Оптимизация флюоресцентной диагностики при использовании в качестве метаболического предшественника порфиринов 5-аминолевулиновой кислоты

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

И.Л. Васильченко, С.П. Селиванов, С.Н. Исаева, В.Е. Прокопьев, А.В. Петлин, В.В. Удут

Кемеровский областной клинический онкологический диспансер,

г. Кемерово,

НМУ Лечебно-диагностический центр, Институт сильноточной электроники СО РАН, Томский военно-медицинский институт, ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН,

г. Томск

ОПТИМИЗАЦИЯ ФЛЮОРЕСЦЕНТНОЙ ДИАГНОСТИКИ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ В КАЧЕСТВЕ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО ПРЕДШЕСТВЕННИКА ПОРФИРИНОВ 5-АМИНОЛЕВУЛИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Целью данной работы явилось повышение эффективности флюоресцентной диагностики поверхностного рака мочевого пузыря. Продемонстрирована зависимость интенсивности флюоресценции от фазы клеточного роста.

Ключевые слова: флюоресцентная диагностика, 5-аминолевулиновая кислота, поверхностный рак мочевого пузыря.

The purpose of the given research is the increase of fluorescent diagnostics efficiency of a superficial bladder cancer. Dependence of fluoristic intensity from a phase of cellular growth is shown.

Key words: fluorescent diagnostic, 5-aminolevulenate acid, superficial cancer of bladder.

В последние годы трансуретральная резекция (ТУР) практически вытеснила другие органосохраняющие методы оперативного лечения поверхностного рака мочевого пузыря [1]. Однако основной проблемой остается высокая частота реци-дивирования, так что при тотальной резекции всех видимых при обычной цистоскопии опухолевых очагов рецидивы поверхностного рака мочевого пузыря возникают, в среднем, у 66 % пациентов за период наблюдения от 30 месяцев до 5 лет, достигая к 15 годам наблюдения 88 % [2].

Доминирующей причиной развития рецидива после ТУР является неадекватность идентификации очагов неопластически трансформированных тканей вследствие преимущественно мультицентричного роста поверхностного рака мочевого пузыря [3]. В связи с этим, актуальна разработка метода, позволяющего объективно оценить степень распространенности опухоли в слизистой оболочке мочевого пузыря, что даст возможность выполнить радикально резекцию и снизить частоту рецидивирования.

Привлекательным в этом отношении является метод обнаружения злокачественных тканей по флю-

оресценции экзогенных фотосенсибилизаторов и, в частности, продуктов метаболизма 5-аминолевули-новой кислоты (5-АЛК), обеспечивающих формирование специфических отличительных признаков слизистой оболочки мочевого пузыря, ценных как для дифференциальной диагностики, так и для оценки распространенности поверхностного рака мочевого пузыря [4, 5].

Чувствительность, специфичность и прогностическая значимость флюоресцентной диагностики с экзогенными фотосенсибилизаторами сильно варьирует [6]. Причиной тому могут быть такие факторы, как объем опухоли и ее локализация в мочевом пузыре, состояние окружающей опухоль слизистой мочевого пузыря, наличие в анамнезе ТУР или внут-рипузырной химиотерапии и многие другие [7, 8]. Но, зачастую, природа ложной флюоресценции или недостаточной флюоресценции видимой невооруженным глазом опухоли мочевого пузыря не ясна. К тому же остаются неясными оптимальные дозы и режимы проведения флюоресцентной диагностики, в частности, продолжительность экспозиции в различных исследованиях варьирует от 2 до 4 часов [5, 9].

Цель исследования — отработать методику флюоресцентной диагностики путем изучения условий оптимального синтеза порфиринов при использовании 5-АЛК в качестве метаболического предшественника в эксперименте.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали клетки миелолейкоза человека К-562, клетки костного мозга, мононуклеар-ные клетки, выделенные из периферической крови здоровых доноров, лимфоциты периферической крови, вступившие в реакцию бласттрансформации. Мо-нонуклеарные клетки периферической крови (МПК) и бластные клетки костного мозга выделяли и избавляли от примеси эритроцитов и гранулоцитов на градиенте плотности фиколл-урографина (1,077 г/л) стандартными методами. Для получения активно пролиферирующих лимфоцитов мононуклеарные клетки в концентрации 2 x 105/мл культивировали в объеме 200 мкл в 96-луночных планшетах в присутствии митогена ФГА (10 мкг/мл) в течение 72 часов. Начальная плотность всех клеток, которая использовалась в дальнейших экспериментах in vitro, составляла 2 x 105 клеток/мл, объем микрокультур — 200 мкл.

