ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ПРОТИВОАЛЛЕРГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО (ВАРИАНТЫ), ШТАММ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ПРИ ПРИГОТОВЛЕНИИ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОТИВОАЛЛЕРГИЧЕСКОГО СРЕДСТВА
IMMUNOBIOLOGICAL ANTIALLERGIC AGENT (VERSIONS) AND LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS STRAIN USED FOR PRODUCTION OF IMMUNOBIOLOGICAL ANTIALLERGIC AGENT

Изобретение относится к медицине и фармацевтической промышленности и может быть использовано в производстве и использовании медицинских иммунобиологических препаратов и биологически активных добавок к пище.
Известно противоаллергическое действие молочнокислых бактерий, преимущественно лактобацилл (Weid Т., Ibnou-Zekri N., Pfeifer A. Novel probiotics for the management of allergic inflammation // Digestive and liver disease: official journal of the Italian Society of Gastroenterology and the Italian Association for the Study of the Liver. - 2002. - Vol.34, №2. - P.25-28), которое обусловлено снижением уровня специфических IgE в сыворотке крови (Peng S., Lin J.Y., Lin M.Y. Antiallergic effect of milk fermented with lactic acid bacteria in a murine animal model // Journal of agricultural and food chemistry. - 2007. - Vol.55, №13. - P.5092-5096) при стимуляции лактобациллами синтеза регуляторных цитокинов: штаммы Lactobacillus plantarum CCRC 12944, Lactobacillus acidophilus CCRC 14079, Lactobacillus rhamnosus CCRC 10940, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CCRC 14023, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CCRC 12297, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CCRC 14007 и Lactobacillus deldrueckii subsp. bulgaricus CCRC 14069 стимулировали синтез лимфоцитами интерферона-γ (US патент, номер публикации 2004/0047849 A1, C12N 1/20); штамм Lactobacillus paracasei KW 3110 стимулировал синтез лимфоцитами интерлейкина-12 и интерлейкина-4 (ЕР патент 1634600 A1, A61K 35/74, А61Р 11/02, 11/06, 17/00, 27/02, 37/08, A23L 1/30, C12N 1/20); синтез спленоцитами и мононуклеарами периферической крови интерферона-γ стимулировал штамм Lactobacillus paracasei GM-080 (US патент, номер публикации 2005/0214271 A1; US патент 6994848 В2, А61К 45/00, C12N 1/20).
Однако штаммы разных видов лактобацилл, например: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus delbrueckii, способны продуцировать гистамин (Garai G., Dueñas M.T., Irastorza A., Moreno-Arribas M.V. Biogenic amine production by lactic acid bacteria isolated from cider // Letters in applied microbiology. - 2007. - Vol.45, №5. - P.473-478; Azcarate-Peril M.A., Altermann E., Hoover-Fitzula R.L., Cano R.J., Klaenhammer T.R. Identification and inactivation of genetic loci involved with Lactobacillus acidophilus acid tolerance // Applied and environmental microbiology. - 2004. -Vol.70, №9. - P.5315-5322; Leuschner RG, Kurihara R, Hammes WP. Effect of enhanced proteolysis on formation of biogenic amines by lactobacilli during Gouda cheese ripening // International journal of food microbiology. - 1998. - Vol.20, №44. - P.15-20). Этот недостаток ограничивает показания к применению средств, содержащих лактобациллы, и препятствует использованию лактобацилл в качестве ингредиентов композиций, перспективных для профилактики и лечения заболеваний, в развитии которых имеет значение уровень гистамина в организме.
Ранее не было известно, что производственные штаммы Lactobacillus acidophilus меньше других видов лактобацилл продуцируют гистамин. Кроме того, штаммы Lactobacillus acidophilus способны подвергать гистамин гидролитическому дезаминированию с помощью фермента диаминооксидазы (гистаминазы). При этом соотношение уровня продукции гистамина и уровня его дезаминирования лактобациллами зависит от ряда факторов, в том числе от кислотности, ионного состава и других показателей среды культивирования.
Наиболее близким аналогом заявляемого изобретения - прототипом являются ацидофильные кисломолочные продукты на основе одного штамма Lactobacillus acidophilus NK1 (SU авторское свидетельство 732389, A23C 9/123, C12N 1/20; Ворошилина Н.Н. Микробы вида Lactobacillus acidophilus как основа фармакопейных форм бактерийных препаратов. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. - Москва, 1982. - 22 с.).
