Лейкоз-ассоциированный иммунофенотип опухолевых клеток у детей с острым лимфобластным лейкозом из предшественников В-лимфоцитов

1 ’2012

Лейкоз-ассоциированный иммунофенотип опухолевых клеток у детей с острым лимфобластным лейкозом из предшественников В-лимфоцитов

Л.В. Мовчан

ГУ Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии, Республика Беларусь

Контакты: Людмила Викторовна Мовчан movchan-l@mail.ru

Для возможности мониторинга минимальной остаточной болезни (МОБ) при остром лимфобластном лейкозе (ОЛЛ) методом проточной цитофлуориметрии (ПЦФ) важным является выбор оптимальной комбинации моноклональных антител (МКА), основанный на четком представлении об иммунофенотипических особенностяхлейкемических клеток, позволяющих отличить их от нормальных костномозговых аналогов.

Согласно полученным данным установлено, что лейкемические бласты при ОЛЛ из предшественников В-лимфоцитов (ВПОЛЛ) демонстрируют многочисленные иммунофенотипические аберрации. На опухолевых клетках более чем в 50 % случаев встречается асинхронная экспрессия дифференцировочных антигенов, в 42,6 % случаев ВП ОЛЛ наблюдается аберрантная экспрессия миелоидных маркеров. Основные отличия опухолевых клеток от нормальных костномозговых аналогов выражаются в интенсивности экспрессии таких маркеров, как CD19, СD10, CD20, CD38, CD45, CD34, CD58.

Таким образом, особенности интенсивности экспрессии антигенов CD19, СD10, CD20, CD38, CD45, CD34, CD58 опухолевыми клетками ВП ОЛЛ по сравнению с нормальными предшественниками В-лимфоцитов позволяют использовать эти маркеры в комбинации для мониторинга МОБ с целью прогнозирования исхода заболевания.

Ключевые слова: дети, острый лимфобластный лейкоз, минимальная остаточная болезнь, лейкоз-ассоциированный иммунофенотип, проточная цитофлуориметрия

Leukemia-associated immunophenotype of tumor cells in childhood B-precursors acute lymphoblastic leukemia

L.V. Movchan

Belarusian Research Center for Pediatric Oncology and Hematology, Minsk, Belarus

To allow minimal residual disease (MRD) monitoring using flow cytometry it is needed the optimal combination of monoclonal antibodies (MA), based on a precise knowledge of leukemic cells immunophenotypic features.

Multiple immunophenotypic aberrations in leukemic blasts of B-precursors ALL (BII ALL) were revealed. Asynchronous expression of differentiation antigens on tumor cells occurs in more than 50 % cases. Aberrant myeloid markers expression in 42.6 % BII ALL cases was observed. The main differences between tumor and normal bone marrow cells are the expression intensity of CD19, CD10, CD20, CD38, CD45, CD34 and CD58.

Thus, expression intensity pattern of CD19, CD10, CD20, CD38, CD45, CD34, CD58 on tumor cells compared with normal B-lymphocyte precursors allow to use these markers combination to MRD monitoring.

Key words: children, acute lymphoblastic leukemia, minimal residual disease, leukemia-associated immunophenotype, flow cytometry

Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) из предшественников В-лимфоцитов (ВП ОЛЛ) — наиболее часто встречаемая в детском возрасте опухоль, морфологическим субстратом которой являются незрелые клетки, коммутированные в В-линейном направлении. На сегодняшний день благодаря привлечению новейших диагностических средств и использованию современных протоколов лечения общая 5-летняя выживаемость пациентов составляет более 75 %. Основной проблемой, влияющей на бессобытийную выживаемость при ОЛЛ, в настоящее время остаются рецидивы заболевания. Исход рецидива крайне неблагоприятный как при проведении полихимиотерапии, так и при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток [1—3].

