СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДОЗ ДЕЗИНФИЦИРУЮЩЕГО УФ-ИЗЛУЧЕНИЯ ПРИ ПОМОЩИ ИНДИКАТОРОВ
METHOD FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF DISINFECTANT UV- RADIATION DOSE USING INDICATORS

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к области стерилизации и, более конкретно, дезинфекции офтальмологической линзы при помощи одной или более доз программируемого дезинфицирующего УФ-излучения.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящее время дезинфекция офтальмологической линзы включает в себя множество жидких химических веществ, которые в некоторых случаях могут реагировать с отложениями частиц или микроорганизмами для обеспечения процесса стерилизации. Однако во многих случаях использование данных растворов химических веществ может не обеспечивать стерилизацию, кроме того, они могут оставаться в офтальмологической линзе для взаимодействия с глазом пользователя. Такое взаимодействие может приводить к некоторым побочным эффектам, таким как, например, дискомфорт или жжение, влияние на химический баланс в слезной пленке и т.д.
Следовательно, желательно, чтобы были разработаны новые улучшенные способы стерилизации и аппараты, которые могут преодолеть побочные эффекты и ограничения, для того, чтобы удовлетворить назревшую потребность в стерилизации в области офтальмологических линз.
ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способу проведения количественного определения доз ультрафиолетового (УФ) излучения. Более конкретно, доза может быть определена в контейнере или сосуде, которые используются в данном способе осуществления стерилизации УФ-излучением.
В некоторых аспектах настоящего изобретения описывается разработка способа измерения, которая основана на разрушении различных хромофоров/флуорофоров, что может использоваться в качестве способа количественного определения дозы УФ-излучения в жидкости или визуального химического индикатора для качественного определения, который меняет свой цвет, для стерилизации при помощи УФ-излучения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Прилагаемые чертежи, которые включены в данное описание и являются его частью, изображают варианты осуществления настоящего изобретения, и вместе с описанием служат для раскрытия целей, преимуществ и принципов данного изобретения.
Фиг.1 изображает примерные кривые, которые были получены в ходе независимых экспериментов и изображают: A.) Потерю флуоресценции (поглощение/эмиссия 490/520 нм) различных концентраций флуоресцеина при облучении известными дозами УФ-излучения с длиной волны 254 нм. B.) Все прямые разрушения флуоресцеина сводятся к одной кривой, когда флуоресценция преобразуется в процент от исходного значения флуоресценции.
Фиг.2 изображает примерные химические структуры хромофоров и флуорофоров.
Фиг.3 является примерной кривой, обозначающей независимые эксперименты, демонстрирующие: A.) Потерю поглощения или интенсивности флуоресценции хромофоров с концентрацией 10 мг/мл и флуоресцеина с концентрацией 3,5 мг/мл при облучении известными дозами УФ-излучения с длиной волны 254 нм в виде процента от исходного значения. В круглых скобках для каждого красителя приведены значения длин волн при поглощении, или возбуждении, и эмиссии. Каждая кривая обозначает три независимых эксперимента. B.) Количественный диапазон дозы УФ-излучения для каждого красителя.
2
2
Фиг.4 является примерными группами емкостей из различных пластмасс, которые могут обеспечить от неравномерного перекрытия до частичного блокирования УФ-излучения. A.) Процент пропускания УФ-излучения материалом (материалами) из каждой группы контейнеров. B, C, D.) Снижение пропускания УФ-излучения и соответствующее снижение качества стерилизации при наличии Escherichia coli (B.), Staphylococcus aureus (C.) и Candida albicans (D.). Общая облученность каждой группы (n=6) составила 100 мВт*с/см для бактерий (B,C.) и 250 мВт*с/см для C. albicans (D.), что было измерено по мощности излучения ультрафиолетовых ламп. Доза УФ-излучения в емкости была рассчитана по разрушению эритрозина B (белые полосы) и посредством определения количества жизнеспособных организмов, оставшихся после облучения (черные полосы). Все «усы» обозначают среднеквадратическую погрешность.
Фиг.5(A) изображает примерные визуальные изменения эритрозина B и индигокармина после воздействия УФ-излучения с длиной волны 254 нм и в 12 log превышающего стерилизационную дозу (количество в круглых скобках) для различных биологических индикаторов УФ-излучения и патогенов человека.
Фиг.5(B) является схематическим изображением Фиг.5(A).
