ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ БЕЛКА β2m
THERAPEUTIC USE OF β2m PROTEIN

Настоящая патентная заявка касается области медицины, в частности области лечения аутоиммунных заболеваний.
Настоящее изобретение более конкретно относится к применению белка бета2-микроглобулина (β2m) в качестве активного ингредиента, в частности в фармацевтических композициях, предназначенных для лечения аутоиммунных заболеваний, таких как, например, множественный склероз или болезнь Крона.
ВВЕДЕНИЕ
Белок β2m представляет собой белок, имеющий среднюю молекулярную массу, равную приблизительно 11,6 кДа, обычно образованный из 99 аминокислот, который входит в состав главного комплекса гистосовместимости (MHC-I или HLA-I) [Cunningham B.A. et al. The complete amino acid sequence of beta-2-microglobulin (1973) Biochemistry 12:4811-4821].
Следует напомнить о том, что комплекс гистосовместимости MHC-I играет центральную роль в распознавании "своего" и "не своего" иммунной системой. Эти комплексы присутствуют на поверхности большинства человеческих клеток, за исключением эритроцитов. На их поверхности они презентируют большое количество антигенов, на основании чего T-лимфоциты (CD8) способны отличать клетки индивидуума от клеток, чужеродных ему, больных или подверженных процессу опухолевой трансформации.
Комплексы MHC-I состоят из гликозилированной тяжелой цепи (HC), приблизительно в 44 кДа, и из легкой цепи, β2m, которая нековалентно связана с внеклеточным доменом тяжелой цепи. α-цепь MHC-I состоит из трех внеклеточных доменов (α1, α2 и α3) и из трансмембранного сегмента, как показано на фигуре 1A. β2m связан с последовательностью аминокислот, расположенной в области, в которой конец α1 домена и начало домена α3 в HC расположены в непосредственной близости [Gussov, D. et al. (1987), The human beta-2-microglobulin gene: primary structure and definition of transcriptional unit (1987) Journal of Immunology 139:3132-3138]. Гены, кодирующие молекулы MHC-I, были пронумерованы в порядке их открытия и классифицированы по группам (A, B и C) и комплексам (D, H и G).
Антиген-презентирующие клетки (APC) используют комплексы типа MHC-I в качестве презентаторов антигенов T-клеткам (CD8) иммунной системы. Антигены, представляемые MHC-I, обычно состоят из множества полипептидов, содержащих от 8 до 10 аминокислот, которые получаются благодаря расщеплению эндогенных белков протеасомой. Эти антигены занимают пептидные полости, присутствующие на поверхности субъединиц (HC и β2m) комплексов MHC-I во время их образования в эндоплазматическом ретикулуме. После загрузки антигенов MHC комплексы экспортируются на поверхность клетки. Затем обеспечивается фиксация комплекса MHC-I к плазматической мембране трансмембранным доменом тяжелой цепи, расположенным у домена α3.
Субъединица, образованная белком β2m, отличается от тяжелых цепей практически не изменяющейся последовательностью и тем, что его полипептидная цепь не гликозилирована.
Даже при том, что его физиологическая роль не полностью выяснена, было показано, что белок β2m играет доминирующую роль по отношению к другому белку, образующему комплексы MHC-I, с одной стороны при образовании комплекса MHC-I/антиген [Androlewicz MJ., et al. (1994) MHC class I/p2-microglobulin complexes associate with TAP transporters before peptide binding, Nature 368, 864-867], в котором белок β2m специфически связывается с белком TAP-1 [Corr et al. 1992. Endogenous peptides of a soluble major histocompatibility complex class I molecule H-2Lds: sequence motif, quantitative binding and molecular modeling of the complex, JEM, 176(6):1981-92], позволяя обеспечить поддержание конформации антигенсвязывающего участка [Ljunggren, H-G. (1990) Empty MHC class I molecules come out in the cold. Nature. 346, 476-480], и, с другой стороны, когда комплекс MHC-I/антиген экспортируются на поверхность клетки. β2m участвует в фолдинге тяжелой цепи, а также обнаружено, что он участвует в представлении антигена T-клеткам (CD8). β2m также вносит вклад в стабильность комплекса MHC-I/антиген [Neefjes, F.F. et al. (1993) Selective and ATP-dependent translocation of peptides by the MHC-encoded transporter. Science. 261 (5122):769-771].
Трансгенные животные без β2m оказываются жизнеспособными, но демонстрируют ослабленный иммунный ответ, что делает их более восприимчивыми к вирусным и паразитическим инфекциям. Уменьшение иммунного ответа у этих животных коррелирует, как оказалось, с тем фактом, что их клетки представляют очень немногие антигены относительно их комплекса MHC-I, и что большинство их T-лимфоцитов не функциональны [Pereira P., et al. (1992) Blockade of transgenic gamma delta T cell development in beta 2-microglobulin deficient mice, EMBO Journal 11:25-31].
Также описано, что белок β2m участвует в гликозилировании тяжелых цепей в аппарате Гольджи [Sege et al. (1981) Role of beta2-microglobulin in the intracellular processing of HLA antigens. Biochemistry. 20 (16), pp 4523-4530].
Белок β2m также участвует в других процессах, таких как регуляция внутриклеточной сигнализации и правильный фолдинг ключевых белков, таких как HFE (человеческий белок гемохроматоза), который регулирует поток железа в клетке.
С конца 1980-х также установлено, что β2m может успешно улучшать ответ на антиген и применяться в качестве вакцинного адъюванта для стимуляции иммунного ответа, связанного с T-лимфоцитами (CD8).
Многочисленные документы указывают на то, что β2m может быть благодаря этому включен в вакцинные композиции в комбинации с молекулами, имеющими задачу индуцировать иммунную реакцию, такими как специфические вирусные или опухолевые антигены.
В таких вакцинных композициях β2m может присутствовать в различных формах, очищенный или рекомбинантный. Так, например, описаны генетические конструкции, в которых ген, кодирующий β2m, слит с генетическими последовательностями, кодирующими иммуногенные пептиды, с целью экспрессирования белков слияния, предназначенных для вызывания специфической иммунной реакции in vivo [WO 99/64957].
Сам по себе белок β2m очень слабо иммуногенен, поскольку он не гликозилирован. По этой причине в вышеуказанных вакцинных композициях β2m всегда применяется в качестве адъюванта, а не в качестве активного ингредиента.
Это несомненно обусловлено тем фактом, что к настоящему времени не был обнаружен терапевтический эффект β2m, позволяющий обосновать его применение в фармацевтических композициях.
Помимо вакцинации, некоторые документы известного уровня техники указывают на инактивированные или модифицированные формы белка β2m в терапевтических композициях.
Так, например, международная заявка WO 02/102840 описывает β2m, приведенный в нефункциональное состояние, предназначенный для образования неактивных комплексов MHC-I, которые больше не способны активировать CD8 T-лимфоциты. Образованные таким образом комплексы MHC применяют в качестве "приманки" для иммунной системы с целью получения иммунодепрессантного эффекта.
Другая международная заявка WO 02/24929 описывает терапевтические композиции, в которых β2m конъюгирован с белком HFE в качестве вектора для доставки препаратов (активных ингредиентов этих композиций) во внутриклеточное пространство.
Следует заметить, что в заявках этого типа белок β2m не применяется в его функциональной форме дикого типа в качестве активного ингредиента, но в качестве фармацевтической поддержки или вектора в присутствии активных ингредиентов, не направленных на MHC.
Более того, в противоположность какому-либо терапевтическому применению, белок β2m часто используют в качестве маркера различных патологий, в частности, в качестве средства диагностики.
Так, например, синдром иммунодефицита при заболевании СПИДом, который может проявиться через много лет после инфицирования ВИЧ, предваряется резким повышением концентрации β2m в крови.
Некоторые публикации [Wu C.H. et al. (2001) Oncogene 20:7006-20] акцентируют внимание на том, что повышение концентрации β2m коррелирует и, возможно, связано с развитием некоторых раков, в частности, рака костей и рака простаты [Gross M. et al. (2007) Clin. Cancer Res., 13:1979-1986]. Для других раков наблюдается падение концентрации β2m в сыворотке, как например при раке толстой кишки [Kaklamanis L. et al. (1992) Int. J. Cancer 57:379-385].
Количество β2m в крови (и, более конкретно, в сыворотке крови), спинномозговой жидкости или слюне часто используют в диагностике некоторых инфекционных или паразитических заболеваний, но также, в первую очередь, для диагностики некоторых заболеваний почек, лимфатической системы, ревматизма, воспалительных заболеваний и неврологических заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и лобно-височная деменция [Davidsson P. et al. (2002), Proteome analysis of cerebrospinal fluid proteins in Alzheimer patients Clinical Neuroscience and Pathology 13:611-615 ; Hansson S.F. et al. (2004), Validation of a prefractionation method followed by two-dimensional electrophoresis-Applied to cerebrospinal fluid protein from frontotemporal dementia patients Proteome Science 2:1-11].
