Способ флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда с меткой FGFR1 у разных видов млекопитающих на гистологических препаратах
METHOD FOR FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION USING A DNA PROBE LABELED FGFR1 IN DIFFERENT MAMMALIAN SPECIES ON HISTOLOGICAL PREPARATIONS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к ветеринарной медицине, а именно к лабораторной диагностике и может быть использовано для гистологических срезов, сделанных при биопсии опухоли молочной железы в ходе хирургической операции. Это основано на применении тест-системы из специальных ДНК-зондов с меткой FGFR1 для проведения реакции флуоресцентной in situ гибридизации (fluorescent in situ hybridization - FISH).
Уровень техники
Известен способ выполнения флюоресцентной гибридизации in situ на гистологических парафиновых срезах планарной ткани (Jordi Solana, RNA In Situ Hybridizationon Planarian Paraffin Sections MethodsMolBiol. 2018; 1774: 393-404. doi: 10.1007/978-1-4939-7802-1_13), в котором полученные участки от планарий гибридизуруют с гаптен-мечеными РНК-зондами. Последующее иммунологическое зондовое обнаружение проводят либо с хромогенным, либо с флуоресцентным проявлением, чтобы визуализировать экспрессию генов с клеточным или субклеточным разрешением.
Недостатком данного способа является долгая обработка в промывочных буферах (кол-во 6) перед использованием РНК-зонда. А также относительный дефицит определенных структур доступных антител для планарных белков.
Известен способ амплификации гена HER2 с помощью флуоресценцией in situ гидридизации при карциноме молочной железы у кошек (HER2 Amplification Status in Feline Mammary Carcinoma: A Tissue Microarray - Fluorescence In Situ Hydridization - Based Study» Luisa Vera Muscatello, 1.10.2018). Целью этого способа была оценка эпителиального фактора роста (HER2), статус амплификации гена и его корреляция с экспрессией белка HER2 в карциномах молочной железы кошек, с помощью иммуногистохимического метода (ИГХ) и флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).
Недостатком способа является, что проводят исследование только на амплификацию гена HER2.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятый авторами за прототип является способ флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда FGFR1 у разных видов млекопитающих на цитологических препаратах (патент RU 2755391). При котором FISH-реакцию проводят на цитологическом материале, отобранного при помощи тонкоигольной аспирационной биопсии из опухолей молочных железу собак и кошек.
Недостатками способа заключаются низкая достоверность для некоторых типов опухолей (связана с особенностями их строения), а также исследование ограниченного участка патологической ткани (только тех клеток, которые попадут на стекло при взятии биопсии).
Раскрытие изобретения
Задачей заявляемого изобретения является разработка тест-системы для исследования и определения редких типов опухолей молочной железы.
Технический результат, который может быть получен с помощью предлагаемого способа, сводится к повышению точности диагностики при определении онкологического процесса.
Технический результат достигается способа флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда с меткой FGFR1 у разных видов млекопитающих на гистологических препаратах, включающий взятие на исследование кусочка ткани, который фиксируют в фиксаторе, а затем заключают в расплавленный парафиновый воск, после чего восковой блок с образцом ткани, режут на микротоме для получения тонких срезов парафина, содержащих ткань, типично от 3 до 4 микрон толщины, с последующим нанесением срез образца на предметное стекло, высушиванием на воздухе и нагреванием, после того как срез зафиксирован удаляют парафин путем окунания стекол в две порции ксилола - 5 минут в каждой и две порции спирта 96% - по 5 минут в каждой, после чего проводят ополоскивание в 70% спирте и дистиллированной воде, далее наносят на парафиновый срез примерно 200 мкл раствора пепсина Pepsin Solution и инкубируют 15 минут, затем промывают в дистиллированной воде и помещают в раствор 2×SSC на 5 минут, после дегидратируют препараты в 70% спирте - 1 минута, в двух порциях 96% спирта - по 1 минуте в каждой и высушивают на воздухе в течение 20 минут, после чего наносится ДНК-зонд FGFR1 Breakapart/Amplification Probe, с последующей денатурацией в автоматической FISH- системе в течение 5 минут при 80°С и гибридизацией при 37°С 16-18 часов, затем проводят отмывание буферными растворами в течение 3 минут и наносят флюоресцентный краситель DAPI.
