ПОЛИВАЛЕНТНЫЕ МОДУЛЯТОРЫ РЕГУЛЯТОРНЫХ T-КЛЕТОК
POLYVALENT MODULATORS OF REGULATORY T-CELLS

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США 62/433,533, поданной 13 декабря 2016 года, содержание которой полностью включено в настоящий документ.
ПОДАЧА СПИСКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0002] Список последовательностей, прилагаемый к настоящей заявке, подан в электронном формате через EFS-сеть и включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Название текстового файла, содержащего Список последовательностей - 127754_00502_Sequence_Listing. Размер текстового файла - 91 КБ, текстовый файл был создан 13 декабря 2017 года.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
+
[0003] Воспалительные миопатии представляют собой заболевания, которые характеризуются хроническим мышечным воспалением и мышечной слабостью. Мышечные дистрофии представляют собой дегенеративные заболевания мышц, вызванные мутацией гена дистрофина, но основной причиной прогрессирующей дегенерации является воспаление мышц. Воспаление, связанное с этими заболеваниями, может повреждать мышечные волокна, вызывая усталость, боль и прогрессирующую мышечную дегенерацию. Регуляторные T-клетки (Treg) представляют собой особую субпопуляцию T-клеток. Treg подавляют активацию иммунной системы и, таким образом, регулируют аутотолерантность иммунной системы. Субпопуляции Treg, экспрессирующих определенные молекулярные маркеры, такие как рецептор ST2, присутствуют в воспаленных тканях, таких как поврежденные скелетные мышцы и воспаленные легкие. Размножение и активация ST2-экспрессирующих Treg вовлечены в разрешение острого повреждения мышц и мышечного воспаления, ассоциированного с мышечной дистрофией. Кроме того, ST2 Treg обнаруживаются в тканях, таких как висцеральный жировой слой, толстая кишка и легкие, и обладают иммунорегуляторными и восстановительными функциями в этих тканях.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0004] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен слитый белок, содержащий: белковый домен IL-2 человека; белковый домен Fc иммуноглобулина; и белковый домен, который связывается с интерлейкин-1 рецептор-подобным белком 1 (ST2). В некоторых вариантах осуществления белковый домен, который связывается с ST2, является белковым доменом IL-33 человека. В некоторых вариантах осуществления белковый домен, который связывается с ST2, является антителом, специфичным к ST2, или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит по меньшей мере один пептидный линкерный домен. В некоторых вариантах осуществления белковый домен IL-2 человека содержит IL-2 человека с заменой, выбранной из группы, состоящей из: T3A, N88R, N88G, D20H, C125S, Q126L и Q126F, по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления белковый домен Fc иммуноглобулина содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из варианта Fc IgG1 человека SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9. В некоторых вариантах осуществления белковый домен IL-33 человека содержит IL-33 человека с заменой, выбранной из группы, состоящей из C208S, C227S, C232S и C259S, по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах осуществления пептидный линкерный домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления слитый белок дополнительно содержит первый пептидный линкерный домен и второй пептидный линкерный домен.
[0005] В некоторых вариантах осуществления слитых белков, описанных в настоящем документе, каждый домен имеет амино-конец (N-конец) и карбокси-конец (C-конец); и где слитый белок имеет такую конфигурацию, в которой C-конец белкового домена IL-2 человека слит через пептидную связь с N-концом первого пептидного линкерного домена; N-конец белкового домена Fc IgG слит через пептидную связь с C-концом первого пептидного линкерного домена; N-конец второго пептидного линкерного домена слит через пептидную связь с C-концом белкового домена Fc IgG; и N-конец белкового домена, который связывается с ST2, слит через пептидную связь с C-концом второго пептидного линкерного домена.
[0006] В некоторых вариантах осуществления слитых белков, описанных в настоящем документе, каждый домен имеет амино-конец (N-конец) и карбокси-конец (C-конец); и где слитый белок имеет такую конфигурацию, в которой C-конец белкового домена, который связывается с ST2, слит через пептидную связь с N-концом первого пептидного линкерного домена; N-конец белкового домена Fc IgG слит через пептидную связь с C-концом первого пептидного линкерного домена; N-конец второго пептидного линкерного домена слит через пептидную связь с C-концом белкового домена Fc IgG; и N-конец белкового домена IL-2 человека слит через пептидную связь с C-концом второго пептидного линкерного домена. В некоторых вариантах осуществления слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 или SEQ ID NO: 25.
[0007] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая слитый белок, описанный в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен димерный белок, содержащий слитый белок, описанный в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен димерный белок, содержащий первый слитый белок и второй слитый белок, где каждый слитый белок включает белковый домен Fc иммуноглобулина (IgG) и по меньшей мере один дополнительный белковый домен, выбранный из группы, состоящей из белкового домена IL-2 человека; и белковый домен, который связывается с интерлейкин-1 рецептор-подобным белком 1 (ST2); и димерный белок включает по меньшей мере один белковый домен IL-2 человека и по меньшей мере один белковый домен, который связывается с ST2.
[0008] В некоторых вариантах осуществления первый слитый белок включает белковый домен IL-2 человека, первый белковый домен Fc иммуноглобулина и первый пептидный линкер; и второй слитый белок включает белковый домен, который связывается с ST2, второй белковый домен Fc иммуноглобулина и второй пептидный линкерный домен. В некоторых вариантах осуществления каждый домен имеет амино-конец (N-конец) и карбокси-конец (C-конец); первый слитый белок имеет такую конфигурацию, в которой C-конец белкового домена IL-2 человека слит через пептидную связь с N-концом первого пептидного линкерного домена; и N-конец первого белкового домена Fc IgG слит через пептидную связь с C-концом первого пептидного линкерного домена; и второй слитый белок имеет такую конфигурацию, в которой C-конец второго белкового домена Fc IgG слит через пептидную связь с N-концом второго пептидного линкерного домена; и N-конец белкового домена, который связывается с ST2, слит через пептидную связь с C-концом второго пептидного линкерного домена. В некоторых вариантах осуществления белковый домен, который связывается с ST2, является белковым доменом IL-33 человека. В некоторых вариантах осуществления белковый домен, который связывается с ST2, является антителом, специфичным к ST2, или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из слитых белков димерного белка дополнительно включает по меньшей мере один пептидный линкерный домен. В некоторых вариантах осуществления белковый домен IL-2 человека включает IL-2 человека с заменой, выбранной из группы, состоящей из: T3A, N88R, N88G, D20H, C125S, Q126L и Q126F, по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2. в некоторых вариантах осуществления белковый домен Fc иммуноглобулина включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из варианта Fc IgG1 человека SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9. В некоторых вариантах осуществления белковый домен IL-33 человека включает IL-33 человека с заменой, выбранной из группы, состоящей из C208S, C227S, C232S и C259S, по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах осуществления пептидный линкерный домен включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
[0009] В некоторых вариантах осуществления димерных белков, описанных в настоящем документе, первый слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и второй слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; первый слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и второй слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; первый слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и второй слитый белок включают аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; первый слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и второй слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; первый слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и второй слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; каждый первый слитый белок и второй слитый белок включают аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; каждый первый слитый белок и второй слитый белок включают аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; каждый первый слитый белок и второй слитый белок включают аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, и димерный белок дополнительно включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29; каждый первый слитый белок и второй слитый белок включают аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и димерный белок дополнительно включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30; первый слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, второй слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, и димерный белок дополнительно включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29; первый слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, второй слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и димерный белок дополнительно включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30; первый слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, второй слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и димерный белок дополнительно включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29; первый слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, второй слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и димерный белок дополнительно включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30; первый слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, второй слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и димерный белок дополнительно включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29; первый слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, второй слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и димерный белок дополнительно включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30; первый слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, второй слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, и димерный белок дополнительно включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29; или первый слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, второй слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и димерный белок дополнительно включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30.
+
-
[00010] В некоторых вариантах осуществления димерных белков, описанных в настоящем документе, белок Fc IgG включает остатки цистеина, и первый слитый белок и второй слитый белок соединены друг с другом через остатки цистеина белкового домена Fc IgG. В некоторых вариантах осуществления димерный белок селективно взаимодействует с ST2 регуляторными T-клетками по сравнению с ST2 регуляторными T-клетками. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, включающая слитый белок, описанный в настоящем документе, или димерный белок, описанный в настоящем документе.
+
-
+
-
[00011] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен способ лечения патологического состояния, включающий введение индивиду терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по пункту 28. В некоторых вариантах осуществления введение приводит к большему увеличению уровней ST2 регуляторных T-клеток у индивида по сравнению с уровнями ST2 регуляторных T-клеток у индивида. В некоторых вариантах осуществления введение селективно активирует ST2 регуляторные T-клетки у индивида по сравнению с ST2 регуляторными T-клетками у индивида. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество составляет от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 250 мкг/кг.
[00012] В некоторых вариантах осуществления патологическим состоянием является воспалительная миопатия. В некоторых вариантах осуществления воспалительная миопатия выбрана из группы, состоящей из мышечной дистрофии, полимиозита, дерматомиозита. В некоторых вариантах осуществления патологическое состояние выбрано из группы, состоящей из воспалительного заболевания жировой ткани, воспалительного заболевания толстой кишки и воспалительного заболевания легкого. В некоторых вариантах осуществления жировая ткань является висцеральной жировой тканью. В некоторых вариантах осуществления патологическое состояние является аутоиммунным заболеванием. В некоторых вариантах осуществления аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из реакции трансплантат против хозяина, вульгарной пузырчатки, системной красной волчанки, склеродермии, язвенного колита, болезни Крона, псориаза, диабета 1-го типа, рассеянного склероза, бокового амиотрофического склероза, очаговой алопеции, увеита, оптиконевромиелита и миодистрофии Дюшенна. В некоторых вариантах осуществления введение является внутривенным. В некоторых вариантах осуществления введение является подкожным. В некоторых вариантах осуществления индивид является человеком.
+
-
[00013] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен способ селективной активации ST2 регуляторной T-клетки по сравнению с ST2 регуляторной T-клеткой у индивида, включающий введение индивиду терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по пункту 28. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество составляет от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 250 мкг/кг. В некоторых вариантах осуществления введение является внутривенным. В некоторых вариантах осуществления введение является подкожным. В некоторых вариантах осуществления индивид является человеком.
[00014] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложено соединение, включающее: a) первый фрагмент, который связывается с рецептором IL-2, ковалентно связанный с Fc-доменом иммуноглобулина; и b) второй фрагмент, который связывается с ST2, ковалентно связанный с Fc-доменом иммуноглобулина.
[00015] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложено соединение, включающее: a) первый фрагмент, который связывается с рецептором IL-2; и b) второй фрагмент, который связывается с ST2; где первый фрагмент, который связывается с рецептором IL-2, включает мутацию по сравнению с IL-2 дикого типа, которая увеличивает стабильность по сравнению с фрагментом IL-2 дикого типа, который связывает рецептор IL-2 у индивида.
[00016] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложено соединение, включающее: a) первый фрагмент, который связывается с рецептором IL-2; и b) второй фрагмент, который связывается с ST2; где первый фрагмент, который селективно связывается с рецептором IL-2, связывается с рецептором IL2Rαβγ по сравнению с рецептором IL2Rβγ.
[00017] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложено соединение, включающее: a) первый фрагмент, который связывается с рецептором IL-2; и b) второй фрагмент, который связывается с ST2; где первый фрагмент, который связывается с рецептором IL-2, отличается от IL-2 дикого типа заменой, а именно N88R, по сравнению с IL-2 дикого типа.
[00018] В некоторых вариантах осуществления соединений, описанных в настоящем документе, первый фрагмент включает полипептид. В некоторых вариантах осуществления первый фрагмент, который связывается с рецептором IL-2, включает пептидную последовательность, которая обладает по меньшей мере 90% идентичностью с IL-2 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления мутация, которая увеличивает стабильность по сравнению с IL-2 дикого типа фрагмента, который связывает рецептор IL-2 у индивида, является заменой, а именно C125S, по сравнению с IL-2 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления первый фрагмент, который связывается с рецептором IL-2, отличается от IL-2 дикого типа заменой, а именно T3A, по сравнению с IL-2 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления первый фрагмент, который связывается с рецептором IL-2, обладает по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления первый фрагмент, который связывается с рецептором IL-2, включает SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления первый фрагмент, который связывается с рецептором IL-2, является SEQ ID NO: 1.
[00019] В некоторых вариантах осуществления второй фрагмент, который связывается с ST2, включает полипептид. В некоторых вариантах осуществления второй фрагмент, который связывается с ST2, включает пептидную последовательность, которая обладает по меньшей мере 90% идентичностью с IL-33 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления второй фрагмент, который связывается с ST2, обладает по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах осуществления второй фрагмент, который связывается с ST2, является антителом, направленным против ST2, или его антигенсвязывающим фрагментом. В некоторых вариантах осуществления второй фрагмент, который связывается с ST2, включает SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах осуществления второй фрагмент, который связывается с ST2, является SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах осуществления первый фрагмент, который связывается с рецептором IL-2, и второй фрагмент, который связывается с ST2, ковалентно связаны. В некоторых вариантах осуществления первый фрагмент, который связывается с рецептором IL-2, и второй фрагмент, который связывается с ST2, ковалентно связаны дисульфидной связью.
[00020] В некоторых вариантах осуществления соединений, описанных в настоящем документе, соединение дополнительно включает два мультимеризационных фрагмента. В некоторых вариантах осуществления первый мультимеризационный фрагмент ковалентно связан с первым фрагментом, который связывается с рецептором IL-2, и второй мультимеризационный фрагмент ковалентно связан со вторым фрагментом, который связывается с ST2. В некоторых вариантах осуществления два мультимеризационных фрагмента ковалентно связаны друг с другом. В некоторых вариантах осуществления два мультимеризационных фрагмента представляют собой полипептидные последовательности. В некоторых вариантах осуществления два мультимеризационных фрагмента являются Fc-доменами иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления Fc-домены иммуноглобулина обладают ослабленными эффекторными функциями по сравнению с соответствующими Fc-доменами иммуноглобулина дикого типа. В некоторых вариантах осуществления Fc-домены иммуноглобулина являются Fc-доменами иммуноглобулина IgG1. В некоторых вариантах осуществления Fc-домены иммуноглобулина IgG1 отличаются от Fc-доменов иммуноглобулина IgG1 дикого типа заменой, а именно N297A по сравнению с Fc-доменами иммуноглобулина IgG1 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления каждый Fc-домен иммуноглобулина включает SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления каждый Fc-домен иммуноглобулина является SEQ ID NO: 7.
+
-
[00021] В некоторых вариантах осуществления соединений, описанных в настоящем документе, соединение включает линкерный пептид, ковалентно связанный с первым фрагментом, который связывается с рецептором IL-2, и ковалентно связанный с первым мультимеризационным фрагментом. В некоторых вариантах осуществления соединение включает линкерный пептид, ковалентно связанный со вторым фрагментом, который связывается с ST2, и ковалентно связанный со вторым мультимеризационным фрагментом. В некоторых вариантах осуществления соединение включает первый линкерный пептид, ковалентно связанный с первым фрагментом, который связывается с рецептором IL-2, и ковалентно связанный с первым мультимеризационным фрагментом, и второй линкерный пептид, ковалентно связанный со вторым фрагментом, который связывается с ST2, и ковалентно связанный со вторым мультимеризационным фрагментом. В некоторых вариантах осуществления первый фрагмент, который связывается с рецептором IL-2, расположен на N-конце по отношению к первому линкерному пептиду, и первый мультимеризационный фрагмент расположен на C-конце по отношению к первому линкерному пептиду, и второй фрагмент, который связывается с ST2, расположен на N-конце по отношению ко второму линкерному пептиду, и второй мультимеризационный фрагмент расположен на C-конце по отношению ко второму линкерному пептиду. В некоторых вариантах осуществления каждый первый линкерный пептид и второй линкерный пептид содержат от 6 до 20 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления каждый первый линкерный пептид и второй линкерный пептид содержат от 12 до 17 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления каждый первый линкерный пептид и второй линкерный пептид представляют собой последовательности аминокислотных остатков, каждый из которых независимо является серином или глицином. В некоторых вариантах осуществления каждый первый линкерный пептид и второй линкерный пептид содержат по 15 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления каждый первый линкерный пептид и второй линкерный пептид является GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 6). В некоторых вариантах осуществления соединение селективно воздействует на ST2 регуляторные T-клетки по сравнению с ST2 регуляторными T-клетками.
+
-
+
-
[00022] В некоторых аспектах настоящее описание относится к способу лечения патологического состояния, включающему введение индивиду терапевтически эффективного количества соединения по любому из пунктов 1-40. В некоторых вариантах осуществления введение повышает количество ST2 регуляторных T-клеток у индивида по сравнению с количеством ST2 регуляторных T-клеток у индивида. В некоторых вариантах осуществления введение селективно активирует ST2 регуляторные T-клетки у индивида по сравнению с ST2 регуляторными T-клетками у индивида. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество составляет от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 250 мкг/кг. В некоторых вариантах осуществления патологическое состояние является воспалительной миопатией. В некоторых вариантах осуществления воспалительная миопатия является мышечной дистрофией. В некоторых вариантах осуществления воспалительная миопатия является полимиозитом. В некоторых вариантах осуществления воспалительная миопатия является дерматомиозитом. В некоторых вариантах осуществления патологическое состояние является воспалительным заболеванием жировой ткани. В некоторых вариантах осуществления жировая ткань является висцеральной жировой тканью. В некоторых вариантах осуществления патологическое состояние является воспалительным заболеванием толстой кишки. В некоторых вариантах осуществления патологическое состояние является воспалительным заболеванием легкого. В некоторых вариантах осуществления введение является внутривенным. В некоторых вариантах осуществления введение является подкожным. В некоторых вариантах осуществления индивид является человеком.
ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ОТСЫЛКИ
[00023] Все публикации, патенты и заявки на патент, указанные в настоящем описании, включены в настоящий документ посредством отсылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент была прямо и индивидуально указана как включенная посредством отсылки.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[00024] На ФИГ. 1 показана диаграмма, иллюстрирующая наложение клеток, экспрессирующих IL-2Rαβγ и ST2.
[00025] На ФИГ. 2 показано схематическое изображение примерного соединения согласно настоящему описанию.
[00026] На ФИГ. 3A показана схематическая диаграмма соединения, имеющего IL2R-связывающий фрагмент, ST2-связывающий фрагмент и линкер между ними.
[00027] На ФИГ. 3B показана схематическая диаграмма примерного соединения, имеющего IL2R-связывающий фрагмент, ковалентно связанный с мультимеризационным фрагментом, ST2-связывающий фрагмент, ковалентно связанный с мультимеризационным фрагментом, и ковалентные связи между мультимеризационными фрагментами.
[00028] На ФИГ. 3C показана схематическая диаграмма примерного соединения, имеющего IL2R-связывающий фрагмент, ковалентно связанный с мультимеризационным фрагментом, ST2-связывающий фрагмент, ковалентно связанный с линкером, ковалентно связанным с мультимеризационным фрагментом, и ковалентные связи между мультимеризационными фрагментами.
[00029] На ФИГ. 3D показана схематическая диаграмма примерного соединения, имеющего IL2R-связывающий фрагмент, ковалентно связанный с линкером, ковалентно связанным с мультимеризационным фрагментом, ST2-связывающий фрагмент, ковалентно связанный с мультимеризационным фрагментом, и ковалентные связи между мультимеризационными фрагментами.
[00030] На ФИГ. 3E показана схематическая диаграмма примерного соединения, имеющего IL2R-связывающий фрагмент, ковалентно связанный с линкером, ковалентно связанным с мультимеризационным фрагментом, ST2-связывающий фрагмент, ковалентно связанный с линкером, ковалентно связанным с мультимеризационным фрагментом, и ковалентные связи между мультимеризационными фрагментами.
[00031] На ФИГ. 3F показана схематическая диаграмма примерного соединения, имеющего: a) IL2R-связывающий фрагмент, ковалентно связанный с мультимеризационным фрагментом, ковалентно связанным с ST2-связывающим фрагментом, b) ST2-связывающий фрагмент, ковалентно связанный с мультимеризационным фрагментом, ковалентно связанным с IL2R-связывающим фрагментом, и c) ковалентные связи между мультимеризационными фрагментами.
[00032] На ФИГ. 4A-4J показаны схематические диаграммы димерных белков, включающих Fc-области IgG1. Димерные белки включают вариант IL-33 (C208S, C227S, C232S, C259S) или различные комбинации варианта IL-33 и варианта IL-2 (N88R, C125S). В названиях белков "N" обозначает N-концевой, "C" обозначает C-концевой, "v" обозначает вариант, "B" обозначает бивалентный, и "M" обозначает моновалентный.
[00033] На ФИГ. 5A-5E показаны схематические диаграммы димерных белков, включающих Fc-области IgG1. Димерные белки включают вариант IL-2 (N88R, C125S) и антигенсвязывающий фрагмент (Fab), который связывается с ST2 (Ab2 или Ab4). На каждой диаграмме представлены два различных димерных белка, один из которых содержит Ab2 в качестве Fab-области, а другой содержит Ab4 в качестве Fab-области. В названиях белков "N" обозначает N-концевой, "C" обозначает C-концевой, "v" обозначает вариант, "B" обозначает бивалентный, и "M" обозначает моновалентный.
[00034] На ФИГ. 6A показаны сенсограммы BiaCore, показывающие связывание между человеческим ST2 и IL-2v/IL-33v биспецифичными и моновалентными IL-33 молекулами.
[00035] На ФИГ. 6B показаны сенсограммы BiaCore, показывающие связывание между мышиным ST2 и IL-2v/IL-33v биспецифичными и моновалентным IL-33 молекулами.
[00036] На ФИГ. 7 показаны сенсограммы BiaCore, показывающие связывание между человеческим IL2R-альфа и IL-2v/IL-33v биспецифичными и моновалентными IL-33 молекулами.
[00037] На ФИГ. 8A показаны сенсограммы BiaCore, показывающие связывание между человеческим ST2 и Ab2/IL-2v биспецифичными молекулами.
[00038] На ФИГ. 8B показаны сенсограммы BiaCore, показывающие связывание между человеческим ST2 и Ab4/IL-2v биспецифичными молекулами.
[00039] На ФИГ. 9A показаны сенсограммы BiaCore, показывающие связывание между человеческим IL2R-альфа и Ab2/IL-2v биспецифичными молекулами.
[00040] На ФИГ. 9B показаны сенсограммы BiaCore, показывающие связывание между человеческим IL2R-альфа и Ab4/IL-2v биспецифичными молекулами.
+
[00041] На ФИГ. 10A показана pSTAT5 активность в ST2 регуляторных T-клетках в суспензиях мышиных клеток селезенки, стимулируемых различными концентрациями моновалентного N88R-Fc или моновалентного IL-33-Fc, или биспецифичного IL2vNM-IL33vCM.
-
[00042] ФИГ. 10B показана pSTAT5 активность в ST2 регуляторных T-клетках в суспензиях мышиных клеток селезенки, стимулируемых различными концентрациями моновалентного N88R-Fc или моновалентного IL-33-Fc, или биспецифичного IL2vNM-IL33vCM.
[00043] На ФИГ. 11A и 11B показана биоактивность фрагмента IL-33 в IL33-IL2 биспецифичных белках.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[00044] Регуляторные T-клетки (Treg) являются классом CD4+CD25+ T-клеток, которые подавляют активность других иммунных клеток, таких как обычные CD4+ T-клетки (Tconv) и CD8+ клетки. Treg играют главную роль в гомеостазе иммунной системы, поддерживают толерантность к аутоантигенам и модулируют иммунный ответ против чужеродных антигенов. Treg могут сильно активироваться интерлейкином-2 (IL-2), но IL-2 также активирует многие другие типы клеток, что может привести к серьезным токсическим явлениям. Было установлено, что существуют субпопуляции Treg, которые могут быть определены экспрессией специфических молекулярных маркеров и своей ролью в различных иммунологических ответах. Одной из субпопуляций Treg является ST2+ субпопуляция Treg. Определяющим маркером клеточной поверхности ST2+ Treg является ST2, компонент цитокинового рецептора, также известный как интерлейкин-1 рецептор-подобный белок 1 (IL1RL1), и который является субъединицей рецептора IL-33. IL-33 относится к классу "аларминов", воспалительных цитокинов, связанных с острыми воспалительными реакциями. ST2+ Treg присутствуют в тканях, таких как мышца, висцеральный жир, толстая кишка и легкое, и обладают иммунорегуляторными и восстановительными функциями.
