ВАРИАНТ Fc-ОБЛАСТИ
Fc-REGION OPTION

Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к вариантам Fc-области, в которых аминокислотные модификации были введены в Fc-область антитела для снижения активности связывания со всеми активирующими FcγR, а в частности, с FcγRIIа (типа R), но с сохранением активности связывания с FcγRIIb, в отличие от полипептида, содержащего Fc-область природного человеческого IgG; к полипептидам, содержащим указанные варианты Fc-области, а также к фармацевтическим композициям, содержащим указанные полипептиды.
Предшествующий уровень техники
Антитела представляют особый интерес как фармацевтические средства, поскольку они обладают высокой стабильностью в плазме и имеют мало побочных эффектов. В настоящее время, на фармацевтическом рынке имеется ряд фармацевтических средств на основе антитела типа IgG, и многие антитело-содержащие фармацевтические средства находятся на стадии разработки (непатентные документы 1 и 2). Кроме того, в литературе имеются сообщения о различных технологиях, в которых используются антитело-содержащие фармацевтические средства второго поколения, включая фармацевтические средства, которые повышают эффекторную функцию и способность связываться с антигеном, улучшают фармакокинетику, повышают стабильность, и фармацевтические средства, которые снижают риск иммуногенности (непатентный документ 3). Вообще говоря, необходимая доза антитело-содержащего фармацевтического средства является очень высокой. Это, в свою очередь, связано с такими проблемами, как высокая стоимость получения указанных средств, а также трудности, приготовления препаратов для подкожного введения. Теоретически, доза антитело-содержащего фармацевтического средства может быть снижена путем улучшения фармакокинетики антител или повышение аффинности связывания антител с антигенами.
В литературе описаны методы улучшения фармакокинетики антител путем искусственной замены аминокислот в константных областях (непатентные документы 4 и 5). Аналогичным образом, в литературе сообщалось, что созревание аффинности используется в качестве представляет технологии повышения способности связываться с антигеном или активности в нейтрализации антигена (непатентный документ 6). Такая технология позволяет повышать активность связывания с антигеном путем введения аминокислотных мутаций в CDR вариабельной области или т.п. Повышение способности связываться с антигеном приводит к усилению биологической активности in vitro или позволяет снизить дозу антитела, а также повысить его эффективность in vivo (непатентный документ 7).
Способность одной молекулы антитела нейтрализовать антиген зависит от аффинности связывания этой молекулы. При повышении аффинности, антиген может быть нейтрализован меньшим количеством антитела. Для повышения аффинности связывания антитела могут быть применены различные методы (непатентный документ 6). Кроме того, если аффинность можно было бы повышать до бесконечности посредством ковалентного связывания антитела с антигеном, то одна молекула антитела могла бы нейтрализовать одну молекулу антигена (двухвалентное антитело может нейтрализовать две молекулы антигена). Однако в методах, существующих в настоящее время, связывание одной одной молекулы антитела с одной молекулой антигена (с двумя антигенами, если это антитело является двухвалентным) ограничено. С другой стороны, недавно сообщалось, что использование антигенсвязывающих молекул, которые связываются с антигенами в зависимости от рН, обеспечивает связывание одной антигенсвязывающей молекулы со многими молекулами антигена (патентный документ 1 и непатентный документ 8). В плазме, в нейтральных условиях, рН-зависимые антигенсвязывающие молекулы эффективно связываются с антигенами и высвобождают антигены в кислотных условиях в эндосомы. Кроме того, антигенсвязывающие молекулы могут повторно связываться с антигеном, если они подвергаются рециклингу в плазме под действием FcRn после высвобождения антигенов, а поэтому, одна рН-зависимая антигенсвязывающая молекула может повторно связываться со многими антигенами.
Кроме того сообщалось, что поскольку рН-зависимые антигенсвязывающие молекулы, модифицированные в целях повышения уровня связывания с FcRn в нейтральных условиях (рН 7,4), способны повторно связываться с антигенами и выводить эти антигены из плазмы, то введение таких антигенсвязывающих молекул позволит выводить антиген из плазмы (патентный документ 2). рН-зависимая антигенсвязывающая молекула, содержащая обычную Fc-область антитела IgG, почти не связывается с FcRn в нейтральных условиях. Следовательно, поглощение комплексов, образованных антигенсвязывающей молекулой с антигеном, клетками может осуществляться, главным образом, за счет неспецифического взаимодействия. В соответствии с этим, рН-зависимые антигенсвязывающие молекулы, которые были модифицированы в целях повышения уровня связывания с FcRn в нейтральных условиях (рН 7,4), могут дополнительно усиливать способность выводить антиген, по сравнению с рН-зависимой антигенсвязывающей молекулой, содержащей обычную Fc-область антитела IgG (патентный документ 2).
Поскольку время удерживания антигенов в плазме является очень коротким по сравнению с продолжительностью действия механизама FcRn-опосредуемого рециклинга антител, то связывание антигена в плазме с антителами по механизму рециклинга (где это связывание не зависит от рН) обычно способствует увеличению времени удерживания антигена в плазме и увеличению концентрации антигена в плазме. Так, например, в случае присутствия антигенов в плазме, имеющих физиологические функции многих типов, даже если физиологическая активность одного типа будет блокироваться посредством связывания с антителом, то симптомы, вызываемые другими физиологическими функциями могут обостряться при повышении концентрации антигенов в плазме, что обусловлено их связыванием с антителом. Поскольку бывают случаи, когда выведение антигенов из плазмы является предпочтительным с этой точки зрения, то в литературе были описаны методы, аналогичные вышеописанным методам, в которых в Fc-области были введены модификации в целях повышения уровня связывания с FcRn для ускорения выведения антигена, однако, до сих пор не появилось каких-либо сообщений о других методах ускорения выведения антигена.
Кроме того, в литературе сообщалось о побочных эффектах, вызываемых некоторыми терапевтическими антителами, продуцированными в результате взаимодействия IgG и FcγR. Например, известно, что у группы пациентов, которым был введен бевацизумаб, то есть, анти-VEGF антитело, наблюдался высокий уровень развития тромбоэмболии (непатентный документ 9). Кроме того, тромбоэмболия также наблюдалась при проведении клинических тестов на продуцирование антитела против лиганда СD40, и такие клинические испытания были прерваны (непатентный документ 10). FcγRIIa, активирующий FcγR-рецептор, экспрессируется на тромбоцитах (непатентный документ 11), и последующие исследования, проводимые на животных-моделях и т.п., позволяют предположить, что оба вводимых антитела вызывают агрегацию тромбоцитов в результате связывания с FcγRIIа на тромбоцитах и образование кровяных сгустков (непатентные документы 12 и 13). Также сообщалось, что у пациентов с системной красной волчанкой, которая является аутоиммунным заболеванием, тромбоциты активируются по FcγRIIа-зависимому механизму, и что такая активация тромбоцитов коррелирует с тяжестью симптомов этого заболевания (непатентный документ 14).
Кроме того, как сообщалось в литературе, исследования, проводимые на животных-моделях, показали, что поливалентные иммунные комплексы «антиген - антитело» индуцируют анафилаксию посредством активирующих FcγR (непатентный документ 15).
Кроме того, сообщалось, что введение поливалентных иммунных комплексов «антиген - антитело» посредством активирующих FcγR приводит к повышению титров продуцируемых антител против антигена (непатентные документы 16 и 17). Полученные результаты дают основание предположить, что антитела против самих терапевтических антител могут быть легче продуцированы в том случае, когда это терапевтическое антитело будет распознавать поливалентные антигены. В случае продуцирования антител против терапевтического антитела, кинетика терапевтического антитела в крови будет ухудшаться, либо нейтрализующие антитела могут ослаблять эффекты терапевтических средств.
Таким образом, связывание антитела с поливалентным антигеном с образованием приводит к образованию иммунного комплекса, а взаимодействие этого комплекса с активирующими FcγR может индуцировать различные побочные эффекты, что, в свою очередь, будет снижать ценность этого антитела как фармацевтического средства.
Предшествующий уровень техники
[Патентные документы]
[Патентный документ 1] WO 2009/125825.
[Патентный документ 2] WO 2011/122011.
[Непатентные документы]
[Непатентный документ 1] Monoclonal antibody successes in the clinic, Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078.
[Непатентный документ 2]: Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibodies market to 2008., Eur. J. Pharm. Biopharm. (2005) 59 (3), 389-396.
[Непатентный документ 3]: Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol. Cells. (2005) 20 (1), 17-29.
[Непатентный документ 4]: Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N, J. Immunol. (2006) 176 (1), 346-356.
[Непатентный документ 5]: Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Nat. Biotechnol. (1997) 15 (7), 637-640.
