ПРОТИВОМИКРОБНЫЙ ПЕПТИД
ANTIMICROBIAL PEPTIDE

Настоящее изобретение относится к области биохимии. Более конкретно, настоящее изобретение относится к области противомикробных пептидов и противодействию бактериальным, вирусным, грибковым и паразитарным инфекциям.
Противомикробные пептиды (ПМП) являются важным компонентом иммунной системы организмов в природе и обеспечивают защиту от вторгающихся патогенов. ПМП направлены не против отдельных конкретных молекулярных структур (эпитопов), а действуют на клеточную мембрану, вызывая тем самым быструю гибель бактерий и грибов. В этой связи, в отличие от обычных антибиотиков, противомикробные пептиды являются эффективными независимо от метаболической активности бактерий. Помимо наличия непосредственной микробицидной активности, противомикробные пептиды являются особенно перспективными ввиду того, что некоторые такие пептиды демонстрируют несколько видов активности, например, регуляцию врожденного и приобретенного иммунитета, лечение воспаления и заживление ран, а также обладают дополнительными видами противогрибковой, противовирусной, противопаразитарной и противоопухолевой активностей. Последовательность и вторичная структура ПМП весьма разнообразна, но обладает некоторыми общими свойствами. Обычно ПМП представляют собой короткие (приблизительно 15-40 аминокислот), катионные, амфипатические пептиды и оказывают свое микробицидное действие в основном путем нарушения целостности бактериальной мембраны. Взаимодействие ПМП с анионной поверхностью мембраны микроорганизмов-мишеней приводит к увеличению проницаемости мембраны, лизису и гибели клеток. Общепринято, что цитоплазматическая мембрана является главной мишенью большинства противомикробных пептидов, причем накопление пептида в мембране вызывает увеличение проницаемости и потерю барьерной функции, что приводит к высвобождению компонентов цитоплазмы и гибели клеток. Для объяснения действия ПМП были предложены различные молекулярные механизмы увеличения проницаемости мембраны, одни из которых являются феноменологическими, а другие более количественными.
Экспериментальные наблюдения в модельных системах в основном объясняли с помощью модели «ковра» или модели пор (Фиг. 1). Согласно модели «ковра», ПМП накапливаются на поверхности мембраны, при этом ПМП ориентированы параллельно поверхности мембраны, что приводит к локальному истончению и дестабилизации клеточной мембраны, с последующим высвобождением внутриклеточного содержимого. Однако существуют убедительные доказательства того, что многие ПМП также функционируют аналогично механизму действия поверхностно-активных веществ, нарушая неспецифическим образом упаковку и организацию липидов (например, кластеризацию липидов или разделение полярных и неполярных групп липидов) или путем индукции образования липидных агрегатов за пределами бислоя мембраны. Помимо всего прочего, некоторые ПМП проникают через клеточную мембрану и взаимодействуют с внутриклеточной мишенью (Фиг. 1), что ведет к потере жизнеспособности бактериальной/грибковой клетки.
Очевидно, что механизм(ы) действия ПМП отличается от принципа действия обычных антибиотиков, которые часто имеют простые мишени, такие как уникальный эпитоп на клеточной стенке или этап в процессах синтеза белка и РНК, что позволяет патогенным бактериям быстрее вырабатывать устойчивость. Основным преимуществом противомикробных пептидов, по сравнению с обычными антибиотиками, является то, что устойчивость бактерий в отношении таких ПМП развивается не так быстро, вероятно, вследствие того, что такие пептиды - в отличие от обычных антибиотиков - направлены не на отдельные конкретные молекулярные структуры (эпитопы), а действуют на клеточную мембрану, вызывая тем самым гибель бактерий и грибков в течение нескольких минут. Таким образом, благодаря высокой скорости уничтожения, которая превышает скорость размножения бактерий, и характеру мишени (существенная модификация липидного состава повлияет на жизнеспособность бактериальной клетки), развитие устойчивости является менее вероятным. Появление мутантов, устойчивых к ПМП, было определено путем мониторинга восприимчивости бактерий после повторяющегося дополнительного культивирования в присутствии субингибирующих концентраций пептидов, что указывает на более низкую частоту мутаций, чем этот показатель для других испытанных клинических антибиотиков (например, ципрофлоксацина и эритромицина). В то время как минимальная ингибирующая концентрация (МИК) указанных антибиотиков увеличилась во всех субкультурах (вплоть до 64 раз), давление пептидов не увеличило МИК штамма. Следовательно, в отличие от обычных антибиотиков, развитие устойчивости в присутствии ПМП является менее вероятным. Более того, ПМП являются быстродействующими и поддаются биологическому разложению, что уменьшает существующую в настоящее время озабоченность, касающуюся остаточного присутствия антибиотиков в окружающей среде.
Целый ряд микробных инфекций связан с образованием биопленок, в которых микроорганизмы агрегируют с образованием структурированного сообщества в полимерном матриксе, который они вырабатывают, и прилипают к поверхности. Дополнительным недостатком обычных антибиотиков является то, что они не обеспечивают уничтожение инфекций, связанных с биопленками, по следующим причинам:
1) Недостаточное проникновение обычных антибиотиков в биопленки: матрикс, в который заключены бактерии, защищает их от внешних воздействий, таких как противомикробные вещества. Большинство антибиотиков способны проникать в биопленку, однако они медленно диффундируют в нее, так, что антибиотики инактивируются до того, как вызвать желаемый эффект.
2) Низкая метаболическая активность бактерий: инфекции, связанные с биопленками (biofilm-associated infections; BAI), обычно лечат с использованием ванкомицина, часто в комбинации с рифампицином. Несмотря на то, что ванкомицин, как известно, достаточно хорошо проникает в биопленки, хотя и со значительно сниженной скоростью транспорта, он плохо сокращает количество бактерий, локализованных в биопленке. Лечение с использованием этого антибиотика, таким образом, все еще имеет относительно высокую частоту неблагоприятных исходов, которую можно объяснить низкой метаболической активностью бактерий в биопленке, что приводит к отсутствию эффективности антибиотика.
3) Инактивация или разрушение антибиотиков: при лечении BAI антибиотики вводят в основном системным образом. Поэтому они более подвержены удалению из кровотока путем почечного клиренса и ферментативному разрушению в крови и окружающих тканях. Ферменты (вырабатываемые бактериями) могут непосредственно разрушать или модифицировать соединение. Эти механизмы активно снижают концентрацию лекарственных средств в локальной среде. В биопленках низкая степень проникновения создает дополнительную проблему. Увеличение концентрации при системном введении не представляется возможным вследствие токсичности высоких концентраций антибиотиков в крови.
4) Бактерии вырабатывают устойчивость: помимо общего увеличения устойчивости бактерий к антибиотикам, вследствие снижения концентраций антибиотиков в более глубоких слоях, увеличивается риск того, что бактерии избегнут действия антибиотика, что может привести к выживанию мутантов, обладающих повышенной устойчивостью к этим антибиотикам. Имеются сообщения о том, что субоптимальные концентрации антибиотиков, включая ванкомицин, даже усиливают образование биопленок. Кроме того, многократное введение обычных антибиотиков, которые оказывают недостаточное действие, способствует развитию устойчивости к антибиотикам.
5) Обычные антибиотики вызывают высвобождение провоспалительных микробных соединений: было показано, что при BAI околоимплантатная ткань колонизируется бактериями. Этот процесс в значительной степени связан с нарушением регуляции местного иммунного ответа. Это является причиной, по которой инфекция сохраняется во многих случаях, даже после замены имплантата. Имплантация биоматериала вызывает воспалительный ответ, известный как «ответ на инородное тело», который характеризуется последовательным притоком нейтрофилов, макрофагов/моноцитов и лимфоцитов, с последующим слиянием макрофагов с многоядерными гигантскими клетками инородного тела, выстилающими биоматериал, образованием новых фибробластов и отложением фибрина, что приводит к фиброзу/инкапсуляции инородного тела. Описанная последовательность событий строго регулируется молекулярными сигналами, такими как цитокины, вырабатываемые вовлеченными клетками. В случае инфекции иммунная система хозяина дополнительно индуцируется молекулами бактерий, называемыми «ассоциированные с патогеном молекулярные паттерны» (pathogen-associated molecular patterns; PAMPs), которые распознаются специфичными рецепторами на клетках-хозяевах, такими как Toll-подобные рецепторы (TLR). Например, пептидогликан или липополисахарид бактерий распознается рецепторами TLR2 и TLR4 и является мощным индуктором воспалительных ответов. Активация иммунной системы при участии ответа на инородное тело и бактериальной инфекции приводит к «чрезмерной» реакции иммунной системы хозяина, что вызывает воспаление и разрушение ткани, фактически обеспечивая идеальную среду для инфекции. Следовательно, одновременная активация иммунной функции под действием биоматериала и РАМР может оказывать на нее негативное влияние и сильно повышает восприимчивость к инфекции.
В настоящее время известно более 2000 различных последовательностей противомикробных пептидов (см., например, www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/search.htm), включая цекропины, дефенсины, магаинины и кателицидины. Противомикробные пептиды и белки описаны, например:
в патенте США №6503881, в котором раскрыты катионные пептиды, являющиеся аналогом индолицидина, для применения в качестве противомикробного пептида. Катионные пептиды происходят от различных видов, включая животных и растения;
в патенте США №5912230, в котором раскрыты противогрибковые и антибактериальные пептиды на основе гистатина и способы лечения грибковых и бактериальных инфекций. Пептиды основаны на определенных участках аминокислотных последовательностей природных гистатинов человека;
в патенте США №5717064, в котором раскрыты метилированные богатые лизином литические пептиды. Литические пептиды являются устойчивыми к расщеплению трипсином и не встречаются в природе. Литические пептиды подходят для введения в условиях in vivo;
в патенте США №5646014, в котором раскрыт противомикробный пептид, выделенный из противомикробной фракции из гемолимфы тутового шелкопряда. Пептид проявляет противомикробную активность в отношении нескольких бактериальных штаммов, таких как Escherichia coli, Staphylococcus aureus и Bacillus cereus;
в международной заявке на патент 2004/016653, в которой раскрыт пептид, основанный на последовательности 20-44 azuro-CIDIN. Этот пептид содержит петлевую структуру, связанную дисульфидными мостиками;
в патенте США №6495516, в котором раскрыты пептиды на основе бактерицидного белка массой 55 кДа, который представляет собой бактерицидный/увеличивающий проницаемость белок (BPI). Описанные пептиды оказывают противомикробное действие, а также обладают ЛПС-нейтрализующей способностью;
в международной заявке на патент 01/81578, в которой описаны многочисленные последовательности, кодирующие полипептиды, родственные рецептору, связанному с G-белком, которые можно применять для лечения многих заболеваний;
в международных заявках на патент 2004/067563 и 2005/040192, в которых раскрыты противомикробные пептиды, основанные на пептиде LL-37, С-концевой аминокислотной последовательности кателицидина человека, содержащей 37 остатков;
несколько ПМП, даптомицин и DPK-060, в настоящее время применяют в клинической практике и/или разрабатывают для клинического применения, например, плимиксин В, низин, пексиганан, омиганан, изеганан. Также были проведены клинические исследования, включая исследования 2 фазы, ОР-145, пептида, состоящего из 24 аминокислотных остатков, полученного из эндогенного противомикробного пептида человека кателицидина LL-37. ОР-145 был разработан в качестве противомикробного пептида, нейтрализующего эндотоксины, для местного лечения хронического отита среднего уха. Известные в настоящее время ПМП по-прежнему имеют несколько недостатков. Несмотря на то, что протеолитическое расщепление является благоприятным для окружающей среды (отсутствуют остаточные ПМП), оно предотвращает динамическую циркуляцию. Это также вызвано эффективным клиренсом пептидов. Точные механизмы действия ПМП также остаются неизвестными, поэтому трудно предугадать истинную сферу и все перспективы их применения. Например, часто неизвестно, как ПМП взаимодействуют с клетками-хозяевами, для стимуляции их воздействия. В связи с этим использование ПМП в клинической практике было ограничено местными применениями.
Различные бактерии, такие как P. aeruginosa, Ε. faecalis, Proteus mirabilis, Streptococcus pyogenes и S. aureus, все секретируют протеазы, которые разрушают ряд противомикробных пептидов, таких как кателицидин LL-37. Следовательно, устойчивые к протеазам противомикробные пептиды являются предпочтительными с терапевтической точки зрения. Помимо этого, многие из противомикробных пептидов не обладают высокой эффективностью в отношении проблемных микроорганизмов, таких как бактерии, например, S. aureus и P. aeruginosa, которые часто играют ключевую роль в сложных патогенных процессах, и должны быть оптимизированы, чтобы показать повышенный эффект. Также вследствие возможных литических, а также других свойств ПМП в отношении бактериальных мембран, а также мембран млекопитающих, одна из проблем при создании новых пептидов заключается в разработке ПМП с высокой специфичностью в отношении микроорганизмов, таких как бактериальные или грибковые клетки, по сравнению с клеточными мембранами инфицированного пациента, т.е. обладающих высоким терапевтическим индексом (минимальная гемолитическая концентрация/минимальная противомикробная активность; МНС/МЕС).