Фиг.6(A)-6(K) являются диаграммами, изображающими эффекты примерных доз УФ-излучения и их эффекты при соответствующих исследованиях.
Фиг.6(A) изображает стандартную кривую флуоресценции флуоресцеина (поглощение/эмиссия 490 нм/520 нм).
Фиг.6(B) изображает спектр поглощения красного очаровательного в УФ и видимой областях.
Фиг.6(C) изображает стандартную кривую поглощения красного очаровательного.
Фиг.6(D) изображает спектр поглощения индигокармина в УФ и видимой областях.
Фиг.6(E) изображает стандартную кривую поглощения индигокармина.
Фиг.6(F) изображает спектр поглощения эритрозина B в УФ и видимой областях.
Фиг.6(G) изображает стандартную кривую поглощения эритрозина B.
Фиг.6(H) изображает спектр поглощения тартразина в УФ и видимой областях.
Фиг.6(I) изображает стандартную кривую поглощения тартразина.
Фиг.6(J) изображает спектр поглощения зеленого прочного в УФ и видимой областях.
Фиг.6(K) изображает стандартную кривую поглощения зеленого прочного.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Настоящее изобретение предлагает способ количественного определения различных доз дезинфицирующего УФ-излучения. В следующих разделах приведены подробные описания вариантов осуществления настоящего изобретения. Приведены описания предпочтительных и альтернативных вариантов осуществления, хотя подробно описаны только примерные варианты осуществления, и специалистам в данной области техники будет понятно, что могут быть очевидны вариации, модификации и изменения. Таким образом, необходимо понимать, что указанные примеры возможных вариантов осуществления не ограничивают широту характеристик описываемого изобретения. Этапы описанного здесь способа перечислены в данном обсуждении в логической последовательности; тем не менее, эта последовательность никоим образом не ограничивает порядок, в котором они могут быть реализованы, за исключением некоторых случаев.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
В настоящем документе «офтальмологическая линза», иногда называемая «Линза», обозначает любое офтальмологическое устройство, которое находится в глазу или на глазу. Данные устройства могут обеспечивать оптическую коррекцию либо использоваться в косметических целях. Например, термин «линза» может обозначать контактную линзу, интраокулярную линзу, накладную линзу, глазную вставку, оптическую вставку или другое аналогичное устройство, которое используется для коррекции или модификации зрения или для косметической коррекции физиологии глаза (например, изменения цвета радужной оболочки) без ущерба для зрения. В некоторых вариантах осуществления предпочтительные линзы изобретения являются мягкими контактными линзами и изготовлены из силиконовых эластомеров или гидрогелей, которые включают, но не ограничиваются силиконовыми гидрогелями и флуоресцирующими гидрогелями.
Точное определение ультрафиолетового (УФ) излучения, в особенности в емкости или сосуде, является одной из задач, стоящих перед широким внедрением стерилизации УФ-излучением. Биологические индикаторы могут служить способом определения того, когда приложенная доза УФ-излучения будет обладать необходимой эффективностью для обеспечения стерилизации. Для преодоления некоторых проблем, возникающих при использовании биологических индикаторов, были разработаны химические индикаторы, основанные на разрушении пищи, лекарств и косметики (FD&C). В данной работе была установлена связь между дозой УФ-излучения и разрушением красителя, которая была использована для создания стандартных кривых. Поскольку эта связь известна, разрушение различных красителей может использоваться в качестве системы количественного определения. Применение разрушения красителя для определения дозы УФ-излучения особенно полезно в том случае, когда уровень УФ-облучения в емкости не может измеряться напрямую. Кроме того, в связи с яркой окраской красителей FD&C визуальные изменения, возникающие при облучении красителя, могут использоваться как визуальный индикатор для качественного определения дозы УФ-излучения.
1. Введение
Бактерицидные ультрафиолетовые (УФ) лампы рассматриваются медицинской промышленностью как средства для дезинфекции и стерилизации медицинских инструментов в течение более 60 лет (1). С тех пор УФ-излучение использовалось в качестве дезинфицирующего и стерилизационного агента для множества различных твердых, жидких и газообразных материалов (2, 3, 4). В частности, данная технология нашла широкое применение в обработке питьевой воды в течение последних двух десятилетий (2, 9, 10).