[Непатентный документ 6]: Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (2005) 102 (24), 8466-8471.
[Непатентный документ 7]: Wu H, Pfarr DS, Johnson S, Brewah YA, Woods RM, Patel NK, White WI, Young JF, Kiener PA., J. Mol. Biol. (2007) 368, 652-665.
[Непатентный документ 8]: Igawa T, et al., Nat. Biotechnol. (2010) 28, 1203-1207.
[Непатентный документ 9]: Scappaticci FA, Skillings JR, Holden SN, Gerber HP, Miller K, Kabbinavar F, Bergsland E, Ngai J, Holmgren E, Wang J, Hurwitz H., Arterial thromboembolic events in patients with metastatic carcinoma treated with chemotherapy and bevacizumab., J. Natl. Cancer Inst. (2007) 99 (16), 1232-1239.
[Непатентный документ 10]: Boumpas DT, Furie R, Manzi S, Illei GG, Wallace DJ, Balow JE, Vaishnaw A, A short course of BG9588 (anti-CD40 ligand antibody) improves serologic activity and decreases hematuria in patients with proliferative lupus glomerulonephritis., Arthritis. Rheum. (2003) 48 (3), 719-727.
[Непатентный документ 11]: Mackay M, Stanevsky A, Wang T, Aranow C, Li M, Koenig S, Ravetch JV, Diamond B., Selective dysregulation of the FcgammaIIB receptor on memory B cells in SLE., J. Exp. Med. (2006) 203 (9), 2157-2164.
[Непатентный документ 12]: Meyer T, Robles-Carrillo L, Robson T, Langer F, Desai H, Davila M, Amaya M, Francis JL, Amirkhosravi A., Bevacizumab immune complexes activate platelets and induce thrombosis in FCGR2A transgenic mice., J. Thromb. Haemost. (2009) 7 (1), 171-181.
[Непатентный документ 13]: Robles-Carrillo L, Meyer T, Hatfield M, Desai H, Davila M, Langer F, Amaya M, Garber E, Francis JL, Hsu YM, Amirkhosravi A., Anti-CD40L immune complexes potently activate platelets in vitro and cause thrombosis in FCGR2A transgenic mice., J. Immunol. (2010) 185 (3), 1577-1583.
[Непатентный документ 14]: Duffau P, Seneschal J, Nicco C, Richez C, Lazaro E, Douchet I, Bordes C, Viallard JF, Goulvestre C, Pellegrin JL, Weil B, Moreau JF, Batteux F, Blanco P., Platelet CD154 potentiates interferon-alpha secretion by plasmacytoid dendritic cells in systemic lupus erythematosus., Sci. Transl. Med. (2010) 2 (47), 47-63.
[Непатентный документ 15]: Bruhns P., Properties of mouse and human IgG receptors and their contribution to disease models. Blood. (2012) 119, 5640-9.
[Непатентный документ 16]: Hjelm F, Carlsson F, Getahun A, Heyman B., Antibody-mediated regulation of the immune response. Scand J Immunol. (2006) 64(3), 177-84.
[Непатентный документ 17]: Wernersson S, Karlsson MC, Dahlstrom J, Mattsson R, Verbeek JS, Heyman B., IgG-mediated enhancement of antibody responses is low in Fc receptor gamma chain-deficient mice and increased in Fc gamma RII-deficient mice. J Immunol. (1999) 163, 618-22.
Описание сущности изобретения
[Проблемы, которые могут быть решены с помощью настоящего изобретения]
Настоящее изобретение было разработано с учетом вышеупомянутых факторов. Целью настоящего изобретения является обеспечение молекул, с использованием которых можно решить проблему связывания с активирующими FcγR путем введения аминокислотной модификации в Fc-область антитела для ускорения элиминации антигена. Более конкретно, целью настоящего изобретения является получение вариантов Fc-области, у которых активность связывания со всеми активирующими FcγR, а в частности, FcγRIIа (типа R), может быть снижена с сохранением активности связывания с FcγRIIb, в отличие от полипептида, содержащего Fc-область природного антитела IgG; и получение полипептидов, содержащих указанные варианты Fc-области, а также получение фармацевтических композиций, содержащих указанные полипептиды.
[Способы решения указанных проблем]
Авторами настоящего изобретения были проведены исследования, посвященные получению вариантов Fc-области, у которых активность связывания со всеми активирующими FcγR, а в частности, FcγRIIа (типа R), может быть снижена с сохранением активности связывания с FcγRIIb, в отличие от полипептида, содержащего Fc-область природного IgG, путем введения аминокислотных модификаций в Fc-область; и получению полипептидов, содержащих указанные варианты Fc-области. В результате, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что активности связывания со всеми активирующими FcγR, а в частности, FcγRIIа (типа R), могут быть снижены с сохранением активности связывания с FcγRIIb путем объединения других аминокислотных модификаций в варианте Fc-области с модификацией аминокислоты в положении 238 в Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией.
Более конкретно, настоящее изобретение относится:
[1] к варианту Fc-области, где указанный вариант имеет модификацию аминокислоты в положении 238 в Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией и любой одной из аминокислот (а)-(k), представленных ниже, где FcγRIIb-связывающая активность указанного варианта сохраняется, а активности связывания этого варианта со всеми активирующими FcγR снижаются по сравнению с активностью нативной Fc-области IgG, и где указанный вариант имеет модификацию:
(а) аминокислоты в положении 235 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(b) аминокислоты в положении 237 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(c) аминокислоты в положении 241 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(d) аминокислоты в положении 268 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(e) аминокислоты в положении 295 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(f) аминокислоты в положении 296 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(g) аминокислоты в положении 298 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(h) аминокислоты в положении 323 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(i) аминокислоты в положении 324 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(j) аминокислоты в положении 330 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией; и
(k) по меньшей мере двух аминокислот, выбранных из (а)-(j);
[2] к вышеуказанному варианту [1], где по меньшей мере две аминокислоты, выбранные как указано выше в (k) по п. [1], представляют собой любую одну из нижеследующих комбинаций аминокислот (1)-(3):
(1) аминокислот в положениях 241, 268, 296 и 324 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(2) аминокислот в положениях 237, 241, 296 и 330 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(3) аминокислот в положениях 235, 237, 241 и 296 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
[3] к варианту Fc-области, где аминокислотой в положении 238 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией является Asp, и где указанный вариант включает любую одну из аминокислот (а)-(k), представленных ниже, где FcγRIIb-связывающая активность указанного варианта сохраняется, а активности связывания этого варианта со всеми активирующими FcγR снижаются по сравнению с активностью нативной Fc-области IgG, и где:
(а) аминокислотой в положении 235 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией является Phe;
(b) аминокислотой в положении 237 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией является Gln или Asp;
(с) аминокислотой в положении 241 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией является Met или Leu;
(d) аминокислотой в положении 268 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией является Pro;
(e) аминокислотой в положении 295 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией является Met или Val;
(f) аминокислотой в положении 296 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией является Glu, His, Asn или Asp;
(g) аминокислотой в положении 298 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией является Ala или Met;
(h) аминокислотой в положении 323 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией является Ile;
(i) аминокислотой в положении 324 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией является Asn или His;
(j) аминокислотой в положении 330 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией является His или Tyr; и
(k) по меньшей мере две аминокислоты выбраны из аминокислот (a)-(j);
[4] к варианту Fc-области, где аминокислотой в положении 238 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией является Asp, и где указанный вариант включает любую одну из аминокислот (1) - (3), представленных ниже, и где:
(1) аминокислотой в положении 241 Fc-области является Met, аминокислотой в положении 268 Fc-области является Pro, аминокислотой в положении 296 Fc-области является Glu, а аминокислотой в положении 324 Fc-области является His в соответствии с Европейской нумерацией;
(2) аминокислотой в положении 237 Fc-области является Gln или Asp, аминокислотой в положении 241 Fc-области является Met, аминокислотой в положении 296 Fc-области является Glu, а аминокислотой в положении 330 Fc-области является His в соответствии с Европейской нумерацией;
(3) аминокислотой в положении 235 Fc-области является Phe, аминокислотой в положении 237 Fc-области является Gln или Asp, аминокислотой в положении 241 Fc-области является Met, а аминокислотой в положении 296 Fc-области является Glu в соответствии с Европейской нумерацией;
[5] к варианту Fc-области, где указанный вариант имеет модификацию аминокислоты в положениях 238 и 271 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией и любой одной из аминокислот (а)-(h), представленных ниже, где FcγRIIb-связывающая активность указанного варианта сохраняется, а активности связывания этого варианта со всеми активирующими FcγR снижаются по сравнению с активностью нативной Fc-области IgG; и где указанный вариант имеет модификацию:
