ПОРОШКОВЫЕ БЕЛКОВЫЕ КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
PROTEIN POWDER COMPOSITIONS AND METHODS FOR PREPARING THEM

Родственные заявки
По данной заявке испрашивается приоритет по предварительной патентной заявке США номер 61/021298, поданной 15 января 2008 г., полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.
Уровень техники изобретения
et al., Pharm. Res.
Основным принципом фармацевтических белковых препаратов является то, что должна быть преодолена определенная нестабильность. Пути деградации белков можно разделить на два типа, включающих химическую нестабильность и физическую нестабильность. Химическая нестабильность приводит к изменению белка за счет образования связей или расщепления. Примеры проблем, связанных с химической нестабильностью, включают дезамидирование, рацемизацию, гидролиз, окисление, бета-элиминирование и дисульфидный обмен. Физическая нестабильность, с другой стороны, не приводит к ковалентным изменениям в белках. Скорее, она связана с изменениями в структуре высшего порядка (вторичная и выше) белков. К ним относятся денатурация, адсорбция на поверхности, агрегация и преципитация. Manning  6, 903 (1989).
Next generation pharmaceutical
После открытия структуры ДНК Уотсоном и Криком (1953) и последующего завершения проекта секвенирования человеческого генома интерес к химии белка рос быстрыми темпами. Отношения между генами и их белковыми продуктами при заболеваниях, в тканях и при развитии вызывали особый интерес. , выпуск 6 (GDS publishing Ltd., 2006). За прошедшие десятилетия количество фармацевтических препаратов на основе белков увеличивалось очень быстро. В настоящее время некоторые белки или пептиды можно выделять или синтезировать, модифицировать и доставлять для ослабления или исцеления определенных нарушений и заболеваний. Основным способом применения фармацевтических препаратов на основе белков по-прежнему является внутривенное введение жидких препаратов, однако протестированы и применяются также и другие способы.
et al.,
The Drug Delivery Companies Report
et al., Journal of Pharm. Sci.
et al., Pharm. Res.
Было предпринято много усилий для перевода белковых растворов в твердые формы. Порошковые композиции имеют много преимуществ, например, большие количества белка можно хранить или транспортировать, так как они занимают меньше места и имеют меньший вес, и при этом расходуется энергии меньше, чем требуется для охлаждения жидких препаратов во время хранения и доставки. Порошковые композиции также легче использовать в новых способах доставки, таких как ингаляция (Tzannis  международная публикация № WO 2005067898) или безыгольная инъекция (Burkoth,  76-78 (2001)). Для получения порошков из водных растворов белков используют различные методы, среди них распылительная сушка, распылительная сублимационная сушка, сублимационная сушка или осаждение из сверхкритических жидкостей, либо (частично) органических растворов. Winters  85(6): 586-594 (1996). В отличие от сублимационной сушки, которая является очень дорогой и трудоемкой процедурой, распылительная сушка является эффективным, действенным способом получения нагруженных белком сухих веществ, которые предоставляют возможности для разработки новых форм доставки биофармацевтических препаратов, таких как ингаляция. Maa  16(2): 249-254 (1999).
При распылительной сушке чистого белкового раствора существует риск возникновения частичной инактивации, которая автоматически приводит к снижению качества фармацевтических препаратов. Инактивация, например, может быть вызвана процессом, связанным с физическим стрессом из-за высоких температур, напряжения сдвига и больших поверхностей раздела фаз (жидкость/газ), такая как денатурация или агрегация, либо химическими реакциями, например, гидролизом или окислением.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к способам распылительной сушки белковых препаратов, содержащих белок и эксципиент. В частности, способы и композиции по изобретению основаны на методе распылительной сушки, в котором раствор, содержащий интересующий белок и эксципиент, сушат распылением.
Препарат по изобретению обладает многими преимуществами по сравнению со стандартными растворами и лиофилизированными препаратами. В частности, способы распылительной сушки по изобретению сводят к минимуму связанную с процессом деградацию и повышают стабильность белков при температуре окружающей среды (например, по сравнению с сублимированными композициями). Кроме того, высушенные распылением препараты также легче перевозить, и они пригодны для производства высококонцентрированных препаратов, улучшая биодоступность белка, и разработки препаратов с локальным высвобождением (например, с доставкой в легкие) и замедленным высвобождением (например, липосомные и покрытые PLGA (поли(D,L-лактид-ко-гликолид) микросферы).
in vivo
in vitro
Способы и композиции по изобретению можно использовать для получения стабильной порошковой композиции или препарата, содержащих любой интересующий белок и эксципиент. В одном аспекте способы и композиции по изобретению используют для антител и их фрагментов, включая те, которые применяют  и . В дополнительном варианте осуществления фрагмент антитела представляет собой фрагмент иммуноглобулина G (IgG).
Кроме того, многостадийные способы очистки и концентрирования, необходимые для получения белковых и пептидных препаратов, часто являются причиной вариабельности композиций, такой, что точный состав препарата может варьировать от партии к партии. Федеральное законодательство требует, чтобы композиции лекарственных средств были в высшей степени унифицированными по своему составу, независимо от места производства и номера партии. Способы по изобретению можно использовать для создания порошковых препаратов белков, к которым добавляют эксципиенты в точных количествах, что позволяет создавать белковые препараты с точными концентрациями эксципиентов.
В одном аспекте изобретение относится к способу получения порошкового белка или пептида, который включает распылительную сушку раствора, содержащего более чем примерно 50 мг/мл белка или пептида и по меньшей мере один эксципиент, так что получается порошковый белок или пептид. В некоторых вариантах осуществления раствор содержит более чем примерно 100 мг/мл белка или пептида. Белок может также представлять собой связывающий белок с двойным вариабельным связывающим доменом (DVD).
В некоторых вариантах осуществления способ включает получение порошкового антитела, которое включает распылительную сушку раствора, содержащего более чем примерно 50 мг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и по меньшей мере один эксципиент, так что получается порошковое антитело. В некоторых вариантах осуществления раствор содержит более чем примерно 100 мг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой иммуноглобулин G (IgG), например, MAK 195F, адалимумаб, ABT-325, ABT-308 или ABT-147. В некоторых вариантах осуществления порошок стабилен при температуре и влажности окружающей среды в течение по меньшей мере трех месяцев и/или стабилен при 40°C в течение по меньшей мере трех месяцев.
Эксципиент может включать, например, трегалозу, сахарозу, сорбит, полиэтиленгликоль, по меньшей мере одну аминокислоту, гистидин, аланин, аргинин, глицин или их смесь. В некоторых вариантах осуществления раствор имеет соотношение эксципиент:белок от примерно 0,27:1,0 до примерно 2,8:1,0; от примерно 0,27:1,0 до примерно 1,4:1,0; от примерно 0,27:1,0 до примерно 0,7:1,0 или соотношение примерно 0,7:1,0. В некоторых вариантах осуществления раствор содержит от примерно 20 до примерно 30 мМ эксципиента или примерно 25 мМ эксципиента.
in
out
in
out
В некоторых вариантах осуществления способ включает распылительную сушку с температурой входящего воздуха (T) от примерно 100°C до примерно 180°C, и температурой воздуха на выходе (T) от примерно 60°C до примерно 110°C. В некоторых вариантах осуществления способ включает распылительную сушку с T примерно 130°C и T примерно 80°C. Способ может включать, например, распыление раствора с образованием капель раствора, высушивание капель газом с образованием порошка и извлечение порошка из газа. Способ может включать распыление раствора при помощи распылителя с нагнетательным соплом и/или отделение и извлечение порошкового антитела из газа при помощи циклонного сепаратора.
Способ может также включать помещение порошкового антитела в фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемый носитель может быть приемлемым для парентерального, перорального, энтерального и/или местного введения. Фармацевтически приемлемый носитель может включать жидкость, такую как вода.
В другом аспекте изобретение направлено на создание фармацевтического препарата, который содержит эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, полученного любым из способов, описанных в данном документе. В еще одном аспекте изобретение направлено на создание фармацевтического препарата, который содержит эффективное количество белка или пептида, полученного любым из способов, описанных в данном документе.
В еще одном аспекте изобретение относится к стабильной порошковой композиции, содержащей белок или пептид и эксципиент, где композиция содержит менее чем примерно 6% остаточной влаги, в некоторых вариантах осуществления - менее чем примерно 4% или 3% остаточной влаги. Белок или пептид может включать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, например, антитело IgG или его антигенсвязывающий фрагмент, такое как, например, MAK 195F, адалимумаб, ABT-325, ABT-308 или ABT-147. Белок может также представлять собой связывающий белок с двойным вариабельным связывающим доменом (DVD).
В некоторых вариантах осуществления порошковая композиция стабильна при температуре и влажности окружающей среды в течение по меньшей мере трех месяцев и/или примерно при 40°C в течение по меньшей мере трех месяцев. В некоторых вариантах осуществления белок или пептид, или антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент сохраняет свою биологическую активность.
Эксципиент может включать трегалозу, сахарозу, сорбит, полиэтиленгликоль, по меньшей мере одну аминокислоту, гистидин, аланин, аргинин, глицин или их смесь. Композиция может иметь массовое соотношение эксципиента (например, трегалозы и/или сахарозы) и антитела или его антигенсвязывающего фрагмента от примерно 0,27:1,0 до примерно 2,8:1,0, от примерно 0,27:1,0 до примерно 1,4:1,0, от примерно 0,27:1,0 до примерно 0,7:1,0 или примерно 0,7:1,0. Композиция может иметь массовое соотношение эксципиента (например, сорбита) и антитела или его антигенсвязывающего фрагмента от примерно 0,27:1,0 до примерно 2,8:1,0, от примерно 0,27:1,0 до примерно 1,4:1,0, от примерно 0,27:1,0 до примерно 0,7:1,0 или примерно 0,7:1,0, или примерно 0,35:1.
В еще одном аспекте изобретение относится к способу производства фармацевтической композиции, который включает смешивание эффективного количества стабильной порошковой композиции по изобретению с фармацевтически приемлемым носителем, например, жидкостью, такой как вода. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция адаптирована для парентерального, перорального, энтерального или местного введения. Способ может дополнительно включать обработку стабильной порошковой композиции при температуре значительно выше температуры окружающей среды (например, экструзия расплава) без существенного влияния на стабильность порошковой композиции.
В некоторых вариантах осуществления способ включает покрытие порошковой композиции, например, полимером, таким как PLGA, для получения фармацевтической композиции с замедленным высвобождением или отсроченным высвобождением. Дополнительно или альтернативно, способ может включать покрытие энтеросолюбильным покрытием. В некоторых вариантах осуществления активность белка, пептида, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента защищена эксципиентом от преципитации, денатурации или окисления органическими растворителями, например, PEG 400, этанолом, DMSO, NMP или ледяной уксусной кислотой.
В настоящее время почти все компании используют замороженные нерасфасованные композиции лекарственных средств и сталкиваются с такими проблемами, как воспроизводимость условий замораживания и оттаивания, непредвиденная кристаллизация эксципиентов в составе нерасфасованной субстанции лекарственного средства, сдвиг pH буферного раствора в процессе замораживания, а также длительный период задержки в связи с оттаиванием, например, 2-литрового контейнера при температурах примерно 37°C. Использование высушенных распылением сыпучих композиций лекарственных средств поможет избежать указанных проблем. Кроме того, высушенные распылением сыпучие композиции лекарственных средств очень удобны для обработки в процессе составления конечной композиции лекарственного средства и делают возможным производство в широком диапазоне концентраций. В дополнение к этому, высушенные распылением композиции лекарственных средств, к которым только добавляют воду, могут заменять классическое составление препаратов и, вследствие этого, снижают риск при производстве лекарственного средства и в то же время способствуют увеличению производственной мощности. Кроме того, полноразмерные/полные антитела могут быть менее подвержены физической деградации по сравнению с фрагментами моноклонального антитела (мАТ) (mAb). Вдобавок, как правило, существует небольшое, или полностью отсутствует, увеличение физической или химической деградации с увеличением концентрации белка вплоть до 100 мг/мл. Поскольку более концентрированные растворы повышают эффективность процесса, использование концентраций белка 100 мг/мл будет полезно.
Краткое описание чертежей
Эти и другие особенности и преимущества способов и композиций, раскрытых в данном документе, будут более понятны со ссылкой на следующее подробное описание в сочетании с прилагаемыми чертежами, где:
на фигуре 1 представлена распылительная сушилка Büchi B-191, используемая в примерах;
g
на фигуре 2 представлен выход и T различных смесей сорбит-MAK;
на фигуре 3 представлена агрегация, кристалличность и содержание воды для различных смесей сорбит-MAK;
на фигуре 4 представлены изображения сканирующей электронной микроскопии (SEM) смесей сорбит-MAK 3000x (a) 25 мМ, (b) 100 мМ;
g
на фигуре 5 представлен выход и T различных смесей трегалоза-MAK;
на фигуре 6 представлена агрегация, кристалличность и содержание воды для различных смесей трегалоза-MAK;
на фигуре 7 представлены изображения SEM смесей трегалозы (3000x) (a) 10 мМ трегалоза, (b) 100 мМ трегалоза и (c) высушенная распылением чистая трегалоза;
g
на фигуре 8 представлен выход и T различных смесей сахароза-MAK;
на фигуре 9 представлена агрегация, кристалличность и содержание воды для различных смесей сахароза-MAK;
на фигуре 10 представлены данные эксклюзионной хроматографии (SEC) о физической стабильности для высушенных распылением препаратов MAK 195F: (A) влияние сорбита, трегалозы и сахарозы, и (B) влияние концентрации стабилизатора на степень агрегации белка; и
на фигуре 11 представлено влияние обработки и хранения в течение 3 месяцев (A) на физическую стабильность и (B) на химическую стабильность для высушенных распылением высококонцентрированных MAK 195F, адалимумаба и ABT-325 в 200 мМ растворах трегалозы.
Подробное описание изобретения
I. Определения
Для того чтобы сделать настоящее изобретение более понятным, сначала дается определение некоторым терминам.
Термин «кислый компонент», используемый в данном документе, означает вещество, включая раствор, имеющее кислый pH, то есть менее чем 7,0. Примеры кислых компонентов включают фосфорную кислоту, соляную кислоту, уксусную кислоту, лимонную кислоту, щавелевую кислоту, янтарную кислоту, винную кислоту, молочную кислоту, яблочную кислоту, гликолевую кислоту и фумаровую кислоту.
Термин «антиоксидант», используемый в данном документе, должен означать вещество, которое ингибирует окисление или действует как синергист антиоксиданта, и, таким образом, используется для предотвращения порчи препаратов вследствие окислительного процесса. Такие соединения включают в качестве примера и без ограничений альфа-токоферол (витамин E), аскорбиновую кислоту, аскорбилпальмитат, лимонную кислоту, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, эдетовую кислоту (ЭДТА, эдетат) и ее соли, гидрофосфористую кислоту, яблочную кислоту, монотиоглицерин, пропионовую кислоту, пропилгаллат, метионин, аскорбат натрия, цитрат натрия, сульфид натрия, сульфит натрия, бисульфит натрия, метабисульфит натрия и другие, известные рядовому специалисту в данной области.
Если в данном документе не указано иное, термины «композиция» и «препарат» используются взаимозаменяемо.
Термин «эксципиент» означает вещество, которое можно добавлять к препарату для обеспечения необходимой консистенции, например, для изменения объемных свойств, для улучшения стабильности и/или регулирования осмоляльности. Примеры наиболее часто используемых эксципиентов включают, но не ограничиваются ими, стабилизаторы, сахара, полиолы, аминокислоты, поверхностно-активные вещества, хелатообразующие вещества и полимеры.
Термин «лекарственное средство», используемый в данном документе со ссылкой на композицию, например, водный препарат, представляет собой препарат, полезный для лечения заболевания или нарушения.
in vitro
Термин «белок» должен включать последовательность аминокислот, в которой длина цепи является достаточной для образования более высоких уровней вторичной и/или третичной и/или четвертичной структуры. Это отличает его от «пептидов» или других низкомолекулярных молекул, которые не обладают такой структурой. Примеры белков, предусмотренных в рамках определения, используемого в данном документе, включают терапевтические белки. «Терапевтически активный белок» или «терапевтический белок» означает белок, который можно использовать для терапевтических целей, то есть для лечения нарушения у субъекта. Следует отметить, что в то время как терапевтические белки можно использовать в лечебных целях, изобретение не ограничивается только таким использованием, поскольку белки можно также использовать для исследований . В предпочтительном варианте осуществления терапевтический белок представляет собой слитый белок, либо антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В одном варианте осуществления способы и композиции по изобретению включают по меньшей мере два различных белка, которые определяют как два белка, имеющих различные аминокислотные последовательности. Дополнительные отличающиеся белки не включают продукты распада белка.
Термин «порошковый белок» означает композицию, содержащую белок, которую получают методами распылительной сушки по изобретению. «Порошковое антитело» означает композицию, содержащую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которую получают методами распылительной сушки по изобретению.
Термин «фармацевтический препарат» означает препарат, находящийся в такой форме, которая позволяет биологической активности активных ингредиентов сохранять эффективность, и, вследствие этого, его можно вводить субъекту для терапевтического применения.
Термин «раствор» означает смесь по меньшей мере одного эксципиента или белка, или пептида с жидкостью. Раствор может включать растворенные молекулы белка, коллоидные растворенные молекулы белка, дисперсные агрегаты белка или кристаллы, или осадки, или суспензии в жидкости, либо их сочетания.
Peptide and Protein Drug Delivery
Adv. Drug Delivery Rev.
«Стабильная» композиция представляет собой композицию, в которой, например, находящийся в ней белок в основном сохраняет свою физическую стабильность и/или химическую стабильность и/или биологическую активность при обработке и/или при хранении. В данной области применяются различные аналитические методы для измерения стабильности белка, и их обзор приведен, например, в , 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) и Jones, A.  10: 29-90 (1993). В одном варианте осуществления стабильность белка определяют по процентному содержанию мономера белка в растворе, с малым процентным содержанием деградированного (например, фрагментированного) и/или агрегированного белка. Например, водная композиция, содержащая стабильный белок, может содержать по меньшей мере 95% мономера белка. Альтернативно водная композиция по изобретению может содержать не более 5% агрегатов и/или деградированного белка.
Термин «стабилизатор» означает эксципиент, который улучшает или иным образом повышает стабильность. Стабилизаторы включают, но не ограничиваются ими, α-липоевую кислоту, α-токоферол, аскорбилпальмитат, бензиловый спирт, бисульфиты, бор, бутилированный гидроксианизол (BHA), бутилированный гидрокситолуол (BHT), аскорбиновую кислоту и ее сложные эфиры, каротиноиды, цитрат кальция, ацетил-L-карнитин, хелатообразующие вещества, хондроитин, хондроитинсульфат, лимонную кислоту, коэнзим Q-10, ЭДТА (этилендиаминтетрауксусную кислоту, эдетата динатрий), эриторбовую кислоту, фумаровую кислоту, алкилгаллаты, глюкозамин (хитозан, гиалуронат натрия), яблочную кислоту, метабисульфит, пропилгаллат, бисульфит натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия, сульфит калия, винную кислоту, тиосульфаты, тиоглицерин, токоферол и его сложные эфиры, например, токоферола ацетат, токоферола сукцинат, токотриенал, d-α-токоферола ацетат, витамин C и его сложные эфиры, витамин Е и его сложные эфиры, например, витамина Е ацетат, а также их сочетания.
Термин «модификатор тоничности», используемый в данном документе, должен означать соединение или соединения, которые можно использовать для регулирования тоничности жидкого препарата. Подходящие модификаторы тоничности включают глицерин, лактозу, маннит, декстрозу, хлорид натрия, сульфат магния, хлорид магния, сульфат натрия, сорбит, трегалозу, сахарозу, рафинозу, мальтозу и другие, известные рядовому специалисту в данной области. В одном варианте осуществления тоничность жидкого препарата приближена к тоничности крови или плазмы.
H
H1
H2
H3
L
L
H
L
H
L
Термин «антитело», используемый в данном документе, включает целые антитела и их любой антигенсвязывающий фрагмент (то есть «антигенсвязывающую часть») или одиночные цепи. «Антитело» означает гликопротеин, как правило, включающий по меньшей мере две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи, связанные между собой дисульфидными связями, или его антигенсвязывающий фрагмент. Термин «антитело» также включает его выделенные существующие в природе варианты. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначенной в данном документе V) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, C, C и C. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначенной в данном документе V) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, C. Области V и V можно дополнительно подразделять на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), перемежающиеся с областями, которые являются более консервативными и называются каркасными областями (FR). Каждая V и V состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбоксильному концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента.
L
H
L
H1
2
H
H1
L
H
H
L
L
H
L
H
а
et al.,
Nature
et al.
Science
et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Термин «антигенсвязывающий фрагмент» антитела (или просто «фрагмент антитела»), используемый в данном документе, означает один или несколько фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, TNFα, IL-12, IL-13). Антигенсвязывающая функция антитела может выполняться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, предусмотренных в рамках термина «антигенсвязывающий фрагмент» антитела, включают (i) Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов V, V, C и C; (ii) F(ab')-фрагмент, бивалентный фрагмент, включающий Fab-фрагменты, связанные дисульфидным мостом в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов V и C; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов V и V одного плеча антитела, (v) dAb-фрагмент (Ward  (1989)  341: 544-546), который состоит из домена V или V, и (vi) выделенную определяющую комплементарность область (CDR). Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, V и V, кодируются отдельными генами, их можно соединять, используя рекомбинантные методы, при помощи синтетического линкера, который дает им возможность находиться в составе одной белковой цепи, в которой области V и V образуют пары, формируя моновалентные молекулы (известные как одноцепочечные Fv (scFv), смотри, например, Bird  (1988)  242: 423-426, и Huston  (1988)  85: 5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также должны быть предусмотрены в рамках термина «антигенсвязывающий фрагмент» антитела. Такие фрагменты антитела получают общепринятыми методами, известными квалифицированным специалистам в данной области, и данные фрагменты подвергают скринингу на полезность таким же образом, как и интактные антитела. В одном варианте осуществления изобретения фрагмент антитела выбирают из группы, состоящей из Fab, Fd, Fd', одноцепочечного Fv (scFv), scFv и доменного антитела (dAb).
et al.
Human Antibodies and Hybridomas
et al.
Mol. Immunol.
2
Более того, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может являться частью большей по размеру молекулы иммуноадгезина, образованной ковалентной или нековалентной ассоциацией антитела или фрагмента антитела с одним или несколькими другими белками или пептидами. Эти другие белки или пептиды могут иметь функциональные группы, которые позволяют очищать антитела или их антигенсвязывающие фрагменты или дают им возможность связываться друг с другом или другими молекулами. Так, примеры таких молекул иммуноадгезинов включают использование активной зоны стрептавидина для создания тетрамерных молекул одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) (Kipriyanov  (1995)  6: 93-301) и использование остатка цистеина, маркерного пептида и C-концевого полигистидинового маркера для создания бивалентных и биотинилированных молекул scFv (Kipriyanov  (1994)  31: 1047-1058). Фрагменты антител, такие как Fab- и F(ab')-фрагменты, можно получать из целых антител общепринятыми методами, такими как расщепление папаином или пепсином, соответственно, целых антител. Кроме того, антитела, фрагменты антител и молекулы иммуноадгезинов можно получать при помощи стандартных методов рекомбинантной ДНК.
H
L
H
L
Два домена антитела являются «комплементарными», когда они принадлежат к семействам структур, которые образуют родственные пары или группы, или происходят из таких семейств и сохраняют эту особенность. Например, V-домен и V-домен антитела являются комплементарными, два V-домена не являются комплементарными и два V-домена не являются комплементарными. Комплементарные домены можно найти в других членах суперсемейства иммуноглобулинов, например, Vα и Vβ (или гамма и дельта) домены T-клеточного рецептора.
Термин «домен» означает свернутую белковую структуру, которая сохраняет свою третичную структуру независимо от остального белка. Как правило, домены отвечают за отдельные функциональные свойства белков, и во многих случаях могут добавляться, удаляться или переноситься на другие белки без утраты функции остальной части белка и/или домена. Под единичным вариабельным доменом антитела понимают свернутый полипептидный домен, содержащий последовательности, характерные для вариабельных доменов антитела. Вследствие этого, он включает вариабельные домены полного антитела и модифицированные вариабельные домены, например, в которых одна или две петли заменены последовательностями, которые не характерны для вариабельных доменов антитела, или вариабельные домены антитела, которые были укорочены или содержат N- или C-концевые дополнительные фрагменты, а также свернутые фрагменты вариабельных доменов, которые сохраняют, по меньшей мере частично, активность и специфичность связывания полноразмерного домена.
L
H
Вариабельные домены по изобретению можно комбинировать для образования группы доменов, например, можно комбинировать комплементарные домены, например, V-домены комбинируют с V-доменами. Некомплементарные домены также можно комбинировать. Домены можно комбинировать множеством способов, включая соединение доменов ковалентным и нековалентным образом.
H
L
«dAb» или «доменное антитело» означает полипептид одного вариабельного домена антитела (V или V), который специфически связывает антиген.
Термин «антигенсвязывающая область» или «антигенсвязывающий центр», используемый в данном документе, означает часть(ти) молекулы антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которая содержит аминокислотные остатки, взаимодействующие с антигеном, и придает антителу его специфичность и/или аффинность для антигена.
Термин «эпитоп» должен означать ту часть любой молекулы, которая способна узнаваться и связываться антителом в одной или нескольких антигенсвязывающих областях антитела. В контексте настоящего изобретения, под первым и вторым «эпитопами» понимают эпитопы, которые не являются одинаковыми и не связываются одним моноспецифическим антителом или его антигенсвязывающим фрагментом.
et al.
Nucl. Acids Res.
