Разработка органной культуры мужских гонад для вирусологических исследований

Разработка органной культуры мужских гонад для вирусологических исследований

ЮА. Тюленев 1, В А. Науменко 1, Р.Р. Климова 1, Л.Ф. Курило 2, /7.6. Шилейко 2,

А.С. Сегал 3, В А. Ковалев 4, АА. Кущ 1

1 НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, Москва

2 Медико-генетический научный центр РАМН, Москва

3 МГМСУ, Москва

4 ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА, Москва

Development of male gonad organotypic culture for virological investigations

Y.A. Tulenev1, VA. Naumenko 1,R.R. Klimova 1, L.F. Kurilo2, L.V. Shileiko 2,A.S. Segal3, VA. Kovalev4, A A. Kushch ' 11vanovsky Institute of Virology, Moscow

2 Scientific Center of Medical Genetics, Moscow

3 Moscow State Medico-Stomatological University, Moscow

4 Burnazyan Center of Medicine and Biophysics, Moscow

Разработка органной культуры мужских гонад является актуальной проблемой биотехнологии, которая оставалась нерешенной до последнего времени. В то же время, создание органной культуры яичка необходимо для решения как фундаментальных проблем сперматогенеза, так и задач практического здравоохранения, связанных с лечением мужского бесплодия. Одно из первых мест в этиологии бесплодия занимают инфекционные заболевания, в том числе герпесвирусные инфекции (ГВИ).

Цель настоящей работы состояла в разработке культуральной системы, позволяющей сохранять жизнеспособность мужских половых клеток in vitro и оценивать влияние вирусов герпеса на сперматогенез. Для разработки условий культивирования мужских гонад проведены опыты с семенниками мышей DBA и с фрагментами яичек человека, полученных из операционного материала от пациентов после орхэктомии. Каждые 4 сут. изучали морфологию извитых семенных канальцев, подсчитывали количество клеток сперматогенеза, определяли индекс сперматогенеза (ИС) и ультраструктуру половых клеток. В культуру вносили вирус простого герпеса (ВПП или цитомегаловирус (ЦМВ) и каждые 2 сут. определяли вирусную нагрузку в культуральной жидкости.

Ультраструктурный анализ показал, что архитектоника органа и морфология половых клеток сохраняются in vitro в течение, по крайней мере, 16 сут. Жизнеспособность органной культуры яичка оказалась значительно выше, чем семенника мыши: снижение ИС в яичке составило 4%, в семеннике мыши — 50%.

Наиболее чувствительными к герпесвирусам оказались сперматоциты и сперматиды, в которых были обнаружены вирусные капсиды. В культуральной жидкости выявлено нарастание вирусной нагрузки, которая увеличивалась в 24 раза при заражении ЦМВ и в 165 раз — при заражении ВПГ.

Разработка органной культуры мужских гонад и получение модели ГВИ мужских гонад in vitro позволяет не только исследовать патогенетические механизмы, лежащие в основе нарушения фертильности у мужчин, но и разработать рекомендации по лечению таких пациентов.

Ключевые слова: органная культура мужских гонад, индекс сперматогенеза, вирус простого герпеса, цитомегаловирус, сперматоциты, сперматиды.

Development of male gonad organotypic culture is an actual problem of biotechnology which remained unsolved until recently. However, testicular culture generation is essential both for solving fundamental problems of spermatogenesis and addressing therapeutic aspects of male infertility treatment. Infectious diseases, including herpes virus infections (HVI), are ones of the most frequent in etiology of infertility.

The research was aimed at developing an organotypic culture that could preserve the viability of testicular cells in vitro and at evaluating the influence of herpes viruses on spermatogenesis. In order to generate conditions for male gonads cultivation, a series of experiments was conducted using DBA mice testes and human testicle fragments obtained after orchectomy. Every four days the seminiferous tubule morphology was investigated, the number of spermatogenic cells was counted. Also spermatogenesis index (SI) and the gametic cells ultractructure were determined. Herpes simplex virus (HSV) or cytomegalovirus (CMV1 were inoculated into the culture and every two days the viral load in the culture liquid was determined.

The ultrastructural study revealed that the testicle architectonics and the gametic cell morphology could remain preserved in vitro for at least 16 days. The viability of organotypic culture of human testis proved to be much higher compared to that of mouse testis: the SI in the human testis explants dropped by 4% while in the mouse testes — by 50%.

