Особенности реагирования рекомбинантных люминесцирующих бактерий с различными lux-оперонами в фагоцитарной системе

Дерябин Д.Г., Каримов И.Ф.

Оренбургский государственный университет

ОСОБЕННОСТИ РЕАГИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ЛЮМИНЕСЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ С РАЗЛИЧНЫМИ LUX-ОПЕРОНАМИ В ФАГОЦИТАРНОЙ СИСТЕМЕ

Установлена зависимость биолюминесцентного отклика различных рекомбинантных штаммов Escherichia coli в фагоцитарной системе от природы клонированных в них /их-оперонов. Показано, что использование конструкций на основе генетического материала морской люминес-цирующей бактерии Photobacterium leiognathi при взаимодействии с нейтрофилами периферической крови человека позволяет достичь прямой пропорциональности между интенсивностью свечения и выраженностью развивающегося в этих условиях киллингового эффекта.

Реализация бактерицидного потенциала фагоцитов с развитием киллингового эффекта в отношении микробных клеток-мишеней является одним из завершающих, но наиболее важных этапов фагоцитоза [1], для оценки эффективности которого предложен достаточно большой спектр лабораторных технологий, представленных микроскопическим, микробиологическим, радиоизотоп-ным, цитофлюориметрическим и др. методами [2, 3]. Среди них одним из наиболее экспрессных, в том числе позволяющих проводить оценку результатов исследования в режиме реального времени, является разрабатываемый в настоящее время биолюминес-центный метод оценки фагоцитоза [4], основанный на использовании в качестве фагоцитируемых объектов рекомбинантных микроорганизмов вида Escherichia coli с клонированными в них генами (lwx-оперонами) природных люминесцирующих бактерий. При этом уровень свечения, количественно оцениваемый с использованием специальных приборов - биолюминометров, выступает в качестве результативного параметра, по изменению уровня которого рассчитываются относительные показатели киллингового эффекта. В этой связи важнейшим требованием к используемым объектам фагоцитоза становится существование прямой пропорциональности между показателями жизнеспособности микроорганизмов и уровнем их биолюминесценции. Сказанное определяет необходимость учета природы используемого генетического материала, так как рекомбинантные микроорганизмы, созданные на основе одного и того же реципиентного штамма E. coli, но содержащие lwx-опероны

различных люминесцирующих бактерий, в ответ на воздействие некоторых биологических факторов могут демонстрировать неидентичный, а иногда и противоположный характер изменения уровня свечения [5].

В этой связи целью настоящей работы явилось изучение биолюминесцентного отклика ряда рекомбинантных штаммов E. coli с клонированными lux-оперонами морских (Photobacterium leiognathi) и почвенных (Photorhabdus luminescence) микроорганизмов при контакте с фагоцитами, а также анализ соответствий между изменением интенсивности свечения и выраженностью формируемого в этих условиях киллингового эффекта.

При проведении исследований использовались рекомбинантный штамм E. coli K12 TG1 с клонированными luxCDABE генами P. leiognathi 54D10, выпускаемый МГУ им. М.В. Ломоносова под названием «Эко-люм-9» [6]; тот же реципиент, но несущий lux-оперон P. luminescence Zm1 и известный как «Эколюм-8», а также разработанный в Институте биофизики СО РАН рекомбинантный штамм E. coli Z905 (hsdR+ hsdM+ gal-met- recA tetr) с многокопийной плазмидой pPHL7, созданной на основе вектораpUC18 и lux-оперона P. leiognathi [7]. Названные микроорганизмы восстанавливали из лиофили-зированного состояния добавлением холодной дистиллированной воды и выдерживали в течение 30 минут при 4о С для реактивации биолюминесценции. Непосредственно перед проведением исследований названные микроорганизмы опсонизировали в условиях, исключающих развитие бактерицидного эффекта и оказывающих минимальное воздействие на базовый уровень их биолюми-

несценции [8]. Для этого бактериальную суспензию смешивали в равных объемах с коммерческим препаратом нормального иммуноглобулина человека так, чтобы его конечная концентрация составляла 6-10 мг/мл, а конечная концентрация бактерий равнялась 5х108/мл. Полученную смесь выдерживали при 37о С в течение 10 мин.

