АВТОМАТИЗИРОВАННЫЙ ПРОБООТБОРНИК ДЛЯ СЕМЯН И СПОСОБЫ ОТБОРА ПРОБ, ТЕСТИРОВАНИЯ И УВЕЛИЧЕНИЯ СЕМЯН
AUTOMATED SAMPLER FOR SEEDS AND METHODS OF SEEDS SAMPLING, TESTING AND INCREASING

Предпосылки создания изобретения
Настоящее изобретение относится к системам и способам отбора проб из биологических материалов, таких как семена.
При развитии и усовершенствовании растений осуществляют генетическое усовершенствование растений либо посредством селекционного разведения, либо генетического воздействия, и когда желательное усовершенствование достигнуто, получают товарное количество семян посредством посадки и уборки урожая семян в течение нескольких генераций. Не все семена демонстрируют желательные признаки и, таким образом, эти семена должны быть отбракованы из популяции. Для ускорения процесса увеличения объема популяции проводят статистические пробы семян и тестируют их для отбраковки из популяции семян, которые не демонстрируют адекватно желательных признаков. Однако этот статистический отбор проб неизбежно допускает то, что некоторые семена без желательного признака остаются в популяции, а также то, что можно непреднамеренно исключать некоторые семена с желательным признаком из желательной популяции.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к системам и способам неразрушающего отбора проб материала из семян. Способы, в частности, приспособлены для автоматизации, которая допускает больший отбор проб, чем было осуществимо раньше. Благодаря автоматизированному неразрушающему отбору проб, обеспечиваемому, по меньшей мере, некоторыми из вариантов осуществления настоящего изобретения, можно тестировать каждое семя в популяции и отбраковывать те семена, которые не обладают желательным признаком. Это очень ускоряет процесс увеличения данной популяции семян и может приводить к получению улучшенной конечной популяции.
Варианты осуществления настоящего изобретения облегчают тестирование большей части или всех семян популяции до посадки таким образом, чтобы не затрачивать время и ресурсы на выращивание растений без желательных признаков.
По существу, система, соответствующая настоящему изобретению, содержит: станцию отбора проб; пробоотборник для извлечения материала семян на станции отбора проб; конвейер для семян для транспортировки семян из станции отбора проб в отсек в лотке для семян; и конвейер для транспортировки материала, извлеченного из семян, в соответствующий отсек в лотке для проб.
Согласно способу, соответствующему настоящему изобретению, семена подают индивидуально в станцию отбора проб; и они содержатся в станции отбора проб при отборе пробы из семени. Каждая проба транспортируется в, по меньшей мере, один индивидуальный отсек в лотке для проб, и каждое из семян транспортируется в отсек в лотке для семян с известной взаимозависимостью относительно отсека (отсеков) лотка для проб, в который была направлена соответствующая проба. Пробы могут подвергаться тестированию, и семена могут сортироваться на основе результатов тестирования.
Эти система и способ, соответствующие настоящему изобретению, облегчают автоматизированный неразрушающий отбор проб семян. Они обеспечивают тестирование и сортировку больших объемов семян, таким образом облегчая увеличение популяций семян с желательными признаками. Эти и другие признаки и преимущества будут частично очевидны и частично указаны далее.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 - вид в перспективе первого варианта выполнения системы отбора проб семян, изготовленной согласно принципам настоящего изобретения;
Фиг.2 - увеличенный вид в перспективе узла пробоотборника для семян системы отбора проб семян;
Фиг.3 - увеличенный вид в перспективе бункера и механизма подачи семян узла пробоотборника для семян системы отбора проб семян;
Фиг.4 - вид в перспективе зонда для соскабливания проб с семян;
Фиг.5 - вид в перспективе ползуна для направления зонда;
Фиг.6 - вид в перспективе поршня в подающем механизме бункера;
Фиг.7 - вид в перспективе платформы с множеством установленных на ней лотков для семян и лотков для проб;
Фиг.8 - вид в перспективе механизма двумерного перемещения;
Фиг.9 - вид в перспективе входа конвейера для семян;
Фиг.10 - вид в перспективе выхода конвейера для семян;
Фиг.11 - вид в перспективе выхода конвейера для проб;
Фиг.12 - вид в перспективе воздушного усилителя, используемого в конвейерах для семян и для проб;
Фиг.13 - вид сверху высокопроизводительной системы пробоотборника для семян, соответствующей принципам настоящего изобретения;
Фиг.14 - вид сбоку высокопроизводительной системы пробоотборника для семян;
Фиг.15 - вид в перспективе спереди системы пробоотборника для семян;
Фиг.16 - вид в перспективе сзади системы пробоотборника для семян;
Фиг.17 - вид в перспективе станции отбора проб высокопроизводительной системы пробоотборника для семян;
Фиг.18А - частичный вид в перспективе одной части станции отбора проб семян, соответствующей принципам настоящего изобретения, с задвинутым зондом;
Фиг.18В - частичный вид в перспективе одной части станции отбора проб семян, соответствующей принципам настоящего изобретения, с выдвинутым зондом;
Фиг.19А - вид сбоку станции отбора проб семян с зондом в его задвинутом положении;
Фиг.19В - вид сбоку станции отбора проб семян с зондом в его выдвинутом положении;
Фиг.20 - вид продольного сечения станции отбора проб семян;
Фиг.21 - вид спереди станции отбора проб семян;
Фиг.22 - вид поперечного сечения станции отбора проб семян;
Фиг.23А - вид сбоку колеса для отбора семян;
Фиг.23В - вид с пространственным разделением деталей колеса для отбора семян;
Фиг.23С - вид вертикального сечения колеса для отбора семян;
Фиг.24 - вид спереди подающего механизма;
Фиг.25 - вид сбоку подающего механизма;
Фиг.26А - вид в перспективе подающего механизма;
Фиг.26В - вид сбоку подающего механизма;
Фиг.26С - вид продольного сечения подающего механизма, выполненного по линии 26С-26С на фиг.26В;
Фиг.26D - вид снизу подающего механизма;
Фиг.27А - вид вертикального продольного сечения механизма отбора проб;
Фиг.27В - увеличенный частичный вид вертикального сечения механизма отбора проб, показанного на фиг.27А;
Фиг.28А - вид вертикального сечения механизма отбора проб;
Фиг.28В - увеличенный частичный вид сечения механизма отбора проб, показанного на фиг.28А; и
Фиг.29 - аллелограмма, показывающая пробы ткани эндосперма кукурузы, которые подвергнуты полимеразной цепной реакции для определения конкретного однонуклеотидного полиморфизма.
Соответствующие ссылочные позиции обозначают соответствующие детали нескольких видов на чертежах.
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения
Первый вариант выполнения автоматизированной системы пробоотборника для семян, сконструированной согласно принципам настоящего изобретения, обозначен в целом позицией 20 на фиг.1. Система 20 пробоотборника для семян приспособлена для извлечения семени из бункера, подачи его в станцию отбора проб, соскабливания пробы с семени, транспортировки пробы в контейнер для пробы и транспортировки семени в соответствующий контейнер для семян. Как показано на фиг.1, система пробоотборника для семян содержит основание 22, раму 24 на основании; узел 26 отбора проб, платформу 28, установленную на механизме 30 двумерного перемещения, конвейер 32 для семян для транспортировки семян из узла отбора проб семян и конвейер 34 для проб для транспортировки пробы, снятой с семени, в узел отбора проб семян.
Как показано на фиг.1, в первом предпочтительном варианте осуществления изобретения основание 22 содержит колесную тележку 40, имеющую четыре вертикальные стойки 42, соединенные верхними и нижними продольными элементами 44 и 46 на передней и задней сторонах и верхними и нижними поперечными элементами 48 и 50 на левой и правой сторонах, и установленную на них столешницу 52. В основании каждой стойки 42 может быть установлен ролик 54 для облегчения перемещение основания 22. Детали конструкции основания 22 не являются принципиальными для изобретения и, таким образом, основание 22 может иметь какую-либо другую конфигурацию, не отступая от принципов настоящего изобретения.
