УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОТБОРА ПРОБЫ СЛЕЗНОЙ ЖИДКОСТИ

Полезная модель относится к аналитической химии, в частности, к устройству для безболезненного атравматического определения концентраций метаболитов в физиологических жидкостях человека и, более конкретно, к устройству для атравматического отбора биопроб на основе гибких электродов и гибкого пробоотборника для анализа аскорбата, допамина, глюкозы и мочевины в слезной жидкости человека.
Окончательный диагноз многих заболеваний, а также определение состояния организма человека в настоящее время связано, в основном, с различными анализами крови. Также хорошо известно, что неинвазивная диагностика, которая дает близкие результаты с анализами крови, может заменить инвазивные процедуры в связи с тем, что многие пациенты плохо переносят отбор крови, а также в этом случае появляется возможность заражения пациента различными инфекционными заболеваниями, включая СПИД и гепатит.
Одним из самых наглядных примеров является тест на определение беременности, основанный на анализе гормонов, которые находятся как в крови, так и в моче. В настоящее время этот анализ в поликлиниках заменяет простой, достоверный и быстрый анализ в домашних условиях, основанный на использовании диагностических полосок, находящихся в контакте с мочой пациента. К сожалению, имеется не так много соединений, для которых показана прямая корреляция их концентраций в крови и других биологических жидкостях, таких как моча, слюна, потовые выделения и другие.
Среди многих других подходов для определения биоаналитов неинвазивным методом является возможность их количественного определения с использованием базальной слезной жидкости человека, которая является весьма перспективным объектом для получения необходимой информации о состоянии организма человека. Это обусловлено схожестью солевого состава слезной жидкости с плазмой крови, корреляцией различных метаболитов в обеих жидкостях, а также тем, что слезная жидкость по сравнению с кровью является менее вязкой и не содержит много клеток.
Кроме того, изменение концентраций некоторых метаболитов в слезной жидкости при определенных заболеваниях или изменение состояния организма человека хорошо известны и могут быть использованы для диагностических целей. Ниже приведены некоторые примеры таких корреляций.
1. Концентрация допамина в слезной жидкости у здорового пациента составляет примерно 1,8 мМ, в то время как у больных глаукомой его концентрация существенно меньше (до 0,1 мМ) в результате уменьшения активности симпатической иннервации глаза. Таким образом, определение допамина в слезной жидкости может являться тестом при диагностике глаукомы.
2. Концентрация глюкозы в базальной слезной жидкости в норме составляет 0,2 мМ (т.е. примерно в 25 раз меньше по сравнению с концентрацией глюкозы в крови). При этом известно, что значительное повышение уровня глюкозы в слезной жидкости для диабетиков может быть использовано для диагностики сахарного диабета.
3. Концентрация аскорбата (аскорбиновой кислоты) служит показателем воспалительных процессов в глазу и может варьироваться в интервале 0,03÷1 мМ в зависимости от состояния организма в целом и в глазу в, частности, что может быть связано с некоторыми глазными болезнями.
4. Концентрация мочевины в базальной слезной жидкости и в крови является эквивалентной при неограниченном ее проникновении через слезо-кровяной барьер в слезной железе и колеблется в интервале от 1,8 до 7,5 мМ у пациентов в норме в зависимости от возраста, питания и других факторов. Высокая концентрация мочевины в слезной жидкости является достаточно четким указанием на протекание таких серьезных заболеваний как доброкачественные опухоли, различные виды инфаркта, заболевания почек и другие. При этом низкие концентрации мочевины являются симптомами, например отравления химическими соединениями или беременности.
Следует отметить, что в литературе имеются противоречивые данные относительно истинных концентраций метаболитов в слезной жидкости человека. Это объясняется небольшим объемом слезы, который можно отобрать для тестирования, и тем фактом, что большинство известных аналитических процедур, которые могут быть использованы для изучения состава слезной жидкости, недостаточно чувствительны для получения надежных результатов. Кроме того, содержание метаболитов в слезной жидкости сильно зависит от процедуры отбора биообразца, т.к. базальные и рефлекторные слезы, а также слезная жидкость при нервных расстройствах имеют большое различие по составу.
