СПОСОБ ПРЕОБРАЗОВАНИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ АКТИВНЫХ БЕЛКОВ В ГИДРОФОБНЫЕ АКТИВНЫЕ БЕЛКИ, ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СЛОЕВ ОРИЕНТИРОВАННЫХ АКТИВНЫХ БЕЛКОВ И УСТРОЙСТВА, ВКЛЮЧАЮЩИЕ ВОДОРАСТВОРИМЫЕ АКТИВНЫЕ БЕЛКИ, ПРЕОБРАЗОВАННЫЕ В ГИДРОФОБНЫЕ АКТИВНЫЕ БЕЛКИ
METHOD OF WATER-SOLUBLE ACTIVE PROTEIN CONVERSION IN HYDROPHOBIC ACTIVE PROTEINS, THEIR APPLICATION FOR PRODUCING MONOMOLECULAR LAYERS OF ORIENTED ACTIVE PROTEINS, AND DEVICES COMPRISING WATER-SOLUBLE ACTIVE PROTEINS CONVERTED TO HYDROPHOBIC ACTIVE PROTEINS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение имеет отношение к способу преобразования гидрофильных, водорастворимых, активных белков (HPiAP) в гидрофобные активные белки (НРоАР) с помощью ковалентной модификации поверхностных гидрофильных аминокислотных остатков гидрофобными реагентами в гетерогенной фазе или в смеси растворителей с различной полярностью. Белки, которым была придана гидрофобность, сами самопроизвольно объединяются на многих различных гидрофобных твердых подложках в статистически ориентированные монослои, подходящие для внедрения в биореакторы и биосенсоры, для механической манипуляции и для исследований, включающих атомную силовую микроскопию (АРМ).
Уровень техники
Монослои биомолекул, прочно прикрепленных к твердому субстрату, требуются для множества разнообразных экспериментальных биоинженерных исследований и/или приложений. Атомная силовая микроскопия (AFM) представляет собой наиболее очевидный пример. Атомная силовая микроскопия позволяет сканировать образцы, фиксированные на твердых подложках, на уровне размеров атома. Сигналы, воспринимаемые с помощью подвижного кантиливера, позволяют, после соответствующего усиления, проводить топографический анализ исследуемых образцов. Следовательно, атомная силовая микроскопия (АРМ) позволяет исследовать образцы с наноскопическими размерами, т.е. между 1 и 200 нм. Если сканирование проводят в водном растворе, то существует также возможность проанализировать биологические образцы в физиологических условиях. Однако для получения изображений, соответствующих реальности, нужно чтобы исследуемый биологический образец был обязательно закреплен на подложке, так чтобы тонкий кончик зонда микроскопа не мог сдвинуть его во время проведения сканирования. К тому же предпочтительно, чтобы образец был организован как мономолекулярный слой.
Известные в настоящее время использующие гидрофобные взаимодействия способы получения мономолекулярных слоев, иммобилизованных на гидрофобном субстрате, подразумевают или применение природных гидрофобных молекул, смотри Dawn S.Y.Yeo et al. "Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening", 2004, Vol.7, No, 3 pp.213-221, или применение водорастворимых белков, которые приобрели свойства гидрофобных белков в результате конформационных изменений, связанных с температурой, ионной силой или изменениями рН, смотри Kapila Wadu-Mesthrige et al. "Journal Scanning Microscopy", 2000, Vol 22, pp.338-388; Hyun J. et al. "J. Am. Chem. Soc.", 2004, 126(23) pp.7330-7335. Этим способам недостает селективности, так как физико-химические модификации могут также затронуть активный центр белка с последующей потерей природной биологической активности.
Альтернативно гидрофобизированный белок может быть получен с помощью способов генной инженерии водорастворимых белков, которые, однако, бывают очень сложными и не гарантируют сохранения исходной активности, смотри Hyun J. et al. (выше) или С.Tranchant et al. "Rev. Neurol. (Paris)", 1996,152 (3), pp.153-157.
