Аллельный полиморфизм гена тиреоглобулина у крупного рогатого скота мясных пород

Разведение, селекция, генетика

УДК 591.151:636.22/.28.082.13

Аллельный полиморфизм гена тиреоглобулина у крупного рогатого скота мясных пород

Л.Г. Сурундаева

ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт мясного скотоводства»

Аннотация. Исследования проводились на биообразцах, полученных от племенных животных калмыцкой, казахской белоголовой, герефордской, абердин-ангусской и симментальской (Брединского мясного типа) пород. Определена частота встречаемости аллелей и генотипов гена гормона тиреоглобулина. Частота встречаемости аллеля С гормона TG5 в среднем составила 0,739, аллеля Т - 0,261. Частота встречаемости генотипов TG5CC составила 0,709, TG5CT - 0,230 и TG5TT - 0,0606. Установлена породоспецифическая структура по частоте встречаемости генотипов и аллелей. Определены генетические различия между группами. Отмечено достоверное смещение генетического равновесия по изучаемому показателю в калмыцкой породе. Наибольшим уровнем гомозиготности характеризовалась гере-фордская порода. Сформирована база данных, включающая результаты исследований пяти пород крупного рогатого скота мясного направления продуктивности, разводимых в Оренбургской, Курганской, Челябинской областях, Ставропольском крае России и в Республике Казахстан.

Ключевые слова: крупный рогатый скот, мясные породы, полиморфизм, аллель, тиреоглобулин.

Введение.

Ускоренное развитие современной молекулярной генетики позволяет определять гены, контролирующие количественные и качественные продуктивные признаки сельскохозяйственных животных. В свою очередь определение наличия перспективных генотипов животных в раннем возрасте является важным моментом в селекции крупного рогатого скота мясного направления продуктивности. Точность прогнозирования племенных качеств животных позволяет проводить ранний направленный отбор и осуществлять индивидуальный подбор лучших особей в качестве родительских пар в процессе селекционной работы [1].

В настоящее время в литературе имеются сообщения отечественных и зарубежных учёных о маркерных генах, связанных с липидным метаболизмом и влияющих на мясные качества крупного рогатого скота, к ним относится ген тиреоглобулина [2-6].

Исследователи рассматривали ген, контролирующий выработку тиреоглобулина (TG5) в качестве функционального и позиционного гена - кандидата мраморности мяса из-за влияния его на жировой метаболизм [7, 8]. В то же время ряд учёных считает, что ген гормона тиреоглобулина также связан с качественным составом молока и может быть использован в качестве маркера жирномолочности [9].

На основании полиморфизма этого гена был создан коммерческий тест мраморности (GeneSTAR), проверенный на более чем 3500 голов крупного рогатого скота различных пород. Проведёнными исследованиями было установлено, что самой высокой частотой встречаемости желательного аллеля характеризуется японская порода крупного рогатого скота Wagyu (76 %), которая отличается чрезвычайно высокой мраморностью мяса [10]. Разница по степени мраморности при откорме групп скота между альтернативными гомозиготами составила 3,5 % IMF (СС-генотип) к 11 % (TT-генотип), при этом достоверного влияния на другие признаки мясной продуктивности выявлено не было.

Тем не менее в нашей стране проведено не достаточно исследований по идентификации генотипов животных, несущих желательные фенотипические особенности среди скота мясных пород.

Цель исследования.

Проведение исследований, позволяющих определить желательные особенности генофонда крупного рогатого скота мясных пород для совершенствования методов рационального использования в племенной работе.

Материалы и методы исследования.

