Способ определения риска развития воспалительного заболевания кишечника по характеристике метаболитов
METHOD FOR DETERMINING THE RISK OF DEVELOPING INFLAMMATORY BOWEL DISEASE BY CHARACTERIZING METABOLITES

Настоящая заявка относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и медицины. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу определения воспалительного заболевания кишечника у индивида, а именно выявлению маркеров воспалительных заболеваний кишечника по соотношению метаболитов в образцах стула.
Воспалительные заболевания кишечника - гетерогенная группа заболеваний желудочно-кишечного тракта, в структуре которой различают болезнь Крона и язвенный колит. На сегодняшний день указанные патологии занимают одно из ведущих мест среди заболеваний органов пищеварения и остаются актуальной проблемой в области гастроэнтерологии, что обусловлено не только тяжестью течения заболеваний, но также частотой осложнений и летальностью (Burisch, J.; Munkholm, P. Inflammatory bowel disease epidemiology. Curr. Opin. Gastroenterol. 2013, 29, 357-362.). Высокий уровень вариабельности симптомов, скрытое течение и толерантность к терапии формируют сразу несколько задач: поиск новых ранних маркеров заболеваний и разработка новых вариантов терапии заболеваний, основанных на вновь открываемых механизмах патогенеза (Cosnes, J.; Gower-Rousseau, С; Seksik, P.; Cortot, A. Epidemiology and natural history of inflammatory bowel diseases. Gastroenterology 2011, 140, 1785-1794.). Два основных вида ВЗК - болезнь Крона и язвенный колит имеют различные варианты патогенеза и особенности течения заболеваний, однако на ранних стадиях трудно диагностируются, что зачастую способствует несвоевременному лечению (Baumgart, D.C.; Sandborn, W.J. Crohn's disease. Lancet 2012, 380, 1590-1605). В случае болезни Крона ошибочная диагностика провоцирует переход заболевания в тяжелую или хроническую форму (Ordas, I.; Eckmann, L.; Talamini, M.; Baumgart, D.C.; Sandborn, W.J. Ulcerative colitis. Lancet 2012, 380, 1606-1619.).
В этой связи основной проблемой, которую необходимо решать, является поиск новых вариантов ранней диагностики заболеваний. На сегодняшний день к вопросу изучения основ патогенеза ВЗК, а, соответственно, и новых принципов диагностики и терапии необходимо подходить комплексно. Значительный арсенал омиксных технологий является важнейшим этапом на пути поиска и последующей верификации наиболее информативных маркеров заболеваний (Yunki Yau, Rupert W Leong, Ming Zeng, Valerie С Wasinger Proteomics and metabolomics in inflammatory bowel disease J Gastroenterol Hepatol. 2013 Jul;28(7):1076-86.). Кроме того, необходимо разрабатывать дополнительные молекулярно-биологические тесты как на основе уже имеющихся омиксных данных, так и с применением новейших технологий. Ранняя диагностика должна при этом быть малоинвазивной или в идеале неинвазивной, для повышения охвата тестируемого населения. Известно, что инструментальные методы исследования, такие как колоноскопия, являясь "золотым стандартом" диагностики патологий ЖКТ, имеют соответствующие риски и вызывают чувство опасения у пациентов перед предстоящей процедурой. В свою очередь, данная настороженность может усугубить течение заболевания при несвоевременном обращении, что сводит к минимуму попытки выявить указанные патологии на ранней стадии.
Молекулярные методы диагностики призваны не заменить, но дополнить инструментальные способы исследования. Такие биологические образцы, как сыворотка крови, кал, моча - являются кладезем полезной прогностической информации, а все более развивающиеся методы исследования молекулярных маркеров способствуют более глубокому пониманию механизмов патогенеза заболеваний.
