ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ, СПОСОБ И ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОМА ВИРУСА БЛЮТАНГА МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В ФОРМАТЕ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИИ ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ
OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS, METHOD AND TEST SYSTEM FOR DETECTING BLUETONGUE VIRUS GENOME BY POLYMERASE CHAIN REACTION IN ELECTROPHORETIC DETECTION OF AMPLIFICATION PRODUCTS

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к средствам диагностики и специфической профилактики.
Блютанг (катаральная лихорадка овец) - инфекционная вирусная болезнь овец, коз, крупного рогатого скота (КРС), передающаяся кровососущими насекомыми рода Culicoides, протекающая эпизоотически. У КРС болезнь протекает как латентные инфекции, особенно в эпизоотических зонах, и только у 5% инфицированных животных болезнь клинически выражена. Поэтому для выявления латентной формы болезни нужно иметь экспресс-метод обнаружения вируса у клинически здоровых животных.
В настоящее время для диагностики вирусных и бактериальных болезней используется метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Известен способ обнаружения вируса блютанга с помощью ПЦР, который включает три отдельные процедуры. На первой стадии РНК вируса блютанга экстрагируют из крови с использованием вызывающего диссоциацию агента, второй процедурой является денатурирование вирусной РНК и обратная транскрипция с целью синтеза кДНК, которая амплифицируется при постановке ПЦР, при этом в качестве мишени использован ген NS1, третьей процедурой - анализ ПЦР-продукта методом гель-электрофореза [1].
МЭБ (Международное эпизоотическое бюро) регламентирует правила постановки ПЦР при выявлении генома вируса блютанга. Эти правила предусматривают для денатурации двухцепочечной РНК применение в реакции метилгидроксид ртути, который, встраиваясь между ними, разрывает водородную связь.
Вторым недостатком данных способов является то, что перед постановкой реакции требуется предварительное выделение форменных элементов из крови, что достаточно трудоемко и требует специальных навыков.
Целью изобретения является разработка олигонуклеотидных праймеров и более общедоступного, безопасного и быстрого способа и соответствующей тест-системы для обнаружения РНК вируса блютанга методом ПЦР в формате электрофоретической детекции продуктов амплификации.
Поставленная цель достигается тем, что для постановки ПЦР подобраны и синтезированы две пары олигонуклеотидных праймеров:
5'-gttaaaaatctatagagatg-3'
5'-gtaagtgtaatctaagaga-3'
5'-acaactgatgctgcgaatga-3'
5'-aacccacacccgtgctaagtgg-3'
Праймеры комплементарны консервативной области генома NS1 вируса блютанга с предварительным циклом денатурации 94°С 3 мин, с последующими 30 циклами амплификации при температуре денатурации 94°С 10 с, отжига 55°С 20 с, элонгации при 72°С 15 с, с завершающим циклом элонгации 72°С в течение 1 мин, затем проводят оценку результатов реакции без предварительной рестрикции полученного продукта. Способ выявления РНК вируса катаральной лихорадки овец в образцах крови, пробах органов латентно инфицированных, больных и павших животных и/или в инфицированной культуре клеток включает предварительную денатурацию вирусной РНК при 88°С в течение 5 мин с последующей ее инкубацией в охлажденном при -40°С - -70°С песке в течение 1 мин. Синтез кДНК проводится при 42°С в течение 20 мин.
Тест-система состоит из трех отдельных наборов с пластиковыми флаконами и пробирками.
Набор 1 - для выделения нуклеиновых кислот, содержащий нуклеосорбент с отмывочным буфером на основе гуанидинтиоционата, буфер для реакции, отрицательный контроль.
Набор 2 - для постановки ПЦР, включающий пластиковые пробирки, содержащие олигонуклеотидные праймеры, термостабильный фермент Taq-полимеразу, ПЦР-смесь для постановки реакции, положительный контроль.
Набор 3 - для проведения электрофореза, содержащий агарозу, буфер для электрофореза.
Первый набор позволяет быстро и качественно выделить РНК вируса блютанга без предварительной подготовки суспензии из органов и выделения форменных элементов из крови.
При постановке ПЦР во втором наборе производится денатурация сегментированной двухцепочечной РНК предварительным прогревом ее до 88°С с последующей инкубацией в охлажденном при -40°С - -70°С песке и одновременной гибридизацией праймеров, что заменяет использование метилгидроксида ртути. В процессе амплификации концентрация синтезированного фрагмента в исследуемой пробе увеличивается в миллионы раз, что позволяет визуально учитывать результаты анализа при проведении электрофоретического разделения продуктов амплификации в агарозном геле (третий набор).
