Способ лечения опухолевых и воспалительных заболеваний с применением фотодинамической терапии
METHOD OF TREATING TUMOR AND INFLAMMATORY DISEASES USING PHOTODYNAMIC THERAPY

Изобретение относится к способам диагностики и лечения заболеваний, связанных с накоплением порфиринов, в частности заболеваний микробной и неопластической природы (опухолевые, воспалительные и т.д.), с применением фотодинамической терапии (ФДТ).
Уровень техники
Порфирины - промежуточные продукты на пути биосинтеза простетических групп хромопротеинов. Конечный продукт биосинтеза представляет собой комплекс протопорфирина IX с металлами; одним из наиболее распространенных является гем со включенным в центре молекулы железом (II). Гем обнаружен у всех организмов, за исключением анаэробных клостридий и молочнокислых бактерий. В организме человека синтез гема осуществляется во всех аэробных клетках и наиболее интенсивен в клетках печени и костного мозга. Двухвалентное железо в составе гема связывает молекулу кислорода, что позволяет ему выполнять транспорт и хранение кислорода и выступать посредником в аэробных процессах.
Другой значимый порфириновый пигмент - магнийсодержащий хлорофилл, который является ключевым элементом фотосинтеза. Считают, что фотосинтез возник у анаэробных бактерий. Способные к дыханию гетеротрофные микроорганизмы, произошедшие от предков, синтезировавших порфирины стали использовать порфиринсодержащие белки как переносчиков электронов (например, цитохромы) при анаэробном окислении веществ субстрата. Затем, присутствие порфиринов, используемых в дыхательной цепи преадаптировало клетки для фотосинтеза благодаря тому, что большинство из них поглощает видимый свет.Таким образом, можно с уверенностью сказать, что порфирины -неотъемлемая часть метаболизма как гетеротрофных, так и фотосинтезирующих бактерий, участвующая в получении энергии. Наконец, существует еще одна важная, сходная с порфиринами структура - витамин В12 (кобаламин). Ни животные, ни растения не способны синтезировать витамин В12. Продукция его доступна лишь микроорганизмам - бактериям, актиномицетам, сине-зеленым водорослям. Кобаламин служит источником образования двух коферментов: дезоксиаденозилкобаламина в митохондриях и метилкобаламина в цитоплазме. Первый участвует в метаболизме жирных кислот с нечетным числом углеродных атомов и аминокислот с разветвленной углеводородной цепью; второй участвует в образовании метионина из гомоцистеина и в превращениях производных фолиевой кислоты, необходимых для синтеза нуклеотидов, что делает кобаламин незаменимым для делящихся клеток.
Несмотря на столь важные функции порфиринсодержащих белков и их широкую распространенность, стоит еще раз упомянуть, что сами порфирины, за исключением протопорфирина, являются побочными продуктами, которые покидают путь биосинтеза вследствие необратимого окисления соответствующего порфириногена, и не несут никакой физиологической функции, но приобретают, в отличие от своих предшественников, окраску и способность к флуоресценции.
Как и любые побочные продукты метаболизма порфирины должны быть удалены сначала из клеток в кровь, а затем с мочой и калом из организма. Конечными продуктами катаболизма гема являются циклические тетрапирролы, называемые желчными пигментами, а не порфирины, в то время как у здоровых людей порфирины все же присутствуют в небольших количествах в эритроцитах, моче и кале. Повышение концентрации наблюдается при повреждении клеток или воспалительных процессах, когда повышается проницаемость цитоплазматической мембраны и порфирины, являясь липофильными соединениями, с легкостью мигрируют в окружающие ткани или в соседние клетки.
Таким образом, действие на организм человека различных приводящих к повреждению клеток стрессовых факторов, таких как травмы, инфекционные, неинфекционные (опухоли и др.) заболевания, отравления или даже интенсивная физическая нагрузка, будут провоцировать повышение концентрации порфиринов.
Метод ФДТ основан на использовании светочувствительных веществ - фотосенсибилизаторов, которые способны селективно (избирательно) накапливаться в злокачественных, патологически измененных или пораженных вирусами или микробами клетках. При активации фотосенсибилизатора волновым излучением (светом), молекулярный кислород переходит высокоактивную синглетную форму, что запускает цепь окислительных реакций в патологических клетках, приводя к их гибели. Следует отметить, что без присутствия кислородсодержащего препарата реакция ФДТ не происходит.
Из уровня техники известен способ лечения воспалительных и опухолевых заболеваний методом фотодинамической терапии с использованием фотосенсибилизатора на основе производных хлорофилла (например, препарата «Радахлорин») (см. патент РФ RU 2345803, 10.02.2009, наиболее близкий аналог). Согласно данному способу фотосенсибилизатор активируют вне организма пациента путем воздействия источниками волновой энергии мощностью 0,1-20000 Вт, в дозе 1-100000 Дж и вводят в организм пациента.
