Способ диагностики рака молочной железы по уровню метилирования генов ZNF177 и CCDC181 в малых опухолях
METHOD FOR DIAGNOSING BREAST CANCER BY THE LEVEL OF METHYLATION OF THE ZNF177 AND CCDC181 GENES IN SMALL TUMORS

Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее актуальной проблемой современной онкологии, что в первую очередь обусловлено высокой заболеваемостью. Согласно данным GLOBOCAN (совместного проекта Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) и Международного агентства исследований рака (IARC)) в 2020 г. в мире зарегистрировано более 2,26 млн. больных РМЖ [1]. В целом четверть (25,2%) случаев злокачественных новообразований (ЗНО) у женщин представлена РМЖ [2]. В Российской Федерации в 2020 г. было выявлено 46 тыс новых случая РМЖ. Для своевременного лечения РМЖ является необходимой разработка новых маркеров позволяющих улучшить диагностику рака молочной железы.
Широко признано, что на ранних стадиях развития рака, включая рак груди, наблюдаются изменения метилирования многих генов [3]. Метилирование ДНК происходит путем модификации ДНК выраженной в добавлении метальной группы в положение 5 'цитозина, предшествующего гуанину (CpG). CpG часто обнаруживаются в высокой плотности на «островках CpG», особенно в промоторных областях генов. Гиперметилирование CpG-островков может приводить к подавлению транскрипции генов-супрессоров опухолей при раке, тогда как гипометилирование CpG-островков может приводить к активации онкогенов, что также может способствовать возникновению и развитию РМЖ. Аберрантные уровни метилирования промоторов генов, связанных с опухолью (таких как гены репарации ДНК, гены, связанные с апоптозом, гены транспорта и метаболизма лекарств), могут влиять на чувствительность опухолевых клеток к химиотерапевтическим препаратам. Учитывая, что профиль метилирования ДНК опухолей может отличаться от такового в нормальной ткани, можно допустить, что определенные метилированные гены могут использоваться в качестве биомаркеров в неинвазивных тестах, тем самым расширяя диагностические возможности.
Аберрантное метилирование ДНК считается событием, связанным с ЗНО и характеристика опухолеспецифического метилома стала предметом многочисленных исследований [4]. Важно, что гипер- или гипометилирование ДНК является ранним событием в канцерогенезе молочной железы. Эти данные указывают на перспективность изучения уровня метилирования в малых опухолях как ранних маркеров РМЖ.
Ранняя диагностика рака молочной железы (РМЖ) позволяет своевременно провести комплекс профилактических и лечебных мероприятий, что способствует снижению частоты рецидивов заболевания и существенному улучшению показателей отдаленной выживаемости.
Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии и предназначено для дифференциации опухолевых образований менее двух сантиметров. Благодаря недавним достижениям в диагностике и лечении рака молочной железы увеличилась частота обнаружения различных атипичных пролиферативных поражений и небольших карцином молочной железы, которые часто трудно диагностировать, особенно в небольших образцах тканей, полученных с помощью игольчатой биопсии. Предложенный анализ позволяет дифференцировать злокачественные опухоли от нормальных тканей и фиброаденом.
Было проведено исследование уровня метилирования генов ZNF177 и CCDC181 в малых опухолях. В исследование были включены 48 пациентов с морфологически верифицированным инвазивным РМЖ и 24 пациентов с фиброаденомой молочной железы, у которых исследовался участок здоровой ткани и участок с доброкачественной опухолью-фиброаденомой.
