НЕЙРОПРОТЕКТИВНАЯ ПИЩЕВАЯ ДОБАВКА
NEUROPROTECTIVE FOOD ADDITIVE

Изобретение относится к новой пищевой добавке, которая применима в качестве нейропротективного средства и которая вводится перорально.
Во всем мире устойчиво растет количество стариков. Факт, что пожилые люди в настоящее время живут дольше. Поэтому возрастные нарушения, такие как ассоциированное с возрастом ухудшение памяти, снижение когнитивной способности и тому подобное, становятся важной проблемой здравоохранения.
В EP 1325747 A2 раскрыта пищевая добавка, содержащая сбалансированные количества природных веществ, обладающих нейропротективным действием, таких как α-липоевая кислота и γ-линолевая кислота или фосфолипиды сои, в комбинации с соединениями, обладающими противовоспалительными и антиоксидантными свойствами и свойствами регуляции обмена сахаров и жиров, вместе с комплексом витаминов B.
Предметом изобретения является новая смесевая пищевая добавка, обладающая улучшенным нейропротективным действием и предупреждающая, ослабляющая нейродегенерацию или препятствующая ей, а также и предупреждающая, препятствующая и/или облегчающая процесс снижения когнитивной функции.
Другой предмет изобретения связан с пищевой добавкой для введения в виде пероральной лекарственной формы.
Новая смесевая пищевая добавка, обладающая нейропротективным действием, содержит пептидную композицию, содержащую по меньшей мере один из двух пептидов, определяемых последовательностью 1: NMVPFPR или последовательностью 2: ASAFQGIGSTHWVYDGVGNS.
Новая смесевая пищевая добавка может предупреждать или ослаблять возрастную нейродегенерацию, возрастное снижение когнитивной функции и возрастное ухудшение памяти. Она служит средством для улучшения памяти, внимания и вигильности у человека, предпочтительно у пожилых людей.
Новая смесевая пищевая добавка состоит, по существу, из молекул с молекулярной массой менее 10 кДа и содержит по меньшей мере один из пептидов, определяемых следующими последовательностями:
Последовательность 1: NMVPFPR
Последовательность 2: ASAFQGIGSTHWVYDGVGNS
Определение последовательности было выполнено общеизвестными методами, такими как масс-спектрометрия, тандемная масс-спектрометрия, электрофорез, хроматографическое разделение с последующим секвенированием и пр.
Новая смесевая пищевая добавка может дополнительно содержать добавочные пептиды с молекулярной массой менее 10 кДа. Она может дополнительно содержать аминокислоты.
Подходящие аминокислоты представляют собой, например, аспарагин (N), метионин (M), глутаминовую кислоту (E), валин (V), пролин (P), аргинин (R), аланин (A), цистеин (C), фенилаланин (F), глутамин (Q), глицин (G), треонин (T), изолейцин (I), триптофан (W), тирозин (Y), треонин (T), серин (S), гистидин (H), аспарагиновую кислоту (D), лизин (K), лейцин (L) и пр. Аминные добавки предпочтительно используют в их оптически активной форме, наиболее предпочтительно использование L-аминокислоты.
Новая смесевая пищевая добавка может дополнительно содержать витамины, такие как витамин А, различные витамины группы B, витамин C, витамин D, E и/или K. Дополнительно она может содержать минеральные вещества и/или микроэлементы, такие как кальций, магний, железо, медь, натрий, цинк, марганец, йод, калий, селен, хром, молибден, фтор, хлор, фосфор. Дополнительно компоненты могут представлять собой кофеин и таурин, жирные кислоты, такие как Ω-жирные кислоты, альфа-липоевую кислоту, фосфолипиды, фосфатидилсерины, растительные экстракты, такие как гинкго билоба, гуперзин, предшественники нейротрансмиттеров, подобные DMAE (диметиламиноэтанолу), и пр.
Она может дополнительно содержать вкусовые вещества, красители, подобные диоксиду титана, оксидам железа и пр, и/или консерванты и пр. Консерванты могут представлять собой
Этилпарабен (этиловый эфир п-гидроксибензойной кислоты)
Бензалкония хлорид
Бензетония хлорид
Бензойную кислоту
Бутилпарабен (бутиловый эфир п-гидроксибензойной кислоты)
Метилпарабен (метиловый эфир п-гидроксибензойной кислоты)
Калия сорбат
Пропионовую кислоту
Пропилпарабен (пропиловый эфир п-гидроксибензойной кислоты)
Натрия бензоат
Натрия пропионат
Сорбиновую кислоту
Дополнительно смесь может содержать приемлемые добавки, наполнители и/или нейтральные наполнители, такие как микрокристаллическая целлюлоза, мальтодекстрин, стеарат магния, коллоидный диоксид кремния, диоксид кремния, лактоза, мальтоза, натрийкарбоксиметилцеллюлоза, модифицированная целлюлоза, растительная целлюлоза, фосфат кальция, фосфат натрия, растительный глицерин, крахмал натрия, поливинилпирролидон, поливинилполипирролидон, целлюлозная смола, стеариновая кислота, желатин, маннит, аскорбат натрия, глицерин, рисовая мука, мальтодекстрина динатрия фосфат и пр.
