Влияние интервала времени между воздействием излучений разного качества на выживаемость клеток мышиной меланомы В-16

DOI: 10.21870/0131-3878-2019-28-1-59-67 УДК 616-006.04:612.014.482.4/6

Влияние интервала времени между воздействием излучений разного качества на выживаемость клеток мышиной меланомы В-16

Исаева Е.В., Бекетов Е.Е., Наседкина Н.В., Малахов Е.П., Трошина М.В., Лычагин А.А.,

Ульяненко Л.Н., Ульяненко С.Е.

МРНЦ им. А.Ф. Цыба - филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, Обнинск

В современных схемах лучевой терапии злокачественных новообразований используются излучения различного качества. Последовательность облучения и интервал между воздействиями могут быть различными. При сочетанном гамма-нейтронном воздействии вклад нейтронов в суммарную очаговую дозу, как правило, колеблется от 20 до 40%. Принимая во внимание биофизические особенности заряженных частиц и особенности процессов клеточного поражения и восстановления, при разных режимах воздействия редко- или плотноиони-зирующего излучений можно ожидать отличный по силе поражающий эффект. В настоящей работе исследовано влияние длительности временного интервала между облучениями клеток мышиной меланомы В-16 у-квантами 60Со со средней энергией 1,25 МэВ и нейтронами с энергией 14,1 МэВ. Источником нейтронного излучения служил портативный нейтронный генератор (НГ-14) непрерывного действия, разработанный во ВНИИ автоматики им. Н.Л. Духова (Москва); источником гамма-излучения - установка «Луч». Облучение проводили в двух последовательностях: сначала гамма-излучение, затем нейтронное ^-п), и наоборот (п^); интервал между воздействиями составлял 30, 60 и 120 минут. Эффективность облучения оценивали по количеству выживших клеток, определяемых по их клоногенной активности. Показано, что биологическая эффективность сочетанного действия нейтронов и фотонов не зависела от последовательности их применения. С увеличением длительности интервала между облучениями (от 30 до 120 мин) число выживших опухолевых клеток возрастало, т.е. в промежутках между воздействиями в клетках запускался механизм репарации сублетальных повреждений ДНК. Наиболее приемлемым, с точки зрения планирования схем сочетанной лучевой терапии, является интервал между облучениями фотонами и нейтронами независимо от их последовательности, не более 1 часа.

Ключевые слова: быстрые нейтроны, НГ-14, фотоны, сочетанное облучение, последовательность облучения, синергизм, репарация ДНК, клоногенная активность, меланома, клетки В-16.

Введение

Конкуренция в сфере разработки новых медицинских технологий, интенсивное внедрение методов ионной терапии, а также побочные негативные эффекты, наблюдавшиеся при лечении быстрыми нейтронами в 70-е годы прошлого столетия, привели к ограничению использования нейтронов и, как следствие, утрате возможностей реализации преимуществ нейтронной терапии в медицинской практике в целом [1]. В России дистанционная нейтронная терапия осуществляется в двух центрах: НИИ онкологии СО РАМН (Томск) и Уральском центре нейтронной терапии (Снежинск). В МРНЦ им. А.Ф. Цыба - филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России (Обнинск) нейтронная терапия не проводится с 2002 г., с момента выведения из эксплуатации реактора БР-10 (АО «ГНЦ РФ - ФЭИ», Обнинск). Вместе с тем, исследования биологических эффектов нейтронов с использованием портативных нейтронных генераторов с энергией ~14 МэВ (ИНГ-031, НГ-14, НГ-24), разработанных во ВНИИ автоматики им. Н.Л. Духова (Москва) продолжаются как в опытах in vitro, так и in vivo [2-6].

Исаева Е.В. - с.н.с., к.вет.н.; Бекетов Е.Е.* - зав. лаб., к.б.н.; Наседкина Н.В. - лаб.-иссл.; Малахов Е.П. - м.н.с.; Трошина М.В. - н.с.; Лычагин А.А. - зав. лаб., к.ф.-м.н.; Ульяненко Л.Н. - в.н.с., д.б.н., проф.; Ульяненко С.Е. - зав. отделом, д.б.н. МРНЦ им. А.Ф. Цыба -филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России.

•Контакты: 249036, Калужская обл., Обнинск, ул. Королёва, 4. Тел.: +7-910-514-9947; e-mail: beketov.ee@yandex.ru.