Оценку результатов реакции проводят без предварительной рестрикции полученного продукта. Результат реакции считается положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента в 800 пар оснований.
Техническим результатом изобретения является общедоступность, безопасность, чувствительность, а также сокращение времени проведения диагностической работы с пробами органов и крови от больных и латентно инфицированных животных.
Сущность изобретения заключается в том, что выявление вируса блютанга проводят методом полимеразной цепной реакции, предусматривающим амплификацию кДНК вируса, перенос продукта амплификации на гель и оценку результатов амплификации. Синтезируется фрагмент, который в геле агарозы соответствует размеру 800 п.о. Для определения размера фрагмента вносится маркер молекулярного веса.
Существенным отличием заявляемого способа является следующее:
1. Анализ можно проводить из стабилизированной крови, при этом не требуется предварительного выделения из нее форменных элементов, как это делалось в известном способе. Таким образом, значительно сокращается время постановки реакции.
2. При постановке реакции не используется метилгидроксид ртути, а проводится денатурация сегментированной двухцепочечной РНК предварительным прогревом ее до 88°С с одновременной гибридизацией праймеров путем инкубации в охлажденном при -40°С - -70°С песке для предотвращения соединения цепей РНК
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Тест-система укомплектована пластиковыми флаконами и пробирками.
Пример 1. Набор 1 для выявления нуклеиновых кислоты используют для работы с пробами органов, культуральным вируссодержащим материалом и кровью.
3
Исследуемый материал (кровь, смывы, мазки, 10% суспензия органов) в объеме 25-100 микролитров (далее мкл) вносят в 1,5 см пробирку и добавляют лизирующий буфер на основе гуанидинтиоцианата и 20 мкл нуклеосорбента. В течение 5 мин пробы инкубируют при 65°С. Пробирки центрифугируют при 5000 об/мин и удаляют надосадочную жидкость. В пробирки вносят 200 мкл отмывочного буфера, встряхивают пробирки и центрифугируют при 5000 об/мин, удаляют надосадочную жидкость. В пробирки вносят 500 мкл 70%-ного спирта. Пробирки встряхивают и центрифугируют при 12000 об/мин, удаляют надосадочную жидкость. Пробирки инкубируют 5 мин при 56°С и вносят в пробирки 50 мкл бидистиллированной воды, тем самым эллюируя нуклеиновые кислоты с нуклеосорбента в воду. 5-10 мкл этого раствора используют для дальнейшего синтеза комплементарной ДНК.
Пример 2. Амплификация участка РНК (фрагмент гена NS1) вируса блютанга с применением набора 2 для проведения ПЦР и синтетическими олигонуклеотидами
Тест-система апробирована на различных серотипах вируса блютанга. В качестве отрицательных контролей использованы родственные орбивирусы - штаммы вируса АЧЛ, ЭГБО и Ибараки.
3
Подготавливают и подписывают пробирки объемом 0,5 см для N-количества образцов, в число которых входят анализируемые пробы. В каждую пробирку добавляют 3,0 мкл праймеров.
В пробирки вносят 5,0 мкл исследуемой РНК. Проводят предварительный отжиг праймеров, прогревая смесь на амплификаторе с температурным режимом:
денатурация 88°С - 5 мин 1 цикл
Затем пробирки немедленно помещают в ледяную баню (-70°С) на 2 мин.
В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на N-количество образцов, состоящую из буфера для ревертазы, 2,5 mM каждого dNTP, 10 mM каждого праймера, 2 ед. ревертазы. Реакционную смесь быстро добавляют в охлажденные пробирки и пробы вносят в амплификатор со следующим температурным режимом:
синтез кДНК 42°С - 30 мин 1 цикл
Затем пробирки инкубируют в охлажденном песке (-40 - -70°С) на 2 мин.
Инкубационная смесь для ПЦР с конечным объемом 25 мкл содержит:
2
буфер для Taq-полимеразы с 15 mM MgCl, 2,5 mM каждого dNTP, 10 mM каждого праймера, 5 ед. Taq-полимеразы. Реакционную смесь быстро добавляют в охлажденные пробирки.
Температурный режим проведения ПЦР показан в таблице 1.
