БИОЛОГИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
BIOLOGICAL MATERIALS AND THEIR APPLICATION METHODS

Изобретение относится к агентам, которые предотвращают связывание между доменом Fc антитела и FcγRIIb на клеточной поверхности. Изобретение также относится к композициям, которые включают агенты для применения при лечении пациентов, имеющих клетки-мишени, такие как злокачественные опухолевые клетки, которые обрабатываются композициями на основе антител.
Кроме того, изобретение относится к способам прогноза ответа клеток-мишеней на обработки на основе антител, особенно, когда лиганд антитела восприимчив к FcγRIIb-опосредованной интернализации, и в частности, к использованию уровней экспрессии FcγRIIb и/или терапевтической антитело-опосредованной интернализации через FcγRIIb в качестве прогностического маркера ответа клеток-мишеней на такую обработку.
Механизм, по которому моноклональные антитела (мАТ) могут проявлять терапевтические эффекты, заключается в стимуляции удаления злокачественных опухолевых и других нежелательных клеток рекрутированием естественных эффекторных систем, таких как цитотоксические клетки (например, макрофаги) и ферменты (например, комплемент), которые после этого поражают клетку, с которой связано мАТ.
Например, анти-CD20 мАТ I типа (такое как ритуксимаб, лидер рынка на настоящий момент) действует, связывая, через антигенсвязывающие домены мАТ, молекулы CD20 на поверхности В-клеток и удаляя эти В-клетки-мишени. Данные антитела осуществляют такое действие путем рекрутирования и активации эффекторных клеток, которые взаимодействуют с Fc-доменами мАТ через Fc-гамма рецепторы (FcγR), экспрессированные на поверхности этих эффекторных клеток.
Анти-CD20 моноклональное антитело (мАТ) ритуксимаб обладает улучшенной общей выживаемостью (ОВ) пациентов с фолликулярной (англ. follicular, FL) и диффузной В-крупноклеточной лимфомой (англ. diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL) (1-4). В случае лимфомы из клеток мантийной зоны (англ. mantle cell lymphoma, MCL), наблюдали только незначительные ответы (5), тогда как при хроническом лимфолейкозе (англ. chronic lymphocytic leukemia, CLL), исходные исследования ритуксимаба в режиме монотерапии показали менее выраженные ответы, чем в других вариантах неходжкинской лимфомы (англ. non-Hodgkin lymphoma, NHL) (обзор представлен в (6)). Часть лимфом демонстрирует первичную устойчивость к ритуксимабу или, в конечном счете, становится устойчивой к содержащей ритуксимаб комбинированной терапии (7). Молекулярная основа, обуславливающая эту устойчивость к лечению и наблюдаемую чувствительность различных подтипов NHL к лечению ритуксимабом, в настоящее время неизвестна, но может включать уровни экспрессии CD20 (8-10), высокую экспрессию защитных молекул комплемента (CD55 и CD59) (11, 12), развитие устойчивости к апоптозу (13) и субоптимальные взаимодействия Fc-гамма рецептора (FcγR) как результат экспрессии низкоаффинных аллелей (14).
Крайне желательно повысить эффективность таких антител, в случае если лечение не является оптимальным, или появилась устойчивость.
Общеизвестно, что взаимодействия Fc:FcγR являются ключевыми для анти-CD20 мАТ (15-18). В соответствии с этим пациенты с лимфомой, имеющие аллель 158V с более высокой аффинностью в FcγRIIIa, реагируют на ритуксимаб лучше, чем пациенты с низкоаффинным аллотипом 158F (14), что заставило многих исследователей сконцентрироваться на усилении взаимодействия мАТ с FcγRIIIa, например, через дефукозилирование (19). Напротив, меньше внимания было уделено потенциальным эффектам ингибирующего FcγRIIb, который действует как отрицательный регулятор стимулирующей активности, воспринимаемой ITAM-несущими рецепторами, такими как B-клеточный рецептор для антигена (англ. B-cell receptor for antigen, BCR) и активирующий FcγR. В В-клетках это взаимодействие служит для ограничения B-клеточной пролиферации, которая следует за связыванием иммунных комплексов, тогда как в макрофагах сцепление FcγRIIb приводит к ингибированию цитотоксической активности (15).
Среди В-клеточных злокачественных новообразований, FcγRIIb экспрессируется при CLL/SLL, MCL и FL, в последнем случае особенно в ходе трансформации. При DLBCL экспрессия FγRIIb слабее, что объясняет, почему не была показана корреляция между его экспрессией и ответом на химиотерапию ритуксимаб-CHOP (R-CHOP) (20, 21). Как и в случае активирующего FcγR, также были обнаружены полиморфизмы, оказывающие влияние на активность FcγRIIb (22, 23) с аллелью 232I, ингибирующей BCR-опосредуемый кальциевый поток более эффективно, чем аллель 232T. Однако Weng and Levy (24) не смогли найти корреляцию между этими полиморфизмами и ответом на терапию ритуксимабом пациентов с FL.
Растет количество анти-CD20 мАТ, которые доступны для клинического исследования. Эти различные анти-CD20 мАТ могут быть классифицированы как мАТ I типа (например, ритуксимаб, офатумумаб) или II типа (например, тоситумомаб (B1), GA101, 11B8) в соответствии с их способностью перераспределять CD20 в плазматической мембране и в соответствии с их активностью при проведении различных эффекторных анализов (25-27).
Мы и другие авторы показали, что мАТ II типа более эффективны при удалении B-клеток мишеней в нескольких модельных системах (18, 19). Например, в трансгенной (Tg) модели элиминации В-клеток с человеческим CD20, в которой большая способность мАТ II типа вызывать лизосомальную клеточную смерть не является очевидной (25, 27), мы продемонстрировали, что эта их способность коррелирует с устойчивостью к интернализации (28). В этом заключается отличие от мАТ I типа, подобных ритуксимаб, которые вместе с CD20 быстро интернализуются с клеточной поверхности, в процессе, который является зависимыми от энергии и температуры и который включает перераспределение актина (28). Скорость модуляции значимо отличается на клетках различного происхождения (первичная опухоль против клеточных линий; CLL против FL) хотя молекулярная основа этого явления остается необъяснимой.
В WO 2008/002933 описаны антитела, специфичные к Fc-гамма RIIB (CD32B) и CD20, и способы лечения с помощью комбинации обоих антител связанных с В-клетками заболеваний или расстройств. Однако нет описания или указания по распознаванию и/или лечению подмножества пациентов, а именно тех, чьи клетки-мишени экспрессируют повышенные уровни FcγRIIb, или тех, к которым тип антитела подходит для комбинированного лечения с антителами против FcγRIIb.
Неожиданно мы продемонстрировали, что модуляция строго коррелирует с поверхностной экспрессией FcγRIIb, независимо от подтипа клеток, при этом сверхэкспрессия способна превратить клетки Ramos из медленных модуляторов в быстрые. Интернализация FcγRIIb происходила наряду с CD20 и предшествовала его активации. В совокупности эти данные дают ясное молекулярное объяснение ранее наблюдаемой гетерогенности скоростей модуляции в подтипах NHL и между различными подтипами NHL.
Таким образом, в настоящее время мы демонстрируем, что ключевым фактором, определяющим эффективность антител по отношению к антигенам, таким как CD20, является взаимодействие с ингибиторным FcγRIIb, также известным как и включающим CD32, CD32B, CD32B1, CD32B2, FcRII, FcγRII или FcRIIB) на поверхности одной и той же клетки. Это взаимодействие приводит к интернализации антитела клеткой-мишенью, что, таким образом, устраняет их способность взаимодействовать с Fc-рецепторами эффекторных клеток. Мы дополнительно продемонстрировали, что агенты, такие как анти-CD32 мАТ, способны блокировать данную интернализацию. Мы также продемонстрировали, что такие агенты могут быть использованы в комбинации с антителами (такими как ритуксимаб) для мечения антигенов клеточной поверхности и для улучшения их активности in vivo при удалении нормальных В-клеток и опухолевых клеток.
Согласно изобретению предлагается композиция, содержащая:
(i) молекулу антитела, которая специфически связывает антиген клеточной поверхности клетки-мишени, где антитело имеет Fc-домен, способный связывать FcγRIIb; в комбинации с
(ii) агентом, который предотвращает или уменьшает связывание FcγRIIb с Fc-доменом молекулы антитела; и характеризующаяся тем, что композиция предназначена для применения при лечении пациента с клетками-мишенями, имеющими повышенный уровень экспрессии FcγRIIb.
Согласно другому аспекту, в изобретении предлагается применение агента, который предотвращает или уменьшает связывание между Fc-доменом молекулы антитела и FcγRIIb на клетке-мишени; где молекула антитела специфически связывает поверхностный антиген клетки-мишени; и характеризуется тем, что используется при изготовлении медикамента для лечения пациентов с клетками-мишенями, имеющими повышенный уровень экспрессии FcγRIIb.
Согласно другому аспекту, в изобретении предлагается способ лечения пациента, имеющего клетки-мишени, которые экспрессируют FcγRIIb, который включает введение (i) молекулы антитела, которая специфически связывает поверхностный антиген клеток-мишеней, где молекула антитела имеет Fc-домен, способный связывать FcγRIIb; в комбинации с (ii) агентом, который предотвращает или уменьшает связывание между Fc-доменом молекулы антитела и FcγRIIb; характеризующийся тем, что пациента выбирают на основании экспрессии его клетками-мишенями повышенного уровня FcγRIIb.
В некоторых воплощениях композиции, применений или способов изобретения агент предотвращает или уменьшает связывание Fc-домена молекулы антитела с FcγRIIb, присутствующим на клетке-мишени.
Использование экспрессии FcγRIIb на клетках-мишенях в качестве прогностического маркера ответа клеток-мишеней на обработку молекулой антитела, которая специфически связывает поверхностный антиген клеток-мишеней, где молекула антитела имеет Fc-домен, способный связывать FcγRIIb; на основании чего повышенные уровни FcγRIIb являются индикаторами снижения или отсутствия ответа на лечение молекулами антитела.
В одном воплощении использование экспрессии FcγRIIb на клетках-мишенях в качестве прогностического маркера не требует использования экспрессии FcγRIIc на клетках-мишенях в качестве прогностического маркера.
Согласно другому аспекту, в изобретении предлагается способ прогноза ответа клеток-мишеней пациента на лечение молекулой антитела, которая специфически связывает поверхностный антиген клетки-мишени, и имеет Fc-домен, способный связывать FcγRIIb; характеризующийся тем, что включает определение уровня экспрессии FcγRIIb на клетках-мишенях, на основании чего повышенные уровни FcγRIIb являются прогностическими в отношении уменьшения или отсутствия ответа на лечение молекулой антитела.
В одном воплощении способ прогноза ответа клеток-мишеней пациента включает определение уровня экспрессии FcγRIIb на клетках-мишенях и не включает дополнительно определение уровня экспрессии FcγRIIc на клетках-мишенях.
Было продемонстрировано, что не все антитела, несмотря на их общий Fc-связывающий константный домен антитела и известную способность связывать Fc-гамма рецептор, интернализуются FcγRIIb-зависимым образом, что делает идентификацию подходящих антител критически важной для терапевтического успеха комбинированных терапий, включающих реактивы для модуляции функции FcγRIIb, и наоборот, для того, чтобы избежать проведения лечения, которое не принесет пользы пациентам.
В некоторых воплощениях композиции, применения или способов изобретения, молекула антитела, имеющего Fc-домен, способный связывать FcγRIIb, которая специфически связывает антиген клеточной поверхности клетки-мишени, способна интернализоваться в клетку-мишень FcγRIIb-зависимым образом.
В некоторых воплощениях композиции, применения или способов изобретения, агент, который предотвращает или уменьшает связывание FcγRIIb с Fc-доменом молекулы антитела, дополнительно предотвращает или уменьшает последующую интернализацию молекулы антитела в клетку.
В некоторых воплощениях композиции, применения или способов изобретения клетка-мишень является клеткой злокачественной опухоли. Целесообразной клеткой-мишенью является В-клетка.
Предпочтительно, если в соответствии с изобретением повышенная экспрессия FcγRIIb на клетках-мишенях определяется относительно контроля или эталона. Предпочтительно, если контроль является нормальным уровнем экспрессии FcγRIIb в клетках того же типа, что и клетки-мишени.
‘Повышенные уровни экспрессии FcγRIIb' определяется ниже в ‘Определениях'. Уровень экспрессии FcγRIIb может быть измерен как соотношение Геометрической Средней Интенсивности Флюоресценции (Geo MFI) FcγRIIb к Geo MFI изотипического контроля. В ином случае, уровни экспрессии FcγRIIb могут быть измерены иммуногистохимией опухолевых биопсий. Специалистам в данной области известно о существовании множества методов и методологий для определения уровней экспрессии FcγRIIb.
В настоящем изобретении также описано как идентифицировать антитела, которые подходят для комбинированного лечения с антителами к FcγRIIb, а именно антителами, которые интернализуются с поверхности клетки-мишени зависимым от FcγRIIb образом. В настоящем изобретении дополнительно предлагаются средства для идентификации подмножеств пациентов, которые подходят для комбинированного лечения антителами против FcγRIIb.
В другом аспекте изобретения предлагается анализ для идентификации агентов, которые уменьшают или предотвращают связывание между Fc-доменом антитела и поверхностным антигеном клетки-мишени и FcγRIIb на клетке-мишени, включая определение степени связывания между Fc-доменом и FcγRIIb в присутствии или отсутствии тестируемого агента. Применимые агенты определяются, если тестируемый агент уменьшает или предотвращает связывание Fc-домена с FcγRIIb. Такой анализ также применим при идентификации применимости агента (например, молекулы антитела) для комбинированной терапии с анти-FcγRIIb антителами.
В другом предпочтительном воплощении анализ для идентификации агентов, целесообразных в практическом плане в применениях и способах изобретения, включает скрининг агентов, которые блокируют стимуляцию/передачу сигнала FcγRIIb, на что указывает фосфорилирование тирозина-293 во внутриклеточном мотиве ITIM, определяемое вестерн-блоттингом. Например, клетки Raji культивируются с антителом к антигену клеточной поверхности, например, с анти-CD20 мАТ ритуксимабом, в присутствии или отсутствии анти-FcγRIIb тестируемого агента перед иммуноблоттингом фосфорилированного FcγRIIb. Количество фосфорилированного FcγRIIb становится повышенным в клетках, стимулированных ритуксимабом, и должно быть ингибировано добавлением тестируемых агентов, схожих с теми, что представлены на фиг. 4А при использовании AT10 в качестве блокирующего агента. Кроме того, эти агенты предпочтительно должны также блокировать интернализацию ритуксимаба в анализе гашения сигнала, представленном на фиг. 1А. На фиг. 2В показан типичный пример блокирования анти-FcγRIIb блокирующим объектом, в данном случае AT10. Такой анализ также применим при идентификации применимости агента (например, молекулы антитела) для комбинированной терапии с анти-FcγRIIb антителами.
В предпочтительном воплощении анализ, используемый для идентификации агентов, подходящих для комбинированной терапии с антителами против FcγRIIb, измеряет процент интернализации агента (например, молекулы антитела) в FcγRIIb-экспрессирующие клетки. Этот анализ характеризуются тем, что способ включает определение процента агента (например, молекул антитела), оставшихся после инкубации с агентом (например, молекулой антитела) на клеточной поверхности мишень-экспрессирующих и FcγRIIb-экспрессирующих клеток, на основании чего уменьшение процента агента (например, молекул антитела), доступного на клеточной поверхности (эквивалентно росту интернализации молекул антител) является прогностическим в отношении ответа на обработку молекулой антитела.
В работе Neubig et al (2003) Pharmacol. Rev. 55, 597-606, включенной в данный документ ссылкой, описаны различные классы лигандов, которые могут быть подвергнуты скринингу для идентификации агентов, которые предотвращают или уменьшают связывание FcγRIIb с Fc-доменом молекулы антитела по изобретению.
r
Вышеупомянутые лиганды могут быть малыми органическими или неорганическими молекулами, но предпочтительно являются пептидами или полипептидами. Как правило, если лиганд является малой органической или органической молекулой, то имеет M от 50 до 2000, например, от 100 до 1000, например, от 100 до 500.
d
Как правило, лиганд связывает FcγRIIb с K в диапазоне от мМ до пМ, например, в диапазоне от мкМ до нМ. Как правило, предпочтительными являются лиганды с наиболее низким Kd.
Лиганд может быть пептидомиметиком, нуклеиновой кислотой, пептиднуклеиновой кислотой или аптамером. Лиганд также может быть липидом, или углеводом.
r
Лиганд может быть полипептидом, который связывает FcγRIIb. Такие полипептиды (в которые мы включаем олигопептиды), как правило, имеют M от 500 до 50 000, но могут быть больше.
Полипептид также может быть связывающим белком, основанным на модульном каркасе, таким как белки с анкириновым повторами, белки с повторами армадилло, лейцинбогатые белки, белки с повторами тетрариопептида или сконструированные белки с анкириновыми повторами (DARPins) или белки на основе доменов липокалина или фибронектина или каркасов для аффилинов.
Удобно, если тестируемый агент является библиотекой тестируемых соединений, а предпочтительно, если библиотека является любой из числа пептидной библиотеки, белковой библиотеки, антительной библиотеки, рекомбинантной комбинаторной антительной библиотеки или scFV- или Fab-библиотеки фагового дисплея.
Предпочтительно, если в композиции, применении или способе по изобретению агент (ii) является одной или несколькими молекулами антитела, которое специфически связывает FcγRIIb. Удобно, если одна или несколько молекул антител не имеют домена, способного рекрутировать эффекторную клетку.
Предпочтительно, если одна или несколько молекул антител являются одной или несколькими молекулами моноклональных антител.
Предпочтительно, если агент предотвращает или уменьшает передачу сигнала через FcγRIIb. Еще более предпочтительно, если агент предотвращает или уменьшает интернализацию молекулы антител клеткой-мишенью.
В дальнейших воплощениях, SEQ ID NO относятся к последовательностям, указанным ниже в клонах 1-13.
Как известно специалистам, три гипервариабельных участка (англ. complementarity determining regions, CDR) присутствуют в вариабельных доменах как тяжелой, так и легкой цепей иммуноглобулинов. Обозначение аминокислот в любом CDR, описанном в данном документе, находится в соответствии с определениями по Kabat EA et al. 1991, In «Sequences of Proteins of Immulogical Interest» Fifth Edition, NIH Publication No. 91-3242, pp xv-xvii.).
Специалистам известно, что существуют другие способы обозначения аминокислот в любом CDR. Например, the International ImMunoGeneTics information system (IMGT) (http://www.imgt.org/ и Lefranc and Lefranc «The Immunoglobulin FactsBook» published by Academic Press, 2001).
В одном воплощении агент содержит вариабельный участок тяжелой цепи (VH), содержащий следующие CDR:
(i) SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 31; или
(ii) SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 37; или
(iii) SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 43; или
(iv) SEQ ID NO: 47 и SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 49; или
(v) SEQ ID NO: 53 и SEQ ID NO: 54 и SEQ ID NO: 55; или
(vi) SEQ ID NO: 59 и SEQ ID NO: 60 и SEQ ID NO: 61; или
(vii) SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 66 и SEQ ID NO: 67; или
(viii) SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 73; или
(ix) SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 78 и SEQ ID NO: 79; или
(x) SEQ ID NO: 83 и SEQ ID NO: 84 и SEQ ID NO: 85; или
(xi) SEQ ID NO: 89 и SEQ ID NO: 90 и SEQ ID NO: 91; или
(xii) SEQ ID NO: 95 и SEQ ID NO: 96 и SEQ ID NO: 97; или
(xiii) SEQ ID NO: 101 и SEQ ID NO: 102 и SEQ ID NO: 103.
Предпочтительно, если агент содержит вариабельный участок легкой цепи (VL), содержащий следующие CDR:
(i) SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34; или
(ii) SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 40; или
(iii) SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 45 и SEQ ID NO: 46; или
(iv) SEQ ID NO: 50 и SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52; или
(v) SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 58; или
(vi) SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 64; или
(vii) SEQ ID NO: 68 и SEQ ID NO: 69 и SEQ ID NO: 70; или
(viii) SEQ ID NO: 74 и SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 76; или
(ix) SEQ ID NO: 80 и SEQ ID NO: 81 и SEQ ID NO: 82; или
(x) SEQ ID NO: 86 и SEQ ID NO: 87 и SEQ ID NO: 88; или
(xi) SEQ ID NO: 92 и SEQ ID NO: 93 и SEQ ID NO: 94; или
(xii) SEQ ID NO: 98 и SEQ ID NO: 99 и SEQ ID NO: 100; или
(xiii) SEQ ID NO: 104 и SEQ ID NO: 105 и SEQ ID NO: 106.
Необязательно агент содержит аминокислотную последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (VH), выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; и SEQ ID NO: 15.
Необязательно агент содержит аминокислотную последовательность вариабельного участка легкой цепи (VL), выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; и SEQ ID NO: 28.