(а) аминокислоты в положении 234 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(b) аминокислоты в положении 235 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(c) аминокислоты в положении 236 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(d) аминокислоты в положении 237 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(e) аминокислоты в положении 239 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(f) аминокислоты в положении 265 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(g) аминокислоты в положении 267 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией; и
(h) аминокислоты в положении 297 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
[6] к вышеуказанному варианту [5], где аминокислотной модификацией является комбинация модификаций любой из аминокислот (1)-(3), представленных ниже:
(1) аминокислот в положениях 233, 238, 264, 267, 268 и 271 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(2) аминокислот в положениях 233, 237, 238, 264, 267, 268, 271, 296, 297, 330 и 396 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(3) аминокислот в положениях 233, 238, 264, 267, 268, 271 и 296 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
[7] к варианту Fc-области, где аминокислотой в положении 238 Fc-области является Asp, а аминокислотой в положении 271 Fc-области является Gly в соответствии с Европейской нумерацией; и где указанный вариант включает любую одну из аминокислот (а) - (h), представленных ниже, где FcγRIIb-связывающая активность указанного варианта сохраняется, а активности связывания этого варианта со всеми активирующими FcγR снижаются по сравнению с активностью нативной Fc-области IgG, и где:
(а) аминокислотой в положении 234 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией является Ala, His, Asn, Lys или Arg;
(b) аминокислотой в положении 235 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией является Ala;
(с) аминокислотой в положении 236 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией является Gln;
(d) аминокислотой в положении 237 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией является Arg или Lys;
(e) аминокислотой в положении 239 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией является Lys;
(f) аминокислотой в положении 265 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией является Lys, Asn, Arg, Ser или Val;
(g) аминокислотой в положении 267 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией является Lys, Arg или Tyr; и
(h) аминокислотой в положении 297 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией является Ala;
[8] к варианту Fc-области, где аминокислотой в положении 238 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией является Asp, а аминокислотой в положении 271 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией является Gly, и где указанный вариант включает любую одну из аминокислот (1)-(3), представленных ниже, и где:
(1) аминокислотой в положении 233 Fc-области является Asp, аминокислотой в положении 238 Fc-области является Asp, аминокислотой в положении 264 Fc-области является Ile, аминокислотой в положении 267 Fc-области является Arg, аминокислотой в положении 268 Fc-области является Glu, а аминокислотой в положении 271 Fc-области является является Gly в соответствии с Европейской нумерацией;
(2) аминокислотой в положении 233 Fc-области является Asp, аминокислотой в положении 237 Fc-области является Asp, аминокислотой в положении 238 Fc-области является Asp, аминокислотой в положении 264 Fc-области является Ile, аминокислотой в положении 267 Fc-области является Ala, аминокислотой в положении 268 Fc-области является Glu, аминокислотой в положении 271 Fc-области является Gly, аминокислотой в положении 296 Fc-области является Asp, аминокислотой в положении 297 Fc-области является Ala, аминокислотой в положении 330 Fc-области является Arg, а аминокислотой в положении 396 Fc-области является Met в соответствии с Европейской нумерацией;
(3) аминокислотой в положении 233 Fc-области является Asp, аминокислотой в положении 238 Fc-области является Asp, аминокислотой в положении 264 Fc-области является Ile, аминокислотой в положении 267 Fc-области является Arg, аминокислотой в положении 268 Fc-области является Pro, аминокислотой в положении 271 Fc-области является Gly, а аминокислотой в положении 296 Fc-области является Glu в соответствии с Европейской нумерацией;
[9] к варианту Fc-области по любому из вышеуказанных пунктов [1]-[8], где его способность связываться с комплементом также является пониженной;
[10] к варианту Fc-области по вышеуказанному пункту [9], где указанный вариант Fc-области, обладающий пониженной способностью связываться с комплементом, имеет модификацию аминокислоты в положении 322 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией или модификации аминокислот в положениях 327, 330 и 331 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
[11] к варианту Fc-области по вышеуказанному пункту [9], где аминокислотой в положении 322 Fc-области является Ala или Glu, аминокислотой в положениии 327 Fc-области является Gly, аминокислотой в положениии 330 Fc-области является Ser и аминокислотой в положениии 331 Fc-области является Ser в соответствии с Европейской нумерацией;
[12] к варианту Fc-области, где указанный вариант включает модификации аминокислот в положениях 238, 271, 327, 330 и 331 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией; и где FcγRIIb-связывающая активность указанного варианта сохраняется, а активности связывания этого варианта со всеми активирующими FcγR снижаются по сравнению с активностью нативной Fc-области IgG;
[13] к варианту по вышеуказанному пункту [12], где указанный вариант также имеет модификацию любой из аминокислот (a)-(e), представленных ниже:
(а) аминокислоты в положении 233 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(b) аминокислоты в положении 237 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(c) аминокислоты в положении 264 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(d) аминокислоты в положении 267 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией; и
(e) аминокислоты в положении 268 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
[14] к варианту по вышеуказанному пункту [13], где аминокислотной модификацией является комбинация модификаций любой из аминокислот (1)-(4), представленных ниже:
(1) аминокислот в положениях 237, 238, 268, 271, 327, 330 и 331 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(2) аминокислот в положениях 233, 237, 238, 268, 271, 327, 330 и 331 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(3) аминокислот в положениях 238, 267, 268, 271, 327, 330 и 331 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией; и
(4) аминокислот в положениях 238, 264, 267, 271, 327, 330 и 331 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
[15] к варианту Fc-области, где аминокислотой в положении 238 Fc-области является Asp, аминокислотой в положении 271 Fc-области является Gly, аминокислотой в положении 327 Fc-области является Gly, аминокислотой в положении 330 Fc-области является Ser, и аминокислотой в положении 331 Fc-области является Ser в соответствии с Европейской нумерацией; и где FcγRIIab-связывающая активность указанного варианта сохраняется, а активности связывания этого варианта со всеми активирующими FcγR снижаются по сравнению с активностью нативной Fc-области IgG;
[16] к варианту по вышеуказанному пункту [15], где указанный вариант также содержит любую из аминокислот (а)-(е), представленных ниже, где:
(a) аминокислотой в положении 233 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией является Asp;
(b) аминокислотой в положении 237 Fc-области в соответствиис Европейской нумерацией является Asp;
(с) аминокислотой в положении 264 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией является Ile;
(d) аминокислотой в положении 267 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией является Ala;
(e) аминокислотой в положении 268 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией является Asp или Glu;
[17] к варианту Fc-области, где аминокислотой в положении 238 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией является Asp, а аминокислотой в положении 271 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией является Gly, и где указанный вариант также включает любую одну из аминокислот (1)-(4), представленных ниже, и где:
(1) аминокислотой в положении 237 Fc-области является Asp, аминокислотой в положении 238 Fc-области является Asp, аминокислотой в положении 268 Fc-области является Asp или Glu; аминокислотой в положении 271 Fc-области является Gly, аминокислотой в положении 327 Fc-области является Gly, аминокислотой в положении 330 Fc-области является Ser, и аминокислотой в положении 331 Fc-области является Ser соответствии с Европейской нумерацией;
(2) аминокислотой в положении 233 Fc-области является Asp, аминокислотой в положении 237 Fc-области является Asp, аминокислотой в положении 238 Fc-области является Asp, аминокислотой в положении 268 Fc-области является Asp, аминокислотой в положении 271 Fc-области является Gly, аминокислотой в положении 327 Fc-области является Gly, аминокислотой в положении 330 Fc-области является Ser, и аминокислотой в положении 331 Fc-области является Ser в соответствии с Европейской нумерацией;
(3) аминокислотой в положении 238 Fc-области является Asp, аминокислотой в положении 267 Fc-области является Ala, аминокислотой в положении 268 Fc-области является Glu, аминокислотой в положении 271 Fc-области является Gly, аминокислотой в положении 327 Fc-области является Gly, аминокислотой в положении 330 Fc-области является Ser, и аминокислотой в положении 331 Fc-области является Ser в соответствии с Европейской нумерацией;
