1C
ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ НАБОР ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗОВ КРОВИ НА СОДЕРЖАНИЕ ГЛИКОЗИЛИРОВАННОГО ГЕМОГЛОБИНА HbA

Настоящая полезная модель относится к диагностическому оборудованию, в частности, к наборам для определения гликозилированного гемоглобина в венозной и капиллярной крови человека и может быть использована в клинико-диагностических и биохимических лабораториях и в научно-исследовательской практике, в частности, для диагностики сахарного диабета.
Одним из достоверных методов определения гликозилированного гемоглобина в крови является метод хроматографии, основанный на использовании колонок, заполненных сорбентом с привитой аминофенилборной кислотой.
Например, в RU 2093525, 1997 г. описан сшитый поливиниловый спирт с иммобилизованной м-аминофенилбороновой кислотой. В RU 2231059, 2004 г. описан пористый силикагель, модифицированный глицерилпро-пилсиланом, активированный эпихлоргидрином и содержащий иммобилизованную м-аминофенилбороновую кислоту.
В RU 2234703, 2004 для определения гликогемоглобина в качестве сорбента используют привитую на агарозе 4-аминометилфенилборную кислоту
Однако в описанных выше источниках информации не описан комплекс средств, необходимых для проведения анализа. Известен аналитический тестовый набор для определения гликозилированного гемоглобина в крови дигидроксиборильным реагентом,
состоящий из реагента, включающего сигналобразующую молекулу, содержащую коньюгат одного или более дигидроксиборильных остатков или их солей, связанный с сигналобразующей молекулой, и средства для отделения гемоглобина от образца необязательно в комбинации с буферными солями или растворами, предпочтительно, указанный реагент и/или средство для отделения гемоглобина введены или нанесены на твердую фазу хроматографической или фильтрующей среды. (RU 2111494, 1998).
Наиболее близким к предложенному набору является диагностический комплект для 100 определений гликогемоглобина в крови, содержащий коробку с размещенными в ней набором из пяти микроколонок с аффинным сорбентом с привитой 4-аминометилфенилбороновой кислотой, набором флаконов с растворами для хроматографии и флаконами, соответственно с контрольным образцом гликогемоглобина, антикоагулянтом и гемолитиком, при этом набор флаконов с растворами для хроматографии включает два флакона для выделения негликированной фракции, содержащих аммоний ацетатный буфер одномолярный с рН 8,2±0,2 и один флакон для выделения гликированной фракции, содержащий раствор уксусной кислоты 0,1-молярный с рН 2,9±0,1 (RU 28965 U1, 27.04.2003).
Недостатком набора является то, что в состав входит только один флакон с контрольным образцом, что является недостаточным для осуществления контроля при количестве 100 анализов. Отсутствие регенерирующего и консервирующего растворов в составе набора отрицательно сказывается на достоверности результатов полученных измерений и сохранности сорбента при его длительном хранении.
Задачей настоящей полезной модели является разработка набора, позволяющего просто и достоверно определять содержание гликозилированного гемоглобина в крови.
1C
Поставленная задача решается описываемым диагностическим набором для проведения до 100 анализов крови на содержание гликозилированного гемоглобина НвА содержащим коробку с размещенными в ней пятью микроколонками, заполненными аффинным сорбентом с привитой аминофенилборной кислотой, 2 флакона объемом по 1,0 мл, содержащие контрольные образцы лиофилизированного гликозилированного гемоглобина, 1 флакон объемом 12 мл, заполненный раствором антикоагулянта для забора крови, 1 флакон объемом 25 мл, заполненный раствором гемолитика для гемолиза эритроцитов, флаконы, заполненные рабочими растворами, в частности, 4 флакона объемом 50 мл с раствором, содержащим аммоний уксуснокислый - 2,5 М, магний хлорид - 0,5 М, натрий азид - 80 мМ, 4 флакона, заполненные раствором гидроксида натрия - 1 М, 1 флакон объемом 50 мл с раствором 10%-ой уксусной кислоты, 1 флакон объемом 50 мл, содержащий натрий азид -0,8 М, 1 флакон, содержащий 18 г сорбитола.
Предпочтительно, антикоагулянт для забора крови содержит динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, 0,1 М; натрий хлорид, 0,9% (раствор 1).
Предпочтительно, гемолитик для гемолиза эритроцитов содержит Тритон Х-100, 0,1%; натрий азид, 8 мМ (раствор 2).
