СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПЛОТНОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ
METHOD OF PREPARING SOLID CULTURE MEDIUM

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к способам приготовления плотных питательных сред для культивирования микроорганизмов, и может быть использовано в практике микробиологических лабораторий.
Известен способ приготовления плотных питательных сред для выращивания микроорганизмов, заключающийся в добавлении к жидкой питательной основе специальных добавок по предназначению (микро- и макроэлементов в составе разных химических соединений, индикаторов, стимуляторов и ингибиторов роста, красителей и др.) и уплотнителей (отвердителей), способных к гелеобразованию и придающих плотность этим средам (Методы общей бактериологии / Под ред. Ф.Герхардта // Пер. с англ., под ред. Е.Кондратьевой и Л.Калакуцкого в 3 т. - М.: Мир, 1983. - Т.1 - 536 с).
К недостаткам данного способа следует отнести то, что застывшие агаровые гели обеспечивают относительно слабый уровень диффузии питательных веществ, индикаторных и биологически активных добавок в плотных средах в направлении растущей на поверхности плотной среды микробной культуры, что, в конечном итоге, приводит к замедлению роста микробных культур и снижению урожая микробных клеток.
Наиболее близким к заявляемому является способ приготовления плотной среды, где в качестве уплотнителя используется агар в количестве 2,5% (в зависимости от вида среды и качества самого агара) (Семенов С. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. - М.: Агропромиздат, 1990. - С.86-94.). Питательный субстрат растворяют в воде, добавляют необходимое количество агар-агара и нагревают до полного растворения в автоклаве текучим паром в течение 40-90 мин. По окончании кипячения объем среды доводят до первоначального значения горячей дистиллированной водой и кипятят еще 2-3 мин. Расплавленную среду помещают в теплое место, чтобы она отстоялась, и фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр. Осадок не используют. Проверяют и если нужно корректируют рН, затем разливают в соответствующую посуду, не замачивая края горлышек, куда вставляют ватные пробки. Стерилизуют среду 15-30 мин автоклавированием при температуре в автоклаве 120°С. После стерилизации плотную питательную среду асептически разливают в чашки Петри, пробирки и другую микробиологическую посуду, в которой агаровый гель застывает при охлаждении.
Общим с заявляемым способом является использование при приготовлении плотных питательных сред уплотнителей, источников углерода, азота, фосфора, минеральных солей, микроэлементов, других питательных и дополнительных ингредиентов и технологии, обычно применяемой при приготовлении плотных питательных сред.
К недостаткам данного способа следует отнести то, что плотные питательные среды, получаемые принятым способом, из-за относительно низкого уровня диффузии в застывшем геле питательных веществ (химических микро- и макроэлементов, воды, углеводов и т.д.) индикаторных и биологически активных добавок в направлении растущей на поверхности плотной среды микробной культуры, не обеспечивают должный интенсивный рост и прорастание всей засеваемой популяции микроорганизмов.
Задачей предполагаемого изобретения является разработка способа приготовления плотной питательной среды, позволяющего увеличить интенсивность роста и получаемый урожай культур микроорганизмов, засеваемых на эти среды.
Поставленная задача решается путем внесения предварительно приготовленной эмульсии смеси перфторорганических соединений (ПФОС) - перфтор-1,3-диметилциклогексана (карбогала) и перфтордекалина в соотношении 3:1 со средними размерами эмульгированных частиц 90-270 нм до конечной общей концентрации 0,2-0,3 мас.% в расплавленную после стерилизации в автоклаве плотную питательную среду, имеющую жидкую консистенцию при охлаждении до температуры (60±5)°С.
8
16
2
-1
3
Карбогал (КГ, химическая формула - CF), ТУ 95-1693 - бесцветная прозрачная негорючая жидкость без запаха, с вязкостью 1,04 мм× сСт при 25°С, плотностью 1,85 г/см и температурой кипения 102°С. КГ не растворим в воде и в органических растворителях, смешивается без ограничений с фторуглеродными жидкостями, обладает исключительно высокими физической и химической устойчивостью, взаимодействует с кислотами и щелочами при температуре выше 450°С.
