НАГРЕВАТЕЛЬНЫЙ БЛОК ПЦР С ПОВТОРНО РАСПОЛОЖЕННЫМИ КОНТУРНЫМИ НАГРЕВАТЕЛЯМИ И УСТРОЙСТВО ПЦР, СОДЕРЖАЩЕЕ ЕГО
HEATING PCR UNIT WITH RE-ARRANGED OF CONTOUR HEATERS AND PCR DEVICE CONTAINING IT

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к устройству ПЦР, снабженному нагревательным блоком ПЦР, с повторяющимся образом размещаемыми последовательными нагревателями.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Полимеразная цепная реакция, то есть ПЦР (Polymerase Chain Reaction, далее по тексту то же самое) - это метод повторного нагрева и охлаждения определенных фрагментов матричной нуклеиновой кислоты, цепного клонирования вышеуказанных определенных фрагментов и экспоненциальной амплификации нуклеиновой кислоты, имеющей эти определенные фрагменты, поэтому он широко используется в целях анализа и диагноза в области биологической науки, генной инженерии, медицинской области и других. В последнее время различными способами разрабатываются устройства для эффективного проведения ПЦР.
Одним из примеров обычного устройства ПЦР является установка контейнера, содержащего образец раствора, в том числе и матричную нуклеиновую кислоту, к нагревателю, а затем повторное нагревание и охлаждение вышеуказанного раствора, и проведение ПЦР. Однако, поскольку вышеуказанное устройство ПЦР оборудовано одним нагревателем, общая структура не сложная, но для точного регулирования температуры оно должно иметь сложные контуры, и в связи с повтором нагрева или охлаждения одним нагревателем, общее время ПЦР может быть более продолжительным, что является недостатком.
Кроме того, другим примером обычного устройства ПЦР является установка нескольких нагревателей, имеющих температуру ПЦР, и проведение ПЦР путем прохождения образцов раствора, содержащих нуклеиновую кислоту через один канал, который проходит через эти нагреватели. Однако в вышеуказанных устройствах ПЦР используются несколько нагревателей, поэтому возможно проведение по сравнительно простому контуру, но поскольку обязательно нужен длинный проточный канал для прохождения горячих и холодных нагревателей, вся структура сложная, и требуется отдельное устройство управления для контроля скорости потока образца раствора, содержащего нуклеиновую кислоту, протекающего в канале, в котором проходят вышеуказанные нагреватели.
С другой стороны, в последние годы в устройстве ПЦР не только разрабатываются эффективные методы для улучшения числа переносов ПЦР и распознавания процесса ПЦР в режиме реального времени, но также используются компактные нагреватели, поэтому проводятся разработки для того, чтобы устройства были компактными и портативными. В этом случае, поскольку характеристики компактных нагревателей оказывают существенное влияние на число переносов ПЦР, очень большое значение имеют разработки технологий, позволяющих точно контролировать или проводить установленную температуру компактного нагревателя. Таким образом, можно достигнуть значительного сокращения времени ПЦР и одновременно с тем получить надежное число переносов ПЦР, и кроме того, по-прежнему требуется осуществление устройства ПЦР, в котором возможна компактность и портативность продукции.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ТЕХНИЧЕСКИЕ ЗАДАЧИ
Для того, чтобы решить вышеупомянутые проблемы, в настоящем варианте осуществления изобретения значительно улучшены время и число переносов ПЦР, кроме того предлагается нагревательный блок ПЦР для возможности миниатюризации и портативности изделия, а в дальнейшем предлагается устройство ПЦР, содержащее его.
ТЕХНИЧЕСКОЕ РЕШЕНИЕ
Вариант осуществления № 1 настоящего изобретения: при нагревательном блоке ПЦР, повторяющимся образом выполняемыми двумя или более нагревателями, в вышеуказанных нагревателях для предотвращения наложения неоднородного тепла между соседними нагревателями, вследствие радиального распределения тепла, возникающего от отдельных нагревателей, по меньшей мере, в части вышеуказанных нагревателей обеспечивается нагревательный блок ПЦР, особенностью которого является содержание компенсирующего контура, регулирующего сопротивление и регулирующего коэффициент однородности нагрева на поверхности вышеупомянутого нагревателя.
В варианте осуществления №1 настоящего изобретения, вышеупомянутый компенсирующий контур повторяющимся образом образует зазор, как минимум в части вышеуказанного нагревателя, и путем регулирования сопротивления в соответствии с прерывающимся контуром, коэффициент однородности нагрева на поверхности вышеуказанного нагревателя может быть отрегулирован.
Вышеупомянутый компенсирующий контур регулирует сопротивление и может регулировать коэффициент однородности нагрева на поверхности вышеуказанного нагревателя за счет выполнения различной ширины зазора, повторяющимся образом образуемой, как минимум, в части вышеуказанного нагревателя.
Вышеупомянутый компенсирующий контур регулирует сопротивление и может регулировать коэффициент однородности нагрева на поверхности вышеуказанного нагревателя за счет выполнения различной толщины линии, повторяющимся образом образуемой, как минимум, в части вышеуказанного нагревателя.
Вышеупомянутый компенсирующий контур регулирует сопротивление и может регулировать коэффициент однородности нагрева на поверхности вышеуказанного нагревателя за счет выполнения различных материалов, повторяющимся образом образуемой, как минимум, в части вышеуказанного нагревателя.
Вышеупомянутый компенсирующий контур регулирует сопротивление и может регулировать коэффициент однородности нагрева на поверхности вышеуказанного нагревателя за счет выполнения различного расположения нагревательных электродов, повторяющимся образом образуемой, как минимум, в части вышеуказанного нагревателя.
В варианте осуществления №2 обеспечивается чип ПЦР, в котором имеется нагревательный блок ПЦР, соответствующий варианту осуществления №1 настоящего изобретения; и реакционный блок в форме пластины, который хотя и крепится для возможности теплообмена с нагревательным блоком ПЦР, она снабжена одним или более реакционными каналами, выполняемым на входе и выходе обоих концов, вытянутых для прохождения в продольном направлении верхних частей нагревателей, расположенных в вышеуказанном нагревательном блоке ПЦР.
В варианте осуществления №2 настоящего изобретения верхняя поверхность вышеуказанного нагревательного блока ПЦР может образовывать изолятор для предотвращения электролиза раствора ПЦР.
Вариант осуществления №3 обеспечивает нагревательный блок ПЦР, соответствующий варианту осуществления №1 настоящего изобретения; реакционный блок в форме пластины, которая хотя и соединяется с нагревательным блоком ПЦР для возможности теплообмена, но снабжена одним или более реакционными каналами, выполняемым в части входа и выхода обоих концов, вытянутых для прохождения в продольном направлении верхних частей нагревателей, расположенных в вышеуказанном нагревательном блоке ПЦР; и устройство ПЦР, содержащий блок питания для подачи электроэнергии в нагреватели, имеющиеся в вышеуказанном нагревательном блоке ПЦР.
В варианте осуществления №3 настоящего изобретения на верхней поверхности вышеуказанного нагревательного блока ПЦР может образовываться изолятор для защиты нагревателя.
Вышеуказанное устройство ПЦР может также содержать размещенный насос, выполненный с возможностью обеспечения положительного или отрицательного давления, для контроля расхода и скорости раствора ПЦР, протекающего в одном или более вышеуказанных реакционных каналов.
Вышеуказанное устройство ПЦР может также содержать источник света, выполненный с возможностью обеспечения света в реакционный блок ПЦР и светодетектор, выполненный с возможностью приема света, испускаемого от вышеуказанного реакционного блока ПЦР.
Вышеуказанные источники света и светодетекторы могут повторяющимся образом размещаться в пространстве между соседними нагревателями вышеупомянутого нагревательного блока ПЦР.
Вышеупомянутые реакционные блоки ПЦР повторяющимся образом размещаются на расстоянии друг от друга в продольном направлении вышеуказанного реакционного канала через его нижнюю поверхность, но поскольку они снабжены электродами определения, выполненными так, чтобы определять электрохимические сигналы, вызванные амплифицированной нуклеиновой кислотой и соединением активных веществ внутри вышеуказанного реакционного канала, вышеупомянутые электроды определения могут выполняться так, чтобы располагаться между группой из двух или более вышеуказанных нагревателей, при тепловом контакте с вышеуказанным нагревательным блоком ПЦР.
В этом случае в устройстве ПЦР может также содержаться измерительный модуль электрохимического сигнала, выполненного так, чтобы измерять электрохимические сигналы в режиме реального времени, возникающие внутри вышеупомянутого реакционного канала ПЦР, путем электрического соединения с вышеуказанным электродом определения.
В вышеупомянутом реакционном блоке ПЦР повторяющимся образом размещаются изоляционные промежутки через ее поперечное сечение, но поскольку оно снабжено электродами определения, выполненными так, чтобы определять электрохимические сигналы, путем формирования в слое иммобилизации поверхностно-обработанных зондов захвата, которые могут комплементарно соединяться с одной областью амплификационной нуклеиновой кислоты, путем формирования в одной области внутри вышеупомянутого реакционного канала, а также другой области внутри вышеупомянутого реакционного канала. Поэтому, несмотря на то, что она подключена к металлическим наночастицам и вышеупомянутым металлическим частицам, она может включать в себя композитный материал, имеющее сигнальный зонд, который может комплементарно соединяться с другой областью вышеупомянутой амплификационной нуклеиновой кислотой.
В этом случае в устройстве ПЦР может также содержаться измерительный модуль электрохимического сигнала, выполненного так, чтобы измерять электрохимические сигналы в режиме реального времени, возникающие внутри вышеупомянутого реакционного канала ПЦР, путем электрического соединения с вышеуказанным электродом определения.
ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, предотвратив наложение неоднородного тепла при радиальном тепловом распределении, возникающем в отдельных нагревателях в нагревательном блоке, с повторяющимся образом расположенными нагревателями, и между соседними нагревателями, соответствующими этому, может значительно улучшиться число переносов ПЦР, и поскольку не требуются отдельные средства регулирования температуры, можно будет внести значительный вклад в миниатюризацию и интеграцию устройства. Кроме того, поскольку используя нагревательные блоки и реакционные блоки ПЦР формы пластины, с повторяющимся образом расположенными блоками нагревания, можно одновременно и быстро амплифицировать несколько образцов нуклеиновой кислоты, и измерить непрерывные оптические сигналы или электрохимические сигналы, поэтому можно проверить процесс амплификации нуклеиновой кислоты в режиме реального времени.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг. 1 показаны нагревательные блоки (100) ПЦР, повторяющимся образом выполняемые двумя или более нагревателями (111, 121).
На фиг. 2-6 показаны структуры расположения нагревателей, образующие нагревательные блоки (100) ПЦР в варианте осуществления настоящего изобретения.
На фиг. 7 - фото, показывающее неоднородное радиальное распределение тепла, возникающее в случае подачи электроэнергии в отдельный нагреватель, в котором не используется компенсирующий контур.
На фиг. 8 - фото, показывающее наложение неоднородного тепла между соседними нагревателями (111, 121), соответствующими неоднородному радиальному тепловому распределению, возникающего от отдельного нагревателя, в случае подачи электроэнергии при состоянии повторного расположения двух или более нагревателей, в которых не используется компенсирующий контур в нагревательном блоке ПЦР.
На фиг. 9 показан нагревательный блок (100) ПЦР, соответствующий варианту осуществления №1 настоящего изобретения, в котором используется компенсирующий контур (1000).
На фиг. 10 показан компенсирующий контур, включающий в себя зазор (1100), образованный в одной части нагревателя (110) в нагревательном блоке ПЦР, соответствующего варианту осуществления №1 настоящего изобретения.
На фиг. 11 показан компенсирующий контур, в котором выполняется различная ширина зазора, образованная в одной части нагревателя (111) в нагревательном блоке ПЦР, соответствующего варианту осуществления №1 настоящего изобретения.
На фиг. 12 показан компенсирующий контур, в котором выполняется различная толщина одной части нагревателя (111) в нагревательном блоке ПЦР, соответствующего варианту осуществления №1 настоящего изобретения.
На фиг. 13 показан компенсирующий контур, который выполняется из различного материала, как минимум одной части нагревателя (111) в нагревательном блоке ПЦР, соответствующего варианту осуществления №1 настоящего изобретения.
На фиг. 14 показан компенсирующий контур, в котором выполняется различное расположение как минимум одной части нагревателя (111) в нагревательном блоке ПЦР, соответствующего варианту осуществления №1 настоящего изобретения.
На фиг. 15 - фото, показывающее распределение тепла, возникающего от нагревательного блока ПЦР, соответствующего варианту осуществления №1 настоящего изобретения.
На фиг. 16 - график, показывающий распределение тепла, возникающего от нагревательного блока ПЦР, соответствующего варианту осуществления №1 настоящего изобретения.
На фиг. 17 показаны нагревательный блок ПЦР и реакционный блок (300) ПЦР, находящиеся в тепловом контакте.
На фиг. 18 показан чип ПЦР, в котором выполняется единая форма нагревательного блока (100) ПЦР и реакционного блока (300) ПЦР.
На фиг. 19 показано устройство ПЦР, в котором выполняется отдельная форма нагревательного блока (100) ПЦР и реакционный блок (300) ПЦР.
На фиг. 20 показана ПЦР, которая выполняется посредством устройства ПЦР, снабженного нагревательным блоком (100) ПЦР, в котором повторяющимся образом расположены нагреватели, с использованием компенсирующего контура, соответствующего варианту осуществления №1 настоящего изобретения.
На фиг. 21 показана оптическая ПЦР в режиме реального времени, выполняемая посредством устройства ПЦР, снабженного нагревательным блоком (100) ПЦР, источником (150) света и светодетектором (600), в которых повторяющимся образом расположены нагреватели, с использованием компенсирующего контура, соответствующего варианту осуществления №1 настоящего изобретения.
На фиг. 22-25 показан реакционный блок (900) ПЦР другого типа, находящийся в тепловом контакте с нагревательным блоком ПЦР, показанным на фиг. 12-16.
На фиг. 26 показана ПЦР, выполняемая посредством устройства ПЦР, снабженного реакционным блоком (900) ПЦР на фиг. 22-25 и нагревательного блока (100) ПЦР, в котором повторяющимся образом расположены нагреватели, с использованием компенсирующего контура, соответствующего варианту осуществления №1 настоящего изобретения.
На фиг. 27 показана электрохимическая ПЦР в режиме реального времени, которая выполняется посредством устройства ПЦР, снабженного модулем (800) измерения сигнала, электродом (950) определения, реакционным блоком (900) ПЦР на фиг. 22-25, нагревательным блоком (100) ПЦР, в котором повторяющимся образом расположены нагреватели, с использованием компенсирующего контура, соответствующего варианту осуществления №1 настоящего изобретения.
На фиг. 28-31 показан реакционный блок (900) ПЦР другого типа, находящийся в тепловом контакте с нагревательным блоком ПЦР, показанным на фиг. 12-16.
На фиг. 32 показана ПЦР, которая выполняется посредством устройства ПЦР, снабженного реакционным блоком (900) ПЦР на фиг. 28-31 и нагревательным блоком ПЦР, в котором повторяющимся образом расположены нагреватели, с использованием компенсирующего контура, соответствующего варианту осуществления №1 настоящего изобретения.
На фиг. 33 показана электрохимическая ПЦР в режиме реального времени, которая выполняется посредством устройства ПЦР, снабженного модулем (800) измерения сигнала, электродом (950) определения, слоем иммобилизации, реакционным блоком (900) ПЦР на фиг. 28-31, нагревательного блока (100) ПЦР, в котором повторяющимся образом размещаются нагреватели, с использованием компенсирующего контура, соответствующего варианту осуществления №1 настоящего изобретения.
ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее, смотрите прилагаемые фигуры, в которых подробно описаны варианты осуществления, соответствующие настоящему изобретению. Следующее описание предназначено только для облегчения понимания вариантов осуществления, соответствующих настоящему изобретения, и не предназначено для ограничения сферы защиты.
В варианте осуществления настоящего изобретения, ПЦР (полимеразная цепная реакция) относится к типу реакции амплификации нуклеиновой кислоты, имеющей определенную нуклеотидную последовательность. Например, определенная температура раствора в устройстве ПЦР, содержащая образец и реагент ПЦР, включающие в себя двухцепочечную ДНК, являющуюся матричной нуклеиновой кислотой, для амплификации ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты), имеющей определенную нуклеотидную последовательность; например, этап денатурации, разделяющий вышеупомянутую двухцепочечную ДНК на одноцепочечные ДНК путем нагревания примерно до 95°С; обеспечение праймера олигонуклеотида (oligonucleotide), имеющего комплементарную последовательность и нуклеотидную последовательность, которая должна быть амплифицирована; определенная температура вместе с вышеупомянутой отделенной одноцепочечной ДНК; например, этап отжига, образующий частичный комплекс ДНК-праймер, путем охлаждения до 55°С, и соединения вышеупомянутого праймера к определенной нуклеотидной последовательности вышеуказанной одноцепочечной ДНК, а также температура, соответствующая вышеуказанному раствору после вышеупомянутого этапа отжига; например, осуществление этапа элонгации (или амплификации), который образует двухцепочечную ДНК, на основе праймера вышеупомянутого частичного комплекса ДНК-праймер, согласно полимеразе ДНК при поддержании на 72°С. Путем повтора вышеуказанных 3 этапов, например, от 20 до 40 раз, можно экспоненциально амплифицировать ДНК, имеющую вышеупомянутую нуклеотидную последовательность. В некоторых случаях вышеуказанное устройство ПЦР может выполнять одновременно вышеуказанный этап отжига и вышеуказанный этап элонгации (или амплификации), и в этом случае устройство ПЦР может завершить 1-й цикл путем выполнения 2 этапов, состоящих из вышеуказанного этапа элонгации и этапа вышеуказанного отжига и элонгации (или амплификации). Таким образом, нагревательный блок ПЦР, соответствующий варианту осуществления настоящего изобретения, и устройство ПЦР, содержащее его, относится к устройству, включающего в себя модуль для выполнения вышеуказанных этапов, а модули, которые не описаны подробно в настоящей спецификации, опубликовываются среди предшествующих технологий для выполнения ПЦР, или являются любым модулем, снабженным всем в очевидной сфере.