Предпочтительно, если агент содержит следующие аминокислотные последовательности CDR:
(i) SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34; или
(ii) SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 40; или
(iii) SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 45 и SEQ ID NO: 46; или
(iv) SEQ ID NO: 47 и SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 49 и SEQ ID NO: 50 и SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52; или
(v) SEQ ID NO: 53 и SEQ ID NO: 54 и SEQ ID NO: 55 и SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 58; или
(vi) SEQ ID NO: 59 и SEQ ID NO: 60 и SEQ ID NO: 61 и SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 64; или
(vii) SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 66 и SEQ ID NO: 67 и SEQ ID NO: 68 и SEQ ID NO: 69 и SEQ ID NO: 70; или
(viii) SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 73 и SEQ ID NO: 74 и SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 76; или
(ix) SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 78 и SEQ ID NO: 79 и SEQ ID NO: 80 и SEQ ID NO: 81 и SEQ ID NO: 82; или
(x) SEQ ID NO: 83 и SEQ ID NO: 84 и SEQ ID NO: 85 и SEQ ID NO: 86 и SEQ ID NO: 87 и SEQ ID NO: 88; или
(xi) SEQ ID NO: 89 и SEQ ID NO: 90 и SEQ ID NO: 91 и SEQ ID NO: 92 и SEQ ID NO: 93 и SEQ ID NO: 94; или
(xii) SEQ ID NO: 95 и SEQ ID NO: 96 и SEQ ID NO: 97 и SEQ ID NO: 98 и SEQ ID NO: 99 и SEQ ID NO: 100; или
(xiii) SEQ ID NO: 101 и SEQ ID NO: 102 и SEQ ID NO: 103 и SEQ ID NO: 104 и SEQ ID NO: 105 и SEQ ID NO: 106.
Еще более предпочтительно, если агент содержит следующие аминокислотные последовательности:
(i) SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 16; или
(ii) SEQ IS NO: 4 и SEQ ID NO: 17; или
(iii) SEQ IS NO: 5 и SEQ ID NO: 18; или
(iv) SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 19; или
(v) SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 20; или
(vi) SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 21; или
(vii) SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 22; или
(viii) SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 23; или
(ix) SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 24; или
(x) SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 25; или
(xi) SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 26; или
(xii) SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 27; или
(xiii) SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 28.
Агенты изобретения также могут содержать константные области (CH) и (CL) из SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2.
В дополнительном воплощении, агент способен конкурировать с агентами изобретения, описанными в данном документе, например, агентами, имеющими аминокислотную последовательность, изложенную в воплощениях выше (например, SEQ ID NO: 1-106), для предотвращения или уменьшения связывания FcγRIIb с Fc-доменом молекулы антитела.
Под «способен конкурировать» для предотвращения или уменьшения связывания FcγRIIb с Fc-доменом молекулы антитела с агентом (таким как молекула антигена), как определено в данном документе, мы подразумеваем, что тестируемый агент способен ингибировать или в противном случае препятствовать, по меньшей мере, частично, связыванию агента, как определено в данном документе, с FcγRIIb и предотвращать или уменьшать связывание FcγRIIb с Fc-доменом молекулы антитела.
Например, агент может быть способен ингибировать связывание агента, описанного в данном документе, по меньшей мере, на 10%, например, по меньшей мере, на 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95% или даже на 100% и/или ингибировать способность агента предотвращать или уменьшать связывание FcγRIIb с Fc-доменом молекулы антитела, по меньшей мере, на 10%, например, по меньшей мере, на 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95% или даже на 100%.
Конкурирующее связывание может быть определено способами хорошо известными специалистам в данной области, такими как твердофазный иммуноферментный анализ (тИФА).
тИФА может быть использован для оценки эпитоп-модифицирующих или блокирующих антител. Дополнительные способы, подходящие для идентификации конкурирующих антител, описаны в Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow & Lane, который включен в данный документ ссылкой (например, см. стр. 567-569, 574-576, 583 и 590-612, 1988, CSHL, NY, ISBN 0-87969-314-2).
Агенты изобретения могут содержать следующие константные области (CH и CL):
IgG1-CH [SEQ ID NO: 1]
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
λ-CL [SEQ ID NO: 2]
QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
Агенты изобретения могут содержать одну или несколько последовательностей клонов 1-14:
Клон 1
CDRL3 FrL4
CDR Области
CDRH1: NYGMH [SEQ ID NO: 29]
CDRH2: VISYDGSNKYYADSVKG [SEQ ID NO: 30]
CDRH3: EWRDAFDI [SEQ ID NO: 31]
CDRL1: TGSSSNIGAGYDVH [SEQ ID NO: 32]
CDRL2: SDNQRPS [SEQ ID NO: 33]
CDRL3: AAWDDSLSGSWV [SEQ ID NO: 34]
Клон 2
CDR Области
CDRH1: TYGMH [SEQ ID NO: 35]
CDRH2: VIAYDGSKKDYADSVKG [SEQ ID NO: 36]
CDRH3: EYRDAFDI [SEQ ID NO: 37]
CDRL1: TGSSSNIGAGYDVH [SEQ ID NO: 38]
CDRL2: GNSNRPS [SEQ ID NO: 39]
CDRL3: AAWDDSVSGWM [SEQ ID NO: 40]
Клон 3
CDR Области
CDRH1: NYGMH [SEQ ID NO: 41]
CDRH2: VISYDGSNRYYADSVKG [SEQ ID NO: 42]
CDRH3: DRWNGMDV [SEQ ID NO: 43]
CDRL1: SGSSSNIGAGYDVH [SEQ ID NO: 44]
CDRL2: ANNQRPS [SEQ ID NO: 45]
CDRL3: AAWDDSLNGPWV [SEQ ID NO: 46]
Клон 4
CDR Области
CDRH1: SYGMH [SEQ ID NO: 47]
CDRH2: VISYDGSDTAYADSVKG [SEQ ID NO: 48]
CDRH3: DHSVIGAFDI [SEQ ID NO: 49]
CDRL1: SGSSSNIGSNTVN [SEQ ID NO: 50]
CDRL2: DNNKRPS [SEQ ID NO: 51]
CDRL3: SSYAGSNNVV [SEQ ID NO: 52]
Клон 5
CDR Области
CDRH1: NYGMH [SEQ ID NO: 53]
CDRH2: VISYDGSNKYYADSVKG [SEQ ID NO: 54]
CDRH3: DQLGEAFDI [SEQ ID NO: 55]
CDRL1: TGSSSNIGAGYDVH [SEQ ID NO: 56]
CDRL2: DNNKRPS [SEQ ID NO: 57]
CDRL3: ATWDDSLSGPV [SEQ ID NO: 58]
Клон 6
CDR Области
CDRH1: DYGMS [SEQ ID NO: 59]
CDRH2: AISGSGSSTYYADSVKG [SEQ ID NO: 60]
CDRH3: GDIDYFDY [SEQ ID NO: 61]
CDRL1: TGSSSNFGAGYDVH [SEQ ID NO: 62]
CDRL2: ENNKRPS [SEQ ID NO: 63]
CDRL3: AAWDDSLNGPV [SEQ ID NO: 64]
Клон 7
CDR Области
CDRH1: SYGMH [SEQ ID NO: 65]
CDRH2: VISYDGSNKYYADSVKG [SEQ ID NO: 66]
CDRH3: ERRDAFDI [SEQ ID NO: 67]
CDRL1: TGSSSNIGAGYDVH [SEQ ID NO: 68]
CDRL2: SDNQRPS [SEQ ID NO: 69]
CDRL3: ATWDSDTPV [SEQ ID NO: 70]
Клон 8
CDR Области
CDRH1: SYGMH [SEQ ID NO: 71]
CDRH2: VISYDGSNKYYADSVKG [SEQ ID NO: 72]
CDRH3: DHSAAGYFDY [SEQ ID NO: 73]
CDRL1: SGSSSNIGSNTVN [SEQ ID NO: 74]
CDRL2: GNSIRPS [SEQ ID NO: 75]
CDRL3: ASWDDSLSSPV [SEQ ID NO: 76]
Клон 9
CDR Области
CDRH1: SYGMH [SEQ ID NO: 77]
CDRH2: GISWDSAIIDYAGSVKG [SEQ ID NO: 78]
CDRH3: DEAAAGAFDI [SEQ ID NO: 79]
CDRL1: TGSSSNIGAGYDVH [SEQ ID NO: 80]
CDRL2: GNTDRPS [SEQ ID NO: 81]
CDRL3: AAWDDSLSGPVV [SEQ ID NO: 82]
Клон 13
CDR Области
CDRH1: SYGIS [SEQ ID NO: 101]
CDRH2: GISGSGGNTYYADSVKG [SEQ ID NO: 102]
CDRH3: SVGAYANDAFDI [SEQ ID NO: 103]
CDRL1: TGSSSNIGAGYDVH [SEQ ID NO: 104]
CDRL2: GDTNRPS [SEQ ID NO: 105]
CDRL3: AAWDDSLNGPV [SEQ ID NO: 106]
Клон 10
CDR Области
CDRH1: SYGMH [SEQ ID NO: 83]
CDRH2: VISYDGSNKYYADSVKG [SEQ ID NO: 84]
CDRH3: ELYDAFDI [SEQ ID NO: 85]
CDRL1: TGSSSNIGAGYDVH [SEQ ID NO: 86]
CDRL2: ADDHRPS [SEQ ID NO: 87]
CDRL3: ASWDDSQRAVI [SEQ ID NO: 88]
Клон 11
CDR Области
CDRH1: SYGMH [SEQ ID NO: 89]
CDRH2: VISYDGSNKYYADSVKG [SEQ ID NO: 90]
CDRH3: EFGYIILDY [SEQ ID NO: 91]
CDRL1: SGSSSNIGSNTVN [SEQ ID NO: 92]
CDRL2: RDYERPS [SEQ ID NO: 93]
CDRL3: MAWDDSLSGVV [SEQ ID NO: 94]
Клон 12
CDR Области
CDRH1: NHGMH [SEQ ID NO: 95]
CDRH2: VISYDGTNKYYADSVRG [SEQ ID NO: 96]
CDRH3: ETWDAFDV [SEQ ID NO: 97]
CDRL1: SGSSSNIGSNNAN [SEQ ID NO: 98]
CDRL2: DNNKRPS [SEQ ID NO: 99]
CDRL3: QAWDSSTVV [SEQ ID NO: 100]
Предпочтительные антигены клеточной поверхности могут быть выбраны из числа следующих: CD20, Thy-1 (CD90, кластер дифференцировки 90 (Biofactors. 2009 May-Jun;35(3):258-65)); Ly-6 (Lymphocyte Antigen 6 (Mol Biol Rep. 2009 Apr;36(4):697-703)); CD59 (регуляторный белок комплемента (Mol Immunol. 2007 Jan;44(1-3):73-81)); Fas (FS7-ассоциированный антиген клеточной поверхности, CD95, APO-1 или TNFRSF6 (Adv Exp Med Biol. 2009;647:64-93)); EGFR (рецептор эпидермального фактора роста (FEBS J. 2010 Jan;277(2):301-8)); Her2 (человеческий рецептор 2 эпидермального фактора роста (Clin Breast Cancer. 2008 Oct;8(5):392-401)); CXCR4 (хемокиновый рецептор 4 (Biochim Biophys Acta. 2007 Apr;1768(4):952-63)); CD19 (кластер дифференцировки 19 (Cell Immunol. 1989 Feb;118(2):368-81)); CD40 (кластер дифференцировки 40 (Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2009 Feb;104(2):87-92)); HLA-молекулы (молекулы человеческого лейкоцитарного антигена (Korean J Lab Med. 2010 Jun;30(3):203)); GM1 (ганглиозид, моносиалотетрагексозилганглиозид (J Lipid Res. 2010 Sep;51(9):2731-8)); CD22 (Cheson (2008) NEJM 359(6): 613-26); CD23 (Cheson, 2008); CD80 (Cheson, 2008); CD74 (Cheson, 2008); DRD (Cheson, 2008).
Предпочтительно, если в композиции, применении или способе по изобретению поверхностный антиген выбирают из числа CD19, CD20 или CD40, а более предпочтительно, из числа их человеческих форм. CD20, а особенно человеческий CD20, является наиболее предпочтительным.
Предпочтительно, если молекула антитела, которое специфически связывает антиген клеточной поверхности, является моноклональным антителом, также предпочтительно, если моноклональное антитело после связывания с клеткой-мишенью удаляется с клеточной поверхности и интернализуется в клетку-мишень FcγRIIb-зависимым образом. Предпочтительно, если моноклональное антитело является анти-CD19, анти-CD20 или анти-CD40 антителом. Наиболее предпочтительно, если моноклональное антитело является анти-CD20 моноклональным антителом.
В предпочтительном воплощении молекула антитела, специфически связывающего антиген клеточной поверхности, является анти-CD20 антителом I типа. В другом предпочтительном воплощении, молекула антитела, специфически связывающего антиген клеточной поверхности не является анти-CD20 антителом II типа.
В одном воплощении антиген клеточной поверхности является CD20, а молекула антитела, специфически связывающего антиген клеточной поверхности, является антителом I типа.
Как упоминалось выше, существуют два типа анти-CD20 моноклональных антител (мАТ). В 2003 году авторы впервые определили, что анти-CD20 мАТ относятся к различным группировкам (43 и 25), а затем в 2004 году определили их как мАТ I и II типа (26). Изначально основанием для этого было то, что анти-CD20 мАТ относятся к двум обособленным типам реактивов, исходя из их способности уничтожать ксенотрансплантат лимфомы: антитела I типа (например, ритуксимаб и 1F5) привлекают комплемент; а II типа (например, B1) не привлекают. Оба типа мАТ отлично пролонгируют выживание, но при истощении активности комплемента, путем введения CVF, значительно ослабляется эффективность ритуксимаба и 1F5, но не оказывается влияние на активность B1. Эти результаты ясно демонстрируют, что различные CD20 мАТ используют различные эффекторные механизмы in vivo. Кроме того, результаты полностью согласуются с предшествующей работой, демонстрирующей, что ритуксимаб и 1F5 способны эффективно активировать комплемент, в результате транслокации CD20 в липидные рафты на мембране клетки-мишени, чего мАТ B1-типа не могут делать (43). Существует отличная корреляция со способностью мАТ вовлекать комплемент и индуцировать перемещение CD20 в липидные рафты (43, 26). Следовательно, природа I и II типа может быть определена по их способности перемещать CD20 в липидные рафты. Определение может быть осуществлено, как указано ниже. Существует также корреляция между мАТ II типа и проявлением более действенной гомотипической адгезии и прямой клеточной смерти, но эти явления не могут быть использованы отдельно для определения мАТ I или II типа (в отличие от анализа рафтов с Tx-100; см. ниже).
Следовательно, различные анти-CD20 мАТ могут быть классифицированы как мАТ I типа (например, ритуксимаб, офатумумаб) или II типа (например, тоситумомаб (B1), GA101, 11B8) в соответствии с их способностью перераспределять CD20 в плазматической мембране и в соответствии с их активностью в различных эффекторных анализах (25-27). Анти-CD20 моноклональные антитела I типа (например, ритуксимаб, офатумумаб) индуцируют перераспределение CD20 в большие устойчивые к детергентам микродомены (рафты), тогда как анти-CD20 моноклональные антитела II типа (подобные тоситумомабу) - не индуцируют (50).
Как обсуждалось выше, анти-CD20 мАТ могут быть обозначены как мАТ I типа и II типа согласно перераспределению CD20 в липидные рафты. Данное разделение может быть осуществлено с помощью анализа нерастворимости с Tx-100 или с помощью разделения в градиенте плотности сахарозы и вестерн-блоттинга. Оба способа, описанные в Cragg et al Blood 2003 (43), представлены ниже:
1. Оценка ассоциированного с рафтами антигена по нерастворимости в присутствии Triton X-100
6
2
Для быстрой оценки присутствия антигена в микродоменах-рафтах, мы использовали проточную цитометрию, основанную на нерастворимости Тритон Х-100 при низких температурах. Вкратце, клетки отмывали в RPMI / 1% БСА и ресуспендировали в концентрации 2,5 х 10/мл. Затем клетки инкубировали с 10 мкг/мл FITC-конъюгированного мАТ в течение 15 минут при 37°C, отмывали в холодном PBS / 1% БСА / 20 мМ азиде натрия, а затем образец делили пополам. Одну половину сохраняли на льду для подсчета уровней 100 % поверхностного антигена, тогда как другую обрабатывали 0,5 % Тритон Х-100 в течение 15 минут на льду для определения пропорции антигенов, оставшихся в нерастворимой фракции рафтов. Клетки затем сохраняли при 4°C до конца анализа, отмывали однократно в PBS/БСА/азид, ресуспендировали и оценивали проточной цитометрией, как подробно описано выше. Похожие результаты получали с помощью непрямых способов детекции. Для определения конститутивного уровня ассоциации рафтов с антигенами-мишенями, клетки вначале обрабатывали 0,5% Тритоном X-100 в течение 15 минут на льду и отмывали в PBS/БСА/азид, до связывания с FITC-мечеными мАТ. Для оценки возможности большего перемещения антигена в нерастворимую фракцию с Тритоном Х-100 путем дополнительного перекрестного связывания, клетки инкубировали с FITC-мАТ, как и раньше, отмывали, а затем разделяли на четыре части. Две части образцов инкубировали с козьими F(ab')-фрагментами, связывающими мышиные Ig, в течение 15 минут на льду. После отмывки, один перекрестно-связанный и один не перекрестно-связанный образец лизировали в Тритон X-100 и отмывали, как подробно описано выше, перед проточной цитометрией.
2. Разделение в градиенте плотности сахарозы и вестерн-блоттинг. Получение фракции липидных рафтов и вестерн-блоттинг
6
Моноклональное антитело (1 мкг/10 клеток) добавляли к клеткам при 37°C. После 20 минут инкубации, клетки высаживали и лизировали в ледяном 1,0 % Тритоне Х-100 в MES-буферном солевом растворе (25 мM MES, pH 6,5, 150 мM NaCl, 1мM фенилметилсульфонил фторид, 5 μг/мл апротинин, 5 μг/мл лейпептин, 10 мM EDTA). Затем центрифугированием в градиенте плотности сахарозы получали фракции липидных рафтов. Вкратце, лизаты смешивали с равным объемом 80% сахарозы в лизирующем буфере, покрывали ступенчатым 5-30% градиентом плотности сахарозы, а затем центрифугировали при 200 000 x g в течение 16 ч. Фракции (0,5 мл) собирали и анализировали вестерн-блоттингом. 15 мл аликвоты каждой фракции разводили 1:1 в 2 х загрузочном буфере, нагревали до 95°C в течение 5 мин и разделяли на 15% ДСН-ПААГ геле перед переносом на PVDF-мембраны, и инкубировали с первичным антителом (например, мышиным анти-CD20, клоном 7D1, для обнаружения CD20 или анти-Lyn кроличьей поликлональной сывороткой; «Serotec», Великобритания, для идентификации фракций рафтов), с последующей инкубацией с вторичным антителом, конъюгированным с HRP («Amersham Biosciences UK Ltd»). Блоты визуализировали с помощью «ECL+plus» («Amersham Biosciences UK Ltd»).
Анти-CD20 мАТ могут нуждаться в AxP-мотиве в большой петле CD20. (Офатумумаб и другие генмаб-антитела не нуждаются). Однако (Niederfelner et al.(51)) указывают на то, что мАТ II типа связывают немного другую область на петле CD20 по сравнению с мАТ II типа.
Предпочтительно, если в композиции, применении или способе по изобретению клетка-мишень является злокачественной опухолевой клеткой. Более предпочтительно, если злокачественное новообразование выбирают из неходжкинской лимфомы, включая, без ограничения перечисленным, фолликулярную лимфому, дифузную B-крупноклеточную лимфому, лимфому из клеток мантийной зоны или хронический лимфолейкоз.
В одном воплощении в изобретении предлагаются композиции, применения и способы лечения злокачественного новообразования, в частности, B-клеточных злокачественных новообразований, которые предпочтительно выбирают из лимфом, хронических лимфолейкозов, острых лимфобластных лейкозов, множественной миеломы, болезни Ходжкина и не-Ходжкина, диффузной В-крупноклеточной лимфомы, мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, лимфомы из клеток мантийной зоны и диффузной мелкоклеточной с расщеплёнными ядрами лимфомы и их комбинаций. В некоторых воплощениях, В-клеточным злокачественным новообразованием является лимфома, такая как неходжкинская лимфома (NHL).
В другом воплощении в изобретении предлагаются композиции, применения и способы для лечения воспалительного заболевания. Это заболевание может быть аутоиммунным заболеванием, таким как тиреоидит Хашимото, пернициозная анемия, болезнь Адисона, диабет 1 типа, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, дерматомиозит, синдром Шёгрена, дерматомиозит, красная волчанка, рассеянный склероз, аутоиммунная болезнь внутреннего уха, миастения гравис, синдром Рейтера, болезнь Грейвса, аутоиммунный гепатит, семейный аденоматозный полипоз и язвенный колит или их комбинации. В конкретных воплощениях аутоиммунное заболевание является ревматоидным артритом или системной красной волчанкой.
В предпочтительных воплощениях подвергаемые лечению заболевания включают хронический лимфолейкоз (CCL), неходжкинская лимфома (NHL), B-клеточные злокачественные новообразования, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, дерматомиозит, системный склероз и аутоиммунные пузырчатки.
В предпочтительном воплощении лечением, которое усиливается при применении изобретения, является лечение с помощью анти-СD20 мАТ, таких как ритуксимаб.
Определения
Под «повышенными» мы понимаем, что рассматриваемые клетки экспрессируют на своей поверхности более высокие уровни FcγRIIb, чем контрольные или эталонные клетки, которые экспрессируют на своей поверхности низкий или средний уровни FcγRIIb. Например, если обсуждаемые клетки являются В-клетками, уровни экспрессии FcγRIIb будут считаться «повышенными» если уровень экспрессии выше, чем нормальный (предпочтительно средний) уровень экспрессии FcγRIIb В-клетками того же клеточного типа. В ином случае, уровни будут считаться «повышенными» если рассматриваемые клетки экспрессируют FcγRIIb на уровне выше, чем различные другие типы клеток, которые экспрессируют FcγRIIb на низком или среднем уровне.