Spermatocytes and spermatides were the most sensitive to herpes viruses. In these cells virus capsids were detected. The cultural liquid analysis revealed a viral load increase: it increased 24 times in CMV-infected cases and 165 times in HSV-infected cases.

Development of male gonad organotypic culture and in vitro male gonads HVI model obtaining makes it possible not only to study the pathogenic mechanisms underlying male fertility dysfunctions but also to come up with recommendations for treating such patients.

Key words: male gonad organotypic culture,

spermatogenesis index, herpes simplex virus, cytomegalovirus, spermatocytes, spermatides.

e-mail: tulenev86@mail.ru

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010

Попытки разработать органотипические культуры семенников млекопитающих предпринимались давно, однако до последнего времени не удавалось создать культуральную систему, которая позволила бы мужским половым клеткам выживать, делиться и осуществлять дифференцировку in vitro [1, 2]. Стимулами для преодоления сложностей, связанных с разработкой органной культуры яичка, являются возможности решать как фундаментальные проблемы гаметогенеза, так и прикладные задачи медицины. Одна из важных задач состоит в изучении действия вирусных инфекций на структуру и функцию мужских гамет, а также в оценке эффективности действия противовирусных препаратов на вирусиндуцирован-ные патологические процессы. Актуальным объектом для решения этих задач являются вирусы семейства Herpesviridae — вирус простого герпеса (ВПГ) и ци-томегаловирус (ЦМВ), которые широко распространены как в человеческой популяции, так и среди животных. Герпесвирусы вызывают широкий спектр заболеваний, в том числе с тяжелыми последствиями и нередко — с летальным исходом. Установлено, что ВПГ и ЦМВ являются этиологическими агентами заболеваний, передающихся половым путем.

Цель работы заключалась в разработке органной культуры яичка и в создании на её основе модели герпесвирусной инфекции (ГВИ) in vitro.

Материал и методы

Для разработки и оптимизации условий культивирования фрагментов мужских гонад на первом этапе проводили эксперименты с семенниками взрослых половозрелых мышей линии DBA. На следующем этапе проводили опыты с фрагментами яичек человека, полученных из операционного материала от пациентов (средний возраст 65 лет) с раком простаты, которым выполнялась радикальная простатэктомия с орхэктомией.

Оптимальные условия культивирования определяли, варьируя величину эксплантатов, состав питательных сред и тип культуральных планшетов. Лучшие результаты были получены при использовании: фрагментов органов объемом 3 мм3; ростовой среды ДМЕМ, содержащей 10% сыворотки эмбриона коровы («Gibco»); витамины А, С и Е; 1 ммоль/л пирувата натрия («Sigma»); 10 мкг/мл инсулина («Lilly»;

4 ммоль/л глутамина; 5 мкг/мл трансферрина и 50 мкг/мл гентамицина («Панэко»), Зкспланты помещали на полупроницаемую мембрану в 6-луночные планшеты со вставками («Falcon Labware»), что создавало возможность культивирования на границе двух фаз — воздушной и жидкой. Инкубацию проводили при 37°С в атмосфере 5% С02, со сменой среды с интервалом в 2 сут.

Каждые 4 суток изучали морфологию извитых семенных канальцев (ИСК). На гистологических срезах идентифицировали четыре типа ИСК: I тип — содержащие половые клетки четырех стадий развития (сперматогонии, сперматоциты, сперматиды, сперматозоиды); II тип — содержащие три стадии; III тип — две стадии; IV тип — одну стадию. Суммарное количество клеток в 100 семенных канальцах вычисляли умножением числа канальцев первого типа на четыре, второго — на три и т.д. Для оценки влияния условий и продолжительности культивирования на выживание половых клеток высчитывали индекс сперматогенеза (ИС) — отношение суммарного количества клеток

к числу изученных семенных канальцев (100). Ультраструктуру половых клеток исследовали методом электронной микроскопии.

Для заражения органной культуры эксплантаты инкубировали с вирусом в течение 1 ч, после чего промывали, культивировали и изучали морфологическими методами, как описано ранее. Выявление ВПГ и ЦМВ в культуральной жидкости проводили быстрым культуральным методом через каждые 48 ч. Вирусную нагрузку выражали в количестве бляшкообразующих единиц в 1 мл (БОЕ/мл). Для выявления зараженных клеток проводили иммунопер-оксидазное окрашивание с использованием моноклональных антител к ранним белкам ВПГ и ЦМВ.

