ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ НУКЛЕОЗИДЫ
OLIGONUCLEOTIDES CONTAINING MODIFIED NUCLEOSIDES

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001]
Данная заявка испрашивает преимущество по приоритету предварительной заявки на патент США № 62/357,623, поданной 1 июля 2016 г., и предварительной заявки на патент США № 62/437,592, поданной 21 декабря 2016 г., каждая из которых включена посредством ссылки в данный документ во всей своей полноте для любой цели.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0002]
Данная заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и тем самым включен посредством ссылки во всей своей полноте. Указанная копия в формате ASCII, созданная 15 июня 2017 г., называется 01137-0020-00PCT_SL.txt и имеет размер 21863 байта.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0003]
Настоящее изобретение в общем относится к области олигонуклеотидов, содержащих модифицированные нуклеозиды, таких как аптамеры, которые способны к связыванию с молекулами-мишенями. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к олигонуклеотидам, таким как аптамеры, которые содержат более чем один тип модифицированного по основанию нуклеозида, а также к способам получения и применения таких аптамеров.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0004]
Модифицированные нуклеозиды применяли в качестве терапевтических средств, диагностических средств и для внедрения в олигонуклеотиды для улучшения их свойств (например, стабильности).
[0005]
SELEX (систематическая эволюция лигандов при экспоненциальном обогащении) представляет собой способ идентификации олигонуклеотидов (называемых «аптамерами»), которые селективно связывают молекулы-мишени. Способ SELEX описан, например, в патенте США № 5270163. Способ SELEX включает отбор и идентификацию олигонуклеотидов из случайной смешанной выборки олигонуклеотидов для достижения практически любого желаемого критерия аффинности связывания и селективности. Посредством введения модифицированных нуклеозидов конкретных типов в олигонуклеотиды, идентифицированные в ходе осуществления способа SELEX, могут быть изменены стабильность в присутствии нуклеаз, суммарный заряд, гидрофильность или липофильность для обеспечения отличий в трехмерной структуре и показателей способности связывания с мишенью олигонуклеотидов.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0006]
В некоторых вариантах осуществления представлен аптамер, содержащий по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин являются различными. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении уридин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента и фрагмента морфолинo. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении цитидин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента и фрагмента морфолинo. В некоторых вариантах осуществления фрагмент ковалентно связан с 5-положением основания посредством линкера, предусматривающего группу, выбранную из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении цитидин выбран из NapdC, 2NapdC, TyrdC и PPdC. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении уридин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой NapdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU и ThrdU. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой PPdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой TyrdU. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин способны к встраиванию посредством фермента полимеразы. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин способны к встраиванию посредством ДНК-полимеразы из KOD.
[0007]
В некоторых вариантах осуществления аптамер связывает белок-мишень, выбранный из PCSK9, PSMA, ErbBl, ErbB2, FXN, KDM2A, IGF1R, pIGF1R, a1-антитрипсина, CD99, MMP28 и PPIB.
[0008]
В некоторых вариантах осуществления аптамер содержит участок на 5'-конце аптамера, который составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или по меньшей мере 30 нуклеотидов в длину,
или от 5 до 30, от 10 до 30, от 15 до 30, от 5 до 20 или от 10 до 20 нуклеотидов в длину, где участок на 5'-конце аптамера не содержит модифицированных в 5-положении пиримидинов. В некоторых вариантах осуществления аптамер содержит участок на 3'-конце аптамера, который составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или по меньшей мере 30 нуклеотидов в длину, или от 5 до 30, от 10 до 30, от 15 до 30, от 5 до 20 или от 10 до 20 нуклеотидов в длину, где участок на 3'-конце аптамера не содержит модифицированных в 5-положении пиримидинов. В некоторых вариантах осуществления аптамер составляет от 20 до 100, или от 20 до 90, или от 20 до 80, или от 20 до 70, или от 20 до 60, или от 20 до 50, или от 30 до 100, или от 30 до 90, или от 30 до 80, или от 30 до 70, или от 30 до 60, или от 30 до 50, или от 40 до 100, или от 40 до 90, или от 40 до 80, или от 40 до 70, или от 40 до 60, или от 40 до 50 нуклеотидов в длину.
[0009]
В некоторых вариантах осуществления аптамер характеризуется улучшенной стабильностью в присутствии нуклеаз по сравнению с аптамером такой же длины и с нуклеотидной последовательностью, которая содержит немодифицированный пиримидин вместо каждого из первых модифицированных в 5-положении пиримидинов и/или немодифицированный пиримидин вместо каждого из второго модифицированного в 5-положении пиримидина. В некоторых вариантах осуществления аптамер характеризуется более длительным периодом полувыведения из сыворотки человека по сравнению с аптамером такой же длины и с нуклеотидной последовательностью, которая содержит немодифицированный пиримидин вместо каждого из первых модифицированных в 5-положении пиримидинов или немодифицированный пиримидин вместо каждого из второго модифицированного в 5-положении пиримидина.
[0010]
В некоторых вариантах осуществления представлена композиция, содержащая множество полинуклеотидов, где каждый полинуклеотид содержит по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин являются различными. В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид содержит фиксированный участок на 5'-конце полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления фиксированный участок на 5'-конце каждого полинуклеотида составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или по меньшей мере 30 нуклеотидов в длину, или от 5 до 30, от 10 до 30, от 15 до 30, от 5 до 20 или от 10 до 20 нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид содержит фиксированный участок на 3'-конце полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления фиксированный участок на 3'-конце полинуклеотида составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или по меньшей мере 30 нуклеотидов в длину, или от 5 до 30, от 10 до 30, от 15 до 30, от 5 до 20 или от 10 до 20 нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении уридин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, триптофанильного фрагмента, индольного фрагмента и фрагмента морфолинo. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении цитидин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента и фрагмента морфолинo. В некоторых вариантах осуществления фрагмент ковалентно связан с 5-положением основания посредством линкера, предусматривающего группу, выбранную из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении цитидин выбран из NapdC, 2NapdC, TyrdC и PPdC. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении уридин выбран из NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой NapdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой PPdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TrydU, TrpdU и ThrdU. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой TyrdU. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин способны к встраиванию посредством фермента полимеразы. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин способны к встраиванию посредством ДНК-полимеразы из KOD.
[0011]
В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид композиции содержит произвольный участок. В некоторых вариантах осуществления произвольный участок составляет от 20 до 100, или от 20 до 90, или от 20 до 80, или от 20 до 70, или от 20 до 60, или от 20 до 50, или от 20 до 40, или от 30 до 100, или от 30 до 90, или от 30 до 70, или от 30 до 60, или от 30 до 50, или от 30 до 40 нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид составляет от 20 до 100, или от 20 до 90, или от 20 до 80, или от 20 до 70, или от 20 до 60, или от 20 до 50, или от 30 до 100, или от 30 до 90, или от 30 до 80, или от 30 до 70, или от 30 до 60, или от 30 до 50, или от 40 до 100, или от 40 до 90, или от 40 до 80, или от 40 до 70, или от 40 до 60, или от 40 до 50 нуклеотидов в длину.
[0012]
В некоторых вариантах осуществления представлена композиция, содержащая первый аптамер, второй аптамер и мишень, где первый аптамер содержит по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин; при этом второй аптамер содержит по меньшей мере один третий модифицированный в 5-положении пиримидин или где второй аптамер содержит по меньшей мере один третий модифицированный в 5-положении пиримидин и по меньшей мере один четвертый модифицированный в 5-положении пиримидин; где первый аптамер, второй аптамер и мишень способны к образованию тримерного комплекса; и где первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин являются различными модифицированными в 5-положении пиримидинами.
[0013]
В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении уридин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента и фрагмента морфолинo. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении цитидин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента и фрагмента морфолинo. В некоторых вариантах осуществления фрагмент ковалентно связан с 5-положением основания посредством линкера, предусматривающего группу, выбранную из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении цитидин выбран из NapdC, 2NapdC, TyrdC и PPdC. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении уридин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой NapdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой PPdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой TyrdU. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин способны к встраиванию посредством фермента полимеразы. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин способны к встраиванию посредством ДНК-полимеразы из KOD.
[0014]
В некоторых вариантах осуществления третий модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из модифицированного в 5-положении цитидина и модифицированного в 5-положении пиримидина. В некоторых вариантах осуществления третий модифицированный в 5-положении пиримидин и четвертый модифицированный в 5-положении пиримидин являются различными модифицированными в 5-положении пиримидинами. В некоторых вариантах осуществления третий модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин, и четвертый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин. В некоторых вариантах осуществления третий модифицированный в 5-положении цитидин выбран из BndC, PEdC, PPdC, NapdC, 2NapdC, NEdC, 2NEdC и TyrdC. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении уридин выбран из BNdU, NapdU, PEdU, IbdU, FBndU, 2NapdU, NEdU, MBndU, BFdU, BTdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU.
[0015]
В некоторых вариантах осуществления мишень выбрана из белка, пептида, углевода, малой молекулы, клетки и ткани.
[0016]
В некоторых вариантах осуществления представлен способ, включающий:
(a) приведение в контакт аптамера, способного к связыванию с молекулой-мишенью в образце;
(b) инкубирование аптамера с образцом с обеспечением образования комплекса аптамер-мишень;
(c) обогащение в отношении комплекса аптамер-мишень в образце и
(c) выявление наличия аптамера, комплекса аптамер-мишень или молекулы-мишени, где обнаружение аптамера, комплекса аптамер-мишень или молекулы-мишени указывает на то, что молекула-мишень присутствует в образце, и при этом отсутствие обнаружения аптамера, комплекса аптамер-мишень или молекулы-мишени указывает на то, что молекула-мишень отсутствует в образце;
где аптамер представляет собой аптамер с двойной модификацией, представленный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления способ включает по меньшей мере одну дополнительную стадию, выбранную из: добавления молекулы конкурента к образцу; захвата комплекса аптамер-мишень на твердую подложку и добавления молекулы конкурента и разбавления образца; где по меньшей мере одну дополнительную стадию проводят после стадии (a) или стадии (b). В некоторых вариантах осуществления молекула конкурента выбрана из полианионного конкурента. В некоторых вариантах осуществления полианионный конкурент выбран из олигонуклеотида, полидекстрана, ДНК, гепарина и дНТФ. В некоторых вариантах осуществления полидекстран представляет собой сульфат декстрана; и ДНК представляет собой ДНК молок сельди или ДНК молок лосося. В некоторых вариантах осуществления молекула-мишень выбрана из белка, пептида, углевода, малой молекулы, клетки и ткани. В некоторых вариантах осуществления образец выбран из цельной крови, лейкоцитов, мононуклеарных клеток периферической крови, плазмы, сыворотки, мокроты, выдыхаемого воздуха, мочи, семенной жидкости, слюны, менингеальной жидкости, околоплодной жидкости, жидкости из желез, лимфатической жидкости, аспирата из сосков, бронхиального аспирата, синовиальной жидкости, суставного аспирата, клеток, клеточной вытяжки, кала, ткани, тканевого биопсийного материала и спинномозговой жидкости.
[0017]
В некоторых вариантах осуществления представлен способ выявления мишени в образце, включающий
a) приведение в контакт образца с первым аптамером с образованием смеси, где первый аптамер способен к связыванию с мишенью с образованием первого комплекса;
b) инкубирование смеси в условиях, которые обеспечивают образование первого комплекса;
c) приведение в контакт смеси со вторым аптамером, где второй аптамер способен к связыванию с первым комплексом с образованием второго комплекса;
d) инкубирование смеси в условиях, которые обеспечивают образование второго комплекса;
e) выявление наличия или отсутствия первого аптамера, второго аптамера, мишени, первого комплекса или второго комплекса в смеси, где присутствие первого аптамера, второго аптамера, мишени, первого комплекса или второго комплекса указывает на то, что мишень присутствует в образце;
где первый аптамер содержит по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин;
где второй аптамер содержит по меньшей мере один третий модифицированный в 5-положении пиримидин или где второй аптамер содержит по меньшей мере один третий модифицированный в 5-положении пиримидин и по меньшей мере один четвертый модифицированный в 5-положении пиримидин;
где первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин являются различными модифицированными в 5-положении пиримидинами.
[0018]
В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении уридин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента и фрагмента морфолинo. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении цитидин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента и фрагмента морфолинo. В некоторых вариантах осуществления фрагмент ковалентно связан с 5-положением основания посредством линкера, предусматривающего группу, выбранную из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении цитидин выбран из NapdC, 2NapdC, TyrdC и PPdC. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении уридин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой NapdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU и ThrdU. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой PPdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой TyrdU. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин способны к встраиванию посредством фермента полимеразы. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин способны к встраиванию посредством ДНК-полимеразы из KOD.
[0019]
В некоторых вариантах осуществления третий модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из модифицированного в 5-положении цитидина и модифицированного в 5-положении пиримидина. В некоторых вариантах осуществления третий модифицированный в 5-положении пиримидин и четвертый модифицированный в 5-положении пиримидин являются различными модифицированными в 5-положении пиримидинами. В некоторых вариантах осуществления третий модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин, и четвертый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин. В некоторых вариантах осуществления третий модифицированный в 5-положении цитидин выбран из BndC, PEdC, PPdC, NapdC, 2NapdC, NEdC, 2NEdC и TyrdC. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении уридин выбран из BNdU, NapdU, PedU, IbdU, FbndU, 2NapdU, NedU, MbndU, BfdU, BtdU, PpdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU.
[0020]
В некоторых вариантах осуществления молекула-мишень выбрана из белка, пептида, углевода, малой молекулы, клетки и ткани. В некоторых вариантах осуществления первый аптамер, второй аптамер и мишень способны к образованию тримерного комплекса.
[0021]
В некоторых вариантах осуществления представлен способ идентификации одного или нескольких аптамеров, способных к связыванию с молекулой-мишенью, включающий:
(a) приведение в контакт библиотеки аптамеров с молекулой-мишенью с образованием смеси и обеспечение образования комплекса аптамер-мишень, где комплекс аптамер-мишень образуется, когда аптамер обладает аффинностью по отношению к молекуле-мишени;
(b) отделение комплекса аптамер-мишень от остальной части смеси (или обогащение в отношении комплекса аптамер-мишень);
(c) диссоциацию комплекса аптамер-мишень и
(d) идентификацию одного или нескольких аптамеров, способных к связыванию с молекулой-мишенью;
где библиотека аптамеров содержит множество полинуклеотидов, где каждый полинуклеотид содержит по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин являются различными модифицированными в 5-положении пиримидинами. В некоторых вариантах осуществления стадии (a), (b) и/или (c) повторяют по меньшей мере один раз, два раза, три раза, четыре раза, пять раз, шесть раз, семь раз, восемь раз, девять или десять раз.
[0022]
В некоторых вариантах осуществления один или несколько аптамеров, способных к связыванию с молекулой-мишенью, являются амплифицированными. В некоторых вариантах осуществления смесь содержит молекулу полианионного конкурента. В некоторых вариантах осуществления полианионный конкурент выбран из олигонуклеотида, полидекстрана, ДНК, гепарина и дНТФ. В некоторых вариантах осуществления полидекстран представляет собой сульфат декстрана; и ДНК представляет собой ДНК молок сельди или ДНК молок лосося.
[0023]
В некоторых вариантах осуществления молекула-мишень выбрана из белка, пептида, углевода, малой молекулы, клетки и ткани.
[0024]
В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид содержит фиксированный участок на 5'-конце полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления фиксированный участок на 5'-конце каждого полинуклеотида составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или по меньшей мере 30 нуклеотидов в длину, или от 5 до 30, от 10 до 30, от 15 до 30, от 5 до 20 или от 10 до 20 нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид содержит фиксированный участок на 3'-конце полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления фиксированный участок на 3'-конце полинуклеотида составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или по меньшей мере 30 нуклеотидов в длину, или от 5 до 30, от 10 до 30, от 15 до 30, от 5 до 20 или от 10 до 20 нуклеотидов в длину.
[0025]
В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении уридин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента и фрагмента морфолинo. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении цитидин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента и фрагмента морфолинo. В некоторых вариантах осуществления фрагмент ковалентно связан с 5-положением основания посредством линкера, предусматривающего группу, выбранную из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении цитидин выбран из NapdC, 2NapdC, TyrdC и PPdC. В некоторых вариантах осуществления модифицированный в 5-положении уридин выбран из NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой NapdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TrydU, TrpdU и ThrdU. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой PPdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой TyrdU. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин способны к встраиванию посредством фермента полимеразы. В некоторых вариантах осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин способны к встраиванию посредством ДНК-полимеразы из KOD.
[0026]
В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид содержит произвольный участок. В некоторых вариантах осуществления произвольный участок составляет от 20 до 100, или от 20 до 90, или от 20 до 80, или от 20 до 70, или от 20 до 60, или от 20 до 50, или от 20 до 40, или от 30 до 100, или от 30 до 90, или от 30 до 70, или от 30 до 60, или от 30 до 50, или от 30 до 40 нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид составляет от 20 до 100, или от 20 до 90, или от 20 до 80, или от 20 до 70, или от 20 до 60, или от 20 до 50, или от 30 до 100, или от 30 до 90, или от 30 до 80, или от 30 до 70, или от 30 до 60, или от 30 до 50, или от 40 до 100, или от 40 до 90, или от 40 до 80, или от 40 до 70, или от 40 до 60, или от 40 до 50 нуклеотидов в длину.
[0027]
В некоторых вариантах осуществления каждый полинуклеотид представляет собой аптамер, который связывает мишень, и при этом библиотека содержит по меньшей мере 1000 аптамеров, где каждый аптамер содержит различные нуклеотидные последовательности.
[0028]
n
n
В некоторых вариантах осуществления представлен аптамер, который связывает белок PCSK9. В некоторых таких вариантах осуществления аптамер содержит последовательность 5'-yGpppG-3', где каждый у представляет собой TyrdU, и каждый p представляет собой NapdC. В некоторых вариантах осуществления аптамер дополнительно содержит последовательность 5'-yEAyGApAp-3', где E выбран из y, A и G; и n равняется 0 или 1. В некоторых вариантах осуществления n равняется 0. В некоторых вариантах осуществления последовательность 5'-yEAyGApAp-3' расположена на 5'-конце последовательности 5'-yGpppG-3'. В некоторых вариантах осуществления E представляет собой y.
[0029]
n
В некоторых вариантах осуществления представлен аптамер, который связывает PCSK9, где аптамер содержит последовательность 5'-FpppAAGRJrpRppWm-3' (SEQ ID NO: 81), где F выбран из r и G; каждый R независимо выбран из G и A; J выбран из r и A; W выбран из r, G и A; n равняется 0 или 1; m равняется 0 или 1; r представляет собой PpdC; и p представляет собой NapdU. В некоторых вариантах осуществления m равняется 1. В некоторых вариантах осуществления F представляет собой r. В некоторых вариантах осуществления J представляет собой r. В некоторых вариантах осуществления W представляет собой G.
[0030]
В некоторых вариантах осуществления представлен аптамер, который связывает PCSK9, где аптамер содержит последовательность 5'-TTppGGpp-3', где каждый p представляет собой NapdC.
[0031]
В некоторых вариантах осуществления аптамер, который связывает PCSK9, составляет от 20 до 100, или от 20 до 90, или от 20 до 80, или от 20 до 70, или от 20 до 60, или от 20 до 50, или от 30 до 100, или от 30 до 90, или от 30 до 80, или от 30 до 70, или от 30 до 60, или от 30 до 50, или от 40 до 100, или от 40 до 90, или от 40 до 80, или от 40 до 70, или от 40 до 60, или от 40 до 50 нуклеотидов в длину.
[0032]
50
В некоторых вариантах осуществления аптамер ингибирует связывание PCSK9 с LDL-R. В некоторых вариантах осуществления аптамер ингибирует связывание PCSK9 с LDL-R при IC менее 30 нМ, менее 20 нМ или менее 15 нМ.
[0033]
В некоторых вариантах осуществления представлен способ снижения уровня холестерина у субъекта, включающий введение субъекту, нуждающемуся в нем, аптамера, который связывает PCSK9. В некоторых вариантах осуществления аптамер, который связывает PCSK9, представляет собой аптамер, представленный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления холестерин представляет собой холестерин (LDL-C) липопротеинов низкой плотности (LDL). В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется гетерозиготная семейная гиперхолестеринемия или клиническое атеросклеротическое сердечно-сосудистое заболевание (CVD).
[0034]
Вышеуказанные и другие цели, признаки и преимущества настоящего изобретения станут более очевидными из следующего подробного описания, которое следует далее со ссылкой на прилагаемые графические материалы.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0035] Фиг. 1.
Отбор аптамеров нуклеиновых кислот, модифицированных с помощью библиотек ДНК, содержащих модифицированный в C5-положении уридин и цитидинтрифосфаты. Схематические изображения отбора с применением двух модифицированных оснований. Схема способа отбора, при которой применяли библиотеку на основе 30N рандомизированных химически синтезированных эталонных антисмысловых биотинилированных шаблонов для ферментативного синтеза различных модифицированных и немодифицированный библиотек посредством реакций удлинения праймера.
[0036] Фиг. 2.
Значения аффинности связывания 40-мерных (30N+5+5) аптамеров с PCSK9, полученных с применением различных модифицированных библиотек. Аптамеры со значениями аффинности ≥ 1 нМ выделены оттенком серого цвета, и при этом аптамеры, показанные при аффинности 320 нМ, представляют отсутствие выявляемого связывания при верхнем значении концентрации 32 нМ на кривой связывания. Черная линия на каждой из библиотек указывает на медианное значение для всех аптамеров в такой библиотеке.
[0037] Фиг. 3.
Аффинность и число копий в процентах для одной модификации, либо dU, либо dC, по сравнению с двумя модификациями, dC с dU. Каждая точка представляет один из аптамеров при значениях аффинности, показанных по оси Y, и число их копий в процентах по оси X. Красные точки представляют аптамеры с одной модификацией, а зеленые точки (незаштрихованные и заштрихованные) представляют аптамеры с двумя модификациями. Заштрихованные зеленые точки представляют некоторые аптамеры Nap-dC/Tyr-dU и PP-dC/Tyr-dU.
[0038] фиг. 4A-B.
