Сосудистые факторы регуляции и их влияние на реологические свойства крови

УДК 612.014.1

А.О. Ослякова, И.А. Тихомирова

Сосудистые факторы регуляции и их влияние на реологические свойства крови

Работа выполнена в рамках реализации Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы. Поддержана грантом РФФИ, № 09-04-00436-а.

В настоящем исследовании проанализировано влияние вазодилататоров эндотелиальной природы на реологические свойства крови, показаны изменения клеточных характеристик эритроцитов под действием оксида азота и простациклина

Ключевые слова: оксид азота, простациклин, гемореология, эритроциты, микрососуды, регуляция.

А.О. Osljakova, I.A. Tikhomirova

Vascular Factors of Regulation and Its Influence on Rheological Blood Properties

The influence of endothelium-derived vasodilators on the rheological blood properties was analy sed in this study. The changes of cellular parameters of erythrocytes were revealed after nitric oxide and prostacyclin treatment.

Key words: nitric oxide, prostacyclin, hemorheology, erythrocytes, microvessels, change mechanisms.

Введение

Жизнедеятельность организма связана с постоянным изменением потребностей тканей и органов в кислороде и питательных веществах. В снабжении тканей кислородом в соответствии с их локальными метаболическими потребностями важную роль играет регуляция тонуса кровеносных сосудов. Вазодилатация, обусловленная функционированием микроваскулярного эндотелия (выбросом вазодилататоров оксида азота и простагландина Pg I2), в достаточной степени изучена [1].

Интерес к молекуле оксида азота NO как составной части «эндотелиального фактора расслабления сосудов» (endothelium-derived relaxing factor, EDRF) первоначально был вызван его способностью регулировать тонус сосудов. Однако очень скоро список биологических функций NO значительно расширился. Оксид азота оказался связан с передачей сигналов нейронами, иммунными реакциями, репродуктивными и другими функциями. Также оксид азота и простациклин (Pg I2), высвобождающиеся из эндотелия, препятствуют агрегации и адгезии тромбоцитов [2].

В последнее время появились публикации, посвященные участию эритроцитов в регуляции микрокровотока посредством NO [3].

Оксид азота является важным вазодилататор-ным агентом в условиях гипоксии. Гипоксиче-ская вазодилатация представляет собой ответ, посредством которого падение напряжения кислорода вызывает периферическое увеличение кровотока [4,5]. Хотя гипоксия усиливает опосредованное оксидом азота расслабление сосудов [6,7], N0 эндотелиальной природы не играет непосредственной роли в гипоксической вазоди-латации, и фактически активность eN0S ослабляется при гипоксии вследствие ограничения субстрата - 02. Однако eN0S может обеспечивать субстратом - N0 эндотелиальной природы (EDN0) гемоглобин эритроцитов для осуществления гипоксической вазодилатации, в большинстве случаев отдаленной во времени и пространстве от момента и места поступления EDN0 в эритроциты. Таким образом, используя 02-сенсорную функцию гемоглобина, эритроциты стимулируют ступенчатую дилатацию кровеносных сосудов при снижении напряжения кислорода [7,8], тем самым регулируя сосудистый тонус.

Несмотря на то, что сосудистые эффекты ва-зодилататоров, высвобождаемых эндотелиоци-тами, достаточно изучены, их возможному влиянию на собственно реологические свойства кро-

© Ослякова А.О., Тихомирова И.А. 2010

ви (а, значит, и на ее кислородтранспортный потенциал) не уделялось должного внимания.

Целью настоящего исследования было оценить эффекты простациклина и Spermine NONOate (Spermine-Nitric oxide complex hydrate; SPER/NO) - донора оксида азота на макро- и микрореологические свойства крови.

Материалы и методы

В исследование были включены 10 практически здоровых доноров-добровольцев (лица обоего пола). Для определения реологических параметров забор крови проводился из локтевой вены квалифицированным медицинским персоналом. В качестве антикоагулянта использовали гепарин (10 Ед/мл).

Эритроциты использовались в исследовании после отделения от плазмы путем центрифугирования и 3-кратной отмывки в растворе NaCl (0,154M).

Отмытые клетки инкубировали при 370 С в физиологическом растворе (контроль) и в растворах донора оксида азота SPER/NO (SIGMA, 10-6 М) и простагландина Pg I2 (простациклин) (SIGMA, 10-7 М) (эксперимент). Инкубационный раствор удаляли центрифугированием, а клетки крови ресуспендировали в аутоплазме при фиксированном значении гематокрита (для измерения вязкости и степени агрегации эритроцитов) и в неагрегирующей среде (для оценки деформируемости клеток).