Вследствие этого до сих пор можно было успешно исследовать только мембранные белки, которые самопроизвольно закрепляются на липидном бислое, или молекулярные комплексы, имеющие крупные размеры. Об изображениях растворимых белков не сообщалось.
Следовательно, в объем настоящего изобретения входит обеспечение новыми способами гидрофобирования водорастворимых гидрофильных функциональных белков без влияния на природную биологическую функцию белка, что дает возможность сканировать, получать изображения и манипулировать водорастворимыми белками.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение имеет отношение к способам преобразования гидрофильных, водорастворимых, функциональных белков (HPiAP) в гидрофобные белки (НРоАР), с сохранением их природной биологической активности. Способы подразумевают асимметричные химические модификации гидрофильных белков, т.е. то, что с их помощью вводят химические модификации в находящиеся на поверхности аминокислотные остатки, расположенные в такой области, которая удалена или расположена с противоположной стороны от области молекулы, ответственной за функцию белка. Этого результата достигают путем проведения реакции с "гидрофобирующими" реагентами в гетерогенной фазе или в гомогенной смеси растворителей с сильно различающейся полярностью.
Настоящее изобретение основано на том факте, что растворимость белков в воде зависит от соотношения числа гидрофобных и гидрофильных аминокислотных остатков, находящихся на поверхности. В общем, в активных белках, таких как ферменты, область поверхности различной протяженности ответственна за взаимодействие с небольшими водорастворимыми молекулами различной природы, а именно с субстратами, ингибиторами, кофакторами и другими, и эта область, т.е. активный центр, представляет собой преимущественно гидрофильную область.
Способ изобретения применяет асимметричное распределение полярности для направления реакции химической модификации, необходимой для изменения природы белка, в область, удаленную или расположенную с противоположной стороны от этого активного центра.
Затем полученные таким способом "гидрофобизированные" функциональные белки иммобилизуют или прикрепляют к гидрофобным твердым подложкам с помощью гидрофобных взаимодействий с целью получить ориентированные мономолекулярные слои активных белков.
Термин "ориентированные", примененный в настоящем изобретении, означает то, что все иммобилизованные белки были существенным образом ориентированны так, чтобы гидрофобизированная часть молекулы была прикреплена к поверхности субстрата, тогда как свободный активный центр был отдален от точки прикрепления. Термин не означает то, что иммобилизованные молекулы были одинаково ориентированы в пространстве, напротив эта ориентация была случайной.
Термин "мономолекулярный слой" означает то, что полученные слои, главным образом и предпочтительно, представляют собой "мономолекулярные" слои, хотя также не было возможности избежать образования нежелательных ограниченных областей полимолекулярных слоев.
Следовательно, первая цель изобретения представляет собой способ получения гидрофобного или частично гидрофобного активного белка, такого как раскрыт в любом из пунктов формулы изобретения с 1 по 8.
Вторая цель изобретения представляет собой природный гидрофильный активный белок, из которого был сделан гидрофобный активный белок, такой как раскрыт в п.9 или 10.
Третья цель изобретения представляет собой способ получения устройства, такого как было раскрыто в п.11 и 13, и полученное таким способом устройство.
Дополнительные цели изобретения представляют собой биореакторы или биосенсоры, включающие это устройство.
Еще дополнительные цели изобретения представляют собой образцы для исследования конформации водорастворимого белка или конформации его комплекса с лигандом или для исследования взаимодействия между белком и лигандом или тем, что может быть лигандом для этого белка, такие как раскрыты в п.17 и 18.
Итоговая цель изобретения представляет собой применение биореактора или биосенсора в виде твердой реакционноспособной подложки для получения микрочипов для диагностического, генетического, иммунологического анализа или механической манипуляции с белком или генетическим материалом, или для обработки жидкостей или газов.
Существует много факторов, в норме способных влиять на функции активного белка, такого как фермент. Например, конформационные эффекты, если имеют место конформационные модификации или модификации в распределении заряда; стерические эффекты, если на взаимодействие субстрата с ферментом влияет стерический барьер; распределяющие эффекты, имеющие отношение к химической природе материала подложки и к модифицированному микроокружению.