[00045] В скелетной мышце обычно нет T-клеток, но после острой мышечной травмы ST2+ Treg быстро мигрируют в мышечную ткань в больших количествах. Рекрутинг таких Treg в мышечную ткань и продукция фактора роста амфирегулина (AREG) связывали с активацией сателлитных клеток мышц и с восстановлением ткани. Недостаточность Treg ухудшает восстановление мышц после повреждения, и размножение Treg в мышце при использовании комплексов IL-2-IL-2R приводит к улучшенным результатам в модели дистрофин-дефицитной миодистрофии на животных. Значительная доля Treg, которые вырабатывают AREG, является ST2+. ST2+ Treg также связывали с воспаленной тканью легкого после гриппа и связывали с восстановлением ткани легкого после инфекции. Обработка ST2+ Treg лигандом рецептора ST2, IL-33, увеличивает продукцию AREG и восстановление ткани. Таким образом, при увеличении количества ST2+ Treg или активности ST2+ Treg можно лечить или предотвращать аутоиммунные заболевания и воспалительные заболевания, такие как воспалительные миопатии, воспалительные мышечные патологии, и улучшать заживление тканей после повреждения или нагрузки.
[00046] Например, роль ST2+ Treg была установлена в моделях воспаления мышц на животных. Одной из таких моделей на животных является острая мышечная травма (Burzyn et al., 2013, Cell 155(6): 1282-1295) у мышей дикого типа, и второй моделью является модель миодистрофии на мышах mdx, модель хронического воспаления мышц, вызванного генетически обусловленной недостаточностью дистрофина (мыши mdx; Villalta et al., 2014, Sci Transl Med 5(258): 258ra142). Роль ST2+ Treg также была установлена в модели воспалительного заболевания кишечника на мышах (Schiering et al., 2014, Nature 513(7519):564-568).
[00047] В результате предоставления соединений и способов, которые позволяют селективно увеличивать количество ST2+ Treg и/или повышать активность ST2+ Treg, настоящее изобретение делает возможными новые способы лечения воспалительных и дегенеративных заболеваний. Например, настоящее изобретение относится к соединению с первым фрагментом, который связывается с рецептором IL-2 (IL-2R или IL2R), и вторым фрагментом, который связывается с ST2. IL-2R представляет собой гетеротримерный белок, экспрессируемый в различных типах иммунных клеток, включая T-клетки, NK-клетки, эозинофилы и моноциты. Такой широкий профиль экспрессии обеспечивает плейотропный эффект в отношении иммунной системы и высокую системную токсичность терапии IL-2, а также может затруднить адресное воздействие на IL-2R+ клетки.
[00048] IL2-R имеет три формы, образуемые различными комбинациями трех разных белков IL-2R: α (альфа), β (бета) и γ (гамма). Эти цепи рецептора собираются с образованием трех разных формы рецептора: (1) рецептор низкой аффинности, IL2Rα, который не передает сигнал; (2) рецептор промежуточной аффинности (IL2Rβγ), состоящий из IL2Rβ и IL2Rγ, который широко экспрессируется на обычных CD4+ T-клетках (Tconv), NK-клетках, эозинофилах и моноцитах; и (3) рецептор высокой аффинности (IL2Rαβγ), состоящий из IL2Rα, IL2Rβ и IL2Rγ, который транзиентно экспрессируется на активированных T-клетках и конститутивно на Treg-клетках. Обычные T-клетки (Tconv) являются клетками, которые активируются антигенами и участвуют в иммунном ответе. Обычные T-клетки включают Т-хелперы, цитотоксические T-клетки и T-клетки памяти. Мутации в IL-2 могут изменять аффинность связывания IL-2 к различным формам рецептора IL-2R. Таким образом, в настоящем изобретении предложены соединения, которые селективно активируют и вызывают размножение Treg, например ST2+ Treg, благодаря тому, что они включают фрагмент, который селективно связывается с рецептором высокой аффинности (IL2Rαβγ). Пример фрагмента включает, без ограничения перечисленным, вариант IL-2, включающий одну или более мутаций, которые изменяют связывание по сравнению с IL-2 дикого типа, в результате чего вариант IL-2 селективно связывается с рецептором высокой аффинности (IL2Rαβγ) по сравнению с рецептором промежуточной аффинности и рецептора низкой аффинности.
in vivo
[00049] Способы и композиции настоящего изобретения относятся к соединению, включающему первый фрагмент, который связывается с рецептором IL-2, и второй фрагмент, который связывается с ST2, что делает соединение намного более селективным и активным в его способности активировать и вызывать размножение ST2+ Treg. В некоторых вариантах осуществления эти соединения направленно воздействуют на клетки, которые экспрессируют как рецептор IL-2, или его определенную изоформу, так и ST2. Например, соединение, которое специфично связывается с изоформой IL2Rαβγ, может связываться с Treg-клетками, экспрессирующими ST2. На ФИГ. 1 показаны домены экспрессии IL-2Rαβγ и ST2 в смешанной популяции Treg, а также пример области наложения, в которой может связываться соединение согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления первый и второй фрагменты ковалентно связаны, например, Fc-доменом иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления соединение также включает линкер, соединяющий IL-2 рецептор-связывающий фрагмент и Fc-домен иммуноглобулина, и/или линкер, соединяющий ST2-связывающий фрагмент и Fc-домен иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления соединение может регулировать активность белых кровяных клеток, например, лейкоцитов или лимфоцитов, которые отвечают за иммунитет. Fc-домен иммуноглобулина может увеличивать стабильность молекулы , а линкер ковалентно соединяет фрагмент и Fc-домен. При включении фрагментов, которые связываются с рецептором IL2 и с ST2, соединения, описанные в настоящем документе, могут направленно воздействовать на клетки (например, T-регуляторные клетки), которые экспрессируют как рецептор IL2, так и ST2. В некоторых вариантах осуществления Fc-домен обладает ослабленными эффекторными функциями. Примерное соединение включает первый фрагмент, который связывается с рецептором IL-2, и второй фрагмент, который связывается с ST2, где первый фрагмент, который связывается с рецептором IL-2, ковалентно связан с первым эффекторно-дефицитным Fc-доменом через линкер, и второй фрагмент, который связывается с ST2, ковалентно связан со вторым эффекторно-дефицитным Fc-доменом через линкер, и где первый эффекторно-дефицитный Fc-домен и второй эффекторно-дефицитный Fc-домен ковалентно связаны через дисульфидную связь. Пример такого соединения показан на ФИГ. 2. Другие примерные соединения показаны на ФИГ. 3A-3E, на которой представлены соединения, включающие ST2-связывающий и IL2R-связывающий фрагменты, в различных комбинациях с линкерами и мультимеризационными доменами (которые могут быть, например, Fc-доменами). Другой пример такого соединения показан на ФИГ. 3F, где фрагмент IL2 и ST2-связывающий фрагмент присутствуют на N-конце и C-конце, соответственно, IgG Fc белка. Такой белок может находиться в обратной ориентации, где ST2-связывающий фрагмент расположен на N-конце, а фрагмент IL2 - на C-конце, и может включать пептидные линкеры между одним или обоими ST2-связывающими фрагментами и их соответствующими Fc-доменами, или между одним или обоими IL2R-связывающими фрагментами и их соответствующими Fc-доменами. Примерный способ лечения патологического состояния, например воспалительного заболевания, такого как воспалительная миопатия, включает введение индивиду терапевтически эффективного количества соединения, описанного в настоящем документе. Примеры патологического состояния включают, без ограничения перечисленными, мышечную дистрофию и дерматомиозит.
Фрагменты, которые связывают рецептор IL-2
[00050] Как описано выше, в настоящем изобретении предложено соединение, включающее первый фрагмент, который связывает рецептор IL-2, и второй фрагмент, который связывает ST2. Фрагмент, который связывает рецептор IL-2, может быть полипептидом, включающим полноразмерный IL-2 дикого типа, более коротким или более длинным. IL-2 рецептор-связывающий фрагмент может быть последовательностью IL-2 дикого типа, которая показана в SEQ ID NO: 2: (APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEE LKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFXQS IISTLT) или вариантом IL-2. Варианты IL-2 могут содержать одну или более замен, делеций или вставок, которые отличаются от аминокислотной последовательности IL-2 дикого типа. Остатки обозначены в настоящем документе однобуквенным аминокислотным кодом, после которого указано положение аминокислоты в IL-2, например, K35 является остатком лизина в положении 35 последовательности IL-2 дикого типа. Замены обозначены в настоящем документе однобуквенным аминокислотным кодом, после которого указано положением аминокислоты в IL-2, а затем следует однобуквенный код заменяющей аминокислоты, например, K35A является заменой остатка лизина в положении 35 в SEQ ID NO: 2 остатком аланина.
[00051] Соединения в настоящем документе могут демонстрировать специфичность в отношении разных классов рецепторов IL-2, которая является такой же или отличается от специфичности IL-2 дикого типа. Соединения в настоящем документе могут демонстрировать увеличенную стабильность или биологическое действие по сравнению с IL-2 дикого типа. Например, мутация может придавать соединению увеличенную специфичность в отношении некоторых рецепторов IL-2 по сравнению с IL-2 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления соединение селективно связывается с рецептором IL2Rαβγ по сравнению с рецептором IL2Rβγ, например, через его IL-2 связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления такое селективное связывание является результатом одной или более мутаций в последовательности IL-2 по сравнению с последовательностью IL-2 дикого типа. Например, IL-2 N88R является селективным в отношении связывания с рецептором IL2Rαβγ по сравнению с рецептором IL2Rβγ. IL-2 может стимулировать пролиферацию IL2Rαβγ-экспрессирующих PHA-активированных T-клеток так же эффективно как IL-2 дикого типа, демонстрируя 3000-кратно сниженную стимуляцию пролиферации IL2Rβγ-экспрессирующих NK-клеток. Другие мутации, которые демонстрируют увеличенную селективность в отношение IL2Rαβγ, включают замены D20H, N88I, N88G, Q126L и Q126F.
in vivo
[00052] В некоторых вариантах осуществления IL-2 рецептор-связывающий фрагмент включает мутацию, которая увеличивает стабильность соединения согласно настоящему изобретению. Например, мутация IL-2 C125S способствует стабильности в результате удаления неспаренного остатка цистеина, препятствуя, таким образом, неправильному сворачиванию полипептида IL-2. Неправильное сворачивание может привести к агрегации белка и увеличивает клиренс полипептида . В некоторых вариантах осуществления полипептид IL-2 включает мутацию, которая вводит или удаляет сайт гликозилирования. Например, мутация IL-2 T3A удаляет сайт O-гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления вариант IL-2 с мутацией T3A также включает мутацию N88R и/или мутацию C125S. В некоторых вариантах осуществления вариант IL-2 включает мутации T3A, N88R и C125S, как в SEQ ID NO: 3.
[00053] В некоторых вариантах осуществления замены присутствуют в одном или более из положений 3, 20, 88, 125 и 126. В некоторых вариантах осуществления замены присутствуют в одном, двух, трех, четырех или пяти положениях. В некоторых вариантах осуществления вариант IL-2 включает мутации в положениях 88 и 125, например, N88R и C125S. В некоторых вариантах осуществления IL-2 рецептор-связывающий фрагмент включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1: APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISRINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT. В некоторых вариантах осуществления вариант IL-2 включает мутации в положениях 3, 88 и 125, например, T3A, N88R и C125S, как в SEQ ID NO: 3: APASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISRINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT. В некоторых вариантах осуществления вариант IL-2 включает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 мутаций (например, замен) по сравнению с последовательностью IL-2 дикого типа.
[00054] Соединения в настоящем документе включают варианты IL-2, включающие аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 61%, по меньшей мере на 62%, по меньшей мере на 63%, по меньшей мере на 64%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 66%, по меньшей мере на 67%, по меньшей мере на 68%, по меньшей мере на 69%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 76%, по меньшей мере на 77%, по меньшей мере на 78%, по меньшей мере на 79%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности IL-2 дикого типа (SEQ ID NO: 2). Соединения в настоящем документе включают варианты IL-2, включающие аминокислотную последовательность, которая на 60%-99% идентична аминокислотной последовательности IL-2 дикого типа, например, аминокислотную последовательность, которая на 80%-99% идентична аминокислотной последовательности IL-2 дикого типа, аминокислотную последовательность, которая на 85%-99% идентична аминокислотной последовательности IL-2 дикого типа, аминокислотную последовательность, которая на 90%-99% идентична аминокислотной последовательности IL-2 дикого типа, или аминокислотную последовательности, которая на 95%-99% идентична аминокислотной последовательности IL-2 дикого типа (SEQ ID NO: 2). Соединения в настоящем документе включают варианты IL-2, которые включают аминокислотную последовательность, имеющую мутацию N88R, которая по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 61%, по меньшей мере на 62%, по меньшей мере на 63%, по меньшей мере на 64%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 66%, по меньшей мере на 67%, по меньшей мере на 68%, по меньшей мере на 69%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 76%, по меньшей мере на 77%, по меньшей мере на 78%, по меньшей мере на 79%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности IL-2 дикого типа (SEQ ID NO: 2). Соединения в настоящем документе включают варианты IL-2, включающие аминокислотную последовательность, имеющую мутацию N88R, которая на 60%-99% идентична аминокислотной последовательности IL-2 дикого типа, например, аминокислотную последовательность, которая на 80%-99% идентична аминокислотной последовательности IL-2 дикого типа (SEQ ID NO: 2), аминокислотную последовательность, которая на 85%-99% идентична аминокислотной последовательности IL-2 дикого типа (SEQ ID NO: 2), аминокислотную последовательность, которая на 90%-99% идентична аминокислотной последовательности IL-2 дикого типа (SEQ ID NO: 2), или аминокислотную последовательность, которая на 95%-99% идентична аминокислотной последовательности IL-2 дикого типа (SEQ ID NO: 2).
[00055] Варианты осуществления также включают варианты IL-2, которые селективно стимулируют Treg-клетки и включают аминокислотную последовательность, содержащую мутации N88R и C125S, которая по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 61%, по меньшей мере на 62%, по меньшей мере на 63%, по меньшей мере на 64%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 66%, по меньшей мере на 67%, по меньшей мере на 68%, по меньшей мере на 69%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 76%, по меньшей мере на 77%, по меньшей мере на 78%, по меньшей мере на 79%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности IL-2 дикого типа (SEQ ID NO: 2). Соединения в настоящем документе включают варианты IL-2, включающие аминокислотную последовательность, содержащую мутации N88R и C125S, которая на 60%-99% идентична аминокислотной последовательности IL-2 дикого типа (SEQ ID NO: 2), например, аминокислотную последовательность, которая на 80%-99% идентична аминокислотной последовательности IL-2 дикого типа (SEQ ID NO: 2), аминокислотную последовательность, которая на 85%-99% идентична аминокислотной последовательности IL-2 дикого типа (SEQ ID NO: 2), аминокислотную последовательность, которая на 90%-99% идентична аминокислотной последовательности IL-2 дикого типа (SEQ ID NO: 2), или аминокислотную последовательность, которая на 95%-99% идентична аминокислотной последовательности IL-2 дикого типа (SEQ ID NO: 2).
[00056] Соединения также включают варианты IL-2, которые селективно стимулируют Treg-клетки и включают аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 60%, по меньшей мере 61%, по меньшей мере 62%, по меньшей мере 63%, по меньшей мере 64%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 66%, по меньшей мере 67%, по меньшей мере 68%, по меньшей мере 69%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 71%, по меньшей мере 72%, по меньшей мере 73%, по меньшей мере 74%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 76%, по меньшей мере 77%, по меньшей мере 78%, по меньшей мере 79%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 81%, по меньшей мере 82%, по меньшей мере 83%, по меньшей мере 84%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью IL-2 дикого типа (SEQ ID NO: 2). Соединения также включают варианты IL-2, которые селективно стимулируют Treg-клетки и включают аминокислотную последовательность, которая на 60%-99% идентична аминокислотной последовательности IL-2 дикого типа (SEQ ID NO: 2), например, аминокислотную последовательность, которая на 80%-99% идентична аминокислотной последовательности IL-2 дикого типа (SEQ ID NO: 2), аминокислотную последовательность, которая на 85%-99% идентична аминокислотной последовательности IL-2 дикого типа (SEQ ID NO: 2), аминокислотную последовательность, которая на 90%-99% идентична аминокислотной последовательности IL-2 дикого типа (SEQ ID NO: 2), или аминокислотную последовательность, которая на 95%-99% идентична аминокислотной последовательности IL-2 дикого типа (SEQ ID NO: 2).
[00057] Различные методы и программы могут использоваться для определения гомологии между двумя или более пептидами или нуклеиновыми кислотами, такие как NCBI BLAST, Clustal W, MAFFT, Clustal Omega, AlignMe, Praline, или другой подходящий метод или алгоритм. В некоторых вариантах осуществления идентичность процента вычислена с помощью FastDB на основе следующих параметров: штраф за несовпадение 1; штраф за пропуск 1; штраф за размер пропуска 0,33; и штраф за присоединение 30.
[00058] Примером подходящего алгоритма является PILEUP. PILEUP создает множественное выравнивание последовательностей из группы подобных последовательностей при использовании последовательных парных выравниваний. Алгоритм также может строить дерево, которое показывает кластеризационные отношения, используемые для создания выравнивания. Неограничивающий пример параметров PILEUP включает вес пропуска по умолчанию 3,00, вес длины пропуска по умолчанию 0,10 и взвешенные концевые пропуски.
[00059] Другим примером подходящего алгоритма является алгоритм BLAST. Неограничивающим примером программы BLAST является программа WU-BLAST-2. В WU-BLAST-2 используются несколько параметров поиска, большинство которых установлено, например, со значениями по умолчанию. Корректируемые параметры устанавливают, например, со следующими значениями: длина перекрывания = 1, доля перекрывания = 0.125, пороговая длина слова (T)=11. Параметры HSP S и HSP S2 являются динамическими значениями и задаются самой программой в зависимости от состава конкретной последовательности и состава конкретной базы данных, в которой проводят поиск представляющей интерес последовательности. Значения можно корректировать для повышения чувствительности.
[00060] Дополнительным подходящим алгоритмом является gapped BLAST. В gapped BLAST используется оценочная матица замен BLOSUM-62; параметр порогового значения T установлен на 9; метод двойного совпадения для подбора удлинений без пропусков, штраф за длину пропуска k со значением 10+k; Xu установлен на 16, и Xg установлен на 40 для стадии поиска по базе данных и 67 для стадии вывода результата алгоритмов. Выравнивания с пропусками инициируют при оценке, например, приблизительно 22 бита.
[00061] Дополнительным подходящим инструментом является Clustal, серия часто используемых компьютерных программ для множественного выравнивания последовательностей. Последние версии Clustal включают ClustalW, ClustalX и Clustal Omega. Параметры по умолчанию для парных выравниваний и вычисления процента идентичности белковых последовательностей при использовании метода Clustal являются следующими: KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 и DIAGONALS SAVED=5. Для нуклеиновых кислот эти параметры являются следующими: KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WINDOW=4 и DIAGONALS SAVED=4.
[00062] Мутации могут быть введены в выбранные сайты или случайным образом. Например, неспецифический мутагенез в целевом кодоне или области может давать мутанты, подлежащие скринингу на активность. Методики введения мутаций с заменами в определенные сайты в ДНК, имеющей известную последовательность, включают, например, олигонуклеотид-направленный мутагенез на основе ДНК фага M13 и ПЦР-мутагенез. Скрининг мутантов может быть выполнен, например, при использовании анализов, описанных в настоящем документе.
[00063] Аминокислотные замены могут затрагивать один или множество остатков. Вставки могут составлять, например, от приблизительно 1 до приблизительно 20 аминокислотных остатков или больше. Делеции могут составлять, например, от приблизительно 1 до приблизительно 20 аминокислотных остатков или больше. Замены, делеции, вставки или их любая комбинация могут присутствовать в тестируемом соединении.
Фрагменты, которые связывают ST2
[00064] ST2 (интерлейкин 1 рецептор-подобный белок 1) является мембраносвязанным цитокиновым рецептором и представителем семейства рецепторов IL-1. Человеческий ST2 состоит из внеклеточного домена (ECD) длиной 310 аминокислот (ак) с тремя Ig-подобными доменами, 21 ак трансмембранным сегментом и 207 ак эндоплазматическими доменами с внутриклеточным доменом TIR (Tominaga, S. et al., 1992, Biochim. Biophys. Acta 1171:215; и Li, H. et al., 2000, Genomics 67:284). ST2 связывает IL-33 и гетеродимеризуется с акцессорным белком рецептора IL-1 (1RAcP). В некоторых вариантах осуществления соединение согласно настоящему изобретению включает связывающий фрагмент, который связывает ST2. Фрагмент, который связывает ST2, может быть полипептидом, включающим полноразмерный IL-33 дикого типа, более коротким или более длинным. ST2-связывающий фрагмент может иметь последовательность IL-33 дикого типа, как показано в SEQ ID NO: 10 (SITGISPITEYLASLSTYNDQSITFALEDESYEIYVEDLKKDEKKDKVLLSYYESQHPSNESGDG VDGKMLMVTLSPTKDFWLHANNKEHSVELHKCEKPLPDQAFFVLHNMHSNCVSFECKTDPG VFIGVKDNHLALIKVDSSENLCTENILFKLSET) или он может быть вариантом IL-33. Варианты IL-33 могут содержать одну или более замен, делеций или вставок, которые отличаются от аминокислотной последовательности IL-33 дикого типа. Остатки обозначены в настоящем документе при использовании однобуквенного аминокислотного кода, после которого указано аминокислотное положение IL-33. Замены обозначены в настоящем документе при использовании однобуквенного аминокислотного кода, после которого указано аминокислотное положение IL-33, а затем указан однобуквенный код заменяющей аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления последовательность IL-33 является последовательностью IL-33 человека, например, из остатков 112-170 последовательности дикого типа.
[00065] Соединения в настоящем документе могут обладать увеличенной или уменьшенной аффинностью к ST2 или к комплексу рецептора ST2-1RAcP. Некоторые соединения могут обладать увеличенной аффинностью к ST2. Другие соединения могут обладать уменьшенной аффинностью к 1RAcP, что может приводить к снижению способности активировать рецептор IL-33. Соединения в настоящем документе могут демонстрировать повышенную стабильность или биологический эффект по сравнению с IL-33 дикого типа.
[00066] Могут быть получены варианты IL-33 с измененной аффинностью к субъединицам рецептора IL-33 ST2 или IL1RAcP. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность IL-33 может быть подвергнута мутации в одном или больше следующих положениях по сравнению с последовательностью IL-33 дикого типа: E119, Y122, D131, E144, Y146, D149, Y163, H246, N222 и N226. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены в одном или более из этих положений могут модулировать аффинность IL-33 к ST2. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность IL-33 может быть подвергнута мутации с целью изменения контактов с IL1RAcP: H168, N171, E200, H201, H224, D244, K251 и E261 (все положения в сравнении с последовательностью IL-33 дикого типа). В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены в одном или более из этих положений могут модулировать аффинность IL-33 к IL1RAcP и, таким образом, модулировать способность активировать рецептор.
[00067] В некоторых вариантах осуществления ST2-связывающий фрагмент включает вариант IL-33, включающий, например, аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 61%, по меньшей мере на 62%, по меньшей мере на 63%, по меньшей мере на 64%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 66%, по меньшей мере на 67%, по меньшей мере на 68%, по меньшей мере на 69%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 76%, по меньшей мере на 77%, по меньшей мере на 78%, по меньшей мере на 79%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности IL-33 дикого типа (SEQ ID NO: 10). Соединения в настоящем документе включают варианты IL-33, включающие аминокислотную последовательность, которая на 60%-99% идентична аминокислотной последовательности IL-33 дикого типа (SEQ ID NO: 10), например, аминокислотную последовательность, которая на 80%-99% идентична аминокислотной последовательности IL-33 дикого типа (SEQ ID NO: 10), аминокислотную последовательность, которая на 85%-99% идентична аминокислотной последовательности IL-33 дикого типа (SEQ ID NO: 10), аминокислотную последовательность, которая на 90%-99% идентична аминокислотной последовательности IL-33 дикого типа (SEQ ID NO: 10), или аминокислотную последовательность, которая на 95%-99% идентична аминокислотной последовательности IL-33 дикого типа (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах осуществления ST2-связывающий фрагмент на 100% идентичен аминокислотной последовательности IL-33 дикого типа (SEQ ID NO: 10).
