Флуоресцентный поляризационный иммуноанализ для экспрессного контроля содержания антибиотиков: разработка и характеристика на примере хлорамфеникола

Флуоресцентный поляризационный иммуноанализ для экспрессного контроля содержания антибиотиков: разработка и характеристика на примере хлорамфеникола

С. А. ЕРЕМИН', О. Ю. ХАН', В. В. ПИСАРЕВ2, Е. А. ЗВЕРЕВА3, А. В. ЖЕРДЕВ3, Б. Б. ДЗАНТИЕВ3

1 Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, Москва

2 Научно-производственный центр «Пробиотек», Москва

3 Институт биохимии им. А. Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, Москва

Fluorescence Polarization Immunoassay, for Express Control of Antibiotic Levels: Design and Characteristics for Chloramphenicol, as an Example

S. A. EREMIN1, O. YU. KHAN1, V. V. PISAREV2, E. A. ZVEREVA3, A. V. ZHERDEV3, B. B. DZANTIEV3

1 M. V. Lomonosov Moscow State University, Moscow

2 Scientific-Production Center «Probiotek», Moscow

3 A. N. Bakh Institute of Biochemistry, Federal Research Centre «Fundamentals of Biotechnology» Russian Academy of Sciences, Moscow

Рассмотрены особенности флуоресцентного поляризационного иммуноанализа (ФПИА) как средства экспрессного контроля наличия и содержания антибиотиков в различных видах проб, его преимущества по сравнению с другими аналитическими методами. На примере детекции антибиотика хлорамфеникола рассмотрены этапы разработки аналитической методики, определения её параметров. Анализ основан на конкурентном взаимодействии антител против хлорамфеникола с коньюгатом хлорамфеникол-флуорофор и потенциально содержащимся в тестируемой пробе свободным антибиотиком. Представлены экспериментальные результаты сравнения методик ПФИА хлорамфеникола, реализованных с использованием двух коньюгатов, которые отличаются длиной мостикового участка между функциональными группами антибиотика и флуорофора (флуоресцеина). Охарактеризованы требования к выбору концентраций антител и коньюгата, обеспечивающих высокочувствительную детекцию. Предел обнаружения хлорамфеникола при использовании разработанного ФПИА — 10 нг/мл, диапазон определяемых концентраций — от 20 нг/мл до 10 мкг/мл. Время определения — 10 мин.

Ключевые слова: хлорамфеникол, иммуноанализ, флуоресцентный поляризационный иммуноанализ.

Characteristics of the fluorescence polarization immunoassay (FPIA) as a mean for express control of antibiotic levels in various specimens and its advantages vs. other analytical tests are described. The developmental stages of the analytical procedure and its parameters are considered for chlorampnenicol as an example. The analysis is based on competitive interaction of anti-chloramphenicol antibodies with the chloramphenicol-fluorophore conjugate and the potential free chloramphenicol in the specimen. The experimental results of the comparison of the chloramphenicol FPIA with the use of two conjugates differing in the length of the bridge length between the antibiotic functional groups and fluorophore (fluorescein) are presented. The requirements to the choice of the antibody and conjugate concentrations providing highly sensitive detection are characterized. The detection limit of chloramphenicol in the FPIA was 10 ng/ml and the determination of the concentrations ranged from 20 ng/ml to 10 mcg/ml. The time of the assay was 10 min.

Key words: chloramphenicol, immunoassay, fluorescence polarization immunoassay.

Введение

В настоящее время крайне востребованы высокочувствительные и производительные методы детекции антибиотиков. Это связано как с их медицинским применением (выбор индивидуальных терапевтических доз), так и с сопоставимым по объемам использованием в ветеринарии. Неконтролируемое применение антибиотиков в животноводстве для лечения и профилактики забо-

© Коллектив авторов, 2016

Адрес для корреспонденции: 119992 Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова, Химический факультет

леваний приводит к загрязнению продуктов питания животного происхождения остаточными количествами соответствующих препаратов [1, 2] и их негативному воздействию на здоровье человека — возникновению аллергических реакций, развитию дисбактериозов и др. [3]. Важным последствием циркуляции антибиотиков в низких концентрациях в биосфере является распространение штаммов микроорганизмов, резистентных к действию лекарственных средств, что осложняет борьбу с инфекционными заболеваниями [4].