Хотя бактерицидные лампы имеют широкое применение, одной из главных проблем использования УФ-излучения для дезинфекции или стерилизации жидкостей является точное определение дозы УФ-излучения в жидкости. Повторяемое и воспроизводимое определение дозы УФ-излучения было затруднительным, когда бактерицидные лампы были впервые предложены в качестве способа стерилизации (5). В то время как энергия на единицу площади, сообщенная емкости с жидкостью, легко рассчитывается по мощности источника УФ-излучения и продолжительности воздействия, расчет энергии в растворе не так тривиален. К сожалению, даже сегодня стандартизация определения дозы УФ-излучения остается ненадежной вместе со многими новыми опубликованными способами определения (6, 7, 8).
avg
avg
avg
avg
avg
o
-A*L
Средняя доза (D) УФ-излучения в жидкости может быть рассчитана по продолжительности воздействия (t), умноженной на среднюю интенсивность (I): D=I*t. Средняя интенсивность рассчитывается при помощи следующего уравнения: I=I*(1-e)/(A*L), где A обозначает поглощающую способность жидкости на сантиметр, и L обозначает длину пути луча в облучаемом растворе (12). Однако данный расчет действителен только для гомогенного раствора. Поглощение УФ-излучения веществами в самом в растворе или оберткой, содержащей раствор, может приводить к получению очень неравномерной дозы при облучении. Полученные тени при УФ-излучении могут способствовать появлению мест, где микроорганизмы эффективно не уничтожаются. В последнее время были созданы компьютерные моделирования/имитации в попытке обеспечения лучшего прогнозирования дозы и эффективности УФ-излучения в растворах, что привело менее чем к желательным результатам (11, 21, 22). В связи с трудностями получения точной дозы и прогнозирования антимикробной эффективности дозы в жидкости существует очевидная необходимость в дополнительных способах количественного определения.
В дополнение к количественным определениям в процессе стерилизации обычно используются визуальные индикаторы для качественного определения. Поскольку были разработаны биологические индикаторы дезинфекции и стерилизации УФ-излучением (14, 15), которые, как правило, рассматриваются как наиболее точные способы контроля стерилизации, они обладают некоторыми недостатками по сравнению с химическими индикаторами, а именно задержкой при получении результатов, стоимостью и возможностью контаминации (13, 20). Эти недостатки могут ограничивать применимость биологических индикаторов в некоторых условиях. В то время как для других видов стерилизации, таких как паровая и химическая стерилизация, существуют эффективные химические индикаторы, имеющихся в продаже химических индикаторов для УФ-стерилизации недостаточно. Сообщалось о флуоресцентно меченых микросферах (17, 19) и кварце (18), используемых для определения дозы излучения в УФ-реакторах, и разложение свободного хлора был предложено в качестве способа количественного определения дозы УФ-излучения в растворе (16). Тем не менее все данные методики химического разложения могут применяться для количественного определения дозы УФ-излучения в растворе, однако недостаточность качественных изменений, которые могут быть замечены невооруженным глазом, объединяет их с другими химическими индикаторами.
В настоящем документе авторы описывают разработку системы измерения, основанной на разрушении различных хромофоров/флуорофоров, которая может использоваться в качестве количественного способа определения дозы УФ-излучения в жидкости или визуального химического индикатора для качественного определения, который меняет свой цвет, для стерилизации при помощи УФ-излучения.
2. Материалы и способы
2.1. Материалы
Красный очаровательный AC и желтый закат FCF были приобретены в компании Tokyo Chemical Industry (Токио, Япония). Эриоглауцин был приобретен в компании Spectrum (Гардина, Калифорния). Эритрозин B, тартразин и зеленый прочный FCF были приобретены в компании Alfa Aesar (Уорд Хилл, Массачусетс). Индигокармин был приобретен в компании Amresco (Солон, Огайо). Натриевая соль флуоресцеина была приобретена в компании Sigma (Сент-Луис, штат Миссури, США). Сертифицированный Национальным институтом по стандартизации и технологии бактерицидный УФ-датчик PMA2122 и регистратор данных PMA2100 были приобретены в компании Solar (Гленсайд, Пенсильвания). УФ-лампы были приобретены в компании LCD Lighting (Ориндж, Коннектикут). Программа TableCurve2D была приобретена в компании Systat Software (Сан-Хосе, Калифорния). Триптический соевый бульон, триптический соевый агар, бульон Сабуро с декстрозой и агар Сабуро с декстрозой были приобретены в Northeast Laboratories (Уотервилл, Мэн). Прозрачные 96-луночные планшеты #3585 фирмы Corning, кварцевые полумикрокюветы, чашки Петри и другие материалы были приобретены в компании VWR (Атланта, Джорджия).