Набор содержит микроколонки емкостью 0,85 мл, заполненные аффинным сорбентом на полимерной основе с привитой аминофенилборной кислотой.
На фиг.1 представлена схема заявленного диагностического набора. Набор состоит из коробки - 1, пять микроколонок - 2, флакон с
антикоагулянтом - 3, флакон с гемолитиком - 4, 4 флакона с гидроксидом натрия - 5, 4 флакона с раствором аммония уксуснокислого, хлорида магния и азида натрия - 6, флакон с раствором уксусной кислоты - 7, флакон с раствором азида натрия - 8, флакон с сорбитолом - 9.
Принцип действия набора основан на аффинной хроматографии гликозилированной и негликозилированной фракций гемоглобина в гемолизате крови. Используемый в микроколонках набора сорбент с привитой 3-аминофенилборной кислотой обеспечивает на первой стадии специфическое связывание гликозилированного гемоглобина и его отделение от негликозилированной фракции за счет его вытеснения с сорбента сорбитолом.
Измерение оптических плотностей обеих фракций при длине волны 414 нм позволяет рассчитать относительное содержание гликозилированного гемоглобина в анализируемой пробе по известным расчетным формулам. После обработки регенерирующим раствором микроколонка может быть использована повторно.
Пример.
Набор для определения гликозилированного гемоглобина, рассчитанный на 100 определений, содержит картонную коробку с размещенными в ней 5 микроколонками с сорбентом на основе привитой аминофенилборной кислоты, 2 флакона с контрольными образцами гликозилированного гемоглобина и 13 флаконов со следующими растворами:
1. Раствор 1, 12 мл - 1 флакон
(антикоагулянт для забора крови)
2. Раствор 2, 25 мл - 1 флакон
(гемолитик для гемолиза эритроцитов)
3. Раствор 3, 50 мл - 4 флакона
(для рабочих буферных растворов 1 и 2)
4. Раствор 4, 15 мл - 4 флакона
(для рабочих буферных растворов 1 и 2)
5. Раствор 5, 50 мл - 1 флакон
(10% уксусная кислота для регенерирующего раствора)
6. Раствор 6, 50 мл - 1 флакон
(азид натрия для консервирующего раствора)
7. Сорбитол, 18 г - 1 флакон
(для рабочего буферного раствора 2)
Набор используют следующим образом.
Раствор 1. Антикоагулянт для получения эритроцитарной массы.
Использовать без разведения.
Хранится при комнатной температуре в течение 1 года.
Раствор 2. Гемолитик для разрушения мембран эритроцитов.
Использовать без разведения.
Хранится при комнатной температуре в течение 1 года.
Рабочий буферный раствор 1. Для уравновешивания микроколонок и
элюции негликозилированного гемоглобина (ацетат аммония, 0,25 М; хлорид магния, 50 мМ; азид натрия, 8 мМ, рН 8,1±0,1).
Содержимое флакона с раствором 3 количественно перенести в мерную колбу вместимостью 500 мл. В эту же колбу внести 300-400 мл дистиллированной или деионизованной воды. К содержимому колбы постепенно добавить при постоянном помешивании содержимое одногофлакона с раствором 4, довести объем дистиллированной водой до метки и тщательно перемешать.
Хранится при комнатной температуре в течение 1 года.
Рабочий буферный раствор 2. Для элюции гликозилированного гемоглобина (ацетат аммония, 0,25 М; хлорид магния, 50 мМ; сорбитол, натрий гидроксид 0,2 М; азид натрия, 8 мМ, рН 8,1±0,1).
Содержимое одного флакона с раствором 3 количественно перенести в мерную колбу вместимостью 5000 мл. В эту же колбу добавить 300-400 мл дистиллированной или деионизованной воды. К содержимому колбы постепенно добавить при постоянном помешивании содержимое одного флакона с раствором 4. В эту же колбу внести содержимое флакона ссорбитолом, тщательно перемешать до полного растворения осадка и довести объем дистиллированной водой до метки, после чего вновь тщательно перемешать.
Хранится при комнатной температуре в течение 1 года.
Регенерирующий раствор. Для удаления сорбитола и белков с сорбента (уксусная кислота 0,5%).
Содержимое флакона с раствором 5 количественно перенести в мерную колбу вместимостью 1000 мл. В эту же колбу добавить 500-700 мл дистиллированной или деионизованной воды, перемешать, довести объем дистиллированной водой до метки, после чего вновь тщательно перемешать.
