Изучение действия фармацевтической субстанции гидросукцинат разветвлённого олигогексаметиленгуанидина в отношении микроорганизмов

DOI: 10.37489/0235-2990-2019-64-11-12-8-15

Изучение действия фармацевтической субстанции гидросукцинат разветвлённого олигогексаметиленгуанидина в отношении микроорганизмов

*И. С. ИВАНОВ1-2, Д. О. ШАТАЛОВ1-2, С. А. КЕДИК12, И. П. СЕДИШЕВ12, Н. Э. ГРАММАТИКОВА1, А. В. АЙДАКОВА12, К. Н. ТРАЧУК1, Е. И. ЯЗЫКОВА1

1 МИРЭА — Российский технологический университет, Москва

2 АО «Институт фармацевтических технологий», Москва

Study of the Effect of the Pharmaceutical Substance Branched Oligohexamethylene Guanidine Hydrosuccinate in Relation to Microorganisms

*I. S. IVANOV12, D. O. SHATALOV12, S. A. KEDIK12, I. P. SEDISHEV12, N. E. GRAMMATIKOVA1, A. V. AYDAKOVA12, K. N. TRACHUK1, E. I. YAZYKOVA1

1 MIREA — Russian Technological University, Moscow

2 Institute of pharmaceutical technologies, Moscow

Приобретение микроорганизмами резистентности по отношению к применяемым антибиотикам и антибактериальным агентам ставит задачу поиска новых активных дезинфектантов. Известно, что соединения класса олигогуанидины обладают ярко выраженными антибактериальными свойствами, низкой токсичностью и могут проявлять продолжительное биоцидное действие, вызывающее деструкцию биоплёнок, формируемых патогенной микрофлорой. Одним из таких соединений является гидросукцинат разветвлённого олигогексаметиленгуанидина (ОГМГсукц). Указанное соединение может быть использовано в качестве активного компонента при разработке лекарственного средства, действующего на микробные дегидрогеназы, для профилактики и лечения конъюнктивитов инфекционной природы, в связи с чем целью настоящего исследования являлось исследование и визуализация механизма действия ОГМГсукц в отношении микробных дегидрогеназ грамотрицательных бактерий Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa колориметрическими методами, изучение его действия на формирование биоплёнки и зрелую биоплёнку Escherichia coli, на её клеточную стенку методом сканирующей электронной микроскопии, а также экспериментальное доказательство влияния ОГМГсукц на морфологию нескольких видов бактерий, дрожжевых и плесневых грибов, вызывающих конъюнктивит, методом атомно-силовой микроскопии. Помимо этого, требовалось выявить зависимость нарушения сегрегации клеток от возрастающей концентрации ОГМГсукц. Таким образом, было доказано, что ОГМГсукц оказывает влияние не только на микробные дегидрогеназы некоторых грамотрицательных бактерий, зрелую биоплёнку кишечной палочки, но и на её клеточную стенку. Также выявлено действие ОГМГсукц на морфологию нескольких видов бактерий, грибов дрожжей и плесени. Указанная информация свидетельствует о том, что создание антимикробного препарата на основе ОГМГсукц представляет интерес, и эта работа может послужить основой для разработки инновационного фармакологического препарата для лечения конъюнктивитов инфекционной природы.

Ключевые слова: антибактериальный агент, биоплёнка, конъюнктивит, механизм действия, микробные дегидрогеназы, офтальмология, возбудители.

