Изучение сперматогенеза трансгенных петухов

DOI: 10.24411/0235-2451-2019-10909 УДК 36.52/.58:576.3/.7.086.83:591.04

Изучение сперматогенеза трансгенных петухов

Н. А. ВОЛКОВА, А. Н. ВЕТОХ, Л. А. ВОЛКОВА, Е. К. ТОМГОРОВА, Н. А. ЗИНОВЬЕВА

Федеральный научный центр животноводства - Всероссийский институт животноводства имени академика Л. К. Эрнста, пос. Дубровицы, 60, Подольский р-н, Московская обл., 142132, Российская Федерация

Резюме. Важный критерий востребованности трансгенных технологий в птицеводстве - результативность получения трансгенной птицы в требуемом количестве. Поэтому представляет интерес изучение репродуктивных показателей генетически модифицированных особей. Цель исследований состояла в изучении особенностей сперматогенеза у трансгенных петухов. Для экспериментов отобрали трансгенных и нетрансгенных птиц породы русская белая. Трансгенные петухи были получены с использованием лентивирусного вектора посредством его введения в эмбрионы in vivo (I группа, n = 6) и генетической трансформации сперматогенных клеток семенников in vivo (II группа, n = 6). Были проведены гистологические исследования семенников трансгенных и нетрансгенных петухов в возрасте 4 и 6 мес. Отобранные образцы семенников фиксировали в растворе Буэна, заливали в парафин и готовили гистологические срезы толщиной 5 мкм. Оценивали гистологическую структуру семенных канальцев и состав сперматогенных клеток в них. Значительных патологических нарушений в структуре семенных канальцев не выявлено во всех группах. При этом у трансгенных петухов отмечено снижение количества сперматогенных клеток в семенных канальцах и изменение процентного соотношения разных их типов, по сравнению с контролем. Такие изменения зависели от способа введения лентивирусного вектора. В I группе разница с контролем по изучаемым показателям не превышала 4 %, в то время как во II группе в ряде случаев были установлены достоверные различия. В возрасте 4 мес. у петухов II группы количество сперматогенных клеток в одном семенном канальце снизилось, по сравнению с контролем, на 20 %. Произошло это в результате уменьшения числа сперматоцитов второго порядка и сперматид на 25 и 27 % соответственно. Однако в возрасте 6 мес. в обеих экспериментальных группах различия с контролем нивелировались до 2 %, что свидетельствует о восстановлении сперматогенеза у трансгенных петухов по прошествии определенного времени после проведения генно-инженерных манипуляций.

Ключевые слова: трансгенез, петухи, сперматогенез, сперматогенные клетки.

Сведения об авторах: Н. А. Волкова, доктор биологических наук, зав. лабораторией (e-mail: natavolkova@inbox.ru); А. Н. Ветох, научный сотрудник; Л. А. Волкова, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник; Е. К. Томгорова, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник; Н. А. Зиновьева, доктор биологических наук, академик РАН, директор. Для цитирования: Изучение сперматогенеза трансгенных петухов / Н. А. Волкова, А. Н. Ветох, Л. А. Волкова и др. // Достижения науки и техники АПК. 2019. Т. 33. № 9. С. 44-47. DOI: 10.24411/0235-2451-2019-10909.

Examination of Spermatogenesis of Transgenic Roosters

N. A. Volkova, A. N. Vetokh, L. A. Volkova, E. K. Tomgorova, N. A. Zinovieva

Federal Scientific Center of Animal Husbandry - L. K. Ernst All-Russian Research Institute of Animal Husbandry, pos. Dubrovitsy, 60, Podol'skii r-n, Moskovskaya obl., 142132, Russian Federation

