Способ генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В бета-лактоглобулина (полиморфизм rs109625649) на основе ПЦР с аллель-специфичными зондами
METHOD FOR CATTLE GENOTYPING BY BETA-LACTOGLOBULIN A AND B ALLELES (RS109625649 POLYMORPHISM) BASED ON PCR WITH ALLELE-SPECIFIC PROBES

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, генетики и селекции сельскохозяйственных животных, в частности к оценке аллельного полиморфизма бета-лактоглобулина крупного рогатого скота молекулярно-генетическим методом исследования.
Бета-лактоглобулин (βLG) является одним из превалирующих сывороточных белков, присутствующих в молоке крупного рогатого скота в гомодимерной форме с молекулярной массой 36 кДа. Биологическими функциями βLG предположительно являются транспортировка ретинола и жирных кислот, участие в метаболизме фосфатов (Kontopidis, G., С.Holt and L. Sawyer. 2004. Invited review: β-lactoglobulin: Binding properties, structure, and function. J. Dairy Sci. 87(4):785-796. doi:10.3168/jds.S0022-0302(04)73222-1). Ген βLG крупного рогатого скота локализован на 11-ой хромосоме, имеет размер 4662 п.н., состоит из 7 экзонов и 6 интронов и кодирует полипептид из 162 аминокислотных остатков (Harris, S., S. АН, S. Anderson, A. L. Archibald, A. J. Clark. 1988. Complete nucleotide sequence of the genomic bovine beta-lactoglobulin gene. Nucleic Acids Res. 16(21): 10379-103 80. doi:10.1093/nar/16.21.10379). Известно 13 аллельных вариантов гена βLG (А, В, В*, С, D, Dr, Е, F, G, Н, I, J и L), но наиболее часто встречаются аллели А и В (Martin, P. Genetic polymorphism of milk proteins: Quantitative variability and molecular diversity / P. Martin, L. Bianchi, C. Cebo, G. Miranda. - Advanced dairy chemistry. Springer Science + Business, Media. - New York, 2013. - V. 1A: Proteins: Basic Aspects, 4th ed. - P. 387- 429 [https://doi.org/10.1007/978-1-4614-4714-6]. Различия между вариантами А и В заключаются в замене глицина на аспарагиновую кислоту в положении 64 белка (полиморфизм rs110066229) и замене аланина на валин в положении 118 (полиморфизм rs109625649). Исследования показали, что генотип АА ассоциирован с более высокими удоями и массовой долей сывороточных белков, генотип ВВ - с более высоким содержанием жира и казеина, а также свойствами молока, благоприятными для сыроделия (Badola, S., Т. Bhattacharya, Т. Biswas, P. Kumar, A. Sharma. 2003.Association of Beta-lactoglobulin Polymorphism with Milk Production Traits in Cattle. Asian-Australas. J. Anim. Sci. 16(11): 1560-1564. doi.org/10.5713/ajas.2003.1560; Cecchinato, A., C. Ribeca, A. Maurmayr, M. Penasa, M. De Marchi, N. P. P. Macciotta, M. Mele, P. Secchiari, G. Pagnacco, G. Bittante. 2012. Short communication: Effects of β-lactoglobulin, stearoyl-coenzyme A desaturase 1, and sterol regulatory element binding protein gene allelic variants on milk production, composition, acidity, and coagulation properties of Brown Swiss cows. J. Dairy Sci. 95(1):450-454. doi:10.3168/jds.2011-4581; Kyselová, J., K. Ječmínková, J. Matějíčková, O. Hanuš, T. Kott, M. Štípková, M. Krčjcová. 2019. Physiochemical characteristics and fermentation ability of milk from Czech Fleckvieh cows are related to genetic polymorphisms of β-casein, κ-casein, and β-lactoglobulin. Asian-Australas J. Anim. Sci. 32(1):14-22. doi:10.5713/ajas. 17.0924).
На сегодняшний день известны несколько способов генотипирования крупного рогатого скота по аллельным вариантам А и В βLG, которые отличаются по способу детекции полиморфизма, сложности и продолжительности процедуры генотипирования.
Способ генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В βLG на основе анализа конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК (single-strand conformation polymorphism analysis, или SSCP-анализ) заключается в амплификации с помощью ПЦР фрагмента гена  длиной 240 п.н., содержащего полиморфную область (полиморфизм rs109625649), в денатурации продуктов ПЦР, в разделении денатурированных продуктов ПЦР с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и в определении генотипа животного на основании различий в электрофоретической подвижности однонитевых ДНК аллельных вариантов А и В βLG (Kaminski, S., Т. Zabolewicz. 1997. Genotyping of bovine beta-lactoglobulin (LBG) by PCR-SSCP technique. J. Appl. Genet. 38(4):471-476). Недостатком данного метода является двустадийность анализа (ПЦР и электрофоретическое разделение денатурированных продуктов ПЦР), что делает его сложным, длительным (8-10 часов) и неудобным для крупномасштабного генотипирования крупного рогатого скота. Кроме того, в основе метода лежит неспецифический способ детекции полиморфных вариантов, что приводит к выявлению любых нуклеотидных замен в ДНК, вследствие чего возможны недостоверные результаты генотипирования в случае наличия нецелевых полиморфных участков в анализируемых продуктах ПЦР.
