Исследование активности цитратсинтазы гриба Aspergillus niger - продуцента лимонной кислоты

УДК 661.734.1

Исследование активности цитратсинтазы

гриба Aspergillus niger — продуцента лимонной кислоты

т. а. Никифорова, д-р техн. наук, профессор; т. в. выборнова

Всероссийский НИИ пищевых добавок, г. Санкт-Петербург

В. П. КоМоВ, д-р биол. наук, профессор; К. В. АЛЕКсЕЕВ, аспирант Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия

Лимонная кислота и ее соли (цитраты) — объекты многотоннажного биотехнологического производства и находят применение во многих отраслях промышленности, в первую очередь, в пищевой, фармацевтической и медицинской. Образование лимонной кислоты осуществляется в цикле трикарбоновых кислот (ЦТК), где важнейшая роль в регуляции ее синтеза принадлежит ферменту цитратсинтазе. До настоящего времени нет полного понимания механизма сверхсинтеза микробной клеткой лимонной кислоты, роли ферментов ЦТК в скорости протекания реакции и регуляции направленности процесса.

Цель данных исследований — разработка метода выделения цитратсинтазы из клеток гриба-продуцента, анализ динамики изменения ее активности в ходе ферментации, а также определение кинетических характеристик фермента для конкретного штамма гриба.

Объектом исследования служил мицелиальный гриб Aspergillus niger штамма ВКПМ F-171 (Л-4) — промышленный продуцент лимонной кислоты. Штамм селекционирован в ВНИИ пищевых добавок методом направленного мутагенеза под влиянием химических факторов в комбинации с УФ-облучением. Выбор мицелиального гриба Aspergillus niger для исследований обусловлен тем, что в отличие от других микроорганизмов (дрожжей и бактерий) он способен осуществлять синтез целевого продукта при низких значениях pH среды, толерантен к высоким концентрациям углеводов и температурным колебаниям, для него также характерна пластичность метаболизма, что позволяет достичь значительной селективности биосинтеза лимонной кислоты [1, 2].

Культивирование продуцента лимонной кислоты осуществляли в шейкерах — инкубаторах Multitron фирмы INFORS (Швейцария) периодическим способом на саха-розоминеральных средах при параметрах, установленных для данных культур микроорганизмов [3].

При разработке методики выделения цитратсинтазы (ЦС) из мицелия гриба в основу легла работа [4], посвященная скринингу адсорбентов с красителями, а также работа [5], посвященная выделению цитратсинтазы из гриба Asp. niger. Для выделения ЦС было решено использовать краситель-лигандную аффинную хроматографию (КЛАХ) с красителем Reactive Red 120 Sigma-Aldrich (США). Иммобилизацию красителя на полигидроксиль-ной матрице Sepharose 2В Pharmacia (Uppsala, Sweden) проводили в соответствии с процедурой, описанной в работе [4]. Концентрацию иммобилизованного красителя для оценки теоретической емкости колонки, а также

эффективности процесса сшивки можно определить спектрофотометрическим измерением количества красителя, выделившегося после кислотного гидролиза агароз-ной матрицы [6].

Коммерческие красители представляют собой гетерогенные смеси с примесями зачастую неопределенного состава [6, 7]. Чистота препарата красителя Reactive Red 120, Sigma-Aldrich составляет > 50%. Поэтому для получения высокоочищенного красителя можно применять колоночную или препаративную тонкослойную хроматографию (ТСХ) по унифицированным протоколам [6]. Однако использование для иммобилизации очищенного и коммерческого образца красителя не отражается существенно на конечной сорбционной емкости колонки.

Мицелий гриба в зависимости от массы обрабатываемого образца разрушали либо посредством механического растирания в жидком азоте (не более 10 г) как было описано [5], либо на шаровой мельнице с ледяным охлаждением (> 10 г). В экстракционный буфер вводили дополнительные добавки: н-октанол до конечной концентрации 0,5—0,8 % для подавления пенообразования и Tween 20 в конечной концентрации 0,2—0,5 % для деструкции митохондриальных мембран и облегчения выхода белков и белковых комплексов, связанных с ней. Также с целью ингибирования активности металл-зависимых протеаз в буфер вводили ЭДТА в конечной концентрации 1 мМ, а для необратимого ингибирования сериновых про-теиназ одновременно с ЭДТА использовали фенилметил-сульфонила фторид (ФМСФ) либо бензамидина гидрохлорид в конечной концентрации не менее 1 мМ. Для снижения вязкости получаемых гомогенатов при обработке больших количеств мицелия проводили их соника-цию и фильтрование супернатанта после центрифугирования. Очистка бесклеточных гомогенатов от мелкодисперсной взвеси оказалась наиболее важным этапом, так как она значительно улучшала показатели хроматографи-ческого процесса и уменьшала время процесса.