Как также показано на фиг.1, рама 24 содержит четыре проходящие вертикально стойки 60, установленные на столешнице 52, которые поддерживают в целом горизонтальную пластину 62. Узел 26 отбора проб установлен на пластине 62, как описано более подробно ниже. На пластине также установлена опора 64, проходящая от нее в целом горизонтально. Свободный конец опоры 64 имеет первую и вторую вертикальные стойки 66 и 68 для установки конвейера 32 для семян и частей конвейера 34 для проб, соответственно. Детали конструкции рамы 24 не являются принципиальными для изобретения и, таким образом, рама может иметь какую-либо другую конфигурацию, не отступая от принципов настоящего изобретения.
Как показано на фиг.1 и 2, узел 26 отбора проб установлен на пластине 62 рамы 24. Узел отбора проб содержит ящик или бункер 70, станцию 72 отбора проб и подающий механизм 74 для подачи одного семени из бункера 70 в станцию отбора проб.
Как показано на фиг.1 и 3, платформа 28 приспособлена для прочной установки множества лотков 80 для семян и лотков 82 для проб в зафиксированных положениях и направлениях. Каждый из лотков 80 для семян и лотков 82 для проб, предпочтительно, разделен на множество отсеков. Количество и расположение отсеков в лотках 80 для семян, предпочтительно, соответствуют количеству и расположению отсеков в лотках 82 для проб. Это облегчает взаимно-однозначное соответствие между семенем и его пробой. Однако в некоторых вариантах осуществления изобретения может быть желательно применять множество отсеков в лотке для проб для каждого отсека в лотке для семян, например, когда с пробами проводят множество тестов, или когда различные пробы могут быть отобраны от одного семени (например, пробы с различных глубин).
Платформа 28 установлена на механизме 30 двумерного перемещения, который в этом предпочтительном варианте осуществления изобретения содержит основание 90 с первым линейным приводом 92, имеющим перемещаемую каретку 94, установленную на основании 90, и вторым линейным приводом 96, имеющим каретку 98, установленную на каретке 94 первого линейного привода 92. Платформа 28 установлена на каретке 98 второго линейного привода 96 и, таким образом, может точно перемещаться в двух измерениях при работе первого и второго линейных приводов 92 и 96.
Конвейер 32 для семян содержит трубку 100 с входным концом 102, примыкающим к станции 72 отбора проб, и выходным концом 104, установленным на стойке 66 рамы 24. Применено первое устройство 106 Вентури на входном конце 102 трубки 100 для создания потока воздуха в трубке к выходному концу 104 трубки и второе устройство 108 Вентури на выходном конце 104 трубки 100 для создания потока воздуха к входному концу 102 трубки. Первое устройство 106 Вентури работает для создания потока воздуха в трубке и всасывания семян из станции отбора проб в трубку через первый конец. Второе устройство 108 Вентури в таком случае работает для создания потока воздуха в противоположном направлении, таким образом, замедляя движение семени для уменьшения возможности повреждения семени, когда оно выходит через выходной конец 104 трубки и доставляется в отсек в лотке. В этом предпочтительном варианте осуществления изобретения вторая трубка 108 Вентури фактически останавливает перемещение семени, допуская его падение под действием силы тяжести в его отсек на лотке 90. На трубке 100 могут быть расположены различные датчики положения для обнаружения наличия семени и подтверждения надлежащей работы конвейера 32 для семян.
Конвейер 34 для проб содержит трубку 120 с входным концом 122, примыкающим к станции 72 отбора проб, и выходным концом 124, установленным на стойке 68 рамы 24. Применено первое устройство 126 Вентури на входном конце 122 трубки 120 для создания потока воздуха в трубке к выходному концу 124 трубки. На выходном конце расположен сепаратор 128 для отделения материала проб от несущего его воздушного потока таким образом, чтобы воздушный поток не выдувал пробу из отсека в лотке 92. Сепаратор, предпочтительно, также содержит фильтр для предотвращения перекрестного загрязнения проб.
Как показано на фиг.2, узел 26 отбора проб семян приспособлен для установки на пластине 62 на стойке 140. Узел 26 отбора проб семян содержит пластину 142 для установки бункера, пластину 144 для установки ползуна и четыре опорные распорки 146 для ползуна между ними. Бункер 70 (показанный на фиг.3), который подает отдельные семена в станцию 72 отбора проб, установлен на пластине 142 для установки бункера. Станция 72 отбора проб содержит гнездо 148 для семян, установленное на держателе 150 гнезда, который поддерживается на пластине 144 для установки ползуна парой опорных распорок 152. Гнездо 148 имеет углубленное отверстие в его донной поверхности, в которое бункер 70 подает одно семя. В верхней части гнезда 148 для семян расположена прорезь, к которой обращена часть семени, расположенного в углублении. Зонд 154 (фиг.4) установлен в держателе 156 зонда, который установлен на переходной пластине 158 ползуна на программируемом ползуне 160, при помощи зажимного блока 162 для зонда. Программируемый ползун 160 (фиг.5) установлен на нижней стороне пластины 144 для установки ползуна и перемещает зонд 154 в прорези в гнезде 148 для семян для отбора пробы семени в выемке в гнезде для семян.
Как лучше показано на фиг.4, зонд 154 имеет множество зубьев 164, высота которых увеличивается к проксимальному концу таким образом, что по мере продвижения зонда 154 в прорези он врезается в семя, расположенное в выемке в гнезде 148, с нарастающей глубиной. Полученное в результате постепенное срезание уменьшает повреждение семени, предохраняя его жизнеспособность. Кроме того, как описано более подробно ниже, благодаря срезанию на разную глубину в разные моменты времени можно производить отбор проб с различных глубин одного семени отдельно для отдельного анализа.
Трубка 166 для передачи проб проходит от выемки в гнезде 148 для семян и имеет соединитель 168 на ее конце для соединения с конвейером 34 для проб.
Станция 26 отбора проб также включает бункер 70, лучше показанный на фиг.3. Бункер 70 содержит левую и правую пластины 170 и 172 для установки бункера и пластину 174 для установки цилиндра и верхний кронштейн 176 для цилиндра. Бункер 70 также имеет переднюю панель 178, заднюю панель 180, первую и вторую торцевые панели 182 и 184 и дно 186. Перегородка 188 делит бункер на первый и второй отсеки 190 и 192. Первый отсек 190 содержит запас семян, которые индивидуально передаются во второй отсек 192.
Привод 194 поршня приводит в действие поршень 196 для подъема семени из первого отсека. Воздушно-струйный узел 198 перемещает семя с конца поршня 196 во второй отсек 192. Второй отсек имеет фигурное дно 200 с отверстием 202 для приема семени и его позиционирования. Привод 210 поршня приводит в действие поршень 214 для подъема семени из второго отсека 192. Воздушно-струйный узел 216 используется для перемешивания семян в ходе подхвата семени.
Как показано на фиг.7, платформа 28 имеет держатели 220 для установки лотков 90 для семян и лотков 92 для проб с их совмещением таким образом, чтобы конвейер для семян и конвейер для проб доставляли семена и пробы в соответствующие отсеки в соответствующих лотках. Лотки 92 для проб могут (как показано) быть приспособлены для удерживания индивидуальных пробирок. Конечно, можно использовать лотки различных конфигураций, например, в которых расположено множество отсеков для множества проб от одного семени. Например, когда одна проба разделена на несколько проб или когда пробы отделены друг от друга в соответствии с тем, откуда они отобраны, например, по глубине.
Как показано на фиг.8, механизм 30 двумерного перемещения также включает ползун 230, имеющий направляющую 232 и каретку 234, которая расположена параллельно первому линейному приводу 92. Второй линейный привод 96 установлен на каретке 94, имеющей каретку 98, установленную на каретке 94 первого линейного привода 92. Платформа 28 установлена на каретке 98 второго линейного привода 96 и, таким образом, может точно перемещаться в двух измерениях при работе первого и второго линейных приводов 92 и 96. При надлежащем управлении механизм перемещения может совмещать индивидуальные отсеки лотков 90 для семян и лотков 92 для проб с выходами конвейера для семян и конвейера для проб.
Как показано на фиг.9, на входном конце 102 трубки 100 конвейера 32 для семян кронштейн 240 удерживает воздушный усилитель 242 и сенсорную трубку 244 для обнаружения семян. Кронштейн 240 содержит секции 246, 248, 250, 252 и 254. Как показано на фиг.2, кронштейн 240 установлен на пластине 142 для установки бункера. Воздушный усилитель 242 (показанный на фиг.12) приспособлен для соединения с источником сжатого воздуха. Когда воздух подают в воздушный усилитель, он создает поток воздуха в трубке 100 с использованием эффекта трубки Вентури. Сенсорная трубка 244 удерживает датчики 256 обнаружения семян для обнаружения прохождения через нее семян. Датчики 256, предпочтительно, являются оптическими датчиками, совмещенными с отверстиями в сенсорной трубке 244, которые оптически обнаруживают прохождение семени.
