Способ длительного хранения прихотливых микроорганизмов
METHOD OF LONG-TERM STORAGE OF FASTIDIOUS MICROORGANISMS

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и может найти применение для научно-исследовательских и других лабораторий клинической микробиологии при необходимости сохранения прихотливых бактериальных культур Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae в течение длительного времени, в том числе для длительного хранения музейных штаммов.
Практика консервации и расконсервации микроорганизмов эмпирически выработала ряд приемов, основанных на знании механизмов погружения клеток в анабиотическое состояние и выхода из него.
Однако эффективная консервация с полным сохранением популяций и геномов разнообразных микроорганизмов представляет собой пока еще не решенную проблему, нуждающуюся в дальнейшем изучении. Так, известно, что способность сохранять жизнеспособность в определенных условиях консервации связана не только с родом и видом микроорганизмов, но и с другими свойствами бактерий.
Среди методов хранения микроорганизмов, практикуемых в различного ранга коллекциях живых культур, различают два основных подхода:
1. Методы непродолжительного хранения микроорганизмов;
2. Методы длительного хранения микроорганизмов.
1. Методы первой группы позволяют сохранять микроорганизмы от нескольких недель, месяцев до одного года и имеют ряд недостатков, а именно: диссоциация микроорганизмов, загрязнение, неконтролируемая селекция мутантов микроорганизмов, не гарантированный срок сохранения жизнеспособности и т.д. Неправильный выбор поддерживающей среды может привести к потере микроорганизма. Большинство этих методов непригодно для сохранения прихотливых микроорганизмов, таких как S.pneumoniae и Н. Influenzae.
2. Методы длительного хранения микроорганизмов:
- глубокое замораживание, или криоконсервация микроорганизмов (от минус 70°С до минус 196°С);
- лиофильное высушивание (из замороженного состояния) или высушивание из жидкого состояния.
Криоконсервация осуществляется в сосудах с жидким газом (азотом) или в стационарных морозильных камерах. Заморозка проводится путем посева микроорганизмов в специальные среды сохранения с добавлением криопротекторов, обеспечивающих внутриклеточную и (или) внеклеточную защиту микроба от повреждающих факторов в процессе замораживания и размораживания. В качестве среды сохранения используют различные субстраты, но больший процент биомассы микроорганизмов при расконсервации сохраняется при использовании богатых по составу питательных сред [1, 2]. Это особенно важно учитывать при сохранении прихотливых микроорганизмов.
Лиофильное высушивание обеспечивает наиболее длительное хранение микроорганизмов, но выполняется на дорогостоящем оборудовании, что малодоступно для лабораторной практики.
Известны способы хранения прихотливых микроорганизмов:
- на яично-желточной среде Дорсэ при комнатной температуре (до 4-6 месяцев для пневмококков) [3, 4]. Недостатками метода являются - короткий срок хранения, невозможность культивирования Haemophilus influenzae.
- на стерильной дефибринированной крови кролика при температуре ниже минус 40°С [5]. Недостатком метода является то, что стерильная дефибринированная кровь кролика является недоступным препаратом для практических лабораторий.
- на консервированной донорской человеческой цельной крови, содержащей гемоконсервант ЦФДА-1 при температуре минус 20°С [6].
Недостатки способа - возможное содержание антител к возбудителям инфекционных болезней и гибель сохраняемой культуры, низкий срок хранения - один год, невозможность дальнейшего хранения после расконсервации.
Наиболее близким способом к заявляемому является способ сохранения бактерий с использованием 18-24-часовых культур, выращенных на соответствующих питательных средах, путем замораживания при температуре минус 80°С в триптиказо-соевом бульоне с добавлением 30% глицерина [7, 8]. В известном способе используется в качестве среды сохранения триптиказо-соевый бульон в виде сухой среды для приготовления бульона в условиях лаборатории или жидкой среды, готовой к использованию. Недостаток способа - низкая жизнеспособность микроорганизмов при хранении в результате недостаточного набора питательных компонентов в среде сохранения [1].
Задачей разработки является создание наиболее доступного способа длительного хранения прихотливых микроорганизмов для практических и научно-исследовательских лабораторий.
Техническим результатом заявленного способа является сохранение жизнеспособности (выживаемости) прихотливых микроорганизмов при консервации в течение длительного времени.
