НАНОЧАСТИЦЫ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ПОВЫШЕНИИ РАБОТОСПОСОБНОСТИ ГОЛОВНОГО МОЗГА ИЛИ В ЛЕЧЕНИИ СТРЕССА
NANOPARTICLES FOR USE IN INCREASING BRAIN WORKING CAPACITY OR IN STRESS TREATMENT

ijk
ijk
Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к повышению работоспособности мозга и к лечению патологического стресса. Более конкретно, настоящее изобретение относится к наночастице или агрегату наночастиц для применения в повышении работоспособности мозга или в профилактике или лечении патологического стресса у субъекта без воздействия на наночастицу или агрегат наночастиц электрического поля и предпочтительно без воздействия на них любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука, где материал наночастицы или агрегата наночастиц выбран из проводникового материала, полупроводникового материала, изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε, равной или выше 200, и изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε, равной или ниже 100. Кроме того, оно относится к композициям и наборам, включающим такие наночастицы и/или агрегаты наночастиц, а также к их применениям без воздействия на них электрического поля и предпочтительно без воздействия на них любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Fornito
., Nature Reviews Neuroscience, 2015, 16, 159-172: The connectomics of brain disorders
Ward et al., Trends in Cognitive Sciences, 2003, 7(12), 553-559: Synchronous neural oscillations and cognitive processes
Engel et al., Nature Reviews Neuroscience, 2001, 2, 704-716: Dynamic predictions: oscillations and synchrony in top-down processing
Schnitzler et al., Nature Reviews Neuroscience, 2005, 6, 285-296: Normal and pathological oscillatory communication in the brain
С продвижением в понимании нейронауки, мозг можно представить как электрическую сеть, кодирующую и передающую информацию по своим электрическим проводам, нейронам. Связь между нейронами проста и сложна одновременно: проста, потому что она основана на притоке/оттоке ионов внутри нейронов, которые приводят к потенциалам действия (или “спайкам” электрической активности); сложна, потому что сеть мозга состоит из сотен миллиардов нейронов, которые образуют узлы, хабы и модули, демонстрирующие скоординированные взаимодействия в различных пространственных и временных масштабах (et al). Нейронная связь зависит от анатомических компонентов, которые соединяют отдельные нейроны (структура) и от процесса передачи информации (функция). Оба аспекта влияют на общую работу нервной системы. Нейронные взаимодействия передаются колебаниями паттерна электрической активности мозга, которые обычно измеряют при помощи электроэнцефалограммы (ЭЭГ). Наблюдают разные полосы частот колебаний: дельта, тета, альфа, бета, гамма (). Структурно, наиболее яркой нейроанатомической особенностью мозга является обильная связь между нейронами, что отражает важность нейронной коммуникации. Синхронизация колебаний (“синхронность”) между одной областью мозга и другой, по-видимому, составляет последний уровень кодирования информации [первый уровень (нейрон): потенциалы действия; второй уровень (нейронная сеть(сети)): нейронные колебания] путем обеспечения пространственно-временной координации (). Важно отметить, что появляются доказательства того, что деликатно сбалансированный паттерн синхронизации и десинхронизации в пространстве и времени является основополагающим для функциональных показателей нервной системы ().
Miller et al., Neurology, 1998, 978-982: Emergence of artistic talent in frontotemporal dementia
Andreasen N.C., American Journal of Psychiatry, 1987, 144(10), 1288-1292: Creativity and mental illness: prevalence rates in writers and their first-degree relatives; Baron-Cohen et al., Autism, 1997, 101-109: Is there a link between engineering and autism; Sussman et al., Stanford Journal of Neuroscience, 2007, 1(1), 21-24: Mental illness and creativity: a neurological view of the “tortured artist”
Flaherty et al., J Comp Neurol, 2005, 493(1), 147-153: Frontotemporal and dopaminergic control of idea generation and creative drive
Snyder
, Proceedings of the Royal Society of London B, 1999, 266, 587-592: Is integer arithmetic fundamental to mental processing?: the mind’s secret arithmetic
Treffert D.A., Philosophical Transactions of the Royal Society B, 2009, 364, 1351-1357: The savant syndrome: an extraordinary condition. A synopsis: past, present, future
Развитие определенных навыков, креативности или генерации идей у определенных людей, а у других нет, является чем-то очень загадочным, и это до сих пор не объяснено. Однако изучение определенных заболеваний и их симптомов может помочь понять функционирование “нормального” и “аномального” головного мозга. Например, было отмечено, что у людей с нейродегенеративным заболеванием, таким как лобно-височная деменция, развиваются навыки рисования и живописи с развитием их заболевания (). Несколько публикаций показывают, что склонность к развитию неврологического заболевания, такого как биполярный синдром, шизофрения или аутизм, выше у людей (и их родственников первой степени), работающих в творческой сфере (инженерия, литература, живопись), чем для “не творческих людей” (). Для описания процесса создания и генерации идей было разработано несколько моделей: модель полушария, которая предполагает, что недоминантное полушарие специализируется на творческой активности, или совсем недавно разработанная фронтотемпоральная модель, которая предполагает, что изменения в височной доле могут увеличивать генерацию идей, тогда как изменения в лобной доле могут уменьшить ее (). Действительно, некоторые ученые могут выполнять эзотерические числовые вычисления, в то же время имея недостаточные знания элементарной арифметики (et al.). Интересно, что есть свидетельства того, что такая необычная способность связана с торможением в левом (доминирующем) полушарии вместе с фасилитацией в правом (недоминантном) полушарии ().
Kapur et al., Brain, 1996, 119, 1775-1790: Paradoxical functional facilitation in brain-behaviour research, a critical review
Таким образом, мозг представляет собой динамическую систему, в которой специфические состояния церебрального функционирования происходят в результате сложных возбуждающих и ингибирующих взаимодействий между популяциями нейронов. Таким образом, “аномальное” состояние отражает дисбаланс между сложными возбуждающими и ингибирующими взаимодействиями между популяциями нейронов ().
Настоящее изобретение относится к наночастицам и/или агрегатам наночастиц (агрегаты наночастиц) для применения в повышении, увеличении или улучшении работоспособности/производительности мозга или для профилактики или лечения/для применения в профилактике или лечении патологического стресса или по меньшей мере одного его симптома.
,
Наночастицы и агрегаты наночастиц, описанные авторами в настоящей заявке, не требуют применения/индукции электрического тока или поля/стимула и предпочтительно не требуют воздействия любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука, чтобы проявить их функцию (т.е. быть эффективными). Для описанных в настоящей заявке наночастиц и агрегатов наночастиц не требуется воздействия на них электрического тока или поля/стимула, и предпочтительно не требуется воздействия любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука, чтобы они были функциональными в контексте описанных в настоящей заявке применений. Разработчики изобретения обнаружили, что эти наночастицы или агрегаты наночастиц можно выгодно и неожиданно эффективно использовать без воздействия или без воздействия на субъекта, которому их вводят, электрического тока или поля/стимула, обычно электрического тока или поля/стимула, воздействующего на указанного субъекта, например, путем транскраниальной электростимуляции (TES) путем транскраниальной магнитной стимуляции (TMS), и предпочтительно без воздействия любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука. Это означает, что получающий лечение субъект не будет испытывать негативных побочных эффектов воздействия электрического тока или поля/стимула или любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука, благодаря настоящему изобретению.
M. Auffan et al., Environmental Pollution 157 (2009) 1127-1133: Chemical Stability of metallic nanoparticles: a parameter controlling their potential cellular toxicity in vitro
Как хорошо известно специалисту в данной области техники, наночастица имеет повышенное/высокое отношение поверхность/объем, обычно приблизительно 35-40% атомов локализовано на поверхности наночастицы размером 10 нм по сравнению с менее чем 20% для наночастицы размером более 30 нм. Это высокое отношение поверхность/объем связано с высокой поверхностной реактивностью, которая зависит от размера. В результате, наночастицы (особенно те, которые размером менее 20 нм) могут проявлять новые свойства по сравнению с объемными материалами. Например, известно, что частицы золота химически инертны и устойчивы к окислению в макроскопическом масштабе, тогда как частицы золота размером менее 10 нм имеют химически активную поверхность. Токсичными механизмами, связанными с химической дестабилизацией металлических наночастиц, могут быть (i) прямое высвобождение металлов в растворах (процесс растворения), (ii) каталитические свойства металлических наночастиц и (iii) окислительно-восстановительная эволюция поверхности наночастиц, которые могут окислять белки, генерировать активные формы кислорода (АФК) и вызывать окислительный стресс (см. ).
2
3
4
in vitro
M. Auffan et al., Environmental Pollution 157 (2009) 1127-1133: Chemical Stability of metallic nanoparticles: a parameter controlling their potential cellular toxicity in vitro
S-A Yang et al., Scientific Reports 2018 8:185: Silica nanoparticle stability in biological media revisited
Помимо описанных выше наночастиц золота, которые обладают каталитическими свойствами, наночастицы оксида церия (7 нм частица CeO) или оксида железа (20 нм частица FeO) показали окислительно-восстановительную модификацию их поверхности, что приводит к цитотоксическим эффектам, связанным с окислительным стрессом (см. ). Кроме того, 11-нм наноструктура диоксида кремния разрушается биологическими средами (см. ).
in vivo
Как поясняется авторами изобретения ниже, наночастицы, имеющие размер менее 30 нм, должны быть тщательно отобраны, когда предполагают их использование  у субъекта, обычно у млекопитающего, в частности у человека
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ijk
ijk
Обеспечивается преимущество, состоящее в том, что в настоящей заявке впервые описаны наночастица или агрегат наночастиц для применения в повышении, увеличении или улучшении работоспособности/производительности мозга или для профилактики или лечения/для применения в профилактике или лечении патологического стресса или по меньшей мере одного его симптома у субъекта без воздействия на наночастицу или агрегат наночастиц электрического поля и предпочтительно без воздействия на них любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука. Материал наночастицы или агрегата наночастиц обычно выбирают из проводникового материала, полупроводникового материала, изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε, равной или выше 200, и изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε, равной или ниже 100.
ijk
ijk
ijk
В настоящей заявке авторы изобретения описывают, в конкретном аспекте, наночастицу или агрегат наночастиц для применения в повышении работоспособности мозга или для применения в профилактике или лечении патологического стресса у субъекта без воздействия на наночастицу или агрегат наночастиц электрического поля или любого другого внешнего источника активации, где материал наночастицы или агрегата наночастиц выбран из проводникового материала, полупроводникового материала, изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε, равной или выше 200, и изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε, равной или ниже 100, где i) наибольший медианный размер ядра наночастицы или агрегата наночастиц популяции составляет по меньшей мере 30 нм, когда материал представляет собой проводниковый материал, полупроводниковый материал или изоляционный материал с диэлектрической проницаемостью ε, равной или выше 200, и где ii) ядро наночастицы или агрегата наночастиц покрыто биосовместимым покрытием, обеспечивающим нейтральный или отрицательный поверхностный заряд, при измерении в растворе воды, имеющем концентрацию электролитов от 0,001 до 0,2 M, концентрацию материала наночастиц или агрегатов наночастиц от 0,01 до 10 г/л и рН между 6 и 8.
Также в настоящей заявке описано применение наночастицы или агрегата наночастиц для получения композиции для повышения, увеличения или улучшения работоспособности/производительности мозга или для профилактики или лечения патологического стресса или по меньшей мере одного его симптома у нуждающегося в этом субъекта без воздействия на наночастицу или агрегат наночастиц электрического поля и предпочтительно без воздействия на них любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука.
ijk
ijk
Также в настоящей заявке описана композиция для применения в повышении работоспособности мозга или для профилактики или лечения/для применения в профилактике или лечении патологического стресса или по меньшей мере одного его симптома у субъекта, где композиция включает или состоит из наночастиц и/или агрегатов наночастиц и фармацевтически приемлемого носителя, где материал наночастицы или агрегата наночастиц обычно выбирают из проводникового материала, полупроводникового материала, изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε, равной или выше 200, и изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε, равной или ниже 100, и где повышение работоспособности мозга или профилактику или лечение патологического стресса осуществляют без воздействия электрического поля на вводимые субъекту посредством композиции наночастицы или агрегаты наночастиц, и предпочтительно без воздействия на них любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука.
ijk
ijk
Кроме того, в настоящей заявке описан набор, включающий или состоящий из по меньшей мере из двух отдельных наночастиц и/или агрегатов наночастиц, при этом каждая наночастица или агрегат наночастиц состоит из отдельного материала, обычно выбранного из проводникового материала, полупроводникового материала, изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε, равной или выше 200, и изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε, равной или ниже 100, и его применения типично в повышении работоспособности мозга или в способе для повышения работоспособности мозга, или в профилактике или лечении патологического стресса или по меньшей мере одного его симптома у субъекта без воздействия на наночастицы или агрегаты наночастиц электрического поля, и предпочтительно без воздействия на них любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Herculano-Houzel S. Frontier in Human Neuroscience (2009), 3(31): 1-11, The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain
По оценкам, нервная система человека состоит примерно из 80-120 миллиардов нервных клеток (). Определяющей характеристикой нейрона (или нервной клетки) является его способность передавать электрические сигналы в виде потенциалов действия.
Нейрон/нервная клетка составляет элементарный узел головного мозга. Структура нейрона/нервной клетки состоит из: “сомы” или “тела клетки”, которое содержит ядро и может быть удлинено дендритами, “аксона”, который передает электрический сигнал, и терминали аксона, которая состоит из синаптических окончаний.
наносхемы
Нейрон/нервная клетка составляет элементарный узел головного мозга. Нервные клетки могут сообщаться друг с другом высоко структурированным образом, образуя нейронные сети. Нейрон передает сигналы через синаптические связи. Внутри нейрона, образуют основной биохимический механизм, опосредующий ключевые нейронные свойства, такие как обучение и память, а также генез ритмичности нейронов.
Микросхема может быть сформирована только с несколькими взаимосвязанными нейронами и может выполнять сложные задачи, такие как опосредование рефлексов, обработка сенсорной информации, инициация двигательной активности, а также посредничество в обучении и запоминании. Макросхема представляет собой более сложную сеть, состоящую из нескольких встроенных микросхем. Макросхемы опосредуют более высокие функции мозга, такие как распознавание объектов и познавательная способность. Таким образом, несколько уровней сетей расположены в нервной системе.
