АНТАГОНИСТЫ WNT И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ И ТЕСТИРОВАНИЯ
WNT ANTAGONISTS AND METHODS OF TREATING AND TESTING

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Эта заявка претендует на приоритет Предварительной Заявки США №61/294270, поданной 12 января 2010, Предварительной Заявки США №61/393675, поданной 15 октября 2010, Предварительной Заявки США №61/424408, поданной 17 декабря 2010, каждая из которых включена в описание во всей полноте посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0002] Настоящее изобретение предоставляет новые составы и способы для лечения рака и других Wnt-связанных заболеваний или расстройств, а также новые способы тестирования для идентификации новых терапевтических средств. В частности, настоящее изобретение предоставляет Wnt антагонисты, включая растворимые рецепторные белки, используемые при лечении солидных опухолей и других Wnt-связанных заболеваний или состояний.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Рак является одной из лидирующих причин смерти в развитом мире. Только в Соединенных Штатах рак диагностируется у примерно одного миллиона человек и приводит к 500000 смертей в год. По общей оценке более чем у 1 из 3 людей в течение жизни развивается какая-либо форма рака. Существует более 200 различных форм рака, четыре из которых - рак груди, легких, кишечника и предстательной железы - составляют примерно половины от всех новых случаев рака (Jemal et al., 2009, Cancer J. Cln., 58:225-249).
[0004] Сигнальный путь Wnt определяется как потенциальная цель раковой терапии. Сигнальный путь Wnt - один из нескольких основных регуляторов формирования эмбриональных паттернов, постэмбрионального обеспечения функционирования тканей и биологии стволовых клеток. В частности, Wnt-сигналинг играет важную роль в образовании клеточной полярности и в определении судьбы клетки, включая самообновление популяции стволовых клеток. Неконтролируемая активация пути Wnt связана со множеством видов рака человека, при которых она может влиять на определение направления развития опухолевых клеток, поддерживая их в недифференцированном и пролиферирующем состоянии. Так, канцерогенез может развиться при узурпации гомеостатического механизма, контролирующего нормальное развитие и тканевое восстановление благодаря стволовым клеткам (обзор в Reya & Clevers, 2005, Nature, 434:843-50; Beachy et al., 2004, Nature, 432:324-31).
[0005] Сигнальный путь Wnt впервые был описан в развитии Drosophila на бескрылых (wg) мутантах и на мышином протоонкогене int-1, в настоящее время Wnti (Nusse & Varmus, 1982, Cell, 31:99-109; Van Ooyen & Nusse, 1984, Cell, 39:233-40; Cabrera et al., 1987, Cell, 50:659-63; Rijsewijk et al., 1987, Cell, 50:649-57). Wnt гены кодируют секретируемые липид-модифицированные гликопротеины, из которых 19 идентифицированы у млекопитающих. Эти секретируемые лиганды активируют рецепторный комплекс, состоящий из члена семейства «Frizzled» (FZD) рецепторов и связанного с рецептором к липопротеинам низкой плотности (ЛНП) белка 5 или 6 (LRP5/6). FZD-рецепторы представляют собой семь белков трансмембранного домена суперсемейства рецепторов, связанных с G-белками (GPCR), и содержат большой внеклеточный N-терминальный лиганд-связывающий домен с 10 консервативными цистеинами, известный как богатый цистеином домен (CRD) или Fri домен. Существует десять FZD рецепторов человека, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9 и FZD 10. Различные FZD CRD обладают различной способностью связываться с определенными Wnt (Wu & Nusse, 2002, J. Biol. Chem., 277:41762-9), и FZD рецепторы подразделяются на группы: рецепторы, активирующие канонический β-катениновый путь, и рецепторы, активирующие неканонические пути, описанные ниже (Miller et al., 1999, Oncogene, 18:7860-72). Для образования рецепторного комплекса, который связывает FZD лиганды, FZD рецепторы взаимодействуют с LRP5/6, одиночными проходящими через мембрану белками с четырьмя внеклеточными EGF-подобными доменами, разделенными отделенными шестью YWTD аминокислотными повторами (Johnson et al., 2004, J. Bone Mineral Res., 19:1749).
[0006] Канонический сигнальный путь Wnt, активируемый при связывании с рецепторами, опосредован цитоплазматическим белком Dishevelled (Dsh), взаимодействующим непосредственно с FZD рецептором и приводящим к цитоплазматической стабилизации и аккумуляции β-катенина. В отсутствие Wnt сигнала, β-катенин локализуется в цитоплазматическом деструктивном комплексе, который включает белки - опухолевые супрессоры аденоматозного полипоза толстой кишки (АРС) и Аксин. Эти белки работают как ключевые факторы, позволяющие гликогенсинтазы киназе Зр (GSK3p) связываться и фосфорилировать β-катенин, отмечая его для деградации посредством убиквитин/протеасомного пути. Активация Dsh приводит к фосфорилированию GSK3p и распаду деструкционного комплекса. Накопленный в цитоплазме β-катенин затем транспортируется в ядра, где он взаимодействует с ДНК-связывающими белками TCF/LEF семейства, активируя транскрипцию.
[0007] Кроме канонического сигнального пути, Wnt лиганды также активируют β-катенин-независимые пути (Veeman et al., 2003, Dev. Cell, 5:367-77). Неканонический сигнальный путь Wnt задействован во множестве процессов, но в первую очередь - в гаструляционных перемещениях, благодаря механизму, сходному с механизмом планарной полярности клеток (РСР) у Drosophila. Другие потенциальные механизмы неканонического сигнального пути Wnt включают кальциевый поток, JNK и как малые, так и гетеротримерные G-белки. Между каноническим и неканоническим путями часто наблюдается антагонизм, а некоторые данные указывают на то, что неканонический сигнальный путь может подавлять образование рака. (Olson & Gibo, 1998, Exp. Cell Res., 241:134; Topol et al., 2003, J. Cell Biol., 162:899-908). Так, в определенных случаях FZD рецепторы действуют как негативные регуляторы канонического сигнального пути Wnt. Например, FZD6 подавляет Wnt3a-индуцируемый канонический сигнальный путь, когда коэкспрессируется с FZD1, в ходе TAK1-NLK пути (Golan et al., 2004, JBC, 279:14879-88). Подобным образом было показано, что FZD2 является антагонистом канонического сигнального пути Wnt в присутствии Wnt5a благодаря TAK1-NLK МАРК каскаду (Ishitani et al., 2003, Mol. Cell. Biol., 23:131-39).
[0008] Канонический сигнальный путь Wnt также играет центральную роль в поддержании популяций стволовых клеток в тонкой кишке и ободочной кишке, и несвоевременная активация этого пути играет заметную роль при колоректальных раках (Reya & Clevers, 2005, Nature, 434:843). Абсорбирующий эпителий кишечника покрыт ворсинками и криптами. Стволовые клетки находятся в криптах и медленно делятся, образуя быстро пролиферирующие клетки, которые дают начало всем дифференцированным популяциям клеток, которые выходят из крипт и попадают в ворсинки кишечника. Каскад Передачи сигнала с участием Wnt играет доминирующую роль в контроле нарпавления развития клеток по оси крипта-ворсинка и необходим для поддержания популяции стволовых клеток. Нарушение Передачи сигнала с участием Wnt при генетической утрате TCF7/2 во время гомологичной рекомбинации (Korinek et al., 1998, Nat. Genet., 19:379) или при сверхэкспрессии Dickkopf-1 (Dkk1), сильного секретируемого Wnt антагониста (Pinto et al., 2003, Genes Dev., 17:1709-13; Kuhnert et al., 2004, PNAS, 101:266-71) приводит к истощению популяции кишечных стволовых клеток.
[0009] Роль Передачи сигнала с участием Wnt в развитии рака впервые была открыта при индентификации Wnti (первоначально inti) как онкогена в опухолях молочной железы, трасформированных вставкой мышиного вируса (Nusse & Varmus, 1982, Cell, 31:99-109). С того времени были получены дополнительные доказательства роли Передачи сигнала с участием Wnt в развитии рака молочной железы. Например, трансгенная сверхэкспрессия β-катенина в молочных железах приводит к гиперплазиям и аденокарциномам (Imbert et al., 2001, J. Cell Biol., 153:555-68; Michaelson & Leder, 2001, Oncogene, 20:5093-9), поскольку утрата Передачи сигнала с участием Wnt нарушает нормальное развитие молочной железы (Терега et al., 2003, J. Cell Sci., 116:1137-49; Hatsell et al., 2003, J. Mammary Gland Biol. Neoplasia, 8:145-58). В последнее время было показано, что стволовые клетки молочной железы активируются Wnt-сигналингом (Liu et al., 2004, PNAS, 101:4158-4163). При раке молочной железы человека аккумуляция β-катенина влечет за собой активированный Wnt-сигналинг в более чем 50% карцином, и, хотя специфические мутации не обнаруживаются, наблюдается повышенная регуляция экспрессии «Frizzled» рецепторов (Brennan & Brown, 2004, J. Mammary Gland Neoplasia, 9:119-31; Malovanovic et al., 2004, Int. J. Oncol., 25:1337-42).
[0010] Колоректальный рак чаще всего вызывается активацией мутаций в каскаде сигнального пути Wnt. Приблизительно 5-10% всех колоректальных раков наследуются в одной из основных форм, представляющих собой семейные аденоматозные полипозы (FAP), аутосомную доминантную болезнь, при которой примерно 80% подверженных ею индивидуумов имеют ген аденоматозного полипоза толстой кишки (АРС). Также идентифицируются мутации в других компонентах Wnt-пути, включая Аксин и β-катенин. Отдельные аденомы являются клональными разрастаниями эпителиальных клеток, содержащих второй инактивированный аллель, и большое число FAP аденом неизбежно приводит к развитию аденокарцином при дополнительных мутациях в онкогенах и/или генах-супрессорах опухолей. Кроме того, активация сигнального пути Wnt, включая ведущие к усилению функций мутации в АРС и β-катенине, может вызывать развитие гиперплазии и рост опухоли в мышиных моделях. (Oshima et al., 1997, Cancer Res., 57:1644-9; Haradaetal., 1999, EMBO J., 18:5931-42).
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0011] Настоящее изобретение предоставляет спектр средств, которые связываются с одним или несколькими Wnt-белками человека, включая, но не ограничиваясь этим, растворимые FZD рецепторы и другие средства, составляющие Fri домен, и новые способы использования этих средств. Изобретение также предоставляет способы использования средств в лечении рака путем введения средств пациенту, нуждающемуся в таком лечении. В некоторых вариантах воплощения изобретения способы включают подавление роста раковых клеток. В определенных вариантах воплощения Wnt-связывающее средство является Wnt-антагонистом. Предоставляются также новые способы отбора таких Wnt-связывающих средств. Таким же образом предоставляются полинуклеотиды, кодирующие средства, способы создания средств и различные составы, содержащие средства.
[0012] Так, в одном аспекте изобретение предоставляет способ подавления роста опухоли. В некоторых вариантах воплощения способ заключается в контакте опухоли с эффективным количеством средства, которое связывается с одним или несколькими Wnt-белками (например, Wnt-белками человека). Способ может осуществляться in vivo или in vitro. В некоторых вариантах воплощения опухоль находится в пациенте, и контакт опухоли со средством осуществляется путем введения терапевтически эффективного количества Wnt-связывающего средства пациенту.
[0013] В другом аспекте изобретение предоставляет способ уменьшения частоты встречаемости раковых стволовых клеток в опухоли, содержащей раковые стволовые клетки. Соответственно, изобретение также предоставляет способы уменьшения онкогенности опухолей. В некоторых вариантах воплощения способы заключаются в контакте опухоли с эффективным количеством средства, которое связывается с одним или более Wnt-белками (например, Wnt-белками человека). Способ может осуществляться in vivo или in vitro. Например, контакт может осуществляется путем введения терапевтически эффективного количества Wnt-связывающего средства человеку, имеющему опухоль.
[0014] В другом аспекте изобретение предоставляет способ стимуляции дифференцировки в клетках опухоли или стимуляции экспрессии маркеров дифференцировки в опухоли. В некоторых вариантах воплощения способ заключается в контакте опухоли с эффективным количеством средства, которое связывается с одним или несколькими Wnt-белками (например, Wnt-белками человека). Способ может осуществляться in vivo или in vitro.
[0015] В еще одном аспекте изобретение предоставляет способ лечения рака у пациента, включающий введение терапевтически эффективного количества Wnt-связывающего средства пациенту.
[0016] В дополнительном аспекте изобретение предоставляет способ лечения заболевания у пациента в случае, когда заболевание связано с активацией Передачи сигнала с участием Wnt, включающий введение терапевтически эффективного количества Wnt-связывающего средства пациенту.
[0017] В еще одном аспекте изобретение предоставляет способ лечения заболевания у пациента в случае, когда заболевание характеризуется возросшим уровнем стволовых клеток и/или клеток-предшественников, включающий введение терапевтически эффективного количества Wnt-связывающего средства пациенту.
[0018] В некоторых вариантах воплощения каждого из вышеупомянутых аспектов, а также других аспектов, предоставляемых здесь, Wnt-связывающее средство является полипептидом. В некоторых вариантах воплощения средство представляет собой растворимый рецептор.
[0019] В некоторых вариантах воплощения каждого из вышеупомянутых аспектов, а также других аспектов, предоставляемых здесь, средство содержит Fri домен FZD рецептора или фрагмент FZD Fri домена, который связывает один или несколько Wnt-белков. В некоторых вариантах воплощения FZD рецепторы являются FZD рецепторами человека. Например, Fri домен может быть из человеческого FZD4 или человеческого FZD5. В определенных альтернативных вариантах воплощения изобретения средство может содержать Fri домен человеческого FZD8 рецептора или фрагмент этого Fri домена, который связывает один или несколько Wnt-белков. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство является растворимым FZD рецептором. В альтернативных вариантах воплощения Wnt-связывающее средство не содержит Fri домена FZD рецептора.
[0020] В некоторых вариантах воплощения каждого из вышеупомянутых аспектов, а также других аспектов, предоставляемых здесь, средство содержит Fri домен растворимого Frizzled-связанного белка (SFRP) или фрагмент SFRP Fri домена, который связывает один или несколько Wnt-белков. В некоторых вариантах воплощения SFRP является человеческим SFRP.
[0021] В некоторых вариантах воплощения каждого из вышеупомянутых аспектов, а также других аспектов, предоставляемых здесь, средство содержит Fri домен Ror-белка или фрагмент Ror Fri домена, который связывает один или несколько Wnt-белков. В некоторых вариантах воплощения Ror-белок является человеческим Ror-белком.
[0022] В некоторых вариантах воплощения каждого из вышеупомянутых аспектов, а также других аспектов, предоставляемых здесь, средство, кроме того, содержит человеческий Fc-участок. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство является гибридным белком. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит SEQ ID №:1. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит SEQ ID №:46. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит SEQ ID №:48. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит SEQ ID №:50. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит SEQ ID №:53. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство (до расщепления сигнальной последовательности) содержит SEQ ID №:50 и сигнальную последовательность, выбранную из группы, состоящей последовательности SEQ ID NO:67, SEQ ID №:68, SEQ ID №:69, SEQ ID №:70, SEQ ID №:71, SEQ ID №:72, SEQ ID №:73 и SEQ ID №:74. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство (до расщепления сигнальной последовательности) содержит SEQ ID №:50 и сигнальную последовательность, выбранную из группы, состоящей последовательности SEQ ID NO:70, SEQ ID №:71, SEQ ID №:72, SEQ ID №:73 и SEQ ID №:74. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство (до расщепления сигнальной последовательности) содержит SEQ ID №:50 и SEQ ID №:71. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство (до расщепления сигнальной последовательности) содержит SEQ ID №:53 и сигнальную последовательность, выбранную из группы, состоящей последовательности SEQ ID NO:67, SEQ ID №:68, SEQ ID №:69, SEQ ID №:70, SEQ ID №:71, SEQ ID №:72, SEQ ID №:73 и SEQ ID №:74. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство (до расщепления сигнальной последовательности) содержит SEQ ID №:53 и сигнальную последовательность, выбранную из группы, состоящей последовательности SEQ ID NO:70, SEQ ID №:71, SEQ ID №:72, SEQ ID №:73 и SEQ ID №:74. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство (до расщепления сигнальной последовательности) содержит SEQ ID №:53 и SEQ ID №:71.
[0023] В некоторых вариантах воплощения каждого из вышеупомянутых аспектов, а также других аспектов, предоставляемых здесь, Wnt-связывающее средство связывается с одним или более, двумя или более, тремя или более или четырьмя или более Wnt-белков человека, выбранных из группы, состоящей из: Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt10a и Wnt10b. В некоторых вариантах воплощения средство связывается с Wnt1, Wnt2, Wnt3, Wnt3a и Wnt7b.
[0024] В некоторых вариантах воплощения каждого из вышеупомянутых аспектов, а также других аспектов, предоставляемых здесь, средство является антагонистом Wnt. В некоторых вариантах воплощения средство подавляет передачу сигнала через Wnt. В некоторых вариантах воплощения средство подавляет Wnt канонический Wnt-сигналинг.
[0025] В некоторых вариантах воплощения каждого из вышеупомянутых аспектов, а также других аспектов, предоставляемых здесь, опухоль или рак представляет собой опухоль/рак, выбранные из группы, состоящей из колоректальной опухоли/рака, опухоли/рака поджелудочной железы, опухоли/рака легких, опухоли/рака яичников, опухоли/рака печени, опухоли/рака молочной железы, опухоли/рака почек, опухоли/рака предстательной железы, желудочно-кишечной опухоли/рака, меланомы, опухоли/рака шейки матки, опухоли/рака мочевого пузыря, глиобластомы и опухоли/рака головы и шеи.
[0026] В некоторых вариантах воплощения каждого из вышеупомянутых аспектов, а также других аспектов, предоставляемых здесь, способы также включают в себя контакт опухоли со вторичным терапевтическим средством или введение вторичного терапевтического средства пациенту. В некоторых вариантах воплощения вторичное терапевтическое средство является химиотерапевтическим средством. В некоторых вариантах воплощения вторичное терапевтическое средство является антиметаболитическим (например, гемцитабином) или антимитотическим средством (например, таксаном, таким как паклитаксел).
[0027] В еще одном аспекте изобретение предоставляет полипептид, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID №:1, SEQ ID №:45, SEQ ID №:46, SEQ ID №:47, SEQ ID №:48, SEQ ID №:49, SEQ ID №:50, SEQ ID №:51, SEQ ID №:53, SEQ ID №:54, SEQ ID №:55, SEQ ID №:65 и SEQ ID №:66, а также клетки, вырабатывающие полипептид, и составы, содержащие полипептид. Также предоставляются фармацевтические составы, содержащие полипептид и фармацевтически допустимый носитель. Кроме того, также предоставляются полинуклеотиды, содержащие полинуклеотид, который кодирует полипептиды SEQ ID №:1, SEQ ID №:45, SEQ ID №:46, SEQ ID №:47, SEQ ID №:48, SEQ ID №:49, SEQ ID №:50, SEQ ID №:51, SEQ ID №:53, SEQ ID №:54, SEQ ID №:55, SEQ ID №:65 и SEQ ID №:66, или имеющие последовательность SEQ ID №:2. Таким же образом предоставляются векторы и клетки, содержащие полинуклеотиды.
[0028] В дополнительном аспекте изобретение предоставляет способ поиска средства, обладающего противоопухолевым действием и/или действием, направленным против раковых стволовых клеток. В некоторых вариантах воплощения изобретения способ включает сравнение уровня одного или нескольких маркеров дифференцировки и/или одного или нескольких маркеров стволовых клеток в первичной солидной опухоли (например, в солидной опухоли, содержащей раковые стволовые клетки), которую обрабатывали средством, с уровнем одного или нескольких маркеров дифференцировки во вторичной солидной опухоли, которую не обрабатывали средством. В некоторых вариантах воплощения способ включает в себя: (а) воздействие средством на первичную солидную опухоль, но не на вторичную солидную опухоль; (б) оценку уровня одного или нескольких маркеров дифференцировки и/или одного или нескольких маркеров стволовости в первичных и вторичных солидных опухолях; и (в) сравнение уровня одного или нескольких маркеров дифференцировки в первичной опухоли с уровнем одного или нескольких маркеров дифференцировки во вторичной солидной опухоли. В некоторых вариантах воплощения (а) возросшие уровни одного или нескольких маркеров дифференцировки в первичной солидной опухоли по сравнению со вторичной солидной опухолью указывают на противоопухолевое действие средства или действие, направленное против раковых стволовых клеток; и/или (б) снизившиеся уровни одного или нескольких маркеров стволовости указывают на противоопухолевое действие средства или действие, направленное против раковых стволовых клеток. В некоторых вариантах воплощения средство связывает один или несколько Wnt-белков. В некоторых вариантах воплощения средство представляет собой растворимый FZD рецептор. В некоторых способах средство представляет собой антитело, такое как анти-FZD или анти-Wnt антитело. В некоторых альтернативных вариантах воплощения средство представляет собой синтетический препарат.
[0029] Если аспекты или варианты воплощения изобретения описаны в терминах группы Маркуша или других группирований альтернатив, настоящее изобретение охватывает не только всю группу, перечисленную в целом, но и каждый член группы по отдельности и все возможные подгруппы основной группы, а также основную группу, в которой отсутствует один или более из членов группы. Настоящее изобретение также предусматривает однозначное исключение одного или более из любых членов группы в изобретении, описанном в заявке.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
[0030] Фигура 1. Фармакокинетика FZD8-Fc (54F03) у крыс. После введения однократной дозы (10 мг/кг) FZD8-Fc следовала оценка фармакокинетических свойств FZD8-Fc. Концентрации FZD8-Fc в сыворотке определялись на 1,24, 48, 72, 96, 168, 240 и 336 часы после введения.
3
[0031] Фигура 2. Подавление роста PN4 опухоли поджелудочной железы при лечении FZD8-Fc (54F03). Клетки PN4 поджелудочной железы вводились подкожно NOD/SCID мышам. К мышам применялась обработка FZD8-Fc (--), гемцитабином (--), комбинацией FZD8-Fc и гемцитабина (-Δ-) или контрольным антителом (-●-). Показаны данные по объему опухоли (мм) по дням после обработки.
hi
[0032] Фигура 3. Уменьшение CD44 клеточной популяции в PN4 опухолях, обработанных FZD8-Fc (54F03). Клеточная поверхность опухолевых клеток, обработанных контрольным антителом, FZD8-Fc, гемцитабином или комбинацией FZD8-Fc и гемцитабина, была окрашена на ESA и CD44. Для каждой опытной группы перед окрашиванием были объединены суспензии отдельных клеток из пяти опухолей.
[0033] Фигура 4. Метод предельного разведения т vivo на PN4 опухолях поджелудочной железы, обработанных FZD8-Fc (54F03).
[0034] Фигура 5. Возрастание клеточной дифференцировки в PN4 опухолях поджелудочной железы, обработанных FZD8-Fc (54F03). Парафиновые срезы PN4 опухолей, обработанных контрольным антителом, FZD8-Fc, гемцитабином или комбинацией FZD8-Fc и гемцитабина, были окрашены альциановым синим для детекции экспрессирующих муцин клеток.
[0035] Фигура 6. Возрастание клеточной дифференцировки в PN8 опухолях поджелудочной железы, обработанных FZD8-Fc (54F03). Парафиновые срезы PN8 опухолей, обработанных контрольным антителом, FZD8-Fc, гемцитабином или комбинацией FZD8-Fc и гемцитабина, были окрашены альциановым синим для детекции экспрессирующих муцин клеток.
[0036] Фигура 7. Возрастание клеточной дифференцировки в PN13 опухолях поджелудочной железы после обработки FZD8-Fc (54F03). Парафиновые срезы PN13 опухолей, обработанных контрольным антителом или FZD8-Fc, были окрашены альциановым синим для детекции экспрессирующих муцин клеток. Кроме того, срезы были окрашены Ki67, маркером активно пролиферирующих клеток.
[0037] Фигура 8. Возрастание окраски Mud 6 в PN13 опухолях поджелудочной железы после обработки FZD8-Fc (54F03). Парафиновые срезы PN13 опухолей, обработанных контрольным антителом или FZD8-Fc, были окрашены на белке Mud 6.
[0038] Фигура 9. Возрастание окраски CK20 в PN13 опухолях поджелудочной железы после обработки FZD8-Fc (54F03). Парафиновые срезы PN13 опухолей, обработанных контрольным антителом или FZD8-Fc, были окрашены на белке CK20
3
[0039] Фигура 10. Подавление роста РЕ 13 опухоли молочной железы после обработки FZD8-Fc (54F03) в комбинации с паклитакселом. Клетки РЕ13 опухоли молочной железы были введены путем подкожной инъекции NOD/SCID мышам. Мыши были обработаны контрольным антителом (-●-), FZD8-Fc (), пакситакселом (--) или комбинацией FZD8-Fc и пакситаксела (-○-). Показаны данные по объему опухоли (мм) по дням после обработки.
3
3
[0040] Фигура 11. Дозозависимое подавление роста С28 опухоли ободочной кишки при обработке FZD8-Fc (54F03). Клетки С28 опухоли ободочной кишки были введены путем подкожной инъекции NOD/SCID мышам. Мыши были обработаны FZD8-Fc 1,5 мг/кг два раза в неделю (--), 5 мг/кг один раз в неделю (--), 5 мг/кг два раза в неделю (-○-), 15 мг/кг один раз в неделю (--) или 15 мг/кг два раза в неделю (-Δ-) или контрольным антителом (--). Показаны данные по объему опухоли (мм) по дням после обработки (Фигура 11А). Подавление роста опухоли ободочной кишки FZD8-Fc в комбинации с иринотеканом. Мыши были обработаны FZD8-Fc (--), иринотеканом (--), комбинацией FZD8-Fc и иринотекана (-●-) или контрольным антителом (--). Показаны данные по объему опухоли (мм) по дням после обработки. (Фигура 11В).
[0041] Фигура 12. Возрастание окраски CK20 в С28 опухолях после обработки FZD8-Fc (54F03). Парафиновые срезы С28 опухолей, обработанных контрольным антителом или FZD8-Fc, были окрашены на белке CK20.
3
[0042] Фигура 13. Подавление роста PN21 опухоли поджелудочной железы и уменьшение частоты встречаемости раковых стволовых клеток при обработке FZD8-Fc (54F03). Клетки PN21 опухоли поджелудочной железы были введены путем подкожной инъекции NOD/SCID мышам. Мыши были обработаны FZD8-Fc (--), гемцитабином (--), комбинацией FZD8-Fc и гемцитабина (--) или контрольным антителом (-●-). Показаны данные по объему опухоли (мм) по дням после обработки (Фигура 13А). Метод предельного разведения in vivo на PN21 опухолях панкреатической железы, обработанных FZD8-Fc (Фигура 13В).
[0043] Фигура 14. Возрастание клеточной дифференцировки в PN21 опухолях панкреатической железы после обработки FZD8-Fc (54F03). Парафиновые срезы PN21 опухолей, обработанных контрольным антителом или FZD8-Fc, были окрашены альциановым синим для детекции муцинов.
[0044] Фигура 15. Увеличение клеточной дифференцировки и уменьшение пролиферации в PN21 опухолях поджелудочной железы с последующей обработкой FZD8-Fc (54F03). Парафиновые срезы PN21 опухолей, обработанных контрольным антителом, FZD8-Fc, гемцитабином или комбинацией FZD8-Fc и гемцитабина, были окрашены альциановым синим для детекции муцина. Кроме того, срезы были окрашены на Ki67, маркер активности пролиферирующих клеток.
[0045] Фигура 16. Фармакокинетика вариантов FZD8-Fc у обезьян. Введение однократной дозы (30 мг/кг) FZD8-Fc вариантов 54F15 и 54F16 с последующей оценкой фармакокинетических свойств вариантов. Концентрации 54F15 (-○-) и 54F16 (-♦-) в сыворотке определялись на 1, 6, 12, 24, 48, 72,96, 168, 240 и 336 часы после введения.
3
[0046] Фигура 17. Подавление роста С28 опухоли ободочной кишки при обработке FZD8-Fc вариантами. Клетки С28 опухоли ободочной кишки были введены путем подкожной инъекции NOD/SCID мышам. Мыши были обработаны контрольным антителом (-Х-), 54F03 (--), 54F09 (--), 54F12 (--), 54F13 (-♦-), 54F15 (-○-) или 54F16 (-Δ-). Показаны данные по объему опухоли (мм) по дням после обработки.
3
[0047] Фигура 18. Подавление роста PN4 опухоли поджелудочной железы и уменьшение частоты встречаемости раковых стволовых клеток при обработке FZD8-Fc. Клетки PN4 опухоли поджелудочной железы были введены путем подкожной инъекции NOD/SCID мышам. Мыши были обработаны контрольным антителом (-●-), 54F03 (--), 54F09 (--), 54F12 (-○-), 54F13 (--), 54F15 (--) или 54F16 (-♦-). Показаны данные по объему опухоли (мм) по дням после обработки.
hi
+
+
[0048] Фигура 19. Редукция CD44 и CD44CD201 клеток в PN4 опухолях, обработанных FZD8-Fc вариантами 54F03 и 54F16. Клеточная поверхность, окрашенная ESA, CD44 и CD201 на опухолевых клетках, обработанных контрольным антителом, FZD8-Fc вариант 54F03 или вариант 54F16 был приготовлен и проанализирован FACS.