Недостатком известного способа является отсутствие пробоподготовки и надлежащего контроля за активацией фотосенсибилизатора, отсутствие критериев активации препарата вне организма, динамики накопления фотосенсибилизатора в биологических жидкостях, тканях и органах организма в процессе подготовки к ФДТ, во время и после терапии, а также определения оптимальных для каждого пациента параметров проведения ФДТ и объективных критериев реабилитации пациента.
Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является разработка высокоэффективного комплексного физико-химического и/или физико-биологического метода диагностики, лечения и реабилитации опухолевых или воспалительных заболеваний.
Техническим результатом изобретения является повышение эффективности и селективности воздействия фотосенсибилизатора на пораженные клетки, снижение времени восстановления пораженных органов и тканей, снижении токсической нагрузки на непораженные ткани и органы, возможность контроля процесса лечения и реабилитации, внесение необходимых изменений, а также расширение возможностей способа для диагностики и лечения различных типов воспалительных или опухолевых заболеваний.
2
Указанный технический результат достигается за счет того, что способ лечения заболеваний, связанных с накоплением порфиринов, включает применение фотодинамической терапии с использованием препарата на основе хлорофилл содержащего фотосенсибилизатора, при которой осуществляют предварительное накопление не активированного фотосенсибилизатора в организме и\или активацию фотосенсибилизатора вне организма путем воздействия на препарат источника волновой энергии и последующее введение обработанного препарата в организм пациента. При активации фотосенсибилизатора вне организма дополнительно проводят обогащение препарата кислородом посредством барботирования и/или добавления кислородсодержащего соединения, а воздействие источника волновой энергии осуществляют с плотностью мощности не менее 10 мВт/см и дозе облучения не менее 0,02 Дж. Перед введением препарата осуществляют определение индивидуальных для пациента параметров фотодинамической терапии, включающих концентрацию фотосенсибилизатора в препарате и параметры его активации. Определение индивидуальных параметров фотодинамической терапии предусматривает два варианта. Первый вариант включает забор проб микробосодержащего субстрата пациента, обработку проб субстрата препаратами, характеризующимися различными содержаниями фотосенсибилизатора и параметрами его активации, воздействие на пробы нефлюоресцирующего детергента и определение нефелометрических индексов проб до и после воздействия нефлюоресцирующего детергента, при этом для фотодинамической терапии используют препарат соответствующий пробе с наибольшим отношением нефелометрического индекса после воздействия к нефелометрическому индексу до воздействия. Второй вариант включает анализ зоны задержки роста соответствующих микробов при воздействии проб препарата, характеризующихся различными содержаниями фотосенсибилизатора и параметрами его активации, при этом для фотодинамической терапии используют препарат, соответствующий пробе с наибольшей зоной задержки роста указанных микробов. Кроме того, в процессе фотодинамической терапии осуществляют периодический контроль накопления фотосенсибилизатора в тканях организма пациента путем оценки интенсивности флюоресценции патологического объекта или путем непосредственного внешнего или эндоскопического исследования тканей, или по индивидуальному нормированному индексу флюоресценции плазмы крови. Введение препарата прекращают после того, как интенсивность флюоресценции перестает по существу изменяться или достигает значения, не менее чем в 1,5 раза превышающего значение интенсивности флюоресценции интактных тканей.
Кроме того, предусмотрены частные варианты реализации способа, согласно которым:
- используют препарат в виде раствора, содержащего 0,035-10 мас. % фотосенсибилизатора, осуществляют дополнительную активацию хлорофиллсодержащего фотосенсибилизатора в организме пациента путем воздействия источником волновой энергии,
- препарат вводят внутривенно и/или перорально и/или ректально и/или методом аппликации, для фотодинамической терапии используют хлорофиллсодержащий препарат, например «Радахлорофилл-С» или «Фотостим»,
- осуществляют предварительное определение патологического объекта организма, а также его контроль в процессе и после проведения фотодинамической терапии методом флуоресцентной или раман, или раман-флуоресцентной диагностики,
- осуществляют предварительный контроль нормированных показателей аутофлуоресценции различных биологических жидкостей пациента.