Хранится при комнатной температуре в течение 1 года.
Консервирующий раствор. Для консервации сорбента (азид натрия 0,8мМ).
Содержимое флакона с раствором 6 количественно перенести в мерную колбу на 500 мл, в эту же колбу добавить 300-400 мл дистиллированной или деионизованной воды, перемешать, довести объем дистиллированной водой до метки, после чего вновь тщательно перемешать.
Хранится при комнатной температуре в течение 1 года.
Контрольный раствор гликозилированного гемоглобина. Во флакон с контрольным образцом гликозилированного гемоглобина внести 1,0 мл дистиллированной или деионизованной воды и тщательно перемешать в течение 10-15 минут, избегая вспенивания.
Затем добавить 1,0 мл раствора 2 и перемешать. Хранится при температуре 4-8°С в течение 1 недели.
Микроколонки. Новые и используемые микроколонки с сорбентом, заполненные консервирующим раствором, хранить в холодильнике при 4-8°С.
Приготовление образцов крови для анализа.
Для анализа используют капиллярную или венозную кровь.
В пластиковую пробирку вместимостью 1,5-2,0 мл внести 0,05 мл раствора 1 (или 1 каплю) и около 0,5 мл крови. Перемешать, отобрать 0,02 мл крови, перенести в пробирку, содержащую 0,2 мл раствора 2 и перемешать в течение 1-2 минут.
Образцы крови с антикоагулянтом и гемолизаты могут храниться при температуре 4-8°С в течение одной недели.
Проведение анализа с использованием заявленного набора.
1. Подготовительные операции.
В емкость с водопроводной водой объемом 2-5 л, нагретой до 25°С, поместить в эту емкость колбу с рабочим буферным раствором 1 и выдержать в течение 15 мин. при периодическом помешивании. Промаркировать по 2 мерные стеклянные пробирки для каждого анализируемого образца (А и Б). Установить пробирки А в штатив в ряд 1, соответствующие пробирки Б - в соседние гнезда ряда 2. Достать микроколонки из холодильника, снять в первую очередь верхнюю крышку, затем нижний колпачок и слить консервирующий раствор.
Внести в микроколонки по 5 мл регенерирующего раствора и дать жидкости стечь. Затем прилить по 5 мл рабочего буферного раствора 1 и дать жидкости стечь (данная операция выполняется однократно перед началом работы с колонками). Вставить микроколонки в пробирки А и выдержать в течение 15-20 минут при комнатной температуре. 2. Проведение анализа образцов крови. В микроколонки нанести на верхний фильтр по 0,1 мл исследуемых гемолизатов, выдержать 1-2 мин, затем в микроколонки внести по 0,1 мл рабочего буферного раствора 1 и выдержать 3-5 мин. Затем внести в микроколонки по 10,0 мл рабочего буферного раствора 1 и дать жидкости стечь.
Внимание! Необходимо строго выдерживать температурный режим элюции рабочим буферным раствором 1.
Микроколонки параллельно переместить на штативе с пробирками таким образом, чтобы микроколонки находились в пробирках Б. В микроколонки внести по 5,0 мл рабочего буферного раствора 2 и дать жидкости стечь.
Вынуть микроколонки из пробирок.
Пробирки А последовательно извлечь из штатива и перемешать (фракция А).
Пробирки Б последовательно извлечь из штатива и перемешать (фракция Б).
Растворы из пробирок А и Б поместить в кювету спектрофотометра и измерить оптическую плотность при длине волны 414 нм, используя в качестве образца сравнения дистиллированную воду.
Содержание гликозилированного гемоглобина в процентах рассчитать по известной формуле.
Регенерация микроколонок.
В микроколонки внести по 4,5мл регенерирующего раствора и дать жидкости стечь. Затем в микроколонки внести по 4,5 мл рабочего буферного раствора 1 и дать жидкости стечь.
Микроколонки готовы для проведения следующего анализа крови.
Заявленный набор предназначен для применения только in vitro.
Набор может быть использован для ранней диагностики сахарного диабета, особенно при массовых обследованиях населения на скрытые формы диабета, а также для оценки степени компенсации данного заболевания за последние три месяца для улучшения контроля за эффективностью лечения сахарного диабета.
Набор рассчитан на проведение анализа 100 неизвестных образцов.
Набор обеспечивает хорошую воспроизводимость результатов:
1C
Коэффициент вариации определения содержания НвА в цельной крови человека, полученных с помощью набора, не превышает 7%.