ОЦЕНКА МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ХОБЛ С ПОМОЩЬЮ КАТИОННОГО КРАСИТЕЛЯ JC-1 МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОФЛУОРИМЕТРИИ

Оценка митохондриальной дисфункции при обострении ХОБЛ с помощью катионного красителя JC-1 методом проточной цитофлуориметрии

Э.С. Бельских, О.М. Урясьев, В.И. Звягина, О.Н. Журина, В.Г. Демихов

ФГБОУ ВО «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Минздрава России, г. Рязань, Россия

Работа посвящена изучению мембранного потенциала митохондрий мононуклеарных лейкоцитов периферической крови у больных с хронической обструктивной болезнью легких. 22 исследуемых в возрасте от 40 до 75 лет были разделены на несколько групп. Первая группа служила контролем и включала 5 некурящих добровольцев без сопутствующих хронических заболеваний органов дыхания. В соответствии со спирометрической классификацией GOLD были выделены группы пациентов с ХОБЛ 2 (n = 10) и ХОБЛ 3 (n = 7). Относительно курения исследуемые пациенты были разделены на группы курильщиков (группа 4, n = 8) и экс-курильщиков (группа 5, n = 9). Для определения мембранного потенциала митохондрий лимфоцитов и моноцитов методом проточной цитофлуориметрии использовали катионный краситель JC-1 и антитела к CD45, конъюгированные с флуорохромом. Было установлено, что больные с тяжелой бронхобструкцией по классификации GOLD характеризуются значительным снижением мембранного потенциала митохондрий лимфоцитов периферической крови. Отказ от курения способен снизить выраженность митохондриальной дисфункции мононуклеарных лейкоцитов периферической крови у больных с ХОБЛ.

Ключевые слова: митохондриальная дисфункция, ХОБЛ, проточная цитометрия, JC-1, курение, лимфоциты.

Evaluation of mitochondrial dysfunction during exacerbation of copd using cationic dye JC-1 by flow cytometry

E.S. Belskikh, O.M. Uryasev, V.I. Zvyagina, O.N. Zhurina, V.D. Demikhov

Ryazan State Medical University named after academician I.P. Pavlov, ul. Vysokovoltnaya 9, 390026, Russia

The investigation is devoted to the study of membrane potential of mitochondria of mononuclear leukocytes of peripheral blood in patients with chronic obstructive pulmonary disease. 22 subjects aged between 40 and 75 years were divided into several groups. The first group served as a control and included 5 non-smoking volunteers without concomitant chronic respiratory diseases. In accordance with the spirometric classification of GOLD, groups of patients with COPD 2 (n = 10) and COPD 3 (n = 7) were isolated. Regarding smoking, the patients studied were divided into groups of smokers (group 4, n = 8) and ex-smokers (group 5, n = 9). To determine the membrane potential of mitochondria of lymphocytes and monocytes, cationic dye JC-1 and antibodies to CD45 conjugated with fluorochrome were used by flow cytofluorimetry. It was found that patients with severe bronchial obstruction according to the GOLD classification are characterized by a significant decrease in the membrane potential of mitochondria of peripheral blood lymphocytes. Smoke cessation can reduce the severity of mitochondrial dysfunction of peripheral blood mononuclear leukocytes in patients with COPD.

Keywords: mitochondrial dysfunction, COPD, flow cytometry, JC-1, smoke cessation, lymphocytes.