В основе возникновения рецидивов лежит пер-систирование остаточных лейкемических клеток или минимальная остаточная болезнь (МОБ). Определение содержания остаточных опухолевых клеток возможно только с применением высокочувствительных методов исследования. Одним из таких методов определения МОБ является метод многопараметрической проточной цитофлуориметрии (ПЦФ) с использованием моноклональных антител (МКА). Данный метод основан на идентификации лейкоз-ассоциированного иммунофенотипа опухолевых клеток на момент диагностики и затем отслеживании клеток с установленными характеристиками на этапах противоопухолевой терапии среди нормальных костномозговых предшественников [4—6]. Таким образом, для возможности

мониторинга МОБ методом ПЦФ необходимо выбрать оптимальную комбинацию МКА, основываясь на четком знании иммунофенотипических особенностей лейкемических клеток, позволяющих отличить их от нормальных костномозговых аналогов.

Целью данной работы была оценка особенностей лейкоз-ассоциированного иммунофенотипа опухолевых клеток у детей с ВП ОЛЛ, включающих асинхронную экспрессию дифференцировочных маркеров, аберрантную экспрессию миелоидных/Т-линейных маркеров, а также изменения интенсивности экспрессии специфичных маркеров для мониторинга МОБ.

Пациенты и методы

В исследование включены 286 детей в возрасте O—18 лет (медиана 4 года) (154 мальчика и 1З2 девочки) с первичным ВП ОЛЛ, диагностированным в Республиканском научно-практическом центре детской онкологии, гематологии и иммунологии (Беларусь) в период с 2OO5 по 2O11 г. Диагноз Про-В-ОЛЛ, Common В-ОЛЛ и Пре-В-ОЛЛ был установлен в соответствии с классификацией ВОЗ и на основании оценки имму-нофенотипической характеристики опухолевых клеток (EGIL-95) [7].

Анализ иммунофенотипических характеристик опухолевых клеток, полученных из костного мозга

(КМ) пациентов, выполняли методом многопараметрической ПЦФ. Для этого с использованием градиента плотности (Histopaque-1077 (Sigma)) из полученного после диагностической пункции образца КМ выделяли мононуклеарное кольцо, отбирали полученные клетки, проводили лизирование эритроцитов и дважды отмывали в растворе фосфатного буфера (Phosphate buffered saline — PBS). Затем полученную суспензию клеток в концентрации 1 млн/мл вносили в сухие пробирки (по 100 мкл) и добавляли МКА в количестве, указанном фирмой-производителем в инструкции по применению. Для диагностического иммунофенотипирования использовали панель МКА, конъюгированных с флуоресцентными метками FITC, PE, PE-Cy5 (табл. 1).

Для оценки интенсивности флуоресценции (Mean Fluorescence Intensity — MFI) маркеров CD10, CD20, CD34, CD38, CD58, CD45, CD19 и CD11a использовали следующую панель МКА, конъюгированных с флуоресцентными метками PE, ECD, PE-Cy5 и PE-Cy7 (см. табл. 1). Анализ интенсивности флуоресценции маркеров проводили на лейкемических клетках 32 пациентов с ВП ОЛЛ до начала противоопухолевой терапии и для сравнения на нормальных предшественниках В-лимфоцитов КМ 14 здоровых доноров (доноры КМ для аллогенной трансплантации).

Таблица 1. Панели моноклональных антител для иммунофенотипической диагностики ОЛЛ

Для диагностического иммунофенотипирования FITC/PE/PC5 Для оценки интенсивности флуоресценции FITC/PE/ECD/PE-Cy5/PE-Cy7

IgGl(mouse) / IgG2a(mouse) / CD45 Syto16 / CD2O / CD45 / CD1O / CD19

CD45 / CD14/ - Syto16 / CD58 / CD45 / CD1O / CD19

CD4 / CD8 / CD45 Syto16 / CD34 / CD45 / CD1O / CD19

CD3 / HLA-DR / CD45 Syto16 / CDlla / CD45 / CD1O / CD19

CD2O / CD5 / CD45 Syto16 / CD38 / CD45 / CD1O / CD19

CD7 / CD13 / CD45

CD1O / CD117 / CD45

CD19 / CD33 / CD45

CD34 / CD22 / CD45

CD2 / CDla / CD45

CD15 / CDllb / CD45

sIgM / - / CD45

CD65 / CD56 / CD45

cyIgGl(mouse) / cyIgG2(mouse) / CD45

cyIgM / - / CD45

Tdt / cyCD79a / CD45

cyMPO / - / CD45

cyCD3 / - / CD45

Все моноклональные антитела фирмы Beckman Coulter

1 ’2012

1 ’2012

Образцы тщательно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин (согласно инструкции по применению фирмы-производителя). Для определения внутриклеточных антигенов дополнительно применяли состав реагентов для фиксации и пермеабилизации (Becton Dickinson). После инкубации клетки однократно отмывали в растворе PBS с последующей фиксацией 1 % раствором параформальдегида. Учет и анализ результатов проводили на проточном цитофлуориметре FC500 (Beckman Coulter) в программе CXP.