Следовательно, a priori можно было ожидать, что реакция гидрофобизация может изменить кинетику и другие свойства активного белка, например повлиять на специфическую энзиматическую активность.
Наоборот, результаты, приведенные в примерах, показывают, что заявленный способ исключает или сводит к минимуму эту ожидаемую потерю активности.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 иллюстрирует протекание гидролиза BAPNA от t0h до t6h холестерил-трипсином, иммобилизованным на кремниевой пластинке.
На фиг.2 показана топография холестерил-трипсина, гидрофобно закрепленного в водном растворе на кремниевой пластинке (область сканирования 150 кв. нм). Панель (а) показывает изображение области примерно в 1 мкм; панель (b) показывает изображение области примерно в 150 нм; панель (С) представляет поперечный разрез мономолекулярного слоя.
На фиг.3 показана топография холестерил-трипсина, закрепленного в водном растворе на кремниевой пластинке (область сканирования 50 кв. нм). Панель (а) показывает изображение области примерно в 50 нм; панель (b) показывает поперечный разрез мономолекулярного слоя.
На фиг.4 показана топография холестерил-трипсина, закрепленного в водном растворе на кремниевой пластинке (область сканирования 24 кв. нм). Панель (а) показывает изображение области примерно в 24 нм область; панель (b) показывает поперечный разрез мономолекулярного слоя.
На фиг.5 показан масс-спектр дистиллированной воды (верхняя панель), пройденный с помощью функционализированного трипсинового сверхтонкого зонда: пики автолиза трипсина отсутствуют, и трипсин в растворе (нижняя панель). Ясно видны пики автолиза.
На фиг.6 показан масс-спектр человеческого сывороточного альбумина (HSA) (верхняя панель), гидролизованного в течение 10 мин с помощью функционализированного трипсинового сверхтонкого зонда: пики автолиза трипсина отсутствуют, тогда как пики HSA присутствуют полностью; HAS, гидролизованный в течение ночи трипсином в растворе: кружком показан пик автолиза(нижняя панель).
Фиг.7 показывает кинетику кварцевого демпинга, индуцированного блокированием молекул трипсина, модифицированного в соответствии со стратегией II изобретения. Кварцевую поверхность покрывают тончайшим золотым покрытием, которое делают гидрофобными с помощью тиохолестерина.
Осуществление изобретения
Гидрофильные активные белки (HPiAP) в соответствии с настоящим изобретением представляют собой любой водорастворимый белок, который выбирают из группы, включающей ферменты, гормоны, рецепторы, антигены, антитела, аллергены, иммунореактивные белки, партнеров по сродству и любые производные, фрагменты, комплексы их функциональных эквивалентов. В особенности, активный белок может быть любым ферментом в его природной форме, который выбирают из основных классов оксидоредуктаз, трансфераз, гидролаз, лиаз, изомераз и лигаз. Этот белок представляет собой любой из ферментов, в настоящее время применяемых в фундаментальных и прикладных исследованиях и в промышленности, таких как трипсин, мышечная альдолаза, амилаза, липаза, коллагеназа или эластаза.
Обычно в практике химической модификации белков как белок, так и реагенты находятся в водном растворе (гомогенная реакция). Однако настоящее изобретение характеризуется двумя основными ограничениями: модифицированный белок, например фермент, должен сохранять свою активность и реагенты были мало или полностью нерастворимы в воде.
Поэтому для того чтобы превратить гидрофильный активный белок в гидрофобный или частично гидрофобный белок, с сохранением его функциональных возможностей, были созданы две различные стратегии, обе нацеленные на "гидрофобируемые" части белка, удаленные или находящиеся с противоположной стороны по отношению к активному центру, в котором должны быть сохранены его природная конформация и свойства.
[Стратегия I]
В первой стратегии применена гетерогеная твердая/жидкая система. Активный центр и близлежащую область обратимо защищают путем прикрепления его к твердой основе с помощью аффинной хроматографии. Твердая фаза несет на своей поверхности лиганд, специфический для активного центра функционального белка. Затем проводят стадию "гидрофобизации" на иммобилизованном белке. Реагирующее вещество растворяют в водном буферном растворе и применяют в качестве элюанта, т.е. жидкой фазы. Таким образом, молекулу белка принудительно обращают к элюанту только той частью, которая находится далеко от активного центра.
