Способ консервации биологических материалов
METHOD FOR PRESERVATION OF BIOPHARMACEUTICALS

Область техники
[0001] Данное изобретение относится в целом к биологическим материалам; и более конкретно к улучшенным способам для консервации биологических материалов с применением обычного лиофилизатора.
Уровень техники
[0002] Область, связанная с методиками консервации биологических материалов, в последнее время продвинулась и достигла значительного улучшения с появлением определенных высококачественных способов, известных как "консервация путем выпаривания (PBV)", как описано в патенте США №9469835, выданном 18 октября 2016 года.
[0003] В настоящее время обычные лиофилизаторы (сублимационная сушилка) не предназначены для осуществления консервации биологических материалов и других композиций с применением протоколов PBV.
[0004] Кроме того, согласно обычным протоколам сублимационного высушивания биологические материалы часто подвергают воздействию чрезвычайно низких температур, которые, как правило, влияют на активность этих композиций.
[0005] Поскольку множество лабораторий и промышленных объектов имеют обычную сублимационную сушилку, биологические материалы, как правило, консервируют с применением устаревших протоколов, например, с осуществлением обычного сублимационного высушивания, что приводит к более низкой активности и стабильности продукта.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Техническая задача
[0006] Существует необходимость в улучшенных способах консервации биологических материалов с применением обычных лиофилизаторов.
[0007] Более конкретно существует необходимость в улучшенных способах, которые предусматривают применение обычного лиофилизатора для консервации биологических материалов в соответствии с технологией PBV.
[0008] Дополнительно существует необходимость в поддержании стерильной изоляции биологических материалов при консервации биологических материалов в соответствии с такими способами.
[0009] Для защиты биологических материалов во время выполнения протоколов PBV будут необходимы уникальные подлежащие консервации составы.
Решение задачи
[0010] Изобретение относится к способам выполнения протоколов PBV для консервации биологических материалов с применением обычного лиофилизатора.
[0011] Изобретение также относится к стадиям поддержания выделения биологических материалов для достижения высушивания в асептических условиях с применением обычного лиофилизатора.
[0012] Кроме того, изобретение относится к способам, совместимым с надлежащими производственными правилами (GMP), для достижения высушивания в асептических условиях биологических материалов с применением обычного лиофилизатора, расположенного вне зоны чистого помещения.
[0013] Наконец, изобретение относится к способам и составам для получения микронизированных биологических материалов, стабильных при температуре окружающей среды, подходящих для доставки пациенту через слизистые оболочки или трансдермальной доставки.
[0014] Эти и другие решения задач будут понятны специалисту в данной области техники после тщательного рассмотрения прилагаемых описаний, графических материалов и формулы изобретения.
Преимущественные эффекты изобретения
[0015] Консервация путем выпаривания (PBV) представляет собой предпочтительную методику в области технологий консервации биологического материала, поскольку способ включает одновременное кипячение воды, сублимацию кристаллов льда и выпаривание с целью достижения относительно мягкой среды во время исходного высушивания, также называемого стадией "первичного высушивания", которая является стадией, где большую часть воды удаляют из подлежащей консервации композиции. Мягкая среда является особенно чувствительной в отношении чувствительных белков, вирусов, бактерий и других клеточных элементов и может применяться для стабилизации вакцины, крови и компонентов микробиома при температуре окружающей среды. Последующее непрерывное высушивание (также известное как "вторичное высушивание") незначительно повышает температуру стеклования подлежащей консервации композиции так, чтобы достичь механически устойчивой аморфной сухой стекловидной пены, при этом биологические материалы, инкапсулированные в пену, защищают и консервируют для (i) хранения свыше девяноста дней ("долговременное хранение") и, (ii) через некоторое время, для восстановления или доставки пациенту. Раскрытые способы позволяют специалисту в данной области техники подвергать консервации биологические материалы в соответствии с протоколами PBV, адаптированными для выполнения с применением обычного лиофилизатора. Таким образом специализированное оборудование не является необходимым для консервации биологических материалов с применением технологии PBV.
[0016] Композиции биологических материалов, которые консервируют с применением технологии PBV, обеспечивают лучшую эффективность по сравнению с такими же композициями, консервируемыми с применением обычной методики сублимационного высушивания. Предполагается, что экстремальные температуры, которые используют при применении обычной методики сублимационного высушивания, как правило, приводят к разрушению эпитопов белка и полезных компонентов таких композиций и, таким образом, к становлению полученного продукта хуже композиций, консервированных путем PBV.
[0017] Получение композиций биологических материалов по GMP, таких как без ограничения вакцины, может быть достигнуто с применением способов, раскрытых в данном документе. Действительно, способы обеспечивают улучшенную и более эффективную GMP-совместимую обработку материалов для стабилизации для промышленных применений.
[0018] Раскрыты определенные составы и протоколы для консервации, которые защищают биологические материалы во время консервации и которые предотвращают расстекловывание материалов.
[0019] Другие преимущественные эффекты будут понятны специалисту в данной области техники после тщательного рассмотрения данного документа.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0020] На фиг.1 показан способ консервации биологических материалов.
[0021] На фиг. 2 показана таблица результатов, связанных с экспериментальным испытанием активности PBV LAIV после микронизации и последующего хранения.
[0022] На фиг. 3 показан график DSC, связанный с одним экспериментом, подробно описанным в данном документе.
[0023] На фиг. 4 показан график DSC, связанный с другим экспериментом, подробно описанным в данном документе.
[0024] На фиг. 5 показан график DSC, связанный с другим экспериментом, подробно описанным в данном документе.
