Способ получения фитопрепарата для повышения иммунитета при бактериальных инфекциях крупного рогатого скота
METHOD FOR OBTAINING A HERBAL FORMULATION TO INCREASE IMMUNITY IN BACTERIAL INFECTIONS OF CATTLE

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности ветеринарной фармакологии.
Известно приготовление иммуностимулирующих веществ на основе растительного сырья, например эхинацеи (Bauer R., Wagner Н. Echinacea species as potential immunostimulator drugs. In: Wagner H., Farnsworth N.R. (eds.), economic and Medicinal Plant Research. Vol. 5 New York: Akademic Press, 1991, p.p. 253-351) для профилактики иммунодефицита организма.
Известен способ получения препарата, включающий измельчение лекарственной травы: мелиссы лекарственной, зверобоя продырявленного, эхинацеи пурпурной и листьев крапивы двудомной, которую заливают 70% этиловым спиртом и настаивают (патент РФ №2147223, 2000 г. ), но используется в медицине, в стоматологии, для сокращения сроков лечения.
Наиболее близким техническим решением является способ приготовление водно-спиртовой настойки для повышения иммунобиологической реактивности и воспроизводительной функции у животных (патент РФ №2609869, кл. A61K 36/00, 2016 г.) которую готовят следующим образом: 2 части эхинацеи пурпурной, 1 часть корневища девясила и 1 часть цветков календулы лекарственной смешивают с 70 об. % этилового спирта, настаивают в течение 14-15 дней при температуре 36-37°С, а водный раствор серебра вводят в водно-спиртовую настойку в дозе не более 200 мл, что составляет не более 8 мг ионов серебра, со 100 мл кипяченой воды.
Недостатком прототипа является недостаточная эффективность профилактики иммунитета крупного рогатого скота.
Техническим результатом является повышение эффективности профилактики иммунитета крупного рогатого скота.
Технический результат достигается тем, что в способе получения фито препарата для повышения иммунитета при бактериальных инфекциях крупного рогатого скота, предусматривающем подготовку настойки на основе 70% этилового ректифицированного спирта и водного раствора серебра «Аргерита-40», сбор травы эхинацеи пурпурной, листьев и цветков зверобоя продырявленного, листьев крапивы двудомной и листьев и верхушечных по- бегов мелиссы, высушивание и измельчение высушенного сырья - стеблей и листьев до 3 мм, цветков до 5 мм, смешивание сырья в следующих массовых соотношениях: 2 части эхинацеи пурпурной, 1 часть зверобоя продырявленного - листьев и цветков по 0,5 частей, 0,5 частей листьев крапивы двудомной и 0,5 частей мелиссы - листьев и верхушечных побегов по 0,25 частей, добавление в 100 г смешенного сырья 500 мл 70% этилового спирта, перемешивание и затем добавление 200 мл «Аргерита-40», помещение получен- ной смеси в посуду из темного стекла, плотно ее закрыв, а затем термостат при температуре 36-37 градусов С на 14 дней, проводя периодичное перемешивание, процеживание через бумажный фильтр, предварительно отжав смесь, доведение полученной настойки до 30% концентрации дистиллированной водой с последующим перемешиванием и настаиванием в течение суток для лучшей диффузии.
1
2
Рабочее название фитопрепарата получаемого заявляемым способом «Каргмэз», который приготовлен из не дефицитного, экологически чистого сырья, экономически выгодный. Действующим началом фитопрепарата является оксикоричные кислоты (1,0-1,15%); флавоноиды (гиперицин - 0,6-0,7%, цинарозид, лютеолин); эфирные масла (0,1-1,2%) - азулен, цитраль, цитронеллаль, гераниол, линалоол, кофейная кислоты и ее эфиры: розмариновая, хлорогеновая кислоты; гликозиды (антоцианы 5-6%); рутин, кверцитрин, изокверцитрин; витамины, В, В, аскорбиновая кислота (135-150 мг%), каротиноиды (45-55%), РР, холин, дубильные вещества (1,8-2%),белковые вещества, следы алкалоидов, ионы серебра (Аргерит-40). Данные вещества играют большую роль в проявлении иммуномодулирующих свойств растения. Фитопрепарат «Каргмэз» нормализует факторы неспецифической резистентности, активность иммунокомпетентных клеток, стимулирует обменные процессы. !