(4) аминокислотой в положении 238 Fc-области является Asp, аминокислотой в положении 264 Fc-области является Ile, аминокислотой в положении 267 Fc-области является Ala, аминокислотой в положении 271 Fc-области является Gly, аминокислотой в положении 327 Fc-области является Gly, аминокислотой в положении 330 Fc-области является Ser, и аминокислотой в положении 331 Fc-области является Ser в соответствии с Европейской нумерацией;
[18] к варианту Fc-области по любому из вышеуказанных пунктов [1]-[17], где указанный вариант обладает FcγRIIb-связывающей активностью, которая составляет по меньшей мере 80% от связывающей активности нативной Fc-области IgG, и FcγRIIaR-связывающей активностью, которая составляет 30% или менее от связывающей активности нативной Fc-области IgG;
[19] к варианту Fc-области по любому из вышеуказанных пунктов [1]-[18], где отношение FcγRIIb-связывающей активности указанного варианта к связывающей активности полипептида, содержащего нативную Fc-область IgG, составляет по меньшей мере 0,75, а отношения активности связывания со всеми активирующими FcγR составляют 0,2 или менее;
[20] к варианту Fc-области по вышеуказанному пункту [19], где, кроме того, отношение FcγRIIаR-связывающей активности указанного варианта к связывающей активности полипептида, содержащего нативную Fc-область IgG, составляет 0,1 или менее;
[21] к полипептиду, содержащему вариант Fc-области по любому из вышеуказанных пунктов [1]-[20];
[22] к полипептиду по вышеуказанному пункту [21], где полипептидом, содержащим вариант Fc-области, является антитело IgG;
[23] к полипептиду по вышеуказанному пункту [21], где полипептидом, содержащим вариант Fc-области, является молекула гибридного Fc-белка;
[24] к фармацевтической композиции, содержащей полипептид по любому из вышеуказанных пунктов [21]-[23], и фармацевтически приемлемый носитель;
[25] к полипептиду по вышеуказанному пункту [21], который также включает антигенсвязывающий домен, обладающий антигенсвязывающей активностью, изменяющейся в зависимости от концентрации ионов;
[26] к полипептиду по вышеуказанному пункту [25], где указанной концентрацией ионов является концентрация ионов кальция;
[27] к полипептиду по вышеуказанному пункту [26], где вышеупомянутый антигенсвязывающий домен при низкой концентрации ионов кальция имеет более низкую антигенсвязывающую активность, чем при высокой концентрации ионов кальция;
[28] к полипептиду по любому из вышеуказанных пунктов [25]-[27], где концентрация ионов зависит от величины рН;
[29] к полипептиду по вышеуказанному пункту [28], где антигенсвязывающий домен при кислотном рН имеет более низкую антигенсвязывающую активность, чем при нейтральном рН;
[30] к полипептиду по любому из вышеуказанных пунктов [25]-[29], где полипептидом, содержащим вариант Fc-области, является антитело IgG;
[31] к полипептиду по любому из вышеуказанных пунктов [25]-[29], где полипептидом, содержащим вариант Fc-области, является молекула гибридного Fc-белка;
[32] к фармацевтической композиции, содержащей полипептид по любому из вышеуказанных пунктов [25]-[31], и фармацевтически приемлемый носитель;
[33] к фармацевтической композиции по вышеуказанному пункту [32], используемой для стимуляции выведения антигена из плазмы, где указанный антиген связывается с антигенсвязывающим доменом полипептида по любому из вышеуказанных пунктов [25]-[31] и присутствует в плазме;
[34] к применению полипептида по любому из вышеуказанных пунктов [25]-[31] для стимуляции выведения антигена из плазмы, где указанный антиген связывается с антигенсвязывающим доменом полипептида и присутствует в плазме;
[35] к способу снижения уровня связывания полипептида, содержащего Fc-область, со всеми активирующими FcγR, с сохранением FcγRIIb-связывающей активности полипептида, где указанный способ включает замену аминокислоты в положении 238 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией и замену по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из аминокислот в положениях 235, 237, 241, 268, 295, 296, 298, 323, 324 и 330 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией, другими аминокислотами;
[36] к способу по вышеуказанному пункту [35], где модификацией аминокислоты Fc-области является замена аминокислоты в положении 238 аминокислотой Asp, замена аминокислоты в положении 235 аминокислотой Phe, замена аминокислоты в положении 237 аминокислотой Gln, замена аминокислоты в положении 241 аминокислотой Met или Leu, замена аминокислоты в положении 268 аминокислотой Pro, замена аминокислоты в положении 295 аминокислотой Met или Val, замена аминокислоты в положении 296 аминокислотой Glu, His, Asn или Asp, замена аминокислоты в положении 298 аминокислотой Ala или Met, замена аминокислоты в положении 323 аминокислотой Ile, замена аминокислоты в положении 324 аминокислотой Asn или His, и замена аминокислоты в положении 330 аминокислотой His или Tyr в соответствии с Европейской нумерацией;
[37] к способу продуцирования полипептида, содержащего вариант Fc-области, где указанный способ включает замену аминокислоты в положении 238 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией, и замену по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из аминокислот в положениях 235, 237, 241, 268, 295, 296, 298, 323, 324 и 330 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией, другими аминокислотами, где уровни связывания этого полипептида со всеми активирующими FcγR снижаются по сравнению с уровнем связывания полипептида до его модификации, но с сохранением FcγRIIb-связывающей активности данного полипептида;
[38] к способу по вышеуказанному пункту [37], где модификацией аминокислоты Fc-области является замена аминокислоты в положении 238 аминокислотой Asp, замена аминокислоты в положении 235 аминокислотой Phe, замена аминокислоты в положении 237 аминокислотой Gln, замена аминокислоты в положении 241 аминокислотой Met или Leu, замена аминокислоты в положении 268 аминокислотой Pro, замена аминокислоты в положении 295 аминокислотой Met или Val, замена аминокислоты в положении 296 аминокислотой Glu, His, Asn или Asp, замена аминокислоты в положении 298 аминокислотой Ala или Met, замена аминокислоты в положении 323 аминокислотой Ile, замена аминокислоты в положении 324 аминокислотой Asn или His, и замена аминокислоты в положении 330 аминокислотой His или Tyr в соответствии с Европейской нумерацией;
[39] к способу снижения активности связывания полипептида, содержащего Fc-область, со всеми активирующими FcγR, с сохранением FcγRIIb-связывающей активности полипептида на уровне, аналогичном уровню связывания нативного IgG, где указанный способ включает объединение и введение аминокислотной(ых) модификации(й), которая(ые) повышает(ют) FcγRIIb-связывающую активность в два раза или более по сравнению с активностью связывания нативной Fc-области IgG, и аминокислотной(ых) модификации(й), которая(ые) снижает(ют) активность связывания со всеми FcγR;
[40] к способу по вышеуказанному пункту [39], где аминокислотной(ыми) модификацией(ями), которая(ые) повышает(ют) FcγRIIb-связывающую активность в два раза или более по сравнению с активностью связывания нативной Fc-области IgG, является(ются) аминокислотная(ые) модификация(и), представленная(ые) в таблице 11;
[41] к способу по вышеуказанному пункту [39] или [40], где аминокислотной(ыми) модификацией(ями), которая(ые) снижает(ют) активности связывания со всеми FcγR, является(ются) замена(ы) по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из аминокислот в положениях 234, 235, 236, 237, 239, 265, 267 и 297 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией, другой аминокислотой;
[42] к способу по любому из вышеуказанных пунктов [39]-[41], где аминокислотной(ыми) модификацией(ями) Fc-области является(ются) замена аминокислоты в положении 234 аминокислотой Ala, His, Asn, Lys или Arg, замена аминокислоты в положении 235 аминокислотой Ala, замена аминокислоты в положении 236 аминокислотой Gln, замена аминокислоты в положении 237 аминокислотой Arg или Lys, замена аминокислоты в положении 239 аминокислотой Lys, замена аминокислоты в положении 265 аминокислотой Lys, Asn, Arg, Ser или Val, замена аминокислоты в положении 267 аминокислотой Lys, Arg или Tyr, и замена аминокислоты в положении 297 аминокислотой Ala в соответствии с Европейской нумерацией;
[43] к способу по любому из вышеуказанных пунктов [35], [36] и [39]-[42], где FcγRIIb-связывающая активность составляет по меньшей мере 80% от связывающей активности нативной Fc-области IgG, а FcγRIIaR-связывающая активность снижена на 30% или менее по сравнению со связывающей активностью нативной Fc-области IgG;
[44] к способу по любому из вышеуказанных пунктов [35], [36] и [39]-[43], где отношение FcγRIIb-связывающей активности указанного варианта к связывающей активности полипептида, содержащего нативную Fc-область IgG, составляет по меньшей мере 0,75, а отношения активности связывания со всеми активирующими FcγR снижены до 0,2 или менее;
[45] к способу по вышеуказанному пункту [44], где, кроме того, отношение FcγRIIаR-связывающей активности указанного варианта к связывающей активности полипептида, содержащего нативную Fc-область IgG, снижено до 0,05 или менее;
[46] к способу получения полипептида, содержащего вариант Fc-области, где активности связывания со всеми активирующими FcγR были снижены, с сохранением FcγRIIb-связывающей активности полипептида на уровне, аналогичном уровню связывания нативного IgG, где указанный способ включает объединение и введение аминокислотной(ых) модификации(й), которая(ые) повышает(ют) FcγRIIb-связывающую активность в два раза или более по сравнению с активностью связывания нативной Fc-области IgG, и аминокислотной(ых) модификации(й), которая(ые) снижает(ют) активность связывания со всеми FcγR;