Предпочтительно смесевая пищевая добавка согласно изобретению содержит 10-30 мас.% пептидов, 2-20 мас.% аминокислот и до 2-76 мас.% дополнительных компонентов, наполнителей и пр., определяемых выше.
Смесевая пищевая добавка применяется перорально в виде таблеток, покрытых оболочкой таблеток, капсул, паст, жевательных таблеток или растворов для питья. Если используется покрытая оболочкой таблетка, препарат может быть устойчивым к желудочным сокам, следовательно, может использоваться лекарственная форма с кишечно-растворимым покрытием. Смесевую пищевую добавку можно использовать в пероральной лекарственной форме по меньшей мере один раз в сутки.
Продукт пищевой добавки согласно изобретению применим для предотвращения, ослабления, противодействия нарушениям, вызванным процессом старения, предпочтительно у млекопитающих, особенно у человека, наиболее предпочтительно у пожилых людей.
Пищевая добавка может быть использована как средство для защиты нейронов от метаболических дефицитов и стресса, вызванных процессами старения, для предотвращения, противодействия и/или ослабления последствий возрастных поражений нейронов, обусловленных последствиями гипоксии или ишемии, возрастных поражений нейронов, обусловленных внутриклеточной перегрузкой кальцием, последствий возрастных поражений нейронов, вызванных, например, L-глутаматом, и последствий возрастных поражений нейронов вследствие оксидативного стресса.
Он также применим, в частности, для предотвращения, противодействия или ослабления последствий возрастной нейродегенерации, для предотвращения гибели нейронов вследствие клеточного стресса, нейродегенеративных явлений и интоксикации, для поддержания и сохранения нормальной цитоархитектоники нейронов во время процессов старения, для поддержания и/или улучшения функции синапсов и плотности синапсов, для предотвращения, противодействия или ослабления последствий возрастного снижения пластичности и плотности синапсов, для активации церебральных механизмов, относящихся к функциональным характеристикам внимания и памяти, для предотвращения, противодействия и/или ослабления снижения функции памяти, для предотвращения, противодействия и/или ослабления снижения вигильности (бдительности), связанного с процессами старения, и для поддержки, сохранения и/или улучшения долговременной памяти и процедурной памяти, также как функции обучения, внимания и вигильности, и для сохранения/поддержания здоровых психических функций в процессе старения.
ПРИМЕР 1
Приготовление порошковой смеси
- 49,490 кг порошка, содержащего 6,7% пептидов, 17,5% аминокислот и 75,8% лактозы
- 6,738 кг карбоксиметилцеллюлозы
- 9,607 кг микрокристаллической целлюлозы
- 0,525 кг коллоидного безводного диоксида кремния
просеивали через сито с ячейками 1,2 мм в барабан из нержавеющей стали и смешивали в смесителе вращающегося типа при скорости 6 об/мин в течение 10 мин (смесь 1).
1,015 кг стеарата магния просеивали через сито с ячейками 1,2 мм в барабан из нержавеющей стали, содержащий смесь 1. Затем весь гранулят смешивали в смесителе вращающегося типа при скорости 4 об/мин в течение 5 мин (окончательная смесь).
Прессование порошковой смеси (таблетирование)
Смесь прессовали таблеточным прессом при скорости таблетирования примерно 40000 таблеток в час. Использовали круглый двусторонний выпуклый пуансон диаметром 11 мм.
Таким образом получали таблетки со следующими свойствами:
- средняя масса: 385,0 +/- 7,7 мг
- твердость: 40-70 Н
- распад: не более 15,00 минут
- хрупкость: не более 1,00%
(Все способы испытания соответствовали требованиям Европейской Фармакопеи).
ПРИМЕР 2
Нанесение покрытия на таблетки
На таблетки, полученные в примере 1, может быть нанесено покрытие.