Введение

В патогенезе хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) в настоящее время выделяют несколько механизмов. Среди них, например, — усиленный воспалительный ответ на действие токсичных частиц, поступающих с табачным дымом, связан с увеличением количества нейтрофилов, лимфоцитов и макрофагов в альвеолах и дыхательных путях различного калибра [7, 9, 10]. Наряду с этим, большое значение придается дисбалансу между повышенной активностью матриксных металлопротеиназ и снижением уровня ингибиторов протеиназ. Данный механизм, как генетически обусловленный (дефицит а1-антитрипсина), так и опосредованный развитием воспалительной реакции, способствует развитию эмфиземы за счет активного разрушения эластических волокон стенок альвеол [7, 9 ,12]. Отдельно выделяется роль окислительного стресса, приводящего к дисфункции клеток или их смерти, что сопровождается повреждением легочного экстрацеллюлярного матрикса [6, 7, 9, 10]. Окислительный стресс развивается в результате неэффективности эндогенной антиоксидантной защитной системы в условиях избытка оксидантов: экзогенных — поступающих ингаляционно, и эндогенных, образующихся в воспалительных клетках и эпителиоцитах [11, 12]. Результаты исследований процессов клеточного старения и апоптоза легли в основу представлений четвертого механизма — нарушения соотношения между проапоптотическими процессами и элиминацией апоптических клеток в легких [13, 14, 17]. Учитывая, что выраженность патологических изменений при ХОБЛ в значительной мере варьируется от пациента к пациенту, повышенный уровень апоптоза клеток дыхательных путей способен объяснить прогрессирование ХОБЛ у ряда больных даже после прекращения курения, одного из важнейших аспектов в ведении больных с ХОБЛ

[5, 9, 13, 15].

В настоящее время, наряду с вышеназванными патогенетическими механизмами, активно изучается роль митохон-дриальной дисфункции в развитии ХОБЛ, которая связана как с избыточной генерацией активных форм кислорода с развитием окислительного стресса, так и с повышенным уровнем апоптоза [1—3, 7, 9]. Выявлено патологическое изменение структуры митохондрий в эпителиальных клетках бронхов, в том числе истощение крист, повышенное разветвление, удлинение и набухание митохондрий у экс-курильщиков-больных с ХОБЛ крайне тяжелой степени тяжести [9]. Установлено, что длительное воздействие сигаретного дыма изменяет уровень маркеров митохон-дриального биогенеза, окислительного фосфорилирования, повышает показатели окислительного стресса провоспали-тельных медиаторов [9, 13]. Исследование клеток гладкой мускулатуры стенки дыхательных путей от пациентов с ХОБЛ продемонстрировало снижение потенциала мито-хондриальной мембраны, содержания АТФ и повышенный

уровень генерации активных форм кислорода [13, 16]. Работы с моделями окислительного стресса, вызванного хроническим воздействием озона на мышей, позволили выявить способность митохондриального антиоксиданта MitoQ восстанавливать функцию митохондрий в легочной ткани, что было связано с предотвращением развития гиперчувствительности дыхательных путей и уменьшало количество воспалительных клеток и медиаторов [17]. Эти результаты демонстрируют, что митохондриальная дисфункция может играть ключевую роль в патогенезе ХОБЛ и потенциально обеспечить новую терапевтическую цель для поддержания и профилактики ХОБЛ [3, 7, 16, 17].

Для пациентов с ХОБЛ характерно поражение не только легких, но и системные проявления. Обнаружено, что митохондриальная дисфункция под длительным воздействием сигаретного дыма также способна развиваться вне легких — в скелетной мускулатуре, сосудистой стенке, клетках крови [1, 4, 5, 8, 12]. С учетом этого, выделение и исследование митохондриальной функции клеток крови, таких как лимфоциты и моноциты, непосредственно от больных более доступно, чем проведение биопсии для получения гладкомышечных клеток стенки бронха, и позволяет получить эти клетки в достаточном количестве для изучения, что не требует их дополнительного культивирования.

Функционирование комплексов дыхательной цепи связано с формированием трансмембранной разности электрохимических потенциалов на внутренней мембране митохондрий. Снижение митохондриального мембранного потенциала указывает на нарушение функции митохондрии и возможное развитие апоптоза и может быть оценено методом проточной цитофлуориметрии при помощи флуоресцентных красителей, позволяющих оценить деполяризацию мембран митохондрий [2—5]. Наиболее распространенным способом определения детекции митохондрий с низким и высоким потенциалом мембраны в настоящее время является проточная цитофлуорометрия с использованием катионного красителя JC-1 (5,5>,6,6>-тетрахлор-1,1>,3,3>-тетраэтилбензимидазолкарбоцанин йодид/ хлорид) [5, 16].

