Зd-культивирование: от отдельных клеток к регенерационной ткани (к вопросу о феномене эпителио-мезенхимальной пластичности)

Общетеоретические и дискуссиож-

ОБЩЕТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ДИСКУССИОННЫЕ РАБОТЫ

Зй-культивирование: от отдельных клеток к регенерационной ткани

И.Н. Сабурина, B.C. Репин

УРАМН НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН, Москва

3D culturing: from individual cells to blastemic tissue

I.N. Saburina, VS. Repln

The RAMS Institute of General Pathology and Pathophysiology, Moscow

Феномену эпителио-мезенхимальной пластичности муль-типотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), наблюдаемому в 20 культурах, до сих пор не найдено удовлетворительного объяснения. Новые возможности открывает ЗО культивирование ММСК, которое моделирует закономерности образования слоев эпителиальных клеток (ламинацию). Проведенный анализ собственных и литературных данных позволил предположить, что именно спонтанное формирование ММСК-сфероидов индуцирует образование регенерационной («бластемной») ткани в фетальных и взрослых органах при повреждении. Продемонстрирована возможность репрограм-мирования плотных сфероидов ММСК в нейроэктодерму и примитивную энтодерму.

Ключевые слова: эпительально-мезенхимальная пластичность, мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, 30 культура клеток, индукция.

The phenomenon of epithelial — mesenchymal plasticity of multipotent mesenchymal stromal cells (MMSCs) observed in 2D cultures has not been clarified yet. MMSC 3D culturing to model the patterns of epithelial cell layer formation (lamination) gives new opportunities. The review of literature and own findings enabled a suggestion that it is spontaneous formation of MMSC spheroids that induces generation of blastemic tissue in fetal and adult organs when damaged. The feasibility of reprogramming dense MMSC spheroids into neuroectoderm and primitive entoderm has been demonstrated.

Key words: epithelial-mesenchymal plasticity, multipotent mesenchymal stromal cells, 3D cell culture, induction.

В предыдущих исследованиях было показано, что высоко очищенные культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) человека и млекопитающих формируют три типа адгезированных на пластике колоний: 1) типичные фибробластоподоб-ные (мезенхимальные) 2D кластеры; 2) эпителиоид-ные колонии из распластанных поляризованных по апикально-базальной оси клеток и 3) смешанные эпи-телио-мезенхимальные 2D колонии из эпителиоподоб-ныхи фибробластоподобных (стромальных) клеток [1 — 3]. При длительном культивировании и пассировании эпителиальные и смешанные 2D колонии исчезают из культур и только мезенхимальные колонии стабильно выживают in vitro. D. Zipori предположил, что ММСК in vitro находятся в двух устойчивых эпигенетических состояниях [4]. Однако найти функциональное объяснение эпителио-мезенхимальной пластичности клеток в 2D культурах не удалось.

Не понятно также, какую роль играет обратимая эпителио-мезенхимальная пластичность клеток в 3D-культурах. Известно, что закладка, паттернинг и осевое формирование органов, включая органы чувств,

e-mail: saburina@mail.ru

реализуются за счет сложных сигнальных сетей и каскадов, управляющих взаимодействием эпителия и стро-мы (плакоды и папиллы). При развитии зародыша обнаружены первичные, вторичные и третичные циклы обратимых эпителио-мезенхимальных конверсий клеток [5, 6]. Взаимосвязь эпителио-мезенхимальной пластичности клеток с морфогенезом стало возможным изучать в ЗО-системах, в которых были минимизированы цитодифференцировка адгезированных клеток и вклад экстрацеллюлярного матрикса. Любые клетки органа теряют организацию и естественные связи с экстрацеллюлярным матриксом и другими компонентами ткани в плоской культуре. В 30 культуре клетки на коллагеновом матриксе, базальной мембране или матригеле частично восстанавливают организацию и функции через взаимодействия клетка-мат-рикс. В случае формирования клеточных сфероидов они восстанавливают организацию ткани через избирательные межклеточные взаимодействия. Каждый из подходов позволяет оценить роль клеточных и внеклеточных факторов в морфогенезе. Очень часто в культуре наблюдается генетический и сигнальный антагонизм

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, 1У< 2, 2010

между программами, контролирующими взаимодействие клеток друг с другом и клеток с матриксом [7].

Сфероиды имеют минимальное соотношение поверхности к объему. Силы поверхностного натяжения в наружном слое клеток минимизируют объем сфер. В отсутствие матрикса многие клетки внутри сфероида принимают самую экономичную в энергетическом отношении шаровидную форму [8]. Более того, сигнальная кооперация округлых клеток в сфероиде не только возвращает систему к ранним генам энтодермы, нейроэктодермы, но и активирует те ранние гены клеточной регенерации, которые работают в регене-рационной ткани (бластеме) [9].

Практический интерес к мультиклеточным сфероидам как модулю функциональной ткани, полученной в лабораторных условиях, был разогрет тупиком в выращивании органов мелких лабораторных животных. Центральная масса переживающих ex vivo органов подвергалась гибели вследствие гипоксии с остановкой специализированных биохимических и регуляторных функций [10].

Термин «клеточные сфероиды» появился в научной литературе в начале 90-х годов прошлого столетия. До его появления в клеточной биологии, эмбриологии и биологии развития широко использовались два других термина: клеточные кластеры и клеточные агрегаты для характеристики ЗО-взаимодействий в новом тканевом измерении [11—14].

История вопроса

А. Каррель первым показал, что эксплантаты сердца и других органов способны не только переживать в культуре несколько месяцев, но и сохранять физиологические функции (ритмические сокращения) [11]. По этой причине А. Каррель сосредоточился на выращивании 3D «гисто-культур». В 50-х годах прошлого века J. Leighton добавил технологию ЗО-крупнопористого лабораторного матрикса для длительного выращивания клеток. На искусственном губчатом материале J. Leighton не только научился выращивать многие соматические линии клеток, но и первый показал, что раковые линии клеток на матриксе формировали шаровидные клеточные агрегаты (в отличие от нормальных клеток) [15—17]. Далее было продемонстрировано, что агрегаты менее чувствительны к цитотоксинам, радиации и гипоксии [18, 19]. Рост сфероидов раковых клеток в тканевых культурах связали с возникновением химио- и радиорезистентных клеточных метастазов. В дальнейшем было показано, что эпителиальные сферы лучше сохраняют специализированные характеристики, чем монослойные клеточные культуры. 2D-культуры имели изменённую чувствительность к гормонам и ростовым факторам [20, 21].

Интерес к межклеточным взаимодействиям в раннем эмбриогенезе восходит к работам А. Москоны, посвященным селективной самоагрегации зародышевых клеток на базе высокоаффинного сродства поверхностных лигандов и комплементарных рецепторов [22, 23]. Идеи А. Москоны были далее развиты М. Стейн-бергом в концепции морфогенеза органов и тканей, основанного на региональной дифференциальной адгезии клеток [24, 25]. В начале 60-х годов прошлого века П. Вайс проложил первый экспериментальный мост между 20-культурами клеток и ЗО-сборкой ткани в лабораторных условиях, применив в качестве матрикса биоиндуктивные пористые материалы. Началась эра лабораторной тканевой инженерии. ЗО-пористый

биоматериал служил пространственной сигнальной матрицей для организованного заселения, миграции и дифференцировки незрелых прогениторов, сопряженных с организованной сборкой ткани. Зачастую создание «лабораторной ЗО-ткани» шло в обход эмбриогенеза и органогенеза.

Наконец, в последние два десятилетия бурно развивается концепция сфероидов (микротканей) как серийно повторяющихся клеточных модулей, воспроизводящих и накапливающих ключевые события эмбриогенеза [26]. Основу модулей составляют серийные копии многоклеточных агрегатов из эпителиальных и стромальных клеток. Вторым важным отличием сфероидов является отсутствие или минимальная доля компонентов экстрацеллюлярного матрикса. Сигналы микроокружения создают условия для длительного (несколько месяцев) выживания клеток в сфероидах. Выживание сфероидов не связано с их неоваскуляри-зацией. Увеличенная выживаемость клеток в сфероидах связана с минимизацией метаболизма, расходования АТФ и кислорода в ЗО-агрегатах по сравнению с монослойной культурой [27, 28].