У лиц, считающихся здоровыми, средняя концентрация β2m в крови остается относительно постоянной, меньшей или равной 2 мг/л, в отличие от вышеупомянутых заболеваний, при которых данная концентрация может достигаться значений вплоть до 4,0 мг/л.
Для некоторых патологий возрастание сывороточного β2m может быть вызвано повышенным "слущиванием" (высвобождением белков клеточной поверхности) β2m [Bellotti V., et al. (1999) Cell. Mol. Life Sci., 55-977-991].
Плазматический β2m, циркулирующий в крови, в норме фильтруется клубочками в почках, затем реабсорбируется и катаболизируется в канальцах.
Исследования показали, что половина плазматического β2m (свободная форма β2m), который обновляется каждый день, приходит, в основном, из кругооборота комплексов MHC-I. Оказалось, что это обновление само по себе вносит вклад в высокую выработку сывороточного β2m, составляющую приблизительно 150 мг за 24 часа для лица среднего размера. Тем не менее, данный "оборот", по-видимому, стабилизирует сывороточную концентрацию при 2 мг/л.
У пациентов на диализе, у которых β2m не удаляется почками, накопление β2m в жидкостях организма ведет к вредным последствиям. В частности, оно вызывает артропатии и нейропатии через образование амилоидных бляшек в некоторых соединительных тканях (нервной и суставной) [Ohshi K., et al. Pathogenesis of beta2-microglobulin amyloidosis (2001) Pathol. Int. 51:1-10].
Описано, что при остеоартрите (артрозе) β2m обладает ингибирующим эффектом на пролиферацию хондроцитов, последствием чего является усиление разрушения хрящей [WO 2004/020586].
В случае некоторых аутоиммунных заболеваний, таких как множественный склероз (МС), обычным является отслеживание изменений концентрации β2m у пациентов, для того чтобы предопределить начало воспалительных эпизодов [Bagnato, F., (2003), beta-2 microglobulin and neopterin as markers of disease activity in multiple sclerosis Neurol. Sci. 24:51301-51304]. При этом концентрацию β2m предпочтительно измеряют в спинномозговой жидкости, поскольку концентрация β2m в крови считается слишком изменчивой [Caudie C. et al. (2005), Valeurs usuelles et utilite diagnostique de la β2-microglobuline dans le liquide cephalorachidien Ann. Biol. Clin. 63(6):631-637; Ryu O.H., et al. (2006) Rheumatology, 45:1077-1086].
Участие β2m в аутоиммунных заболеваниях остается неясным и требует дальнейшего изучения.
Аутоиммунные заболевания образуют большой ряд заболеваний, симптомы которых можно объяснить гиперактивностью иммунной системы, с присутствием или отсутствием аутоантител, направленных на вещества или ткани, которые обычно присутствуют в организме.
Несомненно, что иммунный ответ на "свое" при аутоиммунных заболеваниях является результатом активации T-лимфоцитов через систему MHC, и это может быть вызвано несколькими механизмами.
- В иммунной системе:
- Посредством индуцирования аутоантител с применением T-клеток посредством представления антигенов, известных упомянутым аутоантителам. Это имеет место при системной красной волчанке (SLE), тиреоидите Хашимото, множественном склерозе (МС), инсулинозависимом диабете (I тип) и т.д.
- В клетках:
- Индуцирование аутоиммунного ответа посредством активации T-клеток, специфических к вирусному антигену;
- Изменение в отношении распознавания APC-MHC-I/TcR (T-клеточный рецептор) и в отношении сигнального каскада(ов) активированного T-лимфоцита.
- Неправильная сборка компонентов системы MHC-I в APC.
- Нарушение(я) работы регуляторных клеток.
- На молекулярном уровне:
- Молекулярная мимикрия или толерантность;
- MHC-I в качестве аутоантигена.
Обычно считают, что аутоиммунные заболевания являются результатом совпадения генетической предрасположенности и инфекционного эпизода, во время чего в организме развивается иммунная реакция на его собственные антигены. Тем не менее точные причины данных заболеваний точно идентифицированы не были.
Наиболее широко распространенными аутоиммунными заболеваниями являются ревматоидный полиартрит, синдром Шегрена, тиреоидит Хашимото, болезнь Аддисона, системная красная волчанка, склеродермия, фибромиалгия, миозит, анкилозирующий спондилит, инсулинозависимый диабет I типа, болезнь Крона, целиакия и множественный склероз (МС).
Среди заболеваний, называемых "орфанными", существуют многочисленные другие нарушения, которые, как полагают, также являются аутоиммунными заболеваниями. Амиотрофический боковой склероз (ALS) является одним из этих заболеваний, для которого в настоящее время эффективное лечение не доступно.
Следует различать два типа аутоиммунных заболеваний: специфические аутоиммунные заболевания и неспецифические аутоиммунные заболевания.
При неспецифических заболеваниях поражаются различные органы, что вызывает системные заболевания, такие как ревматоидный артрит, системная красная волчанка, синдром Шегрена и склеродермия.
Специфические заболевания ограничены главным образом определенными органами. Наиболее распространенными являются инсулинозависимый диабет, заболевания щитовидной железы, болезнь Аддисона, некоторые заболевания почек, легких, пищеварительной системы и, особенно, множественный склероз.
Современные способы лечения включают диапазон подходов от противовоспалительных средств до иммунодепрессантов, включая антиметаболиты и противораковые препараты. Например, применяют следующие: нестероидные противовоспалительные препараты (НПВС), гликокортикоиды, антиметаболиты (метотрексат, азатиоприн), циклофосфамид, сульфасалазин, соли золота, циклоспорин A, микофенолат и лефлуномид.
Недавно для МС был рекомендован интерферон β, а для лечения эритематозной волчанки и ревматоидного полиартрита рекомендованы производные хлорохина (применяемого против малярии).
Данные способы лечения, применяемые для лечения других заболеваний, не очень хорошо адаптированы и обладают многочисленными нежелательными побочными эффектами, в частности когда их применяют в течение долгого времени. Кроме того, хотя они могут позволить по меньшей мере частично ослабить симптомы данных заболеваний, они не позволяют получить ремиссию заболеваний.
Изобретатели, указанные в настоящей заявке, проявили особенный интерес к ситуации четырех пациентов, страдающих четко различающимися аутоиммунными заболеваниями:
- Первый пациент (P1), страдающий неспецифическим аутоиммунным заболеванием, то есть не поражающим определенный орган, но также страдающий тиреоидитом Хашимото и первичным синдромом Шегрена;
- Второй пациент (P2), страдающий изначально МС, впоследствии с дуоденальной лимфоцитарной инфильтрацией;
- Третий пациент (P3), страдающий целиакией;
- Четвертый пациент (P4), страдающий тиреоидитом Хашимото и целиакией.
Для данных пациентов настоящие изобретатели попытались установить отношение количеств HC(MHC-ABC)/β2m, полученное из лимфоцитов, выделенных из крови пациентов с применением обычных способов, указанных далее.
Неожиданно оказалось, что данное отношение HC/β2m растет у этих четырех пациентов по сравнению с контрольными донорами, тогда как концентрация сывороточного β2m была средней: приблизительно 1,9 мг/л для P1, 1,8 мг/л для P2, 1,1 мг/л для P3 и 1,1 мг/л для P4 (ср. с таблицей 1).
Таблица 1Определение различных форм β2m у пациентов, страдающих аутоиммунными заболеваниями
Пациенты
Сывороточный β2m(а)
HC/β2m в белках(b)
HC/β2m в мембранах(с)
P1
1,9
1,3
1,8
P2
1,8
1,1
1,7
P3
1,1
1,6
1,5
P4
1,1
1,2
2,1
HC: тяжелые цепи MHC-I(a) концентрация β2m в мг/л;(b) HC/β2m, вычисленное по всем лимфоцитарным белкам.(c) HC/β2m, вычисленное по плазматическим мембранам, выделенным из очищенной лимфоцитарной фракции.
Результаты из таблицы 1 выше демонстрируют дисбаланс в отношении ΗC/β2m. Эти результаты выявили неожиданную ситуацию, при которой мембранные комплексы MHC-I, присутствующие у данных четырех пациентов, очевидно значительно дефицитны по β2m по отношению к концентрации HC, при отсутствии повышения концентрации свободного β2m в крови.
