СЕНСОР И СЕНСОРНАЯ СИСТЕМА ДЛЯ СЕКВЕНИРОВАНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
SENSOR AND SENSOR SYSTEM FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING

Перекрестная ссылка на родственные заявки
Данная заявка заявляет приоритет по первоначальной заявке США №62/692468, поданной 29 июня 2018 года, и нидерландской заявке № N2021376, поданной 23 июля 2018 года; содержание каждой из них включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки.
Ссылка на перечень последовательностей
Перечень последовательностей, представленный наряду с этим в EFS-Web, включен в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки. Название файла представляет собой ILI149BPCT_IP-1687-PCT_sequence_listing_ST25.txt, размер файла составляет 366 байт, и дата создания файла 7 июня 2019 года.
Предшествующий уровень техники
Разные протоколы в биологическом или химическом исследовании включают проведение большого количества контролируемых реакций на локальных поверхностях подложек или в заданных реакционных камерах. За указанными реакциями можно затем наблюдать или их выявлять, и последующий анализ может помочь идентифицировать или обнаружить свойства химических веществ, участвующих в реакции. Например, в некоторых мультиплексных анализах, неизвестный аналит, имеющий идентифицируемую метку (например, флуоресцентную метку), может подвергаться воздействию тысяч известных зондов в контролируемых условиях. Каждый известный зонд может быть внесен в соответствующую лунку микропланшета. Наблюдение за какими-либо химическими реакциями, которые протекают между известными зондами и неизвестным аналитом в лунках, может помочь идентифицировать или обнаружить свойства данного аналита. Другие примеры таких протоколов включают известные способы секвенирования ДНК, такие как секвенирование методом синтеза (SBS - от англ. sequencing-by-synthesis) или циклическое секвенирование на основе чипов. Посредством методик секвенирования полинуклеотидов анализ может помочь идентифицировать или обнаружить свойства полинуклеотида, участвующего в реакциях.
Введение
Первым аспектом, раскрытым в данном документе, является сенсор. В одном примере сенсор содержит два электрода, имеющих пространство между ними; и модулируемый электропроводящий канал, присоединенный к двум электродам, причем данный модулируемый электропроводящий канал включает полимер в виде модифицированной, частично двухцепочечной нуклеиновой кислоты, электрически соединенной с двумя электродами и образующей мостик в пространстве между двумя электродами, причем полимер в виде модифицированной, частично двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает: две полинуклеотидные цепи, частично связанные вместе; гэп в первой из полинуклеотидных цепей, где отсутствуют нуклеотиды; и множество нуклеотидных оснований второй из полинуклеотидных цепей, экспонированных в области гэпа в первой из полинуклеотидных цепей.
В одном примере сенсора гэп имеет длину, находящуюся в интервале от примерно 10 нм до примерно 50 нм.
Пример сенсора дополнительно включает полимеразу, присоединенную к полимеру - модифицированной, частично двухцепочечной нуклеиновой кислоте.
В одном примере сенсора i) линкеры соответственно присоединяют каждый конец первой из полинуклеотидных цепей к соответствующему одному из двух электродов; или ii) линкеры соответственно присоединяют каждый конец второй из полинуклеотидных цепей к соответствующему одному из двух электродов; или iii) и i и ii.
В примере сенсора по меньшей мере одно из множества нуклеотидных оснований, экспонированных в области гэпа, представляет собой основание гуанин.
В примере сенсора каждое из множества нуклеотидных оснований, экспонированных в области гэпа, представляет собой основание гуанин.
Пример сенсора дополнительно включает детектор для выявления ответа от полимера - модифицированной, частично двухцепочечной нуклеиновой кислоты, когда нить-переключатель, включающая нить нуклеотидов, включающих основания, комплементарные по меньшей мере некоторым из множества нуклеотидных оснований, экспонированных в области гэпа, ассоциирует с по меньшей мере некоторыми из множества нуклеотидных оснований в области гэпа.
Пример сенсора дополнительно включает субстрат, поддерживающий два электрода; и полимеразу, присоединенную к данному субстрату.
Пример сенсора дополнительно включает жидкостную систему для введения реагента к полимеру - модифицированной, частично двухцепочечной нуклеиновой кислоте. В одном примере реагент включает меченые нуклеотиды, причем по меньшей мере один из меченых нуклеотидов включает: нуклеотид; связывающую молекулу, присоединенную к фосфатной группе нуклеотида; и нить-переключатель, присоединенную в связывающей молекуле, причем нить-переключатель включает нить нуклеотидов, включающих основания, комплементарные по меньшей мере некоторым из множества нуклеотидных оснований, экспонированных в области гэпа.
Пример сенсора дополнительно включает множество других модулируемых электропроводящих каналов, присоединенных к двум электродам, каждый из других модулируемых электропроводящих каналов включает соответствующий в виде модифицированной, частично двухцепочечной нуклеиновой кислоты, электрически соединенной с двумя электродами и образующей мостик в пространстве между двумя электродами.
В одном примере сенсора модулируемый электропроводящий канал демонстрирует первую проводимость, когда множество нуклеотидных оснований экспонировано в области гэпа; и вторую проводимость, которая отличается от первой проводимости, когда по меньшей мере некоторые из множества нуклеотидных оснований в области гэпа ассоциированы с комплементарными нуклеотидными основаниями.
Следует понимать, что любые признаки сенсора, раскрытые в данном документе, можно объединять вместе любым желаемым образом и/или в любой желаемой конфигурации, и/или с любым другим примером, раскрытым в данном документе.
Вторым аспектом, раскрытым в данном документе, является меченый нуклеотид, который содержит нуклеотид; связывающую молекулу, присоединенную к фосфатной группе нуклеотида; и нить-переключатель, присоединенную к связывающей молекуле, причем нить-переключатель включает нить нуклеотидов, включающих основания, комплементарные по меньшей мере некоторым из множества нуклеотидных оснований, экспонированных в области гэпа сенсора по первому аспекту.
Третий аспект, раскрытый в данном документе, представляет собой набор, содержащий: электронный компонент, включающий: подложку и два электрода, функционально расположенных на данной подложке и разделенных пространством; и раствор полимера, включающий: жидкий носитель и полимер в виде модифицированной, частично двухцепочечной нуклеиновой кислоты в данном жидком носителе, причем полимер в виде модифицированной, частично двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает: две полинуклеотидные цепи, частично связанные вместе и имеющие противоположные концы; линкер, присоединенный к каждому из противоположных концов, причем каждый линкер присоединяется к соответствующему одному из двух электродов; гэп в первой из полинуклеотидных цепей, где отсутствуют нуклеотиды; и множество нуклеотидных оснований второй из полинуклеотидных цепей, экспонированных в области гэпа в первой из полинуклеотидных цепей; причем полимер в виде модифицированной, частично двухцепочечной нуклеиновой кислоты образует модулируемый электропроводящий канал в пространстве между двумя электродами, когда каждый линкер присоединяется к соответствующему одному из двух электродов.
В одном примере набор дополнительно содержит раствор реагента, включающий меченые нуклеотиды, причем по меньшей мере один из меченых нуклеотидов включает: нуклеотид, связывающую молекулу, присоединенную к фосфатной группе нуклеотида; и нить-переключатель, присоединенную к связывающей молекуле, при этом нить-переключатель включает нить нуклеотидов, включающих основания, комплементарные по меньшей мере некоторым из множества нуклеотидных оснований, экспонированных в области гэпа. В одном примере набора основания в нити-переключателе полностью комплементарны множеству нуклеотидных оснований, экспонированных в области гэпа. В другом примере набора нить-переключатель дополнительно включает по меньшей мере один нуклеотид, имеющий ошибочно спаренное основание, которое не комплементарно соответствующему одному из множества нуклеотидных оснований, экспонированных в области гэпа. В еще одном примере набора нить нуклеотидов в нити-переключателе имеет по меньшей мере на один нуклеотид меньше, чем множество нуклеотидных оснований, экспонированных в области гэпа. В еще одном примере набора нить нуклеотидов в нити-переключателе имеет большее число нуклеотидов, чем множество нуклеотидных оснований, экспонированных в области гэпа; и где часть нити-переключателя образует «петлю на стебле» при ассоциировании в области гэпа. В одном примере набора нить нуклеотидов в нити-переключателе имеет большее число нуклеотидов, чем множество нуклеотидных оснований, экспонированных в области гэпа; часть нити-переключателя образует «петлю на стебле» при ассоциировании в области гэпа; и другая часть нити-переключателя полностью комплементарна множеству нуклеотидных оснований, экспонированных в области гэпа, или включает по меньшей мере один нуклеотид, имеющий ошибочно спаренное основание, которое не комплементарно соответствующему одному из множества нуклеотидных оснований, экспонированных в области гэпа.
Следует понимать, что любые признаки набора можно объединять вместе любым желательным образом. Кроме того, следует понимать, что любую комбинацию признаков набора и/или сенсора и/или меченого нуклеотида можно использовать вместе и/или объединять с любым из примеров, раскрытых в данном документе.
В четвертом аспекте сенсорная система содержит проточную ячейку; и электронный сенсор, интегрированный в проточную ячейку, причем электронный сенсор включает: два электрода, имеющих пространство между ними; модулируемый электропроводящий канал, присоединенный к двум электродам, причем модулируемый электропроводящий канал включает полимер в виде модифицированной, частично двухцепочечной нуклеиновой кислоты у, электрически соединенной с двумя электродами и образующей мостик в пространстве между двумя электродами, при этом полимер в виде модифицированной, частично двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает: две полинуклеотидные цепи, частично связанные вместе; гэп в первой из полинуклеотидных цепей, где отсутствуют нуклеотиды; и множество нуклеотидных оснований второй из полинуклеотидных цепей, экспонированных в области гэпа в первой из полинуклеотидных цепей.
