Характер микрососудистых реакций в эмбриональном нейротрансплантате зрительной коры мозга крыс

УДК 612.824-089.843:591.3

to hypergravity (Gx vs. Gz) on dynamic cerebral autoregulation // J. Appl. Physiol. 2001. V. 91. P. 1986-1994.

17. Sung R. Y T., Du Z. D., Yu C. W., Yam M. C., Fok T. F. Cerebral blood flow during vasovagal syncope induced by active standing or head up tilt // Arch. Dis. Child. 2000. V. 82. P. 154-158.

18. Zhang R., Zukerman J., Giller C., Levine B. Transfer function analysis of dynamic cerebral autoregulation in humans. Am. J. Physiol. 1998. V. 274. P. 233-241.

19. Van Lieshout J. J., Wieling W., Karemaker J. M., Secher N. H. Syncope, cerebral perfusion, and oxygenation // J. Appl. Physiol. 2003. V. 94. P. 833-848.

N. V. ZABOLOTSKIKH

COMPARATIVE ESTIMATION OF CHANGES IN THE CEREBRAL HEMODYNAMIC IN THE CAROTID AND VERTEBRO-BASILARBASINSDURINGACTIVE ORTHOSTASIS TRIAL IN HEALTHY MEN

The regularity of the changes in cerebral hemodynamic have been investigated during the active orthostasis trial with 28 healthy man 20-26 years old. The decreasing of the velocity of blood flow in carotid and vertebro-

basilar basins have been observed in all the volunteers in spite of the increasing of the velocity of blood pressure during the all period of orthostasis trial. The most decreased Vs in the middle cerebral artery (MCA) was observed in 50% volunteers, while Vd has slightly increased. On the other hand, the peripheral resistance (PI) has decreased. Uniform decreasing blood flow character (Vs,Vd,Vm) in MCA has been observed in other 50% volunteers, the meaning of PI in this case has not been reliable changed. The constriction reaction of the cerebral arterioles in vertebro-basilar basin has prevailed in the response of the orthostatic trial. Has been revealed the heterogeneity of the mechanisms maintained postural responses for the cerebral and central hemodynamics. This is the evidence that the received results give the possibility to suppose the less adequate cerebral autoregulation in the basilar basin in comparison with the carotid basin and dominating constriction reaction of cerebral arterioles vertebro-basilar basin in response to the orthostatic trial.

Keywords: active orthostasis, cerebral hemodynamics, cerebral autoregulation.

Г. Ш. ГАФИЯТУЛЛИНА, А. А. ХАРАХАШЯН

ХАРАКТЕР МИКРОСОСУДИСТЫХ РЕАКЦИЙ В ЭМБРИОНАЛЬНОМ НЕЙРОТРАНСПЛАНТАТЕ ЗРИТЕЛЬНОЙ КОРЫ МОЗГА КРЫС

Кафедра нормальной физиологии Ростовского государственного медицинского университета

Введение

Нейробиологические исследования свидетельствуют о возможности восстановления нарушенных болезнью или травмой функций мозга посредством пересадок эмбриональной нервной ткани [1, 4]. Эмбриональный нейротрансплантат (ЭНТ) способен развиваться, при этом его клеточные элементы пролиферируют, дифференцируются и интегрируют с мозгом реципиента [5]. Вместе с тем, несмотря на определенные успехи нейротрансплантологии, ключевые вопросы о факторах, определяющих интеграцию имплантированной нервной ткани с мозгом реципиента и влияющих на жизнеспособность ЭНТ, остаются нерешенными. Представляется очевидным, что одним из этих факторов является уровень кровеобеспечения метаболических потребностей ЭНТ. Реконструкция удаленных отделов мозга и реорганизация функциональной активности трансплантата возможны в условиях адекватного кровоснабжения, зависящего от восстановления компонентов микрососудистого русла в мозге взрослого животного. Послеоперационные эффекты нейротрансплантации определяются уровнем циркуляторно-метаболического обеспечения нейронных популяций, анализ становления которого возможен при оценке поэтапного приживления нейротрансплантата.

Однако данные о характере кровоснабжения ЭНТ неокортекса и, в частности, о способности его микрососудов к осуществлению адаптивных регуляторных реакций в различные сроки приживления в литературе освещены недостаточно. Для разработки этого воп-

роса представляется перспективным исследование гемодинамического обеспечения аллотрансплантата эмбриональной нервной ткани, имплантированного в одну из важнейших проекционных зон мозга - зрительную область коры.

С учетом вышеизложенного целью настоящего исследования явилось изучение характера локальных сосудистых реакций в ЭНТ через 4, 8 и 12 месяцев после его аллогенной гомотопической пересадки в зрительную кору (ЗК) мозга крысы-реципиента.

