СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ АУТОАНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ, АССОЦИИРОВАННЫХ С АУТОИММУННЫМ ПОЛИГЛАНДУЛЯРНЫМ СИНДРОМОМ I ТИПА, НА ГИДРОГЕЛЕВОМ БИОЧИПЕ
METHOD FOR IDENTIFYING AUTOLOGOUS ANTIBODIES IN BLOOD SERUM, ASSOCIATED WITH TYPE I AUTOIMMUNE POLYGLANDULAR SYNDROME, ON A HYDROGEL BIOCHIP

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к молекулярной биологии, иммунологии, эндокринологии и может быть использовано в клинической лабораторной диагностике для выявления аутоантител в сыворотке крови, характерных для аутоиммунного полигландулярного синдрома 1 типа (АПС-1). Способ предназначен для мультиплексного обнаружения как специфичных для АПС-1 аутоантител к интерферону омега, интерферону альфа-2-a, интерлейкину 22, так и органо-специфичных аутоантител к 21-гидроксилазе, глутаматдекарбоксилазе, цитоплазматическому антигену островковых клеток, тирозинфосфатазе, тиреоглобулину, тиреопероксидазе.
Уровень техники
Аутоиммунные эндокринопатии, в связи с общими звеньями патогенеза, часто сочетаются друг с другом в рамках аутоиммунных полигландулярных синдромов (АПС). Различают несколько типов АПС. Аутоиммунный полигландулярный синдром первого типа (АПС-1) - редкое моногенное заболевание, опосредованное мутациями в гене AIRE. Распространенность среди популяции составляет примерно 1:80000, болезнь дебютирует преимущественно в детском возрасте. АПС-1 характеризуется развитием как минимум двух из трех основных компонентов: хронического слизисто-кожного кандидоза, гипофункции паращитовидных желез и первичной недостаточности надпочечников (болезни Аддисона), а также возможным проявлением других иммуноопосредованных заболеваний [Husebye, Е.S., Anderson, М.S., &  (2018). Autoimmune Polyendocrine Syndromes. New England Journal of Medicine, 378(12), 1132-1141. https://doi.org/10.1056/NEJMra1713301]. Критерием диагностики АПС-1 является присутствие двух из трех характерных заболеваний, однако классическая диагностическая диада позволяет распознавать лишь небольшую часть новых случаев [Perheentupa, J. (2006). Autoimmune Polyendocrinopathy-Candidiasis-Ectodermal Dystrophy. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 91(8), 2843-2850. https://doi.org/10.1210/jc.2005-2611]. Диагноз АПС-1 может быть подтвержден генетическим тестированием, в настоящее время описано более 100 мутаций в гене AIRE [Bruserud, ∅., Oftedal, В.Е., Wolff, А.В., & Husebye, E.S. (2016). AIRE-mutations and autoimmune disease. Current Opinion in Immunology, 43, 8-15. https://doi.org/10.1016/j.coi.2016.07.003].
Выделяют также другие типы аутоиммунных полигландулярных синдромов (-2,-3 и т.д.) которые имеют отличный от АПС-1 патогенез заболевания, полигенный тип наследования, а эндокринопатии в большинстве случаев манифестируют во взрослом возрасте. Кроме того, по мере появления новых компонентов синдрома, диагноз может быть переклассифицирован из одного типа АПС в другой. Поэтому большинство специалистов выделяют единый тип АПС: АПС второго типа (АПС-2) или АПС взрослых (Husebye E.S., Anderson M.S., Autoimmune Polyendocrine Syndromes. N Engl J Med. 2018; № 378 (12):1132-1141). На практике нередко возникают сложности в дифференциальной диагностике АПС-1 и АПС-2 (нетипичная картина заболевания, неполная манифестации основных компонентов), а проведение молекулярно-генетической диагностики (особенно полное секвенирование гена AIRE) не всегда возможно. В таких случаях выявление циркулирующих аутоантител может быть эффективным диагностическим критерием АПС-1. В настоящее время установлено, что более чем у 95% пациентов с АПС-1 обнаруживаются аутоантитела к интерферонам первого типа, в том числе против интерферонов α2 и ω [Meager, A., Visvalingam, K., Peterson, Р.,  Krohn, K., Willcox, N. (2006). Anti-interferon autoantibodies in autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1. PLoS Medicine, 3(7), 1152-1164. https://doi.org/10.13711\ournal.pmed.0030289"]. Исследование антител к интерлейкину 22 также показало свою высокую эффективность в диагностике АПС-1 (определяются у 91% пациентов). При этом повышение данных антител ассоциировано с наличием кожно-слизистого кандидоза и, предположительно, является предиктором его развития [Kisand K, Wolff ASB,  et al., Chronic mucocutaneous candidiasis in APECED or thymoma patients correlates with autoimmunity to Th17-associated cytokines (2010). J. Exp. Med. 207(2), 299-308. https://doi.org/10.1084/iem.200916691]. Однако определение аутоантител против интерферонов первого типа и к интерлейкину 22 до сих пор доступно только в исследовательских лабораториях.