Данные наблюдения следует сравнить с представителями контрольной группы с хорошим здоровьем, которые демонстрируют отношение ΗC/β2m, приблизительно равное 1. Напротив, оказалось, что β2m секвестрируется во внутриклеточном пространстве у пациентов, страдающих аутоиммунными заболеваниями.
Эти результаты удивили настоящих авторов и привели их к формулировке гипотезы, что для четырех аутоиммунных заболеваний, которыми страдали данные пациенты, дефицит β2m в мембранных комплексах MHC-I может быть общей причиной. В более общем смысле, дисбаланс ΗC/β2m в комплексах MHC, по-видимому, вносит вклад в появление нарушений, встречающихся при многих аутоиммунных заболеваниях.
В соответствии с данной гипотезой, изложенной далее, аутоиммунная реакция в контексте патологий, которыми страдали четыре пациента, не является, вероятно, следствием общего повышения свободного β2m в крови, но, напротив, происходит от локального дефицита β2m в мембранных комплексах MHC-I, который является причиной изменения представления антигенов T-клеткам (CD8).
Следует заметить, что данная гипотеза никоим образом не исключает участие β2m в активации T-лимфоцитов и в воспалительном процессе, как это могло быть описано в известном уровне техники.
Принимая во внимание эти первые наблюдения, настоящие авторы осуществили анализ HC/β2m во всех лимфоцитарных белках, присутствующих у других пациентов, страдающих МС или болезнью Крона, и смогли обнаружить, что отношение HC/β2m, полученное из лимфоцитов этих пациентов, оказалось также выше, чем у контрольных пациентов.
На основании этих результатов настоящие авторы разработали фармацевтические композиции, главным активным ингредиентом которых являлся белок β2m в функциональной форме.
Целью данных композиций является уменьшение дефицита β2m в мембранных комплексах MHC-I у пациентов, страдающих аутоиммунными заболеваниями.
Фигура 1: Схематическое представление комплекса MHC I типа на плоскости (A) и в пространстве (B). Тяжелая цепь (HC) образована 3 внеклеточными доменами (α1, α2 и α3) и одним трансмембранным доменом. Легкая цепь (β2m), которая является внеклеточной, помещается между мембраной и местом, в котором α1 и α3 тяжелой цепи находятся в непосредственной близости. Фигура B показывает местоположение пептидов (антигенов), представляемых тяжелой цепью.
Фигура 2: Фотография (×630) лимфоцитов, приведенных в контакт с липосомами в соответствии с настоящим изобретением. Липосомы были получены в соответствии со способом диализа, описанном в примере 2. Липосомы (светлые пятна) адсорбированы на мембране лимфоцитов (HLA-ABC). Клеточное ядро остается нетронутым (серое).
Фигура 3: Фотография (×630) лимфоцитов, приведенных в контакт с липосомами в соответствии с настоящим изобретением, содержащими альбумин. Белок (альбумин) сделан флуоресцирующим с помощью DAPI. Он образует более темные пятна, детектируемые с помощью иммунофлуоресценции, внутри более светлых лимфоцитов (HLA-ABC положительных).
Фигура 4: Фотография (×630) липосом, полученных с применением экструзионного способа (зеленые) и содержащих флуоресцирующий β2m (TRITC). A: Флуоресценция, испускаемая флуоресцирующим липидом NBD-PC-Oleyl, содержащимся в липосомах. B: Флуоресценция, испускаемая флуорофором (родамин B изотиоцианат), связанным с β2m. C: Суперпозиция двух флуоресценций A и B.
Фигура 5: Фотография (×630) лимфоцитов, полученных от пациента (P1) и инкубированных с липосомами, полученными в соответствии с экструзионным способом и содержащими флуоресцирующий β2m (TRITC). A: Флуоресценция, испускаемая маркером Хехст 33342, который окрашивает ядра лимфоцитов в голубой цвет. B: Флуоресценция, испускаемая флуорофором (родамин B изотиоцианат), связанным с β2m. Такая окраска показывает включение β2m в лимфоциты, которые становятся красного цвета. C: Флуоресценция, испускаемая флуоресцирующим зеленым липидом NBD-PC-Oleyl, содержащимся в липосомах. Такая окраска показывает связь липосом с лимфоцитами. D: Суперпозиция окрасок B и C (желтый цвет) - масштабная метка: 10 мкм.
Фигура 6: Микроскопическое исследование флуоресценции липосом, содержащих альбумин (TRITC), после 30 дней хранения при двух различных температурах (25°C и 37°C). По наблюдениям нельзя обнаружить значительных отличий между различными типами получения и хранения. A и B: Партия 30 (30 мг белка на 150 мл). C и D: Партия 60 (60 мг белка на 150 мл). Нижняя часть: Флуоресценция, испускаемая флуоресцирующим липидом NBD-PC-Oleyl, содержащимся в липосомах. Верхняя часть: Флуоресценция, испускаемая флуорофором (родамин B изотиоцианат), связанным с альбумином. Масштабная метка: 200 нм. Увеличение ×630.
Фигура 7: Распределение по размерам (%) липосом (<50 нм, между 50 и 100 нм, >100 нм), содержащих альбумин, в зависимости от времени (2, 30 и 60 дней) и температуры хранения (25°C и 37°C). A и B: Партия 30 (30 мг белка на 150 мл), C и D: Партия 60 (30 мг белка на 150 мл).
Фигура 8: Распределение по размерам (%) липосом (<50 нм, между 50 и 100 нм, >100 нм), содержащих высокую концентрацию β2m (партия 80 мг белка на 150 мл), в зависимости от времени хранения при 25°C в течение 6 и 40 дней.
Фигура 9: Профили деградации чистого или покрытого липосомой β2m сыворотками пациентов или здоровых доноров с течением времени. A и B: чистый/липосомный препарат β2m (сыворотка пациента 1: женщины в возрасте 51 года, страдающей заболеванием Хашимото). C и D: чистый/липосомный препарат β2m (сыворотка пациента 2: женщины в возрасте 73 лет, ревматоидный полиартрит). E и F: контрольный пациент, здоровый мужчина в возрасте 62 лет.
Фигура 10: Электрофорезный гель белка, демонстрирующий связь между β2m (липосомный препарат) и тяжелыми цепями MHC-I на клеточной поверхности лимфоцитов, полученных от пациентов. A: В присутствии глутаральдегида комплексы HLA-β2m видны при 55 кДа, а свободный β2m при 12 кДа. Полоска 12 кДа на дорожке без глутаральдегида представляет клеточный β2m (дорожка 3). B: Количественное определение мембранной экспрессии β2m. Этот контроль делает возможным обоснование применения глутаральдегида для получения комплексов HLA-β2m. C: Сравнение лимфоцитов пациента, страдающего множественным склерозом, (женщина, 39 лет) и здорового донора (мужчина, 67 лет) после инкубации с липосомным препаратом β2m в течение 90 минут. β2m, содержащийся в липосомах, в больших количествах связывается с лимфоцитами, полученными от пациента (в присутствии глутаральдегида), чем это имеет место в контроле.
Фигура 11: Анализ токсичности β2m, свободного или в липосомах, "in vitro" на человеческих клетках печени и почек.
A, C и E: анализ на клетках печени HH после 24, 48 и 72 часов воздействия. B, D и F: клетки почек HREpic после 24, 48 и 72 часов воздействия. 1. контроль. 2. контроль и ненагруженные липосомы. 3. 3 мкг свободного β2m. 4. 3 мкг β2m в липосомной форме (партия 66 мкг на 150 мл). 5. 6 мкг свободного β2m. 6. 6 мкг β2m в липосомной форме (партия 132 мкг на 150 мл). Общее содержание белка определяли способом с BCA.
Фигура 12: Анализ токсичности β2m, свободного или в липосомах, "in vitro" на человеческих клетках печени и почек. Те же самые обозначения, что и на фигуре 11. Результат MTT-теста на жизнеспособность.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Настоящее изобретение, таким образом, относится к применению белка β2m в качестве активного ингредиента, в частности, для получения лекарственного средства.
Белок β2m предпочтительно представляет собой человеческую форму белка, очищенного или рекомбинантного, референсная полипептидная последовательность, а также генетические детерминанты которого описаны в базе данных GENEBANK под номером доступа CAG33347.
В случае очищенного β2m, он может быть получен из сывороток здоровых доноров.
Также может быть предусмотрено обращение к химическому синтезу, поскольку белок может применяться в не гликозилированной форме.
Настоящее терапевтическое применение β2m распространяется на функциональные варианты этого белка, то есть на его изоформы, на видоизмененные копии или на фрагменты этого белка, отличительной особенностью которых является то, что они обладают той же функциональностью, что и белок дикого типа, то есть тем же терапевтическим эффектом, описанным в настоящей заявке, причем, однако, возможно, что интенсивность этого эффекта уменьшается или возрастает по отношению к упомянутому белку дикого типа.
