Определение внеклеточных пероксидаз в назальном секрете больных аллергическим и инфекционным ринитами

Краткие сообщения

©2004, СПбРОРААКИ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ПЕРОКСИДАЗ В НАЗАЛЬНОМ СЕКРЕТЕ БОЛЬНЫХАЛЛЕРГИЧЕСКИМ И ИНФЕКЦИОННЫМ РИНИТАМИ

Кочетова Ю.И., Смольникова Е.В., Анташев А.В.*, Мокроносова М. А.

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН,

*ГУ НКЦ оториноларингологии М3 РФ, г. Москва, Россия

Резюме. При воспалении обычно наблюдают активацию процессов окисления с высвобождением внеклеточных пероксидаз. Цель - определить уровень внеклеточных пероксидаз в назальном секрете больных аллергическим и инфекционным ринитами. Были обследованы 163 пациента. Диагноз и степень тяжести заболевания устанавливали на основании стандартов диагностики. Забор назального секрета проводили абсорбционным методом. Концентрацию внеклеточных пероксидаз определяли спектрофотометрически в цветной реакции. Средние значения внеклеточных пероксидаз во всех группах достоверно выше, чем у здоровых доноров. У больных персистирующим аллергическим ринитом выявлены наиболее высокие значения внеклеточных пероксидаз, достоверно различающиеся с таковыми при инфекционном рините. Выявлена тенденция к повышению уровня внеклеточных пероксидаз у больных с усугублением тяжести течения аллергического ринита. Распределение значений уровня внеклеточных пероксидаз не зависит ни от возраста пациентов, ни от клеточного состава назального секрета. Таким образом, уровень внеклеточных пероксидаз в назальном секрете представляет собой объективный маркер воспаления, характерный и для инфекционного, и для аллергического ринитов.

Ключевые слова: внеклеточные пероксидазы, назальный секрет, аллергический ринит, инфекционный ринит.

Kochetova Yu.I., Antasheva A.V., Smolnikova E.V., Mokronosova M.A.

LEVELS OF EXHACELLULAR PEROXIDASES IN NASAL SECRET OF PATIENTS WITH ALLERGIC AND INFECTIONS RHINITIS

Abstract. The activation of oxidation processes with peroxidases" liberation is usually observed in inflammation. Aim was to investigate the level of peroxidases in nasal secret in patients with allergic and infectious rhinitis. 163 patients were observed. The diagnosis and the severity of disease were established with standards of diagnostics. Nasal secret was obtained with the method based upon absorption. Concentration of peroxidases was determined in color reaction with the use of spectrophotometer. Mean level of peroxidases was significantly higher in all groups in comparison with healthy donors. The level of peroxidases in patients with persistent allergic rhinitis was significantly higher than in those with infectious rhinitis. Although the peroxidases" level was higher in patients with severe allergic rhinitis, no significant differences were observed. The level of peroxidases was not associated with age and cellular content of nasal secret. Thus, peroxidases11 level in nasal secret represents the objective marker of inflammation, it is distinctive either for infectious or for allergic rhinitis.

Адрес для переписки: ВВбДбНИб

117420 г. Москва, Профсоюзная ул., д.43, к.1, кв. В последнее время в литературе широко диску-

100. тируется вопрос о влиянии инфекции на течение пер-

Тел.: (095) 917-08-91, систирующего аллергического ринита.

факс: (095) 917-49-00. В проведенном ранее обследовании больных ал-

E-mail: mmokronosova@mccinet.ru лергическим ринитом было выявлено, что постоян-

ным представителем микрофлоры в полости носа является Б.аигеиэ, и добавочными - 5.ер1йегт1<Из и СогупоЬасСепит зрр. [4].

Особое внимание уделяют инфекции, обусловленной 5.гшгемз, что связано со способностью этих микроорганизмов продуцировать суперантигены [7]. Объективно оценить, является ли присутствие Б.аигеиз в назальной полости носительством или фактором персистирующей инфекции, необходимо для назначения адекватной терапии.

Для цитологической картины мазка - отпечатка со слизистой полости носа - характерна преимущественная инфильтрация тремя типами клеток: эози-нофилами, нейтрофилами и эпителием. Причем, нейтрофилы составляют наибольший удельный вес (>70% клеток в поле зрения). При исследовании изменений цитологических параметров носового секрета при проведении назального провокационного теста несомненный интерес вызывала группа больных, у которых в развитии острой реакции доминировала не эозинофильная, а нейтрофильная инфильтрация назального секрета [3].