The acquisition of resistance to the antibiotics and antibacterial agents used by microorganisms sets the task of finding new active disinfectants. It is known that compounds of the oligoguanidine class possess pronounced antibacterial properties, low toxicity, and can exhibit a prolonged biocidal effect, causing destruction of biofilms formed by pathogenic microflora. One of these compounds is branched oligohexamethylene guanidine hydrosuccinate (OHMG succ). The specified compound can be used as an active component in the development of a drug that acts on microbial dehydrogenases for the prevention and treatment of conjunctivitis of an infectious nature. In this regard, the purpose of this work is to study and visualize the mechanism of action of OHMG succ in relation to microbial dehydrogenases of Gram-negative bacteria Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa by colorimetric methods, to study its effect on the formation of biofilms and mature biofilms of E.coli, on its cell wall by scanning electron microscopy, as well as experimental evidence of the influence of OHMG succ on the morphology of several types of bacteria, yeasts, and molds that cause conjunctivitis, by atomic force microscopy. In addition, it was necessary to identify the dependence of cell segregation disturbance on the increasing concentration of OHMG succ. Thus, it was proved that OHMG succ affects not only the microbial dehydrogenases of certain Gram-negative bacteria, the mature biofilm of E.coli, but also its cell wall. The effect of OHMG succ on the morphology of several types of bacteria, yeast and mold fungi was also revealed. The indicated information shows that the creation of an antimicrobial drug based on OHMG succ is of interest, and this work may serve as the basis for the development of an innovative pharmacological drug for the treatment of conjunctivitis of an infectious nature.

Keywords: antibacterial agent, biofilm, conjunctivitis, mechanism of action, microbial dehydrogenases, ophthalmology, pathogens.

© Коллектив авторов, 2019

*Адрес для корреспонденции: 119571 Москва, Проспект Вернадского, д. 86. МИРЭА

Введение

В настоящее время инфекционные заболевания глаз являются одной из причин временной нетрудоспособности населения и могут стать причиной слепоты [1]. На современном фармацевтическом рынке представлено большое число антимикробных агентов, используемых в офтальмологической практике [2], однако их частое применение приводит к появлению резистентных штаммов микроорганизмов [3]. Также одной из проблем, возникающих при применении различных биоцидов и антибиотиков, является способность микроорганизмов образовывать биоплёнки. Биоплёнки состоят из ассоциации культур микроорганизмов и внеклеточного матрикса, представленного сложной биохимической смесью полисахаридов, гликопептидов, нуклеиновых кислот и липидов. Она обеспечивает защиту от воздействия антимикробных агентов, поэтому препараты, способные нарушать их структуру и развитие, в настоящее время вызывают большой интерес [4, 5]. В связи с этим возникает необходимость поиска новых средств, обладающих широким спектром действия. Особенно примечательны соединения класса гуанидины, которые проявляют выраженные антибактериальные свойства и склонны к пролонгации биоцидного действия [6, 7]. Принято считать, что основным механизмом действия подобных соединений является нарушение целостности структуры бактериальных мембран [8], что приводит к лизису клетки. В частности, в работе [9] было показано, что полигексаметиленбигуанидин (ПГМБ) нарушал барьерную функцию мембран Escherichia coli. Позднее T. Ikeda и др. в работе [10] продемонстрировали, что ПГМБ способен связываться с отрицательно заряженными фосфолипида-ми клеточных мембран, вызывая агрегацию отрицательно заряженных молекул фосфатидилг-

лицерола в мембранах, что приводило к образованию участков мембраны с повышенной текучестью и проницаемостью. В работе [11] Z. X. Zhou и соавт. доказана эффективность использования полигексаметиленгуанидина гидрохлорида (ПГМГ-ГХ) в качестве антибактериального агента. Результаты электронной микроскопии демонстрировали повреждение клеточной мембраны E.coli вследствие воздействия ПГМГ-ГХ. Клетки, обработанные ПГМГ-ГХ, испытывали состояние коллапса и теряли свою характерную цилиндрическую форму, а подложка покрывалась большим количеством дебриса. Помимо этого, в работе имеются данные о том, что ПГМГ-ГХ способствует потере клеткой не только ДНК и РНК, но и белков. Изменения схожего характера в структуре клеток E.coli под воздействием указанного соединения были зарегистрированы в работе L. Qian и и соавт. [12].

S. A. Kedik и соавт. [13] синтезировали новое соединение с устойчиво воспроизводимыми дезинфицирующими свойствами и низкой токсичностью — гидросукцинат разветвлённого олиго-гексаметиленгуанидина (ОГМГсукц) (рис. 1).