Клетки культивировали в питательной среде RPMI 1640 с 10 % эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС), 2 мМ глютамина и 40 мкг/мл гентами-цина, при температуре 37°С, во влажной атмосфере с 5 % СО2. В качестве метаболического предшественника протопорфирина IX (ПП IX) использовали 5-аминолевулиновую кислоту (5-АЛК), которую добавляли в среду культивирования в конечной концентрации 0,4-15 мМ. Инкубирование проводили в течение 1-24 часов.

Микроскопическое изучение клеток после инкубации в присутствии 5-АЛК проводили с использованием люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ И-2. Визуальное и телевизионное наблюдение общего количества клеток и их флюоресценции проводилось в камере Горяева. Источником излучения, возбуждающим флюоресценцию препаратов (образцов), служила кварцевая ртутная лампа высокого давления мощностью 250 Вт ДРШ-250. Для получения фазово-контрастного изображения использовалась гало-геновая лампа мощностью 100 Вт. Освещение объекта лучами, возбуждающими его флюоресценцию, производили через кварцевый объектив микроскопа с увеличением x40, при помощи опак-иллюминатора, снабженного дихроичным делительным зеркалом, селективно отражающим синий свет от ртутной лампы. Регистрацию фазово-контрастного и флюоресцентного изображения клеток проводили через канал наблюдения дихроичного зеркала, пропускающего свет красного диапазона спектра.

Дополнительно к этому, возбуждение и наблюдение флюоресценции производилось в системе двух скрещенных светофильтров. Светофильтр, пропускающий свет в диапазоне 350-490 нм (СС-8), устанав-

ливался в осветительном (возбуждающем) канале микроскопа. Светофильтр (ЖЗ-18), пропускающий излучение с длинами волн больше 580 нм, устанавливался в наблюдательном канале перед чувствительной видеокамерой VNC-703. Съемка каждого поля зрения осуществлялась на два кинокадра: на первый — фазово-контрастное изображение клетки, на второй — флюоресцентное изображение клетки, обусловленное излучением порфириновых молекул в красной области спектра.

Спектральные характеристики проб изучали на спектрофлюорометре «Н^асЫ MPF-4». Измерения проводили в термостатируемых кварцевых кюветах (1 x 1 см). Интенсивность флюоресценции регистрировали при длине волны 625, 630, 635 нм (длина волны возбуждения 405 нм) и выражали в относительных единицах. Большинство измерений проводили при ширине щели возбуждения 10 нм и ширине щели регистрации флюоресценции 3 нм, а спектры возбуждении флюоресценции — при 3 и

3 нм, соответственно.

Для уменьшения побочных эффектов светорассеяния между возбуждающим светом и кюветой ставили светофильтры СС-8 или ФС-4, хорошо пропускающие свет синего участка спектра. С этой же целью в канале регистрации устанавливали фильтр, пропускающий свет длин волн больше 430 нм. В работе проводилась дополнительная работа по калибровке, привязке и корректировке длин волн монохроматора возбуждения и монохроматора регистрации. В видимом диапазоне спектра для этого использовался спектр излучения ксеноновой лампы, а в красной области — спектр излучения неоновой лампы и линия излучения Не-№ лазера с X = 632,8 нм. Поэтому точность привязки длин монохроматоров была не хуже, чем 0,3 нм. Все используемые в работе реактивы были проверены на содержание неконтролируемых флюоресцирующих добавок в изучаемом нами диапазоне спектра.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При оценке влияния различных доз 5-АЛК на интенсивность флюоресценции протопорфирина IX в суспензии клеток и выживаемость клеток миело-лейкоза К-562 установлено, что добавление 5-АЛК в среду культивирования в дозах от 0,4 до 15 мМ приводит к дозозависимому снижению интенсивности флюоресценции ПП IX и увеличению числа погибших клеток. В экспериментах с краткосрочной инкубацией клеток было показано, что 5-АЛК в концентрации до 5 мМ не оказывает существенного цитотоксического действия, при этом интенсивность флюоресценции ПП IX возрастает, достигая максимума при 5 мМ и продолжительности инкубации

4 часа.

В области высоких концентраций (выше 10 мМ) происходит снижение интенсивности флюоресценции ПП IX и увеличение числа погибших клеток до 20 %. При увеличении срока инкубации до 24 часов

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

максимальная интенсивность флюоресценции ПП IX в суспензии клеток наблюдается при концентрации 5-АЛК 2,5 мМ, а при максимальной дозе 5-АЛК (15 мМ) интенсивность флюоресценции снижается в 3,5 раза. Начиная с дозы 8 мМ, проявляется эффект темновой фототоксичности 5-АЛК — гибель 43 % клеток, достигающая 86 % при максимальной дозе 5-АЛК (15 мМ). Этот факт можно объяснить тем, что с увеличением содержания 5-АЛК в среде роста происходит уменьшение рН, приводящее к нарушению процессов нормального функционирования клеток и кислотному разрушению плазматических мембран клеток.