Словосочетание «рекомбинантное антитело» означает антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют рекомбинантными методами, такие как антитела, экспрессируемые при помощи рекомбинантного экспрессионного вектора, трансфицированного в клетку-хозяина, антитела, выделенные из комбинаторной библиотеки антител, антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным по генам иммуноглобулина человека (смотри, например, Taylor  (1992)  20: 6287-6295), или антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими способами, включающими сплайсинг конкретных последовательностей генов иммуноглобулинов (таких как последовательности генов иммуноглобулинов человека) с другими последовательностями ДНК. Примеры рекомбинантных антител включают химерные, CDR-привитые и гуманизированные антитела.
et al.
et al
Sequences of Proteins of Immunological Interest
in vitro
in vivo
Термин «человеческое антитело» означает антитела, имеющие вариабельные и константные области, соответствующие или происходящие из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека, как описано, например, в Kabat  (смотри Kabat, . (1991) , Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Однако человеческие антитела по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулинов зародышевой линии человека (например, мутации, внесенные в результате случайного или сайт-специфического мутагенеза  или в результате соматической мутации ), например, последовательности CDR и, в частности, CDR3.
Sequences of Proteins of Immunological Interest
in vitro
in vivo
in vivo
H
L
H
L
Рекомбинантные человеческие антитела по изобретению имеют вариабельные области и могут также включать константные области, происходящие из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека (смотри Kabat et al. (1991) , Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Однако в некоторых вариантах осуществления такие рекомбинантные человеческие антитела подвергают мутагенезу  (или, если используют животное, трансгенное по последовательностям Ig человека, то соматическому мутагенезу ), и, таким образом, аминокислотные последовательности областей V и V рекомбинантных антител являются последовательностями, которые, несмотря на то, что происходят от и родственны последовательностям V и V зародышевой линии человека, могут не существовать естественным образом в репертуаре антител зародышевой линии человека . Однако в некоторых вариантах осуществления такие рекомбинантные антитела являются результатом избирательного мутагенеза или обратной мутации, или и того и другого.
Термин «обратная мутация» означает процесс, при котором некоторые или все из аминокислот человеческого антитела, подвергшихся соматической мутации, заменены соответствующими остатками зародышевой линии из гомологичной последовательности антитела зародышевой линии. Последовательности тяжелой и легкой цепей человеческого антитела по изобретению отдельно выравнивают с последовательностями зародышевой линии в базе данных VBASE для выявления последовательностей с наибольшей гомологией. Отличия, имеющиеся в человеческом антителе по изобретению, устраняют возвратом к последовательности зародышевой линии путем мутирования нуклеотидов на определенных позициях, кодирующих такую отличающуюся аминокислоту(ты). Роль каждой аминокислоты, идентифицированной таким образом в качестве кандидата для обратной мутации, должна быть исследована на ее прямую или опосредованную роль в связывании антигена, и любая аминокислота, которая, как установлено после мутации, влияет на любую желательную характеристику человеческого антитела, не должна быть включена в конечное человеческое антитело. Чтобы свести к минимуму число аминокислот, подвергающихся обратной мутации, те аминокислотные позиции, которые, как было установлено, отличаются от ближайшей последовательности зародышевой линии, но идентичны соответствующим аминокислотам во второй последовательности зародышевой линии, можно оставлять, при условии, что вторая последовательность зародышевой линии идентична и коллинеарна с последовательностью человеческого антитела по изобретению по меньшей мере по 10, предпочтительно по 12 аминокислотам, с обеих сторон от интересующей аминокислоты. Обратная мутация может иметь место на любом этапе оптимизации антитела.
Термин «химерное антитело» означает антитела, которые содержат последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей из одного вида, а последовательности константных областей из другого вида, например, антитела, имеющие вариабельные области тяжелой и легкой цепей мыши, соединенные с константными областями человека.
H
L
Термин «CDR-привитое антитело» означает антитела, которые содержат последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей из одного вида, но в которых последовательности одной или нескольких CDR-областей V и/или V заменены последовательностями CDR из другого вида, например, антитела, имеющие вариабельные области тяжелой и легкой цепей мыши, в которых одна или более мышиных CDR (например, CDR3) заменены последовательностями CDR человека.
H
L
H
L
Термин «гуманизированное антитело» означает антитела, которые содержат последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей из видов, отличных от человека (например, мыши), но в которых по меньшей мере часть последовательности V и/или V была изменена, чтобы стать более «человеческой», то есть более сходной с вариабельными последовательностями зародышевой линии человека. Один тип гуманизированного антитела представляет собой CDR-привитое антитело, в котором последовательности CDR человека вводят в последовательности V и V, отличные от человеческих, для замены соответствующих последовательностей CDR, отличных от человеческих.
Различные аспекты изобретения описаны более подробно в следующих подразделах.
II. Способы по изобретению
Способы по настоящему изобретению и полученные композиции по настоящему изобретению обладают множеством преимуществ для доставки и/или распространения лекарственной субстанции, например, препараты являются более легкими и стабильными при температуре окружающей среды. Существуют также преимущества для составления и/или производства лекарственных средств, например, отсутствие длительного оттаивания нерасфасованных растворов с контролируемой скоростью. Можно легко отвешивать сухие порошковые белки по настоящему изобретению в количествах, достаточных для нужных концентраций, и смешивать или составлять препарат с нужными эксципиентами, такими как вода. Также нет необходимости в отделении и высушивании белковых осадков или суспензий белковых кристаллов, как в случае обычных препаратов. Существуют и другие преимущества для разработки лекарственного продукта с точки зрения возможности достижения высокой концентрации препаратов, улучшения биодоступности, локального высвобождения (например, доставки в легкие), замедленного высвобождения (например, липосомы и покрытые PLGA микросферы), а также новых твердых или гидрогелевых белковых лекарственных форм, которые можно вводить множеством способов, включая пероральный и местный. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления способы также включают дальнейшую обработку, например, встраивание порошковых композиций в покрытые композиции с замедленным высвобождением, липосомы, покрытые PLGA микросферы, встраивание в матрицы эксципиентов путем экструзии расплава и тому подобное. Полученные композиции также являются дополнительными вариантами осуществления настоящего изобретения, например, композиции с замедленным высвобождением или нацеленные композиции и/или композиции, делающие возможными альтернативные пути введения, например, пероральное, кожное и энтеральное введение. Еще одним преимуществом является то, что композиции по настоящему изобретению можно обрабатывать при более высоких температурах, чем обычные препараты. Например, порошки можно обрабатывать методом экструзии расплава, таким как метод экструзии расплава MELTREX.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам эффективного и действенного получения стабильных порошков, которые включают один или более белков или пептидов. В некоторых вариантах осуществления белки или пептиды представляют собой антитела и/или их антигенсвязывающие фрагменты. Способ получения порошка включает распылительную сушку раствора белка, пептида, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Например, раствор может содержать по меньшей мере примерно 50 мг/мл белка, пептида, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. В дополнительных вариантах осуществления раствор может иметь другую концентрацию, например, быть более концентрированным, например, раствор может содержать по меньшей мере примерно 40 мг/мл, 50 мг/мл, 60 мг/мл, 70 мг/мл, 80 мг/мл, 90 мг/мл, 100 мг/мл, 130 мг/мл, 150 мг/мл, 180 мг/мл и так далее белка, пептида, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Раствор может также содержать один или несколько эксципиентов. Способ может включать концентрирование или дополнительное концентрирование раствора любым известным методом, включая, например, ультрафильтрацию. Белок или пептид может представлять собой любой подходящий белок или пептид. Белок может представлять собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, например, антитело иммуноглобулин G (IgG) или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой MAK 195F, адалимумаб, ABT-325, ABT-308 или ABT-147.
В некоторых вариантах осуществления раствор содержит эксципиент. Подходящие эксципиенты включают, но не ограничиваются ими, трегалозу, сахарозу, сорбит, полиэтиленгликоль, по меньшей мере одну аминокислоту, гистидин, аланин, аргинин, глицин или их смесь. Способ может дополнительно включать добавление кислого компонента, антиоксиданта и/или модификатора тоничности к раствору или к порошку.
Раствор может содержать от примерно 15 до примерно 140 мМ, или от примерно 20 до примерно 30 мМ эксципиента. В некоторых вариантах осуществления раствор содержит примерно 25 мМ эксципиента. В некоторых вариантах осуществления раствор имеет соотношение эксципиент:белок от примерно 0,27:1,0 до примерно 2,8:1,0, от примерно 0,27:1,0 до примерно 1,4:1,0 или от примерно 0,27:1,0 до примерно 0,7:1,0. В некоторых вариантах осуществления раствор имеет соотношение эксципиент:белок примерно 0,7:1,0.
В некоторых вариантах осуществления раствор имеет низкое процентное содержание белковых агрегатов, несмотря на высокую концентрацию водного белкового препарата. В одном варианте осуществления водный раствор, включающий воду и высокую концентрацию белка, например, антител, содержит менее чем примерно 5% белковых агрегатов, даже при отсутствии поверхностно-активного вещества или другого типа эксципиента. В одном варианте осуществления раствор содержит не более чем примерно 7,3% агрегированного белка, раствор содержит не более чем примерно 5% агрегированного белка, раствор содержит не более чем примерно 4% агрегированного белка, раствор содержит не более чем примерно 3% агрегированного белка, раствор содержит не более чем примерно 2% агрегированного белка, или раствор содержит не более чем примерно 1% агрегированного белка. В одном варианте осуществления раствор содержит по меньшей мере примерно 92%, по меньшей мере примерно 93%, по меньшей мере примерно 94%, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 97%, по меньшей мере примерно 98% или по меньшей мере примерно 99% мономера белка. Диапазоны, промежуточные для приведенных выше концентраций, например, по меньшей мере примерно 98,6% мономера белка, не более чем примерно 4,2% агрегированного белка, также предназначены являться частью данного изобретения. Кроме того, диапазоны значений при использовании сочетания любых из приведенных выше значений в качестве верхней и/или нижней границ также предусмотрены для включения.
in
in
out
out
В некоторых вариантах осуществления температура входящего воздуха (T) составляет от примерно 105°C до примерно 175°C, от примерно 130°C до примерно 155°C, от примерно 120°C до примерно 160°C или от примерно 125°C до примерно 160°C. В некоторых вариантах осуществления T составляет примерно 130°C. В некоторых вариантах осуществления температура воздуха на выходе (T) составляет от примерно 60°C до примерно 112°C, от примерно 60°C до примерно 90°C, от примерно 70°C до примерно 90°C или от примерно 75°C до примерно 85°C. В некоторых вариантах осуществления T составляет примерно 80°C.
in
out
in
out
В некоторых вариантах осуществления способы по изобретению включают распылительную сушку с температурой входящего воздуха (T) от примерно 100°C до примерно 180°C и температурой воздуха на выходе (T) от примерно 60°C до примерно 110°C. В некоторых вариантах осуществления способ включает распылительную сушку с T примерно 130°C и T примерно 80°C.
В некоторых вариантах осуществления остаточное содержание влаги в полученной порошковой композиции составляет от примерно 1% до примерно 3%, от примерно 1,5% до примерно 2,5%, от примерно 1,4% до примерно 2%, от примерно 4% до примерно 6% или от примерно 4,5% до примерно 5%. В других вариантах осуществления порошковая композиция содержит примерно 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5% или 7% остаточной влаги.
В одном варианте осуществления порошок стабилен при температуре и влажности окружающей среды в течение по меньшей мере 3 месяцев. В некоторых вариантах осуществления порошок стабилен в течение по меньшей мере 6 месяцев, 9 месяцев, 1 года, 2 лет, 3 лет или 5 лет при температуре и влажности окружающей среды. В других вариантах осуществления порошок стабилен при 40°C в течение по меньшей мере 3 месяцев. В дополнительных вариантах осуществления порошок стабилен при 40°C в течение по меньшей мере 3 месяцев, 6 месяцев, 9 месяцев, 1 года, 2 лет или 5 лет.
В некоторых вариантах осуществления распылительная сушка включает распыление раствора с образованием капель раствора, высушивание капель газом с образованием порошка и извлечение порошка из газа. Раствор можно распылять при помощи, например, распылителя с нагнетательным соплом. Порошок можно извлекать, например, при помощи циклонного сепаратора. Типичные способы распылительной сушки обсуждаются и иллюстрируются примерами в данном документе.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтического препарата, который может включать любой из способов, описанных в данном документе для получения порошков, и дополнительно включает смешивание (например, погружение или растворение) порошка с фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтически приемлемый носитель может являться любым носителем, приемлемым для парентерального, перорального, энтерального или местного введения. Носитель может быть твердым, полутвердым или жидким (например, вода), либо их сочетаниями.
В некоторых вариантах осуществления способ включает растворение порошкового антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в фармацевтически приемлемом носителе. Фармацевтически приемлемый носитель может, например, быть приемлемым для парентерального введения и может включать, например, воду. Способ может дополнительно включать добавление одного или нескольких кислых компонентов, антиоксидантов и/или модификаторов тоничности к фармацевтической композиции. Дополнительно или альтернативно, к фармацевтическим композициям по изобретению можно добавлять подходящие добавки, например, буферные растворы, модификаторы вязкости, ароматизаторы, красители и так далее.
Способ может включать дополнительную обработку стабильной порошковой композиции по изобретению при температуре выше температуры окружающей среды без существенного влияния на стабильность порошковых композиций. Например, способ может включать экструзию расплава стабильной порошковой композиции.
В некоторых вариантах осуществления на порошковую композицию наносят одно или более покрытий, например, так, что отдельные частицы или агрегаты частиц являются покрытыми, и/или так, что совокупность частиц, например, прессованная таблетка, является покрытой. Покрытие может включать любое покрытие, обычно используемое в данной области. Такие покрытия могут включать полимеры, такие как PLGA, для создания фармацевтической композиции с замедленным высвобождением или отсроченным высвобождением. Покрытия могут представлять собой или включать энтеросолюбильное покрытие. Композицию можно инкапсулировать, например, в желатиновую капсулу, или суспендировать в гидрогеле. В некоторых вариантах осуществления активность белка, пептида, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента защищена таким или иным образом эксципиентом от преципитации, денатурации или окисления органическими растворителями, тем самым позволяя проводить покрытие такими веществами, как PLGA, которые растворимы только в органических растворителях. Такие растворители могут включать растворители, обычно встречающиеся в фармацевтических препаратах, включая, но не ограничиваясь ими, полиэтиленгликоль (например, с низким молекулярным весом, такой как PEG 400), этанол, диметилсульфоксид (DMSO), N-метилпирролидон (NMP) или ледяную уксусную кислоту.
Распылительная сушка
В распылительной сушилке прокачиваемая жидкость (раствор, суспензия, эмульсия или паста) приобретает форму высушенных твердых частиц. Процесс сочетает образование частиц и высушивание в одном этапе путем распыления подаваемой жидкости в горячую высушивающую среду (как правило, воздух или инертные газы). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения концентрированные белковые растворы высушивают распылением. Соответственно, способы по изобретению могут включать концентрирование белковых растворов с помощью любого подходящего метода. В некоторых вариантах осуществления используют метод тангенциальной фильтрации потока (TFF), поскольку это очень быстрый и щадящий метод. Однако дополнительно или альтернативно можно использовать нормальную фильтрацию потока или диализ.
2
Распыление жидкости приводит к увеличению поверхности жидкости и, вследствие этого, приводит к сильному сокращению времени высыхания. Например, уменьшение размера капли с 10 мкм до 1 мкм приводит к увеличению площади поверхности с 600 до 6000 м и сокращает время высыхания в 100 раз (от 0,01 с до 0,0001 с). Stahl, Feuchtigkeit und Trocknen in der Pharmazeutischen Technologie. Dr. Dieter Steinkopf Verlag GmbH & Co. KG, Darmstadt (1999).
Контакт между подаваемой жидкостью и высушивающим воздухом может происходить двумя различными способами. В прямоточной системе высушивающий воздух и частицы (капли) движутся через сушильную камеру в одном направлении. Это наиболее предпочтительный способ для чувствительных к нагреванию материалов (таких как белки), поскольку наиболее горячий воздух контактирует с влажными каплями. Когда высушивающий воздух и капли движутся в противоположном направлении, это называют противоточным способом. Частицы, получаемые с помощью противоточного способа, имеют более высокую температуру, чем выходящий воздух. Сам выходящий воздух может покидать систему («открытый цикл») или может рециркулировать («замкнутый цикл», как правило, используемый для выпаривания органических растворителей с помощью инертных газов). Spray Drying Process Principles («www.niro.com», Feb. 2007). Путем выбора из различных конструкций распылительных сушилок (размер, распылитель, асептические условия и так далее) и настройки различных параметров процесса (поток высушивающего воздуха, температура высушивающего воздуха и так далее) можно контролировать свойства полученного порошка, такие как размеры, форма и структура или даже стерильность частиц. Если остаточная влажность извлеченного порошка недостаточно низка, может потребоваться последующая обработка, например, в виде сушилок в кипящем слое и охлаждающих устройств, контактных сушилок и даже микроволновых сушилок. Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsiilt International ApS; Charlottenlund (2002).
Процесс распылительной сушки, как правило, включает: распыление подаваемой жидкости, высушивание капель, а также разделение и извлечение высушенного продукта. Каждый этап по-своему влияет на полученный продукт и имеет свои сложности, особенно в случае чувствительного материала, такого как белки.
Rational Design of Stable Protein Formulations, Theory and Practice
Для того чтобы высушивать распылением белок или пептид, часто бывает полезно использовать стабилизирующие адъюванты. Сахара, такие как трегалоза и сахароза, являются эффективными стабилизаторами белков. Они не только могут уменьшать агрегацию и/или инактивацию белков в процессе сушки распылением, они также могут оказывать положительное влияние на стабильность при хранении полученного порошка в условиях хранения ниже температуры стеклования. Lee,  (Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2002).
Verfahrenstechnik, Sonderausgabe Martübersicht
Распыление представляет собой фрагментацию жидкости на множество отдельных капель, так называемый аэрозоль. Выбор устройства для распыления влияет на качество конечного продукта и пропускную способность. Richter,  11: 96-100 (1997). Общим для всех распылителей является использование энергии для дробления жидкости. Различные виды энергии отличают различные распылители. Энергия вызывает турбулентность в выпускаемой жидкости. Вместе с приложенными воздушными силами, поверхностное натяжение и вязкость жидкости преодолеваются, и происходит дезинтеграция.
et al.
Eur. Journal of Pharm. and Biopharm.
et al., Eur. Journal of Pharm. Sci.
et al., Biotechnology and Bioengineering
et al., Diabetes
Для процесса распылительной сушки наиболее подходящим аэрозолем является аэрозоль с небольшими каплями более или менее одинакового размера. Не все системы распыления способны обеспечивать узкий диапазон размеров частиц для высушиваемых распылением порошков. Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002). Белки являются очень чувствительным материалом, следовательно, распыление является стрессовым фактором, поскольку оно подразумевает наличие усилия сдвига, возможной причины нестабильности. Mahler  обнаружили корреляцию между высоким усилием сдвига (перемешивание и встряхивание) и увеличением агрегации в растворе IgG1. Mahler et al.,  59: 407-417 (2005). В растворе лизоцима также обнаружена агрегация и потеря активности при распылении. Yu  27: 9-18 (2006). Напряжение сдвига и резкое увеличение границы раздела жидкость/воздух, судя по всему, являются причиной для такого рода ухудшения качества белка. Maa  54(6): 503-512 (1997). Но даже усилий сдвига, которые имеют место в процессе перекачивания, может оказаться достаточно для подвергания стрессу раствора белка. Brennan  34, 353-359 (1985). Для распылительной сушки можно использовать множество распылителей различных типов.
Роторные распылители ускоряют подаваемую жидкость под действием центробежных сил до подачи ее в атмосферу воздуха/газа. Подаваемая жидкость распределяется централизованно на вращающееся колесо, диск или чашку. При низкой скорости диска образование капель в основном зависит от вязкости и поверхностного натяжения жидкости. Чем выше скорость диска, тем больше инерция и трение воздуха вступают в игру и вносят вклад в механизм образования капель. Кроме того, размер капель зависит от скорости подачи жидкости, ее твердого содержания и плотности, диаметра диска распылителя и конструкции. Существуют различные конструкции роторных распылителей: безлопастные диски/стаканы/чашки или лопастные колеса с изогнутыми или прямыми лопастями. Masters, Spray Drying Handbook (Wiley & Sons Inc., New York, 1991).
Роторные распылители имеют угол разбрызгивания 360° и, вследствие этого, требуют определенного диаметра сушильной камеры (для уменьшения осаждения на стенках). Эти системы обычно используют для больших емкостей.
Verfahrenstechnik, Sonderausgabe Martübersicht
Системы с нагнетательным соплом получают всю энергию, необходимую для подачи жидкости, от самой жидкости путем преобразования энергии давления в кинетическую энергию. Простейшее сопло для одной жидкости представляет собой трубчатый капилляр, используемый для выпускания отдельных капель. Это устройство используется только для создания небольших количеств одинаковых капель. При увеличении скорости потока можно достигнуть распыления, при котором струя жидкости дробится на капли при помощи турбулентности. Можно повысить качество дезинтеграции жидкости, если заставить жидкость отклоняться от прямого направления, совершать вращения и повороты, например, путем снабжения сопла вихревыми вставками или вихревыми камерами. Размер полученных капель зависит от приложенного давления и диаметра сопла, помимо обсуждавшихся выше параметров (вязкости, скорости потока и так далее). Richter,  11: 96-100 (1997). Подаваемая жидкость покидает отверстие в виде полого конуса, то есть нагнетательные сопла можно использовать в небольших распылительных сушильных установках с малым диаметром сушильных камер. Большое количество различных конструкций сопла можно по-разному использовать для распыления растворов, эмульсий и суспензий, с ограничением только по размеру частиц (суспензии) и вязкости (необходимо очень высокое давление). Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002).
Verfahrenstechnik, Sonderausgabe Martübersicht
При использовании распыления пневматическим соплом столкновение высокоскоростной газообразной среды (как правило, воздуха) с жидкостью дает энергию для образования капель. В зависимости от места, где происходит столкновение жидкости и газа, различают системы внутреннего смешивания и внешнего смешивания. Richter,  11: 96-100 (1997). Два жидкостных сопла предпочтительно используют, когда очень вязкие жидкости нужно разбить на мелкие капли. Газовая среда подвергается давлению внутри сопла (вплоть до 7 бар), которое иногда снабжено дополнительной вихревой вставкой для создания турбулентности газа, облегчающей дезинтеграцию подаваемой жидкости. Последняя, как правило, закачивается наносами низкого давления, поддерживающими эжекторный эффект воздушного потока. Системы пневматического сопла производят капли в диапазоне от 5 до 75 мкм. К недостаткам можно отнести высокую стоимость сжатого газа/воздуха и его охлаждающий эффект внутри сушильной камеры. При работе с жидкостями с очень высокой вязкостью существует также опасность забивания отверстия сопла. Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002).
В ультразвуковых соплах для распыления используются звуковые волны высокой частоты. Пьезоэлектрические преобразователи получают электрическую энергию высокой частоты из ультразвукового генератора и превращают ее в вибрационное механическое движение с той же частотой. Вводимая жидкость пробегает по длине сопла. Когда подаваемая жидкость достигает отверстия, она поглощает вибрационную энергию, вызывающую ее распыление, Sono Tek Corporation; Ultrasonic spray nozzle systems (SONO TEK Corporation, New York, 2007).
Звуковые сопла работают при низких давлениях (особенно по сравнению с пневматическими соплами), и полученные капли имеют диаметр от 10 до 50 мкм. Один большой недостаток использования ультразвуковых распылителей заключается в непредсказуемости непрерывной работы, например, при использовании для содержащего твердые вещества сырья, риск предварительного высушивания в области сопла может привести к неполадкам в генераторе/процессе распыления. Вследствие этого, данные системы наиболее часто используют в лабораторных условиях и вспомогательных сушилках для получения мелкодисперсных аэрозолей, либо когда неньютоновские или очень вязкие жидкости не позволяют использовать другие системы сопла. Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002).
Journal of Pharm. Sci
Прогнозирование кинетики высушивания аэрозолей в процессе распылительной сушки осложняется как трудностями в осуществлении контроля за поведением всего аэрозоля, так и неоднородными условиями внутри сушильной камеры. Однако кинетику высушивания отдельных капель можно изучать теоретически и практически. Elversson et al.,  94(9): 2049-2060 (2005).
Acta Pharmaceutica Technologica,
et al., Biotechnology and Bioengeneering
et al.
et al., Journal of Pharm. Sci.
in
LF
DA
AA
out
out
in
out
i
s
s
wb
s
i
Как только подаваемая жидкость распыляется, отношение ее поверхности к массе возрастает, передача тепла между воздухом и каплями ускоряется, и теперь капли могут высыхать очень быстро. При обычных размерах капель <100 мкм, испарение происходит в течение менее чем 1 с. Nürnberg et al.,  26 (1): 39-67, Tab 3-1 (1980). Происходят два конвекционных процесса: передача тепла (воздух→капля) и массоперенос влаги (капля→воздух). В последнем случае, влага должна проникать через пограничный слой, который окружает каждую каплю. На скорость передачи влияют температура, влажность, транспортные свойства окружающего воздуха, диаметр капель и относительная скорость между каплями и воздухом. Masters, Spray Drying Handbook (Wiley & Sons Inc., New York, 1991). Сначала испарение происходит с постоянной скоростью (первая стадия высушивания = период постоянной скорости). Диффузия влаги изнутри капли поддерживает условия насыщенной поверхности. В так называемой «критической точке» содержание влаги становится слишком низким, чтобы сохранять насыщенность на поверхности капли, и сухой слой начинает образовываться на поверхности капли. С этого момента существует дополнительный возрастающий барьер для пересечения при помощи диффузии. В результате постоянно меняющихся условий капли/частицы скорость испарения снижается (период снижения скорости = второй этап высушивания). Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002). Температура капель/частиц во время процесса в основном зависит от температуры входящего высушивающего воздуха (T) и скорости подаваемой жидкости (Q), в некоторой степени от скорости потока высушивающего воздуха (Q) и скорости потока распыляющего воздуха (Q). Эти четыре параметра также определяют T. На практике, температура чуть ниже отверстия сопла гораздо ближе к T, чем к T, так что T, очевидно, является доминирующей переменной для скорости высушивания капли. Разумеется, температура внутри капли (T) ниже, чем на ее поверхности (T). T вскоре достигает температуры смоченного термометра, T, и остается такой в течение периода постоянной скорости. С ростом корки на поверхности капли в период снижения скорости, T и T начинают возрастать, Maa  53 (6): 503-512 (1997). Для морфологии полученной капли решающую роль играет размер капли, а также текстура корки. Elversson  постулировали линейную зависимость между размерами капель и размерами частиц, но также предположили, что содержание твердых веществ в подаваемой жидкости сильно влияет на размер частиц. Elversson  92(4): 900-910 (2003).