У пациентов с АПС могут быть выявлены органо-специфичные аутоантитела, обнаруживаемые при иных аутоиммунных заболеваниях  Myhre, A.G., Ekwall, О., Gebre-Medhin, G., Hedstrand, Н., Landgren, Е., Nilsson, Т. (2004). Prevalence and Clinical Associations of 10 Defined Autoantibodies in Autoimmune Polyendocrine Syndrome Type I. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 89(2), 557-562. https://doi.org/10.1210/ic.2003-0302791], [Landegren, N., Sharon, D., Freyhult, E., Hallgren, A., Eriksson, D., Edqvist, P.H., (2016). Proteome-wide survey of the autoimmune target repertoire in autoimmune polyendocrine syndrome type 1. Scientific Reports, 6 (October 2015), 1-11. https://doi.org/10.1038/srep20104]. Среди них антитела против глутаматдекарбоксилазы GAD-65, антитела к цитоплазматическому антигену островковых клеток ICA и тирозинфосфатазе IA2 при сахарном диабете первого типа (СД1) [Hansen, М.Р. (2015). Туре 1 diabetes and polyglandular autoimmune syndrome: A review. World Journal of Diabetes, 6(1), 67. https://doi.org/10.4239/wid.v6.il.671. антитела против 21-гидроксилазы (21-OH) при болезни Аддисона [Betterle, С, & Morlin, L. (2011). Autoimmune Addison's Disease (Vol. 20, pp. 161-172). https://doi.Org/10.1159/000321239], аутоантитела к тиреопероксидазе (ТРО) и тиреоглобулину (Tg) в случае аутоиммунных заболеваний щитовидной железы [Soh, S.-B., & Aw, Т.-С. (2019). Laboratory Testing in Thyroid Conditions - Pitfalls and Clinical Utility. Annals of Laboratory Medicine, 39(1), 3. https://doi.org/10.3343/alm.2019.39.l.3].
Из уровня техники известно множество способов, основанных на использовании биологических микрочипов (биочипов) для выявления аутоантител (например, CN 1338633 A "Protein chip for diagnosing autoimmune diseases", US 20050260770 A1 "Antigen array and diagnostic uses thereof, US 6159748 A "Evaluation of autoimmune diseases using a multiple parameter latex bead suspension and flow cytometry", CN 1866013 А "Liquid phase chip for parallel detection of autoantibodies, preparation method and application thereof). Однако в настоящее время ни один из заявленных способов не предназначен для выявления аутоантител, характерных для эндокринологических аутоиммунных синдромов. Наиболее разработанной областью мультиплексного иммуноанализа в случае аутоиммунных эндокринопатий является диагностика сахарного диабета первого типа. Так Amoroso и др. разработали систему «3 Screen» - метод, основанный на ИФА-анализе, предназначенный для комбинированного измерения аутоантител к GAD-65, к IA2 и к ZnT8 [Amoroso, М., Achenbach, P., Powell, M., Coles, R., Chlebowska, M., Carr, L., … Rees Smith, B. (2016). 3 Screen islet cell autoantibody ELISA: A sensitive and specific ELISA for the combined measurement of autoantibodies to GAD-65, to IA2 and to ZnT8. Clinica Chimica Acta, 462, 60-64. https://doi.Org/10.1016/i.cca.2016.08.0131]. В патенте CN1448724A "Type 1 diabetes related antigen-antibody simultaneous detection egg white slice" заявлен способ одновременного обнаружения антигенов и антител, соответствующих СД1, с помощью микрочипа, содержащего белки, закрепленные на твердой подложке, в том числе антиген вируса эпидемического паротита, В4 антиген вируса Коксаки, антиген краснухи, антиген респираторно-кишечного вируса, Tg, ТРО, рецептор тиреоидного гормона, антиген микросомальной фракции щитовидной железы, ICAs, IAAs, GADAs, IA-2As, поверхностный антиген островковых клеток, рецептор инсулина, Н-карбоксипептидаза, IA-2β, антитело против клубочковой базальной мембраны. Однако описанные методы не содержат аутоантигенов, специфичных для АПС-1.