Препарат обладает иммуномодулирующим, общеукрепляющим, секретолитическим, повышающим функцию половых желез, противовоспалительным, противомикробным, спазмолитическим, гипотензивным, кардиотоническим, антигипоксантным, гипертензивным, кардиотоничесим, мочегонным, кровоостанавливающим, седативным, бронхолитическим, анальгезирующим, вяжущим, репаративным, потогонным, ветрогонным, повышающим аппетит, желчегонным и десенсибилизирующим действием.
Компоненты используемые в фитопрепарате, характеризуются следующими свойствами:
- водной раствор серебра в качестве него используют «Аргерит-40» производителем, которого является ООО «Предприятие «Кубаньагроток» разработаны ТУ 9154-001-10073810-2002, «Концентрат гидратированного серебра химически чистый». «Аргерит-40» имеет широкий спектр действия, по внешнему виду представляет собой жидкость без цвета и запаха с кисловатым вкусом, обладает высокой микробицидной активностью вещества при концентрации ионов серебра от 0,001 мг/л, что значительно ниже допустимой санитарной нормы (0,01 г/л), против культур Candida albicans, Staphylococcus aureus 209-P, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Listeria monocytogenes. Устойчивые микробицидные свойства ионов серебра усиливаются его кислой реакцией;
- эхинацея пурпурная (Echinacea purpurea) в своем составе содержит вещество эхинацин, оксикоричные кислоты (1,0-1,15%), которые стимулируют организм на выработку своего собственного интерферона - важного белка, блокирующего деление РНК- и ДНК-содержащих вирусов. Стимулирует активность Т- и В-клеток являющихся важным посредником в иммунной системе организма. Стимулирует кору надпочечников, повышая обменные процессы, при этом не вызывает его истощения. Также обладает антибактериальным, антифунгицидным и антивирусным свойствами;
- зверобой продырявленный - Hypericum perforatum L., семейство зверобойных - Hyperiecaceae, в своем составе содержит дубильные (12-13%) вещества, флавоноиды: гиперозид (0,6-0,7%), рутин, кверцитрин, изокверцитрин; эфирное масло (0,1-1,2%), азулен, антоцианы (5-6%), каротин (50-55 мг%), гиперицин, РР, холин, аскорбиновая кислота (135-140 мг %), спирты, следы алкалоидов. Зверобой продырявленный обладает иммуномодулирующим, общеукрепляющим, повышающим функцию половых желез, противовоспалительным, противомикробным, сосудорасширяющим, спазмолитическим, гипертензивным, кардиотоничесим, мочегонным, кровоостанавливающим, бронхолитическим, аналгизирующим, вяжущим, репаративным, тонизирующим, желчегонным действием;
- крапива двудомная - Urtica dioica L., семейство крапивных - Urticaceae, листья содержит в своем составе дубильные (2%) и белковые вещества, муравьиную кислоту, гликозид уртицин, витамин К, аскорбиновую кислоту (0,6%), пантотеновую кислоту, каротиноиды (50 мг %), ситостерин, гистамин, виолаксантин, соли железа и воск. Крапива двудомная обладает противовоспалительным, антигипоксантным, кардиотоничесим, мочегонным, кровоостанавливающим, анальгезирующим, репаративным, потогонным, ветрогонным, повышающим аппетит, тонизирующим, желчегонным и десенсибилизирующим действием;
- мелисса лекарственная - Melissa officinalis семейство яснотковые - Lamiaceae, листья и верхушечные побеги мелисы во время цветения содержит в своем составе эфирные масла (0,33%) - цитраль, цитронеллаль, гераниол, линалоол, кофейная кислоты и ее эфиры: розмариновая, хлорогеновая кислоты; флавоноиды - цинарозид, лютеолин; каротин (7 мг/%), аскорбиновую кислоту (150 мг/%). Мелиса обладает противовоспалительным, противомикробным, спазмолитическим, гипотензивным, антигипоксантным, седативным, бронхолитическим, анальгезирующим, репаративным, потогонным, ветрогонным, повышающим аппетит.
