацетилированных ксиланов и других ацетилированных сахаридов.
[0059] Как используют в настоящем описании, термины "цефалоспорин-C-деацетилаза" и "цефалоспорин-C-ацетилгидролаза" относятся к ферменту (E.C. 3.1.1.41), который катализирует деацетилирование цефалоспоринов, таких как цефалоспорин C и 7-аминоцефалоспориновой кислоты (Mitsushima et al., (1995) Appl. Env. Microbiol., 61 (6): 2224-2229). В настоящем описании предоставлены аминокислотные последовательности некоторых цефалоспорин-C-деацетилаз, обладающих достаточной пергидролитической активностью.
Bacillus subtilis
B. subtilis
тм
ти
тм
[0060] Как используют в настоящем описании, термин " ATCC 31954" относится к бактериальной клетке, депонированной в American Type Culture Collection (ATCC) с международным депонируемым номером доступа ATCC 31954. Как описано в настоящем описании, фермент, обладающий достаточной пергидролазной активностью, из  ATCC 31954 предоставлен как SEQ ID NO: 4 (см. публикацию патентной заявки США № 2010-0041752).
Thermotoga maritima
Thermotoga maritima
Thermotoga maritima
[0061] Как используют в настоящем описании, термин " MSB8" относится к бактериальной клетке, для которой опубликовано, что она обладает ацетилксиланэстеразной активностью (GENBANK NP_227893.1, см. публикацию патентной заявки США № 2008-0176299). Аминокислотная последовательность фермента, обладающего пергидролазной активностью, из  MSB8 предоставлена как SEQ ID NO: 11. Варианты пергидролазы  MSB8 предоставлены как SEQ ID NO: 1 и 16.
[0062] Как используют в настоящем описании, "выделенная молекула нуклеиновой кислоты", "выделенный полинуклеотид" и "выделенный фрагмент нуклеиновой кислоты" используются взаимозаменяемо и обозначают полимер РНК или ДНК, который является одноцепочечным или двухцепочечным, необязательно содержащий синтетические, неприродные или измененные основания нуклеотида. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты в форме полимера ДНК может состоять из одного или более сегментов кДНК, геномной ДНК или синтетической ДНК.
[0063] Термин "аминокислота" относится к основной химической структурной единице белка или полипептида. Для обозначения конкретных аминокислот в настоящем описании используют следующие ниже сокращенные обозначения:
Аминокислота
Трехбуквенное сокращенное обозначение
Однобуквенное сокращенное обозначение
Аланин
Ala
A
Аргинин
Arg
R
Аспарагин
Asn
N
Аспарагиновая кислота
Asp
D
Цистеин
Cys
C
Глутамин
Gln
Q
Глутаминовая кислота
Glu
E
Глицин
Gly
G
Гистидин
His
H
Изолейцин
Ile
I
Лейцин
Leu
L
Лизин
Lys
K
Метионин
Met
M
Фенилаланин
Phe
F
Пролин
Pro
P
Серин
Ser
S
Треонин
Thr
T
Триптофан
Trp
W
Тирозин
Tyr
Y
Валин
Val
V
Любая аминокислота, или как определено в настоящем описании
Xaa
X
[0064] Как используют в настоящем описании, "выделенная молекула нуклеиновой кислоты", "выделенный полинуклеотид" и "выделенный фрагмент нуклеиновой кислоты" используются взаимозаменяемо и обозначают полимер РНК. Как используют в настоящем описании, термины "опознавательный мотив" и "диагностический мотив" обозначают консервативные структуры, встречающиеся в семействе ферментов, обладающих определенной активностью. Опознавательный мотив можно использовать для определения и/или идентификации семейства структурно родственных ферментов, обладающих аналогичной ферментативной активностью для определенного семейства субстратов. Опознавательный мотив может представлять собой одну непрерывную аминокислотную последовательность или набор непрерывных консервативных мотивов, которые совместно образуют опознавательный мотив. Как правило, консервативный мотив(ы) предоставлены аминокислотной последовательностью. В одном из вариантов осуществления пергидролитические ферменты, используемые в настоящих композициях и способах, содержат опознавательный мотив углеводной эстеразы CE-7.
Comput
Methods Genome Res
[0065] Как используют в настоящем описании, термин "программное обеспечение для анализа последовательностей" относится к любому компьютерному алгоритму или программному обеспечению, которое является пригодным для анализа нуклеотидных или аминокислотных последовательностей. "Программное обеспечение для анализа последовательностей" может являться коммерчески доступным или независимо разработанным. Характерное программное обеспечение для анализа последовательностей включает, но не ограничивается ими, пакет программ GCG (Wisconsin Package Version 9.0, Accelrys Software Corp., San Diego, CA), BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990)) и DNASTAR (DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, WI 53715 USA), CLUSTALW (например, версию 1.83, Thompson et al., Nucleic Acids Research, 22 (22): 4673-4680 (1994)), и программу FASTA, включающую алгоритм Смита-Уотермана (W.R. Pearson, . ., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(s): Suhai, Sandor. Publisher: Plenum, New York, NY), Vector NTI (Informax, Bethesda, MD) и Sequencher v. 4.05. В рамках такого применения следует понимать, что в случае, когда программное обеспечение для анализа последовательностей используют для анализа, результаты анализа будут основаны на "значения по умолчанию" указанной программы, если не указано иное. Как используют в настоящем описании "значения по умолчанию" означают любой набор значений или параметров, установленный производителем программного обеспечения, который исходно загружают с программным обеспечением при первой установке.
[0066] Термин "поверхность организма" относится к любой поверхности организма человека, которая может служить в качестве мишени для оказывающего благоприятное действие средства, такого как оказывающее благоприятное действие средство на основе перкислоты. Способы и композиции по настоящему изобретению относятся к применениям и продуктам для ротовой полости. В связи с этим, поверхность организма включает вещество ротовой полости/поверхность. В одном из вариантов осуществления вещество ротовой полости включает зубную эмаль.
[0067] Как используют в настоящем описании, термины "отбеливание зубов" и "придание зубам белизны" используют взаимозаменяемо для обозначения улучшения яркости (например, отбеливания) зуба или зубов.
[0068] Как используют в настоящем описании, "внутренние пятна" зубов относятся к получаемому цвету из хромогенов в эмали и нижележащем дентине. При старении естественный цвет зубов человека, как правило, становится более желтым вследствие утончения эмали и потемнения нижележащего желтого дентина. Для удаления внутренних пятен, как правило, необходимо использовать пероксиды или другие окисляющие химические вещества, которые проникают в эмаль и обесцвечивают внутренние хромогены.
[0069] В отличие от внутренней окраски "внешние пятна" образуется на поверхности зубов, когда экзогенные хромогенные вещества связываются с эмалью, как правило, в пелликуле, естественным образом покрывающей зубы. Большинство людей накапливают некоторый уровень неприглядных внешних пятен на своих зубах в течение длительного периода времени. Этому процессу окрашивания способствуют такие факторы как: (1) потребление содержащих танин продуктов питания и напитков, таких как кофе, чай или красное вино; (2) использование табачных изделий и/или (3) воздействие определенных катионных веществ (например, олова, железа и хлоргексидина). Эти вещества, как правило, сцепляются с гидроксиапатитной структурой эмали, что приводит к потере естественной окраски зуба и последующему снижению белизны зуба. С годами внешние пятна могут проникать в слой эмали и вызывать образование внутренних пятен.
[0070] Как используют в настоящем описании, термин "обесцвечивать" или "обесцвечивание" относится к процессу удаления пятна с поверхности ротовой полости. Пятно(а) могут представлять собой внутренние пятна, внешние пятна или их сочетание.
[0071] Как используют в настоящем описании, "эффективное количество фермента пергидролазы" относится к количеству фермента пергидролазы, необходимого для получения ферментативной активности, необходимой для конкретного применения. Специалист в данной области легко устанавливает такие эффективные количества, и они зависят от многих факторов, таких как конкретный используемый вариант фермента.
2
2
[0072] Как используют в настоящем описании, термины "пероксидный источник" и "источник пероксида" относится к соединениям, способным обеспечивать пероксид водорода в концентрации приблизительно 1 мМ или более, находясь в водном растворе, включая, но, не ограничиваясь ими, пероксид водорода, продукты присоединения пероксида водорода (например, продукт присоединения мочевина-пероксид водорода (пероксид карбамида)), пербораты и перкарбонаты. Как описано в настоящем описании, источник пероксида в отбеливающих полосках по настоящему изобретению находится в форме гранулярных частиц, где пользователь увлажняет гранулярные частицы пероксида для выделения эффективного количества пероксида водорода. Как описано в настоящем описании, концентрация пероксида водорода, обеспечиваемая соединением пероксида в водном реакционном составе, изначально составляет по меньшей мере 0,1 мМ или более при объединении компонентов реакции. В одном из вариантов осуществления концентрация пероксида водорода в водном реакционном составе составляет по меньшей мере 0,5 мМ. В одном из вариантов осуществления концентрация пероксида водорода в водном реакционном составе составляет по меньшей мере 1 мМ. В другом варианте осуществления концентрация пероксида водорода в водном реакционном составе составляет по меньшей мере 10 мМ. В другом варианте осуществления концентрация пероксида водорода в водном реакционном составе составляет по меньшей мере 100 мМ. В другом варианте осуществления концентрация пероксида водорода в водном реакционном составе составляет по меньшей мере 200 мМ. В другом варианте осуществления концентрация пероксида водорода в водном реакционном составе составляет 500 мМ или более. В еще одном варианте осуществления концентрация пероксида водорода в водном реакционном составе составляет 1000 мМ или более. Молярное отношение пероксида водорода к субстрату фермента, например, триглицериду, (HO:субстрат) в составе может составлять приблизительно от 0,002 до 20, предпочтительно приблизительно от 0,1 до 10 и наиболее предпочтительно приблизительно от 0,1 до 1.
2
n
[0073] Как используют в настоящем описании, термин "олигосахарид" относится к соединениям, содержащим от 2 по меньшей мере до 24 моносахаридных звеньев, связанных гликозидными связями. Термин "моносахарид" относится к соединению эмпирической формулы (CHO), где n≥3, углеродный скелет является неразветвленным, каждый атом углерода, за исключением одного атома, содержит гидроксильнную группу, и оставшийся атом углерода представляет собой альдегид или кетон при 1 атоме углерода. Термин "моносахарид" также относится к внутриклеточным циклическим полуацетальным или полукетальным формам.
