СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАХЕОБРОНХИАЛЬНОГО БИОИМПЛАНТА
METHOD OF OBTAINING TRACHEOBRONCHIAL BIOIMPLANT

Настоящее изобретение относится к области медицины и ветеринарии, в частности трансплантологии.
При развитии стеноза трахеи, вызванного злокачественными новообразованиями, инфекционными заболеваниями, послеоперационными осложнениями или травмой, возникает необходимость в резекции значительных участков органа. В ряде случаев невозможно формирование первичного анастомоза и требуется замена дефекта трансплантатом. Для восстановления целостности трахеи использовались различные протезы и ткани: замещение трахеальных дефектов аутологичными тканями, такими как надкостница, тонкая кишка, мышцы, пищевод, ткани бронха и аорты. Эти способы оказались малоэффективными и не позволяли формировать полноценный каркас трахеи. Кроме того, эти трансплантаты в дальнейшем замещались соединительной тканью, блокирующей воздухопроводящие пути [Grillo НС. Tracheal replacement: a critical review. Ann. Thorac. Surg. - 2002. - Vol.73. - P.1995-2004].
Известны аллотрансплантаты для замещения дефектов трахеи, содержащие эпителий и хрящевые кольца, которые являлись мишенями для отторжения [M.Sykes. Immune evasion by chimeric trachea. N. Engl. J. Med. -. 2010 - Vol.362. - P.172-174]. В большинстве случаев после прекращения иммуносупрессивной терапии наблюдалось отторжение трансплантированных тканей. Для предотвращения отторжения аллотрансплантата требуется проведение длительной неспецифической иммуносупрессивной терапии, вызывающей ряд побочных эффектов.
Известен способ получения биоимпланта трахеи, который послужил прототипом заявляемого способа [P.Macchiarini at al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway // Lancet. - 2008. - Vol.372. - P.2023-2030]. Для снижения иммуногенности и удаления молекул главного комплекса гистосовместимости МНС I и II классов образец трахеи выдерживали в дистиллированной воде в течение 72 часов, затем проводили деселлизацию путем инкубирования трахеи в смеси 4% раствора натрия деоксихолата и 2000 ед. дезоксирибонуклеазы в 1 mM/л натрия хлорида, всего 25 циклов в течение 6 недель. В последующем полученный матрикс заселяли аутологичными хондроцитами, генерированными из стволовых клеток костного мозга, и эпителиальными клетками слизистой оболочки воздухоносных путей реципиента. Подготовленный таким образом биоимплант главного бронха был пересажен пациенту.
Недостатки прототипа: 1) не обеспечивает стерильность матрикса биоимпланта, что может привести к гнойно-септическим осложнениям и к последующему его отторжению; 2) длительность получения биоимпланта (не менее 52 суток) не позволяет использовать его у больных с острой дыхательной недостаточностью, обусловленной дефектом или обтурацией воздухоносных путей; 3) нарушает структуру хрящевой ткани; 4) длительное пребывание тканевого образца в растворе, содержащем детергент и энзимы, неизбежно приводит к их сорбции, а после трансплантации к десорбции этих соединений, что замедляет процесс фиксации биоимпланта после трансплантации вследствие разрушения липидно-белковой оболочки клеток тканей реципиента. Эти обстоятельства ограничивают возможность применения данного способа у пациентов с декомпенсированным стенозом трахеи, в частности у онкологических больных, нуждающихся в незамедлительном хирургическом вмешательстве.
Задачей заявляемого изобретения является создание способа получения трахеобронхиального биоимпланта, состоящего из стерильного матрикса донорской трахеи/бронхов, покрытого белком и слоем мезенхимальных стволовых и эпителиальных клеток реципиента.
Заявляемый способ включает: механическое очищение ткани трахеи/бронхов донора от соединительной и жировой тканей, деселлизацию ткани трахеи/бронхов донора, криоконсервацию (при необходимости), выделение мезенхимальных стволовых CD271+ клеток из костного мозга реципиента методом иммуномагнитной сепарации, генерацию культуры мезенхимальных клеток реципиента, получение суспензии эпителиальных клеток реципиента, покрытие матрикса трахеи/бронхов белком сыворотки крови реципиента, заселение поверхности биоимпланта эпителиальными и мезенхимальными клетками.
