Уровень мутаций хромосом в лимфоцитах периферической крови детей-подростков из Горной Шории с учетом экологического и этнического факторов

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

В.Г. Дружинин, А.В. Шабалдин, А.В. Мальцев, Т.А. Головина, В.Р. Ахматьянова

Кемеровский государственный университет, Институт экологии человека СО РАН,

г. Кемерово,

МУЗ Центральная городская больница,

г. Таштагол

УРОВЕНЬ МУТАЦИЙ ХРОМОСОМ В ЛИМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ДЕТЕЙ-ПОДРОСТКОВ ИЗ ГОРНОЙ ШОРИИ С УЧЕТОМ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО И ЭТНИЧЕСКОГО ФАКТОРОВ

С целью проверки гипотезы о модификации спонтанного уровня цитогенетических нарушений в малой этнической группе были изучены хромосомные аберрации в культурах лимфоцитов периферической крови 132 детей-подростков, проживающих в Горной Шории. Среднее значение метафаз с аберрациями составило 4,7 ± 0,2 %, что достоверно выше фонового уровня этого показателя для Кузбасского региона в целом - 2,6 ± 0,3 %.

Общая когорта была разделена на этнические группы: шорцы (N 59), русские (N 48), метисы (N 25). Эти группы были согласованы по полу, возрасту и статусу здоровья. Обнаружено значимое увеличение показателя метафаз с аберрациями в группе метисов -

5,4 ± 0,4 % в сравнении с шорцами - 4,2 ± 0,4 % (Р = 0,01). Русские (5,1 ± 0,4 %) и шорцы по этому показателю не отличались. Обсуждаются причины увеличения частоты хромосомных аберраций у жителей данного горного района (включая радиационный фактор), а также причины увеличения фоновых цитогенетических нарушений у метисов по сравнению с шорцами и русскими.

Ключевые слова: дети-подростки, хромосомные аберрации.

The hypothesis about modification of a spontaneous level of chromosomal aberrations (CA) in a small ethnic group has been checked up. CA in 48-hour cultures of a peripheral blood lymphocytes of 132 children-teenagers, living in the same ecological conditions - mountain area in Western Siberia (Gornaya Shoria), has been investigated. Average value of metaphases with CA has made 4,7 ± 0,2 %, that is significantly higher than a background level of this parameter for the given region (the Kemerovo region) - 2,6 ± 0,3 %. The general cohort has been divided into ethnic groups: Shors (N 59), Russian (N 48), metis (N 25). The significant increase in a parameter of metaphases with CA in group of metis - 5,4 ± 0,4 % in comparison with Shors -4,2 ± 0,4 % (Р = 0,01) has been found. Russian (5,1 ± 0,4 %) and Shors on this parameter did not differ. The reasons of increase in frequency of CA at inhabitants of the given mountain area, and also the reasons of increase background cytogenetic damages at metis in comparison with Shors and Russian are discussed.

Key words: children-teenagers, chromosomal aberrations.

Несмотря на почти полувековую историю ис- остается вопрос о вариабельности частоты спонтан-пользования цитогенетических методов для ных хромосомных аберраций на популяционном уров-изучения спонтанного хромосомного мутаге- не с учетом этнического фактора. Данный аспект ос-неза у человека, отдельные аспекты этой фундамен- вещен в литературе крайне мало и остается неясным тальной проблемы до настоящего времени остаются из-за отсутствия унифицированных обследований. недостаточно изученными. В частности, открытым Вместе с тем, известно, что каждая популяция об-

ладает собственным уровнем «генетического груза», который может определяться, в том числе, эффективной численностью, уровнем инбридинга, особенностями миграционных процессов, климатогеографическими особенностями территории проживания и т.п. Проживая в относительной изоляции, отдельные малые этнические группы способны накапливать с высокой частотой ряд генов, в том числе ответственных за формирование наследственных патологий, что, теоретически, может приводить к вымиранию популяций и целых этносов. В связи с этим, становится понятным значение исследований по изучению особенностей генома и мутационного процесса у населения малочисленных народностей.