Фибробласты управляют морфогенезом эпителия молочной железы через передачу сигналов паракринной связи, которая между стромальными и эпителиальными клетками является двунаправленной, т.е. эпителиальные клетки также сигнализируют стромальным клеткам. Одним из таких является фактор роста фибробластов 1 (FGF1) - циркулирующий белок, состоящий из 181 аминокислот, который способен стимулировать пролиферацию фибробластов, а также участвует в регуляции клеточной миграции и выживания, регенерации тканей, в процессах ангиогенеза и нейрогенеза. При наличии аберрантно активированных стромальных клеток, особенно миофибробластов, может произойти нарушение сигнального пути FGF1, что может привести к злокачественной трансформации эпителиальных клеток в молочной железе, которая способствует развитию опухолевого роста.
Рецептор, кодирующий FGFR1, локализуется на хромосоме 8 в локусе p11.23 (8p11.23), преимущественно всего его обнаруживают на плазматической мембране и цитоплазме, включая аппарат Гольджи. При наличии опухолевой патологии данный ген подвергается многообразным изменениям, в том числе амплификации и мутации в различных экзонах.
В настоящее время в опубликованных источниках отсутствуют какие-либо данные о применении флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда с меткой FGFR1 на гистологических срезах опухоли молочной железы у лабораторных (крысы) и домашних млекопитающих (кошка, собака) животных. Понимание того, как сигнальные пути фибробластов регулируют развитие молочной железы, можно дать представление о механизме биологии рака молочной железы (РМЖ).
Краткое описание чертежей и иных материалов
Фиг. 1 - сигнал Fibroblast Growth Factor Receptor 1 (FGFR1) в клетке фибробластического дифферона у собаки. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH). Фильтр FITC (зеленое свечение). Ок. 15, об. 100.
Фиг. 2 - сигнал Fibroblast Growth Factor Receptor 1 (FGFR1) в клетке фибробластического дифферона у собаки. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH). Фильтр Texas Red (красное свечение). Ок. 15, об. 100.
Фиг. 3 - количество клеток с сигналами гена FGFR1.
Осуществление изобретения
Исследования проводят на базе Научно-диагностического и лечебного ветеринарного центра ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет» в гистологической лаборатории.
Гистологическое исследование материала опухоли молочных желез, отобранного при биопсии в ходе хирургической операции, осуществляют следующим образом: для приготовления образца ткани для гистологического исследования кусочки ткани фиксируют в фиксаторе (формальдегид), а затем заключают в расплавленный парафиновый воск. Затем восковой блок, содержащий образец ткани, режут на микротоме для получения тонких срезов парафина, содержащих ткань, типично от 3 до 4 микрон толщины. Потом срез образца наносят на предметное стекло, высушивают на воздухе и нагревают, чтобы вызвать приклеивание образца к предметному стеклу.
Далее удаляют парафин (депарафинизация и регидратация) путем окунания стекол в 1 порции ксилола -5 минут, во 2 порции ксилола -5 минут, затем окунали в 1 порцию спирта 96% - 5 минут, 2 порцию спирта 96% - 5 минут и полоскание в 70% спирте, затем полоскание в дистиллированной воде. После чего наносят на парафиновый срез примерно 200 мкл раствора пепсина (Pepsin Solution) и инкубируют 15 минут. Затем промывают в дистиллированной воде и помещают в раствор 2×SSC на 5 минут, после дегидратируют препараты в 70% спирте и после дегидратируют препараты в 70% спирте - 1 минута, в 1 порции 96% спирта -1 минута, во 2 порции 96% спирта -1 минута и высушивают на воздухе в течение 20 минут.
2
Далее накрывают каждый гистологический материал квадратным покровным 24×24 ммстеклом и наносят по краям покровного стекла универсальный резиновый клей Момент «Кристалл» для герметизации, который согласно проведенным исследованиям имеет высокую прочность склеивания, водостойкость клеевого соединения, теплостойкость и легкое снятие без повреждения исследуемого материала после проведения денатурации и гибридизации (https://dm.henkel-dam.com/is/content/henkel/TDS-003003-RU-Moment-Contact-Crystal-tube).