Как показано на фиг.10, на выходном конце 104 трубки 100 конвейера 32 для семян расположен узел 260 выпуска семян. Узел выпуска установлен на стойке 66 при помощи кронштейна 262 и выпускной опоры 264. Сенсорная трубка 266 для обнаружения семян установлена в кронштейне 262 и удерживает датчики 268 обнаружения семян для обнаружения прохождения через нее семени. Датчики 268, предпочтительно, представляют собой оптические датчики, совмещенные с отверстиями в сенсорной трубке 266, которые оптически обнаруживают прохождение семени. С сенсорной трубкой 266 для обнаружения семян соединен воздушный усилитель 270. Воздушный усилитель 270 (фиг.12) приспособлен для соединения с источником сжатого воздуха. Когда воздух подают в воздушный усилитель, он создает поток воздуха в трубке 100 с использованием эффекта Вентури. Под воздушным усилителем 270 расположена соединительная трубка 272, и под ней расположена продуваемая трубка 274 для выпуска семян, которая также удерживается держателем 276 трубки для выпуска семян, удерживаемым приводом 278 трубки для выпуска семян.
Входной конец 122 трубки 120 конвейера 34 для проб соединен соединителем 168 с трубкой 166 для выпуска проб. Как показано на фиг.11, выходной конец 124 трубки 120 соединен с соединителем 280 для проб, который, в свою очередь, соединен с воздушным усилителем 282, который соединен с узлом 284 наконечника для стружки. Узел наконечника 284 для стружки установлен на держателе 286 выпускной трубки для семян, который удерживается на приводе 288 выпуска. Привод выпуска установлен на стойке 68. В выпускных отверстиях узла 284 наконечника для стружки установлены фильтры 290 для предотвращения загрязнения других отсеков выпускаемыми пробами.
Работа системы пробоотборника
При работе множество семян, например, сои, откладываются в бункере 70. Механизм 74 подачи семян транспортирует индивидуальное семя в станцию 72 отбора проб. В станции отбора проб от семени отбирается проба материала таким образом, который минимизирует ущерб для жизнеспособности семян.
Проба удаляется из станции 72 отбора проб конвейером 34 для проб 34. Устройство 126 Вентури создает поток воздуха в трубке 120 к выходному концу 124. Материал пробы всасывается в трубку и в направлении отсека лотка для пробы, совмещенного с выходным концом 124 трубки 120. Сепаратор 128 отделяет пробу от несущего ее воздушного потока и допускает падение пробы в отсек. В некоторых вариантах осуществления изобретения проба может быть распределена в два или более отсеков в лотке для проб, и в этом случае механизм 30 двумерного перемещения работает для приведения одного или более дополнительных отсеков в положение, совмещенное с выходным концом 124. Можно точно координировать перемещение лотков для проб с работой станции 72 отбора проб таким образом, чтобы пробы от различных частей семени и, в частности с различных глубин в семени, можно было доставлять в отдельные отсеки в лотке для пробы.
После того, как отбор проб от семени закончен, конвейер 32 для семян работает для удаления семени из станции отбора проб. Первое устройство 106 Вентури работает для создания потока воздуха в трубке и всасывания семени из станции 72 отбора проб в трубку 100. Второе устройство 108 Вентури в этом случае работает для создания потока воздуха в противоположном направлении, таким образом, замедляя движение семени для уменьшения повреждения семени, когда оно выходит из выходного конца 104 трубки 100 и доставляется в отсек в лотке 92 для семян. Вторая трубка 108 Вентури, предпочтительно, останавливает движение семени, обеспечивая его падение под действием силы тяжести в его отсек в лотке 90. Работа первой и второй трубок 106 и 108 Вентури может быть синхронной или они могут приводиться в действие датчиками положения, контролирующими трубку 100.
Вариант выполнения высокопроизводительной системы пробоотборника для семян обозначен в целом ссылочной позицией 500 на фиг.13-26. Как показано на фиг.13 и 14, система 500 пробоотборника для семян содержит станцию 502 отбора проб, станцию 504 обработки проб и станцию 506 обработки семян. Желательно, но не существенно, чтобы система 500 пробоотборника для семян была установлена на одну или более колесных тележек, которые могут проходить в обычные дверные проемы таким образом, чтобы систему можно было удобно транспортировать. В этом предпочтительном варианте осуществления изобретения станция 502 отбора проб семян установлена на тележке 508, станция обработки проб установлена на тележке 510 и станция обработки семян установлена на тележке 512.
Станция 502 отбора проб семян содержит механизм 514 подачи семян и механизм 516 строгания семян. От поверхности 520 тележки 508 проходит вертикально вверх множество стоек 518. Платформа 522 установлена на поверхностях стоек 518 и поддерживает механизм 516 строгания семян. Два L-образных кронштейна 524 проходят горизонтально от стоек 518 и поддерживают платформу 526. Платформа 528 установлена на платформе 526 при помощи множества стоек 530 и поддерживает механизм 514 подачи семян.
Множество опор 532 проходят вверх от пластины 522. Пластина 534 установлена на опорах 532. Множество стоек 536 отступают вниз от пластины 534 и удерживают полку 538.
Как показано на фиг.13, 14, 15 и 16, механизм 514 подачи семян содержит бункер 550 с фигурной поверхностью, приспособленной для подачи семян, отложенных в бункер, к отделяющему колесу 552 (см. также фиг.23А-23С). Отделяющее колесо 552 установлено с возможностью вращения в вертикальной плоскости, смежной с бункером 550, и имеет множество разнесенных выемок 554, каждая из которых имеет отверстие 556, сообщающееся с вакуумной системой (не показана). Колесо 552 продвигается шаговым электродвигателем 560. Индивидуальные семена подхватываются выемками 554 в колесе 552 и удерживаются в выемках всасыванием вакуумной системой через отверстия 556. Скребок 562 извлекает индивидуальные семена из выемок 554, обеспечивая их падение по направляющей 564 в отверстие в распределителе 566.
Как показано на фиг.24-26, распределитель 566 содержит вал 568, имеющий множество (шесть в предпочтительном варианте осуществления изобретения) проходов 570, проходящих сквозь него в поперечном направлении. Поверх каждого конца вала 568 с возможностью скольжения установлены рукава 572 и 574, которые могут перемещаться между первым (внутренним) и вторым (внешним) положениями. Рукава 572 и 574 имеют множество пар выровненных отверстий 576 и 578 на их противоположных сторонах. Отверстия 576 имеют продолговатую форму, и отверстия 576 и 578 имеют такие размеры и расположены таким образом, что когда рукава 572 и 574 находятся в их первом (внутреннем) положении (слева на фиг.24), части продолговатых отверстий 576 совмещены с проходами 570 вала 568, и когда рукава находятся в их вторых (внешних) положениях, части продолговатых отверстий 576 и вторых отверстий 578 совмещены с проходами (справа на фиг.24). Привод 580 избирательно обеспечивает скольжение рукавов 572 и 574 между их первым и вторым положениями.
Распределитель 566 установлен при помощи кронштейна 582 на каретке 584 линейного привода 586 с возможностью перемещения относительно направляющей 564 и последовательного совмещения каждого из проходов 570 вала 568 с направляющей 564 таким образом, что семя может быть отложено в него. Датчик обнаружения семян (не показан) может быть установлен смежно с направляющей 564 для подтверждения того, что семя отложено в каждый проход 570. На платформе 528 установлено множество воздушных сопел 590, и они выровнены относительно проходов 570, когда распределитель 566 перемещен в его положение распределения приводом 586. С каждым проходом 570 совмещена трубка 592, и каждая трубка соединена с одной из множества станций 600 отбора проб семян в механизме 516 строгания семян. Рукава 572 и 574 перемещаются, обеспечивая падение семян, находящихся в проходах 570, в трубки 592. Одно из сопел 590 совмещено с каждым из проходов 570 и приводится в действие для содействия перемещению семян из проходов 570 по трубкам 592 в их соответствующие станции 600 отбора проб семян.