[00068] ST2-связывающие лиганды могут включать антитела и антигенсвязывающие фрагменты антител с аффинностью связывания к ST2. При использовании в настоящем документе "антитело" представляет собой белок, который включает по меньшей мере одну определяющую комплементарность область, которая связывается с определенным антигеном-мишенью, например, ST2. Антитело часто содержит по меньшей мере одну вариабельную область иммуноглобулина, например, аминокислотную последовательность, которая обеспечивает вариабельный домен иммуноглобулина, или последовательность вариабельного домена иммуноглобулина. Например, антитело может включать вариабельную область тяжелой (H) цепи (сокращенно именуемую в настоящем документе как VH), и вариабельную область легкой (L) цепи (сокращенно именуемую в настоящем документе как VL). В другом примере антитело включает две вариабельных области тяжелой (H) цепи и две вариабельных области легкой (L) цепи. Легкие цепи иммуноглобулина могут относиться к типам каппа или лямбда. Например, антитело может быть моноклональным антителом, модифицированным антителом, химерным антителом, реконструированным антителом или гуманизированным антителом. Термин "моноклональное антитело" при использовании в настоящем документе относится к популяции молекул антитела, которые содержат только один вид антигенсвязывающего участка, способного к иммунореакции с конкретным эпитопом. Антитела могут быть получены из коммерческих источников или получены при использовании известных методов. Антитело может быть любым типом иммуноглобулина, например, IgG, IgM, IgY, IgA1, IgA2, IgD или IgE. В варианте осуществления антитело может быть человеческим антителом.
[00069] Антигенсвязывающие фрагменты антитела, подходящие для применения в изобретении, включают, без ограничения перечисленными, Fab-фрагмент, F(ab')2-фрагмент, Fd-фрагмент, Fv-фрагмент, dAb-фрагмент, одноцепочечный Fv, димеризованный фрагмент вариабельной области (V-области) (диатело), стабилизированный дисульфидной связью фрагмент V-области (dsFv), аффитела, миметики антител и одну или более выделенных определяющих комплементарность областей (CDR), которые сохраняют специфичное связывание с полезной нагрузкой, например, ST2. При использовании в настоящем документе "выделенная" CDR представляет собой CDR, не находящуюся в природном антителе.
[00070] Поликлональные антитела могут быть получены путем иммунизации подходящего субъекта белком согласно изобретению в качестве иммуногена. Титр антител у иммунизированного субъекта можно отслеживать в динамике с помощью стандартных методов, таких как твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) с использованием иммобилизованного полипептида. В подходящее время после иммунизации, например, когда титры специфического антитела являются наиболее высокими, антитело-продуцирующие клетки могут быть получены у индивида и могут использоваться для получения моноклональных антител (мАт) стандартными методами, такими как метод гибридом, первоначально описанный Колером и Милстейном (Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497), метод гибридом человеческих В-клеток (см. Kozbor et al., 1983, Immunol. Today 4:72), метод EBV-гибридом (см. Cole et al., pp. 77-96 In Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 1985) или методы триом. Технология получения гибридом известна (см. в общем Current Protocols in Immunology, Coligan et al. ed., John Wiley & Sons, New York, 1994). Клетки гибридом, продуцирующие моноклональное антитело согласно изобретению, обнаруживают при скрининге супернатантов культур гибридом на антитела, которые связывают целевой полипептид (т.е. ST2), например, при использовании стандартного анализа ИФА.
[00071] Альтернативно получению гибридом, секретирующих моноклональные антитела, моноклональное антитело, направленное против ST2, может быть идентифицировано и выделено путем скрининга рекомбинантной комбинаторной библиотеки иммуноглобулинов (например, библиотеки фагового дисплея антител) с представляющим интерес полипептидом. В продаже доступны наборы для создания и скрининга библиотек фагового дисплея (например, система получения антител Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, номер по каталогу 27-9400-01; и набор для фагового дисплея Stratagene SurfZAP Phage Display Kit, номер по каталогу 240612). Кроме того, примеры способов и реагентов, особенно подходящих для применения при создании и скрининге библиотеки дисплея антител, можно найти, например, в патенте США 5,223,409; публикации PCT WO 92/18619; публикации PCT WO 91/17271; публикации PCT WO 92/20791; публикации PCT WO 92/15679; публикации PCT WO 93/01288; публикации PCT WO 92/01047; публикации PCT WO 92/09690; публикации PCT WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734.
[00072] Также могут быть получены рекомбинантные антитела, которые специфично связывают ST2. Рекомбинантные антитела включают, без ограничения перечисленными, химерные и гуманизированные моноклональные антитела, включающие как человеческие, так и нечеловеческие фрагменты, одноцепочечные антитела и мультиспецифичные антитела. Химерное антитело представляет собой молекулу, в которой разные части получены из разных видов животных, таких как антитела, имеющие вариабельную область, полученную из мышиного мАт, и константную область человеческого иммуноглобулина (см., например, Cabilly et al., патент США 4,816,567; и Boss et al., патент США 4,816,397, которые полностью включены в настоящий документ посредством отсылки.) Одноцепочечные антитела имеют сайт связывания антигена и состоят из одного полипептида. Они могут быть получены с помощью способов, известных в уровне техники, например, при использовании способов, описанных в Ladner et al., патент США 4,946,778 (который полностью включен в настоящий документ посредством отсылки); Bird et al., (1988) Science 242:423-426; Whitlow et al., (1991) Methods in Enzymology 2:1-9; Whitlow et al., (1991) Methods in Enzymology 2:97-105; и Huston et al. (1991) Methods in Enzymology Molecular Design and Modeling: Concepts and Applications 203:46-88.
[00073] Гуманизированные антитела представляют собой молекулы антител из не относящихся к человеку видов, содержащие одну или более определяющих комплементарность областей (CDR-облатей) из не относящихся к человеку видов и каркасную область из молекулы человеческого иммуноглобулина (см., например, Queen, патент США 5,585,089, который полностью включен в настоящий документ посредством отсылки). Гуманизированные моноклональные антитела могут быть получены с помощью технологий рекомбинантных ДНК, известных в уровне техники, например, при использовании способов, описанных в публикации PCT WO 87/02671; европейской заявке на патент 184,187; европейской заявке на патент 171,496; европейской заявке на патент 173,494; публикации PCT WO 86/01533; патенте США 4,816,567; европейской заявке на патент 125,023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; и Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) Bio/Techniques 4:214; патенте США 5,225,539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; и Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060.
[00074] В частности, гуманизированные антитела могут быть получены, например, при использовании трансгенных мышей, которые неспособны экспрессировать эндогенные гены тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, но которые могут экспрессировать гены тяжелых и легких цепей человека. Трансгенных мышей иммунизируют выбранным антигеном, например ST2, стандартным способом. Моноклональные антитела, направленные против антигена, могут быть получены при использовании стандартной технологии гибридом. Трансгены иммуноглобулинов человека, которые несут трансгенные мыши, перестраиваются при дифференцировке B-клеток и впоследствии подвергаются переключению классов и соматической мутации. Таким образом, при использовании такой методики можно получать антитела IgG, IgA и IgE. По поводу обзора этой технологии получения человеческих антител см. Lonberg and Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93). Для ознакомления с подробным описанием этой технологии получения человеческих антител и человеческих моноклональных антител, а также методиками получения таких антител см., например, патент США 5,625,126; патент США 5,633,425; патент США 5,569,825; патент США 5,661,016; и патент США 5,545,806. Кроме того, компании могут быть привлечены для получения человеческих антител, направленных против выбранного антигена (например, ST2), при использовании технологии, аналогичной описанной выше.
[00075] Полностью человеческие антитела, которые распознают ST2, могут быть получены при использовании методики, называемой "управляемым отбором". В этом методе отобранное нечеловеческое моноклональное антитело, например мышиное антитело, используют для направления отбора полностью человеческого антитела, распознающего такой же эпитоп (Jespers et al., 1994, Bio/technology 12:899-903).
[00076] Антитела к ST2 могут быть выделены после продукции (например, из крови или сыворотки субъекта) или синтеза и затем очищены известными способами. Например, IgG антитела могут быть очищены с помощью хроматографии с белком A. Антитела, специфичные к ST2, могут быть отобраны (например, частично очищены) или очищены, например, с помощью афинной хроматографии. Например, рекомбинантно экспрессированный и очищенный (или частично очищенный) белок ST2 получают и ковалентно или нековалентно связывают с твердым носителем, таким как, например, хроматографическая колонка. Затем колонка может использоваться для аффинной очистки антител, специфичных к ST2, из образца, содержащего антитела, направленные против большого количества разных эпитопов, с получением в результате по существу очищенной композиции антитела, т.е. такой, которая по существу не содержит контаминирующих антител.
[00077] Антитела, которые связывают ST2, известны в уровне техники. Например, в US 2017/0002079 описан ряд ST2-связывающих антител (например, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4 и Ab12-Ab36), направленных против человеческого ST2, которые были получены с применением технологии XENOMOUSE (патенты США 6,114,598; 6,162,963; 6,833,268; 7,049,426; 7,064,244, которые полностью включены в настоящий документ посредством отсылки; Green et al., 1994, Nature Genetics 7:13-21; Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15:146-156; Green and Jakobovitis, 1998, J. Ex. Med. 188:483-495, Kellermann and Green, 2002, Current Opinion in Biotechnology, 13:593-597). См., в частности Пример 2 в US 2017/0002079, который полностью включен в настоящий документ посредством отсылки. Антитела против ST2, направленные против человеческого ST2, также описаны в WO 2012/113813 (например, моноклональное антитело ral70) и патент США 7087396 (например, моноклональные антитела 2A5, FB9 и HB12), каждый из которых полностью включен в настоящий документ посредством отсылки. Например, в Примере 1 патента США 7087396 описано получение моноклональных антител, направленных против человеческого ST2. Также ST2-связывающие антитела доступны в продаже (например, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, номера по кат. MAB523 и AF523). MAB523 является моноклональным мышиным IgG1 антителом, которое детектирует человеческий ST2. AF523 является аффинно очищенным на антигене поликлональным IgG1 козы, который детектирует человеческий ST2.
Связь между IL-2R-связывающим фрагментом и ST2-связывающим фрагментом
[00078] IL-2R и ST2-связывающие фрагменты связаны. Первый фрагмент, который связывается с рецептором IL-2, и второй фрагмент, который связывается с ST2, связаны ковалентно или нековалентно. В некоторых вариантах осуществления первый фрагмент, который связывается с рецептором IL-2, и второй фрагмент, который связывается с ST2, связаны ковалентно. Например, первый фрагмент, который связывается с рецептором IL-2, и второй фрагмент, который связывается с ST2, могут быть ковалентно связаны сульфидной связью или дисульфидной связью. В некоторых вариантах осуществления соединение, включающее первый фрагмент, который связывается с рецептором IL-2, и второй фрагмент, который связывается с ST2, включает мультимеризационный фрагмент или два мультимеризационных фрагмента, например, Fc-домены. Например, первый мультимеризационный фрагмент может быть ковалентно связан с первым фрагментом, который связывается с рецептором IL-2, и второй мультимеризационный фрагмент может быть ковалентно связан со вторым фрагментом, который связывается с ST2. Два мультимеризационных фрагмента также могут быть ковалентно связаны друг с другом. В некоторых вариантах осуществления два мультимеризационных фрагмента являются полипептидными последовательностями. Например, в некоторых вариантах осуществления дисульфидная связь ковалентно связывает первый Fc-домен, который ковалентно связан с IL-2R-связывающим фрагментом, и второй Fc-домен, который ковалентно связан с ST2-связывающим фрагментом.
Fc-домены иммуноглобулинов
[00079] В некоторых вариантах осуществления мультимеризационный фрагмент является Fc-доменом иммуноглобулина, например, Fc-доменом иммуноглобулина с ослабленной эффекторной функцией по сравнению с соответствующим Fc-доменом иммуноглобулина дикого типа. Неограничивающими примерами Fc-доменов иммуноглобулинов являются Fc-домены иммуноглобулина IgG, IgA, IgD, IgM и IgE. В некоторых вариантах осуществления Fc-доменом иммуноглобулина является Fc-домен IgG1 иммуноглобулина.
[00080] Fc-домены иммуноглобулинов обладают многими терапевтическими преимуществами при включении в слитые белки. Например, Fc-домены иммуноглобулина могут увеличивать полупериод существования белка-партнера по слиянию в системном кровотоке. В некоторых вариантах осуществления увеличенный полупериод существования в системном кровотоке обусловлен присутствием Fc-домена, препятствующего агрегации слитого белка, в результате чего повышается его стабильность и замедляется клиренс.
[00081] Четыре субкласса IgG человека различаются по эффекторным функциям (CDC, ADCC), полупериоду существования и стабильности. IgG1 обладает Fc-эффекторными функциями и является наиболее распространенным субклассом IgG. IgG2 дефицитный по Fc-эффекторным функциям, но подвержен как димеризации с другими молекулами IgG2, так и нестабильности из-за образования перекрестных дисульфидных связей в шарнирной области. IgG3 обладает Fc-эффекторными функциями и имеет длинную жесткую шарнирную область. IgG4 дефицитный по Fc-эффекторным функциям и имеет более короткий полупериод существования в кровотоке, чем другие субклассы. Димер IgG4 является биохимически нестабильным из-за присутствия только одной дисульфидной связи в шарнирной области, что приводит к обмену H-цепей между разными молекулами IgG4. Модификации последовательности Fc могут быть введены в шарнирную область Fc IgG2 для предотвращения агрегации или в шарнирную область Fc IgG4 для стабилизации димеров.
[00082] Могут быть получены дефицитные по эффекторной функции варианты IgG1. Например, аминокислотная замена может быть сделана в положении N297, положении сайта N-гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления заменой является N297A. Замена этого остатка аспарагина удаляет сайт гликозилирования и значительно уменьшает активность антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) и комплементзависимой цитотоксичности (CDC), предотвращая, таким образом, нежелательный лизис клеток.
[00083] Другие возможные дефицитные по эффекторной функции варианты IgG1 могут быть также оценены специалистом. Одним неограничивающим примером такого варианта является IgG1(L234F/L235E/P331S), который содержит мутации аминокислот в участках связывания C1q и FcyR. Такие (или подобные) варианты Fc могут использоваться для создания эффекторно-дефицитных и стабильных IL-2 селективных агонистических Fc-слитых белков (IL2SA-Fc). Формы белковых фрагментов Fc также могут быть сконструированы с целью создания стабильных мономеров, а не димеров. Такие модифицированные белковые фрагменты Fc также могут быть объединены с IL-2 соединением согласно настоящему изобретению. Кроме того, функционально мономерный гетеродимер, включающий полипептид IL-2-Fc H-цепи, может быть объединен с полипептидом Fc H-цепи и подвергнут сборке при использовании технологии биспецифичных антител с селективным агонистом IL-2. IL-2 Fc слитые белки также могут быть получены с интактными молекулами IgG антитела, с или без антигенной специфичности во фрагменте IgG. Кроме того, варианты Fc, которые не содержат часть шарнирной области, могут использоваться с соединениями и способами, описанными в настоящем документе.
A
[00084] В некоторых вариантах осуществления последовательность фрагмента Fc иммуноглобулина является фрагментом Fc IgG1, включающим мутацию N297A, например, последовательностью, показанной ниже: DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 7; мутация N297A выделена полужирным шрифтом и подчеркнута).
[00085] В некоторых вариантах осуществления фрагмент Fc IgG1 обладает по меньшей мере 60%, по меньшей мере 61%, по меньшей мере 62%, по меньшей мере 63%, по меньшей мере 64%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 66%, по меньшей мере 67%, по меньшей мере 68%, по меньшей мере 69%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 71%, по меньшей мере 72%, по меньшей мере 73%, по меньшей мере 74%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 76%, по меньшей мере 77%, по меньшей мере 78%, по меньшей мере 79%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 81%, по меньшей мере 82%, по меньшей мере 83%, по меньшей мере 84%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7.
[00086] Соединение согласно настоящему изобретению может быть получено при условиях, которые позволяют двум полипептидам Ig формировать Fc-домен. Два полипептида Ig могут быть конъюгированы с разными фрагментами. В некоторых случаях один полипептид IgG конъюгирован с фрагментом IL-2, а второй полипептид Ig связан с фрагментом, который связывает белок клеточной поверхности, отличный от рецептора IL2. В некоторых вариантах осуществления белком клеточной поверхности, связываемым связывающим фрагментом, является ST2.
Линкер
n
[00087] Связь в точке соединения между Fc-доменом и IL2 рецептор-связывающим фрагментом или ST2-связывающим фрагментом может быть: (1) прямым слиянием двух белковых последовательностей; (2) слиянием с промежуточным линкерным пептидом; или (3) слиянием с непептидным фрагментом. В некоторых вариантах осуществления линкер непосредственно связывает IL2R-связывающий фрагмент и ST2-связывающий фрагмент. Линкерные пептиды могут быть включены в качестве спейсеров между двумя белковыми фрагментами. Линкерные пептиды могут способствовать правильному фолдингу белка, стабильности, экспресии и биоактивности фрагментов, являющихся компонентами белка. Длинные гибкие линкерные пептиды могут состоять из глицина, серина или треонина, при этом множество остатков глицина обеспечивают получение очень гибкой конформации. Остатки серина или треонина обеспечивают область полярной поверхности, ограничивающей гидрофобное взаимодействие в молекуле пептида или с фрагментами, которые являются компонентами слитого белка. В некоторых вариантах осуществления пептидные линкеры богаты глицином и серином, например, повторы последовательности GGGGS (SEQ ID NO: 31). В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер имеет последовательность (GGGGS) (SEQ ID NO: 31), где n равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В некоторых вариантах осуществления n равно 3; т.е. пептидный линкер имеет последовательность GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 6). В некоторых вариантах осуществления IL-2 рецептор-связывающий фрагмент является N-концевым по отношению к линкерному пептиду, а Fc-домен иммуноглобулина является C-концевым по отношению к линкерному пептиду. В некоторых вариантах осуществления IL-2 рецептор-связывающий фрагмент является C-концевым по отношению к линкерному пептиду, а Fc-домен иммуноглобулина является N-концевым по отношению к линкерному пептиду.
[00088] В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер обладает по меньшей мере 60%, по меньшей мере 61%, по меньшей мере 62%, по меньшей мере 63%, по меньшей мере 64%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 66%, по меньшей мере 67%, по меньшей мере 68%, по меньшей мере 69%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 71%, по меньшей мере 72%, по меньшей мере 73%, по меньшей мере 74%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 76%, по меньшей мере 77%, по меньшей мере 78%, по меньшей мере 79%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 81%, по меньшей мере 82%, по меньшей мере 83%, по меньшей мере 84%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6.
Фармацевтические композиции
[00089] Фармацевтическая композиция изобретения может включать любое соединение, описанное в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает соединение настоящего изобретения с другими химическими компонентами, такими как носители, стабилизаторы, разбавители, диспергирующие вещества, суспендирующие вещества, загустители и/или вспомогательные вещества. Фармацевтическая композиция облегчает введение соединения настоящего изобретения в организм. Фармацевтические композиции можно вводить в терапевтически эффективных количествах как фармацевтические композиции различными формами и путями, включая, например, внутривенное, подкожное, внутримышечное, пероральное, парентеральное, глазное, подкожное, трансдермальное, назальное, вагинальное и местное введение.
[00090] Фармацевтическую композицию можно вводить локально, например, путем инъекции соединения непосредственно в орган, необязательно в форме депо или композиции с замедленным высвобождением, или имплантата. Фармацевтические композиции могут быть предоставлены в форме композиции с быстрым высвобождением, в форме композиции с пролонгированным высвобождением или в форме композиции с промежуточным высвобождением. Форма с быстрым высвобождением может обеспечить немедленное высвобождение. Композиция с пролонгированным высвобождением может обеспечивать контролируемое высвобождение или замедленное отсроченное высвобождение.
[00091] Для перорального введения фармацевтические композиции могут быть изготовлены путем объединения соединения согласно настоящему изобретению с фармацевтически приемлемыми носителями или вспомогательными веществами. Такие носители могут использоваться для приготовления жидкостей, гелей, сиропов, настоек или суспензий для приема внутрь субъектом. Неограничивающие примеры растворителей, используемых в растворимой композиции для перорального применения, могут включать воду, этанол, изопропанол, раствор хлорида натрия, физиологический раствор, ДМСО, диметилформамид, калий-фосфатный буфер, фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), натрий-фосфатный буфер, буферный раствор 4-2-гидроксиэтил-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES), буферный раствор 3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты (MOPS), буферный раствор пиперазин-N,N'-бис(2-этансульфоновой кислоты) (PIPES) и буферный раствор хлорида и цитрата натрия (SSC). Неограничивающие примеры сорастворителей, используемых в растворимой композиции для перорального применения, могут включать сахарозу, мочевину, кремафор, ДМСО и калий-фосфатный буфер.
[00092] Фармацевтические препараты могут быть изготовлены для внутривенного введения. Фармацевтические композиции могут находиться в форме, подходящей для парентерального введения в виде стерильной суспензии, раствора или эмульсии в масляных или водных растворителях, и могут содержать вспомогательные вещества, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие вещества. Фармацевтические препараты для парентерального введения включают водные растворы соединения согласно настоящему изобретению в водорастворимой форме. Суспензии соединения настоящего изобретения могут быть приготовлены в виде масляных суспензий для инъекций. Подходящие липофильные растворители или среды включают жирные масла, такие как кунжутное масло, или синтетические сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат или триглицериды, или липосомы. Суспензия также может содержать подходящие стабилизаторы или вещества, которые повышают растворимость соединений, что позволяет получать высококонцентрированные растворы. В альтернативе действующее вещество может находиться в форме порошка для восстановления подходящим растворителем, например стерильной апирогенной водой, перед применением.
[00093] Соединение согласно настоящему изобретению может применяться наружно и может быть включено в различные композиции для наружного применения, такие как растворы, суспензии, лосьоны, гели, пасты, лекарственные стики, бальзамы, кремы и мази. Такие фармацевтические композиции могут содержать солюбилизаторы, стабилизаторы, вещества, повышающие тоничность, буферы и консерванты.
[00094] Соединение согласно настоящему изобретению может быть также включено в композиции для ректального введения, такие как клизмы, ректальные гели, ректальная пена, ректальные аэрозоли, суппозитории, гелевые суппозитории или удерживаемые клизмы, содержащие обычные суппозиторные основы, такие как масло какао или другие глицериды, а также синтетические полимеры, такие как поливинилпирролидон и ПЭГ. В суппозиторных формах композиций низкоплавкий воск, такой как смесь глицеридов жирных кислот, необязательно в комбинации с маслом какао, может быть расплавлен.
[00095] При практическом осуществлении способов лечения или применения, предложенных в настоящем документе, терапевтически эффективные количества соединений, описанных в настоящем документе, вводят в фармацевтических композициях индивиду, имеющему заболевание или состояние, подлежащее лечению. В некоторых вариантах осуществления субъектом является млекопитающее, такое как человек. Терапевтически эффективное количество может изменяться в широких пределах, в зависимости от тяжести заболевания, возраста и относительного состояния здоровья субъекта, эффективности используемых соединений и других факторов. Соединения могут применяться отдельно или в комбинации с одним или более терапевтическими средствами в качестве компонентов смесей.
[00096] Фармацевтические композиции могут быть изготовлены при использовании одного или более физиологически приемлемых носителей, включающих вспомогательные вещества и добавки, которые облегчают технологическую обработку соединения согласно настоящему изобретению с получением препаратов, которые могут применяться фармацевтически. Состав композиции может быть изменен в зависимости от выбранного пути введения. Фармацевтические композиции, содержащие соединение, описанное в настоящем документе, могут быть изготовлены, например, при использовании процессов смешивания, растворения, эмульгирования, инкапсулирования, заключения или прессования.
[00097] Фармацевтические композиции могут включать по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество и соединения, описанные в настоящем документе в форме свободного основания или фармацевтически приемлемой соли. Фармацевтические композиции могут содержать солюбилизаторы, стабилизаторы, повышающие тоничность вещества, буферы и консерванты.
[00098] Способы получения композиций, включающих соединения, описанные в настоящем документе, включают смешивание соединений с одним или более инертными фармацевтически приемлемыми наполнителями или носителями с получением твердой, полутвердой или жидкой композиции. Твердые композиции включают, например, порошки, таблетки, диспергируемые гранулы, капсулы и облатки. Жидкие композиции включают, например, растворы, в которых растворено соединение, эмульсии, содержащие соединение, или раствор, содержащий липосомы, мицеллы или наночастицы, содержащие соединение, раскрытое в настоящем документе. Полутвердые композиции включают, например, гели, суспензии и кремы. Композиции могут быть в виде жидких растворов или суспензий, твердых форм, подходящих для растворения или суспендирования в жидкости перед применением, или в виде эмульсий. Такие композиции также могут содержать небольшие количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие вещества, рН-буферные вещества и другие фармацевтически приемлемые добавки.
[00099] Неограничивающие примеры лекарственных форм, подходящих для применения в изобретении, включают жидкость, порошок, гель, наносуспензию, наночастицы, микрогель, водные или масляные суспензии, эмульсию и их любую комбинацию.
[000100] Неограничивающие примеры фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ, подходящих для применения в изобретении, включают связующие вещества, разрыхлители, антиадгезивы, антистатические вещества, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, вещества для получения покрытия, красители, пластификаторы, консерванты, суспендирующие вещества, эмульгирующие вещества, противомикробные вещества, сферонизирующие вещества и их любые комбинации.
