Способ количественного определения летучих органических веществ в клатратных комплексах методом ГЖХ.
METHOD FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF VOLATILE ORGANIC SUBSTANCES IN CLATHRATE COMPLEXES BY GC METHOD

Изобретение относится к способам количественного определения летучих органических веществ в клатратных комплексах методом ГЖХ.
Получение и использование клатратных комплексов (комплексов включения) является относительно новой областью т.н. «супрамолекулярной» химии.  Комплексы включения представляют собой молекулярные соединения, имеющие характерную структуру аддукта, в котором молекула одного из соединений (молекула-"хозяин") пространственно ограничивает, по меньшей мере, часть молекулы другого соединения. Заключенная в этот объем молекула соединения (молекула-"гость") расположена в полости молекулы-хозяина таким образом, что она не влияет на остовную структуру хозяина. Характерной особенностью комплекса включения является то, что размер и конфигурация соответствующей полости чаще всего остаются неизменными, не считая легкой деформации, "хозяином" может являться любое соединение-хозяин или любая молекула-хозяин, известные в технике. Примеры подходящих "хозяев" включают, но без ограничения, циклодекстрины, карцеранды, кавитанды, краун-эфиры, криптанды, кукурбитурилы, каликсарены, арабиногалактан лиственницы сибирской, сферанды и т.п. Примеры "гостей", пригодных в качестве комплексообразующих агентов, включают такие соединения, как адамантан, диадамантан, нафталин и холестерин.
Циклодекстрины являются предпочтительными хозяевами, способными взаимодействовать со многими ионными и молекулярными соединениями и дающими в результате соединения включения, относящиеся к классу комплексов "гость-хозяин". Используемые для получения комплексов включения циклодекстрины и арабиногалактан являются широко  известными комплексообразователями. Так, известно, что молекулы циклодекстринов имеют тороидальную форму, причем ее внутренняя полость гидрофобна. Водорастворимые межмолекулярные комплексы липофильных органических соединений образуются в растворе за счет интеркапсуляции их молекул в эту полость. Арабиногалактан  является полисахаридным метаболитом эндемиков сибирской лесной флоры лиственницы сибирской (Larix sibirica) и лиственницы Гмелина (Larix Gmelinii) и легко выделяется из древесины указанных деревьев.
Для того, чтобы реализовалось взаимодействие "хозяин-гость", соединения должны отвечать нескольким требованиям: одно из них - это то, что связывание молекул хозяина и гостя должно быть комплементарным с точки зрения стереоэлектронных эффектов. Циклодекстрины способны образовывать комплексы включения с соединениями, размеры молекул которых сравнимы с размерами полости. Однако степень образования комплекса зависит также от полярности молекулы-"гостя". Образование комплекса с молекулами, значительно большими по объему, чем полость, также возможно при условии, что только некоторые группы или боковые цепи проникают в канал углевода (См. /1/) .
Известно получение клатратных комплексов в решении проблем транспорта лекарственных средств оказывает существенное влияние практически на каждый способ введения от перорального до инъекционного.  Широко применяются также клатратные комплесы 1-метилциклопропена для решения задач по увеличению сроков хранения сельскохозяйственной продукции (См. /2-4/).
Для получения клатратных циклодекстриновых комплексов могут быть использованы  -,   - или  -циклодекстрины, гидроксипропил--циклодекстрин.
В связи с большим разнообразием известных и вновь синтезируемых комплексов включения актуальной является задача по разработке простого и надежного метода количественного определения веществ, инкапсулированных в виде «гостя» в клатрат. Так, в /5/ описан способ количественного определения содержания «гостя» в комплексе включения весьма дорогостоящим и требующим высокой квалификации специалиста методом  - дериватографией. Этот метод заключается в определении весового содержания путем гравиметрического анализа потерь комплексом вещества  «гостя» и связанной с носителем кристаллизационной воды путем постепенного нагрева образца. Кроме уже перечисленных неудобств, при таком методе возникает необходимость расшифровки диаграмм потери веса и отделения потерь кристаллизационной воды от основного вещества.
Метод газо-жидкостной хроматографии является широко распространенным способом определения содержания органических веществ и может быть произведен даже силами обычного лаборанта.  В хромрафии довольно часто приходится иметь дело с анализом смесей, представляющих собой одно основное вещество и сопутствующие примеси. Задача хроматографического анализа заключается в установлении концентрации основного вещества и концентраций регламентируемых примесей. Для этого предварительно проводят калибровку детектора хроматографа по всем определяемым веществам и далее определяют поправочные коэффициенты по всем компонентам летучей пробы.
