ПЕПТИДЫ, ПОДАВЛЯЮЩИЕ ИНФЕКЦИИ РЕСПИРАТОРНЫХ ВИРУСОВ, ИХ ПРИМЕНЕНИЕ И СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ
PEPTIDES SUPPRESSING RESPIRATORY VIRUSE INFECTIONS, THEIR APPLICATION AND METHODS FOR OBTAINING

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области профилактики и лечения вирусной инфекции. В частности, оно относится к пептиду, подавляющему инфекции респираторных вирусов, к способу блокирования инфекций респираторных вирусов в клетках-мишенях с помощью этого пептида, к использованию этого пептида при производстве лекарственного средства для профилактики или лечения инфекций респираторных вирусов, к способу подготовки этого пептида, к композиции, содержащей этот пептид, к изолированной ДНК с кодом этого пептида, к экспрессионному вектору, содержащему такую ДНК, функционально связанную с промотором, к клетке-хозяину, содержащей такой экспрессионный вектор, а также к набору для скрининга пептида, подавляющего инфекции респираторных вирусов, и к способу скрининга.
Уровень техники
Антимикробные пептиды (АМП) - это собственные молекулы иммунной защиты, которые, вероятно, производятся всеми многоклеточными растениями и животными (см. Zasloff, М. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 415, 389-395 (2002)). Они представляют собой первую линию врожденной иммунной системы, которая быстро уничтожает инвазивные патогены на ранней стадии инфекции и также может вызывать системную адаптивную иммунную реакцию (см. Rohrl, J., Huber, В., Koehl, G.E., Geissler, E.K. & Hehlgans, T. Mouse beta-defensin 14 (Defb 14) promotes tumor growth by inducing angiogenesis in a CCR6-dependent manner. J Immunol 188, 4931-4939 (2012) и Yang, D., et al. Beta-defensins: linking innate and adaptive immunity through dendritic and T cell CCR6. Science 286, 525-528 (1999)). Большинство АМП - это амфипатические и катионные молекулы, обладающие способностью связываться с мембранами микробов, которые, как правило, имеют отрицательный заряд. Сотни АМП идентифицированы и классифицированы в соответствии с их структурными особенностями и/или составом аминокислот. Два семейства АМП у позвоночных - кателицидины и дефензины - это небольшие молекулы, которые, в основном, производятся лейкоцитами и клетками эпителия (см. Lehrer, R.I. Primate defensins. Nat Rev Microbiol 2, 727-738 (2004) и Selsted, M.E. & Ouellette, A.J. Mammalian defensins in the antimicrobial immune response. Nat Immunol 6, 551-557 (2005)). Прекурсоры кателидицинов содержат консервативную аминоконцевую область «кателин» (длиной приблизительно 100 остатков). Обработанные пептиды кателицидина варьируются по длине от 12 до 80 аминокислотных остатков, с α-спиральными, β-пластинчатыми или другими видами третичных структур, или без них (см. Lehrer, R.I. & Ganz, Т. Cathelicidins: a family of endogenous antimicrobial peptides. Curr Opin Hematol 9, 18-22 (2002) и Zanetti, M. Cathelicidins, multifunctional peptides of the innate immunity. J Leukoc Biol 75, 39-48 (2004)). Дефензины - это небольшие (2-6 кДа) богатые цистеином АМП, которые в основном формируют β-пластинчатые структуры, стабилизированные тремя (реже четырьмя) консервативными внутримолекулярными дисульфидными мостами. Три подсемейства дефензинов у позвоночных классифицируются как α-, β- и θ-дефензины, в зависимости от их дисульфидных моделей (см. Lehrer, R.I. Primate defensins. Nat Rev Microbiol 2, 727-738 (2004)). У данных пептидов, как правило, более широкий диапазон неспецифической активности в отношении инфекций микроорганизмов, включая грампозитивные и грамнегативные бактерии, грибки и вирусы. Разные механизмы действия АМП против бактерий включают в себя нарушение целостности мембраны (см. Shai, Y. Mechanism of the binding, insertion and destabilization of phospholipid bilayer membranes by alpha-helical antimicrobial and cell non-selective membrane-lytic peptides. Biochim Biophys Acta 1462, 55-70 (1999) и Yang, L, Weiss, T.M., Lehrer, R.I. & Huang, H.W. Crystallization of antimicrobial pores in membranes: magainin and protegrin. Biophys J 79, 2002-2009 (2000)), нарушение ядерного и протеинового синтеза, угнетение сворачивания белка с помощью шаперона, нарушение пути биосинтеза клеточной мембраны и биогенезиса специфической мембраны (см. Brogden, K.А. Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nat Rev Microbiol 3, 238-250 (2005), Hale, J.D. & Hancock, R.E. Alternative mechanisms of action of cationic antimicrobial peptides on bacteria. Expert Rev Anti Infect Ther 5, 951-959 (2007) и Srinivas, N., et al. Peptidomimetic antibiotics target outer-membrane biogenesis in Pseudomonas aeruginosa. Science 327, 1010-1013 (2010)). Вместе с тем, в настоящее время антивирусный механизм АМП все еще не изучен в достаточной степени.
Известно, что дефензины обладают разными свойствами, включая антибактериальные (см. Nizet, V., et al. Innate antimicrobial peptide protects the skin from invasive bacterial infection. Nature 414, 454-457 (2001) и Mygind, P.H., et al. Plectasin is a peptide antibiotic with therapeutic potential from a saprophytic fungus. Nature 437, 975-980 (2005)), противовирусные (см. Gong, Т., et al. Recombinant mouse beta-defensin 2 inhibits infection by influenza A virus by blocking its entry. Arch Virol 155, 491-498 (2010) и Leikina, E., et al. Carbohydrate-binding molecules inhibit viral fusion and entry by crosslinking membrane glycoproteins. Nat Immunol 6, 995-1001 (2005)) и противогрибковые (см. Krishnakumari, V., Rangaraj, N. & Nagaraj, R. Antifungal activities of human beta-defensins HBD-1 to HBD-3 and their C-terminal analogs Phd1 to Phd3. Antimicrob Agents Chemother 53, 256-260 (2009) и Jiang, Y., et al. Antifungal activity of recombinant mouse beta-defensin 3. Lett Appl Microbiol 50, 468-473 (2010)).
Природные дефензины производятся врожденными или адаптивными иммунными системами в ответ на инфекции, например, вирусные (см. Zasloff, М. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 415, 389-395 (2002)). У мышей экспрессия гена мышиного β-дефензина-3 и β-дефензина-4 вызывается в верхних дыхательных путях инфекцией вируса гриппа (см. Chong, К.Т., Thangavel, R.R. & Tang, X. Enhanced expression of murine beta-defensins (MBD-1, -2, -3, and -4) in upper and lower airway mucosa of influenza virus infected mice. Virology 380, 136-143 (2008)). Белок HIV-1 Tat может вызвать экспрессию человеческого β-дефензина-2 в клетках В человека (см. Ju, S.M., et al. Extracellular HIV-1 Tat induces human beta-defensin-2 production via NF-kappaB/AP-1 dependent pathways in human В cells. Mol Cells 33, 335-341 (2012)).
Индуцированные дефензины играют важную роль в защите от поражения микробами на ранней стадии инфицирования (см. Zasloff, М. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 415, 389-395 (2002)). Доказано, что человеческий α-дефензин-1 угнетает репликацию вируса гриппа, вероятно, из-за подавления активации протеинкиназы С (см. Salvatore, М., et al. alpha-Defensin inhibits influenza virus replication by cell-mediated mechanism(s). J Infect Dis 196, 835-843 (2007)). Было показано, что мышиный β-дефензин-2 угнетает вирусную инфекцию путем блокирования проникновения вируса в клетки-мишени (см. Gong, Т., et al. Recombinant mouse beta-defensin 2 inhibits infection by influenza A virus by blocking its entry. Arch Virol 155, 491-498 (2010)). Также было доказано, что θ-дефензин, ретроцилин 2 (РЦ2), препятствует слиянию мембран клеток и вируса путем сшивания гликопротеинов мембран (см. Leikina, Е., et al. Carbohydrate-binding molecules inhibit viral fusion and entry by crosslinking membrane glycoproteins. Nat Immunol 6, 995-1001 (2005)). Эффекторы адаптивной иммунной системы, такие как антитела и Т-лимфоциты, весьма патоген-специфичны. В противоположность им, эффекторы врожденной иммунной системы, такие как дефензины, как правило, имеют более широкий спектр воздействия на микроорганизмы. Уникальные свойства дефензинов делают их привлекательными кандидатами для разработки противовирусных препаратов широкого спектра действия со сниженным риском возникновения резистентности к лекарству. В плане антивирусных стратегий, предотвращение попадания вируса в клетку, выработки вирусной РНК, репликации и выработки вируса может служить в качестве цели при разработке противовирусных препаратов.
Специфические противовирусные препараты против распространенных семейств респираторных вирусов, таких как ортомиксовирусы, парамиксовирусы и коронавирусы, которые вызывают острые инфекции, либо еще не разработаны, либо вызывают резистентность из-за быстрой мутации вирусных генов (см. Cheng, V.C., S.K. Lau, Р.С. Woo, and K.Y. Yuen. 2007. Severe acute respiratory syndrome coronavirus as an agent of emerging and reemerging infection. Clin Microbiol Rev 20:660-694; Cheng, V.C., K.K. To, H. Tse, I.F. Hung, and K.Y. Yuen. 2012. Two years after pandemic influenza A/2009/H1N1: what have we learned? Clin Microbiol Rev 25: 223-263 и Wong, S.S., and K.Y. Yuen. 2008. Antiviral therapy for respiratory tract infections. Respirology 13: 950-971). Хотя многие дефензины, мышиные или человеческие, как правило, демонстрируют противовирусную активность как in vitro, так и in vivo (см. Jiang, Y., Y. Wang, Y. Kuang, B. Wang, W. Li, T. Gong, Z. Jiang, D. Yang, and M. Li. 2009. Expression of mouse beta-defensin-3 in MDCK cells and its anti-influenza-virus activity. Arch Virol 154: 639-647; Quinones-Mateu, M.E., M.M. Lederman, Z. Feng, B. Chakraborty, J. Weber, H.R. Rangel, M.L. Marotta, M. Mirza, B. Jiang, P. Kiser, K. Medvik, S.F. Sieg, and A. Weinberg. 2003. Human epithelial beta-defensins 2 and 3 inhibit HIV-1 replication. Aids 17: F39-48 и Sun, L., C.M. Finnegan, T. Kish-Catalone, R. Blumenthal, P. Garzino-Demo, G.M. La Terra Maggiore, S. Berrone, C. Kleinman, Z. Wu, S. Abdelwahab, W. Lu, and A. Garzino-Demo. 2005. Human beta-defensins suppress human immunodeficiency virus infection: potential role in mucosal protection. J Virol 79: 14318-14329), применение дефензинов для терапии сдерживается несколькими факторами, такими как недостаточная эффективность, побочные эффекты и отсутствие рентабельных способов производства в коммерческих масштабах.
Таким образом, срочно требуется безопасное и сильное противовирусное средство широкого спектра действия, которое позволит противодействовать появлению острых респираторных вирусных заболеваний.
Раскрытие изобретения
Технические проблемы, требующие разрешения.
Одна из целей настоящего изобретения заключается в обеспечении пептида, подавляющего инфекции респираторных вирусов. Другой целью текущего изобретения является обеспечение способа синтеза этого пептида, композиции, содержащей этот пептид, изолированной ДНК, кодирующей этот пептид, экспрессионного вектора, содержащего ДНК, функционально связанную с промотором, а также клетку-хозяина, содержащую этот экспрессионный вектор. Кроме того, в данном изобретении обеспечивается способ блокирования инфекций респираторных вирусов в клетках-мишенях и лекарственное средство для профилактики или лечения инфекций респираторных вирусов. Еще одна цель настоящего изобретения заключается в обеспечении набора для скрининга пептидов, способных подавлять инфекции респираторных вирусов, а также способа скрининга.
Технические решения.
Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает пептид, синтезируемый химическим путем или на основе генной инженерии, при этом пептид содержит функциональную область, которая может связываться с поверхностным гликопротеином респираторного вируса и способна подавлять инфекции респираторных вирусов.
Предпочтительно, пептид также имеет функцию предотвращения окисления в поздней эндосоме клетки.
Предпочтительно, пептид содержит 5 или более основных аминокислот; более предпочтительно, пептид содержит 2 или более основных аминокислот в N-терминальной или С-терминальной области; наиболее предпочтительно, пептид содержит 3 или более основных аминокислот в N-терминальной или С-терминальной области.
Предпочтительно, пептид содержит 4 или более цистеинов.
