СПОСОБЫ РАЗДЕЛЕНИЯ СПЕРМАТОЗОИДОВ И ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ ЭТОГО КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ АПТАМЕРЫ ИЛИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
METHOD TO SEPARATE SPERMATOZOA AND APPLIED COMPOSITIONS, CONTAINING APTAMERS OR SEQUENCES OF NUCLEIC ACIDS

Родственные заявки
В данной заявке заявлен приоритет предварительной патентной заявки U.S. № 60/824069 от 30.08.2006, которая полностью введена сюда с помощью ссылки.
Область техники
Настоящее изобретение относится к способам и композициям для идентификации и отделения клеток из популяции клеток, в частности сперматозоидов млекопитающего, посредством применения нуклеиновых кислот, в частности аптамеров, которые специфично связываются с высокой аффинностью и специфичностью или предпочтительно связываются с любыми сперматозоидами, содержащими X-хромосому или Y-хромосому.
Уровень техники
Способность селектировать сперматозоиды, обладающие целевыми характеристиками, остается важной задачей в области искусственной репродукции. Эффективный и экономически выгодный способ идентификации и разделения сперматозоидов для селекции пола имел бы значительные экономические последствия для промышленного животноводства и, конкретно, для мясной и молочной промышленности. Например, в мясной промышленности, самец крупного рогатого скота имеет большую коммерческую ценность, чем самка крупного рогатого скота, из-за своего размера, поэтому способы, которые дают возможность обогащения в поголовье самцов крупного рогатого скота, обеспечат очевидное конкурентное преимущество фермерам, которые будут применять такие методы. С другой стороны, в молочной промышленности, появление производящих молоко коров, как правило, является более целесообразным. Однако в настоящий момент только небольшой процент фермеров-скотоводов применяет способы искусственного оплодотворения, включающие применение специфичных по половому признаку сперматозоидов в качестве средства получения поголовья крупного рогатого скота, обладающего целевым полом. Несмотря на преимущества возможности контроля и планирования по половому признаку состава крупного рогатого скота, такой способ не является широко применяемым в промышленности, так как настоящие методы сортировки сперматозоидов на сперматозоиды, специфичные по половому признаку, которые включают методы проточной цитометрии, одновременно являются дорогостоящими и включают необратимое окрашивание сперматозоидов перед процессом оплодотворения. Менее дорогие способы и способы с меньшим воздействием для идентификации и разделения сперматозоидов на основе качества, физических характеристик или содержания сперматозоидов, также имели бы важное применение во многих технологиях репродукции животного и человека.
Сущность изобретения
В настоящем изобретении предлагается, по меньшей мере, один аптамер или последовательность нуклеиновой кислоты, которая связывается с молекулой-мишенью, доступной на поверхности клетки, конкретно, сперматозоида млекопитающего, и предлагается способ получения аптамеров или последовательностей нуклеиновых кислот. Способ включает контактирование коллекции различных молекул нуклеиновых кислот с молекулой-мишенью при условиях, благоприятных для связывания между, по меньшей мере, одной из молекул нуклеиновых кислот и молекулой-мишенью, с образованием, по меньшей мере, одного комплекса, включающего молекулу нуклеиновой кислоты, связанную с молекулой-мишенью, где каждая из молекул нуклеиновых кислот включает, по меньшей мере, один сегмент случайных нуклеотидных последовательностей. Комплексы затем отделяют от несвязанных молекул-мишеней, и связанную молекулу нуклеиновой кислоты извлекают из отделенного комплекса.
В настоящем изобретении дополнительно предлагается одна или более специфичная молекула нуклеиновой кислоты или аптамер, предпочтительно, олигонуклеотид, более предпочтительно, ДНК-молекула, которая предпочтительно связывается со сперматозоидом, содержащим X-хромосому (далее обозначается как "X-сперматозоид"), или со сперматозоидом, содержащим Y-хромосому (далее обозначается как "Y-сперматозоид"), и наиболее предпочтительно, лучше связывается с одним из X-сперматозоидов или связывается с каждым типом X- и Y-сперматозоидов, но с существенно различающейся степенью аффинности.
В настоящем изобретении также предлагается выделенная синтетическая последовательность нуклеиновой кислоты или аптамер, который связывается с молекулой-мишенью на сперматозоиде млекопитающего, включающая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:3-35 или их участка связывания с молекулой-мишенью.
В настоящем изобретении также предлагается способ применения аптамеров или последовательности нуклеиновой кислоты для идентификации, селекции и разделения X- и Y-сперматозоидов. Предпочтительно, способ включает разделение сперматозоидов млекопитающего с помощью контактирования X- и Y-сперматозоидов, по меньшей мере, с одним аптамером по изобретению и разделение клеток на две или более популяций на основе их способности предпочтительного связывания с аптамером.
Изобретение дополнительно включает популяцию(и) X- и Y-сперматозоидов, полученных способом разделения. Изобретение дополнительно включает набор реагентов для искусственного оплодотворения, включающий популяцию сперматозоидов, полученную способом по изобретению, и способ искусственного оплодотворения млекопитающего путем введения выбранной популяции сперматозоидов млекопитающему.
В настоящем изобретении также предлагаются диагностические и технологические средства, имеющие отношение к характеристикам качества сперматозоидов, таким как выживаемость сперматозоидов, подвижность, функциональность, стимуляция и консервация, а также диагностические и технологические средства, которые относятся к показателям качества оплодотворения, показателям фертилизации и показателям рождаемости целевого потомства путем создания способа селективной сортировки клеток спермы или сперматозоидов, полученных от различных видов, индивидуумов и экземпляров.
Подробное описание фигур
Фиг.1 представляет собой график проточной цитометрии, показывающий специфичность пулов ДНК-аптамеров к живым сортированным сперматозоидам быка после 9 раундов селекции аптамера (A = сортированные Y-клетки спермы быка, связывающиеся с библиотекой интактной ДНК; B = сортированные Y-клетки спермы быка, связывающиеся с пулом аптамеров, специфичных для X-клеток; C = сортированные X-клетки спермы быка, связывающиеся с библиотекой интактной ДНК; и D = сортированные X-клетки спермы быка, связывающиеся с пулом аптамеров, специфичных для X-клеток).
На фиг.2A показан анализ связывания обогащенного пула аптамеров, специфичного для Х-клеток. Флуоресцентные конфокальные изображения сперматозоидов (слева) и оптические изображения сперматозоидов (справа), (a) X-специфичный пул аптамеров с X-клетками, (b) X-специфичный пул аптамеров с Y-клетками; (c) Библиотека интактной ДНК с X-клетками.
На фиг.2B показан анализ связывания обогащенного пула аптамеров, специфичного для Y-клеток. Флуоресцентные конфокальные изображения сперматозоидов (слева) и оптические изображения сперматозоидов (справа), (a) Y-специфичный пул аптамеров с Y-клетками, (b) Y-специфичный пул аптамеров с X-клетками; (c) Библиотека интактной ДНК с Y-клетками.
Подробное описание изобретения
В контексте настоящего изобретения аптамеры определяются как класс лигандов или последовательностей нуклеиновых кислот, определения которых используются взаимозаменяемо по всему содержанию настоящего описания; также аптамеры обозначаются олигомерами или олигонуклеотидами, т.е. нуклеиновыми кислотами, которые предпочтительно связываются с конкретной молекулой-мишенью, такой как полипептид, короткий пептид, фермент, белок, липид, гликолипид, фосфолипид, гликопротеин, углевод, малая молекула или молекула клеточной поверхности, такая как рецептор, молекула внеклеточного матрикса или структурная молекула, или ионный канал. Аптамеры по настоящему изобретению представляют собой лиганды или одноцепочечные олигонуклеотиды, которые связываются с молекулами-мишенями с высокой степенью аффинности и специфичности посредством взаимодействий комплементарного типа. Аптамеры или последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению способны к связыванию или образованию комплекса с молекулой-мишенью с более высокой степенью или аффинностью, чем аптамер мог бы связываться с посторонними или контрольными молекулами, которые, предположительно не содержат мишени на поверхности X- или Y-сперматозоидов или не являются доступными с поверхности X- или Y-сперматозоидов. Аптамеры или последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению могут предпочтительно связываться с молекулой-мишенью на поверхности X-сперматозоида по сравнению с Y-сперматозоидом или наоборот. Нуклеиновые кислоты могут представлять собой любую последовательность ДНК, РНК, одноцепочечную или двухцепочечную, и любые их химические модификации. Модификации включают, но не ограничены ими, такие модификации, которые представляют собой другие химические группы, которые вводят в основания нуклеиновой кислоты или в молекулу нуклеиновой кислоты в целом, дополнительный заряд, поляризуемость, водородную связь, электростатическое взаимодействие, гибкость или метку. Предпочтительно, аптамеры представляют собой молекулы ДНК. Наиболее предпочтительно, они представляют собой олигонуклеотиды.