Сушка подразумевает еще два стрессовых фактора для белков: нагревание и дегидратацию. Устойчивость белков к тепловому стрессу является важнейшей переменной в белковом препарате. Изменения температуры во время процесса распылительной сушки оказывают огромное влияние на стабильность белка (например, стабильность в процессе, срок годности в ускоренных испытаниях стабильности). Под воздействием повышенных температур белки становятся более гибкими (водородные связи ослабевают), что приводит к частичному развертыванию, и возрастает их частота соударений. Brange, Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins (Taylor & Francis Ltd., 2000). Этот процесс, как правило, обратим, однако, будучи частично развернуты, белки становятся очень чувствительными к другим путям деградации, таким как агрегация или неправильное свертывание, что сильно влияет на их функцию и долгосрочную стабильность.
et al., Protein Formulation and Delivery
et al.
et al., Pharm. Res.
et al., Current Pharmaceutical Biotechnology
out
out
Для большинства белков температура для максимальной стабильности составляет от -10 до 35°C. Bummer (Marcel Dekker AG, Basel, 2000). Mumenthaler  предположили, что высыхающие частицы достигают максимальной температуры примерно 25°C ниже T. Mumenthaler  11(1): 12-20 (1994). По настоящему изобретению T может находиться в диапазоне от примерно 60°C до примерно 80°C. Тепловая денатурация, как правило, не считается основным фактором нестабильности в процессе распылительной сушки. Maa  1(3): 283-302 (2000).
Биологическая активность белков зависит от их нативной трехмерной структуры. В водном растворе белки сохраняют свою нативную структуру благодаря тому, что они окружены нековалентно связанными молекулами воды на их поверхности. Как правило, неполярные аминокислотные остатки погружены внутрь, а полярные аминокислотные остатки находятся на поверхности. Это приводит к более плотной группировке белков в растворе (более высокая плотность размещения, чем в кристаллах органических молекул). Brange, Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins (Taylor & Francis Ltd., 2000). Удаление воды может дестабилизировать эту группировку, и могут происходить конформационные изменения.
Chemical Engineering
et al.
et al., Eur. Journal of Pharm. and Biopharm.
Последним этапом в процессе распылительной сушки, как правило, является отделение порошка от воздуха/газа и удаление высушенного продукта. В некоторых вариантах осуществления данный этап является настолько эффективным, насколько возможно, чтобы получить высокий выход порошка и предотвратить загрязнение воздуха в результате выброса порошка в атмосферу. С этой целью можно использовать оборудование для сухой и влажной сборки, такое как циклонные сепараторы, мешочные фильтры или электростатические осадители. Можно устанавливать даже комбинации таких блоков. Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002). Благодаря своей простой конструкции и эффективности, циклонный сепаратор является одним из наиболее распространенных сепараторов и используется в различных отраслях промышленности. Coulson and Richardson, , 4th, Vol.2 (Butterworth-Heinemann, Oxford, 1991). Движение частиц внутри циклона является результатом действия двух противоположных сил. Центробежная сила перемещает частицы к стенкам циклона, в то время как сила сопротивления воздуха/газа стремится перенести частицы в центральный воздушный сердечник для выхода из циклона. Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002). Порошок и воздух поступают в циклон по касательной и кружатся по спирали вниз по направлению к дну циклона (внешний вихрь). В этот момент большинство частиц покидает циклон и собирается в помещенный на дно сосуд, воздух, содержащий только фракцию мелких частиц и других частиц, которые не могут быть отделены, движется по спирали вверх в центре (внутренний вихрь) циклона и выходит через верх. На практике, частицы размером более 30 мкм должны быть извлечены, что также зависит от размеров распылительной сушки. Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002). Однако выход можно оптимизировать за счет изменения размеров циклона. Maury  достигли более высоких выходов, используя недавно разработанный циклонный сепаратор на распылительной сушилке Buchi B-191, по сравнению со стандартным циклоном. Maury  59(3): 565-573 (2005). Высокоэффективный циклон (с малым диаметром) разделял больше, в том числе даже очень мелкие частицы (диаметром менее 1,5 мкм).
Была выполнена теоретическая работа по расчету эффективности циклона. Один подход заключается в вычислении так называемой «точки отсечения», например, по следующей формуле:
p
i
ri
s
g
i
i
et al., VDI Berichte
d* представляет собой диаметр отсекаемых частиц, η представляет собой вязкость воздуха, r означает радиус внутреннего вихря, v представляет собой радиальную скорость воздуха на входе, p и p представляют собой плотности твердого вещества и газа, u представляет собой тангенциальную скорость частицы при r. В данной точке (диаметр частицы) центробежная сила и сила сопротивления имеют одинаковые значения. Частицы такого размера вращаются, не направляясь ни к внутреннему, ни к внешнему вихрю, меньшие частицы увлекаются выходящим воздухом, большие частицы попадают в собирающий сосуд. Staudinger  1511: 1-23 (1999).
et al., Chem. Eng. Technol.
Подход, касающийся времени полета, представляет собой еще один способ рассчитать критический диаметр частиц. Согласно ему, учитывают, сколько времени занимает перемещение частицы к стенке циклона. При таком подходе можно принимать во внимание геометрические характеристики собирающего сосуда, поскольку они влияют на поток газа внутри циклона. Qian  29(6): 724-728 (2006).
et al.
et al.
et al.
et al., Journal of Pharm. Sci.
et al., Journal of Pharm. Sci.
et al., Eur. Journal of Pharm. and Biopharm.
Rational Design of Stable Protein Formulations, Theory and Practice
et al., Biochemistry
et al., Advanced Drug Delivery Reviews
Annual Reviews Biophys. Biomol. Struct
et al., Advanced Drug Delivery Reviews
et al.,
et al., Journal of Pharm. Sci.
et al., Journal of Pharm. Sci.,
g
g
Распылительная сушка водного раствора белка без адъювантов, как правило, ведет к развертыванию, агрегации и инактивации. Это испытывали несколько раз с различными белками: оксигемоглобином (Labrude ), трипсиногеном (Tzannis ), IgG (Maury  2005), и во всех случаях наблюдали появление нестабильности. Labrude  78(3): 223-229 (1989), Tzannis,  88(3): 351-359 (1999) и Maury 59(2): 251-261 (2005). Соответственно, в некоторых вариантах осуществления композиции по изобретению защищают активный фармацевтический ингредиент (API) во время процесса распылительной сушки, а также во время хранения. При сублимационной сушке белков в качестве стабилизирующих средств были использованы сахара (трегалоза, сахароза), аминокислоты (аргинин) или поверхностно-активные вещества (Tween). Lee, (Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2002). Для использования полиолов, дисахаридов и аминокислот было предложено несколько теорий стабилизации. Одной из них является так называемая теория «предпочтительного исключения», созданная Arakawa и Timasheff. Arakawa  21: 6536-6544 (1982), Arakawa  46: 307-326 (2001), и Timasheff, ., 22: 67-97 (1993). Она основана на предпосылке, что белки в растворе являются преимущественно гидратированными, так что сорастворенные вещества не имеют контакта с поверхностью белка. Поскольку развертывание приведет к увеличению поверхности белка, также увеличится и площадь, контакт с которой должен быть исключен для сорастворенных веществ. В данном случае развертывание приводит к термодинамически неблагоприятной ситуации, следовательно, белок остается в естественной свернутой конформации. Arakawa  46: 307-326 (2001). Белки также могут быть защищены механизмом «замены воды». Эта теория утверждает, что эксципиенты предотвращают развертывание путем образования водородных связей с сухим белком вместо испарившейся воды. Carpenter Rational Design of Stable Protein Formulations, Theory and Practice (Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2002). Кроме того, образование стеклообразной матрицы, которая иммобилизует белок, может являться причиной стабильности белка при сушке и хранении. Tzannis 88(3): 360-370 (1999). Таким образом, необходимы препараты, которые обладают высокой температуры стеклования (T), например, T более высокой, чем температура хранения, чтобы препятствовать молекулярному движению. Механизм стабилизации поверхностно-активных веществ основан на конкуренции поверхностно-активных веществ и белков за поверхности раздела (например, поверхности раздела жидкость/воздух), демонстрирующие термодинамическое преимущество для поверхностно-активного вещества. При небольшой возможности для белка адсорбироваться на поверхности раздела, риск развертывания и агрегации значительно снижается. Adler 88 (2), 199-208 (1999).
g
g
g
gmix
Влажность представляет собой другой фактор, влияющий на стабильность белка, особенно в течение длительного срока хранения. Воздействие влаги на порошковые белки подробно описано в литературе. Как правило, химическая стабильность твердого белкового препарата уменьшается с увеличением содержания влаги из-за воды, выступающей в качестве реагента или в качестве средства для мобилизации реагентов. Она также может нести ответственность за конформационные изменения в структуре белка. Кроме того, T высушенных распылением порошков также зависит от воды. Вода действует как пластификатор, это означает, что она снижает T вещества. Влияние воды можно рассчитать при помощи уравнения Гордона Тейлора, уравнения для расчета T бинарных смесей (T).
g
g
et al., Pharm. Res.
et al.
et al.
Journal of Pharm. Sci.,
ω, T и ρ представляют собой массовую долю, температуру стеклования и плотность различных компонентов, соответственно. Поскольку вода имеет T примерно -138°C, очевидно, что содержание воды в полученных порошках должно быть низким. Hancock  11(4): 471-477 (1994). Однако корреляция между содержанием воды и стабильностью, очевидно, не является линейной. Chang получили оптимальную стабилизацию лиофилизированного IgG при промежуточном содержании воды 2-3%. Chang , 94(7): 1427-1444 (2005).
et al., Pharm. Res.
in
Исходя из данной информации, порошок, полученный методом распылительной сушки, должен иметь низкую остаточную влажность и, кроме того, быть защищен от влажности при хранении. Maa  15(5): 768-775 (1998). Первое может в определенной степени зависеть от условий процесса (температура входящего воздуха (T), относительная влажность (RH) входящего воздуха); последнее зависит от герметичности сосудов или контролируемых условий хранения.
III. Препараты по изобретению
2
2
Любой подходящий белок, пептид, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент можно использовать для получения композиций по настоящему изобретению. Например, он может представлять собой IgG. Типичные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты включают, но не ограничиваются ими, MAK 195F, адалимумаб или ABT-325. Анти-TNF антитела, пригодные для использования по изобретению, хорошо известны (например, как описано в EP-A-0260610, EP-A-0351789, EP-A-0218868). Можно использовать как поликлональные, так и моноклональные антитела. Более того, подходящими являются также фрагменты TNF-связывающего антитела, такие как Fab- или F(ab')-фрагменты, либо одноцепочечные Fv-фрагменты. Подходящее моноклональное анти-hTNF-альфа антитело описано в EP-A-0260610, обозначенное AM-195 или MAK-195, которое продуцируется гибридомной клеточной линией, депонированной в ECACC под регистрационным номером 87 050803. Подходящим является и фрагмент (F(ab')) мышиного анти-TNF антитела, также обозначаемый MAK 195F (INN: афелимомаб).
d
off
50
-8
-3
-1
-7
in vitro
В одном варианте осуществления препарат по изобретению содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывает TNFα человека, включая, например, адалимумаб (другие названия: хумира или D2E7; Abbott Laboratories). В одном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент диссоциирует от TNFα человека с K, равной 1×10 M или меньше, и константой скорости K, равной1×10 с или меньше, обе величины определены поверхностным плазмонным резонансом, и нейтрализует цитотоксичность TNFα человека в стандартном тесте  с использованием L929 с IC 1×10 M или меньше. Примеры и способы получения человеческих нейтрализующих антител, имеющих высокую аффинность для TNFα человека, включая последовательности таких антител, описаны в патенте США № 6090382, включенном в данный документ посредством ссылки.
D
D
-7
-5
В одном варианте осуществления препарат по изобретению содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывает интерлейкин-12 (IL-12) человека, включая, например, антитело ABT-874 (Abbott Laboratories) (патент США № 6914128). ABT-874 представляет собой полностью человеческое моноклональное антитело, предназначенное нацеливаться и нейтрализовать интерлейкин-12 и интерлейкин-23. В одном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет одну или более из следующих характеристик: оно диссоциирует от IL-1α человека с K 3×10 M или меньше, диссоциирует от IL-1β человека с K 5×10 M или меньше и не связывает IL-1α мыши или IL-1β мыши. Примеры и способы получения человеческих нейтрализующих антител, имеющих высокую аффинность для IL-12 человека, включая последовательности антитела, описаны в патенте США № 6914128, включенном в данный документ посредством ссылки.
В одном варианте осуществления препарат по изобретению содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывает IL-18 человека, включая, например, антитело ABT-325 (Abbott Laboratories) (смотри патентную заявку США № 2005/0147610).
В одном варианте осуществления препарат по изобретению содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывает IL-12 человека, такое как антитело ABT-147 (Abbott Laboratories) (смотри WO 2007/005608 A2, дата публикации 11 января 2007 г.).
В одном варианте осуществления препарат по изобретению содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывает IL-13 человека, такое как антитело ABT-308 (Abbott Laboratories) (смотри PCT/US2007/19660).
Примеры белков, которые можно вводить в порошковый препарат, включают антитела или их антигенсвязывающие фрагменты. Примеры различных типов антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые можно использовать по изобретению, включают, но не ограничиваются ими, химерное антитело, человеческое антитело, гуманизированное антитело и доменное антитело (dAb). В одном варианте осуществления антитело, используемое в способах и композициях по изобретению, представляет собой анти-TNFα антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, либо анти-IL-12 антитело, либо анти-IL-13 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Дополнительные примеры антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое можно использовать по изобретению, включают, но не ограничиваются ими, ABT-147 (Abbott Laboratories), ABT-325 (анти-IL-18, Abbott Laboratories), ABT-308 (Abbott Laboratories), ABT-874 (анти-IL-12, Abbott Laboratories), афелимомаб (Fab2 анти-TNF, Abbott Laboratories), хумиру (адалимумаб, Abbott Laboratories), кампат (алемтузумаб), CEA-Scan арцитумомаб (fab-фрагмент), эрбитукс (цетуксимаб), герцептин (трастузумаб), миосцинт (имциромаб пентетат), простасцинт (капромаб пендетид), ремикад (инфликсимаб), РеоПро (абциксимаб), ритуксан (ритуксимаб), симулект (базиликсимаб), синагис (паливизумаб), верлуму (нофетумомаб), ксолаир (омализумаб), зенапакс (даклизумаб), зевалин (ибритумомаб тиуксетан), ортоклон OKT3 (муромонаб-CD3), панорекс (эдреколомаб) и милотарг (гемтузумаб озогамицин).
В одном из альтернативных вариантов белок представляет собой слитый белок, включая, но не ограничиваясь ими, пульмозим (дорназу альфа), ребиф, регранекс (бекаплермин), активазу (алтеплазу), альдуразим (ларонидазу), амевив (алефацепт), аранесп (дарбэпоэтин альфа), бекаплермин концентрат, бетасерон (интерферон бета-1b), ботокс (ботулинический токсин типа A), элитек (расбуриказу), элспар (аспарагиназу), эпоген (эпоэтин альфа), энбрель (этанерцепт), фабразим (агальзидазу бета), инферген (интерферон альфакон-1), интрон A (интерферон альфа-2a), кинерет (анакинру), миоблок (ботулинический токсин типа B), невласту (пегфилграстим), ньюмегу (опрелвекин), нейпоген (филграстим), онтак (денилейкин дифтитокс), пегасис (пегинтерферон альфа-2a), пролейкин (алдеслейкин), пульмозим (дорназу альфа), ребиф (интерферон бета-1a), регранекс (бекаплермин), ретавазу (ретеплазу), роферон-A (интерферон альфа-2), ТНКазу (тенектеплазу) и ксигрис (дротрекогин альфа).
Другие примеры белков, которые можно использовать в способах и композициях, описанных в данном документе, включают белки млекопитающих, включая полученные из них рекомбинантные белки, такие как, например, гормон роста, в том числе гормон роста человека и гормон роста крупного рогатого скота; фактор, высвобождающий гормон роста; паратиреоидный гормон; тиреотропный гормон; липопротеины; α-1-антитрипсин; А-цепь инсулина; B-цепь инсулина; проинсулин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы свертывания крови, такие как фактор VIIIC, фактор IX, тканевой фактор и фактор фон Виллебранда; факторы, препятствующие свертыванию крови, такие как белок C; предсердный натрийуретический фактор; легочный сурфактант; активатор плазминогена, такой как урокиназа или тканевой активатор плазминогена (t-PA); бомбазин; тромбин; фактор некроза опухолей-α и β, энкефалиназа, RANTES (регулируемый при активации, обычно экспрессируемый и секретируемый T-клетками); человеческий воспалительный белок макрофагов (MIP-1-α); сывороточный альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин; мюллерова ингибирующая субстанция; A-цепь релаксина; B-цепь релаксина; прорелаксин; гонадотропин-ассоциированный пептид мыши; ДНКаза; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов (VEGF); рецепторы гормонов или факторов роста; интегрин; белок A или D; ревматоидные факторы; нейротрофический фактор, такой как костный нейротрофический фактор (BDNF), нейротрофин-3, -4, -5 или -6 (NT-3, NT-4, NT-5 или NT-6), или фактор роста нервов, такой как NGF-β; тромбоцитарный фактор роста (PDGF); фактор роста фибробластов, такой как aFGF и bFGF; эпидермальный фактор роста (EGF); трансформирующий фактор роста (TGF), такой как TGF-α и TGF-β, в том числе TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 или TGF-β5; инсулиноподобный фактор роста-I и -II (IGF-I и IGF-II); дез(1-3)-IGF-I (IGF-I головного мозга); белки, связывающие инсулиноподобный фактор роста; белки CD, такие как CD3, CD4, CD8, CD19 и CD20; эритропоэтин (EPO); тромбопоэтин (TPO); остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины; костный морфогенетический белок (BMP); фактор роста и дифференцировки, интерферон, такой как интерферон-α, -β и -γ; колониестимулирующие факторы (CSF), например, M-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлейкины (IL), например, от IL-1 до IL-10; супероксиддисмутаза; Т-клеточные рецепторы; поверхностные мембранные белки; стимулятор гемолиза (DAF); вирусный антиген, такой как, например, часть оболочки СПИД; транспортные белки; «хоминг»-рецепторы; адрессины; регуляторные белки; иммуноадгезины; антитела, а также биологически активные фрагменты или варианты любого из вышеперечисленных полипептидов.
Поликлональные антитела
2
1
1
Antibodies: A Laboratory Manual,
Поликлональные антитела обычно означают смесь антител, которые специфичны для определенного антигена, но связываются с различными эпитопами данного антигена. Продукцию поликлональных антител, как правило, вызывают у животных путем многократных подкожных (sc) или внутрибрюшинных (ip) инъекций соответствующего антигена и адъюванта. Может оказаться полезным конъюгировать соответствующий антиген с белком, который является иммуногенным для видов животных, подлежащих иммунизации (например, гемоцианин лимфы улитки, сывороточный альбумин, бычий тиреоглобулин или соевый ингибитор трипсина), при помощи бифункционального или дериватизирующего средства, например, сложного эфира малеимидобензоилсульфосукцинимида (конъюгация через остатки цистеина), N-гидроксисукцинимида (через остатки лизина), глютаральдегида, янтарного ангидрида, SOCl или RNCNR, где R и R представляют собой разные алкильные группы. Способы получения поликлональных антител известны в данной области и описаны, например, в  Lane and Harlow (1988), включенном в данный документ посредством ссылки.
Моноклональные антитела
et al., Nature,
Термин «моноклональное антитело», используемый в данном документе, предназначен для обозначения антитела, полученного из гибридомы (например, антитела, секретируемого гибридомой, полученной по гибридомной технологии, такой как стандартный метод гибридом Келера и Мильштейна). Например, моноклональные антитела можно получать методом гибридом, впервые описанным Kohler  256: 495 (1975), либо можно получать методами рекомбинантной ДНК (патент США № 4816567). Таким образом, полученное из гибридомы антитело с двойной специфичностью по изобретению по-прежнему называется моноклональным антителом, хотя оно обладает антигенной специфичностью для более чем одного антигена.
Моноклональные антитела получают из популяции в основном гомогенных антител, то есть отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных естественных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Таким образом, определение «моноклональное» указывает на характерную особенность антитела, как не являющегося смесью отельных антител.
et al., Nature
et al., Nature,
et al., J. Mol. Biol.,
et al., Bio/Technology
in vivo
et al., Nuc. Acids. Res.,
В дополнительном варианте осуществления антитела можно выделять из фаговых библиотек антител, полученных с помощью методов, описанных в McCafferty , 348: 552-554 (1990). Clackson  352: 624-628 (1991) и Marks  222: 581-597 (1991), где описано выделение мышиных и человеческих антител, соответственно, при помощи фаговых библиотек. В последующих публикациях описано получение высокоаффинных (нМ диапазон) человеческих антител методом перетасовки цепей (Marks , 10: 779-783 (1992)), а также комбинаторной инфекции и  рекомбинации в качестве стратегии для конструирования очень больших фаговых библиотек (Waterhouse  21: 2265-2266 (1993)). Таким образом, эти методы выделения моноклональных антител являются приемлемой альтернативой традиционным гибридомным методам получения моноклональных антител.
Антитела и фрагменты антител также можно выделять из дрожжей и других эукариотических клеток с помощью экспрессионных библиотек, как описано в патентах США №№ 6423538, 6696251, 6699658, 6300065, 6399763 и 6114147. Эукариотические клетки можно генетически изменять для экспрессии белков библиотеки, включая белки из комбинаторных библиотек антител, для экспонирования на клеточной поверхности, что позволяет отбирать конкретные клетки, содержащие библиотечные клоны для антител с аффинностью для выбора молекул-мишеней. После извлечения из выделенной клетки, библиотечный клон, кодирующий интересующее антитело, можно масштабно экспрессировать в подходящей линии клеток млекопитающих.
in vitro
Дополнительные методы разработки интересующих антител включают скрининг в бесклеточной среде при помощи технологии дисплея нуклеиновых кислот, как описано в патентах США №№ 7195880, 6951725, 7078197, 7022479, 6518018, 7125669, 6846655, 6281344, 6207446, 6214553, 6258558, 6261804, 6429300, 6489116, 6436665, 6537749, 6602685, 6623926, 6416950, 6660473, 6312927, 5922545 и 6348315. Данные методы можно использовать, чтобы транскрибировать белок с нуклеиновой кислоты  таким образом, что белок является физически ассоциированным или связанным с нуклеиновой кислотой, от которой он происходит. При отборе экспрессированного белка с помощью молекулы-мишени, нуклеиновая кислота, которая кодирует данный белок, также отбирается. В одном варианте метода скрининга в бесклеточной среде последовательности антител, выделенные из клеток иммунной системы, можно выделять и применять метод частично рандомизированного мутагенеза полимеразной цепной реакцией для увеличения разнообразия антител. Эти частично рандомизированные гены антител затем экспрессируются в бесклеточной системе, с одновременной физической ассоциацией, создаваемой между нуклеиновой кислотой и антителом.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
ДНК также можно модифицировать, например, заменяя кодирующими последовательностями константных доменов тяжелой и легкой цепей человека гомологичные мышиные последовательности (патент США № 4816567, Morrison, 81: 6851 (1984)), либо ковалентно присоединяя к кодирующей последовательности иммуноглобулина всю или часть кодирующей последовательности для неиммуноглобулинового полипептида.
Как правило, такими неиммуноглобулиновыми полипептидами заменяют константные домены антитела, или ими заменяют вариабельные домены одного антигенсвязывающего центра антитела, чтобы создать химерное бивалентное антитело, содержащее один антигенсвязывающий центр, обладающий специфичностью для антигена, и другой антигенсвязывающий центр, обладающий специфичностью для другого антигена.
in vitro
Химерные или гибридные антитела также можно получать , используя известные методы синтетической белковой химии, включая те, в которых используют перекрестно-сшивающие реагенты. Например, можно сконструировать иммунотоксины при помощи дисульфид-обменной реакции или путем образования тиоэфирной связи. Примеры подходящих реагентов для этой цели включают иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат.
Гуманизированные антитела
et al., Nature,
et al., Nature,
et al., Science,
et al., J. Immunol.,
et al., J. Mol. Biol.,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
et al., J. Immunol.,
Способы гуманизации антител, отличных от человеческих, хорошо известны в данной области. Как правило, гуманизированное антитело имеет один или более аминокислотных остатков, введенных в него из источника, который не является человеком. Данные аминокислотные остатки, отличные от человеческих, часто называют «импортированными» остатками, которые обычно берут из «импортированного» вариабельного домена. Гуманизацию можно в основном проводить в соответствии с методом Winter и соавторов (Jones  321: 522-525 (1986), Riechmann  332: 323-327 (1988), Verhoeyen  239: 1534-1536 (1988)), заменяя CDRs или последовательностями CDR, отличными от человеческих (например, последовательностями грызунов), соответствующие последовательности человеческого антитела. Соответственно, такие «гуманизированные» антитела являются химерными антителами (патент США № 4816567), где существенно меньше, чем интактный, человеческий вариабельный домен заменен соответствующей последовательностью из видов, отличных от человека. На практике, гуманизированные антитела, как правило, являются человеческими антителами, в которых некоторые остатки CDR и, возможно, некоторые каркасные (FR) остатки заменены остатками из аналогичных сайтов в антителах грызунов. Дополнительные ссылки, описывающие процесс гуманизации, включают Sims  151: 2296 (1993), Chothia  196: 901 (1987), Carter  89: 4285 (1992), Presta  151: 2623 (1993), каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки.