Таким образом, диапазон доз 5-АЛК до 5 мМ и время инкубации 4 часа являются нетоксичными и оптимальными для эффективной флюоресценции, в связи с чем культивирование клеток с 5-АЛК в дальнейшем проводили, придерживаясь именно этих параметров.

Сравнительные исследования in vitro по изучению накопления ПП IX клетками костного мозга, нормальными лимфоцитами, лимфоцитами, активированными митогеном ФГА, и клетками миелолей-коза К-562, показали исключительно высокую степень избирательности накопления данного вещества в опухолевых клетках, по сравнению с нормальными клетками.

При измерении спектров флюоресценции образцов микрокультур, указанных выше, обнаружено, что полоса флюоресценции в красной области спектра с максимумом интенсивности вблизи длин волн 630 нм и слабой широкой полосой в области 690 нм наблюдается только в суспензии клеток миелолейко-за К-562. Полоса флюоресценции в длинноволновой области с максимумом на X = 675 нм характерна для димерных форм молекул ПП IX и регистрируется при относительно высоких концентрациях этих молекул как в супернатанте, так и в клетках. Для того, чтобы выделить вклад различных молекулярных компонент, было проведено сравнительное изучение спектральных характеристик суспензии опухолевых клеток в среде инкубации, супернатанта и клеток, отмытых от среды инкубации.

Суммарный спектр суспензии опухолевых клеток в среде инкубации состоит из полос флюоресценции с максимумами интенсивности на длине волны 625 нм, совпадающим со спектром супернатанта, и на длине волны 635 нм, совпадающим со спектром излучения отмытых клеток. Первый максимум флюоресценции характерен для молекул протопорфири-на IX в водном растворе, а второй — для этих же молекул, находящихся в клетках [10].

Следует заметить, что незначительный вклад флюоресценции в данной области спектра на длинах волн 618-623 нм могут вносить гидрофильные молекулы уропорфирина и копропорфирина. Эти молекулы являются предшествующими ПП IX метаболитами в синтезе гема, и поэтому их спектры флюоресценции наблюдались нами лишь в первые часы (1-3 часа) инкубирования клеток в присутствии 5-АЛК. Спектр возбуждения флюоресценции сус-

пензии опухолевых клеток в среде инкубации имеет основной максимум при 400-410 нм и четыре менее интенсивных пика в области 500-620 нм, что характерно для соединений порфириновой природы [11].

Таким образом, полученные данные показывают, что в нашем случае, при анализе спектрофлю-орометрических характеристик исследуемых растворов, необходимо выделять два компонента с максимумами интенсивности полос на X1 = 625 нм и X2 = 635 нм.

Микроскопическое изучение опухолевых клеток линии К-562 после культивирования в присутствии

5 мМ 5-АЛК показало, что увеличение интенсивности флюоресценции зависит от времени инкубации и от фазы клеточного роста. Из анализа видеозаписей следует, что спустя 2-4 часа после начала инкубации флюоресцируют не более 30-40 % всех клеток. При этом максимальной интенсивностью флюоресценции обладают клетки больших размеров с высоким ядерно-цитоплазматическим отношением, то есть клетки, находящиеся в стадии пролиферативной активности.

После суточной инкубации флюоресцируют не менее 95 % клеток, наблюдаемых в поле зрения микроскопа. Это объясняется увеличением скорости синтеза и накопления молекул ПП IX в активно пролиферирующих клетках, а также захватом молекул ПП IX из супернатанта плазматической мембраной покоящихся клеток. При этом отмечаются значительные колебания в яркости флюоресценции наблюдаемых клеток. Время затухания свечения клеток составляло 5 секунд, и зависело от интенсивности возбуждающего излучения.

ВЫВОДЫ:

1. Сравнительные исследования in vitro по изучению накопления 5-АЛК клетками костного мозга, нормальными лимфоцитами, лимфоцитами, активированными митогеном ФГА, и клетками мие-лолейкоза К-562 показали исключительно высокую степень избирательности накопления данного вещества в опухолевых клетках, по сравнению с нормальными клетками.

2. Определены параметры оптимальной флюоресценции опухолевых клеток: диапазон нетоксичных доз 5-АЛК — до 5 мМ, оптимальное время инкубации — 4 часа.

3. Суммарный спектр суспензии опухолевых клеток в среде инкубации состоит из полос флюоресценции с максимумами интенсивности на длине волны 625 нм, совпадающим со спектром супернатанта, и на длине волны 635 нм, совпадающим со спектром излучения отмытых клеток. Первый максимум флюоресценции характерен для молекул протопорфирина IX в водном растворе, а второй — для этих же молекул, находящихся в клетках.

