РЕГУЛЯТОР РОСТА РАСТЕНИЙ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
REGULATOR OF PLANTS GROWTH AND ITS APPLICATION

Область техники
Настоящее изобретение относится к регуляторам роста растений и способам их применения. Более конкретно, настоящее изобретение касается регулятора роста растений, способного увеличить индекс урожайности (harvest index, процентное отношение массы урожая к общей массе растений) благодаря применению глутатиона, и способа применения регулятора роста растений.
Уровень техники
Деятельность человека традиционно тесно связана с применением растений, например, в таких областях как пищевое, декоративное производство, а также производство промышленных материалов, таких как бумага и химикаты, и топлива. Кроме того, в последнее время растительная биомасса привлекла внимание как источник биоэнергии, который может заменить использование ископаемого топлива.
Несмотря на широкое использование растений в различных областях, их жизненные механизмы, такие как почкование, рост и цветение во многих аспектах еще не изучены. Как следствие этого, их культивирование в основном базировалось на опыте и интуиции, урожай растений сильно зависел при этом от природных условий, таких как погода. Поэтому изучение механизмов жизни растений, таких как почкование, рост и цветение, и регулирование и контроль этих механизмов очень важны не только для увеличения урожаев декоративных растений и пищевых растений, например зерновых и овощных культур, но и для лесоводства и биоэнергетики.
Для регулирования роста растений использовали такие приемы как регулирование цветения с помощью искусственно создаваемых условий, например в оранжерее, или стимулирование роста за счет применения химикатов, таких как этилен. Однако большинство этих традиционных приемов базируется на опыте и интуиции, а не на данных, позволяющих произвести научную оценку роста растений.
Принимая во внимание все вышесказанное, авторы настоящего изобретения исследовали механизмы почкования, роста и цветения. В результате авторы настоящего изобретения показали, что активные формы кислорода (ROS) имеют значение не только в качестве основы биосинтеза, но и как фактор контроля роста растений (см. источник 1 Патентной литературы). Конкретно, в источнике 1 Патентной литературы описан регулятор, который содержит вещество, регулирующее окислительно-восстановительное состояние клеток, и который способен регулировать дифференцировку клеток или органов; а также описан способ контроля дифференцировки и морфогенеза организма и образующийся таким образом организм.
Далее в источнике патентной литературы 2 раскрывается адъювант, регулирующий рост растений и способ проведения редифференцировки растений с помощью адъюванта. Конкретно, каллюс, выделенный из части растения, например риса и евстомы, культивируется в редифференцированной культуральной среде, содержащей глутатион, предпочтительно окисленный глутатион (здесь и далее по тексту обозначается GSSG), так чтобы способствовать ризогенезу с эффективным получением в короткие сроки редифференцированной массы из каллюса.
Перечень ссылок
Источник патентной литературы 1 Patent Literature 1:
Публикация международной заявки International Application Publication No. WO 01/080638 (Дата публикации 22 июля 2003 г.)
Источник патентной литературы 2 Patent Literature 2:
Публикация заявки на получение патента Японии, Tokukai, No. 2004-352679 А (Дата публикации 16 декабря 2004 г.)
Сущность изобретения
В источнике патентной литературы 1 описан способ управления дифференцировкой и морфогенезом растений путем применения вещества, регулирующего окислительно-восстановительное состояние растений. Однако механизм управления еще недостаточно изучен, и неизвестно вещество, контролирующее рост растений. Также, хотя в источнике патентной литературы 2 описана методика проведения редифференцировки растительного организма, такая методика недостаточно эффективна. Необходима новая методика управления приростом биомассы, выходом семян, качеством семян нового поколения и т.д.
Научное понимание процесса роста растений, научное прогнозирование цветения и регулирование этих процессов очень важно не только для декоративных цветов и пищевых растений, но также и для лесов, и растений, являющихся биоэнергетическим ресурсом. Поэтому существует большая необходимость в разработке методики установления контрольного фактора роста растений и эффективного управления почкованием, ростом, цветением и другими процессами, протекающими в растениях.
Настоящее изобретение было осуществлено с учетом вышеупомянутых проблем. Задачей настоящего изобретения является создание способа определения контрольного фактора для растений и осуществления эффективного управления почкованием, ростом, цветением и другими процессами, протекающими в растениях.
Для решения вышеупомянутых проблем авторы настоящего изобретения провели тщательные исследования и обнаружили, что культивирование растения с применением глутатиона позволяет значительно увеличить количество семян и цветков растения. Кроме того, авторы изобретения обнаружили, что при культивировании с помощью глутатиона растения, имеющего мутацию функции синтеза фитогормона (например, гибберилина) или реакции на действие фитогормона, можно значительно увеличить число боковых побегов (пазушных почек) и соответственно увеличить число цветков (трубок). Авторы изобретения составили заявку на настоящее изобретение на основании полученных данных. Настоящее изобретение изложено на основании указанных вновь обнаруженных данных и включает в себя следующие объекты изобретения.
(1) Регулятор роста растений, направленный на увеличение процентного отношения массы урожая к общей массе растений, содержащий глутатион.
(2) Регулятор роста растений по пункту (1), в котором глутатион представляет собой окисленный глутатион.
(3) Регулятор роста растений по пункту (1) или (2), направленный на увеличение числа семян и/или цветков растения.
(4) Регулятор роста растений по пункту (1) или (2), направленный на увеличение числа боковых побегов и/или отростков от корня растения.
(5) Способ культивирования растения, включающий стадию культивирования растения с применением глутатиона, для увеличения процентного отношения массы урожая к общей массе растений.
(6) Способ по пункту (5), в котором глутатион представляет собой окисленный глутатион.
(7) Способ по пункту (5) или (6), в котором внесение глутатиона проводят периодически.
(8) Способ по любому из пунктов (5)-(7), в котором внесение глутатиона проводят ближе к моменту перехода от вегетативного к репродуктивному развитию.
(9) Способ увеличения количества семян и/или цветков растения посредством использования глутатиона.
(10) Способ по пункту (9), в котором глутатион представляет собой окисленный глутатион.
(11) Способ увеличения числа боковых побегов и/или отростков от корня растения путем использования глутатиона.
(12) Способ по пункту (11), в котором глутатион представляет собой окисленный глутатион.
(13) Способ по пункту (11) или (12), в котором растение характеризуется наличием мутации функции синтеза фитогормона и/или функции реакции на фитогормон.
(14) Способ по пункту (13), в котором фитогормон представляет собой гиббереллин.
(15) Растение, полученное способом по любому из пунктов (5)-(14), обладающее повышенным процентным отношением массы урожая к общей массе растений.
Для более полного понимания сущности и преимуществ изобретения далее представлено подробное описание, которое следует рассматривать совместно с сопроводительными фигурами.
Краткое описание фигур
2
2
Фиг.1 иллюстрирует состояния Arabidopsis (Арабидопсис), обработанного водой, раствором GSSG или раствором HO, наблюдавшиеся через 3 или 4 недели после посева.
2
2
Фиг.2 иллюстрирует состояния Arabidopsis, обработанного водой, раствором GSSG или раствором HO, наблюдавшиеся через 6 недель после посева.
2
2
Фиг.3 иллюстрирует состояния Arabidopsis, обработанного водой, раствором GSSG или раствором HO, наблюдавшиеся через 7 недель после посева.
2
2
Фиг.4 иллюстрирует состояния Arabidopsis, обработанного водой, раствором GSSG или раствором HO, наблюдавшиеся через 8 недель после посева.
2
2
Фиг.5 иллюстрирует урожай и состояние семян Arabidopsis, обработанного водой, раствором GSSG или раствором HO.
Фиг.6 иллюстрирует результаты исследования влияния концентрации окисленного глутатиона на рост Arabidopsis.
Фиг.7 иллюстрирует результаты исследования влияния концентрации окисленного глутатиона на рост Arabidopsis.
Фиг.8 иллюстрирует результаты исследования влияния окисленного глутатиона на семена Arabidopsis.
Фиг.9 иллюстрирует результаты исследования влияния окисленного глутатиона на мутант Arabidopsis в отношении синтеза гибберилина.
Фиг.10 иллюстрирует результаты исследования влияния продолжительности обработки окисленным глутатионом и концентрации окисленного глутатиона на массу семян Arabidopsis.
Фиг.11 иллюстрирует результаты исследования влияния продолжительности обработки окисленным глутатионом и концентрации окисленного глутатиона на массу семян Arabidopsis.
Фиг.12 иллюстрирует результаты исследования влияния продолжительности обработки окисленным глутатионом и концентрации окисленного глутатиона на массу семян Arabidopsis.
Фиг.13 иллюстрирует результаты исследования влияния продолжительности обработки окисленным глутатионом на массу семян Arabidopsis.
Фиг.14 иллюстрирует результаты исследования влияния продолжительности обработки окисленным глутатионом на массу семян Arabidopsis.
Фиг.15 иллюстрирует результаты исследования влияния продолжительности обработки окисленным глутатионом на массу семян Arabidopsis.
Фиг.16 иллюстрирует результаты исследования влияния продолжительности обработки окисленным глутатионом и концентрации окисленного глутатиона на массу семян, массу сухого вещества и процентное отношение массы урожая к общей массе растений Arabidopsis.
Фиг.17 иллюстрирует результат исследования влияния окисленного глутатиона на рост розы (сорт Patiohit alicante).
Фиг.18 иллюстрирует результаты исследования влияния окисленного глутатиона на рост розы (сорт English rose).
Фиг.19 иллюстрирует результаты исследования влияния окисленного глутатиона на рост tsai-hsin, представляющего собой сорт рапса.
Фиг.20 иллюстрирует расположение индивидуальных соевых бобов в сельскохозяйственном полевом испытании, в котором изучали влияние окисленного глутатиона на рост соевых бобов.
Фиг.21 иллюстрирует внесение окисленного глутатиона в сельскохозяйственном полевом испытании, в котором изучали влияние окисленного глутатиона на рост соевых бобов.
Фиг.22 иллюстрирует результаты исследования массы семян, общего объема биомассы и процентного отношения массы урожая к общей массе растения в сельскохозяйственном полевом испытании, в котором изучалось влияние окисленного глутатиона на рост соевых бобов.
Фиг.23 иллюстрирует результаты исследования влияния окисленного глутатиона на формирование цветочных почек кукурузы.
Фиг.24 иллюстрирует результаты исследования влияния окисленного глутатиона на урожайность кукурузы.
Фиг.25 иллюстрирует результаты исследования влияния окисленного глутатиона на количество биомассы и процентное отношение массы урожая к общей массе растений - плодов, наземных частей и частей индивидуальных растений кукурузы, отличных от плодов.
Фиг.26 иллюстрирует результаты исследования влияния продолжительности обработки окисленным глутатионом на количество биомассы и процентное отношение массы урожая к общей массе растения - плодов, наземных частей и частей индивидуальных растений кукурузы, отличных от плодов.
Фиг.27 иллюстрирует результаты исследования влияния способа обработки окисленным глутатионом на количество биомассы и процентное отношение массы урожая к общей массе растений - плодов, наземных частей и частей индивидуальных растений кукурузы, отличных от плодов.
Фиг.28 иллюстрирует результаты исследования влияния способа обработки окисленным глутатионом и продолжительности обработки окисленным глутатионом на количество биомассы и процентное отношение массы урожая к общей массе растений кукурузы.
Фиг.29 иллюстрирует расположение индивидуальных растений кукурузы в сельскохозяйственном полевом испытании, в котором изучалось влияние окисленного глутатиона на рост кукурузы.
Фиг.30 иллюстрирует результаты исследования влияния продолжительности обработки окисленным глутатионом на общее количество биомассы с площади, урожайность кукурузных початков с площади и процентное отношение массы урожая к общей массе растений в сельскохозяйственном полевом испытании, в котором изучалось влияние окисленного глутатиона на рост кукурузы.
