Способ прогнозирования появления отдаленных метастазов меланомы хориоидеи
METHOD FOR PREDICTING THE APPEARANCE OF DISTANT METASTASES OF MELANOMA OF THE CHOROID

Изобретение относится к медицине, в частности к специальности Патологическая анатомия, Офтальмология, Онкология. Предлагаемый способ информативен и может быть применен в работе врача-патологоанатома на этапе хирургического лечения меланомы хориоидеи (MX) в ходе прижизненного патолого-анатомического исследования операционного материала энуклеированных глаз на основании разработанной модели прогнозирования появления отдаленных метастазов MX, которая с чувствительностью 83,3% и специфичностью 92% позволяет прогнозировать появление вторичных очагов опухоли.
Данный способ позволяет спрогнозировать появление отдаленных метастазов MX на основе количественных показателей лимфоцитов и макрофагов, а также количественных показателей объемной плотности кровеносных сосудов в опухоли.
Ранняя диагностика метастазов, а также прогнозирование их появления при различных злокачественных новообразованиях (ЗНО) является актуальной в современной онкоморфологии с целью формирования скрининговых групп пациентов, потенциально угрожаемых по развитию метастатической болезни, а также для дальнейшей разработки углубленного клинико-инструментального дообследования и возможных подходов к лечебной тактике ведения.
MX метастазирует вне зависимости от метода проведенного лечения. Таким образом прогнозирование появления ее вторичных очагов - актуальная проблема современной офтальмоонкологии. MX преимущественно метастазирует гематогенным путем, существенно снижая показатели выживаемости пациентов с данной патологией. Процессы ангиогенеза в опухоли, а также склонность атипичных клеток к «васкулярной мимикрии» играют важную роль в развитии отдаленных метастазов [Grossniklaus Н.Е., Eberhart C.G., Kivela T.T., editors (2018). WHO Classification of tumours of the eye. 4th edition. Lyon: IARC. 228р.]. При этом, вне зависимости от метода лечения, отдаленные метастазы могут выявляться с частотой в диапазоне 12-50% [Li Y, Shi J, Yang J, Ge S, Zhang J, Jia R, Fan X. Uveal melanoma: progress in molecular biology and therapeutics. Ther Adv Med Oncol. 2020; 12:1758835920965852. DOI: 10.1177/1758835920965852.; Beran TM, McCannel ТА, Stanton AL, Straatsma BR, Burgess BL. Reactions to and desire for prognostic testing in choroidal melanoma patients. Journal of genetic counseling. 2009;18(3):265-274. DOI: 10.1007/s 10897-009-9223-2; Damato BE, Heimann H, Kalirai H, Coupland SE. Age, survival predictors, and metastatic death in patients with choroidal melanoma: tentative evidence of a therapeutic effect on survival. JAMA ophthalmology. 2014;132 (5):605-13. DOI: 10.1001/jamaophthalmol.2014.77.; Панова И.Е., Власова O.C., Гюнтнер Е.И., Самкович Е.В., Шаманова А.Ю. Клинико-инструментальные критерии риска метастазирования меланомы хориоидеи. Российский офтальмологический журнал. 2019;12(3):30-36. DOI: 10.21516/2072-0076-2019-12-3-30-36; Panova IE, Vlasova OS, Gyuntner EI, Samkovich EV, Shamanova AYu. Clinical and instrumental criteria for the risk of metastasis of choroid melanoma. Russian Ophthalmological Journal. 2019;12(3):30-36 (in Russ.). DOI: 10.21516/2072-0076-2019-12-3-30-36; Pham ChM, Custer PL, Couch SM. Comparison of primary and secondary enucleation for uveal melanoma. Orbit. 2017; 36(6):422-427. DOI: 10.1080/01676830.2017.1337183].
