Способ неинвазивной полуколичественной оценки жизнеспособности клеток линии MDA-MB-231 в мультиорганных микрофизиологических моделях
METHOD FOR NON-INVASIVE SEMI-QUANTITATIVE ASSESSMENT OF VIABILITY OF MDA-MB-231 CELLS IN MULTIORGAN MICROPHYSIOLOGICAL MODELS

Область техники, к которой относится изобретение.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для полуколичественной оценки жизнеспособности клеток линии MDA-MB-231 в мультиорганных микрофизиологических моделях.
Уровень техники.
Существует ограниченный перечень схем неоадьювантной и адьювантной химиотерапии рака молочной железы (РМЖ). Химиотерапевтические препараты (такие как доксирубицин, циклофосфамид, доцетаксел, фторурацил и др.) назначаются курсами в виде различных комбинаций. При этом эффективность такой терапии может быть оценена только по результатам продолжительного (не менее 2 месяцев) наблюдения за динамикой развития опухолевого процесса. В то же время известны случаи различной чувствительности клеток РМЖ к химиотерапевтическим препаратам вплоть до полной резистентности. В этом случае схема оказывается малоэффективной или неэффективной для терапии и может привести к прогрессии опухоли и вызвать неоправданные нежелательные побочные явления.
Впервые индивидуальная оценка чувствительности опухолевых клеток к различным препаратам in vitro c целью выбора оптимальной персонифицированной схемы терапии была успешно реализована для острых лейкозов (Pieters R. [и др.]. Clinical relevance of in vitro drug resistance testing in childhood acute lymphoblastic leukemia: The state of the art // Medical and Pediatric Oncology. 1994. № 5 (22). C. 299-308). В настоящее время ведутся работы по созданию микрофизиологических in vitro моделей на основе собственных клеток пациента для изучения фармакологической активности препаратов (Marx U. [и др.]. Biology-inspired microphysiological system approaches to solve the prediction dilemma of substance testing // ALTEX. 2016. № 3 (33). C. 272-321). Одна из них, так называемый «человек-на-чипе», создана на основе плюрипотентных индуцированных стволовых клеток человека: моделей тонкого кишечника, печени, лимфатического узла и сфероидов рака молочной железы, состоящих из клеток линии MDA-MB-231 (Maschmeyer I. [и др.]. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro // European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 2015. № Pt A (95). C. 77-87; Suresh R. [и др.]. Differential Expression of MicroRNAs in Papillary Thyroid Carcinoma and Their Role in Racial Disparity. // Journal of cancer science & therapy. 2015. № 5 (7). C. 145-154). Эта модель позволяет оценить активность химиотерапевтическихпрепаратов в отношении клеток опухоли.
Одной из проблем, связанных с применением микрофизиологических моделей, является сложность отслеживания их текущего состояния. Микрофизиологическая модель позволяет отбирать и анализировать культуральную среду, циркулирующую по микроканалам между органоподобными структурами (органоидами) и являющуюся аналогом крови, однако взять образцы клеток из органоидов для анализа не представляется возможным ввиду нарушения при этом целостности всей системы.
Оценка жизнеспособности в культуре клеток служит одним из наиболее распространенных и важных показателей их функционального состояния. Большинство существующих методов оценки этих показателей достаточно сложны в исполнении и требуют предварительной фиксации или лизиса клеток. Это морфометрия, определение активности каспаз, исследование асимметрии плазматической мембраны клеток при помощи аннексина V, конъюгированного с флуоресцентными красителями, изучение состояния митохондрии и оценка фрагментации ДНК. Между тем поиск более простых методов и возможность прижизненной оценки жизнеспособности очень важна для широкого круга исследований, прежде всего, для оценки состояния клеток в микрофизиологических моделях.
.