В связи с тем, что ОГМГсукц представляет особый интерес для разработки на его основе противо-микробных лекарственных препаратов, то целью настоящего исследования является изучение механизма действия указанной субстанции в отношении микробных дегидрогеназ грамотрицательных бактерий, его влияния на биоплёнку, а также на клеточную стенку E.coli и исследование воздействия ОГМГсукц на морфологию бактерий, дрожжевых и плесневых грибов, вызывающих конъюнктивит.

Материал и методы

Исследуемое вещество. Исследуемым соединением является синтезируемая микрофлюидным способом фармацевтическая субстанция «Гидросукцинат разветвлённого олигогексаметилен-гуанидина» (производство ФГБОУ ВО «РТУ МИРЭА», Россия).

Рис. 1. Общая формула ОГМГсукц.

Примечание. H2A - 1/2 (HOOCCH2CH2COOH) эквивалент янтарной кислоты; «r^», «n2» и «n3» - количество линейных звеньев (1-3); «z» - степень разветвлённости в пересчёте на одну молекулу (0,15-1,10). Среднечисловая молекулярная масса Mn - в интервале от 0,6 до 1,2 кДа.

Наименование. Гидросукцинат разветвлённого олигогек-саметиленгуанидина. Международное непатентованное название (МНН): олиго (иминокарбонимидоилимино-1,6-гек-сандиил) гидросукцинат.

Внешний вид. Белый кристаллический порошок. Производитель: АО «Институт фармацевтических технологий», Москва, Россия.

Тест-система. В экспериментах были использованы культуры клинических штаммов микроорганизмов из коллекции лаборатории биологически активных наноструктур НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи: E.coli K12, Pseudomonas aeruginosa PA103, P.aeruginosa Z720-17R, Staphylococcus aureus R 116-14, Staphylococcus epidermidis R194-18, Candida albicans G21-0218, Aspergillus niger F503-18.

Подготовка препарата и выбор доз. ОГМГсукц растворяли в воде в концентрации 100 мг/мл и хранили при +4°C. Рабочие разведения ОГМГсукц готовились в воде, физрастворе или PBS (натрий-фосфатный буфер) [14] перед каждым экспериментом.

Дизайн исследования для экспериментов с использованием колориметрических методов восстановления красителей in vivo. Для визуализации действия фармакологической субстанции ОГМГсукц на бактерии был использован тест на восстановление красителей дегидрогеназами живых клеток. Живые клетки обладают способностью изменять окраску добавленного раствора красителя. В экспериментах применялись красители: метиленовая синька (Difco Laboratories, Detroit, MI, США) (далее МС) и 2,3,5-трифенилтетразолий бромид (Lachema, Phan Erba Lachema s.r.o., Чешская Республика) (далее ТФТБ). Восстановление красителей живыми клетками приводит к образованию окрашенных соединений: в случае ТФТБ — красно-фиолетовых кристаллов формазана, в случае МС — к обесцвечиванию раствора.

В работе использовали грамотрицательные бактерии E.coli K12 и P.aeruginosa PA103.

Ночные культуры бактерий в L-бульоне [14] засевали в свежую среду в соотношении 1:10 и выращивали с аэрацией в течение 2,5 ч при 37°С (для E.coli) и 35°С (для P.aeruginosa). Суспензии бактерий разводили пополам буфером PBS (pH 7,0), разливали по 180 мкл в лунки 96-луночного планшета, добавляли по 20 мкл красителя, растворенного в PBS (ТФТБ до конечной концентрации 50 мкг/мл, МС — 35 мкг/мл).

Готовили серию разведений препарата ОГМГ (исходно — 2 мг/мл) в 2 раза и вносили в лунки по 10 мкл. Таким образом, концентрация препарата в лунках составляла 100, 50, 25 и 12,5 мкг/мл.

Планшеты инкубировали при 37°С в течение 2 ч или 18 ч в темноте, измеряли оптическую плотность при 450 нм с помощью спектрофотометра Multiskan FC (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, США).