(A)
(B)
Возможность укорачивания аптамеров с модификацией по одному основанию и аптамеров с модификацией по двум основаниям. Все 40-мерные последовательности с высокой аффинностью дополнительно укорачивали до 30-мерных, до длины их произвольного участка с удалением лишь 5 нуклеотидов с каждого из 5'- и 3'-концов. Доля в процентах аптамеров, которые сохраняют аффинность связывания или имеют улучшенную аффинность связывания с PCSK9, нанесены на ось Y. Сравнения аффинности и возможности укорачивания аптамеров с модификацией по одному основанию и аптамеров с модификацией по двум основаниям из каждой отдельной библиотеки. Аптамеры со значениями аффинности ≥ 1 нМ выделены оттенком серого цвета, при этом наивысшие средние значения аффинности были для аптамеров с комбинациями двух модифицированных оснований PP-dC с PP-dU, Nap-dU и Tyr-dU.
[0039] Фиг. 5.
Специфичность связывания мишени для трех аптамеров с высокой аффинностью из каждой библиотеки с другими пропротеинконвертазами (PC). Измерения аффинности в растворе проводили всего для тридцати трех аптамеров (40-мерных), причем одиннадцать аптамеров с одним модифицированным основанием (т. е. три аптамера с Nap-dC/dT; три аптамера с dC/Nap-dU; три аптамера с dC/Pp-dU и два аптамера с dC/Ty-dU) и двадцать два аптамера с двумя модифицированными основаниями (т. е. три аптамера с Nap-dC/Nap-dU; три аптамера с Nap-dC/Pp-dU; три аптамера с Nap-dC/Moe-dU; три аптамера с Nap- dC/Tyr-dU; три аптамера с Pp-dC/Pp-dU; три аптамера с Pp-dC/Nap-dU; три аптамера с Pp-Ty-dU и один аптамер с Pp-dC/Moe-dU). Аптамеры, которые находятся ниже пунктирной линии при аффинности 100 нМ, указывают на отсутствие выявляемого связывания при концентрации 100 нМ. Значения аффинности для остальных PC (PCSK5, PCSK6 и PCSK8) не проверяли.
[0040] Фиг. 6.
d
Межвидовая перекрестная реактивность аптамеров с модификацией по одному основанию и с модификацией по двум основаниям. Аффинность укороченных 30-мерных аптамеров с одной модификацией (три аптамера) и с двумя модификациями (38 аптамеров) (величина K ≤ 1 нМ) к PCSK9 человека, обезьяны, мыши и крысы. Аптамеры с одной модификацией связываются с PSCKS9 человека и обезьяны, но не связываются с PSKC9 мыши или крысы. Напротив, аптамеры с двумя модификациями связываются с белками человека, обезьяны, мыши и крысы. Процент идентичности белка PCSK9 от каждого вида представлен относительно PSCK9 человека.
[0041] Фиг. 7A-C
(B)
. Скрининг сэндвич-пар в анализе с применением частиц Luminex. (A) Схематические изображения скрининга сэндвич-пар аптамеров. Сэндвич-пары, демонстрирующие сигнал, который равняется 50-кратному или больше него при концентрации PCSK9 10 нМ, сравнивали с буфером без белка. Все аптамеры, тестируемые в сэндвич-анализе, были 40-мерными с Kd ≤ 1 нМ. Всего 70 пар продемонстрировали значения сигнала ≥ 50-кратного. Идентифицировали три сэндвич-пары, когда каждый аптамер из пары выбирали из библиотек с одной модификацией (3 сэндвич пары аптамеров/3 библиотеки с модификацией по одному основанию). Напротив, идентифицировали 22 сэндвич-пары, когда один аптамер из пары выбирали из трех библиотек с модификацией по одному основанию, а другой аптамер из пары выбирали из четырех библиотек с модификацией по двум основаниям (т. е. 22 сэндвич-пары аптамеров/3 библиотеки с модификацией по одному основанию, и 4 библиотеки с модификацией по двум основаниям), и 45 сэндвич-пар идентифицировали, когда оба аптамера из пары выбирали из библиотек с двумя модификациями (45 сэндвич-пар аптамеров/5 библиотек с модификацией по двум основаниям). (C) Сравнение числа сэндвич-пар для белка-мишени PCSK9, полученного из библиотеки аптамеров для захвата с аптамером с модификацией по одному основанию и библиотеки аптамеров для обнаружения с аптамером с модификацией по одному основанию; библиотеки аптамеров для захвата с аптамером с модификацией по одному основанию и библиотеки аптамеров для обнаружения с аптамером с модификацией по двум основаниям; и библиотеки аптамеров для захвата с аптамером с модификацией по двум основаниям и библиотеки аптамеров для обнаружения с аптамером с модификацией по двум основаниям.
[0042] Фиг. 8A-D.
(A)
(B)
(C)
(D)
Сэндвич-пары, демонстрирующие зависимые от концентрации PCSK9 сигналы в анализах с применением частиц Luminex. Зависимые от концентрации сигналы наблюдали при наилучшей эффективности аптамера для захвата или первичного аптамера в паре с выбранными вторичным аптамером или аптамером для обнаружения. Зависимые от концентрации сигналы наблюдали при наилучшей эффективности вторичного аптамера или аптамера для обнаружения с выбранными первичным аптамером или аптамером для захвата. Ведущая сэндвич-пара, аптамер (первичный) с dC/PP-dU и аптамер (вторичный) с Nap-dC/Nap-dU, демонстрирующая сигналы при изменении ориентация аптамеров. Стандартная кривая, полученная с применением рекомбинантного PCSK9 дикого типа и мутантного PCSK9 D374Y с новыми патологическими функциями. Линейные зависимые от концентрации сигналы получали с сэндвич-парой для выявления PCSK9 дикого типа (кольца) и мутантного белка PCSK9 D374Y с новыми патологическими функциями (треугольники).
[0043] Фиг. 9A-B.
(A)
(B)
Чувствительность сэндвич-анализа: показатели сэндвич-анализа с применением аптамеров (аптамер (первичный) с dC/PP-dU и аптамер (вторичный) с Nap-dC/Nap-dU), демонстрирующие пределы обнаружения концентраций PCSK9 в буфере. Линейные зависимые от концентрации сигналы наблюдали с применением сэндвич-анализа с применением аптамеров с нижним пределом количественного определения ~80 пг/мл (LLOQ) Линейные зависимые от концентрации сигналы наблюдали с помощью сэндвич-анализа с применением аптамеров при верхнем пределе количественного определения ~10 нг/мл (ULOQ).
[0044] Фиг. 10.
Линейность разбавления при сэндвич-анализе с применением аптамера (первичного) с dC/PP-dU и аптамера (вторичного) с Nap-dC/Nap-dU.
[0045] Фиг. 11.
Сэндвич-анализ, включающий первичный аптамер с модификацией по одному основанию и вторичный аптамер с модификацией по двум основаниям (аптамер (первичный) с dC/PP-dU и аптамер (вторичный) с Nap-dC/Nap-dU).
[0046] Фиг. 12.
Сверхэкспрессия PCSK9 в клетках HepG2 дикого типа.
[0047] Фиг. 13.
in vitro
Анализы ингибирования PCSK9  с применением планшетов: схематические изображения ингибирования PCSK9 аптамерами.
[0048] Фиг. 14.
Скрининг ингибирования для аптамеров с модификацией по одному основанию или двум основаниям.
[0049] Фиг. 15A-B.
(A)
(B)
50
50
Потенциальные терапевтические аптамеры с межвидовой перекрестной реактивностью с модификацией по двум основаниям. Значения аффинности 30-мерного аптамера грызуна с модификацией по двум основаниям (PP-dC/Nap-dU) с межвидовой перекрестной реактивностью (11733-44, SEQ ID NO: 44) по отношению к PCSK9 человека (заштрихованное синее кольцо), мутантному PCSK9 D374Y человека с новыми патологическими функциями (заштрихованное красное кольцо), PCSK9 макака-резус (заштрихованный зеленый квадрат), PCSK9 крысы (заштрихованный розовый шестиугольник), PCSK9 мыши (заштрихованный перевернутый треугольник) и зашифрованного контрольного аптамера (незаштрихованный черный ромб). Потенциальный терапевтический аптамер с межвидовой перекрестной реактивностью с модификацией по двум основаниям, демонстрирующий ингибирование взаимодействия PCSK9 с LDL-R. Аптамер, потенциально ингибирующий взаимодействие PCSK9 с LDL-R при величине EC 2,1 нМ (синее заштрихованное кольцо) и PCSK9 D374Y при величине EC 3,6 нМ (красный заштрихованный треугольник), и зашифрованный контрольный аптамер, демонстрирующий отсутствие ингибирования PCSK9 дикого типа (зеленые заштрихованные квадраты) и мутантного PCSK9 D374Y с новыми патологическими функциями (незаштрихованные черные квадраты).
[0050] Фиг. 16.
Схематические изображения анализа обратимого поглощения LDL.
[0051] Фиг. 17.
50
Ингибирование аптамера с PP-dC/Nap-DU с межвидовой перекрестной реактивностью разложения LDL-R посредством блокирования взаимодействия PCSK9 с LDL-R и повышение уровней LDL-R на поверхности клеток HepG2. Величина EC для обратимого поглощения LDL составляет 13,5 нМ для активного SOMAmer (красное кольцо), которую наблюдали с зашифрованным контролем с такой же последовательностью (синий треугольник).
[0052] Фиг. 18.
Стабильность аптамеров с одной модификацией и с двумя модификациями в 90% сыворотке человека с течением времени. Распределение модификаций аптамеров с одной модификацией по C-5 или с двумя модификациями по C-5 представлены на легенде фигуры (например, X/Y где X представляет собой dC (немодифицированный нуклеотид), NapdC (Nap) или PPdC (PP); и Y представляет собой dU или dT (немодифицированный нуклеотид, TyrdU (Tyr), NapdU (Nap), PPdU (PP) или MOEdU (MOE)).
[0053] Фиг. 19A-C.
Значения аффинности связывания для 40-мерных (30N+5+5) аптамеров с ErbB2 (A), ЕгЬВЗ (В) и PSMA (C), полученных с применением различных модифицированных библиотек. Аптамеры со значениями аффинности ≥ 1 нМ выделены оттенком серого цвета, и при этом аптамеры, показанные при аффинности 320 нМ, представляют отсутствие выявляемого связывания при верхнем значении концентрации 32 нМ на кривой связывания. Черная линия на каждой из библиотек указывает на медианное значение для всех аптамеров в такой библиотеке.
[0054] Фиг. 20.
Некоторые иллюстративные модифицированные в 5-положении уридины и цитидины, которые могут быть встроены в аптамеры.
[0055] Фиг. 21.
Некоторые иллюстративные модификации, которые могут находиться в 5-положении уридина. Химическая структура модификации по C-5 включает иллюстративный амидный мостик, который соединяет модификацию с 5-положением уридина. Показанные фрагменты в 5-положении включают бензильный фрагмент (например, Bn, PE и PP), нафтильный фрагмент (например, Nap, 2Nap, NE), бутильный фрагмент (например, iBu), фторбензильный фрагмент (например, FBn), тирозильный фрагмент (например, Tyr), 3,4-метилендиоксибензил (например, MBn), фрагмент морфолинo (например, MOE), бензофуранильный фрагмент (например, BF), индольный фрагмент (например, Trp) и гидроксипропильный фрагмент (например, Thr).
[0056] Фиг. 22.
Некоторые иллюстративные модификации, которые могут находиться в 5-положении цитидина. Химическая структура модификации по C-5 включает иллюстративный амидный мостик, который соединяет модификацию с 5-положением цитидина. Показанные фрагменты в 5-положении включают бензильный фрагмент (например, Bn, PE и PP), нафтильный фрагмент (например, Nap, 2Nap, NE и 2NE) и тирозильный фрагмент (например, Tyr).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0057]
Genes V
et al.
The Encyclopedia of Molecular Biology
Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference,
Если не указано иное, технические термины употребляются в соответствии с общепринятым использованием. Определения часто используемых терминов в области молекулярной биологии могут быть найдены в Benjamin Lewin, , опубликованном Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew (eds.), , опубликованной Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); и Robert A. Meyers (ed.),  опубликованном VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081- 569-8).
[0058]
Если не указано иное, все технические и научные термины, приведенные в данном документе, имеют то же значение, обычно понимаемое специалистом в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Термины в единственном числе включают в себя определяемые объекты во множественном числе, если из контекста явно не следует иное. «Содержащий A или B» подразумевает включающий A, или B, или A и B. Дополнительно следует понимать, что все размеры оснований или размеры аминокислот и все значения молекулярного веса или молекулярной массы, приведенные для нуклеиновых кислот или полипептидов, являются приблизительными и предназначены для описания.
[0059]
Кроме того, диапазоны, представленные в данном документе, подразумевают все значения в пределах данного диапазона. Например, понятно, что диапазон от 1 до 50 включает любое число, комбинацию чисел или поддиапазон из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 (а также их долей, если контекст явно не предусматривает иное). Следует понимать, что любой диапазон концентраций, диапазон долей в процентах, диапазон соотношений или диапазон целых чисел включает значение в виде любого целого числа в пределах указанного диапазона и, когда это целесообразно, его доли (например, одну десятую и одну сотую целого числа), если не указано иное. Также, следует понимать, что любой числовой диапазон, приведенный в данном документе, относящийся к любому физическому признаку, такому как полимерные субъединицы, размер или толщина, включает любое целое число в пределах приведенного диапазона, если не указано иное. Применяемые в данном документе выражения «приблизительно» или «по сути состоящий из» означают ± 20% от указанного диапазона, величины или структуры, если не указано иное. Применяемые в данном документе термины «включает» и «содержит» предусматривают открытость списка и применяются синонимически.
[0060]
Хотя способы и материалы аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе могут быть использованы на практике или при испытании настоящего изобретения, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие ссылки, упоминаемые в данном документе, включены посредством ссылки во всей своей полноте. В случае конфликта настоящее описание, включая разъяснения терминов, будет преобладать. Кроме того, материалы, способы и примеры являются лишь иллюстративными и не предназначены для ограничения.
[0061]
Применяемый в данном документе термин «нуклеотид» относится к рибонуклеотиду, или дезоксирибонуклеотиду, или их модифицированной форме, а также их аналогам. Нуклеотиды включают соединения, которые включают пурины (например, аденин, гипоксантин, гуанин, а также их производные и аналоги), а также пиримидины (например, цитозин, урацил, тимин, а также их производные и аналоги). Применяемый в данном документе термин «цитидин» применяют в общем по отношению к рибонуклеотиду, дезоксирибонуклеотиду или модифицированному рибонуклеотиду, содержащим основание цитозин, если конкретно не указано иное. Термин «цитидин» включает 2'-модифицированные цитидины, такие как 2'-фтор, 2'-метокси и т. д. Подобным образом, термин «модифицированный цитидин» или конкретный модифицированный цитидин также относится к рибонуклеотиду, дезоксирибонуклеотиду или модифицированному рибонуклеотиду (такому как 2'-фтор, 2'-метокси и т. д.), содержащим модифицированное основание цитозин, если конкретно не указано иное. Термин «уридин» применяют в общем по отношению к рибонуклеотиду, дезоксирибонуклеотиду или модифицированному рибонуклеотиду, содержащим основание урацил, если конкретно не указано иное. Термин «уридин» включает 2'-модифицированные уридины, такие как 2'-фтор, 2'-метокси и т. д. Подобным образом, термин «модифицированный уридин» или конкретный модифицированный уридин также относится к рибонуклеотиду, дезоксирибонуклеотиду или модифицированному рибонуклеотиду (такому как 2'-фтор, 2'-метокси и т. д.), содержащим модифицированное основание урацил, если конкретно не указано иное.
[0062]
Применяемый в данном документе термин «модифицированный в 5-положении цитидин» или «C-5-модифицированный цитидин» относится к цитидину с модификацией в C-5-положении цитидина, например, как показано на фигуре 20. Не имеющие ограничительного характера иллюстративные модифицированные в 5-положении цитидины включают таковые, показанные на фигуре 22. Не имеющий ограничительного характера иллюстративные модифицированные в 5-положении цитидины включают без ограничения 5-(N-бензилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (называемый «BndC» и показанный на фигуре 21); 5-(N-2-фенилэтилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (называемый «PEdC» и показанный на фигуре 21); 5-(N-3-фенилпропилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (называемый «PPdC» и показанный на фигуре 21); 5-(N-1-нафтилметилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (называемый «NapdC» и показанный на фигуре 21); 5-(N-2-нафтилметилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (называемый «2NapdC» и показанный на фигуре 21); 5-(N-1-нафтил-2-этилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (называемый «NEdC» и показанный на фигуре 21); 5-(N-2-нафтил-2-этилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (называемый «2NEdC» и показанный на фигуре 21); и 5-(N-тирозилкарбоксамид)-2'-дезоксицитидин (называемый TyrdC и показанный на фигуре 21). В некоторых вариантах осуществления C5-модифицированные цитидины, например, в их трифосфатной форме, способны к встраиванию в олигонуклеотид посредством полимеразы (например, ДНК-полимеразы из KOD).
[0063]
Химические модификации C-5-модифицированных цитидинов, описанные в настоящем документе, также могут быть объединены, по отдельности или в любой комбинации, с модификациями в 2'-положении сахара (например, 2'-O-метил или 2'-фтор), модификациями при экзоциклических аминах, и замещениях 4-тиоцитидина, и т. п.
[0064]
Применяемый в данном документе термин «C-5-модифицированный уридин» или «модифицированный в 5-положении уридин» относится к уридину (как, правило дезоксиуридину) с модификацией в C-5-положении уридина, например, как показано на фигуре 20. В некоторых вариантах осуществления C5-модифицированные уридины, например, в их трифосфатной форме, способны к встраиванию в олигонуклеотид посредством полимеразы (например, ДНК-полимеразы из KOD). Не имеющие ограничительного характера иллюстративные модифицированные в 5-положении уридины включают таковые, показанные на фигуре 21. Не имеющий ограничительного характера иллюстративные модифицированные в 5-положении уридины включают:
5-(N-бензилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (BndU),
5-(N-фенэтилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (PEdU),
5-(N-тиофенилметилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (ThdU),
5-(N-изобутилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (iBudU),
5-(N-тирозилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (TyrdU),
5-(N-3,4-метилендиоксибензилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (MBndU),
5-(N-4-фторбензилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (FBndU),
5-(N-3-фенилпропилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (PPdU),
5-(N-имидизолилэтилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (ImdU),
5-(N-триптаминокарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (TrpdU),
R
5-(N--треонинилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (ThrdU),
5-(N-[1-(3-триметиламмоний)пропил]карбоксамид)-2'-дезоксиуридина хлорид,
5-(N-нафтилметилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (NapdU),
5-(N-[1-(2,3-дигидроксипропил)]карбоксамид)-2'-дезоксиуридин),
5-(N-2-нафтилметилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (2NapdU),
5-(N-1-нафтилэтилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (NEdU),
5-(N-2-нафтилэтилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (2NEdU),
5-(N-3-бензофуранилэтилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (BFdU),
5-(N-3-бензотиофенилэтилкарбоксамид)-2'-дезоксиуридин (BTdU).
[0065]
Химические модификации C-5-модифицированных уридинов, описанные в настоящем документе, также могут быть объединены, по отдельности или в любой комбинации, с модификациями в 2'-положении сахара (например, 2'-O-метил или 2'-фтор), модификациями при экзоциклических аминах, и замещениях 4-тиоуридина, и т. п.
[0066]
C)
Применяемые в данном документе термины «модифицировать», «модифицированный», «модификация» и любые их вариации, в случае применения в отношении олигонуклеотида, означают, что по меньшей мере одно из четырех составляющих нуклеотидных оснований (то есть A, G, T/U и олигонуклеотида представляет собой аналог или сложный эфир встречающегося в природе нуклеотида. В некоторых вариантах осуществления модифицированный нуклеотид придает олигонуклеотиду устойчивость к нуклеазам. Дополнительные модификации могут включать модификации главной цепи, метилирования, комбинации при спаривании нестандартных оснований, таких как изоснования изоцитидин и изогуанидин, и т. п. Модификации также могут включать 3'- и 5'-модификации, такие как кэппирование. Другие модификации могут включать замещение по одному или нескольким из встречающихся в природе нуклеотидам аналогами, межнуклеотидные модификации, такие как, например, таковые с незаряженными мостиками (например, метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфоамидаты, карбаматы и т. д.) и таковые с заряженными мостиками (например, фосфотиоаты, фосфодитиоаты и т. д.), таковые с интеркаляторами (например, акридин, псорален и т. д.), таковые, содержащие хелатирующие средства (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, окислительные металлы и т. д.), таковые, содержащие алкилирующие средства, и таковые с модифицированными мостиками (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и т. д.). Дополнительно, любые из гидроксильных групп, обычно находящихся в сахаре нуклеотида, могут быть заменены фосфонатной группой или фосфатной группой; защищены стандартных ми защитными группами или активированы для получения дополнительных мостиков с дополнительными нуклеотидами или с твердой подложкой. 5'- и 3'-концевые группы OH могут быть фосфорилированы или замещены аминами, фрагментами органических кэппирующих групп из от приблизительно 1 до приблизительно 20 атомов углерода, полимерами на основе полиэтиленгликоля (PEG), которые в одном варианте осуществления составляют от приблизительно 10 до приблизительно 80 кДа, полимерами на основе PEG, которые в другом варианте осуществления составляют от приблизительно 20 до приблизительно 60 кДа, или другими гидрофильными или гидрофобными биологическими или синтетическими полимерами.
[0067]
Применяемые в данном документе «нуклеиновая кислота», «олигонуклеотид» и «полинуклеотид» применяют взаимозаменяемо по отношению к полимеру из нуклеотидов, и при этом они включают ДНК, РНК, гибриды ДНК/РНК и модификации таких видов нуклеиновых кислот, олигонуклеотидов и полинуклеотидов, причем включено присоединение различных частиц или фрагментов к нуклеотидным звеньям в любом положении. Термины «полинуклеотид», «олигонуклеотид» и «нуклеиновая кислота» включают двух- или однонитевые молекулы, а также тройные спиральные молекулы. Нуклеиновая кислота, олигонуклеотид и полинуклеотид представляют собой более широкие термины, чем термин аптамер и, таким образом, термины нуклеиновая кислота, олигонуклеотид и полинуклеотид включают полимеры из нуклеотидов, которые представляют собой аптамеры, но при этом термины нуклеиновая кислота, олигонуклеотид и полинуклеотид не ограничены аптамерами.