[0074] Как используют в настоящем описании, термин "гидратируемый адгезив" относится к адгезивному веществу, которое можно гидратировать. Гидратируемый адгезив по существу является сухими и неадгезивным до гидратирования. После гидратации гидратируемый адгезив становится достаточно адгезивным, чтобы связываться с поверхностью зуба.
[0075] Как используют в настоящем описании, термин "эффективное количество" относится к количеству вещества, необходимому для получения желаемого действия.
[0076] Как используют в настоящем описании, термин "по существу неадгезивный до гидратирования" означает отсутствие прочности адгезии достаточной, для сцепления с поверхностью зубов до гидратации.
[0077] Под "идентичностью последовательности" подразумевают идентичность аминокислот с использованием программы для выравнивания последовательностей, например, ClustalW или BLAST, например, в основном как описано у Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J., "Basic local alignment search tool", J. Mol. Biol., (1990) 215 (3): 403-410, и Goujon M., McWilliam H., Li W., Valentin F., Squizzato S., Paern J., Lopez R., Nucleic Acids Research, (2010) 38 Suppl.: W695-9.
2-18
2-6
1-4
[0078] Доноры ацила для использования в настоящем изобретении, например, для получения перкислот при взаимодействии с пероксидом, выбраны из одного или более из (i) Cкарбоновых кислот, например, Cкарбоновых кислот (например, уксусной кислоты), включая низшие линейные или разветвленные алкилкарбоновые кислоты, необязательно замещенные гидрокси и/или Cалкокси; (ii) их гидролизуемые и приемлемые сложные эфиры (например, моно-, ди- и триглицериды и ацилированные сахариды) и (iii) их смесей. Например, доноры ацила включают 1,2,3-триацетоксипропан (иногда обозначаемый в настоящем описании как триацетин или глицеринтриацетат) и ацилированные сахариды, например, ацетилированные сахариды. В конкретном варианте осуществления сложные эфиры для такого применения могут, например, представлять собой сложные эфиры с растворимостью в воде по меньшей мере 5 м.д. при 25°C.
[0079] Доноры ацила и/или ферменты могут необязательно являться инкапсулированными. Существуют различные средства как природные, так и синтетические для инкапсулирования, хорошо известные специалисту в данной области. Особенно подходящими являются модифицированные крахмалы и гуммиарабик, т.к. они являются пищевыми, относительно недорогими, быстрорастворимыми и могут адсорбировать относительно высокие уровни жидких масел. Необходимо учитывать любое влияние на конечную вязкость.
[0080] В некоторых вариантах осуществления гранулы содержат антисенсибилизирующее средство, способное десенсибилизировать нервы или вызывать окклюзию дентинных канальцев. В некоторых вариантах осуществления антисенсибилизирующее средство выбрано из источника ионов калия, силиката, источника ионов олова, основной аминокислоты, глины и их сочетания. В некоторых вариантах осуществления источник ионов калия представляет собой перорально приемлемую калиевую соль и содержится в количестве, эффективном для снижения чувствительности дентина. В некоторых вариантах осуществления источник ионов калия выбран из хлорида калия, нитрата калия и их сочетания. В некоторых вариантах осуществления основная аминокислота представляет собой аргинин. В некоторых вариантах осуществления основная аминокислота выбрана из фосфата аргинина, бикарбоната аргинина и гидрохлорида аргинина. В некоторых вариантах осуществления силикат представляет собой силикат кальция.
Пергидролазы CE-7
[0081] Композиции и способ по настоящему изобретению содержат ферменты, обладающие пергидролитической активностью, которые структурно классифицируют как ферменты представителей семейства углеводных эстераз 7 (семейства CE-7) (см. Coutinho P.M., Henrissat B. "Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach" in Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering, H.J. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat and B. Svensson eds., (1999) The Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 3-12.). Продемонстрировано, что семейство CE-7 ферментов является особенно эффективным для получения пероксикарбоновых кислот из ряда субстратов сложных эфиров карбоновых кислот при объединении с источником пероксида (патенты США 7794378, 7951566, 7723083 и 7964378 и публикация патентной заявки США №2008-0176299, 2010-0087529, 2011-0081693 и 2011-0236335 на имя DiCosimo et al., каждая включена в настоящее описание посредством ссылки).
[0082] Представители семейства CE-7 включают цефалоспорин-C-деацетилазы (CAH, E.C. 3.1.1.41) и ацетилксиланэстеразы (AXE, E.C. 3.1.1.72). Представители семейства эстераз CE-7 содержат консервативный опознавательный мотив (Vincent et al., J. Mol. Biol., 330:593-606 (2003)). Пергидролазы, содержащие опознавательный мотив CE-7 ("пергидролазы CE-7"), и/или по существу аналогичную структуру, являются пригодными для использования в композициях и способах, описываемых в настоящем описании. Способы идентификации по существу аналогичных биологических молекул хорошо известны в данной области (например, протоколы выравнивания последовательностей, гибридизация нуклеиновой кислоты и/или наличие консервативного опознавательного мотива). В одном из аспектов пергидролаза включает фермент, содержащий опознавательный мотив CE-7 и обладающий по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 33%, более предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 42%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью аминокислот с одной из последовательностей, предоставленных в настоящем описании.
Thermotoga maritima
[0083] Как используют в настоящем описании, фраза "фермент структурно классифицируют как фермент CE-7", "пергидролаза CE-7" или "структурно классифицированный как фермент семейства 7 углеводных эстераз" используют для обозначения ферментов, обладающих пергидролитической активностью, которые структурно классифицируют как углеводную эстеразу CE-7. Это семейство ферментов можно идентифицировать по наличию опознавательного мотива (Vincent et al., выше). Опознавательный мотив для эстераз CE-7 содержит три консервативных мотива (нумерация положений остатков относительно эталонной последовательности SEQ ID NO: 1, вариант C277S пергидролазы ).
Arg118-Gly119-Gln120;
Ser188
Gly186-Xaa187--Gln189-Gly190 и
His303
-Glu304.
[0084] Как правило, Xaa в положении 187 аминокислотного остатка представляет собой глицин, аланин, пролин, триптофан или треонин. Два из трех аминокислотных остатков, принадлежащих к каталитической триаде, обозначены жирным шрифтом. В одном из вариантов осуществления Xaa в положении 187 аминокислотного остатка выбрана из группы, состоящей из глицина, аланина, пролина, триптофана и треонина.
[0085] Дополнительный анализ консервативных мотивов в семействе углеводных эстераз CE-7 указывает на наличие дополнительного консервативного мотива (LXD в положения аминокислот 272-274 SEQ ID NO: 1), который можно использовать для дополнительного определения пергидролазы, принадлежащей к семейству углеводных эстераз CE-7. В дополнительном варианте осуществления определяемый выше опознавательный мотив может содержать дополнительный (четвертый) консервативный мотив, определяемый как:
Asp274
Leu272-Xaa273-.
Ser188
Asp274
His303
[0086] Xaa в положении 273 аминокислотного остатка, как правило, представляет собой изолейцин, валин или метионин. Четвертый мотив содержит остаток аспарагиновой кислоты (жирным шрифтом), принадлежащий к каталитической триаде (--).
[0087] Пергидролазы CE-7 могут находиться в форме слитых белков, содержащих по меньшей мере один пептидный компонент, обладающий аффинностью по меньшей мере к одной поверхности организма. В одном из вариантов осуществления все выравнивания, используемые для определения, содержит ли направленная пергидролаза (слитый белок) опознавательный мотив CE-7, основаны на аминокислотной последовательности пергидролитического фермента без пептидного компонента, обладающего аффинностью к поверхности организма.
[0088] Можно использовать ряд хорошо известных глобальных алгоритмов выравнивания (т.е. программное обеспечение для анализа последовательностей) для выравнивания двух или более аминокислотных последовательностей, предоставляющих ферменты, обладающие пергидролазной активностью, для определения, состоит ли фермент из опознавательного мотива по настоящему изобретению. Выровненную последовательность(и) сравнивают со ссылочной последовательностью (SEQ ID NO: 1) для определения наличия опознавательного мотива. В одном из вариантов осуществления для идентификации пергидролаз, принадлежащих семейству эстераз CE-7, используют выравнивание CLUSTAL (такое как CLUSTALW) с использованием эталонной аминокислотной последовательности (как используют в настоящем описании, последовательности пергидролазы (SEQ ID NO: 1)). Для подсчета небольших вставок или делеций (например, как правило, менее пяти аминокислот) в выровненной последовательности относительная нумерация консервативных аминокислотных остатков основана на нумерации остатков эталонной аминокислотной последовательности.
[0089] Примеры других подходящих алгоритмов, которые можно использовать для идентификации последовательностей, содержащих опознавательный мотив по настоящему изобретению, (при сравнении с эталонной последовательностью) включают, но не ограничиваются ими, алгоритм Нидлмана-Вунша (J. Mol. Biol., 48, 443-453 (1970), средство глобального выравнивания) и Смита-Уотермана (J. Mol. Biol., 147: 195-197 (1981), средство локального выравнивания). В одном из вариантов осуществления выравнивание Смита-Уотермана проводят с использованием параметров по умолчанию. Пример подходящих параметров по умолчанию включает использование оценочной матрицы BLOSUM62 со штрафом за создание пропуска = 10 и штрафом за продление пропуска = 0,5.
[0090] В одном из вариантов осуществления подходящие пергидролазы включают ферменты, содержащие опознавательный мотив CE-7 и обладающие по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 30%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью аминокислот с SEQ ID NO: 1.
[0091] Примеры подходящих углеводных эстераз CE-7, обладающих пергидролитической активностью, включают, но не ограничиваются ими, аминокислотную последовательность, такую как SEQ ID NO: 1 и 4-28. В одном из вариантов осуществления фермент содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 1, 10, 11, 15 и 16.
[0092] Как используют в настоящем описании, термин "вариант CE-7", "вариант пергидролазы" или "вариант" относится к пергидролазам CE-7, содержащим генетическую модификацию, которая приводит к добавлению, делеции и/или замене по меньшей мере одной аминокислоты при сравнении с соответствующим ферментом (как правило, ферментом дикого типа), из которого получают вариант, при условии, что сохраняется опознавательный мотив CE-7 и ассоциированная пергидролитическая активность. В композициях и способах по настоящему изобретению также можно использовать вариант пергидролазы CE-7. Примеры вариантов CE-7 предоставлены как SEQ ID NO: 1, 15, 16, 17, 18, 19 и 20. В одном из вариантов осуществления варианты могут содержать SEQ ID NO: 1 и 16.