[000101] Композиция согласно изобретению может быть, например, формой с немедленным высвобождением или лекарственной формой с контролируемым высвобождением. Лекарственная форма с немедленным высвобождением может иметь такой состав, который позволяет соединениям действовать быстро. Неограничивающие примеры лекарственных форм с немедленным высвобождением включают легкорастворимые лекарственные формы. Лекарственная форма с контролируемым высвобождением может быть фармацевтической композицией, которая была адаптирована таким образом, что скорости высвобождения и профили высвобождения действующего вещества могут соответствовать физиологическим и хронотерапевтическим требованиям или, в альтернативе, была изготовлена с таким составом, который обеспечивает высвобождение действующего вещества с заданной скоростью. Неограничивающие примеры лекарственных форм с контролируемым высвобождением включают гранулы, гранулы с отсроченным высвобождением, гидрогели (например, синтетического или природного происхождения), другие желирующие вещества (например, гелеобразующие пищевые волокна), лекарственные формы на основе матрицы (например, лекарственные формы, содержащие полимерный материал, через который диспергировано по меньшей мере одно действующее вещество), гранулы в матрице, полимерные смеси и гранулированные массы.
[000102] В некоторых случаях лекарственная форма с контролируемым высвобождением является лекарственной формой с отсроченным высвобождением. Форма с отсроченным высвобождением может иметь состав для задержки действия соединения на длительный период времени. Форма с отсроченным высвобождением может иметь состав для задержки высвобождения эффективной дозы одного или более соединений, например, на приблизительно 4, приблизительно 8, приблизительно 12, приблизительно 16 или приблизительно 24 часа.
[000103] Лекарственная форма с контролируемым высвобождением может быть формой с замедленным высвобождением. Форма с замедленным высвобождением может иметь состав для замедления, например, действия соединения в течение длительного периода времени. Форма с замедленным высвобождением может иметь состав для обеспечения эффективной дозы любого соединения, описанного в настоящем документе (например, для обеспечения физиологически эффективного профиля в крови), в течение приблизительно 4, 8, 12, 16 или 24 часов.
[000104] Неограничивающие примеры фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ можно найти, например, в справочниках Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; и Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 1999), каждый из которых полностью включен посредством отсылки.
[000105] Множество лекарственных средств могут вводить в любом порядке или одновременно. В некоторых вариантах осуществления соединение согласно изобретению вводят в комбинации с антибиотиком, до или после антибиотика. При одновременном введении несколько лекарственных средств могут быть предоставлены в единой стандартной форме или во множестве форм, например, в виде множества отдельных таблеток. Средства могут быть упакованы вместе или по отдельности, в одной упаковке или во множестве упаковок. Одно или все лекарственные средства могут вводить во множестве доз. При раздельном введении интервал времени между несколькими дозами может изменяться вплоть до примерно месяца.
[000106] Лекарственные средства, описанные в настоящем документе, могут вводить до, во время или после возникновения заболевания или состояния, при этом время введения композиции, содержащей лекарственное средство, может изменяться. Например, композиции могут применять в качестве профилактического средства и могут вводить непрерывно субъектам со склонностью к развитию состояний или заболеваний для уменьшения вероятности возникновения заболевания или состояния. Композиции могут вводить индивиду во время или как можно скорее после появления симптомов. Введение лекарственных средств могут начинать в течение первых 48 часов после появления симптомов, в течение первых 24 часов после появления симптомов, в течение первых 6 часов после появления симптомов или в течение 3 часов после появления симптомов. Первичное введение могут осуществлять любым практическим путем, таким как любой путь, описанный в настоящем документе, с использованием любой лекарственной формы, описанной в настоящем документе. Лекарственное средство могут вводить настолько быстро, насколько это практически осуществимо, после обнаружения или подозрения наличия заболевания или состояния, и в течение периода времени, необходимого для лечения заболевания, такого как, например, от приблизительно 1 месяца до приблизительно 3 месяцев. Продолжительность лечения может изменяться для каждого субъекта.
[000107] Фармацевтические композиции, описанные в настоящем документе, могут быть в единичных дозированных лекарственных формах, подходящих для однократного введения точных доз. В стандартной лекарственной форме композиция разделена на стандартные дозы, содержащие подходящие количества одного или более соединений. Стандартная доза может быть в форме упаковки, содержащей отдельные количества композиции. Неограничивающими примерами являются упакованные препараты для инъекций, флаконы или ампулы. Водные суспензионные композиции могут быть упакованы в однодозовые контейнеры, не допускающие повторного закрывания. Многодозовые контейнеры с возможностью повторного закрывания могут использоваться, например, в комбинации с консервантом или без него. Композиции для инъекций могут быть представлены в стандартной лекарственной форме, например, в ампулах или в многодозовых контейнерах с консервантом.
[000108] Фармацевтические композиции, предложенные в настоящем документе, могут применять вместе с другими терапиями, например, химиотерапией, радиацией, хирургией, противовоспалительными средствами и отдельными витаминами. Другие средства могут вводить до, после или параллельно с фармацевтическими композициями.
[000109] В зависимости от предполагаемого способа введения фармацевтические композиции могут быть в форме твердых, полу твердых или жидких лекарственных форм, таких как, например, таблетки, суппозитории, пилюли, капсулы, порошки, жидкости, суспензии, лосьоны, кремы или гели, например, в единичной лекарственной форме, подходящей для однократного введения точной дозы.
[000110] Для твердых композиций нетоксичные твердые носители включают, например, фармацевтические сорта манита, лактозы, крахмала, стеарата магния, сахарина натрия, талька, целлюлозы, глюкозы, сахарозы и карбоната магния.
[000111] Неограничивающие примеры лекарственных форм, подходящих для применения в настоящем описании, включает жидкость, настойку, наносуспензию, водные или масляные суспензии, капли, сиропы и их любую комбинацию. Неограничивающие примеры фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ, подходящих для применения в настоящем описании, включает гранулирующие вещества, связующие вещества, смазывающие вещества, разрыхляющие вещества, подсластители, скользящие вещества, антиадгезивы, антистатические вещества, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, камеди, вещества для получения покрытия, красители, ароматизаторы, пластификаторы, консерванты, суспендирующие вещества, эмульгирующие вещества, растительный целлюлозный материал и сферонизирующие вещества, и их любую комбинацию.
[000112] Композиции согласно изобретению могут быть упакованы в виде набора. В некоторых вариантах осуществления набор включает письменные инструкции по введению/применению композиции. Письменный материал может быть, например, этикеткой. В письменном материале могут быть предложены условия и методы введения. Инструкции предоставляют индивиду и наблюдающему врачу наилучшие рекомендации по достижению оптимального клинического результата от применения терапии. Письменный материал может быть этикеткой. В некоторых вариантах осуществления этикетка может быть одобрена регулирующим органом, например, Управлением по контролю качества продуктов и лекарственных средств США (FDA), Европейским агентством по лекарственным средствам (EMA) или другими регулирующими органами.
Заболевания
[000113] Соединения согласно настоящему изобретению могут применяться при различных аутоиммунных или иммуно-ассоциированных заболеваниях или состояниях, например для лечения таких заболеваний или состояний. Например, в настоящем описании предложен способ лечения состояния, включающий введение индивиду терапевтически эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления соединение, вводимое индивиду, включает первый фрагмент, который связывает IL-2R, и второй фрагмент, который связывает ST2, где первый фрагмент ковалентно связан через линкер с первым Fc-доменом, а второй фрагмент ковалентно связан через линкер со вторым Fc-доменом, и при этом первый и второй Fc-домены ковалентно связаны, и, кроме того, где первый и второй Fc-домены обладают ослабленными эффекторными функциями.
[000114] Аутоиммунные заболевания включают заболевания, которые поражают органы, такие как сердце, почку, печень, легкое, репродуктивные органы, пищеварительную систему или кожу. Аутоиммунные заболевания включают заболевания, которые поражают железы, включая эндокринные железы, надпочечники, щитовидную железу, слюнные и экзокринные железы, и поджелудочную железу. Аутоиммунные заболевания могут быть также полигландулярными. Аутоиммунные заболевания могут поражать одну или более тканей, например, соединительную ткань, мышцы или кровь. Аутоиммунные заболевания могут поражать нервную систему или глаза, уши или сосудистую систему. Аутоиммунные заболевания также могут быть системными, поражая множество органов, тканей и/или систем. В некоторых вариантах осуществления иммуно-ассоциированное заболевание или состояние является воспалительным заболеванием или состоянием. В некоторых вариантах осуществления воспалительное заболевание или состояние является таким, которое вовлекает воспаленную мышцу, висцеральный жир, толстую кишку и/или ткань легкого.
[000115] В некоторых вариантах осуществления аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из реакции трансплантат против хозяина, вульгарной пузырчатки, системной красной волчанки, склеродермии, язвенного колита, болезни Крона, псориаза, диабета 1-го типа, рассеянного склероза, бокового амиотрофического склероза, очаговой алопеции, увеита, оптиконевромиелита и миодистрофии Дюшенна.
[000116] В некоторых вариантах осуществления соединения согласно настоящему изобретению лечат заболевания, поражающие мышечную ткань, например, воспалительные миопатии, мышечные дистрофии, мышечные заболевания с участием иммунной системы и мышечные заболевания, включающие воспаление.
[000117] Воспалительные миопатии - это заболевания, которые обычно включают воспаление мышц и связанные с ним симптомы, такие как мышечная слабость. Мышечная слабость может быть прогрессирующей. Симптомы, связанные с воспалительными миопатиями (например, дерматомиозит), могут включать, например, мышечную слабость (например, слабость проксимальных мышц), кожную сыпь, усталость после ходьбы или стояния, спотыкание или падение, дисфагию, дисфонию, затрудненное дыхание, мышечную боль, слабые мышцы, потерю веса, субфебрильную температуру, воспаленные легкие, чувствительность к свету, отложения кальция (кальциноз) под кожей или в мышцах и сопутствующие биологические проявления воспалительных миопатий.
[000118] Воспалительные миопатии могут быть вызваны аллергическими реакциями, другими заболеваниями, воздействием лекарственного средства или токсина или воздействием инфекционного агента, или могут быть идиопатическими (с неизвестной причиной). Воспалительная миопатия может быть острой воспалительной миопатией или хронической воспалительной миопатией. Воспалительные миопатии могут поражать как взрослых, так и детей (например, ювенильный дерматомиозит). Воспалительные миопатии могут включать симптомы, которые влияют на другие органы или системы организма, такие как кожу, легкие, сердце, глаза и желудочно-кишечную систему. В некоторых вариантах осуществления воспалительная миопатия является хронической воспалительной миопатией (например, дерматомиозитом, полимиозитом или миозитом с тельцами включения).
[000119] В некоторых вариантах осуществления воспалительная миопатия может быть вызвана аллергической реакцией, другим заболеванием (например, раком или коллагенозом), воздействием токсичного вещества, лекарственного средства или возбудителя инфекции (например, вируса). В некоторых вариантах осуществления воспалительная миопатия связана с волчанкой, ревматоидным артритом или системным склерозом. В некоторых вариантах осуществления воспалительная миопатия является идиопатической. В некоторых вариантах осуществления воспалительная миопатия выбрана из полимиозита, дерматомиозита, миозита с тельцами включения и иммуно-опосредованной некротической миопатии. В некоторых вариантах осуществления воспалительной миопатией является дерматомиозит.
[000120] Сопутствующие биологические проявления воспалительных миопатий (например, дерматомиозита) включают, например, измененные (например, повышенные) уровни цитокинов (например, интерферонов I типа (таких как IFN-α и/или IFN-β), интерлейкинов (таких как IL-6, IL-10, IL-15, IL-17 и IL-18), и TNF-α), TGF-β, активирующего фактора В-клеток (BAFF) и повышенную экспрессию IFN-индуцируемых генов (например, IFN-индуцируемых генов I типа). Другие сопутствующие биологические проявления воспалительных миопатий могут включать, например, увеличенную скорость оседания эритроцитов (СОЭ) и/или повышенный уровень креатинкиназы. Другие сопутствующие биологические проявления воспалительных миопатий могут включать аутоантитела, например, аутоантитела против синтетазы (например, антитела против Jo1), антитела против частицы распознавания сигнала (антитела против SRP), антитела против Mi-2, антитела против p155, антитела против PM/Sci и антитела против RNP.
[000121] Мышечные дистрофии являются группой разнообразных наследственных нейромышечных нарушений, которые представляют собой группу тяжелых нейромышечных заболеваний, характеризующихся первичным или вторичным поражением скелетных мышц. Примеры мышечных дистрофий включают, без ограничения перечисленными, миодистрофию Дюшенна, миодистрофию Беккера, тазово-плечевую мышечную дистрофию, фациоскапулохумеральную мышечную дистрофию, врожденную мышечную дистрофию Фукуямы и мерозин-дефицитную врожденную мышечную дистрофию. Наиболее распространенной формой мышечной дистрофии является миодистрофия Дюшенна (МДД). МДД - X-сцепленное рецессивное заболевание, характеризующееся мутацией в гене, который кодирует дистрофин. Большинство пациентов умирают до 30 лет из-за дыхательной или сердечной недостаточности. Миодистрофия Беккера (также известная как доброкачественная псевдогипертрофическая мышечная дистрофия) сходна с МДД тем, что оба заболевания являются результатом мутации в гене дистрофина. Организм, страдающий МДД, не продуцирует функциональный дистрофин. При этом МДД гораздо более тяжелое заболевание, чем МДБ.
Индивиды
[000122] Соединения согласно настоящему изобретению вводят индивиду, такому как позвоночное. В некоторых вариантах осуществления субъектом является мышь, крыса, кролик, собака, кошка, лошадь, овца, корова, обезьяна, яванский макак или человек. Субъектами могут быть, например, пожилые люди, взрослые, подростки, дети предподросткового возраста, дети, дети раннего возраста и младенцы. В некоторых вариантах осуществления индивид представляет собой модель воспалительной миопатии на животных. В некоторых вариантах осуществления субъектом является человек с воспалительной миопатией или человек с риском развития воспалительной миопатии. В некоторых вариантах индивид имеет случай воспалительной миопатии у близких родственников. В некоторых вариантах осуществления индивид является носителем гена, связанного с воспалительной миопатией. В некоторых вариантах осуществления индивид является положительным на биомаркер, связанный с воспалительной миопатией. В некоторых вариантах у индивида была диагностирована воспалительная миопатия. В некоторых вариантах осуществления индивид имеет один или более признаков или симптомов, связанных с воспалительной миопатией, например, один или более симптомов, описанных в настоящем документе.
[000123] В некоторых вариантах осуществления индивид представляет собой модель мышечной дистрофии на животных. В некоторых вариантах осуществления субъектом является человеком с мышечной дистрофией или человеком с риском развития мышечной дистрофии. В некоторых вариантах осуществления индивид имеет случай мышечной дистрофии у близких родственников. В некоторых вариантах осуществления индивид является носителем гена, связанного с мышечной дистрофией. В некоторых вариантах осуществления индивид является положительным на биомаркер, связанный с мышечной дистрофией. В некоторых вариантах осуществления у индивида была диагностирована мышечная дистрофия. В некоторых вариантах осуществления индивид имеет один или более признаков или симптомов, связанных с мышечной дистрофией, например, один или более симптомов, описанных в настоящем документе.
Введение доз
[000124] Фармацевтические композиции, описанные в настоящем документе, могут находиться в единичных лекарственных формах, подходящих для однократного введения точных доз. В единичной лекарственной форме композиция разделена на стандартные дозы, содержащие подходящие количества одного или более соединений. Единичная доза может быть в форме пакета, содержащего дискретные количества композиции. Неограничивающими примерами являются жидкости во флаконах или ампулах. Водные суспензионные композиции могут быть упакованы в однодозовые контейнеры, не допускающие повторного закрывания. Многодозовые контейнеры с возожностью повторного закрывания могут использоваться, например, в комбинации с консервантом. Композиции для инъекций могут быть представлены в стандартной лекарственной форме, например, в ампулах или в многодозовых контейнерах с консервантом.
[000125] Соединение, описанное в настоящем документе, может присутствовать в композиции в диапазоне от приблизительно 0,5 мкг до приблизительно 7000 мкг, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 1000 мкг, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 250 мкг, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 25 мкг, от приблизительно 5 мкг до приблизительно 50 мкг, от приблизительно 0,5 мкг до приблизительно 15 мкг или от приблизительно 0,5 мкг до приблизительно 10 мкг на дозу.
[000126] Соединение, описанное в настоящем документе, может присутствовать в композиции в количестве приблизительно 0,5 мкг, приблизительно 1 мкг, приблизительно 2 мкг, приблизительно 3 мкг, приблизительно 4 мкг, приблизительно 5 мкг, приблизительно 6 мкг, приблизительно 7 мкг, приблизительно 8 мкг, приблизительно 9 мкг, приблизительно 10 мкг, приблизительно 11 мкг, приблизительно 12 мкг, приблизительно 13 мкг, приблизительно 14 мкг, приблизительно 15 мкг, приблизительно 16 мкг, приблизительно 17 мкг, приблизительно 18 мкг, приблизительно 19 мкг, приблизительно 20 мкг, приблизительно 21 мкг, приблизительно 22 мкг, приблизительно 23 мкг, приблизительно 24 мкг, приблизительно 25 мкг, приблизительно 26 мкг, приблизительно 27 мкг, приблизительно 28 мкг, приблизительно 29 мкг, приблизительно 30 мкг, приблизительно 31 мкг, приблизительно 32 мкг, приблизительно 33 мкг, приблизительно 34 мкг, приблизительно 35 мкг, приблизительно 36 мкг, приблизительно 37 мкг, приблизительно 38 мкг, приблизительно 39 мкг, приблизительно 40 мкг, приблизительно 41 мкг, приблизительно 42 мкг, приблизительно 43 мкг, приблизительно 44 мкг, приблизительно 45 мкг, приблизительно 46 мкг, приблизительно 47 мкг, приблизительно 48 мкг, приблизительно 49 мкг, приблизительно 50 мкг, приблизительно 55 мкг, приблизительно 60 мкг, приблизительно 65 мкг, приблизительно 70 мкг, приблизительно 75 мкг, приблизительно 80 мкг, приблизительно 85 мкг, приблизительно 90 мкг, приблизительно 95 мкг, приблизительно 100 мкг, приблизительно 125 мкг, приблизительно 150 мкг, приблизительно 175 мкг, приблизительно 200 мкг, приблизительно 250 мкг, приблизительно 300 мкг, приблизительно 350 мкг, приблизительно 400 мкг, приблизительно 450 мкг, приблизительно 500 мкг, приблизительно 550 мкг, приблизительно 600 мкг, приблизительно 650 мкг, приблизительно 700 мкг, приблизительно 750 мкг, приблизительно 800 мкг, приблизительно 850 мкг, приблизительно 900 мкг, приблизительно 950 мкг, приблизительно 1000 мкг, приблизительно 1050 мкг, приблизительно 1100 мкг, приблизительно 1150 мкг, приблизительно 1200 мкг, приблизительно 1250 мкг, приблизительно 1300 мкг, приблизительно 1350 мкг, приблизительно 1400 мкг, приблизительно 1450 мкг, приблизительно 1500 мкг, приблизительно 1550 мкг, приблизительно 1600 мкг, приблизительно 1650 мкг, приблизительно 1700 мкг, приблизительно 1750 мкг, приблизительно 1800 мкг, приблизительно 1850 мкг, приблизительно 1900 мкг, приблизительно 1950 мкг, приблизительно 2000 мкг, приблизительно 2500 мкг, приблизительно 3000 мкг, приблизительно 3500 мкг, приблизительно 4000 мкг, приблизительно 4500 мкг, приблизительно 5000 мкг, приблизительно 5500 мкг, приблизительно 6000 мкг, приблизительно 6500 мкг, приблизительно 7000 мкг, приблизительно 7500 мкг, приблизительно 8000 мкг, приблизительно 9000 мкг, приблизительно 10000 мкг (10 мг), приблизительно 11 мг, приблизительно 12 мг, приблизительно 13 мг, приблизительно 14 мг, приблизительно 15 мг, приблизительно 16 мг, приблизительно 17 мг, приблизительно 18 мг, приблизительно 19 мг, приблизительно 20 мг, приблизительно 21 мг, приблизительно 22 мг, приблизительно 23 мг, приблизительно 24 мг, приблизительно 25 мг, приблизительно 26 мг, приблизительно 27 мг, приблизительно 28 мг, приблизительно 29 мг, приблизительно 30 мг, приблизительно 31 мг, приблизительно 32 мг, приблизительно 33 мг, приблизительно 34 мг, приблизительно 35 мг, приблизительно 36 мг, приблизительно 37 мг, приблизительно 38 мг, приблизительно 39 мг или приблизительно 40 мг. Любое из этих значений может использоваться для определения диапазона для количества соединения в композиции. Например, соединение может присутствовать в композиции в диапазоне от приблизительно 0,5 мкг до приблизительно 40 мг, от приблизительно 500 мкг до приблизительно 10 мг или от приблизительно 50 мкг до приблизительно 5 мг.
[000127] В некоторых вариантах осуществления доза может быть выражена в количестве лекарственного средства, разделенном на массу индивида, например, в микрограммах или миллиграммах лекарственного средства на килограмм массы тела субъекта. В некоторых вариантах осуществления соединение вводят в дозе приблизительно 0,5 мкг/кг, приблизительно 1 мкг/кг, приблизительно 2 мкг/кг, приблизительно 3 мкг/кг, приблизительно 4 мкг/кг, приблизительно 5 мкг/кг, приблизительно 6 мкг/кг, приблизительно 7 мкг/кг, приблизительно 8 мкг/кг, приблизительно 9 мкг/кг, приблизительно 10 мкг/кг, приблизительно 11 мкг/кг, приблизительно 12 мкг/кг, приблизительно 13 мкг, приблизительно 14 мкг/кг, приблизительно 15 мкг/кг, приблизительно 16 мкг/кг, приблизительно 17 мкг/кг, приблизительно 18 мкг/кг, приблизительно 19 мкг/кг, приблизительно 20 мкг/кг, приблизительно 25 мкг/кг, приблизительно 30 мкг/кг, приблизительно 35 мкг/кг, приблизительно 40 мкг/кг, приблизительно 45 мкг/кг, приблизительно 50 мкг/кг, приблизительно 55 мкг/кг, приблизительно 60 мкг/кг, приблизительно 65 мкг/кг, приблизительно 70 μg/kg, приблизительно 75 мкг/кг, приблизительно 80 мкг/кг, приблизительно 85 мкг/кг, приблизительно 90 мкг/кг, приблизительно 95 мкг/кг, приблизительно 100 мкг/кг, приблизительно 125 мкг/кг, приблизительно 150 мкг/кг, приблизительно 175 мкг/кг, приблизительно 200 мкг/кг, приблизительно 250 мкг/кг, приблизительно 300 мкг/кг, приблизительно 350 мкг/кг, приблизительно 400 мкг/кг, приблизительно 450 мкг/кг, приблизительно 500 мкг/кг, приблизительно 550 мкг/кг, приблизительно 600 мкг/кг, приблизительно 650 мкг/кг, приблизительно 700 мкг/кг, приблизительно 750 мкг/кг, приблизительно 800 мкг/кг, приблизительно 850 мкг/кг, приблизительно 900 мкг/кг, приблизительно 950 мкг/кг, приблизительно 1000 мкг/кг, приблизительно 1050 мкг/кг, приблизительно 1100 мкг/кг, приблизительно 1150 мкг/кг, приблизительно 1200 мкг/кг, приблизительно 1250 мкг/кг, приблизительно 1300 мкг/кг, приблизительно 1350 мкг/кг, приблизительно 1400 мкг/кг, приблизительно 1450 мкг/кг, приблизительно 1500 мкг/кг, приблизительно 1550 мкг/кг, приблизительно 1600 мкг/кг, приблизительно 1650 мкг/кг, приблизительно 1700 мкг/кг, приблизительно 1750 мкг/кг, приблизительно 1800 мкг/кг, приблизительно 1850 мкг/кг, приблизительно 1900 мкг/кг, приблизительно 1950 мкг/кг, приблизительно 2000 мкг/кг, приблизительно 2500 мкг/кг, приблизительно 3000 мкг/кг, приблизительно 3500 мкг/кг, приблизительно 4000 мкг/кг, приблизительно 4500 мкг/кг или приблизительно 5000 мкг/кг. Любое из этих значений может использоваться для определения диапазона дозы соединения. Например, в некоторых вариантах осуществления, соединение вводят в дозе в пределах от приблизительно 0,5 мкг/кг до приблизительно 250 мкг/кг, от 1 мкг/кг до приблизительно 200 мкг/кг, от 5 мкг/кг до приблизительно 150 мкг/кг, от приблизительно 10 мкг/кг до приблизительно 100 мкг/кг, от приблизительно 10 мкг/кг до приблизительно 50 мкг/кг, от приблизительно 15 мкг/кг до приблизительно 35 мкг/кг или от приблизительно 0,5 мкг/кг до приблизительно 5000 мкг/кг.