Недостатком указанного штамма лактобацилл является то, что он может более чем в 1,5 раза повышать содержание гистамина в среде культивирования при высоком показателе кислотности среды, который достигается за счет высокой кислотообразующей активности штамма Lactobacillus acidophilus NK1.
Задачей заявляемого изобретения является повышение эффективности противоаллергического действия иммунобиологических средств на основе лактобацилл.
Задача решена тем, что варианты иммунобиологического средства содержат микроорганизмы штамма Lactobacillus acidophilus ГРК-08, коллекционный №222, обладающего критериями противоаллергического действия.
Штамм Lactobacillus acidophilus ГРК-08 получен из содержимого кишечника ребенка, депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ имени Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора под №222 и характеризуется следующими свойствами:
1. Морфологические свойства
Прямые, крупные, длинные, неподвижные, бесспоровые, грамположительные палочки, располагающиеся в мазке попарно или в виде цепочек по две - четыре клетки.
2. Культуральные свойства
Микроаэрофил, оптимальные условия для культивирования - анаэробные. Температура культивирования - 34-40°С. На полужидких средах вырастает в течение 16-24 часов, на агаризованных - 48 часов.
1+
2+
2+
2+
В среды для культивирования для стабилизации свойств штамма можно дополнительно добавлять источники гистамина, ионов Сu, Сu, Со, Ni, глюкозы, галактозы, фруктозы, лактозы, маннозы, фракций казеина или гидролизатов фракций казеина, жидкое масло, которое может быть выбрано из ряда: растительное масло, жир рыб, жир морских млекопитающих, минеральное масло, синтетическое масло или их сочетания.
Сквашивает молоко с образованием плотного ровного тягучего сгустка.
8
9
На полужидких средах растет равномерно по всему объему, без зоны аэробиоза. Единичные колонии имеют форму шариков диаметром 1-2 мм. При выращивании в течение 16-24 часов число КОЕ/мл лактобацилл составляет 10-10.
На поверхности агаризованной МРС в анаэробных условиях через 24 часа роста образуются полупрозрачные однородные белые, выпуклые, круглые колонии с ровными краями. Диаметр колонии - 2-4 мм. Время культивирования - 24-48 часов.
3. Биохимическая активность
Штамм гомоферментативен. Каталазу не продуцирует. Желатину не разжижает. Ферментирует без образования газа глюкозу, галактозу, маннозу, фруктозу, N-ацетилглюкозамин, лактозу, трегалозу, салицин, замедленно ферментирует арабинозу, ксилозу. Штамм не повышает содержание гистамина в среде культивирования. Продуцирует лектины, связывающие в гликоконъюгатах остатки N-ацетил-D-галактозамина с α-связью (GalNAc-α-), D-маннозы с α-связью (Man-α-) и D-маннозы-6-фосфата с α-связью (Man-6Р-α-). Продуцирует биосурфактанты.
4. Активность кислотообразования
В процессе культивирования на производственных средах снижает рН до 3,5-4,5. Значение титруемой кислотности при этом составляет 180°Т, а при выращивании в стерильном молоке через 24 часа - 175°Т.
5. Антагонистическая активность
Штамм антагонистически активен в отношении тест-культур (Shigella flexneri-2 штамма, Shigella sonnei, энтеропатогенной Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Salmonella enterica серовар typhimurium): зона угнетения роста тест-штаммов должна быть не менее 20 мм.
6. Устойчивость к антибиотикам
Штамм высокоустойчив к стрептомицину, устойчив к неомицину, канамицину, гентамицину, промежуточно устойчив к тетрациклину, эритромицину.
7. Содержание гуанина и цитозина в ДНК составляет 36 мол.%.
8. Генотипирование
ПЦР-анализ подтвердил принадлежность к виду Lactobacillus acidophilus.