Хорошо изучена роль нейтрофилов в противоин-фекционном иммунном ответе. Важная форма реактивности нейтрофилов - активация кислорода с превращением его в мощный инструмент биоагрессивности. Активация молекулярного кислорода сводится к его частичному восстановлению с образованием частичных радикалов (супероксидный анион, синглетный кислород, гидроксильный радикал) и перекиси водорода. Вместе с миелопероксидазой (МПО) и галогенами они формируют аппарат кис-лородзависимой биоцидности - важнейшее эффек-торное звено фагоцитарных реакций и один из чувствительных индикаторов возбуждения клеток. Интенсивность окислительных процессов имеет прямое отношение к степени цитотоксического эффекта [10].

Ряд наблюдений доказывает, что нейтрофилы могут служить мишенью в реакциях гиперчувствительности немедленного типа. Давно известно, что при анафилактическом шоке происходит резкое сокращение пула нейтрофилов. Экспрессирующие на своей поверхности Бсу-рецепторы нейтрофилы способны фиксировать ^С-антитела, а поэтому специфически взаимодействовать с антигеном [8,10].

Активно изучается роль нейтрофильных лейкоцитов в поздней фазе аллергического ответа. При бронхиальной астме этот период наступает спустя 2-12 часов после ингаляции аллергена, в альвеолах и бронхах возникает воспалительная реакция, при которой пусковая роль ^Е-сенсибилизированных тканевых базофилов теряется в каскаде межклеточных взаимодействий. В лаважной жидкости доминируют нейтрофилы, нередко в сочетании с эозинофила-ми. В связи с этим существует гипотеза, согласно которой либерация гистамина может быть обуслов-

лена высвобождением свободных радикалов в ходе перекисного окисления или метаболической активации нейтрофилов [8,11].

Таким образом, роль нейтрофилов и продуктов их активации, таких как, например, МПО, до сих пор не изучена. МПО - протеин, высвобождающийся из основных гранул нейтрофилов в процессе их активации. Выявлено достоверное увеличение уровня МПО в сыворотке крови детей с бронхиальной астмой легкой степени тяжести, не получавших противовоспалительную терапию, по сравнению с пациентами, не страдающими аллергической патологией. Предполагается, что нейтрофилы у пациентов с бронхиальной астмой обладают повышенной способностью к активации и высвобождению активных веществ из гранул. И уровень сывороточного МПО резко возрастает при астматическом приступе, вместе с увеличением уровня эозинофильного катионного протеина, что свидетельствует о хроническом воспалении [11].

Очевидно, МПО составляет основной компонент внеклеточных пероксидаз (ПО), обнаруженных в биологических секретах [1]. Кроме МПО в назальном секрете могут присутствовать эозинофильная пероксидаза и продукты перекисного окисления бактериальных клеток.

Учитывая вышеизложенное, целью исследования явилось определение ПО в назальном секрете больных персистирующим аллергическим ринитом (ПАР), интермиттирующим аллергическим ринитом (ИАР) и инфекционным ринитом (ИР).

Материалы и методы

Пациенты. Были обследованы 163 пациента в возрасте от 1 до 60 лет (средний возраст - 21,9± 1,5 года). Все пациенты были разделены на 4 группы. Нозологическая форма была представлена: ПАР, ИАР, ИР и контрольная группа практически здоровых.

Диагноз и степень тяжести заболевания устанавливали на основании данных анамнеза, анкетирования [6], скарификационных кожных проб, риноци-тограммы, микробиологического анализа назального секрета, рентгенографии придаточных пазух носа, риноскопии, учитывая общепринятые стандарты диагностики [2].

Взятие назального секрета проводили абсорбционным методом [9]. Пинцетом в средний носовой ход каждой половины полости носа помещали по ватному шарику на 15 мин. Пинцетом выжимали волокно в 1 мл. 2,7% раствора динатриевой соли этилендиа-минотетрауксусной кислоты (ЭДТА), (рН=7,4) и с помощью пробки фиксировали в верхней части из пробирки. Раствор центрифугировали при ЮООё в течение 20 мин для осаждения целых эритроцитов, лейкоцитов, слизи и корок. После удаления сухого

волокна измеряли количество полученного назального секрета.