Чтобы получить суспензию пленочного покрытия, пропеллерной мешалкой смешивали следующие компоненты:
- 23,810 кг фталата ацетата целлюлозы (30% водный раствор)
- 0,595 кг талька
- 0,833 кг диоксида титана
- 1,429 кг триэтилцитрата
Таблетки покрывали суспензией пленочного покрытия до конечной массы 428,0 мг на таблетку, покрытую оболочкой, в барабане для нанесения покрытий.
Таблеткам, покрытым оболочкой, можно придать блеск с помощью воска или парафина.
Таким образом получали белые таблетки, покрытые оболочкой, со следующими параметрами:
- средняя масса: 428,0 +/-8,6 мг
- распад: не более 30,00 минут
- хрупкость: не более 1,00%
(Все способы испытаний соответствовали требованиям Европейской Фармакопеи)
ПРИМЕР 3
Порошковую смесь, используемую для таблетирования (см. пример 1), альтернативно можно расфасовать в жесткие желатиновые капсулы.
Жесткие желатиновые капсулы № 0 или 1 заполняли 385 мг порошковой смеси. Таким образом получали капсулы со следующими параметрами:
- средняя масса: 462,0 +/- 28,8 мг (размер 1),
- средняя масса: 481,0 +/- 28,8 мг (размер 0),
- распад: не более 15,00 минут
Альтернативно, твердые желатиновые капсулы № 2 или 3 могут быть составлены с эквивалентным количеством гранулята.
ПРИМЕР 4
Приготовление раствора для питья:
- 70,72 г порошка, содержащего 6,7% пептидов, 17,5% аминокислот и 75,8% лактозы
- 400,00 г сахарозы
- 5,00 г бензойной кислоты
растворяли в 1500 г воды в стеклянной колбе, оборудованной пропеллерной мешалкой. Получали почти прозрачный раствор (раствор 1).
- 85,0 мг рибофлавина
- 17,00 г земляничной эссенции
- 10,00 г ароматизатора «молоко-карамель» или 2,6 мг ароматизатора «апельсин»
растворяли в растворе 1 в стеклянной колбе, оборудованной пропеллерной мешалкой. Получали почти прозрачный раствор (раствор 2).
- 125,0 мг витамина E
суспендировали в 200,00 г воды в стеклянной колбе, оборудованной пропеллерной мешалкой. Данную суспензию добавляли к раствору 2 (раствор 3).
- 5,00 г альгината натрия
растворяли в 500,00 г теплой воды и добавляли к раствору 3 (раствор 4).
Раствор 4 доводили до 5000 мл водой и перемешивали в стеклянной колбе, оборудованной пропеллерной мешалкой. Получали почти прозрачный раствор, который дополнительно осветляли путем фильтрации через 0,45 мкм мембранный фильтр. Раствор разливали в 20-миллилитровые стеклянные бутылочки с завинчивающимися пробками.
ПРИМЕР 5
Нейропротективный эффект - защита корковых нейронов в культуре от различных возрастных поражений
5.1. Методы
Все необходимые предметы до экспериментов стерилизовали. Готовые растворы приобретали стерильными, и окончательные растворы смешивали в шкафу с ламинарным потоком воздуха.
Питательная среда для исследования повреждений состояла из модифицированной Дульбекко Игла среды (DMEM) с 4,5 г глюкозы/л, 5% фетальной телячьей сыворотки, 0,01% гентамицина и 2 мМ L-глутамина. L-глутамин в среде требовался для роста и дифференцировки, а гентамицин добавляли для предупреждения инфицирования культур клеток микоплазмами или другими нежелательными микроорганизмами. Для каждого эксперимента готовили свежую питательную среду в шкафу с ламинарным потоком воздуха в стерильных условиях.
(Pettmann, B., Louis, J.C. and Sensenbrenner, LM. (1979) Nature 281:378-380).
Клетки, используемые для экспериментов, представляли собой гибриды куриных эмбрионов Lohman Brown. Однодневные оплодотворенные яйца приобретали у местного производителя кур (Schlierbach Geflügel GmbH, Австрия) и хранили в соответствующих условиях (12 ± 0,3°C и влажности 80 ± 5%). Яйца в эмбриональный день 0 переносили в инкубатор для выведения и хранили, постоянно поворачивая, до эмбрионального дня 8 при 38 ± 0,5°C и влажности 55 ± 5%. Для выделения нейронов использовали 3-4 куриных эмбриона на эксперимент. Возраст эмбрионов имеет решающее значение, поскольку только в определенный период развития головной мозг почти полностью состоит из нервных клеток и менее 5% глии
Яйца обтирали 70% этанолом и раскалывали большими щипцами с тупого конца. После декапитации эмбриона ткани, покрывающие конечный мозг, удаляли и забирали полушария. После удаления сопутствующих тканей и оставшихся мозговых оболочек полушария помещали в кювету, содержащую питательную среду. После этого ткани механически разделяли, используя 1-миллилитровую пипетку, путем 3-кратного продавливания сквозь стерильное нейлоновое сито с размером ячеек 100 мкм.
