Особенности семенного и клонального микроразмножения liriodendrontulipifera L

Features of seed and clonal micropropagation of Liriodendron tulipifera L

1 2 Safarova N. , Kholova Sh.

Особенности семенного и клонального микроразмножения

Liriodendron tulipifera L 12 Сафарова Н. К. , Холова Ш. А.

1Сафарова Нигора Каримджановна /Safarova Nigora - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, лаборатория интродукции древесных и травянистых растений, Ташкентский ботанический сад Институт генофонда растительного и животного мира Академия наук Республики Узбекистан;

2Холова Шохиста Абдувазитовна / Kholova Shokhista - ассистент, кафедра декоративного садоводства и озеленения, Ташкентский государственный аграрный университет, г. Ташкент, Республика Узбекистан

Аннотация: в статье приведены результаты исследований по биологии семенного и клонального микроразмножения тюльпанного дерева. Рассмотрены причины низкой всхожести семян и особенности введения в культуру Liriodendron tulipifera. Abstract: the article presents the results of studies on the biology of seed and clonal micropropagation of Tulip tree. The causes of low seed germination and features introduction to the culture of Liriodendron tulipifera were considered.

Ключевые слова: семена, выполненность, всхожесть, клональное микроразмножение, каллус, дифференциация, Liriodendron tulipifera.

Keywords: seeds, implementations, germination, clonal micropropagation, callus, differentiation, Liriodendron tulipifera.

Liriodendron tulipifera L. - крупное, листопадное и быстрорастущее дерево из семейства Magnoliaceae J. ST. Hill. В Ташкентском ботаническом саду Liriodendron tulipifera L. в возрасте 55 лет достигло в высоту 30 метров при диаметре 28-52 см.

Листья простые, с сердцевидным основанием, 4-6 лопастные, черешковые длиной 12-15 см. Они имеют голубовато-зеленую оттенку, окрашиваются осенью в золотистый цвет.

Цветки обоеполые, крупные, по форме напоминают тюльпан. Околоцветник из 9 долей, расположенных в три круга.

Лепестки прямостоячие, зеленовато-жёлтые с оранжевой полосой по нижней части лепестка. Тычинок до 30-40 шт. и более, плодолистики и пестики многочисленные.

Плод - сборный многосемянной орешек (Федоров, Артюшенко, 1986). Орешки (крылатки) 3,4 см длины и 0,4 см в диаметре. В каждом орешке находятся до 60-70 крылаток, семена находятся в конце крылатки. Вес 1000 шт. крылаток варьирует от 44,6 до 59,7 г. (в воздушно-сухом состоянии). Вес 1000 шт. очищенных от крылаток семян составляет 5,9-6,2 г.

Всхожесть семян тюльпанного дерева очень низкая (2-5%). Малая всхожесть семян обусловлена невыполненностью семян. Выполненность семян в зависимости от погодных условий года может варьировать в пределах 5-10 % [7, 9].

Считается, что семена тюльпанного дерева сохраняют всхожесть в течение одного года. Посев свежесобранных семян производят осенью или весной после стратификации во влажном песке [6].

Тюльпанное дерево благодаря высокой декоративности и устойчивости к условиям резко континентального климата нашей республики является перспективным растением для озеленения населенных пунктов.

В этой связи целью данной работы явилось изучение особенности семенного и клонального микроразмножения Liriodendron tulipifera L.

Материалы и методы исследования.

Семена тюльпанного дерева собирались из маточных деревьев, произрастающих в Ташкентском Ботаническом саду и на площади Мустакиллик г. Ташкента. Всхожесть семян определяли в лабораторных и полевых условиях по общепринятым методам [1].

Стратифицированные и контрольные семена проращивали в эмалированных кюветах по 100 шт. в каждом варианте при температуре +250С в термостате ЕД53 (±0,30С).

Семена стратифицировались в течение 4-5 месяцев в песчаном субстрате. Наклюнувшиеся крылатки (с семенами) посеяли в грунт в начале весны. Другую часть семян посеяли осенью без какой-либо обработки на хорошо подготовленную почву. Делянки сверху осыпали мелкой опилкой и временами увлажняли.

Результаты и их обсуждение.

Высокие декоративные качества и достаточная устойчивость тюльпанного дерева в условиях резко континентального климата способствуют широкому внедрению его в целях озеленения населенных пунктов. Для этого необходимо разрабатывать методы его ускоренного размножения.