Исходя из анализа данных литературы и результатов собственных исследований, мы сформировали рабочую гипотезу о том, что этнический фактор может выступать в качестве модификатора спонтанного уровня хромосомных мутаций в популяциях человека. Гипотеза основана на положении о том, что в малых этнических группах, вследствие усиления действия фактора репродуктивной изоляции и инбридинга, способны накапливаться с повышенной частотой ряд генов или вариантов иных полиморфных генетических систем, ассоциированных с увеличением уровня хромосомной нестабильности.

Для проверки этой гипотезы была сформулирована цель исследования — изучить спонтанный уровень хромосомных аберраций в сочетании с оценкой полиморфизма некоторых генов биотрансформации ксенобиотиков (GSTM1 and GSTT1) в группах, различающихся по этнической принадлежности.

как возможного модификатора спонтанного уровня хромосомных аберраций, появляется при введении возрастного ценза при формировании изучаемой выборки. С этих позиций выбор детей-подростков может быть наиболее удачным, так как в этом случае минимизируется воздействие таких факторов, как вредные привычки, хронические болезни и влияние профессионального контакта с производственными вредностями. Помимо этого, компактное нахождение всех членов выборки (все обследованные живут совместно в школе-интернате) обеспечивает максимальную унификацию по параметрам питания и условиям проживания.

В таблице 1 представлены данные, характеризующие изучаемую группу по полу и возрасту.

Таблица 1

Пол и возраст детей-подростков из Горной Шории, включенных в исследуемую группу

Индивиды N Возраст (M ± m) Вариации возраста

Всего: 132 14,2 ± 0,18 10-19

- мальчики 66 14,2 ± 0,28 10-19

- девочки 66 14,2 ± 0,22 11-19

Шорцы: 59 14,3 ± 0,27 10-19

- мальчики 31 14,6 ± 0,42 10-19

- девочки 28 14,0 ± 0,37 11-19

Русские: 48 14,2 ± 0,29 10-18

- мальчики 23 13,8 ± 0,47 10-18

- девочки 25 14,6 ± 0,35 11-17

Метисы: 25 13,9 ± 0,38 10-18

- мальчики 12 13,8 ± 0,6 10-18

- девочки 13 13,9 ± 0,51 11-17

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Были изучены хромосомные аберрации в 48-часовых культурах лимфоцитов периферической крови у 132 детей-подростков в возрасте 10-19 лет, проживающих в Таштагольском районе Кемеровской области.

Данный район представлен горной таежной местностью, характеризуется относительно небольшим уровнем химического загрязнения воздушной, водной и почвенной среды. В то же время в этом районе идет интенсивная добыча полезных ископаемых: руды и каменного угля, так что некоторая часть территории имеет негативные загрязнения окружающей среды. Все обследованные были также разделены на три этнические группы: шорцы (Ы 59), русские (Ы 48) и метисы (шорец/русский, N 25).

Коренным малочисленным тюркским народом Сибири, проживающим на территории Таштагольско-го района, являются шорцы. Общая численность — 12000 человек, традиционный вид занятий — охота, рыбалка, собирательство [http://shoriya.ngpi.rdtc.ru]. За последние годы увеличивается число межнациональных браков, тем не менее, инбридинг в популяции шорцев остается высоким варьирует от 0,0019 до 0,0043 для разных населенных пунктов).

Как представляется, наиболее оптимальная возможность оценить значимость этнического фактора,

Все доноры не имели хронических заболеваний, были некурящие. В обследование не включали лиц, проходивших медикаментозное лечение, рентгенологическое обследование в течение 3-х месяцев до сбора материала.