Согласно изобретению, чем больше степень повышения экспрессии FcγRIIb на клетках-мишенях, тем хуже прогнозируемый ответ этих клеток на обработку молекулой антитела, которая специфически связывает поверхностный антиген клеток-мишеней и которая имеет Fc-домен, способный связывать FcγRIIb. Поэтому, чем больше повышение экспрессии FcγRIIb, тем больше пользы можно получить от применения агента, который предотвращает или уменьшает связывание Fc-домена с FcγRIIb по изобретению, о чем свидетельствуют фиг. 2D и 3A. После измерения уровней FcγRIIb с помощью ИГХ (фиг. 10b) и разделения образцов MCL на положительные и отрицательные по FcγRIIb, в ответ на терапию на основе ритуксимаба наблюдали четкое клиническое различие (фиг. 10с и d).
Специалисты легко могут определить уровни экспрессии FcγRIIb на клетках различными известными способами, такими как проточная цитометрия и иммуногистохимическое окрашивание, описанные в сопровождающих фигурах и примерах.
Специалист должен понимать, что «нормальный» и «повышенный» уровень экспрессии FcγRIIb будет варьировать между различными типами клеток и различными стадиями заболевания и должен быть способен идентифицировать «нормальный» и «повышенный» уровни экспрессии FcγRIIb для данной клетки-мишени или стадии заболевания с помощью способов, хорошо известных в данной области и описанных в данном документе. Примерные уровни «нормальных» (или медианных) и «повышенных» уровней экспрессии FcγRIIb на некоторых типах клеток представлены на фиг. 2C. В этих конкретных примерах, при фолликулярной лимфоме (FL) «нормальные» уровни составляют примерно 50 (соотношение Geo MFI FcγRIIb к Geo MFI изотипического контроля), а «повышенные» уровни составляют примерно 125 и 400 или больше, при этом при диффузной В-крупноклеточной лимфоме (DLBCL) «нормальные» уровни составляют примерно 20, а «повышенные» уровни составляют примерно 80 или больше, при этом при лимфоме из клеток мантийной зоны (MCL) «нормальные» уровни составляют примерно 60, а «повышенные» уровни составляют примерно 110 или 190 или больше, а при хроническом лимфолейкозе (CLL) «нормальные» уровни составляют примерно 100, а «повышенные» уровни составляют примерно 300 или больше.
Предпочтительно, если повышенный уровень экспрессии FcγRIIb, по меньшей мере, в 1,1 раза превышает нормальный (предпочтительно медианный) уровень экспрессии клеток того же клеточного типа (или клеток другого клеточного типа) или, по меньшей мере, в 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7 ,3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5, 20,0, 21,0, 22,0, 23,0, 24,0 или 25,0 или в большее количество раз превышает нормальный (или медианный) уровень экспрессии клеток того же клеточного типа или клеток другого клеточного типа. Предпочтительно, если они, по меньшей мере, в 1,8 раз превышают нормальный (или медианный) уровень экспрессии клеток того же клеточного типа или клеток другого клеточного типа.
Как показано в сопровождающих примерах, авторы определили, что уровень экспрессии FcγRIIb коррелирует с повышенной модуляцией мАТ с клеточной поверхности. Более высокие уровни экспрессии FcγRIIb дают более высокую модуляцию, т.е. существует корреляция между степенью повышения экспрессии и модуляцией, показанная на фиг. 2В и 3A. На фиг. 2В уровень экспрессии FcγRIIb нанесен на диаграмму относительно уровня наблюдаемой модуляции. Корреляция такова, что наиболее высокие уровни FcγRIIb (например >400) дают наиболее низкий уровень поверхностного CD20 (<20%) т.е. оказывают наибольший эффект на модуляцию мАТ с клеточной поверхности. На фиг. 3А, низкий (18), средний (70) и высокий (124) уровни FcγRIIb были введены в отрицательную по FcγRIIb клеточную линию (Ramos), и это прямо коррелировало с понижением уровней CD20 клеточной поверхности (60, 40, 30% для низкого, среднего и высокого уровней) пропорционально экспрессии FcγRIIb. Уровни экспрессии FcγRIIb даны как соотношение геометрической средней интенсивности флуоресценции (Geo MFI) FcγRIIb к изотипическому контролю.
Модуляция уменьшает количество мАТ, оставшегося на клеточной поверхности. мАТ необходим Fc для привлечения иммунных эффекторных механизмов (ADCC, ADCP, CDC) для удаления клеток-мишеней. Следовательно, уменьшение модуляции с помощью мАТ, блокирующих FcγRIIb, улучшит Fc-зависимые эффекторные функции. Это показано для ADCP (фагоцитоза) на фиг. 8. Фагоцитоз с ритуксимабом отдельно составлял 40%, но вырос до 55% при блокировании FcγRIIb посредством AT10.
В «молекулу антитела» мы включаем, моноклональные антитела, синтетические антитела, рекомбинантно-продуцируемые антитела, мультиспецифичные антитела, человеческие антитела, химерные антитела, антитела, подобные верблюжьим антителам, одноцепочечные Fv (scFv), одноцепочечные антитела, Fab-фрагменты, F(ab')-фрагменты, дисульфидсвязанные Fv (sdFv), интратела, или эпитопсвязывающие фрагменты любых из вышеперечисленных. Предпочтительно, если антитела изобретения являются моноклональными антителами, а более предпочтительно, гуманизированными или человеческими антителами.
Способы получения и описания молекул антител, которые применимы в композициях, применениях и способах настоящего изобретения хорошо известные специалистам. Например, в WO 2008/002933, в разделе 5.3 - 5.3.1 на страницах 74-91, описано получение и дано описание моноклональных антител, которые специфически связывают поверхностный антиген клетки-мишени, такой как CD20 или FcγRIIb. Применяемые антитела, которые специфически связывают FcγRIIb и CD20, включают моноклональные антитела, продуцируемые гибридомами, депонированными согласно Будапештскому соглашению, также описаны на страницах 15-21 WO 2008/002933, описание которого включено в данный документ ссылкой.
Под «специфически связывающими» мы понимаем агенты, такие как молекулы антитела, которые связывают антиген-мишень, но не связывают (перекрестно реагируют) другие антигены или связывают такие антигены более слабо, т.е. с более низкой аффиностью, чем антиген-мишень. Например, антитело, которое специфически связывает FcγRIIb, может быть связано с другими пептидами или полипептидами с низкой аффинностью, определенной, например, иммуноанализами «BIAcore», или другими известными в данной области анализами. Предпочтительно, если антитела, которые специфически связывают FcγRIIb, или их фрагменты не реагируют перекрестно с другими антигенами. Антитела, которые специфически связывают FcγRIIb, могут быть идентифицированы, например, иммуноанализами «BIAcore», или другими методами, известными специалистам в данной области. Антитело или его фрагмент связывает FcγRIIb специфически, когда связывает FcγRIIb с более высокой аффинностью, чем любой перекрестно-связываемый антиген, что определяется с помощью экспериментальных методов, таких как вестерн-блоттинг, радиоиммуноанализ (RIA) и твердофазный иммуноферментный анализ (тИФА) (см. в Fundamental Immunology Second Edition, Raven Press, New York at pages 332-336 (1989) обсуждение вопроса специфичности антител) и связывают FcγRIIb, особенно человеческий FcγRIIb, более предпочтительно, нативный человеческий FcγRIIb, с большей аффинностью, чем указанное антитело или фрагмент связывают FcγRIIA, особенно человеческий FcγRIIA, более конкретно, нативный человеческий FcγRIIA. Репрезентативные антитела описаны в патентных заявках США No. 2004-0185045; 2005-0260213; и 2006-0013810, которые полностью включены в данный документ в явном виде ссылкой.
4
5
6
7
8
4
5
6
7
8
Предпочтительно, если некоторые антитела к FcγRIIb, используемые в комбинации с антителами к CD20 в композициях и способах изобретения, связывают внеклеточный домен нативного человеческого FcγRIIb. В некоторых воплощениях антитело или его фрагмент связывают FcγRIIb, по меньшей мере, в 2 раза большей аффинностью, чем указанное антитело или его фрагмент связывают FcγRIIA. В других воплощениях антитело или его фрагмент связывают FcγRIIb, по меньшей мере, в 4 раза, по меньшей мере, 6 раз, по меньшей мере, 8 раз, по меньшей мере, 10 раз, по меньшей мере, 100 раз, по меньшей мере, 1000 раз, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 10, или, по меньшей мере, 10 раз большей аффинностью, чем указанное антитело или его фрагмент связывают FcγRIIA. В предпочтительном воплощении, указанное антитело или его фрагмент связывают FcγRIIb 100 раз, 1000 раз, 10 раз, 10 раз, 10 раз, 10 раз, 10 раз большей аффинностью, чем указанное антитело или его фрагмент связывают FcγRIIA.
Примеры
Примеры, которые воплощают аспекты изобретения, будут описаны с учетом сопутствующих фигур, в которых:
Фигура 1. мАТ I типа интернализуется с клеточной поверхности нормальных и злокачественных человеческих В-клеток.
A) Первичные клетки CLL культивировали с Tosit-488, GA101gly-488, Ritux-488 или Ofatum-488 (все по 5 μг/мл) в течение 2 и 6 часов. Затем клетки собирали и отмывали дважды перед добавлением анти-Alexa-488 к одной половины образца в течение 30 минут при 4°C для различения между интернализованным и неинтернализованным мАТ. Поверхностно доступный CD20 (%) рассчитывали следующим образом: Поверхностно доступный CD20 + (Geo MFI перед гашением - Geo MFI после гашения)/(Geo MFI перед гашением) x 100. Каждая точка представляет собой образец отдельного пациента с CLL. Статистический анализ осуществляли с помощью парного критерия Вилкоксона, **p-значение < 0,001; показаны медианы. B) Затем с помощью того же анализа с Tosit-488 или Ritux-488 проверили множество первичных В-клеточных опухолей и нормальных B-клеток из здоровых волонтеров. Статистический анализ осуществляли с помощью теста Манна-Уитни, показаны медианы.
+ve
-ve
+ve
-ve
Дополнительная фигура 1. Утрата корреляции между модуляцией CD20 и фенотипическими/прогностическими маркерами CLL. a) Корреляция между модуляцией и известными прогностическими факторами CLL: случаи CLL фенотипировали по мутационному статусу гена IgVH, экспрессии Zap-70 и CD38 и на всех образцах для оценки модуляции проводили анализы интернализации как на фиг. 1а). Корреляцию между каждым прогностическим признаком и модуляцией CD20 изучали корреляционным анализом Спирмана. Не наблюдали корреляции для какого-либо прогностического фактора (p>0,05). b) Подобным образом, оценивали статус sIg, способность клеток вызывать поток кальция и жизнеспособность клеток CLL, и сравнивали с модуляцией CD20. И в этом случае не наблюдали корреляции. c) Экспрессию CD20 клетками CLL оценивали FACS с помощью Ritux-488, и сравнивали с модуляцией CD20. Наблюдалась слабая корреляция (Значение r Спирмена -0,34, p=0,038). Последующий анализ с помощью многомерной регрессии экспрессии CD20 и FcγRIIb против модуляции CD20 показал, что слабая корреляция с CD20 не была значимой (p=0,638). d) sIg экспрессию IgM-положительных случаев CLL определяли с помощью FACS, и сравнивали уровень экспрессии с модуляцией CD20. Корреляция не была обнаружена (p>0,05). e) случаи CLL культивировали с Rit m2a-488 в течение 2 часов, и осуществляли анализ интернализации, как на фиг. 1а). В пределах одиночного случая CLL, наблюдали изменчивость экспрессии CD38. Диаграммы FACS демонстрируют образцы перед гашением (слева) и после гашения (справа). Соответствующие гистограммы подчеркивают, что CD38 и CD38 клетки в пределах одного образца модулируются с одинаковой скоростью. CD38 и CD38 клетки представлены сплошным и полым пиками, соответственно. Эти результаты представляют 3 различных случая.
2
Фигура 2. Модуляция является Fc-зависимым процессом. A) Анализ интернализации, описанный в 1a) повторяли после культивирования клеток CLL в течение 6 часов с Alexa-488-мечеными фрагментами ритуксимаба; Fab', F(ab') и IgG. Данные представляют средние уровни модуляции +/- SD для 3 различных образцов CLL. B) Клетки CLL культивировали с Tosit-488, Ritux-488 +/- AT10 и Rit m2a-488 как в 1a) в течение 2 и 6 ч. Среднее +/- модуляция показаны для 6 различных образцов CLL. Добавление анти- FcγRII мАТ AT10, к ритуксимабу, уменьшает модуляцию CD20 до уровней, схожих с уровнями Rit m2a, тогда как добавление AT10 к Rit m2a не дает значимых различий в модуляции. C) Множество образцов нормальных и озлокачествленных В-клеток окрашивали с помощью AT10-PE для выявления экспрессии FcγRIIb. На диаграмме продемонстрировано разнообразие экспрессии FcγRIIb в 3 различных случаях CLL, представляющих экспрессоров с условно высокой (черная линия), средней (темно-серая линия) и низкой (светло-серая линия) экспрессией. В диаграмме рассеяния показаны отличия в экспрессии FcγRIIb по всем здоровым В-клеткам, CLL, SLL, MCL, FL и SLBCL. Экспрессия FcγRIIb была выражена как соотношение Geo MFI FcγRIIb: изотипический контроль для контроля малых отличий из-за варьирования между экспериментами. Показаны медианные значения. D) Экспрессия FcγRIIb была нанесена на график относительно модуляции CD20 по всем субтипам NHL и нормальных В-клеток (полученных в анализе интернализации, описанном в 1А) и ко-культивированных с Ritux-488 в течение 6 ч). Анализ осуществляли с помощью корреляции Спирмена, предполагая непараметрическое распределение. Была продемонстрирована сильная корреляция. Значение r Спирмена = -0,74, 95% доверительная область между -0,83 и -0,61 и p<0,0001.
Фигура 3. Экспрессия FcγRIIb является основной детерминантой модуляции CD20. A) Клетки Ramos, трансфецированные FcγRIIb, сортировали по низкому, среднему и высокому уровням экспрессии FcγRIIb и оценивали в анализе интернализации с помощью Tosit-488 и Ritux-488 в 6 часовой временной точке наряду с ложнотрансфецированными клетками. Столбики представляют средние значения +/- SD из независимых экспериментов. Значения Geo MFI экспрессии FcγRIIb сортированных клеток перечислены справа. B) Анализ интернализации повторяли при использовании Tosit-488 и Ritux-488 на нормальных клетках Ramos, клетках Rx3 (которые утратили экспрессию BCR), ложно-трансфецированных клетках Rx3 и FcγRIIb-трансфецированных клетках Rx3, с последующей инкубацией в течение 6 часов. Точки по данным 5 независимых экспериментов представлены вместе со средним значением.
-ve
+ve
-ve
5
5
Фигура 4. Колигирование CD20 и FcγRIIb происходит преимущественно в цис положениях и приводит к активации FcγRIIb. A) Клетки Raji культивировали с упомянутым мАТ (10 мкг/мл) в течение 2 ч при 37°C перед сбором, лизисом и последующим иммуноблотингом фосфорилированного FcγRIIb. B) Левая панель; PKH26-меченые клетки Ramos (FcγRIIb, R1) смешивали 1:1 с сортированными сильно экспрессирующими FcγRIIb трансфектантами Ramos (R2) (описанными на фиг. 3A). Правая панель; модуляция CD20 на FcγRIIb и FcγRIIb клетках после культивирования с Ritux-488 в течение 6 часов. В качестве контролей обе популяции также культивировали отдельно. Данные представляют средние значения модуляции +/- SD из трех независимых экспериментов. C) В похожем эксперименте, низко экспрессирующие FcγRIIb CLL метили PKH26, затем смешивали 1: 1 с сильно экспрессирующими FcγRIIb CLL. Эксперимент осуществляли трижды, каждый раз с отдельным высокоэкспрессирующим FcγRIIb CLL. Уровни FcγRIIb (Geo MFI) составляли 42 (низкий) и 275, 306 и 165 для высокой экспрессии. Затем осуществляли анализ интернализации также, как и в 4B. Данные представляют средние значения модуляции +/- SD. D) Различные образцы CLL культивировали с Ritux-488 в течение 6 часов в концентрации 20, 4 и 1 x 10 клеток/мл, и проводили анализ интернализации через 6 ч как и ранее. E) Клетки Raji культивировали в концентрации 20, 4, и 1 x 10 клеток/мл с указанным мАТ (10 мкг/мл) в течение 2 часов при 37°C. Изображения получали с помощью светлопольного микроскопа для демонстрации различий в пространственной близости между клетками. Клетки затем собирали и оценивали иммуноблоттингом фосфорилированный FcγRIIb, как описано в 4A.
Фигура 5. Ритуксимаб, CD20 и FcγRIIb вместе интернализуются в лизосомы. A) Клетки CLL инкубировали либо с Tosit-488, либо Ritux-488 в течение 2 ч перед окрашиванием анти--CD19-APC и AT10-PE. Данные демонстрируют среднее +/1 SD для экспрессии FcγRIIb как % от необработанных (n+6 образцов CLL). Экспрессия FcγRIIb после Ritux-488 была значительно ниже, чем после Tosit-488, * p<0,05. B) Клетки CLL отмывали, фиксировали и пермеабилизовали перед окрашиванием AT10-647 (синий), отмывали и анализировали с помощью конфокальной микроскопии. Это изображение представляет паттерн окрашивания FcγRIIb в нестимулированных клетках. C) Тот же самый образец CLL культивировали с Ritux-488 в течение 30 минут, затем обрабатывали как описано в 5b). Клетки во всех временных точках демонстрировали явную колокализацию Ritux-488 (зеленый) с AT10-647 (синий). D) Клетки CLL инкубировали с Tosit-488 в течение 6 часов перед приготовлением препарата для микроскопии как в 5В. Дополнительно клетки также окрашивали биотинилированным LAMP-1 и стрептавидином-546 (красный) для окрашивания лизосом. Tosit-488 остался равномерно распределенным на поверхности, а окрашивание AT10-647 не изменилось по сравнению с исходным значением, представленным в 5В. Колокализация с LAMP-1 отсутствовала. E) Клетки CLL обрабатывали Ritux-488 в течение 6 ч и оценивали как и в 5D). Две репрезентативные клетки показаны здесь. Верхняя клетка демонстрирует однозначную колокализацию между Ritux-488 и AT10-647, но не колокализацию с LAMP-1. Нижняя клетка демонстрирует колокализацию всех трех флуорохромов. В каждом случае для той же клетки показано светлопольное изображение. Масштабная метка равна 5 мкм.
Фигура 6. Утрата ингибирующего рецептора дополняет истощающую способность анти-CD20 мАТ. Трансгенных по hCD20 мышей (дикий тип) или трансгенных по hCD20 мышей, утративших CD32 (CD32KO) обрабатывали вариантами ритуксимаба, на основе мышиных IgG1 (m1) или мышиных IgG2a (m2a); 250 мг внутривенно, а затем отслеживали проточной цитометрией истощение В-клеток в течение 90 дней посредством периодического забора крови у мышей и окрашивания B220 и CD19 мАТ.
Фигура 7. Блокирование ингибирующего рецептора CD32b (FcγRIIb) дополняет эффективность анти-CD20 мАТ в системе человеческого ксенотрансплантата. CD20-положительные человеческие опухолевые клетки (Daudi или Raji) инокулировали в мышей с ТКИН (англ. SCID), а затем обрабатывали либо ритуксимабом или AT10, либо и тем и другим, и отслеживали выживаемость мышей или рост опухолей. Дозы используемых мАТ указаны в легендах фигур. В А) клетки Daudi инокулировали подкожно, а опухоль отслеживали измерением штангенциркулем каждые 305 дней. В B) и C) клетки Raji инокулировали внутривенно.
5
2
2
Фигура 8. Усиленный фагоцитоз клеток CLL, обработанных ритуксимабом, с ко-инкубацией с FcγRII-блокирующими мАТ. Моноциты были получены из здоровых волонтеров и дифференцированы в макрофаги с помощью M-CSF в 6-луночном планшете в течение минимального периода 7 дней перед применением. Затем макрофаги собирали, позволяли им прикрепиться в 96-луночном планшете в количестве 5 x 10 клеток/лунку в течение минимум 2 часов перед добавлением CFSE-меченых клеток CLL. CSFE-меченые клетки CLL были необработанные или опсонизированные 10 мкг/мл ритуксимабом (ritux) и (fab')FcγRIIb-блокирующего мАТ AT10 либо в течение 15 минут, либо в течение 6 ч перед двойной отмывкой и добавлением макрофагов (соотношение 1:1) в течение, по меньшей мере, 30 минут. Затем в каждую лунку на 15 минут добавляли анти-CD16 f(ab)-APC (5 мкг/мл) при комнатной температуре (RT) для окрашивания макрофагов, после чего однократно промывали лунки отмывкой для Facs (PBS БСА азид) при RT. Далее добавляли ледяную отмывку для FACS и инкубировали планшеты на льду в течение 10 минут перед сбором для анализа Facs. % дважды положительных макрофагов представляет % CD16+CFSE+ положительных клеток, выраженный от общего % CD16+ клеток. N=3 повтора, линия представляет среднее значение. Данные ясно демонстрируют, что фагоцитоз клеток CLL выше, когда ритуксимаб добавляли только на 15 минут, по сравнению с 6 ч. Это уменьшение эффективности связано с модуляцией ритуксимаба с клеточной поверхности и может быть обращено обработкой FcγRIIb блокирующим мАТ AT10. Важно отметить, что FcγRIIb мАТ добавляется только к клеткам CLL, и таким образом не оказывает влияния на сами макрофаги. Боле того, используются только Fab2-фрагменты АТ10 и, следовательно, увеличение фагоцитоза не может произойти как результат связывания с больше чем одним мАТ на поверхности клеток CLL. Этот вывод также подтверждается тем фактом, что никакого увеличения фагоцитоза не наблюдается после инкубации в течение только 15 минут (времени, за которое незначительная модуляция ритуксимаба могла бы произойти).