Для получения фагоцитов цельную кровь в количестве 2-4 мл забирали из локтевой вены в пластиковую пробирку, содержащую гепарин (50 Ед/мл), после чего выдерживали в течение 2 часов при 4о С для разделения эритроцитов (нижняя фаза) и обогащенной лейкоцитами плазмы (верхняя фаза). Содержимое верхней фазы наслаивали на двойной градиент фиколл-верографи-на с плотностями 1,077 г/мл и 1,092 г/мл, после чего центрифугировали в течение 45 мин. при 1500 об/мин [9]. Нейтрофилы собирали с нижней интерфазы, отмывали холодным физиологическим раствором и ресуспендирова-ли в среде 199 до концентрации 5х106/мл.

Фагоцитарную систему формировали путем смешивания 0,1 мл опсонизированных люминесцирующих бактерий и 0,9 мл суспензии фагоцитов, так что достигаемое соотношение «бактерии:фагоциты» составляло 10:1. Полученную смесь инкубировали в течение 60 минут при 37о С в термостатируе-мой измерительной ячейке двухканального биохемилюминометра [10,11], выпущенного СКТБ «Наука» (Красноярск) под названием «8802М2К». Интенсивность свечения в пробе осуществляли в непрерывном режиме, после чего итоговый расчет показателей активности фагоцитоза проводили по формуле:

ХимпК -ХимпО 1ПП0. _

--------------х100%, где ХимпК - сумма

ЪимпК

импульсов, испускаемых в контроле (без фагоцитов), ХимпО - сумма импульсов, испускаемых фагоцитарной системой в опыте.

Одновременно проводили изучение кил-лингового эффекта фагоцитов в отношении используемых бактериальных клеток-мишеней с использованием микробиологического метода [2, 3], для чего на 0, 10, 30 и 60 мин. из фагоцитарной системы отбирали пробы по 10 мкл, которые смешивали с 10 мкл 0,2% сапонина. После лизиса фагоцитов осуще-

ствляли высев жизнеспособных бактерий на BCP-агар (Bio-Merieux, Франция) с добавлением ампициллина в концентрации 100 мкг/мл (селективный маркер для всех использованных рекомбинантных штаммов E. coli). Учет количества колониеобразующих единиц (КОЕ) проводили после дополнительной 18-24 часовой инкубации при 37о С.

Параллельно методом хемилюминесцен-тного анализа [12] оценивалась степень активации (респираторного взрыва) фагоцитов с использованием люминола (Sigma, США). В последнем случае объектом исследования являлись полученные авторами настоящей статьи нелюминесцирующие варианты E. coli (lux-).

При проведении исследований с использованием рекомбинантного штамма E. coli «Эколюм-9» с клонированными luxCDABE генами P leiognathi (рисунок 1 а) было установлено, что непосредственно после введения в фагоцитарную систему они демонстрировали развивающуюся к 45-75 секунде кратковременную стимуляцию уровня свечения до уровня 129,9±8,5% от исходного. При этом природа данного явления может объясняться возрастанием в составе бактериальных клеток-мишеней продуктов перекисно-го окисления липидов, возникающих как результат начинающегося в это же время «окислительного взрыва» фагоцитов и представляющих собой потенциальные субстраты для бактериальной люциферазы [13]. Дальнейшие же события заключались в прогрессирующем снижении уровня биолюминесценции до уровня 47,1±6,5% от исходного, что происходило на фоне пропорционального снижения количества жизнеспособных микроорганизмов при высеве на плотные питательные среды (коэффициент корреляции г = 0,96; t = 7,11; P < 0,001). Таким образом, развивающееся в динамике эксперимента поглощение и внутриклеточный киллинг использованных рекомбинантных микроорганизмов своим следствием имели дезорганизацию клонированных в них систем генерации свечения с соответствующим изменением (снижением) измеряемого результативного параметра.

