Структурные изменения в тимусе крыс в остром периоде после воздействия экспериментальной гипертермии

структурные изменения в тимусе крыс в остром периоде после воздействия экспериментальной гипертермии

Васендин Д. В.1*, кандидат медицинских наук,

Мичурина C. В.2, доктор медицинских наук,

Ищенко И. Ю.2, кандидат биологических наук

1 ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, 630091, г. Новосибирск, Красный пр., д. 52

2 ГУ «Новосибирский научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии» Сибирского отделения РАМН, 630117, г. Новосибирск, ул. Академика Тимакова, д. 2

РЕЗЮМЕ Изучен клеточный состав тимуса крыс после экспериментальной гипертермии. Установлено, что данное воздействие приводит к формированию акцидентальной инволюции тимуса. Инволюция органа соответствовала острому постгипертермическому периоду, что выражалось в снижении относительного веса органа, уменьшении относительной площади коркового вещества и плотности лимфоцитов во всех зонах, особенно во внутренней зоне коркового вещества. На тканевом уровне выявлено усиление деструктивных процессов, признаки периваскулярного отека, миграции клеточных элементов в лимфатические пространства и капилляры.

Ключевые слова: тимус, гипертермия, крысы линии Вистар, инволюция.

* Ответственный за переписку (corresponding author): е-mail: vasendindv@gmail.com

Все усложняющееся взаимодействие между процессами жизнедеятельности и многочисленными средовыми факторами, в том числе высокой температурой, заставляет уделять большее внимание изучению фундаментальных основ адаптации. Тимус, как один из главных органов иммунной системы, отвечает за постоянство внутренней среды организма. Исследование особенностей структурной организации тимуса при общей гипертермии является важнейшей задачей современной анатомии и гистологии, поскольку вопрос об обратимости изменений на различных уровнях структурной организации организма при гиперме-таболическом состоянии, индуцированном тепловым стрессом, изучен еще очень слабо. Поэтому целью нашего исследования явилось изучение изменений в структурной организации тимуса крыс в различные сроки после воздействия экспериментальной гипертермии (ЭГ).

материал и методы

В эксперименте использовались крысы-самцы линии Вистар, по 15 животных в каждую временную точку. Животные нагревались однократно до стадии теплового удара. На разных сроках эксперимента (через 5 часов и на 3-и сутки) после ЭГ животных забивали под легким наркозом и забирали тимус для исследования. Разогревание экспериментальных животных производилось в полном соответствии с патентом «Способ экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных» [2].

Тимус фиксировали в растворе по Телесницко-му, обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и заливали смесь парафина с добавлением воска. Срезы изготавливали на ротационном микротоме, окрашенные препараты заключали в канадский бальзам.

STRUCTURAL ALTERATIONS IN THYMUS IN ACUTE PERIOD AFTER EXPERIMENTAL HYPERTHERMIA EXPOSURE IN RATS

Vasendin D. V., Michurina S. V., Ishchenko I. Yu.

ABSTRACT Thymus cellular composition was examined after experimental hyperthermia in rats. It was determined that this exposure resulted in thymus accidental involution formation. The organ involution corresponded to acute posthyperthermic period and it was expressed in the decrease of the organ relative weight, diminishment of relative square of cortical substance and lymphocyte density in all areas particularly in the inner area of the cortical substance. The increase of the destructive processes, the signs of perivascular oedema and cellular elements migration into lymphatic space and capillaries were revealed at tissular level.

Key words: thymus, hyperthermia, Vistar line rats, involution.

Определение относительных площадей коркового и мозгового вещества, капсулы и междолько-вых перегородок проводили на срезах толщиной 10 мкм, окрашенных гематоксилином Майера [1]. Морфометрию срезов осуществляли при увеличении в 16 раз, морфометрию железистых образований - при увеличении в 200 раз. Клеточный состав тимуса изучали на срезах толщиной 5 мкм, окрашенных азуром II и эозином. При увеличении в 1 000 раз подсчитывали абсолютное количество клеток на стандартной площади 4 500 мкм2, дифференцируя следующие клеточные элементы: иммунобласты, средние и малые лимфоциты, клетки с фигурами митозов, клетки с пикнотичес-кими ядрами, эпителиальные клетки, макрофаги.