Известны несколько методик построения градуировочных графиков. Так, применяют метод нормировки, исходя из предположения, что на хроматограмме видны все пики веществ, находящихся в пробе. Более точным является метод абсолютной калибровки, когда площадь пика соответствующего вещества пропорциональна содержанию его в пробе. Однако точность данного метода очень условна, поскольку целиком зависит от квалификации специалиста, проводящего анализ. Более распространенным и точным методом определение концентраций основного вещества и примесей  является метод добавки вещества в пробу с известной заранее концентраций, т.н. «Внутренний стандарт».  И хотя процедура введения Внутреннего стандарта сопряжена с определенными трудностями, такими как:
- необходимость отсутствия вводимого вещества в исходной пробе;
- уверенность в полном делении пиков анализируемых веществ и стандартного вещества;
- подбор концентрации стандартного вещества, чтобы была сравнима с анализируемыми ( См. /6,7/);
очевидные преимущества по увеличению точности анализа, независимость метода от количества вводимой пробы приводит к преимущественному использованию в аналитических ГЖХ-методиках именно способа «Внутреннего стандарта».
По отношению к анализу комплексов включения трудности по использованию метода «Внутреннего стандарта» еще более возрастают, особенно, если анализируемое вещество нестойкое в обычных условиях. В частности, затрудняется процедура ввода внутреннего стандарта в подготовленную пробу вещества, выделившегося из клатрата, в пробу, подготовленную для анализа методом газовой хроматографии.
Наиболее близким по своей технической сущности и достигаемому результату к заявленному способу является способ количественного определения 1-метилциклопропена, выделившегося из клатратного комплекса с -циклодекстрином во внутренний объем фруктохранилища из препарата «Фитомаг» после взаимодействия клатратного комплекса с водой или водным раствором, содержащим органические (синтанол ДС-10, этанол и др.) и/или неорганические вещества (гидроксиды или карбонаты щелочных металлов - NaOH, КОН, NaHCO 3 и др.). Концентрация органических или неорганических веществ в водном растворе обычно составляет от 0.1 до 3 мас.%. Количество воды или водного раствора органических или неорганических веществ составляет 3÷7 массовых частей на 1 массовую часть препарата.
3
3
Концентрацию 1-МЦП в объеме хранилища или контейнера определяют путем отбора проб воздуха из фруктохранилища и дальнейшим анализом их методом газохроматографического анализа (Газовый хроматограф «КРИСТАЛЛ ЛЮКС - 4000». Капиллярная колонка OV - 101,  =0.3 мм, L=50 м. Пламенно-ионизационный детектор. Температура испарителя - 130°С. Температура колонки - 270°С. Температура детектора - 270°. Расход водорода - 28 см/мин. Расход воздуха - 500 см/мин) (/9/, прототип).
Недостатками известного способа являются недостоверность сведений, отраженных в описании к патенту, в частности, огромная температура в гжх-колонке, при которой 1-МЦП гарантированно разлагается, а также отсутствие каких-либо сведений о методе калибровке детектора по анализируемому веществу, сведений об изомерах и других загрязняющих веществах, находящихся в препарате «Фитомаг», из чего можно сделать вывод о том, что, скорее всего, в известном способе применен метод абсолютной калибровки.
Задачей настоящего изобретения является увеличение точности анализа летучих соединений в клатратных комплексах.
Заявленный способ осуществляется путем ГЖХ-анализа газовой фазы, выделившейся в результате взаимодействия взвешенной пробы клатратного комплекса с водным щелочным или кислотным  раствором, отличающийся тем, что пробу клатратного комплекса предварительно смешивают с известным количеством другого клатратного комплекса, содержащим один или несколько Внутренних стандартов, затем взвешенную объединенную пробу, помещенную в хроматографическую виалу, вакуумируют при 2-100 мм рт.ст. в течение 0,5-3 минут, после чего в виалу впрыскивают водный раствор щелочи или кислоты, интенсивно встряхивают в течение 1-10 мин. и далее отбирают для анализа выделившуюся газовую фазу.