Предпочтительно, пептид содержит описанную ниже последовательность (а) или (b) аминокислот:
(a) последовательность аминокислот, указанная в SEQ ID NO: 10;
(b) последовательность аминокислот, полученная путем замещения, удаления и/или добавления одной или нескольких аминокислот в последовательности (а) аминокислот.
Предпочтительно, последовательность (b) аминокислот по меньшей мере на 70%, более предпочтительно - по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90% повторяет последовательность (а) аминокислот.
Предпочтительно, последовательность аминокислот пептида такова, как указано в SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 17.
Предпочтительно, N-терминальная область включает в себя последовательность не более 10 аминокислот, считая от N-терминальной аминокислоты пептида, С-терминальная область включает в себя последовательность не более 10 аминокислот, считая от С-терминальной аминокислоты пептида.
Предпочтительно, в С-терминальной области содержится два цистеина и основные аминокислоты.
Предпочтительно, в С-терминальной области содержится 10 аминокислот со следующим аминокислотным составом:
основная аминокислота - нейтральная аминокислота - основная аминокислота - нейтральная аминокислота - основная аминокислота - цистеин - цистеин - основная аминокислота - нейтральная аминокислота - основная аминокислота - свободный карбоксил.
Предпочтительно, пептид происходит от человека или мыши, более предпочтительно, пептид является производным от мышиного β-дефензина-4.
Предпочтительно, респираторный вирус выбран из вирусов гриппа и коронавирусов; при этом вирусы гриппа включают в себя такие подтипы как Н1, Н3, Н5, и Н7, а коронавирусы - коронавирус атипичной пневмонии (SARS-CoV) и коронавирус ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV).
Другой аспект данного изобретения заключается в обеспечении композиции, включающей в себя:
- любой из пептидов по настоящему изобретению; и
- фармацевтически приемлемый наполнитель.
Еще один аспект настоящего изобретения заключается в обеспечении способа блокирования инфекции респираторного вируса в клетке-мишени, включающего в себя:
- обеспечение возможности для любого пептида по настоящему изобретению входить в контакт и связываться с респираторным вирусом в системе, включающей в себя клетку-мишень и респираторный вирус; и
- обеспечение возможности для такого пептида подавлять выработку вирусной РНК поздней эндосомой клетки-мишени, таким образом, блокируя инфекцию респираторного вируса в клетке-мишени;
при этом респираторный вирус выбран из вирусов гриппа и коронавирусов, вирусы гриппа включают в себя такие подтипы как Н1, Н3, Н5, и Н7, а коронавирусы - SARS-CoV и MERS-CoV.
Предпочтительно, связывание пептида с вирусом включает в себя связывание пептида с поверхностным гликопротеином вируса и пептид способен подавлять выработку вирусной РНК путем противодействия снижению рН в поздней эндосоме.
Еще один аспект настоящего изобретения заключается в обеспечении использования любого из пептидов по настоящему изобретению при производстве лекарственного средства для профилактики или лечения инфекции респираторного вируса.
Еще один аспект настоящего изобретения заключается в обеспечении способа получения любого из пептидов по настоящему изобретению, включающего синтез пептида химическим путем или на основе генной инженерии.
Еще один аспект настоящего изобретения заключается в обеспечении изолированной ДНК, кодирующей любой из пептидов по настоящему изобретению.
Еще один аспект настоящего изобретения заключается в обеспечении экспрессионного вектора, который содержит ДНК по настоящему изобретению, функционально связанную с промотором.
Еще один аспект настоящего изобретения заключается в обеспечении клетки-хозяина, содержащей экспрессионный вектор по настоящему изобретению.
Еще один аспект настоящего изобретения заключается в обеспечении набора для скрининга пептида, способного подавлять инфекцию респираторного вируса, содержащего:
- позитивную пробу, представляющую собой один из пептидов по настоящему изобретению; и
- клетку-мишень, которая может быть инфицирована респираторным вирусом.
Предпочтительно, набор также содержит среду для культивирования клеток.
Предпочтительно, набор также содержит негативную пробу или пустую пробу.
Предпочтительно, респираторный вирус выбран из вирусов гриппа и коронавирусов, при этом вирусы гриппа включают в себя такие подтипы как Н1, Н3, Н5, и Н7, а коронавирусы - SARS-CoV и MERS-CoV.
Предпочтительно, клетка-мишень выбрана из клетки Мадин-Дарби почки собаки (MDCK, АТСС № CCL-34), зародышевой клетки почки макаки-резус (FRhK-4, АТСС № CRL-1688) и клетки почки Е6 африканской зеленой мартышки (Vero-Е6, АТСС № CRL-1586).
Еще одним аспектом настоящего изобретения является обеспечение способа скрининга пептида, способного подавлять инфекцию респираторного вируса, включающего в себя следующие шаги:
a) обеспечение изолированного или синтезированного произвольным образом пептида-кандидата;
b) обеспечение позитивной пробы, являющейся одним из пептидов по настоящему изобретению;
c) обеспечение возможности раздельного контакта с респираторным вирусом, соответственно, пептида-кандидата и позитивной пробы;
d) раздельное инфицирование клетки-мишени, соответственно, респираторным вирусом, контактировавшим с пептидом-кандидатом, и респираторным вирусом, контактировавшим с позитивной пробой;
e) оценка способности пептида-кандидата и позитивной пробы подавлять инфекцию респираторного вируса в клетке-мишени; и
f) выбор пептида-кандидата, способность к подавлению у которого равна или превышает способность позитивной пробы.
Положительный эффект
Настоящее изобретение обеспечивает пептид, способный подавлять различные респираторные вирусные инфекции, а также раскрывает механизм действия пептида при подавлении инфекций респираторных вирусов. Благодаря функциональной области, способной связываться с поверхностным гликопротеином респираторного вируса, пептид может связываться с поверхностным гликопротеином вируса и далее доставляться в эндосомы клеток посредством эндоцитоза. Поскольку пептид богат основными аминокислотами, он способен препятствовать снижению рН в поздних эндосомах, блокируя, таким образом, слияние мембран вируса и эндосомы и последующий распад вируса с выработкой вирусной РНК. Таким образом, пептид по настоящему изобретению демонстрирует сильную способность блокировать инфекции респираторных вирусов, таких как различные подтипы вирусов гриппа и коронавирусов, и его можно использовать для блокирования инфекций респираторных вирусов в клетках-мишенях, а также для профилактики или лечения инфекций респираторных вирусов. В настоящем изобретении описан механизм действия такого пептида, связанный с подавлением инфекций респираторных вирусов, который обеспечивает теоретическую основу для разработки новых профилактических и терапевтических противовирусных средств широкого спектра действия, а также указывает дальнейший путь для разработки таких профилактических и терапевтических средств.
Краткое описание чертежей
Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения далее объяснены на примерах со ссылкой на приложенные чертежи.
На фиг. 1 показана конфигурация, экспрессия и очистка рекомбинантного 3-дефензина-4 мыши (rmBD4): (А) показывает, что оригинальные кодоны 3-дефензина-4 гена мыши (mBD4) были оптимизированы с помощью оптимизатора в предпочтительные кодоны для Е. coli; (В) показывает, что на основе оптимизированной последовательности было разработано шесть пар олигонуклеотидов для синтеза гена rmBD4 методом ПЦР, а подчеркнутые нуклеотиды указывают на участки распознавания KpnI и XhoI; (С) показывает анализы экспрессии и очистки составного белка β-дефензина-4, Trx-rmBD4 (Trx-β-D-4), методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ) и вестерн-блоттинга; при этом во время анализа протеины в образцах были сначала разведены в 12% (масса/объем) ДСН-ПААГ и визуализированы путем окрашивания раствором кумасси бриллиантового голубого, и параллельно разведенные в геле протеины были перемещены на поливинилиденфторидную (ПВДФ) мембрану, а затем определены методом вестерн-блоттинга с помощью кроличьего антитела к mBD4 (1:2000, предоставлено компанией Max Biotechnology Co. Ltd., Китай) в качестве первичного антитела и козьих антител к кроличьим, конъюгированных с пероксидазой хрена (1:3000, предоставлено компанией Dako, Дания), в качестве второго антитела; (D) показывает результат анализа методом электрофореза с использованием трицин-геля (16% (масса/объем)) очищенного Trx-β-D-4, переваренного Trx-β-D-4 и очищенного rmBD4 (т.е. на фиг. 1(D) показан восстановленный β-D-4).
На фиг. 2 показана оценка противовирусной активности и цитотоксичности пептидов in vitro: (А) показывает скрининг противовирусной деятельности 11 коротких пептидов, полученных из mBD4, в 30 ммоль фосфатного буферного раствора (ФБ) и минимальной поддерживающей среды (МПС) с помощью анализа бляшкообразования культур клеток Мадин-Дарби почки собаки; (В) показывает выявление противовирусной эффективности Р9 при различных концентрациях в ФБ с помощью анализа бляшкообразования; (С) показывает выявление цитотоксичности Р9, smBD4 и rmBD4 с помощью колориметрического анализа на основе тетразола (МТТ).
На фиг. 3 показана оценка профилактического и терапевтического эффекта Р9 в модели введения летальной дозы вируса мышам: (А) показывает выживаемость мышей, которым вводили интраназально Р9 или rmBD4 (50 мкг/мышь) до введения летальной дозы вируса; (В) показывает выживаемость мышей, которым вводили интраназально Р9 или rmBD4 (50 мкг/мышь) через 4 часа после введения летальной дозы вируса; (С) показывает выживаемость мышей, которым вводили внутрибрюшинно Р9 в указанной дозировке (200 или 400 мкг/мышь) через 4 часа после введения летальной дозы вируса. Статистическая значимость показателей выживаемости (9 мышей в группе) была проанализирована с помощью GraphPad Prism 5 и на данных рисунках показаны значения Р.
На фиг. 4 показано определение концентрации вируса в крови и гистопатологических изменений в тканях легких мышей, подвергнутых профилактической или терапевтической обработке с использованием Р9 или rmBD4: (А) показывает содержание копии вирусной РНК в тканях легких мышей, которых подвергали профилактической обработке (профилактика) или терапии путем интраназального введения (ИН терапия) или внутрибрюшинной инъекции (ВБ терапия), измеренные методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в реальном времени, при этом данные представлены как среднее значение плюс стандартное отклонение результатов для пяти мышей, символ * указывает на Р<0,05 согласно двустороннему парному критерию Стьюдента; (В) показывает, что титры инфекционного вируса в легочных тканях мышей также определялись анализом бляшкообразования, а результаты представлялись как среднее значение плюс стандартное отклонение результатов для пяти мышей, символ * указывает на Р<0,05 согласно двустороннему парному критерию Стьюдента; (С) представляет собой изображения гистопатологических изменений в легочных тканях мышей, полученных с помощью окраски гематоксилин-эозином. Характерные гистологические срезы легочной ткани, взятые у мышей, которых лечили Р9 (профилактика, ИН терапия или ВБ терапия) или rmBD4 (профилактика или ИН терапия), нелеченых мышей (нелеченая группа) и неинфицированных мышей (нормальная группа) показаны на фиг. 4(C) (исходное увеличение - 100*).
На фиг. 5 показано, что Р9 подавил вирусную инфекцию в клетках Мадин-Дарби почки собаки путем реакции с вирусом: (А)-(С) показывают содержание копий вирусной РНК внутри инфицированных клеток, собранных в указанные моменты времени после инфицирования, которое определялось методом ОТ-ПЦР в реальном времени; (D)-(F) показывают содержание копий вирусной РНК в супернатантах культуры, собранных в указанные моменты времени после инфицирования, которое определялось методом ОТ-ПЦР в реальном времени; (G)-(I) показывают титры вирусов в супернатантах культуры, собранных в указанные моменты времени после инфицирования, которые определялись анализом бляшкообразования. В эксперименты была включена не получавшая лечения вирусная контрольная проба (VC). Данные на указанных фигурах представлены как среднее значение плюс стандартное отклонение результатов для пяти мышей, символ * указывает на Р<0,05 согласно двустороннему парному критерию Стьюдента.
На фиг. 6 показано, что Р9 связан с частицами вируса и гемагглютинином (ГА) поверхностного протеина вируса: (А) показывает репрезентативные флуоресцентные изображения, полученные с помощью конфокального микроскопа (исходное увеличение 400×), результаты которого свидетельствуют, что Р9 связан с вирусом, а не с клетками; (В) на основе вестерн-блоттинга показывает, что Р9 связан с поверхностным гликопротеином ГА вируса, но не с нейраминидазой (НА); (С) показывает способность Р9 связываться с ГА и с НА, определяемую методом иммуносорбентного ферментного анализа (ИФА), результаты которого подтверждают, что Р9 связан с ГА, но не с НА.