Соответственно, к недостаткам существующих способов можно отнести инвазивность процедуры оценки жизнеспособности органоидов в микрофизиологической модели
В число перспективных маркеров жизнеспособности органоидов входят циркулирующие нуклеиновые кислоты, в частности микроРНК. МикроРНК представляют собой короткие некодирующие РНК длиной около 22 нуклеотидов, осуществляющие посттранскрипционную регуляцию экспрессии генов. Известно, что микроРНК, как внутри клетки, так и во внеклеточной среде, полностью экранированы от РНКаз белками-партнерами, принадлежащими к семейству Argonaute, и поэтому обладают высокой стабильностью, в том числе во внеклеточном пространстве (Makarova J. A. [и др.]. Circulating microRNAs // Biochemistry (Moscow). 2015. № 9 (80). C. 1117-1126). Благодаря этим свойствам микроРНК стали рассматривать в качестве маркеров самых различных состояний как организма, так и его моделей, в том числе клеточных культур.
Необходимо отметить, что клетки организма человека экспрессируют ограниченный репертуар микроРНК (Panwar B., Omenn G. S., Guan Y. miRmine: a database of human miRNA expression profiles. // Bioinformatics (Oxford, England). 2017. № 10 (33). C. 1554-1560), что затрудняет выбор органоид-специфических микроРНК для оценки жизнеспособности отдельный органоидов в микрофизиологических моделях.
Известен способ оценки влияния наночастиц на жизнедеятельность клеточных культур (RU 2460997 С1). Способ предназначен для оценки влияния наночастиц на жизнедеятельность клеточных культур и предусматривает инкубацию первичных культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделяемых из стромально-васкулярной фракции жировой ткани человека, и мононуклеарных клеток - лимфоцитов, выделяемых из периферической крови человека, с суспензиями наночастиц. По завершении инкубации определяют влияние наночастиц на производство активных форм кислорода, на образование апоптотических и некротических клеток, на функции митохондрий, на состояние лизосомального компартмента, а также оценивают внутриклеточное накопление тестируемых наночастиц. Полученные показатели сравнивают с соответствующими показателями контрольных образцов исследуемых клеток. Способ позволяет определить биологическое влияние наночастиц на основные функциональные особенности клеточной системы живого организма, которые имитируются первичными культурами мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и мононуклеарными клетками - лимфоцитами.
Однако, известный способ не предполагает неинвазивной оценки субпопуляций клеток, все анализируемые показатели предполагают либо лизис, либо фиксацию клеток.
Самым близким является способ оценки жизнеспособности клеток в микробиореакторе с помощью оптического световода (RU 2532839 С2). Способ включает помещение клеток в мембранную ячейку сменного клеточного блока микробиореактора, приготовление рабочего раствора витального красителя, внесение красителя в ячейку микробиореактора. После внесения осуществляют инкубацию клеток в растворе витального красителя и удаление несвязавшегося с клетками раствора витального красителя. Удаление осуществляют путем замены раствора инкубации на ростовую среду, не содержащую краситель. При этом оптический световод, соединенный со спектрометром, приводят в контакт с оптически прозрачным материалом сменного клеточного блока под мембранной ячейкой микробиореактора. Далее измеряют опорный спектр флуоресцентного сигнала как интеграл интенсивности флуоресценции на мембранной ячейке микробиореактора, в которой отсутствуют исследуемые клетки. Также измеряют спектр флуоресцентного сигнала как интеграл интенсивности флуоресценции на мембранной ячейке микробиореактора с исследуемыми клетками. После из полученного спектра флуоресцентного сигнала для мембранной ячейки с исследуемыми клетками вычитают опорный спектр флуоресцентного сигнала для мембранной ячейки микробиореактора без исследуемых клеток. Вычисляют количество жизнеспособных клеток в мембранной ячейке микробиореактора на основании полученной величины интенсивности сигнала флуоресценции.
Однако, данным способом невозможно анализировать состояние моделей не находящихся на мембранной вставке.
Техническим результатом является выбор минимального количества микроРНК, а также пороговых уровней их представленности в культуральной среде для оценки жизнеспособности опухолевых клеток под воздействием химиотерапевтических препаратов.
Раскрытие сущности изобретения.
Технический результат достигается тем, что также как и в известных способах выделяют РНК из образца культуральной среды набором реагентов miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen, ФРГ) с добавлением 0,3 мкл GlycoBlue Coprecipitant 15 мг/мл (Thermo Fisher Scientific, США), подготавливают библиотеки кДНК для секвенирования микроРНК с использованием CATS Small RNA-seq (Diagenode, Belgium), библиотеки кДНК секвенируют с помощью секвенатора Illumina NextSeq500 System и проводят анализ результатов секвенирования алгоритмом обработки данных BCGSC miRNA Profiling Pipeline с последующим представлением данных о представленности микроРНК в культуральной среде в виде двоичного логарифма counts per million reads mapped (CPM).
