Состояние коры надпочечников и динамика содержания оксипролина у крыс при термическом воздействии

УДК 612.751.3

СОСТОЯНИЕ КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ И ДИНАМИКА СОДЕРЖАНИЯ ОКСИПРОЛИНА У КРЫС ПРИ ТЕРМИЧЕСКОМ ВОЗДЕЙСТВИИ

© 2006 В.Г.Подковкин, Д.Г.Иванов1

В работе исследовано изменение состояния надпочечников и содержания свободного и белковосвязанного оксипролина в плазме крови крыс в результате ежедневного температурного воздействия. Для характеристики состояния надпочечников определяли массу железы, содержание адреналина, но-радреналина в надпочечниках и 11-оксикортикостероидов в надпочечниках плазме крови и печени. Показана волнообразная динамика изменения этих показателей и корреляция между изменением уровня 11-оксикортикостерои-дов в надпочечниках и белковосвязанного оксипролина в плазме.

Введение

В экспериментальной практике часто возникает необходимость в отработке методов создания модельных ситуаций тех или иных патологических процессов для возможности их дальнейшего исследования. В целях испытания лекарственных препаратов, предотвращающих различного рода остеопении, и биокерамики, используемой в ортопедической практике, становится актуальной разработка экспериментальных моделей развития различного рода остеопений у лабораторных животных.

В настоящее время предложено несколько способов индукции резорбции костной ткани в эксперименте: овариоэктомия и гастроэктомия, введение глюкокор-тикоидов и гепарина, имобилизация и др. [11—14]. В их числе предложен способ температурного воздействия на животных.

Влияние температурного стресса у крыс на обмен костной ткани было показано ранее [7]. Однако в этой работе были использованы двухнедельные сроки температурного воздействия на крыс и не показана динамика развития остеопо-ротических изменений в кости. В целях лабораторного моделирования остеопороза и исследования механизма развития остеопении на ранних этапах температурного воздействия представляется интересным исследовать динамику развития резорбции костной ткани крыс в более короткие сроки температурного воздействия.

Кроме того, в работе [7] показано стрессовое воздействие температуры на лабораторных животных и сделано предположение в пользу того, что остеопения развивается в результате температурного воздействия за счет повышения содержания глюкокортикоидов в организме животного. Поэтому параллельно с маркерами резорбции костной ткани необходимо диагностировать состояние надпочечников.

1 Подковкин Владимир Георгиевич (podkovkin@rambler.ru), Иванов Дмитрий Геннадьевич (dg1983@rambler.ru), кафедра биохимии Самарского государственного университета, 443011, Россия, г.Самара, ул. Акад. Павлова, 1.

Целью нашей работы было исследовать состояние надпочечников и концентрацию оксипролина в крови лабораторных животных в результате температурного воздействия.

1. Материалы и методы

Исследования проведены на лабораторных беспородных крысах-самцах массой 80-110 г.

В эксперименте исследовали две группы животных. Животные первой группы помещались в камеру с температурой воздуха 70 °С ежедневно в течение 9 суток. Продолжительность воздействия составляла 9 мин, а затем увеличивалась на 15 секунд ежедневно.

Животные второй группы служили контролем. Контрольных животных содержали в аналогичных условиях в клетках, находившихся в том же помещении. Все животные получали одинаковое питание.

Животных выводили из эксперимента путем декапитации на третьи, пятые, седьмые и девятые сутки. Одновременно с животными опытной группы забивали одно или два животных контрольной группы. Забитых животных взвешивали и определяли среднюю массу в группах. Масса забитых в различные сроки животных опытной группы не отличалась значимо между собой и от средней массы животных контрольной группы.

У декапитированных животных отбирали на анализ печень, надпочечники и плазму.

Надпочечники взвешивали, и гомогенизировали. Содержание 11-оксикортико-стероидов определяли в левом надпочечнике, плазме крови и печени по методу Ю.А.Панкова, И.Я. Усватовой, в модификации В.Г. Подковкина [5]. Концентрацию адреналина и норадреналина определяли в правом надпочечнике по методу Э.Ш.Матлиной и соавт., в модификации В.Г. Подковкина [6]. Свободный и бел-ковосвязанный оксипролин определяли в плазме крови по реакции с п-диметил-аминобензальдегидом [8].

Полученные результаты были обработаны с помощью стандартного ¿-критерия Стьюдента и с помощью корреляционного анализа [10].

2. Результаты

В эксперименте масса надпочечников значимо возрастала относительно контроля у крыс забитых на пятые и седьмые сутки эксперимента. На девятые сутки этот показатель снижался и не отличался значимо от контроля. На третьи сутки нагрева масса надпочечников животных опытной группы была ниже массы надпочечников животных контрольной группы.