Для электронно-микроскопического исследования материал (по 5 фрагментов тимуса от каждого животного, по 5 животных из каждой экспериментальной группы) фиксировали в 4%-ном парафор-мальдегидном изотоническом 0,1 М фиксаторе на фосфатном буфере Миллонига (рН = 7,4) в течение 2 часов при температуре 4°С. Дофиксацию проводили в 1%-ном осмиевом фиксаторе на 0,2 М какодилатном буфере (рН = 7,4). После дегидратации образцов в серии спиртов возрастающей концентрации они заключались в эпон-812. Уль-тратонкие срезы толщиной 35-45 нм получали на ультратоме LKB-8800, контрастировали насыщенным водным раствором уранилацетата при 40°С в течение 40 мин, а затем цитратом свинца при комнатной температуре в течение 20 мин. После напыления углеродом в вакууме контрастирован-ные срезы изучались на электронном микроскопе JEM-1010 [9, 11].

Статистическую обработку данных проводили методом вариационной статистики с применением критерия Стьюдента [6]. Результаты обработаны при помощи пакета программ <^а^юа» 6.0. Различия сравниваемых показателей принимались как значимые при р < 0,05.

Все экспериментальные работы выполнены с соблюдением правил биоэтики, утвержденных Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для лабораторных или других целей.

результаты и обсуждение

Установлено, что воздействие ЭГ на организм крыс приводит к значительным изменениям структурной организации тимуса, характерным для острого постгипертермического периода [5].

В первые часы после воздействия ЭГ относительный вес тимуса не отличался от такового в контрольной группе (интактные животные). Мор-

фометрически обнаружено увеличение относительной площади коркового вещества органа и уменьшение размеров мозгового вещества, что привело к возрастанию индекса К/М.

Уже с первых часов острого периода выявлено увеличение периваскулярных пространств в тимусе, особенно в области корково-медуллярного соединения и мозговой зоны (рис. 1). На ультра-структурном уровне обращало на себя внимание очень большое количество пиноцитозных везикул в эндотелиоцитах капилляров и венул, разволокнение базальных мембран, преимущественно со стороны периваскулярных эпителиальных клеток, наличие соединительнотканных фибрилл и детрита разрушенных эпителиальных клеток в периваскулярных пространствах. Такие морфологические изменения свидетельствуют о нарушении гематотимического барьера и лимфодренажной функции, поскольку перивенуляр-ные пространства рассматриваются исследователями как прелимфатические структуры [7]. На светооптическом уровне отмечалось появление плазматических клеток на фоне большого числа лимфоидных клеточных элементов, заполняющих периваскулярные пространства (рис. 2), что может свидетельствовать о наличии антигена в паренхиме и строме тимуса [10]. На протяжении всего острого периода после ЭГ на ультраструк-турном уровне имела место дилатация и заполнение клеточным детритом интерстициальных пространств во всех зонах тимуса. Обнаружено значительное разрушение эпителиальных клеток. В них наблюдалось баллонообразное расширение профилей гранулярного эндоплазматическо-го ретикулума, осыпание рибосом с его мембран, что является признаком нарушения процессов синтеза. В митохондриях выявлено набухание митохондриального матрикса, дезорганизация и разрушение крист, что может указывать на нарушение энергообеспечения эпителиальных клеток тимуса.

На фоне выраженных деструктивных процессов в органе, затруднения дренажа интерстициальных пространств установлены значительные изменения в лимфоидном отделе тимуса. Общая плотность клеточных элементов, особенно во внутренней зоне коркового вещества тимуса, достоверно снижалась и через 5 часов после ЭГ составила 177,8 ± 12,1 кл. Основной вклад в эти изменения вносило уменьшение количества лимфоидных клеток, и в первую очередь в коре снижалось содержание именно зрелых лимфоцитов (во внутренней зоне коркового вещества - 120,4 ± 8,1). В мозговом веществе общая плотность клеточных элементов не менялась, но при этом обнаруживалось уменьшение числа зрелых лимфоцитов до

Рис. 1. Отечность периваскулярных пространств венул и артериолы. Окраска гематоксилином Майера и эозином. Объектив 40, окуляр 10

69,0 ± 6,4. По-видимому, значительный вклад в эти изменения вносит процесс миграции зрелых лимфоцитов из коры через посткапиллярные венулы и лимфатические сосуды, что согласуется с данными многих исследователей [4, 8]. Интересно, что при этом не снижалась интенсивность лимфопоэтической функции тимуса, так как неизменным оставалось количество иммунобластов и митоти-чески делящихся клеток в субкапсулярной зоне (табл.), увеличивалось число иммунобластов во внутренней зоне коркового вещества (16,0 ± 2,6) и росло содержание средних лимфоцитов в суб-капсулярной зоне коры (табл.) и мозговом веществе (25,4 ± 1,52). Видимо, эти данные свидетельствуют об усилении лимфоцитопоэтической функции и ускорении созревания имеющихся ти-моцитов в соответствующих зонах, что рассматривается нами как компенсаторные процессы.

