СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ВЫРАЖЕННОСТИ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ ПАТОЛОГИИ ПО КЛЕТОЧНЫМ МАРКЕРАМ
METHOD FOR DETERMINATION OF DEGREE OF MANIFESTATION OF CARDIOVASCULAR PATHOLOGY BY CELL MARKERS

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, неврологии, терапии, лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения степени выраженности сердечно-сосудистой патологии у пациентов с различными сосудистыми заболеваниями.
Существующие и широко распространенные методы диагностики выраженности сердечно-сосудистой патологии включают, как правило, инструментальные данные: эхокардиографическое исследование, тредмил-тест, сфингоманометрию, электрокардиографию. Однако эти методы лишь выявляют последствия патологии сосудистой системы и не говорят о состоянии сосудов. Рентгеноконтрастная коронарография обладает узкой областью применения и тоже относится к методам диагностики осложнений патологии крововазальной единицы [Назаренко Г.И., Полубенцева Е.И. и др. Современные технологии повышения эффективности использования возможностей лаборатории. Клин. лаб. диагностика. 2004; 1: С.52-55].
Из существующих и распространенных методов диагностики состояния клеточного звена крови используют развернутый анализ крови и карту гемостаза. Развернутый анализ крови учитывает различные количественные клеточные характеристики, но не несет информации о важнейших качественных показателях, таких как изменение мембраны лимфоцитов (блеббинг), генерация мембрано-высвобожденных микрочастиц и формирование клеточных агрегатов. Карта гемостаза дает изолированное понятие о состоянии тромбоцитарно-фибриногенного звена гомеостаза [Меньшиков В.В. Лекарственная терапия и результаты лабораторных исследований. Лекция. Клин. лаб. диагностика. 2001; 1: С.21-36].
Наиболее близким к предлагаемому является способ определения степени состояния крововазальной единицы, предложенный Мясоедовой Е.Г. (Патент РФ №2338192, G01N 33/49, 10.11.2008), заключающийся в определении по стандартной методике десквамированных эндотелиальных клеток в одном литре цельной крови с учетом уровня гематокрита. Недостаток этого способа - отсутствие измерения других клеточных параметров крови, что не дает полноценной картины состояния сосудистой стенки и физико-химических параметров клеток крови, а следовательно, не позволяет оценить риск возникновения осложнений.
Другой способ, предложенный Казак М.В. с соавторами (Патент РФ №2380705, G01N 33/48, 27.01.2010), заключается в изучении показателей суммарной концентрации нитрит- и нитрат-ионов, цитруллина, количества десквамированных эндотелиоцитов в плазме крови, позволяет выявить эндотелиальную дисфункцию и судить о ее компенсации или декомпенсации. Недостатком способа является отсутствие учета состояния клеток крови, а также отсутствие градации степени выраженности эндотелиальной дисфункции.
Известен способ оценки эндотелиальной дисфункции на основе учета содержания лимфоцитов, микрочастиц и слущенных эндотелиоцитов (Патент РФ №2324939, G01N 33/49, 20.05.2008), заключающийся в использовании математической формулы расчета степени выраженности эндотелиальной дисфункции. Несмотря на экономическую выгоду от применения предложенного способа, он является времязатратным и не учитывает формирование клеточных агрегатов в крови, а значит не позволяет оценить степень выраженности сердечно-сосудистой патологии на крововазальном уровне.
Задачей предлагаемого способа является снижение риска развития тяжелых сердечно-сосудистых заболеваний, их осложнений, а также ятрогенных осложнений.
2
Поставленную задачу осуществляют за счет того, что с помощью фазово-контрастной микроскопии проводят подсчет в 10 полях зрения из расчета на 100 лимфоцитов на 4 см изучаемого образца лимфоцитарной фракции количества слущенных эндотелиоцитов, лимфоцитов в состоянии терминального блеббинга, мембран-высвобожденных микрочастиц, отличающийся тем, что дополнительно подсчитывают агрегаты лимфоцита с микрочастицами и тромбоцитами; затем устанавливают степень выраженности сердечно-сосудистой патологии при наличии хотя бы 2 показателей, свидетельствующих в ее пользу, при отклоненнии полученных значений исследуемых показателей от установленных для каждой степени выраженности следует выбирать более тяжелую степень: норма - 0-1 эндотелиоцит, 1-5% лимфоцитов в терминальном блеббинге, 0-60 микрочастиц, 0 агрегатов; умеренная степень выраженности сердечно-сосудистой патологии - 0-2 эндотелиоцитов, 5,5-15% лимфоцитов в терминальном блеббинге, 40-80 микрочастиц, 0 агрегатов; средняя степень - 2,5-5 эндотелиоцитов, 15,5-35,5% лимфоцитов в терминальном блеббинге, 70-160 микрочастиц, 1-5 агрегатов; выраженная степень - 5,5-9,0 эндотелиоцитов, 40,0-75,5% лимфоцитов в терминальном блеббинге, 165-280 микрочастиц, 6-15 агрегатов; критическое состояние сердечнососудистой системы - 9,5 и более эндотелиоцитов, 80% и более лимфоцитов в состоянии терминального блеббинга, более 280 микрочастиц, более 15 агрегатов.