На фиг. 1 показан нагревательный блок (100) ПЦР, который повторяющимся образом выполняется двумя или более нагревателями (111, 121), а на фиг. 2-6 показаны структура расположения нагревателей, выполняющих нагревательный блок (100) ПЦР, соответствующий варианту осуществления настоящего изобретения.
Как показано на фиг. 1, варианты осуществления настоящего изобретения - это все варианты, в которых повторяющимся образом расположены два или более нагревателей в нагревательном блоке (100) ПЦР, подающего тепло в раствор ПЦР. Вышеуказанный нагревательный блок (100) ПЦР является модулем, подающим тепло по определенной температуре в пробу или реагент для выполнения раствора ПЦР, т.е. ПЦР, поэтому чтобы выполнить ПЦР, путем подачи тепла в раствор ПЦР посредством контакта тепла с одной поверхностью вышеуказанного реакционного блока (900) ПЦР путем снабжения поверхности контакта реакционного блока (900) ПЦР, содержащей пробы и реагенты как минимум на одной поверхности.
Как показано на фиг. 2-6, под вышеуказанным нагревательным блоком (100) ПЦР расположена подложка (99). Вышеуказанная подложка (99) не изменяет физические или химические свойства из-за нагревания нагревателями (111,121), расположенными на ее поверхности, и выполнена из материала, который не вызывает частый теплообмен между двумя или более нагревателями. Например, вышеуказанная подложка (99) может быть выполнена из материала типа пластика, стекла, силикона (кремния) и прочих, но если требуется, может выполняться в прозрачном или полупрозрачном виде. Вышеуказанный нагревательный блок (100) ПЦР, как правило, сформирован из тонкой пластины для миниатюризации и интеграции устройства, пластина может быть выполнена имеющей, например, толщину примерно от 1 нм до 1 мм, желательно примерно 250 мкм, но не ограничиваясь этим. В вышеуказанном нагревательном блоке (100) ПЦР повторяющимся образом расположены два или более нагревателей, например, в нагревательном блоке (100) ПЦР содержатся группа нагревателей, две или более группы нагревателей, упомянутых выше, снабженных одним или более нагревателями, но могут быть повторяющимся образом расположены два или более нагревательных блоков, в которых вышеупомянутые две или более группы нагревателей расположены на расстоянии друг от друга. Кроме того, поверхность контакта реакционного блока (900) ПЦР с вышеуказанным нагревательным блоком (100) ПЦР может быть выполнена в различной форме для эффективной подачи тепла в реакционный блок (900) ПЦР, содержащий раствор ПЦР, например плоской формы, формы канала или формы столба для увеличения отношения поверхности к объему.
Вышеупомянутые нагреватели (111, 112, 121, 122, 131, 132) являются проводящими нагревательными элементами, расположенными или копируемыми в вышеуказанной подложке (99), поэтому могут выполняться термоэлементами, вызывающими эффект Пельтье, нагревателями, использующими нагрев джоулевым теплом. Вышеуказанные нагреватели (111, 112, 121, 122, 131, 132) могут быть подсоединены для возможности управления различными модулямипитания и модулями управления для поддержания постоянной температуры, а также могут быть соединены для возможности управления с датчиками для мониторинга температуры вышеупомянутых нагревателей (111, 112, 121, 122, 131, 132). В вышеуказанных нагревателях (111, 112, 121, 122, 131, 132) блоки электродов, т.е. нагревательные электроды, могут быть симметрично расположены в вертикальном и/или горизонтальном направлении по отношению к центру поверхности верхних нагревателей (111, 112, 121, 122, 131, 132) для поддержания постоянной температуры внутри них. Кроме того, для вышеуказанных нагревателей (111, 112, 121, 122, 131, 132) может быть выбран один или более металлических материалов для быстрой передачи тепла и выполнения проводимости, например, от групп, состоящих из хрома, алюминия, меди, железа, серебра и углерода, или могут быть изготовлены из композиционного материала на их основе, но не ограничиваются этим. Кроме того, вышеуказанные нагреватели (111, 112, 121, 122, 131, 132) могут содержать один и более материал, выбираемый из групп, содержащих светопропускающие тепловыделяющие элементы, например, проводящие наночастицы, оксид индия и олова, проводящие полимеры, углеродные нанотрубки, графен, включающие в себя вещества с добавленными примесями, выбранными из оксидных полупроводниковых веществ или группы, состоящей из In, Sb, Al, Ga, C и Sn в вышеуказанных оксидных полупроводниковых веществах.
Вышеуказанные группы нагревателей (110, 120, 130) являются блоком, включающим в себя один или более вышеупомянутых нагревателей (111, 112, 121, 122, 131, 132), поэтому означают область, поддерживающую температуру для выполнения этапа денатурации для выполнения ПЦР, этапа отжига и/или этапа элонгации. Две или более вышеуказанных групп нагревателей (110, 120, 130) размещаются в вышеуказанном нагревательном блоке (100) ПЦР, и вышеупомянутые две или более группы нагревателей (110, 120, 130) размещаются в вышеуказанной подложке (99) на расстоянии друг от друга, но предпочтительно, чтобы в нагревательном блоке (100) ПЦР были 2-4 группы. Если вышеуказанный нагревательный блок (100) ПЦР оснащен 2 группами нагревателей, вышеуказанная 1-я группа нагревателей поддерживает температуру при этапе денатурации ПЦР, а 2-я группа нагревателей поддерживает температуру при этапе отжига/элонгации ПЦР, либо вышеупомянутая 1-я группа нагревателей поддерживает температуру при отжиге/элонгации ПЦР, а вышеупомянутая 2-я группа нагревателей может поддерживать температуру при этапе денатурации ПЦР. Кроме того, если вышеуказанный нагревательный блок (100) ПЦР оснащен 3 группами нагревателей, вышеуказанная 1-я группа нагревателей поддерживает температуру при этапе денатурации ПЦР, вышеуказанная 2-я группа нагревателей поддерживает температуру при этапе отжига ПЦР, а вышеуказанная 3-я группа нагревателей поддерживает температуру при этапе элонгации, либо вышеуказанная 1-я группа нагревателей поддерживает температуру при этапе отжига ПЦР, вышеуказанная 2-я группа нагревателей поддерживает температуру при этапе элонгации ПЦР, а вышеуказанная 3-я группа нагревателей поддерживает температуру при этапе денатурации ПЦР, либо вышеуказанная 1-я группа нагревателей поддерживает температуру при этапе элонгации ПЦР, вышеуказанная 2-я группа нагревателей поддерживает температуру при этапе денатурации ПЦР, а вышеуказанная 3-я группа нагревателей может поддерживать температуру при этапе отжига ПЦР. Предпочтительно, чтобы вышеупомянутые группы нагревателей были расположены на 3 фазах в вышеуказанном нагревательном блоке (100) ПЦР, и каждая из них поддерживала температуру для выполнения 3 этапов для выполнения ПЦР, т.е. этапа денатурации, этапа отжига и этапа элонгации. Еще более предпочтительнее, чтобы в вышеуказанном нагревательном блоке (100) ПЦР были расположены 2 фазы, и каждая из них могла поддерживать температуру для выполнения 2 этапов для выполнения ПЦР, т.е. этапа денатурации и этапа отжига/элонгации. В случае если вышеуказанные группы нагревателей расположены на 2 фазах в вышеупомянутом нагревательном блоке (100) ПЦР выполняют 2 этапа для выполнения ПЦР, т.е. этапа денатурации и этапа отжига/элонгации, можно сократить время ПЦР, по сравнению с выполнением 3 этапов для выполнения ПЦР, т.е. этапа денатурации, этапа отжига и этапа элонгации, и сократить количество нагревателей, поэтому можно повысить упрощение и плотность структуры, что является преимуществом. С другой стороны, в этом случае в 3-х этапах для выполнения ПЦР, температура для выполнения этапа денатурации составляет 85°С-105°С, предпочтительно, 95°С, температура для выполнения этапа отжига составляет 40°С-60°С, предпочтительно, 50°С, температура для выполнения этапа элонгации составляет 50°С-80°С, предпочтительно, 72°С. Кроме того, в 2-х этапах для выполнения ПЦР, температура для выполнения этапа денатурации составляет 85°С-105°С, предпочтительно, 95°С, а температура для выполнения этапа отжига/элонгации составляет 50°С-80°С, предпочтительно, 72°С. Однако, определенная температура и диапазон температуры при выполнении ПЦР конечно же можно регулировать в пределах обозначенных диапазонов. Вышеуказанная группа нагревателей (110, 120, 130) может включать в себя дополнительные нагреватели для выполнения роли буфера температуры.
Вышеуказанный нагревательный блок (10, 20) является блоком, включающим в себя два или более вышеупомянутые группы нагревателей, содержащие один или более нагревателей, что обозначает область завершения 1-го цикла, включающего в себя этап денатурации, этап отжига и/или элонгации для выполнения ПЦР. Вышеуказанный нагревательный блок (10, 20) может повторяющимся образом размещаться в количестве два или более в нагревательном блоке (100) ПЦР, но, предпочтительно, чтобы он мог быть повторяющимся образом расположен в нагревательном блоке (100) ПЦР на 10, 20, 30 или 40 фазе.
Как показано на фиг. 2, нагревательный блок (100) ПЦР снабжен нагревательным блоком (10, 20), повторяющимся образом расположенным на его верхней поверхности, по 2 группы нагревателей (110, 120), содержащихся в нем, и по 1 нагревателю (111, 121), содержащегося в них, поэтому температура 2 этапа для выполнения ПЦР, т.е. 1 температура этапа денатурации и 1 температура этапа отжига/элонгации может повторяющимся образом обеспечиваться в порядке очередности. Например, 1-й нагреватель (111) сохраняет 1 температуру в пределах диапазона 85°С-105°С, предпочтительно на 95°С, и 1-я группа нагревателей (110) обеспечивает температуру для выполнения этапа денатурации, а 2-й нагреватель (121) поддерживает 1 температуру в пределах диапазона 50°С-80°С, предпочтительно на 72°С, и 2-я группа нагревателей (120) обеспечивает температуру для выполнения этапа отжига/элонгации; нагревательный блок (100) ПЦР может повторяющимся образом обеспечивать в порядке очередности температуру 2 этапа для выполнения ПЦР в 1-м нагревательном блоке (10) и 2-м нагревательном блоке (20).
Как показано на фиг. 3, нагревательный блок (100) ПЦР снабжен нагревательным блоком (10, 20), повторяющимся образом расположенным на его верхней поверхности, по 2 группы нагревателей (110, 120), содержащихся в нем, и по 1 нагревателю (111, 112, 121, 122), содержащегося в них, поэтому он может повторяющимся образом обеспечивать температуру 2-х этапов для выполнения ПЦР, т.е. 2 температуру этапа денатурации и 2 температуру этапа отжига/элонгации в порядке очередности. Например, 1-й нагреватель (111) поддерживает 1 температуру в пределах диапазона 85°С-105°С, а 2-й нагреватель (112) поддерживает 1 температуру, одинаковую или отличную от вышеуказанной температуры 1-го нагревателя (111) в пределах диапазона 85°С-105°С, и 1-я группа нагревателей (110) обеспечивает температуру для выполнения этапа денатурации; 3-й нагреватель (121) поддерживает 1 температуру в пределах диапазона 50°С-80°С, а 4-й нагреватель (122) поддерживает 1 температуру, одинаковую или отличную от вышеуказанной температуры 3-го нагревателя (121) в пределах диапазона 50°С-80°С, и 2-я группа нагревателей (120) обеспечивает температуру для выполнения этапа отжига/элонгации; вышеупомянутый нагревательный блок (100) ПЦР может повторяющимся образом обеспечивать температуру 2-х этапов для выполнения ПЦР в 1-м блоке нагревателя (10) и 2-м блоке нагревателя (20) в порядке очередности.
Как показано на фиг. 4, нагревательный блок (100) ПЦР снабжен нагревательным блоком (10, 20), повторяющимся образом расположенным на его верхней поверхности, по 3 группы нагревателей (110, 120, 130), содержащихся в нем, и по 1 нагревателю (111, 121, 131), содержащегося в них, поэтому он может повторяющимся образом обеспечивать температуру 3-х этапов для выполнения ПЦР, т.е. 1 температуру этапа денатурации, 1 температуру этапа отжига и 1 температуру этапа элонгации в порядке очередности. Например, 1-й нагреватель (111) поддерживает 1 температуру в пределах диапазона 85°С-105°С, предпочтительно, на 95°С, а 1-я группа нагревателей (110) обеспечивает температуру для выполнения этапа денатурации; 2-й нагреватель (121) поддерживает 1 температуру в пределах диапазона 40°С-60°С, предпочтительно, на 50°С, и вышеуказанная 2-я группа нагревателей (120) обеспечивает температуру для выполнения этапа отжига; 3-й нагреватель (131) поддерживает 1 температуру в пределах диапазона 50°С-80°С, предпочтительно, на 72°С, а вышеуказанная 3-я группа нагревателей (130) обеспечивает температуру для выполнения этапа элонгации, поэтому вышеупомянутый нагревательный блок (100) ПЦР может повторяющимся образом обеспечивать температуру 3-х этапов для выполнения ПЦР в 1-м блоке нагревателя (10) и 2-м блоке нагревателя (20) в порядке очередности.
Как показано на фиг. 5, нагревательный блок (100) ПЦР снабжен нагревательным блоком (10, 20), повторяющимся образом расположенным на его верхней поверхности, по 3 группы нагревателей (110, 120, 130), содержащихся в нем, и по 2 нагревателя (111, 112, 121, 122, 131, 132), содержащегося в них, поэтому он повторяющимся образом обеспечивает температуру 3-х этапов для выполнения ПЦР, т.е. 2 температуру этапа денатурации, 2 температуру этапа отжига и 2 температуру этапа элонгации в порядке очередности. Например, 1-й нагреватель (111) поддерживает 1 температуру в пределах диапазона 85°С - 105°С, а 2-й нагреватель (112) поддерживает 1 температуру, одинаковую или отличную от вышеуказанной температуры 1-го нагревателя (111) в пределах диапазона 85°С - 105°С, и 1-я группа нагревателей (110) обеспечивает температуру для выполнения этапа денатурации; 3-й нагреватель (121) поддерживает 1 температуру в пределах диапазона 40°С - 60°С, а 4-й нагреватель (122) поддерживает 1 температуру, одинаковую или отличную от вышеуказанной температуры 3-го нагревателя (121) в пределах диапазона 40°С-60°С, и 2-я группа нагревателей (120) обеспечивает температуру для выполнения этапа отжига; 5-й нагреватель (131) поддерживает 1 температуру в пределах диапазона 50°С-80°С, а 6-й нагреватель (132) поддерживает 1 температуру, одинаковую или отличную от вышеуказанной температуры 5-го нагревателя (131) в пределах диапазона 50°С-80°С, и 3-я группа нагревателей (130) обеспечивает температуру для выполнения этапа элонгации; вышеупомянутый нагревательный блок (100) ПЦР может повторяющимся образом обеспечивать температуру 3-х этапов для выполнения ПЦР в 1-м блоке нагревателя (10) и 2-м блоке нагревателя (20) в порядке очередности.
Как показано на фиг. 2-5, два или более нагревателей (111, 112, 121, 122, 131, 132), поддерживающих определенную температуру, повторяющимся образом расположены в нагревательном блоке (100) ПЦР, поэтому можно значительно увеличить нормы изменения почасовой температуры. Например, в соответствии с обычным единственным методом нагревания, норма изменения почасовой температуры находится в пределах диапазона 3°С-7°С в секунду, в то время как согласно структуре нагревателей, повторяющимся образом расположенных в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, норма изменения почасовой температуры между вышеупомянутыми нагревателями находится в пределах диапазона 20°С-40°С в секунду, что позволяет значительно сократить время ПЦР. В соответствии со структурой повторного расположения нагревателей, соответствующей варианту осуществления настоящего изобретения, стал возможным точный контроль температуры на этапе денатурации, этапе отжига и этапе элонгации (или вышеупомянутом этапе денатурации и этапе отжига/денатурации), следовательно, стало возможным поддержание температуры или диапазона температуры только в области, которая снабжается теплом от вышеупомянутых нагревателей. Кроме того, поскольку в нагревательном блоке (100) ПЦР повторяющимся образом располагается различное число нагревательных блоков (10, 20), можно выполнять различные периоды циклов ПЦР. Например, в случае применения периода цикла в ПЦР по 10 фазам, вышеупомянутый блок нагревателя можно повторяющимся образом расположить 10 раз. То есть вышеупомянутый блок нагревателя можно повторяющимся образом расположить 10 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз и т.д. в вышеуказанном нагревательном блоке (100) ПЦР, учитывая период цикла предназначенного ПЦР. Таким образом, вышеуказанный нагревательный блок можно повторяющимся образом расположить на половине заданного числа периодов цикла ПЦР. Например, в случае применения в ПЦР, период цикла которой составляет 20 фаз, вышеуказанный блок нагревателя можно повторяющимся образом расположить 10 раз. В этом случае раствор пробы и реагента выполняет повторяющимся образом 10 раз период цикла ПЦР по направлению от входа к выходу внутри реакционного канала реакционного блока ПЦР, которая далее подробно описана, но в последующем, наоборот, можно повторяющимся образом выполнить 10 раз период цикла ПЦР по направлению от выхода к входу.
На фиг. 6 показан блок (200) питания, выполненный так, чтобы подавать электроэнергию в нагревательный блок (100) ПЦР, соответствующий варианту осуществления настоящего изобретения и в нагреватели, повторяющимся образом расположенные в вышеуказанном нагревательном блоке (100) ПЦР. В частности, в верхней части фиг. 6 показано вертикальное сечение вышеупомянутого нагревательного блока (100) ПЦР, а в нижней части фиг. 6 показано горизонтальное сечение вышеупомянутого нагревательного блока (100) ПЦР. Нагревательный блок (100) ПЦР, показанный на фиг. 6, включает в себя нагревательные блоки, повторяющимся образом расположенные 10 раз, а вышеупомянутый блок нагревателя включает в себя 1-ю и 2-ю группу нагревателей; вышеупомянутые 1-я и 2-я группа нагревателей, каждая из них включает в себя 1 нагреватель, т.е. 1-й нагреватель (110) и 2-й нагреватель (120). Вышеупомянутый блок (200) питания является модулем, который осуществляет нагревание путем подачи электроэнергии в вышеуказанный нагревательный блок (100) ПЦР от источника питания, поэтому включает в себя проводку (210, 220), осуществляющую распределение электроэнергии в каждый из вышеуказанных нагревателей (110, 120).