Возбудимость нейронной сети
Нейроны посылают сообщения электрохимически (то есть химические вещества/ионы вызывают электрический сигнал). Важными ионами в нервной системе являются натрий и калий, кальций и хлорид. Когда нейрон не посылает сигнал, он находится «в покое». Когда нейрон находится в состоянии покоя, внутренняя часть нейрона отрицательна по отношению к внешней части. Хотя концентрации различных ионов пытаются найти баланс на обеих сторонах мембраны, они не могут это сделать, потому что клеточная мембрана пропускает только некоторые ионы через каналы (ионные каналы). В дополнение к этим селективным ионным каналам есть насос, который использует энергию для перемещения трех ионов натрия из нейрона для каждых двух ионов калия, которые он вводит. Наконец, когда все эти силы уравновешиваются и измерена разница в напряжении между внутренней и внешней частью нейрона, потенциал покоящейся мембраны (также называемый “потенциал покоя”) нейрона составляет около -70 мВ. Это означает, что внутри нейрона на 70 мВ меньше, чем снаружи. В состоянии покоя снаружи нейрона находится относительно больше ионов натрия, а внутри этого нейрона больше ионов калия. Потенциал действия (также обозначаемый как “спайк” или “импульс”) возникает, когда нейрон посылает информацию вниз по аксону, от тела клетки. Это означает, что некоторое событие (стимул) заставляет потенциал покоя двигаться к 0 мВ. Когда деполяризация достигает около -55 мВ, нейрон запускает потенциал действия. Если деполяризация не достигает этого критического порогового уровня, то не срабатывает потенциал действия (механизм включения/выключения). Кроме того, при достижении порогового уровня всегда срабатывает потенциал действия с фиксированной амплитудой. Следовательно, либо деполяризация не достигает порога, либо генерируется полный потенциал действия.
Большая вариабельность обнаружена в скорости распространения потенциалов действия. Фактически, скорость распространения потенциалов действия в нервах может варьироваться от 100 метров в секунду до менее одной десятой метра в секунду. В то время как постоянная времени является показателем того, насколько быстро мембрана будет отвечать на стимул по времени, пространственная постоянная (также постоянная длины) является показателем того, насколько хорошо электрический потенциал будет распространяться вдоль аксона в качестве функции расстояния.
Структура коры головного мозга
Shipp S., Current Biology, 2007, 17(12), R443-449: Structure and function of the cerebral cortex
Bikson et al., J Physiol, 2004, 557(1), 175-190: Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro
Shipp S., Current Biology, 2007, 17(12), R443-449: Structure and function of the cerebral cortex
Существует два широких класса кортикальных нейронов: “ингибирующие нейроны” или “промежуточные нейроны”, которые создают только ближние локальные связи; и “возбуждающие нейроны” или “проекционные нейроны” или “пирамидальные нейроны”, у которых аксоны протягиваются к отдаленным внутрикортикальным, подкорковым и субцеребральным мишеням. “Ингибирующие нейроны” или “промежуточные нейроны” составляют меньшинство (20%) кортикальных нейронов; большая часть приходится на “пирамидальные нейроны” (). Проекционные нейроны представляют собой глутаматергические нейроны, которые передают информацию между различными областями неокортекса и другими областями мозга (). Проекционные нейроны или пирамидальные нейроны названы из-за их выдающегося апикального дендрита, который обычно выделяется на поверхности, обеспечивая им пирамидальную морфологию. Как правило, нейрон “принадлежит” слою, в котором находится его клеточное тело (или “сома”) - даже если апикальный и базальный дендриты между ними охватывают еще несколько слоев, улавливая более широкий диапазон сигналов ().
Shipp S., Current Biology, 2007, 17(12), R443-449: Structure and function of the cerebral cortex
Серое вещество коры головного мозга представляет собой извилистый, слоистый пласт ткани, толщиной 2-3 мм у человека, но с площадью поверхности в несколько сотен квадратных сантиметров (). В коре головного мозга распознают шесть основных слоев:
- Слой I, молекулярный слой, содержит мало рассеянных нейронов и состоит в основном из расширений апикальных дендритных пучков пирамидальных нейронов и горизонтально ориентированных аксонов, а также глиальных клеток;
- Слой II, внешний зернистый слой, содержит преимущественно мелкие и средние пирамидальные нейроны и многочисленные звездчатые нейроны;
- Слой III, внешний пирамидальный слой, содержит преимущественно мелкие и средние пирамидальные нейроны, а также непирамидальные нейроны с вертикально ориентированными интракортикальными аксонами;
- Слой IV, внутренний зернистый слой, содержит различные типы звездчатых и пирамидальных нейронов;
- Слой V, содержит крупные пирамидальные нейроны, которые дают начало аксонам, покидающим кору и спускающимся в подкорковые структуры (такие как базальные ганглии). В первичной моторной коре лобной доли слой V содержит клетки, аксоны которых проходят через внутреннюю капсулу, ствол головного мозга и спинной мозг, образуя корково-спинномозговой путь, который является основным путем для произвольного моторного контроля; и
- Слой VI, полиморфный или многоформный слой, содержит мало крупных пирамидальных нейронов и много мелких веретенообразных пирамидальных и многоформных нейронов; слой VI направляет эфферентные волокна к таламусу, устанавливая очень точное взаимное соединение между корой и таламусом.
Эти слои по-разному развиваются в различных областях коры головного мозга, например, пирамидальные слои более развиты в двигательных центрах, а зернистые слои в сенсорных центрах коры головного мозга.
Связь внутри и между нейронными сетями
Bowyer et al., Neuropsychiatric Electrophysiology, 2016, 2(1), 1-12: Coherence a measure of the brain networks: past and present
Существует три типа сетей связи, которые используются для изучения передачи сигналов внутри головного мозга и по всему головному мозгу. Структурная связность основана на обнаружении проводящих путей, которые физически соединяют области мозга. Это анатомические сетевые карты, которые указывают возможные пути прохождения сигналов в мозге. Функциональная связность идентифицирует активность в областях мозга, которые имеют сходную частоту, фазу и/или амплитуду коррелированной активности. Эффективная связность использует информацию о функциональной связности и делает еще один шаг в определении прямого или косвенного влияния, которое одна нейронная система может оказывать на другую, более конкретно, направление динамического информационного потока в мозге ().
Bowyer et al., Neuropsychiatric Electrophysiology, 2016, 2(1), 1-12: Coherence a measure of the brain networks: past and present.
Синхронизированная активность в нейронной сети может быть обнаружена при помощи магнитоэнцефалограммы (МЭГ), электроэнцефалограммы (ЭЭГ), функциональной магнитно-резонансной томографии (фМРТ) или позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ), затем изображения с использованием анализа связности в сети. МЭГ (магнитоэнцефалограмма) или ЭЭГ (электроэнцефалограмма) являются предпочтительными, поскольку они имеют высокое временное разрешение для анализа динамического потока информации. Анализ связности мозга осуществляют для установления сетей связи, необходимых для функционирования мозга. Отдельные области мозга специализируются на обработке определенных типов информации. Методы визуализации показали, что эти области связаны и взаимодействуют с другими специализированными областями через сети в мозге. “Когерентность” () представляет собой математический метод, который количественно определяет частоту и амплитуду синхроничности (состояния синхронности или синхронизации) нейронных паттернов колебательной активности мозга. Детекцию синхронной активации нейронов можно использовать для определения благополучия или целостности функциональных связей в мозге человека. Наложение карт функциональной связности на изображения структурной связности, а также использование направления потока информации, полученного из эффективной связности, обеспечивает всеобъемлющее понимание того, как функционирует мозг.
Cohen E.
, Brain Research, 2008, 1235, 21-30: Determinants of spontaneous activity in networks of cultured hippocampus).
Интактный (т.е. “нормальный” или “здоровый”) мозг экспрессирует сложные паттерны (“нормальной” или “здоровой”) синхронной активности, ассоциированные с различными ‘состояниями’ организма, от медленного дельта-ритма (0,5-4 Гц), до тета (4-8 Гц), альфа (8-12 Гц), бета (15-30 Гц) и гамма (30-70 Гц) колебаний. Интересно отметить, что диссоциированная культура кортикальных структур предлагает удобную систему для изучения правил, которые определяют возникновение, генерацию и распространение сетевых ипульсов (спайки) и ‘взрыва’ импульса (кластеры спайков) в популяциях плотно связанных друг с другом нейронов. Активность сети можно регистрировать в течение длительных периодов времени неинвазивным способом и с конечным временным разрешением с использованием мультиэлектродных матриц. Двумерную диссоциированную культуру можно использовать в качестве жизнеспособной тестовой системы для изучения правил, которые регулируют формирование и поддержание активности сети в мозге, позволяя проверить гипотезу, которая не может быть проверена в интактном мозге (et al.
(Gray J.R.
, Nature Review Neuroscience, 2004, 5, 471-482: Neurobiology of intelligence: science and ethics; Garlick D., Psychological Review, 2002, 109(1), 116-136: Understanding the nature of general factor of intelligence: the role of individual difference in neural plasticity as an explanatory mechanism.).
Умственные способности человека или работоспособность мозга, такая как интеллект, являются особенно сложными. Понимание этих способностей в механистическом плане может способствовать их улучшению. Исследования с использованием энцефалограмм и связанных с событиями потенциалов показывают, что скорость и надежность нейронной передачи связаны с более высокой работоспособностью, как правило, с более высоким интеллектом. Ранние исследования нейровизуализации с использованием ПЭТ показали, что интеллект отрицательно коррелирует с метаболизмом глюкозы в мозге во время умственной деятельности, что приводит к формулировке гипотезы ‘эффективности нейронов’. Согласно этой гипотезе, более умные люди расходуют меньше нейронных ресурсов для выполнения действий на заданном уровне. Интеллект в смысле рассуждений и новых способностей к решению проблем постоянно связан с целостностью, структурой и функцией латеральной префронтальной коры и, возможно, с другими областями. Нерешенные вопросы о нейронных основах интеллекта включают, среди прочего, взаимосвязи между психометрическим интеллектом (т.е. интеллектом, измеряемым тестом IQ-типа, обычно оценивающим точность ответа (а не скорость)), и (i) функциональной связностью между компонентами сетей рабочей памяти, как показано в исследованиях на основе электроэнцефалограмм, и (ii) пластичностью нейронов (т.е. используемой для обозначения тех процессов, которые охватывают большую часть изменений в связности нервной системы в ответ на переживаемое и которые, согласно наблюдениям, перестают действовать в зрелом возрасте у человека). Сообщали, что развитие нейронных связей согласуется с развитием интеллекта et al.
Massobrio P et al. Neural Plasticity, 2015, Article ID 196195, In vitro studies of neuronal networks and synaptic plasticity in invertebrates and in mammals using multi electrode arrays
Коммуникация между нейронами действительно важна для высших функций мозга, таких как восприятие, память и движение (). Хотя предполагается, что формирование и развитие связей имеют решающее значение в процессе обучения, их сохранение, по-видимому, необходимо для памяти. Синаптическая пластичность уже давно наблюдается в когнитивные процессах, такие как обучение и память. Синаптическая пластичность на сетевом уровне обеспечивает распределенный механизм для преобразования и хранения временной информации в пространственно распределенных паттернах синаптических модификаций. Каждый раз, когда что-то узнается, сеть развивает новые способности к взаимодействию и инкорпорирует новоузнанные факты.
(Lichtman JW et al., Curr Opin Neurobiol, 2008, 22, 144-153: Ome sweet ome: what can the genome tell us about the connectome?; Cai D., et al., Nat Methods, 2013, 10(6), 540-547: Improved tools for the Brainbow toolbox)
(Micheva KD., et al., 2007, Neuron, 55, 25-36: Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits; Micheva KD., et al., 2010, Neuron, 68, 639-653: Single-synapse analysis of a diverse synapse population: proteomic imaging methods and markers)
(Kim J, et al., 2012, Nat Methods, 9(1), 96-102: mGRASP enables mapping mammalian synaptic connectivity with light microscopy; Feng L, et al., 2012, Bioinformatics, 28, i25-i31: Improved synapse detection for mGRASP-assisted brain connectivity.)
(Osakada F, et al., 2011, Neuron, 71, 617-631: New rabies virus variants for monitoring and manipulating activity and gene expression in defined neural circuits; Wickersham IR, et al., 2007, Nat Methods, 4(1), 47-49: Retrograde neuronal tracing with a deletion-mitant rabies virus; Wickersham IR, et al., 2007, Neuron, 53(5), 639-647: Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons)
(Tomer R, et al., 2012 Nat methods, 9, 755-763: Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous Multiview light-sheet microscopy; York AG, et al., 2012, Nat Methods, 9(7), 749-754: Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.),
(Chung K, et al., 2013, Nature, 497 (7449), 332-337: Structural and molecular interrogation of intact biological systems.)
(Petreanu L,
., 2007, Nat Neurosci, 10, 663-668: Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections; Wang H,
., 2007, Proc Natl Acad Sci USA, 104, 8143-8148: High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in channelrhodopsin-2 transgenic mice),
(Little JP, et al., 2012, J Neurosci: Off J Soc Neurosci, 32(37), 12808-12819: Subcellular synaptic connectivity of layer 2 pyramidal neurons in the medial prefrontal cortex; MacAskill AF, et al., 2012, Nat Neurosci, 15(12), 1624-1626: Subcellular connectivity underlies pathway-specific signaling in the nucleus accumbens)
(Yook C. et al., Cellular and Molecular Life Sciences, 2013, 70, 4747-4757: Mapping mammalian synaptic connectivity).
Эффективные связи между нейронами могут быть обнаружены с использованием типичных методов визуализации, хорошо известных специалисту, таких как электронные методы визуализации, которые предоставляют структурную информацию о синаптической связности, обычно электронная микроскопия (ЭМ), например, электронная микроскопия серийных блоков-поверхностей (SBFEM), сканирующая электронная микроскопия серийных срезов (SSSEM), автоматизированная трансмиссионная электронная микроскопия (ATEM) и т.д.; методы визуализации на основе фотонов, например “Брэйнбоу” , “матричная томография” (AT) , воспроизведение GFP по синаптическим партнерам («GRASP») (“GRASP”), в частности GRASP млекопитающих “mGRASP” , транссинаптическое маркирование вирусом бешенства , флуоресцентная селективная микроскопия плоскостного освещения (fSPIM)  предпочтительно в сочетании с разъясняющим методом, таким как “CLARITY” ; а также оптогенетические методы, такие как методы визуализации родопсиновых каналов и/или двухфотонные микроскопические методы визуализации кальция, которые позволяют картировать пространственное распределение синаптических связей вместе с измерениями синаптической силы et alet alа также детекция активных синапсов, иннервируемых разными входами ; или любые комбинации этих различных методов
Обеспечивается преимущество, состоящее в том, что в настоящей заявке впервые описаны наночастица или агрегат наночастиц для применения в повышении, увеличении или улучшении работоспособности/производительности мозга или для профилактики или лечения/для применения в профилактике или лечении патологического стресса или по меньшей мере одного его симптома без воздействия на наночастицу или агрегат наночастиц электрического поля и предпочтительно без воздействия на них любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука. Такое воздействие (терапевтическое или диагностическое) электрического поля или любого другого (терапевтического или диагностического) внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука, в настоящей заявке следует понимать, как правило, как терапевтическое или диагностическое воздействие, обычно осуществляемое медицинским персоналом, например, врачом или медсестрой.
ijk
ijk
Материал наночастицы или агрегата наночастиц обычно выбирают из проводникового материала, полупроводникового материала, изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε, равной или выше 200, и изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε, равной или ниже 100.