[0049] Фигура 20. Характеристика N-конца FZD8-Fc белков. FZD8-Fc варианты анализировались по методу масс-спектрометрии. Показаны результаты для 54F16 (Фигура 20А), 54F26 (Фигура 20В), 54F28 (Фигура 20С), 54F30 (Фигура 20D) и 54F32 (Фигура 20Е).
3
[0050] Фигура 21. Подавление роста С28 опухоли ободочной кишки при обработке FZD8-Fc. Клетки С28 опухоли ободочной кишки были введены путем подкожной инъекции NOD/SCID мышам. Мыши были обработаны контрольным антителом (--), 54F03 (-Δ-), 54F23 (--) или 54F26 (-○-). Показаны данные по объему опухоли (мм) по дням после обработки.
ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0051] Настоящее изобретение предоставляет новые средства, включая, но не ограничиваясь этим, полипептиды, содержащие Fri домен Frizzled (FZD) рецепторов человека, секретируемых Frizzled-родственных белков (SFRPs) человека, или Ror белки, которые связываются с одним или несколькими Wnt человека. Также предоставляются соответствующие полипептиды и полинуклеотиды, составы, содержащие Wnt-связывающие средства, и способы создания Wnt-связывающих средств. Кроме того, предоставляются способы использования Wnt-связывающих средств, таких как способы подавления роста опухоли, лечения рака, индукции дифференцировки и уменьшения онкогенности. Предоставляются также способы тестирования средств для идентификации новых Wnt-связывающих средств, обладающих противоопухолевой активностью или действием, направленным против раковых стволовых клеток.
+
hi
+
+
[0052] Было произведено Wnt-связывающий агент, содержащий Fri домен FZD8 человека и Fc домен, и здесь оно обозначается как FZD8-Fc или FZD8-Fc (54F03) (Пример 1). Было произведено определенное число вариантов FZD8-Fe белка (Пример 10). Было показано, что произведенные FZD8-Fc белки обладают приблизительно 95% или большей гомологичностью в N-конце (Пример 16). Фармакокинетические исследования с использованием нескольких FZD8-Fc вариантов были проведены на крысах и показали, что период полувыведения FZD8-Fc вариантов составлял не менее 100 часов (Примеры 2 и 12; Фигура 1 и Таблица 4). Фармакокинетическое исследование, проведенное на обезьянах с FZD8-Fc вариантами 54F15 и 54F16, продемонстрировало, что эти белки имеют период полувыведения не менее 100 часов (Пример 13 и Таблица 5). При воздействии FZD8-Fc (54F03) отдельно, или в комбинации с химиотерапевтическим средством, было показано уменьшение роста опухолей поджелудочной железы, опухолей молочной железы и опухолей ободочной кишки (Примеры 3, 5, 6 и 8 и Фигуры 2, 10, 11 В и 13А). Кроме того, было показано, что это воздействие уменьшает процент CD44 клеток и снижает частоту встречаемости раковых стволовых клеток в модели поджелудочной железы (Примеры 3 и 8 и Фигуры 3, 4 и 13В). При воздействии FZD8-Fc (54F03) отдельно, или в комбинации с химиотерапевтическим средством, было показано увеличение клеточной дифференцировки в клетках опухоли поджелудочной железы и клетках опухоли ободочной кишки (Примеры 4, 7 и 9 и Фигуры 5-9, 12, 14 и 15). Воздействие вариантами FZD8-Fc продемонстрировало подавление роста опухоли в опухолях ободочной кишки и поджелудочной железы, при этом степень подавления зависела от вариантов (Примеры 14, 15 и 17 и Фигуры 17, 18 и 21). Показано, что обработка FZD8-Fc вариантом 54F03 и вариантом 54F16 уменьшает процент CD44 клеток, а также процент CD44CD202 клеток в опухолях поджелудочной железы (Пример 15 и Фигура 19).
I. Определения
[0053] Термин "антагонист", используемый здесь, включает любую молекулу, которая частично или полностью блокирует, ингибирует или нейтрализует экспрессию или биологическую активность белка (например, маркера раковой стволовой клетки). Блокировка, ингибирование и/или нейтрализация биологической активности включает, не ограничиваясь этим, подавление роста опухоли. Термин "антагонист" включает любую молекулу, которая частично или полностью блокирует, ингибирует или нейтрализует биологическую активность Wnt-пути. Подходящие молекулы-антагонисты включают, не ограничиваясь этим, фрагменты и/или варианты аминокислотной последовательности нативных белков FZD рецептора, включая растворимые FZD рецепторы, а также дериваты SFRP и дериваты Ror белков.
[0054] Полипептид, антитело, полинуклеотид, вектор, клетка или соединение, которые «выделены», являются полипептидом, антителом, полинуклеотидом, вектором, клеткой или соединением, которые находится в форме, не встречающейся в природе. Выделенные полипептиды, антитела, полинуклеотиды, векторы, клетки или соединения включают те, которые очищены до степени, не наблюдающейся у той формы, в которой они встречаются в природе. В некоторых вариантах воплощения «выделенные» полипептид, антитело, полинуклеотид, вектор, клетка или соединение являются в значительной степени очищенными.
[0055] При использовании здесь "в значительной степени очищенный" относится к веществу, которое является по меньшей мере на 50% очищенным (то есть не содержащим примесей), более предпочтительно - по меньшей мере на 90% очищенным, более предпочтительно - по меньшей мере на 95% очищенным, более предпочтительно - по меньшей мере на 98% очищенным, более предпочтительно - по меньшей мере на 99% очищенным.
[0056] При использовании здесь термин "растворимый рецептор" относится к N-концевому внеклеточному фрагменту рецепторного белка, предшествующему первому трансмембранному домену рецептора, который может секретироваться клеткой в растворимой форме. В некоторых вариантах воплощения рецепторный белок является FZD рецептором. В некоторых вариантах воплощения рецепторный белок является Ror рецептором.
[0057] При использовании здесь термин "FZD растворимый рецептор" относится N-концевому внеклеточному фрагменту FZD рецепторного белка человека, предшествующему первому трансмембранному домену рецептора, который может секретироваться клеткой в растворимой форме. Имеются в виду FZD растворимые рецепторы, содержащие как полный N-терминальный внеклеточный домен (ECD) (называемый здесь "FZD ECD"), так и меньшие фрагменты. Раскрыты также FZD растворимые рецепторы, содержащие Fri домен (называемый здесь "FZD Fri"). FZD Fri растворимые рецепторы могут демонстрировать измененную биологическую активность (например, возросший период полувыведения белка) по сравнению с растворимыми рецепторами, содержащими полный FZD ECD. Период полувыведения белка может возрастать также благодаря ковалентной модификации полиэтиленгликолем (PEG) или полиэтиленоксидом (РЕО). FZD растворимые рецепторы включают FZD ECD или Fri домены, связанные внутри рамки считывания с другими функциональными и структурными белками, включая, но не ограничиваясь этим, Fc участок человека (например, Fc человека из иммуноглобулинов IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM); белковые маркеры (например, myc, FLAG, GST); другие эндогенные белки или белковые фрагменты, или любые другие пригодные белковые последовательности, включая любой линкерный участок между FZD ECD или Fri доменом и присоединенным белком. В некоторых вариантах воплощения, Fri домен FZD рецептора непосредственно связан с Fc участком человека. В некоторых вариантах воплощения Fri домен FZD рецептора связан с человеческим IgG1 Fc (называемым здесь "FZD Fri.Fc"). В некоторых вариантах воплощения Fri домен FZD рецептора связан с Fc участком человека посредством пептидного линкера. FZD растворимые рецепторы также включают различные белки, содержащие аминокислотные вставки, делеции, замены и/или консервативные замены.
[0058] При использовании здесь термин "линкер" или "линкерный участок" обозначает линкер, встроенный между первым полипептидом (например, FZD компонентом) и вторым полипептидом (например, Fc участком). В некоторых вариантах воплощения линкер является пептидным линкером. Линкеры не должны неблагоприятно влиять на экспрессию, секрецию или биоактивность полипептидов. Предпочтительно линкеры не являются антигенами и не вызывают иммунный ответ.
[0059] При использовании здесь термины "рак" и "раковый" обозначают или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, при котором для популяции клеток характерен неконтролируемый рост клеток. Термин рак охватывает Wnt-зависимые раки. Примеры раков включают, не ограничиваясь этим, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкемию. В частности, примеры таких раков включают плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, аденокарциному легких, плоскоклеточную карциному легких, рак брюшины, гепатоцеллюлярный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак ободочной кишки, колоректальный рак, рак кожи, меланому, карциному эндометрия или матки, карциному слюнной железы, рак почек, рак печени, рак предстательной железы, рак влагалища, рак щитовидной железы, печеночную карциному и различные типы рака головы и шеи.
[0060] Термины "пролиферативное расстройство" и "пролиферативное заболевание" обозначают расстройства, связанные с ненормальной клеточной пролиферацией, такой как рак.
[0061] "Опухоль" и "неоплазма" при использовании здесь обозначают любое скопление клеток, которое возникает вследствие чрезмерного клеточного роста или пролиферации как доброкачественного (неракового), так и злокачественного (ракового), включая предраковые поражения. В некоторых вариантах воплощения опухоль является эпителиальной опухолью. В некоторых вариантах воплощения опухоль является Wnt-зависимой опухолью.
[0062] При использовании здесь термин "пациент" обозначет любое животное (например, млекопитающее), включая, но не ограничиваясь этим, людей, не являющихся людьми приматов, собак, кошек, грызунов и тому подобных, которые получают определенное лечение.
[0063] Термины "раковая стволовая клетка" и "РСК", и "опухолевая стволовая клетка", и "стволовая клетка солидной опухоли" используются здесь взаимозаменяемо и обозначают популяцию клеток из солидной опухоли, которые: (1) обладают экстенсивной пролиферативной способностью; (2) способны к асимметричному клеточному делению, давая начало одному или нескольким типам потомков с редуцированной способностью к пролиферации или развитию; и (3) способны к симметричному клеточному делению для самовосстановления или самоподдержания. Такие свойства "раковых стволовых клеток, "РСК", "опухолевых стволовых клеток" или "стволовых клеток солидной опухоли" позволяют этим раковым стволовым клеткам формировать пальпируемые опухоли при серийной трансплантации в хозяина с ослабленным иммунитетом (например, мышь) по сравнению с большинством опухолевых клеток, которые не в состоянии образовать опухоль. Раковая стволовая клетка вместо дифференцировки подвержена хаотическому самовоспроизводству, образуя опухоли с ненормальными клеточными типами, которые могут изменяться с течением времени, если происходят мутации.
[0064] Термины "раковая клетка" и "опухолевая клетка", и их грамматические эквиваленты обозначают всю популяцию клеток, берущих свое происхождение из опухоли, включая как неонкогенные клетки, которые составляют основную массу популяции опухолевых клеток, так и онкогенные стволовые клетки, также называемые здесь раковыми стволовыми клетками.
[0065] Термин "онкогенный" обозначает функциональные свойства стволовой клетки солидной опухоли, включая свойства самовосстановления (образования дополнительных онкогенных раковых стволовых клеток) и пролиферацию для образования всех других опухолевых клеток (давать начало дифференцированным и поэтому неонкогенным опухолевым клеткам), которые позволяют стволовым клеткам солидной опухоли формировать опухоль. Эти свойства самовосстановления и пролиферации для образования всех других раковых клеток позволяют раковым стволовым клеткам формировать пальпируемые опухоли при серийной трансплантации в хозяина с ослабленным иммунитетом (например, мышь) по сравнению с неонкогенными опухолевыми клетками, которые не в состоянии образовать опухоль при серийной трансплантации. Наблюдалось, что неонкогенные опухолевые клетки могут формировать опухоль при первичной трансплантации в хозяина с ослабленным иммунитетом (например, мышь) после получения опухолевых клеток из солидной опухоли, но эти неонкогенные опухолевые клетки не дают начало опухоли после серийной трансплантации.
[0066] При использовании здесь "приемлемый фармацевтический носитель" или "фармацевтически приемлемый носитель" обозначает любое вещество, которое при комбинации с активным ингридиентом фармацевтического состава, таким как терапевтический полипептид, дает возможность терапевтическому полипептиду, например, сохранять биологическую активность. Кроме того, "приемлемый фармацевтический носитель" не вызывает иммунный ответ у пациента-реципиента. В некоторых вариантах воплощения термин "фармацевтический растворитель" используется взаимозаменяемо с "фармацевтическим носителем". Примеры включают, но не ограничиваются этим, любые из стандартных фармацевтических носителей, таких как фосфатно-солевой буферный раствор, и различные масляные/водные эмульсии. Примерами растворителей для аэрозольного или парэнтерального введения являются фосфатный буфер, солевой или нормальной (0,9%) солености.
[0067] Термин "терапевтически эффективное количество" обозначает количество средства (например, растворимого рецептора или другого вещества), эффективное при лечении заболевания или расстройства у пациента или млекопитающего. В случае рака терапевтически эффективное количество средства (например, растворимого рецептора) может уменьшать число раковых клеток; уменьшать размер опухоли; уменьшать встречаемость раковых стволовых клеток; подавлять и/или останавливать проникновение раковых клеток в периферийные органы; подавлять и/или останавливать метастазы опухоли; подавлять и/или останавливать рост опухоли; и/или в некоторой степени облегчать один или несколько симптомов, связанных с раком. В зависимости от степени, в которой средство (например, растворимый рецептор) предотвращает рост и/или убивает существующие раковые клетки, его можно считать цитостатическим или цитотоксическим.
[0068] При использовании здесь термин "подавление роста опухоли" обозначает любой механизм, благодаря которому можно подавить рост опухолевых клеток. В некоторых вариантах воплощения роет опухолевых клеток подавляется замедлением пролиферации опухолевых клеток. В некоторых вариантах воплощения рост опухолевых клеток подавляется остановкой пролиферации опухолевых клеток. В некоторых вариантах воплощения рост опухолевых клеток подавляется уничтожением опухолевых клеток. В некоторых вариантах воплощения рост опухолевых клеток подавляется индукцией апоптозов в опухолевых клетках. В некоторых вариантах воплощения рост опухолевых клеток подавляется индукцией дифференцировки в клетках опухоли. В некоторых вариантах воплощения рост опухолевых клеток подавляется лишением опухолевых клеток питательных веществ. В некоторых вариантах воплощения рост опухолевых клеток подавляется предотвращением миграции опухолевых клеток. В некоторых вариантах воплощения рост опухолевых клеток подавляется предотвращением инвазии опухолевых клеток.
[0069] Такие термины как "лечебный", "лечение", "лечить", "облегчение" и "облегчать" обозначают как 1) терапевтические мероприятия, которые излечивают, замедляют, уменьшают симптомы и/или останавливают прогрессию диагностированного патологического состояния или заболевания, так и 2) профилактические или превентивные мероприятия, которые предотвращают или замедляют развитие целевого патологического состояния или заболевания. Таким образом, те, кто нуждаются в лечении, включают в себя тех, кто уже имеет заболевание, тех, кто предрасположен к появлению заболевания, и тех, у кого заболевание предотвращается. В некоторых вариантах воплощения изобретения пациент получает успешное "лечение" рака в соответствии со способами настоящего изобретения, если пациент показывает один или несколько из следующих признаков: уменьшение числа или полное отсутствие раковых или опухолевых клеток; уменьшение размера опухоли; подавление или отсутствие проникновения раковых или опухолевых клеток в периферийные органы, включая, например, распространение рака в мягкие ткани и кости; подавление или отсутствие опухолевых метастаз; подавление или отсутствие опухолевого или ракового роста; облегчение одного или несколько симптомов, связанных с определенным раком; уменьшение болезненности и смертности; улучшение качества жизни; уменьшение онкогенности, встречаемости онкогенных клеток или онкогенного потенциала опухоли; уменьшение числа или встречаемости раковых стволовых клеток в опухоли; дифференцировка онкогенных клеток к неонкогенному состоянию или определенная комбинация этих эффектов.
[0070] При использовании здесь термины "полинуклеотид" и "нуклеиновая кислота" обозначают полимер, состоящий из множества нуклеотидных единиц (рибонуклеотиду или дезоксинуклеотиду или родственных по структуре разновидностей), связанных фосфодиэфирными связями, включая, но не ограничиваясь этим, ДНК или РНК. Термин охватывает последовательности, которые включают в себя любые из известных основных аналогов ДНК и РНК, включая, но не ограничиваясь этим, 4-ацетилцитозин, 8-гидрокси-N6-метиладенозин, азиридинилцитозин, псевдоизоцитозин, 5-(карбоксигидроксил-метил) урацил, 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоурацил, 5-карбоксиметил-аминометилурацил, дигидроурацил, инозин, N6-изопентиниладенин, 1-метиладенин, 1-метилпсевдо-урацил, 1-метилгуанин, 1-метилинозин, 2,2-диметил-гуанин, 2-метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метил-цитозин, 5-метилцитозин, N6-метиладенин, 7-метилгуанин, 5-метиламинометилурацил, 5-метокси-амино-метил-2-тиоурацил, бета D-маннозилквеуозин, 5'-метоксикарбонилметилурацил, 5-метоксиурацил, 2-метилтио-N6-изопентиниладенин, урацил-5-оксиацетиловой кислоты метилэфир, урацил-5-оксиацетиловая кислота, оксибутоксозин, псевдоурацил, квеуозин, 2-тиоцитозин, 5-метил-2-тиоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-метилурацил, N-урацил-3-оксиацетиловой кислоты метилэфир, урацил-5-оксиацетиловой кислоты, псевдоурацил, квеуозин, 2-тиоцитозин и 2,6-диаминопурин. Последовательность нуклеотидов может быть прервана ненуклеотидными компонентами. Полинуклеотид может быть затем модифицирован после полимеризации, например, при конъюгации с меченым компонентом. Другие типы модификаций включают, например, замену одного или нескольких имеющихся в природе нуклеотидов на аналог; межнуклеотидные модификации, такие как не несущие заряда связи (например, метил фосфонаты, фосфотриэфиры, фосфоамидаты, карбаматы и так далее) и несущие заряд связи (например, фосфотиоаты, фосфодитиоаты и так далее); пендантные компоненты, такие как белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, поли-L-лизин и так далее); интеркаляторы (например, акридин, псорален и так далее); хелаторы (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, окислительные металлы и так далее); алкиляторы; модифицированные линкеры (например, альфа аномерные нуклеиновые кислоты и так далее); а также немодифицированные формы полинуклеотида(ов). Кроме того, любые гидроксильные группы, обычно присутствующие в сахарах, могут быть заменены, например, на фосфонатные группы, фосфатные группы, блокированные стандартными блокирующими группами или активированные для дополнительных связей с дополнительными нуклеотидами, или могут быть конъюгированы с твердыми подложками. 5' и 3'-концевая группа ОН может быть фосфорилирована или заменена аминами или органическими кэп-группировками из от 1 до 20 атомов углерода. Другие гидроксилы также могут быть производными стандартных блокирующих групп. Полинуклеотиды могут также содержать аналоговые формы Сахаров рибозы или дезоксирибозы, которые обычно известны специалистам, включая, например, 2'-O-метил-, 2'-O-аллил, 2'-фторо- или 2'-азидорибозу, аналоги карбоциклических Сахаров, альфа-аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилоза или ликсоза, пиранозные формы Сахаров, фуранозные формы Сахаров, гептулозы, ациклические аналоги и абазические нуклеозидные аналоги, такие как метил рибозид. Одна или более фосфодиэфирных связей могут быть заменены альтернативными линкерными группами. Эти альтернативные линкерные группы включают, но не ограничиваются этим, воплощения, в которых фосфат замещен P(O)S ("тиоатом"), P(S)S ("дитиоатом"), (O)NR2 ("амидатом"), P(O)R, P(O)OR', CO CH2 ("формацеталом"), в которых каждый R или R' представляет собой независимо Н или замененный или незамененный алкил (1-20С), необязательно содержащим (--O--) связь, арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралдил. Не все связи в полинуклеотиде должны быть одинаковыми.
[0071] При использовании здесь термин "вектор" используется для обозначения молекул нуклеиновых кислот, которые транспортируют сегмент(ы) ДНК из одной клетки в другую. Термин "вектор" означает конструкт, который способен доставлять и, предпочтительно, экспрессировать один или более интересующих генов или последовательностей в клетке хозяина. Примеры векторов включают, не ограничиваясь этим, вирусные векторы, депротеинизированные ДНК или РНК векторы экспрессии, плазмиды, фагмиды, космиды или фаговые векторы, ДНК или РНК векторы экспрессии, связанные с катионными конденсирующими средствами, и ДНК или РНК векторы экспрессии, инкапсулированные в липосомах.
[0072] Термины "полипептид" и "пептид", и "белок", и "белковый фрагмент" используются здесь взаимозаменяемо в отношении полимера аминокислотных остатков любой длины. Термины обозначают аминокислотные полимеры, у которых один или несколько аминокислотных остатков в полимере является искусственным химическим миметиком соответствующей встречающейся в природе аминокислоты, а также относится к встречающимся в природе аминокислотным полимерам и не встречающимся в природе аминокислотным полимерам. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты, и в него могут быть встроены неаминокислоты. Термины также обозначают аминокислотный полимер, который модифицирован естественным образом или при вмешательстве, например, образованием дисульфидной связи, гликозилированием, липидизацией, ацетилированием, фосфорилированием или любой другой манипуляцией или модификацией, такой как конъюгация с меченым компонентом. Под определение подпадают также, например, полипептиды, содержащие один или несколько аналогов аминокислот (включая, например, не встречающиеся в природе аминокислоты и так далее), а также другие модификации, известные специалистам в данной области техники. Понятно, что, поскольку полипептиды этого изобретения основаны, по меньшей мере частично, на антителах, в определенных вариантах воплощения полипептиды могут встречаться в виде одиночных цепей или связанных цепей.
[0073] Термин "аминокислота" обозначает встречающиеся в природе и синтетические аминокислоты, а также аналоги аминокислот и миметики аминокислот, которые функционируют так же, как и встречающиеся в природе аминокислоты. Встречающиеся в природе аминокислоты - это те аминокислоты, которые кодируются генетическим кодом, а также те аминокислоты, которые затем модифицируются, например, гидроксипролином, гамма-карбоксиглутаматом и O-фосфосерином. Аналогами аминокислот называются вещества, которые имеют ту же основную химическую структуру, что и встречающиеся в природе аминокислоты, например, альфакарбон, который связан с водородом, карбоксильной группой, аминогруппой и R-группой, например, гомосерином, норлейцином, метионин сульфоксидом, метионин метилсульфонием. Такие аналоги могут иметь модифицированные R-группы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные основные цепи, но у них сохраняется та же основная химическая структура, что и у встречающихся в природе аминокислот. Миметиком аминокислот называются химические вещества, которые имеют структуру, отличную от общей для аминокислот химической структуры, но функционируют так же, как и встречающиеся в природе аминокислоты.
[0074] Если полипептид или другое средство "специфически связывается" с белком, это означает, что полипептид или другое средство реагирует или соединяется с белком более часто, более быстро, с большей длительностью, с большей аффинностью или с определенными комбинациями вышеперечисленного, чем альтернативные вещества, включая неродственные белки. В некоторых вариантах воплощения "специфически связывается" означает, например, что средство связывается с белком с Ко примерно 0,1 мМ или менее, но обычно менее чем примерно 1 мкМ. В некоторых вариантах воплощения "специфически связывается" означает, что средство связывается с белком в некоторых случаях с Кр не более чем примерно 0,1 мкМ, не более чем примерно 0,01 мкМ, а в других случаях - не более чем примерно 1 нМ. Поскольку последовательность гомологичных белков у различных видов одинакова, специфическое связывание может включать средство, которое распознает определенный белок, такой как Wnt-белок, у более чем одного вида. Подобным образом, поскольку различные Wnt-белки гомологичны в определенных участках последовательностей Wnt, специфическое связывание может включать полипептид (или другое средство), который распознает несколько Wnt-белков. Следует понимать, что средство, которое специфически связывается с первой мишенью, может или не может специфически связываться со второй мишенью. Таким образом, "специфическое связывание" не обязательно требует (хотя может включать) эксклюзивного связывания, т.е. связывания с одной мишенью. Так, в определенных вариантах воплощения средство может специфически связываться с более чем одной мишенью (например, со множеством различных Wnt человека). Обычно, но не обязательно, обозначение «связывание» означает специфическое связывание.
[0075] Термины "совпадающий" или "процент совпадения" в контексте двух или нескольких нуклеиновых кислот или полипептидов обозначает две или более последовательностей или подпоследовательностей, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент нуклеотидных или аминокислотных остатков, которые являются одинаковыми, при сравнении и выпрямлении (вставляя гэпы, если необходимо) для максимального соответствия, не рассматривая любые консервативные аминокислотные замены как часть совпадающей последовательности. Процент совпадения может быть подсчитан с использованием программы сравнения последовательностей или алгоритмов или путем визуальной инспекции. Различные алгоритмы и программы, которые могут быть использованы для получения выровненных аминокислотных или нуклеотидных последовательностей, известны специалистам в данной области техники. Одним таким неограничивающим примером алгоритма выравнивания последовательности является алгоритм, описанный Karlin et al, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2264-2268, модифицированный в Karlin et al., 1993, PNAS, 90:5873-5877 и включенный в NBLAST и XBLAST программы (Altschul et al., 1991, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402). Дополнительные публичные доступные программы, которые можно использовать для выравнивания последовательностей, включают, но не ограничиваются этим, Gapped BLAST, BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266:460-480), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, Южный Сан-Франциско, Калифорния), Megalign (DNASTAR), и программу Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Версия 8 для Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Мэдисон, WI 53711).
[0076] В некоторых вариантах воплощения, если две нуклеиновые кислоты или полипептиды изобретения в значительной степени совпадают, это означает, что они обладают по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, а в некоторых вариантах воплощения - по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% совпадающими нуклеотидными или аминокислотными остатками при сравнении и выпрямлении для максимального соответствия, как подсчитано с использованием алгоритма сравнения последовательностей или путем визуальной инспекции. В некоторых вариантах воплощения совпадение имеется в участке последовательностей, который имеет по меньшей мере примерно 10, по меньшей мере примерно 20, по меньшей мере примерно 40-60, по меньшей мере примерно 60-80 остатков в длину или любой существенный объем между указанными. В некоторых вариантах воплощения совпадение существует на участке более длинном, чем 60-80 остатков, таком как по меньшей мере 90-100 остатков. В некоторых вариантах воплощения последовательности в значительной степени совпадают по всей длине сравниваемых последовательностей, таких как кодирующий участок нуклеотидной последовательности.
[0077] "Консервативное аминокислотное замещение" означает, что один аминокислотный остаток замещается другим аминокислотным остатком, имеющим такую же боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющие одинаковые боковые цепи, определены специалистами в данной области техники, включая основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотообразующие боковые цепи (например, аспаргиновую кислоту, глутаминовую кислоту), незаряженные поляризованные боковые цепи (например, глицин, аспаргин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин), неполяризованные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Например, замена фенилаланина на тирозин является консервативной заменой. Предпочительно консервативные замены в последовательностях полипептидов и других средств изобретения не исключают связывание полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, с мишенью(ями), то есть с одним или более Wnt, с которыми связывается полипептид или другое средство. Способы идентификации консервативных замен нуклеотидов и аминокислот, которые не мешают связыванию с мишенью, хорошо известны специалистам в данной области техники (см., например, Brummell et al., 1993, Biochem., 32: 1180-87; Kobayashi et al., 1999, Protein Eng. 12:879-84; и Burks et al., 1997, PNAS, 94:412-17).
[0078] При использовании здесь "примерно" обозначает плюс или минус 10% от указанного числа. Например, "примерно 10%" обозначает диапазон от 9% до 11%.
[0079] При использовании в настоящем раскрытии и формуле форма единственного числа включает множественное число, если в контексте явно не указано другое.
[0080] Следует понимать, что если одни варианты воплощения изобретения описываются здесь словом "включает", допустимо также, что другие аналогичные варианты воплощения изобретения описываются термином "содержит" и/или "обязательно содержит".
[0081] Термин "и/или" при использовании здесь в такой фразе как "А и/или В" подразумевает включение как А, так и В; А или В; А (единственно) и В (единственно). Подобным образом подразумевается, что термин "и/или" при использовании в такой фразе как "А, В и/или С" охватывает каждое из следующих воплощений изобретения: А, В и С; А, В или С; А или С; А или В; В или С; А и С; А и В; В и С; А (единственно), В (единственно) и С (единственно).