Функциональный вариант более конкретно обозначает полипептид, способный связываться с комплексами MHC, присутствующими на поверхности клеток, полипептидная последовательность которого по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90% и еще более предпочтительно по меньшей мере на 95% идентична полипептидной последовательности человеческого белка β2m (сравнение последовательности осуществляют, например, с применением программного приложения ClustalW).
Функциональный вариант β2m, предпочтительно, состоит из фрагмента белка β2m, демонстрирующего тот же терапевтический эффект или даже ту же биологическую активность.
Такие функциональные варианты могут также быть результатом экспрессии нуклеотидных последовательностей, клонированных в векторе экспрессии или в генно-терапевтическом векторе.
Многочисленные публикации описывают, например, присутствие изоформ β2m в грызунах [Goding J.W. and Walker I.D. Allelic forms of β2-microglobulin in mouse (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7395-7399] и в людях [Davidsson P. et al., Proteome analysis of cerebrospinal fluid proteins in Alzheimer patients (2002) Clinical Neuroscience and Pathology 13:611-615; Hansson S.F. et al., Validation of a prefractionation method followed by two-dimensional electrophoresis-Applied to cerebrospinal fluid protein from frontotemporal dementia patients (2004) Proteome Science 2:1-11]. Эти изоформы, которые более точно различаются различными изоэлектрическими точками (pI), рассматриваются как функциональные варианты β2m.
Такие функциональные варианты могут обладать определенными преимуществами с точки зрения эффективности продукта или его составления по отношению к очищенному человеческому белку (растворимость, большая стабильность, уменьшенная протеолитическая деградация).
Настоящее изобретение касается фармацевтических композиций, содержащих β2m или один из функциональных вариантов β2m в качестве активного ингредиента.
Предпочтительно, β2m или его функциональный вариант образуют единственный активный ингредиент упомянутых композиций.
Как это понимается в настоящем изобретении, активный ингредиент представляет собой вещество, которое входит в композицию лекарственного средства, и которое ответственно за его фармакодинамические или терапевтические свойства. Адъювант не считается активным ингредиентом, как это понимается в настоящем изобретении.
Более предпочтительно, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, состоящей из β2m или функционального варианта β2m, содержащегося в фармацевтически приемлемом носителе или основе, причем упомянутые фармацевтически приемлемые носитель или основа предпочтительно представляют собой липосому.
В соответствии с предпочтительным аспектом настоящего изобретения β2m вводят отдельно, с упомянутым фармацевтически приемлемым носителем или физиологическим раствором, в соответствии с регламентирующими рекомендациями и требованиями.
В соответствии с настоящим изобретением β2m применяется в первую очередь из-за его способности восстанавливать нормальное отношение HC/β2m в мембранных комплексах MHC-I у пациента.
Отношение HC/β2m предпочтительно рассматривается по отношению к лимфоцитам, в частности, B клеткам. Отношение HC/β2m соответствует молярному отношению субъединиц HC и β2m в очищенных комплексах MHC-I.
Предпочтительно, данное отношение возвращают к уровню, сравнимому с уровнем у пациента, не страдающего заболеванием. Более предпочтительно, β2m применяют с целью уменьшения отношения HC/β2m у пациента, для того чтобы получить молярное отношение, близкое к 1.
Настоящее изобретение более конкретно направлено на предотвращение возникновения дефицита β2m в комплексах MHC-I у пациентов, страдающих аутоиммунными заболеваниями.
Применение β2m в соответствии с настоящим изобретением, таким образом, более конкретно предназначено для лечения аутоиммунных заболеваний.
Настоящие изобретатели смогли определить, что дефицит внутриклеточного или мембранного β2m может приводить к отношению HC/β2m большему, чем 1 или даже 2 у некоторых пациентов, страдающих аутоиммунными заболеваниями. Настоящее изобретение, таким образом, направлено на возвращение упомянутого HC/β2m к значению, близкому к физиологическим значениям, т.е., предпочтительно, менее чем 2, более предпочтительно, менее чем 1,5 и еще более предпочтительно менее чем 1,2.
Настоящее изобретение может, конечно, применяться к любому заболеванию, связанному с дисбалансом в отношении HC/β2m в комплексах MHC-I, отличному от аутоиммунных заболеваний.
Как это понимается в настоящем изобретении, патологии, связанные с трансплантатами органов или отторжением трансплантата, не рассматриваются ни как аутоиммунные заболевания, ни как заболевания, вызванные нарушением распознавания "не своего" иммунной системой. Точнее говоря, отторжение трансплантата рассматривается здесь как следствие распознавания "не своего" иммунной системой, а не как нарушение распознавания "своего".
Анализы, осуществленные настоящими изобретателями у различных пациентов, указывают на то, что отношение HC/β2m, вычисленное исходя из общего лимфоцитарного белка, большее, чем 1,2, может наблюдаться по меньшей мере для следующих заболеваний: ревматоидный полиартрит, системная красная волчанка, синдром Шегрена, склеродермия, фибромиалгия, миозит, анкилозирующий спондилит, инсулинозависимый диабет I типа, тиреоидит Хашимото, болезнь Аддисона, болезнь Крона, целиакия, амиотрофический боковой склероз (ALS) и множественный склероз (МС). Хотя данный вопрос все еще остается предметом дискуссии в научном сообществе, ALS приравнивают к аутоиммунному заболеванию в виду полученных результатов.
Настоящее изобретение касается более конкретно разработки лекарственного средства для повышения количества β2m в крови до концентрации, лежащей между 2,5 и 12 мг/л, предпочтительно между 3 и 8 мг/л, более предпочтительно между 3 и 5 мг/л, для того чтобы уменьшить дефицит HC/β2m мембранного комплекса MHC-I.
Как описано ниже в экспериментальной части настоящего изобретения, лекарственное средство в соответствии с настоящим изобретением может состоять из липосомного препарата, содержащего β2m или его функциональный вариант. Липосомы можно изготовить с применением различных способов, известных специалисту в данной области техники, таких как изложенные в примерах в настоящей заявке. Можно применять различные липиды, образующие липосомы [Medical Application of Liposomes (1986) edited by Kunio Yagi, Japan Scientific Societies Press, Tokyo, Karger].
Предпочтительное лекарственное средство настоящего изобретения в связи с этим состоит из липосомы, нагруженной β2m.
Предпочтительно, β2m или функциональный вариант этого белка составляют единственные активные ингредиенты, содержащиеся в упомянутом липосомном препарате.
Применение липосомы в соответствии с настоящим изобретением в качестве лекарственного средства является предпочтительным, поскольку оно позволяет защитить β2m от протеолитических атак, которые могут иметь место, и поскольку оно позволяет доставлять β2m целевым образом в комплексы MHC-I, в частности посредством слияния липосомы с фосфолипидами, которые образуют клеточные мембраны.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения применяют генно-терапевтический вектор, кодирующий β2m или один из его функциональных вариантов, для того чтобы синтезировать данный белок in vivo, предпочтительно в окружении комплексов MHC. Такой генно-терапевтический вектор может содержаться в липосомах.
Настоящее изобретение, таким образом, также относится к генно-терапевтическому способу, содержащему стадию in vivo или ex vivo экспрессии β2m или его функционального варианта в качестве активного ингредиента. Различные типы вирусных или не вирусных векторов, описанные в литературе, можно адаптировать для экспрессии белка β2m для данной цели [Urnov et al. (2005) Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases, Nature, 435:577-579]. Предпочтительно, генно-терапевтический вектор в соответствии с настоящим изобретением делает возможной экспрессию в организме человека белка β2m (или его функционального варианта) без какого-либо другого активного ингредиента, и, предпочтительно, какого-либо другого полипептида.
В соответствии с аспектом настоящего изобретения пациент может подвергаться лечению посредством перфузии раствора липосом, содержащих β2m или вектор, экспрессирующий этот белок, или посредством трансфузии лимфоцитов от пациентов, предварительно приведенных в контакт с β2m. Такое приведение в контакт можно осуществлять посредством инкубации "ex vivo" лимфоцитов, экстрагированных из образца крови, предварительно взятого у того же пациента.
В соответствии с предпочтительным аспектом настоящего изобретения лекарственное средство, содержащее β2m, получают в форме солевого раствора. Предпочтительный способ получения лекарственного средства состоит из инкубации β2m в форме солевого раствора, ex vivo, в контакте с сывороткой пациента, для которого предназначено это лекарственное средство.
Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением, описанные выше, могут принимать любую соответствующую форму, известную специалисту в данной области техники, для их перорального введения, посредством инъекции, перфузии или ингаляции.