[0068]
2
2
3
2
2
X
X
X
X
X1
Полинуклеотиды также могут содержать аналоговые формы сахаров рибозы или дезоксирибозы, которые в общем известны из уровня техники, включая 2'-O-метил, 2'-O-аллил, 2'-O-этил, 2'-O- пропил, 2'-О-СНСНОСН, 2'-фтор, 2'-NH или 2'-азидо, аналоги карбоциклических сахаров, α-аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилозы или ликсозы, пиранозные сахара, фуранозные сахара, седогептулозы, ациклические аналоги и абазические аналоги нуклеозидов, такие как метилрибозид. Как отмечено в данном документе, один или несколько фосфодиэфирных мостиков могут быть заменены альтернативными линкерными группами. Такие альтернативные линкерные группы включают варианты осуществления, где фосфат заменен P(O)S («тиоатом»), P(S)S («дитиоатом»), (O)NR («амидатом»), P(O) R, P(O)OR', CO или CH2 («формацеталем»), в которых каждый R или R независимо представляет собой H или замещенный или незамещенный алкил (C1-C20), необязательно содержащий эфирный (-O-) мостик, арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралкил. Не все мостики в полинуклеотиде должны быть одинаковыми. Замещение аналоговыми формами сахаров, пуринов и пиримидинов может быть выгодным при разработке конечного продукта, поскольку возможны альтернативные структуры главной цепи, например, подобные полиамидной главной цепи.
[0069]
Полинуклеотиды также могут содержать аналоговые формы аналогов карбоциклических сахаров, α-аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилозы или ликсозы, пиранозные сахара, фуранозные сахара, седогептулозы, ациклические аналоги и абазические аналоги нуклеозидов, такие как метилрибозид.
[0070]
Если она присутствует, модификация нуклеотидной структуры может быть обеспечена до или после сборки полимера. Последовательность нуклеотидов может быть прервана компонентами, не относящимися к нуклеотидам. Полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован после полимеризации, например, путем конъюгации с компонентом для введения метки.
[0071]
Применяемый в данном документе термин «по меньшей мере один нуклеотид» по отношению к модификациям нуклеиновой кислоты относится к одному, нескольким или всем нуклеотидам в нуклеиновой кислоте, указывая на то, что любой или все случаи любого или всех из A, C, T, G или U в нуклеиновой кислоте могут быть модифицированы или не модифицированы.
[0072]
Применяемые в данном документе «лиганд на основе нуклеиновой кислоты», «аптамер», «SOMAmer» и «клон» применяют взаимозаменяемо по отношению к не встречающейся в природе нуклеиновой кислоте, которая характеризуется необходимым действием в отношении молекулы-мишени. Необходимое действие включает без ограничения связывание мишени, каталитическое изменение мишени, вступление в реакцию с мишенью по пути, при котором происходит модификация или изменение мишени или функциональной активности мишени, ковалентное присоединение к мишени (как в суицидном ингибиторе) и способствование протеканию реакции мишени с другой молекулой. В одном варианте осуществления действие представляет собой аффинность специфического связывания с молекулой-мишенью, причем такая молекула-мишень имеет трехмерную химическую структуру, отличную от таковой для полинуклеотида, который связывается с аптамером посредством механизма, который является независимым от спаривание оснований по Уотсону/Крику или образования тройной спирали, где аптамер не является нуклеиновой кислотой, обладающей известной физиологической функцией связывания молекулой-мишенью. Аптамеры для заданной мишени включают нуклеиновые кислоты, которые идентифицируют из смеси кандидатов нуклеиновых кислот, где аптамер представляет собой лиганд мишени, с помощью способа, включающего: (a) приведение в контакт смеси кандидатов с мишенью, где нуклеиновые кислоты, обладающие повышенной аффинностью к мишени относительно других нуклеиновых кислот в смеси кандидатов, могут быть отделены от остальной части смеси кандидатов; (b) отделение нуклеиновых кислот с повышенной аффинностью от остальной части смеси кандидатов и (c) проведение амплификации нуклеиновых кислот с повышенной аффинностью с получением обогащенной лигандами смеси нуклеиновых кислот, посредством чего идентифицируют аптамеры для молекулы-мишени. Следует признать, в отношении аффинных взаимодействий имеет место вопрос степени; однако в данном контексте «аффинность специфического связывания» аптамера в отношении его мишени означает, что аптамер связывается со своей мишенью в целом с гораздо более высокой степенью аффинности относительно того, как он связывается с другими, не относящимися к мишени, компонентами в смеси или в образце. «Аптамер», «SOMAmer» или «лиганд на основе нуклеиновой кислоты» представляет собой набор копий молекулы нуклеиновой кислоты одного типа или вида, который имеет определенную нуклеотидную последовательность. Аптамер может включать любое подходящее число нуклеотидов. «Аптамеры» относятся к более чем одному такому набору молекул. Различные аптамеры могут иметь либо одинаковые, либо различные числа нуклеотидов. Аптамеры могут представлять собой ДНК или РНК и могут быть однонитевыми, двунитевыми или могут содержать двунитевые или трехнитевые участки. В некоторых вариантах осуществления аптамеры получают с применением способа SELEX, описанного в настоящем документе или известного из уровня техники.
[0073]
Применяемый в данном документе «SOMAmer» или модифицированный аптамер с замедленной скоростью диссоциации относится к аптамеру с улучшенными характеристиками в отношении скорости диссоциации. SOMAmer могут быть образованы с применением улучшенных способов SELEX, описанных в патенте США № 7947447 под названием "Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates".
[0074]
Применяемый в данном документе аптамер, содержащий два модифицированных в 5-положении пиримидина или C-5-модифицированных пиримидины различного типа, может называться «аптамерами с двумя модификациями», аптамерами, содержащими «два модифицированных основания», аптамерами, имеющими «модификации по двум основаниям» или «модифицированными по двум основаниям», аптамерами, содержащими «два модифицированных основания», все из которых могут применяться взаимозаменяемо. В библиотеке аптамеров или аптамерной библиотеке также может применяться такая же терминология. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления аптамер содержит два различных модифицированных в 5-положении пиримидина, где два различных модифицированных в 5-положении пиримидина выбраны из NapdC и NapdU, NapdC и PPdU, NapdC и MOEdU, NapdC и TyrdU, NapdC и ThrdU, PPdC и PPdU, PPdC и NapdU, PPdC и MOEdU, PPdC и TyrdU, PPdC и ThrdU, NapdC и 2NapdU, NapdC и TrpdU, 2NapdC и NapdU, и 2NapdC и 2NapdU, 2NapdC и PPdU, 2NapdC и TrpdU, 2NapdC и TyrdU, PPdC и 2NapdU, PPdC и TrpdU, PPdC и TyrdU, TyrdC и TyrdU, TrydC и 2NapdU, TyrdC и PPdU, TyrdC и TrpdU, TyrdC и TyrdU, и TyrdC и TyrdU. В некоторых вариантах осуществления аптамер содержит по меньшей мере один модифицированный уридин и/или тимидин и по меньшей мере один модифицированный цитидин, где по меньшей мере один модифицированный уридин и/или тимидин модифицированы в 5-положении фрагментом, выбранным из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, фторбензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента, фрагмента морфолинo, изобутильного фрагмента, 3,4-метилендиоксибензильного фрагмента, бензотиофенильного фрагмента и бензофуранильного фрагмента, и при этом по меньшей мере один модифицированный цитидин модифицирован в 5-положении фрагментом, выбранным из нафтильного фрагмента, тирозильного фрагмента и бензильного фрагмента. В некоторых вариантах осуществления фрагмент ковалентно связан с 5-положением основания посредством линкера, предусматривающего группу, выбранную из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера.
[0075]
Применяемый в данном документе аптамер, содержащий один модифицированный в 5-положении пиримидин или C-5-модифицированный пиримидин одного типа, может называться «аптамерами с одной модификацией», аптамерами, содержащими «одно модифицированное основание», аптамерами, имеющими «модификацию по одному основанию» или «модифицированными по одному основанию», все из которых могут применяться взаимозаменяемо. В библиотеке аптамеров или аптамерной библиотеке также может применяться такая же терминология. Применяемый в данном документе «белок» применяют синонимически с «пептидом», «полипептидом» или «пептидным фрагментом». «Очищенные» полипептид, белок, пептид или пептидный фрагмент практически не содержат материала клетки или другие загрязняющие белки из клетки, ткани или бесклеточного источника, из которого получают аминокислотную последовательность, или практически не содержат химических предшественников или других химических веществ в случае химического синтеза.
[0076]
В некоторых вариантах осуществления аптамер содержит первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин содержит тирозильный фрагмент в 5-положении первого модифицированного в 5-положении пиримидина, а второй модифицированный в 5-положении пиримидин содержит нафтильный фрагмент или бензильный фрагмент в 5-положении второго модифицированного в 5-положении пиримидина. В соответствующем варианте осуществления первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой урацил. В соответствующем варианте осуществления второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой цитозин. В соответствующем варианте осуществления по меньшей мере 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% урацилов в аптамере модифицированы в 5-положении. В соответствующем варианте осуществления по меньшей мере 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% цитозинов в аптамере модифицированы в 5-положении.
Модифицированные нуклеотиды
[0077]
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает олигонуклеотиды, такие как аптамеры, которые содержат модифицированные по основанию нуклеотиды двух различных типов. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотиды содержат модифицированные в 5-положении пиримидины двух различных типов. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид содержит по меньшей мере один C5-модифицированный цитидин и по меньшей мере один C5-модифицированный уридин. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид содержит два различных C5-модифицированных цитидина. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид содержит два различных C5-модифицированных уридина. Не имеющие ограничительного характера иллюстративные C5-модифицированные уридины и цитидины показаны, например, в формуле I ниже и на фигуре 20. Некоторые не имеющие ограничительного характера иллюстративные C5-модифицированные уридины показаны на фигуре 21, и некоторые не имеющие ограничительного характера иллюстративные C5-модифицированные цитидины показаны на фигуре 22.
[0078]
В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид содержит по меньшей мере один пиримидин формулы I:
Формула I,
где
2
n-
R независимо представляет собой -(CH), где n представляет собой целое число, выбранное из 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;
X1
R независимо выбран из группы, состоящей из
X1
2
n-
где * обозначает точку присоединения группы R к группе -(CH); и где
X4
X2
X2
X2
X3
X2
2
2
2
2
2
R независимо выбран из группы, состоящей из разветвленного или линейного низшего алкила (C1-C20); гидроксильной группы; галогена (F, Cl, Br, I); нитрила (CN); бороновой кислоты (BOH); карбоновой кислоты (COOH); сложного эфира карбоновой кислоты (COOR); первичного амида (CONH); вторичного амида (CONHR); третичного амида (CONRR); сульфонамида (SONH); N-алкилсульфонамида (SONHR);
X2
X3
X4
X4
X4
X5
X5
X2
X3
6
5
6
4
R и R независимо, для каждого случая, выбраны из группы, состоящей из разветвленного или линейного низшего алкила (C1-C20); фенила (CH); замещенного R фенильного кольца (RCH), где R определен выше; карбоновой кислоты (COOH); сложного эфира карбоновой кислоты (COOR), где R представляет собой разветвленный или линейный низший алкил (C1-C20) и циклоалкил, где R и R вместе образуют замещенное или незамещенное 5- или 6-членное кольцо;
2
2
3
2
X независимо выбран из группы, состоящей из -H, -OH, -OMe, -O-аллил, -F, -OEt, -OPr, -OCHCHOCH, NH и -азидо;
2
2
2
2
R' независимо выбран из группы, состоящей из -H, -OAc; -OBz; -P(NiPr)(OCHCHCN) и -OSiMetBu;
2
R'' независимо выбран из группы, состоящей из водорода, 4,4'-диметокситритила (DMT) и трифосфата (-Р(О)(ОН)-О-Р(О)(ОН)-О-Р(О)(ОН)) или их соли;
Z независимо выбран из группы, состоящей из -H, замещенного или незамещенного C(1-4)алкила и его солей.
[0079]
2
2
3
2
В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид содержит по меньшей мере один модифицированный пиримидин, показанный на фигуре 21, где каждый X независимо выбран из -H, -OH, - OMe, -O-аллила, -F, -OEt, -OPr, -OCHCHOCH, NH и -азидо.
[0080]
2
2
3
2
В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид содержит по меньшей мере один модифицированный пиримидин, показанный на фигуре 22, где каждый X независимо выбран из -H, -OH, - OMe, -O-аллила, -F, -OEt, -OPr, -OCHCHOCH, NH и -азидо.
[0081]
2
2
3
2
В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид содержит по меньшей мере один модифицированный пиримидин, показанный на фигуре 21, и по меньшей мере один модифицированный пиримидин, показанный на фигуре 22, где каждый X независимо выбран из -H, -OH, -OMe, -O-аллила, -F, -OEt, -OPr, -OCHCHOCH, NH и -азидо. Некоторые не имеющие ограничительного характера иллюстративные пары модифицированных пиримидинов показаны в примерах, описанных в настоящем документе.
[0082]
2
2
3
2
2
2
3
2
В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид содержит по меньшей мере один модифицированный пиримидин, показанный на фигуре 20, где 2'-положение рибозы независимо выбрано из -H, -OH, -OMe, -O-аллила, -F, -OEt, -OPr, -OCHCHOCH, NH и -азидо. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид содержит по меньшей мере два модифицированных пиримидина, показанных на фигуре 20, где 2'-положение рибозы независимо выбрано из -H, -OH, -OMe, -O-аллила, -F, -OEt, -OPr, -OCHCHOCH, NH и -азидо.
[0083]
2
2
3
2
В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид содержит по меньшей мере один модифицированный пиримидин, показанный на фигуре 20, и по меньшей мере один модифицированный пиримидин, показанный на фигуре 21 или фигуре 22, где 2'-положение рибозы независимо выбрано из -H, -OH, -OMe, -O-аллила, -F, -OEt, -OPr, -OCHCHOCH, NH и -азидо. Некоторые не имеющие ограничительного характера иллюстративные пары модифицированных пиримидинов показаны в примерах, описанных в настоящем документе.
[0084]
В любом из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, олигонуклеотид может представлять собой аптамер. В некоторых таких вариантах осуществления олигонуклеотид представляет собой аптамер, который специфически связывает полипептид-мишень.
Получение олигонуклеотидов
[0085]
103
126
132,
J.
Am. Chem. Soc.
Автоматизированный синтез олигодезоксинуклеозидов является обычной практикой во множестве лабораторий (см., например, Matteucci, M. D. and Caruthers, M. H., (1990) J. Am. Chem. Soc., :3185-3191, содержания которых включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Синтез олигорибонуклеозидов также широко известен (см., например, Scaringe, S. A., et al., (1990) Nucleic Acids Res. 18:5433-5441, содержания которых включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Как отмечено в данном документе, фосфоамидиты являются применимыми для внедрения модифицированного нуклеозида в олигонуклеотид посредством химического синтеза, и при этом трифосфаты являются применимыми для внедрения модифицированного нуклеозида в олигонуклеотид посредством ферментативного синтеза. (См., например, Vaught, J. D. et al. (2004) J. Am. Chem. Soc., :11231-11237: Vaught, J. V., et al. (2010)  4141-4151; Gait, M. J. "Oligonucleotide Synthesis a practical approach" (1984) IRL Press (Оксфорд, Великобритания); Herdewijn, P. "Oligonucleotide Synthesis" (2005) (Humana Press, Тотова, Нью-Джерси (каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте).
Способ SELEX
[0086]
Термины «SELEX» и «способ SELEX» применяют взаимозаменяемо в данном документе для общего наименования комбинации (1) отбора нуклеиновых кислот, которые взаимодействуют с молекулой-мишенью желательным образом, например, путем связывания с высокой аффинностью к белку, с (2) амплификацией таких выбранных нуклеиновых кислот. Способ SELEX может использоваться для идентификации аптамеров с высокой аффинностью к конкретной молекуле-мишени или биомаркеру.
[0087]
См., например,
SELEX в общем включает получение смеси кандидатов нуклеиновых кислот, связывание смеси кандидатов с желаемой молекулой-мишенью с образованием комплекса с аффинностью, отделение комплексов с аффинностью от несвязанных кандидатных нуклеиновых кислот, отделение и выделение нуклеиновой кислоты из комплекса с аффинностью, проведение очистки нуклеиновой кислоты и идентификацию конкретной последовательности аптамера. Способ может включать множество раундов для дополнительного улучшения аффинности отобранного аптамера. Способ может включать стадии амплификации в одной или нескольких точках способа.  патент США № 5475096 под названием "Nucleic Acid Ligands". Способ SELEX может использоваться для генерации аптамера, который ковалентно связывает свою мишень, а также аптамера, который ковалентно не связывает свою мишень. См., например, патент США № 5705337 под названием "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX".
[0088]
2
Способ SELEX может использоваться для идентификации аптамеров с высокой аффинностью, содержащих модифицированные нуклеотиды, которые придают улучшенные характеристики аптамеру, такие как, например, улучшенная стабильность in vivo или улучшенные характеристики доставки. Примеры таких модификаций включают химические замещения по положениям в рибозе, и/или фосфате, и/или основании. Идентифицированные с помощью способа SELEX аптамеры, содержащие модифицированные нуклеотиды, описаны в патенте США № 5660985 под названием "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides", в котором описаны олигонуклеотиды, содержащие производные нуклеотидов, химически модифицированные в 5'- и 2'-положениях пиримидинов. В патенте США № 5580737, см. выше, описываются высоко специфичные аптамеры, содержащие один или несколько нуклеотидов, модифицированных посредством 2'-амино (2'-NH), 2'-фтор (2'-F) и/или 2'-O-метил (2'-OMe). См. также публикацию заявки на патент США № 20090098549, под названием "SELEX and PHOTOSELEX", в которой описывается библиотека нуклеиновых кислот, обладающая расширенными физическими и химическими свойствами, и ее применение в способах SELEX и photoSELEX.
[0089]
SELEX также может применяться для идентификации аптамеров, которые характеризуются необходимыми характеристиками в отношении скорости диссоциации. См. патент США № 7947447 под названием "Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates", который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте, в нем описываются улучшенные способы SELEX для генерации аптамеров, которые могут связываться с молекулами-мишенями. Описаны способы получения аптамеров и фотоаптамеров, характеризующихся более низкими скоростями диссоциации относительно их соответствующих молекул-мишеней. Способы включают приведение в контакт смеси кандидатов с молекулой-мишенью, обеспечение образования комплексов нуклеиновая кислота-мишень и осуществление процесса обогащения по низкой скорости диссоциации, где комплексы нуклеиновая кислота-мишень с высокими значениями скорости диссоциации диссоциируют и не преобразуются, при этом комплексы с низкими значениями скоростей диссоциации остаются в неизменном виде. Дополнительно, способы включают применение модифицированных нуклеотидов при получении смесей кандидатных нуклеиновых кислот для генерации аптамеров с улучшенной характеристикой в отношении скорости диссоциации (см. патент США № 8409795 под названием "SELEX and PhotoSELEX"). (См. также патент США № 7855054 и публикацию патента США № 20070166740). Каждая из таких заявок включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
[0090]
«Мишенью», или «молекулой-мишенью», или «мишенью» в данном документе называется любое соединение, в присутствии которого нуклеиновая кислота может действовать необходимым образом. Молекула-мишень может представлять собой без ограничения белок, пептид, нуклеиновую кислоту, углевод, липид, полисахарид, гликопротеин, гормон, рецептор, антиген, антитело, вирус, патоген, токсичное вещество, субстрат, метаболит, аналог в переходном состоянии, кофактор, ингибитор, лекарственное средство, краситель, питательное вещество, фактор роста, клетку, ткань, любую часть или фрагмент любого из вышеуказанного и т. д. Фактически любой химический или биологический эффектор может представлять собой подходящую мишень. В качестве мишеней могут выступать молекулы любого размера. Мишень также может быть модифицирована посредством некоторых способов для улучшения вероятности или эффективности взаимодействия мишени с нуклеиновой кислотой. Мишень также может включать любую незначительную вариацию относительно определенного соединения или молекулы, такую как, в случае белка, например, незначительные вариации в аминокислотной последовательности, образование дисульфидной связи, гликозилирование, липидизация, ацетилирование, фосфорилирование, или любые другие манипуляцию или модификацию, такие как конъюгация с компонентом для введения метки, который практически не изменяет идентичность молекулы. «Молекула-мишень» или «мишень» представляет собой набор копий молекулы или мультимолекулярной структуры одного типа или вида, который способен к связыванию с аптамером. «Молекулы-мишени » или «мишени» относятся к более чем одному такому набору молекул. Варианты осуществления способа SELEX, в которых мишень представляет собой пептид, описаны в патенте США № 6376190, под названием "Modified SELEX Processes Without Purified Protein". В некоторых вариантах осуществления мишень представляет собой белок.
[0091]
Применяемые в данном документе «молекула конкурента» и «конкурент» применяют взаимозаменяемо для обозначения любой молекулы, которая может образовывать неспецифический комплекс с молекулой, не являющейся мишенью. В данном контексте молекулы, не являющиеся мишенями, включают свободные аптамеры, где, например, конкурент может использоваться для ингибирования связывания аптамера (повторного связывания), неспецифического, с другой молекулой, не являющейся мишенью. «Молекула конкурента» или «конкурент» представляет собой набор копий молекулы одного типа или вида. «Молекулы конкурентов» или «конкуренты» относятся к более чем одному такому набору молекул. Молекулы конкурентов включают без ограничения олигонуклеотиды, полианионы (например, гепарин, ДНК молок сельди, ДНК молок лосося, тРНК, сульфат декстрана, полидекстран, абазические фосфодиэфирные полимеры, дНТФ и пирофосфат). В различных вариантах осуществления может использоваться комбинация одного или нескольких конкурентов.
[0092]
Применяемый в данном документе «неспецифический комплекс» относится к нековалентной связи между двумя или более молекулами, отличными от аптамера и его молекулы-мишени. Неспецифический комплекс представляет взаимодействие между классами молекул. Неспецифические комплексы включают комплексы образованные между аптамером и молекулой, не являющейся мишенью, конкурентом и молекулой, не являющейся мишенью, конкурентом и молекулой-мишенью, и молекулой-мишенью и молекулой, не являющейся мишенью.