Предпочтительно, существует окно 596 в бункере 550, которое совмещается с отверстием 556 в каждой выемке 554 при повороте колеса 552. Окно 596 может сообщаться с вакуумом для всасывания любых загрязнений или частиц шелухи семян или семени, которые могли бы забивать отверстия 556 в выемках 554 и ухудшать способность колеса 552 отбирать индивидуальные семена из бункера 550.
Механизм 516 строгания семян содержит, по меньшей мере, один и, в этом предпочтительном варианте осуществления изобретения, шесть станций 600 отбора проб. Каждая станция 600 отбора проб семян отбирает пробу материала от семени, доставленного в нее. В этом предпочтительном варианте осуществления изобретения станции 600 отбора проб расположены или разбиты на две группы по три, но количество и расположение станций отбора проб могут изменяться. Станция 504 обработки проб принимает пробы ткани, отобранные из семени и отправленные из каждой станции 600 отбора проб. Подобным образом, станция 506 обработки семян принимает семя после того, как проба была отобрана из семени, и семя отправлено из станции 600 отбора проб.
Каждая станция 600 отбора проб семян имеет входную втулку 602, соединенную с трубкой 590, которая открыта в камеру 604. Нижняя поверхность камеры 604 сформирована концом стержня 606 привода 608. Нижняя поверхность расположена ниже входной втулки 602 для обеспечения того, что все семя упадет в камеру 604 и не застрянет в положении лишь частично в камере. Напротив входной втулки 602 может быть расположено вентиляционное отверстие 610 для обеспечения выпуска воздуха, поступающего из воздушных форсунок 590. Вентиляционное отверстие 610 может быть закрыто ячеистой сеткой 612 для предотвращения выпадения семени из камеры 604 и смягчения удара семени, когда оно доставляется в камеру.
Этот стержень 606 поднимает семя из камеры 604 и в выемку 614 для приема семян в нижней стороне пластины 616 для отбора проб семян. Пластина 616 для отбора проб имеет отверстие 618 для отбора проб, в которое выступает семя, находящееся в выемке 614 для приема семян. В верхней поверхности пластины 616 для отбора проб сформирована канавка 620 для отбора проб таким образом, что часть семени, находящегося выемке 614, выступает в канавку. Пластина 616 для отбора проб также имеет поперечно ориентированные отверстия 622 и 624, выровненные с выемкой 614 для приема семян. Когда стержень 606 поднимает семя, доставленное в станцию 600 отбора проб в выемку 614 в пластине 616, пальцы 626 и 628 проходят поперек сквозь отверстия 622 и 624 и приводятся в действие приводом 630 для вхождения в контакт и сжатия семени. Было обнаружено, что сжатие, по меньшей мере, некоторых типов семян в процессе отбора проб может улучшать жизнеспособность семян после отбора проб. Для семян, таких как семена сои, было обнаружено, что сжимающее давление увеличивает жизнеспособность семян, и что сжимающее давление между приблизительно 2,5 и приблизительно 5 фунтами является достаточным для увеличения жизнеспособности.
Зонд 650 для отбора проб, имеющий множество режущих кромок 652, совершает возвратно-поступательное движение в канавке 620 таким образом, что режущие кромки 652 могут соскребать пробу с семени, удерживаемого в выемке 614 стержнем 606 и пальцами 626 и 628. Режущие кромки 652, предпочтительно, параллельные и ориентированы под косым углом меньше 90° относительно направления движения зонда. Желательно, но не принципиально, чтобы режущие кромки 652 были наклонены достаточно для того, чтобы одна кромка всегда находилась в контакте с семенем. Наклон режущих кромок позволяет следующему лезвию установить контакт с семенем до того, как текущее лезвие потеряет контакт с семенем. В предпочтительном варианте осуществления изобретения режущие кромки ориентированы под углом приблизительно 60°, хотя этот угол будет зависеть в некоторой степени от ширины зонда. Ширина зонда может также быть важной для сохранения жизнеспособности семян после осуществления отбора проб и может изменяться в зависимости от типа семени и его влажности.
Режущие кромки 652 имеют ступенчатую конфигурацию, при этом каждый срез прогрессивно глубже предыдущего. Количество материала пробы и глубина среза могут регулироваться посредством регулирования продвижения зонда 650. Для меньших проб и меньших глубин среза ход зонда 650 короче, и для больших проб или более глубоких срезов ход зонда длиннее. При частичных ходах ткань от семени может быть захвачена между кромками 652. Зонд 650 может выдвигаться и задвигаться для содействия освобождения всей пробы. Например, после того, как семя высвобождено, зонд может быть выдвинут и задвинут для содействия извлечению ткани семени, захваченной между режущими кромками. Полный диапазон движения зонда 650 показан на фиг.19А и 19В.
Зонд 650 для отбора проб, предпочтительно, приводится в действие линейным приводом 654. В предпочтительном варианте осуществления изобретения три зонда 650 приводятся в действие одним приводом 654. Использование одного привода для приведения в действие нескольких зондов позволяет экономить пространство и более экономично.
Система 656 транспортировки проб, содержащая канал 658, имеющий вход 660, сообщающийся с проходом 662, который открыт в отверстие 618 для отбора проб и канавку 620 в пластине 616 для отбора проб, удаляет пробы ткани, отобранные действием режущих кромок 652 зонда для отбора проб. Канал 658 транспортирует пробу к выходу 664, где она откладывается в уникальный держатель пробы в станции 504 обработки пробы. Этим держателем пробы может быть, например, гнездо 666 в лотке 668, установленном на двухкоординатном столе 670 на тележке 510 таким образом, что может быть определена зависимость между пробами и их соответствующими семенами. Система 656 транспортировки проб включает воздушно-струйное устройство 672, которое создает поток воздуха в канале 658 для перемещения пробы по каналу.
На линейном приводе 654 может быть установлен второй механизм отбора проб, и он может двигаться вместе с зондом 650. Второй механизм отбора проб может содержать устройство 674 отбора керновой пробы, имеющее колонковый бур 676 для отбора штырьковой пробы семени из надреза, сделанного зондом 650. Эту ткань в этой пробе отбирают из более глубокого места чем ткань, соскобленную зондом 650, и это обеспечивает получение другой информации. В некоторых вариантах осуществления изобретения материал, снятый зондом 650, может быть просто удален, и может быть оставлена только проба, отобранная устройством 674 отбора керновой пробы 674. В некоторых вариантах осуществления изобретения обе пробы могут быть оставлены и могут отдельно храниться для раздельного тестирования. В других вариантах осуществления изобретения единственной пробой является проба, отобранная зондом 650. В вариантах осуществления изобретения без второго механизма отбора проб устройство 674 отбора керновой пробы и колонковый бур 676, могут быть заменены приводом с простым толкателем, который проходит сквозь отверстие 618 для отбора проб, для содействия подталкиванию семени в выемку 614.
Система 680 транспортировки семян имеет вход 682, смежный с выемкой 614, для втягивания семян после того, как они высвобождены пальцами 626 и 628 и стержень 606 опускает семя после операции отбора пробы. Система 680 транспортировки семян 680 транспортирует семена к отдельному держателю семян в станции 506 обработки семян на тележке 512. Этот держатель семян может представлять собой, например, гнездо 684 в лотке 686, установленном на двухкоординатном столе 688 на тележке 612 таким образом, что может быть определена зависимость между пробами и их соответствующими семенами. Механизм 680 транспортировки семян включает воздушно-струйное устройство 690, которое создает поток воздуха в канале 680 для перемещения пробы по каналу.
Работа
При работе множество семян, например, семян сои засыпают в бункер 550 системы 500 отбора проб. Эти семена проходят под действием силы тяжести к диску 552, и всасывание через отверстия 556 удерживает по одному семени в каждой выемке 554. При вращении диска 552 шаговым электродвигателем 560, отдельные семена удаляются с диска скребком 562 и падают под действием силы тяжести по направляющей 564 к выходу. Линейный привод 586 перемещает распределитель 566 таким образом, что каждый проход 570 распределителя выравнивается относительно направляющей 564 для загрузки одного семени сквозь отверстие 576 и в проход 570. Когда все проходы 570 в распределительном элементе 566 заполнены, линейный привод 586 перемещает распределитель в положение для загрузки его семян в станцию 600 отбора проб в механизме 516 строгания семян. Рукава 572 и 574 перемещаются приводом 580, который выравнивает отверстия 578 с проходами 570, позволяя семенам в проходах 570 падать в трубки 592, которые ведут к станциям 600 отбора проб. Сопла 590 продувают воздух, который содействует увлечению семян из проходов 570 через трубки 592 к камерам 604 в станциях 600 отбора проб.