Например, в соответствии с фиг. 6, вышеупомянутый 1-й провод (210) нагревательного блока ПЦР подсоединен для подачи питания в 1-й нагреватель (110), а вышеупомянутый 2-й провод подсоединен для подачи питания во 2-й нагреватель (120). Например, в случае 1-й нагреватель (110) поддерживает температуру этапа денатурации ПЦР, например, в пределах 85°С-105°С, а 2-й нагреватель поддерживает температуру этапа отжига/элонгации ПЦР, например, в пределах 50°С-80°С, вышеупомянутый 1-й провод (210) получает питание для поддержания температуры этапа денатурации ПЦР от вышеупомянутого блока (200) питания ПЦР, а вышеупомянутый 2-й провод (220) может получать питание для поддержания температуры этапа отжига/элонгации ПЦР от вышеупомянутого блока (200) питания ПЦР. Вышеупомянутые 1-й провод (210) и 2-й провод (220) могут быть выполнены из золота, серебра, меди и других проводящих материалов, но не ограничиваются ими.
Фиг. 7 - это фото, показывающее неоднородное радиальное распределение тепла, возникающее в случае подачи питания в отдельные нагреватели, в которых не используется компенсирующий контур, а фиг. 8 - это фото, показывающее наложение неоднородного тепла между соседними нагревателями (111, 121), соответствующее неоднородному радиальному распределению тепла, возникающего от отдельных нагревателей, в случае подачи питания в ситуации повторного расположения двух или более нагревателей, где в нагревательном блоке ПЦР не используется компенсирующий контур.
Как показано на фиг. 7, образование радиального распределения тепла происходит при нагревании на основе подачи питания одним нагревателем, в котором все границы выполнены в прямоугольной форме. Обычно, при поддержании определенной температуры после подачи питания одним нагревателем, в котором все границы выполнены в прямоугольной форме, в центральной области происходит явление теплового смещения и высокотемпературное нагревание, и с приближением к части границ нагревателя, происходит явление потери тепла, поэтому по сравнению с центральной областью нагревателя, в части границ происходит низкотемпературное нагревание. В связи с явлением неравномерного нагревания, как показано на фиг. 7, вокруг одного нагревателя наблюдается радиальное распределение тепла. Такое радиальное распределение тепла обеспечивает причину увеличения коэффициента неоднородности тепла, основанного на наложении тепла между соседними нагревателями в нагревательном блоке ПЦР, в котором повторяющимся образом расположены два или более нагревателей прямоугольной формы. Согласно фиг. 8, можно проверить возникновение явления наложения неоднородного тепла между 1-м (111) и 2-м (121) нагревателем, вызванного явлением радиального распределения тепла, происходящего от отдельного нагревателя между 1-м (111) и 2-м (121) нагревателями. Например, в можно легко проверить возникновение явления наложения неоднородного тепла, подобного вышеупомянутому, в нагревательном блоке ПЦР, в котором повторяющимся образом расположены два или более нагревателей, в которых ширина прямоугольного нагревателя составляет примерно 4 мм, а расстояние между вышеуказанными соседними нагревателями составляет примерно 8 мм. Такое явление наложения неоднородного тепла препятствует созданию точной температуры, которая должна поддерживаться каждым нагревателем в нагревательном блоке, в котором два или более нагревателей повторяющимся образом располагаются на расстоянии друг от друга, как показано на фиг. 1-4, таким образом создаются трудности контроля температуры в каждом нагревателе, к тому же это создает трудности в точном выполнении ПЦР, что в конечном счете снижает эффективность ПЦР. Для того чтобы решить подобные проблемы из-за наложения неоднородного тепла между соседними нагревателями, можно обеспечить достаточное расстояние между соседними нагревателями или обработать материал, блокирующий тепло между соседними нагревателями, но в этом случае, общий размер нагревательного блока ПЦР увеличивается, что затрудняет миниатюризацию и портативность устройства, и затрудняет обеспечение экономичности из-за сложности производственного процесса.
На фиг. 9 показан нагревательный блок ПЦР, соответствующий варианту осуществления №1 настоящего изобретения, в котором используется компенсирующий контур (1000).
Как показано на фиг. 9, нагревательный блок (100) ПЦР, соответствующий варианту осуществления №1 настоящего изобретения, оснащен компенсирующим контуром (1000), который регулирует сопротивление, по крайней мере, в одной части вышеупомянутых нагревателей (111, 121) и коэффициент однородности нагрева на поверхности вышеуказанных нагревателей, для предотвращения наложения неоднородного тепла между соседними нагревателями, соответствующего радиальному распределению тепла, возникающему от отдельных нагревателей (111, 121). Вышеупомянутый компенсирующий контур (1000) изменяет структуру, материал, размер, расположение и т.п., по крайней мере, одной части прямоугольного нагревателя, поэтому относится к структуре контуров, обработанных для регулирования сопротивления и тепловыделения части этих нагревателей. Вышеупомянутый компенсирующий контур (1000), в зависимости от особенностей прямоугольного нагревателя, может быть выполнен по-разному, но, к примеру, повторяющимся образом образовав зазор, по крайней мере, в одной части вышеуказанного нагревателя, можно выполнить зазорный контур или волновой контур, либо выполнить материал, по крайней мере, одной части вышеуказанного нагревателя, отличающийся от другой части, либо выполнить размер, по крайней мере, одной части вышеуказанного нагревателя, отличающийся от другой части, либо выполнить электроды блока, т.е. расположение электродов нагревателя, по крайней мере, одной части вышеуказанного нагревателя, отличается от расположения в другой части. Кроме того, вышеупомянутый компенсирующий контур (1000) может быть равномерно использован по всей площади вышеуказанного нагревателя, но в некоторых случаях, может быть использован, ограничиваясь только частичной областью вышеуказанного нагревателя, или может быть выполнен по-разному для каждого нагревателя, в котором он повторяющимся образом располагается. С другой стороны, в нагревательном блоке ПЦР, соответствующему варианту осуществления №1 настоящего изобретения, нагреватель, оснащенный вышеупомянутым компенсирующим контуром, может быть выполнен согласно способу изготовления, выбираемого от группы, составленной из фотолитографии, гальванического покрытия, теневой маски и осаждения методом напыления, теневой маски и осаждения методом распыления, струйной печати, глубокой печати, глубокой офсетной печати, трафаретной печати, компьютеризированного станка с числовым программным управлением, лазерной обработки, и электроэрозионной обработки на вышеуказанной пластине.
На фиг. 10 показан компенсирующий контур, оснащенный зазором (1100), образованным в одной части нагревателя (111) в нагревательном блоке ПЦР, соответствующем варианту осуществления №1 настоящего изобретения.
Как показано на фиг. 10, вышеупомянутый компенсирующий контур (1000) повторяющимся образом образует зазоры (1100), по крайней мере, в одной части вышеуказанного нагревателя, и регулирует сопротивление, соответствующее контуру зазоров, поэтому, таким образом может быть отрегулирован коэффициент однородности нагрева на поверхности вышеуказанного нагревателя. Вышеупомянутый зазор (1100) является изменением формы, по крайней мере, одной части вышеуказанного нагревателя (111), поэтому он относится к обработанному контуру формы нагревателя, подобно углубленной области или выступающей области, или щели. Как показано на фиг. 10, вышеупомянутый зазор (1100) может быть по-разному выполнен на поверхности нагревателя (111), но ссылочная позиция 1100a обозначает выпуклый зазор, ссылочная позиция 1100b обозначает вогнутый зазор, а ссылочная позиция 1100c обозначает промежуточный зазор. Кроме того, вышеупомянутый зазор (1100) выполняется повторяющимся образом на поверхности границ нагревателя и может быть выполнен в форме волны, но это является выполнением путем повторения непрерывной углубленной и выступающей области поверхности границ вышеуказанного нагревателя (111). Следовательно, форма поверхности нагревателя может быть по-разному выполнена согласно различным структурам вышеупомянутых зазоров (1100), в связи с чем, можно регулировать сопротивление, по крайней мере, одной части вышеуказанного нагревателя и регулировать тепловыделение. С другой стороны, вышеупомянутые зазоры (1100) могут быть расположены, по крайней мере, на одной поверхности вышеуказанного нагревателя (111), но могут быть выполнены по различным стандартам. Например, размеры вышеуказанного зазора (1100) или ширина зазора может быть выполнена по-разному на любой поверхности каждого нагревателя (111). Как указано выше, путем регулирования стандартов вышеупомянутых зазоров (1100) на поверхности два или более нагревателей, можно отрегулировать сопротивление, по крайней мере, в каждой из 2 областей вышеупомянутого нагревателя, в результате чего можно выполнить распределение однородного тепла в каждом нагревателе, путем регулирования тепловыделения.
На фиг. 11 показан компенсирующий контур, в котором выполняется различная ширина зазора, образованная в одной части нагревателя (111) в нагревательном блоке ПЦР, соответствующем варианту осуществления №1 настоящего изобретения.
Вышеупомянутый компенсирующий контур (1000) регулирует сопротивление путем выполнения различной ширины зазора, повторяющимся образом образованных, по крайней мере, в одной части вышеуказанного нагревателя (111), таким образом может регулироваться коэффициент однородности нагрева на поверхности вышеупомянутого нагревателя. Компенсирующий контур (1000), в котором коэффициент однородности нагрева регулируется путем регулировки сопротивления, соответствующая ширине линий, как указано выше, относится к форме обработки для регулирования количества тепла по каждой позиции нагревателя, посредством изменения сопротивления, по крайней мере, в одной части вышеуказанного нагревателя, путем выполнения различной ширины линий, по крайней мере, одной части вышеуказанного нагревателя (111). Контур, в котором компенсируется вышеупомянутая ширина линий, может быть выполнен различным способами в структуре, в которой повторяющимся образом образуются зазоры на поверхности вышеуказанного нагревателя. Контур, в котором компенсируется вышеупомянутая ширина линий, может быть равномерно использован на всей площади вышеуказанного нагревателя (111), но в некоторых случаях, может также быть использован в одной области вышеуказанного нагревателя (111). С другой стороны, нагревательный блок (100) ПЦР, соответствующий варианту осуществления №1 настоящего изобретения, может быть выполнен с помощью различной ширины линий на любом отрезке отсека, образованного, по крайней мере, на двух или более поверхностях вышеуказанного нагревателя (111). То есть, можно отрегулировать количество тепла области нагревателя, на каждом соответствующем отрезке отсека (A, B, C), установив несколько отрезков отсека (A, B, C) среди поверхностей вышеуказанного нагревателя. Например, сравнив ширину линий выпуклых зазоров отрезков отсека (A, B, C) в нагревательном блоке (100) ПЦР, соответствующего варианту осуществления №1 настоящего изобретения, как показано на фиг. 11, в отрезке отсека А и С ширина линий выполнена уже, чем в отрезке отсека В, поэтому они имеют относительно высокое сопротивление, тем самым повышая количество тепла, тогда как в отрезке отсека В ширина линий выполнена шире, чем в отрезках отсека А и С, поэтому он обладает относительно низким уровнем сопротивления, тем самым снижая количество тепла. Как показано выше, путем регулирования ширины линий зазоров, выполненных на поверхности нагревателя, часть в обычном прямоугольном нагревателе с высокой температурой может регулировать сопротивление, снижая и повышая его, тем самым можно улучшить коэффициент неоднородности всей температуры.
На фиг. 12 показан компенсирующий контур, в котором выполняется различная толщина одной части нагревателя (111) в нагревательном блоке ПЦР, соответствующего варианту осуществления №1 настоящего изобретения.
Вышеупомянутый компенсирующий контур (1000) регулирует сопротивление путем выполнения различной толщины, по крайней мере, одной части вышеуказанного нагревателя(111), таким образом может регулироваться коэффициент однородности нагрева на поверхности вышеупомянутого нагревателя. Контур, в котором компенсируется толщина, по крайней мере, одной части вышеуказанного нагревателя (111), как указано выше, относится к форме обработки для регулирования количества тепла по каждой позиции вышеуказанного нагревателя (111), посредством изменения сопротивления, по крайней мере, в одной части вышеуказанного нагревателя (111), путем выполнения различной толщины, по крайней мере, одной части вышеуказанного нагревателя (111). Например, вышеупомянутый контур, в котором компенсирующий контур (1000), повторяющимся образом располагает непрерывную выпуклую и вогнутую стороны на поверхности вышеуказанного нагревателя (111), но толщина этих выпуклых и вогнутых сторон может выполняться различной, и хотя эта толщина выполняется в пределах диапазона примерно 0,001 мкм - 1 мм, но не ограничивается ими. Кроме того, контур, в котором компенсируется вышеупомянутая толщина, может быть равномерно использован на всей площади вышеуказанного нагревателя (111), но в некоторых случаях, может также быть использован в одной области вышеуказанного нагревателя (111). С другой стороны, нагревательный блок (100) ПЦР, соответствующий варианту осуществления №1 настоящего изобретения, может быть выполнен с помощью различной толщины на любом отрезке отсека, образованного, по крайней мере, на двух или более поверхностях вышеуказанного нагревателя (111). То есть, можно отрегулировать количество тепла области нагревателя, на каждом соответствующем отрезке отсека (A, B, C), установив несколько отрезков отсека (A, B, C) среди поверхностей вышеуказанного нагревателя. Например, сравнив толщину выпуклых сторон отрезков отсека (A, B, C) в нагревательном блоке (100) ПЦР, соответствующего варианту осуществления №1 настоящего изобретения, как показано на фиг. 12, в отрезке отсека А и С толщина выполнена тоньше, чем в отрезке отсека В, поэтому они имеют относительно высокое сопротивление, тем самым повышая количество тепла, тогда как в отрезке отсека В толщина выполнена толще, чем в отрезках отсека А и С, поэтому он обладает относительно низким уровнем сопротивления, что снижает количество тепла. Как показано выше, путем регулирования толщины любой одной части нагревателя, часть в обычном прямоугольном нагревателе с высокой температурой может регулировать сопротивление, снижая и повышая его, тем самым можно улучшить коэффициент неоднородности всей температуры.
На фиг. 13 показан компенсирующий контур, который выполняется из различного материала, как минимум одной части нагревателя (111) в нагревательном блоке ПЦР, соответствующего варианту осуществления №1 настоящего изобретения.
Вышеупомянутый компенсирующий контур (1000) регулирует сопротивление путем выполнения из различного материала, по крайней мере, одной части вышеуказанного нагревателя (111), таким образом может регулироваться коэффициент однородности нагрева на поверхности вышеупомянутого нагревателя. Контур, в котором компенсируется материал, как указано выше, относится к форме обработки для регулирования количества тепла по каждой позиции вышеуказанного нагревателя (111), посредством изменения сопротивления, по крайней мере, в одной части вышеуказанного нагревателя (111), путем выполнения из различного материала, по крайней мере, одной части нагревателя. Вышеупомянутым материалом нагревателя может быть композитный материал, выбранный из группы, состоящей из хрома, алюминия, меди, железа, серебра и углерода, или основанный на них, а также нет особых ограничений, если материал обладает проводимостью. Контур, в котором компенсируется вышеуказанный материал, может быть равномерно использован по всей площади вышеуказанного нагревателя (111), но в некоторых случаях, он, безусловно, может быть использован в одной области вышеуказанного нагревателя. С другой стороны, нагревательный блок (100) ПЦР, соответствующий варианту осуществления №1 настоящего изобретения, может быть выполнен с помощью различного материала на любом отрезке отсека, образованного, по крайней мере, на двух или более поверхностях вышеуказанного нагревателя (111). То есть, можно отрегулировать количество тепла области нагревателя, на каждом соответствующем отрезке отсека (A, B, C), установив несколько отрезков отсека (A, B, C) среди поверхностей вышеуказанного нагревателя. Например, сравнив материал выпуклых сторон (или выпуклых зазоров) отрезков отсека (A, B, C) в нагревательном блоке (100) ПЦР, соответствующего варианту осуществления №1 настоящего изобретения, как показано на фиг. 13, отрезки отсека А и С выполнены из материала с высоким удельным сопротивлением, чем отрезок отсека В, поэтому имеют относительно высокое сопротивление, тем самым повышая количество тепла, тогда как отрезок отсека В выполнен из материала с относительно низким сопротивлением, чем отрезки А и С, поэтому он обладает относительно низким уровнем сопротивления, что снижает количество тепла. Как показано выше, путем регулирования материала любой одной части нагревателя, часть в обычном прямоугольном нагревателе с высокой температурой может регулировать сопротивление, снижая и повышая его, тем самым можно улучшить коэффициент неоднородности всей температуры.
На фиг. 14 показан компенсирующий контур, в котором выполняется различное расположение как минимум одной части нагревателя (111) в нагревательном блоке ПЦР, соответствующего варианту осуществления №1 настоящего изобретения.
Вышеупомянутый компенсирующий контур (1000) регулирует сопротивление путем выполнения из различного расположения, по крайней мере, одной части вышеуказанного нагревателя (111), таким образом может регулироваться коэффициент однородности нагрева на поверхности вышеупомянутого нагревателя. В нагревательном блоке (100) ПЦР, соответствующем варианту осуществления №1 настоящего изобретения, располагаются зазоры (1100), например, выгнутые или вогнутые зазоры на одной поверхности вышеуказанного нагревателя (111) и на других поверхностях, соответствующих им, но могут содержаться нагревательные электроды (1110a, 1110b), в котором выполняются зигзагообразной формой в парном направлении друг к другу. Например, вышеуказанные зазоры (1100) могут выполняться в зигзагообразной форме на поверхности, соответствующей электродам вышеуказанного нагревателя (1110a, 1110b). Кроме того, в нагревательном блоке ПЦР, соответствующем варианту осуществления №1 настоящего изобретения, располагаются электроды (1500) прямоугольного нагревателя и на расстоянии от электродов вышеуказанного (1500) прямоугольного нагревателя, но могут и содержаться нагревательные электроды (1110a, 1110b), в которых используется вышеупомянутый компенсирующий контур (1000). Кроме того, вышеуказанные электроды (1500) прямоугольного нагревателя, как показано на фиг. 14, располагаются в центральной области вышеуказанного нагревателя (111), но нагревательные электроды (1110a, 1110b), в которых используется вышеуказанный компенсирующий контур, располагаются на расстоянии друг от друга в обоих направлениях от вышеупомянутых электродов (1500) прямоугольного нагревателя, но нагревательные электроды (1110a, 1110b), в которых используется вышеуказанный компенсирующий контур, могут выполняться симметрично, относительно позиций вышеуказанных электродов (1500) прямоугольного нагревателя. То есть, нагревательный блок (100) ПЦР, соответствующий варианту осуществления №1 настоящего изобретения, может выполняться только с помощью электродов нагревателей, содержащих компенсирующий контур (1000), но при необходимости, путем выполнения электродов нагревателей, в которых используется компенсирующий контур (1000), и обычных электродов прямоугольных нагревателей с помощью различных комбинаций, можно улучшить коэффициент неоднородности всей температуры, посредством регулирования сопротивления, снижая и повышая его, частью с высокой температурой из обычных прямоугольных нагревателей, и регулирования тепловыделения.