Длина этих молекул составляет более чем один нуклеотид и может включать короткие последовательности, такие как димеры или триммеры, которые могут представлять собой интермедиаты при получении специфичных молекул нуклеиновых кислот, которые связываются с мишенью. Аптамеры по настоящему изобретению включают молекулы нуклеиновых кислот любой длины, но предпочтительно, менее чем 200 нуклеотидов, предпочтительно, менее чем 150 нуклеотидов, предпочтительно, менее чем 100 нуклеотидов, предпочтительно, менее чем 80 нуклеотидов, предпочтительно, более менее чем 60 нуклеотидов, более предпочтительно, менее чем 40 нуклеотидов, предпочтительно, менее чем 35 нуклеотидов, предпочтительно, менее чем 30 нуклеотидов, предпочтительно, менее чем 25 нуклеотидов, предпочтительно, менее чем 20 нуклеотидов, предпочтительно, менее чем 15 нуклеотидов, и предпочтительно, менее чем 10 нуклеотидов. Типично, длина таких олигонуклеотидов составляет примерно 15-60 нуклеотидов.
В контексте настоящего изобретения следует понимать, что аптамеры включают оба типа аптамеров - моноклональные и поликлональные аптамеры. При использовании здесь, моноклональные аптамеры представляют собой аптамеры с одинаковыми нуклеотидными последовательностями, которые связываются с одной и той же мишенью, и поликлональные аптамеры представляют собой аптамеры с некоторой вариацией в нуклеотидной последовательности, которые связываются с одной и той же мишенью. Моноклональные аптамеры являются предпочтительными. При использовании здесь, аптамер предпочтительно представляет собой олигонуклеотид, который способен к комплексообразованию или к связыванию с молекулой-мишенью, как описано здесь. Аффинность или комплексообразование аптамера с его молекулой-мишенью определяется степенью аффинности или комплексообразования и измеряется по способности аптамера связываться с более высокой степенью с молекулой-мишенью, чем с контрольными или посторонними молекулами. Таким образом, специфичность аптамеров определяется подобно применяемому обозначению специфичности антител.
Примененные аптамеры, которые связываются с X-сперматозоидами или с Y-сперматозоидами, но предпочтительно с любыми из X-сперматозоидов или Y-сперматозоидов, идентифицируются с помощью одного из методов, описанных здесь, при этом аптамеры могут быть получены с помощью любого известного метода получения молекул нуклеиновых кислот, такого как синтетический метод, рекомбинантный или метод очистки. Дополнительно, аптамеры могут быть соединены с другой молекулой для содействия детекции и/или выделению после контактирования аптамера со сперматозоидом. Представляется важным, что эта дополнительная молекула не будет оказывать существенного влияния на аффинность связывания аптамера с молекулой-мишенью или препятствовать этому. Применяемые метки включают известные метки, применяемые для выделения и детекции белков, пептидов, метаболитов и антител, такие как флуоресцентные или биотиновые компоненты, или магнитные частицы, или другие типы частиц, применяемых при выделении.
Аптамеры или последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению могут применяться или индивидуально или в комбинации с другими аптамерами, специфичными для одной и той же молекулы-мишени. Различные аптамеры, которые содержат один и тот же консенсус, будут известны благодаря сравнению двух или более известных аптамеров для специфичной молекулы-мишени, или, возможно, для другой молекулы-мишени на поверхности или близко от поверхности Х- или Y-сперматозоида. Если X- и Y-сперматозоиды должны быть разделены, то представляется важным применение одного или более аптамеров, специфичных или предпочтительных для одной или другой клетки с целью получения наилучшего разделения с получением популяции спермы, содержащей или X- или Y-сперматозоиды.
Аптамеры для поверхностных белков сперматозоидов или другие поверхностные мишени сперматозоидов (включающих, но не ограниченных ими, углеводы, липиды, нуклеотиды или другие малые молекулы, которые могут быть доступны для связывания со специфичными аптамерами) идентифицируются и селектируются с помощью способов по изобретению. В одном воплощении, в изобретении предлагается способ получения аптамера, который связывается с молекулой-мишенью на поверхности сперматозоида млекопитающего. Коллекция различных молекул нуклеиновой кислоты контактирует с молекулой-мишенью, которая может быть доступна для связывания с этими молекулами на клеточной поверхности, или с молекулой-мишенью, которая выступает из клеточной поверхности, при условиях, благоприятных для связывания, между, по меньшей мере, одной из молекул нуклеиновых кислот и молекулой-мишенью. Каждая из молекул нуклеиновых кислот содержит, по меньшей мере, один сегмент случайных нуклеотидных последовательностей. Это обеспечивает вариацию в молекулах нуклеиновых кислот. Контактирование приводит в результате к образованию, по меньшей мере, одного комплекса, включающего, по меньшей мере, одну молекулу нуклеиновой кислоты, связанную с молекулой-мишенью. Комплекс затем отделяют от несвязанных молекул нуклеиновых кислот и несвязанных молекул-мишеней. Затем связанную молекулу нуклеиновой кислоты извлекают из отделенного комплекса, таким образом, получая целевой аптамер. В следующем воплощении, способ включает дополнительную стадию амплификации извлеченных молекул нуклеиновых кислот с созданием дополнительных молекул. В следующем предпочтительном воплощении, извлеченные и амплифицированные молекулы, т.е. аптамеры, дополнительно смешивают с коллекцией X- и Y-сперматозоидов, содержащих молекулы-мишени, предпочтительно расположенные на клеточной поверхности или доступные с клеточной поверхности, и последовательность вышеописанных стадий повторяют достаточное количество раз до тех пор, пока не будут извлечены аптамеры целевой специфичности/предпочтительности и аффинности связывания. Аптамеры связываются с молекулой-мишенью, расположенной на клетке, более специфично по сравнению с контрольным пулом ДНК-последовательностей для той же клетки. В альтернативном воплощении, стадия контактирования включает инкубацию молекул с образованием равновесной смеси, и стадия отделения включает капиллярный электрофорез.
Предпочтительно, молекула-мишень на поверхности клетки представляет собой молекулу, которая является уникальной или для X-сперматозоида, или для Y-сперматозоида, и которая не вступает в перекрестную реакцию с каждым типом клеток. Такая молекула-мишень может представлять собой белок, пептид, фермент, липид, гликолипид, фосфолипид, гликопротеин, углевод, малую молекулу или молекулу клеточной поверхности, такую как рецептор, молекула внеклеточного матрикса, или структурную молекулу, или ионный канал. Наиболее предпочтительно, белок отличает X-сперматозоиды от Y-сперматозоидов, содержащих Y-хромосому.
В одном воплощении изобретения, способы по изобретению осуществляются многократно, так чтобы существовали повторяющиеся стадии (a) контактирования коллекции различных нуклеиновых кислот (т.е. аптамеров) с молекулой-мишенью, доступной на клеточной поверхности, с образованием, по меньшей мере, одного комплекса, включающего, по меньшей мере, одну молекулу нуклеиновой кислоты, связанную с молекулой-мишенью, доступной на клеточной поверхности, (b) отделения комплексов от несвязанных молекул нуклеиновых кислот и несвязанны молекул-мишеней; и (c) извлечения связанной молекулы нуклеиновой кислоты из отделенного комплекса. В этом воплощении, множество аптамеров, извлеченных из отделенного комплекса стадии (c), используется в следующем раунде способа в стадии (a). В одном воплощении изобретения, стадии сортировки сперматозоидов (т.е. вышеописанные стадии (a), (b) и (c)) повторяют 1 или более, 2 или более, 3 или более, 4 или более, 5 или более, 6 или более, 7 или более, 8 или более, 9 или более, 10 или более, или 11 или более раз с получением пула аптамеров, специфичных к X-сперматозоидам или к Y-сперматозоидам. Сортированные аптамеры могут быть очищены с помощью методов, известных из области техники, и отсеквенированы с помощью известных методов или в соответствующей коммерческой фирме.
