СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАРОТИНОИДОВ ИЗ БИОМАССЫ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ Chlorella vulgaris
METHOD FOR OBTAINING CAROTENOIDS FROM THE BIOMASS OF MICROALGAE Chlorella vulgaris

Изобретение относится к области химической технологии получения биологически активных веществ и позволяет получать экстракты каротиноидных пигментов из сухой биомассы микроводорослей Chlorella vulgaris.
Система сопряженных двойных связей в молекулах каротиноидов, а также структурное сходство с некоторыми витаминами обуславливает их высокую биологическую ценность в составе растений (антиоксидантная, фотопротекторная, структурообразующая функции) [1] и в рационе питания человека (провитаминная, детоксицирующая активность, укрепление иммунной системы, химиопрофилактика рака, сердечно-сосудистых заболеваний, катаракты и других дегенеративных нарушений) [2-4]. В качестве промышленного источника каротиноидов перспективными считаются одноклеточные водоросли, содержащие в несколько раз больше пигментов, чем наземные растения.
Из всего многообразия микроводорослей Chlorella относится к наиболее ценным, благодаря высокому содержанию липидных соединений, в том числе каротиноидов и других ценных пластидных пигментов [5-8]. Водоросли группы Chlorophyta также содержат ксантофиллы уникальной химической структуры, которая зачастую характерна для отдельных таксонов, так как оксикаротиноиды водорослей - производные не только β-, но и α-, и γ-каротинов. В их числе фикоцианин, сифоноксантин, астаксантин, лороксантин, зеиноксантин, неоксантин, а также такие алленовые и ацетиленовые каротиноиды, как диатоксантин и диадиноксантин, и другие [9].
Способ получения каротиноидного комплекса из биомассы микроводорослей Chlorella vulgaris направлен на получение продуктов, которые могут быть использованы в пищевой или фармацевтической промышленности в качестве биологически активной или функциональной пищевой добавки для снижения дефицита витамина А у детей и взрослых, а также для профилактики онкологических заболеваний.
Аналог 1.
Известен способ получения каротиноидов из панцирьсодержащих отходов речных раков (Патент на изобретение №2292163 «Способ получения каротиноидов», опубл. 27.01.2007). Техническое решение предполагает получение каротиноидов методом экстракции этиловым спиртом с дальнейшим переносом каротиноидов в раствор гексана с целью очистки от примесей, оставшихся после экстракции, и последующим упариванием растворителя для получения сухого остатка. Выход каротиноидов при использовании данного метода составляет 0,65-0,75% в сухом остатке. Недостаткам данного метода является использование высоких температур при удалении растворителя из экстракта (60-70°С), что может инициировать деструктивные изменения и изомеризацию каротиноидов.
Аналог 2.
Известен способ получения каротиноидов, в частности, ксантофиллов из растительного типа сырья (Патент на изобретение № RU 2436771 C1 «Способ выделения ксантофиллов из растительного сырья», опубл. 20.12.2011). В данном техническом решении используют растительное сырье, высушенное без доступа прямых солнечных лучей. Экстракцию проводят, используя н-гексан или петролейный эфир, с последующим центрифугированием для удаления шрота и сорбции ксантофиллов на силикагеле. Силикагель отделяют от растворителя, высушивают и переносят в любое растительное масло. Смесь масла с силикагелем перемешивают до обесцвечивания силикагеля, затем силикагель отделяют центрифугированием от масла, насыщенного ксантофиллами. При использовании данного метода выход ксантофиллов составляет 0,088 мг вещества на 1 мл масла. К недостаткам данного метода стоит отнести использование в качестве экстрагента только полярного растворителя, что снижает чистоту выделяемых ксантофиллов и влияет на выход каротиноидов.
Прототип.
Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является технология получения каротиноидов, описанная авторами [10], которые использовали для экстракции каротиноидов влажную биомассу микроводорослей Chlorella vulgaris и в качестве экстрагентов этанол и 2-метилтетрагидрофуран (MTHF). Чистый MTHF был протестирован как альтернативный растворитель для экстракции каротиноидов из биомассы микроводорослей Chlorella vulgaris. При экстракции в течение 30 мин при температуре 110°C было извлечено 45% от общего количества каротиноидов. При использовании смеси MTHF и этанола в соотношении 1:1 из влажной биомассы количество экстрагированных каротиноидов увеличилось до 66%. Недостатком данного метода является использование влажной биомассы и высокая температура экстракции. Известно, что присутствие воды в растительной биомассе снижает экстрактивную способность липофильных веществ и экстрагирующую способность 2-метилтетрагидрофурана, поскольку MTHF обладает «обратной растворимостью», то есть его растворимость при повышении температуры снижается.