Процедуру хроматографической очистки ЦС проводили в соответствии с данными [5], однако финальную элю-цию ЦС осуществляли экстракционным буфером, содержащим одновременно 0,5—0,7 мМ оксалоацетата и 0,6 мМ коэнзима А.

В ходе оптимизации методики выделения ЦС было показано, что при обработке больших количеств биологического материала наиболее эффективным подходом является батч-адсорбция. В отличие от батч-адсорбции, динамическая адсорбция характеризуется равновесностью (или близостью процесса к равновесному). Из пропуска-

емой подвижной фазы неподвижным слоем сорбента, щью 5,5'-дитиобис-(2-нитробензоата) (DTNB), более

заполняющим колоночное пространство, адсорбируются известного как реагент Эллмана. Активность фермента

целевые вещества. ЦС определяли по выбранной методике с помощью спе-

Для проведения процедуры батч-адсорбции, получен- циального набора Citrate Synthase Assay Kit Sigma-Aldrich

ный и предварительно осветленный супернатант смеши- (США).

вали с аффинным сорбентом в емкости, снабженной В рамках поставленной задачи для базовой характерис-лопастной мешалкой. Полученную смесь инкубировали тики фермента цитратсинтазы гриба-продуцента A. niger при температуре 4...5 °С при перемешивании, обеспечи- был выбран показатель — константа Михаэлиса (Km). Так вающем эффективный массообмен между зернами сор- как значение этой константы не зависит от концентрации бента и раствором, но при этом не нарушающем сферич- фермента, было решено определить ее значение в полу-ность гранул сефарозы. Время инкубации с перемеши- очищенном бесклеточном гомогенате, условия в котором ванием в среднем составляло 2—2,5 ч, однако можно наиболее приближены к условиям in vivo в сравнении с увеличить продолжительность до 6—8 ч при температуре высокоочищенным ферментным препаратом. Для прове-не выше 4 °С. По окончании процесса инкубирования дения данной процедуры также использовали набор реа-сорбентом набивали колонку, промывали экстракцион- гентов Citrate Synthase Assay Kit Sigma-Aldrich (США). ным буфером и элюировали сорбированные вещества по В экстракционный буфер агентов вносили подавляю-схеме, описанной [5], с указанными выше изменениями. щие пенообразование детергенты для улучшения лизиса Основные достоинства процедуры батч-адсорбции биомембран, а также ингибиторы протеиназ, которые заключаются в возможности единовременной обработки способны инактивировать фермент в процессе выделения достаточно большого количества биоматериала, а также и очистки. В процедуру выделения включали два допол-разнесения во времени процессов сорбции и элюции, нительных этапа: соникацию (обработку ультразвуком) и что снижает трудоемкость операции выделения и очис- осветление раствора посредством фильтрования. Полутки белка. ченный гомогенат подвергали соникации не более 5 мин Еще одним нововведением в процедуре очистки ЦС из с целью разрушения ДНК-агломератов и улучшения рео-клеток гриба стал отказ от процедуры диализа. Данная логических свойств суспензии. Также было установлено, процедура имеет ряд недостатков: длительность процесса, что после центрифугирования гомогената и удаления деб-относительно невысокая эффективность, необходимость риса, супернатант требует осветления, так как содержит больших объемов диализируемых фракций. Поэтому мелкодисперсную неосаждаемую взвесь. При нанесении отобранные в процессе финальной элюции фракции, такого «раствора» на колонку хроматографический про-содержащие ЦС, было решено очистить от оксалоацетата цесс либо существенно замедлялся, либо полностью оста-и коэнзима А на ультрафильтрационной ячейке Sartorius навливался из-за засорения полостей колонки балласт-Vivaspin 500 Sartorius (США). Преимущество данного ными веществами. Поэтому полученный супернатант методического подхода состоит в том, что в отличие от пропускали через обеззоленную фильтровальную бумагу диализа данный процесс занимает не только меньше вре- медленной фильтрации и уже после этого наносили на мени, но и позволяет совместить его с процедурой сгуще- предварительно подготовленную и уравновешенную экс-ния фракций, что заметно сокращает длительность выде- тракционным буфером колонку.

