ПОЛИКАТИОННОЕ СОЕДИНЕНИЕ "ТРИВИРОН (TRIVIRON)" И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
POLYCATIONIC TRIVIRON COMPOUND AND METHOD FOR PRODUCTION THEREOF

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и предназначено для лечения у сельскохозяйственной птицы вирусных заболеваний, в основе которых лежат РНК-вирусы (вирусы гриппа, острая респираторная инфекция, гепатит, синий гребень, инфекционный энтерит, трансмиссивный энтерит, реовирусный энтеронефрит, теносиновит, вирусный артрит, инфекционный бронхит кур, болезнь Гамборо, пневмовирус и т.д.).
В настоящее время известен ряд противовирусных препаратов (они принадлежат к различным классам химических соединений), рекомендуемых к применению в медицинской практике. Однако вследствие их высокой стоимости, только некоторые из них испытаны в качестве терапевтических средств при вирусных заболеваниях животных, как правило, при лечении дорогостоящих пород собак и кошек. В ряде случаев, когда отсутствуют препараты, специфичные для конкретных вирусных инфекций, для лечения вирусных заболеваний используются иммуномодуляторы. Однако такие препараты, применяемые в медицинской практике, так же имеют высокую стоимость, что исключат возможность их широкого применения в ветеринарной практике.
50
Соединения, способные расщеплять РНК (искусственные РНКазы), обладают противовирусной активностью в отношении РНК-содержащих вирусов (Goncharova E.P. et. al. Inactivation of the tick-borne encephalitis virus by RNA-cleaving compounds // J. Mol. Gen. Med., 2011, V.5, P.266-272; Fedorova A.A. et.al. Inactivation of a non-enveloped RNA virus by artificial ribonucleases: Honey bees and acute bee paralysis virus as a new experimental model for in vivo antiviral activity assessment // Antiviral Res. 2011 V.91, P.267-277; RU 2399388, 20.09.2010). В частности, искусственные РНКазы на основе производных 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана, а именно 1,5-бис-(4-додецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1-ил)пентан дихлорид дибромид, обладают противовирусной активностью по отношению к вирусам гриппа A/WSN/33 (H1N1) и вирусу клещевого энцефалита (штамм Софьин, RU 2399669, 20.09.2010). Однако концентрация этого соединения, необходимая для инактивации указанных вирусов, составляла 20 мкМ, что почти в два раза превышало значение IC (12 мкМ).
Некоторые другие производные бисчетвертичных солей 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана, будучи ковалентно присоединенными к различного рода поверхностям, придают полученным таким образом материалам противовирусные свойства.
Наиболее близким аналогом по заявленным свойствам является препарат Арговит (RU 2147237, 10.04.2000). Данный препарат обладает широким спектром антимикробного действия в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий. Проявляет вирулицидную (противовирусную) и фунгицидную (противогрибковую) активность. К недостаткам, помимо высокой стоимости, следует отнести тот факт, что препарат выпускается в виде стабилизированного концентрированного 20%-ного раствора (содержание серебра в арговите в пересчете на 100% сухой препарат составляет 5-7%). Перед использованием необходимо разбавлять препарат, в зависимости от назначения в широких пределах (0.05-5%). Форма выпуска препарата накладывает значительные ограничения на условия и сроки хранения препарата. Так, при длительном хранении и особенно под воздействием таких факторов, как свет, колебания температуры, замораживание, происходит агрегация кластерных частиц с образованием коллоидных, малоактивных частиц серебра. Возможно также появление пленки металлического серебра на поверхности концентрата.
Наиболее близкими структурными аналогами предлагаемого соединения являются некоторые четвертичные соли 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана, обладающие антибактериальной активностью. [M. Thomas, D. Montenegro, A. Castaco, L. Friedman, J. Leb, М.L. Huang, L. Rothman, H. Lee, C. Capodiferro, D. Ambinder, E. Cere, J. Galante, J.L. Rizzo, K. Melkonian, R. Engel. Polycations. 17. Synthesis and properties of polycationic derivatives of carbohydrates // Carbohydrate Research 344 (2009) 1620-1627]. Было обнаружено, что данные соединения проявляют антимикробную активность к ряду микроорганизмов. Однако данные соединения не обладают противовирусным действием.