Дизайн исследования для экспериментов по изучению действия фармацевтической субстанции ОГМГсукц на формирование биоплёнки и зрелую биоплёнку. В опыте были использованы бактерии E.coli K12 LBG1623 (лабораторный штамм).

Ночную культуру бактерий в L-бульоне засевали в соотношении 1:100 в синтетическую среду М9 [14] с 0,4% казаминовых кислот в качестве источника углерода и необходимыми добавками.

При изучении воздействия препарата на формирование биоплёнок суспензию бактерий разливали по 200 мкл в лунки 96-луночного планшета. В лунки добавляли различные концентрации препарата и помещали планшет в термостат при 35°С. Через 18 ч инкубации отбирали аликвоты планктонной культуры, замеряли оптическую плотность при 620 нм с помощью спектрофотометра ThermoFisher Scientific (Waltham, MA, США). Биоплёнку, сформированную в лунках планшета, окрашивали с помощью кристаллвиолета (Alfa Aesar, Ward Hill, MA, США), растворяли в 32% уксусной кислоте и определяли оптическую плотность при 550 нм.

Влияние препарата на зрелую биоплёнку определяли следующим образом: по 200 мкл бактериальной суспензии разли-

вали в лунки 96-луночного планшета и инкубировали 18 ч при 35°С. Отбирали планктонную фракцию, добавляли по 200 мкл свежей среды М9 с добавками и различные концентрации препарата. Планшет инкубировали 18 ч, отбирали планктонную фракцию, а оставшуюся в лунках биоплёнку окрашивали с помощью кристаллвиолета, растворяли в 32% уксусной кислоте и определяли оптическую плотность раствора при 550 нм.

Дизайн исследования для экспериментов по изучению влияния фармацевтической субстанции ОГМГсукц на клеточную стенку бактерий E.coli K12 методом сканирующей электронной микроскопии. Получение препаратов планктонной культуры. Ночную культуру E.coli в L-бульоне разводили в 10 раз свежим бульоном и подращивали с аэрацией при 37°С в течение 2 ч. Выращенную суспензию разделяли на 3 части: первая служила контролем, в две другие добавляли исследуемую субстанцию до конечных концентраций 8 и 40 мкг/мл. Пробы выдерживали с перемешиванием при 37°С в течение 1 ч, клетки осаждали центрифугированием и суспендировали в 10% растворе формальдегида. Полученные препараты использовали для электронной микроскопии.

Получение покровных стекол с биоплёнками, выращенными при разных концентрациях препарата, для дальнейшей микроскопии. Ночную культуру E.coli в L-бульоне засевали в среду М9 с казаминовыми кислотами и необходимыми добавками (1:100). По 100 мкл полученной суспензии наносили на стерильные покровные стёкла и инкубировали 18 ч при 35°С в термостате. Капли с планктонной культурой отбрасывали и на их место наносили по 100 мкл свежей М9 с ростовыми добавками. В капли вносили фармацевтическую субстанцию ОГМГсукц в субингибирующей концентрации 2 мкг/мл и минимальной ингибирующей концентрацией (далее МИК) 8 мкг/мл. Контрольные пробы не содержали ОГМГсукц. Стёкла инкубировали 18 ч при 35°С, промывали водой и помещали в 10% раствор формальдегида. Полученные препараты использовали для сканирующей электронной микроскопии.

Дизайн исследования для экспериментов по изучению влияния фармацевтической субстанции ОГМГсукц на морфологию микроорганизмов методом атомно-силовой микроскопии.

Тест-штаммы микроорганизмов, использованные в работе: S.aureus R 116-14, минимальная бактерицидная концентрация (МБК) 32 мг/л), S.epidermidis R194-18 (МБК 16 мг/л), P.aeruginosa Z720-17R (МБК 32 мг/л), C.albicans G21-0218 (МБК 2 мг/л), A.niger F503-18 (МБК н/о).