Устройства для отбора слезной жидкости широко используются в клиниках (полоски фильтровальной бумаги, стеклянные капилляры, стеклянные микропипетки или полиэфирные микротрубки), однако не могут быть непосредственно использованы непрофессиональными пользователями в бытовых условиях вследствие возможности повреждения роговицы глаза, болезненности процедуры и других отрицательных ощущений. Поэтому экспрессные (быстрые), чувствительные и специфические по отношению к каждому метаболиту слезной жидкости методы с использованием ультра малых объемов биообразца являются весьма востребованными. В дополнение к вышеупомянутому, атравматические и безболезненные методы отбора и количественного анализа метаболитов в слезной жидкости представляют значительный интерес для понимания различных эффектов, влияющих на состояние глаза, а именно, диеты, ношения контактных линз, факторов окружающей среды и профилактики глазных заболеваний.
Несмотря на значительные трудности, связанные с отбором биопробы слезной жидкости и анализа в ней различных метаболитов, в литературе описаны способы и устройства для выполнения указанных выше функций (патенты США: 4,269197; 4,996,993; 5,352,411; 7,133,712; заявка на патент США 20080103376; заявка на международный патент 2004/046726). Например, в патенте США 5,352,411 "Device for determination of tear constituents" описано одно из таких устройств для определения различных метаболитов в слезной жидкости. Однако это устройство является достаточно громоздким и изготовлено таким образом, чтобы отбирать большое количество слезной жидкости с использованием широко используемых в медицине бумажных полосок Ширмера (Schirmer). Устройство для отбора слезной жидкости, основанное на полосках Ширмера для сбора слезной жидкости, должно быть помещено в отдельные участки глаза и находиться в них в течение 5 минут. Затем бумажная полоска должна быть удалена и проведен анализ компонентов слезной жидкости. Степень смачивания полосок Ширмера изменяется от одного измерения к другому. Этот метод является весьма травматичным, т.к. фильтровальная бумага стимулирует развитие конъюнктивита и вызывает рефлекторное выделение слезной жидкости, что приводит к изменению концентраций метаболитов в слезе в непредсказуемых пропорциях ввиду разбавления. Для проведения одного анализа требуется значительное количество слезной жидкости, что затрудняет практическую реализацию известного метода, его воспроизводимость и затрудняет использование простых детектирующих устройств. Кроме того, полоски Ширмера не разрешается использовать в бытовых условиях.
Другой пример атравматического анализа метаболитов в слезной жидкости описан в работе (S.Iguchi, Н.Kudo et al. Biomedical Microdevices (2007) V.9 (4), P.603-609). Устройство представляет собой гибкий, портативный сенсор для измерения глюкозы в слезной жидкости на основе кислородного электрода типа Кларка. Однако он представляет собой достаточно сложное в техническом плане устройство, которое быстро теряет свои функциональные свойства и не может быть использовано непрофессиональным пользователем.
В литературе также имеются данные по неинвазивному in situ определению глюкозы в слезной железе кроликов с использованием сенсоров инкорпорированных в контактные линзы (М. Chu, К. Miyajima et al. Talanta (2011) V.83, P.960-965; H.Yao, A.Shum et al. Biosensors and Bioelectronics (2011) V.26, P.3290-3296). Была показана четкая зависимость между концентрациями глюкозы в крови и слезной жидкости животных. Однако разработанные устройства не могут быть использованы для реальных измерений, так как имеют макроскопическое проводное соединение с измерительной аппаратурой.
Таким образом, актуальным является создание простого, надежного, атравматического и безболезненного устройства для мониторинга различных метаболитов в слезной жидкости человека, пригодное как для использования в клинике, так и в бытовых условиях.
