Изменения липидной композиции микросом печени крыс при экспериментальном перитоните

С.С. ОСОЧУК, Н.Ю. КОНЕВАЛОВА

ИЗМЕНЕНИЯ ЛИПИДНОЙ КОМПОЗИЦИИ МИКРОСОМ ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ПЕРИТОНИТЕ

УО «Витебский государственный медицинский университет», Республика Беларусь

Эндоплазматический ретикулум печени крыс обеспечивает формирование и экспорт в кровь липидно-белковых комплексов и таким образом участвует в функционировании липидтранспортной системы. В литературе отсутствуют сведения об изменении липидного спектра эндоплазматического ретикулума печени при генерализованных воспалительных процессах. В настоящей работе исследовали изменения фосфолипидного спектра и состава жирных кислот лизофосфатидов, фосфати-дилхолинов и фосфатидилэтаноламинов мнкросом печени белых беспородных крыс при экспериментальном перитоните. Обнаружены признаки увеличения поставки фосфолипидов митохондриям печени, возможно, для обеспечения их функциональной активности. Отмечено увеличение включения насыщенных жирных кислот в фосфолипиды, что способно активировать Аб-десатуразы и продукцию эндогенных полиненасыщенных жирных кислот, а так же активацию цитохрома Р450 и усиление детоксикации ксенобиотиков. Выявлены признаки увеличения экспорта диго-мо-г-линоленовой кислоты и снижения поставки арахидоновой кислоты, что может быть одним из факторов контроля воспалительного процесса посредством продукции простаноидов, продуцирующихся из дигомо-г-линоленовой кислоты, обладающих меньшей активностью, чем простаноиды синтезирующиеся из арахидоновой кислоты.

Одним из наиболее серьезных осложнений абдоминальной хирургии, в 70 -100% случаев ведущим к летальному исходу [2], является перитонит, изучение этиологии и патогенеза которого является актуальным до настоящего времени. Известно, что крысы высокоустойчивы к развитию воспалительного процесса. Исследование метаболизма крыс при воспалительном процессе позволит найти способы увеличения резистентности к воспалению. Микро-сомальный аппарат клеток печени играет важную роль в процессе биосинтеза экспортируемых в кровь соединений, в том числе, необходимых для формирования липопро-теиновых комплексов и поставки перифе-

рическим клеткам холестерола, фосфолипидов [7]. С мембранами эндоплазматического ретикулума (ЭПР) ассоциирована система цитохрома Р450, играющего важную роль в детоксикации ксенобиотиков [7]. При генерализованных воспалительных процессах осуществляется модификация структуры липидтранспортной системы и поставки холестерола надпочечникам [3]. Однако практически отсутствуют сведения об изменениях строения ЭПР при генерализованных воспалительных процессах. Целью настоящей работы является исследование фосфолипидного состава и жирно-кислотного спектра лизофосфатидов (ЛФ), фосфатидилхолинов (ФХ) и фосфатидилэ-

таноламинов (ФЭА) микросом клеток печени белых беспородных крыс при экспериментальном перитоните.

Материалы и методы

Перитонит моделировали однократным внутрибрюшинным введением 4 млрд. микробных тел E.Coli (штамм 0-26) пятнадцати белым беспородным крысам-самцам средней массой тела 180 - 200 гр. Контро-лем служили 12 интактных крыс. Животных декапитировали через 4 часа после инъекции E.Coli. Печень перфузировали охлажденным физиологическим раствором и сохраняли до обработки в жидком азоте. Микросомы печени выделяли низкоскоростным центрифугированием, описанным в работе Baker S. и соавторов [4]. Липиды экстрагировали смесью хлороформа и метанола (соотношение 2:1 по объему). Фос-фолипиды разделяли двумерной тонкослойной хроматографией [1], собирали в огнеупорные пробирки и минерализовали в хлорной кислоте при температуре 220 -240°С. Процентное содержание оценивали по неорганическому фосфату [5]. Для определения спектра жирных кислот ЛФ, ФХ и ФЭА липидный экстракт разделяли двумерной тонкослойной хроматографией [1]. Фракции ЛФ, ФХ и ФЭА собирали в виа-лы, метилировали 0,75N серной кислотой