[000128] Раскрытые соединения могут вводить с любым требуемым интервалом. Например, соединение могут вводить один раз в неделю, 2 раза в неделю, 3 раза в неделю, 4 раза в неделю, 5 раз в неделю, 6 раз в неделю, 7 раз в неделю, 8 раз в неделю, 9 раз в неделю или 10 раз в неделю. Интервал между ежедневным дозированием может быть любым часовым интервалом, например, каждый час, каждые 2 часа, каждые 3 часа, каждые 4 часа, каждые 5 часов, каждые 6 часов, каждые 7 часов, каждые 8 часов, каждые 9 часов, каждые 10 часов, каждые 11 часов или каждые 12 часов. Соединение могут вводить один раз в неделю, один раз в 2 недели, один раз в 3 недели, один раз в 4 недели, один раз в 5 недель, один раз в 6 недель, один раз в 7 недель или один раз в 8 недель. Введение соединения могут производить согласно схемам нерегулярного введения, которые зависят либо от лица, выполняющего введение соединения, либо от субъекта, которому вводят соединение. Фактически, соединение могут вводить, например, один раз в день, два раза в день или три раза в день.
[000129] Вводимое количество может быть одинаковым количеством для каждой дозы, или доза может изменяться. Например, первое количество можно вводить утром, а второе количество можно вводить вечером. Индивид может получить высокую первую дозу и более низкие последующие дозы. Дозу можно повышать или понижать в зависимости от улучшения симптомов или маркеров заболевания, или развития нежелательных реакций.
[000130] Неограничивающие примеры фармацевтически приемлемых носителей включают раствор хлорида натрия, раствор Рингера и раствор декстрозы. Жидкие носители могут использоваться при приготовлении растворов, суспензий и эмульсий. Описанное в настоящем документе соединение может быть растворено или суспендировано в фармацевтически приемлемом жидком носителе, таком как вода, органический растворитель или их смесь, или в фармацевтически приемлемых маслах или жирах. Жидкий носитель может содержать другие подходящие фармацевтические добавки, такие как солюбилизаторы, эмульгаторы, буферы, консерванты, подсластители, ароматизаторы, суспендирующие вещества, загустители, красители, регуляторы вязкости, стабилизаторы и осморегуляторы. Примеры жидких носителей для парентерального введения включают воду, спирты (в том числе одноатомные спирты и многоатомные спирты, например, гликоли) и их производные, а также масла (например, фракционированное кокосовое масло и арахисовое масло). В случае парентерального введения носитель может быть сложным эфиром жирной кислоты, таким как этилолеат или изопропилмиристат. Стерильные жидкие носители используются в композициях в форме стерильных жидкостей для парентерального введения. Показатель рН раствора может составлять от приблизительно 5 до приблизительно 8, например, от приблизительно 7 до приблизительно 7,5.
[000131] В некоторых вариантах осуществления лечение молекулой согласно настоящему изобретению переносится лучше, чем лечение полипептидом IL-2 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления лечение терапевтически эффективной дозой молекулы согласно настоящему изобретению вызывает меньше случаев диареи по сравнению с лечением IL2(C125S). В некоторых вариантах осуществления лечение терапевтически эффективным количеством молекулы согласно настоящему изобретению не вызывает синдром капиллярной утечки. В некоторых вариантах осуществления лечение терапевтически эффективным количеством молекулы согласно настоящему изобретению не приводит к снижению активности нейтрофилов или повышенному риску инфекции.
[000132] Соединения согласно настоящему изобретению имеют высокую, среднюю или низкую аффинность к рецептору IL-2. Соединения согласно настоящему изобретению имеют высокую, среднюю или низкую аффинность к ST2. Соединение, которое обладает средней или низкой аффинностью к IL2R и ST2 по отдельности, может иметь высокую авидность, когда оба рецептора присутствуют на клетке. Соединение согласно настоящему изобретению имеет константу диссоциации (Kd), например, от приблизительно 1 пмоль до приблизительно 1 ммоль, от приблизительно 10 пмоль до приблизительно 1 ммоль, от приблизительно 100 пмоль до приблизительно 1 ммоль, от приблизительно 1 мкмоль до приблизительно 1 ммоль, от приблизительно 10 мкмоль до приблизительно 1 ммоль, от приблизительно 1 мкмоль до приблизительно 100 мкмоль, от приблизительно 1 мкмоль до приблизительно 500 мкмоль, от приблизительно 200 мкмоль до приблизительно 800 мкмоль, от приблизительно 10 мкмоль до приблизительно 100 мкмоль или от приблизительно 500 мкмоль до приблизительно 1 ммоль для связывания с ST2 или с IL2R в отдельности. Соединение согласно настоящему изобретению может иметь более низкую кажущуюся Kd при связывании с ST2 и с IL-2R, например, меньше 95%, меньше 90%, меньше 85%, меньше 80%, меньше 75%, меньше 70%, меньше 65%, меньше 60%, меньше 55%, меньше 50%, меньше 45%, меньше 40%, меньше 35%, меньше 30%, меньше 25%, меньше 20%, меньше 15%, меньше 10%, меньше 5%, меньше 4%, меньше 3%, меньше 2% или меньше 1% от индивидуальной Kd.
Фармакокинетика
[000133] Дозу можно модулировать для достижения требуемого фармакокинетического (ФК) или фармакодинамического профиля, такого как требуемый или эффективный профиль в крови, как описано в настоящем документе.
[000134] Фармакокинетические и фармакодинамические данные могут быть получены с помощью различных экспериментальных методик. Соответствующие компоненты фармакокинетического и фармакодинамического профиля, описывающие конкретную композицию, могут варьировать вследствие различий метаболизма лекарственных соединений у людей. Фармакокинетические и фармакодинамические профили могут быть основаны на определении средних показателей в группе субъектов. Группа субъектов включает любое обоснованное количество субъектов, подходящих для определения репрезентативного среднего значения, например, 5 субъектов, 10 субъектов, 15 субъектов, 20 субъектов, 25 субъектов, 30 субъектов, 35 субъектов или больше. Среднее значение определяют, например, путем вычисления среднего значения на основе всех измерений у индивида для каждого измеряемого показателя. Дозу можно модулировать с целью достижения требуемого фармакокинетического или фармакодинамического профиля, такого как требуемый или эффективный профиль в крови, как описано в настоящем документе.
[000135] Фармакодинамические параметры могут быть любыми параметрами, подходящими для описания композиций изобретения. Например, фармакодинамический профиль может быть получен в определенное время после введения дозы, например, приблизительно ноль минут, приблизительно 1 минуты, приблизительно 2 минут, приблизительно 3 минут, приблизительно 4 минут, приблизительно 5 минут, приблизительно 6 минут, приблизительно 7 минут, приблизительно 8 минут, приблизительно 9 минут, приблизительно 10 минут, приблизительно 11 минут, приблизительно 12 минут, приблизительно 13 минут, приблизительно 14 минут, приблизительно 15 минут, приблизительно 16 минут, приблизительно 17 минут, приблизительно 18 минут, приблизительно 19 минут, приблизительно 20 минут, приблизительно 21 минуты, приблизительно 22 минут, приблизительно 23 минут, приблизительно 24 минут, приблизительно 25 минут, приблизительно 26 минут, приблизительно 27 минут, приблизительно 28 минут, приблизительно 29 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 31 минуты, приблизительно 32 минут, приблизительно 33 минут, приблизительно 34 минут, приблизительно 35 минут, приблизительно 36 минут, приблизительно 37 минут, приблизительно 38 минут, приблизительно 39 минут, приблизительно 40 минут, приблизительно 41 минуты, приблизительно 42 минут, приблизительно 43 минут, приблизительно 44 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 46 минут, приблизительно 47 минут, приблизительно 48 минут, приблизительно 49 минут, приблизительно 50 минут, приблизительно 51 минуты, приблизительно 52 минут, приблизительно 53 минут, приблизительно 54 минут, приблизительно 55 минут, приблизительно 56 минут, приблизительно 57 минут, приблизительно 58 минут, приблизительно 59 минут, приблизительно 60 минут, приблизительно ноль часов, приблизительно 0,5 часа, приблизительно 1 часа, приблизительно 1,5 часа, приблизительно 2 часов, приблизительно 2,5 часа, приблизительно 3 часов, приблизительно 3,5 часа, приблизительно 4 часов, приблизительно 4,5 часа, приблизительно 5 часов, приблизительно 5,5 часа, приблизительно 6 часов, приблизительно 6,5 часа, приблизительно 7 часов, приблизительно 7,5 часа, приблизительно 8 часов, приблизительно 8,5 часа, приблизительно 9 часов, приблизительно 9,5 часа, приблизительно 10 часов, приблизительно 10,5 часа, приблизительно 11 часов, приблизительно 11,5 часа, приблизительно 12 часов, приблизительно 12,5 часа, приблизительно 13 часов, приблизительно 13,5 часа, приблизительно 14 часов, приблизительно 14,5 часа, приблизительно 15 часов, приблизительно 15,5 часа, приблизительно 16 часов, приблизительно 16,5 часа, приблизительно 17 часов, приблизительно 17,5 часа, приблизительно 18 часов, приблизительно 18,5 часа, приблизительно 19 часов, приблизительно 19,5 часа, приблизительно 20 часов, приблизительно 20,5 часа, приблизительно 21 часа, приблизительно 21,5 часа, приблизительно 22 часов, приблизительно 22,5 часа, приблизительно 23 часов, приблизительно 23,5 часа, приблизительно 24 часов, приблизительно 2 дней, приблизительно 3 дней, приблизительно 4 дней, приблизительно 5 дней, приблизительно 6 дней, приблизительно 7 дней, приблизительно 8 дней, приблизительно 9 дней, приблизительно 10 дней, приблизительно 11 дней, приблизительно 12 дней, приблизительно 13 дней или приблизительно 14 дней.
max
max
max
max
max
[000136] Фармакокинетические параметры могут быть любыми параметрами, подходящими для описания соединения. C может составлять, например, не меньше чем приблизительно 1 нг/мл; не меньше чем приблизительно 5 нг/мл; не меньше чем приблизительно 10 нг/мл; не меньше чем приблизительно 15 нг/мл; не меньше чем приблизительно 20 нг/мл; не меньше чем приблизительно 25 нг/мл; не меньше чем приблизительно 50 нг/мл; не меньше чем приблизительно 75 нг/мл; не меньше чем приблизительно 100 нг/мл; не меньше чем приблизительно 200 нг/мл; не меньше чем приблизительно 300 нг/мл; не меньше чем приблизительно 400 нг/мл; не меньше чем приблизительно 500 нг/мл; не меньше чем приблизительно 600 нг/мл; не меньше чем приблизительно 700 нг/мл; не меньше чем приблизительно 800 нг/мл; не меньше чем приблизительно 900 нг/мл; не меньше чем приблизительно 1000 нг/мл; не меньше чем приблизительно 1250 нг/мл; не меньше чем приблизительно 1500 нг/мл; не меньше чем приблизительно 1750 нг/мл; не меньше чем приблизительно 2000 нг/мл; не меньше чем приблизительно 2500 нг/мл; или являться любыми другими C, подходящими для описания фармакокинетического профиля соединения, описанного в настоящем документе. C может составлять, например, от приблизительно 5 до приблизительно 10000 нг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 10000 нг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 10000 нг/мл, от приблизительно 5000 до приблизительно 10000 нг/мл, от приблизительно 1000 до приблизительно 5000 нг/мл, от приблизительно 1000 до приблизительно 3000 нг/мл, от приблизительно 5000 до приблизительно 8000 нг/мл или от приблизительно 500 до приблизительно 1000 нг/мл в крови, при введении путем внутривенной инъекции, например, в дозе 50 мкг/кг. C может быть, например, приблизительно 5 до приблизительно 50 нг/мл, приблизительно 50 до приблизительно 500 нг/мл, приблизительно 100 до приблизительно 250 нг/мл, приблизительно 1000 до приблизительно 5000 нг/мл, приблизительно 1000 до приблизительно 2000 нг/мл, приблизительно в 2000 до приблизительно 5000 нг/мл, приблизительно 5000 до приблизительно 10000 нг/мл или приблизительно 5000 до приблизительно 7000 нг/мл в крови при введении путем подкожной инъекции, например, в дозе 50 мкг/кг. C может зависеть от вводимой дозы соединения. Вводимая доза может составлять 50 мкг/кг, 100 мкг/кг, 200 мкг/кг, 250 мкг/кг, 300 мкг/кг, 400 мкг/кг, 500 мкг/кг, 600 мкг/кг, 700 мкг/кг, 800 мкг/кг, 900 мкг/кг или 1000 мкг/кг.
max
max
max
[000137] T соединения, описанного в настоящем документе, может составлять, например, не больше чем приблизительно 0,5 часа, не больше чем приблизительно 1 час, не больше чем приблизительно 1,5 часа, не больше чем приблизительно 2 часа, не больше чем приблизительно 2,5 часа, не больше чем приблизительно 3 часа, не больше чем приблизительно 3,5 часа, не больше чем приблизительно 4 часа, не больше чем приблизительно 4,5 часа, не больше чем приблизительно 5 часов, не больше чем приблизительно 5,5 часа, не больше чем приблизительно 6 часов, не больше чем приблизительно 6,5 часа, не больше чем приблизительно 7 часов, не больше чем приблизительно 7,5 часа, не больше чем приблизительно 8 часов, не больше чем приблизительно 8,5 часа, не больше чем приблизительно 9 часов, не больше чем приблизительно 9,5 часа, не больше чем приблизительно 10 часов, не больше чем приблизительно 10,5 часа, не больше чем приблизительно 11 часов, не больше чем приблизительно 11,5 часа, не больше чем приблизительно 12 часов, не больше чем приблизительно 12,5 часа, не больше чем приблизительно 13 часов, не больше чем приблизительно 13,5 часа, не больше чем приблизительно 14 часов, не больше чем приблизительно 14,5 часа, не больше чем приблизительно 15 часов, не больше чем приблизительно 15,5 часа, не больше чем приблизительно 16 часов, не больше чем приблизительно 16,5 часа, не больше чем приблизительно 17 часов, не больше чем приблизительно 17,5 часа, не больше чем приблизительно 18 часов, не больше чем приблизительно 18,5 часа, не больше чем приблизительно 19 часов, не больше чем приблизительно 19,5 часа, не больше чем приблизительно 20 часов или являться любым другим T, подходящим для описания фармакокинетического профиля соединения, описанного в настоящем документе. T может составлять, например, от приблизительно 0,1 часа до приблизительно 24 часов; от приблизительно 0,1 часа до приблизительно 0,5 часа; от приблизительно 0,5 часа до приблизительно 1 часа; от приблизительно 1 часа до приблизительно 1,5 часа; от приблизительно 1,5 часа до приблизительно 2 часов; от приблизительно 2 часов до приблизительно 2,5 часа; от приблизительно 2,5 часа до приблизительно 3 часов; от приблизительно 3 часов до приблизительно 3,5 часа; от приблизительно 3,5 часа до приблизительно 4 часов; от приблизительно 4 часов до приблизительно 4,5 часа; от приблизительно 4,5 часа до приблизительно 5 часов; от приблизительно 5 часов до приблизительно 5,5 часа; от приблизительно 5,5 часа до приблизительно 6 часов; от приблизительно 6 часов до приблизительно 6,5 часа; от приблизительно 6,5 часа до приблизительно 7 часов; от приблизительно 7 часов до приблизительно 7,5 часа; от приблизительно 7,5 часа до приблизительно 8 часов; от приблизительно 8 часов до приблизительно 8,5 часа; от приблизительно 8,5 часа до приблизительно 9 часов; от приблизительно 9 часов до приблизительно 9,5 часа; от приблизительно 9,5 часа до приблизительно 10 часов; от приблизительно 10 часов до приблизительно 10,5 часа; от приблизительно 10,5 часа до приблизительно 11 часов; от приблизительно 11 часов до приблизительно 11,5 часа; от приблизительно 11,5 часа до приблизительно 12 часов; от приблизительно 12 часов до приблизительно 12,5 часа; от приблизительно 12,5 часа до приблизительно 13 часов; от приблизительно 13 часов до приблизительно 13,5 часа; от приблизительно 13,5 часа до приблизительно 14 часов; от приблизительно 14 часов до приблизительно 14,5 часа; от приблизительно 14,5 часа до приблизительно 15 часов; от приблизительно 15 часов до приблизительно 15,5 часа; от приблизительно 15,5 часа до приблизительно 16 часов; от приблизительно 16 часов до приблизительно 16,5 часа; от приблизительно 16,5 часа до приблизительно 17 часов; от приблизительно 17 часов до приблизительно 17,5 часа; от приблизительно 17,5 часа до приблизительно 18 часов; от приблизительно 18 часов до приблизительно 18,5 часа; от приблизительно 18,5 часа до приблизительно 19 часов; от приблизительно 19 часов до приблизительно 19,5 часа; от приблизительно 19,5 часа до приблизительно 20 часов; от приблизительно 20 часов до приблизительно 20,5 часа; от приблизительно 20,5 часа до приблизительно 21 часа; от приблизительно 21 часа до приблизительно 21,5 часа; от приблизительно 21,5 часа до приблизительно 22 часов; от приблизительно 22 часов до приблизительно 22,5 часа; от приблизительно 22,5 часа до приблизительно 23 часов; от приблизительно 23 часов до приблизительно 23,5 часа; или от приблизительно 23,5 часа до приблизительно 24 часов.
(0-inf)
(0-∞)
(last)
(0-inf)
(0-inf)
(0-inf)
[000138] AUC (также называемая AUC) или AUC соединения, описанного в настоящем документе, может составлять, например, не меньше чем приблизительно 1 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 5 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 10 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 20 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 30 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 40 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 50 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 100 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 150 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 200 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 250 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 300 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 350 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 400 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 450 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 500 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 600 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 700 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 800 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 900 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 1000 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 1250 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 1500 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 1750 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 2000 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 2500 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 3000 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 3500 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 4000 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 5000 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 6000 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 7000 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 8000 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 9000 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 10000 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 11000 н⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 12000 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 13000 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 14000 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 15000 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 16000 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 17000 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 18000 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 19000 нг⋅ч/мл, не меньше чем приблизительно 20000 нг⋅ч/мл или являться любым другим значением AUC, подходящим для описания фармакокинетического профиля соединения, описанного в настоящем документе. AUC соединения может составлять, например, от приблизительно 1 нг⋅ч/мл до приблизительно 10000 нг⋅ч/мл; от приблизительно 1 нг⋅ч/мл до приблизительно 10 нг⋅ч/мл; от приблизительно 10 нг⋅ч/мл до приблизительно 25 нг⋅ч/мл; от приблизительно 25 нг⋅ч/мл до приблизительно 50 нг⋅ч/мл; от приблизительно 50 нг⋅ч/мл до приблизительно 100 нг⋅ч/мл; от приблизительно 100 нг⋅ч/мл до приблизительно 200 нг⋅ч/мл; от приблизительно 200 нг⋅ч/мл до приблизительно 300 нг⋅ч/мл; от приблизительно 300 нг⋅ч/мл до приблизительно 400 нг⋅ч/мл; от приблизительно 400 нг⋅ч/мл до приблизительно 500 нг⋅ч/мл; от приблизительно 500 нг⋅ч/мл до приблизительно 600 нг⋅ч/мл; от приблизительно 600 нг⋅ч/мл до приблизительно 700 нг⋅ч/мл; от приблизительно 700 нг⋅ч/мл до приблизительно 800 нг⋅ч/мл; от приблизительно 800 нг⋅ч/мл до приблизительно 900 нг⋅ч/мл; от приблизительно 900 нг⋅ч/мл до приблизительно 1000 нг⋅ч/мл; от приблизительно 1000 нг⋅ч/мл до приблизительно 1250 нг⋅ч/мл; от приблизительно 1250 нг⋅ч/мл до приблизительно 1500 нг⋅ч/мл; от приблизительно 1500 нг⋅ч/мл до приблизительно 1750 нг⋅ч/мл; от приблизительно 1750 нг⋅ч/мл до приблизительно 2000 нг⋅ч/мл; от приблизительно 2000 нг⋅ч/мл до приблизительно 2500 нг⋅ч/мл; от приблизительно 2500 нг⋅ч/мл до приблизительно 3000 нг⋅ч/мл; от приблизительно 3000 нг⋅ч/мл до приблизительно 3500 нг⋅ч/мл; от приблизительно 3500 нг⋅ч/мл до приблизительно 4000 нг⋅ч/мл; от приблизительно 4000 нг⋅ч/мл до приблизительно 4500 нг⋅ч/мл; от приблизительно 4500 нг⋅ч/мл до приблизительно 5000 нг⋅ч/мл; от приблизительно 5000 нг⋅ч/мл до приблизительно 5500 нг⋅ч/мл; от приблизительно 5500 нг⋅ч/мл до приблизительно 6000 нг⋅ч/мл; от приблизительно 6000 нг⋅ч/мл до приблизительно 6500 нг⋅ч/мл; от приблизительно 6500 нг⋅ч/мл до приблизительно 7000 нг⋅ч/мл; от приблизительно 7000 нг⋅ч/мл до приблизительно 7500 нг⋅ч/мл; от приблизительно 7500 нг⋅ч/мл до приблизительно 8000 нг⋅ч/мл; от приблизительно 8000 нг⋅ч/мл до приблизительно 8500 нг⋅ч/мл; от приблизительно 8500 нг⋅ч/мл до приблизительно 9000 нг⋅ч/мл; от приблизительно 9000 нг⋅ч/мл до приблизительно 9500 нг⋅ч/мл; от приблизительно 9500 нг⋅ч/мл до приблизительно 10000 нг⋅ч/мл; от приблизительно 10000 нг⋅ч/мл до приблизительно 10500 нг⋅ч/мл; от приблизительно 10500 нг⋅ч/мл до приблизительно 11000 нг⋅ч/мл; от приблизительно 11000 нг⋅ч/мл до приблизительно 11500 нг⋅ч/мл; от приблизительно 11500 нг⋅ч/мл до приблизительно 12000 нг⋅ч/мл; от приблизительно 12000 нг⋅ч/мл до приблизительно 12500 нг⋅ч/мл; от приблизительно 12500 нг⋅ч/мл до приблизительно 13000 нг⋅ч/мл; от приблизительно 13000 нг⋅ч/мл до приблизительно 13500 нг⋅ч/мл; от приблизительно 13500 нг⋅ч/мл до приблизительно 14000 нг⋅ч/мл; от приблизительно 14000 нг⋅ч/мл до приблизительно 14500 нг⋅ч/мл; от приблизительно 14500 нг⋅ч/мл до приблизительно 15000 нг⋅ч/мл; от приблизительно 15000 нг⋅ч/мл до приблизительно 15500 нг⋅ч/мл; от приблизительно 15500 нг⋅ч/мл до приблизительно 16000 нг⋅ч/мл; от приблизительно 16000 нг⋅ч/мл до приблизительно 16500 нг⋅ч/мл; от приблизительно 16500 нг⋅ч/мл до приблизительно 17000 нг⋅ч/мл; от приблизительно 17000 нг⋅ч/мл до приблизительно 17500 нг⋅ч/мл; от приблизительно 17500 нг⋅ч/мл до приблизительно 18000 нг⋅ч/мл; от приблизительно 18000 нг⋅ч/мл до приблизительно 18500 нг⋅ч/мл; от приблизительно 18500 нг⋅ч/мл до приблизительно 19000 нг⋅ч/мл; от приблизительно 19000 нг⋅ч/мл до приблизительно 19500 нг⋅ч/мл; или от приблизительно 19500 нг⋅ч/мл до приблизительно 20000 нг⋅ч/мл. Например, AUC соединения может составлять приблизительно 8500 нг⋅ч/мл при внутривенном введении в дозе 50 мкг/кг или приблизительно 4000 нг⋅ч/мл при подкожном введении в дозе 50 мкг/кг.