-z
Способ диагностики рака молочной железы по уровню метилирования генов ZNF177 и CCDC181 в малых опухолях отличается тем, что опухоли дифференцируют от нормальных тканей и фиброаденом по формуле Р=1/(1+е),
где е - основание натурального логарифма,
z=-20,27-0,324*X1-0,633*X2,
где X1 - Среднее значение уровня метилирования шести CpG-сайтов гена CCDC181, расположенных на хромосоме 1: 169460654, 169460652, 169460624, 169460616, 169460609, 169460587 согласно сборке GRCh38.p14
Х2 - Среднее значение уровня метилирования семи CpG-сайтов гена ZNF177, расположенных на хромосоме 19: 9362992, 9362998, 9363008, 9363012, 9363015, 9363020, 9363039 согласно сборке GRCh38.p14,
если Р<0.58188, то образец является раком молочной железы.
Диагностическая точность описанного метода оценки уровня метилирования в малых опухолях составила 98%. Площадь под ROC-кривой составила 0,99, что классифицируется как предсказания отличного качества. Чувствительность метода - 97,9%. Специфичность метода - 95,8%.
ROC анализ был проведен с помощью SPSS STATISTICS 17.
Способ оценки уровня метилирования генов ZNF177 и CCDC181 осуществляют следующим образом:
Для проведения исследования ДНК из образцов ткани выделяют набором QIAamp DNA Mini Kit (Quiagen, USA). Бисульфитную конверсию проводят набором EpiJET Bisulfite Conversion Kit (Thermo Scientific, USA). ПЦР проводят с праймерами к фрагментам CpG-островков исследуемых генов (таблица 1), по следующей программе амплификации: 95°С - 5 мин; (95°С - 15 с., 50°С - 30 с., 72°С - 45 с.)×40.
Для оценки среднего значения уровня метилирования генов CCDC181 и ZNF177 используют метод пиросеквенирования на приборе PyroMark Q48 в соответствии с инструкциями производителя.
-z
Способ диагностики рака молочной железы по уровню метилирования генов ZNF177 и CCDC181 в малых опухолях отличается тем, что опухоли дифференцируют от нормальных тканей и фиброаденом по формуле Р=1/(1+е),
где е - основание натурального логарифма,
z=-20,27-0,324*X1-0,633*X2,
где X1 - Среднее значение уровня метилирования шести CpG-сайтов гена CCDC181, расположенных на хромосоме 1: 169460654, 169460652, 169460624, 169460616, 169460609, 169460587 согласно сборке GRCh38.p14
Х2 - Среднее значение уровня метилирования семи CpG-сайтов гена ZNF177, расположенных на хромосоме 19: 9362992, 9362998, 9363008, 9363012, 9363015, 9363020, 9363039 согласно сборке GRCh38.p14,
если Р<0.58188, то образец является раком молочной железы.
Предложены способы ранней диагностики РМЖ:
Способ тройного теста, включает в себя тонкоигольное аспирационную биопсию (ТИАБ), клиническое обследование (пальпация) и маммографию. ТИАБ имеет диагностическую точность примерно 90%, клиническое обследование (пальпация) 70-90%, и маммография - 85-90%. Совокупная диагностическая точность всех 3 тестов достигает 90%.
Недостатки метода: точность дифференциальной диагностики при использовании тройного теста снижается при уменьшении размера патологического образования в силу неспецифичности ряда признаков. Для выполнения маммографии и анализа ТИАБ требуется специальное дорогостоящее оборудование и реактивы. Стоимость исследования превышает 1,5-3 тыс. руб.
Способ магнитно-резонансной томографии (МРТ) с контрастированием. Чувствительность данного метода диагностики достигает 98%.
Недостатки метода: низкая специфичность (80%), высокая стоимость исследования (более 5 тыс. руб.) Не может быть использована в качестве основного метода исследования молочных желез на предмет ранней диагностики опухолевой патологии.
Способ ультразвукового исследования (УЗИ) молочных желез и региональных лимфатических узлов. Преимуществом этого метода является простота получения изображения, полная безвредность и возможность многократного повторения исследования, что важно для динамического наблюдения.
Недостатки метода: недостаточная информативность в силу физических особенностей при ряде непальпируемых образований, что не позволяет использовать данный метод в качестве скринингового.