Однако обилие молекулярных методов исследования приводит к формированию значительного объема неинтерпретируемых результатов. Особенно при анализе таких сложных структур, как геном, протеом или метаболом биологического образца. В этой связи необходимо найти удачное вычислительное решение, которое позволит перевести найденные маркеры из терминов молекулярной биологии в термины практической медицины, а именно, сформировать удобные для итогового прочтения результаты молекулярной диагностики.
Известно, что воспалительные заболевания имеют в своей основе генетическую предрасположенность (Barrett, J.C.; Hansoul, S.; Nicolae, D.L.; Cho, J.H.; Duerr, R.H.; Rioux, J.D.; Brant, S.R.; Silverberg, M.S.; Taylor, K.D.; Barmada, M.M.; et al. Genome-wide association defines more than 30 distinct susceptibility loci for Crohn's disease. Nat. Genet. 2008, 40, 955-962.).
Описаны и достоверно подтверждены ассоциации целого ряда полиморфизмов генов и продуктов генной активности - белков-маркеров в патогенезе язвенного колита и болезни Крона (Franke, A.; McGovern, D.P.; Barrett, J.C.; Wang, K.; Radford-Smith, G.L.; Ahmad, Т.; Lees, C.W.; Balschun, Т.; Lee, J.; Roberts, R.; et al. Genome-wide meta-analysis increases to 71 the number of confirmed Crohn's disease susceptibility loci. Nat. Genet. 2010, 42, 1118-1125). Однако процессы, способствующие накоплению продуктов биохимических реакций, также связаны с патогенезом заболеваний, а некоторые типы метаболитов могут уже на ранних стадиях сигнализировать о наличии воспалительной реакции в пределах ЖКТ. Важно отметить, что развитию практически любого заболевания ЖКТ предшествует воспалительная реакция, глубина и особенности течения которой при прочей совокупности факторов могут определить тип развивающейся патологии. Но выявить именно воспалительную реакцию на уровне имеющихся биохимических, генетических или иных существующих тестов невозможно, поскольку даже сам пациент не связывает транзиторные нарушения пищеварения с развитием патологии. Поэтому тестирование должно быть в первую очередь направлено на выявление воспаления в пределах ЖКТ, тогда как последующие диагностические процедуры уже будут способствовать уточнению диагноза.
Среди прочих молекулярно-биологических направлений метаболомика является наиболее динамичной областью исследований для поиска маркеров воспаления (McIntosh, K.; Reed, D.E.; Schneider, Т.; Dang, F.; Keshteli, A.H.; de Palma, G.; Madsen, K.; Bercik, P.; Vanner, S. Fodmaps alter symptoms and the metabolome of patients with IBS: A randomised controlled trial. Gut 2016). Происходящие в ЖКТ процессы пищеварения и естественный результат функциональной активности микрофлоры в полной мере могут быть оценены путем метаболомного анализа стула пациента. При данном исследовании большое внимание уделяется оценке комплекса короткоцепочечных жирных кислот (КЖК), активно продуцируемых как микрофлорой ЖКТ, так и формирующихся в процессе пищеварения (De Preter, V.; Machiels, K.; Joossens, М.; Arijs, I.; Matthys, С.; Vermeire, S.; Rutgeerts, P.; Verbeke, K. Faecal metabolite profiling identifies medium-chain fatty acids as discriminating compounds in IBD. Gut2015, 64, 447-458). Известно, что количественное изменение некоторых КЖК связано с популяционными изменениями в составе микрофлоры вследствие развития патологии ЖКТ (Rehman, A.; Lepage, P.; Nolte, A.; Hellmig, S.; Schreiber, S.; Ott, S.J. Transcriptional activity of the dominant gut mucosal microbiota in chronic inflammatory bowel disease patients. J. Med. Microbiol. 2010, 59, 1114-1122). Однако данная оценка проводится таргетно, т.