Также опубликованы работы по применению планарных белковых микрочипов для исследования анти-цитокиновых антител и новых кандидатных-аутоантигенов. Rosenberg и соавторами создан планарный микрочип с 102 белками, который апробировали на 58 образцах сывороток крови, включая 7 образцов пациентов с АПС-1 [Rosenberg, J.М., Price, J.V., Barcenas-Morales, G., Ceron-Gutierrez, L., Davies, S., Kumararatne, D.S., … Utz, P.J. (2016). Protein microarrays identify disease-specific anti-cytokine autoantibody profiles in the landscape of immunodeficiency. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 137(1), 204-213.e3. https://doi.org/10.1016/i.jaci.2015.07.032]. Микрочипы высокой плотности для поиска новых серологических маркеров АПС-1 были использованы в работе Landegren и соавторов [Landegren, N., Sharon, D., Freyhult, E., Hallgren, A., Eriksson, D., Edqvist, P.H., (2016). Proteome-wide survey of the autoimmune target repertoire in autoimmune polyendocrine syndrome type 1. Scientific Reports, 6 (2015), 1-11. https://doi.org/10.1038/srep20104]. Авторы провели анализ сывороток 51 пациента с АПС-1 и 21 здорового донора для выявления аутоантител на белковых микрочипах, содержащих более 9000 полноразмерных белков (ProtoArray, ThermoFisher). Поиск новых серологических маркеров АПС-1 требует иммобилизации сотен молекул, такие микрочипы отличаются высокой себестоимостью, интерпретация результатов теста требует применения специальных математических методов, применение данных биочипов в рутинной клинической лабораторной практике с целью выявления АПС-1 нецелесообразно.
Gu и соавторами разработан мультиплексный анализ аутоантител к инсулину (IAA), GADA, IA2A и к тканевой трансглутаминазе (TGA), ТРО, Tg, IFNαA на основе электрохемилюминисценции [Gu, Y., Zhao, Z., Waugh, K., Miao, D., Jia, X., Cheng, J., … Yu, L. (2019). High-throughput multiplexed autoantibody detection to screen type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases simultaneously. EBioMedicine, 47, 365-372. https://doi.org/10.1016/i.ebiom.2019.08.0361. Метод основан на проведении конкурентного анализа аутоантител к семи иммобилизованным в лунке иммунологического планшета через специфической линкер антигенам. При инкубации образца биспецифичные аутоантитела из сыворотки крови связываются одновременно с иммобилизованными аутоантигенами и с добавленным в реакционную смесь аутоантигенами, меченными SULFO-TAG (Meso Scale Diagnostics, LLC, США). Авторы апробировали метод с использованием сывороток крови пациентов с СД1 (3 когорты: n=186, n=168, n=1022) и контрольных образцов (2 когорты: n=118, n=1026). Предложенный в работе Gu, et al. метод предназначен для скрининга маркеров сахарного диабета 1 типа и не апробирован на когорте пациентов с АПС-1. Более того, описанный микрочип включал только один специфичный для АПС-1 аутоантиген (интерферон α), а также не содержал аутоантиген 21-ОН, антитела к которому характерны для аутоиммунной надпочечниковой недостаточности, одного из мажорных компонентов АПС-1.
Из анализа уровня техники можно сделать вывод, что в настоящее время существует необходимость разработки способа выявления набора аутоантител, ассоциированных с АПС-1, который выгодно отличался бы от известных способов возможностью одновременного обнаружения различных аутоантител, как непосредственно характерных для АПС-1 (к интерферону омега, интерферону альфа-2-a, интерлейкину 22), так и органо-специфичных, а также отличался высокой скоростью и простотой проведения анализа.
Раскрытие сущности изобретения
В настоящем изобретении предложен способ выявления аутоантител в сыворотке крови, ассоциированных с аутоиммунным полигландулярным синдромом I типа, который выгодно отличается от известных из уровня техники способов возможностью одновременного обнаружения в сыворотке крови как специфичных для АПС-1 аутоантител к интерферону омега (IFN-ω), интерферону альфа-2-a (IFN-α-2-a), интерлейкину 22 (IL-22), так и органо-специфичных аутоантител к 21-гидроксилазе (21-ОН), глутаматдекарбоксилазе (GAD-65), цитоплазматическому антигену островковых клеткок поджелудочной железы (ICA), тирозинфосфатазе (IA2), тиреоглобулину (Tg), тиреопероксидазе (ТРО) с использованием гидрогелевого биочипа, представляющего собой матрицу трехмерных гидрогелевых элементов на подложке.