Метод генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В βLG (полиморфизм rs109625649) на основе анализа кривых плавления с высоким разрешением (HRM-анализ) заключается в амплификации участка гена длиной 247 п.н., содержащего полиморфную область, с помощью ПЦР в присутствии в реакционной смеси интеркалирующего красителя EvaGreen и в определении температур плавления ДНК на основе измерения интенсивности флуоресценции EvaGreen при нагревании продуктов ПЦР в градиенте температур от 82 до 92°С со скоростью 0,1°С в течение 2 с (Miluchová, М., A. Trakovická, М. Gábor. 2012. Analysis of Beta-Lactoglobuline Gene (LGB) Polymorphism in Different Breeds of Bulls by High Resolution Melting. Scientific Papers Animal Science and Biotechnologies. 45(1):193-197). Недостатком данного метода является то, что он, как и SSCP-анализ, основан на неспецифическом методе детекции полиморфных вариантов гена , что может приводить к недостоверным результатам в случае наличия нецелевых полиморфных участков в анализируемых продуктов ПЦР.
Прототипом заявленного способа является способ генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В бета-лактоглобулина на остове ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция с последующим анализом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов), предложенный Medrano с соавторами (Medrano, J. F., Е. Aguilar-Cordova. 1990. Polymerase chain reaction amplification of bovine β-lactoglobulin genomic sequences and identification of genetic variants by RFLP analysis. Animal Biotechnology. 1(1):73-77. doi.org/10.1080/10495399009525730). Метод заключается в использовании фермента рестрикции HaeIII, распознающего строго определенную последовательность ДНК (5'-…GGCC…-3'), что делает этот метод высокоспецифичным и позволяет с высокой точностью дифференцировать аллельные варианты А и В βLG (полиморфизм rs109625649). В прототипе генотипирование крупного рогатого скота проводят в 3 этапа. На первом этапе проводят ПЦР с прямым праймером JβLG2: 5'-TGTGCTGGACACCGACTACAAAAAG-3' и обратным праймером JβLG3: 5'-GCTCCCGGTATATGACCACCCTCT-3'. На втором этапе анализа продукт ПЦР длиной 247 п.н. обрабатывают ферментом рестрикции HaeIII в течение 16 часов при 37°С, на третьем этапе полученные продукты рестрикции разделяют методом электрофореза в 4% агарозном геле. При генотипе АА продукты рестрикции имеют размеры 148 и 99 п.н., при генотипе ВВ - 99 и 74 п.н., при генотипе АВ - 148, 99 и 74 п.н. Основным недостатком данного метода являет его многостадийность и длительность (около 20 часов), что делает его сложным и неудобным для крупномасштабного генотипирования крупного рогатого скота.
Техническим результатом предлагаемого способа является расширение арсенала способов генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В βLG (полиморфизм rs109625649) на основе ПЦР в реальном времени с аллель-специфичными зондами типа TaqMan, а также упрощение анализа и сокращение времени его проведения до 1 часа.
Технический результат достигается тем, что способ генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В бета-лактоглобулина (полиморфизм rs109625649) на основе ПЦР с аллель-специфичными зондами отличается тем, что используются:
прямой праймер F: 5'-GCATGGAGAACAGTGCTGAGC-3'
обратный праймер R: 5'-GCAGCGAGGACCACACAG-3'
βLG_B - аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд
5'-FAM- TGGCAGGCCAGGC-BHQ1-3
BLG_A -аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд
5'-VIC- TGGCAGACCAGGCT-BHQ1-3',
при этом для гомозиготных образцов по аллелю В детектируется нарастание флуоресценции по каналу FAM, для гомозиготных образцов по аллелю А детектируется сигнал по каналу VIC, для гетерозиготного образца (генотип АВ) наблюдается нарастание флуоресценции по обоим каналам детекции, а наличие двух красителей, FAM и VIC, позволяет однозначно определить присутствие каждого из исследуемых аллелей BLG в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип животного. Перечень графических материалов.
На фиг. 1 представлены нуклеотидные последовательности фрагмента гена  длиной 103 п.н., кодирующие аллели А и В βLG (rs109625649). Жирным шрифтом отмечены последовательности праймеров, жирным шрифтом и курсивом - последовательности зондов.
На фиг. 2 представлен пример детекции аллельных вариантов А и В βLG (полиморфизм rs109625649) крупного рогатого скота методом ПЦР с аллель-специфичными зондами. Представлены кривые флуоресценции (Б-Г) и диаграмма распределения генотипов (А).