Любые доступные для приобретения аффинные матриксы, пригодные для хроматографии, могут быть применены в соответствии с изобретением, например смолы на основе декстрана или смолы на основе целлюлозы, такие как фосфоцеллюлоза. Известные материалы снабжены функциональными группами, подходящими для пришивания лигандов любого типа, таких как аналоги субстрата, обратимые ингибиторы, кофакторы. Следовательно, получение твердой аффинной фазы и условия нагрузки гидрофильных белков и последующее элюирование гидрофобизированного белка хорошо известны специалисту в этой области техники. Элюирование обычно проводят с помощью аффинного элюирования.
В соответствии с этим способом молекулы, случайным образом модифицированные по аминокислотным остаткам активного центра, будут отделены на стадии элюции.
[Стратегия II]
Во второй стратегии применяют жидкую/жидкую смесь, полученную с применением гидрофильного белка, растворенного в полярном растворителе (обычно в воде), и гидрофобного реагента, растворенного в менее полярном растворителе, который, по меньшей мере, частично смешивается с водой. В соответствии с разницей в полярности между растворителями, и в примененных объемах, возможны два реакционных режима:
а) два растворителя представляют собой частично несмешивающиеся растворители: формируется две макроскопические фазы, и реакция между гидрофильным белком и гидрофобным реагентом происходит на границе раздела между двумя фазами. В этом случае белок стремится сориентировать свой активный центр по направлению к полярной фазе, поскольку активный центр и его окружение представляют собой наиболее полярную область поверхности белка. Остатки, вовлеченные в реакцию гидрофобизации, локализованы, следовательно, далеко от активного центра, таким образом, происходит сохранение активности белка. Это воплощение изобретения менее предпочтительно, потому что белок стремится к выпадению на разделе фаз, что приводит к снижению в конечном выходе;
b) в предпочтительном режиме два растворителя представляют собой смешивающиеся растворители. В этом случае различную растворимость микроокружения создают в смеси на молекулярном уровне. Гидрофобная часть молекул реагирующего вещества нерастворима в полярном растворителе, затем в смеси, она будет сольватирована молекулами менее полярного растворителя. С другой стороны, молекулы полярного растворителя будут окружать более гидрофильную сторону молекулы белка. Реакция гидрофобизации следует за полярным градиентом: наиболее полярная область гидрофобного реагирующего вещества стремится прореагировать с менее полярной областью белка (т.е. областью, удаленной от активного центра). Даже в этом случае вероятность вовлечения остатков, принадлежащих к области активного центра, очень низка, и, следовательно, активность сохраняется.
Для того чтобы дополнительно убедиться в сохранении активности, можно, необязательно, защитить аминокислоты, отвечающие за активность или вовлеченные в распознавание, взаимодействие, и каталитические процессы будут улучшены путем совместного растворения в той же водной фазе защитных молекул, таких как субстраты, аналоги субстратов и/или конкурентные ингибиторы.
После реакции химически модифицированный белок может быть очищен с помощью гидрофобной хроматографии, или с помощью диализа, или с помощью других способов очистки.
Термин полярный растворитель или водный раствор означает любой водный раствор, нейтральный для функции белка.
Для менее полярного растворителя это означает любой хорошо известный растворитель, частично растворимый или нерастворимый в воде, например алкиловые спирты, алкиламины, галоидированные алканы и т.д.
Химические модификации
2
Многие аминокислотные остатки имеют функциональные группы в боковых цепях, такие как -NH, -ОН, -SH и, следовательно, подходят для реакции с гидрофобирующим реагентом: они представлены Thr, Met, Trp, Lys, Arg, Asp, Cys, Glu, His, Ser, Туr. Из этого списка исключили аминокислоты, имеющие амидные группы в боковой цепи, углеводородные боковые цепи и глицин, по причине их относительно низкой концентрации на доступных поверхностях белка и, что даже более важно, по причине их нереакционноспособной гидрофобной боковой цепи. Следовательно, можно предсказать множество возможных модификаций.