В сфероидах округлые клетки минимально экспрес-сируют белки цитоскелета и аппарат клеточной адгезии. Это возвращает сфероидным клеткам чувствительность к ранним сигналам эмбриогенеза. Одновременно шаровидный статус клеток в отсутствии матрикса блокирует раннюю чувствительность клеток к сигналам цитодифференцировки [26].

Современная биология и медицина переживает фазу «бума» вокруг ЗО-технологий выращивания тканепо-добных министруктур. Только исследования стволовых клеток сопоставимы по скорости накопления новых открытий и инноваций. В наше время идея сборки минимальных строительных блоков ткани размером 50100 мкм3 через спонтанную ЗО-агрегацию клеток in vitro обрастает множественными путями реализации [29, 30].

Первое очевидное преимущество этой технологии — возможность достичь плотности клеток на единицу объема, сопоставимую с плотностью клеток в органах [31]. Во-вторых, стало очевидным, что лабораторная реконструкция мини-ткани из паренхимо-стромальных модулей требует соответствующего осевого hard/soft-микроокружения. Лабораторные структуры типа смешанных мини-агрегатов стали использоваться для создания временной провизорной зародышевой и экстраэмбриональной [32]. В-третьих, в силу отсутствия внеклеточного матрикса в сфероидах заблокирована дифферен-цировка шаровидных неприкрепленных клеток.

Характеристика сфероидов

из переживающих миниэксплантатов

фетальныж и дефинитивных тканей

В культуре органных мини-эксплантатов выявляются общие закономерности реорганизации переживающей ткани. В первые 7 сут. происходит повреждение базальной мембраны, изменение полярности эпителиального монослоя, частичная гибель ткани. На примере культивирования дыхательного эпителия было продемонстрировано, что одновременно с морфологическими изменениями дыхательный эпителий терял молекулярные маркеры зрелости — трансмембранный регулятор ионной проводимости CETR-Z0-1 -ezrin комплекс и цилии [33]. Через несколько дней культивирования сформированные эпителиальные сфероиды демонстрировали восстановление утраченных молеку-

лярных маркеров зрелости эпителия вместе с цилями. Признаки дифференцировки (в виде поляризованного цилиарного аппарата) хорошо сохранялись в сфероидах эпителия. Культивирование дыхательного эпителия только в виде плотных агрегатов сохраняло признаки терминальной дифференцировки клеток. Другие способы выращивания клеток в культуре вели к де-дифференцировке клеток [28].

Формирование сфероидов по периферии эксплантата в течение 3^5 нед. [34]. В течение первых 7 сут. эпителий терял апикально-базальную полярность одновременно с фрагментацией базальной мембраны, а также организованную структуру ацинусов и дуктул. В такой модели образование сфероидов — это согласованный ответ стромы и эпителия на повреждение ткани. Как правило, пролиферация стромы ограничена в сферах, формирующих один или несколько слоев эпителия. В то же время нарастает плотность межклеточных контактов, сопоставимая с контактами в исходной ткани.

Эксплантаты бронхиальной слизистой оболочки диаметром 400^500 мкм приобретали округлую форму в культуре и за 5 сут. формировали типичные сферы-агрегаты. Поверхностный слой был представлен эпителиальными цитокератин+-клетками, а также фрагментами базальной мембраны из коллагена IV типа, ламинина и фибронектина. Центральная часть сфер содержала фибробласты и межклеточный матрикс [36]. Сфероиды назального и бронхиального эпителия в течение 30^50 сут. культивирования сохраняют дифференцированный статус [36].

Клетки бронхосфер экспрессируют ранние гены эмбриогенеза и «стволовости», сохраняя одновременно клетки с признаками терминальной дифференцировки, в которых сохранялся в неактивном состоянии

ген Slug, контролирующий эпителио-мезенхимальную перестройку клеток. Slug-экспрессирующие клетки подвергались одновременно дедифференцировке и эпителио-мезенхимальной трансформации [37].

Микроэкспланты (2x2 мм) скелетной мышцы человека (биопсийный материал) в ходе культивирования в неприкрепленном состоянии формировали сфероиды на поверхности срезов [38]. Регенерационные ЗО-агрегаты (миосферы) были описаны двумя независимыми группами исследователей [39, 40]. Для выделения миосфер были использованы условия, близкие протоколу выделения нейросфер: среда DMEM/F12 с добавлением В27, EGF (20ng/ml) и bFGF (40 ng/ml). Растущие из прикрепленных миосфер клетки приобретали мезенхимальный статус и дифференцировались, главным образом, в эндотелиальные и гладкомышечные клетки. В другой работе суспензионные миосферы получали из первичной гетерогенной клеточной суспензии, состоящей из Seal + (60%), Всгр-1 + (85%), Myo D(15%), N-tubulin-3 (25%), GFAP (30%), Nkx2.5 (1%) позитивных клеток, а также side-популяция из Hoechst 33342-клеток. Эти гетерогенные клетки формировали плавающие миосферы в среде DMEM/F12 с добавлением 20% FBS [41]. Плотные агрегаты миогенных клеток появлялись на раневой поверхности миофибрилл уже через 5 сут. после культивирования биоптатов [1—2 мм) скелетных мышц [42]. Культивируя отпрепарированные миофибриллы из биоптата мышцы человека (биопсийный материал), мы через 5^7 сут. наблюдали образование сфероидов на краевых концах миофибрилл (рис. 1А). При адгезии сфероидов к пластику отмечали массовое выселение мелких полигональных клеток с последующим формированием новых мышечных трубочек (рис. 1 Б).

Рис, 1,

Культура поперечно-полосатой скелетной мышечной ткани: А - сфероид на краевом конце мышечного волокна [указан стрелкой) через 5-7 сут куль тивирования; Б - мышечные трубочки из прикрепившегося миосфероида. Фазово-контрастная микроскопия. Ув. х£00

Сфероиды из целого мозга 15-дневных фетусов крыс получали из отфильтрованной через фильтры (150 мкм) нервной ткани с последующим центрифугированием. Осажденные клетки в концентрации 10 млн/мл ре-суспендировали в среде DMEM с 10% FCS и культивировали при непрерывном помешивании на шейкере. В течение первой недели формировались рыхло упакованные сфероиды с множеством гетероморфных клеток. На периферии сфероидов и на стыке разных сфероидов накапливались в основном клетки округлой формы. Клетки сохранялись по периферии сфероидов в течение 3^5 нед. культивирования [43]. Центральную часть сфер занимали дифференцированные клетки глии и нейроны с отростками и синапсами.

При культивировании мини-эксплантатов коры больших полушарий человека 11 нед. развития, полученных, как и в предыдущей работе, с помощью фильтрации

через фильтры (150 мкм) с последующим центрифугированием и культивированных в чашках Петри в среде DMEM/F12 с добавлением 2% FBS, В27, N2, EGF (10 ng/ml) и bFGF (10 ng/ml), нами было отмечено спонтанное формирование сфероидов на поверхности эксплантатов через 5^7 сут. культивирования (рис. 2 А., Б).

Эффективность и скорость формирования сфероидов возрастала, когда в культуру помещали крошечные эксплантаты мозга размером 0,4x0,4x0,3 мм. Кусочки субвентрикулярной ткани и других отделов мозга помещали в среду DMEM/F12, N2, В27 и глютамин. Уже через 24^48 ч кусочки эксплантатов реорганизовывались в нейросфероиды с бурной миграцией клеток из ткани [44]. В неприкрепленном состоянии эксплантаты росли до 4^5 мес. с сохранением фенотипа дифференцированных нейронов и глии. Очаги пролиферации

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, 1У< 2, 2010

>етинеские и дискуссионные работы

в ткани идентифицировали по скоплению Ю-67+ клеток. Состояли они в основном из нестин+, виментин+, ОРАР+-клеток [45].

Рис. 2. Нейросфероиды на поверхности эксплантатов фетального головного мозга [11 нед.] через 5-7 сут. культивирования.

