Оценка влияния природных ассоциаций углеводородокисляющих микроорганизмов на состояние нефтезагрязненной почвы

Том 153, кн. 3

Естественные науки

2011

УДК 631.474+631.452

ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ПРИРОДНЫХ АССОЦИАЦИЙ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ НА СОСТОЯНИЕ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННОЙ ПОЧВЫ

И.А. Дегтярева, А.Я. Хидиятуллина Аннотация

Из почв, загрязненных нефтью, выделены ассоциации углеводородокисляющих микроорганизмов. В лабораторных условиях была исследована их способность к утилизации углеводородов нефти. Результаты биотестирования в вегетационном опыте подтвердили ускорение процесса очищения загрязненных почв после внесения ассоциации микроорганизмов.

Ключевые слова: нефть, углеводороды, почва, загрязнение, мониторинг, углево-дородокисляющие микроорганизмы, ассоциации.

Введение

Нефть и нефтепродукты относятся к наиболее опасным загрязнителям биосферы, поэтому вопросы изыскания способов рекультивации нефтезагрязнен-ных территорий являются весьма актуальными.

Загрязнение углеводородами отличается от других антропогенных воздействий на биосферу тем, что оно дает не постоянную, а «залповую» нагрузку на среду, вызывая быструю ответную реакцию. Во всех мероприятиях, связанных с ликвидацией последствий загрязнения и восстановлением нарушенных земель, необходимо исходить из главного принципа: не нанести экосистеме больший вред, чем тот, который уже нанесен при загрязнении. Суть восстановления загрязненных экосистем - максимальная мобилизация их внутренних ресурсов на восстановление своих первоначальных функций. Рекультивация нефтезагряз-ненных земель - это ускорение процесса самоочищения, при котором используются все природные резервы экосистемы [1-3].

Перспективным решением проблемы реабилитации нефтезагрязненных почв является применение штаммов и сообществ углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ), полученных в результате селекции и адаптированных к конкретным условиям применения [2-4].

1. Материалы и методы

Проводимые исследования по использованию УОМ состояли из несколько этапов: выделение природных ассоциаций; определение их свойств; характеристика эффективности микроорганизмов-деструкторов в отношении различных углеводородов. Чистые культуры УОМ были выделены по методу Коха на мясо-пептонном агаре (МПА) и поддерживались на скошенном МПА при комнатной

температуре [5]. Родовую и видовую идентификацию выделенных штаммов УОМ проводили в соответствии с общепринятыми методами [6-8].

Для скрининга выделенных ассоциаций УОМ по способности утилизировать дизельное топливо (ДТ) в пробирки со средой Ворошиловой - Диановой объемом 10.0 мл вносили посевной материал из накопительной культуры в количестве 1.0 мл на 10.0 мл среды. Культивирование проводили при перемешивании (200 об/мин) при 30 °С в термостате. Контрольным вариантом служила стерильная среда с ДТ без внесения культур. В течение 30 сут визуально оценивалась степень разрушения нефтяной пленки на поверхности среды.

Способность микроорганизмов-деструкторов расти в присутствии различных углеводородов (мазута, вакуумной газоли, гексана, фенола, толуола) проверяли при помощи метода реплик. В каждую ячейку репликатора добавляли физиологический раствор и выделенные ассоциации УОМ.

Степень токсичности остаточных углеводородов оценивалась биотестами с использованием проростков ТгШеит aestivum Ь. [9].

Вегетационный опыт по изучению влияния ДТ в концентрации 5% на состояние микробоценоза был проведен на выщелоченном черноземе по следующей схеме: контроль (незагрязненная почва); почва + ДТ (5%); почва + ДТ (5%) + №К; почва + ДТ (5%) + растения; почва + ДТ (5%) + сообщество А; почва + ДТ (5%) + сообщество Б; почва + ДТ (5%) + №К+ сообщество А; почва + ДТ (5%) + №К+ сообщество Б; почва + ДТ (5%) + растения + сообщество А; почва + ДТ (5%) + растения + сообщество Б. Микробиологическим контролем являлась почва без растений. Титры вносимых сообществ: А - 1.6-1011 КОЕ/мл, Б - 1.4-1011 КОЕ/мл.