в метаноле при температуре 650С в течение 24 часов. Метиловые эфиры жирных кислот экстрагировали гексаном. Экстракт упаривали досуха в токе азота, немедленно растворяли в ацетоне и анализировали на газовом хроматографе Цвет 500М (колонка длиной 2 м, набита реоплекс 400, скорость потока газа-носителя (He) - 30 мл/мин, детектирование пламенно-ионизационным детектором по стандартам метиловых эфи-ров жирных кислот (Sigma)). Соотношения детектированных жирных кислот рассчитывали по площади пиков и выражали в процентах. Результаты обрабатывались статистически с помощью компьютерной программы Excel.

Результаты и обсуждение

Оценка фосфолипидного состава микросом печени (таблица 1) продемонстрировала достоверное снижение количества по-лиглицерофосфатидов (ПГФ) (p=0,0005), одним из представителей которых является кардиолипин - фосфолипид, характерный в большей степени для митохондрий [1]. Данное изменение может быть обусловлено переходом кардиолипинов в состав митохондрий для обеспечения их функциональной активности. Исследование жирных кислот (ЖК) фосфолипидов (ФЛ) показало, что сумма полиненасыщенных жир-

ЛФ СФ ФХ ФЭА ПГФ

Контроль 4,81±0,34 7,1±0,67 57,17±2,2 25,86±2,39 6,02±0,38

E.Coli 4 часа 4,49±0,38 7,53±0,69 55,89±2,06 28,74±2,35 3,26±0,53**

Таблица 1

Спектр фосфолипидов микросом и активность антиоксидантных

ферментов печени

ных кислот (ПНЖК) всех ФЛ снижалась (p<0,0001). В фосфатидилхолинах (ФХ) (таблица 2) росла сумма насыщенных жирных кислот (НЖК) и отношение сумм НЖК/ПНЖК (р=0,02, 0,04). В ЖК спектре ФХ (таблица 3) сумма НЖК увеличивалась за счет пальмитиновой кислоты (С 16:0) (р=0,002), а снижение суммы ПНЖК обуславливалось падением содержания линоле-новой (С18:2) и арахидоновой (С20:4) кислот (p=0,004, 0,008). Рост содержания пальмитиновой кислоты может обуславливаться активацией пальмитатсинтазного комплекса. Снижение содержания линоленовой и арахидоновой кислот, вероятно, обусловлено активацией ПОЛ, а также использованием как предшественников метаболически активных продуктов (липокисны).

ФХ являются основными ФЛ мембран, поэтому снижение содержания их ПНЖК способно увеличить вязкость мембран ЭПР и, как следствие, должно привести к кон-

формационным изменениям ассоциированных с ними белков и модифицировать их функциональную активность. При росте микровязкости мембран ЭПР ключевой фермент биосинтеза эндогенных ПНЖК А6-десатураза выталкивается на поверхность мембраны, освобождается ее активный центр, и фермент активируется [4]. Обнаруженный дефицит ПНЖК должен привести к активации Д6-десатуразы и продукции ПНЖК. ФХ так же участвуют в регуляции активности цитохрома Р450.

