СПОСОБ ОБРАБОТКИ ОБРАЗЦА КРОВИ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА АЛЛЕРГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКИХ И ОБЩИХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ Е
METHOD OF TREATMENT OF BLOOD SAMPLE AT IMMUNOLOGICAL ANALYSIS OF ALLERGEN-SPECIFIC AND TOTAL IMMUNOGLOBULINS E

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к биохимии и медицине, в частности к аналитической биохимии и иммунохимическому анализу с использованием биолоогическихмикрочипов, и касается способа обработки анализируемого образца крови при проведении количественного определения общих и аллерген-специфических иммуноглобулинов Е. Биологический микрочип представляет собой массив элементов (ячейки), содержащих иммобилизованные аллергены (смеси аллергенов) и антитела против иммуноглобулинов Е. Предлагаемое изобретение может найти применение в аналитической биохимии, иммунологии и медицине, в частности, при проведении диагностики и мониторинга лечения аллергий.
Уровень техники
Аллергия - это реакция гиперчувствительности, инициируемая определенным иммунным механизмом. Термин «аллергия» наиболее часто используется для реакции гиперчувствительности 1-го типа: реакция немедленного типа, клинические симптомы которой появляются через 30-60 мин после контакта с аллергеном. Реакция основана на высвобождении гистамина, происходящего с участием аллерген-специфических иммуноглобулинов (антител) класса Е (sIgE). Наиболее частые симптомы - сенная лихорадка (ринит), конъюнктивит, крапивница, астма; развитие симптомов может привести к анафилактическому шоку.
В последнее время во всем мире наблюдается рост числа аллергических заболеваний, что связано, в частности, с ухудшением экологической обстановки и увеличением количества продуктов экономической деятельности в окружающей среде. По разным оценкам аллергические заболевания встречаются у 20-40% населения.
Классическим и широко распространенным способом диагностики аллергии 1-го типа является постановка кожных проб. Недостатками этого способа являются дискомфорт для пациента, риск провокации повышенной сенсибилизации и анафилактического шока (Liccardi G., D'Amato G. et al. Systemic reactions from skin testing: literature review. J. Investig. Allergol. Clin. Immunol., 2006, v.16, p.75-78). Безопасной альтернативой методу кожных проб является иммунологический анализ аллерген-специфических IgE в крови пациента, включающий радиоаллергосорбентный тест (RAST), иммуноферментный анализ (ELISA) и др. (Hamilton R.G. and Adkinson N.F., In vitro Assays for the Diagnosis of IgE-Mediated Disorders, J. Allergy Clin. Immunol., 2004, v.114 (2), p.213-225).
Тест-системы для полуколичественного и количественного анализа sIgE производятся несколькими компаниями в Европе и Америке, например, "Dr. Fooke Laboratorien" (Германия), "Phadia" (Швеция), "Cypress Diagnostics" (Бельгия), "Hycor Biomedical" (США), и иммунологический метод анализа в последние годы приобретает все большую популярность. В большинстве случаев используется вариант анализа, в котором аллергены или смеси аллергенов иммобилизованы на твердой фазе, например в лунках иммунологического планшета, внутри капиллярных трубок (тест-система «IVT Allergy Screen» компании «Arlington Scientific)) (США) (www.arlingtonscientific.com), на нитроцеллюлозных полосках (тест-системы фирмы «Heska», Швейцария (www.heska.com) и др. Используются также целлюлозные диски, которые при проведении анализа помещаются в лунки иммунологического планшета (аллергодиски «R-Biopharm AG», Германия и «Dr. Fooke Laboratorien», Германия). Используются также тест-системы для анализа IgE методом реверсивного иммуноанализа, при котором в лунках планшета сорбированы анти-IgE-антитела, например, тест-система производства «Dr. Fooke Laboratorien» (Германия).