В типичном аспекте, наночастица или агрегат наночастиц, описанные в настоящей заявке, предназначены для применения для улучшения физической деятельности или для улучшения когнитивной деятельности, т.е. обучения, запоминания, чувственного восприятия, внимания и/или принятия решений субъектом, без воздействия на наночастицу или агрегат наночастиц электрического поля и предпочтительно без воздействия на них любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука.
НАНОЧАСТИЦЫ
ijk
ijk
В настоящей заявке описаны наночастица или агрегат наночастиц для применения в соответствии с настоящим изобретением для повышения работоспособности мозга или в лечении патологического стресса или по меньшей мере одного его симптома у субъекта без воздействия на наночастицу или агрегат наночастиц электрического поля и предпочтительно без воздействия на указанную наночастицу или агрегат наночастиц любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука, где материал наночастицы или агрегата наночастиц обычно выбирают из проводникового материала, полупроводникового материала, изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε, равной или выше 200, и изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε, равной или ниже 100.
Величина или размер наночастиц или агрегата наночастиц
В соответствии с настоящим изобретением, термины “наночастица” или “агрегат наночастиц” относятся к продукту, в частности, синтетическому продукту, с размером в нанометровом диапазоне, обычно от 1 нм до 1000 нм или от 1 нм до 500 нм, например от по меньшей мере 10 нм до около 500 нм или до около 1000 нм, от по меньшей мере 30 нм до около 500 нм или до около 1000 нм, от по меньшей мере 40 нм до около 500 нм или до около 1000 нм, от по меньшей мере 45 нм до около 500 нм или до около 1000 нм, предпочтительно ниже 500 нм.
Термин “агрегат наночастиц” или “агрегат, состоящий из наночастиц” относится к совокупности наночастиц, которые сильно, как правило ковалентно, связаны друг с другом.
Электронная микроскопия, такая как сканирующая электронная микроскопия (SEM), просвечивающая электронная микроскопия (TEM), или крио-TEM, может использоваться для измерения размера наночастицы или агрегата наночастиц и, в частности, размера ядра наночастицы или агрегата наночастиц, т.е., наночастицы или агрегата наночастиц без их биосовместимого покрытия. Фактически, биосовместимое покрытие обычно состоит из соединений, которые состоят в основном из легких элементов (полимерные или органические соединения), чьи упругие взаимодействия с электронами повышенной энергии относительно слабы, что приводит к плохому контрасту изображения. TEM измеряет проецируемые изображения частиц, нанесенных на электронно-прозрачную подложку. Записанное изображение более чем около 50, предпочтительно более чем около 100, 150 или 200 наночастиц или агрегатов наночастиц на образец, как правило, следует обработать для оценки размера. Таким образом, записанное изображение более чем около 50 или предпочтительно более чем около 100, 150 или 200 наночастиц или агрегатов наночастиц позволяет установить наибольший медианный размер ядра наночастиц или агрегатов наночастиц популяции, а также размер ядра наночастиц или агрегатов наночастиц, представляющих 30%-70% процентиль популяции наночастиц и агрегатов наночастиц. Типичный протокол анализа можно найти в “NIST - NCL Joint Assay Protocol, PCC-7; Measuring the size of using transmission electron microscopy (TEM); version 1,1 December 2009”.
Кроме того, динамическое рассеяние света (DLS) можно использовать для измерения гидродинамического диаметра наночастиц или агрегатов наночастиц (т.е. диаметра наночастиц или агрегата наночастиц, включающего как их ядро, так и их биосовместимое покрытие) в растворе. Гидродинамический диаметр это диаметр эквивалентной твердой сферы, которая диффундирует с той же скоростью, что и аналит. Типичный протокол анализа можно найти в “NIST - NCL Joint Assay Protocol, PCC-1; Measuring the size of nanoparticles in aqueous media using batch-mode dynamic light scattering; version 1,1 February 2010”. Результаты измерения размера частиц методом DLS могут не совпадать с результатами других методов (например, электронной микроскопии). Частично это связано с различиями в физических свойствах, которые фактически измеряются (например, гидродинамическая диффузия в сравнении с проектируемой площадью). Кроме того, DLS чувствителен к присутствию небольших количеств крупных частиц или кластеров более мелких частиц, тогда как электронная микроскопия обычно отражает размер первичных частиц (т.е. размер ядра наночастиц или агрегатов наночастиц) (см. NIST - NCL Joint Assay Protocol, PCC-1; Measuring the size of nanoparticles in aqueous media using batch-mode dynamic light scattering; version 1.1 February 2010).
International Standard ISO22412 Particle Size Analysis - Dynamic Light Scattering, International Organisation for Standardisation (ISO) 2008
Эти два метода, DLS и электронная микроскопия, могут далее использоваться один за другим для сравнения размеров и подтверждения указанного размера. Предпочтительным методом измерения размера наночастиц и агрегатов наночастиц является DLS (см. ). Средний гидродинамический диаметр наночастицы или агрегата наночастиц, измеренный при помощи DLS в растворе, представлен как распределение частиц по размерам по интенсивности (интенсивность рассеяния света пропорциональна размеру частиц) и измеренное при комнатной температуре (около 25°C).
Как правило, самая большая величина или размер представляет собой диаметр наночастицы круглой или сферической формы или самую большую длину наночастицы яйцевидной или овальной формы.
Самая большая величина наночастицы или агрегата, как определено в настоящей заявке, обычно составляет от около 2 нм до около 250 нм или до около 500 нм, предпочтительно от около 4 нм или 10 нм до около 100 нм или до около 200 нм, даже более предпочтительно от около (предпочтительно, по меньшей мере) 10 нм до около 150 нм, от около (предпочтительно, по меньшей мере) 30 нм до около 150 нм, от около (предпочтительно, по меньшей мере) 40 нм до около 500 нм, от около (предпочтительно, по меньшей мере) 45 нм до около 500 нм, предпочтительно ниже 500 нм.
При измерении среднего гидродинамического диаметра наночастицы или агрегата наночастиц в растворе обычно используют метод DLS. Определенный с использованием DLS, средний гидродинамический диаметр наночастицы или агрегата наночастиц в растворе обычно составляет от около 10 нм до около 500 нм, предпочтительно от около 10 нм или около 30 нм до около 100 нм или до около 500 нм, даже более предпочтительно от около 10 нм или около 30 нм до около 100 нм, около 150 нм, около 200 нм, около 250 нм, около 300 нм, около 350 нм, около 400 нм, около 450 нм или около 500 нм.
При измерении ядра наночастицы или агрегата наночастиц обычно используют метод электронной микроскопии. При использовании электронной микроскопии медианное значение наибольшего размера (также указано далее как “наибольший медианный размер”) ядра наночастицы или агрегата наночастиц популяции обычно составляет от около 5 нм до около 250 нм или до около 500 нм, предпочтительно от около 5 нм, около 6 нм, около 7 нм, около 8 нм, около 9 нм, около 10 нм, около 11 нм, около 12 нм, около 13 нм, около 14 нм, около 15 нм, около 16 нм, около 17 нм, около 18 нм, около 19 нм, около 20 нм, около 21 нм, около 22 нм, около 23 нм, около 24 нм, около 25 нм, около 26 нм, около 27 нм, около 28 нм, около 29 нм, около 30 нм, около 31 нм, около 32 нм, около 33 нм, около 34 нм, около 35 нм, около 36 нм, около 37 нм, около 38 нм, около 39 нм, около 40 нм, около 41 нм, около 42 нм, около 43 нм, около 44 нм или около 45 нм до около 75 нм, около 76 нм, около 77 нм, около 78 нм, около 79 нм, около 80 нм, около 81 нм, около 82 нм, около 83 нм, около 84 нм, около 85 нм, около 86 нм, около 87 нм, около 88 нм, около 89 нм, около 90 нм, около 91 нм, около 92 нм, около 93 нм, около 94 нм, около 95 нм, около 96 нм, около 97 нм, около 98 нм, около 99 нм, около 100 нм, около 101 нм, около 102 нм, около 103 нм, около 104 нм, около 105 нм, около 106 нм, около 107 нм, около 108 нм, около 109 нм, около 110 нм, около 111 нм, около 112 нм, около 113 нм, около 114 нм, около 115 нм, около 116 нм, около 117 нм, около 118 нм, около 119 нм, около 120 нм, около 121 нм, около 122 нм, около 123 нм, около 124 нм, около 125 нм, около 130 нм, около 140 нм, около 150 нм, около 200 нм, около 250 нм, около 300 нм, около 350 нм, около 400 нм, около 450 нм или около 500 нм.
Обычно, при измерении размера ядра наночастицы или агрегата наночастиц при помощи инструментов электронной микроскопии, размер ядра наночастицы или агрегата наночастиц, представляющий 30%-70% процентиль популяции наночастиц и агрегатов наночастиц, составляет от около 5 нм, около 6 нм, около 7 нм, около 8 нм, около 9 нм, около 10 нм, около 11 нм, около 12 нм, около 13 нм, около 14 нм, около 15 нм, около 16 нм, около 17 нм, около 18 нм, около 19 нм, около 20 нм, около 21 нм, около 22 нм, около 23 нм, около 24 нм, около 25 нм, около 26 нм, около 27 нм, около 28 нм, около 29 нм, около 30 нм, около 31 нм, около 32 нм, около 33 нм, около 34 нм, около 35 нм, около 36 нм, около 37 нм, около 38 нм, около 39 нм, около 40 нм, около 41 нм, около 42 нм, около 43 нм, около 44 нм или около 45 нм до около 75 нм, около 76 нм, около 77 нм, около 78 нм, около 79 нм, около 80 нм, около 81 нм, около 82 нм, около 83 нм, около 84 нм, около 85 нм, около 86 нм, около 87 нм, около 88 нм, около 89 нм, около 90 нм, около 91 нм, около 92 нм, около 93 нм, около 94 нм, около 95 нм, около 96 нм, около 97 нм, около 98 нм, около 99 нм, около 100 нм, около 101 нм, около 102 нм, около 103 нм, около 104 нм, около 105 нм, около 106 нм, около 107 нм, около 108 нм, около 109 нм, около 110 нм, около 111 нм, около 112 нм, около 113 нм, около 114 нм, около 115 нм, около 116 нм, около 117 нм, около 118 нм, около 119 нм, около 120 нм, около 121 нм, около 122 нм, около 123 нм, около 124 нм, около 125 нм, около 130 нм, около 140 нм, около 150 нм, около 200 нм, около 250 нм, около 300 нм, около 350 нм, около 400 нм, около 450 нм, около 500 нм или около 520 нм.
Композиция наночастиц
Наночастица, полученная из проводникового материала
Наночастица, полученная из проводникового материала, представляет собой органическую наночастицу или неорганическую наночастицу.
см. Table 2 “reduction reactions having E° values more positive than that of the standard hydrogen electrode”, 8-25, Handbook of chemistry and physics; David R. Lide; 88
Edition
th
Неорганическую наночастицу из проводникового материала обычно получают из металлического элемента, имеющего значение стандартного потенциала восстановления E°, равное или выше около 0,01, обычно измеряемое при 25°C и давлении 1 атм относительно стандартного водородного электрода (), более предпочтительно, равное или выше около 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 или 0,5. Типичные металлические элементы, используемые для получения наночастицы, можно выбрать из Tl, Po, Ag, Pd, Ir, Pt, Au и их смесей. Предпочтительно металлический элемент, используемый в качестве проводникового материала для получения наночастицы, выбран из Ir, Pd, Pt, Au и их смеси, даже более предпочтительно выбран из Au, Pt, Pd и любой их смеси. Особенно предпочтительными материалами являются Au и Pt.
M. Auffan et al., Nature Nanotechnology 2009, 4(10), 634-641: Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective)
Обычно, наночастицы золота проявляют каталитическую активность, когда их размер уменьшается до нескольких нм (см. . Для того, чтобы уменьшить отношение поверхность/объем и, таким образом, минимизировать вклад поверхности неорганической наночастицы в каталитическую активность, предпочтительным является наибольший медианный размер ядра наночастицы или агрегата наночастиц популяции, составляющий по меньшей мере 30 нм, обычно по меньшей мере 40 нм или по меньшей мере 45 нм.
Органическую наночастицу из проводникового материала обычно получают из органического материала, имеющего в своей структуре смежные sp2-гибридизированные углеродные центры (т.е. двойную углеродную связь или ароматические циклы, содержащие гетероатомы, обычно N или S, в ароматическом цикле или вне ароматического цикла). Предпочтительные органические материалы выбирают из полианилина, полипиррола, полиацетилена, политиофена, поликарбазола, полипирена, поли(3,4-этилендиокситиофена) и/или поли(3,4-этилендиокситиофен)полистиролсульфоната.
В конкретном аспекте наибольший медианный размер ядра наночастицы или агрегата наночастиц популяции составляет по меньшей мере 30 нм или по меньшей мере 40 нм и предпочтительно ниже 500 нм, как описано выше, например 45 нм, когда материал представляет собой проводниковый материал, как описано выше, в частности, металлический материал, обычно металл, имеющий стандартный потенциал восстановления E° выше 0,2, или органический материал, обычно органический материал, имеющий в своей структуре смежные sp2 гибридизированные углеродные центры, предпочтительно металлический материал, как описано выше, в частности, любой один из Au, Pt, Pd и любая их смесь.
Наночастица, полученная из полупроводникового материала
Наночастица, полученная из полупроводникового материала обычно представляет собой неорганическую наночастицу.
см., например, table 12-77, Table 3; Handbook of chemistry and physics; David R. Lide; 88
Edition
th
Неорганические наночастицы обычно получают с использованием полупроводникового материала, имеющего относительно малую энергию запрещенной зоны (Eg) между его валентной зоной и зоной проводимости. Обычно полупроводниковый материал имеет энергию запрещенной зоны (энергетическую щель) Eg ниже 3,0 эВ, обычно при измерении при комнатной температуре (около 25°C) (). В конкретном аспекте, материал представляет собой беспримесный полупроводниковый материал или примесный полупроводниковый материал, как дополнительно описано ниже.
Беспримесные полупроводниковые материалы обычно состоят из элемента из группы IV A периодической таблицы Менделеева, такого как кремний (Si) или германий (Ge), в смешанной композиции элементов из групп III и V периодической таблицы Менделеева, такой как AlSb, AlN, GaP, GaN, InP, InN и т.д., или в смешанной композиции элементов из групп II и VI периодической таблицы Менделеева, такой как ZnSe, ZnTe, CdTe и т.д.