ления и очистки фермента. Очищенный препарат ЦС Помимо этого в ходе оптимизации методики выделе-

хранили при температуре не выше 20 °С в экстракцион- ния ЦС из мицелия гриба было показано, что батч-адсор-

ном буфере, массо-объемная доля глицерина в котором бция является наиболее эффективным подходом при

должна составлять не менее 40 %. обработке большого количества биологического матери-

Для определения активности полученных препаратов ала (более 10 г). Выход целевого белка при использовании

был выбран прямой метод определения активности ЦС, методики аффинной хроматографии составляет около

основанный на спектрофотометрическом измерении 1 мг очищенного фермента из 16 г мицелия (при условии:

количества образовавшихся свободных тиоловых SH- Мг и 47,9 кДа; удельный коэффициент экстинкции 1,3).

групп в высвобождающемся продукте КоА-SH с помо- Удельная активность очищенного ферментного препара-

1,2______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________та составила 3,0—3,5 мкмоль/мг/мин. Хроматографичес-

кая кривая элюции ЦС представлена на рис. 1 (объем

------------------------------------одной фракции составляет 1,5 мл, концентрация белка

определялась спектрофотометрически).

Также было установлено, что фермент ЦС в очищенном состоянии становится высоколабильным и либо утрачивает активность уже после 1—2 циклов заморозки-разморозки, либо его активность значительно снижается. Данный феномен был ранее показан для ЦС, выделенных из хлебопекарных дрожжей S. cerevisiae [8]. При-

^__! роду данного явления связывают со стабилизирующим

0 5 10 15 20 25 действием оксалоацетата на молекулу фермента в водных

Номер фракции растворах [9], а также влиянием молекулярного окруже-

Рис. 1. Хроматографическая кривая элюции цитратсинтазы ния в клетке.

1 -

3 0,8-

к 0,6-

' 0,4-

0,025 -,

3

4

5

Продолжительность ферментации, сут. Щ Активность цитратсинтазы в клетках гриба A. niger штамма Л-4 Активность цитратсинтазы в клетках гриба A. niger для «дикого» штамма NW131

Рис. 2. изменение активности цитратсинтазы в клетках гриба A. niger штамма Л-4 и расчетные значения для «дикого» штамма NW131

Измерение цитратсинтазной активности в гомогенатах показало, что в динамике роста гриба-продуцента лимонной кислоты в условиях ферментации сахарозоминераль-ных сред явно видна тенденция к падению активности цитратсинтазы к концу процесса культивирования (рис. 2) [5]. Аналогичные результаты применительно к штамму Aspergillus niger 82, прародителю исследуемого штамма Л-4, отмечены в работе [2].

Таким образом, максимальная активность фермента ЦС приходится на пик ацидогенеза, наблюдаемого на третьи сутки культивирования продуцента, и постепенно

снижается пропорционально падению скорости накопления цитрата.

Анализ ферментативной активности ЦС в динамике синтеза лимонной кислоты позволяет заключить, что регуляция активности энзима осуществляется не только на транскрипционном, но и на уровне изменения активности фермента, т. е. имеет место интенсивная регуляция. Данный вид регуляции фермента ЦС осуществляется двумя путями: доступностью субстратов оксалоацетата и ацетил-КоА и модуляцией активности фермента интер-медиатами цикла Кребса, соотношением макроэргов и восстановительных эквивалентов [5, 10].

Кинетическая характеристика фермента ЦС из гриба-продуцента была изучена в условиях максимально приближенных к условиям in vivo [11], в бесклеточных гомогенатах при рН 7,5. Для обоих субстратов энзима наблюдалась гиперболическая кинетика. Константа Михаэлиса для ацетил-КоА составила 29 мкМ (при 0,5 мМ оксалоацетата, рН 7,5), для оксалоацетата 9 мкМ (при 0,3 мМ ацетил-КоА, рН 7,5). Полученные кинетические характеристики ЦС хорошо согласуются с данными для других штаммов A niger, описанных в литературе [5, 11], однако существенно отличаются от цитратсинтаз из других видов [12—14]. Данные значения констант Михаэлиса для двух субстратов фермента находят подтверждение в теории Йоханссона и Петтерсона [15] о последовательном механизме функционирования ЦС, т. е. оксалоацетат, имея более высокое сродство к активному центру фермента, присоединяется первым и увеличивает тем самым константу связывания ацетил-КоА.