Объект исследования. Исследования проводились на племенных животных, разводимых в Оренбургской, Челябинской, Курганской областях, Ставропольском крае России и Республики Казахстан. Калмыцкая порода (СПК ПЗ «Дружба» Ставропольского края) - 40 гол., казахская белоголовая

48 Разведение, селекция, генетика

порода (КХ «Талап» Сырымский район Республика Казахстан) - 16 гол., герефордская порода (ПЗК ОАО ПФ «Челябинская» обл.) - 37 гол., абердин-ангусская порода (ООО «Суерь» Курганская обл.) - 33 гол., симментальская порода брединского мясного типа (ООО Совхоз «Брединский» Челябинской обл.) - 39 гол.

Схема эксперимента. Кровь, полученную утром до кормления из ярёмной вены животных, вносили в пробирки с 100 мМ ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ.

Все четыре нуклеотида - 10(2,5) mM dNTPs (Fermentas) были добавлены в реакционную смесь в конечной концентрации 0,2 мМ. Праймеры использовали в концентрации 1 пМ на мкл реакционной смеси. Матричную ДНК добавляли в количестве 10-100 нг на одну реакцию (табл. 1).

Таблица 1. Специфические олигонуклеотиды и программа проведения ПЦР

Гены Праймеры Программа ПЦР

Тиреоглобулин F: 5'-GTGAAAATCTTGTGGAGGCTGTA-3' 95 °С - 30 сек,

64 °С - 30 сек,

R: 5'-GGGGATGACTACGAGTATGACTG-3' 72 °С - 60 сек

ПДРФ-анализ продуктов амплификации исследуемых полиморфных участков проводился по следующей схеме (табл. 2).

Таблица 2. Схема проведения ПДРФ-анализа продуктов амплификации исследуемых полиморфных участков генов

Полиморфизм Рестриктаза Замена нуклеотида Распознаваемый нуклеотид/ аллель Генотипы и соответствующие длины рестрикционных фрагментов

BstXI- полиморфизм гена тиреоглобу-лина BstXI T C C/TG5-BsXIT TG5-BstX Т:473 TG5-BstXIСС:295+173 TG5-BstXICT:4 73+295+173

Оборудование и технические средства. Выделение ДНК из цельной крови крупного рогатого скота, проводили с использованием набора «DIAtomtm DNA Prep» (IsoGene Lab, Москва), согласно прописи, представленной изготовителем.

Исследовали полиморфизм гена TG5 методом полимеразной цепной реакции («GenePakR PCR Core», IsoGene Lab, Москва) с последующим рестрикционным анализом рестриктазой BstXI в соответствии с рекомендациями изготовителя.

Фрагменты ДНК амплифицировали на программируемом термоциклере MyCycler (Bio-Rad, США). Для ПЦР использовали Taq полимеразу (5 ед./мкл) с поставляемым буфером - lOxTag буфер.

Статистическая обработка данных проводилась с помощью программного обеспечения «Excel» (Microsoft). Уровень достоверности полученных результатов определяли по критерию %2 [11].

Результаты исследований.

В результате полимеразной цепной реакции нами были получены продукты, соответствующие ожидаемым результатам. Каждая реакция дала положительный продукт. Наличие продуктов ПЦР визуализировали в 1 %-ном агарозном геле.

Полиморфизм гена тиреотропного гормона в анализируемых популяциях представлен в таблице 3.

Установлено, что каждая популяция имеет свою породоспецифическую структуру. Наиболее высокой частотой аллеля C характеризовались животные герефордской породы, а наименьшей - калмыцкой.

Разведение, селекция, генетика

Таблица 3. Полиморфизм гена тиреотропного гормона

Порода п Частота встречаемости генотипов Частота аллеля

СС СТ ТТ

п % п % п % С Т

Калмыцкая 40 25 62,5 10 25,0 5 12,5 0,705 0,295

Казахская белоголовая 16 9 56,3 6 37,5 1 6,3 0,75 0,25

Герефордская 37 33 89,2 4 10,8 - - 0,946 0,054

Абердин-ангусская 33 25 75,75 7 21,21 1 3,03 0,864 0,136

Симментальская

(мясной тип) 39 25 64,1 11 28,20 3 7,70 0,782 0,218

Итого 165 117 70,91 38 23,03 10 6,06 0,739 0,261

Анализ полученных данных (табл. 4) показал, что в целом в анализируемых популяциях смещено генное равновесие, обусловленное действием искусственного отбора - селекции. Тем не менее в популяции крупного рогатого скота калмыцкой породы отмечено смещение генного равновесия (Р<0,05) за счёт избытка гомозигот и недостатка гетерозигот. В других популяциях совпадение между ожидаемыми и наблюдаемыми фенотипами в пределах каждого из трёх классов оказалось довольно большим.

