УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ГЛЮКОЗЫ, ФРУКТОЗЫ, МЕТАНОЛА И ЭТАНОЛА

Техническое решение относится к области биотехнологии и пищевой промышленности, а именно, к биосенсорным аналитическим устройствам. Устройство может быть использована для определения содержания глюкозы, фруктозы, метанола и этанола при их совместном присутствии в реальных образцах ферментационных сред ликеро-водочных, глюкозо-паточных и других производств.
Одновременное определение содержания в ферментационных средах исходных компонентов и продуктов важно для контроля биотехнологических процессов, степени превращения сырья и качества готовой продукции. Так, дифференциальная оценка содержания четырех компонентов - глюкозы, фруктозы, метилового и этилового спиртов на различных стадиях процесса позволяет оптимизировать технологический процесс брожжения и снижать материальные затраты, приводя в соответствие качество исходного сырья с качеством применяемых ферментов и дрожжевой массы. Традиционные методы определения указанных компонентов либо отличаются недостаточной точностью и селективностью (пикнометрия, поляриметрия), либо трудоемки, дороги и характеризуются длительным временем анализа (газовая хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография), что не позволяет использовать их при постоянном мониторинге содержания указанных компонентов [Bishop В.F., Lorbert S.J. The needs for sensors in bacterial and yeast fermentations // Bioprocess Technol. 1990. V.6. P.1.].
Наиболее близким по своим признакам, принятым за прототип является устройство для селективного определения глюкозы и этанола при их совместном присутствии, описанное в работе Lobanov A.V., Borisov I.A., Gordon S.H., Greene R.V., Leathers T.D., Reshetilov A.N. Analysis of ethanol-glucose mixtures by two microbial sensors: application of chemometrics and artificial neural networks for data processing. // Biosens. Bioelectron. 2001. V.16. P.1001-1007].
Измерительная система состояла из двух амперометрических кислородных электродов с иммобилизованными клетками Gluconobacter oxydans ВКМ В-1280 и Pichia methanolica ВКМ Y-2621. Иммобилизация микроорганизмов проводилась адсорбцией на стекловолоконном фильтре Whatman GF/A. Измерения выполнялись при постоянном перемешивании в открытой кювете с рабочим объемом 5 мл.
Описанная измерительная система на основе двух сенсоров не позволяют осуществлять анализ смесей, содержащих более двух компонентов в водном растворе.
Задачей технического решения является расширение области исследования, путем определения содержания глюкозы, фруктозы, метанола и этанола при совместном присутствии в водной среде.
Технический результат, который может быть получен при использовании заявляемой полезной модели, заключается в том, что предлагаемое устройство для определения содержания глюкозы, фруктозы, метанола и этанола позволяет селективно и экспрессно определять содержание глюкозы, фруктозы, метанола и этанола при совместном присутствии в водных средах.
Сущность технического решения заключается в том, что устройство для определения глюкозы, фруктозы, метанола и этанола, содержащее измерительную кювету и биосенсорную систему, включающую кислородные электроды, на которых размещены иммобилизованные микроорганизмы Gluconobacter oxydans subsp. industrius ВКМ В-1280, отличается тем, что дополнительно введены два кислородных электрода на одном из которых размещены иммобилизованные микроорганизмы Pichia angusta BKM Y-2559, а на другом иммобилизованные микроорганизмы Saccharomyces bayanus BKM Y-349.
На фиг.1 показано устройство для определения содержания глюкозы, фруктозы, метанола и этанола, представляющее собой четыре кислородных электрода с биорецепторами - иммобилизованными на различных носителях бактериальными и дрожжевыми клетками.
На фиг2 показана диаграмма субстратной специфичности (чувствительности) используемых рецепторных элементов.
