Способ прогнозирования рисков тяжелого течения респираторных заболеваний вирусной природы
METHOD FOR PREDICTION OF RISKS OF SEVERE COURSE OF RESPIRATORY DISEASES OF VIRAL NATURE

Область техники
Изобретение относится к молекулярной биологии и генетике и может быть использовано в вирусологии, иммунологии и медицине для прогнозирования генетической предрасположенности человека к тяжелому или осложненному течению респираторного заболевания  вирусной природы и повышенной или пониженной предрасположенности к нему.
Уровень техники
Orthomyxoviridae
Paramyxoviridae
Picobirnaviridae
Picornaviridae
Coronaviridae
Adenoviridae
Parvoviridae
Респираторные заболевания вирусной природы вызываются как РНК- содержащими вирусами (семейства , , , , ), так и ДНК-содержащими вирусами (семейства , ). Эти заболевания остаются основной причиной смертности, инвалидности и социальных и экономических волнений для миллионов людей в мире. Бедность, отсутствие надлежащего доступа к медицинскому обслуживанию, миграция людей, появление новых возбудителей болезней и применение антибиотикотерапии к вирусным инфекциям – все это способствует усилению воздействия этих болезней.
Идентификация специфических полиморфизмов в генах человека, которые связаны с  восприимчивостью или устойчивостью к вирусным заболеваниям, является перспективным направлением в медицинской диагностике. Человеческое знание о генетических факторах, вовлеченные в патогенез вирусные инфекции, и особенно - в патогенез развития их осложнений, продолжает расти. Основная цель генетических исследований в области инфекционных заболеваний - прогнозирование восприимчивости, предотвращение осложнений и своевременно подобранная терапия для снижения тяжести течения заболевания (AdamD.Kenney, JamesA. Dowdle, LeoniaBozzacco, ThemetM. McMichael, CorineSt. Gelais, AmandaR. Panfil, YanSun, LarryS. Schlesinger, MatthewZ. Anderson, PatrikL. Green, CarolinaB. Lopez, BradR. Rosenberg, LiWuandJacobS. Yount. HUMAN GENETIC DETERMINANTS OF VIRAL DISEASES.Annu Rev Genet.2017 November 27; 51: 241 – 263).
IFIH1
Известно решение по заявке  USA № US20160273044 A1,  C12Q1/6883, заключающееся в идентификации, диагностике и прогнозировании системной красной волчанки, включая методы лечения, построенное на основе точечного генотипирования полиморфизмов в генах, связанных с иммунитетом, включая полиморфизм rs1990760 (), где T аллель является фактором риска. Ген IFIH1 принадлежит к семейству паттерн-распознающих рецепторов, является сенсором вирусных нуклеиновых кислот в цитоплазме и играет главную роль в распознавании вирусной инфекции и активации каскада антивирусных ответов: стимуляция выброса интерферонов I типа и провоспалительных цитокинов.
Однако этот способ относится только к аутоиммунным заболеваниям, и хотя и затрагивает большинство генов сигнальных путей вирусного патогенеза, не является инфекционным.
Известны также решения, касающиеся оценки риска тяжести инфекционного заболевания на основе определения различныхбиомаркеров.
Заявка WO 2017/050988 Al описывает способ прогнозирования тяжелого протекания гриппа на основе детекции белкового маркера - альфа-интерферон-индуцируемого протеина 27.
Также, в заявке WO2014/008545A1 рассматривается уровень этого же белка как диагностический критерий вирусной пневмонии и как прогностический критерий тяжести заболевания.
Недостатком данного способа является то, что альфа-интерферон-индуцируемый белок 27 - это маркер только одного из сигнальных путей иммунного ответа. Также недостатком является то, что данный белок детектируется уже на стадии развития заболевания, и выявление риска осложнений может произойти слишком поздно.
Генетические маркеры, как критерий риска тяжести заболевания, являются перспективными, так как они могут быть проанализированы в любой момент и в любом возрасте и выбор терапии в соответствии с генотипом может быть сделан в самом начале заболевания, без дополнительных анализов.
Некоторые генетические маркеры тяжести вирусной респираторной инфекции описаны в научной литературе.
