СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ПОЛИКЛОНАЛЬНОГО БЕЛКА

1. Способ получения поликлональной клеточной линии, способной экспрессировать поликлональный белок, содержащий от 2 до n различающихся членов, где указанный способ включает:
a) получение набора экспрессирующих векторов, в котором каждый из указанных векторов содержит, по меньшей мере, одну копию отличающейся нуклеиновой кислоты, кодирующей отдельный член указанного поликлонального белка;
b) раздельную трансфекцию клеток-хозяев каждым из указанных экспрессирующих векторов в условиях, исключающих сайт-специфичную интеграцию экспрессирующих векторов в геном клеток, с получением таким образом от 2 до n клеточных композиций, где каждая композиция экспрессирует один отдельный член поликлонального белка;
c) смешивание указанных от 2 до n клеточных композиций для получения поликлональной клеточной линии.
2. Способ по п.1, в котором экспрессирующие векторы представляют собой эписомальные векторы.
3. Способ по п.1, в котором экспрессирующие векторы стабильно и случайно встроены в одну или несколько хромосом клеток-хозяев.
4. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором клонируют трансфицированные клетки, полученные на стадии b).
5. Способ по п.4, в котором клетки клонируют с использованием FACS клонирования.
6. Способ по п.4, в котором клоны отобраны, по меньшей мере, по одному критерию, выбранному из группы, состоящей из: скорости роста, времени удвоения, уровня экспрессии, уровня продуцирования, стабильности продуцирования во времени, жизнеспособности, стойкости, устойчивости, морфологии и количества копий.
7. Способ по п.6, в котором клоны отбирают по однородности в отношении, по меньшей мере, одного критерия.
8. Способ по п.7, включающий отбор по однородности в отношении времени удвоения и уровня экспрессии.
9. Способ по п.4, в котором для каждого отдельного члена поликлонального белка отобран более чем один клон.
10. Способ по п.9, в котором 2 клона отобраны для каждого отдельного члена поликлонального белка или в котором отобраны 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 клонов.
11. Способ по п.1, в котором указанные клеточные композиции, экспрессирующие различные отдельные члены, смешаны в соотношении 1:1.
12. Способ по п.1, в котором указанные клеточные композиции смешаны в соотношении, которое отличается от соотношения 1:1.
13. Способ по п.1, в котором экспрессирующие векторы идентичны, за исключением различий в кодирующей последовательности поликлонального белка.
14. Способ по п.1, в котором клетки-хозяева получены от одного клона перед трансфекцией.
15. Способ по п.1, в котором поликлональный белок представляет собой мультимерный белок.
16. Способ по п.15, в котором один экспрессирующий вектор кодирует все субъединицы одного отдельного члена поликлонального белка.
17. Способ по п.15, в котором набор экспрессирующих векторов на стадии a) состоит из двух или более подгрупп экспрессирующих векторов, где первая подгруппа содержит варианты последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующие одну субъединицу белка, и вторая подгруппа содержит варианты последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующие другую субъединицу белка так, что каждая трансфекция осуществляется с использованием члена из первой подгруппы и члена из второй подгруппы экспрессирующих векторов.
18. Способ по п.1, в котором экспрессирующий вектор или дополнительный экспрессирующий вектор кодирует селектируемый маркер.
19. Способ по п.18, в котором клетки культивируют непрерывно в условиях, способствующих росту клеток, экспрессирующих селектируемый маркер.
20. Способ по п.18, в котором селектируемый маркер содержит продукт гена, в котором клетка-хозяин испытывает недостаток.
21. Способ по п.18, в котором селектируемый маркер кодируется транскриптом, который также кодирует полипептидный член или субъединицу указанного полипептидного члена, предпочтительно в котором селектируемый маркер кодируется транскриптом, кодирующим самую крупную субъединицу.
22. Способ по п.1, в котором поликлональный белок в природе не связан с клетками-хозяевами.
23. Способ по п.1, в котором поликлональный белок представляет собой поликлональное антитело или фрагмент поликлонального антитела.