Следовательно, даже несмотря на то, что имеется относительно большое количество противомикробных пептидов, доступных в настоящее время, все еще существует большая потребность в новых улучшенных противомикробных пептидах, которые могут быть использованы для противодействия микроорганизмам, в частности, тем, которые являются устойчивыми или толерантными к антибиотикам и/или другим противомикробным агентам. Что особенно важно, существует потребность в новых противомикробных пептидах, которые не вызывают аллергических реакций при введении млекопитающим, таким как люди, и которые имеют высокую специфичность в отношении патогенных микроорганизмов.
Задачей настоящего изобретения является обеспечение нового эффективного противомикробного пептида, который лишен недостатков обычных антибиотиков и имеет улучшенные свойства по сравнению с известными противомикробными пептидами. Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение нового пептида, который проявляет высокую активность в отношении патогенных микроорганизмов при инфекциях, связанных с биопленками.
99,9
90
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что полипептид Р10, содержащий последовательность LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR, является высокоэффективным в отношении (устойчивых к лекарственным препаратам) грамположительных (например, Staphylococcus aureus) и грамотрицательных (например, Pseudomonas aeruginosa) бактерий, а также в отношении грибов, например, Candida albicans и Aspergillus niger, в условиях in vitro. Как показано на Фигурах 2А и 2 В, Р10 является значительно более эффективным, чем любой другой испытанный пептид. Помимо этого, Р10 способен предотвратить образование биопленки метициллин-устойчивого S. aureus на пластиковых, а также биотических (трехмерная модель ранения кожи человека) поверхностях. Более того, Р10 нейтрализует эндотоксины липотейхоевой кислоты (LTA), пептидогликана (PG) и липополисахаридов (LPS), уменьшая тем самым провоспалительный ответ.Р10 принимает форму альфа-спирали, что приводит к образованию амфипатической структуры, в которой полярные аминокислоты расположены на одной стороне спирали и липофильные аминокислоты на противоположной стороне. Пептиды, в которые были введены остатки пролина, чтобы нарушить спираль, были неактивны, это указывает на то, что амфипатическое свойство полипептида имеет большое значение для его биологической активности. Как это следует из Фигур 2-5 Р10 оказался даже значительно более эффективным, чем ОР-145 (Р60.4Ас), для которого были проведены клинические исследования. Как показано на Фигуре 2 В и подробно описано в примерах, Р10 имеет величину ИК (0,59 мкМ), которая даже ниже, чем величина ИК в отношении Р60.4Ас (0,75 мкМ). Следовательно, при концентрации 0,59 мкМ Р10 вызывает гибель 999 из 1000 бактерий, тогда как Р60.4Ас вызывает гибель только 900 из 1000 бактерий в аналогичной и даже незначительно более высокой концентрации. Следовательно, после лечения с использованием Р60.4Ас выживает в 100 раз больше бактерий, чем при лечении с использованием Р10 в аналогичной концентрации. Более того, Р10 имеет широкий спектр активности, поскольку он активен в отношении широкого спектра микроорганизмов, включая бактерии, грибки, вирусы и паразитов.
Уникальное действие противомикробных пептидов согласно настоящему изобретению в отношении инфекций, связанных с биопленками, является тройным - они: 1) предотвращают образование биопленки и диспергируют существующие биопленки, 2) вызывают гибель бактерий, грибков и других микроорганизмов непосредственно в месте высвобождения и вокруг него, и 3) координируют иммунные ответы путем нейтрализации провоспалительных микробных эндотоксинов, таких как липотейхоевая кислота (LTA), пептидогликан (PG) и липополисахариды (ЛПС), и активации макрофагов, чтобы повысить их фагоцитарную и бактерицидную активность. Подобный иммунный контроль необходим, чтобы предотвратить образование новой ниши для патогенов в ткани, окружающей имплантаты. Полипептиды согласно настоящему изобретению активны против широкого спектра микроорганизмов, включая те, которые устойчивы к обычным антибиотикам.
2
2
11
Также было установлено, что i) варианты Р10, в которых одна или все аминокислоты были заменены соответствующей D-аминокислотой (таблица 2), ii) варианты Р10, в которых пептид был удлинен с N-конца и С-конца с помощью различных групп, включая ацетил, амид, NH-(CH-CH-O)-CO, гексаноил, деканоил, миристоил, пропионил, одну или две аминогексаноильные группы, iii) варианты Р10, в которых одна аминокислота была заменена другой L-аминокислотой, и iv) более короткие варианты Р10 обладают противомикробной активностью, которая сравнима с такой активностью для самого Р10, как показано в примерах (см. Таблицы 2, 3, 5 и 6).
Следовательно, полипептид в соответствии с настоящим изобретением имеет высокую противомикробную активность в отношении микроорганизмов, как локализованных в биопленках, так и не локализованных в них, с оптимальной противовоспалительной (нейтрализация микробных соединений) активностью, о чем свидетельствует активность, направленная на нейтрализацию эндотоксинов, высокая селективность, т.е. высокая противомикробная активность, приемлемая низкая цитотоксичность и активность, направленная на усиление иммунного ответа.
Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением предложен выделенный или рекомбинантный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR или вариант указанной аминокислотной последовательности,
указанный полипептид обладает противомикробной, противобактериальной, противовирусной, противогрибковой, противопаразитарной и/или противовоспалительной активностью,
указанный вариант, содержит по меньшей мере 16 аминокислот и:
- содержит не более 5 из следующих замен аминокислот:
замену одной или более аминокислот, выбранных из группы L, I, V или А, другой аминокислотой, выбранной из указанной группы;
замену одной или более аминокислот, выбранных из группы R, К или Н, другой аминокислотой, выбранной из указанной группы;
замену Е остатком Q
замену Y или W остатком F
замену одной или более аминокислот, выбранных из группы Q, N, A, S или Т, другой аминокислотой, выбранной из указанной группы
- содержит одну или более замен аминокислот соответствующей D-аминокислотой,
- содержит одну или более замен аминокислот соответствующей неприродной аминокислотой, и/или
- содержит ретроинвертированную последовательность из по меньшей мере 16 последовательных аминокислот из указанной аминокислотной последовательности.
В аминокислотных последовательностях или их вариантах, определенных в настоящей заявке, аминокислоты указаны с использованием однобуквенных обозначений. Указанные однобуквенные обозначения и трехбуквенные обозначения хорошо известны специалистам в данной области техники и имеют следующее значение: A (Ala) представляет собой аланин, С (Cys) представляет собой цистеин, D (Asp) представляет собой аспарагиновую кислоту, Ε (Glu) представляет собой глутаминовую кислоту, F (Phe) представляет собой фенилаланин, G (Gly) представляет собой глицин, H (His) представляет собой гистидин, I (Не) представляет собой изолейцин, К (Lys) представляет собой лизин, L (Leu) представляет собой лейцин, M (Met) представляет собой метионин, N (Asn) представляет собой аспарагин, Ρ (Pro) представляет собой пролин, Q (Gin) представляет собой глутамин, R (Arg) представляет собой аргинин, S (Ser) представляет собой серии, Τ (Thr) представляет собой треонин, V (Val) представляет собой валин, W (Trp) представляет собой триптофан, Y (Tyr) представляет собой тирозин.
Полипептид согласно настоящему изобретению обладает прртивомикробной активностью, предпочтительно противобактериальной, противовирусной и/или противогрибковой активностью, более предпочтительно противобактериальной и/или противогрибковой активностью. Также полипептид согласно настоящему изобретению предпочтительно обладает как противомикробной, так и противовоспалительной активностью. В настоящей заявке термин «противомикробная активность» полипептида относится к противодействию размножению или пролиферации по меньшей мере одного микроорганизма, например, бактерии, вируса и/или грибка, и включает ингибирование, уменьшение или предотвращение размножения или пролиферации, а также гибель микроорганизма. Микроорганизм представляет собой организм, который имеет микроскопические размеры, т.е., как правило, слишком мал, чтобы быть видимым невооруженным глазом человека. Микроорганизмы очень разнообразны, они включают бактерии, вирусы, грибки, археи, простейших и микроскопические водоросли. Аналогичным образом, в настоящей заявке термин «противобактериальная активность», «противовирусная активность», «противогрибковая активность» и «противопаразитарная активность» относится в целом к противодействию размножению или пролиферации, соответственно, бактерии, вируса, грибка и паразита и включает ингибирование, уменьшение или предотвращение их размножения или пролиферации, а также их гибель. Противомикробная, противобактериальная, противовирусная, противогрибковая и противопаразитарная активность может быть измерена с помощью способов, известных в данной области техники.
Один из таких способов подробно описан в примерах данной заявки и включает количественный способ исследования литической активности в условиях in vitro. В соответствии с этим способом микроорганизмы, например, бактерии или грибки, инкубируют, например, в течение 1-2 часов с различными концентрациями полипептида согласно настоящему изобретению, затем смесь микроорганизма и полипептида инкубируют в подходящей культуральной среде или на ее поверхности, чтобы установить число выживших и/или погибших микроорганизмов по сравнению с образцом микроорганизмов, не подвергнутым инкубации с полипептидом, который далее обрабатывали аналогичным образом.
Количественные исследования вирусных бляшек можно использовать для оценки противовирусной активности полипептида согласно настоящему изобретению. В общих чертах, вирусный инокулят подвергают воздействию полипептида перед инфицированием чувствительного монослоя клеток. После стандартного промежутка времени титр вируса в клеточных экстрактах определяют с помощью нескольких разведений этих экстрактов путем инфицирования свежих монослоев клеток и количественного определения их воздействия на монослой клеток.
Для оценки противопаразитарной активности полипептид согласно настоящему изобретению и паразита инкубируют в течение стандартного периода времени. После этого метаболическая активность паразитов может быть непосредственно исследована, например, с помощью МТТ-теста, или паразитов переносят в клетки млекопитающих, и после инкубации оценивают размножение паразита в этих клетках с помощью микроскопических способов.
В настоящей заявке термин «противовоспалительная активность» полипептида относится к ингибированию, уменьшению или предотвращению воспалительного ответа у субъекта, который был инфицирован микроорганизмами, например, бактериями, вирусами, грибками и/или паразитами. Противовоспалительная активность полипептидов согласно настоящему изобретению достигается путем ингибирования, уменьшения или предотвращения высвобождения провоспалительных микробных соединений, таких как липотейхоевая кислота (LTA), пептидогликан (PG) и/или липополисахариды (LPS). Противовоспалительная активность может быть измерена с помощью способов, известных в данной области техники. Одним из примеров такого способа является количественный способ исследования нейтрализации липополисахаридов. В соответствии с этим способом полипептид согласно настоящему изобретению смешивают с 1 мг липополисахаридов и инкубируют в течение 60 мин. После этого указанные смеси добавляли к образцам свежей крови человека, разбавленным в 4 раза, и через 18 часов оценивали уровень цитокинов (ИЛ-8, ИЛ-12р40) в образце крови с помощью твердофазного иммуноферментного анализа.
В настоящей заявке вариант аминокислотной последовательности LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR имеет в длину по меньшей мере 16 аминокислот и предпочтительно содержит не более 5 из следующих замен аминокислот:
- замену одной или более аминокислот, выбранных из группы L, I, V или А, другой аминокислотой, выбранной из указанной группы;
- замену одной или более аминокислот, выбранных из группы R, К или Н, другой аминокислотой, выбранной из указанной группы;
- замену Е остатком Q
- замену Y или W остатком F
- замену одной или более аминокислот, выбранных из группы Q, N, A, S или Т, другой аминокислотой, выбранной из указанной группы,
- замену одной или более аминокислот соответствующей D-аминокислотой,
- замену одной или более аминокислот соответствующей неприродной аминокислотой. Указанный вариант может содержать 1, 2, 3, 4 или 5 из указанных замен L-аминокислоты другой аминокислотой, и/или L-аминокислоты соответствующей ей D-аминокислотой. В другом варианте, все из по меньшей мере 16 L-аминокислот указанного варианта заменены соответствующей им D-аминокислотой.
Предпочтительно указанный вариант содержит не более 5 замен аминокислот, перечисленных ниже:
замену L в положении аминокислоты 1 остатком I, V или А
замену А в положении аминокислоты 2 остатком L, V, Q или I
замену R в положении аминокислоты 3 остатком К или Н
замену Е в положении аминокислоты 4 остатком Q
замену Y в положении аминокислоты 5 остатком F или W
замену К в положении аминокислоты 6 остатком R или Н
замену К в положении аминокислоты 7 остатком R или Н
замену I в положении аминокислоты 8 остатком L, V или А
замену V в положении аминокислоты 9 остатком L, I или А
замену Е в положении аминокислоты 10 остатком Q
замену К в положении аминокислоты 11 остатком R или Н
замену L в положении аминокислоты 12 остатком I, V или А
замену К в положении аминокислоты 13 остатком R или H
замену R в положении аминокислоты 14 остатком К или H
замену W в положении аминокислоты 15 остатком F или Y
замену R в положении аминокислоты 17 остатком H или К
замену Q в положении аминокислоты 18 остатком N, A, S или Τ
замену V в положении аминокислоты 19 остатком L, I или А
замену L в положении аминокислоты 20 остатком I, V или А
замену R в положении аминокислоты 21 остатком К или H
замену Τ в положении аминокислоты 22 остатком Q, N или А
замену R в положении аминокислоты 24 остатком H или К
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
2l
22
23
24
замену от 1 до 5 аминокислот соответствующей D-аминокислотой. В настоящей заявке нумерация аминокислот является следующей: LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR.