TNF
Например, при инфекции H1N1 в 2009 году выявлена значительно более высокая частота генотипа  rs1800629 G/A в тяжелых и летальных случаях (ChoudharyM.L., AlagarasuK., ChaudharyU., KawaleS., MalasaneP., GuravY.K., PadbidriV., KadamD., SangleS.A., SalviS., BavdekarA.R., D'costaP., ChadhaM.S.AssociationofSingleNucleotidePolymorphismsinTNFAandIL10 GeneswithDiseaseSeverityinInfluenzaA/H1N1pdm09 VirusInfections: AStudyfromWesternIndia. ViralImmunol.2018 Dec;31(10):683-688).
Известно решение по патенту RU №2339701, в котором рассматривается способ для определения предрасположенности человека к различным видам физической работы на основе генетической панели, включающей ряд полиморфизмов. Но рассматриваемый в данном патенте способ не пригоден для определения предрасположенности к вирусным инфекциям, так как гены, включенные в панель, не связаны с иммунной системой человека либо с регуляцией воспалительного процесса
Известно решение по патенту RU №2494400, в котором рассматривается способ для прогнозирования патологий беременности на основании определения полиморфизма в гене PAI-1.
Но рассматриваемый в данном патенте способ не пригоден для определения предрасположенности к вирусным инфекциям, так как хотя ген PAI-1 связан с развитием воспалительного процесса, в том числе при инфекционных заболеваниях, для данного полиморфизма не известна связь с риском возникновения респираторной вирусной инфекции либо с её тяжестью.
Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является создание способа прогнозирования рисков тяжелого течения респираторных заболеваний вирусной природы у человека и предрасположенности к ним, а также создание генетической панели для осуществления способа путем проведения генетического анализа сразу нескольких полиморфизмов.
Технический результат достигается за счет созданной авторами генетической панели, в которую включены полиморфизмы, достоверно связанные с риском возникновения респираторной вирусной инфекции или с её тяжелым течением, позволяющей осуществить способ прогнозирования рисков тяжелого течения респираторных заболеваний вирусной природы у человека и предрасположенности к ним путем проведения генетического анализа в области полиморфизмов в геноме человека сразу нескольких полиморфизмов в 10 генах. При этом оценка риска производится по генотипу в области полиморфизмов, включенных в данную панель.
IFIH1
IFITM3
TNF,
TMPRSS2
C3AR1
STAT3
STAT6
TLR7
CCR2
TLR2,
Техническая задача осуществляется за счет того, что создана генетическая панель для прогнозирования рисков тяжелого течения респираторных заболеваний вирусной природы и предрасположенности к ним на основе методов генетических исследований, включающая генотип в области патогенных или протективных аллелей полиморфизмов в геноме человека: rs1990760 в гене , rs12252 в гене  , rs1800629 в гене   rs75603675 в гене, rs7842 в гене , rs744166 в гене, rs324011 в гене , rs179008 в гене, rs1799864 в гене, rs1898830 в генепри этом,
Ген
Полиморфизм и генотип в его области
Значимый генотип
Функциональное значение
<i>IFIH1</i>
rs1990760;   T/C
CC, CT
Риск
<i>IFITM3</i>
rs12252; A/G
GG
Риск
<i>TNF</i>
rs1800629; G/A
GA,AA
Риск
<i>TMPRSS2</i>
rs75603675; C/A
CA, AA
Риск
<i>C3AR1</i>
rs7842; T/C
TC, CC
Риск
<i>STAT3</i>
rs744166; A/G
AG, GG
Протективный
<i>STAT6</i>
rs324011; C/T
CT, TT
Риск
<i>TLR7</i>
rs179008; A/T
TT
Риск
<i>CCR2</i>
rs1799864; G/A
GA, AA
Риск
<i>TLR2</i>
rs1898830; A/G
GG
Протективный
IFIH1
IFITM3
TNF,
TMPRSS2
C3AR1
STAT3
STAT6
TLR7
CCR2
TLR2
Создан способ прогнозирования рисков тяжелого течения респираторных заболеваний вирусной природы и предрасположенности к ним, заключающийся  в выделении ДНК человека, определении последовательности ДНК  в области полиморфизмов в геноме человека: rs1990760 в гене , rs12252 в гене  , rs1800629 в гене   rs75603675 в гене, rs7842 в гене , rs744166 в гене, rs324011 в гене , rs179008 в гене, rs1799864 в гене, rs1898830 в генепо п.1, после чего полученный генотип анализируют с учетом возможных аллельных вариантов полиморфизмов, анализируют генетическую панель предрасположенности путем суммирования эффектов разных патогенных или протективных аллелей полиморфизмов из п.1, затем выявленный генотип оценивают согласно патогенной или протективной роли аллелей в развитии инфекционного заболевания, суммируют и оценивают общий результат.