Способ прогнозирования исхода плоскоклеточного рака языка и ротоглотки
METHOD FOR PREDICTING THE OUTCOME OF SQUAMOUS CELL CARCINOMA OF THE TONGUE AND OROPHARYNX

Предлагаемое изобретение относится к области медицины и может быть использовано в онкологии для прогнозирования продолжительности жизни больных плоскоклеточным раком языка и ротоглотки.
Существующие способы прогнозирования возможного течения плоскоклеточного рака головы и шеи характеризуют непосредственно первичную опухоль: размеры новообразования, характер и степень распространенности процесса [1]. Экспериментальные исследования также демонстрируют влияние молекулярных маркеров на клиническое течение заболевания. Однако эти методы в основном не учитывают канцерогенное влияние вируса папилломы человека (ВПЧ) на развитие рака ротоглотки и его биологические особенности, что продемонстрировано в нескольких крупных исследованиях [2].
Аналогов по прогнозированию исхода плоскоклеточного рака непосредственно языка и ротоглотки заявители не обнаружили. Известен способ прогнозирования продолжительности жизни онкологических больных после радикальной операции, основанный на комплексном учете показателей общего и биохимического анализов крови, антропометрических данных и характеристик злокачественного новообразования, при этом определяют онкологические индексы и по количеству индексов, превышающих порог, и по их численным значениям определяют благоприятный (выживаемость 5 и более лет) или неблагоприятный (выживаемость менее 5 лет) прогноз жизни больного. При неблагоприятном прогнозе вычисляют продолжительность жизни больного после операции (Патент РФ №2101704 от 01.10.1998). Недостатками данного способа являются:
- способ не подходит для прогнозирования продолжительности жизни онкологических больных, не получивших оперативное лечение;
- способ не специфичен для разных локализаций опухолевого процесса;
- характеризуется низкой клинической информативностью в отношении биологических особенностей первичной опухоли;
- предполагает дополнительный забор материала для проведения исследования;
- способ предусматривает влияние сопутствующей патологии и искажает интерпретацию результатов;
Известен способ прогнозирования продолжительности жизни больных при распространенных злокачественных новообразованиях, при котором в крови определяют лимфоциты CD4+Leu8+, CD8+11b+, CD21+, CD2+, моноциты (М) и спонтанный (SS) и индуцированный (RBT) фитагемагглютинином синтезы ДНК. По ним находят соотношения CD4+Leu8+/ CD2+, CD21+/CD2+, CD4+Leu8+/CD8+11b+, CD8+11b+/CD2+, CD4+Leu8+/CD8+11b/ (CD8+11b+/CD2+), (M.CD2+)/CDS8+11b+ и [M(CD2+)2] /(CD8+11b+)2, RBT.SS. При этом прогнозируемой продолжительностью жизни больного считают тот диапазон ее значений, который является совпадающим для всех указанных соотношений на калибровочных кривых, предварительно построенных как зависимость продолжительности жизни контрольной группы больных от каждого из названных соотношений их исходных показателей крови (Патент РФ 2222813 от 27.01.2004).
Недостатками данного способа являются:
- не специфичен для разных локализаций опухолевого процесса, что может вызвать затруднение при интерпретации результатов;
- способ не может быть использован для прогнозирования продолжительности жизни больных при нераспространенных злокачественных новообразованиях;
- при проведении предполагается дополнительный забор материала для проведения исследования;
Наиболее близким к предлагаемому является способ прогнозирования исходов плоскоклеточных карцином головы и шеи, заключающийся в определении онкомаркеров, проводят иммуноферментное исследование уровня ММП-2, ММП-9, ТИМП-1 и ТИМП-2 в сыворотке крови до лечения, и при уровне ММП-9 более 550 нг/мл и уровне ТИМП-1 более 230 нг/мл прогнозируют снижение общей и безрецидивной 2-летней выживаемости, также, при ТИМП-2 более 120 нг/мл, ММП-2 более 250 нг/мл дополнительно к упомянутым показателям прогнозируют высокую вероятность появления метастазов (Патент РФ 2426991 от 20.08.2011).
Недостатками данного способа являются:
- не учитываются биологические особенности течения заболевания в зависимости от этиологического фактора;
- исключается одновременное проведение анализа при гистологической верификации заболевания, что предполагает дополнительный забор материала для проведения исследования;
- технические трудности осуществления в клинической лаборатории при отсутствии реактивов;
Задачи:
- повышение клинической информативности способа с учетом биологических особенностей опухоли;
- прогнозирование по первичной опухоли с целью исключения воздействия на результаты анализа иных метаболических причин;
- проведение исследования без дополнительного забора биологического материала;
- повышение доступности диагностического процесса;
Сущностью изобретения является иммуногистохимическое определение уровня экспрессии молекулярных маркеров р16 и Ki-67 и при экспрессии р16 более или равной 70% опухолевых клеток и Ki-67 более 50% в комплексе прогнозируют увеличение общей 3-летней выживаемости больных.