Митохондриальная дисфункция у больных ХОБЛ, тесно связанная с окислительным стрессом и проапоп-тотическими процессами, может стать новой целью для проведения терапии и профилактики прогрессирования ХОБЛ [7]. При этом исследование показателей функций митохондрий у больных ХОБЛ с различной степенью тяжести, выраженностью симптомов, стажем курения, сможет способствовать выделению групп больных для подбора оптимального режима терапии.

Таким образом, цель работы — пилотное исследование мембранного потенциала митохондрий лимфоцитов и моноцитов периферической крови с помощью катионного красителя JC-1 методом проточной цитофлуориметрии у больных с ХОБЛ.

Были поставлены следующие задачи: изучить уровень мембранного потенциала митохондрий как маркера митохондриальной дисфункции и определить влияние отказа от курения на уровень мембранного потенциала митохондрий лимфоцитов и моноцитов крови у больных с обострением ХОБЛ в сравнении со здоровыми добровольцами.

Материалы и методы

Исследование было одобрено ЛЭК ФГБОУ ВО РязГ-МУ Минздрава России (от 07.10.2016, протокол №2). Критериями включения для больных с ХОБЛ служили: постбронходилатационный модифицированный индекс Тиффно < 0,7; возраст от 40 до 75 лет. В качестве группы контроля использовали условно-здоровых некурящих добровольцев без заболеваний органов дыхания. Критериями исключения в отношении обоих групп служили: наличие легочных заболеваний, отличных от ХОБЛ; другие хронические заболевания внутренних органов в фазе декомпенсации; хирургические вмешательства на легких в анамнезе; злоупотребление алкоголем и наркотиками; беременность. Средний возраст включенных в исследование лиц составил 62 лет.

Первая группа служила контролем и включала 5 некурящих добровольцев без сопутствующих хронических заболеваний органов дыхания. В соответствии со спирометрической классификацией GOLD больные с ХОБЛ, госпитализированные в связи с обострением, разделялись

на группы ХОБЛ 2 (n = 10) и ХОБЛ 3 (n = 7). В зависимости от статуса курения включенные в исследование пациенты были разделены на группы курильщиков (n = 8) и экс-курильщиков (n = 9), которые бросили курить минимум 1 год назад. Забор крови осуществлялся утром натощак на второй день госпитализации путём венепункции с использованием пробирок BD Vacutainer CPT (США). Выделение мононуклеаров проводили путем центрифугирования в течение 16 минут при 1600 G. Полученные суспензии клеток троекратно отмывали теплым (370) солевым буфером Хэнкса (рН 7,4). Ресуспенди-рованные клетки подсчитывали при помощи гемоцитометра SysmexXT-2000i (Япония) и разводили до концентрации 106/мл. Для изучения мембранного потенциала митохондрий (Ду) использовали катионный краситель JC-1 («Molecular Probes», США). Для выделения клеточных популяций в ходе проточной цитометрии использовали антитела к CD45, конъюгированные с флуорохромом (CD45-PC-5, Beckman Coulter, США). Инкубирование проводили в термостате течение 20 минут при 370. Окрашенные клетки однократно отмывали, после чего подвергали проточной цитофлуориметрии на цитометре Cytomics FC 500 (США) с использованием программы CXP. Использованный метод основан на способности мономеров JC-1 в зависимости от уровня Ду накапливаться в митохондриальном матриксе с

образованием агрегатов, характеризующихся максимумом флуоресцентного свечения в красном—оранжевом спектре (~Х = 590 нм). Красная флуоресценция измерялась на FL-2-канале проточного цитофлуориметра. Мономеры JC-1 имеют максимум флуоресценции в зеленом спектре («X = 529 нм), которая измерялась на FL-1-канале. В изучаемых образцах определяли соотношение красная/ зеленая флуоресценция и принимали его за условный показатель мембранного потенциала митохондрий. Соотношение FL-2/FL-1 измерялось в популяциях клеток, выделенных по показателям бокового светорассеивания (SS) и флуоресценции анти-CD45 (рис. 1).