В одном примере сенсорная система дополнительно содержит систему доставки реагента для селективного введения реагента в входное устройство проточной ячейки. В одном примере реагент находится в контейнере для образцов, при этом реагент включает меченые нуклеотиды, по меньшей мере один из меченых нуклеотидов, включающий: нуклеотид; связывающую молекулу, присоединенную к фосфатной группе нуклеотида; и нить-переключатель, присоединенную к связывающей молекуле, включающую нить нуклеотидов, включающих основания, комплементарные по меньшей мере некоторым их множества нуклеотидных оснований, экспонированных в области гэпа.
Пример сенсорной системы дополнительно содержит детектор для выявления ответа от электронного сенсора.
Пример сенсорной системы дополнительно содержит полимеразу, заякоренную на полимере - модифицированной, частично двухцепочечной нуклеиновой кислоте, или подложке электронного сенсора; и полинуклеотидную цепь-матрицу, подлежащую введению в электронный сенсор.
Следует понимать, что любые признаки сенсорной системы можно объединять вместе любым желаемым образом. Кроме того, следует понимать, что любую комбинацию признаков сенсорной системы и/или сенсора, и/или набора и/или меченого нуклеотида можно использовать вместе и/или в комбинации с любым из примеров, раскрытых в данном документе.
Пятый аспект, раскрытый в данном документе, представляет собой способ. В одном примере способ включает введение полинуклеотидной цепи-матрицы в электронный сенсор, имеющий полимеразу, связанную с i) модулируемым электропроводящим каналом, который образует мостик в пространстве между электродами, и электрически соединен с двумя электродами, или ii) субстратом, поддерживающим два электрода, причем модулируемый электропроводящий канал включает полимер в виде модифицированной, частично двухцепочечной нуклеиновой кислоты, которая включает: две полинуклеотидные цепи, частично связанные вместе; гэп в первой из полинуклеотидных цепей, где нуклеотиды отсутствуют; и множество нуклеотидных оснований второй из полинуклеотидных цепей, экспонированных в области гэпа в первой из полинуклеотидных цепей; введение реагентов, включая меченые нуклеотиды, в электронный сенсор, посредством чего нуклеотид одного из меченых нуклеотидов ассоциирует с полимеразой, и нуклеотид-специфичная нить-переключатель одного из меченых нуклеотидов ассоциирует с по меньшей мере некоторыми из множества нуклеотидных оснований, экспонированных в области гэпа; и в ответ на данное ассоциирование в области гэпа, выявление ответа электронного сенсора.
Пример способа дополнительно включает ассоциирование ответа электронного сенсора с ассоциированной нуклеотид-специфичной нитью-переключателем; и на основе ассоциированной нуклеотид-специфичной нити-переключателя, идентификацию нуклеотида одного из меченых нуклеотидов.
Пример способа дополнительно включает нагревание для диссоциации нуклеотид-специфичной нити-переключателя от гэпа.
Следует понимать, что любые признаки способа можно объединять вместе любым желательным образом. Кроме того, следует понимать, что любая комбинация признаком способа и/или сенсорной системы и/или сенсора, и/или любых наборов и/или меченого нуклеотида может быть использована вместе и/или в комбинации с любыми из примеров, раскрытых в данном документе.
Краткое описание графических материалов
Признаки примеров настоящего раскрытия станут очевидными со ссылкой на следующее подробное описание и графические материалы, в которых подобные номера позиций соответствуют похожим, хотя возможно не идентичным компонентам. Для краткости, номера позиций или признаки, имеющие ранее описанную функцию, могут быть или могут не быть описаны в связи с другими графическими материалами, в которых они встречаются.
Фиг. 1А представляет собой схематичное изображение примера сенсора, раскрытого в данном документе;
Фиг. 1В представляет собой схематичное изображение сенсора и примера жидкостной системы для введения реагента в полимер - модифицированную, частично двухцепочечную нуклеиновую кислоту сенсора;
Фиг. 2 представляет собой схематичное изображение примера меченого нуклеотида, раскрытого в данном документе;
Фиг. 3A-3D представляют собой схематичные изображения в разрезе иллюстративных меченых нуклеотидов, включающих разные нити-переключатели, ассоциированные с нуклеотидными основаниями, экспонированными в области гэпа полимера - модифицированной, частично двухцепочечной нуклеиновой кислоты;
Фиг. 4 представляет собой трехмерное схематичное изображение примера сенсорной системы, включающей проточную ячейку, и примера сенсора, раскрытого в данном документе.
Фиг. 5 представляет собой схематичное изображение примера сенсорной системы; и
Фиг. 6 представляет собой блок-схему примера способа, раскрытого в данном документе.
Подробное описание изобретения
В данном документе раскрыт электронный/электрический сенсор, который можно использовать для выявления одиночных молекул в способах секвенирования нуклеиновых кислот. Сенсор включает модулируемый электропроводящий канал, электрически присоединенный к двум электродам. Модулируемый электропроводящий канал включает полимер в виде модифицированной, частично двухцепочечной нуклеиновой кислоты (называемой в данном документе модифицированной «дцНК»), и таким образом может называться проводящей молекулярной нанопроволокой. Одна полинуклеотидная цепь или нить модифицированной дцНК имеет гэп, к которому экспонированы нуклеотидные основания. Другая из полинуклеотидных цепей или нитей протянута от одного из электродов до другого из электродов, и таким образом модулируемый электропроводящий канал обеспечивает проводящий путь между данными двумя электродами, даже когда нуклеотидные основания экспонированы в области гэпа (и выявления одиночных молекул не происходит). Нуклеотидные основания в области гэпа способны ассоциировать с нитью-переключателем, имеющей по меньшей мере некоторые нуклеотидные основания, комплементарные нуклеотидным основаниям в области гэпа. Когда нить-переключатель ассоциирует с гэпом, проводящий путь возрастает, и проводимость электропроводящего канала модулируется. В связи с этим, модулируемый электропроводящий канал демонстрирует первую проводимость, когда множество нуклеотидных оснований экспонировано в области гэпа; и вторую проводимость, которая отличается от первой проводимости, когда по меньшей мере некоторые из множества нуклеотидных оснований в области гэпа ассоциируют с комплементарными нуклеотидными основаниями. В одном примере, когда нуклеотидные основания экспонированы в области гэпа, проводимость модулируемого электропроводящего канала является относительно низкой. Напротив, когда нить-переключатель ассоциирует с гэпом, проводимость модулируемого электропроводящего канала меняется (например, увеличивается или уменьшается), в некоторых случаях, на порядки величины.
Нить-переключатель может быть частью меченого нуклеотида, который включает специфичный нуклеотид, связанный с нитью-переключателем. Когда специфичный нуклеотид включается в растущую нить во время процедуры секвенирования нуклеиновой кислоты, переключатель ассоциирует с гэпом, что приводит к изменению проводимости модулируемого электропроводящего канала. Так как нуклеотид и нить-переключатель являются специфичными друг к другу, изменение проводимости, ассоциированное с переключателем, также ассоциировано с нуклеотидом. В связи с этим, изменение в проводимости можно использовать для идентификации нуклеотидного основания, включаемого в растущую нить.
Обращаясь теперь к Фиг. 1А, изображен пример сенсора 10. Сенсор 10 согласно примеру представляет собой электрический/электронный сенсор. Сенсор 10 включает два электрода 12, 14, имеющих пространство между ними, и модулируемый электропроводящий канал 16, присоединенный к данным двум электродам 12, 14. Модулируемый электропроводящий канал включает полимер в виде модифицированной, частично двухцепочечной нуклеиновой кислоты (то есть модифицированной дцНК) 16', электрически соединенную с двумя электродами 12, 14 и образующую мостик в пространстве между двумя электродами 12, 14, причем модифицированная дцНК 16' включает две полинуклеотидные цепи 18, 20, частично связанные вместе; гэп 22 в первой из полинуклеотидных цепей 18, где отсутствуют нуклеотиды; и множество нуклеотидных оснований 24 второй из полинуклеотидных цепей 20, экспонированных в области гэпа 22 в первой из полинуклеотидных цепей 18.
Электроды 12, 14 имеют электрическую связь с модифицированной дцНК 16'/модулируемым электропроводящим каналом 16, и таким образом между электродами 12, 14 существует постоянный проводящий путь, когда сенсор 10 функционирует. Как уже упоминалось, данный проводящий путь является модулируемым посредством ассоциации нити-переключателя в области гэпа 22.
Может быть использован любой подходящий материал электрода, который может химически и электрически присоединяться к модифицированной дцНК 16'. Примеры подходящих материалов электродов включают золото, платину, углерод, оксид индия-олова и т.д.
Модифицированная дцНК 16' представляет собой полимер в виде нуклеиновой кислоты, которая включает две полинуклеотидные цепи 18, 20, частично связанные вместе. Под фразой «частично связанные вместе» подразумевается, что некоторые из нуклеотидных оснований двух цепей 18, 20 связаны водородными связями друг с другом с образованием двойной спирали, но что одна из цепей 18 имеет гэп 22 без каких-либо нуклеотидов. В области гэпа 22 в одной цепи 18 экспонированы нуклеотидные основания другой из цепей 20. Под термином «экспонированы» подразумевается, что основания данных нуклеотидов не связаны с другим нуклеотидом, и таким образом могут быть связаны, гибридизованы или иным образом ассоциированы с комплементарными нуклеотидами.