Abstract. An important criterion for the demand for transgenic technologies in poultry farming is the effectiveness of obtaining the transgenic poultry in the required quantity. Therefore, the study of the reproductive parameters of genetically modified individuals was of interest. The research aimed to study the characteristics of spermatogenesis in transgenic roosters. For experiments, transgenic and non-transgenic birds of the Russian white breed were selected. Transgenic roosters were bred using a lentiviral vector by introducing it into embryos in vivo (group I, n = 6) and transforming spermatogenic testicular cells in vivo genetically (group II, n = 6). We conducted histological studies of the testicles of transgenic and non-transgenic roosters at the age of 4 and 6 months. The selected testicle samples were fixed in the Buen's solution, embedded in paraffin, then 5 microns thick histological sections were prepared. The histological structure of the seminiferous tubules and the composition of spermatogenic cells in them were evaluated. We did not detect any significant pathological disorders in the structure of the seminiferous tubules in any group. At the same time, a decrease in the number of spermatogenic cells in the seminiferous tubules and a change in the ratio of their types in comparison with the control were noted in the transgenic roosters. Such changes depended on the route of administration of the lentiviral vector. In group I, the difference with control in the studied parameters did not exceed 4%, while significant differences were detected in some cases in group II. At the age of 4 months, the roosters in group II showed a 20% decrease in the number of spermatogenic cells in one seminiferous tubule compared to the control. This happened as a result of a decrease in the number of second-order spermatocytes and spermatids by 25% and 27%, respectively. However, at the age of 6 months, in both experimental groups, the differences with the control levelled up to 2% that indicated the restoration of spermatogenesis in transgenic roosters after a certain period after genetic engineering manipulations. Keywords: transgenesis; roosters; spermatogenesis; spermatogenic cells.

Author Details: N. A. Volkova, D. Sc. (Biol.), head of laboratory (e-mail: natavolkova@inbox.ru); A. N. Vetokh, research fellow; L. A. Volkova, Cand. Sc. (Biol.), senior research fellow; E. K. Tomgorova, Cand. Sc. (Biol.), senior research fellow; N. A. Zinovieva, D. Sc. (Biol.), member of the RAS, director.

For citation: Volkova N. A., Vetokh A. N., Volkova L. A., Tomgorova E. K., Zinovieva N. A. Studying Spermatogenesis of Transgenic Roosters. Dostizheniya naukii tekhnikiAPK. 2019. Vol. 33. No. 9. Pp. 44-47 (in Russ.). DOI: 10.24411/0235-2451-2019-10909.

Трансгенные технологии в птицеводстве используют для улучшения продуктивных качеств сельскохозяйственной птицы, повышения ее устойчивости к инфекционным заболеваниям, а также получения ре-комбинантных белков фармакологического назначения с белком яйца [1, 2]. При этом методы, применяемые для генетической модификации клеток животных, как правило, имеют низкую эффективность при получении трансгенной птицы. Это связано с особенностями воспроизводства и развития птиц: ко времени снесения яйца эмбрион содержит около 60000 клеток. Вместе с тем, развитие зародышей вне организма самки значительно облегчает доступ к ним для проведения генно-

инженерных манипуляций, что позволяет значительно расширить спектр методов для эффективного введения рекомбинантной ДНК в клетки-мишени [3, 4]. В качестве перспективных рассматривают клетки бластодермы, эмбриональные стволовые клетки [5], примордиальные зародышевые клетки [6, 7, 8], сперматогонии [9]. Их направленная генетическая модификация позволяет повысить эффективность трансгенеза птиц.

С использованием изложенных подходов в ряде лабораторий получены генетически модифицированные птицы с репортерными и целевыми генами человека [10, 11, 12]. Однако, несмотря на относительно высокую эффективность этих методов на сельскохозяйственных

птицах, при дальнейшем разведении таких особей может возникать ряд проблем, связанных с трансгенным потомством, в частности, его низкой жизнеспособностью или ограниченным количеством. Это может быть обусловлено несколькими причинами, одна из которых -низкая фертильность исходных родительских форм. Для решения этой проблемы представляет интерес изучение воздействия трансгенеза на функциональное состояние репродуктивных клеток генетически модифицированных особей.