Осуществление изобретения
2
Заявленное изобретение характеризует комплексный метод лечения опухолевых и/или воспалительных заболеваний с применением хлорофиллсодержащего сенсибилизатора, который обеспечивает эффективное накопление в месте локализации патологического объекта:икробной и/или опухолевой природы. Данный препарат по составу аналогичен хлорофиллу растений, что определяет и обеспечивает безвредность и доступность. Для повышения эффективности ФДТ в заявленном изобретении активация фотосенсибилизатора осуществляется вне организма, что позволяет повысить точность и эффективность объемной активации. При этом активация проводится путем воздействия волнового источника излучения (света), при котором происходит возбуждение молекул фотосенсибилизатора и повышается его реакционная активность, а также путем дополнительного обогащения препарата кислородом. Определены минимальные значения плотности мощности излучения - 10 мВт/см и дозы облучения - 0,02 Дж, при которых воздействие света способствует активизации хлорофилла и его производных с переносом энергии на кислород тканей.
Представленная комплексная медицинская технология способствует профилактике заболеваний, особенно, при диагностике и лечении скрытых патологических объектов, повышению эффективности и скорости диагностики, индивидуально обоснованной терапии заболеваний и процессов микробной и неопластической природы. В связи с возможностью профилактики, ранней экспресс-диагностики заболеваний и дальнейшего комплексного лечения увеличивается социальная значимость предлагаемого способа, так как уровень здоровья населения можно будет поддерживать на постоянном адекватном метаболическом и структурно - функциональном индивидуально обоснованном гомеостатическом уровне, а при возникновении патологических состояний(выявлении и/или объективном подозрении на их наличие) эффективно помогать, воздействуя на разные уровни выявления патологических состояний организма человека (на принципе обратной связи).
Заявленный способ диагностики и лечения включает следующие этапы Предварительная диагностика.
Предварительная диагностика может включать выявление патологических объектов (органов и тканей) организма методами лазерно-конверсионной диагностики (ЛКД), основанными на воздействии лазерного излучения на пробу вещества, сбор рассеянного излучения и его последующем спектральном анализе. В частности, могут применяться флуоресцентные, раман или раман-флюоресентные методы (см., например, патент на полезную модель RU 144665, 27.08.2014).
1
3
Для диагностики скрытых (с неизвестной топографией), для мониторинга или скрининга очагов инфекции и\или неопластических процессов может осуществлять периодический контроль нормированных показателей аутофлуоресценции различных биологических жидкостей пациента (плазмы крови, слюны, мочи, мокроты, экссудатов, транссудатов и др.), регистрируемых в соответствии его геронтологическими градиентами жизни. В частности, вычисляют нормированный индекс флуоресценции, определяемый как отношение интенсивности флуоресценции биологического объекта в геронтологической норме к значению интенсивности в момент введения фотосенсибилизатора. Изменение данного показателя более чем на 5-20% свидетельствует о развитии скрытого патологического объекта и необходимости профилактического и/или лечебного применения ФДТ. При этом для реализации указанных методов ЛКД необходимо применение аппаратов с высокой степенью аналитической и диагностической чувствительности порядка 5⋅10-5⋅10 КОЕ/МЛ.
Определение индивидуальных параметров фотодинамической терапии
Препараты для проведения ФДТ выпускают в различных концентрациях для разных способов введения, например, для внутривенного введения используют 0,035%-ный раствор, для перорального введения и аппликаций - 5-7%-ный раствор. Однако возможно менять концентрацию препарата путем разбавления или выпаривания стандартизированных растворов.
При определении индивидуальных параметров терапии осуществляется подбор оптимальной концентрации фотосенсибилизатора в препарате и параметров его активации.
Это может быть осуществлено двумя методами:
1. Нефелометрический метод.
Согласно данному методу у пациента берутся пробы асептично микробосодержащего субстрата (гнойное отделяемое, слюна, моча, плазма крови, транссудаты, экссудаты, ликвор или их комбинация) в объеме не менее 0,001-0,1 мл и помещается в стерильную емкость. Производят замер исходной интенсивность флюоресценции в нормированных единицах.
2
2
2
Далее пробы субстрата обрабатывают препаратами с различными концентрациями фотосенсибилизатора и параметрами активации (плотность и доза лазерного излучения, дополнительная активация введением кислорода). Например, используют 5-%ный раствор препарата в активированной и неактивированной форме, и, аналогично, разведеннный в 10 и 100 раз препарат. Для подбора методов активации осуществляют воздействие лазерным излучением разными дозами (не менее 0,02 Дж и не более 20 Дж) и плотностями мощности (не менее 10-20 мВт/см) без дополнительной активации и с дополнительной активацией путем барботирования в течение не менее 30 секунд и/или добавлением НО различных концентрациях.