Предпочтительно, все проходы 570 загружаются последовательно и выпускают их семена одновременно в станции 600 отбора проб, но распределитель может быть запрограммирован для работы некоторым другим образом. Как только семена поступают в станцию 600 отбора проб, стержни 606 поднимают семена в выемки 614 в нижней стороне пластин 616. Выемки 614 могут иметь размеры и конфигурации, способствующие оптимальной ориентации семени. В выемках 614 части семян выступают сквозь отверстия 618 для отбора проб и в канавки 620. Зонды 650 перемещаются в канавках 620, позволяющих их режущим кромкам 652 удалять материал с частей семян, выступающих в канавки 620, и формировать небольшие срезы на семенах. Когда каждый зонд 650 удалил материал, система 656 транспортировки образцов втягивает материал пробы сквозь проход 662 и во вход 660. Пробы движутся в каналах 658 из станций 600 отбора проб к месту хранения проб, такому как гнезда 666 в лотке 668 для проб. Вторая проба может быть отобрана колонковым буром 676 из устройства 674 отбора проб через отверстие 618 в пластине 616 для отбора проб. После того как отбор проб закончен, стержень 606 задвигается, и когда семя падает, система 680 транспортирования семян после отбора проб транспортирует семя после отбора пробы в место хранения семян, такое как гнездо 684 в лотке 686 для семян.
Двухкоординатные столы 670 и 688 перемещаются для выравнивания различных гнезд с выходами системы 656 транспортировки проб и системы 680 транспортировки семян, и процесс отбора проб повторяется. Когда все гнезда 666 в лотке 668 для проб заполнены, пробы в лотке для проб могут подвергаться тестированию, и семена в соответствующем лотке 686 для семян могут подвергаться селекции на основе результатов тестирования проб. Отбор проб, предпочтительно, по существу не оказывает неблагоприятного воздействия на жизнеспособность семян.
Варианты применения
Настоящее изобретение обеспечивает получение способов анализа семян, имеющих желательный признак, маркерный ген или генотип. Согласно одному варианту изобретения, аналитические способы позволяют анализировать индивидуальные семена, которые присутствует в популяции в партии или в основной массе семян, таким образом, что могут быть определены химические и/или генетические характеристики индивидуальных семян.
Пробы, подготовленные согласно настоящему изобретению, могут использоваться для определения множества разных физических, химических и/или генетических признаков. Примеры химических исследований для использования согласно способам, соответствующим настоящему изобретению, включают определение содержания крахмала, содержания белка, содержания масла, определение профилей жирной кислоты и т.д.
1
Согласно одному варианту осуществления изобретения, способы и устройства, соответствующие настоящему изобретению, могут использоваться в программе разведения для селекции растений или семян, имеющих желательный признак или маркерный генотип. Способы, соответствующие настоящему изобретению, могут использоваться в комбинации с любой методологией селекции и могут использоваться для селекции единственной генерации или селекции множества генераций. Выбор способа селекции зависит от способа воспроизведения растения, наследуемости улучшаемого признака (признаков), и типа культивара (культурного сорта растения), используемого коммерчески (например, F гибридный культивар, чистолинейный культивар и т.д.). Выбранные не вносящие ограничений подходы для разведения растений, соответствующие настоящему изобретению, изложены ниже. Также понятно, что в программе разведения могут использоваться любые коммерческие и некоммерческие культивары. Обычно диктовать выбор будут такие факторы, как, например, мощность прорастания, мощность вегетации, устойчивость к стрессам, болезнеустойчивость, ветвление, цветение, завязь семени, размер семени, плотность семени, способность к насаждению, способность к молотьбе и т.д.
В конкретном варианте осуществления изобретения, способы, соответствующие настоящему изобретению, используются для определения генетических характеристик семян по программе разведения с использованием маркера. Такие способы предусматривают усовершенствованные программы разведения с использованием маркера, причем может производиться неразрушающий прямой отбор проб семян при поддержании тождества особей от пробоотборника для семян до поля. В результате программа разведения с использованием маркера приводит к работе на платформе "высокой производительности", когда популяция семян, имеющих желательный признак, маркер или генотип, может увеличиваться более эффективно за более короткий период времени, с меньшим количеством требуемых полевых и трудовых ресурсов. Такие преимущества будут более полно описаны ниже.
В одном варианте осуществления изобретения настоящее изобретение обеспечивает получение способа анализа индивидуальных семян в пределах популяции семян, имеющих генетические отличия. Способ содержит отбор пробы, содержащей клетки с ДНК, от семян в популяции без повреждения жизнеспособности и способности прорастания семян; тестирование ДНК, извлеченной из пробы, на предмет наличия или отсутствия, по меньшей мере, одного генетического маркера; отбор семян из популяции на основе результатов тестирования ДНК; и культивирование растений из отобранных семян.
Как описано выше, системы отбора проб и способы, соответствующие настоящему изобретению, предохраняют жизнеспособность прорастающих семян, поскольку они не являются разрушающими. Жизнеспособность прорастающих семян означает, что преобладающее количество семян после отбора проб (то есть больше 50% всех семян после отбора проб) остается жизнеспособным после осуществления отбора проб. В конкретном варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, приблизительно 75% семян после отбора проб и в некоторых вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере, приблизительно 85% семян после отбора проб остаются жизнеспособными. Следует отметить, что более низкие коэффициенты жизнеспособности прорастания могут быть допустимы при некоторых обстоятельствах или для некоторых вариантов применения, например, когда затраты на создание генотипа уменьшаются со временем, потому что большее количество семян может подвергаться отбору проб при той же стоимости получения генотипа.
В другом варианте осуществления изобретения, жизнеспособность проращиваемых семян поддерживается в течение, по меньшей мере, приблизительно шести месяцев после осуществления отбора проб для обеспечения того, что семена после отбора проб будут жизнеспособны до достижения участка для посадки. В конкретном варианте осуществления изобретения способы, соответствующие настоящему изобретению, также содержат обработку семян после отбора проб для поддержания жизнеспособности проращиваемых семян. Такая обработка может обычно включать любой способ, известный в данной области для предохранения семян от воздействия окружающей среды при хранении или транспортировке. Например, в одном варианте осуществления изобретения семена после отбора проб могут быть обработаны полимером и/или фунгицидом для предохранения семени после отбора пробы при хранении или при транспортировке на участок перед посадкой.
ДНК может быть извлечена из пробы с использованием любых способов извлечения ДНК, известных специалистам в данной области, которые обеспечивают достаточную выработку ДНК, качество ДНК и полимеразную цепную реакцию. Не ограничивающим примером способов извлечения ДНК является извлечение на основе додецилсульфата натрия с центрифугированием. Кроме того, извлеченная ДНК может быть амплифицирована после извлечения с использованием любого способа амплификации, известного специалистам в данной области. Например, одним пригодным способом амплификации является способ GenomiPhi амплификации ДНК от Amersham Biosciences.
Извлеченную ДНК тестируют на предмет присутствия или отсутствия пригодного генетического маркера. Широкое разнообразие генетических маркеров доступно и известно специалистам в данной области. Тестирование ДНК на предмет присутствия или отсутствия генетического маркера может использоваться для отбора семян в разводимой популяции. Тестирование может использоваться для отбора по локусу количественного признака (QTL), аллелям или геномным областям (гаплотипам). Отбираемые аллели, локусы количественного признака (QTL) или гаплотипы могут быть идентифицированы с использованием новейших технологий молекулярной биологии с модификациями классических стратегий селекции.
В одном варианте осуществления изобретения семя отбирают на основе наличия или отсутствия генетического маркера, который генетически связан с QTL. Примеры локусов количественного признака, которые часто представляют интерес, включают, но не ограничиваются ими, касающиеся урожайности, устойчивости к полеганию, высоты, зрелости, болезнеустойчивости, устойчивости к вредителям, устойчивости к недостатку питания и составу зерна. В альтернативном варианте семя может быть отобрано на основе наличия или отсутствия маркера, который генетически связан с гаплотипом, связанным с локусом количественного признака. Примеры такого локуса количественного признака могут вновь включать без ограничения касающийся урожайности, устойчивости к полеганию, высоты, зрелости, болезнеустойчивости, устойчивости к вредителям, устойчивости к недостатку питания и составу зерна.
