КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ТЕРАПИИ ПАТОЛОГИЙ ПЕЧЕНИ И ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
COMPOSITION FOR THERAPY OF HEPATIC PATHOLOGIES AND ONCOLOGICAL DISEASES

Предлагаемое изобретение относится к области химии природных соединений, биотехнологии, фармакологии и медицине, а именно к препаратам на основе экстрактов расторопши пятнистой, и может быть использовано для терапии патологий печени и злокачественных новообразований.
Одной из важнейших задач современной медицины и биотехнологии является поиск новых и совершенствование уже имеющихся путей создания эффективных препаратов для терапии целого ряда патологий, представляющих серьезную угрозу жизни населения практически всех стран мира. Среди этих патологий, часто связанных с техногенными факторами и ухудшением экологической обстановки, - поражения печени различного генеза, целый ряд онкологических заболеваний, а также патологий, связанных с нарушениями ангиогенеза.
В настоящее время первостепенное внимание научным и медицинским сообществом уделяется поиску средств или их комбинаций, обладающих комплексным профилактическим и терапевтическим потенциалом, позволяющим снизить риск возникновения и осуществить эффективную терапию патологий, связанных с неблагоприятными факторами окружающей среды. Особое значение при этом придается снижению токсичности препаратов и увеличению их биодоступности.
К наиболее перспективным препаратам, отвечающим требованиям современной медицины, относятся флаволигнаны, выделяемые из лекарственного растения расторопши пятнистой (Silybum marianum (L.) Gaerth). Сумму флаволигнанов силибинина, силикристина, силидианина, изосилибинина и дегидросилибинина, выделяемых из лекарственного сырья расторопши, традиционно называют силимарином.
Известно использование плодов расторопши пятнистой или их экстрактов в качестве гепатопротекторных препаратов, таких как Карсил, Легалон, Силибор (М.Д.Машковский. Лекарственные средства, М., 1993 г., т.1), и препаратов, обладающих противоопухолевом действием (Larocca, Br. J. Of Haemotology 75, 489, 1990), (Scambia, Br. J. Ginecologic Oncology 45, 13, 1992), (пат РФ 2161488).
Флаволигнаны из расторопши пятнистой являются сильными антиоксидантами и способны инактивировать как свободные радикалы, так и активные формы кислорода в клетке, что во многом обусловливает их высокую гепатопротекторную и терапевтическую эффективность при лечении таких заболеваний печени, как токсические и вирусные гепатиты, цирроз, лекарственные, радиационные и ишемические повреждения и др. Другой сферой применения флаволигнанов из расторопши является терапия онкологических заболеваний.
Однако главным препятствием на пути проявления максимальной терапевтической активности флаволигнанов является их низкая биодоступность при пероральном применении. Флаволигнаны, как правило, нерастворимы или минимально растворимы в воде, вследствие чего скорость высвобождения этих соединений и, следовательно, также их биологическая доступность и их всасываемость в организме человека неудовлетворительны. Кроме того, низкая растворимость флаволигнанов в воде и биологических жидкостях не позволяет применять их для инъекций или инфузий, что могло бы значительно повысить эффективность терапевтического действия этих препаратов.
Известны многочисленные лекарственные формы на основе силимарина.
Так, известно гепатопротекторное средство, выполненное в форме таблеток, покрытых многослойной оболочкой, содержащее в качестве флаволигнана силимарин и целевые добавки: микрокристаллическую целлюлозу, лактозу, крахмал кукурузный, кросповидон, поливинилпирролидон, натрия бикарбонат (пат. РФ №2205637).
Известна флаволигнановая композиция, содержащая силимарин-сопреципитат или силибинин-сопреципитат и вспомогательные вещества, такие как сорбитановые эфиры жирных кислот и полиоксиэтиленовых производных сложных сорбитановых эфиров, водорастворимого производного сахара или целлюлозы и поливинилпирролидона (пат. РФ №2157225).
Данные формы обладают низкой биологической эффективностью. Делались попытки добиться молекулярного изменения флаволигнанов путем обработки или взаимодействия их с подходящими химическими агентами и перевести их таким образом в производные с улучшенной водорастворимостью и повышенной скоростью высвобождения.
Примером химических производных флаволигнанов, в частности силибинина, может служить 3,9'-дигемисукцинат силибинина или его натриевая соль (Пат. США 5,196,448, 1993).
Недостатком таких производных является то, что рассматриваемый в отдельном случае флаволигнан связан с химическим соединением, которое может физиологически действовать как чужеродное вещество и вызывать нежелательные побочные реакции или снижать активность флаволигнана.
Известно средство для лечения и профилактики онкологических заболеваний на основе флаволигнанов, выбранных из изомеров силимарина, в комплексе с фосфолипидами (Патент РФ №2161488). В качестве носителя средство содержит жидкие полусинтетические глицириды жирных кислот со средней длиной цепи. Данное средство можно вводить перорально или путем инфузии: для перорального пути введения в качестве носителей особенно пригодны натуральные или синтетические фосфолипиды, поскольку они образуют жирорастворимые стабильные комплексы с изомерами силимарина; а также жидкие полусинтетические глицериды, содержащие триглицериды жирных кислот со средней длиной цепи, или их аналоги, которые могут облегчать биодоступность отдельных соединений, их натуральных смесей или содержащих их экстрактов.