Технология гидрогелевых биочипов разработана в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ИМБ РАН) и основана на одновременном формировании гидрогелевых ячеек с иммобилизацией молекулярных зондов [Грядунов Д.А., Шаскольский Б.Л., Наседкина Т.В., Рубина А.Ю., Заседателев А.С. 2018. Технология гидрогелевых биочипов ИМБ РАН: 30 лет спустя. Acta Naturae. 10(4): 4-18. https://doi.org/10.32607/20758251-2018-10-4-4-181]. При этом молекулярные зонды равномерно распределены по всему объему ячейки. За счет развитой поверхности гидрогеля молекулярные зонды иммобилизованы с достаточной плотностью иммобилизации, однако, на значительном удалении друг от друга для нивелирования стерических эффектов. Структура геля предотвращает контакт соединений с гидрофобной подложкой, и обеспечивает нативное водное окружение биологических молекул. Таким образом, иммобилизация белков в геле стабилизирует их нативную структуру и биологическую активность, в противоположность двумерным носителям, которые не обеспечивают водное окружение для молекул белков. Данный метод подходит для иммобилизации белковых молекул и по своим характеристикам выгодно отличается от классических методов планарной иммобилизации [Rubina AY, Dementieva EI, Stomakhin AA, Darii EL, Pan'kov SV, Barsky VE, Ivanov SM, Konovalova EV, Mirzabekov AD. Hydrogel-based protein microchips: manufacturing, properties, and applications. Biotechniques. 2003 May; 34(5): 1008-14, 1016-20, 1022. https://doi.org/l0.2144/03345rr01].
Заявленный способ основан на проведении мультиплексного иммуноанализа образца сыворотки крови на гидрогелевом биочипе. Для выявления аутоантител проводят последовательно: инкубацию содержащего иммобилизованные аутоантигены гидрогелевого биочипа с образцом сыворотки крови, инкубацию с раствором меченных вторичных антивидовых антител против иммуноглобулинов человека класса G, регистрацию и обработку флуоресцентных сигналов, интерпретацию сигналов. Способ включает следующие стадии:
а) обеспечение биочипа, представляющего собой матрицу элементов, в которых иммобилизованы специфичные белки - аутоантигены (интерферон омега, интерферон альфа-2-a, интерлейкин 22, 21-гидроксилаза, глутаматдекарбоксилаза, цитоплазматический антиген островковых клеток, тирозинфосфатаза, тиреоглобулин, тиреопероксидаза, каждый - в группе из четырех отдельных элементов) к аутоантителам - иммуноглобулинам класса G, ассоциированным с аутоиммунным полигландулярным синдромом I типа, элементов, содержащих человеческий иммуноглобулин класса G и антивидовые антитела против иммуноглобулинов человека класса G, и группы контрольных элементов, не содержащих иммобилизованных белков;
б) взаимодействие образца сыворотки крови человека с элементами биочипа с образованием специфичных бинарных иммунных комплексов аутоантигенов, иммобилизованных в элементах биочипа, с аутоантителами, находящимися в образце сыворотки крови;
в) детекцию образовавшихся иммунных комплексов;
г) регистрацию и интерпретацию результатов анализа.
В одном из воплощений способ характеризуется тем, что биочип представляет собой подложку с гидрогелевыми элементами, полученными способом химической или фотоиндуцируемой сополимеризации, содержащими иммобилизованные белки. Перечень белков, используемых для изготовления биочипа, приведен в Таблице 1.
В другом воплощении способ характеризуется тем, что стадию (в) детекции иммунных комплексов в элементах биочипа проводят, добавляя флуоресцентно-меченные антивидовые антитела против иммуноглобулинов человека класса G с образованием тройного комплекса «иммобилизованный аутоантиген - аутоантитело - антивидовое флуоресцентно-меченное антитело».
В следующем воплощении способ характеризуется тем, что на стадии (г) регистрацию результатов проводят с использованием анализатора флуоресценции и программного обеспечения, регистрируя флуоресцентную картину и определяя значения флуоресцентных сигналов элементов биочипа, полученных в результате образования тройного комплекса на стадии (в).
В следующем воплощении способ характеризуется тем, что на стадии (г) интерпретации результатов, для каждой группы элементов, содержащих одинаковые аутоантигены, результирующее значение сигнала рассчитывают как медиану значений сигналов от четырех соответствующих элементов, а для группы контрольных элементов, не содержащих иммобилизованных белков, результирующее значение сигнала рассчитывают как медиану значений от сигналов соответствующих элементов.
В следующем воплощении способ характеризуется тем, что на стадии (г) интерпретации результатов, проводят анализ групп элементов, содержащих интерферон омега, интерферон альфа-2-a и интерлейкин 22, и в случае, если для двух и более белков отношение результирующего сигнала группы элементов с соответствующим иммобилизованным белком к результирующему сигналу группы контрольных элементов превышает пороговое значение, делают заключение о наличии в сыворотке крови соответствующих аутоантител, ассоциированных с аутоиммунным полигландулярным синдромом I типа.
Наконец, в еще одном своем воплощении способ характеризуется тем, что на стадии (г) интерпретации результатов, проводят анализ групп элементов, содержащих 21-гидроксилазу, глутаматдекарбоксилазу, цитоплазматический антиген островковых клеток, тирозинфосфатазу, тиреоглобулин, тиреопероксидазу, и в случае, если для одного или нескольких белков отношение результирующего сигнала группы элементов с соответствующим иммобилизованным белком к результирующему сигналу группы контрольных элементов превышает пороговое значение, делают заключение о наличии в сыворотке крови соответствующих органоспецифических аутоантител, характерных для других компонентов аутоиммунных полигландулярных синдромов, включая болезнь Аддисона, сахарный диабет 1 типа, аутоиммунные заболевания щитовидной железы.
