СПОСОБ ДЛИТЕЛЬНОГО ХРАНЕНИЯ IN VITRO МИКРОРАСТЕНИЙ БЕРЕЗЫ
METHOD FOR BIRCH MICRO PLANTS LONG-TERM STORAGE IN VITRO

Изобретение относится к области биотехнологии растений и лесного хозяйства. Изобретение представляет собой способ беспересадочного (свыше одного года) хранения микрорастений (пробирочных растений) березы в условиях in vitro.
Современным биотехнологическим подходом сохранения ex situ представителей ценного генофонда растений является создание и длительное поддержание коллекции микрорастений ценных генотипов в культуре in vitro. Существование таких коллекций позволяет сохранить особо ценные генотипы, снизить затраты на их воспроизводство, получить сортовой посадочный материал для создания лесных культур целевого назначения, провести быстрое восстановление культур (за счет круглогодичного, селективного, массового тиражирования нужных генотипов) после пожаров, засухи, вырубок, техногенного загрязнения и др.
Наиболее часто используемым подходом сохранения растений in vitro является депонирование (сохранение живых растений без частых пересадок) в условиях пониженной температуры при слабом уровне освещения [1-5]. Для торможения роста растений помимо снижения температуры в питательную среду добавляют осмотики (сорбит, манит, повышают концентрацию сахарозы и др.), ретарданты (например, хлорхолинхлорид), гормоны (регуляторы роста), уплотняют питательную среду (путем повышения в ней содержания агара) и др. [5-9 и др.]. Martin et.al [10] хранение коллекции 32-х клонов осины осуществляли путем субкультивирования каждые 3 месяца на питательные среды, дополненные регуляторами роста (6-БАП и НУК). Недостатком способа является удорожание и трудоемкость технологии (особенно при наличии большого числа клонов в коллекции) из-за частых пересадок.
Положительные результаты хранения (в течение 6 месяцев) коллекции разных видов березы (пушистой, повислой, карельской) получены Концевой И.И. на питательной WPM с сорбитом при обычных условиях культивирования (23±1°С, 16-часовом фотопериоде, освещенности 2-3 клк) [8]. Недостаток метода - краткосрочность хранения.
Крицкая Т.А. и Кашин Т.А. [11] хранение культур редких и исчезающих видов растений осуществляли в течение 6-12 мес при пониженной температуре (+5±1°С) на питательной среде WPM, дополненной сахарозой в повышенной концентрации (до 60 и 90 г/л). Отмечены значительные генотипические различия на одни и те же условия депонирования in vitro.
Известен способ депонирования растений винограда «Способ длительного сохранения in vitro растений винограда» (патент России №2110172). Он включает высадку междоузлий пробирочных растений с узлом и листом длиной 10-12 мм на твердую питательную среду Мурасиге и Скуга, в которую добавляют тонкоразмолотые семена винограда [13]. Возможность использования данного способа на березе не описана.
Наиболее близким техническим решением является способ депонирования растений осины «Способ длительного хранения in vitro растений осины» (патент России №2522823). Он включает культивирование растений на среде WPM с добавлением сорбита 5-10 г/л, маннита 5-10 г/л, агара 9 г/л при пониженной температуре +4°С в режиме освещения 8 ч день /16 ч ночь с интенсивностью освещенности 2000 люкс. После года хранения выживаемость растений осины разных генотипов составляла 100% [14]. Однако возможность использования данного способа на березе не изучалась и потребует дополнительного финансирования для его апробации и модификации.
Целью предлагаемого изобретения является повышение эффективности длительного хранения in vitro микрорастений березы (их сохранности и жизнеспособности) при пониженной положительной температуре +4°С, без пересадок в течение одного года.
Поставленная цель достигается за счет одновременного использования нескольких факторов: пониженной температуры, оптимального упрощенного состава питательной среды (без фитогормонов, с повышенным содержанием аскорбиновой кислоты) и изменения режима освещения (в темноте).