[0093]
Применяемый в данном документе термин «процесс обогащения по низкой скорости диссоциации» относится к процессу изменения относительных концентраций некоторых компонентов смеси кандидатов так, чтобы относительная концентрация аптамерных комплексов с аффинностью, характеризующихся низкими значениями скорости диссоциации, повышалась относительно концентрации аптамерных комплексов с аффинностью, характеризующихся более высокими, менее желательными значениями скорости диссоциации. В одном варианте осуществления процесс обогащения по низкой скорости диссоциации представляет собой процесс обогащения в растворе по низкой скорости диссоциации. В данном варианте осуществления процесс обогащения в растворе по низкой скорости диссоциации происходит в растворе так, чтобы ни мишень, ни нуклеиновые кислоты, образующие аптамерные комплексы с аффинностью в смеси, не иммоблизировались на твердой подложке во время процесса обогащения по низкой скорости диссоциации. В различных вариантах осуществления процесс обогащения по низкой скорости диссоциации может включать одну или несколько стадий, включающих добавление молекулы конкурента и инкубацию с ней, разбавление смеси или комбинацию таковых (например, разбавление смеси в присутствии молекулы конкурента). Поскольку эффект процесса обогащения по низкой скорости диссоциации в общем зависит от отличающихся значений скорости диссоциации различных аптамерных комплексов с аффинностью (т. е. аптамерных комплексов с аффинностью, образованных молекулой-мишенью и различными нуклеиновыми кислотами в смеси кандидатов), продолжительность процесса обогащения по низкой скорости диссоциации выбирают так, чтобы сохранять высокую долю аптамерных комплексов с аффинностью, характеризующихся низкими значениями скорости диссоциации, при этом с существенным уменьшением числа аптамерных комплексов с аффинностью, характеризующихся высокими значениями скорости диссоциации. Процесс обогащения по низкой скорости диссоциации может применяться за один или несколько циклов во время осуществления способа SELEX. Когда разбавление и добавление конкурента применяют в комбинации, они могут осуществляться одновременно или последовательно в любом порядке. Процесс обогащения по низкой скорости диссоциации может использоваться, когда общая концентрация мишени (белка) в смеси является низкой. В одном варианте осуществления, когда процесс обогащения по низкой скорости диссоциации включает разбавление, смесь может быть разбавлена настолько, насколько это практически возможно, учитывая, что удерживаемые аптамером нуклеиновые кислоты извлекают на последующих раундах в способе SELEX. В одном варианте осуществления процесс обогащения по низкой скорости диссоциации включает применение конкурента, а также разбавление, позволяющее разбавлять смесь в меньшей степени, чем это может потребоваться, без применения конкурента.
[0094]
во время
после
В одном варианте осуществления процесс обогащения по низкой скорости диссоциации включает добавление конкурента, и при этом конкурент представляет собой полианион (например, гепарин или сульфат декстрана (декстран)). Гепарин или декстран применяли при идентификации конкретных аптамеров в предыдущих отборах SELEX. Однако в таких способах гепарин или декстран присутствуют  стадии установления равновесия, на которой мишень и аптамер связываются с образованием комплексов. В таких способах, поскольку концентрация гепарина или декстрана повышается, соотношение комплексов мишень/аптамер с высокой аффинностью и комплексов мишень/аптамер с низкой аффинностью повышается. Однако высокая концентрация гепарина или декстрана может привести к снижению числа комплексов мишень/аптамер с высокой аффинностью при равновесии за счет конкуренции в отношении связывания мишени между нуклеиновой кислотой и конкурентом. Напротив, в описанных в данном случае способах конкурента добавляют  обеспечения образования комплексов мишень/аптамер и поэтому не влияют на число образованных комплексов. Добавление конкурента после равновесного связывания мишени и аптамера приводит к неравновесному состоянию, которое переходит в новое равновесие с течением времени с меньшим количеством комплексов мишень/аптамер. Захват комплексов мишень/аптамер до достижения нового равновесия
приводит к обогащению образца по аптамерам с низкой скоростью диссоциации, поскольку комплексы с высокой скоростью диссоциации, будут диссоциировать первыми.
[0095]
В другом варианте осуществления применяют полианионный конкурент (например, сульфат декстрана или другой полианионный материал) в процессе обогащения по низкой скорости диссоциации для облегчения идентификации аптамера, который невосприимчив к присутствию полианиона. В данном контексте «невосприимчивый к присутствию полианиона аптамер» представляет собой аптамер, который способен к образованию комплекса аптамер/мишень, который с меньшей вероятностью диссоциирует в растворе, который также содержит невосприимчивый к присутствию полианиона материал, отличный от комплекса аптамер/мишень, который включает восприимчивый к присутствию полианиона аптамер. Таким образом, невосприимчивые к присутствию полианиона аптамеры могут использоваться при осуществлении аналитических способов для определения наличия, или количества, или концентрации мишени в образце, где способ определения включает применение полианионного материала (например, сульфата декстрана), к присутствию которого аптамер не восприимчив.
[0096]
Таким образом, в одном варианте осуществления представлен способ получения невосприимчивого к присутствию полианиона аптамера. В данном варианте осуществления после приведения в контакт смеси кандидатов нуклеиновых кислот с мишенью. Обеспечивают установления равновесия между мишенью и нуклеиновыми кислотами в смеси кандидатов. Полианионный конкурент вводят и оставляют инкубироваться в растворе в течение периода времени, достаточного для обеспечения того, чтобы аптамеры с самой высокой скоростью диссоциации в смеси кандидатов диссоциировали из молекулы-мишени. Также аптамеры в смеси кандидатов, которые могут диссоциировать в присутствии полианионного конкурента, будут высвобождаться из молекулы-мишени. Смесь разделяют для выделения аптамеров с высокой аффинностью, низкой скоростью диссоциации, которые остались связанными с молекулой-мишенью, и удаления любых несвязанных в комплекс материалов из раствора. Затем аптамер может быть высвобожден из молекулы-мишени и выделен. Выделенный аптамер также может быть амплифицирован и по отношению к нему могут быть применены дополнительные раунды отбора для повышения общей характеристики отобранных аптамеров. Данный способ также может применяться с минимальным временем инкубации, если отбор аптамеров с низкой скоростью диссоциации не предназначена для специфической области применения.
[0097]
Таким образом, в одном варианте осуществления представлен модифицированный способ SELEX для идентификации или получения аптамеров, характеризующихся низкими (длительными) значениями скорости диссоциации, где молекула-мишень и смесь кандидатов приводят в контакт и инкубируют вместе в течение периода времени, достаточного для обеспечения равновесного связывания молекулы-мишени с нуклеиновыми кислотами, содержащимися в смеси кандидатов. После равновесного связывания к смеси добавляют избыток молекулы конкурента, например, полианионного конкурента, и смесь инкубируют вместе с избытком молекулы конкурента в течение предварительно определенного периода времени. Значительная доля аптамеров, характеризующихся значениями скорости диссоциации, которые меньше данного предварительно определенного периода инкубации, будут диссоциировать из мишени в течение предварительно определенного периода инкубации. Реассоциация таких аптамеров с «быстрой» скоростью диссоциации с мишенью минимизируется из-за избытка молекулы конкурента, которая может неспецифически связываться с мишенью и занимать сайты связывания мишени. Значительная доля аптамеров, характеризующихся более длительными значениями скорости диссоциации, будет оставаться связанной в комплексе с мишенью в течение предварительно определенного периода инкубации. В конце периода инкубации отделение комплексов нуклеиновая кислота-мишень от остальной части смеси обеспечивает отделение популяции аптамеров с низкой скоростью диссоциации от таковых, характеризующихся высокими значениями скорости диссоциации. Стадия диссоциации может использоваться для диссоциации аптамеров с низкой скоростью диссоциации из их мишени и обеспечивает выделение, идентификацию, секвенирование, синтез и амплификацию аптамеров с низкой скоростью диссоциации (либо отдельных аптамеров, либо группы аптамеров с низкой скоростью диссоциации), которые характеризуются высокой аффинностью и специфичностью в отношении молекулы-мишени. Как и в случае традиционного SELEX, последовательности аптамеров, идентифицированные в результате одного раунда модифицированного способа SELEX, могут использоваться в синтезе новой смеси кандидатов так, что стадии приведения в контакт, равновесного связывания, добавления молекулы конкурента, инкубации с молекулой конкурента и отделения аптамеров с низкой скоростью диссоциации при необходимости могут выполняться итеративно/повторяться многократно.
[0098]
Комбинация обеспечения равновесного связывания смеси кандидатов с мишенью перед добавлением конкурента с последующим добавлением избытка конкурента и инкубации с конкурентом в течение предварительно определенного периода времени обеспечивает отбор популяции аптамеров, характеризующихся значениями скорости диссоциации, которые в значительной степени выше таковых, достигаемых ранее.
[0099]
С целью достижения равновесного связывания смесь кандидатов может инкубироваться с мишенью в течение по меньшей мере приблизительно 5 минут, или по меньшей мере приблизительно 15 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 45 минут, приблизительно 1 часа, приблизительно 2 часов, приблизительно 3 часов, приблизительно 4 часов, приблизительно 5 часов или приблизительно 6 часов.
[00100]
Предварительно определенный период инкубации молекулы конкурента со смесью из смеси кандидатов и молекулы-мишени может быть выбран по необходимости с учетом факторов, таких как природа мишени и известные значения скорости диссоциации (если требуется) известных аптамеров для мишени. Предварительно определенные периоды инкубации могут быть выбраны из: по меньшей мере приблизительно 5 минут, по меньшей мере приблизительно 10 минут, по меньшей мере приблизительно 20 минут, по меньшей мере приблизительно 30 минут, по меньшей мере приблизительно 45 минут, по меньшей мере приблизительно 1 часа, по меньшей мере приблизительно 2 часов, по меньшей мере приблизительно 3 часов, по меньшей мере приблизительно 4 часов, по меньшей мере приблизительно 5 часов, по меньшей мере приблизительно 6 часов.
[00101]
В других вариантах осуществления разбавление применяют в качестве способа повышения скорости диссоциации, и при этом инкубация разбавленной смеси кандидатов, комплекса молекула-мишень/аптамер может быть проведена в течение предварительно определенного периода времени, который может быть выбран из: по меньшей мере приблизительно 5 минут, по меньшей мере приблизительно 10 минут, по меньшей мере приблизительно 20 минут, по меньшей мере приблизительно 30 минут, по меньшей мере приблизительно 45 минут, по меньшей мере приблизительно 1 часа, по меньшей мере приблизительно 2 часов, по меньшей мере приблизительно 3 часов, по меньшей мере приблизительно 4 часов, по меньшей мере приблизительно 5 часов, по меньшей мере приблизительно 6 часов.
[00102]
Варианты осуществления настоящего изобретения касаются идентификации, получения, синтеза и применения аптамеров с низкой скоростью диссоциации. Таковые представляют собой аптамеры, которые характеризуются скоростью диссоциации (t1/2) из нековалентного комплекса аптамер-мишень, которая выше таковой для аптамеров, обычно получаемых посредством традиционного SELEX. Для смеси, содержащей нековалентные комплексы аптамера и мишени, t1/2 представляет собой время, затрачиваемое половиной аптамеров для диссоциации из комплексов аптамер-мишень. t1/2 для аптамеров с низкой скоростью диссоциации в соответствии с настоящим изобретением выбрано из одного из: больше приблизительно 30 минут или равняется; от приблизительно 30 минут до приблизительно 240 минут; от приблизительно 30 минут до приблизительно 60 минут; от приблизительно 60 минут до приблизительно 90 минут, от приблизительно 90 минут до приблизительно 120 минут; от приблизительно 120 минут до приблизительно 150 минут; от приблизительно 150 минут до приблизительно 180 минут; от приблизительно 180 минут до приблизительно 210 минут; от приблизительно 210 минут до приблизительно 240 минут.
[00103]
d
Характеристическим признаком аптамера, идентифицированного посредством процедуры SELEX, является его высокая аффинность по отношению к его мишени. Аптамер будет характеризоваться константой диссоциации (k) в отношении его мишени, которая выбрана из одного из: менее приблизительно 1 мкМ, менее приблизительно 100 нМ, менее приблизительно 10 нМ, менее приблизительно 1 нМ, менее приблизительно 100пМ, менее приблизительно 10 пМ, менее приблизительно 1 пМ.
Библиотеки олигонуклеотидов
[00104]
В некоторых вариантах осуществления представлены библиотеки олигонуклеотидов, содержащие произвольные последовательности. Такие библиотеки могут быть применимыми в некоторых вариантах осуществления для осуществления SELEX. В некоторых вариантах осуществления каждый олигонуклеотид в библиотеке олигонуклеотидов характеризуется числом рандомизированных положений, таким как по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 или 20-100, 20-80, 20-70, 20-60, 20-50, 20-40 или 30-40 рандомизированных положений. В некоторых вариантах осуществления каждый олигонуклеотид в библиотеке олигонуклеотидов содержит фиксированные последовательности, фланкирующие рандомизированные положения. Такие фиксированные фланкирующие последовательности могут быть одинаковыми или отличными друг от друга (т. е. 5'-фланкирующая последовательность и 3'-фланкирующая последовательность могут быть одинаковыми или различными) и могут в некоторых вариантах осуществления быть одинаковыми для всех членов библиотеки (т. е. все члены библиотеки могут содержать одинаковую 5'-фланкирующую последовательность и/или все члены библиотеки могут содержать одинаковую 3'-фланкирующую последовательность).
[00105]
В некоторых вариантах осуществления рандомизированные положения могут быть представлены четырьмя или более различными нуклеотидными основаниями, одно или несколько из которых являются модифицированными. В некоторых вариантах осуществления все нуклеотидные основания одного типа являются модифицированными или немодифицированными (например, либо все цитидины в рандомизированном участке являются модифицированными, либо все являются немодифицированными). В некоторых вариантах осуществления нуклеотидное основание одного типа в рандомизированном участке присутствует как в модифицированной, так и в немодифицированной формах. В некоторых таких вариантах осуществления рандомизированные положения представлены двумя модифицированными и двумя немодифицированными нуклеотидными основаниями. В некоторых таких вариантах осуществления рандомизированные положения представлены аденином, гуанином, C5-модифицированным цитидином и C5-модифицированным уридином. Не имеющие ограничительного характера иллюстративные C5-модифицированные цитидины и C5-модифицированные уридины показаны на фигурах 19-21. Библиотеки олигонуклеотидов и способы получения таковых дополнительно описаны, например, в примерах в данном документе.
Иллюстративные аптамеры
[00106]
n
n
В некоторых вариантах осуществления представлены аптамеры, которые связывают молекулу-мишень. В некоторых вариантах осуществления молекула-мишень представляет собой белок-мишень. В некоторых вариантах осуществления представлены аптамеры, которые связывают PCSK9. В некоторых вариантах осуществления аптамер, который связывает PCSK9, ингибирует связывание PCSK9 с LDL-R. В некоторых таких вариантах осуществления аптамер содержит последовательность 5'-yGpppG-3', где каждый у представляет собой TyrdU, и каждый p представляет собой NapdC. В некоторых вариантах осуществления аптамер дополнительно содержит последовательность 5'-yEAyGApAp-3', где E выбран из y, A и G; и n равняется 0 или 1. В некоторых вариантах осуществления n равняется 0. В некоторых вариантах осуществления последовательность 5'-yEAyGApAp-3' расположена на 5'-конце последовательности 5'-yGpppG-3'. В некоторых вариантах осуществления E представляет собой y.
[00107]
n
m
В некоторых вариантах осуществления представлен аптамер, который связывает PCSK9, где аптамер содержит последовательность 5'-FpppAAGRJrpRppW-3' (SEQ ID NO: 81), где F выбран из r и G; каждый R независимо выбран из G и A; J выбран из r и A; W выбран из r, G и A; n равняется 0 или 1; m равняется 0 или 1; r представляет собой PpdC; и p представляет собой NapdU. В некоторых вариантах осуществления m равняется 1. В некоторых вариантах осуществления F представляет собой r. В некоторых вариантах осуществления J представляет собой r. В некоторых вариантах осуществления W представляет собой G.
[00108]
В некоторых вариантах осуществления представлен аптамер, который связывает PCSK9, где аптамер содержит последовательность 5'-TTppGGpp-3', где каждый p представляет собой NapdC.
[00109]
В некоторых вариантах осуществления аптамер, который связывает PCSK9, составляет от 20 до 100, или от 20 до 90, или от 20 до 80, или от 20 до 70, или от 20 до 60, или от 20 до 50, или от 30 до 100, или от 30 до 90, или от 30 до 80, или от 30 до 70, или от 30 до 60, или от 30 до 50, или от 40 до 100, или от 40 до 90, или от 40 до 80, или от 40 до 70, или от 40 до 60, или от 40 до 50 нуклеотидов в длину.
[00110]
50
В некоторых вариантах осуществления аптамер ингибирует PCSK9 связывание с LDL-R. В некоторых вариантах осуществления аптамер ингибирует связывание PCSK9 с LDL-R при IC менее 30 нМ, менее 20 нМ или менее 15 нМ.
[00111]
В некоторых вариантах осуществления представлен способ снижения уровня холестерина у субъекта, включающий введение субъекту, нуждающемуся в нем, аптамера, который связывает PCSK9. В некоторых вариантах осуществления аптамер, который связывает PCSK9, представляет собой аптамер, представленный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления холестерин представляет собой холестерин (LDL-C) липопротеинов низкой плотности (LDL). В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется гетерозиготная семейная гиперхолестеринемия или клиническое атеросклеротическое сердечно-сосудистое заболевание (CVD).
Соли
[00112]
Может быть удобно или желательно получить, очистить и/или обработать соответствующую соль соединения, например, фармацевтически приемлемую соль. Примеры фармацевтически приемлемых солей рассмотрены в Berge et al. (1977) "Pharmaceutically Acceptable Salts" J. Pharm. Sci. 66:1-19.
[00113]
-
+
+
2+
2+
+3
+
X+
X
+
X
+
X
+
+
4
3
2
3
4
3
Например, если соединение является анионным или содержит функциональную группу, которая может быть анионной (например, -COOH может быть -COO), то соль может быть образована с применением подходящего катиона. Примеры подходящих неорганических катионов включают без ограничения ионы щелочных металлов, такие как Na и K, щелочноземельные катионы, такие как Ca и Mg, и другие катионы, такие как Al. Примеры подходящих органических катионов включают без ограничения ион аммония (т. е., NH) и замещенные ионы аммония (например, NHLR, NHR 2, NHR, NR). Примеры некоторых подходящих замещенных ионов аммония представляют собой таковые, полученные из: этиламина, диэтиламина, дициклогексиламина, триэтиламина, бутиламина, этилендиамина, этаноламина, диэтаноламина, пиперизина, бензиламина, фенилбензиламина, холина, меглюмина и трометамина, а также аминокислот, таких как лизин и аргинин. Примером обычного иона четвертичного аммония является N(CH)4 .
[00114]
2
3
+
Если соединение является катионным или содержит функциональную группу, которая может быть катионной (например, -NH может быть -NH), то соль может быть образована с применением подходящего аниона. Примеры подходящих неорганических анионов включают без ограничения таковые, полученные из следующих неорганических кислот: хлористоводородной, бромистоводородной, йодистоводородной, серной, сернистой, азотной, азотистой, фосфорной и фосфористой.
[00115]
Примеры подходящих органических анионов включают без ограничения таковые, полученные из следующих органических кислот: 2-ацетоксибензойной, уксусной, аскорбиновой, аспарагиновой, бензойной, камфорсульфоновой, коричной, лимонной, эдетовой, этансульфоновой, этансульфоновой, фумаровой, глюкогептоновой, глюконовой, глутаминовой, гликолевой, гидроксималеиновой, гидроксинафталинкарбоновой, изэтиновой, молочной, лактобионовой, лауриновой, малеиновой, яблочной, метансульфоновой, муциновой, олеиновой, щавелевой, пальмитиновой, памовой, пантотеновой, фенилуксусной, фенилсульфоновой, пропионовой, пировиноградной, салициловой, стеариновой, янтарной, сульфаниловой, винной, толуолсульфоновой и валериановой. Примеры подходящих полимерных органических анионов включают без ограничения таковые, полученные из следующих полимерных кислот: дубильной кислоты, карбоксиметилцеллюлозы.
[00116]
Если не указано иное, ссылка на конкретное соединение также включает его солевые формы.
НЕКОТОРЫЕ НЕ ИМЕЮЩИЕ ОГРАНИЧИТЕЛЬНОГО ХАРАКТЕРА ИЛЛЮСТРАТИВНЫЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Вариант осуществления 1. Аптамер, содержащий по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин являются различными модифицированными в 5-положении пиримидинами.
Вариант осуществления 2. Аптамер в соответствии с вариантом осуществления 1, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин.
Вариант осуществления 3. Аптамер в соответствии с вариантом осуществления 1, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин.
Вариант осуществления 4. Аптамер в соответствии с вариантом осуществления 2 или вариантом осуществления 3, где модифицированный в 5-положении уридин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента и фрагмента морфолинo.
Вариант осуществления 5. Аптамер в соответствии с любым из вариантов осуществления 2-4, где модифицированный в 5-положении цитидин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента и фрагмента морфолинo.
Вариант осуществления 6. Аптамер в соответствии с любым из вариантов осуществления 2-5, где модифицированный в 5-положении цитидин выбран из NapdC, 2NapdC, TyrdC и PPdC.
Вариант осуществления 7. Аптамер в соответствии с любым из вариантов осуществления 2-6, где модифицированный в 5-положении уридин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU.
Вариант осуществления 8. Аптамер в соответствии с вариантом осуществления 1, где по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой NapdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU и ThrdU.
Вариант осуществления 9. Аптамер в соответствии с вариантом осуществления 1, где по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой PPdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU и ThrdU.
Вариант осуществления 10. Аптамер в соответствии с вариантом осуществления 8 или вариантом осуществления 9, где по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой TyrdU.
Вариант осуществления 11. Аптамер в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-10, где аптамер связывает белок-мишень, выбранный из PCSK9, PSMA, ErbBl, ErbB2, FXN, KDM2A, IGF1R, pIGFIR, a1-антитрипсина, CD99, MMP28 и PPIB.
Вариант осуществления 12. Аптамер в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-11, где аптамер содержит участок на 5'-конце аптамера, который составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или по меньшей мере 30 нуклеотидов в длину, или от 5 до 30, от 10 до 30, от 15 до 30, от 5 до 20 или от 10 до 20 нуклеотидов в длину, где участок на 5'-конце аптамера не содержит модифицированных в 5-положении пиримидинов.
Вариант осуществления 13. Аптамер в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-12, где аптамер содержит участок на 3'-конце аптамера, который составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или по меньшей мере 30 нуклеотидов в длину, или от 5 до 30, от 10 до 30, от 15 до 30, от 5 до 20 или от 10 до 20 нуклеотидов в длину, где участок на 3'-конце аптамера не содержит модифицированных в 5-положении пиримидинов.
Вариант осуществления 14. Аптамер в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-13, где аптамер составляет от 20 до 100, или от 20 до 90, или от 20 до 80, или от 20 до 70, или от 20 до 60, или от 20 до 50, или от 30 до 100, или от 30 до 90, или от 30 до 80, или от 30 до 70, или от 30 до 60, или от 30 до 50, или от 40 до 100, или от 40 до 90, или от 40 до 80, или от 40 до 70, или от 40 до 60, или от 40 до 50 нуклеотидов в длину.