Среди множества различных количественных методов анализа электрохимические способы детекции имеют много преимуществ с точки зрения чувствительности, селективности, возможности мониторинга в реальном времени, простоты. Разработаны различные устройства на основе электрохимических реакций для определения большого количества биоаналитов, включая биосенсоры для определения концентраций глюкозы в крови. Эти устройства нашли широкое применение в бытовых условиях для определения глюкозы в крови пациентов.
В целом, электрохимические устройства могут быть разделены на несколько групп в зависимости от способа детекции сигнала: амперометрические, потенциометрические, кулонометрические, а также устройства с использованием спектроскопии электрохимического импеданса. Более того, в зависимости от конструкции сенсора, объем биообразца для анализа глюкозы в крови может варьироваться в интервале 0,3-10 мкл как, например, устройство, представленное фирмой "Albot" (TheraSensce). Такого типа биосенсор для определения глюкозы в крови пациента в бытовых условиях широко представлен на рынке различными фирмами ("Johnson&Johnson"; "Bayer" и другие). Некоторые из них позволяют отбирать биопробу в нанолитровом объеме и их принято называть "полуинвазивными".
Последние достижения в области электрохимии и нанотехнологии позволяют в настоящее время разрабатывать аналитические устройства с использованием нанообъемов биопробы и проводить в ней количественный анализ различных метаболитов. Таким образом, устройства подобного типа могут быть использованы для безболезненного и атравматического анализа компонентов в слезной жидкости человека электрохимическим методом с высокой точностью и воспроизводимостью анализа.
В качестве прототипа выбрано устройство для определения составляющих слезной жидкости с использованием полоски из фильтровальной бумаги для отбора слезы (Ширмер-полоски) - пробоотборника, закрепленного на соединительном элементе, на конце которого расположены контакты для электрического соединения с измерительной аппаратурой (Патент США 5,352,411). Конец полоски из фильтровальной бумаги размещают в углу глаза, в результате чего она пропитывается слезной жидкостью. После отбора биопробы один из концов бумажной полоски присоединяют с помощью клея к сенсору, со стороны, противоположной от электрических контактов. С помощью описанного устройства можно неинвазивным путем определять содержание глюкозы, мочевины, кетонов, ионов калия и кальция в слезе. В качестве сенсоров используются: для определения глюкозы - стрип на основе хромогенной реакции с глюкозооксидазой; для определения мочевины - стрип на основе уреазы; для определения кетонов - амперометрический индикатор на основе редокс реакций; для определения ионов калия - стрип на основе валиномицина; для определения ионов кальция - индикатор на основе органофосфатных солей и известной электрометрической детекции этого компонента. В качестве сенсоров в изобретении предлагается использовать коммерческие диагностические полоски и амперометрические или ион-селективные электроды.
Недостатками известного устройства являются: большое время отбора биообразца (не менее нескольких минут) для полного смачивания полоски Ширмера; различная смачиваемость бумажных полосок от одного измерения к другому; травматичность и болезненность процедуры отбора пробы слезной жидкости; недостаточная воспроизводимость результатов измерений; сложность и отсутствие универсальности сенсорного устройства.
Задачей полезной модели является разработка устройства для атравматического и безболезненного отбора слезной жидкости человека, позволяющего проводить количественный анализ широкого спектра метаболитов слезы, таких как глюкоза, мочевина, допамин, аскорбат.
Для решения поставленной задачи предложено устройство для отбора пробы слезной жидкости, состоящее из пробоотборника, соединенного посредством соединительного элемента с электрическими контактами для подключения к электроизмерительной аппаратуре, при этом оно дополнительно содержит микроэлектроды: контрольный, рабочий и сравнения, рабочий микроэлектрод и микроэлектрод сравнения заведены в пробоотборник, выполненный в виде пластиковой микротрубки, а контрольный электрод установлен снаружи в отверстии микротрубки, другие концы электродов соединены с электрическими контактами электроизмерительной аппаратуры.
Кроме того, соединительный элемент выполнен в виде гибкой пластиковой трубки, с помещенными в нее заизолированными электродами.