е. внимание уделяется в большей степени относительному количественному содержанию ацетата, пропионата и бутирата, тогда как спектр легколетучих соединений (ЛС) значительно более разнообразен и должен быть исследован совокупно. Новейшие инструменты для оценки летучего состава образцов стула уже активно эксплуатируются в формате научных исследований и работ. Такие методы как газожидкостная хроматография, совмещенная с масс-спектрометрией (ГХ-МС), позволяют получить исчерпывающую информацию о метаболитах в анализируемых образцах (Ahmed, R Greenwood, В Costello, N Ratcliffe, С S Probert. Investigation of faecal volatile organic metabolites as novel diagnostic biomarkers in inflammatory bowel disease. Aliment Pharmacol Ther. 2016 Mar;43(5):596-611). Однако именно для образцов стула важно избрать такой способ пробоподготовки, который не затрагивал бы существенно количественно анализируемый спектр летучих соединений. Для этих целей ГХ-МС дополняется методом парофазной экстракции, что позволяет минимизировать этапы пробоподготовки и получить более полную информацию о содержании в образце короткоцепочечных, среднецепочных и длинноцепочечных жирных кислот, кислот с фенильным радикалом, альдегидов, гетероциклов и других (Sofia El Manouni El Hassani, Ruud J Soers, Daniel J С Berkhout, Hendrik J Niemarkt, Hans Weda, Tamara Nijsen, Marc A Benninga, Nanne K H de Boer, Tim G J de Meij, Hugo H Knobel. Optimized sample preparation for fecal volatile organic compound analysis by gas chromatography-mass spectrometry. Metabolomics. 2020 Oct 10;16(10):112).
Метод парофазной экстракции с последующим анализом ЛС позволяет получить информацию о более чем 200 соединениях и произвести количественное профилирование в рамках сравнительного анализа проб стула от пациентов с ВЗК и обследуемых лиц без патологии, т.е. нормы (Zakharzhevskaya D. Kardonsky, D. Konanov, A. Silantyev, A. Troshenkova, S. Lyamina, I. Kolesnikova, E. Zhgun, E. Ilina, I. Maev, V. Govorun. HS-GC/MS-based metabolomics approach for volatile compounds analysis in IBD. N. UEG Journal Vol 9 Issue 8, Oct 2021, p.471).
Но решение задачи ранней диагностики лежит не только в области применения новейших методов исследования, но и надлежащей интерпретации получаемых данных и трансляции результатов в область практической медицины. Для этих целей необходимым является подбор адекватного математического решения, основанного на данных статистической обработки. Применение логистической регрессии или классификаторов по типу Байесовского классификатора позволяет с высокой степенью достоверности сформировать математическое правило, позволяющее оценивать конкретные параметры метаболомного анализа и переводить их в формат числового значения риска развития патологии в пределах ЖКТ. Сформированные значения рисков позволят выявить группы лиц, для которых необходимо проведение подтверждающих диагностических процедур.
Таким образом, в целях повышения эффективности выявления воспалительных заболеваний на ранней стадии необходимо выявить наборы метаболитов, комбинации которых достоверно характеризуют указанную патологию. Для оценки потенциала данного способа необходимо рассмотреть имеющиеся в данной области заявки по выявлению маркеров воспаления в образцах стула и предлагаемые схемы интерпретации получаемых данных.
Международная заявка WO/2021/113989 описывает способ диагностики болезни Крона и язвенного колита на основании определения метаболитов в образцах мочи, таких как серии, гипоксантин, кинуренин, треонин, диметилглицин, триптофан, индоксилсульфат, фенилацетилглутамин, сиаловая кислота, 5-гидрокси-6-индолил -о-сульфат, 5-(Δ-карбоксибутил)гомоцистеин и/или анион, имеющий m/z:RMT:полярность 345,1553:0,770:n, также предлагается определение таких метаболитов в образцах стула, как кетодезоксихолевая кислота, холевая кислота, холин, триптофан, триметиллизин, серин, масляная кислота, молочная кислота, гипоксантин и/или гуанин.