Кажущуюся вязкость плазмы, крови и суспензий эритроцитов со стандартным показателем гематокрита 40% в разных средах (плазме, физиологическом растворе) измеряли с помощью полуавтоматического капиллярного вискозиметра [9].

Принцип действия прибора основан на создании в системе градиента давления, передающегося исследуемой жидкости, и возможности измерения скорости перемещения этой жидкости при заданном фиксированном давлении, что позволяет выполнить определение кажущейся вязкости объекта в интервале заданных напряжений сдвига за один цикл измерений.

Измерения проводились при постоянной температуре 21°С. Калиброванный капилляр заполняли исследуемой жидкостью, при нагнетании фиксированного давления жидкость начинала перемещаться по капилляру, скорость ее движения в данном случае обратно пропорциональна вязкости.

Скорость перемещения исследуемой жидкости фиксировалась автоматически с помощью встроенных фотодиодов.

Величину кажущейся вязкости вычисляли по формуле: П = К Р!,

где п - кажущаяся вязкость крови (плазмы или суспензии, мПас),

К - константа капилляра (зависит от его геометрии, определяется при калибровке системы ньютоновской жидкостью с известной вязкостью (40% раствор сахарозы);

1 - время движения пробы жидкости по измерительной части капилляра (фиксируется автоматически с помощью встроенных фотодиодов);

Р - приложенное рабочее давление (задается экспериментатором).

Измерение кажущейся вязкости производили при следующих напряжениях сдвига (Па): 1,06; 0,85; 0,64; 0,42; 0,21.

Эритроциты ресуспендировали в обедненной тромбоцитами аутологичной плазме при стандартном уровне №=0,5% для оценки процесса агрегатообразования. Степень агрегации эритроцитов определяли с помощью метода оптической микроскопии с последующей видеорегистрацией и компьютерным анализом изображения [10]. При регистрации рассчитывали степень агрегации (СА=Кагрегатов/Ксвободных эритроцитов) как отношение числа агрегатов к количеству одиночных эритроцитов и показатель агрегации (РА= №ритроцитов в агрегате/ Кагрегатов), равный среднему числу эритроцитов, приходящихся на один агрегат.

О деформируемости красных клеток крови судили по индексу элонгации в проточной микрокамере в сдвиговом потоке при фиксированном напряжении сдвига 0,78 Па [11]. В качестве косвенной оценки деформируемости использовали показатели вязкости суспензии эритроцитов со стандартным гематокритом 40% в неагреги-рующей среде [12].

Содержание АТФ в эритроцитах измеряли методом биолюминесценции с помощью люми-нометра ЛЮМ-1 («Люмтек», Москва). Концентрацию АТФ в экстракте эритроцитов рассчитывали по формуле:

[ АТФ] обр = 5- 10"8((1обр)/(1Контр)), моль/л, где 1обр - среднее значение величины биолюминесцентного сигнала для образца клеток;

!контр - биолюминесцентный сигнал для АТФ-контроля.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием параметриче-

ских критериев (в случае нормального распределения). В случае попарно связанных выборок (при оценке влияния препаратов на исследуемые показатели) использовали парный критерий Стъюдента.

Результаты и обсуждение

Простациклин (Pg Ь) и оксид азота (N0) синтезируются в эндотелиальных клетках сосудов и обладают наиболее выраженным вазодилататор-ным эффектом из всех известных в настоящее время агентов аналогичного действия. Однако, помимо влияния на тонус сосудов, они оказывают воздействие на реологические и клеточные свойства крови. Реологические характеристики крови практически здоровых лиц, полученные в ходе исследования, представлены в табл 1.

Таблица1

Реологические показатели крови

Примечание: статистически значимые различия обозначены: * - при р < 0,05;

Обозначения: ВСП - вязкость суспензии эритроцитов в аутоплазме с гематокритом 40%; ВСФ - вязкость суспензии эритроцитов в физиологическом растворе с гематокритом 40%; подстрочные индексы для напряжений сдвига: 1 — 1,06 Па, 2 — 0,85 Па, 3 — 0,64 Па, 4 — 0,42 Па, 5 — 0,21 Па; СА — степень агрегации; РА — показатель агрегации; АТФ — концентрация внутриклеточного АТФ; ИЭ — индекс элонгации (деформируемость).

После инкубации красных клеток крови со БРЕИ/КО кажущаяся вязкость суспензий эритроцитов в аутоплазме со стандартным показателем гематокрита 40% (табл. 1) не имела значимых отличий от группы контроля. Также под влиянием донора оксида азота не изменилась вязкость суспензий эритроцитов с фиксированным показателем гематокрита в физиологическом растворе при всех напряжениях сдвига.

