Современные возможности методов количественного ИФА и результаты их использования в судебно-медицинской практике

ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ

изменения в кардиомиоцитах с нарастанием метаболических повреждений. Определяется интерстициаль-ный и периваскулярный склероз, максимально выраженный вокруг мелких сосудов микроциркуляторного русла.

4. Развитие искусственной менопаузы у нормотен-зивных крыс (линия Wistar) сопровождается морфологическими признаками гипертрофии стенки левого желудочка сердца в 62,5 % случаев. У гипертензивных крыс (линия SHR) в условиях искусственной менопаузы наблюдается увеличение толщины стенки левого желудочка сердца и признаки перегрузки правых отделов в виде гипертрофии стенки правого желудочка, с тенденцией к дилатации полостей как левого, так правого желудочков сердца.

ЛИТЕРАТУРА

1. Groban L. et al. Progressive diastolic dysfunction in the female mRen(2). Lewis rat: influence of salt and ovarian hormones // J. Gerontol. A Bio. Sci. Med. Sci. 2008. № 63. Р. 3-11.

2. Douglas S. et al. Effect of ovariectomy on blood pressure and venous tone in female SHR // Am. J. of Hypertension. 2008. Vol. 21. № 9. Р. 983-988.

3. Dubey R. K. et al. The Protective Function of 17_-Estradiol in Aldosterone Salt-treated rats. 17Beta-estradiol, its metabolites, and progesterone inhibit cardiac fibroblast growth // Hypertension. 1998. № 31(1. Part 2). Р. 522-528.

4. Jose Dias da Silva et al. Heart rate and arterial pressure variability and baroreflex sensitivity // Life Sciences. 2009. № 84. Р. 719-724.

5. Paula Anahi Arias-Loza et al. Medroxyprogesterone Acetate But Not Drospirenone Ablates // Hypertension. 2006. № 48. Р. 9941001.

6. Takahiro Moril et al. Enhanced cardiac inflammation and fibrosis in ovariectomized hypertensive rats: a possible mechanism of diastolic dysfunction in postmenopausal women // Hypertension Research. 2011. № 34. Р. 496-502.

РЕЗЮМЕ

О. О. Большакова, Т. Х. Юсипова, Г. М. Нут-фуллина, И. А. Кузнецова

Характеристика морфо-функциональных параметров сердечно-сосудистой системы крыс в условиях экспериментальной постменопаузы

Представлены данные об изменениях сердечно-сосудистой системы у крыс в моделе постменопаузы. В условиях искусственной менопаузы происходит увеличение массы тела обеих групп животных, нарастание степени артериальной гипертензии у крыс линии SHR. У нормотензивных животных овариоэктомия не влияет на цифры АД. При морфологическом и морфометрическом анализе миокарда ЛЖ на фоне недостаточности женских половых гормонов отмечаются выраженные метаболические повреждения и активизируются адаптивные репаративно-синтетические процессы, что сопровождается признаками гипертрофии стенки левого желудочка сердца у 62,5 % нормотензивных и у всех гипертен-зивных крыс.

Ключевые слова: постменопауза, овариоэктомия, ремодели-рование миокарда, морфометрия.

SUMMARY

0. O. Bolshakoua, Т. H. Yusipova, G. M. Nutfullina,

1. A. Kusnetzova

Morpho-functional changes of the cardiovascular system of rats in the experimental menopause model

This paper deals with changes of the cardiovascular system in menopausal experimental model. There are weight gain in both groups of the rats and increase of the arterial pressure in SHR menopause model. Ovariectomy doesn't cause arterial hypertension in normo-tensive animals. Morphological and morphometrical analyses in estrogen deficiency showed marked metabolic injuries and activated adoptive reparative-synthetic process. Left ventricular hypertension develops in 62.5 % of normotensive and all hypertensive animals.

Key words: postmenopause, ovariectomy, remodeling of myocardium, morphometry.