Современные тенденции использования быстрых нейтронов в лучевой терапии заключаются в отказе от их самостоятельного применения [1, 7]. Вместо этого используют схемы соче-танного гамма-нейтронного воздействия, в которых вклад нейтронов в суммарную очаговую дозу колеблется от 20 до 40%. Теоретическим обоснованием сочетанного применения редко- и плотноионизирующего излучений является предположение [8], из которого следует, что излучения с высокой и низкой линейной передачей энергии (ЛПЭ) не действуют независимо друг от друга, а существует взаимодействие между двумя типами излучений. Характер этого взаимодействия может зависеть как от вклада плотноионизирующего компонента в суммарную дозу облучения, так и от последовательности применения излучений и временного интервала между воздействиями.

В проведённых ранее исследованиях нами было показано, что при одновременном облучении клеток мышиной меланомы В-16 у-квантами 60Со и нейтронами с энергией 14,1 МэВ (с вкладом последних 15, 20 и 30% по физической дозе) по тесту клоногенной активности клеток наблюдался синергетический эффект [2, 9]. Целью данной работы являлось исследование влияния длительности временного интервала между облучениями нейтронами и у-квантами в разной последовательности на сохранение эффекта синергетического взаимодействия.

Материалы и методы

Клеточная линия. В качестве экспериментальной тест-системы использовали культуру клеток мышиной меланомы B-16F10. Культуру клеток получили из ГУЗ «Московский НИИ медицинской экологии», выращивали в монослое в культуральных флаконах с площадью поверхности 25 см2 (Corning, США) в среде RPMI-1640 (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Biosera, Франция) и гентамицина (ПанЭко, Россия) из расчёта 0,01 мг/мл среды. Клетки культивировали в СО2-инкубаторе (MCO-5AC, Sanyo, Япония) при температуре +37 °С и 5% содержании СО2. Характеристика клеточной линии приведена в ранее опубликованной работе авторов [10].

Анализ клоногенной активности. Клетки облучали в монослое в чашках Петри диаметром 3,5 см (Corning, США). После облучения определяли их клоногенную активность. Клетки снимали с пластика смесью растворов версена (0,02%) и трипсина (0,25%) в соотношении 1:1, ресуспендировали в среде RPMI-1640 до получения одиночных клеток и подсчитывали в камере Горяева. Облучённые и интактные (без облучения) клетки высевали в чашки Петри диаметром 100 мм (Corning, США) в среду RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. На одну чашку высевали по 10000 клеток, подвергшихся облучению, и по 1000 - без облучения. Чашки с клетками выдерживали в СО2-инкубаторе в течение 8-9 суток до формирования видимых невооружённым глазом колоний. По окончании инкубации культуральную среду удаляли, колонии окрашивали 2% раствором метиленового синего в 50% этаноле. Подсчёт вели на ручном счётчике Interscience Scan 100 (Франция), учитывая колонии, содержащие 50 и более клеток. Фракцию клоногенных клеток выражали в процентах по отношению к высеянным. Итоговая выживаемость представляла собой отношение выживаемости в экспериментальной и контрольной группах.

Процедура облучения. Источником нейтронного излучения служил портативный генератор нейтронов НГ-14 непрерывного действия, разработанный во ВНИИ автоматики им. Н.Л. Духова, Москва. Генератор позволяет получить практически моноэнергетические (7%) ней-

троны с энергией, зависящей от угла вылета и энергии дейтронов (при угле вылета 90° незави-

10

симо от энергии дейтронов - 14,1 МэВ) с интенсивностью до 1,5-10 н/с. В качестве источника гамма-излучения (60Со) использовали установку «Луч» (Е=1,25 МэВ). Схема опыта включала два варианта облучения клеток в разной последовательности: сначала гамма-излучение, затем нейтронное й-п), и наоборот - сначала нейтронное, затем гамма-излучение ^-д) с интервалами 30, 60 и 120 минут между воздействиями. В интервале между облучениями клетки находились в СО2-инкубаторе. Доза гамма-излучения составляла 4,5 Гр, мощность дозы ~1 Гр/мин; доза нейтронного излучения ~ 1,0 Гр, мощность дозы ~ 0,3 Гр/мин. Исследования проводили в трёх повторностях для каждого варианта опыта.