Затем, не менее чем через 30 мин после действия препарата (в активированной и неактивированной форме) определяют нефелометрический индекс (мутность) полученных взвесей. После этого в каждую пробу вводят раствор нефлюоресцирующего детергента, например, мирамистина в конечной концентрации в смеси не менее 0,1-0,2%, повторно выдерживают взвесь с детергентом не менее 1-20 минут и снова аналогичным образом определяют нефелометрический индекс. Путем сравнения измеренных до и после нефелометрических показателей определяют нормированный нефелометрический индекс, выражающий отношение значения нефелометрического индекса после введения детергента к индексу до введения. При этом для дальнейшего лечения используют препарат, имеющий наибольший нормированный индекс. Для исключения влияния концентрационного тушения флюоресценции на итоговые результаты допускается разведение исследуемого субстрата в 10 и более раз.
2. Микробиологический метод.
В данном методе используют анализ конкретных микробов, являющихся причиной заболевания конкретного пациента. Чашки Петри с питательной средой засеивают монокультурой микроба и накладывают на них микропористые диски, смоченные препаратом с различными концентрациями и методами активации. Не менее чем через 1-3 часа определяют размеры зон задержки роста микроба препаратом вокруг диска (она должна быть не менее 10-20 мм). При этом для дальнейшей терапии применяют препарат, соответствующий пробе с наибольшей зоной.
Следует также упомянуть возможность осуществления подбора параметров ФДТ путем анализа показателей флуоресценции проб до и после обработки препаратом.
Проведение фотодинамической терапии.
Для проведения ФДТ используют препарат в виде раствора, включающего от 0,035 до 10 мас. % хлорофиллсодержащего фотосенсибилизатора. В качестве примера может быть использован препарат «радахлорофилл-С», содержащий соли щелочных металлов (натрия и калия) (см. патент РФ №21839566 27.06.2002). Конкретную концентрацию препарата подбирают в зависимости от способа введения и типа заболевания описанными выше способами.
2
Д ля проведения терапии препарат активирует вне организма воздействием источника волновой энергии с плотностью мощности не менее 10 мВт/см и дозе облучения не менее 0,02 Дж. в присутствии кислородсодержащего препарата. Для этого, осуществляют дополнительную активацию фотосенсибилизатора путем обогащения раствора кислородом. Введение кислорода может осуществляться посредством барботирования раствора или его разбавления кислородсодержащими соединениями в жидкой форме (например, раствором перекиси водорода). Конкретные параметры активации подбирают индивидуально для каждого пациента описанным выше способом.
Активированный препарат может вводиться в организм пациента различными способами в зависимости от типа заболевания, например, внутривенно, перорально, ректально, методом аппликации и т.д. Например, при пероральном введении препарат применяют каплями при достижении дозы не менее 1-3 чайных ложек. Допускается предварительное введение в организм не активированного препарата в течении не менее 10-30 дней для лучшего его накопления в тканях и органах,особенно при хронической патологии и/или скрытой, когда поступление препарата в объект (очаг) патологии возможно затруднено из за нарушенного и/или замедленного кровотока.
После введения препарата в организм может осуществляться его дополнительная активация путем воздействия волнового излучения непосредственно на очаг поражения (ткань или орган,биологические жидкости).
При этом перед применением активированного препарата желательно принимать неактивированный препарат не менее 1- 2 месяцев для его накопления в тканях. Активированный препарат принимают в течении не менее 1-3 недель и/или используют дополнительную активацию препарата экстра- или интракорпоративным облучением лазерным излучением при клиническом и ЛКД контроле качества и эффективности процесса реабилитации пациента, его корректировки (при необходимости).
Контроль процесса фотодинамической терапии
Для определения эффективности проводимой терапии и внесения необходимых корректировок осуществляют контроль накопления фотосенсибилизатора в патологических тканях организма пациента путем определения интенсивности флюоресценции патологического объекта или предполагаемой его топографии или различных биологических субстратов, связанных с патологическим объектом до, в процессе и после проведения курса терапии. Для этого могут применяться различные методы нефелометрии и/или ЛКД (раман и/или флуоресцентной ее составляющей) диагностики.
При наличие прямого доступа к биологическому объекту осуществляют анализ кожи и видимых слизистых оболочек. Также возможно применение эндоскопических исследований органов и тканей, например, в случае поражения пазух челюстно-лицевой области, внутреннего уха, желудка, кишечника, суставов, матки и т.д. При отсутствии доступа к биологическому объекту осуществляют определение нормированного индекса флуоресценции плазмы крови, по отношению к индивидуальному нормированному показателю флуоресценции, измеренному в геронтологической норме (проводят каждые 5 лет).