II. Wnt-связывающие средства
[0082] Настоящее изобретение предоставляет средства, которые связываются (например, специфически связываются) с одним или несколькими Wnt-белками человека. Эти средства обозначаются здесь как "Wnt-связывающее(ие) средство(а)." В некоторых вариантах воплощения изобретения средства специфически связываются с одним, двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью, семью, восемью, девятью, десятью или более Wnt-белков. В качестве неограничивающего примера, Wnt-связывающее средство может связываться с Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt10a и/или Wnt10b. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство связывает Wnt1, Wnt2, Wnt3, Wnt3a и Wnt7b.
[0083] В некоторых вариантах воплощения изобретения Wnt-связывающее средство является Wnt-антагонистом. В некоторых вариантах воплощения средство подавляет передачу сигнала через Wnt. В некоторых вариантах воплощения средство подавляет канонический Wnt-сигналинг.
[0084] В некоторых вариантах воплощения изобретения Wnt-связывающее средство является полипептидом. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство является растворимым рецептором.
[0085] В некоторых вариантах воплощения изобретения Wnt-связывающее средство содержит внеклеточный домен FZD рецептора. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит Fri домен FZD рецептора. В некоторых вариантах воплощения FZD рецептор является FZD рецептором человека. В некоторых вариантах воплощения FZD рецептор человека является FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9 или FZD10. В некоторых альтернативных вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит часть SFRP. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит Fri домен SFRP. В некоторых вариантах воплощения SFRP является SFRP человека. В некоторых вариантах воплощения SFRP человека является SFRP1, SFRP2, SFRP3, SFRP4 или SFRP5. В других альтернативных вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит внеклеточный домен Ror белка. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит Fri домен Ror белка. В некоторых вариантах воплощения Ror является Ror человека. В некоторых вариантах воплощения Ror человека является Rorl или Ror2.
[0086] В некоторых вариантах воплощения изобретения Wnt-связывающее средство является растворимым рецептором. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство является растворимым белком. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство является растворимым FZD рецептором. Неограничивающие примеры растворимых FZD рецепторов можно найти в Патенте США №7723477, который включен в описание во всей полноте посредством ссылки. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство является растворимым SFRP или растворимым Ror рецептором.
[0087] Fri домен FZD1 включает приближенно аминокислоты 87-237 последовательности SEQ ID NO:27. Fri домен FZD2 включает приближенно аминокислоты 24-159 последовательности SEQ ID NO:28. Fri домен FZD3 включает приближенно аминокислоты 23-143 последовательности SEQ ID NO:29. Fri домен FZD4 включает приближенно аминокислоты 40-170 последовательности SEQ ID NO:22, Fri домен FZD5 включает приближенно аминокислоты 27-157 последовательности SEQ ID NO:23. Fri домен FZD6 включает приближенно аминокислоты 19-146 последовательности SEQ ID NO:24. Fri домен FZD7 включает приближенно аминокислоты 33-170 последовательности SEQ ID NO:25. Fri домен FZD8 включает приближенно аминокислоты 28-158 последовательности SEQ ID NO:30. Fri домен FZD9 включает приближенно аминокислоты 23-159 последовательности SEQ ID NO:31. Fri домен FZD 10 включает приближенно аминокислоты 21-154 последовательности SEQ ID NO:26. Соответствующие прогнозируемые Fri домены для каждого из FZD рецепторов человека предоставляются как SEQ ID №:32-41. Минимальные основные последовательности Fri доменов для каждого из человеческих FZD рецепторов (FZD 1-10) предоставляются как SEQ ID №:3-12. Минимальные основные последовательности Fri доменов для каждого из SFRP (SFRP 1-5) предоставляются как SEQ ID №: 13-17. Минимальные основные последовательности Fri доменов для Ror1 и Ror2 человека предоставляются как SEQ ID №:58 и SEQ ID №:59. Специалисты в данной области техники могут иметь различные представления о том, какие именно аминокислоты соответствуют различным Fri доменам. Таким образом, N-концы или С-концы доменов описаны выше и здесь могут быть длиннее или короче на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или даже 10 аминокислот.
[0088] В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит Fri домен FZD рецептора человека или фрагмент, или вариант Fri домена, который связывается с одним или более Wnt-белками человека. В некоторых вариантах воплощения FZD рецептор человека представляет собой FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9 или FZD10. В некоторых вариантах воплощения FZD рецептор человека представляет собой FZD4. В некоторых альтернативных вариантах воплощения FZD рецептор человека представляет собой FZD5. В некоторых дополнительных альтернативных вариантах воплощения FZD рецептор человека представляет собой FZD8. В некоторых вариантах воплощения FZD является FZD4, a Wnt-связывающее средство содержит SEQ ID №:6 или содержит приближенно аминокислоты с 40 по 170 последовательности SEQ ID NO:19. В некоторых вариантах воплощения FZD является FZD5, а Wnt-связывающее средство содержит SEQ ID №:7 или содержит приближенно аминокислоты 27-157 последовательности SEQ ID NO:20. В некоторых вариантах воплощения FZD является FZD7, а Wnt-связывающее средство содержит SEQ ID №:9 или содержит приближенно аминокислоты от 33 до 170 последовательности SEQ ID NO:25. В некоторых вариантах воплощения FZD является FZD8, а Wnt-связывающее средство содержит SEQ ID №:10 или содержит приближенно аминокислоты 28-158 последовательности SEQ ID NO:21. В некоторых вариантах воплощения FZD является FZD10, а Wnt-связывающее средство содержит SEQ ID №:12 или содержит приближенно аминокислоты 21-154 последовательности SEQ ID NO:26.
[0089] В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит минимальную последовательность Fri домена, выбранную из группы, состоящей последовательности SEQ ID NO:3-12. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит минимальную последовательность Fri домена, выбранную из группы, состоящей последовательности SEQ ID NO:13-17. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит минимальную последовательность Fri домена, выбранную из группы, состоящей последовательности SEQ ID NO:58 и SEQ ID №:59.
[0090] В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит вариант любой из вышеупомянутых последовательностей FZD Fri доменов, которая содержит одну или более (например, одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять и так далее) консервативных замен и способна связывать Wnt.
[0091] В некоторых альтернативных вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит Fri домен человеческого SFRP или фрагмент, или вариант такого Fri домена, который связывает один или более Wnt-белков человека. Например, в некоторых вариантах воплощения средство содержит минимальную последовательность SFRP Fri домена, выбранную из группы, состоящей последовательности SEQ ID NO:13-17. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит вариант любой из вышеупомянутых последовательностей SFRP Fri домена, которая содержит одну или более (например, одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять и так далее) консервативных замен и обладает способностью связывать Wnt.
[0092] В некоторых альтернативных вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит Fri домен Ror белка человека или фрагмент, или вариант такого Fri домена, который связывает один или более Wnt-белков человека. Например, в некоторых вариантах воплощения средство содержит минимальную последовательность Ror Fri домена, выбранную из группы, состоящей последовательности SEQ ID NO:58 и SEQ ID №:59. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит любую из вышеупомянутых последовательностей Ror Fri домена, которая содержит одну или более (например, одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять и так далее) консервативных последовательностей и способна связывать Wnt.
[0093] В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство, такое как средство, содержащее минимальный Fri домен FZD рецептора человека или другого растворимого FZD рецептора, также содержит участок Fc человека (например, человеческий IgG1 Fc участок). Fc участок может быть получен из любого класса иммуноглобулинов, IgG, IgA, IgM, IgD и IgE. В некоторых вариантах воплощения Fc участок является Fc участком дикого типа. В некоторых вариантах воплощения Fc участок является мутировавшим Fc участком. В некоторых вариантах воплощения Fc участок усечен на N-конце на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот (например, в шарнирном домене). В некоторых вариантах воплощения аминокислота в шарнирном домене заменена для того, чтобы помешать образованию нежелательной дисульфидной связи. В некоторых вариантах воплощения цитозин замещен серином, чтобы помешать образованию нежелательной дисульфидной связи. В некоторых вариантах воплощения Fc участок содержит или состоит последовательности SEQ ID NO:18, SEQ ID №:42 или SEQ ID №:43.
[0094] В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство является гибридным белком, содержащим по меньшей мере минимальный Fri домен FZD рецептора, SFRP или Ror белок и Fc участок. При использовании здесь "гибридный белок" означает гибридный белок, экспрессируемый молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидные последовательности не менее чем двух генов. В некоторых вариантах воплощения С-конец первого полипептида связан с N-концом Fc участка иммуноглобулина. В некоторых вариантах воплощения первый полипептид (например, FZD Fri домен) напрямую связан с Fc участком (то есть без встроенного пептидного линкера). В некоторых вариантах воплощения первый полипептид связан с Fc участком посредством пептидного линкера.
n
[0095] При использовании здесь термин "линкер" обозначает линкер, вставленный между первым полипептидом (например, FZD компонентом) и вторым полипептидом (например, Fe участком). В некоторых вариантах воплощения линкер является пептидным линкером. Линкеры не должны оказывать неблагоприятное влияние на экспрессию, секрецию или биоактивность полипептида. Линкеры не должны представлять собой антигены и не должны вызывать иммунный ответ. Подходящие для использования линкеры известны специалистам в данной области техники и часто включают смеси глициновых и сериновых остатков, и часто включают стерически незатрудненные аминокислоты. Другие аминокислоты, которые могут быть встроены в подходящие линкеры, включают треониновые и аланиновые остатки. Линкеры могут отличаться по длине, например, 1-50 аминокислот в длину, 1-22 аминокислот в длину, 1-10 аминокислот в длину, 1-5 аминокислот в длину или 1-3 аминокислоты в длину. Линкеры могут включать, но не ограничиваться этим, SerGly, GGSG, GSGS, GGGS, S(GGS), где n равняется 1-7, GRA, poly(Gly), poly(Ala), ESGGGGVT (SEQ ID №:60), LESGGGGVT (SEQ ID №:61), GRAQVT (SEQ ID №:62), WRAQVT (SEQ ID №:63) и ARGRAQVT (SEQ ID №:64). При использовании этого термина здесь линкер представляет собой встраиваемую пептидную последовательность, которая не включает аминокислотные остатки не из С-конца первого полипептида (например, FZD Fri домен), не из N-конца второго полипептида (например, Fc участок).
[0096] FZD рецепторы, SFRP и Ror белки содержат сигнальную последовательность, которая направляет транспорт белков. Сигнальные последовательности (также обозначаемые как сигнальные пептиды или лидерные последовательности) локализуются в N-концах образующихся полипептидов. Их мишенью являются полипептиды эндоплазматического ретикулума, а белки сортируются по их предназначению, например, для внутреннего пространства органелл, для внутренней мембраны, для наружной мембраны клетки или для секреции вне клетки. Большинство сигнальных последовательностей выщепляются из белков сигнальной пептидазой после того как белки транспортируются в цитоплазматический ретикулум. Расщепление сигнальной последовательности из полипептида обычно происходит в специфическом сайте аминокислотной последовательности и зависит от аминокислотных остатков внутри сигнальной последовательности. Хотя обычно существует один специфический сайт расщепления, сигнальной пептидазой может распознаваться и/или использоваться более чем один сайт расщепления, что приводит к негомогенности N-концов полипептида. Например, использование различных сайтов расщепления внутри сигнальной последовательности может приводить к экспрессии полипептида с различными N-терминальными аминокислотами. Соответственно, в некоторых вариантах воплощения полипептиды, как описано здесь, могут содержать смесь полипептидов с различными N-концами. В некоторых вариантах воплощения N-конец отличается по длине на 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот. В некоторых вариантах воплощения полипептид в значительной степени гомогенен, то есть полипептиды имеют одинаковые N-концы. В некоторых вариантах воплощения сигнальная последовательность полипептида содержит одну или более (например, одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять и так далее) аминокислотных замен и/или делеций. В некоторых вариантах воплощения сигнальная последовательность полипептида содержит аминокислотные замены и/или делеций, которые позволяют одному сайту расщепления быть доминантным, тем самым приводя к значительно гомогенным пептидам с одним N-концом. В некоторых вариантах воплощения сигнальная последовательность представляет собой SEQ ID №:67 (аминокислоты 1-27 последовательности SEQ ID NO:30). В некоторых вариантах воплощения аминокислоты 25 и/или 26 последовательности SEQ ID NO:67 заменены другими аминокислотами. В некоторых вариантах воплощения аминокислоты 17, 18, 19, 23, 24, 25 и/или 26 последовательности SEQ ID NO:67 заменены другими аминокислотами. В некоторых вариантах воплощения аминокислоты 17, 23, 24, 25 и 26 последовательности SEQ ID NO:67 заменены другими аминокислотами. В некоторых вариантах воплощения аминокислота 17 последовательности SEQ ID NO:67 заменена фенилаланином или лейцином. В некоторых вариантах воплощения аминокислота 23 последовательности SEQ ID NO:67 заменена пролином. В некоторых вариантах воплощения аминокислота 24 последовательности SEQ ID NO:67 заменена изолейцином или фенилаланином. В некоторых вариантах воплощения аминокислота 25 последовательности SEQ ID NO:67 заменена валином, изолейцином или аланином. В некоторых вариантах воплощения аминокислота 26 последовательности SEQ ID NO:67 заменена гистидином или тирозином. В некоторых вариантах воплощения аминокислота 25 последовательности SEQ ID NO:67 заменена валином. В некоторых вариантах воплощения аминокислота 26 последовательности SEQ ID NO:67 заменена лейцином. В некоторых вариантах воплощения сигнальная последовательность из полипептида содержит или состоит из последовательности, выбранной из группы, перечисленной в Таблице 1.
Таблица 1
MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGAAA
SEQ ID №:67
MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGALA
SEQ ID №:68
MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGVLA
SEQ ID №:69
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPIVHA
SEQ ID №:70
MEWGYLLEVTSLLAALFLLQRSPIVHA
SEQ ID №71
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPFVHA
SEQ ID №:72
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPIIYA
SEQ ID №:73
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPIAHA
SEQ ID №:74
[0097] В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит первый полипептид, содержащий компонент FZD домена и Fc участок. В некоторых вариантах воплощения компонент FZD домена происходит из FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9 или FZD 10. В некоторых вариантах воплощения Fc участок происходит из IgG1 иммуноглобулина. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит (а) первый полипептид, обязательно содержащий аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из: от X1 до Y1 последовательности SEQ ID NO:27, от Х2 до Y2 последовательности SEQ ID NO:28, от Х3 до Y3 последовательности SEQ ID NO:29, от Х4 до Y4 последовательности SEQ ID NO:22, от Х5 до Y5 последовательности SEQ ID NO:23, от Х6 до Y6 последовательности SEQ ID NO:24, от Х7 до Y7 последовательности SEQ ID NO:25, от Х8 до Y8 последовательности SEQ ID NO:30, от Х9 до Y9 последовательности SEQ ID NO:31 и от Х10 до Y10 последовательности SEQ ID NO:26; и (б) второй полипептид, обязательно содержащий аминокислоты от А до В последовательности SEQ ID NO:43;
где X1 = аминокислота 69, 70, 71,72, 73, 74, 75 или 76
Y1 = аминокислота 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242 или 243
Х2 = аминокислота 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28
Y2 = аминокислота 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170,171 или 172
Х3 = аминокислота 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25
Y3 = аминокислота 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148 или 149
Х4 = аминокислота 38, 39, 40, 41 или 42
Y4 = аминокислота 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 или 176
Х5 = аминокислота 25, 26, 27, 28 или 29
Y5 = аминокислота 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163 или 164
Х6 = аминокислота 19, 20, 21, 22, 23 или 24
Y6 = аминокислота 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151 или 152
Х7 = аминокислота 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 или 34
Y7 = аминокислота 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185 или 186
Х8 = аминокислота 25, 26, 27, 28, 29, 30 или 31
Y8 = аминокислота 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163 или 164
Х9 = аминокислота 21, 22, 23 или 24
Y9 = аминокислота 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145 или 146
Х10 = аминокислота 20, 21, 22, 23, 24 или 25
Y10 = аминокислота 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 или 160
А = аминокислота 1, 2, 3, 4, 5 или 6
В = аминокислота 231 или 232.
В некоторых вариантах воплощения первый полипептид напрямую связан со вторым полипептидом. В некоторых вариантах воплощения первый полипептид связан со вторым полипептидом посредством пептидного линкера. В некоторых вариантах воплощения первый полипептид связан со вторым полипептидом посредством пептидного линкера. Полипептид (например, первый или второй полипептид), который "обязательно содержит" определенные аминокислоты, может, в некоторых вариантах воплощения, включать одну или более (например, одну, две, три, четыре или более) дополнительных аминокислот на одном или обоих концах, так, чтобы дополнительные аминокислоты не оказывали ощутимого влияния на функцию Wnt-связывающего средства.
[0098] В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит: (а) первый полипептид, состоящий по существу из аминокислот от Х до Y последовательности SEQ ID NO:30; и (б) второй полипептид, состоящий по существу из аминокислот от А до В последовательности SEQ ID NO:43; при этом первый полипептид непосредственно связан со вторым полипептидом, и при этом:
Х = аминокислота 25, 26, 27, 28, 29, 30 или 31
Y = аминокислота 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163 или 164
А = аминокислота 1, 2, 3, 4, 5 или 6
В = аминокислота 231 или 232.
В некоторых вариантах воплощения изобретения первый полипептид состоит по существу из аминокислот 25-158 последовательности SEQ ID NO:30. В других вариантах воплощения первый полипептид состоит из аминокислот 25-158 последовательности SEQ ID NO:30. В некоторых вариантах воплощения первый полипептид состоит по существу из аминокислот 28-158 последовательности SEQ ID NO:30. В других вариантах воплощения первый полипептид состоит из аминокислот 28-158 последовательности SEQ ID NO:30. В некоторых вариантах воплощения первый полипептид состоит из аминокислот 31-158 последовательности SEQ ID NO:30. В некоторых вариантах воплощения второй полипептид состоит из аминокислот 1-232 последовательности SEQ ID NO:43. В некоторых вариантах воплощения второй полипептид состоит из аминокислот 3-232 последовательности SEQ ID NO:43. В некоторых вариантах воплощения второй полипептид состоит из аминокислот 6-232 последовательности SEQ ID NO:43. В некоторых вариантах воплощения первый полипептид является SEQ ID №:39, а второй полипептид является SEQ ID №:43. В некоторых вариантах воплощения первый полипептид является SEQ ID №:39, а второй полипептид является SEQ ID №:42. В некоторых вариантах воплощения первый полипептид является SEQ ID №:39, а второй полипептид является SEQ ID №:18.
[0099] В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство является полипептидом, содержащим первый полипептид и второй полипептид, где полипептиды выбраны из Таблицы 2.
Таблица 2
Первый полипептид
Второй полипептид
Аминокислоты 25-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 1-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 1-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-158 последовательности SEQ ID
Аминокислоты 2-232 последовательности SEQ ID
NO:30
NO:43
Аминокислоты 25-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 2-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 3-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 3-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 4-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 4-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 5-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 5-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 6-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 6-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 1-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 1-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 2-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 2-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 3-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 3-231 последовательности SEQ IDNO:43
Аминокислоты 26-158 последовательности SEQ ID
Аминокислоты 4-232 последовательности SEQ ID
NO:30
NO:43
Аминокислоты 26-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 4-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 5-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 5-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 6-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 6-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 1-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 1-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 2-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 2-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 3-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 3-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 4-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 4-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 5-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 5-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-158 последовательности SEQ ID
Аминокислоты 6-232 последовательности SEQ ID
NO:30
NO:43
Аминокислоты 27-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 6-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 1-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 1-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 2-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 2-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 3-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 3-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 4-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 4-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 5-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 5-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 6-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-158 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 6-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 1-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 1-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-161 последовательности SEQ ID
Аминокислоты 2-232 последовательности SEQ ID
NO:30
NO:43
Аминокислоты 25-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 2-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 3-232 последовательности SEQ IDNO:43
Аминокислоты 25-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 3-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 4-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 4-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 5-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 5-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 6-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 6-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 1-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 1-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 2-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 2-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 3-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 3-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-161 последовательности SEQ ID
Аминокислоты 4-232 последовательности SEQ ID
NO:30
NO:43
Аминокислоты 26-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 4-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 5-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 5-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 6-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 6-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 1-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 1-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 2-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 2-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 3-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 3-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 4-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 4-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 5-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 5-231. последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-161 последовательности SEQ ID
Аминокислоты 6-232 последовательности SEQ ID
NO:30
NO:43
Аминокислоты 27-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 6-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 1-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 1-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 2-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 2-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 3-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 3-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 4-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 4-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 5-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 5-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 6-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-161 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 6-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 1-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 1 -231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-164 последовательности SEQ ID
Аминокислоты 2-232 последовательности SEQ ID
NO:30
NO:43
Аминокислоты 25-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 2-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 3-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 3-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 4-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 4-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 5-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 5-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 6-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 25-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 6-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 1-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 1-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 2-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 2-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 3-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 3-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-164 последовательности SEQ ID
Аминокислоты 4-232 последовательности SEQ ID
NO:30
NO:43
Аминокислоты 26-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 4-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 5-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 5-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 6-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 26-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 6-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 1-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 1-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 2-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 2 7-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 2-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 3-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 3-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 4-232 последовательности SEQ IDNO:43
Аминокислоты 27-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 4-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 5-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 5-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 27-164 последовательности SEQ ID
Аминокислоты 6-232 последовательности SEQ ID
NO:30
NO:43
Аминокислоты 27-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 6-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 1-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 2 8-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 1-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 2-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 2-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 3-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 3-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 4-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 2 8-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 4-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 5-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 5-231 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 6-232 последовательности SEQ ID NO:43
Аминокислоты 28-164 последовательности SEQ ID NO:30
Аминокислоты 6-231 последовательности SEQ ID NO:43
[00100] В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID №:1, SEQ ID №:45, SEQ ID №:46, SEQ ID №:47, SEQ ID №:48, SEQ ID №:49, SEQ ID №:50, SEQ ID №:51, SEQ ID №:53, SEQ ID №:54, SEQ ID №:55, SEQ ID №:65 и SEQ ID №:66.
[00101] В некоторых вариантах воплощения изобретения Wnt-связывающее средство содержит последовательность SEQ ID №:1. В некоторых альтернативных вариантах воплощения средство содержит последовательность SEQ ID №:1, включающую одну или более (например, одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять и т.д.) равноценных замен. В некоторых вариантах воплощения средство содержит последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 90%, примерно 95% или примерно 98% совпадения с SEQ ID №:1. В некоторых вариантах воплощения модификации SEQ ID №:1 сохраняют способность связывать один или несколько Wnt человека.
[00102] В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит последовательность SEQ ID №:46. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство представляет собой SEQ ID №:46. В некоторых альтернативных вариантах воплощения средство содержит последовательность SEQ ID №:46, включающую одну или более (например, одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять и т.д.) равноценных замен. В некоторых вариантах воплощения средство содержит последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 90%, примерно 95% или примерно 98% совпадения с SEQ ID №:46. В некоторых вариантах воплощения модификации SEQ ID №:46 сохраняют способность связывать один или более Wnt человека.
[00103] В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит последовательность SEQ ID №:48. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство представляет собой SEQ ID №:48. В некоторых альтернативных вариантах воплощения средство содержит последовательность SEQ ID №:48, включающую одну или более (например, одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять и т.д.) равноценных замен. В некоторых вариантах воплощения средство содержит последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 90%, примерно 95% или примерно 98% совпадения с SEQ ID №:48. В некоторых вариантах воплощения модификации SEQ ID №:48 сохраняют способность связывать один или более Wnt человека.
[00104] В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит последовательность SEQ ID №:50. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство представляет собой SEQ ID №:50. В некоторых альтернативных вариантах воплощения средство содержит последовательность SEQ ID №:50, включающую одну или более (например, одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять и т.д.) равноценных замен. В некоторых вариантах воплощения средство содержит последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 90%, примерно 95% или примерно 98% совпадения с SEQ ID №:50. В некоторых вариантах воплощения модификации SEQ ID №:50 сохраняют способность связывать один или более Wnt человека.
[00105] В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит последовательность SEQ ID №:53. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство представляет собой SEQ ID №:53. В некоторых альтернативных вариантах воплощения средство содержит последовательность SEQ ID №:53, включающую одну или более (например, одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять и т.д.) равноценных замен. В некоторых вариантах воплощения средство содержит последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 90%, примерно 95% или примерно 98% совпадения с SEQ ID №:53. В некоторых вариантах воплощения модификации SEQ ID №:53 сохраняют способность связывать один или более Wnt человека.
[00106] В некоторых вариантах воплощения описанные здесь Wnt-связывающие средства подавляют рост опухоли или опухолевых клеток. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающие средства вызывают диффенцировку клеток опухоли. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающие средства вызывают экспрессию маркеров дифференцировки в опухоли или опухолевой клетке. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающие средства снижают концентрацию раковых стволовых клеток в опухоли. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающий агент, содержащий SEQ ID №:46, замедляет развитие опухоли в большей степени, чем Wnt-связывающий агент, содержащий SEQ ID №:1. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающий агент, содержащий SEQ ID №:48, замедляет развитие опухоли в большей степени, чем Wnt-связывающий агент, содержащий SEQ ID №:1. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающий агент, содержащий SEQ ID №:50, замедляет развитие опухоли в большей степени, чем Wnt-связывающий агент, содержащий SEQ ID №:1. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающий агент, содержащий SEQ ID №:53, замедляет развитие опухоли в большей степени, чем Wnt-связывающий агент, содержащий SEQ ID №:1. В некоторых вариантах воплощения описанное здесь Wnt-связывающее средство замедляет развитие опухоли в большей степени, чем Wnt-связывающий агент, содержащий компонент домена FZD, домен Fc и компонент-линкер, соединяющий компонент домена FZD и домен Fc. В некоторых вариантах воплощения линкерный компонент представляет собой встроенный пептидный линкер.
[00107] В некоторых вариантах воплощения описанные здесь Wnt-связывающие средства тормозят развитие Wnt-зависимой опухоли. В некоторых вариантах воплощения опухоль представляет собой опухоль, выбранную из группы, состоящей из: колоректальной опухоли, опухоли ободочной кишки, опухоли поджелудочной железы, опухоли легких, опухоли яичников, опухоли печени, опухоли молочной железы, опухоли почки, опухоли простаты, опухоли ЖКТ, меланомы, опухоли шейки матки, опухоли мочевого пузыря, полиморфной глиомы и опухоли головы и щей. В некоторых вариантах воплощения опухоль представляет собой колоректальную опухоль. В некоторых вариантах воплощения опухоль представляет собой опухоль поджелудочной железы. В некоторых вариантах воплощения опухоль представляет собой опухоль молочной железы.
[00108] В некоторых вариантах воплощения изобретения представлен полипептид, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID №:1, SEQ ID №:45, SEQ ID №:46, SEQ ID №:47, SEQ ID №:48, SEQ ID №:49, SEQ ID №:50, SEQ ID №:51, SEQ ID №:53, SEQ ID №:54, SEQ ID №:55, SEQ ID №:65 и SEQ ID №:66. В некоторых вариантах воплощения полипептид содержит последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID №:1, SEQ ID №:46, SEQ ID №:48, SEQ ID №:50 и SEQ ID №:53. В некоторых вариантах воплощения полипептид состоит из последовательности аминокислот, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID №:1, SEQ ID №:46, SEQ ID №:48, SEQ ID №:50 и SEQ ID №:53. В некоторых вариантах воплощения полипептид содержит последовательность аминокислот SEQ ID №:50. В некоторых вариантах воплощения полипептид представляет собой SEQ ID №:50. В некоторых вариантах воплощения полипептид содержит последовательность аминокислот SEQ ID №:53. В некоторых вариантах воплощения полипептид представляет собой SEQ ID №:53.
[00109] В некоторых вариантах воплощения полипептид (до расщепления сигнальной последовательности) содержит SEQ ID №:50 и сигнальную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID №:67, SEQ ID №:68, SEQ ID №:69, SEQ ID №:70, SEQ ID №:71, SEQ ID №:72, SEQ ID №:73 и SEQ ID №:74. В некоторых вариантах воплощения полипептид (до расщепления сигнальной последовательности) содержит SEQ ID №:50 и сигнальную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID №:70, SEQ ID №:71, SEQ ID №:72, SEQ ID №:73 и SEQ ID №:74. В некоторых вариантах воплощения полипептид (до расщепления сигнальной последовательности) содержит SEQ ID №:53 и сигнальную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID №:67, SEQ ID №:68, SEQ ID №:69, SEQ ID №:70, SEQ ID №:71, SEQ ID №:72, SEQ ID №:73 и SEQ ID №:74. В некоторых вариантах воплощения полипептид (до расщепления сигнальной последовательности) содержит SEQ ID №:53 и сигнальную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID №:70, SEQ ID №:71, SEQ ID №;72, SEQ ID №:73 и SEQ ID №:74. В некоторых вариантах воплощения полипептид содержит SEQ ID №:71 и SEQ ID №:50. В некоторых вариантах воплощения полипептид содержит SEQ ID №:71 и SEQ ID №:53. В некоторых вариантах воплощения полипептид содержит SEQ ID №:75. В некоторых вариантах воплощения полипептид состоит в основном последовательности SEQ ID NO: 75.