При этом определение последовательности ДНК  в области полиморфизмов в геноме человека проводят методом секвенирования или методом ПЦР в реальном времени, или методом анализа длины рестрикционных фрагментов, а   риски тяжелого течения респираторных заболеваний вирусной природы и предрасположенности к ним оценивают путем присвоения баллов генотипу в области каждого полиморфизма, суммирования этих баллов и оценки рисков в зависимости от суммы баллов, при этом сумма баллов =  «0» - риск общепопуляционный, сумма баллов меньше «0» – риск повышен, сумма баллов больше «0» – риск снижен, причем,
генотип - баллы
ген
полиморфизм
гомозигота по главному аллелю
гетерозигота
гомозигота по минорному аллелю
CCR2
rs1799864
GG  "0"
GA "-2"
AA "-2"
IFIH1
rs1990760
TT "0"
TC "0"
CC "-2"
IFITM3
rs12252
AA "0"
AG "0"
GG "-3"
TNF
rs1800629
GG  "0"
GA "-1"
AA "-1"
TMPRSS2
rs75603675
CC "0"
CA "-1"
AA "-1"
C3AR1
rs7842
TT "0"
TC "-2"
CC "-2"
STAT3
rs744166
AA "0"
AG "0"
GG "+2"
STAT6
rs324011
CC "0"
CT "0"
TT "-1"
TLR2
rs1898830
AA "0"
AG "0"
GG "+1"
TLR7
rs179008
AA "0"
AG "0"
GG "-1"
Реализация изобретения
В основу изобретения положен способ для определения предрасположенности человека к респираторной вирусной инфекции, а также к тяжелому или осложненному течению респираторного вирусного заболевания с использованием созданной авторами генетической панели, позволяющей проведение генетического анализа в области полиморфизмов в геноме человекасразу нескольких полиморфизмовв 10 генах.
Повышение точности, более полные рекомендации основываются на введении в рассмотрение большего количества полиморфизмов в большем количестве генов и интерпретации на основании суммирования эффектов влияния разных генотипов по мере увеличения выборки обследуемых людей.
В механизме иммунного ответа организма на вирусы-возбудители респираторных инфекций можно выделить следующие сигнальные пути, проанализированные авторами.
Первый путь - инициируемый мембранными толл-подобными рецепторами TLR2 и TLR4, являющимися образ-распознающими молекулами в отношении патогенов. Этот путь в конечном итоге приводит к активации генов провоспалительных цитокинов (интерлейкин 1-бета, интерлейкин-6, альфа-ФНО) и обеспечивает развитие ранних воспалительных реакций.
Второй сигнальный путь начинается  с распознавания вирусных нуклеиновых кислот внутриклеточными толл-подобными рецепторами TLR3, TLR7 и TLR8. Этот путь приводит к активации антивирусной защиты и позднего воспалительного ответа за счет выработки интерферонов альфа и бета.
Третий путь – путь активации системы комплемента. Гены, кодирующие компоненты этого пути, также были включены в исследование.
То есть, все элементы этих сигнальных путей играют роль в развитии своевременного иммунного ответа, поэтому мутации в генах, кодирующих белки сигнальных цепочек или регулирующих активность сигнальных белков могут быть ответственны за протекание вирусного заболевания.
Антивирусные белки
IFIH1
IFIH1
Передача сигнала от патогена в клетку, активация ответа иммунной системы (в том числе антивирусного ответа) зависит от иммунных модуляторов, одним из которых является продукт гена . Этот белок способен проявлять антивирусный ответ непосредственно в ответ на вирусную инфекцию, выбрасывая интерфероны I типа и стимулируя выброс цитокинов. При наличии минорного генотипа C/C в области полиморфизма rs1990760 гена  происходит нарушение функциональности белка, приводящее к недостатку интерферона-альфа. Недостаток интерферона способен вызывать задержку в первичном иммунном ответе и увеличение скорости репликации вируса и его распространение.
IFITM3
На структуру продукта гена , также являющегося регулятором выброса интерферонов, влияет генотип в области полиморфизма rs12252. Генотип GG в результате альтернативного сплайсинга дает белок, укороченный на 21 аминокислоту с N-концевого участка. Такой белок не функционален и, посколькуявляется индуктором интерферона, приводит к  облегченному входу вируса в клетку и риску более тяжелого течения респираторного заболевания.