Известно, что семена тюльпанного дерева созревают в конце сентября и осыпаются с деревьев в течение всей осени и зимы. Они сохраняют свою всхожесть один год. Всхожесть семян тюльпанного дерева очень низкая (2-5%). Низкая всхожесть их семян объясняется невыполненностью семян в верхней и нижней частях орешка. Показано, что только у 7 -10% семян присутствуют зародыши: выполненность семян составила 2,3-3,6%.

Для выяснения низкой всхожести семян тюльпанного дерева нами проведены эксперименты. В первой декаде октября собрано 2,1 кг семян с дерева. Из них один кг семян высеян в тщательно подготовленную почву.

0,5 кг семян стратифицированы в течение 3 месяцев в песчаном субстрате при регулярном увлажнении. Затем посеяны весной. Единичные всходы появились в середине мая. При этом общая всхожесть семян тюльпанного дерева была близкой и составила 3,8-3,9%. Часть семян тюльпанного дерева обрабатывали перед посевом ультрафиолетовыми лучами (5-20 минут), замачивали в течение 12 часов в растворах стимулятора роста «Навруз» и оксигумата.

В результате опытов заметной стимуляции прорастания семян не выявлено, хотя такая обработка способствует образованию корней у зеленых черенков в условиях туманообразующей установки.

В другой серии опытов нами изучена возможность микроклонального размножения тюльпанного дерева.

Успехи, достигнутые в области культивирования клеток и тканей растений in vitro, привели к разработке методов клонального микроразмножения, позволяющих быстро и в массовых количествах получать формы, идентичные исходному генотипу. Эти методы находят все большее применение для крупномасштабного размножения перспективных сортов культурных растений. Вместе с тем методы клонирования in vitro стали также широко использоваться для размножения редких и исчезающих видов растений, произрастающих в естественных фитоценозах (Бутенко Р. Г., 1999). В основе метода клонального микроразмножения лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность [4].

Главнейшим условием микроклонального размножения является использование для культивирования in vitro тканей, сохраняющих генетическую стабильность. Этому требованию наиболее полно удовлетворяют меристематические ткани, апексы и почки стеблевого происхождения [2]. С биологической точки зрения клональное микроразмножение - очень сложный процесс, на который влияют разнообразные факторы: свойства самого растения, состав питательной среды, освещение, температура и др. Очевидно, что для каждого вида растений должна быть подобрана своя индивидуальная методика.

В экспериментальной работе с семенами многих редких видов часто возникает такая проблема, как покой семян и его преодоление. Культура in vitro позволяет значительно сократить срок выведения семян из покоя [5].

На первом этапе клонального микроразмножения необходимо ввести растительный материал в стерильную культуру, что предусматривает как выбор экспланта, так и подбор эффективных условий стерилизации. В наших экспериментах при введении в культуру in vitro Liriodendron tulipifera в качестве эксплантов для получения стерильных растений служили листо-почковые черенки.

Для удаления поверхностных загрязнений перед стерилизацией экспланты предварительно промывали в мыльной воде в течение 20-25 минут. Затем, отмыв их в проточной воде, отрезанные концы закрывали парафином во избежание попадания в проводящие сосуды стерилизирующего вещества, которое может вызвать повреждение ткани [4]. Листо-почковые черенки были погружены в растворы тимеросала (0,06%) и нитрата серебра (0,08%) по 40 минут.

Далее в условиях ламинарного бокса растворы тимеросаля и нитрата серебра слили, эксплант погрузили в этанол (70%) на 1 -2 минуты, после чего их отмыли стерилизованной водой два раза. После этого эксплант поместили в раствор цефозалина (10%) в течение одного часа (также были проведены опыты без погружения экспланта в раствор цефозалина). Затем их несколько раз промывали стерилизованной водой. Те части, которые были обмакнуты в парафин, были срезаны. После стерилизации экспланты помещали на агаризованную (0,6%), безгормональную питательную среду, приготовленную по прописи Т. Мурасиге и Ф. Скуга (MS) [10]. Культуру содержали при температуре воздуха 23±20С, относительной влажности 80-85%, на свету белых люминесцентных ламп при 16-часовом фотопериоде.

Надо отметить, что при таком способе стерилизации ростки появились через 4-5 дней, а при стерилизации без участия цефозалина ростки появились через 14-16 дней. Тронувшиеся в рост экспланты пересаживали на питательные среды MS содержащие фитогормоны ИУК/БАП 0,25 и БАП в концентрации 1 мг/л. Темпы роста эксплантов в гормональных средах всегда были интенсивнее по сравнению со средами без фитогормонов.

