Состояние иммунитета у больных прогрессирующим фиброзно-кавернозным туберкулезом легких

методы диагностики и технологии

УДК 616.24-002.5:612.017.1

состояние иммунитета у вольных прогрессирующим фиброзно-кавернозным туберкулезом легких

Б. Е. Кноринг А. В. Елькин, Т. С. Басек, Е. И. Потапенко

Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии, г. Санкт-Петербург

Исследовали параметры клеточного, гуморального иммунитета, а также цитокинового статуса у больных прогрессирующим фиброзно-кавернозным туберкулезом (ФКТ) легких. Установлено выраженное снижение относительного содержания Т-хелперов, повышение числа цитотоксических клеток, активированных Т-лимфоцитов и NKT-клеток. Для большинства больных прогрессирующим ФКТ характерен выраженный пролиферативный ответ лимфоцитов на специфические антигены и низкий на общий митоген ФГА. Одновременно выявлено значительное повышение кислородзависимого метаболизма нейтрофилов и увеличение их поглотительной функции. Отмечены высокий уровень ПТАТ различного характера, высокий синтез ЦИК мелких размеров. Показано выраженное увеличение продукции ИЛ-8, ИЛ-2, индуцированного туберкулином, и, напротив, снижение продукции ИЛ-2, индуцированного ФГА. Выявлен значительный дефицит выработки ИФН-у. Наиболее значительные изменения в иммунной системе выявлены у больных с более обширными деструктивными изменениями. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности применения у ряда больных ФКТ иммуномоду-лирующей терапии в процессе их подготовки к операции.

Ключевые слова: прогрессирующий фиброзно-кавернозный туберкулез легких, иммунитет.

ВВЕДЕНИЕ

До настоящего времени, несмотря на многолетнюю историю борьбы с туберкулезом, это заболевание остается проблемой «всемирной опасности» (заключение ВОЗ 1993 г.) и причиной смерти многих больных. На современном этапе отмечается увеличение числа больных с деструктивными полирезистентными к химиотерапии формами процесса, прогрессирующим течением, неэффективной терапией. В первую очередь к ним относится неуклонно прогрессирующий фиброзно-кавернозный туберкулез с наличием осложнений и выраженным иммунодефицитом. Патогенез туберкулеза в значи-

тельной мере определяется состоянием иммунологической реактивности организма, и одной из причин безуспешного лечения является именно недостаточная эффективность защитных механизмов [1, 3, 6]. Поэтому выяснение особенностей иммунного статуса у этого контингента больных и вариантов нарушений иммунной системы представляет особый интерес. Выраженность иммунопатологических проявлений у больного может стать основой для прогнозирования направленности процесса, обоснования иммуно-коррекции при подготовке к операции.

Цель исследования — оценка выраженности нарушений иммунной системы у больных с прогрессирующими формами фиброз-

но-кавернозного туберкулеза легких и прогностической значимости иммунологических сдвигов в развитии заболевания, сроках и объемах предоперационной подготовки.

Материалы и методы

ИССЛЕДОВАНИЯ

Клинико-иммунологическое обследование выполнено у 135 больных фиброзно-ка-вернозным туберкулезом (ФКТ), неуклонно прогрессирующим на фоне проводимой терапии. В их число вошли 79 мужчин и 56 женщин. Возраст больных колебался от 19 до 63 лет (до 20 лет — 9 человек, от 20 до 50 лет — 108 больных, свыше 50 лет — 18 человек).

У всех больных при поступлении установлены выраженная интоксикация, массивное бактериовыделение. Штаммы выделенных у больных микобактерий имели множественную лекарственную устойчивость. Во всех случаях процесс характеризовался наличием множественного распада легочной ткани и значительной протяженностью легочного процесса. Из них двухсторонний процесс выявлен у 50 пациентов, односторонний — у 85 человек. Выраженный распад легочной ткани (>4 сегментов) выявлен у 83 больных, менее распространенные деструктивные изменения (<4 сегментов) имели место у 52 пациентов. Степень тяжести процесса оценивалась с учетом клинических особенностей заболевания.

Практически у всех больных на фоне многомесячной интенсивной полихимиотерапии положительная клинико-рентгеноло-гическая динамика отсутствовала.