Число клеток и жизнеспособность клеток определяли, используя стандартный тест исключения трипанового синего (PM Laboratories). Для подсчета клеток одну часть клеточной суспензии пришлось разбавить 9 частями раствора трипанового синего (270IJ I PBS и 180IJ I 0,5% раствора трипанового синего). Живые клетки и имеющие синюю окраску мертвые клетки подсчитывали на гемоцитометре Бюркера-Тюрка. Общее число клеток минус окрашенные мертвые клетки давало количество живых клеток.
5
5
2
Для исследования повреждений первоначальную среду для культивирования тканей отделяли от клеток и сохраняли. Добавляли новую среду, содержащую цианид натрия или колхицин (0,01 мМ, 0,1 мМ, 1 мМ цианида натрия; 0,1 мкМ, 1 мкМ, 10 мкМ колхицина), и оставляли в ней клетки на 30 минут. Затем повреждающую среду удаляли и выбрасывали, возвращали первоначальную питательную среду и поддерживали культуру еще в течение 24- или 48- часового восстановительного периода. Затем проводили анализ жизнеспособности клеток. В экспериментах использовали 96-луночные микротитровальные планшеты, покрытые поли-D-L-лизином. К каждой заранее подготовленной лунке, содержащей 80_1 среды с добавками, добавляли 80_1 среды, которая содержала 6 × 10 клеток/мл. Таким образом, окончательное число клеток в каждой лунке составляло 3 × 10 клеток/мл питательной среды. Поврежденные и неповрежденные контроли выращивали только на питательной среде в течение всего эксперимента. При подготовке планшетов лунки, обычно находящиеся снаружи, заполняли только питательной средой, чтобы предотвратить испарение. Планшеты хранили при 37°С, 95% влажности и 5% СО, не меняя среду до конца эксперимента. Через несколько часов культивирования у нейронов начинали вытягиваться отростки.
Смесь согласно изобретению использовали в виде готового раствора в ампулах. Чтобы создать концентрации 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 мкл/мл среды, смесь добавляли к лункам однократно в подходящих концентрациях на DIV 1 и оставляли с нейронами до конца эксперимента. Повреждения начинали производить на DIV 8, оценку жизнеспособности клеток производили на DIV 9 и DIV 10 соответственно. Во время периода культивирования после создания повреждения никаких дополнительных веществ не добавляли.
В исследовании повреждения смесь согласно изобретению испытывали при идентичных условиях в два различных дня. В каждом эксперименте создавали по меньшей мере 6 отдельных значений для поврежденных и неповрежденных контролей и 2 для каждой концентрации (всего n=12). Смесь согласно изобретению добавляли в концентрациях 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 мкл/мл среды. Исследовали различные экспериментальные группы с различными повреждениями.
По окончании каждого эксперимента жизнеспособность оставшихся нервных клеток измеряли колориметрическим анализом на восстановление MTT. Этот анализ основан на восстановлении желтого MTT (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида) в темно-синие кристаллы формазана митохондриальными дегидрогеназами (сукцинатдегидрогеназой). Так как описанная реакция катализируется только в живых клетках, анализ может использоваться для количественной оценки жизнеспособности клеток. Для определения жизнеспособности клеток к каждой лунке добавляли раствор MTT в конечной концентрации 0,5 мг/мл. Через 2 ч среду, содержащую MTT, отсасывали. Клетки лизировали 3% SDS, кристаллы формазана растворяли в изопропаноле/HCl. Для оценки оптической плотности (570 нм) использовали устройство для чтения планшетов (Anthos HT II). Жизнеспособность нейронов определяли по оптической плотности (OD).
Для анализа использовали методы описательной статистики. Значения MTT (OD) выражали как среднее ± стандартное отклонение.
5.2. Результаты
Во-первых, различные концентрации повреждающих соединений (цианида натрия и колхицина) использовались для повреждения приблизительно 50% нейронов по сравнению с неповрежденными нейронами. Подходящую повреждающую дозировку и время повреждения выбирали таким способом, при котором общее повреждение значительно, но все еще позволяет нейронам выживать и восстанавливаться. Слишком высокие дозировки ведут к быстрой гибели нейронов, ограничивая возможность нейропротективных веществ спасти их; слишком низкие дозировки тоже не позволяют надежно оценить защитные соединения, поскольку различия между поврежденными и неповрежденными контролями слишком малы.