Характерные аптамеры, полученные описанным здесь способом, включают выделенную синтетическую последовательность нуклеиновой кислоты, которая связывается с молекулой-мишенью на сперматозоиде млекопитающего, включающую нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
(a) нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:3-35 или их участка связывания с молекулой-мишенью;
(b) нуклеотидной последовательности, которая, по существу, гомологична нуклеотидной последовательности (a) или ее участку связывания с молекулой-мишенью и обладает, по существу, такой же способностью связываться с указанной молекулой-мишенью на указанном сперматозоиде, как у нуклеотидной последовательности (a) или ее участка связывания с молекулой-мишенью; и
(c) нуклеотидной последовательности, имеющей, по существу, такую же структуру, как у нуклеотидной последовательности (a) или (b) или у их участка связывания с молекулой-мишенью, и обладающей, по существу, такой же способностью связываться с указанной молекулой-мишенью на указанном сперматозоиде, как у нуклеотидной последовательности (a) или (b) или у их участка связывания с молекулой-мишенью.
Выделенная синтетическая последовательность нуклеиновой кислоты, как описано выше, также охватывает, по меньшей мере, участок нуклеотидов 1-20, удаленных из указанных последовательностей SEQ ID NO:3-35, или их участок связывания с молекулой-мишенью; по меньшей мере, участок нуклеотидов 61-80, удаленных из указанных последовательностей SEQ ID NO:3-10 и 12-35, или нуклеотиды 44-63 последовательности SEQ ID NO:11, или их участок связывания с молекулой-мишенью; по меньшей мере, участок нуклеотидов 1-20, удаленных из указанных последовательностей SEQ ID NO:3-35 и/или где, по меньшей мере, участок нуклеотидов 61-80 удален из указанных последовательностей SEQ ID NO:3-10 или 12-35, или нуклеотиды 44-63 последовательности SEQ ID NO:11, или их участок связывания с молекулой-мишенью; и последовательности ДНК включают нуклеотиды 21-60 последовательностей SEQ ID NO:3-10 или 12-35, или нуклеотиды 21-43 последовательности SEQ ID NO:11, или их участок связывания с молекулой-мишенью.
Настоящее изобретение также охватывает композицию, включающую, по меньшей мере, одну из последовательностей нуклеиновых кислот, выбранных из группы, состоящей из всех последовательностей нуклеиновых кислот, указанных здесь выше.
Настоящий способ дополнительно включает стадию амплификации извлеченной молекулы нуклеиновой кислоты с созданием дополнительных молекул нуклеиновых кислот. Стадия контактирования (a) может включать инкубацию молекул с образованием равновесной смеси, и где стадия отделения включает капиллярный электрофорез.
Настоящий способ дополнительно включает инкубацию коллекции различных молекул нуклеиновых кислот или аптамеров после каждого раунда и сперматозоидов, содержащих молекулу-мишень, с праймером, который, по существу, коплементарен матричной последовательности нуклеиновой кислоты. Матричная последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность, которая соответствует сегменту аптамера, который является неизменным (или константным) среди множества аптамеров. Аптамер предпочтительно получают из ДНК-библиотеки, и эта матричная последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой векторную последовательность. Стадия контактирования (a) дополнительно включает стадию негативной селекции, за которой следует стадия позитивной селекции. Множество извлеченных аптамеров количественно оценивают с использованием известного метода проточной цитометрии.
Молекула-мишень на сперматозоиде, с которой может связываться аптамер, выбирается из группы, состоящей из белка, пептида, фермента, липида, гликолипида, фосфолипида, гликопротеина, углевода, малой молекулы или молекулы клеточной поверхности. В предпочтительном воплощении молекула-мишень содержится на сперматозоиде и отличает, по меньшей мере, один X-сперматозоид от, по меньшей мере, одного Y-сперматозоида путем сравнения связывания или отсутствия связывания, или дифференциального связывания. Сперматозоиды, идентифицированные таким способом, представляют собой сперматозоиды крупного рогатого скота или сперматозоиды человека.
Аптамеры, которые специфично связываются со сперматозоидами, могут быть идентифицированы с помощью методов, известных из области техники, включающих, но не ограниченных ими, методы сортировки клеток или проточной цитометрии. В настоящем способе предлагается способ получения аптамеров, который позволит отделение X-сперматозоидов млекопитающего от Y-сперматозоидов млекопитающего, где с помощью способа получают первую группу аптамеров, которые связываются с X-сперматозоидами в первом образце, и получают вторую группу аптамеров, которые связываются с Y-сперматозоидами во втором образце; и способ дополнительно включает: (d) сравнение первой и второй групп аптамеров для идентификации методом исключения, по меньшей мере, одного аптамера, который связывается или только с X-сперматозоидами или с Y-сперматозоидами. Первый и второй образцы сперматозоидов млекопитающего получают с помощью проточной цитометрии и сортировки клеток.
Способ получения спермоспецифичных аптамеров дополнительно включает стадию контактирования (a), которая дополнительно включает: (a1) контактирование первой коллекции различных молекул нуклеиновых кислот с молекулой-мишенью, которая содержится в первом образце X-сперматозоидов млекопитающего, при условиях, благоприятных для связывания между указанными молекулами нуклеиновых кислот и указанными X-сперматозоидами, с образованием, по меньшей мере, одного комплекса, включающего, по меньшей мере, одну молекулу нуклеиновой кислоты, связанную, по меньшей мере, с одним X-сперматозоидом, где каждая из указанных молекул нуклеиновых кислот, включает, по меньшей мере, один сегмент случайных нуклеотидных последовательностей; и (a2) контактирование второй коллекции различных молекул нуклеиновых кислот с молекулой-мишенью, которая содержится во втором образце Y-сперматозоидов, при условиях, благоприятных для связывания между указанными молекулами нуклеиновых кислот и указанными Y-сперматозоидами, с образованием, по меньшей мере, одного комплекса, включающего, по меньшей мере, одну молекулу нуклеиновой кислоты, связанную, по меньшей мере, с одним Y-сперматозоидом, где каждая из указанных молекул нуклеиновых кислот, включает, по меньшей мере, один сегмент случайных нуклеотидных последовательностей; где, таким образом, с помощью стадии отделения (b) и стадии извлечения (c) получают аптамеры для X-сперматозоидов и аптамеры для Y-сперматозоидов. Аптамеры, извлеченные таким способом, представляют собой аптамеры, которые связываются с X-сперматозоидами, и аптамеры, которые связываются с Y-сперматозоидами.
Способ получения спермоспецифичных аптамеров дополнительно включает перед стадией (a) проведение, по меньшей мере, 1 раунда контактирования молекул нуклеиновых кислот с популяцией несортированных клеток, включающих оба типа сперматозоидов млекопитающего: X-сперматозоиды и Y-сперматозоиды. Также стадия отделения (b) дополнительно включает стадию отделения сперматозоидов, связанных с аптамером, от аптамера, и стадия извлечения (c) дополнительно включает извлечение отделенных сперматозоидов. Сперматозоиды млекопитающего предпочтительно представляют собой сперматозоиды крупного рогатого скота или сперматозоиды человека.
В одном воплощении изобретения, раунды селекции несортированного аптамера могут осуществляться перед раундами селекции сортированных X- и Y-сперматозоид/аптамер. Например, может осуществляться 1-5 раундов селекции несортированного аптамера. Изобретение включает способы, включающие 3 раунда селекции несортированного аптамера перед раундами селекции сортированного аптамера. Способ по п.1 дополнительно включает инкубацию коллекции различных молекул нуклеиновых кислот и молекулы-мишени с праймером, который, по существу, коплементарен матричной последовательности нуклеиновой кислоты.