Содержание катехоламинов в надпочечниках крыс на протяжении всего времени нагрева имело волнообразную динамику. Концентрация адреналина в правой железе значимо снижалась относительно контроля на третьи и седьмые сутки температурного воздействия, а на пятые и девятые сутки эксперимента эти показатели не отличались от контроля достоверно. Уровень норадреналина в правом надпочечнике опытных животных на протяжении всего эксперимента не имел значимых отличий от контроля. При этом можно отметить тенденцию к увеличению содержания норадреналина в железе на третьи сутки температурного воздей-

ствия и снижение концентрации этого гормона в последующие дни эксперимента (табл. 1).

Мы наблюдали волнообразную динамику 11-оксикортикостероидов в эксперименте. У животных забитых на третьи, седьмые и девятые сутки содержание 11-оксикортикостероидов в надпочечниках было выше относительно содержания 11-оксикортикостероидов в надпочечниках контрольной группы. При этом у животных забитых на пятые сутки эксперимента этот показатель снижался относительно контрольной группы. Содержание 11-оксикортикостероидов в плазме крови животных экспериментальных групп не отличалось достоверно от уровня 11-окси-кортикостероидов в плазме крови животных контрольной группы, кроме животных забитых на девятые сутки эксперимента, у которых этот показатель достоверно снижался относительно контрольных животных. Содержание 11-оксикорти-костероидов в печени крыс всех опытных групп было достоверно выше концентрации 11-оксикортикостероидов в печени контрольных животных (табл. 1).

Динамика содержания свободного и белковосвязанного оксипролина представлена в табл. 2. Уровень свободного оксипролина в плазме крови крыс было достоверно выше у животных забитых на пятые и седьмые сутки эксперимента, относительно того же показателя у животных контрольной группы. У животных забитых на третьи сутки эксперимента этот показатель был ниже, относительно контроля, а на седьмые сутки снижался недостоверно. Содержание белковосвязан-ного оксипролина было на порядок выше, чем содержание свободного оксипроли-на, и имело обратную динамику изменению содержания свободного оксипролина. Из табл. 2 видно, что содержание белковосвязанного оксипролина в плазме крови крыс забитых на третьи и седьмые сутки было достоверно выше, содержания белковосвязанного оксипролина в плазме крови животных контрольной группы. При этом у животных забитых на пятые и девятые сутки эксперимента нами было отмечено снижение этого показателя относительно контрольных животных.

Коэффициент корреляции между уровня свободного оксипролина в плазме и содержанием 11-ОКС в надпочечниках был равен — 0,62, а белковосвязанного оксипролина в плазме и содержанием 11-ОКС в надпочечниках был равен 0,70.

3. Обсуждение

Наблюдаемое нами в эксперименте увеличение массы надпочечников крыс на пятые и седьмые сутки температурного воздействия может косвенно отражать развитие стрессовой реакции у животных, т.к. средняя масса животных опытной группы, забитых в различные экспериментальные сроки, и в контроле не отличалась. Вероятно, увеличение массы желез обусловлено гипертрофией коры надпочечников вследствие повышения активности процессов синтеза глюкокортикоидов [1]. Характерно повышение содержания глюкокортикоидов в левом надпочечнике животных в этот период. Снижение массы надпочечников на девятые сутки эксперимента, по-видимому, можно объяснить истощением желез.

В эксперименте мы не обнаружили значимых отличий в содержании норад-реналина в правом надпочечнике крыс подвергнутых различному по продолжительности тепловому воздействию. С другой стороны концентрация адреналина в железе имела волнообразную динамику. В целом можно отметить тенденцию к снижению содержания адреналина в надпочечниках у крыс опытной группы, относительно контроля.

Необходимо отметить, что повышение концентрации адреналина в железе, до

Показатели, характеризующие состояние надпочечников и содержание 11-оксипролина в плазме крови крыс в эксперименте

Анализируемый образец Группа животных

Контроль 3 сутки 5 сутки 7 сутки 9 сутки

Масса надпочечников, мг 14,08 ± 0,71 12,98 ±0,81 16,31 ±0,62* 16,50 ±0,71* 14,54 ± 0, 85

Содержание адреналина в правом надпочечнике, нмоль/мг 1642, 87 ±150,71 980,81 ± 185,69* 1250,97 ± 120,90 765,26 ± 65,54* 1766,45 ± 344,99

Содержание норадреналина в правом надпочечнике, нмоль/мг 72,72 ±21, 81 73,42 ± 19,76 32,79 ±9,02 47,00 ± 23,18 44,16 ± 16,40

Содержание 11-ОКС в левом надпочечнике, мкг/мг 0,15 ±0,01 0,24 ± 0,02* 0,11 ±0,01* 0,27 ± 0,02* 0,23 ±0,01*