Заявляемый способ позволяет одновременно выявлять необходимое и достаточное число аутоантител для скрининга АПС-1, что не требует проведения дополнительных тестов для подтверждения результатов.
Далее изобретение будет раскрыто подробнее со ссылками на фигуры, которые приводятся исключительно с целью иллюстрации и пояснения сущности заявленного изобретения, но которые не предназначены для ограничения объема притязаний.
Краткое описание фигур
Фигура 1. Схема размещения элементов биочипа для выявления аутоантител, ассоциированных с АПС-1. Элементы биочипа представлены в виде кругов. Биочип содержит функциональные группы элементов, каждая группа из которых состоит из четырех идентичных элементов. Функциональные группы включают элементы с иммобилизованными аутоантигенами, характерными для АПС-1 (элементы IFN-ω, IFN-α-2-а, IL-22), и с органо-специфичными аутоантигенами, характерными для компонентов синдрома (21-ОН, как маркер болезни Аддисона, GAD-65, ICA, IA2, как маркеры сахарного диабета 1 типа, Tg и ТРО, как маркеры аутоиммунных заболеваниях щитовидной железы). Характеристика аутоантигенов, иммобилизованных на биочипе приведена в таблице 1. Биочип также содержит элементы 'human igG' и 'anti-human igG' с иммобилизованными иммуноглобулинами класса G человека и антителами к ним, соответственно. Получение флуоресцентных сигналов от данных элементов является необходимым условием для контроля соблюдения условий проведения анализа, исключения грубых мануальных ошибок, а также контроля сохранности способности детектирующих антител узнавать свою мишень, а иммобилизованных белков сохранять свою биологическую активность. Контрольная группа из восьми элементов 'Empty', не содержащих иммобилизованных белков, предназначена для вычисления значения фонового сигнала. Биочип также включает 4 элемента, обозначенных 'М', содержащих флуоресцентный маркер для обработки сигналов элементов биочипа после проведения анализа.
Фигура 2. Примеры флуоресцентных изображений биочипа после анализа образца сыворотки крови здорового пациента (А), пациента с аутоиммунным заболеванием щитовидной железы (Б), пациента с изолированной болезнью Аддисона (В) и пациента с АПС-1 (Г).
Фигура 3. Пример репертуара аутоантител у пациентов с различными полиэндокринопатиями, а именно аутоиммунных полигландулярных синдромов 1 и 2 типа.
Фигура 4. Спектр выявленных аутоантител против интерферонов омега (А) и альфа (Б), а также интерлейкина-22 (В) у пациентов с АПС-1 и АПС-2.
Фигура 5. Аутоантитела против интерферонов омега (А) и альфа (Б), а также интерлейкина 22 (В) у пациентов, не имеющих диагностированного АПС-1.
Осуществление изобретения
Целью изобретения являлось создание способа одновременного выявления девяти аутоантител в сыворотке крови, ассоциированных с аутоиммунным полигландулярным синдромом I типа. Заявленный в данном изобретении способ заключается в обеспечении биочипа, содержащего как аутоантигены, специфичные для АПС-1, включая ИФН-ω, ИФН-α-2а, IL-22, так и органоспецифические аутоантигены, характерные для компонентов синдрома, а именно: 21-ОН, GAD-65, ICA, IA2, Tg и ТРО. Схема биочипа представлена на Фиг. 1. Каждый тип аутоантигенов иммобилизован в четырех одинаковых элементах, повторы используются для увеличения воспроизводимости анализа.
Биочип для осуществления заявляемого способа представляет собой матрицу трехмерных гидрогелевых элементов на подложке из стекла или пластика [Грядунов Д.А., Шаскольский Б.Л., Наседкина Т.В., Рубина А.Ю., Заседателев А.С. 2018. Технология гидрогелевых биочипов ИМБ РАН: 30 лет спустя. Acta Naturae. 10(4): 4-18. https://doi.org/10.32607/20758251-2018-10-4-4-181]. Технология основана на иммобилизации молекул в трехмерных ячейках в виде микрокапель, закрепленных на твердой подложке. Макропористая структура гидрогелевых элементов формируется за счет сополимеризации мономера - производного метакриловой кислоты, бифункционального кроссшивающего агента и иммобилизуемых молекул. При этом белковые молекулы не нуждаются в дополнительной модификации, поскольку имеют в своей структуре соответствующие функциональные группы аминокислот (N-концевые аминогруппы, ε-аминогруппы лизинов, сульфгидрильные группы цистеинов и др.). Для белков подобраны условия полимеризации (длина волны при фотополимеризации, температура) позволяющие максимально сохранить их исходную биологическую активность. Ячейки с иммобилизованными белками располагаются рядами на подготовленных стеклянных подложках. Контроль качества нанесения осуществляется с помощью специализированной оптики и компьютерного анализа изображения.