Примесные полупроводниковые материалы обычно включают или состоят из беспримесного полупроводника, полученного с высокой степенью химической чистоты, причем беспримесный полупроводниковый материал содержит легирующую примесь. В конкретном аспекте, когда примесный полупроводниковый материал наночастиц или агрегата наночастиц состоит из элемента из группы IVA периодической таблицы Менделеева, он легируется носителем заряда, выбранным из Al, B, Ga, In и P. Такие примесные полупроводниковые материалы могут быть либо n-типа, в которых преобладают отрицательные носители заряда, либо p-типа, в которых преобладают положительные носители заряда. Типичный примесный полупроводниковый материал p-типа состоит из кремния (Si) или германия (Ge), легированного заряженным носителем, выбранным из алюминия (Al), бора (B), галлия (Ga) и индия (In); Типичный примесный полупроводниковый материал p-типа состоит из кремния (Si) или германия (Ge), обычно легированного фосфором (P).
M. Auffan et al., Nature Nanotechnology 2009, 4(10), 634-641: Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective)
Как правило, было показано, что энергия запрещенной зоны полупроводниковых наночастиц увеличивается, когда размер наночастиц уменьшается ниже 10 нм (см. . Чтобы обеспечить низкое отношение поверхность/объем и поддерживать объемную энергетическую щель наночастиц или агрегатов наночастиц ниже 3,0 эВ, предпочтительным является наибольший медианный размер ядра наночастицы или агрегата наночастиц популяции, составляющий по меньшей мере 30 нм, предпочтительно по меньшей мере 40 нм.
Таким образом, в конкретном аспекте наибольший медианный размер ядра наночастицы или агрегата наночастиц популяции составляет по меньшей мере 30 нм или по меньшей мере 40 нм и предпочтительно ниже 500 нм, когда материал представляет собой полупроводниковый материал, как описано выше, в частности, полупроводниковый материал с энергетической щелью Eg ниже 3,0 эВ, обычно материал, состоящий из элемента из группы IVA периодической таблицы Менделеева, в частности, элемента из группы IVA периодической таблицы Менделеева, легированного носителем заряда, выбранным из Al, B, Ga, In и P, или смешанной композиции элементов из группы III и V периодической таблицы Менделеева или смешанной композиции элементов из группы II и VI периодической таблицы Менделеева.
Наночастица, полученная из изоляционного материала, имеющего высокую относительную диэлектрическую проницаемость (диэлектрическую проницаемость), т.е. равную или выше 200
ijk
ijk
2
th
см., например, table 12-45 “Permittivity (dielectric constant) of inorganic solid”; Handbook of chemistry and physics; David R. Lide; 88
Edition; Compilation of the static dielectric constant of inorganic solid. K.F. Young and H.P.R. Frederikse. J. Phys. Chem. Ref. Data, Vol. 2, No. 2, 1973
Наночастицы, полученные из, или состоящие из, изоляционного материала, имеющего высокую относительную диэлектрическую проницаемость ε (также называемую диэлектрической проницаемостью), обычно получают из материала, имеющего величину энергетической щели Eg, равную или выше 3,0 эВ, обычно при измерении при комнатной температуре (около 25°C), и относительную диэлектрическую проницаемость ε, равную или выше 200, которую обычно измеряют между 20°C и 30°C и от 10 Гц до частоты инфракрасного диапазона ().
3
3
3
3
3
3
Такие наночастицы обычно получают из диэлектрического материала, который представляет собой смешанный металлооксид, предпочтительно выбранный из BaTiO, PbTiO, KTaNbO, KTaO, SrTiO, BaSrTiO и т.д.
3
M. Auffan et al., Nature Nanotechnology 2009, 4(10), 634-641: Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective)
Как правило, структура типа перовскита PbTiOнаночастиц показала изменение температуры их перехода из параэлектрической в сегнетоэлектрическую фазу для наночастиц размером менее 20 нм - 30 нм (см. . Для обеспечения низкого соотношения поверхность/объем и поддержания диэлектрических свойств наночастиц или агрегатов наночастиц предпочтительным является наибольший медианный размер ядра наночастицы или агрегата наночастиц популяции, составляющий по меньшей мере 30 нм, обычно по меньшей мере 40 нм.
ijk
3
3
3
3
3
Таким образом, в конкретном аспекте наибольший медианный размер ядра наночастицы или агрегата наночастиц популяции составляет по меньшей мере 30 нм или по меньшей мере 40 нм и предпочтительно ниже 500 нм, когда материал представляет собой изоляционный материал, как описано выше, имеющий высокую относительную диэлектрическую проницаемость ε, равную или выше 200, в частности, изоляционный материал с энергетической щелью Eg, равной или выше 3,0 эВ, предпочтительно смешанный металлооксид, выбранный из BaTiO, KTaNbO, KTaO, SrTiO и BaSrTiO.
Наночастица, полученная из изоляционного материала, имеющего низкую относительную диэлектрическую проницаемость (диэлектрическую проницаемость), т.е. равную или ниже 100
ijk
2
см., например, table 12-45 “Permittivity (dielectric constant) of inorganic solid”; Handbook of chemistry and physics; David R. Lide; 88th Edition; Compilation of the static dielectric constant of inorganic solid. K.F. Young and H.P.R. Frederikse. J. Phys. Chem. Ref. Data, Vol. 2, No. 2, 1973
Наночастицы, полученные из, или состоящие из, изоляционного материала, имеющего низкую относительную диэлектрическую проницаемость, обычно получают из материала, имеющего величину энергетической щели Eg, равную или выше 3,0 эВ, обычно при измерении при комнатной температуре (около 25°C), и относительную диэлектрическую проницаемость ε, равную или ниже 100, предпочтительно ниже 50 или ниже 20, которую обычно измеряют между 20°C и 30°C и от 10 Гц до частоты инфракрасного диапазона, ().
2
3
3
2
3
2
2
2
5
2
2
2,
2
3
2
2
2
2
2
2
3
4
2
Такие наночастицы обычно получают из диэлектрического материала, который выбран из оксида металла, смешанного оксида металла, металлический элемент которого выбран из периода 3, 5 или 6 периодической таблицы Менделеева или лантаноида, и углеродного материала. Диэлектрический материал предпочтительно выбирают из AlO, LaAlO, LaO, SiO, SnO, TaO, ReO, ZrO, HfOYO и алмазоподобного углерода. Более предпочтительно, диэлектрический материал представляет собой оксид металла, выбранный из ReO, ZrO, HfOи любой их смеси. Особенно предпочтительным является диэлектрический материал, выбранный из ZrO и HfO. В конкретном и предпочтительном аспекте диэлектрический материал или оксид металла не является CeO (оксид церия), FeO (оксид железа), SiO (диоксид кремния) или любой их смесью.
+
4+
4+
chapter 8, section 8,2 Zr4+ and Hf4+, p. 147 “The hydrolysis of cations”, Baes C.F. & Mesmer R.E.; John Wiley and Sons, Inc. reprint Edition 1986
Цирконий (Zr) и гафний (Hf) оба являются элементами в состоянии окисления 4, а элементы Zr и Hf практически идентичны по размеру и химическим свойствам; именно поэтому эти два иона рассматривают вместе при установлении химии их водных растворов (см. ).
2
2
2
2
2
В конкретном аспекте наибольший медианный размер ядра наночастицы или агрегата наночастиц популяции составляет по меньшей мере 10 нм и предпочтительно ниже 500 нм, как описано выше, когда материал выбран из ReO, ZrO, HfO, предпочтительно из ZrO и HfO, и любой их смеси, как описано выше.
Форма наночастиц или агрегата наночастиц
Поскольку форма частицы или агрегата может влиять на их «биосовместимость», предпочтительными являются частица или агрегат, имеющие довольно однородную форму. По фармакокинетическим причинам предпочтительными являются наночастицы или агрегаты по существу сферической, круглой или яйцевидной формы. Такая форма также способствует взаимодействию наночастицы или агрегата с клетками или поглощению клетками. Сферическая или круглая форма является особенно предпочтительной.
Форму наночастицы или агрегата наночастиц обычно оценивают при помощи электронной микроскопии, такой как просвечивающая электронная микроскопия (TEM).
Биосовместимое покрытие наночастиц или агрегатов наночастиц
В предпочтительном варианте осуществления ядро наночастицы или агрегата наночастиц, используемых в контексте настоящего изобретения для получения представляющей интерес композиции, может быть покрыто биосовместимым материалом, выбранным из агента, проявляющего малозаметные свойства. Агент, проявляющий малозаметные свойства, может быть агентом, демонстрирующим стерическую группу. Такая группа может быть выбрана, например, из полиакрилата; полиакриламид(поли(N-изопропилакриламида)); поликарбамида; биополимера; полисахарида, такого как декстран или ксилан; и коллагена. В другом предпочтительном варианте осуществления ядро наночастиц или агрегатов наночастиц может быть покрыто биосовместимым материалом, выбранным из агента, обеспечивающего взаимодействие с биологической мишенью. Такой агент обычно может вносить положительный или отрицательный заряд на поверхность наночастиц или агрегата наночастиц. Агент, образующий положительный заряд на поверхности наночастицы или агрегата наночастиц, может представлять собой, например, аминопропилтриэтоксисилан или полилизин. Агент, образующий отрицательный заряд на поверхности наночастицы или агрегата наночастиц, может представлять собой, например, фосфат (например, полифосфат, метафосфат, пирофосфат и т.д.), карбоксилат (например, цитрат или дикарбоновую кислоту, в частности, янтарную кислоту) или сульфат.
В предпочтительном варианте осуществления ядро наночастицы или агрегата наночастиц, используемых в контексте настоящего изобретения, представляет гидрофильный нейтральный поверхностный заряд или покрыто биосовместимым материалом (т.е. агентом для покрытия), выбранным из гидрофильного агента, придающего нейтральный поверхностный заряд наночастице. Действительно, когда наночастицы по настоящему изобретению вводят субъекту, наночастицы, представляющие гидрофильный нейтральный поверхностный заряд, или ядро наночастиц, покрытых биосовместимым агентом, выбранным из гидрофильного агента, придающего нейтральный поверхностный заряд наночастицам, являются особенно выгодными для оптимизации использования описанных в настоящей заявке наночастиц.
Гидрофильный агент, придающий нейтральный поверхностный заряд ядру наночастицы или агрегата наночастиц, может представлять собой агент, включающий функциональную группу, выбранную из спирта (R-OH), альдегида (R-COH), кетона (R-CO- R), сложного эфира (R-COOR), кислоты (R-COOH), тиола (R-SH), сахарида (например, глюкозы, фруктозы, рибозы), ангидрида (RCOOOC-R) и пиррола. Гидрофильный агент, придающий нейтральный поверхностный заряд ядру наночастицы или агрегата наночастиц, может представлять собой мономер, димер, олигомер, полимер или сополимер. Когда агент представляет собой олигомер, он может представлять собой олигосахарид, такой как циклодекстрин. Когда агент представляет собой полимер, он может быть сложным полиэфиром (таким как поли(молочная кислота) или полигидроксиалкановая кислота), простым полиэфиром, полиэтиленоксидом, полиэтиленгликолем, поливиниловым спиртом, поликапролактоном, поливинилпирролидоном, полисахаридом, таким как целлюлоза, полипирролом и т.д.
Кроме того, гидрофильный агент, придающий нейтральный поверхностный заряд ядру наночастицы или агрегата наночастиц, может представлять собой агент, включающий специфические группы (R-), способные взаимодействовать с поверхностью наночастицы или агрегата наночастиц. R обычно выбирают из тиольной, силановой, карбоксильной и фосфатной группы.
Когда ядро наночастицы или агрегата наночастиц представляет собой проводник или полупроводник и металлическую наночастицу, R предпочтительно представляет собой тиольную, тиоэфирную, сложную тиоэфирную, дитиолановую или карбоксильную группу. Предпочтительно, гидрофильный нейтральный агент для покрытия выбран из тиоглюкозы, 2-меркаптоэтанола, 1-тиоглицерина, тиодигликоля и гидроксимасляной кислоты.
Когда ядро наночастицы или агрегата наночастиц представляет собой диэлектрик и оксидную или смешанную оксидную наночастицу, R предпочтительно представляет собой силановую или фосфатную группу. Предпочтительно, гидрофильный нейтральный агент для покрытия представляет собой гидроксиметилтриэтоксисилан, фруктозо-6-фосфатное или глюкозо-6-фосфатное соединение.
Гидрофильный агент, придающий нейтральный поверхностный заряд ядру наночастицы или агрегата наночастиц, может представлять собой цвиттерионное соединение, такое как аминокислота, пептид, полипептид, витамин или фосфолипид.
Поверхностный заряд наночастицы или агрегата наночастиц обычно определяют, как хорошо известно специалисту, путем измерения зета-потенциала, обычно в (растворе) в воде, имеющем концентрацию материала наночастиц или агрегатов наночастиц от 0,01 до 10 г/л, рН между 6 и 8 и типично концентрацию электролитов (в воде) от 0,001 до 0,2 M, например 0,01 M или 0,15 M. В условиях, определенных выше, поверхностный заряд наночастицы или агрегата наночастиц обычно составляет от -10 мВ до+10 мВ (соответствует нейтральному поверхностному заряду), от -20 мВ до+20 мВ или от -35 мВ до+35 мВ. В нейтральном состоянии поверхностный заряд наночастиц или агрегатов наночастиц обычно находится в диапазоне от -10 мВ, -9 мВ, -8 мВ, -7 мВ, -6 мВ, -5 мВ, -4 мВ, -3 мВ, -2 мВ или -1 мВ до 1мВ, 2 мВ, 3 мВ, 4 мВ, 5 мВ, 6 мВ, 7 мВ, 8 мВ, 9 мВ или 10 мВ. При отрицательном значении поверхностный заряд наночастиц или агрегата наночастиц обычно ниже -11 мВ, -12 мВ, -13 мВ, -14 мВ -15 мВ, -16 мВ, -17 мВ, -18 мВ, -19 мВ, -20 мВ, -21 мВ, -22 мВ, -23 мВ, -24 мВ, -25 мВ, -26 мВ, -27 мВ, -28 мВ, -29 мВ, -30 мВ, -31 мВ, -32 мВ, -33 мВ, -34 мВ или -35 мВ.
Полное биосовместимое покрытие наночастицы или агрегата может быть выгодным в контексте настоящего изобретения, чтобы избежать какого-либо электрического заряда на поверхности наночастицы, когда наночастица представляет гидрофильный нейтральный поверхностный заряд. “Полное покрытие” подразумевает наличие очень высокой плотности/компактности биосовместимых молекул, способных создавать по меньшей мере полный монослой на поверхности частицы.
Биосовместимое покрытие обеспечивает, в частности, стабильность наночастиц в жидкости, такой как физиологическая жидкость (кровь, плазма, сыворотка и т.д.) или любой изотонической среде или физиологической среде, необходимой для фармацевтического введения.