Культуры бактерий инкубировали на кровяном агаре в течение 24 ч при 36°С, культуры грибов — на агаре Сабуро в тех же условиях (кроме A.niger — 72 ч при 28°С). По окончании инкубации культуры суспендировали в физрастворе до финальной плотности суспензии порядка 109 КОЕ/мл. Суспензию бактерий смешивали с равным объёмом водного раствора ОГМГсукц или воды (контроль) и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре. Использовали растворы ОГМГсукц с концентрацией 100 мг/л и 40 мг/л. После инкубации 5 мкл суспензии наносили на свежесколотую слюду и высушивали. Полученные препараты помещали в индивидуальные чашки Петри. Приготовленные таким образом образцы исследовали на атом-но-силовом микроскопе «ФемтоСкан» (ООО НПП «Центр перспективных технологий», Москва, Российская Федерация) в контактном режиме с кантилеверами CSG01.

Результаты исследования

Изучение действия фармацевтической субстанции ОГМГсукц на живые клетки грамотрицатель-ных бактерий E.coli K12 и P.aeruginosa PA103 с использованием колориметрических методов восстановления красителей in vivo. Восстановление красителей живыми клетками приводит к образованию окрашенных соединений: в случае ТФТБ — красно-фиолетовых кристаллов формазана, в случае МС — к обесцвечиванию раствора.

Результаты экспериментов представлены на рис. 2 а, б. На рис. 2 а хорошо заметно, как изменяется цвет раствора в лунках в зависимости от концентрации добавленного к бактериям ОГМГсукц после 2 ч инкубации.

Результаты сканирующей электронной микроскопии клеток E.coli K12 (лабораторный штамм) после обработки планктонной культуры и биоплёнок фармацевтической субстанцией ОГМГсукц. Образцы готовили в соответствии с методами исследования. Результаты сканирующей электронной микроскопии клеток приведены на рис. 3 а—г.

На рис. 3 а показано влияние ОГМГсукц на культуру планктона E.coli, что проявляется в нарушении клеточного деления и выпячивания клеточной стенки. С увеличением концентрации ОГМГсукц нарушения клеточной стенки становятся гораздо более выраженными.

При субингибирующих концентрациях ОГМГсукц (рис. 3 в) наблюдается более активное образование микроколоний, чем в контроле. Когда концентрация ОГМГсукц равна МИК, отдельные клетки с нарушенной морфологией остаются в поле зрения (рис. 3 г).

Результаты исследования влияния фармацевтической субстанции ОГМГсукц на морфологию микроорганизмов. Чтобы изучить влияние исследуемой фармацевтической субстанции на морфологию бактериальных клеток, бактерии инкубировались с 40 мкг/мл ОГМГсукц, 100 мкг/мл ОГМГсукц и без ОГМГсукц (контроль) в течение 15 мин, затем образцы наносились на слюду, высушивались и исследовались с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ).

На рис. 4 а—е приведены результаты АСМ для S.epidermidis R194-18, S.aureus R 116-14 и P.aerugi-nosa Z720-17R.

Из результатов проведённой АСМ видно, что на рис. 4 б образцы бактерий представлены гладкими плотными колониями, без видимых нарушений оболочек, на рис. 4 в в составе колонии показаны шаровидные бактерии. На рис. 4 в и рис. 4 г бактерии идентифицированы небольшими группами, хотя плотные скопления бактерий обнаружены, единичные образцы не встречаются, структурное повреждение мембран не определено.

Как и в случае S.epidermidis, влияние ОГМГсукц на структуру бактерий выражается в их стремлении плотнее объединяться в колонии, что обеспечивает их выживаемость.

На рис. 4 д показано много отдельных объектов по сравнению с образцом, обработанным концентрацией 40 мг/л (рис. 4 е). Очевидных повреждений мембран не наблюдается, однако, сегрегационные нарушения являются выраженными.

Результаты АСМ для грибов рода C.albicans G21-0218 и A.niger F503-18 показаны на рис. 5 а—г.