Патентуемый способ заключается в проведения ПЦР в режиме реального времени с аллель-специфичными зондами для генотипирования крупного рогатого скота по аллельным вариантам А и В βLG (полиморфизм rs109625649). Заявленный способ отличается тем, что используются два общих для аллельных вариантов праймера: прямой праймер F: 5'-GCATGGAGAACAGTGCTGAGC-3' и обратный праймер R: 5'-GCAGCGAGGACCACACAG-3', фланкирующие участок гена  длиной 103 п.н., и два аллель-специфичных флуоресцентно-меченых зонда типа TaqMan:
βLG_B: 5'-FAM- TGGCAGGCCAGGC-BHQ1-3 и BLG_A: 5'-VIC-TGGCAGACCAGGCT-BHQ1-3' (фиг. 1). Точки мутаций те же, что и в прототипе, однако подход к их детекции иной: в заявленном изобретении осуществляется идентификация аллельных вариантов А и В βLG (полиморфизм rs109625649) методом ПЦР в режиме реального времени с помощью флуоресцентно-меченых аллель-специфичных зондов типа TaqMan. Зонд типа TaqMan представляет собой олигонуклеотид, комплементарный нужному участку ПЦР-продукта и меченый флюорофором и гасителем флюоресценции. В структуре зонда TaqMan флуорофор и гаситель TaqMan зонда сближены настолько, что флуоресценция подавлена. При накоплении продукта реакции зонд гибридизуется на соответствующий участок ампликона, после чего разрушается за счет 5'-концевой активности Taq-полимеразы. Разрушение зонда приводит к отрыву флуорофора от гасителя и началу флуоресценции. Интенсивность флуоресцентного сигнала возрастает с каждым циклом ПЦР пропорционально накоплению целевого ПЦР-продукта. Дифференциация аллелей с помощью аллель-специфичных зондов TaqMan основана на эффективности их гибридизации на содержащие полиморфную позицию продукты ПЦР (Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю., Семенов П.А., Савилова A.M., Кофиади И.А., Абрамов Д.Д. ПЦР в реальном времени // Бином. Лаборатория знаний, 2009).
Использование ПЦР в реальном времени с двумя аллель-специфичными флуоресцентно-мечеными зондами типа TaqMan делает заявляемый способ генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В бета-лактоглобулина (полиморфизм rs109625649) надежным и быстрым. С помощью праймеров F и R проводят амплификацию фрагмента гена  длиной 103 п.н. в 10 мкл смеси ПЦР, содержащей 1 единицу Taq-полимеразы, 1 мкл 1×ПЦР буфера, 0,5 мкМ прямого праймера F:5'-GCATGGAGAACAGTGCTGAGC-3', 0,5 мкМ обратного праймера R:5'-GCAGCGAGGACCACACAG-3', по 0,4 мкМ аллель-специфичных зондов βLG_B: 5'-FAM-TGGCAGGCCAGGC-BHQ1-3' и BLG_A:5'-VIC-TGGCAGACCAGGCT-BHQ1-3', 10 нг ДНК. ПЦР проводят при следующем температурно-временном режиме: начальная денатурация при 95°С - 10 мин; 40 циклов последовательно - 95°С - 15 сек, 55°С - 30 сек, 72°С - 30 сек. Детекцию флуоресценции проводят по каналам FAM и VIC. Идентификацию аллельных вариантов А и В βLG (rs109625649) проводят на основании сравнения интенсивности флуоресценции красителей VIC и FAM, соответственно.
Для определения генотипа животного используют конечные значения флуоресценции красителей FAM и VIC (фиг. 2А). Для животных с генотипом ВВ наблюдается рост флуоресцентного сигнала по каналу FAM (фиг. 2Б). Для коров с генотипом АА сигнал флуоресцентного регистрировался по каналу VIC (фиг. 2В). Для гетерозиготных коров (генотип АВ) детектируются сигналы по обоим каналам - FAM и VIC (фиг. 2Г). Таким образом, результаты ПЦР в реальном времени с использованием аллель-специфичных зондов TaqMan позволяют определять присутствие каждого из исследуемых аллелей А и В βLG (полиморфизм rs109625649) в анализируемом образце ДНК и, соответственно, генотип животного.
Контрольное использование предложенного способа было апробировано на 90 образцах ДНК коров черно-пестрого голштинизированного скота. По результатам генотипирования 56,6% животных являлись гетерозиготами (генотип АВ), 17,0% - гомозиготами по аллелю А (генотип АА) и 26,4% животных - гомозиготами по аллелю В (генотип ВВ). На той же выборке патентуемый способ сравнивали со способом по прототипу. Результаты обоих способов генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В бета-лактоглобулина (полиморфизм rs109625649) совпали, однако, предложенный нами способ значительно упрощает и сокращает до 1 часа проведение генотипирования крупного рогатого скота, что выгодно отличает его от способа на основе ПЦР-ПДРФ, длительность которого составляет около 20 часов.
Предложенный способ применим для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В бета-лактоглобулина (полиморфизм rs109625649), ассоциированным с показателями молочной продуктивности коров, с целью последующего использования полученных результатов при разведении и селекции крупного рогатого скота.