Помимо простоты проведения операций, заявленный способ обладает очень высокой точностью, поскольку заранее приготовленный клатратный комплекс с Внутренним стандартом имеет постоянную концентрацию стандартного вещества, определенную любым доступным специалисту способом, например, методом дериватографии. Такой комплекс может быть приготовлен заранее в больших количествах и незамедлительно использован при необходимости. При этом отпадает необходимость в сложных устройствах, дозирующих с высокой точностью  газообразные или легкоиспаряющиеся вещества в пробу, то есть резко упрощается методика введения внутреннего стандарта.
Изобретение иллюстрируется приведенными ниже примерами, которые никак не ограничивают возможность осуществления способа в пределах заявляемого объема притязаний.
Пример 1 (по прототипу).
3
3
3
3
Анализу подвергали образец препарата «Фреш-Форма», содержащие 1-метилциклопропен и ряд других примесей, инкапсулированных в альфа-циклодекстрине. Газо-хроматографический анализ производили на газовом хроматографе «YL 6500 GC» (производство Японии) с пламенно-ионизационным детектором с капиллярной кварцевой колонкой диной 30 м внутренний диаметр 0,25 мм с нанесенной  слабо полярной неподвижной жидкой фазой (НЖФ). В качестве НЖФ применялся состав, содержащий 5% фенилполисилоксана и 95% диметилполисилоксана.  (Температура испарителя - 110°С. Температура колонки - 56°С. Температура детектора - 120°С. Расход водорода - 25 см/мин. Расход воздуха - 400 см/мин). Расход газа носителя (азот) - 25 см/мин. Деление потока – 1:100. Расход азота на «поддув» в детектор - 15 см/мин. Время анализа – 8 минут).
Предварительно строили калибровочный график по методу абсолютной калибровки по чистому сконденсированному и дважды перегнанному  1-метилциклопропену, полученного в результате синтеза по известной методике /8/.
Газовую фазу анализировали после выделения ее из пробы весом 5 грамм препарата «Фреш-Форма», помещенного в колбу с внутренним объемом 500 см 3
и залитую 35 грамм 5% раствора натриевой щелочи.
Точность построения градуировочного графика не превысила 5% отн. по 6 точкам, воспроизводимость метода по абсолютной калибровке пробы с неизвестной концентрацией – не более 12 отн. %, по пяти повторениям с исключением двух повторений, отличающихся более чем на 20%. Содержание 1-метилциклопропена в пробе по методу абсолютной калибровки – от 2,35 масс.% до 2,68 масс.%, содержание 3-метилциклопропена – от 0,04 масс.% до 0,045 масс.%, содержание метилциклопропана – от 0,3 до 0,34 масс.%, содержание метиленциклопропана – от 0,23 масс.% до 0,26 масс.%.
Пример 2 (по заявленному способу).
3
3
3
3
Анализу подвергали такой же, как и в примере 1 образец препарата «Фреш-Форма», содержащие 1-метилциклопропен и ряд других примесей, инкапсулированных в альфа-циклодекстрине. Газо-хроматографический анализ производили на газовом хроматографе « YL 6500 GC» (производство Японии) с пламенно-ионизационным детектором с капиллярной кварцевой колонкой диной 30 м внутренний диаметр 0,25 мм с нанесенной  слабо полярной неподвижной жидкой фазой (НЖФ). В качестве НЖФ применялся состав, содержащий 5% фенилполисилоксана и 95% диметилполисилоксана.  (Температура испарителя - 110°С. Температура колонки - 56°С. Температура детектора - 120°С. Расход водорода - 25 см/мин. Расход воздуха - 400 см/мин). Расход газа носителя (азот) - 25 см/мин. Деление потока – 1:100. Расход азота на «поддув» в детектор - 15 см/мин. Время анализа – 8 минут).
Предварительно строили калибровочный график по методу внутреннего стандарта по чистому сконденсированному и дважды перегнанному  1-метилциклопропену, полученного в результате синтеза по известной методике /8/.
В качестве внутреннего стандарта использовали газ этилен, находящийся в клатратном комплексе с бета-циклодекстрином.