Снижение количества зрелых лимфоцитов может объясняться и гибелью дифференцированных Т-лимфоцитов. В первые часы острого периода в тимусе выявлено усиление процесса гибели клеток. В субкапсулярной и внутренней зонах коры тимуса увеличивалось число клеток с пикноти-ческими ядрами (7,2 ± 1,75), была ярко выражена макрофагальная реакция (7,6 ± 1,04) (табл.). Следует отметить, что в условиях гипертермического стресса главную роль в усилении гибели лимфоидных клеток, причем осуществляющейся по типу апоптоза, играют глюкокортикоидные гормоны надпочечников [4].

Определенный вклад в усиление процесса разрушения лимфоцитов в корковом веществе тимуса вносят тучные клетки. Появление в начале острого периода большого количества деграну-

Рис. 2. Мозговая зона тимуса крыс. Большое количество плазматических клеток в периваскулярных пространствах. Окраска гематоксилином Майера и эозином. Объектив 40, окуляр 10

лированных тучных клеток согласуется с имеющимися данными литературы о стереотипности ответной реакции этих клеток на внешние дестабилизирующие влияния. Дегрануляция является обычной реакцией тучных клеток на повреждение тканей. Этот процесс сопровождается выбросом гепарина, гистамина, серотонина, ферментов в соединительную ткань, что ведет к повышению сосудистой проницаемости, изменению тонуса сосудов [3].

К концу острого периода происходило восстановление долевых соотношений коркового и мозгового вещества органа до уровня контроля. Отмечалось дальнейшее снижение численной плотности всех клеточных элементов в исследованных зонах тимуса (167,0 ± 4,35 и 111,75 ± 5,57), а среди них - клеток лимфоидного ряда, особенно во внутренней зоне коркового вещества (151,0 ± 3,83) (табл.). Во всех структурно-функциональных зонах выявлялся (по сравнению с контролем) низкий уровень зрелых лимфоцитов (113,75 ± 4,8 и 52,5 ± 8,7), во внутренней зоне коркового слоя тимуса поддерживался возросший уровень им-мунобластов (16,0 ± 2,87), а в мозговом веществе - высокое содержание средних лимфоцитов (30,0 ± 5,83).

На 3-и сутки после ЭГ в тимусе снижалась интенсивность процесса гибели клеток, что подтверждалось восстановлением до контрольного уровня числа клеток с пикнотическими ядрами (1,75 ± 0,55 и 2,0 ± 0,82) и макрофагов (2,75 ± 0,87 и 2,25 ± 0,55), возрастала относительная площадь железистых образований, а в обеих зонах коркового вещества увеличивалось количество эпителиальных клеток (7,5 ± 1,11), что, по-видимому,

Таблица. Клеточный состав субкапсулярной зоны коркового вещества тимуса у крыс контрольной группы и в остром постгипертермическом периоде

Виды клеток В контроле После воздействия экспериментальной гипертермии

Через 5 часов Через 3 суток

Иммунобласты:

абсолютное количество 2б,б і 2,2 2б,8 і 3,83 26,б і 2,97

относительное количество, % 14,8б і 1,46 1б,0б і 1,42 17,38 і 2,17

Средние лимфоциты:

абсолютное количество 14,0 і 2,0 20,0 і 2,24 20,7б і 2,б1

относительное количество, % 8,13 і 1,16 11,76 і 0,99* 13,32і0,87*

Малые лимфоциты:

абсолютное количество 119,0 і б,99 101,4 і 3,42* 92,б і 9,22*

относительное количество, % 68,72 і 1,71 60,2б і 2,36* 59,64і2,75*

Сумма всех лимфоцитов:

абсолютное количество 1б8,б і б,81 147,2 і 7,31 139,7б і 9,8

относительное количество, % 91,71 і 0,63 87,07 і 0,48* 90,16і0,62#

Клетки с фигурами митозов:

