СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАНО-МИКРО-ПРИМЕСЕЙ
METHOD OF DETERMINATION OF NANO TRACE CONTAMINANTS

Настоящее изобретение относится к измерительной технике, в частности к аппаратуре и способам определения наличия и количества примесей, например патогенных вирусов и бактерий в диапазоне микро- и пикограмм примесей на мг раствора, причем основным чувствительным элементом являются жидкие кристаллы (ЖК) в виде пленок или капель, диспергированных в воде.
Известен способ определения примесей, в котором используется пленка ЖК, ориентированного монослоем ориентирующего материала, например карбоксильных кислот, нанесенных на термопластическую пленку, покрытую тонким слоем металла, например золота или никеля [1]. Пленка ЖК контактирует с изотропной жидкостью и в исходном состоянии в скрещенных поляроидах выглядит однородно черной. Если в изотропной жидкости, например в воде, находятся микрочастицы, такие как вирусы, бактерии или иные мелкие органические водорастворимые образования, то те из них, которые находятся на границе раздела изотропная жидкость - жидкий кристалл приводят к локальным изменениям в ориентации ЖК, которые выглядят как яркие точки на черном поле. Наличие таких точек свидетельствует о наличии примесей, а их количество зависит от концентрации примесей.
Количественную информацию можно получить из сравнения интенсивностей света, проходящего сквозь слой ЖК до введения эмульсии с примесями и после введения эмульсии.
Недостатками известного способа являются сложность использования способа в связи с необходимостью создавать тонкую однородную хорошо ориентированную пленку ЖК с одной открытой поверхностью и необходимостью поддержания ее в процессе введения эмульсии с примесями. Точность измерений достаточна для определения количества примесей в диапазоне концентраций от 1 мкг/мл и более, тогда как требуется определять меньшие концентрации.
Известен способ определения примесей, в котором используется эмульсия ЖК, состоящая из воды и капель ЖК размером в диапазоне от 1 до 10 мкм [2] - прототип.
Капли ЖК в чистой воде (без искомых примесей) имеют внутри тангенциальную ориентацию молекул относительно границы раздела вода-ЖК вдоль некоторой оси с образованием двух точечных дефектов (буджумов) на полюсах капель (биполярная конфигурация). При прохождении света через данную конфигурацию с направлением оси под углом 45 градусов относительно скрещенных поляроидов наблюдается светлое поле с двумя точечными дефектами на полюсах капель.
Когда в эту эмульсию вводится некоторое количество примесей, например бактерий, то в некоторых каплях меняется направление ориентации молекул от преимущественно тангенциального на перпендикулярное. В случае перпендикулярной ориентации молекулы ЖК ориентированы на границе раздела вода-ЖК по радиусу с образованием одного точечного дефекта в центре капли (радиальная конфигурация). В скрещенных поляроидах радиальная конфигурация выглядит как черный крест, с радужными интерференционными полосами. Интенсивность рассеянного света под заданным углом для эмульсии радиальных капель отличается от соответствующей интенсивности для эмульсии биполярных капель. Измеряя разность интенсивностей в двух случаях, можно судить о наличии примесей и об их количестве. Известный способ обладает достаточно высокой чувствительностью, зависящей от вида примеси (например, для эндотоксинов или липида А пороговая чувствительность составляет 0,1 пг/мл, а для лецитинов 10 мкг/мл - 100 мкг/мл) и достаточно прост в использовании. Однако в любом случае для практического использования в биомедицинских приложениях актуальной задачей является повышение чувствительности. Эта задача решена в предлагаемом способе определения примесей.
Предлагаемый способ состоит в том, что используется эмульсия капель ЖК, диспергированных в воде, ЖК выбран из соединений, имеющих транс- и цис-изомеры, обладающие способностью перехода из одной формы в другую под действием актиничного излучения. Капли ЖК с изомерами имеют преимущественно планарную ориентацию. Когда в эмульсию добавляют раствор, содержащий примеси, например бактерии, некоторое количество ЖК капель, также как и в прототипе приобретает радиальную конфигурацию. Интенсивность света, рассеянного под данным углом, несколько изменяется, и по этому изменению определяют наличие и концентрацию примесей. При освещении эмульсии актиничным светом некоторая часть молекул ЖК дополнительно переходит из транс-формы в цис-форму, что облегчает вызванный наличием примесей дальнейший переход капель в радиальную конфигурацию. Как следствие, возрастает количество капель с радиальной конфигурацией, что приводит к соответствующему изменению интенсивности рассеянного света и снижению минимально регистрируемого значения концентрации примесей, определяемого данным методом.