[0093] Специалисту в данной области понятно, что в композициях и способах по настоящему изобретению также можно использовать по существу аналогичные последовательности пергидролазы CE-7 (содержащие опознавательные мотивы). В одном из вариантов осуществления по существу аналогичные последовательности определяют по их способности гибридизоваться при условиях с высокой жесткостью с молекулами нуклеиновой кислоты, ассоциированными с последовательностями, иллюстрируемыми в настоящем описании. В другом варианте осуществления можно использовать алгоритмы выравнивания последовательностей для идентификации по существу аналогичных ферментов на основании процента идентичности с ДНК или аминокислотными последовательностями, предоставленными в настоящем описании.
[0094] Как используют в настоящем описании, молекула нуклеиновой кислоты "гибридизуется" с другой молекулой нуклеиновой кислоты, такой как кДНК, геномная ДНК или РНК, когда одна цепь первой молекулы может отжигаться на другой молекуле при подходящих условиях температуры и ионной силы раствора. Условия гибридизации и промывания хорошо известны и проиллюстрированы у Sambrook J. and Russell D.T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2001). Условия температуры и ионной силы определяют "жесткость" гибридизации. Можно регулировать условия жесткости, чтобы проводить скрининг относительно сходных молекул, таких как гомологичные последовательности от организмов с низкой степенью родства, в значительной степени сходных молекул, таких как гены, которые дублируют функциональные ферменты у близкородственных организмов. Промывание после гибридизации, как правило, определяет условия жесткости. В одном из наборов предпочтительных условий используют серии промываний, начиная с 6X SSC, 0,5% SDS при комнатной температуре в течение 15 минут, затем повторяют с 2X SSC, 0,5% SDS при 45°C в течение 30 минут, а затем дважды повторяют с 0,2X SSC, 0,5% SDS при 50°C в течение 30 минут. В более предпочтительном наборе условий используют более высокие температуры, при которых промывания являются идентичными указанному выше промыванию, за исключением того, что температуру двух последних промываний 30 минут в 0,2X SSC, 0,5% SDS повышали до 60°C. Другой предпочтительный набор условий гибридизации с высокой жесткостью представляет собой 0,1X SSC, 0,1% SDS, 65°C и промывание 2X SSC, 0,1% SDS с последующим конечным промыванием 0,1X SSC, 0,1% SDS, 65°C.
m
m
m
[0095] Для гибридизации необходимо, чтобы две нуклеиновые кислоты содержали комплементарные последовательности, хотя в зависимости от жесткости гибридизации допустимы несоответствия между основаниями. Подходящая жесткость для гибридизации нуклеиновых кислот зависит от длины нуклеиновых кислот и степени комплементарности, хорошо известных в данной области переменных. Чем больше степень сходства или гомологии между двумя нуклеотидными последовательностями, тем больше значение T для нуклеиновых кислот, содержащих такие последовательности. Относительная стабильность (соответствующая более высокой T) гибридизации нуклеиновых кислот снижается в следующем порядке: РНК:РНК, ДНК:РНК, ДНК:ДНК. Для гибридов длиной более 100 нуклеотидов, было получено уравнение для расчета T (Sambrook and Russell, выше). Для гибридизации с более короткими нуклеиновыми кислотами, т.е. олигонуклеотидами, положение несоответствий становится более важным, и длина олигонуклеотида определяет ее специфичность (Sambrook and Russell, выше). В одном из аспектов длина способной к гибридизации нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере приблизительно 10 нуклеотидов. Предпочтительно минимальная длина способной к гибридизации нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере приблизительно 15 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 20 нуклеотидов, даже более предпочтительно по меньшей мере 30 нуклеотидов, даже более предпочтительно по меньшей мере 300 нуклеотидов и наиболее предпочтительно по меньшей мере 800 нуклеотидов. Кроме того, специалисту в данной области известно, что температуру и концентрацию солей раствора для промывания можно регулировать по мере необходимости в соответствии с факторами, такими как длина зонда.
[0096] Как используют в настоящем описании, термин "процент идентичности" представляет собой отношение между двумя или более полипептидными последовательностями или двумя или более полинуклеотидными последовательностями, как определяют, сравнивая последовательности. "Идентичность" в данной области также означает степень сходства последовательностей между полипептидными или полинуклеотидными последовательностями, соответственно, как определяют по совпадению между нитями таких последовательностей. "Идентичность" и "сходство" можно легко рассчитывать известными способами, включая, но, не ограничиваясь ими, такие, как описанные в: Computational Molecular Biology (Lesk A.M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith D.W., ed.) Academic Press, NY (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin A. M. and Griffin H.G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje G., ed.) Academic Press (1987) и Sequence Analysis Primer (Gribskov M. and Devereux J., eds.) Stockton Press, NY (1991). Способы определения идентичности и сходства закодированы в общедоступных компьютерных программах. Выравнивания последовательностей и расчеты процента идентичности можно проводить с использованием программы Megalign пакета для биоинформационных вычислений LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI), программы AlignX Vector NTI v. 7.0 (Informax, Inc., Bethesda, MD) или открытого пакета программного обеспечения EMBOSS (EMBL-EBI, Rice et al., Trends in Genetics, 16, (6): 276-277 (2000)). Множественное выравнивание последовательностей можно проводить способом выравнивания Клустала (таким как CLUSTALW, например, версии 1.83) (Higgins and Sharp, CABIOS, 5: 151-153 (1989); Higgins et al., Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680 (1994) и Chenna et al., Nucleic Acids Res., 31 (13): 3497-500 (2003)), доступным от European Molecular Biology Laboratory через European Bioinformatics Institute) с использованием параметров по умолчанию. Подходящие параметры выравниваний белка CLUSTALW включают штраф за создание пропуска y = 15, удлинение пропуска = 0,2, матрица = Gonnet (например, Gonnet250), белок ENDGAP = -1, белок GAPDIST = 4 и KTUPLE = 1. В одном из вариантов осуществления используют быстрое или медленное выравнивание с установками по умолчанию, где медленное выравнивание является предпочтительным. Альтернативно, параметры, в которых используют способ CLUSTALW (например, версию 1.83), можно модифицировать, чтобы также использовать KTUPLE = 1, штраф за пропуск = 10, удлинение пропуска = 1, матрица = BLOSUM (например, BLOSUM64), WINDOW = 5 и TOP DIAGONALS SAVED = 5.
[0097] В одном из аспектов подходящие выделенные молекулы нуклеиновой кислоты кодируют полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере приблизительно на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 30%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной аминокислотным последовательностям, описанным в настоящем описании. В другом аспекте подходящие выделенные молекулы нуклеиновой кислоты кодируют полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере приблизительно на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 30%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной аминокислотным последовательностям, описанным в настоящем описании. Подходящие молекулы нуклеиновой кислоты только обладают указанными выше типами гомологии, а также, как правило, кодируют полипептид длиной приблизительно от 210 до 340 аминокислот, приблизительно от 300 приблизительно до 340 аминокислот, предпочтительно приблизительно от 310 приблизительно до 330 аминокислот и наиболее предпочтительно приблизительно от 318 приблизительно до 325 аминокислот, где каждый полипептид характеризуется как обладающий пергидролитической активностью.
Направленные пергидролазы
[0098] Как используют в настоящем описании, термин "направленная пергидролаза" и "направленный фермент, обладающий пергидролитической активностью" относятся к слитым белкам, содержащим по меньшей мере один пергидролитический фермент (дикого типа или его вариант), слитый/связанный по меньшей мере с одним пептидным компонентом с аффинностью к поверхности-мишени, предпочтительно направленный на поверхность организма. Пергидролитический фермент в направленной пергидролазе может представлять собой любую углеводную эстеразу CE-7, обладающую пергидролитической активностью. Пергидролазу CE-7 можно идентифицировать по наличию опознавательного мотива CE-7, выравнивается с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 1, где указанный опознавательный мотив содержит:
i) мотив RGQ в положениях, соответствующих положениям 118-120 SEQ ID NO: 1;
ii) мотив GXSQG в положениях, соответствующих положениям 186-190 SEQ ID NO: 1, и
iii) мотив HE в положениях, соответствующих положениям 303-304 SEQ ID NO: 1.
[0099] Как используют в настоящем описании, молекула нуклеиновой кислоты "гибридизуется" с другой молекулой нуклеиновой кислоты, такой как кДНК, геномная ДНК или РНК, когда одна цепь первой молекулы может отжигаться на другой молекуле при подходящих условиях температуры и раствора. В одном из вариантов осуществления пергидролитические ферменты могут представлять собой ферменты, содержащие аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере приблизительно на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 30%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной любой из аминокислотных последовательностей, описанных в настоящем описании (т.е. SEQ ID NO: 1 и 4-28).
[0100] В другом варианте осуществления слитый белок содержит пергидролитический фермент, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и 4-28.
[0101] Как используют в настоящем описании, термины "пептидный компонент", "пептидный компонент, обладающий аффинностью к поверхности полости рта", "домен связывания с полостью рта" и "OCBD" обозначают компонент слитого белка, который не является частью пергидролитического фермента, содержащий по меньшей мере один полимер из двух или более аминокислот, соединенных пептидной связью, где компонент обладает аффинностью к поверхности-мишени полости рта. В предпочтительном аспекте OCBD обладает аффинностью к зубной эмали.
Camelidae
[0102] В одном из вариантов осуществления пептидный компонент с аффинностью к поверхности организма может представлять собой антитело, Fab фрагмент антитела, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) антитела, антитело (Muyldermans S., Rev. Mol. Biotechnol., (2001) 74:277-302), каркасный белок дисплея, не относящийся к антителу (Hosse et al., Prot. Sci., (2006) 15 (1): 14-27, и Binz H. et al., (2005) Nature Biotechnology, 23, 1257-1268 для обзора различных подходов на основе использования каркасной области) или одноцепочечный полипептид, не содержащий иммуноглобулиновую складку. В другом аспекте пептидный компонент, обладающий аффинностью к ткани/поверхности полости рта (такой как зубная эмаль) представляет собой одноцепочечный пептид, не содержащий иммуноглобулиновую складку.