Таким образом, штамм Lactobacillus acidophilus ГРК-08 обладает оригинальным сочетанием свойств, обеспечивающих наличие критериев его противоаллергического действия: уникальной биохимической активностью с особенностями регуляции уровня гистамина, продукции лектинов, биосурфактантов, антагонистической активностью в отношении микроорганизмов, интенсивно продуцирующих гистамин, и устойчивостью к антибиотикам. Поэтому он является перспективной основой вариантов иммунобиологического средства, эффективных при аллергическом заболевании, псевдоаллергическом заболевании без сопутствующей патологии или в сочетании с заболеванием инфекционной этиологии, дисбактериозом кишечника. Также подобраны ингредиенты сред для культивирования, целевые добавки, в сочетании стабилизирующие уникальную биохимическую активность микроорганизмов штамма Lactobacillus acidophilus ГРК-08.
4
10
Варианты иммунобиологического противоаллергического средства содержат микроорганизмы штамма Lactobacillus acidophilus ГРК-08 в виде их биомассы в среде культивирования в количестве 10-10 КОЕ/мл или в виде супернатанта, полученного при культивировании микроорганизмов штамма Lactobacillus acidophilus ГРК-08. Среда культивирования может быть выбрана из ряда: казеиново-дрожжевая среда после культивирования лактобацилл, сквашенное молоко, имеющее жирность 0,5-1,5% и рН 5,0-6,8, сквашенное обезжиренное молоко, имеющее рН 5,0-6,8, сквашенное обезжиренное, выпаренное на 10-20% молоко, имеющее рН 5,0-6,8, гидролизатно-молочная среда после культивирования лактобацилл или их смеси. Заявляемое средство может дополнительно содержать целевые добавки в количестве 0,01-95,0 мас.% и быть выполнено в форме суспензии или крема, или мази, или пасты, или маски. Заявляемое средство может содержать целевые добавки, выбранные из ряда: казеин, желатин, агар, глицерин, яичный желток, яичный белок, пектин, целлюлоза, производные целлюлозы, бентонит, каолин, аэросил, меди сульфат, меди глюконат, хинозол, хитозан, экстракт корня солодки, экстракт шиповника, настой ромашки, воск эмульсионный, комбижир, ланолин, спермацет, вазелин, церезин, вазелиновое масло, искусственный вазелин, пальмитин, гидрированный жир, переэтирифицированный жир, кондитерский жир, пальмовый олеин, пальмовый стеарин, масло оливковое, масло персиковое, масло подсолнечное, масло касторовое, полиэтиленоксид, нипагин, нипазол, микрокаре РМ5, микрокаре IT или их смеси. Заявляемое средство может быть использовано при профилактике и лечении дефектов кожи, дерматита, аллергического заболевания, псевдоаллергического заболевания без сопутствующей патологии или в сочетании с заболеванием инфекционной этиологии, дисбактериозом кишечника.
Заявляемые варианты иммунобиологического противоаллергического средства являются новыми и в литературе не описаны.
Техническим результатом заявляемого изобретения является повышение эффективности противоаллергического действия иммунобиологических средств на основе лактобацилл. Повышение эффективности противоаллергического действия при использовании заявляемого изобретения показано при наличии у пациентов аллергического заболевания, псевдоаллергического заболевания без сопутствующей патологии или в сочетании с заболеванием инфекционной этиологии, дисбактериозом кишечника.
Сущность изобретения поясняется на следующих примерах, показывающих эффективность противоаллергического действия иммунобиологических средств на основе штамма Lactobacillus acidophilus ГРК-08. При этом приведенные в примерах комбинации ингредиентов вариантов заявляемого средства показывают конкретную реализацию заявляемого изобретения, но не ограничивают объем притязаний формулы заявляемого изобретения.
8
Пример 1. В двух группах больных с аллергической крапивницей, в каждой из которых было по 10 пациентов, проводилось сравнение эффективности противоаллергического действия ацидофильного кисломолочного продукта на основе штамма Lactobacillus acidophilus NK1 (в первой группе пациентов) и варианта заявляемого иммунобиологического средства (во второй группе пациентов), содержащего биомассу микроорганизмов штамма Lactobacillus acidophilus ГРК-08 в среде их культивирования (в сквашенном обезжиренном молоке, имеющем рН 5,5), в количестве 10КОЕ/мл и целевые добавки (меди сульфат и экстракт ромашки) в общем количестве 2,0 мас.%. При этом заявляемое иммунобиологическое средство было выполнено в форме суспензии. При проведении исследования критерии наличия противоаллергического средства чаще регистрировались во второй группе пациентов (у 9 больных, 90% случаев), чем в первой группе (у 6 больных, 60% случаев).