Результаты

Начиная с 4-х сут. культивирования органной культуры семенника мыши, наблюдали постепенное уменьшение численности герминативных клеток, преимущественно за счет сперматоцитов и сперматид. На 16-е сут. пребывания клеток в культуре отмечали отхождение базального слоя герминативного эпителия от мембраны и гибель сперматогониев. Указанные изменения нашли отражение в двухкратном снижении ИС на протяжении 16 сут. культивирования (с 3,4 до 1,73).

Жизнеспособность органной культуры яичка человека оказалась значительно выше: в течение 16 сут. культивирования снижение ИС составило менее 4% (с 3,32 до 3,19). На рисунке 1А представлен ИСК I типа, содержащий клетки всех стадий сперматогенеза. Ультраструктурный анализ показал, что архитектоника органа и морфология половых клеток сохраняются in vitro в течение, по крайней мере, 16 суток. На рисунке 2А показаны ранние сперматиды с формирующейся акросомой.

Изучение динамики ВПГ-инфекции семенника мыши позволило выявить вирус в культуральной среде только на 12-е сут. инфицирования (8 БОЕ/мл), с нарастанием вирусной нагрузки к 16-м сут. (130 БОЕ/ мл). В зараженной культуре яичка человека ВПГ выявляли уже со 2-х сут. инфекции (25 БОЕ/мл), с пиком вирусной нагрузки на 8-е сут. (4130 БОЕ/мл). Сравнение ИС в зараженной и интактной культуре позволило выявить гаметотоксический эффект ВПГ: на 16-е сут. ИС составил 2,67 и 3,19 соответственно (р<0,05).

Вирусная нагрузка ЦМВ в культуре яичка человека оказалась значительно ниже, чем ВПГ: вирус выявляли в культуральной среде с 8-х сут. инфекции (2,5 БОЕ/мл), с максимумом на 12-е сут. (60 БОЕ/мл). Морфологические изменения, вызванные ЦМВ, также оказались менее выраженными: на 16-е сут. инфекции ИС в зараженной и интактной культурах составил соответственно 2,99 и 3,19 (р<0,05).

Наиболее чувствительными к герпесвирусам оказались сперматоциты и ранние сперматиды — численность популяции этих клеток к 16-м сут. культивирования составила соответственно 18% и 20% от исходных значений. Иммуногистохимическая окраска и электронная микроскопия подтвердили преимущественное поражение этих клеток в органной культуре яичка. На рисунке 1Б показано выявление раннего белка ЦМВ в сперматоците. Результаты ультраструктурного анализа эксплантата представлены на рисунке 2Б: капсиды ВПГ выявлены в ядре сперматиды, полноценные вирионы — в межклеточном пространстве.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010

ИМИ!

68 Оригинальные исследования

Обращают на себя внимание морфологические изменения в инфицированной культуре: вакуолизация герминативного эпителия, нарушение межклеточных

контактов (рис. 1Б), дегенеративные изменения ак-сонемы, накопление плотных телец в цитоплазме сперматиды (рис. 2Б).

а"#

*

* ^"

»7

2

л

_ - й1 --v

V

s’ Г»*Л

r *

Д

afc-IS* '*

Braa^i

Я

sB

•Д\ /ЗзЙЗГ ^

В !* ; /.-*

WlT- W.'-l * Г 7

Г

Рис. 7. Эксплантат извитого семенного канальца яичка человека на 16-е сут. культивирования in vitro:

А - незараженный эксплантат; Б - эксплантат, зараженный ЦМВ; 1 - сперматогонии; 2 - сперматоциты; 3 - сперматиды; 4 - сперматозоиды; БМ - базальная мембрана; ПК - просвет канальца; * - сперматоцит, содержащий антиген ррБ5 ЦМВ. Иммунопероксидазное окрашивание моноклональными антителами к белку ррБ5 ЦМВ, докраска гематоксилином.

У в. х400

Рис. 2. Сперматиды человека на 16-е сут. культивирования in vitro:

А - в незараженном эксплантате яичка; Б - в зараженном экспалантате яичка; 1 - акросома; 2 - капсиды ВПГ в ядре сперматиды; 3 - полные вирионы в межклеточном пространстве; 4 - электронно-плотные тельца.