Способ осуществляется следующим образом: образцы трахеи/бронхов донора механически очищают от жировой и соединительной тканей, промывают дистиллированной водой. С целью деселлизации трахею инкубируют в водном растворе хлорсодержащего окислителя (перхлорат натрия, хлорит натрия, гипохлорит натрия) в течение 10-14 суток. Затем образцы трахеи промывают стерильным физиологическим раствором. При необходимости образец может храниться в криоконсервирующей жидкости (1/9 смесь диметилсульфоксида и 6% раствора декстрана в 0,9% растворе хлорида натрия) при t -70°C. У реципиента производят забор костного мозга, из которого методом иммуномагнитной сепарации выделяют стволовые мезенхимальные CD 271+ клетки. Полученную клеточную суспензию культивируют в селективной среде MACS NH Expansion Medium (Miltenyi Biotec). Клетки слизистой оболочки воздухоносных путей без признаков патологии, полученные при биопсии, инкубируют в среде RPMI-1640 («Sigma», USA), содержащей 200 мкг/мл гентамицина, 1000 мкг/мл стрептомицина и 1000 МЕ/мл пенициллина, в течение 4 часов. Далее клетки инкубируют в среде RPMI-1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, инактивированной при t=56°C в течение 30 мин (Filtron, Victoria, Australia), 2 мМ L-глутамина, 100 МЕ/мл пенициллина G, 100 мкг/мл стрептомицина, 20 мкг/мл гентамицина. Полученный тканевой матрикс покрывают белком сыворотки крови реципиента, наносят на его внешнюю поверхность подготовленные суспензии клеточных культур и инкубируют в среде RPMI-1640 до имплантации.
Пример 1. Макро- и микроструктура, иммуногистохимические особенности неиммуногенного биоимпланта трахеи
4
Исследования проведены на мышах линии C57BL/6 весом 22-25 г. У мышей под эфирным наркозом удаляли трахею и механически освобождали ее от слизи, мышечных элементов, жировой и соединительной тканей; затем промывали дистиллированной водой. С целью деселлизации образцы трахеи инкубировали в 4%, 5%, 10% растворах перхлората натрия (NaClO) в течение 10 суток. Раствор обновляли трехкратно. Затем образцы отмывали физиологическим раствором и проводили морфологическое и иммуногистохимическое исследования. Экспрессию антигенов МНС I и II классов определяли в криостатных срезах образцов трахеи. Для этих целей использовали антитела МНС I-FITC и МНС II-FITC фирмы Coltag. Световую и флюоресцентную микроскопию проводили с использованием фотовидеосистемы фирмы Zeiss и программы Axiovision 2.
4
При деселлизации 4-10% растворами NaClO образцы трахеи сохраняли макроструктуру хрящевой и соединительной тканей при полном разрушении структуры слизистого и серозного слоев (Фиг.1-7). При иммунофлюоресцентном исследовании отпечатков биоимплантов не обнаружено специфической реакции на антигены гистосовместимости МНС I класса, определяли лишь единичные МНС II-положительные клетки.
Пример 2. Гетеротопная аллогенная трасплантация биоимпланта трахеи у мышей
2
2
Подготовку матрикса трахеи мышей осуществляли, как описано в примере 1, однако деселлизацию проводили с применением 4%, 6%, 10% растворов хлорита натрия (NaClO) в течение 10 суток. Затем тканевые образцы смачивали раствором CaCl в концентрации 100 мг/мл и наносили сыворотку крови. У мышей реципиентов линии Balb/c в дорзолатеральной области грудной клетки формировали подкожный карман, в который помещали деселлизированный матрикс. Мышам контрольной группы подшивали участок трахеи, не подвергавшейся химической обработке (интактный). Через 28 суток импланты извлекали и проводили гистологическое исследование. Световую микроскопию проводили с использованием фотовидеосистемы фирмы Zeiss (Германия) и программы Axio vision 2. На фиг.8 представлен образец интактной трахеи мыши через 28 суток после аллотрансплантации, а на фиг.9-11 - биоимпланты трахеи мыши через 28 суток после аллотрансплантации. Установлено, что в деселлизированных биоимплантах сохранялись хрящевые полукольца и соединительная ткань, в то время как хрящ интактной трахеи в контроле был полностью разрушен.