В настоящее время известно несколько сотен различных типов аллергенов, и для обеспечения максимальной эффективности диагностики аллергии необходимо проводить определение множества типов sIgE, причем стоимость анализа должна быть невысокой. Использование биологических микрочипов - массивов элементов, содержащих иммобилизованные биологические зонды, в частности белковых микрочипов, дает возможность проводить одновременный параллельный анализ множества соединений в минимальном количестве биологического образца. Описанные в патентной литературе и открытых источниках биологические микрочипы для анализа sIgE в большинстве случаев представляют собой подложки (стекло, пластик, мембрана), на которые наносятся растворы аллергенов (Kim Е., Park S.W., Cho N.Y., et al, Quantitative Measurement of Serum Allergen-Specific IgE on Protein Chip, Exp. Mol. Med., 2002, v.34 (2), p.152-158; Jahn-Schmid В., Harwanegg C, Hiller R, et al, Allergen microarray: comparison of microarray using recombinant allergens with conventional diagnostic methods to detect allergen-specific serum immunoglobulin E. Clin. Exp.Allergy, 2003, v.33, p.1443-1449; Fall B.I., Eberlein-Konig В., Behrendt H., et al., Microarrays for the Screening of Allergen-Specific IgE in Human Serum, Anal. Chem, 2003, v.75, p.556-562; заявка на патент США №20090068233; патентная заявка WO 2002/029415 (VBC Genomics Bioscience Research GmbH); патент США №7846713 ("Randox Laboratories Ltd.").
Способ анализ sIgE на микрочипах с иммобилизованными аллергенами включает взаимодействие анализируемого образца с аллергенами (при этом специфические антитела sIgE захватываются иммобилизованными аллергенами) и далее проявку микрочипов меченными видоспецифичными антителами (Harwanegg С.and Hiller R., Protein Microarrays for the Diagnosis of Allergic Diseases: State-of-the-Art and Future Development, Clin. Chem. Lab. Med., 2005, v.43, p.1321-1326).
Для определения используются, как правило, образцы крови пациентов: обычно неразбавленная сыворотка или плазма крови. Однако следует отметить, что 75-80% антител сыворотки крови приходится на долю иммуноглобулинов G (IgG), a IgE составляет лишь около 0,002%. Таким образом, концентрация IgG в крови на несколько порядков выше, чем концентрация IgE (10-20 мг/мл для IgG и ~50 нг/мл для IgE). Присутствие IgG в столь высоких концентрациях затрудняет определение sIgE, поскольку (1) происходит конкуренция между IgG и IgE за связывание с иммобилизованными аллергенами, (2) аутоантитела (IgG) против IgE могут образовывать комплекс IgG-IgE, препятствуя дальнейшему связыванию IgE с видоспецифичными антителами, содержащими метку для детекции (проявляющие антитела) (Johansson S.G., Anti-IgE antibodies in human serum, J. Allergy Clin. Immunol., 1986, v.77 (4), p.555-557; Gleich G.J, Zimmermann E.M, Gleich M.C, Yunginger J.W., Measurement of IgG blocking antibodies by interference in the radioallergosorbent test, J. Immunol., 1981, v.126 (2), p.575-579).
Таким образом, наличие IgG в образце крови препятствует определению sIgE при проведении иммуноанализа, приводя к ухудшению взаимодействия sIgE с аллергенами, иммобилизованными в элементах (ячейках) биологического микрочипа, и повышению фоновых сигналов за счет неспецифической сорбции. Неспецифические  взаимодействия и фоновые сигналы особенно сильно проявляются в случае проведения анализа с использованием биочипов, так как биочип для проведения одновременного параллельного анализа ряда соединений в образце содержит множество элементов с различными иммобилизованными зондами, и неспецифические фоновые сигналы могут наблюдаться для каждого из множества элементов, что приводит к значительному снижению чувствительности и воспроизводимости анализа. Кроме того, конкуренция между IgE и IgG за связывание с иммобилизованными аллергенами часто приводит к заниженным результатам определения аллерген-специфических IgE.
Данные недостатки преодолены настоящим изобретением, в котором предложен способ обработки образца крови при проведении анализа аллерген-специфических и общих иммуноглобулинов Е на биологических микрочипах, включающий удаление IgG из анализируемого образца.
Раскрытие изобретения
Изобретением предлагается способ обработки образца крови при проведении анализа аллерген-специфических и общих иммуноглобулинов Е с использованием биологических микрочипов. Биологический микрочип представляет собой массив элементов, содержащих иммобилизованные аллергены (смеси аллергенов) и антитела против иммуноглобулинов Е. Термин «иммобилизованные» включает аллергены и антитела, связанные с носителем в элементах микрочипа любым способом, то есть путем адсорбции, через гидрофобные взаимодействия, ковалентное связывание, комплексообразование и др.
На первом этапе анализа происходит взаимодействие образца с иммобилизованными соединениями. Образцы крови содержат высокую концентрацию IgG, на несколько порядков превышающую концентрацию измеряемых IgE. Из-за этого наблюдается неполное связывание IgE с иммобилизованными зондами и высокие фоновые сигналы, которые различаются от образца к образцу, что приводит к недостаточной чувствительности и воспроизводимости анализа, а также к заниженным результатам при анализе аллерген-специфических sIgE.