Способ получения фитопрепарата для повышения иммунитета при бактериальных инфекциях крупного рогатого скота осуществляется следующим образом
Предварительно готовят настойку на основе 70 об. % этилового ректифицированного спирта, водного раствора серебра («Аргерита-40»), сбора травы эхинацеи пурпурной, листья и цветки зверобоя продырявленного, листья крапивы двудомной, листьев и верхушечных побегов мелисы, сырье закупали на предприятии северокавказского ЗОС ВИЛАР. Высушенное сырье стебли и листья измельчают до 3 мм, цветки - до 5 мм и смешивают в следующих массовых соотношениях: 2 части эхинацеи пурпурной, 1 часть зверобоя продырявленного - листьев и цветков по 0,5 частей, листьев крапивы двудомной - 0,5 частей, 0,5 частей мелисы - листьев и верхушечных побегов по 0,25 частей.
Технологический процесс получения фитопрепарата состоит из следующих стадий: смешивание сбора эхинацеи пурпурной, листья и цветки зверобоя продырявленного, листья крапивы двудомной, листьев и верхушечных побегов мелисы с 70 об. % этиловым ректифицированным спиртом в соотношении 1:5 и 200 мл водного раствора серебра, что составляет 0,8 мг ионов серебра «Аргерит-40» на 100 мл воды. Для этого брали 1 часть сырья (100 г.), добавляли 5 частей 70 об. % этилового спирта (500 мл.) (т.е. в разведении 1:5), перемешивали, затем добавляли 200 мл «Аргерит-40», помещали в посуду из темного стекла, плотно закрывали и ставили в термостат при температуре 36-37°С на 14 дней на 14 дней, периодически перемешивали. Затем процеживали через бумажный фильтр, предварительно хорошо отжав сырье. Полученную настойку доводили до 30% концентрации дистиллированной водой, после чего перемешивали, настаивали в течение суток для лучшей диффузии.
В процессе длительного хранения (в течение трех лет) препарат не изменял свои свойства (таблица 1).
По внешнему виду фитопрепарат «Каргмэз» представляет собой жидкость темно-коричневого цвета со специфическим травяным запахом и вкусом.
Полученный фитопрепарат исследовали на токсикологические свойства, острую и субхроническую токсичности, аллергизирующее, раздражающее и кожно-резорбтивное действия, а также были проведены гематологические исследования и функциональные пробы. В качестве подопытных животных были использованы лабораторные животные и коровы.
При пероральном введении белым мышам препарата «Каргмэз» в тест-дозе 0,15 мл/кг случаев токсикоза или побочного действия не наблюдали. Полученные результаты позволили сделать заключение о стабильности и безвредности препарата при длительном хранении (таблица 1).
Токсикологические свойства фитопрепарата. Фармакотоксикологическую оценку фитопрепарата «Каргмэз» осуществляли на лабораторных животных (мышах, крысах) на основании изучения их острой и хронической токсичности; влияния на рост и развитие, а также на гематологические, биохимические и иммунологические показатели.
Определение острой токсичности проводили на 25 белых мышах (масса 19-20 г) и 25 белых крысах (масса 160-180 г). Опытным группам фитопрепарат вводили внутрижелудочно с помощью атравматического зонда с тупым наконечником в максимальном объеме для белых мышей 0,5 мл, белых крыс - 3 мл. Контрольным аналогам в тех же дозировках вводили физиологический раствор. После введения препарата в течение 14-и дней за животными осуществляли наблюдение. При этом у лабораторных животных отмечали общее состояние организма, аппетит, подвижность, поведенческие реакции.
50
100
У белых мышей и белых крыс через 3-5 минут после перорального введения препарата максимально возможном в объеме наблюдали развитие релаксации и глубокого сна (продолжительностью 1,5-2 ч) без летального исхода. Данное действие мы связывали с влиянием алкоголя входящего в состав препарата. Развитие побочных эффектов (парезы, параличи, угнетение) у животных отмечено не было. В связи с отсутствием гибели животных после введения максимального возможного объема препарата их LD и LD не установлена, что позволяет отнести препараты к разряду малотоксичных.