Любые химические модификации, полученные с помощью химических реагентов, способных или превратить один гидрофильный аминокислотный остаток или несколько гидрофильных аминокислотных остатков в гидрофобные остатки, или способных присоединить большую сильно гидрофобную часть молекулы к подходящей полярной аминокислоте, могут быть применены для превращения гидрофильных водорастворимых белков в гидрофобные белки. Это превращение может затрагивать как одинаковые, так и различные аминокислотные остатки.
Подходящие гидрофобирующие реагенты представляют собой химические соединения, способные к выполнению любой ковалентной модификации, включая, но не ограничиваясь, O-, N-, S-алкилирование, O-, N-, S-ацилирование, образование диазосвязи, образование пептидной связи, арилирование, образование основания Шиффа и т.п. Примеры этих реагентов включают ацилангидриды, ацилхлориды, диазосоединения, альдегиды, кетоны, но также соединения, способные интегрировать большие липофильные части молекул, такие как холестерил-хлороформат или эквивалентные ему.
Полученный модифицированный белок, представляющий собой амфипатический белок с более высокой гидрофобностью, чем его природная форма, характеризуется асимметричным распределением неполярных/полярных остатков и сохраняет свою водорастворимость и свои исходные функциональные возможности, так как во время проведения реакции активный центр был защищен.
В соответствии с обеими стратегиями способ может включать необязательную стадию отделения гидрофобизированных активных белков от инактивированных случайным образом белков. Любая методика очистки белка, которая применяет или сродство белка к специфическому субстрату, или более высокую гидрофобность модифицированных белков, может быть применена для очистки активного продукта. Они включают аффинную хроматографию и аффинную элюцию или промывание водой молекул белка непосредственно на гидрофобном AFM-субстрате.
Существует множество факторов, обычно способных влиять на функции активного белка как фермента, например, конформационные эффекты - если имели место конформационные модификации или модификации с перераспределением заряда; стерические эффекты - если взаимодействию субстрата с ферментом мешает стерическое препятствие; распределительные эффекты, имеющие отношение к химические природе материала подложки и к модифицированному микроокружению.
Следовательно, можно ожидать, что гидрофобизации в соответствии с настоящим изобретением может изменить кинетику и другие свойства активного белка, например снизить специфическую ферментативную активность.
Наоборот, результаты, о которых мы сообщаем в примерах в этом документе, показывают, что заявленный способ исключает или сводит к минимуму ожидаемую потерю активности.
Иммобилизация
Гидрофобизированные активные белки, полученные в соответствии с настоящим изобретением, представляют собой белки, подходящие для связывания с гидрофобным субстратом посредством гидрофобных взаимодействий. Эти взаимодействия приводят к сборке упорядоченного слоя, предпочтительно мономолекулярного слоя белка на поверхности субстрата. Кроме того, гидрофобные силы могут быть достаточно сильными для того, чтобы можно было осуществить смывание водой немодифицированных молекул, что означает возможность высокоэффективной очистки.
Подходящие гидрофобные субстраты представляют собой любую подложку, гидрофобную от природы или сделанную гидрофобной путем получения производных. Например, субстрат может стать гидрофобным в результате покрытия его функционализированными липидами, такими как тиолированные липиды, например тиохолестерины или другие эквивалентные липиды, способные вступать в реакцию с поверхностью субстрата. Субстраты включают, но не ограничиваются, природный полимер, такой как целлюлоза, или синтетические полимеры, такие как PVC, поли(мета)акрилаты, нейлон, полиэтилен, тефлон, материалы из угля, кремний, стекло, смолы, металлические частички или металлические листы, бумага и т.п. Подложка может быть в виде тонких дисков, пластин, тонких пластинок, листков, трубочек, волокон, частиц, гранул, порошков, все макро-, микро- или наноразмеров, а также может иметь атомарный настил с гладкой поверхностью или шероховатой поверхностью.