Всем больным проведено полное клини-ко-лабораторное обследование. Оценивали показатели лейкограммы крови. Определение субпопуляций лимфоцитов по маркерам клеточной дифференцировки ^3+ — маркер зрелых Т-лимфоцитов, CD4+ — маркер

56

Т-хелперов, CD8+ — маркер цитотоксиче-ских лимфоцитов, CD16+ — маркер натуральных киллеров, CD19+ — маркер В-лим-фоцитов, HLA-DR+ — маркер поздней активации, CD95+ — антиген Fas/APO-1, опосредующий апоптоз) проводили методом иммунофенотипирования с использованием моноклональных антител фирмы «Becton Dickinson» (USA), меченных FITC (изотиоци-анат флуоресцеина) и PE (фикоэритрин). Анализ окрашенных клеток проводили на проточном цитофлюориметре «FACS Calibur» (BD, США) в программе SimulSet.

Пролиферативную активность лимфоцитов крови в ответ на туберкулин и ФГА изучали методом подсчета доли окрашенных про-пидий йодидом клеток, находящихся в фазах клеточного цикла S и G2/M, на проточном цитофлюориметре «FACS Calibur» (BD, США) в программе CellQuest.

Специфический гуморальный ответ оценивали по комплексу серологических реакций с использованием в качестве антигена туберкулина Линниковой [5]. Концентрацию иммуноглобулинов классов G, A, M определяли методом радиальной иммунодиффузии по Mancini. Также определяли уровни циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) с различной способностью реагирования с полиэтиленгликолем (3,5%, 5%, 7,8%).

Функциональную активность нейтрофи-лов оценивали с помощью спонтанного и индуцированного зимозаном НСТ-теста по уровню восстановления клетками красителя нитросинего тетразолиевого (НСТ), отражающего уровень кислородзависимого метаболизма фагоцитирующих клеток [10], способность к фагоцитозу оценивали по интенсивности поглощения убитых нагреванием клеток дрожжей (Saccharomyces cerevisiae).

Концентрацию цитокинов ИЛ-8 и ИФН-у в сыворотке крови и супернатантах мононук-леаров периферической крови (МПК), не стимулированных и индуцированных фито-

гемагглютинином (ФГА) и полимеразнозной цепной реакцией (ППД), определяли методом иммуноферментного анализа, используя тест-системы производства «Цитокин» (г. Санкт-Петербург). Продукцию ИЛ-2 МПК исследовали биологическим методом с использованием ИЛ-2 зависимой линии

ст-2.

Математическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета программ <^а1Мса 6.0».

Результаты и их обсуждение

Выявление наиболее значимых отличий в характере иммунного ответа у больных неуклонно прогрессирующим ФКТ выполнено при оценке выраженности факторов клеточного и гуморального иммунитета и особенностей цитокинового статуса. В результате проведенного исследования наблюдали гетерогенные нарушения иммунной системы, затрагивающие все ее звенья.

Анализ лейкограммы показал, что практически у каждого второго больного имеют место лейкоцитоз (>10 000), высокая СОЭ (>25 мм/ч), относительная лимфопения (<19%), у 1/3 пациентов выражен палочко-ядерный сдвиг.

Вся группа обследованных больных ФКТ легких имела в той или иной степени выраженные иммунологические нарушения.

Для успешного контроля микобактери-альной инфекции необходимо накопление определенных субпопуляций лимфоцитов, способных ответить на специфические туберкулезные антигены.

Сравнительная характеристика субпопу-ляционного состава лимфоцитов крови исследуемой группы больных и лиц контрольной группы (здоровых доноров) представлена в таблице 1.

Анализ иммунофенотипического спектра лимфоидных клеток показал, что для всей

группы больных ФКТ легких оказалось характерным значительное увеличение относительного содержания цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3+, CD8+), активированных Т-лимфоцитов, FAS-позитивных клеток и NKT-клеток (T-лимфоциты с активностью неспецифических киллеров), а также достоверное снижение Т-хелперов, экспрессии HLA-DR маркера на антигенпредставляющих клетках и уменьшение цитотоксических клеток с фенотипами CD8+ и CD3-.

В целом, выявленные при фенотипирова-нии клеток периферической крови больных прогрессирующим ФКТ легких изменения в распределении регуляторных и эффектор-ных субпопуляций лимфоцитов свидетельствуют о подавлении клеточного иммунитета и определенном истощении возможностей иммунной системы.

Получить полноценное представление о состоянии иммунной системы возможно, лишь дополнив количественную характеристику иммунокомпетентных клеток оценкой функциональных свойств изучаемого класса клеток [9] (табл. 2).