Проведенные исследования показали, что в динамике ферментации сахарозоминеральных сред грибом Л. niger, штаммом-продуцентом Л-4, происходят существенные изменения активности фермента синтеза лимонной кислоты — цитратсинтазы, а именно, ее снижение. Полученные данные в дальнейшем позволят уточнить роль ЦС в

Литература

1. Plassard C. Regulation of low-molecular weight organic acid production in fungi / C. Plassard, P. Fransson // Fungal Biol. Rev. — 2009. — Т 23. — № 1-2. — С. 30-39.

2. Никифорова, Т. А. Основы микробного синтеза лимонной кислоты. / Т А. Никифорова, Л. Н. Мушникова, Е. Б. Львова. — СПб.: Полиграфическое предприятие № 3, 2005. — 180 с.

3. Пат. № 2428481, Российская Федерация, МПК С 12 Р 7/48. Способ получения лимонной кислоты / Т. В. Выборнова, ТА. Никифорова, В. П. Комов, Л. Б. Пиотровский, М. А Дум-нина, Е. В. Литасова; заявитель и патентообладатель ГУ ВНИИПАКК. № 2010112411; Заяв. 30.03.2010, опубл. 10.09.2011; Бюл. № 25.

4. Hondmann, D. H. Screening method for large numbers of dye-adsorbents for enzyme purification / D. H. Hondmann, J. Visser // J. Chromatogr. — 1990. — Т 510. — С. 155-164.

5. Ruijter, G. J. G. Properties of Aspergillus niger citrate synthase and effects of citA overexpression on citric acid production / G. J. G. Ruijter [et al] // FEMS Microbiol. Lett. — 2000. -Т 184. — С. 35-40.

6. Labrou, N. E. Dye-ligand affinity adsorbents for enzyme purification / N. E. Labrou // Mol. Biotechnol. — 2002. — Т 20. — № 1. — С. 77-84.

7. Magdeldin S., Moser A. Affinity Chromatography: Principles and Applications / S. Magdeldin, A. Moser; Под ред. S. Magdeldin. Rijeka, Croatia: InTech, 2012. — С. 3-29.

8. Kispal, G. Studies on yeast peroxisomal citrate synthase / G. Kispal, P Srere // Arch. Biochem. Biophys. — 1991. — Т 286. — № 1. — С. 132-137.

9. Kubicek, C. P. Regulation of citrate synthase from the citric acid-accumulating fungus, Aspergillus niger / C. P Kubicek, M. Rohr // Biochim. Biophys. Acta. — 1980. — Т 615. — № 2. — С. 449-457.

10. Karaffa L., Kubicek C. P. Aspergillus niger citric acid accumulation: do we understand this well working black box// Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. Т 61. С. 189-196.

11. Cordewener J., Busink R., Visser J. A permeabilized cell assay system for studying enzyme regulation and localisation in Aspergillus niger // J. Microbiol. Methods. 1989. Т. 10. С. 231-240.

12. Beeckmans, S. Purification and Physicochemycal Characterization of Chicken Heart Citrate Synthase / S. Beeckmans, L. Kanarek // Int. J. Biochem. — 1983. — Т 15. — № 4. — С. 469-478.

13. Moriyama, T. Purification of Rat and Rat Liver Citrate Synthases. Physical, Kinetic, and Immunological Studies / T Moriyama, P. A. Srere // J. Biol. Chem. — 1971. — Т 246. — № 10. — С. 3217-3223.

14. Srere, P. Citric Acid Cycle / P. Srere // Methods Enzymol. — 1969. — Т 13. — № 1945. — С. 3-11.

15. Johansson, C. J. Substrate-inhibiton by acetyl-CoA in the condensation reaction between oxaloacetate and acetyl-CoA catalyzed by citrate synthase from pig heart / C. J. Johansson, G. Pettersson // Biochim. Biophys. Acta. — 1977. — Т 484. — № 1. — С. 208-215.

процессе сверхсинтеза и накопления цитрата продуцентом Л. niger, а также могут быть использованы в качестве параметров контроля протекания процесса ферментации и биосинтетической активности гриба. Помимо этого, были установлены кинетические характеристики фермента и сопоставлены с таковыми для других видов.