Комплекс, созданный из гидрофобизированных активных белков, иммобилизованных на гидрофобном или гидрофобизированном субстрате, представляет собой устройство, подходящее для получения биореакторов или биосенсоров. Эти устройства находятся в виде "активированных" тонких дисков, пластин, тонких пластинок, листков, трубочек, частиц, волокон, гранул, порошков, все макро-, микро- или наноразмеров.
Устройства изобретения собраны в биореакторы или биосенсоры. Например, гранулы активированных частиц могут быть применены для сборки картриджей, упакованных в обычный лабораторный наконечник, или для сборки фильтров, упакованных в контейнер или в колонку. Пластинка, тонкая пластинка и листки могут быть собранные в наборы для микрочипов для диагностического, генетического, иммунологического анализа или для механической манипуляции белком или генетическим материалом.
Наши результаты показали, что модифицированные и закрепленные молекулы не отличаются значительно, как структурно, так и функционально, от природных молекул. В примерах, например, показано, что ферменты сохраняют большую часть своей природной активности.
Исследования методом АРМ и определение ферментативной активности образцов кремниевых пластинок, покрытых ферментом, показали, что у прикрепленных молекул сохранена активная конформация, тогда как гомогенный внешний вид, полученный при сканировании с помощью АРМ, наряду с рассчитанными размерами модифицированного белка указывает на то, что инактивированные или неправильно модифицированные молекулы были отмыты (смотри фиг.1, 2, 3 и 4).
Еще более важен тот факт, что гидрофобные взаимодействия были настолько сильными и стабильными, что позволили многократно применять покрытую белком подложку в водной среде, например, как многократные ферментативные образцы.
Поскольку молекулы, закрепленные на гидрофобной подложке, были подвергнуты химической модификации в области, которая не содержит активный центр, все они в водной среде ориентированы так, что активный центр обращен в водную фазу. Это благоприятные условия для исследования с атомным разрешением механизма взаимодействия активного белка с некоторыми небольшими молекулами, такими как субстраты, аналоги субстратов, аллостерические эффекторы, ингибиторы, антитела и т.д.
Кроме того, поскольку каждая молекула белка устойчиво прикреплена к подложке, эта фиксированная конформация защищает от случайных контактов между молекулами, предотвращая таким путем нежелательные повреждающие реакции. Таким образом, случайные контакты с молекулами (т.е. с субстратами, ингибиторами, эффекторами и т.д.), находящимися в водном растворе, контролируются в ходе эксперимента. Эти условия изменяют состояние упорядоченного мономолекулярного слоя ориентированных активных белков в проточных биореакторах или биосенсорах, подходящих для применения в медицине, промышленности и оборудовании для аналитической химии. Настоящее изобретение обеспечивает легкий способ изготовления таких биосенсоров, с применением нескольких сотен водорастворимых ферментов или других активных белков, применяемых в настоящее время в области прикладной биологии.
Изобретение также имеет отношение к анализам, в которых применяют заявленные биореакторы и биосенсоры для исследований конформации водорастворимого активного белка или конформации его комплекса с лигандом путем получения изображений мономолекулярного слоя иммобилизованного ориентированного белка и/или его комплексов с помощью атомной силовой микроскопии (AFM). Этот тип анализа в особенности полезен для исследования взаимодействия между водорастворимым белком и тем, что может быть лигандом для этого белка, с целью идентификации новых лигандов. Иммобилизованные белки изобретения также подходят в качестве твердой реакционноспособной подложки для получения микрочипов для диагностического, генетического, иммунологического анализа или для механической манипуляции белком или генетическим материалом.
Наконец, методика модификации может быть изменена, с целью получить в большей степени "гидрофобизированные" молекулы или молекулы случайным образом модифицированные по разным областям поверхности, включая активный центр. Следовательно, возможно получить большое число модифицированных молекул. В водной среде все они будут самопроизвольно выстраиваться со случайной ориентацией и образовывать слой на гидрофобном субстрате. Современное применение изображения активных форм и множества изображений различно ориентированных одних и тех же молекул позволит получить с помощью компьютерной техники точную реконструкцию изображения исходной исследуемой молекулы.
