СПОСОБЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ РЕТИНАЛЬНЫХ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ

1. Способ выделения первичных ретинальных клеток из человеческого образца, включающий:
(a) выделение образца сетчатки, включающего множество первичных ретинальных клеток, из человеческого образца, где человеческий образец получен от человека-донора гестационного возраста от приблизительно 12 недель до приблизительно 28 недель,
(b) механическую диссоциацию множества первичных ретинальных клеток в образце сетчатки, выделенном на этапе (a), без обработки множества первичных ретинальных клеток протеазой, с получением в результате разделенной суспензии клеток и скоплений клеток, и
6
(c) определение жизнеспособности, количества и морфологии первичных ретинальных клеток, полученных из образца сетчатки, где получают по меньшей мере 30×10 жизнеспособных первичных ретинальных клеток.
2. Способ по п.1, где человеческий образец представляет собой одно или пару человеческих глазных яблок.
3. Способ по п.2, где глазное яблоко(и) обладает нормальной морфологией, включающей интактное глазное яблоко(и), прозрачную роговицу, нормальную форму или любую комбинацию этого.
4. Способ по любому из пп.1-3, где перед этапом (a) человеческий образец помещают в среду для транспортировки культуры клеток после изъятия у человека-донора.
5. Способ по п.4, где среда для транспортировки культуры клеток включает RPMI-1640 с L-глутамином или улучшенную DMEM/F12.
6. Способ по п.4 или 5, где среда для транспортировки культуры клеток включает гентамицин в концентрации приблизительно 0,5-50 микрограммов на миллилитр, где, необязательно, среда для транспортировки культуры клеток включает 50 микрограммов гентамицина на миллилитр.
7. Способ по любому из пп.1-6, где человеческий образец хранят приблизительно при 1-8°C непосредственно после помещения в среду для транспортировки культуры клеток.
8. Способ по любому из пп.1-7, где человеческий образец используют через приблизительно от 7 до приблизительно 26 часов после изъятия у человека-донора.
9. Способ по любому из пп.1-8, где выделение образца сетчатки из человеческого образца в этапе (a) включает:
(i) извлечение одного или пары человеческих глазных яблок из среды для транспортировки культуры,
(ii) промывку одного или пары человеческих глазных яблок фосфатно-солевым буфером с температурой приблизительно 1-8°C (PBS) и добавкой антибиотика,
(iii) удаление зрительного нерва и мезенхимальной ткани из одного или пары человеческих глазных яблок,
(iv) промывку одного или пары человеческих глазных яблок PBS с температурой приблизительно 1-8°C и добавкой антибиотика,
(v) прокол одного или пары человеческих глазных яблок по краю роговицы с помощью иглы,
(vi) круговой разрез по краю роговицы одного или пары человеческих глазных яблок,
(vii) удаление хрусталика, роговицы и ассоциированного стекловидного тела из одного или пары человеческих глазных яблок,
(viii) отделение сетчатки (сетчаток) от слоя пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) с получением выделенной сетчатки или пары выделенных сетчаток, и
(ix) помещение выделенной сетчатки или пары выделенных сетчаток в культуральную среду или PBS приблизительно при 1-8°C, где культуральная среда или PBS содержат добавку антибиотика.
10. Способ по п.9, где этап (ii) повторяют 1-5 раз или 3 раза.
11. Способ по п.9 или 10, где в этапе (iii) удаляют некоторые или все экстраокулярные ткани и клетки.
12. Способ по любому из пп.1-11, где этап (b) включает:
(i) перенос образца сетчатки в пробирку,
(ii) механическую диссоциацию образца сетчатки с получением множества разделенных первичных ретинальных клеток,
(iii) осаждение множества разделенных первичных ретинальных клеток с помощью центрифугирования, и
(iv) удаление супернатанта.
13. Способ по п.12, где механическую диссоциацию сетчатки производят путем суспендирования стерильной пипеткой.
14. Способ по п.13, где суспендирование выполняют от 2 до 50 раз, от 2 до 10 раз или от 4 до 8 раз.
15. Способ по любому из пп.12-14, где множество разделенных первичных ретинальных клеток осаждают с помощью центрифугирования приблизительно при 140×g в течение приблизительно 3 минут при 4°C.
16. Способ по любому из пп.12-15, включающий промывку множества разделенных первичных ретинальных клеток культуральной средой или PBS с добавкой антибиотика после этапа (ii) и перед этапом (iii).
17. Способ по любому из пп.12-16, где множество разделенных первичных ретинальных клеток включает одиночные клетки и скопления клеток.
18. Способ по любому из пп.1-17, где этап (c) включает:
(i) ресуспендирование осажденных первичных ретинальных клеток из этапа (b) в культуральной среде с температурой приблизительно 1-8°C и добавкой антибиотика,
(ii) посев множества разделенных ретинальных клеток в один или более флаконов или планшетов для культур клеток с покрытием, содержащих культуральную среду, где, необязательно, культуральная среда модержи добавку антибиотика,
(iii) инкубирование множества разделенных ретинальных клеток при 10-50°C, где, необязательно, инкубирование проходит при 37°C, и
(iv) определение количества и жизнеспособности первичных ретинальных клеток и скоплений ретинальных клеток.