10
18
2
3
Перфтордекалин (ПФД, химическая формула - CF), ТУ 95-1233 - бесцветная прозрачная негорючая жидкость без запаха, с вязкостью 2,74 мм× сСт при 25°С, плотностью 1,945 г/см и температурой кипения 155°С. ПФД не растворим в воде и в органических растворителях, смешивается с фторуглеродными жидкостями без ограничений, обладает исключительно высокими физической (термически устойчив до 400°С) и химической устойчивостью, взаимодействует с кислотами и щелочами при температуре выше 400°С, является основным компонентом голубой крови (Перфторорганические соединения в биологии и медицине/ Под ред. Г.Р.Иваницкого и В.В.Мороза. - Пущино, 1999. - 286 с). КГ и ПФД не являются питательными веществами и не утилизируются микроорганизмами.
2
Наличие в агаровом геле 0,2-0,3 мас.% эмульгированных частиц смеси КГ и ПФД в указанном соотношении в застывшей при ее охлаждении плотной питательной среде эффективно поддерживает диффузию питательных веществ к растущей культуре микроорганизмов и высокий уровень обмена между средой и микробными клетками. При этом в среде формируется двухфазная система, где, на границе раздела фаз, частицы ПФОС, имеющие суммарную площадь поверхности около 12-18 м, обеспечивают существенное повышение уровней диффузии и оптимальные условия для направленного перемещения потоков питательных веществ, клеточных метаболитов, индикаторных и биологически активных добавок в плотных средах в направлении растущей на поверхности плотной среды микробной культуры, что в конечном итоге приводит к улучшению условий прорастания всей засеваемой популяции микроорганизмов, увеличению интенсивности роста и увеличению урожая растущей микробной культуры.
КГ, ПФД и 0,01 мас.% агар в дистиллированной воде стерилизуются отдельно текучим паром в течение 50 мин, затем КГ и ПФД смешиваются асептически в соотношении 3:1 при температуре 60-70°С и при данной температуре к данной смеси добавляется равное количество по массе стерилизованного жидкого 0,01 мас.% водного агара. Полученная неоднородная смесь подвергается в течение 20 мин перемешиванию на высокоскоростной мешалке без доступа воздуха и газов при скорости вращения ротора не менее 6 тысяч об/мин с погружением вращающейся лопасти или турбины мешалки в смесь ПФОС при температуре 55-65°С. Полученная данным методом эмульсия содержит взвесь ПФОС со средним размером частиц в диапазоне от 90-270 нм, не подвергающихся коалесценции в течение не менее 20 сут при температуре 10-22°С. Полученную эмульсию с содержанием 50 мас.% по массе ПФОС используют в дальнейшем в качестве добавки в расплавленные плотные питательные агаровые среды после их охлаждения до (60±5)°С. Для получения конечной концентрации смеси ПФД и КГ 0,2-0,3 мас.%, в среду добавляют 0,4-0,6 мас.% приготовленной эмульсии ПФОС.
Сущность предложенного способа заключается в следующем. Питательный субстрат растворяют в воде, добавляют ингредиенты согласно стандартной прописи среды и необходимое количество агар-агара, нагревают до полного растворения в автоклаве текучим паром в течение 20-90 мин. По окончании кипячения объем среды доводят до первоначального значения горячей дистиллированной водой и кипятят еще 2-3 мин. Расплавленную среду помещают в теплое место, чтобы она отстоялась, и фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр. Осадок не используют. Проверяют и если нужно корректируют рН, затем разливают в соответствующую посуду, не замачивая края горлышек, куда вставляют ватные пробки. Стерилизуют среду 15-40 мин автоклавированием при давлении насыщенного пара 0,2-0,3 МПа, обеспечивающего температуру в автоклаве 121-134°С. Затем в плотную питательную среду, имеющую жидкую консистенцию после стерилизации в автоклаве и охлаждении до температуры (60±5)°С, вносят 0,2-0,3 мас.% предварительно приготовленной эмульсии смеси перфторорганических соединений в соотношении 3:1 перфтор-1,3-диметилциклогексана и перфтор декалина со средними размерами эмульгированных частиц 90-270 нм. После этого плотную питательную среду асептически разливают в чашки Петри, пробирки и другую микробиологическую посуду, в которой среда застывает при охлаждении. Полученные плотные питательные среды выдерживают 1 сут и засевают известным способом (шпателем, иглой, пипеткой и т.п.), после чего инкубируют требуемое время в условиях, необходимых для культивирования конкретных микроорганизмов.
