Характеристика солеустойчивости регенерантов мягкой яровой пшеницы

5. Особенности лигнификации клеточных стенок каллусов гречихи, различающихся по способности к морфогенезу / Румянцева Н.И., Валиева А.И., Самохвалова Н.А., Мухитов А.Р., Агеева М.В., Лозовая В.В. // Цитология. - 1998. - Т. 40, № 10. - С. 835-843.

6. Сафонов В.И., Сафонова М.П. Исследование белков и ферментов растений методом электрофореза в полиакриламидном геле // Биохим. методы в физиол. растений. - М.: Наука, 1971. -С.113-119.

7. Фролова J1.B. Особенности популяций культивированных клеток // Культура клеток растений. - М.: Наука, 1981. - С. 5-16.

8. Хавкин Э.Е., Забродина М.В. Наследуемые изменения в спектрах пероксидаз и эстераз у сомаклонов кукурузы // Физиология растений. - 1994. - Т. 41, № 6. - С. 859-867.

9. Хавкин Э.Е., Забродина М.В. Органоспецифичные спектры пероксидаз у кукурузы // Физиология растений. - 1995. - Т. 42, № 2. - С. 281-289.

10. Чаянова С.С., Хавкин Э.Е. Использование нейтрального полиакриламидного геля для изоферментного анализа пероксидаз и эстераз // Физиология растений. - 1990. - Т. 37. - С. 10371039.

11. Bredford M.M. A rapid sensitive method for the action of microgram guantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. - 1976. - V. 72. - P. 248-254.

12. Van den Berg B.M., Wijsman H.J.W. Genetics of the peroxidase isoenzymes in Petunia. Part 1: Organ specificity and general genetic aspects of peroxidase isoenzymes // Theor. Appl. Genet. - 1981. - V. 60, N2. - P. 71-76.

Рекомендовано к печати д.б.н. Митрофановой И.В.

ХАРАКТЕРИСТИКА СОЛЕУСТОЙЧИВОСТИ РЕГЕНЕРАНТОВ МЯГКОЙ ЯРОВОЙ

ПШЕНИЦЫ

В.Ю. СТУПКО;

Н.В. ЗОБОВА, кандидат биологических наук

Красноярский научно-исследовательский институт Сибирского регионального отделения

Россельхозакадемии, Красноярск, Россия

Введение

В связи с повышенным спросом на продовольственное зерно яровую пшеницу в Красноярском крае возделывают во всех почвенно-климатических зонах, где зачастую солонцовые пятна занимают до 10% пашни [8], что сильно лимитирует ее урожайность. В борьбе с засолением сорт является самым дешевым и доступным средством роста урожайности [1, 3]. При традиционных методах селекции сорт приходит на поля лишь через 12-20 лет. Современные технологии, генная инженерия и культура тканей in vitro могут уменьшить этот срок. Однако методы генетической трансформации имеют рад недостатков, главный из которых - ограничение введения полученных таким образом растений в рацион человека из-за возможных, по мнению ряда ученых, опасных для здоровья побочных эффектов [5], а количественная оценка реакции на стресс генетически модифицированных растений проводится крайне редко [12]. Культура изолированных растительных тканей является экологически чистой технологией, ускоряющей создание адаптивных форм зерновых культур, использующей природные резервы сомаклональной изменчивости растений. Многие ее приемы уже успешно применяются селекционерами [10], в том числе в селекции пшеницы [9, 11, 14]. Однако повторение описанных в литературе биотехнологических протоколов не эффективно из-за зависимости регенерационных процессов в каллусе от вводимого в культуру генотипа.

Целью работы являлось создание в культуре in vitro на материале сибирской селекции солеустойчивых форм мягкой яровой пшеницы и их характеристика. Для этого было необходимо решить следующие задачи: оптимизировать гормональный состав питательных сред; подобрать уровни давления селектирующего агента и параметры эксплантов; провести лабораторными методами сравнительную физиологическую оценку солеустойчивости регенерантов и их родительских форм.

Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили 15 линий-регенерантов мягкой яровой пшеницы, полученные на засоленной селективной (0,42% №С1) и нейтральной средах в каллусной культуре по разработанному протоколу [4, 5] от сортов Таежная, Новосибирская 15, Минуса и селекционной линии КС-1607 сибирской селекции. Оценку солеустойчивости проводили рулонным методом с использованием 1,68% раствора №С1 в качестве стрессовой среды и дистиллированной воды -контрольной среды. По окончании 7-суточной экспозиции фиксировали длину и сырую массу побегов и корней у проростков. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента [2].

Результаты и обсуждение

Оптимизированная технология получения стрессоустойчивых регенерантов включала в себя двукратный отбор на селективных средах на этапах пролиферации каллуса и регенерации растений (рис. 1) [4, 5].