2.2. Получение спектров и стандартной кривой
В кварцевую кювету было добавлено по 1 мл раствора красителя в деионизированной воде с концентрацией 10 мкг/мл. Спектры поглощения в УФ и видимой областях были определены при помощи Molecular Devices M5 (Саннивейл, Калифорния) на длинах волн от 200 до 800 нм с шагом 2 нм. Для каждого красителя был определен пик максимального поглощения в видимой области.
По 100 мкл различных концентраций раствора красителя в деионизированной воде было трижды добавлено в лунки 96-луночного планшета. Поглощение 96-луночного планшета было определено на соответствующих длинах волн при помощи Molecular Devices M5.
2.3. Затухание флуоресценции флуоресцеина
2
1-d
1/(1-d)
В кварцевые кюветы для анализа флуоресценции было добавлено по 1 мл различных концентраций флуоресцеина в деионизированной воде. Интенсивность флуоресценции в каждой кювете была измерена при помощи Molecular Devices M5 с поглощением на длине волны 490 нм, эмиссией на длине волны 520 нм и ограничивающим фильтром на длине волны 515 нм. Кюветы были облучены в течение различных отрезков времени бактерицидными УФ-лампами, находящимися в специальных зажимных приспособлениях. Мощность лампы, измеряемая в мкВт/см, была записана перед и после каждого цикла облучения. Интенсивность флуоресценции была снова определена таким же образом, как было описано выше. Доза была рассчитана путем умножения мощности лампы на время. Кривые затухания были построены в программе TableCurve2D при помощи уравнения 8119 DecayN в виде y=(b+cdx-cx)+a.
2.4. Разрушение хромофоров
2
В кварцевые кюветы было добавлено по 1 мл различных концентраций каждого красителя в деионизированной воде. Поглощение в каждой кювете было определено при помощи Molecular Devices M5 в пике с длиной волны максимального поглощения для каждого красителя. Кюветы были облучены в течение различных отрезков времени бактерицидными УФ-лампами, находящимися в специальных зажимных приспособлениях. Мощность лампы, измеряемая в мкВт/см, была записана перед и после каждого цикла облучения. Поглощение было снова определено таким же образом, как было описано выше. Доза была рассчитана путем умножения мощности лампы на время. Кривые были построены таким же образом, как было описано выше.
2.5. Подготовка микроорганизмов
Газон микроорганизмов был выращен в чашке Петри, содержащей триптический соевый агар для бактерий или агар Сабуро с декстрозой для C. albicans, в течение ночи при 35°C. Клетки были соскоблены с чашки Петри и перенесены в фосфатно-солевой буфер Дюльбекко (DPBS) объемом 5 мл, содержащий 0,05% полисорбата 80 (о/о) (TDPBS). После определения поглощения микроорганизмов оно было сравнено со стандартной кривой. Затем клетки были разведены до соответствующих концентраций, которые были необходимы для каждого конкретного эксперимента.
2.6. Стерилизация и эксперименты по определению дозы красителя
6
2
Инокулят каждого микроорганизма был скорректирован до ~10 КОЕ/мл в TDPBS. В кварцевые полумикрокюветы было добавлено по 1,5 мл инокулята. Кюветы были неровно обернуты различными видами целлофановой пленки для создания емкости с различными значениями поглощения УФ-излучения. Была определена мощность УФ-лампы, и время воздействия было скорректировано таким образом, чтобы каждая емкость кюветы подвергалась облучению в общей дозе 250 мВт*с/см. Количество жизнеспособных микроорганизмов было подсчитано описанным ниже способом. В такую же емкость кюветы был добавлен раствор эритрозина В с концентрацией 10 мкг/мл, после чего он был облучен описанным выше образом. После облучения поглощение красителя было определено на длине волны 525 нм, и соответствующая доза была рассчитана при помощи кривой, которая была построена выше.