Статистическая обработка. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программного обеспечения R (www.R-project.org) версии 3.4.1 с применением пакета "тиКсотр". Сравнение выживаемости клеток в разных вариантах опыта - с применением дисперсионного анализа и критерия Тьюки. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Результаты исследований влияния длительности временного интервала между нейтронным и гамма-облучением в разной последовательности на клоногенную активность клеток ме-ланомы В-16 свидетельствуют об эффекте взаимодействия повреждений, индуцированных разными видами излучения (рис. 1). Даже после двухчасового интервала между облучениями выживаемость клеток меланомы (~ 3%) была значительно ниже выживаемости, которую мы наблюдали при независимом действии двух агентов в тех же дозах (8-10%) в ранее опубликованном исследований [2]. Данный эффект может объясняться с позиций синергизма [8, 11]. Временной интервал между воздействием редко- и плотноионизирующего излучений может оказывать влияние на уровень клоногенной активности облучённых клеток. Увеличение интервала между облучениями от 30 до 120 минут сопровождалось повышением количества выживших клеток примерно в два раза (с 1,5 до 3,0%). Экстраполяция данных позволяет рассчитать выживаемость при отсутствии интервала между воздействием, которая составляет около 1%. Статистически значимое различие по критерию Тьюки отмечено для вариантов опыта с интервалами между облучениями 30 и 120 минут независимо от последовательности воздействия нейтронов или фотонов.

,я л о р т 4,0 3,5

но 3,0

I т ° ^ т 2,5 2,0

о м е а в 1,5 1,0

жи 0,5

т 0,0

30 60 120

Интервал между облучениями, мин

Рис. 1. Выживаемость клеток меланомы B-16 (по данным клоногенной активности, средние значения и стандартные отклонения) в зависимости от интервала между облучениями: левый столбик - сначала облучение нейтронами затем фотонами (п^), правый - фотонами,

затем нейтронами й-п).

Следовательно, как в случае первоначального воздействия фракции нейтронов (плот-ноионизирующее излучение), так и в случае первоначального воздействия фотонами (редкоио-низирующее излучение) имеется некоторый пул клеток, способных к восстановлению при наличии определённого временного интервала до следующей фракции (другого типа воздействия) и физиологических условий содержания клеток между облучениями (+37 оС, содержание 5% СО2). Исходя из характера дозовых зависимостей обоих типов излучений (линейная для нейтронов и линейно-квадратичная для фотонов [2, 5]), следовало ожидать, что после облучения фотонами будет наблюдаться более выраженный рост выживаемости клеток с увеличением интервала между облучениями, в то же время наши данные не подтвердили это. При облучении нейтронами формируется достаточное количество сублетальных повреждений ДНК, которые после облучения фотонами становятся летальными для клетки. Можно предположить, что это связано с характером вторичных ионизирующих частиц, образующихся после облучения нейтронами с энергией 14,1 МэВ. В условиях протонного равновесия ~70% поглощённой дозы нейтронов обусловлено протонами и 30% - а-частицами и ядрами отдачи более тяжёлых элементов ткани C, N, O [12]. Таким образом, именно редкоионизирующий компонент вторичного излучения нейтронов с энергией 14,1 МэВ обеспечивает как взаимодействие повреждений, наносимых двумя видами излучений, так и их восстановление.

В основу современных представлений о механизмах синергетического действия двух агентов ионизирующей природы на клетку положены два предположения: они изменяют качество повреждений при сочетанном действии, приводя к формированию сложных кластерных повреждений, и/или влияют на клеточные механизмы восстановления этих повреждений. В пользу обеих точек зрения свидетельствуют результаты исследования Staaf и соавт. [13] о формировании гамма-фокусов в клетках, подвергнутых облучению смешанным пучком альфа-частиц и рентгеновских лучей. Авторами была выдвинута гипотеза, что наличие повреждений, вызванных рентгеновским излучением, изменяет механизм репарации ДНК и приводит к отсроченному ответу на более сложное повреждение, вызванное альфа-частицами. Позднее Sollazzo и соавт. [14] предположили, что повреждение ДНК, вызванное излучением с высокой ЛПЭ, приводит к изменению структуры хроматина, что делает ДНК более восприимчивой к воздействию активных форм кислорода, генерируемых излучением с низкой ЛПЭ. Cary и соавт. [15] и Zhang и соавт. [16] показали, что гамма-нейтронное облучение усиливает экспрессию некоторых генов, в частности, фактора роста тромбоцитов (PDGF) и ангиопоэтина 2 (ANG2).