n
ref
n
ref
n
ref
n
ref
Для выявления аутоантител, ассоциированных с АПС-1, проводят последовательно: инкубацию содержащего иммобилизованные аутоантигены гидрогелевого биочипа с анализируемым образцом, инкубацию с флуоресцентно-меченным вторичным антивидовым антителом против иммуноглобулинов человека класса G, регистрацию флуоресцентных сигналов элементов биочипа и их интерпретацию. Анализируемый образец представляет собой сыворотку крови человека, предварительно разведенный в 100 раз буфером 100 мМ Трис-HCl с 0.1% Triton Х-100. Во время инкубации ячеек биочипа с образцом происходит образование бинарных комплексов «иммобилизованный аутоантиген - специфическое аутоантитело». Инкубацию с образцом проводят при 37°С в течение ночи, поскольку установлено, что через 16 часов инкубации на гидрогелевом биочипе процесс формирования бинарных комплексов «антиген-антитело» выходит на насыщение [Rubina AY, Kolchinsky A, Makarov АА, Zasedatelev AS. Why 3-D? Gel-based microarrays in proteomics. Proteomics, 8(4), 817-831 (2008). https://doi.org/10.1002/pmic.2007006291]. После отмывки непрореагировавших компонентов реакции, связавшиеся с иммобилизованными аутоантигенами аутоантитела детектируют антивидовыми флуоресцентно-меченными антителами. Экспериментально установлено, что оптимальная рабочая концентрация детектирующих антивидовых антител составляет 5 мкг/мл при 37°С, время инкубации 30 мин. Во время инкубации ячеек биочипа с антивидовыми флуоресцентно-меченными антителами происходит образование тройных комплексов «иммобилизованный аутоантиген - специфическое аутоантитело - антивидовое флуоресцентно-меченное антитело». После финальной отмывки проводят регистрацию флуоресцентных изображений биочипов, используя анализаторы флуоресценции или сканеры микрочипов со специальным программным обеспечением, позволяющим вычислить значения флуоресцентного сигнала каждого элемента биочипа. Интерпретацию результатов выполняют посредством сравнения интенсивностей сигналов элементов с иммобилизованными аутоантигенами и интенсивностей сигналов элементов контрольной группы, не содержащих белков. Для каждой функциональной группы элементов n, содержащих одинаковые иммобилизованные антигены, результирующее значение сигнала I рассчитывают как медиану значений от четырех соответствующих элементов. В контрольной группе из восьми элементов 'Empty', не содержащих иммобилизованных белков, результирующее значение сигнала I рассчитывают как медиану значений от 8 соответствующих сигналов элементов. Наличие аутоантитела в сыворотке крови определяют в случае, если отношение результирующего сигнала I к результирующему сигналу I превышает пороговое значение. Экспериментально установлены пороговые значения, характеризующие наличие аутоантител в сыворотке крови по результатам анализа с использованием заявленного способа: I/I ≥ 5,0 для IFN-ω, IFN-α-2a, IL-22 и I/I ≥ 2,0 для 21-ОН, GAD-65, IA2, ICA, Tg и ТРО.
Заявленный способ выявления аутоантител, характерных для аутоиммунных заболеваний, обеспечивает возможность скрининга образцов крови от пациентов на наличие АПС-1 посредством одновременного выявления 9 различных аутоантител. Способ позволит существенно упростить и удешевить выявление АПС-1 в случаях неполной или скрытой клинической манифестации компонентов синдрома.
Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами, которые предназначены для обеспечения лучшего понимания сущности заявленного изобретения, но не должны рассматриваться как ограничивающие данное изобретение
Пример 1. Выявление аутоантител в сыворотках крови пациентов с помощью гидрогелевого биочипа
Гидрогелевые биочипы изготавливали методом сополимеризационной иммобилизации по ранее разработанной методике, описанной выше [Rubina, A.Y., Filippova, М.A., Feizkhanova, G.U., Shepeliakovskaya, А.О., Sidina, Е.I., Boziev, K.М., … Grishin, Е.V. (2010). Simultaneous detection of seven staphylococcal enterotoxins: Development of hydrogel biochips for analytical and practical application. Analytical Chemistry, 82(21), 8881-8889. https://doi.org/10.1021/ас10166341. Схема размещения элементов изготовленного биочипа для выявления аутоантител, ассоциированных с АПС-1, приведена на Фигуре 1.