4. Полоса флюоресценции в длинноволновой области с максимумом на X = 675 нм обусловлена из-

лучением димерных форм молекул ПП IX и должна приниматься во внимание в процедурах диагностики участков неопластически измененных тканей.

5. Микроскопические исследования показали, что максимальной интенсивностью флюоресценции обладают клетки, находящиеся в стадии пролиферативной активности.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Okamura, K. Randomized study of single early instillation of tetrahydrop-yranyl-doxorubicin for a single superficial bladder carcinoma /K. Okamura, Y. Ono, T. Kinukawa //Cancer. - 2002. - Vol. 94. - P. 2363-2368.

2. T1 GIII bladder cancer. Management with transurethral resection only /E. Zungri, L. Martinez, E.A. Da Silva et al. //Eur. Urol. - 1999. -Vol. 36. - № 5. - P. 380-384.

3. Treatment of superficial bladder tumors: achievements and needs /K.H. Kurth, C. Bouffioux, R. Sylvester et al. //Eur. Urol. - 2000. -Vol. 37, N 1. - P. 1-9.

4. Hexyl aminolevulinate fluorescence cystoscopy: new diagnostic tool for photodiagnosis of superficial bladder cancer - a multicenter study /P. Jichlinski, L. Guillou, S.J. Karlsen, P.U. Malmstrom //J. Urol. -2003. - Vol. 170, N 1. - P. 226-229.

5. Cell-type Specific Protoporphyrin IX Metabolism in Human Bladder Cancer in vitro /R. Krieg, S. Fickweiler, O. Wolfbeis, R. Knuechel //Photochem. and Photobiol. - 2000. - Vol. 72, N 2. - P. 226-233.

6. Селиванов, С.П. Диагностика и лечение поверхностного рака мочевого пузыря /С.П. Селиванов: Автореф. дис. ... докт. мед. наук. -Томск, 2001. - 38 с.

7. 5-aminolevulinic acid-induced fluorescence endoscopy applied at secondary transurethral resection after conventional resection of primary superficial bladder tumors /T. Filbeck, W. Roessler, R. Knuechel et al. //Urology. - 1999. - Vol. 53, N 1. - P. 77-81.

8. Reduced specificity of 5-ALA induced fluorescence in photodynamic diagnosis of transitional cell carcinoma after previous intravesical therapy /M.C. Grimbergen, C.F. van Swol, T.G. Jonges et al. //Eur. Urol. -2003. - Vol. 44, N 1. - P. 51-56.

9. Brunner, H. New 5-aminolevulinic acid esters-efficient protoporphyrin precursors for photodetection and photodynamic therapy /H. Brunner, F. Hausmann, R. Knuechel //Photochem. and Photobiol. - 2003. -Vol. 78, N 5. - P. 481-486.

10. Cellular fluorescence of the endogeneous photosensitizer protoporphyrin IX following exposure to 5-aminolevulinic acid /P. Stein-bach, H. Weingandt, R. Baumgartner et al. //Photochem. and Pho-tobiol. - 1995. - Vol. 62. - P. 887-895.

11. Векшин, Н.Л. Фотоника биологических структур /Н.Л. Векшин. -Пущино, 1988. - 164 с.

М-Я МЕЖДУНАРОДНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ "НОВЫЕ МЕДИЦИНСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ В ОХРАНЕ ЗДОРОВЬЯ, ДИАГНОСТИКЕ, ЛЕЧЕНИИ И РЕАБИЛИТАЦИИ БОЛЬНЫХ".

Пенза, 24-25 марта 2006 г.

Прием заявок и тезисов до 1 марта 2006 г.

V-Я ВСЕРОССИЙСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ "ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ РОССИЙСКОЙ ЭКОНОМИКИ".

Пенза, март 2006 г.

Прием заявок и тезисов до 25 февраля 2006 г.

XV-Й ВСЕМИРНЫЙ КОНГРЕСС МЕЖДУНАРОДНОГО КАРДИОЛОГИЧЕСКОГО ДОПЛЕРОВСКОГО ОБЩЕСТВА И ВСЕРОССИЙСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ ПО СЕРДЕЧНОЙ РЕСИНХРОНИЗИРУЮЩЕЙ ТЕРАПИИ.

Тюмень, 24-26 мая 2006 г.

Прием заявок и тезисов до 15 февраля 2006 г.

МЕЖДУНАРОДНАЯ НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ "СТРАТЕГИЧЕСКОЕ УПРАВЛЕНИЕ ОРГАНИЗАЦИЕЙ: ТЕОРИЯ, МЕТОДЫ, ПРАКТИКА".

С-Петербург, 1-3 марта 2006 г.

Прием заявок и тезисов до 24 января 2006 г.