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
[0025] В целях пояснения, а не для ограничения, подробности и описания определенных предпочтительных вариантов осуществления далее представлены в данном документе так, чтобы специалист в данной области техники мог иметь возможность создавать и использовать настоящее изобретение в его различных аспектах и вариантах осуществления. Однако эти подробности и описания являются иллюстративными только для определенных предпочтительных вариантов осуществления, и большое количество других вариантов осуществления, которые не будут намеренно описаны, будет легко понять специалисту в данной области техники после тщательного рассмотрения настоящего изобретения. Соответственно, любой рецензент настоящего изобретения должен интерпретировать объем настоящего изобретения формулой изобретения, поскольку такой объем не предназначен для ограничения вариантами осуществления, описанными и проиллюстрированными в данном документе.
[0026] Теперь в общем варианте осуществления раскрыт способ консервации биологических материалов. Способ включает по порядку следующие стадии.
[0027] Стадия (i): предоставление подлежащей консервации водной композиции в контейнере, при этом подлежащая консервации композиция включает один или несколько биологических материалов.
[0028] Стадия (ii): размещение контейнера и подлежащей консервации композиции в нем на терморегулируемой полке в вакуумной камере лиофилизатора, при чем терморегулируемая полка приспособлена для обеспечения температуры полки и вакуумная камера приспособлена для обеспечения вакуумметрического давления в нем.
[0029] Стадия (iii): снижение температуры полки ниже 0°С и уменьшение вакуумметрического давления ниже 1,0 торр, обеспечивая тем самым переход подлежащей консервации композиции в двухфазное шугообразное состояние, где подлежащая консервации композиция содержит кристаллы льда в двухфазном шугообразном состоянии.
[0030] Стадия (iv): повышение температуры полки выше 0°С и поддержание вакуумметрического давления ниже 1,0 торр, тем самым преобразование подлежащей консервации композиции в механически устойчивую стекловидную пену; и
[0031] стадия (v): повышение температуры полки выше 40°С с целью повышения до температуры стеклования механически устойчивой стекловидной пены.
[0032] Для целей настоящего изобретения термин "подлежащая консервации композиция" обычно означает подлежащую консервации композицию биологических материалов для долговременного хранения при температуре окружающей среды от -30°С до +40°С и последующее восстановление или доставку пациенту. Подлежащая консервации композиция обычно содержит один или несколько сахаров и один или несколько биологических материалов, при этом биологические материалы могут содержать одну или несколько бактерий, один или несколько вирусов, один или несколько белков или их комбинацию. Подлежащая консервации композиция является водной в своем исходном состоянии, т.е. представляет собой жидкость или гель с некоторым процентным содержанием в композиции воды, составляющим более одного процента. В этом исходном состоянии различные компоненты, такие как биологические материалы, сахара, сахароспирты и другие компоненты выбирают и смешивают вместе. Однако, во время исходной стадии высушивания по протоколу PBV, также известной как "первичное высушивание", воду удаляют посредством одновременного кипячения, выпаривания и сублимации из водной композиции под вакуумметрическим давлением. Таким образом, подлежащая консервации композиция после первичного высушивания будет по большей части лишена воды и, как правило, будет являться аморфной сухой стеклообразной матрицей или пеной (в данном документе "механически устойчивая стекловидная пена") с биологическими материалами, иммобилизированными в ней.
[0033] Соответственно, а также для целей, указанных в данном документе, термин "механически устойчивая стекловидная пена" означает подлежащую консервации композицию после первичного высушивания с помощью PBV, где подлежащая консервации композиция практически лишена воды и образует аморфную сухую стекловидную пену, характеризующуюся механической прочностью, достаточной для поддержания структурной формы. В частности, во время консервации с помощью PBV, как только начинается кипение подлежащей консервации композиции, внутри композиции образуются и растут пузырьки, которые в начале процесса будут представлять собой движущуюся (неустойчивую) пену, пока вязкость композиции в результате дегидратации не предотвратит дополнительный рост пузырьков водного пара, и пузырьки не будут иммобилизованы внутри композиции под конец первичного высушивания или когда большая часть воды испаряется и пена становится механически устойчивой.
[0034] В одном варианте осуществления во время стадии (iv) температуру полки повышают выше 20°С и вакуумметрическое давление снижают ниже 0,3 торр в вакуумной камере лиофилизатора.
[0035] В других вариантах осуществления во время стадии (iv) температуру полки повышают выше 20°С, а вакуумметрическое давление снижают ниже 0,3 торр в вакуумной камере в течение первого периода, а после первого периода температуру полки повышают выше 30°С, а вакуумметрическое давление поддерживается на уровне ниже 0,3 торр в вакуумной камере.
[0036] В некоторых вариантах осуществления во время стадии (v) температуру полки повышают выше 50°С.
[0037] В различных вариантах осуществления подлежащая консервации водная композиция (до первичного высушивания) содержит жидкость или гель.
[0038] Гель может быть получен путем химической сшивки полимеров, включенных в растворы для консервации, или полимеров и других молекул или ионов. Ионы могут включать катионы, т.е. Са++, или анионы.
[0039] Гель может быть получен путем химического сшивания во время подогревания смесей замерзших капель, содержащих отдельные сшивающие компоненты. Замерзшие капли можно получить с применением криогрануляции, например, путем распыления раствора в криожидкости, такой как жидкий азот (LN2).
[0040] Гель также можно получить посредством охлаждения подлежащих консервации композиций, которые превращаются в гель при температуре ниже 0°С.
[0041] В некоторых вариантах осуществления охлаждение полимерных растворов, которые могут превращаться в гель во время охлаждения, проводят путем криогрануляции. Криогрануляция является способом в котором перед охлаждением материал диспергируют на множество капель.