Предпочтительно вариант, определенный в настоящей заявке, содержит не более 4 из указанных замен аминокислот, более предпочтительно не более 3 из указанных замен аминокислот, например, 1, 2, 3, 4 или 5 указанных замен. Также вариант, определенный в настоящей заявке, предпочтительно содержит по меньшей мере аминокислотную последовательность YKJGVEKLKRWLRQVL, содержащую не более 5, более предпочтительно не более 4, наиболее предпочтительно не более 3 указанных замен аминокислот.
Не более 5 замен L-аминокислот в указанном варианте другой L-аминокислотой, предпочтительно представляют собой следующие замены:
замену L в положении аминокислоты 1 остатком I, V или А
замену А в положении аминокислоты 2 остатком L, V или Q
замену R в положении аминокислоты 3 остатком К или H
замену Ε в положении аминокислоты 4 остатком Q
замену Y в положении аминокислоты 5 остатком F
замену К в положении аминокислоты 6 остатком R или H
замену К в положении аминокислоты 7 остатком R или H
замену К в положении аминокислоты 11 остатком R или H
замену L в положении аминокислоты 12 остатком I, V или А
замену К в положении аминокислоты 13 остатком H
замену R в положении аминокислоты 14 остатком К или H
замену W в положении аминокислоты 15 остатком F
замену R в положении аминокислоты 17 остатком H
замену Q в положении аминокислоты 18 остатком N, A, S или Т
замену V в положении аминокислоты 19 остатком L
замену L в положении аминокислоты 20 остатком I, V или А
замену R в положении аминокислоты 21 остатком К или Н
замену Т в положении аминокислоты 22 остатком Q, N или А
замену R в положении аминокислоты 24 остатком Н.
В другом предпочтительном варианте полипептид согласно настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
2
2
11
2
2
11
необязательно содержащую N-концевую и/или С-концевую модификацию, предпочтительно содержащую на N- и/или С-конце удлиняющую группу, причем указанная модификация на N-конце предпочтительно выбрана из группы, состоящей из ацетил-, гексаноил-, деканоил-, миристоил-, NH-(CH-CH-O)-CO- и пропионил- групп, а указанная модификация на С-конце предпочтительно выбрана из группы, состоящей из амид-, NH- NH-(CH-CH-O)-СО-амид- и одной или двух аминогексаноильных групп. В одном варианте реализации полипептид согласно настоящему изобретению состоит из одной из указанных аминокислотных последовательностей.
В другом варианте, или помимо не более 5 замен аминокислот другой аминокислотой, как описано выше, вариант аминокислотной последовательности LAREYKKIVEKLICRWLRQVLRTLR, как определено в настоящей заявке, может содержать одну или более замен L-аминокислоты соответствующей ей D-аминокислотой. Аминокислоты, указанные в настоящей заявке с помощью прописного однобуквенного обозначения, например, А для аланина, представляют собой L-аминокислоты, которые обычно встречаются в природных белках. Как показано в примерах (таблица 2), полипептиды, в которых L-аминокислота заменена соответствующей ей D-аминокислотой, сохраняют свою противомикробную активность. Следовательно, вариант аминокислотной последовательности LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR, определенный в настоящей заявке, может содержать одну или более замен аминокислот соответствующей D-аминокислотой. В настоящей заявке термин «соответствующая D-аминокислота» определяется как D-аминокислотный аналог L-аминокислоты. Например, соответствующая D-аминокислота для аланина (А) представляет собой D-аланин (а), соответствующая D-аминокислота для аргинина (R) представляет собой D-аргинин (r), соответствующая D-аминокислота для аспарагина (N) представляет собой D-аспарагин (n), и т.д. Все L-аминокислоты варианта, определенного в настоящей заявке, могут быть заменены соответствующими им D-аминокислотами. Вариант аминокислотной последовательности LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR, определенный в настоящей заявке, может содержать не более 24 замен L-аминокислот соответствующими им D-аминокислотами. Следовательно, вариант может состоять полностью из D-аминокислот, поскольку в полипептидах, содержащих такой вариант аминокислотной последовательности, сохраняется противомикробная активность. Например, вариант может содержать 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 5, 4, 3, 2 или 1 замену L-аминокислоты соответствующей ей D-аминокислотой. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения вариант аминокислотной последовательности LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR, определенный в настоящей заявке, содержит замену одной аминокислоты соответствующей ей D-аминокислотой. Положение D-аминокислоты в аминокислотной последовательности не имеет значения. Как показано в Таблице 2, во всех полипептидах, имеющих последовательность LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR, в которой одна аминокислота замещена D-аминокислотой, противомикробная активность сохраняется. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения вариант содержит замену всех L-аминокислот соответствующими им D-аминокислотами. Как показано в примерах (Таблица 2), полипептид, содержащий последовательность LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR (пептид #1313-07), который представляет собой вариант, содержащий только D-аминокислоты, обладает противомикробной активностью. Вариант, определенный в настоящей заявке, может дополнительно содержать ретроинвертированный (retro-inverso) пептид, содержащий по меньшей мере 16 последовательных аминокислот из аминокислотной последовательности LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR. Предпочтительно указанный вариант представляет собой ретроинвертированный пептид полноразмерной указанной аминокислотной последовательности. Ретроинвертированный пептид представляет собой пептид, состоящий из D-аминокислот в обратной последовательности относительно эталонной аминокислотной последовательности. Следовательно, предпочтительный вариант реализации настоящего изобретения может содержать по меньшей мере 16 аминокислот из D-аминокислотной последовательности RLTRLVQRLWRKLKEVIKKYERAL. Как показано в таблице 2, полипептид, содержащий последовательность LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR (пептид #1241-03), который представляет собой вариант, содержащий ретроинвертированную последовательность аминокислотной последовательности LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR, обладает противомикробной активностью.
Вариант аминокислотной последовательности LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR, как определено в настоящей заявке, может содержать не более 5 замен аминокислот неприродными аминокислотами. В настоящей заявке термин «неприродные аминокислоты» относится к не кодируемым генетически аминокислотам, независимо от того, обнаруживаются они в природных условиях или нет. Неприродные аминокислоты, которые могут присутствовать в варианте аминокислотной последовательности, определенном в настоящей заявке, включают: β-аминокислоты; п-ацил-L-фенилаланин; N-ацетиллизин; O-4-аллил-L-тирозин; 2-аминоадипиновую кислоту; 3-аминоадипиновую кислоту; β-аланин; 4-трет-бутил водород 2-азидосукцинат; бета-аминопропионовую кислоту; 2-аминомасляную кислоту; 4-аминомасляную кислоту; 2,4,-диаминомасляную кислоту; 6-аминокапроновую кислоту; 2-аминогептановую кислоту; 2-аминоизомасляную кислоту; 3-аминоизомасляную кислоту; 2-аминопимелиновую кислоту; п-аминофенилаланин; 2,3-диаминомасляную кислоту; 2,3-диаминопропионовую кислоту; 2,2'-диаминопимелиновую кислоту; п-амино-L-фенилаланин; п-азидо-L-фенилаланин; D-аллилглицин; р-бензоил-L-фенилаланин; 3-бензотиенилаланин, п-бромфенилаланин; t-бутилаланин; t-бутилглицин; 4-хлорфенилаланин; циклогексилаланин; цистеиновую кислоту; D-цитруллин; тио-L-цитруллин; десмозин; ε-аминогексановую кислоту; N-этилглицин; N-этиласпарагин; 2-фторфенилаланин; 3-фторфенилаланин; 4-фторфенилаланин; гомоаргинин; гомоцистеин; гомосерин; гидроксилизин; аллогидроксилизин; метиловый эфир 3-(3-метил-4-нитробензил)-L-гистидина; изодесмозин; аллоизолейцин; изопропил-L-фенилаланин; 3-метилфенилаланин; N-метилглицин; N-метилизолейцин; 6-Ν-метиллизин; О-метил-L-тирозин; N-метилвалин; метионинсульфоксид; 2-нафтилаланин; L-3-(2-нафтил)аланин; изосерин; 3-фенилсерин; норвалин; норлейцин; 5,5,5-трифтор-DL-лейцин; орнитин; 3-хлортирозин; N5-карбамоилорнитин; пеницилламин; фенилглицин; пиперидиную кислоту; пиридилаланин; 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоксиловую кислоту; бета-2-тиенилаланин; γ-карбокси-DL-глутаминовую кислоту; 4-фтор-DL-глутаминовую кислоту; D-тироксин; аллотреонин; 5-гидрокситриптофан; 5-метокситриптофан; 5-фтортриптофан; 3-фторвалин.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения природная аминокислота указанной последовательности заменена соответствующей неприродной аминокислотой. В настоящей заявке термин «соответствующая неприродная аминокислота» относится к неприродной аминокислоте, которая является производным упомянутой природной аминокислоты. Например, природная аминокислота заменена соответствующей β-аминокислотой. Аминогруппы β-аминокислот связаны с бета-атомом углерода, а не альфа-атомом углерода, как в природных аминокислотах. Например, α-аланин заменен β-аланином и т.д. Другие примеры замены природной аминокислоты неприродной аминокислотой, которая является производным указанной природной аминокислоты, перечислены далее. Аланин, например, заменен бета-аланином, трет-бутилаланином, 2-нафтилаланином; L-3-(2-нафтил)аланином, 2-аминоизомасляной кислотой. Аргинин, например, заменен гомоаргинином, орнитином, N5-карбамоилорнитином, 3-аминопропионовой кислотой. Аспарагин, например, заменен N-этиласпарагином. Аспарагиновая кислота, например, заменена 4-трет-бутил водород 2-азидосукцинатом. Цистеин, например, заменен цистеиновой кислотой, гомоцистеином. Глутаминовая кислота, например, заменена γ-карбокси-DL-глутаминовой кислотой; 4-фтор-DL-глутаминовой кислотой. Глутамин, например, заменен D-цитруллином, тио-L-цитруллином. Глицин, например, заменен N-метилглицином, трет-бутилглицином, N-метилглицином, D-аллилглицином. Гистидин, например, заменен метиловым эфиром 3-(3-метил-4-нитробензил)-L-гистидина. Изолейцин, например, заменен изодесмозином, N-метилизолейцином, аллоизолейцином. Лейцин, например, заменен норлейцином, десмозином, 5,5,5-трифторлейцином. Лизин, например, заменен 6-N-метиллизином, 2-аминогептановой кислотой, N-ацетиллизином, гидроксилизином, аллогидроксилизином. Метионин, например, заменен метионинсульфоксидом. Фенилаланин, например, заменен п-амино-L-фенилаланином, 3-бензотиенилаланином, п-бромфенилаланином, п-ацил-L-фенилаланином, 2-фторфенилаланином, 3-фторфенилаланином, 4-фторфенилаланином. Пролин, например, заменен 3-гидроксипролином, 4-гидроксипролином, 1-ацетил-4-гидрокси-Ь-пролином. Серии, например, заменен гомосерином, изосерином, 3-фенилсерином. Треонин, например, заменен D-тироксином, аллотреонином. Триптофан, например, заменен 5-гидрокситриптофаном, 5-метокситриптофаном, 5-фтортриптофаном. Тирозин, например, заменен О-метил-L-тирозином, O-4-аллил-L-тирозином, 3-хлортирозином. Валин, например, заменен норвалином, N-метилвалином, 3-фторвалином.
99,9
99,9
Особенно предпочтительный полипептид согласно настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR или ее вариант, имеющий 99,9% летальную концентрацию (ЛК) в ФСБ не более 3,2 мкМ, выбранный из Таблиц 2, 3, 5 или 6. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен полипептид, имеющий ЛК в ФСБ не более 2,4 мкМ, выбранный из Таблиц 2, 3, 5 или 6.
