Долговременно стабильные магнитно-полимерные частицы
LONG-TERM STABLE MAGNETIC-POLYMER PARTICLES

Изобретение относится к нанотехнологии и наноматериалам, в частности к полимерно-магнитным наночастицам, которые обладают долговременной стабильностью и эффективно взаимодействуют с макрофагами и могут быть использованы для мечения клеток системы мононуклеарных фагоцитов.
В последнее время, наблюдается существенный прогресс в области применения нано- и микро-структурированных материалов в области биомедицины- Многие наночастицы обладают уникальными физическими или химическими свойствами, диктующими им широкий спектр применений для диагностических и терапевтических целей. Например, многие магнитные частицы являются суперпарамагнитными, что позволяет не инвазивно их детектировать в живом организме на большой глубине методами магнитно-резонансной томографии, гигантского магнитного сопротивления, ферромагнитного резонанса, мессбауровской микроскопии и другими.
Существенное внимание привлекает вопрос взаимодействия нано- и микро- частиц с организмом. В настоящее время известно, что частицы после попадания в кровоток, как инородные агенты для организма, распознаются макрофагами системы мононуклеарных фагоцитов и, связываются и выводятся из циркуляции. И хотя долгое время, считалось, что для диагностической и терапевтической применимости наночастицы должны иметь минимальное взаимодействие с макрофагами, [Pelaz, В., et al. "Surface functionalization of nanoparticles with polyethylene glycol: effects on protein adsorption and cellular uptake." ACS nano 9.7 (2015): 6996-7008] современные данные показывают, что хорошо распознаваемые системой фагоцитов также могут быть применены для улучшения диагностики и терапии заболеваний.
Так, возможность не инвазивно наблюдать за распространением частиц в организме, позволяет маркировать и отслеживать активность, количество, плотность и фенотип тканево-ассоциированных макрофагов и таким образом проводить раннюю диагностику и корректировать ход лечения рака, атеросклероза, диабета и других заболеваний человека. [Weissleder, R., et.al. (2014). Imaging macrophages with nanoparticles. Nature materials, 13(2), 125-138] Более того, в случае взаимодействия частиц с опухолево-ассоциированными макрофагами, поглощение наночастиц может привести к изменению фенотипа макрофагов, изменению микроокружения опухоли и замедлению развития заболевания. [Zanganeh, S., et.al. (2016). Iron oxide nanoparticles inhibit tumour growth by inducing pro-inflammatory macrophage polarization in tumour tissues. Nature nanotechnology, 11(11), 986-994.] С другой стороны, в последнее время липосомальные нано- и микро-частицы стали применяться для создания блокады клеток макрофагов для улучшения терапии опухолей наночастицами. [Liu, Т., et.al. (2015). RES blockade: А strategy for boosting efficiency of nanoparticle drug. Nano Today, 10(1), 11-21.] В этом случае хорошо взаимодействующие с макрофагами липосомы, вводятся в кровоток и быстро поглощаются фагоцитами, при этом клетки оказываются не способны и к быстрому распознаванию последующих вводимых доз препарата обычных наночастиц или липосом, что увеличивает их время циркуляции в кровотоке, количество доставленного в целевую область препарата и увеличивает терапевтический индекс наночастиц. [Sun, X., et.al. (2017). Improved Tumor Uptake by Optimizing Liposome Based RES Blockade Strategy. Theranostics, 7(2), 319.]