С другой стороны, генно-инженерная конструкция на основе того же реципиент-

ного штамма E. coli, но с клонированными luxCDABE генами P luminescence (Эколюм-8) в тех же условиях демонстрировала развивающуюся во времени стимуляцию уровня свечения, выходящего на «плато» к 180-200 секунде и достигающего 268,1±18,0% от его исходного уровня (рисунок 1б). Однако параллельная оценка киллингового эффекта, проводимая с использованием бактериологического метода, свидетельствовала о происходящем снижении количества жизнеспособных (колониеобразующих) клеток-мишеней, по своей выраженности достоверно не отличающемся от такового при использовании «Эколюм-9». При этом отражением противоположного характера изменения величин биолюминесценции и киллинга стали отрицательные значения связывающего их коэффициента корреляции (г = -0,92; t = 6,99; P < 0,001).

Обсуждая полученные парадоксальные результаты, следует указать, что отсутствие гашения биолюминесценции E. coli с клонированными luxCDABE генами P. luminescence при гибели самой бактериальной клетки отмечалось нами и ранее, в частности при развитии бактерицидного эффекта в присутствии сыворотки крови [5]. При этом возможной причиной подобной ситуации является отличная от прочих люминесцирую-щих микроорганизмов чрезвычайно высокая прочность нековалентных связей между ферментами, обеспечивающими свечение P. luminescence, разрушающихся только после жесткой обработки 5М мочевиной [14]. Условием же для возникновения подобных аномально стабильных мультиферментных систем могут являться экологические особенности P. luminescence, на определенном этапе своей циркуляции в симбиотически-пара-зитарной системе «бактерия - нематода - насекомое» призванных обеспечивать свечение тела личинки насекомого, что предполагает тесную степень контакта с его гуморальными и клеточными механизмами противоин-фекционной резистентности [15]. Соответственно даже при освобождении ферментных систем из тела бактериальной клетки при ее гибели, но с сохранением их структурно-функциональной целостности и в условиях возобновляемого притока продуктов перекис-

ного окисления липидов, определяемого активностью кислородзависимых систем фагоцитов, интенсивность биолюминесценции может сохраняться и даже нарастать.

При проведении исследований с использованием в качестве объекта для фагоцитоза третьего из изученных рекомбинантных штаммов E. coli Z905, созданного на основе иного реципиента, но вновь несущего генетическую конструкцию с lux-опероном морского люминесцирующего микроорганизма вида P. leiognathi, сделанное предположение о зависимости биолюминесцентного отклика в фагоцитарной системе от природы клонированной ферментной системы генерации свечения получило свое подтверждение. Так в первые 50-65 секунд после введения в фагоцитарную систему данный рекомбинантный штамм демонстрировал рост интенсивности свечения, в данном случае несколько превышающий уровень аналогичной реакции у «Эколюм-9» и достигающий 161,9±1,2% от исходного. Дальнейшие же события, происходящие на фоне регистрируемого бактериологическим методом падения количества жизнеспособных бактериальных клеток, вновь заключались в синхронном снижении интенсивности биолюминесценции до 46,5±4,8% от исходного (коэффициент корреляции между названными параметрами г = 0,93; t = 7,03; P < 0,001).

Таким образом, полученные результаты демонстрируют существование зависимости биолюминесцентного отклика рекомбинантных штаммов Escherichia coli при их введении в фагоцитарную систему от природы клонированных lux-оперонов. При этом, несмотря на априорную предпочтительность использования в составе таких генно-инженерных конструкций luxCDABE генов почвенного люминесцирующего микроорганизма P. luminescence, кодирующих ферментную систему с температурным оптимумом 35-37о С, для заявленных целей более предпочтительным оказывается использование генетического материала морской люминес-цирующей бактерии Photobacterium leiognathi, что позволяет достичь прямой зависимости результативного параметра (интенсивности свечения) от выраженности развивающегося в этих условиях киллингового эффекта.

Время

Рисунок 1. Кинетика хемилюминесценции нейтрофилов периферической крови человека (1) и биолюминесценции рекомбинантных штаммов E. coli (2) с клонированными lux-оперонами P. leiognathi 54D10 (а); P. luminescence Zm1 (б) и P. leiognathi (в) при их взаимодействии в фагоцитарной системе.