В отношении последовательного применения двух излучений разного качества и эффективности той или иной последовательности, опубликованные в литературе данные противоречивы. Их результаты зависят не только от характеристик излучений, но и изучаемых биологических систем. Некоторым доказательством большей эффективности режима, при котором фракция редкоионизирующего излучения предшествует облучению нейтронами, могут служить результаты облучения рентгеновскими лучами и ионами неона [17]. Меньшая эффективность режима облучения «n-g» по сравнению с обратной последовательностью («g-n») выявлена при действии нейтронов с энергией 3 МэВ на кожные покровы мышей [18]. Аналогичный вывод о большей эффективности режима «g-n» получен отечественными исследователями на проростках и покоящихся семенах Crepis Capillaris [19] и на дрожжах с использованием реакторных нейтронов [20].

О большей биологической эффективности облучения при предварительном нейтронном воздействии с последующим гамма-облучением («n-g») свидетельствуют многочисленные данные. С помощью метода ДНК-комет в исследованиях на лимфоцитах [21] показано, что предварительное облучение приводило к выраженному адаптивному ответу как в случае редкоионизи-рующего излучения (у-у), так и плотноионизирующего излучения 252Cf (n-n). Облучение в режиме y-n также приводило к достоверному снижению эффективности облучения. Использование нейтронов в брахитерапии показало другой возможный механизм большей эффективности последовательности «n-g» [22]: идущая сначала фракция нейтронов 252Cf приводит к гибели гипокси-ческих клеток, что провоцирует последующую реоксигенацию соседних клеток и уже через 5-6 суток после воздействия клетки опухоли оказываются более радиочувствительными к у-излучению.

Кроме вывода о большей эффективности той или иной последовательности применения плотно- и редкоионизирующих излучений имеются данные и об отсутствии каких-либо различий при облучении сочетанным гамма-нейтронным излучением клеток китайского хомячка линии V79 [23-25]. Однако, в отличие от фундаментальных исследований in vitro, кроме противоопухолевого действия, в лучевой терапии решающую роль играет и действие излучения по отношению к здоровым тканям. С учётом того, что в здоровых и опухолевых клетках репаративные процессы выражены в разной степени, возможен подбор режима, который будет оказывать разнонаправленное действие в отношении опухолевых и нормальных клеток. Так, в исследованиях in vivo было показано, что фракционирование гамма-нейтронного излучения в режиме «g-g-n-n» по сравнению с обратной последовательностью обеспечивает как менее выраженные кожные реакций, так и повышение числа полностью излеченных животных [26].

Заключение

На основании полученных в рамках настоящего исследования экспериментальных данных на клетках меланомы В-16 можно сделать заключение о независимости эффективности сочетанного воздействия нейтронов портативного генератора НГ-14 (14,1 МэВ) и фотонов (60Со, 1,25 МэВ) от последовательности их применения. Это достаточно неожиданно ввиду большой разницы в ЛПЭ этих излучений и отличается от результатов ряда исследований о наличии зависимости развития поражения от последовательности применения излучений разного качества. Выживаемость клеток меланомы В-16 даже после двухчасового интервала между облучениями находится ниже уровня, ожидаемого, исходя из предположения о независимом действии нейтронов и фотонов, таким образом, эффект синергизма сохраняется в течение этого времени. Увеличение интервала между воздействиями нейтронов и фотонов, независимо от их последовательности («n-g», «g-n»), позволяет клеткам запускать и успешно реализовывать механизмы восстановления повреждений ДНК. Наиболее приемлемым, с точки зрения практической реализации результатов исследования, является интервал между облучениями фотонами и нейтронами независимо от их последовательности не более 1 ч. Однако данный вывод касается только противоопухолевой эффективности и не распространяется на действие такого соче-танного воздействия на здоровые ткани.

Данная работа проводилась в рамках выполнения тем государственного задания МРНЦ им. А. Ф. Цыба - филиала ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России за 2015-2017 гг. [27].

Литература

1. Wagner F.M., Specht H., Loeper-Kabasakal B., Breitkreutz H. Современное состояние терапии быстрыми нейтронами //Сибирский онкологический журнал. 2015. № 6. С. 5-12.