Вегетационный опыт проводили в теплице с естественным освещением в летний период в 6-килограммовых сосудах. В ходе эксперимента растения поливали деминерализованной водой, поддерживая влажность почвы на уровне 60% ППВ. После прореживания в каждом сосуде оставляли по 15 растений яровой пшеницы, которые выращивали в течение 90 сут.

Из всех вариантов опыта отбирали в динамике (на 0-е, 10-е, 21-е, 30-е, 45-е, 60-е, 90-е сутки) пробы почв, в которых определяли базальное дыхание, численность УОМ, гетеротрофов, микромицетов, длину и массу корешков и проростков.

Базальную респираторную активность почвенного микробного сообщества определяли по количеству выделяемого СО2 титрованием после его поглощения щелочью [10].

Выделение различных ризосферных микроорганизмов проводили по общепринятым методикам [5, 11, 12] на элективных питательных средах: углеводо-родокисляющие микроорганизмы - на среде Ворошиловой - Диановой методом предельных разведений с последующим пересчетом по таблице Мак-Креди, гетеротрофные бактерии - на МПА, микромицеты - на агаризованной среде Чапека. Численность микроорганизмов выражали в количестве колоние-образующих единиц (КОЕ) на 1 г почвы после ее высушивания при температуре 105 °С. Родовую и видовую принадлежность ризосферных микроорганизмов устанавливали по определителю бактерий Берджи [7].

Изучение влияния комплекса аборигенных УОМ на увеличение длины и биомассы проростков проводили по модифицированной методике Л.К. Павловой-Ивановой с соавторами [13].

Измерение всех параметров проводили не менее чем в 3-кратной повторно-сти. Статистическую обработку результатов проводили с помощью электронных таблиц Excel и программы Origin 4.1. Достоверность различий полученных результатов оценивали с использованием коэффициента Стьюдента (р < 0.05). Взаимосвязь ряда факторов устанавливали посредством расчета коэффициента корреляции [14].

2. Результаты исследований

В процессе исследований проводили искусственное загрязнение почвенных образцов дизельным топливом в дозах 1, 3, 5, 7, 10, 12% от массы почвы. Были выделены более 80 ассоциаций микроорганизмов-деструкторов, 15 из которых проявили активный рост. В дальнейшем проверяли способность этих консорциумов расти на среде с приведенными выше углеводородами. Большинство ассоциаций хорошо развивались в присутствии всех углеводородов, кроме фенола. Наилучший рост в присутствии всех углеводородов показали консорциумы А и Б.

В результате скрининга для дальнейшего изучения из вариантов с 7% и 10% ДТ были отобраны именно эти природные ассоциации, проявившие наибольшую углеводородокисляющую активность: сообщество А, в котором образовывались оранжевые сгустки биомассы, пленка была самой мощной и визуально количество ДТ уменьшалось более чем на 80% уже на 7-е сутки; сообщество Б, в котором происходило изменение цвета среды, образовывалась бежевая пленка и количество ДТ также уменьшалось намного быстрее.

Проведенная идентификация культур, входящих в состав ассоциаций, показала, что они представлены родами Sphingobacterium, Achromobacter, Azotobacter, Pseudomonas, Rhodococcus, Flavobacterium, Acinetobacter, Aeromonas, Arthrobacter, дрожжами рода Candida, микромицетами рода Trichoderma и др.

Наиболее активные из выделенных УОМ задепонированы в коллекции ФГУП ГосНИИгенетика. Эти штаммы идентифицированы методом установления нуклеотидной последовательности 16S рРНК.

В вегетационном опыте осуществили сравнительную оценку эффективности выбранных сообществ, а также их сочетания с яровой пшеницей (Triticum aestivum L.) и минеральным удобрением с целью биоремедиации почвы.

В качестве показателя оценки состояния среды и интенсивности процесса очищения почвы от углеводородов использовалась динамика численности УОМ. В исследуемой почве в начале эксперимента количество аборигенной углево-дородокисляющей микрофлоры составляло порядка 106 КОЕ/г почвы.