На фиг. 7 показано, что Р9 не предотвратил возникновение связи вирус-рецептор и эндоцитоз, но блокировал выработку вирусной РНК из поздних эндосом: (А) и (В) показывают репрезентативные флуоресцентные изображения, полученные с помощью конфокального микроскопа (исходное увеличение 400×), в частности, результаты (А) показывают, что Р9 не смог предотвратить возникновение связи вирус-рецептор и эндоцитоз, а на (В) показана колокализация (оранжевые пятна на цветном изображении, которые соответствуют серым пятнам на черно-белом изображении, как представлено на правом изображении (В)) вируса (зеленые пятна на цветном изображении, которые соответствуют серым пятнам на черно-белом изображении, как представлено на левом изображении (В)) и Р9 (красные пятна на цветном изображении, которые соответствуют серым пятнам на черно-белом изображении, как представлено на среднем изображении (В)), через два часа после инфицирования; (С) показывает результаты, полученные путем инфицирования клеток Мадин-Дарби почки собаки необработанным вирусом (обозначено VC) и предварительно пролеченным с помощью Р9 вирусом (обозначено Р9), со сбором инфицированных клеток в указанные моменты времени после инфицирования, которые определялись методом ОТ-ПЦР в реальном времени, результаты представлялись как среднее значение плюс-минус стандартное отклонение результатов трех независимых экспериментов.
На фиг. 8 показано, что Р9 подавил снижение рН в поздних эндосомах и блокировал выработку вирусной РНК в инфицированных клетках: (А) показывает содержание копии вирусной РНК в образцах клеток, собранных в указанные моменты времени, которые определялись методом ОТ-ПЦР в реальном времени, результаты которых свидетельствуют, что подавляющий эффект Р9 сходен с воздействием ингибитора поздней эндосомы (NH4Cl); (В) представляет изображения, на которых показано выявление эндосомального окисления, сделанные с помощью конфокального микроскопа, где белыми стрелками показано расположение вируса (зеленые пятна на цветном изображении, которые соответствуют серым пятнам на черно-белом изображении, как представлено на нижнем левом изображении (В)) и их соответствующее эндосомальное окисление (красные пятна на цветном изображении, которые соответствуют серым пятнам на черно-белом изображении, как представлено на верхнем левом изображении (В)), а в клетках, инфицированных вирусом, предварительно пролеченным Р9, не наблюдается эндосомального окисления (см. верхнее правое изображение (В)), однако вирусы были обнаружены в эндосомах (зеленые пятна на цветном изображении, которые соответствуют серым пятнам на черно-белом изображении, как представлено на нижнем правом изображении (В)).
На фиг. 9 показано, что основные аминокислоты в Р9 играют ключевую роль в подавлении инфекций вирусов: (А) показывает связывающую способность указанных пептидов, включая пептиды, аналогичные Р9 (см. приведенную ниже таблицу 3), получаемые путем замещения 1-3 основных аминокислот в С-терминальной области Р9 нейтральными или кислыми аминокислотами (P9-S1, P9-S2 и P9-S3), или добавления 3 кислых аминокислот в N-терминальной области Р9 (P9-aci-1), или путем добавления 3 основных аминокислот в N-терминальной области Р9 (P9-KHR), с протеином ГА вируса, что было протестировано в указанных концентрациях (нг) с применением ИФА, с альбумином бычьей сыворотки в качестве отрицательной пробы (NC); (В) показывает подавляющую активность пептидов в отношении гемагглютинации протеина ГА вируса, которая измерялась путем анализа подавления гемагглютинации (АПГ); (С) показывает результаты определения противовирусного воздействия пептидов, аналогичных Р9, в клетках с использованием метода ОТ-ПЦР в реальном времени.
На фиг. 10 показано выявление противовирусного воздействия Р9 на респираторные вирусы широкого спектра действия in vitro, где 50% подавляющая концентрация (ПК50) соответственно показана пунктиром, а результаты представлены как среднее значение плюс-минус стандартное отклонение для трех независимых экспериментов. На фиг. 10 график (А) показывает выявление противовирусного воздействия Р9 на инфекции различных подтипов вируса гриппа А с помощью анализа бляшкообразования; график (В) показывает выявление противовирусного воздействия Р9 на инфекции SARS-CoV и MERS-CoV с применением анализа бляшкообразования.
Осуществление изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает пептид, синтезируемый химическим путем или на основе генной инженерии. Пептид имеет функциональную область, способную связываться с поверхностным гликопротеином респираторного вируса и подавлять инфекцию респираторного вируса.
Например, если респираторным вирусом является вирус гриппа, такой как вирус гриппа подтипа Н1, Н3, Н5 или Н7, пептид по настоящему изобретению может связываться с поверхностным гликопротеином ГА вируса. Если респираторный вирус является коронавирусом SARS-CoV или MERS-CoV, пептид по настоящему изобретению может связываться со спайк-протеином (S-протеином) поверхностного гликопротеина вируса.
Имея функциональную область, способную связываться с поверхностным гликопротеином респираторного вируса, пептид может связываться с поверхностным гликопротеином респираторного вируса и затем доставляться посредством эндоцитоза в эндосомы клеток, проявляя способность к подавлению инфекции респираторного вируса.
Предпочтительно, пептид по настоящему изобретению дополнительно имеет функцию предотвращения окисления в поздних эндосомах клеток. В частности, пептид может препятствовать снижению рН в поздних эндосомах для блокирования слияния вирусной и эндосомной мембран, последующего распада вируса и выработки вирусной РНК.
Предпочтительно, пептид по настоящему изобретению имеет 5 или более (например, количество, меньшее или равное 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6) основных аминокислот. Предпочтительно, пептид имеет 2 или более (например, количество, меньшее или равное 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3) основных аминокислот в N-терминальной области или С-терминальной области. Более предпочтительно, пептид имеет 3 или более (например, количество, меньшее или равное 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4) основных аминокислот в N-терминальной области или С-терминальной области.
Также предпочтительно, пептид по настоящему изобретению имеет 4 или более (например, количество, меньшее или равное 10, 9, 8, 7, 6, 5), предпочтительно от 4 до 6, цистеинов.
Предпочтительно, в настоящем изобретении N-терминальная область пептида содержит последовательность не более 10 аминокислот, считая от N-терминальной аминокислоты пептида, а С-терминальная область пептида содержит последовательность не более 10 аминокислот, считая от С-терминальной аминокислоты пептида.
Предпочтительно, С-терминальная область содержит два цистеина и богата основными аминокислотами. Выражение «богата основными аминокислотами», которое употребляется в данном контексте, означает, что С-терминальная часть пептида содержит 2 или более (например, количество, меньшее или равное 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3), предпочтительно от 3 до 6, основных аминокислот.
Более предпочтительно, С-терминальная область содержит 10 аминокислот со следующей аминокислотной композицией: основная аминокислота - нейтральная аминокислота - основная аминокислота - нейтральная аминокислота - основная аминокислота - цистеин - цистеин - основная аминокислота - нейтральная аминокислота - основная аминокислота - свободный карбоксил. В контексте настоящего документа «свободный карбоксил» в С-терминальной области означает карбоксил С-терминальной основной аминокислоты.
Предпочтительно, пептид по настоящему изобретению содержит последовательность (а) или (b) аминокислот, описанные ниже:
(a) последовательность аминокислот, указанная в SEQ ID NO: 10; или
(b) последовательность аминокислот, полученная путем замещения, удаления и/или добавления одной или нескольких аминокислот в последовательность (а) аминокислот.
Последовательность аминокислот, показанная в SEQ ID NO: 10, содержит функциональную область, способную связываться с поверхностным гликопротеином респираторного вируса, имеет два цистеина и богата основными аминокислотами в С-терминальной области. Пептид с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 10 (т.е. с последовательностью (а) аминокислот), способен связываться с поверхностными гликопротеинами респираторных вирусов и имеет функцию предотвращения окисления в поздних эндосомах клеток, подавляя инфекции респираторных вирусов.
Пептид с описанной выше последовательностью (b) аминокислот может быть получен путем замены, удаления и/или добавления одной или нескольких аминокислот в последовательность (а) аминокислот, при условии, что замена, удаление и/или добавление существенно не влияют на активность пептида, связанную с подавлением инфекций респираторных вирусов. Предпочтительно, число основных аминокислот остается неизменным или увеличивается в последовательности аминокислот, полученной путем замены, удаления и/или добавления одной или нескольких аминокислот. Предпочтительно, последовательность (b) аминокислот по меньшей мере на 70%, более предпочтительно - по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно - по меньшей мере на 90% и еще более предпочтительно - по меньшей мере на 97% идентична последовательности (а) аминокислот.
Также предпочтительно, последовательность аминокислот пептида в соответствии с настоящим изобретением соответствует SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, или SEQ ID NO: 17. Как указывалось выше, пептид с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 10 способен связываться с поверхностными гликопротеинами респираторных вирусов и может предотвращать окисление в клетках поздних эндосом, т.е. служить для профилактики инфекций респираторных вирусов. Пептид с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 13 был получен путем замены одной основной аминокислоты K на N в С-терминальной области последовательности аминокислот, показанной в SEQ ID NO: 10. Было продемонстрировано, что такая замена не влияет на способность пептида связываться с поверхностными гликопротеинами респираторных вирусов и существенно не влияет на воздействие пептида на инфекции респираторных вирусов. Пептид с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 17 был получен путем добавления 3 основных аминокислот K, Н и R в N-терминальной области последовательности аминокислот, показанной в SEQ ID NO: 10. Было продемонстрировано, что такое добавление не влияет на способность пептида связываться с поверхностными гликопротеинами респираторных вирусов и существенно не влияет на воздействие пептида на инфекции респираторных вирусов.
Предпочтительно, пептид по настоящему изобретению получен путем генной инженерии (например, получен как рекомбинантный пептид) или методом химического синтеза. Кроме того, предпочтительно, пептид по настоящему изобретению получен от мыши или человека, предпочтительно - из мышиного 3-дефензина-4 (mBD4).
Другой аспект изобретения заключается в обеспечении композиции, содержащей один или более пептидов в соответствии с настоящим изобретением, и фармацевтически приемлемый наполнитель.
Количество пептида, которое используется в композиции, определяется в зависимости от специфики применения и может находиться в диапазоне от 5 до 500 мкг/мл, предпочтительно от 20 до 300 мкг/мл и более предпочтительно от 50 до 200 мкг/мл.
Фармацевтически приемлемые наполнители, применимые в настоящем изобретении, представляют собой традиционно используемые в данной отрасли. Наполнители могут выбираться надлежащим образом в соответствии с требованиями практического применения или конкретной дозировки и могут включать в себя, например, раскрытые в главе 4 «Research of Peptide Drug Formulations», см. Peptide Drugs Research and Development, edited by Baoqiu LI, People's Medical Publishing House, July 2011, pages 82-100. В композиции по настоящему изобретению фармацевтически приемлемый наполнитель может быть использован в количестве, не выходящем за пределы общего диапазона, и подходящее его количество может быть определено специалистом в соответствии с практическим применением.
Другой аспект изобретения обеспечивает способ блокирования инфекции респираторного вируса в клетке-мишени, включающий в себя:
- обеспечение возможности для любого пептида, упомянутого в настоящем изобретении, входить в контакт и связываться с респираторным вирусом в системе, содержащей клетку-мишень и респираторный вирус; и
- обеспечение возможности для такого пептида подавлять выработку вирусной РНК поздней эндосомой клетки-мишени, таким образом, блокируя инфекцию респираторного вируса в клетке-мишени.
Предпочтительно, респираторный вирус выбран из вирусов гриппа и коронавирусов; при этом вирусы гриппа могут включать в себя такие подтипы как Н1, Н3, Н5, и Н7, а коронавирусы - SARS-CoV и MERS-CoV.
Предпочтительно, связывание пептида с вирусом включает в себя связывание пептида с поверхностным гликопротеином вируса. Кроме того, пептид может подавлять выработку вирусной РНК, препятствуя снижению рН в поздней эндосоме. Таким образом, пептид обеспечивает блокирование инфекций респираторных вирусов в клетках-мишенях.
В одном частном варианте осуществления настоящего изобретения способ блокирования инфекции респираторного вируса в клетке-мишени осуществляется в условиях in vivo или in vitro.
Другой аспект изобретения обеспечивает использование пептида по настоящему изобретению при изготовлении лекарственного препарата для профилактики или лечения инфекций респираторных вирусов. Лекарственное средство может изготавливаться в виде спрея, в инъекционной форме (жидкости для инъекций или сублимированного порошка для инъекций), в пероральной форме и т.п.
Еще один аспект изобретения обеспечивает способ терапии или профилактической обработки инфицированного пациента или находящегося в состоянии риска развития инфекций респираторных вирусов, включая введение пациенту эффективного количества одного или более пептидов в соответствии с настоящим изобретением.