Изобретение будет дополнительно подробно описано в следующих примерах, которые просто имеют своей целью описать характерные воплощения изобретения, без ограничения объема охраны.
Пример 1 и пример 2 описывает две предусмотренные изобретением основные стратегии получения заявленной покрытой белком подложки для применения в области биоинженерии в водном растворе.
Два водорастворимых природных фермента, а именно мышечная альдолаза и трипсин, ковалентно модифицируют in vitro путем алкилирования исходных аминогрупп для получения амфипатических молекул.
Пример 1 (стратегия I). Применяемый HPiAP представляет собой кроличью мышечную альдолазу, алкилирующий агент представляет собой уксусный ангидрид. Получение производных проводят в гетерогенной фазе. HPiAP абсорбируют для аффинной хроматографии на колонке с фосфоцеллюлозой (аналогом субстрата фруктозо-1,6-бифосфата), проводят реакцию с профильтрованным водным раствором уксусного ангидрида и затем элюируют субстратом фруктозо-1,6-бифосфатом. Титрование остатков лизина показало, что было модифицировано 15 остатков на молекулу. В результате был извлечен активный НРоАР с неизмененными кинетическими параметрами. Альдолазную активность измеряли по методу Ракера, применяя фруктозо-1,5-бифосфат в качестве субстрата и глицеральдегидфосфатдегидрогеназу и триозофосфатизомеразу в качестве вспомогательных ферментов (смотри таблицу I).
Таблица I
Кинетический параметр
Природный
15 ацетилированных лизиловых остатков
Vмакс.
2000
3200
Км(мкМ)
23
22
Пример 2 (стратегия II). HPiAP представляет собой трипсин, алкилирующий агент представляет собой раствор холестерил- хлороформата в пропаноле. Водный раствор трипсина смешивают с раствором холестерил-хлороформата в пропаноле при энергичном перемешивании в течение 30 минут. После завершения реакции собирают гидрофобизированный трипсин.
После реакции химически модифицированный белок очищают с помощью гидрофобной хроматографии, применяя смолу Phenyl HS, и элюируют 0-30 мМ сульфатом аммония в 20 мМ буфере Gly-HCl. Фракцию, составляющую основной пик, как по белку, так и по активности, применяли для экспериментов по иммобилизации. После получения производных измеряли активность трипсина при рН 8, применяя Nα-бензоил-DL-аргинин-n-нитроанилид (BAPNA) в качестве синтетического субстрата. НРоАР демонстрировал полную активность, неизмененные кинетические параметры и 3 модифицированных лизиловых остатка на молекулу (смотри таблицу II).
Силикагель погружают в раствор холестерил-трипсина, многократно промывают водой, погружают в раствор синтетического субстрата BAPNA в буфере с рН 8 и инкубируют при 37°С в течение указанного времени. В качестве контроля применяют кремниевую пластинку, погруженную в тот же раствор. Появление желтого цвета указывает на то, что закрепленный холестерил-трипсин сохраняет протеолитическую активность после нескольких промываний водой (смотри фиг.1).
Иммобилизованный фермент был активен в течение месяцев, как было показано с помощью спектрофотометрического метода, с применением BAPNA (Nα-бензоил-DL-аргинин-n-нитроанилид) в качестве субстрата, что указывает на чрезвычайно прочное гидрофобное связывание между амфипатической молекулой фермента и гидрофобной кремниевой пластинкой.
-8
Кремневую пластинку, покрытую холестерил-трипсином, сканировали с помощью AFM при 10 N и 1000 нм/сек. Полученное изображение представлено на фиг.2, 3 и 4.
Таблица II
Кинетический параметр
Природный
3 холестерил-лизиловых остатковооосостатка
Специфическая активность
1,1
0,90
Км (мкМ)
1,67
1,68
Пример 3. Гидрофобизированным ферментом в соответствии с жидкой/жидкой стратегией II настоящего изобретения была аденозиндезаминаза. Гидрофобирующий агент был представлен холестерил-хлороформатом, растворенным в растворе пропанола.