Фиг.31 иллюстрирует результаты исследования влияния продолжительности обработки окисленным глутатионом на количество биомассы плодов, наземных частей и частей индивидуальных растений кукурузы, отличных от плодов, в сельскохозяйственном полевом испытании, в котором изучалось влияние окисленного глутатиона на рост кукурузы.
Фиг.32 иллюстрирует результаты исследований влияния окисленного глутатиона на урожайность кукурузы в условиях недостатка азота.
Фиг.33 иллюстрирует результаты исследования влияния окисленного глутатиона на количество биомассы и процентное отношение массы урожая к общей массе растений - плодов, наземных частей и частей индивидуальных растений кукурузы, отличных от плодов, в условиях недостатка азота.
Фиг.34 иллюстрирует результаты исследования влияния окисленного глутатиона на рост побега и цветение розы (сорт Purple rose).
Фиг.35 иллюстрирует результаты исследования влияния окисленного глутатиона на рост побега и цветение розы (сорта JJ scarlet и JJ apricot).
Фиг.36 иллюстрирует результаты исследования влияния окисленного глутатиона и восстановленного глутатиона на рост корней евстомы.
Фиг.37 иллюстрирует результаты исследования влияния окисленного глутатиона на бутонизацию розы.
Фиг.38 иллюстрирует результаты исследования влияния окисленного глутатиона на бутонизацию розы.
Фиг.39 иллюстрирует результаты исследования влияния окисленного глутатиона и восстановленного глутатиона на рост и размножение (число усов) клубники (знаменитая садовая серия Yokubari-ichigo kurenai (SUMIKA)).
Фиг.40 иллюстрирует расположение индивидуальных растений при культивировании и продолжительность внесения окисленного глутатиона при испытании, в котором исследовалось влияние окисленного глутатиона на рост трансформантов Arabidopsis, имеющих встроенный ген gFBA.
Фиг.41 иллюстрирует результаты исследования концентрации нитрата аммония, при которой достигают предельного значения эффекты увеличения процентного отношения массы урожая к общей массе растений, общее количество биомассы и масса семян дикого вида Arabidopsis и трансформантов Arabidopsis, имеющих встроенный ген gFBA1.
Фиг.42 иллюстрирует результаты исследования влияния окисленного глутатиона на процентное отношение массы урожая к общей массе растений, общее количество биомассы и массу семян дикого вида Arabidopsis и трансформантов Arabidopsis, имеющих встроенный ген gFBA, при условии насыщения азотным удобрением.
Фиг.43 иллюстрирует результаты исследования влияния окисленного глутатиона, восстановленного глутатиона и сульфата аммония на процентное отношение массы урожая к общей массе растений, общее количество биомассы и массу семян дикого вида Arabidopsis и трансформантов Arabidopsis, имеющих встроенный ген gFBA, при условии насыщения азотным удобрением.
Фиг.44 иллюстрирует результаты исследования влияния концентрации GSSG в качестве удобрения на урожай семян трансформантов Arabidopsis, имеющих встроенный ген gFBA, и дикого вида Arabidopsis.
Фиг.45 иллюстрирует результаты исследования влияния концентрации GSSG в качестве удобрения на процентное отношение массы урожая к общей массе растений трансформантов Arabidopsis, имеющих встроенный ген gFBA, и дикого вида Arabidopsis.
Фиг.46 иллюстрирует результаты исследования влияния внесения таких удобрений как GSSG, GSH и сульфат аммония, в качестве источников сульфатов на урожай семян трансформантов Arabidopsis, имеющих встроенный ген gFBA.
Фиг.47 иллюстрирует результаты исследования влияния внесения таких удобрений как GSSG, GSH и сульфат аммония, в качестве источников сульфатов на процентное отношение массы урожая к общей массе растений трансформантов Arabidopsis, имеющих встроенный ген gFBA.
Описание вариантов реализации изобретения
Один вариант реализации настоящего изобретения описан далее по тексту в соответствии с прилагающимися фигурами. Заметим, что настоящее изобретение не ограничивается этим вариантом реализации.
Регулятор роста растений по настоящему изобретению не имеет особых ограничений помимо факта содержания глутатиона, и в частности, отсутствуют ограничения по таким характеристикам регулятора роста растений, как плотность, содержание других компонентов и т.д. Глутатион может представлять собой восстановленный глутатион (который здесь и далее по тексту обозначен "GSH") или окисленный глутатион (который здесь и далее по тексту обозначен "GSSG"), при этом предпочтительнее использовать GSSG.
Как хорошо известно специалисту в данной области техники, GSH обладает свойством легко окисляться. Следовательно, при добавлении GSH в качестве глутатиона к регулятору роста растений согласно настоящему изобретению регулятор роста растений как правило будет содержать также значительное количество GSSG. Таким образом, регулятор роста растений согласно настоящему изобретению может содержать в качестве глутатиона смесь GSH и GSSG.
Регулятор роста растений согласно настоящему изобретению может быть обеспечен таким образом, чтобы он содержал глутатион в виде GSH, при этом в ходе хранения или использования регулятора роста растений может произойти окисление GSH до GSSG. Окисление GSH до GSSG может происходить также после того, как регулятор роста растений будет доставлен к растению.
Способ окисления GSH до GSSG не ограничен какими-либо конкретными вариантами. Например, GSH может быть легко переведен в GSSG путем окисления на воздухе. Альтернативным образом GSH может быть легко переведен в GSSG любым стандартным способом синтеза, известным на сегодняшний день.
"Окисленный глутатион" согласно настоящему изобретению представляет собой хорошо известное специалисту в данной области техники вещество, не нуждающееся в каком-либо специальном пояснении. Например, термин "окисленный глутатион" может быть определен как молекула, полученная связыванием сульфидными мостиками двух молекул восстановленного глутатиона.
В целом известно, что большая часть (98% или более) глутатиона в клетках организма представляет собой восстановленный глутатион.
Следовательно, специалист в данной области техники будет считать глутатионом восстановленный глутатион, и поэтому использование окисленного глутатиона не является общепринятым. На основании вышеотмеченного у специалиста в данной области техники складывается впечатление о том, что окисленный глутатион ухудшает рост растений. Следовательно, специалист в данной области техники не имеет оснований для использования окисленного глутатиона для культивирования растений.
Тем не менее авторы настоящего изобретения обнаружили, что функции фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы, являющейся ферментом для цикла Кальвина, можно регулировать посредством связывания с глутатионом. Авторы изобретения добавляли окисленный глутатион, необходимый для связывания, что позволяло достигать значительного увеличения продуктивности биомассы и урожайности.
Таким образом, авторы изобретения обнаружили, что культивирование растения с использованием "окисленного глутатиона (GSSG)", который обычно не применяется для культивирования растений, позволяет значительно увеличить число семян растения и число цветков растения, что и послужило основанием для создания настоящего изобретения. Поэтому настоящее изобретение обладает существенной новизной.
Регулятор роста растений согласно настоящему изобретению содержит глутатион и обеспечивает увеличение процентного отношения массы урожая к общей массе растений.
В настоящем описании изобретения "процентное отношение массы урожая к общей массе растения" обозначает отношение массы урожая к массе растения в целом. Другими словами, "процентное отношение массы урожая к общей массе растения" обозначает отношение количества биомассы урожая к количеству всей биомассы индивидуальных растений.
В настоящем описании изобретения "урожай" означает часть растения, которая используется в пищевых целях. Например, в случае растения, плоды которого используются в пищевых целях, "урожаем" являются плоды. В случае растения, семена которого используются в пищевых целях, "урожаем" являются семена. В случае растения, стебли которого используются в пищевых целях, "урожаем" являются стебли. В случае растения, корни которого используются в пищевых целях, "урожаем" являются корни. В случае растения, цветки которого используются в пищевых целях, "урожаем" являются цветки. В случае растения, листья которого используются в пищевых целях, "урожаем" являются листья. Кроме того, "урожай" означает часть растения, которая несъедобна, но содержит целевой при культивировании растения продукт. В частности, в случае декоративных растений образцы "урожая" включают цветки, стебли, листья, корни, семена и т.д., каждый из которых должен оцениваться.
Кроме того, в настоящем описании изобретения "увеличение процентного отношения массы урожая к общей массе растения" обозначает эффект увеличения процентного отношения массы урожая к общей массе растения по сравнению с условием, когда регулятор роста растений не вносится, и указывает на то что отношение количества биомассы урожая ко всей биомассе может быть увеличено в условиях общепринятого и стандартного внесения удобрения, которое оптимизировано для получения максимального урожая с единицы площади. Несмотря на то что урожай с единицы площади растет с ростом посевной нормы, при определенной посевной норме этот показатель достигает своего предельного значения. "Увеличение процентного отношения массы урожая к общей массе растения" в настоящей спецификации указывает на то, что отношение количества биомассы урожая к объему всей биомассы может быть увеличено даже при такой посадке.
Поскольку регулятор роста растений в настоящем изобретении позволяет увеличивать процентное отношение массы урожая к общей массе растения, можно не только увеличить количество пищевых ресурсов или ресурсов биомассы, полученных с единицы площади, но также значительно способствовать увеличению производства востребованных промышленностью растений и их урожая.
Далее, желательно, чтобы регулятор роста растений настоящего изобретения увеличивал количество семян растения и/или количество цветков растения. На основании данных нижеследующих Примеров очевидно, что использование регулятора роста растений согласно настоящему изобретению позволяет увеличить количество семян и количество цветков. Кроме того, также показано, что другое направление действия регулятора роста растений настоящего изобретения состоит в продлении срока жизни растения, получении более крупного и округлого листа, укорачивании высоты растения и утолщении его стебля.
Это позволяет, например, увеличить урожай семян. Поэтому промышленная применимость регулятора роста растений довольно высока не только в случае продажи семян как таковых, но и учитывая содержание в семенах жиров и масел и других эффективных компонентов, так как выход этих жиров и масел и т.д. также возрастает. Кроме того, такие повышенные урожаи также благоприятны в отношении производства материала биомассы.
Когда регулятор роста растений применяется для декоративных растений или затеняющих деревьев, эффект, связанный с удлинением жизни растения, позволяет увеличить интервал замены растений вследствие их увядания. Это снижает трудоемкость работы по обслуживанию декоративных растений или затеняющих деревьев. Далее, эффект, связанный с получением более крупного и округлого листа, применим при выращивании уникальных декоративных растений, имеющих необычный внешний вид. Далее, эффект, связанный с уменьшением высоты растения и утолщением его стебля, применим при выращивании декоративных растений и для увеличения стойкости сельскохозяйственных культур против сильных ветров.
Далее, желательно, чтобы регулятор роста растений настоящего изобретения увеличивал число боковых побегов и/или отростков от корня растений. На основании пояснений, представленных в нижеследующих Примерах, данное изобретение сделано на основе нового открытия, заключающегося в том, что когда растение, имеющее мутацию функции синтеза фитогормона (гибериллина) или функции реакции на фитогормон, культивируется с использованием окисленного глутатиона, число боковых побегов существенно увеличивается. Поскольку число боковых побегов и/или отростков от корня растения увеличивается, увеличивается и число цветков (трубок).
Поэтому когда регулятор роста растений настоящего изобретения применяется для растения, например, семейства Gramineae (злаковые), отростки от корня которого имеют существенное влияние на урожайность, появляется возможность увеличить урожай семян.
Целевым растением, для которого должен быть применен регулятор роста растений, предпочтительно является растение, имеющее мутацию функции синтеза фитогормона или функции реакции на фитогормон.
Это связано с тем, что применение глутатиона предпочтительнее окисленного глутатиона в отношении мутанта или трансформанта, имеющего ту же функцию, что и мутант, позволяет увеличить сферу применения окисленного глутатиона.