Постановка реакции определения внеклеточных пероксидаз в назальном секрете. Концентрацию ПО определяли в образцах надосадочной жидкости в разведениях от 1:10 до 1:50 в цветной реакции на спектрофотометре Stap Fax 2200. ПО при смешивании с хромогеном тетраметилбензидином (ТМБ) в цитратно-фосфатном буферном растворе с перекисью водорода дает окрашивание в цвета синего оттенка. В качестве контроля использовали 2,7% раствор динатриевой соли ЭДТА. Инкубацию исследуемых образцов с ТМБ проводили в течение 10 мин при температуре 18-25°С. Реакцию останавливали добавлением серной кислоты, оптическую плотность раствора измеряли при длиие волны 492 нм на спектрофотометре. Интенсивность желтого окрашивания пропорциональна количеству ПО в назальном секрете. Оценку результата в пересчете на 1 мл назального секрета рассчитывали по значению оптической плотности (ОП) [5].

Кожные пробы. Для выявления сенсибилизации к причинным аллергенам было использовано тестирование методом прик-теста с растворами коммерческих аллергенов, содержащими 10 тыс. единиц белкового азота (PNU) в 1 мл. Постановку тестов проводили на сгибательной поверхности предплечья. Учитывали размер волдыря не менее 5 мм спустя 20 мин. В качестве положительного контроля использовали раствор гистамина, в качестве отрицательного - разводящую жидкость.

Риноцитограмма. Назальный секрет собирали из обеих половин носа на предметное стекло. Препарат окрашивали раздельным методом красителями эозином и азуром. Подсчитывали не менее 200 клеточных элементов и определяли процентное содержание нейтрофильных и эозинофильных лейкоцитов, эпителиальных клеток, наличие гранул.

Микробиологическое исследование. Для оценки микрофлоры верхних дыхательных путей прово-

дили бактериологическое исследование мазков со слизистой оболочки полости носа и зева с посевом материала на кровяной, шоколадный агар, среду Сабуро. Засеянные чашки с кровяным и шоколадным агаром инкубировали при температуре 37°С в течение 24 часов в атмосфере с повышенным содержанием С02 и в анаэробных условиях. Посевы на чашках с плотной средой Сабуро выдерживали при температуре 25‘С до 5 суток. После просмотра чашек выделяли чистую культуру микроорганизмов и проводили идентификацию отобранных колоний по общепринятой методике.

Статистическая обработка результатов проводилась общепринятыми методами статистической обработки данных с использованием программы Microsoft Excel-97.

Результаты

Определение ПО в назальном секрете было проведено 163 пациентам с хроническими ринитами. Распределение пациентов по нозологической форме представлено в табл.1. Как видно, среди обследованных пациентов преобладали больные с аллергическим ринитом (84/51, 5%). Разделение пациентов на группы с ПАР и ИАР использовали для учета острого и хронического аллергического воспаления. То есть, забор назального секрета у больных поллинозом проводили в период весеннего или летного обострения. У больных ПАР обследование проходило на фоне обычного хронического течения заболевания. Однородность пациентов, распределенных по нозологической форме, равномерное распределение пациентов по полу и возрасту соответствует понятию репрезентативности, что в последующем позволило сравнивать эти группы.

Аллергический ринит (и персистирующий, и интермиттирующий) оценивали по степени тяже-

Табл. 1. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ОБСЛЕДОВАННЫХ БОЛЬНЫХ

Нозологическая форма Общее число (п) Муж./Жен. Возраст <14 лет Возраст >14 лет

Персистирующий аллергический ринит 40 19/21 23 17

Интермиттирующий аллергический ринит 44 21 /23 22 22

Инфекционный ринит 52 26/26 9 43

Здоровые 27 11/16 6 21

Всего 163 87/89 67 109

Табл. 2. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ БОЛЬНЫХ АЛЛЕРГИЧЕСКИМ РИНИТОМ ПО СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ

Степень тяжести течения аллергического ринита в баллах [6] Интермиттирующий аллергический ринит

Легкая (1-9 баллов) 27/61,4% 7/17,5% 34/40,5%

Среднетяжелая (10-19 баллов) 11 /24,9% 20/50,1% 31 /36,9%

Тяжелая (20-29 баллов) 6/13,7% 13/32,6% 19/22,6%

3500 3000 2800 О 2000 Ш 1500 1000 500 О

j* V * . ♦ О ф0 сг ♦

♦

♦1 . ♦ О о

п ♦ о ♦ ♦ 0 ° о * ♦ ♦ ° о

* **♦ ♦ J о» w Лл е* й X

*° ♦ А о* 0 о

♦«*!£ ♦♦•лр*оз ♦ о*’ —S3 о- о

Возраст пациентов

♦ А л п • р г и ч • с кийрннит

О Инфекционный рмнит

Рис. 1. Содержание внеклеточных пероксидаз в назальном секрете обследуемых больных*. *р, 2<0,1 (НД), Р, 3<0,01, р м<0,01, Рм<0,1 (НД),Рм<0,01,рм<0101‘.

