Ферменты семейства PARP как платформа для создания новых лекарств

НОВЫЕ БИОМИШЕНИ ДЛЯ ДЕЙСТВИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ И ТЕСТ-СИСТЕМЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ИСПЫТАНИЙ

А. Куимов

ФЕРМЕНТЫ СЕМЕЙСТВА PARP КАК ПЛАТФОРМА ДЛЯ СОЗДАНИЯ НОВЫХ ЛЕКАРСТВ

НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского МГУ, Москва

Поли-АСР-рибозилирование - один из способов посттраисляциоиной модификации белков, который клетка использует в механизмах защиты ДНК от повреждений, для регуляции митоза и других жизненно важных процессов. К ферментам семейства РАИР (поли-АСР-рибоза-полимераз) относят 17 белков, закодированных в геноме человека. Среди них наиболее изученными являются РАИР-1, активируемая разрывами ядерной ДНК, и тан-киразы, два сигнальных белка, локализованных в различных клеточных компартментах. Все ферменты этого семейства используют КАС+ для синтеза поли-АСР-рибозы, ковалентно связанной с рядом специфических белковых субстратов. В нашей и зарубежных лабораториях изоэнзим танкираза-2 человека был клонирован как опухолевый антиген. Этот фермент в норме экспрессируется в клетках эпителия почечных канальцев и в некоторых других типах дифференцированных клеток. Танкираза-2 обнаружена нами также в 20-30% исследованных опухолей молочной железы, а ферментативная активность одной или обеих танкираз повышена во всех исследованных опухолевых клетках. Функция танкиразы состоит в регуляции длины теломер ДНК, расхождения хромосом при митозе и некоторых других процессов. Ингибиторы танкиразы и других ферментов семейства РАИР могут найти применение при лечении многих заболеваний, в том числе онкологических.

Несмотря на широкую известность РАИР-1 в связи с расщеплением этого фермента при апоптозе, семейство РАИР до сих пор мало привлекало внимание отечественных ученых. Его изучение началось в конце прошлого века, когда в связи с сокращением финансовой базы российской науки новые объекты исследования практически перестали интересовать сокращаемые институты и лаборатории нашей страны. В международных журналах обширная литература по этой теме была обобщена в ряде обзоров [1-9].

Поли-АСР-рибоза-полимеразы (РАИР) катализируют одну из реакций посттрансляционной модификации белка, поли-АСР-рибозилирование. В ходе этой реакции молекула КАС+ подвергается необратимому расщеплению, в ходе которого никотинамид освобождается в раствор, а остаток АСР-рибозы используется для полимеризации. Никотинамид является не только одним из продуктов, но и конкурентным ингибитором реакции. На основе никотинамида или бен-замида синтезируют значительную часть эффекторов ферментов семейства РАИР [7].

Различают два основных типа ферментов, катализирующих АСР-рибозилирование: моно-АСР-рибоза-полимеразы и поли-АСР-рибоза-полимеразы. Примером моно-АСР-рибоза-полимераз является холерный токсин (КФ 2.4.2.31). Все известные поли-АСР-

рибоза-полимеразы (КФ 2.4.2.30) относятся к одному семейству с гомологичным каталитическим PARP доменом. Первым ферментом этого семейства была описана PARP-1 [10, 11]. Известна пространственная структура этого фермента и его отдельных доменов. Основная (но не единственная) функция PARP-1 состоит в регуляции репарации, поэтому фермент активируется поврежденной ДИК.

Для синтеза каждой молекулы NAD+, затрачиваемой в качестве одного из субстратов ферментами семейства PARP, используется четыре молекулы ATP. Если PARP активирована слишком долго, то клетка гибнет от истощения запасов макроэргов, что вызывает некроз тканей. Поэтому ингибиторы PARP с успехом применяют для лечения патологических процессов, в которых происходит повреждение и активируется репарация ДИК. Конечно, ингибиторы не могут предотвратить гибель клеток из-за повреждения ДИК, она может быть только отсрочена, но вместо острого некроза происходит медленная и постепенная замена гибнущих клеток, позволяющая сохранить целостность ткани. К тому же сам процесс гибели клетки происходит в виде апоп-тоза, а не некроза, что существенно смягчает негативные последствия отмирания части клеток для организма в целом.

Среди патологических процессов, лечение которых возможно с использованием ингибиторов PARP, можно перечислить последствия ионизирующего облучения, ишемии, воспаления, а также аутоиммунные заболевания и диабет [6, 7, 9].

Важность ингибирования PARP-1 в процессе гибели клетки подтверждается и тем, что в процессе эволюции появился специальный механизм протеоли-тической деградации этого фермента, который включается, когда клетка инициирует апоптоз. В ходе апоптоза происходит рестрикция ДИК, и если бы к этому моменту в клетке присутствовала каталитически активная PARP-1, то был бы запущен механизм репарации с неизбежной затратой энергии и последующим некрозом.