Здесь, "растение, имеющее мутацию функции синтеза фитогормона или реакции на фитогормон", означает растение, у которого есть мутация, по крайней мере, в одном из ферментов системы биосинтеза фитогормона, рецепторе фитогормона, биологическом веществе коммуникативной системы фитогормона и т.д., и являющееся растением, у которого функция, относительно выработки фитогормона, не работает по сравнению с растением дикого типа, или которое является растением очень чувствительным (приобретенный признак) к фитогормону из-за мутации. В частности, предпочтительнее использовать мутант, функция которого относительно выработки фитогормона ниже, чем у дикого типа, или чья функция относительно выработки фитогормона существенно потеряна.
Примером такого растения является, как пояснено в нижеследующих Примерах, мутант, в котором фрагмент ДНК, например Т-ДНК, встроен в ген, кодирующий фермент системы биосинтеза фитогормона.
Предпочтительным фитогормоном является гибериллин. Предполагается, что окисленный глутатион действует по механизму фитогормона, такого как гибериллин, или совместно с фитогормоном.
Далее, предпочтительнее, чтобы регулятор роста растений настоящего изобретения способствовал росту побега, завязыванию бутона и/или цветению. На основании поясненений, представленных в нижеприведенных Примерах, очевидно, что регулятор роста растений настоящего изобретения способствует росту побега, завязыванию бутона и/или цветению.
Это позволяет сократить продолжительность культивирования растения и увеличить производительность растения. В случае обработки растения, применяемого в пищевых целях, эта особенность способствует росту пищевого производства. Кроме того, в связи с тем что регулятор роста растений позволяет управлять цветением или ростом растения, применение регулятора роста растений позволяет обеспечить эффективное производство растений. Что, в свою очередь, позволяет регулировать поставку растений на рынок в соответствии с рыночным спросом.
Далее, предпочтительнее, чтобы регулятор роста растений настоящего изобретения способствовал росту корней растения. На основании поясненений, представленных в нижеприведенных Примерах, очевидно, что использование регулятора роста растений настоящего изобретения способствует росту корней растения.
В случае когда урожаем растения являются его корни, такая особенность регулятора роста растений позволяет получить большое количество урожаев, даваемых растением в короткий срок. Поэтому применение регулятора роста растений для растения, корни которого используются в пищевых целях, способствует росту пищевого производства.
Далее, предпочтительнее, чтобы регулятор роста растений настоящего изобретения предотвращал ухудшение роста, связанное с недостатком азота. Известно, что недостаток азота или отсутствие источника азота обычно ухудшает рост растения. Однако, как пояснено в нижеприведенных Примерах, даже если растение выращено в условиях дефицита азота, применение регулятора роста растений настоящего изобретения позволяет предотвратить ухудшение роста, связанного с недостатком азота.
Поэтому даже если имеет место ухудшение роста растения, связанное с недостатком азота, применение регулятора роста растений способствует стимуляции его роста.
В случае когда регулятор роста растений содержит окисленный глутатион, количество глутатиона не ограничено частными случаями. В случае Arabidopsis предпочтительное количество глутатиона составляет 10 мМ - 20 мМ, еще лучше - 0,2 мМ - 5 мМ и наиболее предпочтительно - 0,5 мМ - 2 мМ.
С другой стороны, в случае когда регулятор роста растений содержит восстановленный глутатион, количество восстановленного глутатиона, которое должно содержаться в регуляторе роста растений, должно быть больше, чем количество окисленного глутатиона. В частности, в случае Arabidopsis, предпочтительное количество восстановленного глутатиона составляет 100 мМ - 40 мМ, еще лучше - 0,4 мМ - 20 мМ и наиболее предпочтительно - 4 мМ - 10 мМ.
В случае когда регулятор роста растений содержит восстановленный глутатион в вышеупомянутом диапазоне, при окислении 50% восстановленного глутатиона в ходе хранения или использования регулятора роста растений концентрация окисленного глутатиона в регуляторе роста растений составляет по меньшей мере от 1 мМ до 2,5 мМ. По сути, это приводит к тому же результату, то есть когда регулятор роста растений содержит 1 мМ - 2,5 мМ окисленного глутатиона. Окисление 50% восстановленного глутатиона в регуляторе роста растений происходит достаточно легко из-за свойств восстановленного глутатиона. Это легко понять специалисту в данной области техники.
В случае внесения определенного количества раствора, что поясняется в нижеследующих Примерах, когда количество окисленного или восстановленного глутатиона находится в вышеуказанном диапазоне, можно контролировать рост растения соответствующим образом. Заметим, что вышеуказанный диапазон концентрации характерен для случая внесения определенного количества раствора в отношении Arabidopsis. Изменение вносимого количества или использование других видов растений (например, деревьев и т.д.) может потребовать внесения окисленного или восстановленного глутатиона с более высокой концентрацией. В некоторых случаях можно достичь эффекта действия регулятора роста растений настоящего изобретения с окисленным или восстановленным глутатионом и при более низкой их концентрации.
Характерная особенность настоящего изобретения основана на обнаружении того, что окисленный глутатион увеличивает число семян и/или число цветков растения, продолжительность жизни растения, обеспечивает получение более крупного и округлого листа, увеличивает число боковых побегов и/или отростков от корня и увеличивает число цветков (трубок), связанное с увеличением числа боковых побегов и т.д., с целью увеличения урожая семян, и другое ограничение изобретения не предусматривается. Поэтому диапазон концентрации в настоящем изобретении не ограничен вышеуказанным диапазоном.
При этом согласно настоящему изобретению отсутствуют ограничения по способу внесения регулятора роста растений, и регулятор роста растений согласно настоящему изобретению применяют таким же образом, как и традиционные и общепринятые регуляторы роста растений. Например, в случае когда регулятор роста растений по настоящему изобретению находится в жидкой форме или в виде эмульсии, регулятор роста растений может быть распылен, наноситься в виде капель или наноситься не только на вегетативную точку роста, но также и на часть или на все растение, а именно на стебель и лист. В случае когда регулятор роста растений настоящего изобретения находится в виде твердого или порошкового агента, он может поглощаться корнем непосредственно в земле. В случае если растение представляет собой водное растение, например floating grass, регулятор роста растений настоящего изобретения может поглощаться корнем как аквариумная добавка или регулятор роста растений в форме твердого агента может постепенно растворяться в воде. В частности, в случае когда регулятор роста растений настоящего изобретения используется для наземного растения, предпочтительнее, чтобы растение культивировалось по способу водной культуры с использованием регулятора роста растений в форме водного раствора.
Согласно изобретению регулятор роста растений обязательно содержит глутатион (GSH и/или GSSG), при этом выбор других специальных компонентов регулятора роста растений не ограничен. Например, в том случае когда регулятор роста растений находится в форме аквариумной добавки или твердого агента, компоненты-носители представляют собой твердые носители, примерами которых являются неорганические материалы, такие как тальк, глина, вермикулит, диатомит, каолин, карбонат кальция, гидроксид кальция, белая глина и силикагель, а также мука и крахмал. В том случае когда регулятор роста растений находится в форме жидкого агента, компонентами-носителями являются жидкие носители, примеры которых включают воду; ароматические углеводороды, например ксилол; спирты, например этанол и этиленгликоль; кетоны, например ацетон; простые эфиры, например диоксан и тетрагидрофуран; диметилформамид; диметилсульфоксид и ацетонитрил.
Кроме того, регулятор роста растений согласно настоящему изобретению в случае необходимости может содержать другой вспомогательный агент. Примеры вспомогательных агентов включают анионные поверхностно-активные вещества, такие как сложный эфир алкилсульфатов, алкилсульфонат, алкиларилсульфонат и диалкилсульфосукцинат; катионные поверхностно-активные вещества, например соли высшего алифатического амина; неионногенные поверхностно-активные вещества, например полиоксиэтиленгликолевый простой алкиловый эфир, полиоксиэтиленгликолевый сложный ациловый эфир, полиоксиэтиленгликолевый сложный ациловый эфир многоатомного спирта, и производное целлюлозы; а также загуститель, например желатин, казеин и гуммиарабик; наполнитель; и связующее.
В случае необходимости другой регулятор роста растений, например бензойная кислота, никотиновая кислота, амид никотиновой кислоты и пипеколиновая кислота может быть добавлен к продукту в таком количестве, которое не подавляет целевой эффект настоящего изобретения. Кроме того, обычно применяемое и хорошо известное удобрение может быть добавлено к продукту.
Далее, согласно изобретению отсутствуют ограничения вида растений, к которым можно вносить регулятор роста растений согласно настоящему изобретению, в частности, отсутствуют ограничения по конкретным видам, и регулятор роста растений можно вносить к любому классу растений, например однодольные, двудольные и деревья. Среди примеров однодольных растений можно привести Lemnaoideae, включая Spirodela (floating grass) и Lemna (L. perpusilla и L. trisuica); Orchidaceae, включая Cattleya, Cymbidium, Dendrobium, Phalaenopsis, Vanda, Paphiopedilum, и Oncidium; Typhaceae; Sparganiaceae; Potamogetonaceae; Najadaceae; Scheuchzeriaceae; Alismataceae, Hydrocharitaceae; Triuridaceae; Poaceae; Cyperaceae; Arecaceae; Araceae; Eriocaulaceae; Commelinaceae; Pontederiaceae; Juncaceae; Stemonaceae; Liliaceae; Amaryllidaceae; Dioscoreaceae; Iridaceae; Musaceae; Zingiberaceae; Cannaceae; и Burmanniaceae.
Среди примеров двудольных растений: Convolvulaceae, включая Pharbitis (morning glory), Calystegia (Calystegia japonica, Calystegia hederacea и Calystegia soldanella), Ipomoea (Ipomoea pes-caprae, Ipomoea batatas), и Cuscuta (Cuscuta japonica, Cuscuta australis); Caryophyllaceae, включая Dianthus (Dianthus caryophyllus и т.д.), Stellaria, Minuartia, Cerastium, Sagina, Arenaria, Moehringia, Pseudostellaria, Honckenya, Spergula, Spergularia salina, Silene, Lychnis, Melandryum, и Cucubalus; Casuarinaceae; Saururaceae; Piperaceae; Chloranthaceae; Salicaceae; Myricaceae; Juglnaceae; Betulaceae; Fagaceae; Ulmaceae; Moraceae; Urticaceae; Podostemaceae; Proteaceae; Olacaceae; Santalaceae; Viscum album; Aristolochiaceae; Mitrastemonaceae; Balanophoraceae; Polygonaceae; Chenоpodiасеае; Amaranthaceae; Nyctaginaceae; Theligonaceae; Phytolaccaceae; Tetragoniaceae; Portulacaceae; Magnoliaceae; Trochodendraceae; Cercidiphyllaceae; Nymphaeaceae; Ceratophyllaceae; Ranunculaceae; Lardizabalaceae; Berberidaceae; Menispermaceae; Calycanthaceae; Lauraceae; Papaveraceae; Capparaceae; Brassicaceae; Droseraceae; Nepenthaceae; Crassulaceae; Saxifragaceae; Pittosporaceae; Hamamelidaceae; Platanaceae; Rosaceae; Fabaceae; Oxalidaceae; Geraniaceae; Linaceae; Zygophyllaceae; Rutaceae; Simaroubaceae; Meliaceae; Polygalaceae; Euphorbiaceae; Callitrichaceae; Buxaceae; Empetraceae; Coriariaceae; Anacardiaceae; Aquifoliaceae; Celastraceae; Staphyleaceae; Icacinaceae; Aceraceae; Hippocastanaceae; Sapindaceae; Sabiaceae; Balsaminaceae; Rhamnaceae; Vitaceae; Elaeaocarpaceae; Tiliaceae; Malvaceae; Sterculiaceae; Actinidia arguta; Theaceae; Clusiaceae; Elatinaceae; Tamaricaceae; Violaceae; Flacourtiaceae; Stachyuraceae; Passifloraceae; Begoniaceae; Cactaceae; Thymelaeaceae; Elaeagnaceae; Lythraceae; Punica granatum; Rhizophoraceae; Alangiaceae; Melastomataceae; Trapaceae; Onagraceae; Haloragaceae; Hippuridaceae; Araliaceae; Apiaceae; Cornaceae; Diapensiaceae; Clethraceae; Pyrolaceae; Ericaceae; Myrsinaceae; Primulaceae; Plumbaginaceae; Ebenaceae; Symplocaceae; Styracaceae; Oleaceae; Buddlejaceae; Gentianaceae; Apocynaceae; Asclepiadaceae; Polemoniaceae; Boraginaceae; Verbenaceae; Lamiaceae; Solanaceae; Scrophulariaceae; Bignoniaceae; Pedaliaceae; Orobanchaceae; Gesneriaceae; Lentibulariaceae; Acanthaceae; Myoporaceae; Phrymaceae; Plantaginaceae; Rubiaceae; Caprifoliaceae; Adoxaceae; Valerianaceae; Dipsacaceae; Cucurbitaceae; Campanulaceae; и Asteraceae.