Оценка жизнеспособности клеток через 48 часов после 30 минут интоксикации цианидом натрия показала все еще значимый нейропротективный эффект согласно изобретению, но слегка сниженный по сравнению с тем, который наблюдался через 24 часа (фиг.1 и 2). Разрушение цитоскелета колхицином тоже ведет к массивной нейродегенерации. Через 24 часа низкая дозировка 0,4 мг [средства] согласно изобретению была не в состоянии обеспечить значимую защиту, но все другие дозировки увеличивали жизнеспособность нейронов приблизительно на 50% по сравнению с уровнем повреждения в контрольных группах. Через 48 часов от начала поражения все дозировки обладают четким нейропротективным эффектом, и теперь жизнеспособность в группе высокой дозы - 3,2 мг - уже на 100% выше жизнеспособности неповрежденных контрольных групп, что указывает на то, что может быть спасено большинство нейронов (фиг.3 и 4).
На фиг.1-4 представлены относительные изменения жизнеспособности вследствие применения смеси согласно изобретению по сравнению с нелеченными поврежденными контрольными группами (=100%).
Общее заключение из этих экспериментов ясно демонстрирует, что изобретение дает возможность сохранять нервные клетки живыми, защищать их от метаболического стресса и сбоев и стимулировать жизнеспособность клеток, разрастание нейритных отростков и их ответвлений. Если повреждение нейрона, вызванное различными токсинами in vitro, слишком тяжелое, можно достичь лишь небольшой защиты, в случае легких или умеренных условий повреждения можно оценить выраженный дозозависимый эффект.
Однако комплексная композиция согласно изобретению предполагает, что пептиды действуют синергичным способом, комбинируя нейротрофическую стимуляцию, повышенный синтез антиапоптотических факторов и структурных белков, ингибирование аномально повышенной активности протеаз и усиленного метаболизма. При суммировании эффектов выявляется интересная активность данной пищевой добавки в защите очень уязвимых клеток in vitro.
ПРИМЕР 6
Длительное лечение пожилых крыс (3 месяца ежедневного лечения пероральным принудительным питанием по сравнению с пероральным введением физиологического раствора)
6.1. Способы
6.1.1. Лечение и поведенческие тесты
Все эксперименты были выполнены на 18-месячных (± 1 месяц) крысах Long Evans. Крыс случайным образом распределяли по различным группам, в которых животных либо лечили смесью согласно изобретению, либо давали им физиологический раствор в качестве контроля. Количество животных в группе составляло от 12 до 15. Животных в обеих экспериментальных группах лечили 3 месяца 1 ежедневным пероральным принудительным введением либо смеси согласно изобретению, определяемой в примере 5, либо физиологического раствора. В течение последних 4 дней лечения каждый месяц (дни лечения 27-30 = дни испытания 1-4; дни лечения 56-60 = дни испытания 5-8 и дни лечения 87-90 = дни испытания 9-12), проводили поведенческие тесты в ВЛМ, чтобы оценить функцию обучения и памяти животных.
Использованный ВЛМ состоял из круглого плавательного бассейна диаметром 170 сантиметров и высотой 45 сантиметров. Дополнительное внутреннее алюминиевое кольцо служило для того, чтобы скрыть все кабели, соединяющие компьютерную систему со скрытой платформой. Это было необходимо, чтобы не давать животным ориентиров внутри лабиринта, которые повлияли бы на нормальное поведение обучения. Внутреннюю поверхность бассейна покрасили в черный цвет, так чтобы прозрачную плегсигласовую платформу невозможно было обнаружить снаружи. Затопленную платформу (диаметром 15 сантиметров) всегда помещали точно в одно и то же положение в бассейне - юго-восточный квадрант. След от каждой плывущей крысы регистрировали видеокамерой, соединенной с персональным компьютером, что позволяло непрерывно отслеживать проплытый путь. Специально разработанное программное обеспечение (ART3) позволяло вычислять длину проплытого пути, латентность при достижении скрытой платформы, потраченное в квадрантах время, число проплывов над целевой областью и все другие параметры, подходящие для оценки функции обучения и памяти. Латентность (латентный период) спасения при нахождении платформы, также как длину проплытого пути использовали для статистических вычислений, которые касались влияний смеси согласно изобретению на функцию обучения. Каждое животное выполняло 4 испытательных заплыва в каждый день испытания (тренировочный день). Статистический анализ выполняли, используя h-критерий Kruskal и Wallis, или, в случае нормального распределения значений, используя ANOVA и критерий Scheffe для post hoc-анализа.