Содержание 11-ОКС в плазме крови, мкг/мл 0,91 ±0,07 0,71 ± 0,13 0,74 ± 0,12 0,91 ±0,14 0,57 ±0,08*

Содержание 11-ОКС печени, мг/г 0,0073 ± 0,0004 0,0109 ±0,0009* 0,0136 ± 0,0014* 0,0119 ± 0,0009* 0,0126 ±0,0008*

* — значимость результатов относительно контроля р < 0.05

Таблица 2

Показатели, характеризующие состояние надпочечников и содержание 11-оксипролина в плазме крови крыс в эксперименте

Анализируемый образец Группа животных

Контроль 3 сутки 5 сутки 7 сутки 9 сутки

Содержание свободного оксипролина, мкг/мг 1,24 ± 0,17 0,75 ± 0,14* 2,27 ± 0,28* 1,06 ± 0,12 1,92 ± 0,28*

Содержание бел-ковосвязанного оксипролина, мкг/мг 11,76 ± 0,27 16,22 ± 1,50* 10,49 ± 1,28 15,32 ± 1,38* 10,60 ± 0,39*

* — значимость результатов относительно контроля р<0.05

уровня, не отличающегося значимо от значений содержания адреналина в надпочечнике контрольных животных, следовало через двое суток после повышения концентрации 11-оксикортикостероидов. Такое наблюдение позволяет предположить, что температурное воздействие на крыс в эксперименте влияло на мозговой слой надпочечников опосредовано, через изменение содержания глюкокортико-идов. Из литературы известно, что функциональная связь коркового и мозгового слоя надпочечников состоит в том, что кровь из коркового слоя надпочечников, прежде чем попасть в общий кровоток перфузирует мозговой слой надпочечников, поэтому хромаффинные клетки оказываются под непосредственным контролем глюкокортикоидов. Последние же, регулируя активность фенилэтаноламин^-метилтрансферазы и концентрацию 8-аденозилметионина, оказывают влияние на синтез адреналина, но при этом не затрагивают синтез норадреналина [9]. На отсутствие реакции со стороны мозгового слоя надпочечников при температурном воздействии на животных было указано и ранее [3].

Отмеченное нами повышенное содержание глюкокортикоидов в коре надпочечников свидетельствует о том, что у животных в результате нагревания развивалась стрессовая реакция [1]. Отсутствие заметного повышения содержания 11-оксикортикостероидов в плазме крови крыс, вероятно можно объяснить интенсивной утилизацией гормонов в печени животных, т.к. в нашем эксперименте было отмечено достоверное повышение уровня содержания 11-оксикортикостероидов в плазме (табл. 1).

В литературе показано, что глюкокортикоиды синтезируются преимущественно в пучковой зоне коры надпочечников, однако при стрессе в процессе синтеза глю-кокортикоидов может включаться и сетчатая зона [1]. Резкое снижение 11-оксикор-тикостероидов в коре надпочечников крыс на пятые сутки, отмеченное в нашей работе (табл. 1), вероятно можно объяснить истощением клеток пучковой зоны коры. На снижение активности синтеза глюкокортикоидов отчасти указывает и снижение содержания 11-оксикортикостероидов в печени животных забитых на седьмые сутки эксперимента. Таким образом, можно предположить, что на седьмые сутки и в последующие дни эксперимента повышение содержания 11-оксикор-тикостероидов в надпочечниках крыс вызвано включением компенсаторных механизмов.

Уровень свободного и белковосвязанного оксипролина в крови отражает обмен коллагена в организме. При этом по содержанию свободного оксипролина судят

о процессах синтеза коллагена, а белковосвязанного — о процессах его деградации [2]. Между тем имеются данные, что метаболическая активность коллагена в костной ткани выше, чем в коже и других тканях. В настоящее время установлено, что содержание метаболитов коллагена в виде свободного и белковосвязанного ок-сипролина в биологических жидкостях отражает в основном метаболизм костного коллагена [11].

В эксперименте нами была отмечена корреляция между содержанием белковосвязанного оксипролина и содержанием 11-оксикортикостероидов в плазме. В целом такая корреляция была ожидаема, так как катаболическое действие глю-кокортикоидов на костную ткань хорошо известно [4]. По современным представлениям эффект, оказываемый глюкокортикоидами на кость, достигается через ин-гибирование активности остеобластов [12].

Заключение

В целом, в проведенном нами эксперименте развитие стрессовой реакции у крыс обусловленной ежедневным температурным воздействием начиналось уже на третьи сутки воздействия и носило волнообразный характер вплоть до девятых суток. Вместе с тем в ранние сроки температурного воздействия увеличивалась концентрация белковосвязанного оксипролина и снижался уровень свободного ок-сипролина в плазме крови крыс. В дальнейшем изменение концентрации белко-восвязаного оксипролина коррелировало с содержанием 11-оксикортикостероидов в надпочечниках.