2
2
11
2
2
11
Полипептид согласно настоящему изобретению может состоять из аминокислотной последовательности LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR или варианта указанной последовательности, определенного в настоящей заявке. В настоящей заявке термин «полипептид» относится к пептидам, полипептидам и пептидомиметикам, которые содержат несколько аминокислот. Термины «полипептид» и «пептид» используются взаимозаменяемо. Наименьший полипептид согласно настоящему изобретению, который, как показано, обладает противомикробной активностью, содержит 16 аминокислот в длину. Однако аминокислотная последовательность или ее вариант может быть частью более крупного полипептида, то есть полипептида, который был удлинен на N-конце и/или С-конце с помощью одной или более дополнительных аминокислот. Аминокислотная последовательность или вариант полипептида согласно настоящему изобретению могут быть модифицированы на N-конце и/или С-конце, предпочтительно путем присоединения N- и/или С-концевой удлиняющей группы. В другом варианте указанная аминокислотная последовательность или ее вариант являются удлиненными на N-конце и/или С-конце. Полипептид согласно настоящему изобретению, следовательно, содержит по меньшей мере 16 аминокислот, и может содержать не более 1000 аминокислот. Однако менее крупные полипептиды являются предпочтительными для поддержания максимально низкого уровня производственных затрат. Предпочтительно полипептид согласно настоящему изобретению содержит 16-200 аминокислот в длину, более предпочтительно 16-100 аминокислот, более предпочтительно 16-50 аминокислот. В одном варианте реализации настоящего изобретения полипептид согласно настоящему изобретению содержит от 16 до 24 аминокислот, т.е. 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 аминокислоты. Указанный полипептид предпочтительно содержит 16-24 аминокислоты. Указанный полипептид, содержащий 16-24 аминокислоты, может дополнительно содержать модификацию на N-конце и/или С-конце, такую как N-концевая модификация, выбранная из группы, состоящей из ацетил-, гексаноил-, деканоил-, миристоил-, NH-(CH-СН-О)-СО- и пропионил- групп, и/или такую как С-концевая модификация, выбранная из группы, состоящей из амид-, NH-(CH-CH-О)-CO-амид и одной или двух аминогексаноильных групп.Типичные полипептиды различной длины и их противомикробная активность приведены в примерах. В одном варианте реализации настоящего изобретения полипептид согласно настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR или ее вариант, как определено в настоящей заявке, возможно, содержащий N-концевую и/или С-концевую модификацию, предпочтительно содержащий на N- и/или С-конце удлиняющую группу.
В настоящей заявке термин «пептид омиметик» относится к соединению, содержащему непептидные структурные элементы, причем такое соединение имитирует противомикробные, противобактериальные, противовирусные, противогрибковые, противопаразитарные и/или противовоспалительные свойства полипептида согласно настоящему изобретению. Следовательно, полипептид согласно настоящему изобретению может содержать непептидные структурные элементы. Такие непептидные структурные элементы могут присутствовать в аминокислотной последовательности LAPvEYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR, или в ее варианте, определенном в настоящей заявке, в результате замены или модификации одной или более аминокислот указанной последовательности или ее варианта. В другом варианте полипептид согласно настоящему изобретению может содержать непептидные структурные элементы, находящиеся за пределами аминокислотной последовательности LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR, или в ее варианте, определенном в настоящей заявке, т.е. в необязательной N- и/или С-концевой удлиняющей группе. Непептидные структурные элементы в пептидомиметике, как правило, представляют собой модификацию одной или более существующих аминокислот. Предпочтительные пептидомиметики получают путем модификации структуры полипептидов согласно настоящему изобретению, например, с использованием неприродных аминокислот, таких как те, которые определены в настоящей заявке выше, конформационных ограничений, циклизации полипептида, изостерической замены или других модификаций. Аминокислотная последовательность полипептида согласно настоящему изобретению, следовательно, необязательно содержит одну или более модификаций. Указанный полипептид может быть модифицирован в результате природных процессов, таких как посттрансляционный процессинг, или с помощью химических методов модификации. Модификации могут быть введены в указанный полипептид в любом месте, включая полипептидный остов, боковые цепи аминокислот и N-конец или С-конец. Один полипептид может содержать несколько типов модификаций или несколько модификаций одного типа. Модификации включают ацетилирование, амидирование, ацилирование, фосфорилирование, метилирование, деметилирование, ADP-рибозилирование, образование дисульфидных связей, убиквитинирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, гидроксилирование, йодирование, окисление, ПЭГилирование и сульфатирование. Помимо этого, полипептид согласно настоящему изобретению может быть снабжен меткой, такой как биотин, флуоресцеин или флавин, липид или производное липида, сахарная группа. Полипептид согласно настоящему изобретению может быть снабжен нацеливающей группой.
2
2
11
2
2
11
2
2
11
2
2
11
В предпочтительном варианте полипептид согласно настоящему изобретению, в котором указанная аминокислотная последовательность LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR или указанный вариант последовательности, как определено в настоящей заявке, модифицированы на N-конце и/или С-конце. Полипептид согласно настоящему изобретению, следовательно, предпочтительно содержит на N- и/или С-конце удлиняющую группу. N- и С-концевые удлиняющие группы, которые можно использовать в полипептиде согласно настоящему изобретению, хорошо известны в данной области техники. Предпочтительные примеры N-концевой модификации включают ацетил-, гексаноил-, деканоил-, миристоил-, NH-(CH-CH-О)-CO- и пропионил- группы. Предпочтительные примеры С-концевой модификации включают амид-, NH-(CH-CH-O)-СО-амид, и одну или две аминогексаноильные группы. Однако другие N- или С-концевые удлиняющие группы также приведут к получению активных соединений, которые известны специалистам в данной области техники. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанная аминокислотная последовательность LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR или указанный вариант последовательности, как определено в настоящей заявке, содержит на N-конце ацетил-, гексаноил-, деканоил-, миристоил-, NH-(CH-CH-O)-CO- или пропионил группу и на С-конце амид-, NH-(CH-CH-O)-СО-амид- и одну или две аминогексаноильные группы. Как показано в примерах (Таблица 3), полипептиды, содержащие такие N-концевые или С-концевые модификации, сохраняют высокую противомикробную активность. В одном варианте реализации настоящего изобретения предложен полипептид согласно настоящему изобретению, в котором N-конец ацетилирован и С-конец амидирован.
Соответственно, в настоящем изобретении предложен выделенный или рекомбинантный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR, или вариант указанной аминокислотной последовательности, указанный полипептид обладает противомикробной, противобактериальной, противовирусной, противогрибковой, противопаразитарной и/или противовоспалительной активностью, указанный вариант содержит по меньшей мере 16 аминокислот и содержит не более 5, предпочтительно не более 3, более предпочтительно не более 1 из следующих замен аминокислот:
замену L в положении аминокислоты 1 остатком I, V или А
замену А в положении аминокислоты 2 остатком L, V, Q или I
замену R в положении аминокислоты 3 остатком К или H
замену Ε в положении аминокислоты 4 остатком Q
замену Y в положении аминокислоты 5 остатком F или W
замену К в положении аминокислоты 6 остатком R или H
замену К в положении аминокислоты 7 остатком R или H
замену I в положении аминокислоты 8 остатком L, V или А
замену V в положении аминокислоты 9 остатком L, I или А
замену Ε в положении аминокислоты 10 остатком Q
замену К в положении аминокислоты 11 остатком R или H
замену L в положении аминокислоты 12 остатком I, V или А
замену К в положении аминокислоты 13 остатком R или H
замену R в положении аминокислоты 14 остатком К или H
замену W в положении аминокислоты 15 остатком F или Y
замену R в положении аминокислоты 17 остатком H или К
замену Q в положении аминокислоты 18 остатком N, A, S или Τ
замену V в положении аминокислоты 19 остатком L, I или А
замену L в положении аминокислоты 20 остатком I, V или А
замену R в положении аминокислоты 21 остатком К или H
замену Τ в положении аминокислоты 22 остатком Q, N или А
замену R в положении аминокислоты 24 остатком Η или К
замену от 1 до 4 аминокислот соответствующей D-аминокислотой,
2
2
11
2
2
11
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
причем указанная аминокислотная последовательность или вариант указанной последовательности содержит на Ν- и/или С-конце удлиняющую группу, предпочтительно содержит на N-конце ацетил-, гексаноил-, деканоил-, миристоил-, ΝΗ-(СН-СН-О)-СО или пропионил- группа и на С-конце амид-, NH-(CH-CH-O)-СО-амид-, и одну или две аминогексаноильные группы. Специалист в данной области техники поймет, что другие N- или С-концевые удлиняющие группы также позволят получить активные соединения. В настоящей заявке нумерация аминокислот представлена следующим образом: LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR. Указанный полипептид предпочтительно содержит 16-24 аминокислот.
В предпочтительном варианте полипептид согласно настоящему изобретению содержит гидрофобный фрагмент.Добавление гидрофобных групп к катионным (поли)пептидам улучшает их способность к нейтрализации микробного эндотоксина и взаимодействию с микробными мембранами и тем самым улучшает их способность устранять микроорганизмы, например, патогены.
Как описано выше в настоящей заявке, полипептид согласно настоящему изобретению может быть модифицирован с помощью химических методов модификации, известных в данной области техники. Модификации полипептидов согласно настоящему изобретению могут быть введены в течение или в конце синтеза полипептида. Например, при синтезе полипептида с использованием методики твердофазного синтеза, N-концевое ацетилирование может быть осуществлено в конце синтеза с помощью взаимодействия аминокислотной последовательности, которая остается связанной со смолой, с уксусной кислотой. В качестве другого примера, С-концевое амидирование, например, осуществляют с использованием специального вида смолы при твердофазном синтезе пептидов, например, коммерчески доступной смолы Tentagel S AM (ex Rapp, Тюбинген, Германия). Такие смолы содержат химическую метку-манипулятор, от которой амидированные (поли)пептиды высвобождаются во время расщепления. Описанные и другие способы модификации полипептидов известны любому специалисту в данной области техники.
Согласно одному варианту реализации в настоящем изобретении предложен выделенный или рекомбинантный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR или вариант указанной аминокислотной последовательности, указанный полипептид обладает противомикробной, противобактериальной, противовирусной, противогрибковой, противопаразитарной и/или противовоспалительной активностью,
указанный вариант содержит по меньшей мере 16 аминокислот и:
- содержит не более 5 замен аминокислот, перечисленных ниже:
замену одной или более аминокислот, выбранных из группы L, I, V или А, другой аминокислотой, выбранной из указанной группы;
замену одной или более аминокислот, выбранных из группы R, К или Н, другой аминокислотой, выбранной из указанной группы;
замену Е остатком Q
замену Y или W остатком F
замену одной или более аминокислот, выбранных из группы Q, N, A, S или Т, другой аминокислотой, выбранной из указанной группы, и/или
- содержит одну или более замен аминокислот соответствующей D-аминокислотой.
В настоящем изобретении дополнительно предложен мультимер, содержащий не более шести полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR или ее вариант, как определено в настоящей заявке. Указанный мультимер может содержать не более шести полипептидных мономеров, имеющих идентичные аминокислотные последовательности, или не более шести полипептидных мономеров, из которых два или более полипептидных мономеров имеют различные аминокислотные последовательности. В предпочтительном варианте реализации мультимер согласно настоящему изобретению содержит не более шести полипептидов согласно настоящему изобретению, имеющих идентичные аминокислотные последовательности.
В настоящем изобретении дополнительно предложены соли полипептидов согласно настоящему изобретению. Такие соли включают, но не ограничиваются ими, кислотно-аддитивные соли и основно-аддитивные соли. В настоящей заявке термин «фармацевтически приемлемая соль» полипептида относится к соли, которая сохраняет желаемую противомикробную, противобактериальную, противогрибковую, противовирусную, противопаразитарную и/или противовоспалительную активность полипептида и подходит для введения человеку или животным. Способы получения солей полипептидов известны в данной области техники и обычно включают смешивание полипептида с фармацевтически приемлемой кислотой или основанием, например, с помощью взаимодействия продукта в форме свободной кислоты или свободного основания с одним или более эквивалентами соответствующей кислоты или основания в растворителе или среде, в которой соль нерастворима, или в растворителе, таком как вода, который затем удаляют в вакууме или с помощью сублимационной сушки, или путем обмена катионов существующей соли на другой катион на соответствующей ионообменной смоле. Примеры фармацевтически приемлемых кислот и оснований включают органические и неорганические кислоты, такие как муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, молочная кислота, гликолевая кислота, щавелевая кислота, пировиноградная кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота, малоновая кислота, трифторуксусная кислота, коричная кислота, серная кислота, соляная кислота, бромистоводородная кислота, азотная кислота, хлорная кислота, фосфорная кислота и тиоциановая кислота, которые образуют соли аммония со свободными аминогруппами полипептидов, и основания, которые образуют соли карбоновых кислот со свободными карбоксильными группами полипептидов, такие как этиламин, метиламин, диметиламин, триэтиламин, изопропиламин, диизопропиламин и другие моно-, ди- и триалкиламины, и ариламины.
Полипептиды согласно настоящему изобретению могут быть получены различными способами. Например, полипептид может быть синтезирован с использованием общепринятых способов твердофазного синтеза, например, способов, которые включают защиту альфа-аминогрупп с использованием t-BOC или Fmoc, которые хорошо известны в данной области техники. В соответствии с настоящим изобретением аминокислоты последовательно добавляют к растущей цепи аминокислот. Такие способы описаны, например, в работе Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2156; и Atherton et al, «Solid Phase Peptide Synthesis» IRL Press, London, (1989). Способы твердофазного синтеза являются особенно подходящими для синтеза относительно коротких полипептидов, например, полипептидов длиной не более приблизительно 70 аминокислот в крупномасштабном производстве.
В другом варианте, полипептид согласно настоящему изобретению может быть получен с использованием рекомбинантных методик, хорошо известных в данной области техники, с помощью которых нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, экспрессируют в клетках-хозяевах. Следовательно, в настоящем изобретении предложен способ получения полипептида согласно настоящему изобретению, включающий:
обеспечение молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид согласно настоящему изобретению;
трансформацию клетки-хозяина указанной молекулой нуклеиновой кислоты;
культивирование указанной клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного полипептида;
получение указанного полипептида из указанных клеток;
необязательно, модификацию N-конца или С-конца указанного полипептида, например, путем добавления N- и/или С-концевой удлиняющей группы.