Нуклеотиды двух полинуклеотидных цепей 18, 20 могут представлять собой природные нуклеотиды. Природные нуклеотиды включают азот-содержащее гетероциклическое основание, сахар и одну или более фосфатных групп. Примеры природных нуклеотидов двух полинуклеотидных цепей 18, 20 включают рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды. В рибонуклеотидах сахар представляет собой рибозу и в дезоксирибонуклеотидах сахар представляет собой дезоксирибозу, то есть сахар, лишенный гидроксильной группы, которая находится в 2' положении в рибозе. В одном примере нуклеотид находится в полифосфатной форме, поскольку он включает несколько фосфатных групп (например, трифосфат (а именно, гамма-фосфат), тетрафосфат, пентафосфат, гексафосфат (как показано на Фиг. 5), и т.д.). Гетероциклическое основание (а именно нуклеотидное основание) может представлять собой пуриновое основание или пиримидиновое основание или любой другой аналог нуклеотидного основания. Пуриновые основания включают аденин (А) и гуанин (G) и их модифицированные производные или аналоги. Пиримидиновые основания включают цитозин (С), тимин (Т) и урацил (U) и их модифицированные производные или аналоги. Атом С-1 дезоксирибозы связан с N-1 пиримидина или N-9 пурина. Полинуклеотидные цепи 18, 20 могут также включать любые аналоги нуклеиновой кислоты. Аналог нуклеиновой кислоты может иметь любой фосфатный остов, сахар или измененное нуклеотидное основание. Примеры аналогов нуклеиновой кислоты включают, например, универсальные основания или аналоги остова на основе фосфата-сахара, такие как пептидо-нуклеиновая кислота (PNA - от англ. peptide nucleic acid).
Как упомянуто в данном документе, первая полинуклеотидная цепь 18 имеет гэп 22, где отсутствуют нуклеотиды. Гэп 22 может быть локализован в любом месте вдоль цепи 18, например, в или рядом с центром, на одном из концов цепи 18, между центром и одним концом цепи 18 и т.д. В связи с этим, в некоторых примерах первая полинуклеотидная цепь 18 включает две более короткие цепи, разделенные гэпом 22. В других примерах (например, когда гэп 22 находится на одном из концов цепи 18), первая полинуклеотидная цепь 18 представляет собой единственную непрерывную цепь. В других примерах первая полинуклеотидная цепь 18 может иметь множество гэпов 18 вдоль полимерного остова. Гэп(ы) 22 может(гут) иметь любую длину, которая меньше, чем общая длина дцНК 16'. В одном примере длина каждого гэпа 22 находится в интервале от примерно 5 нм до примерно 60 нм. В другом примере длина каждого гэпа 22 находится в интервале от примерно 10 нм до примерно 50 нм. В еще одном примере длина каждого гэпа 22 находится в интервале от примерно 20 нм до примерно 40 нм. В то время как длина гэпа 22 установлена как метрическая единица, следует понимать, что длина гэпа может также определяться, исходя из числа нуклеотидов, которое могло бы вместиться в гэп 22, или числа нуклеотидных оснований второй полимерной цепи 20, которые экспонированы в области гэпа 22. Гэп(ы) 22 в первой полинуклеотидной цепи 18 уменьшает проводимость модифицированной дцНК 16'.
В области гэпа 22 в первой полинуклеотидной цепи 18 экспонировано множество нуклеотидов второй полимерной цепи 20. В частности, экспонированы основания 24 данных нуклеотидов. Все экспонированные основания 24 могут быть одинаковыми основаниями или могут представлять собой комбинацию разных оснований. В одном примере по меньшей мере одно из экспонированных оснований 24 представляет собой гуанин (G). В данном примере другие экспонированные основания 24 могут представлять собой любое одно из или любую комбинацию аденина (А), цитозина (С), тимина (Т) и/или урацила (U). В другом примере каждое из экспонированных оснований 24 представляет собой гуанин (G). Может быть желательным включать несколько оснований гуанин (G) в ряд, (экспонированный в области гэпа 22, поскольку основания гуанина (G) проводят ток лучше, чем другие основания.
Две частично связанные полинуклеотидные цепи имеют противоположные концы, и линкер может быть присоединен к каждому из противоположных концов. В примерах, раскрытых в данном документе, i) линкеры соответственно присоединяют каждый конец первой из полинуклеотидных цепей 18 к соответствующему одному из двух электродов 12, 14; или ii) линкеры соответственно присоединяют каждый конец второй из полинуклеотидных цепей к соответствующему одному из двух электродов; или iii) и i, и ii. При том, что на Фиг. 1 проиллюстрирована вторая полинуклеотидная цепь 20, связанная с электродами 12, 14 посредством линкеров 26, следует понимать, что первая полинуклеотидная цепь 18 или обе цепи 18, 20 могут быть связаны с электродами 12, 14 посредством соответствующих линкеров 26. В связи с этим, соответствующие 5' и 3' концы первой и/или второй полинуклеотидной цепи 18, 20 могут иметь линкер 26, присоединенный к ним. Линкеры 26 электрически соединяли модифицированную дцНК 16' с электродами 12, 14. Линкеры 26 могут также быть способны к химическому связыванию с соответствующими электродами 12, 14, таким образом, образуя мостик в виде модифицированной дцНК 16' между электродами 12, 14. Таким образом, линкеры 26 могут зависеть от материала электрода. В качестве примеров, линкеры на основе тиолата или амина могут присоединяться к золотым электродам, линкеры на основе тиолов могут присоединяться к платиновым электродам и линкеры на основе силанов (например, азидосилана) могут присоединяться к ITO электродам. Присоединение соответствующего линкера 26 к одному из электродов 12, 14 может осуществляться посредством ковалентного связывания, координационного связывания или другой химической или физической связи, в зависимости от линкера и материала электрода. Линкеры 26 также являются электропроводящими, таким образом, что устанавливается проводящий путь между электродами 12, 14, когда модифицированная дцНК 16' присоединяется к каждому их электродов 12, 14.
Любой пример сенсора 10, раскрытый в данном документе, может включать множество других модулируемых электропроводящих каналов 16, присоединенных к двум электродам 12, 14, причем каждый из других модулируемых электропроводящих каналов 16 включает соответствующий полимер в виде модифицированной, частично двухцепочечной нуклеиновой кислоты 16', электрически соединенной с двумя электродами 12, 14 и образующей мостик в пространстве между двумя электродами 12, 14. Иными словами, сенсор 10 может включать два или более полимеров в виде частично двухцепочечных нуклеиновых кислот 16', где каждая модифицированная дцНК 16' электрически соединена с двумя электродами 12, 14. Множество каналов 16 относительно легко изготовить (обеспечивая присоединение множества нитей модифицированных дцНК 16'), и оно обеспечивает несколько гэпов 22, с которыми нить(ти)-перекпючатель(ли) может(гут) ассоциировать. В случае множества каналов 16, основной сигнал (например, в случае, когда нить(ти)-переключатель(ли) не ассоциирована(ны) с гэпом(ами) 22), выше, и когда соответствующие нити-переключатели ассоциируют с множеством модулируемых электропроводящих каналов 16, выявляемый сигнал может быть усилен.
3
4
2
5
х
2
Не будучи показанным на Фиг. 1А, сенсор 10 может также включать субстрат или подложку, на которой расположены электроды 12, 14. Пример подложки/субстрата 13 показан на Фиг. 1В. Подложка/субстрат 13 может представлять собой любую твердую поверхность, на которую могут быть насажены электроды 12, 14. Можно использовать любую непроводящую или полупроводящую твердую поверхность. Твердая поверхность может быть также непроницаемой и инертной в отношении жидкостей, реагентов и т.д., используемых в процессе секвенирования одиночных молекул. Некоторые примеры подходящих подложек/субстратов 13 включают эпоксисилоксан, стекло и модифицированное или функционализированное стекло, пластик (включая акриловые соединения, полистирол и сополимеры стирола и других веществ, полипропилен, полиэтилен, полибутилен, полиуретаны, политетрафторэтилен (как например, TEFLON из Chemours), циклические олефины/циклоолефиновые полимеры (СОР - от англ. cyclo-olefin polymer) (как например, ZEONOR из Zeon), полиимиды и т.д.), нейлон, керамику/керамические оксиды, диоксид кремния, плавленый кварц или материалы на основе диоксида кремния, силикат алюминия, силикон или модифицированный силикон (например, р+ силикон с примесью бора), нитрид кремния (SiN), оксид кремния (SiO), пентоксид тантала (TaO) или другой(ие) оксид(ы) тантала (ТаО), оксид гафния (HaO), неорганическое стекло или тому подобное. Подложка или субстрат 13 могут также представлять собой стекло или силикон с покрывающим слоем диоксида кремния или оксида тантала или другого керамического оксида на поверхности.
Также хотя и не будучи показанным на Фиг. 1А, сенсор 10 может также включать детектор, который может выявлять электрический ответ сенсора 10. Примеры детектора 15 показаны на Фиг. 1В, 4 и 5. В одном примере детектор 15 представляет собой амперметр. Как будет описано более подробно со ссылкой на Фиг. 5, проводимость модифицированной дцНК 16' (и таким образом модулируемого электропроводящего канала 16) может повышаться, когда нить-переключатель 28 (показана на Фиг. 2), включая нить нуклеотидов, включающих основания, комплементарные по меньшей мере некоторым из множества нуклеотидных оснований 24, экспонированных в области гэпа 22, ассоциирует с по меньшей мере некоторыми из множества нуклеотидных оснований 24 на уровне 22.