Время накопления фотосенсибилизатора тем меньше, чем выше допустимая для применения концентрация препарата (для перорального и ректального введения составляет около 3-7 мас. %, для внутривенного введения не более 0,05 мас. % для избежания клинически выраженного фототоксического действия препарата).
Препарат вводят в организм пациента до тех пор, пока измеренное (или определенное) значение интенсивности флуоресценции не перестанет подвергаться существенным изменениям (кривая значений не выйдет на «плато») или не менее чем в 1,5 раза (в некоторых случаях в 2-3 раза) превысит значение интенсивности флуоресценции интактных тканей, т.е. аналогичных непораженных тканей и/или биологических жидкостей, подвергаемым исследованиям.
При наличие данных по нормированным индексам флуоресценции ФДТ проводят до их нормализации для данного показателя у конкретного пациента.
Пример 1
Проводили лабораторные исследования эффективности заявленного способа путем:
1. Обоснования технологии выбора, регистрации и активации хлорофилл содержащего препарата (Фотостим, Радохлорофилл С);
2. Моделирования объемной ФДТ в пробирке.
3. Исследования накопления хлорофилл содержащего препарата в тканях и органах,
4. Исследования эффекта воздействия объемной активированной ФДТ на микробы и опухолевые клетки (культуральный материал) in vitro.
5. Моделирования эффекта объемной активированной ФДТ на животных (карцинома Эрлиха).
Во всех исследованиях и клинических наблюдениях использовали сертифицированный аппаратно-программный комплекс раман-флюоресцентной диагностики «Ин Спектр М» с чувствительностью не менее 50×1-10×3 КОЕ\мл.
Для исследований по этапам 1 и 2 использовали неактивированный и активированный хлорофилл содержащий препарат (Фотостим или Радохлорофилл С) и аналоги различных производителей.
Для выявления накопления хлорофилл содержащего препарата (третий этап) в органах и тканях (мыши в возрасте 2 мес.и весом 70-80 г) лабораторных животных разделили на 4 группы по 15 мышей в каждой: 1 группа получала стандартный корм и чистую воду; 2 группа аналогичный корм и в качестве питья препарат фотостим в концентрации 0.07%; 3 группа - в концентрации 0.007%; в 4 - в концентрации 0.0007%. Через 1 месяц животных усыпляли и исследовали метотом лазерной флюоресцентной диагностики на аппарате «ИнСпектр М» для регистрации нормированных показателей(по отношению к контролю) накопления флюоресцирующего препарата Фотостим в различных органах и тканях животных.
Исходя из представленной концепции в качестве модельного объекта (4 этап) использовали культуру микробов - 20 тест образцов (из них 5 - контрольная группа). Для проведения эксперимента были взяты два микроорганизма Ps.aeruginosa и S.aureus.
8
В качестве основы для эксперимента был взят диско-диффузионный метод, основанный на диффузии антибиотиков из носителя в плотную питательную среду и ингибиции роста исследуемой культуры в той зоне, где концентрация антибиотика превосходит минимальная подавляющая концентрация (МПК). Из чистой суточной культуры Ps.aeruginosa и S.aureus, выращенной на неселективной плотной питательной среде с помощью дистиллированной воды, готовили инокулят 0.5 по МакФарланду, что соответствует концентрации 1×10 КОЕ/мл. Полученный инокулят наносили на MX агар.
Затем помещали диски пропитанные, предварительно активированным кислородсодержащим препаратом и лазерным излучением с длиной волны 0.63 нм, 0.514 нм, 0.405 нм в дозе 0.2-20 дж/мл), в концентрации 0.7%, 0.07% и 0.007%. В качестве контроля использовали стерильные диски, диски с неактивированным препаратом (в тех же концентрациях), диски с препаратом после воздействия на него кислородсодержащего водного раствора, диски с кислородсодержащим водным раствором (перекись водорода 3%).
8
В другом варианте эксперимента готовили инокулят из чистой суточной культуры Ps.aeruginosa, выращенной на не селективной плотной питательной среде, с помощью дистиллированной воды, 0.5 по МакФарланду, что соответствует концентрации 1×10 КОЕ/мл. Добавляли в него Фотостим, исходной концентрацией 0.7%, с добавлением 3% раствором перекиси водорода, активировали лазерным излучением. Далее проводили измерение спектров на приборе «ИнСпектр М» и делали высев на плотную питательную среду. Исследование проводилось в следующих временных интервалах: сразу, через 30 минут, 1 час, 1 час 30 минут, 2 часа, 2 часа 30 минут.