2.7. Подсчет микроорганизмов
В каждую из шести лунок ряда A на 96-луночном планшете было добавлено по 100 мкл микроорганизмов. По 90 мкл бульона Сабуро с декстрозой или триптического соевого бульона было добавлено в ряды B-H данного планшета. Было проведено серийное разведение 1:10 путем переноса 10 мкл из ряда A в ряд B с последующим смешиванием. Эта схема была применена ко всему планшету. Затем во все лунки было добавлено по 100 мкл бульона Сабуро с декстрозой или триптического соевого бульона. Планшеты были инкубированы в течение 48 часов при 35°C. Поглощение каждой лунки было определено при помощи Molecular Devices SpectraMax 384Plus. Рост микроорганизмов в лунке рассматривался как положительный или отрицательный, и исходные концентрации микроорганизмов были рассчитаны при помощи наиболее вероятного метода подсчета (23, 24).
2.8. Визуальные изменения красителей при облучении УФ-излучением
В кварцевую кювету было добавлено по 1 мл раствора эритрозина В с концентрацией 10 или 100 мкг/мл или раствора индигокармина с концентрацией 100 мкг/мл в деионизированной воде. Была определена мощность УФ-лампы, и время воздействия было скорректировано таким образом, чтобы каждая кювета подверглась облучению определенной дозой УФ-излучения. Перед облучением и после него кюветы были сфотографированы.
3. Результаты и обсуждение
3.1. Разрушение красителя под действием УФ-облучения
В связи с полным отсутствием химических индикаторов для стерилизации УФ-излучением был проведен поиск химических веществ, которые обладают легко заметным цветом и/или изменением флуоресценции после УФ-облучения. Эти химические красители должны быть растворимы в воде, поскольку большая часть процессов стерилизации УФ-излучением проводится на сухих поверхностях или в водной среде (31); должны обладать высоким коэффициентом поглощения, благодаря чему красители легко распознаются невооруженным глазом; и предпочтительно должны быть нетоксичными. Обнаружено, что ярко окрашенные красители FD&C соответствуют всем требованиям, обладают очень низкими уровнями токсичности и высокой растворимостью в воде.
Для изображения того, как эти красители разрушаются под действием УФ-излучения, в качестве показательного примера в первую очередь был выбран флуоресцеин (D&C желтый 8). Различные концентрации флуоресцеина были облучены в кварцевых кюветах бактерицидными УФ-лампами с длиной волны 254 нм. В ходе эксперимента были определены интенсивность флуоресценции, поглощение и доза УФ-излучения. Кривые были построены при помощи программы TableCurve2D, и было установлено, какие из них лучше всего соответствуют кривой затухания. Как показано на Фиг.1(A), при каждой концентрации флуоресцеина наблюдалось хорошее соответствие кривой затухания.
Как и при любом затухании, когда интенсивность флуоресценции каждой кривой была преобразована в процент от ее исходного значения, все кривые свелись к кривой насыщения (Фиг.1(B)). Поглощение при разрушении вещества и кривые интенсивности флуоресценции были схожи. Использование одного уравнения подобранной кривой существенно упрощает выполнение и анализ эксперимента, поскольку нет необходимости в знании точной концентрации красителя, важны значения исходного определения его поглощения или интенсивности. Тем не менее, начальные и конечные значения должны находиться в линейном диапазоне датчика.
Для идентификации других красителей, которые обладают схожей кривой затухания при воздействии УФ-излучения с длиной волны 254 нм и различной чувствительностью, благодаря чему они могут использоваться для количественного определения диапазона различных доз, были выбраны эритрозин B (FD&C красный 3), красный очаровательный (FD&C красный 40), бриллиантовый голубой FCF (FD&C синий 1), индигокармин (FD&C синий 2), тартразин (FD&C желтый 5), желтый закат FCF (FD&C желтый 6) и зеленый прочный FCF (FD&C зеленый 3). В первую очередь были определены спектр поглощения, длина волны пикового поглощения и линейная область определения для каждого хромофора (См. Вспомогательную информацию).
В исследованиях разрушения УФ-излучением концентрация 10 мкг/мл была выбрана для обеспечения того, чтобы каждый краситель находился в линейном диапазоне обнаружения. Аналогично исследованиям флуоресцеина, каждый краситель был подвергнут воздействию известного количества УФ-излучения, и в течение всего эксперимента определялось поглощение. Эритрозин B также обладает значительной эмиссией флуоресценции, которая может использоваться в дополнение к его поглощению. Значения поглощения были преобразованы в процент от исходного значения поглощения, и полученные кривые соответствовали той же кривой затухания, как и у флуоресцеина.