24. Способ по п.16, в котором набор экспрессирующих векторов на стадии a) состоит из двух подгрупп экспрессирующих векторов, где первая подгруппа содержит варианты последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующие тяжелую цепь антитела, и вторая подгруппа содержит варианты последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующие легкую цепь антитела так, что каждая трансфекция осуществляется с использованием члена из первой подгруппы и члена из второй подгруппы экспрессирующих векторов.
25. Способ по п.23, в котором поликлональные антитела имеют одни и те же константные области тяжелой или легкой цепи, предпочтительно тяжелой цепи.
26. Способ по п.1, в котором поликлональный белок представляет собой поликлональный T-клеточный рецептор или фрагмент поликлонального T-клеточного рецептора.
27. Способ по п.1, в котором клетки-хозяева являются прокариотическими.
28. Способ по п.1, в котором клетки-хозяева являются эукариотическими.
29. Способ по п.28, в котором эукариотические клетки выбраны из группы, состоящей из растений, дрожжей, грибов, позвоночных или беспозвоночных животных.
30. Способ по п.28, в котором эукариотические клетки выбраны из группы, состоящей из клеток яичника китайского хомячка (CHO), клеток COS, клеток BHK, миеломных клеток (например клеток Sp2/0, NSO, YB2/0), NIH 3T3, фибробластов или иммортализованных клеток человека, включая клетки HeLa, клетки HEK293 или PER.C6.
31. Способ по п.28, в котором клетка-хозяин экспрессирует рекомбинантный трансактиватор, допускающий трансактивацию промотора, кодирующего экспрессию поликлонального белка.
32. Способ производства поликлонального белка, включающий:
a) обеспечение поликлональной клеточной линии, полученной с использованием способа по любому из пп.1-31;
b) культивирование поликлональной клеточной линии в условиях, допускающих экспрессию поликлонального белка; и
c) сбор и необязательно очистку поликлонального белка от клеток или среды.
33. Способ по п.32, в котором смешанные композиции культивируют в емкости, такой как встряхиваемая колба, одноразовый биореактор, биореактор.
34. Способ по п.33, в котором одну поликлональную клеточную линию, экспрессирующую одну популяцию отдельных членов поликлонального белка, культивируют в одной емкости, и, по меньшей мере, вторую поликлональную клеточную линию, экспрессирующую вторую популяцию отдельных членов поликлонального белка, культивируют во второй емкости, и поликлональные белки из каждой емкости смешивают до или после очистки.
35. Способ по любому из пп.32-34, дополнительно содержащий стадию проверки присутствия каждого отдельного члена в выделенном и необязательно очищенном поликлональном белке.
36. Поликлональная клеточная линия, содержащая от 2 до n популяций клеток, где каждая популяция экспрессирует отдельный член рекомбинантного поликлонального белка, где рекомбинантный поликлональный белок содержит различные, но гомологичные белковые молекулы, где клетки содержат, по меньшей мере, одну экспрессионную конструкцию, случайным образом встроенную в геном так, что сайты интеграции различаются между членами поликлональной клеточной линии.
37. Поликлональная клеточная линия по п.36, в которой, по меньшей мере, одна экспрессионная конструкция интегрирована в одну или несколько хромосом.
38. Поликлональная клеточная линия по п.36 или 37, где n равно 3 или более, например 4 или более, например 5 или более, например 6 или более, например 7 или более, например 8 или более, например 9 или более, например 10 или более, например 11 или более, например 12 или более, например 13 или более, например 14 или более, например 15 или более, например 16 или более, например 17 или более, например 18 или более, например 19 или более, например 20 или более, например 21 или более, например 22 или более, например 23 или более, например 24 или более, например 25 или более, например 26 или более, например 27 или более, например 28 или более, например 29 или более, например 30 или более, например 35 или более, например 40 или более, например 45 или более, например 50 или более, например 60 или более, например 70 или более, например 80 или более, например 90 или более, например 100 или более.
39. Поликлональная клеточная линия по любому из пп.36-38, где n составляет менее 50, например менее 45, например менее 40, например менее 35, например менее 30.