Если пептид используется для лечения пациента, инфицированного респираторным вирусом, доза подразумевает терапевтически эффективное количество лекарственного препарата. Например, общая доза пептидов настоящего изобретения, используемых при лечении, может находиться в диапазоне 1-40 мг на кг массы в сутки, предпочтительно 2-20 мг на кг массы в сутки, более предпочтительно 2,5-10 мг на кг массы в сутки.
Если пептид используется для профилактической обработки пациента при наличии угрозы инфицирования респираторными вирусами, применяется эффективная профилактическая доза препарата. Например, общая доза пептидов в настоящем изобретении, используемая в профилактических целях, может находиться в диапазоне 0,1-40 мг на кг массы в сутки, предпочтительно 0,5-20 мг на кг массы в сутки, более предпочтительно - 1-10 мг на кг массы в сутки.
Пептид по настоящему изобретению можно вводить интраназально (например, с помощью спрея) или путем внутривенной инъекции (например, внутрибрюшной инъекции).
Респираторные вирусы, описанные здесь, предпочтительно содержат вирусы гриппа и коронавирусы. Более предпочтительно, вирусы гриппа включают в себя вирусы гриппа подтипов Н1, Н3, Н5 и Н7, такие как H1N1, H3N2, H5N1, H7N7, а коронавирусы включают в себя SARS-CoV и MERS-CoV.
Другой аспект изобретения обеспечивает способ изготовления пептида в соответствии с настоящим изобретением, включающий в себя синтез пептида химическим или биологическим методом (т.е. путем генной инженерии).
При необходимости, пептид возможно синтезировать химическим или биологическим методом с применением общепринятого в данной отрасли процесса. Например, желаемый пептид можно синтезировать химическим путем - путем соединения конститутивных аминокислот друг за другом посредством химической реакции. Синтез желаемого пептида биологическим путем может включать в себя, например, следующие шаги: амплификация ДНК, кодирующей желаемый пептид, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), субклонирование ДНК в экспрессионный вектор; трансфектирование или трансформация экспрессионного вектора, содержащего ДНК, в эукариотные и прокариотные клетки-хозяева с последующей экспрессией желаемого пептида.
Другой аспект изобретения заключается в обеспечении изолированной ДНК, где закодирован любой из пептидов в соответствии с настоящим изобретением.
Следующий аспект изобретения заключается в обеспечении экспрессионного вектора, содержащего ДНК, функционально связанную с промотором.
В данном контексте термин «экспрессионный вектор» относится к вектору, способному направлять экспрессию гена, с которым он функционально связан. Экспрессия соответствующего пептида согласно настоящему изобретению может направляться промоторной последовательностью, посредством функциональной связи промоторной последовательности с ДНК изобретения, которую требуется экспрессировать. В целом, экспрессионные векторы, используемые в технике генной инженерии, часто представлены в виде плазмид. Тем не менее, данное изобретение призвано охватить и другие известные формы экспрессионных векторов.
Промотор и ДНК, кодирующей пептид по изобретению, «функционально связаны», когда промотор способен на осуществление экспрессии ДНК в РНК. Указанный промотор может быть любым промотором, который обычно используют в области генной инженерии.
Экспрессионный вектор изобретения также может содержать дополнительную последовательность или последовательности, например, терминальную последовательность, способную повышать уровни мРНК и минимизировать сквозное считывание из конструкции в другие последовательности. Кроме того, экспрессионный вектор может иметь дополнительно селектируемые маркеры, например, в форме генов резистентности к антибиотикам, которые разрешают исключение клеток, несущих такие векторы.
Еще один аспект изобретения обеспечивает клетку-хозяина, содержащую экспрессионный вектор в соответствии с настоящим изобретением.
Термин «клетка-хозяин», используемый в данном контексте, относится к клетке, в которую вводится экспрессионный вектор в соответствии с настоящим изобретением. Такие клетки могут быть прокариотическими, что, например, может использоваться для быстрого создания большого количества экспрессионных векторов по изобретению.
Клетки-хозяева могут временно или постоянно трансформироваться с помощью экспрессионного вектора по изобретению. Такая трансформация экспрессионных векторов в клетки может осуществляться с помощью любой техники, используемой в данной области, включая стандартные бактериальные трансформации, осаждение фосфатом кальция или электропорацию, но не ограничиваясь ими.
Другой аспект изобретения обеспечивает набор для скрининга пептидов, способных подавлять инфекцию респираторного вируса, содержащий позитивную пробу - пробу в виде любого из пептидов в соответствии с настоящим изобретением; а также клетку-мишень, которая может быть инфицирована респираторным вирусом.
Предпочтительно, набор также содержит среду для культивирования клеток. Более предпочтительно, набор содержит негативную пробу или пустую пробу. Негативная проба или пустая проба - это пептид, который не способен подавить инфекцию респираторного вируса в клетке-мишени.
Упомянутая клетка-мишень инфицируется респираторным вирусом и может быть выбрана из таких вариантов, как клетка Мадин-Дарби почки собаки (MDCK, АТСС № CCL-34), зародышевая клетка почки макаки-резус (FRhK-4, АТСС № CRL-1688) и клетка почки Е6 африканской зеленой мартышки (Vero-Е6, АТСС № CRL-1586). Респираторный вирус может быть выбран из вируса гриппа и коронавируса. Предпочтительно, вирусы гриппа включают в себя вирус гриппа подтипов Н1, Н3, Н5 и Н7, а коронавирусы включают в себя SARS-CoV и MERS-CoV.
Другой аспект изобретения обеспечивает метод скрининга пептида, способного подавлять инфекцию респираторного вируса, включающий в себя следующие шаги:
a) обеспечение изолированного или синтезированного произвольным образом пептида-кандидата;
b) обеспечение позитивной пробы в виде любого из пептидов по изобретению;
c) обеспечение раздельного контакта с респираторным вирусом, соответственно, пептида-кандидата и позитивной пробы;
d) раздельное инфицирование клетки-мишени, соответственно, с помощью респираторного вируса, который контактировал с пептидом-кандидатом, и с помощью респираторного вируса, который контактировал с позитивной пробой;
e) оценка способности пептида-кандидата и позитивной пробы подавлять инфекцию респираторного вируса в клетке-мишени; и
f) выбор пептида-кандидата, у которого способность к подавлению соответствует или превосходит способность позитивной пробы.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения способ скрининга пептида, обладающего способностью к подавлению инфекции респираторного вируса, проводится in vivo или in vitro.
Далее настоящее изобретение более детально описано на примерах со ссылкой на фигуры. Объекты, признаки и аспекты настоящего изобретения раскрыты в дальнейшем описании или очевидны из него. Специалисту ясно, что данное описание предназначено только для иллюстрации вариантов осуществления и не предполагает ограничения более широких аспектов настоящего изобретения, которые воплощаются в этих примерах.
Материалы и методы
Вирусы и культуры клеток
Высоковирулентный адаптированный к мышам мутантный штамм вируса гриппа А - A/Hong Kong/415742Md/2009 (H1N1) (см. Zheng, В., et al. D225G mutation in hemagglutinin of pandemic influenza H1N1 (2009) virus enhances virulence in mice. Exp Biol Med (Maywood) 235, 981-988 (2010)), вируса A/Hong Kong/8/68 (H3N2) (ATCC No. VR-544), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) (см. Chan MC, et al. Proinflammatory cytokine responses induced by influenza A (H5N1) viruses in primary human alveolar and bronchial epithelial cells. Respir Res. Nov. 11, 2005; 6: 135), вируса A/Netherlands/219/2003 (H7N7) (см. Fouchier RA, et al. Avian influenza A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 1356-1361. 2004) и вируса A/Anhui/1/2013 (H7N9) (см. Gao R, et al. Human infection with a novel avian-origin influenza A (H7N9) virus. N Engl J Med. 368(20): 1888-97. May 2013) культивировались в клетках Мадин-Дарби почки собаки (MDCK, АТСС № CCL-34) и их титры определялись с помощью анализа бляшкообразования и анализа ЦПД50 (см. Zheng, B.J., et al. Delayed antiviral plus immunomodulator treatment still reduces mortality in mice infected by high inoculum of influenza A/H5N1 virus. Proc Natl Acad Sci USA 105, 8091-8096 (2008)). Штамм коронавируса атипичной пневмонии (SRAS-CoV) HKU39849 культивировался в зародышевых клетках почки макаки-резус (FRhK-4, АТСС № CRL-1688) (см. Peiris JS, et al. Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome. Lancet. 361 (9366): 1319-25. Apr. 2003), а штамм коронавируса ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV) hCoV-EMC/2012 (предоставлено д-ром Роном Фушье (Ron Fouchier), Медицинский центр университета Erasmus, Роттердам (Erasmus University Medical Center Rotterdam)) культивировался в клетках почки Е6 африканской зеленой мартышки (Vero-Е6, АТСС № CRL-1586), их титры определялись с помощью анализа бляшкообразования и анализа ЦПД50 (см. Zhong, N.S., et al. Epidemiology and cause of severe acute respiratory syndrome (SARS) in Guangdong, People's Republic of China, in February, 2003. Lancet 362, 1353-1358 (2003)).
Клонирование, экспрессия и очищение рекомбинантного мышиного дефензина-4
Кодоны мышиного β-дефензина-4 (mBD4) с помощью оптимизатора были оптимизированы в предпочтительные кодоны для Е. coli (фиг. 1(A)) (см. Puigbo, P., Guzman, Е., Romeu, А. & Garcia-Vallve, S. OPTIMIZER: a web server for optimizing the codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Res 35, W126-131 (2007)). Фрагмент гена mBD4 был сформирован путем синтеза гена методом ПЦР с помощью 6 пар олигонуклеотидов (фиг. 1(B)). Кодон-оптимизированный ген был клонирован в вектор PCR2.1 (производства компании Invitrogen, США) а затем субклонирован в РЕТ32а(+) (производства компании Novagen, США) на участках KpnI и XhoI. Полученная плазмида была трансформирована в BL21 (DE3) для выделения гибридного белка тиоредоксин-β-дефензин-4 (Trx-β-D-4). Trx-β-D-4 был выделен из цитоплазмы Е. coli с помощью простой процедуры осмотического удара (см. McCoy, J. & Lavallie, Е. Expression and purification of thioredoxin fusion proteins. Curr Protoc Mol Biol Chapter 16, Unit 16 18 (2001)) и затем очищен способом быстрой жидкостной хроматографии (AKTA-FPLC) (производства компании GE Healthcare, United Kingdom) с применением колонки His Trap FF в соответствии с инструкциями производителя (фиг. 1(C)). Далее 80 мкг Trx-β-D-4 было переварено с помощью 1U энтерокиназы (производства компании Merck, США) для выделения рекомбинантного мышиного β-дефензина-4 (rmBD4, или β-D-4 для краткости). Препарат β-D-4 был получен катионообменной хроматографией с помощью хроматографии в сефарозе (Sp sepharose Fast Flow) (производства компании GE Healthcare) согласно инструкциями производителя. Очищенный β-D-4 был подвергнут обессоливанию с применением колонки PD-10 (GE Healthcare) в 25 ммоль буфера ГЭПЭС (рН 7,4) (фиг. 1(D)).
Конфигурирование пептида и оценка противовирусного действия
Пептиды с полной длиной mBD4 (smBD4) и короткие пептиды, полученные из mBD4, были сконфигурированы как показано в таблице 1, синтезированы химическим путем и подтверждены компанией Mocell Biotech Limited (Шанхай, Китай). Противовирусное действие коротких пептидов, smBD4 и rmBD4, было первоначально оценено в слабосоленой среде, т.е. в 30 ммоль ФБ, содержащем 24,6 ммоль Na2HPO4 и 5,6 ммоль KH2PO4, рН 7,4 (см. Gong, Т., et al. Recombinant mouse beta-defensin 2 inhibits infection by influenza A virus by blocking its entry. Arch Virol 155, 491-498 (2010)), а затем - в минерализованной среде МПС (производства компании Invitrogen, США). Пептиды (25 мкг/мл) предварительно смешивались с вирусом H1N1 (50 БОЕ/лунка) в ФБ или МПС и инкубировались при комнатной температуре (КТ) в течение 1 часа. Клетки Мадин-Дарби почки собаки инфицировались вирусом, предварительно обработанным пептидом, а затем противовирусная активность пептидов измерялась с помощью анализа на бляшкообразование (см. Sui, H.Y., et al. Small interfering RNA targeting m2 gene induces effective and long term inhibition of influenza A virus replication. PLoS One 4, e5671 (2009)).