Множественные предыдущие исследования фармакокинетики различных частиц в организме позволяет сделать выводы какими свойствами должны обладать частицы, чтобы эффективно взаимодействовать с макрофагами организма. Так, в [Blanco, Е., et.al. (2015). Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nature biotechnology, 33(9), 941-951] показано, что частицы менее 150 нм имеют долгое время циркуляции и плохо улавливаются фагоцитами. С другой стороны, наночастицы не должны содержать на своей поверхности маскирующих биополимеров, таких как полиэтиленгликоль, [Moghimi, S.М., et.al.. (2003). Stealth liposomes and long circulating nanoparticles: critical issues in pharmacokinetics, opsonization and protein-binding properties. Progress in lipid research, 42(6), 463-478.] молекулы CD-47 [Rodriguez, P.L., et.al. (2013). Minimal" Self peptides that inhibit phagocytic clearance and enhance delivery of nanoparticles. Science, 339(6122), 971-975.], полиэтиленфосфат [Schottler, S., et.al. (2016). Protein adsorption is required for stealth effect of poly (ethylene glycol)-and poly (phosphoester)-coated nanocarriers. Nature nanotechnology, 11(4), 372-377.] и другие. Также, известно, что магнитно-полимерные частицы покрытые сильно заряженными полимерами, например несущими отрицательный заряд полимерами декстрана, [Weissleder, R., et.al. (2014). Imaging macrophages with nanoparticles. Nature materials, 13(2), 125-138.] или несущими положительный заряд полимерами хитозана, [Не, С., et.al. (2010). Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles. Biomaterials, 37(13), 3657-3666.] при введении в кровоток эффективно поглощаются тканевыми макрофагами.
Таким образом, для эффективного маркирования макрофагами перспективными агентами являются крупные субмикронные полимерно-магнитные наночастицы. Однако, полимерные частицы имеют часто имеют проблему отсутствия долговременной стабильности. Например, полимер не защищает наночастицы оксидов железа от доступа растворителя и они могут окисляться, что приводит к ухудшению возможности их детекции со временем. Также, полимер при длительном хранении десорбируется с поверхности частиц [Kim, Н.J., etal. (2009). FeO nanoparticles remain mobile in porous media after aging due to slow desorption of polymeric surface modifiers. Environmental Science & Technology, 43(10), 3824-3830], что одновременно и приводит к изменению коллоидной стабильности частиц, и к изменению фармакокинетики, фармакодинамики и клинической эффективности таких наноагентов. Описываемой проблемой, на которое направлено решение является отсутствие долговременно стабильных магнитно-полимерных частиц, эффективно взаимодействующих с макрофагами организма. Под долговременной стабильностью частиц здесь и далее мы понимаем сохранение магнитных, биохимических и коллоидно-агрегационных свойств частиц на уровне не менее 95% начальных при хранении их в водных растворах в течение года.
Одно решение описано в US Pat. №7868145 В2 и представляет собой полимерно-магнитные частицы, полностью покрытые оболочкой из оксида кремния, поверхность которого в свою очередь функционализируется амино-группами для биоконъюгации. Недостатком метода является отсутствие полимера на поверхности частиц, что будет приводить к изменению поведения частиц при их взаимодействии с макрофагами.
Еще одно решение описано в [Hsu, J.С., et.al. (2011). Silica nanohybrids integrated with CuInS2/ZnS quantum dots and magnetite nanocrystals: multifunctional agents for dual-modality imaging and drug delivery. Journal of Materials Chemistry, 21(4%), 19257-19266]. В данном методе наночастицы магнетита покрывают оболочками оксида кремния по методу обратной микроэмульсии, а после модифицируют поверхность силанизирующими агентами, содержащими аминогруппу и полиэтиленгликолевые фрагменты. Недостатком метода является использование линейных полиэтиленгликолево-подобных полимеров для закрепления их на поверхности, которые приводят к ослаблению взаимодействия наночастиц с макрофагами.
Наиболее близкое решение представляет суспензию магнитно-полимерных наночастиц, в котором частицы магнетита покрыты глицидилоксипропил(триметокси) силан-модифицированным декстраном, и далее частично сшиты оксидом кремния по сайтам модификации декстрана. [Gruttner, С, et.al. (1999). New types of silica-fortified magnetic nanoparticles as tools for molecular biology applications. Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 194(1), 8-15.] Недостатком метода является невозможность получения сплошной оболочки оксида кремния для защиты магнетита, так как из-за возможности частиц реагировать между собой даже при небольшом количестве силиката они формировали крупные агрегаты и теряли монодисперсность распределения по размерам. При этом, при массовом соотношении SiO2/Dextran более 1/20 частицы полностью теряли коллоидную стабильность.