Пример 3. Гетеротопная ксеногенная трасплантация биоимпланта трахеи у собак
2
Подготовку образцов трахеи человека осуществляли, как описано в примере 1, но деселлизацию проводили с применением 4%, 7%, 10% растворов гипохлорита натрия (NaClO) в течение 14 суток. Образцы трахеи были криоконсервированы при t -70°C. Затем образцы трахеи смачивали раствором CaCl в концентрации 100 мг/мл и наносили сыворотку крови собаки-реципиента. Далее у животных в области паховой складки делали дугообразный разрез кожи и формировали подкожный карман, в который помещали биоимплант на 1 месяц. После имплантации у собак не наблюдалось симптомов общей или местной воспалительных реакций. Биоимпланты сохранили форму, хрящевую основу и эластичность (Фиг.12). На фиг.13-18 представлены биоимпланты трахеи человека, деселлизированные 4-10% растворами NaClO, до и после гетеротопной трансплантации собаке. При гистологическом исследовании было установлено, что через 1 месяц после имплантации микроструктура образцов полностью сохранялась, целостность хрящевой и мембранозной частей трахеи не претерпевала существенных изменений, признаки отторжения гетеротопных биоимплантов (лейкоцитарная инфильтрация, деструкция хряща) отсутствовали.
Пример 4. Подготовка и характеристика образцов индивидуализированных аллогенных бронхиальных биоимплантов человека
2
Подготовку образцов главного бронха человека осуществляли, как описано в примере 1, но деселлизацию проводили с применением 5% и 10% раствора гипохлорита натрия, а также 5% и 10% раствора хлорита натрия в течение 10 суток. Такая обработка обеспечивает удаление из ткани антигенов донора. Образцы бронха были криоконсервированы при t -70°C. Затем поверхность образцов смачивали раствором CaCl в концентрации 100 мг/мл, наносили сыворотку крови потенциального реципиента, проводили забор костного мозга (1,5 мл), из которого методом иммуномагнитной сепарации выделяли стволовые мезенхимальные CD 271+ клетки с использованием набора CD 271 Microbeads Kit (Miltenyi Biotec). Проводили направленную селекцию мезенхимальных клеток в селективной среде MACS NH Expansion Medium (Milteny Biotec) в течение 2 суток. На фиг.19 показано формирование колоний дифференцированных мезенхимальных клеток человека. Кроме того, потенциальному реципиенту проводили биопсию слизистой бронха без признаков патологии. Материал инкубировали в среде RPMI-1640 («Sigma», USA), содержащей 200 мкг/мл гентамицина, 1000 мкг/мл стрептомицина и 1000 МЕ/мл пенициллина, в течение 4 часов. Затем образец ресуспендировали, отмывали центрифугированием при 900 g в течение 5 минут от среды с антибиотиком и помещали в среду RPMI-1640, содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки, инактивированной при t=56°C в течение 30 минут (Filtron, Victoria, Australia), 2 мМ L-глутамина, 100 МЕ/мл пенициллина G, 100 мкг/мл стрептомицина, 20 мкг/мл гентамицина. На фиг.20-21 приведены микрофотографии культивируемых эпителиальных клеток слизистой бронхов человека. Окончательный этап подготовки биоимплантов предусматривал нанесение на внешнюю поверхность матрикса клеточной культуры мезенхимальных клеток, на внутреннюю - эпителиальных клеток реципиента. Затем образцы инкубировали 4 суток в среде RPMI-1640. За этот период на внешней поверхности каркаса бронхов сформировалась белково-клеточная оболочка. Таким образом, срок подготовки иммуноадаптированного биоимпланта составил 6 суток. На фиг.22-23 показана адгезия мезенхимальных клеток к поверхности матрикса, покрытого сывороточным белком, на фиг.24-25 - формирование слоя мезенхимальных клеток на основе хрящевого каркаса.
Технический результат
Заявляемый способ получения трахеобронхиального биоимпланта обеспечивает короткий цикл подготовки (15-21 сутки) индивидуализированного биоимпланта на основе стерильного матрикса с сохранением каркасной функции органа, покрытого белково-клеточной оболочкой, не обладающего гетерогенными иммунными свойствами. Криоконсервация не является обязательным этапом заявляемого способа, но позволяет в течение длительного срока сохранять подготовленный неиммуногенный матрикс. На основе данного образца в течение 5-7 суток может быть создан иммуноадаптированный биоимплант для трансплантации пациенту.