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программы Statistica 10.0. С помощью критерия Шапиро-Уилка проверяли соответствие выборок нормальному распределению. В связи с тем, что распределение в исследуемых группах было отлично от нормального, для попарного сравнения исследуемых групп применялся критерий Манна-Уитни. Статистически значимыми считали отличия при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Было установлено значительное снижение показателя Ду у исследуемых в группе с ХОБЛ 3 GOLD относительно контрольной, что, возможно, было связано с повреждением митохондрий и могло быть оценено как признак развития проапоптотических процессов в моноядерных лейкоцитах (табл. 1). При сравнении мембранного потенциала митохондрий лимфоцитов контрольной группы с Ду лимфоцитов крови больных с ХОБЛ средней тяжести (ХОБЛ 2 GOLD) статистически значимых отличий обнаружено не было. При сравнении показателей групп 2 и 3 между собой и в сравнении с контрольной группой Ду митохондрий моноцитов статистически значимо не изменялся.

Было обнаружено, что уровень мембранного потенциала митохондрий клеток, относящихся к популяции лимфоцитов, у курильщиков с обострением ХОБЛ в сравнении с показателями контрольной группы значительно снижен. Показатели Ду контрольной группы и экс-курильщиков при этом статистически значимо не различались (рис. 2). Среди исследуемых больных с ХОБЛ в группе экс-курильщиков уровень Ду был значительно выше по сравнению с группой курильщиков, как для популяции лимфоцитов, так и для моноцитов. Показатели мембранного потенциала митохондрий моноцитов экс-курильщиков с ХОБЛ были статистически значимо больше по сравнению с Ду популяции моноцитов контрольной группы.

Полученные результаты позволили предположить, что, изменение митохондриального потенциала напрямую не связано с показателями функции внешнего дыхания, характеризующими степень тяжести бронхообструкции. При этом курение, связанное с хроническим воздействием

Рис. 1. Выделение мононуклеарных лейкоцитов и их субпопуляций с определением отношения красная/ зеленая флуоресценции

Примечание:

ББ — показатель бокового светорассеивания; С045-РС5 — флуоресценция меченых антител к СЭ45№ регион А включает лимфоциты выделенные по гейту Ьу45; регион С включает моноциты выделенные по гейту Моп45.

Таблица 1

Уровень мембранного потенциала митохондрий лимфоцитов и моноцитов крови в исследуемых группах

Группа Red/Green, лимфоциты

Контроль, n = 5 0,2517 [0,2421; 0,2628] 0,1613 [0,1300;0,1647]

ХОБЛ 2, n = 10 0,2663 [0,2000; 0,2687] 0,1055 [0,0908; 0,1659]

ХОБЛ 3, n = 7 0,1722 [0,1548; 0,1914] |на 31,58 %,р12 = 0,0105 |на 17,22 %,р23 = 0,025 0,1597 [0,1447; 0,1665]

Примечание:

Red/Green — отношение красного-оранжевой к зеленой флуоресценции, определяющее уровень Ду митохондрий исследуемых клеток; гейт A включает лимфоциты выделеные по гейту Ly45; гейт С включает моноциты выделеные по гейту Mon45. Результаты представлены в виде Me[Q1;Q3]

Рис. 2. Уровень мембранного потенциала митохондрий мононуклеаров крови у курящих и экс-курильщиков с ХОБЛ

Примечание: Ау лимфоцитов на 36,4 % (р = 0,0143), в группе курильщиков с ХОБЛ по сравнению с контролем, ** | Ду лимфоцитов на 69,7 % (р = 0,0045), в группе экс-курильщиков по сравнению с группой курящих, *** | Ду моноцитов на 49,62 % (р = 0,0321) в группе экс-курильщиков по сравнению с группой курящих, **** | Ду моноцитов на 34,5 % (р = 0,033) в группе экс-курильщиков по сравнению с группой контроля.