Стабильность может быть подтверждена количественным определением сухого экстракта с использованием сушильной печи и измерением на суспензии наночастиц до и после фильтрации, обычно на фильтре 0,45 мкм.
in vivo
Преимущественно покрытие сохраняет целостность частицы , обеспечивает или улучшает ее биосовместимость и облегчает ее необязательную функционализацию (например, с молекулами спейсера, биосовместимыми полимерами, таргетирующими агентами, белками и т.д.).
in vivo
Биосовместимая наночастица или агрегат наночастиц по изобретению не должна ни растворять, ни высвобождать токсичные вещества после введения  (т.е. при физиологическом pH), ни представлять окислительно-восстановительное поведение, обычно для того, чтобы указанную наночастицу или агрегат наночастиц считали биосовместимой, то есть для безопасного применения для субъекта, в частности млекопитающего, предпочтительно человека.
Другой конкретный объект, описанный в настоящей заявке, относится к композиции, в частности, фармацевтической композиции, включающей наночастицы и/или агрегаты наночастиц, такие, которые определены выше, предпочтительно вместе с фармацевтически приемлемым носителем или растворителем.
ijk
ijk
В частности, в настоящей заявке описана композиция для применения в повышении работоспособности мозга или для профилактики или лечения/для применения в профилактике или лечении патологического стресса или по меньшей мере одного его симптома, как описано в настоящей заявке, у субъекта без воздействия на наночастицы или агрегаты наночастиц электрического поля, и предпочтительно без воздействия на них любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука, где композиция включает или состоит из наночастиц и/или агрегатов наночастиц и фармацевтически приемлемого носителя, и где материал наночастицы или агрегата наночастиц обычно выбирают из проводникового материала, полупроводникового материала, изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε, равной или выше 200, и изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε, равной или ниже 100 как описано и объяснено выше.
ijk
ijk
В предпочтительном аспекте, композиция включает или состоит из по меньшей мере двух отдельных наночастиц и/или агрегатов наночастиц, при этом каждая наночастица или агрегат наночастиц состоит из отдельного материала, обычно выбранного из проводникового материала, полупроводникового материала, изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε, равной или выше 200, и изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε, равной или ниже 100.
В типичном аспекте изобретения описанные в настоящей заявке наночастица(ы) или агрегат(ы) наночастиц не используются в качестве носителя(носителей) (активного) терапевтического соединения(соединений) или лекарственного средства(средств).
Композиция может быть в форме твердого вещества, жидкости (частицы в суспензии), аэрозоля, геля, пасты и т.п. Предпочтительные композиции находятся в форме жидкости или геля. Особенно предпочтительные композиции находятся в жидкой форме.
Используемая фармацевтически приемлемая подложка или носитель может представлять собой любой классический носитель, известный специалистам в данной области, такой как, например, солевой, изотонический, стерильный, буферный раствор, неводный раствор носителя и т.п.
Композиция также может включать стабилизаторы, подсластители, поверхностно-активные вещества, полимеры и т.п.
Она может быть сформулирована, например, в виде ампулы, аэрозоля, флакона, таблетки, капсулы с использованием методов формулирования фармацевтических препаратов, известных специалисту в данной области.
Наночастицы или агрегаты наночастиц по изобретению можно вводить субъекту с использованием различных возможных путей, таких как внутричерепной, внутривенный (IV), через дыхательные пути (ингаляция), интратекальный, внутриглазной или пероральный путь (per os), интрацеребровентрикулярный (ICV), предпочтительно с использованием внутричерепного или интратекального пути.
При необходимости можно использовать повторные инъекции или введения наночастиц. Предпочтительно, наночастицы или агрегаты наночастиц должны вводиться один раз.
После введения наночастицы и/или агрегаты наночастиц обычно взаимодействуют с нейронами. В предпочтительном аспекте это взаимодействие представляет собой длительное взаимодействие, то есть взаимодействие в течение нескольких часов, дней, недель или месяцев. В конкретном аспекте наночастицы или агрегаты наночастиц остаются в организме субъекта.
В настоящей заявке описаны наночастицы, агрегаты наночастиц и композиции, включающие такие наночастицы или агрегаты наночастиц, предназначенные для применения у субъекта, обычно для применения у животного, предпочтительно у млекопитающего, даже более предпочтительно у человека, независимо от его возраста и пола.
5
17
5
16
5
15
7
14
9
12
2
12
3
Типичное количество(количества) наночастиц или агрегатов наночастиц, вводимых в кору головного мозга, гиппокамп или миндалевидное тело субъекта, составляет(составляют) от 10 до 10, от 10 до 10илиот 10 до 10, предпочтительно от 10 до 10, более предпочтительно от 10 до 10. Кроме того, типичное количество(количества) наночастиц или агрегатов наночастиц, вводимых в кору головного мозга, гиппокамп или миндалевидное тело субъекта, составляет(составляют) от 10 до 10 наночастиц или агрегатов наночастиц на см.
4
17
4
16
4
15
4
14
6
12
8
11
1
11
3
Типичное количество(количества) наночастиц или агрегата наночастиц, вводимых глубоко в мозг субъекта, составляет(составляют) от 10 до 10, от 10 до 10, от 10 до 10или от 10 до 10, предпочтительно от 10 до 10, более предпочтительно от 10 до 10. Кроме того, типичное количество(количества) наночастиц или агрегатов наночастиц, вводимых глубоко в мозг субъекта, составляет(составляют) от 10 до 10 наночастиц или агрегатов наночастиц на см.
Кроме того, в настоящей заявке описаны способ для повышения работоспособности мозга у субъекта и способ для лечения патологического стресса или по меньшей мере одного его симптома у субъекта, где каждый способ включает стадию введения любых из описанных в настоящей заявке наночастиц или агрегатов наночастиц субъекту. Этот способ обычно не включает какую-либо стадию воздействия на субъекта, и более точно на наночастицы или агрегаты наночастиц, которые были введены указанному субъекту, электрического поля, и предпочтительно также не включает какую-либо стадию воздействия на субъекта, и более точно на наночастицы или агрегаты наночастиц, которые были введены указанному субъекту, любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука.
ijk
ijk
Следующий объект, описанный в настоящей заявке, относится к набору, включающему по меньшей мере две отдельные наночастицы и/или агрегаты наночастиц, как описано в настоящей заявке, при этом каждая наночастица или агрегат наночастиц состоит из отдельного материала, обычно выбранного из проводникового материала, полупроводникового материала, изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε, равной или выше 200, и изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε, равной или ниже 100, как описано в настоящей заявке.
in situ
in vitro,
ex vivo
В конкретном варианте осуществления набор включает, в отдельных контейнерах, отдельные наночастицы и/или агрегаты наночастиц, как описано в настоящей заявке, (которые предназначены для контакта, обычно в смешанном виде, либо , т.е. на участке-мишени, либо  либо  до осаждения смеси на участке-мишени).
in vivo
in vitro
ex vivo
Также в настоящей заявке описано применение, ,  или , такого набора в способе, описанном в настоящей заявке, для повышения работоспособности/ производительности мозга, обычно для повышения синаптической пластичности, синаптической связности и/или емкости памяти нейронной сети у субъекта, или в способе для профилактики или лечения патологического стресса или по меньшей мере одного его симптома у нуждающегося в этом субъекта, без воздействия на наночастицы или агрегаты наночастиц, вводимые субъекту, электрического поля, и предпочтительно без воздействия на них любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука. Кроме того, в настоящей заявке раскрыт набор, описанный выше, для применения в профилактике или лечении патологического стресса или по меньшей мере одного его симптома у субъекта без воздействия на наночастицы или агрегаты наночастиц, вводимые субъекту, электрического поля, и предпочтительно без воздействия на них любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука.
В конкретном аспекте, наночастица или агрегат наночастиц, описанные в настоящей заявке, предназначены для применения для, или для применения в способе лечения для, улучшения физической деятельности или улучшения обучения, запоминания, чувственного восприятия, внимания и/или принятия решений субъектом, нуждающимся в таком лечении, без воздействия на указанную наночастицу или агрегат наночастиц электрического поля, и предпочтительно без воздействия на них любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука.
Carey S,
Proceedings of the Standford Child Language Conference., 1978, 15, 17-29: Acquiring a single new word)
(Matzel L.D et al. Current Directions in Psychological Science, 2013, 22(5), 342-348: The architecture of intelligence. Converging evidence from studies of humans and animals).
У грызунов, как правило, у мышей, надежные доказательства психометрического интеллекта могут быть получены из батарей тестов, включающих различные задачи. Эти тесты обычно включают задачи на обучение, такие как распознавание запахов или пространственная навигация. Тест обучения связан с сенсорными, двигательными или мотивационными требованиями, предъявляемыми к животному. Например, для оценки мышления у мышей можно использовать тест, основанный на концепции “быстрое картирование” ( et al., , чтобы оценить задачу на внимание у мышей, можно использовать “тест Струпа для мышей”, и для оценки эффективности рабочей памяти или объема рабочей памяти у мышей можно использовать анализ “радиальный восьмирукавный лабиринт”
(Stroop JR, Journal of Experimental Psychology, 1935, 18, 643-652: Studies of interference in serial verbal reactions)
(Huang L, et al., Journal of Experimental Psychology: Human Perception and Performance, 2012, 38, 414-428: Measuring the interrelations among multiple paradigms of visual attention: an individual differences approach)
Тест на IQ может быть использован для оценки объема памяти у человека. Тесты на IQ, такие как матрица Равена или шкала оценки интеллекта взрослых по Векслеру, хорошо известны специалистам и обычно используются для оценки объема рабочей памяти у человека. Тест Струпа словесно-цветовой интерференции  также можно использовать для человека для прогнозирования общего интеллекта .
В другом конкретном аспекте наночастица или агрегат наночастиц, описанный в настоящей заявке, предназначен для применения в повышении нейронных связей/связей нейронов, функциональной связности и/или синаптической пластичности в головном мозге субъекта, нуждающегося в таком лечении, без воздействия на наночастицу или агрегат наночастиц электрического поля и предпочтительно без воздействия на них любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука.
В типичном аспекте наночастица или агрегат наночастиц, описанные в настоящей заявке, предназначены для профилактики или лечения/для применения в профилактике или лечении субъекта, страдающего измененной функциональной активностью мозга, без воздействия на наночастицу или агрегат наночастиц электрического поля и предпочтительно без воздействия на них любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука.
В другом конкретном аспекте наночастица или агрегат наночастиц, описанные в настоящей заявке, предназначены для профилактики или лечения/для применения в профилактике или лечении субъекта, страдающего от патологического стресса или по меньшей мере от одного его симптома, в частности от хронического стресса, без воздействия на наночастицы или агрегаты наночастиц электрического поля, и предпочтительно без воздействия на них любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука. Все живые организмы стремятся к динамическому равновесию, которое называется гомеостазом. Этому равновесию угрожают определенные физические и психологические события. Интерфейс между поступающей сенсорной информацией и процессом оценки формируется лимбическими структурами головного мозга, в которые входят гиппокамп, миндалевидное тело и префронтальная кора. Стресс может быть вызван различными ситуациями, такими как новизна, неопределенность, разочарование, конфликт, страх, боль и т.д. Постоянное воздействие неблагоприятной окружающей среды, включая раздражители, такие как шум, загрязнение и межличностные конфликты, также может вызывать стресс.
Патологический стресс, возникающий в результате таких кумулятивных и/или повторяющихся ситуаций, изменяет структуру (морфологию) и/или связи клеток мозга и/или функциональные свойства клеток мозга. Как следствие, патологический стресс сильно влияет на здоровье и ограничивает качество жизни человека.
Неконтролируемый стресс может иметь серьезные неблагоприятные последствия и вызывать симптомы, включая ухудшение способности к обучению и памяти. При умеренном уровне стресса некоторые нейрохимические системы (например, катехоламины, глюкокортикоиды) могут влиять на обучение. По мере увеличения уровня стресса (по продолжительности и/или интенсивности) в гиппокампе наблюдают некоторые временные и постоянные изменения, включая изменения синаптической пластичности, клеточные морфологические изменения, подавление нейрогенеза у взрослых и/или деструкцию или атрофию нейронов (эти изменения описаны в настоящей заявке как симптомы патологического стресса). Эти связанные со стрессом изменения в мозге влияют на процессы обучения и памяти. Действительно, гиппокамп, миндалевидное тело и префронтальная кора подвергаются стресс-индуцированному структурному ремоделированию, которое изменяет поведенческие и физиологические реакции. Хронический стресс вызывает атрофию нейронов в гиппокампе и префронтальной коре, а также в областях мозга, участвующих в памяти, избирательном внимании и исполнительной функции, и вызывает гипертрофию нейронов в миндалевидном теле, области мозга, связанной со страхом, а также агрессивностью. Способность к обучению, запоминанию и принятию решений может быть поставлена под угрозу и, как правило, снижается вследствие хронического стресса и может сопровождаться повышенной агрессивностью.
in vitro
in vivo
Обширные наблюдения, проведенные в электрофизиологических исследованиях  и , подтверждают, что стресс и гормоны стресса ослабляют долгосрочное потенцирование (LTP) (т.е. длительное облегчение нейротрансмиссии в синапсе после естественной или искусственной стимуляции синапса, что, как полагают, является клеточным механизмом пластичности в мозге и особенно вовлеченном в обучение и память).
(Kim J.J. et al. Nature Reviews Neuroscience, 2002, 3, 453-462: The stressed hippocampus, synaptic plasticity and lost memories; McEwen B.X. Physiological Review, 2007, 87, 873-904: Physiology and neurobiology of stress and adaptation: central role of the brain)
Существует много фармацевтических средств, таких как снотворные препараты, анксиолитики и бета-блокаторы, которые противодействуют некоторым проблемам, связанным с патологическим стрессом. Аналогичным образом, лекарственные средства, которые уменьшают окислительный стресс или воспаление, блокируют синтез или абсорбцию холестерина и лечат инсулинорезистентность или хроническую боль, могут помочь справиться с метаболическими и неврологическими последствиями “патологического опустошения”. Все эти лекарственные средства в некоторой степени ценны, но, к сожалению, у каждого из них есть свои побочные эффекты и ограничения . Описанные в настоящей заявке наночастицы теперь можно преимущественно использовать для лечения субъекта, страдающего таким патологическим стрессом, в частности хроническим стрессом, обычно субъекта, имеющего связанные со стрессом изменения, обнаруженные в головном мозге, как описано выше.
Термин “лечение” относится к терапевтическому лечению или мерам, способным предотвратить, облегчить или вылечить патологический стресс или его симптом, как описано выше в настоящей заявке, в частности, хронический стресс. Такое лечение предназначено для субъекта-млекопитающего, предпочтительно субъекта-человека, нуждающегося в нем. В качестве таковых рассматриваются субъекты, уже идентифицированные (диагностированные) как страдающие патологическим стрессом, как описано в настоящей заявке, или лица, которые считаются «подверженными риску развития» такого патологического стресса, для которых лечение является превентивным или профилактическим лечением. Конкретными субъектами, страдающими патологическим стрессом, являются субъекты, которым назначают лекарственное средство, выбранное из снотворного препарата, анксиолитика и бета-блокатора.