В альтернативном и предпочтительном воплощении, в изобретении предлагается способ получения аптамера, который позволяет отделение X-сперматозоидов от Y-сперматозоидов. Получают первый образец X-сперматозоидов и получают второй образец Y-сперматозоидов. Получают первую группу аптамеров, которые связываются с X-сперматозоидами в первом образце, и вторую группу аптамеров, которые связываются с Y-сперматозоидами, во втором образце. Первую и вторую группы аптамеров сравнивают для идентификации методом исключения, по меньшей мере, одного аптамера, который связывается или с X-сперматозоидами, или с Y-сперматозоидами. Как правило, идентифицируют несколько различных аптамеров, которые связываются с любым типом клеток.
Предпочтительно, первый и второй образцы сперматозоидов млекопитающего, которые содержат или Y-сперматозоиды, или X-сперматозоиды, получают с помощью проточной цитометрии и методов сортировки клеток, которые известны специалисту в данной области. Такие методы описаны в патенте США № 5135759, от 4.08.1992. Как правило, проточный цитометр измеряет количество флуоресцентного света, испускаемого в момент, когда сперма, предварительно обработанная с помощью флуоресцентного красителя, проходит через лазерный луч. Краситель связывается с ДНК. Так как X-хромосома содержит больше ДНК, чем Y-хромосома, «женская» (X) сперма принимает больше красителя и испускает больше флуоресцентного света, чем «мужская» (Y) сперма. Для детекции небольших различий в ДНК между X- и Y-спермой, сперма проходит один раз через лазерный луч, с помощью которого измеряют содержание ДНК индивидуальной спермы. Это позволяет разделение индивидуальных X- и Y-сперматозоидов с помощью сортера клеток. Сортированные X- и Y-сперматозоиды могут быть получены из коммерческих источников, где их сортировку проводят с использованием подобных методов сортировки клеток.
Предпочтительно, аптамеры получают с помощью способа, включающего стадии: (a) контактирования первой коллекции различных молекул нуклеиновых кислот с первым образцом Y-сперматозоидов при условиях, благоприятных для связывания между молекулами нуклеиновых кислот, и Y-сперматозоидами с образованием, по меньшей мере, одного комплекса, включающего, по меньшей мере, одну молекулу нуклеиновой кислоты, связанную, по меньшей мере, с одним сперматозоидом, несущим Y-хромосому, где каждая из молекул нуклеиновых кислот включает, по меньшей мере, один сегмент случайных нуклеотидных последовательностей; (b) контактирования второй коллекции различных молекул нуклеиновых кислот со вторым образцом X-сперматозоидов при условиях, благоприятных для связывания между молекулами нуклеиновых кислот и X-сперматозоидами, с образованием, по меньшей мере, одного комплекса, включающего, по меньшей мере, одну молекулу нуклеиновой кислоты, связанную, по меньшей мере, с одним X-сперматозоидом, где каждая из молекул нуклеиновых кислот включает, по меньшей мере, один сегмент случайных нуклеотидных последовательностей; (c) отделения комплекса от несвязанных молекул нуклеиновых кислот и не связанных молекул-мишеней; и (d) извлечения связанных молекул нуклеиновых кислот из комплексов, с получением, таким образом, аптамеров для Y-сперматозоидов и аптамеров для X-сперматозоидов.
В предпочтительном воплощении, аптамеры тестируют и подтверждают с помощью их контактирования с образцом сперматозоидов, содержащих X-сперматозоиды и Y-сперматозоиды, разделяя сперматозоиды с помощью проточной цитометрии и сортировки клеток, и определяя, что предположительный X-связывающий аптамер связывается с X-сперматозоидом, и предположительный Y-связывающий аптамер связывается с Y-сперматозоидом. Как правило, аптамеры являются меченными, например, с помощью флуоресцентного компонента, для возможности подходящей идентификации.
При получении аптамеров по изобретению могут использоваться различные определенные методы, известные специалисту в данной области. Один такой метод представляет собой способ MonoLex от AptaRes, Luckenwalde, Germany. Способ включает стадии: (1) синтеза библиотеки олигонуклеотидов с участками случайной последовательности; (2) аффинной адсорбции олигонуклеотидов на мишень; (3) аффинной сортировки олигонуклеотидов на аффинной смоле; (4) разделения олигонуклеотидов с различным уровнем аффинности на многочисленные пулы, включающие множество аптамеров на пул; (5) амплификации отделенных нуклеотидных пулов (из которых получают поликлональные аптамеры); и (6) идентификации индивидуальных олигонуклеотидов (из которых получают моноклональные аптамеры) с помощью клонирования и секвенирования.
Другой метод известен как способ SELEX (Систематическая Эволюция Лигандов с помощью Экспоненциального обогащения). Способ SELEX и его варианты описаны в патентах США № 5861254; 6261774 B1; 6376190 B1; 6506887 B1; 6706482 B2 и 6730482 B2. Этот способ включает стадии: (1) контактирования смеси нуклеиновых кислот, предпочтительно включающих сегменты случайных последовательностей, с мишенью при условиях, благоприятных для связывания; (2) отделения несвязанных нуклеиновых кислот от нуклеиновых кислот, которые специфично связаны с молекулами-мишенями; (3) разделения комплексов нуклеиновой кислоты-мишени; (4) амплификации нуклеиновых кислот, отделенных от комплексов нуклеиновой кислоты-мишени с получением смеси нуклеиновых кислот, обогащенной лигандом; и (5) повторения предыдущих стадий столько раз, сколько целесообразно или необходимо для получения высокоспецифичных, высокоаффинных аптамеров для молекулы-мишени.
Родственный способ представляет собой способ CE-SELEX (капиллярный электрофорез-SELEX), как описано в публикации J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 20-21. В этом методе используется электрофорез для отделения связанных последовательностей от неактивных последовательностей. Селекцию проводят в свободном растворе. Активные последовательности, которые связываются с мишенью, подвергают анализу по сдвигу пятна, подобно тому, что можно наблюдать в аффинном капиллярном электрофорезе. Активные последовательности отделяют от неактивных последовательностей и собирают в виде отдельных фракций.
Предпочтительный метод идентификации и выделения аптамеров представляет собой способ NECEEM (Неравновесный Капиллярный электрофорез Равновесных Смесей), как описано в публикациях J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 13674-13675, Anal. Chem. 2003, 75, 1382-1386, Krylov, "NECEEM for Development, Characterization and Analytical Utilization of Aptamers," Lab Plus International, November 2005 и Krylov, "Nonequilibrium Capillary Electrophoresis of Equilibrium Mixtures (NECEEM): A Novel Method for Biological Screening," J. Biomol. Screen Online First, January 17, 2006.
Вкратце, этот метод начинается с использования библиотеки интактной ДНК (каждая последовательность является статистически уникальной), которую смешивают с белком-мишенью и инкубируют до образования равновесной смеси. Молекулы ДНК, имеющие высокую аффинность, связываются с белком-мишенью, в то время как молекулы ДНК, имеющие низкую аффинность, не связываются. Пробку равновесной смеси затем вводят в капилляр и применяют высокое напряжение. Равновесную фракцию ДНК-мишени отделяют от равновесной фракции ДНК с помощью капиллярного электрофореза в отсутствии геля при неравновесных условиях. При этих условиях подвижность мишени выше, чем у ДНК, и подвижность комплекса мишени-ДНК обычно является промежуточной между подвижностью ДНК и мишени. В электрическом поле, таким образом, происходит разделение зон, и равновесие между тремя компонентами более не поддерживается. Комплекс ДНК-мишени начинает разделяться, что приводит в результате к получению "пятен" ДНК и мишени между тремя пиками. Благодаря высокой эффективности разделения, повторное соединение разделенных ДНК и мишени является незначительным.
Компоненты достигают конца капилляра в следующем порядке: (1) равновесная часть свободной мишени; (2) свободная мишень, образованная при разделении комплекса ДНК-мишени во время NECEEM; (3) остаток интактного комплекса ДНК-мишени; (4) свободная ДНК, образованная при разделении комплекса ДНК-мишени во время NECEEM; и (5) равновесная часть свободной ДНК. Фракцию собирают на выходе из капилляра в течение временного интервала. Наиболее широкий интервал коллекции аптамеров включает комплексы ДНК-мишени и ДНК, отделенную от комплексов ДНК-мишени во время NECEEM.