[0103] Пептидный компонент с аффинностью к поверхности полости рта может быть отделен от пергидролитического фермента необязательным пептидным линкером. Длина определенных пептидных линкеров/спейсеров составляет от 1 до 100 или 1 до 50 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина пептидных спейсеров составляет приблизительно от 1 приблизительно до 25, от 3 приблизительно до 40 или от 3 приблизительно до 30 аминокислот. В других вариантах осуществления длина спейсеров составляет приблизительно от 5 приблизительно до 20 аминокислот. Можно использовать многие пептидные линкеры. В одном из вариантов осуществления содержится и может повторяться до 10 раз по меньшей мере один пептидный линкер.
[0104] В одном из вариантов осуществления слитый пептид содержит по меньшей мере один связывающийся с поверхностью полости рта пептид, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 178-197.
[0105] Пептидный компонент с аффинностью к поверхности полости рта может быть отделен от пергидролазы CE-7 необязательным пептидным линкером. Длина определенных пептидных линкеров/спейсеров составляет от 1 до 100 или от 1 до 50 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления длина пептидных спейсеров составляет приблизительно от 1 приблизительно до 25, от 3 приблизительно до 40 или от 3 приблизительно до 30 аминокислот. В других вариантах осуществления длина спейсеров составляет приблизительно от 5 приблизительно до 20 аминокислот. Можно использовать многие пептидные линкеры. Примеры пептидных линкеров предоставлены как SEQ ID NO: 164-177.
[0106] Таким образом, примеры направленных пергидролаз CE-7 могут включать, но не ограничиваться ими, любую из пергидролаз CE-7, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и 4-28, связанную с пептидным компонентом с аффинностью к поверхности полости рта. В предпочтительном варианте осуществления примеры направленных пергидролаз могут включать, но не ограничиваться ими, любую из пергидролаз CE-7, содержащих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 и 28, связанную с одним или более связывающихся с поверхностью организма пептидов с аффинностью к поверхности полости рта (необязательно посредством пептидного спейсера). В предпочтительном варианте осуществления направленная пергидролаза включает пергидролазу CE-7, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и 16.
[0107] В одном из вариантов осуществления пергидролаза представляет собой пергидролазу CE-7 в форме слитого белка, обладающего следующей ниже общей структурой:
PAH - [L]y - OCBD или OCBD - [L]y - PAH,
где PAH представляет собой фермент, обладающий пергидролитической активностью, например, содержащий опознавательный мотив CE-7, например, SEQ ID NO: 1, и OCBD представляет собой пептидный компонент с аффинностью к поверхности полости рта, и L представляет собой необязательный линкер, и y представляет собой целое число в диапазоне от 0 до 10. В одном из вариантов осуществления содержится линкер (L), и он представляет собой пептидный линкер длиной в диапазоне от 1 до 100 аминокислот.
[0108] Например, SEQ ID NO: 2 представляет собой слитый белок, содержащий последовательность пергидролазы SEQ ID NO: 1, связанную с C-концевым направляющим доменом с аффинностью к тканям полости рта.
[0109] Пергидролазы для применения в продуктах и способах по изобретению могут находиться в свободной форме, защищенной форме (например, ацетилированной) или в форме соли.
[0110] В другом варианте осуществления поверхность-мишень представляет собой вещество, которое является частью упаковки и/или доставки в полость рта. Пептидный компонент выбирают на основании его аффинности к используемому веществу или веществам, таким как полимеры, пластики и пленки. Конструирование белка, слитого с направленной пергидролазой CE-7, обеспечивает возможность контролируемой доставки и удаления пергидролазы у пользователя посредством содержания ее на съемном устройстве, таком как капа или полоска.
Аффинность связывания
-5
-5
-5
D
50
[0111] Пептидный компонент с аффинностью к поверхности полости рта обладает аффинностью связывания с поверхностью полости рта 10 моль (M) или менее. В определенных вариантах осуществления пептидный компонент представляет собой один или более связывающихся с поверхностью полости рта пептидов и/или связывающего домена(ов), обладающих аффинностью связывания к зубной эмали 10 моль (M) или менее. В некоторых вариантах осуществления значение аффинности связывания связывающих пептидов или доменов составляет 10 M или менее в присутствии по меньшей мере приблизительно 50-500 мМ соли. Термин "аффинность связывания" относится к силе взаимодействия связывающего пептида со своим соответствующим субстратом. Аффинность связывания можно определять или измерять по отношению к константе диссоциации ("K") связывающего пептида или "MB".
D
D
-5
[0112] "K" соответствует концентрации пептида, при которой участок связывания на мишени является на половину занятым, т.е., когда концентрация мишени со связанным пептидом (связанным веществом-мишенью) равна концентрации мишени без связанного пептида. Чем меньше константа диссоциации, тем сильнее связывается пептид. Например, пептид с наномолярной (нМ) константой диссоциации связывается сильнее, чем пептид с микромолярной (мкМ) константой диссоциации. Определенные варианты осуществления изобретения имеют значение K 10 или менее.
50
50
50
50
50
50
-5
[0113] "MB" относится к концентрации связывающего пептида, которая обеспечивает сигнал, который составляет 50% от максимального сигнала, получаемого в анализе связывания на основе ELISA. См., например, пример 3 публикации патентной заявки США 2005/022683, включенной, таким образом, посредством ссылки. MB представляет собой показатель силы связывающего взаимодействия или аффинности компонентов комплекса. Чем меньше значение MB, тем сильнее, т.е. "лучше", взаимодействие пептида со своим соответствующим субстратом. Например, пептид с наномолярной (нМ) MB связывается сильнее, чем пептид с микромолярной (мкМ) MB. Определенные варианты осуществления изобретения имеют значение MB 10 M или менее.
D
50
-5
-6
-7
-8
-9
-10
[0114] В некоторых вариантах осуществления пептидный компонент с аффинностью к поверхности полости рта может иметь аффинность связывания, как измеряют по значениям K или MB, менее или равную приблизительно 10 M, менее или равную приблизительно 10 M, менее или равную приблизительно 10 M, менее или равную приблизительно 10 M, менее или равную приблизительно 10 M или менее или равную приблизительно 10 M.
D
50
-5
-6
-7
-8
-9
-10
[0115] В некоторых вариантах осуществления связывающиеся с поверхностью полости рта пептиды и/или связывающиеся с поверхностью полости рта домены могут иметь аффинность связывания, как измерено по значениям K или MB, менее или равную приблизительно 10 M, менее или равную приблизительно 10 M, менее или равную приблизительно 10 M, менее или равную приблизительно 10 M, менее или равную приблизительно 10 M или менее или равную приблизительно 10 M.
D
50
-5
-6
-7
-8
-9
-10
[0116] Как используют в настоящем описании, термин "сильная аффинность" означает аффинность связывания со значением K или MB менее или равным приблизительно 10 M, предпочтительно менее или равным приблизительно 10 M, более предпочтительно менее или равным приблизительно 10 M, более предпочтительно менее или равным приблизительно 10 M, менее или равным приблизительно 10 M или наиболее предпочтительно менее или равным приблизительно 10 M.
[0117] Порошкообразные ферменты
[0118] В некоторых вариантах осуществления в композициях для личной гигиены можно использовать ферментативный катализатор в форме стабилизированного порошкообразного фермента. Способы получения и стабилизации составов, содержащих порошкообразный фермент, описаны в публикации патентной заявки США № 2010-0086534 и 2010-0086535.
[0119] В одном из вариантов осуществления фермент может содержаться в порошкообразном ферменте в количество в диапазоне приблизительно от 5 массовых процентов (% масс.) приблизительно до 75% масс. в пересчете на сухую массу порошкообразного фермента. Предпочтительный диапазон массовых процентов фермента в порошкообразном ферменте/высушенной распылением смеси составляет приблизительно от 10% масс. до 50% масс., и более предпочтительный диапазон массовых процентов фермента в порошкообразном ферменте/высушенной распылением смеси составляет приблизительно от 20% масс. до 33% масс.
[0120] В одном из вариантов осуществления порошкообразный фермент может дополнительно содержать эксципиент. В одном из аспектов эксципиент предоставлен в количестве в диапазоне приблизительно от 95% масс. приблизительно до 25% масс. в пересчете на сухую массу порошкообразного фермента. Предпочтительный диапазон % масс. эксципиента в порошкообразном ферменте составляет приблизительно от 90% масс. до 50% масс., и более предпочтительный диапазон % масс. эксципиента в порошкообразном ферменте составляет приблизительно от 80% масс. до 67% масс.
[0121] В одном из вариантов осуществления эксципиент, используемый для получения порошкообразного фермента, может представлять собой эксципиент на основе олигосахарида. В одном из вариантов осуществления среднечисловая молекулярная масса эксципиента на основе олигосахарида составляет по меньшей мере приблизительно 1250, и средневзвешенная молекулярная масса составляет по меньшей мере приблизительно 9000. В некоторых вариантах осуществления среднечисловая молекулярная масса эксципиента на основе олигосахарида составляет по меньшей мере приблизительно 1700, и средневзвешенная молекулярная масса составляет по меньшей мере приблизительно 15000. Конкретные олигосахариды могут включать, но не ограничиваться ими, мальтодекстрин, ксилан, пуллулан, маннан, фукоидан, галактоманнан, хитозан, рафинозу, стахиозу, пектин, инсулин, леван, граминан, амилопектин, сахарозу, лактулозу, лактозу, мальтозу, трегалозу, целлобиозу, нигеротриозу, мальтотриозу, мелицитозу, мальтотриулозу, рафинозу, кестозу и их смеси. В предпочтительном варианте осуществления эксципиент на основе олигосахарида представляет собой мальтодекстрин. Эксципиенты на основе олигосахаридов также могут включать, но не ограничиваться ими, водорастворимые неионные простые эфиры целлюлозы, такие как гидроксиметилцеллюлоза и гидроксипропилметилцеллюлоза, и их смеси. В еще одном дополнительном варианте осуществления эксципиент можно выбирать, но не ограничиваться ими, из одного или более из следующих ниже соединений: трегалозу, лактозу, сахарозу, маннит, сорбит, глюкозу, целлобиозу, α-циклодекстрин, пуллулан и карбоксиметилцеллюлозу.