Для большинства больных прогрессирующим ФКТ характерен выраженный проли-феративный ответ лимфоцитов на специфические антигены и низкий на общий митоген ФГА. Недостаточная пролиферация в ответ на ФГА, а также на специфический индуктор отражает снижение функциональной активности Т-лимфоцитов, ведущее к развитию вторичного иммунодефицита. Выраженный ответ на ППд свидетельствует о накоплении специфических клонов иммунокомпетент-ных клеток, направленных против антигенов M. tuberculosis. Очень высокий ответ на специфические антигены может указывать на чрезмерную активацию клеток с последующими иммунопатологическими процессами в организме больного. Избыточному накоплению специфически ориентированных лимфоцитов сопутствуют усиление апоптоза

Таблица 1

Распределение субпопуляций лимфоцитов периферической крови у больных прогрессирующим ФКТ легких и здоровых доноров

Показатели, % Обследуемая группа М±т Доля лиц с измененными параметрами, % Из них процент больных с показателями

сниженными повышенными

CD3+ ФКТ (п=97) 70,62±0,95 25,43 * 6,58 * 18,75 *

Доноры (п=30) 70,37±0,99 0,00 0,00 0,00

CD3+, CD4+ ФКТ (п=75) 43,36±0,95 * 57,33 * 49,33 * 8,00

Доноры (п=30) 47,33±1,17 20,00 16,66 3,33

CD3+, CD8+ ФКТ (п=98) 28,5±0,96 * 35,71 * 0,00 35,71 *

Доноры (п=29) 23,1±0,94 6,90 0,00 6,90

CD4/CD8 ФКТ (п=73) 1,6±0,06 * 48,00 * 46,58 * 1,37

Доноры (п=30) 2,2±0,12 20,00 13,30 6,67

CD8+, CD3- ФКТ (п=28) 6,46±0,55 51,28 30,77 * 20,51

Доноры (п=30) 7,17±0,41 43,48 10,34 24,14

CD3-, CD16+ ФКТ (п=82) 14,85±0,67 23,17 6,10 17,07

Доноры (п=30) 15,33±0,92 6,66 0,00 6,66

CD3+, CD16+ ФКТ (п=49) 7,15±0,73 * 50,82 * 10,00 40,82 *

Доноры (п=30) 4,5±0,44 14,08 4,08 10,00

CD19+ ФКТ (п=86) 12,5±0,64 24,72 * 15,05 * 9,67

Доноры (п=30) 13,33±1,06 3,33 0,00 3,33

CD3+, HLA-DR+ ФКТ (п=73) 12,61±0,95 52,10 * 13,70 38,40 *

Доноры (п=13) 9,0±0,85 23,07 7,69 15,38

CD3-, HLA-DR+ ФКТ (п=58) 16±0,95 41,39 * 27,59 * 13,80 *

Доноры (п=13) 16,46±1,19 7,69 7,69 0,00

CD95+ ФКТ (п=46) 58,31±3,00 * 67,39 * 17,39 * 50,00 *

Доноры (п=11) 47,36±2,68 0,00 0,00 0,00

Примечание. Здесь и в других таблицах индексами * обозначены достоверные различия между сравниваемыми группами больных и доноров ф<0,05).

Таблица 2

Пролиферативная активность лимфоцитов крови доноров и больных прогрессирующим ФКТ

Обследуемая группа Показатели пролиферативной активности лимфоцитов на контакт с

ППД ФГА

Средние показатели Частота выявления больных с пролифера-тивным ответом на ППД Средние показатели Частота выявления больных с низким пролиферативным ответом

М±т <3% >3% 3-8,99% >9% М±т <18%

ФКТ 6,5±0,80 * 27,80 * 72,20 * 50,00 * 22,20 * 20,9±1,45 * 46,15 *

Донор 2,3±0,33 73,20 26,80 26,80 0 27,5±1,21 9,50

Т-клеток, нарастание патологической роли ГПЗТ с усилением реакции повреждения ткани [4].

Важным показателем неспецифической резистентности организма является функциональное состояние нейтрофильных гра-нулоцитов, ответственных за процесс фагоцитоза в очаге воспаления (табл. 3).

В результате исследования функциональной активности нейтрофилов у больных ФКТ выявлено значительное повышение кисло-родзависимого метаболизма нейтрофилов в индуцированном и особенно НСТ-спонтан-ном тесте (до 217,28±б2,48 у. е. против 113,2±35,78 у. е. у доноров, р<0,05) и увеличение их поглотительной функции (76,32±10 у. е. против 59,07±12 у. е. у доноров, р<0,05). Значительное повышение уровня спонтанной активности мембранных окси-даз в итоге может привести к истощению резерва клеток.