C3AR1.
В патогенезе осложнений респираторных заболеваний участвует ген Аллель С (генотип ТС или C/С) в области полиморфизма rs7842 способствует сосудистой проницаемости и выходе лейкоцитов из сосудистого русла при абсцессе легкого, являющегося осложнением пневмонии. Это может привести к сепсису.
TMPRSS2
Ген  кодирует белок из семейства трансмембранных протеаз. Аллель А в области полиморфизма rs75603675 является фактором риска тяжелого течения COVID-19, так как белок TMPRSS2 связан с облегчением прохождения вируса SARS-CoV-2.
Транскрипционные факторы
STAT3
STAT6
STAT6
STAT6
Ген  STAT3 кодирует белок, являющийся активатором транскрипции из семейства STAT и выполняющий роль регулятора экспрессии ряда генов в ответ на цитокины и факторы роста. Кроме того, STAT3 участвует в регуляции ответа организма на вирусные и бактериальные инфекции, поскольку взаимодействие интерлейкина-6 с соответствующими рецепторами запускает процесс фосфорилирования STAT3. Уровень интерлейкина-6 связан с тяжестью инфекционного заболевания и риском осложнений. Генотип G/G в области полиморфизма rs744166 в гене  играет протективную роль.  активируется внутри клетки чужеродными нуклеиновыми кислотами, которые приводят к активации врожденного иммунитета. Активированный таким образом,  регулирует определенный набор генов, необходимых для рекрутирования различных иммунных клеток в очаг инфекции. Минорный генотип ТТ в области полиморфизма rs324011 в гене  является фактором риска тяжелого течения заболевания вирусной природы.
Рецепторы
TLR2
TLR7
Семейство толл-подобных рецепторов является важным компонентом врожденного иммунитета, отвечая за взаимодействие компонентов вирусных частиц (белков или генетического материала) с клеточными структурами. К этому семейству относятся белки TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR9. Они играют фундаментальную роль в распознавании патогенов и активации врожденного иммунитета. Активация TLR-зависимых сигнальных путей, приводящая к секреции провоспалительных цитокинов (интерлейкин-1, интерлейкин-6, фактор некроза опухоли-α, интерферон 1 типа), происходит при проникновении в организм различных инфекционных агентов. TLR2/6 и 4 локализуются на клеточной мембране, а TLR3, TLR7/8 и 9 - на поверхности эндосом. Минорный генотип GG в области полиморфизма rs1898830 в гене  обладает протективнымхаракетром, так как, теоретически, может усиливать иммунный ответ. Минорный генотип GG в области rs179008 в гене  является фактором риска перерастания легкой либо бессимптомной формы заболевания в более тяжелую.
Цитокины и хемокины
CCR2
CCR2
– ключевой функциональный рецептор для хемокина CCL2, который, в свою очередь, регулирует экспрессию Т-клеточных воспалительных цитокинов и Т-клеточную дифференциацию и способствует дифференциации Т-клеток в Т-хелпер 17 (Th17) во время воспаления. Аллель А в области полиморфизма rs1799864 в гене  является фактором риска в отношении вирусных респираторных инфекций.
TNF
Фактор некроза опухолей (ФНО, TNF) - провоспалительный цитокин, секретируемый моноцитами и макрофагами(не только). Является пирогеном, вызывает лихорадочное состояние, в т.ч. кахексию, напрямую или через стимуляцию секрецией IL-1. Ключевой медиатор клеточной смерти и участник цитокинового шторма. Аллель А в области полиморфизма rs1800629 в гене  является фактором риска в отношении вирусных респираторных инфекций.
Таблица 1. Полиморфизмы, связанные с предрасположенностью к тяжелому течению заболеваний вирусной природы
Ген
Полиморфизм
Ассоциация
<i>1. CCR2</i>
rs1799864
HIV1, HCV, SARS-CoV-2, связан с чувствительностью
<i>2. IFIH1</i>
rs1990760
Аутоиммунные заболевания, HCV, SARS-CoV-2, связан с чувствительностью,
<i>3. TLR2</i>
rs1898830
Бронхиолит (RSV), цитомегаловирусная инфекцияПродолжительность использования подачи кислорода
<i>4. STAT3</i>
rs744166
COVID-19; Астма, рак легких,
<i>5. STAT6</i>
rs324011
COVID-19, связан с тяжелым течением;
<i>6. C3AR1</i>
rs7842
SARS-CoV-2, чувствительность, нарушения в кровообращении
<i>7. TMPRSS2</i>
rs75603675
SARS-CoV-2, COVID-19
<i>8. TLR7</i>
rs179008
COVID-19
<i>9. TNF</i>
rs1800629
Грипп (риск тяжелого течения), астма, туберкулёз, восприимчивость к ВИЧ, герпетический энцефалит, COVID-19,
<i>10. IFITM3</i>
rs12252
COVID-19, грипп, герпесвирусы
Пример №1
Анализ полиморфизмов в 30 генах, связанных с возникновением и развитием  COVID-19 с целью выявления ключевых факторов патогенезакоронавирусной инфекции.