В настоящем изобретении дополнительно предложена молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид согласно настоящему изобретению, которая также называется в настоящей заявке молекулой нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. В настоящей заявке молекула нуклеиновой кислоты или последовательность нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению содержит цепь нуклеотидов, предпочтительно ДНК и/или РНК.
В настоящем изобретении дополнительно предложен вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. В настоящей заявке термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, такой как плазмида, бактериофаг или вирус животных, способной вводить гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Вектор согласно настоящему изобретению обеспечивает экспрессию или получение полипептида согласно настоящему изобретению, кодируемого гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Вектор, используемый в соответствии с настоящим изобретением, например, получен из вируса животных, примеры которого включают, но не ограничиваются ими, вирус коровьей оспы (включая ослабленные производные, такие как модифицированный вирус коровьей оспы Анкара, MVA), вирус псевдочумы (NDV), аденовирус или ретровирус.Вектор согласно настоящему изобретению предпочтительно содержит кассету экспрессии, содержащую промотор, который является подходящим для инициации транскрипции полипептида согласно настоящему изобретению в выбранных клетках-хозяевах. Примеры подходящих промоторов для экспрессии полипептидов согласно настоящему изобретению в эукариотических клетках-хозяевах включают, но не ограничиваются ими, промотор бета-актина, промотор иммуноглобулина, промотор 5 S РНК или промоторы, полученные из вирусов, такие как промоторы цитомегаловируса (CMV), вируса саркомы Рауса (RSV) и вируса обезьян 40 (SV40), подходящие для хозяев-млекопитающих.
В настоящем изобретении дополнительно предложена рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты и/или вектор в соответствии с настоящим изобретением. Клетка-хозяин представляет собой клетку, которая была трансформирована или может быть трансформирована молекулой нуклеиновой кислоты, такой как вектор в соответствии с настоящим изобретением. «Трансформация» относится к введению чужеродной нуклеиновой кислоты в реципиентную клетку. Трансформация клетки-хозяина может привести к временной экспрессии рекомбинантного белка с помощью указанной клетки, это означает, что рекомбинантный белок экспрессируется только в течение определенного периода времени. В другом варианте, трансформация реципиентной клетки может привести к стабильной экспрессии, это означает, что нуклеиновая кислота вводится в геном клетки и тем самым передается последующим поколениям клеток. Помимо этого, может быть достигнута индуцируемая экспрессия рекомбинантного белка. Индуцируемая система экспрессии требует присутствия или отсутствия молекулы, которая обеспечивает экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид согласно настоящему изобретению. Примеры индуцируемых систем экспрессии включают, но не ограничиваются ими, системы экспрессии Tet-On и Tet-Off, индуцируемую гормоном систему экспрессии гена, такую как, например, система экспрессии гена, индуцируемая экдизоном, систему экспрессии гена, индуцируемую арабинозой, и индуцируемую систему экспрессии в клетках Drosophila на основе вектора pMT/BiP (Invitrogen), которая включает промотор, индуцируемый металлотионеином. Клетка-хозяин, использованная в способе получения полипептида согласно настоящему изобретению, представляет собой, например, грамположительного прокариота, грамотрицательного прокариота или эукариота. Предпочтительно указанная клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, такую как растительная клетка, дрожжевая клетка, клетка млекопитающего или клетка насекомого, наиболее предпочтительно клетку насекомого или клетку млекопитающего. Примеры подходящих клеток-хозяев включают растительные клетки, такие как клетки кукурузы, клетки риса, клетки ряски, клетки табака (например, клетки BY-2 или NT-1) и клетки картофеля. Примеры дрожжевых клеток включают клетки Saccharomyces и Pichia. Примеры клеток насекомых включают клетки Spodoptera frugiperda, такие как клетки Tn5, SF-9 и SF-21, и клетки дрозофилы, такие как клетки Drosophila Schneider 2 (S2). Примеры клеток млекопитающих, которые подходят для экспрессии полипептида согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются ими, клетки почек африканской зеленой мартышки (Vero), клетки почек детеныша хомячка (например, ВНК-21), клетки сетчатки человека (например, клетки PerC6), клетки мезонефроса человека (например, клетки НЕК293), клетки Мадин-Дарби почек собак (MDCK), фибробласты эмбриона курицы (CEF), клетки мезонфероса курицы (клетки СЕК), эмбриональные стволовые клетки, полученные из бластодермы (например, ЕВ 14), эмбриональные фибробласты мыши (например, клетки 3Т3), клетки яичника китайского хомячка (СНО) и производные этих типов клеток.
Способ согласно настоящему изобретению предпочтительно дополнительно включает этап получения, очистки и/или выделения полипептидов в соответствии с настоящим изобретением. Полученные полипептиды в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно используют в терапии человека, возможно, после дополнительных этапов очистки, выделения или обработки, например, после очистки с помощью гель-электрофореза или хроматографических методов.
Полипептид в соответствии с настоящим изобретением проявляет несколько видов активности, которые могут быть предпочтительно использованы для терапевтического и нетерапевтического применения. В частности, полипептиды в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы для противодействия различным микробным инфекциям, таким как бактериальные инфекции, грибковые инфекции, вирусные инфекции, и противодействия паразитарным инфекциям. В настоящем изобретении, следовательно, предложены фармацевтические композиции, содержащие полипептид в соответствии с настоящим изобретением или его фармацевтически приемлемую соль и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или вспомогательное вещество. В настоящем изобретении также предложены фармацевтические композиции, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты или вектор в соответствии с настоящим изобретением и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или вспомогательное вещество.
В настоящем изобретении предложен полипептид в соответствии с настоящим изобретением для применения в качестве лекарственного средства. В настоящем изобретении также предложена молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид в соответствии с настоящим изобретением, для применения в качестве лекарственного средства. Указанное лекарственное средство может представлять собой терапевтическое или профилактическое средство.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен способ лечения субъекта, страдающего бактериальной, грибковой, вирусной и/или паразитарной инфекцией, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества полипептида согласно настоящему изобретению, фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением или молекула нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением. В настоящем изобретении также предложен способ получения лекарственного средства для лечения субъекта, инфицированного микроорганизмом, или для профилактики микробной инфекции. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения указанный микроорганизм представляет собой бактерию, грибок, вирус или паразита. В настоящем изобретении также предложен полипептид и/или молекула нуклеиновой кислоты для применения в соответствии с настоящим изобретением для лечения микробной, бактериальной, грибковой, вирусной и/или паразитарной инфекции или состояния, вызванного микробной, бактериальной, грибковой, вирусной и/или паразитарной инфекцией.
В настоящем изобретении термин «субъект» представляет собой человека или животное. Субъекты включают, но не ограничиваются ими, млекопитающих, таких как люди, свиньи, хорьки, тюлени, кролики, кошки, собаки, коровы и лошади, и птиц, таких как куры, утки, гуси и индейки. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения субъектом является млекопитающее. Согласно особенно предпочтительному варианту реализации субъектом является человек.
В настоящем изобретении также предложен способ ингибирования размножения микроорганизма, например, бактерии, вируса, грибка или паразита, включающий приведение указанного микроорганизма или паразита в контакт с полипептидом или фармацевтической композицией согласно настоящему изобретению. Указанное приведение в контакт может быть осуществлено в условиях in vivo и in vitro.
Полипептиды и фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением эффективны при лечении различных микробных инфекций, таких как различные вирусные, бактериальные и грибковые инфекции. Например, полипептиды и фармацевтические композиции являются эффективными в лечении инфекций, вызванных грамотрицательными и грамположительными бактериями. Примеры патогенных бактерий, которые могут вызывать инфекции у человека или животных, поддающиеся лечению с использованием полипептидов и композиций согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются ими, бактерии Listeria, Escherichia, Chlamydia, Rickettsia, Mycobacteria, Staphylococci, Streptocci, Pneumonococci, Meningococci, Klebsiella, Pseudomonas, Legionella, Corynebacterium diphtheriae, Salmonella, Bacilli, Vibrio cholerae, Clostridium tetani, Clostridium, Bacillus, Yersinia и Leptospira.
Примеры патогенных вирусов, которые могут вызывать инфекции у человека или животных, поддающиеся лечению с использованием полипептидов и композиций согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются ими, гепатит А, В или С, вирус герпеса (например, VZV, HSV-I, HAV-6, HSV-II, CMV, вирус Эпштейна-Барр), аденовирус, вирус гриппа, флавивирусы, эховирус, риновирус, вирус Коксаки, коронавирус, респираторно-синцитиальный вирус (РСВ), ротавирус, морбилливирус, вирус краснухи, парвовирус, вирус коровьей оспы, вирус HTLV, вирус денге, вирус папилломы, вирус полиомиелита, вирус бешенства и вирус иммунодефицита человека (ВИЧ-вирус, например, типа I и И).
Примеры патогенных грибков, которые могут вызывать инфекции у человека или животных, поддающиеся лечению с использованием полипептидов и композиций согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются ими, Candida (например, albicans, krusei, glabrata, tropicalis), Aspergillus (например, fumigatus, niger), Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, род Mucorales, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis и Coccidioides immitis.
Примеры патогенных паразитов, которые могут вызывать инфекции у человека или животных, поддающиеся лечению с использованием полипептидов и композиций согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются ими, Entamoeba histolytica, Plasmodium (например, falciparum, vivax), Entamoeba, Giardia, Balantidium coli, Acanthamoeba, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Babesia microti, Trypanosoma (например, brucei, cruzi), Leishmania (например, donovani) и Toxoplasma gondii.
В предпочтительном варианте полипептиды и фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению являются эффективными при лечении инфекций, вызванных метициллин-устойчивым Staphylococcus aureus (МРЗС) и (неустойчивым) Staphylococcus aureus, грамотрицательной бактерией Pseudomonas aeruginosa и видами грибков Candida albicans и Aspergillus niger.
Композиции, содержащие полипептиды, могут быть введены для профилактического и/или терапевтического лечения. При терапевтическом применении полипептиды или композиции вводят субъекту, предпочтительно человеку, уже страдающему заболеванием, в количестве, достаточном для того, чтобы противодействовать симптомам инфекции или состояния, вызванного инфекцией и ее осложнениями. При профилактическом применении полипептиды или композиции вводят субъекту, например, человеку или животному, которое подвержено риску развития микробной или паразитарной инфекции, в количестве, достаточном для того чтобы предотвратить инфекцию или по меньшей мере ингибировать развитие инфекции. Полипептид, как правило, присутствует в фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением в терапевтическом количестве, которое представляет собой количество, достаточное для излечения состояния или заболевания, в частности, симптомов, связанных с микробной или паразитарной инфекцией. Типичные дозы для введения полипептида согласно настоящему изобретению или комбинаций по меньшей мере двух полипептидов находятся в диапазоне от 0,01 и 10 мг полипептида на кг массы тела, в зависимости от размера полипептида.
Полипептиды и фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению являются особенно подходящими для местного применения, например, для лечения или предотвращения инфекций кожи, раневых инфекций и инфекций мочевых путей. Как подробно описано в настоящей заявке выше, полипептиды согласно настоящему изобретению способны предотвращать образование биопленки и диспергировать существующие биопленки, вызывать гибель бактерий, грибков и других микробов в месте образования биопленки и вокруг него и модулировать иммунный ответ путем нейтрализации провоспалительных микробных эндотоксинов. Бактериальные биопленки могут задержать заживление кожных ран и уменьшить местную противобактериальную эффективность обычных антибиотиков при заживлении или лечении инфицированных ран кожи, инфекций кожи или инфекций мочевыводящих путей. Полипептиды в соответствии с настоящим изобретением являются, например, особенно подходящими при заживлении ран, как было показано в примерах настоящей заявки. В примерах показано, что полипептиды согласно настоящему изобретению эффективно вызывают гибель бактерий, локализованных в биопленках, в модели инфекции ожоговой раны на основе кератиноцитов, выращенных на слое фибробластов человека. Согласно одному варианту реализации в настоящем изобретении, следовательно, предложен полипептид, фармацевтическая композиция и/или молекула нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением для применения в лечении или предотвращении инфекции кожи, раневой инфекции и/или инфекции мочевых путей. В настоящем изобретении также предложено применение полипептида, фармацевтической композиции и/или молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению для применения при заживлении ран. В настоящем изобретении дополнительно предложено применение полипептида, фармацевтической композиции и/или молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению в производстве фармацевтической композиции для лечения или предотвращения инфекции кожи, раневой инфекции, инфекции мочевых путей и/или для заживления ран. В настоящем изобретении дополнительно предложен способ лечения субъекта, страдающего инфекцией кожи, раневой инфекцией и/или инфекцией мочевых путей, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества полипептида в соответствии с настоящим изобретением, фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением или молекулы нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением.