[00110] В некоторых вариантах воплощения полипептид представляет собой в значительной степени очищенный полипептид, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID №:1, SEQ ID №:46, SEQ ID №:48, SEQ ID №:50 и SEQ ID №:53. В некоторых вариантах воплощения значительно очищенный полипептид по меньшей мере на 90% состоит из полипептида, имеющего N-терминальную последовательность ASA. В некоторых вариантах воплощения незрелый полипептид содержит сигнальную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID №:67-74. В некоторых вариантах воплощения незрелый полипептид содержит сигнальную последовательность SEQ ID №:71. В некоторых вариантах воплощения незрелый полипептид содержит сигнальную последовательность, производящую в значительной степени однородный полипептидный продукт с одной N-терминальной последовательностью.
[00111] В некоторых альтернативных вариантах воплощения средство не содержит домена Fri рецептора FZD.
[00112] В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство является антителом (например, антителом, связывающимся с одним или более Wnt-белками).
[00113] В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит участок Fc иммуноглобулина. Специалисты в данной области техники поймут, что связывающие агенты настоящего изобретения будут содержать гибридные белки, в которых по меньшей мере доля участка Fc была удалена либо изменена, чтобы обеспечить желаемые биохимические характеристики, такие как улучшенная локализация раковых клеток, улучшенное проникновение в опухоль, сокращенный период полувыведения сыворотки или увеличенный период полувыведения сыворотки, по сравнению с гибридным белком примерно той же иммуногенности, содержащим исходный или неизмененный константный участок. Модификации участка Fc могут включать добавления, удаления или замены одной или более аминокислот в одном или более доменах. Описанные здесь модифицированные гибридные белки могут содержать изменения или модификации одного или более из двух константных доменов тяжелой цепи (СН2 или СН3) или шарнирного участка. В других воплощениях весь домен СН2 удален (конструкты АСН2). В некоторых вариантах воплощения удаленный домен константного участка заменен коротким аминокислотным спейсером (например, остатком 10 аа), частично обеспечивающим молекулярную гибкость, обычно создаваемую отсутствием домена константного участка. [00114] В некоторых вариантах воплощения модифицированные гибридные белки разработаны так, чтобы связывать домен СН3 напрямую с шарнирным участком антитела. В других вариантах воплощения пептидный спейсер введен между шарнирным участком и модифицированными доменами СН2 и/или СН3. Например, могут быть экспрессированы конструкты, где домен СН2 был удален, а оставшийся домен СН3 (модифицированный или немодифицированный) присоединен к шарнирному участку при помощи аминокислотного спейсера 5-20. Такой спейсер может быть добавлен, чтобы гарантировать, что регулирующие элементы константного домена останутся свободными и доступными или что шарнирный участок останется гибким. Тем не менее, следует заметить, что аминокислотные спейсеры могут в некоторых случаях оказаться иммуногенными и вызвать нежелательную иммунную реакцию на конструкт. Соответственно, в некоторых воплощениях, любой добавленный в конструкт спейсер будет относительно неиммуногенным, чтобы сохранить желаемые биологические качества модифицированных антител.
[00115] В некоторых вариантах воплощения изобретения модифицированные гибридные белки могут отличаться лишь частичным удалением константного участка или заменой немногих или даже одной аминокислоты. Например, мутации одной аминокислоты в выбранных областях домена СН2 может быть достаточно, чтобы значительно снизить связывание Fc и тем самым повысить локализацию раковых клеток и/или проникновение в опухоль. Подобным образом может быть предпочтительным просто удалить ту долю одного или нескольких доменов константного участка, которая контролирует определенную эффекторную функцию (например, комплементарное связывание C1q), подлежащую модуляции. Такие частичные удаления костантных участков могут улучшить избранные характеристики антитела (например, период полувыведения сыворотки), не затрагивая другие желательные функции, связанные с рассматриваемым доменом константного участка. Более того, как упоминалось выше, константные участки описанных гибридных белков могут быть модифицированы путем мутации или замены одной или более аминокислот, что усиливает параметры готового конструкта. В этом контексте может быть возможным нарушить действие, обеспечиваемое консервативным участком связывания (например, связывание Fc), при этом в значительной степени сохраняя конфигурацию и иммуногенный профиль модифицированного антитела. В некоторых вариантах воплощения модифицированные гибридные белки содержат одну или более аминокислот, добавленных к константному участку, чтобы усилить желаемые характеристики, такие как снижение или повышение эффекторной функции, или обеспечение большего присоединения цитотоксина или углеводорода.
[00116] Специалисты знают, что константный участок управляет несколькими эффекторными функциями. Например, связыванием компонента С1 комплемента с участком Fc антител IgG или IgM (связанных с антигеном) активирует систему комплемента. Активация комплемента важна для опсонизации и лизиса клеточных патогенов. Активация комплемента также стимулирует воспалительную реакцию и может быть связана с автоиммунной гиперчувствительностью. Также участок Fc антитела может связываться с клеткой, экспрессирующей рецептор Fc (FcR). Существует большое число рецепторов Fc, характерных для различных классов антител, в том числе IgG (гамма-рецепторы), IgE (эпсилон-рецепторы), IgA (альфа-рецепторы) и IgM (мю-рецепторы). Связывание антитела с рецепторами Fc на поверхности клетки запускает множество важных и разнообразных биологических реакций, таких как обволакивание и уничтожение частиц, покрытых антителами, клиренс иммунных комплексов, лизис покрытых антителами целевых клеток при помощи фагоцитов (опосредованная антителами клеточная цитотоксичность или ADCC), выброс воспалительных медиаторов, плацентарный перенос и контроль выработки иммуноглобулина.
[00117] В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающие средства обеспечивают видоизмененные эффекторные функции, которые, в свою очередь, влияют на биологические параметры вводимого средства. Например, в некоторых воплощениях удаление либо деактивация (при помощи точечных мутаций либо иных средств) домена константного участка могут понизить связывание рецептора Fc циркулирующего модифицированного средства (например, Wnt-связывающего средства), тем самым улучшая локализацию раковых клеток и/или проникновение в опухоль. В других воплощениях модификации константного участка повышают либо снижают период полувыведения средства из сыворотки. В некоторых вариантах воплощения константный участок модифицирован путем удаления дисульфидных связей или олигозидных групп.
[00118] В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство не обладает одной или несколькими эффекторными функциями, обычно связанными с участком Fc. В некоторых вариантах воплощения средство не обладает ADCC активностью и/или комплементзависимой цитотоксичностью (CDC). В некоторых вариантах воплощения средство не связывается с рецептором Fc и/или комплементными факторами. В некоторых вариантах воплощения у средства нет эффекторной функции.
[00119] В некоторых вариантах воплощения описанные здесь Wnt-связывающие средства модифицированы, чтобы снизить иммуногенность. В целом при использовании этих белков как терапевтических средств иммунные реакции на совершенно нормальные человеческие белки случаются редко. Тем не менее, хотя многие гибридные белки содержат такие же полипептидные последовательности, как и последовательности, встречающиеся в природе, несколько терапевтических гибридных белков оказались иммуногенными для млекопитающих. В некоторых исследованиях гибридный белок, содержащий линкер, оказывался более иммуногенным, чем гибридный белок, несодержащий линкер. Соответственно, в некоторых вариантах воплощения полипептиды данного изобретения проанализированы при помощи способов расчета для прогноза иммуногенности. В некоторых вариантах воплощения полипептиды проанализированы на предмет наличия Т-клеточных и/или В-клеточных антигенных детерминант.Если Т-клеточные или В-клеточные антигенные детерминанты обнаружены и/или спрогнозированы, могут быть выполнены модификации данных участков (например, замены аминокислот), чтобы нарушить или уничтожить антигенные детерминанты. Различные алгоритмы и программное обеспечение, которые можно использовать для прогноза Т-клеточных и/или В-клеточных антигенных детерминант, известны специалистам в данной области техники. Например, компьютерные программы SYFPEITHI, HLA Bind, PEPVAC, RANKPEP, DiscoTope, ElliPro и Antibody Epitope Prediction находятся в свободном доступе.
[00120] В некоторых вариантах воплощения представлена клетка, вырабатывающая любые из описанных здесь Wnt-связывающих средств или полипептидов. В некоторых вариантах воплощения представлен состав, содержащий любые из описанных здесь Wnt-связывающих средств или полипептидов. В некоторых вариантах воплощения состав содержит полипептид, в котором по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% полипептида имеет N-терминальную последовательность ASA. В некоторых вариантах воплощения состав содержит полипептид, в котором 100% полипептида имеет N-терминальную последовательность ASA. В некоторых вариантах воплощения состав содержит полипептид, в котором по меньшей мере 80% полипептида имеет N-терминальную последовательность ASA. В некоторых вариантах воплощения состав содержит полипептид, в котором по меньшей мере 90% полипептида имеет N-терминальную последовательность ASA. В некоторых вариантах воплощения состав содержит полипептид, в котором по меньшей мере 95% полипептида имеет N-терминальную последовательность ASA.
[00121] Полипептиды настоящего изобретения могут быть рекомбинантными полипептидами, природными полипептидами или синтетическими полипептидами. Специалисты в данной области техники поймут, что некоторые аминокислотные последовательности данного изобретения могут варьироваться без значимого влияния на структуру либо функцию белка. При рассмотрении таких отличий в последовательности стоит помнить, что у белка есть ключевые области, предопределяющие его активность. Таким образом, настоящее изобретение также включает вариации полипептида, которые показывают особую активность либо включают участки белков FZD, белков SFRP или белков Ror, такие как обсуждаемые здесь части белков. Такие мутанты включают удаления, инсерции, инверсии, повторы и типичные замены. Как указано ниже, инструкции относительно того, какие изменения аминокислот вероятнее всего окажутся фенотипически непроявлеными, можно найти в Bowie, et al., 1990, Science, 247:1306-10.
[00122] Разумеется, число аминокислотных замен, которые сделает специалист, зависит от многих факторов, включая описанные выше. В некоторых вариантах воплощения число замен для любого данного растворимого рецепторного полипептида не будет превышать 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 5 или 3.
[00123] Фрагменты или доли полипептида настоящего изобретения могут быть задействованы для производства соответствующего полноценного полипептида при помощи пептидного синтеза; следовательно, фрагменты могут быть задействованы как посредники для производства полноценных полипептидов. Эти фрагменты или доли полипептида могут также быть названы "фрагменты белка" или "фрагменты полипептида".
-11
-12
-7
-13
[00124] Фрагмент белка этого изобретения представляет собой долю белка, который способен связываться с одним или несколькими Wnt-белками человека (например, рецептор FZD человека, SFRP либо Ror белок человека), либо целый такой белок. В некоторых вариантах воплощения фрагмент обладает высокой аффинностью к одному или более Wnt-белков человека. Некоторые фрагменты описанных здесь гибридных белков представляют собой фрагменты белка, содержащие по меньшей мере часть внеклеточной доли рецептора FZD, SFRP или внеклеточной доли Ror белка, которая включает связывающий домен, соединенный по меньшей мере с частью константного участка иммуноглобулина (например, участок Fc). Связывающая способность фрагмента белка может находиться в пределах примерно от 10 до 10 М, хотя она может значительно варьироваться у фрагментов различных размеров, в диапазоне от 10 до 10 М. В некоторых вариантах воплощения фрагмент представляет собой примерно от 100 до 200 аминокислот в длину и содержит связывающий домен, соединенный по меньшей мере с частью константного участка иммуноглобулина.
[00125] Wnt-связывающие средства настоящего изобретения могут быть исследованы в отношении специфичности связывания любыми методами, известными специалистам в данной области техники. Иммуноанализы, которые можно использовать, включают, не ограничиваясь этим, сравнительные и несравнительные системы исследования, использующие такие техники как метод BIAcore, метод FACS, иммунофлюоресценция, иммуноцитохимия, вестерн-блоты, радиоиммуноанализы, ELISA, «бутербродные» иммуноанализы, метод иммунопреципитации, реакции преципитации, реакции гель-диффузии, метод иммунодиффузии, метод агглютинации, метод связывания комплемента, метод иммунорадиометрии, флюоресцентный метод и иммуноанализ белка А. Такие методы являются стандартными и хорошо известны специалистам в данной области техники (см., например, Ausubel et. al., eds. 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol.1, John Wiley & Sons, Inc., New York, которая включена в описание во всей полноте посредством ссылки).
[00126] Например, специфичное связывание полипептида с Wnt человека может быть определено с использованием ELISA. Анализ ELISA включает подготовку антигенов, покрытие лунок 96-луночного микропланшета антигеном, добавление полипептида (например, Wnt-связывающего средства), конъюгированного с детектируемым соединением, таким как энзимный субстрат (например, пероксидаза хрена или фалкалин фосфатаза), в лунки, инкубацию в течение определенного периода времени и определение наличия средства. В некоторых вариантах воплощения полипептид (например, Wnt-связывающее средство) не конъюгирован с детектируемым соединением, но вместо этого второе конъюгированное соединение, которое распознает полипептид, добавляется в лунку. В некоторых вариантах воплощения вместо покрытия лунки антигеном полипептид (например, Wnt-связывающее средство) может покрывать лунку, а второе антитело, конъюгированное с детектируемым соединением, может быть добавлено после добавления антигена к покрытой лунке. Специалисту в данной области техники будет хорошо понятно, какие параметры можно модифицировать для усиления детекции сигнала, точно так же, как и другие вариации ELISA, известные в данной области техники (см., например, Ausubel et. al., eds. 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol.1, John Wiley & Sons, Inc., New York 11.2.1).
3
125
[00127] Аффинность средства к Wnt и скорость диссоциации связанного комплекса антиген-антитело можно определить путем сравнительного анализа связывания. Одним примером сравнительного анализа связывания является радиоиммунный анализ, включающий инкубацию с меченым антигеном (например, H или I) или их фрагментом, или вариантом, с интересующим связывающим средством в присутствии увеличивающихся количеств немеченого антигена после детекции антитела, связанного с меченым антигеном. Аффинность связывающего средства к Wnt и скорость диссоциации связывания можно определить по данным анализов распределения Скэтчарда. В некоторых вариантах воплощения BIAcore кинетический анализ используется для определения связывания и скорости диссоциации средства, которое связывается с одним или более Wnt человека. BIAcore кинетический анализ включает анализ связывания и диссоциации антител из чипов с иммобилизованными Wnt антигенами на поверхности.
[00128] В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство связывает по меньшей мере один Wnt с константой диссоциации (Кц) примерно 1 мкМ или меньше, примерно 100 нМ или меньше, примерно 40 нМ или меньше, примерно 20 нМ или меньше или примерно 10 нМ или меньше.
[00129] В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство (например, FZD8-Fc) является антагонистом по меньшей мере одного Wnt (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 Wnt), связывающегося со средством. В некоторых вариантах воплощения средство ингибирует по меньшей мере примерно 10%, по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 75%, по меньшей мере примерно 90% или примерно 100% активности одного или более связанных Wnt человека.
[00130] In vivo или in vitro методы для определения того, ингибирует ли Wnt-связывающее средство (или предполагаемое Wnt-связывающее средство) Wnt-сигналинг, известны специалистам в данной области техники. Например, основанный на клетках метод люциферазного репортера, использующий tcf/luc репортерный вектор, содержащий множественные копии TCF-связанного домена, расположенного выше светящегося гена люциферазного репортера, может быть использован для количественной оценки уровней канонического Передачи сигнала с участием Wnt in vitro (Gazit et. al., 1999, Oncogene 18: 5959-66). Уровень Передачи сигнала с участием Wnt при наличии одного или более Wnt (например, Wnt, экспрессируемого трансфицированными клетками или предоставленного содержащей Wnt средой) в присутствии Wnt-связывающего средства сравнивался с уровнем сигналинга в отсутствие Wnt-связывающего средства. В добавление к методу tcf/luc репортера действие Wnt-связывающего средства (или предполагаемого средства) на канонический Wnt-сигналинг может быть оценено in vitro или in vivo путем количественной оценки действия средства на уровнеь экспрессии генов, регулируемых β-катенином, таких как c-myc (He et. al., Science, 281:1509-12 (1998)), cyclin Dl (Tetsu et al., Nature, 398:422-6 (1999)) и/или фибронектан (Gradi et al. Mol. Cell Biol., 19:5576-87 (1999)). В некоторых вариантах воплощения действие средства на Wnt-сигналинг также может быть определено путем оценки действия средства на фосфорилационный статус Dishevelled-1, Dishevelled-2, Dishevelled-3, LRP5, LRP6 и/или β-катенин.
[00131] Описанные здесь полипептиды могут быть произведены любым подходящим способом, известным специалистам в данной области техники. Такие способы варьируются от способов прямого синтеза белка до создания последовательностей ДНК, кодирующих последовательности полипептида и экспрессии этих последовательностей в подходящем носителе. В некоторых вариантах воплощения последовательность ДНК создана с использованием рекомбинантной технологии путем выделения или синтеза последовательности ДНК, кодирующей целевой белок дикого типа. Необязательно последовательность может быть подвергнута мутагенезу путем сайт-специфического мутагенеза, чтобы обеспечить функциональные аналоги. См., например, Zoeller et al., 1984, PNAS, 81:5662-66 и Патент США №4588585. В некоторых вариантах воплощения последовательность ДНК создана с использованием рекомбинантной технологии путем выделения нескольких последовательностей ДНК, кодирующих два целевых полипептида, и склеивания этих последовательностей ДНК вместе для создания гибридного белка. В некоторых вариантах воплощения слияние двух полипептидов прибавляет дополнительную аминокислоту на скрещении двух полипептидов (т.е. участок слияния последовательностей ДНК). Эти добавочные аминокислоты считаются линкерами. В некоторых вариантах воплощения пептидный линкер введен между двумя полипептидами гибридного белка.
[00132] В некоторых вариантах воплощения последовательность ДНК, кодирующая целевой полипептид, может быть создана путем химического синтеза с использованием олигонуклеотидного синтезатора. Такие олигонуклеотиды могут быть разработаны, опираясь на последовательность аминокислот желаемого полипептида. В некоторых вариантах воплощения олигонуклеотиды разработаны для выбора кодонов, предпочитаемых клеткой-носителем, в которой рекомбинантный целевой полипептид будет производиться. Стандартные способы могут быть применены для синтеза полинуклеотидной последовательности, кодирующей целевой полипептид. Например, целая аминокислотная последовательность может быть использована, чтобы создать «обратно транслируемый» ген. Более того, может быть синтезирован олигомер ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую конкретный полипептид. Например, несколько малых олигонуклеотидов, кодирующих части желаемого полипептида, могут быть синтезированы и затем склеены. Одиночные олигонуклеотиды обычно содержат 5' или 3' «липкие концы» для комплементарной сборки. В некоторых вариантах воплощения нуклеотидная последовательность, кодирующая желаемый гибридный белок синтезирована так, чтобы два полипептида были соединены напрямую без встроенного пептидного линкера.
[00133] После сборки (путем синтеза, сайт-специфического мутагенеза, рекомбинантной технологии или иного способа) полинуклеотидные последовательности, кодирующие конкретный целевой полипептид, могут быть введены в вектор экспрессии и оперативно связаны с последовательностью контроля экспрессии, подходящей для экспрессии полипептида в желаемом носителе. Правильность сборки может быть подтверждена нуклеотидным секвенированием, рестриктазным картированием и/или экспрессией биологически активного полипептида в подходящем носителе. Как хорошо известно в данной области техники, чтобы получить высокий уровень экспрессии трансфицированного гена в носителе, ген должен быть оперативно связан с транскрипционными и трансляционными последовательностями контроля экспрессии, которые функциональны в выбранном носителе экспрессии.
[00134] В некоторых вариантах воплощения рекомбинантные векторы экспрессии используются для усиления и экспрессии ДНК, кодирующей описанные здесь Wnt-связывающие средства и полипептиды. Например, рекомбинантные векторы экспрессии могут являться воспроизводимыми конструктами ДНК, которые обладают синтетическими или кДНК-производными фрагментами ДНК, кодирующими гибридный белок, содержащий домен FZD Fri и участок Fc, оперативно связанными с подходящими транскрипционными или трансляционными регуляторными элементами, произведенными из генов млекопитающих, микробов, вирусов или насекомых. Транскрипционная единица обычно содержит совокупность (1) генетического элемента или элемента, играющего регуляторную роль в генной экспрессии, например, транскрипционные промоторы или энхансеры, (2) структурной или кодирующей последовательности, которая транскрибируется в мРНК и транслируется в белок, и (3) соответствующих транскрипционных и трансляционных инициирующих и терминирующих последовательностей. Регуляторные элементы могут включать последовательность гена-оператора, контролирующего транскрипцию. Дополнительно может быть встроена способность реплицироваться в носителе, обычно обеспечиваемая началом репликации, и выбор гена, облегчающего распознавание трансформантов. ДНК участки "оперативно связаны", если они функционально связаны друг с другом. Например, ДНК для сигнального пептида (секреторная сигнальная последовательность) оперативно связана с ДНК для полипептида, если он экспрессируется как предшественник, который участвует в секреции полипептида; промотор оперативно связан с кодирующей последовательностью, если она контролирует транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосом оперативно связан с кодирующей последовательностью, если она расположена так, чтобы разрешать трансляцию. Обычно оперативно связанный означает смежный и, в случае секреторных лидеров, означает соседний и в рамке считывания. В некоторых вариантах воплощения структурные элементы, предназначенные для использования в дрожжевых системах экспрессии, могут включать лидерные последовательности, делающие возможной внеклеточную секрецию транслируемого белка клетками-носителями. В некоторых вариантах воплощения, где рекомбинантный белок экспрессируется без лидерной или транспортной последовательности, он может включать N-терминальный метиониновый остаток. Этот остаток, необязательно, может быть впоследствии очищен из экспрессируемого рекомбинантного белка для получения конечного продукта.
[00135] Выбор контролирующей экспрессию последовательности и вектора экспрессии зависит от выбора носителя. Может быть задействовано множество экспрессионных комбинаций носитель/вектор. Подходящие векторы экспрессии для эукариотического носителя включают, например, векторы, содержащие контролирующие экспрессию последовательности из SV40, бычьего вируса папилломы, аденовируса и цитомегаловируса. Подходящие векторы экспрессии для бактериального носителя включают известные бактериальные плазмиды, такие как плазмиды из Е. coli, включая pCR1, pBR322, pMB9 и их производные, и широкий спектр носителей векторов, таких как М13 и другие нитевидные одноцепочечные ДНК фаги.
[00136] Подходящие клетки-носители для экспрессии Wnt-связывающего средства включают клетки прокариот, дрожжей, насекомых или высших эукариот под контролем соответствующего промотора. Прокариоты включают грамм-отрицательные или грамм-положительные микроорганизмы, например, Е. coli или Bacilli. Клетки высших эукариот включают стабильные клеточные линии млекопитающих, полученные, как описано ниже. Могут также быть задействованы неклеточные трансляционные системы. Подходящие клонирующие и экспрессионные векторы для использования с носителями - бактериями, грибами, дрожжами и клетками млекопитающих - описаны Pouwels et al., 1985, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., релевантное раскрытие которого включено в описание посредством ссылки.
[00137] Различные системы культивирования клеток млекопитающих или насекомых используются для экспрессии рекомбинантных полипептидов. В некоторых вариантах воплощения предпочтительна экспрессия рекомбинантных белков в клетках млекопитающих, поскольку такие белки обычно правильно уложены, соответствующим образом модифицированы и полностью функциональны. Примеры клеточных линий подходящих носителей включают клеточные линии COS-7 (происходит из почек обезьян), L-929 (происходит из мышиных фибробластов), С127 (происходит из мышиной опухоли), ЗТЗ (происходит из мышиных фибробластов), СНО (происходит из яичника китайского хомячка), HeLa (происходит из рака шейки матки-человека) и ВНК (происходит из фибробластов почек хомячка). Векторы экспрессии млекопитающих могут содержать нетранскрибируемые элементы, такие как начало репликации, соответствующие промотор и энхансер, связанные с экспрессируемым геном, и другие 5'- или 3'-фланкирующие нетранскрибируемые последовательности, и 5'- или 3'-нетранслируемые последовательности, такие как требуемые сайты связывания рибосом, сайт полиаденилирования, сайты донора сплайсируемого фрагмента и акцепторные сайты, а также последовательности терминации транскрипции. Бакуловирусные системы для производства гетерологичных белков в клетках насекомых известны специалистам в данной области техники, а их обзор есть в Luckow и Summers, 1988, Bio/Technology, 6:47.
[00138] Белки, производимые трансформированным носителем, могут быть очищены любым подходящим методом. Такие стандартные методы включают хроматографию (например, ионообменную, аффинную и колоночную хроматографию), центрифугирование, дифференциальную растворимость или любую другую стандартную технологию для очищения белков. Аффинные метки, такие как гексагистидин, связывающий мальтозу домен, последовательность оболочки вируса гриппа и глютатион-S-трансфераза, могут быть присоединены к белку, чтобы дать возможность легкой очистке при прохождении через соответствующую колонку для аффинной хроматографии. Выделенные белки также могут быть физически охарактеризованы с использованием таких техник, как протеолиз, масспектрометрия (МС), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и рентгенокристаллография.
[00139] В некоторых вариантах воплощения супернатанты из систем экспрессии, которые секретируют рекомбинантные белки в культуральной среде, могут быть вначале сконцентрированы с использованием имеющихся в продаже фильтров для концентрации белка, например, Amicon или Millipore Pellicon приспособление для ультрафильтрации. После этапа концентрации к концентрату может быть применена подходящая матрица для очистки. В некоторых вариантах воплощения может использоваться анионообменная смола, например, матрица или субстрат, имеющий концевые группы диэтилминоэтила (DEAE). Матрица может представлять собой акриламид, агарозу, декстран, целлюлозу или другие типы, обычно используемые при очистке белка. В некоторых вариантах воплощения может быть использован катионобменный этап. Подходящие катионные обменники включают различные нерастворимые матрицы, содержащие сульфопропиловые или карбоксиметиловые группы. В некоторых вариантах воплощения может быть использована гидроксиапатитная (СНТ) среда, включая, но не ограничиваясь этим, керамический гидроксиапатит. В некоторых вариантах воплощения есть одна или несколько этапов обратимых фаз ВЭЖХ, использующих гидрофобную среду RP-ВЭЖХ, например, силикагель, имеющий концевые метиловые или другие алифатические группы, может быть использован для дополнительной очистки гибридного белка. Некоторые или все из вышеупомянутых этапов очистки, в различных комбинациях, также могут быть использованы для получения гомогенного рекомбинантного белка.
[00140] В некоторых вариантах воплощения рекомбинантный белок, производимый в бактериальной культуре, может быть выделен, например, путем первичной экстракции из клеточной массы, после одной или нескольких концентраций, высаливания, водного ионного обмена и/или на этапе эксклюзионной хроматографии. ВЭЖХ может быть использована на конечных этапах очистки. Микробные клетки, используемые при экспрессии рекомбинантных белков, могут быть разрушены любым подходящим методом, включая цикл заморозка-оттаивание, разрушение ультразвуком, механическое разрушение или использование лизирующих клетки средств.
[00141] Известные специалистам способы очистки антител и других белков также включают, например, способы, описанные в заявке на Патент США №2008/0312425, 2008/0177048 и 2009/0187005.
st
[00142] Описанные здесь полипептиды могут быть затем модифицированы для включения дополнительных химических компонентов, обычно не являющихся частью белка. Такие производные компоненты могут улучшить растворимость, биологический период полувыведения или абсорбцию белка. Компоненты могут также уменьшать или исключать любые побочные эффекты белков и тому подобное. Обзор таких компонентов можно найти в Remington: Science and Practice of Pharmacy, 21 Edition, University of the Sciences, Philadelphia, 2005.
[00143] Химические компоненты, наиболее подходящие для дериватизации, включают водорастворимые полимеры. Водорастворимый полимер желателен, поскольку белок, к которому он присоединен, не осаждается в водной среде, такой как физиологическая среда. В некоторых вариантах воплощения полимер будет фармацевтически приемлемым для приготовления терапевтического продукта или состава. Специалист в данной области техники сможет выбрать желаемый полимер, основываясь на таких соображениях, как то, будет ли конъюгат полимер/белок использоваться в терапевтических целях, и если будет, - какова желаемая дозировка, время кровообращения, устойчивость к протеолизу и другие условия. Эффективность дериватизации может быть оценена при введении деривата в желаемой форме (например, осмотической помпой или инъекцией, или инфузией, или затем он будет изготовлен для введения орально, пульмонально или другим способом) и определении его эффективности. Подходящие водорастворимые полимеры включают, но не ограничиваются этим, полиэтиленгликоль (PEG), кополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливиниловый пирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, ангидрида этиленовой/малеиновой кислот кополимер, полиаминокислоты (или гомополимеры, или случайным образом выбранные кополимеры), декстран, поли(n-винил пирролидон)-полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, кополимеры оксида пролипропилена/оксида этилена, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерол), поливиниловый спирт и их смеси. Полиэтилеггликоль пропиональдегид может обладать преимуществами при производстве благодаря своей стабильности в воде.