Сущность предлагаемого способа определения наличия и концентрации примесей органических соединений, например бактерий, вирусов, липидов, протеинов и т.д. в растворах в сверхмалых количествах: нано- и пикограмм на мл раствора поясняется на конкретном примере реализации. В качестве образцов использовался нематический жидкий кристалл, представляющий собой смесь, содержащую следующие компоненты: а) п-н-бутил-п-гексилоксиазоксибензол, б) п-н-бутил-п-метоксиазоксибензол (БМОАБ,) в) н-бутил-п-(н-гексилоксифеноксикарбонил)-фенилкарбонат, г) н-бутил-п-(н-этоксифеноксикарбонил)-фенилкарбонат. Для приготовления эмульсии использовалась 1 часть ЖК и 600 частей деионизированной воды. Приготовление эмульсии осуществлялось при помощи ультразвуковой мешалки в течение 1-2 мин. Приготовленная эмульсия в течение суток отстаивалась в темном помещении в узком высоком пузырьке для получения максимального количества транс-изомеров молекул ЖК. В качестве наноразмерной биопримеси использовался лецитин L-α-Phosphatidylcholine (с чистотой >99%, SIGMA Aldrich). С помощью последовательных разбавлений L-α-Phosphatidylcholine в деионизированной воде были получены концентрации в диапазоне от 100 мкг/мл до 0,1 нг/мл. Затем при помощи шприца из пузырька отбиралось некоторое количество эмульсии из верхних или средних слоев. В результате была отобрана эмульсия с размерами капель от 1 до 5 мкм, в которых наиболее сильно проявляется эффект перехода капель ЖК от биполярной конфигурации к радиальной, вызванный наличием примесей. После чего в водный раствор биопримеси с соответствующей концентрацией добавлялась эмульсия с каплями ЖК.
Процесс определения наличия примесей и их концентрации заключается в следующем. Эмульсию помещают в кювету или измерительную ячейку нефелометра и измеряют исходное рассеяние, соответствующее образцу, не имеющему примесей. Затем помещают эмульсии, имеющие заранее известную концентрацию примесей, и вновь определяют несколько значений интенсивности рассеяния, т.е. производится калибровка. После чего строится зависимость изменения интенсивности рассеянного света от концентрации примеси, экстраполяция которой в область минимально возможных изменений интенсивности, регистрируемых измерительным устройством, позволяет определить пороговую концентрацию примесей, определяемую данным методом. Для приготовленной эмульсии этот порог составлял 1 мкг/мл. Затем производится засветка эмульсии с найденным порогом чувствительности актиничным светом (излучение лазера с длиной волны 405 нм) и вновь производится измерение интенсивности рассеяния. После засветки интенсивность рассеяния возрастает вследствие перехода капель ЖК от исходной биполярной к радиальной конфигурации. После повторения описанной процедуры с эмульсиями меньших концентраций находят новый порог чувствительности засвеченной эмульсии и строится калибровочная кривая. Теперь порог чувствительности составил 1 нг/мл, т.е. улучшился в 1000 раз. Этот результат подтверждает достижение цели, поставленной настоящим изобретением.
Близкие результаты были получены для эмульсий с каплями жидкого кристалла, диспергированных в гидрогеле; диспергированных в физиологическом, буферном растворах; а также диспергированных в смеси глицерина и воды.
Схожий порог чувствительности достигался в случае использования жидких кристаллов на основе азо (азокси) соединений, а также смеси азо (азокси) соединений с фотостабильными жидкими кристаллами, не обладающими транс-цис-изомеризацией.
В дальнейшем описанная процедура используется для определения концентраций примесей в исследуемых образцах.
Настоящее изобретение может использоваться для определения концентраций многих органических примесей, имеющих нано (микро) размеры, таких как: бактерии, вирусы, липиды, протеины, и, возможно, ряда низкомолекулярных включений, таких как ионы водорода, натрия, калия и т.д.
Источники информации
[1] US Patent 6,288,392, prior. Sept. 11, 2001, Int. Cl G02F 1/13, C23C 14/04 (20060101); C23C 14/22 (20060101); H01J 037/00.
[2] US Appl. 20110007261 A1, prior Jan. 13.2011, Int. C1. G02F 1/13(200611) - прототип.