Для детекции антибиотиков реализуются преимущественно две группы подходов — хромато-

графические и иммунохимические. Хроматогра-фические методы позволяют проводить измерения с высокой точностью, но требуют специального дорогостоящего оборудования и сложной пробоподготовки [5—7]. В связи с этим для высокопроизводительного скрининга востребованы иммунохимические методы, сочетающие чувствительность и специфичность, но при этом реализуемые с использованием сравнительно простого приборного обеспечения, с минимальной пробоподготовкой и позволяющие одновременно характеризовать несколько десятков и даже сотен проб [8, 9]. Следует, однако, заметить, что доминирующие в настоящее время иммунохими-ческие методы детекции антибиотиков — микропланшетный иммуноферментный анализ (ИФА) и иммунохроматографический анализ (ИХА) с использованием тест-полосок — имеют свои ограничения. В случае ИФА это существенное время, требуемое для получения результатов тестирования — 1—2 ч. Иммунохроматографические же тесты в традиционном исполнении предназначены лишь для качественного заключения о превышении определённой концентрации ана-лита в пробе и не позволяют проводить количественный анализ [10].

В этом отношении перспективны разработки иммуноаналитических методов, сочетающих экс-прессность с возможностью количественного определения, но при этом не требующих сложного несерийного приборного обеспечения и трудоёмких аналитических процедур. Таким решением, показавшим эффективность при контроле разнообразных биологически активных соединений, является флуоресцентный поляризационный им-муноанализ (ФПИА). ФПИА относится к гомогенным методам анализа и основывается на явлении поляризации флуоресценции, которое обусловлено одновременным протеканием в растворе процессов поглощения и испускания света молекулами флуорофора и их вращением [11, 12]. При облучении реакционной среды плоскополя-ризованным возбуждающим светом степень поляризации флуоресценции зависит от того, находится ли флуорофор в свободном виде (высокая скорость вращения молекулы, низкая остаточная поляризация) или в комплексе с антителом (низкая скорость вращения крупного комплекса, высокая поляризация), что позволяет измерять концентрацию аналита в пробе. В качестве источника плоскополяризованного света и регистратора флуоресценции могут быть использованы различные серийно выпускаемые приборы, существующие как в стационарном, так и в переносном исполнении.

Достоинствами ПФИА являются: достаточно высокая чувствительность и специфичность, хорошая воспроизводимость, отсутствие трудоём-

кой пробоподготовки, экспрессность и производительность анализа. Следует также отметить простоту перехода от минимального количества необходимых исходных реагентов — стандарт антибиотика, флуорофор и специфические (поли-или моноклональные) антитела — к практической реализации аналитической методики, состоящей лишь в синтезе конъюгата флуорофор-ан-тибиотик (трейсер) и последовательном выборе используемых концентраций реагентов.

В настоящей статье на примере иммунодетек-ции хлорамфеникола представлены все стадии такой разработки и характеристики аналитической методики. Экспрессный контроль содержания хлорамфеникола крайне востребован. Хотя обнаружение серьёзных побочных эффектов привело к законодательным ограничениям применения данного препарата и введению официальных требований к его максимально допустимым уровням в пищевой продукции [3, 13], хлорамфени-кол вследствие широкого спектра антибактериальной активности и дешевизны продолжает активно использоваться в лечебных и профилактических целях.

Данная разработка продолжает цикл исследований, проводимых на Химическом факультете МГУ и направленных на создание комплекса тест-систем для мониторинга содержания антибиотиков, основанных на принципе ФПИА. Разработки методик ФПИА антибиотиков других классов представлены в ранее вышедших публикациях [14—18]. Дополнение этого ряда тест-систем данной разработкой обеспечивает возможность комплексного мониторинга антибиотиков основных классов.

Материал и методы

Химические реагенты. Для проведения синтезов и разработки методики были использованы химические реактивы отечественного (марки ос.ч. и х.ч.) и импортного («Sigma») производства. Овечьи поликлональные антитела против хло-рамфеникола были любезно предоставлены проф. Р. Абукне-ша (R. Abuknesha), Великобритания.

Исходный концентрированный раствор хлорамфеникола для хранения готовили в дистиллированной воде. Для проведения ФПИА растворы реагентов разбавляли 2,5 мМ борат-ным буфером, рН 8,0, содержащим 0,1% азида натрия.

Оборудование. Поляризацию флуоресценции регистрировали в кюветах с помощью поляризационного флуориметра «Beacon 2000» (Panvera, США). Длина волны возбуждения — 480 нм, эмиссии — 520 нм.