Способ осуществляют следующим образом: забор венозной крови в объеме 5 мл проводят из локтевой вены пациента в пластмассовую пробирку с рисками, содержащую 0,015 мл гепарина; затем тщательно перемешивают кровь с гепарином в пробирке. Допустимо хранение пробирки с кровью в холодильнике при +5С° в течение 3-4 часов. В условиях лаборатории проводят повторное ресуспендирование крови в пробирке; выделение лимфоцитарной фракции осуществляют на градиенте плотности фиколл-верографина 1077 г/мл (в соотношении 1:2 фиколл-верографина и крови) при 3500 оборотах в минуту в течение 15 минут при комнатной температуре. Верографин создает градиент плотности, по которому сепарируются клетки, а фиколл придает раствору дополнительные сепарирующие свойства, увеличивая вязкость и повышая устойчивость клеток в довольно токсичном растворе верографина. Полученное кольцо, состоящее из клеток и микрочастиц, центрифугируют при 3500 оборотах в течение 5 минут, к полученному осадку добавляют PBS (фосфатный буфер) в объеме 250 мкл. И проводят подсчет клеточности в камере Горяева в 4 больших квадратах. Расчет осуществляют по следующей формуле: X = среднее количество в 4 квадратах камеры Горяева × 250 мкл. Клеточность должна быть не менее 5000 клеток в объеме разведения или не менее 20 клеток/мкл PBS.
Допускается проведение лабораторного анализа без подсчета клеточности в камере Горяева, для этого проводят оценку собираемого кольца взвеси клеток и микрочастиц после центрифугирования на градиенте плотности фиколл-верографин. Если клеточное кольцо достаточно широкое, а осадок после центрифугирования составляет около 100 мкл, то добавляют 500 мкл раствора PBS или Хенкса. В случае тонкого кольца и осадка около 50 мкл вносят 250 мкл PBS или раствора Хенкса.
2
В дальнейшем тщательно проводят ресуспендирование с использованием дозатора с широким носиком наконечника и наносят на предметное стекло 12 мкл суспензии. Затем осуществляют рутинный подсчет эндотелиоцитов, лимфоцитов в состоянии терминального блеббинга (выпячивания >1/3 радиуса клетки), мембрано-высвобожденных микрочастиц и клеточных агрегатов лимфоцитов с адгезированными к одному из их полюсов микрочастицами и тромбоцитами с использованием фазово-контрастного микроскопа и увеличением × 900 в 10 полях зрения на 100 лимфоцитов на 4 см.
На рисунке 1 представлена микрофотография лимфоцита диаметром 10 мкм с адгезированными к его верхнему полюсу тромбоцитами и микрочастицами, увеличение × 900.
Для оценки полученных результатов микрокопирования используют данные, представленные в таблице 1. Степень выраженности патологии сердечно-сосудистой системы при наличии хотя бы 2 показателей, свидетельствующих в ее пользу, при отклонении полученных значений исследуемых показателей от установленных для каждой степени выраженности следует выбирать более тяжелую степень.
Таблица 1
Показатели степени выраженности сердечно-сосудистой патологии
Эндотелиоциты (ед. × 4 см<sup>2</sup>)
Лимфоциты в терминальном блеббинге (%)
Микрочастицы (ед. на 4 см<sup>2</sup>)
агрегаты (ед. на 4 см<sup>2</sup>)
Норма
0-1
1-5%
0-60 на 4 см<sup>2</sup>(до 5 в 1 мкл)
0
Умеренная степень
0-2
5,5-15%
40-80 на 4 см<sup>2</sup>(4-7 в 1 мкл)
0
Средняя степень
2,5-5
15,5-35,5%
70-160 на 4 см<sup>2</sup>(6-14 в 1 мкл)
1-5
Выраженная степень
5,5-9,0
40,0-75,5%
165-280 на 4 см<sup>2</sup>(15-24 в 1 мкл)
6-15
Критическое состояние
9,5 и более
80% и более
более 280 на 4 см<sup>2</sup>(≥25 в 1 мкл)
более 15
Исследование способа оценки степени выраженности сердечно-сосудистой патологии проведены у 259 пациентов, страдающих гипертонической болезнью (30 человек), гипертонической болезнью и ишемической болезнью сердца (94 человека), гипертонической болезнью и острым нарушением мозгового кровообращения (60 человек), рефрактерной гипертонией (15 человек), нейро-циркуляторной дистонией (20 человек), а также у относительно здоровых пациентов без сердечно-сосудистой патологии (40 человек). Чувствительность метода (С.С.Катаев и др., 2005) рассчитана по формуле [истинно "+" / (истинно "+" + ложно "-")]·100% и составляет 89,62% (m=1,05; р<0,01); специфичность метода рассчитана по формуле [истинно "-" / (истинно "-" + ложно "+")]·100% и составляет 92,33% (m=2,6; р<0,05); точность метода рассчитана по формуле [истинно "+" + истинно "-" / (истинно "+" + истинно "-" + ложно "+" + ложно "-")]·100% и составляет 90,74% (m=3,03; р<0,05).