2. Бекетов Е.Е., Исаева Е.В., Корякин С.Н. Лычагин А.А., Ульяненко С.Е. Зависимость эффективности одновременного воздействия гамма-квантов и нейтронов с энергией 14 МэВ от вклада плотноио-низирующего компонента //Радиация и риск. 2012. Т. 21, № 3. С. 82-90.

3. Исаева Е.В., Бекетов Е.Е., Корякин С.Н., Лычагин А.А., Ульяненко С.Е. Сравнение биологической эффективности импульсного и непрерывного нейтронного излучения с энергией 14 МэВ на культуре клеток мышиной меланомы В-16 //Радиация и риск. 2012. Т. 21, № 2. С. 83-90.

4. Лычагин А.А., Бекетов Е.Е., Корякин С.Н. Исаева Е.В., Ульяненко С.Е. Экспериментальная установка для облучения биологических объектов смешанными полями ионизирующих излучений разного качества //Медицинская физика. 2013. T. 59, № 3. С. 56-60.

5. Isaeva E.V., Beketov E.E., Koryakin S.N., Ulyanenko S.E., Lychagin A.A. A comparative study of the biological effectiveness of 14-МеУ neutron pulse and continuous radiation using mouse B-16 cells //Radiat. Prot. Dosimetry. 2014. V. 161, N 1-4. P. 478-482.

6. Корякин С.Н., Кайдан Н.А., Исаева Е.В., Ульяненко Л.Н., Лычагин А.А., Ульяненко С.Е. Опыт применения портативного отечественного нейтронного генератора в схемах гамма-нейтронной терапии домашних животных со злокачественными новообразованиями //Радиация и риск. 2018. Т. 27, № 1. С. 94-106.

7. Мардынский Ю.С., Гулидов И.А., Аминов Г.Г., Рагулин Ю.А., Сысоев А.С. Сочетанная (фотонно-нейтронная) терапия в комплексном лечении местнораспространённого рака молочной железы //Вопросы онкологии. 2014. Т. 60, № 4. С. 489-492.

8. Zaider M., Rossi H.H. The synergistic effect of different radiation //Radiat. Res. 1980. V. 83, N 3. P. 732-739.

9. Бекетов Е.Е. Влияние сочетанного гамма-нейтронного облучения на гибель опухолевых клеток in vitro и in vivo: дис. ... канд. биол. наук. Обнинск, 2012. 139 с.

10. Beketov E., Isaeva E., Malakhov E., Nasedkina N., Koryakin S., Ulyanenko S., Solovev A., Lychagin A. The study of biological effectiveness of U-70 accelerator carbon ions using melanoma B-16 clonogenic assay //Rad. Applic. 2017. V. 2, N 2. P. 90-93.

11. McNally N., de Ronde J., Hinchliffe M. The effect of sequential irradiation with X-rays and fast neutrons on the survival of V79 Chinese hamster cells //Int. J. Radiat. Biol. 1984. V. 45, N 4. P. 301 -310.

12. Caswell R.S., Coyne J.J., Randolph M.Z. Kerma factors for neutron energies below 30 MeV //Radiat. Res. 1980. V. 83, N 2. P. 217-254.

13. Staaf E., Brehwens K., Haghdoost S., Czub J., Wojcik A. Gamma-H2AX foci in cells exposed to a mixed beam of X-rays and alpha particles //Genome Integr. 2012. V. 3, N 1. P. 8.

14. Sollazzo A., Shakeri-Manesh S., Fotouhi A., Czub J., Haghdoost S., Wojcik A. Interaction of low and high LET radiation in TK6 cells-mechanistic aspects and significance for radiation protection //J. Radiol. Prot. 2016. V. 36, N 4. P. 721-735.

15. Cary L.H., Noutai D., Salber R.E., Williams M.S., Ngudiankama B.F., Whitnall M.H. Interactions between endothelial cells and T cells modulate responses to mixed neutron/gamma radiation //Radiat. Res. 2014. V. 181, N 6. P. 592-604.

16. Zhang J., He Y., Shen X., Jiang D., Wang Q., Liu Q., Fang W. y-H2AX responds to DNA damage induced by long-term exposure to combined low-dose-rate neutron and y-ray radiation //Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 2016. N 795. P. 36-40.

17. Ngo F., Blakely E., Tobias C. Sequential exposures of mammalian cells to low- and high-LET radiations //Radiat. Res. 1981. V. 87, N 1. P. 59-78.