Фазово-контрастная микроскопия. У в.: А х100;Бх200

Клетки стромы роговицы в норме синтезируют уникальные компоненты прозрачного матрикса. В случае активной пролиферации они теряют уникальные свойства и превращаются в обычные фибробласты, формирующие рубцовую ткань [46]. Для сохранения уникальных биохимических свойств первичные культуры модифицировали в сфероиды в бессывороточной среде с добавлением ЮР1/ЬРОР в условиях, где прикрепление клеток к подложке было блокировано. В течение 7^10 первых сут. из монослоя возникали многослойные агрегаты. К концу 3-й нед. формировались плотные многослойные сфероиды диаметром 0,1—2 мм. Далее такие компактные сфероиды удавалось культивировать в течение нескольких месяцев без потери уникальных биохимических свойств составляющих их клеток. В этих сфероидах не были идентифицированы пролиферирующие популяции клеток [47]. Группа других исследователей обнаружила, что клетки внутри сфероидов из клеток стромы роговицы одновременно

маркировались антителами к белкам мезенхимы и ней-роэпителия [48].

Поврежденная сетчатка млекопитающих отвечает на повреждение новообразованием двух типов сфероидов: розетко-подобных и слоистых. Клетки пигментного эпителия являются главными участниками новообразования и трансдифференцировки клеток для слоистых сфероидов [49]. В ходе роллерного культивирования эксплантов сетчатки взрослых крыс были получены полые сфероиды. В зоне повреждения наблюдали формирование регенерационной ткани — агрегатов и розеток из клеток пигментного эпителия [50].

В 1994 г. было показано, что агрегаты постнаталь-ных энтероцитов и соединительной ткани подслизис-той основы тонкой кишки при трансплантации в ткани иммунодефицитных животных повторяли эктопическую сборку неомукозы тонкой кишки из диссоциированных клеток [51]. Несколько ранее — в 1992 г. был создан метод выращивания первичной суспензионной культуры энтероцитов и стромы [52]. Суспензию с высокой плотностью клеток выращивали на матригеле с периодическим центрифугированием для получения плотного пеллета. Процедуру дисперсии клеток и центрифугирования повторяли 5^8 раз до получения многоклеточных организованных сфер [53]. На 7-е сут. культивирования возникали многочисленные кавитированные агрегаты, выстланные изнутри высоким столбчатым поляризованным эпителием — дериватом исходных энтероцитов. Одновременно в просвете кист встречались уплощенные недифференцированные прогениторные клетки. В поляризованном эпителии были идентифицированы энтероциты с микроворсинчатой каймой, бокаловидные, энтероэндокринные и клетки Панета. В течение последующих 5 мес. культивирования кавитированные агрегаты периодически формировали упакованные зрелые типичные ворсинки и крипты. В своих опытах мы также наблюдали формирование организованных многослойных энтеросфероидов из диссоциированной ткани тонкой кишки человека через 4^5 сут. культивирования (рис. ЗА). Некоторые энтеросферои-ды при дальнейшем культивировании формировали внутреннюю неолуминальную полость (рис. ЗБ).

Возникновение конденсированных агрегатов хонд-ропрогениторных или остеопрогениторных клеток наблюдали в развивающейся почке конечности млекопитающих. Далее клеточные агрегаты дифференцировались в хондрогенные или остеогенные узелки [54]. При повреждении хрящевой ткани зачатка конечности вьюна наблюдалось формирование сфер из хондропрогени-торных клеток в зоне повреждения [55]. В зоне повреждения костной ткани наблюдалось формирование гетерогенных сфероидов из мезенхимальных и остеопрогениторных клеток [56].

Не только повреждение, но и экспериментальные условия невесомости индуцируют формирование сфероидов. В условиях, способствующих формированию межклеточных контактов, клетки культуры эпителия протоков слюнной железы формировали плотные сфероиды на жидком геле из поливинилового спирта [57].

In vivo перевязка выводного протока слюнной железы является удобной воспроизводимой моделью повреждения ацинарного эпителия. После перевязки протока большинство ацинарных клеток погибает апоп-тозом. При этом из клеток дуктулярного эпителия наблюдалось формирование ЗО-сфероидов. Эпителиальные клетки сфероидов получали способность дифференцироваться в гепатоциты или островные клетки

11111

Общетеоретические и дискуссионнь е

поджелудочной железы [58, 59]. Предполагается, что в образующихся сфероидах при повреждении дуктул появляются прогениторные клетки энтодермального генеза. Эти прогениторы энтодермы [С029 + , С049 + , С090+, ламинин+, ЦК18+, ЦК19+, с-кй+) удалось перевести в культуру на коллагене I типа.

Приведенные выше данные позволяют заключить, что механически поврежденные эксплантаты фетальных и дефинитивных тканей демонстрируют универсальную «реакцию на повреждение» в виде образования регенерационной ткани имеющих сфероидную организацию.

^ С*

Шур. * * А •>' -  - ,

Шь- . *

' .

в* - -V 4 ?  1

Г >.¿«1

"л*

' - XV

«-•• 4 у. ЪУ

Рис. 3.

Многослойный энтеросфероид из диссоциированной ткани тонкой кишки человека через 4-5 сут. культивирования [А); энтеросфероид с полостью [указана стрелкой) [Б]. Фазово-контрастная микроскопия. Ув. х200

Сфероиды из диссоциированных клеток

в суспензии

В начале 80-х годов XX в. было описано много линий раковых и соматических клеток взрослых, чувствительных и резистентных к спонтанной агрегации и образованию многоклеточных сфероидов. Преобладающая часть раковых и соматических линий сохраняли в культуре способность генерировать сфероиды в условиях полного блока прикрепления клеток к подложке [ВО].

В первую очередь получали сфероиды из разных соматических линий клеток выращиванием на поверхности низкоадгезивного агара [61]. Организованные сфероиды были получены впервые из диссоциированных клеток сетчатки. Благодаря клеткам мюллеровой глии, сферы сохраняли радиальный каркас и организованное послойное расположение клеток. После сквозных повреждений сетчатки часть мюллеровой глии формирует агрегаты округлых клеток в зонах повреждения. В дальнейшем клетки сфероидов дифференцировались в линии нейронов [62]. Очевидно, что агрегаты клеток глии играют роль регенерирующего модуля из плюрипотентных клеток.

Диссоциированные клетки фетального головного мозга и мозжечка также хорошо формировали сфероиды, но расположение клеток в них не было радиально или послойно организованным [63]. Описаны методы получения кластеров разного размера из диссоциированных клеток эмбрионального головного мозга человека. Кластеры содержали нейроны, глию и нейральные стволовые клетки [64]. Сфероиды, выделенные из суммарной ткани головного мозга крыс, характеризовались преобладанием в клетках опережающей экспрессии регуляторных генов и наличием белков различных сигнальных сетей [43]. Вероятно, такие провизорные структуры головного мозга служат для накопления новой регуляторной эпигеномной памяти.

Сфероиды из эпителиальных клеток были получены в ходе культивирования диссоциированных биопсийных эксплантов 12-перстной кишки. Они использовались для изучения анионо-катионного транспорта [65].

Прикрепленные к подложке соматические дифференцированные клетки, а также стволовые и [или) прогениторные клетки существенно меняли фенотип и

поведение, присущее им в тканях. Оказалась, что плотные сфероиды ММСК, полученные агрегацией клеток, гораздо лучше сохраняли тканевые особенности [66]. Формируя плотные клеточные агрегаты, стро-мальные прогениторные клетки не только хорошо и длительно сохраняют фенотип, но и реэкспрессируют целые блоки ранних генов эмбриогенеза. Поэтому сфероиды ММСК сейчас широко используют для получения энтодермы, нейроэктодермы и нейросфер.

В отсутствии сыворотки часть ММСК образует сферы над монослоем стромальных клеток. Незрелые сфероиды маркируются экспрессией ОсЬ4/Зох2. По-видимому, в отсутствии сыворотки и матрикса, образуются ранние плюрипотентные клетки, способные участвовать в регенерации ткани. Эти клетки обладают максимальным потенциалом к дифференцировке в разных условиях микроокружения [67].

Незрелые стромальные прогениторы, выделенные энзиматической диссоциацией из тканей аорты и крупных артерий, формируют весьма гомогенные сферы из Ыдп2+, нестин+, РОСРА+, РОСНЗ+-клеток в среде с ЬРСР, но без сыворотки [68]. Как известно, набор перечисленных маркеров характеризует перициты. Добавление ЬРСР необходимо для блокирования адгезии незрелых клеток к подложке. Значительное число эн-дотелиальных клеток первичной культуры или клеток первых пассажей способны формировать сфероиды. После прикрепления на матригель, желатин или фибрин сфероиды формируют трехмерную сеть капилляров, вырастающих из каждой сферы [69].