50
Таким образом, данные токсикометрии, а также наблюдения за лабораторными животными на протяжении 14-ти суток в постинтоксикационном периоде острого отравления, позволяет отнести препарат каргмэз по ГОСТу 12.1.007-76 «Вредные вещества» к четвертому классу опасности - вещества малотоксичные, для которых диапазон доз LD при внутрижелудочном введении в опытах составляет 5000 мг/кг.
Субхроническую токсичность изучали на белых беспородных крысах со средней массой тела 170,30±4,83 г., для чего было сформировано 4 группы животных в количестве 25 в каждой. Препарат «Каргмэз» вводили животным 1, 2 и 3 опытным группам. Животным первой опытной группе препарат вводили в количестве 1/10 дозы от максимально введенной при установлении острой токсичности (0,3 мл на одно животное); второй опытной группе - 1/20 дозы от введенной при установлении острой токсичности (0,15 мл на одно животное); третьей опытной группе - 1/50 дозы от введенной при установлении острой токсичности (0,06 мл на одно животное). Животным четвертой группы (контрольной группы) в максимальной дозировке (1/10) вводили физиологический раствор в количестве 0,3 мл на одно животное. Препарат животным вводили с помощью пипетки в разведенном состоянии до объема 1 мл в течение 30 дней.
Установлено, что длительное принудительное введение изучаемых препарата не привело к возникновению и развитию признаков токсикоза у всех подопытных крыс. На основании полученных результатов установлено, что препарат каргмэз не обладает токсическими свойствами.
Аллергизирующее действие препарата «Каргмэз» изучали на морских свинках методом накожных аппликаций, и на кроликах - методом конъюнктивальной пробы.
Методом эпикутаных аппликаций на морских свинках применяли провокационные кожные пробы. Предварительно проводили сенсибилизацию животных путем многократного нанесения на кожу фитопрепарата «Каргмэз». С левой задней трети спины на выстриженный участок кожи для каждого препарата трем морским свинкам ежедневно наносили водный раствор препарата в разведениях 1:10, 1:100, 1:1000. Затем с правой стороны выстригали такой же участок и наносили по 0,1 мл раствора препарата в 1, 3, 5, 7 день, экспозицией 4 часа, после чего препарат удаляли. По окончании инкубационного периода, на 14 день на свежевыстриженный участок кожи наносили разрешающую дозу препарата «Каргмэз» (0,3 мл). На протяжении всего периода проводили наблюдение за опытными животными: термометрию тела, измерение толщины кожной складки на месте эпикутирования, определяли температуру на месте введения испытуемых препаратов.
Изменений общего состояния животных и на месте аппликации препаратов не было выявлено как в период эксперимента, так и после его отмены. У морских свинок оставалась неизменной упругость кожи, эластичность и подвижность. Отсутствовала болевая реакция при пальпации места аппликации, отек кожи, трещины, корочки и геморрагии. На основании полученных результатов ответную реакцию оценивали как отрицательную.
Затем изучали раздражающее действие фитопрепарата «Каргмэз», для этого брали трем кроликам и во внутренний угол конъюнктивального мешка правого глаза вносили по 1-1,5 капли 30%-ного раствора препарата, придавливая слезно-носовой канал у внутреннего угла глаза. Для контроля в левый глаз этим же опытным животным вносилось по одной капле физиологического раствора.
Результаты исследования учитывали через 5 минут, 24 и 48 часов, обращали внимание на общее состояние слизистой оболочки глаза и век, наличие инъекции сосудов склеры и роговицы, секрецию слезы.
Изучение местно-раздражающего действия препарата «каргмэз» на слизистую глаза кроликов показало, что влияние на слизистые оболочки глаз выражалось незначительной гиперемией конъюнктивы, слезотечением, которое проходило в течение 3-5 минут. Изъязвления конъюнктивы, рубцовых изменений век, помутнения роговицы не регистрировали. При последующих наблюдениях негативного воздействия препаратов на слизистые оболочки глаз (гиперемия конъюнктивы, слезотечение и сужение зрачка) не наблюдалось.