6.1.2. Гистологические исследования
Немедленно после окончания поведенческих экспериментов в ВЛМ 4-6 крыс из каждой группы умерщвляли большой дозой нембутала. Для надлежащей гистологической подготовки проводили транскардиальную перфузию физиологическим раствором и формалином. Для полной фиксации мозг переносили в 10% формалин, а затем заключали в парафин. На микротоме получали срезы толщиной 3 мкм (Bregma Level - 4,00 мм) и инкубировали с антителами к синаптофизину сосудистого белка. Иммунологическую реакцию визуализировали с помощью ферментативной реакции (метод APC, пероксидазу конъюгировали со вторичным антителом, в качестве субстрата использовали диаминобензидин).
Вследствие того, что существует хорошая корреляция между плотностью синапсов и иммунореактивностью синаптофизина, количество синапсов определяли с помощью световой микроскопии при использовании системы анализа изображения (LUCIA-Nikon Photo Systems, AUSTRIA). Анализ изображения проводили в четко определенных субзонах гиппокампа (CA1 радиальный слой, CA2 радиальный слой, CA3 радиальный слой, CA3 прозрачный слой, латеральная пластинка зубчатой извилины и медиальная пластинка зубчатой извилины), также как энторинальной зоне коры (слои 2 и 3). Для этой цели подсчитывали и статистически обрабатывали (Kruskal-Wallis ANOVA) число точек, иммунореактивных по синаптофизину.
6.2. РЕЗУЛЬТАТЫ
6.2.1. Поведенческие тесты в ВЛМ
6.2.1.1. Латентность спасения
Латентность спасения определяется как время между помещением животного в плавательный бассейн и успешным обнаружением скрытой платформы в ВЛМ. Животным приходилось ориентироваться по дополнительным ориентирам лабиринта, как описано ранее. Латентность спасения служит мерой обучения и памяти.
Во время первого тренировочного курса после 1 месяца введения значимых различий между обеими экспериментальными группами не было. Тем не менее имелась явная тенденция к тому, что крысы, леченные смесью согласно изобретению, выполняли задачу быстрее, но через 4 дня тренировок результат был идентичным.
К концу второго месяца в первый день тренировок появилось статистически значимое различие между леченными смесью согласно изобретению и контрольными животными, леченными физиологическим раствором (p=0,0049). Это указывает на стабилизацию долговременной памяти и, наиболее вероятно, на улучшенное процедурное обучение. Крысы, леченные смесью согласно изобретению, запоминали первоначальное положение платформы, начиная с первой тренировки, другими словами, они не забывали положение за период времени в один месяц, потому что они уже знали о процедуре, задачу они выполняли лучше, чем контрольные животные. Поскольку они демонстрировали очень низкую латентность спасения уже на первый день тренировок второго месяца, дополнительное улучшение было невозможно из-за предельного эффекта, обусловленного ограничениями скорости плавания. Контрольные животные демонстрировали непрерывное улучшение от одного дня тренировок к следующему, но к последнему дню они все равно были хуже, чем животные, леченные смесью согласно изобретению. К концу 3-го месяца крысы, леченные смесью согласно изобретению, все еще начинали с более низких латентных периодов, чем контрольная группа. Тем не менее, обе группы демонстрировали очень хорошие показатели и возможностей для дальнейшего улучшения не было.
6.2.1.2. Исследование долговременной памяти
Исследование различий в латентности спасения между днем 4 тренировки 4 и днем 5 тренировки 1, а также днем 8 тренировки 4 и днем 9 тренировки 1
Оценка долговременной памяти (различие в латентности между последней тренировкой последнего дня исследования в конце первого месяца и первой тренировкой первого дня тренировки в конце месяца 2; различие между последней тренировкой дня тренировок в конце месяца 2 и первой тренировкой первого тренировочного дня в конце 3-месячного периода лечения) показало ясную тенденцию к улучшению долговременной памяти у крыс, леченных смесью согласно изобретению. У животных, леченных смесью согласно изобретению, улучшались показатели почти на 10 секунд, если латентность спасения последней тренировки последнего тренировочного дня первого месяца сравнивать с латентностью первой тренировки первого тренировочного дня в период 2 месяцев. Сравнение показателей между первой тренировкой последнего тренировочного дня в конце 2-месячного периода с первой тренировкой в первый тренировочный день снова продемонстрировало более чем 10-секундное преимущество группы, леченной смесью согласно изобретению. У контрольных животных, леченных физиологическим раствором, почти не было выявлено различий, что указывает на то, что у крыс, леченных смесью согласно изобретению, долговременная память улучшилась.