Растение, к которому можно вносить регулятор роста растений, может быть мутантом или трансформантом вышеупомянутого растения, так же как и диким типом вышеупомянутого растения. Как пояснено в нижеприведенных Примерах, применение регулятора роста растений настоящего изобретения к растению-трансформанту, у которого встроен определенный ген, усиливает эффект регулятора роста растений настоящего изобретения (другими словами, применение регулятора роста растений настоящего изобретения к такому трансформанту приводит к большему эффекту, чем применение регулятора роста растений настоящего изобретении к растению дикого типа).
Поэтому такое трансформантное растение может считаться объектом, к которому предпочтительнее применение регулятора роста растений согласно настоящему изобретению.
Особый пример такого трансформанта - растение-трансформант, у которого встроен ген, кодирующий связывающую глутатион фруктозо-1,6-бисфосфатадолазу пластидного типа (который может в дальнейшем обозначаться как "gFBA").
На основании пояснений, представленных в нижеприведенных Примерах, очевидно, что применение регулятора роста растений настоящего изобретения к растению-трансформанту, у которого встроен ген gFBA, позволяет регулятору роста растений дополнительно повышать эффективность увеличения процентного отношения массы урожая к общей массе растения.
Растение-трансформант, у которого встроен ген gFBA, и способ производства растения-трансформанта описаны в публикации Международной заявки No. WO 2007/091634 А1 (издано 16 августа 2007 г.) и т.д. Поэтому содержание публикации Международной заявки служит ссылкой для существующей спецификации.
Регулятор роста растений настоящего изобретения может быть применен к различным организмам, органам, тканям или клеткам таким способом, который является наиболее подходящим в зависимости от формы регулятора роста растений.
Кроме того, семена, полученные от растения, обработанного регулятором роста растений настоящего изобретения, являются промышленно применимыми и включены в настоящее изобретение. Как пояснено в нижеследующих Примерах, анализ зрелости (скорость прорастания) таких семян показал, что эти семена проросли быстрее, чем нормальные семена. Поэтому можно полагать, что семена, полученные от растения, выращенного с применением глутатиона, предпочтительнее окисленного глутатиона, являются более зрелыми.
Обработка регулятором роста растений согласно настоящему изобретению может быть произведена так, чтобы регулятор роста растений с соответствующей концентрацией использовался перед и/или во время обычного культивирования семени или каллюса целевого растения. Обычно эффективное использование регулятора роста растений достигается при обработке, проводимой в зависимости от природных особенностей целевого растения (например, растение короткого дня или длинного дня). В связи с тем что такая обработка известна специалисту в данной области техники, детальные пояснения здесь не приводятся. Например, в случае растения длинного дня эффективно использовать регулятор роста растений согласно настоящему изобретению при освещении светом с установленной интенсивностью или более того.
Поэтому настоящее изобретение включает использование регулятора роста растений в способ выращивания любого растения (способ производства растения), который обычно используется в области, к которой принадлежит настоящее изобретение.
Регулятор роста растений настоящего изобретения может включать только глутатион, который является эффективным компонентом. Однако предпочтительнее, чтобы регулятор роста растений настоящего изобретения использовался в форме, применимой к индивидуальным растениям, например, как жидкий агент, твердый агент, порошковый агент, эмульсия и аквариумная добавка. Такой агент может быть произведен обычным способом, соответствующим образом добавляя к глутатиону, который является эффективным компонентом, известный носитель или вспомогательный материал и т.д., которые фармацевтически годны к употреблению в индивидуальных областях в таком количестве, которое не ослабляет действие регулятора роста растений настоящего изобретения.
Кроме того, настоящее изобретение включает способ культивирования растения при помощи регулятора роста растений, а именно способ культивирования растения в соответствии с настоящим изобретением является способом культивирования растения при помощи глутатиона с целью увеличения процентного отношения массы урожая к общей массе растения, и другие специфические стадии и условия и т.д. способа, которые не ограничены частными случаями. В данном способе глутатион может быть в формах GSH и/или GSSG, но предпочтительнее, чтобы глутатион содержал GSSG.
Один из примеров реализации способа культивирования растения в соответствии с настоящим изобретением пояснен ниже. Заметим, что настоящее изображение не ограничено нижеследующим вариантом реализации.
В способе культивирования растения в соответствии с настоящим изобретением глутатион можно вносить к растению в условиях, позволяющих растению непрерывно поглощать глутатион, или глутатион может вноситься к растению в условиях, позволяющих растению периодически поглощать глутатион во время культивирования (например, при условии, что глутатион вносится с интервалом один раз в неделю или два раза в неделю). Далее, глутатион может вноситься в течение определенного времени, то есть в течение определенного времени роста.
Периодическое внесение глутатиона позволяет уменьшать количество подаваемого глутатиона. Это сокращает затраты на культивирование растения. В случае периодической подачи глутатиона предпочтительнее подавать глутатион с постоянным интервалом. Как альтернатива, глутатион может подаваться с непостоянным интервалом.
Интервал, с которым подается глутатион, не ограничен частным случаем и может быть установлен в соответствии с концентрацией подаваемого глутатиона, с растением, которому глутатион должен подаваться, и продолжительностью (точнее, временем роста), когда глутатион должен подаваться. Обычно, в случае когда растение, которому должен подаваться глутатион, является травянистым растением, предпочтительнее, чтобы глутатион подавался один раз в неделю или два раза в неделю или подавался во время дополнительного внесения удобрения.
В случае подачи глутатиона в определенное время предпочтительнее, чтобы глутатион подавался ближе к времени перехода от вегетативного к репродуктивному развитию (включая время перехода от вегетативного к репродуктивному развитию) или во время формирования цветоложа после перехода от вегетативного к репродуктивному развитию или во время перехода к формированию целевого урожая. Это позволяет эффективно достичь необходимого результата за счет применения глутатиона. Кроме того, в связи с тем что глутатион подается только в определенное время, можно сократить затраты на выращивание растения.
В случае подачи глутатиона строго в определенное время его можно вносить растению в условиях, позволяющих растению непрерывно поглощать глутатион в течение установленного периода в определенное время, или глутатион может подаваться растению в условиях, позволяющих растению периодически поглощать глутатион в течение установленного периода в определенное время. Периодическая подача глутатиона в течение установленного периода в определенное время также позволяет сократить затраты на выращивание растения.
Далее, настоящее изобретение включает способ увеличения количества семян растения и/или количества цветков растения. В данном способе глутатион также может быть окисленным или восстановленным глутатионом. Предпочтительнее, чтобы глутатион включал окисленный глутатион.
В этом способе время, в течение которого глутатион подается растению, и количество глутатиона, которое необходимо вносить, конкретным образом не ограничено. Предпочтительнее подавать глутатион в условиях, описанных в способе культивирования растения.
Далее, настоящее изобретение охватывает растение, полученное вышеописанным способом. Растение в соответствии с настоящим изобретением демонстрирует более высокое процентное отношение массы урожая к общей массе растения. Поскольку растение согласно настоящему изобретению демонстрирует более высокое процентное отношение массы урожая к общей массе растения, чем растение, культивированное в обычных рекомендованных условиях, измерение процентного отношения массы урожая к общей массе растения позволяет четко различать растение по настоящему изобретению от растения, полученного иным способом.
Кроме того, данное растение можно легко и однозначно отличить от растения, полученного иным способом, отличающимся от способа настоящего изобретения, путем измерения количества или доли окисленного глутатиона в растении. Другим способом, не основанным на изучении количества и концентрации окисленного глутатиона в растении, при помощи которого можно отличить растение согласно настоящему изобретению от растения, полученного иным способом, является сравнение паттернов экспрессии генов с помощью технологии ДНК-микрочип (DNA micro allay) и т.д. В частности, сначала изучают паттерн экспрессии генов растения, культивированного с применением окисленного глутатиона, и сравнивают с паттерном экспрессии генов растения, культивированного способом, отличным от способа настоящего изобретения, с тем чтобы установить паттерн экспрессии, характерный для случая внесения окисленного глутатиона (образец экспрессии GSSG). Исследуют паттерн экспрессии рассматриваемого растения и сравнивают с паттерном экспрессии GSSG. Таким образом можно легко определить, является ли изучаемое растение растением согласно настоящему изобретению или нет.
Далее, такое растение можно четко отличить от растения, полученного способом, отличным от способа настоящего изобретения, путем измерения процентного отношения массы урожая к общей массе растения.
Вышеизложенные способы (то есть способы определения растения настоящего изобретения) могут применяться по отдельности или совместно. Совместное применение способов также позволяет четко отличить растение настоящего изобретения от растения, полученного способом, отличным от способа настоящего изобретения.
Нижеследующий материал конкретизирует данный пример реализации настоящего изобретения, ссылаясь на Примеры. Заметим, что настоящее изобретение не ограниченно нижеприведенными Примерами, и возможны различные модификации с учетом специфики настоящего изобретения. Кроме того, настоящее изобретение не ограничивается описанием вышеприведенных способов реализации, но может быть изменено специалистом в рамках формулы изобретения. Способ реализации, основанный на соответствующей комбинации технических средств, раскрытых в различных способах реализации, включен в технический объем настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
1. Влияние окисленного глутатиона на рост Arabidopsis
Arabidopsis культивировали при освещении 100 µE/м2 и температуре 22°С при таком условии продолжительности дня, когда световой период составляет 16 часов, а темновой период составляет 8 часов, с применением питательной среды с двумя частями вермикулита (Asahi Kogyo, Inc.) в более низком слое, одной частью почвы Kureha Ikubyou Baido (Kureha) в среднем слое и одной частью вермикулита (Asahi Kogyo, Inc.) в верхнем слое. Обычно Arabidopsis, выращенный в данных условиях, не проявляет признаков недостатка азота без дополнительного внесения удобрения.
2
2
В настоящем опыте наблюдали состояние роста растений при внесении только воды, раствора 1мМ окисленного глутатиона (GSSG) или 5 мМ раствора HO. В частности, растения культивировали с размещением двух или трех растений на одном поддоне с приблизительными размерами: ширина - 65, глубина - 65, высота - 50, и подавали соответствующее количество раствора для обработки.
Результат обработки оценивали по числу листьев розетки, скорости растущего цветочного стебля, числа цветков и числа семян. Результаты показаны на Фиг.1-5.
2
2
Как показано на Фиг.1, установлено, что спустя 3-4 недели после посева, листья растения, культивируемого с 1 мМ раствором GSSG, выросли больше и были более округлые, чем листья растения, культивируемого только с водой, и чем листья растения, культивируемого с 5 мМ раствором HO.
2
2
Далее, как показано на (а) и (b) Фиг.2, было установлено, что спустя 6 недель после посева, растение, культивируемое с 1 мМ раствором GSSG, имело меньшую высоту, более толстый стебель и крупнее листья, чем растение, культивируемое только с водой, и чем растение, культивируемое с 5 мМ раствором HO. (а) и (b) Фиг.2 - это фотографии одного и того же образца, сделанные под различными углами.