2
1
2
Отбор разводимой популяции может начинаться уже на таком раннем уровне селекции, как F, если гомозиготные инбредные родители используются в начальном (межсортовом) скрещивании (кроссбридинге). Также может быть отобрана и продвинута генерация F, если один или больше родителей при скрещивании являются гетерозиготными в отношении представляющих интерес аллелей или маркеров. Селекционер может тестировать популяцию F для установления маркерного генотипа каждой особи в популяции. Начальные размеры популяции, ограниченные только количеством располагаемых семян для тестирования, могут быть отрегулированы, для соответствия желательной вероятности успешной идентификации желательного количества особей. См. Sedcole, J.R. "Количество растений, необходимых для установления признака" Crop Sci. 17: 667-68 (1977). Соответственно, вероятность обнаружения желательного генотипа, начального размера популяции и размера целевой конечной популяции могут быть модифицированы для различных методологий разведения и уровня межродственного скрещивания (генбридинга) отобранной популяции.
2
Семена после отбора проб могут быть собраны или могут храниться отдельно в зависимости от методологии разведения и цели. Например, когда селекционер тестирует популяцию F на предмет болезнеустойчивости, все особи с желательным генотипом могут быть собраны и посажены в селекционном питомнике. Наоборот, если множество локусов количественного признака с различными эффектами для признака, такого как урожайность зерна, отбираются из данной популяции, селекционер может сохранять идентичность особей, работая в поле для дифференцирования особей с различными комбинациями целевых локусов количественного признака.
Может использоваться несколько способов сохранения идентичности единичного семени при передаче семени из лаборатории отбора проб в поле. Способы включают, но не ограничены ими, передачу отобранных особей на семенную ленту, в кассетный лоток или лоток с шаговым перемещением, пересадку при помощи торфяных горшков и ручную посадку из индивидуальных семенных пакетов.
Может использоваться множество циклов селекции в зависимости от целей разведения и генетической сложности.
Преимущества использования способов тестирования, соответствующих настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются ими, уменьшение трудовых и полевых ресурсов, требуемых на каждую популяцию или генеалогическую линию, увеличение емкости для оценки большего количества разводимых популяций на единицу площади поля и увеличение тестируемого объема разводимых популяций относительно желательных признаков до посадки. Полевые ресурсы на каждую популяцию уменьшены посредством ограничения полевого пространства, требуемого для продвижения желательных генотипов. Например, популяция из 1000 особей может быть посажена по 25 семян в ряду с затратой в сумме 40 рядов на поле. С использованием обычного отбора проб ткани все 1000 растений были бы помечены и вручную подвержены отбору проб посредством соскабливания ткани листа. Результаты молекулярного маркирования были бы необходимы до опыления, и только те растения, которые содержат желательный генетический состав, могли бы опыляться. Таким образом, если было определено, что 50 семян содержат желательный генетический состав, обычная методология разведения требует посадки 1000 растений для получения 50 семян. В противоположность этому способы тестирования, соответствующие настоящему изобретению, позволяют селекционеру тестировать 1000 семян в лаборатории и отбирать 50 желательных семян до посадки. Эти 50 особей можно в таком случае сажать в поле, используя только два ряда по 25 семян. Кроме того, способы тестирования, соответствующие настоящему изобретению, не требуют маркировки или отбора проб в поле, таким образом значительно уменьшая требуемые ресурсы ручного труда.
2
В дополнение к уменьшению количества полевых рядов на каждую популяцию, способы тестирования, соответствующие настоящему изобретению, могут дополнительно увеличить количество популяций, которые селекционер может оценивать в данном селекционном питомнике. С использованием описанного выше примера, в котором 50 семян из каждой популяции из 1000 семян, содержащих желательный генетический состав, селекционер, применяющий способы, соответствующие настоящему изобретению, может оценить 20 популяций по 50 семян в каждой с использованием той же площади поля, используемой для единственной популяции, с использованием обычных технологий полевого отбора проб ткани. Даже если популяции отобраны для единственной аллели с использованием ожидаемого отношения расщепления 1:2:1 для популяции F, селекционер может оценить 4 популяции на той же площади поля, как и для одной популяции при отборе проб в поле.
Дополнительное потенциальное преимущество соскабливания проб семени состоит в том, что оно могло бы использоваться для уменьшения рисков, связанных с выращиванием растений в некоторых географических широтах, где растения могут расти плохо, или могут испытывать воздействие неблагоприятных условий окружающей среды, или могут даже быть повреждены ураганами. Например, семена с "лучшим" генотипом или композицией маркера могли бы выращиваться в географических условиях 1, и семена со "следующим лучшим" генотипом могли бы выращиваться в географических условиях 2. В этом случае географические условия 2 дублируют любую проблему, случающуюся с растениями, выращиваемыми в географических условиях 1. Это очень трудно сделать с использованием традиционного способа отбора проб ткани проращиваемых растений для определения генотипа, поскольку эти растения требовалась бы корчевать и пересаживать во вторые географические условия. Использование способа, соответствующего настоящему изобретению, устраняет проблемы трансплантации.
Способы тестирования, соответствующие изобретению, могут также использоваться в программе разведения для интрогрессии признака в растение. Такие способы содержат извлечение пробы, содержащей клетки с ДНК семян в популяции, тестирование ДНК, извлеченной из каждого семени на предмет наличия или отсутствия, по меньшей мере, одного генетического маркера, отбор семян из популяции на основе результатов тестирования ДНК; культивирование плодородного растения из семян; и использование плодородного растения или как женского родителя, или как мужского родителя при скрещивании с другим растением.
Примеры генетического тестирования для отбора семян для интегрирования признака включают, без внесения ограничений, идентификацию высоких частот повторения родительских аллелей, отслеживание представляющих интерес трансгенов или тестирование на предмет отсутствия нежелательных трансгенов, отбор гибридного тестируемого семени и тестирование зиготности.
Идентификация высоких частот повторения парных аллелей при помощи способов тестирования, соответствующих настоящему изобретению, вновь предусматривает уменьшение количества рядов на популяцию и увеличение количества популяций или инбредных линий, выращиваемых на данной единице площади поля. Таким образом, способы тестирования, соответствующие настоящему изобретению, могут также эффективно уменьшать ресурсы, требуемые для завершения конверсии инбредных линий.
Способы, соответствующие настоящему изобретению, также обеспечивают гарантию качества и контроль качества посредством обеспечения того, что регулируемые или нежелательные трансгены будут идентифицированы и забракованы до посадки. Этот вариант применения способности обеспечения качества может эффективно устранять непреднамеренные нарушения высвобождения.
1
1
Способы, соответствующие настоящему изобретению, могут также применяться для идентификации гибридного семени для тестирования трансгена. Например, в конверсии инбредной линии на стадии BCnF, селекционер может эффективно создавать партию гибридных семян (за исключением гаметической селекции), которая была бы на 50% гемизиготной в отношении представляющего интерес признака и на 50% гомозиготной за отсутствием признака, для получения гибридных семян для тестирования. Селекционер может в таком случае тестировать все семена F, полученные при аналитическом скрещивании, и идентифицировать и отбирать те семена, которые являются гемизиготными. Такой способ выгоден тем, что выводы из испытаний гибрида представили бы коммерческую гибридную генетику в отношении зиготности признака.
Другие варианты применения способов тестирования, соответствующих настоящему изобретению, для идентификации и отслеживания представляющего интерес признака имеют такие же преимущества, как и указанные выше относительно требуемых полевых и трудовых ресурсов. Обычно программы трансгенной конверсии осуществляют в многосезонных районах, которые предусматривают структуру значительно больших расходов на землю и управление. Как таковые, влияния либо уменьшения потребностей в рядах на популяцию, либо увеличения количества популяций в пределах данной единицы площади поля являются значительно более серьезными на основе стоимости относительно умеренных вариантов применения.
Кроме того, способы тестирования, соответствующие настоящему изобретению, могут использоваться для улучшения эффективности программы получения сдвоенного гаплоида посредством селекции желательных генотипов на гаплоидной стадии и идентификации уровня плоидности для исключения обработки и продвижения на поле негаплоидных семян. Оба варианта применения вновь приводят к уменьшению полевых ресурсов на каждую популяцию и к способности оценивать большее количество популяций в пределах данной единицы площади поля.