По сравнению с известными, полезная модель позволяет: проводить отбор слезной жидкости, в объеме достаточном для электрохимического анализа (от 10 нл до 1000 нл), используя безболезненный атравматический отбор биопробы, и использовать микроэлектроды для анализа биопробы с объемом 25-100 нл для количественного определения допамина, аскорбата, глюкозы и мочевины, которые могут находиться в слезной жидкости человека. После отбора слезной жидкости аналитическое устройство должно быть подключено к электронному измерительному блоку, который имеет конструкцию, аналогичную таковой у уже существующих устройств, например глюкометров.
На фигуре 1 представлено схематическое изображение варианта выполнения устройства, на фигуре 2 - увеличенное изображение пробоотборника с микроэлектродами, где
1 - электрические контакты.
2 - пластиковая полоска держателя.
3 - гибкая пластиковая трубка, внутри которой проходят электроды 5, 7, 8 от пробоотборника 4 к электрическим контактам 1
4 - пробоотборник - пластиковая микротрубка
5 - микроэлектрод сравнения/противоэлектрод
6 - контрольный микроэлектрод
7 - рабочий микроэлектрод
В предлагаемом устройстве, согласно фигурам 1 и 2 три электрических контакта 1 для рабочего, контрольного микроэлектродов и микроэлектрода сравнения расположены, например, на пластиковой полоске держателя 2. Возможен и другой вариант закрепления контактов. На него выведены концы помещенных в гибкую пластиковую трубку 3 закодированных электродов. Другие концы микроэлектродов 5 и 7 введены внутрь пробоотборника 4. Контрольный микроэлектрод 6 предназначен для проверки полноты заполнения пробоотборника 4 отбираемой пробой слезной жидкости и установлен снаружи в отверстии пробоотборника 4, выполненного в виде пластиковой микротрубки.
Контакты 1 могут быть непосредственно подсоединены к электронному измерительному устройству, уже имеющемуся на рынке, например такому как «Free Style». Основные параметры устройства: микроэлектроды 5, 6, 7 могут иметь диаметр от 0,05 мм до 0,5 мм; длина пластиковой полоски держателя 2 от 10 мм до 50 мм, ширина - от 5 до 10 мм; длина гибкой части устройства 3 от 30 до 100 мм.
Основными параметрами аналитического устройства являются: рабочий электрод 7 с диаметром от 0,01 мм до 0,2 мм; внешний диаметр пластиковой микротрубки 4 от 0,15 мм до 0,25 мм; внутренний диаметр микротрубки 4 от 0,02 мм до 0,4 мм; длина микротрубки 4 от 1 мм до 40 мм; противоэлектрод (электрод сравнения) 5 может иметь длину от 0,01 мм до 0,2 мм; контрольный электрод 6 может иметь диаметр от 0,01 мм до 0,2 мм. Расстояние между концами рабочего 7 и противоэлектрода 5 может варьироваться от 0,01 до 1 мм.
Устройство работает следующим образом.
Пробоотборник 4 (пластиковая микротрубка фиксированного объема ~ 60 нл) помещается в слезное озеро глаза и за счет капиллярного поднятия заполняется слезной жидкостью. Далее устройство подключается к электрическому измерительному оборудованию с помощью электрических контактов 1. С использованием контрольного электрода 6 тестируется полнота заполнения пробоотборника 4 слезной жидкостью путем измерения сопротивления между рабочим 7 и тестовым 6 электродами. После полного заполнения ячейки проводится кулонометрический анализ веществ. С помощью электроизмерительного оборудования между рабочим электродом 7 и электродом сравнения 5, пропускается количество электричества, необходимое для полного окисления определяемых компонентов, которое прямо пропорционально концентрации определяемого вещества.
Данная полезная модель может быть использована для атравматического и безболезненного анализа некоторых гормонов, витаминов, а также неорганических ионов, таких как калий, натрий, кальций, магний, хлорид и других маркеров заболеваний человека.