Литература

[1] Винаградов, В.В. Стресс: Морфобиология коры надпочечников / В.В. Винаградов. - Минск: Беларуская навука, 1998. - 319 с.

[2] Герасимов, A.M. Биохимическая диагностика в травматологии и ортопедии / А.М.Герасимов, Л.Н.Фурцева. - М.: Медицина, 1986. - 240 с.

[3] Грибкова, О.В. Влияние аллогенного гидроксиапатиа и постоянного магнитного поля на показатели метаболизма костной ткани и функциональное состояние коры надпочечников: автореф. дис. .. .канд. биол. наук / О.В. Грибкова. -Самара, 2005. - 19 с.

[4] Егорова, Л.И. Лечение глюкокортикоидами и АКТГ / Л.И.Егорова. - М.: Медицина, 1965. - 306 с.

[5] Подковкин, В.Г. Микромодификация метода определения 11-оксикортикосте-роидов / В.Г. Подковкин // Деп. в ВИНИТИ 4.7.1988. №5348-В 88.

[6] Подковкин, В.Г. Микрометод определения катехоламинов в крови и тканях мелких лабораторных животных / В.Г. Подковкин // Деп. в ВИНИТИ 4.7.1988 №5349-В 88

[7] Подковкин, В.Г. Влияние искаженного геомагнитного поля на метаболизм соединительной ткани у крыс при тепловой нагрузке / В.Г. Подковкин, О.В. Грибкова // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2005. - Т. 45. -№4. - 32 с.

[8] Современные методы в биохимии / Под ред. В.Н. Ореховича. - М.: Медицина, 1977. - 392 с.

[9] Теппермен, Дж. Физиология обмена веществ и эндокринной системы / Дж. Теппермен, Х. Теппермен. - М.: Мир, 1989. - 656 с.

[10] Фролов, Ю.П. Математические методы в биологии. ЭВМ и программирование / Ю.П.Фролов. - Самара: Изд-во СамГУ, 1997. - 265 с.

[11] Биохимия костной и хрящевой ткани / Л.Н.Фурцева // Актуальные проблемы теоретической и клинической остеоартологии / Под ред. Ю.И.Денисов-Никольский, С.П.Миронов, Ю.П. Омельяненко, И.В.Матвейчук. - М.: ОАО "Типография "Новости", 2005. - 336 с.

[12] Цыган Е.Н., ДеевР.В. Морфофункциональные основы остеопороза / Е.Н. Цыган, Р.В.Деев. - Спб.: ВМедА, 2005. - 116 с.

[13] Pharmacological treatment of osteopenia induced by gastrectomy or ovariectomy in young female rats / Andersson N., [et al.] // Acta Orthop Scand. - 2004. -V. 75(2). - P. 201-209.

[14] Bisphosphonate effects in rat unloaded hindlimb bone loss model: three-dimensional microcomputed tomographic, histomorphometric, and densitometric analyses / Barou O., [et al.] // The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. - 1999. - Vol. 291. - No. 1. - P. 321-328.

[15] Prevention and treatment of osteopenia in the ovariectomized rat: effect of combined therapy with estrogens, 1-alphavitamin D and prednisone / P. Geusens [et. al.] // Calcif. Tissue Int. - 1991. - V. 48. - P. 127-137.

[16] Mmutoh, S. Characterization of heparin-induced osteopenia in rats / S.Mmutoh, N.I. Takeshita, T.Yoshino // Endocrinology. - 1993. - V. 133. - No. 6. -P. 2743-2748.

Поступила в редакцию 26/ VIII/2006;

в окончательном варианте — 26/VIII/2006.

ADRENALS STATE AND OXIPROLINE CONTENT DYNAMICS OF RATS UNDER TEMPERATURE EFFECT

© 2006 V.G. Podkovkin, D.G.Ivanov2

In the paper the adrenals state and both free and proteinbinding oxiprolines content in plasma of rats under daily temperature effect are studied. The weigh of glands and adrenalin, noradrenalin, 11-oxycorticosteroids content in adrenals, liver and plasma for characteristic adrenals status are analyzed. In an experiment the wavy dynamics of these makers and correlation between 11-oxycorticosteroids content in adrenals and proteinbinding oxiprolines content in plasma are observed.

Paper received 26/VIII/2006. Paper accepted 26/VIII/2006.

2 Podkovkin Vladimir Georgievich (podkovkinarambler.ru), Ivanov Dmitriy Gennadevich (dg1983arambler.ru), Dept. of Biochemystry, Samara State University, Samara, 443011, Russia.