Как показано на Фиг. 1В, сенсор 10 может дополнительно включать жидкостную систему 17 для введения реагента в модулируемый электропроводящий канал 16. Данная жидкостная система 17 может представлять собой любое жидкостное устройство, которое может доставлять реагент к дцНК 16', или которое позволяет реагенту содержаться вблизи дцНК 16'. Как показано на Фиг. 1В, жидкостная система 17 может представлять собой крышку проточной ячейки, которая может присоединяться к и сниматься с подложки/субстрата 13. Данный пример жидкостной системы 17 включает входной канал 19, через который может быть введен реагент. Стенки данной жидкостной системы поддерживают реагент вблизи дцНК 16'. В качестве другого примера (не показанного), жидкостная система 17 может представлять собой пипетку (иди другое устройство доставки), которая может быть использована для доставки реагента к модулируемому электропроводящему каналу 16/дцНК 16'. В данном примере подложка/субстрат 13 может иметь борозду рядом с модулируемым электропроводящим каналом 16/дцНК 16', которая может получать реагент и позволять реагенту вступать в контакт с модулируемым электропроводящим каналом 16/дцНК 16'. В то время, как были предложены некоторые иллюстративные жидкостные системы, следует понимать, что сенсор 10 может включать любую жидкостную систему 17, которая может доставлять реагент к модулируемому электропроводящему каналу 16/дцНК 16', и/или которая позволяет реагенту содержаться вблизи модулируемого электропроводящего канала 16/дцНК 16'.
Сенсор 10, раскрытый в данном документе, может обеспечивать чувствительность на уровне одиночной молекулы. Кроме того, располагаясь в ряд (то есть несколько сенсоров 10, размещенных на субстрате/подложке 13), могут быть использованы очень маленькие расстояния между сенсорами, таким образом, чтобы плотность (то есть сенсор/площадь) могла быть очень высокой.
Для образования сенсора 10 можно использовать любые подходящие способы. В одном примере можно синтезировать модифицированную дцНК 16', и затем модифицированную дцНК 16' можно присоединять к электродам 12, 14 с образованием модулируемого электропроводящего канала 16 в пространстве между двумя электродами 12, 14.
Модифицированная дцНК 16' может быть получена посредством синтеза второй полинуклеотидной цепи 20 и затем смешивания второй полинуклеотидной цепи 20 с комплементарной(ыми) нитью(тями), которая(ые) будет(ут) присоединяться ко второй полинуклеотидной цепи 20 в соответствующем(их) положении(ях). Затем можно осуществлять отжиг смеси с инициированием присоединения. В одном примере две комплементарные нити могут присоединяться к соответствующим частям второй полинуклеотидной цепи 20, таким образом, что образуется гэп 22 где-то между двумя концами полученной модифицированной дцНК 16'. В другом примере одна комплементарная нить, которая короче, чем вторая полинуклеотидная цепь 20, может присоединяться к части второй полинуклеотидной цепи 20, таким образом, что гэп 22 образуется на одном конце полученной модифицированной дцНК 16'. Следует понимать, что вторая полинуклеотидная цепь 20 и комплементарная(ые) нить(ти), которые присоединяются с образованием первой полинуклеотидной цепи 18, могут быть выбраны для контроля длины гэпа 22 и нуклеотидных оснований 24, которые экспонированы в области гэпа 22.
Модифицированная дцНК 16' может затем присоединяться к электродам 12, 14. Линкеры 26 могут присоединяться к модифицированной дцНК 16' с использованием любой подходящей методики, и затем линкеры 26 могут присоединяться к электродам 12, 14. В одном примере тиол-модифицированные ДНК-основания могут быть конъюгированы на 3' и 5' концах цепей 18, 20. В одном примере модифицированная дцНК 16' может быть иммобилизована на электродах 12, 14 посредством выдерживания электродов 12, 14 в растворе модифицированной дцНК 16' на протяжении подходящего периода времени с последующей промывкой подходящим буфером для удаления несвязанной модифицированной дцНК 16'.
В способе получения сенсора 10 электроды 12, 14 могут быть также электрически соединены с детектором 15.
В некоторых примерах сенсор 10 может быть предварительно собранным.
В других примерах компоненты сенсора могут быть частью набора, и данные компоненты набора можно использовать для сборки сенсора 10. Пример набора включает электронный компонент и раствор полимера. Электронный компонент включает подложку 13 и два электрода 12, 14, функционально расположенных на подложке и разделенных пространством. Под фразой «функционально расположенные» подразумевается, что электроды 12, 14 могут быть соединены с электронной схемой, что обеспечивает их функционирование (например, будучи единовременно подключенными к детектору 15 и источнику питания). Электронная схема может быть электрически соединяемой с детектором 15 и с источником питания. Раствор полимера включает жидкий носитель и модифицированную дцНК 16' в данном жидком носителе, где модифицированная дцНК 16' представляет собой любую из примеров, описанных в данном документе. Как описано в данном документе, модифицированная дцНК 16' включает две полинуклеотидные цепи 18, 20, частично связанные вместе и имеющие противоположные концы. Модифицированная дцНК 16' может иметь линкеры 26, присоединенные к одной или обеим нитям 18 и/или 20 на каждом их противоположных концов. В одном примере модифицированная дцНК 16' находится в буферном растворе ионной соли, таком как физиологический раствор цитрата в миллимолярных-молярных концентрациях.
При использовании набора пользователь может осуществлять осаждение данного раствора полимера на электронных компонентах, обеспечивать возможность того, чтобы раствор полимера оставался на электронных компонентах на протяжении времени, подходящего для присоединения линкеров 26 к соответствующим электродам 12, 14, и затем электронные компоненты могут быть промыты подходящим буфером для удаления несвязанной модифицированной дцНК 16'.
Помимо содержания компонентов для образования сенсора 10, некоторые примеры набора могут также включать раствор реагентов, который нужно использовать с сенсором 10. Раствор реагентов включает меченые нуклеотиды, которые описаны, ссылаясь на Фиг. 2.
Обращаясь теперь к Фиг. 2, изображен пример меченого нуклеотида 30, который включает нить-переключатель 28, упомянутую выше. Меченый нуклеотид 30 включает нуклеотид 32, связывающую молекулу 34, присоединенную к фосфатной группе нуклеотида 32, и нить-переключатель 28, присоединенную к связывающей молекуле 34, причем нить-переключатель 28 включает нить нуклеотидов, включающих основания 36, комплементарные по меньшей мере некоторым из множества нуклеотидных оснований 24, экспонированных в области гэпа 22 сенсора 10. Меченый нуклеотид 30 можно считать неприродным или синтетическим нуклеотидом, поскольку он структурно или химически отличается от природного нуклеотида.
Нуклеотид 32 меченого нуклеотида 30 может представлять собой природный нуклеотид. Природные нуклеотиды включают азотсодержащее гетероциклическое основание, сахар и три или более фосфатных групп. Примеры природных нуклеотидов включают, например, рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды. Как упомянуто выше, в рибонуклеотиде сахар представляет собой рибозу, и в дезоксирибонуклеотиде сахар представляет собой дезоксирибозу. В одном примере нуклеотид 32 находится в форме фосфата, поскольку он включает несколько фосфатных групп (например, трифосфат, тетрафосфат, пентафосфат, гексафосфат и т.д..). Гетероциклическое основание (а именно, нуклеотидное основание) может представлять собой пуриновое основание (например, аденин (А) или гуанин (G)) или пиримидиновое основание (например, цитозин (С), тимин (Т) и урацил (U)).
Меченый нуклеотид 30 также включает связывающую молекулу 34. Связывающая молекула 34 может представлять собой любую длинноцепочечную молекулу, которая может химически связываться, на одном конце, с фосфатной(ыми) группой(ами) нуклеотида 32 и которая может химически связываться, на другом конце, с нитью-переключателем 28. Связывающая молекула 34 может также быть выбрана таким образом, чтобы она не взаимодействовала с полимеразой 38, используемой в системе 40, 40' (см. Фиг. 4 и 5), раскрытой в данном документе. Связывающую молекулу 34 выбирают таким образом, чтобы она была достаточной длинной, чтобы позволить нити-переключателю 28 ассоциировать с нуклеотидными основаниями 24, экспонированными в области гэпа 22 электрического сенсора 10, в то врем как, например, нуклеотид 32 удерживается полимеразой 38.
В качестве примеров, связывающая молекула 34 может включать алкильную цепь, поли(этиленгликолевую) цепь, амидогруппу, фосфатную группу, гетероцикл, такой как триазол, нуклеотиды или их комбинации. Примеры алкильной цепи могут включать по меньшей мере 6 атомов углерода и примеры поли(этиленгликолевой) цепи могут включать по меньшей мере 3 этиленгликолевых звена.
Следующий пример иллюстрирует пример меченого нуклеотида 30, где связывающая молекула 34 содержит алкильную цепь, амидогруппу, поли(этиленгликолевую) цепь и триазол:
Следующий пример иллюстрирует другой пример меченого нуклеотида 30, где связывающая молекула 34 содержит алкильные цепи, амидогруппу, поли(этиленгликолевые) цепи, триазол и фосфатную группу:
В то время как было описано несколько примеров связывающих молекул 34, следует понимать, что могут быть использованы другие связывающие молекулы 34.
Нить-переключатель 28 представляет собой нить нуклеотидов. Нуклеотиды в нити-переключателе 28 похожи на нуклеотид 32, то есть они включают азотсодержащее гетероциклическое основание, сахар и три или более фосфатных групп. По меньшей мере некоторые из нуклеотидов в нити-переключателе 28 включают основания 36, которые комплементарны основаниям 24, которые экспонированы в области гэпа 22 сенсора 10. В связи с этим, последовательность нуклеотидов в нити-переключателе 28 зависит, по меньшей мере частично, от последовательности экспонированных оснований 24.