Изменение физико-химических свойств ФХ, способно изменить активность этой важной ферментативной системы. Показано, что L-б-1,2-дипaльмитoилфocфa-тидилхолин и L-б-1,2-дипaльмитoилфocфa-тидилэтанол-амин, введенные в микроокружение цитохрома Р450, увеличивали его активность [7]. ФХ и ФЭА этерифициро-ванные короткоцепочечными ЖК (С8-12) увеличивали активность этого фермента на

УНЖК УМНЖК УПНЖК УНЖК / УПНЖК

Фосфатидилхолины %

Контроль 83,45±2,08 2,38±0,62 13,61±1,59 6,19±0,88

4 часа 89,71±2,49 р1=0,02 2,64±0,66 6,98±1,99 р1=0,01 13,66±4,39 р1=0,04

Фосфатидилэтаноламины %

Контроль 71,84±5,05 0,94±0,24 26,49±5,01 2,8±0,73

4 часа 93,59±1,53 р1=0,002 0,37±0,15 р1=0,02 4,81±1,66 р1=0,002 21,23±7,93 р1=0,016

Лизофосфатиды %

Контроль 53,47±4,96 22,05±1,96 22,03±3,99 2,51±0,7

4 часа 81,36±4,31 р1=0,001 1,63±0,32 рК0,0001 16,07±4,29 5,37±1,78

Таблица 2

Изменения сумм жирных кислот и их отношений в составе фосфатидилхолинов и фосфатидилэтаноламинов лизофосфатидов микросом печени при экспериментальном перитоните

Таблица 3

Спектр жирных кислот фосфатидилхолинов и лизофосфатидов

микросом печени

ЛФ ФХ ФЭА

Контроль Е.СоП 4 часа Контроль Е.СоП 4 часа Контроль Е.СоП 4 часа

14:0 19,7±1,34 12,1±1,36** 1,2±0,19 1,32±0,2 0,82±0,1 4,56±0,8**

15:0 4,0±1,18 2,35±0,59 1,2±0,25 0,93±0,2 0,64±0,14 1,23±0,24

16:0 24,0±2,02 59,09±2,24** 58,4±0,69 64,4±0,5** 44,89±0,34 46,38±1,27

16:1 7,26±0,25 Следы Следы Следы Следы Следы

17:0 2,43±0,57 0,92±0,17** 0,55±0,07 0,65±0,09 0,72±0,1 1,21±0,15

17:1 2,29±0,29 0,54±0,09** 0,27±0,05 0,17±0,03 0,33±0,06 0,37±0,08

18:0 5,72±1,0 7,81± 1,0 22,64±1,83 23,01±1,95 25,48±2,54 41,41±2,72**

18:1 11,1±0,55 0,6±0,05** 2,1±0,3 2,47±0,34 0,6±0,07 Следы**

18:2 2,84±0,62 Следы** 6,01±0,76 1,36±0,17** 6,41±0,8 0,72±0,08**

20:3 19,18±2,93 0,07±0,01** 4,1±0,99 5,56±1,3 4,07±0,9 4,08±1,04

20:4 Следы 16,0±2,46** 3,45±0,69 0,05±0,01** 16,0±2,92 Следы**

50-124%. Вышеизложенное свидетельствует о том, что увеличение включения в ФХ пальмитата (С16:0) может увеличить активность цитохрома Р450.

Таким образом, в ФХ происходят сдвиги, способные увеличить активность А6- де-сатуразы и цитохрома Р450, модифицировать биосинтез эндогенных ПНЖК и обезвреживание ксенобиотиков.

В ЖК ФЭА (таблицы 2, 3), сумма НЖК и отношение сумм НЖК/ПНЖК увеличивались (р=0,002, 0,016), а суммы МНЖК и ПНЖК были ниже, чем у интактных животных (р=0,02, 0,002). В отличие от ФХ, увеличение суммы НЖК обуславливалось возрастанием содержания миристиновой (С14:0) и стеариновой (С18:0) кислот (р=0,009, 0,012), а снижение сумм МНЖК и ПНЖК - уменьшением до следовых количеств содержания олеиновой (С18:1) и ара-хидоновой (С20:4) кислот. Такие изменения также вносят свой вклад в увеличение вязкости мембран ЭПР и могут способствовать увеличению активности цитохрома Р450 [7].