Известно, что оксид азота, продуцируемый в сосудистом эндотелии, ингибирует агрегацию тромбоцитов [1]. Обработка эритроцитов БРЕИ/КО показала аналогичное действие данного агента (окиси азота) и в отношении красных клеток крови - степень агрегации эритроцитов в эксперименте достоверно снизилась на 43,9% (р<0,05).

Простациклин - вазодилататор, который является главным продуктом метаболизма арахи-доновой кислоты во всех эндотелиальных клетках. Данное соединение оказывает сосудорасширяющее действие за счет стимуляции специфических рецепторов гладкомышечных клеток сосудов, что приводит к повышению активности аденилатциклазы и к увеличению образования в них циклического АМФ. Основная локализация рецепторов простациклина - гладкомышечные клетки артериальных сосудов, в венозных сосудах эти рецепторы не обнаружены. Внутривенное введение простациклина приводит к вазоди-латации и системному снижению артериального давления, причем в сосудах не только большого, но и малого кругов кровообращения.

После инкубации клеток с простациклином наблюдалась достоверно более низкая вязкость суспензий эритроцитов в физиологическом растворе по сравнению с контрольной группой при напряжениях сдвига 0,85 и 0,64 Па - на 5,12% (р<0,01) и 5,75% (р<0,05) соответственно.

При сравнении показателей вязкости суспензий эритроцитов со стандартным показателем гематокрита (40%) в аутоплазме не было выявлено статистически значимых различий текучести суспензий интактных клеток и эритроцитов, подвергшихся обработке простагландином Pg !2. Однако эффект данного препарата на клеточные свойства эритроцитов был значимым. Несмотря на то, что простациклин, как и окись азота, представляет собой мощный ингибитор агрегации тромбоцитов, нами было отмечено противоположно направленное влияние этого агента на аг-регатообразование красных клеток крови. После инкубации с простациклином степень агрегации

и внутриэритроцитарное содержание АТФ

Параметр Контроль

ВСП(1) (мПа-с) 4,25±0,61 4,54±0,59 4,27±0,79

ВСП(2) (мПа-с) 5,50±0,95 5,56±0,69 5,41±0,94

ВСП(з) (мПа-с) 7,54±1,18 7,81±1,08 7,34±1,34

ВСП(4) (мПа-с) 12,0±1,5 12,2±1,7 11,4±1,8

ВСП(5) (мПа-с) 24,7±2,5 26,1±2,5 23,6±3,0

ВСФ(1) (мПа-с) 2,97±0,23 2,95±0,15 2,85±0,15

ВСФ(2) (мПа-с) 3,71±0,19 3,63±0,09 3,52±0,21**

ВСФ(3) (мПа-с) 5,04±0,29 5,00±0,22 4,75±0,33*

ВСФ(4) (мПа-с) 7,68±0,52 7,75±0,22 7,34±0,51

ВСФ(5) (мПа-с) 15,6±0,9 15,9±0,7 15,2±1,3

СА (отн.ед.) 0,139±0,050 0,078±0,020* 0,190±0,074*

РА (отн.ед.) 5,52±0,59 5,48±0,69 5,29±0,55

АТФ, 10"8 (моль/л) 8,76±7,77 4,89±4,51* 6,45±5,30*

ИЭ (отн.ед.) 0,317±0,021 0,318±0,018 0,317±0,012

достоверно повышалась - на 36,7% (р<0,05) (табл. 1).

Проведенное исследование не зафиксировало существенных изменений деформируемости клеток под действием препаратов при сравнении индексов элонгации эритроцитов в сдвиговом потоке. При оценке деформируемости по показателям вязкости суспензий эритроцитов в физиологическом растворе зафиксировано достоверное повышение способности клеток к деформации под влиянием простациклина.

Нами было выявлено достоверное снижение содержания АТФ в эритроцитах после инкубации красных клеток крови со Spermine NONOate на 44,2% (р<0,05) и после их обработки проста-циклином на 26,4% (р<0,05).

Несмотря на то, что молекула NO сама по себе действует аутокринно и паракринно, она также находится в химическом равновесии с другими молекулами, которые представляют собой стабильные запасы биоактивности NO. К этим молекулам можно отнести S-нитрозилированный гемоглобин (S-нитрозогемоглобин; Hb-SNO), который является преобразователем биоактивности оксида азота в организме, действуя тонко регулируемым образом для управления кардио-респираторным и сосудистым гомеостазом.