В одном примере основания 36 в нити-переключателе 28 полностью комплементарны множеству нуклеотидных оснований 24, экспонированных в области гэпа 22. В качестве примера, нуклеотидные основания 24, экспонированные в области гэпа 22, могут представлять собой G-G-G-G-G-G-G, и нить-переключатель 28А может представлять собой С-С-С-С-С-С-С. В качестве другого примера, нуклеотидные основания 24, экспонированные в области гэпа 22, могут представлять собой G-A-G-T-G-C-G-G, и нить-переключатель 28А может представлять собой C-T-C-A-C-G-C-C. В примере, показанном на Фиг. 3А, любую подходящую последовательность можно использовать для нити-переключателя 28А, при условии, что она имеет такое же число оснований, как и число оснований 24, экспонированных в области гэпа 22, и полностью комплементарна им. Пример меченого нуклеотида 30А, включающего полностью комплементарную нить-переключатель 28А, показан на Фиг. 3А. Как изображено, нить-переключатель 28А меченого нуклеотида 30А сама ассоциирует с нуклеотидными основаниями 24, экспонированными в области гэпа 22. Более конкретно, в данном примере каждое из нуклеотидных оснований 36 в нити-переключателе 28А временно и по меньшей мере частично гибридизуется с комплементарным ему основанием 24 (полинуклеотидной цепи 20), которое экспонировано в области гэпа 22 в полинуклеотидной цепи 18. В некоторых примерах гибридизация не является полной, и в других примерах гибридизация является полной. Для достижения частичной или полной гибридизации можно регулировать температуру плавления взаимодействия между комплементарными основаниями. Разные степени гибридизации разных нитей-переключателей 28А и нуклеотидных оснований 24 позволяют достигать разных временных показателей с разными нитями-переключателями 28А. При включении нить-переключатель 28А выключает модифицированную дцНК 16', что значительно меняет (например, повышает) проводимость дцНК 16', модулирует канал 16 и приводит к выявляемому изменению.
В другом примере основания 36 в нити-переключателе 28 не являются полностью комплементарными множеству нуклеотидных оснований 24, экспонированных в области гэпа 22; а скорее нить-переключатель 28В включает по меньшей мере один нуклеотид, имеющий ошибочно спаренное основание 42, которое не комплементарно соответствующему основанию (показанному, как 24') множества нуклеотидных оснований 24, экспонированных в области гэпа 22, как показано на Фиг. 3В. Иными словами, ошибочно спаренное основание 42 не является комплементарным соответствующему нуклеотидному основанию 24', экспонированному в области гэпа 22. В качестве примера, нуклеотидные основания 24, экспонированные в области гэпа 22, могут представлять собой G-G-G-G-G-G-G, и нить-переключатель 28В может представлять собой С-С-С-А-С-С-С. В данном примере, аденин нити-переключателя 28В представляет собой ошибочно спаренное основание 42, поскольку он не комплементарен соответствующему гуанину, экспонированному в области гэпа 22 полинуклеотидной цепи 20. В качестве другого примера, нуклеотидные основания 24, экспонированные в области гэпа 22, могут представлять собой G-A-G-T-G-C-G-G, и нить-переключатель 28В может представлять собой C-C-C-A-C-G-C-C. В данном примере второй цитозин нити-переключателя 28В представляет собой ошибочно спаренное основание 42, поскольку оно не является комплементарным соответствующему аденину, экспонированному в области гэпа 22 полинуклеотидной цепи 20. В примере, показанном на Фиг. 3В, любая подходящая последовательность может быть использована для нити-переключателя 28В, при условии, что она имеет такое же число оснований, как и число оснований 24, экспонированных в области гэпа 22, частично комплементарна им и включает по меньшей мере одно ошибочно спаренное основание в отношении их. Как изображено, нить-переключатель 28В меченого нуклеотида 30В сама ассоциирует с нуклеотидными основаниями 24, экспонированными в области гэпа 22. Более конкретно, в данном примере, в то время, как некоторые нуклеотидные основания 36 в нити-переключателе 28В временно гибридизуются с соответствующими комплементарными основаниями 24, ошибочно спаренное основание 42 и соответствующее нуклеотидное основание 24' в полинуклеотидной цепи 20 остаются несвязанными. При включении, нить-переключатель 28В по существу выключает модифицированную дцНК 16' (но не полностью выключает из-за ошибочно спаренного основания 42), что значимо меняет (например, повышает) проводимость дцНК 16', модулирует канал 16 и приводит к выявляемому изменению. Следует понимать, что в некоторых примерах повышение проводимости с нитью-переключателем 28В может не быть таким же большим, как повышение, наблюдаемое с нитью-переключателем 28А, из-за ошибочно спаренного основания 42.
В еще одном примере нить нуклеотидов в нити-переключателе 28 имеет по меньшей мере на один нуклеотид меньше, чем множество нуклеотидных оснований 24, экспонированных в области гэпа 22. Пример данной нити-переключателя 28С показан на Фиг. 3С. Нуклеотиды в нити-переключателе 28С комплементарны некоторым из нуклеотидных оснований 24, экспонированных в области гэпа 22; однако, после ассоциирования нити-переключателя 23С в области гэпа, по меньшей мере одно из нуклеотидных оснований 24'' остается несвязанным из-за меньшей длины нити-переключателя (из-за отсутствующих оснований). В качестве примера, нуклеотидные основания 24, экспонированные в области гэпа 22, могут представлять собой G-G-G-G-G-G-G, и нить-переключатель 28С может представлять собой С-С-С-С-С. В данном примере в нити-переключателе 28С отсутствуют два основания, или она на два нуклеотида короче, чем общее число нуклеотидных оснований 24 (включая 24''), экспонированных в области гэпа 22. В качестве другого примера, нуклеотидные основания 24, экспонированные в области гэпа 22, могут представлять собой G-A-G-T-G-C-G-G, и нить-переключатель 28С может представлять собой T-C-A-C-G-C-C. В данном примере в нити-переключателе 28С недостает одного основания, и она на один нуклеотид короче, чем общее число нуклеотидных оснований 24 (включая 24''), экспонированных в области гэпа 22. В примере, показанном на Фиг. 3С, любая подходящая последовательность может быть использована для нити-переключателя 28С, при условии, что она имеет меньше оснований, чем общее число оснований 24, экспонированных в области гэпа 22, и является комплементарной некоторым из оснований 24, экспонированных в области гэпа 22. Как изображено на Фиг. 3С, когда нить-переключатель 28С меченого нуклеотида 30С сама ассоциирует в области гэпа 22, i) нуклеотидные основания 36 в нити-переключателе 28С временно и по меньшей мере частично гибридизуются с соответствующими комплементарными основаниями 24, и ii) некоторые из нуклеотидных оснований 24'' в полинуклеотидной цепи 20 остаются несвязанными, поскольку в нити-переключателе 28 отсутствуют основания. При включении нить-переключатель 28С по существу выключает модифицированную дцНК 16' (но не полностью выключает из-за отсутствующего (их) основания(ий)), что значимо меняет (например, повышает) проводимость модифицированной дцНК 16' (и канала 16) и приводит к выявляемому изменению. Следует понимать, в некоторых примерах, повышение проводимости в случае нити-переключателя 28С может не быть таким же большим, как повышение, наблюдаемое с нитью-переключателем 28А, из-за отсутствующих оснований.
В еще одном примере нить нуклеотидов в нити-переключателе 28 имеет большее число нуклеотидов, чем множество нуклеотидных оснований 24, экспонированных в области гэпа 22, и часть нити-переключателя 28 образует «петлю на стебле» при ассоциировании с гэпом 22. Пример данной нити-переключателя 28D показан на Фиг. 3D. Некоторые нуклеотиды в нити-переключателе 28D комплементарны нуклеотидным основаниям 24, экспонированным в области гэпа 22; однако, после ассоциации нити-переключателя 28D в области гэпа 22, некомплементарные нуклеотиды 36' нити-переключателя 28D остаются несвязанными и образуют «петлю на стебле» 44. В качестве примера нуклеотидные основания 24, экспонированные в области гэпа 22, могут представлять собой G-G-G-G-G-G-G-G-G, и нить-переключатель 28D может представлять собой С-С-С-С. В данном примере нить-переключатель 28D включает девять дополнительных оснований 36', которые образуют «петлю на стебле» 44. В качестве другого примера нуклеотидные основания 24, экспонированные в области гэпа 22, могут представлять собой A-G-T-T-T-T-T-T-G, и нить-переключатель 28D может представлять собой Т-С-С. В данном примере, нить-переключатель 28D включает шесть дополнительных оснований 36', которые образуют «петлю на стебле» 44. В примере, показанном на Фиг. 3D, любая подходящая последовательность может быть использована для нити-переключателя 28D, при условии, что она имеет больше чем общее число оснований 24, экспонированных в области гэпа 22, и включает по меньшей мере некоторые нуклеотидные основания, которые комплементарны основаниям 24, экспонированным в области гэпа 22. Нуклеотидные основания на одном из концов «петли на стебле» 44 могут быть полностью комплементарными нуклеотидными основаниями 24, экспонированными в области гэпа 22, могут включать одно или более некомплементарных оснований, могут иметь отсутствующие основания или могут включать комбинации комплементарных, некомплементарых и отсутствующих оснований. Как изображено на Фиг. 3D, где нить-переключатель 28D меченого нуклеотида 30D сама ассоциирует с гэпом 22, i) некоторые из нуклеотидных оснований 36 в нити-переключателе 28D временно и по меньшей мере частично гибридизуются с соответствующими комплементарными основаниями 24, и ii) некоторые некомплементарные нуклеотидные основания 36'' в нити-переключателе 28D остаются несвязанными и образуют «петлю на стебле» 44. При включении нить-переключатель 28D выключает модифицированную дцНК 16', что значимо меняет (например, повышает) проводимость модифицированной дцНК 16', модулирует канал 16 и приводит к выявляемому изменению. Некоторая часть электронного тока собирается переноситься по одной из цепей 18, 20 (например, когда обе цепи 18, 20 связаны с электродами 12, 14), таким образом, добавление «петли на стебле» 44 сравнимо с добавлением большего параллельно включенного резистора.