Человеческие антитела
H
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
et al., Nature,
et al., Year in Immuno.,
et al., J. Mol. Biol.,
J. Mol. Biol.,
Альтернативно, теперь возможно получать трансгенных животных (например, мышей), которые способны при иммунизации производить полный репертуар человеческих антител при отсутствии эндогенной продукции иммуноглобулинов. Например, описано, что гомозиготная делеция гена соединительной области (J) тяжелой цепи антитела у мышей-химер и мышей-мутантов зародышевой линии приводит к полному ингибированию эндогенной продукции антител. Перенос совокупности генов иммуноглобулинов зародышевой линии человека таким мышам-мутантам зародышевой линии приведет к продукции человеческих антител при стимуляции антигеном. Смотри, например, Jakobovits  90: 2551 (1993), Jakobovits 362: 255-258 (1993), Bruggermann  7: 33 (1993). Человеческие антитела можно также получать из библиотеки фагового дисплея (Hoogenboom  227: 381 (1991), Marks et al.,  222: 581-597 (1991)).
Биспецифические антитела
2
Биспецифические антитела (BsAb) представляют собой антитела, которые обладают специфичностями связывания по меньшей мере для двух отдельных эпитопов. Такие антитела можно получать из полноразмерных антител или фрагментов антител (например, биспецифические антитела F(ab')).
et al., Nature,
el al., EMBO J.,
Способы получения биспецифических антител известны в данной области. Традиционное получение полноразмерных биспецифических антител основано на совместной экспрессии двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулинов, где две цепи имеют различные специфичности (Millstein  305: 537-539 (1983)). Вследствие случайного ассортимента тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, данные гибридомы (квадрогибридомы) продуцируют потенциальную смесь 10 различных молекул антитела, из которых только одна обладает правильной биспецифической структурой. Очистка правильной молекулы, которую обычно выполняют методом аффинной хроматографии, является довольно трудоемкой, а выход продукта невысоким. Подобные процедуры описаны в WO 93/08829 и в Traunecker  10: 3655-3659 (1991).
Согласно другому подходу, проводят слияние вариабельных доменов антител, обладающих нужными специфичностями связывания (центры связывания антитело-антиген), с последовательностями константных доменов иммуноглобулинов.
H2
H3
H1
Предпочтительно слияние проводят с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим по меньшей мере часть шарнирных областей C и C. Предпочтительно, чтобы первая константная область тяжелой цепи (C), содержащая сайт, необходимый для связывания легкой цепи, присутствовала по меньшей мере в одном из слитых продуктов. ДНК, кодирующие слитые продукты тяжелой цепи иммуноглобулинов, и, при необходимости, легкой цепи иммуноглобулинов, встраивают в отдельные экспрессионные векторы и совместно трансфицируют в подходящий организм-хозяина. Это обеспечивает большую гибкость в регулировании взаимных пропорций трех полипептидных фрагментов в вариантах осуществления, когда неравное соотношение трех полипептидных цепей, используемых в конструкции, обеспечивает оптимальный выход продукта. Однако возможно встраивать кодирующие последовательности для двух или всех трех полипептидных цепей в один экспрессионный вектор, если экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных соотношениях приводит к высоким выходам, либо когда соотношения не имеют большого значения.
et al., Methods in Enzymology
В предпочтительном варианте осуществления данного подхода биспецифические антитела составлены из тяжелой цепи гибридного иммуноглобулина с первой специфичностью связывания на одном плече и пары тяжелая цепь-легкая цепь гибридного иммуноглобулина (обеспечивающей вторую специфичность связывания) на другом плече. Установлено, что такая ассиметричная структура облегчает отделение нужного биспецифического соединения от нежелательных сочетаний цепей иммуноглобулина, поскольку присутствие легкой цепи иммуноглобулина только на одной половине биспецифической молекулы облегчает разделение. Данный подход раскрыт в WO 94/04690, дата публикации 3 марта 1994 г. Для более подробной информации о получении биспецифических антител смотри, например, Suresh , 121: 210 (1986).
Биспецифические антитела включают перекрестно-сшитые или «гетероконъюгированные» антитела. Например, одно из антител в гетероконъюгате может быть связано с авидином, а другое с биотином. Такие антитела, например, были предложены для нацеливания клеток иммунной системы на нежелательные клетки (патент США № 4676980), а также для лечения ВИЧ-инфекции (WO 91/00360, WO 92/200373 и EP 03089). Гетероконъюгированные антитела можно получать с помощью любого удобного метода перекрестной сшивки. Подходящие перекрестно-сшивающие реагенты хорошо известны в данной области и раскрыты в патенте США № 4676980, вместе с целым рядом методов перекрестной сшивки.
E. Coli,
in vitro,
et al.,
J. Exp. Med.,
Методы создания биспецифических антител из фрагментов антител также описаны в литературе. Следующие методы также можно использовать для производства бивалентных фрагментов антитела, которые не обязательно являются биспецифическими. Например, Fab'-фрагменты, выделенные из  можно химически соединять  получая бивалентные антитела. Смотри Shalaby  175: 217-225 (1992).
et al., J. Immunol.,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
J. Immunol.,
H
L
H
L
L
H
Описаны также различные методы получения и выделения бивалентных фрагментов антитела непосредственно из культуры рекомбинантных клеток. Например, бивалентные гетеродимеры были получены при помощи лейциновых застежек. Kostelny  148(5): 1547-1553 (1992). Пептиды с лейциновыми застежками из белков Fos и Jun были присоединены к Fab'-фрагментам двух различных антител путем слияния генов. Гомодимеры антитела были восстановлены в шарнирной области с образованием мономеров, а затем повторно окислены с образованием гетеродимеров антитела. Метод «диател», описанный Hollinger 90: 6444-6448 (1993) предоставляет альтернативный механизм для получения биспецифических/бивалентных фрагментов антител. Фрагменты включают вариабельный домен тяжелой цепи (V), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (V) линкером, который является слишком коротким, чтобы допустить спаривание между двумя доменами на одной и той же цепи. Соответственно, V и V домены одного фрагмента принудительно образуют пары с комплементарными V и V доменами другого фрагмента, тем самым создавая два антигенсвязывающих центра. Сообщали также о другой стратегии получения биспецифических/бивалентных фрагментов антител путем использования одноцепочечных Fv (sFv) димеров. Смотри Gruber et al.,  152: 5368 (1994).
В одном варианте осуществления препарат по изобретению содержит антитело, которое является биспецифическим для IL-1 (включая IL-1α и IL-1β). Примеры и методы получения биспецифических антител к IL-1 можно найти в WO 08/082651, дата публикации 10 июля 2008 г.
Связывающие белки с двойными вариабельными доменами (DVD)
et al.,
Связывающие белки с двойными вариабельными доменами (DVD) представляют собой белки, которые содержат два или более антигенсвязывающих центров и являются тетравалентными или мультивалентными связывающими белками. DVD могут быть моноспецифическими, то есть способными связывать один антиген, или мультиспецифическими, то есть способными связывать два или более антигенов. Связывающие белки с DVD, содержащие два полипептида DVD тяжелой цепи и два полипептида DVD легкой цепи, называют DVD Ig™. Каждая половина DVD Ig содержит полипептид DVD тяжелой цепи и полипептид DVD легкой цепи и два антигенсвязывающих центра. Каждый центр связывания включает вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, в общей сложности с шестью CDR, вовлеченными в связывание антигена, на антигенсвязывающий центр. В некоторых вариантах осуществления DVD может включать любой из DVD, раскрытых в патентной публикации США № 20070071675 авторов Wu  опубликованной 29 марта 2007 г., которая включена в данный документ посредством ссылки.
Молекулы DVD-Ig полезны в качестве терапевтических средств для одновременного блокирования двух различных мишеней с целью повышения эффективности/безопасности и/или для увеличения охвата пациентов. Такие мишени могут включать растворимые мишени (IL-13 и TNF) и мишени - рецепторы клеточной поверхности (VEGFR и EGFR). Их также можно использовать, чтобы индуцировать перенаправленную цитотоксичность между опухолевыми клетками и T-клетками (Her2 и CD3) для лечения рака, либо между аутореактивными клетками и эффекторными клетками при аутоиммунных реакциях/трансплантации, либо между любой клеткой-мишенью и эффекторной клеткой для элиминации болезнетворных клеток при той или иной болезни.
Кроме того, DVD-Ig можно использовать, чтобы вызвать кластеризацию и активацию рецепторов, когда оно разработано для нацеливания на два различных эпитопа на одном и том же рецепторе. Это может иметь преимущество в создании агонистических и антагонистических анти-GPCR терапевтических средств. В данном случае DVD-Ig можно использовать для нацеливания на два различных эпитопа на одной клетке для кластеризации/передачи сигнала (две молекулы клеточной поверхности) или передачи сигнала (на одной молекуле). Аналогичным образом, молекулу DVD-Ig можно сконструировать для запуска лигирования CTLA-4 и отрицательного сигнала путем нацеливания на два различных эпитопа (или две копии одного и того же эпитопа) внеклеточного домена CTLA4, что приводит к подавлению иммунного ответа. Аналогичным образом, DVD-Ig может быть нацелено на два различных члена рецепторного комплекса поверхности клетки (например, IL-12R альфа и бета). Кроме того, DVD-Ig может быть нацелено на CR1 и растворимый белок/патоген для стимулирования быстрого выведения целевого растворимого белка/патогена.
Кроме того, DVD-Ig по изобретению можно использовать для тканеспецифической доставки (нацеленной на тканевой маркер и медиатор болезни для усиления местной PK, и, следовательно, более высокой эффективности и/или меньшей токсичности), в том числе внутриклеточной доставки (нацеленной на интернализирующий рецептор и внутриклеточную молекулу), доставки внутрь мозга (нацеленной на рецептор трансферрина и медиатор заболевания ЦНС для пересечения гематоэнцефалического барьера). DVD-Ig может также служить белком-носителем для доставки антигена к определенному месту путем связывания с не-нейтрализующим эпитопом данного антигена, а также для повышения времени полужизни антигена.
Данное изобретение относится к стабильным порошковым композициям, включающим любой подходящий белок, включая те, что описаны в данном документе, и полученным, как описано в данном документе. Например, порошок может включать белок или пептид (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент) и эксципиент, где композиция содержит менее чем примерно 6% остаточной влаги. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит менее чем примерно 5,5%, 5%, 4,4%, 4%, 3,5% или 3% остаточной влаги. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит менее чем 2% или 1% остаточной влаги. В других вариантах осуществления композиция содержит остаточную влагу в диапазоне, ограниченном приведенными выше значениями, например, примерно от 4% до 6%, примерно от 4,5% до 5,5% или примерно от 3% до 5% остаточной влаги. В некоторых вариантах осуществления содержание остаточной влаги полученной порошковой композиции составляет от примерно 1% до примерно 3%, примерно от 1,5% до 2,5%, от примерно 1,4% до примерно 2%, примерно от 4% до 6% или от примерно 4,5% до примерно 5%. В других вариантах осуществления порошковая композиция содержит примерно 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5% или 7% остаточной влаги.
В некоторых вариантах осуществления белок сохраняет свою биологическую активность в течение желаемого периода времени. В одном варианте осуществления порошок стабилен при температуре и влажности окружающей среды в течение по меньшей мере 3 месяцев. В некоторых вариантах осуществления порошок стабилен в течение по меньшей мере 6 месяцев, 9 месяцев, 1 года, 2 лет, 3 лет или 5 лет при температуре и влажности окружающей среды. В других вариантах осуществления порошок стабилен при 40°C в течение по меньшей мере 3 месяцев. В дополнительных вариантах осуществления порошок стабилен при 40°C в течение по меньшей мере 3 месяцев, 6 месяцев, 9 месяцев, 1 года, 2 лет или 5 лет. В других дополнительных вариантах осуществления порошок стабилен при 40°C и влажности окружающей среды в течение по меньшей мере 3 месяцев, 6 месяцев, 9 месяцев, 1 года, 2 лет или 5 лет.
Порошковые композиции по изобретению и/или фармацевтические композиции, включающие порошковые композиции, могут содержать эксципиент. Подходящие эксципиенты включают, но не ограничиваются ими, трегалозу, сахарозу, сорбит, полиэтиленгликоль, по меньшей мере одну аминокислоту, гистидин, аланин, аргинин, глицин или их смесь. Способ может дополнительно включать добавление кислого компонента, антиоксиданта и/или модификатора тоничности.
В некоторых вариантах осуществления композиция имеет массовое соотношение эксципиента и антитела или его антигенсвязывающего фрагмента от примерно 0,27:1,0 до примерно 2,8:1,0; от примерно 0,27:1,0 до примерно 1,4:1,0; от примерно 0,27:1,0 до примерно 0,7:1,0 или примерно 0,7:1,0, и эксципиент представляет собой трегалозу или сахарозу. В других вариантах осуществления композиция имеет массовое соотношение эксципиента и антитела или его антигенсвязывающего фрагмента от примерно 0,27:1,0 до примерно 2,8:1,0, от примерно 0,27:1,0 до примерно 1,4:1,0, от примерно 0,27:1,0 до примерно 0,7:1,0, примерно 0,7:1,0 или примерно 0,35:1, и эксципиент представляет собой сорбит.
Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим препаратам, которые содержат эффективное количество порошков, описанных в данном документе. Фармацевтически приемлемый носитель может быть любым носителем, приемлемым для парентерального, перорального, энтерального и/или местного применения. Носитель может быть твердым, полутвердым или жидким (например, вода или органическая жидкость), либо их сочетаниями.
Порошок можно смешивать (например, растворять или погружать) с фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтически приемлемый носитель может быть, например, приемлемым для парентерального введения, и может включать, например, воду. Способ может дополнительно включать добавление одного или нескольких кислых компонентов, антиоксидантов и/или модификаторов тоничности к фармацевтической композиции. Дополнительно или альтернативно, к фармацевтическим композициям по изобретению можно добавлять подходящие добавки, например, буферные растворы, модификаторы вязкости, ароматизаторы, красители и так далее.
К порошковым фармацевтическим композициям можно применять экструзию расплава, прессование или иную обработку для создания, например, таблеток или других твердых или полутвердых композиций. Порошок можно покрывать, например, полимерами, такими как PLGA, для создания фармацевтической композиции с замедленным высвобождением или отсроченным высвобождением. Дополнительно или альтернативно, композиции можно инкапсулировать или покрывать, например, энтеросолюбильным покрытием. Покрытия и/или эксципиенты можно использовать, например, для защиты лекарственного средства от преципитации, денатурации или окисления органическими растворителями, такими как полиэтиленгликоль (например, PEG 400), этанол, DMSO, NMP, ледяная уксусная кислота, или тому подобное.
Жидкие композиции, например, водные композиции, также предусмотрены. Такие композиции могут подходить, например, для перорального или внутривенного введения и могут содержать любой подходящий эксципиент или добавку, такую как модификатор тоничности или буферные растворы. В некоторых вариантах осуществления жидкая фармацевтическая композиция имеет низкое процентное содержание белковых агрегатов, невзирая на высокую концентрацию водного белкового препарата. В одном варианте осуществления водная композиция содержит воду и белок, например, антитела, в высокой концентрации, который содержит менее чем примерно 5% белковых агрегатов, даже в отсутствие поверхностно-активного вещества или другого типа эксципиента. В одном варианте осуществления композиция содержит не более чем примерно 7,3% агрегированного белка, композиция содержит не более чем примерно 5% агрегированного белка, композиция содержит не более чем примерно 4% агрегированного белка, композиция содержит не более чем примерно 3% агрегированного белка, композиция содержит не более чем примерно 2% агрегированного белка, или композиция содержит не более чем примерно 1% агрегированного белка. В одном варианте осуществления композиция содержит по меньшей мере примерно 92%, по меньшей мере примерно 93%, по меньшей мере примерно 94%, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 97%, по меньшей мере примерно 98% или по меньшей мере примерно 99% мономера белка. Диапазоны, промежуточные для приведенных выше концентраций, например, по меньшей мере примерно 98,6% мономера белка, не более чем примерно 4,2% агрегированного белка, также предназначены являться частью данного изобретения. Кроме того, диапазоны значений при использовании сочетания любых из приведенных выше значений в качестве верхней и/или нижней границ также предусмотрены для включения.
IV. Способы применения изобретения
in vivo
in vitro
in situ
Композиции по изобретению можно использовать как для терапевтических целей, то есть , так и в качестве реагентов для  или  применения. Как описано и проиллюстрировано на примерах в данном документе, можно использовать распылительную сушку для получения сухих порошковых белков с целью применения в качестве исходных материалов для разработки/производства, например: (a) энтерального препарата ABT-874 для лечения язвенного колита, (b) препарата адалимумаба местного применения для лечения диабетических язв и (c) легочную лекарственную форму ABT-308 для лечения астмы. Кроме того, высушенные распылением антитела можно использовать в методе экструзии расплава MELTREX, поскольку вполне вероятно, что моноклональное антитело (мАТ) (mAb), заключенное в матрицу стеклообразных эксципиентов (например, трегалозу), обладает большей устойчивостью к тепловому развертыванию/денатурации. Это также может создать возможности для разработки новых твердых белковых лекарственных форм, например, для перорального введения белков.
Терапевтическое применение
Способы по изобретению можно также использовать для получения фармацевтических композиций, обладающих характеристиками, которые полезны для терапевтического применения. Фармацевтические композиции, в том числе жидкие и твердые композиции, можно использовать в качестве фармацевтической композиции или препарата для лечения нарушения у субъекта.
Композиции по изобретению можно использовать для лечения любого нарушения, для которого терапевтический белок, пептид, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент являются подходящими для лечения. «Нарушение» представляет собой любое состояние, которое улучшается в результате лечения антителом. Сюда относятся хронические и острые нарушения или заболевания, включая те патологические состояния, которые предрасполагают млекопитающее к рассматриваемому нарушению. В случае анти-TNFα антитела, терапевтически эффективное количество антитела можно вводить для лечения аутоиммунного заболевания, такого как ревматоидный артрит, кишечные расстройства, например, болезнь Крона, спондилоартропатия, например, анкилозирующий спондилоартрит, или заболевание кожи, например, псориаз. В случае анти-IL-12 антитела, терапевтически эффективное количество антитела можно вводить для лечения неврологического нарушения, такого как рассеянный склероз, или заболевания кожи, такого как псориаз. Другие примеры нарушений, для лечения которых можно использовать композиции по изобретению, включают рак, в том числе рак молочной железы, лейкемию, лимфому и рак толстой кишки.
Термин «субъект» должен включать живые организмы, например, прокариоты и эукариоты. Примеры субъектов включают млекопитающих, например, людей, собак, коров, лошадей, свиней, овец, коз, кошек, мышей, кроликов, крыс и трансгенных животных, отличных от человека. В определенных вариантах осуществления изобретения субъект является человеком.
Термин «лечение» означает как терапевтическое лечение, так и профилактические и превентивные меры. Нуждающиеся в лечении включают тех, которые уже имеют заболевание, а также тех, у которых заболевание должно быть предотвращено.
Водные или твердые композиции можно вводить млекопитающему, включая человека, нуждающемуся в лечении, известными способами введения. Примеры способов введения включают внутривенное введение, такое как болюсное введение или путем непрерывной инфузии на протяжении определенного периода времени, внутримышечное, внутрибрюшинное, интрацереброспинальное, подкожное, внутрисуставное, интрасиновиальное, интратекальное, внутрикожное, трансдермальное, пероральное, местное или ингаляционное введение.
В одном варианте осуществления композицию вводят млекопитающему путем подкожного введения. Для этих целей композицию можно вводить, используя шприц, а также другие устройства, в том числе инъекционные устройства (например, устройства Inject-ease и Genject); инжекторы-ручки (например, GenPen); безыгольные устройства (например, MediJector и BioJector) и подкожные системы доставки с помощью пластырей.
Изобретение также охватывает устройства доставки, в которых размещена композиция. Примеры таких устройств включают, но не ограничиваются ими, шприц, ручку, имплантат и пластырь. Пример аутоинъекционной ручки описан в патентной заявке США № 11/824516, зарегистрированной 29 июня 2007 г.
Соответствующая дозировка («терапевтически эффективное количество») белка, пептида, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента будет зависеть, например, от состояния, подлежащего лечению, тяжести и течения состояния, вводят ли его с превентивной или терапевтической целью, предшествующей терапии, истории болезни пациента и его реакции на белок, типа используемого белка, а также от усмотрения лечащего врача. Композиции по изобретению надлежащим образом вводят пациенту за один раз или на протяжении ряда процедур, и их можно вводить пациенту с момента постановки диагноза и далее. Композиции можно вводить в качестве единственного лечения или в сочетании с другими лекарственными средствами или методами лечения, пригодными для лечения рассматриваемого состояния.
В одном варианте осуществления композиции по настоящему изобретению, например, те, которые включают афелимомаб и/или любое другое подходящее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, используют терапевтически. В одном варианте осуществления композиции представляют собой фармацевтические композиции для использования в лечении сепсиса.
Сепсис, фактор некроза опухолей-α (TNF-α) и афелимомаб
Сепсис определяют как системный воспалительный ответ на инфекцию. Инфекция может быть, например, вирусной, бактериальной, грибковой или паразитарной. Сепсис в конечном итоге приводит к активации иммунокомпетентных клеток и системному воспалительному ответу, связанному с высвобождением многих цитокинов (TNF-α, IL-1 и так далее). Существуют различные стадии/виды сепсиса, как определено ACCP (Американской коллегией врачей - специалистов по заболеваниям грудной клетки) (American College of Chest Physicians): SIRS (синдром системного воспалительного ответа) (системная воспалительная реакция различного генеза (инфекция, эритема и так далее), сепсис (SIRS, вызванный инфекцией), тяжелый сепсис (сепсис с отказом/дисфункцией органов) и септический шок (сепсис с шоком)). Для диагностики этих видов сепсиса должны быть соблюдены различные критерии.
Первичный возникающий иммунный ответ организуется и усиливается различными вторичными медиаторами. Организм не в состоянии ограничивать воспаление местом его возникновения, (главным образом в легких или в системе кровообращения). Могут быть затронуты различные органы, что оказывает сильное влияние на некоторые функции организма. Вследствие этого, возможные признаки сепсиса включают гипертермию, тахипноэ, тахикардию, гипотонию и спутанность сознания. Из-за целого ряда показателей сепсис очень трудно диагностировать, что вносит вклад в высокие показатели смертности среди пациентов с сепсисом.
et al., Aktuelle Ernährungsmedizin,
et al., Immunobiology
Известны различные лекарственные препараты для лечения больных сепсисом, в том числе дротрекогин α (активированный белок C) и антитромбин III для блокирования свертывания крови, и кортизон (в низких дозах) для уменьшения воспаления. Bloos  28: 186-190 (2003). Поскольку TNF-α является одним из основных медиаторов сепсиса, одним из подходов к лечению сепсиса является блокирование TNF-α для устранения его эффектов. Локальное высвобождение TNF-α увеличивает приток крови и проницаемость сосудов. Это создает условия для притока в инфицированную ткань жидкостей, клеток и белков, которые участвуют в иммунной защите организма. Для предотвращения распространения инфекции в кровь в малых сосудах позже образуются сгустки, и жидкость просачивается в лимфатические узлы, где начинает развиваться адаптивный иммунный ответ. При системных инфекциях TNF-α работает аналогичным образом, вызывая шок и диссеминированное внутрисосудистое свертывание. Результатами являются истощение факторов свертывания крови, постоянное кровотечение и полиорганная недостаточность. Janeway  (Garland Publishing, 1994). Блокирование TNF-α может быть достигнуто парентеральным введением анти-TNF-α антител. Благодаря конструированию фрагмента антитела афелимомаба должно быть достигнуто лучшее проникновение в ткани в сочетании с меньшей проблемой иммуногенности.