Критерием позитивности считали наличие экспрессии маркера на поверхности более чем 20 % лей-кемических клеток. Для цитоплазматических антигенов лимит позитивности снижен до 10 % [7].

Статистическая обработка результатов

Для математической обработки и статистического анализа данных использовали программу Statistica 6.0.

Результаты исследований интенсивности флуоресценции маркеров на лейкемических и нормальных предшественниках представлены в виде значений медианы и диапазона данных (25-75-й перцентили). Оценку достоверности различий между независимыми группами проводили с использованием теста Манна—Уитни. Результаты считали достоверными при р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Согласно рекомендациям EGIL-95 ВП ОЛЛ в зависимости от наличия или отсутствия на поверхности опухолевых клеток специфичных маркеров разделяются на 3 подтипа: Про-В-ОЛЛ, Common В-ОЛЛ и Пре-В-ОЛЛ [7]. Иммунофенотипический диагноз ВП ОЛЛ ставится на основании экспрессии лейкеми-ческими клетками 2 и более специфичных В - линейных маркеров: CD19, и/или CD79a, и/или CD22, кроме того, в большинстве случаев на лимфобластах присутствует экспрессия антигенов гистосовместимости II класса — HLA-DR и цитоплазматически выявляется фермент — терминальная дезоксинуклеотидил-трансфераза (TdT). Иммунофенотипической особенностью Про-В-ОЛЛ, помимо наличия основных линейно-специфичных маркеров, является отсутствие на поверхности опухолевых клеток экспрессии антигена CD10 и цитоплазматического (cy) IgM. Для Common В-ОЛЛ диагностическим критерием служит обязательное присутствие на лейкемических клетках маркера CD10 при условии отсутствия экспрессии cy IgM, тогда как для Пре-В-ОЛЛ обязательным является выявление cy IgM.

При анализе собственных данных мы определили, что у пациентов с ОЛЛ 90,5 % случаев приходятся на долю ВП ОЛЛ, из которых 78,7 % составляют Common В-ОЛЛ, 12,9 % - Пре-В-ОЛЛ и 8,4 % - Про-В-ОЛЛ.

Иммунологическая классификация ВП ОЛЛ основана на представлении об экспрессии линейно-

специфичных и стадийно-специфичных антигенов на поверхности клеток в ходе нормальных этапов дифференцировки В-лимфоцитов (гематогонов). Однако в настоящее время установлено, что лей-кемические бласты при ВП ОЛЛ демонстрируют многочисленные иммунофенотипические аберрации по сравнению с их нормальными гемопоэтиче-скими аналогами [8]. Такие особенности определяют лейкоз-ассоциированный иммунофенотип (ЛАИФ) опухолевых клеток, который, в свою очередь, играет важную роль в диагностике ОЛЛ и мониторинге МОБ на этапах терапии заболевания.

Понятие ЛАИФ при ВП ОЛЛ включает в себя асинхронную экспрессию дифференцировочных маркеров; аберрантную экспрессию (коэкспрессию) миелоидных/Т-линейных маркеров; увеличение/ снижение интенсивности экспрессии специфичных маркеров [8—11].