Оценка ответной реакции полученных регенерантов и исходных форм на солевой стресс на основании физиологических лабораторных тестов показала, что регенеранты, сформировавшиеся на селективной среде в присутствии КаС1 (РС), в большинстве своем продемонстрировали устойчивость к засолению среды (№С1 - 1.68%) (табл. 1, 2). Однако эта реакция зависела от донорного генотипа.

Незрелые зародыши

Светокультура

Индукция Пролиферация Регенерация

каллусогенеза каллуса растении

МС+ 2,4-Д МС+ 2,4-Д (0,5 мг/л) + МС+ ИУК/Кинетин

Рис. 1. Схема получения солеустойчивых форм мягкой яровой пшеницы на основе генотипов

сибирской селекции

Линии, полученные от сорта Минуса, имевшие в контрольных условиях показатели близкие или ниже родительской формы, в стрессовых условиях превзошли ее в 1,5 раза по длине корней (табл. 1) и массе побегов и в 2 раза по длине побегов (табл. 2). Отмечено увеличение у них числа корней по сравнению с донорным сортом в присутствии стрессового фактора, сочетавшееся с увеличением их суммарной длины.

Однако регенерант РС-3-13 в этих условиях по массе корней не отличался от родительской формы. При этом число корней у данного регенеранта по сравнению с контрольными условиями не уменьшалось, что говорит о его высокой толерантности к повышенным концентрациям КаС1 (табл. 1).

Различия между регенерантом и родительской формой достоверны при уровне значимости * -Р<0,1, ** - Р<0.05; *** - Р<0,01.

Регенерант РС-1-21 от селекционной линии КС-1607 в стрессовых условиях имел длину побега в 5 раз, а массу в 2 раза больше, чем у родительского генотипа (табл. 2). По всем остальным показателям (длина, число, масса корней) регенерант превзошел линию в 2 раза. Проростки регенеранта имели максимальное число корней в стрессовых условиях, достоверно не изменившееся по сравнению с контрольными (табл. 1). Регенерант РС-2-9 в свою очередь превзошел родительскую форму по массе побегов в стрессовых условиях (табл. 1, 2).

Оставшийся третий регенерант также проявил тенденцию к увеличению показателей по отношению к родительской форме во всех исследованных условиях.

У всех регенерантов сорта Новосибирская 15, полученных на селективной с КаС1 и нейтральной (РН) средах, показатели проростков в присутствии соли были на уровне родительского сорта (табл. 1, 2). Отличия отмечены только по массе корней в стрессовых условиях при уровне

значимости Р < 0,1, где она была ниже, чем у родительской формы (табл. 1). В то время, как образовавшиеся на нейтральной среде регенеранты от линии КС-1607, которая уже была отмечена как подходящая для получения стрессоустойчивых форм, имели большой разброс значений длины и массы проростков в контрольных условиях в основном ниже, чем у родительской формы. При этом снижение их ростовых характеристик под действием №С1 было менее значительным, чем у родительской формы (КС-1607), что говорит о их большей толерантности к данному стрессовому фактору (табл. 1, 2).

Таблица 1

Параметры корневой системы исходных форм и их регенерантов

Генотип Число корней, шт. Длина корней, мм Масса корней, мг

контроль контроль контроль

Минуса (исходная форма) 4,94 4,04 423,04 61,91 78,59 28,71

Регенеранты РС -3-13 4,84 4,74** 316,68*** 89,29** 57,89*** 30,23

РС -9-9 5,00 4,52 468,55 77,59 89,50 24,39

КС-1607(исходная форма) 4,08 2,82 295,56 35,53 83,00 15,91

Регенеранты РС- 1-21 4,48 4,00*** 291,57 62,69** 84,03 24,53**

РС-2-9 4,42 3,09 386,80** 46,09 95,00 18,16

РС-3-11 4,40 2,93 345,03 38,57 91,38 18,79

КС-1607 4,27 3,12 410,19 52,06 104,23 22,31

Регенеранты РН-2-1 3 47*** 3,25 214,87*** 40,42 62,65*** 21,10

РН-8-1 3,56** 3,40 298,09** 56,92 76,36*** 23,94

РН-9-1 3,56*** 2,87 295,79*** 40,80 77 31*** 19,53

РН-3-12 3,64** 3,38 311,88** 52,15 86,00* 21,95

Новосибирская 15 4,54 4,65 500,13 117,87 85,72 25,87

Регенеранты РС- 8-13 4,40 4,61 477,09 110,92 79,60 23,51*

РС-11-8 4,67 4,52 466,65 105,50 78,19 21 17***

РН-12-6 4,56 4,81 393,98*** 106,67 80,16 24,39

РН-8-12 4,66 4,59 464,74 122,36 86,62 24,91

Таежная 4,63 4,91 406,59 234,26 85,52 54,47

Регенеранты РН-1-71 4,75 4,84 406,14 246,52 83,55 51,61

РН-1-9 4,83 4,87 376,52 174,22*** 78,49 39,89***

Различия между регенерантом и родительской формой достоверны при уровне значимости * -Р<0,1, ** - Р<0.05; *** - Р<0,01.