Международная заявка US 2018/0203018 описывает способ идентификации фенотипа болезни Крона у обследуемых, в основе которого лежит определение методом масс-спектрометрии трех и более идентифицированных метаболитов в разбавленном образце фекалий. Идентифицированные метаболиты выбирают из общего пула 21 метаболитов, сопоставляя полученные данные со средними уровнями метаболитов у здоровых субъектов. В качестве метаболитов интереса заявлены гликохолат, таурохолат и хенодезоксигликохолат. Гликохолат в указанном контексте используется в качестве маркера, определяющего БК, а повышенные уровни таурохолата или хенодезоксигликохолата позволяют предположить поражение подвздошной кишки. Также для дифференцировки фенотипа болезни Крона предложено использование (Z)/4/гидроксифенил-ацетальдоксима - для поражения толстой кишки, а арахидоновая кислота или октадекатриеновая кислота - для идентификации поражения подвздошной кишки.
Международная заявка US 8679457 описывает способ диагностики ВЗК, в том числе болезни Крона и язвенного колита, на основании применения различных биомаркеров воспалительных заболеваний кишечника. Предлагается способ дифференциальной диагностики болезни Крона и язвенного колита по анализу биологического образца обследуемого для определения уровня (уровней) одного или нескольких биомаркеров воспалительного заболевания кишечника, включающих 6-бета-ОН-литохолат, 7-альфа-гидрокси-3-оксо-4-холестеноат (7-НОСА), дезоксихолевую кислоту, гликодезоксихолевую кислоту и гиодезоксихолевую кислоту; а также сравнение уровня (уровней) одного или нескольких биомаркеров в образце с референсными уровнями, установленными для болезни Крона, язвенного колита.
Международная заявка WO 2012/127213 описывает способ выявления или мониторинга синдрома раздраженного кишечника (СРК) или воспалительного заболевания кишечника на основании обнаружения одного или нескольких летучих органических соединений (ЛОС) в образце, взятом у субъекта. В качестве биологического материала заявлены фекалии или моча. Согласно представленным данным, ЛОС могут представлять собой один или несколько этиловых эфиров пропановой или бутановой кислот, пропановой кислоты, бутановой кислоты, метилового эфира бутановой кислоты, метилового эфира пропановой кислоты, 3-метилбутановой кислоты, 1-бутанола, 1-пропанола, индола, 2-метилпропановая кислота, 1-пентанол, гидроксимочевина, метилциклобутан, (R)-(-)-2-амино-1-пропанол, 2-гидроксипропанамид, гидразид уксусной кислоты, 2-пентанон, пиррол, 1-бутокси-2-пропанол, 2-бутанон, диметилдисульфид, 2-метил-1,3-диоксолан и диоксид серы.
Рассмотренные международные заявки предлагают способы анализа метаболитов для верификации и дифференциальной диагностики таких заболеваний, как болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК). Предлагаемые технические решения позволяют выявить широкий спектр отличий анализируемых маркеров при сравнении патологии и нормы. При всем разнообразии выявляемых достоверно маркеров у предложенных способов есть недостатки, которые могут преодолены в описываемом в данной заявке способе.
Во-первых, работа с образцом стула сопряжена с необходимостью использования различных способов пробоподготовки, а также анализа с применением твердофазной экстракции. Большинство описанных способов исследования метаболома стула содержат многоступенчатые протоколы пробоподготовки. Высушивание и расчет итоговых концентраций на количество исходного материала также не является универсальным методическим решением, а результат в свою очередь полностью зависит от выбранного метода анализа и технических параметров используемого оборудования. Парофазный способ экстракции полностью решает вопрос о методике пробоподготовки, сводя к минимуму число необходимых подготовительных этапов, кроме того, позволяет в полной мере проанализировать весь спектр летучих компонентов, без существенного влияния на исходные концентрационные соотношения компонентов метаболома в образце стула.