Фигура 9. Экспрессия FcγRIIb в ИГХ. Парафинизированные ткани окрашивали на предмет экспрессии FcγRIIb с помощью анти-CD32b специфичного мАТ, EP888Y. Представлены изображения для 4 различных пациентов с FL (x40 общее увеличение, и x150 увеличение во врезке). Экспрессию FcγRIIb также проверяли проточной цитометрией путем окрашивания соответствующих жизнеспособных клеток с помощью AT10-PE. Экспрессия FcγRIIb, полученная с помощью проточной цитометрии, представлена в верхнем левом углу каждого изображения.
Фигура 10. Уровни FcγRIIb прогнозируют клинический эффект у подвергнутых лечению ритуксимабом пациентов с MCL. Для доказательства правильности концепции наших in vitro результатов, мы ретроспективно проверили экспрессию FcγRIIb когорты пациентов с MCL, получавших ритуксимаб. Диагностическую залитую в парафин ткань окрашивали иммуногистохимически с помощью FcγRIIb-специфичного антитела (фиг. 11). Сильное окрашивание мембраны наблюдалось в образцах лимфомы FcγRIIb+ve, но не в FcγRIIb-ve. ИГХ-окрашивание FcγRIIb, показанное на фиг. 10а и b, коррелировало с экспрессией FcγRIIb, выявленной с помощью проточной цитометрии и представленной на фиг. 2D (со значением, определенным проточной цитометрией, представленным в 2D как числовая врезка на фиг. 10а и b). Эти результаты коррелируют с экспрессией FcγRIIb соответствующих замороженных в DMSO образцов, полученных проточной цитометрией (фиг. 2C, значения во врезке). Несмотря на исследование всего лишь малой когорты из 16 пациентов с MCL, пациенты с FcγRIIb-ve лимфомой имеют значимо более лучшую медианную выживаемость без прогрессии, чем с клетками FcγRIIb+ve (медиана 852 и 189 дней, соответственно). На фиг. 10с показаны различия в выживаемости в подмножествах FcγRIIb + и -. Группы были сравнимыми по показателям клинических признаков (международный прогностический индекс для MCL, данные не показаны), но существовала гетерогенность в типах применяемой химиотерапии. Для того чтобы решить эту проблему, мы изучили результаты у тех пациентов, которые получали монотерапию либо ритуксимабом. либо флударабином, циклофосфамидом и ритуксимабом (FCR) для начальной терапии, и получили аналогичные результаты. На фиг. 10d показаны различия в выживаемости в подмножествах FcγRIIb + и - после осуществления дополнительного контроля над когортами пациентов, как обсуждалось.
Фигура 11. Подтверждение специфичности анти-FcγRIIb мАТ, использованных в иммуногистохимии.
FcγRIIa- и FcγRIIb-трансфецированные клетки Ramos осаждали в цитоцентрифуге и заливали парафином. Иммуногистохимия с мАТ к человеческому FcγRIIb продемонстрировала сильное окрашивание мембраны в FcγRIIb-трансфецированных Ramos, но не продемонстрировала окрашивания в FcγRIIa-трансфецированных клетках.
Фигура 12. CD32B-специфичные клоны ингибируют интернализацию ритуксимаба.
Способность анти-CD32b мАТ блокировать модуляцию ритуксимаба. Ось Y демонстрирует поверхностно доступный CD20 (%). Ритуксимаб-alexa 488 добавляли к клеткам Ramos, трансфецированным CD32B, в присутствии или отсутствии различных блокирующих CD32b мАТ (дикого типа или мутанты 297Q (nq)) и оценивали модуляцию через 1, 2, 6 и 24 ч. В качестве контроля блокирующей способности мАТ к CD32 мы также включили мАТ, с двойной специфичностью к CD32a и b, AT10 (IgG и Fab2-фрагменты (Fab)), наряду с отрицательным контролем, совпадающим по изотипу иррелевантным мАТ (iso wt или nq). И наконец, ALEXa 488-меченый B1 был включен в качестве контрольного мАТ, которое модулирует не быстро. Данные ясно указывают на то, что все 3 «nCoDeR©» мАТ (C1, C11 и C13) способны блокировать модуляцию ритуксимабом либо дикого типа, либо формата 297q. В частности, мАТ C11 было крайне эффективным.
Фигура 13. Способность анти-CD32b мАТ блокировать модуляцию ритуксимаба. Все 15 мАТ (nq) и C11 в качестве дикого типа.
Ритуксимаб-alexa 488 добавляли к клеткам Ramos, трансфецированным CD32B, в присутствии или отсутствии различных блокирующих CD32b мАТ (дикого типа или мутанта 297Q) и оценивали модуляцию через 1, 2, 6 и 24 ч. Ось Y демонстрирует поверхностно доступный CD20 (%). В качестве контроля блокирующей способности мАТ к CD32 мы также включили мАТ, с двойной специфичностью к CD32a и b, AT10 (IgG и Fab2 фрагменты (Fab)), наряду с отрицательным контролем, совпадающим по изотипу иррелевантным мАТ (iso wt или nq). И наконец, ALEXa 488-меченый B1 был включен в качестве контрольного мАТ, которое модулирует не быстро. Кроме того, контрольные, отрицательные по CD32 клетки Ramos были включены для оценки максимального эффекта мАТ, блокирующих CD32. Данные ясно указывают на то, что основная часть «nCoDeR©» мАТ была способна блокировать модуляцию ритуксимаба. В частности, мАТ C10 и C11 были крайне эффективны и, по всей видимости, блокировали модуляцию почти полностью даже через 24 часа.
Фигура 14A. Корреляция между аффинностью и способностью анти-CD32b блокирующего мАТ предотвращать фосфорилирование CD32b после связывания ритуксимаба.
Относительную аффинность мАТ оценивали в эксперименте титрования дозы, измеряя мАТ, связанный с CD32B-трансфецированными клетками CHO. Вкратце, CD32B-трансфецированные адгерентные клетки CHO K1 рассевали в планшеты для FMAT. IgG титровали в разведениях 1:2 от 30 нМ до примерно 0,015 нМ и оставляли связываться в течение 1 ч при комнатной температуре. После отмывки связанный IgG детектировали с помощью APC против человеческого IgG. И наконец, планшеты отмывали и считывали с них данные в FMAT («Applied Biosystems»). Процедура дает значение EC50 для мАТ, связывающего клетки, которые экспрессируют мишень, и может быть преобразована в относительную аффинность. Относительная аффинность, кроме того, коррелировала со способностью анти-CD32b блокирующего мАТ предотвращать фосфорилирование CD32b после связывания ритуксимаба. Эта способность была определена стимуляцией клеток ритуксимабом в присутствии или отсутствии анти-CD32b мАТ с последующим осуществлением вестен-блоттинга мАТ к CD32b с последующим ранжированием согласно из способности блокировать фосфорилирование CD32, при этом 1 являлось наиболее эффективным. Очевидно, что существовала тесная корреляция между аффинностью мАТ и способностью блокировать фосфорилирование CD32b.
Фигура 14B. Корреляция между аффинностью и способность анти-CD32b блокирующего мАТ предотвращать модуляцию ритуксимаба.
Корреляция между аффинностью и анти-CD32b блокирующего мАТ и его способностью предотвращать модуляцию ритуксимаба. Относительную аффинность мАТ оценивали в эксперименте титрования дозы, измеряя мАТ, связанный с CD32B-трансфецированными клетками CHO. Вкратце, CD32B-трансфецированные адгерентные клетки CHO K1 рассевали в планшеты для FMAT. IgG титровали в разведениях 1:2 от 30 нМ до примерно 0,015 нМ и оставляли связываться в течение 1 ч при комнатной температуре. После отмывки связанное IgG детектировали с помощью APC против человеческого IgG. И наконец, планшеты отмывали и считывали с них данные в FMAT («Applied Biosystems»). Процедура дает значение EC50 для мАТ, связывающего клетки, которые экспрессируют мишень, и может быть преобразована в относительную аффинность. Эта относительная аффинность, кроме того, коррелировала со способностью анти-CD32b блокирующих мАТ предотвращать модуляцию ритуксимабом на CD32b-трансфецированных клетках Ramos (показаны на предыдущей фигуре). Имела место, по всей видимости, сильная корреляция между аффинностью мАТ и способностью блокировать модуляцию ритуксимаба. Эти данные подтверждают центральную роль CD32B в ускорении модуляции ритуксимаба на поверхности клетки-мишени.
Фигура 15. Опосредовано клоном 1. Дозозависимое связывание с клетками, трансфецированными hCD32B, и дозозависимое связывание и ингибирование иммунного комплекса клеток, трансфецированных hCD32B
Кружки указывают на дозозависимое связывание с клетками CHO K1, трансфецированными hCD32A, а черные ромбы указывают на зависимое связывание с клетками CHO K1, трансфецированными hCD32B. Кресты указывают на дозозависимое ингибирование иммунного комплекса клеток CHO K1, трансфецированных hCD32B. Опосредовано клоном 1. Клетки рассевали в планшеты для FMAT. Иммунные комплексы готовили путем покрытия БСА FITC и после этого смешиванием в молярном соотношении 10:1 с FITC-специфичным антителом hIgG1. Общая интенсивность отражает связывание, чем больше интенсивность, тем выше уровень связывания. Связывание является либо связыванием иммунного комплекса (ИК), либо связыванием мАТ.
Фигура 16. Опосредовано клоном 2. Дозозависимое связывание с клетками, трансфецированными hCD32B, и дозозависимое связывание и ингибирование иммунного комплекса клеток, трансфецированных hCD32B
Кружки указывают на дозозависимое связывание с клетками CHO K1, трансфецированными hCD32A, а черные ромбы указывают на зависимое связывание с клетками CHO K1, трансфецированными hCD32B. Кресты указывают на дозозависимое ингибирование иммунного комплекса клеток CHO K1, трансфецированных hCD32B. Опосредовано клоном 2. Клетки рассевали в планшеты для FMAT. Иммунные комплексы готовили путем покрытия BSA FITC и после этого смешиванием в молярном соотношении 10:1 с FITC-специфичным антителом hIgG1. Общая интенсивность отражает связывание, чем больше интенсивность, тем выше уровень связывания. Связывание является либо связыванием иммунного комплекса (ИК), либо связыванием мАТ.
Фигура 17. Опосредовано клоном 3. Дозозависимое связывание с клетками, трансфецированными hCD32B, и дозозависимое связывание и ингибирование иммунного комплекса клеток, трансфецированных hCD32B
Кружки указывают на дозозависимое связывание с клетками CHO K1, трансфецированными hCD32A, а черные ромбы указывают на зависимое связывание с клетками CHO K1, трансфецированными hCD32B. Кресты указывают на дозозависимое ингибирование иммунного комплекса клеток CHO K1, трансфецированных hCD32B. Опосредовано клоном 3. Клетки рассевали в планшеты для FMAT. Иммунные комплексы готовили путем покрытия БСА FITC и после этого смешиванием в молярном соотношении 10:1 с FITC-специфичным антителом hIgG1. Общая интенсивность отражает связывание, чем больше интенсивность, тем выше уровень связывания. Связывание является либо связыванием иммунного комплекса (ИК), либо связыванием мАТ.
Фигура 18. Опосредовано клоном 4. Дозозависимое связывание с клетками, трансфецированными hCD32B, и дозозависимое связывание и ингибирование иммунного комплекса клеток, трансфецированных hCD32B
Кружки указывают на дозозависимое связывание с клетками CHO K1, трансфецированными hCD32A, а черные ромбы указывают на зависимое связывание с клетками CHO K1, трансфецированными hCD32B. Кресты указывают на дозозависимое ингибирование иммунного комплекса клеток CHO K1, трансфецированных hCD32B. Опосредовано клоном 4. Клетки рассевали в планшеты для FMAT. Иммунные комплексы готовили путем покрытия БСА FITC и после этого смешиванием в молярном соотношении 10:1 с FITC-специфичным антителом hIgG1. Общая интенсивность отражает связывание, чем больше интенсивность, тем выше уровень связывания. Связывание является либо связыванием иммунного комплекса (ИК), либо связыванием мАТ.
Фигура 19. Опосредовано клоном 5. Дозозависимое связывание с клетками, трансфецированными hCD32B, и дозозависимое связывание и ингибирование иммунного комплекса клеток, трансфецированных hCD32B
Кружки указывают на дозозависимое связывание с клетками CHO K1, трансфецированными hCD32A, а черные ромбы указывают на зависимое связывание с клетками CHO K1, трансфецированными hCD32B. Кресты указывают на дозозависимое ингибирование иммунного комплекса клеток CHO K1, трансфецированных hCD32B. Опосредовано клоном 5. Клетки рассевали в планшеты для FMAT. Иммунные комплексы готовили путем покрытия БСА FITC и после этого смешиванием в молярном соотношении 10:1 с FITC-специфичным антителом hIgG1. Общая интенсивность отражает связывание, чем больше интенсивность, тем выше уровень связывания. Связывание является либо связыванием иммунного комплекса (ИК), либо связыванием мАТ.
Фигура 20. Опосредовано клоном 6. Дозозависимое связывание с клетками, трансфецированными hCD32B, и дозозависимое связывание и ингибирование иммунного комплекса клеток, трансфецированных hCD32B
Кружки указывают на дозозависимое связывание с клетками CHO K1, трансфецированными hCD32A, а черные ромбы указывают на зависимое связывание с клетками CHO K1, трансфецированными hCD32B. Кресты указывают на дозозависимое ингибирование иммунного комплекса клеток CHO K1, трансфецированных hCD32B. Опосредовано клоном 6. Клетки рассевали в планшеты для FMAT. Иммунные комплексы готовили путем покрытия БСА FITC и после этого смешиванием в молярном соотношении 10:1 с FITC-специфичным антителом hIgG1. Общая интенсивность отражает связывание, чем больше интенсивность, тем выше уровень связывания. Связывание является либо связыванием иммунного комплекса (ИК), либо связыванием мАТ.
Фигура 21. Опосредовано клоном 7. Дозозависимое связывание с клетками, трансфецированными hCD32B, и дозозависимое связывание и ингибирование иммунного комплекса клеток, трансфецированных hCD32B
Кружки указывают на дозозависимое связывание с клетками CHO K1, трансфецированными hCD32A, а черные ромбы указывают на зависимое связывание с клетками CHO K1, трансфецированными hCD32B. Кресты указывают на дозозависимое ингибирование иммунного комплекса клеток CHO K1, трансфецированных hCD32B. Опосредовано клоном 7. Клетки рассевали в планшеты для FMAT. Иммунные комплексы готовили путем покрытия БСА FITC и после этого смешиванием в молярном соотношении 10:1 с FITC-специфичным антителом hIgG1. Общая интенсивность отражает связывание, чем больше интенсивность, тем выше уровень связывания. Связывание является либо связыванием иммунного комплекса (ИК), либо связыванием мАТ.
Фигура 22. Опосредовано клоном 8. Дозозависимое связывание с клетками, трансфецированными hCD32B, и дозозависимое связывание и ингибирование иммунного комплекса клеток, трансфецированных hCD32B
Кружки указывают на дозозависимое связывание с клетками CHO K1, трансфецированными hCD32A, а черные ромбы указывают на зависимое связывание с клетками CHO K1, трансфецированными hCD32B. Кресты указывают на дозозависимое ингибирование иммунного комплекса клеток CHO K1, трансфецированных hCD32B. Опосредовано клоном 8. Клетки рассевали в планшеты для FMAT. Иммунные комплексы готовили путем покрытия БСА FITC и после этого смешиванием в молярном соотношении 10:1 с FITC-специфичным антителом hIgG1. Общая интенсивность отражает связывание, чем больше интенсивность, тем выше уровень связывания. Связывание является либо связыванием иммунного комплекса (ИК), либо связыванием мАТ.
Фигура 23. Опосредовано клоном 9. Дозозависимое связывание с клетками, трансфецированными hCD32B, и дозозависимое связывание и ингибирование иммунного комплекса клеток, трансфецированных hCD32B
Кружки указывают на дозозависимое связывание с клетками CHO K1, трансфецированными hCD32A, а черные ромбы указывают на зависимое связывание с клетками CHO K1, трансфецированными hCD32B. Кресты указывают на дозозависимое ингибирование иммунного комплекса клеток CHO K1, трансфецированных hCD32B. Опосредовано клоном 9. Клетки рассевали в планшеты для FMAT. Иммунные комплексы готовили путем покрытия БСА FITC и после этого смешиванием в молярном соотношении 10:1 с FITC-специфичным антителом hIgG1. Общая интенсивность отражает связывание, чем больше интенсивность, тем выше уровень связывания. Связывание является либо связыванием иммунного комплекса (ИК), либо связыванием мАТ.
Фигура 24. Опосредовано клоном 10. Дозозависимое связывание с клетками, трансфецированными hCD32B, и дозозависимое связывание и ингибирование иммунного комплекса клеток, трансфецированных hCD32B
Кружки указывают на дозозависимое связывание с клетками CHO K1, трансфецированными hCD32A, а черные ромбы указывают на зависимое связывание с клетками CHO K1, трансфецированными hCD32B. Кресты указывают на дозозависимое ингибирование иммунного комплекса клеток CHO K1, трансфецированных hCD32B. Опосредовано клоном 10. Клетки рассевали в планшеты для FMAT. Иммунные комплексы готовили путем покрытия БСА FITC и после этого смешиванием в молярном соотношении 10:1 с FITC-специфичным антителом hIgG1. Общая интенсивность отражает связывание, чем больше интенсивность, тем выше уровень связывания. Связывание является либо связыванием иммунного комплекса (ИК), либо связыванием мАТ.
Фигура 25. Опосредовано клоном 11. Дозозависимое связывание с клетками, трансфецированными hCD32B, и дозозависимое связывание и ингибирование иммунного комплекса клеток, трансфецированных hCD32B
Кружки указывают на дозозависимое связывание с клетками CHO K1, трансфецированными hCD32A, а черные ромбы указывают на зависимое связывание с клетками CHO K1, трансфецированными hCD32B. Кресты указывают на дозозависимое ингибирование иммунного комплекса клеток CHO K1, трансфецированных hCD32B. Опосредовано клоном 11. Клетки рассевали в планшеты для FMAT. Иммунные комплексы готовили путем покрытия БСА FITC и после этого смешиванием в молярном соотношении 10:1 с FITC-специфичным антителом hIgG1. Общая интенсивность отражает связывание, чем больше интенсивность, тем выше уровень связывания. Связывание является либо связыванием иммунного комплекса (ИК), либо связыванием мАТ.
Фигура 26. Опосредовано клоном 12. Дозозависимое связывание с клетками, трансфецированными hCD32B, и дозозависимое связывание и ингибирование иммунного комплекса клеток, трансфецированных hCD32B
Кружки указывают на дозозависимое связывание с клетками CHO K1, трансфецированными hCD32A, а черные ромбы указывают на зависимое связывание с клетками CHO K1, трансфецированными hCD32B. Кресты указывают на дозозависимое ингибирование иммунного комплекса клеток CHO K1, трансфецированных hCD32B. Опосредовано клоном 12. Клетки рассевали в планшеты для FMAT. Иммунные комплексы готовили путем покрытия БСА FITC и после этого смешиванием в молярном соотношении 10:1 с FITC-специфичным антителом hIgG1. Общая интенсивность отражает связывание, чем больше интенсивность, тем выше уровень связывания. Связывание является либо связыванием иммунного комплекса (ИК), либо связыванием мАТ.
Фигура 27. Опосредовано клоном 13. Дозозависимое связывание с клетками, трансфецированными hCD32B, и дозозависимое связывание и ингибирование иммунного комплекса клеток, трансфецированных hCD32B
Кружки указывают на дозозависимое связывание с клетками CHO K1, трансфецированными hCD32A, а черные ромбы указывают на зависимое связывание с клетками CHO K1, трансфецированными hCD32B. Кресты указывают на дозозависимое ингибирование иммунного комплекса клеток CHO K1, трансфецированных hCD32B. Опосредовано клоном 13. Клетки рассевали в планшеты для FMAT. Иммунные комплексы готовили путем покрытия БСА FITC и после этого смешиванием в молярном соотношении 10:1 с FITC-специфичным антителом hIgG1. Общая интенсивность отражает связывание, чем больше интенсивность, тем выше уровень связывания. Связывание является либо связыванием иммунного комплекса (ИК), либо связыванием мАТ.
Фигура 28. Демонстрация клеточной специфичности анти-CD32B антител.
PBMC, выделенные из периферической крови, получали в градиенте плотности Фиколла. Клетки окрашивали клеткоспецифичными маркерами и оценивали по связыванию с антителами, специфичными к CD32B. Как показано на данной фигуре, только В-клетки (CD19+ клетки) окрашены положительно клонами 1-13.
Фигура 29. Дозозависимое окрашивание В-клеток клонами 1-13.
PBMC, выделенные из периферической крови, получали в градиенте плотности Фиколла. Клетки окрашивали по CD19, а затем с помощью 10, 1 или 0,1 мг/мл антител, специфичных к CD32B, как указано. На фигуре, В-клетки (известные своей экспрессией CD32B) были выделены в целевой регион с помощью мАТ, специфичных к CD19. Этот целевой регион назвали «M1». При уменьшении концентрации мАТ к CD32B количество окрашенных В-клеток падает от около 100% до намного более низких значений, демонстрируя тем самым специфическое и дозозависимое окрашивание В-клеток, как и ожидалось от мАТ, специфичных к CD32B.
Фигура 30. Емкость ингибирования Fc-опосредованного фосфорилирования CD32B каждым мАТ
Клетки Raji (положительные по CD32B) обрабатывали ритуксимабом (Rit), который вызывал фосфорилирование CD32B. Обработку осуществляли в отсутствии или присутствии мАТ 1-13, специфичных к CD32B, и на фигуре продемонстрирована способность каждого мАТ ингибировать Fc-опосредованное фосфорилирование CD32B. «TUB» = тубулин, контроль.