Для проведения анализа образцы сывороток крови пациентов разводили 1:100 буфером 100 мМ Трис-HCl с 0.1% Triton Х-100, 120 мкл вносили в реакционную камеру биочипа. После инкубации с образцом в течение ночи при 37°С, промежуточной отмывки (PBS с 0,01% Tween 20, 20 мин), споласкивания и высушивания, биочипы проявляли флуоресцентно-меченными антивидовыми антителами (5 мкг/мл; F(ab')2-Goat anti-Human IgG-Cy5; 50 мкл) в буфере PBS с 0,14% поливинилового спирта (50 кДа) и 0,14% поливинилпирролидона (360 кДа). После инкубации (30 мин, 37°С) биочипы отмывали (PBS с 0,01% Tween 20, 30 мин), споласкивали, высушивали центрифугированием. Флуоресцентные изображения биочипов получали с помощью биочип-анализатора с лазерным возбуждением, разработанного в ИМБ РАН, Москва [Lysov, Y., Barsky, V., Urasov, D., Urasov, R., Cherepanov, A., Mamaev, D., … Zasedatelev, A. (2017). Microarray analyzer based on wide field fluorescent microscopy with laser illumination and a device for speckle suppression. Biomedical Optics Express, 8(11), 4798. https://doi.org/10.1364/boe.8.0047981]. Вычисление флуоресцентных сигналов осуществляли с помощью программного обеспечения Image Assay (ИМБ РАН, Москва).
Tg
ref
TPO
ref
21-OH
ref
IFN-ω
ref
IFN-α-2a
ref
IL-22
ref
21-OH
ref
GAD-65
ref
Tg
ref
TPO
ref
Фигура 2 иллюстрирует флуоресцентные изображения биочипов после проведения анализа сывороток крови здорового донора (А) и сывороток крови пациентов, страдающими разными эндокринопатиями, такими как болезнь Аддисона (Б), аутоиммунный тиореоидит (В), АПС-1 (Г). Для образца сыворотки крови здорового пациента (А) наблюдали отсутствие сигналов от функциональных групп элементов, содержащих иммобилизованные аутоантигены. Для образца сыворотки пациента с аутоиммунным заболеванием щитовидной железы (Б) сигналы от групп элементов с иммобилизованными антигенами Tg и ТРО превышали пороговое значение, т.е. выполнялось условие I/I ≥ 2,0; I/I ≥ 2,0, сигналы других элементов функциональных групп не превышали сигналов элементов контрольной группы. Для образца сыворотки пациента с изолированной болезнью Аддисона (В) было выполнено условие I/I ≥ 2,0, что соответствовало наличию аутоантител к 21-гидроксилазе, характерных для данной патологии. Сигналы других элементов функциональных групп не превышали сигналов элементов контрольной группы. Анализ образца сыворотки крови пациента с АПС-1 (Г) выявил превышение пороговых значений для следующих групп элементов I/I ≥ 5,0; I/I ≥ 5,0; I/I ≥ 5,0, что свидетельствовало о присутствии в образце от пациента соответствующих специфичных для АПС-1 аутоантител. Кроме того, зарегистрировано превышение пороговых значений I/I ≥ 2,0; I/I ≥ 2,0; I/I ≥ 2,0; I/I ≥ 2,0, подтверждающее наличие органо-специфических аутоантител к 21-ОН, GAD-65, TG and ТРО.
Для всех образцов флуоресцентные изображения которых представлены на Фиг. 2, зарегистрированы сигналы элементов биочипа 'anti-human IgG' и 'human IgG'. При проведении анализа на стадии взаимодействия образца сыворотки крови с элементами биочипа, иммобилизованные в элементе 'anti-human IgG' антивидовые антитела к иммуноглобулину класса G человека взаимодействуют с аутоантителами класса G, формируя бинарные комплексы «иммобилизованные антивидовые антитела - антитела класса G из сыворотки крови». На стадии детекции образовавшихся иммунных комплексов в элементе 'anti-human IgG', образуются тройные комплексы «иммобилизованные антивидовые антитела- антитела класса G из сыворотки крови - флуоресцентно-меченные детектирующие антивидовые антитела», а в элементах биочипа 'human IgG', содержащих иммуноглобулина класса G человека, образуются двойные комплексы «иммобилизованные антитела класса G человека - флуоресцентно-меченные детектирующие антивидовые антитела».