Техническим результатом заявляемого изобретения является увеличение выхода каротиноидов из сухой биомассы микроводорослей Chlorella vulgaris. Технический результат достигается за счет предварительной механической активации биомассы, последующей жидкостной экстракции пигментного комплекса из биомассы при использовании ультразвука (УЗ), омыления и очистки каротиноидов, удаления растворителя.
Важным этапом технологии получения каротиноидов является предварительная активация полученной биомассы. Несмотря на то, что клеточная оболочка микроводорослей Chlorella vulgaris имеет более тонкую оболочку относительно Chlorella vulgaris Chlorella Sorokiniana, предварительная механическая дезинтеграция оболочки положительно влияет на выход пигментов в процессе их экстрагирования [14].
Предварительная механическая активация биомассы способствует более эффективному экстрагированию пигментов.
Для осуществления процесса активации биомассы в заявляемом способе получения каротиноидов предлагается использовать высокоскоростную гомогенизацию для разрушения клеточной оболочки микроводорослей, которую проводят на ледяной бане, предварительно смешивая биомассу с жидкой фазой в соотношении (1:5) - (1:7). В качестве жидкой фазы используют смесь гексана (ч) и этилового спирта (95,6%) в соотношении 2:1.
Далее осуществляют экстракцию каротиноидов при использовании УЗ (25 кГц) в течение от 5 до 25 минут при температуре (23±2)°С.
Высокоскоростную гомогенизацию осуществляют на приборе Silentcrusher М (IKA Werke, T25 Basic) в диапазоне скорости вращения ротора от 5000 (минимально возможная скорость) до 12000 об/мин.
В таблице 1 приведены результаты исследований влияния активации биомассы путем высокоскоростной гомогенизации на содержание каротиноидов в экстрактах.
Установлено, что увеличение скорости вращения ротора более 6000 об/мин приводит к значительному увеличению доли поврежденных клеток. Это вызывает смешивание каротиноидных пигментов с внутриклеточными ферментами (оксидазами) и быстрое их окисление, о чем свидетельствует снижение содержания каротиноидов в экстрактах при использовании скорости вращения ротора более 6000 об/мин. Таким образом, наиболее эффективным режимом активации биомассы, при котором наблюдается сохранение целостности клеточной структуры, является скорость вращения ротора 6000 об/мин. Это дает возможность увеличить выход каротиноидов при их экстрагировании.
В таблице 2 представлено влияние времени экстрагирования на содержание каротиноидов в полученных экстрактах.
Наибольший выход каротиноидов наблюдается примерно через 20 минут от начала процесса (таблица 2).
Дальнейшее увеличение продолжительности экстракции приводит к снижению выхода каротиноидов, что связано с их окислением в экстракте кислородом воздуха (фигура 1).
Отделение остаточной биомассы после извлечения пигментного комплекса проводят путем центрифугирования при 3300 об/мин в течение 5 минут.
Отделение суммарных каротиноидов от хлорофиллов производят путем омыления хлорофиллиновых кислот в полученном экстракте с использованием щелочи калия KOH, хорошо растворимого в этиловом спирте, с последующим разделением фракций. К полученному экстракту добавляют KOH из расчета 0,05 г на каждые 10 мл экстракта. Смесь встряхивают в течение 10 минут и затем центрифугируют при 3300 об/мин в течение 5 минут. При этом фракция каротиноидов (верхняя фаза) окрашена в жёлто-оранжевый цвет, а фракция солей хлорофиллиновых кислот (нижняя фаза) - в тёмно-зелёный цвет.
Процесс омыления позволяет очистить каротиноиды от жирных кислот, хлорофилла и восковых эфиров.
Полученный экстракт каротиноидов промывают для нейтрализации до рН 7-7,5 двумя объемами холодной дистиллированной воды, свободной от кислорода, и подвергают сгущению с помощью роторного испарителя ввакууме (2 к Па) при температуре 45°С. В полученном сухом остатке определяют выход каротиноидов согласно способу, представленному в [15]. Выход к аротиноидов из сухой биомассы микроводорослей Chlorella vulgaris при использовании заявляемого способа получения каротиноидов составляет (50±5) мг в 1 г сухого остатка.