Рис. 3. Содержание внеклеточных пероксидаз в назальном секрете больных различных возрастных групп.

3000

2500

2000

с

о

а 1500

ш

1000

500

0

2168,9

1700,3

тяжелое среднетяжелое легкое течение аллергического ринита

3500 1 V* ♦ ♦ 4

♦ ♦

♦ *

о ♦ $ ♦ ♦> 4

Е ♦

4 ♦ ♦

♦

01 23458789 10 11 12

% эоэинофилов /% нейтрофилов

Рис.2. Содержание внеклеточных пероксидаз в назальном секрете больных с аллергическим ринитом различной степени тяжести*. *р<0,1

Рис. 4. Содержание внеклеточных пероксидаз и клеточных элементов в назальном секрете больных аллергическим ринитом.

сти в баллах (табл.2). Очевидно, что у пациентов ИАР заболевание протекало значительно легче, и в 61,4% случаев зафиксировано как легкое, против 17,5% - у пациентов с ПАР. В связи с этим, последующее исследование уровня ПО в назальном секрете проводили в зависимости от степени тяжести течения общего числа больных, страдающих ПАР и ИАР.

При кожном тестировании было показано, что пациенты с ПАР в 77,5% случаев были сенсибилизированы преимущественно к клещам домашней пыли, а у 37,5% больных выявлена сенсибилизация к эпидермальным аллергенам. Для пациентов с поллинозом была характерна гиперчувствительность к пыльце березы (56,8%) и злаковых трав (31,8%).

Результаты риноцитограммы характеризовались наличием эозинофилии у больных аллергическим ринитом, и нейтрофилии у пациентов с ИР. Для оценки клеточного состава назального секрета использовали коэффициент сооотношения процентного содержания эозинофилов к процентному содержанию нейтрофилов. Для аллергического воспаления полости носа этот коэффициент превышал 0,7.

Для больных ИР была не характерна эозинофильная инфильтрация (коэффициент = 0).

52 пациента с синуситами были обследованы в фазе острого инфекционного воспаления. Все они жаловались на гнойное отделяемое из полости носа. У большинства пациентов диагноз синусит был подтвержден рентгенологически.

Микробиологическое исследование мазка из назальной полости выявил обильный рост S.aureus у 73,8%, C.pseudodiphtericum - у 34,5% и

S.epidermidis у 33,3% больных аллергическим ринитом. У больных синуситами инфекция была обусловлена S.aureus (51,9%), S.pneumoniae (48,1%), C.pseudotuberculosis (32,7%), Pseudomonas aeroginosa (11,5%),

Сравнительный анализ уровня ПО у пациентов с различными нозологическими формами представлен на рис.1. Очевидно, что средние значения ПО во всех обследованных группах достоверно выше, чем у здоровых доноров. Удивительным оказался тот факт, что у больных ПАР выявлены наиболее высокие значения ПО (2006,3+184,9 ЕД ОП), достоверно различающиеся с таковыми при ИР (1221,21149,2 ЕД ОП; р<0,01). Уровень ПО у па-

циентов с ИАР был ниже (1539,2± 184,7 ЕД ОП), чем в группе больных ПАР, однако достоверного различия не наблюдали (р<0,1).

Таким образом, полученные данные позволили нам определить границу нормы и патологии ири определении уровня ПО в назальном секрете у больных ПАР, ИАР и ИР, которая составила 605,1 ±5,2 ЕДОП.

Далее оценивали зависимость уровня ПО назального секрета от степени тяжести течения аллергического ринита (рис.2). Несмотря на то, что выявлена тенденция к повышению уровня этого показателя у больных с усугублением тяжести течения аллергического ринита, достоверных различий между сравниваемыми группами выявлено не было (р<0,1).

Распределение значений уровня ПО в зависимости от возраста не выявило никаких закономерностей ни для больных ИР, ни для пациентов с аллергическим ринитом (рис.З). Во всех возрастных группах получали как низкие, так и высокие значения ПО (п=-0,24).

Аналогично не было найдено зависимости уровня ПО от клеточного состава назального секрета (г=-

0,08), (рис.4).