Анализ латентности спасения между первым тренировочным днем после периода в один месяц и первым тренировочным днем после 2 месяцев лечения, и первым тренировочным днем после 3-месячного периода лечения соответственно
В качестве второй меры долговременной памяти оценивались различия между самым первым днем обучения и первыми днями тренировок после 2 и 3 месяцев лечения. Это должно было служить мерой общего улучшения латентности спасения при сравнении исходной ситуации с ситуацией повторных тренировок. Более значительные различия отражали лучшую долговременную память; малые различия свидетельствовали о том, что животные забыли локализацию платформы во время периода лечения без тренировок.
±
Фиг.5 (различия в латентности спасения между тренировочным днем 1 (1 месяц лечения) и днем 5 (2 месяца лечения); данные представляют собой среднее стандартная ошибка среднего. ** = P < 0,01) демонстрирует различия между самым первым днем, когда неподготовленных крыс поместили в ВЛМ, и повторной тренировкой после 2 месяцев лечения. Животные, леченные смесью согласно изобретению, улучшили показатели почти на 25 секунд или почти на 50% по сравнению с первым тренировочным днем, в то время как контрольные животные, леченные физиологическим раствором, показали улучшение примерно на 12 секунд или менее чем на 25%. Сравнение различий в латентности спасения между первым тренировочным днем и повторной тренировкой в первый день обучения после окончания периода лечения (3 мес) не выявило никаких значимых различий между группами. Тем менее существовала тенденция в пользу лечения смесью согласно изобретению, однако данные ясно показывали, что повтор тренировок в конце концов приводил к успеху во всех леченных группах. Авторам пришлось предположить, что все эксперименты были проведены на старых, но в остальном здоровых животных без явных неврологических нарушений. Поэтому ожидалось, что продолжение тренировок будет постоянно улучшать когнитивные способности в обеих леченных группах.
6.2.1.3. Оценка длины проплытого пути
На латентность спасения может влиять систематическая ошибка, вызванная моторными различиями, поэтому также подсчитывали длину проплытого пути. Повышенная скорость плавания или сниженная скорость плавания должны были имитировать другие изменения в обучении и памяти. Длина проплытого пути служит мерой функции обучения и памяти, независимой от скорости плавания.
Данные подтвердили статистически значимое различие между крысами, леченными смесью согласно изобретению, и контрольными животными в первый тренировочный день после окончания 2-месячного периода лечения (p = 0,0133). Это указывает на то, что ранее проанализованные данные согласуются и что лечение смесью согласно изобретению улучшает когнитивную функцию независимо от каких бы то ни было изменений в двигательном поведении (фиг.6).
Анализ различий в длине проплытого пути между днем 4 тренировки 4 и днем 5 тренировки 1, а также днем 8 тренировки 4 и днем 9 тренировки 1
Сравнение длины проплытого пути между последней тренировкой в первой серии тренировочных сессий и первой тренировкой второй тренировочной сессии после 2 месяцев лечения точно отражают то, что наблюдалось при оценке латентного периода спасения. Длина проплытого пути у группы, леченной смесью согласно изобретению, примерно на 2,1 метра короче, что означает, что они плавают более точно даже после 4 недель без тренировок. Контрольным животным требуется на 1,4 метра больше, чтобы найти платформу, что отражает некоторые трудности с началом возвращения в прежнее состояние, или, другими словами, им приходится заново выучивать точное и кратчайшее направление к цели.
Длина проплытого пути почти на 2 метра короче, если мы сравниваем показатели последней тренировки последнего испытательного дня второго курса (после 2 месяцев лечения) с показателями первой тренировки в первый тренировочный день в конце 3-месячного периода. Это снова указывает на сильное влияние смеси по изобретению на функцию долговременной памяти. У контрольных животных не выявлено дальнейшего улучшения.
6.2.2. Гистологическая оценка плотности синапсов
Число «точек», иммунореактивных по синаптофизину
Трехмесячный курс лечения смесью согласно изобретению ведет к статистически значимому повышению плотности синапсов в 4-х из исследованных областей. В CA3 радиальном слое и латеральной пластинке зубчатой извилины имеется по меньшей мере сильная тенденция к повышению плотности синапсов у животных, леченных смесью согласно изобретению, и только в CA3 прозрачном слое лечение не приводило к повышению плотности синапсов.