Метод упьтратонких срезов. Ув. ^ШО, вставка - хЗОООО

Заключение

Проблема орхитов герпесвирусной этиологии представляется актуальной в свете накопления данных о влиянии вирусов на фертильность [3, 4], а также о возможности вертикальной передачи инфекции с мужскими гаметами [5]. Механизмы взаимодействия вируса с мужскими половыми клетками изучены недостаточно, что во многом связано с трудностью моделирования in vitro сперматогенеза — многоэтапного процесса пролиферации и дифференцировки половых клеток, регулируемого больших количеством клеточных и гуморальных факторов.

Нами разработана органная культура мужских гонад и получена модель ГВИ мужских гонад in vitro на двух биологических объектах — семеннике мыши и яичке человека, позволяющая изучать процессы спер-

матогенеза, их нарушения и коррекцию в течение 16 сут. Моделирование на яичке человека представляет сложность в связи с труднодоступностью материала, однако обладает рядом преимуществ: лучшие показатели витальности герминативного эпителия в культуре по сравнению с семенником мыши; возможность моделирования как ВПГ-инфекции, так и видоспецифичной ЦМВ-инфекции человека; большая степень приближения к процессам, происходящим в организме человека.

Изучение влияния ВПГ и ЦМВ на сперматогенез позволяет не только исследовать патогенетические механизмы, лежащие в основе нарушения фертильности у мужчин, но и разработать рекомендации по лечению таких пациентов.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010

ЛИТЕРАТУРА

1. Aflatoonian В., Ruban L., Jones M. In vitro post-meiotic germ cell development from human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 2009; 24: 3150-9.

2. Clark A.T., Bodnar M.S., Fox M. Spontaneous differentiation of germ cells from human embryonic stem cells. Hum. Mol. Genetics. 2DD6; 13: 727-39.

3. Климова P.P., Чичев E.B., Науменко В.А. и др. Вирус простого герпеса и цитомегаловирус в эякуляте мужчин: вирус простого герпеса чаще встречается при идиопатическом бесплодии

и коррелирует со снижением показателей спермы. Вопросы вирусологии 2010; 1: 12—16.

4. Kotronias, D., Kapranos N. Detection of herpes simplex virus DIMA in human spermatozoa by in situ hybridization technique. In Vivo 1998; 12: 391-4.

5. Baskar J.F., Furnari B., Huang E.S. Demonstration of developmental anomalies in mouse fetuses by transfer of murine cytomegalovirus DNA-injected eggs to surrogate mothers. J. Infect. Dis. 1993; 167: 1288-95.

Поступила 97,092010

VTheratos

( nciEMlXn врсчимпшн ifcTipjJlQflHUpLliLiOtn* фошифсрсл - L VVR XTN («ТкипклкС III

iKcq^qmpiKTiiTbiiHiH фетгфсрп прел ста  пгт добоШ «рстп!, осчляямйлО «* cmc I ншы лсНкифсрс и и ofuyieinia лсГпачитж. прслвфтслии»

оЛрдГнЛМйШЫХ ifcnCKCIHkkfilLkllUlDpOU | R- klClt1*!. НГиОрл itill'ki I V ill ji*|illii h.44!hU U i|«LaMiU JMUiJ! НИЩ Д l' 4J0 - 41Ю 11Ы |

IKiMfb 11) i  'ьЫ  i С- H-1 i Ы.

ЛСЧСПИГ UllllU.M.HH'M.’I.MIA- 4FIUIIV4) iCpHBILUmnCtUI It

ПрЛЛНфериПШШ* т\:Т!Г.Ы11 llll

* ! ainiai 1|№ЕГшПкпи1 зияНччн илки.

- .I.M«i||4s4hHll ICfTUjnil,

склеримсрыц*.

ГКИ.Т'ИЛ I.

* punkl.iri'ri.jlliUU j| 4 |‘l

* ^tiiipmnu: тгвшя rucnc

yilLi!L.ii: 3lllC |4-.ir'ni lit rp-Jl!L ii jiiilji не* ч и * Ix'iHlllu 1.Г lIlAi

Отавгшж-м ЖТН№

HrfWHHlfААШ ИяйигнП:

+ ' .шора uui снстткв pom шил. члге рмллия.

* Hi I IIWIIIIC pWCvll Bi>V.yilliMJii iklDOJJIII,

» II, z jb-i.iiiu-pit. ь j . ij'u.b: illn

* otyuiPriHUMMlHtf II IMvryittcfillii мпНиЫу.мпы,

* SIMPrp 111- ЛЛА.Х1Ч1И я L'MCICMC.