Полипептиды и фармацевтические композиции также можно применять в качестве противовоспалительных агентов, поскольку они нейтрализуют провоспалительные микробные эндотоксины, такие как липотейхоевая кислота, пептидогликан и липополисахариды, тем самым ингибируя, уменьшая или предотвращая приток нейтрофилов, макрофагов/моноцитов и лимфоцитов и высвобождение провоспалительных микробных соединений у инфицированного субъекта. В настоящем изобретении также предложен способ ингибирования высвобождения провоспалительных соединений, включающий приведение клетки, способной к высвобождению провоспалительных соединений, в контакт с полипептидом в соответствии с настоящим изобретением. Указанное приведение в контакт может быть осуществлено в условиях in vivo и in vitro. В настоящем изобретении также предложен полипептид в соответствии с настоящим изобретением для применения в качестве противовоспалительного агента.
Полипептид согласно настоящему изобретению предпочтительно включен в носитель с контролируемым высвобождением и/или носитель, обеспечивающий направленную доставку. В настоящей заявке термин «контролируемое высвобождение» относится к высвобождению полипептида согласно настоящему изобретению, которое изменяется по времени. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения контролируемое высвобождение относится к медленному высвобождению. В настоящей заявке термин «направленная доставка» относится к высвобождению полипептида согласно настоящему изобретению сайт-направленным способом. Использование носителя с контролируемым высвобождением является предпочтительным ввиду того, что позволяет избежать частого введения, например, путем инъекции полипептида согласно настоящему изобретению. Использование носителя, обеспечивающего направленную доставку, является предпочтительным ввиду того, что полипептид согласно настоящему изобретению эффективно доставляется и/или удерживается в очаге, представляющем интерес, в теле субъекта, таком как очаг воспаления или очаг инфекции. Предпочтительно полипептид согласно настоящему изобретению направлен к очагу, инфицированному микроорганизмами, включая бактерии, грибки, вирусы и паразитов. Носители с контролируемым высвобождением и/или носители, обеспечивающие направленную доставку, хорошо известны в данной области техники. Неограничивающие примеры носителей с контролируемым высвобождением и/или носителей, обеспечивающих направленную доставку, включают наночастицы, микрочастицы, нанокапсулы, микрокапсулы, липосомы, микросферы, гидрогели, полимеры, липидные комплексы, сывороточный альбумин, антитела, циклодекстрины и декстраны. Контролируемое высвобождение, например, обеспечивается путем встраивания полипептида согласно настоящему изобретению в такой носитель или прикрепления на его поверхности. Носители состоят из материалов, образующих частицы, которые захватывают полипептид согласно настоящему изобретению и медленно разрушаются или растворяются в соответствующей среде, такой как водная, кислотная или основная среда или физиологические жидкости, и тем самым высвобождают полипептид. Направленная доставка, например, достигается посредством обеспечения носителя, содержащего направляющие группы на своей поверхности. Примеры указанного носителя, содержащего направляющие группы, включают носители, функционализированные с помощью антител, носители, имеющие сайтспецифичный лиганд, и носители, имеющие положительный или отрицательный поверхностный заряд. Предпочтительные частицы для контролируемого высвобождения и/или направленной доставки представляют собой наночастицы, т.е. частицы, диаметр которых находится в диапазоне приблизительно от 1 до 500 нм, предпочтительно не более приблизительно 200 нм в диаметре, и липосомы, возможно, содержащие направляющие группы.
Исходя из вышеизложенного, настоящее изобретение дополнительно обеспечивает носитель, обеспечивающий контролируемое высвобождение, содержащий полипептид согласно настоящему изобретению, и фармацевтические композиции, содержащие указанный носитель с контролируемым высвобождением. В настоящем изобретении предложен носитель, обеспечивающий направленную доставку, содержащий полипептид согласно настоящему изобретению, и фармацевтические композиции, содержащие указанный носитель, обеспечивающий направленную доставку. Указанный носитель, в одном из вариантов реализации, выбран из группы, состоящей из наночастиц, микрочастиц, нанокапсул, микрокапсул, липосом, микросфер, гидрогелей, полимеров, липидных комплексов, сывороточного альбумина, антител, циклодекстринов и декстрана.
Предпочтительные носители для направленной доставки и/или носители с контролируемым высвобождением состоят из биоразлагаемых материалов. В настоящей заявке термин «биоразлагаемый» относится к молекулам, которые разлагаются в физиологических условиях. Такие молекулы включает те, которые поддаются гидролитическому расщеплению, и молекулы, которые требуют ферментативного расщепления. Подходящие биоразлагаемые материалы включают, но не ограничиваются ими, биоразлагаемые полимеры и природный биоразлагаемый материал, такой как PLA (полимолочная кислота), PGA (полигликолевая кислота), поликапролактон (РСА), полиэтиленоксид (PEO), полидиоксанон (PDS), поликапролактон (PCL), полипропилен фумарат, полимеры, полученные из лактонов, таких как лактид, гликолид и капролактон, карбонаты, такие как триметиленкарбонат и тетраметиленкарбонат, диоксаноны, этиленгликоль, полиэфирамид (PEA) этиленоксида, эфирамиды, γ-гидроксивалерат, β-гидроксипропионат, α-гидроксикислоты, гидроксибутираты, гидроксиалканоаты, полиимидкарбонаты, полиуретаны, полиангидриды и их комбинации, полисахариды, такие как гиалуроновая кислота, хитозан и целлюлоза, и белки, такие как желатин и коллаген.
Полипептиды согласно настоящему изобретению можно предпочтительно использовать в качестве консерванта для материалов, которые чувствительны к микробной, например, бактериальной, вирусной, грибковой, паразитарной инфекции. Такой материал может быть пропитан или обернут, или покрыт полипептидом согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептид согласно настоящему изобретению используют в качестве консерванта для медицинских устройств. В настоящей заявке термин «медицинские устройства» относится к устройствам, которые можно использовать в организме человека или животного, и включает, но не ограничивается ими, медицинские инструменты, медицинское оборудование, протезы, такие как искусственные суставы, включая бедренные и коленные суставы, и стоматологические протезы, имплантаты молочной железы, имплантируемые устройства, такие как стимуляторы сердечной активности, сердечные клапаны, стенты, катетеры, ушные трубки, шины, винты для медицинских устройств, и повязки для ран или тканей. Такие медицинские устройства являются особенно подходящими для прикрепления, например, бактерий, включая прикрепление как отдельных бактерий, так и бактерий в биопленках.
В соответствии с настоящим изобретением, следовательно, также предложено применение полипептида согласно настоящему изобретению в качестве консерванта для медицинского устройства. В настоящем изобретении также предложено покрытие, предпочтительно для медицинских устройств, содержащее полипептиды согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанное покрытие обеспечивает контролируемое высвобождение полипептида согласно настоящему изобретению. Указанное покрытие с контролируемым высвобождением для медицинских устройств предпочтительно содержит биоразлагаемый материал так, что высвобождение полипептида согласно настоящему изобретению достигается с помощью разложения материала покрытия. В настоящем изобретении, следовательно, также предложено покрытие с контролируемым высвобождением, содержащее полипептид согласно настоящему изобретению. В настоящем изобретении дополнительно предложено медицинское устройство, содержащее указанное покрытие, содержащее полипептид согласно настоящему изобретению и биологически разлагаемый материал. Биоразлагаемое покрытие в соответствии с настоящим изобретением содержит биоразлагаемый материал, определенный выше. В частности, указанное биоразлагаемое покрытие содержит материал, выбранный из группы, состоящей из PLA (полимолочной кислоты), PGA (полигликолевой кислоты), поликапролактона (РСА), полиэтиленоксида (PEO), полидиоксанона (PDS), поликапролактона (PCL), полипропиленфумарата, полимеров, полученных из лактонов, таких как лактид, гликолид и капролактон, карбонатов, таких как триметиленкарбонат и тетраметиленкарбонат, диоксанонов, этиленгликоля, полиэфирамида (PEA) этиленоксида, эфирамидов, β-гидроксивалерата, β-гидроксипропионата, альфа-гидроксикислоты, гидроксибутиратов, гидроксиалканоатов, полиимидкарбонатов, полиуретанов, полиангидридов и их комбинации, полисахаридов, таких как гиалуроновая кислота, хитозан и целлюлоза, и белков, таких как желатин и коллаген.
Несмотря на то, что полипептиды в соответствии с настоящим изобретением являются эффективными противомикробными агентами, их можно комбинировать с известными противомикробными агентами, такими как обычные противобактериальные агенты, такие как антибиотики, противовирусные и противогрибковые препараты или другие противомикробные пептиды, а также антителами и химическими веществами, например, сенсибилизаторами, наночастицами. Такая комбинация может привести к увеличению противомикробной активности или расширению спектра активности. Полипептиды согласно настоящему изобретению можно, например, комбинировать с пенициллинами, цефалоспоринами, макролидами, фторхинолонами, сульфаниламидами, тетрациклинами и/или аминогликозидами для лечения бактериальных инфекций. Для лечения вирусных инфекций полипептиды можно комбинировать с противовирусными аналогами нуклеозидов, такими как ацикловир, ганцикловир, зидовудин (ΑΖΤ) или диданозин, или ингибиторами нейраминидазы, такими как озельтамивир, перамивир или занамивир. Для лечения грибковых инфекций полипептиды и композиции согласно настоящему изобретению можно комбинировать с полиеновыми противогрибковыми препаратами, имидазолами, триазолами, аллиламинами, эхинокандинами, циклопироксом, флуцитозином и/или гризеофульвином. В настоящем изобретении, следовательно, предложена фармацевтическая композиция, содержащая полипептид в соответствии с настоящим изобретением и дополнительный противомикробньш агент, такой как антибиотик или противомикробньш пептид, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из пенициллинов, цефалоспоринов, карбапенемов и мупироцина.
Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением содержат по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество. Примеры подходящих носителей, например, включают гемоцианин лимфы улитки (KLH), сывороточный альбумин (например, BSA или RSA) и овальбумин. В предпочтительном варианте указанный подходящий носитель представляет собой раствор, например, физиологический солевой раствор. Примеры вспомогательных веществ, которые могут быть включены в таблетки, капсулы и т.п., включают следующие: связующее вещество, такое как трагакантовая камедь, гуммиарабик, кукурузный крахмал или желатин; вспомогательное вещество, такое как микрокристаллическая целлюлоза; дезинтегрирующий агент, такой как кукурузный крахмал, прежелатинизированный крахмал, альгиновая кислота и тому подобное; смазывающее вещество, такое как стеарат магния; подсластитель, такой как сахароза, лактоза или сахарин; ароматизатор, такой как мята перечная, масло грушанки или вишни. В тех случаях, когда стандартная лекарственная форма представляет собой капсулу, она может содержать, в дополнение к материалам указанного выше типа, жидкий носитель, такой как нелетучее масло. Различные другие материалы могут присутствовать в качестве покрытий или для модификации иным образом физической формы стандартной лекарственной формы. Например, таблетки могут быть покрыты шеллаком, сахаром или ими обоими. Сироп или эликсир может содержать активное соединение, сахарозу в качестве подсластителя, метил- и пропилпарабены в качестве консервантов, краситель и ароматизатор, например, вишневый или апельсиновый. Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно подходит для применения у человека.
Фармацевтические композиции, описанные в настоящей заявке, могут быть введены множеством различных способов. Примеры включают введение фармацевтической композиции, содержащей полипептид в соответствии с настоящим изобретением и содержащей фармацевтически приемлемый носитель, с помощью перорального, интраназального, ректального, местного, внутрибрюшинного, внутривенного, внутримышечного, подкожного, субдермального, чрескожного, интратекального и внутричерепного способов введения. В случае перорального введения активный ингредиент можно вводить в виде твердых лекарственных форм, таких как капсулы, таблетки и порошки, либо в виде жидких лекарственных форм, таких как эликсиры, сиропы и суспензии.
Стерильные композиции для инъекций могут быть приготовлены в соответствии с требованиями стандартной фармацевтической практики путем растворения или суспендирования полипептида согласно настоящему изобретению в носителе для инъекций, таком как вода или природное растительное масло, такое как кунжутное масло, кокосовое масло, арахисовое масло, хлопковое масло и т.д., или в синтетическом жирном носителе, таком как этилолеат или т.п. В состав композиции также могут быть включены буферы, консерванты, антиоксиданты и т.п.
В предпочтительном варианте реализации фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим изобретением изготавливают для местного введения. В настоящей заявке «местное введение» относится к нанесению на поверхность тела, такую как кожа или слизистые оболочки, для местного лечения состояний, вызванных микробными или паразитарными инфекциями. Примеры составов, походящих для местного введения, включают, но не ограничиваются ими, крем, гель, мазь, лосьон, пену, суспензию, спрей, аэрозоль, порошковый аэрозоль. Лекарственные средства для местного введения могут быть предназначены для накожного нанесения, это означает, что их наносят непосредственно на кожу. Лекарственные средства для местного введения также могут представлять собой ингаляционные препараты, например, препараты для нанесения на эпителий слизистой оболочки дыхательных путей, или нанесения на поверхность тканей, отличных от кожи, например, глазные капли, которые наносят на конъюнктиву, или ушные капли, которые вносят в ухо. Указанная фармацевтическая композиция, изготовленная для местного введения, предпочтительно содержит по меньшей мере одно фармацевтическое вспомогательное вещество, подходящее для местного применения, такое как эмульгатор, разбавитель, увлажнитель, консервант, регулятор рН и/или вода.