Предпочтительные мишени представляют собой (пептиды и белки) на сперматозоидах, которые определяются полом, или иначе дают возможность идентификации или разделения спермы на основе селекции пола или других целевых характеристик. Примеры таких полипептидов описаны в патентах США №№ 4191749; 4448767; 5021244; 6153373; и 6489092 и в патентной заявке США 2003/0162238 Al. Например, в опубликованной патентной заявке описан выделенный белок, специфичный для определенного пола и хромосомы, который характеризуется следующим образом: (a) специфичностью для X-хромосомы, (b) ассоциацией с клеточной мембраной сперматозоидов быка, и (c) молекулярной массой, составляющей примерно 32 кДа, определенной с помощью SDS-PAGE.
Выбранные подходящие аптамеры могут быть многократно получены с помощью множества методов, хорошо известных специалисту в данной области, включающих ферментативные методы или методы химического синтеза. Могут быть добавлены дополнительные химические группы посредством известных химических методов. Такие группы включают флуоресцеин или биотин и другие группы, которые создают детектируемый сигнал. Кроме того, для защиты аптамеров от деградации нуклеазами могут использоваться модифицированные нуклеотиды. Такие модифицированные нуклеотиды включают 2'-О-метил- и 2'-фтор-производные.
В некоторых воплощениях, аптамеры, селектированные и/или полученные, как описано выше, применяются в анализе разделения популяций сперматозоидов на основе того, несут они X- или Y-хромосому, аномального количества половых хромосом или других целевых характеристик сперматозоидов. В предпочтительном воплощении, способ разделения сперматозоидов млекопитающего включает стадии: 1) контактирования сперматозоидов млекопитающего с аптамером по изобретению и 2) разделение сперматозоидов на две или более популяций на основе способности сперматозоидов связываться с аптамером. В одном воплощении, способ включает дополнительную стадию отделения сперматозоидов, связанных с аптамером, от аптамера и извлечения отделенных сперматозоидов. В другом воплощении, извлекаются сперматозоиды, которые не связаны с аптамером.
В альтернативном воплощении, может применяться более чем один тип аптамера. Таким образом, два или более аптамеров по изобретению могут применяться в способе разделения, и эти аптамеры могут содержать консенсусные последовательности, которые связываются с одной и той же молекулой-мишенью. Аптамеры, полученные с помощью настоящего способа, применяются для связывания с молекулами-мишенями на сперматозоидах обоих типов - X-сперматозоидах и Y-сперматозоидах.
С помощью этого способа получают популяции сперматозоидов, селектированных и разделенных на основе определенных целевых характеристик клеток. Разделенные популяции могут быть связанными или не связанными с аптамером. Если целевая популяция является связанной с аптамером, предпочтительно, сперматозоиды отделяют от молекул аптамеров. Предпочтительно, сперматозоиды представляют собой сперматозоиды крупного рогатого скота. В одном предпочтительном воплощении, сперматозоиды содержат Y-хромосому. В альтернативном предпочтительном воплощении, сперматозоиды содержат только X-хромосому.
В следующем воплощении, в изобретении предлагается способ получения аптамера или последовательности нуклеиновой кислоты, которая позволяет отделение X-сперматозоидов от Y-сперматозоидов. Этот полученный аптамер контактирует со смешанной популяцией X- и Y-сперматозоидов, и аптамер предпочтительно связывается с X-сперматозоидами, и эти комплексы аптамеров, связанных с X-сперматозоидами, отделяются от исходной смешанной популяции сперматозоидов, покидая обогащенную популяцию Y-сперматозоидов. Комплекс аптамера, связанного со сперматозоидом, содержащим X-хромосому, может быть подвергнут обработке для высвобождения сперматозоидов, содержащих Х-хромосому так, чтобы они были выделены в виде популяции клеток.
Способ разделения сперматозоидов с использованием аптамеров может применяться следующим образом. На коммерчески доступные микроскопически малые магнитные частицы наносят покрытие в виде подходящего аптамера по изобретению, такого как аптамер, специфичный для X-сперматозоидов. Эти частицы помещают в суспензию сперматозоидов в подходящем приемнике, таком как стеклянная пробирка. Так как белки, специфичные для половых хромосом, присутствуют на клеточной поверхности, то X-сперматозоиды будут затем связываться с аптамером на частицах, специфичным/предпочтительным для X-сперматозоидов, в то время как Y-сперматозоиды не будут связываться или будут связываться менее предпочтительно. Частицы затем собирают в пул на боковую часть пробирки с использованием магнита. Затем извлекают сперматозоиды, обладающие Y-хромосомой. Могут также использоваться другие типы частиц для захвата и извлечения аптамеров. Дополнительные методы, использующие частицы с нанесенным покрытием в виде веществ, которые связываются со сперматозоидами, описаны в патентных заявках США № 2003/0068654 Al, 2004/0142384 Al и 2005/0114915 Al.
В другом примере, может использоваться агглютинация сперматозоидов. В таком способе живая несортированная сперма может быть суспендирована в бессывороточной культуральной in vitro-среде и подвергнута воздействию аптамеров, специфичных/предпочтительных или для Y-сперматозоидов или для X-сперматозоидов. После обработки, среду фильтруют на стекловатном фильтре, и сперму в фильтрате используют для осуществления in vitro-оплодотворения.
В другом примере, аптамеры против поверхностных белков, специфичных для X- или Y-сперматозоидов, могут связываться с X- или Y-сперматозоидами и инактивировать X- или Y-сперматозоиды, соответственно, и могут предотвращать оплодотворение ими яйцеклетки. Сперматозоиды, не связанные с помощью аптамеров, могут оставаться живыми и активными для оплодотворения яйцеклетки. Таким образом, в изобретении предлагается способ получения образца спермы, обогащенной активными X- или Y-сперматозоидами, и, таким образом, способной к увеличению возможности того, чтобы потомство имело целевой пол или несло ген, связанный с признаком половой принадлежности.
В другом примере, препарат нативной спермы может быть подвергнут воздействию первого аптамера, который связывается, например, с Y-специфичными молекулами. Подвергнутая воздействию сперма может быть суспендирована вместе с конъюгатом второго аптамера, который связывается с первым аптамером и иммуноабсорбирующим субстратом в свободном от белка разбавителе, с образованием препарата конъюгата/спермы, посредством чего Y-сперматозоиды связываются с субстратом. Y-сперматозоиды могут быть затем извлечены из субстрата с помощью специфичного связывания субстрата.
В способах, описанных здесь, предлагаются средства для разделения спермы по факторам качества и целесообразности, включающим подвижность сперматозоидов, функциональность, стимуляцию и консервацию, которые могут оказывать влияние на показатели фертильности, показатели оплодотворения, показатели фертилизации, здоровья потомства и показатели появления целевого потомства для различных видов млекопитающих, включающих, но не ограниченных ими, людей, лошадей, крупный рогатый скот, свиней, кошек, собак, буйволов, быков и лосей.
Способы разделения спермы на основе целевых характеристик, описанные здесь, минимизируют повреждение спермы механической обработкой так, что сперма обладает улучшенной выживаемостью. Способы являются неинвазивными, не требуют химического связывания с внутренними клеточными структурами, включают минимум манипуляций и являются недорогими. Требуется минимум оборудования или инструментов, и способы легко осуществляются специалистом в данной области.
Аптамеры, полученные с помощью настоящего способа, и способы по настоящему изобретению также могут использоваться для оценки других характеристик спермы. Например, они могут использоваться для определения качества спермы, определения фертильности самки, идентификации здоровой спермы или идентификации аномальной или поврежденной спермы.
Разделенные сперматозоиды по изобретению предпочтительно применяются для искусственного оплодотворения млекопитающего. Предпочтительно, млекопитающее представляет собой крупный рогатый скот. Способ для искусственного оплодотворения включает введение спермы млекопитающему с использованием методов, известных специалисту в данной области.
Изобретение дополнительно включает набор реагентов для искусственного оплодотворения млекопитающего. Набор реагентов содержит, по меньшей мере, отделенную популяцию сперматозоидов по изобретению и необязательно содержит другие компоненты или устройства для введения популяции сперматозоидов млекопитающему. Предпочтительно, набор реагентов содержит индивидуальный образец сперматозоидов в пробирке для введения во влагалище самки животного. Такая пробирка с образцом известна из области техники как пробирка «straw».