CCR2
IFIH1
TNF
TMPRSS2
C3AR1
TLR7
STAT6
STAT3
TLR2
Авторами было прогенотипировано 319 образцов геномной ДНК от пациентов с различными степенями тяжести заболевания COVID-19 и 78 образцов контрольной ДНК от людей, регулярно или длительно контактировавшими с больными COVID-19, но  не имевших клинических проявлений и/или антител к SARS-CoV-2. Генотипирование проводилось в области 34 полиморфизмов, находящихся в 30 генах. Было выявлено 8 полиморфных маркеров, достоверно связанных с риском возникновения заболевания либо его тяжелого течения - rs1799864 в гене  (OR = 2.21),  rs1990760 в гене  (OR = 1.8), rs1800629 в гене (OR = 1.98), rs75603675 в гене  (OR = 1.86), rs7842 в гене  (OR = 2.08), rs179008 в гене  (OR = 1.85), rs12252 в гене IFIH3 (OR = 2.37) и  rs324011 в гене  (OR = 1.83), а также два протективных в отношении COVID-19 варианта - rs744166 в гене  (OR = 0.36) и rs1898830 в гене  (OR = 0.47).
Данный пример позволил спрогнозировать риск тяжелого течения респираторного вирусного заболевания COVID-19   (10 полиморфизмов в 10 генах) и повысить качество рекомендаций по терапии заболевания.
Таблица 2. Генетическая предрасположенность человека к тяжелому течению вирусных респираторных инфекций
Ген
Полиморфизм
Интерпретация полиморфизма
<i>IFIH1</i>
rs1990760
Роль полиморфизма IFIH1, rs1990760 (C> T) в эпидемиологии вирусной инфекции, хорошо изучена, а минорный аллель T противостоит вирусной инфекции. У мышей с мутированным белком IFIH1 (946T) по этомуаллелю повышена продукция интерферона и повышена защита от летальной вирусной инфекции. На основании исследований на мышах и клеточных культурах ожидается, что люди - носители аллеля Т, должны иметь более высокие уровни интерферона и более низкий риск заражения SARS-COV2 и должны быть защищены от инфекции. (PMID: 32737579)
<i>IFITM3</i>
rs12252
Ген IFITM3 кодирует трансмембранный белок, который стимулирует продукцию интерферона. Аллель G в области rs12252 связана с укороченной изоформой белка, дефектной в функциональном отношении.Исследование, проведенное китайцами ханьской национальности, пришло к выводу, что генотип rs12252 (G/G), по оценкам, дает в шесть раз больший риск тяжелой инфекции, чем генотипы A/G и A/A. Аналогичные результаты были получены и для корейской популяции (PMID: 23361009; PMID: 33169083)
<i>TNF</i>
rs1800629
Мощный пироген, вызывает лихорадку прямого действия или путем стимуляции интерлейкина-1 секреции и участвует в индукции кахексии, при определенных условиях он может стимулировать пролиферацию клеток и индуцировать дифференцировку клеток.  Заболевания, связанные с мутациями в гене TNF, включают астму и малярию. В отношении COVID-19:  TNF - провоспалительный цитокин, который непосредственно участвует в избыточном воспалении. Ранний и высокий подъем уровня TNF в крови предсказывает высокий риск смертности. В связи с этим ингибирование фактора некроза опухоли (TNF) является одним из иммуномодулирующих подходов, который имеет большие перспективы для лечения COVID-19 (PMID: 33294881)
<i>TMPRSS2</i>
rs75603675
Сериновая протеаза TMPRSS2 участвует в  проникновении вируса SARS-CoV-2 в хозяйскую клетку. Вариант А в rs35074065 вызывает гиперэкспрессию протеазы, что облегчает попадание вируса в клетку и явлляется фактором риска повышенной восприимчивости к вирусу SARS-CoV-2. Также пациенты - носители аллеля А могут быть потенциальными кандидатами для лечения ингибиторами сериновой протеазы (PMID: 32410502)
<i>C3AR1</i>
rs7842
Показано, что аллель С rs7842 в C3AR1 связан с повышенным уровнем экспрессии C3AR1 и, соответственно,  с повышенной выработкой C3a является одним из самых мощных провоспалительныханафилатоксинов, вырабатываемых во время активации пути комплемента, и участвующего в активации лейкоцитов и привлечении лейкоцитов к участкам воспаления в стенке сосудов (PMID: 25249547).