а

б

12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Рис. 2. Действие фармацевтической субстанции ОГМГсукц на бактерии E.coli и P.aeruginosa.

a - 2 ч инкубации. Линии A - D - E.coli-, линии E - H -P.aeruginosa РА103. Концентрация ОГМГсукц в 1-2 рядах составила 100 мкг/мл, в 3-4 - 50 мкг/мл, в 5-6 -25 мкг/мл, в 7-8 - 12,5 мкг/мл, в 9-10 - контроль с отсутствием субстанции, в 11-12 - контроль среды с красителем без бактерий. Линии A, B, Е, F - краситель ТФТБ, линии C, D, G, H - краситель МС. b - 18 ч инкубации. Линии С-D - E.coli, линии E-F - P.aeruginosa РА103. Концентрация ОГМГсукц в 1-2 рядах составила 100 мкг/мл, в 3-4 - 50 мкг/мл, в 5-6 - 25 мкг/мл, в 7-8 - 12,5 мкг/мл, в 9-10 - контроль с отсутствием субстанции, в 11-12 - контроль среды с красителем без бактерий. Линии C-F - краситель - ТФТБ (МС быстро окисляется в аэробных условиях, в связи с чем в эксперименте не применялась).

На рис. 5 а показаны нити ложного мицелия, который подвержен деформации. Образец, обработанный ОГМГсукц в концентрации 100 мг/л (рис. 5 б), имеет более ровную клеточную стенку, но есть отдельные частицы неправильной формы (разрушенные). Образец на рис. 5 в содержит группы клеток, однако из-за сканирования в контактном режиме частицы выглядят гладкими хотя на самом деле они имеют шероховатую поверхность. На рис. 5 г обнаружены кластеры того же типа: застрявшие бесформенные клетки с нечёткими краями. Исходя из представленных данных, можно сделать вывод о высокой эффективности ОГМГсукц в отношении данного микроорганизма.

Обсуждение

В связи с перспективой применения и отсутствия подробных экспериментальных доказательств механизма действия ОГМГсукц на живые клетки

Рис. 3. Результаты сканирующей электронной микроскопии.

а — планктонная культура £со//при воздействии ОГМГсукц в концентрации 8 мкг/мл; б— планктонная культура Е.со// при воздействии ОГМГсукц в концентрации 40 мкг/мл; в — биоплёнки Е.со//при воздействии субингибирующей концентрации ОГМГсукц 2 мкг/мл; г — биоплёнки Е.со// при воздействии МИК ОГМГсукц 8 мкг/мл. Кругом изображены видимые дефекты морфологии клеток.

грамотрицательных бактерий E.coli и P.aeruginosa были использованы колориметрические методы in vivo. Эффективность фармацевтической субстанции ОГМГсукц в отношении микробных де-гидрогеназ показана на рис. 2. Проведённые эксперименты доказывают, что фармацевтическая субстанция ОГМГсукц ингибирует метаболизм живых грамотрицательных бактерий, что, в свою очередь, свидетельствует о подавлении реакций восстановления применяемых красителей.

Действие фармацевтической субстанции ОГМГсукц на планктонную культуру и биоплёнку E.coli показано на рис. 3. На основании

полученных данных можно сделать вывод, что соединение эффективно против культуры планктона, особенно при концентрации 2 мкг/мл наблюдается более активное образование микроколоний, а МИК для штамма E.coli составляет 3 мкг/мл. Согласно результатам отмечено, что ОГМГсукц влияет на образование биоплёнки, однако можно предположить, что этот эффект наблюдается из-за ингибирования роста бактерий. Таким образом, при субингибирующей концентрации ОГМГсукц 2 мкг/мл наблюдается увеличение образования биоплёнки, но при МИК 8 мкг/мл наблюдаются отдельные клетки

Рис. 4. Результаты АСМ бактерий.