2
2
Далее, как показано на Фиг.3, было установлено, что спустя 7 недель после посева, число цветков и площадь листьев растения, культивируемого с 1 мМ раствором GSSG, превышали данные параметры растения, культивируемого только с водой, и растения, культивируемого с 5 мМ раствором HO.
2
2
Далее, как показано на Фиг.4, было установлено, что спустя 8 недель после посева, растение, культивируемое только с водой, и растение, культивируемое с 5 мМ раствором HO, увядало, тогда как растение, культивируемое с 1 мМ раствором GSSG, имело большое количество зеленых листьев. Это говорит о том, что растение, культивируемое с 1 мМ раствором GSSG, продлило свою жизнь.
2
2
2
2
Далее, как показано на Фиг.5, было установлено, что урожай семян растения, культивируемого с 1 мМ раствором GSSG, был значительно большим, чем урожай семян растения, культивируемого с водой, и чем урожай семян растения, культивируемого с 5 мМ раствором HO. Результат измерения показал, что эффективное число семян, собранное с одного растения, культивируемого с 1 мМ раствором GSSG, было приблизительно в три или четыре раза больше, чем эффективное число семян, собранное с одного растения, культивируемого только с водой, и растения, культивируемого с 5 мМ раствором НО (см. верхнюю фотографию на Фиг.5).
2
2
Далее было исследовано, наблюдаются ли какие-нибудь отличия в форме и размере семян. Результат проверки показан на нижних фотографиях на Фиг.5. Как показано на Фиг.5, у семян, полученных от растения, культивируемого с 1 мМ раствором GSSG, по сути была та же форма и тот же размер, как у семян, полученных от растения, культивируемого только с водой. Было установлено, что семена, полученные от растения, культивируемого с 5 мМ раствором HO, были ненамного более крупными.
Вышеизложенные результаты наглядно показывают, что при культивировании растения с использованием окисленного глутатиона увеличивается число семян и/или число цветков.
2. Влияние концентрации окисленного глутатиона на рост Arabidopsis
Было исследовано влияние концентрации окисленного глутатиона на рост Arabidopsis. В частности, почва загружалась в поддон размером приблизительно 65 по ширине, 65 по глубине и 50 по высоте и пропитывалась 0 мМ-, 0,01 мМ-, 0,2 мМ-, 1 мМ-, 2 мМ- и 5 мМ-растворами GSSG. Семена Arabidopsis сеялись таким образом, чтобы в каждом поддоне находилось приблизительно по три семени, и эти семена наблюдались хронологически в течение 3 недель после посева.
Результаты наблюдения представлены на Фиг.6 и 7. Как показано на фигурах, результаты, связанные с получением более округлого листа, и результаты, связанные с продлением жизни растения, наглядно выражены при концентрации 0,2-2 мМ, результат, связанный с образованием более толстого стебля, наблюдался при концентрации 1-2 мМ. В случае когда концентрация GSSG составляла 0,01 мМ, практически не было разницы между Arabidopsis, культивируемым с GSSG и Arabidopsis, культивируемым с водой (0 мМ). В случае когда концентрация GSSG составляла 5 мМ, рост Arabidopsis был существенно ограничен, и большая часть Arabidopsis завяла.
3. Влияние окисленного глутатиона на семена Arabidopsis
Была исследована зрелость семян, полученных от Arabidopsis, выращенного с применением окисленного глутатиона. В частности, семена, полученные от растений, культивируемых с водой или с раствором GSSG, высевались в питательную среду 1/2 MS, и скорости прорастания семян были исследованы хронологически.
Результаты исследования показаны на (а) и (b) Фиг.8. Как показано на фигуре, семена растений, культивированных с раствором GSSG, проросли быстрее, чем семена растений, культивированных обычным образом. В частности, скорость прорастания семян растений, культивированных с раствором GSSG, была значительно более высокой спустя 2 дня после посева. Однако спустя 7 дней после посева практически не наблюдалось различия между семенами растений, культивированных с раствором GSSG, и семенами растений, культивированных обычным образом.
4. Влияние окисленного глутатиона на мутант синтеза гиббереллина
Было исследовано действие окисленного глутатиона на мутант синтеза гиббереллина (GA). В частности, мутанты синтеза Arabidopsis GA - ga20ox1 культивировали с водой или GSSG (1мМ) со времени посева и наблюдали состояние их роста.
На Фиг.9 показано состояние растений спустя 8 недель после посева. Верхняя фотография Фиг.9 показывает вид спереди наблюдаемых растений, и нижняя фотография Фиг.9 показывает вид сверху (под углом) наблюдаемых растений. На фигуре "Col" обозначает дикий тип Columbia и "ga20ox1" указывает мутант, в котором Т-ДНК встроена в ген оксидазы GA20, который кодирует фермент биосинтеза GA. "ga20ox1-1" и "ga20ox1-2" являются независимыми мутантами, в которые Т-ДНК встроена в различные области.
Как это проиллюстрировано на фигуре, мутант GA ga20ox1, культивированный с помощью GSSG, показал значительное увеличение количества боковых побегов по сравнению с растениями, культивированными с применением воды. В связи с увеличением числа боковых побегов число цветков (трубок) также увеличилось. Кроме того, как это показано в правой части Фиг.9, масса семян также значительно увеличилась.
2
Следовательно, этот способ позволяет увеличивать урожай семян за счет применения GSSG к мутанту, имеющему мутацию синтеза фитогормона и реакции на фитогормон. В частности, способ эффективен для растения, такого как gramineae, урожай которого существенно зависит от отростков от корня. Это следует из того, что при культивировании риса (Akita 63) в гидропонике со стандартным количеством удобрений 5 кг N/10а и дополнительным введением удобрения - 2 кг N/10а на стадии формирования метелки и в мейотической стадии, применение GSSG в стандартном количестве - 0,2 г N на каждом опытном участке (0,1 м) при дополнительном введении удобрения обеспечило получение числа колосьев приблизительно в 1,4 раза больше, чем число колосьев у растения, культивированного только с водой.
Регулятор роста растений настоящего изобретения содержит окисленный глутатион и поэтому может способствовать росту растения. Например, регулятор роста растений настоящего изобретения может увеличить число семян растения и/или число цветков (трубок) растения.
Кроме того, культивирование с помощью окисленного глутатиона мутанта, имеющего мутацию синтеза, фитогормона (например, гиббереллина) или реакции на фитогормон, позволяет значительно увеличивать боковые побеги и соответственно позволяет увеличивать число цветков (трубок). Следовательно, применение регулятора роста растений настоящего изобретения для растения, например, gramineae, отростки которого существенно влияют на урожайность, позволяет увеличивать число урожаев семян.
5. Влияние 1 условий обработки окисленным глутатионом на семена Arabidopsis
Семена Arabidopsis были посеяны в поддоны, заполненные почвой, пропитанной в 0 мМ-, 0.01 мМ-, 0.2 мМ-, 1 мМ-, 2 мМ- и 5 мМ-GSSG. Поддоны были перенесены в лотки с водой, не содержащей GSSG, спустя 2 дня, спустя 1 неделю, спустя 2 недели, спустя 3 недели или спустя 4 недели после посева.
Arabidopsis культивировали в тех же условиях, которые описаны в 1. Влияние окисленного глутатиона на рост Arabidopsis, за исключением вышеуказанного условия.
Была измерена масса семян с одного поддона Arabidopsis, выращенного таким образом (три растения в каждом поддоне). Результаты измерения показаны на Фиг.10-12. n - число растений, которые могут быть в результате собраны в виде урожая.
На Фиг.10 "Отношение" обозначает отношение массы семян растения, выращенного таким образом, к массе семян (рассматриваемому как 1) растения, выращенного в лотке, заполненном водой, не содержащей GSSG.
Как показано на Фиг.10-12, обнаружено, что восприимчивость Arabidopsis к GSSG менялась в зависимости от вносимого количества GSSG (концентрации GSSG) и продолжительности внесения GSSG. Обнаружено, что при внесении GSSG в течение длительного времени GSSG с низкой концентрацией более эффективен, чем GSSG высокой концентрации, а в случае внесения GSSG в течение короткого периода времени предпочтителен GSSG с высокой концентрацией.
6. Влияние 2 условий обработки окисленным глутатионом на семена Arabidopsis
Семена Arabidopsis высевались в поддоны, заполненные почвой, пропитанной водой. Поддоны перемещались в лотки с водой, содержащей 1 мМ-GSSG спустя 2 дня, спустя 1 неделю, спустя 2 недели, спустя 3 недели, спустя 4 недели, спустя 5 недель, спустя 6 недель или спустя 7 недель после посева. Затем был подготовлен поддон, который содержался в лотке, заполненном водой, не содержащей GSSG, который не перемещали в воду, содержащую 1 мМ-GSSG.
Arabidopsis культивировали при тех же условиях, которые описаны в 1. Влияние окисленного глутатиона на рост Arabidopsis, за исключением вышеуказанного условия.
Была измерена масса семян с одного поддона Arabidopsis, выращенного таким образом (три растения в каждом поддоне).
Результаты измерения показали, что, как видно из Фиг.13, даже когда концентрации вносимого GSSG были для всех поддонов одинаковы, существовало большое различие в количестве полученных семян в зависимости от продолжительности обработки растений GSSG, указывая на то, что существует период времени, наиболее подходящий для внесения GSSG. С другой стороны, независимо от продолжительности обработки растений GSSG, обработка GSSG позволила получать большую массу семян, чем отсутствие обработки GSSG.
7. Влияние 3 условий обработки окисленным глутатионом на семена Arabidopsis
Семена Arabidopsis высевались в поддоны, заполненные почвой, пропитанной водой. Поддоны перемещались в лотки, заполненные водой, содержащей 1 мМ-GSSG, и культивировали Arabidopsis в течение только одной недели, которая являлась первой неделей (0-й - 7-й день), второй неделей (8-й - 14-й день), третьей неделей (15-й - 21-й день), четвертой неделей (22-й - 28-й день), пятой неделей (29-й - 35-й день), шестой неделей (36-й - 42-й день) и седьмой неделей (43-й - 49-й день) после посева. Таким образом, Arabidopsis обрабатывали 1 мМ-GSSG в течение только одной недели в определенный период роста.
Был подготовлен поддон, который находился в лотке, заполненном водой, не содержащей GSSG, и который не был перемещен в лоток, содержащий 1 мМ-GSSG, непосредственно с момента высевания, и поддон, который находился в лотке, заполненном водой, содержащей 1 мМ - GSSG, непосредственно с момента посева.
Arabidopsis культивировали при тех же условиях, которые описаны в 1. Влияние окисленного глутатиона на рост Arabidopsis, за исключением вышеупомянутого условия.
Была измерена масса семян в одном поддоне Arabidopsis, выращенного таким образом (три растения в каждом поддоне).
Результат измерения показал, что, как видно из Фиг.14, введение GSSG к Arabidopsis в течение только одной недели в определенный период роста значительно увеличивало массу семян по сравнению с массой семян Arabidopsis, не обработанного GSSG, хотя результат, достигаемый при использовании GSSG к Arabidopsis в течение только одной недели в определенный период роста, был меньшим, чем результат, достигаемый при применении GSSG к Arabidopsis непрерывно.
Также в этом случае существовало большое различие в количестве полученных семян в зависимости от времени обработки растений GSSG. В частности, применение окисленного глутатиона спустя 4 недели после посева привело к получению максимальной массы семян. Период спустя 4 недели после сеяния приблизительно соответствует периоду стрелкования.