Hb-SNO оказывает сосудорасширяющее действие и усиливает кровоток в сосудах. Таким образом, Hb-SNO как в свободном виде, так и в составе

Библиографический список

1. Cavar I., Kelava T., Heinzel R., Culo F. The role of prostacyclin in modifying acute hepatotoxicity of acetaminophen in mice // Coll Antropol. - 2009. - № 33. - Р. 25-29.

2. Dusting G.J., Fennessy P., Yin Z.L., Gurevich V. Nitric oxide in atherosclerosis: vascular protector or villain? // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. Suppl. - 1998. - № 25. - Р. 34-41.

3. Mark W. Vaughn, Kuang-Tse Huang, Lih Kuoll, James C. Liao Erythrocytes Possess an Intrinsic Barrier to Nitric Oxide Consumption // The Journal of Biological Chemistry. - 2000. - № 4. - Р. 2342-2348.

4. Allen B.W., Piantadosi C.A. How do red blood cells cause hypoxic vasodilation? The SNO-hemoglobin paradigm // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. - 2006. -№ 291. - P. 1507-1512.

5. Singel D.J., Stamler J.S. Chemical physiology of blood flow regulation by red blood cells: the role of nitric oxide and S-nitrosohemoglobin // Ann. Rev. Physiol. -2005. -№ 67. - P. 99-145.

6. Crawford J.H., White C.R., Patel R.P. Vasoactivity of S-nitrosohe-moglobin: role of oxygen, heme, and NO oxidation states // Blood. - 2003. - № 101. - P. 44084415.

7. Datta B., Tufnell-Barrett T., Bleasdale R.A., Jones

8. C.J., Beeton I., Paul V., Frenneaux M., James P. Red blood cell nitric oxide as an endocrine vasoregulator:

9. a potential role in congestive heart failure // Circulation. - 2004. - № 109. - P. 1339-1342.

10. Gonzalez-Alonso J., Richardson R.S., Saltin B. Exercising skeletal muscle blood flow in humans re

эритроцитов обладает EDRF-подобными свойствами [13].

Следует учитывать и то, что N0 может реагировать не только с SH-группами гемоглобина, но и с его гемом, образуя нитрозильные комплексы (№N0). И №>^N0, и №N0 образуют большой пул депонированного в красных клетках крови оксида азота. Синтез простациклина происходит постоянно, но он не депонируется, а секретиру-ется в непосредственно в кровь.

Являясь регулятором тонуса сосудов (и тем самым кровяного давления), N0 участвует и в патогенезе различных сердечно-сосудистых заболеваний, включая гипертоническую болезнь и атеросклероз. Хорошо известна защитная роль N0 в начальной стадии ишемии как фактора, улучшающего кровоток и снижающего повреждение тканей [13]. Также большой интерес представляет влияние окиси азота и простациклина на функциональную активность сердца.

Таким образом, в результате проведенного исследования установлено, что вазодилататоры эндотелиальной природы (оксид азота и проста-циклин) оказывают влияние не только непосредственно на сосуды, но и воздействуют на собственно макро- и микрореологические свойства крови, существенно изменяя клеточные свойства, в частности способность к агрегатообразованию и энергетику эритроцитов.

sponds to reduction in arterial oxyhaemoglobin, but not to altered free oxygen // J. Physiol. - 2001. - № 530. - P. 331-341.

11. Муравьев, А.В., Туров, В.Е., Колбаско, И.В. Новый капиллярный полуавтоматический вискозиметр [Текст] // Гемореология в микро- и макроциркуляции: мат. международн. конф.. - Ярославль, 2005. -С. 28.

12. Муравьев, А.В. Компьютерная регистрация агрегации эритроцитов при их инкубации с адреналином [Текст] // Методы исследования регионарного кровообращения и микроциркуляции в клинике: мат. научно-практ. конференции. - СПб, 2003. - С. 78-80.

13. Муравьев, А.В., Муравьев, А.А., Булаева, С.В., Маймистова, А.А. Методы изучения деформируемости эритроцитов в эксперименте и клинике [Текст] / А.В. Муравьев // Клиническая лабораторная диагностика. - 2010. - №1. - С. 28-29.

14. Муравьев, А.В., Чепоров, С.В. Гемореология (экспериментальные и клинические аспекты реологии крови). [Текст] - Ярославль, 2009. - 178 с.

15. Осипов, А.Н., Борисенко, Г.Г., Владимиров, Ю.А. Биологическая роль нитрозильных комплексов гемопротеинов // [Текст] Успехи биологической химии. - 2007. - Т. 47. - С. 259-292.