Во-вторых, получая полный спектр летучих соединений, важнейшим этапом становится интерпретация полученных данных. В описанных способах анализа метаболома стула для диагностики ВЗК в качестве оценочной метрики приводят значения относительных концентраций компонентов метаболома, что в значительной степени является вариативным параметром и во многом определяется методическим подходом, используемым для анализа и идентификации метаболитов. Трансляция результатов описанных способов в область их практического применения, а именно, использования данных клиническими специалистами для диагностики ВЗК, является полностью невозможным. Получаемые данные хорошо интерпретируются профильными специалистами в области масс-спектрометрии и биоинформатики, тогда как должны легко быть интерпретируемы в первую очередь практикующими врачами. Описываемый в предлагаемой заявке способ решает проблему интерпретации, позволяя обработать в минимальном формате получаемые данные и благодаря представленному расчетному решению перевести значения относительных концентрации или интенсивностей анализируемых метаболитов в количественную метрику риска развития патологии.
Описание изобретения
Авторами изобретения был разработан способ выявления воспалительных заболеваний кишечника на основании данных количественного соотношения интенсивностей следующих метаболитов: n-Hexadecanoic acid, Hexanoic acid, Indole. Измерение метаболитов необходимо проводить в образце стула методом ГХ-МС с парофазным способом экстракции. Полученные значения интенсивностей, нормированные на суммарный ионный ток, должны быть соотнесены в формулу, подготовленную для определения коэффициента риска развития воспалительного заболевания кишечника. Рассчитанные коэффициенты сравнивают с пограничными значениями, полученными из соотношения коэффициентов логистической регрессии, обученной разделять группы по значению предиктора для группы с воспалительными заболеваниями кишечника и группы контроля. Вывод о степени риска развития ВЗК делается исходя из значения рассчитанного коэффициента.
Краткое описание изобретения
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу выявления воспалительных заболеваний кишечника на основании данных количественного соотношения интенсивностей метаболитов, нормированных на суммарный ионный ток в образце стула, который включает:
а) выделение метаболитов из образца стула,
б) поиск и идентификацию следующих метаболитов: n-Hexadecanoic acid, Hexanoic acid, Indole стула методом ГХ-МС с парофазным способом экстракции,
в) расчет относительных интенсивностей следующих метаболитов: n-Hexadecanoic acid, Hexanoic acid, Indole, нормированных на общий ионный ток,
г) расчет коэффициента риска развития ВЗК согласно формуле:
[I] - интенсивность ионного тока анализируемого метаболита, нормированная на общий ионный ток;
Kr - коэффициент риска развития ВЗК (безразмерная величина), и
если значение Kr менее 50, определяют отсутствие риска развития воспалительного заболе вания кишечника,
значение Kr от 50 до 100 является «серой зоной», пограничным результатом, если значение Kr равно или более 100, определяют высокий риск развития воспалительного заболевания кишечника.
Краткое описание чертежей
Фигура 1 показывает распределение коэффициента риска развития воспаления ЖКТ в группах с воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК) и в группе контроля (Норма).
Определения и общие методы
Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области.
Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемые названия метаболитов, описанный метод газожидкостной хроматографии, совмещенной с масс-спектрометрией, методы парофазной экстракции метаболитов, расчет коэффициентов риска развития воспалительного заболевания ЖКТ хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Описанные методы экстракции метаболитов проводятся согласно стандартному протоколу выделения метаболитов.
Техническим результатом данного способа неинвазивной диагностики воспалительных заболеваний кишечника по характеристике метаболитов является снижение числа этапов пробоподготовки благодаря применению новейшего метода исследования метаболитов посредством парофазной экстракции с последующим ГХ-МС анализом с минимальным числом. Снижение числа возможных техническим проблем на указанных этапах пробоподготовки минимизирует риск получения неинтерпретабельного результата. Уровень предлагаемого методического решения позволяет допустить до используемого оборудования в том числе клинических специалистов при минимальной технической подготовке кадров.