Получение конъюгатов хлорамфеникол-флуорофор. Использовали флуорофоры флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ) и этилендиаминфлуоресцеинизотиоцианат (ЭДФ). Их конъюгацию с хлорамфениколом проводили в соответствии с [17]. Продолжительность взаимодействия — 2 ч при комнатной температуре. Для разделения продуктов реакции методом тонкослойной хроматографии применяли пластины «Silufol», Чехия; элюент — смесь метанола и хлороформа в объемном соотношении 1:4.

Определение оптимального разведения трейсера. В 10 кюветах проводили последовательное двукратное разведение

трейсера в 0,1 мл боратного буфера, начиная с разведения 1:100. В кюветы добавляли по 0,4 мл того же буфера и затем измеряли интенсивность флуоресценции и её поляризацию.

Определение оптимального разведения антител. В 10 кюветах проводили последовательное двукратное разведение антител в 0,1 мл боратного буфера, начиная с разведения 1:20. В кюветы добавляли по 0,3 мл раствора трейсера в ранее выбранном разведении и по 0,1 мл буфера, после чего измеряли поляризацию флуоресценции.

Методика ФПИА: построение градуи-ровочного графика и тестирование проб. В кюветы к 0,1 мл стандартного раствора хлорамфеникола (или тестируемой пробы) добавляли по 0,3 мл раствора трейсера и по 0,1 мл антител в ранее выбранных разведениях, затем измеряли поляризацию флуоресценции.

Однореагентный ФПИА проводили в соответствии с [19]. Для приготовления исходного реагента — комплекса трей-сер-антитело — смешивали равные объёмы рабочих разведений трейсера и антител, разбавляли буфером в 5 раз и оставляли реагент на ночь в холодильнике, чтобы обеспечить достижение химического равновесия.

При проведении анализа в кюветы к 0,1 мл стандартного раствора хлорамфе-никола (или тестируемой пробы) добавляли 0,4 мл однореагентного раствора, инкубировали при комнатной температуре 10 мин и измеряли поляризацию флуоресценции.

Обработка результатов измерений. Предел обнаружения анализа определяли согласно рекомендациям ГОРАС по методу Родбарда [20]. Проводили 10 измерений стандарта с нулевой концентрацией антибиотика и рассчитывали среднее значение поляризации флуоресценции (тР0), а также стандартное отклонение (5) этой величины. Значение поляризации флуоресценции, соответствующее пределу обнаружения, вычисляли по формуле тРтп = шР0 — 35, после чего по градуировоч-ной кривой определяли концентрацию хлорамфеникола, обеспечивающую достижение данной величины тРтПп.

При оценке воспроизводимости результатов измерений выбирались концентрации из линейной области градуировоч-ного графика и для них по трём повторностям, выполненным в течение одного дня, рассчитывали стандартное квадратичное отклонение (8Б) и коэффициенты вариации (8Б/Хср *100%).

Результаты и обсуждение

Получение конъюгатов хлорамфеникол-флуоро-

фор. Для конъюгата хлорамфеникол-ФИТЦ при очистке реакционной смеси были выделены три фракции с разными значениями Ш (0,1, 0,5, 0,6). Хлорамфеникол-ЭДФ был получен в виде одной полосы с Ш = 0,7.

Продукты синтеза растворяли в боратном буфере и хранили при +4°С (рис. 1).

Определение оптимальнъх разведений трейсеров и антител. В соответствии с практикой ФПИА [12] выбирали разведения трейсеров, для которых интенсивность флуоресценции при 520 нм в 10 раз

Рис. 1. Химические структуры.

а — хлорамфеникол; б, в — иммуногены для получения антител 1 и 2; г — трейсер 1 — хлорамфеникол-ФИТЦ; д — трейсер 2 — хлорамфеникол-ЭДФ.

превышала фоновое значение флуоресценции рабочего буферного раствора.

Были протестированы две антисыворотки на хлорамфеникол, полученные против иммуноге-нов, структурные формулы которых представлены на рис. 1 б, е. Получены зависимости степени поляризации флуоресценции от разведения антисывороток при фиксированных концентрациях взаимодействующих с ними трейсеров хлорамфе-никол-ЭДФ и хлорамфеникол-ФИТЦ (рис. 2). Основным параметром связывания являлось разведение антисыворотки (титр), приводящее к 50% ингибированию поляризации флуоресценции.

Установлено, что для трейсера хлорамфеникол-ЭДФ отсутствует взаимодействие с антисыворотками. При использовании трейсера хлорамфеникол-ФИТЦ титры антисывороток 1 и 2 составили 1:100 и 1:250, соответственно.