а — обработка культуры Б.ер1с1егт1сИ5 КК194-18 ОГМГсукц, 40мг/л; б — обработка культуры Б.ер1с1егт1сИ5 КК194-18 ОГМГсукц, 100 мг/л; в — обработка культуры Б.аигеи5 К 116-14 ОГМГсукц в концентрации 40 мг/л; г — обработка культуры Б.аигеи5 К 116-14 ОГМГсукц в концентрации 100 мг/л; д — обработка культуры Р.аегид1по5а 7720-Ш ОГМГсукц в концентрации 40 мг/л; е — обработка культуры Р.аегид\по5аТ720-11К ОГМГсукц в концентрации 100 мг/л.

с нарушенной морфологией. Результаты исследований, полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа, подтверждают влияние фармацевтического вещества ОГМГсукц на клетки кишечной палочки, которое связано с нарушением целостности бактериальной клеточной стенки.

Разрушающее действие ОГМГсукц на бактериальные клетки с помощью АСМ можно наблюдать и у других микроорганизмов. В частности, на рис. 4 a, б влияние ОГМГсукц на структуру бактерий S.epidermidis выражается в их стремлении более тесно объединяться в колонии благодаря за-

щитному механизму. На рис. 4 в, г, как и в случае с 8.ер1йегш1й1$, влияние ОГМГсукц на Б.аыгет выражается в их стремлении к более тесному объединению в колониях, что обеспечивает их выживание. В случае P.aeruginosa, напротив, наблюдаются выраженные нарушения сегрегации клеток под влиянием ОГМГсукц (рис. 4 д, е).

В образцах, обработанных ОГМГсукц, имеется много отдельных объектов, и чем выше концентрация ОГМГсукц, тем более выражены нарушения сегрегации клеток. Действие ОГМГсукц выражено по отношению к грибам как в случае с С.а1Ысат (рис. 5 а, б), так и в случае с A.niger (рис. 5 в, г) в

Рис. 5. Результаты АСМ грибов.

а — обработка С.а/Ь/сапБ С21-0218 ОГМГсукц в концентрации 40 мг/л; б — обработка С.а/Ь/сапБ С21-0218 ОГМГсукц в концентрации 100 мг/л; в — обработка А.п/дегР503-18 ОГМГсукц в концентрации 40 мг/л; г— обработка А.п/дегР503-18 ОГМГсукц в концентрации 100 мг/л.

пробах много клеток, разрушенных под воздействием исследуемого вещества.

Таким образом, мы можем сделать вывод, что создание антимикробного препарата на основе ОГМГсукц представляет интерес. Изучение влияния ОГМГсукц на бактериальную клеточную стенку, морфологию клеток, а также на способность влиять на микробную биоплёнку позволило понять механизм действия ОГМГсукц, который служит основой для создания фармакологического препарата, активного в отношении конъюнктивита инфекционного характера.

Работа выполнялась в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего образования «МИРЭА — Российский технологический университет», Институт тонких химических технологий им. М. В. Ломоносова, департамент Биотехнологии и Промышленной Фармации (БТиПФ).

Выражение признательности. Авторы статьи выражают признательность коллективу НИЦ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи за помощь в проведении экспериментов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Frost L.S., Boesze-Battaglia K, Mitchell C.H. Autophagy in the eye: implications for ocular cell health. Experimental Eye Research 2014; 124: 56-66.

2. Avery R.A., Fisher M.J., Liu G.T. Optic pathway gliomas. Journal of Neuro-Ophthalmology 2011; 31: 269-278.

3. Cohen N.R., Lobritz M.A., Collins J.J. Microbial persistence and the road to drug resistance. Cell Host & Microbe 2013; 13: 632-642.

4. Campoccia D, Montanaro L, Arciola C.R. A review of the biomaterials technologies for infection-resistant surfaces. Biomaterials 2013; 34: 8533-8554

5. Jala J.F. Development of antimicrobial surfaces. The first European congress on microbial biofilms: Eurobiofilms 2009, Rome 2-5 September: 98-99.