Еще до открытия остальных ферментов семейства PARP были обнаружены эффекты ингибирования PARP на развитие опухолей и повышенная активность PARP в опухолевых клетках. Механизмы этих эффектов оставались неясными до тех пор, пока не выяснились функции еще одного фермента семейства PARP, открытого в 1998 г. Это была танкираза.

Впервые танкираза была обнаружена в Рокфеллеровском университете (Иью-Йорк) группой, изучающей белковые компоненты теломер. Этот ранее неизвестный фермент был локализован на теломерах человека, его белковым субстратом был один из теломерных белков, и первое время фермент считался связанным с теломерами регулятором теломеразы [12]. Однако уже через год была показана его локализация на ядерных порах [13], а еще через год - в аппарате Гольджи и в цитоплазматических везикулах [14]. Поэтому стало ясно, что функциями на теломерах роль танкиразы не ограничивается.

Подавление активности танкиразы в клетках человека приводит к аресту митоза и их последующей гибели [15, 16]. Показано, что танкираза необходима для расхождения гомологичных хромосом [17-19], но ее присутствие было также обнаружено в центросомах, где роль этого фермента до сих пор остается неясной.

Как оказалось впоследствии, участие танкиразы в регуляции пролиферации и поддержания целостности теломер свойственно далеко не всем живым существам.

Этот фермент обнаружен только в геноме животных и некоторых простейших, но отсутствует у растений, грибов и прокариот. Кроме того, эволюция тан-киразы происходила практически целиком в пределах царства животных.

Как показано на рис.1, танкираза возникла у простейших, вероятно в результате слияния генов PARP-1 и анкирина. У простейших и примитивных беспозвоночных животных фермент еще сохраняет один из важных признаков PARP-1 - присутствие кроме каталитического также и прилегающего к нему регуляторного PARP домена (рис.2).

У танкираз насекомых и хордовых регуляторный PAPR домен замещен SAM доменом, происхождение которого остается неизвестным. У позвоночных жи-

Dd

Се

___________ Мт2

------------ --------- HS2

_____________________ G02

________________| Мт1

--------------- Gg1

---------------- НЕ1

Рис.1. Филогенетическое древо танкираз:

Dd - Dictyostelium discoideum; Ce - Caenor-habditis elegans; Ag - Anopheles gambiae; Dm - Drosophila melanogaster; Mm2 - Mus musculus tankyrase 2; Hs2 - Homo sapiens tankyrase 2; Gg2 - Gallus gallus tankyrase 2; Mm1 - Mus musculus tankyrase 1; Gg1 -Gallus gallus tankyrase 1; Hs1 - Homo sapiens tankyrase 1.

|NP_7e030Q} *n

-OJ-----i Mm

{AAN-tlfiM 1) UH J AAN41 B5G.1} i«T

---1--------  Gfl

(hlP_SSl4lO) „„

Dm

_______i -----Сй

1САОЕЭ2Э9) „н

---------1 _______________ _______ Dd

idAflP (Wff1

Рис.2. Схемы доменных структур танкираз мыши (Mm), цыпленка (Gg), дрозофилы (Dm), нематоды (Ce) и простейших (Dd). На схемах слева направо показаны домены анкириновый (ANKYRIN), регуляторный PARP (rPARP) и каталитический (PARP). У большинства животных регуляторный PARP домен замещен на SAM (квадрат). В скобках указаны коды доступа к последовательностям в базе данных Genbank, цифрами в конце каждой схемы указан размер белка в аминокислотных остатках.

вотных, кроме того, произошло удвоение гена, и вместо одной танкиразы, как у беспозвоночных и простейших, человек и другие хордовые имеют два изозима танкиразы. Ген танкиразы-1 человека локализован на хромосоме 8, а танкиразы-2 - на хромосоме 10.

Работа с танкиразой-2 на момент публикации первой статьи о танкиразе-1 уже велась в нескольких лабораториях, и ее первые результаты были опубликованы в 2001 г. Изозим 2 был клонирован как опухолевый антиген [20, 21]. Не менее 10% больных раком молочной железы и толстого кишечника имеют в кро-

ви заметное количество антител против этого белка, в то время как у здоровых людей аутоиммунный ответ против танкиразы-2 встречается редко [22]. При им-муногистохимическом анализе большее или меньшее количество этого белка также может быть обнаружно в 20-30% опухолей молочной железы, в то время как в здоровых тканях и в большинстве раковых опухолей этот антиген не определяется. В норме танкиразу-2 можно видеть в эпителии почечных канальцев и тонкого кишечника [23].