табачного дыма, вероятно, оказывало значимое влияние на развитие митохондриальной дисфункции мононуклеаров крови у исследуемых пациентов.

Отсутствие статистически значимых отличий между показателями мембранного потенциала митохондрий лимфоцитов у исследуемых контрольной группы и группы экс-курильщиков с ХОБЛ способно указывать на обратимость изменений митохондриальной дисфункции заболевания, что требует дальнейшего исследования на большей выборке.

Значительное увеличение Ду популяции моноцитов у экс-курильщиков больных с ХОБЛ 2 могло быть связано с повышенной функциональной активностью этих клеток при обострении ХОБЛ, что не противоречит современным представлениям о патогенезе ХОБЛ, связанным с повышенной инфильтрацией слизистой бронхов и альвеол макрофагальными клетками.

Выводы

1. Определение отношения интенсивности флуоресценции с применением катионного красителя JC-1 может быть использовано для выявления снижения мембранного потенциала митохондрий мононуклеарных лейкоцитов периферической крови у больных при обострении ХОБЛ.

2. Отмечается положительный эффект предшествующего отказа от курения, связанный с большим уровнем мембранного потенциала митохондрий у больных при обострении ХОБЛ, что требует подтверждения на большей выборке.

Литература

1. Бельских Э.С., Урясьев О.М., Звягина В.И. и др. Развитие вторичной митохондриальной дисфункции мононуклеарных лейкоцитов крови у больных хронической об-структивной болезнью легких и хроническим бронхитом //

Казанский мед. ж. 2018. -Т. 99, №5. -С. 741-747. DOI: 10.17816/KMJ2018-741.

2. Попов К.А., Быков И.М., Цымбалюк И.Ю. и др. Изменения мембранного потенциала митохондрий в зависимости от длительности ишемии и реперфузии печени у крыс // Медицинский вестник Северного Кавказа. — 2019. -Т. 14, №-1-2. -С. 231-234. doi:10.14300/mnnc.2019.14022.

3. Денисенко Ю.К., Новгородцева Т.П., Виткина Т.И. и др. К вопросу о митохондриальной дисфункции при хронической обструктивной болезни легких // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. -2016. — №.60. -С. 28-33.

4. Лобанова Е.Г., Кондратьева Е.В., Минеева Е.Е. и др. Мембранный потенциал митохондрий тромбоцитов

у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких // Клиническая лабораторная диагностика. —

2014. — Т. 59, № 6. -С. 13-16.

5. Ли Л.А., Лебедько О.А., Козлов В.К. Оценка дисфункции митохондрий при внебольничной пневмонии у детей // Дальневосточный медицинский журнал. —

2015. — №2. — С. 30-36.

6. Anthonisen N.R., Skeans M.A., Wise R.A. et al. The effects of a smoking cessation intervention on 14.5-year mortality: a randomized clinical trial // Ann. Intern. Med. — 2005. — Vol.142, № 4. — P. 233-239. doi: 10.7326/0003-4819142-4-200502150-00005

7. Agrawal A., Mabalirajan U. Rejuvenating cellular respiration for optimizing respiratory function: targeting mitochondria // Am. J. Physiol. — Lung Cell. Mol. Physiol. — 2016. — Vol. 310, № 2. — P. 103-113. doi: 10.1152/ajplung.00320.2015

8. Degens H., Gayan-Ramirez G., Van Hees H.W.H. Smoking-induced skeletal muscle dysfunction: From evidence to mechanisms // Am. J. Respir. Crit. Care Med. — 2015. — Vol. 191, № 6. — P. 620-625. doi: 10.1164/rccm.201410-1830PP

9. Hoffmann R.F., Zarrintan S., Brandenburg S.M. et al. Prolonged cigarette smoke exposure alters mitochondrial structure and function in airway epithelial cells // Respiratory Research. — 2013. — Vol. 14, № 1. -P. 97.