Подготовку препаратов метафазных хромосом осуществляли с использованием стандартного полумик-рометода культивирования лимфоцитов [1]. Культивировали цельную венозную кровь, которую брали из локтевой вены. В культуральный флакон помещали 0,5 мл крови, 0,1 мл фитогемагглютинина (ПанЭко), 6 мл среды RPMI 1640 (ПанЭко), 1,5 мл сыворотки крупного рогатого скота. Длительность культивирования составляла 48 часов. За 2 часа до фиксации в культуры добавляли колхицин в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. По окончании культивирования клетки обрабатывали гипотоническим раствором 0,55 % КС1 в течение 10-15 мин. при 37°С. Фиксацию материала проводили в 3 сменах охлажденного этанол-уксусного фиксатора (3 : 1). Клеточную суспензию раскапывали на чистые, охлажденные, смоченные водой предметные стекла. Препараты шифровали и окрашивали 2 % раствором красителя Гимза.

Учет хромосомных аберраций проводили без ка-риотипирования. Отбор метафаз, включаемых в анализ, и критерии для регистрации цитогенетических

ОУШщит ..

вКуэбассе N2 2 2007 25

нарушений соответствовали общепринятым рекомендациям [2, 3]. Учитывали четыре основные категории хромосомных аберраций: хроматидные (B*) и хромосомные (B**) разрывы; хроматидные (E*) и хромосомные (E**) обмены. Ахроматические пробелы в число аберраций не включали, и учитывали отдельно. В среднем, на каждого индивида анализировали по 225 метафаз (100-500).

Оценку полиморфизма генов глутатион S-тран-сфераз М1 и Т1 (GSTM1 и GSTT1) осуществляли методом ПЦР в соответствии с Zhong et al. [4] и Pemble et al. [5]. Смесь для амплификации объемом 25 мкл включала 2,5 мкл 10х каждого праймера,

2.5 мкл 10х ПЦР буфера (10 мМ трис-НС1, pH 8.3,

1.5 mM MgCl2, 50 mM KCl), 0,2 mM каждого dNTP и 0,5 ед. Taq-полимеразы и 5 мкл геномной ДНК.

Статистическую обработку осуществляли с помощью IBM PC средствами «STATISTICA for WINDOWS 5.0». Использовали методы непараметрической статистики. Выбор такого подхода связан с отсутствием нормального распределения в клеточных культурах по частоте хромосомных аберраций в большинстве случаев. Сравнение групп осуществляли с помощью рангового U-теста Манна-Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты изучения хромосомных аберраций в группе детей-подростков из Горной Шории представлены в таблице 2. Для сравнения включены наши прошлые данные цитогенетического исследования де-тей-подростков из этого же района, выполненные в 1992 г. [6], а также данные о фоновом уровне chromosomal aberrations в группе жителей экологически чистых деревень в Кемеровском регионе — базисный контроль [7].

Из данных таблицы 2 следует, что основной цитогенетический показатель — AB.C. в группах детей-подростков из Горной Шории высокодостоверно увеличен, по сравнению с базисной контрольной группой (P < 0,001). Между собой выборки детей-подрос-тков из Горной Шории, изученные в 1992 г. и 2005 г., не имеют значимых различий по значению AB.C. (P > 0,05). Значения отдельных категорий аберраций: хро-матидных и хромосомных разрывов, а также обменов хромосомного типа были достоверно выше у жителей Горной Шории, в сравнении с базисной контрольной группой.

Стабильно высокие значения фоновых цитогенетических нарушений в целом указывают, что на популяцию человека в Горной Шории постоянно воздействуют генотоксические факторы. Особенно важен тот факт, что обмены хромосомного типа, включающие дицентрические и кольцевые хромосомы, также чаще регистрировались у детей-подростков из Горной Шо-

Таблица 2

Хромосомные аберрации в группах детей-подростков из Горной Шории: 2005 (данное исследование), 1992 [6] и в базисной контрольной группе [7]

Хромосомные аберрации Горная Шория

N 132 28 110

AB.C. (%) 4,74 ± 0,21a ** 5,78 ± 0,63** 2,86 ± 0,26

B* 2,83 ± 0,16** 3,93 ± 0,49* 2,08 ± 0,22

B** 1,89 ± 0,14** 1,82 ± 0,36* 0,89 ± 0,14

E* 0,05 ± 0,02 0,04 ± 0,04 0,04 ± 0,02

E** 0,32 ± 0,05** 0,32 ± 0,14 0,08 ± 0,03

Примечание: a Mean ± SE; * P < 0,01; ** P < 0,001.