8. Влияние 4 условий обработки окисленным глутатионом на семена Arabidopsis
Семена Arabidopsis высевались в поддоны, заполненные почвой, пропитанной водой. Поддоны перемещали в лотки, заполненные водой, содержащей 1 мМ-GSSG, и культивировали Arabidopsis в течение только двух недель, которые являются первой и второй неделями (0-ой - 14-ый день), второй и третьей неделями (8-ой - 21-ый день), третьей и четвертой неделями (15-ый - 28-ой день), четвертой и пятой неделями (22-ой - 35-ый день), пятой и шестой неделями (29-ый - 42-ой день) или шестой и седьмой неделями (36-ой - 49-ый день) после посева. Таким образом, растения Arabidopsis обрабатывали 1 мМ-GSSG только в течение двух недель в определенный период роста.
Был подготовлен поддон, который находился в лотке, заполненном водой, не содержащей GSSG, и который не был перемещен в лоток, содержащий 1 мМ-GSSG непосредственно с момента высевания, и поддон, который находился в лотке, заполненном водой, содержащей 1 мМ-GSSG, непосредственно с момента посева.
Arabidopsis культивировали при тех же условиях, которые описаны в 1. Влияние окисленного глутатиона на рост Arabidopsis, за исключением вышеуказанного условия.
Была измерена масса семян Arabidopsis, выращенного таким образом (три растения в каждом поддоне).
Результат измерения показал, что, как видно из Фиг.15, применение окисленного глутатиона к Arabidopsis только в течение двух недель в определенный период роста значительно увеличило массу семян по сравнению с массой семян Arabidopsis, не обрабатывавшегося GSSG, хотя результат, достигаемый при использовании GSSG к Arabidopsis только в течение двух недель в определенный период роста, был меньшим, чем результат, достигаемый при использовании GSSG к Arabidopsis непрерывно.
Также в этом случае существовало большое различие в количестве полученных семян в зависимости от времени обработки растений GSSG.
9. Влияние 5 условий обработки окисленным глутатионом на семена Arabidopsis
Семена Arabidopsis высевались в поддоны, заполненные почвой, пропитанной водой. Поддоны перемещали в лотки, заполненные водой, содержащей 0,2 мМ-GSSG или 1 мМ-GSSG, и культивировали Arabidopsis в течение только двух недель, которые являются первой и второй неделями (0-й - 14-й день), третьей и четвертой неделями (15-й - 28-й день), пятой и шестой неделями (29-й - 42-й день) или седьмой и восьмой неделями (43-й - 56-й день) после посева. Таким образом, Arabidopsis обрабатывался 0,2 мМ-GSSG или 1 мМ-GSSG в течение только двух недель в определенный период роста.
Был подготовлен поддон, который находился в лотке, заполненном водой, не содержащей GSSG, и который не был перемещен в лоток, содержащий 0,2 мМ-GSSG или 1 мМ-GSSG непосредственно с момента высевания, и поддон, который находился в лотке, заполненном водой, содержащей 0,2 мМ-GSSG или 1 мМ-GSSG непосредственно с момента посева.
Arabidopsis культивировали при тех же условиях, которые описаны в 1. Влияние окисленного глутатиона на рост Arabidopsis, за исключением вышеуказанного условия.
Были измерены масса семян, масса сухого вещества и процентное отношение массы урожая к общей массе растения Arabidopsis, выращенного таким способом (три растения в каждом поддоне), и было рассчитано среднее значение для трех поддонов.
Как видно из Фиг.16, результат вычисления показал, что, когда Arabidopsis обрабатывали 0,2 мМ-GSSG, масса сухого вещества увеличилась незначительно по сравнению с тем случаем, где Arabidopsis не обрабатывали GSSG, тогда как масса семян увеличилась, что привело к увеличению процентного отношения массы урожая к общей массе растения.
С другой стороны, когда Arabidopsis обрабатывали 1 мМ-GSSG, масса семян, масса сухого вещества и процентное отношение массы урожая к общей массе растения несомненно возросло по сравнению с тем случаем, где Arabidopsis не обрабатывали GSSG, за исключением процентного отношения массы урожая к общей массе растения в случае, когда Arabidopsis обрабатывали GSSG спустя 1 или 2 недели после высевания.
На Фиг.16 звездочка указывает большое различие между нормальным культивированием (с водой) и обработкой GSSG в t-испытании (*Р<0,05, **<0,01).
Как описано выше, результаты 5. Влияние условий обработки окисленным глутатионом на семена Arabidopsis 1 - 9. Влияние условий обработки окисленным глутатионом на семена Arabidopsis 5 показали, что восприимчивость Arabidopsis к окисленному глутатиону была различна в зависимости от времени роста Arabidopsis. В частности, в случае когда Arabidopsis обрабатывали окисленным глутатионом в течение 1 или 2 недель, когда Arabidopsis обрабатывали в период от момента 4 недель после посева до момента 5 недель после высевания, урожай семян увеличивался эффективно. При существующем условии роста время около 2 недель после высевания соответствует времени перехода от вегетативного к репродуктивному развитию, и время между моментами 4 и 5 недель после высевания приблизительно соответствует времени стрелкования Arabidopsis. Таким образом, было найдено, что обработка Arabidopsis окисленным глутатионом в пределах от времени перехода от вегетативного к репродуктивному развитию до приблизительно времени стрелкования позволяет эффективно увеличивать урожай семян.
10. Влияние окисленного глутатиона на рост розы (сорт Patiohit alicante)
Розу (сорт Patiohit alicante) удобряли 50 мл 0,5 мМ-GSSG раствором два раза в неделю в течение четырех месяцев и затем полностью срезали и культивировали. В дополнение к GSSG розу дополнительно удобряли 2 г S604 раз в 2 недели.
Далее, как показано на Фиг.17, было установлено, что растение, обработанное GSSG (растение, помещенное в левосторонний лоток на фигуре), показало существенное ускорение роста новых цветочных почек по сравнению с растением, не обработанным GSSG (растение, помещенное в правосторонний лоток на фигуре).
11. Влияние окисленного глутатиона на рост розы (сорт English rose)
Розу (сорт English rose) удобряли 50 мл 0,5 мМ раствором GSSG два раза в неделю в течение четырех месяцев и затем полностью срезали и культивировали. В дополнение к GSSG розу дополнительно удобряли 2 г S604 каждые две недели.
В результате, как показано на Фиг.17, было установлено, что растение, обработанное GSSG (растение, помещенное вверху фигуры), показало значительно более раннее прорастание и существенное ускорение роста новых бутонов по сравнению с растением, не обработанным GSSG (растение, помещенное внизу фигуры).
12. Влияние окисленного глутатиона на рост tsai-hsin (Sakata Seed Со.) 1
Tsai-hsin культивировали в течение двух недель и затем переносили на сельскохозяйственное поле и выращивали с обработкой или без обработки GSSG. Tsai-hsin удобряли азотным удобрением KUMIAI RIN RYUANKARI S604 в соотношении 20 кгN на 10 ар и дополнительно удобряли 5 кгN 3 недели спустя.
2
В обрабатываемой GSSG хозяйственной зоне 0,5 мМ- или 5 мМ-раствор GSSG распыляли по поверхности листьев растения два раза в неделю таким образом, чтобы 1 л раствора GSSG был распылен в 1 зоне (3 м).
В результате, как показано на Фиг.19, растение из обрабатываемой GSSG хозяйственной зоны давало значительно большее увеличение роста, чем растение из хозяйственной зоны с нормальным содержанием азота (не обрабатываемой GSSG).
13. Влияние окисленного глутатиона на рост и урожай семян сои 2
Сою (сорт Tsurumusume) и сою (сорт Toyomusume) выращивали в течение двух недель и затем перемещали на сельскохозяйственное поле, размещая в соответствии с Фиг.20, и выращивали с обработкой или без обработки GSSG. Сою удобряли азотным удобрением KUMIAI RIN RYUANKARI S604 в соотношении 20 кгN на 10 ар и дополнительно удобряли 5 кгN 3 недели спустя.
Затем в обрабатываемой GSSG хозяйственной зоне 0,5 мМ раствор GSSG подавали к основанию стебля (см. стрелку на Фиг.21) в количестве 50 мл на одно растение два раза в неделю таким образом, чтобы раствор тек вдоль стебля.
В том случае если должен был пойти дождь, раствор GSSG подавали растению после дождя. Аналогично поступали в случае полива, раствор GSSG подавали растению после полива. Когда приходило время сбора урожая контрольного растения (то есть в хозяйственной зоне с нормальным содержанием азота), подача раствора GSSG растениям в обрабатываемой GSSG хозяйственной зоне была остановлена.
Измеряли массу семян, количество биомассы и процентное отношение массы урожая к общей массе растения, полученного указанным образом в обрабатываемой GSSG хозяйственной зоне, и каждый показатель сравнивали с аналогичным показателем для растения из хозяйственной зоны с нормальным содержанием азота.
В результате, как показано на Фиг.22 относительно каждого сорта, растение из обрабатываемой GSSG хозяйственной зоны давало большую массу семян, более высокое количество биомассы и более высокое процентное отношение массы урожая к общей массе растения, чем растение из хозяйственной зоны с нормальным содержанием азота.
14. Действие 1 окисленного глутатиона на урожайность кукурузы
Сахарная кукуруза (Canberra 90, TAKII & CO., LTD) была посеяна и затем две недели спустя пересажена в горшок гидропоники (1/2000 ар), заполненный питательной средой (6 л вермикулита в качестве нижнего слоя, 3 л почвы Kureha Ikubyou Baido в качестве среднего слоя и 3 л вермикулита в качестве верхнего слоя) и дополнительно удобрена 3 г KUMIAI RIN RYUANKARI S604 четыре недели спустя и шесть недель спустя. Затем обработанному GSSG растению вносили 200 мл 0.5 мМ GSSG два раза в неделю в течение 2 недель после его прорастания к корням. Что касается продолжительности обработки GSSG, см. (с) Фиг.25. Заштрихованная часть, представленная на (с) Фиг.25, представляет собой продолжительность обработки GSSG.
В результате, как показано на Фиг.23, растение, обработанное GSSG (левая сторона (а) на Фиг.23), показало ускоренное формирование цветочных почек по сравнению с растением, которое не обрабатывали GSSG (правая сторона (b) на Фиг.23).
Кроме того, как показано на Фиг.24, плоды растения, которое обрабатывали GSSG (верхняя левая группа (а) на Фиг.24), были более крупными, чем початки растения, необработанного GSSG (верхняя правая группа (b) на Фиг.24), и имели большее число съедобных семян, чем у растения, необработанного GSSG.
Далее, семена растения, которое обрабатывали GSSG (нижняя левая группа (с) на Фиг.24), были более крупными, чем семена растения, необработанного GSSG (нижняя правая группа (а) на Фиг.24).
Это отчетливо указывает на то, что обработка кукурузы GSSG увеличивает ее урожайность.
Впоследствии были измерены количество биомассы плодов, наземных частей и частей, отличных от плодов растения, обработанного GSSG, и растения, которое не обрабатывали GSSG. Как показано на (а) Фиг.25, результат измерения показал, что не было большого различия в количестве биомассы частей растения, отличных от плодов, между обработанным GSSG растением и растением, которое не обрабатывалось GSSG, тогда как количество биомассы плодов и наземных частей растения, обработанного GSSG, было значительно выше.
Ввиду вышеизложенного, было вычислено процентное отношение массы урожая к общей массе растения. Результат вычисления показал, что, как видно из (b) Фиг.25, растение, обработанное GSSG, давало значительно более высокое процентное отношение массы урожая к общей массе растения, чем растение, которое не обрабатывали GSSG.
15. Действие 2 окисленного глутатиона на урожайность кукурузы
Было исследовано влияние продолжительности обработки окисленным глутатионом на урожайность кукурузы.
Сахарная кукуруза (Canberra 90, TAKII & CO., LTD) была посеяна и затем две недели спустя пересажена в горшок гидропоники (1/2000 ар), заполненный питательной средой (6 л вермикулита в качестве нижнего слоя, 3 л почвы Kureha Ikubyou Baido в качестве среднего слоя и 3 л вермикулита в качестве верхнего слоя) и дополнительно удобрена 3 г KUMIAI RIN RYUANKARI S604 четыре недели спустя и шесть недель спустя.