Методика исследования

В работе представлены результаты исследований, выполненных в экспериментах на 115 крысах-самцах линии Wistar массой 180-200 г. Основную группу составили крысы с ЭНТ (п=51). Контрольная группа была представлена крысами с интактной ЗК (п=64). Крысам основной группы осуществляли аллогенную гомотопическую трансплантацию эмбриональной нервной ткани. Для этого наркотизированных кетамином (12,5 мг/кг, внутрибрюшинно) крыс фиксировали в стереотакси-ческом приборе СЭЖ-3, трепанировали кость черепа справа в области проекции ЗК, координаты которой соответствовали: 3 мм латеральнее лямды; 1 мм рост-ральнее лямды, глубина 2 мм [8], надрезали твердую мозговую оболочку и с помощью шприца со стеклопластиковым наконечником удаляли 1 мм3 серого вещества, формируя в коре углубление, в которое под микроскопическим контролем помещали донорскую ткань. Производили костную аутопластику, ткани головы ушивали.

Пространственно-временные параметры функциональной гиперемии (ФГ) в эмбриональном нейротрансплантате (ЭНТ) и зрительной коре (ЗК) контрольных крыс при фотостимуляции через 4, 8 и 12 месяцев после пересадки, M±m

Сроки

Показатель 4 месяца 8 месяцев 12 месяцев

ЭНТ ЗК ЭНТ ЗК ЭНТ ЗК

Латентный 5,1± 6,4± 6,5± 3,8± 15,1± 5,4±

период ФГ, сек. 0,8 2,6 3,37 1,98 0,8* 2,6

Амплитуда 15,4± 8,45± 7,4± 15,1 ± 5,7± 14,4±

ФГ, % 1,67* 4,84 3,48** 4,21 1,97** 3,65

Примечание: * - различие достоверно между ЭНТ и контролем при р<0,05; ** - при р<0,01.

Донорскую ткань получали от 17-18-дневных эмбрионов, которых после извлечения из матки помещали в стерильный 5%-ный раствор глюкозы ^=37° С). Затем из зоны мозга, соответствующей ЗК [7], с помощью шприца со стеклопластиковым наконечником извлекали фрагмент ткани объемом 1 мм3, используемый в качестве трансплантата.

К исследованию оперированных животных приступали спустя соответственно 4, 8 и 12 месяцев после операции. Голову животного, наркотизированного ке-тамином (12,5 мг/кг, внутрибрюшинно), фиксировали в стереотаксическом приборе СЭЖ-3. Над областью локализации трансплантата у крыс основной группы, над зоной проекции ЗК у контрольных крыс кость черепа вновь трепанировали и надрезали твердую мозговую оболочку. Поверхность мозга покрывали слоем агар-агара и заливали вазелиновым маслом ^ = 37° С).

Идентифицировали зрительную проекционную зону в ЭНТ и интактной ЗК мозга контрольных крыс путем определения фокуса максимальной активности вызванного потенциала при сенсорной стимуляции (на контралатеральной к оперированному полушарию стороне). Отведение фокальных ответов осуществляли эпидурально от поверхности мозга, монополярно, хлорированными серебряными шариковыми электродами диаметром 200 мкм при полосе пропускания усилителей 1-2000 Гц. Биопотенциалы регистрировали при помощи электрофизиологической установки УЭФПТ-5. Устанавливали фокус максимальной амплитуды вызванного потенциала, возникавшего с наименьшим латентным периодом.

В идентифицированную зону ЭНТ и интактной коры контрольных крыс ступенчато (с шагом 10 мкм) с помощью микроманипулятора погружали блок электродов для регистрации локального мозгового кровотока (рисунок). Глубину расположения электродов определяли по показаниям микрометрического индикатора КИ-0.01.

Локальный мозговой кровоток регистрировали с использованием метода полярографического определения рН2 при электрохимической генерации водорода непосредственно в мозговую ткань [3, 9]. При этом диаметр платинового электрода генерации водорода

составлял 30 мкм, а измерительного электрода -10 мкм. Хлорсеребряные электроды сравнения для цепи измерения рН2, а также референтный платиновый электрод для цепи генерации водорода помещали под кожу животного в области шеи. Для регистрации локального мозгового кровотока использовали прибор «Физиоблок-01», выход которого соединяли с компьютером через аналого-цифровой преобразователь 1_152. Сигналы от электродов усиливали биоусилителем и записывали на жесткий магнитный диск компьютера, производили расчет количественных характеристик показателя. Анализировали латентные периоды развития микрососудистых реакций и их амплитуду (% прироста величины показателя относительно его исходного уровня).