Цитотоксичность и пробы на ПК50
Цитотоксичность пептидов выявлялась с помощью определения 50% токсической концентрации (ТК50) с использованием колориметрического анализа на основе тетразола (МТТ) (см. Pauwels, R., et al. Rapid and automated tetrazolium-based colorimetric assay for the detection of anti-HIV compounds. J Virol Methods 20, 309-321 (1988)). Вкратце, клетки Мадин-Дарби почки собаки культивировались в 96-луночной чашке в течение ночи. Клетки дважды промывались фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ) (производства компании Invitrogen, США) (упоминаемый далее ФСБ также произведен компанией Invitrogen, США), затем трижды добавили 100 мкл/на лунку МПС с различными концентрациями пептидов или без пептидов. После инкубирования при 37°С в течение 24 часов в чашку было добавлено 10 мкл на лунку раствора МТТ (производства компании Beyotime, Китай). После инкубирования чашки в течение 4 часов в каждую лунку было добавлено 100 мкл 10% (масса/объем) ДСН в 0,01-молярном HCl. После дальнейшей инкубации при температуре 37°С в течение ночи с чашки сняли данные при ОП570 и ОП640 с помощью ридера VictorTM Х3 Multilabel Reader (производства компании PerkinElmer, США).
Эксперименты проводились в соответствии с методами, изложенными в указанной ниже ссылке, при этом 50% подавляющая концентрация (ПК50) пептидов против инфекций различных подтипов вируса гриппа А, то есть, H1N1, H3N2, H5N1, H7N7 и H7N9 и коронавирусов SARS-CoV и hCoV-EMC, определялась непосредственно анализом бляшкообразования, и/или титры вируса в супернатантах культуры, собранных в течение 18 часов после инфицирования, обнаруживались косвенно с помощью анализа бляшкообразования и ОТ-ПЦР в реальном времени (см. Zheng, B.J., et al. Delayed antiviral plus immunomodulator treatment still reduces mortality in mice infected by high inoculum of influenza A/H5N1 virus. Proc Natl Acad Sci USA 105, 8091-8096 (2008)).
Оценка противовирусного воздействия in vivo
Женские особи белой мыши (BALB/c) (17-21 г) в возрасте 6-8 недель содержались в лаборатории, соответствующей 3 уровню биологической безопасности, где им обеспечивались гранулированный корм и вода. Все протоколы экспериментов соответствовали стандартным операционным процедурам, утвержденными для помещений 3 уровня биологической безопасности, где содержатся животные, и были одобрены Комитетом по этическому отношению к животным (см. Zheng, B.J., et al. Delayed antiviral plus immunomodulator treatment still reduces mortality in mice infected by high inoculum of influenza A/H5N1 virus. Proc Natl Acad Sci USA 105, 8091-8096 (2008)). Адаптированный к мышам высоковирулентный мутантный штамм гриппа A/Hong Kong/415742Md/2009 (H1N1) был использован для летального инфицирования мышей. Для оценки профилактического воздействия мышам интраназально вводили пептиды Р9 или rmBD4 из расчета 50 мкг на одну мышь, а затем дополнительно 5 ЛД50 вируса. Для оценки терапевтического воздействия мышам вводили 5 ЛД50 вируса, а затем интраназально вводили три дозы пептидов Р9 или rmBD4 (из расчета 50 мкг на мышь в день) с интервалом в один день, или внутрибрюшинно вводили Р9 по 200 или 400 мкг на мышь в день в течение 6 дней с интервалом в один день, начиная вводить спустя 4 часа после летального инфицирования. За продолжительностью жизни и общим состоянием наблюдали в течение 21 дня или до смерти. Для проведения вирусологических и патологических анализов мышей умерщвляли спустя 5 дней после инфицирования. Брали образцы крови и легких.
Гистопатологическое окрашивание
Ткани легких, которые брали у инфицированных мышей, немедленно помещали в 10% (объемное содержание) раствор формалина в фосфатно-солевом буфере, подвергали дегидратации и заливали парафином. Срезы толщиной 4-6 мкм помещали на предметные стекла. Гистопатологические изменения исследовали под оптическим микроскопом с помощью окрашивания гематоксилин-эозином (Н&Е) (см. Zheng, B.J., et al. Delayed antiviral plus immunomodulator treatment still reduces mortality in mice infected by high inoculum of influenza A/H5N1 virus. Proc Natl Acad Sci USA 105, 8091-8096 (2008)).
Выделение вирусной РНК и ОТ-ПЦР в реальном времени
Концентрация вируса в крови выявлялась с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени (см. Zheng, В., et al. D225G mutation in hemagglutinin of pandemic influenza H1N1 (2009) virus enhances virulence in mice. Exp Biol Med (Maywood) 235, 981-988 (2010)). Вкратце, вирусная РНК выделялась из супернатантов культуры с помощью набора RNeasy Mini Kit (производства компании Qiagen, США) согласно протоколам производителя, в то время как вирусная РНК в клеточном лизисе и тканях легких мыши выделялась с помощью набора QIAamp Viral RNA Mini Kit (производства компании Qiagen, США) согласно протоколам производителя. Обратная транскрипция выполнялась с помощью набора RSII kit (производства компании Invitrogen, США) согласно инструкции производителя. Анализ ОТ-ПЦР в реальном времени проводился с использованием смеси ABI SYBR Green Mastermix и системы 7500 system (производства компании Invitrogen). Клоны гена ГА вируса H1N1 использовались в качестве позитивной пробы и в качестве стандарта. Анализы ПЦР в реальном времени выполнялись трижды.
Флуоресцентный анализ изображения
Вирус H1N1 пометили зеленым флуоресцентным липофильным красителем Dio (производства компании Invitrogen, США) согласно инструкции производителя, а пептид Р9 был помечен красным цветом с использованием кроличьих антител против smBD4 в соотношении 1:5000 (производства Мах Biotechnology) и козьих антител против кроличьих, помеченных Alexa594, в соотношении 1:4000 (производства Invitrogen, США) для выявления пептида Р9. Оболочку клетки окрасили красителем Alexa594 (производства компании Invitrogen) согласно инструкции производителя. Маркированный вирус и пептид Р9 предварительно смешивали в течение 1 часа, а затем выдерживали с клетками Мадин-Дарби почки собаки при температуре 4°С или 37°С. Инфицированные клетки помещали в 10% (объемное содержание) раствор формалина в фосфатно-солевом буфере в различные моменты времени после инфицирования, а изображения были получены с помощью конфокальной микроскопии (Carl Zeiss LSM 700, Zeiss, Германия).
Выявление эндосомальных окислений
Эндосомальные окисления после вирусной инфекции выявлялись согласно инструкции производителя к красителю, чувствительному к рН, то есть, pHrodo Red dextran (производства компании Invitrogen, США). Вкратце, вирус H1N1 предварительно маркировали красителем Dio и затем инкубировали с пептидом Р9 в количестве 50 мкг/мл (далее - "обработанный Р9") или ФБ (далее - «необработанный») при комнатной температуре в течение 45 минут с последующей инкубацией при температуре 4°С в течение 15 мин. Клетки Мадин-Дарби почки собаки подвергали заражению при индексе множественного заражения (ИМЗ), равном 5, обработанным или необработанным вирусом и инкубировали при температуре 4°С в течение 1 часа. 100 мкг/мл красителя, чувствительного к рН, т.е. pHrodo Red dextran, добавляли к клеткам, а затем инкубирование продолжалось в течение 10 мин. при температуре 4°С, после чего клетки выращивались в питательной среде при температуре 37°С в течение 10 мин. После двукратного промывания клеток в фосфатно-солевом буферном растворе, была добавлена свежая среда и изображения были получены с помощью конфокальной микроскопии (Carl Zeiss LSM 700, Zeiss, Германия).
Вестерн-блоттинг
Белок вируса, связанный пептидом, определялся с помощью вестерн-блоттинга (см. Guan, Y., et al. Isolation and characterization of viruses related to the SARS coronavirus from animals in southern China. Science 302, 276-278 (2003)). Вкратце, пробы вирусного белка фракционировали ДСН-ПААГ-электрофорезом и перенесли на поливинилиденфторидную (ПВДФ) мембрану Hi-bond (производства Amersham Biosciences, США). Набор Signal Boost Immunoreaction Enhancer Kit (производства EMD MILLPORE, Германия) использовался для растворения первичных и вторичных антител. После связывания вирусного белка с указанными антителами или пептидом, иммунореактивные полоски визуализировались с помощью усиленной хемилюминесценции.
ИФА (иммуносорбентный ферментный анализ)
Способность пептидов связываться с белком вируса была выявлена с помощью ИФА (см. Du, L, et al. Intranasal vaccination of recombinant adeno-associated virus encoding receptor-binding domain of severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) spike protein induces strong mucosal immune responses and provides long-term protection against SARS-CoV infection. J Immunol 180, 948-956 (2008)). Вкратце, пептидами в различной концентрации покрывали пластинки ИФА, которые затем инкубировали в блокирующем буфере (5% (масса/объем) альбумина бычьей сыворотки в фосфатно-солевом буферном растворе) при температуре 4°С в течение ночи. Затем добавлялся ГА или НА вируса H1N1 (производства Invitrogen, США) и состав инкубировался при температуре 37°С в течение 2 часов, способность пептидов связываться с белком вируса определялась кроличьим антителом против His (1:2000, производства Santa Crvi Biotechnology, США) или же кроличьими антителами против ГА или НА (1:2000, производства Immune Technology, США), и опознавалась козьим антителом против кролиьего IgG-HRP в качестве вторичного антитела (1:2000, производства Invitrogen, США), затем проводилось считывание данных ридером ИФА (Victor 1420 Multilabel Counter производства PerkinElmer, США).
Статистический анализ
Выживаемость мышей и статистическую значимость анализировали с помощью GraphPad Prism 5 (http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/). Статистическая значимость других результатов была подсчитана с помощью двустороннего парного критерия Стьюдента с применением статистического программного обеспечения Stata. Результаты считались достоверными при Р<0,05.
Примеры
Экспериментальный пример 1: Противовирусный пептид Р9 продемонстрировал самую высокую противовирусную активность в культивируемых клетках.
Было разработано и синтезировано одиннадцать пептидов, полученных из mBD4 (таблица 1). Определялось противовирусное воздействие пептидов smBD4, rmBD4 и 11 пептидов, полученных из mBD4 (таблица 1) на вирус гриппа A (H1N1) в культивируемых клетках. В отличие от полноразмерного синтетического пептида mBD4 (smBD4) и рекомбинантного mBD4 (rmBD4), короткий пептид Р9 (30 аминокислот) продемонстрировал сильную и дозозависимую противовирусную активность, в то время как другие короткие пептиды показали среднее или отрицательное противовирусное воздействие (фиг. 2). Представленный на фиг. 2(A) вирус H1N1 был предварительно инкубирован при комнатной температуре в течение одного часа с короткими пептидами и позитивной пробой (то есть, пептидами smBD4 и rmBD4), соответственно, затем он был введен в клетки Мадин-Дарби почки собаки. Подавляющее воздействие на вирусную инфекцию выявлялось с помощью анализа бляшкообразования. Индекс инфицирования рассчитывался как количество бляшек вируса, предварительно обработанного пептидом, поделенное на количество бляшек вируса, предварительно обработанного ФБ. Данные были представлены как среднее значение плюс стандартное отклонение для трех независимых экспериментов. Как показано на фиг. 2(A), пептид Р9 показал самое высокое противовирусное воздействие, а его более короткие формы Р7 и Р8 показали среднее противовирусное воздействие. Кроме того, Р9, smBD4 и rmBD4 показали более высокую эффективность в слабом фосфатно-солевом буфере, чем в минерализированной минимальной поддерживающей среде (МПС). На фиг. 2(B), после того как вирус H1N1 (50 бляшкообразующих единиц (БОЕ) на лунку) был предварительно обработан пептидами Р9, smBD4 или rmBD4 в различных концентрациях, его ввели в клетки Мадин-Дарби почки собаки. Противовирусную активность определяли непосредственно анализом бляшкообразования. ПК50 обозначалась пунктирными линиями и результаты показали, что среднее значение ПК50 пептидов smBD4, rmBD4 и Р9 составило 3,2 мкг/мл (0,7 ммоль), 1,5 мкг/мл (0,33 ммоль) и 1,2 мкг/мл (0,36 ммоль), соответственно. Данные были представлены как среднее значение плюс-минус стандартное отклонение для трех независимых экспериментов. ПК50 пептида Р9 составила приблизительно 1,2 мкг/мл, что ниже, чем у пептидов smBD4 или rmBD4 (приблизительно 3,2 и 1,5 мкг/мл, соответственно) (фиг. 2(B)). Кроме того, 50% токсические концентрации (ТК50) пептидов Р9, smBD4 и rmBD4 на фиг. 2(C) определялись с помощью колориметрического анализа на основе тетразола (МТТ). Результаты были представлены как отношение оптической плотности (ОП) обработанных клеток к оптической плотности необработанных нормальных клеток (обозначено как отношение ОП), а ТК50 обозначена пунктирными линиями. Данные были представлены как среднее значение плюс-минус стандартное отклонение для трех независимых экспериментов. Результаты показали, что ТК50 пептидов Р9, smBD4 и rmBD4 составила 860, 94 и 580 мкг/мл, соответственно (таблица 2 и фиг. 2(C)). Цитотоксичность пептида Р9 была самой низкой, в 9 раз ниже, чем у пептида smBD4. Учитывая высокую цитотоксичность пептида smBD4, авторы изобретения не применяли его в экспериментах с животными. Индекс избирательности (ТК50/ПК50) пептида Р9 составил 717, что приблизительно в 25 раз выше и в два раза выше, чем у пептидов smBD4 (индекс избирательности 29) и rmBD4 (индекс избирательности 387), соответственно. Эти результаты показали, что пептид Р9 демонстрирует самую высокую противовирусную активность и индекс избирательности in vitro.