Кожно-резорбтивное действие препарата «Каргмэз» изучали на белых крысах методом погружения хвоста. В специальном станке было зафиксировано 10 опытных животных так, чтобы хвосты были помещены на 2/3 длины, всей пробирки, содержащей 70%-ный водный раствор фитопрепарата «Каргмэз».
Учет реакции кожно-резорбтивного действия препарата проводили через четыре часа по наличию на хвосте местных изменений, степени выраженности интоксикации и смертельных исходов. Результатами экспериментов не были установлены признаки интоксикации у подопытных животных. Таким образом, исследуемый фитопрепарат «Каргмэз» не оказывает местного токсического действия на организм животных.
В результате проведенных исследований установлено, что препарат стимулирует рост массы тела и внутренних органов в пределах физиологической нормы, что свидетельствует об отсутствии негативного влияния на развитие органов и тканей организма животных (таблица 2).
Гематологические исследования. При анализе периферической крови крыс, получавших фитопрепарат «Каргмэз», установлена некоторая тенденция к снижению общего количества эритроцитов. При этом общее количество гемоглобина не несколько повышалось. Скорость оседания эритроцитов и цветной показатель у контрольных и подопытных лабораторных животных была практически на одном уровне. Количество лейкоцитов у подопытных животных отмечено в пределах физиологической нормы, однако, прослеживалась четкая дозозависимая тенденция к их снижению. В лейкоцитарной формуле подопытных крыс значительных сдвигов не обнаружено, выявлено снижение содержания лимфоцитов на 22% (Р>0,05) палочкоядерных нейтрофилов - в 1,6 раза и, напротив, повышение сегментоядерных нейтрофилов в 2 раза у крыс, получавших фитопрепарат «Каргмэз» в дозе 0,12 мл/кг массы животного, относительно контрольной группы (таблица 3).
При биохимических исследованиях сыворотки крови у животных, получавших препарат, обнаруживали сдвиги в количественном содержании белка, глюкозы, мочевины и активности аминотрансфераз. Они были в пределах физиологической нормы и достоверно не отличались от таковых у крыс контрольной группы (таблица 4).
Полученные данные свидетельствуют о позитивном действии фитопрепарата «Каргмэз» на обмен веществ и функциональную активность внутренних органов (печени, почек, поджелудочной железы).
Функциональные пробы. Анализ проведения пробы с феноловым красным позволил установить, что как у животных, получавших препараты, так и у интактных животных, концентрация красителя в моче была практически на одном уровне, что свидетельствовало об отсутствии нарушения метаболических процессов в мочевыделительной системе (таблица 5).
Для подтверждения эффективности фитопрепарата «Каргмэз» был проведен научно-хозяйственный опыт в учебном хозяйстве «Кубань» Кубанского агроуниверситета на крупном рогатом скоте. Для опыта сформировали две группы коров по 15 голов в каждой: первая - контрольная (интактные), вторая - опытная группа.
3
3
Для изучения иммунобиологических свойств, подбора дозы препарата опытной группе давали ежедневно в течение 14 дней в дозе 0,15 см на 1 кг животного, разбавленного со 130-145 см кипяченой воды фитопрепарат «Каргмэз».
Кровь брали из хвостовой вены в серологические и гематологические моноветы с соблюдением правил асептики и антисептики.
Результаты исследования применения фитопрепарата крупному рогатому скоту приведены в таблицах 6, 7 и 8.
После применения фитопрепарата «каргмэз» установлено, что у животных произошло повышение количества эритроцитов в опытной группе (лептоспирозе) на 24%, уровня гемоглобина - на 14% и, напротив, снижение количества лейкоцитов на 33%, относительно контрольных (интактных) животных. Количество базофилов снизилось на 37% эозинофилов - на 73% (в 4 раза), и, напротив, происходило повышение сегментоядерных нейтрофилов на 60% (в 1,6 раза), относительно контрольной группы (таблица 6).