Было обнаружено, что желтый закат и эриоглауцин не обладают простой кривой затухания, и поэтому они не использовались в дальнейших экспериментах. Оставшиеся красители, которые обладали простой кривой затухания, приведены на Фиг.2. Как показано на Фиг.3(A), скорость затухания различных красителей, которые обладают простой кривой затухания, охватывает широкий диапазон доз УФ-излучения. Диапазон количественного определения каждого красителя был определен между дозами, которые составляют процент между 100% и ~20% от исходного значения поглощения (Фиг.3(B)). После построения стандартных кривых и установления диапазона количественного определения данные красители затем могут использоваться для количественного определения дозы УФ-излучения, которая фактически была получена облучаемым объектом.
3.2. Определение внутренней дозы УФ-излучения емкостей и стерильности
Стерилизация УФ-излучением наиболее эффективна при ее приложении к среде с низким поглощением УФ-излучения, такой как воздух. Тем не менее, в большинстве видов стерилизации, в особенности во время процесса стерилизации жидкости, требуется прохождение УФ-излучения через некоторые емкости в дополнение к самой среде. Несоответствие поглощения обертки красителя в связи с изменением ее толщины или вида материала может привести к появлению областей, на которые воздействует меньшая доза ультрафиолета. Аналогичным образом, гетерогенные растворы также могут обладать различными уровнями поглощения доз УФ-излучения.
Поскольку доза УФ-излучения облучает наружную часть емкости, то ее довольно просто определить посредством измерения мощности лампы, но не так легко обеспечить возможность определения средней суммарной дозы внутри емкости. Тем не менее, поскольку в емкость может быть помещен растворимый краситель, возможно определение приблизительной средней дозы, полученной в данной емкости при воздействии УФ-излучения.
Для изучения влияния неравномерного поглощения материала во время стерилизации кварцевые кюветы были неравномерно обернуты в различные целлофановые пленки. Данная обертка содержит сгибы, мелкие складки и зазоры, которые обеспечивают различия в поглощении УФ-излучения. Было использовано десять различных оберток, которые были распределены по группам с уменьшающимся средним пропусканием УФ-излучения (Фиг.4(A)).
6
В упакованные кюветы было добавлено по 1,5 мл раствора с концентрацией микроорганизмов ~1×10 КОЕ/мл или раствор красителя эритрозина В с концентрацией 10 мкг/мл. Микроорганизмы и краситель были суспендированы в модифицированном Дюльбекко физиологическом растворе с фосфатным буфером, содержащем 0,05% полисорбата-80 (TDPBS). TDPBS использовался для предотвращения образования микроорганизмами крупных скоплений, а также для придания раствору значительной поглощающей способности для УФ-излучения. Затем заполненные запакованные кюветы были облучены постоянной внешней дозой излучения, которая была определена по мощности лампы, и количество выживших микроорганизмов, или внутренняя доза, была определена по уменьшению полученного поглощения красителя.
2
2
2
2
2
Для данного эксперимента по стерилизации были выбраны грамотрицательные бактерии, E. Coli, грамположительные бактерии, Staphylococcus aureus, и дрожжи Candida albicans. Дозы УФ-излучения, которые обеспечивают превышение в 12-log стерилизационной дозы, были получены или рассчитаны по опубликованным данным. В связи с различной методологией и определенными трудностями определения доз УФ-излучения в литературе имеются значительные различия в избыточных стерилизационных дозах, причем дозы для E. coli находятся в диапазоне от 2,5 до 98 мВт*с/см (25, 26, 27, 28, 31), для S. aureus - от 2,7 до 174 мВт*с/см (25, 26, 27, 29, 30, 31) и для C. albicans - от 26 до 537 мВт*с/см (25, 26, 31). В соответствии с различными опубликованными значениями и нашими собственными неопубликованными данными доза 100 мВт*с/см была выбрана для бактерий, а доза 250 мВт*с/см была выбрана для C. albicans.
Как видно на Фиг.4(B)-(D), рассчитанная внутренняя доза была меньше, чем приложенная доза, и поскольку проницаемость целлофановой обертки уменьшалась (группы емкостей с большими номерами имеют меньшую проницаемость для УФ-излучения, как показано на Фиг.4(A)), показано, что аналогичным образом уменьшалась и внутренняя доза. Меньшая внутренняя доза даже в необернутой кювете (группа емкостей 1) более вероятна в связи с увеличением поглощения раствора TDPBS, что приводит к почти 20% снижению проницаемости на 1 см. Увеличение расстояния от лампы до оберток на других группах кювет и небольшое поглощение самой кюветой также играют роль в снижении внутренней дозы.