Таблица 4. Генное равновесие в популяциях крупного рогатого скота по гену TG5

Генотип Распределение

фактическое теоретически ожидаемое

Калмыцкая порода

СС СТ ТТ Всего 25 22,5 0,278 10 15,0 1,667 5 2,5 2,500 40 40 4,444*

Казахская белоголовая порода

СС СТ ТТ Всего 9 9 0 6 6 0 1 1 0 16 16 0

Герефордская порода

СС СТ ТТ Всего 33 33,108 0,00035 4 3,784 0,01236 - 0,108 0,10811 37 37 0,12082

Абердин-ангусская порода

СС СТ ТТ Всего 25 24,613 0,0061 7 7,773 0,0768 1 0,614 0,2433 33 33 0,3262

Симментальская порода брединского мясного типа

СС СТ ТТ Всего 25 23,852 0,055 11 13,295 0,396 3 1,853 0,711 39 39 1,162

В целом по всем породам

СС СТ ТТ Итого 117 90,21 7,96 38 63,59 10,30 10 11,20 0,13 165 165 18,38***

Примечание: * - х21 - 3,8; ** - %22 - 6,6 *** - %2з - 10,8 при v=3-2=1

50 Разведение, селекция, генетика

Однако в целом по анализируемым популяциям отмечено достоверное по третьему порогу смещение распределения генотипов (х2факт=18,38; Р<0,001). При этом наибольший показатель смещения фактического и теоретически ожидаемого значений был у гетерозигот - 59,75 %.

Степень гомозиготности по анализируемым популяциям представлена в таблице 5.

Таблица 5. Гомозиготность по гену гормона TG5 в популяциях

Порода Генотип Число гомозиготных генотипов Доля гомозиготных генотипов, %

Калмыцкая СС тт 25 5 75,0

Казахская белоголовая СС тт 9 1 62,5

Герефордская СС тт 33 0 89,19

Абердин-ангусская СС тт 25 1 78,79

Симментальская СС тт 25 3 71,79

Итого СС тт 117 10 76,97

Самый высокий показатель гомозиготности оказался в популяции герефордского скота. В свою очередь показатель гетерозиготности популяций, основанный на фактическом и теоретически ожидаемом распределении генотипов по гену тиреотропного гормона, показал обратную взаимосвязь величины гомо- и гетерозиготности (табл. 6).

Таблица 6. Показатель гетерозиготности по гену TG5

Порода Фактическое распределение гетерозигот TG5 СТ, гол. Доля гетерозигот по фактическому распределению, % Теоретически ожидаемое распределение гетерозигот TG5 СТ, гол. Доля гетерозигот по теоретически ожидаемому распределению, % Тест гетерози-готности Ф=Т, %

Калмыцкая 10 25,00 15,00 32,72 -26,7

Казахская

белоголовая 6 37,50 6,00 100,0 0

Герефордская 4 10,81 3,78 12,13 0,73

Абердин-ангусская 7 21,20 7,77 16,95 -3,9

Симментальская 11 28,20 13,29 28,99 -12,4

Итого 38 23,60 45,84 28,47 -32,78

Из данных таблицы 6 следует, что величина теста гетерозиготности зависит от разности между фактическим и теоретически ожидаемым значениями. Отрицательные значения геста гетерозиготности свидетельствуют о недостатке относительной гетерозиготности, полученной по фактическим данным по сравнению с аналогичным показателем, вычисленным по теотерической численности генотипов.