[47] к способу по вышеуказанному пункту [46], где аминокислотной(ыми) модификацией(ями), которая(ые) повышает(ют) FcγRIIb-связывающую активность в два раза или более по сравнению с активностью связывания нативной Fc-области IgG, является(ются) аминокислотная(ые) модификация(и), представленная(ые) в таблице 11;
[48] к способу по вышеуказанному пункту [46] или [47], где аминокислотной(ыми) модификацией(ями), которая(ые) снижает(ют) активности связывания со всеми FcγR, является(ются) замена(ы) по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из аминокислот в положениях 234, 235, 236, 237, 239, 265, 267 и 297 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией, другой аминокислотой;
[49] к способу по любому из вышеуказанных пунктов [46]-[48], где аминокислотной(ыми) модификацией(ями) Fc-области является(ются) замена аминокислоты в положении 234 аминокислотой Ala, His, Asn, Lys или Arg, замена аминокислоты в положении 235 аминокислотой Ala, замена аминокислоты в положении 236 аминокислотой Gln, замена аминокислоты в положении 237 аминокислотой Arg или Lys, замена аминокислоты в положении 239 аминокислотой Lys, замена аминокислоты в положении 265 аминокислотой Lys, Asn, Arg, Ser или Val, замена аминокислоты в положении 267 аминокислотой Lys, Arg или Tyr, и замена аминокислоты в положении 297 аминокислотой Ala в соответствии с Европейской нумерацией;
[50] к способу по любому из вышеуказанных пунктов [37], [38] и [46]-[49], где FcγRIIb-связывающая активность составляет по меньшей мере 80% от связывающей активности нативной Fc-области IgG, а активность связывания со всеми активирующими FcγR снижена на 30% или менее по сравнению со связывающей активностью нативной Fc-области IgG;
[51] к способу по любому из вышеуказанных пунктов [37], [38] и [46]-[50], где отношение FcγRIIb-связывающей активности указанного варианта к связывающей активности полипептида, содержащего нативную Fc-область IgG, составляет по меньшей мере 0,75, а отношения активности связывания со всеми активирующими FcγR снижены до 0,2 или менее;
[52] к способу по вышеуказанному пункту [51], где, кроме того, отношение FcγRIIаR-связывающей активности указанного варианта к связывающей активности полипептида, содержащего нативную Fc-область IgG, снижено до 0,1 или менее;
[53] к способу по любому из вышеуказанных пунктов [37], [38] и [46]-[52], где указанный способ также включает объединение и введение модификации(й), которая(ые) снижает(ют) активность связывания с комплементом;
[54] к способу по вышеуказанному пункту [53], где модификацией(ями), которая(ые) снижает(ют) активность связывания с комплементом, является(ются) модификация(и) аминокислоты в положении 322 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией или модификация(и) аминокислот в положениях 327, 330 и 331 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
[55] к способу по вышеуказанному пункту [53], где модификацией(ями), которая(ые) снижает(ют) активность связывания с комплементом, является(ются) замена аминокислоты в положении 322 аминокислотой Ala или Glu Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией, или, альтернативно, замена аминокислоты в положении 327 аминокислотой Gly, замена аминокислоты в положении 330 аминокислотой Ser и замена аминокислоты в положении 331 аминокислотой Ser Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
[56] к способу снижения уровня связывания полипептида, содержащего Fc-область, со всеми активирующими FcγR с сохранением FcγRIIb-связывающей активности полипептида, где указанный способ включает замену аминокислот в положениях 238, 271, 327, 330 и 331 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией другими аминокислотами, или замену по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из аминокислот в положениях 233, 237, 264, 267 и 268 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией, другой аминокислотой;
[57] к способу по вышеуказанному пункту [56], где модификацией аминокислоты Fc-области является замена аминокислоты в положении 238 аминокислотой Asp, замена аминокислоты в положении 271 аминокислотой Gly, замена аминокислоты в положении 327 аминокислотой Gly, замена аминокислоты в положении 330 аминокислотой Ser, замена аминокислоты в положении 331 аминокислотой Ser, замена аминокислоты в положении 233 аминокислотой Asp, замена аминокислоты в положении 237 аминокислотой Asp, замена аминокислоты в положении 264 аминокислотой Ile, замена аминокислоты в положении 267 аминокислотой Ala и замена аминокислоты в положении 269 аминокислотами аминокислотой Asp или Glu в Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
[58] к способу продуцирования полипептида, содержащего вариант Fc-области, где указанный способ включает замену аминокислот в положениях 238, 271, 327, 330 и 331 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией другими аминокислотами, или замену по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из аминокислот в положениях 233, 237, 264, 267 и 268 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией, другой аминокислотой, где уровни связывания этого полипептида со всеми активирующими FcγR и с комплементом снижены по сравнению с указанными уровнями до модификации указанного полипептида, но с сохранением FcγRIIb-связывающей активности данного полипептида; и
[59] к способу по вышеуказанному пункту [58], где модификацией аминокислоты Fc-области является замена аминокислоты в положении 238 аминокислотой Asp, замена аминокислоты в положении 271 аминокислотой Gly, замена аминокислоты в положении 327 аминокислотой Gly, замена аминокислоты в положении 330 аминокислотой Ser, замена аминокислоты в положении 331 аминокислотой Ser, замена аминокислоты в положении 233 аминокислотой Asp, замена аминокислоты в положении 237 аминокислотой Asp, замена аминокислоты в положении 264 аминокислотой Ile, замена аминокислоты в положении 267 аминокислотой Ala и замена аминокислоты в положении 269 аминокислотой Asp или Glu в Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способам снижения активности связывания Fc-области со всеми активирующими FcγR, а в частности, с FcγRIIа (тпа R), но с сохранением FcγRIIb-связывающей активности, путем введения в Fc-область аминокислотных модификаций согласно изобретению. Настоящее изобретение также относится к способам подавления продуцирования антител против полипептидов, содержащих Fc-область, путем введения в Fc-область аминокислотных модификаций согласно изобретению.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способам стимуляции выведения антигена, вызывающего заболевание, из плазмы, где указанные способы осуществляют путем введения в Fc-область аминокислотных модификаций согласно изобретению, и к полипептиду, который обладает активностью связывания с антигеном, присутствующим в растворимой форме в плазме, и содержит антигенсвязывающий домен, у которого активность связывания с антигеном изменяется в зависимости от концентрации. Настоящее изобретение также относится к применению варианта Fc-области, продуцированного путем введения в Fc-область аминокислотных модификаций согласно изобретению, и полипептида, который обладает активностью связывания с вызывающим заболевание антигеном, присутствующим в растворимой форме в плазме, и содержит антигенсвязывающий домен, у которого активность связывания с антигеном изменяется в зависимости от концентрации ионов, где указанное применение позволяет стимулировать выведение антигена из плазмы.
Настоящее изобретение также относится к терапевтическому или профилактическому средству для лечения иммунных воспалительных заболеваний, где указанное средство содержит полипептид согласно изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения иммунных воспалительных заболеваний, где указанный способ включает стадию введения индивидууму полипептида согласно изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к набору, применяемому в способе согласно изобретению для лечения или предупреждения иммунных воспалительных заболеваний, где указанный набор содержит полипептид согласно изобретению. Настоящее изобретение также относится к применению полипептида согласно изобретению в целях получения терапевтического или профилактического средства для лечения иммунных воспалительных заболеваний. Кроме того, настоящее изобретение относится к полипептиду согласно изобретению, применяемому в способе лечения или предупреждения иммунных воспалительных заболеваний согласно изобретению.
Настоящее изобретение относится к ингибитору активации В-клеток, тучных клеток, дендритных клеток и/или базофилов, где указанный ингибитор содержит полипептид согласно изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу ингибирования В-клеток, тучных клеток, дендритных клеток и/или базофилов, где указанный способ включает введение индивидууму полипептида согласно изобретению. Настоящее изобретение также относится к набору для его применения в способе ингибирования активации В-клеток, тучных клеток, дендритных клеток и/или базофилов, где указанный набор содержит полипептид согласно изобретению. Настоящее изобретение относится к применению полипептида согласно изобретению для продуцирования ингибиторов активации В-клеток, тучных клеток, дендритных клеток и/или базофилов. Настоящее изобретение также относится к полипептиду согласно изобретению, применяемому в способе ингибирования активации В-клеток, тучных клеток, дендритных клеток и/или базофилов согласно изобретению.