Сфероиды из гепатоцитов печени взрослых животных характеризовались минимальной скоростью по-лиферации [более 80% клеток в стадии С0). В плотном контакте гепатоциты долго сохраняли признаки биохимической и функциональной дифференцировки. Из 242 генов специализированной биохимической и физиологической функции около 80% сохраняли активность в сфероидах из гепатоцитов [70]. После прикрепления к подложке гепатоциты начинали пролифе-рировать, формируя монослой. Однако в монослое гепатоциты теряли признаки биохимической специализации [71]. Очевидно, гепатоциты в статусе сфероидов более активно участвуют в регенерации локальных

повреждений печени по сравнению с гепатоцитами, выращенными в монослое.

Трансплантаты хромаффинных клеток надпочечника в виде агрегатов выживали лучше и давали больший терапевтический эффект (чем одиночные диссоциированные клетки) после их трансплантации в средний мозг крыс с моделированной болезнью Паркинсона. Контрольные гистологические исследования показали хорошую выживаемость агрегатов в ткани мозга [72].

Сфероиды из кардиомиоцитов хорошо выживали и сохраняли ритмическую контрактильность в культуре. Кардиомиоциты взаимодействовали с ММСК или эн-дотелиальными клетками в суспензии, формируя гетерогенные сфероиды. Большинство стромальных клеток в сфероидах дифференцировались в эндотелиаль-ные клетки, которые реорганизовывались в капиллярные сети [73].

Таким образом, диссоциированные клетки органов и тканей, подобно тканевым эксплантатам, демонстрируют универсальную способность формировать сфероиды в ЗО-культуре. Эта способность поврежденных тканей формировать репаративные агрегаты сохраняется в изолированных клетках органов.

Эпителио-мезенхимальная пластичность

[конверсия) в ЗО культурах

Предполагается, что образование тканей и органов, как и репарация органов, требуют постоянного перехода мезенхимы в эпителий и наоборот. В органах с высоким темпом репарации частота таких переходов резко возрастает [2].

В эмбриогенезе пласты эпителиальных клеток в кооперации со стромой подвергаются обратимой 30-реорганизации в ходе формирования основных дефинитивных органов и тканей. Динамика и пластичность эпителиальных структур находится в эпицентре конденсации, паттернинга, осевого морфогенеза и органогенеза [4, 74].

Интерес к эпителио-мезенхимальным обратимым конверсиям в эмбриогенезе стал быстро развиваться после классических исследований К. Гробстайна, посвященных самосборке клеток эпителиальных органов в эмбриогенезе [75]. Многолетние исследования в этом направлении завершились фундаментальным выводами: 1) органогенез млекопитающих и человека сопровождается селективным взаимодействием эпителиальных и стромальных клеток; 2) мезенхима играет роль сигнального индуктора в осевой закладке и паттернинге желез; 3) развитие эпителия органов зависит от серии сигналов подлежащей стромы; 4) взаимодействие эпителия и мезенхимы имеет форму сигнального диалога. Строма индуцирует ЗО-заклад-ку/паттернинг, тогда как эпителий контролирует терминальную дифференцировку стромы [76].

Еще недавно казалось, что многоступенчатый диалог эпителия и мезенхимы волосяного фолликула не удастся воспроизвести современными средствами [77]. Для этого потребовалось использовать ЗО-мик-росферы дермальных папиллярных фибробластов и кератиноциты внешнего слоя фолликула. В такой 30-микромодели удалось воспроизвести пространственно-временной порядок эпителио-мезенхимальных взаимодействий в зачатке фолликула.

Локальное разветвление эпителия протоков слюнной и других желез контролируется сигнальным стро-мальным микроокружением. Инкубация слюнной

железы мыши с Noggin (блокатор ВМР-7) приводит к значительному уменьшению числа бифуркаций прото-кового эпителия. Аналогично этому, мутантные новорожденные ВМР-7-/- мыши имеют слабо разветвленный эпителий протоков слюнных желез [78]. В то же время инкубация эксплантатов слюнной железы с ВМР-7 приводит к гиперразветвленности эпителия железы. Было показано, что ВМР-7 не изменяет скорости пролиферации дуктулярного эпителия. Однако ВМР-7 сильно активировал образование стромальных клеточных агрегатов в зонах будущих бифуркаций. Оказалось, что агрегаты стромы являются предшественниками локального эпителия, инициирующего ветвление тубул.

650 клеток эпителиального пласта эпибласта являются предшественницами клеток зародышевых слоев и экстраэмбриональных тканей. По-видимому, все мезенхимальные клетки гаструлы и постгаструлы возникают из эпителиальных клеток [79].

Гаструла — это сбалансированная эпителио-мезенхимальная зародышевая ткань, собранная из плюри-потентных клеток. За сутки в ней возникает более 8000 новых клеток с временем удвоения 5 ч, главным образом, за счет перехода эпителиальных клеток в мезен-химный статус. В ходе раннего эмбриогенеза мезенхимальные клетки образуются в гаструле через примитивную полоску и узелок путем эпителио-мезенхи-мальной конверсии. Кроме того, часть клеток нейро-эпителия нервной трубки и нервного гребня формируют нейромезенхиму. Впервые идея динамической организации фенотипа клеток зародышевых листков была сформулирована 3. Хэй в середине 90-х прошлого века [80, 81]. Если эпителий эпибласта способен генерировать мезенхиму через примитивную полоску или узелок, то зародышевые ткани гаструлы способны генерировать эпителий и мезенхиму из общих клеток предшественников. Основу временной эпителио-мезен-химальной пластичности ранних зародышевых тканей составляют провизорные сфероидные агрегаты с маркерами эпителия и мезенхимы. И объясняется это следующим. Во-первых, статус шаровидных клеток блокирует образование локального внеклеточного мат-рикса. Во-вторых, плотные межклеточные коннекси-новые контакты индуцируют экспрессию ранних генов органогенеза, блокируя гены терминальной дифферен-цировки клеточных линий. В-третьих, зародышевые ткани постгаструлы наделены автоматическими программами взаимопревращений эпителия в мезенхиму и наоборот (вторичные эпителио-мезенхимо-эпители-альные переходы) [82]. В одном и том же зачатке мезенхима может генерировать эпителий и, наоборот, строма генерирует паренхиму органов. Исследования эпителиальных и стромальных линий in vitro показывают, что способностью к обратимой конверсии наделены не все клетки в культуре. Лишь часть клеток образует модули для эпителио-стромальных либо ме-зенхимо-эпителиальных конверсий [79]. В части сомитов клетки мезенхимы становятся мышечными клетками. Мезенхимальные прогениторы зачатка почки переходят в дуктулярный эпителий. Мезенхима поджелудочной железы служит предшественником эпителия протоков. Генетическая и сигнальная программа этих конверсий сложна и упакована в несколько разных «файлов».

В тканях взрослых организмов эпителио-мезенхимальная конверсия клеток индуцируется локальным повреждением и гибелью эпителиальных клеток. Независимо от генов Snail/Slug/Twist, в цитоплазме

нарастает концентрация транскрипционного фактора FoxC2, который подготавливает смену фенотипа частично поврежденных эпителиальных клеток [83]. Однако длительная высокая экспрессия FoxC2 отмечена только в тех мезенхимальных субпопуляциях, которые подвергаются мезенхимо-эпителиальному переходу в зоне повреждения. Показано, что FoxC2 активирует синтез Е-кадгерина, белков базальной мембраны. Экспрессия FoxC2 маркирует локально те кластеры, которые участвуют в реэпителизации повреждений. У мышей с двойной гомоделецией гена Slug (Snail2) полностью исчезала возможность перехода дермаль-ных фибробластов в эпителий [84].

Приведенные данные свидетельствуют о том, что ЗО-сфероиды могут являться уникальным многоклеточным модулем, в котором активно идет обратимая эпителио-мезенхимальная конверсия клеток, сопровождающаяся их генетическим репрограммированием, а следовательно, удобной моделью для изучения этого феномена.