Проводят денатурацию на автоматической FISH-гибридизационной системе «ThermoBrite», (кампания StatSpin), устанавливают стекла на пластину и вставляют две увлажняющие полоски, смоченные в ультрачистой ионизированной воде, в держатели на внутренней стороне крышки (https://manualzz.com/doc/4619533/wasser-bi-destillationsapparate-water-stills-for). Далее устанавливают программу «Денатурация и Гибридизация». Денатурация - это когда молекула ДНК приобретает вид одноцепочечной нити. При реакции гибридизации происходит взаимодействие ДНК-зонда и комплементарным ему участком ядерной ДНК материала.
Денатурируют материал при 80°С - 5 минут. Потом происходит автоматическое охлаждение столика, на котором расположены предметные стекла, после чего происходит автоматическая гибридизация. При гибридизации инкубируют препараты в течение 18 часов при температуре 37°С у собак и 16 часов при температуре 37°С у кошек, в связи с разным сцеплением белков с ДНК-зондом.
2
После гибридизации удаляют клей с краев покровного стекла и при помощи гистологической иглы снимают стекло. Затем следует отмывка, в предварительно нагретый отмывочный буфер Prewarm Wash Buffer 1 (0,4×SSC / 0,3% lgepal) до 72°С вносят стекла на 2 минуты. После чего стекла быстро (чтобы не высохли клетки) промакивают вокруг исследуемых зон одноразовыми бумажными полотенцами для создания сухого поля вокруг материала и наносят гидрофобный слой восковым маркером (для предотвращения растекания реактивов). Далее наносят при помощи 1-канальной автоматической пипетки (Eppendorf Reference 2, 0,5-10 мкл) 20 мкм буфера Wash Buffer 2 (2×SSC / 0,1% lgepal) на 1 минуту. Промакивают препараты бумажными полотенцами и наносят с помощью автоматической пипетки (Eppendorf Reference 2, 0,5-10 мкл) 15 мкл контрастирующего красителя DAPI/Antifadec0.1, содержащий флюорохромом, после чего накрывают каждое предметное стекло покровным стеклом размерами 24×60 мм.
После этого помещают в термостат при температуре 25°С, при этом время выдержки в термостате предметных стекол с флюорохромом для собак составляет 10 минут, для кошек составляет 15 минут. Затем предметные стекла с исследуемым цитологическим материалом помещают под темную светонепроницаемую пластину, после чего поочередно анализируют каждый препарат при помощи флюоресцентного микроскопа, остальные стекла с материалом остаются под темной светонепроницаемой пластиной во избежание попадания света, что влияет на экспрессию свечения.
Таким образом, время на проведение FISH-реакции составляет примерно 19 часов.
Способ флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда с меткой FGFR1 у разных видов млекопитающих на гистологических препаратах: выполняется следующим образом материал, полученный от собак под номерами №1, 3, 5 показал наличие флюоресцирующих сигналов под фильтрами Texas Red (красный) и FITC (зеленый), что означает среднее количество копий гена FGFR1 на клетку регистрировалось ≥6, свечения сигналов были выражены, что говорит об амплификации гена в клетках фибробластического дифферона, их активной пролиферации и синтеза белка коллагена. Материал под №2 показал среднее количество копий гена FGFR1 на клетку ≥4 и <6 (амплификация неопределенная), в то время у № 3 показал количество копий гена <4, что говорит об отсутствии амплификации гена FGFR1.
Таким образом, при патогистологическом исследовании были диагностированы такие новообразования, как папиллярная аденокарцинома, тубулярная аденокарцинома.
Материал, полученный от кошек под номерами №2, 3 ,5 показал наличие флюоресцирующих сигналов под фильтрами Texas Red/FITC, что означает среднее количество копий гена FGFR1 на клетку регистрировалось ≥6. Свечения сигналов были выражены, что говорит об амплификации гена FGFR1 в клетках фибробластического дифферона. Материал под №1 показал среднее количество копий гена FGFR1 на клетку ≥4 и <6 (амплификация неопределенная), в то время у №4 показал количество копий гена <4, что говорит об отсутствии амплификации гена FGFR1.
При патогистологическом исследовании были диагностированы такие новообразования, как папиллярная аденокарцинома, плеоморфная аденокарцинома.
Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:
- непродолжительное время обработки материала;
- высокое разрешение локализации экспрессии свечения и большая чувствительность на клеточном и даже субклеточном уровнях, благодаря значительно уменьшенной толщины ткани;
- высокая оценка флюоресцентного сигнала и его интенсивность;
- снижение стоимости гистологического препарата за счет малого расхода жидких реактивов и буферов.