На основании проведенных экспериментов по стерилизации было установлено, что наиболее оптимальна много ступенчатая стерилизация, т.е. для почек Liriodendron tulipifera L. лучшим вариантом является последовательное выдерживание в 0,08% растворе нитрата серебра (40 минут), в 70% этаноле (2 мин) и в 10% растворе цефозалина (1 час). При данной схеме удается достичь максимального числа жизнеспособных эксплантов.

В другой серии опытов в качестве экспланта использовали семена тюльпанного дерева, стратифицированные в морозильнике (0-40С) в течение одной недели. Как отмечено выше, на начальном этапе клонального микроразмножения очень важно подобрать оптимальные условия для стерилизации эксплантов.

Семена L.tulipifera погружали в 0,08% раствор AgNO3 в течение 25 минут. Далее в условиях ламинарного бокса раствор нитрата серебра слили, промыли стерилизованной водой, затем семена погрузили в этанол (70%) на 1 -2 минуты, после чего их отмыли стерилизованной водой ещё четыре раза. После стерилизации семена были посеяны на агаризованную (0,6%) безгормональную питательную среду, приготовленную по прописи Т. Мурасиге и Ф. Скуга [10].

Первый росток Liriodendron tulipifera появился спустя 32 дня после посева, длина основного корня составила 1 см, после пересадки на гормональную среду (ИУК/Кин в концентрации 2/0,02 мг на литр) удлинился на 2,6 см.

Для дальнейшего роста использовали MS с добавлением фитогормонов (ИУК/БАП 0,2 мг/2,0 мг). Затем ростки были пересажены в базовую среду MS с добавлением фитогормонов (0,5 мг/0,05 мг). Для формирования листьев концентрация ИУК была уменьшена (0,1 мг/л), БАП-увеличина (1,0 мг/л).

В результате проведенных исследований выявлено следующее:

1. При стерилизации эксплантов Liriodendron tulipifera раствором цефозалина (погружением в раствор в течение 1 часа) и последующем посеве на питательную среду без фитогормонов ростки появились на 4-5 сутки.

2. При стерилизации эксплантов обычном способом без погружения в раствор цефозалина и посеве на безгормональную среду ростки появились спустя 14-16 дней.

3. Темпы роста эксплантов Liriodendron tulipifera в гормональных средах (ИУК/БАП 0,25) всегда были интенсивнее по сравнению со средами без фитогормонов.

Таким образом, наиболее перспективным способом для размножения Liriodendron tulipifera является использование микроклонального размножения в культуре in vitro. Разработка этого метода для тюльпанного дерева до сих пор не проводилась, поскольку микроклональное размножение остается еще сравнительно сложным и дорогостоящим методом. В этой связи исследования по оптимизации этапов этого процесса являются определенным вкладом в разработку технологии размножения тюльпанного дерева.

Литература

1. ГОСТ 13056.6-97 Семена деревьев и кустарников. Метод определения всхожести. Межгосударственный Совет по стандартизации, метрологии и сертификации. Минск.

2. Бугара А. М., Бугара И. А. Использование методов биотехнологии для размножения растений и сохранения генофонда / Тематический сборник научных работ «Экосистемы Крыма, их оптимизация и охрана», 2003. С. 14-20.

3. Бутенко Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. 159 с.

4. Калинин Ф. Л., Сарнацкая В. В., Полищук В. Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев: Наукова думка, 1980. 488 с.

5. Маркова Е. М., Конькова Л. И. Развитие особей двух видов рода Iris L. в культуре in vitro. Вестник Удмуртского Университета, 2010. Вып. 4. С. 69-73.

6. Методические указания по семеноведению интродуцентов М.: Наука, 1980.

7. Мурзова Р. М. Культура и семяноношение тюльпанного дерева (Liriodendron tulipifera L.) в дендрарии Ботанического сада АН УзССР // Интродукция и акклиматизация растений. Ташкент: Фан, 1974. С. 37-43.

8. Федоров Ал. А., Артюшенко З. Т. Атлас по описательной морфологии высших растений. Плод. Л.: Наука, 1986. 392 с.

9. Штонда Н. И., Холмурзаева Д. Ж. Лириодендрон тюльпанный или тюльпанное дерево -перспективная порода для озеленения // Интродукция растений: проблемы и перспективы: Материалы IV Республиканской научно-практической конференции. Ташкент, 2009. С. 57-58.

10.Murashige T., Scoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol.Plant., 1962. Vol. 15. № 13. P. 473-497.