Для идентификации и расчета содержания каротиноидов использовали спектр поглощения полученных экстрактов ввидимой области (фигура 2). С пектральный профиль характеризуется наличием трех пиков: 1-420 нм 2-440 нм и 3-470 нм. Форма спектра определяется числом двойных связей, заместителями, наличием цис-, трансизомерных форм и типом растворителя.
Полученный сухой остаток каротиноидов перерастворяют в пищевом растительном масле в соотношении 1:100 по массе для дальнейшего хранения и использования полученного масляного экстракта в качестве пищевой или биологической активной добавки.
Характеристики масляного экстракта каротиноидов приведены в таблице 3.
Список литературы
1. Ладыгин В.Г. Пути биосинтеза, локализация, метаболизм и функции каротиноидов в хлоропластах различных видов водорослей // Федеральное государственное бюджетное учреждение науки, Институт фундаментальных проблем биологии, Российской академии наук, Вопросы современной альгологии. - 2015. - 87 с.
2. Шашкина М.Я., Шашкин П.Н., Сергеев А.В. Каротиноиды какоснова для создания лечебно-профилактических средств // Российский биотерапевтический журнал. - 2009. - №4. - Т. 8. - С. 91-98.
3. Plant Carotenoids: Pigmentsf or Photoprotection, Visual Attraction, and Human Health / Glenn E. Bartley, Pablo A. Scolnik // The Plant Cell. - 1995. - vol. 7. - рр. 1027 - 1038.
4. Дымова О.В., Головко Т.К. Фотосинтетические пигменты: функционирование, экология, биологическая активность // Известия уфимского научного центра РАН. - 2018. - №3. - С. 5-16.
5. Andressa Bacalau Diprat, Roberta Cruz Silveira Thys, Eliseu Rodrigues, Rosane Rech, Chlorella sorokiniana: A new alternativesource of carotenoids and proteins for gluten-free bread, LWT, Volume 134, 2020, 109974.
6. Matsukawa, R., Hotta, M., Masuda, Y. et al. Antioxidants from carbon dioxide fixing Chlorella sorokiniana. Journal of Applied Phycology.2000. - 12, 263-267.
7. Guedes, A.C.; Amaro, H.M.; Malcata, F.X. Microalgae as sources of carotenoids. Mar. Drugs. 2011. - 9. - 625-644.
8. Marino, T.; Casella, P.; Sangiorgio, P.; Verardi, A.; Ferraro, A.; Hristoforou, E.; Molino, A.; Musmarra, D. Natural beta-carotene: A microalgae derivate for nutraceutical applications. Chem. Eng. Trans. 2020, 79, 103-108.
9. Галицкая А.А. Эколого-биохимическая адаптация WOLFFIA ARRHIZA (L.) к абиотическим и биотическим факторам среды: автореф. дис. … канд. био. наук. - Саратов, 2012. - 20 с.
10. Eya Damergi,  Dominik Refardt, Shivom Sharma, Christof Holliger, Christian Ludwig, Extraction of carotenoids from Chlorella vulgaris using green solvents and syngas production from residual biomass, Algal Research, Volume 25, 2017, p. 488-495.
11. Taucher J, Baer S, Schwerna P, Hofmann D,  et al. (2016) Cell Disruption and Pressurized Liquid Extraction of Carotenoids from Microalgae. J Thermodyn Catal 7: 158.
12. Н.П. Дмитрович, А.С. Крыльчук и Н.А. Симончик Влияние питательной среды и интенсивности барботажа на динамику физиологических параметров роста хлореллы», Вестник Полесского государственного университета. Серия природоведческих наук. 2016. №2.
13. Э.С. Челебиевой, Г.С. Минюк Физиолого-биохимические характеристики микроводоросли Ettlia Carotinosa  1989 (Chlorophyceae) в условиях экспериментального стресса, Морський Екологiчний журнал, 2-е изд., Севастополь.
14. Bazarnova J., Kuznetsova T., Aronova E., Popova L., Pochkaeva E.A method for obtaining plastid pigments from the biomass of Chlorella microalgae. Agronomy Research, 2020.
15. Lichtenthaler, H.K. Chlorophylls and carotenoids: pigments of photosynthetic biomembranes / H.K. Lichtenthaler // Methods Enzymol. - 1987. - V 148, No 34, P. 350-382.