10. Lerner C.A., Sundar I.K., Rahman I. Mitochondrial redox system, dynamics, and dysfunction in lung inflammaging and COPD // Int. J. Biochem. Cell Biol. — 2016. — Vol. 81. — P. 294-306. doi: 10.1016/j.biocel.2016.07.026

11. Mailloux R.J. Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species // Redox Biology. —

2015. — Vol. 4. — P. 381-398. doi: 10.1016/j. redox.2015.02.001

12. Miro O., Alonso J.R., Jarreta D. et al. Smoking disturbs mitochondrial respiratory chain function and enhances lipid peroxidation on human circulating lymphocytes // Carcinogenesis. — 1999. — Vol. 20, № 7. — P. 1331-1336.

13. Nam H.-S., Izumchenko E., Dasgupta S. et al. Mitochondria in chronic obstructive pulmonary disease and lung cancer: where are we now? // Biomarkers in Medicine. —

2017. -Vol. 11, №6. — P. 475-489. doi:10.2217/bmm-2016-0373

14. Apoptotic mechanisms in the pathogenesis of COPD / M. Plataki, E. Tzortzaki, P. Rytila, et al. // International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. — 2006. — Vol.1, № 2. -P. 161-171. doi:10.2147/

copd.2006.1.2.161

15. T0 nnesen, P. Smoking cessation and COPD // European Respiratory Review. — 2013. — Vol. 22, № 127. — P.37-43. doi: 10.1183/09059180.00007212.

16. Wiegman C.H., Michaeloudes C., Haji G., et al. Oxidative stress-induced mitochondrial dysfunction drives inflammation and airway smooth muscle remodeling in patients with chronic obstructive pulmonary disease // J. Allergy Clin.

Immunol. — 2015. — Vol. 136, № 3. — P. 769-780. doi: 10.1016/j.jaci.2015.01.046

17. L. Yue, H. Yao Mitochondrial dysfunction in inflammatory responses and cellular senescence: pathogenesis and pharmacological targets for chronic lung diseases // Br. J. Pharmacol. — 2016. — P. 2305-2318. doi: 10.1111/ bph.13518

Сведения об авторах

Бельских Эдуард Сергеевич, канд. мед. наук, ассистент кафедры факультетской терапии с курсом терапии ФДПО ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России (ed.bels@ yandex.ru); https://orcid.org/0000-0003-1803-0542

Урясьев Олег Михайлович, д-р мед. наук, профессор, заведующий кафедрой факультетской терапии с курсом терапии ФДПО, ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России (uryasev08@yandex.ru); https://orcid.org/0000-0003-1803-0542

Звягина Валентина Ивановна, канд. биол. наук, доцент кафедры биологической химии с курсом клинической лабораторной диагностики ФДПО ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России; https://orcid.org/0000-0003-2800-5789

Журина Ольга Николаевна, канд. мед. наук, заведующая отделом клинической лабораторной диагностики научно-клинического центра гематологии, онкологии и иммунологии ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России; https://orcid.org/0000-0002-2159-582X

Демихов Валерий Григорьевич, д-р мед. наук, профессор, директор научно-клинического центра гематологии, онкологии и иммунологии ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России; https://orcid.org/0000-0002-6120-4678

Belskikh Eduard Sergeevich, Ph. D., assistant of the Department of Faculty Therapy with a course of Therapy FDPO of the Ryazan State Medical University, (ed.bels@yandex.ru), contact phone: +7 (920) 979-68-46

Uryasev Oleg Mikhailovich, M.D., Professor, Head of the Department of Faculty Therapy with a course of Therapy FDPO of the Ryazan State Medical University

Zvyagina Valentina Ivanovna, Ph. D, associate professor, associate professor of the department of biological chemistry with the course of clinical laboratory diagnostics FDPO of the Ryazan State Medical University

Zhurina Olga Nikolaevna, Ph. D, Head of the Department of Clinical Laboratory Diagnostics, Scientific and Clinical Center of Hematology, Oncology of Ryazan State Medical University Valery D. Demikhov, M.D., Professor, Director of the Scientific and Clinical Center of Hematology, Oncology and Immunology of the Ryazan State Medical University