Диагностический иммунохимический препарат на основе гексацианферрата железа для выявления онкоассоциированных экзосом в биологических жидкостях.
DIAGNOSTIC IMMUNOCHEMICAL PRODUCT ON THE BASIS OF IRON HEXACIANFERRATE FOR THE IDENTIFICATION OF ONCO-ASSOCIATED EXOSOMES IN BIOLOGICAL FLUIDS

Диагностический иммунохимический препарат на основе гексацианферрата железа для выявления онкоассоциированных  экзосом в биологических жидкостях.
Изобретение относится к иммунохимии и биотехнологии и направлено на извлечение полезного эффекта - бесприборной экспрессной диагностики и выявления онкомаркёров в биологических жидкостях человека.
С каждым годом заболеваемость онкологией только возрастает. Согласно последним статистическим данным, смертность от рака в мире составляет 70%. И если на ранних стадиях это заболевание поддаётся лечению, то на поздних опухоль порождает метастазы и становится неоперабельной.
Чтобы выявить рак на ранней стадии, а в большинстве случаев болезнь сначала проходит почти бессимптомно, необходимо с завидным постоянством посещать врача и проходить дорогостоящие и зачастую болезненные процедуры, такие как маммография или колоноскопия. К тому же, эти услуги предоставляются в городах с развитой медицинской инфраструктурой, тогда как в небольших населённых пунктах относительно простых способов диагностики рака пациентам и вовсе не предлагают.
В 2014 году  в  статье Andrew D. Warren et al. Point-of-care diagnostics for noncommunicable diseases using synthetic urinary biomarkers and paper microfluidics// Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Mar 11; 111(10): 3671–3676  был опубликован простой и дешевый метод экспресс-тестирования на онкологические заболевания. Диагностика рака, по аналогии с тестом на беременность, осуществляется с помощью образца мочи и бумажной тест-полоски, а ее результат готов уже через несколько минут. Но, в отличие от того же теста на беременность, экспресс-тест на выявление рака требует предварительного введения в организм специального препарата, который содержит наночастицы, взаимодействующие с белками протеазы опухоли. Результатом реакции являются биомаркеры-пептиды, выделяемые из мочи тестируемого. Эти биомаркеры и вызывают изменение цвета тест-полосок
Недостатком описанного метода является необходимость предварительного введения в организм наночастиц, а также нанесение антител на нитроцеллюлозную бумагу, что усложняет процесс проведения анализа.
На российском рынке также присутствует экспресс-тест для выявления в домашних условиях рака простаты производства ООО «Мед-Экспресс-Диагностика» (№ ФСР 2010/08485 от 04.08.2010). Указанный тест позволяет обнаружить специфический человеческий антиген предстательной железы в цельной крови.
Недостатком описанного теста является использование в качестве биологического материала крови, забор которого может быть некорректно произведен простым пользователем.
Одним из маркеров онкологических заболеваний являются онкоассоциированные экзосомы. Экзосомы, секретируемые опухолевыми клетками, играют важную роль в различных аспектах прогрессии заболевания: локальной инвазии, подавлении противоопухолевых иммунных реакций, стимуляции неоангиогенеза и формировании отдаленных метастазов. В настоящее время онкоэкзосомы выявляют приборными методами, например - иммуноферментным анализом (RU 2520741 C2 27.06.2014). Недостатком данного метода является его исполнение с использованием дорогих и дефицитных приборов, он невозможен к постановке в условиях хоум - тестинга. Общее время постановки занимает от 1 до 10 часов.
Целью изобретения является упрощение процесса диагностики, снижение времени проведения иммунохимического анализа, возможность его исполнения в моче пациента.
Поставленная цель достигается с использованием диагностического иммунохимического препарата в виде коллоидного раствора, содержащего, мас.%
Гексацианферрат железа
0,7717-4,1266
Антитела к онкоэкзосомам
0,0018-0,0019
Глутаровый альдегид
0,0230-0,0239
Деионизированная вода
остальное
Гидрозоли гексацианоферрата (II) железа (III) обладают разветвленной поверхностью, способны к адсорбции иммунных компонентов - антител и антигенов различной химической природы, стабильны, обладают яркой окраской.