Хорошо известно, что в ходе нормального гемо-поэза для каждого этапа созревания В-лимфоцитов характерен определенный спектр экспрессии антигенов. На самой ранней стадии (стадия Про-В лимфоцитов) В-предшественники экспрессируют CD34 и TdT, наблюдается низкая интенсивность экспрессии CD10, при этом отмечается полное отсутствие антигена CD20. По мере созревания клеток происходит постепенная потеря таких маркеров, как CD34 и TdT, и становится более выраженной экспрессия CD10 (стадия Пре-Пре-В-лимфоцитов). На следующей стадии постепенно появляется экспрессия CD20, внутриклеточного ^М и отмечается слабое проявление поверхностного ^М (стадия Пре-В-лимфоцитов). На этих стадиях клетки умеренно экспрессируют CD22, а также выявляется выраженная экспрессия антигена CD38. При переходе на стадию зрелых В-лимфоцитов происходит потеря экспрессии CD10, CD38, увеличивается уровень экспрессии маркера CD22. На поверхности зрелых клеток экспрессируется высокий уровень ^М. Умеренная экспрессия CD45 наблюдается на самой ранней стадии дифференцировки и увеличивается по мере созревания клеток. Такие маркеры, как CD19, CD79a и HLА-DR, позитивны на протяжении всех этапов дифференцировки В-лимфоцитов [8].

В результате нашей работы было установлено, что во всех случаях заболевания в той или иной степени выраженности встречаются иммунофеноти-пические аберрации, не свойственные нормальным гемопоэтическим предшественникам. Асинхронная экспрессия дифференцировочных маркеров наблюдалась в большинстве случаев ВП ОЛЛ (табл. 2А). Наличие экспрессии антигена СD34 было выявлено в 74 % ВП ОЛЛ, причем в 75,4 % случаев Соттоп-В ОЛЛ и в 62,1 % — Пре-В ОЛЛ, которые соответствуют более зрелым стадиям нормального гемопоэза. Тогда как в 21,8 % случаев Про-В ОЛЛ экспрессия этого маркера не отмечена. Аналогичным образом

Таблица 2. Особенности экспрессии антигенов при ВП ОЛЛ

Маркер Про-В ОЛЛ п

А

CD10

Негативная экспрессия 24

Гетерогенная экспрессия 0

Гомогенная экспрессия 0

CD20

Негативная экспрессия 23

Позитивная экспрессия 1

CD34

Негативная экспрессия 5

Позитивная экспрессия 19

T

Негативная экспрессия 5

Позитивная экспрессия 15

CD34+/ CD20+ коэкспрессия 1

CD45-

Б

Миелоидный антиген+

CD13+

CD33+

CD15+

CD117+

В

CD2+

CD3+

CD5+

CD1a+

CD7+

CD4+

CD8+

(*) — экспрессия хотя бы 1 миелоидного антигена.

наблюдалась нетипичная для соответствующих этапов нормальной дифференцировки экспрессия фермента TdT В 25% случаев Про-В ОЛЛ данный антиген не выявлялся, в то время как у 96,3 % пациентов с Соттоп-В и у 88,2 % с Пре-В ОЛЛ на опухолевых клетках отмечалась экспрессия TdT. Экспрессия маркера CD20, появление которого характерно для более поздней стадии гемопоэза В-лимфоцитов, наблюдалась в 1 (4,2 %) случае из 23 Про-В ОЛЛ и в 89 (39,8 %) случаях из 224 Соттоп-В ОЛЛ, тогда как у 16 (44,5 %) пациентов из 37 с Пре-В ОЛЛ экспрессия данного маркера была отрицательной. У 69 (24,4 %) из 210 детей выявлена одномоментная

коэкспрессия маркеров разных стадий дифферен-цировки CD34+/CD20+, причем данная аберрация чаще встречалась при Пре-В подтипе ОЛЛ (33,3 %), в 25,1 % случаев Соттоп-В ОЛЛ и в 4,2 % Про-В ОЛЛ соответственно. Отсутствие экспрессии антигена CD45 было выявлено у 117 (41,6 %) из 286 пациентов. Однако во всех случаях Про-В ОЛЛ экспрессия данного маркера была позитивной.

Коэкспрессия миелоидных маркеров на поверхности опухолевых клеток была часто встречаемой аберрацией у пациентов с ВП ОЛЛ и наблюдалась в 116 (42,6 %) из 272 случаев (табл. 2Б). Было установлено, что на лейкемических лимфобластах с раз-

1 ’2012

1 ’2012

личнои частотой и интенсивностью экспрессируются такие миелоидные антигены, как CD13, CD117, CD15 и CD33. Наиболее часто, у 79 (28 %) из 282 пациентов, среди миелоидной коэкспрессии встречалась аберрантная экспрессия маркера CD13. С меньшей частотой была отмечена коэкспрессия маркеров CD33, CD15, CD117, что составляло 17,2 %; 8,27 % и 1,1 % случаев соответственно.