Mycobacterium avium
В некоторых вариантах осуществления изобретение включает введение субъекту (например, человеку) белка, пептида, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента таким образом, что активность его мишени или мишеней у субъекта ингибируется и осуществляется лечение. В некоторых вариантах осуществления заболевание выбирают из группы, включающей артрит, остеоартрит, ювенильный хронический артрит, септический артрит, артрит Лайма, псориатический артрит, реактивный артрит, спондилоартропатию, системную красную волчанку, болезнь Крона, язвенный колит, воспалительное заболевание кишечника, инсулинозависимый сахарный диабет, тиреоидит, астму, аллергические заболевания, псориаз, дерматит, склеродермию, реакцию «трансплантат против хозяина», отторжение пересаженного органа, острое или хроническое иммунное заболевание, связанное с трансплантацией органов, саркоидоз, атеросклероз, диссеминированное внутрисосудистое свертывание, синдром Кавасаки, диффузный токсический зоб, нефротический синдром, синдром хронической усталости, гранулематоз Вегенера, пурпуру Геноха-Шонлейна, микроскопический васкулит почек, хронический активный гепатит, увеит, септический шок, синдром токсического шока, синдром сепсиса, кахексию, инфекционные заболевания, паразитарные болезни, синдром приобретенного иммунодефицита, острый поперечный миелит, хорею Гентингтона, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, инсульт, первичный билиарный цирроз, гемолитическую анемию, злокачественные новообразования, сердечную недостаточность, инфаркт миокарда, болезнь Аддисона спорадического характера, полигландулярный дефицит типа I и полигландулярный дефицит типа II, синдром Шмидта, синдром расстройства дыхания у взрослых (острый), алопецию, очаговую алопецию, серонегативную артропатию, артропатию, болезнь Рейтера, псориатическую артропатию, артропатию язвенного колита, энтеропатический синовит, хламидиоз, связанную с иерсинией и сальмонеллой артропатию, спондилоартропатию, атероматозную болезнь/артериосклероз, атопическую аллергию, аутоиммунную буллезную болезнь, пузырчатку обыкновенную, пузырчатку листовидную, пемфигоид, IgA-зависимый линейный дерматоз, аутоиммунную гемолитическую анемию, Кумбс-положительную гемолитическую анемию, приобретенную злокачественную анемию, ювенильную злокачественную анемию, миальгический энцефалит/синдром хронической усталости, хронический слизисто-кожный кандидоз, гигантоклеточный артериит, первичный склерозирующий гепатит, криптогенный аутоиммунный гепатит, синдром приобретенного иммунодефицита, заболевания, связанные с приобретенным иммунодефицитом, гепатит B, гепатит С, общие вариабельные иммунные недостаточности (общую вариабельную гипогаммаглобулинемию), дилатационную кардиомиопатию, женское бесплодие, угасание функции яичников, преждевременное угасание функции яичников, легочный фиброз, криптогенный фиброзирующий альвеолит, поствоспалительное интерстициальное заболевание легких, интерстициальный пневмонит, связанное с коллагенозом интерстициальное заболевание легких, связанное со смешанным заболеванием соединительной ткани заболевание легких, связанное с системной склеродермией интерстициальное заболевание легких, связанное с ревматоидным артритом интерстициальное заболевание легких, связанное с системной красной волчанкой заболевание легких, связанное с дерматомиозитом/полимиозитом заболевание легких, связанное с болезнью Шегрена заболевание легких, связанное с анкилозирующим спондилоартритом заболевание легких, васкулитное диффузное заболевание легких, связанное с гемосидерозом заболевание легких, обусловленное действием лекарственного средства интерстициальное заболевание легких, фиброз, лучевой фиброз, облитерирующий бронхиолит, хроническую эозинофильную пневмонию, лимфоцитарное инфильтрирующее заболевание легких, постинфекционное интерстициальное заболевание легких, подагрический артрит, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный гепатит типа 1 (классический аутоиммунный или волчаночный гепатит), аутоиммунный гепатит типа 2 (гепатит, связанный с антителами против LKM), аутоиммунную гипогликемию, инсулинорезистентность типа B с акантокератодермией, гипопаратиреоз, острые иммунные заболевания, связанные с трансплантацией органов, хронические иммунные заболевания, связанные с трансплантацией органов, остеоартроз, первичный склерозирующий холангит, псориаз типа 1, псориаз типа 2, идиопатическую лейкопению, аутоиммунную нейтропению, почечную недостаточность, связанную с NOS, гломерулонефрит, микроскопический васкулит почек, болезнь Лайма, дискоидную красную волчанку, идиопатическое или связанное с NOS мужское бесплодие, аутоиммунитет против спермы, рассеянный склероз (все подтипы), симпатическую офтальмию, легочную гипертонию, вторичную по отношению к болезни соединительной ткани, синдром Гудпасчера, легочное проявление узелкового полиартрита, острую ревматическую лихорадку, ревматоидный спондилит, болезнь Стилла, системную склеродермию, синдром Шегрена, болезнь Такаясу/артериит, аутоиммунную тромбоцитопению, идиопатическую тромбоцитопению, аутоиммунные заболевания щитовидной железы, гипертиреоз, струмозный аутоиммунный гипотиреоз (зоб Хасимото), атрофический аутоиммунный гипотиреоз, первичную микседему, факогенный увеит, первичный васкулит, витилиго, острые заболевания печени, хронические заболевания печени, алкогольный цирроз, вызванные алкоголем повреждения печени, холеостаз, идиосинкразическое заболевание печени, лекарственный гепатит, неалкогольный стеатогепатит, аллергию и астму, стрептококковую инфекцию группы B (GBS), психические расстройства (например, депрессию и шизофрению), опосредованные Th2-типом и Th1-типом заболевания, острые и хронические боли (различные формы боли), а также раковые заболевания, такие как рак легких, молочной железы, желудка, мочевого пузыря, толстой кишки, поджелудочной железы, яичников, простаты и прямой кишки, а также гемопоэтические злокачественные новообразования (лейкемии и лимфомы), абеталипопротеинемию, акроцианоз, острые и хронические паразитарные и инфекционные процессы, острый лейкоз, острый лимфобластный лейкоз (ALL), острый миелобластный лейкоз (AML), острые или хронические бактериальные инфекции, острый панкреатит, острую почечную недостаточность, аденокарциномы, воздушную эктопическую систолу, комплекс СПИД-деменция, алкогольный гепатит, аллергический конъюнктивит, аллергический контактный дерматит, аллергический ринит, отторжение трансплантата, альфа-1-антитрипсиновую недостаточность, боковой амиотрофический склероз, анемию, стенокардию, дегенерацию клеток переднего рога спинного мозга, анти-cd3 терапию, антифосфолипидный синдром, антирецепторную реакцию гиперчувствительности, аортальную и периферическую аневризмы, расслоение аорты, артериальную гипертензию, атеросклероз, артериовенозную фистулу, атаксию, фибрилляцию предсердий (постоянную или пароксизмальную), трепетание предсердий, атриовентрикулярную блокаду, B-клеточную лимфому, отторжение костного трансплантата, отторжение трансплантата костного мозга (BMT), межжелудочковую блокаду, лимфому Беркитта, ожоги, аритмии сердца, сердечный синдром оглушения, сердечные опухоли, кардиомиопатию, воспалительный ответ на экстракорпоральное кровообращение, отторжение хрящевого трансплантата, дегенерацию коры мозжечка, мозжечковые расстройства, хаотическую или мультифокальную предсердную тахикардию, вызванные химиотерапией заболевания, хронический миелоцитарный лейкоз (CML), хронический алкоголизм, хронические воспалительные патологии, хронический лимфолейкоз (CLL), хроническую обструктивную болезнь легких (COPD), хроническую интоксикацию салицилатом, колоректальный рак, застойную сердечную недостаточность, конъюнктивит, контактный дерматит, легочное сердце, ишемическую болезнь сердца, болезнь Крейтцфельдта-Якоба, культурально-негативный сепсис, кистозный фиброз, связанные с терапией цитокинами заболевания, «деменцию боксеров», демиелинизирующие заболевания, геморрагическую лихорадку денге, дерматит, дерматологические состояния, диабет, сахарный диабет, диабетическое атеросклеротическое заболевание, болезнь диффузных телец Леви, дилатированную застойную кардиомиопатию, нарушения базальных ганглиев, синдром Дауна в среднем возрасте, лекарственные двигательные расстройства, вызванные лекарственными средствами, которые блокируют рецепторы дофамина в ЦНС, чувствительность к лекарственным препаратам, экзему, энцефаломиелит, эндокардит, эндокринопатию, эпиглоттит, инфекцию вирусом Эпштейна-Барра, эритромелалгию, экстрапирамидные и мозжечковые поражения, семейный гематофагоцитарный лимфогистиоцитоз, отторжение имплантата фетального тимуса, атаксию Фридрейха, функциональные расстройства периферических артерий, грибковый сепсис, газовую гангрену, язву желудка, клубочковой нефрит, отторжение трансплантата какого-либо органа или ткани, грамотрицательный сепсис, грамположительный сепсис, гранулемы из-за внутриклеточных микроорганизмов, лейкоз ворсистых клеток, болезнь Галлервордена-Шпатца, тиреоидит Хашимото, сенную лихорадку, отторжение трансплантата сердца, гемохроматоз, гемодиализ, гемолитический уремический синдром/тромболитическую тромбоцитопеническую пурпуру, кровотечение, гепатит (A), аритмии пучка Гиса, ВИЧ-инфекцию/ВИЧ-невропатиию, болезнь Ходжкина, гиперкинетические нарушения движения, реакции гиперчувствительности, гиперчувствительный пневмонит, гипертонию, гипокинетические нарушения движения, освидетельствование гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, идиопатическую болезнь Аддисона, идиопатический легочный фиброз, опосредованную антителами цитотоксичность, астению, детскую спинальную мышечную атрофию, воспаление аорты, грипп, воздействие ионизирующего облучения, иридоциклит/увеит/неврит зрительного нерва, ишемию-реперфузионные повреждения, ишемический инсульт, ювенильный ревматоидный артрит, ювенильную спинальную мышечную атрофию, саркому Капоши, отторжение трансплантата почки, легионеллу, лейшманиоз, лепру, поражения кортикоспинальной системы, жировой отек, отторжение трансплантата печени, лимфедему, малярию, злокачественную лимфому, злокачественный гистиоцитоз, злокачественную меланому, менингит, менингококкемию, метаболические/идиопатические головные боли, мигрень, митохондриальное мультисистемное расстройство, смешанные заболевания соединительной ткани, моноклональную гаммапатию, множественную миелому, многосистемные дегенерации (Менцеля, Дежерина-Тома, Ши-Драгера и Мачадо-Джозефа), миастению, внутриклеточную , микобактериальный туберкулез, миелодиспластический синдром, инфаркт миокарда, ишемические поражения миокарда, карциному носоглотки, неонатальное хроническое заболевание легких, нефрит, нефроз, нейродегенеративные заболевания, нейрогенные I мышечные атрофии, нейтропеническую лихорадку, неходжкинскую лимфому, окклюзию брюшной аорты и ее ветвей, окклюзионные артериальные нарушения, терапию okt3, орхит/эпидидимит, орхит/обратную процедуру вазэктомии, органомегалию, остеопороз, отторжение трансплантата поджелудочной железы, карциному поджелудочной железы, паранеопластический синдром/гиперкальциемию злокачественного перерождения, отторжение трансплантата паращитовидной железы, воспаление тазовых органов, многолетний ринит, болезнь перикарда, периферическое атеросклеротическое заболевание, периферические сосудистые заболевания, перитонит, злокачественную анемию, пневмоцистную пневмонию, пневмонию, POEMS синдром (полинейропатия, органомегалия, эндокринопатия, моноклональная гаммапатия и синдром изменения кожи), постперфузионный синдром, постнасосный синдром, постинфарктный кардиотомный синдром, преэклампсию, прогрессирующий надъядерный паралич, первичную легочную гипертензию, лучевую терапию, феномен и болезнь Рейно, болезнь Рейно, болезнь Рефсума, регулярную тахикардию с узким комплексом QRS, реноваскулярную гипертензию, реперфузионные повреждения, ограничительную кардиомиопатию, саркому, склеродермию, старческую хорею, старческое слабоумие с тельцами Леви, серонегативные артропатии, шок, серповидно-клеточную анемию, отторжение кожного трансплантата, синдром изменения кожи, отторжение трансплантата тонкого кишечника, солидные опухоли, специфические аритмии, спинальную атаксию, спиноцеребеллярные дегенерации, стрептококковый миозит, структурные поражения мозжечка, подострый склерозирующий панэнцефалит, обморок, сифилис сердечно-сосудистой системы, общую анафилактическую реакцию, синдром системного воспалительного ответа, системный ювенильный ревматоидный артрит, T-клеточную или FAB ALL, телеангиэктазию, облитерирующий тромбангиит, тромбоцитопению, токсические реакции, трансплантаты, травму/кровоизлияния, реакции гиперчувствительности III типа, гиперчувствительность IV типа, нестабильную стенокардию, уремию, уросепсис, крапивницу, пороки сердечных клапанов, варикозное расширение вен, васкулит, венозные заболевания, тромбоз вен, фибрилляцию желудочков, вирусные и грибковые инфекции, энцефалит с высоким риском смертельного исхода/асептический менингит, связанный с высоким риском для жизни гемофагоцитарный синдром, синдром Вернике-Корсакова, болезнь Вильсона и отторжение ксенотрансплантата любого органа или ткани.
Не терапевтическое применение
in vitro
Композиции по изобретению можно также использовать для не терапевтических целей, то есть для исследований . Например, порошковые белки и родственные композиции, описанные в данном документе, можно использовать для диагностических или экспериментальных методов в медицине и биотехнологии, включая, но не ограничиваясь ими, применения в геномике, протеомике, биоинформатике, культивировании клеток, биологии растений и клеточной биологии. Например, композиции, описанные в данном документе, можно использовать для получения белка, необходимого в качестве молекулярного зонда в методе маркировки и обнаружения. Дополнительное использование композиций, описанных в данном документе, заключается в обеспечении добавок к реагентам для культивирования клеток, в том числе для наращивания клеток и производства белка для промышленных целей.
Композиции, содержащие высокие концентрации, например, антител, можно использовать в качестве реагента для лабораторных исследований. Такие высококонцентрированные формы антител расширяют современные рамки лабораторных экспериментов.
Другое альтернативное применение препарата по изобретению заключается в производстве добавок к пищевым продуктам. В некоторых вариантах осуществления, поскольку композиции по изобретению содержат в основном белок и сахар, они могут быть использованы для доставки нужных белков в высоких концентрациях, например, пищевых добавок, в пищевые продукты. Таким образом, композиции по изобретению могут обеспечивать высокие концентрации белка.
Изделия
В другом варианте осуществления изобретения предложено изделие, которое содержит порошковый белок или родственные композиции по настоящему изобретению и включает инструкции для их применения. В одном варианте осуществления изделие включает контейнер. Подходящие контейнеры включают, например, один или несколько сосудов, флаконов (например, двухкамерные флаконы), шприцы (в том числе одно- и двухкамерные шприцы), ручки-автоинжекторы, включающие шприц, и пробирки. Контейнер может быть создан из различных материалов, таких как стекло, пластик или поликарбонат. Контейнер содержит водный препарат и этикетку на нем, или прикрепленную к нему, на контейнере могут находиться инструкции по применению. Например, на этикетке может быть указано, что композиция является полезной или предназначенной для подкожного применения. На этикетке, например, могут быть указания для пользователя добавлять жидкость, например, стерильную воду или физиологический раствор, чтобы подготовить композицию для введения, например, путем инъекции. Контейнер, содержащий композицию, может представлять собой флакон многократного использования, позволяющий проводить повторные введения (например, 2-6 введений), например, водного препарата. Изделие может дополнительно включать второй контейнер. Изделие может дополнительно включать другие материалы, желательные с коммерческой и пользовательской точек зрения, в том числе другие буферные растворы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши с инструкциями по использованию.
Далее данное изобретение будет проиллюстрировано на следующих примерах, которые не должны быть истолкованы как ограничивающие.
ПОЯСНЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ НА ПРИМЕРАХ
В данном примере Fab-фрагмент молекулы IgG был высушен распылением и проанализирован. Данное исследование имело целью поиск подходящих препаратов и условий процесса для распылительной сушки Fab-фрагмента с высоким выходом и хорошей стабильностью при хранении, так как он предназначен для использования в качестве промежуточного продукта для хранения. Стабилизация белка во время процесса распылительной сушки и последующего хранения достигается за счет добавления различных сахаров. Для данного исследования трегалозу, сахарозу и сорбит добавляли к жидкому белковому концентрату. Стабильность белка анализировали, используя данные различных аналитических методов, в том числе эксклюзионной хроматографии, динамического рассеяния света, измерения мутности и изоэлектрического фокусирования.
Материалы
Концентрат MAK 195F
3
4
3
Белок, использованный в данном примере, представлял собой афелимомаб (MAK 195F), предоставленный компанией Abbott Laboratories в виде водного раствора, содержащего: MAK 195F (12,4 мг/мл), NaCl (8,77 мг/мл), NaPO (1,64 мг/мл), Pluronic F68 (0,1 мг/мл) и воду (q.s.). Концентрат MAK 195F имел pH 7,2 и был близок к изотоническому (~286 мосмол/кг). Он имел вязкость 0,981 мПа (измерено вискозиметром Schott Ubbelohde) и плотность 1,0086 г/см (измерено с помощью DMA 46 от Chempro).
2
3
3,
H222
Белок афелимомаб представляет собой F(ab')-фрагмент мышиного анти-TNF-альфа антитела (IgG) с приблизительной молекулярной массой 100 килодальтон (кДа). Его получают расщеплением при помощи пепсина моноклонального антитела IgG в результате чего легкие цепи содержат 214 аминокислот каждая, и тяжелые цепи содержат 233-241 аминокислот. Примерно 30% Fd'-фрагментов гликозилированы по Ser. Из-за различных особенностей гликозилирования афелимомаб имеет вплоть до семи изоформ в диапазоне изоэлектрических точек (IEP) от 7,5 до 8,8.
Концентрат получали под сухим льдом частями примерно по 400 г. Чтобы избежать повторных циклов замораживания-оттаивания и длительного хранения в жидком состоянии, концентрат размораживали и разносили по аликвотам в 40-50 мл, хранили при -80°C и заново размораживали перед использованием.
Эксципиенты
Три различных сахара были использованы для стабилизации белка: D-сорбит (Sigma, продукт: S-7547, партия: 108H01461); сахароза (Sigma, продукт S-7903, партия: 014K0010) и D-(+) трегалозы дигидрат (Sigma, продукт: T5251, партия: 113K3775).
Все водные растворы готовили на бидистиллированной воде (Fi-stream 4BD; Fisons) и, при необходимости, фильтровали через 0,2-мкм мембранный фильтр (Schleicher & Schuell).
Методы
Распылительная сушка
1
2
3
4
5
6
7
LF
AA
Эксперименты по распылительной сушке проводили на устройстве Büchi Mini-Spray Dryer B-191 (фигура 1), используя высокопроизводительный циклон  для извлечения порошка. Высушивающий воздух фильтровали через Luwa UItrafilter  (стекловолокно; класс фильтра: HEPA H13 высокоэффективный уловитель частиц) при скорости воздушного потока 800 л/мин (90% мощности аспиратора) перед поступлением в нагревательное устройство  и сушильную камеру. Всю подаваемую жидкость фильтровали через 0,22-мкм фильтрующий элемент перед транспортировкой в сушильную камеру  с помощью перистальтического насоса  (Q=~3 мл/мин; Ø силиконовой трубки =3 мм). Распыление проводили двумя жидкостными соплами  (диаметр отверстий: 0,7 мм) с использованием сжатого воздуха из собственного источника (Q=700 л/ч). Два жидкостных сопла были оснащены автоматической системой очистки, также с использованием сжатого воздуха (4,5 бар), и системой водяного охлаждения. После распылительной сушки полученные порошки извлекали из собирающего сосуда  в суховоздушный бокс с перчатками (RH<2%), помещали в стеклянные сосуды (пробки из хлорбутилового каучука), запечатывали парафильмом и хранили при -80°C. Выход порошка определяли как количество порошка внутри собирающего сосуда, деленное на общее количество твердых веществ в подаваемой жидкости. Порошковые отложения на внутренней поверхности циклона не собирали.
Эксклюзионная хроматография (SEC)
Для выявления растворимых агрегатов использовали эксклюзионную хроматографию. Колонку 12/300 GL с Tricorn Superose (диапазон разделения 1-300 кДа), приобретенную у Amersham Biosciences, соединяли с системой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) Perkin Elmer, включающей комплект из 200 LC насоса, ISS 200 автоматического пробоотборника и 235C детектора на диодной матрице. До колонки с Superose устанавливали предварительную колонку SecurityGuard™ от Phenomenex (заправленную картриджами AJO-4489), чтобы избежать примеси крупных частиц. Подвижная фаза (буфер A, скорость потока: 0,5 мл/мин) представляла собой калий-фосфатный буфер (рН 6,9) с добавлением хлорида натрия (0,5 моль/л), профильтрованный через 0,2-мкм мембранный фильтр (Schleicher & Schuell, FP 30/0,2 CA) и дегазированный в течение 10 минут с помощью гелия. Все образцы измеряли непосредственно (например, подаваемую жидкость) или осторожно повторно растворяли в буфере A до концентрации белка 1 мг/мл (высушенные распылением (sd) порошки) и анализировали вскоре после получения. Объем впрыска за прогон составлял 100 мкл, и, как правило, все образцы измеряли дважды (подаваемая жидкость) или трижды (sd порошки) для обеспечения воспроизводимости результатов. Все хроматограммы интегрировали вручную, используя программу Perkin Elmer TotalChrom Navigator, версия 6.2.
Дифференциальная сканирующая калориметрия (DSC)
e
g
2
Термические события изучали при помощи Mettler Toledo DSC 822. Отвешивали 5-15 мг порошка (Mettler, AT DeltaRange) в алюминиевые контейнеры в суховоздушных условиях (бокс с перчатками). Алюминиевые контейнеры запечатывали холодным способом и помещали в калориметр, где их подвергали воздействию определенной температурной программы (в зависимости от препарата) нагревания и охлаждения по очереди через ожидаемую T (скорость нагрева/охлаждения: 10°C/мин). Температуру стеклования оценивали при помощи программы Mettler STARe Software V 6.10, предварительно определяли как срединную точку эндотермического перехода в процессе этапа нагревания. Только второй и третий циклы нагревания были приняты во внимание, чтобы избежать помех со стороны других необратимых эндотермических событий. На протяжении эксперимента измерительную ячейку высушивали и продували газом N.
Широкоугольная дифракция рентгеновских лучей (WAXD)
α
Journal of Pharmacy and Pharmacology
Кристалличность порошков исследовали методом дифракции рентгеновских лучей на порошке при помощи устройства Philips модели X`pert MPD c Cu K-излучением (λ=0,15418 мм) при 40 кВ/40 мА и 25°C. Порошок в количестве 60-80 мг помещали в алюминиевый прободержатель и сразу же сканировали. Все сканограммы измеряли в диапазоне 2θ=0,5°-40° с шагом в 0,02°/с. Кристалличность образца (степень кристалличности) рассчитывали, исходя из кристаллических и аморфных областей дифракционной диаграммы (смотри ниже) с помощью метода, основанного на методе Black и Lovering. Black, Lovering  29: 684-687 (1977).
C=I
/(I
+I
)=AUC
/AUC
=(AUC
-AUC
)/AUC
к
к
а
кристаллический
общий
общий
аморфный
общий
к
а
аморфный
C представляет собой степень кристалличности (иногда также называемую процентом кристалличности, при умножении на 100), I и I представляют собой интенсивность рентгеновских лучей, рассеянных кристаллическими или аморфными областями, которая равна площади под кривой (AUC) пиков и широких ореолов, соответственно. AUC рассчитывали путем вырезания кристаллических пиков из диаграммы и используя вычерчивание эмпирической кривой.
Динамическое рассеяние света
Измерения динамического рассеяния света (DLS) проводили при помощи устройства Zetasizer Nano ZS (Malvern, Germany, программа: DTS версия: 4.2) для обнаружения растворимых, а также нерастворимых агрегатов. В устройстве Zetasizer используется лазерное излучение 633 нм и определяется рассеяние на 173° (обнаружение обратного рассеяния). Оно имеет диапазон измерений 0,6-6000 нм для измерения размеров. Размер частиц определяли путем измерения броуновского движения частиц в образце. Malvern Instruments: Zetasizer Nano Series User Manual. MAN 0317, выпуск 2.0, март 2004 г. Жидкие препараты тестировали без каких-либо добавок, а порошки разбавляли бидистиллированной водой (профильтрованной через 0,2 мкм) до исходной концентрации белка. При использовании кювет малого объема (одноразовые кюветы малого объема, Malvern) для измерения требовалось только по 0,5 мл раствора. Тесты с использованием 2-мл кювет дали аналогичные результаты (данные не приводятся). После 2 минут времени уравновешивания (25°C) проводили 3 измерения каждого образца с 5 прогонами каждое (продолжительность прогона: 30 с, задержка между прогонами: 2 с). Данную процедуру проводили трижды для каждого образца порошка/раствора. Полученные диаграммы экспортировали как таблицы баллов и преобразовывали в диаграммы с помощью MS Excel, в результате получали три построенные кривые на образец, демонстрирующие распределения размер-объем и размер-интенсивность.
Сканирующая электронная микроскопия (SEM)
Размер и морфологию частиц изучали с помощью изображений с электронного микроскопа, используя сканирующий электронный микроскоп Amray 1810 T при 20 кВ. Небольшие образцы порошков фиксировали на Al столбиках для образцов (G301, Plano) с помощью самоклеящейся пленки. После напыления Au при 20 мА/кВ (Hummer JR Technics) в течение 1,5 минут образцы помещали под микроскоп и делали снимки при различном увеличении (обычно 1000x, 2000x и 3000x). Как правило, оценивали снимки при увеличении 3000x.
Титрование по Карлу Фишеру
2
Содержание влаги в высушенных распылением (sd) порошках измеряли с помощью устройства для определения влажности Mitsubishi Moisture Meter (CA-06 Coulometric) и испарителя воды Mitsubishi water vaporizer (VA-06). Образцы порошка примерно по 70 мг помещали в специальный прободержатель в суховоздушных условиях (бокс с перчатками). Пустой прободержатель взвешивали на аналитических весах Mettler AT DeltaRange analytical balance. При соединении прободержателя с блоком испарителя порошок заполнял стеклянную лодочку, которая въезжала в нагретый блок сушильной печи. В то время как вода испарялась (150°C) и количественно переносилась в ячейку для титрования через поток газообразного азота (~200 мл/мин), прободержатель повторно взвешивали, чтобы рассчитать реальный вес образца. Титрование начинали при скорости ≤0,01 мкг HO/мин.
Невидимые частицы
Примеси частиц, например, в повторно растворенных sd порошках наблюдали с помощью автоматизированного устройства для счета частиц Syringe (Klotz, Germany, программа: SW-CA версия 1.2). Жидкость всасывалась через проточную ячейку, диаметр которой сокращался до 250 мкм перед лазером. Когда частицы попадали под луч лазера, их детектируемая интенсивность была снижена. Ослабление лазерного излучения являлось показателем размера частиц. Все порошки восстанавливали до их исходной концентрации бидистиллированной водой (профильтрованной через 0,2 мкм) и 0,8 мл растворов прокачивали через систему (один раз для промывки системы, три раза для расчетов частиц). Результаты рассчитывали на 1 мл раствора. Для фармацевтического применения программа ранжировала частицы по 8 различным диапазонам размеров (1-50 мкм) в соответствии с правилами Фармакопеи США (USP) или Европейской фармакопеи (Ph. Eur.).
Изоэлектрическое фокусирование (IEF)
Разделение афелимомаба методом IEF было основано на различиях в заряде Fd'-фрагмента и вариантов легкой цепи. В первую очередь оно служило в качестве теста на идентичность для афелимомаба, но его также можно использовать в качестве инструмента для тестов на стабильность. Фокусирование проводили в камере прибора Pharmacia Multiphor II, присоединенной к источнику питания Serva Blue Power 3000. Готовые к использованию гели с градиентом рН 6-9 (Servalyt Precotes 6-9, 125×125 мм, толщина 0,3 мм; Serva, Germany) помещали на охлаждающую пластину (4°C, покрытую некоторым количеством Bayol F в качестве теплоносителя). Все образцы разбавляли до концентрации белка примерно 4 мг/мл, 10 мкл помещали на гель. Программа фокусирования начиналась при 200 В и занимала примерно 195 мин (конечное напряжение 2000 В). После фиксации в течение 20 минут гели окрашивали Кумасси бриллиантовым голубым (20 мин), а затем несколько раз отмывали краситель. Используемые растворы приведены в таблице 1 ниже.