Пример 4. Цитозиндезаминаза представляла собой фермент, гидрофобизированный в соответствии с жидкой/жидкой стратегией II настоящего изобретения. Схема реакции была такой же, как в примере 2.
Пример 5. Глутамат-оксалоацетат-трансаминаза представляла собой фермент, гидрофобизированный в соответствии с жидкой/твердой стратегией I настоящего изобретения, с применением пиридоксальфосфата, связанного на смоле, в качестве твердой фазы для аффинной хроматографии.
Пример 6. Аланин-пируват-трансаминаза представляла собой фермент, гидрофобизированный в соответствии жидкой/твердой стратегией I настоящего изобретения, с применением пиридоксальфосфата, связанного на смоле, в качестве твердой фазы для аффинной хроматографии.
Пример 7. Декарбоксилирующая малатдегидрогеназа представляла собой фермент, гидрофобизированный в соответствии жидкой/твердой стратегией I настоящего изобретения, с применением никотинамида, связанного на смоле, в качестве твердой фазы для аффинной хроматографии.
Пример 8. Алкогольдегидрогеназа представляла собой фермент, гидрофобизированный в соответствии жидкой/твердой стратегией I настоящего изобретения, с применением никотинамида, связанного на смоле, в качестве твердой фазы аффинной хроматографии.
Пример 9. Липаза представляла собой фермент, гидрофобизированный в соответствии жидкой/твердой стратегией I настоящего изобретения, с применением пропионилацетата, связанного на смоле, в качестве твердой фазы для аффинной хроматографии.
ПРИМЕРЫ ПРИМЕНЕНИЯ
Пример 10. Биореактор, применяемый для расщепления белков в растворе, применяют для получения производных бычьего трипсина, как в примере 2, и закрепления его на PVC (поливинилхлоридных) гранулах. Эти гранулы применяют для сборки картриджа, упакованного в обычный лабораторный наконечник. Это устройство способно расщеплять белок в растворе со значительным усилением реакции расщепления. В особенности, по сравнению с классической методикой расщепления белка с помощью прямого добавления трипсина в раствор, при применении функционализированных устройств в наконечниках было получено три основных усовершенствования:
a) это устройство не выпускает молекулы трипсина в раствор;
b) это устройство снижает (или даже исключает) фрагменты автолиза трипсина (смотри фиг.5 и 6);
c) время расщепления, требуемое для хорошего белкового анализа методом масс-спектрометрии, снижается от периода в течение ночи в классической методике расщепления в растворе до всего нескольких минут (от 1 до 10 минут, в зависимости от концентрации расщепляемого белка) (смотри фиг.5 и 6).
Пример 11. Был собран биореактор, аналогичный тому, что был описан в примере 10, в котором несколько картриджей PVC, способных связывать различные гидрофобизированные гидролитические ферменты, объединяют вместе в трубу. Это устройство применимо для очистки сточных вод промышленного производства. Специфические ферменты, примененные в картриджах, изменяют в зависимости от состава сточных вод, которые предстоит очистить. Например, для очистки сточных вод пекарни применяли картриджи, активированные амилазой и трипсином. Для очистки сточных вод кожевенного завода применяли картриджи, актированные липазой, коллагеназой и эластазой.
Пример 12. Был создан биосенсор, в котором кварцевый диск был покрыт тончайшей золотой поверхностью. Эта поверхность была гидрофобизирована путем покрытия слоем тиохолестринов, которые взаимодействовали самопроизвольно с золотом, формируя упорядоченный слой. Эта гидрофобизированная поверхность подходит для закрепления гидрофобизированных белков, полученных с помощью обеих предложенных стратегий. Закрепление белков можно измерить с помощью увеличения количества демпинга, индуцированного белковой массой на спонтанной частоте колебаний кварца (смотри пример на фиг.7). Закрепление активного белка может быть применено в качестве зонда на любое специфическое белок-белковое взаимодействие. Если между зондом и специфическим фактором возникла связь, то это может быть зарегистрировано как возникновение дополнительного демпинга в осцилляции кварца.