[00144] Число полимерных молекул, присоединенных таким образом, может варьировать, и специалист в данной области техники сможет установить их влияние на функцию. Это может быть монодериват или могут быть ди-, три-, тетра- или какие-либо комбинации дериватов с одним и тем же или различными химическими компонентами (например, полимерами, такими как полиэтиленгликоли различного молекулярного веса). Отношение полимерных молекул к белковой (или пептидной) молекуле может варьировать так же, как их концентрация в реакционной смеси. В целом оптимальное соотношение (в отношении эффективности реакции, чтобы не оставалось избытка непрореагировавшего белка или полимера) будет определяться по таким факторам как желаемая степень дериватизации (например, моно-, ди-, три- и т.д.), молекулярный вес выбранного полимера, является ли полимер разветвленным или неразветвленным, а также условия реакции.
[00145] Молекулы полиэтиленгликоля (или другие химические компоненты) должны быть присоединены к белку с учетом их действия на функциональные или антигенные домены белка. Существует множество способов присоединения, доступных специалистам в данной области техники. См., например, ЕР 0401384, раскрытие которого включено в описание посредством ссылки (соединение PEG и G-CSF), см. также Malik et al., 1992, Exp.Hematol., 20:1028-35 (сообщение о пегилировании GM-CSF с использованием хлорида трезила). Например, полиэтиленгликоль может быть ковалентно связан с аминокислотными остатками благодаря реакционно-способной группе, такой как свободная аминная или карбоксильная группа. Реакционно-способные группы - те группы, в которых активируемая молекула полиэтиленгликоля может быть связана. Аминокислотные остатки, имеющие свободную аминную группу, могут включать лизиновые остатки и N-терминальный аминокислотный остаток. Остатки, имеющие свободную карбоксильную группу, могут включать остатки аспаргиновой кислоты, остатки глутаминовой кислоты и С-терминальные аминокислотные остатки. Сульфгидрокильные группы также могут использоваться как реакционно-способная группа для присоединения молекул(ы) полиэтиленгликоля. Для терапевтических целей может быть осуществлено присоединение аминогруппы, такое как присоединение N-терминальной или лизиновой группы. Следует избегать присоединения остатков, важных для связывания рецептора, если связывание рецептора желательно.
[00146] Можно специально разработать амино-терминальный химически модифицированный белок. При использовании полиэтиленгликоля как примера данных составов, можно выбирать из множества молекул пропиленгликоля (по молекулярному весу, ветвлению и т.д.), отношения в реакционной смеси молекул пропиленгликоля к молекулам белка (или пептида), типа реакции пегиляции, которую следует произмести, и способа получения выбранного N-терминально пегилированного белка. Способ получения N-терминально пегилированного препарата (напр., сепарация этого компонента от других монопегилированных компонентов, при необходимости) может быть осуществлен путем очистки N-терминально пелилированного материала из множества пегилированных белковых молекул. Выбранная N-концевая химическая модификация может быть завершена путем сокращения алкилирования, которое использует различную реактивность различных типов первичных аминогрупп (лизин по отношению к N-концу), доступных для дериватизации в определенных белках. При соответствующих реакционных условиях достигается преимущественно избирательная дериватизация белка на N-конце с карбонильной группой, содержащей полимер. Например, можно избирательно N-терминально пегилировать белок, проведя реакцию при рН, которая позволяет добиться благоприятного pKa между эпсилон-аминогруппой лизиновых остатков и альфа-аминогруппой N-терминального остатка белка. Путем такой избирательной дериватизации контролируется присоединение растворимого в воде полимера к белку, например, конъюгация с полимером происходит преимущественно на N-конце белка, и нет существенной модификации других реактивных групп, таких как лизиновые аминогруппы боковой цепи. При использовании восстановительного алкилирования водорастворимый полимер может быть описанного выше типа и должен иметь один реактивный альдегид для присоединения к белку. Может быть использован полиэтиленгликоль пропиональдегид, содержащий один реактивный альдегид.
[00147] Пегилирование может быть осуществлено любой из известных реакций пегилирования, известных специалистам в данной области техники. См., например, Focus on Growth Factors, 1992, 3: 4-10; EP 0154316, раскрытие которого включено в описание посредством ссылки; ЕР 0401384 и другие цитируемые здесь публикации, относящиеся к пегилированию. Пегилирование может быть осуществлено посредством реакции алкилирования с реактивной молекулой полиэтиленгликоля (или аналогичным реактивным водорастворимым полимером).
[00148] Таким образом, предполагается, что растворимый рецепторный полипептид, используемый в соответствии с настоящим изобретением, может включать пегилированный рецепторный белок или его варианты, при этом PEG-группа(ы) присоединяется(ются) посредством ацильных или алкильных групп. Такие продукты могут быть монопегилированными или полипегилированными. PEG-группы обычно присоединяются к белку через α- или ε-аминогруппы аминокислот, но также предполагается, что PEG-группы могут быть присоединены к любой аминогруппе, присоединенной к белку, которая достаточно реактивна, чтобы присоединиться к PEG-группе при подходящих реакционных условиях.
[00149] Полимерные молекулы, используемые как при ацилировании, так и при алкилировании могут быть выбраны из водорастворимых полимеров, как описано выше. Выбранный полимер может быть модифицирован для обладания одной реактивной группой, такой как активный эфир для ацилирования или альдегид для алкилирования, таким образом, что степень полимеризации может контролироваться, как предусматривается настоящими способами. Примером реактивного PEG-альдегида является полиэтиленгликоль пропиональдегид, который стабилен в воде, или его моно С 1-С 10 алкокси или арилокси дериваты, (см. Патент США №5252714). Полимер может быть разветвленным или неразветвленным. Для реакции ацилирования выбираемый(е) полимер(ы) должен иметь одну реактивную эфирную группу. Для данного восстановительного алкилирования выбираемый(е) полимер(ы) должен иметь одну реактивную альдегидную группу. Обычно водорастворимый полимер не будет выбираться из присутствующих в природе гликозильных остатков, поскольку те обычно удобней делать в рекомбинантной экспрессионной системе млекопитающего. Полимер может быть любого молекулярного веса и может быть разветвленным или неразветвленынм. Одним водорастворимым полимером для использования здесь является пропиленгликоль. При использовании здесь пропиленгликоль означает включение любых форм PEG, которые используются для дериватизации других белков, таких как моно (С1-С10) алкокси-или арилокси-полиэтиленгликоль.
[00150] Другие реакционные параметры, такие как растворитель, время реакции, температуры и т.д., и способы очищения продуктов могут быть определены в индивидуальном порядке на основе опубликованной информации, имеющей отношение к дериватизации белков с водорастворимыми полимерами (см. публикации, цитируемые здесь). В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство представляет собой полипептид, который не происходит от FZD или SFRP человека. Множество способов для идентификации и производства полипептидов, которые с высоким сродством связываются с белками-мишенями, известны специалистам в данной области техники. См., например, Skerra, 2007, Curr. Opin. Biotechnol., 18:295-304; Hosse et al., 2006, Protein Science, 15:14-27; Gill et al., 2006, Curr. Opin. Biotechnol., 17:653-58; Nygren, 2008, FEBS J., 275:2668-76; и Skerra, 2008, FEBS J., 275:2677-83, каждая из которых включена в описание во всей полноте посредством ссылки. В некоторых вариантах воплощения для идентификации/производства Wnt-связываюшего полипептида используются технологии фагового отображения. В некоторых вариантах воплощения полипептид содержит структурный белок типа, выбранного из группы, состоящей из: белок А, ликокалин, домен фиброниктина, повторяющийся домен анкирина и тиоредоксин.
[00151] В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство представляет собой небелковую молекулу. В некоторых вариантах воплощения средство представляет собой синтетический препарат. Комбинаторные химические библиотеки и техники, подходящие для определения небелковых Wnt-связывающих средств, известны специалистам в данной области техники. См., например, Kennedy et al., 2008, J. Comb. Chem., 10:345-54; Dolle et al, 2007, J. Comb. Chem., 9:855-902; и Bhattacharyya, 2001, Curr. Med. Chem., 8:1383-404, каждая из которых включена в описание во всей полноте посредством ссылки. В некоторых дальнейших воплощениях средство представляет собой углеводород, гликозаминогликан, гликопротеин или протеогликан.
[00152] В некоторых вариантах воплощения средство представляет собой нуклеотидный аптамер. Аптамеры - это полинуклеотидные молекулы, выбранные (например, из случайных или мутировавших пулов) за их способность связываться с другой молекулой. В некоторых вариантах воплощения аптамер содержит полинуклеотид ДНК. В некоторых альтернативных вариантах воплощения аптамер содержит полинуклеотид РНК. В некоторых вариантах воплощения аптамер содержит один или более модифицированных остатков нуклеиновых кислот. Методы создания и отбора нуклеотидных аптамеров для связывания с белками хорошо известны специалистам в данной области техники. См., например. Патенты США под номерами: 5270163, 5683867, 5763595, 6344321, 7368236, 5582981, 5756291, 5840867, 7312325 и 7329742, Международной патентной заявка № WO 02/077262 и WO 03/070984, Международная патентная заявка США №2005/0239134, 2005/0124565 и 2008/0227735, каждая из которых включена в описание во всей полноте посредством ссылки.
[00153] В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство имеет период полувыведения в мышах, явайских макаках или людях по меньшей мере примерно 5 часов, по меньшей мере примерно 10 часов, по меньшей мере примерно 24 часов, по меньшей мере примерно 3 дней, по меньшей мере примерно 1 недели или по меньшей мере примерно 2 недель. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство является IgG (например, IgG1 или IgG2) антителом, которое имеет период полувыведения в мышах, явайских макаках или людях по меньшей мере примерно 10 часов, по меньшей мере примерно 24 часов, по меньшей мере примерно 3 дней, по меньшей мере примерно 1 недели или по меньшей мере примерно 2 недель. Способы повышения периода полувыведения средств, таких как полипептиды и антитела, известны специалистам в данной области техники. Например, известные методы повышения периода полувыведения антител к IgG включают вызывание мутаций в Fc участке, которые повышают рН-зависимое связывание антитела с неонатальным Fc рецептором (FcRn) при рН 6,0 (см., например. Публикации патента США под номерами: 2005/0276799, 2007/0148164 и 2007/0122403). Известные методы повышения периода полувыведения фрагментов антител с отсутствующим Fc участком включают такие техники как пегилация.
[00154] В некоторых вариантах воплощения описанные здесь Wnt-связывающие средства и полипептиды обладают периодом полувыведения сроком по меньшей мере примерно 50 часов в крысе при введении через хвостовую вену в дозировке, варьирующейся от примерно 2 мг/кг до примерно 10 мг/кг. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство или полипептид обладает периодом полувыведения сроком по меньшей мере примерно 50 часов в крысе при введении через хвостовую вену в дозировке примерно 10 мг/кг. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство или полипептид обладает периодом полувыведения сроком по меньшей мере примерно 100 часов в крысе при введении через хвостовую вену в дозировке, варьирующейся от примерно 2 мг/кг до примерно 10 мг/кг. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство или полипептид обладает периодом полувыведения сроком по меньшей мере примерно 100 часов в крысе при введении через хвостовую вену в дозировке примерно 10 мг/кг. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство обладает периодом полувыведения сроком по меньшей мере примерно 120 часов в крысе при введении через хвостовую вену в дозировке, варьирующейся от примерно 2 мг/кг до примерно 10 мг/кг. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство обладает периодом полувыведения сроком по меньшей мере примерно 150 часов в крысе при введении через хвостовую вену в дозировке, варьирующейся от примерно 2 мг/кг до примерно 10 мг/кг.
[00155] В некоторых вариантах воплощения средство представляет собой растворимый рецептор FZD, который содержит домен Fri рецептора FZD человека (или фрагмент или вариант домена Fri, который связывается с одним или несколькими Wnt) и участок Fc человека и обладает более продолжительным периодом полувыведения in vivo (например, в мыше или крысе), чем растворимый рецептор FZD, содержащий внеклеточный домен рецептора FZD и участок Fc человека.
[00156] Предоставлены клетки, вырабатывающие описанные здесь Wnt-связывающие средства или полипептиды. В некоторых вариантах воплощения клетка производит растворимое Wnt-связывающее средство, которое содержит домен Fri человеческого FZD8, в котором по меньшей мере примерно 80% Wnt-связывающего средства имеет N-терминальную последовательность ASA. В некоторых вариантах воплощения клетка производит растворимое Wnt-связывающее средство, которое содержит домен Fri человеческого FZD8, в котором по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95% или по меньшей мере примерно 98% Wnt-связывающего средства имеет N-терминальную последовательность ASA. В некоторых вариантах воплощения клетка представляет собой клетку млекопитающего. В некоторых вариантах воплощения клетка производит Wnt-связывающее средство, которое содержит участок Fc человека. В некоторых вариантах воплощения клетка производит Wnt-связывающее средство, которое содержит последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID №:53, SEQ ID №:50, SEQ ID №:46, SEQ ID №:48 и SEQ ID №:1. В некоторых вариантах воплощения клетка производит Wnt-связывающее средство, которое содержит последовательность аминокислот последовательности SEQ ID NO:53. В некоторых вариантах воплощения клетка производит Wnt-связывающее средство, которое содержит последовательность аминокислот последовательности SEQ ID NO:50.
[00157] Представлены производимые описанными здесь клетками Wnt-связывающие средства.
[00158] Также представлены составы, содержащие описанные здесь Wnt-связывающие средства или полипептиды. В некоторых вариантах воплощения состав содержит растворимое Wnt-связывающее средство, которое содержит домен Fri человеческого FZD8, в котором по меньшей мере примерно 80% Wnt-связывающего средства имеет N-терминальную последовательность ASA. В некоторых вариантах воплощения состав содержит растворимое Wnt-связывающее средство, которое содержит домен Fri человеческого FZD8, в котором по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95% или по меньшей мере примерно 98% Wnt-связывающего средства имеет N-терминальную последовательность ASA. В некоторых вариантах воплощения состав содержит Wnt-связывающее средство, которое содержит участок Fc человека. В некоторых вариантах воплощения состав содержит Wnt-связывающее средство, которое содержит последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID №:53, SEQ ID №:50, SEQ ID №:46, SEQ ID №:48 и SEQ ID №: 1. В некоторых вариантах воплощения состав содержит Wnt-связывающее средство, которое содержит последовательность аминокислот последовательности SEQ ID NO:53. В некоторых вариантах воплощения состав содержит Wnt-связывающее средство, которое содержит последовательность аминокислот последовательности SEQ ID NO:50. В некоторых вариантах воплощения описанные здесь составы также содержат фармацевтически приемлемый носитель.
[00159] Также представлены способы применения составов, содержащих описанные здесь Wnt-связывающие средства или полипептиды.
III. Полинуклеотиды
[00160] В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение охватывает полинуклеотиды, содержащие полинуклеотиды, кодирующие полипептид, который специфически связывается с Wnt-белком человека, или фрагмент такого полипептида. Например, настоящее изобретение представляет полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую растворимый рецептор FZD, или фрагмент такого растворимого рецептора. В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение представляет полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую растворимый SFRP, растворимый белок Ror или фрагмент такого растворимого белка. В некоторых вариантах воплощения полинуклеотиды содержат полинуклеотиды, кодирующие любые из описанных здесь Wnt-связывающих средств. Полинуклеотиды данного изобретения могут быть в форме РНК или в форме ДНК. ДНК включает кДНК, геномную ДНК и синтетическую ДНК и может быть двухцепочечной или одноцепочечной, при этом одноцепочечная ДНК может быть кодирующей цепочкой или некодирующей (антисмысловой) цепочкой.
[00161] В некоторых вариантах воплощения полинуклеотиды выделены. В некоторых вариантах воплощения полинуклеотиды в значительной степени очищены.
[00162] Настоящее изобретение представляет полинуклеотид, содержащий полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий последовательность SEQ ID №:1, SEQ ID №:45, SEQ ID №:46, SEQ ID №:47, SEQ ID №:48, SEQ ID №:49, SEQ ID №:50, SEQ ID №:51, SEQ ID №:52, SEQ ID №:53, SEQ ID №:54, SEQ ID №:55, SEQ ID №:65, SEQ ID №:66 и SEQ ID №:75. В некоторых вариантах воплощения полинуклеотид также содержит полинуклеотид, кодирующий полипептидную сигнальную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID №:67, SEQ ID №:68, SEQ ID №:69, SEQ ID №:70, SEQ ID №:71, SEQ ID №:72, SEQ ID №:73 и SEQ ID №:74. В некоторых вариантах воплощения полинуклеотид также содержит полинуклеотид, кодирующий полипептидную сигнальную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID №:70, SEQ ID №:71, SEQ ID №:72, SEQ ID №:73 и SEQ ID №:74. В некоторых вариантах воплощения полинуклеотид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид с последовательностью SEQ ID №:71 и SEQ ID №:50. В некоторых вариантах воплощения полинуклеотид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид с последовательностью SEQ ID №:71 и SEQ ID №:53. В некоторых вариантах воплощения полинуклеотид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид с последовательностью SEQ ID №:75. Настоящее изобретение также представляет полинуклеотид, содержащий последовательность SEQ ID №:2.
[00163] Настоящее изобретение представляет полинуклеотид, содержащий полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий: сигнальную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID №:71, SEQ ID №:70, SEQ ID №:72, SEQ ID №:73 и SEQ ID №:74; домен Fri человеческого FZD8 и участок Fc человека. В некоторых вариантах воплощения полинуклеотид содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий: сигнальную последовательность SEQ ID №:71, домен Fri человеческого FZD8 и участок Fc человека.
[00164] Также представлен полинуклеотид, содержащий полинуклеотид, который гибридизируется с полинуклеотидом, обладающим последовательностью SEQ ID №:2, и/или с полинуклеотидом, кодирующем полипептид с последовательностью SEQ ID №:1, SEQ ID №:45, SEQ ID №:46, SEQ ID №:47, SEQ ID №:48, SEQ ID №:49, SEQ ID №:50, SEQ ID №:51, SEQ ID №:52, SEQ ID №:53, SEQ ID №:54, SEQ ID №:55, SEQ ID №:65, SEQ ID №:66 и SEQ ID №:75. В некоторых вариантах воплощения гибридизация проходит в строгих условиях.
[00165] В некоторых вариантах воплощения полинуклеотиды содержат кодирующую последовательность для зрелого полипептида, вставленную в ту же рамку считывания, которая способствует, например, экспрессии и выделению полипептида из клетки-носителя (например, лидерная последовательност или сигнальная последовательность, которая функционирует как секреторная последовательность для контроля вывода полипептида из клетки). Полипептид, обладающий лидерной последовательностью, является белком-предшественником, а его лидерная последовательность может быть расщеплена клеткой-носителем, чтобы сформировать зрелую форму полипептида. Полинуклеотиды также могут кодировать белок-предшественник, который является зрелым белком, плюс дополнительные 5'-аминокислотных остатков. Зрелый белок, обладающий пропоследовательностью, представляет собой белок-предшественник и представляет собой неактивную форму белка. Когда пропоследовательность расщеплена, остается активный зрелый белок.
[00166] В некоторых вариантах воплощения полинуклеотиды содержат кодирующую последовательность для зрелого полипептида, входящую в ту же рамку считывания, что и маркерная последовательность, которая обеспечивает, например, очищение закодированного полипептида. Например, маркерная последовательность может быть маркером гексагистидина, доставленным pQE-9 вектором для обеспечения очищения зрелого полипептида, присоединенного к маркеру в случае бактериального носителя, или маркерная последовательность может быть маркером гемагглютинина (НА), полученным из белка гемагглютинина вируса гриппа, если используется носитель-млекопитающее (например, COS-7 клетки).
[00167] Настоящее изобретение также относится к вариантам описанных здесь полинуклеотидов, кодирующих, например, фрагменты, аналоги и производные. Фрагменты или части полинуклеотидов настоящего изобретения могут быть использованы для синтеза полноценных полинуклеотидов настоящего изобретения.
[00168] В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение представляет выделенные полинуклеотиды,, содержащие полинуклеотиды, имеющие нуклеотидную последовательность по меньшей мере на 80% совпадающую, по меньшей мере на 85% совпадающую, по меньшей мере на 90% совпадающую, по меньшей мере на 95% совпадающую, а в некоторых воплощениях по меньшей мере на 96%, 97%, 98% или 99% совпадающую с полинуклеотидом, кодирующим полипептид, содержащий растворимый рецептор FZD или другое описанное здесь Wnt-связывающее средство.
[00169] Если полинуклеотид имеет нуклеотидную последовательность по меньшей мере, например, на 95% "совпадающую с" эталонной нуклеотидной последовательностью, под этим подразумевается, что нуклеотидная последовательность полинуклеотида совпадает с эталонной последовательностью, не считая того, что эта полинуклеотидная последовательность может включать до пяти точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов эталонной нуклеотидной последовательности. Другими словами, чтобы получить полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 95% совпадающую с эталонной нуклеотидной последовательностью, до 5% нуклеотидов в эталонной последовательности могут быть удалены или заменены другими нуклеотидами или некоторое число нуклеотидов, до 5% нуклеотидов в эталонной последовательности, может быть введено в эталонную последовательность. Такие мутации эталонной последовательности могут происходить на амино- или карбокси-терминальных позициях эталонной нуклеотидной последовательности или где угодно между этими терминальными позициями, будучи либо разбросаными поодиночке среди нуклеотидов эталонной последовательности, либо собраными в одну или более смежных групп внутри эталонной последовательности.
[00170] Варианты полинуклеотида могут содержать изменения в кодирующих участках, некодирующих участках или в обоих. В некоторых вариантах воплощения варианты полинуклеотида содержат изменения, которые заключаются в молчащих заменах, добавлениях или удалениях аминокислот, но не меняют свойств кодируемого полипептида. В некоторых вариантах воплощения варианты нуклеотида создаются молчащими заменами, приводящими к вырождению генетического кода. В некоторых вариантах воплощения варианты нуклеотида содержат нуклеотидные последовательности, которые приводят к отличиям в экспрессии (например, повышенной или сниженной экспрессии), несмотря на то, что аминокислотная последовательность не изменена. Варианты полинуклеотида могут быть произведены с различными целями, например, чтобы оптимизировать экспрессию кодона для конкретного носителя (заменить кодоны в тРНК человека на предпочтительные для бактериального носителя, такого как Е. coli).
[00171] Описанные здесь полинуклеотиды могут быть произведены любым подходящим способом, известным специалистам в данной области техники. Как описано здесь, в некоторых воплощениях последовательность ДНК создана с использованием рекомбинантной технологии путем выделения или синтеза последовательности ДНК, кодирующей целевой белок дикого типа. В некоторых вариантах воплощения последовательность ДНК создана с использованием рекомбинантной технологии путем выделения нескольких последовательностей ДНК, кодирующих два целевых полипептида, и склеивания этих последовательностей ДНК вместе для генерации гибридного белка.
[00172] В некоторых вариантах воплощения последовательность ДНК, кодирующая целевой полипептид, может быть создана путем химического синтеза с использованием олигонуклеотидного синтезатора. Такие олигонуклеотиды могут быть разработаны, опираясь на последовательность аминокислот желаемого полипептида. Стандартные способы могут быть применены для синтеза полинуклеотидной последовательности, кодирующей целевой полипептид. Например, целая аминокислотная последовательность может быть использована, чтобы создать «обратно транслируемый» ген. Более того, может быть синтезирован олигомер ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую конкретный полипептид. Например, несколько малых олигонуклеотидов, кодирующих части желаемого полипептида могут быть синтезированы и затем склеены. Одиночные олигонуклеотиды обычно содержат 5'- или 3'-«липкие концы» для комплементарной сборки. В некоторых вариантах воплощения нуклеотидная последовательность, кодирующая желаемый гибридный белок синтезирована так, чтобы два полипептида были соединены напрямую без встроенного пептидного линкера.
[00173] После сборки (путем синтеза, сайт-специфического мутагенеза, рекомбинантной технологии или иного способа) полинуклеотидные последовательности, кодирующие конкретный целевой полипептид, могут быть введены в вектор экспрессии и оперативно связаны с последовательностью контроля экспрессии, подходящей для экспрессии полипептида в желаемом носителе. Правильность сборки может быть подтверждена нуклеотидным секвенированием, рестриктазным картированием и/или экспрессией биологически активного полипептида в подходящем носителе. Как хорошо известно специалистам в данной области техники, чтобы получить высокий уровень экспрессии трансфицированного гена в носителе, ген должен быть оперативно связан с транскрипционной и трансляционной последовательностями контроля экспрессии, которые функциональны в выбранном носителе экспрессии.
[00174] Представлены векторы, содержащие описанные здесь полинуклеотиды. Также представлены клетки, содержащие описанные здесь векторы или полинуклеотиды.
IV. Фармацевтический состав
[00175] Настоящее изобретение также представляет фармацевтический состав, содержащий средства (например, растворимый рецептор FZDs), которые связываются с одним или более Wnt-белками и/или являются Wnt-антагонистами. В некоторых вариантах воплощения фармацевтический состав содержит описанные Wnt-связывающие средства и полипептиды. Эти фармацевтические составы применяются для подавления роста опухолевых клеток и лечения рака у людей. В некоторых вариантах воплощения описанные здесь Wnt-связывающие средства применяются при изготовлении медикаментов для лечения рака.
st
[00176] Составы подготавливаются для хранения и использования путем сочетания очищенного средства или антагониста настоящего изобретения с фармацевтически приемлемым носителем, наполнителем и/или стабилизатором в виде стерильного лиофилизированного порошка, водного раствора и т.д.. (Remington: Science and Practice of Pharmacy, 21 Edition, University of Sciences, Philadelphia, 2005). Подходящие носители, наполнители или стабилизаторы содержат нетоксичные буферы, такие как фосфаты, цитраты и другие органические кислоты; соли, такие как калия хлорид; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (например, октадецилдиметилбезил хлорид аммония; гексаметония хлорид; бензалкония хлорид; бензетония хлорид; феноловый, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как мелил или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и т-крезол); полипептиды с низким молекулярным весом (такие как имеющие менее чем 10 аминокислотных остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулин; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспаргин, гистидин, аргинин или лизин; углеводороды, такие как моносахариды, дисахариды, глюкоза, манноза или декстрины; комплексообразующие средства, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннитол, трегалоза или сорбитол; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексные соединения металлов (например, Zn-белковые комплексы); и/или неионные поверхностноактивные вещества, такие как TWEEN или полиэтиленгликоль (PEG).
[00177] Фармацевтический состав настоящего изобретения может быть введен любыми путями для местного или системного лечения. Введение может быть внешним (в частности, через слизистые оболочки, включая вагинальное и ректальное введение), например, посредством трансдермальных пластырей, мазей, лосьонов, кремов, гелей, капель, суппозиториев, спреев, жидкостей и порошков; пульмонарым (например, путем ингаляции или вдувания порошков или аэрозолоей, в том числе распылителем; внутритрахейно, интраназально, эпидермально и трансдермально); пероральным или парэнтеральным, в том числе путем внутривенной, внутриартелиальной, подкожной, внугрибрюшинной или внутримышечной инъекции или вливания; или внутричерепным (например, интратекальным или внутрижелудочковым) введением.
[00178] Терапевтический состав может быть в форме единицы дозирования. Такие составы включают таблетки, пилюли, капсулы, порошки, гранулы, растворы или суспензии в воде или неводной среде, или суппозитории для орального, парэнтерального или ректального введения, или для введения путем ингаляции. В твердых формах, таких как таблетки, основной активный ингредиент смешан с фармацевтическим носителем. Традиционные ингридиенты таблеток включают кукурузный крахмал, лактозу, сахарозу, сорбитол, тальк, стеариновую кислоту, магния стеарат, кальция фосфат или смолы и другие разбавители (например, воду) для создания твердого, предназначенного для дальнейшего производства состава, содержащего гомогенную смесь вещества настоящего изобретения или его нетоксичной фармацевтически приемлемой соли. Твердый, предназначенный для дальнейшего производства состав затем разделяется на формы единиц дозировки типа, описанного выше. Таблетки, пилюли и т.д. нового состава могут быть покрыты или другим способом составлены для обеспечения формы дозировки, дающей возможность пролонгированного действия. Например, таблетка или пилюля может содержать внутренний компонент, покрытый другим компонентом. Кроме того, два компонента могут быть разделены энтеросолюбильным слоем, который служит для сохранения дезинтеграции и защищает внутренний компонент при прохождении через желудок или замедляет его доставку. Для таких энтеросолюбильных слоев или покрытий может быть использовано множество веществ, включая различные полимерные кислоты и смеси полимерных кислот с такими материалами, как шеллак, цетиловый спирт и ацетат целлюлозы.