Другой аспект настоящего изобретения касается диагностики аутоиммунных заболеваний, более конкретно диагностики заболеваний, перечисленных выше, посредством определения in vivo или in vitro отношения HC/β2m комплексов MHC-I.
Способ диагностики в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно содержит одну или несколько из следующих стадий, состоящих из:
i) забора клеток у пациента, у которого осуществляется скрининг аутоиммунного заболевания, предпочтительно лимфоцитов;
ii) экстрагирования комплексов MHC-I из этих клеток и при необходимости;
iii) определения относительных количеств HC и β2m, содержащихся в упомянутых комплексах;
iv) установления молярного отношения HC/β2m; и
v) сравнения полученного отношения HC/β2m с результатами, полученными ранее у других пациентов.
Отношение HC/β2m может быть установлено для всей клетки (клеточное отношение HC/β2m) или, предпочтительно, для мембраны (отношение HC/β2m мембранных комплексов MHC-I). Предпочтительно, способ диагностики в соответствии с настоящим изобретением содержит стадию сравнения отношения HC/β2m с этим отношением в контроле, или, в контексте наблюдения за пациентом, с другими отношениями, определенными ранее.
Относительные количества белков HC и β2m можно определять стандартным способом в соответствии со способами, известными специалисту в данной области техники, например посредством количественного иммунологического анализа (например, ELISA, иммунодоттинга, "вестерн-блоттинга", микрочипов с аутоантигеном и т.д.). Экстракцию комплексов MHC-I осуществляют в соответствии с известными протоколами экстрагирования клеточных и мембранных белков.
Способ диагностики в соответствии с настоящим изобретением можно применять в контексте терапевтического наблюдения за пациентами, страдающими различными аутоиммунными заболеваниями.
Следующие примеры предназначены для дополнения описания настоящего изобретения без ограничения его объема.
ПРИМЕРЫ
1 - Анализ компонентов мембранного комплекса HLA-I лимфоцитов у пациентов, страдающих аутоиммунными заболеваниями.
Не ограничивая себя теорией, настоящие изобретатели разработали рабочую гипотезу, что повышение отношения HC/β2m может приводить к реакциям аутоиммунного типа. В частности, настоящие изобретатели предположили, что избыток HC, уменьшение β2m, на уровне комплексов MHC-I, или и то, и другое в одно и то же время, могут приводить к явлению "переэкспонирования" TcR "своего". Следует заметить, что β2m защищает некоторые участки HC и специфически определяет представление "не своего" CD8 T-клеткам [Hill, D.M. et al. (2003), A dominant negative mutant β2-microgobulin blocks the extracellular folding of major histocompatibility complex class I heavy chain. JBC. 278:5630-5638].
Для того чтобы проверить эту гипотезу, осуществили первый анализ, чтобы определить молярные количества HC и β2m в комплексах MHC-I, экстрагированных из лимфоцитов четырех пациентов. Результаты этих анализов представлены в таблице 1, обсужденной выше.
Лимфоциты выделили из крови здоровых доноров и у пациентов в соответствии со способом Lightbody J. [Manual of Clinical Immunology, Rose NR., Friedman H. Editors American Society for Microbiology Washington (DC), 1976, стр. 851-857], модифицированным Hofman F.M. et al. [Ann. J. Clin. Pathol. (1982) 77:710-716]. Комплексы MHC-I детектировали на целых лимфоцитах или на плазматических мембранах, полученных в соответствии со способом Warley A. et al. [Biochim. Biophys-Acta (1973), 323:55-66] с некоторыми модификациями. Детектирование белковых компонентов MHC-I осуществили с помощью электрофореза (ДСН-ПААГ система) в соответствии с Laemmli U.K. [Nature (1970) 227:680-685], затем с помощью электропереноса на мембраны из PVDF и иммуноблоттинга в соответствии со способом Towbin H. et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76:4350-4354]. Обнаружение провели с помощью вторичных антител, связанных с щелочной фосфатазой, с применением смеси NBT-DCIP.
Было подтверждено, что избыток тяжелых цепей действительно имеет мембранное происхождение, посредством выделения плазматических мембран и применения способа связывания с глутаральдегидом, описанного ниже.
Как показано выше, четыре других случая МС и два случая болезни Крона демонстрировали клеточное отношение HC/β2m>1. Эти наблюдения побудили заявителя разработать экспериментальный подход, позволяющий восстанавливать баланс HC/β2m (MHC-I), в частности, с помощью применения липосом.
2 - Получение липосом, нагруженных β2m:
2.1 - Определение количества β2m, которое следует доставить пациентам
Для того чтобы вывести β2m на поверхность лимфоцитов в избытке, его концентрация в крови должна быть повышена в "разумных" пределах, для того чтобы не включить сигнальные каналы в клетках, обладающих потенциалом для размножения.
Принимая во внимание легкость, с которой β2m отделяется от мембран и циркулирует в крови и почечной системе, концентрацию β2m в крови следует довести до диапазона от 3 мг/л до 8 мг/л (нормальная концентрация варьирует около приблизительно 2 мг/л крови). Это повышение ведет к адсорбции β2m на поверхности клеток.
Следует отметить, что главные комплексы гистосовместимости I типа состоят в соотношении моль/моль из тяжелых цепей (м.в. ≈43 кДа) и из β2m (м.в. ≈12 кДа). Комплекс (м.в. ≈55 кДа), таким образом, состоит по весу на 79% из тяжелой цепи и на 21% из легкий цепи.
-12
-12
-14
Среднее содержание белка в лимфоците составляет 650 × 10 г, а содержание белка в его плазматической мембране составляет только 1% от общего содержания, т.е. 6,5 × 10 г. Если считать, что MHC-I составляет не более 1% от общего содержания мембранных белков покоящегося лимфоцита, содержание β2m составляет, следовательно, приблизительно 1,4 × 10 г на лимфоцит.
6
-6
-6
-9
-9
Если взять средние физиологические параметры, 2 × 10 лимфоцитов на мл крови и 5 литров крови на человека, диапазон "веса" общего MHC-I на человека (что касается лимфоцитов) будет составлять от 1,4 × 10 г до 1,8 × 10 г лимфоцитарного β2m. Эти цифры представляют собой максимальные цифры, в том смысле, что наши первые оценки дают значения, преимущественно лежащие в среднем в диапазоне от 0,2 × 10 до 500 × 10 г у пациентов. Поскольку среднее количество в крови составляет 10 мг β2m на человека, т.е. количество, по существу значительно превышающее то, которое присутствует на поверхности лимфоцитов, то, судя по всему, в нормальных условиях отношение по существу меньшее, чем 1, уже существует между мембранным β2m и сывороточным β2m. Следовательно, не бессмысленным является увеличение количества β2m в циркуляции крови (увеличивающее его онкотическое парциальное давление) с целью компенсации мембранного дефицита β2m.
Введение β2m можно осуществлять двумя способами:
(1) Введение липосом, нагруженных β2m. Этот тип фармацевтического носителя является общеупотребительным для введения пептидов, антител, генетического материала и т.д. Применение липосом ("искусственных" или синтетических мембран) способствует контакту между клеточной поверхностью и активным ингредиентом;
(2) Инкубация активного ингредиента в форме солевого раствора с сывороткой пациентов до введения. Целью такой инкубации является то, что липопротеины сыворотки действуют как вектор наподобие липосом.
Степень включения β2m в лимфоциты после введения с помощью способа 1 или 2 можно сравнить с контрольным введением; в последнем случае перфузию солевым раствором β2m осуществляют при 0,10 мг/мл (общий объем 150 мл), что дает 3 мг β2m на литр крови (партия с 15 мг β2m на 150 мл липосомного раствора, обозначенная как "партия 15").
2.2 - Составление липосом
2
2
Для получения липосом (для 1 мл): после выпаривания дихлорметана (CHCl), содержащего компоненты для высушивания под азотом, образуется пленка, содержащая фосфатидилхолин, с добавлением или без добавления холестерина, с добавлением или без добавления сфингомиелина или с добавлением холестерина и сфингомиелина. Соотношение этих трех соединений (фосфатидилхолина, холестерина и сфингомиелина) составляет, соответственно, 10 M, 2 M и 1 M - т.е. для 1 мл конечного раствора 7,60 мг, 0,76 мг и 0,38 мг. К этой пленке добавляют 1 мл солевого раствора (ФСБ 10 мМ pH=7,4; HANKS, трис/глицин или DMEM), содержащего 2 мг β2m. Молярная концентрация остается той же самой для каждого из соединений, если получают липосомы, составленные из фосфатидилхолина (10 M), из фосфатидилхолина (10 M) и из холестерина (2 M), из фосфатидилхолина (10 M) и из сфингомиелина (1 M). Тем не менее, могут использоваться другие молярные концентрации в отношении липидных компонентов. Количества белков могут быть различными, и pH может быть больше, чем 7,4, в зависимости от обстоятельств. Диспергирование липидной пленки осуществляют посредством перемешивания вплоть до 3 часов при температуре между 20 и 37°C.