Группы емкостей, которые обладают высокой проницаемостью и соответствующими высокими внутренними дозами, продемонстрировали полную стерилизацию для всех трех организмов (группы емкостей 1-4). Однако если поглощение целлофановой обертки повышено, то внутренняя доза в конечном счете упадет до уровня, при котором некоторые микроорганизмы могут выжить (группы емкостей 5-7). После преодоления этой точки перехода количество выживших микроорганизмов возрастает, а внутренняя доза продолжает падать (группы емкостей 8-11). Выжившие микроорганизмы неравномерно распределены среди копий каждого образца в связи с неравномерной обмоткой целлофановой пленкой, что приводит к большему непостоянству.
3.3. УФ-разрушение красителя в качестве визуального химического индикатора УФ-излучения
В дополнение к применению в качестве инструмента для количественного определения, разрушение красителей также может использоваться в целях качественного определения как визуальный химический индикатор дозы УФ-излучения. Поскольку были выбраны ярко окрашенные красители FD&C, изменение цвета при разрушении красителя может использоваться в качестве визуального индикатора. Для демонстрации визуальных изменений некоторые концентрации различных красителей были возбуждены известными дозами УФ-излучения с изображением каждого красителя во время процесса возбуждения. Растворы эритрозина В с концентрациями 10 и 100 мкг/мл и раствор индигокармина с концентрацией 100 мкг/мл были выбраны в качестве примерных образцов, поскольку они хорошо способны к изменению цвета в диапазоне исследуемых доз.
2
2
2
2
2
2
Как показано на Фиг.5(A) и (B), раствор эритрозина B с концентрацией 10 мкг/мл продемонстрировал наибольшее визуальное изменение при низких дозах УФ-излучения с резким различием цветов от 0 до 500 мВт*с/см и полное изменение цвета при 1000 мВт*с/см. Раствор индигокармина с концентрацией 100 мкг/мл был менее чувствителен, продемонстрировав небольшое изменение цвета при 500 мВт*с/см, резкое изменение цвета при 1000 Вт*с/см и полную потерю цвета при 2500 мВт*с/см. Наконец, более концентрированный раствор эритрозина B с концентрацией 100 мкг/мл допускал визуальные изменения при больших дозах УФ-излучения, и полная потеря цвета не наблюдалась вплоть до воздействия дозы 5000 мВт*с/см. Менее чувствительные к УФ красители могут применяться в качестве визуальных индикаторов, если необходимы большие дозы УФ-излучения.
3.4. 12-log превышение стерилизационной дозы УФ-излучения для микроорганизмов
2
2
2
Эталонные значения 12-log превышения значения стерилизационной дозы для различных бактерий, грибов, вирусов и простейших были получены или рассчитаны по опубликованным данным (31). Эти микроорганизмы были выбраны для их использования в качестве биологических индикаторов при стерилизации УФ-излучением или в связи с тем, что они являются известными патогенами для человека. В целом, большинство бактерий, вирусов и простейших стерилизуются при воздействии УФ-излучения с интенсивностью менее 500 мВт*с/см, однако некоторые микроорганизмы обладают повышенной резистентностью. Грибы, в особенности их споры, более резистентны к стерилизации УФ-излучением, чем другие группы микроорганизмов, большая часть которых стерилизуется в диапазоне интенсивности от 500 до 2500 мВт*с/см. Подавляющее большинство микроорганизмов стерилизуется в диапазоне интенсивности от 0 до 5000 мВт*с/см, эритрозин B и/или индигокармин могут использоваться в качестве эффективных химических индикаторов для качественного определения того, достаточна ли доза УФ-излучения для стерилизации.
4. Выводы
Семь красителей FD&C и краситель D&C флуоресцеин были исследованы с целью определения того, может ли их поглощение и/или снижение флуоресценции при УФ-облучении с длиной волны 254 нм использоваться для количественного определения дозы УФ-излучения. Шесть из восьми красителей продемонстрировали простые кривые затухания при УФ-облучении. Были созданы стандартные кривые УФ-разрушения этих шести красителей, и все эти красители могут использоваться для определения средней дозы УФ-излучения, которая была сообщена раствору. В связи с различной чувствительностью красителей могут быть количественно определены различные диапазоны доз УФ-излучения.