[00179] Фармацевтические составы включают антагонисты (например, Wnt-связывающие средства) настоящего изобретения в комплексе с липосомами (Epstein et al., 1985, PNAS, 82:3688; Hwang et al., 1980, PNAS, 77:4030; и Патент США №4485045 и 4544545). Липосомы с увеличенным временем циркуляции раскрыты в Патенте США 5013556. Липосомы могут быть произведены путем обратной фазы выпаривания с липидным составом, содержащим фосфатидилхолин, холестерол и PEG-дериват фосфатидилэтаноламин (PEG-PE). Липосомы прогоняют через фильтры с определенным размером пор для получения липосом заданного диаметра.
st
[00180] Антагонист (например, Wnt-связывающее средство) также может быть заключен в микрокапсулы. Такие микрокапсулы изготавливаются, например, путем техник коацервации или путем межфазной полимеризации, гидроксилметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли-(метилметацилат) микрокапсулы, соответственно, в коллоидных системах доставки препарата (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсиях, как описано в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21 Edition, University of the Sciences, Филадельфия, 2005.
[00181] Кроме того, могут быть приготовлены препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые частицы матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащих средство, матрицы которых представляют собой имеющие определенную форму частицы (например, пленки или микрокапсулы). Примеры матриц с замедленным высвобождением включают полиэфиры, гидрогели, такие как поли(2-гидроксиэтил-метакрилат) или поли(виниловый спирт), полилактиды (Патент США №3773919), кополимеры L-глутаминовой кислоты и 7 этил-L-глутамат, неразлагаемый этиленвинилацетат, разлагаемые кополимеры молочной кислоты-гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (вводимые с помощью инъекции микросферы, состоящие из кополимера молочной кислоты-гликолевой кислоты и лейпрорелина), изобутирата ацетата сахарозы и поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту.
V. Способы применения
[00182] Wnt-связывающие средства (включая растворимые рецепторы) данного изобретения применяются для множества задач, включая, в числе прочих, способы терапевтического лечения, в том числе лечения рака. В некоторых вариантах воплощения агенты применимы для подавления сигнального пути Wnt (например, канонического сигнального пути Wnt), подавления развития опухоли, в том числе дифференциации, снижения объема опухоли, снижения концентрации стволовых клеток рака и/или снижения онкогенности опухоли. Способы применения могут быть способами in vitro, ex vivo или in vivo. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство или полипептид представляет собой антагонист одного или нескольких Wnt-белков человека, с которыми он связывается.
[00183] В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающие средства или антагонисты используются при лечении заболевания, связанного с активацией сигнального пути Wnt. В отдельных вариантах воплощения заболевание представляет собой заболевание, зависимое от сигнального пути Wnt. В отдельных воплощениях сигнальный путь Wnt является каноническим сигнальным путем Wnt. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающие средства или антагонисты используются при лечении заболеваний, характеризующихся повышенным уровнем содержания стволовых клеток и/или клеток-предшественников.
[00184] В некоторых вариантах воплощения болезнь, которую лечат при помощи Wnt-связывающего средства или антагониста (например, растворимого рецептора FZD, SFRP-производного белка или растворимого рецептора Ror), представляет собой рак. В некоторых вариантах воплощения для рака характерны Wnt-зависимые опухоли. В некоторых вариантах воплощения для рака характерны опухоли, экспрессирующие один или более Wnt, с которыми связывается Wnt-связывающее средство (например, растворимый рецептор).
[00185] В некоторых вариантах воплощения болезнь, которую лечат при помощи Wnt-связывающего средства или антагониста, не является раком. Например, болезнь может являться метаболическим расстройством, таким как ожирение или диабет (например, диабет II-го типа) (Jin Т., 2008, Diabetologia, 51:1771-80). Альтернативно заболевание может быть костным заболеванием, таким как остеопороз, остеоартрит или ревматоидный артрит (Corr M., 2008, Nat. Clin. Pract. Rheumatol., 4:550-6; Day et al., 2008, Bone Joint Surg. Am., 90 Suppi 1:19-24). Заболевание может также быть заболеванием почек, таким как поликистозное заболевание почек (Harris et al., 2009, Ann. Rev. Med., 60:321-37; Schmidt-Ott et al., 2008, Kidney Int., 74:1004-8; Benzing et al., 2007, J. Am. Soc. Nephrol., 18:1389-98). Альтернативно могут подвергаться лечению глазные заболевания, включая, но не ограничиваясь этим, макулярную дистрофию и семейную экссудативную форму витреоретинопатии (Lad et al., 2009, Stem Cells Dev., 18:7-16). Также могут подвергаться лечению кардиоваскулярные заболевания, включая инфакрт миокарда, атеросклерозы и заболевания сердечных клапанов (Al-Aly Z., 2008, Transl. Res., 151:233-9; Kobayashi et al., 2009, Nat. Cell Biol., 11:46-55; van Gijn et al., 2002, Cardiovasc. Res., 55:16-24; Christman et al., 2008, Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 294:H2864-70). В некоторых вариантах воплощения заболевание представляет собой легочное заболевание, такое как идиопатическая легочная артериальная гипертензия или легочный фиброз (Laumanns et al., 2008, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2009, 40:683-91; Konigshoff et al., 2008 PLoS ONE, 3:e2142). В некоторых вариантах воплощения заболевание, которое лечат Wnt-связывающим средством, представляет собой заболевание печени, такое как цирроз или фиброз печени (Cheng et al., 2008, Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 294:039-49).
[00186] Настоящее изобретение представляет способы лечения рака, включающие введение пациенту терапевтически эффективного количества Wnt-связывающего средства (например, пациенту, нуждающемуся в лечении). В некоторых вариантах воплощения рак представляет собой рак, выбранный из группы, состоящей из: колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак легкого, рак яичника, рак печени, рак молочной железы, рак почки, рак простаты, рак ЖКТ, меланома, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, полиморфная глиома и рак головы и шеи. В некоторых вариантах воплощения рак представляет собой рак поджелудочной железы. В некоторых вариантах воплощения рак представляет собой колоректальный рак. В некоторых вариантах воплощения рак представляет собой рак молочной железы. В некоторых вариантах воплощения пациент является человеком.
[00187] Настоящее изобретение также представляет способы для подавления роста опухоли с использованием описанных здесь Wnt-связывающих средств. В некоторых вариантах воплощения способ подавления роста опухоли включает доставку в опухоль или опухолевую клетку Wnt-связывающего средства in vitro. Например, иммортализированная линия клеток или раковая линия клеток, которая экспрессирует целевой(-ые) Wnt, культивируется в среде, к которой добавлено Wnt-связывающее средство для подавления роста опухолевых клеток. В некоторых вариантах воплощения опухолевые клетки выделены из образца клеток пациента, такого как, например, биопсия ткани, плевральный выпот или образец крови, и культивируются в среде, к которой добавлено Wnt-связывающее средство для подавления роста опухолевых клеток.
[00188] В некоторых вариантах воплощения способ подавления роста опухоли включает доставку в опухоль или опухолевые клетки Wnt-связывающего средства (например, растворимого рецептора FZD) in vivo. В некоторых вариантах воплощения доставка в опухоль или опухолевые клетки Wnt-связывающего средства производится на животной модели. Например, Wnt-связывающие средства для подавления роста опухоли могут быть введены ксенотрансплантантам, экспрессирующим один или более Wnt, которые выращивают у мышей с ослабленным иммунитетом (например, NOD/SCID мыши). В некоторых вариантах воплощения стволовые клетки рака выделены из образца клеток пациента, такого как, например, биопсия ткани, плевральный выпот или образец крови, и введены путем инъекции мышам с ослабленным иммунитетом, которым затем введено Wnt-связывающее средство для подавления роста опухолевых клеток. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство вводится одновременно или непосредственно после онкогенных клеток животному для предотвращения роста опухоли. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство вводится как терапевтическое средство после того, как онкогенные клетки выросли в опухоль заданного размера.
[00189] В некоторых вариантах воплощения способ подавления роста опухоли содержит введение пациенту терапевтически эффективного количества Wnt-связывающего средства. В некоторых вариантах воплощения пациент является человеком. В некоторых вариантах воплощения у пациента наличествует опухоль либо опухоль была удалена.
[00190] Настоящее изобретение также представляет способы снижения частоты встречаемости стволовых клеток рака в опухоли, содержащей раковые стволовые клетки, способ, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества Wnt-связывающего средства. В дополнение представлены способы, вызывающие дифференцировку опухолевых клеток у пациента, при этом способ содержит введение пациенту терапевтически эффективного количества Wnt-связывающего средства. В некоторых вариантах воплощения способы, вызывающие экспрессию маркеров дифференцировки в опухоли, включают введение пациенту терапевтически эффективного количества Wnt-связывающего средства. В некоторых вариантах воплощения пациент является человеком.
[00191] В некоторых вариантах воплощения опухоль представляет собой опухоль, в которой Wnt-сигналинг активен. В некоторых вариантах воплощения активный Wnt-сигналинг является каноническим сигнальным путем Wnt. В некоторых вариантах воплощения опухоль представляет собой Wnt-зависимую опухоль, например, в некоторых воплощениях опухоль чувствительна к сверхэкспрессии аксина. В некоторых вариантах воплощения опухоль не содержит инактивированной мутации (например, усеченной мутации) в гене супрессора опухоли аденоматозного полипоза толстой кишки (АРС) или активированной мутации в бета-катинин гене. В некоторых вариантах воплощения опухоль экспрессирует один или несколько генов в сигнатуре Wnt гена. В некоторых вариантах воплощения рак, от которого пациент лечится, включает такую опухоль.
[00192] В некоторых вариантах воплощения опухоль экспрессирует один или более из тех Wnt-белков человека, которые Wnt-связывающее средство связывает. В некоторых вариантах воплощения опухоль экспрессирует Wnt человека в чрезмерном количестве.
[00193] В некоторых вариантах воплощения опухоль представляет собой опухоль, выбранную из группы, состоящей из: колоректальная опухоль, опухоль поджелудочной железы, опухоль легких, опухоль яичников, опухоль печени, опухоль молочной железы, опухоль почки, опухоль простаты, опухоль ЖКТ, меланома, опухоль шейки матки, опухоль мочевого пузыря, полиморфная глиома и опухоль головы и шеи. В некоторых вариантах воплощения опухоль представляет собой колоректальную опухоль. В некоторых вариантах воплощения опухоль представляет собой опухоль поджелудочной железы. В некоторых вариантах воплощения опухоль представляет собой опухоль молочной железы.
[00194] Настоящее изобретение также представляет способ подавления сигнального пути Wnt в клетке, включающий доставку в клетку эффективного количества Wnt-связывающего средства. В некоторых вариантах воплощения клетка представляет собой опухолевую клетку. В некоторых вариантах воплощения способ представляет собой способ in vivo, в котором стадия доставки в клетку средства включает введение терапевтически эффективного количества средства пациенту. В некоторых альтернативных вариантах воплощения способ представляет собой способ in vitro или ex vivo. В некоторых вариантах воплощения сигнальный путь Wnt представляет собой канонический сигнальный путь Wnt. В некоторых вариантах воплощения сигнальный путь Wnt является сигналингом посредством Wnt1, Wnt2, Wnt3, Wnt3a, Wnt7a, Wnt7b и/или Wnt10b. В некоторых вариантах воплощения сигнальный путь Wnt является сигналингом посредством Wnt1, Wnt3a, Wnt7b и/или Wnt10b.
[00195] Дополнительно настоящее изобретение представляет способ снижения онкогенноети опухоли у пациента, включающий введение терапевтически эффективного количества Wnt-связывающего средства пациенту. В некоторых вариантах воплощения опухоль содержит стволовые клетки рака. В некоторых вариантах воплощения онкогенность опухоли уменьшается при уменьшении частоты встречаемости раковых клеток в опухоли. В некоторых вариантах воплощения концентрация стволовых клеток рака в опухоли снижается путем введения Wnt-связывающего средства. В некоторых вариантах воплощения средство или антитело способно уменьшать онкогенность составляющих опухоль раковых стволовых клеток в животной модели, такой как мышиный ксенотрансплантант. В некоторых вариантах воплощения число или частота встречаемости раковых стволовых клеток в опухоли уменьшается по меньшей мере примерно в два раза, примерно в три раза, примерно в пять раз, примерно в десять раз, примерно в 50 раз, примерно в 100 раз или примерно в 1000 раз. В некоторых вариантах воплощения уменьшение числа или частоты встречаемости раковых стволовых клеток определяется методом предельного разведения, используемого на животной модели. Дополнительные примеры и инструкции, разъясняющие использование метода предельного разведения для определения уменьшения числа или частоты встречаемости раковых стволовых клеток в опухоли, можно найти, например, в Международной Публикации № WO 2008/042236, публикации Заявки на Патент США №2008/0064049 и публикации Заявки на Патент США №2008/0178305, каждая из которых включена в описание во всей полноте посредством ссылки.
[00196] Таким образом, настоящее изобретение также представляет способ снижения частоты встречаемости раковых стволовых клеток в опухоли, содержащей раковые стволовые клетки, способ включает в себя контакт опухоли с эффективным количеством Wnt-связывающего средства (например, растворимого рецептора FZD, растворимого рецептора Ror или гибрида SFRP-Fc).
[00197] Настоящее изобретение также представляет способы дифференцировки онкогенных клеток в неонкогенные клетки, заключающийся в контакте онкогенных клеток с Wnt-связывающим средством (например, путем введения Wnt-связывающего средства пациенту, у которого имеется опухоль, содержащая онкогенные клетки, или у которого такая опухоль была удалена). В некоторых вариантах воплощения онкогенные клетки являются клетками опухоли поджелудочной железы. В некоторых альтернативных вариантах воплощения онкогенные клетки являются клетками опухоли ободочной кишки.
[00198] Предоставляется также применение описанных здесь Wnt-связывающих средств для стимуляции дифференцировки клеток, включая, но не ограничиваясь этим, опухолевые клетки. Например, предлагаются описанные здесь способы стимуляции клеток к дифференцировке, заключающиеся в контакте клеток с эффективным количеством Wnt-связывающего средства (например, растворимого рецептора FZD, растворимого рецептора Ror или гибрида SFRP-Fc). Предоставляются также способы стимуляции к дифференцировке клеток опухоли пациента, включающие в себя введение терапевтически эффективного количества Wnt-связывающего средства пациенту. В некоторых вариантах воплощения опухоль представляет собой опухоль поджелудочной железы. В некоторых других вариантах воплощения опухоль представляет собой опухоль ободочной кишки.
[00199] Предоставляются также способы лечения заболевания или расстройства у пациента, при этом заболевание или расстройство связано с активацией сигнального пути Wnt и/или характеризуется возрастанием уровня стволовых клеток и/или клеток-предшественников. В некоторых вариантах воплощения способы содержат введение терапевтически эффективного количества Wnt-связывающего средства пациенту. В некоторых вариантах воплощения сигнальный путь Wnt является каноническим сигнальным путем Wnt.
[00200] Wnt-связывающие средства или антагонисты вводятся в виде подходящего фармацевтического состава пациенту, являющемуся человеком, в соответствии с известными способами. Подходящие способы введения включают, не ограничиваясь этим, внутривенный (введение в виде болюса или путем непрерывного вливания в течение определенного периода времени), внутримышечный, внутрибрюшинный, внутрь спинного мозга, подкожный, внутрисуставный, интранозальный, интратекальный, оральный, местный или путем ингаляции.
[00201] В некоторых вариантах воплощения, в дополнение к введению Wnt-связывающего средства, способ или лечение также включает введение второго терапевтического средства (например, антиракового средства) перед, совместно и/или после введения Wnt-связывающего средства. Предоставляется также фармацевтический состав, содержащий Wnt-связывающее средство и второе терапевтическое средство.
[00202] Следует понимать, что комбинация Wnt-связывающего средства и второго терапевтического средства может вводиться в любом порядке или одновременно. В определенных вариантах воплощения Wnt-связывающие средства будут вводиться пациенту, который до этого подвергался лечению вторым терапевтическим средством. В некоторых других вариантах воплощения Wnt-связывающее средство и второе терапевтическое средство будут вводиться практически одновременно или совместно. Например, пациенту могут давать Wnt-связывающее средство во время прохождения курса лечения вторым терапевтическим средством (например, химиотерапии). В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство будет вводиться во время 1 года лечения вторым терапевтическим средством. В некоторых альтернативных вариантах воплощения Wnt-связывающее средство будет вводиться напротяжении 10, 8, 6, 4 или 2 месяцев любого лечения вторым терапевтическим средством. В некоторых других вариантах воплощения Wnt-связывающее средство будет вводиться напротяжении 4, 3, 2 или 1 недели любого лечения вторым терапевтическим средством. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство будет вводиться напротяжении 5, 4, 3, 2 или 1 дней любого лечения вторым терапевтическим средством. Следует также понимать, что два средства или лечения могут вводиться пациенту в пределах часов или минут (то есть практически одновременно).
[00203] Комбинированная терапия по меньшей мере двумя терапевтическими средствами часто использует средства, механизм действия которых различен, хотя это не обязательно. Комбинированная терапия с использованием средств с различными механизмами действия может приводить к аддитивным или синергичным эффектам. Комбинированная терапия может давать возможность использования более низкой дозы каждого средства, чем при использовании в монотерапии, тем самым снижая токсические побочные эффекты. Комбинированная терапия уменьшает вероятность того, что у раковых клеток разовьется резистентность. В некоторых вариантах воплощения комбинированная терапия содержит терапевтическое средство, которое действует (например, подавляет или убивает) на неонкогенные клетки, и терапевтическое средство, которое действует (например, подавляет или убивает) на онкогенные РСК.
[00204] Используемые классы терапевтических (например, антираковых) средств включают, например, антитубулиновые средства, ауристатины, связующие вещества малой бороздки ДНК, ингибиторы репликации ДНК, алкилирующие средства (например, комплексы платины, такие как цисплатин, моно(платина), бис(платина) и три-ядерные платиновые комплексы, и карбоплатин), антрациклины, антибиотики, антифолаты, антиметаболиты, сенсибилизаторы химиотерапии, дуокармицины, этопозиды, фторированные пиримидины, ионофоры, лекситропсины, нитрозомочевину, платинолы, предшествующие соединения, антиметаболиты пуринов, пуромицины, сенситайзеры радиации, стероиды, таксаны, ингибиторы топоизомеразы, алкалоиды барвинка и тому подобное. В некоторых вариантах воплощения второе терапевтическое средство представляет собой антиметаболит, антимитотическое средство, топоизомеразный ингибитор или ингибитор ангиогенеза.
[00205] Терапевтические средства, которые можно вводить в комбинации с Wnt-связывающими средствами, включают средства химиотерапии. Таким образом, в некоторых вариантах воплощения способ или лечение включает комбинированное введение Wnt-связывающего средства настоящего изобретения и химиотерапевтического средства или смесь множества различных химиотерапевтических средств. Лечение Wnt-связывающим средством может происходить до, совместно или после введения химиотерапии. Предполагаемая изобретением химиотерапия включает химические вещества или препараты, которые известны специалистам в данной области техники и имеются в продаже, такие как гемцитабин, иринотекан, доксорубицин, 5-фторурацил, цитозина арабинозид ("Ara-С"), циклофосфамид, тиотепа, бусульфан, цитоксин, паклитаксел, метотрексат, цисплан, мелфалан, винбластин и карблоплатин. Комбинированное введение может включать ко-введение либо в одном фармацевтическом составе, либо с использованием различных составов, или последовательное введение в любом порядке, но обычно - в пределах временного периода, за который все активные средства могут совместно проявить свою биологическую активность. Препараты и схемы дозирования для таких химиотерапевтических средств могут быть использованы в соответствии с инструкциями производителя или как определено эмпирически практикующими специалистами. Препараты и схемы дозирования для такой химиотерапии также описаны в Chemotherapy Service Ed., М.С.Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md. (1992).
[00206] Химиотерапевтические средства, используемые в настоящем изобретении, также включают, не ограничиваясь этим, алкилирующие средства, такие как тиотепа и циклосфосфамид; алкил-сульфонаты, такие как бузульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, трижтилентиофосфаорамид и триметилоломеламим; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, мехлорэтамина оксида гидрохлорид, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как аклациномуцины, актиномуцины, аутрамуцины, азасерин, блеомучины, кактиномуцин, калихеамуцин, карабицин, каминомуцин, карцинофилин, хромомуцин, дактиномуцин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицин, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромуцин, пуромицин, квеламицин, рордорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, циностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексан, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, ддеоксиуридин, доксифлуоридин, эноцитабин, флоксуридин, 5-FU; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадреналины, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; репленишеры фолиевой кислоты, такие как фролиниевая кислота; ацеглатон; альдофосфамида гликозид; аминолевулиновая кислота; амсакрин; бестрабуцил; бизантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквинон; элформитин; эллиптинума ацетат; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидамин; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновая кислота; 2-этилгидрацид; прокарбазин; PSK; разоксангагохапе; сизофуран; спирогерманиум; тенуазоновая кислота; триазиквин; 2,2',2"-трихлортриэтиламин; уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид ("Ara-С"); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например паклитаксел (TAXOL) и доцетаксел (TAXOTERE), хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митомицин С; митоксантрон; винкристин; винорелбин; навелбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; СРТ11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноевая кислота; эсперамицины; капецитабин и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или дериваты любого из вышеперечисленного. Химиотерапевтические средства также включают антигормональные средства, которые действуют, регулируя или подавляя гормональное действие на опухоль, такие как антиэстрогены, включая, например, тамоксифен, ралоксифен, ингибиторы ароматазы 4(5)-имидазолы, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онаприетон и торемифен (Fareston); и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпрорелин и госерелин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или дериваты любого из вышеперечисленного.
[00207] В некоторых вариантах воплощения химиотерапевтическое средство представляет собой ингибитор топоизомеразы. Ингибиторы топоизомеразы представляют собой средства, которые усиливают действие фермента топоизомеразы (например, топоизомеразы I или II). Ингибиторы топоизомеразы включают, не ограничиваясь этим, доксорубицин HCl, даунорубицина цитрат, митоксантрон HCl, актиномицин D, этопозид, топотекан HCl, тенипозид (VM-26) и иринотекан. В некоторых вариантах воплощения второе терапевтическое средство представляет собой иринотекан. В некоторых вариантах воплощения подвергаемая лечению опухоль представляет собой колоректальную опухоль, а второе терапевтическое средство представляет собой ингибитор топоизомеразы, такой как иринотекан. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит SEQ ID №:53, а второе терапевтическое средство представляет собой иринотекан. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит SEQ ID №:75, а второе терапевтическое средство представляет собой иринотекан.
[00208] В некоторых вариантах воплощения химиотерапевтическое средство представляет собой антиметаболит. Антиметаболит представляет собой химическое вещество, обладающее структурой, которая подобна структуре метаболита, необходимого для нормальных биохимических реакций, но достаточно отличается для того, чтобы усиливать одну или несколько нормальных функций клетки, таких как клеточное деление. Антиметаболиты включают, не ограничиваясь этим, гемцитабин, фторурацил, капецитабин, нитрат метотрексата, ралитрексед, перметрексед, тегафур, цитозина арабинозид, тиогуанин, 5-азацитидин, 6-меркаптопурин, азатиоприн, 6-тиогуанин, пентостатин, фосфат флударабина и кладрибин, а также фармацевтически приемлемые соли, кислоты или дериваты любого из вышеперечисленного. В некоторых вариантах воплощения второе терапевтическое средство представляет собой гемцитабин. В некоторых вариантах воплощения подвергаемая лечению опухоль представляет собой опухоль поджелудочной железы, а второе терапевтическое средство представляет собой антиметаболит (например, гемцитабин). В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит SEQ ID №:53, а второе терапевтическое средство представляет собой гемцитабин. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит SEQ ID №:75, а второе терапевтическое средство представляет собой гемцитабин.
[00209] В некоторых вариантах воплощения химиотерапевтическое средство представляет собой антимитотическое средство, включая, но не ограничиваясь этим, средства, которые связывают тубулин. В качестве примера, которым нельзя ограничиваться, средство содержит таксан. В некоторых вариантах воплощения средство содержит паклитаксел или доцетаксел, или фармацевтически приемлемые соли, кислоты или дериваты паклитаксела или доцетаксела. В некоторых вариантах воплощения средство представляет собой паклитаксел (TAXOL), доцетаксел (TAXOTERE), альбумин-связывающий паклитаксел (ABRAXANE), DHA-паклитаксел или PG-паклитаксел. В некоторых альтернативных вариантах воплощения антимитотическое средство содержит алкалоиды барвинка, такие как винкристин, бинбластин, винорелбин или виндезин, или их фармацевтически приемлемые соли, кислоты или дериваты. В некоторых вариантах воплощения антимитотическое средство представляет собой ингибитор Eg5 кинезина или ингибитор митотической киназы, такой как Aurora А или Plk1. В некоторых вариантах воплощения, в которых химиотерапевтическое средство вводится в комбинации с Wnt-связывающим средством или полипептид содержит антимитотическое средство, подвергаемые лечению рак или опухоль представляют собой рак молочной железы или опухоль молочной железы. В некоторых вариантах воплощения подвергаемя лечению опухоль представляет собой опухоль молочной железы, а второе терапевтическое средство представляет собой паклитаксел. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит SEQ ID №:53, а второе терапевтическое средство представляет собой паклитаксел. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит SEQ ID №:75, а второе терапевтическое средство представляет собой паклитаксел.
[00210] В некоторых вариантах воплощения лечение включает в себя комбинированное введение Wnt-связывающего средства настоящего изобретения и радиационной терапии. Лечение Wnt-связывающим средством может происходить до, совместно или после введения радиационной терапии. Для такой радиационной терапии могут быть использованы любые схемы дозировки, определенные практикующими специалистами.
[00211] В некоторых вариантах воплощения второе терапевтическое средство содержит антитело. Таким образом, лечение может включать комбинированное введение Wnt-связывающих средств настоящего изобретения с антителами против связанных с опухолью антигенов, включая, но не ограничиваясь этим, антитела, которые связываются с EGFR, ErbB2, HER2, DLL4 Notch, и/или VEGF. В качестве примера описаны анти-DLL4 антитела, например, в Патенте США №7750124, включенном в описание во всей полноте посредством ссылки. Дополнительные анти-DLL4 антитела описаны, например, в Международной Публикации Патента №WO 2008/091222 и WO 2008/0793326, и Публикации Заявки на Патент США под номерами США 2008/0014196, США 2008/0175847, США 2008/0181899 и США 2008/0107648, каждая из которых включена в описание во всей полноте посредством ссылки. В некоторых вариантах воплощения второе терапевтическое средство представляет собой антитело, которое является ингибитором ангиогенеза (например, анти-VEGF антитело). В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит SEQ ID №:53, а второе терапевтическое средство представляет собой анти-VEGF антитело. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит SEQ ID №:75, а второе терапевтическое средство представляет собой анти-VEGF антитело. В некоторых вариантах воплощения второе терапевтическое средство представляет собой ингибитор Notch сигналинга. В некоторых вариантах воплощения второе терапевтическое средство представляет собой анти-Notch антитело. Примеры анти-Notch антител описаны, например, в Публикации Заявки на Патент США №США 2008/0131434, включенной в описание во всей полноте посредством ссылки. В некоторых вариантах воплощения второе терапевтическое средство представляет собой бевацизумаб (AVASTIN), трастузумаб (HERCEPTIN), панитумумаб (VECTIBIX) или цетуксимаб (ERBITUX). Комбинированное введение может включать ко-введение либо в виде одного фармацевтического состава, либо с использованием отдельных составов, либо последовательное введение в любом порядке, но обычно - в пределах временного периода, за который все активные средства могут совместно проявить свою биологическую активность.
[00212] Кроме того, лечение может включать введение одного или нескольких цитокинов (например, лимфокинов, интерлейкинов, факторов некроза опухоли и/или факторов роста) или может сопровождаться хирургическим удалением опухоли или раковых клеток или любой другой терапией, которую считает необходимой лечащий врач.
[00213] Для лечения заболевания подходящая дозировка средства настоящего изобретения зависит от типа подвергаемого лечению заболевания, серьезности и течения заболевания, реактивности заболевания, от того, вводится средство с терапевтическими или же с профилактическими целями, от предыдущей терапии, истории болезни пациента и тому подобного, что полностью находится на усмотрении лечащего врача. Средство может вводиться однократно или в ходе лечения, продолжающегося от нескольких дней до нескольких месяцев, или пока лечение эффективно, или пока достигается снижение тяжести заболевания (например, уменьшается размер опухоли). Оптимальные схемы дозировки могут быть рассчитаны, исходя из количества препарата, аккумулирующегося в организме пациента, и будут варьировать в зависимости от соответствующей силы конкретного средства. Производящий введение терапевт может легко определить оптимальные дозировки, методы дозировки и интервалы между введениями. В некоторых вариантах воплощения дозировка составляет от 0,01 мкг до 100 мг на кг веса тела и может даваться один раз в день или чаще, раз в неделю или чаще, раз в месяц или чаще или раз в год или чаще. В некоторых вариантах воплощения дозировка растворимого рецептора или другого Wnt-связывающего средства составляет от примерно 0,1 мг до примерно 20 мг на кг веса тела. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство дается один раз каждую неделю. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство дается один раз каждые две недели или один раз каждые три недели. Лечащий врач может оценить интервалы между дозировками, основываясь на оценке времени удержания и концентрациях препарата в жидкостях или тканях тела.