Липосомы образуют посредством так называемого способа "детергентного диализа", или же посредством так называемого "экструзионного" способа. Во втором случае раствор (Lipofast, Sodexim S.A., 51140 Muizon, Франция) пропускают 41 раз через фильтрующие мембраны 100 нм в поликарбонате под давлением, равным 69 бар. Полученные липосомы имеют гомогенный размер. Липосомы в данном случае выдерживают в течение 2 дней при 4°C и добавляют к суспензии лимфоцитов (диаметр <100 нм; фигура 4). В больших масштабах раствор (3 л/час; sodexim 2770; emulsifflex c3; sodexim s.a.) пропускают 4 раза при давлении, равном 450 бар, для того чтобы получить SUV (маленькие однослойные везикулы).
В "предэкспериментальных" исследованиях, для того чтобы продемонстрировать включение β2m в липосомы, адсорбцию липосом на клеточной поверхности и перенос белка из липосомы внутрь клеток, авторы получили флуоресцентные липосомы. В соответствии с данными исследованиями получили липосомы, которые флуоресцируют на 520 нм или 572 нм. Для этого добавили 0,5 M NBD-PC (1-олеил-2-(-6-(((7-нитро-2-1,3-бензоксадиазол-4-ил)амино)гексаноил)-sn-глицеро-3-фосфохолин) (возбуждение при 490 нм и испускание при 520 нм) или 0,5 M Liss Rhod PE (1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин-N-(лиссамин родамин B сульфонил) (аммониевая соль) (возбуждение при 541 нм и испускание при 572 нм) к липидной смеси перед выпариванием и получением липидной пленки (смотри выше).
В предэкспериментальном масштабе липосомы получали способом детергентного диализа. С помощью данного метода также получили хорошо откалиброванные и стабильные SUV.
Кратко говоря, после перемешивания вплоть до 3 часов при температуре между 20 и 37°C мицеллярную суспензию подвергают диализу против солевого раствора, содержащего β2m, а также 4 мкМ (0,8 мг/мл) н-гексил-βD-глюкопиранозида, в течение 12 ч. при 4°C в установке для микродиализа. Диализные мембраны имеют порог, равный 3,5 кДа, и н-гексил-βD-глюкопиранозид (детергент) разбавляется в конечном растворе до менее чем 1 м.д.
Полученные липосомы имеют размер приблизительно 200 нм в диаметре. Они стабильны в течение по меньшей мере 3 месяцев при температуре окружающей среды и содержат по меньшей мере 0,1 мг (β2m) на мл исходного раствора.
2.3 - Применение тестовых липосом к лимфоцитам, поддерживаемым "ex vivo" в культуре
Для того чтобы продемонстрировать применимость составления белка β2m для направленной доставки к комплексам MHC лимфоцитов в форме суспензий липосом, лимфоциты инкубировали с липосомами, нагруженными альбумином, белком, который можно детектировать с помощью флуоресценции с применением относительно простого метода.
Включение белка в липосомы и применение липосом, полученных в соответствии с протоколом, описанным выше, с помощью фосфатидилхолина с Liss Rhod PE, исследовали ex vivo.
Белок сделали флуоресцирующим посредством маркировки флуорескамином, соединением, флуоресценция которого сравнима с флуоресценцией DAPI (диаминофенилиндол; возбуждение при 372 нм и испускание при 456 нм). Альбумин, кристаллизованный из бычьей сыворотки, сделали флуоресцирующим с помощью ковалентного связывания флуорескамина на N-терминальном конце белка с применением способа, описанного Hames B.D. et al. [Gel Electrophoresis of Proteins, a practical approach, Hames BD. and Rickwood D. eds. The practical Approach Series, 2 Edition. IRL Press, Oxford, New York, Tokyo, p.67], за исключением того, что маркировку осуществляли в буфере трис-HCl (25 мМ)/глицин (192 мМ) (pH=8,3), не содержащем детергент (ДСН). Липосомы, образованные как описано ранее, содержали 2 мг флуоресцирующего альбумина на мл раствора липосом.
2
Затем 0,2 мл суспензии лимфоцитов (Хэнкс/0,5 мМ ЭДТА, pH=7,4), содержащей 250000 лимфоцитов, инкубировали с 0,2 мл липосом, образованных так, что они содержали альбумин (буфер 25 мМ трис-HCl/192 мМ глицин, pH=8,3) в течение 1 часа при 37°C во влажной атмосфере, насыщенной CO (5%).
Наконец, контрольные липосомы (200 мкл), контрольные лимфоциты (200 мкл) и лимфоциты, обработанные липосомами, нагруженными белком (200 мкл), седиментировали на покровных стеклах, обработанных и покрытых полилизином и ламинином, с применением способа, описанного Rakotoarivelo C et al. [Receptors to steroid hormones and aromatase are expressed by cultured motoneurons but not by glial cells derived from rat embryo spinal cord (2004) Neuroendocrinology 80:284-297].
Препараты наблюдали непосредственно с помощью эпифлуоресцентного микроскопа (Axiovert; Zeiss, Германия) или фиксировали с помощью раствора 4% (plv) параформальдегида в воде в течение 30 минут, причем покровные стекла 3 раза промыли ФСБ (160 мМ, pH=7,2). Препараты аккуратно сделали проницаемыми с помощью 0,1% Triton X-100 (об/об), приготовленного в ФСБ, в течение 5 мин.
Клетки маркировали первичными антителами против HLA-ABC. В некоторых случаях клеточные ядра маркировали с помощью Хехст (испускание флуоресценции голубое при 450 нм, DAPI). Первичные антитела, полученные в кроликах, являются теми же, что и использованные для "вестерн-блоттинга". Первичные антитела разбавили до 1/50, и вторичные антитела, связанные с FITC (зеленая флуоресценция) и полученные в козле, разбавили до 1/160. Инкубацию антител осуществляли в ФСБ, содержащем 2% бычьего сывороточного альбумина. Для линз ×63 покровные стекла закрепили с помощью Fluorsave (Calbiochem, США).
Фотографии на фигурах 2 и 3 демонстрируют, что липосомы адсорбированы на поверхности лимфоцитов, и что маркированный белок, содержащийся в липосомах, расположен на поверхности мембраны упомянутых лимфоцитов.
Данные результаты ясно демонстрируют осуществимость экспериментального подхода, который авторы предлагают для восстановления мембранного равновесия HC/β2m.
2
Были также получены в соответствии с экструзионным способом другие липосомы с зеленой флуоресценций, содержащие человеческий β2m, очищенный из мочи (Sigma, США) в концентраци 0,6 мг/мл. β2m маркировали с помощью родамина B изотиоцианата, который обладает красной флуоресценцией (возбуждение: 540 нм; флуоресценция: 625 нм). Связывание β2m-родамин B осуществили с применением способа, описанного Riggs et al. [(1958) Am. J. Pathol. 34:1081-1097]. После связывания белок очистили в колонке Sephadex (Pharmacia, Швеция, G-10: объем слоя 9 мл; внутренний диаметр колонки 0,7 мм). Колонку гидратировали в ФСБ (Bio-rad, 10 мМ фосфатов, 150 мМ NaCl, pH=8,3). Белок разбавили (4,5-7,0 мл) в ФСБ, разбавленном 1:1 milli-Q HO. Образовавшиеся липосомы (фигура 4) очистили в такой же колонке (2,5-6,5 мл) и дважды сконцентрировали с помощью роторного испарителя (Buchi, Швейцария). Лимфоциты, выделенные из крови пациента P1, инкубировали, как описано ранее, в течение 90 минут и исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа. Результаты демонстрируют включение β2m в 89% лимфоцитов (фигура 5).
2.4 - Стабильность липосом (фигуры 6-8)
"Тестовые" липосомы, полученные выше, содержащие альбумин, исследовали в различных условиях, для того чтобы определить их стабильность с течением времени.
Стабильность исследовали на партиях 30 (соответствующей 30 мг альбумина на 150 мл липосом) и 60 (соответствующей 60 мг альбумина на 150 мл липосом) в зависимости от времени и температуры инкубации.