* шигр.пь ^atporni и м-ифиисиш iptinii auuiciffrj.

* WlUllellOCI L II 1№Ж»1ПЯ iupjlls I piHi LlpUIKCi-й p ICICIlHf dipiHX.typU

* при neuAuL iiHiwin ялмтм* *н Л адыдопш гены чдгнпдони Прмсип и v рлФыс й wfa.n mihjiiir:

ViI.iHjMiH1 1ь. ill li. liii л ill . IB iMU‘|i,.r.iI; i j

* i ..in, t |n x: in  м||чр.1 IX II рл: n i; пи ч u.n L |m j u ib ПцгМв.ртвгi c.i ii.iit>Aiu t/l U

•хппйш iqpn штгушс,

* LxbHifcpidliiu ttiHhf yiKuHi,

till III.li illll ir*>lJ1 111 Lllllil lipctil? V. I'lJ.

* i -iJt:i|kw и кшвдпк н hi гсченнс npoucLiypiHiru шодрй иск. ж

ЫРС(1ПГС1П1Н проислурч

* ил ЛМ1РИ i 1йИ1а 1-IIII LH. 111 11 -I |||М'.1Х {нЩЛфуО CH b.1 li Ilij. фк1л|и i u llpOrt-UillliJ МрНДОЛ J

аЬоьвГе

Г li rix iu JLfff «tUr.IriPHV kциншимк К-ЯГ11СК - Vppi fHHiuSth'S

* Гныар ч.' -1рсч.'нплв. v 'uiiaKi»» сктсна. iipim 'скипав hij ?. \wгь лк>м«1Е I HVk.il irk пушпмпшпй II ОС|ШферМ*1еСВДй KpL4U. » I Jfc.jtL£ irk Ы1СТПЛГО Hi ИГА

| l.-jrj i ичj i un, IVW* .in ewtpvA М№МНЧп№п* «брйвсиГяЧ kpi'PM с яьхакщг i.-piiDiic'»! :вш1кс1№сай|ютп1 клети* гшслс прапелури,

* ScjUA nOiEmilHr ид№Ы1Л1ГГЬ ||£рЛ4ОЕЬу i рои 11 I fUUUX ¥ лр4#шшэаи

* JlpHIIUllQ .leliCllUIH DniilHJUl Ш ССШ1|Ы1ШИ исшрифу! lfJ4ieJJIII«SI

ТН1№1Н№13ГЧ ра1ЛСЛ11№ ЩЫГЫИ1Г1ГГЫ kjhliir V ц'ОППЮСТРПИ <r ПК

джшккгпж! и ptncepiwn 4|£ь ~

* Система мрслилпЕпэти для npiiHiciiciriia м клсл^ашй ссрлпан. гзе ilrttftV!.Ill 1*1 пошучу|l*f DlipC.l^lAlllUX Мйпьшенпад яроы

* t *.|Ч-р II 11.111 ее bCnldlilH^MlLTk. «|риМСш>,ЩГ » LLifU Mill ГI IfULIUailll LHCIW

Клышоппгш ipnnii ctidHpauTCi  сттллртпис- ишисп н пшви ш .ильпеилигп riciiLKlfc ЦЖ1МИ14^11Ш11Р1ссраа1и4«, млртшимм^мс пя vilrr. игрс.-иидимс п*1гттт) и лр I

Ъкттшшяъм IWJ «Нкикнинвы* Чкннннстиг iciwiLiejMM-

ИнИи Фр»п«№ .1.4, кпрм 15. гг.Р'фяьтг +7j-i?5j3IW-3*-W;

E-mill:

drJFc^nmvg h лп1»1!п,(.гу , аег*Ч|1пкп1ЬФй'.й vailJ№llBVy£4|dt1Kl.jl(X

г С р(

I

•\В1#ЫУ1Ни1р4|НЛЛМЯя iiHfieiL* ,LtH l|ibbl ilUn i I hiLiUtaul hilt I U*; m AU.Ikvkl KHiTF