Изобретение позволяет улучшить условия прорастания популяции микроорганизмов, повысить интенсивность роста микробной культуры и увеличить урожай культур, засеваемых на разные плотные питательные среды, приготовленные разработанным способом.
Возможность осуществления изобретения показана следующими примерами. В качестве тест-микробов использовали лабораторные штаммы микроорганизмов различных таксономических групп Escherichia coli М 17, Saccharomyces cerevisiae 5, Pseudomonas putida 15, Azotobacter chroococcum 17, Fusarium nivale 1727 и Streptomyces purpurogeniscleroticus ВБМ 158 (таблицы 1-8).
Для выращивания культур микроорганизмов использовали плотные питательные среды, имеющие стандартные прописи ингредиентов, приготовленные обычным и предлагаемым способами.
3
Количество живых клеток в 1 см исследуемой суспензии (М) определяли чашечным методом Коха - путем высева соответствующих десятикратных разведений исследуемой суспензии микроорганизмов на плотные питательные среды и расчетом по формуле
,
а
где  - среднее число колоний при высеве из данного разведения;
10 - коэффициент разведения;
n - порядковый номер разведения, из которого сделан высев;
3
V - объем суспензии, взятый для посева (см).
В качестве посевных в экспериментах использовали культуры микроорганизмов, выращенные на плотной питательной среде в течение 24-72 ч, разведенные физиологическим раствором до заданной концентрации по оптическому стандарту мутности (ОСМ) ГИСК им. Л.А.Тарасевича.
6
Под урожаем понимали конечное количество микроорганизмов, выросших на средах в заданных условиях при высеве 10 микробных клеток по ОСМ на чашку Петри.
В качестве контроля использовали высевы тех же разведений приготовленных суспензий микроорганизмов на плотные питательные среды того же состава, но приготовленные без использования ПФОС.
По результатам, представленным в таблицах 1-8, видно, что разные по составу плотные питательные среды, специфичные для микроорганизмов разных таксономических групп, при использовании предлагаемого способа их приготовления с внесением в застывающий после стерилизации агаровый гель 0,2-0,3 мас.% эмульгированных частиц смеси КГ и ПФД соотношении 3:1 обеспечивает улучшение условий прорастания засеваемой популяции микроорганизмов на 10,5-44,4% и увеличение урожая растущей микробной культуры на 16,3-41,6% без внесения в состав сред дополнительных количеств питательных веществ.
Таблица 1
Количество клонов бактерий родов Escherichia и Pseudomonas, вырастающих на мясопептонном агаре и среде Эйкмана, приготовленных принятым и предлагаемым способами, при высеве 10<sup>2</sup> микробных клеток по ОСМ на чашку Петри <img file="00000002.tif" he="6" wi="32" img-content="undefined" img-format="tif" />
Среда
Способ приготовления среды
Количество клонов бактерий штамма выросших на плотной среде, абсолютное число (в процентах к контролю)
Е. coli M 17
P. putida 15
Мясопептонный агар
принятый (контроль)
84±6 (100,0)
57±5 (100,0)
предлагаемый
97±6 (115,4)
63±4 (110,5)
Эйкмана
принятый (контроль)
86±8 (100,0)
61±5 (100,0)
предлагаемый
106±7 (123,3)
69±6 (113,1)
Таблица 2
Урожай культур бактерий родов Escherichia и Pseudomonas за 24 ч роста на мясопептонном агаре и среде Эйкмана, приготовленных принятым и предлагаемым способами, при высеве 10<sup>6</sup> микробных клеток по ОСМ на чашку Петри <img file="00000003.tif" he="6" wi="32" img-content="undefined" img-format="tif" />
Среда
Способ приготовления среды
Урожай культуры бактерий штамма…, полученный на плотной среде, абсолютное число ×10<sup>9</sup> (в процентах к контролю)
Е. coli M 17
P. putida 15
Мясопеп-тонный агар
принятый (контроль)
27±3 (100,0)
21±3 (100,0)
Эйкмана
предлагаемый
34±3 (125,9)
26±4 (123,8)
принятый (контроль)
31±4(100,0)
40±4(100,0)