Полипептид в соответствии с настоящим изобретением также является особенно подходящим для диагностического применения. Полипептиды можно использовать для детектирования микробной инфекции, например, путем детектирования микробных токсинов, например, бактериальных токсинов, включая LPS, LTA и PG, присутствующих в физиологических образцах, таких как кровь, плазма, слизь, раневой экссудат и моча. Полипептиды также можно использовать для определения количества микробных токсинов в указанных образцах. В настоящем изобретении, следовательно, предложена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид согласно настоящему изобретению, для применения в качестве диагностического агента. В настоящем изобретении также предложено применение полипептида согласно настоящему изобретению для детектирования микробного токсина, предпочтительно бактериального или грибкового токсина, в физиологическом образце, например, в образце крови, плазмы, слизи, раневого экссудата и мочи. Как описано выше, полипептид согласно настоящему изобретению может быть присоединен к соответствующему фрагменту, такому как биотин, метка на основе флуоресцеина, краситель с испусканием в ближнем инфракрасном диапазоне или радиоактивный изотоп. Такие меченые полипептиды можно использовать в соответствии со способом детектирования микробных инфекций, таких как бактериальные инфекции, поскольку они мигрируют к очагу микробной инфекции. Используя детектор, подходящий для используемой метки, прикрепленной к полипептиду, можно детектировать очаги инфекций. Следовательно, в настоящем изобретении также предложены способы детектирования микробных инфекций, таких как бактериальные инфекции. Способ, как правило, включает введение меченого полипептида субъекту, инфицированному или у которого подозревают наличие инфекции, вызванной микроорганизмом. Поскольку меченый полипептид способен взаимодействовать с инфекционным организмом, то он накапливается в очаге инфекции. Применительно к детектированию микробных токсинов в физиологическом образце способ включает введение меченого полипептида в физиологический образец субъекта, инфицированного или у которого подозревают наличие инфекции, вызванной микроорганизмом. Существует возможность детектирования накопления полипептида в очаге инфекции или в образце с использованием различных детекторов, которые чувствительны к метке, которая присоединена к полипептиду.
Другой подходящий способ применения полипептидов согласно настоящему изобретению заключается в консервировании пищевых продуктов. В настоящем изобретении, следовательно, также предложено применение полипептида согласно настоящему изобретению в качестве пищевого консерванта. В целом, патогенные микроорганизмы или микроорганизмы, вызывающие порчу, разрушаются с помощью термической обработки пищевых продуктов, при которой продукты подвергают воздействию температур, находящихся в пределах от 60 до 100°С. Такая обработка может оказывать нежелательное влияние на пищевой продукт, такое как нежелательное органолептическое влияние. Применение полипептида согласно настоящему изобретению в качестве консерванта в пищевых продуктах может привести к увеличению срока хранения и/или повышению безопасности пищевого продукта.
Патогенные микроорганизмы в пищевых продуктах могут привести к инфицированию или интоксикации субъектов и включают бактерии, такие как Campylobacter jejuni, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, и нетифоидные виды Salmonella, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Shigella и Clostridium Botulinum, вирусы, такие как ротавирусы и вирус Норуолк, паразитов, таких как Taenia solium, Taenia saginata и Trichinella spiralis, и плесневые грибы. Порча продуктов относится к изменению внешнего вида, консистенции, аромата и/или запаха пищевых продуктов, и может быть вызвана бактериями, такими как Lactobacillus, Leuconostoc, Pseudomonas, Micrococcus, Flavobacterium, Serratia, Enterobacter и Streptococcus, грибами, такими как Aspergillus, Fusarium и Cladosporium, и дрожжами.
Настоящее изобретение будет более подробно описано с помощью неограничивающих примеров, приведенных ниже.
Краткое описание чертежей
Фигура 1: Упрощенная схема этапов механизма действия ПМП, на которой показаны две наиболее известные модели нарушения целостности мембраны (ковровая модель и модель образования пор) и перенос ПМП во внутриклеточную среду. Для того чтобы связаться с цитоплазматической бактериальной мембраной, которая состоит преимущественно из анионного фосфатидилглицерина (PG) и нейтрального фосфатидилэтаноламина (РЕ), ПМП должны переместиться через внеклеточный полимерный матрикс биопленки, а также наружную мембрану и/или слой пептидогликана/липотейхоевой кислоты (не показаны для упрощения), что осуществляется, в основном, за счет электростатических сил.
90
99
99,9
Фигура 2: Гибель штамма МРЗС LUH14616 под действием пептидов Р60.4Ас (Nell MJ et al. Peptides (2006) 649-660) и пептидов Р2, Р3, Р4, Р5, Р6, Р9, Р10, P11, Р12, Р13, Р14, Р15, Р16, Р17 and Ρ19, представленная как количество КОЕ (колониеобразующих единиц) МРЗС на мл культуральной среды при различных концентрациях пептидов (А) и значениях ИК, ИК и ИК (90%, 99% и 99,9% ингибирующая концентрация) в отношении пептидов (В).
Фигура 3: Гибель МРЗС в присутствии различных концентраций Р60.4Ас и Р10, представленная как количество КОЕ МРЗС на мл культуральной среды.
Фигура 4: Влияние LL-37, Р60.4Ас, Р10 и мупироцина на штамм МРЗС LUH14616 в модели термического ранения кожи, представленное как количество КОЕ МРЗС LUH14616 в модели кожи (А) и выживание МРЗС LUH14616 (в %) в модели кожи.
Фигура 5: Влияние LL-37, Р60.4АС, Р10 и мупироцина на устойчивый к мупироцину штамм МРЗС LUH15051 в модели термического ранения кожи, представленное как количество КОЕ МРЗС LUH15051 в модели кожи (А) и выживание МРЗС LUH15051 (в %) в модели кожи.
Примеры
Материалы и методы
Синтез противомикробных пептидов
2
Синтетические пептиды получали путем стандартных химических реакций с использованием Fmoc с помощью предварительно загруженной смолы TentaGel, PyBop/NMM для активации in situ и 20% пиперидина в н-метил-2-пирролидоне для удаления Fmoc [Hiemstra HS et al. Proc Natl Acad Sci USA, 94, 10313-10318 (1997)]. Реакции связывания проводили в течение 60 мин в присутствии 6-кратного избытка ацилирующих фрагментов. После окончательного удаления Fmoc пептиды расщепляли с использованием смеси TFA/HO в соотношении 19:1 (об./об.), содержащей дополнительные поглотители, если в пептидной последовательности присутствовали С (триэтилсилан) или W (этантиол). Пептиды выделяли с помощью осаждения эфиром/пентаном в соотношении 1:1 (об./об.), с последующим выделением продукта путем центрифугирования. После сушки на воздухе при температуре около 40°С пептиды растворяли в смеси уксусной кислоты/воды в соотношении 1:10 (об./об.) и лиофилизировали. Чистоту пептидов контролировали с помощью UPLC-MS (Acquity, Waters) и целостность пептидов контролировали, используя масс-спектрометрию MALDI-TOF (Microflex, Bruker), при этом пептиды имели ожидаемые молекулярные массы.
Сокращения:
Fmoc: 9Н-фторенилметилоксикарбонил
NMM: N-метилморфолин
РуВОР: бензотриазол-1-ил-окси-трис-пирролидино-фосфонийгексафторфосфат
TFA: трифторуксусная кислота
Бактериальные штаммы
Клинический изолят метициллин-резистентного золотистого стафилококка (МРЗС), LUH14616 был любезно предоставлен др. С. Кросс (S. Croes), Медицинский центр Университета Маастрихта, Маастрихт, Нидерланды (см. Croes S ВМС Microbiol. 2009; 9:229. doi: 10.1186/1471-2180-9-229) и штамм мупироцин-резистентного МРЗС LUH 15051 был любезно предоставлен др. М. Хек (Мах Е.О.С. Heck) (Лаборатория инфекционных болезней и скрининга, Национальный институт здравоохранения и окружающей среды, PJVM, Билтховен, Нидерланды).
Штамм S. aureus JAR описан в работе Campoccia et ah (Int J Artif Organs. 2008 Sep; 31(9):841-7).
Бактерии хранили при -80°C до использования. Инокуляты бактерий, находящихся в середине логарифмической фазы размножения, получали путем инкубирования выделенных колоний МРЗС из чашек с кровяным агаром в триптическом соевом бульоне (ТСБ) (Becton Dickinson, Ле Пон-де-Кла, Франция) в течение 2,5 ч, а затем разводили до необходимой концентрации.
Количественный способ исследования гибели в условиях in vitro
6
90
99
99,9
Для осуществления количественного способа исследования гибели бактерий, находящихся в середине логарифмической фазы размножения, в условиях in vitro, штаммы МРЗС LUH14616 и МРЗС LUH15051 ресуспендировали до концентрации 1×10 бактерий/мл в фосфатно-солевом буфере (ФСБ). Затем по 200 мкл добавляли к пептидам LL-37, Р60.4Ас (ОР-145) и Р10 в различных концентрациях, которые заранее лиофилизировали. Затем смесь бактерии-пептид инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Чтобы установить способность указанных пептидов вызывать гибель бактерий, суспензии последовательно разбавляли и высевали на чашки с агаром DST для измерения количества жизнеспособных КОЕ. Значения ИК, ИК и ИК рассчитывали с помощью линейной регрессии.
99,9
Для осуществления количественного способа исследования гибели бактерий с использованием вариантов Р10, штамм S. aureus JAR (1 млн. КОЕ/мл) инкубировали в течение 2 часов при 37°С с различными концентрациями пептидов в ФСБ либо в смеси ФСБ/плазма человека (1:1, об./об.). В таблицах 2-6 приведена концентрация пептида, которая вызывает гибель 99,9% бактерий (оставалось 1000 КОЕ/мл). Величина ЛК представляет собой среднее значение из двух независимых экспериментов.
Эквиваленты кожи человека
5
-5
-5
2
Эквиваленты кожи человека получали, как описано в работе El Ghalbzouri et al. (Lab Invest. 2004 Jan; 84(1):102-12). В общих чертах, 5×10 нормальных кератиноцитов человека высевали на фибробласты крысы, заселяющие коллагеновый матрикс хвоста крыс. Коллагеновые матриксы получали заранее путем создания базального (0,1% уксусная кислота, 4 мг/мл коллагена, сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS, ×10), 1 M NaOH и ФТС) и верхнего слоя коллагена, в которые высевали нормальные фибробласты человека (4 мг/мл коллагена, ×10 HBSS, 1 M NaOH, ФТС и фибробласты). Трансвел-фильтры с размером пор 3 мкм (Corning 3414, Costar) использовали для культивирования эквивалентов кожи человека. Коллагеновые матриксы культивировали в среде фибробластов в течение недели. Эквиваленты кожи человека полной толщины сначала культивировали погруженными в среду кератиноцитов в течение 2 или 3 дней при 37°С и 7,3% СО и затем культивировали в среде кератиноцитов, как описано выше, но с добавлением 1% ФТС и 2 M L-серина, 10 мМ L-карнитина, 1 мкМ DL-α-токоферола ацетата, 50 мкМ аскорбиновой кислоты, липидной добавки, которая содержала пальмитиновую кислоту, линолевую кислоту и арахидоновую кислоту в соотношении 1:1:1, и 2,4×10 M бычьего сывороточного альбумина. Через 2 или 3 дня эквиваленты кожи человека культивировали на границе раздела фаз воздух-жидкость в течение 14 дней в среде кератиноцитов, как описано выше, но без сыворотки и с добавлением 2 M L-серина, 10 мМ L-карнитина, 1 мкМ DL-α-токоферола ацетата, 50 мкМ аскорбиновой кислоты, липидной добавки, которая содержала 25 мкМ пальмитиновой кислоты, 30 мкМ линолевой кислоты и 7 мкМ арахидоновой кислоты (2:1:1), и 2,4×10 M бычьего сывороточного альбумина. Культуральную среду обновляли два раза в неделю.
Модель инфекции ожоговой раны и экспериментальное лечение
2
5
2
Модели полноразмерной кожи реконструировали, как описано выше, с использованием Трансвел-фильтров с размером пор 0,4 мкм (Corning Costar 3460). Через 10 дней культивирования на границе раздела фаз воздух-жидкость, создавали ожоговые раны площадью 20 мм путем нанесения жидкого азота на кожные эквиваленты в течение 15 сек. Термически поврежденные кожные эквиваленты инкубировали в течение 1 ч при 37°С и 7,3% СО перед инфицированием. Инфекцию создавали путем нанесения инокулята 1×10 МРЗС на кожные эквиваленты. После инкубации в течение 1 часа неприкрепившиеся бактерии удаляли. Лечение начинали через 1 или 8 часов после инфицирования, вводили однократную дозу (100 мкг в 100 мл ФСБ) LL-37, Р60.4Ас или Р10. Лечение продлевали на 4 или 24 ч до обработки. Кожные эквиваленты промывали 1 мл ФСБ, чтобы удалить все неприкрепившиеся бактерии. Затем отбирали два образца биопсии толщиной по 4 мм и гомогенизировали в 1 мл ФСБ. Гомогенаты и смывы серийно разводили для измерения количества жизнеспособных КОЕ на чашках с агаром для диагностики чувствительности (DST).