Цель работы - оценка влияния трансгенеза на сперматогенез петухов.

Условия, материалы и методы. Исследования проводили в Федеральном научном центре животноводства - Всероссийском институте животноводства имени академика Л. К. Эрнста в 2018-2019 гг. Объектом исследований служили трансгенные петухи и их нетрансгенные аналоги породы русская белая. Изучали гистологическую структуру семенников и состав сперматогенных клеток в семенных канальцах у разновозрастных трансгенных петухов, полученных с использованием различных методических подходов, в сравнении с контролем. С этой целью было сформировано 2 опытных группы: I группа - птицы, полученные посредством введения лентивирусного вектора в эмбрионы кур in vivo (n = 6), II группа - трансгенные петухи, полученные в результате генетической трансформации сперматогенных клеток семенников in vivo (n = 6). Трансформацию сперматогенных клеток семенников in vivo осуществляли посредством введения лентивирусного препарата в паренхиматозную ткань семенников петушков в возрасте 3 мес. Контрольная группа включала нетрансгенных петухов, подобранных по принципу аналогов (порода, возраст; n = 6). Эксперименты проводили строго в соответствии с законодательной базой с соблюдением принципов гуманного обращения с животными.

Гистологические исследования семенников петухов проводили в возрасте 4 и 6 мес. В каждом случае исследовали по 3 особи. Семенники отбирали при убое птицы. Гистологические препараты готовили по общепринятой методике. Фиксацию образцов ткани проводили в растворе Буэна (пикриновая кислота : уксусная кислота : формалин в соотношении 15:1:5) в течение 48 ч. После фиксации образцы заливали в парафин и готовили гистологические срезы толщиной 5 мкм. Препараты окрашивали гематоксилин-эозином. С целью исключения ошибочных результатов для анализа от-

бирали только семенные канальцы, имеющие округлую форму и просвет (поперечный срез). Идентификацию клеток сперматогенного ряда проводили, исходя из их морфологии. От каждого самца исследовали не менее 30 семенных канальцев. Обработку и анализ изображений проводили с применением пакета программ NIS-Elements (Nikon, Япония). Определяли диаметр семенных канальцев, количество сперматогенных клеток в них, клеточный состав популяции сперматогенных клеток.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета анализа данных MS Excel 2016 (t-тест). Результаты в таблице представлены в виде средних арифметических значений величин (Х) и их ошибок (х).

Результаты и обсуждение. Изучение гистологической структуры семенных канальцев семенников трансгенных и нетрансгенных петухов в разные возрастные периоды не выявило патологических изменений в общей архитектонике этого органа. Вместе с тем, анализ популяции сперматогенных клеток в семенных канальцах исследуемых петухов показал некоторые изменения в количественном содержании разных типов клеток у трансгенных особей, по сравнению с контролем.

В возрасте 4 мес. размер семенных канальцев исследуемых трансгенных и нетрансгенных петухов варьировал от 98 до 131 мкм. При этом достоверных различий по величине этого показателя между опытными и контрольной группой не установлено. Средний размер семенных канальцев семенников самцов I опытной группы составляли (115 ± 11) мкм, II опытной - (117 ± 9) мкм, контрольной - (111 ± 12) мкм. У петухов контрольной группы популяция сперматогенных клеток семенных канальцев была представлена сперматогониями, спер-матоцитами первого и второго порядка и сперматидами (см. рисунок, а). Сперматогонии выявлены на базальной мембране рядом с клетками Сертоли. Над ними рядами располагались сперматоциты первого и второго порядка. Ближе к просвету семенных канальцев идентифицировали сперматиды. Структура семенных канальцев и состав сперматогенных клеток у самцов I и II опытных групп были аналогичны контролю. Различия между контрольной и опытными группами были установлены по количеству сперматогенных клеток внутри семенных канальцев.