У регенерантов сорта Таежная, полученных на нейтральной среде, толерантности не наблюдали. Они не только не превосходили исходный генотип, но и уступали ему по этому параметру. В стрессовых условиях проростки обоих образцов уступили донорному генотипу по массе побегов - регенерант РН-1-9 имел длину и массу органов в 1,5-2 раза меньшую, чем донорный сорт при показателях в контрольных условиях, близких к родительской форме. Таким образом, снижение его ростовых характеристик было значительным (табл. 1).

Вариации в количественных показателях реакции регенерантов на засоление можно объяснить образованием сомаклонов в каллусной культуре. В пользу этой гипотезы свидетельствует сохранение признака устойчивости до третьего поколения (исследованы семена регенерантов R2).

Важно отметить, что из 7 отобранных на селективной среде регенерантов 4 (57%) проявили высокую по сравнению с исходной формой устойчивость к действию соли. В то время как в подобных опытах других авторов этот показатель достигал только 43% [13].

Выводы

1. Показана эффективность получения солеустойчивых форм мягкой яровой пшеницы в каллусной культуре с использованием донорных генотипов сибирской селекции по разработанному в Красноярском НИИСХ протоколу.

Таблица 2

Параметры стеблей исходных форм и их регенерантов

генотип Длина побегов, мм Масса побегов, мг

контроль NaCl контроль NaCl

Минуса (исходная форма) 151,00 21,78 85,58 31,27

Регенеранты РС -3-13 120,74** 35,41*** 72,82** 34,93

РС -9-9 157,90 40,74*** 89,75 41,55**

КС-1607(исходная форма) 128,84 7,59 104,80 15,22

Регенеранты РС- 1-21 154,30 31 77*** 98,87 33,94***

РС-2-9 136,72 14,64 95,56 24,76*

РС-3-11 127,59 10,07 99,66 14,01

КС-1607 136,85 17,24 99,04 26,54

Регенеранты РН-2-1 82,12*** 9,42 75,00* 19,29

РН-8-1 125,03 12,60 85,61 21,90

РН-9-1 88,75*** 7,73 77,50** 15,19*

РН-3-12 99,72** 7,92 82,80 24,98

Новосибирская 15 170,33 58,93 107,32 51,61

Регенеранты РС- 8-13 167,84 58,65 112,75 52,77

РС-11-8 185,23 60,95 112,75 48,70

РН-12-6 162,68 55,14 106,67 50,64

РН-8-12 186,90 56,56 116,99* 48,26

Таежная 130,49 95,23 88,73 73,33

Регенеранты РН-1-71 119,00 100,17 90,72 62,54***

РН-1-9 117,76 41,11*** 101,43** 34,78***

2. Отмечено, что регенеранты отличаються от исходной формы по основным ростовым показателям, которые можно характеризовать как сомаклональную изменчивость, связанную с культивированием in vitro.

Список литературы

1. Безе С. Мало влаги, а пшеницы много! // Новое сельское хозяйство. - 2005. - N° 6. - С. 46-48.

2. Лакин Г. Биометрия. - М.: Высш. шк., 1980. - 290 с.

3. Семина С.А., Мачнева В.В. Урожай и качество зерна яровой мягкой пшеницы в зависимости от сорта // Зерновое хозяйство. - 2005. - № 3. - С. 23-24.

4. Ступко В.Ю. Подбор уровней давления селектирующих факторов для отбора стрессоустойчивых форм мягкой яровой пшеницы in vitro // Молодые ученые - науке Сибири: Сб. ст. молодых ученых. - Красноярск: Краснояр. гос. аграр. ун-т, 2008. - Вып. 3, Ч. I. - С. 80-83.

5. Ступко В.Ю., Зобова Н.В., Сурин Н.А. Подбор условий для создания стрессоустойчивых форм мягкой яровой пшеницы in vitro // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. - 2008. -Т. 168, № 6. - С. 20-26.

6. Удовенко Г.В. Методы оценки устойчивости растений к неблагоприятным условиям среды.

- Л.: Колос, 1976. - 318 с.

7. Фридт В. Генная инженерия: возможности и ограничения // Новое сельское хозяйство. -2005. - № 1. - С. 62-65.

8. Шаманин В.С., Чернов В.М., Трущенко А.Ю., Коваль В.С., Потоцкая И.В. Селекция яровой мягкой пшеницы и адаптивность в условиях Западной Сибири: Итоги и перспективы // Актуальные задачи селекции и семеноводства сельскохозяйственных растений на современном этапе: Докл. и сообщ. IX генетико-селекц. шк., 5-9 апреля 2004 г. - Новосибирск: Сиб. отд-ние РАСХН Сиб-НИИРС НГАУ, 2005. - С. 204-221.