рии, как в 1992 г. (0,32 ± 0,14), так и в 2005 г. (0,32 ± 0,05). Известно, что эта категория аберраций является хорошим маркером воздействия радиации [8]. Поэтому мы полагаем, что результаты цитогенетического исследования выборки из Горной Шории в 2005 г. подтверждают нашу раннюю гипотезу о том, что основным кластогенным фактором в этом горном районе является радиация [6].

Кроме клеток с единичными цитогенетическими изменениями, в группе детей-подростков из Горной Шории (2005 г.) у 6 индивидов (4,6 %) были найдены типичные мультиаберрантные — rogue cells [9]. Характеристика этих клеток представлена в таблице 3.

До настоящего времени причина появления rogue cells остается неизвестной. В некоторых публикациях появление этих клеток связывают с инфицированием JC вирусом полиомы человека [10, 11], воздействием бактериальных эндонуклеаз рестрикции [12]. Согласно другим данным, появление rogue cells может быть вызвано плотноионизирующим излучением альфа-частицами [13, 14, 15, 16]. На этом этапе исследования мы не можем подтвердить или опровергнуть какую либо точку зрения. Появление rogue cells у детей-подростков из Горной Шо-рии может быть связано как с радиацией, так и с неустановленной вирусной инфекцией. Данный вопрос требует дальнейшего изучения. Вместе с тем, мы не можем подтвердить данные J.V. Neel [17] о том, что индивиды с rogue cells имеют увеличение частоты «единичных» хромосомных аберраций (AB.C. в группе индивидов с rogue cells составила только

4,5 ± 0,7 %).

Таблица 3

Rogue cells у детей-подростков из Горной Шории

N инд. Пол N клеток ) % .C. B. A Нарушения в rogue cells

1 Ж 500 2,8 tetra - 1, tric - 1, dic - 5, R - 1, t - 2, double minutes - 16

2 Ж 500 4,8 dic - 2, R - 4, t - 1, fra - 7, double minutes - 7

3 М 500 4,2 tric - 1, dic - 3, double minutes - 8

4 М 200 4,5 dic - 3, R - 2, double minutes - 14

5 М 200 3,0 dic - 3, R - 3, fra - 1, double minutes - 6

6 М 400 7,5 dic - 3, fra - 6, double minutes - 4

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Значения цитогенетических показателей в подгруппах детей-подростков из Горной Шории, дифференцированных по этнической принадлежности, представлены в таблице 4. Для сравнения, в этой же таблице даны результаты пилотного цитогенетического исследования в 1992 г.

[6]. Наименьшее значение АВ.С. в этом исследовании выявлено у шорцев (4,2 ± 0,3 %), наибольшее — у метисов (5,4 ± 0,4 %), различия достоверны (Р < 0,01).

Промежуточное значение АВ.С. было выявлено у русских (5,1 ± 0,4 %), но оно статистически не отличалось при сравнении с шорцами или метисами. В исследовании 1992 г. результаты были противоположны по направленности. Возможно, это связано с малой численностью выборки, изученной в пилотном исследовании. Таким образом, результаты данного исследования показали, что шорцы (дети и подростки) в целом неплохо адаптированы к современным условиям окружающей среды в месте своего традиционного проживания.

В то же время, увеличенное значение АВ.С. у метисов позволяет предположить, что фактор метисации потенциально может влиять на фоновый уровень хромосомных аберраций в популяции человека. Эта идея нуждается в дальнейшей экспериментальной проверке.