На фиг. 15 - фото, показывающее распределение тепла, возникающего от нагревательного блока ПЦР, соответствующего варианту осуществления №1 настоящего изобретения, а на фиг. 16 - график, показывающий распределение тепла, возникающего от нагревательного блока ПЦР, соответствующего варианту осуществления №1 настоящего изобретения.
По сравнению с обычными прямоугольными нагревателями, нагревательный блок (100) ПЦР, соответствующий варианту осуществления №1 настоящего изобретения, для подтверждения эффекта повышения коэффициента однородности нагрева в нагревательном блоке (100) ПЦР, был изготовлен нагревательный блок ПЦР, как показано на фиг. 11. Вышеуказанный нагревательный блок ПЦР был выполнен так, чтобы на пластине повторяющимся образом располагались нагреватели, оснащенные компенсирующим контуром, в котором непрерывно повторяющимся образом располагаются выпуклые и вогнутые зазоры. Кроме того, вышеуказанный нагревательный блок ПЦР, регулирует количество тепла каждого отрезка отсека нагревателя, путем выполнения ширины линий выпуклых зазоров и все интервалы между зазорами отрезков отсеков А и С по 200 мкм, а ширину линий выпуклых зазоров и все интервалы между зазорами отрезка отсека В по 400 мкм. В этом случае, было установлено, что ширина линий выпуклых зазоров и интервалы между зазорами могут регулироваться в пределах диапазона примерно 50 нм - 1 мм, а толщина вышеуказанного нагревателя выполняется по 10 мкм, но может регулироваться в пределах диапазона примерно 10 нм - 1 мм.
Как показано на фиг. 15, можно убедиться, что распределение тепла в нагревательном блоке ПЦР, соответствующего варианту осуществления №1 настоящего изобретения проявляется однородно в значительной степени, по сравнению с распределением тепла в обычных прямоугольных нагревателях. Следовательно, как показано на фиг. 16, отчетливо видно различие максимальных точек температуры (круглые пунктирные линии) 1-го нагревателя нагревательного блока ПЦР (111), соответствующего варианту осуществления №1 настоящего изобретения, и 2-я нагревателя, прилегающего к нему (121), поэтому можно убедиться в значительном снижении явления наложения неоднородного тепла и увеличения коэффициента однородности нагрева. Исходя из этого, в случае если после подачи питания в нагреватель, в котором используется компенсирующий контур, подобный вышеуказанному, при проверке в состоянии поддержания определенной температуры, можно убедиться, что образование распределения однородного тепла везде, уменьшив разницу температур между центральными областями и частями границ нагревателя. Кроме того, при проверке в состоянии поддержания определенной температуры после подачи питания в нагревательный блок ПЦР, в котором нагреватели, использующие компенсирующий контур, подобный вышеуказанному, расположены два или более раза повторяющимся образом, можно убедиться в значительном увеличении коэффициента однородности нагрева между соседними нагревателями. Кроме того, по результатам выполнения 2-х этапов ПЦР через нагревательный блок ПЦР, в котором повторяющимся образом расположены нагреватели, использующие компенсирующий контур, подобный вышеуказанному, было установлено точное поддержание температуры 2-мя соседними нагревателями на каждом из этапов, как на этапе денатурации (95°С), так и на этапе отжига/элонгации (72°С). Как описано выше, в случае использования нагревательного блока ПЦР, соответствующего варианту осуществления №1 настоящего изобретения, возможен точный контроль температуры и можно значительно увеличить эффективность ПЦР с помощью процесса ПЦР, а также можно осуществить упрощение и интеграцию модуля контроля, что позволит выполнить миниатюризацию устройства ПЦР, и, поскольку производственный процесс упрощается, ожидается обеспечение еще большей экономичности.
На фиг. 17 показаны нагревательный блок ПЦР и реакционный блок (300) ПЦР, находящиеся в тепловом контакте.
Как показано на фиг. 17, вышеуказанный реакционный блок (300) ПЦР располагается на 1-й пластине (310), которая соединена или прикреплена к вышеуказанному нагревательному блоку (100) ПЦР, или на вышеуказанной 1-й пластине (310), а также располагается на 2-й пластине (320), оснащенной вышеуказанным одним или более реакционными каналами (303), и на вышеуказанной 2-й пластине (320), и может включать в себя 3-ю пластину, оснащенную входом (304) и выходом (305) на обоих концах вышеуказанных одного или более реакционных каналов (303). Как указано выше, выполнив вышеуказанный реакционный блок (300) ПЦР в виде многослойной структуры в форме тонкой пленки, можно упростить метод изготовления и значительно сократить расходы, а также теплообмен с вышеуказанным нагревательным блоком (100) ПЦР очень сильно облегчается. Вышеуказанный реакционный блок (300) ПЦР может быть выполнен из различного материала, но предпочтительно, выполнение ее полностью в форме тонкой пленки из пластикового материала. Кроме того, вышеуказанный реакционный блок (300) ПЦР может быть выполнен из световодного материала, в случае использования в целях ПЦР в режиме реального времени на основе оптических измерений, подобных флуоресценции, фосфоресценции, люминесценции, спектроскопии рамановского рассеяния, поверхностно усиленного рамановского рассеяние, поверхностного плазмонного резонанса, предпочтительно выполнять вышеуказанную реакционный блок (300) ПЦР из световодного материала.
Вышеупомянутая 1-я пластина (310) соединяется или прикрепляется к вышеуказанному нагревательному блоку (100) ПЦР, и получает тепло от вышеуказанного нагревательного блока (100) ПЦР. Вышеупомянутая 1-я пластина (310) может быть выполнена из различного материала, но, предпочтительно, чтобы это мог быть материал, выбираемый из групп, состоящих из полидиметилсилоксана (PDMS), циклоолефинового сополимера (COC), полиметилметакрилата (PMMA), поликарбоната (PC), пропилен-карбоната (PPC), полиэфирсульфона (PES), полиэтилентерефталата (PET), и их соединений. Кроме того, верхняя сторона вышеуказанной 1-й пластины (310) может быть обработана гидрофильным веществом (не показано), которая выполняется для беспрепятственного выполнения ПЦР. Согласно обработке вышеуказанного гидрофильного вещества, может быть образован один слой, содержащий гидрофильное вещество в вышеуказанной 1-й пластине (310). Вышеуказанное гидрофильное вещество может быть различным материалом, но предпочтительно, чтобы он был выбран от группы, состоящей из карбоксильной группы (-COOH), аминогруппы (-NH2), гидроксильной группы (-OH), и сульфоновой группы (-SH); вышеуказанная обработка гидрофильного вещества может выполняться в соответствии со способами, известными в технике.
Вышеуказанная 2-я пластина (320) располагается в вышеупомянутой 1-й пластине (310). Вышеуказанная 2-я пластина (320) содержит один или более реакционных каналов (303). Вышеуказанный один или более реакционных каналов (303) подсоединяется к соответствующей части во входе (304) и выходе (305), образованных в вышеуказанной 3-й пластине (330). Следовательно, после введения целевых растворов образца, которые нужно амплифицировать, в один или более вышеуказанных реакционных каналов (303), протекает реакция ПЦР. Кроме того, один или более вышеуказанных реакционных каналов (303) могут существовать в количестве два или более, в соответствии с целью и диапазоном использования, и, как показано на фиг. 1, изображены 5 каналов реакций (303). Кроме того, вышеуказанная 2-я пластина (320) может выполняться из различного материала, но, предпочтительно, чтобы это могла быть термопластичная смола или термореактивная смола, выбираемая из групп, состоящих из полиметилметакрилата (PMMA), поликарбоната (PC), циклоолефинового сополимера (COC), полиамида (PA), полиэтилена (PE), полипропилена (PP), полифениленового эфира (PPE), полистирола (PS), полиоксиметилена (POM), полиэфирэфиркетона (PEEK), политетрафторэтилена (PTFE), поливинилхлорида (PVC), поливинилиденфторида (PVDF), полибутилентерефталата (PBT), фторированного этиленпропилена (FEP), перфторалкокси алканов (PFA), и их комбинаций. Кроме того, толщина вышеуказанной 2-й пластины (320) может быть различной, но может выбираться из 0,01 мм - 5 мм. Кроме того, ширина и длина вышеуказанного реакционного канала (303) может быть различной, но предпочтительно, чтобы ширина вышеуказанного реакционного канала (303) выбиралась из 0,001 мм - 10 мм, а длина вышеуказанного реакционного канала (303) могла выбираться из 1 мм - 400 мм. Кроме того, внутренняя стенка вышеуказанной 2-й пластины (320) может быть покрыта веществом из силанового ряда, альбумина бычьей сыворотки (BSA) и т.п. для предотвращения поглощения ДНК, белка, а вышеуказанная обработка материала может выполняться в соответствии со способами, известными в технике.
Вышеупомянутая 3-я пластина (330) располагается на 2-й пластине (320). Вышеупомянутая 3-я пластина (330) оснащена входом (304), образованным в одной области и выходом (305), образованным в другой области, на одном или более реакционных каналов (303), образованных на 2-й пластине (320). Вышеуказанный вход (304) представляет собой часть, в который вводится целевой раствор образца, содержащий нуклеиновую кислоту, которая должна быть амплифицирована. Вышеуказанный выход (305) представляет собой часть, которая выпускает вышеупомянутый целевой раствор образца после завершения ПЦР. Соответственно, вышеуказанная 3-я пластина (330) покрывает один или более реакционных каналов (303), образованный на 2-й пластине (320), но вышеупомянутый вход (304) и выход (305) выполняют роль входа и выхода вышеуказанных одного или более реакционных каналов (303). Вышеупомянутая 3-я пластина (330) может быть выполнена из различного материала, но, предпочтительно, чтобы это мог быть материал, выбираемый от групп, состоящих из полидиметилсилоксана (PDMS), циклоолефинового сополимера (COC), полиметилметакрилата (PMMA), поликарбоната (PC), пропилен-карбоната (PPC), полиэфирсульфона (PES), полиэтилентерефталата (PET), и их соединений. Кроме того, вход (304) может иметь различные размеры, но, предпочтительно, чтобы диаметр мог быть выбран из диапазона 0,001 мм -10 мм. Кроме того, выход (305) может иметь различные размеры, но, предпочтительно, чтобы диаметр мог быть выбран из диапазона 0,001 мм -10 мм. Кроме того, вышеупомянутый вход (304) и выход сквозного отверстия (305) оснащено отдельным средством покрытия (не показано), и может предотвратить утечку целевого раствора образца во время протекания ПЦР относительно целевого раствора образца внутри вышеупомянутого одного или более реакционных каналов (303). Вышеуказанное средство покрытия может быть выполнено в различной форме, по различным размерам или из различного материала. Кроме того, толщина вышеупомянутой 3-й пластины (330) может быть различной, но, предпочтительно, чтобы она могла быть выбрана из 0,001 мм - 10 мм. Кроме того, количество вышеуказанных входов (304) и выходов (305) может быть два или более.
Вышеуказанный реакционный блок (300) ПЦР может быть легко изготовлен методом, включающему в себя этап обеспечения вышеуказанной 3-й пластины (330), путем образования вышеуказанного входа (304) и вышеуказанного выхода (305) посредством механической обработки; этап обеспечения 2-й пластины (320), путем образования одного или более реакционных каналов (303) посредством механической обработки, начиная от части, подходящей ко входу (304) вышеуказанной 3-й пластины (330) в плите, имеющей размеры, совпадающие с нижней стороной вышеуказанной 3-й пластины (330), вплоть до части, подходящей к выходу (305) вышеуказанной 3-й пластины (330); этап обеспечения 1-й пластины (310), путем формирования поверхности, выполненной из гидрофильного вещества (не показано) посредством поверхностной обработки на верхней стороне плиты, имеющей размеры, совпадающие с нижней стороной вышеуказанной 2-й пластины (320); этап соединения, посредством процесса соединения нижней стороны вышеуказанной 3-й пластины (330) к верхней стороне вышеуказанной 2-й пластины (320) и этапа соединения посредством процесса соединения нижней стороны вышеуказанной 2-й пластины (320) к верхней стороне вышеуказанной 1-й пластины (310).
Вышеуказанный вход (304) и выход (305) 3-й пластины (330) и вышеуказанный один или более реакционных каналов 2-й пластины (320) могут быть образованы методом обработки, выбираемом из группы, состоящей из литья под давлением, горячего теснения, разливки и лазерной абляции. Кроме того, вышеуказанное гидрофильное вещество, поверхности 1-й пластины (310) может быть обработано методом, выбираемым из группы, состоящей из кислородной обработки и обработки аргоновой плазмой, обработки коронным разрядом и покрытием поверхностно-активным веществом, а также может выполняться, в соответствии с методами, известными в технике. Кроме того, нижняя сторона вышеуказанной 3-й пластины (330) и верхняя сторона вышеуказанной 2-й пластины (320), нижняя сторона 2-й пластины (320) и верхняя сторона вышеуказанной 1-й пластины (310) могут быть соединены с помощью процесса термического соединения, ультразвуковой сварки, соединения растворителем, сварка нагретой пластиной, соединения ультрафиолетовыми лучами, и соединения под давлением, а также могут быть выполнены в соответствии с методами, известными в технике. Между вышеуказанной 3-й пластиной (330) и 2-й пластиной (320), а также между вышеуказанной 2-й пластиной (320) и 1-й пластиной (310) может быть проведена обработка с обеих сторон клеящим веществом или термопластичной смолой, или термореактивной смолой (не показано).
На фиг. 18 показан чип ПЦР, в котором выполняется единая форма нагревательного блока (100) ПЦР и реакционного блока (300) ПЦР, а на фиг. 19 показано устройство ПЦР, в котором выполняется отдельная форма нагревательного блока (100) ПЦР и реакционный блок (300) ПЦР.
2
2
2
3
2
3
4
2
2
3
2
3
3
4
3
5
нагревательный блок ПЦР, оснащенный компенсирующим контуром, соответствующим варианту осуществления №1 настоящего изобретения, может использоваться в различных модулях и устройствах ПЦР. Например, нагревательный блок ПЦР, оснащенный вышеуказанным компенсирующим контуром, крепится к реакционному блоку ПЦР, который принимает раствор ПЦР и может быть выполнен из чипа ПЦР (встроенный чип, фиг. 18), а также может быть выполнен с помощью устройства ПЦР, оснащенного для контакта и разделения тепла с отдельным чипом ПЦР, снабженным реакционным блоком ПЦР (внешний чип, фиг.19). В случае встроенного чипа, верхняя сторона нагревательного блока ПЦР, оснащенного вышеуказанным компенсирующим контуром, может образовать изолятор (306) для предотвращения электролиза раствора ПЦР, а в случае вышеуказанного внешнего чипа, верхняя сторона нагревательного блока ПЦР, оснащенного вышеуказанным компенсирующим контуром, может образовать изолятор (307) для защиты от нагрева. Толщина вышеуказанных изоляторов (306, 307), предпочтительно выполнять по 20 мкм, но также подтверждена возможность выполнения в пределах диапазона примерно 50 нм - 1 мм. Вышеуказанный изолятор может быть выполнен из различных материалов, для предотвращения электролиза раствора ПЦР, например он может быть выбран из группы, состоящей из оксида, нитрида, термореактивной смолы, термопластичной смолы и УФ-отверждаемой смолы. В частности, вышеуказанные оксиды могут быть выбраны из группы, состоящей из оксида кремния (SiO), оксида титана (TiO), оксида алюминия (AlO), оксида гафния (HfO), оксид ванадия (VO), оксид циркония (ZrO), оксида сурьмы (SbO), и оксида иттрия (YO); вышеуказанные нитриды могут быть выбраны из группы, состоящей из нитрида кремния (SiN), нитрида титана (TiN), нитрида алюминия (AlN), нитрида тантала (TaN), нитрида гафния (HfN), нитрида ванадия (VN), и нитрида циркония (ZrN); вышеуказанная реактивная смола может быть выбрана из группы, состоящей из фенольной смолы, эпоксидной смолы, полимочевины, меламиновой смолы, алкидной смолы, полиэфирной смолы, анилина, полиимида, и силиконовой смолы; вышеуказанная термопластичная смола может быть выбрана из группы, состоящей из полиэтилена, поливинилхлорида, полистирола, полиамидной смолы, политетрафторэтилена и полипропилена; вышеуказанная УФ-отверждаемая смола может быть выбрана из группы, состоящей из эпоксиакрилата, полиэфиракрилата, уретанакрилата, полибутадиенакрилата, силиконакрилата, и алкилакрилата. С другой стороны, вышеуказанный изолятор может быть выполнен методом изготовления, выбираемого из группы, состоящей из фотолитографии, гальванопокрытия, теневой маски и осаждения методом напыления, теневой маски и осаждения методом распыления, струйной печати, глубокой печати, глубокой офсетной печати, трафаретной печати.
На фиг. 20 показана ПЦР, которая выполняется посредством устройства ПЦР, снабженного нагревательным блоком (100) ПЦР, в котором повторяющимся образом расположены нагреватели, с использованием компенсирующего контура, соответствующего варианту осуществления №1 настоящего изобретения.
Как показано на фиг. 20, устройство ПЦР, соответствующее варианту осуществления №1 настоящего изобретения, включает в себя реакционный блок (300) ПЦР, блок (400) питания и насос (500). В частности, вышеуказанный реакционный блок (300) ПЦР находится в контакте с вышеуказанным нагревательным блоком ПЦР.