Выявленное нами повышение функциональной активности нейтрофилов при прогрессирующих формах ФКТ можно рассматривать в качестве малоэффективного у данной группы больных компенсаторного механизма элиминации туберкулезной инфекции (табл. 3).

Практически у всех больных ФКТ выявлены ПТАТ различного характера. При этом интенсивность антителообразования была очень высокой. Высокий уровень антител в данных условиях не отражает повышенной

сопротивляемости организма больного, а является результатом длительного антигенного раздражения.

Одновременно выявлено значительное увеличение концентрации ^ и ^ по сравнению с контрольной группой. Высокий синтез 1&А и ^ указывает на выраженную активность и хронизацию патологического процесса [7].

Более чем у половины больных (52%) процесс сопровождался появлением в крови высокого уровня иммунных комплексов мелких размеров и у 30% — средних размеров, что, по-видимому, обусловлено наличием у них большой дозы антигена, длительным персистированием инфекционного агента, возможным присоединением аутоиммунного компонента.

Значительную роль в защите организма от туберкулезной инфекции играют цито-кины. Однако чрезмерно высокие уровни продукции этих цитокинов указывают на возможность возникновения нежелательных последствий, в том числе иммунопатологических процессов. В то же время значительное снижение продукции ряда ци-токинов нарушает механизмы противоин-фекционной защиты [2, 6, 8].

Синтез индуцированного ИЛ-2, отражающего активность ТЫ-клеток, играющих основную роль в протективном ответе при туберкулезе, зарегистрирован у большинства пациентов. Однако уровень его продукции в

Таблица 3

Показатели продукции ПТАТ и иммуноглобулинов классов A, G, M у больных прогрессирующим ФКТ

Обследуемая группа РПК, у. е. РГЛ, у. е. ИФА, у. е. г/л № г/л ^М, г/л

М±m М±m М±m М±m М±m М±m

ФКТ прогр. 42,1±1,99 * 25,4±1,60 * 1,14±0,13 * 3,6±0,22 * 15,3±0,72 * 2,13±0,12

Доноры 12,5±0,86 6,7±0,64 0,12±0,01 1,84±0,13 12,2±0,87 1,86±0,13

ответ на ФГА был достоверно ниже, чем у здоровых доноров. Под воздействием туберкулина, напротив, выработка ИЛ-2 (ИЛ-2П) значительно усилилась. Разность в интенсивности продукции ИЛ-2, стимулированного ФГА и ППД, составила всего 5,6—19,53 у. е. против 36,8 у. е. в контроле (р<0,01).

Выраженный спонтанный и индуцированный синтез провоспалительного цитоки-на й-8 зарегистрирован у всех больных ФКТ. При этом интенсивность его продукции намного превосходила нормальные значения как при стимуляции лПС и ППД, так и без индукции (соответственно 17 061± ±1804,9 пг/мл, 13 751,4±1160,7 пг/мл, 13 323,7±1280,76 пг/мл, у доноров — 10 782± ±3219,40, 7261±1645,8 и 8843,7±3516 пг/мл, р<0,04).

Под действием ФГА, а также в сыворотке крови достоверного усиления выработки Ил-2 и его содержания по сравнению с контрольной группой не наблюдалось (14 987,3±1453 и 291,5±62,1 пг/мл, в группе здоровых лиц — 11 643±3354 и 178,8± ±47,78 пг/мл, р>0,05).

ИФН-у — продукт иммунных Т-лимфо-цитов. Из всех медиаторов он самый сильный активатор макрофагов, от активности которых во многом зависит их способность сдерживать рост и размножение микобакте-рий на всех этапах заражения туберкулезом.

Частота выявления ИФН-у, стимулированного и сывороточного, практически не отличалась, колеблясь в пределах от 56 до 60%. Реже определялась спонтанная продукция ИФН-у (39,2%). В ответ на индукцию ППД и ФГА у половины пациентов выработка ИФН-у отсутствовала. У трети больных (30,95%) выработка ИФН-у отсутствовала как при стимуляции МНК, так и без нее, а также и в сыворотке крови. Обращает внимание величина разбросов в уровне продукции ИФН-у в супернатантах — от 0 до 1968 пг/мл.

В целом, выявленные у больных ФКТ сдвиги в иммунном статусе, заключающиеся в снижении Т-хелперов и иммунорегуля-торного индекса, повышении числа цито-токсических клеток, изменении соотношения остальных субпопуляций, низкой пролиферативной активности лимфоцитов, резком снижении продукции ИФН-у, ИЛ-2 в ответ на индукцию ФГА, увеличении выработки провоспалительных цитокинов, гиперпродукции иммуноглобулинов, противотуберкулезных антител, ЦИК, указывают на развитие у этих больных II типа иммунного ответа, не протективного по отношению к туберкулезу.