Подробное описание изобретения
Выделение метаболитов проводят методом парофазной экстракции. Под ГХ-МС анализом мы понимаем прицельное исследование группы отобранных метаболитов методом газожидкостной хроматографии, совмещенной с масс-спектрометрией с последующим анализом относительного количественного содержания следующих метаболитов: n-Hexadecanoic acid, Hexanoic acid, Indole. Под относительным количественным содержанием мы понимаем сравнение интенсивностей исследуемых метаболитов, нормированных на общий ионный ток.
В исследование, которое легло в основу данного патента, были включены 100 индивидов. Анализируемая выборка включала группу индивидов с установленным диагнозом болезнь Крона (n=15), группу индивидов с установленным диагнозом язвенный колит (n=35), а также здоровый контроль (n=50).
У всех испытуемых были собраны образцы стула для последующего исследования ЛС методом газожидкостной хроматографии, совмещенной с масс-спектрометрией.
200 мкг образца стула помещали во флаконы с завинчивающейся крышкой в парофазный экстрактор Shimadzu HS-20. Для увеличения ионной силы раствора добавляли 2 г смеси солей (сульфат аммония и дигидрофосфат калия в соотношении 4:1). Применяли следующие настройки: температура печи 80°С, температура линии пробы 220°С, температура линии передачи 220°С, время уравновешивания 15 мин, время повышения давления 2 мин, время загрузки 0,5 мин, время впрыска 1 мин, время промывки иглы 7 мин.
Флаконы запечатывали и анализировали на ГХ/МС Shimadzu QP2010 Ultra с парофазным экстрактором Shimadzu HS-20, колонкой VF-WAXMS длиной 30 м, диаметром 0,25 мм и толщиной фазы 0,25 мкм. Начальная температура колонки 80°С, скорость нагрева 20°С/мин до 240°С, экспозиция 20 мин. Газ-носитель - гелий 99,9999, режим ввода - без деления потока - безраздельный, расход 1 мл/мин. Температура источника ионов - 230С.Использовался режим мониторинга общего ионного тока. Для анализа полученных масс-спектров использовалась библиотека масс-спектров NIST 2014.
В результате анализа в исследуемых группах были получены значения интенсивностей пиков следующих метаболитов: n-Hexadecanoic acid, Hexanoic acid, Indole. В дальнейшем полученные значения интенсивностей были нормированы на общий ионный ток. Для выделения наиболее значимых метаболитов использовался тест Манна-Уитни. Дополнительно, для определения размера эффекта и направления изменения использовался размер эффекта по Коэну. Соединения с абсолютным размером эффекта более 0.8 были приняты в формулу с положительным значением как числители, а с отрицательным значением, как знаменатели. Для групп (Болезнь Крона+ЯК) методами статистики были выявлена формулы для расчета коэффициента риска развития воспалительного заболевания кишечника. На основании данных была произведена оценки принадлежности анализируемых пациентов к группам контроля и ВЗК:
[I] - интенсивность ионного тока, нормированная на общий ионный ток
Kr - коэффициент риска развития ВЗК (безразмерная величина).
Границы значений коэффициента риска развития ВЗК формируются из соотношения коэффициентов логистической регрессии, обученной разделять группы по значению предиктора. Значение коэффициента риска развития ВЗК I менее 50 свидетельствует об отсутствии риска развития воспалительного заболевания кишечника, Значение коэффициента риска развития ВЗК I от 50 до 100 является «серой зоной», пограничным результатом. Значение коэффициента риска развития ВЗК I, равное или более 100, свидетельствует о риске развития воспалительного заболевания кишечника.
Таким образом, согласно полученным результатам возможно оценить принадлежность тестируемого пациента к группе контроля или к группе пациентов с высоким риском развития ВЗК. Получение значения индекса риска развития ВЗК в "серой зоне" будет свидетельствовать в пользу необходимости проведения дополнительного тестирования.
