СПОСОБ КРИОКОНСЕРВАЦИИ КЛЕТОК ЦИАНОБАКТЕРИЙ
METHOD OF CRYOPRESERVATION OF CYANOBACTERIUM CELLS

Изобретение относится к биотехнологиям и предназначено для хранения клеток цианобактерий в замороженном состоянии, обеспечивающем в наибольшей степени длительное сохранение ими жизнеспособности и пролиферативной способности.
Известен метод лиофилизации, который заключается в высушивании культур под вакуумом при низких температурах (-20°С, -40°С). Лиофилизированные культуры могут храниться при пониженных температурах в течение длительного времени без доступа кислорода, влаги и света (Corbett, Parker 1976). Лиофилизация обеспечивает для широкого круга микроорганизмов большую стабильность, чем общеизвестные способы высушивания и периодических пересевов. Этот метод удобен для практических целей, т.к. дает возможность иметь большое число ампул каждой культуры (Kordowska-Wiater,  etc. 2011). Однако титр жизнеспособных клеток микроорганизмов в результате лиофилизации часто оказывается низким и довольно быстро падает при хранении даже при 4°С. Кроме того, многие неспорообразующие микроорганизмы не переносят обычно используемые режимы лиофилизации. Установлено также, что процесс лиофилизации приводит к отбору наиболее устойчивых клеток в культуре, которые могут и не обладать желаемыми свойствами.
Используется также метод низкотемпературного замораживания на носителях, что позволяет увеличить срок хранения микроорганизмов до 5 и более лет (Pasch,2000), а также способ длительного хранения микроорганизмов при температурах от -20 до -130°С с сохранением высокого титра клеток. Однако в коллекциях микроорганизмов, в том числе международных, последний прием используется как один из этапов лиофилизации культур.
Таким образом, традиционные способы сохранения культур цианобактерий с использованием процедуры последовательного пересева субкультур не способны обеспечить долговременное сохранение этих штаммов ввиду трудоемкости, высоких рисков загрязнения по причине человеческого фактора, генетического дрейфа и мутаций, что приводит к потере исследовательских видов. В данной ситуации вполне реальным представляется долговременное хранение цианобактерий путем низкотемпературного консервирования, что позволяет обойти проблемы, связанные с содержанием коллекции культур. Несомненным преимуществом низкотемпературного консервирования является использование температур существенно выше температуры жидкого азота, позволяющих применять более простое и дешевое оборудование.
Известен способ долгосрочного хранения фототропных микроорганизмов с помощью криоконсервации. Этот способ осуществляется путем замораживания клеток в различных условиях с последующим их хранением в замороженном состоянии. Но при быстром охлаждении вода не успевает покинуть клетку и образовавшиеся внутриклеточные кристаллы льда способны нарушить целостность мембран и цитоскелета. Тодрин, А.Ф. «Теплофизические свойства криопротекторов». А.Ф. Тодрин, Л.И. Попивненко, С.Е. Коваленко // Проблемы криобиологии. - 2009. -Т. 19, №2. - С. 163-176. (Day, 2007; Тодрин, 2009). Происходит увеличение объема мембранных структур, что, в свою очередь, приводит к лизису клетки после размораживания (Volk, 2006). Известны работы по криоконсервации Spirulina platensis с использованием в качестве криопротектора аминокислот (0,1-5,0%) и альбумина яичного белка (2-4%), гуммиарабика (2-10%), желатины (2-10%), гидролизата казеина (2-4%) (Takano, Sado and etc., 1973), глицерина (5 и 10%), телячьей сыворотки (10%) (Day, 2007; Motham, 2012). Имеются данные о том, что использование в качестве криопротекторов глицерина (Muhling, 2000), сахарозы и лактозы (Takano, Sado and etc., 1973) не способствовали успешной криоконсервации.
Известен «Способ культивирования термофильных цианобактерий», включающий насыщение субстрата углекислотой, регулирование освещенности, температуры и химического состава субстрата, при этом регулирование температуры и химического состава субстрата осуществляют путем подачи термальных вод природных источников при обеспечении ее проточности.
Патент РФ на изобретение №2292389, МКИ: C12N 1/12; опубл. 2007.01.27. Известен «Способ сохранения жизнеспособности культуральных штаммов бледных трепонем с использованием криоконсервации», включающий получение стабилизированных микробных суспензий из нативных концентрированных культур штаммов бледных трепонем путем добавления сахарозо-глицериновой криозащитной среды с последующим замораживанием и хранением стабилизированных микробных суспензий при температуре минус 40±2°С.
Патент РФ на изобретение №2600883, МКИ: C12N 1/04; опубл. 2015.04.24.