References

1. Plassard C., Fransson P. Regulation of low-molecular weight organic acid production in fungi. Fungal Biol. Rev., 2009, vol. 23, no. 1-2, pp. 30-39.

2. Nikiforova T. A., Mushnikova L. N., L'vova E. B. Osnovy mik-robnogo sinteza limonnoi kisloty [Fundamentals of microbial synthesis of citric acid]. St. Petersburg, Polygraphic enterprise No. 3 Publ., 2005. 180 p.

3. Vybornova T V, Nikiforova TT A., Komov V P., Piotrovskii L. B., Dumnina M. A., Litasova E. V. Sposob polucheniya limonnoi kisloty [Method for the production of citric acid]. Patent RF No. 2428481, MPK S 12 R 7/48; 10.09.2011.

4. Hondmann D. H., Visser J. Screening method for large numbers of dye-adsorbents for enzyme purification. J. Chromatogr., 1990, vol. 510, pp. 155-164.

5. Ruijter G. J. G. et al. Properties of Aspergillus niger citrate synthase and effects of citA overexpression on citric acid production. FEMS Microbiol. Lett., 2000, vol. 184, pp. 35-40.

6. Labrou N. E. Dye-ligand affinity adsorbents for enzyme purification. Mol. Biotechnol., 2002, vol. 20, no. 1, pp. 77-84.

7. Magdeldin S., ed., Moser A. Affinity Chromatography: Principles and Applications. Rijeka, Croatia, InTech, 2012, pp. 3-29.

8. Kispal G., Srere P. Studies on yeast peroxisomal citrate synthase. Arch. Biochem. Biophys., 1991, vol. 286, no. 1, pp. 132137.

9. Kubicek C. P., Röhr M. Regulation of citrate synthase from the citric acid-accumulating fungus, Aspergillus niger. Biochim. Biophys. Acta, 1980, vol. 615, no. 2, pp. 449-457.

10. Karaffa L., Kubicek C. P. Aspergillus niger citric acid accumulation: do we understand this well working black box. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2003, vol. 61, pp. 189-196.

11. Cordewener J., Busink R., Visser J. A permeabilized cell assay system for studying enzyme regulation and localisation in Aspergillus niger. J. Microbiol. Methods, 1989, vol. 10, pp. 231240.

12. Beeckmans S., Kanarek L. Purification and Physicochemycal Characterization of Chicken Heart Citrate Synthase. Int. J. Biochem, 1983, vol. 15, no. 4, pp. 469-478.

13. Moriyama T., Srere P. A. Purification of Rat and Rat Liver Citrate Synthases. Physical, Kinetic, and Immunological Studies. J. Biol. Chem., 1971, vol. 246, no. 10, pp. 32173223.

14. Srere P. Citric Acid Cycle. Methods Enzymol, 1969, vol. 13, no. 1945, pp. 3-11.

15. Johansson C. J., Pettersson G. Substrate-inhibiton by acetyl-CoA in the condensation reaction between oxaloacetate and acetyl-CoA catalyzed by citrate synthase from pig heart. Biochim. Biophys. Acta, 1977, vol. 484, no. 1, pp. 208-215.

Исследование активности цитратсинтазы гриба Aspergillus niger — продуцента лимонной кислоты

Ключевые слова

Aspergillus niger; лимонная кислота; кинетическая характеристика фермента; мицелий гриба; продуцент; синтез; цитратсинтаза.