[0042] Хотя возможны множественные составы, подлежащая консервации композиция обычно содержит: один или несколько невосстанавливающих сахаров, один или несколько сахароспиртов или их комбинацию.
[0043] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из указанных одного или нескольких невосстанавливающих Сахаров выбран из группы, состоящей из: сахарозы, трегалозы, рафинозы, метилглюкозида и 2-дезоксиглюкозы. Однако другие невосстанавливающие сахара, известные специалисту в данной области техники, могут быть использованы подобным образом.
[0044] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из указанных одного или нескольких сахароспиртов выбран из группы, состоящей из: маннита, изомальта, сорбита и ксилита. Однако другие невосстанавливающие сахара, известные специалисту в данной области техники, могут быть использованы подобным образом.
[0045] Подлежащая консервации композиция может содержать: один или несколько внутриклеточных криопротекторов один или несколько внеклеточных криопротекторов или их комбинацию.
[0046] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из одного или нескольких внутриклеточных криопротекторов выбран из группы, состоящей из: глицерина, пропиленгликоля, эритритола, сорбита, маннита, метилглюкозида и полиэтиленгликоля.
[0047] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из одного или нескольких внеклеточных криопротекторов выбран из группы, состоящей из: глутаминовой кислоты, глицина, пролина, серина, треонина, валина, аргинина, аланина, лизина, цистеина, поливинилпирролидона, полиэтиленгликоля и гидроксиэтилкрахмала.
[0048] Подлежащая консервации композиция может дополнительно содержать одно или несколько противовспенивающих средств.
[0049] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно из одного или нескольких противовспенивающих средств выбрано из группы, состоящей из: полипропиленгликоля и этиленгликоля.
[0050] В некоторых вариантах осуществления способ может дополнительно включать перед стадией (i) загрузку биологических материалов с одним или несколькими проникающими внутриклеточными криопротекторами и затем смешивание загруженных биологических материалов с раствором для консервации с образованием подлежащей консервации композиции.
[0051] Один или несколько биологических материалов содержат: бактерию, вирус, белок или их комбинацию.
[0052] Один или несколько биологических материалов содержат комбинацию из одной или нескольких бактерий, одного или нескольких вирусов и одного или нескольких белков.
[0053] В различных вариантах осуществления контейнер может содержать одно из: пенициллинового флакона, пластиковой бутылкт, металлического контейнера или лотка.
[0054] В некоторых вариантах осуществления контейнер может содержать пористую мембрану, характеризующуюся размером пор, который меньше или равняется 0,25 мкм, и подлежащая консервации композиция может быть выделена из среды вакуумной камеры через пористую мембрану. Пористая мембрана может содержать любой обычный фильтр, применяемый для стерилизации водных растворов.
[0055] В некоторых вариантах осуществления контейнер также запечатан в пакет для стерилизации.
[0056] В некоторых вариантах осуществления контейнер может содержать множество металлических или керамических шариков, которые предусмотрены в объеме контейнера наряду с подлежащей консервации композицией.
[0057] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает, после стадии (v) размалывание механически устойчивой стекловидной пены в контейнере с применением металлических или керамических шариков, содержащихся в нем ("шаровой размол") для преобразования механически устойчивой стекловидной пены в частицы/порошок.
[0058] В некоторых вариантах осуществления, в частности, где биологические материалы предназначены для доставки через слизистые оболочки или трансдермальной доставки, подлежащая консервации композиция может содержать по меньшей мере пять частей дисахарида на одну часть сахароспиртов. Кроме того, подлежащая консервации композиция может дополнительно содержать водорастворимые аминокислоты или их соли. В некоторых вариантах осуществления водорастворимые аминокислоты или их соли могут содержать: аргинин, глутаминовую кислоту, глицин, пролин или их комбинацию.
[0059] В другом аспекте раскрыт способ стерильного получения термостабильных биологических материалов. Способ включает следующие стадии:
[0060] в пределах первой зоны чистого помещения: размещение подлежащей консервации композиции внутри контейнера, при этом подлежащая консервации композиция содержит один или несколько биологических материалов; запечатывание отверстия контейнера пористой мембраной с образованием запечатанного мембраной контейнера, где пористая мембрана имеет отверстие, размер которого меньше или равняется 0,25 микрон; и размещение запечатанного мембраной контейнера в стерильном пакете для стерилизации предназначенном для использования в медицине и термическое сваривание пакета для стерилизации;
[0061] перемещение пакета для стерилизации и запечатанного мембраной контейнера в нем из первой зоны чистого помещения во вторую зону, при этом способ дополнительно включает: размещение пакета для стерилизации и запечатанногоо мембраной контейнера в нем на терморегулируемой полке в вакуумной камере лиофилизатора; регулирование вакуумметрического давления и температуры полки для выполнения протокола высушивания, при этом протокол высушивания включает преобразование подлежащей консервации композиции в механически устойчивую стекловидную пену; и
[0062] после выполнения протокола высушивания, удаление запечатанного мембраной контейнера из пакета для стерилизации перед возвратом запечатанного мембраной контейнера в первую зону чистого помещения, при этом в первой зоне чистого помещения способ дополнительно включает: замену пористой мембраны стерильной крышкой или покрытие фильтра водонепроницаемой стерильной наклейкой для обеспечения того, чтобы механически устойчивая стекловидная пена в контейнере оставалась изолированной от воздействия внешней влажности во время последующего хранения; и, необязательно, преобразование механически устойчивой стекловидной пены в контейнере в порошок.
[0063] Чистые помещения, как правило, предназначены для включения трех зон, которые часто называют: А, В и С, А представляет собой первую и наиболее стерильную часть чистого помещения. В соответствии с правилами FDA индивиды могут выполнять какую-либо работу или могут находиться за пределами зоны А (в зонах В и С) чистого помещения, если они одеты в чистую одежду или/и на них есть другие покрытия. Индивидам не позволено находится в наиболее чистой зоне А. Только руки, покрытые стерильными перчатками, могут на короткий период времени пересекать линию разделения зоны А от зоны В для проведения небольших операций, таких как доставка флакона или инструмента в зону А или открытие или закрытие контейнера или подобное. Перед помещением инструмента или флакона в зону А они должны быть изолированы от воздействия окружающей среды, находясь за пределами зоны А. Например, они должны быть помещены внутрь стерильного пакета, который будет удален перед помещением инструмента или флакона в зону А для того, чтобы убедиться, что зона А остается стерильной.
[0064] В различных вариантах осуществления сухая пена накапливается в результате образования и роста пузырьков пара во время кипения и проявляется в виде пены из пузырьков, которая формируется во время высушивания жидкости, или может проявляться в виде сухого гидрогеля, содержащего включения газа.
[0065] Эти и другие варианты осуществления созданы и обоснованы в соответствии со следующими экспериментальными примерами, где:
Пример 1. Консервация путем выпаривания (PBV)
[0066] Консервация путем выпаривания (PBV) представляет собой относительно новую методику стабилизации неустойчивых вакцин и других биологических материалов при температуре окружающей среды (AT). Выполнение PBV требует одновременного контроля температуры и вакуумметрического давления. Это может быть сделано путем приведения в контакт сушильной камеры с источником вакуума и подачи тепла к образцам для высушивания для борьбы с охлаждением, происходящим в результате испарения воды. Источник тепла может быть представлен источником электромагнитного нагревания или обычным тепловым потоком из полки для нагревания, на которой образец размещали во время высушивания. Может быть много конструкций вакуумного сушильного оборудования, с помощью которого можно выполнять способ PBV. PBV можно также выполнять с применением обычного лиофилизатора, например, из тех, которые в настоящее время используются для получения сухих биологических препаратов с применением протоколов сублимационного высушивания. Поскольку выполнение сублимационного высушивания, как правило, требует применения относительно высокого вакуума, обычные лиофилизаторы не предназначены для контроля вакуумметрического давления автоматически, если давление внутри сушильной камеры является выше 1 торр, или, в некоторых случаях, выше 2 торр. Это ограничивает объем способов PBV, которые могут быть автоматически выполнены с использованием обычных лиофилизаторов. Однако в различных вариантах осуществления в данном документе раскрыто, как можно использовать обычные лиофилизаторы для консервации биологических материалов при температуре окружающей среды и как протокол высушивания может быть запрограммирован на автоматическое выполнение протоколов PBV без вовлечения оператора, который необходим для получения по GMP, и утверждения FDA, и утверждения различных контролирующих органов за пределами США.
[0067] В соответствии с технологией PBV первичное высушивание должно проводиться из двухфазного шугообразного состояния. Таким образом, чтобы выполнить PBV для данной подлежащей консервации композиции, такой как образец, включая подлежащую консервации смесь (РМ) биологической суспензии с раствором для консервации (PS), или гидрогель, содержащий биологические препараты и PS, образец сначала следует частично заморозить. "Замороженный" означает, что внутри образца образуются кристаллы льда. "Частично замороженный" означает, что температура образца на по меньшей мере 10°С выше Tg', где Tg' представляет собой температуру, ниже которой подлежащая консервации композиция находится в твердом состоянии, включающем кристаллизированные твердые вещества и аморфные твердые вещества (стекло) без жидкой фазы. Одно ключевое отличие между PBV и обычным сублимационным высушиванием заключается в том, что температура образца должна быть на уровне или ниже Tg' во время первичного сублимационного высушивания (или лиофилизации). Однако, температура образца на стадии первичного высушивания PBV должна быть на по меньшей мере 10°С выше Tg', чтобы обеспечить наличие жидкой фазы между кристаллами льда. Также, для обеспечения того, что данная жидкость не только испаряется, но также кипит, вакуумметрическое давление в камере должно быть ниже равновесного давления водяного пара над жидкостью. В данном документе, в соответствии с общепринятой терминологией, первичное высушивание определено как стадия исходного высушивания, во время которой образец теряет примерно 90% исходного количества воды в образце.
[0068] До консервации с помощью PBV биологические материалы необходимо смешать с растворами для консервации (PS), предназначенными для защиты биологических материалов от разрушающего действия заморозки и высушивания. Правильный отбор PS является важным для обеспечения успешной консервации. Чем ниже температура заморозки, тем более важно включить обычные криопротекторы в PS. Важно использовать как внутриклеточные криопротекторы, которые проникают внутрь клеточных элементов, так и внеклеточные криопротекторы, которые защищают клеточную и вирусную мембраны и оболочки.
Пример 2. Консервация клеток животных
[0069] CTV-1 представляет собой клеточную линию Т-клеточного лейкоза человека. Клетки CTV-1 выращивали в инкубаторе при 37°С, 5% CO2 и культивировали в суспензии в среде RPMI (85-90%) и термически инактивированной FBS (10-15%) с пенициллин-стрептомицином. Клетки разделяли каждые 4-5 дней и поддерживали на уровне около 1Е6 клеток/мл. Клетки затем собирали и концентрировали посредством центрифугирования до приблизительно 0,5-1Е7 клеток/мл.
[0070] Процедура: 5,5 г культуры клеток смешивали с 0,5 мл 50% глицерина и загружали в течение 30 мин. при комнатной температуре (к. т.). Две подлежащие консервации смеси (РМ) получали путем смешивания загруженных клеток с в два раза большим объемом двух растворов для консервации: PS1, содержащий 30% сахарозы, 15% MAG; и PS2, содержащий 30% сахарозы, 15% метилглюкозида (MAG) и 5% поливинилпирролидона (PVP). РМ помещали в 5 мл пенициллиновые флаконы (0,5 мл на флаконы) и высушивали внутри сублимационной сушилки с применением протокола PBV, описанного ниже.
[0071] Используемый протокол PBV включает следующие стадии:
[0072] частичную заморозку указанной РМ путем уменьшения температуры полки до -18°С и поддержание в течение 18 мин. при -18°С;
[0073] уменьшение вакуумметрическоого давления внутри сушильной камеры до0,1 торр и поддержание этого давления в течение 5 мин. для того, чтобы убедиться, что РМ заморожена;
[0074] повышение температуры полки до 0°С и вакуумметрического давления до 0,9 торр и поддержание этого давления и температуры полки в течение 50 мин.;
[0075] повышение температуры полки до 10°С и вакуумметрического давления до 0,5 торр и поддержание этого давления и температуры полки в течение 22 мин.;
[0076] повышение температуры полки до 10°С и вакуумметрического давления до 0,5 торр и поддержание этого давления и температуры полки в течение 22 мин.;
[0077] повышение температуры полки до 20°С и уменьшение вакуумметрического давления до 0,1 торр и поддержание этого давления и температуры полки в течение 22 мин;
[0078] повышение температуры полки до 30°С и поддержание вакуумметрического давления на уровне 0,1 торр и поддержание этого давления и температуры полки в течение 20 часов; и
[0079] повышение температуры полки до 40°С и поддержание вакуумметрического давления на уровне 0,1 торр и поддержание этого давления и температуры полки в течение 20 часов.
[0080] После консервации образцы PBV восстанавливали с помощью 0,5 мл среды для культивирования RPMI и дополнительно разбавляли средой для культивирования RPMI 1:2. Жизнеспособность клеток тестировали с применением цитометра с визуализацией mvitrogen Tali™ с набором для определения жизнеспособности Tali™ - Dead Cell Red, раствором пропидиум йодида. Пропидиум йодид неспособен к проникновению в живые клетки, но проникает в мертвые клетки (мембранно-поврежденные клетки) и флуоресцирует красным после связывания с нуклеиновыми кислотами. Набор для определения жизнеспособности включает протокол, который использовали для измерений: (https://tools. thermofisher. com/content/sfs/manuals/mp10786.pdf). Питометр Tali™ использовали для контроля состояния/жизнеспособности клетки с помощью протокола пропидиум йодида, подсчета процентного содержания живых/мертвых клеток и измерения среднего размера клетки. Измерения на приборе проводили с порогом флуоресценции пропидиум йодида (PIF), установленным на 440 RFU, а пороговый уровень среднего размера клетки ограничивали до 4-20 мкм.
[0081] Результаты: выживаемость клеток после высушивания с помощью PS1 составляла менее 10%; выживаемость клеток после высушивания с помощью PS2 составляла более 75%. Таким образом, PVP обеспечивал защиту клеточной мембраны во время консервации.
Пример 3. Консервация бактериальных клеток
[0082] Суспензию бактериальных клеток смешивали с 9% глицерином в PBS 3:1. После этого 3 РМ получали путем смешивания суспензии с в два раза большим объемом 3 растворов для консервации.
[0083] (PS1): глутаминовая кислота 7,86%, сахароза 10%, маннит 5%, NaOH 2% и PVP 4,76%, доведенные до рН=7;
[0084] (PS2): глутаминовая кислота 7,86%, сахароза 10%, маннит 5%, NaOH 2%, доведенные до рН=7; и
[0085] (PS3): глутаминовая кислота 7,86%, сахароза 10%, маннит 5%, NaOH 2% и PEG 4.76%, доведенные до рН=7.
[0086] Процедура: РМ помещали в 5 мл пенициллиновые флаконы (0,5 мл на флаконы) и высушивали внутри лиофилизатора с применением протокола PBV, описанного ниже.
[0087] Используемый протокол PBV включает следующие стадии:
[0088] частичную заморозку указанной РМ путем уменьшения температуры полки до -18°С и поддержание в течение 18 мин при -18°С;
[0089] уменьшение вакуумметрическоого давления внутри сушильной камеры до 0,1 торр и поддержание этого давления в течение 5 мин для того, чтобы убедиться, что РМ заморожена;
[0090] повышение температуры полки до 0°С и вакуумметрического давления до 0,9 торр и поддержание этого давления и температуры полки в течение 50 мин.;
[0091] повышение температуры полки до 10°С и вакуумметрического давления до 0,5 торр и поддержание этого давления и температуры полки в течение 22 мин.;
[0092] повышение температуры полки до 10°С и вакуумметрического давления до 0,5 торр и поддержание этого давления и температуры полки в течение 22 мин.;
[0093] повышение температуры полки до 20°С и уменьшение вакуумметрического давления до 0,1 торр и поддержание этого давления и температуры полки в течение 22 мин; и
[0094] повышение температуры полки до 30°С и поддержание вакуумметрического давления на уровне 0,1 торр и поддержание этого давления и температуры полки в течение 20 часов.
[0095] Результаты: после высушивания PBV материал восстанавливали с помощью 0,5 мл PBS и высевали на планшеты с агаром BHI после последовательных разведений. Планшеты хранили в инкубаторе при 37°С в течение 24 ч. Выживаемость бактерий после высушивания с помощью PS3 составляла менее 30%; выживаемость клеток после высушивания с помощью PS2 составляла менее 60%, выживаемость клеток после высушивания с помощью PS1 составляла более 90%. Таким образом, PVP обеспечивал дополнительную защиту бактерий во время консервации.
Пример 4. Валидация технологического процесса и увеличение масштаба высушивания в пенициллиновых флаконах
[0096] Исследования проводили с целью валидации воспроизводимости способа высушивания PBV. Альбумин человека применяли в качестве модельного белка в этих экспериментах. 2 мл подлежащей консервации смеси, содержащей 20 мг рекомбинантного альбумина человека (Novozymes ALBiX), 266 мг сахарозы и 133 мг изомальта, заполняли 20 мл пенициллиновые флаконы, помещали на стальной лоток и помещали на полку в лиофилизаторе (сублимационной сушилке) от Virtis. Лоток полностью заполняли флаконами общим количеством 120. Протокол высушивания пены PBV состоял из 3 часов первичного высушивания при 1500 мторр при температурах, находящихся в диапазоне от -15°С до 30°С и 20 часов вторичного высушивания при 50°С. Внешне сухая пена (механически устойчивая стекловидная пена) выглядела очень однородно от флакона к флакону без видимых всплесков.
Измерение температуры стеклования (Tg)
[0097] Цель: измерение Tg PBV образцов альбумина, взятых из различных областей лотка для высушивания, для проверки равномерности условий высушивания в лиофилизаторе.
[0098] Экспериментальная процедура: 5 флаконов с образцами PBV альбумина собирали из четырех углов полного лотка для высушивания (всего 20 флаконов с образцами). 3 DSC кювета для образцов получали с применением сухого материала из каждого флакона в сушильном отделении. Каждый образец содержал примерно 5 мг вручную размолотой PBV-пены. Анализ кювет для образцов проводили в DSC 8000 с помощью автоматического дозатора (Perkin Elmer, Массачусетс, США). Каждую кювету сканировали при температуре от -50°С до 80°С со скоростью 20°С/мин, a Tg рассчитывали с применением программного обеспечения Pyris Data Analysis (см. пример расчета ниже).
[0099] Результаты.
Измерения водной активности
[0100] Цель: измерение водной активности (aw) PBV образцов альбумина, взятых из различных областей лотка для высушивания, для проверки равномерности условий высушивания в лиофилизаторе.
[0101] Экспериментальная процедура: 5 флаконов с образцами PBV альбумина собирали из четырех углов полного лотка для высушивания (всего 20 флаконов с образцами). PBV-пену в каждом флаконе вручную размалывали в порошок. Примерно 150 мг порошка из каждого флакона тестировали с помощью измерителя для водной активности Aqualab 4ТЕ (Decagon Devices, Вашингтон, США), помещенном в сушильное отделение.
[0102] Результаты.
Пример 5. Высушивание внутри 1-литровых пластиковых бутылок, накрытых и изолированных от среды камеры 0,2 мкм фильтром стерилизации (мембраной).
[0103] РМ получали аналогично предыдущему примеру и заполняли 1-литровые пластиковые контейнеры 150 г/контейнер. После получения РМ каждый контейнер накрывали 0,2 мкм фильтром, используемым для стерилизации водных растворов.
[0104] Температуру хранения понижали до -18°С, после этого вакуумметрическое давление понижали до менее 0,1 торр и сохраняли равным 0,1 торр до конца процесса.
Далее температуру хранения повышали до 30°С и сохраняли при 30°С в течение 24 часов. Затем температуру хранения повышали до 40°С и сохраняли при 40°С в течение 24 часов.
Пример 6. Консервация живой ослабленной гриппозной вакцины (LAIV)
[0105] Единственный исходный раствор с высоким титром замороженного штамма LAIV (A/17/Texas/2012/30 (H3N2)) консервировали с применением технологии консервации путем выпаривания (PBV). Для консервации LAIV размораживали и смешивали 1:1 с различными растворами для консервации (PS) с рН 7 с образованием подлежащих консервации смесей (РМ). РМ распределяли в пенициллиновые флаконы и высушивали с применением способа PBV с температурами вторичного высушивания, составляющими 45°С и 50°С. Испытание активности различных вакцинных препаратов проводили с применением модифицированного протокола анализа LAIV TCID50, предоставленного CDC. Эксперимент Flu-1.
[0106] В эксперименте Flu-1 применяли 7 различных PS, содержащих:
[0107] PS1: сахарозы 30%, метилглюкозида (MAG) 10%, желатина 0,5%;
[0108] PS2: сахарозы 30%, метилглюкозида (MAG) 1170%, альбумина 0,5%;
[0109] PS3: сахарозы 30%, маннита 10%;
[0110] PS4: сахарозы 30%, маннита 10%, желатина 0,5%;
[0111] PS5: сахарозы 30%, ацетоглюкозы 10%;
[0112] PS6: сахарозы 30%, ацетоглюкозы 10%, желатина 0,5%; и
[0113] PS7: сахарозы 30%, MAG 10%.
[0114] К сожалению, PS6 кристаллизировался во время высушивания и впоследствии не изучался. Авторы настоящего изобретения предположили, что раствор PS6 был перенасыщен и желатин каким-то образом влиял на образование кристаллов ацетоглюкозы.
10
50
[0115] Результаты. Активность (log TCID/мл) высушенной вакцины после PBV и последующих 1,6 лет хранения при комнатной температуре (к. т.) показана в таблице ниже.
Эксперимент Flu-2.