Кроме того, настоящее изобретение относится к терапевтическому средству для лечения заболеваний, ассоциированных с дефицитом белка, необходимого для организма, где указанное средство содержит полипептид согласно изобретению. Настоящее изобретение также относится к способу лечения заболеваний, ассоциированных с дефицитом белка, необходимого для организма, где указанный способ включает введение индивидууму полипептида согласно изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к набору, применяемому в способе согласно изобретению для лечения заболеваний, ассоциированных с дефицитом белка, необходимого для организма, где указанный набор содержит полипептид согласно изобретению. Настоящее изобретение относится к применению полипептида согласно изобретению в целях получения терапевтического средства для лечения заболеваний, ассоциированных с дефицитом белка, необходимого для организма. Настоящее изобретение также относится к полипептиду согласно изобретению, применяемому в способе согласно изобретению для лечения заболеваний, ассоциированных с дефицитом белка, необходимого для организма.
Кроме того, настоящее изобретение относится к средству для подавления пролиферации вируса, где указанное средство содержит полипептид согласно изобретению. Настоящее изобретение также относится к способу подавления пролиферации вируса, где указанный способ включает введение индивидууму полипептида согласно изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к набору, применяемому в способе подавления пролиферации вируса, где указанный набор содержит полипептид согласно изобретению. Настоящее изобретение относится к применению полипептида согласно изобретению в целях получения средства для подавления пролиферации вируса. Настоящее изобретение также относится к полипептиду согласно изобретению, применяемому в способе согласно изобретению для подавления пролиферации вируса.
[Эффекты настоящего изобретения]
Настоящее изобретение относится к вариантам Fc-области, которые обладают пониженной активностью связывания со всеми активирующими FcγR, а в частности, с FcγRIIа (R-типа), по сравнению с активностью природной Fc-области IgG, но, при этом сохраняют природную активность связывания с FcγRIIb. С использованием полипептидов, содержащих варианты Fc-области, могут быть усилены сигналы, ингибирующие воспалительные иммунные ответы, опосредуемые фосфорилированием ITIM FcγRIIb, при условии, что способность элиминировать иммунные комплексы, образуемые посредством FcγRIIb, будет сохраняться на прежнем уровне, то есть, будет аналогичной способности природного IgG. Кроме того, благодаря сообщению Fc-области такого свойства, как селективное связывание с FcγRIIb, может быть ингибировано продуцирование антиантитела. Кроме того, в результате снижения уровня связывания с активирующими FcγR, могут быть предотвращены активация тромбоцитов, опосредуемая взаимодействием между FcγRIIа, присутствующим на тромбоцитах, и иммунным комплексом, а также активация дендритных клеток, индуцируемая перекрестным связыванием активирующих FcγR.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 представлены результаты анализа, проводимого с помощью гель-фильтрации, который подтвердил рН-зависимое образование крупного иммунного комплекса между человеческим IgЕ и рН-зависимым анти-IgЕ антителом, клоном 278.
На фиг.2 показано изменение концентрации человеческого IgЕ в плазме нормальных мышей для группы, которой вводили только человеческий IgЕ, для группы, которой вводили человеческий IgЕ+клон 278 антитела, и для группы, которой вводили человеческий IgЕ+клон 278 антитела.
На фиг.3 показано изменение концентрации антитела в плазме нормальных мышей для группы, которой вводили только человеческий IgЕ+клон 278, и для группы, которой вводили человеческий IgЕ+антитело Xolair.
На фиг. 4 показано изменение концентрации человеческого IgЕ в плазме нормальных мышей для группы, которой вводили только человеческий IgЕ, для группы, которой вводили человеческий IgE+антитело 278-IgG1, и для группы, которой вводили человеческий IgЕ+антитело 278-F760.
На фиг. 5 показано изменение концентрации нормального мышиного антитела для группы, которой вводили человеческий IgE+антитело 278-IgG1, и для группы, которой вводили человеческий IgЕ+антитело 278-F760.
На фиг. 6 показаны результаты анализа, проводимого с использованием уровней экспрессии IL-8 в качестве индикатора для оценки активации ДК Fc-вариантом.
На фиг.7 подтверждена экспрессия CD62p (Р-селектина) на поверхности промытой тромбоцитарной мембраны, в которую добавляли Fc-варианты. Случай добавления 5с8-F648 и стимуляции АДФ показан сплошной линией, а случай добавления 5с8-F600 и стимуляции АДФ показан заштрихованной областью.
На фиг. 8 подтверждена экспрессия активированного интегрина (РАС-1) на поверхности промытой тромбоцитарной мембраны, в которую добавляли Fc-варианты. Случай добавления 5с8-F648 и стимуляции АДФ показан сплошной линией, а случай добавления 5с8-F600 и стимуляции АДФ показан заштрихованной областью.
На фиг. 9 проиллюстрированы механизмы повторного связывания антител, способных к рН-зависимому связыванию с растворимыми антигенами, где: (i) антитело связывается с растворимыми антигенами; (ii) антитело неспецифически поглощается клетками посредством пиноцитоза; (iii) антитело связывается с FcRn в эндосоме, а затем растворимые антигены диссоциируются из антитела; (iv) растворимые антигены транспортируются в лизосому, а затем разлагаются; (v) антитело, из которого диссоциируются растворимые антигены, подвергается рециклингу в плазму под действием FcRn; и (vi) антитело, подвергнутое рециклингу, может повторно связываться с растворимыми антигенами.
На фиг. 10 проиллюстрированы механизмы повышения уровня связывания с FcRn в нейтральных условиях, которое способствует улучшению свойств антител, способных к рН-зависимому повторному связыванию с антигенами, где: (i) антитело связывается с растворимыми антигенами; (ii) антитело поглощается клетками посредством пиноцитоза, опосредуемого FcRn; (iii) растворимые антигены диссоциируются из антитела в эндосому; (iv) растворимые антигены разлагаются после их транспорта в лизосому; (v) антитело, из которого диссоциируются растворимые антигены, подвергается рециклингу в плазму под действием FcRn; и (vi) подвергнутое рециклингу антитело может повторно связываться с растворимыми антигенами.
2+
На фиг. 11 представлены сенсорограммы, полученные с помощью Biacore, на которых продемонстрировано взаимодействие антител против человеческого IgA с человеческим IgA при рН 7,4 или при pH 5,8 и при концентрации Ca 1,2 мМ или 3 мкМ.
На фиг. 12 проиллюстрированы изменения концентраций антител GA2-IgG1 и GA2-F1087 в плазме нормальных мышей.
На фиг. 13 проиллюстрированы изменения концентраций hIgA в плазме нормальных мышей, которым вводили только hIgA, GA2-IgG1 или GA2-F1087.
На фиг. 14 проиллюстрированы изменения концентрации человеческого рецептора IL-6 в плазме нормальных мышей, которым вводили антитело Fv4-mIgG1; антитело Fv4-mIgG1-mF44, представляющее собой вариант Fv4-mIgG1 с повышенной способностью связываться с мышиным FcγRIIb и мышиным FcγRIII; и антитело Fv4-mIgG1-mF46, представляющее собой вариант Fv4-mIgG1 с повышенной способностью связываться с мышиным FcγRIIb и мышиным FcγRIII.
На фиг. 15 проиллюстрированы изменения концентрации человеческого рецептора IL-6 в плазме FcγRIII-дефицитных мышей, которым вводили антитело Fv4-mIgG1; антитело Fv4-mIgG1-mF44, представляющее собой вариант Fv4-mIgG1 с повышенной способностью связываться с мышиным FcγRIIb и мышиным FcγRIII; и антитело Fv4-mIgG1-mF46, представляющее собой вариант Fv4-mIgG1 с повышенной способностью связываться с мышиным FcγRIIb и мышиным FcγRIII.
На фиг. 16 проиллюстрированы изменения концентрации человеческого рецептора IL-6 в плазме мышей, дефицитных по γ-цепи Fc-рецептора, которым вводили антитело Fv4-mIgG1; антитело Fv4-mIgG1-mF44, представляющее собой вариант Fv4-mIgG1 с повышенной способностью связываться с мышиным FcγRIIb и мышиным FcγRIII; и антитело Fv4-mIgG1-mF46, представляющее собой вариант Fv4-mIgG1 с повышенной способностью связываться с мышиным FcγRIIb и мышиным FcγRIII.