Вышеуказанный источник (400) питания является модулем для подачи питания в блок (200) питания, поэтому 1-й (210) и 2-й (220) провод может быть подсоединен к вышеуказанному блоку (200) питания. Например, 1-й порт питания (не показан) вышеуказанного источника (400) питания при выполнении ПЦР электрически соединяется с вышеуказанным 1-м проводом (210), а 2-й порт питания (не показан) вышеуказанного источника (400) питания электрически соединяется с вышеуказанным 2-м проводом (220). В дальнейшем, в случае наличия у пользователя указаний для выполнения ПЦР, вышеуказанный источник (400) питания подает питание в каждый из вышеуказанных проводов: 1-й провод (210) и 2-й провод (220) и может быстро нагреть 1-й и 2-й нагреватель в вышеуказанном нагревательном блоке ПЦР, и когда каждый нагреватель достигнет заранее заданной температуры, источник питания контролирует объем энергии и сохраняет вышеуказанную заданную температуру. Например, вышеуказанная заданная температура в вышеупомянутом 1-м нагревателе может быть температурой этапа денатурации ПЦР (85°С-105°С, предпочтительно, 95°С) и во 2-м нагревателе может быть температурой этапа отжига/элонгации ПЦР (50°С-80°С, предпочтительно, 72°С), либо в 1-м нагревателе это может быть температура этапа отжига/элонгации ПЦР (50°С-80°С, предпочтительно, 72°С) и во 2-м нагревателе - температура этапа денатурации ПЦР (85°С-105°С, предпочтительно, 95°С).
Вышеуказанный насос (500) представляет собой модуль для контроля объема и скорости текучей среды, протекающей внутри одного или более реакционных каналов (303) вышеуказанного нагревательного блока (300) ПЦР, поэтому это может быть насос с положительным давлением и насос с отрицательным давлением, например, это может быть шприцевой насос. Вышеуказанный насос (500) может быть расположен с возможностью приведения в действие в одной части вышеуказанного реакционного канала (303), но, предпочтительно, чтобы он был расположен для подключения на входе (304) и/или выходе (305), образованных на обоих концах вышеуказанного реакционного канала (303). В случае расположения и подключения вышеупомянутого насоса (500) на вышеуказанном входе (304) и/или выходе (305), выполняет не только роль насоса, но также может выполнять роль ограничителя, который предотвращает утечку целевого раствора образца через вышеуказанный вход (304) и/или выход (305). Кроме того, в случае контроля текучей среды, протекающей внутри вышеуказанного реакционного канала (303), т.е. объема и скорости целевого раствора образца в одном направлении, вышеупомянутый насос (500) располагается и подключается только к чему-нибудь одному из вышеуказанного входа (304) и вышеуказанного выхода (305), а к оставшемуся может быть герметично подключен обычный ограничитель; в случае контроля текучей среды, протекающей внутри вышеуказанного реакционного канала (303), т.е. объема и скорости целевого раствора образца в обои направлениях, вышеуказанный насос (500) может располагаться, подключаясь к обоим: вышеупомянутому входу (304) и вышеупомянутому выходу (305).
Реакция амплификации нуклеиновой кислоты раствора ПЦР внутри устройства ПЦР, содержащего вышеуказанную реакционный блок (300) ПЦР, вышеуказанный источник (400) питания и вышеуказанный насос (500), является вариантом осуществления №1, поэтому может выполняться с помощью следующих этапов.
1. Подготовьте раствор ПЦР, включающий в себя желаемую двухцепочечную целевую ДНК, олигонуклеотидный праймер, имеющий определенную нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности, подлежащей амплификации, ДНК-полимеразу, дезоксирибонуклеотид-трифосфаты (dNTP), реакционный буфер ПЦР.
2. Введите вышеуказанный раствор ПЦР в реакционный блок (300) ПЦР. В этом случае, вышеуказанный раствор ПЦР располагается в реакционном канале (303) внутри реакционного блока (300) ПЦР через вышеуказанный вход (304).
3. Подсоедините вышеуказанный блок (200) питания, в частности, каждый из проводов: 1-й провод (210) и 2-й провод (220) к вышеуказанному источнику (400) питания, а вышеуказанный вход (304) и выход (305) реакционного блока (300) ПЦР герметично подключите к насосу (500).
4. Нагрейте вышеуказанный 1-й и 2-й нагреватель с помощью 1-го провода (210) и 2-го провода (220), направив подачу питания в вышеуказанный блок (400) питания, и поддерживайте определенную температуру, например, в случае 1-го нагревателя, температуру этапа денатурации ПЦР (95°С), и в случае 2-го нагревателя, температуру этапа отжига/элонгации ПЦР (72°С).
5. При обеспечении положительного давления по насосу (500), подключенному к вышеуказанному входу (304) либо при обеспечении отрицательного давления по насосу (500), подключенному к вышеуказанному выходу (305), направьте поток вышеупомянутого целевого раствора образца в горизонтальном направлении внутри вышеуказанного реакционного канала (303). В этом случае, вышеуказанный объем и скорость раствора ПЦР может контролироваться путем регулирования силы положительного или отрицательного давления, обеспечиваемого за счет вышеуказанного насоса (500).
Путем выполнения вышеописанных этапов, вышеупомянутый раствор ПЦР, перемещаясь в продольном направлении, в части, соответствующей верхней стороне вышеупомянутого 1-го нагревателя и части, соответствующей верхней стороне вышеупомянутого 2-го нагревателя от конца входа (304) до конца выхода (305) вышеуказанного реакционного канала (303), выполняет ПЦР. Как показано на фиг. 20, вышеупомянутый раствор ПЦР получает тепло от нагревательного блока (100), в котором повторяющимся образом расположен 10-фазный блок нагревателя, включающий в себя вышеупомянутый 1-й и 2-й нагреватель, и, проходя через этап денатурации ПЦР в части, соответствующей верхней стороне 1-го нагревателя и этап отжига/элонгации ПЦР в части, соответствующей верхней стороне 2-го нагревателя, завершает цикл 10-фазного ПЦР. В дальнейшем, по желанию, вышеупомянутый раствор ПЦР, перемещаясь обратно в продольном направлении, в части, соответствующей верхней стороне вышеупомянутого 1-го нагревателя и части, соответствующей верхней стороне вышеупомянутого 2-го нагревателя от конца выхода (305) до конца входа (304) вышеуказанного реакционного канала (303), может повторяющимся образом выполнить ПЦР.
На фиг. 21 показана оптическая ПЦР в режиме реального времени, выполняемая посредством устройства ПЦР, снабженного нагревательным блоком (100) ПЦР, источником (150) света и светодетектором (600), в которых повторяющимся образом расположены нагреватели, использующие компенсирующий контур, соответствующий варианту осуществления №1 настоящего изобретения.
Как показано на фиг. 21, устройство ПЦР, соответствующее варианту осуществления №1 настоящего изобретения, содержит реакционный блок (300) ПЦР из световодного материала и его, но включает в себя также нагревательный блок, в котором между 1-м нагревателем (110) и 2-м нагревателем (120) расположен источник (150) света, а также включает в себя блок (400) питания, насос (500) и светодетектор (600)
Реакционный блок (300) ПЦР, в соответствии с фиг. 21, выполняется из световодного материала, и отличается тем, что между 1-м нагревателем (110) и 2-м нагревателем (120) вышеупомянутого нагревательного блока (100) ПЦР располагается источник (150) света. Кроме того, вышеупомянутое устройство ПЦР также включает в себя светодетектор (600) для определения света, испускаемого вышеуказанным источником (150) света. Таким образом, вышеуказанное устройство ПЦР при выполнении ПЦР может проводить измерения и анализ процесс амплификации нуклеиновой кислоты в режиме реального времени. В этом случае, в вышеупомянутый раствор ПЦР может быть еще добавлено отдельное флуоресцирующее вещество, оно излучает свет на основе света с определенной длиной волны, в соответствии с генерацией результатов ПЦР, таким образом вызывая световой сигнал, который может измерять и анализировать. Вышеупомянутый источник (150) света может быть выбран из группы, состоящей из ртутной дуговой лампы, ксеноновой дуговой лампы, дуговой лампы на вольфрамовых электродах, металлогалогенной дуговой лампы, металлогалогенного волокна и светодиодов. Кроме того, длина волны вышеупомянутого источника (150) света может быть выбрана в пределах диапазона примерно 200 нм - 1300 нм, а также может быть выполнена несколькими волнами, используя несколько источников света или фильтров. Кроме того, светодетектор (600) может быть выбран из групп, состоящих из прибора с зарядовой связью (CCD), прибора с инжекцией заряда (CID), детектора на КМОП-структурах, и фотоэлектронного умножителя (PMT). В варианте осуществления №1 настоящего изобретения вышеупомянутый источник (150) света может располагаться в пространстве между вышеуказанным 1-м нагревателем (110) и 2-м нагревателем (120). Кроме того, вышеупомянутый источник (150) света располагается и соединяется с возможностью приведения в действие линзы (не показано), собирающей свет, излучаемый вышеупомянутым источником (150) света и светового фильтра (не показано), через который проходит свет диапазона определенной длины волны.
Как показано на фиг. 21, можно проверить этап измерения реакции амплификации нуклеиновой кислоты в режиме реального времени посредством устройства ПЦР, в соответствии с вариантом осуществления №1 настоящего изобретения. Например, раствор ПЦР, непрерывно проходя часть (301), соответствующую верхней стороне вышеупомянутого 1-го нагревателя (110), и часть (302), соответствующую верхней стороне 2-го нагревателя (120), внутри вышеуказанного реакционного канала (303), выполняет этап денатурации ПЦР и этап отжига/элонгации ПЦР, в этом случае, раствор ПЦР проводит часть, соответствующую верхней стороне вышеуказанного источника тепла (150), между вышеупомянутым 1-м нагревателем (110) и 2-м нагревателем (120), и между нагревательными блоками, содержащих вышеупомянутый 1-й нагреватель (110) и 2-й нагреватель (120). При прохождении раствора ПЦР части, соответствующей верхней стороне вышеупомянутого источника (150) света, скорость вышеупомянутого раствора ПЦР замедляется или некоторое время сохраняется в приостановленном состоянии, а после этого заставляет вышеуказанный источник (150) света излучать свет, и вышеупомянутый излучаемый свет проходит через вышеуказанную оптически прозрачную реакционный блок (300) ПЦР, в частности, проходит через вышеуказанный реакционный канал (330), и вышеупомянутый светодетектор (600) может измерять и анализировать световой сигнал, происходящий согласно амплификации нуклеиновой кислоты внутри вышеуказанного реакционного канала (330). Таким образом, во время протекания каждого цикла ПЦР, путем мониторинга результатов реакции в режиме реального времени согласно амплификации нуклеиновой кислоты (комбинированной с флуоресцентным материалом) внутри вышеупомянутого реакционного канала (303), можно измерить и проанализировать количество целевой нуклеиновой кислоты в режиме реального времени.
На фиг. 22-25 показан реакционный блок (900) ПЦР другого типа, находящийся в тепловом контакте с нагревательным блоком ПЦР, показанного на фиг. 12-16.
реакционные блоки (900) ПЦР, в соответствии с фиг. 22-25, повторяющимся образом размещаются на расстоянии друг от друга в продольном направлении вышеуказанного реакционного канала через его нижнюю поверхность, но поскольку они снабжены электродами определения, выполненными так, чтобы определивать электрохимические сигналы, вызванные амплифицированной нуклеиновой кислотой и сочетанием активных веществ внутри вышеуказанного реакционного канала, вышеупомянутый электрод определения может выполняться так, чтобы располагаться между группой из двух или более вышеуказанных нагревателей, при тепловом контакте с вышеуказанным нагревательным блоком. Вышеупомянутые реакционные блоки (900) ПЦР выполняются в форме пластины, и располагаются в одном или более вышеупомянутых реакционных каналах (921), на обоих концах которого выполняются выход (931) и выход (932), а также повторяющимся образом располагаются на расстоянии друг от друга в продольном направлении вышеуказанного реакционного канала (921) через его нижнюю поверхность, но поскольку они снабжены электродами (950) определения, выполненными так, чтобы определять электрохимические сигналы, вызванные амплифицированной нуклеиновой кислотой и сочетанием активных веществ внутри вышеуказанного реакционного канала (921), вышеуказанный электрод (950) определения может выполняться так, чтобы располагаться между группой из двух или более вышеуказанных нагревателей (110,20, 130), при тепловом контакте с вышеуказанным нагревательным блоком (100) ПЦР. Вышеупомянутый реакционный блок (900) ПЦР может вместить раствор, содержащий нуклеиновую кислоту, например, матричную двухцепочечную ДНК, являющуюся пробой ПЦР, олигонуклеотидный праймер, являющийся реагентом ПЦР и имеющий определенную нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности, подлежащей амплификации, ДНК-полимеразу, дезоксирибонуклеотид-трифосфаты (dNTP), реакционный буфер ПЦР. Вышеупомянутый реакционный блок (900) ПЦР имеет вход (931) для введения вышеуказанных проб и реагентов, выход (932) для выпуска раствора, завершившего реакцию амплификации нуклеиновой кислоты, а также реакционного канала (921), в котором выполняется реакция амплификации нуклеиновой кислоты вышеуказанных проб и реагентов. Как показано на фиг. 22, вышеупомянутый реакционный канал (921) может располагаться вдоль, чтобы проходить часть, соответствующую верхней стороне вышеуказанного 1-го нагревателя, и часть, соответствующую верхней стороне вышеуказанного 2-го нагревателя, в продольном направлении. Вышеупомянутый реакционный блок (900) ПЦР обеспечивается теплом от вышеуказанного нагревательного блока (100), а пробы и реагенты ПЦР, содержащиеся в реакционном канале (921) вышеупомянутого реакционного блока (900) ПЦР, могут нагреваться и поддерживаться. Кроме того, вышеупомянутый реакционный блок (900) ПЦР выполняется полностью в форме пластины, чтобы можно было повысить коэффициент теплопроводности, а также иметь два или более реакционного канала (921). Кроме того, вышеупомянутый реакционный блок (900) ПЦР может быть выполнена из прозрачного или непрозрачного пластичного материала, и благодаря свойствам пластичного материала, можно легко регулировать толщину и повысить эффективность теплопередачи только за счет регулирования толщины, производственный процесс может быть упрощен и можно сократить производственные затраты.
16
18
3
2
16
18
3
С другой стороны, вышеуказанное активное вещество (окислительно-восстановительный индикатор) определяется как вещество, которое вызывает электрохимический сигнал, химически реагируя (соединяясь) с амплифицированной нуклеиновой кислотой, а вышеупомянутый электрохимический сигнал представляет собой сигнал, который может непрерывно определяться и измеряться, в соответствии с непрерывной амплификацией нуклеиновой кислоты. Например, в случае двухцепочечной нуклеиновой кислоты (ДНК), она полностью заряжена отрицательно, а в случае если активное вещество заряжено положительно, в соответствии с непрерывной амплификацией нуклеиновой кислоты, вышеупомянутое активное вещество реагирует с амплифицированной нуклеиновой кислотой, и может быть получен сигнал, который можно определить по изменению общего заряда. Таким образом, электрохимический сигнал, упомянутый выше, может возникать вследствие изменения общего значения тока, связанного с комбинацией отрицательного заряда вышеуказанной амплифицированной нуклеиновой кислоты и положительным зарядом вышеуказанного активного вещества, а вышеуказанное активное вещество может быть катионным веществом среди результатов ионизации вещества, имеющего ионную связь. Если говорить более конкретно, вышеупомянутое вещество, имеющее ионную связь, представляет собой метиленовый синий, а вышеупомянутое активное вещество может быть катионным веществом из результатов ионизации метиленового синего. Если растворить вышеупомянутый метиленовый синий (CHNSCl·3HO) в растворителе, он ионизируется и произойдет ионизация в CHNS+ и Cl-, в первом случае происходит положительный заряд с помощью атома серы (S). Двухцепочечная нуклеиновая кислота (ДНК) состоит из сахара, основы и фосфорной кислоты, из них фосфорная кислота имеет отрицательный заряд, поэтому двухцепочечная нуклеиновая кислота (ДНК) в общем имеет отрицательный заряд. Катионы метиленового синего соединяются с фосфатными группами ДНК, поэтому уменьшается скорость диффузии внешнего вида метиленового синего, соединенного с двухпочечной нуклеиновой кислотой, по сравнению со скоростью диффузии внешнего вида метиленового синего, в соответствии с чем, снижается пиковое значение тока. Таким образом, в соответствии с протеканием цикла ПЦР, двухцепочечная нуклеиновая кислота (ДНК) амплифицируется, увеличивается количество метиленового синего, соединенного с двухпочечной нуклеиновой кислотой (ДНК), а пиковое значение тока снижается, в конечном счете, возможна количественная амплифицированная нуклеиновая кислота в реальном времени, благодаря электрическому сигналу, вызванного химическим соединением амплифицированного результата ПЦР и метиленового синего.
Вышеописанный электрод (950) определения может быть выполнен из различного материала для возможности определения электрохимических сигналов, происходящих в связи с соединением амплифицированной нуклеиновой кислоты и активного вещества внутри одного или более вышеупомянутых реакционных каналов (921), например, может быть выбран из группы, состоящей из золота (Au), кобальта (Co), платины (Pt), серебра (Ag), углеродной нанотрубки, графена и углерода. Вышеупомянутые электроды (950) определения повторяющимся образом располагаются на расстоянии друг от друга в продольном направлении реакционного канала (921), через его нижнюю часть, но электрод (950) определения выполняется так, чтобы располагаться между двумя или более группами нагревателей (110, 120, 130) при тепловом контакте с вышеупомянутым нагревательным блоком (100). Как показано на фиг. 22, вышеупомянутые электроды (950) определения повторяющимся образом располагаются на расстоянии друг от друга с равными интервалами в области реакционного канала (921) от вышеупомянутого входа (931) до выхода (932); они могут повторяющимся образом определять электрохимический сигнал, последовательно исходящий от амплифицированной нуклеиновой кислоты, благодаря подобной структуре, проходя через реакционный канал (921) в продольном направлении. К тому же, как показано на фиг. 23, можно проверить расположение вышеупомянутого электрода (950) определения на нижней стороне вышеуказанного реакционного канала (921). С другой стороны, как показано на фиг. 23, вышеупомянутый реакционный блок (900) ПЦР может быть разделен на 3 слоя относительно вертикального сечения. Вышеупомянутый реакционный блок (900) ПЦР может содержать 1-ю пластину (910), оснащенную вышеуказанным электродом (950) определения; 2-ю пластину, которая хотя располагается на вышеупомянутой 1-й пластине (910), но оснащена вышеупомянутым одним или более реакционными каналами (921); и 3-ю пластину (930), которая хотя располагается на 2-й пластине (920), но оснащена вышеупомянутым входом (931) и выходом (932).
