СПОСОБ ФОРМИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
METHOD FOR CHRONIC ALCOHOL INTOXICATION IN EXPERIMENT

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для выведения серии алкоголезависимых лабораторных животных (крыс).
Одной из актуальных проблем современной медицины является изучение механизмов развития хронического алкогольного синдрома. Алкоголизм относится к проградиентным заболеваниям, характеризующимся патологическим влечением к употреблению спиртных напитков, развитием абстинентного синдрома при прекращении употребления алкоголя, а в дальнейшем появлению стойких соматоневрологических расстройств и психической деградации (Шабанов П.Д. Основы наркологии. СПб.: Лань; 2002). Алкоголь опасен токсическим влиянием на большинство органов и систем. Злоупотребление алкоголем представляет собой третий в мире фактор риска заболеваний и инвалидности, является причиной 60 видов заболеваний и травм, а также сопутствующей причиной, по меньшей мере, 200 других (Rocco A, Compare D, Angrisani D, Sanduzzi Zamparelli M, Nardone G. Alcoholic disease: liver and beyond. World J Gastroenterol. 2014;20(40): 14652-9). Токсическое действие алкоголя доказано в развитии патологий печени, полых органов желудочно-кишечного тракта, слизистых оболочек, сердечно-сосудистой и мочеполовой системы (Gardner JD, Mouton AJ. Alcohol effects on cardiac function. Compr Physiol. 2015;5(2):791-802). Алкоголизм приводит к нарушениям центральной и периферической нервной системы, среди которых абстинентный синдром, синдром лобной атрофии, синдром мозжечковой деградации, алкогольная амблиопия и деменция, корсаковский синдром, миопатический синдром и алкогольная полинейропатия. На разных этапах возможны неврозоподобные, психопатоподобные нарушения, что отражается не только на медицинском прогнозе, но также на социальном и трудовом: лица, которые хронически употребляют алкоголь, обретают проблемы в общественной жизни и трудовой деятельности (Алкоголизм. Руководство для врачей. Под ред. Н.Н. Иванца, М.А. Винниковой. М.: Медицинское информационное агентство; 2011).
Учитывая роль алкоголизма в целом, продолжает оставаться актуальным исследование отдельных звеньев патогенеза хронического алкогольного синдрома, а также коморбидной патологии. Однако, исследование данной патологии на лабораторных животных осложняется тем, что, как правило, они не имеют изначального предпочтения к алкогольсодержащим напиткам. Следовательно, существует необходимость в разработке простой и бюджетной модели выведения животных (крыс), предпочитающих алкоголь. Несмотря на то, что в последнее время в экспериментальной медицине уделяется большое внимание изучению хронической алкогольной интоксикации, модели, воспроизводящие ситуацию, наблюдаемую в клинике, единичны.
Известен способ формирования хронической алкогольной интоксикации в эксперименте (Майский А.И., Селимов P.M. "Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ". М.; 2000:164-171), заключающийся в проведении теста этанолового наркоза, включающего отбор животных по общему состоянию здоровья, показателям развития, роста, возраста и введение им внутрибрюшинно 12,5% раствора этанола из расчета 4,5 г/кг, причем объем вводимого раствора выбирают пропорционально весу тела так, чтобы боковое положение у животных продолжалось 0,5-1,5 часа, что позволяет зарегистрировать как усиление, так и ослабление наркотического действия этанола, т.е. выявить коротко- и длинноспящих животных, при этом животных располагают на горизонтальной поверхности при постоянной комнатной температуре и протоколируют время наступления этанолового наркоза и выхода из него по критерию перехода в неподвижное лежачее положение и выходу из него.
Однако данный способ имеет ряд недостатков, таких как травматичность, зависимость от температуры окружающей среды и от физиологического состояния животных.
Известен способ формирования хронической алкогольной интоксикации в эксперименте (Патент РФ №2646454, опубл. 20.05.2015), заключающийся в принудительной алкоголизации животных 10%-ным водным раствором этанола в течение 13 недель, последующем отборе животных с высоким предпочтением к алкоголю и продолжении алкоголизации до конца 24 недели от начала алкоголизации, причем в пересчете на чистый этанол среднее потребление алкоголя животными в течение эксперимента варьировалось в пределах 5,0-6,5 г/кг.