Фигура 31. Воздействие CD32b на скорость модуляции анти-CD20 мАТ I типа.
Способность CD32b ускорять интернализацию других анти-CD20 мАТ I типа. Меченные Alexa-488 версии каждого антитела инкубировали с pCDNA3-трансфецированными клетками Ramos или CD32B-трансфецированными клетками Ramos в течение 1 или 6 часов и степень модуляции определяли в обычном порядке. Использованными мАТ являлись ритуксимаб (RTX), собственного производства офатумумаб (OFA) и тоситумумомаб (Tos). Данные ясно демонстрируют, что скорость интернализации OFA схожа со скоростью RTX и растет в присутствии CD32b.
Фигура 32. Анти-CD19 мАТ также интернализуются с клеточной поверхности злокачественных человеческих В-клеток, в такой форме, которая частично зависит от CD32B.
huCD32b-трансфектанты Ramos. Экспрессия CD32b также может оказывать воздействие на интернализацию других поверхностных антигенов. Анализ модуляции осуществляли как и ранее с различными мАТ в присутствии (+) или отсутствии (-) CD32 БЛОКИРОВАННОГО AT10. В этом 6 ч анализе использовали CD32B-трансфектанты Ramos. * p < 0,05. f3.3 = MHC Класс II; RFB9 = CD19; RTX = ритуксимаб. Если мАТ остаются на клеточной поверхности, то они могут быть погашены. Если они интернализуются, они не могут быть погашены. Чем более низкий % погашения, тем более высокий уровень интернализации. Данные ясно демонстрируют значимое уменьшение поверхностно модуляции для RTX и RFB9 мАТ, и меньшее уменьшение для F3.3 мАТ, после инкубации для блокировки CD32. Эти данные указывают на то, что антигены-мишени, такие как CD19, могут интернализоваться с клеточной поверхности злокачественных человеческих В-клеток в форме, которая частично зависит от CD32B и может быть блокирована анти-CD32b мАТ.
Фигура 33. Интернализация других поверхностных антигенов также может быть затронута экспрессией CD32b. Меченные Alexa-488 версии каждого мАТ инкубировали с pCDNA3-трансфецированными клетками Ramos или CD32B-трансфецированными клетками Ramos в течение 24 часов и определяли степень модуляции в обычном порядке. * = p < 0,05. Ось y демонстрирует модуляцию/интернализацию или поверхностно доступный антиген (%). Из фигуры видно, что величина интернализации/модуляции повышается в присутствии huCD32b. Следует отметить, что для обоих анти-CD19 и анти-CD40 мАТ существует статистически значимое (*, p <0,05) уменьшение антигена клеточной поверхности в присутствии CD32b.
Фигура 34. Аминокислотные последовательности константных областей 14 клонов антител, направленных против человеческого CD32B, в формате IgG1-λ. Показаны аминокислотные последовательности IgG1-CH и λ-CL областей.
Фигура 35. Аминокислотные последовательности вариабельных областей 2 клона антитела, направленного против человеческого CD32B. Аминокислотные последовательности представлены для областей VH и VL. Отмеченные последовательности CDR представлены в рамках, отделенных от отмеченных каркасных областей.
Фигура 36. Аминокислотные последовательности вариабельных областей 2 клона антитела, направленного против человеческого CD32B. Аминокислотные последовательности представлены для областей VH и VL. Последовательности в рамке представляют собой последовательности CDR.
Фигура 37. Аминокислотные последовательности вариабельных областей 3 клона антитела, направленного против человеческого CD32B. Аминокислотные последовательности представлены для областей VH и VL. Последовательности в рамке представляют собой последовательности CDR.
Фигура 38. Аминокислотные последовательности вариабельных областей 4 клона антитела, направленного против человеческого CD32B. Аминокислотные последовательности представлены для областей VH и VL. Последовательности в рамке представляют собой последовательности CDR.
Фигура 39. Аминокислотные последовательности вариабельных областей 5 клона антитела, направленного против человеческого CD32B. Аминокислотные последовательности представлены для областей VH и VL. Последовательности в рамке представляют собой последовательности CDR.
Фигура 40. Аминокислотные последовательности вариабельных областей 6 клона антитела, направленного против человеческого CD32B. Аминокислотные последовательности представлены для областей VH и VL. Последовательности в рамке представляют собой последовательности CDR.
Фигура 41. Аминокислотные последовательности вариабельных областей 7 клона антитела, направленного против человеческого CD32B. Аминокислотные последовательности представлены для областей VH и VL. Последовательности в рамке представляют собой последовательности CDR.
Фигура 42. Аминокислотные последовательности вариабельных областей 8 клона антитела, направленного против человеческого CD32B. Аминокислотные последовательности представлены для областей VH и VL. Последовательности в рамке представляют собой последовательности CDR.
Фигура 43. Аминокислотные последовательности вариабельных областей 9 клона антитела, направленного против человеческого CD32B. Аминокислотные последовательности представлены для областей VH и VL. Последовательности в рамке представляют собой последовательности CDR.
Фигура 44. Аминокислотные последовательности вариабельных областей 10 клона антитела, направленного против человеческого CD32B. Аминокислотные последовательности представлены для областей VH и VL. Последовательности в рамке представляют собой последовательности CDR.
Фигура 45. Аминокислотные последовательности вариабельных областей 11 клона антитела, направленного против человеческого CD32B. Аминокислотные последовательности представлены для областей VH и VL. Последовательности в рамке представляют собой последовательности CDR.
Фигура 46. Аминокислотные последовательности вариабельных областей 12 клона антитела, направленного против человеческого CD32B. Аминокислотные последовательности представлены для областей VH и VL. Последовательности в рамке представляют собой последовательности CDR.
Фигура 47. Аминокислотные последовательности вариабельных областей 13 клона антитела, направленного против человеческого CD32B. Аминокислотные последовательности представлены для областей VH и VL. Последовательности в рамке представляют собой последовательности CDR.
Пример 1. Модуляция CD20 в первичных CLL и других образцах NHL
gly
gly
Ранее мы наблюдали гетерогенность в скорости и степени модуляции ритуксимаба в когорте образцов CLL (28). Чтобы проверить и обобщить эти результаты, мы увеличили эту когорту до в общей сложности 48 образцов CLL (фиг. 1А). Как и ранее, мы сравнивали способность ритуксимаба и тоситумомаба (клинически релевантных прототипов мАТ I и II типа, соответственно) уменьшать количество поверхностно доступного CD20 в течение 2, 6 и 24 ч (фиг. 1А, и не представленные данные). Кроме того, также мы протестировали офатумумаб собственного производства (ofatum; тип I), который недавно был одобрен FDA для применения при рецидивирующем CLL, и негликомодифицированную версию GA101 (GA101; тип II), которая в настоящее время находится в стадии клинической разработки для ряда NHL (19). В соответствии с нашими предыдущими наблюдениями, между образцами не было существенной неоднородности, но мАТ I типа в результате дает значительно большую модуляцию, чем мАТ II типа. В 6 ч, модуляция в присутствии ритуксимаба была почти максимальная, с от 18 до 65% (медиана 37%) мАТ, остающегося доступным в анализе гашения (фиг. 1А). В соответствии со своей природой I типа, афатумумаб также привел к высокой степени модуляции (медиана 26% доступного через 6 ч). Напротив, тоситумомаб и GA101 показали намного меньшую модуляцию, с медианой 80% (диапазон 61 - 89%) и 70% (диапазон 57-81%) связанного мАТ, доступного через 6 h, соответственно.
В пределах когорты CLL мы проверили несколько факторов, о которых известно как о важных при прогнозе CLL, включая экспрессию ZAP-70 (29, 30), положительность по CD38 (31, 32) и статус мутации гена IgVH (31, 33, 34). Результаты (дополнительная фиг. 1А) показали отсутствие корреляции с любым из этих маркеров заболевания.
Ранее мы показали, что, несмотря на то, что каждый подтип NHL имеет отличный паттерн модуляции, они также демонстрируют существенную гетерогенность модуляции CD20 (28). Для дальнейшего изучения этого явления, мы расширили количество первичных анализируемых образцов, включением 8 здоровых волонтеров, 7 SLL, 7 MCL, 11 FL и 7 DLBCL (фиг. 1B). Различие в способности мАТ I и II типа индуцировать модуляцию сохраняется во всех гистологических подтипах. Мы также обнаружили, что CD20 на В-клетках из здоровых волонтеров в присутствии ритуксимаба модулируется быстро, а также более равномерно, чем на злокачественных В-клетках, что подтверждает, что факторы, ассоциированные со злокачественностью вносят вклад в наблюдаемую гетерогенность. Скорость ритуксимаб-индуцированной модуляции на клетках SLL и MCL была схожа с модуляцией на CLL (фиг. 1А), тогда как для DLBCL и FL скорость немного медленнее (p <0,0001 и 0.0027, соответственно, при сравнении с CLL из фиг. 1A). Однако при FL мы наблюдали, что в 2/11 образцов пациентов модуляция ритуксимаба идет очень быстро, оставляя едва заметные уровни мАТ или CD20 через 6 ч в культуре.
Пример 2. Модуляция CD20 в B-NHL является Fc-зависимым процессом.
2
2
2
2
Мы и другие исследователи ранее показали, что эффективность анти-CD20 мАТ in vivo является Fc-зависимой (28). Мы выдвинули гипотезу о том, что модуляция даже в отсутствии эффекторных клеток, также может быть Fc-зависимой, и протестировали это путем повтора анализа интернализации с фрагментами Fab' и F(ab') ритуксимаба (фиг. 2А). Fab' ритуксимаба продемонстрировал только низкий уровень модуляции, который может быть объяснен либо потребностью в бивалентном перекрестном связывании CD20, либо его низкоаффинным унивалентным связыванием, что подтверждено с помощью анализов клеточного связывания (данные не показаны). Напротив, F(ab') и IgG продемонстрировали схожий профиль связывания (результаты не показаны), но после 6 ч в культуре F(ab')-фрагмент модулировал значимо меньше (40% поверхностно доступного CD20), чем интактный IgG (20% поверхностно доступного CD20). Поскольку эти анализы были осуществлены на сильно обогащенных (чистота >95%) В-клетках, единственным FcR, присутствующим в избытке, мог быть только ингибирующий FcγRIIb. В присутствии блокирующего анти-FcγRII мАТ, AT10, модуляция ритуксимабом была снижена, и сравнима с модуляцией с F(ab')-фрагментом ритуксимаба или Rit m2a, которые связывают FcγRIIb с более низкой аффинностью, чем ритуксимаб на основе человеческого IgG1 (фиг. 2В). Как и ожидалось, коинкубация с AT10 привела к очень незначительному воздействию на модуляцию Rit m2a.
Пример 3. Экспрессия FcγRIIb на нормальных клетках и В-клеточных опухолях.
С учетом возможности того, что взаимодействия FcγRIIb:Fc могут оказать влияние на скорость модуляции CD20, мы изучили экспрессию FcγRIIb на нормальных B-клетках и нашей панели первичных В-клеточных опухолей. Как показано на фиг. 2C, была отмечена гетерогенность экспрессии FcγRIIb в каждой группе. Экспрессия на клетках CLL была относительно высокой в пределах 20-300 раз больше изотипического контроля. DLBCL и большая часть FL продемонстрировали низкую экспрессию FcγRIIb. Два случая FL продемонстрировали очень высокую экспрессию FcγRIIb, и поразительно, что это были те самые два случая, которые ранее наблюдались как крайне быстро модулирующие. MCL и SLL экспрессируют промежуточный, но, тем не менее, гетерогенный уровень FcγRIIb (фиг. 2C), что опять же соответствует предшествующим результатам (21).
Пример 4. Экспрессия FcγRIIb регулирует модуляцию CD20
В общем, эти результаты говорят о том, что экспрессия FcγRIIb может быть основной детерминантой модуляции CD20 В-клеток-мишеней. Для проверки этой гипотезы мы сравнили экспрессию FcγRIIb и скорости модуляции CD20 всех наших доступных образцов со здоровыми В-клетками и образцов первичной NHL (фиг. 2D). Анализ корреляции Спирмена выявил сильное взаимодействие между этими параметрами (Значение r Спирмена -0,74, с 95% доверительными областями между -0,83 и -0,61 и p<0,0001). Данные демонстрируют обратную экспоненциальную кривую в большей части случаев FL и DLBCL, расположенных вверху с образцами CLL и MCL, демонстрируя обширное распределение. Данная диаграмма также демонстрирует, что при низких уровнях экспрессии, незначительные различия в экспрессии FcγRIIb могут быть ответственными за относительно большие изменения в модуляции CD20, таким образом, подчеркивая способность этого рецептора регулировать очистку комплексов анти-CD20:CD20 с клеточной поверхности.
-ve
+ve
-
-ve
+ve
+ve
+ve
Для того чтобы напрямую выяснить роль FcγRIIb в модуляции CD20, клетки FcγRIIbRamos трансфецировали плазмидой, кодирующей FcγRIIb. Полученные FcγRIIb клетки демонстрировали варьирующие уровни экспрессии FcγRIIb и соответственно были отсортированы в суб-клоны, экспрессирующие FcγRIIb на низком, среднем и высоком уровне. Эти клетки, вместе с родительскими клетками FcγRIIb Ramos оценивали в анализе интернализации. В присутствии ритуксимаба, скорости модуляции CD20 через 6 ч коррелировали с экспрессией FcγRIIb с повышающейся модуляцией в следующем порядке FcγRIIb>FcγRIIb низкий уровень >FcγRIIb средний уровень >FcγRIIb высокий уровень (фиг. 3A). Подобным образом, с помощью В-клеток, полученных из мышей дикого типа и мышей, нокаутированных (англ. knockout, KO) по FcγRII, модуляция в клетках мышей FcγRIIb -/- была меньше, чем в контрагентах (данные не показаны), хотя следует отметить, что заметная модуляция все еще наблюдалась в отсутствие FcγRII, указывая на то, что в данной трансгенной модели в регуляцию модуляции CD20 также вовлечены факторы в дополнение к FcγRII.
+ve
Поскольку FcγRIIb является отрицательным регулятором активации BCR на В-клетках (обзор дан в (35)) и CD20 становится физически ассоциированным с BCR после сцепления CD20 мАТ (36, 37), мы предполагаем, что экспрессия BCR или активность проведения сигналов могут оказывать влияние на модуляцию. Следовательно, для исключения различий в экспрессии BCR в качестве причины этих результатов, дефектные по BCR клетки Ramos (Rx3) трансфецировали FcγRIIb, и модуляцию CD20 сравнивали с необработанными клетками Ramos и ложно-трансфецированными клетками Rx3 (Фигура 3B). Эти данные ясно указывают на то, что клетки Rx3, утратившие экспрессию BCR, модулируют медленнее, чем клетки Ramos, но что этот дефект может быть преодолен экспрессией высоких уровней FcγRIIb (клетки FcγRIIb Rx3). Эта доминантная роль FcγRIIb над BCR при регуляции модуляции CD20 поддержана следующим: 1) тем, что мы наблюдали высокие уровни модуляции в клетках CLL, которые характерно экспрессируют низкие уровни BCR (38); и 2) тем, что не смогли продемонстрировать какой-либо корреляции между экспрессией поверхностного иммуноглобулина (sIg) на клетках CLL и модуляцией CD20 (дополнительная фиг. 1C).
Пример 5. Модуляции CD20 и FcγRIIb предшествует активация FcγRIIb
Для дальнейшей проверки взаимодействия между анти-CD20 мАТ и FcγRIIb, мы исследовали опосредованную антителом стимуляцию FcγRIIb, на которую указывает фосфорилирование тирозина-293 во внутриклеточном мотиве ITIM. Клетки Raji культивировали с тоситумомабом или ритуксимабом в присутствии или отсутствии анти-FcγRIIb блокирующего мАТ (АТ10) перед иммуноблоттингом фосфорилированного FcγRIIb. Фосфорилированный FcγRIIb был повышен в клетках, стимулированных ритуксимабом, но не тоситумомабом, и был ингибирован добавлением AT10 (фиг. 4A). Похожие результаты наблюдали с клетками Daudi (данные не показаны).
Пример 6. Перекрестное связывание CD20 и FcγRIIb происходит главным образом в cis форме
-
+ve
-ve
+ve
Ритуксимаб может быть ко-лигирован с CD20 и FcγRIIb либо на той же (цис), либо на граничащей клетке (транс). Для исследования этого, мы совместно культивировали PKH26-меченые FcγRIIb Ramos клетки с высоко экспрессирующими FcγRIIb трансфектантами Ramos (фиг. 4B), а затем сравнивали с уровнем модуляции в каждом клеточном типе, с отдельным культивированием обоих клеточных типов в качестве контроля. Как показано ранее, при культивировании клеток FcγRIIb отдельно продемонстрирована более значительная модуляция, чем при культивировании клеток, утративших FcγRIIb(фиг. 4B). При ко-культивировании уровень модуляции FcγRIIbбыл слегка повышен, но не достигал уровня, наблюдаемого в клетках FcγRIIb. Этот результат говорит о том, что, несмотря на то, что транс-взаимодействие может происходить, модуляция CD20 мАТ посредством FcγRIIb преимущественно управляется цис образом.
Для демонстрации того, что это результат не являлся специфичным для клеточной линии Ramos, мы ко-культивировали образец CLL, экспрессирующий на низком уровне FcγRIIb (который можно отличить мечением по PKH26) с клетками, из трех различных случаев CLL, экспрессирующих высокие уровни FcγRIIb (фиг. 4C). Как видно в предыдущем анализе с клетками Ramos, в смешанных популяциях модуляция В-клетках с низкой экспрессией FcγRIIb не приближается к той, что наблюдалась в популяции с высоким уровнем FcγRIIb, что опять же говорит о том, что модуляция CD20 мАТ посредством FcγRIIb преимущественно управляется цис образом. Однако, интересно отметить, что ко-культивирование с наиболее быстро модулирующими клетками CLL дает наиболее высокое повышение модуляции CLL с низкой экспрессией FcγRIIb, но увеличение было достаточно скромным (примерно 18%; данные не показаны).
5
6
В дополнительном эксперименте этого типа, клетки CLL культивировали при понижающихся концентрациях для уменьшения возможности межклеточных взаимодействий, результатом которого являлся слабая тенденция уменьшения модуляции с понижением концентрации клеток (фиг. 4D). Такой же эксперимент повторяли с различными концентрациями клеток Raji и опять наблюдали незначительное изменение порядка или степени модуляции (данные не показаны). Важно отметить, что изображения светлопольной микроскопии, полученные в ходе данного эксперимента, демонстрируют, что вероятность межклеточного (транс) взаимодействия была значительно меньше при 1 x 10 по сравнению с 2 x 10 клеток/мл. Кроме того, мы наблюдали отсутствие значимого различия в уровнях фосфорилированного FcγRIIb при различных плотностях клеток (фиг. 4E). В целом эти данные указывают на то, что FcγRIIb опосредует свои воздействия на модуляцию CD20 мАТ преимущественно через события на той же самой клетке, с очень незначительным вкладом от соседних экспрессирующих FcγRIIb клеток.
Пример 7. FcγRIIb с CD20 подвергаются эндоцитозу в лизосомы
Для выяснения судьбы FcγRIIb после связывания с ритуксимабом на клеточной поверхности, мы отследили его экспрессию и расположение с помощью проточной цитометрии и конфокальной микроскопии. С помощью проточной цитометрии мы оценили поверхностную экспрессию FcγRIIb на В-клетках из шести различных случаев CLL и обнаружили, что она убывает в течение 2 ч инкубации с ритуксимабом, но не с тоситумомабом (фиг. 5А). Эти результаты говорят о том, что FcγRIIb может быть интернализован вместе с CD20 и ритуксимабом (но не с тоситумомабом) как часть тройного комплекса.
2
Мы и другие авторы ранее сообщали о эндоцитозе ритуксимаба, приводящем к его направленному движению к ранним эндосомам и последующей деградации в лизосомах (9, 28). Для выяснения того, такой же процесс происходит с FcγRIIb как части комплекса анти-CD20:CD20:FcγRIIb в клетках CLL, мы культивировали их либо с Tosit-488, либо с Ritux-488 перед фиксацией и окрашиванием FcγRIIb (с использованием Alexa 647-меченого F(ab') AT10) и лизосомального маркера LAMP-1. До стимуляции мАТ, окрашивание FcγRIIb было диффузным и не локализованным в плазматической мембране (фиг. 5В). После инкубации с анти-CD20 мАТ в течение 30 минут, мы наблюдали четко выраженные различия в окрашивании между Ritux-488 и Tosit-488, в соответствии с чем Tosit-488 остался исключительно на поверхности, а Ritux-488 продемонстрировал межклеточное точечное окрашивание, согласующееся с нашими предыдущими наблюдениями (фиг. 5C, данные не представлены и (28)). После 6 ч стимуляции, Tosit-488 оставался равномерно распределенным по клеточной поверхности, тогда как распределение AT10-647 не изменилось от своего базового проявления в 30 минут, и у AT10-647 не было колокализации с LAMP-1 (фиг. 5D). Напротив, за тот же период времени Ritux-488 продемонстрировал четко выраженный точечный паттерн в большинстве клеток (58%), демонстрируя колокализацию между AT10-647 и Ritux-488 (фиг. 5E). Колокализация Ritux-488 с LAMP1 и AT10-647 также наблюдалась в 33% клеток. Предположительно, низкая степень колокализации наблюдалась среди всех трех окрасок, что отражает тот факт, что Ritux-488 и FcγRIIb интернализуются вместе и вероятно занимают другие внутриклеточные компартменты до их появления в лизосомах.