Сфероиды из ЭСК

Пролиферация ЭСК в суспензионной культуре при высокой плотности клеток происходит, главным образом, в спонтанных агрегатах (кластерах) ЭСК в чашках из низко адгезивного материала (бактериальные чашки, гидрогели). Спонтанную дифференцировку прогени-торных клеток в агрегатах блокируют своевременным пипетированием, разрушающим контакты «клетка-клетка». В таких условиях удается поддерживать пролиферацию ЭСК в 10—15 пассажах, сохраняя неизменным недифференцированный статус и максимальную плюрипотентность клеток [85, 86]. ЗО-выращивание ЭСК в сферах над матригелем позволяло на выходе получать в 2^4 раза больше плюрипотентых клеток, чем традиционный способ выращивания ЭСК над фидером [87]. Агрегаты ЭСК на фидере из фибробластов сохраняли плюрипотентность даже при очень высоких уровнях плотности клеток в культуре [88]. В случае миникультуры в 96-ячеечных микровеллах (дно которых было покрыто матригелем) удавалось поддерживать в течение 10—15 пассажей недифференцированный статус клеток в кластерах ЭСК в микро-масштабе [89]. Прикрепленные агрегаты ЭСК сохраняли высокую пролиферацию без дифференцировки на малоадгезивном ЗО-матриксе из поликапролактона [90]. Отсутствие рецепторов клеточной адгезии и соответствующего цитоскелета позволяло сфероидным клеткам сохранять примитивный фенотип. Гиалуроновая кислота, пористый полиэтилентетрафталат, ЗО-поли-капролактон являются малоадгезивными субстратами, на которых слабо прикрепленные агрегаты ЭСК активно пролиферировали, сохраняя полный потенциал развития [90—92].

Было показано, что агрегаты клеток линии NT-2 тератокарциномы гораздо быстрей и эффективней дифференцируются в нейроны в суспензии, чем те же клетки в монослое [93]. Полную количественную конверсию клеток NT-2 в нейроны получали за 24^28 дней без примеси опухолевых клеток.

Возникающие при культивировании агрегаты эпителиальных линий ЭСК, как правило, содержат одновременно клетки в эпителиальном и мезенхимальном статусе.

В нескольких лабораториях удалось проследить возникновение прогениторных клеток в мезенхимальном статусе из исходных ЭСК в эпителиальном статусе

[94—97]. Однако никому не удалось получить типичные мезенхимальные клетки в культуре из мезодер-мальных прогениторов. Многие линии ЭСК также содержали клетки со смешанным набором маркеров эпителия и стромы. Такие культуры после прикрепления одновременно формируют эпителиальные и мезенхимальные колонии. Обе популяции сохраняли плюрипотентность [98]. Образование мигрирующих клеток в мезенхимальном статусе наблюдали в плоских дискоидных эпителиальных колониях, растущих над фидером из фибробластов [99]. Зоны эпителио-мезенхимальной конверсии в колониях маркировали по появлению Snail2+, Brachyury+ одиночных свободно мигрирующих клеток. Новообразованные мезенхимальные клетки теряли поверхностный Е-кадгерин и белки межклеточных контактов (ZO-1). Мигрирующие одиночные клетки заселяли глубокие слои фидера из фибробластов (имитация примитивной полоски и мезодермы).

На эпителиальных линиях ЭСК было показано, что клоногенные плюрипотентные ЭСК генерируют смешанные эпителио-мезенхимальные агрегаты, регенераци-онный потенциал которых сопоставим со сфероидами, получаемыми из быстро обновляемых тканей. Зпите-лио-мезенхимальная конверсия была изучена прицельно на уровне отдельных прикрепленных колоний. Этот переход отличался следующими особенностями: 1) в новообразованных мезенхимальных клетках (м-клетки) идентифицирована экспрессия Twist и SnaiH; 2) новообразованные м-клетки теряют Е-кад-герин, но экспрессируют заново виментин, фибронек-тин и N-кадгерин. Плотная упаковка клеток в агрегатах является необходимой предпосылкой дифференцировки трофэктодермы и энтодермы. Образование примитивной энтодермы значительно ускорялось в суспензионных супер-агрегатах эмбриобласта, выделенных сразу от 4^5 зародышей [100]. Возникновение энтодермы через спонтанную агрегацию ЭСК в суспензии, автоматически блокировало образование эктодермы и мезодермы в силу антагонизма двух генов — Nanog и Dppa4 [101].

Таким образом, в сфероидах из плюрипотентных стволовых клеток наблюдаются спонтанные и индуцированные обратимые эпителио-мезенхимальные переходы. Роль этих переходов в развитии остается недостаточно изученной.

Сфероиды из ММСК

Стандартным методом поддержания линии ММСК in vitro является адгезированная 20-культура. В ответ на специфические сигналы от факторов, находящихся в основной ростовой среде, ММСК способны дифференцироваться в трех основных направлениях — остео-генном, хондрогенном и адипогенном. При особых условиях возможна индукция экспрессии маркеров мышечных и нервных клеток, однако полноценных функционирующих клеток при этом не образуется [102]. Поэтому 20-культивирование может являться лишь основным способом масштабирования ММСК in vitro.

Наиболее простыми в своей реализации способами получения сфероидов как ММСК, так и других типов клеток являются: культуры в «висячих каплях» [103, 104]; получение агрегатов путем компактизации клеток при центрифугировании на низких скоростях в 15-мл полипропиленовых конических центрифужных пробирках [105, 106] или культивирование в 96-лу-ночных платах с V-образным дном, покрытым полипропиленом [107, 108].

>етинеские и дискуссионные работы

Ключевую роль в образовании сфероидов, как и в эмбриональном развитии и морфогенезе органов, играют молекулы клеточной адгезии. Можно выделить три стадии в процессе формирования сфероидов (рис. 4) [109]. На первой стадии клетки расположены рыхло, контакты между клетками и внеклеточным матриксом обусловлены взаимодействием между РЮО-последо-вательностями на белках матрикса и интегринами на клеточной поверхности. Следующая стадия связана с постепенным накоплением Е-кадгерина на поверхности клеток, в результате чего, на третьем этапе, возникают кадгерин-кадгериновые межклеточные контакты, и образуется плотный агрегат.

со,

Кислород, питательные вещества, факторы роста

Зона пролиферации

Зона покоящихся клеток

Зона некроза

Рис. 4. Модель формирования агрегата [по R.Z. Lin, H.Y. Chang, 2008 с изм.]

В связи с плотной упаковкой клеток и отсутствием сосудов в крупных агрегатах могут возникнуть затруднения диффузии питательных веществ и, в особенности, кислорода к центральным клеткам. Если диаметр агрегата превышает 200^250 мкм, возникает градиент концентрации кислорода с наименьшим его количеством в центре агрегата [110, 111]. Помимо этого, в крупных агрегатах накапливаются углекислый газ и продукты жизнедеятельности клеток. Учитывая все эти факторы, агрегаты размером более 500 мкм в диаметре можно условно подразделить на несколько слоев: в центре находится зона погибших клеток, окруженная внутренним слоем живых клеток, относительно неизменным, и, наконец, снаружи расположены активно пролиферирующие клетки (рис. 5) [29].

А. Рыхлое клеточное скопление

В. Формирование компактного агрегата

Б. Накопление Е-кадгерина

Рис. 5. Строение агрегата с диаметром более 500 мм [по RZ. Lin, H.Y. Chang, 2008 с изм.)

В своих опытах для получения ММСК сфероидов использовали метод «висячая капля». Клетки культивировали в «висячих каплях» в стандартных условиях (37°С, 5% С02) в течение 3-6 сут. Подобранная концентрация клеток и условия культивирования [104] позволяют получать сфероиды размером 100^150 мкм, что обеспечивает высокий уровень жизнеспособности клеток сфероида в течение всего периода культивирования. Отдельные агрегаты после пяти суток культивирования в «висячих каплях» помещали на пластик, получая вторично прикрепленные культуры.

На третий день ведения 30 культуры формировались небольшие (20^30 мкм), рыхлые по своей структуре скопления клеток. Большая часть клеток, помещенных в каплю, на третий день в состав агрегата не входила. К шестому дню практически все скопления и разрозненные клетки объединялись и формировали одиночные агрегаты, достигавшие 100^150 мкм. По своей структуре к шестому дню культивирования в «висячей капле» агрегат становился плотным, с более гладкой поверхностью (рис. 6).