Таким образом, требуемый технический результат представляет собой долговременно сохраняющие свои магнитные, биохимические и коллоидные свойства магнитно-полимерные частицы, способные эффективно поглощаться тканевыми макрофагами в организме.
Для получения технического результата предложена суспензия магнитно-полимерных долговременно стабильных микро- и субмикро-частиц, схема строения которых приведена на Рис. 1. Частица состоит из ядер оксигидроксидов железа (1 на рисунке 1), полимера на основе декстрана (2 на рисунке 1) и кремний-содержащей оболочки (3 на рисунке 1), в которой: полимер одновременно соединяет несколько магнитных ядер в составе частицы и выходит на поверхность частицы, а сплошная кремний содержащая оболочка формируется вокруг магнитных ядер и закрепляет в своей структуре полимер. Кроме того, предложена вышеописанная суспензия, в котором частицы имеют размер более 500 нм. Кроме того, вышеописанная суспензия, в которой полимер декстрана функционализирован различными активными группами. Кроме того, вышеописанная суспензия, в которой используется полимер на основе карбоксидекстрана. Кроме того, вышеописанная суспензия, в которой используется смесь различных полимеров на основе декстрана. Кроме того, вышеописанная суспензия, в которой ядро оксигидроксида железа представляет собой контрастный агент для магнитно-резонансной томографии. Кроме того, вышеописанная суспензия, в которой ядро оксигидроксида железа представляет собой наночастицу магнетита. Кроме того, вышеописанная суспензия, в которой кремний содержащая оболочка содержит силоксаны, кварцевое стекло, оксид кремния или соли силиката. Кроме того, вышеописанная суспензия, в которой кремний содержащая оболочка составляет более 10% массы частиц. Кроме того, вышеописанная суспензия, в которой сохраняющая свои магнитные, биохимические и коллоидные свойства в течение года. Кроме того, вышеописанная суспензия, в которой частицы быстро распознаются и поглощаются макрофагами организма. Кроме того, вышеописанная суспензия, в которой частицы осуществляют диагностическое или терапевтическое действие на организм.
Работа предлагаемого агента и способа иллюстрируется чертежами Рис. 1. и Рис. 2.
Список рисунков чертежей
Рис. 1. Схема строения долговременно стабильных магнитно-полимерных наночастиц. 1 - ядро оксигидроксидов железа, 2 - полимер на основе декстрана, 3 - кремний содержащая оболочка
Рис. 2. Электронная микрофотография одного из реализованных вариантов стабильных магнитно-полимерных наночастиц.
Примеры
Варианты реализации изобретения разнообразны. Приведем различные примеры. Нижеприведенные примеры даны в качестве иллюстрации данного изобретения и не ограничивают его применения.
Пример 1. Получение 200 нм долговременно стабильных магнитно-полимерных наночастиц
Суспензия наночастиц представляет себя полимерные частицы с инкапсулированным одним или несколькими частицами оксигидроксидов железа, полимер на поверхности которых закреплен дополнительно выращенной оболочкой из диоксида кремния. Для получения полимерных железосодержащих наночастиц сначала готовят водный раствор наночастиц оксигидроксидов железа, с использование стандартного метода копреципитации солей железа в щелочных условиях. Затем формируется полимерная оболочка добавлением сильно отрицательно заряженного полимера карбоксиметилдекстрана в концентрации 200 г\л при нагревании. Затем готовят раствор содержащий один из или комбинацию спиртов: метиловый, этиловый, пропиловый, гидроксид аммония, дистиллированную воду, полимер-стабилизированные магнитные наночастицы, затем добавляют тетраэтоксисилан и перемешивают до окончания реакции образования оболочки оксида кремния. При этом используются реагенты в следующем соотношении: на 1 мл метилового\этилового или изопропилового спирта добавляется 5 мг покрытых полимером магнитных наночастиц, 20 мкл гидроксида аммония, 50 мкл дистиллированной воды и 40 мкл тетраэтилортосиликата. В результате получаются стабильные магнитно-кремниевые частицы со средним размером 200 нм, электронная микрофотография которых приведена на Рис. 2.