Последние годы обсуждается взаимодействие между клетками увеальной меланомы и ее микроокружением (лимфоциты, макрофаги), а также противоопухолевое и проопухолевое воздействие последних. Авторами показано, что к факторам неблагоприятного прогноза MX относятся повышенная инфильтрация MX туморинфильтрирующими лимфоцитами, макрофагами, пожилой возраст пациента, развитая сосудистая сеть [Impact of macrophages on tumor growth characteristics in a murine ocular tumor model /Stei M.M., Loeffler K.U., Kurts C, Hoeller Т., Pfarrer C, Holz F.G., Herwig-Carl M.C. // Exp Eye Res. - 2016. - 151. - P. 9-18. doi: 10.1016/j.exer.2016.07.008.; Makitie Т., Summanen P., Tarkkanen A.,Kivela T. Tumor-infiltrating macrophages (CD68(+) cells) and prognosis in malignant uveal melanoma / Invest Ophthalmol Vis Sci. - 2001. - 42(7). - P. 1414-21.].
В некоторых работах показано, что для выявления скрытого метастазирования увеальных меланом возможно исследовать иммунологические параметры (уровень лимфоцитов) в сыворотке крови пациентов [Патент №2147373 Российская Федерация, МПК G01N 33/53. Способ выявления скрытого метастазирования при увеальной меланоме: заявл. 19.06.1998: опубл. 10.04.2000 / Лихванцева В.Г., Бровкина А.Ф., Гусев Г.А., Юровская Н.Н.; заявитель Московский НИИ глазных болезней имени Гельмгольца. - 9 с.]. Данный способ успешно применяется для иммунологического исследования сыворотки крови, но имеют ограниченное применение, так как не позволяют оценить клеточное микроокружение в самой опухоли меланомах хориоидеи при прижизненном патологоанатомическом "исследовании операционного материала энуклеированных глаз. Данный способ взят нами за прототип.
А также известен способ оценки степени васкуляризации ткани, основанный на определении кровеносных сосудов в ткани ИГХ-методом с антителом CD34 и измерении удельной плотности кровеносных сосудов [Патент №2366951 Российская Федерация, МПК G01N 33/483. Способ оценки степени васкуляризации: 2019140755: заявл. 31.03.2008: опубл. 10.09.2009 / Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Франк Г.А., Петров А.Н., Батева М.В.; заявитель ФГУ МНИОИ им. П.А. Герцена Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи. - 6 с.]. Данный способ успешно применяется для иммуногистохимических исследований по специальности Патологическая анатомия, позволяет определить удельную плотность сосудов на единицу площади образца исследуемой ткани -отношение количества сосудов к площади исследуемой ткани. Данный способ имеет ограниченное применение, так как при данном способе оценивается только количество сосудов и не учитывается площадь просветов сосудов. Данный способ взят нами за прототип.
В основу предлагаемого способа положена задача, заключающаяся в определении количества CD4- Т-лимфоцитов хелперов/индукторов, CD68, Macrophage - макрофагов и объемной плотности кровеносных сосудов (иммунореактивных к CD34) в опухоли в ходе ИГХ исследования операционного материала энуклеированных глаз с опухолью и оценки полученных показателей относительно статистически достоверно рассчитанных пороговых уровней исследуемых параметров.
Данный способ подразумевает использование комбинации широко применяемых в патологической анатомии стандартных методов ИГХ -исследования с использованием нами предлагаемой комбинации маркеров (антител) для обнаружения эндотелия кровеносных сосудов (CD34), макрофагов (CD68, Macrophage), Т лимфоцитов хелперов / индукторов (CD 4). Использование конкретной комбинации исследований обусловлено задачей предлагаемого способа, которой является обнаружение и количественная оценка исследуемых клеток и сосудов для дальнейшего прогнозирования появления отдаленных метастазов меланомы хориоидеи.
Изготовление ИГХ-микропрепаратов опухоли проводится стандартными методиками.
Раскрытие предлагаемого способа
Технический результат - обеспечение возможности прогнозирования появления отдаленных метастазов MX на основе количественных показателей лимфоцитов и макрофагов, объемной плотности кровеносных сосудов в опухоли.
Предлагаемый способ включает в себя следующие этапы проведения:
1. Тканевой образец опухоли (меланомы хориоидеи), полученный после хирургического лечения (энуклеации), фиксируют в 10% забуференом формалине в течении 24 часов.
2. Осуществляют механизированную проводку материала в гистологическом процессоре в соответствии с программой аппарата Sakura, Tissue-Tek Xpress х50.