На рисунке 2 отображена динамика изменения назначаемой дозы эналаприла, лабораторных показателей содержания количества слущенных эндотелиоцитов, лимфоцитов в состоянии терминального блеббинга, мембрано-высвобожденных микрочастиц, агрегатов лимфоцита с микрочастицами и тромбоцитами, выраженность симптомов сердечно-сосудистой патологии, где по вертикали - степень выраженности патологии сердечно-сосудистой системы: 0 - норма, 1 - умеренная, 2 - средняя, 3 - выраженная, 4 - критическое состояние; по горизонтали - период наблюдения пациентов с гипертонической болезнью и ИБС с оценкой выраженности симптомов (), выраженности изучаемых лабораторных показателей (), применяемой дозы препарата (), соответствует возрастанию дозы по условным единицам от 0 до 4. Как видно из рисунка, степень выраженности симптомов сердечно-сосудистой патологии и содержание лабораторных показателей эндотелиальной дисфункции ниже при назначении более высоких доз эналаприла.
Пример 1
Пациент А., 58 лет, поступил в клинику с диагнозом ИБС. Прогрессирующая стенокардия напряжения; гипертоническая болезнь II, риск 3; ХСН 2б по Васильеву-Стражеско. На момент поступления АД составляет 130/90 мм рт.ст.
В развернутом анализе крове отмечается нормальное значение показателей лейкограммы, эритроцитарнорго звена крови и тромбоцитов, СОЭ в пределах нормы, в биохимическом анализе крови: отклонений не выявлено. По ЭКГ депрессия сегмента ST в пределах 1,5 мм во II и III стандартных отведениях, расщепление зубца R в V1, гипертрофия левого желудочка.
При проведении лабораторных анализов определено, что у пациента выраженная степень сердечно-сосудистой патологии (таблица 2). Жирным шрифтом выделен интервал разброса данных, в который укладываются лабораторные показатели пациента А.
Таблица 2
Таблица оценки выраженности сердечно-сосудистой патологии
Эндотелиоциты (ед ×4 см<sup>2</sup>)
Лимфоциты в терминальном блеббинге (%)
Микрочастицы(ед на 4 см<sup>2</sup>)
агрегаты(ед на 4 см<sup>2</sup>)
Норма
0-1
1-5%
0-60 на 4 см<sup>2</sup>(до 5 в 1 мкл)
0
Умеренная степень
0-2
5,5-15%
40-80 на 4 см<sup>2</sup>(4-7 в 1 мкл)
0
Средняя степень
<b>2,5-5</b>
15,5-35,5%
70-160 на 4 см<sup>2</sup>(6-14 в 1 мкл)
1-5
Выраженная степень
5,5-9,0
<b>40,0-75,5%</b>
<b>165-280 на 4 см</b><sup>2</sup><b>(15-24 в 1 мкл)</b>
<b>6-15</b>
Критическое состояние
9,5 и более
80% и более
более 280 на 4 см<sup>2</sup>(≥25 в 1 мкл)
более 15
Пациенту была назначена стандартная терапия: нитраты пролонгированного действия, ингибитор АПФ, бета-адреноблокатор, аспирин. Так как анализ крови на липиды и липидный спектр был в норме, то гипохолестеринемические препараты согласно МЭС не назначались.
У пациента в течение первых трех суток регрессировала симптоматика прогрессирующей стенокардии напряжения, АД составляло 115/80 мм рт.ст., по ЭКГ - неполная блокада правой ножки пучка Гиса, гипертрофия левого желудочка.
Лабораторно на 7 день госпитализации определено, что степень выраженности сердечно-сосудистой патологии увеличилась - критическое состояние (таблица 3).