Сказанное также свидетельствует в пользу необходимости использования в технологии биолюминесцентного метода оценки фагоцитоза не абстрактных генно-инженерных

микроорганизмов, в наиболее общем виде обозначаемых как /их+ [3], но, напротив, рекомбинантных штаммов с жестко контролируемыми по происхождению /их-оперонами.

Список использованной литературы:

1. Ярилин А.А. Основы иммунологии. - М.: Медицина, 2000. - 608 с.

2. Рудик Д.В., Тихомирова Е.Н. Методы изучения процесса фагоцитоза и функционально-метаболитического состояния фагоцитирующих клеток. - Саратов: СГУ, 2006. - 112 с.

3. Хаитов Р.М., Пенегин Б.В. Современные подходы к оценке основных этапов фагоцитарного процесса // Иммунология. - 1995. - №3. - С. 3-8.

4. Ширшев С.В., Куклина Е.М., Заморина С.А., Никитина Н.М., Некрасова И.В. Способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови человека по степени гашения биолюминесценции // Патент РФ на изобретение №2292553, опубл. 27.01.2007, Бюлл. №3.

5. Дерябин Д.Г., Поляков Е.Г. Влияние сыворотки крови человека на уровень свечения природных и рекомбинантных люминесцирующих бактерий // Бюлл. экспер. биол. мед. - 2004. - №9. - С. 311-315.

6. Данилов В.С., Зарубина А.П., Ерошников Г.Е. и др. Сенсорные биолюминесцентные системы на основе lux-оперонов разных видов люминесцентных бактерий // Вестник МГУ. Сер.16. Биология. - 2002. - №3. - С. 20-24.

7. Илларионов Б.А., Протопопова М.В. Клонирование и экспрессия генов люминесцентной системы Photobacterium leiognathi в плазмидном векторе pUC18 // Генетика. - 1985. - №6. - С. 10-13.

8. Дерябин Д.Г., Грудинин Д.А., Каримов И.Ф. Обоснование оптимального режима опсонизации рекомбинантных люминесцирующих бактерий // Вестник ОГУ. - 2006. - №12. - С. 6-10.

9. Хейфец Л.Б., Абалакина В.А. Разделение форменных элементов крови человека в градиенте плотности фиколл-ве-рографин // Лаб. дело. - 1973. - №10. - С. 579-581.

10. Дерябин Д.Г., Никиян А.Н., Каримов И.Ф., Грудинин Д.А. Кюветное определение для биохемилюминометра // Патент РФ на полезную модель №64373 опубл. 27.06.2007, Бюлл. №18.

11. Дерябин Д.Г., Никиян А.Н., Каримов И.Ф., Грудинин Д. А. Устройство для измерения хемилюминесценции и биолюминесценции // Патент РФ на полезную модель №49998, опубл. 10.12.2005, Бюлл. №34.

12. Albrecht D., Jungi T.W. Luminol-enhanced chemiluminescence induced in peripheral blood-derived human phagocytes: obligatory requirement of myeloperoxidase exocytosis by monocytes // J.Leucocyte Biol. - 1993. - V.54. - N4. - P. 300-306.

13. Исмаилов А.Д., Берия Л.В., Данилов В.С. Ферментативный и неферментативный процессы перекисного окисления липидов в бесклеточном экстракте Vibrio harveyi // Микробиология. - 1994. - Т. 63. - №3. - С. 466-472

14. Forst S., Nealson K. Molecular biology of the symbiotic-pathogenic bacteria Xenorhabdus spp. and Photorhabdus spp. // Microbiol. rev. - 1996. - V.60 - N1. - P. 21-43.

15. Silva C.P., Waterfield N.R., Daborn P.J. et al. Bacterial infection of a model insect: Photorhabdus luminescens and Manduca sexta // Cell. Microbiol. - 2002. - V.4. - N6. - P. 329-339.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 06-04-96906-р_офи.