Глутаровый альдегид является эффективным сшивающим агентом, получившим широкое применение для иммобилизации белков. Глутаровый альдегид, линейный 5-углеродный диальдегид, представляет собой прозрачную, бесцветную до бледно-соломенного цвета острую маслянистую жидкость, которая растворяется во всех пропорциях в воде и спирте, а также в органических растворителях.
Антитела к онокоэкзосомам, пригодные для использования в рамках настоящего изобретения, например, могут быть выбраны из антител к антигенам CD-9, СD-63, CD-81.
Препарат получают последовательным смешением компонентов. Сначала получают коллоидный раствор гексацианферрата железа в деионизированной воде. Затем в этот раствор вносят при интенсивном перемешивании антитела к онкоэкзосомам в  физиологическом растворе и глутаровый альдегид.
Процесс диагностики с помощью предлагаемого препарата осуществляют следующим образом. В сосуд из пластика или стекла осуществляют забор мочи. Далее вносят предлагаемый препарат в количестве 1/7-1/10 объема мочи, перемешивают. По прошествии 1-3 минут фиксируют изменение цвета смеси гидрозоля и мочи. В положительном варианте цвет остаётся синим, в отрицательном - изменяется от зеленого до полного обесцвечивания.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами исполнения.
Пример 1.
Заявляемый препарат получают следующим образом. Осуществляют создание коллоидного раствора гексацианферрата железа в деионизированной воде. Полученный гидрозоль имеет интенсивный синий цвет. Далее в этот раствор вносят при интенсивном перемешивании расчётное количество антител к онкоэкзосомам солидных опухолей (CD-9 в опытах 1 и 2, СD-63 в опыте 3, CD-81 в опытах 4 и 5) в  физиологическом растворе и глутаровый альдегид.
Составы получаемых гидрозолей представлены в таблице 1.
Таблица 1.
Компонент
Опыт 1
Опыт 2
Опыт 3
Опыт 4
Опыт 5
Гексацианферрат железа
0,7710
0,7717
2,4496
4,1266
5,0916
Антитела конкоэкосомам
0,0017
0,0018
0,0018
0,0019
0,0019
Глутаровый альдегид
0,0228
0,0230
0,0234
0,0239
0,0241
Вода деионизированная
До 100%
До 100%
До 100%
До 100%
До 100%
Далее полученный гидрозольный препарат и тестируемую мочу смешивают в сосуде из пластика либо стекла в объемном соотношении 1:7-10. По прошествии 1-3 минут фиксируют изменение цвета смеси гидрозоля и мочи. В положительном варианте цвет остаётся синим, в отрицательном - изменяется от зеленого до полного обесцвечивания.
Всего было исследовано 50 проб мочи от пациентов с верифицированным диагнозом "солидный рак", предлагаемый тест выявил положительную реакцию у 46 больных. В качестве контроля использовали мочу от 38 здоровых пациентов.
Результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2.
Опыт 1
Опыт 2
Опыт 3
Опыт 4
Опыт 5
% ложноположительных результатов
11
2
2
2
12
Как видно из таблицы 2, выход за пределы оптимальных дозировок приводит к увеличению числа ложноположительных проб.
Пример 2.
Приготовление препарата осуществляют по аналогии с методикой, описанной в примере 1, с той разницей, что используют антитела к онкоэкзосомам гематологических опухолей. Составы получаемых гидрозолей  аналогичны  составам, представленным ранее в таблице 1.
Постановка реакции также осуществлялась по аналогии с методикой, описанной в примере 1. Для подтверждения возможности применения получаемых препаратов по назначению было исследовано 48 проб мочи от пациентов с верифицированным диагнозом "гематологический рак", предлагаемый тест выявил положительную реакцию у 45 больных. В качестве контроля использовали мочу от 38 здоровых пациентов.
Результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3.
Опыт 1
Опыт 2
Опыт 3
Опыт 4
Опыт 5
% ложноположительных результатов
10
2
2
2
11
Таким образом, предлагаемый препарат позволяет осуществлять простое, быстрое  и достоверное  выявление онкоэкзосом в моче пациента, что позволяет производить диагностику раковых заболеваний в домашних условиях.