Вариант осуществления 15. Композиция, содержащая множество полинуклеотидов, где каждый полинуклеотид содержит по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин являются различными модифицированными в 5-положении пиримидинами.
Вариант осуществления 16. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 15, где каждый полинуклеотид содержит фиксированный участок на 5'-конце полинуклеотида.
Вариант осуществления 17. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 16, где фиксированный участок на 5'-конце каждого полинуклеотида составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или по меньшей мере 30 нуклеотидов в длину, или от 5 до 30, от 10 до 30, от 15 до 30, от 5 до 20 или от 10 до 20 нуклеотидов в длину.
Вариант осуществления 18. Композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 15-17, где каждый полинуклеотид содержит фиксированный участок на 3'-конце полинуклеотида.
Вариант осуществления 19. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 18, где фиксированный участок на 3'-конце полинуклеотида составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или по меньшей мере 30 нуклеотидов в длину, или от 5 до 30, от 10 до 30, от 15 до 30, от 5 до 20 или от 10 до 20 нуклеотидов в длину.
Вариант осуществления 20. Композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 15-19, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин.
Вариант осуществления 21. Композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 15-19, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин.
Вариант осуществления 22. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 20 или вариантом осуществления 21, где модифицированный в 5-положении уридин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента и фрагмента морфолинo.
Вариант осуществления 23. Композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 20-22, где модифицированный в 5-положении цитидин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента и фрагмента морфолинo.
Вариант осуществления 24. Композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 20-23, где модифицированный в 5-положении цитидин выбран из NapdC, 2NapdC, TyrdC и PPdC.
Вариант осуществления 25. Композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 20-24, где модифицированный в 5-положении уридин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU.
Вариант осуществления 26. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 15, где по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой NapdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU.
Вариант осуществления 27. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 15, где по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой PPdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TrydU, TrpdU и ThrdU.
Вариант осуществления 28. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 26 или вариантом осуществления 27, где по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой TyrdU.
Вариант осуществления 29. Композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 15-28, где каждый полинуклеотид содержит произвольный участок.
Вариант осуществления 30. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 29, где произвольный участок составляет от 20 до 100, или от 20 до 90, или от 20 до 80, или от 20 до 70, или от 20 до 60, или от 20 до 50, или от 20 до 40, или от 30 до 100, или от 30 до 90, или от 30 до 70, или от 30 до 60, или от 30 до 50, или от 30 до 40 нуклеотидов в длину.
Вариант осуществления 31. Композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 15-29, где каждый полинуклеотид составляет от 20 до 100, или от 20 до 90, или от 20 до 80, или от 20 до 70, или от 20 до 60, или от 20 до 50, или от 30 до 100, или от 30 до 90, или от 30 до 80, или от 30 до 70, или от 30 до 60, или от 30 до 50, или от 40 до 100, или от 40 до 90, или от 40 до 80, или от 40 до 70, или от 40 до 60, или от 40 до 50 нуклеотидов в длину.
Вариант осуществления 32. Композиция, содержащая первый аптамер, второй аптамер и мишень,
где первый аптамер содержит по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин;
где второй аптамер содержит по меньшей мере один третий модифицированный в 5-положении пиримидин;
где первый аптамер, второй аптамер и мишень способны к образованию тримерного комплекса; и
где первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин являются различными модифицированными в 5-положении пиримидинами.
Вариант осуществления 33. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 32, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин.
Вариант осуществления 34. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 32, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин.
Вариант осуществления 35. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 33 или вариантом осуществления 34, где модифицированный в 5-положении уридин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента и фрагмента морфолинo.
Вариант осуществления 36. Композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 33-35, где модифицированный в 5-положении цитидин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента и фрагмента морфолинo.
Вариант осуществления 37. Композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 33-36, где модифицированный в 5-положении цитидин выбран из NapdC, 2NapdC, TyrdC и PPdC.
Вариант осуществления 38. Композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 33-37, где модифицированный в 5-положении уридин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU.
Вариант осуществления 39. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 32, где по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой NapdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU.
Вариант осуществления 40. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 32, где по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой PPdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU.
Вариант осуществления 41. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 39 или вариантом осуществления 40, где по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой TyrdU.
Вариант осуществления 42. Композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 32-41, где третий модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из модифицированного в 5-положении цитидина и модифицированного в 5-положении пиримидина.
Вариант осуществления 43. Композиция в соответствии с вариантом осуществления 42, где третий модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из BndC, PEdC, PPdC, NapdC, 2NapdC, NEdC, 2NEdC, TyrdC, BndU, NapdU, PEdU, IbdU, FBndU, 2NapdU, NEdU, MBndU, BFdU, BTdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU.
Вариант осуществления 44. Композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 32-43, где мишень выбрана из белка, пептида, углевода, малой молекулы, клетки и ткани.
Вариант осуществления 45. Способ, включающий:
(a) приведение в контакт аптамера, способного к связыванию с молекулой-мишенью в образце;
(b) инкубирование аптамера с образцом с обеспечением образования комплекса аптамер-мишень;
(c) обогащение в отношении комплекса аптамер-мишень в образце и
(c) выявление наличия аптамера, комплекса аптамер-мишень или молекулы-мишени, где обнаружение аптамера, комплекса аптамер-мишень или молекулы-мишени указывает на то, что молекула-мишень присутствует в образце, и при этом отсутствие обнаружения аптамера, комплекса аптамер-мишень или молекулы-мишени указывает на то, что молекула-мишень отсутствует в образце;
где аптамер представляет собой аптамер в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-14.
Вариант осуществления 46. Способ в соответствии с вариантом осуществления 45, где способ включает по меньшей мере одну дополнительную стадию, выбранную из: добавления молекулы конкурента к образцу; захвата комплекса аптамер-мишень на твердую подложку и добавления молекулы конкурента и разбавления образца; где по меньшей мере одну дополнительную стадию проводят после стадии (a) или стадии (b).
Вариант осуществления 47. Способ в соответствии с вариантом осуществления 46, где молекула конкурента выбрана из полианионного конкурента.
Вариант осуществления 48. Способ в соответствии с вариантом осуществления 47, где полианионный конкурент выбран из олигонуклеотида, полидекстрана, ДНК, гепарина и дНТФ.
Вариант осуществления 49. Способ в соответствии с вариантом осуществления 48, где полидекстран представляет собой сульфат декстрана; и ДНК представляет собой ДНК молок сельди или ДНК молок лосося.
Вариант осуществления 50. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 45-49, где молекула-мишень выбрана из белка, пептида, углевода, малой молекулы, клетки и ткани.
Вариант осуществления 51. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 45-50, где образец выбран из цельной крови, лейкоцитов, мононуклеарных клеток периферической крови, плазмы, сыворотки, мокроты, выдыхаемого воздуха, мочи, семенной жидкости, слюны, менингеальной жидкости, околоплодной жидкости, жидкости из желез, лимфатической жидкости, аспирата из сосков, бронхиального аспирата, синовиальной жидкости, суставного аспирата, клеток, клеточной вытяжки, кала, ткани, тканевого биопсийного материала и спинномозговой жидкости.
Вариант осуществления 52. Способ выявления мишени в образце, включающий
a) приведение в контакт образца с первым аптамером с образованием смеси, где первый аптамер способен к связыванию с мишенью с образованием первого комплекса;
b) инкубирование смеси в условиях, которые обеспечивают образование первого комплекса;
c) приведение в контакт смеси со вторым аптамером, где второй аптамер способен к связыванию с первым комплексом с образованием второго комплекса;
d) инкубирование смеси в условиях, которые обеспечивают образование второго комплекса;
e) выявление наличия или отсутствия первого аптамера, второго аптамера, мишени, первого комплекса или второго комплекса в смеси, где присутствие первого аптамера, второго аптамера, мишени, первого комплекса или второго комплекса указывает на то, что мишень присутствует в образце;
где первый аптамер содержит по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин;
где второй аптамер содержит по меньшей мере один третий модифицированный в 5-положении пиримидин;
где первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин являются различными модифицированными в 5-положении пиримидинами.
Вариант осуществления 53. Способ в соответствии с вариантом осуществления 52, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин.
Вариант осуществления 54. Способ в соответствии с вариантом осуществления 53, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин.
Вариант осуществления 55. Способ в соответствии с вариантом осуществления 53 или вариантом осуществления 54, где модифицированный в 5-положении уридин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента и фрагмента морфолинo.
Вариант осуществления 56. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 53-55, где модифицированный в 5-положении цитидин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента и фрагмента морфолинo.
Вариант осуществления 57. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 53-56, где модифицированный в 5-положении цитидин выбран из NapdC, 2NapdC, TyrdC и PPdC.
Вариант осуществления 58. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 53-57, где модифицированный в 5-положении уридин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU.
Вариант осуществления 59. Способ в соответствии с вариантом осуществления 52, где по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой NapdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU.
Вариант осуществления 60. Способ в соответствии с вариантом осуществления 52, где по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой PPdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU.
Вариант осуществления 61. Способ в соответствии с вариантом осуществления 59 или вариантом осуществления 60, где по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой TyrdU.
Вариант осуществления 62. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 52-61, где третий модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из модифицированного в 5-положении цитидина и модифицированного в 5-положении пиримидина.
Вариант осуществления 63. Способ в соответствии с вариантом осуществления 62, где третий модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из BndC, PEdC, PPdC, NapdC, 2NapdC, NEdC, 2NEdC, TyrdC, BNdU, NapdU, PedU, IbdU, FbndU, 2NapdU, NedU, MbndU, BfdU, BtdU, PpdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU.
Вариант осуществления 64. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 52-63, где молекула-мишень выбрана из белка, пептида, углевода, малой молекулы, клетки и ткани.
Вариант осуществления 65. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 52-64, где первый аптамер, второй аптамер и мишень способны к образованию тримерного комплекса.
Вариант осуществления 66. Способ идентификации одного или нескольких аптамеров, способных к связыванию с молекулой-мишенью, включающий:
(a) приведение в контакт библиотеки аптамеров с молекулой-мишенью с образованием смеси и обеспечение образования комплекса аптамер-мишень, где комплекс аптамер-мишень образуется, когда аптамер обладает аффинностью по отношению к молекуле-мишени;
(b) отделение комплекса аптамер-мишень от остальной части смеси (или обогащение в отношении комплекса аптамер-мишень);
(c) диссоциацию комплекса аптамер-мишень и
(d) идентификацию одного или нескольких аптамеров, способных к связыванию с молекулой-мишенью;
где библиотека аптамеров содержит множество полинуклеотидов, где каждый полинуклеотид содержит по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин являются различными модифицированными в 5-положении пиримидинами.
Вариант осуществления 67. Способ в соответствии с вариантом осуществления 66, где каждый полинуклеотид содержит фиксированный участок на 5'-конце полинуклеотида.
Вариант осуществления 68. Способ в соответствии с вариантом осуществления 67, где фиксированный участок на 5'-конце каждого полинуклеотида составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или по меньшей мере 30 нуклеотидов в длину, или от 5 до 30, от 10 до 30, от 15 до 30, от 5 до 20 или от 10 до 20 нуклеотидов в длину.
Вариант осуществления 69. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 66-68, где каждый полинуклеотид содержит фиксированный участок на 3'-конце полинуклеотида.
Вариант осуществления 70. Способ в соответствии с вариантом осуществления 69, где фиксированный участок на 3'-конце полинуклеотида составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или по меньшей мере 30 нуклеотидов в длину, или от 5 до 30, от 10 до 30, от 15 до 30, от 5 до 20 или от 10 до 20 нуклеотидов в длину.
Вариант осуществления 71. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 66-70, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин.
Вариант осуществления 72. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 66-71, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин.
Вариант осуществления 73. Способ в соответствии с вариантом осуществления 71 или вариантом осуществления 72, где модифицированный в 5-положении уридин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента и фрагмента морфолинo.
Вариант осуществления 74. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 71-73, где модифицированный в 5-положении цитидин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента и фрагмента морфолинo.
Вариант осуществления 75. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 71-74, где модифицированный в 5-положении цитидин выбран из NapdC, 2NapdC, TyrdC и PPdC.
Вариант осуществления 76. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 71-75, где модифицированный в 5-положении уридин выбран из NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU.
Вариант осуществления 77. Способ в соответствии с вариантом осуществления 66, где по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой NapdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TrydU, TrpdU и ThrdU.
Вариант осуществления 78. Способ в соответствии с вариантом осуществления 66, где по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой PPdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU.
Вариант осуществления 79. Способ в соответствии с вариантом осуществления 77 или вариантом осуществления 78, где по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой TyrdU.
Вариант осуществления 80. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 66-79, где каждый полинуклеотид содержит произвольный участок.
Вариант осуществления 81. Способ в соответствии с вариантом осуществления 80, где произвольный участок составляет от 20 до 100, или от 20 до 90, или от 20 до 80, или от 20 до 70, или от 20 до 60, или от 20 до 50, или от 20 до 40, или от 30 до 100, или от 30 до 90, или от 30 до 70, или от 30 до 60, или от 30 до 50, или от 30 до 40 нуклеотидов в длину.
Вариант осуществления 82. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 66-81, где каждый полинуклеотид составляет от 20 до 100, или от 20 до 90, или от 20 до 80, или от 20 до 70, или от 20 до 60, или от 20 до 50, или от 30 до 100, или от 30 до 90, или от 30 до 80, или от 30 до 70, или от 30 до 60, или от 30 до 50, или от 40 до 100, или от 40 до 90, или от 40 до 80, или от 40 до 70, или от 40 до 60, или от 40 до 50 нуклеотидов в длину.
Вариант осуществления 83. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 66-82, где каждый полинуклеотид представляет собой аптамер, который связывает мишень, и при этом библиотека содержит по меньшей мере 1000 аптамеров, где каждый аптамер содержит различные нуклеотидные последовательности.
Вариант осуществления 84. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 66-83, где стадии (a), (b) и/или (c) повторяют по меньшей мере один раз, два раза, три раза, четыре раза, пять раз, шесть раз, семь раз, восемь раз, девять или десять раз.
Вариант осуществления 85. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 66-84, где один или несколько аптамеров, способных к связыванию с молекулой-мишенью, являются амплифицированными.
Вариант осуществления 86. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 66-85, где смесь содержит молекулу полианионного конкурента.
Вариант осуществления 87. Способ в соответствии с вариантом осуществления 86, где полианионный конкурент выбран из олигонуклеотида, полидекстрана, ДНК, гепарина и дНТФ.
Вариант осуществления 88. Способ в соответствии с вариантом осуществления 87, где полидекстран представляет собой сульфат декстрана; и ДНК представляет собой ДНК молок сельди или ДНК молок лосося.
Вариант осуществления 89. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 66-88, где молекула-мишень выбрана из белка, пептида, углевода, малой молекулы, клетки и ткани.
Вариант осуществления 90. Аптамер в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-14, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин способны к встраиванию посредством фермента полимеразы.
Вариант осуществления 91. Композиция в соответствии с любым из вариантов осуществления 15-44, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин способны к встраиванию посредством фермента полимеразы.
Вариант осуществления 92. Способ в соответствии с любым из вариантов осуществления 45-89, где первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин способны к встраиванию посредством фермента полимеразы.
Вариант осуществления 93. Аптамер в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-14 и 90, где аптамер характеризуется улучшенной стабильностью в присутствии нуклеаз по сравнению с аптамером такой же длины и с нуклеотидной последовательностью, которая содержит немодифицированный пиримидин вместо каждого из первых модифицированных в 5-положении пиримидинов или немодифицированный пиримидин вместо каждого из второго модифицированного в 5-положении пиримидина.
Вариант осуществления 94. Аптамер в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-14, 90 и 93, где аптамер характеризуется более длительным периодом полувыведения из сыворотки человека по сравнению с аптамером такой же длины и с нуклеотидной последовательностью, которая содержит немодифицированный пиримидин вместо каждого из первых модифицированных в 5-положении пиримидинов или немодифицированный пиримидин вместо каждого из второго модифицированного в 5-положении пиримидина.
ПРИМЕРЫ
[00117]
Следующие примеры представлены с целью более полной иллюстрации некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения. Тем не менее, никоим образом не следует истолковывать их как ограничивающие широкий объем настоящего изобретения. Специалисты в данной области техники могут легко принять основополагающие принципы данного открытия для разработки различных соединений без отступления от сущности настоящего изобретения.
Пример 1. Аптамеры, содержащие два модифицированных основания
[00118]
(фиг. 1).
15
Для сравнения относительной эффективности SELEX с двумя модифицированными основаниями анализировали пять единичных модификаций по dU (Nap-dU, PP-dU, MOE-dU, Tyr-dU и Thr-dU) с немодифицированным dT в качестве контроля и комбинации с модификациями по dC (Nap-dC и PP-dC) с немодифицированным dC в качестве контроля для всего 18 исходных библиотек Типы тестируемых модификаций включали гидрофобные ароматические боковые цепи, аналогичные гидрофобным боковым цепям в аминокислотах. Также тестировали гидрофильные боковые цепи при dU (MOE-dU и ThrdU). Каждая из 18 библиотек, содержащая 30 рандомизированных нуклеотидов, обеспечивала ≥10 различных последовательностей. Библиотеки ферментативно синтезировали с применением природных и/или модифицированных нуклеотидтрифосфатов с применением ДНК-полимеразы из KOD, Exo- (данные не показаны).
[00119]
(Таблица 2)
Тридцать (30N) рандомизированных библиотек нуклеотидов применяли вместо предыдущих 40N рандомизированных библиотек с одним модифицированным dU. Без ограничения какой-либо конкретной теорией, было высказано предположение, что повышение плотности модифицированных оснований будет обеспечивать более короткие аптамеры с высокой аффинностью. Дополнительно, библиотеки с более короткими олигонуклеотидами обеспечивают более высокие выходы. Соотношение каждого нуклеотида составляло 1:1:1:1 для dA/dC/dG/dT (25% каждый). В каждом случае произвольный участок фланкировали фиксированными последовательностями для гибридизации праймеров для ПЦР-амплификации с дополнительными спейсерами на 5'-конце и на 3'-конце. Применяли синтетический шаблон для генерации модифицированных библиотек во всех положениях dU и или dC, однородно модифицированных в реакциях замещения с удлинением праймера.
[00120]
32
4
2
4
4
Всего 18 ферментативно синтезированных библиотек, содержащих один модифицированный dU (Nap-dU,PP-dU, MOE-dU, Tyr-dU и /Thr-dU) с немодифицированным dT в качестве контроля; один модифицированный dC (Nap-dC и PP-dC) с немодифицированным dC в качестве контроля и комбинацию двух модифицированных оснований: либо Nap-dC, либо PP-dC, со всеми возможными модифицированными dU (Nap-dU, PP-dU, MOE-dU, Tyr-dU и Thr-dU). Качественные реакции удлинения праймера (в трех повторностях) проводили с применением антисмыслового шаблона, меченного радиоактивным изотопом 5'-праймера с природными или модифицированными нуклеотидтрифосфатами и полимеразой из KOD (Exo-) в растворе следующим образом. В 60 пл реакционной смеси для удлинения праймера, 20 пмоль биотинилированной антисмысловой библиотеки смешивали с 40 пмоль холодного 5'-праймера (2X) и следовыми количествами меченного P 5'-праймера, 0,5 мМ природного или модифицированного дНТФ в 1X буфере SQ20 (120 мМ Трис-HCl, pH 7,8; 10 мМ KCl; 6 мМ (NH)SO; 7 мМ MgSO, 0,1% Triton X-100 и 0,1 мг/мл BSA) и 0,25 ед./мл полимеразы из KOD (Exo-). Смесь нагревали-охлаждали перед добавлением ДНК-полимеразы и реакцию проводили при 68°C в течение 2 ч., затем охлаждали при 10°C. Фракцию из каждой из реакций с библиотеками пропускали через гель на основе 10% TBU-мочевина наряду со свободным меченным праймером. Небольшую аликвоту прогоняли через денатурирующие гели, которые подвергали воздействию люминесцентных экранов, и получали изображения с помощью устройства для формирования изображения на люминесцентном фосфорном покрытии Fuji, производили количественный анализ полос с применением программного обеспечения ImageGauge 4.0 и результаты наносили на график в программном обеспечении Graph pad Prism 6.05. Для получения исходных библиотек проводили крупномасштабные реакции удлинения праймера с применением эталонной биотинилированной антисмысловой рандомизированной библиотеки, захваченной на стрептавидин-агарозные частицы высокой емкости Pierce™ (Life Technologies). Более низкие выходы библиотек получали для некоторых двух комбинаций модифицированных нуклеозидов, например, 28 ± 1,3% для Nap-dC/Nap-dU, 40 ± 5,2% для Nap-dC/MOE-dU и 43 ± 2,7% для PP-dC/Nap- dU по сравнению с контролем, представляющим собой библиотеку на основе на 100% немодифицированной ДНК (dC/dT). Рассчитывали частоту для каждого нуклеотида на основании результатов секвенирования, полученных для исходной библиотеки и эталонного антисмыслового рандомизированного шаблона, применяемого для генерации каждой из библиотек с модификацией по одному и двум основаниям. Эталонный рандомизированный антисмысловой шаблон (30N) химически синтезировали при соотношении 1:1:1:1 dA:dG:dC:dT (TriLink Biotechnologies) при масштабе 1 пМ. Исходные рандомизированные библиотеки с модификацией по одному основанию и по двум основаниям ферментативно синтезировали в крупномасштабной реакции и применяли в экспериментах по отбору. Такие библиотеки секвенировали наряду с обогащенными пулами и наносили значения частоты для нуклеотидов с всего 100% для всех четырех оснований в произвольном участке 30N. Значительного отклонения в значениях частоты нуклеотидов не наблюдали, когда состав оснований в библиотеках определяли с применением глубокого секвенирования по сравнению с исходной библиотекой на основе синтетического природного ДНК-шаблона и ферментативно синтезированной контрольной исходной библиотекой на основе немодифицированной ДНК (данные не показаны).
[00121]
См.