<i>STAT3</i>
rs744166
Аллель А связан с гиперактивацией сигнального пути JAK-STAT. Поскольку сам по себе вирус SARS-Cov-2 также способствует активации этого сигнального пути, то активирующий генотип и оказывает дополнительное тормозящее влияние на выработку интерферона-1. Это связано с риском развития таких осложнений течения COVID-19, как коагулопатия/тромбоз, провоспалительным состояниям, профибротический статус и Т-клеточнаялимфопения (PMID: 33037393)
<i>STAT6</i>
rs324011
По литературным данным минорный аллель Т связан с повышенным уровнем IgE. Это связано с риском различных атопических состояний, в том числе бронхиальной астмы. Кроме того, аллель Т связан с увеличением промотора гена STAT6 с созданием нового сайта связывания фактора транскрипции ядерного фактора-κB (PMID: 19665768)
<i>TLR7</i>
rs179008
У носителей минорного генотипа ТТ в rs179008 гена TLR7, значительно более низкая экспрессия гена интерлейкина-29 (IL-29), также называемого интерфероном-лямбда (IFN-λ). Это является фактором риска лучшей восприимчивости и более тяжелого протекания вирусных инфекций (PMID: 20872712)
<i>CCR2</i>
rs1799864
Полиморфизм rs1799864 хорошо изучен в связи с восприимчивостью к ВИЧ1 инфекции. Показано, что у носителей генотипов G/A и A/A, инфицированных вирусом ВИЧ1 прогрессирование инфекции в СПИД существенно замедлено по сравнению с носителями генотипа дикого типа G/G. Так, в первые 4 года после заражения вирусом ВИЧ1 вероятность развития СПИД у них снижена на 58%, а в последующие 4 года - на 19% по сравнению с носителями генотипа дикого типа G/G (PMID 12556692)
<i>TLR2</i>
rs1898830
Генетический вариант GG полиморфизма rs7656411 в  гене TLR2 связан с риском острого вирусного бронхиолита при различных вирусных респираторных инфекциях. В ситуации заражения вирусом SARS-Cov-2 рецептор TLR-2 распознает S-белок вируса SARS-Cov-2, но и узнает белки HSV и запускает через Myd88 и TRAF6 сигнальный путь NF-kappaB с последующей выработкой цитокинов (PMID: 29253610; PMID: 2925361)
IFIH1
IFITM3
TNF
TMPRSS2
C3AR1
STAT3
STAT6
TLR7
CCR2
TLR2
На основании анализа, представленного в таблицах 1 и 2 создана генетическая панель для определения предрасположенности человека к тяжелому течению респираторных инфекций, которая  включает соотношение риска в зависимости наличия тех или иных аллелей и генотипов в полиморфизмах генов , , , , , , , , , .
Таблица 3. Генетическая панель для прогнозирования рисков тяжелого течения респираторных заболеваний вирусной природы и предрасположенности к ним
Ген
Полиморфизм и генотип в его области
Значимый генотип
Функциональное значение
<i>IFIH1</i>
rs1990760;   T/C
CC, CT
Риск
<i>IFITM3</i>
rs12252; A/G
GG
Риск
<i>TNF</i>
rs1800629; G/A
GA,AA
Риск
<i>TMPRSS2</i>
rs75603675; C/A
CA, AA
Риск
<i>C3AR1</i>
rs7842; T/C
TC, CC
Риск
<i>STAT3</i>
rs744166; A/G
AG, GG
Протективный
<i>STAT6</i>
rs324011; C/T
CT, TT
Риск
<i>TLR7</i>
rs179008; A/T
TT
Риск
<i>CCR2</i>
rs1799864; G/A
GA, AA
Риск
<i>TLR2</i>
rs1898830; A/G
GG
Протективный
Пример №2
Подтверждение связи выявленных в примере 1полиморфзмов с риском вирусных респираторных заболеваний.