© В. Л. Сидоров, О. Д. Ягмуров, 2012 г. УДК 571.1.083.3:340.6

В. Л. Сидоров, О. Д. Ягмуров

СОВРЕМЕННЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ МЕТОДОВ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ИФА И РЕЗУЛЬТАТЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ ПРАКТИКЕ

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова; Бюро судебно-медицинской экспертизы, Санкт-Петербург

В настоящее время в Российской Федерации отмечается значительный рост преступности, в частности, тяж-

ких преступлений против жизни, здоровья и достоинства граждан. Наиболее тяжкими преступлениями являются убийства, количество которых в последние годы не снижается, а также преступления сексуального характера. Зачастую убийства сопровождаются последующим расчленением трупов. В некоторых случаях проходит значительный срок между совершением противоправных действий и проведением экспертиз. За это время следы биологического происхождения на вещественных доказательствах, в частности, кровь и сперма, уничтожаются или значительно разрушаются под воздействием факторов внешней среды (света, температуры, атмосферных осадков, повышенной влажности и др.). Часть экспертиз по исследованию вещественных доказательств выполняются после того, как следы биологического происхождения на них целенаправленно подвергаются уничтожению (застирываются, замываются). Кроме того, у насильников все чаще встречаются случаи олигозооспер-мии и азооспермии. В связи с этим установление видо-

вой принадлежности крови костных фрагментов, а также наличия спермы на вещественных доказательствах при использовании в экспертной практике традиционных лабораторных методов исследования, разработанных достаточно давно, вызывает определенные затруднения [7-9]. В отечественной судебно-медицинской литературе [6, 7] освещается проблема необходимости более чувствительных методов в экспертной практике для установления видовой принадлежности биологических объектов, в частности рекомендуется реакция иммунофлюоресценции (РИФ), которая достаточно широко применялась за рубежом в 80-е гг. XX столетия. Однако эта методика не нашла широкого применения в биологических отделениях территориальных бюро судебно-медицинской экспертизы в связи с трудоемкостью, невысоким качеством отечественных флюоресцирующих сывороток и субъективной оценкой полученных результатов [5]. Зарубежные исследователи используют для установления видовой принадлежности биологических объектов методы им-муноферментного анализа (ИФА) с использованием антител против IgG человека [11], а также молекулярно-генетические технологии [10, 12, 14]. В последние годы достаточно широкое распространение получила также методика установления видовой принадлежности крови (одновременно с ее наличием) по гликофорину А человека [13]. Для определения наличия спермы во всех су-дебно-биологических отделениях территориальных бюро судебно-медицинской экспертизы самым распространенными и решающими до сих пор остаются морфологические и цитологические методы обнаружения сперматозоидов [1, 9].

Среди судебно-медицинских экспертиз, выполняемых при половых преступлениях, особо важным является установления факта полового сношения. Однако методы выявления и исследования пятен спермы до настоящего времени разработаны недостаточно, что диктует необходимость привлечения большого внимания к этому вопросу [3].

В отечественной судебно-медицинской литературе практически отсутствуют работы, в которых рассматривается возможность получения объективной количественной оценки результатов поисковых и иммунологических реакций, применяемых для установления наличия, а также видовой принадлежности биологических объектов в пятнах на вещественных доказательствах. Метод иммуно-ферментного анализа рекомендуется применять лишь в дот-варианте, для установления групповой принадлежности выделений по системам АВО и Lewis [4], а не на поли-стирольных планшетах и не для поисковых реакций. В последнее десятилетие интенсивно развивается в России молекулярно-генетическая экспертиза, в частности, оптимизируются методы выделения ДНК [2], но прежде чем выделять ДНК или устанавливать групповую принадлежность биологических объектов, например, крови и спермы, надо четко и доказательно установить их присутствие на вещественных доказательствах, а достаточно часто также и их принадлежность человеку, а не животному. Та-