Рис. 6. Агрегат ММСК на 6 сут. культивирования в «висячей капле». Фазово-контрастная микроскопия. Ув. х£00

Иммуноцитохимическое исследование позволило выявить усиление экспрессии нестина и компонентов базальной мембраны — коллагена IV типа (рис. 7) и ламинина на периферии ММСК сфероидов (рис. 8). При дальнейшем культивировании отмечались процессы поляризации сфероидов и синтеза элементов внеклеточного матрикса. Клетки в сфероидах, преимущественно на поверхности, экспрессировали не только эпителиальные маркеры, но и мезенхимальные — С0105 и виментин. Наблюдалась также экспрессия САТА-6 и нестина — маркеров примитивной энтодермы и нейроэктодермы

Зпителиоподобная морфология клеток и ламина-ция ЗО-культуры подтверждены методами сканирующей электронной микроскопии и трансмиссионной электронной микроскопии. По своей структуре сфероиды состоят из плотно упакованных шаровидных клеток (рис. 9). Вытянутая форма и тесное прилегание клеток поверхностного слоя друг к другу свидетельствуют о протекающей поляризации клеточного слоя (рис. 10).

Общетеоретические и

Рис. 7. Экспрессия коллагена IV типа [зеленый} и СОЮ5 [красный} в клетках сфероиде ММСК, ядра докрашены ОАР1. Ув. х£00

Рис. 8. Экспрессия ламинина в клетках сфероида ММСК, ядра докрашены ОАР1. Ув. х£00

Рис. 9. Внешний вид сфероида ММСК. Сканирующая электронная микроскопия

Рис. 10. Поверхностный слой сфероида ММСК. Стрелками указаны электронноплотные участки плазмалеммы контактирующих клеток. Трансмиссионная электронная микроскопия. Ув. х9000

При помещении сфер на 5 сут. культивирования в «висячей капле» в обычную чашку Петри наблюдалась адгезия сфероидов к пластику, после чего начиналось выселение и миграция эпителиоподобных клеток из состава сфероидов, что свидетельствует о сохранении эпителиального статуса внешнего слоя клеток сфероидов [рис. 11).

Добавление ламинина (использовались чашки Петри, покрытые ламинином) приводило к активации миграции

клеток в течение первых 10ч после адгезии сфероидов к пластику. При этом не было отмечено изменений в миграции клеток сфероидов, помещенных на другие компоненты базального матрикса и фибронектин. Быструю миграцию клеток, вероятно, можно объяснить стимуляцией экспрессии БАТА-б, что в свою очередь, приводит к активации ТОСК/Сс)с42 и реорганизации цитоскелета быстро мигрирующих клеток. Это говорит о возможном появлении примитивной энтодермы в сфероидах.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 2, 2010

>етинеские и дискуссионные работы

Рис. 11.

Выселившиеся и мигрирующие эпителиоподобные клетки из прикрепившегося сфероида ММСК через сутки после адгезии. Пунктиром очерчены границы сфероида. Фазово-контрастная микроскопия. У в. хЮО

По-видимому, в 20-культуре происходит однонаправленный эпителио-стромальный переход. 30-культиви-рование ММСК индуцирует стромально-эпителиальный переход статуса клеток и активацию экспрессии ранних генов эмбриогенеза.

ЗО-культивирование ММСК/ЗСК, таким образом, открывает беспрецедентные возможности изучения раннего соматического эмбриогенеза млекопитающих и человека и механизмов согласованного ответа на повреждения тканей.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Репин B.C., Сабурина И.Н. Обратимые эпителио-мезенхимальные трансформации клеток в эмбриогенезе и поотнатальном обновлении тканей. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2006; 3: 64—73.

2. Zipori D. MSCs: harnessing cell plasticity to tissue and organ repair. Blood Cell Mol. Dis. 2004; 33: 211-15.

3. Zipori D. Biology of Stem Cells and the molecular basis of the stem state. Ed. Bosch G. Thomas C.G. Springer Verlag, Munich, Heidelberg. 2DD9.

4. Zipori D. The stem state: mesenchymal plasticity as a paradigm. Curr. Stem Cell Res. Ther. 2DD6; 1: 95-102.

5. Prindull G., Zipori D. Environmental guidance of normal and tumor cell plasticity: epithelio-to-mesenchymal transitions as a paradigm. Blood 2004; 8: 8-12.

6. Thiery J.P., Acloque H., Huang R.Y. et al. Epithelial-to- mesenchymal transitions in development and disease. Cell 2009; 139: 871—90.

7. Ryan P., Foty R.A., Kohn J. et al. Tissue spreading on implantable substrates is a competitive outcome of cell-cell vs cell-substratum adhesivity. Proc. Natl. Acad. Sci. US. 2001; 98: 4323-27.

8. Ninomiya H., Winklbauer R. Epithelial coating controls mesenchymal shape change through tissue-positioning effects and reduction of surface-minimizing tension. Nat. Cell Biol. 2008; 10: 61-71.

9. Marga F., Neagu A., Kostzin I. et al. Developmental Biology and Tissue Engineering. Birth Defects Res. Part C. 2007; 81: 320—8.

10. Takezawa T. A strategy for the development of tissue engineering scaffolds that regulates cell behavior. Biomaterials 2003; 24: 2267-75.

11. Hoffman R.M. To do culture in 2D or 3D? That is the question. Stem Cells 1993; 11: 105-11.

12. Walsh K., Megyesi J., Hammond R. Human CNS tissue cultures: a historical review and examination of recent advances. Neurobiol. Dis. 2005; 18: 2-18.

13. Raiteri M. Functional pharmacology in human brain. Pharmacol. Rev. 2006; 58: 162-93.

14. Gibbons H.M., Dragunow M. Adult human brain cell culture for neuroscience research. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2010; 42(B): 844—56.

15. Sutherland R.M. Cell and environment interactions in tumor genesis: the multicell spheroid model. Science 1988; 240: 177-84.

16. Chun M.H. Serum signaling factors and spheroids. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2000; 36: 89-98.

17. Morales J., Alpaugh M.L. Gain in cellular organization of inflammatory breast cancer: a 3D in vitro model that mimics the in vivo metastasis. BMC Cancer 2009; 9: 462-9.

18. Miller B.E. Michelson S. Tumor micro-ecology and competitive interactions. J. Theoret. Biol. 1987; 128: 233-46.

19. Kuwashima Y., Yamada Т., Saio M. et al. Formation and growth of multicellular spheroids in medium containing low concentration of agarose. Cancer Letters 1993; 71: 31-36.

20. Emerman J.T., Pitelka D.R. Maintenance and induction of morphologic differentiation in dissociated mammary epithelium on floating collagen membrane. In Vitro 1977; 13: 316-28.

21. Li M.L., Aggler J., Farson D.A. Influence of reconstituted basement membrane and its components on casein gene expression and secretion in mouse mammary epithelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci US. 1987; 84: 136-40.

22. Moscona A., Moscona H. The dissociation and aggregation of cells from organ rudiments of the early chick embryos. J. Anat. 1952; 86: 287-303.

23. Moscona A.A. Tissues from dissociated cells. Sci. Amer. 1959; 200: 132-4.

24. Steinberg M.S. Reconsttution of tissues by dissociated cells: some morphogenetic tissue movements and the sorting out of embryonic cells may have a common explanation. Science 1963; 141: 401—8.

25. Steinberg M.S. Differential adhesion and morphogenesis: a modern view. Curr. Opin. Genet. Dev. 2007; 17: 281-5.

26. Mironov V., Visconti R.R., Kasjanov V. et al. Organ printing: tissue spheroids as a building blocks. Biomaterials 2009; 30: 2164—74.

27. Takezawa T., Mori Y., Yonaha T. et al. Characterization of morphology and cellular metabolism during spheroid formation. Exp. Cell Res. 1993; 208: 430-41.

28. Takahashi K., Mitsui M., Takeuchi K. et al. Preservation of the characteristics of the cultured human type 2 alveolar epithelial cells. Lung 2004; 182: 213-28.