Авторами  было прогенотипировано 98 медицинских работников (врачи и медсёстры инфекционных отделений и отделений интенсивной терапии), регулярно контактирующих с пациентами с респираторными вирусными инфекциями. Из них у 52 наблюдалась сниженная частота заболеваемости респираторными заболеваниями (ОРВИ, грипп) - от 0 до 2 раз на протяжении 5 лет (в среднем 1.21 раза). У оставшихся 46 заболеваемость составила от 3 до 4 раз на протяжении 5 лет (в среднем 3.75 раз).
Таблица 4. Результаты исследования частоты встречаемости минорных аллелей полиморфизмов  по примеру 1 у групп с разной частотой вирусной инфекции
ген
полиморфизм
группа со сниженной частотой заболеваемости
группа с  повышенной частотой заболеваемости
количество исследуемых с минорным аллелем
частота встречаемости аллеля риска (протективногоаллеля) среди исследуемых
количество исследуемых с минорным аллелем
частота встречаемости аллеля риска (протективногоаллеля) среди исследуемых
частота встречаемости аллеля риска (протективногоаллеля) среди европейской популяции (данные 1000 Genomes)
IFIH1
rs1990760
27
0.519
29
0.630
0.605
IFITM3
rs12252
1
0.019
2
0.043
0.041
TNF
rs1800629
5
0.096
6
0.130
0.134
TMPRSS2
rs75603675
21
0.404
19
0.413
0.405
C3AR1
rs7842
15
0.288
13
0.282
ND
CCR2
rs1799864
4
0.077
4
0.087
0.087
STAT3
rs744166
33
0.635
18
0.391
0.414
STAT6
rs324011
12
0.231
16
0.348
0.347
TLR7
rs179008
9
0.173
8
0.174
0.176
TLR2
rs1898830
18
0.346
15
0.326
0.325
Выявлено, что у группы с пониженной заболеваемостью отличается частота встречаемости минорногоаллеля у 5 полиморфизмов. Это подтверждает связь генотипа анализируемых полиморфных маркеров с риском респираторных вирусных заболеваний
Пример №3
Прогноз риска возникновения или тяжелого течения респираторной вирусной инфекции либо устойчивости к респираторной вирусной инфекции на основании анализа полученного разными способами генотипа в области полиморфизмов, приводимых в примере 1.
Таблица 5.Прогноз риска возникновения, тяжелого течения или устойчивости к респираторным вирусным инфекциям на основе анализа генотипа вобласти полиморфизмов из примера1.
Ген, полиморфизм и варианты генотипа
Генотип риска или протективный
значимость генотипа
Баллы
C3AR1  rs7842  (TT/TC/CC)
T/C, С/С
Риск
-2
CCR2 rs1799864  (GG/GA/AA)
G/A, A/A
Риск
-2
TLR7 rs179008 (AA/AG/GG)
G/G
Риск
-1
IFIH1 rs1990760  (TT/CT/CC)
С/С
Риск
-2
IFITM3 rs12252  (AA/AG/GG)
G/G
Риск
-3
TMPRSS2 rs75603675 (CC/CA/AA)
C/A, A/A
Риск
-1
TNF rs1800629 (GG/GA/AA)
G/A, A/A
Риск
-1
STAT6 rs324011 (CC/CT/TT)
T/T
Риск
-1
TLR2 rs1898830 (AA/AG/GG)
G/G
Протективный
+1
STAT3 rs744166 (AA/AG/GG)
G/G
Протективный
+2
Из цельной крови пациента №1 была выделена геномная ДНК и проанализирована в области полиморфизмов из примера 1 методом капиллярного секвенирования по Сэнгеру. Был получен следующий генотип:
1) C3AR1 rs7842  генотип T/T - 0 баллов;
2) CCR2 rs1799864  генотип G/A – -2 балла;
3) TLR7 rs179008 генотип A/A – 0 баллов;
4) IFIH1 rs1990760  генотип C/T – 0 баллов;
5) IFITM3 rs12252  генотип A/A – 0 баллов.
6) TMPRSS2 rs75603675 генотип С/A – -1 балл.
7) TNFrs1800629 генотип G/G – 0 баллов;
8) STAT6 rs324011 генотип T/T – -1 балл.