K|n \iThhf <-.Т||«а.пиг№г%ЪИ1 CIII.U

Г lie ;c4J рнч-чн ivii ill 3626 обрн iij-:'m С1м»кп«к. k.wtivb

* i 111 If.il v 14! >Kk': L I. . il-'xUm-.'imi- IO ItfUJIIsin. x

- dmkiiii puH- kit I цлр.1| >» *«11 i Hri tUJM I^ptirh fci ijfuiK-nlia

H lips-M |StIM1! 1ИНЧ.Я 1яии1|КяжцнЛ11М *

* ПпЛЯ1>С1ЫС1 лппшггяганровпшып npoilVCC СШ|Ш1ШСТ ирсыя ртГн*ш | крнщщ

С ll-iirtlLlIt IJ С ["и I illi I4.IPJK [' nullllit

- Ik 1рсйуетм &К1ЫШН« .tyuipBH jLii ^ряМРХЧн

I лип емггпйа НюЛлсИпс пиоигт ft-"1 лыюлраи)

* Наличие .«sk KipoaiHin. приераыыиик ллчоряашштлгЛ

* И МШЙТЧ

Hi>.L% lXlLfiurU CHCICkU iuiqtflUIAei HfLlHICTIkke1  И1Г1 lui ULKfU l-jp*

- lU'limiliil nrpp'-.i.in-ii I:- PHfl PlIU i ill! *mr И? | |ИШ«(ИЬ « «Wli |f.

ly^iitai fi с лучае йШМвМ пГтшрамич авд твПВОд*ПИв

’ IliqwMcipu 24'i wownki ют г 1 роля я уирочпвя Лклупин ш.лшм'п и cedi'

IMkiiiHiupiiiiF у ровна жлишги ивпгя ПлрйВ ,111 жнлучя

Иит рпрпиипыМ lifn'iP рЯкГНВЫЛ U'HtpdXniJt-.lb

- Мн11МЫ1Г111р>е^ ICUCtffUiypllUc! kUWulMUl

-OltytCnyiT rt Hi pVliMHn «скипев >|$рл М1Д ill 1|(ке«р*ЧЧЖ!П* рНЩШПИГ- * Лк-Ч»*р .114 tpaiKMid

Kplli'H'-’ll Г4 Hill 31 HI kl.l

- Гккгшишпин 1«*»егр«1|ЕТ1ЖМи jixxlricjl «tifUILLi

Ёккпрп<пш1л.11гы1л1 прлцссс irappoirn .щ ижлли ldiiiiiieu

- FlniUi! jriliK'l h {HlAnrUlUpp|Ulilll!H LiL U'lLII 11Л крИИСИНС II И1ВСШ(!к411£ lifipj 1II1MI

- СЧ!ГЛ .1Г1С* »гр{!вп«ий№ iWllfikH, l ni li nl|i U'l t 4vHmr<«fi, LnU Krp*AI ГяпгЧя гиря» 1CMM* '|1фй Ujnn

1 IklllKIK k'UiniC III I pill Id'.LI ПККЛКЧЛС! С111н£гки. прп перенппсинм IXipaiim

- О1ЧСТ пв uflpuqy

llL ltifMIl nCfUHIH

НЯ№ЧГ(ЦМ1«М1 E'pm(mIK EliPOj4KBKlflllH

www.thtrmoKcnrKisTy

l-jtYinlilbJr HI I rji 11л. ikJ 1 i li Lk .1 L) HJiHpanMHli H c i яя I11H.IJ k «i.irkiiU  [ r IK i<rHLk w 4 I 1 |i UunirM I! IuiUILICVIU 4 clK>HB.|.li кЛ.ГЫИйНрААЯНиН »-..й:с.‘к h UKflkJIUl CHCIf-Hril .

* ClOCn UPC JUD ЦЩ.П11ЧЧ1ННН4 Я-hilOk.

NK-iumfm, Т-ияетив

* 4'dHiirw IK.! лйш кулнпкрсаанна «сил pi пи us Lie top IrfVL'LlbL'pii'Ml'lllUr i'p4 IM 1'р1ЬППк1

* ,1 . b'a.I li ilhll£4>|Uhili4 kx'.v 'ill111 il'iCCllt4 ll|4il i lllri i-|-ilL.X

яле-ЦП. NK-n.lfiw. T-PL4ff4*

* 14' ,i»i «y.tuaiklip-iHjniiri .ъ млрмпгмг x ktm*

Кч ль^ рикпгиг H4UIKH ^BC-L.Ifr

fслезши! и I f № Icllofl)

CtfUK^r* ich iiwiHHM

Для h яс im’kiiiii rc4iMMi ijwict mi npnrcpm ифм m\ s iSniK. NK-K.itiica.

Туалетов hi дсчдрмтд «дстчк-________________________________________________

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том М, N° 4, 2010

А