3
Исследование эффекта воздействия объемной активированной ФДТ на опухолевые клетки проводилось на клетках линии хронической миелогенной лейкемией К562. Изучалось воздействие ФДТ на миграцию опухолевых клеток с использованием камеры Бойдена 96 - Well Filtration Plate Multiscreen TM - MIC с размером пор 8 мкм (фирма Millipore). В верхний отсек камеры помещалась взвесь клеток линии в объеме 60 мкл и количестве 60±1×10. В нижний отсек камеры вносили хемоаттрактант/лиганд в объеме 175 мкл в концентрации 5 мкг/мл (DNA_lig) и в концентрации 200нг/мл (CXCL12). Исследование хемотаксиса проводился в динамике через 10, 60 мин и через сутки с использованием вышеперечисленных лигандов. Перед проведением эксперимента пробирки с концентрациями препарата 0.7%, 0.07%, 0.007%, с использованием перекиси водорода облучались лазерным излучением с длиной волны 0.63 нм,0.514 нм,0.405 нм в дозе 0.2-20 дж/мл), после чего в пробирки помещались клетки и в дальнейшем исследовалась их мигрирующая способность.
Культуру клеток карциномы Эрлиха (5 этап) использовали в качестве объекта исследования для заражения ею лабораторных мышей (вводили внутрибрюшинно по 0.1 мл) в возрасте 2 мес.и весом 70-80 г (45 тест образцов и 15-контрольная группа). Результаты учитывали по срокам гибели мышей на фоне асцита, вызванного карциномой Эрлиха. 15 мышей контрольной группы не заражали.
Для объективной оценки результататов исследований были выбраны оптимальные параметры времени и мощности излучения лазера, при которых не наблюдается эффект выгорания(не возмущающая и воспроизводимая диагностика): мощность 2,5 мВт и время экспозиции 50 мс для лазера с длиной волны 405 нм и, при которых эффект выгорания составляет не более 5%; мощность 170 мкВт и время экспозиции 100 мс для лазера с длиной волны 532 нм, при которых эффект выгорания составляет не более 5%; аналогичные параметры - для лазера с длиной волны 637 нм, при которых эффект выгорания составил не более 6%.
Наиболее эффективными длинами волн возбуждения являются - 405 нм и 637 нм.
Исследование действия объемной активированной ФДТ на культуру микробов и опухолевых клеток показали, что при использовании активированного фотостима наблюдалось незначительное подавление зоны роста. микроорганизма через 24 часа, при этом не активированный препарат с Ps.aeruginosa не давал задержки зоны роста, а у S.aureus наблюдалась минимальное подавление зоны роста.
2
Показана значительно более высокая бактерицидная эффективность активированного вне бактериального субстрата препарата фотостим. Наибольшая зона задержки роста (20- 30 мм) выявлена при концентрации препарата-0.7%+3%HO г и дозе лазерного облучения 20Дж. Полученный эффект сравним с бактерицидным действием антибиотика цефепима, как объекта сравнения (цефепим 30 мг, диск на 12 часа, на всех чашках Петри).
Таким образом, было подтверждено, что способность фотосенсибилизатора накапливаться в измененных тканях, микробных клетках с реализацией эффекта летальной фотосенсибилизации бактерий может быть использована при лечении заболеваний и процессов микробной природы, в том числе при выявлении антибиотикорезистентных штаммов патогенных микроорганизмов. При этом эффекта привыкания к препарату не выявлено.
Исследование миграции опухолевых клеток под воздействием хемокина CXCL12 и без него при инкубации клеток с разными концентрациями препарата (0.7%, 0.07%, 0.007%) и при разной длительности воздействия лазера (0, 10 и 100 секунд) с использованием перекиси водорода выявлено, что чем выше концентрация препарата тем ниже эффект миграции опухолевых клеток(в 4-8 раз). Полученные результаты имеют высокую воспроизводимость и степень достоверности.. Таким образом, можно сказать, что ФДТ может снижать миграционную активность опухолевых клеток, что потенциально может быть использовано для блокировки процесса метастазирования у онкологических больных.
2
2
При апробации методики объемной активированной ФДТ при лечении опухолей (карцинома Эрлиха у мышей) установлено, что мыши в группе с чистым контролем были активны и живы в течении всего исследования (1 год). Мыши со вторым чистым контролем быстро увеличивались в размерах (асцит) и погибали на 4-6 день. Мыши, принимавшие не активированный хлорофилл содержащий препарат или раствор 1:10 HO 3% погибали на 6-12 день. Мыши, принимавшие не активированный препарат 1 месяц и затем активированный препарат в разведении 1:10 до последнего дня жизни, жили 21-24 дня, а при его разведении 1:1000 - погибали в пределах 10 дней.
Таким образом убедительно показан противоопухолевый эффект хлорофилл содержащего препарата, активированного вне организма, особенно при предварительном накоплении препарата в организме животного до введения онкосодержащего субстрата.