предлагаемый
38±3 (122,6)
49±5 (122,5)
Таблица 3
Количество клонов микромицетов родов Fusarium и Saccharomyces на средах Сабуро и Чапека, приготовленных принятым и предлагаемым способами, при высеве 10<sup>2</sup> микробных клеток по ОСМ на чашку Петри <img file="00000003.tif" he="6" wi="32" img-content="undefined" img-format="tif" />
Среда
Способ приготовления среды
Количество клонов микромицетов штамма выросших на плотной среде, абсолютное число (в процентах к контролю)
S. cerevisiae 5
F. nivale - 1727
Сабуро
принятый (контроль)
27±3 (100,0)
57±5 (100,0)
предлагаемый
39±3 (144,4)
63±4 (110,5)
Чапека
принятый (контроль)
21±4(100,0)
61±5 (100,0)
предлагаемый
29±3 (138,1)
69±6 (113,1)
Таблица 4
Урожай культур микромицетов родов Fusarium и Saccharomyces за 72 ч роста на средах Сабуро и Чапека, приготовленных принятым и предлагаемым способами, при высеве 10<sup>6</sup> микробных клеток по ОСМ на чашку Петри <img file="00000003.tif" he="6" wi="32" img-content="undefined" img-format="tif" />
Среда
Способ приготовления среды
Урожай культуры микромицетов штамма полученный на плотной среде, абсолютное число ×10<sup>7</sup> (в процентах к контролю)
S. cerevisiae 5
F. nivale - 1727
Сабуро
принятый (контроль)
42±4 (100,0)
21±3 (100,0)
предлагаемый
58±5 (138,1)
28±3 (133,3)
Чапека
принятый (контроль)
36±4 (100,0)
18±4 (100,0)
предлагаемый
51±5 (141,6)
25±3 (138,8)
Таблица 5
Количество клонов актиномицета Streptomyces purpurogeniscleroticus ВБМ 158 на овсяном агаре и среде Ваксмана, приготовленных принятым и предлагаемым способами, при высеве 10<sup>2</sup> микробных клеток по ОСМ на чашку Петри <img file="00000003.tif" he="6" wi="32" img-content="undefined" img-format="tif" />
Среда
Способ приготовления среды
Количество клонов актиномицета, выросших на плотной среде, абсолютное число (в процентах к контролю)
Овсяный агар
принятый (контроль)
41±3 (100,0)
предлагаемый
55±4 (134,1)
Ваксмана
принятый (контроль)
34±3 (100,0)
предлагаемый
48±4 (141,2)
Таблица 6
Урожай культуры актиномицета Streptomyces purpurogeniscleroticus ВБМ 158 за 72 ч роста на овсяном и картофельный агарах, приготовленных принятым и предлагаемым способами, при высеве 10<sup>6</sup> микробных клеток по ОСМ на чашку Петри <img file="00000004.tif" he="6" wi="32" img-content="undefined" img-format="tif" />
Среда
Способ приготовления среды
Урожай культуры актиномицета, полученный на плотной среде, абсолютное число ×10<sup>7</sup> (в процентах к контролю)
Овсяный
принятый (контроль)
26±3 (100,0)
агар
предлагаемый
33±4 (126,9)
Картофельный агар
принятый (контроль)
19±3 (100,0)
предлагаемый
25±3 (131,6)
Таблица 7
Количество клонов A. chroococcum 17 на агаровых средах Эшби и Федорова, приготовленных принятым и предлагаемым способами, при высеве 10<sup>2</sup> микробных клеток по ОСМ на чашку Петри <img file="00000005.tif" he="6" wi="32" img-content="undefined" img-format="tif" />
Среда
Способ приготовления среды
Количество клонов азотобактера, выросших на плотной среде, абсолютное число (в процентах к контролю)
Эшби
принятый (контроль)
61±3 (100,0)
предлагаемый
71±4(116,4)
Федорова
принятый (контроль)
58±3 (100,0)
предлагаемый
70±4 (120,7)
Таблица 8
Урожай культуры A. chroococcum 17 за 48 ч роста на агаровых средах Эшби и Федорова, приготовленных принятым и предлагаемым способами, при высеве 10<sup>6</sup> микробных клеток по ОСМ на чашку Петри <img file="00000006.tif" he="6" wi="32" img-content="undefined" img-format="tif" />
Среда
Способ приготовления среды
Урожай культуры азотобактера, полученный на плотной среде, абсолютное число ×10<sup>8 </sup>(в процентах к контролю)
Эшби
принятый (контроль)
49±5 (100,0)
предлагаемый
57±4 (116,3)
Федорова
принятый (контроль)
41±4(100,0)
предлагаемый
52±3 (126,8)