Способ определения серологических опухолеассоциированных маркеров в сыворотке крови и других биологических жидкостях у онкологических больных. В клинической практике для пациенток РМЖ в основном применяются следующие опухолевые маркеры - СА 15-3, РЭА, СА 19-9, СА 72-4.
Недостатки метода: чувствительность опухолеассоциированных маркеров для ранних стадий РМЖ крайне низка (<15-35%), что не позволяет использовать их в целях ранней диагностики, не смотря на относительно низкую стоимость методики (500-800 руб./1 маркер).
Таким образом, в настоящее время нет лабораторного теста, который может быть рекомендован для скрининга рака молочной железы. Предложенный нами способ позволяет с высокой диагностической точностью верифицировать РМЖ по уровню метилирования в малых опухолях.
Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами:
Пример №1.
Пациентка Г., 36 лет поступила в стационар с диагнозом:
Узловое образование правой молочной железы.
Из анамнеза: Семейный анамнез не отягощен. При осмотре определялись узловые образования неправильной формы с четкими границами, размерами до 20 мм, в верхнем наружном квадрате молочной железы.
Выполнена core- биопсия узлового образования правой молочной железы под контролем УЗ.
По результатам иммуногистохимического анализа были получены следующие данные: 3 столбика ткани, длинной от 0,3 до 0,5 см, белесоватого цвета, с желтоватыми вкраплениями. При микроскопическое описании отмеечались фрагменты ткани молочной железы с фибросклерозом стромы, без атипии эпителия протоков и долек.
Получены следующие результаты:
Значение Р=0,99984, что больше 0,582.
Таким образом, мы верифицировали доброкачественную опухоль, что было подтверждено результатами иммуногистохимического анализа. Выполнена секторальная резекция правой молочной железы.
Пример №2.
Пациентка С., 37 лет поступила в стационар с диагнозом:
Рак правой молочной железы cT1N0M0, pT1cN0(sn)
Из анамнеза: Семейный анамнез отягощен по материнской и отцовской линиям.
Выполнена трепан-биопсия образования правой молочной железы.
По результатам иммуногистохимического анализа получены следующие данные: инвазивный апокриновый рак, Grade 3 (17×9 мм), с выраженным внутрипротоковым компонентом высокой степени злокачественности. В "хвосте" молочной железы - узел неинвазивного протоково-долькового рака (4×3 мм). В ткани молочной железы - множественные очаги внутрипротокового рака высокой степени злокачественности с апокринизацией клеток (DCIS high-grade), неинвазивного долького рака (LCIS), атипического аденоза. В 3-х подмышечных лимфатических узлах - без метастазов рака. pT1cNO(sn)(i-).
Иммунофенотип люминального В-подобного her2-позитивного подтипа рака молочной железы.
Получены следующие результаты:
Значение Р=0,00001, что меньше или равно 0,582.
Таким образом, мы верифицировали злокачественную опухоль, что было подтверждено результатами иммуногистохимического анализа. Пациентке была проведена радикальная подкожная мастэктомия справа с одномоментной маммопластикой большой грудной мышцей в комбинации с эндопротезом.
Список литературы
1. Sung Н., Ferlay J., Rebecca M.E.L., Siegel H., Laversanne M., Soerjomataram I., Jemal A., Bray F. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries // CA: A Cancer Journal for Clinicians - 2021. №71(3). - P. 209-249.
2. Злокачественные заболевания в России в 2020 году (заболеваемость и смертность) / под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, А.О. Шахзадовой - М.: МНИОИ им. П.А.Герцена - филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2021. - 252 с.
3. Esteller М. Epigenetics in cancer. // N Engl J Med. - 2008. - №358. P. 1148-59.
4. Campoy E.M., Laurito S., Urrutia G., Branham M.T., Roqué M. Aberrant DNA Methylation in Breast Cancer Cells. 2013. Med Epigenet. №1(1): 88-92