Верхняя сторона 1-й пластины (910), снабженная вышеупомянутым электродом (950) определения прикрепляется и располагается на вышеуказанной нижней стороне 2-й пластины (920). Поскольку вышеуказанная 1-я пластина (910) прикрепляется и располагается на 2-й пластине (920), имеющей вышеупомянутый реакционный канал (921), обеспечивается пространство для вышеупомянутого реакционного канала (921), а кроме того на вышеупомянутом реакционном канале (921) располагается вышеуказанный электрод (950) определения, по крайней мере, на одной области (поверхности) реакционного канала (921). С другой стороны, вышеупомянутая 1-я пластина (910) может быть выполнена из различного материала, но, предпочтительно, чтобы это мог быть материал, выбираемый из групп, состоящих из полидиметилсилоксана (PDMS), циклоолефинового сополимера (COC), полиметилметакрилата (PMMA), поликарбоната (PC), пропилен-карбоната (PPC), полиэфирсульфона (PES), полиэтилентерефталата (PET), и их соединений. Кроме того, верхняя сторона вышеуказанной 1-й пластины (910) обрабатывается гидрофильным веществом (не показано), которая выполняется для возможности беспрепятственного выполнения ПЦР. Согласно обработке вышеуказанного гидрофильного вещества, может быть образован один слой, содержащий гидрофильное вещество в вышеуказанной 1-й пластине (910). Вышеуказанное гидрофильное вещество может быть различным материалом, но предпочтительно, чтобы он был выбран из группы, состоящей из карбоксильной группы (-COOH), аминогруппы (-NH2), гидроксильной группы (-OH), и сульфоновой группы (-SH); вышеуказанная обработка гидрофильного вещества может выполняться в соответствии со способами, известными в технике.
Вышеупомянутая верхняя сторона вышеуказанной 2-й пластины (920) прикрепляется и располагается вместе на вышеуказанной нижней стороне 3-й пластины (930). Вышеуказанная 2-я пластина (920) содержит вышеупомянутый реакционный канал (921). Вышеуказанный реакционный канал (921) подсоединяется к части, подходящей входу (931) и выходу (932), образованными в вышеупомянутой 3-й пластине (910), и завершает реакционный канал (921), оснащенный входом (931) и выходом (932) на обоих концах. Следовательно, ПЦР выполняется после введения пробы и реагента ПЦР в вышеупомянутый реакционный канал (921). Кроме того, вышеуказанный реакционный канал (921) может существовать в количестве два или более, в соответствии с целью и диапазоном использования. Кроме того, вышеуказанная 2-я пластина (920) может выполняться из различного материала, но, предпочтительно, чтобы это могла быть термопластичная смола или термореактивная смола, выбираемая из групп, состоящих из полиметилметакрилата (PMMA), поликарбоната (PC), циклоолефинового сополимера (COC), полиамида (PA), полиэтилена (PE), полипропилена (PP), полифениленового эфира (PPE), полистирола (PS), полиоксиметилена (POM), полиэфирэфиркетона (PEEK), политетрафторэтилена (PTFE), поливинилхлорида (PVC), поливинилиденфторида (PVDF), полибутилентерефталата (PBT), фторированного этиленпропилена (FEP), перфторалкокси алканов (PFA), и их комбинаций. Кроме того, толщина вышеуказанной 2-й пластины (920) может быть различной, но может выбираться из 10 мкм - 2000 мкм. Кроме того, ширина и длина вышеуказанного реакционного канала (921) может быть различной, но, предпочтительно, чтобы ширина вышеуказанного реакционного канала (921) выбиралась из 0,001 мм - 10 мм, а длина вышеуказанного реакционного канала (921) могла выбираться из 1 мм - 400 мм. Кроме того, внутренняя стенка вышеуказанной 2-й пластины (920) может быть покрыта веществом из силанового ряда, альбумина бычьей сыворотки (BSA) и т.п. для предотвращения поглощения ДНК, белка, а вышеуказанная обработка материала может выполняться в соответствии со способами, известными в технике.
Вышеупомянутая нижняя сторона 3-й пластины (930) располагается на верхней стороне 2-й пластины (920). Вышеупомянутая 3-я пластина (930) оснащена входом (931), образованным в одной области и выходом (932), образованным в другой области, в реакционном канале (921), образованными на вышеуказанной 2-й пластине (920). Вышеуказанный вход (931) представляет собой часть, в который вводится проба и реагент ПЦР. Вышеуказанный выход (932) представляет собой часть, которая выпускает результаты ПЦР после завершения ПЦР. Соответственно, вышеуказанная 3-я пластина (930) покрывает реакционный канал (921), образованный на вышеуказанной 2-й пластине (920), но вышеупомянутый вход (931) и выход (932) выполняют роль входа и выхода вышеуказанного реакционного канала (921). Кроме того, вышеупомянутая 3-я пластина (930) может быть выполнена из различного материала, но, предпочтительно, чтобы это мог быть материал, выбираемый из групп, состоящих из полидиметилсилоксана (PDMS), циклоолефинового сополимера (COC), полиметилметакрилата (PMMA), поликарбоната (PC), пропилен-карбоната (PPC), полиэфирсульфона (PES), полиэтилентерефталата (PET), и их соединений. Кроме того, вход (931) может иметь различные размеры, но, предпочтительно, чтобы диаметр мог быть выбран из диапазона 1,0 мм - 3,0 мм. Кроме того, выход (932) может иметь различные размеры, но, предпочтительно, чтобы диаметр мог быть выбран из диапазона 1,0 мм - 1,5 мм. Кроме того, вышеупомянутый вход (931) и выход (932) оснащен отдельным средством покрытия (не показано), и может предотвратить утечку раствора во время протекания ПЦР относительно проб и реагентов внутри вышеупомянутого реакционного канала (921). Вышеуказанное средство покрытия может быть выполнено в различной форме, по различным размерам или из различного материала. Кроме того, толщина вышеупомянутой 3-й пластины может быть различной, но, предпочтительно, чтобы она могла быть выбрана из 0,1 мм – 2,0 мм. Кроме того, количество вышеуказанных входов (931) и выходов (932) может быть два или более.
С другой стороны, вышеуказанный реакционный блок (900) ПЦР может быть легко изготовлен методом, включающему в себя этап обеспечения вышеуказанной 3-й пластины (930), путем образования вышеуказанного входа (931) и вышеуказанного выхода (932) посредством механической обработки; этап обеспечения 2-й пластины (920), путем образования реакционного канала (921) посредством механической обработки, начиная от части, подходящей ко входу (931) вышеуказанной 3-й пластины (930) в плите, имеющей размеры, совпадающие с нижней стороной вышеуказанной 3-й пластины (930), вплоть до части, подходящей к выходу (932) вышеуказанной 3-й пластины (930); этап обеспечения 1-й пластины (910), путем формирования поверхности, выполненной из гидрофильного вещества (922) посредством поверхностной обработки на верхней стороне плиты, имеющей размеры, совпадающие с нижней стороной вышеуказанной 2-й пластины (920); этап соединения, посредством процесса соединения нижней стороны вышеуказанной 3-й пластины (930) к верхней стороне вышеуказанной 2-й пластины (920) и этапа соединения посредством процесса соединения нижней стороны вышеуказанной 2-й пластины (920) к верхней стороне вышеуказанной 1-й пластины (910). Вышеуказанный вход (931) и выход (932) 3-й пластины (930) и вышеуказанный реакционный канал (921) 2-й пластины (920) могут быть изготовлены методом обработки, выбираемом из группы, состоящей из литья под давлением, горячего теснения, разливки и лазерной абляции. Кроме того, вышеуказанное гидрофильное вещество (922) поверхности 1-й пластины (910) может быть обработано методом, выбираемым из группы, состоящей из кислородной обработки и обработки аргоновой плазмой, обработки коронным разрядом и покрытием поверхностно-активным веществом, а также может выполняться, в соответствии с методами, известными в технике. Кроме того, нижняя сторона вышеуказанной 3-й пластины (930) и верхняя сторона вышеуказанной 2-й пластины (920), нижняя сторона 2-й пластины (920) и верхняя сторона вышеуказанной 1-й пластины (910) могут быть соединены с помощью процесса термического соединения, ультразвуковой сварки, соединения растворителем, сварки нагретой пластиной, соединения ультрафиолетовыми лучами, и соединения под давлением, а также могут быть выполнены в соответствии с методами, известными в технике. Между вышеуказанной 3-й пластиной (930) и 2-й пластиной (920), а также между вышеуказанной 2-й пластиной (920) и 1-й пластиной (910) может быть проведена обработка с обеих сторон клеящим веществом или термопластичной смолой, или термореактивной смолой (500).
С другой стороны, как показано на рисунках24-25, на которых увеличена часть “а” фиг. 22, вышеупомянутые электроды (950) определения могут быть выполнены по-разному. Например, как показано на фиг. 24, может выполняться 2-электродным модулем, оснащенным рабочим электродом (950a), в котором происходит соединение вышеупомянутой амплифицированной нуклеиновой кислоты и активного вещества, и электродом (950b) сравнения, который является стандартом измерения потенциала электрода, поскольку соединения вышеупомянутой амплифицированной нуклеиновой кислоты и активного вещества не происходит; кроме того, как показано на фиг. 25, может выполняться 3-электродным модулем, оснащенным вышеуказанным рабочим электродом (950a), вышеупомянутым электродом (950b) сравнения, а также противоэлектродом (950c), по которому проходит ток, возникающий от рабочего электрода. Как указано выше, если структура вышеупомянутого электрода (950) определения выполняется в форме многоэлектродного модуля, как показано выше, можно будет не только повысить чувствительность электрохимического сигнала, возникающего внутри вышеупомянутого реакционного канала (921), но и легко выполнить определение и измерение возникающего сигнала.
На фиг. 26 показан нагревательный блок (100) ПЦР, в котором повторяющимся образом располагаются нагреватели, использующие компенсирующий контур, соответствующий варианту осуществления №1 настоящего изобретения, а также ПЦР, выполняемая с помощью устройства ПЦР, снабженного реакционным блоком (900) ПЦР, показанным на фиг. 22-26.
Как показано на фиг. 26, вышеупомянутый реакционный блок (900) ПЦР располагается в нагревательном блоке (100) ПЦР, а вышеуказанный электрод (950) определения повторяющимся образом располагается между 1-м и 2-м нагревателем, повторяющимся образом расположенным на верхней поверхности вышеупомянутого нагревательного блока (100) ПЦР. Относительно вышеуказанного реакционного блока ПЦР и компонентов, содержащихся в ней, описано выше.
Вышеуказанный источник (400) питания является модулем для подачи питания в блок (200) питания, поэтому 1-й (210) и 2-й (220) провод может быть подсоединен к вышеуказанному блоку (200) питания. Например, 1-й порт питания (не показан) вышеуказанного источника (400) питания при выполнении ПЦР электрически соединяется с вышеуказанным 1-м проводом (210), а 2-й порт питания (не показан) вышеуказанного источника (400) питания электрически соединяется с вышеуказанным 2-м проводом (220). В дальнейшем, в случае наличия у пользователя указаний для выполнения ПЦР, вышеуказанный источник (400) питания подает питание в каждый из вышеуказанных проводов: 1-й провод (210) и 2-й провод (220) и может быстро нагреть 1-й и 2-й нагреватель в вышеуказанном нагревательном блоке (100) ПЦР, и когда каждый нагреватель достигнет заранее заданной температуры, источник питания контролирует объем энергии и сохраняет вышеуказанную заданную температуру. Например, вышеуказанная заданная температура в вышеупомянутом 1-м нагревателе может быть температурой этапа денатурации ПЦР (85°С-105°С, предпочтительно, 95°С) и во 2-м нагревателе может быть температурой этапа отжига/элонгации ПЦР (50°С-80°С, предпочтительно, 72°С), либо в 1-м нагревателе это может быть температура этапа отжига/элонгации ПЦР (50°С-80°С, предпочтительно, 72°С) и во 2-м нагревателе - температура этапа денатурации ПЦР (85°С-105°С, предпочтительно, 95°С).
Вышеуказанный насос (500) представляет собой модуль для контроля объема и скорости текучей среды, протекающей внутри одного или более реакционных каналов (921) вышеуказанного нагревательного блока (900) ПЦР, поэтому это может быть насос с положительным давлением и насос с отрицательным давлением, например, это может быть шприцевой насос. Вышеуказанный насос (500) может быть расположен с возможностью приведения в действие в одной части вышеуказанного реакционного канала (921), но, предпочтительно, чтобы он был расположен для подключения на входе (931) и/или выходе (932), образованных на обоих концах вышеуказанного реакционного канала (921). В случае расположения и подключения вышеупомянутого насоса (500) на вышеуказанном входе (931) и/или выходе (932), выполняет не только роль насоса, но также может выполнять роль ограничителя, который предотвращает утечку раствора проб и реагента через вышеуказанный вход (931) и/или выход (932). Кроме того, в случае контроля текучей среды, протекающей внутри вышеуказанного реакционного канала (921), т.е. объема и скорости раствора пробы и реагента в одном направлении, вышеупомянутый насос (500) располагается и подключается только к чему-нибудь одному из вышеуказанного входа (931) и вышеуказанного выхода (932), а к оставшемуся может быть герметично подключен обычный ограничитель; в случае контроля текучей среды, протекающей внутри вышеуказанного реакционного канала (921), т.е. объема и скорости раствора пробы и реагента в обоих направлениях, вышеуказанный насос (500) может располагаться, подключаясь к обоим: вышеупомянутому входу (931) и вышеупомянутому выходу (932).
Реакция амплификации нуклеиновой кислоты раствора ПЦР внутри устройства ПЦР в режиме реального времени, является вариантом осуществления №1, поэтому может выполняться с помощью следующих этапов.
1. Подготовьте раствор ПЦР, включающий в себя желаемую двухцепочечную целевую ДНК, олигонуклеотидный праймер, имеющий определенную нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности, подлежащей амплификации, ДНК-полимеразу, дезоксирибонуклеотид-трифосфаты (dNTP), реакционный буфер ПЦР.
2. Введите вышеуказанный раствор ПЦР в реакционный блок (900) ПЦР. В этом случае, вышеуказанный раствор ПЦР располагается в реакционном канале (921) внутри реакционного блока (900) ПЦР через вышеуказанный вход (931).
3. Подсоедините вышеуказанный блок (200) питания, в частности, каждый из проводов: 1-й провод (210) и 2-й провод (220) к вышеуказанному источнику (400) питания, а вышеуказанный вход (931) и выход (932) реакционного блока (900) ПЦР герметично подключите к насосу (500).
4. Нагрейте вышеуказанный 1-й и 2-й нагреватель с помощью 1-го провода (210) и 2-го провода (220), направив подачу питания в вышеуказанный источник (400) питания, и поддерживайте определенную температуру, например, в случае 1-го нагревателя, температуру этапа денатурации ПЦР (95°С), и в случае 2-го нагревателя, температуру этапа отжига/элонгации ПЦР (72°С).
5. При обеспечении положительного давления по насосу (500), подключенному к вышеуказанному входу (931) либо при обеспечении отрицательного давления по насосу (500), подключенному к вышеуказанному выходу (932), направьте поток вышеупомянутого целевого раствора образца в горизонтальном направлении внутри вышеуказанного реакционного канала (921). В этом случае, вышеуказанный объем и скорость раствора пробы и реагента может контролироваться путем регулирования силы положительного или отрицательного давления, обеспечиваемого за счет вышеуказанного насоса (500).
Путем выполнения вышеописанных этапов, вышеупомянутый раствор ПЦР, перемещаясь в продольном направлении, в части, соответствующей верхней стороне вышеупомянутого 1-го нагревателя и части, соответствующей верхней стороне вышеупомянутого 2-го нагревателя от конца входа (931) до конца выхода (932) вышеуказанного реакционного канала (921), выполняет ПЦР. Как показано на фиг. 26, вышеупомянутый раствор ПЦР получает тепло от нагревательного блока (100), в котором повторяющимся образом расположен 10-фазный блок нагревателя, включающий в себя вышеупомянутый 1-й и 2-й нагреватель, и, проходя через этап денатурации ПЦР в части, соответствующей верхней стороне 1-го нагревателя и этап отжига/элонгации ПЦР в части, соответствующей верхней стороне 2-го нагревателя, завершает цикл 10-фазного ПЦР. В дальнейшем, по желанию, вышеупомянутый раствор ПЦР, перемещаясь обратно в продольном направлении, в части, соответствующей верхней стороне вышеупомянутого 1-го нагревателя и части, соответствующей верхней стороне вышеупомянутого 2-го нагревателя от конца выхода (931) до конца входа (932) вышеуказанного реакционного канала (921), может повторяющимся образом выполнить ПЦР.
На фиг. 27 показана электрохимическая ПЦР в реальном времени, выполняемая посредством устройства ПЦР, оснащенного нагревательным блоком (100) ПЦР, в котором повторяющимся образом расположены нагреватели, использующие компенсирующий контур, соответствующий варианту осуществления №1 настоящего изобретения, реакционный блок (900) ПЦР, показанный на фиг. 22-25, электроды (950) определения и модуль (800) измерения сигнала.