В таблице 5 представлено распределение обследованных индивидов по генотипам «+» и «0» в локу-сах GSTM1 и GSTT1, а также значения частот показателя доли метафаз с аберрациями, выявленными в данных группах. Значение АВ.С. в выборке индивидов с GSTМ1 нулевым генотипом оказалось несколько выше, чем при GSTM1 позитивном варианте генотипа, однако различия были недостоверны

Таблица 4

Хромосомные аберрации в группах детей-подростков из Горной Шории, дифференцированных по этническому фактору

Хромосомные Горная Шория

аберрации Шорцы Русские Метисы Шорцы Русские

N Б9 48 2Б 20 8

AB.C. (%) 4,19 ± 0,26a 5,08 ± 0,4 5,4 ± 0,4* 6,7 ± 0,77 3,5 ± 0,54**

B* 2,42 ± 0,21 3,1 ± 0,28 3,27 ± 0,37 4,5 ± 0,62 2,5 ± 0,42

B** 1,88 ± 0,23 1,77 ± 0,2 2,14 ± 0,26 2,2 ± 0,47 0,86 ± 0,29

E* 0,07 ± 0,03 0,03 ± 0,02 0,02 ± 0,02 0 0,13 ± 0,13

E** 0,26 ± 0,08 0,39 ± 0,1 0,35 ± 0,09 0,45 ± 0,19 0

Примечание: a Mean ± SE; * отличается от значения для группы "шорцы" (2005), P < 0,01; ** отличается от значения для группы "шорцы" (1992), P < 0,01.

Таблица 5

Эффект GSTM1 и GSTT1 генотипов на частоту хромосомных аберраций (АВ.С.) в группах детей-подростков из Горной Шории

Генотип N AB.C.

GSTM1 ( + ) 105 4,65 ± 0,22

(0) 8 6,16 ± 0,77

GSTP1 ( + ) 105 4,47 ± 0,22

(0) 8 4,15 ± 0,68

(Р = 0,09). Отмечено также отсутствие влияния GSTT1 генотипов на частоту AB.C. В целом, у шорцев была отмечена более низкая частота встречаемости GSTM1 нулевого генотипа (4,8 %) в сравнении с русскими (13,7 %) и метисами (б,3 %). GSTT1 нулевой генотип был распределен сходным образом:

4,5 % у шорцев; 9,8 % у русских и 9,1 % у метисов.

В дальнейшем мы планируем исследовать представляемую выборку на распределение генотипов по некоторым другим полиморфным локусам xenobiotic-metabolizing enzymes, таким как CYP1A1, CYP2E1, N-acetyltransferases (NAT1 and NAT2), paraoxonase 1 (PONl) и др.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Human biomonitoring of occupational exposure to 1,3-butadiene /M. Sorsa, K. Autio, N.A. Demopoulos, et al. //Mutat. Res. - 1994. - N 307. - P. 355-363.

2. WHO, Guidelines for the study of genetic effects in human populations, Environ. Health Cri-ter. 46 (1985) Geneva.

3. Considerations for population monitoring using cytogenetic techniques /A.V. Carrano, A.T. Natarajan //Mutat. Res. - 1988. - N 204. - P. 379-406.

4. Relationship between the GSTM1 genetic polymorphism and susceptibility to bladder, breast and colon cancer /S. Zhong, A.H. Wyllie, D. Barnes et al. //Carcinogenesis. - 1993. -N 14. - P. 1821-1825.

5. Human glutathione-S-transferase theta GSTM1 : cDNA cloning and the characterization of a genetic polymorphism /S. Pemble, K.R. Schroeder, S.R. Spencer et al. //Biochem. J. -1994. - N 300. - P. 271-276.

6. Druzhinin, V.G. Cytogenetic effects in adolescent children from various regions of the Ke-merovskaia district /V.G. Druzhinin, A.Iu. Lifanov, T.A. Golovina. //Genetika. - 1995. -N 31. - P. 983-987.