Технический результат достигается тем, что в способе длительного хранения прихотливых микроорганизмов с использованием 18-24-часовых культур путем замораживания при температуре минус 80°С в среде сохранения с добавлением криопротектора в виде 30% глицерина, в качестве среды сохранения используют готовую среду Signal blood culture system medium производства фирмы Oxoid, первоначально предназначенную для диагностики бактериального заражения крови.
Изучив особенности микроорганизмов установили, что:
2
Streptococcus pneumoniae нуждается в особых условиях культивирования. К питательным средам обычно добавляют кровь и сыворотку крупного рогатого скота или лошадиную сыворотку, для роста требуется повышенная концентрация СО. Хранение культур в обычных условиях затруднено вследствие склонности пневмококка к аутолизу.
Бактерии рода Haemophilus также относят к труднокультивируемым микробам - все виды гемофильных бактерий нуждаются в присутствии в питательной среде ростовых факторов V и X, источником которых являются эритроциты крови [1]. Практическим путем подобраны среда сохранения, криопротектор, определена температура криоконсервации.
1. Выбор среды сохранения.
9
11
Выбор среды сохранения микроорганизмов основывается на питательных потребностях патогенов. Правильный выбор сред важен как для накопления микроорганизмов (жизнеспособность микроорганизмов значительно повышается, если исходная концентрация микробных клеток в суспензии была высокой, порядка 10-10кл/мл), так и для защиты клеток в процессе криоконсервации и расконсервации. Более концентрированная суспензия клеток имеет более высокий титр выживания при размораживании, чем разбавленная суспензия [9].
Для обеспечения ростовых потребностей Streptococcus pneumoniae в состав искусственных питательных сред должны входить аминокислоты (лизин, аргинин, метионин, треонин, гистидин, глицин, цистеин, аспарагин, изолейцин, валин и глютаминовая кислота). Необходимыми компонентами питательных сред также являются холин, витамины группы В. Учитывая физиологические потребности прихотливых микроорганизмов в качестве основ питательных сред, используются гидролизаты мяса, сои, казеина, куриные эмбрионы, продукты ферментативного гидролиза плаценты человека [1].
Несмотря на то, что предложенные среды обеспечивают типичный рост пневмококков и гемофилов, использование в них нестандартизованных компонентов существенно снижает их эффективность. Поэтому эффективное долговременное сохранение прихотливых микроорганизмов возможно только при использовании качественной, богатой по составу питательных веществ и стандартизованной среды [9]. Среда Signal blood culture system medium полностью соответствует этим требованиям.
2. Выбор криопротектора.
Криопротекторы - вещества, способные предотвращать развитие повреждений биологических объектов при охлаждении, замораживании и последующем отогреве. К настоящему времени известно свыше 100 соединений в качестве криопротекторов (спирты, амины, аминокислоты и их амиды, оксиды, углеводы, белки, природные и искусственные полимеры, неорганические соли и др.). Однако многие из известных криопротекторов могут оказывать на клетки токсическое действие, величина которого зависит от температуры и длительности экспозиции клеток с криопротектором. Поэтому, как правило, сразу после оттаивания удаляют криопротектор из клеток и среды путем последовательных отмываний и центрифугирования [10, 11, 12, 13]. В качестве криопротекторов в микробиологии обычно используют 10, 15, 20% растворы глицерина [9, 10]; 5, 7% растворы диметилсульфоксида (ДМСО); 12, 24% растворы сахарозы, а также глицерин и ДМСО в сочетании с глюкозой или сахарозой [9, 10, 11, 14].
Для нашего способа в качестве криопротектора был выбран 30% глицерин, обеспечивающий внутриклеточную и внеклеточную защиту микроорганизмов от повреждающих факторов. Для дальнейшей исследовательской работы с микроорганизмами не требуется отмывать и центрифугировать состав.
3. Определение температуры криоконсервации.
В настоящее время криоконсервация (криоанабиоз) является наиболее перспективным методом долгосрочного хранения микроорганизмов. При криоконсервации удается получить высокий уровень жизнеспособных клеток, титр которых при длительном хранении при температуре от минус 70°С до минус 196°С сохраняется на исходном уровне, что делает практически неограниченным возможное время хранения [10]. Существенным преимуществом криоконсервации перед высушиванием и лиофилизацией является возможность сохранения высокой биохимической активности и генетической стабильности [2]. Наиболее доступным для практических и научно-исследовательских лабораторий методом является криоконсервация в морозильниках при -70°С - 80°С.
Способ осуществляют следующим образом.