У петухов контрольной группы в 4 мес. общее число сперматогенных клеток в одном семенном канальце варьировало от 316 до 335 и составило в среднем (322 ± 7) клеток (см. табл.). У трансгенных самцов величина этого

Рисунок. Гистоструктура семенника петуха (контрольная группа): а) в возрасте 4 мес., б) в возрасте 6 мес.; 1 - просвет семенного канальца, 2 - сперматогонии, 3 - сперматоциты 1 порядка, 4 - сперматоциты 2 порядка, 5 - сперматиды, 6 - спер-мии. Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение х 400.

Таблица. Количество сперматогенных клеток разных типов в семенных канальцах петухов

Тип клеток 4-месячные петухи 6-месячные петухи

контроль I группа II группа контроль I группа II группа

штук | % штук | % штук % штук | % штук | % штук %

Сперматогонии 64 ± 2 20 62 ± 7 20 63 ± 3 24 65 ± 4 5 64 ± 8 6 65 ± 2 6

Сперматоциты 27 ± 3 8 26 ± 4 8 27 ± 3 11 330 ± 17 29 321 ± 12 29 305 ± 5 27

1 порядка

Сперматоциты 72 ± 3 22 70 ± 4 22 54 ± 4* 21 247 ± 8 22 242 ± 26 22 245 ± 15 22

2 порядка

Сперматиды 159 ± 4 50 158 ± 5 50 114 ± 9* 44 226 ± 7 20 229 ± 17 21 221 ± 14 20

Спермии 0 0 0 0 0 0 276 ± 4 24 246 ± 18 22 281 ± 14 25

Сперматогенные 322 ± 7 100 316 ± 7 100 258±14* 100 1144±18 100 1102±69 100 1117 ± 39 100

клетки

*разница достоверна при Р > 0,95

показателя была ниже. В I опытной группе разница с контролем оказалась незначительной и не превышала 2 %. Во II группе различия с контролем достигали 20 %. Изучение состава сперматогенных клеток семенных канальцев показало, что у петухов контрольной группы основную долю составляли сперматиды - 48 %, на сперматогонии, спер-матоциты первого и второго порядка проходилось 20, 8 и 22 % соответственно. У трансгенных петухов I группы процентное соотношение разных типов сперматогенных клеток в семенных канальцах, в целом, соответствовало контрольной группе. У трансгенных самцов II группы отмечено снижение доли сперматоцитов второго порядка и сперматид. Их количество в семенных канальцах было на 25.. .27 % ниже, чем в контроле (Р > 0,95).

В возрасте 6 мес. размеры семенных канальцев семенников исследуемых петухов увеличивались как в контрольной, так и в опытных группах. В контрольной группе они варьировали от 171до 198 мкм и составили в среднем (186 ± 6) мкм. У трансгенных петухов обеих групп величина этого показателя незначительно отличалась от контрольной.

Популяция сперматогенных клеток у петухов возрасте 6 мес. была представлена сперматогониями, сперма-тоцитами первого и второго порядка, сперматидами и спермиями (см. рисунок, б). Сперматогенные клетки располагались рядами в направлении от базальной мембраны к просвету семенного канальца в следующем порядке: сперматогонии, сперматоциты первого порядка, сперматоциты второго порядка и сперматиды. Спер-мии выявлены в просвете семенного канальца. Общее количество сперматогенных клеток в одном семенном канальце у петухов контрольной группы варьировало от 1110 до 1173 клеток и составило в среднем (1144 ± 18) клеток (см. табл.). У трансгенных петухов отмечено снижение величины этого показателя - до 4 %, однако различия были недостоверными. Не было установлено достоверных различий и по соотношению разных типов сперматогенных клеток в семенных канальцах петухов между контрольной и опытными группами (см. табл.).

