Выделение мультипотентных прогениторных клеток из фетальной печени человека

I I I I I I

I I I

Новости клеточных технологий

технике. Тем не менее, значение работы для научного мира велико, поскольку был реализован совершенно новый под ход. Разработанный метод может найти применение при изучении плюрипотентности в эмбриологии, а также для

получении лучших результатов ЭКО в клинической репро дуктологии. Компания также рекламирует, что в скором времени учёные получат свободный доступ к выделенным линиям для исследований.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Chung Y., Klimanskaya I., Becker S. et al. Embryonic and extraembryonic stem cell lines derived from single mouse blastomeres. Nature 2006; 439: 216 9.

2. Strelchenko N., Verlinsky 0., Kukharenko V., Verlinsky Y. Morula derived human embryonic stem cells. Reprod Biomed Online 2004; 9(6): 623 9.

3. Hardy K., Martin K.L., Leese H. et al. Human preimplantation development in vitro is not adversely affected by biopsy at the 8 cell stage.

Hum. Reprod. 1990; 5: 708 14.

4. Geber S., Winston R.M.L., Handyside A.H. Proliferation of blastomeres from cleavage stage human embryos in vitro: an alternative to blastocyst biopsy for preimplantation diagnosis. Hum. Reprod. 1995; 10: 1492 6.

5. Sills E.S, Takeuchi T, Tanaka N et al. Identification and isolation of embryonic stem cells in reproductive endocrinology: theoretical protocols for conservation of human embryos derived from in vitro fertilization. Theor. Biol. Med. Model. 2005; 2:25.

Подготовил A.B. Берсенев

По материалам Nature advance online publication 23 August 2006; doi:10.1038/nature05142

Выделение мультипотентных прогениторных клеток из фетальной печени человека

Трансплантация гепатоцитов или прогениторных клеток печени для лечения печёночной недостаточности является одним из самых востребованных направлений современной регенеративной медицины. Залогом успеха реализации этих подходов является понимание основных ступеней диффе ренцировки клеток предшественников в функционирующие гепатоциты в процессе эмбрионального развития, а также их характеристика, выделение и размножение в культуре. У грызунов прогениторные клетки печени присутствуют в каналах Геринга [1, 2] и могут дифференцироватья как в гепатоциты, так и в эпителиальные клетки выстилки желчных протоков, но не способны пролиферировать в ответ на повреж дение [3, 4].

К настоящему времени были успешно выделены и до вольно хорошо описаны прогениторные клетки из фетальной печени и эпителиальные клетки из печени взрослых грызунов. Suzuki et al. [5] изолировали из фетальной печени мышей клетки с фенотипом с mer/CD49FVCD29VCD45V CDTER119 , которые были способны к дифференцировке в гепатоциты и клетки желчных протоков, а также в эпители альные клетки поджелудочной железы. Однако выделение мультипотентных клеток из фетальной печени человека и создание их линий гораздо более сложны, и к настоящему времени не было получено постоянной линии таких клеток печени [6].

Недавно группа исследователей из Вашингтонского Уни верситета (Seattle, USA) впервые выделила и описала новую популяцию клеток фетальной печени человека, способных дифференцироваться как в мезенхимальном направлении, так и формировать гепатоциты. Эти клетки были названы фетальными мультипотентными прогениторными клетками печени hFLMPC (hepatic Fetal Liver Multipotent Progenitor Cells).

hFLMPC были выделены из семи фетальных печеней че ловека (74 108 дни гестации), после чего поддерживались в первичной культуре в течение трёх месяцев. Далее от них получали клоны, которые культивировались ещё в течение шести месяцев (100 удвоений популяции, 20 пассажей). Фенотипически hFLMPC представляли собой мелкие клетки с небольшим количеством цитоплазмы, экспрессирующие весьма интересный набор маркёров. Так, hFLMPC были