Библиотеки применяли для отбора аптамеров, которые связывают PCSK9. Отборы проводили по сути, как сообщалось ранее, с применением сульфата декстрана в качестве полианионного конкурента всего для шести раундов с применением возрастающего разбавления мишени во время каждого из последующих раундов отбора.  таблицу 1 (R1=раунд 1, R2=раунд 2 и т. д.). Отбор начинали со смешивания модифицированных рандомизированных библиотек (или немодифицированного контроля) (≥1000 пмоль) и рекомбинантный белок-мишень, PCSK9, человека с His-меткой, который находился при концентрации 0,5 пМ в объеме 100 пл. Отобранные комплексы разделяли путем захвата His-метки с помощью магнитных частиц Dynabeads, несвязанные последовательности промывали, отобранные аптамеры элюировали и амплифицировали с помощью ПЦР с применением всех природных нуклеотидов и праймера с биотином на 3'-конце. Природные двунитевые ДНК, биотинилированные на 3'-конце, захватывали с помощью стрептавидиновых частиц C1 MyOne™ Dynabeads, нетранскрибируемые нити отщепляли посредством щелочной денатурации и заменяли модифицированными dC и/или dU в реакциях удлинения праймера с регенерацией обогащенного пула и цикл отбора повторяли с разбавленным белком. Концентрацию белка для следующего раунда SELEX определяли по отношению сигнал/фон, рассчитанному по критическому значению времени цикла (Ct) для каждого образца.
Таблица 1. Условия отбора
in vitro
<b>Состав</b><b>библиотеки</b>
<b>R1 ДНК</b><b>[нМ]</b>
<b>R2-R6</b><b>ДНК</b><b>[нМ]</b>
<b>PCSK9 [нМ]</b>
<b>R1</b>
<b>R2</b>
<b>R3</b>
<b>R4</b>
<b>R5</b>
<b>R6</b>
dC/dT (контрольнаяДНК)
10 000
100
500
100
50
50
50
50
Nap-dC/dT
10 000
100
500
100
100
10
10
0,1
PP-dC/dT
10 000
100
500
100
100
100
100
10
dC/Nap-dU
10 000
100
500
100
50
50
5
0,5
dC/PP-dU
10 000
100
500
100
100
100
10
1
dC/MOE-dU
10 000
100
500
100
100
100
100
100
dC/Tyr-dU
10 000
100
500
100
100
100
50
5
dC/Thr-dU
10 000
100
500
100
100
100
100
10
Nap-dC/Nap-dU
10 000
100
500
100
50
10
1
0,1
Nap-dC/PP-dU
10 000
100
500
100
100
10
1
0,1
Nap-dC/MOE-dU
10 000
100
500
100
100
100
10
1
Nap-dC/Tyr-dU
10 000
100
500
100
100
10
1
0,1
Nap-dC/Thr-dU
10 000
100
500
100
100
100
10
1
PP-dC/PP-dU
10 000
100
500
100
100
100
10
1
PP-dC/Nap-dU
10 000
100
500
100
100
100
10
1
PP-dC/MOE-dU
10 000
100
500
100
100
100
100
100
PP-dC/Tyr-dU
10 000
100
500
100
50
10
1
0,1
PP-dC/Thr-dU
10 000
100
500
100
100
100
10
1
[00122]
Синтезировали 5'-праймер для амплификации, содержащий (AT4)-хвост, и 3'-праймер, содержащий (A-биотин)2-T8-хвост (SEQ ID NO: 82), которые исключают добавление модифицированных dC или dU при модификации библиотек.
Таблица 2. Последовательность природного ДНК-шаблона, праймеров, применяемых в SELEX
<b>Название</b>
<b>Последовательность</b>
Анти-AB2-30N41.36SEQ ID NO: 1
(Ab2)TTTTTTTTCTCTTTCTCTTCTCTCTTTCTCC<b>30N</b>GACCCACCCAGCGTGG
(AT)4-5P41SEQ ID NO: 2
ATATATATCCACGCTGGGTGGGTC
(AB)2(T)8-3P3SEQ ID NO: 3
(Аb2)TTTTTTTTCTCTTTCTCTTCTCTCTTTCTCC
[00123]
(фиг. 2).
(фиг. 3).
d
После шести раундов отборов аптамеры, содержащие природные нуклеотиды, подвергали глубокому секвенированию с применением прибора Ion Torrent PGM. Проводили анализ последовательностей с применением специального программного обеспечения с применением локального группового выравнивания. Данные из анализа последовательностей для всех обогащенных пулов продемонстрировали, что комбинации библиотек с двумя модификациями приводят к более высокому разнообразию в обогащенных последовательностях по сравнению с библиотекой с одной модификацией (данные не показаны). Для испытания аффинности связывания аптамеров выбирали обширное множество последовательностей, представляющий не только многокопийные уникальные последовательности, но также низкокопийные последовательности из разных семейств (данные не показаны). Все аптамеры химически синтезировали посредством стандартной твердофазной фосфорамидитной химии с применением модифицированных/немодифицированных фосфорамидитных реагентов. Сначала в отношении всех аптамеров проводили скрининг, укороченных 40-мерных аптамеров, содержащих произвольный участок из 30 нуклеотидов и дополнительных 5 нуклеотидов из фиксированных праймерных участков с 5'- и 3'-концов, в отношении их значений аффинности связывания PCSK9 в растворе с помощью анализов методом связывания на фильтрах с применением радиоактивной метки. Укороченные аптамеры (40-мерные) содержали 10 нуклеотидов на фиксированных участках. Библиотека на основе немодифицированной контрольной ДНК (dC/dT) не приводила к каким-либо активным последовательностям (K< 32 нМ), чего ожидали, поскольку аффинность пула по отношению к данной библиотеки была плоской (данные не показаны), а также по данным глубокое секвенирование не приводило к каким-либо обогащенным многокопийным последовательностям (данные не показаны). Библиотеки с одной модификацией, с модификацией Nap (нафтилом) либо при dC, либо при dU, приводили к аптамерам, характеризующимся аффинностью по отношению к мишени, однако аптамеры, характеризующиеся наивысшей аффинностью по отношению к мишени, получали с модифицированным Nap (нафтильным фрагментом) или PP (бензильным фрагментом) dC с модифицированным Tyr (тирозильным фрагментом) dU Замена Tyr-dU dT приводила к отсутствию связывания с мишенью, что указывает на важность тирозильных фрагментов для взаимодействий со связыванием с поверхностью мишени PCSK9 (данные не показаны). Данные аффинности продемонстрировали, что аптамеры с двумя модифицированными нуклеотидами в целом обладали более высокой аффинностью по сравнению с аптамерами с одним модифицированным нуклеотидом, а также обеспечивали большее число аптамеров, которые связываются с PCSK9, по сравнению с аптамерами с одним модифицированным нуклеотидом Дополнительно, многокопийные аптамеры с одним модифицированным нуклеотидом характеризуются средними значениями аффинности 0,1-100 нМ, при этом многокопийные аптамеры с двумя модифицированными нуклеотидами характеризуются средними значениями аффинности ≤ 0,1 нМ.
[00124]
Сводные данные сравнения аптамеров с одной модификацией (40-мерных) и аптамеров с двумя модификациями (40-мерных) в отношении PCSK9 показаны в таблице 3 ниже.
Таблица 3. Сводные данные для связывания в отношении PCSK9 для аптамеров с одной и двумя модификациями
<b>Мишень PCSK9</b>
<b>Категория</b>
<b>Модификация в 5-положении аптамера</b>
<b>% апта</b><b>меров, тестируемых при Kd ≤ 10 нМ</b>
<b>Общее число аптамеров, аптамеров</b>
<b>Kd для аптамера с наивысшей аффинностью по отношению к мишени</b>
<b>Общее число аптаме</b><b>ров, не предусматривающих связы</b><b>вание</b>
<b>% аптамеров, не предусматривающих связывание</b>
Контроль (немодифицированный)
dC/dT
0%
19
Н/Д
19
100%
С одной мод.
NapdC/dT
57%
23
0,25 нМ
6
26%
PPdC/dT
0%
8
Н/Д
8
100%
dC/NapdU
29%
24
0,28 нМ
11
46%
dC/PPdU
22%
18
0,18 нМ
12
67%
dC/MOEdU
0%
7
Н/Д
7
100%
dC/TyrdU
0%
15
20 нМ
9
60%
dC/ThrdU
0%
18
Н/Д
18
100%
С двумя мод.
NapdC/NapdU
70%
37
0,16 нМ
7
19%
NapdC/PPdU
72%
32
0,05 нМ
7
22%
NapdC/MOEdU
20%
25
0,19 нМ
14
56%
NapdC/TyrdU
65%
34
0,03 нМ
10
29%
NapdC/ThrdU
3%
40
0,23 нМ
38
95%
PPdC/PPdU
44%
34
0,13 нМ
9
26%
PPdC/NapdU
78%
32
0,14 нМ
5
16%
PPdC/MOEdU
17%
6
0,1 нМ
5
83%
PPdC/TyrdU
80%
35
0,04 нМ
5
14%
PPdC/ThrdU
0%
35
Н/Д
35
100%
[00125]
На основании информации в таблице 3 процент всех анализируемых аптамеров с одной модификацией, которые продемонстрировали отсутствие связывания, составлял 62%. Не предусматривающий связывания определяют как аптамер, характеризующийся Kd 320 нМ или больше. Процент всех аптамеров с одной модификацией с Kd ≤ 10 нМ составлял менее 21%, и средняя Kd для всех аптамеров с одной модификацией составляла 5,2 нМ. Напротив, процент для всех анализируемых аптамеров с двумя модификациями (с двумя мод.), которые продемонстрировали отсутствие связывания, составлял 43%. Дополнительно, процент всех аптамеров с двумя модификациями с Kd ≤ 10 нМ составлял 47%, и средняя Kd для всех аптамеров с двумя модификациями составляла 0,12 нМ.
Пример 2. Усечение аптамеров с двумя модификациями
[00126]
(фиг. 4A).
(фиг. 4B).
фиг. 4B
фиг. 4B
Исследовали влияние дополнительного усечения на связывание аптамера с высокой аффинностью (Kd <1 нМ). Аптамеры укорачивали до 30-мерных, что представляло собой уменьшение в длину на 25%. Комбинация PP-dC/Tyr-dU имела самое большое число аптамеров, которые могли быть укорочены до 30-мерных, при этом все еще сохраняя аффинность связывания Аптамеры с модификацией по одному основанию продемонстрировали возможность укорачивания на 21,5% (синий столбик, 3/14), аптамеры с модификацией по двум основаниям Nap-dC с модифицированными dU продемонстрировали возможность укорачивания на 23% (красный столбик, 11/48), при этом аптамеры с модификацией по двум основаниям PP-dC с другими модифицированными dU продемонстрировали повышенную возможность укорачивания на 60% (зеленый столбик, 27/45). Доля в процентах и число 40-мерных, которые могут быть укорочены до 30-мерных, также были более высокими для комбинаций PP-dC с PP-dU, Nap-dU или Tyr-dU с модификацией по двум основаниям по сравнению с другими библиотеками Из библиотек с модификацией по одному основанию тестировали меньшее количество аптамеров, поскольку среди них только 14 аптамеров характеризовались аффинностью ≤ 1 нМ из трех библиотек (40-мерные, в серой зоне на для одной мод.). Напротив, число аптамеров из библиотек с модификацией по двум основаниям с высокой аффинностью составляло 93 (40-мерные, в серой зоне на для двух мод.), 48 для Nap-dC с модифицированными dU и 45 для PP-dC с модифицированными dU. Черная горизонтальная линия на каждой из библиотек указывает на медианное значение для всех аптамеров в такой библиотеке. Без ограничения какой-либо конкретной теорией, возможно, что удлиненная углеродная цепь в модифицированном PP основании (по сравнению с другими модификациями) способствует достижению недостижимых эпитопов на поверхности мишени, и при этом для нее не требуются фиксированные праймерные участки для структурной укладки и эффективных взаимодействий для связывания белка.
[00127]
(фиг. 5)
Также оценивали специфичность аптамеров для PCSK9 с различными другими пропротеинконвертазами (PC). Из каждой библиотеки отбирали три аптамера с наивысшей аффинностью (n=33, 40-мерные; не из контрольной библиотеки на основе немодифицированной ДНК, только два аптамера из библиотеки dC/Tyr-dU и один аптамер из библиотеки PP-dC/MOE-dU) и тестировали в отношении их специфичности с другими PC. Результаты продемонстрировали, что аптамеры были специфичными в отношении PCSK9 и не выявляли наблюдаемого связывания с другими PC при концентрациях 100 нМ.
[00128]
фиг. 6.
(фиг. 6).
d
Тестировали межвидовую перекрестную реактивность укороченных аптамеров (n=41, 30-мерные) с величиной K ≤ 1 нМ в отношении PCSK9 грызунов (мышь и крыса) и макаки-резус (см. таблицу 4). Процент идентичности между PCSK9 у различных видов показан в верхней части графика на PCSK9 мыши/крысы приблизительно на 76% идентичен белкам обезьяны и человека. Большая часть аптамеров связывается с PCSK9 макаки-резус с подобными значения аффинности (идентичность 96,4%), однако несколько аптамеров из библиотек с двумя модификациями (PP-dC/Nap-dU и PP-dC/Tyr-dU) связываются с PCSK9 крысы и мыши (идентичность -76%). Такие результаты продемонстрировали, что некоторые библиотеки с модификацией по двум основаниям (например, PP-dC/Nap-dU и PP-dC/Tyr-dU) генерировали аптамеры, которые могут связываться с PCSK9 как грызунов, так и человека/обезьяны с подобными значениями аффинности
Таблица 4. Межвидовая активность связывания для аптамеров с одной и двумя модификациями
Состав
ЧеловекPCSK9Kd (пМ)
ОбезьянаPCSK9Kd (пМ)
МышьPCSK9Kd (пМ)
КрысаPCSK9Kd (пМ)
Nap-dC/dT
150
149
-
-
Nap-dC/dT
114
56
-
-
dC/Nap-dU
223
174
-
-
Nap-dC/Nap-dU
362
461
-
-
Nap-dC/Nap-dU
609
1710
-
-
Nap-dC/Nap-dU
144
351
-
-
Nap-dC/Pp-dU
379
934
-
-
Nap-dC/Pp-dU
68
924
-
-
Nap-dC/Moe-dU
82
83
-
-
Nap-dC/Moe-dU
172
169
-
-
Nap-dC/Tyr-dU
411
177
-
-
Nap-dC/Tyr-dU
484
70
-
-
Nap-dC/Tyr-dU
191
193
-
-
Nap-dC/Tyr-dU
805
987
-
-
Pp-dC/Pp-dU
186
189
-
-
Pp-dC/Pp-dU
162
198
-
-
Pp-dC/Pp-dU
220
1150
-
-
Pp-dC/Pp-dU
564
638
-
-
Pp-dC/Pp-dU
53
106
-
-
Pp-dC/Pp-dU
213
229
-
-
Pp-dC/Pp-dU
378
306
-
-
Pp-dC/Pp-dU
93
204
-
-
Pp-dC/Pp-dU
413
402
-
-
Pp-dC/Nap-dU
283
247
23800
-
Pp-dC/Nap-dU
70
74
742
1440
Pp-dC/Nap-dU
69
117
-
-
Pp-dC/Nap-dU
111
140
500
680
Pp-dC/Nap-dU
136
205
3820
18100
Pp-dC/Nap-dU
800
780
-
-
Pp-dC/Nap-dU
127
128
1950
45000
Pp-dC/Tyr-dU
701
-
-
-
Pp-dC/Tyr-dU
187
109
-
-
Pp-dC/Tyr-dU
93
-
-
-
Pp-dC/Tyr-dU
61
45
-
-
Pp-dC/Tyr-dU
62
-
-
-
Pp-dC/Tyr-dU
451
350
1090
858
Pp-dC/Tyr-dU
12
21
-
-
Pp-dC/Tyr-dU
122
-
-
-
Pp-dC/Tyr-dU
28
-
-
-
Pp-dC/Tyr-dU
148
-
-
-
Pp-dC/Tyr-dU
109
-
-
-
«-» указывает на то, что отсутствие связывания определяли в анализе
Пример 3. Связывание аптамеров в сэндвич-анализах
[00129]
(фиг. 7A).
(фиг. 7A).
d
Способ SELEX иногда обеспечивает получение аптамеров, которые преимущественно связываются с преобладающими «аптагенными» эпитопами на поверхности мишени. Следовательно, данные о сэндвич-парах аптамеров ограничены в литературе. В способе отбора для поиска аптамеров, которые могут связываться с различными эпитопами на белке-мишени, могут использоваться модификации, такие как выделение поливалентных аптамеров (MAI-SELEX), матричная платформа по разработке для отборов сэндвич-пар поливалентных аптамеров (AD-MAP), при которых первичный аптамер применяют в избытке для блокирования первого эпитопа в попытке разработать второй аптамер, связывающийся с неконкурирующим сигнальным эпитопом. Чтобы продемонстрировать, обусловленное ли расширенное химическое разнообразие множеством модификаций вместе при dC и dU при отборе аптамеров, которые могут связываться с различными эпитопами на поверхности мишени, разрабатывали анализы скрининга пар сэндвич-методом с применением частиц, в которых применяли связанные с авидином магнитные частицы MagPlex Luminex для захвата биотинилированного первичного аптамера Применяемые частицы для захвата с отдельными аптамерами смешивали вместе для поиска второго партнера связывания в многократной попарной комбинации Для данного эксперимента применяли 40-мерные аптамеры (n=96, 9216 пар) с аффинностью K ≤ 1 нМ из библиотек с модификацией по одному и двум основаниям. Вкратце, отдельные аптамеры (0,05 пмоль на образец) захватывали на одну частицу авидинового типа MagPlex и смешивали вместе (24 частицы в одном эксперименте, 1000 частиц на образец) и захватывали в течение 20 мин. при комнатной температуре при 1850 об./мин. Частицы промывали с помощью IX SBT в течение 2 мин., затем 0,5 мМ промывали свободным биотином в течение 5 мин. в 1XSBT, с последующими 3 промывками IX SBT в течение 2 мин. для каждой. Частицы блокировали свободным стрептавидином течение 5 мин. и снова промывали в течение 2 мин. с помощью IX SBT. Частицы 24 различных типов с отдельными аптамерами смешивали вместе для скрининга сэндвич-партнера для каждого захваченного аптамера. Аптамер для обнаружения или вторичный аптамер разбавляли до 500 нМ в 1XSBT, нагревали-охлаждали и смешивали с PCSK9 (конечная 10 нМ), инкубировали при 25°C в течение 1 ч. Добавляли и инкубировали 1000 частиц для захвата в течение дополнительного 1 ч. при встряхивании. Затем частицы захватывали магнитом, промывали трижды IX SBT в течение 2 мин. каждую и ресуспендировали в 75 пл IX SBT с 0,1% BSA и 100 мкМ DxSO4. К полученному добавляли 75 пл стрептавидина/фикоэритрина (конечная 5 пг/мл) и инкубировали при 25°C в течение 20 мин. при встряхивании. Частицы наконец снова промывали в течение 2 мин. с помощью 1X SBT и считывали на установке Luminex 3D xMAP.
[00130]
фиг. 7C, фиг. 7B).
Библиотеки с модификацией по одному основанию генерировали малое число сэндвич-пар (три), при этом добавление аптамеров из библиотек с модификацией по двум основаниям в комбинации с аптамерами с модификацией по одному основанию приводило к большему числу сэндвич-пар (22 пары). Более того, число сэндвич-пар на библиотеку существенно повышалось, когда оба аптамера-партнера (для захвата и для обнаружения) поступали из библиотек с модификацией по двум основаниям (45 пар,
[00131]
фиг. 7C)
фиг. 8A
8B
(фиг. 8C).
(фиг. 8D),
Многократное связывание эпитопов, полученное в результате скрининга сэндвич-пар, показало, что увеличение химического разнообразия в исходной рандомизированной библиотеке привело к модифицированным аптамерам, которые могут связываться с неконкурирующими сайтами на поверхности мишени. Затем для сэндвич-пар, которые приводили к наивысшим значениям сигнала (концентрация PCSK9 10 нМ; 0,75% из всех тестируемых пар, 70 пар из 9216; проводили измерения в отношении зависимых от концентрации PCSK9 ответов с подмножеством результатов, показанных на (зависимые от концентрации сигналы показаны для первичного аптамера с модификацией по одному основанию dC/PP-dU, и при этом наилучший вторичный, который хорошо выполнял свою функцию, представлял собой аптамер с модификацией по двум основаниям Nap-dC/Nap-dU [треугольники]) и (зависимые от концентрации сигналы показаны для вторичного аптамера с модификацией по двум основаниям Nap-dC/Nap-dU, и при этом наилучший первичный, который хорошо выполнял свою функцию, представлял собой аптамер с модификацией по одному основанию dC/PP-dU [заштрихованные квадраты]). Интересно заметить, что одна конкретная пара, представленная первичным с модификацией по одному основанию (PP-dU, аффинность, Kd 175 пМ) и вторичным с модификацией по двум основаниям (Nap-dU/Nap-dC, аффинность, Kd 531 пМ), приводила к помехоустойчивому сигналу, который был значительно выше такового для любых других пар в одной ориентации Однако, когда данный первичный аптамер с модификацией по одному основанию переключали во вторичный аптамер, сигнал терялся, что указывало на то, что ориентация аптамеров была важна для данной сэндвич-пары. Данная сэндвич-пара аптамеров также может обеспечивать измерение активности мутантного белка с новыми патологическими функциями, PCSK9 D374Y который характеризуется более высокой аффинностью по отношению к LDL-R, чем PCSK9 дикого типа и, как сообщается, сверхэкспрессируется у пациентов с тяжелой формой семейной гиперхолестеринемии (FH). Чувствительность и величина MFU были выше для мутантного PCSK9 D374Y, чем для белка дикого типа.
[00132]
Специфичность сэндвич-пары аптамеров также измеряли по отсутствию эндогенного сигнала, когда рекомбинантным PCSK9 человека обогащали сыворотку новорожденных телят (NBCS) по сравнению с плазмой человек (данные не показаны).
[00133]
(фиг. 9A и 9B
таблицы 5 и 6),
(таблицы 7 и 8),
(таблица 9)
(фиг. 10),
Данную сэндвич-пару дополнительно характеризовали для разработки сэндвич-анализа с применением аптамеров для определения циркулирующих концентраций PCSK9 в плазме в клинических образцах человека. Характеристику сэндвич-анализа оценивали посредством проведения исследований, таких как измерения чувствительности и точности надежности и линейности разбавления в плазме все из которых подтвердили устойчивое окно анализа. Для оценки линейности разбавления в образце для анализа проводили сэндвич-анализ с образцами, содержащими высокие концентрации PCSK9 и/или обогащенные при таких концентрациях. Образцы плазмы (n=5) последовательно разбавляли буфером для анализа, чтобы подогнать значения под динамический диапазон анализа.
[00134]
См.
См.
См.