Пример 8. FcγRIIb ингибирует анти-CD20 мАТ I типа in vivo
Для выявления возможности ингибирования FcγRIIb эффективности анти-CD20 мАТ I типа in vivo, мы осуществили эксперименты по истощению В-клеток в трансгенных по hCD20 мышах дикого типа, а также в трансгенных по hCD20 мышах, утративших FcγRIIb (CD32 KO). В этих экспериментах мыши были обработаны вариантами ритуксимаба (250 мкг, в.в.) на основе мышиного IgG1 (m1) или мышиного IgG2a (m2a) после чего отслеживали истощение В-клеток проточной цитометрией в течение 90 дней посредством периодического забора крови у мышей и окрашивания B220 и CD19 мАТ (фиг. 6). Эти варианты связывают CD32b либо сильно (m1), либо слабо (m2a). Эти данные ясно демонстрируют, что при использовании изотипа m1 истощение является субоптимальным (по сравнению с m2a), и что утрата CD32 приводит к существенному улучшению эффективности истощения. Напротив, m2a во многом похож в присутствии или отсутствии CD32.
Пример 9. FcγRIIb повышает и усиливает активность анти-CD20 мАТ против человеческих опухолей in vivo
Для проверки эффекта CD32 на человеческие опухолевые клетки и потенциал дополнения существующих в настоящее время терапевтических мАТ, таких как ритуксимаб, мы использовали систему ксенотрансплантации. В этой системе, только человеческие опухолевые клетки экспрессируют hCD32 и таким образом любые терапевтические эффекты, возникающие вследствие воздействия на опухолевую клетку, вероятнее всего блокируют модуляцию, а не оказывают какое-либо воздействие на хозяйские эффекторные клетки. В этих экспериментах CD20 положительные CD32 положительные человеческие опухолевые клетки (Daudi или Raji) инокулировали в ТКИН-мышей, а затем обрабатывали ритуксимабом, AT10 или обоими антителами и отслеживали выживаемость мышеи или опухолевый рост (фиг. 7). Дозы используемых мАТ указаны в легендах фигур. В А) клетки Daudi инокулировали подкожно, а опухоль отслеживали измерением штангенциркулем каждые 3-5 дней. В B и С опухолевые клетки Raji инъецировали внутривенно и наблюдали выживаемость животных. В обеих моделях для AT10 было показано усиление и дополнение активности ритуксимаба, что демонстрирует потенциал данной комбинации in vivo.
Пример 10. Уровни FcγRIIb прогнозируют клинический эффект у подвергнутых лечению ритуксимабом пациентов с MCL.
Для доказательства правильности концепции наших in vitro результатов, мы ретроспективно проверили экспрессию FcγRIIb когорты пациентов с MCL, получавших ритуксимаб. Диагностическую залитую в парафин ткань окрашивали иммуногистохимией с помощью FcγRIIb-специфичного антитела (фиг. 11). Сильное окрашивание мембраны наблюдалось в образцах лимфомы FcγRIIb+ve, но не FcγRIIb-ve. Эти результаты коррелируют с экспрессией FcγRIIb соответствующих замороженных с DMSO образцов, полученных проточной цитометрией. ИГХ-окрашивание FcγRIIb, показанное на фиг. 10a и b, коррелировало с экспрессией FcγRIIb, выявленной с помощью проточной цитометрии и представленной на фиг. 2D (со значением, определенным проточной цитометрией, представленным в 2D как числовая врезка на фиг. 10а и b). Несмотря на исследование всего лишь малой когорты из 16 пациентов с MCL, пациенты с FcγRIIb-ve лимфомой имеют значимо лучшую медианную выживаемость без прогрессии, чем с клетками FcγRIIb+ve (медиана 852 и 189 дней, соответственно). На фиг. 10С показано различие в выживаемости в подмножествах + и - FcγRIIb. Группы были сравнимыми по показателям клинических признаков (международный прогностический индекс дл MCL, данные не показаны), но существовала гетерогенность в типах применяемой химиотерапии. Для того чтобы решить эту проблему, мы изучили результаты у тех пациентов, которые получали монотерапию либо ритуксимабом, либо флударабином, циклофосфамидом и ритуксимабом (FCR) для начальной терапии, и получили аналогичные результаты. На фиг. 10d показаны различия в выживаемости в подмножествах FcγRIIb + и - после того как когорты пациентов подверглись дополнительному контролю, как указано.
Обоснование для экспериментов в примерах 10 и 11 заключается в следующем. Если клетки экспрессируют высокие уровни CD32b (FcγRIIb), то они будут интернализовать ритуксимаб очень быстро (показано как пониженный % поверхностно-доступного CD20). Чем меньше ритуксимаба на клеточной поверхности, тем меньше Fc-зависимая эффекторная активность (такая как фагоцитоз или ADCC) и, следовательно, меньше уничтожение опухолевых клеток, и поэтому меньше всесторонние терапевтические результаты. По этой причине, мы проверили экспрессию FcγRIIb в когорте подвергнутых лечению пациентов с MCL и определили, имеют ли они высокую или низкую экспрессию CD32b. Клинические данные уже были доступны для этой когорты и таким образом клинические результаты были разделены по опухолям, экспрессирующим низкий или высокий уровень FcγRIIb. Гипотеза заключалась в том, что опухоли, экспрессирующие низкие уровни FcγRIIb, могут быть успешно подвергнуты лечению ритуксимабом, а опухоли с высокими уровнями FcγRIIb подвергаются лечению гораздо хуже. Это именно то, что было показано клиническими данными. На фиг. 11 показана специфичность мАТ, использованного для окрашивания FcγRIIb. Антитело окрашивает только клетки, экспрессирующие FcγRIIb, но не близкородственный FcγRIIa.
После измерения уровней FcγRIIb с помощью ИГХ (фиг. 10b) и разделения образцов MCL на положительные и отрицательные по FcγRIIb, мы увидели ясное клиническое различие в ответе после терапии на основе ритуксимаба (фиг. 10с и d).
Пример 11. Отбор моноклональных антител анти-CD32b
Аминокислотные последовательности вариабельных областей (VH и VL), вместе с областями CDR 14 клонов антител показаны на фиг. 37-50. В каждом случае константные (CH и CL) области одинаковы. Константные области представлены на фиг. 36.

3
Отбор против CD32B (FcγRIIb) осуществляли с помощью библиотеки фагового дисплея «n-CoDeRscFv». Человеческий CD32A использовали в качестве ложной мишени. Внеклеточные домены CD32A и CD32B слитые с mIgG-Fc получали в HEK293E и очищали на протеине А. Проводили подряд три отбора белка. Ложную мишень использовали в качестве конкурента при всех отборах. Полученные фаги преобразовали в формат выработки scFv/Fab и трансформировали в бактерии E.coli Top10 для скрининга индивидуальных клонов. Определенную скринингом специфичность к человеческим CD32B и CD32A анализировали тИФА с помощью прикрепленных белков, а также в FMAT с помощью трансфецированных клеток CHO. Для определения ингибирующих свойств ИК, IgG позволяли связываться с CD32B-трансфецированными клетками CHO с последующим добавлением ИК в виде покрытого IgG1 бычьего сывороточного альбумина. Связанный ИК затем детектировали, на основании чего можно оценить ингибирующие свойства IgG.
Пример 12. Способность анти-CD32b мАТ блокировать модуляцию ритуксимаба
Ритуксимаб-alexa 488 добавляли к клеткам Ramos, трансфецированным CD32B в присутствии или отсутствии различных блокирующих CD32b мАТ (дикого типа или мутанта 297Q) и оценивали модуляцию через 1, 2, 6 и 24 ч. В качестве контроля блокирующей способности мАТ к CD32 мы также включили мАТ, с двойной специфичностью к CD32a и b, AT10 (IgG и Fab2 фрагменты (Fab)), наряду с отрицательным контролем, совпадающим по изотипу иррелевантным мАТ (iso wt или nq). Данные на фиг. 12 ясно указывают на то, что все три «nCoder» мАТ (C1, C11 и C13) способны блокировать модуляцию ритуксимабом либо дикого типа, либо формата 297q.
На фиг. 13 для всех 13 мАТ показана способность анти-CD32b мАТ блокировать модуляцию ритуксимаба. Кроме того, контрольные, отрицательные по CD32 клетки Ramos были включены для оценки максимального эффекта мАТ, блокирующих CD32. Данные на фиг. 12 ясно указывают на то, что все «nCoder» мАТ были способны блокировать модуляцию ритуксимаба.
Предшествующая серия экспериментов продемонстрировала, что FcγRIIb регулирует интернализацию ритуксимаба. Следовательно, в этих экспериментах пытались проверить уменьшает ли блокирование FcγRIIb анти-FcγRIIb мАТ количество интернализируемого ритуксимаба.
Пример 13. Корреляция между аффинностью и способностью анти-CD32b блокирующего мАТ предотвращать фосфорилирование CD32b после связывания ритуксимаба и предотвращать модуляцию ритуксимаба.
Относительную аффинность мАТ оценивали в эксперименте титрования дозы, измеряя мАТ, связанный с CD32B-трансфецированными клетками CHO. Вкратце, CD32B-трансфецированные адгерентные клетки CHO K1 рассевали в планшеты для FMAT. IgG титровали в разведениях 1:2 от 30 нМ до примерно 0,015 нМ и оставляли связываться в течение 1 ч при комнатной температуре. После отмывки связанный IgG детектировали с помощью APC против человеческого IgG. И наконец, планшеты отмывали и считывали с них данные в FMAT («Applied Biosystems»). Считанные данные позволяют получить значение EC50 для мАТ, связывающего клетки, которые экспрессируют мишень, которое может быть преобразовано в относительную аффинность. Относительная аффинность, кроме того, коррелировала со способностью анти-CD32b блокирующего мАТ предотвращать фосфорилирование CD32b после связывания ритуксимаба. Эта способность была определена стимуляцией клеток ритуксимабом в присутствии или отсутствии анти-CD32b мАТ с последующим осуществлением вестен-блоттинга с мАТ к CD32b с последующим ранжированием по способности блокировать фосфорилирование CD32, при этом 1 являлось наиболее эффективным. На фиг. 14А показано, что, по всей видимости, имела места близкая корреляция между аффинностью и мАТ и способностью блокировать фосфорилирование CD32b. На фиг. 14B показано, что, по всей видимости, имела место сильная корреляция между аффинность мАТ и способностью блокировать модуляцию ритуксимаба. Эти данные подтверждают центральную роль CD32B в ускорении модуляции ритуксимаба на поверхности клетки-мишени.
Объяснение заключалось в том, что более высокая аффинность мАТ будет лучше блокировать FcγRIIb. Подобным образом, чем лучше мАТ блокирует FcγRIIb, тем лучше оно будет блокировать модуляцию/интернализацию ритуксимаба. Это именно то, что было показано на фиг. 14. Чем выше аффинность, тем лучше оно блокирует активацию FcγRIIb (измеренную по количеству окрашенного вестерн-блоттингом фосфо-FcγRIIb) индуцированную связыванием ритуксимаба, а также тем лучше они блокируют модуляцию.
Пример 14. Дозозависимое связывание с клетками, трансфецированными hCD32B, и дозозависимое связывание и ингибирование иммунного комплекса с клетками, трансфецированными hCD32B.
Клетки рассевали в планшеты для FMAT. Иммунные комплексы готовили путем покрытия БСА FITC и после этого смешиванием в молярном соотношении 10:1 с FITC-специфичным антителом hIgG1. На фиг. 15-287 показано дозозависимое связывание с клетками, трансфецированными hCD32B, и дозозависимое связывание и ингибирование иммунного комплекса с клетками, трансфецированными hCD32B, опосредованное клонами 1-13, соответственно. Кружки указывают на дозозависимое связывание с клетками CHO K1, трансфецированными hCD32A, а черные ромбы указывают на зависимое связывание с клетками CHO K1, трансфецированными hCD32B. Кресты указывают на дозозависимое ингибирование иммунного комплекса клеток CHO K1, трансфецированных hCD32B.
Эксперименты спланированы для 1) определения специфичности мАТ. CD32B и CD32A являются весьма близкородственными молекулами. Однако, хотя CD32B передает ингибирующий сигнал, CD32A переносит положительный сигнал, поэтому существенным для искомого эффекта является то, что антитело связывает только CD32B. 2) Более того, для эффективного блокирования сигнала через CD32B, антитело должно не только связываться с CD32B, но также должно блокировать связывание его естественного лиганда, иммунного комплекса (ИК). Поэтому на фигуре представлено связывание с CD32A, CD32B и ингибирование связывания ИК. На фигурах показано, что все мАТ являются специфичными к CD32B и не связывают CD32A и что они все ингибируют связывание ИК.
Пример 15. Клеточная специфичность анти-CD32B антител.
PBMC, выделенные из периферической крови, получали в градиенте плотности Фиколла. Клетки окрашивали клеткоспецифичными маркерами и оценивали по связыванию с антителами, специфичными к CD32B. Как показано на фиг. 28, только В-клетки (CD19+ клетки) окрашены положительно клонами 1-13.
В покоящихся PBMC, CD32B экспрессируется только на В-клетках, тогда как близкородственный CD32A экспрессируется на моноцитах и нейтрофилах. Предшествующие фигуры демонстрируют специфичность на трансфецированных клетках CHO. На фиг. 28 показано, что антитела также связывают В-клетки, экспрессирующие CD32B в их достоверно нативной форме на В-клетках, при этом они не окрашивают CD32A-экспрессирующие нейтрофилы и моноциты. Поэтому данная фигура является демонстрацией специфичности антител, когда антиген экспрессируется в нормальных нетрансфецированных PBMC.
Пример 16. Дозозависимое окрашивание В-клеток клонами 1-13 анти-FcγRIIb мАТ.
PBMC, выделенные из периферической крови получали в градиенте плотности Фиколла. Клетки окрашивали по CD19, а затем с помощью 10, 1 или 0,1 мг/мл антител, специфичных к CD32B, как указано. На фиг. 29 показано, в какой степени окрашивание В-клеток является дозозависимым в случае каждого из клонов.
На фиг. 29, В-клетки (известные своей экспрессией CD32B) были выделены в целевой регион с помощью мАТ, специфичных к CD19. Этот целевой регион назвали M1. При уменьшении концентрации мАТ к CD32B количество окрашенных В-клеток падает от около 100% до намного более низких значений, демонстрируя тем самым специфическое и дозозависимое окрашивание В-клеток, как и ожидалось от мАТ, специфичных к CD32B.
Это в свою очередь является демонстрацией специфичности антител. Как уже упоминалось, CD32A и B являются весьма близкородственными и получение специфичных антител не является тривиальным. Любое специфичное антитело должно демонстрировать дозозависимое связывание и это то, что продемонстрировано на фиг. 29, что при понижении дозы антитела понижается количество окрашенных В-клеток, от почти 100%, которые наблюдали при наиболее высокой дозе. Поэтому данная фигура является второй демонстрацией специфичности антитела, когда антиген экспрессируется в нормальных нетрансфецированных В-клетках.
Пример 17. Способность ингибирования Fc-опосредованного фосфорилирования CD32B каждым мАТ
Клетки Raji (положительные по CD32B) обрабатывали ритуксимабом (Rit), который вызывал фосфорилирование CD32B. Обработку осуществляли в отсутствии или присутствии мАТ 1-13, специфичных к CD32B, и на фиг. 30 продемонстрирована способность каждого мАТ ингибировать Fc-опосредованное фосфорилирование CD32B.
Гипотеза в основе примеров 17 и 18 заключается в том, что Fc-область ритуксимаба связывает FcγRIIb и в том, что это вызывает активацию FcγRIIb. Это измеряется по фосфорилированию ITIM-области FcγRIIb. Блокирование этого взаимодействия анти-FcγRIIb мАТ должно блокировать фосфорилирование (фиг. 30) и модуляцию (фиг. 31 и 32). FcγRIIb IgG1 дикого типа также обладают способностью связывать FcγRIIb через его Fc-область и таким образом мы проверили, обладает ли мутант N297Q (который имеет Fc, который не связывает FcγRIIb) подобной активностью. Данным мутант обладал идентичной активностью.
Пример 18. Воздействие CD32b на скорость модуляции анти-CD20 мАТ I типа.
Способность CD32b ускорять интернализацию других анти-CD20 мАТ I типа показана на фиг. 31. Меченные Alexa-488 версии каждого антитела инкубировали с pCDNA3-трансфецированными клетками Ramos или CD32B-трансфецированными клетками Ramos в течение 1 или 6 часов и определяли степень модуляции в обычном порядке. Использованными мАТ являлись ритуксимаб (RTX), собственного производства офатумумаб (OFA) и тоситумумомаб (Tos). Данные ясно демонстрируют, что скорость интернализации OFA схожа со скоростью RTX и растет в присутствии CD32b.
Эти эффекты модуляции наблюдали с ритуксимабом (анти-СD20 I типа), но они были менее очевидны с тоситумомабом (анти-СD20 мАТ II типа). Поэтому мы хотели выяснить, распространяется ли это на другие анти-CD20 мАТ и для этого мы протестировали офатумумаб, другое клинически релевантное мАТ I типа (Teeling, 2004 (52)). Как и ожидалось, офатумумаб, подобно ритуксимабу, быстро интернализовался.
Пример 19. Анти-CD19 мАТ также интернализуются с клеточной поверхности злокачественных человеческих В-клеток, в такой форме, которая частично зависит от CD32B.
huCD32b-трансфектанты Ramos. Экспрессия CD32b также может оказывать воздействие на интернализацию других поверхностных антигенов. Анализ модуляции осуществляли как и ранее с различными мАТ в присутствии (+) или отсутствии (-) CD32 БЛОКИРОВАННОГО AT10. В этом 6 ч анализе использовали CD32B-трансфектанты Ramos. * p < 0,05. f3.3 = MHC Класс II; RFBP = CD19; RTX = ритуксимаб. На фиг. 32 ясно показано значимое уменьшение поверхностной модуляции для RTX и RFB9 мАТ и меньшее для F3.3 после инкубации с CD32-блокатором. Эти данные указывают на то, что антигены-мишени, такие как CD19, могут интернализоваться с клеточной поверхности злокачественных человеческих В-клеток в форме, которая частично зависит от CD32B и может быть блокирована анти-CD32b мАТ.
Мы хотели бы определить затрагиваются ли другие антигены, отличные от CD20, экспрессией FcγRIIb. Поэтому мы проверяли мАТ направленные против других антигенов-мишеней (CD19 и MHCII) и может ли мАТ, блокирующий FcγRIIb, уменьшить их интернализацию. Данные демонстрируют, что модуляция CD19 мАТ также уменьшается блокированием FcγRIIb.
Пример 20. Экспрессия CD32b также может оказывать воздействие на интернализацию других поверхностных антигенов.
Клетки Ramos не имеют CD32b и, таким образом, демонстрируют уровень интернализации в отсутствии CD32B. Если антиген способен интернализоваться с помощью CD32b, то при его экспрессии (на клетках Ramos-CD32B) будет расти уровень интернализации.
Меченные Alexa-488 версии каждого мАТ инкубировали с pCDNA3-трансфецированными клетками Ramos или CD32B-трансфецированными клетками Ramos в течение 1 или 6 часов и определяли степень модуляции в обычном порядке. * = p < 0,05. На фиг. 33 показано, что экспрессия CD32b также оказывает влияние на интернализацию других антигенов.
Материалы и методы
Клетки
2
Человеческие клеточные линии (Daudi, Raji, Ramos) получали из ECACC, поддерживали в среде RPMI («Invitrogen», Великобритания), дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой (FCS) («Lonza», Великобритания), глутамином и пируватом (оба «Invitrogen») и культивировали при 37°C, 5% CO. Клетки Rx3 Ramos, утратившие экспрессию BCR, были получены ранее (36). FcγRIIb-трансфектанты Ramos и контрольные клетки, трансфецированные пустыми векторами (FcγRIIb-негативными), описанные ранее (36), поддерживали в дополненной среде RPMI как указано выше, с добавлением генетицина («Invitrogen», Великобритания). Клетки Rx3, трансфецированные FcγRIIb, и пустые векторы получали и поддерживали таким же образом. Поверхностную экспрессию FcγRIIb определяли проточной цитометрией с использованием PE-меченого AT10 (описанного ниже). Популяции FcγRIIb-трансфектантов Ramos, экспрессирующие низкий, средний и высокий уровни FcγRIIb сортировали с помощью проточного цитометра «FACS Aria» («BD Biosciences», США).
Доноры крови
2
Нормальные человеческие В-клетки получали из здоровых волонтеров с информированным согласием. Периферическую кровь забирали либо в KE или LiH, лимфоциты разделяли с помощью «Lymphoprep» («Axis-Shield», Великобритания) согласно протоколу изготовителя, а В-клетки выделяли негативным отбором с помощью набора «Human B-cell Isolation Kit II» («Miltenyi Biotec», Германия).
Клинические Образцы
2
Образцы CLL/SLL, FL, DLBCL и MCL получали с информированным согласием в соответствии с Хельсинской Декларацией. Образцы крови собирали в KE или LiH с помощью «Lymphoprep», твердые ткани измельчали через стерильное сито и центрифугировали. Клетки криоконсервировали в RPMI, дополненной 50% человеческой АВ сывороткой и 10% ДМСО и хранили в банке опухолей отдела онкологии Саутгемптонского университета согласно лицензии Ассоциации по вопросам человеческих тканей. Этическое разрешение для использования клинических образцов было получено Трастом NHS Саутгемптонского университета от исследовательского этического комитета Саутгемптона и Юго-западного Гэмпшира. Для клеток CLL статус мутаций генов IgVH (33) и позитивность по CD38 (44) определяли, как подробно описано ранее. Вкратце, для анализа IgVH, лидерная праймерная смесь VH и праймер Cμ100 использовали для амплификации генов тяжелой цепи из кДНК. Все нуклеотидные последовательности выравнивали по V-base directory, и мутационный статус определяли с порогом 98%. Для анализа CD38 использовали анти-CD38 PE (клон HB7; BD Biosciences) Определение статуса ZAP-70 проводили, как описано Crespo et al. (30). Поверхностную экспрессию Ig клетками CLL определяли проточной цитометрией, как описано ранее (45, 46).