Результаты исследований показали существенную разницу в количестве микроорганизмов в почвах без загрязнения и загрязненных ДТ, без обработки и с внесением ассоциаций. Так, в течение 45 сут экспозиции существенных изменений численности отмечено не было, что, вероятно, обусловлено высокой токсичностью созданной среды. Активный рост этих микроорганизмов спустя 45 сут во всех вариантах (64.0-106 - 150.0-106 КОЕ/г) почвы можно объяснить изменением погодных условий. Наибольшее увеличение количества УОМ в опытных вариантах связано с адаптацией и активным ростом исследуемых сообществ. На 60-е сутки количество УОМ увеличилось на порядок (120.0^ 106 КОЕ/г

почвы) по сравнению с отбором проб на 10-е сутки (2.8•Ю6 КОЕ/г почвы), в дальнейшем наблюдалась стабилизация роста их численности.

Колебания численности в варианте «почва + ДТ» могут быть связаны с токсическим действием внесенного углеводорода. Полученные результаты свидетельствует о значительном ускорении процесса биодеградации дизельного топлива в почве при внесении исследуемых ассоциаций по сравнению с необработанными вариантами. Сообщества по-разному влияли на численность УОМ: максимальное количество этих микроорганизмов отмечено при внесении одного сообщества Б и сообщества А совместно с минеральными удобрениями (120.0-106 - 150.0^ 106 КОЕ/г почвы).

Одним из диагностических показателей биологической активности почв является состояние комплекса гетеротрофных микроорганизмов, которые используют в качестве источника энергии и углерода органические, то есть углеродсо-держащие соединения. В течение первых 30 сут эксперимента количество этих микроорганизмов в большинстве вариантов заметно снижалось (в 4.9-5.2 раза). Возможной причиной является уменьшение питательных веществ или токсическое действие исследуемого углеводорода.

Обращает на себя внимание тот факт, что минеральные удобрения на 30-е сутки стимулировали увеличение гетеротрофов в варианте с сообществом А в 3.7-4.1 раза. Растения в этот период способствовали росту численности этих микроорганизмов в варианте с сообществом Б в 8.5-9.0 раза. Дальнейшая динамика численности гетеротрофных микроорганизмов характеризовалась постепенным уменьшением их в почве, а спустя 90 сут количество этих микроорганизмов во всех вариантах существенно снизилось (до 22.5-187.5 КОЕ/г почвы). Необходимо отметить, что в конце эксперимента количество гетеротрофных и углеводородокисляющих микроорганизмов стало практически одинаковым.

Почвенные микромицеты представляют собой группу микроорганизмов, универсальных по своему значению для формирования плодородия почвы. Количество микромицетов в исходной почве достигало максимальной величины спустя 45 сут (80.0^ 106 КОЕ/г почвы), впоследствии наблюдалась стабилизация их численности. Дизельное топливо оказало токсическое действие на почвенные грибы: в загрязненной почве численность микромицетов была в 1.8-8.5 раза ниже, чем в контрольной, и находилась приблизительно на одном уровне в течение всего эксперимента. Минимальное их количество (5.0-25.0 тыс./г) наблюдалось при внесении минеральных удобрений как отдельно, так и с исследуемыми сообществами. В вариантах же с растениями была отмечена наименьшая разница с контрольным. Значимым является тот факт, что в вариантах с внесением исследуемых сообществ количество микромицетов было существенно ниже по сравнению с контрольной почвой (в 1.8-5.7 раза). Это, по-видимому, связано с антагонистическим действием входящих в сообщества микроорганизмов. Во всех вариантах, включая контрольные, обнаружены представители родов Penicillum, AspergiUum, Trichoderma, Rhizopus, Fuzarium и др.

Базальное дыхание (БД) является одной из важнейших биохимических характеристик почвы. Во всех опытных вариантах происходило увеличение в 2.36.8 раза базального дыхания по сравнению с контрольной почвой. При внесении исследуемых сообществ в загрязненную почву этот показатель практически

сразу увеличивался вдвое (даже по сравнению с увлажненной почвой + ДТ). При внесении минеральных удобрений как отдельно, так и с сообществами БД возрастало в 1.8-6.6 раза. Необходимо отметить, что яровая пшеница в качестве фитомелиоранта не оказала существенного влияния на этот показатель. Невысокие значения БД в вариантах с растениями (18.Г106 - 26.6^106 СО2 мг/100 г • 24 ч) могут быть связаны с конкуренцией макро- и микроорганизмов за источники питания. Внесенные сообщества увеличивали базальное дыхание, при этом сообщество Б оказывало большее воздействие на этот процесс по сравнению с сообществом А.