Изобретение иллюстрировано следующими фигурами (микрофотографиями):
4
Фиг.1 - Биоимплант трахеи мыши после обработки в 4% раствором NaClO. Ув. 100.
4
Фиг.2 - Биоимплант трахеи мыши после обработки в 5% раствором NaClO. Ув. 100.
4
Фиг.3 - Биоимплант трахеи мыши после обработки в 10% раствором NaClO. Ув. 400.
4
Фиг.4 - Разрушение слизистой оболочки трахеи в биоимпланте мыши после инкубации в 4% растворе NaClO. Окраска гематоксилин-эозином. Ув. 900.
4
Фиг.5 - Биоимплант трахеи мыши после инкубации в 4% растворе NaClO. Окраска гематоксилин-эозин. Ув. 200.
4
Фиг.6 - Биоимплант трахеи мыши после инкубации в 5% растворе NaClO. Окраска гематоксилин-эозин. Ув. 200.
4
Фиг.7 - Биоимплант трахеи мыши после инкубации в 10% растворе NaClO. Окраска гематоксилин-эозин. Ув. 200.
Фиг.8 - Образец интактной трахеи мыши через 28 суток после аллотрансплантации. Окраска гематоксилин-эозин. Ув. 400.
2
Фиг.9 - Биоимплант трахеи мыши после инкубации в 4% растворе NaClO через 28 суток после аллотрансплантации. Окраска гематоксилин-эозин. Ув. 900.
2
Фиг.10 - Биоимплант трахеи мыши после инкубации в 6% растворе NaClO через 28 суток после аллотрансплантации. Окраска гематоксилин-эозин. Ув. 400.
2
Фиг.11 - Биоимплант трахеи трахеи мыши после инкубации в 10% растворе NaClO через 28 суток после аллотрансплантации. Окраска гематоксилин-эозин. Ув. 400.
Фиг.12 - Образцы биоимплантов трахеи человека после инкубации в 4%, 7%, 10% растворе NaClO, имплантированных на 1 месяц собаке. Макрофотография.
Фиг.13 - Биоимплант трахеи человека после инкубации в 4% NaClO до имплантации. Окраска гематоксилин-эозин. Ув. 900.
Фиг.14 - Гетеротопный биоимплант трахеи человека после инкубации в 4% NaClO через 1 месяц после трансплантации собаке. Окраска гематоксилин-эозин. Ув. 900.
Фиг.15 - Биоимплант трахеи человека после инкубации в 7% NaClO до имплантации. Окраска гематоксилин-эозин. Ув. 900.
Фиг.16 - Гетеротопный биоимплант трахеи человека после инкубации в 7% NaClO через 1 месяц после трансплантации собаке. Окраска гематоксилин-эозин. Ув. 900.
Фиг.17 - Биоимплант трахеи человека после инкубации в 10% NaClO до имплантации. Окраска гематоксилин-эозин. Ув. 200.
Фиг.18 - Гетеротопный биоимплант трахеи человека после инкубации в 10% NaClO через 1 месяц после трансплантации собаке. Окраска гематоксилин-эозин. Ув. 200.
Фиг.19 - Культура мезенхимальных клеток человека. Ув. 400.
Фиг.20 - Клетки эпителия слизистой оболочки бронхов человека. Ув.900.
Фиг.21 - Культура эпителиальных клеток слизистой оболочки бронхов человека. Ув. 400.
Фиг.22 - Белково-клеточная оболочка внешней поверхности бронхиального биоимпланта, полученного после инкубации с 5% NaClO. Ув. 100.
2
Фиг.23 - Белково-клеточная оболочка внешней поверхности бронхиального биоимпланта, полученного после инкубации с 5% NaClO. УВ. 100.
Фиг.24 - Сформированный слой мезенхимальных клеток на поверхности бронхиального биоимпланта, полученного после инкубации с 10% NaClO. Ув. 900.
2
Фиг.25 - Сформированный слой мезенхимальных клеток на поверхности бронхиального биоимпланта, полученного после инкубации с 10% NaClO. Ув. 900.