[000139] Концентрация в плазме соединения, описанного в настоящем документе, может составлять, например, не меньше чем приблизительно 1 нг/мл, не меньше чем приблизительно 5 нг/мл, не меньше чем приблизительно 10 нг/мл, не меньше чем приблизительно 15 нг/мл, не меньше чем приблизительно 20 нг/мл, не меньше чем приблизительно 25 нг/мл, не меньше чем приблизительно 50 нг/мл, не меньше чем приблизительно 75 нг/мл, не меньше чем приблизительно 100 нг/мл, не меньше чем приблизительно 150 нг/мл, не меньше чем приблизительно 200 нг/мл, не меньше чем приблизительно 300 нг/мл, не меньше чем приблизительно 400 нг/мл, не меньше чем приблизительно 500 нг/мл, не меньше чем приблизительно 600 нг/мл, не меньше чем приблизительно 700 нг/мл, не меньше чем приблизительно 800 нг/мл, не меньше чем приблизительно 900 нг/мл, не меньше чем приблизительно 1000 нг/мл, не меньше чем приблизительно 1200 нг/мл или являться любой другой концентрацией в плазме соединения, описанного в настоящем документе. Концентрация в плазме может составлять, например, от приблизительно 1 нг/мл до приблизительно 2000 нг/мл; от приблизительно 1 нг/мл до приблизительно 5 нг/мл; от приблизительно 5 нг/мл до приблизительно 10 нг/мл; от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 25 нг/мл; от приблизительно 25 нг/мл до приблизительно 50 нг/мл; от приблизительно 50 нг/мл до приблизительно 75 нг/мл; от приблизительно 75 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл; от приблизительно 100 нг/мл до приблизительно 150 нг/мл; от приблизительно 150 нг/мл до приблизительно 200 нг/мл; от приблизительно 200 нг/мл до приблизительно 250 нг/мл; от приблизительно 250 нг/мл до приблизительно 300 нг/мл; от приблизительно 300 нг/мл до приблизительно 350 нг/мл; от приблизительно 350 нг/мл до приблизительно 400 нг/мл; от приблизительно 400 нг/мл до приблизительно 450 нг/мл; от приблизительно 450 нг/мл до приблизительно 500 нг/мл; от приблизительно 500 нг/мл до приблизительно 600 нг/мл; от приблизительно 600 нг/мл до приблизительно 700 нг/мл; от приблизительно 700 нг/мл до приблизительно 800 нг/мл; от приблизительно 800 нг/мл до приблизительно 900 нг/мл; от приблизительно 900 нг/мл до приблизительно 1000 нг/мл; от приблизительно 1000 нг/мл до приблизительно 1100 нг/мл; от приблизительно 1100 нг/мл до приблизительно 1200 нг/мл; от приблизительно 1200 нг/мл до приблизительно 1300 нг/мл; от приблизительно 1300 нг/мл до приблизительно 1400 нг/мл; от приблизительно 1400 нг/мл до приблизительно 1500 нг/мл; от приблизительно 1500 нг/мл до приблизительно 1600 нг/мл; от приблизительно 1600 нг/мл до приблизительно 1700 нг/мл; от приблизительно 1700 нг/мл до приблизительно 1800 нг/мл; от приблизительно 1800 нг/мл до приблизительно 1900 нг/мл; или от приблизительно 1900 нг/мл до приблизительно 2000 нг/мл.
[000140] Фармакодинамические параметры могут быть любыми параметрами, подходящими для описания композиций настоящего изобретения. Например, фармакодинамический профиль может демонстрировать повышенные количества клеток Treg в течение, например, приблизительно 24 часов, приблизительно 48 часов, приблизительно 72 часов или 1 недели.
D
V
V
=D/C
C
C
C
C
=D/V
t
t
=ln(2)/k
k
k
=ln(2)/t
CL/V
K
K
=C
.CL
CL=V
.k
=D/AUC
d
d
0
0
ss
0
ss
d
1/2
1/2
e
e
e
1/2
d
in
in
ss
0-∞
,ss
d
e
max
max
max
min
[000141] Неограничивающие примеры фармакодинамических и фармакокинетических параметров, которые могут быть вычислены для соединения, которое вводят согласно способам настоящего изобретения, включают: a) вводимое количество лекарственного средства, которое может быть представлено как доза ; b) интервал между введением доз, который может быть представлен как τ; c) кажущийся объем, в котором распределяется лекарственное средство, который может быть представлен как объем распределения , где ; d) количество лекарственного средства в данном объеме плазмы, которое может быть представлено как концентрация  или , где  или , и может быть представлено как средняя концентрация в плазме во множестве образцов; e) период полувыведения лекарственного средства , где ; f) скорость, с которой лекарственное средство выводится из организма , где =; g) скорость инфузии, требуемая для уравновешивания уравнения , где ; h) интеграл кривой зависимости концентрации от времени после введения однократной дозы, который может быть представлен как AUC, где , или в стационарном состоянии, который может быть представлен как AUCτ, где ; i) объем плазмы, очищаемой от лекарственного средства в единицу времени, который может быть представлен как CL (клиренс), где ; j) системно доступную долю лекарственного средства, которая может быть представлена как ƒ, где ; k) пиковую концентрацию лекарственного средства в плазме после введения C; l) время, требуемое для достижения лекарственным средством C, t; m) минимальную концентрацию, которую достигает лекарственное средство перед введением следующей дозы, C; и n) колебание между пиковой и минимальной концентрацией в одном интервале между введением доз в стационарном состоянии, которое может быть представлено как %PTF=100., где .
[000142] Соединения согласно настоящему описанию могут обладать высокой стабильностью при введении индивиду. Вводимое соединение может иметь физиологический период полувыведения больше чем приблизительно 6 часов, больше чем приблизительно 7 часов, больше чем приблизительно 8 часов, больше чем приблизительно 9 часов, больше чем приблизительно 10 часов, больше чем приблизительно 11 часов, больше чем приблизительно 12 часов, больше чем приблизительно 13 часов, больше чем приблизительно 14 часов, больше чем приблизительно 15 часов, больше чем приблизительно 16 часов, больше чем приблизительно 17 часов, больше чем приблизительно 18 часов, больше чем приблизительно 19 часов, больше чем приблизительно 20 часов, больше чем приблизительно 21 час, больше чем приблизительно 22 часа, больше чем приблизительно 23 часа, больше чем приблизительно 24 часа, больше чем приблизительно 25 часов, больше чем приблизительно 26 часов, больше чем приблизительно 27 часов, больше чем приблизительно 28 часов, больше чем приблизительно 29 часов, больше чем приблизительно 30 часов, больше чем приблизительно 31 час, больше чем приблизительно 32 часа, больше чем приблизительно 33 часа, больше чем приблизительно 34 часа, больше чем приблизительно 35 часов, больше чем приблизительно 36 часов, больше чем приблизительно 37 часов, больше чем приблизительно 38 часов, больше чем приблизительно 39 часов, больше чем приблизительно 40 часов, больше чем приблизительно 41 час, больше чем приблизительно 42 часа, больше чем приблизительно 43 часа, больше чем приблизительно 44 часа, больше чем приблизительно 45 часов, больше чем приблизительно 46 часов, больше чем приблизительно 47 часов, больше чем приблизительно 48 часов, больше чем приблизительно 49 часов, больше чем приблизительно 50 часов, больше чем приблизительно 51 час, больше чем приблизительно 52 часа, больше чем приблизительно 53 часа, больше чем приблизительно 54 часа, больше чем приблизительно 55 часов, больше чем приблизительно 56 часов, больше чем приблизительно 57 часов, больше чем приблизительно 58 часов, больше чем приблизительно 59 часов, больше чем приблизительно 60 часов, больше чем приблизительно 61 час, больше чем приблизительно 62 часа, больше чем приблизительно 63 часа или больше чем приблизительно 64 часа.
[000143] Период полувыведения соединения согласно настоящему изобретению может изменяться в зависимости от введенной дозы. Например, период полувыведения соединения в случае введения в дозе 50 мкг/кг может быть меньше, чем период полувыведения того же соединения при введении в дозе 100 мкг/кг или 250 мкг/кг. Период полувыведения соединения может изменяться в зависимости от используемого пути введения. Период полувыведения соединения может быть более длительным, если соединение вводят подкожно, а не внутривенно. Например, период полувыведения соединения, доставленного подкожно, может составлять от приблизительно 15 часов до приблизительно 25 часов, тогда как период полувыведения соединения, доставленного внутривенно, может составлять от приблизительно 5 до приблизительно 15 часов. В некоторых вариантах осуществления период полувыведения соединения при внутривенном введении в дозе 50 мкг/кг составляет от приблизительно 6 часов до приблизительно 14 часов, от приблизительно 7 часов до приблизительно 13 часов, от приблизительно 8 часов до приблизительно 12 часов или приблизительно 9 часов до приблизительно 11 часов. В некоторых вариантах осуществления период полувыведения соединения при внутривенном введении в дозе 50 мкг/кг составляет приблизительно 5 часов, приблизительно 6 часов, приблизительно 7 часов, приблизительно 8 часов, приблизительно 9 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 11 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 13 часов, приблизительно 14 часов или приблизительно 15 часов. В некоторых вариантах осуществления период полувыведения соединения при подкожном введении в дозе 50 мкг/кг составляет от приблизительно 15 часов до приблизительно 27 часов, от приблизительно 16 часов до приблизительно 26 часов, от приблизительно 17 часов до приблизительно 25 часов, от приблизительно 18 часов до приблизительно 24 часов, от приблизительно 19 часов до приблизительно 23 часов или от приблизительно 20 часов до приблизительно 22 часов. В некоторых вариантах осуществления период полувыведения соединения при подкожном введении в дозе 50 мкг/кг составляет приблизительно 10 часов, приблизительно 11 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 13 часов, приблизительно 14 часов, приблизительно 15 часов, приблизительно 16 часов, приблизительно 17 часов, приблизительно 18 часов, приблизительно 19 часов, приблизительно 21 час, приблизительно 22 часа, приблизительно 23 часа, приблизительно 24 часа, приблизительно 25 часов, приблизительно 26 часов, приблизительно 27 часов, приблизительно 28 часов, приблизительно 29 часов или приблизительно 30 часов. Клиренс соединения из крови может быть быстрее для соединения, доставляемого внутривенно, чем для соединения, доставляемого подкожно.
Получение димерных белков: гетеродимеры и гомодимеры
in vitro
[000144] В некоторых вариантах осуществления соединение согласно настоящему изобретению является гетеродимером, например, гетеродимером, включающим IL2R-связывающий фрагмент (например, IL-2 или вариант IL-2), который является частью первого слитого белка, и ST2-связывающий фрагмент (например, IL-33, вариант IL-33, антитело, которое связывает ST2, или его антигенсвязывающий фрагмент), который является частью второго слитого белка. В некоторых вариантах осуществления каждый из первого и второго слитых белков включает Fc-домен IgG, например Fc-домен IgG1 или его вариант. Гетеродимеры могут быть получены при экспрессии двух входящих в их состав рекомбинантных белка по отдельности, их очистке и объединении  с образованием связанных дисульфидной связью гетеродимеров. Гетеродимерные Fc-слитые белки также могут быть получены в одной клетке, трансфицированной двумя входящими в их состав конструкциями кДНК при использовании метода "выступ во впадину". С помощью этой стратегии вводят мутации в область контакта CH2-CH3 между двумя полипептидными цепями Fc, которые препятствуют образованию гомодимеров, но при этом образуют комплементарные области контакта, которые способствуют образованию гетеродимеров. Таким образом, гетеродимерные Fc-слитые белки могут образовываться в клетках-хозяевах, экспрессирующих рекомбинантные белки, и секретироваться в виде гетеродимерных белков. Ниже приведены два примера таких Fc-конструкций в фоне IgG1 человека. Мутантные остатки T366Y и Y407T выделены полужирным шрифтом и подчеркнуты, и остаток N297A подчеркнут.
Y
[000145] (A) Fc IgG1 (N297A; T366Y): DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 8)
T
[000146] (B) Fc IgG1 (N297A; Y407T): DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 9)
[000147] Два различных связывающих фрагмента, например IL-2 и IL-33, могут быть присоединены к Fc последовательностям (A) и (B), соответственно, для конструирования гетеродимерного белка.
[000148] В некоторых вариантах осуществления первый слитый белок включает Fc-домен IgG1, включающий мутации T350V, L351Y, F405A и Y407V (например, SEQ ID NO: 4); и второй слитый белок включает мутации T350V, T366L, K392L и T394W (например, SEQ ID NO: 5). Такие мутации, согласно некоторым сообщениям, улучшали правильное спаривание и стабильность (Von Kreudenstein et al., 2013, mAbs 5:646-654; WO 2014082179 A1). Примеры последовательностей Fc-домена IgG1 человека показаны ниже, при этом мутация N297A подчеркнута, а мутации T350V, L351Y, F405A, Y407V, T350V, T366L, K392L и T394W, выделены полужирным шрифтом и подчеркнуты.
VY
A
V
[000149] (A) Fc IgG1 (N297A, T350V, L351Y, F405A и Y407V): DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 4)
[000150] (B) Fc IgG1 (N297A, T350V, T366L, K392L и T394W)
V
L
L
W
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYLPPSRDELTKNQVSLCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 5)
[000151] Примеры гетеродимеров показаны на Фигурах 4А, 4B, 4C, 4D и 4E.
[000152] В некоторых вариантах осуществления соединение согласно настоящему изобретению является гомодимером, например, гомодимером, включающим два идентичных слитых белка, каждый из которых содержит IL2R-связывающий фрагмент (например, IL-2 или вариант IL-2) и ST2-связывающий фрагмент (например, IL-33, вариант IL-33, антитело, которое связывает ST2, или его антигенсвязывающий фрагмент). В некоторых вариантах осуществления каждый из двух идентичных слитых белков включает Fc-домен IgG, например, Fc-домен IgG1 или его вариант. В конкретном варианте осуществления Fc-домен IgG1 является Fc-доменом IgG1 человека, включающим мутацию N297A (например, SEQ ID NO: 7). Примеры гомодимеров показаны на Фигурах 1F и 1G.
4
[000153] IL2R-связывающий фрагмент (например, IL-2 или вариант IL-2) и ST2-связывающий фрагмент (например, IL-33, вариант IL-33, антитело, которое связывает ST2, или его антигенсвязывающий фрагмент) могут быть присоединены к N-концу или C-концу Fc-домена IgG напрямую или через пептидный линкер (например, линкер GS). Могут использоваться различные комбинации IL2R-связывающего фрагмента и ST2-связывающего фрагмента. В некоторых вариантах осуществления димерный белок включает первый слитый белок, содержащий IL2R-связывающий фрагмент на N-конце относительно Fc-домена IgG, и второй слитый белок, содержащий ST2-связывающий фрагмент на C-конце относительно Fc-домена IgG (см., например, Фигуру 4A). В некоторых вариантах осуществления первый слитый белок включает IL2R-связывающий фрагмент на N-конце относительно Fc-домена IgG, и второй слитый белок включает ST2-связывающий фрагмент на N-конце относительно Fc-домена IgG (см., например, Фигуру 4B и 5D). В некоторых вариантах осуществления первый слитый белок включает IL2R-связывающий фрагмент на C-конце относительно Fc-домена IgG, и второй слитый белок включает ST2-связывающий фрагмент на N-конце относительно Fc-домена IgG (см., например, Фигуру 4C и 5C). В некоторых вариантах осуществления первый слитый белок включает IL2R-связывающий фрагмент на C-конце относительно Fc-домена IgG, и второй слитый белок включает ST2-связывающий фрагмент на C-конце относительно Fc-домена IgG. В некоторых вариантах осуществления первый слитый белок включает ST2-связывающий фрагмент на N-конце относительно Fc-домена IgG и IL2R-связывающий фрагмент на C-конце относительно Fc-домена IgG, и второй слитый белок включает ST2-связывающий фрагмент на N-конце относительно Fc-домена IgG (см., например, Фигуру 4D и 5B). В некоторых вариантах осуществления первый слитый белок включает ST2-связывающий фрагмент на N-конце относительно Fc-домена IgG и IL2R-связывающий фрагмент на C-конце относительно Fc-домена IgG, и второй слитый белок включает IL2R-связывающий фрагмент на N-конце относительно Fc-домена IgG (см., например, Фигуру 4E). В некоторых вариантах осуществления и первый слитый белок, и второй слитый белок включают ST2-связывающий фрагмент на N-конце относительно Fc-домена IgG и IL2R-связывающий фрагмент на C-конце относительно Fc-домена IgG (см., например, Фигуру 4F и Фигуру 5A). В некоторых вариантах осуществления и первый слитый белок, и второй слитый белок включают IL2R-связывающий фрагмент на N-конце относительно Fc-домена IgG и ST2-связывающий фрагмент на C-конце относительно Fc-домена IgG (см., например, Фигуру 4G). В некоторых вариантах осуществления первый слитый белок включает IL2R-связывающий фрагмент на C-конце относительно Fc-домена IgG, и второй слитый белок включает ST2-связывающий фрагмент на N-конце относительно Fc-домена IgG и IL2R-связывающий фрагмент на C-конце относительно Fc-домена IgG (см., например, Фигуру 5E).
[000154] В некоторых вариантах осуществления димерный белок включает по меньшей мере один IL2R-связывающий фрагмент (например, IL-2 или вариант IL-2) и по меньшей мере один ST2-связывающий фрагмент (например, IL-33, вариант IL-33, антитело, которое связывает ST2, или его антигенсвязывающий фрагмент). В некоторых вариантах осуществления димерный белок включает только один IL2R-связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления димерный белок включает только один ST2-связывающий фрагмент.
[000155] В некоторых вариантах осуществления димерный белок включает по меньшей мере два IL2R-связывающих фрагмента. Например, в некоторых вариантах осуществления каждый первый и второй слитые белки содержат по меньшей мере один IL2R-связывающий фрагмент. См., например, Фигуры 4E, 4F и 4G. В некоторых вариантах осуществления димерный белок включает по меньшей мере два ST2-связывающих фрагмента. Например, в некоторых вариантах осуществления каждый первый и второй слитые белки содержат по меньшей мере один ST2-связывающий фрагмент. См., например, Фигуры 4D, 4F и 4G.
4
[000156] В любом из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, IL2R-связывающий фрагмент и ST2-связывающий фрагмент могут быть присоединены к Fc-домену IgG через пептидный линкер (например, линкер GS). Димерный белок может содержать 1, 2, 3, 4 или больше пептидных линкеров. В некоторых вариантах осуществления димерный белок включает по меньшей мере 1, 2, 3 или 4 пептидных линкера.
[000157] В некоторых вариантах осуществления IL2R-связывающий фрагмент и/или ST2-связывающий фрагмент слиты непосредственно с Fc-доменом IgG через пептидную связь, т.е. без добавления пептидного линкера между связывающим фрагментом и Fc-доменом IgG. В некотором варианте осуществления димерный белок не содержит пептидный линкер.
[000158] В некоторых вариантах осуществления первый слитый белок димерного белка имеет такую конфигурацию, что C-конец IL-2 связывающего фрагмента (например, белковый домен IL-2 человека или его вариант) слит через пептидную связь с N-концом первого пептидного линкерного домена; и N-конец первого белкового Fc-домена IgG слит через пептидную связь с C-концом первого пептидного линкерного домена. В некоторых вариантах осуществления второй слитый белок димерного белка имеет такую конфигурацию, что C-конец второго белкового Fc-домена IgG слит через пептидную связь с N-концом второго пептидного линкерного домена; и N-конец белкового домена, который связывается с ST2, слит через пептидную связь с C-концом второго пептидного линкерного домена. См., например, Фигуру 4A. В некоторых вариантах осуществления второй слитый белок димерного белка имеет такую конфигурацию, что C-конец ST2-связывающего фрагмента слит через пептидную связь с N-концом второго пептидного линкерного домена; и N-конец второго белкового Fc-домена IgG слит через пептидную связь с C-концом второго пептидного линкерного домена. См., например, Фигуру 4B.
[000159] В некоторых вариантах осуществления димерный белок включает слитый белок, обладающий по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления димерный белок включает слитый белок, обладающий по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах осуществления димерный белок включает слитый белок, обладающий по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах осуществления димерный белок включает слитый белок, обладающий по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах осуществления димерный белок включает слитый белок, обладающий по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 16. В некоторых вариантах осуществления димерный белок включает слитый белок, обладающий по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления димерный белок включает слитый белок, обладающий по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления димерный белок включает слитый белок, обладающий по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах осуществления димерный белок включает слитый белок, обладающий по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах осуществления димерный белок включает слитый белок, обладающий по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 21. В некоторых вариантах осуществления димерный белок включает слитый белок, обладающий по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах осуществления димерный белок включает слитый белок, обладающий по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах осуществления димерный белок включает слитый белок, обладающий по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления димерный белок включает слитый белок, обладающий по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах осуществления димерный белок включает слитый белок, обладающий по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления димерный белок включает слитый белок, обладающий по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления димерный белок включает слитый белок, обладающий по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления димерный белок включает слитый белок, обладающий по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 29. В некоторых вариантах осуществления димерный белок включает слитый белок, обладающий по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 30.
Описание последовательностей в Списке последовательностей
<b>SEQ ID NO: </b>
<b>Описание</b>
1
IL-2 человека, включающий мутации N88R и C125S
2
IL-2 человека дикого типа
3
IL-2 человека, включающий мутации T3A, N88R и C125S
4
Fc IgG1 человека (N297A, T350V, L351Y, F405A, Y407V)
5
Fc IgG1 человека (N297A, T350V, T366L, K392L, T394W)
6
пептидный линкер GGGGSGGGGSGGGGS (G4S)<sub>3</sub>
7
Фрагмент Fc IgG1 человека (N297A)
8
Fc IgG1 человека (T366Y)
9
Fc IgG1 человека (Y407T)
10
Остатки 112-170 человеческого IL-33 дикого типа
11
Остатки 112-170 человеческого IL-33, включающего мутации C208S, C227S, C232S и C259S
12
Слитый белок IL-2 (N88R, C125)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/Fc IgG1 (N297A, T350V, L351Y, F405A, Y407V)Фиг. 4A
13
Слитый белок Fc IgG1 (N297A, T350V, T366L, K392L, T394W)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/IL-33 (C208S, C227S, C232S, C259S)Фиг. 4A
14
Слитый белок IL-2 (N88R, C125)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/Fc IgG1 (N297A, T350V, T366L, K392L, T394W)Фиг. 4B
15
Слитый белок IL-33 (C208S, C227S, C232S, C259S)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/Fc IgG1 (N297A, T350V, L351Y, F405A, Y407V)Фиг. 4B
16
Слитый белок Fc IgG1 (N297A, T350V, T366L, K392L, T394W)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/IL-2 (N88R, C125)Фиг. 4C
17
Слитый белок IL-33 (C208S, C227S, C232S, C259S)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/Fc IgG1 (N297A, T350V, T366L, K392L, T394W)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/IL-2 (N88R, C125)Фиг. 4D
18
Слитый белок IL-2 (N88R, C125)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/Fc IgG1 (N297A, T350V, T366L, K392L, T394W)(G4S)<sub>3</sub> линкер/IL-33 (C208S, C227S, C232S, C259S)Фиг. 4E
19
Слитый белок IL-33 (C208S, C227S, C232S, C259S)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/Fc IgG1 (N297A)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/IL-2 (N88R, C125)Фиг. 4F
20
Слитый белок IL-2 (N88R, C125)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/Fc IgG1 (N297A)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/IL-33 (C208S, C227S, C232S, C259S)Фиг. 4G
21
Слитый белок IL-33 (C208S, C227S, C232S, C259S)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/Fc IgG1 (N297A)Фиг. 4J
22
Ab2HeavyIL2vC
23
Ab4HeavyIL2vC
24
Ab2HeavyIL2vC(W)
25
Ab4HeavyIL2vC(W)
26
Ab2Heavy(V)
27
Ab4Heavy(V)
28
IL2vCFc(V)
29
Ab2Kappa
30
Ab4Kappa
31
GGGGS пептидный линкер
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Конструирование ST2 и IL2R-направленных биспецифичных молекул
[000160] Были сконструированы биспецифичные молекулы, направленно взаимодействующие с ST2 (рецептор IL-33) и высокоаффинным рецептором IL-2. Все сконструированные молекулы перечислены в Таблицах 1 и 2 ниже. Их схематические диаграммы показаны на Фигурах 4 и 5.
3
[000161] Биспецифичные молекулы в Таблице 1 и на Фиг. 4 представляют собой Fc слитые белки, состоящие из направленно взаимодействующих с рецепторами фрагментов, которые являются агонистом высокоаффинного рецептора IL-2 (т.е. вариантом IL-2) и вариантом IL-33. Каждая молекула содержит моновалентные или бивалентные направленно взаимодействующих с рецепторами фрагменты на N или C-конце. Пептидный линкер (G4S) соединяет Fc-домен IgG1 человека и фрагменты, направленно взаимодействующие с рецепторами. Fc-домен содержит замену N297A для снижения связывания FcgR и C1q и, таким образом, снижения Fc эффекторных функций. Фрагмент IL-33 включает фрагмент Ser112-Thr270 IL-33 человека, который является биоактивной формой белка IL-33. Кроме того, фрагмент IL-33 содержит замены C208S, C227S, C232S и C259S. Сообщали, что замены цистеина на серин препятствуют инактивации IL-33 в результате окисления (Cohen et al., 2015, Nature Commun 6:8327; WO2016/156440). Этот вариант был выбран для облегчения продукции белков, содержащих активный вариант IL-33, в клетках НЕК293. Агонист рецептора IL-2 представляет собой вариант IL-2 человека из 133 аминокислот, содержащий замены N88R и C125S по сравнению с последовательностью человеческого IL-2 дикого типа (SEQ ID NO: 2).