ким образом, для проведения судебно-медицинских экспертиз по исследованию вещественных доказательств назрела острая необходимость в разработке и внедрении новых методик установления наличия спермы, видовой принадлежности крови, костных фрагментов и других биологических объектов, обладающих высокой чувствительностью, имеющих объективную количественную оценку полученных результатов, а также предусматривающих использование высокотехнологичного современного оборудования и лицензированных высококачественных реагентов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В судебно-биологическом отделении бюро судебно-медицинской экспертизы (СМЭ) Санкт-Петербурга активно применяется новая (адаптированная нами для целей судебной медицины) технология ИФА с использованием отечественных реагентов. С ее помощью достигается доказательное установление наличия спермы по простатическому специфическому антигену человека (ПСА) с помощью количественного твердофазного иммунофер-ментного анализа. Используемый тест-набор фирмы «Алкор Био» предназначен для определения ПСА-общего (в сыворотке крови человека есть как связанная с белком-переносчиком, так и свободная фракции ПСА). Свободная фракция активна и имеет важное диагностическое значение, в частности, если свободного ПСА в сыворотке крови больше нормы, это говорит о злокачественных процессах в простате.

Преимущество этого метода перед широко распространенными в настоящее время в судебно-медицинской практике морфологическими методиками, применяемыми для доказательного установления присутствия спермы на вещественных доказательствах, состоит в большей разрешающей способности: метод позволяет определять наличие спермы на объектах-носителях в случае малого количества (олигозооспермия) или отсутствия сперматозоидов (азооспермия), а также при разрушении сперматозоидов под действием внешних факторов.

Данная реакция обладает строгой специфичностью: положительный результат может быть получен только со спермой, причем спермой человека, а не животных. Специфичность методики гарантирована только при разведении экстракта из исследуемых объектов минимум в 50 раз (неразведенные экстракты из объектов, содержащих сыворотку крови, слюну, мочу, пот, влагалищный секрет могут давать неспецифический результат за счет присутствия в них незначительных количеств ПСА). По сравнению с применяемыми в ряде лабораторий иммунохроматографическими пластинами (на ПСА или семеногелин) этот метод позволяет осуществлять объективный и количественный учет результатов с последующей компьютерной обработкой данных, что дает возможность хранить их на жестком диске или других электронных носителях, а также при необходимости распечатывать и иллюстрировать заключение эксперта.

ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ

Преимущество разработанной нами методики заключается также в ее значительной экономичности по сравнению с иммунохроматографией.

Мы провели анализ экспертиз, в которых использовалась вышеуказанная усовершенствованная технология (официальное разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2011/247 от 22 августа 2011 г.), за 2010 г.

Кроме того, в судебно-биологическом отделении бюро судебно-медицинской экспертизы Санкт-Петербурга был разработан усовершенствованный вариант указанного метода, с использованием отечественного тест-набора реагентов для иммуноферментного определения общего 1§0 (иммуноглобулина О) человека «1§О-общий-ИФА-БЕСТ».

Преимущества этого метода перед широко распространенными в настоящее время в судебно-медицинской практике методиками встречного иммуноэлектрофоре-за (ВИЭФ), реакцией кольцепреципитации (РКП) и реакцией иммунофлюоресценции (РИФ), применяемыми для установления видовой принадлежности биологических объектов, состоят в большей чувствительности по сравнению с ВИЭФ и РКП, а также в большей производительности и доказательности по сравнению с РИФ.

Методика установления видовой принадлежности биологических объектов по 1§О человека с помощью количественного твердофазного ИФА может быть использована при судебно-медицинском исследовании вещественных доказательств для установления видовой принадлежности обнаруженных на них следов крови, следов выделений, а также для установления видовой принадлежности фрагментов костей, частиц органов и тканей биологического происхождения.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты исследования ПСА приведены в таблице. Расчет оптической плотности и концентрации осуществлялся по пяти пробам с самыми высокими и самыми низкими числовым значениями.