Альтернативно, отделенная сперма по изобретению может применяться для in vitro-оплодотворения млекопитающего. Предпочтительно, млекопитающим является человек.
ПРИМЕРЫ
Способ селекции аптамеров для спермы
В предпочтительном способе селекции специфичных аптамеров согласно настоящему изобретению применяется способ, в котором используется несколько раундов инкубации несортированных, сортированных X- и/или сортированных Y-сперматозоидов с ДНК-библиотекой с конечной стадией сбора раствора, содержащего ДНК-связывающие вещества, и который используется в качестве матрицы для ПЦР и для разделения цепей на стрептавидиновых частицах. Заявители определили, что согласно настоящему изобретению оптимальным является применение более чем 6 раундов селекции аптамера для спермы. Предпочтительно, осуществляют 7 раундов, более предпочтительно, 8 раундов, и еще более предпочтительно, 9 раундов селекции, как описано ниже. Однако если необходимо для получения аптамеров, которые связываются со специфичной молекулой-мишенью, то может осуществляться более чем 9 раундов селекции. Следует понимать, что протокол, описанный ниже, может варьироваться в зависимости от температуры, объема и других параметров, которые не оказывают влияния на результат протокола, но приводят в результате к получению специфичных аптамеров, которые связываются с молекулами-мишенями. Такие вариации известны специалисту в данной области.
Раунды 1-3 селекции аптамеров
Получение клеток
:
Размораживают аликвоту спермы путем помещения пробирки в воду с температурой 37°C на 1 мин, и затем поддерживают клетки при комнатной температуре (20-25°C)(RT).
7
1. Берут 1 пробирку несортированных сперматозоидов (примерно 0,5 мл и 10 клеток).
2. Добавляют 1 мл буфера для спермы, содержащего PVA (поливиниловый спирт).
3. Центрифугируют сперматозоиды в течение 12 мин при 300×g при 17°C в пробирке объемом 1,5 мл.
4. Удаляют буфер и ресуспендируют клетки в 1 мл свежего буфера для спермы, содержащего PVA.
5. Центрифугируют сперматозоиды в течение 12 мин при 300×g при 17°C в пробирках объемом 1,5 мл.
6
6. Ресуспендируют сперматозоиды в 300 мкл свежего буфера для спермы, содержащего PVA, и считают клетки с использованием гемоцитометра. Разводят клетки до концентрации ~ 2×10 клеток/мл (40000 клеток на 20 мкл) путем добавления 600 мкл буфера.
2
7. Проводят отжиг 50 мкМ библиотеки интактной ДНК (обычно заказываемые из фирмы Integrated DNA Technologyies (IDT), Coralville, IA) вместе с ДНК следующей последовательности: 5'- CTC CTC TGA CTG TAA CCA CG (SEQ ID NO:1) -(40N)- GGC TTC TGG ACT ACC TAT GC (SEQ ID NO:2)-3', растворенной в PBS (фосфатно-солевой буфер) в присутствии 2,5 мМ MgCl путем нагревания до 94°C в течение ~3 мин, и затем охлаждения до комнатной температуры.
8. Добавляют 2 мкл 1 мМ F-праймера (прямой праймер, обычно заказываемый из фирмы IDT и имеющий следующую последовательность 5'-CTC CTC TGA CTG TAA CCA CG-3') (SEQ ID NO:1) к аликвотам клеток объемом 40 мкл до конечной концентрации 50 мкМ. F-праймер представляет собой первые 20 нуклеотидов библиотеки. Он используется при селекции в качестве фоновой ДНК. Эта последовательность выбирается для уменьшения вероятности того, чтобы, по меньшей мере, один из константных участков библиотеки не участвовал в связывании, и при ее удалении получаются более короткие последовательности аптамеров, но без изменения свойств связывания.
9. Добавляют 4 мкл из 100 мкМ отожженной библиотеки к аликвотам, содержащим сперматозоиды, объемом 20 мкл вместе с 50 мкМ F-праймера.
10. Инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре.
11. Добавляют 200 мкл свежего буфера для спермы, содержащего PVA, и центрифугируют в течение 12 мин при 300×g при 17°C.
12. Удаляют супернатант и повторно растворяют осадок в дополнительном объеме 200 мкл свежего буфера для спермы, содержащего PVA.
13. Центрифугируют в течение 12 мин при 300×g при 17°C.
14. Удаляют супернатант и повторно растворяют осадок в дополнительном объеме 200 мкл свежего буфера для спермы, содержащего PVA.
15. Центрифугируют в течение 12 мин при 300×g при 17°C.
16. Удаляют супернатант и добавляют 20 мкл 10 мМ буфера Tris-HCl, pH 7,5 и инкубируют клетки при 95°C в течение 5 мин.
17. Осаждают центрифугированием клеточный дебрис в течение 20 мин при 20000 об/мин.
18. Собирают супернатант и используют его в качестве матрицы для ПЦР с использованием F-праймера и биотинилированного R-праймера (обратный праймер, обычно заказываемый из фирмы IDT, и имеющий следующую последовательность: 5'-биотин-GGC TTC TGG ACT ACC TAT GC-3') (SEQ ID NO:2) и осуществляют разделение цепей на стрептавидиновых магнитных частицах.
Завершение стадий 1-18, описанных выше, представляет собой завершение одного раунда. Предполагается, что супернатант из стадии 18 представляет собой пул аптамеров Раунда 1 (R1) и используется непосредственно или амплифицируется с использованием известных методов ПЦР. Для Раунда 2 (R2) пул аптамеров R1 используют вместо библиотеки интактной ДНК в стадии 7 на новом образце несортированных клеток, которые получают согласно стадиям 1-6. Супернатант или пул аптамеров Раунда 2 (R2) из стадии 18 завершенного Раунда 2 затем используют непосредственно или амплифицируют с использованием известных методов ПЦР и добавляют вместо библиотеки ДНК стадии 7 на новом образце несортированных клеток в Раунде 3 (R3). Супернатант из стадии 18 Раунда 3 или пул аптамеров Раунда 3 (R3) затем используют в стадии 7 Раунда 4, описанного ниже.
Раунды 4-11 (Позитивная и негативная селекции с помощью сортированных клеток)
Получение клеток
:
Размораживают аликвоты спермы (сортированные X-содержащие клетки или сортированные Y-содержащие клетки) путем помещения пробирки в воду с температурой 37°C на 1 мин и затем поддерживают клетки при комнатной температуре (20-25°C).
1. Берут 1 пробирку сортированных X-клеток и 1 пробирку сортированных Y-клеток.
2. К каждой пробирке затем добавляют 200 мкл свежего буфера для спермы, содержащего PVA, и центрифугируют в течение 12 мин при 300×g при 17°C, удаляют супернатант с уменьшением объема примерно на 10 мкл, добавляют 200 мкл свежего буфера для спермы, содержащего PVA, и переносят все в ПЦР-пробирку объемом 200 мкл.
3. Центрифугируют клетки в течение 12 мин при 300×g при 17°C в ПЦР-пробирках объемом 0,2 мл (пробирки с меньшим объемом улучшают извлечение клеток) и удаляют буфер с уменьшением объема примерно на 20 мкл.
4. В каждую пробирку добавляют 60 мкл свежего буфера для спермы, содержащего PVA, и делят содержимое на две пробирки по 30 мкл.
6
4
5. Клетки считают с использованием гемоцитометра. Должно быть примерно 2×10 клеток/мл (4×10 клеток на 20 мкл).
6. Примерно за 1-2 мин перед добавлением пула аптамеров R3 (см. стадию 18 Раунда 3 выше) к клеточной суспензии добавляют F-праймер до конечной концентрации 50 мкМ (добавляют 1 мкл 1 мМ раствора праймера к 20 мкл клеток).
7. Для негативной селекции делают следующие смеси:
A. Y-клетки вместе с 50 мкМ F4 и 5 нМ пула аптамеров для X-клеток из предыдущего раунда селекции (или только пул аптамеров R3, если это четвертый раунд селекции).