абсолютное количество 3,33 і 0,61 4,4 і 1,30 3,б і 0,7б

относительное количество, % 1,94 і 0,36 2,б2 і 0,6 2,23 і 0,39

Клетки с пикнотическими ядрами:

абсолютное количество 2,67 і0,37 6,0 і 1,27* 3,0 і 1,б6

относительное количество, % 1,б3 і 0,17 3,б8 і 0,79* 1,82 і 0,81

Макрофаги:

абсолютное количество 2,33 і 0,23 7,2 і 1,24*# 2,0 і 0,82#

относительное количество, % 1,3б і 0,13 4,27 і 0,74* 1,37 і 0,бб#

Эпителиальные клетки:

абсолютное количество 6,0 і 1,06 4,4 і 0,67 6,7б і 0,73#

относительное количество, % 3,47 і 0,13 2,б7 і 0,3 4,42 і 0,6б#

Сумма 172,83 і 6,18 169,2 і 9,17 1бб і10,92

Примечание. Абсолютное количество - число клеток на стандартной площади (4 500 мкм2). Относительное количество - процент от общего количества клеток. Достоверность различий: * - с показателями интактных животных (р < 0,05); # - с показателями животных экспериментальной группы через 5 часов после воздействия гипертермии.

объясняется острой необходимостью усиления секреции тимических гормонов при экстремальных воздействиях [4, 7].

выводы

В остром периоде (через 5 часов, на 3-и сутки) после воздействия высокой внешней температуры в тимусе имеют место значительные изменения, свидетельствующие о развитии деструктивных процессов и ухудшении дренажа межклеточных пространств в органе: нарушение структуры ге-матотимического барьера, отек периваскулярных и интерстициальных пространств (корней лимфатической системы), разрушение эпителиальных клеток, увеличение содержания клеток с пикноти-ческими ядрами и макрофагов.

На 3-и сутки острого периода после ЭГ наблюдаются изменения, касающиеся лимфоидного отдела тимуса: уменьшение размеров коркового и мозгового вещества, снижение плотности клеточных элементов, угнетение лимфоцитопоэтической функции и усиление гибели лимфоцитов по типу апоптоза, приводящее в итоге к снижению их численности в тимусе, особенно во внутренней зоне коркового вещества органа. Это отражает морфологическую картину акцидентальной инволюции, приводящей к гипотрофии органа, основу морфогенеза которой составляет атрофический процесс. Компенсаторные изменения, заключающиеся в нарастании числа средних лимфоцитов и иммунобластов в корковой зоне тимуса, рассматриваются нами как усиление лимфопоэтической функции и ускорение созревания тимоцитов.

литература

1. Автандилов Г. Г. Медицинская морфометрия : рук-во.

- М. : Медицина, 1990.

2. Пат. Способ экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных / А. В. Ефремов [и др.] // Изобретения. Полезные модели. - 2001. - № 10. - С. 43 - 45.

3. Ефремов А. В., Самсонова Е. Н., Начаров Ю. В. Нарушения микроциркуляции и периферического кровообращения. - Новосибирск: Сибмедиздат НГМУ, 2007. - 44 с.

4. Нейроиммуноэндокринология тимуса / И. М. Кветной [и др.]. - СПб. : ДЕАН, 2005.

5. Маянский Д. В. Лекции по клинической патологии : рук-во для врачей. - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2007.

6. Плохинский Н. А. Биометрия. - М. : Изд-во МГУ, 1970.

7. Селятицкая В. Г, Обухова Л. А. Эндокринно-лимфоидные отношения в динамике адаптивных процессов. - Новосибирск : СО РАМН, 2001.

8. Ярилин А. А. Гомеостатические процессы в иммунной системе. Контроль численности лимфоцитов // Иммунология. - 2004. - № 5. - C. 312-320.

9. Luft J. H. Improvements in epoxy resin embedding methods // J. Biophys. Biochem. Cyt. - 1961. - Vol. 9.

- P. 409-414.

10. Saint-Marie G., Peng F.-S., Marcoux D. The stroma of the thymus of the rat: Morphologic and antigen diffusion, a reconsideration // Amer. J. Anat. - 1996. - Vol. 177, № 3. - P. 333-352.

11. White D. L., Mazurkiewicz J. E., Barnett R. J. A chemical mechanism for tissue staining by osmium tetroxide-ferrocyanide mixtures // J. Histochem. and Cytochem.

- 1979. - Vol. 27, № 7. - P. 1084-1091.