Затем обработанному GSSG растению вносили 50 мл 0,2 мМ раствора GSSG четыре раза за 2 недели (два раза в неделю) после 2 недель, 4 недель или 6 недель с момента посева. Далее, была подготовлена хозяйственная зона, куда 0,2 мМ-GSSG подали в целом 22 раза в течение 11 недель спустя 2 недели с момента посева, а также хозяйственная зона, куда 0,2 мМ-GSSG не подавали. Что касается продолжительности обработки GSSG, следует обратиться к (с) Фиг.26. Заштрихованная часть, представленная на (с) Фиг.26, представляет собой продолжительность обработки GSSG.
Количество плодов и количество биомассы наземных частей каждого растения было измерено, и было вычислено процентное отношение массы урожая к общей массе растения.
В результате, как показано на (а) Фиг.26, растение, обрабатывавшееся GSSG в течение двух недель спустя четыре недели с момента посева и в течение двух недель спустя шесть недель с момента посева, и растение, обрабатывавшееся GSSG в течение одиннадцати недель спустя две недели с момента посева, доказали большее процентное отношение массы урожая к общей массе растения, чем растение, которое не обрабатывали GSSG. В частности, растение, обработанное GSSG в течение двух недель спустя четыре недели с момента посева, и растение, обработанное GSSG в течение одиннадцати недель спустя две недели с момента посева, показали значительное увеличение процентного отношения массы урожая к общей массе растения.
Как показано на (b) Фиг.26, растение, обработанное GSSG в течение двух недель спустя четыре недели с момента посева, и растение, обработанное GSSG в течение одиннадцати недель спустя две недели с момента посева, имело большее количество плодов и большее количество биомассы наземных частей у каждого растения, чем растение, которое не обрабатывали GSSG. Однако растение, обработанное GSSG в течение двух недель спустя шесть недель с момента посева, имело меньшее количество плодов и меньшее количество биомассы наземных частей у каждого растения, чем растение, которое не обрабатывали GSSG.
16. Действие 3 окисленного глутатиона на урожайность кукурузы
Сахарная кукуруза была выращена при тех же условиях, которые указаны в 15. Влияние окисленного глутатиона на урожайность кукурузы 2, за исключением того, что GSSG распыляли на стебель и листья четыре раза в течение двух недель спустя шесть недель с момента посева, зона, где выращивалась сахарная кукуруза, рассматривалась как обрабатываемая GSSG зона, и GSSG распыляли на листья. Продолжительность обработки GSSG представлена на (с) Фиг.27. Заштрихованная часть, представленная на (с) Фиг.27, представляет собой продолжительность обработки GSSG.
Количество плодов и количество биомассы наземных частей полученного таким образом растения было измерено для каждого растения, и было вычислено процентное отношение массы урожая к общей массе растения.
В результате, как показано на (а) и (b) Фиг.27, даже в случае распыления GSSG на стебель и листья обработка GSSG увеличивала количество плодов, количество биомассы наземных частей и процентное отношение массы урожая к общей массе растения для каждого растения.
17. Действие 4 окисленного глутатиона на урожайность кукурузы
Сахарная кукуруза была выращена в тех же условиях, которые представлены в 15. Действие 2 окисленного глутатиона на урожайность кукурузы, за исключением того, что GSSG вносили к корням в форме раствора или распыляли на стебель и листья в течение двух недель спустя две недели с момента посева, или в течение одиннадцати недель спустя две недели с момента посева, или в течение двух недель спустя четыре недели с момента посева, или в течение двух недель спустя шесть недель с момента посева и каждый раз вносили по 20 мл 0,2 мМ-GSSG. Продолжительность обработки GSSG представлена на (b) Фиг.28. Заштрихованная часть, представленная на (b) Фиг.28, является продолжительностью обработки GSSG.
Было измерено процентное отношение массы урожая к общей массе полученного таким образом растения. В результате, как показано на (а) Фиг.28, процентное отношение массы урожая к общей массе растения значительно увеличилось при любом из вышеуказанных условий по сравнению с растением, которое не обрабатывали GSSG.
18. Действие 5 окисленного глутатиона на урожайность кукурузы
Сахарная кукуруза была выращена на сельскохозяйственном поле таким образом, чтобы растения размещались так, как это показано на Фиг.29 (плотность: приблизительно 12000 индивидуальных растений/10а).
Были подготовлены растения, обработанные GSSG следующим образом: растения, корни которых опрыскивали GSSG (каждый раз - 20 мл 0,5 мМ-GSSG) два раза в неделю в течение двух недель спустя две недели с момента посева, в течение двух недель спустя три недели с момента посева, в течение двух недель спустя четыре недели с момента посева, в течение двух недель спустя пять недель с момента посева, в течение двух недель спустя шесть недель с момента посева и в течение семи недель спустя две недели с момента посева; растения, не обработанные GSSG; растения, стебель и листья которых опрыскивали GSSG (каждый раз 20 мл 0,5 мМ-GSSG - каждому растению) два раза в неделю в течение семи недель спустя две недели с момента посева. Продолжительность обработки GSSG представлена на (b) Фиг.30. Заштрихованная часть, представленная на (b) Фиг.30, является продолжительностью обработки GSSG.
Общее количество биомассы с площади и урожай початков (плодов) с площади растений, выращенных в колонии, без учета полученных таким образом растений было измерено, и было вычислено процентное отношение массы урожая к общей массе растений.
В результате, как показано на (а), (с) и (d) Фиг.30, любое из условий обработки GSSG не показало существенного отличия по общему количеству биомассы с площади в отношении растений, которые не обрабатывали GSSG, но обеспечило более высокий урожай початков (плодов) и более высокое процентное отношение массы урожая к общей массе растений.
Затем были измерены количество биомассы плодов, наземных частей, частей, отличных от плодов, от каждого из растений. Как показано на Фиг.31, результаты измерения показали, что любое из условий обработки GSSG обеспечило более высокое количество биомассы плодов (то есть количество плодов), чем растения, которые не обрабатывали GSSG.
Однако любое из условий обработки GSSG показало более низкое количество биомассы частей растения, отличных от плодов, по сравнению с растениями, которые не обрабатывали GSSG. Кроме того, любое из условий обработки GSSG показало, по сути, то же самое или меньшее количество биомассы наземных частей по сравнению с растениями, которые не обрабатывали GSSG. В частности, растения, стебель и листья которых опрыскивали GSSG в течение семи недель спустя две недели с момента посева, показали значительно меньшее количество биомассы частей, отличных от плодов, и наземных частей, по сравнению с растениями, которые не обрабатывали GSSG.
Вышеуказанные результаты показывают, что окисленный глутатион увеличивает количество плодов, являющихся урожаем кукурузы, и, таким образом, увеличивает процентное отношение массы урожая к общей массе растения, не увеличивая количество биомассы наземных частей.
19. Действие окисленного глутатиона на производительность кукурузы в условиях недостатка азота
Сахарную кукурузу высевали и выращивали в течение 84 дней (7 недель) после посева без подачи источника азота. Затем сахарную кукурузу выращивали с подачей 30 кг N/10а источника азота. Обработка GSSG была выполнена таким образом, что растворы GSSG с 0 мМ-, 0,2 мМ-, 0,5 мМ и 1,0 мМ-концентрации вносили в количестве 50 мл в одно время два раза в неделю спустя 8 недель с момента посева (то есть после того, как началась подача источника азота). Условия культивирования представлены на (с) Фиг.33.
Как показано на (а) и (b) Фиг.32, растения, полученные таким образом, давали большее количество плодов, чем растения, которые не обрабатывали GSSG, на (с) Фиг.32.
Чтобы исследовать объем производства растений более подробно, были измерены количество биомассы плодов, наземных частей и частей, отличных от плодов, и было вычислено процентное отношение массы урожая к общей массе растений.
Как показано на (а) и (b) Фиг.33, результаты измерения и вычисление показали, что растения, обработанные GSSG, давали большие объемы биомассы плодов, наземных частей и частей, отличных от плодов, и процентное отношение массы урожая к общей массе растений, чем растения, которые не обрабатывали GSSG.
Вышеуказанные результаты отчетливо показывают, что когда рост растения ограничен дефицитом азота в вегетативном развитии, урожай плодов обычно понижается, однако обработка с GSSG позволяет избежать снижения урожая, даже если рост растения был ограничен в связи с дефицитом азота.
20. Действие 1 окисленного глутатиона на ускорение роста побега и цветочной почки розы
Саженцы розы (сорт Purple rose) были приобретены в хозяйственном магазине и культивировались в поддонах для гидропоники риса. Саженцы розы удобряли 50 мл 0,5 мМ раствора GSSG в форме жидкого удобрения два раза в неделю. Кроме GSSG саженцы розы каждые две недели дополнительно удобряли 2 г S604.
В результате растения, которые обрабатывали GSSG (растения, окруженные кругами, обозначенными сплошной линией, на Фиг.34), давали ускоренный рост побега через месяц после внесения удобрения по сравнению с растениями, которые не обрабатывали GSSG (растения, окруженные пунктирными кругами на Фиг.34).
Вышеуказанный результат отчетливо показывает, что обработка с GSSG ускоряет рост побегов и цветочных почек роз (сорт Purple rose).
21. Действие 2 окисленного глутатиона на ускорение роста ростка и цветочной почки розы
Саженцы розы (сорт JJ scarlet и JJ apricot) были приобретены в хозяйственном магазине и культивировались в поддонах для гидропоники риса. Саженцы розы удобряли 50 мл 0,5 мМ раствора GSSG в форме жидкого удобрения два раза в неделю. Кроме GSSG саженцы розы каждые две недели дополнительно удобряли 2 г S604.
В результате растения, которые обрабатывались GSSG ((а) и (с) Фиг.35), давали ускоренный рост побега через месяц после внесения удобрения по сравнению с растениями, которые не обрабатывали GSSG ((b) и (d) Фиг.35).
На (а)-(d) Фиг.35 сорта трех растений представляют собой: слева направо - JJ scarlet, JJ apricot и JJ scarlet соответственно.
22. Эффект окисленного глутатиона на ускорение роста корней eustoma
Семена eustoma были пророщены в питательной среде MS, содержащей 1 мМ-GSSG или GSH, их выращивали в течение 1 месяца и переносили в посадочную емккость. Посадочная емкость, куда пересаживали вышеуказанные растения, содержала 2 части вермикулита, 1 часть почвы Kureha Ikubyou Baido и 1 часть вермикулита соответственно в качестве нижнего, среднего и верхнего слоев.
В результате, как показано на Фиг.36, растения, обработанные GSSG, давали значительный рост корней по сравнению с растениями, которые не обрабатывали GSSG. С другой стороны, растения, обработанные GSH, показали более слабый рост корней по сравнению с растениями, которые не обрабатывали GSSG.
23. Действие 1 окисленного глутатиона на стимулирование формирования цветочной почки розы
Розы (сорт Patiohit alicante) были приобретены в хозяйственном магазине, их удобряли 50 мл 0,5 мМ раствора GSSG в форме жидкого удобрения два раза в неделю. Приблизительно через три с половиной месяца сравнили растения из GSSG-обрабатываемой и из GSSG-необрабатываемой зон друг с другом.
В результате растения, обработанные GSSG ((а) Фиг.37 и (а) Фиг.38), давали значительно большее число распустившихся цветков, чем растения, которые не обрабатывали GSSG ((b) Фиг.37 и (b) Фиг.38).
Вышеуказанные результаты отчетливо показывают, что окисленный глутатион стимулирует развитие цветочных почек роз.