Комплекс получают следующим образом:
В автоклав с рубашкой и внешним перемешивающим устройством внутренним объемом 500 мл загружают 100 грамм товарного -циклодекстрина. Автоклав соединен газовой линией с 40-литровым баллоном с этиленом, находящимся под давлением 110 атм. Газовая линия, идущая от редуктора баллона, соединена с барбатером, установленным на крышке автоклава, нижний конец барботера доходит до дна внутреннего пространства автоклава.  Редуктор баллона может регулировать давление на выходе из баллона в пределах от 0,5 до 15 атм. Другой газовой линией, идущей от патрубка на крышке автоклава, автоклав через механический фильтр соединен с патроном с внутренним объемом 1,0 литра, в котором находится 250 грамм свежепрокаленного хлористого кальция. В середину газовой линии, идущей от редуктора баллона, через тройник врезана нагнетающая линия от газового насоса, насос имеет производительность 5,0 литра в минуту по газу при нормальных условиях. Всасывающая линия насоса соединена с выходом из патрона с осушителем. Таким образом, обеспечивается непрерывная циркуляция газовой фазы через слой циклодекстрина, проходящей каждый раз через патрон с осушителем.
Автоклав закрывают герметично, в рубашку автоклава начинают подавать водно-глицериновый раствор из термостата при температуре 70 градусов С. Давление в автоклаве с помощью редуктора доводят до 7,0 атм, после чего включают перемешивание.
Поглощение этилена циклодекстрином продолжают 8,5 часов, затем давление сбрасывают, автоклав охлаждают до комнатной температуры, содержимое автоклава выгружают в эксикатор. Всего получено 95,4 грамма комплекса включения, содержащего газ этилен.  Содержание этилена в комплексе, определенное по методу дериватографического анализа, составило 2,31 масс. %.
3
Газовую фазу из пробы препарата «Фреш-Форма» анализировали по следующей методике: отвешивали по 0,15 грамм клатратных комплексов, содержащих 1-МЦП с примесями и Внутренний стандарт - этилен, смешивали их и помещали в хроматографическую виалу объемом 15 см, после чего герметично закрывали ее и вакуумировали при остаточном давлении 25 мм рт.ст. в течение 1,5 мин. Затем в виалу впрыскивали 1,5 мл 10% раствора натриевой щелочи, энергично встряхивали виалу в течение 2-х минут и затем анализировали методом ГЖХ выделившуюся паровую фазу.
Перед проведением измерений выполняли калибровку хроматографа путем определения зависимости отношения масс искомого вещества и других примесей и внутреннего стандарта в пробе от отношения площадей их хроматографических пиков.
i
Массовую долю каждого определяемого вещества (X) в процентах вычисляют по формуле:
,
ст
2
где S - площадь пика «внутреннего стандарта», усл.ед.·мин или мм;
i
2
S - площадь пика определяемого вещества, усл.ед.·мин или мм;
i
K - градуировочный коэффициент определяемого вещества;
m - масса навески анализируемого продукта, г;
ст
m - масса навески «внутреннего стандарта» в растворе анализируемого продукта, г.
Точность построения градуировочного графика не превысила 1,5% отн. по 6 точкам, воспроизводимость метода Внутреннего стандарта пробы с неизвестной концентрацией – не более 2,5 отн. %, по пяти повторениям,  исключений повторений нет. Пик этилена выходит на 2,56 мин ранее всех других пиков, находящихся в клатратном комплексе 1-метилциклопропена.
Содержание 1-метилциклопропена в пробе по методу внутреннего стандарта – от 2,58 масс. % до 2,64 масс. %, содержание 3-метилциклопропена – от 0,044 масс.% до 0,045 масс.%, содержание метилциклопропана – от 0,32 до 0,34 масс.%, содержание метиленциклопропана – от 0,25 масс.% до 0,26 масс.%.
Пример 3 (по заявленному способу).
3
3
3
Анализу подвергали такой же, как и в примере 1 образец препарата «Фреш-Форма», содержащие 1-метилциклопропен и ряд других примесей, инкапсулированных в альфа-циклодекстрине. Газо-хроматографический анализ производили на газовом хроматографе « YL 6500 GC» (производство Японии) с пламенно-ионизационным детектором с капиллярной кварцевой колонкой диной 30 м внутренний диаметр 0,25 мм с нанесенной  слабо полярной неподвижной жидкой фазой (НЖФ). В качестве НЖФ применялся состав, содержащий 5% фенилполисилоксана и 95% диметилполисилоксана.  (Температура испарителя - 110°С. Температура колонки - 56°С. Температура детектора - 120°С. Расход водорода - 25 см/мин. Расход воздуха - 400 см/мин). Расход газа носителя (азот) - 25 см/мин. Деление потока – 1:100. Расход азота на «поддув» в детектор - 15 см 3/мин. Время анализа – 8 минут).