Экспериментальный пример 2: Р9 продемонстрировал намного более сильное защитное действие против вируса гриппа H1N1, введенного в летальной дозе.
Профилактическое и терапевтическое воздействие Р9 оценивалось путем введения животным летальной инфекции вируса гриппа H1N1 (фиг. 3). При интраназальном введении мышам Р9 или rmBD4 до интраназального введения летальной дозы вируса, выживаемость мышей, получивших Р9, составляла 100% (9/9), что значительно выше, чем выживаемость мышей, получивших rmBD4 (22% (2/9)) (Р<0,008), и мышей, не получавших пептидов (0%) (Р<0,0001) (фиг. 3(A)). Для оценки терапевтического воздействия Р9 мышам интраназально вводили 3 дозы (50 мкг/доза в день) Р9 или rmBD4 с интервалом в один день, начав через 4 часа после введения смертельной дозы (фиг. 3(B)). Результаты показали, что выживаемость мышей, которым интраназально вводили Р9 и rmBD4, составила 67% (6/9) и 33% (3/9), соответственно. Выживаемость мышей, которым интраназально вводили Р9, была существенно выше, чем выживаемость контрольных мышей, не получавших пептидов (Р<0,015), а также численно выше, чем мышей, получавших rmBD4 (фиг. 3(B)). Кроме того, для оценки воздействия введенных дозировок мышам внутрибрюшинно вводили 6 доз (200 или 400 мкг/доза в день) Р9 с интервалом в один день, начав через 4 часа после введения инфекции. Результаты показали, что выживаемость составила 56% (5/9) при внутрибрюшинном введении Р9 в дозировке 400 мкг/доза в день, что было значительно выше, чем показатель нелеченых мышей (Р<0,026), при этом выживаемость оказалась сниженной до 22% (2/9), когда мышам внутрибрюшинно вводили Р9 в дозировке 200 мкг/доза в день (фиг. 3(C)). Данные результаты показали дозозависимый эффект. В настоящем изобретении rmBD4, введенный мышам предварительно или после инфицирования, демонстрировал меньшую эффективность в сравнении с Р9 и мыши, которым предварительно или после инфицирования ввели rmBD4, не показали статистически значимого повышения уровня выживаемости (Р>0,05).
Копии вирусной РНК и титры вируса в легочных тканях мышей, которые получали профилактическую обработку, интраназальную или внутрибрюшинную терапию, определялись с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени (фиг. 4(A)) и анализа бляшкообразования (фиг. 4(B)), соответственно. Результаты показали, что концентрация вируса в легочных тканях мышей, которым профилактически ввели Р9, а также ввели Р9 интраназально или внутрибрюшинно после инфицирования, была значительно ниже, чем у мышей, не получавших лечения (Р<0,05). Гистопатологические изменения в легочных тканях изучались с помощью окрашивания гематоксилин-эозином, которое показало, что альвеолярное поражение и интерстициальный инфильтрат воспаления у мышей, получавших профилактику или терапию Р9, были намного менее выражены, чем у мышей, получавших профилактику или терапию rmBD4, а также мышей, не получавших терапии (фиг. 4(C)). Альвеолярное поражение и интерстициальный инфильтрат воспаления у мышей, которые получали Р9 в дозировке 400 мкг/доза в день, были также менее выраженными, чем у мышей, которые получали Р9 в дозировке 200 мкг/доза в день (фиг. 4(C)). Гистопатологические результаты соответствовали показателям выживаемости мышей и концентрации вируса в легочных тканях. Результаты показали, что Р9 имеет намного более выраженное профилактическое и терапевтическое воздействие in vivo на инфекцию вируса H1N1 в летальной дозе, чем rmBD4.
Экспериментальный пример 3: инфицирование вирусом гриппа, подавленным Р9 путем связывания с поверхностным гликопротеином ГА вируса.
Для определения процесса подавления вирусной инфекции пептидом Р9, последний использовался для предварительной обработки клеток Мадин-Дарби почки собаки или вируса H1N1 до инфицирования или просто добавлялся в среду для культивирования клеток после инфицирования. На фиг. 5(A), 5(D) и 5(G) клетки Мадин-Дарби почки собаки были инфицированы вирусом при ИМЗ 0,3, а затем культивировались в присутствии Р9 (25 мкг/мл) (обозначено Р9-maint). На фиг. 5(B), 5(E) и 5(H) клетки были предварительно обработаны Р9 (25 мкг/мл) в течение 1 часа, а затем инфицированы вирусом при ИМЗ 0,3 (обозначено P9-cell-pre). На фиг. 5(C), 5(F) и 5(I) вирус (при ИМЗ 0,3) был предварительно обработан Р9 (25 мкг/мл) в течение 1 часа, а затем введен в среду клеток (обозначено P9-virus-pre). Концентрация вируса в инфицированных клетках (фиг. 5(A), 5(B) и 5(C)) и супернатантах клеточной культуры (фиг. 5(D), 5(E) и 5(F)) определялась с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени, а титры инфекционного вируса в супернатанте определялись с помощью анализа бляшкообразования (фиг. 5(G), 5(H) и 5(I)) в различные моменты времени после инфицирования. Результаты показали, что Р9 не оказал значительного подавляющего воздействия на репликацию и выработку вируса при нахождении в среде культуры (фиг. 5(A), 5(D) и 5(G)). Инфекция вируса также не подавлялась, если клетки предварительно обрабатывали Р9 (фиг. 5(B), 5(E) и 5(H)). Тем не менее, концентрация вируса как в клетках, так и в супернатантах культуры была значительно снижена при предварительной обработке вируса Р9 (Р<0,05, фиг. 5(C), 5(F) и 5(I)). Данные результаты показывают, что (1) Р9 не смог подавить репликацию вируса в клетках и его выработку из клеток, поскольку концентрация вируса внутри инфицированных клеток и в супернатантах культуры в присутствии Р9 во время периода культивирования были сходными с данными необработанной вирусной контрольной пробы (обозначено VC); и (2) Р9 способен подавлять вирусную инфекцию, связываясь с вирусом, но не способен подавлять вирусную инфекцию, связываясь с поверхностью клеток-мишеней.
Для подтверждения того факта, что Р9 подавляет вирусную инфекцию связыванием с поверхностью вируса, изобретатели пометили вирус зеленой флуоресценцией, а Р9 - красной флуоресценцией для наблюдения за их взаимодействием. Вирус (ИМЗ 5), помеченный красителем Dio, был предварительно обработан Р9 с концентрацией 50 мкг/мл (обозначено P9-Virus-Pre на фиг. 6(A)) или ФБ (обозначено VC на фиг. 6(A)) при КТ в течение 1 часа, или клетки Мадин-Дарби почки собаки предварительно обработали Р9 с концентрацией 50 мкг/мл (обозначено P9-Cells-Pre на фиг. 6(A)) при КТ в течение 1 часа. Клетки Мадин-Дарби почки собаки инфицировали вирусом (ИМЗ 5) и инкубировали при 37°С в течение 1 часа. В конечном итоге, ядро клетки метилось реактивом Prolong Gold Antifade Reagent с флуоресцентным красителем DAPI (производства Invitrogen, США). Характерные изображения были получены с помощью конфокального микроскопа (исходное увеличение 400×). Как показано на фиг. 6(A), меченый красным Р9 (соответствует серым пятнам на черно-белом изображении на среднем изображении в первом ряду) связывался с мечеными зеленым частицами вируса (соответствует серым пятнам на черно-белом изображении на левом изображении в первом ряду) при предварительной обработке вируса Р9, и проникал в клетки (оранжевые пятна на цветном изображении, соответствующие серым пятнам на черно-белом изображении, как показано на правом изображении в первом ряду), при этом Р9 не был обнаружен на мембране клеток или внутри клеток, когда клетки предварительно обрабатывались меченым Р9. Результаты подтвердили, что Р9 подавлял вирусную инфекцию путем связывания с вирусными частицами.
Изобретатели также определили, какой поверхностный вирусный белок связывается пептидом Р9 (фиг. 6(B) и 6(C)). На фиг. 6(B) вирусные белки вируса H1N1 отделялись 10% (масса/объем) ДСН-ПААГ-электрофорезом и перемещались на ПВДФ мембрану. Ряд 1 представляет собой вирусные белки, помеченные раствором кумасси бриллиантового голубого. В случае ряда 2, перемещенная мембрана инкубировалась с Р9 (50 мкг/мл) в течение 1 часа, а затем с кроличьим антителом против smBD4 (1:2000, производство Мах Biotechnology) в течение еще 1 часа для выявления связывания Р9. В случае ряда 3, мембрану инкубировали с кроличьим антителом против ГА1 (1:2000, производство Immune Technology, США) для выявления ГА и ГА1. В случае ряда 4, мембрану инкубировали с кроличьим антителом против НА (1:2000, производства Immune Technology, США) для определения НА. Козье антитело против кроличьего IgG (1:2000, производства Invitrogen, США), маркированное пероксидазой хрена (HRP), использовалось как второе антитело для определения связей в рядах 2-4. Результаты показали, что вирусные протеины ГА и ГА1 были признаны как Р9 (ряд 2), так и кроличьими антителами против ГА1 (ряд 3), но Р9 не смог связаться с НА (ряд 2), который был признан кроличьими антителами против НА (ряд 4). Результаты как вестерн-блоттинга (фиг. 6(B)), так и ИФА (фиг. 6(C)) показали, что Р9 связался с вирусным поверхностным гликопротеином ГА, но не НА. Таким образом, было сделано заключение о том, что Р9 может связываться с поверхностным протеином ГА вируса для подавления вирусной инфекции.
Экспериментальный пример 4: Р9 блокирует распад вируса с целью выработки РНК из поздних эндосом.
Дальнейшее исследование посвящено тому, на каком шаге или шагах вирусной инфекции, включая возникновение связи вирус-рецептор, эндоцитоз и слияние мембран вируса и эндосомы для выработки вирусной РНК, происходило ее подавление с помощью Р9. Вирус H1N1, помеченный красителем Dio, был предварительно обработан Р9 с концентрацией 25 мкг/мл (обозначено Р9 на фиг. 7(A)) или ФБ (обозначено VC на фиг. 7(A)) в течение 1 часа. Вирус (ИМЗ 20) был введен в клетки Мадин-Дарби почки собаки и инкубировался при 4°С в течение 3 часов, или вирус при ИМЗ 5 был введен в клетки Мадин-Дарби почки собаки и инкубировался при 37°С в течение 1 часа или 2 часов. Инфицированные клетки были зафиксированы, а мембрана клеток помечена красителем Alex-594. Результаты показали, что когда вирус, меченный флуоресцентным красителем, был предварительно обработан пептидом Р9, а затем инкубировался с клетками при 4°С, Р9 не смог блокировать связывание вируса с клеточной мембраной (фиг. 7(A)). Фиг. 7(A) также показывает, что предварительная обработка меченого вируса пептидом Р9 не повлияла на проникновение вируса в клетки путем эндоцитоза после инкубации при 37°С в течение 1 часа, а предварительная обработка меченого вируса пептидом Р9 не повлияла на созревание эндосом после инкубации при 37°С в течение 2 часов, в течение которых поздние эндосомы переместились к ядру. На фиг. 7(B) вирус H1N1, меченый красителем Dio, был предварительно обработан пептидом Р9 с концентрацией 50 мкг/мл в течение 1 часа, а затем клетки Мадин-Дарби почки собаки были инфицированы вирусом и инкубировались при 37°С в течение 2 часов. Затем клетки помещались в 10% (объем/объем) раствор формалина в буфере ФСБ и окрашивались кроличьим антителом против smBD4 и козьим антителом против кроличьего, меченным Alexa594. Фиг. 7(B) показывает, что Р9 был доставлен в поздние эндосомы путем связывания с вирусом и перемещен в околоядерную зону вместе с вирусом через 2 часа после инфицирования. Далее, как показано на фиг. 7(C), уровни вирусной РНК в клетках, инфицированных вирусом, предварительно обработанным Р9, снизились после инфицирования, став вдвое меньше по сравнению с необработанной контрольной пробой вируса через 3,5 часов после инфицирования. Для сравнения, вирусная РНК в необработанной культуре вируса оставалась на одном уровне в первые 2,5 часа после инфицирования, и ее количество начало повышаться через 3,5 часа после инфицирования, что говорит о том, что вирусная РНК была транспортирована через ядерные поры в ядро и инициировала новую репликацию вируса. Данные результаты показывают, что Р9 не смог блокировать возникновение связи вирус-рецептор и предотвратить проникновение вируса в клетки путем эндоцитоза. Результаты, тем не менее, показывают, что Р9 подавил выработку вирусной РНК из поздних эндосом.