Любой пример меченых нуклеотидов 30 (например, 30А, 30В, 30С, 30D), раскрытый в данном документе, может быть использован в растворе реагентов примера набора, и/или в сенсорной системе 40, 40', примеры которой показаны на Фиг. 4 и 5. Каждая из систем 40, 40' также включает пример сенсора 10, раскрытый в данном документе.
Пример сенсорной системы 40, показанный на Фиг. 4, включает проточную ячейку 41 и электронный сенсор 10, интегрированный в проточную ячейку 41. Электронный сенсор 10 включают два электрода 12, 14; полимер в виде модифицированной, частично двухцепочечной нуклеиновой кислоты 16, образующей мостик с двумя электродами 12, 14, причем полимер в виде модифицированной, частично двухцепочечной нуклеиновой кислоты 16 включает две полинуклеотидные цепи 18, 20, частично связанные (посредством водородной связи) вместе, гэп 22 в первой 18 из полинуклеотидных цепей, где нуклеотиды отсутствуют; и множество нуклеотидных оснований 24 второй 20 из полинуклеотидных цепей, экспонированных в области гэпа 22. Проточная ячейка 41 представляет собой сосуд, который содержит сенсор 10. Следует понимать, что другие сосуды, такие как лунка, пробирка, канал, кювета, чашка Петри, бутыль или тому подобное, могут в качестве альтернативы содержать сенсор 10. Циклические процессы, такие как реакции секвенирования нуклеиновых кислот, особенно хорошо подходят для проточных ячеек 41.
Примеры проточных ячеек 41 включают субстрат/подложку 13 и крышку, прямо или непрямо связанную с ней, или образующую с ней единое целое. Проточная ячейка 41 может включать впускное отверстие для жидкости 45 и выпускное отверстие для жидкости 47, которые обеспечивают доставку объемных реагентов к сенсору 10 или ряду сенсоров 10, содержащихся в проточной ячейке 41.
Сенсорная система 40 может также включать систему доставки реагента 49 для селективного введения реагента в входное устройство (например, впускное отверстие для жидкости 45) проточной ячейки 41, через сенсор 10, и затем выведения из выпускного отверстия для жидкости 47. Система доставки реагента 49 может включать систему трубок или другие струйные системы, которые могут на постоянной основе или с возможностью снятия присоединяться к впускному отверстию для жидкости 45. Система доставки реагента 49 может включать контейнер для образца 51. Реагент (включая меченый нуклеотид 30, подлежащий введению в электронный сенсор 10) может храниться в контейнере для образца или быть получен и введен в контейнер для образца прямо перед применением. Система доставки реагента 49 может также включать насос или другое подходящее оборудование для извлечения реагента из контейнера для образца 51 и доставки его к впускному отверстию для жидкости 45. В других примерах контейнер для образца 51 располагается таким образом, чтобы реагент мог течь самотеком в впускное отверстие для жидкости 45, через сенсор 10, и из выпускного отверстия для жидкости 47.
Сенсор 10 в проточной ячейке 41 может также быть функционально соединен с детектором 15 для выявления изменений проводимости сенсора 10, когда используется сенсорная система 40.
Другой пример системы 40' показан на Фиг. 5 и включает электронный сенсор 10, который включает два электрода 12, 14; полимер в виде модифицированной, частично двухцепочечной нуклеиновой кислоты 16, образующей мостик с двумя электродами 12, 14, причем полимер в виде модифицированной, частично двухцепочечной нуклеиновой кислоты 16 включает две полинуклеотидные цепи 18, 20, частично связанные (посредством водородных связей) вместе, гэп 22 в первой 18 из полинуклеотидных цепей, где нуклеотиды отсутствуют; и множество нуклеотидных оснований 24 второй 20 из полинуклеотидных цепей, экспонированных в области гэпа 22; и отдельные реагенты, которые подлежат введению в электронный сенсор 10, причем реагенты включают меченые нуклеотиды 30, по меньшей мере один из меченых нуклеотидов 30, включающий нуклеотид 32, связывающую молекулу 34, присоединенную к фосфатной группе нуклеотида, нить-переключатель 28, присоединенную к связывающей молекуле 34, причем нить-переключатель 28 включает нить нуклеотидов, включающих основания 36, комплементарные по меньшей мере некоторым из множества нуклеотидных оснований 24, экспонированных в области гэпа 22. В примере, показанном на Фиг. 5, полинуклеотидная цепь 18 представляет собой ACCGGGGTA-ron-ATCCG и полинуклеотидная цепь 20 представляет собой TGGGCCCCATCCCCCCTAGGC (SEQ. ID No. 1). В полинуклеотидной цепи 20 нуклеотидные основания «СССССС» экспонированы в области гэпа 22 (по меньшей мере до тех пор, пока нить-переключатель 28 не будет ассоциирована с ними).
Хоть и не показано, следует понимать, что сенсор 10 может быть расположен в или быть частью сосуда, такого как проточная ячейка 41 (Фиг. 4), пробирка, канал, кювета, чашка Петри, бутыль или тому подобное. Другой пример подходящего сосуда представляет собой проточную ячейку.
В то время как один сенсор 10 показан на Фиг. 5, следует понимать, что сенсорная система 40' может включать ряд сенсоров 10, расположенных на субстрате. Кроме того, каждый сенсор(ы) 10 сенсорной системы 40' может быть электрически соединен с соответствующим детектором 15 для выявления ответа от электрического сенсора 10, когда нить-переключатель 28 ассоциирована с гэпом 22.
Некоторые примеры сенсорной системы 40' дополнительно включают полимеразу 38, заякоренную на модифицированной дцНК 16', и полинуклеотидную цепь-матрицу 48, которая должна быть введена в сенсор 10.
Как показано на Фиг. 5, сенсор 10 включает полимеразу 38. Может быть использована любая ДНК-полимераза, которая может катализировать добавление одного нуклеотида за один раз к растущей нити. ДНК-полимераза может происходить из любого из следующих семейств: А, В, С, D, X, Y и RT. Конкретные примеры из семейства А включают ДНК-полимеразу Т7, Pol I, Pol γ, Pol  или Pol v; или из семейства В включают Pol II, Pol В, Pol , Pol α, Pol δ и Pol ε; или из семейства С включают Pol III; или из семейства D включают Pol D (гетеродимер DP1/DP2) или из семейства X включают Pol β, Pol σ, Pol λ, Pol μ и терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу; или из семейства Y включают Pol ι, Pol κ, Pol η, Pol IV и Pol V; или из семейства RT включают Теломеразу.
Как показано на Фиг. 5, полимераза 38 иммобилизована на модифицированной дцНК 16' посредством связки 46. В другом примере полимераза 38 иммобилизована на субстрате посредством связки 46. Связку 46 используют в качестве якоря для полимеразы 38, и может быть желательным, чтобы связка 46 была непроводящей. Непроводящая связка может быть особенно желательной, когда полимераза 38 присоединена к модифицированной дцНК 16'. Примеры подходящей связки 46 включают полиэтиленгликоль (ПЭГ) с расщепляемой связью в некоторой точке вдоль цепи ПЭГ или могут включать химию никель-NTA (от англ. nitrilotriacetate - нитрилотриацетат)/His-метки, химию стрептавидина/биотина (например, стрептавидин, присоединенный к модифицированной дцНК 16', и биотин, присоединенный к полимеразе 38), гибридизацию ДНК-ДНК, гибридизацию ДНК-PNA, карбоксилсилан 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC - от англ. ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) или любой другой подходящий линкер, который может присоединять полимеразу к модифицированной дцНК 16' или к поверхности субстрата. В некоторых примерах связка 46 удерживает полимеразу 38 на расстоянии по меньшей мере 10 нм от модифицированной дцНК 16'. Может быть желательным, например, чтобы конформные изменения полимеразы 38, заряды полимеразы 38 и/или заряды полинуклеотидной цепи - мишени/матрицы 48, удерживаемой данной полимеразой 38, не мешали процессу распознавания модифицированной дцНК 16'.
В одном примере модифицированная дцНК 16' может быть исходно присоединена к полимеразе 38 посредством связки 46, которая включает расщепляемую связь. Данная комбинация может быть введена к электродам 12, 14 с присоединением противоположных концов модифицированной дцНК 16' к электродам 12, 14 и с присоединением полимеразы 38 к поверхности субстрата, например, посредством химии никель-NTA/His-метки. В данном примере расщепляемая связь может расщепляться с отсоединением полимеразы 38 от модифицированной дцНК 16'. В данном примере полимераза 38 находится вблизи модифицированной дцНК 16', но фактически не соприкасается с ней. Следует понимать, что связка 46 может расщепляться, когда предоставлена химия для удерживания полимеразы 38, например, на поверхности субстрата и вблизи сенсора 10.
Как упоминается в данном документе, примеры системы 40, 40' могут также включать полинуклеотидную цепь-матрицу 48, которая должна вводиться в сенсор 10.