[0122] Подходящие субстраты сложных эфиров/доноры ацила
[0123] Подходящие субстраты сложных эфиров карбоновых кислот могут включать сложные эфиры со следующей ниже формулой:
(a) один или более сложных эфиров со структурой
m
5
[X]R,
где
6
X представляет собой сложноэфирную группу формулы RC(O)O;
6
1
7
1
4
6
6
2
7
R представляет собой линейную, разветвленную или циклическую C-Cгидрокарбильную группу, необязательно замещенную гидроксильной группой или C-Cалкоксигруппой, где R необязательно содержит одну или более простых эфирных связей, где R представляет собой C-C;
5
1
6
5
5
R представляет собой линейную, разветвленную или циклическую C-Cгидрокарбильную группу или пятичленную циклическую гетероароматическую группу или шестичленную циклическую ароматическую или гетероароматическую группу необязательно замещенную гидроксильной группой, где каждый атом углерода в R отдельно содержит не более одной гидроксильной группы или не более одной сложноэфирной группы или группы карбоновой кислоты, и где R необязательно содержит одну или более простых эфирных связей;
5
m представляет собой целое число в диапазоне от 1 до числа атомов углерода в R,
растворимость в воде указанных одного или более сложных эфиров составляет по меньшей мере 5 м.д. при 25°C, или
(b) один или более глицеридов со структурой
,
1
1
7
1
4
3
4
1
где R представляет собой C-Cалкил с неразветвленной или разветвленной цепью, необязательно замещенный гидроксилом или C-Cалкоксигруппой, и R и R независимо представляют собой H или RC(O), или
(c) один или более сложных эфиров формулы
,
1
1
7
1
4
2
1
10
1
10
1
10
1
10
1
10
1
10
1
10
2
2
n
2
3
n
где R представляет собой C-Cалкил с неразветвленной или разветвленной цепью, необязательно замещенный гидроксилом или C-Cалкоксигруппой, и R представляет собой C-Cалкил, C-Cалкенил, C-Cалкинил, C-Cарил, C-Cалкиларил, C-Cалкилгетероарил, C-Cгетероарил с неразветвленной или разветвленной цепью, (CHCHO) или (CHCH(CH)-O)H и n равно от 1 до 10, или
(d) один или более ацетилированных моносахаридов, ацетилированных дисахаридов или ацетилированных полисахаридов, или
(e) любую комбинацию из (a)-(d).
[0124] Подходящие субстраты также могут включать один или более ацилированных сахаридов, выбранных из группы, состоящей из ацетилированных моно-, ди- и полисахаридов. В другом варианте осуществления ацилированные сахариды выбраны из группы, состоящей из ацетилированного ксилана, фрагментов ацетилированного ксилана, ацетилированной ксилозы (такой как тетраацетат ксилозы), ацетилированной глюкозы (такой как пентаацетат α-D-глюкозы, пентаацетат β-D-глюкозы, 1-тио-β-D-глюкоза-2,3,4,6-тетраацетат), пентаацетата β-D-галактозы, гексаацетата сорбита, октаацетата сахарозы, β-D-рибофураноза-1,2,3,5-тетраацетата, β-D-рибофураноза-1,2,3,4-тетраацетата, три-O-ацетил-D-галактала, три-O-ацетил-D-глюкала, тетраацетата β-D-ксилофуранозы, пентаацетата β-D-глюкопиранозы, β-D-глюкопираноза-1,2,3,4-тетраацетата, β-D-глюкопираноза-2,3,4,6-тетраацетата, 2-ацетамидо-2-дезокси-1,3,4,6-тетрацетил-β-D-глюкопиранозы, 2-ацетамидо-2-дезокси-3,4,6-триацетил-1-хлорид-α-D-глюкопиранозы, пентаацетата β-D-нопиранозы и ацетилированной целлюлозы. В предпочтительном варианте осуществления ацетилированный сахарид выбран из группы, состоящей из β-D-рибофураноза-1,2,3,5-тетраацетата, три-O-ацетил-D-галактала, три-O-ацетил-D-глюкаля, октаацетата сахарозы и ацетилированной целлюлозы.
[0125] В другом варианте осуществления дополнительные подходящие субстраты также могут включать 5-ацетоксиметил-2-фурфурол, 3,4-диацетокси-1-бутен, 4-ацетоксибензойную кислоту, ацетат ванилина, ацетат простого метилового эфира пропиленгликоля, метиллактат, этиллактат, метилгликолят, этилгликолят, метилметоксиацетат, этилметоксиацетат, метил-3-гидроксибутират, этил-3-гидроксибутират и триэтил-2-ацетилцитрат.
1
6
1
6
[0126] В другом варианте осуществления подходящие субстраты выбраны из группы, состоящей из моноацетина, диацетина, триацетина, монопропионина, дипропионина, трипропионина, монобутирина, дибутирина, трибутирина, пентаацетата глюкозы, тетраацетата ксилозы, ацетилированного ксилана, фрагментов ацетилированного ксилана, β-D-рибофураноза-1,2,3,5-тетраацетата, три-O-ацетил-D-галактала, три-O-ацетил-D-глюкаля, моноэфиров или диэфиров 1,2-этандиола; 1,2-пропандиола, 1,3-пропандиола, 1,2-бутандиола, 1,3-бутандиола, 2,3-бутандиола, 1,4-бутандиола, 1,2-пентандиола, 2,5-пентандиола, 1,5-пентандиола, 1,6-пентандиола, 1,2-гександиола, 2,5-гександиола, 1,6-гександиола и их смесей. В другом варианте осуществления субстрат представляет собой C-Cполиол, содержащий одну или более сложноэфирных групп. В предпочтительном варианте осуществления одна или более гидроксильных групп в C-Cполиоле являются замещенными одной или более ацетоксигруппами (такими как 1,3-пропандиолдиацетат, 1,2-пропандиолдиацетат, 1,4-бутандиолдиацетат, 1,5-пентандиолдиацетат и т.д.). В дополнительном варианте осуществления субстрат представляет собой диацетат пропиленгликоля (PGDA), диацетат этиленгликоля (EGDA) или их смесь.
[0127] В дополнительном варианте осуществления подходящие субстраты выбраны из группы, состоящей из моноацетина, диацетина, триацетина, монопропионина, дипропионина, трипропионина, монобутирина, дибутирина и трибутирина. В еще одном аспекте субстрат выбран из группы, состоящей из диацетина и триацетина. В наиболее предпочтительном варианте осуществления подходящий субстрат содержит триацетин.
[0128] Сложный эфир карбоновой кислоты содержится в концентрации, достаточной для получения желаемой концентрации пероксикарбоновой кислоты после катализируемого ферментом пергидролиза. Сложный эфир карбоновой кислоты не должен полностью растворяться в реакционном составе, но должен обладать достаточной растворимостью, чтобы обеспечивать преобразование сложного эфира посредством пергидролазного катализатора в соответствующую пероксикарбоновую кислоту. Сложный эфир карбоновой кислоты содержится в реакционном составе в концентрации от 0,05% масс. до 40% масс. реакционного состава, предпочтительно в концентрации от 0,1% масс. до 20% масс. реакционного состава, и более предпочтительно в концентрации от 0,5% масс. до 10% масс. реакционного состава.
[0129] Источник пероксида предоставлен в виде гранул и может включать продукты присоединения пероксида водорода (например, продукт присоединения мочевина-пероксид водорода (пероксид карбамида)) перборатные соли, перкарбонатные соли и пероксидные соли. Концентрация соединения пероксида в реакционном составе может находиться в диапазоне от 0,0033% масс. приблизительно до 50% масс., более предпочтительно от 0,033% масс. приблизительно до 40% масс. и более предпочтительно от 0,1% масс. приблизительно до 30% масс.
[0130] Опубликовано, что многие пергидролазные катализаторы (целые клетки, пермеабилизованные целые клетки и частично очищенные экстракты целых клеток) обладают активностью каталазы (EC 1.11.1.6). Каталазы катализируют преобразование пероксида водорода в кислород и воду. В одном из аспектов пергидролизный катализатор не имеет каталазной активности. В другом аспекте в реакционный состав можно добавлять ингибитор каталазы. Специалист в данной области может регулировать концентрацию ингибитора каталазы по мере необходимости. Концентрация ингибитора каталазы, как правило, находится в диапазоне от 0,1 мМ приблизительно до 1 M, предпочтительно приблизительно от 1 мМ приблизительно до 50 мМ, более предпочтительно приблизительно от 1 мМ приблизительно до 20 мМ.
[0131] В другом варианте осуществления ферментативный катализатор не обладает значительной каталазной активностью, или его можно конструировать, чтобы снижать или устранять каталазную активность. Каталазную активность в клетке-хозяине можно подавлять или устранять, нарушая экспрессии гена(ов), ответственных за каталазную активность, хорошо известными способами, включая, но, не ограничиваясь ими, транспозонный мутагенез, экспрессию антисмысловой РНК, направленный мутагенез и случайный мутагенез.
[0132] Концентрация пероксикарбоновой кислоты, образуемой (например, перуксусной кислоты) посредством пергидролиза по меньшей мере одного сложного эфира карбоновой кислоты, составляет по меньшей мере приблизительно 0,1 м.д., предпочтительно по меньшей мере 0,5 м.д., 1 м.д., 5 м.д., 10 м.д., 20 м.д., 100 м.д., 200 м.д., 300 м.д., 500 м.д., 700 м.д., 1000 м.д., 2000 м.д., 5000 м.д. или 10000 м.д. перкислоты за 10 минут, предпочтительно за 5 минут от начала реакции пергидролиза. Очевидно, что специалист в данной области может регулировать компоненты реакции, чтобы получать желаемую концентрацию перкислоты.
[0133] В одном из аспектов время реакции, необходимое для получения желаемой концентрации перкислоты, составляет не более приблизительно двух часов, предпочтительно не более приблизительно 30 минут, более предпочтительно не более приблизительно 10 минут и наиболее предпочтительно приблизительно 5 минут или менее.
Способ анализа ВЭЖХ определения концентрации пероксикарбоновой кислоты и пероксида водорода
[0134] Для анализа реагентов и продуктов можно использовать ряд аналитических способов, включая, но, не ограничиваясь ими, титрование, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), газовую хроматографию (GC), масс-спектроскопию (MS), капиллярный электрофорез (CE), аналитический способ, описанный U. Pinkernell et al., (Anal. Chem., 69 (17): 3623-3627 (1997)), и анализ с использованием 2,2ʹ-азино-бис(3-этилбензотиазолин)-6-сульфоната (ABTS) (U. Pinkernell et. al., Analyst, 122: 567-571 (1997) и Dinu et. al., Adv. Funct. Mater., 20: 392-398 (2010)), как описано в настоящих примерах.