Суть изобретения заключается в том, что для укоренения микрочеренков и последующего хранения микрорастений используют питательную среду Мурасиге и Скуга с половинным содержанием макросолей -  MS [15] без гормонов с добавлением сахарозы 20 г/л, агар-агара 6 г/л, аскорбиновой кислоты 2,0 иг/л. После укоренения микрочеренков в течение 3-4 недель в стандартных условиях климатического режима (+24…+26°С, интенсивность освещения 2 клк, 16-часовой фотопериод) микрорастения переносят в условия хранения при пониженной температуре +4….+7°С в темноте.
Новизна изобретения заключается в том, что для хранения микрорастений березы используется безгормональная питательная среда MS с повышенным содержанием в ней аскорбиновой кислоты (2 мг/л вместо 0,5 мг/л в норме) в условиях пониженной температуры в темноте, что повышает выживаемость (жизнеспособность) культур. Понижение температуры и отсутствие света приводят к значительному замедлению физиологических процессов, торможению роста растений. Культивирование на питательной среде без гормонов снижает вероятность сомаклональной изменчивости, гарантирует сохранение генетической и хозяйственной ценности исходных (материнских) деревьев. Добавление в питательную среду в повышенной концентрации мощного антиоксиданата - аскорбиновой кислоты, повышает выживаемость длительно хранящихся культур и обеспечивает их полное 100%-ное восстановление (активный рост и развитие) после года хранения in vitro.
Предлагаемый способ реализуется следующим образом.
1. Приготовление питательной среды для укоренения микропобегов и последующего их хранения in vitro. В нестерильных условиях готовится по прописи [15] и общепринятой методике [16] питательная среда  MS без гормонов с добавлением сахарозы 20 г/л, агар-агара 6 г/л, аскорбиновой кислоты 2,0 мг/л, рН 5,6-5,8. Питательная среда разливается по биологическим пробиркам, которые закрывают колпачками из фольги и автоклавируют при 0,8 атм в течение 15 минут.
2. Микрочеренкование стерильных микрорастений и их укоренение. Все манипуляции с растительным материалом производятся в асептических условиях в ламинар-боксе. Микрорастения разрезают лезвием на микропобеги с 1 пазушной почкой (размер 1-1,5 см), которые помещают по одному в биологическую пробирку (культуральный сосуд) на питательную среду и переносят в культуральную комнату, где выдерживают в стандартных условиях климатического режима (температура +25…+26°С, фотопериод 16 часов (16 ч день/8 ч ночь), интенсивность освещения 2,0 клк) в течение 3-4 недель до укоренения микропобегов и начала их роста в высоту.
3. Депонирование укорененных микрорастений. Укорененные микрорастения переносят в условия хранения (темнота, температура хранения +4….+7°С) на 12 месяцев.
4. Восстановление культур после года хранения in vitro. Микрорастения переносят в стандартные условия климатического режима (температура +25…+26°С, фотопериод 16 часов, интенсивность освещения 2,0 клк), где в течение недели появляются новые почки, побеги начинают активно расти (в случае апикального некроза появляются боковые побеги) и нормально развиваются еще в течение 1-3 месяцев. Не выявлены случаи аномального развития растений и сомаклональной изменчивости. Восстановившиеся микрорастения пригодны для микрочеренкования (с использованием питательной среды того же состава) с последующим новым циклом хранения.
Оценку выживаемости (жизнеспособности) культур после хранения проводили после двух недель выдерживания микрорастений в стандартных условиях: по проценту восстановивших рост растений.
Для замедления роста микрорастений и их длительного хранения испытывалась пониженная положительная температура при различных световых режимах, питательные среды с различным содержанием агара, аскорбиновой кислоты, с добавлением ретарданта хлорхолинхлорида (ССС, лимитирующего рост побегов) или активированного угля. Режимы депонирования: 1) температура +4…+7°С, фотопериод 8 часов (8 ч день /16 ч ночь), интенсивность освещения 0,5 клк; 2) температура +4…+7°С, темнота. Полученные результаты представлены в таблицах 1 и 2, на фиг. 1.