Таким образом, гистологические исследования семенников трансгенных петухов, в сравнении с их нетрансгенными аналогами, выявили достоверное снижение количества сперматогенных клеток в семенных канальцах у трансгенных петухов II опытной группы в возрасте 4 мес. Это уменьшение может быть обусловлено проводимыми генно-инженерными манипуляциями, связанными с введением лентивирусного вектора в паренхиматозную ткань семенников петушков в возрасте 3 мес. Вирусный препарат и манипуляции по его введению могли негативно повлиять на жизнеспособ-

ность сперматогенных клеток, о чем свидетельствует снижение количества сперматоцитов второго порядка и сперматид, по сравнению с контролем. При этом число сперматогоний и сперматоцитов первого порядка в целом соответствовало показателям контрольной группы, что можно рассматривать как восстановление сперматогенеза. Этот факт подтверждают и результаты гистологических исследований семенников трансгенных петухов в возрасте 6 мес., когда различия по содержанию сперматогенных клеток в семенных канальцах трансгенных и нетрансгенных петухов были незначительными и не превышали 4 %.

Исследований по оценке влияния трансгенеза непосредственно на развитие клеток сперматогенного эпителия семенников у сельскохозяйственных животных и птицы ранее не проводили. Вместе с тем, есть ряд работ по изучению его воздействия на рост и развитие генетически модифицированных особей, их воспроизводительные качества. Ранее мы установили ухудшение качества семени у трансгенных петухов [13]. Аналогичные результаты были получены у трансгенных сельскохозяйственных животных. Описано снижение качества семени у трансгенных по гену ЬЬР козлов [14, 15]. Выявлено снижение либидо у самцов кроликов, трансгенных по гену bGH [16]. Имеется также ряд сообщений о низкой жизнеспособности и фертильности трансгенных овец [17, 18], свиней [19] и кроликов [20], что может быть обусловлено структурными нарушениями половых клеток и, как следствие, их низкой оплодотворяющей способностью.

Выводы. У трансгенных петухов отмечено снижение количества сперматогенных клеток в семенных канальцах семенников, по сравнению с нетрансгенными аналогами. Значительные различия с контролем по величине этого показателя были установлены у трансгенных особей, которым вводили лентивирусный вектор в сперматогенные клетки семенников (II группа) в возрасте 4 мес. - 20 % (Р > 0,95). Снижение количества сперматогенных клеток в семенных канальцах трансгенных петухов II группы было обусловлено, преимущественно, сокращением количества сперматоцитов второго порядка и сперматид, по сравнению с контролем, на 25 и 27 % (Р > 0,95) соответственно, что было связано с негативным влиянием генно-инженерных манипуляций по введениюлентивирусного препарата в семенники 3-мес. петушков на жизнеспособность сперматогенных клеток. В дальнейшем различия нивелировались: в возрасте 6 мес. разница с контролем не превышала 4 %, что свидетельствует о восстановлении сперматогенеза у трансгенных петухов по прошествии определенного периода времени после проведения генно-инженерных манипуляций.

Литература.

1. Applications of avian transgenesis / B. B. Scott, T. A. Velho, S. Sim, et al.// ILAR J. 2010. Vol. 51. No 4. P. 353-361.

2. A chicken bioreactor for efficient production of functional cytokines / L. R. Herron, C. Pridans, M. L. Turnbull, et al. // BMC Biotechnology. 2018. Vol. 18. Article No 82. DOI: 10.1186/s12896-018-0495-1.

3. A new method for producing transgenic birds via direct in vivo transfection of primordial germ cells / S. G. Tyack, K. A. Jenkins, T. E. O'Neil, et al. // Transgenic Res. 2013. Vol. 22. No. 6. P. 1257-1264.

4. Generation of antiviral transgenic chicken using spermatogonial stem cell transfected in vivo / S. Min, S. Q. Qing, Y. Y. Hui, et al. //African Journal of Biotechnology. 2011. Vol. 10. No 70. P. 15678-15683.

5. Han J. Y. Germ cells and transgenesis in chickens // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 2009. Vol. 32. P. 61-80.