При исследовании характера развития гемодина-мических реакций в ЭНТ и ЗК контрольных крыс в период ответной реакции на стимуляцию в качестве адекватного сенсорного стимула применяли световое воздействие (близкое по спектру к белому), которое осуществляли с помощью фотостимулятора - лампы, размещенной на расстоянии 0,3-0,5 м от глаз крысы. Параметры: длительность 150 мкс, интенсивность 0,2-0,6 Дж, в течение 10 сек., перерывы между сериями - 20 сек. По окончании опытов производили микроскопирова-ние трансплантата с визуализацией треков электродов. В каждой точке регистрации делали проходку микроэлектродом, окрашенным тушью, до заданной глубины. Животное подвергали эвтаназии введением большой дозы кетамина, череп вскрывали, визуально оценивали размеры трансплантатов, микроскопически (микроскоп МБИ-1, ок. х7, об. х3,5) производили верификацию местонахождения треков микроэлектродов.

Статистический анализ полученных результатов производили с помощью программы Statistica 5.0. Для определения значимости различий между данными двух выборок применяли методы параметрической и непараметрической статистики.

Результаты и их обсуждение

Регистрация динамики локального кровотока в ЭНТ и ЗК контрольных крыс через 4, 8 и 12 месяцев после пересадки выявила, что в ответ на сенсорное

Паттерн локального кровотока при стимуляции

г-‘ ' "

!:! І 1 ’ ... :: п: :•! -І ! .

1 : ' :1 иг

Щ ю

Электродный блок

ФОТОСТИМУЛЯЦИЯ

НЕИРОТРАНСПЛАТАТ

Схема регистрации локального мозгового кровотока в эмбриональном нейротрансплантате, помещенном в зрительную кору мозга, при фотостимуляции крысы-реципиента

Электродный блок имплантирован в эмбриональный нейротрансплантат. Остальные пояснения в тексте

раздражение в идентифицированной зоне регистрации наблюдались отчетливые реакции в виде увеличения кровотока, значения которого постепенно восстанавливались до близких к исходному уровню только после окончания воздействия. Очевидно, что зарегистрированные изменения отражали формирование локальной функциональной гиперемии, развивающейся посредством местных сосудистых реакций.

В исходном состоянии интенсивность локального мозгового кровотока через 4 месяца после пересадки составила в ЭНТ 42,9±2,32 мл/100 г/мин, а в Зк контрольных крыс - 55,9±1,94 мл/100 г/мин. Таким образом, объемная скорость кровотока в нейротрансплантате была снижена по сравнению с контролем на 23,2% (р<0,05).

Из таблицы видно, что при фотостимуляции уровень интенсивности локального мозгового кровотока в ЭНТ возрастал с латентным периодом 5,1±0,8 сек. и амп-

литудой, соответствовавшей 15,4±1,67%. Латентный период реакции постстимуляционного повышения кровотока в ЗК контрольных крыс составил 6,4±2,6 сек., а ее амплитуда - 8,45±4,84%.

Таким образом, анализ пространственно-временных характеристик микрососудистых реакций в ЭНТ через 4 месяца после пересадки и в ЗК контрольных крыс не выявил статистически значимых различий продолжительности их латентных периодов. В то же время в ЭНТ прирост локального мозгового кровотока составил в 1,8 раза большую (р<0,01) величину, чем у контрольных животных.

Результаты данной серии экспериментов, выявивших развитие в ЭНТ повышенного уровня локальной функциональной гиперемии в ответ на сенсорную стимуляцию, могут свидетельствовать о повышенной ди-лататорной способности микрососудов при осуществлении ими регуляторных адаптивных реакций [2], компенсирующих снижение исходной величины мозгового

кровотока [6], благодаря чему в нервной ткани, вероятно, поддерживается стабильный уровень парциального напряжения кислорода.

В исходном состоянии интенсивность локального мозгового кровотока через 8 месяцев после пересадки составила в ЭНТ 41,7±2,85 мл/100 г/мин, а в ЗК контрольных крыс - 52,6±1,76 мл/ 100 г/мин. Таким образом, объемная скорость кровотока в ЭНТ была снижена по сравнению с контролем на 20,7% (р<0,05).

Из таблицы видно, что при фотостимуляции уровень интенсивности локального мозгового кровотока в ЭНТ возрастал с латентным периодом 6,5±3,37 сек. и амплитудой, соответствовавшей 7,4±3,48%. Латентный период реакции постстимуляционного повышения кровотока в ЗК контрольных крыс составил 3,8±1,98 сек., а ее амплитуда - 15,1 ±4,21 %.

Таким образом, анализ пространственно-временных характеристик микрососудистых реакций в ЭНТ через 8 месяцев после пересадки и в ЗК контрольных крыс не выявил статистически значимых различий продолжительности их латентных периодов. В то же время в ЭНТ прирост кровотока составил в 2,1 раза меньшую (р<0,01) величину, чем у контрольной группы животных.