Обсуждение

Для ПАР характерно хроническое воспаление слизистой оболочки полости носа, которое отличают черты и аллергического, и инфекционного процесса. Особенности острого аллергического воспаления можно наблюдать у больных поллино-зом, когда за короткий промежуток времени развивается отечность и ринорея. На фоне гиперчувствительности слизистых оболочек происходят нарушения мукозального иммунитета, что влечет присоединение персистирующей инфекции. При инфекционном рините генез воспаления принципиально отличается. Хронические рецидивирующие синуситы протекают чаще всего на фоне первичного снижения параметров локального иммунитета.

МПО - протеин, высвобождающийся из гранул активированных нейтрофилов, появляется при любом инфекционном стимуле. Проведенное исследование отражает характерный для ринита любой природы факт: уровень ПО (включая МПО) повышается более чем в 2 раза, по сравнению с таковым у здоровых доноров.

Сравнительный анализ уровня ПО в назальном секрете у больных ПАР и ИР показал достоверные различия. У большинства пациентов с ПАР был выявлен обильный рост S.aureus. Является ли продукция МПО реакцией на антигены S.aureus, какова доля ПО бактериальных клеток вопросы дискута-бельные.

Значения уровня ПО у больных поллинозом были ниже, чем у пациентов с ПАР, но выше, чем у пациентов с ИР. Полученные данные свидетельствуют, скорее всего, о вовлечении нейтрофилов в аллергическое воспаление, не связанное с инфекцией.

Таким образом, уровень ПО в назальном секрете представляет собой объективный маркер воспаления, характерный и для инфекционного, и для аллергического ринитов.

Список основных сокращений, используемых в тексте:

ПО - внеклеточные пероксидазы;

МПО - миелопероксидаза;

ПАР - персистирующий аллергический ринит;

ИАР - интермиттирующий аллергический ринит;

ИР - инфекционный ринит;

ЭДТА - этилендиаминотетраухсусная кислота;

ТМБ - тетраметилбензидин.

Благодарности

Мы благодарим сотрудников лаборатории условно-патогенных микроорганизмов НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова РАМН Батуро А.П. и Романенко Э.Е. за проведение микробиологического исследования, использованного в настоящей работе.

Список литературы

1. Азнабаева Л.Ф. Провоспалительныецитокины в иммунопатогенезе и лечении хронических гнойных рнносинуситов. // Автореф.дисс. ... докт. мед. наук

- СПб. - 2002 г. - 24с.

2. Диагностика и лечение аллергического ринита, и его влияние на астму. Руководство для врачей. Материалы отчета ARIA EAACI в сотрудничестве с ВОЗ. - М., 2001 г. - 24 с.

3. Кочетова Ю.И., Мокроносова М.А., Ляпорова Т.В. Изменения в цитологическом анализе носового секрета при проведении назального провокационного теста. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2002 г. -№ И. - С. 12-14.

4. Мокроносова М.А., Романенко Э.Е., Батуро А.П., Тарасова Г.Д., Кочетова Ю.И., Сергеев А.В. Особенности микрофлоры слизистых оболочек верхних дыхательных путей при аллергическом рините. // Российская оториноларингология. - 2003 г. -№ 5(2). - С.134-138.

5. Фримель Г. Иммунологические методы. -М.:Медицина. - 1987 г. - 472 с.

6. Annesi-Maesano I., Didier A., Klossek М. The Score for Allergic Rhinitis (SFRA): a simple and valid assessment method in population studies. // Allergy. -2002. - Vol.57. - P.107-114.

7. Bachert C„ Gevaert P., van Cauwenberg P. Staphylococcus aureus enterotoxins: a key in airway disease? //Allergy. - 2002. - Vol.57. - P.480-487.

8. Hurst D.S., Venge P. Evidence of eosinophil, neutrophil, and mast-cell mediators in the effusion of OME patients with and without atopy. // Allergy. - 2000. -Vol.55. - P.435-441.

9. Klimek L., Rasp G. Norm values for eosinophil cationic protein in nasal secretions: influence of speci-

men collection. // Clin. Exp. Allergy. - 1999. - Vol. 29.

- P.367-374.

10. Linden A., Adachi M. Neutrophilic airway inflammation and IL-17. // Allergy. - 2002. - Vol.57. - P.769-775.

11. Tauber E., Herouy Y„ Goetz M. et al. Assessment of serum myeloperoxidase in children with bronchial asthma. // Allergy. - 1999. - Vol.54. - P. 177-182.

поступила в редакцию 06.01.2004 отправлена на доработку 23.02.2004 принята к печати 17.03.2004