Готовят рабочий раствор среды сохранения, используя готовую среду Signal blood culture system medium (производится фирмой Oxoid, Великобритания, каталожный номер ВСО 100 - общее название системы; бутыль в комплекте с индикатором роста - ВСО 100М; флакон со средой без индикатора роста ВСО 102М). Среда представляет собой жидкий стерильный раствор в стерильном флаконе емкостью 84 мл, полностью готовый к использованию в качестве среды сохранения. Среда изначально предназначена для посева крови заболевших лиц с целью выделения даже минимальных количеств прихотливых микроорганизмов. В состав среды Signal blood culture system medium входит: триптонно-соевый бульон 10 г/л, желатиновый пептон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, мясной экстракт 5 г/л, поваренная соль 8 г/л, нитрат калия 2 г/л, глюкоза 1 г/л, L - аргинин 1 г/л, пируват натрия 1 г/л, желатин 1 г/л, тиогликоль натрия 0,5 г/л, цистеин HCl 0,4 г/л, двууглекислая сода 0,4 г/л, фосфатный буфер 0,3 г/л, полианетол сульфонат натрия 0,3 г/л, дитиотреитол 0,2 г/л, сульфат аденина 0,01 г/л, янтарно-кислый натрий 0,01 г/л, хлорид аммония 0,008 г/л, сульфат магния 0,008 г/л, витамин K(Menadione) 0,005 г/л, рН среды 7,0 [16].
Для приготовления рабочего раствора среды сохранения (среда + криопротектор) среда Signal blood culture system medium наливается стерильным шприцем в количестве 7 мл в стерильную пробирку емкостью 10-15 мл. Затем в эту же пробирку добавляется 3 мл глицерина, предварительно простерилизованного 15 мин при давлении 0,5 атм. Таким образом обеспечивается 30% концентрация глицерина в растворе.
Пробирки типа Eppendorf из полипропилена помещают с открытыми крышками в крафт-пакеты по 10 штук, стерилизуют автоклавированием при t 120°С - 45 мин [15]. Срок хранения стерильных пробирок типа Eppendorf трое суток. Рабочий раствор должен быть сразу разлит в стерильные пробирки типа Eppendorf в ламинарном боксе 2 класса биологической защиты по 1 мл. Далее пробирки типа Eppendorf со средой хранятся в штативе при t+2+8°С 7-10 дней.
2
Культуры Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae для длительного сохранения предварительно выращивают на кровяном агаре с добавлением 10% лошадиной сыворотки (Streptococcus pneumoniae) и на шоколадном агаре (Haemophilus influenzae) в атмосфере повышенной концентрации СО 18-24 часа [1].
2
Стерильным одноразовым тампоном-зондом из вискозы снимают с агара видимый рост бактерий. Затем тампон-зонд помещают в пробирку типа Eppendorf со средой сохранения, интенсивно суспендируют его и вынимают, отжав о внутреннюю стенку пробирки. Пробирки типа Eppendorf с культурой маркируют маркером по стеклу, обозначая название, номер культуры, дату заморозки. Каждый штамм сохранялся в 5 экземплярах, чтобы протестировать жизнеспособность бактерий через 3 мес, 6 мес, 12 мес, 1,5 года и 2 года консервации. При обычном сохранении, исключающем исследовательские задачи по определению выживаемости бактерий, каждый штамм сохраняем в нескольких (от 3 до 5) экземплярах. Подписанные пробирки с культурой без дополнительного подращивания помещают в штатив и затем в морозильную камеру при t-80°C. Для расконсервации сохраняемой культуры одноразовой пластиковой бактериологической петлей прокалывается замороженная среда. Затем взятая на петлю масса растирается по поверхности кровяного (шоколадного) агара штриховым способом. Чашки инкубируют при 137°С в атмосфере повышенной концентрации СО 18-24 часа. После посева пробирка с замороженной культурой вновь помещается в морозильник.
Нами было протестировано хранение предлагаемым способом 60 штаммов бактерий: 30 штаммов Streptococcus pneumoniae, 30 штаммов Haemophilus influenzae. Результаты исследований, приведенные в таблице 1, показали, что все 60 культур сохранили свою жизнеспособность в течение 2-х лет хранения на испытуемой среде.