Реферат

Образование лимонной кислоты осуществляется в цикле три-карбоновых кислот (ЦТК), где важнейшая роль в регуляции ее синтеза принадлежит цитратсинтазе. Сегодня нет полного понимания механизма сверхсинтеза микробной клеткой лимонной кислоты. Разработка методов выделения ключевого фермента ЦТК, исследование его роли в скорости протекания реакции и регуляции направленности процесса представляют научный и практический интерес. В экспериментах использован промышленный продуцент лимонной кислоты ВКПМ F-171, полученный методом направленного мутагенеза в сочетании с УФ-облуче-нием. Продуцент лимонной кислоты культивировали в шейке-рах-инкубаторах Multitron (Швейцария) периодическим способом на сахарозоминеральных средах. Мицелий гриба разрушали либо посредством механического растирания в жидком азоте (< 10 г), либо на шаровой мельнице с ледяным охлаждением (> 10 г). Основными новшествами были введение в экстракционный буфер агентов, подавляющих пенообразование, детергентов, улучшающих лизис биомембран. При выделении цитратсинтазы применена соникация (не более 5 мин) для разрушения ДНК-англомератов и улучшения реологических свойств и осветления раствора (фильтрацией). Установлено, что при выделении цитратсинтазы из мицелия гриба наиболее эффективен метод батч-адсорбции. Фермент в очищенном состоянии становится высоколабильным. Изучение цитратсинтазной активности в гомогенатах показало, что к концу процесса культивирования активность фермента снижается, а максимальная активность фермента приходится на пик ацидогенеза, наблюдаемого на третьи сутки культивирования продуцента. Кинетическая характеристика фермента цитратсинтазы гриба была изучена в бесклеточных гомогенатах при pH 7,5. Константа Михаэлиса для ацетил-КоА составила 29 мкМ (при 0,5 мМ оксалоацетата, pH 7,5), для оксалоацетата 9 мкМ (0,3 мМ ацетил-КоА, pH 7,5). Данные значения констант Михаэлиса для двух субстратов фермента находят подтверждения в теории Йоханс-сона и Петтерсона о последовательном механизме функционирования цитратсинтазы.

Авторы

Никифорова Татьяна Алексеевна, д-р техн. наук, профессор;

Выборнова Татьяна Владимировна

Всероссийский НИИ пищевых добавок,

191014, г. Санкт-Петербург, Литейный пр., д. 55,

vniipakk55@mail.ru

Комов Вадим Петрович, д-р техн. наук, профессор;

Алексеев Камиль Владимирович, аспирант

Санкт- Петербургская государственная

химико-фармацевтическая академия,

197022, г. Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д. 14, Лит. А,

komov.vadim@yandex.ru, hermelynn@mail.ru

Research Study of citrate Aynthase Activity of Aspergillus niger — a citric acid producer

Key words

Aspergillus niger; citric acid; enzyme kinetic performance; fungus mycelium; producer; synthesis; citrate synthase.

Abstract

The formation of citric acid is carried out in the cycle of tricarboxylic acids (CTC), where the most important role in the regulation of its synthesis belongs to citrate synthase. Today, there is no complete understanding of the mechanism of supersynthesis by the microbial cell of citric acid. The development of methods for isolating the key enzyme of the CTC, the study of its role in the rate of reaction and the regulation of the direction of the process are of scientific and practical interest. In the experiments, the industrial citric acid producer VKPM F-171 was used, obtained by directional mutagenesis in combination with UV irradiation. The citric acid product was cultivated in multitron shakers (Switzerland) in a batch process on saccharose-mineral environments. Mycelial fungus was destroyed either by mechanical grinding in liquid nitrogen (< 10 g), or on a ball mill with ice cooling (> 10 g). The main innovations were the introduction into the extraction buffer of agents that inhibit foaming, detergents that improve the biomembrane lysis. With the isolation of citrate synthase, a sonication (no more than 5 minutes) is used to destroy DNA-anglomerates and improve the rheological properties and clarify the solution (by filtration). It has been established that the batch-adsorption method is most effective in isolating citrate synthase from the fungal mycelium. The enzyme in the purified state becomes highlabile. The study of citrate synthase activity in homogenates showed that by the end of the cultivation process, the activity of the enzyme decreases, and the maximum enzyme activity falls on the peak of acidogenesis observed on the third day of cultivation of the producer. The kinetic characteristics of the fungus citrate synthase enzyme were studied in cell-free homogenates at pH 7.5. The Michaelis constant for acetyl-CoA was 29 pM (at 0.5 mM oxaloacetate, pH 7.5), for oxaloacetate 9 pM (0.3 mM acetyl-CoA, pH 7.5). These values of Michaelis constants for two substrates of the enzyme are confirmed in the theory of Johansson and Petterson on the sequential mechanism of citrate synthase.

Authors

Nikiforova Tatiana Alekseevna,

Doctor of Technical Sciences, Professor;

Vybornova Tatiana Vladimirovna

All-Russia Scientific Research Institute for Food Additives,

55 Liteyny pr., St. Petersburg, 191014, Russia, vniipakk55@mail.ru

^mov Vadim Petrovich, Doctor of Biological Sciences, Professor;

Alekseev Kamil Vladimirovich, Post-graduate Student

St. Petersburg State Chemical Pharmaceutical Academy,

14 Lit. A Professora Popova str., St. Petersburg, 197022, Russia,

komov.vadim@yandex.ru; hermelynn@mail.ru