18. Joiner M., Brenner J., Denekamp J., Maughan E. The interaction between X-rays and 3 MeV neutrons in the skin of the mouse foot //Int. J. Radiat. Biol. 1984. V. 46, N 5. P. 625-638.

19. Фесенко Э.В., Лучник Н.В. Влияние комбинированного гамма-нейтронного облучения на образование структурных мутаций //Фундаментальные и прикладные аспекты нейтронной радиобиологии. Сборник научных работ. Обнинск: НИИМР АМН СССР, 1985. С. 54-64.

20. Цыб Т.С., Пахомова О.Н. Летальные эффекты последовательного действия у-излучения и быстрых (0,85 МэВ) реакторных нейтронов у клеток дрожжей Saccharomyces //3-й съезд по радиационным исследованиям. Пущино, 1997. Т. 1. С. 138-139.

21. Gajendiran N., Tanaka K., Kumaravel T., Kamada N. Neutron-induced adaptive response studied in go human lymphocytes using the comet assay //J. Radiat. Res. 2001. V. 42, N 1. P. 91-101.

22. Втюрин Б.М., Иванов В.К., Иванов В.Н., Медведев В.С., Абдукадыров С.А. Сочетанная нейтронная и гамма-терапия рака языка //Медицинская радиология. 1986. № 9. С. 14-19.

23. Higgins P., DeLuca P., Pearson D., Gould M. V79 survival following simultaneous or sequential irradiation by 15-MeV neutrons and 60Co photons //Radiat. Res. 1983. V. 95, N 1. P. 45-56.

24. McNally N., de Ronde J., Hinchliffe M. Survival of V79 cells following simultaneous irradiation with X-rays and neutrons in air or hypoxia //Int. J. Radiat. Biol. 1985. V 48, N 5. P. 847-855.

25. Suzuki S. Survival of Chinese hamster V79 cells after irradiation with a mixture of neutrons and 60Co gamma rays: experimental and theoretical analysis of mixed irradiation //Radiat. Res. 1993. V 133, N 3. P. 327-333.

26. Обатуров Г.М., Соколов В.А., Ульяненко С.Е., Цыб Т.С. Актуальные проблемы радиобиологии нейтронов //Радиационная биология. Радиоэкология. 1997. Т. 37, № 4. С. 475-481.

27. Каприн А.Д., Галкин В.Н., Жаворонков Л.П., Иванов В.К., Иванов С.А., Романко Ю.С. Синтез фундаментальных и прикладных исследований - основа обеспечения высокого уровня научных результатов и внедрения их в медицинскую практику //Радиация и риск. 2017. Т. 26, № 2. С. 26-40.

The influence of the time interval between the exposure to different quality radiation on murine B-16 melanoma cells survival

Isaeva E.V., Beketov E.E., Nasedkina N.V., Malakhov E.P., Troshina M.V., Lychagin A.A.,

Ulyanenko L.N., Ulyanenko S.E.

A. Tsyb MRRC, Obninsk

In modern radiotherapy schemes, radiations of different quality are used. Depending on the technical conditions, the irradiation sequence and interval between the exposures can be varied. For the combined gamma-neutron action, the dose contribution of neutrons varies from 20 to 40%. Taking into account the biophysical characteristics of charged particles and the processes of cellular damage and recovery, the dependence of biological effect on irradiation scheme is supposed. The influence of time interval between the irradiations of murine melanoma B-16 cells with 60-Co y-rays with an average energy of 1.25 MeV and neutrons with an energy of 14.1 MeV was investigated. Portable neutron generator (NG-14) of continuous action, developed at the All-Russian Research Institute of Automation. N.L. Dukhova (Moscow) was a source of neutron radiation. Photons were provided by "Luch" installation. Irradiation was carried out in two sequences: first gamma radiation, then neutron (g-n), and vice versa (n-g); the interval between exposures was 30, 60 and 120 minutes. The effectiveness of irradiation was assessed by the cell survival according measured by clonogenic assay. It is shown that the biological effectiveness of neutrons and photons combined action did not depend on the sequence of irradiation. An increase in the time interval between irradiations (from 30 to 120 min) was accompanied with the growth of cell survival. Thus the time interval between promote the repair of non-lethal DNA damages. According to these results the most acceptable scheme of combined radiotherapy with neutrons and photons should include no more than 1 hour time interval between the irradiations with these agents.