29. Lin R.Z., Chang H.Y. Recent advances in 3-D-multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology 2008; 3: 1172—84.

30. Kelm J.M., Dijonov V., Ittner M. Design of custom shaped vascularized microtissues using spheroids as a minimal building units. Tissue Eng. 2006; 12: 2151-60.

31. Torisawa Y., Takagi A., Nashimoto Y. A multicellular spheroid assay to realize spheroid formation, culture and viability assay on a chip. Biomaterials 2007; 28: 559-66.

32. Long S.H., Smith J., Hyde C. Differentiation of prostate epithelial cell cultures by matrigel/stromal cell glandular reconstruction. In Vitro Cell Dev. Anim. 2006; 42: 273-80.

33. Castillon N., Hinnrasky J., Zahm J.M. et al. Polarized expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and associated epithelial proteins during the regeneration of human airway surface epithelium in 3-D- culture. Lab. Invest. 2002; 82: 989—98.

34. Hoem D., Dalen H., Andren-Sandberg A. et al. Nonadhesive organ culture of human exocrine pancreatic cells with their stroma. Pancreas 2002; 26: 71-7.

35. Fjellbirkeland L., Bjerkvig R., et al. Non-adhesive stationary organ culture of human bronchial mucosa. Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 1996; 15: 197-206.

36. Gamarra F., Bergner A., Stauss E. et al. Rotation frequency of human bronchial and nasal epithelial spheroids as an indicator of mucociliary function. Respiration 2006; 73: 864-72.

37. Tesei A., Zoli W., Arienti C. et al. Isolation of stem /progenitor cells from normal lung tissue of adult humans. Cell Prolif. 2009; 42: 298-308.

38. Gati I., Danielsson G., Betmark T. et al. Culturing of diagnostic muscle biopsies as spheroid-like structures: a pilot study of morphology and viability. Neurol Res. 2DD9 Aug 5. Epub ahead of print.

39. Sarig R., Baruchi Z., Fuchs 0. et al. Regeneration and transdifferentiation potential of muscle-derived stem cell propagated as myospheres. Stem Cells 2DD6; 24: 1769-76.

4D. Nomura Т., Ashihara E., Tateishi K. et al. Skeletal myosphere-derived progenitor cell transplantation promotes neovascularization in sarcoglycan knock down cardiomyopathy. Biochem. Biophys. Res. Comms. 2007; 352: 668-74.

41. Arsic N., Mammaeva D., Lamb N.J. et al. Muscle-derived stem cells isolated as non-adherent population give rise to cardiac, skeletal muscle and neural lineages. Exp. Cell Res. 2008; 314: 1266-80.

42. Gati I., Danielsson 0., Betkark T. Spheroid-like structures in cultures of muscle biopsies. Neuromusc. Disorders 2007; 17: 876—82.

43. Teunissen C.E. Whole brain spheroids cultures as a model to study the development of NO-synthase guanylate cyclase signal transduction. Brain Res. 2000; 125: 99-115.

44. Andersen R.M., Johansen M., Blaabjerg M. et al. Neural tissue spheres: a microexplant culture method for propagation of precursor cells from the rat forbrain subventricular zone. J. Neurosci. Methods. 2007; 165: 55-63.

45. Andersen R.K., Zimmer J., Wahlberg L.U. et al. Effect of LIF and long term propagation of precursor cells derived from rat forebrain subventricular zone and ventral mesencephalon. Exp. Neurol. 2008; 211: 301-10.

46. Funderburgh M.L., Du Y., Funerburgh J. Primary keratocytes form spheroid bodies in vitro. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 2005: 46.

47. Ushida S., Yokoo S., Yanagi Y. et al. Sphere formation and expression of neural proteins by human corneal stromal cells in vitro. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 2005; 46: 1620-5.

48. Mimura Т., Amano S., Yokoo S. et al. Isolation and distribution of rabbit keratocyte precursors. Mol. Vision. 2008; 14: 197-208.

49. Layer R.G., Willbold E. Regeneraion of the avian retina by retinospheroid technology. Progr. Retinal Eye Res. 1994; 13: 197—207.

50. Викторов И.В., Александрова О.П., Алексеева Н.Ю. Роллерная органная культура сетчатки постнатальных крыс. Бюлл. Зксп. Биол. мед. 2006; 142: 486-9.

51. Tait I.S., Flint N., Cambell F.C. et al. Generation of neomucosa in vivo by transplantation of dissociated rat postnatal small intestinal epithelial cells. Differentiation 1994; 56: 91-100.

52. Evans G.S., Flint N., Somers A.S. et al. The development of a method for the preparation of rat intestinal epithelial cell primary culture. J. Cell Sci. 1992; 101: 219-31.

53. Slorach E.M., Campbell F.C., Dorin J.R. A mouse model of intestinal stem cell function and regeneration. J. Cell Sci. 1999; 112: 3029-38.

54. Cottrill C.P., Archer C.W., Wolpert L. Cell sorting and hondrogenic aggregate formation in micromass culture. Dev. Biol. 1987; 122: 503—15.

55. Neufeld D.A. Formation of prechondrogenic mesenchymal cell aggregates in the regenerating newt limb. Dev. Biol. 1982; 93: 36—42.

56. Gonzalez P., Epstein D.L., Luna C. et al. Characterization of freefloating spheres from human trabecular meshwork cell culture in vitro. Exp. Eye Res. 2006; 82: 959-67.

57. Chen M.H., Chen Y.J., Liao C.C. et al. Formation of salivary acinar cell spheroids in vitro above a polyvinyl alcohol-coated surface. J. Biomed. Mater. Res. 2009; 90: 1068-72.

58. Hisatomi Y., Okumura K., Nakamura K. et al. Flow cytometric isolation of endodermal progenitors from mouse salivary gland differentiate into hepatic and pancreatic lineages. Hepatology 2004; 39: 667—75.

59. Matsumoto S., Okumura K., Ogata A. et al. Isolation of tissue progenitor cells from duct-ligated salivary gland of swine. Cloning Stem Cells 2007; 9: 176-90.

60. Carlsson J., Nilsson K., Westermark B. et al. Formation and growth of multicellular spheroids of human origin. Int. J. Cancer. 1983; 31: 523-33.

61. Inoue S., Takaoka K., Endo T. et al. In vitro confirmation of a newly established lung cancer lines using flow cytometry and multicellular tumor spheroids. Lung Cancer 1997; 17: 85—101.

62. Kubota A., Nishida K., Nakashima K. et al. Conversion of mammalian Muller glial cells into a neuronal lineage by in vitro aggregate-culture. Biochem. Biophys. Res. Comms. 2006; 351: 514-20.

63. Willbold E., Berger J., Reinicke M. et al. On the role of Muller glia cells in histogenesis: Only retinal spheroids, but not tectal, telencephalic and cerebellar spheroids evelop histiotypical patterns. J. Hirnforsch. 1997; 38: 383-8.

64. Ревищин А.В., Полтавцева P.А., Марей M.B. и др. Характеристика клеточных кластеров возникающих в культуре диссоциированных клеток эмбрионального мозга человека. Бюлл. Зксп. Биол. мед. 2001; 132: 856-60.

65. Weinlich М., Baumstark С., Usta Е. et al. Human duodenal spheroids for non-invasive intracellular pH measurement and quantification of regulation mechanisms under physiological conditions. In Vitro Cell Dev. 2002; 38: 7-13.

66. Frith J.E., Thomson B., Genever P. Dynamic 3D-culture methods enhance MSC cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Eng Part C Methods. 2009 Oct 7. Epub ahead of print.

67. Sauerzweig S., Munsch T., Lessmann V. et al. A population of serum deprivation-induced bone marrow MSCs express markers typical for embryonic and neural stem cells. Exp. Cell Res. 2009; 315(11: 50-66.

68. Howson K.M., Aplin A.C., Gelati M. et al. The postnatal rat aorta contains pericyte progenitor cells that form spheroidal colonies in suspension culture. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2005; 289: 1396-407.

69. Laib A.M., Bartol A., Alajati A. et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nat. Protoc. 2009; 4: 1202-15.

70. BrophyC.M., Luebke-Wheeler J.L., Amiot B.P. etal. Rat hepatocyte spheroids formed by rocked technique maintain differentiated hepatocytes gene expression and function. Hepatology 2009; 49: 578—86.