Полинуклеотидная цепь-матрица 48 матрица может представлять собой любой образец, который подлежит секвенированию, и может состоять из ДНК, РНК или их аналогов (например, пептидо-нуклеиновых кислот). Источник полинуклеотидной цепи-матрицы (или мишени) 48 может представлять собой геномную ДНК, матричную РНК или другие нуклеиновые кислоты из нативных источников. В некоторых случаях полинуклеотидная цепь-матрица 48, которая происходит из таких источников, может быть амплифицирована перед применением в способе или системе 40, 40' в данном документе. Можно использовать любую из множества известных методик амплификации, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР), амплификацию по типу катящегося кольца (RCA - от англ. rolling circle amplification), амплификацию с множественным замещением (MDA - от англ. multiple displacement amplification) или амплификацию со случайными праймерами (RPA - от англ. random primer amplification), но, не ограничиваясь ими. Следует понимать, что амплификация полинуклеотидной цепи-матрицы 48 перед применением в способе или системе 40, 40', изложенной в данном документе, является необязательной. В связи с этим, полинуклеотидная цепь - матрица 48 не будет амплифицирована перед применением в некоторых примерах. Полинуклеотидные цепи - матрицы/мишени 48 могут, возможно, происходить из синтетических библиотек. Синтетические нуклеиновые кислоты могут иметь композиции нативной ДНК или РНК или могут представлять собой их аналоги.
Биологические образцы, из которых может происходить полинуклеотидная цепь-матрица 48, включают, например, биологические образцы из млекопитающего, такого как грызун, мышь, крыса, кролик, морская свинка, копытное животное, лошадь, овца, свинья, коза, корова, кошка, собака, примат, человекообразный примат или примат, отличный от человека; растения, такого как Arabidopsis thaliana, кукуруза, сорго, овес, пшеница, рис, канола или соя; водоросли, такой как Chlamydomonas reinhardtii; круглого червя, такого как Caenorhabditis elegans; насекомого, такого как Drosophila melanogaster, комар, плодовая мушка, медоносная пчела или паук; рыбы, такой как данио-рерио; рептилии; амфибии, такой как лягушка или Xenopus laevis; dictyostelium discoideum; грибов, таких как pneumocystis carinii, Takifugu rubripes, дрожжи, Saccharamoyces cerevisiae или Schizosaccharomyces pombe; или Plasmodium falciparum. Полинуклеотидные цепи - матрицы 48 могут также происходить из прокариот, таких как бактерия, Escherichia coil, staphylococci или mycoplasma pneumoniae; архей; вируса, такого как вирус Гепатита С, вирус Эбола или вирус иммунодефицита человека; или вироида. Полинуклеотидные цепи - матрицы 48 могут происходить из гомогенной культуры или популяции указанных выше организмов или в качестве альтернативы из коллекции нескольких разных организмов, например, в сообществе или экосистеме.
Кроме того, полинуклеотидные цепи-матрицы 48 могут не происходить из природных источников, а скорее могут быть синтезированы с использованием известных методик. Например, зонды для анализа экспрессии генов или зонды генотипирования могут быть синтезированы и использованы в примерах, изложенных в данном документе.
В некоторых примерах, полинуклеотидные цепи - матрицы 48 могут быть получены в виде фрагментов одной или более чем одной более длинной нуклеиновой кислоты. Фрагментацию можно проводить, используя любую из множества методик, известных в данной области, включая, например, распыление, обработку ультразвуком, химическое расщепление, ферментативное расщепление или физическую фрагментацию.
Фрагментация может также получаться в результате применения конкретной методики амплификации, посредством которой получают ампликоны в результате создания копий только части более длинной нуклеотид ной цепи. Например, посредством ПЦР-амплификации получаются фрагменты, имеющие размер, определенный длиной нуклеотидной последовательности на исходной матрице, которая находится между положениями, где во время амплификации гибридизуются фланкирущие праймеры. Длина полинуклеотидной цепи-матрицы 48 может быть выражена в числе нуклеотидов или быть выражена в метрической длине (например, в нанометрах).
Популяция полинуклеотидных цепей - матриц/мишеней 48 или их ампликонов может иметь среднюю длину нити, которая желательна или подходит для конкретного применения способов или системы 40, 40', изложенных в данном документе. Например, средняя длина нити может составлять меньше чем примерно 100000 нуклеотидов, примерно 50000 нуклеотидов, примерно 10000 нуклеотидов, примерно 5000 нуклеотидов, примерно 1000 нуклеотидов, примерно 500 нуклеотидов, примерно 100 нуклеотидов или примерно 50 нуклеотидов. В качестве альтернативы или дополнительно средняя длина нити может быть больше чем примерно 10 нуклеотидов, примерно 50 нуклеотидов, примерно 100 нуклеотидов, примерно 500 нуклеотидов, примерно 1000 нуклеотидов, примерно 5000 нуклеотидов, примерно 10000 нуклеотидов, примерно 50000 нуклеотидов или примерно 100000 нуклеотидов. Средняя длина нити для популяции полинуклеотидных цепей - мишеней 48 или их ампликонов может находиться в интервале от максимального до минимального значения, установленного выше.
В некоторых случаях популяция полинуклеотидных цепей - матриц/мишеней 48 может быть получена в условиях или иначе сконфигурирована таким образом, чтобы иметь максимальную длину для своих членов. Например, максимальная длина для членов может составлять меньше чем примерно 100000 нуклеотидов, примерно 50000 нуклеотидов, примерно 10000 нуклеотидов, примерно 5000 нуклеотидов, примерно 1000 нуклеотидов, примерно 500 нуклеотидов, примерно 100 нуклеотидов или примерно 50 нуклеотидов. В качестве альтернативы или дополнительно популяция полинуклеотидных цепей в качестве матрицы 48 или их ампликонов может быть получена в условиях или иначе сконфигурирована таким образом, чтобы иметь минимальную длину для своих членов. Например, минимальная длина для членов может составлять больше чем примерно 10 нуклеотидов, примерно 50 нуклеотидов, примерно 100 нуклеотидов, примерно 500 нуклеотидов, примерно 1000 нуклеотидов, примерно 5000 нуклеотидов, примерно 10000 нуклеотидов, примерно 50000 нуклеотидов или примерно 100000 нуклеотидов. Максимальная и минимальная длина нити для полинуклеотидных цепей - матриц 48 в популяции может находиться в интервале от максимального до минимального значения, изложенных выше.
Как показано на Фиг. 5, полинуклеотидная цепь - матрица 48 (например, нить одноцепочечной ДНК), подлежащая секвенированию, связана с полимеразой 38 после введения в раствор вместе с реагентами, такими как меченые нуклеотиды 30.
В некоторых примерах несколько разных меченых нуклеотидов 30 (например, соответственно меченых dA, dC, dG, и dT в качестве нуклеотида 32) можно использовать вместе в системе 40, 40', включающей ряд сенсоров 10. В одном примере используют четыре разных меченых нуклеотида 30, причем каждый включает отличный нуклеотид 32 и отличную нуклеотид-специфичную нить-переключатель 28. В качестве примера, меченый нуклеотид 30 включает первый меченый нуклеотид, который включает дезоксиаденозинполифосфат в качестве нуклеотида и первую нуклеотид-специфичную нить-переключатель; второй меченый нуклеотид, который включает дезоксигуанозинполифосфат в качестве нуклеотида и вторую нуклеотид-специфичную нить-переключатель, имеющую последовательность, отличную от первой нити-переключателя; третий меченый нуклеотид, который включает дезоксицитидинполифосфат в качестве нуклеотида и третью нуклеотид-специфичную нить-переключатель, имеющую последовательность, отличную от каждой из первой и второй нитей-переключателей; и четвертый меченый нуклеотид, который включает дезокситимидинполифосфат в качестве нуклеотида и четвертую нуклеотид-специфичную нить-переключатель, имеющую последовательность, отличную от каждой из первой, второй и третей нитей-переключателей. В связи с этим, в данном примере первая, вторая, третья и четвертая нуклеотид-специфичная нити-переключатели отличаются друг от друга. Разные нити-переключатели будут генерировать разные изменения проводимости (при ассоциации с комплементарным гэпом 22), которые можно использовать для идентификации специфичного нуклеотида, присоединенного к ним.
Обращаясь теперь к Фиг. 6, изображен способ. Способ 100 включает следующее: введение полинуклеотидной цепи - матрицы 48 в электронный сенсор 10, имеющий полимеразу 38, связанную с i) модулируемым электропроводящим каналом 16, который образует мостик в пространстве между и электрически связан с двумя электродами 12, 14, или ii) субстратом 13, поддерживающим данные два электрода 12, 14, причем модулируемый электропроводящий канал 16 включает полимер в виде модифицированной, частично двухцепочечной нуклеиновой кислоты 16', которая включает: две полинуклеотидные цепи 18, 20, частично связанные вместе; гэп 22 в первой из полинуклеотидных цепей 18, где отсутствуют нуклеотиды; и множество нуклеотидных оснований 24 второй полинуклеотидной цепи 20, экспонированных в области гэпа 22 в первой из полинуклеотидных цепей 18 (номер позиции 102); введение реагентов, включая меченые нуклеотиды 30, в электронный сенсор 10, в результате чего нуклеотид 32 одного из меченых нуклеотидов ассоциирует с полимеразой 38 и нуклеотид-специфичная нить-переключатель 28 одного из меченых нуклеотидов 30 ассоциирует с по меньшей мере некоторыми из множества нуклеотидов 24, экспонированных в области гэпа 22 (номер позиции 104); и в ответ на ассоциирование в области гэпа 22, выявление ответа электронного сенсора 10. На Фиг. 5 также будут ссылаться на протяжении всего обсуждения способа 100.