Предлагаемое устройство состоит из следующих элементов: четырех кислородных электродов 1 на которых размещены рецепторные элементы 2, 3, 4, 5. Кислородные электроды 1 с рецепторными элементами 2, 3, 4, 5 помещены в измерительную кювету 6, по которой постоянно прокачивается буферный раствор. Проба впрыскивается в поток и через определенное время поступает в измерительную кювету, где иммобилизованные микроорганизмы окисляют субстрат, содержащийся в пробе. Рецепторные элементы 2, 3, 4, 5 представляют собой иммобилизованные на носителе клетки:
2 - микроорганизмы Gluconobacter oxydans subsp. industrius BKM B-1280, адсорбированные на стекловолоконном фильтре Whatman GF/A (толшина 0,26 мм, размер пор 1,6 мкм).
3 - микроорганизмы Gluconobacter oxydans subsp. industrius BKM B-1280, включенные в гель поперечно-сшитого бычьего сывороточного альбумина.
4 - микроорганизмы Pichia angusta BKM Y-2559, адсорбированные на стекловолоконном фильтре Whatman GF/A.
5 - микроорганизмы Saccharomyces bayanus BKM Y-349, адсорбированные на стекловолоконном фильтре Whatman GF/A.
Все штаммы получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов.
Для получения биомассы бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industrius ВКМ В-1280 используют питательную среду, содержащую сорбит и дрожжевой экстракт (г/л): сорбит - 20, дрожжевой экстракт - 2. Для получения биомассы дрожжей Pichia angusta ВКМ Y-2559 и Saccharomyces bayanus ВКМ Y-349 используют питательную среду, содержащую глюкозу, пептон и дрожжевой экстракт (г/л): глюкоза - 10, пептон - 5, дрожжевой экстракт - 0,5
Для регистрации сигнала биосенсорной системы используют многоканальный биосенсорный анализатор проточно-инжекционного типа «Мультибио-01», подключаемый к кислородным электродам и компьютеру.
Принцип работы устройства для определения содержания глюкозы, фруктозы, метанола и этанола заключается в следующем:
Кислородные электроды 1 с размещенными на них рецепторными элементами 2, 3, 4, 5 помещают в измерительную кювету 6. Через кювету 6 непрерывно прокачивается 30 мМ фосфатный буферный раствор (рН 6,8, скорость протока 0,5 мл/мин) и регистрируют силу тока, отражающего содержание кислорода в среде (фоновое), по каждому из кислородных электродов. Затем вводят пробу, содержащую смесь анализируемых веществ (100 мкл). Все измерения проводят при комнатной температуре. После регистрации сигнала кислородных электродов (зависимость силы тока от времени) измерительную кювету промывают буферным раствором. Для каждого кислородного электрода с рецепторным элементом рассчитывают величину максимальной скорости потребления кислорода (ответ сенсора, dI/dt, нА/с) и определяют концентрации глюкозы, фруктозы, метанола и этанола с использованием предварительно обученной искусственной нейронной сети (ИНС). Для обучения используются модельные смеси с концентрациям компонентов от 0 до 5 мМ. Используемая сеть должна содержать четыре входных и четыре выходных нейрона, а так же по 60 нейронов на 4 внутренних слоях.
Обучение ИНС проводится методом Quick Propagation. Для создания сети рекомендуется использовать программу Java Neural Network Simulator 1.1 (SNNS Group, IPVR, University of Stuttgart).
Длительность единичного измерения с использованием предлагаемого устройства составляет 10-15 минут. Диапазон определяемых значений концентраций компонентов составляет 0,01-5 мМ, Долговременная стабильность рецепторных элементов более 15 суток (падение активности микроорганизмов на протяжении этого времени составило 25%). Стандартное отклонение по 15 последовательным измерениям составляет в среднем 3-7%. Ошибка измерения концентраций глюкозы, фруктозы, метанола и этанола составляет не более 10%.
Таким образом, предлагаемое устройство для определения содержания глюкозы, фруктозы, метанола и этанола обеспечивает быстрое определение содержания глюкозы, фруктозы, метанола и этанола без использования сложного дорогостоящего оборудования.