В ЖК ЛФХ (таблицы 2, 3) увеличена сумма НЖК (р=0,001) и уменьшена сумма МНЖК (<0,0001), что обуславливалось воз-

росшим содержанием пальмитиновой кислоты (С16:0) (р=0,0003), снижением содержания миристиновой (С14:0) (р=0,01) и олеиновой (С18:1) кислот (р<0,0001). Содержание дигомо-г-линоленовой кислоты (ДГЛК) (С20:3) падало (р=0,02), а содержание арахидоновой кислоты (20:4) росло. Сравнение ЖК ФХ и ЛФХ показало, что из ФХ ФЛ-А2 изымались главным образом миристиновая (С14:0), пальмитиновая (С 16:1), олеиновая (С18:1) кислоты, атак же ДГЛК (С20:3). Известно, что ЭПР гепа-тоцитов осуществляет синтез ФЛ на своей цитозольной стороне. Для экспорта ФЛ при помощи флипаз переносятся на внутреннюю поверхность ЭПР, а фосфолипаза-А2 ускоряет этот процесс [9]. Вероятно, экспорт ФЛ, этерифицированных ДГЛК (С20:3), усиливается, а этерифицированных арахидоновой кислотой (С20:4) - замедляется. Учитывая, что крысы являются высоко устойчивыми к воспалительному процессу, а простаноиды, синтезирующиеся из ДГЛК, обладают менее выраженной активностью, чем простаноиды, синтезирующиеся из арахидоновой кислоты [8], можно сделать вывод, что снижение экспорта арахидоновой

кислоты и увеличение экспорта ДГЛК может расцениваться как способ регуляции активности воспалительного процесса у крыс.

Таким образом, можно сделать следующие выводы:

1. Из состава ЭПР, возможно для обеспечения возросшей функциональной активности митохондрий, изымаются ПГФ.

2. Изменения ЖК ФХ и ФЭА способствуют увеличению активности цитохрома Р450 и Д6-десатуразы.

3. Отмечены признаки увеличения экспорта вновь синтезированной ДГЛК, возможно, для ограничения активности воспалительного процесса через простаноиды первого ряда.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кейтс, М. Техника липидологии /М. Кейтс. - Москва.: "Мир," 1975. - 358с.

2. Косинец, А.Н. Профилактика и лечение гнойно-воспалительных осложнений при экстренных операциях на органах брюшной полости (клинико.-экспериментальное исследование): дисс. д-ра мед. наук: 14.00.27 / А.Н. Косинец. - Витебск, 1994. -510 л.

3. Осочук, С.С.Изменения липидтранспор-тной системы при экспериментальном пе-

ритоните у крыс / С.С. Осочук // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2002. - № 8.- С. 169-172.

4. Титов, В.Н. Атеросклероз как патология полиеновых жирных кислот/ В.Н. Титов. -Москва: "АЛТУС", 2002. - 495 с.

5. A universal reagent for fosfolipids analisis / V.E. Vaskowsky [et al.] // J. Chromatogr. -1975. - Vol. 114. - P. 129-141.

6. Baker, S. Low speed preparation of microsomes: a comparative study / S. Baker, L. Coons, E. Hodgson //Chem. Biol. Interact. - 1973. -Vol. 6. - P. 307-316.

7. Chul-Ho, Yun Conformational Change of Cytochrome P450 1A2 Induced by Phospholipids and Detergents / Yun Chul-Ho, Song Maengseok, Kim Hyoungman // JBC. -1997. - Vol. 272, № 32. - P. 19725-19730.

8. Li, Zhou. Sources of eicosanoid precursor fatty acid pools in tissues / Zhou Li Nilsson Eke // Journal of Lipid Research. - 2001. - Vol. 42. -P.1521-1542.

9. Sathyanarayana, N. Gummadi Transbilayer Movement of Dipalmitoylphosphatidylcholine in Proteoliposomes Reconstituted from Detergent Extracts of Endoplasmic Reticulum / N. Gummadi Sathyanarayana, Menon Anant K. // J. Biol. Chem. - 2002. - Vol. 277, № 28. -P. 25337-25343.

Поступила 11.04.2006 г.