Пример 2. Получение субмикронных долговременно стабильных магнитно-полимерных наночастиц
Полученные в примере 1 наночастицы дополнительно покрываются слоем оксида кремния за счет гидролиза тетраэтилортосиликата, в результате которого получаются частицы со средним размером 360 нм при завершения однократной реакции, и 520, 640, 780 нм при реализации многократной реакции.
Пример 3. Тестирование эффективности защиты магнитных ядер от взаимодействия с растворителем.
Полученные в примерах 1 и 2 частицы тестировались на способность к защите магнитных ядер от взаимодействия с растворителем. Для этого частицы инкубировались с 2% желтой кровяной солью в присутствии 5М соляной кислоты, для сравнения нами тестировались покрытые полимером декстрана магнитные наночастицы. В случае наличия доступа растворителя к частицам мы ожидали образование растворимой берлинской лазури и изменение поглощения раствором света с длиной волны 630 нм. При этом для полученных в примерах 1 и 2 за 15 минут реакции не наблюдалось изменение окраски раствора, в то время как в контрольном эксперименте с частицами магнетита, покрытыми полимером декстрана поглощение частиц на 630 нм изменялось более чем в 10 раз.
Пример 4. Тестирование сохранения магнитных свойств магнитно-полимерных частиц.
Полученные в примерах 1 и 2 частицы были изучены на сохранение их магнитных свойств со временем. Для этого они детектировались методом MPQ (Magnetic particle quantification) [Nikitin, M.P., et.al. (2009). Highly sensitive room-temperature method of noninvasive in vivo detection of magnetic nanoparticles. Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 321(10), 1658-1661.] сразу после завершения реакции стабилизации магнитно-полимерных частиц и через год. Через 1 год наблюдалось падение магнитного сигнала суспензии наночастиц на 4%, что говорило о высокой стабильности магнитных свойств частиц при длительном хранении.
Пример 5. Определение наличия полимера на поверхности субмикронных долговременно стабильных магнитно-полимерных наночастиц.
Полученные в примерах 1 и 2 магнитно-полимерные частицы использовались для определения наличия полимера на поверхности. Для этого к суспензии наночастиц добавлялся конканавалин А (лектин из Canavalia ensiformis) и наблюдалась агрегация частиц. Данный белок является тетрамером, связывающего сахара, а следовательно и частицы с полисахаридом на поверхности, между собой. Через 1 год хранения частиц конканавалин А также вызывал связывание частиц и их агрегацию.
Пример 6 Определение взаимодействия магнитно-полимерных наночастиц с макрофагами.
Для определения эффективности взаимодействия магнитно-полимерных наночастиц самкам мышей линии Balb/c внутривенно вводилось 5 мг суспензии наночастиц, в качестве контроля использовались полимерные декстран-покрытые магнитные наночастицы. Мерой эффективности взаимодействия с макрофагами являлось время, за которое макрофаги улавливали 95% наночастиц и выводили их из кровотока. Среднее время выведения для полученных в примерах 1 и 2 частиц составило 1 час 23 минуты, 1 час 38 минут, 2 часа 17 минут, 3 часа 2 минуты и 3 часа 54 минут для частиц с размером 780, 640, 520, 360 и 200 нм соответственно. Для контрольных покрытых декстраном магнитных частиц время их выведения составило 5 часов 28 минут. По литературным данным, в случае слабого взаимодействия с макрофагами частицы имеют время выведения более 12 часов.