Таким образом, из испытанных вариантов депонирования березы лучшие результаты получены при хранении микрорастений на среде  МС с повышенным содержанием аскорбиновой кислоты при пониженной температуре в темноте.
Использование предлагаемого режима депонирования позволяет удлинить интервал между пересадками (от 12 до 15 месяцев), увеличить долю жизнеспособных микрорастений до 100%, минимизировать появление аномально развитых растений и сомаклональной изменчивости, что обеспечит при необходимости получение качественного посадочного материала с сохранением у него хозяйственной и генетической ценности материнских деревьев.
Предложенный способ хранения является воспроизводимым, надежным и малозатратным (т.к. используется упрощенная по составу питательная среда без гормонов, пригодная для всех этапов культивирования (укоренения, хранения in vitro, восстановления после хранения), не требуются затраты на круглогодичное освещение). Пригоден для разных видов, разновидностей и генотипов березы.
Источники информации
1. Кухарчик Н.В. Сохранение генофонда Cerasus Mill, in vitro // Плодоводство на рубеже XXI века. Минск, 2000. С. 16-18.
2. Машкина О.С., Табацкая Т.М. Рекомендации по сохранению и воспроизводству методами биотехнологии ценных генотипов карельской березы, осины, тополя белого и сереющего // Воронеж: НИИЛГиС, 2005. 29 с.
3. Новикова Т.И., Набиева А.Ю., Полубоярова Т.В. Сохранение редких и полезных растений в коллекции in vitro центрального сибирского ботанического сада // Вестник ВОГиС. 2008. Том 12. №4. С. 564-572.
4. Иванова Н.Н., Митрофанова И.В. Длительное депонирование в условиях in vitro эксплантов Actinidia Deliciosa // Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира: мат. VI Межд. науч.-пр. конф. 12-17 окт. 2014. Республика Крым. Ялта. 2014. С. 128.
5. Молканова О.И., Васильева О.Г., Коновалова Л.Н. Научные основы сохранения и устойчивого воспроизводства генофонда растений в культуре in vitro // Вестник Удмуртского университета. Биология. Науки о земле. 2015. Т. 25, №2. С. 95-100.
6. Высоцкая О. Н. Длительное сохранение in vitro коллекции растений земляники. // Физиология растений. 1994. Т. 41. №6. С. 935-941.
7. Способ длительного хранения in vitro растений осины / Видягина Е.О., Шестибратов К.А., Патент на изобретение RU 2522823. 20.07.2014
8. Концевая И.И. Длительное хранение микрорастений березы в культуре тканей // Лесоведение. 2009. №5. С. 50-56.
9. Митрофанова И.В. Соматический эмбриогенез и органогенез как основа биотехнологии получения и сохранения многолетних садовых культур. Киев: Аграрна наука, 2011. 344 с.
10. Martin М.Т., Pedranzani Н.Е., Sierra de Grado R. Behavior and preservation of an in vitro collection of European aspen in Spain // Biocell. 2007. Vol. 31, №1. P. 41-49.
11. Крицкая Т.А., Кашин А.С.Особенности длительного депонирования культуры in vitro некоторых редких и исчезающих видов растений Саратовской области // Изв. Сарат. Ун-та. Сер. Химия. Биология. Экология. 2016. Т. 16. Вып. 1. С. 75-80.
12. Машкина О.С., Табацкая Т.М. Сохранение представителей ценного генофонда лиственных древесных растений на основе создания генетического банка in vitro II. Лесные биогеоценозы бореальной зоны: география, структура, функции, динамика. Красноярск, 2014. С. 97-99.
13. Дорошенко Н.П., Музыченко Б.А. Способ длительного сохранения in vitro растений винограда // Патент России №2110172, 1995. Опубликовано 10.05.1998.
14. Видягина Е.О., Шестибратов К.А. Способ длительного хранения in vitro растений осины // Патент России №2522823, 2012 г. Опубликовано 20.07.2014. Бюл. №20.
15. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with Tobacco tissue cultures // Phisiol. Plant. 1962. Vol.15, №13. P. 473-497.
16. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1964. 350 с.