В другом варианте его осуществления изобретение также обеспечивает осуществление анализа для прогнозирования эмбриозиготности для конкретного представляющего интерес гена. Анализ дает прогноз эмбриозиготности на основе отношения относительных чисел копий представляющих интерес генов и генов внутреннего контроля на каждую клетку или на каждый геном. Обычно этот анализ предусматривает использование гена внутреннего контроля, который имеет известную зиготность, например, гомозиготного в локусе (две копии внутреннего контроля на каждую диплоидную клетку), для нормализации анализа представляющего интерес гена. Отношение относительных чисел копий гена внутреннего контроля и представляющего интерес гена прогнозирует число копий представляющего интерес гена в клетке. В гомозиготной клетке, для любого данного гена (или уникальной генетической последовательности) число копий гена равно уровню плоидности клетки, поскольку последовательность присутствует в одном локусе во всех гомологичных хромосомах. Когда клетка является гетерозиготной для конкретного гена, число копий гена будет ниже, чем уровень плоидности клетки. Зиготность клетки в любом локусе, таким образом, может быть определена числом копий гена в клетке.
В конкретном варианте его осуществления, изобретение обеспечивает осуществление анализа для прогнозирования зиготности зародыша зерна. В семени кукурузы ткань эндосперма триплоидная, тогда как ткань зародыша диплоидная. Эндосперм, который является гомозиготным для внутреннего контроля, будет содержать три копии внутреннего контроля. Число копий эндосперма представляющего интерес гена может колебаться от 0 (гомозиготная отрицательная величина) до 3 (гомозиготная положительная величина); и число копий эндосперма представляющего интерес гена, составляющее 1 или 2, обнаружено в гетерозиготном семени для представляющего интерес гена (или гемизиготного для представляющего интерес гена, если представляющий интерес ген представляет собой трансген). Число копий эндосперма отражает зиготность зародыша: гомозиготный (положительная или отрицательная величина) эндосперм сопровождает гомозиготный зародыш, гетерозиготный эндосперм (число копий представляющего интерес гена, составляющее 1 или 2) отражает гетерозиготный (число копий представляющего интерес гена составляет 1) зародыш. Число копий представляющего интерес гена эндосперма (которое может колебаться от 0 до 3 копий) может быть определено по отношению числа копий гена внутреннего контроля эндосперма и числа копий представляющего интерес гена эндосперма (которое может колебаться от 0/3 до 3/3, то есть от 0 до 1), которое в таком случае можно использовать для прогнозирования зиготности зародыша.
Числа копий представляющего интерес гена или гена внутреннего контроля могут быть определены при помощи любого пригодного способа количественного анализа для определения чисел копий, известного в данной области. Примеры пригодных анализов включают, но не ограничиваются ими, анализы ПЦР в реальном времени (TaqMan) (Applied Biosystems, Foster City, CA) и Invader (Third Wave Technologies, Madison, WI). Предпочтительно, такие анализы осуществляют таким образом, что эффективность амплификации последовательностей и гена внутреннего контроля, и представляющего интерес гена одинаковы или очень подобны. Например, согласно анализу ПЦР в реальном времени TagMan, сигнал от единственной копии представляющего интерес гена (клетка-источник определена как гетерозиготная для представляющего интерес гена), будет обнаружен на один цикл амплификации позже, чем сигнал от двух копий гена внутреннего контроля, поскольку количество представляющих интерес генов составляет половину от количества генов внутреннего контроля. Для той же гетерозиготной пробы, анализ Invader дал бы отношение представляющих интерес генов/генов внутреннего контроля, составляющее приблизительно 1:2 или 0,5. Для пробы, которая является гомозиготной и для представляющего интерес гена, и для гена внутреннего контроля, сигнал представляющего интерес гена был бы обнаружен одновременно с сигналом гена внутреннего контроля (TaqMan), и анализ Invader даст отношение представляющих интерес генов/генов внутреннего контроля, составляющее приблизительно 2:2 или 1.
Эти руководящие принципы применяются к любой полиплоидной клетке или к гаплоидным клеткам (таким как клетки пыльцы), так как число копий представляющего интерес гена или гена внутреннего контроля остается пропорциональным числу копий генома (или уровню плоидности) клетки. Таким образом, эти анализы зиготности могут осуществляться с триплоидными тканями, такими как эндосперм семени кукурузы.
Примеры
Нижеследующие примеры являются только иллюстративными и не вносят каких-либо ограничений в это описание.
Пример 1
Этот пример описывает анализ для прогнозирования зиготности зародышей кукурузы с использованием гена внутреннего контроля, гомозиготного в локусе (то есть две копии гена внутреннего контроля в диплоидном зародыше и три копии внутреннего контроля в триплоидном эндосперме). В инбредной линии диплоидного (или с более высокой плоидностью) организма, такого как кукуруза, эндогенный внутренний контроль является, в типичном случае, гомозиготным; трансгенные события в таких организмах в первой генерации (названа "R0" для кукурузы) в типичном случае гемизиготные (то есть трансген обычно присутствует только в одной из двух или более гомологичных хромосом). Кукуруза (Zea mays) - это диплоидный организм и, таким образом, событие "единственная копия" R0 имеет одну копию представляющего интерес гена на клетку, но 0,5 копии на гаплоидный геном, событие "две копии" R0 имеет две копии представляющего интерес гена на клетку, но 1 копию на гаплоидный геном и т.д.
В этом примере тубулин использовался как ген внутреннего контроля, и представляющий интерес ген представлял собой кодирующую трансген неомицинфосфотрансферазу II (NPT II), которую использовали для селекции на устойчивость к канамицину.
От семени была отобрана ткань эндосперма (триплоид) (или посредством ручного отбора проб, или посредством скобления семени с использованием автоматизированного пробоотборника, соответствующего настоящему изобретению). Семя после отбора пробы эндосперма прорастили, и от успешно проросших растений также отобрали пробу ткани листа (диплоид) для генетического анализа. Ткань листа прямо соотносится с зиготностью зародыша и, таким образом, использовалась для демонстрации того, что зиготность эндосперма в целом является прогнозированной зиготностью зародыша и подтверждения сигналов гомозиготности эндосперма. Суммарная геномная ДНК была извлечена из ткани эндосперма и из ткани листа, и был проведен количественный анализ с использованием анализа Invader с олигонуклеотидными зондами, специфическими для представляющего интерес гена, NPT II или для гена внутреннего контроля, тубулина. Отношение представляющих интерес генов и генов внутреннего контроля было измерено с использованием обычных способов молекулярной биологии. См. Таблицу 1.
Таблица 1
Отношение в автоматизированном режиме
Зиготность в автоматизированном режиме
Отношение в ручном режиме
Зиготность в ручном режиме
1,39
Гетерозиготный
1,42
Гетерозиготный
0,14
Отр. гомозиготный
0,12
Отр. гомозиготный
0,08
Отр. гомозиготный
0,08
Отр. гомозиготный
0,13
Отр. гомозиготный
0,10
Отр. гомозиготный
0,10
Отр. гомозиготный
0,08
Отр. гомозиготный
1,55
Гетерозиготный
1,38
Гетерозиготный
0,84
Гетерозиготный
1,45
Гетерозиготный
0,14
Отр. гомозиготный
1,48
Гетерозиготный
1,48
Гетерозиготный
1,37
Гетерозиготный
1,39
Гетерозиготный
1,47
Гетерозиготный
2,03
Пол. гомозиготный
1,93
Пол. гомозиготный
0,13
Отр. гомозиготный
0,05
Отр. гомозиготный
0,71
Неубедительный
1,81
Пол. гомозиготный
0,81
Гетерозиготный
1,41
Гетерозиготный
1,84
Пол. гомозиготный
1,77
Пол. гомозиготный
1,54
Гетерозиготный
1,43
Гетерозиготный
1,48
Гетерозиготный
1,50
Гетерозиготный
0,92
Гетерозиготный
1,40
Гетерозиготный
1,51
Гетерозиготный
1,42
Гетерозиготный
1,60
Гетерозиготный
1,37
Гетерозиготный
0,86
Гетерозиготный
1,47
Гетерозиготный
1,81
Пол. гомозиготный
2,02
Пол. гомозиготный
0,15
Отр. гомозиготный
Низкая ДНК
1,89
Пол. гомозиготный
1,85
Пол. гомозиготный
0,21
Отр. гомозиготный
0,10
Отр. гомозиготный
0,09
Отр. гомозиготный
0,11
Отр. гомозиготный
0,89
Гетерозиготный
1,50
Гетерозиготный
1,50
Гетерозиготный
1,37
Гетерозиготный
1,82
Неубедительный
2,02
Пол. гомозиготный
2,14
Пол. гомозиготный
0,99
Неубедительный
1,22
Гетерозиготный
1,44
Гетерозиготный
2,22
Пол. гомозиготный
2,24
Пол. гомозиготный
0,79
Гетерозиготный
1,40
Гетерозиготный
1,23
Гетерозиготный
1,47
Гетерозиготный
1,49
Гетерозиготный
1,38
Гетерозиготный
1,33
Гетерозиготный
1,37
Гетерозиготный
Сводные результаты множества экспериментов показаны в Таблице 2.