Пример 2.
С помощью заявленного способа проводили лечение женщин с хроническим эндометритом, гиперплазией эндометрия и бесплодием. Было обследовано 1460 женщин в возрасте 38-42 года, которым предстояла программа ЭКО. При обследовании (гистероскопия и биопсия эндометрия) были выявлены: простая гиперплазия эндометрия без атипии - у 7, сложная гиперплазия эндометрия без атипии - у 5 и сложная гиперплазия - у 4 пациенток. При этом характер рецидивирующей сложной гиперплазии эндометрия после неоднократных повторных курсов гормональной терапии был у 3 женщин. Всем женщинам была проведена объемная фотодинамическая терапия под контролем лазерной люминисцентной спектроскопии в течение 4-6 недель с предварительным введением не активированного препарата в течении 20-30 дней и активированного в течении не менее 6-10 дней. Дополнительно проводили активацию препарата внутриматочный лазерным облучением в указанных дозах.Контрольная верификация проведена клийнически и морфологически. Ни у одной женщины не выявлены признаки гиперплазии эндометрия. «Доклинические» онкологические заболевания (рак эндометрия) у 2 из всех (1460) обследованных пациенток.
Для каждого пациента определяли индивидуальные параметры ФДТ: концентрацию фотосенсибилизатора, плотность мощности и дозу излучения и т.д., согласно вышеописанным способам. При этом использовались растворы препарата «Фотостим» В некоторых особо тяжелых клинических случаях использовали дополнительную активацию препарата барботированием раствора или его разбавления перекисью водорода. Терапию осуществляли под контролем ЛКД.
В результате применения комплексной терапии у 238 (91%) наблюдалось повышение регенеративной активности эндометрия и его функциональных резервов. В течение 3 месяцев после лечения в программах ЭКО беременность наступила у 95 (36,5%) пациенток.
По данным УЗИ имело место достоверное улучшение М-ЭХО, прирост был большим, по сравнению с озонотерапией и составил до 5,9 и после 8,1 мм (Р<0,001), т.е. прирост составил 2,2 мм. У 52,5% женщин отмечалось улучшение морфофункционального состояния эндометрия, характеризующееся однородностью эхоструктуры эндометрия в периовуляторное окно.
Для сравнения озонотерапия оптимизировала этот параметр лишь у 35% пациенток.
По данным ультразвукового исследования применение предлагаемой ФДТ технологии активировало кровоток в сосудах маточных артерий и нормализовалопролиферативную активность эндометрия.
Исходя из данных флюоресцентной спектроскопии ФДТ способствовала нормализации пролиферативной активности эндометрия, улучшению метаболических процессов и структурированности эндометрия. При этом по данным анализа результатов исследования системы гемостаза под влиянием ФДТ как фотобиостимулирующей терапии с использованием природного фотосенсибилизатора «Фотостим» не выявлено изменений большинства исследованных показателей (эти показатели до и после лечения находились в пределах биологической нормы).
Пример 3.
Клинический случай: пациентка 38 лет, наблюдалась в клинике репродуктивного здоровья по поводу первичного бесплодия и готовилась вступить в программу ЭКО. Согласно приказу проводилось комплексное обследование, в процессе которого была диагносцирована гиперплазия эндометрия. Была произведена гистероскопия и раздельное диагностическое выскабливание эндометрия и эндоцервикса. Гистологическое заключение: сложная атипическая гиперплазия. Женщина отправилась в Германию на лечение. Немецкие врачи назначили гормональное лечение: гестагены - утрожестан в дозе 600 мг в непрерывном режиме на 3 месяца. Через 3 месяца они же выполнили гистероскопию и биопсию эндометрия из 4 разных точек стенок полости матки. Гистологический диагноз был тот же, атипическая гиперплазия эндометрия без малигнизации. Лечение было продолжено с увеличением дозы утрожестана до 800 мг в сутки. Через 3 месяца проведена повторная гистероскопия и биопсия эндометрия из 6 точек - диагноз атипическая гиперплазия эндометрия без малигнизации. Обсуждался вопрос о радикальном лечении (удаление матки) в связи с неэффективностью консервативной терапии. Женщина отказалась. Тогда было предложено провести курс лечения с использованием фотостима (хлорофилл содержащий препарат) с предварительной эстракорпоральной активацией лазерным излучением с длиной волны 0,63 мкм (объемная фотодинамическая терапия), что и было сделано в течение 6 недель. После этого была произведена гастроскопия с тотальным выскабливанием эндометрия, учитывая прошлый диагноз. Гистологическое заключение показало, что эндометрий с признаками атрофии и атипических клеток не обнаружено.