M. Auffan et al., Environmental Pollution 157 (2009) 1127-1133: Chemical Stability of metallic nanoparticles: a parameter controlling their potential cellular toxicity in vitro
Патологический стресс отличается от окислительного стресса. Согласно М. Ауффану и соавторам (см. ), окислительный стресс представляет собой состояние нарушенного окислительно-восстановительного равновесия, при котором продуцирование ROS (активные формы кислорода) (клеткой или самой наночастицей) превосходит антиоксидантную защитную способность клетки, тем самым приводя к неблагоприятным биологическим последствиям: повреждению макромолекул, липидов, ДНК или белков, приводящие к избыточной пролиферации клеток, апоптозу, перекисному окислению липидов или мутагенезу. В клетках, продукцию ROS можно отслеживать, например, при помощи флуоресцентных красителей, таких как диацетат дихлорфлуоресцеина.
Следующие примеры и соответствующие им чертежи иллюстрируют изобретение, не ограничивая его объем.
ЧЕРТЕЖИ
Фиг. 1.
Схема двух упрощенных вспышек, показывающая некоторые из параметров, которые можно извлечь из регистрации электрической активности. Указываются параметры, описывающие общую активность (спайк, вспышка, интервал между вспышками (IBI) и период вспышки) и структуру вспышки (длительность вспышки, плато вспышки, амплитуда вспышки, интервал между импульсами вспышки (ISI) и площадь вспышки). Стандартные отклонения (SD) этих параметров являются показателями регулярности общей активности и структуры вспышки, соответственно. Коэффициент вариации во времени (CVtime) отражает временную регулярность паттерна активности каждой единицы. CVtime рассчитывают как отношение стандартного отклонения параметра к среднему значению. Коэффициент вариации среди сети (CVnet) отражает синхронизацию между нейронами в сети. CVnet рассчитывают как отношение стандартного отклонения параметра к среднему значению по сети. Большие значения CVnet предполагают широкий диапазон изменений активности в сети, что означает меньшую синхронизацию и более высокую синаптическую пластичность и синаптическую связность.
Фиг. 2.
Функциональные эффекты наночастиц из примера 1, наблюдаемые в группе “Наночастицы”, по сравнению с водой, используемой в “Контрольной” группе, на активность сети лобной коры. Результаты указывают на более высокую синаптическую пластичность и синаптическую связность на клеточном уровне в присутствии наночастиц.
Фиг. 3.
Функциональные эффекты наночастиц из примера 2, наблюдаемые в группе “Наночастицы”, по сравнению с водой, используемой в “Контрольной” группе, на активность сети лобной коры. Результаты указывают на более высокую синаптическую пластичность и синаптическую связность на клеточном уровне в присутствии наночастиц.
Фиг. 4.
Функциональные эффекты наночастиц из примера 3, наблюдаемые в группе “Наночастицы”, по сравнению с водой, используемой в “Контрольной” группе, на активность сети лобной коры. Результаты указывают на более высокую синаптическую пластичность и синаптическую связность на клеточном уровне в присутствии наночастиц.
Фиг. 5.
Функциональные эффекты наночастиц из примера 5, наблюдаемые в группе “Наночастицы”, по сравнению с водой, используемой в “Контрольной” группе, на активность сети лобной коры. Результаты указывают на более высокую синаптическую пластичность и синаптическую связность на клеточном уровне в присутствии наночастиц.
ПРИМЕРЫ
in vitro
Исследования нейронов
На уровне нейронов пэтч-кламп метод очень полезен для определения потенциалов действия, поскольку он позволяет одновременно напрямую измерять и контролировать мембранный потенциал нейрона.
Этот метод используют для оценки эффектов наночастиц на отдельный нейрон.
исследования сети нейронов
In vitro
(Poli D. et al, Frontiers in Neural Circuits, 2015, 9 (article 57), 1-14: Functional connectivity in in vitro neuronal assemblies)
Диссоциированные нейронные культуры, связанные с мультиэлектродными матрицами (MEA), широко используют для лучшего понимания сложности сетей мозга. Кроме того, использование диссоциированных нейронных агрегатов позволяет манипулировать и контролировать связность сети.
(Johnstone A. F. M.
Neurotoxicology (2010), 31: 331-350, Microelectrode arrays: a physiologically based neurotoxicity testing platform for the 21
century)
(Novellino A.
Frontiers in Neuroengineering. (2011), 4(4), 1-14, Development of micro-electrode array based tests for neurotoxicity: assessment of interlaboratory reproducibility with neuroactive chemicals.)
(Taketani, M., et al., (2006). Advances in Network Electrophysiology. New York, NY: Springer; Obien et al., Frontiers in Neurosciences, 2015, 8(423): Revealing neuronal functions through microelectrode array recordings)
(Xia et al., Alcohol, 2003, 30, 167-174: Histiotypic electrophysiological responses of cultured neuronal networks to ethanol; Gramowski et al., European Journal of Neuroscience, 2006, 24, 455-465: Functional screening of traditional antidepressants with primary cortical neuronal networks grown on multielectrode neurochips; Gramowski et al., Frontiers in Neurology, 2015, 6(158): Enhancement of cortical network activity in vitro and promotion of GABAergic neurogenesis by stimulation with an electromagnetic field with 150MHz carrier wave pulsed with an alternating 10 and 16 Hz modulation)
st
Система MEA позволяет осуществлять неинвазивные длительные одновременные внеклеточные регистрации из нескольких участков в нейронной сети в режиме реального времени, увеличивая пространственное разрешение и тем самым обеспечивая надежное измерение активности сети. Одновременный сбор данных о потенциале действия и потенциале поля в течение длительных периодов времени позволяет осуществлять мониторинг функций сети, возникающих в результате взаимодействия всех клеточных механизмов, ответственных за образование пространственно-временных паттерновet al.,. По сравнению с пэтч-кламп методом и другими одноэлектродными методами регистрации, MEA измеряет отклики всей сети, объединяя глобальную информацию о взаимодействии всех рецепторов, синапсов и типов нейронов, присутствующих в сети et al.,. Как таковые, MEA регистрации применяются для понимания нейронной коммуникации, кодирования, распространения и обработки информации в нейронных культурах . Технология MEA представляет собой усовершенствованный фенотипический многопараметрический способ скрининга для характеристики функциональных изменений в активности сети в электрически активных клеточных культурах, который очень чувствителен к нейрогенезу, а также к нейрорегенеративным и нейродегенеративным аспектам. Более того, известно, что нейронные сети, выращенные на MEA, способны реагировать на нейроактивные или нейротоксичные соединения примерно в тех же диапазонах концентраций, которые изменяют функции интактной нервной системы млекопитающих .
Этот метод используют для оценки эффекта наночастиц на нейронную сеть(сети).
in vivo
Исследованиясети нейронов
Считают, что подходящая животная модель позволяет оценить эффект наночастиц по изобретению на нейронные сети животных.
Например, лабиринты используют для изучения пространственного обучения и памяти у крыс или мышей. Исследования с использованием лабиринта помогают раскрыть общие принципы обучения, которые можно применять ко многим видам, включая людей. Сегодня лабиринты обычно используют для определения того, влияют ли различные методы лечения или условия на обучение и память у крыс.
ПРИМЕР 1. Наночастицы, полученные из проводникового материала: синтез наночастиц золота, покрытых биосовместимым покрытием, имеющим нейтральный поверхностный заряд.
4
4
Наночастицы золота синтезировали путем восстановления соли хлорида золота (HAuCl) защитным агентом (цитрат натрия) (протокол был адаптирован из G. Frens Nature Physical Science 241 (1973) 21). В типичном эксперименте раствор HAuCl нагревали до кипения. Затем добавляли раствор цитрата натрия. Полученный раствор поддерживали при кипении в течение дополнительных 5 минут.
Осуществляли 0,22 мкм фильтрацию (фильтрующая мембрана: поли(эфирсульфон) (PES)) суспензии наночастиц и концентрацию золота в суспензии определяли при помощи спектроскопии в видимой области УФ-излучения при 530 нм.
2
Покрытие поверхности осуществляли с использованием α-метокси-ω-меркаптополи(этиленгликоля) 20 кДа (“тиол-ПЭГ20кДа”). Достаточное количество “тиол-ПЭГ 20кДа” добавляли к суспензии наночастиц, чтобы достичь по меньшей мере половины покрытия монослоем (2,5 молекулы/нм) на поверхности наночастицы золота. Уровень рН регулировали между 7 и 7,2, и суспензию наночастиц перемешивали в течение ночи.
Гидродинамический диаметр (измерение интенсивности) определяли при помощи динамического рассеяния света (DLS) при комнатной температуре (около 25°C) с использованием нанозетасайзера (Nano-Zetasizer) (Malvern) под углом рассеяния 173° с использованием лазера, излучающего при 633 нм, путем разбавления суспензии наночастиц в воде (конечная концентрация: [Au] = 0,1 г/л). Было обнаружено, что гидродинамический диаметр полученных таким образом биосовместимых наночастиц золота в суспензии равен 118 нм, с индексом полидисперсности (дисперсия популяции наночастиц по размеру), равным 0,13.
Зета-потенциал определяли путем измерения электрофоретической подвижности наночастиц (Нанозетасайзер, Malvern) путем разбавления суспензии наночастиц в растворе NaCl при 1 мМ при pH 7 (конечная концентрация: [Au] = 0,1г/л). Зета-потенциал при pH 7 был найден равным -1мВ.
ПРИМЕР 2. Наночастицы, полученные из проводникового материала: синтез наночастиц золота, покрытых биосовместимым покрытием, имеющим отрицательный поверхностный заряд.
Наночастицы золота получали как описано в примере 1 (такое же ядро неорганического золота).
Осуществляли 0,22 мкм фильтрацию на мембранном фильтре PES и концентрацию золота в суспензии определяли при помощи спектроскопии в видимой области УФ-излучения при 530 нм.
2
Биосовместимое поверхностное покрытие наносили с использованием мезо-2,3-димеркаптосукциновой кислоты (DMSA). Достаточное количество DMSA добавляли к суспензии наночастиц, чтобы достичь по меньшей мере половины покрытия монослоем (2,5 молекулы/нм) на поверхности. Уровень рН регулировали между 7 и 7,2, и суспензию наночастиц перемешивали в течение ночи.
Гидродинамический диаметр (измерение интенсивности) определяли при помощи динамического рассеяния света (DLS) при комнатной температуре (около 25°C) с использованием нанозетасайзера (Malvern) под углом рассеяния 173° с использованием лазера, излучающего при 633 нм, путем разбавления суспензии наночастиц в воде (конечная концентрация: [Au] = 0,1 г/л). Гидродинамический диаметр полученных таким образом наночастиц в суспензии был равен 76 нм, с индексом полидисперсности (дисперсия популяции наночастиц по размеру), равным 0,46.
Зета-потенциал определяли путем измерения электрофоретической подвижности наночастиц (Нанозетасайзер, Malvern) путем разбавления суспензии наночастиц в растворе NaCl при 1 мМ при pH 7 (конечная концентрация: [Au] = 0,1г/л). Зета-потенциал при pH 7 был найден равным -23мВ.
ПРИМЕР 3. Наночастицы, полученные из изоляционного материала, имеющего низкую относительную диэлектрическую проницаемость, равную или ниже 100: синтез наночастиц оксида циркония, покрытых биосовместимым покрытием, имеющим нейтральный поверхностный заряд.
2
4
Наночастицы оксида циркония (ZrO) синтезировали путем осаждения хлорида циркония (ZrCl) гидроксидом тетраметиламмония (ТМАОН) при основном значении pH. Полученную суспензию переносили в автоклав и нагревали при температуре выше 110°C. После охлаждения суспензию промывали деионизированной водой и подкисляли.
Наибольший медианный размер ядра наночастиц или агрегатов наночастиц популяции и размер ядра наночастиц или агрегатов наночастиц, представляющих 30-70% процентиль популяции наночастиц и агрегатов наночастиц, оценивали с использованием электронной микроскопии и находили равным 10 нм и 8 нм - 12 нм соответственно. Было подсчитано 446 наночастиц и измерен их наибольший размер.
2
Осуществляли 0,22 мкм фильтрацию на мембранном фильтре PES и определяли концентрацию наночастиц (ZrO) путем сушки водного раствора до состояния порошка и взвешивания полученной таким образом массы.
2
Биосовместимое покрытие получали с использованием силан-поли (этилен)гликоля 2кДа (“Si-ПЭГ 2кДа”). Достаточное количество “Si-ПЭГ 2кДа” добавляли к суспензии наночастиц, чтобы достичь по меньшей мере половины покрытия монослоем (2,5 молекулы/нм) на поверхности. Суспензию наночастиц перемешивали в течение ночи и затем рН доводили до 7.
2
2
Гидродинамический диаметр (измерение интенсивности) определяли при помощи динамического рассеяния света (DLS) при комнатной температуре (около 25°C) с использованием нанозетасайзера (Malvern) под углом рассеяния 173° с использованием лазера, излучающего при 633 нм, путем разбавления суспензии наночастиц в воде (конечная концентрация ZrO, составляющего ядро наночастицы: [ZrO] = 0,1 г/л). Гидродинамический диаметр наночастиц был найден равным 55 нм, с индексом полидисперсности (дисперсия популяции наночастиц по размеру), равным 0,1.
2
Зета-потенциал определяли путем измерения электрофоретической подвижности наночастиц (Нанозетасайзер, Malvern) путем разбавления суспензии наночастиц в растворе NaCl при 1 мМ при pH 7 (конечная концентрация: [ZrO] = 0,1г/л). Зета-потенциал при pH 7 был найден равным -1мВ.
ПРИМЕР 4. Наночастицы, полученные из изоляционного материала, имеющего низкую относительную диэлектрическую проницаемость, равную или ниже 100: синтез наночастиц оксида циркония, покрытых биосовместимым покрытием, имеющим отрицательный поверхностный заряд.
Наночастицы оксида циркония получали как описано в примере 3 (такое же неорганическое ядро).
2
Осуществляли 0,22 мкм фильтрацию на мембранном фильтре PES и определяли концентрацию наночастиц (ZrO) путем сушки водного раствора до порошка и взвешивания полученной таким образом массы.
2
Функционализацию поверхности осуществляли с использованием гексаметафосфата натрия. Достаточную массу гексаметафосфата натрия добавляли к суспензии наночастиц, чтобы достичь по меньшей мере половины покрытия монослоем (2,5 молекулы/нм) на поверхности. Суспензию наночастиц перемешивали в течение ночи и затем рН доводили до 7.
2
2
Гидродинамический диаметр (измерение интенсивности) определяли при помощи динамического рассеяния света (DLS) при комнатной температуре (около 25°C) с использованием нанозетасайзера (Malvern) под углом рассеяния 173° с использованием лазера, излучающего при 633 нм, путем разбавления суспензии наночастиц в воде (конечная концентрация ZrO, составляющего ядро наночастицы: [ZrO] = 0,1 г/л). Гидродинамический диаметр наночастиц был найден равным 70 нм, с индексом полидисперсности (дисперсия популяции наночастиц по размеру), равным 0,11.