Определение аналитических характеристик ФПИА. В оптимизированных условиях было реализовано конкурентное взаимодействие антисывороток со свободным хлорамфениколом (стандарт для градуировки или тестируемая проба) и хлорам-фениколом, входящим в состав трейсера. Полученные градуировочные графики представлены на

рис. 3, а характеристики разработанной методики ФПИА хлорам-феникола — предел обнаружения и диапазон определяемых концентраций — в табл. 1.

Однореагентный ФПИА. Охарактеризована возможность детекции хлорамфеникола методом ФПИА с использованием однореагентного препарата — предварительно сформированного комплекса антитело-трей-сер. Для определения кинетики диссоциации данного комплекса к нему добавляли свободный антиген (хлорамфеникол) в разных концентрациях, что приводило к вытеснению трейсера из иммунного комплекса (рис. 4). Установлено, что при этом вытеснении равновесие в системе достигается за 10—15 минут в зависимости от концентрации ана-лита. Подтвержденная экспресс-ность данного варианта ФПИА в сочетании с минимальной трудоемкостью тестирования обуславливают его конкурентный потенциал по сравнению с традиционным ФПИА.

Применение ФПИА для контроля хлорамфеникола в продуктах питания. Для подтверждения эффективности разработанной методики проведены эксперименты по внесению в пробы пищевой продукции (молока) известных количеств хлорамфеникола (метод «введено-найдено») (табл. 2). Показана высокая степень соответствия результатов определения хлорамфеникола методом ФПИА с данными о реальном его содержании в контаминированных пробах.

Таблица 1. Аналитические характеристики ФПИА хлорамфеникола

Антитела Предел обнаружения, Сга1п, нг/мл Диапазон определяемых концентраций

Антитела 1 20 Антитела 2 10 40—20 000 20—10 000

Таблица 2. Полнота открытия хлорамфеникола в молоке

Концентрация, нг/мл Процент открыггия, %

10 50 150 300 101,4+3,0 92,4+4,0 87,3+4,0 87,6+2,0

Рис. 2. Концентрационные зависимости связывания антисывороток с хлорамфениколом.

(а — антитела 1; б — антитела 2) с трейсером 1 (хлорамфеникол-ФИТЦ). По оси абсцисс — кратность разведения антисыворотки; по оси ординат — поляризация флуоресценции.

Рис. 3. Градуировочные графики ПФИА хлорамфеникола

(• — антитела 1, — антитела 2). По оси абсцисс — концентрация хлорамфеникола (мкг/мл) в пробе; по оси ординат — отношение поляризации флуоресценции тестируемой пробы и пробы без хлорамфеникола.

Рис. 4. Кинетические кривые вытеснения трейсера из иммунного комплекса при разных концентрациях хлорамфеникола.

1- 0 мкг/мл; 2- 1 мкг/мл; 3- 10 мкг/мл; 4 - 100 мкг/мл; 5- 1000 мкг/мл.

В результате проведенных исследований, разработана методика флуоресцентного поляризационного иммуноанализа антибиотика хлорамфеникола. Подобраны иммунореагенты и их концентрации, оптимальные для проведения анализа. Определены аналитические характеристики метода — предел обнаружения составил 10 нг/мл, диапазон определяемых концентраций — 20—10000 нг/мл. Продолжительность тестирования — 10 мин. Показана возможность использования разработанной методики при тестировании продуктов питания.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014—2020 годы» (Соглашение о предоставлении субсидии от 11 ноября 2015 г. № 14.616.21.0061, уникальный идентификатор КЕМЕЕТ61615Х0061).

ЛИТЕРАТУРА

1. Blasco C, Torres C.M., Pico Y. Progress in analysis of residual antibacte-rials in food. Trends Anal Chem 2007; 26: 9: 895-913.

2. Durso L. M., Cook K. L. Impacts of antibiotic use in agriculture: what are the benefits and risks? Cur Opin Microbiol 2014; 19: 37—44.

3. Beyene T.Veterinary drug residues in food-animal products: its risk factors and potential effects on public health. J Veterinar Sci Technol 2016, 7: 1: 7.

4. Finley R.L., Collignon P., Larsson D.G.J., McEwen S.A., Li X.Z., Gaze W.H. et al. The scourge of antibiotic resistance: the important role of the environment. Clin Infect Diseases 2013; 57: 5: 704—710.

5. Robert C, Gillard N, Brasseur P. Y, Pierret G, Ralet N, Dubois M, DelahautP. Rapid multi-residue and multi-class qualitative screening for veterinary drugs in foods of animal origin by UHPLC-MS/MS. Food Addit Contam Part A 2013; 30: 3: 443-457.