2+
Как показано на Фиг. 5, полинуклеотидная цепь-матрица 48, вводимая в сенсор 10, может закрепляться на месте посредством полимеразы 38, которая связана с сенсором 10 или с поверхностью субстрата, который поддерживает сенсор 10. Полинуклеотидная цепь - матрица 48, показанная на Фиг. 5, представляет собой нить ДНК - матрицу. Полинуклеотидную цепь - матрицу 48 можно вводить в биологически стабильном растворе, вместе с реагентами, такими как меченые нуклеотиды 30. Биологически стабильный раствор может представлять собой любой буфер, подходящий для реакций включения оснований посредством полимеразы, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) или линейная амплификация. В качестве примера, биологически стабильный раствор может включать буфер, имеющий рН около 7, концентрацию соли выше нескольких миллимоль и концентрацию ионов Mg на уровне миллимолярной концентрации.
Также, как показано на Фиг. 5, меченый нуклеотид 30 может включать основание, которое комплементарно целевой нуклеиновой кислоте полинуклеотидной цепи - матрицы 48. Меченый нуклеотид 30 будет удерживаться на месте, частично, посредством полимеразы 38, которая также связана с полинуклеотидной цепью - матрицей 48.
Взаимодействие между меченым нуклеотидом 30 и полимеразой 38 и длина связывающей молекулы 34 обеспечивают ассоциирование нити-переключателя 28 с гэпом 22 сенсора 10. В одном примере ассоциирование нити-переключателя 28 с гэпом 22 включает гибридизацию по меньшей мере части нити-переключателя 28 с нуклеотидными основаниями 24, экспонированными в области гэпа 22. Происходящая гибридизация будет отчасти зависеть от используемой нити-переключателя 28 (например, 28А, 28В, 28С, 28D). Температуру и/или ионную концентрацию раствора можно регулировать для инициации или стимуляции полной или частичной гибридизации или отжига нити-переключателя 28 с по меньшей мере некоторыми нуклеотидными основаниями 24, экспонированными в области гэпа 22. В качестве одного примера, нить-переключатель 28 может быть сконструирована для частичной или полной гибридизации с гэпом 22 при комнатной температуре (например, от примерно 18°С до примерно 22°С) и в растворе, имеющем концентрацию соли 50 мМ.
Полимераза 38 будет удерживать нить-переключатель вблизи гэпа 22, что, таким образом, позволяет происходить нескольким событиям гибридизации и дегибридизации. Напротив, случайная нить, проплывающая мимо, будет вероятно гибридизоваться один раз и затем отдаляться. Нить-переключатель 28 может удерживаться вблизи гэпа 22 до тех пор, пока не будет диссоциирована, например, с использованием плавления или другой подходящей методики. В некоторых примерах ассоциирование нити-переключателя в гэпе 22 может занимать вплоть до десятков миллисекунд или дольше. Это относительно длительное взаимодействие поворачивает переключатель в положение «Вкл» (например, модулирует канал 16 посредством повышения проводимости с более низкого состояния), и данное изменение в проводимости может быть выявлено. Данное относительно длительное взаимодействие отличается от других меченых нуклеотидов 30, присутствующих в растворе (то есть, от случайной, проплывающей нити), которые могут диффундировать и непродолжительное время касаться, а не подвергаться нескольким событиям по меньшей мере частичной гибридизации и дегибридизации в сенсоре 10. Непродолжительное взаимодействие данных других меченых нуклеотидов 30 может вызывать кратковременное и/или внезапное изменение проводимости, и, таким образом, и отличимо от изменения проводимости, которое происходит в результате удержания нити-переключателя 28 вблизи гэпа 22.
Когда нить-переключатель 28 осуществляет по меньшей мере частичную гибридизацию и дегибридизацию несколько раз с экспонированными нуклеотидными основаниями 24, ответ сенсора 10 может указывать на основание меченого нуклеотида 30, поскольку нить-переключатель 28 является нуклеотид-специфичной (то есть специфичная нить-переключатель 28 выбрана для конкретного основания). В связи с этим, способ 100 может также включать ассоциирование ответа сенсора 10 с ассоциированной нуклеотид-специфичной нитью-переключателем 28 (то есть, меченым нуклеотидом 30, который ассоциировал с полимеразой 38 и гэпом 22), и на основе нуклеотид-специфичной нити-переключателя 28, идентификацию нуклеотида (то есть, основания) ассоциированного меченого нуклеотида 30 (то есть меченого нуклеотида 30, который ассоциировал с полимеразой 38 и гэпом 22).
Основание ассоциированного меченого нуклеотида 30 будет включаться в растущую нить 50, которая гибридизована с полинуклеотидной цепью - матрицей 48. Это, в свою очередь, будет разрывать связь между фосфатной(ыми) группой(ами) меченого нуклеотида 30 и вновь включенным нуклеотидным основанием. Это отщепляет остальную часть меченого нуклеотида 30 от вновь включенного нуклеотидного основания.
Поскольку нить-переключатель 28 может отдавать предпочтение по меньшей мере частичной гибридизации и оставаться соединенной в конфигурации двойной спирали модифицированной дцНК 16', способ 100 может дополнительно включать нагревание для диссоциации нуклеотид-специфичной нити-переключателя 28 от гэпа 22. Температуру плавления нити-переключателя 28 можно регулировать при синтезе меченого нуклеотида 30 для того, чтобы сделать время пребывания в состоянии «Вкл» короче или продолжительнее, в зависимости, частично, от того, как долго полимераза 38 удерживает нуклеотид 32 меченого нуклеотида 30. В одном примере температуру плавления можно регулировать для соответствия температуре, при которой сенсорная система 40, 40' функционирует при связи между фосфатной(ыми) группой(ами) меченого нуклеотида 30 и вновь включенным нуклеотидным основанием. Это будет вызывать диссоциацию нити-переключателя 28 в пределах того же периода времени, когда отщепляется меченый нуклеотид 30. В другом примере может быть желательно, чтобы время пребывания нити-переключателя 28 в состоянии «Выкл.» было гораздо короче, чем время, на протяжении которого меченый нуклеотид 30 удерживается полимеразой 28 во время включения в растущую нить 50. Это может минимизировать фоновые события от нитей-переключателей 28, которые неассоциированы с полимеразой 28.
В результате отщепления и диссоциации оставшаяся часть меченого нуклеотида 30 может диссоциировать от нуклеотидного основания и диффундировать дальше от сенсора 10. Отщепление и диссоциация снова модулирует канал 16, возвращая проводимость сенсора 10 в исходное состояние (например, более низкой) проводимости, в котором он был перед ассоциированием меченого нуклеотида 30 с полимеразой 38 и с гэпом 22. Появление и исчезновение сигнала, когда проводимость сенсора 10 меняется (например, повышение и возвращение в состояние более низкой проводимости), соответственно, может коррелировать с включением нуклеотидного основания в растущую нить 50 нуклеотидной цепи - матрицы 48 и последующей диссоциацией меченого нуклеотида 30.
В примере способа 100 ассоциирование одного из меченых нуклеотидов 30 (с полимеразой 32 и гэпом 22), выявление, ассоциирование ответа и идентификацию вместе можно использовать для выявления одиночных молекул на основе выявления события включения посредством полимеразы (то есть, какой нуклеотид был включен в растущую цепь 50).
Следует понимать, что все комбинации приведенных выше понятий и дополнительных понятий, обсуждаемых более подробно ниже (в том случае, если такие понятия не являются взаимно противоречащими), рассматриваются как часть предмета изобретения, раскрытого в данном документе. В частности, все комбинации заявленного предмета изобретения, появляющиеся в конце данного раскрытия, рассматриваются как часть предмета изобретения, раскрытого в данном документе. Также следует понимать, что терминология, в явном виде используемая в данном документе, которая также может появляться в любом раскрытии, включенном посредством ссылки, должна предоставлять значение, наиболее соответствующее конкретным понятиям, раскрытым в данном документе.
Ссылка на протяжении всего описания изобретения на «один пример», «другой пример», «пример» и т.п., означает, что конкретный элемент (например, признак, структура и/или характеристика), описанный в связи с данным примером, включен в по меньшей мере один пример, описанный в данном документе, и может быть представлен или может не быть представлен в других примерах. Кроме того, следует понимать, что описанные элементы для любого примера можно объединять любым подходящим образом в разных примерах, если контекстом явным образом не продиктовано иное.
Термины «по существу» и «примерно», используемые на протяжении данного раскрытия, включая формулу изобретения, используют для описания и объяснения небольших отклонений, как например, из-за разброса при обработке. Например, они могут относиться к меньше чем или равным плюс/минус 5%, как например, меньше чем или равным плюс/минус 2%, как например, меньше чем или равным плюс/минус 1%, как например, меньше чем или равным плюс/минус 0,5%, как например, меньше чем или равным плюс/минус 0,2%, как например, меньше чем или равным плюс/минус 0,1%, как например, меньше чем или равным плюс/минус 0,05%.
Кроме того, следует понимать, что диапазоны, предложенные в данном документе, включают установленный диапазон или любое значение или поддиапазон в пределах установленного диапазона, как если бы они были в явном виде перечислены. Например, следует понимать, что диапазон, представленный от примерно 10 нм до примерно 50 нм, включает не только в явном виде перечисленные пределы от примерно 10 нм до примерно 50 нм, но также включает отдельные значения, такие как, например, 15 нм, 22,5 нм, 45 нм и т.д., и поддиапазоны, как например, от примерно 20 нм до примерно 48 нм, и т.д.
В то время как несколько примеров было подробно описано, следует понимать, что раскрытые примеры могут быть модифицированы. Таким образом, приведенное выше описание нужно считать неограничивающим.