позитивны по CD34, CD90 (thy 1), с kit и SSFA 4. Эти маркеры характерны для стволовых клеток крови и при сутствуют также на клетках фетальной печени грызунов (7). Также hFLMPC позитивны по эпителиальным маркерам, та ким как ЕРСАМ, СК18 и СК19. СК18 и СК19, являющимися маркерами гепатоцитов и эпителиальных клеток желчных протоков соответственно. Интересно, что hFLMPC также позитивны по мезенхимальным маркерам CD44h и вимен тину, но негативны по другим характерным для мезенхимы поверхностным молекулам, включая CD105, CD73 и 6SMA. Они негативны по гемопоэтическим маркерам CD45 и АС133, позитивны по характерному для гепатоцитов с met, но не экспрессируют других гепато специфичных маркеров, таких, как альбумин, а фетопоэтин и транскрипционных факторов HNF1 а, HNF3P и HNF4p. Таким образом, hFLMPC несут смешанный набор мезодермальных и энтодермаль ных маркеров.

Было установлено, что иммунофенотипические и морфо логические характеристики, а также дифференцировочные потенциалы hFLMPC разных пассажей идентичны. Клетки в культурах после первого, пятого и двадцатого пассажей име ли одинаковую длину теломеров хромосом и не демонстри ровали никаких признаков клеточного старения или «ухода» в апоптоз. Когда исследователи попытались найти в феталь ной печени предшественников hFLMPC, пометив различные субпопуляции печёночных клеток флуоресцентным белком GFP, выяснилось, что ни одна из полученных из них колоний hFLMPC не была позитивна по GFP. hFLMPC оказались совер шенно независимой популяцией клеток фетальной печени, вряд ли связанной с дедифференцированными паренхималь ными гепатоцитами или трансдифференцированными муль типотентными мезенхимальными стромальными клетками костного мозга (ММСК). В различных условиях культиви рования hFLMPC дифференцировались в гепатоциты и эпителиальные клетки желчных протоков, а также в адипо циты, хондроциты, остеоциты и эндотелиальные клетки, то есть вели себя одновременно как энтодермальные и мезен химальные предшественники.

Чтобы определить способность hFLMPC функционировать как гепатоциты in vivo, их трансплантировали иммунотолерант ным мышам. Через тридцать дней от начала эксперимента у

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 1У< 4 (6), 2006

И I II II

m

Новости клеточных технологий

всех животных в печени обнаруживался человеческий сы вороточный альбумин. На гистологических срезах были видны крупные клетки, позитивные по человеческому альбумину (уровень репопуляции достигал 0,8-1,7%). Эти данные сви детельствуют о том, что hFLMPC могут дифференцироваться в функциональные гепатоциты и интегрироваться в печё ночную паренхиму при повреждениях.

Таким образом, морфология, эпителиальные маркеры и способность спонтанно дифференцироваться в гепатоциты отличают hFLMPC от ММСК (в своей работе эксперимента торы использовали ММСК из фетальной печени в качестве контроля и показали, что они не способны давать начало ге патоцитам и эпителиальным клеткам желчных протоков). Они сохраняют свой пролиферативный и дифференцировочный

потенциалы в течение более чем шести месяцев, и развива ются в гепатоциты in vivo, что позволяет предполагать в них возможный источник для репопуляции печени при поврежде ниях органа.

В настоящее время исследователи продолжают работу, изучая критические факторы пролиферации и дифферен цировки в различных направлениях, а также оптимальные условия для поддержания культур hFLMPC в течение более долгого времени. Предполагается, что подобные клетки можно получать не только из фетальной печени, но и из фе тальной поджелудочной железы и почек. hFLMPC могут стать не только важным терапевтическим средством, но и объектом фундаментальных исследований путей дифференцировки клеток печени.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Fausto N., Campbell J.S. The pole of hepatocytes and oval cells in liver regeneration and repopulation. Mech. Dev. 2003; 120: 117 30.

2. Saxena R., Theise N.D., Crawford J.M. Microanatomy of the human liver exploring the hidden interfaces. Hepatology 1999; 30: 1339 46.

3. Soit D.B., Medline A., Farber E. Rapid emergence of carcinogen induced hyperplastic lesions in a new model for the sequential analysis of liver carcinogenesis. Am. J. Pathol. 1977; 88: 595 18.