Предел обнаружения (LLoD), определенный как концентрация PCSK9 (40 пг/мл), которая приводит к более высокому значению RFU по сравнению со средним RFU для холостой пробы (буфер для разбавления) плюс 3 стандартных отклонения, показан в таблице 5. Нижний предел количественного определения (LLoQ) и верхний предел количественного определения (ULoQ), определенные как самая низкая и самая высокая концентрации PCSK9, которые подлежат количественному анализу с применением подгонки логистической кривой для 4 параметров (4PL), применяемой к стандартным кривым с достижением в результате 80-120% определения известных концентраций мишени, показаны в таблице 6. Для определения вариативности результатов одного анализа тестировали пять образцов плазмы с известными концентрациями 16 раз в одном планшете.  таблицу 7. Коэффициенты вариативности (CV) в пределах анализа находились в диапазоне от 4,3% до 6%. Для определения вариативности результатов одного анализа измеряли пять образцов плазмы с известными концентрациями в пяти отдельных анализах.  таблицу 8. CV между анализами находились в диапазоне от 2,3% до 9,8%. Наконец, для определения надежности при измерении в отношении мишени пять образцов плазмы обогащали различными количествами PCSK9 и проводили измерения. Оценивали степень определения уровней PCSK9 после обогащения по всему диапазону анализа.  таблицу 9. Процент определения для образцов в среднем составлял от 83,1% до 137,5% для мишени после обогащения.
[00135]
Набор образцов плазмы, полученных из двух групп индивидуумов, один для контрольной группы (n=42) и другие для группы исследования, в которой субъекты проходили терапию статинами Lipitor (n=42, посредством самоотчета), оценивали с целью определения может ли анализ статистически различаться между такими двумя группами, поскольку известно, что применение статинов приводит к повышению концентраций PCSK9 в плазме. Разрабатывали сэндвич-анализ с применением SOMAmer для захвата или первичного (11723-5) в качестве аптамера с модификацией по одному основанию (PP-dU/dC) и вторичного аптамера или для обнаружения (11727-20) в качестве аптамера с модификацией по двум основаниям (Nap-dC/Nap-dU).
[00136]
(фиг. 11)
Такие результаты указывали на то, что сэндвич-анализ с применением аптамеров может статистически различаться между двумя группами при величине P 0,0044 посредством критерия Манна-Уитни и что данный анализ мог бы применяться при идентификации людей, которые могли бы иметь положительный результат при терапии против PCSK9 вследствие их высоких концентраций PCSK9 в плазме.
[00137]
(фиг. 12).
Сэндвич-анализ с применением аптамеров также применяли для измерения концентраций PCSK9 в бесклеточных супернатантах из клеток HepG2, сверхэкспрессирующих PCSK9, для идентификации сверхэкспрессирующих клонов и для демонстрации исследовательской полезности анализа Обеспечивали сверхэкспрессию PCSK9 в клетках HepG2 с применением системы SBI System Biosciences LentiViral (LV300A-1). Выполняли трансдукцию в клеточную линию HepG2 с помощью лентивирусного клона для экспрессии PCSK9 дикого типа человека, полученного от Origene (RC220000L1), для генерации устойчивой клеточной линии. Проводили скрининг всего 96 отдельных клонов в отношении их способности секретировать PCSK9. Измеряли относительное количество PCSK9, секретируемого в среду, посредством сэндвич-анализа с применением аптамеров для каждого клона и сравнивали с экспрессией из клеток HepG2 дикого типа. Число клеток, используемых для получения рекомбинантного белка, нормализовали с применением люминесцентного анализа жизнеспособности клеток Cell Titer-Glo. Клон под номером 45 секретировал ~ в 100 раз больше PCSK9 по сравнению с клетками HepG2 дикого типа.
Таблица 5. Чувствительность сэндвич-анализа (нижний предел обнаружения)
<b>LLoD количественного определения</b>
<b>№</b>
<b>Холостая проба</b>
<b>PCSK9</b><b>(40 пг/мл)</b>
1
127,5
175,5
2
124
175,5
3
122
179
4
129
181,5
5
136
189,5
6
125,5
185,5
7
117
174,5
8
127,5
170
9
115,5
173,5
10
121
179,5
11
128
166
12
120,5
181,5
13
120,5
181,5
14
130,5
170,5
15
115,5
172
16
130
164
<b>CV (%)</b>
<b>4,73</b>
<b>3,93</b>
Таблица 6. Чувствительность сэндвич-анализа (нижний предел количественного определения)
<b>ULoQ количественного определения</b>
<b>LLoQ количественного определения</b>
Логистическая кривая для 4PL (R<sup>2</sup> =0,99)
Логистическая кривая для 4P L (R<sup>2</sup> =0,99)
<b>PCSK9 (нг/мл)</b>
<b>% ст. определения</b>
<b>PCSK9 (нг/мл)</b>
<b>% ст. определения</b>
Ст. 1
100
Вне диапазона
5
100,1
Ст. 2
31,6000
72,3
2,5
99,3
Ст. 3
9,9856
94,5
1,25
102,6
Ст. 4
3,1554
102,2
0,625
100,2
Ст. 5
0,9971
112,1
0,3125
98,0
Ст. 6
0,3151
108,9
0,156
98,8
Ст. 7
0,0996
89,1
0,078
105,5
Ст. 8
0,0315
54,6
0,039
79,9
Ст. 9
0,0099
Вне диапазона
0,020
82,6
Ст. 10
0,0031
Вне диапазона
0,010
67,2
Ст. 11
0,0010
Вне диапазона
0,005
Вне диапазона
Таблица 7. Точность в анализах
<b>PCSK9 (нг/мл)</b>
<b>№</b>
<b>Плазма 1</b>
<b>Плазма 2</b>
<b>Плазма 3</b>
<b>Плазма 4</b>
<b>Плазма 5</b>
1
139,4
118,8
196,1
220,8
104,4
2
149,4
120,7
164,4
208,5
84,7
3
142
115,9
186,4
224,9
102,3
4
151,4
125,8
196,7
227,1
102
5
147,7
125,6
193,9
226,3
96,7
6
146,6
125,3
183,2
235,2
98,5
7
148,4
123,7
179,4
237,8
100,9
8
133,8
127,6
172
245,1
94,3
9
154,7
130,2
191,3
240,3
100,3
10
147
117,5
181,7
228,3
104,2
11
133
121,3
190,6
229,5
89,3
12
150,9
127,9
189,8
231,3
98
13
146
121,1
193,2
218,5
91,4
14
152,9
125,8
195,2
232,5
100,5
15
126,8
117,7
173,1
220,4
88,2
16
153,6
109
172,9
235,6
93,8
<b>CV (%)</b>
<b>5,4</b>
<b>4,3</b>
<b>5,3</b>
<b>3,9</b>
<b>6</b>
Таблица 8. Точность между анализами
<b>PCSK9 (нг/мл)</b>
<b>№</b>
<b>Плазма 1</b>
<b>Плазма 2</b>
<b>Плазма 3</b>
<b>Плазма 4</b>
<b>Плазма 5</b>
<b>Опыт 1</b>
143,8
111,6
187,0
210,7
99,5
<b>Опыт 2</b>
130,2
99,6
176,7
199,3
93,0
<b>Опыт 3</b>
117,3
106,2
164,4
200,8
83,2
<b>Опыт 4</b>
141,7
111,8
192,2
206,1
90,7
<b>Опыт 5</b>
151,5
112,6
197,1
206,9
91,8
<b>CV (%)</b>
<b>9,8</b>
<b>5,1</b>
<b>7,1</b>
<b>2,3</b>
<b>6,4</b>
Таблица 9. Надежность при измерении в отношении мишени
<b>Образец</b>
<b>Отсутствует</b><b>(необогащенный)</b>
<b>+300 (нг/мл)</b>
<b>+100 (нг/мл)</b>
<b>+30 (нг/мл)</b>
<b>Плазма 1</b>
PCSK9 (нг/мл)
92,4
359,0
192,2
133,7
Определения (%)
-
88,9
99,8
137,5
<b>Плазма 2</b>
PCSK9 (нг/мл)
76,9
351,7
179,8
109,2
Определения (%)
-
91,6
102,9
107,6
<b>Плазма 3</b>
PCSK9 (нг/мл)
137,4
454,5
256,9
172,9
Определения (%)
-
105,7
119,5
118,3
<b>Плазма 4</b>
PCSK9 (нг/мл)
172,0
474,8
275,5
202,3
Определения (%)
-
100,9
103,5
101,1
<b>Плазма 5</b>
PCSK9 (нг/мл)
70,1
334,5
190,6
95,0
Определения (%)
-
88,1
120,5
83,1
Пример 4. Ингибирование активности мишени с помощью аптамеров с двумя модификациями
[00138]
(фиг. 13).
d
50
Для поиска ингибиторов PCSK9, которые блокируют связывание PCSK9 с LDL-R, проводили скрининг 41 укороченного 30-мерного аптамера с K< 1 нМ в анализе с применением планшетов, в котором планшеты покрывали LDL-R и определяли связывание биотинилированного PCSK9 с применением конъюгата стрептавидин-HRP с помощью хемилюминесцентных реагентов Планшеты для ELISA покрывали рекомбинантным LDL-R (Aero Biosystems) (2,5 пг/мл) в течение ночи при 4°C и затем лунки промывали и блокировали Super Block (Invitrogen) в течение 1 ч. при комнатной температуре. Смешивали вместе биотинилированный PCSK9 (Acro Biosystems, Avi-tagged) и аптамер и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч., затем добавляли в планшет для ELISA и дополнительно инкубировали в течение 2 ч. при комнатной температуре при встряхивании. Верхнее значение концентрации PCSK9 составляло 0,5 нМ, и верхнее значение концентрации для аптамера составляло 100 нМ, и такие концентрации затем последовательно разбавляли при  log для кривой ингибирования. Конъюгированный со стрептавидином HRP (Invitrogen, 1 пг/мл) добавляли в лунки и инкубировали в течение 30 мин. при комнатной температуре при встряхивании, добавляли чувствительные к пико-концентрациям хемилюминесцентные субстраты (Invitrogen), измеряли люминесценцию в люминометре (Hidex Plate Chameleon) и данные наносили на график в программном обеспечении Graph Pad Prism 6.0 для расчета значения EC. В качестве контроля применяли нейтрализующее PCSK9 антитело (BPS Bioscience).
[00139]
(фиг. 14)
(фиг. 15A).
(фиг. 15B).
50
50
50
50
Результаты из анализа ингибирования (концентрации для испытания аптамеров при 100 нМ и PCSK9 при 1 нМ) показали, что 70% аптамеров представляли собой ингибиторы (ингибирование свыше 90%), и что некоторые из аптамеров с двумя модификациями потенциально ингибировали взаимодействия PCSK9 с LDL-R (данные не показаны). Аптамеры дополнительно оценивали с помощью кривых доза-ответ для определения их значения EC для ингибирования. Результаты указывали на то, что множество ингибиторов потенциально ингибировали взаимодействие PCSK9 с LDL-R при EC в диапазоне 0,1-1 нМ Для демонстрации потенциальной терапевтической ценности у аптамеров с двумя модификациями, выбирали один аптамер с межвидовой перекрестной реактивностью в отношении PCSK9 (30-мерный, SEQ ID. 11733-91_5 (11733-198)) для измерения аффинности по отношению к мишени для форм PCSK9 у различных видов. Данный аптамер обладал аффинностью, составляющей 14,7, 11,3, 5,2, 77 и 165 пМ для PCSK9 человека (дикого типа), макаки-резус, человека (D374Y с GOF-мутацией), мыши и крысы соответственно Данный аптамер также блокировал взаимодействие PCSK9 дикого типа человека с LDL-R при EC, составляющем 2,1 нМ, и взаимодействие PCSK9 D374Y с GOF-мутацией с LDL-R при EC, составляющем 3,6 нМ Оценивали специфичность данного аптамера в отношении PCSK9 по сравнению с другими PC, и результаты показали, что данный аптамер связывается только с PCSK9 и не связывается с другими PC (данные не показаны).
[00140]
(фиг. 16
фиг. 17).
(фиг. 17.)
50
Для испытания нейтрализующего эффекта аптамера для PCSK9 при блокировании расщепления LDLR тестировали аптамер PP-dC/Nap-dU в анализе обратимого поглощения LDL, при котором клетки HepG2 дикого типа инкубировали в течение 16 ч. с рекомбинантным PCSK9, и затем клетки промывали, и добавляли флуоресцентно меченный LDL в течение 3 ч. Результаты показали, что аптамер способен к обратимому поглощению LDL при EC, составляющем 159 нМ и Дополнительно, обработка аптамера может повысить уровни LDL-R в клетках HepG2, сверхэкспрессирующих PCSK9, как измерено с помощью FACS Такие результаты для аптамера с межвидовой перекрестной реактивностью, с высокой аффинностью, укороченного, специфичного и высоко активного указывают на то, что потенциальная терапевтическая ценность аптамера с модификацией по двум основаниям может быть дополнительно оптимизирована в отношении длины и биологической стабильности посредством модификации после SELEX.
Пример 5. Стабильность в сыворотке аптамеров с двумя модификациями
[00141]
2
Для определения стабильности в сыворотке аптамеров с двумя модификациями в сыворотке человека инкубировали 1 пМ очищенного на геле аптамера в 90% смешанной сыворотке человека в PBS-буфере при общем объеме 200 пл при 37°C. В различные моменты времени отбирали аликвоты по 20 пл и добавляли равный объем смеси EDTA/формамид/краситель (формамид 87,7%, SDS, 0,03%, EDTA натрия, 20 мМ, ксилол цианол, 0,05%, бромфеноловый синий, 0,05%, оранжевый G, 0,1%). Смеси с аликвотами затем выдерживали при -20°C. Перед анализом 40 пл смеси с аликвотой разбавляли 100 пл HO и экстрагировали с помощью 150 мкл смеси 25:24:1 фенол:хлороформ:изоамиловый спирт. Образцы центрифугировали при 16100 x g в течение 15 минут, и удаляли содержащую аптамер водную фазу, и выдерживали при -20°C до анализа на геле.
[00142]
Образцы аптамера загружали на денатурирующий гель 15% TBE PAGE (8 M мочевина) и аптамер окрашивали с помощью 1X (~2 мкМ) SYBR Gold в течение 10 минут. Количество аптамера полной длины в каждый момент времени количественно определяли с применением программного обеспечения для анализа FluorChemQ (Alphalnnotech).
[00143]
фиг. 18.
фиг. 18
Результаты такого эксперимента показаны в таблице 10 и на В таблице 10 показаны состав тестируемых аптамеров в таком эксперименте, доля в процентах аптамера полной длины, остающегося через 96 часов в 90% сыворотке человека, и период полувыведения каждого аптамера, которые рассчитывали посредством подгонки при линейной регрессии с применением количественно определенных на геле данных в программном обеспечении GraphPad Prism 7. На показана доля в процентах аптамера полной длины, остающегося с течением времени. В целом аптамеры с двумя модификациями демонстрировали более высокую стабильность в сыворотке человека с течением времени по сравнению с аптамерами с одной модификацией.
Таблица 10. Состав аптамеров
Аптамер
длина
мод. по dC
мод. по dU
кол-во мод. по dC (%)
кол-во мод. по dU (%)
Число A (%A)
Число C (%C)
Число G (%G)
Число T (%T)
% FL через96 часов
Период полувыведения(часы)
dC/dT
29
отсутствует
отсутствует
отсутствует
отсутствует
7 (24%)
4 (14%)
8 (28%)
10 (34%)
0
11
NapdC/dT
30
Nap-dC
отсутствует
12 (40%)
отсутствует
4 (13,3%)
отсутствует
9 (30%)
5 (16,7%)
39
72
dC/NapdU
30
отсутствует
Nap-dU
отсутствует
5 (16,7%)
10 (33,3%)
6 (20,0%)
9 (30%)
отсутствует
17
23
dC/PPdU
30
отсутствует
PP-dU
отсутствует
11 (36,7%)
7 (23,3%)
6 (20,0%)
6 (20,0%)
отсутствует
57
53
NapdC/NapdU
30
Nap-dC
Nap-dU
5 (16,7%)
4 (13,3%)
9 (30%)
отсутствует
12 (40%)
отсутствует
65
101
NapdC/PPdU
30
Nap-dC
PP-dU
7(23,3%)
8 (26,7%)
5 (16,7%)
отсутствует
10 (33,3%)
отсутствует
44
53
NapdC/MOEdU
30
Nap-dC
MOE-dU
12 (40%)
3 (10,0%)
6 (20,0%)
отсутствует
9 (30%)
отсутствует
40
43
NapdC/TyrdU
30
Nap-dC
Tyr-dU
11 (36,7%)
6 (20,0%)
3 (10,0%)
отсутствует
10 (33,3%)
отсутствует
104
690
PPdC/PPdU
30
PP-dC
PP-dU
7(23,3%)
8 (26,7%)
6 (20,0%)
отсутствует
9 (30%)
отсутствует
108
633
PPdC/NapdU
30
PP-dC
Nap-dU
7(23,3%)
9 (30%)
6 (20,0%)
отсутствует
8 (26,7%)
отсутствует
86
847
PPdC/TyrdU
30
PP-dC
Tyr-dU
6 (20,0%)
12 (40%)
7(23,3%)
отсутствует
5 (16,7%)
отсутствует
75
907
Пример 6. Аптамеры, содержащие два модифицированных основания
[00144]
Применяли библиотеки, описанные в примере 1 для отбора аптамеров, которые связываются с ErbB2, ErbB3 и PSMA. Отборы проводили для каждой мишени по сути, как описано в примере 1. Для ErbB2 и ErbB3 применяли библиотеки с одной модификацией Nap-dC/dT, PP-dC/dT и dC/Tyr-dU; и библиотеки с двумя модификациями Nap-dC/Tyr-dU и PP-dC/Tyr-dU. Для PSMA применяли библиотеку с немодифицированным dC/dT; библиотеки с одной модификацией Nap-dC/dT, PP-dC/dT, dC/Nap-dU, dC-PP-dU dC-MOE-dU и dC/Tyr-dU; и библиотеки с двумя модификациями Nap-dC/Nap-dU, Nap-dC/PP-dU, Nap-dC/MOE-dU, Nap-dC/Tyr-dU, PP- dC/PP-dU, PP-dC/Nap-dU и PP-dC/Tyr-dU.
[00145]
(фиг. 19A-C).
Как и ранее, библиотека на основе немодифицированной контрольной ДНК (dC/dT), которую применяли для PSMA, не приводила к каким-либо аптамерам, которые связываются с PSMA. Библиотеки с одной модификацией, с модификацией Nap (нафтильным фрагментом) либо по dC, либо dU, приводили к связующим для всех трех мишеней, однако библиотеки с двумя модификациями обеспечивали аптамеры с более высокой аффинностью относительно библиотек с одной модификацией
[00146]
Сводные данные сравнения аптамеров с одной модификацией (40-мерных) и аптамеров с двумя модификациями (40-мерных) для каждого из PSMA, ErbB2 и ErbB3 показаны в таблицах 11, 12 и 13 соответственно.
Таблица 11. Сводные данные для связывания в отношении PSMA для аптамеров с одной и двумя модификациями
<b>Мишень PSMA</b>
<b>Категория</b>
<b>Модификация</b><b>в 5-положении</b><b>аптамера</b>
<b>%</b><b>аптамеров,</b><b>тестируемых при</b><b>Kd ≤10 нМ</b>
<b>Общее число</b><b>аптамеров,</b><b>аптамеров</b>
<b>Kd для аптамера</b><b>с наивысшей</b><b>аффинностью по отношению к</b><b>мишени</b>
<b>Общее число</b><b>аптамеров,</b><b>не предусматривающих</b><b>связывание</b>
<b>%</b><b>аптамеров,</b><b>не предусматривающих</b><b>связывание</b>
Контроль(немодифицированный)
dC/dT
0%
6
Н/Д
6
100%
С одной мод.
NapdC/dT
36%
25
0,5 нМ
7
28%
PPdC/dT
0%
7
Н/Д
7
100%
dC/NapdU
13%
24
6,7 нМ
19
79%
dC/PPdU
0%
20
35,5 нМ
17
85%
dC/MOEdU
0%
1
Н/Д
1
100%
dC/TyrdU
5%
21
6,3 нМ
19
90%
dC/ThrdU
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
С двумя мод.
NapdC/NapdU
12%
17
1 нМ
9
53%
NapdC/PPdU
12%
17
0,5 нМ
9
53%
NapdC/MOEdU
15%
13
1,1 нМ
7
54%
NapdC/TyrdU
58%
26
0,3 нМ
9
35%
NapdC/ThrdU
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
PPdC/PPdU
15%
20
1,6 нМ
8
40%
PPdC/NapdU
18%
17
3 нМ
10
59%
PPdC/MOEdU
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
PPdC/TyrdU
0%
24
38,9 нМ
20
83%
PPdC/ThrdU
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т. означает «не тестировали»; Н/Д означает не применимый или нет данных
[00147]
На основании информации в таблице 11 процент всех анализируемых аптамеров с одной модификацией, которые продемонстрировали отсутствие связывания, составлял 71%. Не предусматривающий связывания определяют как аптамер, характеризующийся Kd 320 нМ или больше. Процент всех аптамеров с одной модификацией с Kd ≤ 10 нМ составлял 12%, и средняя Kd для всех аптамеров с одной модификацией составляла 12,3 нМ. Напротив, процент для всех анализируемых аптамеров с двумя модификациями (с двумя мод.), которые продемонстрировали отсутствие связывания, составлял 54%. Дополнительно, процент всех аптамеров с двумя модификациями с Kd ≤ 10 нМ составлял 20%, и средняя Kd для всех аптамеров с двумя модификациями составляла 6,6 нМ.
Таблица 12. Сводные данные для связывания в отношении ERBB2 для аптамеров с одной и двумя модификациями
<b>Мишень ERBB2</b>
<b>Категория</b>
<b>Модификация в 5-положении аптамера</b>
<b>% аптамеров, тестируемых при Kd ≤ 10 нМ</b>
<b>Общее число аптамеров, аптамеров</b>
<b>Kd для аптамера с наивысшей аффинностью по отношению к мишени</b>
<b>Общее число аптамеров, не предусматривающих связывание</b>
<b>% аптамеров, не предусматривающих связывание</b>
Контроль(немодифицированный)
dC/dT
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
С одной мод.
NapdC/dT
0%
23
13,5 нМ
12
52%
PPdC/dT
7%
15
7,8 нМ
8
53%
dC/NapdU
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
dC/PPdU
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
dC/MOEdU
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
dC/TyrdU
0%
29
24,1 нМ
27
93%
dC/ThrdU
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
С двумя мод.