Нокаут гена танкиразы-2 у мышей дал жизнеспособных животных, хотя их рост по сравнению с контрольной группой и был заметно замедлен [24, 25]. Оказалось, что у мышей танкираза не функционирует на теломерах [26] и при митозе, а замедление роста, по-видимому, связано с дисфункцией почек и кишечника.

Когда танкираза может быть обнаружена в клетках опухолей, она, так же как и в эпителии почечных канальцев, локализована в цитоплазме [23]. При ультрацентрифугировании фермент ассоциирован преимущественно с цитоплазматическими везикулами, хотя некоторая часть его находится в растворе [27]. Растворимая танкираза связана в прочный комплекс с другими белками [28, 29], которые также могут быть ассоциированы с цитоплазматическими везикулами, поэтому можно предположить, что основная функция танкиразы - регуляция везикулярного транспорта. Роль танкиразы в регуляции митоза и в подержании целостности теломер в эволюции появилась на сравнительно поздних стадиях и, возможно, свойственна лишь человеку и некоторым животным.

Известно, что активность танкиразы регулируется инсулином и другими пептидными гормонами через сигнальный путь ЯаБ-МАРК [14], включающий продукты нескольких онкогенов. По-видимому, с этим связано отсутствие заметного повышения экспрессии этого фермента в большинстве опухолей [23], хотя некоторое повышение ферментативной активности было отмечено во всех исследованных линиях опухолевых клеток [27]. Когда механизм злокачественной трансформации включает постоянную активацию онкобелков каскада ЯаБ-МАРК, активность танкиразы возрастает за счет посттрансляционной модификации и без заметного увеличения количества фермента.

Всего геном человека содержит семнадцать генов семейства РАИР [5], из которых о большинстве в литературе имеются лишь отрывочные сведения. Поэтому в ближайшем будущем следует ожидать дальнейшего роста исследований как самих этих ферментов, так и их эффекторов или лекарственных препаратов, разработанных на их основе. На сегодняшний день известно несколько методов определения активности ферментов семейства РАИР, из которых для высокопроизводительного скрининга эффекторов наиболее перспективным, вероятно, является недавно запатентованный способ синтеза искусственного субстрата, дающего цветную реакцию [30].

Автор благодарит РФФИ за финансовую поддержку (грант 06-04-49388).

ЛИТЕРАТУРА

1. Ame J. C., Spenlehauer C., de Murcia G. Bioessays 2004; 26: 882-893.

2. Beneke S., Bürkle A. Nucleic Acids Res. 2007; 35: 7456-7465.

3. De Soto J.A., Deng C.-X. Int J Med Sci. 2006; 3: 117-123.

4. Hassa P.O., Haenni S. S., Elser M., Hottiger M.O. Microbiol Mol Biol Rev. 2006; 70: 789-829.

5. Otto H., Reche P.A., Bazan F., Dittmar K., Haag F., Koch-Nolte F. BMC Genomics 2005; 6: 139.

6. Pacher P., Szabo C. Cardiovasc Drug Rev. 2007; 25: 235-260.

7. PARP as Therapeutic Target (Jie Zhang, eds.), CRC Press LLC, 2002.

8. Smith S. Trends Biochem Sci. 2001; 26:174-179.

9. Szabo C., Dawson V.L. Trends Pharmacol Sci. 1998; 19: 287-298.

10. Alkhatib H. M., Chen D., Cherney B., Bhatia K.,

Notario V., Giri C., Stein G., Slattery E., Roeder R.G.,

Smulson M.E. Proc. Nat. Acad. Sci. 1987; 84: 1224-1228.

11. Kurosaki T., Ushiro H., Mitsuuchi Y., Suzuki S., Matsuda M., Matsuda Y., Katunuma N., Kangawa K., Matsuo H., Hirose T., Inayama S., Shizuta Y. J. Biol. Chem. 1987; 262: 15990-15997.

12. Smith S., Giriat I., Schmitt A., de Lange T. Science 1998; 282: 1484-1487.

13. Smith S., de Lange T. J.Cell Sci. 1999; 112: 3649-3656.

14. Chi N.W., Lodish H.F. J Biol Chem. 2000; 275: 38437-38444.

15. Chang P., Coughlin M., Mitchison T.J. Nat Cell Biol. 2005; 7: 1133-1139.

16. Chang W., Dynek J.N., Smith S. Biochem J. 2005; 391: 177-184.

17. Canudas S., Houghtaling B.R., Kim J.Y., Dynek J.N., Chang W.G., Smith S. EMBO J. 2007; 26: 48674878.

18. Hsiao S.J., Smith S. Biochimie 2008; 90: 83-92.

19. Dynek J.N., Smith S. Science. 2004; 304: 97-100.

20. Kuimov A.N., Kuprash D.V., Petrov V.N., Vdovichenko K.K., Scanlan M.J., Jongeneel C.V., Lagarkova M.A., Nedospasov S.A. Genes Immun. 2001; 2: 52-55.