К недостаткам данного способа относятся длительность процесса моделирования хронической алкогольной интоксикации у лабораторных животных, вероятность летальных исходов.
В качестве прототипа выбран способ формирования хронической алкогольной интоксикации в эксперименте (Кнышова Л.П., Поройский С.В., Яковлев А.Т., Морковин Е.И., Тарасов А.С. Критерии достоверности воспроизведения экспериментальной модели хронической алкогольной интоксикации. Волгоградский научно-медицинский журнал, 2016;4:48-51), заключающийся в том, что животных разделяют на 4 группы по 10 особей, контрольные группы получают свободный доступ к корму и воде, в экспериментальных группах используют методы искусственной полидипсии, при которых животные были вынуждены употреблять 15%-й водный раствор этанола в качестве единственного источника жидкости, оценку влияния этанола на питьевое поведение крыс производят на 20-е сутки эксперимента в тесте предпочтения этанола, для чего животных помещают в индивидуальные клетки на 2,5 часа и высчитывают коэффициент предпочтения алкоголя, подтверждающий формирование алкогольной зависимости у крыс обеих экспериментальных групп к 18-20 суткам эксперимента.
Однако способ имеет следующие недостатки: изначально высокая доза этанола в растворе повышает его токсическое действие на крыс и может приводить к дальнейшему отвращению к алкоголю, невысокая концентрация этанола в растворе, предлагаемом для употребления, перемещение животных в индивидуальные клетки, что приводит к дополнительному стрессу, гиподинамии и погрешностям в дальнейшем проведении эксперимента.
Проведенный патентно-информационный поиск не выявил способов формирования хронической алкогольной интоксикации в эксперименте с существенными признаками заявляемого способа.
Исходя из вышеприведенного уровня техники, при формировании хронической алкогольной интоксикации у лабораторных животных проблемой является их принудительная алкоголизация, а также длительность, последующие стрессы и изъяны в поведении животных, что в свою очередь не может достаточно полно отражать состояние, наблюдаемое в клинике у пациентов, страдающих алкогольной зависимостью.
Технический результат заключается в создании модели хронической алкогольной интоксикации, наиболее полно воспроизводящей клиническую картину данного синдрома, что является основой для дальнейшего изучения алкогольной зависимости при различных патологиях внутренних органов и систем.
Разработка более эффективного способа формирования хронической алкогольной интоксикации в эксперименте путем применения щадящего режима постепенной алкоголизации животных для создания необходимых условий для дальнейшего изучения всех звеньев патогенеза данной патологии позволит решить вышеуказанную проблему.
В связи с этим впервые был разработан и апробирован способ формирования хронической алкогольной интоксикации в эксперименте.
Предлагается, как и в прототипе, использовать водный раствор этанола в качестве источника питьевой жидкости.
Сущность заявляемого изобретения заключается в том, что в способе формировании хронической алкогольной интоксикации в эксперименте, включающем применение водного раствора этанола в качестве источника питьевой жидкости, согласно изобретению, в первый день крысы в качестве питьевой жидкости получают 7% водный раствор этанола, затем ежедневно концентрацию водного раствора этанола увеличивают на 1% в течение 14 дней, на 15 день определяют алкоголизацию крыс путем проведения теста с двумя поилками, одна из которых содержит 20% водный раствор этанола, а другая - питьевую воду, и при предпочтении животным в течении одной минуты поилки с водным раствором этанола результат считают положительным.
Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в более точном и легко воспроизводимом способе развития хронической алкогольной интоксикации у экспериментальных животных под влиянием употребления раствора этанола, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».