9. Almansouri M., Kinet J.-M., Lutts S. Effect of salt osmotic stress on germination in durum wheat (Triticum durum Desf.) // Plant and Soil. - 2001. - V. 231, N 2. - P. 243-254.

10. Evaluation of drought-resistance-related traits in durum wheat somaclonal lines selected in vitro / Bajji M., Bertin P., Lutts S., Kinet J-M. // Australian Journal of Experimental Agriculture. - 2004. - V. 44.

- P. 27-35.

11. Farooq S., Azam F. Co-existence of salt and drought tolerance in Triticeae // Hereditas. - 2001. -V. 135, N 2-3. - P. 205-210.

12. Flowers T.J. Improving crop salt tolerance // J. Exp. Bot. - 2004. - V. 55. - P. 307-319.

13. Hsissou D. In vitro selection and characterization of drought-tolerant plants of durum wheat (Triticum durum Desf.) // Agronomie. - 1994. - V. 2. - P. 65-70.

14. Salt tolerance improvement in some wheat cultivars after application of in vitro selection pressure / Zairl I., Chlyah A., Sabounji K., Tittahsen M., Chlyah H. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. - 2003. - V. 73, N 3. - P. 237-244.

Рекомендовано к печати к.б.н. Губановой Т.Б.

СОВРЕМЕННАЯ GERM-LINE БИОТЕХНОЛОГИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ МОДИФИКАЦИИ ФОТОСИНТЕЗА И УРОЖАЙНОСТИ У ПШЕНИЦЫ

О.И. КЕРШАНСКАЯ, доктор биологических наук;

А С. НУРМАГАМБЕТОВА; А.М. ЕСПЕМБЕТОВА;

Л.А. СКВОРЦОВА; Т.М. МУХАНОВ Институт биологии и биотехнологии растений, Национальный центр биотехнологии Республики

Казахстан, Алматы, Казахстан

Введение

Для того, чтобы накормить 9 миллиардов людей в ближайшем будущем, необходимо сочетание традиционных технологий селекции и генетического улучшения культурных растений путем внедрения рекомбинантных ДНК-технологий [4-9]. Растения, использующие традиционный путь фиксации углерода C3, а среди них многие важные сельскохозяйственные виды, такие как пшеница и рис, страдают от кислородного ингибирования фотосинтеза и ассоциированного с ним фотодыхания, демонстрируют низкую эффективность фотосинтеза, особенно в современных условиях высокой инсоляции, роста температуры и засухи. С целью активизации фотосинтеза было сделано несколько попыток генетической модификации фотосинтеза путем переноса генов, кодирующих ферменты С4 метаболизма в С3 растения [4, 6-9]. Этот многообещающий подход был успешно продемонстрирован на рисе [6, 8-9], в настоящее время необходима разработка стратегии С3-С4 генетической инженерии для другой важнейшей сельскохозяйственной культуры - пшеницы [5], а также для представителя бобовых - сои.

Разработка новой germ-line-биотехнологии-создания трансгенных растений пшеницы (генетической трансформации посредством половых элементов растения - пыльцы, яйцеклетки, зародышей и семян) открывает возможность интродукции новых целевых генов, которые могут повысить устойчивость пшеницы к болезням и абиотическим стрессам, улучшить качество зерна, увеличить уровень микроэлементов и витаминов в растении, модифицировать фотосинтез и повысить продуктивность [1, 3].

Целью настоящего исследования является разработка эффективной биотехнологии генетической трансформации и определение подходов к генетической модификации фотосинтеза у пшеницы для повышения ее урожайности до 30% путем введения генов кукурузы, кодирующих ферменты С4 метаболизма фотосинтеза.

Объекты и методы исследования

В исследованиях использовано около 4600 предположительно трансгенных семян пшеницы с геном PEPC, полученных из 5 сортов яровой пшеницы селекции теверо-запада США, и 25 сортов и форм яровой и озимой пшеницы казахстанской селекции с контрастными характеристиками фотосинтеза, продуктивности и засухоустойчивости.

Ген фосфоенолпируват карбоксилазы (PEPC) из кукурузы и Т-плазмида pSB 130/ PEPC, содержащая ген PEPC, любезно предоставлены для проведения совместных и самостоятельных исследований профессором М. Ку из Университета штата Вашингтон (США) [7]. Ген PEPC кодирует фермент С4 метаболизма из кукурузы фосфоeнол пируват карбоксилазу (ФЕПК), функция которого описывается формулой:

ФEП + HCO3- ^ оксалоацетат + Pi

Выращивание суспензии агробактерий для пипетирования проводили в среде LB (Lauri-