Липиды, образующие липосомы, состояли из 636 нмоль ФХ и 31,8 нмоль NBD-PC-Oleyl. После выпаривания до сухого состояния под струей азота смесь липидов солюбилизировали по капле при сильном перемешивании с помощью 1 мл ФСБ (pH довели до 7,2), содержащего 200 или 400 пг альбумина (Sigma, США) (партии 30 и 60 соответственно). Затем получили липосомы посредством механической экструзии с помощью системы LiposoFast-Basic (Sodexim, Франция). Каждую партию затем очистили в колонке Sephadex G10. В заданное время 50 мкл из каждой партии поместили на покрытое поли-D-лизином/ламинином покровное стекло и инкубировали при 37°C в течение 12 ч. Затем биологический материал связывали с применением глутаральдегида в течение 30 при 4°C. Изображения (стабильность при хранении в течение 1 месяца, фигура 6) получили с применением эпифлуоресцентного микроскопа Axiovert 200 (Zeiss) и записали с помощью программного приложения Axion vision. Что касается статистических исследований (фигура 7), диаметр липосом измеряли с применением программного обеспечения Serf (http://www.org/serf). Для исследования каждой партии популяцию липосом разделили на три класса: диаметром <50, между 50 и 100 нм и >100 нм. Высота столбиков диаграммы представляет долю в процентах субпопуляции каждого размера. Партия 60, хранившаяся при 37°C, продемонстрировала наивысшую стабильность в течение 60 дней хранения: 95% липосом имели диаметр <100 нм, что является идеальным диаметром для переноса белка на клеточную поверхность.
Что касается партии 80 (80 мг β2m; фигура 8), на ней исследовали хранение при 25°C, для того чтобы минимизировать контаминацию и выпаривание, в течение 6 и 40 дней. Способ получения был тем же самым, что и предыдущий способ для партий 30 и 60 (альбумин), за исключением того, что использовали не флуоресцирующий β2m (533 мкг/мл ФСБ), и очистку осуществляли с помощью диализной кассеты (мембрана с порогом 20 кДа, Thermo Scientific, США). Столбцовая диаграмма на фигуре 8 ясно показывает, что на данной стадии хранения 98% липосом сохраняют идеальный размер для переноса β2m в лимфоциты (т.е. диаметр <100 нм), и это имеет место вплоть до 40 дней.
2.5 - Защита экзогенного β2m, предоставляемого липосомами, от протеолитической деградации человеческими сыворотками (фигура 9)
Сыворотки отбирали у здоровых доноров и доноров, страдающих аутоиммунными заболеваниями (тиреоидитом Хашимото, ревматоидным полиартритом). Данные сыворотки инкубировали (90 мкл) в течение 15 дней при 25°C в присутствии 2 мкг чистого β2m (Sigma-Aldrich, США) или липосомной формы (партия 30 липосом, соответствующая 30 мг β2m на 150 мл липосом). Общий реакционный объем, дополненный, при необходимости, ФСБ (фосфат натрия 10 мМ, хлорид натрия 150 мМ, pH=7,2), составлял 130 мкл. 10 мкл из этой реакционной среды (соответствующие 150 нг), дополненные до 30 мкл денатурирующим буфером (ДСН-ПААГ, Лэммли), содержащим 6 M мочевины, успешно удалили на 0, 1, 2, 3, 6, 10 и 15 дни. Эти образцы хранили при -20°C до анализа.
После сбора всех образцов их инкубировали в течение 1 часа при 50°C. Затем белки разделили с помощью ДСН-ПААГ на 12% акриламидном геле (% T=12, % C=2,6), содержащем 4 M мочевины.
-12
После электроэлюции на поливинилидендифторидной (PVDF) мембране присутствие β2m детектировали посредством иммуноблоттинга, и интенсивность соответствующей полоски количественно определяли с помощью ImageJ (NIH, США). Количество пикселов, полученных таким образом, с применением стандартной кривой конвертировали в пикомоли (10 моль) β2m. Графики, представленные на фигурах 9 A-F, представляют пример полученных результатов и изображают количество β2m (в пикомолях) в зависимости от времени. Можно заметить, что у лиц, страдающих аутоиммунными заболеваниями, свободный β2m, добавленный к сыворотке, деградирует с течением времени, чего нет в контроле.
В заключение необходимо отметить, что имеет место прогрессирующая и значительная деградация свободного β2m сывороткой аутоиммунных пациентов, что не обнаружено в контроле. С другой стороны, эта деградация не наблюдается, когда β2m заключен в липосомы. Точнее, липосомы, по-видимому, защищают β2m от деградации сывороткой, поскольку не наблюдалось значительного уменьшения его количества.
В заключение необходимо отметить, что липосомы защищают β2m от деградации сывороткой.
2.6 - Связывание β2m, содержащегося в липосомах, с тяжелыми цепями HLA-I, расположенными на поверхности мембраны (фигуры 10)
У здоровых лиц и в физиологических условиях молекулы β2m, экспрессируемые на поверхности лимфоцитов, связаны нековалентно с тяжелыми цепями HLA в отношении 1:1.
Для того чтобы увидеть и количественно представить эти белковые связи, авторы разработали метод, позволяющий связать те белки, среди которых находятся димеры HLA-β2m, вместе ковалентно.
Разработка данного метода была необходима, для того чтобы вычислить точное мембранное отношение HC/β2m, и для того чтобы показать, что добавление β2m в липосомной форме приводит к специфическому связыванию с тяжелыми цепями HLA-I.
Для этого авторы использовали способность диальдегида глутаральдегида связывать аминогруппы белков двумя своими альдегидными группами. Данные альдегидные группы связаны вместе гибкой цепью из трех метиленов, что позволяет глутаральдегиду статистически сшивать две аминогруппы из двух взаимодействующих белков (Sun, T.T., et al. (1974) Protein-protein proximity in the association of ribosomal subunits of Escherichia coli: crosslinking of 30S protein S16 to 50S proteins by glutaraldehyde or formaldehyde. J. Mol. Biol. 87(3):509-22).
В соответствии с данным методом 5 миллионов лимфоцитов, очищенных MSL, промыли единожды с помощью ФСБ (pH=7,2), для того чтобы удалить возможные следы свободных аминов, затем осадили центрифугированием при 10000g в течение 10 минут, и удалили надосадочную жидкость. Затем клетки инкубировали в течение 5 минут при температуре окружающей среды в 1 мл ФСБ, содержащего 0,25% глутаральдегида. Во время этой инкубации пробирку несколько раз переворачивали.
Прекращения реакции добились добавлением 100 мкл 1 M трис (pH=7,2), избыточные аминогруппы из трис-буфера нейтрализовали глутаральдегид. Лимфоциты извлекли центрифугированием при 10000 g в течение 10 минут, затем промыли в 1 мл ФСБ, для того чтобы удалить следы глутаральдегида. После центрифугирования осадок поместили в 400 мкл буфера Лэммли, содержащего 4 M мочевины, содержащего антипротеазы (Roche Diagnostics GmBH, Германия) и 5% β-меркаптоэтанола, затем оставили при -20°C до анализа.
Для того чтобы обеспечить лизис клеток, образец подвергли 3 циклам замораживания-оттаивания и тщательно перемешали на вортексе. Затем образцы инкубировали в течение 5 минут при 95°C и центрифугировали в течение 10 минут при 4000 g, для того чтобы удалить все нерастворимые остатки. Белки (10 мкл гомогената, соответствующие 125000 лимфоцитов) разделили посредством ДСН-ПААГ на 10% акриламидных гелях (% T=10, % C=2,6), содержащих 4 M мочевины, при постоянном напряжении (120 В). Разделенные таким образом белки перенесли полусухими в течение 40 минут при 13 В в присутствии трис-глицинового буфера с 10% метанола на мембрану из PVDF, предварительно активированную метанолом.
Детектирование β2m осуществили посредством инкубации при температуре окружающей среды в течение 1 часа с первичным антителом против β2m, разбавленным 1/600 (DakoCytomation, Дания), затем еще 1 часа со вторичным антикроличьим антителом, связанным с щелочной фосфатазой и разбавленным 1/20000 (Sigma-Aldrich, США). Количественное определение интенсивности полученных полосок осуществили с помощью программного приложения ImageJ (NIH, США).
Фигура 10A демонстрирует фотографию полученного геля. В присутствии глутаральдегида видна полоска при 55 кДа в добавок к обычной полоске при 12 кДа. Данная полоска при 55 кДа соответствует комплексу HLA-β2m, причем молекулярный вес соответствует сумме молекулярных весов молекулы β2m и тяжелой цепи: 12+43 кДа=55 кДа. На той же дорожке полоска при 12 кДа соответствует свободному не образовавшему комплекс β2m. После количественного определения интенсивности каждой полоски проверили, что суммарная интенсивность этих двух полосок при 12 и 55 кДа соответствует интенсивности полоски при 12 кДа на дорожке "без глутаральдегида", которая соответствует общему β2m. На обеих дорожках, как с глутаральдегидом, так и без него, было внесено одинаковое количество общего белка, соответствующее одинаковому количеству лимфоцитов.
