КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ГУМАНИЗАЦИИ И ОПТИМИЗАЦИИ N-ГЛИКАН В РАСТЕНИЯХ

1. Трансгенное высшее растение, которое стабильно трансформировано для экспрессии гликопротеинов с измененным профилем N-гликозилирования, в котором указанный измененный профиль N-гликозилирования характеризуется снижением прикрепления α1,3-фукозных и β1,2-ксилозных остатков к N-гликанам указанных гликопротеинов.
2. Трансгенное высшее растение по п.1, в котором указанные N-гликаны лишены указанных фукозных и ксилозных остатков.
3. Трансгенное высшее растение по п.1 или 2, в котором указанное растение обладает способностью продуцировать гликопротеин млекопитающих, имеющий указанный измененный профиль N-гликозилирования.
4. Трансгенное высшее растение по п.3, в котором указанным гликопротеином является представляющее интерес моноклональное антитело.
5. Трансгенное высшее растение по п.4, в котором указанное моноклональное антитело обладает повышенным сродством к связыванию для FcγRIII, повышенной антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичностью (ADCC), сниженной комплементзависимой цитотоксичной (CDC) активностью или любой их комбинацией, исходя из указанного измененного профиля N-гликозилирования указанного моноклонального антитела.
6. Растение ряска или клетка растения ряски или клубенек, которое экспрессирует гликопротеины, имеющие измененный профиль N-гликозилирования, в котором указанный измененный профиль N-гликозилирования характеризуется снижением прикрепления α1,3-фукозных остатков, β1,2-ксилозных остатков или как α1,3-фукозных остатков, так и β1,2-ксилозных остатков к N-гликанам указанных гликопротеинов.
7. Растение ряска или клетка растения ряски или клубенек по п.6, в котором указанные N-гликаны лишены указанных фукозных остатков, лишены указанных ксилозных остатков или лишены указанных фукозных и ксилозных остатков.
8. Растение ряска или клетка растения ряски или клубенек по п.6 или 7, в котором указанное растение ряска или клетка растения ряски или клубенек обладает способностью продуцировать представляющий интерес гликопротеин млекопитающих.
9. Растение ряска или клетка растения ряски или клубенек по п.8, в котором указанный гликопротеин является моноклональным антителом, представляющим интерес.
10. Растение ряска или клетка растения ряски или клубенек по п.9, в котором указанное моноклональное антитело имеет повышенное сродство к связыванию для FcγRIII, повышенную антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC), сниженную комплементзависимую цитотоксичную (CDC) активность или любую их комбинацию, исходя из указанного измененного профиля N-гликозилирования указанного моноклонального антитела.
11. Композиция, содержащая гликопротеин, продуцированный растением ряска или клеткой растения ряски или клубеньком по любому из пп.6-10.
12. Композиция по п.11, в которой указанные N-гликаны лишены указанных фукозных и ксилозных остатков.
13. Композиция по п.12, в которой указанный гликопротеин имеет профиль N-гликозилирования, характеризующийся наличием единичного предоминантного пика, соответствующего GO гликановым типам.
14. Композиция по п.13, в которой указанный гликопротеин является представляющим интерес моноклональным антителом.
15. Способ изменения профиля N-гликозилирования гетерологичного полипептида, продуцированного в растении ряска или клетке растения ряски или клубеньке, включающий:
(a) ингибирование экспрессии или функционирования, по меньшей мере, одной α1,3-фукозилтрансферазы (FucT) в указанном растении ряска или клетке растения ряски или клубеньке, в котором указанная FucT содержит аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с последовательностью, указанной в SEQ ID NO:3; и
(b) культивирование указанного растения ряска или клетки растения ряски или клубенька при условиях, пригодных для экспрессии указанного гетерологичного полипептида.