24. Влияние окисленного глутатиона на рост земляники
Саженец земляники (сорт Знаменитая садовая серия, Yokubari-ichigo kurenai (SUMIKA)) был приобретен в хозяйственном магазине и культивирован. Землянику удобряли 50 мл 0,5 мМ раствора GSSG в форме жидкого удобрения два раза в неделю. Кроме GSSG землянику дополнительно удобряли 2 г S604 каждые две недели.
В результате, как показано на Фиг.39, спустя четыре месяца после внесения удобрения, в контрольной зоне (зоне, не обработанной GSSG) наблюдалось два или три уса на один саженец, тогда как в зоне, обработанной GSSG, наблюдалось значительно большее количество усов, а именно несколько десятков усов на один саженец.
С другой стороны, хотя зона, обработанная GSH, представила большее число усов на один саженец, чем контрольная зона, увеличение числа усов в зоне, обработанной GSH, составило примерно одну треть от увеличения числа усов в зоне, обработанной GSSG.
Вышеуказанные результаты показывают, что окисленный глутатион стимулирует рост земляники и увеличивает число усов, способствуя быстрому разрастанию саженцев.
25. Влияние 1 окисленного глутатиона на рост трансформанта Arabidopsis, у которого встроен ген, кодирующий gFBA
Первоначально трансформанты Arabidopsis, у которых встроен ген, кодирующий связывающую глутатион фруктозо-1,6-бифосфатадолазу пластидного типа (который может в дальнейшем обозначаться как "gFBA"), и растения Arabidopsis (Columbia; Col) дикого типа культивировали в тех же условиях, которые указаны в 1. Влияние окисленного глутатиона на рост Arabidopsis, за исключением того, что трансформанты Arabidopsis и дикий тип Arabidopsis удобряли раствором 0 мМ-, 3 мМ-, 9 мМ- или 18 мМ-нитрата аммония в количестве 25 мл на три растения один раз в неделю.
Внесение удобрения проводили таким образом, чтобы горшок был помещен на чашу весов, и раствор нитрата аммония разливали на чаше весов. Что касается условий культивирования растения, следует обратиться к Фиг.40.
Было измерено общее количество биомассы и масса семян полученных таким образом растений, и было вычислено процентное отношение массы урожая к общей массе растения. В результате, как показано на Фиг.41, для любого из этих растений общее количество биомассы и масса семян увеличивались по мере роста концентрации нитрата аммония, однако рост замедлялся при концентрации 9 мМ, и предельное значение достигалось при концентрации 18 мМ.
С другой стороны, для любого из этих растений, когда в качестве удобрения использовали 3 мМ- и 9 мМ-нитрат аммония, процентное отношение массы урожая к общей массе растения возрастало. Однако, когда в качестве удобрения использовали 18 мМ-нитрат аммония, процентное отношение массы урожая к общей массе растения было ниже, чем в случае, когда удобрение вообще не использовали. Такое снижение процентного отношения массы урожая к общей массе растения обычно проявляется при избыточном применении азота в качестве удобрения. В этом случае с ростом вносимого в качестве удобрения N наблюдается снижение урожая. В случае сельскохозяйственных культур сельскохозяйственные экспериментальные станции и питомники, чтобы избежать сокращения урожайности, вызываемого чрезмерным внесением удобрения, представляют информацию относительно стандартного количества азотного удобрения, наиболее подходящего для получения высоких урожаев.
В условиях внесения удобрения (18 мМ-нитрат аммония), когда показатель увеличения урожайности с увеличением вносимого количества азотного удобрения N достигал предельного значения, результаты выращивания с внесением GSSG были сравнимы с результатами выращивания при отсутствия внесения GSSG. Трансформанты Arabidopsis, у которых встроен ген, кодирующий gFBA, и дикий тип Arabidopsis (Columbia; Col) удобряли исключительно 1 мМ-GSSG, или исключительно 18 мМ-нитратом аммония, или обоими растворами сразу - 18 мМ-нитратом аммония и 1 мМ-GSSG в форме жидкого удобрения тем же способом, что и при удобрении нитратом аммония на Фиг.41, и культивировали.
Были измерены общее количество биомассы и масса полученных таким образом семян растений, и было вычислено процентное отношение массы урожая к общей массе растения. В результате, как показано на Фиг.42, удобрение только окисленным глутатионом увеличивало такие показатели, как процентное отношение массы урожая к общей массе растения, общее количество биомассы, массу семян, а также влияние окисленного глутатиона наблюдали в условиях, когда влияние нитрата аммония на увеличение массы семян достигало своего предельного значения.
Совместное внесение окисленного глутатиона и нитрата аммония обеспечило достижение большего эффекта у трансформантов, имеющих встроенный ген, кодирующий gFBA, по сравнению с диким типом.
Вышеупомянутые результаты показывают, что совместное внесение окисленного глутатиона и нитрата аммония трансформантам, у которых встроен ген, кодирующий gFBA, позволяет дополнительно усилить эффект GSSG относительно увеличения процентного отношения массы урожая к общей массе растения, общего количества биомассы и массы семян.
26. Влияние 2 окисленного глутатиона и восстановленного глутатиона на рост трансформанта Arabidopsis, имеющего встроенный ген, кодирующий gFBA
В условиях, представленных на Фиг.42, вместо 1 мМ-GSSG вносили GSH или сульфат аммония в том же количестве относительно содержания N, и влияние GSH или сульфата аммония сравнивали с эффектом, оказываемым GSSG. Трансформанты Arabidopsis, имеющие встроенный ген, кодирующий gFBA, и дикий тип Arabidopsis (Columbia; Col) культивировали аналогичным образом, как представлено на Фиг.41 и 42, за исключением условия, касающегося жидкого удобрения. В качестве жидкого удобрения использовали 18 мМ-нитрат аммония, 18 мМ-нитрат аммония + 1 мМ-GSSG, 18 мМ-нитрат аммония + 2 мМ-GSH или 18 мМ-нитрат аммония + 2 мМ-сульфат аммония.
Внесение удобрения производили таким образом, чтобы горшок был помещен на чашу весов, и вышеуказанное жидкое удобрение разливали на чаше весов. Что касается условий культивирования растения, то следует обратиться к Фиг.40.
Было измерено общее количество биомассы и масса полученных таким образом семян растений, и было вычислено процентное отношение массы урожая к общей массе растения. В результате, как показано на Фиг.43, совместное внесение окисленного глутатиона и нитрата аммония к трансформантам, имеющим устроенный ген gFBA, позволяет значительно увеличивать процентное отношение массы урожая к общей массе растения, общее количество биомассы и массу семян по сравнению со другими способами обработки трансформантов.
Что касается процентного отношения массы урожая к общей массе растения, хотя совместное внесение восстановленного глутатиона и нитрата аммония привело не к такому большому эффекту, как влияние совместного внесения окисленного глутатиона и нитрата аммония, совместное внесение восстановленного глутатиона и нитрата аммония значительно увеличило процентное отношения массы урожая к общей массе растения по сравнению с тем случаем, когда удобрение вообще не использовали или в качестве удобрения использовали только нитрат аммония.
Вышеуказанные результаты показали, что как окисленный, так и восстановленный глутатион позволяют значительно увеличить процентное отношение массы урожая к общей массе растения и значительно увеличить урожайность при совместном использовании с нитратом аммония. Кроме того, вышеуказанные результаты показали, что эффективность возрастает, когда такую комбинацию удобрений подавали растениям, имеющим встроенный ген gFBA. Кроме того, вышеуказанные результаты показали, что у окисленного глутатиона более высокая способность к увеличению процентного отношения массы урожая к общей массе растения, а также к значительному увеличению урожайности, чем у восстановленного глутатиона.
27. Влияние 3 окисленного глутатиона на рост трансформанта Arabidopsis, имеющего встроенный gFBA
Трансформанты Arabidopsis, имеющие встроенный ген gFBA, и дикий тип Arabidopsis (Columbia; Col) культивировали аналогичным образом, как представлено на Фиг.41-43, за исключением условия, что только GSSG вносили в качестве жидкого удобрения. Концентрацию GSSG, вносимого в качестве жидкого удобрения, варьировали от 0 мМ до 5 мМ.
Было измерено общее количество биомассы и масса полученных таким образом семян растений, и было вычислено процентное отношение массы урожая к общей массе растения. Результат относительно массы семян показан на Фиг.44, а результат, характеризующий процентное отношение массы урожая к общей массе растения, показан на Фиг.45. Масса семян увеличивалась с ростом концентрации GSSG, и результат не достигал предельного значения при исследуемых концентрациях. Эта тенденция более четко наблюдалась у трансформантов Arabidopsis, имеющих встроенный ген gFBA.
С другой стороны, процентное отношение массы урожая к общей массе растения увеличивалось с ростом концентрации GSSG, и данный результат достигал предельного значения при концентрации GSSG около 2 мМ. Эффективность увеличения массы семян и эффективность увеличения процентного отношения массы урожая к общей массе растения, достигнутые за счет обработки GSSG, были значительно больше, чем максимальные эффекты, достигнутые за счет удобрения азотом, содержащимся в нитрате аммония.
Вышеуказанные результаты показали, что эффективность увеличения массы семян и эффективность увеличения процентного отношения массы урожая к общей массе растения, достигнутые за счет GSSG, больше, чем эффективность, достигнутая за счет нитрата аммония, и активация гена gFBA позволяет усиливать эти эффекты.
28. Сравнения влияния окисленного глутатиона, восстановленного глутатиона и сульфата аммония в качестве источников серы на рост
В условиях, подобных представленным на Фиг.41-45, за исключением того, что GSSG, GSH и сульфат аммония подавались в качестве жидкого удобрения, сравнивали влияние жидких удобрений на рост трансформантов, имеющих встроенный ген gFBA. Количество соответствующих жидких удобрений было задано таким образом, чтобы концентрации жидких удобрений были одинаковы относительно содержания S. Было измерено общее количество биомассы и масса семян полученных таким образом растений, и было вычислено процентное отношение массы урожая к общей массе растения. Результат относительно массы семян показан на Фиг.46, а результат для процентного отношения массы урожая к общей массе растения показан на Фиг.47.
Влияние сульфата аммония, обычно применяемого в качестве азотного удобрения, на увеличение массы семян достигало предела при значении, аналогичном для случая применения нитрата аммония. С другой стороны, при использовании GSSG и GSH предельного значения не достигалось при исследуемых концентрациях, что указывает на большую эффективность GSSG и GSH в отношении увеличения массы семян по сравнению с сульфатом аммония. С другой стороны, для любого из жидких удобрений эффективность увеличения процентного отношения массы урожая к общей массе растения достигала своего максимума, когда количество N составляло 12 мМ. Среди трех жидких удобрений GSSG обеспечивал получение наиболее высокого эффекта.
Вышеуказанные результаты показали, что эффективность глутатиона выше, чем обычного удобрения, а GSSG дает наиболее высокий эффект, чем GSH.
Способы реализации и конкретные примеры выполнения рассматривались в вышеизложенном детальном объяснении исключительно с целью пояснения технических деталей настоящего изобретения, которое не должно узко интерпретироваться в рамках данных способов реализации и конкретных примеров, а скорее может быть применено в многочисленных вариантах в духе настоящего изобретения, если такие варианты не выходят за пределы формулы изобретения, приведенной ниже.
Промышленная применимость
Настоящее изобретение позволяет увеличить процентное отношение массы урожая к общей массе растения. Кроме того, настоящее изобретение позволяет увеличить число семян или цветков растения. Далее, настоящее изобретение позволяет увеличить боковые побеги и отростки от корня и увеличить урожай семян. Следовательно, настоящее изобретение позволяет увеличить число цветков и урожаи не только декоративных цветущих трав и растений, используемых в пищевых целях, но также лесных растений и растений, биомасса которых используется в качестве источника биоэнергии. Поэтому настоящее изобретение имеет широкую промышленную применимость не только в сельском хозяйстве, но и в пищевой промышленности и отраслях энергетики.