3. Заливают тканевой материал в парафиновые блоки и нарезают гистологические срезы на микротоме, тканевые срезы толщиной до 4 мкм (для дальнейшего ИГХ -исследования).
4. Осуществляют постановку ИГХ-реакции в аппаратах согласно стандартным протоколам проведения исследования в аппаратах:
A. в аппарате для иммуногистохимии «Бонд - III» (Bond- III) с принадлежностями 2020 используют антитела CD68 (514Н12) (Bond).
При помощи автоматических устройств Ventana BenchMark. используют антитела к эндотелию кровеносных сосудов CD34 (Clone QBEnd 10), первичное антитело Ready-to-use (Ventana)); к Т-лимфоцитам хелперам/индукторам CD4 (Clone SP35) первичное антитело Ready-to-use (Ventana)); Macrophage (Clone HAM56) (Ventana).
Б. в иммуностейнере автоматическом Ventana BenchMark ULTRA IHC/ISH system используют антитела CD34 (Clone QBEnd 10), CD4 (Clone SP35), Macrophage (Clone HAM56).
B. В аппарате для иммуногистохимии «Бонд - III» (Bond- III) с принадлежностями 2020 используют антитела к макрофагам (CD68 (Clone 514Н12) первичное антитело Ready-to-use (Bond)).
5. Оценить приготовленные гистологические препараты с помощью световой микроскопии с оценкой области опухоли на 10 полей зрения при увеличении микроскопа 400. Сформировать оцифрованное электронное изображение микропрепарата (приготовленные микропрепараты фотографируются через встроенную в световой микроскоп камеру или сканируются в гистосканере) с использованием стандартных прикладных компьютерных программ проводят количественное вычисление исследуемых параметров с подсчетом на 10 полей зрения при увеличении 400.
Этапы постановки ИГХ-реакции:
1. Приготовить парафиновые срезы ткани опухоли (меланомы хориоидеи) на стеклах с адгезивным покрытием, покрытых поли-L-лизином
2. Поместить стекла с размещенными на них тканевыми срезами в термостат на 24 часа при температуре 60,2 градусов по Цельсию.
3. Поместить стекла с размещенными на них тканевыми срезами в аппараты: аппарат для иммуногистохимии «Бонд - III» (Bond- III) с принадлежностями 2020; в иммуностейнер автоматический Ventana BenchMark ULTRA IHC/ISH system
4. Провести автоматизировано депарафинирование срезов ткани опухоли, предварительную обработку, нанесение первичных антител, инкубацию с антителами CD34 (Clone QBEnd 10) (Ventana), CD4 (Clone SP35), Macrophage (Clone HAM56), CD68 (Clone 514H12) (Bond), докрашивание гематоксилином в соответствии с инструкциями и протоколами работы с данными антителами аппаратов.
Принцип окрашивания при ИГХ-исследовании:
В соответствии с инструкциями к аппаратам и антителам продукты реакции преципитируются с комплексом антиген-антитело, окрашивая его в коричневый цвет и его оттенки. Гематоксилин обеспечивает визуализацию ядер клеток в срезах.
В результате окраски гематоксилином ядра клеток приобретают синий либо сине-фиолетовый цвет.
5. Стекла со срезами после протокола проводки в аппарате Ventana промыть в теплой мыльной воде. Провести дегидратацию тканевых срезов по протоколу изопропиловой проводки в аппарате карусельного типа Sakura, Tissue-Tek Xpress х50 в течении 1 минуты дважды в изопропиловом спирте (Изопреп (Biovitrum)), по 1 мин дважды в ксилоле (Xylen for histology). Провести автоматизированное покрытие тканевых срезов на стеклах под покровную пленку в аппарате Sakura, Tissue-Tek Film.
6. Стекла со срезами после протокола проводки в аппарате Bond поместить для автоматизированного покрытия тканевых срезов под покровную пленку в аппарат Sakura, Tissue-Tek Film.