Техническим результатом является способ прогнозирования исхода плоскоклеточного рака языка и ротоглотки, который повышает клиническую информативность в отношении биологического поведения опухоли, исключает влияние на прогнозирование иных метаболических причин. При этом отсутствует необходимость проведения дополнительных диагностических процедур и применения дорогостоящих реактивов.
Способ для лучшего понимания дополнительно поясняется на фиг. 1 - кривые выживаемости Каплана-Майера, где п. 1 - кривая выживаемости больных с наличием экспрессии р16 более или равной 70% опухолевых клеток и Ki-67 более 50% в комплексе, п. 2 - кривая выживаемости больных без этих маркеров в комплексе. Способ осуществляют следующим образом. Проводят гистологическое и иммуногистохимическое исследования опухолевой ткани, взятой до начала лечения. Для фиксации материала используют раствор 10% нейтрального формалина с последующей стандартной проводкой дегидратантами, затем образцы заключают в парафин. Далее приготавливают срезы толщиной 3-5 мкм и окрашивают их гематоксилином и эозином. На срезах с парафиновых блоков, проводят иммуногистохимическое исследование. Согласно протоколу, вначале парафиновые срезы подвергают предварительному нагреву до 65°С, далее восстанавливают антиген в течение 20 минут при температуре 97°С и охлаждение до 65°С. Иммуногистохимическое исследование выполняют на парафиновых срезах автоматизированным методом на иммуногистостейнере ThermoScentific с использованием моноклональных антител к р16 (clone INK4 BioGenex в разведении 1:25) и Ki67 (clone SP6 LabVision в разведении 1:400) с предварительной демаскировкой в цитратном буфере рН 6,0 с использованием РТ - модуля. Визуализацию реакции осуществляют системой детекции UltraVisionQantoDetectionSystem HRP DAB (ThermoScentific). Оценку результатов иммуногистохимической реакции осуществляют с применением светового микроскопа «Leica» под увеличением х100 и применяют балльный критерий для оценки степени экспрессии белка р16:0 (нет окрашивания), 1 балл (окрашено 1-10% опухолевых клеток), 2 балла (11-40%), 3 балла (41-70%) и 4 балла (≥70%). Пролиферативную активность опухоли оценивают количеством Ki-67-положительных клеток, которые приходятся на 200-300 клеток опухоли. Индекс Ki-67 определяют как число Ki-67 - положительных клеток, умноженное на 100, разделенное на общее количество клеток. Полученные данные интерпретируют как низкую пролиферативную активность при результате 0-20%, умеренную пролиферативную активность - 21-50% и высокую пролиферативную активность - более 50%.
Выбор маркеров предлагаемого способа для прогнозирования исходов злокачественных новообразований головы и шеи обусловлен рядом предпосылок. Иммуногистохимическое определение экспрессии р16 часто используется как суррогатный биомаркер для выявления ВПЧ-инфекции по активности вирусных онкопротеинов [3, 4]. Одновременная детекция р16 и определение экспрессии индекса пролиферативной активности Ki-67 в опухолевых эпителиальных клетках может быть интерпретирована как суррогатный маркер нарушения регуляции клеточного цикла при инфицированности ВПЧ высокого онкогенного риска [5].