Как показано на фиг. 27, устройство ПЦР, соответствующее варианту осуществления №1 настоящего изобретения, включает в себя нагревательный блок (100) ПЦР, в котором в горизонтальном направлении повторяющимся образом расположены 1-й нагреватель (110) и 2-й нагреватель (120); реакционный блок (900) ПЦР, в котором повторяющимся образом расположены так, чтобы подходили электроды (950) определения в пространстве между вышеупомянутым 1-м нагревателем (110) и 2-м нагревателем (120); модуль измерения электрохимического сигнала, который выполняется для измерения в реальном времени электрохимического сигнала, происходящего внутри реакционного канала (921) вышеуказанного реакционного блока (900) ПЦР и электрически соединяется с портом подключения (не показан) вышеупомянутого держателя чипа (не показан); и прочие элементы - блок питания, насос и т.д., которые не показаны на фигуре. Вышеупомянутый модуль (800) измерения электрохимического сигнала может быть подключен для электрической связи через средство (700) электрического соединения, например, подводящий провод, с портом подключения вышеупомянутого держателя чипа. Таким образом, электрохимический сигнал, повторяющимся образом возникающий вследствие последовательной амплификации нуклеиновой кислоты внутри реакционного канала (921) реакционного блока (900) ПЦР, последовательно определяется посредством электрода (950) определения вышеуказанного реакционного блока (900) ПЦР, и вышеупомянутый определенный сигнал измеряется в вышеуказанном модуле (800) измерения электрохимического сигнала через порт подключения вышеуказанного держателя чипа и вышеупомянутого средства электрического соединения, а также может быть обработан или проанализирован. Вышеупомянутый модуль (800) измерения электрохимического сигнала может быть разным, но также может быть выбран из групп, состоящих из вольтамперометрии анодного снятия покрытия (ASV), хроноамперометрии (CA), циклической вольтамперометрии, квадратно-волновой вольтамперометрии (SWV), дифференциальной импульсной вольтамперометрии (DPV) и импеданса. Таким образом, в соответствии с устройством ПЦР в реальном времени, соответствующим варианту осуществления №1 настоящего изобретения, во время выполнения ПЦР, можно осуществить измерение и анализ процесса амплификации нуклеиновой кислоты в реальном времени. В этом случае, вышеупомянутый раствор ПЦР не требует добавления отдельного флуоресцентного материала, в отличие от оптического устройства ПЦР в реальном времени. К тому же, реакция амплификации нуклеиновой кислоты согласно устройству ПЦР в реальном времени, соответствующему варианту осуществления №1 настоящего изобретения, может проверить этап измерения в режиме реального времени. Например, раствор ПЦР, непрерывно проходя часть (301), соответствующую верхней стороне вышеупомянутого 1-го нагревателя (110) и часть (302), соответствующую верхней стороне вышеупомянутого 2-го нагревателя (302), внутри вышеупомянутого реакционного канала (921), выполняет этап денатурации ПЦР и этап отжига/элонгации ПЦР; в этом случае, раствор ПЦР проходит область вышеупомянутого электрода (950) определения, повторяющимся образом расположенного между вышеуказанным 1-м (110) и 2-м (120) нагревателем, а также между нагревательными блоками, содержащие вышеуказанный 1-й (110) и 2-й (120) нагреватель. При прохождении раствора ПЦР через вышеупомянутую часть, соответствующую верхней стороне электрода (950) определения, благодаря контролю текучей среды, скорость вышеупомянутого раствора ПЦР замедляется или некоторое время сохраняется в приостановленном состоянии, а затем через электрод (950) определения можно последовательно определить и измерить в режиме реального времени электрохимический сигнал, возникающий в связи с соединением амплифицированной нуклеиновой кислоты и активного вещества. Таким образом, в течение протекания каждого цикла ПЦР, можно определять и измерять количество целевой нуклеиновой кислоты в режиме реального времени, путем мониторинга в реальном времени результатов реакции на основе амплификации нуклеиновой кислоты внутри вышеуказанного реакционного канала (921) (без флуоресцентного материала и системы определения света).
На фиг. 28 показан реакционный блок (900) ПЦР другого типа, а также находящаяся в тепловом контакте с нагревательным блоком ПЦР, изображенным на фиг. 12-16,
Реакционный блок (900) ПЦР, соответствующий фиг. 28-31, повторяющимся образом располагается на расстоянии друг от друга в продольном направлении вышеуказанного реакционного канала, через ее поперечное сечение, но оснащен слоем иммобилизации, с поверхностно обработанным зондом захвата, который может быть комплементарно соединен с одной областью целевой амплифицированной нуклеиновой кислоты, путем образования в одной зоне внутри вышеуказанного реакционного канала, а также электродом определения, выполненным, чтобы определять электрохимический сигнал, путем образования в другой области внутри вышеуказанного реакционного канала, поэтому содержит композитный материал (комплекс), имеющее металлические наночастицы и сигнальный зонд, который хотя и не соединен с металлическими наночастицами, но может быть комплементарно соединен с другой областью вышеупомянутой целевой амплифицированной нуклеиновой кислотой.
вышеупомянутый реакционный блок (900) ПЦР располагается в верхней части теплового (100) ПЦР, поэтому в нем располагается один или более реакционных каналов (921), с выполненными на обоих концах входом (931) и выходом (932), и повторяющимся образом располагаются на расстоянии друг от друга в продольном направлении вышеуказанного реакционного канала, через ее поперечное сечение, но оснащена слоем (940) иммобилизации, с поверхностно обработанным зондом захвата, который может быть комплементарно соединен с одной областью целевой амплифицированной нуклеиновой кислоты, путем образования в одной зоне внутри вышеуказанного реакционного канала (921), а также электродом (950) определения, выполненным, чтобы определять электрохимический сигнал, путем образования в другой области внутри вышеуказанного реакционного канала (921).
3+
Вышеуказанный реакционный канал (921) является пространством, в котором выполняется ПЦР с помощью раствора, поэтому он образовывается внутри вышеупомянутого реакционного блока (900) ПЦР. Вышеуказанный реакционный канал (921) может быть выполнен в различной форме и структуре: в форме пустого цилиндра, форме бруска, форме квадратной колонны и т.д. Вышеупомянутый реакционный канал (921) оснащен слоем (940) иммобилизации, с поверхностно обработанным зондом захвата, который может быть комплементарно соединен с одной областью целевой амплифицированной нуклеиновой кислоты, хотя и расположенным в одной области внутри него, и электродом (950) определения, выполненным так, чтобы определять электрохимический сигнал, хотя и расположенным в другой области внутри него; вышеупомянутый слой (940) иммобилизации и вышеупомянутый электрод (950) определения может быть расположен в различных местах внутри вышеуказанного реакционного канала (921), но, как показано на фиг. 29, предпочтительно расположение таким образом, чтобы они находились лицом друг к другу сверху и снизу или слева и справа. Кроме того, вышеупомянутый реакционный канал (921) вмещает композитный материал (комплекс), имеющее внутри него металлические наночастицы и сигнальный зонд, которые хотя и соединяются с вышеуказанными наночастицами, но могут комплементарно соединяться с другой областью вышеупомянутой целевой амплифицированной нуклеиновой кислотой. В этом случае, вышеуказанное композитный материал (комплекс) может быть заранее помещен в вышеупомянутый реакционный канал (921) до введения пробы ПЦР, содержащей матричную нуклеиновую кислоту и т.п., а также вместе может введен в вышеуказанный реакционный канал (23) в состоянии, содержания в реагент ПЦР, включающем в себя праймер, полимеразы и т.п. Вышеупомянутый слой (940) иммобилизации выполняется из различного материала, например, силикона, пластика, стекла, металла и т.п., чтобы на его одном слое мог осаждаться и подвергаться воздействию зонд захвата. В этом случае, поверхность вышеуказанного слоя (940) иммобилизации, например, может сначала пройти поверхностную обработку веществ, подобных аминам NH, альдегидам COH, карбоксильной группе COOH, до осаждения зонда захвата. Вышеупомянутый зонд захвата выполняется так, чтобы он мог комплементарно соединиться с одной зоной (областью) целевой амплифицированной нуклеиновой кислоты, а также соединившись с наночастицами, образует композитный материал (комплекс). Вышеуказанные наночастицы могут быть различными, но могут быть выбраны в количестве одного или более из группы, состоящей из цинка (Zn), кадмия (Cd), свинца (Pb), меди (Cu), галлия (Ga), индия (In), золота (Au), хрома (Cr), марганца (Mn), железа (Fe), кобальта (Co), никеля (Ni), цезия (Cs), бария (Ba), кадмия (Cd), ртути (Hg), мышьяка (As), селена (Se), олова (Sn), сурьмы (Sb), висмута (Bi) и серебра (Ag). Вышеуказанный сигнальный зонд выполняется так, чтобы он мог комплементарно соединяться с одной областью вышеуказанной целевой амплифицированной нуклеиновой кислоты; в этом случае, в вышеупомянутой целевой амплифицированной нуклеиновой кислоте область комплементарного соединения сигнального зонда отличается от области комплементарного соединения зонда захвата. Таким образом, вышеупомянутый зонд захвата и сигнальный зонд могут комплементарно соединяться вместе с целевой амплифицированной нуклеиновой кислоте. То есть, если целевая нуклеиновая кислота амплифицируется внутри вышеупомянутого реакционного канала (921) при протекании ПЦР, целевая амплифицированная нуклеиновая кислота комплементарно соединяется с зондом захвата, прошедшим поверхностную обработку в вышеуказанном слое (940) иммобилизации, к тому же, комплементарно соединяясь с сигнальным зондом, соединенным с металлическими наночастицами, концентрирует вышеупомянутые металлические наночастицы в области, близкой к слою (940) иммобилизации. В результате, вышеуказанные металлические наночастицы не могут достигнуть вышеупомянутого электрода (26) определения, вызывая изменения тока (уменьшение) между металлическими наночастицами и электродами (26) определения, создавая электрохимические сигналы, которые могут быть определены, в соответствии с амплификацией целевой нуклеиновой кислоты. С другой стороны, вышеописанные целевая амплифицированная нуклеиновая кислота, зонд захвата и сигнальный зонд может быть одноцепочечной ДНК.
Вышеупомянутый электрод (950) определения располагается, по крайней мере, в одной области реакционного канала (921), но выполнен так, чтобы определять электрохимический сигнал, возникающий внутри реакционного канала (921). Вышеупомянутый электрод (950) определения может быть выполнен из различного материала для осуществления вышеописанных функций, но может быть выбран из одного или более группы, состоящей, например, из золота (Au), кобальта (Co), платины (Pt), серебра (Ag), углеродной нанотрубки, графена, и углерода. Кроме того, вышеуказанный электрод (950) определения может быть выполнен в различной форме и структуре, для эффективного определения электрохимического сигнала, возникающего внутри реакционного канала (921), но, например, как показано на фиг. 28, может быть выполнен в форме пластины из металлического материала, расположенного в соответствии с внутренней поверхностью вышеуказанного реакционного канала (921). С другой стороны, вышеупомянутый электрохимический сигнал измеряется модулем измерения электрохимического сигнала, описанного далее; вышеупомянутый модуль измерения электрохимического сигнала может быть различным, но может быть выбран из группы, состоящей из вольтамперометрии анодного снятия покрытия (ASV), хроноамперометрии (CA), циклической вольтамперометрии, квадратно-волновой вольтамперометрии (SWV), дифференциальной импульсной вольтамперометрии (DPV), и импеданса. Вышеупомянутый электрохимический сигнал может быть вызван изменением тока, возникающего в соответствии с комплементарным соединением вышеуказанной целевой амплификационной нуклеиновой кислоты с вышеуказанным зондом захвата и сигнальным зондом. Процесс возникновения электрохимического сигнала устройства ПЦР, соответствующего варианту осуществления №1 настоящего изобретения, показан далее. 1-й этап является этапом до начала ПЦР, поэтому включает в себя исходное состояние композитного материала (сигнальный зонд - металлические наночастицы), содержащий в слое иммобилизации поверхностно обработанный зонд захвата и сигнальный зонд с металлическими наночастицами; 2-й этап включает в себя редукцию между вышеупомянутыми рабочими электродами и металлическими наночастицами, или изменение тока (сигнала), вызванного окислением; 3-й этап является этапом после начала ПЦР, поэтому включает в себя этап, вызывающий уменьшение изменения тока (ухудшение сигнала), после соединения вышеуказанного зонда захвата и сигнального зонда вышеуказанного композитного материала (сигнальный зонд - металлические наночастицы) с целевой амплифицированной нуклеиновой кислотой (целевой ДНК). В частности, при применении сниженного напряжения в металлических наночастицах вышеуказанного композитного материала (сигнальный зонд - металлические наночастицы), вышеупомянутые металлические наночастицы, собираясь на поверхности, ближайшей к вышеуказанному рабочему электроду, образует и снижается слой накопления (накопление металлических наночастиц), а впоследствии при приложении напряжения к вышеупомянутому рабочему электроду, вышеуказанные редукционные металлические наночастицы окисляются (срываются), происходит изменение тока, т.е. сигнала, и вышеупомянутое изменение тока может быть легко измерено по значению напряжения, показывающего пик тока окисления. В этом случае, значение изменения тока, т.е. электрохимический сигнал внутри реакционного канала (921) показывает величину изменения целевой нуклеиновой кислоты (целевой ДНК). Кроме того, значение напряжения вышеупомянутых окисленных металлических наночастиц отличается для каждого вида металлических наночастиц, поэтому, в случае использования две или более металлических наночастиц, также возможно одновременное определение сигнала двух или более проб. А затем, при протекании ПЦР, целевая нуклеиновая кислота (целевая ДНК), амплифициируется от матричной нуклеиновой кислоты, а путем комплементарного соединения (гибридизированная целевая ДНК) вышеупомянутой целевой амплификационной нуклеиновой кислоты (целевой ДНК) с зондом захвата и сигнальным зондом композитного материала (сигнальный зонд - металлические наночастицы), препятствуется накопление поверхности электрода металлических наночастиц сложных веществ (сигнальный зонд - металлические наночастицы), указанных выше, и снижается значение вышеуказанного тока; кроме того, с процессом выполнения цикла ПЦР, увеличивается количество целевой амплифицированной нуклеиновой кислоты (целевой ДНК), комплементарно соединяется (гибридизированная целевая ДНК) или увеличивается зонд захвата и сигнальный зонд композитного материала (сигнальный зонд - металлические наночастицы), поэтому вышеуказанное значение напряжения (сигнала) еще больше уменьшается. Таким образом, явление снижения тока, как указано выше, т.е. поскольку электрохимический сигнал определяется и измеряется, возможно выполнение ПЦР в режиме реального времени.
Как показано на фиг. 28-29, вышеупомянутый слой (940) иммобилизации и электрод (950) определения повторяющимся образом располагаются на расстоянии друг от друга в продольном направлении реакционного канала (921) через ее поперечное сечение, но, при тепловом контакте с нагревательным блоком (100) ПЦР, слой (940) иммобилизации и электрод (950) определения выполняются так, чтобы они располагались между двумя или более группами нагревателей (110, 120, 130). Как показано на фиг. 28, на котором изображено горизонтальное сечение реакционного блока (900) ПЦР, вышеупомянутый слой (940) иммобилизации и электрод (950) определения повторяющимся образом располагается с равными интервалами в области реакционного канала (921) от вышеуказанного входа (931) до выхода (932), с помощью подобной структуры, проходя в продольном направлении реакционный канал (921), может повторяющимся образом определять электрохимический сигнал от последовательно амплифицированной нуклеиновой кислоты. К тому же, как показано на фиг. 29, на котором можно проверить изображение вертикального сечения реакционного блока (900) ПЦР, где вышеупомянутый слой (940) иммобилизации и электрод (950) определения располагаются лицом друг к другу в поперечном сечении реакционного канала (921), но место вышеупомянутого слоя (940) иммобилизации и электрода (950) определения может изменяться вверх и вниз.
Как показано на фиг. 29, вышеупомянутый реакционный блок (900) ПЦР может быть разделен на 3 слоя по отношению к вертикальному сечению. Вышеупомянутый реакционный блок (900) ПЦР может включать в себя 1-ю пластину (910), оснащенную электродом (950) определения; 2-ю пластину (920), хотя и расположенной на 1-й пластине (910), но оснащенной одним или более реакционными каналами (921); а также 3-ю пластину (930), хотя и расположенную на 2-й пластине, но оснащенную слоем (940) иммобилизации, входом (931) и выходом (932). В этом случае, вышеупомянутый электрод (950) определения располагается на 3-й пластине (930), а также, слой (940) иммобилизации, безусловно, может располагаться на 1-й пластине (910).
Верхняя сторона 1-й пластины (910), снабженная вышеупомянутым электродом (950) определения, прикрепляется и располагается на вышеуказанной нижней стороне 2-й пластины (920). Поскольку вышеуказанная 1-я пластина (910) прикрепляется и располагается на 2-й пластине (920), имеющей вышеупомянутый реакционный канал (921), обеспечивается пространство для вышеупомянутого реакционного канала (921), а кроме того на вышеупомянутом реакционном канале (921) располагается вышеуказанный электрод (950) определения, по крайней мере, на одной области (поверхности) реакционного канала (921). С другой стороны, вышеупомянутая 1-я пластина (910) может быть выполнена из различного материала, но, предпочтительно, чтобы это мог быть материал, выбираемый из групп, состоящих из полидиметилсилоксана (PDMS), циклоолефинового сополимера (COC), полиметилметакрилата (PMMA), поликарбоната (PC), пропилен-карбоната (PPC), полиэфирсульфона (PES), полиэтилентерефталата (PET), и их соединений. Кроме того, верхняя сторона вышеуказанной 1-й пластины (910) обрабатывается гидрофильным веществом (не показано), которая выполняется для возможности беспрепятственного выполнения ПЦР. Согласно обработке вышеуказанного гидрофильного вещества, может быть образован один слой, содержащий гидрофильное вещество в вышеуказанной 1-й пластине (910). Вышеуказанное гидрофильное вещество может быть различным материалом, но предпочтительно, чтобы он был выбран из группы, состоящей из карбоксильной группы (-COOH), аминогруппы (-NH2), гидроксильной группы (-OH), и сульфоновой группы (-SH); вышеуказанная обработка гидрофильного вещества может выполняться в соответствии со способами, известными в технике.