[0135] В одном из вариантов осуществления изобретение относится к упаковке для продукта для ухода за полостью рта, который содержит много камер, и сконструирован с возможность хранения ингредиентов в каждой камере раздельно и без взаимодействия до момента использования. Например, настоящее изобретение относится к конструкции химически стабильной структурной упаковки, которая обеспечивает возможность того, что фермент, катализирующий продукт для отбеливания зубов, достигает предстационарную кинетику за миллисекунды после того, как ингредиенты подвергают взаимодействию друг с другом и смешивают. Содержимое контейнера дозируют через открывающееся устройство, например, через выпускное отверстие со съемной крышкой или пробкой, или которое становится функциональным, когда пользователь ломает предпочтительную секцию с риской контейнера, обеспечивая ровное и удобное дозирование продукта через профилированное выпускное отверстие.
[0136] Каждая камера выполнена с возможность хранить, например, 0,1-30 грамм ингредиента. Продукт для ухода за полостью рта представляет собой продукт для отбеливания зубов, обеспечивающий общее количество продукта, доставляемого из всех камер, например, от 1,0 до 5,0 грамм, например, 1-2 грамм, для обеспечения предполагаемого полезного действия. Вместимость камер конструируют таким образом, чтобы они вмещали ингредиенты с удельной плотностью, например, от 1,0 до 1,1 и предпочтительно в диапазоне удельной плотности от 1,02 до 1,05.
[0137] В одном из вариантов осуществления упаковку получают способом горячего формования по меньшей мере двух эластичных пленок толщиной от 50 микрон до 500 микрон и толщиной предпочтительно 300 микрон. Две пленки могут быть непрозрачными, полупрозрачными или прозрачными и могут находиться в любой комбинации при сборке в процессе горячего формования. Оба вещества обеспечивают характеристики паронепроницаемого барьера, например, менее 3% потери влаги в течение периода трех лет, например, менее 1% потери влаги в течение аналогичного периода. Пленки также обеспечивают барьер от потери аромата. Потерю аромата можно определять газовой хроматографией и органолептической оценкой.
[0138] Пленки являются химически устойчивыми к веществам, содержащимся в них. Например, в одном из вариантов осуществления они являются устойчивыми к от 0,1% до 10% раствору пероксида водорода по массе, например, до 0,3% раствора пероксида водорода по массе.
[0139] В одном из вариантов осуществления один из двух эластичных веществ представляет собой полимерное многослойное вещество, и внутренний слой многослойного вещества выбирают, чтобы он связывался с первым эластичным веществом, но отслаивался, когда к камере с хрупкой перегородкой применяют вручную давление. Сила, необходимая для разрушения перегородки, прилагается вручную и может изменяться от 2 дюймов/фунт до 5 дюймов/фунт.
[0140] После разрушения хрупкой перегородки между компартментами, ингредиенты в каждой камере приходят в тесное контактирование друг с другом. Потребитель может смешивать отдельные ингредиенты в течение определенного периода времени для перехода к скорости кинетики предстационарного состояния или фазе "взрыва". Время для кинетики предстационарного состояния или фазы "взрыва" может составлять миллисекунды. Это обеспечивает достаточный период времени для образования и потребления промежуточных соединений фермент-субстрат до достижения их концентраций стационарного состояния. После достижения стационарного состояния пользователь может надламывать предпочтительно секцию с риской многокамерного контейнера и дозировать смесь в стоматологическую капу. Капу накладывают на зубы в течение периода времени от 15 минут до 45 минут, и она обеспечивает эффективное отбеливающее действие.
[0141] Таким образом, иллюстративные варианты осуществления изобретения включают, например, упаковки, композиции для ухода за полостью рта и способы отбеливания зубов, например:
1. Упаковку 1, где упаковка содержит деформируемое вещество, конфигурируемое, чтобы образовывать по меньшей мере две герметичные камеры, содержащая первую камеру, вторую камеру и необязательно дополнительные камеры, где камеры отделены одним или более барьеров, которые являются хрупкими или отрываемыми,
где
первая камера содержит раствор жидкости с низкой вязкостью, содержащей фермент, обладающий пергидролитической активностью, где указанный фермент содержит опознавательный мотив семейства углеводных эстераз 7 (CE-7), который выравнивается с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 1, где указанный опознавательный мотив содержит:
i) мотив RGQ в положениях, соответствующих положениям 118-120 SEQ ID NO: 1,
ii) мотив GXSQG в положениях, соответствующих положениям 186-190 SEQ ID NO: 1, и
iii) мотив HE в положениях, соответствующих положениям 303-304 SEQ ID NO: 1, и
вторая камера содержит по меньшей мере один субстрат донора ацила, где указанный субстрат выбран из группы, состоящей из:
i) сложных эфиров со структурой
m
5
[X]R,
где
6
X=сложноэфирная группа формулы RC(O)O;
6
1
7
1
4
6
6
2
7
R=линейная, разветвленная или циклическая C-Cгидрокарбильная группа, необязательно замещенная гидроксильными группами или C-Cалкоксигруппами, где R необязательно содержит одну или более простых эфирных связей для R=C-C;
5
1
6
5
5
R=линейная, разветвленная или циклическая C-Cгидрокарбильная группа или пятичленная циклическая гетероароматическая группа или шестичленная циклическая ароматическая или гетероароматическая группа, необязательно замещенная гидроксильными группами, где каждый атом углерода в R независимо содержит не более одной гидроксильной группы или не более одной сложноэфирной группы или группы карбоновой кислоты, где R необязательно содержит одну или более простых эфирных связей;
5
M представляет собой целое число в диапазоне от 1 до числа атомов углерода в R, и
где растворимость в воде указанных сложных эфиров составляет по меньшей мере 5 м.д. при 25°C,
ii) глицеридов со структурой
,
1
1
7
1
4
3
4
1
где R=C-Cалкил с неразветвленной или разветвленной цепью, необязательно замещенный гидроксилом или C-Cалкоксигруппой, и R и R независимо представляют собой H или RC(O);
iii) одного или более сложных эфиров формулы
,
1
1
7
1
4
2
1
10
1
10
1
10
1
10
1
10
1
10
1
10
2
2
n
2
3
n
где R представляет собой C-Cалкил с неразветвленной или разветвленной цепью, необязательно замещенный гидроксилом или C-Cалкоксигруппой, и R представляет собой C-Cалкил, C-Cалкенил, C-Cалкинил, C-Cарил, C-Cалкиларил, C-Cалкилгетероарил, C-Cгетероарил, с неразветвленной цепью или разветвленной цепью (CHCHO) или (CHCH(CH)-O)H и n равно от 1 до 10, и
iv) ацетилированных сахаридов, выбранных из группы, состоящей из ацетилированных моносахаридов, ацетилированных дисахаридов и ацетилированного полисахарида, и
где вторая или необязательная дополнительная камера содержит источник пероксида,
таким образом, что когда один или более барьеров между камерами разрушаются, например, при надавливании на первую камеру, раствор жидкости с низкой вязкостью смешивается с источником пероксида и субстратом донора ацила, и фермент, обладающий пергидролитической активностью, катализирует реакцию между пероксидом, выделяемым источником пероксида, и субстратом донора ацила с образованием перкислоты, и
упаковка содержит открывающее устройство, например, область с риской, крышку или пробку, чтобы обеспечивать возможность открытия упаковки, чтобы обеспечивать отверстие, через которое можно дозировать смесь.
1.1. Упаковку 1, где фермент, обладающий пергидролитической активностью, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из:
a) SEQ ID NO: 1, и
b) аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 1.
Упаковку 1 или 1.1, где фермент, обладающий пергидролитической активностью, дополнительно содержит связывающий домен, слитый с N-концом или C-концом фермента, где указанный связывающий домен имеет аффинность к ткани полости рта или к полоске для отбеливания зубов.
1.2. Любую из указанных выше упаковок, где связывающий домен с аффинностью к ткани полости рта содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 178-197.
1.3. Любую из указанных выше упаковок, где фермент, обладающий пергидролитической активностью, обладает аффинностью к ткани полости рта и содержит аминокислотную последовательность, выбранную из:
SEQ ID NO: 2 и аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 2.
1.4. Любую из указанных выше упаковок, где деформируемое вещество представляет собой пластик или алюминий.
1.5. Любую из указанных выше упаковок, где раствор жидкости с низкой вязкостью обладает достаточной низкой вязкостью, чтобы обеспечивать эффективное смешивание содержимого второй камеры, например, менее 5000 сПз, например, менее 500 сПз.
1.6. Любую из указанных выше упаковок, где раствор жидкости с низкой вязкостью содержит буфер.
2-18
2-6
1-4
1.7. Любую из указанных выше упаковок, где субстрат донора ацила выбран из (i) одной или более Cкарбоновых кислот, например, Cкарбоновых кислот (например, уксусной кислоты), включая низшие линейные или разветвленные алкилкарбоновые кислоты, необязательно замещенные гидрокси и/или Cалкокси; (ii) одного или более их гидролизуемых и приемлемых сложных эфиров (например, моно-, ди- и триглицеридов и ацилированных сахаридов) и (iii) их смесей.
1.8. Любую из указанных выше упаковок, где субстрат донора ацила выбран из 1,2,3-триацетоксипропана (иногда обозначаемого в настоящем описании как триацетин или глицеринтриацетат) и ацилированных сахаридов, например, ацетилированных сахаридов.
1.9. Любую из указанных выше упаковок, содержащую субстрат донора ацила, который содержит соединение сложного эфира с растворимостью в воде по меньшей мере 5 м.д. при 25°C.
1.10. Любую из указанных выше упаковок, где источник пероксида выбран из твердых пероксидов и твердых доноров пероксида и их смесей, например, выбран из солей или комплексов пероксидов (например, таких как пероксифосфатные, пероксикарбонатные, перборатные, пероксисиликатные или персульфатные соли, например, пероксифосфат кальция, перборат натрия, пероксид карбоната натрия, пероксифосфат натрия и персульфат калия), гипохлоритов, пероксида мочевины, полимерных комплексов пероксида водорода, таких как полимерные комплексы пероксид водорода-поливинилпирролидона, пероксидов металлов, например, пероксида цинка и пероксида кальция, например, твердого пероксида, выбранного из пероксида мочевины, комплексов поливинилпирролидона-пероксида водорода, перкарбоната натрия, пербората натрия и пероксидов металлов, например, пероксида цинка и пероксида кальция.