На фиг. 17 проиллюстрированы изменения концентрации человеческого рецептора IL-6 в плазме FcγRIIb-дефицитных мышей, которым вводили антитело Fv4-mIgG1; антитело Fv4-mIgG1-mF44, представляющее собой вариант Fv4-mIgG1 с повышенной способностью связываться с мышиным FcγRIIb и мышиным FcγRIII; и антитело Fv4-mIgG1-mF46, представляющее собой вариант Fv4-mIgG1 с повышенной способностью связываться с мышиным FcγRIIb и мышиным FcγRIII.
На фиг. 18 проиллюстрирована взаимосвязь между аминокислотными остатками, составляющими константные области IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 и пронумерованными в соответствии с Европейской нумерацией (которая далее также упоминается как INDEX ЕU).
На фиг. 19 проиллюстрирована эффективность элиминации антигена под действием одной молекулы мультиспецифического рН/Са-зависимого антитела, которое распознает два или более эпитопов, присутствующих на антигенном мономере, и которое может быть использовано для получения крупных иммунных комплексов.
Способ осуществления изобретения
Настоящее изобретение относится к вариантам Fc-области, которые могут снижать активность связывания со всеми активирующими FcγR, а в частности, с FcγRIIа (R-типа), но с сохранением FcγRIIb-связывающей активности, в отличие от полипептида, содержащего нативную Fc-область антитела IgG; и к полипептидам, содержащим такие варианты Fc-области.
Более конкретно, настоящее изобретение относится к вариантам Fc-области, содержащим аминокислотную последовательность, которая имеет комбинацию аминокислотной замены в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) с другими аминокислотными модификациями; и к полипептидам, содержащим такие варианты Fc-области. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам введения аминокислотных модификаций в Fc-область для снижения активности ее связывания со всеми активирующими FcγR, а в частности, с FcγRIIа (R-типа), но с сохранением FcγRIIb-связывающей активности, по сравнению полипептидом, содержащим нативную Fc-область антитела IgG; и к способам введения аминокислотных модификаций в Fc-область для продуцирования полипептидов, содержащих вариант Fc-области, обладающий пониженной активностью связывания со всеми активирующими FcγR, а в частности, с FcγRIIа (R-типа), но сохраняющий FcγRIIb-связывающую активность, по сравнению с полипептидами, содержащими нативную Fc-область антитела IgG. Настоящее изобретение также относится к вариантам Fc-области, в которых были введены аминокислотные модификации, и к полипептидам, которые обладают способностью связываться с вызывающим заболевание антигеном, присутствующим в плазме в растворимой форме, и содержат антигенсвязывающий домен, у которого активность связывания с антигеном изменяется в зависимости от концентрации ионов, а также к способам применения полипептидов для стимуляции выведения антигена из плазмы.
Термин «полипептиды» согласно изобретению в общих чертах означает пептиды или белки, длина которых составляет приблизительно десять или более аминокислот. Кроме того, такие полипептиды могут быть получены от любых организмов без каких-либо ограничений, и такие полипептиды могут представлять собой, например, полипептиды, содержащие искусственно сконструированную последовательность. Кроме того, такими полипептидами могут быть природные полипептиды, синтетические полипептиды, рекомбинантные полипептиды или т.п.
Предпочтительными примерами полипептидов согласно изобретению являются антитела. Более предпочтительными примерами являются природные IgG, а в частности, природные человеческие IgG. Термин «природные (нативные) IgG» означает полипептиды, принадлежащие к классу антител, обычно кодируемых генами гамма-иммуноглобулина и содержащих аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности природных IgG. Так, например, термин «природный человеческий IgG» означает природный человеческий IgG1, природный человеческий IgG2, природный человеческий IgG3, природный человеческий IgG4 или т.п. Природными IgG также являются мутанты, спонтанно продуцируемые из этих IgG.
Если константная область типа IgK (каппа-цепь, k-цепь), IgL1, IgL2, IgL3, IgL6 и IgL7 (лямбда-цепь, λ-цепь) присутствует в константной области легкой цепи антитела, то она может представлять собой любую константную область легкой цепи. Для константной области человеческого IgK (каппа) и константной области человеческого IgL7 (лямбда), множество последовательностей аллотипов, образующихся в результате генетического полиморфизма, описаны в публикации NIH No.91-3242 «Sequences of proteins of immunological interest», и любая из этих последовательностей может быть использована в настоящем изобретении. Кроме того, в настоящем изобретении, константной областью легкой цепи может быть константная область легкой цепи, в которую были введены аминокислотные замены, добавления, делеции, инсерции и/или модификации или т.п. В антителах, например, в антителах IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и IgM имеются Fc-области. Так, например, Fc-областью антитела согласно изобретению может служить Fc-область человеческого антитела IgG, а предпочтительными являются Fc-области человеческого антитела IgG1. Fc-областями, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются, например, Fc-области, происходящие от константных областей природного IgG, или, в частности, константных областей природного человеческого IgG1 (SEQ ID NO: 31), константных областей природного человеческого IgG2 (SEQ ID NО: 32), константных областей природного человеческого IgG3 (SEQ ID NО: 33) и константных областей природного человеческого IgG4 (SEQ ID NО: 34). На фиг. 18 представлены последовательности константной области природных IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Константными областями природных IgG также являются мутанты, спонтанно продуцируемые из этих IgG. Для константных областей человеческих антител IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, множество последовательностей аллотипов, образующихся в результате генетического полиморфизма, описаны в публикации NIH No.91-3242 «Sequences of proteins of immunological interest», и любая из этих последовательностей может быть использована в настоящем изобретении. В частности, аминокислотная последовательность человеческого IgG1 в положениях 356-358 (в соответствии с Европейской нумерацией) может представлять собой DEL или EEM.
Термин «Fcγ-рецепторы» (называемые здесь Fcγ-рецепторами, FcγR или FcgR) означает рецепторы, которые могут связываться с Fc-областью моноклональных антител IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и практически, означает любой член семейства белков, кодируемых генами Fcγ-рецептора. У человека, это семейство включает FcγRI (CD64), включая изоформы FcγRIa, FcγRIb и FcγRIc; FcγRII (CD32), включая изоформы FcγRIIа (включая аллотипы H131 (H-типа) и R131 (R-типа)), FcγRIIb (включая FcγRIIb-1 и FcγRIIb-2) и FcγRIIb-с; а также FcγRIII (CD16), включая изоформы FcγRIIIа (включая аллотипы V158 и F158) и FcγRIIIb (включая аллотипы FcγRIIIb-NA1 и FcγRIIIb-NA2) и любые неограничивающие примеры человеческих изоформ или аллотипов FcγR, которые пока еще не были обнаружены. Сообщалось, что FcγRIIb1 и FcγRIIb2 представляют собой варианты сплайсинга человеческого FcγRIIb. Кроме того, в литературе также описан вариант сплайсинга, обозначаемый FcγRIIb3 (J. Exp Med, 1989, 170: 1369). Человеческий FcγRIIb, помимо этих вариантов сплайсинга, включает все варианты сплайсинга, зарегистрированные в NCBI под номерами NP_001002273.1, NP_001002274.1, NP_001002275.1, NP_001177757.1 и NP_003992.3. Кроме того, человеческий FcγRIIb включает любой ранее описанный генетический полиморфизм, а также FcγRIIb (Arthritis Rheum., 2003, 48: 3242-52, Hum. Mol. Genet, 2005, 14: 2881-92, и Arthritis Rheum, 2002 May; 46(5):1242-54) и каждый генетический полиморфизм, который будет описан в будущем. Неограничивающими примерами FcγR являются человеческие, мышиные, крысиные, кроличьи и обезьяньи FcγR, а также FcγR, которые могут происходить от любого организма. Мышиными FcγR являются FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16) и FcγRIII-2 (CD16-2), и любые неограничивающие примеры мышиных изоформ или аллотипов FcγR, которые пока еще не были обнаружены. Предпочтительными примерами таких Fcγ-рецепторов являются FcγRI (CD64), FcγRIIА (CD32), FcγRIIВ (CD32), FcγRIIIА (CD16) и FcγRIIIВ (CD16).
Полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcγRI представлены в SEQ ID NO: 35 (NM_000566.3) и 36 (NP_000557.1), соответственно;
Полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcγRIIА представлены в SEQ ID NOs: 37 (BC020823.3) и 38 (AAH20823.4), соответственно;
Полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcγRIIb представлены в SEQ ID NOs: 39 (BC146678.1) и 40 (AAI46679.1), соответственно;
Полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcγRIIIА представлены в SEQ ID NOs: 41 (BC033678.1) и 42 (AAH33678.1), соответственно; и
Полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcγRIIIВ представлены в SEQ ID NOs: 43 (BC128562.1) и 44 (AAI28563.1), соответственно (регистрационный номер RefSeq указан в скобках).