Вышеупомянутая верхняя сторона вышеуказанной 2-й пластины (920) прикрепляется и располагается на вышеуказанной нижней стороне 3-й пластины (930). Вышеуказанная 2-я пластина (920) содержит вышеупомянутый реакционный канал (921). Вышеуказанный реакционный канал (921) подсоединяется к части, подходящей входу (931) и выходу (932), образованными в вышеупомянутой 3-й пластине (910), и завершает один или более реакционных каналов (921), оснащенный входом (931) и выходом (932) на обоих концах. Следовательно, ПЦР выполняется после введения пробы и реагента ПЦР в вышеупомянутый реакционный канал (921). Кроме того, вышеуказанный реакционный канал (921) может существовать в количестве два или более, в соответствии с целью и диапазоном использования устройства ПЦР, соответствующего варианту осуществления №1 настоящего изобретения. Кроме того, вышеуказанная 2-я пластина (920) может выполняться из различного материала, но, предпочтительно, чтобы это могла быть термопластичная смола или термореактивная смола, выбираемая из групп, состоящих из полиметилметакрилата (PMMA), поликарбоната (PC), циклоолефинового сополимера (COC), полиамида (PA), полиэтилена (PE), полипропилена (PP), полифениленового эфира (PPE), полистирола (PS), полиоксиметилена (POM), полиэфирэфиркетона (PEEK), политетрафторэтилена (PTFE), поливинилхлорида (PVC), поливинилиденфторида (PVDF), полибутилентерефталата (PBT), фторированного этиленпропилена (FEP), перфторалкокси алканов (PFA), и их комбинаций. Кроме того, толщина вышеуказанной 2-й пластины (920) может быть различной, но может выбираться из 100 мкм - 200 мкм. Кроме того, ширина и длина вышеуказанного реакционного канала (921) может быть различной, но, предпочтительно, чтобы ширина вышеуказанного реакционного канала (921) выбиралась из 0,001 мм - 10 мм, а длина вышеуказанного реакционного канала (921) могла выбираться из 1 мм - 400 мм. Кроме того, внутренняя стенка вышеуказанной 2-й пластины (920) может быть покрыта веществом из силанового ряда, альбумина бычьей сыворотки (BSA) и т.п. для предотвращения поглощения ДНК, белка, а вышеуказанная обработка материала может выполняться в соответствии со способами, известными в технике.
Вышеупомянутая нижняя сторона 3-й пластины (930) располагается на верхней стороне 2-й пластины (920). Вышеупомянутая 3-я пластина (930) оснащена слоем (940) иммобилизации, входом (931) и выходом (932), образованным в реакционном канале (921), образованными на вышеуказанной 2-й пластине (920). Вышеуказанный вход (931) представляет собой часть, в который вводится проба и реагент ПЦР. Вышеуказанный выход (932) представляет собой часть, которая выпускает результаты ПЦР после завершения ПЦР. Соответственно, вышеуказанная 3-я пластина (930) покрывает реакционный канал (921), образованный на вышеуказанной 2-й пластине (920), но вышеупомянутый вход (931) и выход (932) выполняют роль входа и выхода вышеуказанного реакционного канала (921). Кроме того, вышеупомянутая 3-я пластина (930) может быть выполнена из различного материала, но, предпочтительно, чтобы это мог быть материал, выбираемый из групп, состоящих из полидиметилсилоксана (PDMS), циклоолефинового сополимера (COC), полиметилметакрилата (PMMA), поликарбоната (PC), пропилен-карбоната (PPC), полиэфирсульфона (PES), полиэтилентерефталата (PET), и их соединений. Кроме того, вход (931) может иметь различные размеры, но, предпочтительно, чтобы диаметр мог быть выбран из диапазона 1,0 мм - 3,0 мм. Кроме того, выход (932) может иметь различные размеры, но, предпочтительно, чтобы диаметр мог быть выбран из диапазона 1,0 мм - 1,5 мм. Кроме того, вышеупомянутый вход (931) и выход (932) оснащен отдельным средством покрытия (не показано), и может предотвратить утечку раствора во время протекания ПЦР относительно проб и реагентов ПЦР внутри вышеупомянутого реакционного канала (921). Вышеуказанное средство покрытия может быть выполнено в различной форме, по различным размерам или из различного материала. Кроме того, толщина вышеупомянутой 3-й пластины может быть различной, но, предпочтительно, чтобы она могла быть выбрана из 0,1 мм - 2,0 мм. Кроме того, количество вышеуказанных входов (931) и выходов (932) может быть два или более.
С другой стороны, вышеуказанный реакционный блок (900) ПЦР может быть легко изготовлен методом, включающему в себя этап обеспечения вышеуказанной 3-й пластины (930), путем образования вышеуказанного входа (931) и вышеуказанного выхода (932) посредством механической обработки; этап обеспечения 2-й пластины (920), путем образования реакционного канала (921) посредством механической обработки, начиная от части, подходящей ко входу (931) вышеуказанной 3-й пластины (930) в плите, имеющей размеры, совпадающие с нижней стороной вышеуказанной 3-й пластины (930), вплоть до части, подходящей к выходу (932) вышеуказанной 3-й пластины (930); этап обеспечения 1-й пластины (910), путем формирования поверхности, выполненной из гидрофильного вещества (922) посредством поверхностной обработки на верхней стороне плиты, имеющей размеры, совпадающие с нижней стороной вышеуказанной 2-й пластины (920); этап соединения, посредством процесса соединения нижней стороны вышеуказанной 3-й пластины (930) к верхней стороне вышеуказанной 2-й пластины (920) и этапа соединения посредством процесса соединения нижней стороны вышеуказанной 2-й пластины (920) к верхней стороне вышеуказанной 1-й пластины (910). Вышеуказанный вход (931) и выход (932) 3-й пластины (930) и вышеуказанный реакционный канал (921) 2-й пластины (920) могут быть изготовлены методом обработки, выбираемом из группы, состоящей из литья под давлением, горячего теснения, разливки и лазерной абляции. Кроме того, вышеуказанное гидрофильное вещество (922) поверхности 1-й пластины (910) может быть обработано методом, выбираемым из группы, состоящей из кислородной обработки и обработки аргоновой плазмой, обработки коронным разрядом и покрытием поверхностно-активным веществом, а также может выполняться, в соответствии с методами, известными в технике. Кроме того, нижняя сторона вышеуказанной 3-й пластины (930) и верхняя сторона вышеуказанной 2-й пластины (920), нижняя сторона 2-й пластины (920) и верхняя сторона вышеуказанной 1-й пластины (910) могут быть соединены с помощью процесса термического соединения, ультразвуковой сварки, соединения растворителем, сварки нагретой пластиной, соединения ультрафиолетовыми лучами и соединения под давлением, а также могут быть выполнены в соответствии с методами, известными в технике. Между вышеуказанной 3-й пластиной (930) и 2-й пластиной (920), а также между вышеуказанной 2-й пластиной (920) и 3-й пластиной (910) может быть проведена обработка с обеих сторон клеящим веществом или термопластичной смолой, или термореактивной смолой (500).
С другой стороны, как показано на фиг. 30-31, на которых увеличена часть “а” фиг. 28, вышеупомянутые электроды (950) определения могут быть выполнены по-разному. Например, как показано на фиг. 30, может выполняться 2-электродным модулем, оснащенным рабочим электродом (950a), в котором происходит реакция окисления и редукции, и электродом (950b) сравнения, в котором не происходит реакции окисления и редукции; кроме того, как показано на фиг. 31, может выполняться 3-электродным модулем, оснащенным вышеуказанным рабочим электродом (950a), вышеупомянутым электродом (950b) сравнения, а также противоэлектродом (950c), который регулирует электронный баланс, происходящий из индикаторного электрода. Как указано выше, если структура вышеупомянутого электрода (950) определения выполняется в форме многоэлектродного модуля, как показано выше, можно будет не только повысить чувствительность электрохимического сигнала, возникающего внутри вышеупомянутого реакционного канала (921), но и легко выполнить определение и измерение возникающего сигнала.
На фиг. 32 показан нагревательный блок (100) ПЦР, в котором повторяющимся образом располагаются нагреватели, использующие компенсирующий контур, соответствующий варианту осуществления №1 настоящего изобретения, а также ПЦР, выполняемая с помощью устройства ПЦР, снабженного реакционным блоком (900) ПЦР, показанным на фиг. 28-31.
Как показано на фиг. 32, вышеупомянутый реакционный блок (900) ПЦР располагается в нагревательном блоке (100) ПЦР, в частности, вышеуказанный электрод (950) определения повторяющимся образом располагается между 1-м и 2-м нагревателем, повторяющимся образом расположенным на верхней поверхности вышеупомянутого нагревательного блока (100) ПЦР. Вышеуказанный источник (400) питания является модулем для подачи питания в блок (200) питания, поэтому 1-й (210) и 2-й (220) провод может быть подсоединен к вышеуказанному блоку (200) питания. Например, 1-й порт питания (не показан) вышеуказанного источника (400) питания при выполнении ПЦР электрически соединяется с вышеуказанным 1-м проводом (210), а 2-й порт питания (не показан) вышеуказанного источника (400) питания электрически соединяется с вышеуказанным 2-м проводом (220). В дальнейшем, в случае наличия у пользователя указаний для выполнения ПЦР, вышеуказанный источник (400) питания подает питание в каждый из вышеуказанных проводов: 1-й провод (210) и 2-й провод (220) и может быстро нагреть 1-й и 2-й нагреватель в вышеуказанном нагревательном блоке (100) ПЦР, и когда каждый нагреватель (110, 120) достигнет заранее заданной температуры, источник питания контролирует объем энергии и сохраняет вышеуказанную заданную температуру. Например, вышеуказанная заданная температура в вышеупомянутом 1-м нагревателе может быть температурой этапа денатурации ПЦР (85°С-105°С, предпочтительно, 95°С) и во 2-м нагревателе может быть температурой этапа отжига/элонгации ПЦР (50°С -80°С, предпочтительно, 72°С), либо в 1-м нагревателе это может быть температура этапа отжига/элонгации ПЦР (50°С-80°С, предпочтительно, 72°С или 60°С) и во 2-м нагревателе - температура этапа денатурации ПЦР (85°С-105°С, предпочтительно, 95°С).
Вышеуказанный насос (500) представляет собой модуль для контроля объема и скорости текучей среды, протекающей внутри одного или более реакционных каналов (921) вышеуказанного нагревательного блока (900) ПЦР, поэтому это может быть насос с положительным давлением и насос с отрицательным давлением, например, это может быть шприцевой насос. Вышеуказанный насос (500) может быть расположен с возможностью приведения в действие в одной части вышеуказанного реакционного канала (921), но, предпочтительно, чтобы он был расположен для подключения на входе (931) и/или выходе (932), образованных на обоих концах вышеуказанного реакционного канала (921). В случае расположения и подключения вышеупомянутого насоса (500) на вышеуказанном входе (931) и/или выходе (932), выполняет не только роль насоса, но также может выполнять роль ограничителя, который предотвращает утечку раствора проб и реагента через вышеуказанный вход (931) и/или выход (932). Кроме того, в случае контроля текучей среды, протекающей внутри вышеуказанного реакционного канала (921), т.е. объема и скорости раствора пробы и реагента в одном направлении, вышеупомянутый насос (500) располагается и подключается только к чему-нибудь одному из вышеуказанного входа (931) и вышеуказанного выхода (932), а к оставшемуся может быть герметично подключен обычный ограничитель; в случае контроля текучей среды, протекающей внутри вышеуказанного реакционного канала (921), т.е. объема и скорости раствора пробы и реагента в обоих направлениях, вышеуказанный насос (500) может располагаться, подключаясь к обоим: вышеупомянутому входу (931) и вышеупомянутому выходу (932).
Реакция амплификации нуклеиновой кислоты раствора ПЦР внутри устройства ПЦР в режиме реального времени, является вариантом осуществления №1, поэтому может выполняться с помощью следующих этапов.
1. Подготовьте раствор ПЦР, включающий в себя желаемую двухцепочечную целевую ДНК, олигонуклеотидный праймер, имеющий определенную нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности, подлежащей амплификации, ДНК-полимеразу, дезоксирибонуклеотид-трифосфаты (dNTP), реакционный буфер ПЦР.
2. Введите вышеуказанный раствор ПЦР в реакционный блок (900) ПЦР. В этом случае, вышеуказанный раствор ПЦР располагается в реакционном канале (921) внутри реакционного блока (900) ПЦР через вышеуказанный вход (931).
3. Подсоедините вышеуказанный блок (200) питания, в частности, каждый из проводов: 1-й провод (210) и 2-й провод (220) к вышеуказанному источнику (400) питания, а вышеуказанный вход (931) и выход (932) реакционного блока (900) ПЦР герметично подключите к насосу (500).
4. Нагрейте вышеуказанный 1-й (110) и 2-й (120) нагреватель с помощью 1-го провода (210) и 2-го провода (220), направив подачу питания в вышеуказанный источник (400) питания, и поддерживайте определенную температуру, например, в случае 1-го нагревателя (110), температуру этапа денатурации ПЦР (95°С), и в случае 2-го нагревателя (120), температуру этапа отжига/элонгации ПЦР (72°С).
5. При обеспечении положительного давления по насосу (500), подключенному к вышеуказанному входу (931) либо при обеспечении отрицательного давления по насосу (500), подключенному к вышеуказанному выходу (932), направьте поток вышеупомянутого раствора проб и реагентов в горизонтальном направлении внутри вышеуказанного реакционного канала (921). В этом случае, вышеуказанный объем и скорость раствора пробы и реагента может контролироваться путем регулирования силы положительного или отрицательного давления, обеспечиваемого за счет вышеуказанного насоса (500).
Путем выполнения вышеописанных этапов, вышеупомянутый раствор ПЦР, перемещаясь в продольном направлении, в части (301), соответствующей верхней стороне вышеупомянутого 1-го нагревателя (110) и части (302), соответствующей верхней стороне вышеупомянутого 2-го нагревателя (120) от конца входа (931) до конца выхода (932) вышеуказанного реакционного канала (921), выполняет ПЦР. Вышеупомянутый раствор ПЦР получает тепло от нагревательного блока (100) ПЦР, в котором повторяющимся образом расположен 10-фазный блок нагревателя, включающий в себя вышеупомянутый 1-й (110) и 2-й (120) нагреватель, и, проходя через этап денатурации ПЦР в части (301), соответствующей верхней стороне 1-го нагревателя (110) и этап отжига/элонгации ПЦР в части (302), соответствующей верхней стороне 2-го нагревателя (120), завершает цикл 10-фазного ПЦР. В дальнейшем, по желанию, вышеупомянутый раствор ПЦР, перемещаясь обратно в продольном направлении, в части, соответствующей верхней стороне вышеупомянутого 1-го нагревателя (110) и части, соответствующей верхней стороне вышеупомянутого 2-го нагревателя (120) от конца выхода (931) до конца входа (932) вышеуказанного реакционного канала (921), может повторяющимся образом выполнить ПЦР.
На фиг. 33 показана электрохимическая ПЦР в реальном времени, выполняемая посредством устройства ПЦР, оснащенного нагревательным блоком (100) ПЦР, в котором повторяющимся образом расположены нагреватели, использующие компенсирующий контур, соответствующий варианту осуществления №1 настоящего изобретения, реакционным блоком (900) ПЦР, показанным на фиг. 28-31, слоем (940) иммобилизации, электродом (950) определения и модулем (800) измерения сигнала.
Как показано на фиг. 33, устройство ПЦР, соответствующее варианту осуществления №1 настоящего изобретения, включает в себя нагревательный блок (100) ПЦР, в котором в горизонтальном направлении повторяющимся образом расположены 1-й нагреватель (110) и 2-й нагреватель (120), реакционный блок (900) ПЦР, в котором повторяющимся образом расположены так, чтобы подходили слой (940) иммобилизации и электроды (950) определения в пространстве между вышеупомянутым 1-м нагревателем (110) и 2-м нагревателем (120); но, хотя он и не показан на фиг., модуль (800) измерения электрохимического сигнала, который выполняется для измерения в реальном времени электрохимического сигнала, происходящего внутри реакционного канала (921) вышеуказанного реакционного блока (900) ПЦР и электрически соединяется с портом подключения (не показан) вышеупомянутого держателя чипа (не показан); и прочие элементы - блок питания, насос и т.д., которые не показаны на фиг.. Вышеупомянутый модуль (800) измерения электрохимического сигнала может быть подключен для электрической связи через средство (700) электрического соединения, например, подводящий провод, с портом подключения вышеупомянутого держателя чипа. Таким образом, электрохимический сигнал, повторяющимся образом возникающий вследствие последовательной амплификации нуклеиновой кислоты внутри реакционного канала (921) реакционного блока (900) ПЦР, последовательно определяется посредством электрода (950) определения вышеуказанного реакционного блока (900) ПЦР, и вышеупомянутый определяемый сигнал измеряется в вышеуказанном модуле (800) измерения электрохимического сигнала через порт подключения вышеуказанного держателя чипа и вышеупомянутого средства (700) электрического соединения, а также может быть обработан или проанализирован. Вышеупомянутый модуль (800) измерения электрохимического сигнала может быть разным, но также может быть выбран из групп, состоящих из вольтамперометрии анодного снятия покрытия (ASV), хроноамперометрии (CA), циклической вольтамперометрии, квадратно-волновой вольтамперометрии (SWV), дифференциальной импульсной вольтамперометрии (DPV), и импеданса. Таким образом, в соответствии с устройством ПЦР в реальном времени, соответствующим варианту осуществления №1 настоящего изобретения, во время выполнения ПЦР, можно осуществить измерение и анализ процесса амплификации нуклеиновой кислоты в реальном времени. В этом случае, вышеупомянутый раствор ПЦР не требует добавления отдельного флуоресцентного материала, в отличие от обычного устройства ПЦР в реальном времени. Например, раствор ПЦР, непрерывно проходя часть (301), соответствующую верхней стороне вышеупомянутого 1-го нагревателя (110) и часть (302), соответствующую верхней стороне вышеупомянутого 2-го нагревателя (302), внутри вышеупомянутого реакционного канала (921), выполняет этап денатурации ПЦР и этап отжига/элонгации ПЦР; в этом случае, раствор ПЦР проходит область вышеупомянутого электрода (950) определения, повторяющимся образом расположенного между вышеуказанным 1-м (110) и 2-м (120) нагревателем, а также между нагревательными блоками, содержащих вышеуказанный 1-й (110) и 2-й (120) нагреватель. При прохождении раствора ПЦР через вышеупомянутую часть, соответствующую верхней стороне электрода (950) определения, благодаря контролю текучей среды, скорость вышеупомянутого раствора ПЦР замедляется или некоторое время сохраняется в приостановленном состоянии, а затем через электрод (950) определения можно последовательно определить и измерить в режиме реального времени электрохимический сигнал (изменение тока), возникающий в связи с комплементарным соединением амплифицированной нуклеиновой кислоты с вышеуказанным зондом захвата и вышеуказанным сигнальным зондом композитного материала. Таким образом, в течение протекания каждого цикла ПЦР, можно определять и измерять количество целевой нуклеиновой кислоты в режиме реального времени, путем мониторинга в реальном времени результатов реакции на основе амплификации нуклеиновой кислоты внутри вышеуказанного реакционного канала (921) (без флуоресцентного материала и системы определения света).