19. Способ по п.18, где количество и жизнеспособность первичных ретинальных клеток измеряют с помощью счетчика клеток NC-200 при использовании метода подсчета агрегатов клеток, гемоцитометра или трипанового синего.
6
9
6
20. Способ по п.19, где количество жизнеспособных первичных ретинальных клеток составляет от приблизительно 20×10 до приблизительно 1×10 жизнеспособных первичных ретинальных клеток или в пределах приблизительно 73-147×10 жизнеспособных первичных ретинальных клеток.
21. Способ по любому из пп.18-20, где процент жизнеспособных подсчитанных клеток составляет от приблизительно 10% до приблизительно 100% или от приблизительно 68% до приблизительно 85%.
22. Способ по любому из пп.18-21, где флаконы засевают в этапе (ii) приблизительно от 1 до приблизительно 1000000000 клеток.
23. Способ по любому из пп.18-22, где множество разделенных ретинальных клеток инкубируют при:
2
2
(1) 37°C в атмосфере с 0-30% CO и 0-50% O,
2
2
(2) 37°C при содержании CO меньше или равном 5% и O меньше или равном 20%; или
2
2
(3) 37°C при содержании CO меньше или равном 5% и O меньше или равном 3%.
24. Способ по любому из пп.1-23, где этап (c) включает
(i) визуальный осмотр множества разделенных ретинальных клеток под микроскопом, и
(ii) подтверждение, что множество ретинальных клеток, посеянных во флаконы или планшеты для культур клеток, включает скопления ретинальных клеток, состоящие из приблизительно от 2 до приблизительно 1000 клеток.
25. Способ культивирования выделенных первичных человеческих ретинальных клеток для получения популяции неиммортализованных человеческих ретинальных клеток-предшественников, включающий:
(a) посев в один или более культуральных флаконов или планшетов с покрытием, содержащих культуральные среды, в первом пассаже множества первичных ретинальных клеток, полученных способом по любому из пп.1-24, с получением множества культивированных ретинальных клеток;
(b) посев в один или более культуральных флаконов или планшетов с покрытием, содержащих культуральные среды, во втором пассаже множества культивированных ретинальных клеток, полученных в первом пассаже;
(c) посев в одну или более культуральных флаконов или планшетов с покрытием, содержащих культуральные среды, в третьем множества культивированных ретинальных клеток, полученных во втором пассаже; и
(d) криоконсервацию множества культивированных ретинальных клеток;
где:
4
2
6
2
один или более культуральных флаконов с покрытием засевают при плотности от приблизительно 0,5×10 клеток на квадратный сантиметр (см) до приблизительно 5×10 клеток на см,
плотность посева в первом пассаже больше, чем плотность посева во втором пассаже, и
плотность посева во втором пассаже больше, чем плотность посева в третьем пассаже,
с получением в результате популяции неиммортализованных человеческих ретинальных клеток-предшественников.
26. Способ по п.25, дополнительно включающий посев в один или более культуральных флаконов или планшетов с покрытием, содержащих питательную среду, в одном или более дополнительных пассажах множества культивированных ретинальных клеток, полученных в непосредственно предшествующем пассаже.
27. Способ по любому из пп.18-27, где культуральные флаконы или планшеты покрыты не содержащим ксеногенных компонентов фибронектином, орнитином, полилизином, ламинином или их комбинацией.
28. Способ по любому из пп.25-27, где множество первичных или культивированных ретинальных клеток культивируют при:
2
2
(1) 37°C в атмосфере с 0-30% CO и 0-50% O,
2
2
(2) 37°C с содержанием CO меньше или равным 5% и O меньше или равным 20%; или
2
2
(3) 37°C с содержанием CO меньше или равным 5% и O меньше или равным 3%.
29. Способ по любому из пп.25-28, где период времени между пассажами составляет 2-8 дней, 3-6 дней, 4-5 дней или 3-4 дня.
30. Способ по любому из пп.25-29, где множество первичных ретинальных клеток разделяют в первом пассаже с использованием первого ферментативного раствора, включающего:
(1) трипсин или эквивалент, и этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), или
(2) трипсин или эквивалент, ЭДТА и DPBS.
31. Способ по п.30, где эквивалентом трипсина является TrypLE.
32. Способ по п.31, где (1) TrypLE и ЭДТА присутствуют в соотношении 1:4 в первом ферментативном растворе, или где (2) TrypLE, ЭДТА и DPBS присутствуют в соотношении 1:1:3.
33. Способ по любому из пп.25-32, где множество первичных ретинальных клеток разделяют в течение приблизительно 5-20 минут, приблизительно 6-10 минут или приблизительно 7-8 минут при 37°C.