Экспериментальный пример 5: Р9 может препятствовать снижению рН (окислению) в эндосомах для блокирования слияния мембраны вируса и эндосомы и распада вируса с целью выработки РНК.
С учетом богатого состава основных аминокислот в Р9, дальнейшее исследование сконцентрировалось на вопросе, способен ли Р9 подавлять слияние мембраны вируса и эндосомы путем противодействия снижению рН в поздних эндосомах. Вирус H1N1 был предварительно обработан ФБ (обозначено VC на фиг. 8(A)) или Р9 (50 мкг/мл) (обозначено Р9 на фиг. 8(A)), и вирус при ИМЗ 5 был введен в клетки Мадин-Дарби почки собаки и инкубирован при 37°С. Копии вирусной РНК в образцах клеток, собранных в указанные моменты времени после инфицирования, определялись с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени и сравнивались с показателями инфицированных клеток в присутствии 10 ммоль и 0,1 ммоль хорошо известного эндосомного ингибитора NH4Cl. Как показано на фиг. 8(A), Р9 показал сходное подавляющее воздействие на вирусную инфекцию в сравнении с инфекцией, в которую была введена оптимальная подавляющая концентрация (10 ммоль) хорошо известного поздне-эндосомного ингибитора, хлорида аммония (NH4Cl) (см. Lakadamyali, М., M.J. Rust, HP. Babcock, and X. Zhuang. 2003. Visualizing infection of individual influenza viruses. Proc Natl Acad Sci USA 100: 9280-9285 и Matlin, K.S., Reggio, H., Helenius, A. & Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol 91, 601-613 (1981)). Подавляющее воздействие P9 на вирусную РНК достигло максимального уровня через 3,5 часа после инфицирования, при этом количество копий вирусной РНК, полученных из вируса, предварительно обработанного Р9, было даже ниже, чем из вируса, обработанного 10 ммоль NH4Cl. Подавляющий эффект Р9 на вирусную РНК достиг сходного уровня с результатом обработки 10 ммоль NH4Cl через 6,5 часов после инфицирования.
Для дальнейшего подтверждения подавляющей активности пептида Р9 при эндосомальном окислении, авторы изобретения определили снижение показателя рН в эндосомах, используя краситель, чувствительный к рН. Когда клетки инфицировали необработанным вирусом (обозначено VC), красные пятна (на цветном изображении, соответствующие серым на черно-белом изображении, как показано на левом верхнем изображении) в инфицированных клетках указывали на процесс окисления в поздних эндосомах, так как краситель, чувствительный к рН, является индикатором рН, который показал бы красную флуоресценцию при снижении рН с 7 до 5. Белые стрелки на изображениях показывают расположение вирусов (зеленые пятна на цветном изображении, соответствующие серым на черно-белом изображении, как показано на левом нижнем изображении, фиг. 8(B)) и их соответствующее эндосомальное окисление (красные пятна на цветном изображении, соответствующие серым на черно-белом изображении, как показано на левом верхнем изображении фиг. 8(B)). Для сравнения, после инфицирования клеток вирусом, предварительно обработанным Р9 (обозначено Р9), красной флуоресценции на цветном изображении не наблюдалось (см. верхнее правое изображение, фиг. 8(B)), что указывает на отсутствие процесса окисления в эндосомах. Результаты ясно показали, что пептид Р9 способен предотвращать окисление в эндосомах, если он был введен в эндосомы вместе с вирусом.
Экспериментальный пример 6: Основные аминокислоты в пептиде Р9 играют ключевую роль в противовирусной активности.
Чтобы определить, играют ли основные аминокислоты в пептиде Р9 ключевую роль в подавлении снижения показателя рН в поздних эндосомах, пептиды, аналогичные Р9, были разработаны и синтезированы путем замены от 1 до 3 основных аминокислот нейтральными или кислыми аминокислотами на С-терминальном участке или добавлением 3 кислых аминокислот или 3 основных аминокислот на N-терминальном участке пептида Р9 (таблица 3). Способность данных пептидов-аналогов связываться с белком ГА вируса определялась путем ИФА (фиг. 9(A)). Результаты показали, что редукция 1 и 2 основных аминокислот (P9-S1 и P9-S2) и добавление 3 кислых аминокислот (Р9-aci-1) или 3 основных аминокислот (P9-KHR) не влияет на аффинность связывания у данных пептидов-аналогов Р9. Редукция 3 основных аминокислот (P9-S3) приводит к значительному снижению способности связываться с белком ГА вируса. Кроме того, подавляющую активность пептидов в отношении гемагглютинации белка ГА вируса измеряли путем анализа ингибирования гемагглютинации (АИГ) (фиг. 9(B)). Указанные пептиды (50 мкг/мл) последовательно разбавлялись вдвое. Разбавленные пептиды и ФСБ (компания Invitrogen, США) (негативная проба) предварительно инкубировались с вирусом H1N1 в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем в каждую лунку добавляли 50 мкл 5% (объем/объем) эритроцитов индейки. Результаты наблюдались, когда контрольная проба ФСБ проявила признаки типичной гемагглютинации, а также регистрировалась самая высокая степень разведения (АИГ-активность) пептидов, которые все еще подавляли гемагглютинацию. Результаты показали, что P9-S1 и P9-aci-1 показали активность, аналогичную активности Р9 (фиг. 9(B)) (кратность разбавления обозначена на вертикальной оси). Кроме того, противовирусное действие аналога пептида Р9 в клетках Мадин-Дарби почки собаки определялось с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. Вирус (50 БОЕ/лунка) предварительно инкубировали с указанными пептидами (50 мкг/мл) или ФБ (обозначено VC на фиг. 9(C)) в течение 1 часа при КТ, а затем ввели в клетки Мадин-Дарби почки собаки. Инфицированные клетки собирались в указанные моменты времени после введения и вирусные копии РНК определялись с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. Данные были представлены как среднее значение плюс стандартное отклонение для трех независимых экспериментов. Результаты показали, что редукция 1 или 2 основных аминокислот (P9-S1 и P9-S2) и добавление 3 кислых аминокислот (P9-aci-1) привели к снижению противовирусного действия данных аналогов пептида Р9 (фиг. 9(C)). Тем не менее, добавление 3 основных аминокислот в N-терминальной области пептида Р9 (P9-KHR) не привело к уменьшению его противовирусного эффекта. Благодаря данным результатам выяснилось, что основные обогащенные аминокислоты в пептиде Р9 действительно играют чрезвычайно важную роль в подавлении вирусной инфекции.
Примечания: Измененные аминокислоты выделены жирным шрифтом. P9-S1: одна основная аминокислота K была заменена N. P9-S2: две основные аминокислоты K и R были заменены на N и D. P9-S3: три основные аминокислоты R, K и R были заменены на Т, N и D. P9-aci-1: три кислые аминокислоты D, Е и D были добавлены в N-терминальную область пептида Р9. P9-KHR: три основные аминокислоты K, Н и R были добавлены в N-терминальную область пептида Р9.
Экспериментальный пример 7: Противовирусный эффект, достигаемый с помощью Р9, также связан с его высокой способностью связываться с гликопротеином ГА вируса.
Другой пептид, Р8, является более короткой формой пептида Р9 и содержит 20 аминокислот в С-терминальной области пептида Р9, но остальные 6 основных аминокислот - такие же, как и у пептида Р9 (таблица 1). Тем не менее, он показал значительно меньший противовирусный эффект по сравнению с пептидом Р9 (фиг. 2(A) и 9(C)). Способность пептида Р8 связываться с белком ГА вируса определялась с помощью ИФА (фиг. 9(A)) и АИГ (фиг. 9(B)). Результаты показали, что пептид Р8 имеет значительно меньшую способность связываться с ГА, чем Р9. Таким образом, противовирусное воздействие такого рода противовирусных пептидов определяется не только количеством основных аминокислот в пептидах, но и их способностью связываться с вирусами.
Экспериментальный пример 8: Пептид Р9 показал противовирусное действие широкого спектра против респираторных вирусов.
Далее авторы изобретения исследовали, способен ли пептид Р9 подавлять в клетках культуры инфекции других оболочечных респираторных вирусов, которые поступают в клетки-мишени через эндосомный путь, например другие подтипы вируса гриппа А и коронавирусы SARS-CoV и MERS-CoV. Вирусы гриппа подтипов H3N2, H5N1, H7N7 и H7N9 предварительно обрабатывали последовательно разведенным пептидом Р9 в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем вводили в клетки Мадин-Дарби почки собаки. Подавляющее воздействие пептида Р9 на инфекции этих вирусов определялось анализом бляшкообразования. Как показано на фиг. 10(A), пептид Р9 продемонстрировал сильную противовирусную эффективность против инфекций вируса гриппа А подтипов H3N2, H5N1, H7N7 и H7N9. ПК50 пептида Р9 против инфекций данных подтипов вируса гриппа А варьировались от 1,5 до 4,8 мкг/мл, что было немного выше активности против вируса гриппа H1N1 (фиг. 2(B)).
Дополнительно, подавляющий эффект пептида Р9 в отношении инфекции коронавирусов SARS-CoV и MERS-CoV определялся с помощью анализа бляшкообразования в клетках FRhK4 и Vero Е6. Примечательно, что противовирусное действие пептида Р9 в отношении коронавирусов SARS-CoV и MERS-CoV было выше при его концентрации более 25 мкг/мл и ниже при концентрации ниже 25 мкг/мл, по сравнению с его действием против вируса гриппа А (фиг. 10(B)). ПК50 пептида Р9 против коронавирусов SARS-CoV и MERS-CoV составила приблизительно 10 мкг/мл, что в 2-7 раз превышает ПК50 против вируса гриппа А. Эти результаты показывают, что пептид Р9 обладает противовирусной активностью широкого спектра действия против нескольких респираторных вирусов, которые заражают клетки-мишени через эндосомный путь.
Вывод
Хотя известно, что многие дефензины мыши и человека обладают противовирусной активностью in vitro и in vivo (см. Sun, L., et al. Human beta-defensins suppress human immunodeficiency virus infection: potential role in mucosal protection. J Virol 79, 14318-14329 (2005), Quinones-Mateu, M.E., et al. Human epithelial beta-defensins 2 and 3 inhibit HIV-1 replication. Aids 17, F39-48 (2003) и Jiang, Y., et al. Expression of mouse beta-defensin-3 in MDCK cells and its anti-influenza-virus activity. Arch Virol 154, 639-647 (2009)), в настоящем изобретении впервые раскрыто, что созданный согласно настоящему изобретению рекомбинантный мышиный β-дефензин-4 (фиг. 1) обладает сильным противовирусным воздействием в отношении инфекций широкого спектра респираторных вирусов. Тем не менее, разработка дефензинов в качестве средств для системной терапии затруднена рядом факторов, таких как неоптимальная эффективность, побочные эффекты и отсутствие рентабельных средств промышленного производства (см. Zasloff, М. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 415, 389-395 (2002)).