2
Зета-потенциал определяли путем измерения электрофоретической подвижности наночастиц (Нанозетасайзер, Malvern) путем разбавления суспензии наночастиц в растворе NaCl при 1 мМ при pH 7 (конечная концентрация: [ZrO] = 0,1г/л). Зета-потенциал при pH 7 был найден равным -33мВ.
ПРИМЕР 5. Наночастицы, полученные из полупроводникового материала: наночастицы кремния, покрытые биосовместимым покрытием, имеющим нейтральный поверхностный заряд.
2
Наночастицы кремния (Si) (порошок) получали от US Research Nanomaterials Inc. Они были покрыты PVP (1 масс.%), что составляет менее 0,1 молекулы/нм на поверхности.
Наибольший медианный размер ядра наночастиц или агрегатов наночастиц популяции и размер ядра наночастиц или агрегатов наночастиц, представляющих 30-70% процентиль популяции наночастиц и агрегатов наночастиц, оценивали с использованием электронной микроскопии и находили равным 53 нм и 45-61 нм, соответственно. Были подсчитаны семьдесят одна (71) наночастица и был измерен их наибольший размер.
2
Затем их покрывали силан-поли(этиленгликолем) 20кДа (Si-ПЭГ 20кДа), добавляя массу, достаточную для получения по меньшей мере половины монослоя (2,5 молекулы/нм) и инкубируя покрытый раствор в течение ночи при основном рН. Затем их диспергировали в воде при концентрации 30г/л при обработке ультразвуком (при помощи зонда).
Осуществляли 0,22 мкм фильтрацию на мембранном фильтре PES и определяли концентрацию наночастиц (Si) путем сушки суспензии до порошка и взвешивания полученной таким образом массы.
Гидродинамический диаметр (измерение интенсивности) определяли методом динамического рассеяния света (DLS) при комнатной температуре (около 25°C) с использованием нанозетасайзера (Malvern) под углом рассеяния 173° с использованием лазера, излучающего при 633 нм, путем разбавления суспензии наночастиц в воде (конечная концентрация Si, составляющего ядро наночастицы: [Si] = 0,1 г/л). Гидродинамический диаметр наночастиц был найден равным 195 нм, с индексом полидисперсности (дисперсия популяции наночастиц по размеру), равным 0,10,
Зета-потенциал определяли путем измерения электрофоретической подвижности наночастиц (Нанозетасайзер, Malvern) путем разбавления суспензии наночастиц в растворе NaCl при 1 мМ при pH 7 (конечная концентрация: [Si] = 0,1г/л). Зета-потенциал при pH 7 был найден равным -3мВ.
ПРИМЕР 6. Наночастицы, полученные из полупроводникового материала: кремния наночастицы покрытых биосовместимым покрытием, имеющим отрицательный поверхностный заряд.
2
Наночастицы кремния (Si) (порошок) получали от US Research Nanomaterials Inc. Они были покрыты PVP (1 масс.%), что составляет менее 0,1 молекулы/нм на поверхности.
Их диспергировали в воде при 30 г/л при обработке ультразвуком (при помощи зонда).
Осуществляли 0,22 мкм фильтрацию на мембранном фильтре PES и определяли концентрацию наночастиц (Si) путем сушки суспензии до порошка и взвешивания полученной таким образом массы.
Гидродинамический диаметр (измерение интенсивности) определяли при помощи динамического рассеяния света (DLS) при комнатной температуре (около 25°C) с использованием нанозетасайзера (Malvern) под углом рассеяния 173° с использованием лазера, излучающего при 633 нм, путем разбавления суспензии наночастиц в воде (конечная концентрация Si, составляющего ядро наночастицы: [Si] = 0,1 г/л). Гидродинамический диаметр наночастиц был найден равным 164 нм, с индексом полидисперсности (дисперсия популяции наночастиц по размеру), равным 0,16.
Наибольший медианный размер ядра наночастиц или агрегатов наночастиц популяции и размер ядра наночастиц или агрегатов наночастиц, представляющих 30-70% процентиль популяции наночастиц и агрегатов наночастиц, оценивали с использованием электронной микроскопии и находили равным 53 нм и 45-61 нм соответственно. Были подсчитаны семьдесят одна (71) наночастица и был измерен их наибольший размер.
Зета-потенциал определяли путем измерения электрофоретической подвижности наночастиц (Нанозетасайзер, Malvern) путем разбавления суспензии наночастиц в растворе NaCl при 1 мМ при pH 7 (конечная концентрация: [Si] = 0,1г/л). Зета-потенциал при pH 7 был найден равным -19мВ.
ПРИМЕР 7. Наночастицы, полученные из изоляционного материала, имеющего высокую относительную диэлектрическую проницаемость, равную или выше 200: наночастицы титаната бария, покрытые биосовместимым покрытием, имеющим отрицательный поверхностный заряд.
3
Суспензию наночастиц титаната бария (BaTiO) (20 масс.% в воде) получали от US Research Materials Inc. (US3835).
3
Функционализацию поверхности осуществляли с использованием силан-поли(этилен)гликоля 10кДа (“Si-ПЭГ 10кДа”). Вкратце, “Si-ПЭГ 10кДа” сначала растворяли в растворе этанол/вода (1/3 об/об) и добавляли к суспензии BaTiO (20 масс.% в воде) для достижения полного монослойного покрытия на поверхности наночастиц. Суспензию обрабатывали ультразвуком и затем перемешивали в течение ночи. После 0,22 мкм фильтрации (фильтрующая мембрана: поли(эфирсульфон)) осуществляли стадию промывки для удаления непрореагировавших полимеров “Si-ПЭГ 10кДа”.
3
3
Гидродинамический диаметр (измерение интенсивности) определяли при помощи динамического рассеяния света (DLS) при комнатной температуре (около 25°C) с использованием нанозетасайзера (Malvern) под углом рассеяния 173° с использованием лазера, излучающего при 633 нм, путем разбавления суспензии наночастиц в воде (конечная концентрация BaTiO,составляющего ядро наночастицы: [BaTiO] = 0,1 г/л). Гидродинамический диаметр наночастиц был найден равным 164 нм, с индексом полидисперсности (дисперсия популяции наночастиц по размеру), равным 0,16.
3
Зета-потенциал определяли путем измерения электрофоретической подвижности наночастиц (Нанозетасайзер, Malvern) путем разбавления суспензии наночастиц в растворе NaCl при 1 мМ при pH 7 (конечная концентрация: [BaTiO] = 0,1г/л). Зета-потенциал при pH 7 был обнаружен при -11мВ.
Наибольший медианный размер ядра наночастиц или агрегатов наночастиц популяции и размер ядра наночастиц или агрегатов наночастиц, представляющих 30-70% процентиль популяции наночастиц и агрегатов наночастиц, оценивали с использованием электронной микроскопии и находили равным 67 нм и 60-77 нм соответственно. Были подсчитаны пятьдесят одна (51) наночастица и был измерен их наибольший размер.
ПРИМЕР 8. Функциональная оценка наночастиц по изобретению (наночастицы из примеров 1 и 2) на культурах нейронов лобной коры с использованием мультиэлектродных матриц (MEA).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Нейрочипы с микроэлектродной матрицей
Нейрочипы с 48-луночной микроэлектродной матрицей приобретали у Axion Biosystems Inc. Эти чипы имеют 16 пассивных электродов на лунку. Поверхность в течение 1 часа покрывали полиэтиленимином (PEI, 50% в боратном буфере), промывали и высушивали на воздухе.
Первичная культура клеток, условия обработки
2
Ткань лобной коры собирали у эмбрионов (день 15/16) chr:NMRI мышей (Charles River). Мышей умерщвляли путем цервикальной дислокации. Ткань диссоциировали ферментативным расщеплением (133,3 единицы Кунитца/мл ДНКазы; 10 единиц/мл папаина) и механическим растиранием в порошок, подсчитывали, контролировали жизнеспособность и высевали в 20 мкл каплю DMEM, содержащей ламинин (10 мкг/мл), 10% фетальной бычьей сыворотки и 10% лошадиной сыворотки, на MEA. Культуры на MEA инкубировали при 37°C в атмосфере 10% CO до готовности к применению. Культуральные среды пополняли два раза в неделю DMEM, содержащей 10% лошадиной сыворотки. Развивающиеся совместные культуры обрабатывали ингибиторами митоза 5-фтор-2’-дезоксиуридином (25 мкМ) и уридином (63 мкМ) в день 5 после посева для предотвращения дальнейшей глиальной пролиферации.
Лобную кору культивировали в течение 26 дней (период культивирования, также обозначаемый как “нативная фаза”). Подсчитывали количество активных лунок и к активным лункам добавляли суспензии наночастиц ([Au] = 800 мкМ) (группы “Наночастицы”) или воду (“Контрольная” группа). После 2 дней (48 часов) инкубации активность регистрировали в течение 2 часов (значения получали из 60-секундных групп данных, взятых из 30-минутного промежутка).
Многоканальная регистрация и многопараметрический анализ данных
2
Для регистрации использовали многоканальную систему регистрации MAESTRO от Axion Biosystems (США). Для внеклеточной регистрации 48-луночные МЕА помещали на регистрирующую станцию MAESTRO и поддерживали при 37°C. Регистрации осуществляли в DMEM/10% термоинактивированной лошадиной сыворотке. рH поддерживали на уровне 7,4 с использованием непрерывного потока отфильтрованного увлажненного воздушного потока с 10% CO.
Каждая единица представляет активность, исходящую от одного нейрона, зарегистрированную на одном электроде. Единицы разделяются в начале регистрации. Для каждой единицы потенциалы действия (т.е. спайки) регистрировали как последовательности спайков, которые объединены в так называемые “вспышки”. Вспышки количественно описывали при помощи прямого анализа последовательности спайков с использованием программ Spike Wrangler и NPWaveX (обе от компании NeuroProof GmbH, Rostock, Germany). Вспышки определялись началом и концом коротких спайковых событий (см. Фиг. 1).
При помощи многопараметрического высокопроизводительного анализа паттернов активности сети получали 204 описывающих активность параметра последовательности спайков. Эти параметры позволяют получить точное описание изменений активности в следующих четырех категориях: общая активность, структура вспышки, характеристика колебаний и синхронность.
- Изменения в “параметрах общей активности” описывают эффекты на частоту потенциалов действия (скорость спайков), скорость вспышки и период вспышки как время между вспышками.
- “Параметры структуры вспышки” определяют не только внутреннюю структуру спайков в высокочастотной спайковой фазе (“вспышка”), например, частоту спайков во вспышках, скорость спайков во вспышках и плотность спайков вспышки, но также общую структуру вспышки, такую как длительность, площадь и плато.
Gramowski A. et al., Eur. J. Neurosci., 2004, 19, 2815-2825: Substance identification by quantitative characterization of oscillator activity in murine spinal cord networks on microelectrode arrays
- “Параметры колебаний” количественно определяют регулярность возникновения или структуру вспышек, которые рассчитывают по коэффициентам вариации параметров первичной активности, описывающих вариабельность параметров (общая активность, структура вспышки) в экспериментальных эпизодах (). Более высокие значения указывают на менее регулярную структуру вспышки или менее регулярную общую активность (например, пульсация, ‘взрыв’ импульса).
Gramowski A. et al., Eur. J. Neurosci., 2004, 19, 2815-2825: Substance identification by quantitative characterization of oscillator activity in murine spinal cord networks on microelectrode arrays
Gramowski A. et al., Frontiers in Neurology, 2015, 6(158): Enhancement of cortical network activity in vitro and promotion of GABAergic neurogenesis by stimulation with an electromagnetic field with 150MHz carrier wave pulsed with an alternating 10 and 16 Hz modulation
- В качестве меры синхроничности в последовательности спайков, “параметры CVnet” отражают “синхронизацию” между нейронами в сети (). CVnet представляет собой коэффициент вариации по сети. Большие значения CVnet предполагают широкий диапазон изменений активности в сети, что означает меньшую синхронизацию. ().
CVtime отражает периодическое поведение, паттерн активности, отдельной единицы (одиночного нейрона), тогда как CVnet показывает координацию между различными нейронами в определенный период времени и является мерой синхроничности. Если популяция нейронов (сеть) синхронизирована, но колеблется в своем временном паттерне, наблюдаются низкое значение CVnet и высокое CVtime. И наоборот, несинхронизированная сеть с несколькими периодическими паттернами дает высокое значение CVnet и низкое CVtime. Высокое значение CVnet обычно достигается в естественных условиях (то есть в здоровых условиях и при отсутствии какого-либо лечения), когда синаптическая связность (которая обозначает ансамбль химических и электрических связей между нейронами) максимальна.
Функциональные эффекты, индуцируемые наночастицами по изобретению на нейронную сеть, оценивали по описанным выше параметрам (также обобщенно представлены для некоторых из них в таблице 1 ниже).
Таблица 1Параметры, описывающие активность из многопараметрического анализа данных в следующих двух категориях: общая активность и синхроничность
Общая активность
Скорость спайков
Количество спайков в секунду, усредненное по всем зарегистрированным последовательностям спайков
Скорость вспышки
Количество вспышек в минуту, усредненное по всем зарегистрированным единицам
Синхроничность
Скорость спайков CVnet
CVnet скорости спайков, отражающий сетевую вариабельность скорости спайков в экспериментальных эпизодах. Уменьшение этого параметра указывает на увеличение синхронизации в сети, тогда как увеличение этого параметра указывает на снижение синхронизации
Скорость вспышки CVnet
CVnet скорости вспышки, отражающий изменение скорости вспышки по сети во время экспериментальных эпизодов
Высота и частота пиковвспышки CVnet
CVnet длительности вспышки, отражающий изменение длительности вспышки по сети во время экспериментальных эпизодов
Амплитуда вспышки CVnet
CVnet амплитуды вспышки, отражающий изменение амплитуд вспышек в интервалах вспышек в экспериментальных эпизодах по всей сети. Уменьшение этого параметра отражает увеличение синхронизации в сети, тогда как увеличение этого параметра указывает на снижение синхронизации
Период вспышки CVnet
CVnet периода вспышки (расстояние между началом последовательных вспышек), отражающий вариабельность частоты вспышек в экспериментальных эпизодах по всей сети. Уменьшение этого параметра отражает увеличение синхронизации в сети, тогда как увеличение этого параметра указывает на снижение синхронизации
Регистрировали функциональные эффекты на активность сети в присутствии или в отсутствие тестируемых наночастиц. Значения абсолютной активности (значения параметров) выражали как среднее значение ± SEM независимых сетей. Для каждой группы “Наночастицы” или “Контрольной” группы, по меньшей мере 8 активных лунок (“активные” означает лунки с достаточным количеством электродов измерения электрической активности) были включены в анализ. Распределения абсолютных параметров тестировали на нормальность и статистическую значимость между группами оценивали при помощи однофакторного дисперсионного анализа.