Анализ числа эффективных аллелей по гену гормона TG5 показал, что с увеличением гомозиготности происходит уменьшение доли эффективных аллелей, а следовательно, уменьшается и генетическое разнообразие (табл. 7).

Разведение, селекция, генетика

Таблица 7. Число эффективных аллелей в популяциях

Порода Частота аллелей

C±Sc T±Sт

Калмыцкая 0,750±0,056 0,295±0,0755 1,600

Казахская белоголовая 0,750±0,0827 0,250±0,1210 1,600

Герефордская 0,946±0,0266 0,054±0,0821 1,114

Абердин-ангусская 0,864±0,0438 0,136±0,0862 1,308

Симментальская 0,782±0,0499 0,218±0,0781 1,517

Итого 0,739±0,0262 0,261±0,0376 1,627

Так, в популяции крупного рогатого скота абердин-ангусской породы этот показатель оказался самым низким - 1,308, в то время как в популяции герефордского скота оба аллеля гена тиреотропного гормона незначительно различаются (0,15), при этом число эффективных аллелей было наивысшим и составило 1,956.

Обсуждение полученных результатов.

Наши исследования согласуются с публикациями данных ранее проведённых исследований на мясных породах - симментальской, герефордской и шароле [8]. Исследователями были получены данные по частоте встречаемости аллеля С гормона TG5, которая составила соответственно по породам 0,82; 0,93 и 0,72, а аллеля Т гормона TG5 - 0,18; 0,07 и 0,28. Изучая аналогичные показатели, мы получили частоту встречаемости аллеля С в среднем по породам - 0.739 и аллеля Т - 0.261.

В исследованиях, проведённых [9] на популяциях чёрно-пёстрой и холмогорской пород, выявлено два аллеля - TG5С и TG5Т, распределённые по трём генотипам - TG5CC, TG5TC и TG5ТТ. Установлено преобладание особей с нежелательным генотипом TG5СС. При этом частота встречаемости таких животных составила от 64 % до 86 %. Частота встречаемости носителей желательного гомозиготного генотипа TG5ТТ составила от 2,8 % до 7,1 %. В наших исследованиях частота встречаемости генотипов Ш5СС составила 70,91 %, Ш5 ТС - 23,03 % и Ш5 ТТ - 6,06 %.

При идентификации желательных аллелей гена TG5 у коров голштинской породы экотипа «Сайрам» республики Казахстан (п=20) [12], установлено, что частота встречаемости полиморфных аллелей С и Т гормона TG5 соответственно составила 52,5 % и 47,5 %, что значительно выше по алле-лю Т тиреотропного гормона, по сравнению с данными, полученными другими авторами. В наших исследованиях при анализе распределения частот аллелей данного гена у животных симментальской породы брединского мясного типа (п=39) получена достаточно высокая частота встречаемости аллеля Т -21,8 % при соответствующем показателе аллеля С - 78,2 %.

Таким образом, проведённые нами исследования по оценке полиморфизма гена гормона TG5 у крупного рогатого скота мясных пород полностью согласуются с данными, полученными при изучении молочных и мясных пород как в нашей стране, так и за рубежом.

Выводы.

С учётом актуальности проводимых молекулярно-генетических исследований и внедрения их в научное обеспечение производства возникла практическая значимость генетической оценки животных на основе ДНК-диагностики. Проведённые исследования позволили выявить желательные генотипы в популяциях калмыцкой, казахской белоголовой, герефордской, абердин-ангусской и симментальской (брединский мясной тип) пород.

По результатам научных исследований сформирована база данных, включающая материалы генетической экспертизы биосубстратов, полученных от крупного рогатого скота мясных пород, разводимых в Оренбургской, Курганской, Челябинской областях, Ставропольском крае РФ и в Республике Казахстан.