[00214] Настоящее изобретение также представляет способы тестирования средств на эффективность подавления сигнального пути Wnt, на противоопухолевую активность и/или действие против стволовых раковых клеток. В некоторых вариантах воплощения способ заключается в сравннеии уровня одного или нескольких маркеров дифференцировки и/или одного или нескольких маркеров стволовости в первичной солидной опухоли (например, солидной опухоли, содержащей стволовые раковые клетки), которая подвергается действию средства, с уровнем одного или нескольких маркеров дифференцировки во вторичной солидной опухоли, которая не подвергается действию средства. В некоторых вариантах воплощения способ включает в себя: (а) подвергание действию средства первичной солидной опухоли, но не вторичной солидной опухоли; (б) оценку уровня одного или нескольких маркеров дифференцировки и/или одного или нескольких маркеров стволовости в первичной и вторичной солидных опухолях; и (в) сравнение уровня одного или нескольких маркеров дифференцировки в первичной солидной опухоли и уровня одного или нескольких маркеров дифференцировки во вторичной солидной опухоли. В некоторых вариантах воплощения (а) возросшие уровни одного или нескольких маркеров дифференцировки в первичной солидной опухоли по сравнению с уровнями одного или нескольких маркеров дифференцировки во вторичной солидной опухоли указывают на противоопухолевую активность (или действие против раковых стволовых клеток); и (б) снижающиеся уровни одного или нескольких маркеров стволовости указывают на противоопухолевую активность (или действие против раковых стволовых клеток). В некоторых вариантах воплощения средство связывается с одним или несколькими Wnt-белками. В некоторых вариантах воплощения средство представляет собой FZD растворимый рецептор. В некоторых способах средство представляет собой антитело, такое как анти-Wnt антитело.
[00215] Дополнительные способы тестирования средств включают, не ограничиваясь этим, способы, включающие сравнение уровней одного или нескольких маркеров дифференцировки первичной солидной опухоли, которая подвергается действию средства, с уровнями одного или нескольких маркеров дифференцировки во вторичной солидной опухоли, которая не подвергается действию средства. В некоторых вариантах воплощения способы включают в себя: (а) подвергание действию средства первичной солидной опухоли, но не вторичной солидной опухоли; (б) оценку уровня одного или нескольких маркеров дифференцировки в первичной и вторичной солидных опухолях; и (в) сравнение уровней одного или нескольких маркеров дифференцировки в первичной солидной опухоли с уровнями одного или нескольких маркеров дифференцировки во вторичной солидной опухоли. В некоторых вариантах воплощения средство представляет собой Wnt-связывающее средство. В некоторых вариантах воплощения средство представляет собой ингибитор канонического сигнального пути Wnt. В некоторых вариантах воплощения средство ингибирует связывание одного или нескольких Wnt-белков человека с одним или несколькими FZD рецепторами человека. В некоторых вариантах воплощения возросшие уровни одного или нескольких маркеров дифференцировки в первичной солидной опухоли по сравнению с уровнями одного или нескольких маркеров дифференцировки во вторичной солидной опухоли указывают на действие против стволовых клеток солидной опухоли (РСК). В некоторых альтернативных вариантах воплощения снизившиеся уровни одного или нескольких маркеров дифференцировки (например, негативных маркеров дифференцировки) в первичной солидной опухоли по сравнению с уровнями одного или нескольких маркеров дифференцировки во вторичной солидной опухоли указывают на действие против стволовых клеток солидной опухоли.
[00216] В некоторых вариантах воплощения солидная опухоль в способе тестирования представляет собой опухоль поджелудочной железы. В некоторых вариантах воплощения солидная опухоль представляет собой опухоль поджелудочной железы, и один или несколько маркеров дифференцировки могут включать в себя один или несколько муцинов (например, Mud 6), один или несколько цитокератинов (например, CK20) и/или хромогранин A (CHGA).
[00217] В некоторых альтернативных вариантах воплощения солидная опухоль в способе тестирования представляет собой опухоль ободочной кишки. В некоторых вариантах воплощения солидная опухоль представляет собой опухоль ободочной кишки, и один или несколько маркеров дифференцировки могут включать в себя один или несколько цитокератинов (например, цитокератин 7 или CK20).
[00218] В некоторых вариантах воплощения один или несколько маркеров стволовости, используемых в способах тестирования, описанных здесь, включают в себя ALDH1A1, АРС, AXIN2, BMI1, CD44, FGF1, GJB1, GJB2, HES1, JAG1, LGR5, LHX8, MYC, NANOG, NEUROD1, NEUROG2, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, PROCR, RARRES1, RARRES3, RBP2, SOX1, SOX2, ASCL2, TDGF1, OLFM4, MSI1, DASH1, ЕРНВ3 и/или ЕРНВ4. В некоторых вариантах воплощения два или более маркеров стволовости, три или более маркеров стволовости, четыре или более маркеров стволовости, пять или более маркеров стволовости, шесть или более или десять или более маркеров стволовости являются выбранными из группы, состоящей из: ALDH1A1, АРС, AXIN2, BMI1, CD44, FGF1, GJB1, GJB2, HES1, JAG1, LGR5, LHX8, MYC, NANOG, NEUROD1, NEUROG2, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, PROCR, RARRES1, RARRES3, RBP2, SOX1, SOX2, ASCL2, TDGF1, OLFM4, MSI1, DASH1, ЕРНВ3 и ЕРНВ4.
[00219] В некоторых вариантах воплощения один или более маркеров стволовости, используемых в способах тестирования, включают в себя ALDOB, BMP2, ВМР7, BMPR1B, СЕАСАМ5, СЕАСАМ6, CDX1, CDX2, CLCA2, COL1A2, COL6A1, CHGA, CSTA, CST4, CK20, DAB2, FABP4, GST1, KRT4, KRT7, KRT15, KRT17, KRT20, LAMA1, MUC3A, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC13, MUC15, MUC16, MUC17, NDRG2, PIP, PLUNC, SPRR1A, REG4, VSIG1 и/или XAF1. В некоторых вариантах воплощения два или более, три или более, четыре или более, пять или более, шесть или более или десять или более маркеров дифференцировки, используемых в способах тестирования, являются выбранными из группы, состоящей из: ALDOB, BMP2, ВМР7, BMPR1B, СЕАСАМ5, СЕАСАМ6, CDX1, CDX2, CLCA2, COL1A2, COL6A1, CHGA, CSTA, CST4, CK20, DAB2, FABP4, GST1, KRT4, KRT7, KRT15, KRT17, KRT20, LAMA1, MUC3A, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC13, MUC15, MUC16, MUC17, NDRG2, PIP, PLUNC, SPRR1A, REG4, VSIG1 и XAF1.
[00220] Другие потенциальные маркеры дифференцировки для опухолей поджелудочной железы и ободочной кишки, так же, как других типов опухолей, известны специалистам в данной области техники. Кроме того, практическая пригодность потенциальных маркеров дифференцировки в способах тестирования может быть легко оценена специалистом путем лечения желаемого типа опухоли одним или несколькими растворимыми рецепторами FZD, описанными здесь, такими как FZD8-Fc, и затем оценена на изменения в экспрессии маркеров в подвергаемой лечению опухоли по сравнению с контролем. Не являющиеся ограничением примеры таких способов можно найти в конкретных Примерах ниже.
[00221] Настоящее изобретение также представляет способы для производства растворимых Wnt-связывающих средств. В некоторых вариантах воплощения способ включает производство в клетке растворимого Wnt-связывающего средства, которое содержит домен Fri человеческого FZD8, в котором по меньшей мере 80% Wnt-связывающего средства имеет N-терминальную последовательность ASA, включая использование сигнальной последовательности, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID №:71, SEQ ID №:70, SEQ ID №:72, SEQ ID №:73, и SEQ ID №:74. В некоторых вариантах воплощения способа сигнальная последовательность представляет собой SEQ ID №:71. В некоторых вариантах воплощения по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95% или по меньшей мере примерно 98% Wnt-связывающего средства имеет N-терминальную последовательность ASA. В некоторых вариантах воплощения клетка представляет собой клетку млекопитающего. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит человеческий участок Fc. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID №:53, SEQ ID №:50, SEQ ID №:46, SEQ ID №:48 и SEQ ID №:1. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит SEQ ID №:53. В некоторых вариантах воплощения Wnt-связывающее средство содержит SEQ ID №:50. В некоторых вариантах воплощения клетка содержит полинуклеотид, содержащий полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий последовательность SEQ ID №:75.
ПРИМЕРЫ
[00222] Следует понимать, что примеры и варианты воплощения изобретения, описанные здесь, приводятся только с иллюстративными целями и что их различные модификации или изменения в в пределах изобретения будут предлагаться специалистами, и они включены в описание в соответствии с сущностью и областью данной заявки.
ПРИМЕР 1
Производство FZD8-Fc
[00223] кДНК, кодирующая FZD8-Fc (54F03), была субклонирована в рЕЕ14.4 экспрессионный вектор (Lonza), расщепленный посредством HindIII и EcoRI. После клонирования pEE14.4-FZD8-Fc ДНК была линеаризирована посредством расщепления PvuI и затем вставлена в GS-CHOK1 клетки при помощи электропорации с использованием стандартной процедуры. Стабильные клоны, экспрессирующие FZD8-Fc, были получены и увеличены в числе в среде без сыворотки. FZD8-Fc был очищен путем аффинного захвата с использованием конъюгата смолы с белком А. SDS-PAGE анализы показали чистоту выше чем 98%, а концентрация эндотоксина была ниже чем 1 МЕ/мг белка.
[00224] Аминокислотная последовательность FZD8-Fc представляет собой SEQ ID №:1, а нуклеотидная последовательность, кодирующая FZD8-Fc, представляет собой SEQ ID №:2.
ПРИМЕР 2
Фармакокинетика FZD8-Fc у крыс
[00225] Фармакокинетика FZD8-Fc (54F03) оценивалась у крыс в двухнедельном фармакокинетическом (ФК) исследовании с использованием доз 2 мг/кг и 10 мг/кг. Крысы линии Спраг-Доули, пять самцов в каждой группе, получили дозу FZD8-Fc в хвостовую вену 2 мг/кг или 10 мг/кг, и затем в течение двух недель брались пробы во временных точках 1, 24, 48, 72, 96, 168, 240 и 336 часов. В каждой временной точке 1 мл крови собирался в пробирки с калием-EDTA и центрифугировался. Супернатанты плазмы отбирались и замораживались до момента анализа проб.
[00226] Измерялась концентрация FZD8-Fc гибридного белка, присутствующего в плазме в каждой временной точке, и подсчитывался период полувыведения FZD8-Fc для двух доз. Как показано на Фигуре 1, период полувыведения FZD8-Fc оценивался в 163 часа при 2 мг/кг и в 157 часов при 10 мг/кг.
ПРИМЕР 3
Противоопухолевая активность FZD8-Fc в модели поджелудочной железы
3
2
[00227] Подавление роста опухоли посредством FZD8-Fc в модели поджелудочной железы. Противоопухолевая активность FZD8-Fc (54F03) оценивалась по ксенотрансплантанту PN4 опухоли поджелудочной железы. Дисеоциированные OMP-PN4 клетки (50000 на животное) были введены путем подкожной инъекции самцам NOD/SCID мышей в возрасте 6-8 недель. Рост опухоли отслеживался еженедельно, и измерения опухоли начинались с момента, когда опухоли становились пальпируемыми. На 50 день мыши со средним объемом опухолей 137 мм были рандомально разделены на 4 группы по 10 животных в каждой. Животным было введено контрольное антитело, FZD8-Fc (15 мг/кг), гемцитабин (2 мг/кг) или комбинация FZD8-Fc и гемцитабина. Введение FZD8-Fc и гемцитабина проводилось путем инъекции во внутрибрюшинную полость один раз в неделю (гемцитабин) или два раза в неделю (FZD8-Fc). Опухоли измерялись два раза в неделю, и объем опухоли определялся по формуле ½ (а×b); где а = длина, а b = ширина. Данные представлялись как среднее и среднее ±S.E.M. Средние значения по группам сравнивались с использованием двустороннего t-критерия Стьюдента для независимых выборок. Значения вероятности (р)<0,05 считались достоверно различными.
[00228] Обработка FZD8-Fc приводила к 66% уменьшению роста опухоли, как показано на Фигуре 2 (р<0,001). Кроме того, обработка FZD8-Fc и гемцитабином приводила к 29% уменьшению роста опухоли по сравнению с FZD8-Fc в отдельности (р=0,04 по сравнению с FZD8-Fc в отдельности) (Фигура 2). Таким образом, FZD8-Fc демонстрировал противоопухолевую активность в PN4 модели поджелудочной железы как сам по себе, так и в комбинации с гемцитабином.
[00229] Уменьшение CD44hi популяции в PN4 опухолях, обработанных FZD8-Fc. Контрольные и обработанные опухоли из OMP-PN4 исследования на ксенотрансплантанте, описанном выше, были извлечены в конце исследования (день 85). Опухоли были обработаны и диссоциированы на отдельные клетки. Суспензии одиночных клеток, полученные из 5 опухолей в каждой группе, были объединены, и объединенные образцы затем инкубировались на льду в течение 30 минут с антителами, которые избирательно связываются с мышиными клетками (α-мышиный CD45-биотин, разведение 1:200, и крысиный α-мышиный H2Kd-биотин, разведение 1:100, BioLegend, Сан-Диего, Калифорния), после чего к ним добавлялись покрытые стрептавидином магнитные шарики (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). Мышиные клетки удалялись с помощью магнита. Для анализа поверхностных маркеров человеческих клеток суспензия одиночных клеток опухоли окрашивалась анти-ESA (Biomeda, Hayward, СА) и анти-CD44 (BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния) антителами, которые были конъюгированы с флюорохромами. Мертвые клетки исключались благодаря использованию прижизненного красителя DAPI. Проточная цитометрия проводилась с использованием инструмента FACS Aria (Becton Dickinson, Franklin Lakes, Нью Йорк). Боковое светорассеяние и профили прямого рассеяния использовались для исключения агглютинированных клеток.
[00230] Анализы опухолей, обработанных контрольным антителом, показали, что 12,7% от общей массы популяции опухолевых клеток экспрессировали как ESA, так и CD44 в высоких уровнях. Выборка с двойным позитивным ответом не увеличивалась достоверно при обработке одним гемцитабином (13,9%), как показано на Фигуре 3, но обработка FZD8-Fc или комбинацией FZD8-Fc с гемцитабином уменьшала выборку с двойным позитивным ответом (1,9% и 1,7%, соответственно).
[00221] Анализы PN4 опухолей, обработанных FZD8-Fc, по методу предельного разведения. Методы предельного разведения (LDA) можно использовать для оценки действия терапевтических средств на раковые стволовые клетки солидной опухоли и на онкогенность опухоли, содержащей раковые стволовые клетки. Такие методы можно использовать для определения частоты встречаемости раковых стволовых клеток в опухолях из животных, обработанных FZD8-Fc гибридным белком или другим средством, и для сравнения ее с частотой встречаемости раковых стволовых клеток из опухолей контрольных животных.
[00232] Контрольные и обработанные опухоли из исследования на PN4 ксенотрансплантате, описанном выше, были извлечены в конце исследования (день 85). Опухоли были обработаны и диссоциированы на отдельные клетки. Суспензии отдельных клеток, полученные из 5 опухолей каждой опытной группы, были объединены, и объединенные пробы затем инкубировались на льду в течение 30 минут с антителами, которые избирательно связывают мышиные клетки (α-мышиный CD45-биотин, разведение 1:200, и крысиный α-мышиный H2Kd-биотин, разведение 1:100, BioLegend, San Diego, CA), после чего добавлялись покрытые стрептавидином магнитные шарики (Invitrogen, Carlsbad, CA). Мышиные клетки удалялись с помощью магнита. Человеческие клетки в суспензии извлекались, подсчитывались и окрашивались маркерами клеточной поверхности, и подходящие дозы клеток (30, 90 и 270 клеток) в FACS буфере смешивались в пропорции 1:1 с Matrigel и вводились путем подкожной инъекции NOD/SCID мышам (10 мышей на клеточную дозу на опытную группу). Опухолям позволяли расти в течение 4 месяцев.
[00233] В заданной временной точке процент мышей с поддающимися обнаружению опухолями определялся во всех группах, получивших инъекцию обработанными FZD8-Fc опухолевыми клетками, и сравнивался с процентом мышей с поддающимися обнаружению опухолями в контроле. Например, определялось число мышей, получивших инъекцию 125 обработанными антителами опухолевыми клетками, у которых были обнаружены опухоли, и сравнивалось с числом мышей, получивших инъекцию 125 обработанными FZD8-Fc опухолевыми клетками, у которых были обнаружены опухоли.
[00234] На 75 день после инъекции клеток доли опухолей в различных группах были следующими: контроль - 7 мышей из 30 мышей; FZD8-Fc - 3 мышей из 30 мышей; гемцитабин - 7 мышей из 30 мышей; FZD8-Fc и гемцитабин - 0 мышей из 30 мышей (Фигура 4). Уменьшенная доля опухолей в FZD8-Fc и в комбинационной опытных группах показывала, что частота встречаемости раковых стволовых клеток уменьшалась в PN4 опухолях поджелудочной железы под воздействием FZD8-Fc. Данные, полученные при оценке как экспрессии CD44, так и анализа с помощью предельного разведения показал, что обработка FZD8-Fc уменьшает частоту встречаемости раковых стволовых клеток в PN4 опухолях поджелудочной железы.
[00235] Частота встречаемости раковых стволовых клеток (РСК) может быть подсчитана с использованием программы L-CalcTM (StemCell Technologies Inc.; www.stemcell.com). Коротко говоря, основываясь на статистике Пуассона, среди известного числа вводимых с помощью инъекции клеток присутствует именно одна раковая клетка, если у 37% животных опухоли не развиваются. Частота встречаемости РСК в контрольной обработанной антителами группе была 1:280, частота встречаемости РСК в обработанной гемцитабином группе была 1:476, частота встречаемости РСК в обработанной FZD8-Fc группе была 1:881 и подсчитанная частота встречаемости РСК в обработанной комбинацией FZD8-Fc и гемцитабина группе была ниже чем 1:3763. Это число невозможно было точно оценить, поскольку доля опухолей в этой группе равнялась нулю, даже при наиболее высокой дозе клеток.
ПРИМЕР 4
Возросшая клеточная дифференцировка в опухолях поджелудочной железы, обработанных FZD8-Fc
[00236] Возросшая клеточная дифференцировка в PN4 и PN8 опухолях, обработанных FZD8-Fc. Контрольные и обработанные опухоли из исследования ксенотрансплантатов OMP-PN4 (Пример 3) были взяты в конце исследования (день 85). Опухоли были зафиксированы в формалине, залиты в парафин, и были сделаны срезы опухоли толщиной 4 мкм. После депарафинизации и гидратации срезы были обработаны водным раствором уксусной кислоты в течение 5 минут при комнатной температуре. Срезы затем были обработаны 1% альциановым синим в 3% водном растворе уксусной кислоты в течение 30 минут и промыты водой. Срезы были окрашены нейтральным красным, дегидратированы и из них приготовлялись препараты. При использовании этого метода сиаломуцин в образцах ткани окрашивался синим, а окружающий фон выглядел розовым или красным.
[00237] Обработка PN4 опухолей FZD8-Fc приводила к возрастанию в клетках экспрессии сиаломуцинов по сравнению с опухолями, обработанными контрольным антителом или гемцитабином (Фигура 5, где сиаломуцины отмечены темно-серым). Комбинированное воздействие FZD8-Fc и гемцитабина также увеличивало экспрессию сиаломуцинов в PN4 опухолях поджелудочной железы. Следовательно, FZD8-Fc обработка PN4 опухолей увеличивала встречаемость муцин-экспрессирующих дифференцированных клеток. Подобные результаты наблюдались в модели ксенотрансплантатов PN8 опухоли поджелудочной железы (Фигура 6).
3
[00238] Возросшая клеточная дифференцировка PN13 опухолей при обработке FZD8-Fc. Способность FZD8-Fc вызывать дифференцировку клеток также оценивалась по модели ксенотрансплантатов OMP-PN13 опухоли поджелудочной железы. Диссоциированные OMP-PN13 клетки (50000 на животное) были введены путем подкожной инъекции самцам NOD/SCID мышей в возрасте 6-8 недель. Рост опухоли отслеживался еженедельно, и измерения опухоли начинались с момента, когда опухоли становились пальпируемыми. На 40 день мыши со средним объемом опухолей 114 мм были рандомально разделены на 4 группы по 10 животных в каждой. Животным было введено контрольное антитело или FZD8-Fc (15 мг/кг). Введение FZD8-Fc и контрольного антитела проводилось путем инъекции во внутрибрюшинную полость два раза в неделю. После 19 дней с начала опыта опухоли извлекались хирургическим путем, и проводился иммуногистохимический анализ с использованием стандартных техник. Вкратце, опухоли были зафиксированы в формалине, залиты в парафин, и были сделаны срезы опухоли толщиной 4 мкм. После депарафинизации и гидратации срезы опухолей обрабатывались антигеном в Tris буфере (рН 9,5). Срезы инкубировались с перекисью водорода (Sigma-Aldrich, St Louis, МО) 10 минут, чтобы блокировать эндогенные пероксидазы. К каждому срезу добавляли анти-йб7 антитело (Dako, клон MIB-1) в разведении 1:200 в блокирующем буфере (3% NHS, 1% BSA, 0,1% Tween-20, в PBS) и инкубировали в течение 1 часа. Срезы промывались 3 раза в PBST, по 5 минут каждый. К срезам добавляли анти-мышиное вторичное антитело, конъюгированное с HRP (ImmPRESS™ anti-mouse, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA), и инкубировали в течение 30 минут. После нескольких промываний PBST добавлялся Vector Nova Red субстрат (Vector Laboratories Inc., Бурлингем, Калифорния) для локализации Ki67 антигена. Срезы обрабатывались водным раствором уксусной кислоты в течение 5 минут при комнатной температуре. Срезы затем обрабатывались 1% альциановым синим в 3% водном растворе уксусной кислоты в течение 30 минут и промывались водой. Срезы были окрашены нейтральным красным, дегидратированы и из них приготавливались препараты. При использовании этого метода сиаломуцины в образцах ткани окрашивались синим, а пролиферирующие клетки метились темно-красным.
[00239] Обработка PN13 опухолей FZD8-Fc приводила к возрастанию в клетках экспрессии сиаломуцинов по сравнению с опухолями, обработанными контрольным антителом. Обработка PN13 опухолей FZD8-Fc также приводила к снижению числа пролиферирующих клеток, что было показано по экспрессии Ki67. На Фигуре 7 представлено отчетливое снижение числа пролиферирующих клеток (показанных черными точками) в ткани из обработанных FZD8-Fc опухолей. Следовательно, обработка PN13 опухолей FZD8-Fc уменьшала клеточную пролиферацию и увеличивала частоту встречаемости экспрессирующих муцин-дифференцированных клеток.
[00240] Увеличение окрашенного Mud 6 в Рп13 опухолях, обработанных FZD8-Fc. Опухолевые срезы из PN13 опухолей, обработанных контрольным антителом или FZD8-Fc, были получены и обработаны, как описано выше. В этом примере анти-Мис16 (Abeam, Cambridge, MA) антитело в блокирующем буфере при разведении 1:200 (3% NHS, 1% BSA, 0,1% Tween-20 в PBS) было добавлено к каждому срезу, и срезы инкубировались в течение 1 часа. Связанное антитело определялось с использованием иммуногистохимического протокола, описанного выше.
[00241] Обработка PN13 опухолей FZD8-Fc приводила к возрастанию экспрессии Мис16 в клетках по сравнению с опухолями, обработанными контрольным антителом (Фигура 8, темная окраска).
[00242] Увеличение окрашенных CK20 в Pn13 опухолях, обработанных FZD8-Fc. Опухолевые срезы были получены и обработаны, как описано выше. В этом примере анти-CK20 (клон Ks20.8, Dako, Carpinteria, Калифорния) антитело в блокирующем буфере при разведении 1:200 (3% NHS, 1% BSA, 0,1% Tween-20 в PBS) было добавлено к каждому срезу, и срезы инкубировались в течение 1 часа. Связанное антитело определялось с использованием иммуногистохимического протокола, описанного выше.
[00243] Обработка PN13 опухолей FZD8-FC приводила к возрастанию экспрессии CK20 в клетках по сравнению с опухолями, обработанными контрольным антителом (Фигура 9, темная окраска).
ПРИМЕР 5
Подавление роста опухоли молочной железы in vivo при помощи FZD8-FC
3
[00244] Диссоциированные клетки РЕ13 опухоли молочной железы (50000 на животное) были введены путем подкожной инъекции в жировую ткань молочной железы NOD/SCID мышей. Рост опухоли отслеживался еженедельно, и опухолям давали расти, пока они не достигали примерно 106 мм. На 27 день после инъекции клеток мыши были рандомально разделены на четыре группы (n=10 мышей на группу) и обработаны контрольным антителом, FZD8-FC (54F03), таксолом или комбинацией FZD8-FC и таксола. Таксол вводился внутрибрюшинно в дозе 7,5 мг/кг один раз в неделю, a FZD8-FC вводился внутрибрюшинно в дозе 5 мг/кг два раза в неделю. Опухоли измерялись на днях, показанных на Фигуре 10.
[00245] Наблюдалось, что обработка одним FZD8-FC уменьшает рост опухоли на 20% (р=0,002) по сравнению с контрольной группой, обработанной антителом. Кроме того, обработка комбинацией fzds-fc и таксола уменьшала рост опухоли на 55% (р=0,003) по сравнению с обработкой одним таксолом (Фигура 10).
ПРИМЕР 6
Подавление роста опухоли ободочной кишки in vivo при помощи FZD8-FC
[00246] Анализировалось влияние многократных доз и дозового режима FZD8-FC (54F03) на рост ксенотрансплантатов С28 опухоли ободочной кишки. Диссоциированные С28 клетки (10000 на животное) были введены путем подкожной инъекции самцам NOD/SCID мышей в возрасте 6-8 недель. На 2 день мыши были рандомально разделены на 6 групп по 10 животных в каждой. Животным было введено или контрольное антитело, или FZD8-FC в дозах 1,5 мг/кг (два раза в неделю), 5 мг/кг (один раз и два раза в неделю) и 15 мг/кг (один раз и два раза в неделю). Введение антитела и FZD8-FC проводилось путем инъекции во внутрибрюшинную полость. Рост опухоли контролировался еженедельно, и измерения опухоли начинались с того момента, когда опухоли становились пальпируемыми. Опухоли измерялись два раза в неделю, и объем опухоли определялся, как описано здесь.
[00247] Обработка 15 мг/кг FZD8-FC (два раза в неделю) приводила к 83% уменьшению роста опухоли по сравнению с контрольным антителом, как показано на Фигуре НА (р<0,001). Кроме того, обработка FZD8-FC в самой низкой оцениваемой дозе (1,5 мг/кг вводились два раза в неделю) также приводила к 52% уменьшению роста по сравнению с контрольной группой, обработанной антителом (Фигура НА). Таким образом, FZD8-Fc демонстрировал противоопухолевую активность в ОМР-С28 модели опухоли ободочной кишки при использовании его без других средств дозозависимым образом.
3
[00248] Анализировалось влияние FZD8-Fc в комбинации с химиотерапевтическим средством на рост ксенотрансплантатов С28 опухоли ободочной кишки. Диссоциированные клетки С28 опухоли ободочной кишки (10000 на животное) были введены путем подкожной инъекции самцам NOD/SCID мышей в возрасте 6-8 недель. Опухолям давали расти в течение 21 дней, пока они не достигали объема примерно 128 мм. Мыши были рандомально разделены (n=10 мышей на группу) и обработаны FZD8-Fc (54F03) (15 мг/кг один раз в неделю), иринотеканом (15 мг/кг один раз в неделю), комбинацией FZD8-Fc и иринотекана или контрольным антителом. Введение FZD8-Fc, иринотекана и контрольного антитела проводилось путем инъекции во внутрибрюшинную полость. Рост опухолей контролировался еженедельно, и объемы опухолей измерялись электронными циркулями в указанных временных точках. Данные выражались как среднее ±S.E.M.
[00249] Как показано на Фигуре 11 В, обработка FZD8-Fc как одиночным средством (--) приводила к 66% уменьшению роста опухоли по сравнению с обработкой контрольным антителом (--) (р<0,001). Кроме того, обработка FZD8-Fc в комбинации с иринотеканом (-●-) приводила к 76% уменьшению роста по сравнению с контрольной группой, обработанной антителом (р<0,001), что было выше, чем при действии любого средства поодиночке. Таким образом, FZD8-Fc продемонстрировал отрицательное влияние на рост ОМР-С28 опухоли как одиночное средство, а также в комбинации с химиотерапевтическим средством.