Степень влияния почвенной вытяжки на развитие семени является показателем токсического действия углеводородов. При этом оценивали различные биометрические показатели: длина проростков и их биомасса, длина корешков и их биомасса.

Длина проростков оставалась невысокой до 45 сут. Это соотносится с данными по численности углеводородокисляющей микрофлоры. Спустя 60 сут стимулирующий эффект почвенной вытяжки на длину проростка увеличивался в 2.7-5.6 раза по сравнению с началом эксперимента. Минеральные удобрения и растения оказывали приблизительно одинаковый стимулирующий эффект (на 57.3% и 64.6% соответственно). Сообщество Б проявляло больший положительный эффект (в 1.3-1.9 раза) по сравнению с сообществом А.

Биомасса проростков спустя 60 сут увеличивалась в 3.3-5.9 раза. Это соотносится с данными по длине проростков, которые оставались невысокими до 45 сут. Изучаемые сообщества оказывали на биомассу проростков яровой пшеницы практически одинаковый положительный эффект (увеличение на 51.6% и 58.1% по сравнению с контролем соответственно).

При исследовании влияния почвенной вытяжки на прорастание корешка в варианте «почва + ДТ» было установлено угнетающее действие углеводородов. Положительное влияние почвенной вытяжки на длину корешка наблюдалось только спустя 45 сут. Это соотносится не только с численностью УОМ, но и с показателями влияния загрязненной почвы на развитие проросшего корешка. Минеральные удобрения и растения совместно с изучаемыми сообществами оказывали приблизительно одинаковый стимулирующий эффект (на 38.7% и 35.8% соответственно). Необходимо отметить, что сообщество Б проявило большее активизирующее действие (в 1.5 раза).

При изучении влияния почвенной вытяжки на массу корешков было установлено, что этот показатель во всех опытных вариантах был выше контрольного (на 15.0-121.0%). При этом в вариантах с растениями масса корешков была существенно выше, в 1.9 раза, чем при использовании минеральных удобрений.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что важную роль в деток-сикации загрязнителей играет ризосфера растений, которая является областью активного развития микроорганизмов. Интересен тот факт, что сообщество А на протяжении всего эксперимента оказывало большее активизирующее действие на массу корешков (в 1.8 раза).

Показатель устойчивости растений к токсическому действию углеводородов можно получить при оценке влияния загрязненной почвы на развитие проросшего корешка, при котором семена тест-культур проращиваются в чашках Петри со

стерильной фильтровальной бумагой до длины корешков 1.0-2.0 см. Затем они высаживаются в почву, и через 3 сут измеряется длина корешка. Во всех опытных вариантах в течение 30 сут загрязненная почва оказывала угнетающее действие на развитие корешков. Снижение токсичности было отмечено только спустя 45 сут. Это соотносится с численностью углеводородокисляющих микроорганизмов и с данными по влиянию почвенной вытяжки на развитие корешка и проростка. В вариантах с растениями отмечен больший положительный эффект на развитие корешков по сравнению с минеральными удобрениями. Оба исследуемых сообщества оказывали стимулирующий эффект на развитие корешков, и эта тенденция сохранялась в течение всего эксперимента. Практически во всех вариантах сообщество Б продемонстрировало большее положительное действие на данный показатель.

Таким образом, динамика численности почвенных микромицетов, углеводо-родокисляющих и гетеротрофных микроорганизмов, бальное дыхание, а также оценка токсичности ДТ в почве с использованием биотестов показали ускорение процесса деградации дизельного топлива в почве и снижение его токсического действия на почвенную биоту при внесении ассоциаций УОМ.

Заключение

Выделено 15 активных ассоциаций микроорганизмов-деструкторов углеводородов. Микробиологический мониторинг показал, что численность углеводородокисляющих микроорганизмов к концу эксперимента (90-е сутки) значительно возросла. При внесении дизельного топлива в связи с его токсическим действием происходило существенное снижение микромицетов. Базаль-ное дыхание увеличивалось как при внесении минеральных удобрений, так и в присутствии сообщества Б. При сравнительном анализе двух выбранных уг-леводородокисляющих ассоциаций установлено, что сообщество А оказывало наибольший стимулирующий эффект на рост массы корешка, а сообщество Б -на большинство вышеприведенных параметров.