<b>Таблица 1</b>
<b>Название раствора</b>
<b>Состав</b>
<b>Количество</b>
Фиксирующий раствор
трихлоруксусная кислота
40 г
этанол 96%
100 мл
бидистиллированная вода
100 мл
Окрашивающий раствор
Кумасси бриллиантовый голубой R 250
400 мг
уксусная кислота
40 мл
этанол 96%
160 мл
бидистиллированная вода
до 400 мл
Обесцвечивающий раствор
уксусная кислота
50 мл
этанол 96%
250 мл
бидистиллированная вода
до 500 мл
После промывания водой и сушки в течение ночи при комнатной температуре, гели осматривали и сканировали с использованием рабочей станции Desaga CAB UVIS VD 40 с программным обеспечением ProViDoc (версия 3.20).
Мутность
Мутность является выражением оптического свойства, которое заставляет свет рассеиваться и поглощаться, а не передаваться по прямым линиям, проходящим через образец. Она может быть вызвана любыми взвешенными частицами, в том числе твердыми веществами, коллоидами и пузырьками газа. Поскольку мутность не является четко определенным параметром, ее измеряли путем сравнения образцов со стандартами опалесценции, например, гидразиновыми гелями. Для оценки нефелометрических единиц мутности (NTU) образцов использовали нефелометр Hach Ratio XR. Нефелометр калибровали при помощи гидразиновых стандартов. После измерения значения холостой пробы трубок Несслера, образцы растворяли и восстанавливали бидистиллированной водой (профильтрованной через 0,2 мкм) до исходной концентрации белка, а затем помещали в пучок света. Чтобы исключить влияние неоднородности стекла, важно отмечать направление трубок при измерениях холостой пробы и использовать трубки в том же направлении при измерении образца.
Окраска
Для выявления изменений в окраске повторно растворенных sd порошков использовали устройство LICO 400 (Hach Lange, Switzerland), которое представляет собой колориметр для измерения степени окраски прозрачных жидкостей. Он определяет эталонный раствор, ближайший к образцу, и количественно определяет отклонения в цвете между образцом и эталоном. В этом исследовании использовали цветовое пространство CIE-Lab, определяя цвета как координаты яркости (L, черное-белое) и цвета (±a, красное-зеленое; ±b, желтое-синее) (CIE является аббревиатурой Commission Internationale d'Eclairage). Устройство LICO 400 калибровали с использованием стандартных растворов от Ph. Eur. (BG 5-7, коричневато-желтый, разбавленный; B 5-9, коричневый). Все образцы порошка восстанавливали до исходной концентрации, 200 мкл помещали в кюветы из кварцевого стекла небольшого объема.
УФ-спектроскопия
Для определения концентрации белка в аликвотах концентрата или ультрафильтрированных образцов использовали спектрофотометр Perkin Elmer Lambda 25 UV/VIS. Образцы разбавляли до концентрации белка приблизительно 0,6 мг/мл. Три кюветы из кварцевого стекла заполняли раствором образцов и каждый из них измеряли трижды на длине волны (λ)=280 нм и λ=320 нм. Величины поглощения (выданные программой UV WinLab 5.0, Perkin Elmer) использовали для расчета концентрации белка с помощью следующего уравнения:
c=[(A
-A
)
/1,37]*F(мг/мл)
280
320
среднее
1,37=ε
-ε
280нм
320нм
F=V
/V
+1
H2O
белк
В данных уравнениях F представляет собой коэффициент разбавления, A представляет собой измеряемое поглощение, ε представляет собой коэффициент молярной экстинкции (поглощение 1 мг/мл раствора при использовании 1-см кюветы), и V означает объем на первом этапе разведения.
Фильтрация в тангенциальном потоке
Чтобы получить высококонцентрированные растворы афелимомаба, проводили ультрафильтрацию раствора при помощи системы Millipore Labscale TFF. Исходный концентрат афелимомаба постоянно прокачивался через фильтрующее устройство с порогом отсечения молекулярной массы (MWCO) 30 кДа. Все ингредиенты, за исключением белков, проходили через мембрану и были собраны во внешнем сосуде. Сам белок возвращался в систему циркуляции. Текущую концентрацию можно было приблизительно оценивать по шкале объема. Точную концентрацию белка рассчитывали после остановки процесса фильтрации с помощью УФ-спектроскопии.
Результаты
Характеристика концентрата MAK
r
r
В только что размороженном концентрате, как правило, наблюдается агрегация примерно 0,9-1% (различия между аликвотами возможны, поэтому каждую аликвоту исследуют методом SEC сразу после оттаивания) и отсутствует поддающаяся измерению фрагментация. По данным экспериментов с набором маркеров определенного молекулярного веса (карбоангидраза, молекулярный вес (M)=29 кДа, и β-амилаза, M=200 кДа) агрегаты в основном представляли собой димеры. Диаграммы DLS показали, что мономер имеет гидродинамический диаметр примерно 10 нм. Концентрат имел относительно низкий уровень примеси невидимых частиц и значения мутности примерно 5 NTU. Наблюдалась типичная картина IEF полос 5 изоформ. Во всех последующих IEF экспериментах чистый концентрат использовали в качестве маркера/стандарта, вследствие этого любые различия регистрировали напрямую.
3
При измерениях окраски концентрат был ближе всего к стандартному раствору B9, который представлял собой почти бесцветный раствор с легким коричневым оттенком. Концентрат имел плотность 1,009 г/см и вязкость 0,981 мПа (обе величины измеряли при 20°C).
Распылительная сушка концентрата MAK
Первые эксперименты по распылительной сушке проводили с чистым концентратом, который был свободен от любых дополнительных стабилизаторов. Определяли степень повреждения белков в процессе сушки.
Стабильность MAK в процессе
in
LF
AA
DA
out
el al., Eur. Journal of Pharm. and Biopharm.
Чтобы определить, насколько белок страдает в процессе распылительной сушки, параметры процесса для первых экспериментов были взяты из существующих исследований на устройстве Büchi 191, например по Maury: T=130°C, Q=~3 мл/мин, Q=700 л/ч, Q=800 л/мин, что приводило к T приблизительно 80°C. Maury 59(3): 565-573 (2005).
Полученный белый порошок (выход из циклона: ~60%) содержал сферические, кольцевидные или вогнутые частицы с диаметром вплоть до 13 мкм. Повторно растворенный порошок (22,9 мг порошка/мл воды) имел концентрацию белка 12-13 мг/мл, указывая на то, что потеря порошка была вызвана процессом распылительной сушки и параметрами разделения циклона. Никакой преимущественной потери белка или эксципиента из белкового раствора не удалось обнаружить вследствие их аморфного состояния после высушивания распылением. Диаграмма рентгеновской дифракции концентрата sd MAK имела кристаллические пики, вызванные другими компонентами основной лекарственной субстанции (например, фосфатом натрия и хлоридом натрия). Картина пиков была очень близка к таковой для sd хлорида натрия. Остаточное содержание влаги в порошке составляло 1,4-2% и зависело от условий окружающей среды во время процесса (RH высушивающего воздуха, комнатной температуры и так далее).
et al., Eur. Journal of Pharm. and Biopharm.
et al., Journal of Pharm. Sci.
et al.
et al., Biochemistry
При SEC повторно растворенный порошок демонстрировал отчетливое увеличение агрегации (2,5-3%). Однако это было не слишком много для белкового раствора без стабилизаторов. Maury обнаруживал вплоть до 17% для высушенного распылением диализованного раствора IgG. Maury 59(2): 251-261 (2005). Это свидетельствует о том, что фрагменты менее чувствительны в процессе распылительной сушки, чем полноразмерные антитела, хотя это не относится к агрегации, вызванной замораживанием-оттаиванием. Wang  96(1): 1-26 (2007). Другая возможность состоит в том, что имел место стабилизирующий эффект, обусловленный наличием хлорида натрия. Arakawa  на опыте убеждались в наличии стабилизирующих взаимодействий между белками и хлоридом натрия в растворах; однако они исследовали только более высокие концентрации соли, чем те, которые используются здесь. Arakawa  21: 6545-6551 (1982). Увеличение агрегации также наблюдали в результатах DLS и IEF.
В процессе изоэлектрического фокусирования появлялась новая полоса на исходной точке фокусирования. Это можно было бы объяснить наличием крупных агрегатов, которые не могли проникнуть в гель и, следовательно, не могли двигаться в соответствии со своей изоэлектрической точкой (согласно Serva GmbH, поры их гелей для IEF имеют порог отсечения примерно 200-300 кДа). Результаты DLS демонстрировали наличие дополнительного пика в мкм-диапазоне. Пик был едва заметен в распределении размер-объем, но отчетливо виден в распределении размер-интенсивность. Несколько крупных частиц рассеивают гораздо больше света, чем множество мелких частиц, поскольку интенсивность рассеяния частицы пропорциональна шестой степени ее диаметра. Malvern Instruments: Zetasizer Nano Series User Manual. MAN 0317, выпуск 2.0, март 2004 г. Дополнительный пик, по-видимому, был обусловлен белком, так как эксперименты DLS с концентратом плацебо не показали пика такого гидродинамического диаметра. Поскольку эти крупные агрегаты не были видны при SEC, они должны быть нерастворимыми. Примеси частиц в повторно растворенном порошке возрастали для всех фракций частиц. Однако процесс с использованием лабораторной распылительной сушилки не может полностью исключить примеси частиц (хотя приточный высушивающий воздух фильтровался). К тому же, открытие флакона для взятия проб также могло являться источником частиц. Кроме того, мутность повторно растворенного порошка значительно возрастала по сравнению с концентратом (концентрат: 5 NTU; sd концентрат: 118 NTU).
Поиск подходящей T
in
in
in
out
LF
Чтобы выяснить, является ли T 130°C подходящей для распылительной сушки белка афелимомаба, проводили серию экспериментов с различными температурами. Значения T и полученные значения T при Q = ~3 мл/мин для этой серии приведены в таблице 2. Целью было найти приемлемый компромисс между эффективностью сушки и стабильностью белка в процессе.
<b>Таблица 2</b>
<b>T</b><sub>in</sub><b> (°C)</b>
<b>Примерная T</b><sub>out </sub><b>(°C)</b>
100
61
130
80
155
95
180
108
in
in
in
in
Никаких различий в морфологии частиц не наблюдалось, за исключением того, что частицы при 180°C были чуть более сморщенными, чем частицы при 100°C, но различия были крайне незначительными. Содержание воды имеет тенденцию уменьшаться с увеличением T с существенным падением между 100°C и 130°C. Не удалось обнаружить существенных различий в агрегации, так что агрегация, судя по всему, не очень зависит от температуры. Выход порошка слегка увеличивался при более высоких температурах. Все эти результаты свидетельствуют в пользу использования высокой T, однако результаты изоэлектрического фокусирования (IEF) и динамического рассеяния света (DLS) указывают на то, что подходящая T в случае афелимомаба находилась в середине диапазона. Интенсивность полосы агрегации при IEF линейно зависела от приточной температуры высушивающего воздуха. Кроме того, диаграммы DLS показали худшие результаты при 180°C. Пик мономера появлялся в области более высокого гидродинамического диаметра (примерно 16 нм). Судя по всему, агрегаты не только становились более многочисленными, что следовало из IEF, но и более крупными. Кроме того, пик мономера смещался по форме (в сторону меньшего распределения) и размеру, что свидетельствует о существенном повреждении белка. Примеси частиц при 180°C также были выше, особенно во фракции малых частиц (<15 мкм). Согласно данным результатам только 130°C и 155°C можно считать приемлемыми для дальнейших исследований. Поскольку результаты для этих двух значений температуры входящего воздуха были сходными, выбрали T 130°C. Процесс при данной температуре должен свести к минимуму тепловую нагрузку на белок, обеспечивая при этом в целом приемлемые результаты для качества продукции.
Причины агрегации
in
Процесс распылительной сушки заключает в себе целый ряд причин инактивации белков. Некоторые из них можно устранить, модифицируя препарат при помощи эксципиентов, тогда как на другие причины инактивации нельзя оказать влияния. Увеличение агрегации в ходе процесса нельзя четко объяснить одним стрессовым фактором. Тепловой стресс можно контролировать в определенной степени, выбрав правильную T, в данном случае примерно 130°C. Чтобы выяснить степень неизбежного стресса, проводили следующие эксперименты.
Влияние перистальтического насоса
et al
Diabetes
Для количественной оценки влияния на агрегацию напряжения сдвига от перистальтического насоса использовали SEC. Десять мл концентрата афелимомаба использовали в качестве подаваемой жидкости. Образец прокачивали через систему трубок и перистальтический насос устройства Büchi B-191 и собирали сразу перед вхождением в два жидкостных сопла. Подаваемую жидкость анализировали до и после процесса прокачки. Никаких изменений в агрегации не было отмечено. Можно предположить, что перистальтический насос лабораторной распылительной сушилки не влияет или не увеличивает агрегацию белка афелимомаба. Насос вызывал агрегацию инсулина, наблюдаемую Brennan . ( 34, 353-359 (1985)), имеющую место только тогда, когда инсулин выходил из раствора после долгой прокачки. Поскольку прохождение через трубки в данном исследовании занимает самое большее несколько минут, опасность повреждения очень мала.
Влияние процесса распыления
el al.
et al., Biotechnology and Bioengineering
Степень напряжения сдвига в процессе распыления проверяли путем распыления двух образцов концентрата (2 мл) и последующего анализа методами SEC и IEF. При IEF не наблюдали никаких различий между образцами (никакой дополнительной полосы или изменений в картине полос). Результаты SEC показали небольшое увеличение агрегации. Это увеличение было не столь высоким, как в течение всего процесса распылительной сушки. Таким образом, можно сделать вывод, что небольшая часть агрегации была вызвана распылением, однако, как предположили Maa , повреждение белка может быть следствием не только усилия сдвига, но скорее большой границы раздела воздух/жидкость. Maa  54(6): 503-512 (1997).
Влияние теплового стресса
Белки являются чувствительными к нагреванию материалами, но не все белки одинаково чувствительны к тепловому стрессу. Чтобы определить, насколько концентрат афелимомаба может выдерживать температуру (тепловой стресс), небольшие количества раствора белка подвергали воздействию различных температур в течение различных периодов времени. Критериями стабильности концентрата были данные SEC, результаты IEF и оптический внешний вид раствора. После появления коагуляции испытания прекращали. Результаты представлены ниже в таблице 3.
<b>Таблица 3</b>
<b>1 час</b>
<b>4 часа</b>
<b>24 часа</b>
40°C
прозрачный
прозрачный
прозрачный
45°C
прозрачный
прозрачный
слегка мутный
50°C
прозрачный
слегка мутный
мутный
55°C
слегка мутный
мутный
коагуляция
60°C
мутный
коагуляция
65°C
коагуляция
80°C
коагуляция
Wb
out
et al., Pharm. Res.
Концентрат не мог выдерживать температуру выше, чем примерно 60°C. В гелях IEF появление мутности сопровождалось появлением дополнительной полосы в исходной точке. Обесцвечивание исходной картины полос указывает на потерю растворимого белка. Потеря растворимого белка была также обнаружена в массиве данных SEC. Пик мономера сокращался с увеличением температуры и времени (масштабирование по оси ординат). Температура 40°C не влияла на концентрат афелимомаба, даже при воздействии в течение 24 часов. Повреждение белка от теплового стресса выражалось не в увеличении агрегации, а в появлении фрагментов. Пик агрегации оставался практически без изменений. Таким образом, воздействие теплового стресса на концентрат приводило к фрагментации и коагуляции, тогда как воздействие теплового стресса на распыленный концентрат в процессе sd приводило в основном к агрегации. Концентрат афелимомаба мог выдерживать температуру вплоть до примерно 50°C в течение коротких промежутков времени. Примерно при 60°C повреждение белка происходило быстро. В процессе распылительной сушки капли подвергались воздействию температуры смоченного термометра (T), которая обычно составляет 25-30°C ниже T (в данном исследовании обычно 80°C), и время воздействия было очень коротким. Mumenthaler  11(1): 12-20 (1994).
Резюме
out
et al.,
Агрегация, очевидно, не была вызвана усилием сдвига в процессе прокачки. Распыление являлось причиной частичного увеличения агрегации во время процесса распылительной сушки. Тепловой стресс играет важную роль для стабильности белка, однако при воздействии на концентрат он приводит к фрагментации и появлению нерастворимых агрегатов. Когда капли достигали критической температуры примерно 55°C в процессе sd (25-30°C ниже T, постулированной Mumenthaler  но только в течение очень короткого периода), увеличение агрегации, очевидно, было вызвано взаимодействием температуры и распыления. Mumenthaler 1994.
Эксперименты по распылительной сушке с использованием эксципиентов
Для оптимизации стабилизации белка афелимомаба были протестированы различные эксципиенты. Целью являлась достаточная стабильность в процессе сушки и последующего хранения.
Добавление 10-150 мМ сорбита
g
et al., Eur. Journal of Pharm. and Biopharm.
В данном эксперименте 10, 25, 50, 100 или 150 мМ сорбита добавляли к концентрату афелимомаба, чтобы определить наилучшее молярное соотношение стабилизатора и белка, как представлено в таблице 4. Результаты приведены на фигурах 2 и 3. В случае 150 мМ раствора сорбита, T падает далеко за рамки процесса, и даже комнатной температуры, и невозможно надлежащим образом высушить распылением данную смесь, что видно по очень низкому выходу. Смесь не может быть высушена при прохождении ее через сушильную камеру, и она все еще липкая при попадании в циклон, так что большая часть прилипает к стенкам циклона и не может быть собрана. Maury 59(3): 565-573 (2005).
<b>Таблица 4</b>
мМ
m<sub>эксципиент </sub>(мг)
V<sub>концентрат</sub>
массовое соотношение эксципиент:MAK
10
27
15
0,14:1
25
67
15
0,35:1
50
135
15
0,7:1
100
270
15
1,4:1
150
410
15
2,1:1
Из-за небольшого выхода анализы титрования по Карлу Фишеру (ICF) и широкоугольной дифракции рентгеновских лучей (WAXD) для данных образцов выполнить не удалось. Увеличение агрегации не сильно зависит от количества сорбита, за исключением того, что 10 мМ оказалось недостаточно. Различные количества сорбита не влияли на морфологию частиц; хотя чем больше эксципиента присутствовало в смеси, тем больше частиц принимало округлую форму (смотри фигуру 4). Хотя было невозможно высушить распылением чистый раствор сорбита (для сравнения), все порошки-плацебо с различными концентрациями сорбита отличались сферическими частицами.
g
Степень кристалличности уменьшалась при более высокой чистой массе сорбита. Результаты IEF в значительной степени соответствовали результатам с чистым концентратом в том, что дополнительную полосу можно было заметить с трудом, если вообще можно было заметить. 10 мМ смесь также отличалась неожиданной диаграммой DLS. Четкие пики в микрометровом диапазоне с трудом можно было обнаружить в распределении размер-объем, так что количество крупных агрегатов было очень небольшим. Тем не менее, 25, 50 и 100 мМ добавленный сорбит демонстрировал почти идентичные диаграммы. Примеси частиц, очевидно, линейно зависят от количества сорбита (твердые), демонстрируя наибольший перепад между 10 мМ и 25 мМ. Однако различия ограничивались в основном частицами меньшего размера. Значения для частиц размером более 15 мкм были более или менее одинаковые. Таким образом, адекватной стабилизации концентрата афелимомаба, судя по всему, можно добиться при добавлении 25 или 50 мМ сорбита. Эти две смеси не имели больших различий, за исключением содержания воды и, как следствие, полученного значения T.
Добавление 10-100 мМ трегалозы
Из-за результатов, полученных с большим количеством сорбита, из серии тестов с трегалозой исключили 150 мМ смесь. Трегалозу добавляли в виде дигидрата трегалозы, так что смеси содержали от 56,7 до 567 мг дигидрата трегалозы в 15 мл концентрата афелимомаба, массовое соотношение трегалоза:MAK можно увидеть в таблице 5. Как видно на фигурах 5 и 6, результаты были аналогичны для 25 и 100 мМ. Выход в среднем был несколько выше для всех концентраций, по сравнению с сорбитом. С трегалозой была достигнута очень хорошая стабилизация и, кроме того, выходы были стабильными при всех концентрациях. Увеличение агрегации было минимальным, и только для 10 мМ смеси наблюдали небольшое увеличение агрегации при SEC (0,2%).
<b>Таблица 5</b>
мМ
m<sub>эксципиент </sub>(мг)
V<sub>концентрат</sub>
массовое соотношение эксципиент:MAK
10
51
15
0,27:1
25
128
15
0,7:1
50
255
15
1,3:1
100
510
15
2,7:1
g
g
g
et al., Journal of Pharm. Sci
Тем не менее, нерастворимые агрегаты появились во всех смесях, как видно из диаграмм DLS. Количество мономера было сопоставимо с результатами, полученными с сорбитом. Кристалличность и сферичность частиц варьировали в прямой зависимости от количества трегалозы. Добавление трегалозы заставляло частицы принимать более округлую форму, поскольку распылительная сушка чистой трегалозы приводила к образованию сферических частиц (смотри фигуру 7). Как видно из экспериментов с сорбитом, примеси частиц, судя по всему, зависели от концентрации эксципиента, но они опять-таки были ограничены частицами малого размера (≤15 мкм). Из-за высокой T трегалозы (T для высушенной трегалозы составляет 115°C), T смесей с трегалозой также является высокой, что могло бы явиться преимуществом для исследований стабильности порошков. Adler . 88(2): 199-208 (1999). 25 мМ и 50 мМ, очевидно, являются наиболее подходящими значениями для пропорциональной доли трегалозы с целью получения порошков с подходящей стабильностью в процессе получения и хранения. Полученные порошки содержали меньше остаточной воды, чем порошки с сорбитом. Вследствие удовлетворительных результатов, полученных с этими смесями, вариант последующего испытания с 150 мМ трегалозы не применялся.
Добавление 10-100 мМ сахарозы
g
Было протестировано добавление 25-100 мМ сахарозы к концентрату афелимомаба (смотри таблицу 6). Добавление 25-100 мМ сахарозы обеспечивало высокие выходы порошка в количестве 70-80% (фигуры 8 и 9). Величина T достигала оптимума при 25 мМ. Увеличение агрегации существенно не различалось при всех концентрациях. Вновь степень кристалличности (C) уменьшалась в линейной зависимости от количества сахарозы. Остаточное содержание воды в различных порошках в среднем было немного выше, чем в случае со смесями с трегалозой. Сферичность частиц зависела от количества сахарозы. Белок, как правило, образовывал вогнутые сферы, в то время как сахароза, как правило, образовывала сферические частицы.
<b>Таблица 6</b>
мМ
m<sub>эксципиент </sub>(мг)
V<sub>концентрат</sub>
массовое соотношение эксципиент:MAK
10
51
15
0,27:1
25
128
15
0,7:1
50
255
15
1,3:1
100
510
15
2,7:1
В массиве данных DLS количество мономера было ниже при 100 мМ сахарозе по сравнению с 10 мМ, но эта картина была ограничена диаграммами распределения интенсивность-размер. В диаграмме распределения объем-размер для 100 мМ сахарозы пик агрегации было трудно обнаружить. В 10 мМ смеси были видны более крупные агрегаты (>1 мкм). Эти дополнительные пики не появлялись в остальных смесях с сахарозой. В IEF гелях не наблюдали никаких существенных отклонений от нормы. Дополнительная полоса была неясно различима только при 50 и 100 мМ, и была отчетливо видна оригинальная картина полос концентрата. Примеси частиц уменьшались от 10 мМ до 100 мМ, демонстрируя наибольший перепад между 10 мМ и 25 мМ. С увеличением размера частиц различий становилось все меньше, так, для частиц размером более 15 мкм во всех смесях обнаруживали сходное количество частиц. Принимая во внимание все эти результаты, добавление 10 мМ сахарозы к концентрату афелимомаба оказалось недостаточным; наилучшие результаты были получены с 25 мМ и 50 мМ.
Резюме
При сравнении результатов для трех эксципиентов в различных количествах становится очевидным, что 10 мМ эксципиента не достаточно для обеспечения сохранности белков в процессе распылительной сушки. Таким образом, наиболее благоприятные результаты для всех эксципиентов были получены с 25 мМ и 50 мМ; 100 мМ или даже 150 мМ не привели к улучшению результатов (для 150 мМ сорбита как раз наоборот). Результаты по увеличению агрегации были немного выше для сорбита, остальные результаты (для сахарозы и трегалозы) были в целом сходными. Трегалоза и сахароза защищали белок афелимомаб в равной степени и лучше, чем сорбит.
Исследования стабильности при хранении
Высушенные распылением порошки подвергали различным условиям температуры и остаточной влажности в течение трех месяцев. Условия испытаний были следующими: холодильник (5°C, без влажности), 25°C при 60% относительной влажности (аналогичные Центральной Европе, Северной Америке) и 40°C при 75% относительной влажности (аналогичные Юго-Восточной Азии).
План подготовки и инспекции
Хранили чистый концентрат, а также высушенное распылением плацебо. Порошки плацебо содержали те же твердые вещества, что и настоящие порошки (высушенные распылением смеси белок-эксципиент), за исключением белка афелимомаба. Количества порошка, необходимые для аналитических тестов, рассчитывали заранее, чтобы оценить объем партии подаваемой жидкости. Три или четыре партии по 50 мл подаваемой жидкости высушивали распылением в одинаковых условиях, полученные порошки смешивали весте в общую массу, из которой рассчитанное количество помещали в небольшие флаконы из Al с герметизирующим фторэластомером Viton и завинчивающейся крышкой Duroplast. Флаконы из Al с герметизирующим фторэластомером Viton были выбраны, поскольку в предварительных тестах они продемонстрировали лишь небольшую проницаемость для водяных паров (никаких изменений в содержании воды в высушенной распылением лактозе не было обнаружено при хранении в условиях 65% RH при комнатной температуре в течение 10 дней). В каждый изучаемый момент времени (t=1, 2 и 3 месяца) два идентичных образца (флаконы из Al) каждой смеси доставали из камер с различными условиями кондиционирования. Один был использован для анализа, другой был перенесен в морозильную камеру и хранился при -80°C (в качестве резерва для возможных дополнительных тестов). Это дало в общей сложности 152 флакона, 48 для выемки из камер каждый месяц (4 настоящих, 4 настоящих резервных, 4 плацебо, 4 плацебо резервных для каждого значения температуры) плюс 8 флаконов, которые хранили при -80°C без какой-либо дополнительной термической обработки (чистый концентрат или только что высушенные распылением порошки).