ПРИМЕР 7
Возрастание клеточной дифференцировки в опухолях ободочной кишки под действием FZD8-Fc
[00250] Возрастание окрашенных CK20 в С28 опухолях, обработанных FZD8-Fc. Контрольные и обработанные опухоли из исследования ксенотрансплантатов С28, описанного выше (Пример 6), были взяты в конце исследования. Опухоли были извлечены хирургическим путем, и был произведен иммуногистохимический анализ с использованием стандартных технологий. Вкратце, опухоли фиксировались в формалине, заливались в парафин и были сделаны срезы опухолей толщиной 4 мк. После депарафинизации и гидратации срезы опухолей обрабатывались антигеном в Tris буфере (рН 9,5). Срезы инкубировались с перекисью водорода (Sigma-Aldrich, St Louis, МО) в течение 10 минут для блокировки эндогенных пероксидаз. Анти-CK20 (клон Ks20.8, Dako, Carpinteria, Калифорния) антитело в блокирующем буфере при разведении 1:200 (3% NHS, 1% BSA, 0,1% Tween-20 в PBS) было добавлено к каждому срезу, и срезы инкубировались в течение 1 часа. Срезы промывались 3 раза в PBST, по 5 минут каждый. Антимышиное вторичное антитело, конъюгированное с HRP (ImmPRESS™ анти-мышь Ig, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) было добавлено к срезам, и срезы инкубировались в течение 30 минут. После нескольких промываний PBST субстрат Vector Nova Red (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) был добавлен для локализации CK20 антигена.
[00251] Обработка С28 опухолей FZD8-Fc приводила к возрастанию в клетках экспрессирующегося CK20 по сравнению с опухолями, обработанными контрольным антителом (Фигура 12, темная окраска).
ПРИМЕР 8
Противоопухолевая активность FZD8-Fc в модели опухоли поджелудочной железы
3
[00252] Подавление роста опухоли воздействием FZD8-Fc в PN21 модели опухоли поджелудочной железы. Противоопухолевая активность FZD8-Fc (54F03) оценивалась на модели ксенотрансплантата в PN21 опухоли поджелудочной железы. Диссоциированные OMP-PN21 клетки (50000 на животное) были введены путем подкожной инъекции самцам NOD/SCID мышей в возрасте 6-8 недель. Рост опухоли отслеживался еженедельно, и измерения опухоли начинались с момента, когда опухоли становились пальпируемыми. На 36 день мыши со средним объемом опухоли 144 mm были рандомально разделены на 4 группы по 9 животных в каждой. Животным делали инъекцию контрольного антитела, FZD8-Fc (15 мг/кг), гемцитабина (2 мг/кг) или комбинации FZD8-Fc и гемцитабина. Введение FZD8-Fc и гемцитабина осуществлялось путем инъекции во внутрибрюшинную полость один раз в неделю. Опухоли измерялись два раза в неделю, и объем опухоли определялся, как описано выше.
[00253] Обработка FZD8-Fc приводила к 66% уменьшению роста опухоли по сравнению с контролем, как показано на Фигуре 13А (р<0,001). Кроме того, обработка комбинацией FZD8-Fc и гемцитабина приводила к большему уменьшению роста опухоли по сравнению с действием каждого средства по отдельности (р=0,001 по сравнению с гемцитабином). Таким образом, FZD8-Fc демонстрировал противоопухолевую активность в PN21 модели опухоли поджелудочной железы как без других средств, так и в комбинации с гемцитабином.
[00254] Анализы PN21 опухолей, обработанных FZD8-Fc, по методу предельного разведения. Как описано выше в Примере 3, метод предельного разведения использовался для оценки влияния обработки как одним FZD8-Fc, так и в комбинации с гемцитабином на раковые стволовые клетки солидной опухоли в PN21 модели опухоли поджелудочной железы.
[00255] Контрольные и обработанные опухоли из исследования на PN21 ксенотрансплантате, описанном выше, были извлечены в конце исследования. Опухоли были обработаны и диссоциированы на отдельные клетки. Суспензии отдельных клеток, полученные из 5 опухолей каждой опытной группы, были объединены, и объединенные пробы затем инкубировались на льду в течение 30 минут с антителами, которые избирательно связывают мышиные клетки (а-мышиный CD45-биотин, разведение 1:200, и крысиный α-мышиный H2Kd-биотин, разведение 1:100, BioLegend, Сан-Диего, Калифорния), после чего добавлялись покрытые стрептавидином магнитные шарики (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). Мышиные клетки удалялись с помощью магнита. Человеческие клетки в суспензии извлекались, подсчитывались и окрашивались маркерами клеточной поверхности, и подходящие дозы клеток (30, 90 и 270 клеток) в FACS буфере смешивались в пропорции 1:1 с Matrigel и вводились путем подкожной инъекции NOD/SCID мышам (10 мышей на клеточную дозу на опытную группу). Опухолям позволяли расти в течение 4 месяцев.
[00256] В заданной временной точке процент мышей с поддающимися обнаружению опухолями определялся во всех группах, получивших инъекцию обработанными опухолевыми клетками, и сравнивался с процентом мышей с поддающимися обнаружению опухолями в контроле. Например, определялось число мышей, получивших инъекцию 125 обработанными антителами опухолевыми клетками, у которых были обнаружены опухоли, и сравнивалось с числом мышей, получивших инъекцию 125 обработанными FZD8-Fc опухолевыми клетками, у которых были обнаружены опухоли.
[00257] На 72 день после инъекции клеток определялись доли опухолей в различных группах, а частота встречаемости раковых стволовых клеток подсчитывалась с использованием программы L-CalcTM (StemCell Technologies Inc.; www.stemcell.com). Как показано на Фигуре 13В, обработка FZD8-Fc уменьшала частоту встречаемости раковых стволовых клеток до 1:976, приблизительно в четыре раза меньше по сравнению с обработкой контрольным антителом. Напротив, обработка гемцитабином слегка повышала частоту встречаемости раковых стволовых клеток. Что особенно важно, обработка комбинацией FZD8-Fc и гемцитабина уменьшала частоту встречаемости раковых стволовых клеток до 1:5472, почти в 25 меньше по сравнению с обработкой в контроле. Неожиданно, что обработка комбинацией FZD8-Fc и гемцитабина уменьшала частоту встречаемости раковых стволовых клеток в 5,5 раз больше, чем обработка одним FZD8-Fc, несмотря на тот факт, что гемцитабин, по видимости, фактически повышает частоту встречаемости раковых стволовых клеток.
ПРИМЕР 9
[00258] Возросшая клеточная дифференцировка в PN21 опухолях, обработанных FZD8-Fc. Способность FZD8-Fc вызывать дифференцировку клеток также оценивалась по модели ксенотрансплантатов OMP-PN21 опухоли поджелудочной железы. Опухоли PN21 из исследований, описанных в Примере 8, извлекались и фиксировались в формалине, заливались в парафин и были сделаны срезы опухолей толщиной 4 мк. После депарафинизации и гидратации срезы опухолей обрабатывались антигеном в Tris буфере (рН 9,5). Срезы инкубировались с перекисью водорода (Sigma-Aldrich, St Louis, МО) 10 минут, чтобы блокировать эндогенные пероксидазы. К каждому срезу добавляли анти-Ki67 антитело (клон MIB-1, Dako, Carpinteria, CA) в блокирующем буфере (3% NHS, 1% BSA, 0,1% Tween-20 в PBS) при разведении 1:200 и инкубировали в течение 1 часа. Срезы промывались 3 раза в PBST, по 5 минут каждый. К срезам добавляли анти-мышиное вторичное антитело, конъюгированное с HRP (ImmPRESS™ антимышь, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA), и инкубировали в течение 30 минут. После нескольких промываний PBST добавлялся Vector Nova Red субстрат (Vector Laboratories Inc., Бурлингем, Калифорния) для локализации Ki67 антигена. Срезы обрабатывались водным раствором уксусной кислоты в течение 5 минут при комнатной температуре. Срезы затем обрабатывались 1% альциановым синим в 3% водном растворе уксусной кислоты в течение 30 минут и промывались водой. Срезы были окрашены нейтральным красным, дегидратированы, и из них приготовлялись препараты. При использовании этого метода сиаломуцины в образцах ткани окрашивались синим, а пролиферирующие клетки метились темно-красным.
[00259] Обработка PN21 опухолей FZD8-Fc приводила к возрастанию в клетках экспрессии сиаломуцинов по сравнению с опухолями, обработанными контрольным антителом (Фигура 14, окраска темно-серым). Обработка PN21 опухолей FZD8-Fc или fzd-fc в комбинации с гемцитабином также приводила к увеличению клеток, экспрессирующих сиаломуцины, по сравнению с опухолями, обработанными контрольным антителом или одним гемцитабином (Фигура 15). Обработка PN21 опухолей FZD8-Fc или комбинацией FZD8-Fc и гемцитабина также приводила к уменьшению числа пролиферирующих клеток, что было показано экспрессией Ki67. Следовательно, обработка PN21 опухолей FZD8-Fc как в отдельности, так и в комбинации с гемцитабином уменьшала клеточную пролиферацию и увеличила частоту встречаемости экспрессирующих муцин дифференцированных клеток.
ПРИМЕР 10
Производство FZD8-Fc вариантов
[00260] Производство FZD8-Fc вариантов. FZD8-Fc варианты были произведены ДНК2.0 (Menlo Park, Калифорния). DNA2.0 синтезировались, и собирались короткие однонитевые олигонуклеотиды для производства различных вариантов FZD8-Fc белка, 54F05, 54F08, 54F09, 54F12, 54F13, 54F14, 54F15, 54F16, 54F17, 54F18, 54F19, 54F20, 54F21 и 54F22. Собранные олигонуклеотиды затем клонировались, и последовательность проверялась.
ПРИМЕР 11
Подавление Wnt сигналинга вариантами FZD8-Fc
[00261] Способность вариантов FZD8-Fc блокировать или подавлять активацию сигнального пути Wnt определялась in vitro с использованием люциферазного анализа по гену-репортеру. STF293 клетки культивировались в DMEM с добавкой антибиотиков и 10% FCS. STF293 клетки стабильно трансфицировались в репортерный вектор, содержащий семь копий TCF-транскрипционного К заявке №2012130364 «отвечающего элемента», связанного с промотором перед светящимся люциферазным репортерным геном. Этот конструкт измеряет активность канонического сигнального пути Wnt. Клетки добавлялись к культуральным планшетам в количестве 10000 клеток на лунку. После инкубации в течение ночи FZD8-Fc варианты или контрольные мышиные JAGl-Fc добавлялись в комбинации с Wnt3a-содержащей средой. Варианты FZD8-Fc и JAG1-Fc использовались в концентрациях 20, 4, 0,8, 0,16, 0,03, 0,006, 0,0012 и 0,0003 мкг/мл. Клетки инкубировались в 25% Wnt3a-содержащей среде, приготовленной из L-клеток, которые стабильно экспрессируют Wnt3a. После инкубации в течение ночи (примерно 18 часов) уровни люциферазы измерялись с использованием Steady-Glo набора для люциферазного анализа (Promega, Madison, WI).
[00262] Определялась блокирующая активность вариантов FZD8-Fc. Она представлена в Таблице 3 как сравнительная активность по сравнению с эталонным стандартом для каждого метода, который был взят за 100%.
Таблица 3
FZD8-Fc Вариант
% Сравнительной актвности
54F03
107, 143
54F05
167
54F08
137
54F09
156, 157
54F12
52
54F13
103
54F14
125
54F15
128
54F16
125
ПРИМЕР 12
Фармакокинетика вариантов FZD8-Fc
[00263] Фармакокинетика нескольких вариантов FZD8-Fc оценивалась у крыс в двухнедельном исследовании фармакокинетики (PK). Оцениваемыми вариантами FZD8-Fc были 54F03, 54F09, 54F12, 54F13, 54F15 и 54F16. Крысы линии Спраг-Доули, пять самцов в каждой группе, получили дозу FZD8-Fc в хвостовую вену 10 мг/кг, и затем в течение двух недель брались пробы во временных точках 1, 24, 48, 72, 96, 168, 240 и 336 часов. В каждой временной точке 1 мл крови собирался в пробирки с калием-EDTA и центрифугировался. Супернатанты плазмы отбирались и замораживались до момента анализа проб.
[00264] Определялся уровень варианта белка FZD8-Fc, представленный в плазме в каждой временной точке, и подсчитывался период полувыведения для каждого варианта FZD8-Fc. Периоды полувыведения вариантов FZD8-Fc показаны в Таблице 4.
Таблица 4
Вариант FZD8
t<sub>1/2</sub> в часах
Fc участок
54F03
162
IgG1
54F09
136
IgG1
54F12
152
IgG2
54F13
268
IgG2
54F15
109
IgG1
54F16
154
IgG1
ПРИМЕР 13
Фармакокинетика вариантов FZD8-Fc у яванских макак
[00265] Четыре молодых, ранее не участвовавших в экспериментах взрослых самца яванских макак были рандомально разделены на две группы по два, и им делалось внутривенное (IV) болюсное введение fzd-fc варианта 54F15 или варианта 54F16 в дозе 30 мг/кг. Дважды в день (до полудня и после полудня) животных осматривали на смертность и признаки боли и недомогания. Один раз в день делался осмотр внутри клетки по общему здоровью и внешнему виду. В день введения средства каждое животное обследовалось на смертность и признаки боли и недомогания примерно через 1 чае и 4 часа после введения средства. Записывались любые необычные наблюдения, отмеченные в ходе исследования. Вес тела измерялся в день введения средства и в конце сбора проб крови. Кровь (примерно 0,5 мл) бралась из бедренной вены посредством шприца и иглы и переносилась в пробирки, содержащие EDTA КЗ антикоагулянт, перед введением средства и на 1, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 168, 240 и 336 часы после введения средства для ФК анализов. Кроме того, кровь (примерно 0,5 мл) бралась из бедренной вены посредством шприца и иглы и переносилась в пробирки, содержащие антикоагулянт, перед введением средства и на 336 часы после введения средства для анализов антител к препарату (ADA). Супернатанты плазмы отбирались и замораживались до момента анализа проб. HTRF (гомогенная флюорецсценция с временным разрешением) иммуноанализы проводились для определения концентрации fzd-fc в образцах плазмы животных для ФК анализов и концентрации антитела к препарату в сыворотке. Концентрация fzd-fc в плазме в связи со временем анализировалась по методу анализа без компартентализации (NCA) с помощью Phoenix™ WinNonlin Version 6.0 с использованием модели введения болюса IV.
[00266] Измерялась концентрация вариантов FZD8-Fc, присутствующих в плазме в каждой временной точке (Фигура 16), и подсчитывался период полувыведения FZD8-Fc вариантов 54F15 и 54F16. Как показано в Таблице 5, период полувыведения FZD8-Fc варианта 54F15 оценивался как 102 часа при 30 мг/кг, а период полувыведения FZD-Fc8 варианта 54F16 оценивался как 137 часов при 30 мг/кг.
Таблица 5
ID животного
T<sub>1/2λz</sub> (ч)
AUC<sub>0-last</sub> (нг*ч/мл)
AUC<sub>0-∞</sub> (нг*ч/мл)
AUC % Экстраполяция
Vz (мл)
Cl (мл/ч)
FZD8-Fc54F15
С43064
102,3
28642771,4
31231858,7
8,3
141,7
0,960
С43061
102,5
31904918,2
34846234,1
8,4
127,3
0,861
Среднее
102,4
30273845
33039046
8,35
134,5
0,9105
FZDS-Fc54F16
С43066
139,0
29088083,0
35470395,6
18,0
169,6
0,846
С43076
134,1
35934159,0
43449944,6
17,3
133,6
0,690
Среднее
136,6
32511121
39460170
17,65
151,6
0,768
ПРИМЕР 14
Подавление роста опухоли ободочной кишки in vivo вариантами FZD8-Fc
3
[00267] Диссоциированные клетки С28 опухоли ободочной кишки (10000 клеток) были введены путем подкожной инъекции самцам NOD/SCID мышей в возрасте 6-8 недель. Опухолям давали расти в течение 28 дней, пока они не достигали объема примерно 145 мм. Мыши были рандомально разделены (n=9 на группу) и обработаны вариантами FZD8-Fc или контрольным антителом в дозе 15 мг/кг два раза в неделю. Введение вариантов FZD8-Fc проводилось путем инъекции во внутрибрюшинную полость. Рост опухолей контролировался, и объемы опухолей измерялись электронными циркулями в указанных временных точках. Данные выражались как среднее ±S.E.M.
[00268] Варианты 54F12 и 54F13 не оказывали видимого влияния на рост опухоли, поскольку объемы опухолей были практически такими же, как объемы опухолей у мышей, обработанных контрольным антителом. В противоположность этому обработка вариантами 54F03, 54F09, 54F15 и 54F16 приводила к примерно 56%, 70%, 64% и 70% уменьшению (соответственно) роста опухоли по сравнению с обработкой контрольным антителом, как показано на Фигуре 17. Таким образом, отрицательное влияние вариантов FZD8-Fc на рост опухоли, видимо, определяется аминокислотной последовательностью в месте соединения между частью FZD8 и частью Fc. Кроме того, отрицательное влияние на рост опухоли, видимо, определяется источником Fc участка, поскольку оба варианта, являвшиеся IgG2 гибридными белками (54F12 и 54F13), не подавляли роста опухоли в этой модели.
ПРИМЕР 15
Подавление роста опухоли поджелудочной железы in vivo вариантами FZD8-Fc
3
[00269] Диссоциированные клетки PN4 опухоли поджелудочной железы (10000 клеток) были введены путем подкожной инъекции самцам NOD/SCID мышей в возрасте 6-8 недель. Опухолям давали расти в течение 36 дней, пока они не достигали объема примерно 112 мм. Мыши были рандомально разделены (n=10 на группу) и обработаны вариантами FZD8-Fc или контрольным антителом в дозе 15 мг/кг два раза в неделю. Введение вариантов FZD8-Fc проводилось путем инъекции во внутрибрюшинную полость. Рост опухолей контролировался, и объемы опухолей измерялись электронными циркулями в указанных временных точках. Данные выражались как среднее ±S.E.M.
[00270] Варианты 54F12 и 54F13 уменьшали рост опухоли менее чем на 20% по сравнению с опухолями у мышей, обработанных контрольным антителом. Обработка FZD8-Fc вариантами 54F03, 54F09, 54F15 и 54F16 снижала рост опухоли примерно от 20% до 60% по сравнению с обработкой контрольным антителом. Как показано на Фигуре 18, варианты 54F09 и 54F16 наиболее сильно снижали рост опухоли, на 45% (р<0,001) и 60% (р<0,001), соответственно. Таким образом, отрицательное влияние вариантов FZD8-Fc на рост опухоли, видимо, определяется аминокислотной последовательностью в месте соединения между частью FZD8 и частью Fc. Как видно из Примера 14, отрицательное влияние на рост опухоли, видимо, также определяется источником Fc участка, поскольку оба варианта, являвшиеся IgG2 гибридными белками (54F12 и 54F13), обладали меньшей противоопухолевой активностью, чем варианты FZD8-Fc, являвшиеся IgG1 гибридными белками.
3
7
2
[00271] Клетки поджелудочной железы из мышей с привитой опухолью, описанных выше, были собраны и измельчены на фрагменты примерно по 1 мм, после чего были подвергнуты ферментному расщеплению, 1 грам на 10 мл 300 мкг/мл коллагеназы и 200 мкг/мл ДНКазы I на 2 часа при 37°С/5% СО, с помешиванием время от времени 10 мл пипеткой для диспергирования клеток. Расщепление было остановлено добавлением эквивалентного объема FACS буфера (1х буферного солевого раствора Хэнкса (HBSS), 2% нагретой инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) и 2 мМ HEPES рН 7,4). Клетки были профильтрованы через 40 мкм нейлоновые фильтры и собраны центрифугированием при 150 хг в течение 5 минут. Красные кровяные клетки были лизированы в гипотоническом буфере, содержащем хлорид аммония в течение 2 минут на льду, и клетки были снова промыты с добавлением FACS буфера и ресуспендированы с FACS буфером 1х10 клеток/мл.
[00272] Свежеприготовленные суспензии единичных клеток выдерживались 20 минут на льду с биотинилированным антимышиным H-2Kd (клон SF1-1.1, Biolegend, Сан Диего, Калифорния) в концентрации 5 мкг/мл, биотинилированным антимышиным CD45 (30-F11, Biolegend) в концентрации 2,5 мкг/мл и стрептавидином-РегСР-Су5.5 (eBioscience, San Diego, CA) при разведении 1:200. Несвязавшееся антитело удалялось двукратным промыванием в 10 объемах FACS буфера. Для анализа на человеческие маркеры клеточной поверхности суспензия единичных опухолевых клеток была окрашена анти-ESA-FITC (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) при разведении 1:50, античеловеческим CD44-PE-Cy7 (eBioscience, San Diego, CA) при разведении 1:100 и античеловеческим CD201-PE (BD Biosciences) при разведении 1:5. Клетки промывались и ресуспендировались в буфере FACS, содержащем 2,5 мкг/мл 4'-6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI). Клетки, окрашенные одним флюоресцентным цветом, использовались для калибровки оборудования. Все оставшиеся мышиные клетки (с позитивным сигналом на H-2Kd и CD45) и мертвые клетки (DAPI-позитивные) исключались во время сортировки клеток. Дублеты и скопления клеток были исключены с использованием воротного механизма, не пропускающего дублеты.
hi
+
+
+
+
hi
+
hi
+
hi
hi
+
[00273] Как показано на Фигуре 19, воздействие на мышей с привитой опухолью fzds-fc вариантами 54F03 и 54F16 уменьшало процентное содержание CD44 клеток по сравнению с мышами, обработанными контрольным антителом. Хотя процентное содержание CD201CD44 клеток было маленьким, обработка мышей с привитой опухолью fzds-fc вариантами 54F03 и 54F16 уменьшала процентное содержание CD201CD44 клеток по сравнению с мышами, обработанными контрольным антителом. Показано, что CD44 является маркером онкогенных клеток (например, раковых стволовых клеток). Кроме того, в некоторых вариантах воплощения было обнаружено, что клетки CD44CD201являются более онкогенными, чем клетки CD44CD201. Таким образом, важно отметить, что варианты fzds-fc обладали способностью уменьшать процентное содержание как CD44, так и CD44CD201 клеточных популяций, тем самым уменьшая процентное содержание или число онкогенных клеток в подвергавшихся воздействию мышах.
ПРИМЕР 16
Характеристика N-конца
[00274] Рассчитано, что правильный сайт расщепления сигнальной последовательности в FZD8 белке находится между аминокислотой 25 (аланином) и аминокислотой 26 (аланином); расщепление в этом месте приводить к N-концам из ASA. Для определения массы fzds-fc белков по сравнению с теоретической массой fzds-fc белка, расщепленного в прогнозируемом месте, использовался масс-спектрометрическй анализ.
[00275] Дополнительные варианты fzds-fc с модифицированными сигнальными последовательностями были произведены ДНК2.0 (Menlo Park, Калифорния), как описано выше. DNA2.0 синтезировались, и собирались короткие однонитевые олигонуклеотиды для производства вариантов fzds-fc белка, от 54F23 до 54F35. Собранные олигонуклеотиды затем клонировались, и последовательность проверялась.
6
[00276] Плазмидная ДИК каждого варианта FZDS-Fc приготавливалась с использованием QIAGEN макси-преп наборов в соответствии с протпримерном производителя. Экспрессия каждого варианта была сделана с использованием FreeStyle™ MAX реагента (Life Technologies) и 293FS клеток. Клетки росли до логарифмической фазы и разводились до 1×10 клеток/мл. Для каждой реакции 315 мкг плазмидной ДНК разводилось в 5 мл OptiMEM Pro. В другой пробирке 315 мкл FreeStyle™ МАХ реагента разводилось в 5 мл OptiMem Pro. Плазмидная ДНК соединялась с FreeStyle™ МАХ реагентом путем добавления по каплям разведенного реагента к ДНК, после чего следовала инкубация в течение 15 минут при комнатной температуре. Комплекс ДНК-реагент затем добавлялся к 250 мл 293FS клеток. Реакции экспрессии проходили в течение 7-10 дней, после чего продукт собирался путем центрифугирования и фильтрации. Каждый вариант Fzd8-Fc был очищен путем аффинной очистки с использованием 5 мл HiTrap MAbSelect SURE колонок. Вкратце, собранная среда прогонялась через колонки, которые были уравновешены связывающим буфером. Колонки промывались связывающим буфером для удаления несвязавшегося вещества, и затем fzds-fc белок был элюирован элюционным буфером. Элюционные пробы затем были диализированы в буфере, подходящем для масс-спектроскопии.
[00277] Примерно 250 мкг каждой пробы FZD8-FC было редуцировано с Tris (2-крбоксиэтилом) фосфином (ТСЕР) в течение 30 минут при 37°С для разделения тяжелой и легкой цепей антитела. Редуцированные пробы затем алкилировались обработкой йодоацетамидом в течение 30 минут при 37°С. Пробы прогоняли через NAP-5 колонки (GE Health Care) для смены буфера на 10 мМ Tris-HCL (pH 7,4). После замены буфера следовало дегликозилирование с эндогликозидазой PNGase F. Пробы инкубировались на ночь при 37°С в соотношении 1:200 (фермент: проба). Реакции останавливались добавлением кислоты. Редуцированные, алкилированные и дегликозилированные пробы FZD8-Fe были загружены в ампулы для жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ/МС) анализа с использованием Waters UPLC™ и электрораспыляющего QToF масс-спектрометра. Точное измерение массы каждого образца с использованием ионных кластеров цезия трифторуксусной кислоты проводилось с Waters LockSpray™ двойного электрораспыляющего ионного источника.
[00278] Как показано на Фигуре 20А, FZD8-Fe белок (54F16) с сигнальной последовательностью, который обладал той же последовательностью, что и нативная последовательность, был образован как гетерогенная смесь в отношении N-терминальной последовательности. Пропорция белка, представленная в пробе, была эквивалентна по массе белку, расщепленному на аминокислотах 25 и 26 (пик при 41704,0) с N-терминальной последовательностью ASA. Однако, более чем 50% белка было представлено в форме с различной массой (пик при 41918,2). Вероятнее всего, этот пик представляет белок, расщепленный между аминокислотами 22 и 23; расщепление в этом месте приводит к N-терминальной последовательности AAAASA (SEQ ID №:76).
[00279] FZD8-Fc варианты с сигнальными последовательностями от SEQ ID №:68 до SEQ ID №:74 были получены, очищены от клеточной культуры и проанализированы методом масс-спектрометрии, как описано выше. Было отмечено, что варианты с сигнальными последовательностями от SEQ ID №:70 до SEQ ID №:74 давали почти полностью гомогенные белковые образцы (некоторые репрезентативные результаты показаны на Фигурах 20 В-20Е). В качестве белка, расщепленного между аминокислотами 25 и 26 (пик 41930,1) с N-терминальной последовательностью ASA (Фигура 20 В), присутствовал преимущественно FZD8-Fc вариант 54F26, который содержит SEQ ID №:53 с сигнальной последовательностью SEQ ID №:71. Подобные результаты также наблюдались у варианта, содержащего SEQ ID №:53 и сигнальную последовательность SEQ ID №:72 (54F28, Фигура 20С), у варианта, содержащего SEQ ID №:53 и сигнальную последовательность SEQ ID №:73 (54F30, Фигура 20D) и у варианта, содержащего SEQ ID №;53 и сигнальную последовательность SEQ ID №:74 (54F32, Фигура 20Е). Подобные результаты наблюдались с белками, образованными из временных и стабильных трансфекций.
ПРИМЕР 17
Подавление роста опухоли ободочной кишки in vivo вариантами FZD8-Fc
3
[00280] Диссоциированные клетки С28 опухоли ободочной кишки (10000 клеток) были введены путем подкожной инъекции самцам NOD/SCID мышей в возрасте 6-8 недель. Опухолям давали расти в течение 56 дней, пока они не достигали объема примерно 175 мм. Мыши были рандомально разделены (n=10 на группу) и обработаны FZD8-Fc конструктами 54F03, 54F23, 54F26 или контрольным антителом в дозе 15 мг/кг два раза в неделю. Введение вариантов FZD8-Fc и контрольных антител проводилось путем инъекции во внутрибрюшинную полость. Рост опухолей контролировался, и объемы опухолей измерялись электронными циркулями в указанных временных точках. Данные выражались как среднее ±S.E.M.
[00281] FZD8-Fc варианты 54F23 и 54F26 производились как преимущественно гомогенный белок с N-концом из аминокислот ASA, в то время как 54F03 производился как гетерогенная белковая смесь с N-концами из аминокислот ASA и AAAASA. Как показано на Фигуре 21, обработка FZD8-Fc вариантами 54F03, 54F23 и 54F26 уменьшала рост опухоли на 48%, 57% и 52%, соответственно, по сравнению с обработкой контрольным антителом после трех недель лечения.
[00282] Все публикации, патенты, заявки на патенты, Интернет сайты и учетные номера/базы данных последовательностей (включая как полинуклеотидные, так и полипептидные последовательности), цитируемые здесь, включены в описание во всей полноте посредством ссылки для всех целей в той же степени, что и каждая отдельная публикация, патент, заявка на патент, Интернет сайт или учетный номер/база данных последовательностей, которые указаны отдельно и тем самым также включены в описание посредством ссылки.