9) TLR2 rs1898830 генотип A/G – 0 баллов
10)STAT3 rs744166  генотипА/А - 0 баллов.
Суммарный балл: -4.
Заключение:
Пациент №1 обладает повышенным (относительно общепопуляционного) риском в отношении возникновения либо тяжелого течения респираторной вирусной инфекции.
Из цельной крови пациента №2 была выделена геномная ДНК и проанализирована в области полиморфизмов из примера 1 методом ПЦР с флуоресцентными зондами с детекцией в режиме реального времени. Был получен следующий генотип:
1) C3AR1 rs7842  генотип T/T - 0 баллов;
2) CCR2 rs1799864  генотип G/G – -2 балла;
3) TLR7 rs179008 генотип A/A – 0 баллов;
4) IFIH1 rs1990760  генотип C/T – 0 баллов;
5) IFITM3 rs12252  генотип A/A – 0 баллов.
6) TMPRSS2 rs75603675 генотип С/C – -1 балл.
7) TNFrs1800629 генотип G/G – 0 баллов;
8) STAT6 rs324011 генотип C/C – -1 балл.
9) TLR2 rs1898830 генотип G/G – +1 балл
10) STAT3 rs744166 генотип А/А - 0 баллов.
Суммарный балл: +1.
Заключение:
Пациент №2 обладает повышенной устойчивостью в отношении возникновения либо тяжелого течения респираторной вирусной инфекции либо склонностью к бессимптомному протеканию респираторной вирусной инфекции.
Способ прогнозирования рисков тяжелого течения респираторных заболеваний вирусной природы и предрасположенности к ним можно осуществлять как на стадии развития заболевания, так и до развития заболевания.
Выводы о решении поставленной технической задачи.
1) Разработана генетическая панельдля прогнозирования рисков тяжелого течения респираторных заболеваний вирусной природы и предрасположенности к таким заболеваниям на основе методов генетических исследований, включающая генотип в области полиморфизмов в генах : rs1990760 в гене IFIH1, rs12252 в гене  IFITM3, rs1800629 в гене TNF,  rs75603675 в гене TMPRSS2, rs7842 в гене C3AR1, rs744166 в гене STAT3, rs324011 в гене STAT6, rs179008 в гене TLR7, rs1799864 в гене CCR2, rs1898830 в гене TLR2.
2) Показана возможность определения генотипа в области полиморфизмов rs1990760 в гене IFIH1, rs12252 в гене  IFITM3, rs1800629 в гене TNF,  rs75603675 в гене TMPRSS2, rs7842 в гене C3AR1, rs744166 в гене STAT3, rs324011 в гене STAT6, rs179008 в гене TLR7, rs1799864 в гене CCR2, rs1898830 в гене TLR2 различными методами, включающими в себя ПЦР с флуоресцентными зондами в режиме реального времени и секвенирование ДНК.
3) Показана связь генотипа в области полиморфизмов rs1990760 в гене IFIH1, rs12252 в гене  IFITM3, rs1800629 в гене TNF,  rs75603675 в гене TMPRSS2, rs7842 в гене C3AR1, rs744166 в гене STAT3, rs324011 в гене STAT6, rs179008 в гене TLR7, rs1799864 в гене CCR2, rs1898830 в гене TLR2 с риском возникновения или тяжелого протекания респираторной вирусной инфекции или с устойчивостью к респираторной вирусной инфекции.
4) Разработан метод интерпретации результатов генотипирования в области полиморфизмов rs1990760 в гене IFIH1, rs12252 в гене  IFITM3, rs1800629 в гене TNF,  rs75603675 в гене TMPRSS2, rs7842 в гене C3AR1, rs744166 в гене STAT3, rs324011 в гене STAT6, rs179008 в гене TLR7, rs1799864 в гене CCR2, rs1898830 в гене TLR2 на основе присвоения баллов генотипу в области каждого полиморфизма, суммирования этих баллов и заключения на основе итоговой суммы - сумма баллов =  «0»- риск общепопуляционный, сумма баллов меньше «0» –риск повышен, сумма баллов больше «0» – риск снижен.
Таким образом поставленная задача, а именно создание способа прогнозирования рисков тяжелого течения респираторных заболеваний вирусной природы у человека и предрасположенности к ним, а также создание генетической панели для осуществления способа путем проведения генетического анализа сразу нескольких полиморфизмов, решена.
Промышленная применимость
Все приведенные примеры подтверждают промышленную применимость данного изобретения.