6
7
Пример 2. Пациент Л., 34 года. Диагноз: аллергический дерматит, вызванный съеденной пищей, и дисбактериоз кишечника с высевом Staphylococcus aureus. При лечении пациента использовалось иммунобиологическое противоаллергическое средство, содержащее биомассу микроорганизмов штамма Lactobacillus acidophilus ГРК-08 в среде их культивирования (казеиново-дрожжевая среда после культивирования лактобацилл) в количестве 10 КОЕ/мл, которое назначалось перорально 3 раза в сутки, в течение 14 дней по 5×10 КОЕ Lactobacillus acidophilus ГРК-08. В результате лечения было выявлено наличие критериев противоаллергического и противоинфекционного действия средства: исчезновения зуда, разрешения высыпаний на коже, элиминации Staphylococcus aureus и коррекции микробиоценоза кишечника.
8
7
Пример 3. Пациент Ф., 30 лет. Диагноз: аллергический дерматит, вызванный съеденной пищей, и дисбактериоз кишечника с высевом Staphylococcus aureus. При лечении пациента использовалось иммунобиологическое противоаллергическое средство, содержащее биомассу микроорганизмов штамма Lactobacillus acidophilus ГРК-08 в среде их культивирования (сквашенное обезжиренное молоко, имеющее рН 5,0) в количестве 10 КОЕ/мл, которое назначалось перорально 3 раза в сутки, в течение 14 дней по 5×10 КОЕ Lactobacillus acidophilus ГРК-08. В результате лечения было выявлено наличие критериев противоаллергического и противоинфекционного действия средства: исчезновения зуда, разрешения высыпаний на коже, элиминации Staphylococcus aureus и коррекции микробиоценоза кишечника.
10
7
Пример 4. Пациент Т., 26 лет. Диагноз: аллергический дерматит, вызванный съеденной пищей, и пиодермия с высевом Staphylococcus aureus. При лечении пациента использовались иммунобиологическое противоаллергическое средство, содержащее биомассу микроорганизмов штамма Lactobacillus acidophilus ГРК-08 в среде их культивирования (казеиново-дрожжевая среда после культивирования лактобацилл) в количестве 10КОЕ/мл и целевые добавки (меди сульфат) в количестве 0,01 мас.% и выполненное в форме суспензии, которое назначалось перорально 2 раза в сутки, в течение 14 дней по 5×10 КОЕ Lactobacillus acidophilus ГРК-08, а также иммунобиологическое противоаллергическое средство, содержащее супернатант, полученный при культивировании микроорганизмов штамма Lactobacillus acidophilus ГРК-08 в среде их культивирования (казеиново-дрожжевая среда после культивирования лактобацилл), и целевые добавки (вода, глицерин, хитозан) в общем количестве 60,0 мас.% и выполненное в форме суспензии, которое назначалось наружно на поверхность высыпаний 2 раза в сутки в течение 6 дней. В результате лечения было выявлено наличие критериев противоаллергического и противоинфекционного действия средства: исчезновения зуда, разрешения высыпаний на коже и элиминации Staphylococcus aureus.
10
7
Пример 5. Пациент О., 28 лет. Диагноз: острая крапивница (псевдоаллергическая), хронический тонзиллит в стадии обострения, носительство Staphylococcus aureus. При лечении пациента использовалось иммунобиологическое противоаллергическое средство, содержащее биомассу микроорганизмов штамма Lactobacillus acidophilus ГРК-08 в среде культивирования (казеиново-дрожжевая среда после культивирования лактобацилл) в количестве 10 КОЕ/мл и целевые добавки (меди сульфат, экстракт корня солодки, экстракт шиповника и настой ромашки) в общем количестве 95,0 мас.% и выполненное в форме суспензии, которое назначалось перорально 3 раза в сутки, в течение 10 дней по 5×10 КОЕ Lactobacillus acidophilus ГРК-08. В результате лечения было выявлено наличие критериев противоаллергического и противоинфекционного действия средства: полного разрешения уртикарий, отсутствия свежих высыпаний на коже, элиминации Staphylococcus aureus, купирования обострения хронического тонзиллита в течение 3 дней (предыдущие обострения хронического тонзиллита у пациента продолжались в течение 7-10 дней).