Для решения вышеупомянутых проблем, в настоящем изобретении было разработано и синтезировано 11 коротких пептидов, полученных из MBD4. После скрининга противовирусной эффективности данных коротких пептидов было обнаружено, что пептид Р9, который является короткой формой MBD4 и содержит 30 аминокислот в С-терминальной области MBD4 (таблица 1), продемонстрировал самую высокую противовирусную активность в отношении вируса гриппа A H1N1 в лабораторных условиях, достигнув показателя ПК50 приблизительно 1,2 мкг/мл, что ниже, чем у smBD4 и rmBD4 (фиг. 2(B)). Кроме того, было обнаружено, что пептид Р9 показал гораздо более мощный профилактический и терапевтический эффект при летальном заражении вирусом H1N1, чем rmBD4 в мышиной модели (in vivo) (фиг. 3 и 4). По сравнению с пептидами smBD4 и rmBD4, пептид Р9 также показал самую низкую цитотоксичность (фиг. 2(C) и таблица 2) и имеет лучший показатель избирательности, который приблизительно 25 раз и в 2 раза превышал показатели smBD4 и rmBD4, соответственно. Хотя ранее сообщалось, что некоторые короткие пептиды, полученные из человеческого β-дефензина-3, продемонстрировали более мощный антибактериальный эффект и меньшую токсичность к клеткам-хозяевам, чем сам β-дефензин-3 (см. Bai, Y., et al. Structure-dependent charge density as a determinant of antimicrobial activity of peptide analogues of defensin. Biochemistry 48, 7229-7239 (2009)), это первое сообщение о том, что короткие пептиды, полученные из β-дефензина, способны обеспечить лучший показатель избирательности и более мощный противовирусный эффект in vivo. Пептид SmBD4 не может рассматриваться в качестве противовирусного препарата из-за его высокой цитотоксичности. Производство (в том числе экспрессия, ферментативная обработка и очистка) рекомбинантных β-дефензинов - это длительное по времени и дорогостоящее мероприятие, что также ограничивает направление разработки β-дефензинов в качестве противовирусных препаратов. Пептиды по настоящему изобретению, напротив, не только демонстрируют самую высокую противовирусную активность и низкую цитотоксичность, но также могут быть непосредственно синтезированы с использованием химических методов и являются хорошо растворимыми в воде. Таким образом, пептиды по настоящему изобретению являются идеальными претендентами для разработки новых противовирусных препаратов.
Для понимания противовирусного механизма действия пептидов по настоящему изобретению авторы изобретения прежде всего показали, что пептид Р9 подавляет вирусную инфекцию, а не размножение или выработку вируса (фиг. 5(A), 5(D), и 5(G)). Поскольку сообщалось, что противовирусная активность β-дефензинов может осуществляться как через косвенное взаимодействие с клетками-мишенями, инфицированными вирусом, так и через прямое взаимодействие с вирусными гликопротеинами и/или оболочками (см. Klotman, М.Е. & Chang, T.L. Defensins in innate antiviral immunity. Nat Rev Immunol 6, 447-456 (2006) и Ding, J., Chou, Y.Y. & Chang, T.L. Defensins in viral infections. J Innate Immun 1, 413-420 (2009)), авторы изобретения определили, связывается пептид Р9 с вирусом или с клетками-мишенями. Результаты показали, что при подавлении вирусной инфекции пептид Р9 связывался с вирусом (фиг. 5(C), 5(F), 5(I) и 6(A)), а не с клеточной мембраной (фиг. 5(B), 5(E), 5(H) и 6(A)). Также в настоящем изобретении определено, что пептид Р9 связывался на поверхности вируса с гликопротеином ГА, а не с другим белком НА вируса (фиг. 6(B) и 6(C)). Ранее было хорошо известно, что инфицирование вирусом гриппа проходит в несколько этапов, т.е. связывание вирус-рецептор, эндоцитоз, перемещение от ранних эндосом к поздним эндосомам, где эндосомальное окисление приводит к слиянию вирусной и эндосомной мембран и последующему распаду вируса (утрате вирусом оболочки) с целью выработки вирусной РНК, чтобы привести в действие механизм репликации вируса (см. Lakadamyali, М., M.J. Rust, Н.Р. Babcock, and X. Zhuang. 2003. Visualizing infection of individual influenza viruses. Proc Natl Acad Sci USA 100: 9280-9285 и Leikina, E., H. Delanoe-Ayari, K. Melikov, M.S. Cho, A. Chen, A.J. Waring, W. Wang, Y. Xie, J.A. Loo, R.I. Lehrer, and LV. Chernomordik. 2005. Carbohydrate-binding molecules inhibit viral fusion and entry by crosslinking membrane glycoproteins. Nat Immunol 6: 995-1001). Таким образом, в настоящем изобретении дополнительно исследовалось, на каком этапе возникает подавляющий эффект, вызванный пептидом Р9. Как показывают результаты, пептид Р9 не может предотвращать возникновение связи рецептор-вирус и эндоцитоз, но препятствует распаду вируса и выработке вирусной РНК из поздних эндосом (фиг. 7).
Следующий вопрос, который следовало рассмотреть, заключается в том, почему и как пептиды по настоящему изобретению могут подавлять распад вируса и выработку вирусной РНК из поздней эндосомы. Низкий показатель рН (5,0) в поздней эндосоме является критическим для слияния мембран вируса гриппа и эндосомы. Предварительное исследование показало, что поздне-эндосомальный ингибитор NH4CI может предотвращать слияние вирусной и эндосомной мембран, препятствуя снижению показателя рН в поздних эндосомах. (см. Matlin, K.S., Reggio, Н., Helenius, А. & Simons, К. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol 91, 601-613 (1981) и Lakadamyali, M., Rust, M.J., Babcock, H.P. & Zhuang, X. Visualizing infection of individual influenza viruses. Proc Natl Acad Sci USA 100, 9280-9285 (2003)). Учитывая, что пептид P9 богат основными аминокислотами, авторы изобретения проверили, может ли Р9 также выполнять противовирусную функцию, препятствуя снижению показателя рН в поздних эндосомах и, в свою очередь, блокируя слияние вирусной и эндосомной мембран и последующее выделение вирусной РНК в клеточное ядро, чтобы привести в действие механизм репликации вируса. Результаты показали, что пептид Р9 демонстрировал такое же подавляющее воздействие, как NH4Cl, при подавлении выработки вирусной РНК и, соответственно, его подавляющее действие достигало высшего уровня через 3,5 часа после инфицирования (фиг. 8(A)). Было также показано, что пептид Р9 действительно способен препятствовать снижению показателя рН в поздних эндосомах (фиг. 8(B)). Кроме того, основные аминокислоты в пептиде Р9 незаменимы для подавления нарастающего окисления в поздних эндосомах. Когда в пептид Р9 добавили 3 дополнительных кислых аминокислоты (P9-aci-1) или заменили 1-2 основных аминокислоты (P9-S1 и P9-S2), противовирусное действие указанных пептидов, аналогичных Р9, снизилось (фиг. 9(C)), хотя их связывающая способность была такой же или даже выше, чем у пептида Р9 (фиг. 9(A)). Тем самым результаты показали, что основные аминокислоты, содержащиеся в таких противовирусных пептидах, могут играть ключевую роль в противодействии снижению показателя рН в поздних эндосомах.
Примечательно, что другим важным фактором, который может влиять на противовирусную активность таких пептидов, является способность пептида связываться с вирусом. На это указывает тот факт, что пептид Р8 показал более низкую связывающую способность (фиг. 9(A) и 9(B)) и противовирусное воздействие (фиг. 2(A) и 9(C)) чем пептид Р9, хотя он содержит такое же количество основных аминокислот, как и пептид Р9 (таблица 1). Общей особенностью большей части противомикробных пептидов является их общий позитивный заряд, который инициирует начальное взаимодействие между противомикробными пептидами и белком микробной мембраны или фосфолипидами с отрицательным зарядом (см. Jung, S., et al. Human beta-defensin 2 and beta-defensin 3 chimeric peptides reveal the structural basis of the pathogen specificity of their parent molecules. Antimicrob Agents Chemother 55, 954-960 (2011) и Jenssen, H., Hamill, P. & Hancock, R.E. Peptide antimicrobial agents. Clin Microbiol Rev 19, 491-511 (2006)). Кроме того, противомикробная активность катионных пептидов также связана с их гидрофобностью (см. Kustanovich, I., Shalev, D.E., Mikhlin, М., Gaidukov, L. & Mor, A. Structural requirements for potent versus selective cytotoxicity for antimicrobial dermaseptin S4 derivatives. J Biol Chem 277, 16941-16951 (2002) и Zelezetsky, I., Pag, U., Sahl, H.G. & Tossi, A. Tuning the biological properties of amphipathic alpha-helical antimicrobial peptides: rational use of minimal amino acid substitutions. Peptides 26, 2368-2376 (2005)) и со вторичной структурой (см. Jenssen, Н., Hamill, P. & Hancock, R.E. Peptide antimicrobial agents. Clin Microbiol Rev 19, 491-511 (2006)). Меньшая связывающая способность пептида Р8 может быть связана с удалением 10 аминокислот в N-терминальном участке, что, возможно, влияет на гидрофобность и вторичную структуру Р8 и приводит к уменьшению связывающей способности пептида.
Для бесчисленного количества патогенных вирусов, включая вирусы гриппа и коронавирусы, распад вируса и выработка вирусной РНК в клетке-хозяине с целью инициирования продуктивной репликации вируса требует слияния вирусной и эндосомной мембран (см. Smith, А.Е. & Helenius, A. How viruses enter animal cells. Science 304, 237-242 (2004) и Du, L, et al. The spike protein of SARS-CoV - a target for vaccine and therapeutic development. Nat Rev Microbiol 7, 226-236 (2009)). Слияние мембран осуществляется с помощью гликопротеинов вирусной оболочки (например, ГА вируса гриппа или S-протеина коронавируса SARS-CoV) и требует наличия кислой среды в поздних эндосомах (см. Du, L., et al. The spike protein of SARS-CoV - a target for vaccine and therapeutic development. Nat Rev Microbiol 7, 226-236 (2009) и Das, K., Aramini, J.M., Ma, L.C., Krug, R.M. & Arnold, E. Structures of influenza A proteins and insights into antiviral drug targets. Nat Struct Mol Biol 17, 530-538 (2010)). В настоящем изобретении авторы продемонстрировали, что механизм противовирусного эффекта, опосредованно обеспечиваемого пептидами по настоящему изобретению, связан с двумя ключевыми факторами. Первый фактор - это то, что пептиды могут связываться с поверхностным гликопротеином вируса, второй - то, что они могут препятствовать снижению показателя рН (окисление) в поздних эндосомах для блокирования слияния вирусной и эндосомной мембран и последующей выработки вирусной РНК. На основе данного механизма пептиды по настоящему изобретению должны подавлять инфекции также множества других патогенных вирусов. Результаты показали, что пептид Р9 действительно способен подавлять инфекции других подтипов вируса гриппа А, включая H3N2, H5N1, H7N7 и H7N9 (фиг. 10(A)) и двух коронавирусов - SARS-CoV и MERS-CoV (фиг. 10(B)). Есть основания предполагать, что пептиды по настоящему изобретению способны подавлять инфекции множества других патогенных вирусов, если они могут эффективно связывать поверхностный гликопротеин данных вирусов. Таким образом, пептиды по настоящему изобретению являются идеальными претендентами для разработки противовирусных препаратов широкого спектра действия против инфекций множества патогенных вирусов, особенно респираторных вирусов.
Подводя итог, следует отметить, что было продемонстрировано, что короткий пептид, полученный из mBD4, может иметь противовирусную активность широкого спектра действия против различных подтипов вируса гриппа А, включая H1N1, H3N2, H5N1, H7N7 и H7N9, а также двух коронавирусов - SARS-CoV и MERS-CoV. Механизм противовирусного воздействия широкого спектра пептидов по настоящему изобретению связан со следующими факторами: (1) пептиды могут эффективно связываться с вирусными гликопротеинами на поверхности вирусных частиц, и (2) пептиды имеют богатый состав основных аминокислот, благодаря чему они могут препятствовать снижению показателя рН (окисление) в поздних эндосомах для блокирования слияния вирусной и эндосомной мембран, последующего распада вируса и выработки вирусной РНК в поздних эндосомах. Вирус гриппа А и коронавирус стали причиной нескольких губительных пандемий и эпидемий за последнее столетие. Было разработано несколько противогриппозных лекарственных препаратов, но после того, как данные противовирусные лекарственные препараты были применены для клинического лечения, довольно быстро появились резистентные штаммы вируса. В частности, до настоящего времени никакие противовирусные лекарственные препараты не используются для профилактики и лечения инфекции коронавирусов SARS-CoV и MERS-CoV. В этом отношении, противовирусные пептиды, такие как Р9, могут стать новыми перспективными профилактическими и терапевтическими противовирусными средствами широкого спектра действия с низким риском развития резистентности. Более того, основываясь на механизме, который был продемонстрирован в данном изобретении, могут быть разработаны и другие противовирусные пептиды широкого спектра действия для получения новых коммерческих противовирусных средств для профилактики и лечения инфекций множества патогенных вирусов.
Специалистам в данной области понятно, что в описанные иллюстративные варианты осуществления могут быть внесены различные изменения и модификации без отклонения от духа и сути изобретения. Данные изменения и модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения.