СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПОЛИФЕНОЛЬНЫХ ЭКСТРАКТОВ ИЗ ЛИСТЬЕВ ШПИНАТА
METHOD FOR PREPARATION OF POLYPHENOLIC SPINAGE LEAVES EXTRACTS

Объектом настоящего изобретения является новый способ приготовления концентрированных и очищенных полифенольных экстрактов из листьев шпината.
Шпинат (Spinacia oieracea) является однолетним или двулетним овощным растением семейства Лебедевых (Chenopodiacea). Как правило, это растение выращивают и употребляют в пищу как обычный продукт питания.
При традиционном использовании шпинат считается помимо прочего продуктом, укрепляющим, восстанавливающим, тонизирующим мышечную ткань и более конкретно сердечные мышцы. Высокое содержание каротинов, витаминов (в частности, витаминов С, Е), минералов и микроэлементов (в частности, магния, железа, кальция, калия) делает его прекрасным средством против общей усталости и депрессивных состояний.
Шпинат также традиционно используют, имея в виду его антианемические свойства.
Листья шпината содержат полифенолы типа флавонолов и флаванолов в простой или полимеризованной форме.
Эти полифенолы известны как хорошие антиоксиданты и противовоспалительные вещества.
Таким образом, задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы обеспечить способ приготовления концентрированных экстрактов шпината, богатых полифенолами.
Задача настоящего изобретения также заключается в обеспечении экстрактов шпината, имеющих повышенное содержание полифенолов, при этом упомянутые экстракты предназначены для применения с целью улучшения работоспособности поперечно-полосатых мышц у человека или у животных.
Настоящее изобретение относится к способу приготовления концентрированного экстракта шпината, в жидкой или в сухой форме, с содержанием полифенолов выше или равным 50%, включающему этап очистки необработанного экстракта шпината в жидкой форме способом экстракции жидкости жидкостью - пищевым маслом.
По предпочтительному варианту осуществления пищевое масло выбирают из группы, включающей оливковое масло, подсолнечное масло, масло из косточек винограда, рыбий жир и их смеси.
Так, способ по настоящему изобретению включает следующие этапы:
- добавляют пищевое масло к необработанному экстракту в жидкой форме для получения жидкого необработанного экстракта с добавлением пищевого масла,
- подвергают упомянутый жидкий необработанный экстракт с добавлением пищевого масла этапу концентрации в вакууме и при перемешивании для получения всплывающей масляной фазы, содержащей хлорофилловые пигменты и каротиноиды, и водной фазы, содержащей водорастворимые соединения (глюциды, протиды, простые или сложные фенольные соединения…), и
- отделяют индивидуально масляную и водную фазу.
Этап экстракции из жидкого необработанного экстракта согласно изобретению пищевым маслом позволяет получить очищенный экстракт, обладающий повышенным содержанием активных(-ого) веществ(-а). Для этого упомянутый необработанный экстракт подвергают стадии очистки. Эту стадию очистки реализуют объединением двух этапов. Назначение первого этапа состоит в удалении придающих окраску соединений типа хлорофиллов, при этом получают продукт, имеющий ценность как зеленый пищевой краситель высокого качества, этим способом предохраняют пигменты от распада путем окисления, которое обычно происходит при концентрации.
К необработанному экстракту в жидкой форме добавляют обычное пищевое масло, типа оливкового масла, подсолнечного масла, масла из косточек винограда, рыбьего жира или любого другого пищевого масла с идентичными свойствами в пропорциях от 1/1 до 1/1000 в зависимости от желаемой концентрации хлорофилла. Более конкретно, жидкий необработанный экстракт с добавлением масла затем концентрируют в вакууме и при перемешивании оборудованием типа испарителя-концентратора или шара с вакуумом. Кроме того, этот этап позволит уменьшить объем продукта, а также удалить спирт в случае экстракции водно-спиртовой смесью. Полученный продукт имеет форму двухфазной смеси: всплывающая масляная фаза, содержащая хлорофилловые пигменты и каротиноиды, предохраняемые от окислительных явлений, и водная фаза, содержащая совокупность водорастворимых соединений, таких как глюциды, протиды, простые или сложные фенольные соединения. Разделение смеси можно улучшить добавлением достаточной доли воды.
В рамках способа согласно настоящему изобретению упомянутую выше масляную фазу затем улавливают и предпочтительно подвергают одному или нескольким этапам промывания водой и при необходимости высушивают для получения красящего порошка.
Упомянутый выше этап промывания масляной фазы водой позволяет повысить улавливание водорастворимых соединений, которые были случайно эмульгированы с масляной фазой.
Эта масляная фаза может представлять прямую ценность как естественный, то есть биологический зеленый пищевой краситель, полученный из шпината, выращенного в рамках биологически чистого сельского хозяйства. Эту масляную фазу можно также сушить распылительной сушкой, применяя адаптированные носители для сушки, такие как казеинаты, мальтодекстрины, лецитины, для получения красящего диспергируемого в воде порошка.
Собранную водную фазу согласно описанию выше, в частности, содержащую полифенолы, можно высушить непосредственно или подвергнуть второй очистке.
Так, согласно конкретному варианту осуществления способа по изобретению водную фазу, полученную в результате стадии экстракции пищевым маслом, улавливают, затем высушивают для получения концентрированного экстракта в сухой форме.
Согласно другому конкретному варианту осуществления способа по изобретению водную фазу, полученную в результате стадии экстракции пищевым маслом, улавливают, затем подвергают стадии очистки для получения очищенного концентрированного экстракта.
Эту дополнительную стадию очистки можно выполнять пропусканием через абсорбирующие смолы и с вымыванием растворителем типа спирта, или экстракцией жидкости жидкостью при применении несмешиваемого с водой растворителя, такого как этилацетат, бутанол или любой другой растворитель, обладающий сродством к фенольным соединениям.
Применяемые хроматографические смолы могут быть, например, типа ионообменных смол (анионных или катионных) или типа смол адсорбции/десорбции, в частности типа сополимера дивинилбензол/стирол, полистирольных или полиметакриловых смол, которые более конкретно поступают в продажу под марками Rohm & Haas или Mitsubishi Chemical.
Способ согласно изобретению может включать дополнительные стадии, состоящие в получении экстрактов, более насыщенных активными веществами.
Так, очищенный экстракт, полученный в результате очистки методом хроматографии или экстракцией жидкости жидкостью этилацетатом или бутанолом, затем можно концентрировать либо испарением в вакууме, либо мембранной нанофильтрацией для получения концентрата, содержащего от 15 до 70% сухого вещества.
И, наконец, этот очищенный концентрат можно затем высушить с применением оборудования, такого как распылительный сушильный аппарат, сублимационный аппарат или вакуумный сушильный аппарат.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к приготовлению очищенного концентрированного экстракта в сухой форме, при этом упомянутую сухую форму получают высушиванием очищенного концентрированного экстракта в жидкой форме.
По предпочтительному способу осуществления этапы высушивания, выполняемые для получения сухих форм, проводят распылением.
Настоящее изобретение также относится к описанному выше способу, характеризующемуся тем, что необработанный экстракт шпината в жидкой форме получают способом, включающим стадию экстракции приведением в соприкосновение шпината в свежем или замороженном виде с растворителем, выбранным из группы, включающей воду, этанол и их смеси.
По предпочтительному варианту осуществления шпинат, используемый в рамках способа согласно изобретению, происходит от целого растения, в свежем или в сухом виде.
Необработанный экстракт шпината согласно изобретению получают, приводя в соприкосновение для стадии экстракции растение в свежем или в замороженном виде с растворителем, таким как вода, этанол или смесь воды и этанола в пропорциях, которые могут составлять от 100/0 до 0/100, разделяя растение и растворитель для получения необработанного экстракта в жидкой форме. Для получения необработанного экстракта в сухой форме необработанный экстракт в жидкой форме высушивают, например, удалением воды в потоке горячего воздуха, распылением, испарением, сублимацией, дегидратацией, адсорбцией на носителе.
Настоящее изобретение также относится к способу приготовления красящего продукта, включающему следующие стадии:
- добавляют пищевое масло к необработанному экстракту шпината согласно описанию выше в жидкой форме для получения жидкого необработанного экстракта с добавлением пищевого масла,
- подвергают упомянутый жидкий необработанный экстракт с добавлением пищевого масла стадии концентрации в вакууме и при перемешивании для получения всплывающей масляной фазы, содержащей хлорофилловые пигменты и каротиноиды, и водной фазы, содержащей водорастворимые соединения,
- улавливают масляную фазу, чтобы подвергнуть ее одному или нескольким этапам промывания водой для получения жидкого красящего продукта и при необходимости высушивают промытую масляную фазу для получения красящего порошка.
Таким образом, этот способ позволяет получить красящий продукт в жидкой или в сухой форме.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к красящему продукту в жидкой или в сухой форме, который можно получить описанным выше способом.
Так, упомянутый красящий продукт в жидкой форме можно использовать в качестве зеленого пищевого красителя.
Настоящее изобретение также относится к концентрированному экстракту шпината, который можно получить описанным выше способом приготовления.
Концентрированные экстракты согласно изобретению характеризуются тем, что общее содержание в них полифенолов больше или равно 50%.
Настоящее изобретение также относится к концентрированному экстракту шпината в жидкой или в сухой форме, общее содержание полифснолов в котором больше или равно 50%, предпочтительно составляет от 60% до 100%, и наиболее предпочтительно составляет от 90% до 100%.
Количественное определение полифенолов проводят методом спектрофотометрии и ВЭЖХ (например, способом, описанным ниже).
Предпочтительно экстракты по изобретению включают по большей части полифенольные соединения, и предпочтительно из расчета по меньшей мере 70 мас.% (по отношению к общей массе экстракта).
В числе этих полифенольных соединений присутствуют в основном соединения группы флавоноидов и, более конкретно, химического класса флавонолов.
Так, четыре главных представителя полифенольных соединений, входящих в состав экстрактов шпината согласно изобретению, следующие: патулетин, спинацетин, жасеидин и спинатозид (в простой или гликозилированной форме).
Более конкретно, экстракты шпината согласно изобретению содержат следующие соединения:
патулетин-3-глюкозил-(1-6)-апиозил(1-2)-гликозид,
патулетин-3-глюкозил-(1-6)-гликозид,
спинацетин-3-глюкозил-(1-6)-апиозил(1-2)-гликозид,
спинацетин-3-глюкозил-(1-6)-гликозид,
спинацетин-3-ферулоилглюкозил-(1-6)-гликозид,
спинатозид,
жасеидин-4'-глюкуронид,
5,3',4'-тригидрокси-3-метокси-6:7-метилендиоксифлавон-4'-глюкуронид,
5,4'-дигидрокси-3,3'-диметокси-6:7-метилендиоксифлавон-4'-глюкуронид.
В экстрактах согласно изобретению также присутствуют фенольные кислоты, более конкретно о-кумаровая кислота, феруловая кислота, р-кумаровая кислота и глюкуроновая кислота.
В экстрактах согласно изобретению также присутствуют экдистероиды, которые обычно называют фитоэкдистероидами (по большей части 20-гидроксиэкдизон).
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей экстракт шпината согласно определению выше в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
Настоящее изобретение также относится к биологически активной добавке к пище, включающей экстракт шпината согласно определению выше в сочетании с приемлемым носителем.
Экстракты шпината по изобретению предназначены для разных областей применения, в частности, для улучшения работоспособности поперечно-полосатых мышц у человека или у животных. Так, потребление упомянутого экстракта позволяет восстановить соединения, образовавшиеся в результате окислительного метаболизма в мышцах, и производные метаболиты, нарушающие работоспособность мышц и увеличивающие время восстановления.
Настоящее изобретение также относится к использованию упомянутого экстракта в препаратах в различных галеновых формах для приема человеком или животным вне зависимости от того, применяется ли он в медикаментозной форме, в форме биологически активной добавки к пище или в форме диетического продукта.
Применение упомянутых препаратов относится к группе из множества людей или животных, для которых представляет интерес вклад в улучшение работоспособности мышц и повышение способности к восстановлению, например, для опытных спортсменов, спортсменов-любителей, которым требуется помощь в восстановлении после физических усилий, для лиц пожилого возраста, испытывающих трудности при восстановлении после физической активности, и для беговых, гончих или престарелых животных.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящее изобретение относится к экстрактам шпината согласно определению выше для их использования с целью улучшения работоспособности мышц.
Настоящее изобретение также относится к экстрактам шпината согласно определению выше для их использования для лечения и профилактики нарушений опорно-двигательной системы.
Настоящее изобретение также относится к экстрактам шпината согласно определению выше для их использования для лечения и профилактики мышечных нарушений в результате физических усилий.
Краткое описание фигур
На фиг.1 представлена УФ хроматограмма при 280 нм очищенного экстракта шпината, полученного способом согласно изобретению (очищенный экстракт №1 - см. примеры).
МЕТОД КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИФЕНОЛОВ
Для количественного определения полифенолов был использован следующий метод.
Была использована хроматографическая система марки Agilent Technologie серии 1100.
С помощью колонки Kromasil С 18, 250 мм × 4,6 мм - 5 мкм, оснащенной предколонкой того же типа, были выделены различные полифенолы.
Реактивы
В качестве растворителей были использованы: сверхчистая вода Ultra-Pure Millipore, ацетонитрил (Chimie Plus, ссылка: АС03902500), метанол (Chimie Plus, ссылка: М Е03102500), ортофосфорная кислота 85% (Fisher Scientific, ссылка: О/0450/РВ15) и ледяная уксусная кислота (Fisher Scientific, ссылка: А/0400/РВ15).
В качестве аналитических стандартов были использованы: галловая кислота (Extrasynthese, ссылка: 4993 S), катехин (Extrasynthese, ссылка: 0976 S), эпикатехин (Extrasynthese, ссылка: 0977 S), галлат эпикатехина (Extrasynthese, ссылка: 0978 S), процианидин Bl (Extrasynthese, ссылка: 0983) и процианидин В2 (Extrasynthese, ссылка: 0984).
Методика выполнения анализа
1. Хроматографические условия.
Были использованы следующие растворители для элюирования:
- растворитель А: вода качества для ВЭЖХ, подкисленная до рН 2,5 ортофосфорной кислотой
- растворитель В: ацетонитрил/уксусная кислота 90:10
Поток подвижной фазы составлял 1 мл/мин.
Температура колонки была равна 25°С.
Объем вводимой пробы составлял 20 мкл, определение проводилось в УФ части спектра при 280 нм, продолжительность анализа составляла 50 минут.
Был приложен следующий градиент:
Время (мин)
% растворителя А
% растворителя В
0
95
5
30
75
25
35
70
30
45
50
50
50
40
60
2. Растворы, которые необходимо приготовить
- растворитель для растворения:
сверхчистая вода/метанол качества для ВЭЖХ/ледяная уксусная кислота 75:20:5 (объем/объем/объем)
- стандартный раствор
В мерную колбу на 20 мл взвешивали 5 мг галловой кислоты, 5 мг катехина, 5 мг эпикатехина, 5 мг галлата эпикатехина, 2 мг процианидина В1 и 2 мг процианидина В2.
Реагенты растворили в метаноле и довели объем раствора до метки.
- раствор образца для анализа
В мерную колбу на 50 мл взвешивали 100 мг экстракта, предназначенного для анализа, и растворяли в течение 10 минут растворителем для растворения с использованием ультразвука, затем объем раствора доводили до метки.
Контрольный раствор и исследуемые растворы фильтровали через мембрану (мембраны Sartorius, 0,45 мкм, ссылка: Minisart-RC-15).
Из каждого образца было взято две пробы для исследования.
Расчет содержания полифенолов
Содержание полифенолов рассчитывали по следующей формуле:
<mrow><msub><mi>T</mi><mrow><mi>p</mi><mi>o</mi><mi>l</mi><mi>y</mi><mi>p</mi><mi>h</mi><mtext>é</mtext><mi>n</mi><mi>o</mi><mi>l</mi></mrow></msub><mo>=</mo><mfrac><mrow><msub><mi>A</mi><mi>E</mi></msub><mo>×</mo><msub><mi>m</mi><mi>T</mi></msub><mo>×</mo><msub><mi>V</mi><mi>E</mi></msub></mrow><mrow><msub><mi>A</mi><mi>T</mi></msub><mo>×</mo><msub><mi>m</mi><mi>R</mi></msub><mo>×</mo><msub><mi>V</mi><mi>T</mi></msub></mrow></mfrac><mo>×</mo><mi>d</mi><mo>×</mo><mn>100</mn></mrow>
Т: содержание (в %) полифенола Х в экстракте
Е
А: площадь пика полифенола Х анализируемого раствора
T
A: площадь пика полифенола Х контрольного раствора
E
m: масса пробы анализируемого раствора (в мг)
T
m: масса пробы полифенола Х соответствующего контроля (в мг)
T
V: объем, в котором был растворен полифенол Х (в мл)
E
V: объем, в котором был растворен анализируемый экстракт (в мл)
d: коэффициент разведения, если такой необходим
ПРИМЕРЫ I - Очищенные необработанные экстракты:
1.1. Очищенный экстракт №1
Экстрагировали 100 кг свежих листьев шпината мацерацией в 300 л воды при 50°С в течение 2 часов.
В воду можно добавлять ферменты типа целлюлаз и гемицеллюлаз или любой другой фермент, разжижающий фрукты или овощи.
Насыщенный растворитель (воду) отделили от твердого взвешенного вещества и профильтровали.
К насыщенному профильтрованному растворителю добавили оливковое масло из расчета 1 кг масла на кг сухого вещества в жидкости.
Затем смесь насыщенного растворителя и масла концентрировали испарением в вакууме в пленочном испарителе.
Температуру нагрева поддерживали на уровне ниже 60°С.
Процедуру концентрации проводили до уменьшения общего объема в 20 раз.
Затем концентрированную смесь масло/водная фаза промывали умягченной водой при 10°С из расчета 1 объем воды на первоначальный объем смеси.
Эта фаза экстракции жидкости жидкостью - пищевым маслом, реализуемая в ходе процедуры концентрации, позволяет удалить из остаточной водной фазы совокупность лиофильных компонентов, более конкретно пигменты, сохраняя целостность интересующих нас полифенольных компонентов.
Масляную фазу отделяли и фильтровали, и она представляла собой липидный раствор хлорофилловых пигментов и каротиноидов. Ее можно непосредственно использовать в красящих пищевых препаратах.
Водный концентрат представляет собой жидкий очищенный экстракт (очищенный экстракт №1), который можно превратить в порошок удалением растворителя, например, высушиванием в вакууме.
1.2. Очищенный экстракт №2
Экстрагировали 100 кг свежих листьев шпината мацерацией в этаноле 30% по объему при 50°С в течение 2 часов.
Насыщенный растворитель (этанол) отделили от твердого взвешенного вещества и профильтровали.
К профильтрованному растворителю добавили масло из косточек винограда из расчета 1 л масла на кг сухого вещества. К смеси может быть добавлен пищевой антиоксидант типа природного витамина Е.
Затем из смеси был удален спирт дистилляцией и концентрацией в глубоком вакууме.
Полученный концентрат разделили на две части сбором масляной фазы, содержащей хлорофилловые пигменты и каротиноиды. Водную фазу собирали отдельно.
Эта фаза экстракции жидкости жидкостью - пищевым маслом, реализуемая в ходе процедуры концентрации, позволяет удалить из остаточной водной фазы совокупность лиофильных компонентов, более конкретно пигменты, сохраняя целостность интересующих нас полифенольных компонентов.
Масляную фазу, обогащенную пигментами, можно непосредственно использовать после фильтрации в качестве зеленого пищевого красителя. Ее можно также высушить на носителе, состоящем из мальтодекстринов, казеинов, лецитинов сои для получения зеленого красящего и вододиспергируемого порошка.
Водный концентрат представляет собой жидкий очищенный экстракт (очищенный экстракт №2), который можно превратить в необработанный экстракт в виде порошка удалением растворителя, например высушиванием в вакууме или распылением.
1.3. Очищенный экстракт №3
Экстрагировали 100 кг свежих листьев шпината мацерацией в этаноле 90% по объему при 50°С в течение 2 часов. Операцию повторили трижды и объединили все собранные жидкие фракции.
Насыщенный растворитель (этанол) отделили от твердого взвешенного вещества и профильтровали.
К профильтрованному растворителю добавили масло из косточек винограда из расчета 1 л масла на кг сухого вещества. К смеси может быть добавлен пищевой антиоксидант типа природного витамина Е.
Затем из смеси был удален спирт дистилляцией и концентрацией в глубоком вакууме.
Полученный концентрат разделили на две части сбором масляной фазы, содержащей хлорофилловые пигменты и каротиноиды. Водную фазу собирали отдельно.
Эта фаза экстракции жидкости жидкостью - пищевым маслом, реализуемая в ходе процедуры концентрации, позволяет удалить из остаточной водной фазы совокупность лиофильных компонентов, более конкретно, пигменты, сохраняя целостность интересующих нас полифенольных компонентов.
Масляную фазу, обогащенную пигментами, можно непосредственно использовать после фильтрации в качестве зеленого пищевого красителя. Ее можно также высушить на носителе, состоящем из мальтодекстринов, казеинов, лецитинов сои для получения зеленого красящего и вододиспергируемого порошка.
Водный концентрат представляет собой жидкий очищенный экстракт (очищенный экстракт №2), который можно превратить в необработанный экстракт в виде порошка удалением растворителя, например, высушиванием в вакууме или распылением.
II - Очищенные экстракты.
II.1. Очищенный экстракт №1
Очищенный экстракт №1 был подвергнут этапу очистки хроматографией на смоле типа дивинилстиролбензола (XAD 16 компании Rohm & Haas), обеспечивающей выполнение метода адсорбции/десорбции, адаптированного к полифенолам.
Адсорбированные соединения десорбируют из смолы вымыванием из нее водно-спиртовым раствором концентрацией 60% по объему при 35°С.
Полученный таким образом элюат представляет собой очищенный экстракт, который также можно хранить в жидкой или в сухой форме.
Композиция этого очищенного экстракта указана на фиг.1.
Так, этот экстракт содержит следующие соединения:
Феруловая кислота (пик №°1); патулетин-3-глюкозил-(1-6)-апиозил (1-2)-гликозид (пик №°2); патулетин-3-глюкозил-(1-6)-гликозид (пик №°3); спинацетин-3-глюкозил-(1-6)-апиозил (1-2)-гликозид (пик №°4); спинацетин-3-глюкозил-(1-6)-гликозид (пик №°5); спинацстин-3-ферулоилглюкозил-(1-6)-гликозид (пик №°6); спинатозид (пик №°8); жасеидин-4'-глюкуронид (пик №°9); 5,3',4'-тригидрокси-3-метокси-6:7-метилендиоксифлавон-4'-глюкуронид (пик №°10) и 5,4'-дигидрокси-3,3'-диметокси-6:7-метилендиоксифлавон-4'-глюкуронид (пик №°11).
II.2. Очищенный экстракт №2
Очищенный экстракт №2 был подвергнут стадии очистки экстракции жидкости жидкостью - этилацетатом.
Собранный этилацетат содержит интересующую нас полифенольную фракцию, которая в этом случае представляет собой очищенный экстракт, который можно также хранить в жидкой или в сухой форме.