Таблица 3
Таблица оценки выраженности сердечно-сосудистой патологии
Эндотелиоциты(ед ×4 см<sup>2</sup>)
Лимфоциты в терминальном блеббинге (%)
Микрочастицы (ед на 4 см<sup>2</sup>)
агрегаты(ед на 4 см<sup>2</sup>)
Норма
0-1
1-5%
0-60 на 4 см<sup>2</sup>(до 5 в 1 мкл)
0
Умеренная степень
0-2
5,5-15%
40-80 на 4 см<sup>2</sup>(4-7 в 1 мкл)
0
Средняя степень
2,5-5
15,5-35,5%
70-160 на 4 см<sup>2</sup>(6-14 в 1 мкл)
1-5
Выраженная степень
<b>5,5-9,0</b>
40,0-75,5%
<b>165-280 на 4 см</b><sup>2</sup><b>(15-24 в 1 мкл</b>)
6-15
Критическое состояние
9,5 и более
<b>80% и более</b>
более 280 на 4 см<sup>2</sup>(≥25 в 1 мкл)
<b>более 15</b>
Согласно МЭС пациент получал ту же лекарственную терапию. На 12 сутки госпитализации на фоне видимого благополучия во время ночного отдыха у пациента развился инфаркт миокарда.
Пример 2.
Пациент Б., 49 лет, страдающий рефрактерной гипертонией в течение 14 лет, обратился за помощью в амбулаторное звено по поводу постоянно высоких цифр артериального давления. Постоянно принимает агонисты адренорецепторов, блокаторы имидазолиновых рецепторов, клофелин - без видимого эффекта.
На момент обращения уровень АД составил 190/110 мм рт.ст.
В развернутом анализе крови патологии не найдено. В биохимическом анализе крови: гиперхолестеринемия (общий холестерин 6,8 ммоль/л), повышение С-реактивного белка 8 мг/л.
ЭКГ: увеличение левых отделов сердца.
Лабораторные показатели представлены в таблице 4.
Таблица 4
Таблица оценки выраженности сердечно-сосудистой патологии
Эндотелиоциты (ед ×4 см<sup>2</sup>)
Лимфоциты в терминальном блеббинге (%)
Микрочастицы(ед на 4 см<sup>2</sup>)
агрегаты (ед на4 см<sup>2</sup>)
Норма
0-1
1-5%
0-60 на 4 см<sup>2</sup>(до 5 в 1 мкл)
0
Умеренная степень
<b>0-2</b>
5,5-15%
40-80 на 4 см<sup>2</sup>(4-7 в 1 мкл)
<b>0</b>
Средняя степень
2,5-5
<b>15,5-35,5</b>%
<b>70-160 на 4 см</b><sup>2</sup><b>(6-14 в 1 мкл)</b>
1-5
Выраженная степень
5,5-9,0
40,0-75,5%
165-280 на 4 см<sup>2</sup>(15-24 в 1 мкл)
6-15
Критическое состояние
9,5 и более
80% и более
более 280 на 4 см<sup>2</sup>(≥25 в 1 мкл)
более 15
Прием лекарственных препаратов по потребности, несмотря на рекомендации лечащего врача.
В развернутом анализе крове отклонений не выявлено, в биохимическом анализе крове повышена концентрация фибриногена (4,5 г/л), общий холестерин 5,2 ммоль/л.
Лабораторно: средняя степень выраженности патологического процесса.
Пациенту были назначен дополнительно к лечению бета-адреноблокатор, миокардиальный цитопротектор, а также курс внутривенных капельных инъекций поляризующей смеси с магнезией.
Через 3 недели после терапии лабораторно определена умеренная степень выраженности патологии сердечно-сосудистой системы (таблица 5). АД составило 160/90 мм рт.ст. Пациент жалоб не предъявлял.
Таблица 5
Таблица оценки выраженности сердечно-сосудистой патологии
Эндотелиоциты (ед ×4 см<sup>2</sup>)
Лимфоциты в терминальном блеббинге (%)
Микрочастицы(ед на 4 см<sup>2</sup>)
агрегаты (ед на4 см<sup>2</sup>)
Норма
<b>0-1</b>
1-5%
0-60 на 4 см<sup>2</sup>(до 5 в 1 мкл)
0
Умеренная степень
0-2
<b>5,5-15%</b>
40-80 на 4 см<sup>2</sup>(4-7 в 1 мкл)
<b>0</b>
Средняя степень
2,5-5
15,5-35,5%
70-160 на 4 см<sup>2</sup>(6-14 в 1 мкл)
1-5
Выраженная степень
5,5-9,0
40,0-75,5%
165-280 на 4 см<sup>2</sup>(15-24 в 1 мкл)
6-15
Критическое состояние
9,5 и более
80% и более
более 280 на 4 см<sup>2</sup>(≥25 в 1 мкл)
более 15
Использование заявляемого способа позволяет оценить степень выраженности патологии сердечно-сосудистой системы на уровне крововазальной единицы как на этапе диагностики заболевания, так и на фоне терапевтической коррекции, что позволяет вовремя скорректировать лечебную стратегию и снизить риск развития тяжелой сердечно-сосудистой патологии, ее осложнений, а также ятрогенных осложнений.