16. Способ изменения профиля N-гликозилирования гетерологичного полипептида, продуцированного в растении ряска или клетке растения ряски или клубеньке, включающий:
(a) ингибирование экспрессии или функционирования, по меньшей мере, одной β1,2-ксилозилтрансферазы (XyIT) в указанном растении ряска или клетке растения ряски или клубеньке, в котором указанная XyItT содержит аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с последовательностью, указанной в SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:2; и
(b) культивирование указанного растения ряска или клетки растения ряски или клубенька при условиях, пригодных для экспрессии указанного гетерологичного полипептида.
17. Нуклеотидная конструкция, содержащая первую нуклеотидную последовательность, которая способна ингибировать экспрессию или функционирование α1,3-фукозилтрансферазы (FucT) в растении, и вторую нуклеотидную последовательность, которая способна ингибировать экспрессию или функционирование β1,2-ксилозилтрансферазы (XyIT) в растении, в которой указанная первая нуклеотидная последовательность и указанная вторая нуклеотидная последовательность функционально связаны, по меньшей мере, с одним промотором, который функционален в растительной клетке.
18. Нуклеотидная конструкция по п.17, в которой указанная первая нуклеотидная последовательность содержит в направлении 5'-3' и функционально связана:
(a) прямой фрагмент FucT, указанный прямой фрагмент FucT, содержащий от около 500 до около 800 соседних нуклеотидов, имеющих, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с нуклеотидной последовательностью из от около 500 до около 800 соседних нуклеотидов из SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2;
(b) спейсерную последовательность, содержащую от около 200 до около 700 нуклеотидов;
(c) и обратный фрагмент FucT, указанный обратный фрагмент FucT, имеющий достаточную длину и достаточную комплементарность с указанным прямым фрагментом FucT, так, что указанная первая нуклеотидная последовательность транскрибируется как молекула РНК, способная формировать шпильковую РНК структуру.
19. Нуклеотидная конструкция по п.18, в которой указанная вторая нуклеотидная последовательность содержит в направлении 5'-3' и функционально связана:
(a) прямой фрагмент XyIT, указанный прямой фрагмент XyIT, содержащий от около 500 до около 800 соседних нуклеотидов, имеющих, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с нуклеотидной последовательностью, состоящей из от около 500 до около 800 соседних нуклеотидов из SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20;
(b) спейсерную последовательность, содержащую от около 200 до около 700 нуклеотидов;
(c) и обратный фрагмент XyIT, указанный обратный фрагмент XyIT, имеющий достаточную длину и достаточную комплементарность с указанным прямьм фрагментом XyIT, так, что указанная вторая нуклеотидная последовательность транскрибируется как молекула РНК, способная формировать шпильковую РНК структуру.
20. Нуклеотидная конструкция, содержащая слитой полинуклеотид, который способен ингибировать экспрессию или функционирование α1,3-фукозилтрансферазы (FucT) и β1,2-ксилозилтрансферазы (XyIT) в растении, в которой указанный слитой полинуклеотид функционально связан с промотором, который функционален в растительной клетке.
21. Нуклеотидная конструкция по п.20, в которой указанный слитой полинуклеотид содержит в направлении 5'-3' и функционально связана:
1(а) химерный прямой фрагмент, указанный химерный прямой фрагмент, содержащий:
1(i) первый фрагмент, содержащий от около 500 до около 650 соседних нуклеотидов, имеющих, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с нуклеотидной последовательностью из от около 500 до около 650 соседних нуклеотидов полинуклеотида, кодирующего указанную FucT; и
1(ii) второй фрагмент, содержащий от около 500 до около 650 соседних нуклеотидов, имеющих, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с нуклеотидной последовательностью из от около 500 до около 650 соседних нуклеотидов полинуклеотида, кодирующего указанную XyIT;
1(b) спейсерную последовательность, содержащую от около 200 до около 700 нуклеотидов;
1(с) и обратный фрагмент, указанный обратный фрагмент, имеющий достаточную длину и достаточную комплементарность с указанным химерным прямым фрагментом, так, что указанный слитой полинуклеотид транскрибируется как молекула РНК, способная формировать шпильковую РНК структуру или
2(а) химерный прямой фрагмент, указанный химерный прямой фрагмент, содержащий:
2(i) первый фрагмент, содержащий от около 500 до около 650 соседних нуклеотидов, имеющих, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с нуклеотидной последовательностью из от около 500 до около 650 соседних нуклеотидов полинуклеотида, кодирующего указанную XyIT; и
2(ii) второй фрагмент, содержащий от около 500 до около 650 соседних нуклеотидов, имеющих, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с нуклеотидной последовательностью из от около 500 до около 650 соседних нуклеотидов полинуклеотида, кодирующего указанную FucT;
2(b) спейсерную последовательность, содержащую от около 200 до около 700 нуклеотидов;
2(с) и обратный фрагмент, указанный обратный фрагмент, имеющий достаточную длину и достаточную комплементарность с указанным химерным прямьм фрагментом, так, что указанный слитой полинуклеотид транскрибируется как молекула РНК, способная формировать шпильковую РНК структуру.