34. Способ по любому из пп.25-33, где множество культивируемых ретинальных клеток разделяют во втором пассаже с использованием второго ферментативного раствора, включающего:
(1) трипсин или эквивалент, ЭДТА и DPBS, или
(2) эквивалент трипсина и DPBS.
35. Способ по п.34, где эквивалентом трипсина является TrypLE.
36. Способ по п.35, где (1) TrypLE, ЭДТА и DPBS присутствуют в соотношении 1:1:3 во втором ферментативном растворе, или где (2) TrypLE и DPBS присутствуют в соотношении 1:1 во втором ферментативном растворе.
37. Способ по любому из пп.34-36, где множество культивируемых ретинальных клеток разделяют в течение приблизительно 5-20 минут, приблизительно 6-10 минут или приблизительно 7-8 минут при 37°C.
38. Способ по любому из пп.26-37, где множество культивированных ретинальных клеток разделяют в третьем или последующем пассаже с использованием третьего ферментативного раствора, включающего трипсин или эквивалент и DPBS.
39. Способ по п.38, где эквивалент трипсина включает TrypLE.
40. Способ по п.39, где TrypLE и DPBS присутствуют в соотношении 1:1 в третьем ферментативном растворе.
41. Способ по любому из пп.38-40, где множество культивируемых ретинальных клеток разделяют в течение приблизительно 5-10 минут или приблизительно 5-7 минут при 37°C по меньшей мере в третьем или последующем пассаже.
42. Способ по любому из пп.38-41, где последующие пассажи включают два пассажа.
43. Способ по любому из пп.25-42, включающий определение количества и жизнеспособности клеток после диссоциации множества ретинальных клеток после второго пассажа.
44. Способ по п.43, где по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% клеток являются жизнеспособными.
6
6
2
6
6
2
6
6
2
2
45. Способ по любому из пп.25-43, где клетки сеют в культуральные флаконы или планшеты при плотности от приблизительно 0,5×10 до приблизительно 3,0×10 клеток/см в первом пассаже, от приблизительно 0,1×10 до приблизительно 0,5×10 клеток/см во втором пассаже, от приблизительно 0,03×10 до приблизительно 0,2×10 клеток/см в третьем пассаже и от приблизительно 10000 до приблизительно 60000 клеток/см в четвертом и последующих пассажах.
46. Способ по любому из пп.25-45, где криоконсервация в этапе (d) включает:
(i) ферментативную диссоциацию клеток с использованием трипсина или эквивалента,
(ii) остановку диссоциации избытком культуральной среды или улучшенной DMEM/F12,
(iii) центрифунгирование клеток при 10-10000×g в течение 1-30 минут,
(iv) ресуспендирование клеток в культуральной среде и определение общего количества и жизнеспособности клеток,
(v) добавление среды для криоконсервации с получением конечной концентрации диметилсульфоксида (ДМСО) 5-30%,
(vi) аликвотирование множества клеток в каждый криофлакон,
(vii) замораживание каждого флакона при использовании программируемого криозамораживателя, и
2
(viii) помещение каждого флакона с клетками в жидкий N.
47. Способ по любому из пп.8-46, где культуральная среда является бессывороточной.
48. Способ по любому из пп.8-47, где культуральная среда включает полную среду.
49. Способ по любому из пп.8-47, где культуральная среда включает среду Игла в модификации Дульбекко DMEM/F12, улучшенную DMEM/F12, Knockout DMEM/F12, нейробазальную среду, ReNcell или среду Ultraculture.
50. Способ по любому из пп.8-47, где культуральная среда включает улучшенную DMEM/F12.
51. Способ по п.49 или 50, где культуральная среда включает добавку N-2 и GlutaMAX-I.
52. Способ по любому из пп.49-51, где культуральная среда включает B27, B27 xeno-free или StemPro.
53. Способ по любому из пп.49-52, где культуральная среда включает дополнительные компоненты или добавки, поддерживающие выживание или рост клеток.
54. Способ по п.53, где дополнительные компоненты или добавки, поддерживающие выживание или рост клеток, выбраны из группы, состоящей из L-глутамина, рекомбинантного человеческого эпидермального фактора роста (EGF), основного фактора роста фибробластов (bFGF), других факторов роста и их комбинации.
55. Способ по любому из пп.8-54, где антибиотик включает гентамицин в концентрации от приблизительно 0,5 до приблизительно 50 мкг/мл, где, необязательно, концентрация гентамицина составляет приблизительно 30 мкг/мл.
56. Способ по п.46, где эквивалент трипсина в этапе (i) включает TrypLE.
57. Способ по любому из пп.46-56, где среда для криоконсервации включает культуральную среду и 10% ДМСО.
6
6
58. Способ по любому из пп.46-57, где множество клеток в этапе (vi) включает от приблизительно 0,5×10 до приблизительно 20×10 клеток на мл культуральной среды и ДМСО.