Key words: fast neutrons, NG-14, photons, combined action, irradiation sequence, synergism, DNA repair, clonogenic assay, melanoma, B-16 cells.

References

1. Wagner F.M., Specht H., Loeper-Kabasakal B., Breitkreutz H. Current state of therapy with fast neutrons. Sibirskiy onkologicheskiy zhurnal - Siberian Oncological Journal, 2015, no. 6, pp. 5-12. (In Russian).

2. Beketov E.E., Isaeva E.V., Koryakin S.N. Lychagin A.A., Ulyanenko S.E. Dependence of the efficiency of simultaneous action of gamma quanta and neutrons with energy of 14 MeV on the contribution of the densely ionizing component. Radiatsiya i risk - Radiation and Risk, 2012, vol. 21, no. 3, pp. 82-90. (In Russian).

3. Isaeva E.V., Beketov E.E., Koryakin S.N Lychagin A.A., Ulyanenko S.E. Comparison of biological efficiency of pulsed and continuous neutron radiation with energy of 14 MeV on the culture of cells of murine melanoma V-16. Radiatsiya i risk - Radiation and Risk, 2012, vol. 21, no. 2, pp. 83-90. (In Russian).

4. Lychagin A.A., Beketov E.E., Koryakin S.N., Isaeva E.V., Ulyanenko S.E. Experimental setup for irradiating biological objects with mixed fields of ionizing radiations of different quality. Meditsinskaya fizika -Medical Physics, 2013, vol. 59, no. 3, pp. 56-60. (In Russian).

5. Isaeva E.V., Beketov E.E., Koryakin S.N. Ulyanenko S.E., Lychagin A.A. A comparative study of the biological effectiveness of 14-MEV neutron pulse and continuous radiation using mouse B-16 cells. Radiat. Prot. Dosimetry, 2014, vol. 161, no. 1-4, pp. 478-482.

6. Koryakin S.N., Kaydan N.A., Isaeva E.V., Ulyanenko L.N., Lychagin A.A., Ulyanenko S.E. Experience of using a portable domestic neutron generator in gamma-neutron therapy of domestic animals with malignant neoplasms. Radiatsiya i risk - Radiation and Risk, 2018, vol. 27, no. 1, pp. 94-106. (In Russian).

7. Mardynskiy Yu.S., Gulidov I.A., Aminov G.G., Ragulin Yu.A., Sysoev A.S. Combined (photon-neutron) therapy in complex treatment of locally advanced breast cancer. Voprosy onkologii - Oncology Questions, 2014, vol. 60, no. 4, pp. 489-492. (In Russian).

Isaeva E.V. - Sen. Res., C. Sc., Vet.; Beketov E.E.* - Head of Lab., C. Sc., Biol.; Nasedkina N.V. - Lab. Ass.; Malakhov Y.P. - Res.; Troshina M.V. - Res.; Lychagin A.A. - Head of Lab., C. Sc., Phys.-Math.; Ulyanenko L.N. - Lead. Res., D. Sc., Biol., Prof.; Ulyanenko S.E. - Head of Dep., D. Sc., Biol. A. Tsyb MRRC.

•Contacts: 4 Korolev str., Obninsk, Kaluga region, Russia, 249036. Tel.: +7-910-514-9947; e-mail: beketov.ee@yandex.ru.

8. Zaider M., Rossi H.H. The synergistic effect of different radiation. Radiat. Res., 1980, vol. 83, no. 3, pp. 732-739.

9. Beketov E.E. Effect of combined gamma-neutron irradiation on the death of tumor cells in vitro and in vivo. Cand. biol. sci. diss. Obninsk, 2012. 139 p. (In Russian).

10. Beketov E., Isaeva E., Malakhov E., Nasedkina N., Koryakin S., Ulyanenko S., Solovev A., Lychagin A. The study of biological effectiveness of U-70 accelerator carbon ions using melanoma B-16 clonogenic assay. Rad. Applic., 2017, vol. 2, no. 2, pp. 90-93.

11. McNally N., de Ronde J., Hinchliffe M. The effect of sequential irradiation with X-rays and fast neutrons on the survival of V79 Chinese hamster cells. Int. J. Radiat. Biol., 1984, vol. 45, no. 4, pp. 301-310.