Таблица 1
Процесс
Температура
Время
Циклов
Денатурация
94°С
3 мин
1
Денатурация
94°С
10 с
30
Отжиг
55°С
20 с
Элонгация
72°С
15 с
Элонгация
72°С
1 мин
1
Проведение второго раунда ПЦР:
Проводят с аналогичной ПЦР-смесью в том же режиме.
Пример 3. Определение размера продуктов ПЦР с использованием набора 3 для проведения электрофореза
Продукты ПЦР анализируют методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле в стандартном трис-борном буфере.
10 мкл продукта ПЦР смешивают с 2 мкл буфера для нанесения образца и вносят в лунку агарозного геля. Электрофорез проводят при напряжении 10 В/см длины геля до тех пор, пока краситель не пройдет от старта не менее половины геля (примерно 30 мин). Результат электрофореза учитывают, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор». Результат считается положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента 800 пар оснований.
С применением тест-системы и указанных праймеров выявлялись все исследуемые образцы вируса блютанга. Отрицательные контроли не амплифицировались.
Пример 4. Определение чувствительности и специфичности ПЦР на основе синтетических праймеров, синтезированных на район гена NS1
Определение чувствительности разработанного метода ПЦР показало, что с помощью подобранных праймеров можно выявить наличие возбудителя, когда титр инфекционности не превышает значений 5,5-6,0 lg ТЦД 50/мл (табл.2).
Таблица 2
Результаты проведения ПЦР с праймерами, комплементарными гену NS1 вируса блютанга
№
Наименование препаратов
Титр вирусаТЦД<sub>50/мл</sub>
Шифр
Ожидаемый результат
1
вирус блютанга штамм 608 (тип 4), 22.02.2002, лиоф. высуш.
5,5
12
+
2
вирус блютанга штамм 636 (тип 9), 01.03.2002, лиоф. высуш.
4,5
2
+
3
вирус блютанга штамм 617 (тип 14), 01.03.2002, лиоф. высуш.
6,0
13
+
4
вирус блютанга штамм 874 (тип 2), 01.03.2002, культура клеток
6,0
4
+
5
вирус блютанга штамм «Ильичевский» (не типирован), 01.03.2002, культура клеток
5,0
14
+
6
вирус блютанга штамм «Нахичевань» (не типирован), 04.07.1971, культура клеток
-
6
+
7
вирус АЧЛ серотип 2, 23.04.2001, лиоф. высуш.
5,25
7
-
8
вирус АЧЛ серотип 3, 10.04.2001, лиоф. высуш.
5,0
8
-
9
вирус АЧЛ серотип 4, 16.11.2000, лиоф, высуш.
4,75
9
-
10
вирус АЧЛ серотип 6, 16.11.2000, лиоф, высуш.
5,25
10
-
11
вирус ЭГБО штамм «Нью-Джерси», 22.02.1987, лиоф. высуш.
6,0
11
-
12
вирус Ибараки штамм Са саки, 05.06.1991, лиоф. высуш.
6,0
1
-
13
Проба головного мозга интактной мыши
-
3
-
14
Проба головного мозга здоровой овцы
-
5
-
Тест-система и синтетические олигонуклеотидные праймеры были проверены на специфичность и чувствительность. Установлено, что тест-система не амплифицирует РНК других бактерий и вирусов.
Пример 5. Выявление РНК вируса блютанга с применением предлагаемой тест-системы и синтетических олигонуклеотидов в пробах биологического материала, полученного от больных животных
При исследовании более 1000 полевых образцов крови и органов, поступавших из различных регионов страны с подозрением на вирус блютанга, были специфично обнаружены все инфицированные пробы.
Каждая проба после проведения ПЦР была секвинирована и тем самым были
подтверждены результаты.
Таким образом, предлагаемые тест-система и способ позволяют достичь высокого уровня общедоступности, безопасности, чувствительности с помощью двух пар праймеров, провести идентификацию возбудителя в течение 4-6 часов.
С помощью разработанных способа и тест-системы можно выявить наличие вируса не только у больных и павших животных, но и при персистенции вакцинного вируса или у животных в латентной стадии заболевания.
Источники информации
1. Billinis С., Koumbati M., Spyrou V., Nomikou К., Mangana О., Panagiotidis С.А. & Papadopoulos О. (2001). Bluetongue virus diagnosis of clinical cases by a duplex reverse transcription-PCR: a comparison with conventional methods. J. Virol. Methods, 98, 77-89.