Экспрессия Т-линейных маркеров на лейкеми-ческих клетках ВП ОЛЛ наблюдалась в редких случаях (табл. 2В). Так, коэкспрессия антигена CD2 была выявлена в 3,5 %, CD7 — в 2,5 %. Еще реже встречалась экспрессия таких маркеров, как CD5, CD1а, CD3 и CD4.

С учетом того, что аберрантная экспрессия антигенов других линий дифференцировки определялась менее чем в 50 % случаев ВП ОЛЛ, данные маркеры нецелесообразно включать в панель МКА для мониторинга МОБ.

Метод ПЦФ позволяет определить как процент клеток, экспрессирующих исследуемый маркер, так и интенсивность его флуоресценции (MFI), которая выражается в условных единицах (у. е.), соответствующих среднему каналу максимального свечения маркера. Показатели интенсивности флуоресценции отражают количество экспрессируемых антигенных молекул клетки.

Далее мы сравнивали интенсивность экспрессии значимых для диагностики ВП ОЛЛ антигенов CD45, CD19, СD10, CD20, CD34, СD11а, CD58, CD38 опухолевыми клетками у 32 пациентов до начала лечения и нормальными предшественниками В-лимфоцитов КМ у 14 здоровых доноров. Анализ полученных данных показал, что спектр MFI исследуемых маркеров на опухолевых клетках существенно отличается от их нормальных гемопоэтических аналогов (см. табл. 3 и рисунок).

Как представлено на рисунке, схема А, интенсивность экспрессии общего лейкоцитарного антигена CD45 на лейкемических клетках статистически значимо ниже по сравнению с нормальными предшественниками В-лимфоцитов. Так, медиана средней интенсивности флуоресценции данного маркера на опухолевых клетках составляла 3

и 7,5 (2,5—13,3) у. е., тогда как на нормальных клетках — 11,9 (10,4—13) и 2 (1,5—2) у. е. соответственно (р = 0,002 и р = 0,0004 соответственно). Выраженное различие в интенсивности флуоресценции было отмечено относительно антигена CD38 (рисунок, схема Д). Достоверно низкая экспрессия данного маркера наблюдалась на клетках пациентов с ВП ОЛЛ и составляла 11,5 (6—20) у. е., тогда как на нормальных В-предшественниках медиана его экспрессии была равна 43 (42—52) у. е. (р < 0,0001). Согласно данным, представленным на рисунке, схемы Е и Ж, увеличение MFI на лейкемических клетках было характерно для таких маркеров, как CD58 и CD11a. Так, на поверхности лейкемических клеток медиана уровня экспрессии этих маркеров составляла 8,9 (6,9—11) и 0,6 (0,5—1) у. е., тогда как на нормальных предшественниках — 6 (5—7) и 0,5 (0,3—0,8) у. е. соответственно (р = 0,008 и р = 0,04 соответственно). Снижение уровня экспрессии в анализируемых образцах КМ пациентов с ВП ОЛЛ было отмечено для антигена CD20, но оно не имело статистической достоверности (рисунок, схема З). Так, медиана интенсивности флуоресценции на опухолевых клетках составляла 1,25 (0,7—3) у. е. и 2,5 (1,1—5) у. е. на нормальных предшественниках В-лимфоцитов соответственно (р = 0,06).

Согласно полученным данным, очевидно, что лейкемические бласты при ВП ОЛЛ имеют многочисленные иммунофенотипические аберрации по сравнению с их нормальными гемопоэтическими аналогами. На опухолевых клетках более чем в 50 % случаев встречается асинхронная экспрессия диф-ференцировочных антигенов, в 42,6 % ВП ОЛЛ наблюдается аберрантная экспрессия миелоидных маркеров. Однако основного внимания заслуживают различия уровней экспрессии таких маркеров, как CD19, СD10, CD20, CD38, CD45, CD34, CD58, на опухолевых клетках по сравнению с их нормальными костномозговыми аналогами, которые в той или иной степени наблюдаются в исследуемых образцах КМ пациентов с ВП ОЛЛ. Соответственно использование комбинации этих маркеров для мониторинга МОБ позволит с высокой специфичностью идентифицировать опухолевые клетки среди нормальных гемопоэ-тических предшественников КМ, как на этапе диагностики, так и в ходе противоопухолевой терапии, и тем самым идентифицировать пациентов с высокой вероятностью развития рецидива.