Особенностью заявляемого способа является то, что в качестве анализируемых микроРНК выступают hsa-miR-222-3p и hsa-miR-99b-5p, и если:
- представленность микроРНК hsa-miR-222-3p на уровне более 15,2 CPM и hsa-miR-99b-5p не менее 12,5 CPM, то это говорит о 0% жизнеспособности (100% гибели) клеток MDA-MB-231;
- уровень hsa-miR-99b-5p не менее 12,5 CPM и hsa-miR-222-3p не менее 14,3 CPM и не более 15,2 CPM, то это говорит о жизнеспособности 25% клеток MDA-MB-231;
- уровень hsa-miR-99b-5p не менее 12,5 CPM и hsa-miR-222-3p менее 14,3 CPM, то это говорит о жизнеспособности 50% клеток MDA-MB-231;
- уровень hsa-miR-222-3p в интервале от 12,2 до 12,5 CPM и hsa-miR-99b-5p не более 12,5 CPM, то это говорит о 75% жизнеспособных клеток MDA-MB-231;
- представленность в культуральной среде hsa-miR-222-3p на уровне менее 12,2 СРМ и hsa-miR-99b-5p не более 12,5 CPM, то это свидетельствует о том, что все клетки MDA-MB-231 жизнеспособны.
Изобретение поясняется подробным описанием, таблицей, примерами выполнения и иллюстрацией, на которой изображено решающее дерево оценки доли лизированных клеток линии MDA-MB-231.
Способ осуществляют следующим образом.
Заявляемый способ, основан на анализе представленности двух микроРНК с помощью секвенирования в культуральной среде микрофизиологической модели, включающей в свой состав клетки линии MDA-MB-231.
Тотальную РНК из образца культуральной среды выделяли набором реагентов miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen, ФРГ) с добавлением 0,3 мкл GlycoBlue Coprecipitant 15 мг/мл (Thermo Fisher Scientific, США). Библиотеки для секвенирования микроРНК готовили с использованием CATS Small RNA-seq (Diagenode, Belgium). Секвенирование проводили с помощью Illumina NextSeq500 System. Анализ результатов секвенирования осуществляли согласно алгоритму обработки данных BCGSC miRNA Profiling Pipeline. Для анализа использовали данные экспрессии в виде двоичного логарифма counts per million reads mapped (CPM).
Для моделирования воздействия химиотерапевтического препарата на мультиорганную клеточную модель была приготовлена серия смесей тотальной РНК, полученной из лизатов клеточных моделей кишечного барьера (КБ), лимфатического узла (ЛУ), эндотелия сосудов (ЭС) и опухолевых сфероидов (ОС) (Таблица 1).
Таблица 1. Состав модельных образцов культуральных сред
Название образца
Количество РНК эквивалентное доле лизированных клеток, %
КБ
ЛУ
ЭС
ОС
Образец 0
5
5
5
5
Образец 1
100
100
100
100
Образец 2
5
5
5
25
Образец 3
5
5
5
50
Образец 4
5
5
5
75
Примечание: КБ - модель кишечного барьера, ЛУ - модель лимфатического узла, ЭС - модель эндотелия сосудов, ОС -опухолевые сфероиды.
В качестве модели кишечного барьера была использована модель EpiIntestinal (MatTek). Модель EpiIntestinal включала в себя энтероциты, клетки Панета, М-клетки, каемчатые клетки и стволовые клетки кишечника. Модель культивируется на полупроницаемой мембране, что обеспечивает близкие к физиологическим условиям. Модель лимфатического узла состояла из T-лимфоцитов: CD4; B-лимфоцитов: CD19; моноцитов: CD14, а также дендритных клеток культивируемых в 3D-мариксе. Все клеточные компоненты были получены из мононуклеаров периферической крови здорового донора. Опухолевые сфероиды формировали из клеток линий MDA-MB-231 (ATCC HTB-22TM). В качестве первичной культуры эндотелиоцитов использовалась коммерчески доступная культура микроваскулярных эндотелиоциотов кожи человека (Human Dermal Microvascular Endothelial Cells, HDMEC, Sigma-Aldrich, C-14015).