Недостатками известного средства являются сравнительно низкая адресность доставки флаволигнанов к опухолевым клеткам-мишеням и достаточно быстрое выведение их из организма, а следовательно, и недостаточная терапевтическая эффективность препарата.
Известно средство для лечения и профилактики онкологических заболеваний на основе флаволигнанов, выбранных из изомеров силимарина, и фосфолипидов. В качестве изомеров силимарина используют экстракт плодов расторопши пятнистой (Silibum marianum (L.) Gaertn) в липосомной форме с размерами частиц 100-500 нм, содержащий не менее 10 мас.% экстракта плодов расторопши. Средство может содержать дополнительно приемлемый фармакологический носитель для внутривенного введения (например, физиологический раствор или фосфатно-солевой раствор, pH 7.4) (пат. РФ №2283658). Средство обладает повышенной по сравнению со свободными флаволигнанами гидрофильностью и биодоступностью, но недостаточной избирательностью действия.
Известен противоопухолевый липосомный препарат на основе смеси флаволигнанов или их экстрактов из плодов расторопши пятнистой, выполненный в липосомной форме с размерами частиц 100-500 нм, дополнительно содержащий векторный компонент пептидной природы, ковалентно присоединенный к липидам оболочки липосомы (пат. РФ №2292898). В качестве векторного компонента используют белок, выбранный из группы представителей семейств факторов роста эпителия, трансформирующих факторов роста, онкофетальных белков, факторов роста эндотелия и факторов роста фибробластов. В этом случае достигается избирательность действия флаволигнанов в отношении ткани-мишени. Недостатками подобного препарата являются его многокомпонентность и сложность получения.
Наиболее близким техническим решением является композиция для терапии патологии печени и онкологических заболеваний, включающая комбинации одного или нескольких экстрактов лекарственных растений, содержащих вещества фенольной природы, например экстракты расторопши пятнистой, содержащие силибинин, силидианин, силикристин, и носитель (пат. РФ №2306945). В качестве носителя в этом патенте используют фосфолипиды.
Данная композиция обладает рядом недостатков: сложная технология получения, недостаточная биологическая эффективность композиции.
Изобретательской задачей является расширение арсенала терапевтических средств для терапии патологий печени и онкологических заболеваний и повышение терапевтической активности путем создания малокомпонентной композиции для внутривенного введения, содержащей растительные флаволигнаны в водорастворимой форме.
Для решения изобретательской задачи использован подход создания водорастворимого нековалентного комплекса флаволигнанов с белком плазмы крови человека или млекопитающих. При этом в качестве белка предпочтительнее использовать белки, обладающие самостоятельной терапевтической активностью. В качестве белков могут выступать белки плазмы крови, применяемые при терапии некоторых патологий. Так, частым осложнением заболеваний печени, а также онкологических заболеваний являются гипопротеинемии, сопровождающие основное заболевание. При гипопротеинемиях в настоящее время широко применяется плазмозамещающая терапия, заключающаяся во введении в организм больного белков плазмы крови, таких как альбумин, преальбумин, альфа-фетопротеин, альфа- и бета-глобулины. Настоящее изобретение предлагает использовать эти белки или их пептидные фрагменты в качестве носителей для внутривенного введения флаволигнанов расторопши.
Решением изобретательской задачи является создание новой композиции для терапии патологий печени и онкологических заболеваний, включающей флаволигнаны, полученные из экстракта расторопши пятнистой, и наполнитель. При этом композиция представляет собой нековалентный комплекс, в котором в качестве наполнителя используют белок плазмы крови человека или млекопитающих, при этом соотношение флаволигнана к белку равно (1-150):1. В композиции в качестве белка крови человека или млекопитающих используется альбумин, преальбумин, альфа-фетопротеин, альфа- или бета-глобулины или их пептидные фрагменты. Кроме того, композиция в качестве альфа-глобулина содержит липопротеины, транскортин, кислый гликопротеин, тироксинсвязывающий глобулин, гаптоглобин, плазминоген, макроглобулин, ретинолсвязывающий белок, витамин D-связывающий белок, а в качестве бета-глобулина - липопротеины, трансферрин, глобулин, связывающий половые гормоны, транскобаламин.
Преимуществом композиции является двойное терапевтическое действие: реализация гепатозащитной или противоопухолевой активности флаволигнанов сочетается с плазмозамещающей терапией при гипопротеинемии, сопутствующей основному заболеванию. Другим преимуществом композиции является то, что в отличие от свободных растительных флаволигнанов, практически нерастворимых в воде и применяемых лишь перорально, предлагаемая композиция может применяться для внутривенного введения, что является дополнительным фактором повышения эффективности терапии.
Композицию получают путем смешивания и инкубации компонентов композиции в подходящем растворителе. Композиция может быть выполнена как в форме лиофилизата, так и готовых растворов для инъекций и инфузий.