47
100
4
4
Поиск по источникам научно-технической и патентной литературы показал, что для производного 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана, отвечающего составу CHBrN (1,5-бис-(4-тетрадецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1-ил)пентан тетрабромид), проявление противовирусных свойств в известных источниках не описано.
Техническим результатом настоящего изобретения является расширение арсенала противовирусных средств для нужд ветеринарии и получение поликатионного соединения, позволяющего справляться с большим спектром инфекционных заболеваний, в основе которых лежат РНК-вирусы, при обеспечении концентрации заявленного соединения для инактивации РНК-вирусов, не превышающей значения IC50 (12мкМ).
Указанный технический результат достигается в производном 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана со структурной формулой
47
100
4
4
Данный технический результат достигается в способе синтеза производного 1,5-бис-(4-тетрадецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1-ил)пентан тетрабромида (CHBrN), в котором бромид 1-тетрадецил-4-аза-1-азониабицикл[2.2.2]октана растворяют при нагревании до температуры 55°C в метаноле, к полученному раствору, в процессе перемешивания, добавляют двумя порциями 1,5-дибромпентан до получения реакционной смеси, которую затем перемешивают и охлаждают до температуры 18-22°C, после чего к указанной смеси добавляют 20 мл ацетонитрила с последующим отделением выпавшего осадка от маточного раствора, при этом выпавший осадок отфильтровывают и высушивают в вакууме, а полученный маточный раствор упаривают до получения вязкого сиропообразного остатка, к которому добавляют 40 мл ацетонитрила и перемешивают при кипении с обратным холодильником до получения суспензии, которую затем охлаждают до температуры 18-22°C и отфильтровывают образовавшийся осадок с последующим его высушиванием в вакууме и объединением с полученным ранее осадком для получения продукта.
Бромид 1-тетрадецил-4-аза-1-азониабицикло[2.2.2]октана нагревают в течение 24 ч.
Две порции 1,5-дибромпентана добавляют с интервалом 12 ч между собой. Суспензию перемешивают 24 ч при температуре 55°C. Маточный раствор упаривают на ротационном испарителе. Кипение с обратным холодильником осуществляют в течение 1 ч. На фиг.1 изображена схема синтеза 1,5-бис-(4-додецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1-ил)пентан тетрабромида (I).
45
92
4
4
Заявленное соединение относится к классу поликатионных насыщенных гетероциклических соединений, содержащих гидрофобные алкильные фрагменты и отвечающих составу CHBrN.
Сущность изобретения заключается в противовирусном препарате широкого спектра действия - поликатионном соединении 1,5-бис-(4-тетрадецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1-ил)пентан тетрабромид (соединение I), которое можно использовать для лечения вирусных заболеваний в ветеринарии, в частности сельскохозяйственной птицы, в основе которых лежат РНК-вирусы, и обладающем антибактериальным действием.
Способ синтеза/получения производного 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана со структурной формулой
заключается в том, что синтез осуществляют при 55°C в течении 24 ч и мольном соотношении следующих компонентов: 1,5-дибромпентана : бромид 1-тетрадецил-4-аза-1-азониабицикло[2.2.2]октана 1:2,16 в метаноле как растворителе, с выходом целевого соединения, превышающим 89%.
Схема синтеза 1,5-бис-(4-додецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1-ил)пентан тетрабромида (I):
Пример получения поликатионного соединения 1,5-бис-(4-тетрадецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1-ил)пентан тетрабромида (I).
Бромид 1-тетрадецил-4-аза-1-азониабицикло[2.2.2]октана (26,3 г, 65 ммоль) растворяют при нагревании до 55°C в 20 мл метанола. К раствору, при перемешивании на магнитной мешалке добавляют двумя порциями с интервалом 12 ч 1,5-дибромпентан (6,9 г, 30 ммоль). После добавления последней порции реакционную смесь перемешивают 24 ч при 55°C. После охлаждения до комнатной температуры (18-22°C) к реакционной смеси добавляют 20 мл ацетонитрила, выпавший осадок отфильтровывают и высушивают в вакууме (17,5 г, 56%). Маточный раствор упаривают на ротационном испарителе, к вязкому сиропообразному остатку добавляют 40 мл ацетонитрила, перемешивают на магнитной мешалке при кипении с обратным холодильником 1 ч. После охлаждения до комнатной температуры (18-22°C) выпавший осадок отфильтровывают и высушивают в вакууме (10,3 г, 33%). Полученные осадки объединяют. Выход 27,8 г (89,1%).