7. Druzhinin, V.G. Quantitative characteristics of the frequency of chromosomal aberrations in a group of residents of a large western Siberian industrial region /V.G. Druzhinin //Geneti-ka. - 2003. - N 39. - P. 1373-1380.

^М^ицит Mn

вКуэбассе N2 2 2007 27

8. Current status of cytogenetic procedures to detect and quantify previous exposures to radiation /M.A. Bender, A.A. Awa, A.L. Brooks et al. //Mutat Res. - 1988. - N 196. -P. 103-159.

9. Awa, A.A. Cytogenetic «rogue» cells: what is their frequency, origin, and evolutionary significance? //A.A. Awa, J.V. Neel //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1986. - N 83. - P. 1021-1025.

10. Hypothesis: «rogue cell»-type chromosomal damage in lymphocytes is associated with infection with the JC human polyoma virus and has implications for oncogenesis /J.V. Neel, E.O. Major, A.A. Awa et al. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1996. - N 93. - P. 2690-2695.

11. High titers of antibodies to two human polyomaviruses, JCV and BKV, correlate with increased frequency of chromosomal damage in human lymphocytes /J.R. Lazutka, J.V. Neel, E.O. Major et al. //Cancer Lett. - 1996. - N 109. - P. 177-183.

12. Ahuja, Y.R. Are rogue cells an indicator of cancer risk due to the action of bacterial restriction endonucleases? /Y.R. Ahuja, G. Obe //Mutat Res. - 1994. - N 310. - P. 103-112.

13. «Rogue» cells observed in children exposed to radiation from the Chernobyl accident /A.V. Se-vankaev, A.F. Tsyb, D.C. Lloyd et al. /Int. J. Radiat. Biol. - 1993. - N 63. - P. 361-367.

14. Lazutka, J.R. Chromosome aberrations and rogue cells in lymphocytes of Chernobyl cleanup workers /J.R. Lazutka //Mutat. Res. - 1996. - N 350. - P. 315-329.

15. Stable and unstable aberrations in lymphocytes of Chernobyl accident clearance workers carrying rogue cells /E.V. Domracheva, N.B. Rivkind, E.A. Aseeva et al. //Appl. Radiat. Isot. -2000. - N 52. - P. 1153-1159.

16. Popova, N.A. Mutliaberrant cell formation caused by exposure to internal densely-ionizing irradiation /N.A. Popova, L.P. Nazarenko, S.A. Nazarenko //Genetika. - 2004. - N 40. -P. 1419-1422.

17. Neel, J.V. An association, in adult Japanese, between the occurrence of rogue cells among cultured lymphocytes (JC virus activity) and the frequency of «simple» chromosomal damage among the lymphocytes of persons exhibiting these rogue cells /J.V. Neel //Am. J. Hum. Genet. - 1998. - N 63. - P. 489-497.

If

ЙОГА ДЕЛАЕТ ВНИМАТЕЛЬНЕЕ И УВЕРЕННЕЕ Американские психологи научно доказали, что занятия йогой не только развивают гибкость и мышечную силу, но и усиливают мотивацию, улучшают концентрацию, уменьшают тревогу. "Безусловно, йога положительно влияет на психику", - говорит Traci A. Statler, спортивный психолог из Государственного Калифорнийского Университета (Сан-Бернардино, США).

В западном мире йога считается скорее разновидностью физкультуры, в то время как на востоке это, прежде всего, способ релаксации, достижения ясности ума, позитивного мировосприятия.

84 участника исследования регулярно занимались хатха-йогой в течение 10 недель. Участники исследования дважды прошли психологическое тестирование (через 2 недели после начала занятий и через 9 недель). По стандартным методикам у них оценили уровень концентрации, мотивации, тревожности.

Traci A. Statler назвала результаты исследования "удивительными" и "очень приятными". Занятия йогой значительно повлияли на внимание и способность к концентрации. Кроме того, у участников исследования понизился уровень тревоги, повысилась мотивация к достижению успеха.

По материалам Reuters Health. Источник: www.medlinks.ru.