Анализ жизнеспособности
С помощью проточной цитометрии оценивали жизнеспособность клеток с последующим окрашиванием FITC-меченым аннексином V и PI, как подробно описано ранее (25).
Антитела и реактивы
gly
2
Ритуксимаб был подарен онкологической аптекой многопрофильной больницы Саутгемптона. Rit m2a (ритусимаб с Fc-областью мышиного IgG2a) и WR17 (анти-CD37), все мышиные IgG2a, были получены, как описано ранее (18). Анти-FcγRII мАТ (AT10) получали самостоятельно и описали ранее (47). Тоситумомаб был подарен профессором Tim Illidge (Манчестер, Великобритания). Офатумумаб и GA101 (гликозилированный GA101 с немодифицированной Fc-областью) получали самостоятельно из опубликованных в патенте последовательностей. NB: Эти мАТ получали в клетках CHO или 293F и, таким образом, они могут отличаться (например, по их углеводным структурам) от мАТ, полученным для клинического применения. Alexa-488 и анти-Alexa 488 реактивы были приобретены у «Invitrogen». Получение F(ab')-фрагментов было описано ранее (48). Fab'-фрагменты получали инкубацией с 20 мM 2-меркаптоэтанолом при 25°C, в течение 30 минут, с последующим добавлением избытка йодацетамида. Для вестерн-блоттинга использовали антитела к актину (AC74, «Sigma», Великобритания) и фосфо-FcγRIIb («Cell Signaling Technology», Великобритания).
Проточная цитометрия
Меченные флуорохромом мАТ было получены из «BD Biosciences» или изготовлены самостоятельно. мАТ конъюгировали с Alexa 488 («Invitrogen») согласно протоколу изготовителя. Проточная цитометрия была описана ранее (49). Образцы оценивали либо на «FACScan», либо на «FACSCalibur», и анализировали данные с помощью «CellQuest Pro» (все «BD Biosciences») или «FCS Express» («DeNovo Software», США). В-клетки идентифицировали с помощью APC-меченых антител против человеческого CD19 (собственного изготовления), а экспрессию FcγRIIb определяли с помощью PE-меченых AT10 (собственного изготовления). Для контроля варьирования между экспериментами, экспрессию FcγRIIb представляли как соотношение геометрических средних интенсивностей флуоресценции (MFI) FcγRIIb : изотипический контроль.
Анализ интернализации
5
Анализ интернализации проводили так же, как подробно описано ранее (28). Вкратце, 2-4 x 10 клеток на лунку инкубировали с меченными Alexa-488 мАТ в конечной концентрации 5 мкг/мл. Образцы собирали после 1, 2, 6 и/или 24 ч, отмывали дважды, ресуспендировали и инкубировали при 4°C в течение 30 минут с APC-мечеными анти-CD19, c или без гасимого антитела, анти-Alexa-488 (Invitrogen). Образцы затем отмывали однократно и анализировали на проточном цитометре.
-ve
5
Для исследования интернализации Fc-области связанного с клетками анти-CD20 мАТ FcγRIIb на смежных клетках, клетки Ramos, которые являются FcγRIIb, метили с помощью PKH26 (Sigma Aldrich) согласно инструкциям изготовителя. PKH26-меченые клетки затем совместно культивировали с равными количествами (2,5 x 10) клеток Ramos, трансфецированных FcγRIIb. Оба типа клеток культивировали отдельно как контроли. Затем осуществляли анализ интернализации как описано ранее, и модуляцию по сравнению с PKH26-меченой и немеченной популяциями. Дополнительные вариации этого анализа совместного культивирования описаны в легендах фигур.
Вестерн-блоттинг
6
Протокол был описан ранее (36). Вкратце, ~2 x 10 клеток на лунку инкубировали с мАТ (5-10 мкг/мл). Образцы затем разделяли с помощью ДСН-ПААГ и белки сразу же переносили на PVDF-мембрану. Мембраны блокировали 5% масс./об. обезжиренного сухого молока, включая соответствующим образом разведенные первичные антитела, отмывали, а затем инкубировали с конъюгированными с пероксидазой хрена анти-кроличьи и анти-мышиные IgG (Sigma Aldrich), визуализировали усиленной хемилюминесценцией (ECL, «GE Healthcare», Великобритания или «Pierce Biotechnology», Великобритания) путем экспонирования светочувствительной пленки («Hyperfilm ECL», «GE Healthcare», Великобритания) или в системе получения изображения «Biospectrum AC Imaging System» («UVP», Великобритания).
Световая и Конфокальная микроскопия
2
Для определения внутриклеточной направленной миграции анти-CD20 мАТ и FcγRIIb, клетки CLL инкубировали с соответствующим меченным Alexa-488 мАТ в течение различных периодов времени как описано в легендах фигур, и затем собирали, отмывали и фиксировали 2% параформальдегидом. Для детекции FcγRIIb и LAMP-1, соответственно, клетки затем пермеабелизовали 0,3% сапонином и инкубировали с Alexa-647-меченым F(ab')AT10 (мечение осуществляли с помощью набора «Alexa Fluor-647 labeling kit» («Invitrogen») согласно протоколу изготовителя), и/или биотин-конъюгированным анти- CD107a человека (LAMP-1) («eBioscience», Великобритания). Затем клетки отмывали, добавляли стрептавидин-Alexa Fluor-547 («Invitrogen»), после чего дополнительно отмывали. Затем клетки переносили на стекла и получали снимки с помощью программного обеспечения «LAS-AF v2» на лазерном конфокальном сканирующем микроскопе «TCS-SP5» («Leica Microsystems», Великобритания) (10x окуляр, 100x линза объектива).
5
Для определения пространственной близости между клетками в различных разведениях клеток, клетки рассевали в количестве 1-20 x 10/мл, стимулировали различными мАТ в течение 2 и/или 6 часов, а затем их относительную пространственную близость оценивали световой микроскопией. Клетки наблюдали в инвертированном микроскопе «Olympus CKX21» («Olympus», Великобритания) с использованием линз 10x или 20x/0.25 PH. Изображения получали с помощью охлаждаемой цифровой камеры «CCL2» («Olympus») и обрабатывали с помощью «Cell B» («Olympus Soft imaging solutions») и программного обеспечения «Adobe Photoshop version CS2» («Adobe», Сан-Хосе, Калифорния).
Статистический анализ
Статистический анализ осуществляли с помощью «GraphPadPrism» («GraphPad Software», США). Парные, непараметрические данные анализировали с помощью парного критерия Вилкоксона, тогда как непарные данные анализировали с помощью критерия Манна-Уитни.
Примерные композиции, составы и режимы введения
В изобретении предлагаются способы лечения, профилактики и облегчения одного или нескольких симптомов, ассоциированных с заболеванием, расстройством или инфекцией, путем введения объекту или пациенту эффективного количества фармацевтической композиции изобретения.
В конкретном воплощении объект или пациент является животным, предпочтительно млекопитающим, например, неприматным животным (например, коровой, свиньей, лошадью, кошкой, собакой, крысой и т.п.) и приматом (например, обезьяной, такой как яванский макак и человек). В предпочтительном воплощении объектом является человек.
Различные системы доставки известны и могут быть использованы для введения композиции изобретения, например, инкапсуляции в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать антитело и т.п.
В некоторых воплощениях композиции изобретения представлены в липосомах для направленной доставки антител изобретения. Липосомы являются везикулами, состоящими из концентрически направленных фосфолипидных бислоев, которые инкапсулируют водную фазу. Липосомы, как правило, содержат различные типы липидов, фосфолипидов и/или поверхностно-активных веществ. Компоненты липосом расположены в бислойной конфигурации, сходной с расположением липидов в биологических мембранах. Липосомы являются особенно предпочтительными средствами доставки, из-за, отчасти, биосовместимости и низкой токсичности. Способы получения липосом известны в данной области и охвачены изобретением, см., например, Epstein et al, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688; Hwang et al, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4; патенты США No. 4 485 045 и 4 544 545; которые все включены в данный документ ссылкой в полном объеме.
Способы введения композиций изобретения включают, без ограничения перечисленным, парентеральное введение (например, интрадермальное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное и подкожное), эпидуральное или через слизистую (например, интраназальный и пероральный пути). В конкретном воплощении композиции изобретения вводят внутримышечно, внутривенно, или подкожно. Композиции могут быть введены любым обычным путем, например, инфузией или болюсной инъекцией, абсорбцией через эпителиальную или кожно-слизистую выстилки (например, слизистую ротовой полости, ректальную слизистую, слизистую кишечника и т.п.), и могут быть введены вместе с другими биологически активными агентами. Введение может быть системным или местным. Кроме того, также может использоваться введение через легкие, например, путем применения ингалятора или небулайзера, и состава с аэрозольным агентом. См., например, патенты США No. 6 019 968; 5 985 309; 5 934 272; 5 874 064; 5 855 913; 5 290 540; и 4 880 078; и публикации PCT No. WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; и WO 99/66903, каждый из которых полностью включен в данный документ ссылкой.
Количество композиции изобретения, которое будет эффективным при лечении, профилактике или облегчении одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием, может быть определено стандартными клиническими методами. Точная дозировка, используемая в составе, также будет зависеть от пути введения и тяжести состояния, и должна определяться согласно решению лечащего врача и обстоятельств каждого пациента. Эффективные дозы могут быть экстраполированы из дозозависимых кривых, полученных in vitro или в тест-системах на основе моделей на животных.
Для антител, охваченных изобретением, дозировка вводима пациенту, как правило, составляет от 0,0001 мг/кг до 100 мг/кг массы тела пациента независимо для каждого антитела в комбинации. Предпочтительно, если дозировка каждого антитела, вводимого пациенту составляет от 0,0001 мг/кг до 20 мг/кг, от 0,0001 мг/кг до 10 мг/кг, 0,0001 мг/кг до 5 мг/кг, 0,0001 до 2 мг/кг, от 0,0001 до 1 мг/кг, от 0,0001 мг/кг до 0,75 мг/кг, от 0,0001 мг/кг до 0,5 мг/кг, от 0,0001 мг/кг до 0,25 мг/кг, от 0,0001 до 0,15 мг/кг, от 0,0001 до 0,10 мг/кг, от 0,001 до 0,5 мг/кг до 02,5 мг/кг или от 0,01 до 0,10 мг/кг массы тела пациента. В общем, человеческие антитела имеют более продолжительный период полужизни в организме человека, чем антитела других видов, из-за иммунного ответа на инородные полипептиды. Таким образом, становятся возможными более низкие дозировки человеческих антител и менее частое введение. Кроме того, дозировка и частота введения антител изобретения или их фрагментов могут быть снижены путем усиления поглощения и проницаемости тканей антителами, осуществленных посредством модификаций, таких как, например, липидизация.
В одном воплощении дозировка каждого антитела композиции изобретения вводимой пациенту составляет от 0,01 до 1000 мг/день.
Композиции изобретения содержат профилактически или терапевтически эффективное количество агента и антитела, как описано в данном документе, и фармацевтически приемлемого носителя.
В конкретном воплощении термин «фармацевтически приемлемый» означает разрешенный надзорным органом или перечисленным в Фармакопее США или других повсеместно признаваемых фармакопеях для применения на животных, а более конкретно на людях. Термин «носитель» относится к разбавителю, адъюванту, например, адъюванту Фрейнда (полному или неполному), наполнителю или средству распространения, с которым вводится терапевтическое средство. Такие физиологические носители могут быть стерильными жидкостями, такими как вода или масло, включая масло нефтяного, животного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Вода является предпочтительным носителем, если фармацевтическая композиция вводится внутривенно. Также в качестве жидких носителей могут быть использованы солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина, особенно для инъецируемых растворов. Подходящие фармацевтические наполнители включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и т.п. Композиция, если требуется, также может содержать небольшие количества увлажняющих или эмульгирующих агентов, или агентов, буферизующих pH. Эти композиции могут иметь форму растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, составов с замедленным высвобождением и т.п.
В различных воплощениях антитело и агент могут быть введены одновременно или с интервалом менее 1 часа, с интервалом от около 1 часа до около 2 часов, с интервалом от около 2 часов до около 3 часов, с интервалом от около 3 часов до около 4 часов, с интервалом от около 5 часов до около 6 часов, с интервалом от около 6 часов до около 7 часов, с интервалом от около 7 часов до около 8 часов, с интервалом от около 8 часов до около 9 часов, с интервалом от около 9 часов до около 10 часов, с интервалом от около10 часов до около 100 часов, с интервалом от около 11 часов до около 12 часов, не больше чем с интервалом 24 часа, или не больше чем с интервалом 48 часов. В предпочтительных воплощениях два или большее количество компонентов вводят в одно посещение пациента.
th
Количество дозировок и частоты введения, предлагаемые в данном документе, охвачены терминами терапевтически эффективное и профилактические эффективное. Дозировка и частота дополнительно будут, как правило, варьировать согласно факторам, специфичным для каждого пациента, в зависимости от конкретных вводимых терапевтических или профилактических агентов, тяжести и типа заболевания, пути введения, а также возраста, массы тела, ответа, и истории болезни пациента. Подходящие режимы могут быть выбраны специалистом в данной области, с учетом таких факторов и следуя, например, дозам, сообщенным в литературе и рекомендованным в настольном справочнике врача (56 ed., 2002).
Выводы
Недавно мы обнаружили, что мАТ I типа ритуксимаб модулирует человеческий CD20 на поверхности В-клеток трансгенных по CD20 мышей (in vitro и in vivo) и на некоторых первичных опухолевых клетках, полученных из пациентов с NHL, что ограничивает способность данного мАТ рекрутировать эффекторы и истощать клетки-мишени (28). Мы рассмотрели возможный механизм для объяснения ограничения терапевтической активности ритуксимаба и других CD20 мАТ I типа и главное, предложили возможность блокировки или избегания данного процесса, что позволяет получить более эффективные реактивы. В настоящей работе предлагает молекулярное объяснение модуляции CD20, индуцированной ритуксимабом и офатумумабом. Экспрессия FcγRIIb должна обеспечить важный прогностический маркер ответа на анти-CD20 мАТ I типа. При культивировании первичных клеток CLL/SLL с анти-CD20 мАТ I типа, наблюдали значимую, но гетерогенную модуляцию CD20, и эту гетерогенность нельзя было связать с известными прогностическими факторами CLL. Анализ других подтипов B-NHL показал, что MCL демонстрирует гетерогенную модуляцию CLL, но что FL и в особенности DLBCL демонстрируют значимо меньшую модуляцию. На основании этих результатов в настоящее время мы сообщаем о тесной корреляции между уровнем экспрессии FcγRIIb в этих злокачественных новообразованиях и степенью, с которой они модулируют в 6 ч культуре. Кроме того, мы полагаем, что данная модуляция может объяснить некоторую гетерогенность в ответ на ритуксимаб, наблюдаемую при этих заболеваниях. Ритуксимаб оказывает наиболее доказанное благоприятное воздействие при DLBCL и FL, при которых данное средство принято в качестве терапии первой линии, в комбинации с химиотерапией. Напротив, при CLL оказалось тяжелее продемонстрировать улучшение в общей выживаемости при применении ритуксимаба (39), а польза от него при MCL оказалась еще более скромной (5). Таким образом, в качестве основного результата, В-клеточные злокачественные новообразования, которые экспрессируют FcγRIIb, скорее всего модулировали CD20 и демонстрировали меньший эффект от лечения ритуксимабом. Однако, даже при DLBCL и FL, некоторые случаи не отвечали на ритуксимаб. В качестве примера, наблюдение того, что трансформированные случаи FL, как правило, плохо отвечают на терапию, и экспрессируют FcγRIIb (21), совпадает с нашими собственными данными, о том, что один из сильно экспрессирующих FcγRIIb образцов (фиг. 2с) был идентифицирован как FL и продемонстрировал, соответственно, высокие скорости модуляции. Несмотря на единичный случай, мы считаем, что это может потенциально стать важным средством устойчивости к ритуксимабу.
Модуляция CD20 демонстрировала сильную корреляцию с уровнем экспрессии FcγRIIb вне зависимости от подтипа заболевания B-NHL. Ранее предполагалось, что FcγRIIb может ингибировать эффективность терапевтического мАТ путем конкуренции с активаторными Fc-рецепторами на эффекторных клетках, тем самым ингибируя проведение цитотоксичных сигналов (40). Наши in vitro исследования позволяют предположить, что ритуксимаб перекрестно связывает CD20 и FcγRIIb преимущественно на одной и той же клетке, что приводит к активации FcγRIIb, и быстрой парной интернализации обоих поверхностных антигенов вместе со связанным мАТ в лизосомы для деградации. Экспрессия FcγRIIb по всей видимости приводит к уменьшению рекрутирования эффекторных клеток из-за его способности отрицательно регулировать поверхностную экспрессию мАТ на клетке-мишени.
Мы также продемонстрировали, что коинкубация с блокирующим анти-FcγRIIb мАТ позволяла предотвратить как активацию FcγRIIb, так и быструю интернализацию ритуксимаба. В общем, эти данные подтверждают прямую связь между активацией FcγRIIb и быстрой интернализацией мАТ с клеточной поверхности.
Сильная корреляция между модуляцией CD20 индуцированной анти-CD20 мАТ I типа среди различных подтипов B-NHL и экспрессией FcγRIIb, наряду с нашими трансфекционными исследованиями указывает на то, что FcγRIIb является ключевым регулятором модуляции CD20.
Другие группы исследовали роль FcγRIIb в лимфоме. Camilleri-Broet et al (20) не смогли продемонстрировать иммуногистохимией какого-либо значимого взаимоотношения между ответом на R-CHOP и экспрессию FcγRIIb в DLBCL, однако только 18% (42/234 случаев) считались положительными по FcγRIIb в предшествующих сериях (21). С учетом относительно низкой частоты положительности, вполне вероятно, что количество положительных случаев может быть недостаточно для обнаружения разницы. Вместо сверхэкспрессии, Weng and Levy (24) исследовали связь двух аллелей FcγRIIb (аллель 232I, который более эффективен при BCR-опосредованной регуляции кальция, чем аллель 232T при аутоиммунном заболевании (22, 23)), с эффективностью ритуксимаба, но не смогли продемонстрировать какой-либо корреляции между этим полиморфизмом и ответом на монотерапию ритуксимабом пациентов с FL. Основная проблема, поднятая самими авторами, заключалась в том, что только 17 пациентов имеют аллель 232Т, что опять же ограничивает статистическую мощность исследования. Кроме того, исследованные полиморфизмы отражали эффективность ингибирования BCR при аутоиммунном заболевании, и не опубликовано наблюдений, указывающих на то, что эти полиморфизмы являются релевантными при лимфоме или влияют на связывание Fc человеческого IgG1. Экспрессия FcγRIIb вследствие способности регулировать скорость интернализации будет важным прогностическим индикатором успеха иммунотерапии с мАТ I типа (включая ритуксимаб и офатумумаб). Она может иметь менее выраженный эффект на терапию мАТ II типа.
Более того, в двух различных in vivo моделях мы продемонстрировали способность CD32 ограничивать эффективность и способность анти-CD32b мАТ преодолевать данное ограничение и дополнять терапию ритуксимабом.
Список литературы
1. Feugier, P., Van Hoof, A., Sebban, C., Solal-Celigny, P., Bouabdallah, R., Ferme, C., Christian, B., Lepage, E., Tilly, H., Morschhauser, F., et al. 2005. Long-term results of the R-CHOP study in the treatment of elderly patients with diffuse large B-cell lymphoma: a study by the Groupe d'Etude des Lymphomes de l'Adulte. J Clin Oncol 23:4117-4126.
2. Sehn, L.H., Donaldson, J., Chhanabhai, M., Fitzgerald, C., Gill, K., Klasa, R., MacPherson, N., O'Reilly, S., Spinelli, J.J., Sutherland, J., et al. 2005. Introduction of combined CHOP plus rituximab therapy dramatically improved outcome of diffuse large B-cell lymphoma in British Columbia. J Clin Oncol 23:5027-5033.
3. Marcus, R., Imrie, K., Belch, A., Cunningham, D., Flores, E., Catalano, J., Solal-Celigny, P., Offner, F., Walewski, J., Raposo, J., et al. 2005. CVP chemotherapy plus rituximab compared with CVP as first-line treatment for advanced follicular lymphoma. Blood 105:1417-1423.
4. Marcus, R., Imrie, K., Solal-Celigny, P., Catalano, J.V., Dmoszynska, A., Raposo, J.C., Offner, F.C., Gomez-Codina, J., Belch, A., Cunningham, D., et al. 2008. Phase III study of R-CVP compared with cyclophosphamide, vincristine, and prednisone alone in patients with previously untreated advanced follicular lymphoma. J Clin Oncol 26:4579-4586.
5. Lenz, G., Dreyling, M., Hoster, E., Wormann, B., Duhrsen, U., Metzner, B., Eimermacher, H., Neubauer, A., Wandt, H., Steinhauer, H., et al. 2005. Immunochemotherapy with rituximab and cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, and prednisone significantly improves response and time to treatment failure, but not long-term outcome in patients with previously untreated mantle cell lymphoma: results of a prospective randomized trial of the German Low Grade Lymphoma Study Group (GLSG). J Clin Oncol 23:1984-1992.
6. Kharfan-Dabaja, M.A., Fahed, R., Hussein, M., and Santos, E.S. 2007. Evolving role of monoclonal antibodies in the treatment of chronic lymphocytic leukemia. Expert Opin Investig Drugs 16:1799-1815.
7. Stolz, C., and Schuler, M. 2009. Molecular mechanisms of resistance to Rituximab and pharmacologic strategies for its circumvention. Leuk Lymphoma 50:873-885.