Настоящим изобретением предлагается способ обработки образца сыворотки или плазмы крови перед проведением иммуноанализа на биологических микрочипах, характеризующийся тем, что из образца удаляют иммуноглобулины G.
Обработка образца сыворотки или плазмы крови проводится любым способом, который позволяет удалить иммуноглобулины G, не уменьшая количество определяемых соединений: иммуноглобулинов Е, как общих, так и аллерген-специфических. В одном из аспектов изобретения удаление иммуноглобулинов G осуществляют путем взаимодействия образца крови с сорбентом, специфически связывающим иммуноглобулины G.
При проведении анализа с использованием биологических микрочипов с иммобилизованными аллергенами после обработки образца для удаления IgG наблюдается снижение фоновых (неспецифических) сигналов, увеличение соотношения «сигнал/фон», увеличение воспроизводимости измеряемых специфических сигналов и, как следствие, увеличение чувствительности и воспроизводимости определения общих и аллерген-специфических иммуноглобулинов по сравнению с иммуноанализом необработанного образца.
Для ряда аллергенов наблюдается так же увеличение специфических сигналов от элементов микрочипа по сравнению с анализом необработанного образца.
Далее изобретение будет раскрыто подробнее со ссылками на фигуры и примеры, которые приводятся исключительно с целью иллюстрации и пояснения сущности заявленного изобретения, но которые не предназначены для ограничения объема притязаний.
Краткое описание фигур
Фиг.1 представляет флуоресцентные изображения биологических микрочипов при проведении одновременного анализа специфических и общих IgE в образце сыворотки крови человека до (А) и после обработки образца для удаления IgG (Б). Микрочип представляет собой массив гидрогелевых элементов в форме микрокапель. Каждый элемент содержит иммобилизованный аллерген или антитело: 1) пыльца деревьев и кустарников, 2) сорные травы и цветы, 3) луговые травы и злаки, 4) эпидермальные, 5) бытовые, 6) плесневые и дрожжевые грибы, 7) пищевые, 8) элементы, не содержащие биоматериала, и элементы с иммобилизованными антителами 9) IgE в разных концентрациях (для формирования «внутренней калибровочной кривой»), 10) анти-IgE.
Микрочипы инкубировали с образцом и проявляли антителами против IgE, меченными флуоресцентным красителем Су5.
Фиг.2 представляет профили сигналов (интенсивность флуоресценции, отн. ед.) элементов биологического микрочипа при проведении одновременного анализа специфических и общих IgE в образце сыворотки крови человека до и после обработки образца для удаления IgG. Микрочипы инкубировали с образцом и проявляли антителами против IgE, меченными флуоресцентным красителем Су5. Анализ сыворотки крови #5 (А) и #6 (Б) (Таблица 1).
Осуществление изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает способ обработки образца крови при проведении количественного иммунологического анализа аллерген-специфических и общих иммуноглобулинов Е, с использованием биологических микрочипов, содержащих элементы с иммобилизованными аллергенами или смесями аллергенов, а так же иммобилизованными антителами против иммноглобулинов Е.  Аллергены и антитела могут быть иммобилизованы в элементах микрочипа любым способом: сорбированы, связаны через гиброфобные взаимодействия, связаны через комплексообразование (комплексы типа авидин (стрептавидин)-биотин, антиген-антитело, металл - хелатор и др.), путем образования ковалентных связей и т.д.
Настоящим изобретением обеспечивается способ обработки образца крови при проведении анализа с использованием биологических микрочипов, характеризующийся тем, что из образца удаляют иммуноглобулины G. В качестве образцов для анализа используются разбавленные или неразбавленные образцы сыворотки и плазмы крови. Предварительная обработка образца проводится любым методом, который позволяет удалить иммуноглобулины G, не уменьшая количество определяемых соединений: иммуноглобулинов Е, как общих, так и аллерген-специфических. В одном из воплощений изобретения удаление иммуноглобулинов G осуществляют путем взаимодействия образца крови с сорбентом, специфически связывающим иммуноглобулины G, например с сорбентом, содержащим иммобилизованный белок G, сорбентом, содержащим иммобилизованные антитела против IgG человека, но не ограничиваясь ими. Примером сорбента, специфически связывающего IgG, может служить смола с иммобилизованным белком G (Protein G Sepharose).