Заключение

Различия в интенсивности экспрессии антигенов CD19, СD10, CD20, CD38, CD45, CD34, CD58 между опухолевыми клетками ВП ОЛЛ и нормальными предшественниками В-лимфоцитов позволяют использовать комбинацию этих маркеров для мониторинга МОБ с целью прогнозирования исхода заболевания.

Таблица 3. MFIопухолевых клеток и нормальных предшественников

Маркер ОК ВП ОЛЛ, п = 32 Меи (тш-тах) В-предшественники, п = 14 Меи (тш-тах) Р

CD45 3 (0,2-27) 22 (13-43) 0,000001

CD19 9 (1-41,8) 14 (11-19,7) 0,0005

CD10 19,5 (7-77) 11,9 (8-18) 0,002

CD34 7,5 (0,2-30) 2 (1,4-3) 0,00039

CD38 11,5 (1-54) 43 (37,7-64) 0,00000

CD58 8,9 (4,7-27) 6 (5-11) 0,008

CD11a 0,6 (0,1-2) 0,5 (0,1—1,2) 0,04

CD20 1,25 (0,2-11) 2,5 (0,5-12) 0,06

ОК — опухолевые клетки; достоверностьр < 0,05.

Сравнение уровня экспрессии иммунофенотипических маркеров опухолевыми клетками ВПОЛЛ и нормальными предшественниками В-лимфоцитов НК — нормальные предшественники В-лимфоцитов; ОК — опухолевые клетки ВП ОЛЛ; ось У —MFI;

* - р < 0,05; п^. - р > 0,05

1 ’2012

1 ’2012

1. Coustan-Smith E., Sancho J.,

Hancock M.L. et al. Clinical importance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood 2000;96:2691-6.

2. Moppet J., Burke GA., Steward C.G. et al. The clinical relevance of detection of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukaemia. J Clin Pathol 2003;3:249-53.

3. Савва Н.Н. Актуальность и перспективы определения минимальной остаточной болезни при остром лимфобластном лейкозе у детей. Онкол журн 2009;Т. 3;1(9):72—7.

4. van Dongen J.J., Seriu T.,

Panzer-Gmmayer E.R. et al. Prognostic value of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukaemia in childhood. Lancet 1998;352:1731-8.

Литература

5. Dworzak M.N., Froschl G., Printz D. et al. Prognostic significance and modalities of flow cytometric minimal residual disease detection in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood 2002;99:1952-8.

6. Borowitz M.J., Devidas M., Hunger S.P. et al. Clinical significance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia and its relationship to other prognostic factors: a Children’s Oncology Group study. Blood 2008;111:5477—85.

7. Bene M.C., Castoldi G., Knapp W. et al. Proposals for the immunological classification of acute leukemias. European Group for the Immunological Characterization of Leukemias (EGIL). Leukemia 1995;9:1783-6.

8. Seegmiller AC., Kroft S.H., Karandikar N.J., McKenna R.W et al. Characterization of Immunophenotypic Aberrancies in 200 Cases

of B Acute Lymphoblastic Leukemia. Am J Clin Pathol 2009;132(6):940—9.

9. Chen W, Karandikar N.J., McKenna R.W., Kroft S.H. Stability of leukemia-associated immunophenotypes in precursor B-lymphoblastic leukemia/lymphoma:

a single institution experience. Am J Clin Pathol 2007; 127(1): 39—46.

10. McKenna R.W., Asplund S.L., Kroft S.H. Immunophenotypic analysis of hematogones (B-lymphocyte precursors) and neoplastic lymphoblasts by 4-color flow cytometry. Leuk Lymphoma 2004;45:277-85.

11. Iwamoto S., Deguchi T., Ohta H. et al. Flow cytometric analysis of de novo acute lymphoblastic leukemia in childhood: report from the Japanese Pediatric Leukemia/ Lymphoma Study Group. Int J Hematol 2011;94:185-92.