22. Нуклеотидная конструкция по п.21, в которой указанная спейсерная последовательность содержит интрон.
23. Нуклеотидная конструкция, содержащая первую полинуклеотидную последовательность, которая способна ингибировать экспрессию или функционирование α1,3-фукозилтрансферазы (FucT) в растении, в которой указанная первая полинуклеотидная последовательность содержит в направлении 5'-3' и функционально связана:
(a) прямой фрагмент FucT, указанный прямой фрагмент FucT, содержащий от около 500 до около 800 соседних нуклеотидов, имеющих, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с нуклеотидной последовательностью из от около 500 до около 800 соседних нуклеотидов полинуклеотида, кодирующего указанную FucT;
(b) спейсерную последовательность, содержащую от около 200 до около 700 нуклеотидов;
(c) и обратный фрагмент FucT, указанный обратный фрагмент FucT, имеющий достаточную длину и достаточную комплементарность с указанным прямым фрагментом FucT, так, что указанная первая полинуклеотидная последовательность транскрибируется как молекула РНК, способная формировать шпильковую РНК структуру; в которой указанная первая полинуклеотидная последовательность функционально связана с промотором, который функционален в растительной клетке.
24. Нуклеотидная конструкция, содержащая первую полинуклеотидную последовательность, которая способна ингибировать экспрессию или функционирование β1,2-ксилозилтрансферазы (XyIT) в растении, в которой указанная первая полинуклеотидная последовательность содержит в направлении 5'-3' и функционально связана:
(a) прямой фрагмент XyIT, указанный прямой фрагмент XyIT, содержащий от около 500 до около 800 соседних нуклеотидов, имеющих, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с нуклеотидной последовательностью из от около 500 до около 800 соседних нуклеотидов полинуклеотида, кодирующего указанную XyIT;
(b) спейсерную последовательность, содержащую от около 200 до около 700 нуклеотидов;
(c) и обратный фрагмент XyIT, указанный обратный фрагмент XyIT, имеющий достаточную длину и достаточную комплементарность с указанным прямым фрагментом XyIT, так, что указанная первая полинуклеотидная последовательность транскрибируется как молекула РНК, способная формировать шпильковую РНК структуру;
в которой указанная первая полинуклеотидная последовательность функционально связана с промотором, который функционален в растительной клетке.
25. Растение или растительная клетка, содержащая нуклеотидную конструкцию по любому из пп.17-24, стабильно интегрированную в его геном.
26. Растение или растительная клетка по п.25, в котором указанное растение является однодольным, или указанная растительная клетка происходит из однодольного растения.
27. Растение или растительная клетка по п.25, в которой указанное однодольное растение является членом Lemnaceae.
28. Растение или растительная клетка по п.27, в которой указанное однодольное происходит из рода, выбранного из группы, состоящей из рода Spirodela, рода Wolffia, рода Wolflella, рода Landoltia и рода Lemna.