Пример 2. Обнаружение органоспецифических аутоантител с помощью заявляемого способа и референсного метода на основе иммуноферментного анализа (ИФА)
Заявляемым способом были проанализированы образцы сывороток крови от 206 пациентов: АПС1 (n=18), АПС2 (n=39), изолированная аутоимунная эндокринная патология (n=50), неаутоиммунная эндокринная патология (n=71), условно здоровые (n=28). Характеристики пациентов приведены в Таблице 2. Все образцы были измерены также методом ИФА для выявления аутоантител к 21-ОН (BioVendor, Czech Republic), GAD-65 (Euroimmun AG, Германия и Biomerica Inc., США), IA2 (Medipan Gmbh, Германия), ICA (Medipan Gmbh, Германия), ТРО (Abbott Laboratories, США), Tg (Roche Diagnostics, Germany). Сравнение результатов, полученных с использованием ИФА и заявляемого способа показало, что совпадение двух методов при детекции органо-специфических антител варьировалось в пределах от 69,8% до 94% (69,8% для 21-ОН, 80,0% для GAD-65, 77,3% для IA2, 90,0% для ICA, 94,6% для Tg, 87,7% для ТРО), что позволяет использовать разработанный биочип для скрининга органо-специфических аутоантител в сыворотке крови.
Пример 3. Сравнение репертуара аутоантител у пациентов с полиэндокринопатиями
Заявленным способом было проведено сравнение результатов выявления аутоантител в образцах пациентов с диагностированным АПС-1 (n=18) и пациентов из группы сравнения с АПС-2 (n=38). АПС-2, также как и АПС-1, редко дебютирует двумя и более заболеваниями одновременно, полная клиническая картина синдрома также может проявляться в течение многих лет. Кроме того серодиагностика синдромов также затруднена, поскольку наличие орган-специфических аутоантител не всегда указывает на недостаточность соответствующей железы. В этой связи, выявление более одного аутоантитела к тканям железы несет большую диагностическую ценность. С помощью разработанного способа показаны статистически значимые различия для уровней аутоантител к интерферонам INF-ω (Р<0,0001), INF-α-2a (Р<0,0001), интерлейкину IL-22 (Р<0,0001) для пациентов с аутоимунными полигландулярными синдромами 1 и 2 типов (Фигура 3).
Пример 4. Выявление аутоантител против IFN-ω, IFN-α-2a и IL-22
С помощью заявляемого способа было проанализировано 206 образцов пациентов и здоровых доноров, при этом 18 образцов были получены от пациентов с АПС-1 (Таблица 2). Согласно заявленному способу, на стадии интерпретации результатов, был проведен анализ групп элементов, содержащих интерферон омега, интерферон альфа-2-a и интерлейкин 22. В случае если для двух и более белков отношение результирующего сигнала группы элементов с соответствующим иммобилизованным белком к результирующему сигналу группы контрольных элементов превышало пороговое значение ≥ 5,0, делали заключение о наличии в сыворотке крови соответствующих аутоантител, ассоциированных с АПС-1, а результат теста считали положительным. Для обследованной когорты пациентов не было выявлено ни одного ложноотрицательного результата среди 18 пациентов с АПС-1 и был выявлен 1 ложноположительный результат среди 188 пациентов без диагностированного АПС-1. Таким образом, диагностическая специфичность и чувствительность мультиплексного метода определения аутоантител в данной когорте пациентов составили 99,5% и 100% для АПС-1, соответственно.
Из 18 пациентов с АПС-1, у 16 с помощью заявляемого способа выявлен триплет аутоантител IFN-ω+IFN-α-2a+IL-22 (Фигура 4). У двух пациентов с АПС-1 определены одновременно аутоантитела к IFN-ω и IFN-α-2a. При этом связать отсутствие аутоантител к IL-22 у данных двух пациентов с клиническими признаками и результатами генетического тестирования не удалось.
Среди 188 образцов от пациентов из групп сравнения, не имеющих диагностированного АПС-1, превышение порогового значения ≥ 5,0 для аутоантител к IFN-ω, IFN-α-2a и/или IL-22 зафиксировано в трех образцах (Фигура 5). У одного пациента (женщина, 56 лет) с диагностированным первичным гиперпаратиреозом и многоузловым зобом выявлены повышенные аутоантитела к интерлейкину 22. У второго пациента (женщина, 45 лет) с генетически доказанным синдромом МЭН-1 (первичный гиперпаратиреоз; множественные инсулиномы, нефункционирующие опухоли поджелудочной железы, гастриномы 12-перстной кишки; карциноиды легких, мультифокальные гормонально - неактивные образования обоих надпочечников, гиперпролактинемия) выявлены аутоантитела к IFN-α-2a. В образце сыворотки крови третьего пациента выявлены аутоантитела к интерферонам IFN-ω и IFN-α-2a, при этом аутоантитела к IL-22 определены не были. У данного пациента (мужчина, 70 лет) был диагностирован первичный гипокортицизм неаутоимунного генеза вследствие впервые выявленной лимфомы надпочечников, что было подтверждено данными КТ надпочечников, а также нормальным уровнем аутоантител к 21-ОН. Других патологий выявлено не было. Генетическое тестирование на наличие мутаций в гене AIRE для данных пациентов не проводилось.
Стоит отметить, что ни в одном образце от пациентов из групп сравнения не были выявлены триплеты аутоантител IFN-ω+IFN-α-2a+IL-22.