Результаты
Идентификация Р10
Синтезировали набор из 15 пептидов. Пептиды разрабатывали для того чтобы либо усилить, либо ослабить предсказанную амфипатическую структуру по сравнению с Р60.4Ас (Nell MJ et al. Peptides (2006) 649-660), на основании предсказанных с помощью программного обеспечения структур. Активность, направленная против биопленок, сильно варьируется среди пептидов (используя этот способ были получены противомикробные пептиды с более высокой и более низкой активностью). Ожидалось, что между модификацией амфипатической спиральной структуры и активностью противомикробных пептидов, направленной против биопленок, существует чувствительная взаимосвязь. На основании этих наблюдений разрабатывали ряд коротких синтетических пептидов и оценивали их противомикробную активность. Активность таких пептидов варьировалась от отсутствия противомикробной активности до пептидов, обладающих активностью, которая превышала таковую для LL-37 на молярной основе. Последовательности Р60.4Ас и 15 исследованных пептидов приведены ниже:
90
Пептид Р10 очень эффективно вызывает гибель МРЗС LYH14616. Он имеет максимальную активность в отношении МРЗС LUH14616 из всех исследованных пептидов и даже значительно более эффективен, чем Р60.4Ас (ОР-145), см. Фиг. 2А и В. Например, величина ИК99;9 в отношении Р10 составляет 0,59 мкМ, это означает, что в указанной концентрации Р10 вызывает гибель 999 из 1000 бактерий. Р60.4Ас в аналогичной и даже незначительно более высокой концентрации 0,75 мкМ вызывает гибель только 900 из 1000 бактерий (ИК составляет 0,75 мкМ). Таким образом, в 100 раз больше бактерий выживает после лечения с использованием Р60.4Ас по сравнению с этим показателем после лечения с использованием Р10 в аналогичной концентрации. Следовательно, активность Р10 приблизительно в 100 раз выше, чем активность Р60.4Ас.
Активность Р10 и его вариантов
Пептид 10 более эффективно, чем LL-37 и Р60.4Ас, вызывал гибель МРЗС и мупироцин-резистентного МРЗС и устранял эти бактерии из эквивалентов кожи человека в модели термической раны (Фиг. 3-5).
Р10 является высокоэффективным в отношении бактерий МРЗС в логарифмической фазе размножения, стационарных бактерий и бактерий, локализованных в биопленках.
Помимо этого, Р10 высокоэффективен в отношении:
1) грамположительных бактерий, например, различных метициллин-резистентных штаммов, а также чувствительных штаммов (см. фигуры 4 и 5) Staphylococcus epidermidis, 2) грамотрицательных бактерий, включая различные (устойчивые к лекарственным препаратам) штаммы Pseudomonas aeruginosa, (устойчивые к лекарственным препаратам) штаммы Acinetobacter baumannii,
3) микобактерий, и
4) грибковых патогенов (флуконазол-резистентных) Candida albicans и Aspergillus niger.
2
2
11
Варианты PI 0, в которых одна или все аминокислоты были заменены соответствующей D-аминокислотой или одна аминокислота была заменена другой аминокислотой, обладают противомикробной активностью, которая сравнима с таковой для Р10. Также варианты, содержащие различные удлиняющие N-концевые или С-концевые группы, включая ацетил, амид, NH-(CH-CH-О)-CO, гексаноил, деканоил, миристоил, пропионил, одну или две аминогексаноильные группы, и более короткие варианты Р10 обладают противомикробной активностью, которая сопоставима с таковой для Р10. Последовательность и активность указанных вариантов Р10 приведена в таблицах 2, 3, 5 и 6. Пептиды, в которые были введены замены остатком пролина, чтобы разомкнуть спираль, в основном были неактивными (см. таблицу 4).
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Академиш Зикенхойс Лейден х.о.д.н. ЛЮМК
<120>  Противомикробный пептид
<130>  P100005PC00
<140>  PCT/NL2014/050295
<141>  2014-05-09
<150>  EP 13167240.4
<151>  2013-05-10
<160>  107
<170>  PatentIn версия 3.5
<210>  1
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  противомикробный пептид
<400>  1
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  2
<211>  16
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  2
Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu Arg Gln Val Leu
1               5                   10                  15
<210>  3
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  3
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  4
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  4
Ile Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  5
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  5
Val Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  6
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  6
Ala Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  7
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  7
Leu Leu Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  8
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  8
Leu Val Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  9
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  9
Leu Gln Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  10
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  10
Leu Ala Lys Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  11
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  11
Leu Ala His Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  12
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  12
Leu Ala Arg Gln Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  13
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  13
Leu Ala Arg Glu Phe Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  14
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  14
Leu Ala Arg Glu Tyr Arg Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  15
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  15
Leu Ala Arg Glu Tyr His Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  16
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  16
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Arg Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  17
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  17
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Lys Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  18
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  18
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Phe Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  19
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  19
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
His Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  20
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  20
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Asn Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  21
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  21
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Ala Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  22
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  22
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Ser Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  23
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  23
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Thr Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  24
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  24
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Leu Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  25
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  25
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Ile Arg Thr Leu Arg
20
<210>  26
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  26
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Val Arg Thr Leu Arg
20
<210>  27
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  27
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Ala Arg Thr Leu Arg
20
<210>  28
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  28
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Lys Thr Leu Arg
20
<210>  29
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  29
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu His Thr Leu Arg
20
<210>  30
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  30
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Gln Leu Arg
20
<210>  31
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  31
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Asn Leu Arg
20
<210>  32
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  32
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Ala Leu Arg
20
<210>  33
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  33
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu His
20
<210>  34
<211>  22
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  34
Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu Arg Gln
1               5                   10                  15
Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  35
<211>  22
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  35
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr
20
<210>  36
<211>  20
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  36
Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu Arg Gln
1               5                   10                  15
Val Leu Arg Thr
20
<210>  37
<211>  20
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  37
Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu Arg Gln Val Leu
1               5                   10                  15
Arg Thr Leu Arg
20
<210>  38
<211>  20
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  38
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu
20
<210>  39
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  39
Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu Arg Gln Val
1               5                   10                  15
Leu Arg
<210>  40
<211>  16
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант ПМП
<400>  40
Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu Arg Gln Val Leu
1               5                   10                  15
<210>  41
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант P60.4Ac
<400>  41
Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Glu Arg Ile Lys Arg Phe Leu
1               5                   10                  15
Arg Glu Leu Val Arg Pro Leu Arg
20
<210>  42
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант P60.4Ac
<400>  42
Ile Ala Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Glu Arg Ile Lys Arg Phe Leu
1               5                   10                  15
Arg Glu Leu Val Arg Pro Leu Arg
20
<210>  43
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант P60.4Ac
<400>  43
Leu Ala Arg Asp Tyr Lys Arg Leu Val Glu Arg Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Glu Leu Val Arg Pro Leu Lys
20
<210>  44
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант P60.4Ac
<400>  44
Ile Ala Lys Glu Phe Lys Arg Ile Leu Glu Arg Ile Lys Arg Phe Ile
1               5                   10                  15
Arg Glu Ile Thr Arg Pro Ile Arg
20
<210>  45
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант P60.4Ac
<400>  45
Thr Ala Lys Glu Tyr Lys Arg Ile Leu Asp Arg Ile Lys Arg Tyr Leu
1               5                   10                  15
Arg Glu Leu Val Arg Ala Ile Lys
20
<210>  46
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант P60.4Ac
<400>  46
Val Ala Lys Asp Tyr Arg Lys Val Val Asp Arg Ile Lys Arg Phe Leu
1               5                   10                  15
Arg Tyr Leu Leu Arg Pro Val Arg
20
<210>  47
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант P60.4Ac
<400>  47
Leu Ala Lys Asp Tyr Lys Lys Ile Val Glu Arg Leu Arg Lys Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Glu Val Leu Arg Pro Val Lys
20
<210>  48
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант P60.4Ac
<400>  48
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  49
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант P60.4Ac
<400>  49
Leu Ala Lys Glu Tyr Arg Lys Ile Phe Asp Arg Leu Lys Lys Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Ile Val Arg Pro Ser Lys
20
<210>  50
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант P60.4Ac
<400>  50
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Arg Ile Phe Glu Arg Leu Arg Lys Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Ile Val Lys Pro Val Arg
20
<210>  51
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант P60.4Ac
<400>  51
Leu Ala Lys Glu Trp Arg Lys Ile Val Asp Arg Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Asp Ile Leu Lys Ala Thr Lys
20
<210>  52
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант P60.4Ac
<400>  52
Val Ala Arg Glu Trp Lys Arg Ile Leu Glu Lys Ile Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Asp Ile Leu Lys Ala Leu Arg
20
<210>  53
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант P60.4Ac
<400>  53
Val Ala Lys Glu Trp Arg Lys Ile Val Asp Arg Ile Lys Arg Tyr Leu
1               5                   10                  15
Arg Asp Ile Ser Lys Ala Thr Lys
20
<210>  54
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант P60.4Ac
<400>  54
Thr Ala Arg Glu Trp Lys Arg Ile Leu Glu Lys Ile Arg Lys Tyr Leu
1               5                   10                  15
Arg Asp Val Ser Arg Val Thr Arg
20
<210>  55
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант P60.4Ac
<400>  55
Val Ala Lys Asp Trp Lys Arg Ile Val Asp Lys Val Arg Arg Tyr Leu
1               5                   10                  15
Arg Glu Val Thr Lys Ile Leu Lys
20
<210>  56
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант P60.4Ac
<400>  56
Thr Ala Lys Asp Tyr Arg Lys Ile Phe Glu Lys Ile Lys Lys Tyr Leu
1               5                   10                  15
Lys Asp Leu Thr Arg Ile Leu Lys
20
<210>  57
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант P10, содержащий пролин
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  57
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Pro Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Pro
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  58
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант P10, содержащий пролин
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  58
Leu Ala Arg Glu Tyr Pro Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Pro Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  59
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант P10, содержащий пролин
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  59
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Pro Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Pro Arg Thr Leu Arg
20
<210>  60
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант P10, содержащий пролин
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  60
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Pro Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Pro Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  61
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  61
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  62
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  62
Ile Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  63
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  63
Val Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  64
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  64
Leu Leu Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  65
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  65
Leu Val Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  66
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  66
Ala Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  67
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  67
Leu Gln Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  68
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  68
Leu Ala Lys Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  69
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  69
Leu Ala His Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  70
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  70
Leu Ala Arg Gln Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  71
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  71
Leu Ala Arg Glu Phe Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  72
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  72
Leu Ala Arg Glu Tyr Arg Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  73
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  73
Leu Ala Arg Glu Tyr His Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  74
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  74
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Arg Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  75
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  75
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys His Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  76
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  76
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Arg Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  77
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  77
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu His Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  78
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  78
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Ile Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  79
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  79
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Val Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  80
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  80
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Ala Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  81
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  81
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu His Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  82
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  82
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Lys Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  83
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  83
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys His Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  84
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  84
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Phe Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  85
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  85
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
His Gln Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  86
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  86
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Asn Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  87
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  87
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Ala Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  88
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  88
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Ser Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  89
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  89
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Thr Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  90
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  90
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Leu Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  91
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  91
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Ile Arg Thr Leu Arg
20
<210>  92
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  92
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Val Arg Thr Leu Arg
20
<210>  93
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  93
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Ala Arg Thr Leu Arg
20
<210>  94
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  94
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Lys Thr Leu Arg
20
<210>  95
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  95
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu His Thr Leu Arg
20
<210>  96
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  96
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Gln Leu Arg
20
<210>  97
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  97
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Asn Leu Arg
20
<210>  98
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  98
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Ala Leu Arg
20
<210>  99
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Ацетилированные и амидированные варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  99
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr Leu His
20
<210>  100
<211>  22
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Короткие варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (22)..(22)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  100
Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu Arg Gln
1               5                   10                  15
Val Leu Arg Thr Leu Arg
20
<210>  101
<211>  22
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Короткие варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (22)..(22)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  101
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu Arg Thr
20
<210>  102
<211>  20
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Короткие варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (20)..(20)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  102
Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu Arg Gln
1               5                   10                  15
Val Leu Arg Thr
20
<210>  103
<211>  20
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Короткие варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (20)..(20)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  103
Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu Arg Gln Val Leu
1               5                   10                  15
Arg Thr Leu Arg
20
<210>  104
<211>  20
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Короткие варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (20)..(20)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  104
Leu Ala Arg Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu
1               5                   10                  15
Arg Gln Val Leu
20
<210>  105
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Короткие варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (18)..(18)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  105
Glu Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu Arg Gln Val
1               5                   10                  15
Leu Arg
<210>  106
<211>  16
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Короткие варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (16)..(16)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  106
Tyr Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu Arg Gln Val Leu
1               5                   10                  15
<210>  107
<211>  13
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Короткие варианты P10
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  АЦЕТИЛИРОВАНИЕ
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (13)..(13)
<223>  АМИДИРОВАНИЕ
<400>  107
Lys Lys Ile Val Glu Lys Leu Lys Arg Trp Leu Arg Gln
1               5                   10