Пример 1. Способ получения композиции.
Отдельно получают растворы, содержащие необходимые количества белка и флаволигнана в смеси воды и диметилсульфоксида. Полученные растворы смешивают и инкубируют при постоянном перемешивании. Затем реакционную смесь лиофильно высушивают. Перед применением композицию растворяют в воде для инъекций или другом подходящем для внутривенного применения носителе. Варианты композиции приведены в таблице 1.
Таблица 1
№
Белок
Флаволигнан
Соотношениебелок:флаволигнан
1
Альбумин
Силикристин
1:50
2
Преальбумин
Изосилибинин
1:100
3
Альфа-фетопротеин
Силидианин/Силикристин
1:20
4
Липопротеин
Силибинин/Силикристин/ Силидианин/Изосилибинин/ Дегидросилибинин
1:150
5
Ретинолсвязывающий белок
Силибинин
1:10
6
Транскобаламин
Силибинин/Изосилибинин/ Силикристин
1:70
7
Пептидный фрагмент альфа-фетопротеина
Силидианин
1:1
8
Пептидный фрагмент витамин D-связывающего белка
Силибинин/Дегидросилибинин
1:5
9
Глобулин, связывающий половые гормоны
Силидианин
1:15
10
Трансферрин
Силибинин
1:90
Так же были получены композиции с другими перечисленными выше компонентами. В качестве альфа-глобулина использовали также транскортин, кислый гликопротеин, тироксинсвязывающий глобулин, гаптоглобин, плазминоген, макроглобулин. В качестве бета-глобулина использовали также липопротеины. Соотношение флаволигнан:белок составляло (1-150):1.
Заявляемое соотношение определено исходя из сродства флаволигнанов к белкам-переносчикам, а также сохранения способности белка выполнять транспортную функцию при нагрузке его флаволигнанами.
Использование флаволигнанов в составе нековалентного комплекса позволяет сохранить их природные свойства, т.е. не снижает их терапевтической активности.
Все перечисленные белки присутствуют как в организме человека, так и млекопитающих.
Пример 2. Специфическая гепатозащитная активность композиции, включающей альбумин и силикристин.
Исследование специфической гепатозащитной активности композиции проводили на модели острого токсического гепатита у мышей. В экспериментах были использованы белые беспородные мыши в половозрелом возрасте. В качестве гепатотропного средства использовали парацетамол (модель лекарственного гепатита). Животным вводили препарат впервые за 1 ч до введения парацетамола, а затем еще 5 раз ежедневно. В качестве препарата сравнения использовали водную суспензию силикристина, вводимую внутрижелудочно через зонд в эквимолярной дозе. Контрольным животным вводили только парацетамол. Через сутки после последнего введения препаратов животных декапитировали и проводили вскрытие и изучение биохимических показателей крови. Активность аланинаминотрансферазы (АЛАТ) и аспартатаминотрансферазы (АСАТ) определяли по методу Райтмана-Френкеля. Результаты исследования приведены в таблице 2.
Таблица 2
Препарат
Относительная масса печени, % от здоровых животных
Активность АЛАТ, % от здорового контроля
Активность АСАТ, % от здорового контроля
Контроль (гепатит)
157,4
189,3
214,8
Силикристин внутрижелудочно
126,8
139,8
134,9
Композиция (внутривенно)
102,7
102,7
104,5
Как видно из таблицы, степень выраженности воспалительных процессов у животных, получавших заявляемую композицию, заметно снижалась, и применение композиции положительно влияло на дезинтоксикационные функции печени животных с острым лекарственным гепатитом. При этом эффект от заявляемой композиции существенно превышал эффект от препарата сравнения.
Пример 3. Противоопухолевая активность композиции, включающей альфа-фетопротеин и силибинин.
5
on
k
Исследование противоопухолевой активности композиции проводили на модели меланомы линии В16 у мышей С57В1/6. Для индукции солидных опухолей мышам вводили подкожно клеточную суспензию (2·10 клеток в физ. растворе). В качестве препарата сравнения использовали водную суспензию силибинина, вводимую внутрижелудочно через зонд в эквимолярной дозе. Препараты вводили в течение 10 дней подряд, начиная с 3 дня после прививки опухоли. Объем опухоли вычисляли по формуле , где a - короткий, b - длинный диаметр опухоли. Относительный размер опухолей (OPO) определяли по формуле: , где P - средний размер опухолей в опытной группе, P- средний размер опухолей у контрольных животных. Увеличение продолжительности жизни леченых животных по сравнению с контролем определяли по формуле: , где Т - СПЖ леченых животных, дни, С - СПЖ контрольных животных, дни.
Результаты исследования приведены в таблице 3. Как видно из таблицы, противоопухолевая активность заявляемой композиции существенно превышает активность препарата сравнения.
Таблица 3
Препарат
ОРО, %
УСПЖ, %
Физ. раствор (контроль)
100
-
Силибинин внутрижелудочно
75,6
26,7
Композиция (внутривенно)
31,4
76,8