8. Davis, T.A., Czerwinski, D.K., and Levy, R. 1999. Therapy of B-cell lymphoma with anti-CD20 antibodies can result in the loss of CD20 antigen expression. Clin Cancer Res 5:611-615.
9. Michel, R.B., and Mattes, M.J. 2002. Intracellular accumulation of the anti-CD20 antibody 1F5 in B-lymphoma cells. Clin Cancer Res 8:2701-2713.
10. Hiraga, J., Tomita, A., Sugimoto, T., Shimada, K., Ito, M., Nakamura, S., Kiyoi, H., Kinoshita, T., and Naoe, T. 2009. Down-regulation of CD20 expression in B-cell lymphoma cells after treatment with rituximab-containing combination chemotherapies: its prevalence and clinical significance. Blood 113:4885-4893.
11. Treon, S.P., Mitsiades, C., Mitsiades, N., Young, G., Doss, D., Schlossman, R., and Anderson, K.C. 2001. Tumor Cell Expression of CD59 Is Associated With Resistance to CD20 Serotherapy in Patients With B-Cell Malignancies. J Immunother (1991) 24:263-271.
12. Golay, J., Lazzari, M., Facchinetti, V., Bernasconi, S., Borleri, G., Barbui, T., Rambaldi, A., and Introna, M. 2001. CD20 levels determine the in vitro susceptibility to rituximab and complement of B-cell chronic lymphocytic leukemia: further regulation by CD55 and CD59. Blood 98:3383-3389.
13. Jazirehi, A.R., Vega, M.I., and Bonavida, B. 2007. Development of rituximab-resistant lymphoma clones with altered cell signaling and cross-resistance to chemotherapy. Cancer Res 67:1270-1281.
14. Weng, W.K., and Levy, R. 2003. Two immunoglobulin G fragment C receptor polymorphisms independently predict response to rituximab in patients with follicular lymphoma. J Clin Oncol 21:3940-3947.
15. Clynes, R.A., Towers, T.L., Presta, L.G., and Ravetch, J.V. 2000. Inhibitory Fc receptors modulate in vivo cytoxicity against tumor targets. Nat Med 6:443-446.
16. Uchida, J., Hamaguchi, Y., Oliver, J.A., Ravetch, J.V., Poe, J.C., Haas, K.M., and Tedder, T.F. 2004. The innate mononuclear phagocyte network depletes B lymphocytes through Fc receptor-dependent mechanisms during anti-CD20 antibody immunotherapy. J Exp Med 199:1659-1669.
17. Nimmerjahn, F., and Ravetch, J.V. 2007. Antibodies, Fc receptors and cancer. Curr Opin Immunol 19:239-245.
18. Beers, S.A., Chan, C.H., James, S., French, R.R., Attfield, K.E., Brennan, C.M., Ahuja, A., Shlomchik, M.J., Cragg, M.S., and Glennie, M.J. 2008. Type II (tositumomab) anti-CD20 monoclonal antibody out performs type I (rituximab-like) reagents in B-cell depletion regardless of complement activation. Blood 112:4170-4177.
19. Mossner, E., Brunker, P., Moser, S., Puntener, U., Schmidt, C., Herter, S., Grau, R., Gerdes, C., Nopora, A., van Puijenbroek, E., et al. Increasing the efficacy of CD20 antibody therapy through the engineering of a new type II anti-CD20 antibody with enhanced direct- and immune effector cell-mediated B-cell cytotoxicity. Blood.
20. Camilleri-Broet, S., Mounier, N., Delmer, A., Briere, J., Casasnovas, O., Cassard, L., Gaulard, P., Christian, B., Coiffier, B., and Sautes-Fridman, C. 2004. FcgammaRIIB expression in diffuse large B-cell lymphomas does not alter the response to CHOP+rituximab (R-CHOP). Leukemia 18:2038-2040.
21. Camilleri-Broet, S., Cassard, L., Broet, P., Delmer, A., Le Touneau, A., Diebold, J., Fridman, W.H., Molina, T.J., and Sautes-Fridman, C. 2004. FcgammaRIIB is differentially expressed during B cell maturation and in B-cell lymphomas. Br J Haematol 124:55-62.
22. Li, X., Wu, J., Carter, R.H., Edberg, J.C., Su, K., Cooper, G.S., and Kimberly, R.P. 2003. A novel polymorphism in the Fcgamma receptor IIB (CD32B) transmembrane region alters receptor signaling. Arthritis Rheum 48:3242-3252.
23. Kono, H., Kyogoku, C., Suzuki, T., Tsuchiya, N., Honda, H., Yamamoto, K., Tokunaga, K., and Honda, Z. 2005. FcgammaRIIB Ile232Thr transmembrane polymorphism associated with human systemic lupus erythematosus decreases affinity to lipid rafts and attenuates inhibitory effects on B cell receptor signaling. Hum Mol Genet 14:2881-2892.
24. Weng, W.K., and Levy, R. 2009. Genetic polymorphism of the inhibitory IgG Fc receptor FcgammaRIIb is not associated with clinical outcome in patients with follicular lymphoma treated with rituximab. Leuk Lymphoma 50:723-727.
25. Chan, H.T., Hughes, D., French, R.R., Tutt, A.L., Walshe, C.A., Teeling, J.L., Glennie, M.J., and Cragg, M.S. 2003. CD20-induced lymphoma cell death is independent of both caspases and its redistribution into triton X-100 insoluble membrane rafts. Cancer Res 63:5480-5489.
26. Cragg, M.S., and Glennie, M.J. 2004. Antibody specificity controls in vivo effector mechanisms of anti-CD20 reagents. Blood 103:2738-2743.
27. Ivanov, A., Beers, S.A., Walshe, C.A., Honeychurch, J., Alduaij, W., Cox, K.L., Potter, K.N., Murray, S., Chan, C.H., Klymenko, T., et al. 2009. Monoclonal antibodies directed to CD20 and HLA-DR can elicit homotypic adhesion followed by lysosome-mediated cell death in human lymphoma and leukemia cells. J Clin Invest 119:2143-2159.
28. Beers, S.A., French, R.R., Chan, H.T., Lim, S.H., Jarrett, J.C., Vidal, R.M., Wijayaweera, S.S., Dixon, S.V., Kim, H.J., Cox, K.L., et al. 2010. Antigenic modulation limits the efficacy of anti-CD20 antibodies. Blood:In press.
29. Wiestner, A., Rosenwald, A., Barry, T.S., Wright, G., Davis, R.E., Henrickson, S.E., Zhao, H., Ibbotson, R.E., Orchard, J.A., Davis, Z., et al. 2003. ZAP-70 expression identifies a chronic lymphocytic leukemia subtype with unmutated immunoglobulin genes, inferior clinical outcome, and distinct gene expression profile. Blood 101:4944-4951.
30. Crespo, M., Bosch, F., Villamor, N., Bellosillo, B., Colomer, D., Rozman, M., Marce, S., Lopez-Guillermo, A., Campo, E., and Montserrat, E. 2003. ZAP-70 expression as a surrogate for immunoglobulin-variable-region mutations in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med 348:1764-1775.
31. Damle, R.N., Wasil, T., Fais, F., Ghiotto, F., Valetto, A., Allen, S.L., Buchbinder, A., Budman, D., Dittmar, K., Kolitz, J., et al. 1999. Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood 94:1840-1847.
32. Ibrahim, S., Keating, M., Do, K.A., O'Brien, S., Huh, Y.O., Jilani, I., Lerner, S., Kantarjian, H.M., and Albitar, M. 2001. CD38 expression as an important prognostic factor in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood 98:181-186.
33. Hamblin, T.J., Davis, Z., Gardiner, A., Oscier, D.G., and Stevenson, F.K. 1999. Unmutated Ig V(H) genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia. Blood 94:1848-1854.
34. Krober, A., Seiler, T., Benner, A., Bullinger, L., Bruckle, E., Lichter, P., Dohner, H., and Stilgenbauer, S. 2002. V(H) mutation status, CD38 expression level, genomic aberrations, and survival in chronic lymphocytic leukemia. Blood 100:1410-1416.
35. Ravetch, J.V., and Bolland, S. 2001. IgG Fc receptors. Annu Rev Immunol 19:275-290.
36. Walshe, C.A., Beers, S.A., French, R.R., Chan, C.H., Johnson, P.W., Packham, G.K., Glennie, M.J., and Cragg, M.S. 2008. Induction of cytosolic calcium flux by CD20 is dependent upon B Cell antigen receptor signaling. J Biol Chem 283:16971-16984.
37. Polyak, M.J., Li, H., Shariat, N., and Deans, J.P. 2008. CD20 homo-oligomers physically associate with the B cell antigen receptor. Dissociation upon receptor engagement and recruitment of phosphoproteins and calmodulin-binding proteins. J Biol Chem 283:18545-18552.
38. Ternynck, T., Dighiero, G., Follezou, J., and Binet, J.L. 1974. Comparison of normal and CLL lymphocyte surface Ig determinants using peroxidase-labeled antibodies. I. Detection and quantitation of light chain determinants. Blood 43:789-795.
39. Robak, T., Dmoszynska, A., Solal-Celigny, P., Warzocha, K., Loscertales, J., Catalano, J., Afanasiev, B.V., Larratt, L., Geisler, C.H., Montillo, M., et al. Rituximab Plus Fludarabine and Cyclophosphamide Prolongs Progression-Free Survival Compared With Fludarabine and Cyclophosphamide Alone in Previously Treated Chronic Lymphocytic Leukemia. J Clin Oncol.
40. Fridman, W.H., Teillaud, J.L., Bouchard, C., Teillaud, C., Astier, A., Tartour, E., Galon, J., Mathiot, C., and Sautes, C. 1993. Soluble Fc gamma receptors. J Leukoc Biol 54:504-512.
41. Nimmerjahn, F., and Ravetch, J.V. 2008. Fcgamma receptors as regulators of immune responses. Nat Rev Immunol 8:34-47.
42. Aman, M.J., Tosello-Trampont, A.C., and Ravichandran, K. 2001. Fc gamma RIIB1/SHIP-mediated inhibitory signaling in B cells involves lipid rafts. J Biol Chem 276:46371-46378.
43. Cragg, M.S., Morgan, S.M., Chan, H.T., Morgan, B.P., Filatov, A.V., Johnson, P.W., French, R.R., and Glennie, M.J. 2003. Complement-mediated lysis by anti-CD20 mAb correlates with segregation into lipid rafts. Blood 101:1045-1052.
44. Hamblin, T.J., Orchard, J.A., Ibbotson, R.E., Davis, Z., Thomas, P.W., Stevenson, F.K., and Oscier, D.G. 2002. CD38 expression and immunoglobulin variable region mutations are independent prognostic variables in chronic lymphocytic leukemia, but CD38 expression may vary during the course of the disease. Blood 99:1023-1029.
45. Mockridge, C.I., Potter, K.N., Wheatley, I., Neville, L.A., Packham, G., and Stevenson, F.K. 2007. Reversible anergy of sIgM-mediated signaling in the two subsets of CLL defined by VH-gene mutational status. Blood 109:4424-4431.
46. Potter, K.N., Mockridge, C.I., Neville, L., Wheatley, I., Schenk, M., Orchard, J., Duncombe, A.S., Packham, G., and Stevenson, F.K. 2006. Structural and functional features of the B-cell receptor in IgG-positive chronic lymphocytic leukemia. Clin Cancer Res 12:1672-1679.
47. Greenman, J., Tutt, A.L., George, A.J., Pulford, K.A., Stevenson, G.T., and Glennie, M.J. 1991. Characterization of a new monoclonal anti-Fc gamma RII antibody, AT10, and its incorporation into a bispecific F(ab')2 derivative for recruitment of cytotoxic effectors. Mol Immunol 28:1243-1254.
48. Glennie, M.J., McBride, H.M., Worth, A.T., and Stevenson, G.T. 1987. Preparation and performance of bispecific F(ab' gamma)2 antibody containing thioether-linked Fab' gamma fragments. J Immunol 139:2367-2375.
49. Tutt, A.L., French, R.R., Illidge, T.M., Honeychurch, J., McBride, H.M., Penfold, C.A., Fearon, D.T., Parkhouse, R.M., Klaus, G.G., and Glennie, M.J. 1998. Monoclonal antibody therapy of B cell lymphoma: signaling activity on tumor cells appears more important than recruitment of effectors. J Immunol 161:3176-3185.
50. Beer, S.A. et al. 2010. Seminars in Haematology 47(2):pp107-114
51. Niederfellner, G et al. 2011. Blood 118, 358-367.
52. Teeling, J.L. 2004. Blood 104, 1793-1800.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> University of Southampton and BioInvent International AB
<120> BIOLOGICAL MATERIALS AND METHODS OF USING THE SAME
<130> BIOBX/P49525PC
<140> PCT/GB2011/051572
<141> 19/08/2011
<150> GB1013989.7
<151> 20/08/2010
<160> 106
<170> SeqWin99
<210> 1
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CH region
<400> 1
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 2
<211> 105
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CL Region
<400> 2
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 3
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 1 VH region
<400> 3
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Trp Arg Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 2 VH region
<400> 4
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ala Tyr Asp Gly Ser Lys Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Tyr Arg Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 3 VH region
<400> 5
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Trp Asn Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 4 VH region
<400> 6
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asp Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp His Ser Val Ile Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 5 VH region
<400> 7
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gln Leu Gly Glu Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 6 VH region
<400> 8
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Gly Asp Ile Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 7 VH region
<400> 9
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Arg Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 8 VH region
<400> 10
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp His Ser Ala Ala Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 11
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 9 VH region
<400> 11
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asp Ser Ala Ile Ile Asp Tyr Ala Gly Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Glu Ala Ala Ala Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 10 VH region
<400> 12
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Leu Tyr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 11 VH region
<400> 13
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Phe Gly Tyr Ile Ile Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 12 VH region
<400> 14
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn His
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Thr Trp Asp Ala Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 15
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 13 VH region
<400> 15
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Ser Val Gly Ala Tyr Ala Asn Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 1 VL region
<400> 16
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Ser Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
Gly
<210> 17
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 2 VL region
<400> 17
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Thr Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser
85 90 95
Val Ser Gly Trp Met Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 18
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 3 VL region
<400> 18
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ala Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser
85 90 95
Leu Asn Gly Pro Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
Gly
<210> 19
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 4 VL region
<400> 19
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Ser Asn
85 90 95
Asn Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 20
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 5 VL region
<400> 20
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 21
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 6 VL region
<400> 21
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Phe Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Glu Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser
85 90 95
Leu Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 22
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 7 VL region
<400> 22
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Ser Asp
85 90 95
Thr Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 23
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 8 VL region
<400> 23
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Asn Ser Ile Arg Pro Ser Gly Gly Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Ser Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 24
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 9 VL region
<400> 24
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Thr Asp Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
Gly
<210> 25
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 10 VL region
<400> 25
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ala Asp Asp His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Asp Ser
85 90 95
Gln Arg Ala Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 26
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 11 VL region
<400> 26
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asp Tyr Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 27
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 12 VL region
<400> 27
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Asn Ala Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr
85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105
<210> 28
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 13 VL region
<400> 28
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asp Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser
85 90 95
Leu Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 1 CDRH1
<400> 29
Asn Tyr Gly Met His
1 5
<210> 30
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 1 CDRH2
<400> 30
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 1 CDRH3
<400> 31
Glu Trp Arg Asp Ala Phe Asp Ile
1 5
<210> 32
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 1 CDRL1
<400> 32
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His
1 5 10
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 1 CDRL2
<400> 33
Ser Asp Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 34
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 1 CDRL3
<400> 34
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Ser Trp Val
1 5 10
<210> 35
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 2 CDRH1
<400> 35
Thr Tyr Gly Met His
1 5
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 2 CDRH2
<400> 36
Val Ile Ala Tyr Asp Gly Ser Lys Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 2 CDRH3
<400> 37
Glu Tyr Arg Asp Ala Phe Asp Ile
1 5
<210> 38
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 2 CDRL1
<400> 38
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His
1 5 10
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 2 CDRL2
<400> 39
Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 40
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 2 CDRL3
<400> 40
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Val Ser Gly Trp Met
1 5 10
<210> 41
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 3 CDRH1
<400> 41
Asn Tyr Gly Met His
1 5
<210> 42
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 3 CDRH2
<400> 42
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 3 CDRH3
<400> 43
Asp Arg Trp Asn Gly Met Asp Val
1 5
<210> 44
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 3 CDRL1
<400> 44
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His
1 5 10
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 3 CDRL2
<400> 45
Ala Asn Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 46
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 3 CDRL3
<400> 46
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Pro Trp Val
1 5 10
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 4 CDRH1
<400> 47
Ser Tyr Gly Met His
1 5
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 4 CDRH2
<400> 48
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asp Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 4 CDRH3
<400> 49
Asp His Ser Val Ile Gly Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 50
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 4 CDRL1
<400> 50
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn
1 5 10
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 4 CDRL2
<400> 51
Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 52
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 4 CDRL3
<400> 52
Ser Ser Tyr Ala Gly Ser Asn Asn Val Val
1 5 10
<210> 53
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 5 CDRH1
<400> 53
Asn Tyr Gly Met His
1 5
<210> 54
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 5 CDRH2
<400> 54
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 5 CDRH3
<400> 55
Asp Gln Leu Gly Glu Ala Phe Asp Ile
1 5
<210> 56
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 5 CDRL1
<400> 56
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His
1 5 10
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 5 CDRL2
<400> 57
Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 58
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 5 CDRL3
<400> 58
Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Pro Val
1 5 10
<210> 59
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 6 CDRH1
<400> 59
Asp Tyr Gly Met Ser
1 5
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 6 CDRH2
<400> 60
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 61
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 6 CDRH3
<400> 61
Gly Asp Ile Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 62
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 6 CDRL1
<400> 62
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Phe Gly Ala Gly Tyr Asp Val His
1 5 10
<210> 63
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 6 CDRL2
<400> 63
Glu Asn Asn Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 6 CDRL3
<400> 64
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Pro Val
1 5 10
<210> 65
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 7 CDRH1
<400> 65
Ser Tyr Gly Met His
1 5
<210> 66
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 7 CDRH2
<400> 66
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 67
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 7 CDRH3
<400> 67
Glu Arg Arg Asp Ala Phe Asp Ile
1 5
<210> 68
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 7 CDRL1
<400> 68
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His
1 5 10
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 7 CDRL2
<400> 69
Ser Asp Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 7 CDRL3
<400> 70
Ala Thr Trp Asp Ser Asp Thr Pro Val
1 5
<210> 71
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 8 CDRH1
<400> 71
Ser Tyr Gly Met His
1 5
<210> 72
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 8 CDRH2
<400> 72
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 73
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 8 CDRH3
<400> 73
Asp His Ser Ala Ala Gly Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 74
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 8 CDRL1
<400> 74
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn
1 5 10
<210> 75
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 8 CDRL2
<400> 75
Gly Asn Ser Ile Arg Pro Ser
1 5
<210> 76
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 8 CDRL3
<400> 76
Ala Ser Trp Asp Asp Ser Leu Ser Ser Pro Val
1 5 10
<210> 77
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 9 CDRH1
<400> 77
Ser Tyr Gly Met His
1 5
<210> 78
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 9 CDRH2
<400> 78
Gly Ile Ser Trp Asp Ser Ala Ile Ile Asp Tyr Ala Gly Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 79
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 9 CDRH3
<400> 79
Asp Glu Ala Ala Ala Gly Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 80
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 9 CDRL1
<400> 80
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His
1 5 10
<210> 81
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 9 CDRL2
<400> 81
Gly Asn Thr Asp Arg Pro Ser
1 5
<210> 82
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 9 CDRL3
<400> 82
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Pro Val Val
1 5 10
<210> 83
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 10 CDRH1
<400> 83
Ser Tyr Gly Met His
1 5
<210> 84
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 10 CDRH2
<400> 84
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 85
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 10 CDRH3
<400> 85
Glu Leu Tyr Asp Ala Phe Asp Ile
1 5
<210> 86
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 10 CDRL1
<400> 86
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His
1 5 10
<210> 87
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 10 CDRL2
<400> 87
Ala Asp Asp His Arg Pro Ser
1 5
<210> 88
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 10 CDRL3
<400> 88
Ala Ser Trp Asp Asp Ser Gln Arg Ala Val Ile
1 5 10
<210> 89
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 11 CDRH1
<400> 89
Ser Tyr Gly Met His
1 5
<210> 90
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 11 CDRH2
<400> 90
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 91
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 11 CDRH3
<400> 91
Glu Phe Gly Tyr Ile Ile Leu Asp Tyr
1 5
<210> 92
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 11 CDRL1
<400> 92
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn
1 5 10
<210> 93
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 11 CDRL2
<400> 93
Arg Asp Tyr Glu Arg Pro Ser
1 5
<210> 94
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 11 CDRL3
<400> 94
Met Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Val Val
1 5 10
<210> 95
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 12 CDRH1
<400> 95
Asn His Gly Met His
1 5
<210> 96
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 12 CDRH2
<400> 96
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 97
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 12 CDRH3
<400> 97
Glu Thr Trp Asp Ala Phe Asp Val
1 5
<210> 98
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 12 CDRL1
<400> 98
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Asn Ala Asn
1 5 10
<210> 99
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 12 CDRL2
<400> 99
Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 12 CDRL3
<400> 100
Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Val Val
1 5
<210> 101
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 13 CDRH1
<400> 101
Ser Tyr Gly Ile Ser
1 5
<210> 102
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 13 CDRH2
<400> 102
Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 103
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 13 CDRH3
<400> 103
Ser Val Gly Ala Tyr Ala Asn Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 104
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 13 CDRL1
<400> 104
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His
1 5 10
<210> 105
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 13 CDRL2
<400> 105
Gly Asp Thr Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 106
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clone 13 CDRL3
<400> 106
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Pro Val
1 5 10
<---