Из данных таблицы видно, что метод ИФА по ПСА человека для доказательного наличия спермы в следах на вещественных доказательствах в судебно-биологическом отделении СПб БСМЭ применяется достаточно широко и весьма информативен, особенно после отрицательного морфологического исследования на наличие сперматозоидов в исследуемых объектах.

Высокая чувствительность технологии ИФА при определении 1§О человека по сравнению с традиционными методами и реакциями, предназначенными для установления видовой принадлежности биологических объектов, определяет целесообразность ее применения при исследовании замытых следов биологического происхождения и биологических следов с большим сроком давности образования. Технология апробирована на заведомых об-

Результаты применения метода ИФА для доказательного установления наличия спермы в бюро СМЭ Санкт-Петербурга за 2010 г.

Экспертизы Количество проб Оптическая плотность, усл. ед.

наличие ПСА количество

Выгявлен на в/д 27 (+) - 158 Минимальная из всех измеренных: 0,0 84 ±0,00 5 Минимальная из всех измеренных: 1,3 50 ±0,064

Не выгявлен на в/д 51 (-) - 366 Максимальная из всех измеренных: 3,500 ±0,180 Максимальная из всех измеренных: 88,472±7,525

Всего 78 524 - -

разцах крови, пота, слюны, человека, высушенных на марле, а также на фрагментах трубчатых человеческих костей. Чувствительность реакции обнаружения 1§О -разведение 1:10 000 000.

В период с 1 января 2003 г. по 31 декабря 2010 г. в Бюро СМЭ Санкт-Петербурга и Ленинградской области вышеуказанным методом было исследовано более 3000 объектов. В ходе проведения экспертных исследований методом ИФА неоднократно были получены положительные результаты в пятнах, следах и участках на вещественных доказательствах, где реакцией встречного иммуноэлект-рофореза видовую принадлежность биологических объектов установить не представилось возможным (т. е. была установлена их принадлежность человеку, а не животному). Показателен случай установления принадлежности фрагментов мышечной ткани, подвергшихся сильным гнилостным изменениям.

ВЫВОДЫ

На основе выполненной работы можно заключить, что по сравнению с традиционно используемыми для судебно-медицинского исследования методиками по установлению наличия спермы в пятнах на объектах-носителях и тампонах, а также по установлению видовой принадлежности биологических объектов разработанные и усовершенствованные нами технологии твердофазного им-муноферментного анализа успешно применяются в судебной медицине и обладают целым рядом существенных преимуществ:

1) высокая чувствительность и специфичность в сочетании с объективной регистрацией и возможностью компьютерной обработки результатов. Документирование результатов ИФА в табличной форме позволяет дополнительно иллюстрировать заключения экспертов;

2) высокая экономичность методов, связанная со значительно меньшей стоимостью реагентов по сравнению с импортными пластинами для иммунохроматографии «РБЛ БЕМ^ИАМТ», «HEXAGON РБЛ», тестовых стри-пов «Я8ГОТМ-8етеп», «Обти-тест» и другими, сходными с ними;

3) высокая технологичность и производительность методов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Антонова С. Н., Любинская С. И. Установление наличия спермы цитологическим методом // Судебно-медицинская экспертиза. 1980. Т. 23. № 4. С. 30-33.

2. Иванов П. Л., Каганова Н. Л. Оптимизация методики экстрагирования ДНК из объектов судебно-генетической экспертизы // Судебно-медицинская экспертиза. 2009. Т. 52. № 5. С. 14-17.

3. Клевно В. А. и др. Актуальные и наиболее перспективные научные направления судебной медицины // Судебно-медицинская экспертиза. 2007. Т. 38. № 1. С. 3-8.

4. Лапенков М. И. и др. Определение ABH-Lewis-антигенов в следах выделений методом одностадийного иммуноферментно-го анализа в дот-уварианте // Судебно-медицинская экспертиза. 2009. Т. 52. № 2. С. 18-21.