6. Primordial germ cells (PGCs) as a tool for creating transgenic chickens / L. Chojnacka-Puchta, K. Kasperczyk, G. Plucienniczak, et al. // Pol. J. Vet. Sci. 2012. Vol. 15. No 1. P. 181-188.

7. Characterisation and germline transmission of cultured avian primordial germ cells / J. Macdonald, J. D. Glover, L. Taylor, et al. // Plos One. 2010. Vol. 5. P. e15518.

8. Naito M., Harumi T., Kuwana T. Long term in vitro culture of chicken primordial germ cells isolated from embryonic blood and incorporation into germline of recipient cmbryo // Journal of Poultry Science. 2010. Vol. 47. P. 57-64.

9. Transgenic sperm produced by electrotransfection and allogeneic transplantation of chicken fetal spermatogonial stem cells / F. Yu, L. J. Ding, G. B. Sun, et al. // Molecular Reproduction and Development. 2010. Vol. 77. P. 340-347.

10. Production of biofunctional recombinant human interleukin 1 receptor antagonist (rhIL1RN) from transgenic quail egg white / S. C. Kwon, J. W. Choi, H. J. Jang, et al. // Biology of Reproduction. 2010. Vol. 82. P. 1057-1064.

11. Oviduct-specific enhanced green fluorescent protein expression in transgenic chickens / S. J. Byun, S. W. Kim, K. W. Kim, et al. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2011. Vol. 75. No 4. P. 646-649.

12. Oviduct-specific expression of human neutrophil defensin 4 in lentivirally generated transgenic chickens / T. Liu, H. Wu, D. Cao et al. // PLoS ONE. 2015. Vol. 10. No 5. P: e0127922.

13. Изменение количественных и качественных показателей семени петухов под влиянием трансгенеза / А. Н. Ветох, М. А. Жилинский, Е. К. Томгорова и др. // Теоретические и прикладные проблемы агропромышленного комплекса. 2017. № 4. С. 41-44.

14. Айбазов М. М., Мамонтова Т. В., Холмова Е. В. Воспроизводительные показатели трансгенных по гену лактоферрина коз// Сборник научных трудов Всероссийского научно-исследовательского института овцеводства и козоводства. 2016. № 2. С. 67-72.

15. Айбазов М. М., Аксенова П. В. Лактоферрин человека от трансгенных коз. 1. Особенности физиологии репродукции молочных коз зааненской породы //Вестник ветеринарии. 2010. № 3. С. 59-64.

16. Фенотипические показатели трансгенных кроликов с генами соматотропной оси /Л. В. Козикова, С. И. Росохацкий, А. Ф. Яковлев и др. // Цитология. 2005. Т. 47. № 9. С. 814-815.

17. The production of transgenic Merino sheep by microinjection of ovine metallothionein-ovine growth hormone fusion genes / J. D. Murray, C. D. Nancarrow, J. T. Marshall, et al. //Reprod. Fert. Dev. 1989. Vol. 1. P. 147-155.

18. Production of transgenic sheep with growth relating genes / C. E. Rexroad, R. E. Hammer, D. J. Bolt, et al. // Molecular Reproduction and Development. 1989. Vol. 1. P. 164-169.

19. Эрнст Л. К., Гольдман И. Л., Кадулин С. Г. Генная инженерия в животноводстве: трансгенные сельскохозяйственные животные, кормовые растения, микроорганизмы рубца // Биотехнология. 1993. № 5. C. 2-14.

20. Молекулярно-биологические аспекты проблемы позиционно-независимой экспрессии чужеродных генов в клетках трансгенных животных / И. Л. Гольдман, С. В. Разин, Л. К. Эрнст и др. // Биотехнология. 1994. № 2. C. 3-8.

References

1. Scott BB, Velho TA, Sim S, et al. Applications of avian transgenesis. ILAR J. 2010;51(4):353-61.

2. Herron LR, Pridans C, Turnbull ML, et al. A chicken bioreactor for efficient production of functional cytokines. BMC Biotechnology. 2018;18:82. doi: 10.1186/s12896-018-0495-1.