1.11. Указанную выше упаковку, где источник пероксида представляет собой пероксид мочевины.
1.12. Указанную выше упаковку, где источник пероксида содержит комплекс пероксида водорода-поливинилпирролидона.
1.13. Любую из указанных выше упаковок, где ингредиенты камер содержатся в количествах, достаточных для предоставления при смешивании отбеливающего средства в количестве и концентрации, эффективных для отбеливания зубов.
1.14. Любую из указанных выше упаковок, где вторая камера содержит гелеобразующее вещество в форме порошка.
1.15. Указанную выше упаковку, где гелеобразующее вещество выбрано из гелеобразующих веществ на основе карбомеров (например, Carbopol 971P), полисахарида камеди, такого как ксантановая камедь, модифицированных пищевых крахмалов, животного или рыбьего желатина и силикатов.
1.16. Указанную выше упаковку, где гелеобразующее вещество представляет собой гелеобразующее вещество на основе карбомера.
1.17. Любую из указанных выше упаковок, где вторая камера содержит гелеобразующее вещество в форме порошка в относительном количестве для обеспечения вязкости от 100000 до 150000 сПз, например, приблизительно 125000 сПз, при смешивании с содержимым первой камеры, например, где гелеобразующее вещество содержится в количестве от 5% до 50% по массе конечной смеси содержимого первой и второй камер.
1.18. Любую из указанных выше упаковок, где первая камера содержит водный раствор с низкой вязкостью, содержащий фермент, обладающий пергидролитической активностью, и буфер, и вторая камера содержит гелеобразующее вещество, источник пероксида и содержащее ацетил соединение, все в форме порошка, таким образом, что когда хрупкий барьер разрушают, и обеспечивают возможность смешивания содержимого двух камер, пероксид и содержащее ацетил соединение могут взаимодействовать, где реакция катализируется белком, обладающим пергидролазной активностью, с образованием перуксусной кислоты, в выдавливаемом геле, образуемым жидким и гелеобразующим веществом, где выдавливаемый гель затем можно выдавливать и наносить на зубы, например, с использованием капы или полоски в течение достаточного периода времени, например, 10-30 минут, для обеспечения отбеливания.
1.19. Любую из указанных выше упаковок, которая дополнительно содержит устройство-аппликатор, такое как стоматологическая капа или полоска для нанесения смеси из содержимого первой и второй камер на зубы.
1.20. Указанную выше упаковку, где смесь затем дозируют, выпускное отверстие второй камеры напрямую соединено с капой, таким образом, что смесь выдавливают прямо в капу.
2. Композицию 2, которая является композицией для ухода за полостью рта, состоящей из нескольких частей, содержащей первую часть, которая физически отделена от второй части при хранении, и которую объединяют со второй частью непосредственно перед использованием, например, в течение 10 минут использования, где первая часть содержит фермент, обладающий пергидролитической активностью, как описано для любой из указанных выше упаковок, и вторая часть содержит источник пероксида и донор карбокси, выбранный из карбоновой кислоты и соединения ацила, где источник пероксида и донор карбокси взаимодействуют в присутствии пергидролазы с образованием перкислоты, например, источник пероксида и донор карбокси, как описано для любой из указанных выше упаковок, например:
2-18
2.1. Указанной выше композиции, где донор карбокси выбран из Cкарбоновой кислоты (например, уксусной кислоты) и из гидролизуемых и приемлемых ее сложных эфиров (например, моно-, ди- и триглицеридов) и их смесей.
2.2. Указанной выше композиции, где донор карбокси представляет собой 1,2,3-триацетоксипропан (иногда обозначаемый в настоящем описании как триацетин или триацетат глицерина).
2.3. Любую из указанных выше композиций, где источник пероксида представляет собой твердый пероксид, выбранный из пероксида мочевины, комплекса поливинилпирролидона-пероксида водорода, перкарбоната натрия, пербората натрия и пероксидов металлов, например, пероксида цинка и пероксида кальция.
2.4. Любую из указанных выше композиций, где источник пероксида представляет собой пероксид мочевины.
2.5. Любую из указанных выше композиций, где источник пероксида содержит комплекс пероксида водорода-поливинилпирролидона.
2.6. Любую из указанных выше композиций, где упакованное в упаковке является таким, как описанное выше в настоящем описании, например, упаковке 1 и последующих.
3. Способ (способ 3) отбеливания зубов, включающий активацию двух частей композиции для ухода за полостью рта, как описано выше в настоящем описании, путем объединения двух частей и нанесения эффективного количества смеси, получаемой таким образом, на зубы, например, с использованием аппликатора, например, стоматологической капы или полоски, в течение достаточного периода времени для отбеливания зубов, например, по меньшей мере 10 минут, например, 10-30 минут.
in situ
[0142] Пероксикарбоновые кислоты ("перкислоты") известны как эффективные противомикробные и отбеливающие средства. В патенте США 5302375 на имя Viscio D. описаны пероральные композиции для отбеливания, содержащие перуксусную кислоту, растворенную в носителе, где перуксусную кислоту получают в носителе , путем объединения воды, ацетилсалициловой кислоты и водорастворимого перкарбоната щелочного металла. В патенте США 5279816 на имя Church et al. описано применение композиции, содержащей перуксусную кислоту, для отбеливания окрашенных или потемневших зубов. В патентах США 6221341 и 7189385 на имя Montgomery R. описана композиция на основе перкислоты для отбеливания зубов, пригодная для использования в способе отбеливания зубов. Более конкретно, композицию на основе перуксусной кислоты можно получать путем объединения предшественника пероксида водорода, сложного эфира уксусной кислоты и глицерина и воды с получением посредством химического пергидролиза перуксусной кислоты.
M. smegmatis
[0143] В этих ссылках не описан ферментативный пергидролиз. В публикации патентной заявки США № 2009-0311198 на имя Concar et al. описана пероральная композиция для отбеливания зубов, содержащая фермент , обладающий пергидролитической активностью.
[0144] Многие гидролазы и эстеразы, например, липазы, сериновые гидролазы и углеводные эстеразы, катализируют пергидролиз, обратимое образование перкислот из карбоновых кислот и пероксида водорода. Пергидролазы, эстеразы и липазы, как правило, содержат каталитическую триаду, состоящую из серина (Ser), глутамината (Glu) или аспартата (Asp) и гистидина (His). Многие пергидролазы (например, не содержащие металл галопероксидазы) содержат каталитическую триаду Ser-His-Asp и катализируют обратимое образование перкислот из пероксида водорода и карбоновых кислот. Без связи с теорией полагают, что пергидролиз происходит по сходному с действием эстеразы механизму, в котором карбоновая кислота взаимодействует с активным центром серина с образованием промежуточного соединения ацил-фермент, которое затем взаимодействует с пероксидом водорода с образованием перкислоты.
[0145] В данной области описаны различные пергидролазы. В патенте США 7510859 на имя Wieland et al. описано введение конкретного варианта протеазы субтилизин Карлсберг, обладающей пергидролитической активностью, в продукты для ухода за телом. Кроме конкретного варианта протеаз не описаны пергидролитические ферменты, а также не представлено каких-либо демонстрационных примеров, демонстрирующих ферментативное получение перкислоты в качестве средства, оказывающего благоприятное действие на личную гигиену. В публикациях патентных заявок США № 2008-0176783 A1, 2008-0176299 A1, 2009-0005590 A; и 2010-0041752 A1 на имя DiCosimo et al. описаны ферменты, структурно классифицируемые как представители семейства CE-7 углеводных эстераз (т.е. цефалоспорин-C-деацетилазы [CAH] и ацетилксиланэстеразы [AXE]), которые характеризуются значительной пергидролитической активностью в отношении преобразования субстратов сложных эфиров карбоновых кислот (в присутствии подходящего источника пероксида, такого как пероксид водорода) в пероксикарбоновые кислоты в концентрациях, достаточных для применения в качестве дезинфицирующего и/или отбеливающего средства. Было продемонстрировано, что некоторые представители семейства CE-7 углеводных эстераз обладают пергидролитической активностью, достаточной для образования 4000-5000 м.д. перуксусной кислоты из сложных ацетиловых эфиров спиртов, диолов и глицеринов за 1 минуту и до 9000 м.д. в период от 5 минут до 30 минут после смешивания компонентов реакции (DiCosimo et al., U.S. 2009-0005590 A1). В публикации патентной заявки США № 2010-0087529 A1 описаны варианты ферментов CE-7, обладающие улучшенной пергидролитической активностью.
[0146] В одном из вариантов осуществления изобретения используют пергидролазу, которая содержит каталитический домен представителя семейства углеводных эстераз 7, обладающих пергидролитической активностью ("пергидролаза CE-7"). Хотя пергидролазы CE-7 обладают сильной пергидролитической активностью, их использование в косметических средствах личной гигиены не было описано ранее в указанной выше предварительной заявке.
2-18
2-6
1-4
[0147] Доноры ацила в настоящем изобретении выбраны из (i) одного или более сложных эфиров Cкарбоновых кислот, например, сложных эфиров Cкарбоновых кислот, включая низшие линейные или разветвленные алкилкарбоновые кислоты, необязательно замещенные гидрокси и/или Cалкокси, и (ii) их смесей. Например, доноры ацила включают 1,2,3-триацетоксипропан (иногда обозначаемый в настоящем описании как триацетин или триацетат глицерина) и ацилированные сахариды, например, ацетилированные сахариды. В конкретном варианте осуществления сложные эфиры для такого применения могут представлять собой, например, сложные эфиры с растворимостью в воде по меньшей мере 5 м.д. при 25°C.
[0148] Доноры ацила или другие вещества необязательно можно инкапсулировать. Существует ряд средств инкапсулирования, хорошо известных в данной области, как природных и синтетических. Особенно подходящими являются модифицированные крахмалы и гуммиарабик, т.к. они являются пищевыми, относительно недорогими, быстрорастворимыми и могут адсорбировать относительно высокие уровни жидких масел. Необходимо учитывать любое влияние на конечную вязкость.