NapdC/NapdU
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
NapdC/PPdU
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
NapdC/MOEdU
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
NapdC/TyrdU
28%
32
0,65 нМ
10
31%
NapdC/ThrdU
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
PPdC/PPdU
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
PPdC/NapdU
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
PPdC/MOEdU
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
PPdC/TyrdU
20%
20
0,74 нМ
13
65%
PPdC/ThrdU
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
[00148] На основании информации в таблице 12 процент всех анализируемых аптамеров с одной модификацией, которые продемонстрировали отсутствие связывания, составлял 70%. Не предусматривающий связывания определяют как аптамер, характеризующийся Kd 320 нМ или больше. Процент всех аптамеров с одной модификацией с Kd ≤ 10 нМ составлял менее 2%, и средняя Kd для всех аптамеров с одной модификацией составляла 15,1 нМ. Напротив, процент для всех анализируемых аптамеров с двумя модификациями (с двумя мод.), которые продемонстрировали отсутствие связывания, составлял 44%. Дополнительно, процент всех аптамеров с двумя модификациями с Kd ≤ 10 нМ составлял 25%, и средняя Kd для всех аптамеров с двумя модификациями составляла 0,7 нМ.
Таблица 13. Сводные данные для связывания в отношении ERBB3 для аптамеров с одной и двумя модификациями
<b>Мишень ERBB3</b>
<b>Категория</b>
<b>Модификация в 5-положенииаптамера</b>
<b>% аптамеров, тестируемых при Kd ≤ 10 нМ</b>
<b>Общее число аптамеров, аптамеров</b>
<b>Kd для аптамера с наивысшей аффинностью по отношению к мишени</b>
<b>Общее число аптамеров, не предусматривающих связывание</b>
<b>% аптамеров, не предусматривающих связывание</b>
Контроль(немодифицированный)
dC/dT
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
С одной мод.
NapdC/dT
75%
28
0,035 нМ
5
18%
PPdC/dT
0%
12
17,5 нМ
3
25%
dC/NapdU
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
dC/PPdU
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
dC/MOEdU
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
dC/TyrdU
17%
23
0,35 нМ
16
70%
dC/ThrdU
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
С двумя мод.
NapdC/NapdU
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
NapdC/PPdU
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
NapdC/MOEdU
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
NapdC/TyrdU
69%
39
0,02 нМ
10
26%
NapdC/ThrdU
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
PPdC/PPdU
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
PPdC/NapdU
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
PPdC/MOEdU
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
PPdC/TyrdU
69%
35
0,02 нМ
8
23%
PPdC/ThrdU
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
Н. Т.
[00149]
На основании информации в таблице 13 процент всех анализируемых аптамеров с одной модификацией, которые продемонстрировали отсутствие связывания, составлял 38%. Не предусматривающий связывания определяют как аптамер, характеризующийся Kd 320 нМ или больше. Процент всех аптамеров с одной модификацией с Kd ≤ 10 нМ составлял 40%, и средняя Kd для всех аптамеров с одной модификацией составляла 6 нМ. Напротив, процент для всех анализируемых аптамеров с двумя модификациями (с двумя мод.), которые продемонстрировали отсутствие связывания, составлял 24%. Дополнительно, процент всех аптамеров с двумя модификациями с Kd ≤ 10 нМ составлял 69%, и средняя Kd для всех аптамеров с двумя модификациями составляла 0,02 нМ.
Пример 7. Дополнительные аптамеры, содержащие два модифицированных основания
[00150]
15
Библиотеки, содержащие каждую из пар для модификации, показанные в таблице 14, получают следующим образом. В некоторых вариантах осуществления каждая библиотека содержит 40 или более рандомизированных нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления каждая библиотека содержит 30 рандомизированных нуклеотидов, обеспечивая ≥ 10 различных последовательностей. Библиотеки может быть ферментативно синтезированы с применением природных и/или модифицированных нуклеотидтрифосфатов с применением ДНК-полимеразы из KOD, Exo-. В некоторых вариантах осуществления произвольный участок фланкируют фиксированными последовательностями для гибридизации праймеров для ПЦР-амплификации с дополнительными спейсерами на 5'-конце и на 3'-конце или без них. В некоторых случаях применяют синтетический шаблон для генерации модифицированных библиотек во всех положениях dU и или dC, однородно модифицированных в реакциях замещения с удлинением праймера. Синтез библиотек может быть проведен по сути, как описано в примере 1.
Таблица 14. Библиотеки аптамеров с двумя модификациями
<b>Состав</b>
<b>1</b>
dC/dT (контроль на основе ДНК)
<b>2</b>
Nap-dC/dT
<b>3</b>
2Nap-dC/dT
<b>4</b>
PP-dC/dT
<b>5</b>
Tyr-dC/dT
<b>6</b>
dC/Nap-dU
<b>7</b>
dC/2Nap-dU
<b>8</b>
dC/PPdU
<b>9</b>
dC/Trp-dU
<b>10</b>
dC/Tyr-dU
<b>11</b>
Nap-dC/Nap-dU
<b>12</b>
Nap-dC/2Nap-dU
<b>13</b>
Nap-dC/PP-dU
<b>14</b>
Nap-dC/Trp-dU
<b>15</b>
Nap-dC/Tyr-dU
<b>16</b>
2Nap-dC/Nap-dU
<b>17</b>
2Nap-dC/2Nap-dU
<b>18</b>
2Nap-dC/PP-dU
<b>19</b>
2Nap-dC/Trp-dU
<b>20</b>
2Nap-dC/Tyr-dU
<b>21</b>
PP-dC/Nap-dU
<b>22</b>
PP-dC/2Nap-dU
<b>23</b>
PP-dC/PP-dU
<b>24</b>
PP-dC/Trp-dU
<b>25</b>
PP-dC/Tyr-dU
<b>26</b>
Tyr-dC/Nap-dU
<b>27</b>
Tyr-dC/2Nap-dU
<b>28</b>
Tyr-dC/PP-dU
<b>29</b>
Tyr-dC/Trp-dU
<b>30</b>
Tyr-dC/Tyr-dU
[00151] Может применяться одна или несколько библиотек из таблицы 14 для отбора аптамеров, которые связываются с мишенью, такой как мишень-белок. Библиотеки, содержащие два модифицированных основания, как правило, приводят к аптамерам, характеризующимся более высокой специфичностью и/или аффинностью по отношению к мишени.
Пример 8. Иллюстративные аптамеры с двумя модификациями
[00152]
PCSK9-связывающие аптамеры из семейства с консервативной последовательностью из пула 11720 (Nap-dC/dT) показаны в таблице 15. Показан только произвольный участок каждой последовательности. Указано число копий каждой последовательности (идентичной или эквивалентной при не более чем 5 ошибочных спариваниях) из всех 11380 последовательностей. Все аптамеры в данном семействе имеют элемент консервативной последовательности TTppGGpp, где p=Nap-dC. Аптамер 11730-6 (SEQ IDNo: 4, Kd=0,1 нМ) являлся характерным представителем, выбранным из данного пула для анализа метаболической стабильности.
Таблица 15. Аптамеры из пула 11720
<b>SEQ ID</b><b>No</b>
<b>Копии</b>
<b>Последовательность произвольного участка</b>
4
401
AAG TTppGGpp GppTpGGGGTpppTGppAA
5
21
ATAppTGGGA TTppGGpp ATTTGpGpAGTT
6
4
TGAAG TTppGGpp GTGpGpATGGTApppAT
7
3
TTTGTGp TTppGGpp TAGpGpAGATATppT
8
1
ATAGG TTppGGpp TTGpGpTGTTTAGApA
9
1
TAGATGppTGGTAT TTppGGpp TTGpGpAT
10
2
TAGTGpppTGATpTA TTppGGpp AAGpppA
11
3
TTTGppppTGGTTApG TTppGGpp TGGpGpA
12
2
ATGppG TTppGGpp TAGpGpTpGTTApppA
13
1
TGAppAppTGTppAA TTppGGpp TAGpGpA
14
1
TAppAGGTA TTppGGpp GAGpGpTGpTATA
15
1
GAGpppAGTTAp TTppGGpp TTGpATTGTA
16
1
AAGAGT TTppGGpp TAppGpATTpApppT
17
1
ApAGTpppApAGTTTAA TTppGGpp GTAGppGpT
18
1
ATAppAGGGTpG TTppGGpp AAGpGpTGTT
19
1
GAG TTppGGpp TAGpGpAGAAGpppTGGAT
20
1
TTTTppAGGAA TTppGGpp AAGpGpTGTGA
21
1
AATTAppTGAGGA TTppGGpp AAGpGpAGA
22
1
pTGpGTTApGpp TTppGGpp TGGpTGATAG
23
1
TAppTGAGTTATGTA TTppGGpp GTGpGpA
24
1
pAAAGpA TTppGGpp TTGpGpAGTAGpppT
25
1
GTAGTTppAGATTGA TTppGGpp TTGpGpT
26
1
AATApTppAGGTGAG TTppGGpp AAGpGpT
[00153]
d
PCSK9-связывающие аптамеры из семейства с консервативной последовательностью из пула 11730 (Nap-dC/Tyr-dU) показаны в таблице 16. Показан только произвольный участок каждой последовательности. Указано число копий каждой последовательности (идентичной или эквивалентной при не более чем 5 ошибочных спариваниях) из всех 17 695 последовательностей. Все аптамеры в данном семействе имеют элемент консервативной последовательности yGpppG, где p=Nap-dC, и Y=Tyr-dU. Множество последовательностей также содержалось в элементе консервативной последовательности yyAyGpAp. Аптамер 11730-19 (SEQ ID No: 27, K=0,2 нМ) являлся характерным представителем, выбранным из данного пула для анализа метаболической стабильности.
Таблица 16. Аптамеры из пула 11730
<b>SEQ ID</b><b>No</b>
<b>Копии</b>
<b>Последовательность произвольного участка</b>
27
680
GyyAypGpAAyGyGpGpppGGG yGpppG pp
28
163
yG yGpppG GAyAyyAApyGyyppGAGpAGy
29
56
yGyyyAyGpApA yGpppG pGAyGApAGyAA
30
44
AGyGyGAyyAyGpApy yGpppG pAyyyGGy
31
15
yAyAGAApAyAAyGpApA yGpppG pAyApy
32
15
yAypAGyyyAyGpApG yGpppG pGAyGApy
33
13
GApyApGAGGGAyGAyGpApA yGpppG pAy
34
11
AyAAyGAyyAyGpApA yGpppG pAyGypAy
35
4
GGpAypGyG yGpppG AyyyypyAAppGGGA
36
4
GppGAAyyyAyGpApp yGpppG pAyGAyyp
37
2
ppAAypAyGApApA yGpppG GAyGAyApy
38
1
yApGA yGpppG GAyAyyGApyGyyppGypG
39
1
pGyAGpGApGGGpGyGGpA yGpppG Gppppp
40
1
yGGyGAGAG yGpppG GAyAyyAApyGyypp
41
1
ypAAAGGppGyG yGpppG AyyyypyAAppG
42
1
yyypGAAGyyGAGpGyGGpAAyApy yGppp
43
1
pGyGyyyAyGpApy yGpppG pGAyyApApp
[00154]
50
d
PCSK9-связывающие аптамеры из семейства с консервативной последовательностью из пула 11733 (Pp-dC/Nap-dU) показаны в таблице 17. Показан только произвольный участок каждой последовательности. Указано число копий каждой последовательности (идентичной или эквивалентной при не более чем 5 ошибочных спариваниях) из всех 16 118 последовательностей. Все аптамеры в данном семействе имеют элемент консервативной последовательности rPPPAAGGrrPAPPG (SEQ ID NO: 83), где r=Pp-dC, и P=Nap-dU. Аптамер 11733-44 (SEQ ID NO: 44, SL1063) представлял собой наиболее активный 30-мерный ингибитор PCSK9 дикого типа человека (IC=2,8 нМ). Аптамер 11733-198 (SEQ ID No: 46, K=0,07 нМ) являлся характерным представителем, выбранным из данного пула для анализа метаболической стабильности.
Таблица 17. Аптамеры из пула 11733
<b>SEQ ID</b><b>No</b>
<b>Копии</b>
<b>Последовательность произвольного участка</b>
44
1041
AArGpA rpppAAGGrrpAppG AGGAAArpr
45
969
rA rpppAAraprpAppG rGGAraprrpGGG
46
340
rGpG rpppAAraprpGppG AGApGrGrprA
47
204
A rpppAAraprpGppG AGGGrrprGGGAAp
48
158
GrrGGp GpppAAGAArpGppG GGGrArppr
49
154
GrGrA rpppAAraprpAppG GGGAGAArpr
50
127
pppAAGGrrpGppG AGGArrprGGrApGAA
51
105
rAA rpppAAGGrrpGppG GGAGAGrrrppG
52
51
GAApArrArG rpppAAraprpAppG GAprG
53
23
GAGAA rpppAAraprpAppG AGGGrrprpG
54
13
rGA rpppAAGGrrpAppG GGGGArprGAr
55
11
GAArA rpppAAraprpGppG GGAAGrGprp
56
10
A rpppAAGGrrpGppG AGGAAArrGprpGA
57
10
AG rpppAAraprpGppG AGAApprGArAAA
58
8
AG rpppAAraprpGppG AGrAGrrprGArr
59
7
GAAGGprAAGpGGrA rpppAAGGrrpGppr
60
7
AAArrA rpppAAraprpGppG GGGrArprp
61
6
AAAr rpppAAraprpAppG AGGpGGGrprA
62
6
pAGGrG rpppAAraprpAppG AGGGArprr
63
4
GpGArG rpppAAraprpAppA GGGrArppr
64
3
GAAArrA rpppAAraprpAppG AGArappr
65
3
GAAA rpppAAraprpAppG AGrAGGAArpr
67
3
rGA rpppAAraprpGppG AAAGprGrGGGG
68
3
A rpppAAraprpGppG AraprGGrprGGArAp
69
2
GAA rpppAAraprpGppG AGGArrAprArG
70
2
ArGpGGAGprGGArA rpppAAGGrrpGppr
71
2
prGrGA rpppAAGGrrpAppG pGGGArprp
72
2
G rpppAAGGrrpAppG AGAprGGrprGGGp
73
2
GA rpppAAGGrrpGppG AAGGprGAGAGpp
74
2
AArGAp rpppAAGGrrpGppA GGGGrppr
75
2
rAAGrpGrrprGrA rpppAArapGpGppG G
76
2
ArrGp GpppAAGAArpGppG GGGGGAArpr
77
1
GAApArrArG rpppAAraprpAppG AGApGrGrprA
78
1
pAAGrrpGAGAAArrA rpppAAraprpppp
79
1
rGAA rpppAAraprpGppG AGrAGrprppr
80
1
AGAAp rpppAAGGrrpGprG AraprprGAG
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> СОМАЛОДЖИК, ИНК.
<120> ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ НУКЛЕОЗИДЫ
<130> 01137-0020-00PCT
<140>
<141>
<150> 62/437,592
<151> 21.12.2016
<150> 62/357,623
<151> 01.07.2016
<160> 83
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 79
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (34)..(63)
<223> a, c, t, g, неизвестный или другие
<400> 1
aatttttttt ctctttctct tctctctttc tccnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn       60
nnngacccac ccagcgtgg                                                    79
<210> 2
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 2
atatatatcc acgctgggtg ggtc                                              24
<210> 3
<211> 33
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 3
aatttttttt ctctttctct tctctctttc tcc                                    33
<210> 4
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 4
aagttccggc cgcctcgggg tccctgccaa                                        30
<210> 5
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 5
atacctggga ttccggccat ttgcgcagtt                                        30
<210> 6
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 6
tgaagttccg gccgtgcgca tggtacccat                                        30
<210> 7
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 7
tttgtgcttc cggcctagcg cagatatcct                                        30
<210> 8
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 8
ataggttccg gccttgcgct gtttagaca                                         29
<210> 9
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 9
tagatgcctg gtatttccgg ccttgcgcat                                        30
<210> 10
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 10
tagtgccctg atctattccg gccaagccca                                        30
<210> 11
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 11
tttgcccctg gttacgttcc ggcctggcgc a                                      31
<210> 12
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 12
atgccgttcc ggcctagcgc tcgttaccca                                        30
<210> 13
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 13
tgaccacctg tccaattccg gcctagcgca                                        30
<210> 14
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 14
taccaggtat tccggccgag cgctgctata                                        30
<210> 15
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 15
gagcccagtt acttccggcc ttgcattgta                                        30
<210> 16
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 16
aagagtttcc ggcctaccgc attcaccct                                         29
<210> 17
<211> 34
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 17
acagtcccac agtttaattc cggccgtagc cgct                                   34
<210> 18
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 18
ataccagggt cgttccggcc aagcgctgtt                                        30
<210> 19
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 19
gagttccggc ctagcgcaga agccctggat                                        30
<210> 20
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 20
ttttccagga attccggcca agcgctgtga                                        30
<210> 21
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 21
aattacctga ggattccggc caagcgcaga                                        30
<210> 22
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 22
ctgcgttacg ccttccggcc tggctgatag                                        30
<210> 23
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 23
tacctgagtt atgtattccg gccgtgcgca                                        30
<210> 24
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 24
caaagcattc cggccttgcg cagtagccct                                        30
<210> 25
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 25
gtagttccag attgattccg gccttgcgct                                        30
<210> 26
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 26
aatactccag gtgagttccg gccaagcgct                                        30
<210> 27
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 27
guuaucgcaa ugugcgcccg ggugcccgcc                                        30
<210> 28
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 28
ugugcccgga uauuaacugu uccgagcagu                                        30
<210> 29
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 29
uguuuaugca caugcccgcg augacaguaa                                        30
<210> 30
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 30
agugugauua ugcacuugcc cgcauuuggu                                        30
<210> 31
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 31
uauagaacau aaugcacaug cccgcauacu                                        30
<210> 32
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 32
uaucaguuua ugcacgugcc cgcgaugacu                                        30
<210> 33
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 33
gacuacgagg gaugaugcac augcccgcau                                        30
<210> 34
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 34
auaaugauua ugcacaugcc cgcaugucau                                        30
<210> 35
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 35
ggcaucgugu gcccgauuuu cuaaccggga                                        30
<210> 36
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 36
gccgaauuua ugcaccugcc cgcaugauuc                                        30
<210> 37
<211> 29
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 37
ccaaucauga cacaugcccg gaugauacu                                         29
<210> 38
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 38
uacgaugccc ggauauugac uguuccgucg                                        30
<210> 39
<211> 31
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 39
cguagcgacg ggcguggcau gcccggcccc c                                      31
<210> 40
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 40
uggugagagu gcccggauau uaacuguucc                                        30
<210> 41
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 41
ucaaaggccg ugugcccgau uuucuaaccg                                        30
<210> 42
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 42
uuucgaaguu gagcguggca auacuugccc                                        30
<210> 43
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 43
cguguuuaug cacuugcccg cgauuacacc                                        30
<210> 44
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 44
aacguacuuu aaggccuauu gaggaaacuc                                        30
<210> 45
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 45
cacuuuaaga ccuauugcgg agacccuggg                                        30
<210> 46
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 46
cgugcuuuaa gaccuguuga gaugcgcuca                                        30
<210> 47
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 47
acuuuaagac cuguugaggg ccucgggaau                                        30
<210> 48
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 48
gccgguguuu aagaacuguu ggggcacuuc                                        30
<210> 49
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 49
gcgcacuuua agaccuauug gggagaacuc                                        30
<210> 50
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 50
uuuaaggccu guugaggacc ucggcaugaa                                        30
<210> 51
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 51
caacuuuaag gccuguuggg agagcccuug                                        30
<210> 52
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 52
gaauaccacg cuuuaagacc uauuggaucg                                        30
<210> 53
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 53
gagaacuuua agaccuauug agggccucug                                        30
<210> 54
<211> 29
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 54
cgacuuuaag gccuauuggg ggacucgac                                         29
<210> 55
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 55
gaacacuuua agaccuguug ggaagcgucu                                        30
<210> 56
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 56
acuuuaaggc cuguugagga aaccgucuga                                        30
<210> 57
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 57
agcuuuaaga ccuguugaga auucgacaaa                                        30
<210> 58
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 58
agcuuuaaga ccuguugagc agccucgacc                                        30
<210> 59
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 59
gaaggucaag uggcacuuua aggccuguuc                                        30
<210> 60
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 60
aaaccacuuu aagaccuguu ggggcacucu                                        30
<210> 61
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 61
aaaccuuuaa gaccuauuga ggugggcuca                                        30
<210> 62
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 62
uaggcgcuuu aagaccuauu gagggacucc                                        30
<210> 63
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 63
gugacgcuuu aagaccuauu agggcacuuc                                        30
<210> 64
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 64
gaaaccacuu uaagaccuau ugagagacuc                                        30
<210> 65
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 65
gaaacuuuaa gaccuauuga gcaggaacuc                                        30
<210> 66
<400> 66
000
<210> 67
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 67
cgacuuuaag accuguugaa agucgcgggg                                        30
<210> 68
<211> 32
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 68
acuuuaagac cuguugagac cggcucggac au                                     32
<210> 69
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 69
gaacuuuaag accuguugag gaccaucacg                                        30
<210> 70
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 70
acguggaguc ggacacuuua aggccuguuc                                        30
<210> 71
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 71
ucgcgacuuu aaggccuauu gugggacucu                                        30
<210> 72
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 72
gcuuuaaggc cuauugagau cggcucgggu                                        30
<210> 73
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 73
gacuuuaagg ccuguugaag gucgagaguu                                        30
<210> 74
<211> 29
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 74
aacgaucuuu aaggccuguu aggggcuuc                                         29
<210> 75
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 75
caagcugccu cgcacuuuaa gacguguugg                                        30
<210> 76
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 76
accguguuua agaacuguug gggggaacuc                                        30
<210> 77
<211> 36
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 77
gaauaccacg cuuuaagacc uauugagaug cgcuca                                 36
<210> 78
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 78
uaagccugag aaaccacuuu aagaccuuuu                                        30
<210> 79
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 79
cgaacuuuaa gaccuguuga gcagcucuuc                                        30
<210> 80
<211> 30
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 80
agaaucuuua aggccugucg agaccucgag                                        30
<210> 81
<211> 15
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<220>
<221> смешанный_признак
<222> (1)..(1)
<223> /примечание="может присутствовать или может отсутствовать"
<220>
<221> смешанный_признак
<222> (15)..(15)
<223> /примечание="может присутствовать или может отсутствовать"
<220>
<221> источник
<223> /примечание="См. описание, поданное для подробного описания
замещений и предпочтительных вариантов осуществления"
<400> 81
scccaagrmc crccv                                                        15
<210> 82
<211> 10
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 82
aatttttttt                                                              10
<210> 83
<211> 15
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=«Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид»
<400> 83
cuuuaaggcc uauug                                                        15
<---