Предварительно строили калибровочный график по методу внутреннего стандарта по чистому сконденсированному и дважды перегнанному  1-метилциклопропену, полученного в результате синтеза по известной методике /8/.
В качестве внутреннего стандарта использовали бутановую фракцию газа содержащую метан, этан, пропан, н-бутан и изо-бутан и находящуюся в клатратном комплексе с бета-циклодекстрином,  общее содержание бутановой фракции в комплексе составило 4,38 масс. %, определенное по методу дериватографического анализа. Методика получения клатратного комплекса бутановой фракции аналогична, описанной в примере 2.
3
Газовую фазу анализировали из пробы препарата «Фреш-Форма» анализировали по следующей методике: отвешивали по 0,15 грамм клатратных комплексов, содержащих 1-МЦП с примесями и стандарт - этилен, смешивали их и помещали в хроматографическую виалу объемом 15 см, после чего герметично закрывали ее и вакуумировали при остаточном давлении 25 мм рт.ст. в течение 1,5 мин. Затем в виалу впрыскивали 1,5 мл 20% раствора лимонной кислоты, энергично встряхивали виалу в течение 2-х минут и затем анализировали методом ГЖХ выделившуюся паровую фазу.
Точность построения градуировочного графика не превысила 0,8% отн. по 6 точкам, воспроизводимость метода внутреннего стандарта пробы с неизвестной концентрацией – не более 2,0 отн. %, по пяти повторениям,  исключений повторений нет. За внутренний стандарт принимали суммарную площадь всех пяти пиков, находящихся в бутановой фракции. Пик н-бутана (последний из пяти веществ, содержащихся в бутановой фракции, используемой в качестве внутреннего стандарта) выходит на 0,58 мин ранее всех других пиков, находящихся в клатратном комплексе 1-метилциклопропена. Содержание 1-метилциклопропена в пробе по методу внутреннего стандарта – от 2,59 масс.% до 2,62 масс.%, содержание 3-метилциклопропена – от 0,044 масс.% до 0,045 масс.%, содержание метилциклопропана – от 0,33 до 0,34 масс.%, содержание метиленциклопропана – от 0,25 масс.% до 0,26 масс.%.
Пример 4 ( по заявленному способу)
Анализу подвергали содержание этилена в клатратном комплексе из примера 2. Внутренним стандартом служил клатратный комплекс бутановой фракции из примера 3. Методика выполнения анализа совпадает с примерами 2 и 3, за исключением того, что в виалу вместо щелочи впрыскивали 1,5 мл 20% раствора лимонной кислоты. По результатам ГЖХ-анализа, содержание этилена в клатратном комплексе составляет 2,40% (по данным ТГА-анализа – 2,31%).
Пример 5 ( по заявленному способу)
Анализу подвергали содержание бензола в клатратном комплексе с -циклодекстрином. Внутренним стандартом служил клатратный комплекс этилена фракции из примера 2. Методика выполнения анализа совпадает с примером 4, за исключением того, что в виалу впрыскивали 1,5 мл 20% раствора щавелевой кислоты. По результатам ГЖХ-анализа, содержание бензола в клатратном комплексе составляет 5,48% (по данным ТГА-анализа – 5,61%).
Источники информации, принятые во внимание.
1. J. Szejtly, Akademia i Kiado, Cyclodextrins and their inclusion complexes, Budapest, 1982.
2. ЕР 1787513.
3. Патент на изобретение РФ № 2525722.
4. Патент на изобретение РФ RU 2325810.
5. Автореферат кандидатской диссертации Гиатулина А.К. «Твердофазное замещение "гостя" в безводных клатратах бета-циклодекстрина». Казань, 2014 г.
6. Сакодынский К.И., Бражников В.В., Волков С.А., Зельвенский В.Ю., Ганкина Э.С., Гатц В.Д. Аналитическая хроматография. — М.: Изд-во «Химия», 1993. — 463с.
7. Гольберт К.А., Вигдергауз М.С. Введение в газовую хроматографию. – М.: Химия, 1990. – 352 с. 2.
8. Synthesis of 1-Methylcyclopropene" F. Fisher, D.E. Applequist, Noyes Chemical Laboratory. University of Illinois Urbana, Illinois 61803, February 24, 1965.
9. Патент РФ 2325810 «Способ хранения урожая плодоовощной и растениеводческой продукции» (прототип).