1
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
3
2
11
3
2
9
2
2
2
2
2
2
2
3
2
9
2
2
2
2
2
2
2
3
2
10
2
2
2
2
2
3
Спектр ЯМР H, δ, м.д. (J, Гц): 0.93 (уш. т, 6Н, CH(CH)N, J 6.6), 1.32-1.45 (м, 36Н, CH(CH)CHCHN); 1.32 (м, 2Н, NCHCHCHCHCHN); 1.88 (м, 4Н, CH(CH)CHCHN); 1.98 (м, 4Н, NCHCHCHCHCHN); 3.62 (м, 4Н, CH(CH)CHN); 3.75 (м, 4Н, CHCHN); 4.07-4.12 (м, 24Н, N(CHCH)N).
13
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
3
2
11
3
2
2
10
3
2
2
2
9
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
8
3
2
3
2
2
7
3
2
4
2
2
2
5
2
2
2
2
2
3
2
6
2
2
2
3
3
2
8
2
2
2
3
2
9
2
2
3
2
10
2
2
2
3
2
2
3
Спектр ЯМР С, s, м.д.: 12.95 (2С, CH(CH)N); 21.64 (2С, CHCH(CH)N); 22.21 (2С, CHCHCH(CH)N); 25.63 (4С, NCHCHCHCHCHN, CH(CH)CH(CH)N); 28.66 (2С, CH(CH)CH(CH)N); 28.95 (4С, CH(CH)CHCH(CH)N); 29.10 (3С, N(CH)CH(CH)N, CH(CH)CHCH(CH)N); 29.21 (2С, CH(CH)CH(CH)N); 31.54 (2C, CH(CH)CHCHN); 64.24 (2C, CH(CH)CHN); 50.81 и 51.03 (6С, N(CHCH)N); 64.71 (2C, CH2N(CHCH)N).
Пример определения влияния условий и сроков хранения поликатионного соединения 1,5-бис-(4-тетрадецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1-ил)пентан тетрабромида (I) на стабильность его химического состава.
Поликатионное соединение 1,5-бис-(4-тетрадецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1-ил)пентан тетрабромида (I) хранили в условиях бытового холодильника при температуре (-4±2)°C и при комнатной температуре (20±2)°C в течение трех лет (срок наблюдения). Проводили ЯМР и элементный анализ препарата с периодичностью один раз в шесть месяцев. В результате проведенных исследований не было отмечено отклонений в его составе.
Таким образом, полученный препарат стабилен (срок наблюдения 3 года), допускает хранение при комнатной температуре (18-22°C).
Пример оценки противовирусной активности поликатионного соединения 1,5-бис-(4-тетрадецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1 -ил)пентан тетрабромида (I) (далее препарат с названием "TRIVIRON") при испытаниях на сельскохозяйственной птице.
Опыт №1. Применение поликатионного соединения 1,5-бис-(4-тетрадецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1-ил)пентан тетрабромида (I) на промышленном стаде с целью снижения смертности на поголовье бройлеров, пораженное инфекционной болезнью Ньюкасла.
Смертность на птицефабрике была с 28 дней - 0.7% в день, птица была угнетена, корм не потребляла, помет был жидкий.
На вскрытии патологоанатомические признаки были: геморрагическое воспаление трахеи, аэросаккулиты, энтероколиты, геморрагический провентрикулит.
Применение поликатионного соединения 1,5-бис-(4-тетрадецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1-ил)пентан тетрабромида (I) начали на поголовье в 30000 голов в возрасте 31 день. Выпаивали круглые сутки, чтобы обеспечить потребление всем поголовьем препарата в течение 5 дней.
Падеж снизился на 3-и сутки до 0.3%, птица начала потреблять корм.
На патологоанатомическом вскрытии павшей птицы снизилось количество фибринозных отложений в грудной и брюшной полостях.
Отход птицы на 5-й день лечения составил 0.2% в день.
Уровень титров антител в ИФА в 28 дней был - 17000, в 38 дней был - 7000.