12. Caswell R.S., Coyne J.J., Randolph M.Z. Kerma factors for neutron energies below 30 MeV. Radiat. Res., 1980, vol. 83, no. 2, pp. 217-254.

13. Staaf E., Brehwens K., Haghdoost S., Czub J., Wojcik A. Gamma-H2AX foci in cells exposed to a mixed beam of X-rays and alpha particles. Genome Integr., 2012, vol. 3, no. 1, pp. 8.

14. Sollazzo A., Shakeri-Manesh S., Fotouhi A., Czub J., Haghdoost S., Wojcik A. Interaction of low and high LET radiation in TK6 cells-mechanistic aspects and significance for radiation protection. J. Radiol. Prot., 2016, vol. 36, no. 4, pp. 721-735.

15. Cary L.H., Noutai D., Salber R.E., Williams M.S., Ngudiankama B.F., Whitnall M.H. Interactions between endothelial cells and T cells modulate responses to mixed neutron/gamma radiation. Radiat. Res., 2014, vol. 181, no. 6, pp. 592-604.

16. Zhang J., He Y., Shen X., Jiang D., Wang Q., Liu Q., Fang W. y-H2AX responds to DNA damage induced by long-term exposure to combined low-dose-rate neutron and x-ray radiation. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen., 2016, no. 795, pp. 36-40.

17. Ngo F., Blakely E., Tobias C. Sequential exposures of mammalian cells to low- and high-LET radiations. Radiat. Res., 1981, vol. 87, no. 1, pp. 59-78.

18. Joiner M., Brenner J., Denekamp J., Maughan E. The interaction between X-rays and 3 MeV neutrons in the skin of the mouse foot. Int. J. Radiat. Biol., 1984, vol. 46, no. 5, pp. 625-638.

19. Fesenko E.V., Luchnik N.V. Influence of combined gamma-neutron irradiation on the formation of structural mutations. Fundamental and applied aspects of neutron radiobiology. Collection of scientific works. Obninsk, SRIMR RAS USSR, 1985, pp. 54-64. (In Russian).

20. Tsyb T.S., Pakhomova O.N. Lethal effects of sequential action of gamma radiation and fast (0.85 MeV) reactor neutrons in yeast cells of Saccharomyces. 3rd Congress on Radiation Research. Pushchino, 1997, vol. 1, pp. 138-139. (In Russian).

21. Gajendiran N., Tanaka K., Kumaravel T., Kamada N. Neutron-induced adaptive response studied in go human lymphocytes using the comet assay. J. Radiat. Res., 2001, vol. 42, no. 1, pp. 91-101.

22. Vtyurin B.M., Ivanov V.K., Ivanov V.N., Medvedev V.S., Abdulkadirov S.A. Combined neutron and gamma-therapy of the cancer of the tongue. Meditsinskaya radiologiya - Medical Radiology, 1986, no. 9, pp. 1419. (In Russian).

23. Higgins P., DeLuca P., Pearson D., Gould M. V79 survival following simultaneous or sequential irradiation by 15-MeV neutrons and 60Co photons. Radiat. Res., 1983, vol. 95, no. 1, pp. 45-56.

24. McNally N., de Ronde J., Hinchliffe M. Survival of V79 cells following simultaneous irradiation with X-rays and neutrons in air or hypoxia. Int. J. Radiat. Biol., 1985, vol. 48, no. 5, pp. 847-855.

25. Suzuki S. Survival of Chinese hamster V79 cells after irradiation with a mixture of neutrons and 60Co gamma-rays: experimental and theoretical analysis of mixed irradiation. Radiat. Res., 1993, vol. 133, no. 3, pp. 327-333.

26. Obaturov G.M., Sokolov V.A., Ul'yanenko S.Ye., Tsyb T.S. Actual problems of neutron radiobiology. Radiatsionnaya biologiya. Radioekologiya - Radiation Biology. Radioecology, 1997, vol. 37, no. 4, pp. 475-481.

27. Kaprin A.D., Galkin V.N., Zhavoronkov L.P., Ivanov V.K., Ivanov S.A., Romanko Yu.S. Synthesis of fundamental and applied research is the basis for ensuring a high level of scientific results and their introduction into medical practice. Radiatsiya i risk - Radiation and Risk, 2017, vol. 26, no. 2, pp. 26-40. (In Russian).