6. Mottier P., Parisod V., Gremaud E, Guy P.A., Stadler R.H. Determination of the antibiotic chloramphenicol in meat and seafood products by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. J Chromatogr A 2003; 994: 1—2: 75—84.

7. Barreto F, Ribeiro C, HoffR. B, Costa T. D. Determination and confirmation of chloramphenicol in honey, fish and prawns by liquid chro-matography-tandem mass spectrometry with minimum sample preparation: validation according to 2002/657/EC Directive. Food Addit Contam Part A 2012; 29: 4: 550—558.

8. Tao X., Zhou S, Yuan X., Li H. Determination of chloramphenicol in milk by ten chemiluminescent immunoassays: influence of assay format applied. Anal Methods 2016; 8: 22: 4445—4451.

9. Xu F, Ren K., Yang Y, Guo J., Ma G, Liu Y. et al. Immunoassay of chemical contaminants in milk: A review. J Integr Agric 2015; 14: 11: 2282—2295.

10. Dzantiev B.B., Byzova N.A., Urusov A.E., Zherdev A.V. Immunochromatographic methods in food analysis. Trends Anal Chem 2014; 55: 81—93.

11. Smith D.S., Eremin S.A. Fluorescence polarization immunoassays and related methods for simple, high-throughput screening of small molecules. Anal Bioanal Chem 2008; 391: 1499—1507.

12. Еремин C.A. Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ физиологически активных веществ. В кн.: Биохимические методы анализа. / Под ред. Б.Б. Дзантиева; М.: Наука; 2010. Стр. 368—389. / Eremin S.A. Poljarizacionnyj fluorescentnyj immunoanaliz fiziologich-eski aktivnyh veshhestv. V kn.: Biohimicheskie metody analiza. / Pod red. B.B. Dzantieva; M.: Nauka; 2010. Str. 368—389. [in Russian]

13. Gaudin V., Cadieu N, Maris P. Inter-laboratory studies for the evaluation of ELISA kits for the detection of chloramphenicol residues in milk and muscle. Food Agric Immunol 2003; 15: 143.

14. Murtazina N.R., Medjanceva Je.P, Pisarev V.V., Eremin S.A. Immunohimicheskoe opredelenie sul'fametazina v rechnoj vode i lekarstvennyh preparatah. Himiko-farm zhurnal 2005; 39: 8: 93—97. [in Russian]

15. Nesterenko I.S., Nokel' M.A., Eremin S.A. Immunohimicheskie metody opredelenija sul'fanilamidnyh preparatov. Zhurn analit him 2009; 64: 5: 453—462. [in Russian]

16. Shanin I.A., Shajmardanov A.R., Nguen Ti Diu Thaj, Eremin S.A. Opredelenie antibiotika ftorhinolonovogo rjada levofloksacina v moche metodom poljarizacionnogo fluorescentnogo immunoanaliza. Zhurn analit him 2015; 6: 70: 617—623. [in Russian]

17. Gavrilov V.B., Eremin S.A., Egorov A.M. Spavnitel'nyj analiz immuno-himicheskogo oppedelenija gentamicina po poljapizacii i tusheniju flu-opescencii. Antibiotiki i himioter 1992; 37: 9: 36—39. [in Russian]

18. Shanin I.A., Zvereva E.A., Zherdev A.V., Eremin S.A., Dzantiev B.B. Development of fluorescence polarization and enzyme-linked immunosorbent assays for danofloxacin detection in milk. Int J Chem Sci 2016; 14: 12: 283—298.

19. Mi T., Wang Z., Eremin S, Shen J., Zhang S. Simultaneous determination of multiple (fluoro)quinolone antibiotics in food samples by a one-

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:

Еремин Сергей Александрович — д.х.н., профессор, ведущий научный сотрудник кафедры химической энзимоло-гии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, Москва Хан Олег Юрьевич — аспирант, кафедра химической энзи-мологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, Москва Писарев Владимир Викторович — к.х.н., генеральный директор Научно-производственного центра Пробиотек, Москва

step fluorescence polarization immunoassay. J Agric Food Chem 2013; 61: 39: 9347-9355.

20. Rodbard D. Statistical estimation of the minimal detectable concentration («sensitivity») for radioligand assays. Anal Biochem 1978; 90: 1: 1—12.

Зверева Елена Анатольевна — к.б.н., научный сотрудник Института биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук, Москва Жердев Анатолий Виталиевич — к.б.н., ведущий научный сотрудник Института биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук, Москва Дзантиев Борис Борисович — д.х.н., профессор, заместитель директора Института биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук, Москва