Опыт №2 проводился на предприятии с содержанием продуктивного родительского поголовья кросса Хаббард, пораженного вариантным штаммом инфекционного брохита птиц, выделенным и типированным. Заявленное поликатионное соединение 1,5-бис-(4-тетрадецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1-ил)пентан тетрабромида (I) применялось на поголовье возраста старше 50 недель в течении 7 дней с водой. Выпаивали препарат в течение дня. При дальнейшем патологоанатомическом наблюдении были выявлены следующие изменения: снижение влияния нефропатогена, т.е. отложения уратов (солей мочевой кислоты) в мочеточниках, общее прогрессирующее количество ложной несушки также снизилось, имеющиеся кисты на яичниках остались, а продуктивный период стада продлился без естественного (по возрасту) снижения до 63 недель. Количество фибринозных отложений в грудной и брюшной полостях птицы обнаруживали реже, чем до лечения. Количество деформированного яйца и неоплодотворенного также уменьшилось. Состояние печени также улучшилось - гепатозы и холециститы обнаруживали реже, чем до лечения.
Опыт №3. Целью применения было использование поликатионного соединения 1,5-бис-(4-тетрадецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1-ил)пентан тетрабромида (I) как лечебного средства против вирусной инфекции: пневмовирус (ART), который был одной из ведущих причин вызывающих гибель птицы в предубойный период. Диагноз, поставленный на фабрике при вскрытии, был подтвержден при лабораторных исследованиях отобранного патматериала.
Результатом использования препарата была динамика снижения падежа в момент пикового отхода птицы в возрасте? начиная с 24-го дня выращивания, а также динамика отхода (падежа) начиная с 14 дня выращивания и до убоя. Параллельно контролировались показатели продуктивности бройлеров: сохранность и среднесуточный привес.
В закрытых партиях наблюдалась положительная тенденция по увеличению сохранности, среднесуточного привеса и конверсии корма (файл сравнения с предыдущим туром прилагаю) в группах, где выпаивался 1,5-бис-(4-тетрадецил-1.4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1-ил)пентан тетрабромида (I), особенно там, где он выпаивался, начиная с 22-24 дней а именно:
- по сравнению с предыдущим туром средний показатель сохранности в птичниках, где применялся TRIVIRON, на 2,31% был выше,
- по сравнению с предыдущим туром показатель среднесуточного привеса в птичниках, где применялся TRIVIRON, на 1,44 г был выше;
Однозначно был виден результат от введения поликатионного соединения 1,5-бис-(4-тетрадецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1-ил)пентан тетрабромида (I) - повышение процента сохранности по закрытым партиям.
Опыт
РНК-инфекционное заболевание
Сохранность в опытной группе с 1,5-бис-(4-тетрадецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1-ил)пентан тетрабромида (I),%
Сохранность в контрольной группе без 1,5-бис-(4-тетрадецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1-ил)пентан тетрабромида (I,%
№4
Инфекционный бронхит кур
95
91,1
№5
Болезнь Гам-боро
94,7
89,2
№6
Пневмовирус
93,8
89,1
№7
Реовирус
96,1
90,7
№8
Пневмовирус
97
92,1
Таким образом, заявляемое поликатионное соединение 1,5-бис-(4-тетрадецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1-ил)пентан тетрабромида (I):
- имеет стабильный химический состав на протяжении трех лет (срок наблюдения) при режиме его хранения (-4±2)°C и (20±4)°C;
- обладает выраженным противовирусным действием по отношению к вирусным заболеваниям птиц, в основе которых лежат РНК-вирусы.
- может использоваться в ветеринарной практике при разработке методов профилактики и лечения инфекций птицы, вызванных вирусных заболеваний птицы, в основе которых лежат РНК-вирусы.
Использование поликатионного соединения 1,5-бис-(4-тетрадецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1-ил)пентан тетрабромида (I) позволяет справляться с большим спектром инфекционных заболевания на основе которых лежат РНК-вирусы. Эффективность его подтверждается большим количеством проведенных экспериментов на фабриках. Отличительной особенностью его является возможность не профилактировать и лечить данные заболевания, после того как они уже возникли, а также возможность делать это, используя ввод через систему поения перорально, а не путем инъекций внутримышечно. К преимуществам относится также отсутствие побочных эффектов.