[0116] В эксперименте Flu-2 авторы настоящего изобретения применяли PS, содержащий низкую концентрацию маннита (33% сахарозы+7% маннита) и температуру вторичного высушивания 50°С.
50
[0117] Данный эксперимент проводили во время, когда авторы настоящего изобретения впервые настраивали и оптимизировали свой внутренний протокол TCID50, и по этой причине авторы настоящего изобретения впервые измеряли активность консервированной вакцины только после 5 месяцев хранения при к. т., когда установили надежный способ измерения в рамках анализа. Титр вакцины (2Е7 TCID/мл) проявлял снижение активности всего на 0,62 log по сравнению с замороженным контролем после высушивания PBV и 5 месяцев хранения при комнатной температуре. Образцы из данного препарата применяли в исследованиях микронизации ниже.
Эксперимент Flu-3.
[0118] В эксперименте Flu-3 авторы настоящего изобретения исследовали несколько новых составов, включая один с дополнительно сниженной концентрацией маннита (35% сахарозы + 5% маннита), и поддерживали более высокую температуру вторичного высушивания, составляющую 50°С.
50
[0119] Результаты. Активность (TCID/мл) составов FLU-3 после хранения при комнатной температуре (к. т.) и 37°С показаны в таблице ниже.
[0120] Вывод. Высушивание PBV LAIV с помощью состава с 35% сахарозы и 5% маннита способом, который включает стадию вторичного высушивания при 50°С, позволяет получить термостабильную LAIV.
Пример 7. Получение сухой порошкообразной термостабилъной LAIV с диапазоном частиц, подходящим для доставки через слизистую оболочку носа, с применением технологии шарового размола
Шаровой размол плацебо сухого PBV-состава
[0121] Сперва авторы настоящего изобретения изучали шаровой размол PBV-составов с применением образцов плацебо. Образцы плацебо получали и оценивали следующим образом:
[0122] (i) для получения плацебо РМ, 100 г стерильной среды для культивирования клеток смешивали со 100 г PS, содержащим 33% сахарозы и 7% маннита; [0123] (ii) перед высушиванием РМ разделяли на аликвоты в 20 мл пенициллиновые флаконы (2 мл/флакон);
[0124] (iii) материал подвергали тому же протоколу PBV, который применяли для высушивания вакцины в ранних экспериментах с 1 дневным вторичным высушиванием при 45°С;
[0125] (iv) после высушивания плацебо PBV-пену сначала измельчали внутри пенициллиновых флаконов стерильным шпателем для разрушения PBV-пены, уменьшая размер частицы до нескольких сотен микрон;
[0126] (v) последующую микронизацию проводили с применением шаровой мельницы в лабораторных масштабах LabWizz в течение периодов времени 45, 75 или 90 минут с частотой 15 Гц, которую авторы настоящего изобретения ранее определили как подходящую частоту для получения частиц размером приблизительно 20 микрон;
[0127] (vi) порошок пропускали через медное сито с размером отверстий сита 63 мкм для удаления любых комков или более крупных частиц. Части порошкообразного материала, которые не проходили через сито, регистрировали. Размер отверстий сита был выбран равным 63 мкм, поскольку этот размер указан для просеивания лактозного порошка LactoHale, который применяют в качестве разбавителя сухого порошка в препарате сухой вакцины LAIV для доставки через дыхательные пути. Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что частицы, которые могут проходить через данное сито, существенно меньше, чем 63 мкм и хорошо подходят для доставки через дыхательные пути; и
[0128] (vii) порошки суспендировали в минеральном масле внутри сушильного отделения и оценивали с применением традиционной микроскопии.
[0129] Авторы настоящего изобретения обнаружили (см. таблицу ниже), что шарового размола PBV-пены до размеров частиц, достаточных для доставки через дыхательные пути, можно достичь с применением встряхивания с частотой 15 Гц и времени размалывания, находящегося в диапазоне 45-90 минут. Более короткое время размалывания, как правило, приводило к получению более разнообразных размеров частиц, увеличивая процентное содержание частиц, которые не проходили через сито с размером ячейки 63 мкм. Авторы настоящего изобретения пришли к выводу, что 75 минут размалывания при встряхивании с частотой 15 Гц представляют собой оптимальный протокол для получения микронизированных порошков вакцины для доставки через дыхательные пути.
[0130] Результаты проиллюстрированы на фиг. 2.
Активность PBV LAIV после микронизации и последующего хранения.
[0131] В этой части исследования авторы настоящего изобретения оценивали влияние времени размалывания на вакцину, полученную в эксперименте Flu-2 с применением PS, содержащего 33% сахарозы и 7% маннита. Микронизацию вакцины проводили как описано выше, то есть для образцов плацебо.
[0132] Результаты. Активность (TCID50) на миллиграмм сухого порошка PBV
LAIV, микронизированного при 15 Гц в течение 45, 75 и 90 минут и последующих 1,5 месяца хранения при 4°С, к. т. и 37°С, показана ниже.
[0133] Шаровой размол приводил к низкой потере активности и микронизированная вакцина оставалась устойчивой при к. т.в течение по меньшей мере 1,5 месяца. Однако, авторы настоящего изобретения обнаружили значительное снижение стабильности микронизированной вакцины во время хранения при 37°С по сравнению с немикронизированными вакцинными препаратами. Это может быть связанно с кристаллизацией маннита или сахарозы из перенасыщенного сахарозой/маннитом стекловидного вещества. Эта кристаллизация может быть инициирована образованием кристаллов маннита на поверхности трещин, возникающих во время размалывания.
Пример 8. Влияние микронизации на PBV-консервированную живую ослабленную ротавирусную вакцину (LARV).