B. X-клетки вместе с 50 мкМ F4 и 5 нМ пула аптамеров для Y-клеток из предыдущего раунда селекции (или только пул аптамеров R3, если это четвертый раунд селекции). Смеси инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа, и осаждают клетки центрифугированием (300×g, 17°C 12 мин). Берут супернатант и используют его для положительной селекции. В каждую из аликвот X- и Y-клеток добавляют F-праймер до конечной концентрации 50 мкМ и равное количество супернатанта из предыдущей стадии.
C. К X-клеткам добавляют супернатант из фракции 1 с получением 2,5 нМ пула аптамеров для X-клеток и 50 мкМ F4.
D. К Y-клеткам добавляют супернатант из фракции 2 с получением 2,5 нМ пула аптамеров для Y-клеток, и 50 мкМ F4.
8. Инкубируют смеси при комнатной температуре в течение 1 часа.
9. Добавляют 200 мкл свежего буфера для спермы, содержащего PVA, и центрифугируют в течение 12 мин при 300×g при 17°C.
10. Удаляют супернатант и повторно растворяют осадок в дополнительном объеме 200 мкл свежего буфера для спермы, содержащего PVA.
11. Центрифугируют в течение 12 мин при 300×g при 17°C.
12. Удаляют супернатант и повторно растворяют осадок в дополнительном объеме 200 мкл свежего буфера для спермы, содержащего PVA.
13. Центрифугируют в течение 12 мин при 300×g при 17°C.
14. Удаляют супернатант и добавляют 20 мкл буфера и инкубируют клетки при 95°C в течение 5 мин.
15. Осаждают центрифугированием клеточный дебрис в течение 20 мин при 20000 об/мин.
16. Собирают супернатант и используют его в качестве матрицы для ПЦР и разделения цепей на стрептавидиновых магнитных частицах.
Раунд селекции аптамеров раундов 4-9 и следующих раундов включает стадии 1-16, указанных непосредственно перед этим. Пул аптамеров раунда 4 затем добавляют к стадии 7 следующего раунда, раунда 5, пул аптамеров раунда 5 затем добавляют к стадии 7 следующего раунда, раунда 6, пул аптамеров раунда 6 затем добавляют к стадии 7 следующего раунда, раунда 7, пул аптамеров раунда 7 затем добавляют к стадии 7 следующего раунда, раунда 8, пул аптамеров раунда 8 затем добавляют к стадии 7 следующего раунда, раунда 9, пул аптамеров раунда 9 затем добавляют к стадии 7 следующего раунда, и любые дополнительные раунды могут соответственно продолжать повторяться.
Целью этих раундов селекции аптамеров является получение пула аптамеров, которые специфично связываются с Y- или X-сперматозоидами. Таким образом, по меньшей мере, раунд 7 способа селекции следует проводить для получения аптамеров, которые специфично связываются с молекулой-мишенью, более предпочтительно, следует проводить, по меньшей мере, раунд 8, и наиболее предпочтительно, следует проводить, по меньшей мере, раунд 9 или более для получения пула аптамеров, которые специфично связываются с Y- или X-сперматозоидами.
Заявители представили на рассмотрение, что вышеописанный способ может применяться для получения специфичных к мишеням аптамеров любого типа, до тех пор, пока пул клеток, которые содержат молекулу мишень, которая идентифицирует клетку (несортированную или сортированную), будет замещаться в раундах селекции аптамеров для Y- и X-сперматозоидов, как несортированных, так и сортированных.
АНАЛИЗ С ПОМОЩЬЮ КЛЕТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ АПТАМЕРОВ, ПОЛУЧЕННЫХ СПОСОБОМ СЕЛЕКЦИИ АПТАМЕРОВ
Следующий способ осуществляют для получения меченных пулов ДНК и для получения достаточного количества ДНК для анализа, что может дополнительно сэкономить время и стоимость препарата. Известный метод ассиметричного ПЦР приводит в результате к получению одной из цепей ДНК. Для того чтобы определить, обладает ли пул аптамеров свойством приемлемого связывающего вещества, меченные аптамеры, полученные в результате применения метода ассиметричного ПЦР, смешивают со сперматозоидами и подвергают анализу проточной цитометрии. Библиотеку интактной ДНК используют в качестве контроля.
2
Получают следующую смесь, содержащую: 1 мкМ Alexa 647 (полученный из фирмы IDT в качестве заказанного праймера), меченный прямой праймер (5 '-Alexa 647-CTC CTC TGA CTG TAA CCA CG-3') (SEQ ID NO:1), 50 nM обратный праймер (5'-GGC TTC TGG ACT ACC TAT GC-3') (SEQ ID NO:2) 50 мМ KCl, 10 мМ Tris-HCl (pH 8,6), 2,5 мМ MgCl, 200 мкМ каждого дезоксирибонуклеотид трифосфата (dNTP), и 0,05 единиц/мкл Taq ДНК-полимеразы.
Проводят 20 циклов ПЦР, которые включают цикл ПЦР, состоящий из денатурации при 94°C в течение 10 секунд, отжига при 56°C в течение 10 секунд и элонгации при 72°C в течение10 секунд. Первый цикл содержит более продолжительную стадию денатурации в течение 30 секунд. В качестве матрицы используют пулы очищенных одноцепочечных аптамеров после каждого раунда селекции. После завершения ПЦР, продукты очищают с использованием колонки очистки ДНК с отделением продуктов с массой 30 кДа (Microcon ultracel YM-30, от Millipore Bedford MA, USA) с применением стандартной процедуры, описанной в руководстве и известной специалистам в данной области.
Получение клеток
:
Размораживают аликвоту спермы путем помещения пробирки в воду с температурой 37°C на 1 мин и затем поддерживают клетки при комнатной температуре (20-25°C).
7
Берут 1 или более пробирок несортированных клеток (примерно 0,5 мл и 10 клеток).
1. Добавляют 1 мл буфера для спермы, содержащего PVA.
2. Центрифугируют клетки в течение 12 мин при 300×g при 17°C в пробирке объемом 1,5 мл.
3. Удаляют буфер и ресуспендируют клетки в 1 мл свежего буфера для спермы, содержащего PVA.
4. Центрифугируют клетки в течение 12 мин при 300×g при 17°C в пробирке объемом 1,5 мл.
5. Ресуспендируют клетки в 300 мкл свежего буфера для спермы, содержащего PVA, и считают клетки с использованием гемоцитометра.
6
6. Разводят клетки до концентрации ~ 2×10 клеток/мл (20000-40000 клеток на 20 мкл); и
7. 200 мкл клеток + 10 мкл 1 мМ F4-праймера затем разделяют на аликвоты по 20 мкл каждая.
Параллельно:
1. Берут 1 или более пробирок сортированных X-клеток и 1 или более пробирок сортированных Y-клеток.
2. Центрифугируют в течение 12 мин при 300×g при 17°C, удаляют супернатант с уменьшением объема примерно на 10 мкл, добавляют 200 мкл свежего буфера для спермы, содержащего PVA, и переносят все в ПЦР-пробирку объемом 200 мкл.
3. Центрифугируют клетки в течение 12 мин при 300×g при 17°C в ПЦР-пробирках объемом 0,2 мл (пробирки с меньшим объемом улучшают извлечение клеток), и удаляют буфер с уменьшением объема примерно на 20 мкл.
4. В каждую пробирку добавляют 200 мкл свежего буфера для спермы, содержащего PVA.
6
4
5. Клетки считают с использованием гемоцитометра. Должно быть примерно 2×10 клеток/мл (4×10 клеток на 20 мкл).
6. Смешивают микс X-клеток вместе с 1 мМ F-праймера до конечной концентрации 50 мкМ и делают так много аликвот по 20 мкл, как этого требуется для анализа.
7. Смешивают микс Y-клеток вместе с 1 мМ F-праймера до конечной концентрации 50 мкМ и делают так много аликвот по 20 мкл, как этого требуется для анализа.
8. Смешивают несортированные клетки вместе с 1 мМ F-праймера до конечной концентрации 50 мкМ и делают так много аликвот по 20 мкл, как этого требуется для анализа.
2
9. Проводят отжиг очищенных библиотек ДНК и пулов, растворенных в PBS в присутствии 2,5 мМ MgCl (нагревают до 94°C в течение ~3 мин, затем охлаждают до комнатной температуры).