Для увеличения разнообразия по гену гормона TG5 необходимо продолжить работу по дальнейшему выявлению желательных особей, а также по определению взаимосвязи и сравнительной оценки прижизненных показателей мясной продуктивности у животных разных генотипов.

52 Разведение, селекция, генетика

Литература

1. Мирошников С., Макаев Ш., Фомин В. Ведение линий казахского белоголового скота // Молочное и мясное скотоводство. 2012. № 1. С. 4-6.

2. Полиморфизм по генам соматотропина, пролактина, лептина, тиреоглобулина быков-производителей / С.В. Тюлькин, Т.М. Ахматов, Э.Ф. Валиуллина, Р.Р. Вафин // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2012. Т. 16. № 4/2. С. 1008-1011.

3. The TG5 thyroglobulin gene test for a marbling quantitative trait loci evaluated in feedlot cattle / W. Barendse, R. Bunch, M. Thomas, S. Armitage, S. Baud, N. Donaldson // Australian Journal of Experimental Agriculture. 2004. V. 44(7). P 669-674.

4. Markers in DGAT1 and TG genes are not associated with intramuscular lipid content in French beef / G. Renand, N. Pavet, H. Leveziel, C. Denovelle, I.F. Hocquette, I. Lepetit, S. Rousset, V. Dobelin, A. Mal-afosse // In Proceedings of the 53rd international congress of meat science and technology (05-10 August 2007). Beijing, China. 2007. P. 75-76.

5. Validation of commercial DNA tests for quantitative beef quality traits / A.L. Van Eenennaam, J. Li, R.M. Thallman, R.L. Quaas, M.E. Dikeman, C.A. Gill, D.E. Franke, M.G. Thomas // J Anim. Sci. 2007. V. 85. P. 891-900.

6. Association analysis of nucleotide polymorphisms in DGAT1, TG and FABP4 genes and intramuscular fat in crossbred Bos taurus cattle / L. Panier, A.M. Mullen, R.M. Hamill, P.C. Stapleton, T. Sweeney // Meat. Sci. 2010. V. 85. № 3. P. 515-518.

7. DGAT1, a new positional and functional candidate gene for intramuscular fat deposition in cattle / G. Thaller, C. Kuhn, A. Winter, G. Ewald, O. Bellmann, J. Wegner, H. Zuhlke, R. Fries // Anim. Genet. 2003. V. 34. P. 354-357.

8. Kelava N., Konjacic M., Ivanovic A. Effect of TG and DGAT1 polymorphisms on beef carcass traits and fatty acid profile // Acta Veterinaria (Beograd). 2013. V. 63. N1. P. 89-99.

9. Молекулярно-генетическое тестирование быков-производителей по комплексу сочетаний генотипов, коррелирование их генотипов с молочной продуктивностью и качественным составом молока / Ф.Ф. Зиннатова, Ш.К. Шакиров, А.М. Алимов, Ф.Ф. Зиннатов // Молодёжь. Наука. Будущее: технологии и проекты: материалы Междунар. науч.-практ. конф. мол. учёных и специалистов. Казань, 2012. Т. 1. С. 376-380.

10. Relationship among Gene STAR marbling marker, intramuscular fat deposition, and expected progeny differences in early-weaned Simmental steers / C.B. Rincker, N.A. Pyatt, L.L. Berger, D.B. Faulkner // J.Anim.Sci. 2006. V.21. P. 380.

11. Меркурьева Е.К. Генетические основы селекции в скотоводстве. М.: Колос, 1977. 240 с.

12. Байдильдинова Г.К., Рахманов С.С. Исследование полиморфизма генов молочной продуктивности чёрно-пёстрой породы крупного рогатого скота Казахстана // Вестник КазНУ. Серия экологическая. 2014. № 1(40). С. 310-313.