71. Yuasa C., Tomita Y., Shono M. et al. Importance of cell aggregation for expression of liver functions and regeneration demonstrated with the primary cultured hepatocytes, J. Cell. Physiol. 1993; 156: 522—30.

72. Galan-Rodriguez B., del-Marco A., Flores J.A. et al. Grafts of extra-adrenal chromaffin cells as aggregates show better survival rate and regenerative effects on parkinsonian rats than despersed cell grafts. Neurbiol. Dis. 2008; 29: 529-42.

73. Garzoni L.R. Rossi M.I., de Barros A.P. et al. Dissecting coronary angiogenesis: 3D culture of cardiomyocytes with endothelial or mesenchymal cells. Exp. Cell Res. 2009; 315: 3406-18.

74. Thiery J.P., Sleeman J.P. Complex networks orchestrate epithelio-mesenchymal transition. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2006; 7: 131-41.

75. Grobstein C. Mechanisms of organogenetic tissue interaction. J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 1967; 26: 279-99.

76. Cunha G.R. Mesenchymal-epithelial interactions: past, present and future. Differentiation 2008; 76: 578-86.

77. Havlikova B., Biro T., Mescalchin A. et al. Folliculoid microsphere assay for exploring epithelio-mesenchymal interactions in the human hair follicle. J. Investig. Dermatol. 2009; 129: 972-83.

78. Dean C., Ito M., Makarenkova N.P. et al. BMP-7 regulates branching morphogenesis of the lacrimal gland by promoting mesenchymal proliferation and condensation. Development 2004; 131: 4155—65.

79. Yang J., Weinberg R.A. Epithelial-mesenchymal transition: at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev. Cell. 2008; 14: 318-28.

80. Hay E.D., Zuk A. Transformation between epithelium and mesenchyme: normal, pathological and experimentally induced. Am. J. Kidney Dis. 1995; 26: 678-90.

81. Hay E.D. The mesenchymal cell, its role in the embryo, and the remarkable signaling mechanism, that create it. Dev. Dyn. 2005; 233: 706-20.

82. Shook D., Keller R. Mechanisms, mechanics and function of epithelio-mesenchymal transition in early development. Mech. Dev. 2003; 120: 1351-83.

83. Hader C., Marlier A., Cantley L. Mesenchymal-epithelial transition in epithelial response to injury: the role of FoxC2. Oncogene 2009; 131: 1-10.

84. Hudson L.G., Newkirk K.M., Chandler H.L. et al. Cutaneous wound reepithelialization is compromised in mice lacking functional Slug [Snail21. J. Dermatol. Sci. 2009; 56: 19-26.

85. Cornier J.T., zur Nieden N.I., Rancourt D.E. et al. Expansion of undifferentiated murine embryonic stem cells as aggregates in suspension culture bioreactors. Tissue Eng. 2006; 12: 3233—45.

86. zur Nieden N.I., Cormier J.I., Rancourt D.E. et al. Embryonic stem cells remain highly pluripotent following long term expansion as aggregates in suspension bioreactors. J. Biotechnol. 2007; 129: 421—32.

87. Oh S.K., Chen A.K., Mok Y. et al. Long-term microcarrier suspension cultures of hESCs. Stem Cell Res. 2009; 2: 219-30.

88. Djordjevic B., Lange C.S. Cell-cell interactions in ESC spheroids maintained in suspension. Acta Oncol. 2006; 45: 373—5.

89. Mohr J.C., Pablo J.J., Palecek S.P. 3D microwell culture of human ESC. Biomaterials 2006; 27: 6032-42.

90. Yim E.K., Wen J., Leong K.W. Enhanced extracellular matrix production and differentiation of hESCs derivatives in biodegradable poly-caprolactone-co-ethyl ethylenephosphate scaffold. Acta Biomaterialia 2006; 2: 365-76.

91. Ouyang A., Ng R., Yang S.T. et al. Long term culturing of undifferentiated ESCs in conditioned media and 2D fibrous matrices. Stem Cells 2007; 25: 447-54.

92. Gerecht S., Burdick J.A., Ferreira R.S. et al. Hyaluronic acid hydrogel for controlled self-renewal and differentiation of human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. US. 2007; 104: 11298-303.

93. Paquet-Durand F., Tan S., Bicker G. Turning teratocarcinoma cells into neurons: rapid differentiation of NT-2 cells in floating spheres. Dev. Brain Res. 2003; 142: 161-7.

94. Barberi T., Willis L.M., Socci N.D. et al. Derivation of multipotent MSC precursors from hESCs. PloS Medicine 2005; 2: 161-9.

95. Stojkovich P., Lako M., Stewart R. et al. An autogenic feeder cells system that efficintly supports growth of undifferentiated hESCs. Stem Cells 2005; 23: 306-14.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, hl< 2, 2010

96. Hwang N.S., Varghese S., Lee H.J. et al. In vitro commitment and functional regeneration using hESC—derived MSCs. Proc. Natl. Acad. Sci US. 2008; 105: 20641-6.

97. Pozzobon M., Picolli M., Ditadi A. et al. Mesenchymal stem cells can be derived from CD1331 cells: implication for therapy. Stem Cell Dev. 2009; 18: 497-507.

98. Hewitt K.J., Shamis Y., Carlson M.W. et al. Three dimensional epithelial tissues generated from human ESCs. Tissue Eng. 2009; 15: 3417-27.

99. Behr R., Heneweer C., Viebahn C. et al. Epithelial-mesenchymal transition in colonies of rhesus monkey ESCs: a model for processes involved in gastrulation. Sem Cells 2005; 23: 805—16.

100. Alacorn V.B., Marikawa Y. Molecular study of mouse periimplantation development using the in vitro culture of aggregated Inner Cell Mass. Mol. Reprod. Dev. 2004; 67: 83-90.

101. Masaki H., Nishida T., Kitajima S. et al. Developmental pluripotency associated 4 [DPPA4] localized in active chromatin inhibits mESC differentiation into a primitive ectoderm lineage. J. Biol.Chem. 2007; 282: 33034-42.

102. Liu Z.J., Zhuge Y., Velazquez O.C. Trafficking and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells. Journal of Cellular Biochemistry 2009; 106: 984-91.

103. Potapova I.A., Gaudette G.R., Brink P.R., Robinson R.B., Rosen M.R., Cohen I.S., Doronin S.V. Mesenchymal stem cells support migration, extracellular matrix invasion, proliferation, and survival of endothelial cells in vitro. Stem Cells 2007; 25: 1761-8.

104. Сабурина И.Н., Горкун A.A., Кошелева Н.В., Семенова М.Л., Пулин A.A., Репин B.C. Сопоставление поведения стромальных клеток пупочного канатика и мультипотентных стромальных клеток взрослого костного мозга в 2-D и 3-D культуре: моделирование стромальной регенерации. Вестник новых медицинских технологий 2009; XVI [41: 9-11.

105. Yoo J.U., Barthel T.S., Nishimura К. et al. The chondrogenic potential of human bone-marrow-derived mesenchymal progenitor cells. The Journal of Bone and Joint Surgery 1998; 80-AC12]: 1745-57.

106. Wang W., Itaka K., Ohba S. et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials 2009; 30: 2705—15.

107. Penick K.J., Solchaga L.A., Welter J.F. High-throughput aggregate culture system to assess the chondrogenic potential of mesenchymal stem cells. Biotechniques 2005; 39C5): 687—91.

108. Welter J.F., Solchaga L.A., Penick K.J. Simplification of aggregate culture of human mesenchymal stem cells as a chondrogenic screening assay. Biotechniques 2007; 42: 732—7.

109. Lin R-Z., Chou L-F., Chien C-C.M. et al. Dynamic analysis of hepatoma spheroid formation: roles of E-cadherin and e1-integrin. Cell and tissue Research. 2006; 324(31: 411-422.

110. Curcio E., Salerno S., Barbieri G. et al. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials 2007; 28(361: 5287—97.

111. Griffith L.G., Swartz M.A. Capturing complex 3Dtissue physiology in vitro. Molecular Cell Biology 2006; 7: 211-24.

Поступила 19.042010

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, hl< 2, 2010