3
Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является «Способ криоконсервации клеток фототропных микроорганизмов», включающий суспензирование биомассы клеток до концентрации 15-30 мас. % в растворе поливинилового спирта с концентрацией 6-9 мас. %, приготовленном на питательной среде, специфичной для выращивания конкретного фототропного микроорганизма, замораживание и хранение аликвот полученной суспензии объемом 0,1-0,5 см при температуре -80°С.
Патент РФ на изобретение №2508397, MKИ: C12N 01/04, опубл. 2014.02.27.
Задачей настоящего изобретения является расширение функциональных возможностей криоконсервации культуры цианобактерий.
К техническому результату относится повышение эффективности сохранения культуры цианобактерий без нарушения их биотехнологических свойств путем криоконсервации с использованием 10% раствора глюкозы в качестве проникающего криопротектора.
3
Технический результат достигается путем того, что способ криоконсервации клеток цианобактерий включает приготовление питательной среды, специфичной для выращивания конкретного фототропного микроорганизма, выращивание его на этой питательной среде. Затем суспендирование биомассы клеток в растворе поливинилового спирта, замораживание и хранение аликвот полученной суспензии при температуре -80°С. При этом для выращивания клеток цианобактерий используют питательную среду Заррука, на которой осуществляют размножение клеток цианобактерий рода Spirulina subsalsa в течение 25 суток. Суспендирование выращенных клеток до концентрации биомассы 0,6±0,12 г (см. таблицу 1) проводят с помощью 100% изопропилового спирта. При этом замораживание осуществляют в присутствии 10% стерильного раствора глюкозы, а полученную суспензию объемом 0,5-0,7 см выдерживают 25 минут в темноте при постоянном перемешивании на ротаторе со скоростью 20 об/мин. Затем криофлаконы с клетками цианобактерий рода Spirulina subsalsa помещают в предварительно охлажденный до 4°С полимерный контейнер для замораживания. Процесс замораживания осуществляют со скоростью охлаждения -1°С в минуту до достижения -80°С и выдерживают в течение пяти часов.
Пример конкретного выполнения способа криоконсервации цианобактерий: для выращивания клеток фототропного микроорганизма используют питательную среду Заррука, на которой осуществляют размножение Spirulina subsalsa в течение 25 суток. Затем биомассу цианобактерий Spirulina subsalsa смешивали со стерильным 10% раствором глюкозы и выдерживали 20-25 минут в темноте при постоянном перемешивании на ротаторе со скоростью 20 об/мин. После инкубирования с криопротектором в темноте криофлаконы с Spirulina subsalsa помещали в полимерный контейнер для замораживания, который был предварительно охлажден до 4±0,1°С в течение минимум 5-ти часов со скоростью охлаждения -1°С в минуту.
2
Для размораживания криофлаконы с Spirulina subsalsa извлекали из морозильной камеры и переносили на водяную баню с температурой воды 37±0,2°С, где выдерживали до исчезновения льда. После размораживания Spirulina subsalsa в стерильных условиях удаляли из криофлакона и переносили в стерильную питательную среды Заррука. Для предотвращения фотоокисления цианобактерий культивировали в течение первых 40 минут при комнатной температуре в темноте. Последующее культивирование проводили в течение 2 часов при освещении 10-12 мкмоль фотонов/(мс). Выживаемость клеток Spirulina subsalsa после размораживания составляет 90-95% и сохраняется на этом уровне в течение не менее 6 месяцев. Величина биомассы в конце ростового цикла и удельная скорость роста(μ) также соответствуют параметрам исходной культуры (табл. 1). Хранение более 6 месяцев несколько снижает скорость роста, однако Spirulina subsalsa и в этом случае пригодна для дальнейшего выращивания с сохранением биосинтеза основных технологических продуктов (табл. 2 и 3). Остальные примеры приведены в таблицах 1, 2 и 3. Анализ данных, сведенных в таблицы 1, 2 и 3, показал оптимальность предложенного в качестве изобретения способа криоконсервации клеток цианобактерий.
1
2
6
12
Предлагаемый способ позволяет эффективно сохранять культуры цианобактерий без нарушения биотехнологических свойств, что представляет коммерческий интерес, так как Spirulina subsalsa характеризуется уникальным сочетанием биологически активных соединений, таких как провитамин А, витамины группы В (B, В, В, В), С, Е, полиненасыщенные жирные кислоты (с высоким содержанием гамма-линоленовой кислоты), каротиноиды, хлорофилл и фикоцианин, низкомолекулярные протеины, полисахариды, макро- и микроэлементы (фосфор, кальций, калий, магний, цинк, железо, марганец), а также минеральные соли, аминокислоты, в том числе незаменимые, а также позволяет увеличить выживаемость клеток различных фототрофных микроорганизмов в процессе их замораживания-оттаивания до 90-95% в течение не менее 6 месяцев с сохранением биотехнологических свойств, т.е. способности синтезировать биологически активные вещества.