Таблица 2
Количество гомозиготных
Прогнозированное
Подтвержденное
Количество
Способ отбора проб эндосперма
семян, идентифицированных посредством анализа эндосперма
количество гомозиготных семян, которые не проросли
количество гомозиготных сигналов на основе анализа листа
ложноотрицательных гомозиготных сигналов на основе анализа эндосперма
Ручной режим
8 из 36
0
8 (всего)
5 (13,9%)
Автоматизированный
6 из 24
1
5
0
режим
Ручной режим
6 из 36
0
6 (всего)
2 (5,6%)
Автоматизированный
6 из 24
1
5
0
режим
Ручной режим
5 из 36
0
5 (всего)
7 (19,4%)
Автоматизированный
7 из 24
2
5
0
режим
Ручной режим
7 из 36
1
6
0
Автоматизированный
5 из 24
2
3
0
режим
Результаты показали, что зиготность эндосперма в целом представляет собой прогнозированную зиготность зародыша (обозначенную зиготностью листа), и был достоверен прогноз гомозиготности для всех семян, которые проросли. Кроме того, анализ зиготности эндосперма дал немного ложноотрицательных прогнозов гомозиготности (особенно, когда ткань эндосперма была получена с использованием автоматизированного пробоотборника). Эти результаты демонстрируют то, что для клетки с известным уровнем плоидности отношение числа копий представляющего интерес гена и числа копий гена внутреннего контроля указывает на зиготность этой клетки. Кроме того, анализ на зиготность, соответствующий настоящему изобретению, может давать прогноз зиготности одной ткани на основе зиготности другой, то есть анализ может давать прогноз зиготности зародыша на основе зиготности эндосперма.
Пример 2
Этот пример демонстрирует использование способов тестирования согласно настоящему изобретению по программе селекции сои с низким содержанием линолевой кислоты с использованием маркера.
Соя - это самая ценная бобовая культура, находящая много пищевых и промышленных вариантов использования вследствие ее уникального химического состава. Семена сои являются важным источником растительного масла, которое используют в пищевых продуктах во всем мире. Относительно высокий уровень (обычно приблизительно 8%) содержания линолевой кислоты (18:3) в соевом масле ухудшает его стабильность и вкус. Для понижения уровня содержания линолевой кислоты (18:3) и улучшения стабильности и вкуса соевого масла используют гидрирование соевого масла. Однако гидрирование приводит к производству трансжирных кислот, что увеличивает риск коронарной болезни при употреблении. Разработка сои с низким содержанием линолевой кислоты была осложнена количественной природой признака. Разновидности сои с низким содержанием линолевой кислоты, которые были выведены, как было обнаружено, дают низкую урожайность, что ограничивает их пригодность в большинстве промышленных вариантов использования. Разведение продукта с коммерчески существенной урожайностью семян является высоким приоритетом в большинстве программ разработки культивара сои.
Примером применения способов тестирования, соответствующих настоящему изобретению, является селекция соевых растений как с высокой урожайностью, так и уменьшенным содержанием линолевой кислоты. Характеристики потомства сои, касающиеся низкого содержания линолевой кислоты, основаны главным образом на двух основных количественных локусах признака Fad3-1b и Fad3-1c. Анализ сегрегирующих растений показал, что Fad3-1b и Fad3-1c аддитивно управляют содержанием линолевой кислоты в сое. Таким образом, используя комбинацию маркеров для Fad3-1b и Fad3-1c, селекционер, использующий изобретение, может точно прогнозировать содержание линолевой кислоты в соевых растениях.
1
2
3
Маркеры могут использоваться для выведения генотипического состояния семян на любой стадии процесса разведения, например, на стадии завершенной инбредной линии или F, F, F и т.д.
1
2
Семенной гибрид F может быть получен путем скрещивания двух инбредных линий сои (например, скрещивания растения, содержащего аллели Fad3-1b и/или Fad3-1c, связанные со сниженным содержанием линолевой кислоты, с растением, испытывающим недостаток этих аллелей), сопровождаемого естественным самоопылением. Поскольку маркеры могут использоваться для выведения генотипического состояния одного семени, полученного от межспаривания таких инбредных линий, может производиться разведение с использованием маркера ранней генерации (то есть F).
Семя сои при температуре и влажности окружающей среды обычно уравновешивается на уровне 8%-ной влажности на основе сухого веса. Семя сои на этом уровне влажности имеет тенденцию раскалываться при скоблении. Для уменьшения расщепления семя должно быть увлажнено до уровня влажности, составляющего 12%. После предварительной обработки таким образом, расщепление значительно уменьшается до <5%.
2
Отобранные семена генерации F, которые имеют желательный генотип, могут быть собраны или могут храниться отдельно в зависимости от целей разведения. Если из данной популяции отобрано множество локусов количественного признака с разными эффектами, селекционер может фиксировать идентичность одного семени для дифференцирования особей с различными комбинациями целевого локуса количественного признака устойчивости. Эти семена могут быть посажены в поле с адекватной полевой идентификацией. Можно использовать несколько способов фиксации идентичности одного семени при передаче семени из пробоотборной лаборатории в поле. Способы включают передачу отобранных особей на садоводческую семенную ленту, которая может также включать радиочастотную идентификацию для содействия идентификации семени с индивидуальным генотипом. Другие способы могут предусматривать использование двухкоординатного лотка, посадку семян в торфяные горшки и затем их пересадку или ручную посадку из индивидуальных семенных пакетов.
Пример 3
Этот пример демонстрирует использование способов тестирования, соответствующих настоящему изобретению, по программе для периодически повторяющихся родительских аллелей в программе обратного скрещивания.
Способы тестирования, соответствующие настоящему изобретению, могут использоваться для отбора трансгенов, а также для идентификации периодически повторяющихся родительских аллелей. Идентификация генотипов с желательными частотами периодического повторения родительских аллелей до посадки позволяет уменьшить количество рядов на популяцию во всей программе разведения наряду с увеличением количества популяций, включенных в программу конверсии в пределах данной полевой единицы. Это приводит к улучшению землепользования, уменьшению земельных и трудовых затрат и т.д.
Пример тестирования ткани эндосперма кукурузы на предмет периодического повторения родительских аллелей по программе обратного скрещивания показан на фиг.29.
Пример 4
Этот пример демонстрирует использование способов тестирования, соответствующих настоящему изобретению, для исследования линии ДНК методом "отпечатков пальцев" и определения фазы сцепления.
В комбинации со сбором одного семени может исследоваться линия ДНК методом "отпечатков пальцев" без необходимости отбора проб линии в поле.
Благодаря использованию ткани эндосперма семени (семенной оболочки сои), полученной от диплоидного растения, могут быть определены родительные маркерные гаплотипы с использованием системы определения генотипа, которая позволяет обнаруживать различные частоты аллелей в пробах ДНК. Поскольку ткань эндосперма триплоидная с двумя копиями, полученными из женской гаметы, фаза сцепления родительской клеточной линии может быть выведена посредством рассечения гетерозиготных генотипов потомства. Проба ДНК от ткани эндосперма допускает определение уровня плоидности генетического маркера. Уровень плоидности диплоида в генетическом маркере указывает на материнскую наследственность, и уровень плоидности гаплоида в генетическом маркере указывает на отцовскую наследственность.