Результаты модельных и вегетационных экспериментов свидетельствуют о высокой углеводородокисляющей активности выделенных микроорганизмов и возможности создания на их основе препарата для биоремедиации нефтезаг-рязненных почв.

Summary

I.A. Degtyareva, A.Ya. Khidiyatullina. Evaluation of the Influence from Natural Associations of Hydrocarbon-Utilizing Microorganisms on Oil-Contaminated Soil.

Associations of hydrocarbon-utilizing microorganisms were selected from oil-contaminated soil. In laboratory conditions, their ability to utilize hydrocarbon oils was explored. The results of biotesting in a pot experiment confirmed the acceleration of soil decontamination after the introduction of microorganisms associations.

Key words: oil, hydrocarbon, soil, contamination, monitoring, hydrocarbon-utilizing microorganisms, associations.

Литература

1. Исмаилов Н.М., Пиковский Ю.И. Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. - М.: Наука, 1988. - С. 177-197.

2. Хидиятуллина А.Я., Дмитричева Д.С., Яппаров А.Х. Создание коллекции аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов для биологической рекультивации нефтезагрязненных регионов Татарстана // Экологические проблемы сельскохозяйственного производства: Материалы IV Всеукр. науч.-практ. конф. молодых ученых. - Скол. - 2010. - С. 86-89.

3. Яппаров А.Х., Дегтярева И.А., Хидиятуллина А.Я. Использование эффективных аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов при биологической рекультивации нефтезагрязненных территорий РТ // Учен. зап. Казан. гос. акад. вет. мед. им. Н.Э. Баумана. - Казань, 2009. - Т. 199. - С. 218-222.

4. Кудрина Е.А., Максимов А.Ю. Биодеградация дибензотиофена и алканов нефти бактериями рода Rhodococcus // Актуальные аспекты современной микробиологии: Тез. III Междунар. молодеж. шк.-конф. - М., 2007. - С. 57-58.

5. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Д.Г. Звягинцева. - М.: Моск. гос. ун-т, 1991. - 304 с.

6. Лысак Л.В., Добровольская Т.Г., Скворцова И.Н. Методы оценки бактериального разнообразия почв и идентификации почвенных бактерий. - М.: МАКС Пресс, 2003. - 123 с.

7. Определитель бактерий Берджи: в 2 т. / Под ред. Дж. Хоулта и др. - М.: Мир, 1997. -Т. 1. - 432 с.; Т. 2. - 368 с.

8. Watanabe T. Pictorial atlas of soil and seed fungi: Morphologies of cultured fungi and key to species 113. - Boca Raton, Florida, USA: Lewis Publ., 1994. - 411 p.

9. Водопьянов В.В., Киреева Н.А., Григориади А.С., Якупова А.Б. Влияние нефтяного загрязнения почвы на ризосферную микробиоту и моделирование процессов биодеградации углеводородов // Вестн. Оренбург. гос. ун-та. - 2009. - № 6 (100). - С. 545-547.

10. Insam H., Mithchel C.C., Dormaar Y.F. Relationship of soil microbial biomass and activity with fertilization practice and crop yield of three ultisols // Soil Biol. Biochem. -1991. - V. 23, No 5. - Р. 459-464.

11. Колешко О.И. Экология микроорганизмов почвы. Лабораторный практикум. -Минск: Высш. шк., 1981. - 175 с.

12. Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. - М.: Агропром-издат, 1990. - 240 с.

13. Павлова-Иванова Л.К., Баканчикова Т.И., Кортунова Е.Ю. Изучение характера взаимодействия Azospirillum brasilense с растениями // Микробиология. - 1995. -Т. 64, № 3. - С. 387-392.

14. Шайдарова Л.Г., Улахович Н.А. Математическая обработка результатов химического анализа. - Казань: Изд-во Казан. ун-та, 2000. - 44 с.

Поступила в редакцию 27.06.11

Дегтярева Ирина Александровна - доктор биологических наук, заведующая лабораторией агроэкологии и микробиологии Татарского научно-исследовательского института агрохимии и почвоведения РАСН. E-mail: peace-1963@mail.ru

Хидиятуллина Айгуль Ядкарьевна - научный сотрудник Татарского научно-

исследовательского института агрохимии и почвоведения РАСН. E-mail: kindness2006@yandex.ru