40. Поликлональная клеточная линия по п.36 или .37, в которой клетки, экспрессирующие один отдельный член рекомбинантного поликлонального белка, получены из 1 или более клонированных клеток, например из 2 или более, например из 3 или более, например из 4 или более, например из 5 или более, например из 6 или более, например из 7 или более, например из 8 или более, например из 9 или более, например из 10 или более, например из 11 или более, например из 12 или более, например из 13 или более, например из 14 или более, например из 15 или более, например из 16 или более, например из 17 или более, например из 18 или более, например из 19 или более, например из 20 или более, например из 21 или более, например из 22 или более, например из 23 или более, например из 24 или более, например из 25 или более, например из 26 или более, например из 27 или более, например из 28 или более, например из 29 или более, например из 30 или более, например из 35 или более, например из 40 или более, например из 45 или более, например из 50 или более, например из 60 или более, например из 70 или более, например из 80 или более, например из 90 или более, например из 100 или более.
41. Поликлональная клеточная линия по п.36 или 37, где поликлональный белок представляет собой мультимерный белок.
42. Поликлональная клеточная линия по п.41, в которой каждая экспрессионная конструкция кодирует субъединицы мультимерного белка.
43. Поликлональная клеточная линия по п.42, в которой экспрессия субъединиц находится под управлением одних и тех же или идентичных промоторов.
44. Поликлональная клеточная линия по п.36 или 37, в которой экспрессионные конструкции кодируют селектируемый маркер.
45. Поликлональная клеточная линия по п.44, в которой селектируемый маркер кодируется транскриптом, который также кодирует полипептидный член или субъединицу указанного полипептидного члена.
46. Поликлональная клеточная линия по п.36 или 37, в которой поликлональный белок в природе не связан с клетками-хозяевами.
47. Поликлональная клеточная линия по п.36 или 37, где поликлональный белок представляет собой поликлональное антитело или фрагмент поликлонального антитела.
48. Поликлональная клеточная линия по п.47, где набор экспрессирующих векторов состоит из двух подгрупп экспрессирующих векторов, где первая подгруппа содержит варианты последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующие тяжелую цепь антитела, и вторая подгруппа содержит варианты последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующие легкую цепь антитела так, что каждая трансфекция осуществляется с использованием члена из первой подгруппы и члена из второй подгруппы экспрессирующих векторов.
49. Поликлональная клеточная линия по п.47, в которой все члены поликлональных антител принадлежат одному и тому же изотипу.
50. Поликлональная клеточная линия по п.36 или 37, в которой поликлональный белок представляет собой поликлональный T-клеточный рецептор или фрагмент поликлонального T-клеточного рецептора.
51. Поликлональная клеточная линия по п.36 или 37, в которой клетки-хозяева являются прокариотическими.
52. Поликлональная клеточная линия по п.36 или 37, в которой клетки-хозяева являются эукариотическими.
53. Поликлональная клеточная линия по п.36 или 37, в которой клетки содержат стабильно интегрированную экспрессионную конструкцию, кодирующую трансактиватор, допускающий трансактивацию промотора, кодирующего члены поликлонального белка.
54. DHFR-отрицательная клетка CHO, содержащая стабильно интегрированную нуклеиновую кислоту, кодирующую трансактиватор E1A аденовируса 5 типа, функционально связанный с конститутивным промотором.
55. Клеточная линия по п.54, где клеточная линия получена из клеточной линии DG44.
56. Клеточная линия по п.54 или 55, где клеточная линия дополнительно содержит, по меньшей мере, одну копию стабильно интегрированной экспрессионной конструкции, кодирующей представляющий интерес полипептид.
57. Клеточная линия по п.56, в которой представляющий интерес полипептид представляет собой мультимерный белок, предпочтительно, где мультимерный белок представляет собой антитело.
58. Клеточная линия по п.56, в которой экспрессионная конструкция, кодирующая представляющий интерес полипептид, дополнительно кодирует dhfr.
59. Клеточная линия по п.58, в которой dhfr и, по меньшей мере, одна субъединица представляющего интерес полипептида кодируются одним и тем же транскриптом, предпочтительно, где dhfr кодируется транскриптом, кодирующим самую крупную субъединицу.
60. Клеточная линия по п.56, в которой экспрессия представляющего интерес полипептида управляется одним или несколькими промоторами, трансактивируемыми с помощью E1A, предпочтительно, где промоторы представляют собой промоторы CMV или получены из промоторов CMV.