Обработку образца можно осуществлять с использованием хроматографической колонки или спин-колонки со специфическим сорбентом, добавлять сорбент в виде суспензии к образцу или любым другим способом. Обработка образцов крови для удаления IgG с использованием сефарозы, содержащей иммобилизованный белок G, описана в Примере 1. Как видно из Таблицы 1 (Пример 1), обработка образцов крови не приводит к изменению концентрации общих и аллерген-специфических IgE в образцах сыворотки и плазмы крови (в пределах ошибки измерения), т.е. не влияет на проведение измерения концентрации анализируемых соединений.
В Примере 2 приведены результаты проведения количественного анализа аллерген-специфических и общих IgE в образце сыворотки крови на биологическом микрочипе. Биочип представляет собой массив трехмерных гидрогелевых элементов, содержащий элементы, ковалентно связанные с иммобилизованными аллергенами и антителами против IgE. Элементы массива представляют собой микрокапли заданного объема, полученные методом полимеризационной иммобилизации по технологии, запатентованной ИМБ РАН(патент РФ № 2216547 «Способ полимеризационной иммобилизации биологических молекул икомпозиции для его осуществления», международная заявка WO 03/033539).
Результаты анализа образцов до и после обработки по способу, предлагаемому в данном изобретении, приведены на Фигурах 1 и 2 и в Таблице 2. При проведении анализа образца после удаления IgG для ряда аллергенов наблюдается возрастание специфических сигналов от элементов микрочипа с иммобилизованными аллергенами по сравнению (Фиг.1 и 2). Как видно из Таблицы 2, наблюдается также снижение фоновых сигналов. Таким образом, для всех анализируемых специфических и общих IgE наблюдается увеличение соотношения сигнал/фон, что приводит к значительному увеличению чувствительности анализа.
Чувствительность анализа оценивали следующим образом. Пороговая концентрация IgE, ниже которой уровень IgE определяется как недетектируемый - 0,35 МЕ/мл. При проведении анализа образца после удаления IgG флуоресцентные сигналы элементов микрочипа с иммобилизованными аллергенами и антителами после взаимодействия с образцом, содержащим IgE в концентрации 0,35 МЕ/мл, превышали фоновые сигналы в полтора-два раза. Обработка образца (удаление IgG) приводит к тому, что соотношение сигнал/фон при концентрации IgE 0,35 МЕ/мл возрастает до 3-4 и более раз. Особенно заметно повышение чувствительности для аллергенов, где наблюдается увеличение специфических сигналов.
Приводимые ниже примеры предназначены не для ограничения притязаний, а исключительно для иллюстрации отдельных воплощений настоящего изобретения.
Пример 1. Обработка образца крови для удаления иммуноглобулинов G
а) Вариант 1
Хроматографическую колонку Tricorn 5/50 (GE Healthcare, США) заполняли 720 мкл сефарозы, содержащей иммобилизованный белок G (Protein G Sepharose 4 Fast Flow, GE Healthcare, США, емкость сорбента >10 мг/мл). Колонку уравновешивали 5 объемами 25 мМ фосфатно-солевого буфера, рН 7,2 (рабочий буфер). Сыворотку крови человека (или плазму крови, 360 мкл, 0,5 объема сорбента), предварительно отфильтрованную при помощи фильтра Millex SLHA 025 OS (Millipore Corporation, США), наносили на колонку. Проводили элюцию рабочим буфером до полного выхода пика IgE и других белков сыворотки крови, не связавшихся с носителем. Детектирование осуществляли при помощи УФ-детектора "Uvicord S2" (LKB, Швеция) на длине волны 280 нм. Полученный раствор использовали для измерения содержания общих и специфических IgE. При необходимости образец концентрировали до исходного объема при помощи концентратора Vivaspin 2 MWCO 10000 (GE Healthcare, США) либо учитывали разбавление образца при расчете концентраций общих и специфических IgE.
Для регенерации сорбента колонку промывали 0,1 М цитрат-натрий фосфатным буфером, рН 2,8 до полного выхода пика IgG и затем уравновешивали 5 объемами рабочего буфера. После этого сорбент использовали повторно. Для длительного хранения сорбент уравновешивали рабочим буфером с добавлением 0,2% азида натрия.