Фиг. 2 (наночастицы из примера 1) и 3 (наночастицы из примера 2) представляют некоторые репрезентативные параметры (общая активность и синхронность), характеризующие функциональные эффекты, наблюдаемые в группах “Наночастицы” и в “Контрольной” группе. По сравнению с водой (используемой в “Контрольной” группе), наночастицы увеличивают вариабельность сетевой коммуникации (повышенные значения CVnet параметров). Это может быть связано с повышением синаптической пластичности и синаптической связности и, следовательно, с увеличением емкости памяти сети.
ПРИМЕР 9. Функциональная оценка наночастиц по изобретению (наночастицы из примеров 3 и 5) на культурах нейронов лобной коры с использованием мультиэлектродных матриц (MEA).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Нейрочипы с микроэлектродной матрицей
Нейрочипы с 48-луночной микроэлектродной матрицей приобретали у Axion Biosystems Inc. Эти чипы имеют 16 пассивных электродов на лунку. Поверхность в течение 1 часа покрывали полиэтиленимином (PEI, 50% в боратном буфере), промывали и высушивали на воздухе.
Первичная культура клеток, условия обработки
2
Ткань лобной коры собирали у эмбрионов (день 15/16) chr:NMRI мышей (Charles River). Мышей умерщвляли путем цервикальной дислокации. Ткань диссоциировали ферментативным расщеплением (133,3 единицы Кунитца/мл ДНКазы; 10 единиц/мл папаина) и механическим растиранием в порошок, подсчитывали, контролировали жизнеспособность и высевали в DMEM, содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки и 10% лошадиной сыворотки, на покрытые поли-D-лизином и ламинином MEA. Культуры на MEA инкубировали при 37°C в атмосфере 10% CO до готовности к применению. Культуральные среды пополняли два раза в неделю DMEM, содержащей 10% лошадиной сыворотки. Развивающиеся совместные культуры обрабатывали ингибиторами митоза 5-фтор-2’-дезоксиуридином (25 мкМ) и уридином (63 мкМ) в день 5 после посева для предотвращения дальнейшей глиальной пролиферации.
2
Лобную кору культивировали в течение по меньшей мере 4 недель (период культивирования, также обозначаемый как “нативная фаза”). Подсчитывали количество активных лунок и к активным лункам добавляли суспензии наночастиц ([Si] = 800 мкМ для суспензии наночастиц из примера 5 и [ZrO] = 400 мкМ для суспензии наночастиц из примера 3) (группы “Наночастицы”) или воду (“Контрольная” группа). После 4 дней (96 часов) инкубации активность регистрировали в течение 2 часов (значения получали из 60-секундных групп данных, взятых из 30-минутного промежутка).
Многоканальная регистрация и многопараметрический анализ данных
2
Для регистрации использовали многоканальную систему регистрации MAESTRO от Axion Biosystems (США). Для внеклеточной регистрации 48-луночные МЕА помещали на регистрирующую станцию MAESTRO и поддерживали при 37°C. Регистрации осуществляли в DMEM/10% термоинактивированной лошадиной сыворотке. рH поддерживали на уровне 7,4 с использованием непрерывного потока отфильтрованного увлажненного воздушного потока с 10% CO.
Каждая единица представляет активность, исходящую от одного нейрона, зарегистрированную на одном электроде. Единицы разделяются в начале регистрации. Для каждой единицы потенциалы действия (т.е. спайки) регистрировали как последовательности спайков, которые объединены в так называемые “вспышки”. Вспышки количественно описывали при помощи прямого анализа последовательности спайков с использованием программ Spike Wrangler и NPWaveX (обе от компании NeuroProof GmbH, Rostock, Germany). Вспышки определялись началом и концом коротких спайковых событий (см. Фиг. 1).
При помощи многопараметрического высокопроизводительного анализа паттернов активности сети получали 204 описывающих активность параметра последовательности спайков. Эти параметры позволяют получить точное описание изменений активности в следующих четырех категориях: общая активность, структура вспышки, характеристика колебаний и синхронность.
- Изменения в “параметрах общей активности” описывают эффекты на частоту потенциалов действия (скорость спайков), скорость вспышки и период вспышки как время между вспышками.
- “Параметры структуры вспышки” определяют не только внутреннюю структуру спайков в высокочастотной спайковой фазе (“вспышка”), например, частоту спайков во вспышках, скорость спайков во вспышках и плотность спайков вспышки, но также общую структуру вспышки, такую как длительность, площадь и плато.
Gramowski A. et al., Eur. J. Neurosci., 2004, 19, 2815-2825: Substance identification by quantitative characterization of oscillator activity in murine spinal cord networks on microelectrode arrays
- “Параметры колебаний” количественно определяют регулярность возникновения или структуру вспышек, которые рассчитывают по коэффициентам вариации параметров первичной активности, описывающих вариабельность параметров (общая активность, структура вспышки) в экспериментальных эпизодах (). Более высокие значения указывают на менее регулярную структуру вспышки или менее регулярную общую активность (например, пульсация, ‘взрыв’ импульса).
Gramowski A. et al., Eur. J. Neurosci., 2004, 19, 2815-2825: Substance identification by quantitative characterization of oscillator activity in murine spinal cord networks on microelectrode arrays
Gramowski A. et al., Frontiers in Neurology, 2015, 6(158): Enhancement of cortical network activity in vitro and promotion of GABAergic neurogenesis by stimulation with an electromagnetic field with 150MHz carrier wave pulsed with an alternating 10 and 16 Hz modulation
- В качестве меры синхроничности в последовательности спайков, “CVnet параметры” отражают “синхронизацию” между нейронами в сети (). CVnet представляет собой коэффициент вариации по сети. Большие значения CVnet предполагают широкий диапазон изменений активности в сети, что означает меньшую синхронизацию. ().
CVtime отражает периодическое поведение, паттерн активности, отдельной единицы (одиночного нейрона), тогда как CVnet показывает координацию между различными нейронами в определенный период времени и является мерой синхроничности. Если популяция нейронов (сеть) синхронизирована, но колеблется в своем временном паттерне, наблюдаются низкий CVnet и высокий CVtime. И наоборот, несинхронизированная сеть с несколькими периодическими паттернами дает высокий CVnet и низкий CVtime. Высокое значение CVnet обычно достигается в естественных условиях (то есть в здоровых условиях и при отсутствии какого-либо лечения), когда синаптическая связность (которая обозначает ансамбль химических и электрических связей между нейронами) максимальна.
Функциональные эффекты, индуцированные наночастицами по изобретению на нейронную сеть, оценивали по описанным выше параметрам (также обобщенно представлены для некоторых из них в таблице 2 ниже).
Таблица 2Параметры, описывающие активность, из многопараметрического анализа данных в следующих двух категориях: общая активность и синхроничность
Общая активность
Скоростьспайков
Количество спайков в секунду, усредненное по всем зарегистрированным последовательностям спайков
Скорость вспышки
Количество вспышек в минуту, усредненное по всем зарегистрированным единицам
Синхроничность
Скорость спайковCVnet
CVnet скорости спайков, отражающий сетевую вариабельность скорости спайков в экспериментальных эпизодах. Уменьшение этого параметра указывает на увеличение синхронизации в сети, тогда как увеличение этого параметра указывает на снижение синхронизации
Скорость вспышкиCVnet
CVnet скорости вспышки, отражающий изменение скорости вспышки по сети во время экспериментальных эпизодов
Высота и частота пиков вспышки CVnet
CVnet длительности вспышки, отражающий изменение длительности вспышки по сети во время экспериментальных эпизодов
Амплитуда вспышкиCVnet
CVnet амплитуды вспышки, отражающий изменение амплитуд вспышек в интервалах вспышек в экспериментальных эпизодах по всей сети. Уменьшение этого параметра отражает увеличение синхронизации в сети, тогда как увеличение этого параметра указывает на снижение синхронизации
Период вспышки CVnet
CVnet периода вспышки (расстояние между началом последовательных вспышек), отражающий вариабельность частоты вспышек в экспериментальных эпизодах по всей сети. Уменьшение этого параметра отражает увеличение синхронизации в сети, тогда как увеличение этого параметра указывает на снижение синхронизации
Регистрировали функциональные эффекты на активность сети в присутствии или в отсутствие тестируемых наночастиц. Значения активности (значения параметров) были нормализованы к соответствующей нативной активности, установленной на 100% для каждого эксперимента (значения для нативной активности получали из 60-секундных групп данных, взятых из 30-минутного промежутка после 30-минутной стабилизации активности). Значения относительной активности выражали как среднее значение ± SEM независимых сетей. Для каждой группы “Наночастицы” или “Контрольной” группы по меньшей мере 8 активных лунок (“активные” означает лунки с достаточным количеством электродов измерения электрической активности) были включены в анализ. Распределения абсолютных параметров тестировали на нормальность и статистическую значимость между группами оценивали при помощи однофакторного дисперсионного анализа.
Фиг. 4 (наночастицы из примера 3) и 5 (наночастицы из примера 5) представляют некоторые репрезентативные параметры (общая активность и синхронность), характеризующие функциональные эффекты, наблюдаемые в группах “Наночастицы” группы и в “Контрольной” группе. По сравнению с водой (используемой в “Контрольной” группе), наночастицы увеличивают вариабельность сетевой коммуникации (повышенные значения CVnet параметров). Это может быть связано с повышением синаптической пластичности и синаптической связности и, следовательно, с увеличением емкости памяти сети.
Эти результаты подчеркивают выгодные характеристики наночастиц, описанных в настоящей заявке, в повышении функциональных эффектов (синаптической пластичности и синаптической связности в нейронной сети) в нейронной сети.
ПРИМЕР 10: Синтез и физико-химическая характеристика наночастиц золота с различными размерами, имеющих нейтральный поверхностный заряд.
Наночастицы золота получают восстановлением хлорида золота цитратом натрия в водном растворе. Протокол был адаптирован из G. Frens Nature Physical Science 241 (1973) 21.
4
В типичном эксперименте раствор HAuCl нагревали до кипения. Затем добавляли раствор цитрата натрия. Полученную суспензию поддерживали при кипении в течение дополнительных 5 минут.
Размер наночастиц регулировали от примерно 15 нм до примерно 110 нм путем осторожной модификации соотношения цитрата к предшественнику золота (см. Таблицу 3).
Полученную суспензию наночастиц золота затем концентрировали, используя ультрафильтрационное устройство (кювета с перемешиванием Amicon, модель 8400 от Millipore) с целлюлозной мембраной, имеющей соответствующую границу отсечки по молекулярному весу задерживаемых компонентов (MWCO) и фильтровали через 0,22 мкМ мембранный фильтр с отсечкой (мембрана PES от Millipore) в ламинарном шкафу.
Покрытие поверхности осуществляли с использованием α-метокси-ω-меркаптополи(этиленгликоля) 20 кДа (“тиол-ПЭГ20кДа”). Достаточное количество “тиол-ПЭГ 20кДа” добавляли к суспензии наночастиц для получения монослойного покрытия на поверхности наночастиц золота. pH регулировали в пределах между 6,8 и 7,4 и суспензию наночастиц перемешивали в течение ночи. Избыток тиол-ПЭГ 20кДа удаляли при помощи ультрафильтрационного центрифужного фильтра (Vivaspin от Sartorius или Amicon Ultra от Merck Millipore) с соответствующей мембраной MWCO в ламинарном шкафу и полученную суспензию хранили при 4°C.
Размер частиц определяли при помощи просвечивающей электронной микроскопии путем подсчета по меньшей мере 200 наночастиц, беря самый большой размер наночастиц для определения размера. Наибольший медианный размер ядра наночастиц или агрегатов наночастиц популяции и размер ядра наночастиц или агрегатов наночастиц, представляющий 30% - 70% процентиль популяции наночастиц и агрегатов наночастиц, представлены в Таблице 3 вместе с концентрацией золота ([Au]), измеренной при помощи оптико-эмиссионной спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (ICP-OES), и зета-потенциалом, определенным путем измерения электрофоретической подвижности наночастиц (Нанозетасайзер, Malvern) путем разбавления суспензии наночастиц в растворе NaCl при 1 мМ, при концентрации золота ([Au]) от 0,01 до 0,05 г/л и при pH около 7.
Таблица 3
Образцы
Соотношение цитрат/Au в процессе синтеза (моль/моль)
Наибольший медианный размер ядра наночастицы (нм)
30%-70% процентиль (нм)
Зета-потенциал (мВ)
[Au] мг/мл (по ICP-OES)
GOLD-15
3,5
15
14-16
-3
3,6
GOLD-30
1,96
34
30-37
-3
3,9
GOLD-45Такое же ядро наночастиц, как наночастицы из примеров 1 & 2
1,26
45
42-49
-4
3,6
GOLD-80
0,8
83
77-93
-2
3,4
GOLD-110
0,7
108
91-123
-2
2,9
ПРИМЕР 11. Синтез наночастиц, полученных из проводникового материала: поли(3,4-этилендиокситиофеновые) наночастицы (PEDOT наночастицы), имеющие отрицательный поверхностный заряд.
Дисперсию поли(3,4-этилендиокситиофеновых) наночастиц (наночастиц PEDOT) в воде (1,1% масс/масс) получали от Sigma (Sigma 675288) и использовали без дополнительной очистки.
Зета-потенциал определяли путем измерения электрофоретической подвижности наночастиц (Нанозетасайзер, Malvern) путем разбавления суспензии наночастиц в растворе NaCl при 1 мМ при pH 7,3 (конечная концентрация PEDOT: 1г/л). Зета-потенциал при pH 7,3 был найден равным -53мВ.
Наибольший медианный размер наночастиц или агрегатов наночастиц популяции и размер ядра наночастиц или агрегатов наночастиц, представляющий 30%-70% процентиль популяции наночастиц и агрегатов наночастиц, оценивали с использованием сканирующей электронной микроскопии (SEM), и они были равны 408 нм и 311 нм - 518 нм, соответственно (были подсчитаны 56 наночастиц и был измерен их наибольший размер).
ПРИМЕР 12. Синтез наночастиц, полученных из изоляционного материала, имеющего низкую относительную диэлектрическую проницаемость, равную или ниже 100: синтез наночастиц оксида гафния, покрытых биосовместимым покрытием, имеющим отрицательный поверхностный заряд.
2
4
Наночастицы оксида гафния (HfO) синтезировали путем осаждения хлорида гафния (HfCl) гидроксидом тетраметиламмония (ТМАОН) при основном значении pH. Полученную суспензию переносили в автоклав и нагревали при температуре выше 110°C. После охлаждения суспензию промывали деионизированной водой и подкисляли.
2
Функционализацию поверхности осуществляли с использованием гексаметафосфата натрия. Достаточную массу гексаметафосфата натрия добавляли к суспензии наночастиц, чтобы достичь по меньшей мере половины покрытия монослоем (2,5 молекулы/нм) на поверхности. Суспензию наночастиц перемешивали в течение ночи и затем рН доводили до 7.