4. Evarts R.P., Hu Z., Qmori N. et al. Precursor product relationship between

oval cells and hepatocytes: comparison between tritiated thymidine and bromodeoxyuridine as tracers. Carcinogenesis 1996; 17: 2143 51.

5. Suzuki A., Nakauchi H., Taniguchi H. In vitro production of functionally mature hepatocytes from prospectively isolated hepatic stem cells. Cell Transplant. 2003; 12: 469 73.

6. Tosh D., Strain A. Liver stem cells prospects for clinical use. J. Hepatol. 2005; 42: Suppl S75 S84; 101: 2973 82.

7. Laurson J, Selden C., Hodgson H.J. Hepatocyte progenitors in man and in rodents multiple pathways, multiple candidates. Int. J. Exp. Pathol. 2005; 86:118.

Подготовила A.C. Григорян По материалам Proc, Natl, Acad, Sei, USA 2006; 103: 9912-7

С044 - специфичная мишень для селективной элиминации стволовых клеток лейкемии человека

Острый миелолейкоз (ОМЛ) - это злокачественное за болевание, характеризующееся накоплением в организме пациента недифференцированных миелоидных бластов, способных к самообновлению и генерации клоногенных лей кемических клеток предшественников (1, 2]. Лейкемия инициирующие или лейкемические стволовые клетки были описаны у человека Bonnet D. и Dick J.E. в 1997 году (3). В настоящее время термин «раковые стволовые клетки» (РСК), предложенный этими учёными, признан международ ной группой экспертов American Association for Cancer Research (4). Развитие теории РСК может полностью изме нить общепринятую концепцию терапии злокачественных опухолей. Современные химиотерапевтические препараты, направленные на элиминацию активно пролиферирующих клеток, вызывают ремиссию заболевания, которая зачастую оказывается обратимой. Всего лишь менее 30% под вергшихся такой терапии пациентов выживают в течение долгого времени, что указывает на неэффективность подоб ного подхода. До сих пор сохраняется необходимость поиска новых терапевтических подходов, способных обеспечить элиминацию РСК, не затрагивая при этом нормальных ге мопоэтических стволовых клеток (ГСК) (5).

РСК при ОМЛ во многом схожи с ГСК, включая поверх ностный фенотип CD34^CD38~, но при этом они способны к ускоренному самообновлению и могут экспрессировать на своей мембране ряд специфических маркеров. Одним из таких маркеров является молекула адгезии CD44, ответ ственная за хоуминг и энграфтинг лейкемических бластов [6]. CD44 обеспечивает взаимодействие малигнизиро ванных клеток с их микроокружением в костном мозге и,

по видимому, препятствует их дифференцировке. Известно, что CD44 - это трансмембранный гликопротеин, экспресси руемый многими клетками крови и в ходе своей продукции подвергающийся альтернативному сплайсингу с образова нием различных изоформ (CD44v) (7). Повышенная эксп рессия этих изоформ, в особенности изоформы CD44 6v, отмечается при остром миелолейкозе, и свидетельствует о плохом прогнозе заболевания (8).

Исследовательская группа под руководством John Dick предположила, что связывание образовавшейся в резуль тате альтернативного сплайсинга изоформы CD44v специ фическими антителами может селективно воздействовать на РСК, но не затрагивать ГСК. Результаты экспериментов по испытанию таких специфических антител - Н90 опубли кованы в журнале Nature Medicine.

Обнаружилось, что Н90, специфически связывая CD44v, характерный для ОМЛ, препятствует развитию заболева ния у иммунодефицитных мышей, получивших инфузию че ловеческих лейкемических бластов. Также введение Н90 приводило к регрессии уже развившихся опухолей. Иссле дователи доказали, что применение Н90 безопасно и не воздействует на нормальные гемопоэтические клетки. Контрольный трансплантат ГСК практически не реагировал на введение в организм реципиента специфических анти тел к CD44, а снижение количества донорских ГСК было ми нимальным по сравнению с зачастую полной элиминацией РСК.

Было показано, что CD44 является ключевым регулято ром, необходимым для хоуминга стволовых клеток опухоли и их дальнейшего поддержания в недифференцированном

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 1У< 4 (6), 2006