3
[000162] Биспецифичные молекулы в Таблице 2 и на Фигуре 5 состоят из варианта человеческого IL-2 (N88R, C125S) и антигенсвязывающего фрагмента (Fab) антитела против ST2. Для подтверждения такой концепции, два мАт против ST2, Ab2 и Ab4, были выбраны из опубликованной заявки на патент (US2017/0002079 A1). Каждая биспецифичная молекула является либо моновалентной, либо бивалентной по сравнению с антигенсвязывающим фрагментом против ST2 и ковалентно связана с агонистом рецептора IL-2 на N- или C-конце через пептидный линкер, (G4S).
[000163] Получение гетеродимерных Fc белков может быть сложным из-за возможной контаминации гомодимерами. Все гетеродимерные молекул в данном примере имеют мутации на Fc-домене для уменьшения нежелательного гомодимерного спаривания. Мутации включают T350V, L351Y, F405A и Y407V на одной цепи; и T350V, T366L, K392L и T394W на другой цепи. Такие мутации, как сообщали, улучшали правильное спаривание и повышали стабильность (Von Kreudenstein et al., 2013, mAbs 5:646-654; WO 2014082179 A1).
Таблица 1
. Димерные белки, включающие Fc-области IgG1 человека и вариант IL-33 человека (C208S, C227S, C232S, C259S), или комбинации варианта IL-2 человека (N88R, C125S) и варианта IL-33 человека. Диаграммы белков представлены на Фигуре 4A-4J. В названиях димерных белков "N" означает N-концевое слияние с Fc-доменом, "C" означает C-концевое слияние, "M" означает моновалентный, "B" означает бивалентный, и "v" означает вариант.
<b>Димерный белок (Фигура)</b>
<b>Слитые белки</b>
<b>SEQ ID NO: </b>
IL2vNM-IL33vCM (4A)
IL-2 (N88R, C125)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/Fc IgG1 (N297A, T350V, L351Y, F405A, Y407V)
12
Fc IgG1 (N297A, T350V, T366L, K392L, T394W)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/IL-33 (C208S, C227S, C232S, C259S)
13
IL2vNM-IL33vNM (4B)
IL-2 (N88R, C125)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/Fc IgG1 (N297A, T350V, T366L, K392L, T394W)
14
IL-33 (C208S, C227S, C232S, C259S)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/Fc IgG1 (N297A, T350V, L351Y, F405A, Y407V)
15
IL33vNM-IL2vCM (4C)
Fc IgG1 (N297A, T350V, T366L, K392L, T394W)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/IL-2 (N88R, C125)
16
IL-33 (C208S, C227S, C232S, C259S)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/Fc IgG1 (N297A, T350V, L351Y, F405A, Y407V)
15
IL33vNB-IL2vCM (4D)
IL-33 (C208S, C227S, C232S, C259S)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/Fc IgG1 (N297A, T350V, T366L, K392L, T394W)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/IL-2 (N88R, C125)
17
IL-33 (C208S, C227S, C232S, C259S)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/Fc IgG1 (N297A, T350V, L351Y, F405A, Y407V)
15
IL2vNB-IL33vCM (4E)
IL-2 (N88R, C125)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/Fc IgG1 (N297A, T350V, T366L, K392L, T394W)(G4S)3 линкер/IL-33 (C208S, C227S, C232S, C259S)
18
IL-2 (N88R, C125)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/Fc IgG1 (N297A, T350V, L351Y, F405A, Y407V)
12
IL33vNB-IL2vCB (4F)
IL-33 (C208S, C227S, C232S, C259S)/(G4S)3 линкер/Fc IgG1 (N297A)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/IL-2 (N88R, C125)
19
IL-33 (C208S, C227S, C232S, C259S)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/Fc IgG1 (N297A)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/IL-2 (N88R, C125)
19
IL2vNB-IL33vCB (4G)
IL-2 (N88R, C125)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/Fc IgG1 (N297A)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/IL-33 (C208S, C227S, C232S, C259S)
20
IL-2 (N88R, C125)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/Fc IgG1 (N297A)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/IL-33 (C208S, C227S, C232S, C259S)
20
IL33vNM (4H)
Fc IgG1 (N297A, T350V, T366L, K392L, T394W)
5
IL-33 (C208S, C227S, C232S, C259S)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/Fc IgG1 (N297A, T350V, L351Y, F405A, Y407V)
15
IL33vCM (4I)
Fc IgG1 (N297A, T350V, T366L, K392L, T394W)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/IL-33 (C208S, C227S, C232S, C259S)
13
Fc IgG1 (N297A, T350V, L351Y, F405A, Y407V)
4
IL33vNB (4J)
IL-33 (C208S, C227S, C232S, C259S)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/Fc IgG1 (N297A)
21
IL-33 (C208S, C227S, C232S, C259S)/(G4S)<sub>3</sub> линкер/Fc IgG1 (N297A)
21
Таблица 2
. Димерные белки, включающие Fc-области, антигенсвязывающий фрагмент антитела против ST2 и вариант IL-2 (N88R, C125S). Диаграммы белков предоставлены на Фигуре 5A-5E.
<b>ФИГ. </b>
<b>Димерный бнлок</b>
<b>Тяжелая цепь 1 (слитый белок)</b>
<b>Тяжелая цепь 2 (слитый белок)</b>
<b>Легкие цепи</b>
5A
Ab2-IL2vCB
Ab2Heavy-IL2vC (SEQ ID NO: 22)
(такой же, как в Тяжелой цепи 1, гомодимер)
Ab2Kappa (SEQ ID NO: 29)
Ab4-IL2vCB
Ab4Heavy-IL2vC (SEQ ID NO: 23)
(такой же, как в Тяжелой цепи 1, гомодимер)
Ab4Kappa (SEQ ID NO: 30)
5B
Ab2-IL2vCM
Ab2Heavy(V) (SEQ ID NO: 26)
Ab2HeavyIL2vC(W) (SEQ ID NO: 24)
Ab2Kappa (SEQ ID NO: 29)
Ab4-IL2vCM
Ab4Heavy(V) (SEQ ID NO: 27)
Ab4HeavyIL2vC(W) (SEQ ID NO: 25)
Ab4Kappa (SEQ ID NO: 30)
5C
Ab2M-IL2vCM
Ab2Heavy(V) (SEQ ID NO: 26)
IL2vCFc(W) (SEQ ID NO: 16)
Ab2Kappa (SEQ ID NO: 29)
AB4M-IL2vCM
Ab4Heavy(V) (SEQ ID NO: 27)
IL2vCFc(W) (SEQ ID NO: 16)
Ab4Kappa (SEQ ID NO: 30)
5D
Ab2M-IL2vNM
Ab2Heavy(V) (SEQ ID NO: 26)
IL2vNFc(W) (SEQ ID NO: 14)
Ab2Kappa (SEQ ID NO: 29)
Ab4M-IL2vNM
Ab4Heavy(V) (SEQ ID NO: 27)
IL2vNFc(W) (SEQ ID NO: 14)
Ab4Kappa (SEQ ID NO: 30)
5E
Ab2M-IL2vCB
IL2vCFc(V) (SEQ ID NO: 28)
Ab2HeavyIL2vC(W) (SEQ ID NO: 24)
Ab2Kappa (SEQ ID NO: 29)
Ab4M-IL2vCB
IL2vCFc(V) (SEQ ID NO: 28)
Ab4HeavyIL2C(W) (SEQ ID NO: 25)
Ab4Kappa (SEQ ID NO: 30)
[000164] Все молекулы были получены в транзиентно трансфицированных клетках HEK293 и очищены с помощью афинной хроматографии с белком A, с последующей эксклюзионной хроматографией. Из-за значительно сниженных уровней экспрессии белков по сравнению с IL2vNM-IL33vCM (ФИГ. 4A), следующие молекулы не были включены в анализ характеристик связывания: IL33vNM-IL2vCM (ФИГ. 4C), IL33vNB-IL2vCM (ФИГ. 4D), IL2vNB-IL33vCM (ФИГ. 4E), IL33vNB-IL2vCB (ФИГ. 4F) и IL2vNB-IL33vCB (ФИГ. 4G).
Пример 2. Анализ характеристик связывания биспецифичных молекул IL33-IL2v
[000165] Связывание биспецифичных белков с внеклеточными доменами (ECD) ST2 (Sino Biological) и IL2Ra (Lake Pharma, Inc.) оценивали с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) при использовании системы BiaCore T200 (GE). Антитело против His-метки (GenScript) иммобилизировали на чипах CM4 (GE) путем ссвязывания NHS-EDC, и реакции связывания проводили в буфере HBS-EP+ (GE) при 25°C. His-меченный белок ST2 ECD захватывали на чипах, покрытых антителом против His-метки.
a
d
d
[000166] Для связывания ST2 гистидин-меченный белок ST2 ECD человека или мыши захватывали на чипе в качестве лигандов. Биспецифичные молекулы пропускали в качестве аналитов при скорости потока 50 мкл/мин в течение 60 сек и позволяли диссоциировать в течение 200 сек для человеческого ST2 и 120 секунд для мышиного ST2. Биспецифичные молекулы были подготовлены в различных концентрациях (0,12 нМ - 10 нМ путем 3-кратного разведения для взаимодействия с ST2 человека; и 2,5 нМ - 200 нМ путем 3-кратного разведения для взаимодействия с ST2 мыши). Поверхность чипа регенерировали 10 мМ глицина, pH 1,7. Сигналы ассоциации и диссоциации аппроксимировали к модели связывания 1:1 при использовании программы BiaCore Evaluation версии 2.0, с получением кинетических констант (k и k) и для вычисления констант диссоциации (K).
d
d
[000167] Сенсограммы показаны на ФИГ. 6A и 6B; и кинетические константы и константы диссоциации приведены в Таблице 3. IL2vNM-IL33vCM и IL2vNM-IL33vNM связывались с человеческим ST2 со значениями K в пределах 0,17-0,3 нМ, что было немного ниже, чем для описанного ранее взаимодействия IL-33 и ST2 (K=0,4-0,7 нМ) (Lingel et al., 2009, Structure 17(10):1398-1410; Liu et al., 2013, PNAS 110(37):14918-14923). Эти белки связывались с мышиным ST2, но с пониженной аффинностью. Все биспецифичные молекулы и моновалентные молекулы IL-33 показали сравнимую аффинность к человеческому ST2. Однако IL2vNM-IL33vCM показал более высокую аффинность (>10 раз) к мышиному ST2, чем IL2vNM-IL33NM. Кроме того, IL33vCM показал более высокую аффинность к мышиному ST2, чем IL33vNM. Это указывает, что в C-концевой ориентации IL-33 обладает более высокой аффинностью к мышиному ST2, чем N-концевой IL-33.
[000168] Кроме того, образец IL2vNM-IL33vNM содержал контаминирующий гомодимер IL2v, обнаруженный с помощью ДСН-ПААГЭ, тогда как гомодимеры не были обнаружены в образце IL2vNM-IL33vCM. В заключение, биспецифичный белок с C-концевым IL-33, IL2vNM-IL33vCM, показал более высокую аффинность к мышиному ST2 и экспрессировался в виде более гомогенного гетеродимерного белка. Поэтому его выбрали для анализов биоактивности с T-клетками мыши в Примере 4.
Таблица 3
. Анализ связывания с человеческими и мышиными белками ECD ST2
<b>Аналит</b>
<b>ST2</b>
<b>k</b><sub><b>a</b></sub><b> (1/Мс)</b>
<b>k</b><sub><b>d</b></sub><b> (1/с)</b>
<b>K</b><sub><b>d</b></sub><b> (М)</b>
IL2vNM-IL33vCM
Человек
5,15E6
8,69E-4
1,69E-10
Мышь
3,61E6
0,0492
1,36E-8
IL2vNM-IL33vNM
Человек
3,41E6
0,0010
3,02E-10
Мышь
1,17E6
0,1395
1,19E-7
IL33vNM
Человек
4,35E6
0,0012
2,74E-10
Мышь
2,33E6
0,1163
4,99E-8
IL33vCM
Человек
6,11E6
0,0011
1,74E-10
Мышь
3,85E6
0,0452
1,18E-8
Таблица 4
. Одновременное связывание белков с ECD ST2 и с ECD IL2Ra
<b>Иммобилизованный лиганд ST2</b>
<b>Аналит</b>
<b>k</b><sub><b>a</b></sub><b> (1/Мс)</b>
<b>k</b><sub><b>d</b></sub><b> (1/с)</b>
<b>K</b><sub><b>d</b></sub><b> (М)</b>
IL2vNM-IL33vCM
IL2R альфа
4,72E6
0,1236
2,62E-8
IL2vNM-IL33vNM
IL2R альфа
5,04E6
0,1575
3,25E-8
a
d
d
[000169] Для проверки, связываются ли биспецифичные молекулы одновременно и с ST2, и с IL-2R альфа, биспецифичные молекулы захватывали гистидин-меченным человеческим ST2, который был иммобилизирован на чипе. Затем человеческий IL2R альфа вводили в качестве аналита при скорости потока 50 мкл/мин в течение 50 сек и позволяли диссоциировать в течение 60 сек. IL2R альфа приготавливали в различных концентрациях (2,5 нМ - 200 нМ в 3-кратном разведении). Поверхность чипа регенерировали 10 мМ глицином, pH 1,7. Сигналы ассоциации и диссоциации аппроксимировали к модели связывания 1:1 при использовании программы BiaCore Evaluation версии 2.0 для получения кинетических констант (k и k) и вычисления констант диссоциации (K).
d
[000170] Сенсограммы показаны на ФИГ. 7, а кинетические константы и константы диссоциации приведены в Таблице 4 выше. IL2vNM-IL33vCM и IL2vNM-IL33vNM связывались с человеческим IL2R альфа со значениями K (26-32 нМ), сравнимыми со значениями, описанными ранее (Landgraf BE, et al., 1992, J Biol Chem. 267(26):18511-9; Myszka DG, et al., 1996, Protein Sci. 5(12):2468-78; Shanafelt AB, et al., 2000, Nat Biotechnol. (11):1197-202). Эти данные указывают, что фрагмент IL-2v сохраняет связывание с IL2Ra; и биспецифичные молекулы способны одновременно связываться как с ST2, так и с IL2Ra, поскольку они связывались с IL2Ra, будучи связанными с белком ST2.
Пример 3. Анализ характеристик связывания биспецифичных IL2v молекул против ST2
[000171] Связывание биспецифичных белков IL2v против ST2 с ST2 и IL2Ra человека оценивали с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) способом, аналогичным описанному в Примере 2.
a
d
d
[000172] Для связывания с ST2 гистидин-меченный белок ECD ST2 человека иммобилизировали на чипе в качестве лиганда. Биспецифичные молекулы Ab2-IL2v, которые состоят из Fab мАт против ST2 (Ab2) и IL-2v, вводили в качестве аналитов при скорости потока 50 мкл/мин в течение 400 сек и позволяли диссоциировать в течение 600 сек. Биспецифичные молекулы Ab2-IL2v приготавливали в различных концентрациях (0,012 нМ - 1 нМ в 3-кратном разведении). Биспецифичные молекулы Ab4-IL2v, которые состоят из Fab мАт против ST2, Ab4, и IL-2v, вводили в качестве аналита при скорости потока 50 мкл/мин в течение 200 сек и позволяли диссоциировать в течение 400 сек. Биспецифичные молекулы Ab4-IL2v приготавливали в различных концентрациях (0,062 нМ - 5 нМ в 3-кратном разведении). Поверхность чипа регенерировали 10 мМ глицином, рН 1,7. Сигналы ассоциации и диссоциации моновалентных биспецифичных молекул против ST2 аппроксиморовалии к модели связывания 1:1 при использовании программы BiaCore Evaluation версии 2.0 для получения кинетических констант (k и k) и вычисления констант диссоциации (K).
d
d
[000173] Сенсограммы показаны на ФИГ. 8A и 8B; и кинетические константы и константы диссоциации приведены в Таблице 5 ниже. Все биспецифичные молекулы демонстрировали явное связывание с белком ST2. Значения K моновалентных биспецифичных молекул Ab2-IL2v варьировали от 94 пМ до 137 пМ в сравнении со значением 34 пМ, приведенным в патенте US 2017/0002079 A1. Значения K моновалентных биспецифичных молекул Ab4/IL2v варьировали от 289 пМ до 378 пМ в сравнении со значением 301 пМ, приведенным в патенте US 2017/0002079 A1.
Таблица 5
. Анализ связывания с человеческим белком ECD ST2
<b>Аналит</b>
<b>Лиганд</b>
<b>k</b><sub><b>a</b></sub><b> (1/Мс)</b>
<b>k</b><sub><b>d</b></sub><b> (1/с)</b>
<b>K</b><sub><b>d</b></sub><b> (М)</b>
Ab2M-IL2vCM
ST2 человека
3,28E6
3,47E-4
1,06E-10
Ab2M-IL2vNM
ST2 человека
3,34E6
3,17E-4
9,43E-11
Ab2M-IL2vCB
ST2 человека
2,50E6
3,44E-4
1,37E-10
Ab4M-IL2vCM
ST2 человека
5,57E6
0,0020
3,68E-10
Ab4M-IL2vNM
ST2 человека
5,44E6
0,0021
3,78E-10
Ab4M-IL2vCB
ST2 человека
6,16E6
0,0018
2,89E-10
a
d
d
[000174] Для проверки, связываются ли биспецифичные молекулы одновременно и с ST2, и с IL2Ra, биспецифичные молекулы захватывали гистидин-меченным человеческим ST2, который был иммобилизирован на чипе. Затем IL2R-альфа вводили в качестве аналита при скорости потока 50 мкл/мин в течение 50 сек и позволяли диссоциировать в течение 60 сек. IL2Ra приготавливали в различных концентрациях (2,5 нМ - 200 нМ в 3-кратном разведении). Поверхность чипа регенерировали 10 мМ глицином, pH 1,7. Сигналы ассоциации и диссоциации аппроксимировали к модели связывания 1:1 при использовании программы BiaCore Evaluation версии 2.0 для получения кинетических констант (k и k) и вычисления констант диссоциации (K).
d
[000175] Сенсограммы показаны на Фигурах 9А и 9B; и кинетические константы и константы диссоциации приведены в Таблице 6 ниже. Все они связывались с человеческим IL2R-альфа со значениями K (25-43 нМ), сопоставимыми со значениями, которые сообщали ранее. Это указывает на то, что фрагмент IL2v сохраняет связывание с IL2Ra; и биспецифичные молекулы способны одновременно связываться как с ST2, так и с IL2Ra, поскольку они демонстрировали связывание с IL2Ra, будучи связанными с белком ST2.
Таблица 6
. Одновременное связывание белков с ECD ST2 и с ECD IL2Ra
<b>Аналит</b>
<b>ST2-связанный лиганд</b>
<b>k</b><sub><b>a</b></sub><b> (1/Мс)</b>
<b>k</b><sub><b>d</b></sub><b> (1/с)</b>
<b>K</b><sub><b>d</b></sub><b> (М)</b>
IL2R-альфа человека
Ab2M-IL2vCM
6,73E6
0,1819
2,70E-8
IL2R-альфа человека
Ab2M-IL2vNM
6,26E6
0,1550
2,48E-8
IL2R-альфа человека
Ab2M-IL2vCB
5,78E6
0,1885
3,26E-8
IL2R-альфа человека
Ab4M-IL2vCM
9,84E6
0,2513
2,55E-8
IL2R-альфа человека
Ab4M-IL2vNM
7,14E6
0,1788
2,51E-8
IL2R-альфа человека
Ab4M-IL2vCB
5,27E6
0,2002
3,80E-8
IL2R-альфа человека
Ab2-IL2vCB
4,59E6
0,1633
3,56E-8
IL2R-альфа человека
Ab2-IL2vCM
5,13E6
0,1677
3,27E-8
IL2R-альфа человека
Ab4-IL2vCB
4,55E6
0,1944
4,27E-8
IL2R-альфа человека
Ab4-IL2vCM
6,26E6
0,2568
4,10E-8
Пример 4. Активность IL2vNM-IL33vCM на мышиных ST2+ Treg-клетках
[000176] Активация T-клеток под действием IL-2 может быть установлена при определении уровня фосфорилированного STAT5 (pSTAT5) в клетках. pSTAT5 измеряли при окрашивании клеток антителом против pSTAT5 и затем выделяли различные субпопуляции лимфоцитов с помощью проточной цитометрии.
[000177] ST2+ Treg обнаружены в нескольких человеческих тканях на высоком уровне, но присутствуют в крови с очень низкой частотой, <0,01%. Из-за сложности получения тканей от человеческих доноров, действие IL2vNM-IL33vCM сначала оценивали на ST2+ Treg из селезенки мыши, в которой были определены более высокие уровни ST2+ Treg (5-10% Treg), выше, чем обнаруженные в крови (0,1-1,0% Treg). Селезенки извлекали у мышей C57Bl/6J и стимулировали суспензии отдельных клеток различными концентрациями одного из IL2vNM (моновалентный Fc-слитый белок на основе варианта IL-2), IL33vCM (моновалентный Fc-слитый белок на основе варианта IL-33) или биспецифичного IL2vNM-IL33vCM (ФИГ. 10). Активация Treg под действием IL-2 может быть измерена при определении уровня внутриклеточного фосфорилированного STAT5 (pSTAT5) с помощью проточной цитометрии. IL33vCM индуцировал низкие уровни pSTAT5 только при высоких, нефизиологических концентрациях (10-100 нМ, ФИГ. 8B). Напротив, IL2vNM индуцировал pSTAT5 при намного более низких концентрациях, с EC50 2,4 нМ на ST2+ Treg (ФИГ. 8A) и EC50 0,86 нМ на ST2- Treg (ФИГ. 8B). Биспецифичный белок IL2vNM-IL33vCM повышал индукцию pSTAT5 в ST2+ Treg, выше уровней, наблюдаемых с белками IL33vCM или IL2vNM по отдельности (ФИГ. 8A), но не на ST2- Treg (ФИГ. 8B). EC50 в отношении IL2vNM-IL33vCM в этом анализе составлял 0,26 нМ, что было приблизительно в 10 раз ниже, чем EC50 IL2vNM. В заключение, IL2vNM-IL33vCM сильнее индуцировал pSTAT5 в ST2+ Treg, чем ST2- Treg, демонстрируя, что биспецифичная молекула преимущественно активирует ST2+ Treg.
Пример 5. Фрагменты IL-33, расположенные на C-конце относительно Fc-области, являются более активными
[000178] Связывание IL-33 с ST2 и комплексом IL1RAcP активирует сигнализацию через адаптер MyD88. Механизмы сигнализации IL-33 и нижестоящие эффекты варьируют в различных типах клеток. Поэтому сигнальная репортерная клеточная линия была выбрана для измерения биоактивности белков, содержащих фрагменты IL-33. Репортерная клеточная линия HEK-Blue-IL-33™ (InVivoGen Inc) является линией клеток на основе HEK293 с повышенной экспрессией рецепторов IL-33 человека, которая является чувствительным индикатором активности IL-33. Активность IL-33-содержащих молекул, перечисленных в Таблице 1, исследовали на их способность стимулировать сигнализацию IL-33 в HEK-Blue-IL-33™ клетках согласно методике производителя.
[000179] При сравнении моновалентных молекул IL-33v, EC50 IL-33vCM была в три раза выше, чем у IL-33vNM (0,016 пМ в сравнении с 0,053 пМ, Таблица 7, Фиг. 11A). Добавление дополнительного фрагмента IL-33 на N-конец молекулы IL-33vNM не увеличило EC50 (0,059 пМ для IL-33vNB в сравнении с 0,053 пМ для IL-33vNM). Биспецифичные молекулы как с IL-2v, так и с IL-33v, слитыми с N-концом Fc-домена через пептидный линкер (IL2vNM-IL33vNM), обладали значительно более низкой активностью IL-33, чем моновалентный IL-33vNM (0,128 пМ в сравнении с 0,053 пМ, Фиг. 11), что указывает на потерю активности из-за присутствия обоих фрагментов на N-конце Fc-домена. Однако биспецифичные молекулы с IL-2 на N-конце относительно Fc-домена и IL-33 на C-конце относительно Fc-домена (IL2vNM-IL33vCM) обладали лучшей активностью, чем любая из молекул с IL-33 на N-конце Fc-домена (Таблица 7, 0,03 пМ, Фиг. 11B), и имели лишь двукратное снижение активности по сравнению с моновалентным IL-33 на C-конце относительно Fc-домена (IL-33vCM).