Для того чтобы подтвердить, что количественный анализ полоски при 55 кДа действительно дает количество комплекса HLA-β2m, присутствующего на поверхности лимфоцитов, параллельно применили метод очистки плазматических мембран из лимфоцитов. Этот метод позволил нам непосредственно исследовать белки плазматической мембраны лимфоцитов. Присутствие мембранного β2m определили и количественно проанализировали (смотри фигуру 10B). Полученный результат сравним с количественным анализом полоски при 55 кДа, что подтверждает, что эта полоска действительно соответствует мембранному комплексу HLA-β2m. Кроме того, отношение мембранного β2m к общему β2m (фигура 10B) равно отношению интенсивностей полоски 55 кДа и полоски общего β2m 12 кДа (фигура 10A).
Глутаральдегидный метод, подтвержденный таким образом, применили, для того чтобы увидеть и количественно определить степень включения β2m, переносимого липосомами, на лимфоцитах, выделенных из человеческой крови.
Были выбраны два донора, один здоровый в качестве контроля и другой, страдающий множественным склерозом. Второго донора выбрали вследствие дефицита у него мембранного β2m по отношению к тяжелым цепям HLA-I. Этот пациент имел мембранное отношение HC/β2m, равное 1,7, что означает, что лимфоцитарная мембрана содержит на 69% больше тяжелых цепей, чем β2m.
0
90
Лимфоциты двух доноров (25 мл крови) разделили на две партии по 4 мл каждая; 2 мл липосом, содержащих β2m в концентрации 40 мг на 150 мл (партия 40), добавили к 4 мл лимфоцитов. T лимфоциты немедленно отобрали и промыли с помощью ФСБ. Лимфоциты, отобранные при T, инкубировали с липосомами в течение 90 минут при 37°C до того как отобрали и промыли с помощью ФСБ, для того чтобы удалить излишние не прореагировавшие липосомы.
Для обоих условий авторы проанализировали две популяции лимфоцитов, которые или были, или не были обработаны глутаральдегидом (смотри протокол выше).
90
0
Все белки для обоих условий разделили с помощью ДСН-ПААГ, затем обнаружили посредством вестерн-блоттинга. Полученные результаты проиллюстрированы на фигуре 10C, и авторы обнаружили, что после количественного анализа, в отличие от контроля и в присутствии глутаральдегида, интенсивность полоски 55 кДа (представляющей комплекс HLA-β2m) возросла на 55% при T по сравнению с T.
Данный рост согласуется с дефицитом β2m у этого пациента, что является причиной присутствия свободных HLA-1 цепей на поверхности лимфоцитов. Следовательно, тяжелые цепи действительно связываются с экзогенным β2m, предоставляемым липосомами.
Использованный экспериментальный подход позволил получить доказательство терапевтической концепции настоящего изобретения, т.е. того, что:
- Можно восстановить баланс HLA-β2m посредством добавления на поверхность лимфоцитов экзогенного β2m в форме липосом.
- Пациент, имеющий дефицит β2m, может инкорпорировать больше β2m, чем контрольный испытуемый, у которого отсутствует в нем потребность.
- Инкорпорированный β2m действительно связывается со свободными молекулами HLA с образованием димеров HLA-β2m.
Таким образом, полученные экспериментальные данные подтверждают возможность достижения с применением липосомных препаратов β2m лимфоцитов, представляющих свободные тяжелые цепи (HC/β2m>1), с целью восстановления отношения HC/β2m, близкого к физиологической норме, т.е. стремящегося к 1.
3 - Анализ токсичности липосомных композиций β2m
Исследовали возможную токсичность β2m в липосомной форме "in vitro" на культурах клеток печени, почек, скелетных мышц и сердца человеческого происхождения.
3.1 - Типы исследованных клеток
Исследуемые клетки и культуральную среду закупили у Sciencell Research Laboratories (6076 Corte Del Cedro, Carlsbad, Калифорния).
a. HCF: Первичные человеческие сердечные фибробласты, партия № 2136
Культуральная среда: FM (среда для фибробластов), партия № 5673 + раствор для выращивания фибробластов, партия № 5863 + FBS 10% + раствор пенициллина (100 ед./мл) - стрептомицин (100 мкг/мл), партия № 5917
b. HREpiC: первичные человеческие клетки почечного эпителия, партия № 0546
Культуральная среда: среда для эпителиальных клеток, партия № 5967 + раствор для выращивания эпителиальных клеток, партия № 5855 + FBS 10% + PS
c. HH: первичные человеческие гепатоциты, партия № 4607
Культуральная среда: HM (среда для гепатоцитов), партия № 5933 + раствор для выращивания гепатоцитов, партия № 5722 + FBS 10% + PS
d. HSkMC: первичные человеческие клетки скелетных мышц, партия № 5606
Культуральная среда: среда для клеток скелетных мышц + SkMGS + FBS 10% + PS
2
Культуральные колбы или планшеты поместили в инкубатор (Sanyo) при 37°C, 5% CO и с влажностью насыщения (ванна, содержащая сверхчистую воду, отфильтрованную с помощью 0,22 мкм, Nanopure, Thermo-Fisher).
2
Культуральным субстратом для первичных человечески клеток является обработанный пластик (TPP, Switzerland) для клеточных культур, инкубированный с 2 мкг/см поли-L-лизина (Clinisciences; Sciencell Research Laboratories, партия № 5826, раствор: 10 мг/мл) в течение одной ночи в инкубаторе и дважды промытый стерильной сверхчистой водой перед инкубацией.
3.2 - Отделение и диссоциация слоя клеток
3
2
Отделение слоя клеток осуществили посредством удаления полученной среды из культуральной колбы, затем промывания слоя с помощью стерильного ФСБ (SIGMA, партия № 088K2356), затем его обработки раствором 0,05% трипсина (SIGMA Trypsin Ref T-1426, партия № 020M7354), ЭДТА 0,2 г, NaCl 8 г, KCl 0,4 г, NaHCO 0,58 г, глюкозы 1 г (SIGMA), сверхчистой воды до объема 1 литр, раствор стерилизовали посредством мембранной фильтрации (PES) при пористости 0,22 мкм, CML партия № 668919), объем раствора трипсина скорректировали по типу колбы (например, 1 мл для колбы с 25 см), затем культуральную колбу поместили при 37°C (инкубатор Sanyo) на три-четыре минуты.
Когда клетки отделились от своего субстрата, выполнили диссоциацию в присутствии культуральной среды с сывороткой (ингибирование ферментативного действия трипсина), перемещаемой туда и обратно в пипетке (от 5 до 10 мл в соответствии с типом клеток).
3.3 - Испытание на токсичность
Клетки подсчитали с применением камеры Тома (Thermo Fisher) под оптическим микроскопом (Nikon) и посеяли в количестве 5000 клеток на лунку в 200 мкл соответствующей им культуральной среды в плоскодонном культуральном планшете с 96 лунками из обработанного пластика для клеточных культур (NUNC, партия № 114754), затем после подготовки планшеты поместили в инкубатор на 24 часа. Различные разбавления испытываемых веществ концентрировали трижды в 100 мкл среды без антибиотиков, и их добавили к 200 мкл в каждой обрабатываемой лунке (общий объем: 300 мкл). Через 24 часа, через 48 часов и 72 часа обработанные лунки и контрольные лунки исследовали в соответствии с протоколами для MTT (тиазолил синий тетразолий бромид) [Liu Y. et al. (1997) Mechanism of cellular MTT reduction. J. Neurochem. 69:581-593] и для дозировки белков (Ref 23227, BCA protein Assay kit; Pierce), для того чтобы определить клеточную токсичность:
- Добавление раствора MTT до конечной концентрации 25 мкг/мл
- Инкубация 1 час при 37°C
- Аспирация среды
- Добавление 100 мкл ДМСО (200 мкл, если ОП превышает предельное значение)
- Считывание планшета (Biorad) при 490 нм
- Компьютерная обработка с помощью Excel
- Вычитание фонового шума с помощью пустых лунок (контроль)
- Определение отношения ОП X лунок/ОП контрольных лунок
- Построение кривой зависимости этого отношения от концентрации препарата
0
0
Токсичность измерили через 24 часа и 48 часов обработки, т.е. в t+48 ч. и t+72 ч.
Фигуры 11 и 12 ясно демонстрируют, что даже в высокой дозе (партия 132) покрытый липосомами β2m не оказывает влияния на жизнеспособность гепатоцитов и клеток почек, которые, однако, чувствительны к β2m. То же самое имеет место для клеток сердечного происхождения и клеток скелетных мышц (результаты не показаны).