Для обеспечения возможности непосредственного определения дозы УФ-излучения в емкости кюветы, неравномерно обернутые различными целлофановыми пленками, которые поглощают УФ, были облучены постоянной дозой энергии УФ-излучения, которая эквивалентна 12-log превышению стерилизационной дозы. В связи с конструкцией емкостей кюветы количество энергии УФ-излучения, которое может поступить во внутреннее пространство, неизвестно, а его абсолютное вычисление затруднительно. В эти емкости были добавлены краситель эритрозин B или микроорганизмы E. coli, S. aureus или C. albicans. Краситель был использован для количественного определения дозы внутреннего УФ-облучения или количества выживших микроорганизмов. Показано, что снижение внутренней дозы коррелирует с увеличением количества выживших микроорганизмов, даже если общая энергия УФ-излучения, которая поступила в емкость извне, не изменилась.
2
2
В конечном счете, изучали визуальные изменения красителей под действием УФ-облучения. Два наиболее чувствительных красителя, эритрозин B и индигокармин, продемонстрировали хорошее визуальное изменение цвета в диапазоне доз от 0 до 5000 мВт*с/см в зависимости от их концентрации. Кроме того, красители могут использоваться в том случае, если необходимы большие дозы излучения, однако поскольку 12-log превышение стерилизационной дозы для наиболее соответствующих микроорганизмов ниже 5000 мВт*с/см, эти два красителя могут использоваться для подавляющего большинства микроорганизмов.
Таким образом, в связи с затруднениями при определении абсолютной дозы УФ-излучения и текущей нехваткой доступных в продаже химических индикаторов для стерилизации УФ-излучением существует потребность в новых способах количественного и качественного определения. Возможность использования разрушения красителей FD&C является как инструментом количественного определения, так и визуальным индикатором для качественного определения, что делает эти красители хорошим выбором для химического индикатора УФ-излучения.
Заключение
Описано множество вариантов осуществления настоящего изобретения. Поскольку данное описание содержит множество конкретных деталей осуществления, они не должны рассматриваться как ограничения объема любых изобретений или того, что может быть заявлено в формуле изобретения, как и описания конкретных особенностей определенных вариантов осуществления настоящего изобретения.
Некоторые особенности, описанные в настоящем описании относительно отдельных вариантов осуществления, также могут быть осуществлены в комбинации с другими в виде отдельного варианта осуществления. Напротив, различные особенности, описанные относительно отдельного варианта осуществления, также могут осуществляться в сочетании с множеством вариантов осуществления по отдельности или в виде любой подходящей подкомбинации. Более того, хотя особенности могут описываться выше с учетом их взаимодействия с другими комбинациями или даже первоначально заявляться в таком качестве, одна или более особенности заявленной комбинации в некоторых случаях может исключаться из комбинации, и заявленная комбинация может использоваться в подкомбинации или измененной подкомбинации.
Аналогичным образом, поскольку действия изображаются на фигурах в определенном порядке, это не следует понимать как требование того, что такие действия могут осуществляться в показанном определенном порядке или последовательности, или что все изображенные действия должны быть осуществлены для получения желаемых результатов. В некоторых обстоятельствах может быть полезна многозадачная и параллельная обработка. Более того, отделение различных компонентов системы в описанном выше варианте осуществления не следует понимать как требование того, что это необходимо во всех вариантах осуществления, и это следует понимать так, что описанные программные компоненты и системы могут быть интегрированы в единый программный продукт или упакованы в несколько программных продуктов.
Таким образом, были описаны конкретные варианты осуществления описанного объекта изобретения. Другие варианты осуществления входят в объем прилагаемой формулы изобретения. В некоторых случаях действия из формулы изобретения могут проводиться другим образом и все же содействовать достижению желаемых результатов. Кроме того, процессы, изображенные на прилагающихся фигурах, необязательно требуют рассмотрения в определенном порядке или последовательности для достижения желаемых результатов. В некоторых осуществлениях может быть полезна многозадачная и параллельная обработка. Несмотря на это должно быть понятно, что различные модификации могут проводиться без отхода от сущности и объема заявленного изобретения.