Предлагаемые критерии основаны на анализе данных клинических наблюдений. В группу исследования вошли 66 больных плоскоклеточным языка и ротоглотки разной степени дифференцировки (рак тела и корня языка, рак небных миндалин, рак мягкого неба, рак боковых стенок ротоглотки), имеювших распространенность T1-4N0-2M0, проходивших лечение на базе ГБУЗ КОД №1 г. Краснодара с 2011 по 2014 гг. с длительностью наблюдения не менее 3 лет и доступными данными по исходам заболевания. Из этой когорты больных возраст младше 60 лет включительно отмечался в 62% (41 из 66) случаев, а старше 60 лет - у 38% (25 из 66) человек. Средний возраст больных составил 57,39±1,176 лет (95%ДИ 55,04-59,74). При этом рак корня языка выявлялся у 27% (18 из 66), небных миндалин - у 32% (21 из 66), мягкого неба - у 11% (7 из 66), боковых стенок ротоглотки - у 22% (15 из 66), тела языка - у 8% (5 из 66) больных. По признаку поражения регионарных лимфоузлов больные распределены следующим образом - отсутствие метастазов (N0) отмечено у 61% (40 из 66), а наличие метастазов (N1-2) - у 39% (26 из 66) человек. Т 1-2 имели 40% (25 из 66), Т 3-4 - 60% (41 из 66) пациентов. Стадии I-II выявлены у 18%) (12 из 66), a III-IV - у 82% (54 из 66) больных. Самым частым видом лечения явилась лучевая терапия (27%). Меньше всего больных пролечены комбинированным методом лечения (хирургия с адъювантной лучевой терапией) - 3%. Полихимиотерапия в самостоятельном варианте инициально назначалась 30% больных в исследуемой когорте как в индукции, так и в режиме паллиативного лечения. Вариант химиотерапии с последующей лучевой терапией назначен 40%. Сатистический анализ выполнен с использованием статистического пакета IBM SPSS statistics version 22. В зависимости от вида распределения, результаты представлены как m±М, где m - среднее выборочное, М - ошибка среднего или как медиана с интерквартильным размахом (25-й и 75-й процентили). Для оценки влияния факторов риска на выживаемость использован многофакторный регрессионный анализ пропорциональных рисков Кокса. Кумулятивные показатели общей выживаемости для факторов риска оценивались по методу Каплана-Майера, достоверность различий между сравниваемыми группами оценивалась по логарифмическому ранговому критерию. На основании показателей выживаемости построены графические изображения - кривые выживаемости.. Статистически значимыми считались различия при р<0,05.
В исследованной когорте пациентов медиана продолжительности жизни составила 36±12,265 месяца (3±1,1 года) с интерквартильным размахом от 76 до 12. По данным многофакторного анализа по Коксу с включением клинико-морфологических параметров и молекулярных маркеров статистически значимым фактором для общей выживаемости больных явилась комбинации маркеров р16 более и равного 70% и Ki-67 более 50% (HR 0,555, 95% ДИ 0,372-0,826, р=0,002). При этом шанс летального исхода снижался на 45,5%. Средняя продолжительность жизни при обнаружении комбинации составила 54,686±5,005 мес.(4,5±0,42 года), в ее отсутствии - 35,728±4,435 мес.(2,9±0,37 года). Построены кривые выживаемости Каплана-Майера в зависимости от наличия экспрессии р16 более или равной 70% и Ki-67 более 50% в комплексе. Методом логарифмического рангового теста выявлено статистически значимое увеличение 3-летней общей выживаемости в группе больных при наличии этих маркеров в комплексе, п. 1, в сравнении с группой без этого комплекса маркеров, п. 2 (χ2=5,041, р=0,025).
Пример 1. Пациент И., 44 года. Диагноз: Рак ротоглотки T2N1M0 II st, 2 кл. гр. Из анамнеза: Считает себя больным с 2013 года, когда появились жалобы на боль при глотании и образование во рту. ПГИ: умереннодифференцированный плоскоклеточный рак с наклонностью к ороговению. ИГХ - р16=5%, Ki-67=45%. КТ: выявлено образование ротоглотки, метастазы в лимфоузлы шеи справа, данные за отдаленные метастазы отсутствуют. Цитологическое исследования лимфоузла шеи справа - метастаз плоскоклеточного рака. Проведена лучевая терапия до радикальных доз (68 Гр), полихимиотерапия (схема цисплатин с 5-фторурацилом). При динамическом наблюдении за больным через 20 месяцев (1,6 лет) после проведения комбинированного лечения наступил летальный исход.
Пример 2. Пациентка К., 57 лет. Диагноз: Рак правой небной миндалины T2N1M0 II st, 2 кл. гр. Из анамнеза: Считает себя больной с 2011 года, когда появилось образование правой небной миндалины. Обследована. ПГИ от 29.05.2011 - неороговевающий плоскоклеточный рак. ИГХ - р16=75%, Ki-67=55%. Цитология лимфоузла слева: метастаз плоскоклеточного рака. Проведено 3 курса неоадъювантной химиотерапии (схема цисплатин, 5-фторурацил), лучевая терапия на первичный очаг и регионарные лимфоузлы (60 Гр). Отмечен полный регресс опухоли и лимфогенных метастазов. При динамическом наблюдении за больной в 2012 году отмечен рецидив, проведено 6 курсов химиотерапии (5-фторурацил, дакарбазин). Рецидив в 2013 году. Продолженный рост в 2015 году. Проведено 6 курсов химиотерапии по схеме: метотрексат, блеомицин, цисплатин. Продолженный рост опухоли. Назначена таргетная терапия цетукисмабом. Отмечена стабилизация. Период наблюдения с мая 2009 по декабрь 2017 г. составил 96 месяцев (8 лет).