В исходном состоянии интенсивность локального мозгового кровотока через 12 месяцев после пересадки составила в ЭНТ 33,3+2,84 мл/100 г/мин, а в ЗК контрольных крыс - 50,4+5,61 мл/100 г/мин. Таким образом, объемная скорость кровотока в ЭНТ была снижена по сравнению с контролем на 33,9% (р<0,05).

Из таблицы видно, что при фотостимуляции уровень интенсивности локального мозгового кровотока в ЭНТ возрастал с латентным периодом 15,1 ±0,8 сек. и амплитудой, соответствовавшей 5,7±1,97%. Латентный период реакции постстимуляционного повышения кровотока ЗК контрольных крыс составил 5,4±2,6 сек., а ее амплитуда - 14,4±3,65%.

Таким образом, при анализе пространственно-временных характеристик микрососудистых реакций в ЭНТ через 12 месяцев после пересадки установлено, что их латентные периоды были выше, чем в ЗК контрольных крыс (р<0,05). В то же время в ЭНТ прирост кровотока составил в 2,5 раза меньшую (р<0,01) величину, чем у контрольных крыс.

Результаты экспериментов, выявивших развитие в ЭНТ через 8 и 12 месяцев после пересадки снижение уровня локальной функциональной гиперемии в ответ на сенсорную стимуляцию, могут свидетельствовать об уменьшении эффективности вазодилатации при реализации метаболических потребностей пересаженной нервной ткани. При этом микрососудистая сеть ЭНТ в определенной степени проявляет способность к осуществлению активных сосудистых реакций, направленных на регулирование кровотока в нервной ткани.

Поступила 10.11.2006

ЛИТЕРАТУРА

1. Брюховецкий А. С. Информационный подход - методологическая, теоретическая и технологическая база развития нейротрансплантологии как науки биоуправления мозгом // Бюл. эксперим. биол. и медицины. 1998. Т. 126. Прил.1. С. 196-203.

2. Москаленко Ю. Е., Вулсей Т. А., Ровайен К. и др. Динамика кровотока в различных слоях соматосенсорной коры головного мозга у крыс при механической стимуляции вибрисс // Физиол. журн. им. И. М. Сеченова. 1997. Т. 83, № 4. С. 67-76.

3. Москаленко Ю. Е., Ровайен К., Вулсей Т. А. и др. Сопоставление измерений локального мозгового кровотока водородным клиренсом с ингаляцией водорода и его электрохимической генерацией в ткани мозга // Физиол. журн. им. И. М. Сеченова. 19946. Т. 80, № 12. С. 119-125.

4. Семченко В. В., Ерениев С. И., Степанов С. и др. Трансплантация незрелой нервной ткани в экспериментальной и клинической неврологии. Омск: ГУИПП «Омский дом печати», 2000. 340 с.

5. Сухих Г. Т. Трансплантация фетальных клеток в медицине: настоящее и будущее // Бюл. эксперим. биол. и медицины. 1998. Т. 126. Прил. 1. С. 3-13.

6. Хананашвили Я. А., Гафиятуллина Г. Ш. Характер локального кровоснабжения и функциональной гиперемии эмбрионального нейротрансплантата у крыс // Арх. клин. и эксперим. медицины. 2000. Т. 9, № 1. С. 84-86.

7. Altman J., Bayer S. A. Atlas of Prenatal Rat Brain Development. FL. USA: CRC Press. Boca Raton., 1995. 664 с.

8. Konig J., Klippel R. A. Stereotaxic Atlas of Forebrain and Lower Parts of the Brain Stem. Baltimor: Williams and Wilkins, 1963. 162 с.

9. Stosseck K., Lubbers D. W., Cottin S. Determination of local blood flow (micro flow) by electrochemically generated hydrogen. Construction and application of the measuring probe // Pflbg. Arch. 1974. V. 343. P 225-238.

G. SH. GAFIJATULLINA, A. A. KHARAHASHJAN

CHARACTER OF LOCAL MICROVASCULAR REACTIONS AT EMBRYONIC NEUROTRANSPLANT OF SOMA TOSENSORYRECIPIENT’S BRAIN CORTEX A T RATS

The investigation was aimed to study the character of local microvascular reactions at embryonic neurotransplant through 4, 8 и 12 months after its homotopical allotransplantation into the visual zone of recipient’s brain cortex of the rat. It is established, that the voltage of microvascular reactions was higher at neurotransplant through 4 months after transplantation and was lower through 8 and 12 months after, in comparison with visual zone of control rats brain cortex by the photostimulation.

Key words: embryonic neurotransplant, visual cortex, local cerebral blood flow.