Преимуществом заявленного способа является то, что использование среды сохранения на основе среды Signal blood culture system medium, содержащей большой набор питательных компонентов и ростовых факторов, с добавлением 30% глицерина в качестве криопротектора обеспечивает выживаемость в высоком титре максимального количества проб с прихотливыми микроорганизмами, жизнеспособность и возобновление культивирования сохраняемых бактерий в течение минимум 2-х лет хранения. Культуры закладываются на хранение без дополнительного подращивания в термостате, из одной пробирки можно делать высев несколько раз без полного оттаивания, исключен трудоемкий этап «оживления» микроорганизмов после расконсервации. Дополнительным преимуществом является то, что если микробиологическая лаборатория выполняет исследования крови на стерильность с использованием среды Signal blood culture system medium, то можно без дополнительных затрат времени и денежных средств на приобретение другой среды сохранять лабораторные штаммы для последующего изучения.
Литература
1. Методики клинических лабораторных исследований. Справочное пособие, Том 3, Клиническая микробиология под редакцией В.В. Меньшикова. М.: Лабора, 2009. - 879 с.
2. В.Д. Похиленко. Методы длительного хранения коллекционных культур микроорганизмов и тенденции развития / В.Д. Похиленко, A.M. Баранов, К.В. Детушев // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. - 2009. - №4 (12). - С. 99-121.
3. Wasas A.D., Huebner R.E., De Blanch M, Klugman K.P. Long-term survival of Streptococcus pneumoniae at room temperature on Dorset egg medium. J Clin Microbiol. 1998;36:1139-1140.
4. Ajello G.W., Feeley J.C., Hayes P.S., reingold A.L., Bolan G., Broome C.V., Phillips C.J. Trans-isolate medium: a new medium for primary culturing and transport of Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae. J Clin Microbiol. 1984; 20:55-58.
5. Определитель нетривиальных патогенных грамотрицательных бактерий (аэробных и факультативно анаэробных). Пер. с англ. Р. Вейант, У. Мосс, Р. Уивер, Д. Холлис, Дж. Джордан, Э. Кук, М. Дейншвар. - М.: Мир, 1999. - 791 с., стр. 56.
6. Патент 2535984 Российская Федерация, C12N 1/04, 2014. Способ длительного хранения прихотливых бактерий в консервированной цельной донорской крови путем замораживания / Воронина Л.Г., Суматова Е.В., Кукушкина М.П.: опубл. 20.12.2014, Бюл. №35.
7. Протасова И.Н. Смена серотипов Streptococcus pneumoniae у детей, вакцинированных 7-валентной конъюгированной вакциной / И.Н. Протасова, Н.В. Бахарева, О.В. Перьянова, Т.А. Елистратова, М.В. Коваль // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2014. - №5(78).-С. 67-71.
8. Маянский Н.А. Определение капсульных серотипов пневмококка методом мультиплексной ПЦР /Н.А. Маянский, Н.М. Алябьева, Л.К. Катосова, Т.А. Гречуха, В.Г. Пинелис, Л.С. Намазова-Баранова // Вопросы диагностики в педиатрии. - 2010. - Том 2. - №6. - С. 6-11.
9. Патент 2123044 Российская Федерация, C12N 1/04, 2011. Способ длительного хранения естественных симбиотических ассоциаций микроорганизмов человека и животных / Шендеров Б.А., Гахова Э.Н., Манвелова М.А., Пиорунский Д.А., Карнаухов В.Н.: опубл. 10.12.1998.
10. Смит О. Биологическое действие замораживания и переохлаждения: пер. с англ. / О. Смит. - М., 1963. - 430 с.
11. А.М. Белоус Криоконсерванты / A.M. Белоус, М.И. Шраго, Н.С. Пушкарь. - Киев: Наукова думка, 1979. - 198 с.
12. Патент 2008348 Российская Федерация, C12N 1/04, 1994. Способ хранения культур микроорганизмов / Афиногенов Г.Е., Доморад А.А., Шамолина И.И., Краснова М.В.; опубл. 28.02.94, Бюл. №4.
13. Патент 2185435 Российская Федерация, C12N 1/04, 2001. Способ хранения культур микроорганизмов / Ильин Д.Ю., Блинохватов А.Ф., Ильина Г.В., Иванов А.И.: опубл. 20.07.02, Бюл. №20.
14. Патент 2045573 Российская Федерация, C12N 1/04, 1995. Состав для хранения бактерий / Плотников О.П., Маркова Л.И., Виноградова Н.А., Харченко В.Г., Казаринова Т.Д.; опубл. 10.10.95, Бюл. №28.
15. ОСТ 42-21-2-85 «Стерилизация и дезинфекция изделий медицинского назначения. Методы, средства и режимы» стр. 9.
16. Ссылка на источник из уровня техники с описанием среды: http://www.biovitrum.ru/files//instrukciya_sistema_signal.pdf