Сурундаева Любовь Геннадьевна, кандидат сельскохозяйственных наук, руководитель лаборатории генетической экспертизы и книг племенных животных ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт мясного скотоводства», 460000, г. Оренбург, ул. 9 Января, 29, тел.: 8(3532)43-46-80, e-mail: lusour@mail.ru

UDC 591.151:636.22/.28.082.13 Surundayeva Lyubov Gennadyevna

FSBSI «All-Russian Research Institute ofBeef Cattle Breeding», e-mail: lusour@mail.ru Allelic polymorphism of thyroglobulin gene in beef cattle

Summary. The studies were conducted on biological samples obtained from breeding animals of the Kalmyk, Kazakh white-headed, Hereford, Angus and Simmental (Bredy meat type) breeds. The frequency of alleles and gene genotypes of the thyroglobulin hormone was defined. The frequency of allele C TG5 hormone was 0,739, T allele - 0,261. The frequency of TG5CC genotypes was 0,709, TG5CT - 0,230 and TG5TT - 0,0606. Breed specific structure was established according to the frequency of occurrence of genotypes and alleles. Genetic

Разведение, селекция, генетика

differences between groups were defined. There was a significant shift of genetic equilibrium according to the studied parameters in the Kalmyk breed. Hereford breed was characterized by the highest level of homozygosity. A database including the results of studies of five beef breeds, bred in Orenburg, Kurgan, Chelyabinsk regions, Stavropol Territory of Russia and Kazakhstan. Key words: cattle, beef breeds, polymorphism, allele, thyroglobulin.

УДК 636.082.12

Молекулярно-генетическое тестирование животных казахского белоголового скота

Ш.А. Макаев1, А.Ф. Рысаев1, А.В. Фомин2

1 ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт мясного скотоводства»

2 СПК «Племзавод «Красный Октябрь»

«Доля высокоценных питательных веществ животного происхождения (незаменимые аминокислоты, жирные кислоты) в говядине от мясного скота на 8-10 процентов выше, чем в мясе молочного скота и других видов животных и птиц.

При откорме жир в тушах мясного скота откладывается не депонировано и не толстым слоем в виде полива, как происходит у животных молочных пород, а на межмышечных и межклеточных соединительных прослойках так и сухожилиях, разрыхляя их.

От этого мясо становится сочным и нежным, то есть более качественным».

А.В. Черекаев, академик РАСХН.

Аннотация. В статье приводятся результаты исследования ДНК-маркеров, которые позволили выявить динамику частоты встречаемости аллелей и генотипов полезных генов мясной продуктивности животных казахской белоголовой породы крупного рогатого скота ведущих племенных хозяйств различных регионов разведения мясного скота.

Ключевые слова: полиморфизм ДНК генов, порода скота, частота встречаемости аллелей, гомозиготные генотипы желательные и нежелательные, линейная принадлежность животных желательных генов CAPN1, CAST, TG5 и BOLA DRB 3.

Введение.

Развитие мясного скотоводства предусматривает не только увеличение объёмов производства говядины, но и улучшение её качества, которое в первую очередь определяется такими показателями, как мраморность и нежность. Сравнительная генетическая характеристика различных пород крупного рогатого скота проводится с использованием ДНК-маркеров, позволяющих оценивать геном животных и генофонд породы с формированием мясной продуктивности.

Вся совокупность исследований показывает, что генофонд пород крупного рогатого скота, различавшихся по направлению продуктивности, имеет характерные особенности, что позволяет выявить не только породы, но и отдельные стада, более пригодные для использования их в селекции по улучшению параметров мясной продуктивности скота.

Получение высококачественной говядины определяется генетическим потенциалом животных и условиями кормлениями [1-5].

Из результатов зоотехнических исследований известно, что наши мелкие скороспелые породы крупного рогатого скота такие, как калмыцкая, казахская, красностепная и их производные при хороших условиях кормления и содержания (при высоком уровне липидного обмена) дают более нежное и мраморное мясо с высокими вкусовыми качествами [6].