Выводы

Сравнительный анализ показателей иммунного статуса у больных прогрессирующим ФКТ, отличающихся по выраженности деструктивных изменений в легких, показал, что наиболее значительные изменения в иммунной системе выявлены у больных с более обширными деструктивными изменениями.

Выраженная иммунопатология отягощает течение и прогноз заболевания и свидетельствует о целесообразности применения у ряда больных ФКТ иммуномодулирующей терапии.

Библиографический список

1. Авербах М. М. Иммунология и иммуногене-тика туберкулеза: состояние и перспективы развития исследований/М. М. Авербах, В. И. Литвинов//Пробл. туб.— 1989.— № 2.— С. 65—69.

2. Железникова Г. Ф. Цитокины как предикторы течения и исхода инфекций/ Г. Ф. Железникова//Цитокины и воспаление.— 2009.— Т. 8.— № 1.— С. 10—17.

3. Заболевания иммунной системы/Я. М. Калинина, С. А Кетлинский, С. В. Оковитый, С. Я. Шуленин.— СПб., 2008.- 494 с.

4. Кноринг Б. Е. Особенности иммунного статуса больных туберкулезом легких и его роль в диагностике, прогнозировании течения и иммунокоррекции: автореф. дис. ... д-ра мед. наук/Б. Е. Кноринг- СПб., 1996.- 42 с.

5. Кноринг Б. Е. Серологические методы диагностики туберкулеза/Б. Е. Кноринг// Метод. рекоменд.— 1976.

6. Лядова И. В. Реакции Т-клеточного иммунитета при туберкулезе: экспериментальные и клинические исследования/ И. В. Лядова, В. Я. Гергерт^//Туберкулез и болезни легких.— 2009.— № 11.— С. 9—17.

7. Особенности иммунологических показателей у больных с различными формами туберкулеза легких/Е. Э. Колмогорова, Е. В. Костенко, В. А. Стаханов и др.//Им-мунология.— 2005.— № 1.— С. 45—49.

8. Сенников С. В. Полиморфность цитоки-новой сети и ее роль в иммунорегуляции в норме и при патологии/С. В. Сенников// Рос. иммунологический журнал.— 2008.— Т. 2.— № 2—3.— С. 135.

9. Характер специфического иммунного ответа и продукция цитокинов мононуклеа-рами крови больных разными формами туберкулеза легких/Б. Е. Кноринг, И. С. Фрейдлин, А. С. Симбирцев и др.//Мед. иммунология.— 2001.— Т. 3.— № 1.— С. 61—69.

10. A simple method for the solubilisation of reduced NBT, and its use as a colorimetric assay for activation of human macrophages by gamma-interferon/G. A. W. Rook, J. Steel, S. Umar, H. M. Dockrell//J. Immunol. Meth.— 1985.— Vol. 82.— № 1.— P. 161—167.

B. E. Knoring, A. V. Elkin, T. S. Basek, E. I. Potapenko

IMMUNITY STATE IN PATIENTS WITH

PROGRESSING FIBROCAVERNOUS PULMONARY TUBERCULOSIS

Parameters of cellular humoral immunity as well as those of cytokine status were investigated in patients with progressing fibrocavernous pulmonary tuberculosis. Marked decrease in relative T-helper content, heightening of the number of cytotoxic cells, activated T-lymphocytes and NKT-cells was established. For the majority of patients with progressing fibrocavernous tuberculosis (FCT) marked proliferative response of lymphocytes to specific antigens and low one to total mitogen PHA was typical. Simultaneously, significant elevation of oxygen dependent metabolism of neutrophils and growth of their absorbing function was revealed. High synthesis of IgA, IgG, small CIC was noted. Pronounced increase in IL-8, tuberculin-induced IL-2 production and decrease in PHA-induced IL-2 production was shown. Great deficiency of IFN-y production was detected. The most essential changes in immune system were found in patients with more extensive destructive changes. The obtained data demonstrate advisability of using immunomodulating therapy in some FCT patients during their preparation to the operation.

Keywords: progressing fibrocavernous pulmonary tuberculosis, immunity.

Контактная информация: Кноринг Беатриса Ефимовна, зав. лабораторией иммунологии Санкт-Петербургского научно-исследовательского института фтизиопульмонологии, 191036, г. Санкт-Петербург, Лиговский пр,2—4, тел. 8 (812) 579-25-84

Материал поступил в редакцию 20.08.2010