Оценка площади иммунореактивности синаптофизина
В отличие от предыдущей оценки, где подсчитывали каждую отдельную иммунореактивную точку, теперь измеряли общую площадь, на которую распространялась иммунореактивность к синаптофизину, в сравнении с общей площадью среза мозга после поправки на кровеносные сосуды и разрушение ткани. Результат отражает данные, полученные при подсчете иммунореактивных точек, с тем исключением, что эффекты в энторинальной коре были слегка ниже уровня значимости (p=0,0550). Все перечисленные различия оставались значимыми, и общая тенденция к повышению плотности синапсов у крыс, леченных смесью согласно изобретению, может быть подтверждена.
Результаты поведенческих тестов в водном лабиринте Морриса с конца второго месяца показывали статистически значимое различие между группой, леченной смесью согласно изобретению, и контрольной группой. Животные, леченные смесью согласно изобретению, находили скрытую платформу в водном лабиринте Морриса быстрее, чем контрольная группа. Это показывает, что смесь согласно изобретению улучшает долговременную память у здоровых старых крыс. Данные свидетельствуют о том, что длительный прием пептидов, сходных с факторами роста, хорошо переносится и способен обеспечить нейротрофическую стимуляцию головного мозга. Когнитивная функция, улучшенная смесью согласно изобретению, которая была показана в данных экспериментах, коррелирует с морфологическими изменениями в гиппокампе. В итоге в изобретении заявлена новая добавка, которая может помочь поддержать функцию памяти и обучения во время старения и, возможно, снизит риск утраты когнитивной функции, связанной с процессом старения.
ПРИМЕР 7
Улучшение когнитивной функции у здоровых пожилых людей
7.1. Методы
В исследование включили шестерых здоровых взрослых людей (4-х женщин и 2-х мужчин) в возрасте от 51 до 76 лет. Записывали массу, рост, BMI (индекс массы тела) и другие биологические характеристики.
Перед включением в исследование всем людям проводили медицинские и психометрические исследования, количественную оценку ЭЭГ и ЭКГ, а также лабораторный анализ. Ни один из исследуемых не соответствовал критериям DSM-IV и/или NINCDS-ADRDA сенильной деменции (American Psychiatric Association, 1994; McKhann et at., 1984). Все исследуемые до начала исследования и во время него не принимали никаких препаратов. У всех участников исследования было получено письменное информированное согласие. Исследование выполнялось Institutional Review Board и проводилось в соответствии с указаниями Good Clinical Practice.
Исследование представляло собой пробное испытание, в котором участникам было известно о принимаемом препарате, целью исследования была оценка влияния смеси согласно изобретению, принимаемой перорально однократно, на функционирование головного мозга у здоровых пожилых людей. Всего было включено шесть человек старше 50 лет. Длительность исследования для каждого участника составила 2 дня. Участников подвергали оценке когнитивной функции в день 1 за 24 ч перед приемом смеси согласно изобретению и второму обследованию после лечения в день 2 через 6 часов после приема смеси согласно изобретению. Все участники исследования получили одну пероральную дозу смеси согласно изобретению (180 мг).
7.2. Результаты
Средний исходный балл по MMSE у исследуемых составлял 28,4 ± 0,4. Значимое улучшение памяти по баллам ADAS наблюдалось после лечения смесью согласно изобретению (6,9 ±1,0 пропусков исходно против 4,9 ±1,0 пропусков после лечения; p<0,01). Так улучшение памяти также было статистически значимым для узнавания слов (2,8 ± 0,6 пропусков против 1,5 ± 0,7 пропусков; p<0,05) - фиг.8.
Согласно результатам данного исследования, смесь согласно изобретению поддерживает и улучшает функцию памяти у здоровых пожилых людей после однократного приема. Улучшение, вызванное смесью согласно изобретению, достигает значимых показателей в задаче узнавания слов и в общей подшкале памяти ADAS, но не в пункте воспроизведения слов. Смесь согласно изобретению также незначимо повышает производительность в когнитивных задачах SKT, относящуюся как к вниманию, так и к памяти. Отдельные задачи SKT, в которых наблюдался наилучший эффект после лечения смесью согласно изобретению, включали задачи по выстраиванию в определенном порядке блоков, подсчет символов и узнавание. Указанные эффекты указывают на то, что изобретение может усиливать функции внимания и памяти у взрослых пожилых людей без снижения когнитивной (познавательной) функции.
Представленные результаты свидетельствуют о том, что смесь согласно изобретению поддерживает функционирование головного мозга у здоровых пожилых добровольцев с отчетливым положительным действием на когнитивную функцию (память и внимание). Таким образом, смесь согласно изобретению, по-видимому, представляет собой полезную пищевую добавку, которая поддерживает и улучшает когнитивную функцию и внимание у пожилых.