[0134] Вакцину LARV смешивали 1:1 с PS, содержащим 30% сахарозы и 10% маннита, и консервировали путем PBV. Как и в случае с обсуждаемой в настоящее время вакциной против гриппа, уменьшение размера частицы проводили в две стадии: размалывание вручную с последующим шаровым размолом (микронизация) с применением шаровой мельницы лабораторных размеров Laarmann Labwizz. Сначала флаконы, которые хранили при комнатной температуре в течение 3 месяцев, открывали и сухой вспененный материал во флаконах размалывали вручную с применением шпателя в сушильном отделении при относительной влажности 15-18%. Примерно 120 мг пены, которую размалывали вручную, извлекали из каждого флакона. Размер частицы после размалывания вручную, как правило, составлял несколько сотен микрон. Затем пену, которую размалывали вручную, помещали в 2 мл металлические контейнеры, содержащие 3×2 мм стальные шарики каждый. Контейнеры помещали внутрь шаровой мельницы и встряхивали со скоростью 15 Гц в течение 30 минут для уменьшения размера частиц до примерно 50 микрон. Часть порошков высушивали под вакуумом в течение одного дня при 45°С.
[0135] Авторы настоящего изобретения обнаружили, что потеря вирусной активности после микронизации и последующих 5 месяцев хранения при к. т.была очень маленькой (<0,2 log). Однако, после 5 месяцев хранения при 37°С авторы настоящего изобретения наблюдали потерю 0,8 log активности, чего не наблюдали для немикронизированных составов. Это наблюдение коррелирует со снижением стабильности вакцины против гриппа PBV после микронизации выше.
[0136] Измерения авторов настоящего изобретения Tg с применением дифференциального сканирующего калориметра подтвердили рабочую гипотезу о том, что снижение вирусной активности при 37°С в микронизированных образцах может быть ассоциировано с кристаллизацией сахара из кристаллов, образующихся на поверхности фракций.
[0137] Авторы настоящего изобретения исследовали составы PBV, полученные с помощью PS, содержащего 30% сахарозы и 10% маннита. Для каждого состава авторы настоящего изобретения получали 3 независимых образца, герметично запечатанных в алюминиевых кюветах. С немикронизированными составами авторы настоящего изобретения не обнаружили никаких неожиданных результатов и смогли измерить Tg во время первого, второго и третьего прогона DSC, находящуюся в диапазоне от -50 до 80°С. См. фиг. 3, на которой показано сканирование DSC порошка Rota-1 РМ4, который размалывали вручную, без микронизации, 3 прогона.
[0138] Однако только для микронизированного порошка первые прогоны каждой кюветы для образцов характеризовались наблюдаемым поведением перехода в стеклообразное состояние, после чего авторы настоящего изобретения четко наблюдали быстрое снижение выхода DSC, ассоциированное с кристаллизацией во время нагревания. Данное явление, также известное как расстеклование, часто наблюдают в метастабильных перенасыщенных смесях выше температуры стеклования, когда низкая вязкость не останавливает рост кристаллов, которые часто формируются на поверхности фракции в стеклообразном состоянии. На фиг. 4 показаны прогоны DSC для сухого микронизированного состава РМ4.
[0139] Расстеклование представляет собой необратимый кинетический процесс кристаллизации в перенасыщенных растворах, которые не кристаллизируются во время охлаждения, и, таким образом, формируют устойчивые стекловидные вещества при температуре ниже Tg. Как правило, кристаллизация во время охлаждения не происходит, поскольку ядра кристаллов образуются при температурах ниже температуры, при которой кристаллы могут расти, или образование кристаллов может происходить только на поверхности трещин стеклообразного вещества. Во время нагревания выше Tg, когда вязкость раствора уменьшается, кристаллическое ядро, которое формируется при более низких температурах, начинает расти со скоростью, которая увеличивается с увеличением температуры, что необратимо преобразовывает материал в кристаллизированное состояние. Чем выше Tg, тем выше температура, при которой происходит расстеклование для данной скорости нагревания.
[0140] Авторы настоящего изобретения также измеряли Tg в образцах микронизированного сухого состава, который высушивали в течение дополнительного дня при 45°С под вакуумом. В этих образцах не обнаружили эффекта расстеклования во время нагревания из стеклообразного состояния. Прогоны DSC для сухого микронизированного состава РМ4 после дополнительного высушивания при 45°С показаны на фиг. 5.
[0141] После дополнительного высушивания сухого микронизированного состава результаты измерения Tg были в значительной степени выше (Tg была немного выше 50°С), чем результаты, полученные для микронизированного состава (Tg была немного выше 30°С), который не подвергали стадии дополнительного высушивания. Это объясняет, почему не наблюдали расстеклование в дополнительно высушенных порошках.
[0142] Расстеклование не обязательно происходит во всех стекловидных смесях и зависит от состава смеси. В соответствии с предварительными наблюдениями авторов настоящего изобретения оно более выражено в смесях, содержащих маннит, по сравнению со смесями, содержащими MAG. В данном документе предполагается, что увеличение Tg уменьшит или устранит расстеклование.
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
[0143] Заявленное изобретение применимо в фармацевтической промышленности, в частности в вакцинной промышленности, хотя в других частях фармацевтической промышленности является также применимым.
СПИСОК ССЫЛОК
[0144] Патент США №9469835, выданный 18 октября 2016 года.
[0145] Pushkar, N.S. и V.L. Bronshtein. 1988. The mechanism of ice formation on
rewarming of the frozen cryoprotectant solutions. Proc. Ukrainian Acad. Sci. 10: 68-70.