29. Растение или растительная клетка по п.28, в котором указанное однодольное является членом видов, выбранных из группы, состоящей из Lemna minor, Lemna miniscula, Lemna aequinoctialis и Lemna gibba.
30. Растение или растительная клетка по п.25, в которой указанное растение является двудольным, или указанная растительная клетка происходит из двудольного.
31. Способ стабильного трансформирования высшего растения для экспрессирования гликопротеинов, имеющих измененный профиль N-гликозилирования, включающий введение в указанное высшее растение нуклеотидной конструкции по любому из пп.17-24.
32. Способ получения гетерологичного гликопротеина млекопитающих в высшем растении, в котором указанный гетерологичный гликопротеин млекопитающих имеет снижение прикрепления α1,3-фукозных остатков и β1,2-ксилозных остатков к N-гликанам указанного гликопротеина, когда продуцируется в указанном высшем растении, включающий:
(a) введение в указанное растение экспрессионной кассеты, содержащей последовательность, кодирующую полипептид млекопитающих, который посттрансляционно образован как указанный гликопротеин, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную конструкцию по любому из пп.17-22; и
(b) культивирование указанного растения при условиях, пригодных для экспрессии указанного гликопротеина.
33. Способ по п.32, в котором указанный полипептид млекопитающих выбирается из группы, состоящей из интерферона, эритропоэтина (ЕРО), тканевого активатора плазминогена (tPA), плазминогена, факторов свертывания крови, гранулоцит-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и терапевтических иммуноглобулинов.
34. Способ снижения гетерогенности профиля N-гликозилирования гликопротеина, продуцированного в высшем растении, включающий введение в указанное растение нуклеотидной конструкции по любому из пп.17-24, и культивирование указанного растения при условиях, пригодных для экспрессии указанного гликопротеина.
35. Изолированный полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
(a) нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2;
(b) нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20;
(c) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6; или SEQ ID NO:21;
(d) нуклеотидной последовательности, содержащей, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с последовательностью, указанной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, в которой указанный полинуклеотид кодирует полипептид, имеющий активность α1,3-фукозилтрансферазы (FucT);
(e) нуклеотидной последовательности, содержащей, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с последовательностью, указанной в SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20, в которой указанный полинуклеотид кодирует полипептид, имеющий активность β1,2-ксилозилтрансферазы (XyIT);
(f) нуклеотидной последовательности, содержащей, по меньшей мере, 15 соседних нуклеотидов из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20, или ее комплемента;
(g) нуклеотидной последовательности, содержащей, по меньшей мере, 19 соседних нуклеотидов имеющих, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с нуклеотидной последовательностью, содержащей, по меньшей мере, 19 соседних нуклеотидов из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20 и ее комплемента;
(h) нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с последовательностью, указанной в SEQ ID NO:3, в которой указанный полинуклеотид кодирует полипептид, имеющий активность FucT;
(i) нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с последовательностью, указанной в SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:21, в которой указанный полинуклеотид кодирует полипептид, имеющий активность XyIT; и
(j) комплемент нуклеотидной последовательности по любому из вышеуказанных пунктов (а)-(i).
36. Изолированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
(a) аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:3;
(b) аминокислотной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:3, где указанный полипептид имеет активность α1,3-фукозилтрансферазы (FucT);
(c) аминокислотной последовательности, содержащей, по меньшей мере, 20 последовательных аминокислот из SEQ ID NO:3, где указанный полипептид имеет активность FucT;
(d) аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:21;
(e) аминокислотной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью указанной в SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:21, где указанный полипептид имеет активность β1,2-ксилозилтрансферазы (XyIT); и
(f) аминокислотной последовательности, содержащей, по меньшей мере, 20 последовательных аминокислот из SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:21, где указанный полипептид имеет активность XyIT.
37. Композиция, содержащая гликопротеин, продуцированный в соответствии со способом по п.32.
38. Композиция, содержащая гликопротеин, продуцированный в соответствии со способом по п.34.