Оценить приготовленные гистологические препараты с помощью световой микроскопии с оценкой области опухоли на 10 полей зрения при увеличении микроскопа 400. При этом участки микропрепарата, содержащие иммунопозитивный компонент, окрашиваются в коричневый цвет и его оттенки, маркируют кровеносные сосуды (при проведении реакции с антителами к CD34), Т-лимфоциты хелперы/индукторы (с антителами к CD4), макрофаги (с антителами к CD68, Macrophage), а иммунонегативные - окрашиваются в сине-фиолетовый и оттенки синего или серого цветов [Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. - 4-е изд., доп. И перераб./ Под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина. - Казань, 2012. - 624 с.]. Использование конкретной комбинации маркеров обусловлено задачей предлагаемого способа, которой является обнаружение и количественная оценка объемной плотности кровеносных сосудов в MX, количества инфильтрирующих ткань опухоли макрофагов и Т-лимфоцитов хелперов/индукторов. Таким образом, в ходе анализа ИГХ-микропрепаратов проводится оценка по интенсивной окраске данных клеток коричневым хромогеном с последующим подсчетом количества клеток.
В предлагаемом способе для прогнозирования отдаленных метастазов MX предлагается количественно определять параметры с комбинацией иммуногистохимических маркеров (антител) для обнаружения эндотелия кровеносных сосудов (CD34), CD 4- Т-лимфоцитов и макрофагов (CD68, Macrophage) [Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. - 4-е изд., доп. И перераб./ Под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина. - Казань, 2012. - 624 с.]. Использование конкретной комбинации маркеров обусловлено задачей предлагаемого способа, которой является обнаружение и количественный подсчет в опухоли объемной плотности кровеносных сосудов, количества макрофагов и Т-лимфоцитов хелперов/индукторов.
Формируется оцифрованное электронное изображение микропрепарата (приготовленные микропрепараты фотографируются через встроенную в световой микроскоп камеру или сканируются в гистосканере) с использованием стандартных прикладных компьютерных программ проводят количественное вычисление исследуемых параметров с подсчетом на 10 полей зрения при увеличении 400.
При патологоанатомическом исследовании энуклеированных глаз никакие манипуляции с пациентами не проводятся.
Для определения пороговых показателей исследуемых параметров в MX, для решения вышеуказанной задачи были исследованы 50 случая с меланомой хориоидеи (MX): 1 группа исследования представлена случаями MX без отдаленных метастазов (N=30) и 2 группа - с верифицированными отдаленными метастазами меланомы хориоидеи (в печень) (N=20).
Проведены гистологическое и иммуногистохимическое исследование (ИГХ) тканевых образцов с антителами к CD68, Macrophage для идентификации макрофагального звена клеточного окружения MX, CD 4- Т-лимфоцитов хелперов/индукторов, маркера к эндотелию кровеносных сосудов (CD 34). Для получения математической модели (уравнения) прогноза нами был проведен множественный логистический регрессионный анализ с принудительным включением трех переменных: показателей объемной плотности кровеносных сосудов (ИГХ исследование с использованием CD34), количество Т-лимфоцитов индукторов/хелперов CD4, количество макрофагов CD68, Macrophage. Проверка статистических гипотез показала, что уравнение (р<0,001) и его коэффициенты являются статистически значимыми (таблица 1).
где
- объемная плотность кровеносных сосудов (CD34).
- количество Т-лимфоцитов CD4,
- количество макрофагов CD68,
Р - вероятность появления метастазов опухоли.
Данная модель с чувствительностью 83,3% и специфичностью 92% позволяет прогнозировать появление метастазов MX, если рассчитанная по формуле вероятность Р - будет больше 0,5. Общий процент правильно классифицированных наблюдений составил 88,4%.
Применение данного способа в патологической анатомии, в онкологии позволит уже на этапе хирургического, лечения прогнозировать у пациентов появление отдаленных метастазов MX и в дальнейшем разрабатывать для данной категории больных прицельную скрининговую диагностику метастазов с целью раннего их обнаружения и коррекции тактики лечения.
Исходя из вышеперечисленного можно сделать вывод о том, что исследуемый способ информативен в отношении прогнозирования метастазов MX и может быть применен в работе врача-патологоанатома уже на этапе прижизненного: патолого-анатомического исследования операционного материала энуклеированных глаз при MX.