10. Добавляют подходящее количество пула аптамеров из раундов описанной выше селекции аптамеров, которое следует протестировать, к аликвоте 20 мкл, содержащей сперматозоиды, вместе с 50 мкМ F4 до конечной концентрации -10 нМ:
Делают следующие смеси: несортированные, сортированные X- и сортированные Y-клетки, каждые с библиотекой интактной ДНК и пулами из каждого раунда селекции.
11. Инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре.
12. Добавляют 200 мкл свежего буфера для спермы, содержащего PVA, и центрифугируют в течение 12 мин при 300×g при 17°C.
13. Удаляют супернатант и добавляют 200 мкл свежего буфера для спермы, содержащего PVA, и переносят все в пробирку для клеточной цитометрии, и
14. Добавляют PI (пропидиум иодид, краситель для нуклеиновой кислоты и маркер клеточной смерти, Sigma Aldrich) примерно за 2-3 мин перед анализом и дополнительно 200 мкл свежего буфера для спермы, содержащего PVA.
На фиг.1 представлен анализ аптамеров, полученных с помощью настоящего способа, в котором было проведено 9 раундов селекции аптамеров, и анализ с использованием проточной цитометрии. Каждая популяция живых сперматозоидов была представлена клетками в количестве от 8000 до 9000. Популяция живых клеток была дифференцирована от мертвых клеток с помощью красителя мертвых клеток, пропидиум иодида.
Сравнение связывания сортированных X-клеток с библиотекой интактной ДНК и с пулом аптамеров для X-клеток (фиг.1, дорожки C и D, соответственно), результаты демонстрируют, что пул аптамеров для X-клеток обладает в 10 раз большей аффинностью к X-клеткам, чем библиотека интактной ДНК. Эти данные демонстрируют, что из библиотеки с помощью способа селекции были получены аптамеры, специфичные к сперматозоидам. Затем, сравнение аффинности связывания пула аптамеров для X-клеток с сортированными X- и Y-клетками (фиг.1, дорожки D и B, соответственно) показывает, что аффинность аптамеров к X-клеткам примерно в 20 раз больше, чем к Y-клеткам. Все данные, описанные выше, вместе с тем фактом, что аффинность Y-клеток к библиотеке интактной ДНК и к пулу аптамеров для X-клеток (фиг.1, дорожки A и B, соответственно) являются относительно сходными, доказывают, что с помощью настоящего способа получают аптамеры, специфичные к X-клеткам, которые могут специфично связываться с X-клетками, и не обладают аффинностью к Y-клеткам или обладают очень незначительной аффинностью.
В отношении связывания Y-клеток с библиотекой интактной ДНК и с пулом аптамеров для Y-клеток, данные (не показано) демонстрируют, что Y-клетки связываются лучше с пулом аптамеров для Y-клеток, чем с библиотекой интактной ДНК, что является показательным для аптамеров, специфичных для Y-клеток.
После проведения шести раундов селекции, проводят анализ связывания, и пул аптамеров для X-клеток демонстрирует высокую аффинность связывания с X-клетками и низкую аффинность связывания или ее отсутствие с Y-клетками (фиг.2A). Пул аптамеров для Y-клеток демонстрирует аффинность связывания с обоими типами клеток - X- и Y-клетками (фиг.2B). Связывание наблюдают с использованием флуоресцентно-меченной ДНК и флуоресцентной конфокальной микроскопии. Сигнал измеряют с использованием неподвижных клеток.
В общем, с помощью настоящего способа получают аптамеры, которые связываются с молекулами-мишенями, которые могут располагаться или не располагаться на поверхности клеток, но должны быть доступны на поверхности клеток, таких как, предпочтительно, X- или Y-сперматозоиды. С помощью анализа клеточной цитометрии, описанного здесь, предлагается осуществление способа для определения того, содержит ли пул аптамеров, полученных в результате одного раунда селекции аптамеров, как описано здесь, один или более аптамеров, которые связываются с молекулой-мишенью. Специалист может просмотреть данные и сравнить связывание пула аптамеров с образцом, содержащим молекулу-мишень. Эти данные связывания следует сравнить с данными любого связывания одного и того же пула аптамеров с библиотекой интактной ДНК, предпочтительно с библиотекой, из которой был впервые получен пул аптамеров, в качестве отрицательного контроля. Дополнительно, связывание пула аптамеров также следует сравнить со вторым или третьим образцом, который не содержит молекулы-мишени. Результаты, которые демонстрируют более высокую степень связывания пула аптамеров с молекулой-мишенью по сравнению со связыванием с библиотекой интактной ДНК, рассматриваются в качестве положительного предпочтительного связывания. Кроме того, дополнительные раунды селекции, как описано здесь, могут увеличить аффинность связывания пула аптамеров. Кроме того, если необходимо разделение двух популяций клеток на основе специфичного связывания с одним типом клеток, но не с другим, разделение, подобное разделению X- и Y-сперматозоидов, то затем в дополнение к сравнению связывания пула аптамеров с библиотекой интактной ДНК следует проанализировать его связывание с предпочтительной молекулой-мишенью, а также с образцом, содержащим молекулу "не мишень", от которой необходимо отделить молекулу-мишень. В этом последнем примере каждое из этих сравнений следует проанализировать для селекции пула аптамеров, которые связываются со специфичными молекулами-мишенями и не связываются или связываются с меньшей степенью или менее предпочтительно с клеткой или молекулой, от которой необходимо отделить молекулу-мишень. Таким образом, при использовании аптамеров для разделения различных популяций сперматозоидов требуется анализ и сравнение с различными контролями и отрицательными контролями.
В таблице 1 представлены аптамеры, полученные из пула аптамеров после раунда 9 согласно процедуре, представленной выше, которые предпочтительно связываются с X-сперматозоидами и которые не связываются или связываются менее предпочтительно с Y-сперматозоидами по сравнению с X-сперматозоидами. Аптамеры в Таблице 1 (SEQ ID NO:3-35) представляют собой участки нуклеотидов на 5'-конце и 3'-конце каждой последовательности, которая подчеркнута. Эти участки представляют собой константные участки аптамеров, которые соответствуют прямому праймеру CTC CTC TGA CTG TAA CCA CG (SEQ ID NO:1) на 5'-конце, и обратному праймеру, GGC TTC TGG ACT ACC TAT GC (SEQ ID NO:2) на 3'-конце, которые использовали для получения аптамеров из библиотеки интактной ДНК, NP40. Каждый из этих константных участков имеет длину из 20 нуклеотидов. Подразумевается, что аптамеры по настоящему изобретению охватывают по длине нуклеотидную последовательность каждой из последовательностей SEQ ID NO:3-35 или их участок. В следующем воплощении, аптамер по настоящему изобретению включает нуклеотиды 21-60 последовательностей SEQ ID NO:3-10 и 12-35 или их участок, или нуклеотиды 21-43 последовательности SEQ ID NO:11 или ее участок. Предполагается, что аптамер (SEQ ID NO:3-35) или участок приведенной последовательности представляет собой аптамер в рамках определения настоящего изобретения, который должен предпочтительно связываться с молекулой-мишенью на X- или Y-сперматозоиде с более высокой аффинностью, чем любые посторонние или контрольные клетки.
Последовательности ДНК в таблице 1 представляют собой селектированные последовательности, которые содержатся в пуле аптамеров раунда 9. Некоторые из последовательностей присутствуют в пуле аптамеров во множестве копий.
Если не определено иначе, все технические и научные термины, использованные здесь, имеют то же значение, что и общепринятые среди специалистов в данной области, к которой относится настоящее изобретение. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упомянутые здесь, полностью введены сюда с помощью ссылки. Использование здесь слов "a" или "an" для описания любого аспекта настоящего изобретения следует интерпретировать как обозначение для одного или более.
Хотя это изобретение описано по отношению к определенным предпочтительным воплощениям, и много подробных деталей представлено в целях иллюстрации, специалисту в данной области будет очевидно, что изобретение восприимчиво к дополнительным воплощениям, и что определенные из описанных здесь деталей могут варьироваться без существенного отклонения от основных принципов изобретения.