6. Berlinck R.G.S., Trindade-Silva A.E., Santos M.F.C. The chemistry and biology of organic guanidine derivatives. Natural Product Reports 2012; 29: 1382-1406.

7. Кедик C.A., Шаталов Д.О., Бексаев С.Г., Седищев И.П., Жаворонок Е.С., Суслов В В., Панов A.B. Разработка и валидация метода контроля мономерной примеси гидрохлорида гуанидина в фармацевтической субстанции «разветвлённый гидрохлорид олигогексаме-тиленгуанидина». Вестник МИТХТ. — 2014. — № 9. — С. 32-36. / Kedik S.A., Shatalov D.O., Beksaev S.G., Sedishhev I.P., Zhavoronok E.S., Suslov V.V., Panov A.V. Razrabotka i validacija metoda kontrolja monomernoj primesi gidrohlorida guanidina v farmacevticheskoj sub-

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:

Иванов Иван Сергеевич — аспирант кафедры Биотехнологии и Промышленной Фармации Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «МИРЭА — Российский технологический университет», Москва

Шаталов Денис Олегович — к. фарм. н., доцент кафедры Биотехнологии и Промышленной Фармации Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «МИРЭА — Российский технологический университет», Москва

Кедик Станислав Анатольевич — д. т. н., проф., заведующий кафедрой Биотехнологии и Промышленной Фармации Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «МИРЭА — Российский технологический университет», Москва

Седишев Игорь Павлович — к. х. н., доцент кафедры Биотехнологии и Промышленной Фармации Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «МИРЭА — Российский технологический университет», Москва

stancii «razvetvlennyj gidrohlorid oligogeksametilenguanidina». Vestnik MITHT 2014; 9: 32-36. [in Russian]

8. Воинцева И.И., Гембицкий П.А. Полигуанидины — дезинфекционные средства и полифункциональные добавки. М.: ЛКМ-пресс, 2009. — 304 с / Voinceva I.I., Gembickij P.A. Poliguanidiny — dezinfek-cionnye sredstva i polifunkcional'nye dobavki. Moskva: LKM-press, 2009; 304. [in Russian]

9. Broxton P., Woodcock P.M., Gilbert P. A study of the antibacterial activity of some polyhexamethylene biguanides towards Escherichia coli ATCC 8739. J Appl Bacteriol 1983; 54: 345-353.

10. Ikeda T, Ledwith A., Bamford C.H., Hann R. A. Interaction of a polymeric biguanide biocide with phospholipid membranes. BBA — Biomembr 1984; 769: 57-66.

11. Zhou Z.X., Wei D.F., Guan Y, Zheng A.N., Zhong J.J. Damage of Escherichia coli membrane by bactericidal agent polyhexamethylene guanidine hydrochloride: Micrographic evidences. J Appl Microbiol 2010; 108: 898-907.

12. Qian L, Xiao H, Zhao G, He B. Synthesis of modified guanidine-based polymers and their antimicrobial activities revealed by AFM and CLSM ACS. Appl Mater Interfaces 2011; 3: 1895-1901.

13. Kedik S.A., Sedishev I.P., Panov A.V. Branched oligomers on the basis of a guanidine derivative and disinfecting agent containing said oligomers (alternatives). WO Patent 2012/082009, 2012 Jun 21.

14. Sambrook J., Fritsch E, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manuall. 2nd Edition; Cold Spring Harbor Laboratory Press: NY, 1989; 1626.

Грамматикова Наталия Эдуардовна — к. б. н., доцент кафедры Биотехнологии и Промышленной Фармации Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «МИРЭА — Российский технологический университет», Москва

Айдакова Анна Викторовна — аспирант кафедры Биотехнологии и Промышленной Фармации Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «МИРЭА — Российский технологический университет», Москва Трачук Кирилл Николаевич — студент кафедры Биотехнологии и Промышленной Фармации Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «МИРЭА — Российский технологический университет», Москва

Языкова Екатерина Игоревна — студентка кафедры Биотехнологии и Промышленной Фармации Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «МИРЭА — Российский технологический университет», Москва