б) Вариант 2
Сыворотку крови (или плазму крови) и сефарозу с иммобилизованным белком G, уравновешенную рабочим буфером, смешивали в объемном соотношении 1:1, и смесь инкубировали при перемешивании в течение 1 часа при комнатной температуре. Сефарозу удаляли центрифугированием (10000 об/мин, 4 мин), супернатант собирали и использовали для анализа. При необходимости образец концентрировали до исходного объема при помощи концентратора Vivaspin 2 MWCO 10000 (GE Healthcare, США) либо учитывали разбавление образца при расчете концентраций общих и специфических IgE.
Результаты измерений концентраций аллерген-специфических и общих IgE в образцах крови до и после обработки приведены в Таблице 1.
Измерения общего IgE проводили с использованием набора для определения общего IgE методом ELISA, аллерген-специфических IgE - набора для определения специфических IgE методом реверсивного иммуноанализа REAST (оба набора производства Dr. Fooke Laboratorien Gmbh, Германия) согласно процедурам, описанным производителем.
Пример 2. Одновременное количественное определение аллерген-специфических и общих IgE в образце крови на биологическом микрочипе
Для проведения анализа использовали микрочипы, структура которых приведена на Фиг.1. Микрочипы изготавливали по технологии полимеризационной иммобилизации, разработанной в ИМБ РАН (патент РФ №2216547, международная заявка WO 03/033539; Rubina A.Yu, Dementieva E.L, et al., Hydrogel-based protein microchips: manufacturing, properties, and applications, Biotechniques, 2003, v.34 (5), p.1008-1022).
Полимеризационную смесь, содержащую гелеобразующие мономеры на основе метакриламида и аллергены и антитела, подлежащие иммобилизации, наносили на поверхность стеклянного слайда с помощью робота QArray ("Genetix", Великобритания) в виде капель объемом 0,1 нл. Полимеризацию элементов с одновременной ковалентной иммобилизацией белков проводили при облучении лампой ультрафиолетового света с максимумом излучения 350 нм ("Sylvania GTE lamp", F15T 8/350 Bl, Великобритания) в течение 50 мин при 20°С в токе азота. Для повышения достоверности получаемых данных все иммобилизованные аллергены и антитела в составе микрочипа представлены в трех одинаковых гелевых элементах. После полимеризации микрочипы отмывали от непрореагировавших компонентов и для уменьшения неспецифических взаимодействий инкубировали в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,2, содержащем 0,15 М NaCl, 1% поливинилового спирта («блокировочный раствор»), 40 мин. при комн. температуре.
Образец сыворотки крови подвергали обработке для удаления IgG как описано в Примере 1 (вариант 1). Для сравнения проводили анализ с исходным образцом сыворотки крови (без обработки). Микрочипы инкубировали с образцами в течение 20 ч при 37°С и далее с проявляющими анти-IgE, меченными флуоресцентным красителем Су5 (1 ч, 37°С). После завершения инкубации и отмывки от неспецифически связавшихся компонентов регистрировали флуоресцентные сигналы. Для регистрации использовали флуоресцентный микроскоп, снабженный CCD-камерой и программным обеспечением для визуализации изображения и обработки полученных данных, разработанный в ИМБ РАН (Barsky V., Perov A. Tokalov S., et al., Fluorescence data analysis on gel-based biochips, J. Biomol. Screening, 2002, v.7, p.247-257). Интенсивность флуоресценции рассчитывали как медианный сигнал от трех одинаковых гелевых элементов. Флуоресцентные изображения микрочипов после анализа представлены на Фиг.1.
Профили сигналов (интенсивность флуоресценции, отн. ед.) элементов биологического микрочипа для образцов до и после удаления IgG показаны на Фиг.2. Величины фоновых флуоресцентных сигналов при анализе образцов до и после очистки (удаления IgG) приведены в Таблице 2.
Таблица 2.
Фоновые флуоресцентные сигналы при анализе образцов крови на биологических микрочипах до и после обработки (удаление IgG)
Номер образца (Табл. 1)
Флуоресцентные сигналы, отн. ед.
До обработки
После обработки
#5
1,6±0,3
0,9±0,1
#6
1,4±0,2
0,7±0,1
#8
2,6±0,4
0,44±0,06
#10
2,4±0,4
0,50±0,07
После взаимодействия микрочипа с проявляющими антителами на элементах микрочипа, содержащих иммобилизованные IgE в разных концентрациях, получали флуоресцентные сигналы, формирующие внутреннюю калибровочную кривую. Строили калибровочную зависимость «интенсивность флуоресцентного сигнала - концентрация IgE», по которой определяли концентрации специфических и общих IgE в исследуемом образце.