Причинно-следственная связь между совокупностью существенных признаков и обеспечиваемым изобретением техническим результатом, состоит в следующем: применение водного раствора этанола в изначально минимальной концентрации с постепенным ежедневным повышением его концентрации на 1% в питьевой воде в течение 2-х недель и достижением максимальной 20% концентрации водного раствора этанола в поилке на 14 день позволяет снизить риски стрессовых реакций животных, уменьшить погрешности в их поведении, а также своевременно улучшить компенсаторные возможности, снизить токсическое действие этанола, что дает возможность получения конкретной модели патологии, наиболее полно отражающей характер хронической алкоголизации для последующего изучения патологического синдрома в эксперименте. Способ осуществляют следующим образом.
Из крыс линии Wistar выбирают особи разного пола, не младше 3 месяцев, без видимых причин органопатологии, среднего роста и веса, без отклонений развития.
Экспериментальные исследования проводили в соответствии с требованиями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются в исследовательских и других научных целях» (Strasburg, 18.03.1986).
Для эксперимента отбирают 24 крысы лини Wistar, которые распределяют на 4 одинаковые по полу и возрасту группы по 6 особей в каждой. Эксперимент проводят в месте постоянного проживания лабораторного животного и без перемещения в иные условия. При этом питьевую воду постепенно заменяют на водный раствор этанола в титрируемой дозе.
В первый день всем животным в качестве питья дают 100 мл 7% водного раствора этанола, который получали путем смешивания 93 мл обычной питьевой воды и 7 мл 96° этанола.
В дальнейшем на протяжение 14 дней ежедневно концентрацию водного раствора этанола увеличивают на 1% путем увеличения доли 96° этанола на 1 мл. К 14 дню эксперимента концентрацию водного раствора этанола доводят до 20%, что соответствует объему 80 мл обычной питьевой воды и 20 мл 96° этанола.
На 15 день определяют зависимость крыс от алкоголя.
Одним из признаков хронического алкогольного синдрома является неодолимое влечение к постоянному употреблению алкоголя. Для определения алкоголизации животного проводят тест с двумя поилками. Через 2 часа после того, как в поилке закончится питьевая жидкость - водный раствор этанола, в вольер с животными помещают две одинаковые на вид поилки - одну снова с 20% водным раствором этанола, другую с обычной питьевой водой.
Результат считают положительным в том случае, если животное в течение минуты направляется к поилке с водным раствором этанола, предпочитая его обыкновенной питьевой воде.
При апробации заявляемого способа все 24 лабораторные крысы предпочли в качестве питья водный раствор этанола, что свидетельствует об их полной алкоголизации.
При этом, в конце эксперимента не было зафиксировано ни одного летального случая.
Крысы предпочитают водный раствор этанола питьевой воде в более высокой концентрации по сравнению с прототипом. Постепенное увеличение концентрации этанола в растворе сопровождается минимальным риском, что позволяет своевременно включить компенсаторные механизмы, снижая токсическое действие этанола.
Дальнейшее увеличение концентрации водного раствора этанола свыше 20% может быть потенциально опасным в связи с возможностью раздражения глаз и слизистых оболочек, что может приводить к отвращению употребления, увеличению заболеваемости животных и повышению летальных случаев.
На 15 день крысу считают зависимой от алкоголя и пригодной для проведения последующих исследований, позволяющих определять влияние этанола на органы и системы животного.
Данный способ может быть эффективен в отношении иных лабораторных животных.
Возможно перемещение животных в индивидуальные клетки для индивидуального учета выпитой жидкости, но это может негативно отразится на экстраполяции результатов эксперимента, так как такая модель противоречит культуре употребления алкоголя у людей.
В таблице 1 приведены сравнительные аналитические данные способа-прототипа и заявляемого способа.
Использование способа дает возможность вызывать алкогольную зависимость у крыс путем введения водного раствора этанола в месте их постоянного содержания, перемещение в иные условия не требуется, что снижает стрессовые факторы влияния на животных и повышает чистоту эксперимента.
Способ позволяет создать технически простую и высоко воспроизводимую модель, удобную для проведения эксперимента на животных с максимально приближенным к естественным условиям проведения, что позволит эффективно изучать в динамике патофизиологические механизмы алкогольного синдрома.
Использование способа не приводит к преждевременной гибели животных.