[0149] Как указано выше, изобретение может содержать гелеобразующие вещества, например, гелеобразующие вещества на основе карбомера (например, Carbopol 971P), полисахарид камеди, такой как ксантановая камедь, модифицированные пищевые крахмалы, животный или рыбий желатин и силикаты. В данной области известны составы адгезивного геля для использования со средствами для отбеливания зубов, например, как описано в патентах США 7862801, 5746598, 6730316, 7128899. Гелеобразующее вещество является пригодным для сгущения отбеливающих растворов с той точки зрения, что они не вытекают из стоматологической капы или не выходят за границу зубов в области мягких тканей. Это способствует тому, что отбеливающее средство остается в контакте с зубами в течение длительных периодов времени, и защищает мягкие ткани. Использование стоматологической капы и вязкого отбеливающего средства обеспечивает возможность того, что низкая концентрация отбеливающего средства эффективно отбеливает зубы индивидуума в течение периода 1-2 недель с минимальным риском для пациента. Гелеобразующие вещества для применения необходимо выбирать и регулировать так, чтобы обеспечивать вязкость после нанесения от 100000 до 150000 сПз, например, приблизительно 125000 сПз.

[0150] В конкретном варианте осуществления, упаковка или многокомпонентная композиция, как описано выше в настоящем изобретении, содержит гелеобразующее вещество на основе карбомера, например, модифицированный гидрофильный полимер полиакриловой кислоты, такой как CARBOPOL, выпускаемый Lubrizol. Карбомеры способны образовывать вязкие гели при указанных выше концентрациях до 5% по массе.
[0151] Все ингредиенты для применения в составах, описываемых в настоящем описании, должны быть перорально приемлемыми. Под "перорально приемлемым", как используют термин в настоящем описании, подразумевают ингредиент, который содержится в составе, как описано, в количестве и форме, которая не приводит к тому, что состав становится опасным для применения в полости рта.
[0152] В некоторых вариантах осуществления фермент, обладающий пергидролитической активностью, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из: a) SEQ ID NO: 1 и b) аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 1.
[0153] В некоторых вариантах осуществления фермент, обладающий пергидролитической активностью, дополнительно содержит связывающий домен, слитый с N-концом или C-концом фермента, где указанный связывающий домен обладает аффинностью к ткани полости рта.
[0154] В некоторых вариантах осуществления фермент, обладающий пергидролитической активностью, имеет аффинность к ткани полости рта и содержит аминокислотную последовательность, выбранную из: a) SEQ ID NO: 2 и b) аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 2.
[0155] В некоторых вариантах осуществления иммобилизованный фермент адсорбирован на нерастворимом веществе, удерживается на нерастворимых гранулах, ковалентно связан с нерастворимым веществом путем химической реакции, связан со связывающим доменом пептида, обладающего аффинностью к нерастворимому веществу, или заключен в нерастворимую матрицу.
[0156] Некоторые варианты осуществления относятся к способу отбеливания зубов или лечения гингивита, зубного налета или неприятного запаха изо рта, включающему получение жидкости, содержащей отбеливающее средство, способом по предшествующему пункту, и введение жидкости в полость рта, например, посредством ополаскивания рта жидкостью в течение периода от 15 секунд до одной минуты, а затем сплевывания жидкости.
[0157] В некоторых вариантах осуществления продукт доставляет отбеливающее средство в ополаскиватель для полости рта, где отбеливающее средство представляет собой перкислоту, получаемую путем катализируемой ферментом реакции пероксида водорода и триацетина. В некоторых вариантах осуществления две композиции, где одна содержит пероксид водорода, а другая содержит триацетин, хранят в бутылке ополаскивателя для полости рта (в первом компартменте). Некоторые варианты осуществления содержат на верхушке бутылки второй компартмент, который соединен, например, с использованием соединений типа вставки или ввинчиваемого типа. В некоторых вариантах осуществления второй компартмент, например, проточный картридж, который содержит фермент, обладающий пергидролитической активностью, иммобилизован на поверхностях переносимых веществ, таких как гидроксиапатитовые или целлюлозные частицы. В некоторых вариантах осуществления второй компартмент служит в качестве активирующего компонента ополаскивателя для полости рта.
[0158] В некоторых вариантах осуществления пероксид водорода и триацетин отделены от фермента, обладающего пергидролитической активностью. В некоторых вариантах осуществления во время использования смесь протекает через картридж и приходит в контакт с ферментом, обладающим пергидролитической активностью, на поверхностях и катализирует реакцию с быстрым образованием перкислоты. В некоторых вариантах осуществления - после использования - смесь снова отделяют от фермента.
[0159] Как используют на всем протяжении, диапазоны используют в качестве сокращенного обозначения для описания каждого и любого значения, которое входит в диапазон. Любое значение в диапазоне можно выбирать в качестве конечного значения диапазона. Кроме того, все цитируемые в настоящем описании ссылки, таким образом, полностью включены посредством ссылки. В случае противоречия в определении в настоящем описании и определения цитируемой ссылки, настоящее описание является приоритетным.
[0160] Если не указано иное, следует понимать, что все процентные содержания и количества, выражаемые в настоящем описании и где-либо еще в описании, обозначают процентные содержания в пересчете на массу. Приведенные количества основаны на активной массе вещества.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
[0161] В двухкамерной упаковке хранят 1,0 мл фосфатного буфера pH 7, содержащего 0,04 мг фермент пергидролазы отдельно от многокомпонентного порошка. Многокомпонентный порошок проиллюстрирован в таблицах 1A, 1B и 1C и содержит инкапсулированный триацетин и вкусоароматическую добавку, гранулированный пероксид мочевины и гелеобразующее вещество на основе карбомера. Отношение хорошо перемешанных порошков 1A:1B:1C в этом примере составляет 92,3:1,7:6. Две камеры разделены водонепроницаемым с запаянными швами барьером, который является менее прочным, чем внешние швы вокруг упаковки (см. например, фигуру 1). Для подготовки к применению пользователь нажимает на камеру с буфером/ферментом, чем разрушает хрупкую внутреннюю перегородку и проталкивает буфер/фермент камеру с порошком. Порошки быстро смешиваются с жидкостью, растворяя источник пероксида, крахмал с адсорбированными триацетином и вкусоароматической добавкой, и медленнее гидратируя гелеобразующее вещество. Через несколько секунд смешивания этих компонентов эффективно образуется гель, и его быстро наносят на капу. Приблизительно 0,5 грамм только что образованного геля наносят на верхнее и нижнее средство доставки, получая дозу 4,3 мг пероксида мочевины (эквивалентную 1,5 мг пероксида водорода), 10 мг триацетина и 0,01 мг фермента гидролазы.
[0162] Открывая отверстие в упаковке через предварительно подготовленное пропускное отверстие (см. фигуру 1), пользователь может наносить гель на капу, а затем носить капу в течение 20-30 минут. Альтернативно, гель можно наносить на эластичные полоски, такие как непористые эластичные полиэтиленовые или медленно растворяющиеся пленки.
Таблица 1A
Инкапсулированный триацетин
Ингредиент
Масса %
Крахмал (CAPSUL, National National Starch)
94,6
Триацетин
4,3
Вкусоароматическая добавка
1,1
Всего
100
Таблица 1B
Пероксид
Ингредиент
Масса %
Гранулы пероксида мочевины, 5-10 микрон
100
Таблица<b></b>1C
Твердое гелеобразующее вещество
Ингредиент
Масса %
Гелеобразующее вещество на основе карбомера (CARBOPOL<sup></sup> 971P, Lubrizol)
100
Пример 2
[0163] Иллюстративный пергидролитический фермент иммобилизовали на твердой проницаемой матрице. Матрицу помещали в шприц и продавливали раствор, содержащий пероксид водорода и триацетин, через матрицу для получения и дозирования перуксусной кислоты (PAA).
[0164] Матрицу прототипа фермента получали, как указано ниже: 0,1 г порошка гидроксиапатита инкубировали с 1500 микролитрами 5 микромолярного фермента, содержащего пергидролитическую область и домен связывания с гидроксиапатитом, в 10 мМ фосфатном буфере pH 7,2 в течение 1 часа при 37°C. Затем 3x промывали порошок 1 мл 10 мМ фосфатного буфера, каждый раз осаждая, отбрасывая жидкость, ресуспендируя в буфере и повторяя. Затем порошок ресуспендировали в 500 микролитрах 10 мМ фосфатного буфера и помещали в 3 мл шприц с 25 м шприцевым фильтром (мембрана 5 микрон) и пропускали избыток жидкости через фильтр.
3
4
405
[0165] 500 микролитров реакционного буфера, содержащего 100 мМ фосфатного буфера, 100 мМ триацетина и 100 мМ пероксида водорода помещали в шприц, пропускали через фильтр и собирали. Собирали 90 микролитров продукта, затем останавливали реакцию 40 микролитрами 1,3 M HPO. Затем разбавляли получаемую смесь 1:10 в фосфатном буфере и добавляли к реагенту для детекции, инкубировали 10 минут и считывали при A нм. Измеряли относительное содержание образуемой PAA. Затем повторяли процедуру без фермента в качестве контроля.
[0166] Этим способом получали приблизительно 900 м.д. PAA по сравнению с 32 м.д. без фермента пергидролазы. Реагенты контактировали с иммобилизованным ферментом в течение менее 60 секунд:
Таблица 2A
Образец
PAA (м.д.)
Стандартное отклонение
Фермент
903,818
122,922
Нет фермента
32,438
2,414
[0167] Эксперимент повторяли три раза с ферментом, три раза без фермента, обеспечивая возможность контактирования с ферментом не более 15 секунд. PAA получали сопоставимо на уровнях приблизительно 300-350 м.д. с ферментом и приблизительно 65 м.д. без фермента. Результаты описаны ниже в таблице 2B.
Таблица 2B
Образец
PAA (м.д.)
Стандартное отклонение
Фермент 1
363,380
74,462
Фермент 2
356,309
43,188
Фермент 3
308,960
55,096
Нет фермента 1
66,066
2,663
Нет фермента 2
63,299
0,533
Нет фермента 3
65,759
0,533
[0168] Аналогичные результаты получали с использованием более крупного (10 мл) шприца:
Таблица 2C
Образец
PAA (м.д.)
Стандартное отклонение
Фермент
333,864
65,987
Нет фермента
62,223
1,399
[0169] Таким образом, реакция в присутствии иммобилизованного фермента проходит воспроизводимо, быстро и эффективно, обеспечивая уровни PAA, которые во много раз превосходят уровни, необходимые для уничтожения бактерий и являются достаточными для отбеливания зубов.