[000180] По аналогии с кинетическим анализом в Примере 2, эти анализы установили, что IL2vNM-IL33vCM, с IL-33 на C-конце от Fc-домена, обладал превосходной биоактивностью IL-33 по сравнению с IL2vNM-IL33vNM (ФИГ. 11). Поэтому молекула IL2vNM-IL33vCM была выбрана для дальнейших исследований с мышиными регуляторными T-клетками, как описано выше в Примере 4.
Таблица 7. EC50 в анализе биоактивности IL-33
Белок
EC50 [пМ]
IL-33vNM
0,053
IL-33vCM
0,016
IL-33vNB
0,059
IL2vNM-IL33vNM
0,128
IL2vNM-IL33vCM
0,03
Пример 6. Активность биспецифичных молекул IL2/IL-33 у нормальных мышей (предполагаемая)
[000181] Для определения их активности в отношении популяций Treg у нормальных мышей, мышам BALB/c будут вводить внутривенно однократную дозу 0,001, 0,01 или 0,1 мг/кг одного из IL2vNM, IL33vCM или биспецифичного IL2vNM-IL33vCM белков (например, ФИГ. 4A). Селезенки и печень будут собирать через 2, 4, 6 или 8 дней после обработки и определять количество и процентное содержание (в процентах от CD4 клеток) ST2+ Treg. Кроме того, пролиферативный индекс субпопуляций ST2+ и ST2- Treg будут определять с помощью внутриклеточного окрашивания клеток антителом к Ki67.
[000182] Если биспецифичный IL2vNM-IL33vCM обладает большей селективностью в отношении ST2+ Treg, чем белки IL2vNM и IL33vCM, будет наблюдаться более интенсивное размножение ST2+ Treg, чем ST2- Treg, при обработке биспецифичным белком по сравнению с IL2vNM и IL33vCM. Увеличение пролиферативного индекса, отражаемое процентом Ki67+ клеток, также будет наблюдаться в результате обработки биспецифичными белками по сравнению с IL2vNM или IL33vCM. Действие белков на Treg может быть коррелировано с фармакокинетикой вводимых белков. Образцы крови, забранные после введения, будут оценивать с помощью количественного иммуноанализа с целью определения фармакокинетики вводимых молекул.
Пример 7.
Активность в моделях воспаления мышц (предполагаемая)
mdx
mdx
[000183] Роль ST2+ Treg была установлена в моделях мышечного воспаления на животных. Одной из этих моделей на животных является острое повреждение мышц (Burzyn et al., 2013, Cell 155(6):1282-1295) у мышей дикого типа, а второй моделью является модель мышечной дистрофии у мышей , модель хронического мышечного воспаления, вызванного генетической недостаточностью дистрофина (мыши ; Villalta et al., 2014, Sci Transl Med 5(258):258ra142).
[000184] Острое мышечное повреждение будет инициировано у мышей путем введения кардиотоксина в мышцы задних конечностей мышей C57Bl/6J, как описано в публикации Burzyn et al. (цитируемой выше). Введение 0,1 мг/кг биспецифичных молекул IL-2-IL-33 (например, Фиг. 4A и 4B) будет начато в день повреждения и сделано повторно в день 7. Мыши будут умерщвлены в день 1, 4, 7 и 14, и количество Treg, Teff и других инфильтрующих иммунных клеток в мышцах будет определено с помощью проточной цитометрии. Продукция амфирегулина (AREG) клетками Treg является ключевым медиатором восстановления мышц (Burzyn et al., цитируется выше), и частота AREG+ Treg и пролиферативный индекс (Ki67+Treg) будут определять с помощью внутриклеточной проточной цитометрии. Также будут оценивать показатели повреждения и восстановления мышц, такие как уровни креатинкиназы в сыворотке и морфологию мышечных волокон.
mdx
mdx
[000185] Для модели мышечной дистрофии на мышах , лечение мышей  будут начинать в возрасте 2 недель. Мышам будут еженедельно вводить 0,1 мг/кг тестируемых белков и умерщвлять в возрасте 6 недель. Количество и частоту пролиферирующих Treg (Ki67+) и AREG+ Treg будут измерять в мышцах обработанных мышей по сравнению с контрольными необработанными животными такого же возраста.
[000186] Успешная активация ST2+ Treg клеток приведет к количественному увеличению Treg, увеличению доли Ki67+ Treg или увеличению доли AREG+ Treg в мышцах. Кроме того, у мышей может наблюдаться снижение Teff-клеток, снижение креатинкиназы в сыворотке и улучшение морфологии мышц.
Пример 8. Активность в моделях воспалительного заболевания кишечника (предполагаемая)
[000187] Роль ST2+ Treg была установлена в модели воспалительного заболевания кишечника на мышах (Schiering et al., 2014, Nature 513(7519):564-568). Влияние тестируемых белков на ST2+ Treg в ткани толстой кишки будут исследовать в модели острого воспалительного заболевания кишечника. Мыши C57Bl/6J будут получать 3% декстрансульфат натрия (DSS) в питьевой воде в течение 7 дней. Мышам будут вводить в/в, в/б или п/к 0,1 или 0,4 мг/кг биспецифичных молекул IL-2/IL-33 (например, Фиг. 4A и 4B) в день 1 и день 4 обработки DSS, при этом обработку DSS будут начинать в день 1. После 7 дней обработки DSS мышей будут умерщвлять и собирать селезенку, толстую кишку и брыжеечные лимфатические узлы (MLN). Срезы толстой кишки будут исследовать в гистологическом исследовании для оценки тяжести заболевания и колита. Популяции ST2+ Treg клеток будут измерять в селезенке, толстой кишке и MLN.
[000188] Успешное лечение может привести к снижению потери веса Tre, улучшению оценок заболевания или гистологии у обработанных мышей по сравнению с контрольными животными. Улучшение заболевания может сопровождаться специфическим увеличением Ki67+ пролиферирующих ST2+ Treg в толстой кишке и MLN обработанных мышей.
[000189] Хотя в настоящем документе были показаны и описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, специалистам в данной области будет очевидно, что такие варианты осуществления представлены лишь в качестве примера. Специалистам в данной области будут очевидны многочисленные вариации, изменения и замены без отступления от изобретения. Следует понимать, что различные альтернативы вариантам осуществления изобретения, описанным в настоящем документе, могут использоваться при практическом осуществлении изобретения. Предполагается, что следующая формула изобретения определяет объем изобретения, и что таким образом охватываются способы и структуры в пределах объема этой формулы изобретения, а также их эквиваленты.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ДЕЛИНИА, ИНК.
<120> Поливалентные модуляторы регуляторных T-клеток
<130> 127754-00520
<140> PCT/US2017/066163
<141> 2017-12-13
<150> 62/433,533
<151> 2016-12-27
<160> 31
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 133
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IL2 N88R C125S мутант
<400> 1
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20                  25                  30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Arg Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 2
<211> 133
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 2
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20                  25                  30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 3
<211> 133
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IL2 T3A, N88R, C125S мутант
<400> 3
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20                  25                  30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Arg Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 4
<211> 226
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IgG1 Fc N297A, T350V, L351Y, F405A, Y407V мутант
<400> 4
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20                  25                  30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35                  40                  45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50                  55                  60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85                  90                  95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100                 105                 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115                 120                 125
Tyr Val Tyr Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130                 135                 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145                 150                 155                 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165                 170                 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ala Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180                 185                 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195                 200                 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210                 215                 220
Pro Gly
225
<210> 5
<211> 226
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IgG1 Fc N297A, T350V, T366L, K392L, T394W мутант
<400> 5
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20                  25                  30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35                  40                  45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50                  55                  60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85                  90                  95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100                 105                 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115                 120                 125
Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130                 135                 140
Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145                 150                 155                 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro
165                 170                 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180                 185                 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195                 200                 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210                 215                 220
Pro Gly
225
<210> 6
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Пептидный линкер
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
<210> 7
<211> 226
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IgG1 Fc 297A мутант
<400> 7
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20                  25                  30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35                  40                  45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50                  55                  60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85                  90                  95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100                 105                 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115                 120                 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130                 135                 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145                 150                 155                 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165                 170                 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180                 185                 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195                 200                 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210                 215                 220
Pro Gly
225
<210> 8
<211> 226
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IgG1 Fc T366Y мутант
<400> 8
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20                  25                  30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35                  40                  45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50                  55                  60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85                  90                  95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100                 105                 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115                 120                 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130                 135                 140
Leu Tyr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145                 150                 155                 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165                 170                 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180                 185                 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195                 200                 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210                 215                 220
Pro Gly
225
<210> 9
<211> 226
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IgG1 Fc Y407T мутант
<400> 9
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20                  25                  30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35                  40                  45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50                  55                  60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85                  90                  95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100                 105                 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115                 120                 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130                 135                 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145                 150                 155                 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165                 170                 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Thr Ser Lys Leu Thr Val
180                 185                 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195                 200                 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210                 215                 220
Pro Gly
225
<210> 10
<211> 159
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 10
Ser Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser
1               5                   10                  15
Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr
20                  25                  30
Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val
35                  40                  45
Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp
50                  55                  60
Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp
65                  70                  75                  80
Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys
85                  90                  95
Cys Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met
100                 105                 110
His Ser Asn Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe
115                 120                 125
Ile Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser Ser
130                 135                 140
Glu Asn Leu Cys Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr
145                 150                 155
<210> 11
<211> 159
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IL33 C208S, C227S, C232S, C259S мутант
<400> 11
Ser Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser
1               5                   10                  15
Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr
20                  25                  30
Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val
35                  40                  45
Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp
50                  55                  60
Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp
65                  70                  75                  80
Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys
85                  90                  95
Ser Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met
100                 105                 110
His Ser Asn Ser Val Ser Phe Glu Ser Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe
115                 120                 125
Ile Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser Ser
130                 135                 140
Glu Asn Leu Ser Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr
145                 150                 155
<210> 12
<211> 374
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IL2vN Fc цепь
<400> 12
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20                  25                  30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Arg Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130                 135                 140
Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
145                 150                 155                 160
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
165                 170                 175
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
180                 185                 190
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
195                 200                 205
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
210                 215                 220
Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
225                 230                 235                 240
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
245                 250                 255
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
260                 265                 270
Glu Pro Gln Val Tyr Val Tyr Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
275                 280                 285
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
290                 295                 300
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
305                 310                 315                 320
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ala Leu Val Ser
325                 330                 335
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
340                 345                 350
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
355                 360                 365
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
370
<210> 13
<211> 400
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IL-33 Fc слитый белок
<400> 13
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20                  25                  30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35                  40                  45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50                  55                  60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85                  90                  95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100                 105                 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115                 120                 125
Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130                 135                 140
Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145                 150                 155                 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro
165                 170                 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180                 185                 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195                 200                 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210                 215                 220
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225                 230                 235                 240
Ser Ser Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu
245                 250                 255
Ser Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser
260                 265                 270
Tyr Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys
275                 280                 285
Val Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly
290                 295                 300
Asp Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys
305                 310                 315                 320
Asp Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His
325                 330                 335
Lys Ser Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn
340                 345                 350
Met His Ser Asn Ser Val Ser Phe Glu Ser Lys Thr Asp Pro Gly Val
355                 360                 365
Phe Ile Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser
370                 375                 380
Ser Glu Asn Leu Ser Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr
385                 390                 395                 400
<210> 14
<211> 374
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IL-2 Fc слитый белок
<400> 14
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20                  25                  30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Arg Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130                 135                 140
Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
145                 150                 155                 160
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
165                 170                 175
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
180                 185                 190
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
195                 200                 205
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
210                 215                 220
Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
225                 230                 235                 240
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
245                 250                 255
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
260                 265                 270
Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
275                 280                 285
Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
290                 295                 300
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Leu
305                 310                 315                 320
Thr Trp Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
325                 330                 335
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
340                 345                 350
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
355                 360                 365
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
370
<210> 15
<211> 400
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IL33 Fc слитый белок
<400> 15
Ser Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser
1               5                   10                  15
Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr
20                  25                  30
Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val
35                  40                  45
Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp
50                  55                  60
Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp
65                  70                  75                  80
Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys
85                  90                  95
Ser Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met
100                 105                 110
His Ser Asn Ser Val Ser Phe Glu Ser Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe
115                 120                 125
Ile Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser Ser
130                 135                 140
Glu Asn Leu Ser Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr Gly
145                 150                 155                 160
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys
165                 170                 175
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
180                 185                 190
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
195                 200                 205
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
210                 215                 220
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
225                 230                 235                 240
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val
245                 250                 255
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
260                 265                 270
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
275                 280                 285
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val
290                 295                 300
Tyr Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
305                 310                 315                 320
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
325                 330                 335
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
340                 345                 350
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ala Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
355                 360                 365
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
370                 375                 380
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
385                 390                 395                 400
<210> 16
<211> 374
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IL2 Fc слитый белок
<400> 16
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20                  25                  30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35                  40                  45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50                  55                  60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85                  90                  95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100                 105                 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115                 120                 125
Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130                 135                 140
Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145                 150                 155                 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro
165                 170                 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180                 185                 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195                 200                 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210                 215                 220
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225                 230                 235                 240
Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu
245                 250                 255
His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
260                 265                 270
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro
275                 280                 285
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu
290                 295                 300
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His
305                 310                 315                 320
Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Arg Ile Asn Val Ile Val Leu Glu
325                 330                 335
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr
340                 345                 350
Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser
355                 360                 365
Ile Ile Ser Thr Leu Thr
370
<210> 17
<211> 548
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IL33 Fc IL2 слитый белок
<400> 17
Ser Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser
1               5                   10                  15
Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr
20                  25                  30
Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val
35                  40                  45
Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp
50                  55                  60
Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp
65                  70                  75                  80
Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys
85                  90                  95
Ser Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met
100                 105                 110
His Ser Asn Ser Val Ser Phe Glu Ser Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe
115                 120                 125
Ile Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser Ser
130                 135                 140
Glu Asn Leu Ser Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr Gly
145                 150                 155                 160
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys
165                 170                 175
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
180                 185                 190
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
195                 200                 205
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
210                 215                 220
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
225                 230                 235                 240
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val
245                 250                 255
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
260                 265                 270
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
275                 280                 285
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val
290                 295                 300
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu
305                 310                 315                 320
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
325                 330                 335
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro Val Leu
340                 345                 350
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
355                 360                 365
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
370                 375                 380
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
385                 390                 395                 400
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
405                 410                 415
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
420                 425                 430
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
435                 440                 445
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
450                 455                 460
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
465                 470                 475                 480
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
485                 490                 495
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Arg Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
500                 505                 510
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
515                 520                 525
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
530                 535                 540
Ser Thr Leu Thr
545
<210> 18
<211> 548
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IL2 Fc IL33 слитый белок
<400> 18
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20                  25                  30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Arg Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130                 135                 140
Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
145                 150                 155                 160
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
165                 170                 175
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
180                 185                 190
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
195                 200                 205
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
210                 215                 220
Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
225                 230                 235                 240
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
245                 250                 255
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
260                 265                 270
Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
275                 280                 285
Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
290                 295                 300
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Leu
305                 310                 315                 320
Thr Trp Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
325                 330                 335
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
340                 345                 350
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
355                 360                 365
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
370                 375                 380
Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr
385                 390                 395                 400
Leu Ala Ser Leu Ser Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu
405                 410                 415
Glu Asp Glu Ser Tyr Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu
420                 425                 430
Lys Lys Asp Lys Val Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser
435                 440                 445
Asn Glu Ser Gly Asp Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu
450                 455                 460
Ser Pro Thr Lys Asp Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser
465                 470                 475                 480
Val Glu Leu His Lys Ser Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe
485                 490                 495
Val Leu His Asn Met His Ser Asn Ser Val Ser Phe Glu Ser Lys Thr
500                 505                 510
Asp Pro Gly Val Phe Ile Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile
515                 520                 525
Lys Val Asp Ser Ser Glu Asn Leu Ser Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys
530                 535                 540
Leu Ser Glu Thr
545
<210> 19
<211> 548
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IL33 Fc IL2 слитый белок
<400> 19
Ser Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser
1               5                   10                  15
Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr
20                  25                  30
Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val
35                  40                  45
Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp
50                  55                  60
Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp
65                  70                  75                  80
Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys
85                  90                  95
Ser Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met
100                 105                 110
His Ser Asn Ser Val Ser Phe Glu Ser Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe
115                 120                 125
Ile Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser Ser
130                 135                 140
Glu Asn Leu Ser Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr Gly
145                 150                 155                 160
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys
165                 170                 175
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
180                 185                 190
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
195                 200                 205
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
210                 215                 220
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
225                 230                 235                 240
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val
245                 250                 255
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
260                 265                 270
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
275                 280                 285
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
290                 295                 300
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
305                 310                 315                 320
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
325                 330                 335
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
340                 345                 350
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
355                 360                 365
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
370                 375                 380
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
385                 390                 395                 400
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
405                 410                 415
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
420                 425                 430
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
435                 440                 445
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
450                 455                 460
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
465                 470                 475                 480
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
485                 490                 495
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Arg Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
500                 505                 510
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
515                 520                 525
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
530                 535                 540
Ser Thr Leu Thr
545
<210> 20
<211> 548
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IL2 Fc IL33 слитый белок
<400> 20
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20                  25                  30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Arg Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130                 135                 140
Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
145                 150                 155                 160
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
165                 170                 175
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
180                 185                 190
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
195                 200                 205
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
210                 215                 220
Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
225                 230                 235                 240
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
245                 250                 255
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
260                 265                 270
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
275                 280                 285
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
290                 295                 300
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
305                 310                 315                 320
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
325                 330                 335
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
340                 345                 350
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
355                 360                 365
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
370                 375                 380
Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr
385                 390                 395                 400
Leu Ala Ser Leu Ser Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu
405                 410                 415
Glu Asp Glu Ser Tyr Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu
420                 425                 430
Lys Lys Asp Lys Val Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser
435                 440                 445
Asn Glu Ser Gly Asp Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu
450                 455                 460
Ser Pro Thr Lys Asp Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser
465                 470                 475                 480
Val Glu Leu His Lys Ser Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe
485                 490                 495
Val Leu His Asn Met His Ser Asn Ser Val Ser Phe Glu Ser Lys Thr
500                 505                 510
Asp Pro Gly Val Phe Ile Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile
515                 520                 525
Lys Val Asp Ser Ser Glu Asn Leu Ser Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys
530                 535                 540
Leu Ser Glu Thr
545
<210> 21
<211> 400
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IL33 Fc слитый белок
<400> 21
Ser Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser
1               5                   10                  15
Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr
20                  25                  30
Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val
35                  40                  45
Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp
50                  55                  60
Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp
65                  70                  75                  80
Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys
85                  90                  95
Ser Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met
100                 105                 110
His Ser Asn Ser Val Ser Phe Glu Ser Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe
115                 120                 125
Ile Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser Ser
130                 135                 140
Glu Asn Leu Ser Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr Gly
145                 150                 155                 160
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys
165                 170                 175
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
180                 185                 190
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
195                 200                 205
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
210                 215                 220
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
225                 230                 235                 240
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val
245                 250                 255
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
260                 265                 270
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
275                 280                 285
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
290                 295                 300
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
305                 310                 315                 320
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
325                 330                 335
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
340                 345                 350
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
355                 360                 365
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
370                 375                 380
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
385                 390                 395                 400
<210> 22
<211> 598
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Ab2HeavyIL2vC
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Arg Phe Ser Pro Ser Phe
50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg His Gly Thr Ser Ser Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115                 120                 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130                 135                 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180                 185                 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195                 200                 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210                 215                 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225                 230                 235                 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245                 250                 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260                 265                 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275                 280                 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr
290                 295                 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305                 310                 315                 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325                 330                 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340                 345                 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355                 360                 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370                 375                 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385                 390                 395                 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405                 410                 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420                 425                 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435                 440                 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450                 455                 460
Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu
465                 470                 475                 480
His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
485                 490                 495
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro
500                 505                 510
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu
515                 520                 525
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His
530                 535                 540
Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Arg Ile Asn Val Ile Val Leu Glu
545                 550                 555                 560
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr
565                 570                 575
Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser
580                 585                 590
Ile Ile Ser Thr Leu Thr
595
<210> 23
<211> 594
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Ab4HeavyIL2vC
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Val Ser Gly Phe Ile Leu Thr Glu Leu
20                  25                  30
Ser Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Lys Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Trp Trp Asp Phe His Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115                 120                 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130                 135                 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145                 150                 155                 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165                 170                 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180                 185                 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195                 200                 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210                 215                 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225                 230                 235                 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245                 250                 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260                 265                 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275                 280                 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290                 295                 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305                 310                 315                 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325                 330                 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340                 345                 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355                 360                 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370                 375                 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385                 390                 395                 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405                 410                 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420                 425                 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly
435                 440                 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr
450                 455                 460
Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu
465                 470                 475                 480
Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys
485                 490                 495
Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr
500                 505                 510
Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu
515                 520                 525
Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg
530                 535                 540
Asp Leu Ile Ser Arg Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser
545                 550                 555                 560
Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val
565                 570                 575
Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr
580                 585                 590
Leu Thr
<210> 24
<211> 598
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Ab2HeavyIL2vC(W)
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Arg Phe Ser Pro Ser Phe
50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg His Gly Thr Ser Ser Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115                 120                 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130                 135                 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180                 185                 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195                 200                 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210                 215                 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225                 230                 235                 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245                 250                 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260                 265                 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275                 280                 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr
290                 295                 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305                 310                 315                 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325                 330                 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340                 345                 350
Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355                 360                 365
Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370                 375                 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro
385                 390                 395                 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405                 410                 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420                 425                 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435                 440                 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450                 455                 460
Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu
465                 470                 475                 480
His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
485                 490                 495
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro
500                 505                 510
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu
515                 520                 525
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His
530                 535                 540
Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Arg Ile Asn Val Ile Val Leu Glu
545                 550                 555                 560
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr
565                 570                 575
Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser
580                 585                 590
Ile Ile Ser Thr Leu Thr
595
<210> 25
<211> 594
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Ab4HeavyIL2vC(W)
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Val Ser Gly Phe Ile Leu Thr Glu Leu
20                  25                  30
Ser Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Lys Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Trp Trp Asp Phe His Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115                 120                 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130                 135                 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145                 150                 155                 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165                 170                 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180                 185                 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195                 200                 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210                 215                 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225                 230                 235                 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245                 250                 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260                 265                 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275                 280                 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290                 295                 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305                 310                 315                 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325                 330                 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro
340                 345                 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu
355                 360                 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370                 375                 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro Val Leu Asp Ser
385                 390                 395                 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405                 410                 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420                 425                 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly
435                 440                 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr
450                 455                 460
Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu
465                 470                 475                 480
Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys
485                 490                 495
Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr
500                 505                 510
Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu
515                 520                 525
Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg
530                 535                 540
Asp Leu Ile Ser Arg Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser
545                 550                 555                 560
Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val
565                 570                 575
Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr
580                 585                 590
Leu Thr
<210> 26
<211> 450
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Ab2Heavy(V)
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Arg Phe Ser Pro Ser Phe
50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg His Gly Thr Ser Ser Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115                 120                 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130                 135                 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180                 185                 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195                 200                 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210                 215                 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225                 230                 235                 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245                 250                 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260                 265                 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275                 280                 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr
290                 295                 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305                 310                 315                 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325                 330                 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340                 345                 350
Tyr Val Tyr Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355                 360                 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370                 375                 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385                 390                 395                 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ala Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405                 410                 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420                 425                 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435                 440                 445
Pro Gly
450
<210> 27
<211> 446
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Ab4Heavy(V)
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Val Ser Gly Phe Ile Leu Thr Glu Leu
20                  25                  30
Ser Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Lys Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Trp Trp Asp Phe His Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115                 120                 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130                 135                 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145                 150                 155                 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165                 170                 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180                 185                 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195                 200                 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210                 215                 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225                 230                 235                 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245                 250                 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260                 265                 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275                 280                 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290                 295                 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305                 310                 315                 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325                 330                 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Tyr Pro
340                 345                 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355                 360                 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370                 375                 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385                 390                 395                 400
Asp Gly Ser Phe Ala Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405                 410                 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420                 425                 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435                 440                 445
<210> 28
<211> 374
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IL2vCFc(V)
<400> 28
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20                  25                  30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35                  40                  45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50                  55                  60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85                  90                  95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100                 105                 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115                 120                 125
Tyr Val Tyr Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130                 135                 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145                 150                 155                 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165                 170                 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ala Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180                 185                 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195                 200                 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210                 215                 220
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225                 230                 235                 240
Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu
245                 250                 255
His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
260                 265                 270
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro
275                 280                 285
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu
290                 295                 300
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His
305                 310                 315                 320
Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Arg Ile Asn Val Ile Val Leu Glu
325                 330                 335
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr
340                 345                 350
Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser
355                 360                 365
Ile Ile Ser Thr Leu Thr
370
<210> 29
<211> 214
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Ab2Kappa
<400> 29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Asp Asn Phe Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 30
<211> 219
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Ab4Kappa
<400> 30
Asp Phe Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85                  90                  95
Ile Gln Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210> 31
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Пептидный линкер
<400> 31
Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<---