Примеры
Для наилучшего понимания изобретения приводятся следующие примеры. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие сферу применения изобретения в любой форме.
Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в этой спецификации включены в данный документ путем отсылки. Хотя вышеупомянутое изобретение было довольно подробно описано путем иллюстрации и примера в целях исключения двусмысленного толкования, специалистам в данной области на основе идей, раскрытых в данном изобретении, будет вполне понятно, что могут быть внесены определенные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема предлагаемых вариантов осуществления изобретения.
Пример 1
Испытуемый, имеющий в анамнезе воспалительное заболевание кишечника у родственника, а также симптомы, характерные для данной группы заболеваний, обращается в медицинский центр для неинвазивной диагностики и расчета риска развития ВЗК. Производится забор образца стула. Полученный образец замораживается при -20°С и доставляется в лабораторию для исследования.
200 мкг образца стула помещают во флаконы с завинчивающейся крышкой в парофазный экстрактор Shimadzu HS-20. Для увеличения ионной силы раствора добавляют 2 г смеси солей (сульфат аммония и дигидрофосфат калия в соотношении 4:1). Применяют следующие настройки: температура печи 80°С, температура линии пробы 220°С, температура линии передачи 220°С, время уравновешивания 15 мин, время повышения давления 2 мин, время загрузки 0,5 мин, время впрыска 1 мин, время промывки иглы 7 мин.
Флаконы запечатывают и анализируют на ГХ/МС Shimadzu QP2010 Ultra с парофазным экстрактором Shimadzu HS-20, колонкой VF-WAXMS длиной 30 м, диаметром 0,25 мм и толщиной фазы 0,25 мкм. Начальная температура колонки 80°С, скорость нагрева 20°С/мин до 240°С, экспозиция 20 мин. Газ-носитель - гелий 99,9999, режим ввода - без деления потока, - безраздельный, расход 1 мл/мин. Температура источника ионов - 230С. В ходе анализа используется режим мониторинга общего ионного тока. Для анализа полученных масс-спектров используют библиотеку масс-спектров NIST 2014.
В результате анализа в исследуемом образце получены следующие значения интенсивностей пиков следующих метаболитов: n-Hexadecanoic acid (I=11235059), Hexanoic acid (I=1038047), Indole (I=2342458). В дальнейшем полученные значения интенсивностей были нормированы на общий ионный ток, в результате чего были получены следующие значения относительных интенсивностей анализируемых метаболитов: n-Hexadecanoic acid (I=0,87), Hexanoic acid (I=0,038), Indole (I=0,17). Ha основании полученных данных была произведена оценки риска развития ВЗК у данного пациента:
[I] - относительная интенсивность ионного тока
Kr - коэффициент риска развития ВЗК (безразмерная величина),
Границы значений коэффициента риска развития ВЗК формируются из соотношения коэффициентов логистической регрессии, обученной разделять группы по значению предиктора. Значение коэффициента риска развития ВЗК I менее 50 свидетельствует об отсутствии риска развития воспалительного заболевания кишечника, Значение коэффициента риска развития ВЗК I от 50 до 100 является «серой зоной», пограничным результатом. Значение коэффициента риска развития ВЗК I, равное или более 100, свидетельствует о риске развития воспалительного заболевания кишечника.
Для пациента значение Кг оказалось равным 145, что, согласно правилам интерпретации получаемых результатов, свидетельствует о высоком риске развития ВЗК у обследуемого пациента. После получения данного результата для пациента рекомендованы дополнительные инструментальные обследования для уточнения диагноза.
Пример 2
Испытуемый без симптомов желает пройти неинвазивное тестирование с целью выявления риска скрытого течения ВЗК. У испытуемого производится забор образца стула. Полученный образец замораживается при -20°С и доставляется в лабораторию для исследования.