Концентрат афелимомаба
Результаты SEC (смотри таблицу 7). Хроматограммы SEC свидетельствовали о том, что при 5°C концентрат получал лишь незначительные повреждения вследствие агрегации, однако, похоже, данные агрегаты не являлись в основном димерами. Широкое плато на пике агрегации указывало на присутствие тримеров/олигомеров. Более высокие температуры и более длительные сроки хранения приводят к серьезной деградации, о чем свидетельствует появление фрагментации и уменьшающаяся AUC хроматограммы.
<b>Таблица 7</b>
Образец
Пик
Пик
Время (мин)
Площадь (%)
<b>5°C 1 месяц</b>
1
агрегаты
21,9
2,6
2
мономер
24,4
97,4
<b>25°C 2 месяца</b>
1
агрегаты
21,6
3,0
2
мономер
24,2
87,4
3
фрагменты
27,5
9,6
<b>40°C 3 месяца</b>
1
мономер
24,6
7,5
2
фрагменты
27,4
92,5
Изучали кинетику стабильности при хранении различных фракций. В то время как количество мономера постоянно уменьшалось при всех температурах, агрегация, судя по всему, переключалась на фрагментацию примерно через 2 месяца при температуре 25°C и 40°C. При 40°C агрегация уже не обнаруживается в виде отдельного пика на хроматограмме, а через 3 месяца на картине пиков доминирует пик фрагментации. Серьезные дефекты при 40°C можно наблюдать уже при макроскопическом анализе образца. Спустя 1 месяц в концентрате, хранящемся при 40°C, наблюдалась мутность, тогда как образцы, хранящиеся при 5°C и 25°C, отличались только небольшим изменением окраски, невидимым невооруженным глазом.
Измерения мутности показали сопоставимые результаты. Четкие изменения мутности можно было заметить только при 40°C в настоящих (содержащих белок) образцах, а также в концентрате плацебо. Через 1 месяц концентрат демонстрировал величину выше 150 NTU, продолжающую возрастать в последующие месяцы. Из-за оптической мутности измерения DLS были прекращены в образцах, хранящихся при 40°C. При более низких температурах никаких изменений не было обнаружено. Измерения частиц предоставили дополнительную информацию о фрагментации и агрегации. Фракция мелких частиц уменьшалась (частицы <25 мкм), в то время как постоянно росло количество крупных частиц, предположительно, представляющих собой нерастворимые агрегаты, не обнаруживаемые при SEC (что можно предположить, исходя из уменьшающейся AUC на хроматограммах). Это также должны быть частицы, являющиеся причиной видимой мутности образцов.
До сих пор повреждения при 25°C не выглядели слишком серьезными. Такое впечатление, однако, опровергается при анализе IEF гелей. Через 1 месяц уже можно увидеть небольшое изменение интенсивности полос, а через 3 месяца картина полос определенно отличалась от исходной. Полоса для изоформы с наивысшей изоэлектрической точкой (IEP) (pH 8,6-8,7) полностью исчезла. Хранение при 40°C вызывало серьезные повреждения через 1 месяц, становящиеся еще хуже в процессе тестов на стабильность.
Таким образом, концентрат афелимомаба был относительно стабильным при хранении в прохладных условиях. Но как только концентрат размещали при более высоких температурах, происходила деградация различными путями. Даже комнатная температура (25°С) являлась стрессовым фактором при хранении в течение длительного периода.
Стабильность высушенных распылением порошков
Для обеспечения долгосрочной стабилизации при распылительной сушке деградация концентрата афелимомаба с дополнительными эксципиентами должна быть не хуже, чем результаты, полученные для концентрата, хранившегося при 25°C. В качестве дополнительного теста проводили титрование по Карлу Фишеру сразу после процесса распылительной сушки и через 3 месяца хранения, чтобы изучить герметизирующий материал флаконов из Al (до сих пор протестированный только для коротких периодов) и/или влияние влажности на стабильность высушенных распылением порошков.
Концентрат + 25 мМ сорбит
Образцы, хранящиеся при 5°C и 25°C, демонстрировали хорошую стабильность на протяжении 3 месяцев (как показано в таблице 8). По результатам SEC никаких четких изменений не было найдено (Δ агрегации меньше 1%). При 40°C имела место значительная деградация, агрегация сильно увеличивалась и в дополнение к пику димеров появлялись большие мультимеры. Через 3 месяца можно было обнаружить четкий пик фрагментов.
<b>Таблица 8</b>
<b>Образец</b>
<b>Пик</b>
<b>Пик</b>
<b>Время (мин)</b>
<b>Площадь (%)</b>
<b>25°C 3 месяца</b>
1
агрегаты
22,3
1,9
2
мономер
25,1
98,1
<b>40°C 1 месяц</b>
1
агрегаты
21,4
8,6
2
мономер
24,6
91,4
<b>40°C 3 месяца</b>
1
агрегаты
22,1
12,4
2
мономер
25,0
82,4
3
фрагменты
27,2
5,2
g
В то время как образцы, хранящиеся при 5°C и 25°С, не демонстрировали какого-либо изменения в окраске, цвет образца при 40°C (повторно растворенного) немного изменился спустя 1 месяц, и с течением времени в нем даже появлялось заметное помутнение. Это помутнение было вызвано белком, поскольку образцы плацебо не изменяли окраску в любое время и при любой температуре. Наиболее заметные результаты в ходе измерений мутности были получены при температуре 40°C. Начиная примерно с 20 NTU сразу после распылительной сушки, образцы, хранящиеся при 40°C, достигали значения выше 120 NTU через 3 месяца. Однако 20 NTU были заметно больше, чем демонстрировал чистый концентрат. Температура 40°C была критическим параметром для смесей с сорбитом, поскольку она была выше T, так что стеклообразное состояние уже не могло сохраняться.
Для примеси частиц были получены сходные результаты. При 5°C и 25°C были заметны лишь небольшие изменения. В образце, хранящемся при 40°C/75% RH, было обнаружено значительное увеличение, особенно для мелких частиц. Это было связано с тем, что порошок невозможно повторно растворить без появления небольшого помутнения. В образцах плацебо число частиц было гораздо ниже, чем в настоящих образцах, без ограничения по определенным размерам частиц. Флаконы из Al, используемые для хранения порошков, не обеспечивали абсолютную непроницаемость для водяного пара, хотя предварительные исследования свидетельствовали об обратном.
Титрование по Карлу Фишеру проводили сразу после процесса распылительной сушки и через 3 месяца хранения. Поглощение воды не зависело от белка, поскольку образцы плацебо продемонстрировали те же результаты, не считая чуть более высокого начального значения. Поскольку порошки, хранящиеся при 5°C, демонстрировали только небольшое увеличение влажности, поглощение воды зависело от RH кондиционированных камер. Сочетание сорбита и MAK было более гигроскопичным, чем чистый эксципиент, поскольку значения для образцов плацебо были немного выше, чем для настоящих образцов. Температура, остаточная влажность и проницаемость для водяного пара флаконов не оказывали никакого влияния на диаграммы дифракции рентгеновских лучей. Через 3 месяца по-прежнему не было различий в дифракционной картине по сравнению с исходной диаграммой (t=0).
Даже макроскопический внешний вид порошка зависел от влажности. Большинство образцов по-прежнему представляли собой сыпучие рыхлые материалы, однако образцы, хранящиеся при 40°C, слипались (особенно образцы плацебо). Увеличение агрегации, отмеченное для образцов, хранящихся при 40°C, подтверждали результаты DLS. В то время как картина при 5°C и 25°C все еще была типичной (пик мономера на 10 нм и небольшой пик агрегации в мкм-диапазоне), для образца, хранящегося при 40°C, наблюдалась иная картина. Даже при распределении размер-объем небольшое плечо имелось на пике мономера, символизируя мультимерный пик, который становился даже более четким через 3 месяца. В гелях IEF изменения можно было заметить после хранения при 40°C в течение 2 месяцев, на исходной точке возникала дополнительная полоса, не видимая при более низких температурах.
Концентрат + 25 мМ трегалоза
Смеси с трегалозой демонстрировали хорошую стабильность (таблица 9). В процессе хранения при 5°C и 25°C/60% RH не было отмечено никаких существенных изменений на протяжении всех аналитических исследований. Только при 40°C/75% RH для порошков были получены несколько иные результаты. Агрегация возрастала только при 40°C. Через 3 месяца было отмечено увеличение общей агрегации примерно на 2%. Более низкие температуры не приводили к значительному повреждению белка. Однако даже при 40°C количество мономера спустя 3 месяца по-прежнему было выше 95%. При использовании в качестве стабилизатора трегалозы не наблюдали образования фрагментов, по крайней мере, на хроматограммах отсутствовал четкий пик. Фрагменты IgG могут быть менее чувствительными к индуцированной температурой агрегации при хранении, чем полное антитело.
<b>Таблица 9</b>
<b>Образец</b>
<b>Пик</b>
<b>Пик</b>
<b>Время (мин)</b>
<b>Площадь (%)</b>
<b>25°C 3 месяца</b>
1
агрегаты
21,6
2,9
2
мономер
24,3
97,1
<b>40°C 1 месяц</b>
1
агрегаты
21,4
3,3
2
мономер
24,4
96,7
<b>40°C 3 месяца</b>
1
агрегаты
21,5
4,4
2
мономер
24,3
95,6
Аналогичные данные были получены при измерении мутности. Никаких изменений мутности не наблюдали в процессе хранения при 5°C и 25°C, и даже в образцах, хранящихся при 40°C, наблюдали лишь небольшое увеличение мутности. Большая часть помутнения была опять-таки вызвана белком, поскольку образцы плацебо имели значения NTU, близкие к нулю. На примеси частиц не влияли более высокие температуры или более высокая остаточная влажность. За исключением разницы между настоящими образцами и плацебо, число частиц, в основном, оставалось на том же уровне в течение 3 месяцев хранения. Это также подтверждалось оптическим внешним видом повторно растворенных порошков. Из всех образцов получался прозрачный раствор, и даже измерения окраски не показали каких-либо различий в процессе хранения.
Флаконы из Al, используемые для тестов на стабильность, не могли полностью исключить наличие влаги в порошках. Вследствие этого, условия повышенной влажности при 25°C и 40°C приводили к повышению влажности порошков. Порошки, хранящиеся при 5°C, отличались неизменным содержанием воды. Оба стрессовых фактора, температура и повышенная RH, никак не влияли на кристалличность образцов порошка. Дифракционные диаграммы оставались неизменными. Картина пика хлорида натрия по-прежнему доминировала на диаграмме WAXD. Результаты SEC и измерения мутности согласовались с результатами, полученными методом DLS. Низкая температура и низкая остаточная влажность не наносят ущерба нагруженным белком порошкам. Все образцы демонстрировали одинаковую картину, и даже смесь, хранящаяся при 40°C, не демонстрировала необычных пиков или плечей пиков. Для нее была характерна обычная картина с большим пиком примерно на 10 нм и дополнительным пиком в мкм-диапазоне.
Что касается результатов IEF, единственным гелем, где наблюдали дополнительную полосу на исходной точке фокусирования, был гель с образцами 40°C/75% RH. Даже там присутствовало только небольшое синее пятно (как раз под «40°C») спустя три месяца. При всех условиях температуры и влажности трегалоза обладала хорошей стабилизирующей способностью для белка афелимомаба.
Концентрат + 25 мМ сахароза
Растворы сахарозы в концентрате афелимомаба продемонстрировали хорошую стабильность при хранении, особенно при 5°C и 25°C/60% RH (таблица 10). Никаких изменений в агрегации не было замечено в этих условиях. Все хроматограммы для 5°C и 25°C были сходными. Отличающиеся результаты были получены только для образцов 40°C/75% RH, где обнаружили увеличение агрегации примерно на 2,5% на протяжении трех месяцев. И все-таки, количество мономера в это время составляло примерно 95%.
<b>Таблица 10</b>
<b>Образец</b>
<b>Пик</b>
<b>Пик</b>
<b>Время (мин)</b>
<b>Площадь (%)</b>
<b>25°C 3 месяца</b>
1
агрегаты
22,4
2,7
2
мономер
24,9
97,3
<b>40°C 1 месяц</b>
1
агрегаты
21,6
3,0
2
мономер
24,5
97,0
<b>40°C 3 месяца</b>
1
агрегаты
22,0
5,0
2
мономер
24,9
95,0
Все повторно растворенные порошки выглядели оптически прозрачными и бесцветными, неотличимо от концентрата афелимомаба или подаваемой жидкости. Измерения окраски не показали каких-либо изменений в цвете на протяжении 3 месяцев, даже после хранения при высокой температуре (40°C). Растворы были по-прежнему наиболее близки к эталонным растворам R6 или B5, которые представляли собой сильно разбавленные жидкости с оттенком красного или коричневого цвета, распознаваемым только с помощью вспомогательных средств. При использовании нефелометра явно выраженных изменений не было обнаружено. Хотя мутность возросла с начального значения 12 NTU до 20 NTU после хранения при 40°C/75% RH, результаты для мутности были лучше, чем с сорбитом и трегалозой, для которых было получено значение 20 NTU сразу после распылительной сушки. В образцах плацебо наблюдали очень слабое помутнение без особых изменений на протяжении всего периода тестирования стабильности.
Примеси невидимых частиц в настоящих образцах были, как и в случае с мутностью, значительно выше, чем в образцах плацебо. Во фракциях больших частиц (частицы больше чем 10 мкм), однако, наблюдали лишь небольшие изменения. Количество частиц крупнее 40 мкм было, как правило, близко к нулю, количество частиц крупнее, чем 10 мкм, было меньше или около 100 (в мл раствора), и, таким образом, общее количество примесей частиц было не очень высоким. Все показатели деградации при хранении при высокой температуре соответствовали результатам анализа по Карлу Фишеру. Чем выше остаточная влажность в кондиционированных камерах хранения, тем выше количество воды, поглощенное порошками. В образцах с сахарозой отсутствовали большие различия между настоящими порошками и плацебо.
Хотя содержание воды возрастало в условиях более высокой остаточной влажности, поглощение воды не оказывало никакого влияния на кристалличность порошков. Диаграммы WAXD через 3 месяца демонстрировали одинаковую картину дифракции для всех температур, идентично диаграмме WAXD, полученной сразу после распылительной сушки (t=0). Только минимальную деградацию обнаружили на диаграммах DLS и гелях IEF. Через 3 месяца при 40°C и 75% RH для образцов с сахарозой получали диаграммы рассеяния света, очень сходные с теми, которые получали сразу после распылительной сушки. Четкий пик мономера соответствовал 10-нм гидродинамическому диаметру, и очень небольшой пик в мкм-диапазоне (видимый в секции измененного масштаба изображения). 40°C и 75% RH были также единственными условиями, вызывающими появление картины полос IEF, отличающейся от таковой для концентрата. Небольшая полоса на исходной точке фокусирования указывала на некоторое количество больших агрегатов, но, как видно из диаграммы DLS, их число не имело существенного значения.
Сравнение и резюме
Эксперименты по изучению стабильности показали, что различные стабилизирующие реагенты приводят к различным результатам. Изменение эксципиентов или условий хранения, судя по всему, не оказывали влияния на морфологию частиц. Изображения SEM sd смеси с сорбитом сразу после распылительной сушки было трудно отличить от образцов с трегалозой, хранящихся при 40°C и 75% RH в течение 3 месяцев. Температура 5°C не приводила к серьезным повреждениям белка; даже в концентрате афелимомаба не было обнаружено существенной деградации на протяжении 3 месяцев в этих условиях. На хранение при 25°C 60% RH или при 40°C 75% RH чистый концентрат отвечал возникающей агрегацией и фрагментацией.
Трегалоза и сахароза демонстрировали во многом одинаковые результаты. Порошки обладали очень хорошей стабильностью. Даже при 40°C и 75% RH были обнаружены лишь небольшие изменения. Гигроскопичность, однако, была одним из параметров, по которому различались результаты трегалозы и сахарозы. Sd порошки, содержащие трегалозу, в целом имели более низкое содержание воды после распылительной сушки по сравнению со смесями с сахарозой. Поскольку флаконы из Al, используемые для проведения тестов на стабильность, не являлись полностью непроницаемыми для водяного пара, порошки также имели более высокое содержание влаги через 3 месяца, в связи с тем, что sd сахароза более гигроскопична, чем трегалоза.
g
Еще одно различие между сахарозой и трегалозой проявляется в измерениях мутности. Смеси с сахарозой обладали меньшей величиной NTU сразу после распылительной сушки, чем порошки с трегалозой. Измерения мутности также выявили еще одну неожиданную особенность. Судя по всему, процесс распылительной сушки является более стрессовым для смесей белок-эксципиент, чем хранение при повышенной температуре. Будучи высушенными распылением, порошки демонстрировали достаточную устойчивость, по крайней мере, при хранении ниже T sd порошка.
g
Сорбит также обладал стабилизирующим потенциалом. Он показал хорошие результаты при 5°C и 25°C. Содержащие сорбит sd порошки, однако, не выдерживали высокие температуры в течение длительного периода. Критическим параметром для этих результатов, очевидно, является низкая T сорбита. Превышение этой температуры (как видно из результатов хранения при 40°C) превращает стеклообразный препарат в вязкую жидкость, повышая ее мобильность, открывая различные пути для деградации.
Попытки снизить увеличение мутности в процессе распылительной сушки
in
in
in
in
Поскольку было установлено, что мутность является параметром, отличающимся изменчивостью во время процесса распылительной сушки, параметры процесса вновь подвергали изменениям в попытке уменьшить значения мутности после процесса сушки до минимального уровня. Для данных экспериментов использовали параметры процесса из предыдущих экспериментов по высушиванию, которые, как уже доказано, приводят к минимальному повреждению белка афелимомаба. С этой целью проводили эксперименты по распылительной сушке с добавлением 25 мМ и 50 мМ эксципиентов трегалозы и сахарозы при использовании T, равной 130°C и 100°C. Как обсуждалось выше, T 100°C приводила к аналитическим результатам, близким к тем, что были получены с T 130°C. Снижение T уменьшало тепловой стресс для белка и, вследствие этого, могло приводить к меньшим значениям NTU. Аналогичные соображения относятся и к добавлению 50 мМ и 25 мМ эксципиента. Оба препарата показали аналогичные результаты в предыдущих тестах. Увеличение количества эксципиента могло бы привести к лучшим значениям NTU. Поскольку оба изменения в установках процесса не приводили к существенным изменениям в предыдущих тестах, единственным аналитическим методом, используемым для данных экспериментов, было измерение мутности.
Добавление трегалозы
in
in
in
Концентрат афелимомаба, содержащий 25 мМ и 50 мМ трегалозу, высушивали распылением при T 100°C и 130°C. Каждый препарат высушивали распылением многократно, так что по меньшей мере по 3 sd порошка из каждого эксперимента можно было протестировать на мутность. Существенные различия в выходе порошка отсутствовали, независимо ни от T, ни от количества эксципиента. Средний выход составлял примерно 70%, с большими значениями при T 130°C и добавлении 25 мМ эксципиента. Результаты измерений мутности были более разнообразными.
in
in
in
Количество эксципиентов не оказывало большого влияния на мутность, а значения NTU для 25 мМ и 50 мМ трегалозы не сильно отличались. Различные T, тем не менее, приводят к появлению различной мутности. T 130°C приводит к меньшим значениям NTU и стандартным отклонениям. При T 100°C значения NTU в целом были выше и также демонстрировали большую вариабельность. Значения при 130°C и добавлении 25 мМ трегалозы также находились в соответствии с результатами мутности, полученными в ходе тестов на стабильность.
Добавление сахарозы
in
in
in
in
in
in
Смеси концентрата афелимомаба с добавлением 25 мМ и 50 мМ сахарозы высушивали распылением при T 100°C и 130°C. Различные концентрации сахарозы, по-видимому, не оказывают большого влияния на выход порошка в процессе распылительной сушки. Все смеси обеспечивали выход порошка примерно 70%, при этом порошки, полученные при 130°C, демонстрировали немного меньшее стандартное отклонение. Еще больше различались результаты измерения мутности. Значения NTU для 25 мМ и 50 мМ были очень близкими, имея тенденцию при T 100°C немного в пользу 50 мМ сахарозы (демонстрируя меньшую мутность), и в пользу добавления 25 мМ сахарозы при T=130°C. Поскольку эти тенденции не были существенными, количество эксципиента не имело большого влияния на мутность порошков, высушенных распылением. Намного более четким было решение относительно T. Использование температуры 100°C приводило к существенно более высоким значениям NTU, иногда превышающим 50 NTU, которые не были достигнуты даже в течение 3 месяцев хранения при 40°C для порошков, полученных при 130°C. Кроме того, большое стандартное отклонение, полученное при T 100°C, не обещало воспроизводимых результатов. Будучи высушенными при T 130°C, повторно растворенные порошки демонстрировали воспроизводимо низкую мутность примерно 20 NTU. Эти значения также соответствуют результатам, полученным в ходе тестов на стабильность.
Резюме
in
in
Увеличение мутности во время процесса распылительной сушки невозможно снизить путем уменьшения T. Порошки, содержащие трегалозу, а также смеси с сахарозой имели более высокие значения NTU при 100°C. При использовании в качестве T 130°C, добавление 25 мМ эксципиента приводило к немного большим значениям мутности, чем 50 мМ. Вследствие этого, параметры процесса, выведенные из предыдущих экспериментов (130°C и 25 мМ добавка), очевидно, являются оптимальными для распылительной сушки белка афелимомаба. Что касается мутности, результаты с сахарозой были несколько лучше, чем с трегалозой. Порошки, высушенные распылением из концентрата афелимомаба, содержащего 25 мМ сахарозу, имели в среднем 15 NTU, тогда как аналогичные смеси с трегалозой имели в среднем 17 NTU.
Распылительная сушка более концентрированных растворов MAK 195F
Концентрат афелимомаба, содержащий 12,4 мг/мл MAK 195F, успешно высушивали распылением в лабораторном масштабе с использованием трегалозы, сахарозы или сорбита, получая стабильные порошки. Для сушки в промышленных масштабах время процесса является очень важным фактором. Masters, Spray Drying in Practice. SprayDryConsult International ApS; Charlottenlund (2002). Чтобы сократить время процесса для больших партий, более высокие концентрации белка в подаваемой жидкости увеличивают количество белка, пропускаемого через систему распылительной сушилки, без существенного влияния на другие параметры процесса. Для получения более концентрированных растворов MAK 195F концентрат афелимомаба подвергали ультрафильтрации. В ходе этого процесса фильтрации содержание воды, соли и поверхностно-активных веществ было снижено, тогда как белок не мог пройти через мембрану. Это приводило к увеличению концентрации белка, но не изменяло концентрацию других растворенных веществ.
Концентрат афелимомаба 50,6 мг/мл
В первом процессе ультрафильтрации концентрат достигал концентрации 50,6 мг/мл белка на мл (оценка УФ-спектроскопией). Раствор был оптически прозрачным и почти бесцветным (слегка коричневатым), макроскопически трудно отличимым от исходного концентрата афелимомаба (12,4 мг/мл). Данные SEC и DLS не отличались от таковых для исходного концентрата.
3
Степень агрегации была по-прежнему близка к таковой для исходного концентрата (~1%) и профиль DLS точно соответствовал таковому для исходного концентрата, демонстрируя только один пик примерно на 10 нм. Белок не пострадал в результате увеличения его концентрации. При более высокой концентрации белка некоторые измеримые физические свойства могут меняться. Концентрат 50,6 мг/мл имел плотность 1,017 г/см и вязкость 1,375 мПа (обе измерены при 20°C), обе величины несколько выше по сравнению с исходным концентратом. Кроме того, значения мутности концентрата 50,6 мг/мл были выше, чем в исходном растворе: 118 NTU и примерно 5 NTU, соответственно. Данное возрастание было ожидаемым, поскольку количество макромолекул (белков) в растворе увеличилось, то есть стало больше макромолекул, которые могут рассеивать или поглощать свет, уменьшая интенсивность света.
Измерения частиц не показали значительных изменений во время процесса ультрафильтрации. Все фракции частиц концентрата 50,6 мг/мл имели равное или меньшее количество примеси частиц, по сравнению с концентратом 12,4 мг/мл. В геле IEF также не было обнаружено дополнительной полосы. Можно предположить, что увеличение концентрации MAK 195F в растворе до 50,6 мг/мл не приводит к существенному повреждению или иным изменениям, касающимся белка и его функций.
Распылительная сушка концентрата 50,6 мг/мл sd без эксципиента
Концентрат 50,6 мг/мл был столь же чувствительным к повреждениям, как и концентрат 12,4 мг/мл, при высушивании распылением. В процессе распылительной сушки агрегация увеличилась до примерно 2%, возрастание на 1%. Выход порошка составлял примерно 55%, но содержание воды было относительно высоким (3,5%). Кроме того, возникали определенные трудности при обращении с порошком (фасовка и так далее) из-за их высокого статического заряда.
На диаграмме DLS появлялся четкий пик мономера и небольшое плечо, представляющее собой небольшие агрегаты (олигомеры). В отличие от высушенного распылением исходного концентрата (12,4 мг/мл), не были обнаружены большие агрегаты в форме пика в мкм-диапазоне. Так как были обнаружены только небольшие агрегаты, не было выявлено существенных изменений в IEF гелях во время процесса распылительной сушки.
3
4
В процессе ультрафильтрации концентрация белка увеличилась, в то время как у всех других растворенных веществ (NaCl, NaPO и Pluronic F68) исходная концентрация сохранялась. Одно из последствий этого изменения можно было увидеть на картине дифракции рентгеновских лучей высушенного распылением препарата. Белки были полностью аморфными после распылительной сушки, так что кристаллические пики, обусловленные хлоридом натрия, были значительно меньшего размера. Никакого влияния на морфологию частиц не обнаружено, за исключением тенденции к увеличению размеров частиц, вызванной большим количеством твердых веществ в каплях.