Пример 4
На амбулаторном лечении находилось 20 пациентов с остеоартрозом (OA) коленного сустава, верифицированного клинически и рентгенологически и обследованных методом ЛКД.
Лечение пациентов проводили по описанной методике с использованием сначала не активированного (1 месяц), а затем активированного препарата «Фотостим» в течении 10-20 дней до получения клинически и рентгенологически выраженного саногенетического эффекта. Активированный препарат давали капельно (начальная доза 5 капель) и доводили его до объема, равного 1-3 чайной ложки.
На первом этапе исследования было установлено, что чувствительность и специфичность метода ЛКД диагностики (флюоресцентный составляющая) суставного хряща у больных с OA близки к 99-100%. Результаты исследования показаны в Таблице 1.
При этом на втором этапе исследования выявлено, что интенсивность флюоресценции в интактной точке (интактный хрящ) значительно отличается от таковой в исследуемых областях и составляет около от 10000 до 20000 относительных единиц интенсивности флюоресценции (ОЕ). Максимальный пик флюоресценции приходится на величину волнового числа - 5450/пм. При этом показано, что интактный (Т-1) и патологически измененный хрящ (Т-2) имеют различия по спектральной интенсивности флюоресценции в 4-6 раз. Набухший и разволокненный хрящ (Т-2) и узурированный и трещиноватый хрящ с просветами субхондральной кости (Т-3) имеют различия по интенсивности флюоресценции в пять раз, а интактная компактная кость (Т-4) имеет интенсивность флуоресценции в 6 раз меньше предыдущего. Выявлен отчетливый сдвиг длины волны максимума флюоресценции сравниваемых структур хряща на шесть нанометров (различия достоверны уже при разнице в 1 нм.).Т.е для всех сравниваемых структур различие исследованных параметров достоверны (р=0.03), что в реальных клинических условиях позволило, в итоге, использовать предложенную методику для диагностики состояния сустава на этапах консервативного лечения, в том числе ФДТ или при решении вопроса о назначении или исключении операций эндопротезирования.
Вычисления индекса аэробности (ИА) и нормированной интенсивности флуоресценции (ИФ)в интактных (Т-1) и патологически измененных участках суставного хряща (Т-2 и Т3) при OA также выявили значительные различия, представленные в таблице 2.
Причем эти различия наблюдались во всех исследованных случаях.
На фоне лечения через 1-2, а в отдельных случаях 3 месяца (3 пациента) указанные показатели приближались к норме, хотя и отличались от нее не более чем на 10-15%, что свидетельствовало и сопутствовало об эффективности процесса реабилитации пациентов и объективности используемых экспресс методов ЛКД (флюоресцентная составляющая) диагностики.
Дополнительно у 5 пациентов OA и 5 добровольцев без патологии наблюдали интенсивность флюоресценции синовиальный жидкости и плазмы крови (в сравнительном аспекте). У здоровых обследуемых флюоресценция плазмы крови и синовиальный жидкости не имели существенных различий (по спектру и интенсивности флюоресценции). И наоборот - при OA различия были в 1.5-3 раза, что связывали с интенсивностью выброса порфиритов в патологическом объекте при OA. После лечения, указанные показатели практически соответствовали индивидуальной норме.
Таким образом, обоснован антимикробный и противоопухолевый эффект хлорофилл содержащего препарата, активированного вне организма. Выявленный эффект зависит от концентрации вводимого активированного препарата, длины волны и дозы лазерной его активации (индивидуальная оптимизация дозы препарата и объективная оценка эффекта лечения).
Предложенный способ представляет собой ряд лечебно-диагностических мероприятий, предусматривающих комплексное применение флуоресценции, Раман или Раман-флуоресценции для одномоментной диагностики, пробоподготовки фотосенсибилизатора для ФДТ, предварительно или одномоментно с введением подвергнутого действию волновой энергии в присутствии кислорода, или кислород содержащих препаратов, включая оксид азота, проведение на этой основе объемной активированной ФДТ и последующего определения индивидуальной эффективности лечения и/или его коррекции. При этом активация ингибирующего локального воздействия фотосенсибилизаатора на патологический объект (микроб, воспаление, опухоль) может быть реализована как экстра, так и интракорпорально с использованием лазерного излучения в видимом и ближнем ИК диапазоне на всех этапах пробоподготовки, лечения и реабилитации.
Таким образом заявленное изобретение может успешно применяться в таких областях как хирургия, травматология, стоматология, артрология, дерматология челюстно-лицевая хирургия, клиническая микробиология и т.д. при заболеваниях и процессах микробной и неопластической природы.