После применения фитопрепарата «каргмэз» установлено, что у животных произошло повышение количества эритроцитов в опытной группе (пастереллезе) на 38%, уровня гемоглобина - на 20% и, напротив, снижение количества лейкоцитов на 37%, относительно контрольных (интактных) животных. Количество базофилов снизилось на 50% (в 2 раза), эозинофилов - на 77% (в 4,3 раза), и, напротив, происходило повышение сегментоядерных нейтрофилов на 48% (в 1,5 раза), относительно контрольной группы (таблица 7).
После применения фитопрепарата «каргмэз» установлено, что у животных произошло повышение количества эритроцитов в опытной группе (сальмонеллезе) на 42%, уровня гемоглобина - на 21% и, напротив, снижение количества лейкоцитов на 34%, относительно контрольных (интактных) животных. Количество базофилов снизилось на 24%, эозинофилов - на 19%, и, напротив, происходило повышение сегментоядерных нейтрофилов на 57% (в 1,6 раза), относительно контрольной группы (таблица 8).
Следовательно, при анализе гематологических показателей установлено, что применение животным фитопрепарата «каргмэз» позитивно повлияло на эритрогемопоэз.
При исследовании процессов фагоцитоза нами установлено, что у животных в опытной группе происходило повышение иммунобиологической реактивности организма после применения фитопрепарата «каргмэз».
Так, в опытной группе у крупного рогатого скота (лептоспироз) наблюдалось повышение процента активных нейтрофилов на 20%, переваривающей способности нейтрофильных гранулоцитов - на 16%, и, напротив, снижение поглотительной способности нейтрофильных гранулоцитов на 5%, по сравнению с контрольной группой животных.
При исследовании процессов фагоцитоза нами установлено, что у животных в опытной группе происходило повышение иммунобиологической реактивности организма после применения фитопрепарата «каргмэз». Так, в опытной группе у крупного рогатого скота (пастереллез) наблюдалось повышение процента активных нейтрофилов на 25%, переваривающей способности нейтрофильных гранулоцитов - на 22%, и, напротив, снижение поглотительной способности нейтрофильных гранулоцитов на 8%, по сравнению с контрольной группой животных.
При исследовании процессов фагоцитоза нами установлено, что у животных в опытной группе происходило повышение иммунобиологической реактивности организма после применения фитопрепарата «каргмэз». Так, в опытной группе у крупного рогатого скота (сальмонеллезе) наблюдалось повышение процента активных нейтрофилов на 23%, переваривающей способности нейтрофильных гранулоцитов - на 18%, и, напротив, снижение поглотительной способности нейтрофильных гранулоцитов на 4%, по сравнению с контрольной группой животных.
При изучении соотношения иммунокомпетентных клеток (Т-, В- и NK-лимфоциты) нами выявлено, что у животных в опытной группе происходило активация как клеточного, так и гуморального иммунитета. Так, у животных опытной группы (лептоспирозе) наблюдалось достоверное повышение количества Т-лимфоцитов на 15%, В-лимфоцитов - на 10% и, напротив, снижение NK-лимфоцитов в 2,4 раза, по сравнению с контрольной группой животных.
При изучении соотношения иммунокомпетентных клеток (Т-, В- и NK-лимфоциты) нами выявлено, что у животных в опытной группе происходило активация как клеточного, так и гуморального иммунитета. Так, у животных опытной группы (пастереллезе) наблюдалось достоверное повышение количества Т-лимфоцитов на 12%, В-лимфоцитов - на 8% и, напротив, снижение NK-лимфоцитов в 2,1 раза, по сравнению с контрольной группой животных.
При изучении соотношения иммунокомпетентных клеток (Т-, В- и NK-лимфоциты) нами выявлено, что у животных в опытной группе происходило активация как клеточного, так и гуморального иммунитета. Так, у животных опытной группы (сальмонеллезе) наблюдалось достоверное повышение количества Т-лимфоцитов на 17%, В-лимфоцитов - на 16% и, напротив, снижение NK-лимфоцитов в 2,2 раза, по сравнению с контрольной группой животных.