200 мкг образца стула помещают во флаконы с завинчивающейся крышкой в парофазный экстрактор Shimadzu HS-20. Для увеличения ионной силы раствора добавляют 2 г смеси солей (сульфат аммония и дигидрофосфат калия в соотношении 4:1). Применяют следующие настройки: температура печи 80°С, температура линии пробы 220°С, температура линии передачи 220°С, время уравновешивания 15 мин, время повышения давления 2 мин, время загрузки 0,5 мин, время впрыска 1 мин, время промывки иглы 7 мин.
Флаконы запечатывают и анализируют на ГХ/МС Shimadzu QP2010 Ultra с парофазным экстрактором Shimadzu HS-20, колонкой VF-WAXMS длиной 30 м, диаметром 0,25 мм и толщиной фазы 0,25 мкм. Начальная температура колонки 80°С, скорость нагрева 20°С/мин до 240°С, экспозиция 20 мин. Газ-носитель - гелий 99,9999, режим ввода - без деления потока, - безраздельный, расход 1 мл/мин. Температура источника ионов - 230°С. В ходе анализа используется режим мониторинга общего ионного тока. Для анализа полученных масс-спектров используют библиотеку масс-спектров NIST 2014.
В результате анализа в исследуемом образце получены следующие значения интенсивностей пиков следующих метаболитов: n-Hexadecanoic acid (I=12235059), Hexanoic acid (I=1057032), Indole (I=5786324). В дальнейшем полученные значения интенсивностей были нормированы на общий ионный ток, в результате чего были получены следующие значения относительных интенсивностей анализируемых метаболитов: n-Hexadecanoic acid (I=0,54), Hexanoic acid (I=0,057), Indole (I=0,14). Ha основании полученных данных была произведена оценки риска развития ВЗК у данного пациента:
[I] - относительная интенсивность ионного тока
Kr - коэффициент риска развития ВЗК (безразмерная величина),
Границы значений коэффициента риска развития ВЗК формируются из соотношения коэффициентов логистической регрессии, обученной разделять группы по значению предиктора. Значение коэффициента риска развития ВЗК I менее 50 свидетельствует об отсутствии риска развития воспалительного заболевания кишечника, Значение коэффициента риска развития ВЗК I от 50 до 100 является «серой зоной», пограничным результатом. Значение коэффициента риска развития ВЗК I, равное или более 100, свидетельствует о риске развития воспалительного заболевания кишечника.
Для пациента значение Kr оказалось равным 67,5, что, согласно правилам интерпретации получаемых результатов, свидетельствует о пограничном значении риска развития ВЗК у обследуемого пациента. После получения данного результата для пациента могут быть рекомендованы дополнительные обследования для уточнения диагноза при наличии соответствующих симптомов или наблюдение пациента в случае отсутствия таковых.
Таким образом, полученное вычислительное решение позволяет сформировать конечный результат метаболомного анализа образца стула и является уникальным способом трансляции специальных научно-исследовательских данных в область практической медицины. Рассчитанные коэффициенты риска развития ВЗК позволяют мгновенно принимать решения о тактике дальнейшего ведения пациента. Так, в частности, при значении коэффициента риска развития ВЗК I менее 50 и при отсутствии специфических жалоб, совокупно врач может принять решение о прекращении наблюдения за данным пациентом, сводя риск развития ВЗК в конкретном случае к минимуму. При значении коэффициента риска развития ВЗК I от 50 до 100, при отсутствии симптомов ВЗК, врач может как назначить дополнительную диагностику для уточнения возможных причин повышения активности воспалительных маркеров (изменения относительного содержания метаболитов, ассоциированных с риском развития ВЗК), так и наблюдать пациента до появления ассоциированных симптомов без проведения инструментальной диагностики. Рекомендация по дополнительной диагностики при значении коэффициента риска развития ВЗК I от 50 до 100 "серой зоны" приводится для возможности выявления скрытых, бессимптомных патологий ЖКТ. При значении коэффициента риска развития ВЗК I более 100, врач в обязательном порядке назначает дополнительное исследование.