Для приготовления смесей тотальной РНК клеточных моделей была использована культуральная среда, применяемая для длительного совместного культивирования вышеописанных клеточных моделей в микрофлюидном устройстве: 50% среды EGM MV2 и 50% RPMI с добавлением 7,5% фетальной бычьей сыворотки, 2,75% глюкозы, 50% ростовых факторов эндотелиоцитов, 2,5 мкг/мл Гентамицина, 125 нг/мл Амфотерицина В, 0,5% пеницилина и стрептомицина.
Клеточные модели лизировали QIAzol Lysis Reagent (Qiagen, ФРГ). Тотальную РНК выделяли miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen, ФРГ) и элюировали 30 мкл воды без РНКаз и ДНКаз.
После выделения тотальной РНК из клеточных моделей готовили модельные образцы для дальнейшего исследования согласно пропорциям представленным в Таблице 1. В 100 мкл смеси культуральных сред добавляли одну третью от соответствующей доли 30 мкл элюата тотальной РНК клеточной модели. Для каждого модельного образца проводили 10 выделений.
Тотальную РНК из полученных модельных образцов культуральных сред выделяли набором реагентов miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen, ФРГ) с добавлением 0,3 мкл GlycoBlue Coprecipitant 15 мг/мл (Thermo Fisher Scientific, США).
Библиотеки для секвенирования микроРНК готовили с использованием CATS Small RNA-seq (Diagenode, Belgium). Секвенирование проводили на Illumina NextSeq500 System. Анализ результатов секвенирования осуществляли согласно алгоритму обработки данных BCGSC miRNA Profiling Pipeline. Для анализа использовали данные экспрессии в виде двоичного логарифма counts per million reads mapped (CPM). Секвенирование каждого типа модельного образца выполняли в 10 повторах.
Построение деревьев принятия решений осуществляли с помощью жадных алгоритмов, так как задача построения оптимального дерева является NP-трудной (Hyafil L., Rivest R. L. Constructing optimal binary decision trees is NP-complete // Information Processing Letters. 1976. № 1 (5). C. 15-17). Построение дерева проводилось с использованием пакета caret (Kuhn M. Building Predictive Models in R Using the caret Package // Journal of Statistical Software. 2008. № 5 (28). C. 1-26) для среды вычислений R. Критерий Джини был использован для жадной оптимизации.
В рамках решения задачи по выбору микроРНК и пороговых значений их экспрессий для определения доли погибших под воздействием химиотерапевтического препарата клеток линии РМЖ MDA-MB-231 был применен метод построения деревьев решений (Mola F. Classification and Regression Trees Software and New Developments под ред. A. Rizzi, M. Vichi, H. H. Bock, Berlin, Heidelberg: Springer, 1998.C. 311-318).
Оказалось, что для оценки доли погибших клеток линии MDA-MB-231 достаточно оценить экспрессию двух микроРНК: hsa-miR-222-3p и hsa-miR-99b-5p (См.фигуру).
Обе микроРНК, позволяющие оценить степень лизиса клеток MDA-MB-231, характерны для опухолевых клеток. МикроРНК hsa-miR-222-3p кодируется геном MIR222HG, расположенным в Х хромосоме. Ее повышенная экспрессия характерна для различных видов злокачественных новообразований, в том числе и РМЖ. МикроРНК hsa-miR-222-3p комплиментарна 3'-нетранслируемому региону гена ESR1, что позволяет ей ингибировать трансляцию рецептора эстрогенов альфа. Ее экспрессия отрицательно коррелирована с тамоксифениндуцированным торможением клеточного роста и индукцией апоптоза клетками РМЖ (Miller T. E. [и др.]. MicroRNA-221/222 confers tamoxifen resistance in breast cancer by targeting p27Kip1. // The Journal of biological chemistry. 2008. № 44 (283). C. 29897-903). Была продемонстрирована возможность индукции резистентности к тамоксифену с помощью микроРНК hsa-miR-222-3p (Cochrane D. R. [и др.]. MicroRNAs link estrogen receptor alpha status and Dicer levels in breast cancer. // Hormones & cancer. 2010. № 6 (1). C. 306-19). МикроРНК hsa-miR-99b-5p участвует в регуляции дифференцировки, миграции и пролиферации опухолевых клеток. Исследования показали, что hsa-miR-99b-5p может функционировать в качестве модулятора в сложной сети факторов, регулирующих TGF-бета-индуцированный переход эпителия молочной железы в мезенхимальное состояние (Wang L. [и др.]. miR-99a and -99b inhibit cervical cancer cell proliferation and invasion by targeting mTOR signaling pathway // Medical Oncology. 2014. № 5 (31). C. 934). Кроме того, miR-99b ингибирует инвазию и пролиферацию клеток рака шейки матки через сигнальный путь mТor (Turcatel G. [и др.]. MIR-99a and MIR-99b Modulate TGF-β Induced Epithelial to Mesenchymal Plasticity in Normal Murine Mammary Gland Cells // PLoS ONE. 2012. № 1 (7). C. e31032).
Основываясь на решающем дереве (См.Фиг.), представленность hsa-miR-222-3p на уровне более 15,2 CPM свидетельствует о 100% лизисе клеток MDA-MB-231. Уровень hsa-miR-99b-5p не менее 12,5 CPM и hsa-miR-222-3p не менее 14,3 CPM и не более 15,2 CPM свидетельствует о лизисе 75% клеток MDA-MB-231. Уровень hsa-miR-222-3p в интервале от 12,2 до 12,5 CPM свидетельствует о лизисе 25% клеток MDA-MB-231. Представленность в культуральной среде hsa-miR-222-3p на уровне менее 12,2 СРМ свидетельствует об отсутствие лизиса клеток MDA-MB-231.
Примеры осуществления способа неинвазивной полуколичественной оценки жизнеспособности клеток линии MDA-MB-231 в мультиорганных микрофизиологических моделях.
Пример 1.
Изучение влияния 1 мкМ доксирубицина на клетки линии MDA-MB-231 после 24 часов инкубации в составе микрофизиологической модели в условиях микроциркуляции.
После 24 часов инкубации микрофизиологической модели в условиях микроциркуляции с добавлением в культуральную среду 1 мкМ доксирубицина из контура забрали 100 мкл культуральной среды. Клетки линии MDA-MB-231 использовали для анализа жизнеспособности с помощью метода МТТ.
Выделение тотальной РНК из образца культуральной среды осуществляли набором реагентов miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen, ФРГ) с добавлением 0,3 мкл GlycoBlue Coprecipitant 15 мг/мл (Thermo Fisher Scientific, США). Библиотеку кДНК для секвенирования микроРНК готовили с использованием набора реагентов CATS Small RNA-seq (Diagenode, Belgium). Секвенирования библиотеки кДНК осуществляли с помощью секвенатора Illumina NextSeq500 System. Результаты секвенирования обрабатывали с помощью алгоритма обработки данных BCGSC miRNA Profiling Pipeline с последующим представлением данных о представленности микроРНК в культуральной среде в виде двоичного логарифма CPM.
К клеткам линии MDA-MB-231 добавляли раствор МТТ до конечной концентрации 0.5 мг/мл. Далее через 4 часа культуральную среду удаляли, промывали клетки ФСБ и добавляли 500 мкл лизирующего буферного раствора (10% додецилсульфата натрия, 50% диметилформамида, уксусная кислота pH 4.7). Инкубировали при температуре 37°С с использованием шейкера в течение 1 часа. В качестве фона использовали пустые лунки, содержащие эквивалентное количество соответствующей питательной среды с 0.5 мг/мл МТТ. Затем переносили по 100 мкл раствора в чистый 96-луночный планшет с плоским дном.
Оптическую плотность раствора измеряли на длине волны 570 нм при помощи микропланшетного спектрофотометра BioRad X-mark (BioRad, США).
Жизнеспособность клеток MDA-MB-231 методом МТТ была оценена в 61%. Представленность микроРНК hsa-miR-222-3p составила 13,9 cpm, hsa-miR-99b-5p - 12,5 cpm, что соответствует, согласно вышеописанному способу оценки жизнеспособности, от 50 до 75% жизнеспособных клеток линии MDA-MB-231.
Пример 2.
Изучение влияния 15 мкМ 5-фторурацила на клетки линии MDA-MB-231 после 24 часов инкубации в составе микрофизиологической модели в условиях микроциркуляции.
После 24 часов инкубации микрофизиологической модели в условиях микроциркуляции с добавлением в культуральную среду 15 мкМ 5-фторурацила из контура забрали 100 мкл культуральной среды. Клетки линии MDA-MB-231 использовали для анализа жизнеспособности с помощью метода МТТ.
Выделение тотальной РНК из образца культуральной среды осуществляли набором реагентов miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen, ФРГ) с добавлением 0,3 мкл GlycoBlue Coprecipitant 15 мг/мл (Thermo Fisher Scientific, США). Библиотеку кДНК для секвенирования микроРНК готовили с использованием набора реагентов CATS Small RNA-seq (Diagenode, Belgium). Секвенирования библиотеки кДНК осуществляли с помощью секвенатора Illumina NextSeq500 System. Результаты секвенирования обрабатывали с помощью алгоритма обработки данных BCGSC miRNA Profiling Pipeline с последующим представлением данных о представленности микроРНК в культуральной среде в виде двоичного логарифма CPM.
К клеткам линии MDA-MB-231 добавляли раствор МТТ до конечной концентрации 0.5 мг/мл. Далее через 4 часа культуральную среду удаляли, промывали клетки ФСБ и добавляли 500 мкл лизирующего буферного раствора (10% додецилсульфата натрия, 50% диметилформамида, уксусная кислота pH 4.7). Инкубировали при температуре 37°С с использованием шейкера в течение 1 часа. В качестве фона использовали пустые лунки, содержащие эквивалентное количество соответствующей питательной среды с 0.5 мг/мл МТТ. Затем переносили по 100 мкл раствора в чистый 96-луночный планшет с плоским дном.
Оптическую плотность раствора измеряли на длине волны 570 нм при помощи микропланшетного спектрофотометра BioRad X-mark (BioRad, США).
Жизнеспособность клеток MDA-MB-231 методом МТТ была оценена в 45%. Представленность микроРНК hsa-miR-222-3p составила 14,3 cpm, hsa-miR-99b-5p - 12,7 cpm, что соответствует, согласно вышеописанному способу оценки жизнеспособности, от 50 до 25% жизнеспособных клеток линии MDA-MB-231.
Пример 3.
Изучение влияния 0,1 мкМ доксирубицина на клетки линии MDA-MB-231 после 24 часов инкубации в составе микрофизиологической модели в условиях микроциркуляции.
После 24 часов инкубации микрофизиологической модели в условиях микроциркуляции с добавлением в культуральную среду 0,1 мкМ доксирубицина из контура забрали 100 мкл культуральной среды. Клетки линии MDA-MB-231 использовали для анализа жизнеспособности с помощью метода МТТ.
Выделение тотальной РНК из образца культуральной среды осуществляли набором реагентов miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen, ФРГ) с добавлением 0,3 мкл GlycoBlue Coprecipitant 15 мг/мл (Thermo Fisher Scientific, США). Библиотеку кДНК для секвенирования микроРНК готовили с использованием набора реагентов CATS Small RNA-seq (Diagenode, Belgium). Секвенирования библиотеки кДНК осуществляли с помощью секвенатора Illumina NextSeq500 System. Результаты секвенирования обрабатывали с помощью алгоритма обработки данных BCGSC miRNA Profiling Pipeline с последующим представлением данных о представленности микроРНК в культуральной среде в виде двоичного логарифма CPM.
К клеткам линии MDA-MB-231 добавляли раствор МТТ до конечной концентрации 0.5 мг/мл. Далее через 4 часа культуральную среду удаляли, промывали клетки ФСБ и добавляли 500 мкл лизирующего буферного раствора (10% додецилсульфата натрия, 50% диметилформамида, уксусная кислота pH 4.7). Инкубировали при температуре 37°С с использованием шейкера в течение 1 часа. В качестве фона использовали пустые лунки, содержащие эквивалентное количество соответствующей питательной среды с 0.5 мг/мл МТТ. Затем переносили по 100 мкл раствора в чистый 96-луночный планшет с плоским дном.
Оптическую плотность раствора измеряли на длине волны 570 нм при помощи микропланшетного спектрофотометра BioRad X-mark (BioRad, США).
Жизнеспособность клеток MDA-MB-231 методом МТТ была оценена в 102%. Представленность микроРНК hsa-miR-222-3p составила 11,7 cpm, hsa-miR-99b-5p - 12,0 cpm, что соответствует, согласно вышеописанному способу оценки жизнеспособности, 100% жизнеспособных клеток линии MDA-MB-231.
Пример 4.
Изучение влияния 0,7 мкМ доксирубицина на клетки линии MDA-MB-231 после 24 часов инкубации в составе микрофизиологической модели в условиях микроциркуляции.
После 24 часов инкубации микрофизиологической модели в условиях микроциркуляции с добавлением в культуральную среду 0,7 мкМ доксирубицина из контура забрали 100 мкл культуральной среды. Клетки линии MDA-MB-231 использовали для анализа жизнеспособности с помощью метода МТТ.
Выделение тотальной РНК из образца культуральной среды осуществляли набором реагентов miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen, ФРГ) с добавлением 0,3 мкл GlycoBlue Coprecipitant 15 мг/мл (Thermo Fisher Scientific, США). Библиотеку кДНК для секвенирования микроРНК готовили с использованием набора реагентов CATS Small RNA-seq (Diagenode, Belgium). Секвенирования библиотеки кДНК осуществляли с помощью секвенатора Illumina NextSeq500 System. Результаты секвенирования обрабатывали с помощью алгоритма обработки данных BCGSC miRNA Profiling Pipeline с последующим представлением данных о представленности микроРНК в культуральной среде в виде двоичного логарифма CPM.
К клеткам линии MDA-MB-231 добавляли раствор МТТ до конечной концентрации 0.5 мг/мл. Далее через 4 часа культуральную среду удаляли, промывали клетки ФСБ и добавляли 500 мкл лизирующего буферного раствора (10% додецилсульфата натрия, 50% диметилформамида, уксусная кислота pH 4.7). Инкубировали при температуре 37°С с использованием шейкера в течение 1 часа. В качестве фона использовали пустые лунки, содержащие эквивалентное количество соответствующей питательной среды с 0.5 мг/мл МТТ. Затем переносили по 100 мкл раствора в чистый 96-луночный планшет с плоским дном.
Оптическую плотность раствора измеряли на длине волны 570 нм при помощи микропланшетного спектрофотометра BioRad X-mark (BioRad, США).
Жизнеспособность клеток MDA-MB-231 методом МТТ была оценена в 86%. Представленность микроРНК hsa-miR-222-3p составила 12,4 cpm, hsa-miR-99b-5p - 12,3 cpm, что соответствует, согласно вышеописанному способу оценки жизнеспособности, от 75 до 100% жизнеспособных клеток линии MDA-MB-231.
Пример 5.
Изучение влияния 2 мкМ доксирубицина на клетки линии MDA-MB-231 после 24 часов инкубации в составе микрофизиологической модели в условиях микроциркуляции.
После 24 часов инкубации микрофизиологической модели в условиях микроциркуляции с добавлением в культуральную среду 2 мкМ доксирубицина из контура забрали 100 мкл культуральной среды. Клетки линии MDA-MB-231 использовали для анализа жизнеспособности с помощью метода МТТ.
Выделение тотальной РНК из образца культуральной среды осуществляли набором реагентов miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen, ФРГ) с добавлением 0,3 мкл GlycoBlue Coprecipitant 15 мг/мл (Thermo Fisher Scientific, США). Библиотеку кДНК для секвенирования микроРНК готовили с использованием набора реагентов CATS Small RNA-seq (Diagenode, Belgium). Секвенирования библиотеки кДНК осуществляли с помощью секвенатора Illumina NextSeq500 System. Результаты секвенирования обрабатывали с помощью алгоритма обработки данных BCGSC miRNA Profiling Pipeline с последующим представлением данных о представленности микроРНК в культуральной среде в виде двоичного логарифма CPM.
К клеткам линии MDA-MB-231 добавляли раствор МТТ до конечной концентрации 0.5 мг/мл. Далее через 4 часа культуральную среду удаляли, промывали клетки ФСБ и добавляли 500 мкл лизирующего буферного раствора (10% додецилсульфата натрия, 50% диметилформамида, уксусная кислота pH 4.7). Инкубировали при температуре 37°С с использованием шейкера в течение 1 часа. В качестве фона использовали пустые лунки, содержащие эквивалентное количество соответствующей питательной среды с 0.5 мг/мл МТТ. Затем переносили по 100 мкл раствора в чистый 96-луночный планшет с плоским дном.
Оптическую плотность раствора измеряли на длине волны 570 нм при помощи микропланшетного спектрофотометра BioRad X-mark (BioRad, США).
Жизнеспособность клеток MDA-MB-231 методом МТТ была оценена в 18%. Представленность микроРНК hsa-miR-222-3p составила 14,5 cpm, hsa-miR-99b-5p - 12,8 cpm, что соответствует, согласно вышеописанному способу оценки жизнеспособности, от 0 до 25% жизнеспособных клеток линии MDA-MB-231.
Пример 6.
Изучение влияния 3,5 мкМ доксирубицина на клетки линии MDA-MB-231 после 24 часов инкубации в составе микрофизиологической модели в условиях микроциркуляции.
После 24 часов инкубации микрофизиологической модели в условиях микроциркуляции с добавлением в культуральную среду 3,5 мкМ доксирубицина из контура забрали 100 мкл культуральной среды. Клетки линии MDA-MB-231 использовали для анализа жизнеспособности с помощью метода МТТ.
Выделение тотальной РНК из образца культуральной среды осуществляли набором реагентов miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen, ФРГ) с добавлением 0,3 мкл GlycoBlue Coprecipitant 15 мг/мл (Thermo Fisher Scientific, США). Библиотеку кДНК для секвенирования микроРНК готовили с использованием набора реагентов CATS Small RNA-seq (Diagenode, Belgium). Секвенирования библиотеки кДНК осуществляли с помощью секвенатора Illumina NextSeq500 System. Результаты секвенирования обрабатывали с помощью алгоритма обработки данных BCGSC miRNA Profiling Pipeline с последующим представлением данных о представленности микроРНК в культуральной среде в виде двоичного логарифма CPM.
К клеткам линии MDA-MB-231 добавляли раствор МТТ до конечной концентрации 0.5 мг/мл. Далее через 4 часа культуральную среду удаляли, промывали клетки ФСБ и добавляли 500 мкл лизирующего буферного раствора (10% додецилсульфата натрия, 50% диметилформамида, уксусная кислота pH 4.7). Инкубировали при температуре 37°С с использованием шейкера в течение 1 часа. В качестве фона использовали пустые лунки, содержащие эквивалентное количество соответствующей питательной среды с 0.5 мг/мл МТТ. Затем переносили по 100 мкл раствора в чистый 96-луночный планшет с плоским дном.
Оптическую плотность раствора измеряли на длине волны 570 нм при помощи микропланшетного спектрофотометра BioRad X-mark (BioRad, США).
Жизнеспособность клеток MDA-MB-231 методом МТТ была оценена в 18%. Представленность микроРНК hsa-miR-222-3p составила 15,4 cpm, hsa-miR-99b-5p - 13,0 cpm, что соответствует, согласно вышеописанному способу оценки жизнеспособности, 0% жизнеспособных клеток линии MDA-MB-231.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет неинвазивно полуколичественно оценивать жизнеспособность клеток линии MDA-MB-231 в мультиорганной микрофлюидной модели. Применение данного способа позволит осуществлять анализ жизнеспособности опухолевых клеток при последовательном воздействии на них химиотерапевтическими препаратами. Данный подход найдет свое применение при персонализированном подборе схем химиотерапии, снизит требования к количеству необходимых для анализа опухолевых клеток, затраты на наращивание их необходимого количества.