3. Tyack SG, Jenkins KA, O'Neil TE, et al. A new method for producing transgenic birds via direct in vivo transfection of primordial germ cells. Transgenic Res. 2013;22(6):1257-64.

4. Min S, Qing SQ, Hui YY, et al. Generation of antiviral transgenic chicken using spermatogonial stem cell transfected in vivo. African Journal of Biotechnology. 2011;10(70):15678-83.

5. Han JY. Germ cells and transgenesis in chickens. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 2009;32:61-

80.

6. Chojnacka-Puchta L, Kasperczyk K, Plucienniczak G, et al. Primordial germ cells (PGCs) as a tool for creating transgenic chickens. Pol. J. Vet. Sci. 2012;15(1):181-8.

7. Macdonald J, Glover JD, Taylor L, et al. Characterisation and germline transmission of cultured avian primordial germ cells. Plos One. 2010;5:e15518.

8. Naito M, Harumi T, Kuwana T. Long term in vitro culture of chicken primordial germ cells isolated from embryonic blood and incorporation into germline of recipient cmbryo. Journal of Poultry Science. 2010;47:57-64.

9. Yu F, Ding LJ, Sun GB, et al. Transgenic sperm produced by electrotransfection and allogeneic transplantation of chicken fetal spermatogonial stem cells. Molecular Reproduction and Development. 2010;77:340-7.

10. Kwon SC, Choi JW, Jang HJ, et al. Production of biofunctional recombinant human interleukin 1 receptor antagonist (rhIL1RN) from transgenic quail egg white. Biology of Reproduction. 2010;82:1057-64.

11. Byun SJ, Kim SW, Kim KW, et al. Oviduct-specific enhanced green fluorescent protein expression in transgenic chickens. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2011;75(4):646-9.

12. Liu T, Wu H, Cao D, et al. Oviduct-specific expression of human neutrophil defensin 4 in lentivirally generated transgenic chickens. PLoS ONE. 2015;10(5):e0127922.

13. Vetokh AN, Zhilinskii MA, Tomgorova EK, et al. [Change in quantitative and qualitative indicators of rooster seed under the influence of transgenesis]. Teoreticheskie i prikladnye problemy agropromyshlennogo kompleksa. 2017;4:41-4. Russian.

14. Aibazov MM, Mamontova TV, Kholmova EV. [Reproductive indicators of goats transgenic for the lactoferrin gene]. Sbornik nauchnykh trudov Vserossiiskogo nauchno-issledovatel'skogo instituta ovtsevodstva i kozovodstva. 2016;2:67-72. Russian.

15. Aibazov MM, Aksenova PV. [Human lactoferrin from transgenic goats. 1. Features of the physiology of reproduction of milk goats of the Saanen breed]. Vestnik veterinarii. 2010;3:59-64. Russian.

16. Kozikova LV, Rosokhatskii SI, Yakovlev AF, et al. [Phenotypic indicators of transgenic rabbits with somatotropic axis genes]. Tsitologiya. 2005;47(9):814-5. Russian.

17. Murray JD, Nancarrow CD, Marshall JT, et al. The production of transgenic Merino sheep by microinjection of ovine metallothionein-ovine growth hormone fusion genes. Reprod. Fert. Dev. 1989:1:147-55.

18. Rexroad CE, Hammer RE, Bolt DJ, et al. Production of transgenic sheep with growth relating genes. Molecular Reproduction and Development. 1989;1:164-9.

19. Ernst LK, Goldman IL, Kadulin SG. [Genetic engineering in animal husbandry: transgenic farm animals, feed plants, rumen microorganisms]. Biotekhnologiya. 1993;5:2-14. Russian.

20. Goldman IL, Razin SV, Ernst LK, et al. [Molecular and biological aspects of the problem of position-independent expression of foreign genes in transgenic animal cells]. Biotekhnologiya. 1994;2:3-8. Russian.