Распылительная сушка концентрата 50,6 мг/мл без каких-либо эксципиентов также приводила к очень высокой примеси частиц. По сравнению с sd концентратом 12,4 мг/мл все фракции частиц менее 25 мкм содержали большое количество частиц.
Данные результаты можно было улучшить путем добавления эксципиентов до распылительной сушки. Как и в тестах на стабильность, эксципиенты добавляли в массовом соотношении, приравненном к 25 мМ смесям для концентрата 12,4 мг/мл.
Добавление сорбита
g
g
Сорбит добавляли в массовом соотношении сорбит:MAK 195F, равном 0,35:1, что соответствовало 25 мМ смеси для концентрата 12,4 мг/мл. Выход порошка для высушенной распылением смеси составлял примерно 60%. Порошок имел T 20°C и содержание воды 2,3%. Эти величины в значительной степени соответствуют результатам, полученным для аналогичных смесей с концентратом 12,4 мг/мл (67% выход порошка, 2,0% RH, T=19°C). Повторное растворение sd порошка приводило к прозрачному, почти бесцветному раствору, имеющему окраску, наиболее близкую к эталонному раствору B2 (слегка коричневатую), совсем как у исходного концентрата MAK 195F 50,6 мг/мл.
После распылительной сушки у повторно растворенного порошка наблюдали небольшое увеличение агрегации. Данные SEC свидетельствовали об уровне агрегации 1,3%, по сравнению с приблизительно 1% для чистого концентрата 50,6 мг/мл. Опять-таки, это не было существенным изменением по сравнению с высушенным распылением концентратом 12,4 мг/мл с добавлением 25 мМ сорбита.
Количество нерастворимых агрегатов существенно не увеличивалось, как видно из результатов DLS. Четкий пик мономера был обнаружен на гидродинамическом диаметре 10 нм, а также пик агрегации в мкм-диапазоне. Поскольку твердое содержание подаваемой жидкости было увеличено в 2,8 раза, примесь невидимых частиц в повторно растворенном порошке увеличилась. В частности, фракции мелких частиц (<10 мкм) имели очень высокие уровни примесей, в то время как число крупных частиц (>10 мкм) оставалось на том же уровне, что и для менее концентрированных растворов.
Изменение концентрации белка в подаваемой жидкости имело лишь незначительное влияние на морфологию частиц. Частицы имели типичную форму вдавленных сфер, но, похоже, наблюдалась тенденция в сторону более крупных частиц. Поскольку диаметр частиц в растворах, содержащих 12,4 мг афелимомаба в мл, составлял от примерно 2,5 до 13 мкм, высушивание распылением более концентрированных растворов частично приводило к образованию частиц, больших, чем 15 мкм.
Добавление трегалозы
g
g
Соотношение эксципиент:MAK 105F 0,7:1 было взято из серии испытаний на стабильность, при добавлении 25 мМ эксципиента для концентрата 12,4 мг/мл. Количество эксципиента было выше в этом эксперименте, чем в эксперименте с сорбитом, поскольку трегалоза, как дисахарид, имеет молекулярный вес примерно в два раза выше, чем моносахарид сорбит. Это увеличение твердого содержания в растворе подаваемой жидкости затруднило получение выхода белка, такого же высокого, как в предыдущих экспериментах по распылительной сушке. Высушивание распылением растворов с высоким содержанием твердых веществ заключает в себе риск засорения выходного отверстия для порошка высокопроизводительного циклона, и выход сократился до менее 50% (в данном эксперименте примерно 45%). С порошком было трудно обращаться вследствие высокого статического заряда. Он имел содержание воды 3,6% и T примерно 66°C, в некоторой степени сравнимые с аналогичными смесями с низкой концентрацией (3,3% RH, T=56°C). Повторно растворенный sd порошок имел окраску, наиболее близкую к эталонному раствору B2, который был слегка коричневатым.
Стабилизационный потенциал трегалозы был хорошим. Увеличение растворимых агрегатов не было обнаружено на хроматограмме SEC; агрегация сохранялась на уровне 1%, не отличаясь от исходного концентрата 50,6 мг/мл. Количество нерастворимых агрегатов было очень низким, как видно из массива данных DLS, демонстрирующих пик мономера и небольшое количество крупных агрегатов, представленных пиком в мкм-диапазоне.
Примеси невидимых частиц были выше, чем для менее концентрированных смесей (концентрат 12,4 мг/мл с трегалозой). Это можно объяснить высоким содержанием твердых веществ, которое примерно в три раза выше, чем в смесях, полученных с концентратом MAK 195K 12,4 мг/мл.
Изменение концентрации белка и содержания твердых веществ в подаваемой жидкости не имеет большого влияния на морфологию частиц. Форма частиц существенно не менялась, за исключением появления отдельных крупных частиц в более концентрированном порошке.
Добавление сахарозы
Для сохранения массового соотношения сахароза:MAK 195F, равного 0,7:1 (аналогично концентрату 12,4 мг/мл и 25 мМ эксципиенту), количество сахарозы для каждого эксперимента по распылительной сушке должно быть увеличено в 4,08 раза (50,6/12,4). Как видно выше, при использовании этого массового соотношения в процессе распылительной сушки была достигнута почти полная сохранность белка. Высушивание распылением растворов, содержащих такое большое количество твердых веществ, заключает в себе риск засорения выходного отверстия для порошка в циклоне, которое имеет очень небольшой диаметр, особенно в случае высокопроизводительного циклона. Вследствие этого, выход порошка иногда опускался ниже 50%, без какого-либо влияния на стабильность в процессе.
Поскольку концентрат 50,6 мг/мл имеет окраску, отличающуюся от исходного концентрата 12,4 мг/мл, ожидалось, что повторно растворенные sd порошки вследствие более высокой концентрации белкового раствора будут окрашенными. Смесь с трегалозой имела окраску, наиболее близкую к эталонному раствору B1, который был слегка коричневатым.
Агрегация оставалась на уровне 1%, не очень отличаясь от таковой для жидкого концентрата 50,6 мг/мл или даже исходного концентрата 12,4 мг/мл.
Анализ DLS показал пик мономера примерно на 10-нм гидродинамическом диаметре и хорошо известный пик небольшой агрегации в мкм-диапазоне, представляющий собой небольшое число крупных агрегатов. Примеси невидимых частиц были немного выше, чем для менее концентрированных смесей во фракциях всех размеров частиц.
g
g
Морфология частиц не отличались от результатов, полученных в предыдущих экспериментах с теми же соотношениями эксципиент:MAK 195F. Как следствие более высокого содержания твердых веществ в подаваемой жидкости, были замечены некоторые отдельные крупные частицы, которые отсутствовали в менее концентрированных препаратах. Остаточная влажность порошка составляла 2,6%, T препарата была примерно 60°C. Оба значения были сопоставимы с полученными для аналогичного менее концентрированного препарата в тестах на стабильность (2,6% RH, T=63°C).
Резюме
Повышение концентрации белка в подаваемой жидкости до 50,6 мг/мл не оказывало существенного влияния на полученные порошки. Почти все аналитические тесты давали результаты, сопоставимые с экспериментами по распылительной сушке концентрата 12,4 мг/мл с одинаковыми массовыми соотношениями эксципиент:MAK 195F. Таким образом, стабилизирующий потенциал эксципиентов зависел от массового соотношения эксципиент:MAK 195F, а не от молярного соотношения.
Как и в экспериментах с использованием подаваемой жидкости с низкой концентрацией (12,4 мг/мл), использование трегалозы и сахарозы приводило к почти одинаковым результатам с точки зрения стабильности в процессе при распылительной сушке афелимомаба. Использование сорбита для стабилизации фрагмента антитела показало несколько худшие результаты, особенно в агрегации. Сравнение методом IEF высококонцентрированных порошков не выявило никаких существенных различий, для всех смесей была характерна картина полос исходного афелимомаба без дополнительных полос (крупных агрегатов).
В зависимости от разных количеств эксципиента существовали заметные различия в диаграммах WAXD. Поскольку все использованные сахара (а также белок) были полностью аморфными после распылительной сушки, количество хлорида натрия в качестве доминирующего кристаллического ингредиента контролировало появление кристаллических пиков. Концентрат афелимомаба 12,4 мг/мл имел концентрацию хлорида натрия 38% масс./масс. (считая твердые вещества), демонстрируя четкий пик хлорида натрия при °2 Тэта 32. В высушенном распылением концентрате концентрация хлорида натрия была примерно 14% масс./масс., что приводило к уменьшению высоты кристаллического пика. При добавлении трегалозы и сахарозы в качестве эксципиента концентрация хлорида натрия снизилась до значения 9%. Как следствие, кристаллический пик больше не затенял аморфный ореол, вызванный белком и стабилизатором. Поскольку массовое соотношение сорбита было ниже, чем таковое для дисахаридов, кристаллический пик хлорида натрия все еще можно было видеть на диаграмме WAXD смеси с сорбитом.
Расчеты тоничности
Crit Care Medicine
Поскольку концентрат афелимомаба исходно был разработан и составлен для парентерального введения, изотоничность являлась важным фактором. Reinhart et al.,  29(4): 765-769 (2001). Растворы для внутривенного применения должны иметь примерно такое же осмотическое давление как кровь (286 мосмоль/кг). Kommentar zum Europäischen Arzneibuch, Wiss. Verlagsgesellschaft Stuttgart mbH, Band 2 (5.2) (2006). Осмотическое давление можно рассчитывать при помощи понижения точки замерзания, используя следующие уравнения из Deutscher Arzneimittelcodex, dt. Apotheker Verlag Stuttgart, Band 1 (Anlage B), 1-6 (2006):
Расчет понижения точки замерзания 1% (масс./об.) раствора:
Расчет ΔT смесей:
Расчет осмотического давления смеси:
iso
r
iso
mix
В приведенных выше уравнениях ΔT представляет собой понижение точки замерзания 1% (масс./об.) раствора вещества по сравнению с чистой водой, L представляет собой понижение точки замерзания при изотонической концентрации, и M представляет собой молекулярный вес. Значения L различаются для разных электролитов (смотри таблицу 11). Поскольку понижение точки замерзания сыворотки составляет 0,52°C (приравненное к осмотическому давлению 286 мосмоль/кг), величина понижения точки замерзания 1% раствора смеси по сравнению с чистой водой (ΔT) не должна превышать 0,52°C. Афелимомаб с его высоким молекулярным весом не имел существенного влияния на понижение точки замерзания препаратов, поэтому он не был включен в расчеты.
<b>Таблица 11</b>
<b><i>Вещество</i></b>
<b><i>L</i></b><sub>iso</sub>
<b><i>пример</i></b>
не электролит
1,9
сахароза, трегалоза, сорбит
моно-моновалентный электролит
3,4
NaCl
моно-тривалентный электролит
5,2
Na<sub>3</sub>PO<sub>4</sub>
С использованием данных уравнений, исходя из различных концентраций и смесей, можно вывести компьютерные значения осмотического давления, приведенные в таблице 12.
<b>Таблица 12</b>
<b><i>Препарат</i></b>
<b><i>Рассчитанное осмотическое давление [мосмоль/кг]</i></b>
концентрат 12,4 мг/мл
306
концентрат 12,4 мг/мл +25 мМ сорбит
320
концентрат 12,4 мг/мл +25 мМ трегалоза
332
концентрат 12,4 мг/мл +25 мМ сахароза
332
концентрат 50,6 мг/мл
306
концентрат 50,6 мг/мл + сорбит
361
концентрат 50,6 мг/мл + трегалоза
412
концентрат 50,6 мг/мл + сахароза
412
концентрат 100 мг/мл
307
концентрат 100 мг/мл + сорбит
504
концентрат 100 мг/мл + трегалоза
517
концентрат 100 мг/мл + сахароза
517
Для поддержания физиологического осмотического давления количество хлорида натрия было необходимо сократить, если использовались более концентрированные растворы MAK 195F. Исходная концентрация хлорида натрия составляла 8,8 мг/мл. При использовании массовых соотношений эксципиент:MAK 195F, оцененных в данном исследовании (25 мМ эксципиент в концентрате 12,4 мг/мл), концентрацию белка можно увеличивать до примерно 130 мг/мл, при условии, что весь хлорид натрия будет удален из препарата. Это приводило к величине осмотического давления примерно 300 мосмоль/кг.
Резюме
В данном исследовании представлен типовой метод получения порошкового антитела, включающий распылительную сушку. В частности, в этом примере раствор фрагмента IgG, афелимомаба = MAK 195F был преобразован в сухой сыпучий материал. Путем подбора различных эксципиентов и условий процесса был разработан метод распылительной сушки, который обеспечивал стабильность в процессе в сочетании со стабильностью при хранении.
Стабильность анализировали с помощью различных методов, которые могут обнаружить физическую или химическую деградацию белка, например, образование растворимых и нерастворимых агрегатов методами SEC и DLS, термальные события с помощью DSC и влажность sd порошков при помощи титрования по Карлу Фишеру. Деградация имела место в процессе сушки, будучи вызванной различными стрессовыми факторами, или являлась результатом долгосрочного хранения при повышенной температуре. Фрагмент IgG стабилизировали путем добавления сахаров к белку. Трегалозу, сахарозу и сорбит изучали на предмет их стабилизационного потенциала в процессе сушки и последующего хранения.
in
В первой части исследования белковый концентрат характеризовали и затем высушивали распылением без добавления эксципиентов для проверки уязвимости концентрата в процессе сушки. Кроме того, проводили серии испытаний, чтобы подобрать надлежащие параметры процесса. Распылительная сушка чистого концентрата приводила к повреждению белка. Увеличение агрегации было существенным (примерно 2%), особенно при запланированном последующем хранении. Изменение T должно было помочь уменьшить агрегацию, либо определить параметры процесса, при которых имеет место наименьшая агрегация.
Повреждения белка в процессе распылительной сушки, казалось, были вызваны взаимодействием различных стрессовых факторов (например, нагреванием, распылением, усилием сдвига). Ни один из этих стрессовых факторов не мог сам по себе вызвать деградацию белка сравнимо с процессом распылительной сушки.
Стабилизирующие сахара добавляли к белковому концентрату в различных концентрациях от 10 мМ до 150 мМ. Концентрация 150 мМ оказалась непригодной, поскольку содержание твердых веществ в подаваемой жидкости было настолько высоким, что происходило засорение циклонного сепаратора, что приводило к снижению выхода порошка. Добавление 10 мМ эксципиента было недостаточным для всех испытанных сахаров. Наилучшие результаты были получены при добавлении 25 мМ, что соответствовало массовому соотношению эксципиент:MAK 195F = 0,7:1 для трегалозы и сахарозы и 0,35:1 для сорбита. Концентрация 50 мМ приводила к сопоставимым результатам, однако целью было свести к минимуму количество добавок, насколько это возможно. Если сравнивать стабилизационный потенциал для процесса распылительной сушки, добавление трегалозы и сахарозы приводило к аналогичным результатам. Сорбит, судя по всему, немного уступал дисахаридам. Однако этого не наблюдалось при низком массовом соотношении, где добавление большего количества сорбита не улучшало результаты. Что качается стабильности в процессе, рекомендуется добавление предпочтительно 25 мМ трегалозы или сахарозы.
g
Поскольку смеси с 25 мМ являлись наиболее эффективными для стабильности в процессе, их использовали в тестах на краткосрочную стабильность (3 месяца). Вместе с аналогичными смесями плацебо и жидким концентратом sd порошки подвергали 3 различным, наиболее типичным климатическим условиям (холодильник: 5°C, Центральная Европа: 25°C/60% RH, Юго-Восточная Азия: 45°C/75% RH). Как и ожидалось, жидкий концентрат не смог выдержать ни одну из повышенных температур, что привело к серьезным повреждениям белка через 1 месяц (агрегации, фрагментации и оптической мутности). Порошки sd с эксципиентами демонстрировали хорошую стабильность в течение 3 месяцев. Препараты с трегалозой, а также с сахарозой подвергались серьезным повреждениям, только если их хранили при 40°C/75% RH (увеличение агрегации на 2%). Даже условия 25°C/60% RH не оказывали влияния на порошки, за исключением небольшого увеличения агрегации (0,5%). Как можно было предположить, исходя из результатов для стабильности в процессе, сорбит оказался слабым стабилизатором во время хранения. Смеси, хранившиеся при 5°C и 25°C, были одинаково стабильны с другими эксципиентами, однако температура 40°C оказалась критическим параметром для смеси сорбит-белок. Температура 40°C превышала T смеси, так что стабильность при хранении, основанную на иммобилизации белка, больше нельзя было гарантировать. Это приводило к увеличению агрегации примерно на 12%, которое не наблюдалось в каких-либо предварительных тестах данного исследования. Измерения невидимых частиц и мутности привели к неудовлетворительным результатам. Данные образцы по большей части демонстрировали оптическую мутность или даже коагуляцию. Основной проблемой исследований на стабильность были флаконы из Al, используемые для хранения порошков. Они не отличались полной непроницаемостью для водяного пара, таким образом, остаточное содержание влаги в гигроскопичных порошках не могло оставаться постоянным.
В тщательно продуманном препарате почти все изменения белка можно было свести к минимуму. Единственным параметром, который по-прежнему демонстрировал существенные изменения, была мутность. Не хранение, а процесс распылительной сушки приводил к увеличению мутности. Попытки снизить данное увеличение путем добавления большего количества эксципиента или использования более низких температур при высушивании не привели к успеху. Увеличения мутности примерно с 5 NTU (концентрат) до 15-20 NTU (sd смеси) невозможно было избежать. Тем не менее, другие аналитические методы не показали существенных изменений в процессе распылительной сушки белково-сахарного препарата.
В последней части данного исследования концентрация белка в подаваемой жидкости была увеличена с целью достижения более высокой пропускной способности распылительной сушки. Были проведены эксперименты с концентрацией белка 50,6 мг/мл. Процесс ультрафильтрации, а также распылительной сушки более концентрированного раствора белка (с определенным наилучшим массовым соотношением сахарной добавки) не оказывали существенного влияния на стабильность белка афелимомаба. Большинство результатов (за исключением примеси частиц или мутности вследствие более высокого содержания твердых веществ) были сопоставимы с аналогичными экспериментами, проводимыми с концентратом 12,4 мг/мл. Распылительная сушка растворов с концентрацией 100 мг/мл должна оказаться осуществимой, если удастся предотвратить засорение выходного отверстия циклона. Даже более концентрированные порошки можно было бы вводить парентерально, не рискуя вызвать гипо- или гипертонию, так как буфер содержит достаточное количество хлорида натрия, который можно удалять, заменяя на стабилизаторы. Не исключено использование концентрации белков вплоть до 130 мг/мл.
Композиция препаратов антител
LF
AA
Эксперименты по распылительной сушке проводили на распылительной мини-сушилке Büchi Mini-Spray Dryer B-191, как описано выше. Вкратце, высушивающий воздух фильтровали через Luwa Ultrafilter 2 (стекловолокно; класс фильтра: HEPA H13) перед поступлением в нагревательное устройство и сушильную камеру. Всю подаваемую жидкость фильтровали через 0,22-мкм фильтрующий элемент перед транспортировкой в сушильную камеру с помощью перистальтического насоса (Q = ~3 мл/мин; Ø силиконовой трубки = 3 мм). Распыление проводили двумя жидкостными соплами, используя осушенный азот (Q = 700 л/ч). После распылительной сушки полученные порошки извлекали из собирающего сосуда и помещали в стеклянные сосуды (пробки из хлорбутилового каучука), запечатанные парафильмом. Композиции суммированы в таблице 13. Характеристику белка проводили методами UV/VIS, SEC, IEC, PCS, DSC, XRD и титрованием по Карлу Фишеру.
<b>Таблица 13</b>
<b>Фосфат натрия</b>
<b>Хлорид натрия</b>
<b>Гистидин</b>
<b>Трегалоза</b>
<b>Pluronic F68</b>
MAK 195F 95 мг/мл
1,64 мг/мл
8,77 мг/мл
--
65,58 мг/мл
0,1 мг/мл
Адалимумаб 100 мг/мл
--
--
2,33 мг/мл
69,03 мг/мл
0,1 мг/мл
ABT-325 100 мг/мл
--
--
2,33 мг/мл
69,03 мг/мл
0,1 мг/мл
Как обсуждалось выше, препарат и параметры процесса оценивали, используя в качестве модельного соединения MAK 195F в концентрации 12 мг/мл. На фигуре 10 представлены две гистограммы, отражающие данные SEC по физической стабильности для высушенных распылением препаратов MAK 195F: (A) влияние сорбита, трегалозы и сахарозы (c=25 мМ) и (B) влияние концентрации стабилизатора на величину агрегации белков через 3 месяца хранения при 40°C/75% RH. Данные, приведенные на фигуре 10A, показывают, что трегалоза и сахароза обеспечивали наиболее стабильные продукты, тогда как сорбит не обеспечивал адекватную стабильность белка при долгосрочном хранении. Минимальное количество стабилизатора было определено в 25 мМ, что соответствует массовому соотношению эксципиент:белок = 0,7:1 (смотри фигуру 10B). На фигуре 10A столбики в каждой из групп, слева направо, представляют MAK 195F (основная масса), MAK 195F + сорбит, MAK 195F + трегалоза и MAK 195F + сахароза, соответственно. На фигуре 10B столбики в каждой из групп, слева направо, представляют сорбит, трегалозу и сахарозу, соответственно.
Данные параметры воспроизводились с использованием концентраций белка в диапазоне от 12, 50 до 100 мг/мл. Из всех препаратов были получены приемлемые порошки. Средняя остаточная влажность, представленная в таблице 14, составляла от 4,6 весовых % (MAK 195F) до 5,5 весовых % (адалимумаб) и, следовательно, была значительно выше, по сравнению с лиофилизированными препаратами с типичными значениями ниже 1%. Тем не менее, температуры стеклования были измерены при 60°C для MAK 195F и примерно 70°C для обоих полных антител, что предполагало надлежащую стабильность по меньшей мере при температуре хранения 5°C. Предварительные аналитические данные для этих высококонцентрированных (100 мг/мл) высушенных распылением препаратов MAK 195F, адалимумаба и ABT-325 представлены на фигуре 11. На фигуре 11 приведены две гистограммы, изображающие (A) влияние обработки и 3 месяцев хранения при 40°C/75% RH на физическую стабильность, определенное методом SEC, и (B) на химическую стабильность (стандартизованные 100% после обработки), определенное методом IEC, для высушенных распылением высококонцентрированных MAK 195F, адалимумаба и ABT-325 в 200 мМ растворах трегалозы. На фигуре 11A столбики в каждой из групп, слева направо, представляют MAK 195F (95 мг/мл, высушенный распылением), адалимумаб (100 мг/мл, высушенный распылением), ABT-325 (100 мг/мл, высушенный распылением) и ABT-325 (100 мг/мл, лиофилизированный), соответственно (за исключением того, что отсутствуют данные по хранению в течение одного месяца для ABT-325 (100 мг/мл, лиофилизированный) и отсутствуют данные по хранению в течение 3 месяцев для MAK 195F (95 мг/мл, высушенный распылением)).
<b>Таблица 14</b>
<b>Препарат</b>
<b>Остаточная влажность</b><b>[весовые %]</b>
<b>T</b><sub>g</sub><b>[°C]</b>
MAK 195F, <i>высушенный распылением</i>95 мг/мл
4,58
59,3
Адалимумаб, <i>высушенный распылением</i>100 мг/мл
5,46
70,4
ABT-325, <i>высушенный распылением</i>100 мг/мл
4,88
71,3
ABT-325, <i>лиофилизированный</i> 100 мг/мл
0,29
--
Данные для всех испытанных препаратов свидетельствуют о приемлемой физической стабильности белка в процессе обработки и хранения вплоть до 3 месяцев при 40°C, эквивалентно лиофилизату ABT-325. Однако соответствующие данные PCS (не показано) свидетельствуют о влиянии на характеристики белка, которое следует анализировать более подробно. Что касается химической стабильности, данные на фигуре 11B указывают на сопоставимые результаты для высушенного распылением препарата в сравнении со стандартным лиофилизированным препаратом. На фигуре 11B столбики в каждой из групп, слева направо, представляют ABT-325 (100 мг/мл, высушенный распылением), ABT-325 (100 мг/мл, лиофилизированный) и адалимумаб (100 мг/мл, высушенный распылением), соответственно.
Резюме
Приведенные данные свидетельствуют о принципиальной возможности успешного производства высушенных распылением порошковых антител из растворов мАТ с концентрациями вплоть до 100 мг/мл. Представленные данные для MAK 195F, адалимумаба и ABT-325 свидетельствуют, что отсутствует существенное влияние, как в процессе обработки, так и в ходе ускоренных исследований стабильности, на физическую или химическую стабильность белка. Тем не менее, наблюдаемую полидисперсность высушенных распылением белков следует проанализировать более подробно.
Кроме того, в состав препаратов должно входить достаточное количество стабилизаторов для обеспечения долгосрочного хранения. Тем не менее, благодаря универсальности этого метода, он предлагает интересные перспективы в отношении препаратов сыпучих лекарственных субстанций, а также в отношении новых лекарственных форм и способов их применения.
Включение посредством ссылок
Содержание всех цитируемых источников (включая литературные источники, патенты, патентные заявки и веб-сайты), которые могут быть процитированы на протяжении всей данной заявки, специально включено в данный документ посредством ссылок. На практике в данном изобретении будут использованы, если не указано иное, общепринятые методы распылительной сушки и создания белковых препаратов, которые хорошо известны в данной области.
Эквиваленты
Специалисты в данной области признают, или будут в состоянии определить, используя не более чем обычные эксперименты, множество эквивалентов для конкретных вариантов осуществления изобретения, описанных в данном документе. Такие эквиваленты должны быть охвачены следующими далее пунктами формулы изобретения. Содержание всех источников, патентов и опубликованных патентных заявок, процитированных на всем протяжении данной заявки, включено в данный документ посредством ссылок.