21. Monz D., Munnia A., Comtesse N., Fischer U., Steudel W.I., Feiden W., Glass B., Meese E.U. Clin Cancer Res. 2001; 7: 113-119.

22. Shebzukhov Y.V., Lavrik I.N., Karbach J., Khlgatian S.V., Koroleva E.P., Belousov P.V., Kashkin K.N., Knuth A., Jager E., Chi N.W., Kuprash D.V., Nedospasov S.A. Cancer Immunol Immunother. 2007; в печати.

23. Sidorova N., Zavalishina L., Kurchashova S., Korsakova N., Nazhimov V., Frank G., Kuimov A. Cell Tissue Res. 2006; 323: 137-145.

24. Chiang Y.J., Nguyen M.L., Gurunathan S., Kaminker P., Tessarollo L., Campisi J., Hodes R.J. Mol Cell Biol. 200б; 2б: 2037-2043.

25. Hsiao S.J., Poitras M.F., Cook B.D., Liu Y., Smith S. Mol Cell Biol. 200б; 2б: 2044-2054.

26. Muramatsu Y., Ohishi T., Sakamoto M., Tsuruo T., Seimiya H. Cancer Sci. 2007; 98: 850-857.

27. Куимов A.^, Tеpехoв С.М. Биохимия 2003;

68: 318-327.

28. De Rycker M., Price C.M. Mol Cell Biol. 2004; 24: 9802-9812.

29. Сидорова Н.Н., Фадеев А.О., Куимов А.Н. Биохимия 2008; 73: 356-363.

30. Nottbohm A.C., Dothager R.S., Putt K.S., Hoyt M.T., Hergenrother P.J. Angew Chem Int Ed Engl. 2007; 46: 2066-2069.

C.H. Новиков

ПЕРСПЕКТИВЫ СОЗДАНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ МАТРИЦЫ ПИРАЗИН-СВЯЗЫВАЮЩИХ ТРАНСПОРТНЫХ БЕЛКОВ

Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, г. Санкт-Петербург

Современная тенденция развития фармацевтических нанотехнологий свидетельствует о больших перспективах использования в клинической практике новых лекарственных препаратов, ассоциированных с белковой матрицей-носителем (Платэ и др., 2001). Дальнейшие исследования в этом направлении, с одной стороны, могут привести к резкому удешевлению и значительному повышению эффективности действия лекарственных средств, с другой - к снижению нежелательных побочных эффектов (Новиков, 2004). Некоторые из алкилпроизводных пиразина (C4H4N2) обладают выраженной физиологической активностью и являются высоко перспективными средствами в терапии ряда социально значимых заболеваний, в первую очередь, - онкологических (Касьяненко и др., 2002; Yamaguchi et al., 2003). Пиразин-связывающие белки (pyrazine-binding proteins, PyrBP) относятся к семейству низкомолекулярных транспортных белков с М.м. 1822 кДа - липокалинов, осуществляющих адресный перенос гидрофобных физиологически активных соединений к органу- (ткани-).мишени в жидких средах (кровь, лимфа, слизь). В докладе представлен подробный анализ современного состояния экспериментальных исследований по генотоксичности 2,5-диметилпиразина (2,5-DMP), дано теоретическое обоснование перспектив создания новой группы противоопухолевых препаратов на основе 2,3,5,6-тетраметилпиразина (TMP, лигустразина), ассоциированного с рекомбинантным пи-разин-связывающим белком. Рассмотрены принципы конструирования новых лекарственных соединений в составе полимерной матрицы PyrBP (Новиков, 2005). Особое внимание уделено разработке неинвазивных (ингаляционных) методов введения данного комплекса и результатам экспериментальных работ по выделению в клетках обонятельной выстилки и легочной ткани млекопитающих специфических рецепторов к PyrBP (Boudjelal et al., 1996).

Н.Ю. Анисимова1, М.В. Киселевский1, O.K. Жукова1, А.В. Соснов2, А.А. Гах2

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫЕ БИОМИШЕНИ ДЛЯ ТЕРАПИИ ГОРМОНОРЕЗИСТЕНТНОГО РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ДЕЙСТВУЮЩИЕ НА НИХ ТАРГЕТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ

1 Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва Исследовательский Институт Химического Разнообразия, Химки

Oak Ridge National Laboratory, USA

Рак предстательной железы (РПЖ) занимает 3-4 место в мировой структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями среди мужского населения. В США — 1-е место по заболеваемости

(около 300 тыс. больных в год), в Западной Европе — 1-2 места (около 200 тыс. больных в год). В России РПЖ за последние 10 лет занимает первое место по приросту заболеваемости и четвертое в ее структуре.