5. Плаксин В. О. и др. Биофизические методы исследования в судебной медицине // Лабораторные методы исследования в судебной медицине и задачи судебно-медицинской науки и практики по их совершенствованию: Материалы VIII Всерос. пленума судебных медиков. Нижний Новгород, 1994. С. 83-86.

6. Стегнова Т. В., Кисин М. В. Применение метода иммуно-флюоресценции при экспертизе микроследов крови на орудиях травмы // Материалы 1-го Всерос. съезда судебных медиков. М., 1981. С. 103-105.

7. Томилин В. В., Барсегянц Л. О., Гладких А. С. Судебно-медицинское исследование вещественных доказательств. М: Медицина, 1989. 303 с.

8. Туманов А. К. Судебно-медицинское исследование вещественных доказательств. М.: Госюриздат, 1961. 576 с.

9. Туманов А. К. Основы судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств. М.: Медицина, 1975. 407 с.

10. El-Sayed Y. S. et al. Using species-specific repeat and PCR-RFLP in typing of DNA derived from blood of human and animal species // Forensic. Sci. Med. Pathol. 2010. Vol. 6. № 3. P. 158-164.

11. Hurley I. P. et al. Detection of human blood by immunoassay for applications in forensic analysis // Forensic. Sci. Int. 2009. Vol. 10. № 1-3. P. 91-97.

12. Luo H. et al. Species identification of biomaterials by amplifying 12S rRNA gene // Fa Yi Xue Za Zhi. 2008. Vol. 24. № 3. P. 185-188; 193.

13. Schweers B. A. et al. Developmental validation of a novel lateral flow strip test for rapid identification of human blood (Rapid Stain Identification—Blood) // Forensic. Sci. Int. Genet. 2008. Vol. 2. № 3. P. 243-247.

14. Zhang W. J. et al. Allele frequencies and species specificity of six short tandem repeat loci in Chinese population. [Article in Chinese]

// Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 2004. Vol. 21. № 6. P. 587-590.

РЕЗЮМЕ

В. Л. Сидоров, О. Д. Ягмуров

Современные возможности методов количественного ИФА и результаты их использования в судебно-медицинской практике

Доказано, что разработанные и усовершенствованные нами для установления наличия спермы на вещественных доказательствах и видовой принадлежности биологических объектов технологии твердофазного иммуноферментного анализа успешно применяются в судебной медицине и обладают целым рядом существенных преимуществ. Это высокая чувствительность и специфичность в сочетании с объективной регистрацией и возможностью компьютерной обработки результатов, высокая экономичность, связанная со значительно меньшей стоимостью реагентов по сравнению с импортными пластинами для иммунохроматогра-фии, а также высокая технологичность и производительность методов.

Ключевые слова: иммуноферментный анализ, вещественные доказательства, наличие спермы, видовая принадлежность.

SUMMARY

V. L. Sidorov, O. D. Yagmurov

Modern facilities and methods of quantitative ELISA and result of their use in forensic practice

The aim of the work is to show that the technology of enzyme-linked immunosorbent assay elaborated and improved by the authors for revealing the semen presence on the material evidences and for species specificity of the biological objects is successfully applied in forensic medicine and has a number of significant advantages. They are cost saving, associated with a significantly lower cost of the reagents versus the imported plates for immunochromato-graphy, as well as high technology and performance technique

Key words: ELISA, material evidences, presence of sperm, species belonging.

0 ^^ ВНИМАНИЮ ЧИТАТЕЛЕЙ!

Сообщаем Вам, что на журнал «Ученые записки» проводится подписка по каталогу «Роспечати». Подписной индекс для организаций и частных лиц - 29579.

Информацию о подписке на журнал «Ученые записки» Вы также можете получить в издательстве СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова.

Адрес: 193089, Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого, 6/8 Телефон: (812) 234-27-78, 953-73-17 Факс: (812) 234-01-25