Пример 3. Пациентка Е., 40 лет. Диагноз: Рак корня языка T2N1M0 II st, 2 кл. гр. Из анамнеза: Считает себя больной с 2014 года, когда отмечено кровотечение из образования языка. Обследована. ПГИ от 20.01.2014 - неороговевающий плоскоклеточный рак. ИГХ - р16=85%, Ki-67=60%. Цитология лимфоузла слева: метастаз плоскоклеточного рака. КТ: выявлено образование корня языка, метастазы в лимфоузлы шеи справа. ЦИ л/у шеи справа - метастаз плоскоклеточного рака. Проведена химиолучевая терапия на первичный очаг и регионарные лимфоузлы в СОД 68 Гр на фоне цисплатина один раз в 3 недели. При контрольном обследовании отмечен полный регресс опухоли и лимфогенных метастазов. При динамическом наблюдении за больной в 2015 году отмечен рецидив в виде метастсазов в легкие. Проведено 6 курсов химиотерапии (доцетаксел с цисплатином) на фоне таргетной терапии цетуксимабом. Отмечена стабилизация. Период наблюдения с момента постановки диагноза до среза данных составил 48 месяцев (4 года).
Пример 4. Пациент С., 57 лет. Диагноз: Рак ротоглотки T2N2M0, IV st, 2 кл. гр. Из анамнеза: Считает себя больным с 2012 года, когда стало беспокоить образование ротоглотки. ПГИ от 29.05.2011 - неороговевающий плоскоклеточный рак. ИГХ - р16=50%, Ki-67=70%. КТ: выявлено образование ротоглотки, метастазы в лимфоузлы шеи справа и слева. Данные за отдаленные метастазы отсутствуют. Цитология лимфоузлов шеи справа и слева - метастазы плоскоклеточного рака. Проведена лучевая терапия на первичный очаг и регионарные лимфоузлы. Через 2 месяца отмечена отрицательная динамика. Летальный исход через 13 месяцев (1,08 года) от момента постановки диагноза.
Пример 5. Пациент М., Рак корня языка T1N1M0, III st., 2 кл. гр. Считает себя больным с 2013 года, когда появилось образование языка. ПГИ от 22.05.2013 - ороговевающий плоскоклеточный рак. ИГХ - р16=70%, Ki-67=35%. КТ: выявлено образование корня языка, метастазы в лимфоузлы шеи слева. ЦИ л/у шеи слева - метастаз плоскоклеточного рака. Проведена лучевая терапия на первичный очаг и регионарные лимфоузлы. При контрольном обследовании - остаточная опухоль языка, регресс метастазов в регионарные лимфоузлы. Через 6 месяца отмечено прогрессирование процесса. Проведено 6 курсов химиотерапии (цисплатин с 5-фторурацилом). Летальный исход наступил спустя 15 месяца (1,1 лет) от момента постановки диагноза.
Список литературы:
1. Кицманюк З.Д., Чойнзонов Е.Л., Новиков В.А., Карасева В.В. // Злокачественные опухоли головы и шеи. Томск: STT, 1998. Стр. 384.
2. Abogunrin, S. Prevalence of human papillomavirus in head and neck cancers in European populations: a meta-analysis / S. Abogunrin, G.L Di Tanna, S. Keeping et al. // BMC Cancer. - 2014. - Vol. 14. - P. 968.
3. Lewis, J.S. Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists / J.S. Lewis, B. Beadle, J.A. Bishop et al. // Archives of Pathology & Laboratory Medicine. - 2018. - Vol. 142(5). - P.559-597.
4. Rischin, D. Prognostic significance of p16INK4A and human papillomavirus in patients with oropharyngeal cancer treated on TROG 02.02 phase III trial/ D. Rischin, R.J. Young, R. Fisher et al. // J. Clin. Oncol. - 2010. - Vol. 28. - P. 4142-4148.
5. Carico, E. p16INK4/Ki-67 Dual-Staining Expression as a Prognostic Indicator in Laryngeal Cancer / E. Carico, M. Radici, B. Bucci, L. Firrisi, A. Fabiano, G. Salerno, M.R. Giovagnoli, A.J. Vecchione // Cancer. Prev. Curr. Res. - 2014. -Vol. 1(3). - P. 00015.