FcγRIIа имеет два аллотипа, в одном из которых аминокислотой в положении 131 является гистидин (Н-типа), а в другом, эта аминокислота заменена аргинином (R-типа)(J. Exp. Med, 172, 19-25, 1990).
В FcγRI (CD64), включая FcγRIа, FcγRIb и FcγRIс, и в FcγRIII (CD16), включая изоформу FcγRIIIа (включая аллотипы V158 и F158), α-цепь, которая связывается с Fc-частью IgG, ассоциируется со стандартной γ-цепью, имеющей ITAM, ответственный за передачу сигналов активации вовнутрь клеток. FcγRIIIb (включая аллотипы FcγRIIIb-NA1 и FcγRIIIb-NA2) представляет собой GPI-заякоренный белок. С другой стороны, сам цитоплазматический домен FcγRII (CD32), который содержит изоформы FcγRIIа (включая аллотипы H131 и R131) и FcγRIIс, имеет ITAM. Эти рецепторы экспрессируются на многих иммунных клетках, таких как макрофаги, тучные клетки и антигенпрезентирующие клетки. Сигналы активации, передаваемые при связывании этих рецепторов с Fc-частью IgG, повышают фагоцитарную активность макрофагов, стимулируют продуцирование воспалительных цитокинов, способствуют дегрануляции тучных клеток и улучшают функцию антигенпрезентирующих клеток. Fcγ-рецепторы, обладающие способностью передавать сигналы активации, как описано выше, также называются здесь активирующими Fcγ-рецепторами согласно изобретению.
С другой стороны, сам интрацитоплазматический домен FcγRIIb (включая FcγRIIb1-1 и FcγRIIb-2) содержит ITIM, ответственный за передачу ингибирующих сигналов. Перекрестное связывание FcγRIIb и В-клеточного рецептора (BCR) на В-клетках подавляет сигналы активации, передаваемые BCR, что приводит к подавлению способности В-клеток продуцировать антитело посредством BCR. Перекрестное связывание FcγRIII и FcγRIIb на макрофагах подавляет фагоцитарную активность и способность продуцировать воспалительные цитокины. Fcγ-рецепторы, обладающие способностью передавать ингибирующие сигналы, как описано выше, также называются здесь ингибирующими Fcγ-рецепторами согласно изобретению.
В настоящем изобретении, термин «вариант Fc-области» означает Fc-область, в которой по меньшей мере одна аминокислота согласно изобретению была заменена другой аминокислотой в Fc-области, в которую не была введена аминокислотная модификация согласно изобретению. В настоящем изобретении, термин «Fc-область, в которой по меньшей мере одна аминокислота была заменена другой аминокислотой» означает Fc-область, в которую была введена аминокислотная модификация, и Fc-область, содержащую аминокислотную последовательность, идентичную Fc-области, имеющей аминокислотную модификацию.
Термин «природные IgG (нативные IgG)» означает полипептиды, принадлежащие к классу антител, обычно кодируемых генами гамма-иммуноглобулина и содержащих аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности природных IgG. Так, например, термин «природный человеческий IgG» означает нативный человеческий IgG1, нативный человеческий IgG2, нативный человеческий IgG3, нативный человеческий IgG4 или т.п. Природными IgG также являются мутанты, спонтанно продуцируемые из них, и IgG, в которые были введены модификации, по существу, не влияющие на FcγR-связывающую активность.
Термин «Fc-область нативного IgG» означает Fc-область, содержащую аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности Fc-области, происходящей от природного IgG. Константная область тяжелой цепи нативного IgG представлена на фиг. 18 (SEQ ID NO: 31-34), и, например, означает Fc-области в константных областях тяжелой цепи, происходящих от нативного человеческого IgG1, Fc-области в константных областях тяжелой цепи, происходящих от нативного человеческого IgG2, Fc-области в константных областях тяжелой цепи, происходящих от нативного человеческого IgG3, и Fc-области в константных областях тяжелой цепи, происходящих от нативного человеческого IgG4. Fc-областями природных IgG также являются мутанты, спонтанно продуцированные из этих IgG, и Fc-области, в которые были введены модификации, по существу, не влияющие на FcγR-связывающую активность.
В соответствии с настоящим изобретением, активность связывания полипептида, содержащего вариант Fc-области или вариант Fc-области согласно изобретению, с FcγR каждого типа, независимо от того является ли она повышенной, постоянной или пониженной, может быть определена, например, путем мониторинга снижения или увеличения величины константы диссоциации (KD), вычисленной по результатам анализа сенсорограммы, где различные FcγR, используемые в качестве аналита, подвергают взаимодействию с антителами, иммобилизованными на сенсорных чипах или захваченными на сенсорных чипах посредством белка А, белка L, белка А/G, G-белка, антител против цепи лямбда, антител против цепи каппа, антигенных пептидов, антигеных белков или т.п. с применением оборудования BIACORE, которое представляет собой анализатор взаимодействия, работающий на основе поверхностного плазмонного резонанса (ППР), как описано в примерах или в сравнительных примерах. Альтернативно, такая активность может быть определена путем мониторинга увеличения или уменьшения величины, полученной путем деления величины изменения резонансной единицы (RU) на сенсорограмме до и после взаимодействия FcγR различных типов, используемых в качестве аналита, с антителами, иммобилизованными на сенсорных чипах или захваченными на сенсорных чипах посредством белка А, белка L, белка А/G, G-белка, антител против цепи лямбда, антител против цепи каппа, антигенных пептидов, антигеных белков или т.п., на величину изменения резонансных единиц (RU) до и после иммобизизации или захвата антител на сенсорном чипе. Кроме того, активность может быть определена, например, путем мониторинга увеличения или уменьшения величины константы диссоциации (KD), вычисленной по результатам анализа сенсорограммы, где оцениваемый образец, такой как антитело, используемое в качестве аналита, подвергают взаимодействию на сенсорном чипе, на котором FcγR иммобилизован непосредственно или посредством антитела против метки. Альтернативно, активность может быть определена, например, путем мониторинга увеличения или уменьшения величин на сенсорограмме до и после взаимодействия оцениваемого образца, такого как антитело, используемое в качестве аналита, с сенсорным чипом, на котором FcγR иммобилизован непосредственно или посредством антитела против метки.
В частности, активность связывания варианта Fc-области с Fcγ-рецептором может быть определена путем скрининга, проводимого посредством проксимального гомогенного анализа на активацию люминесценции (ALPHA), с применением метода BIACORE на основе поверхностного плазмонного резонанса (ППР) или т.п., а также с помощью ELISA или клеточного сортинга с активацией флуоресценции (FACS) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010).
ALPHA-скрининг осуществляют с применением ALPHA-технологии, в которой используются две сферы, «донор» и «акцептор», и которая основана на нижеследующих принципах. Люминесцентные сигналы детектируются только в том случае, когда молекулы, связанные с донорными сферами, физически взаимодействуют с молекулами, связаннными с акцепторными сферами, и эти две сферы расположены в непосредственной близости друг к другу. Фотосенсибилизатор с лазерным излучением, присутствующий в донорных сферах, превращает кислород окружающей среды в синглетный кислород в возбужденном состоянии. Синглетный кислород диспергируется вокруг донорных сфер, и когда он достигает соседних акцепторных сфер, в этих сферах индуцируется хемилюминесцентная реакция, приводящая, в конечном счете, к излучению света. Если молекулы, связанные с донорными сферами, не взаимодействуют с молекулами, связанными с акцепторными сферами, то хемилюминесцентной реакции не происходит, поскольку синглетный кислород, продуцируемый донорными сферами, не достигает акцепторных сфер.
Так, например, биотинилированный полипептидный комплекс связывается с донорными сферами, а Fcγ-рецептор, меченный глутатион-S-трансферазой (GST), связывается с акцепторными сферами. В отсутствии конкурирующего полипептидного комплекса, содержащего вариант Fc-области, полипептидный комплекс, содержащий Fc-область дикого типа, взаимодействует с Fcγ-рецептором и продуцирует сигналы на длине волны 520-620 нм. Полипептидный комплекс, содержащий немеченную мутантную Fc-область, конкурирует с полипептидным комплексом, содержащим Fc-область дикого типа, за связывание с Fcγ-рецептором. Относительная активность связывания может быть определена путем количественной оценки снижения интенсивности флуоресценции, наблюдаемого после такого конкурентного связывания. Биотинилирование полипептидных комплексов, таких как антитела, с использованием сульфо-NHS-биотина и т.п. хорошо известно специалистам. Экспрессию Fcγ-рецептора и GST в клетке, несущей гибридный ген, продуцируемый путем присоединения полинуклеотида, кодирующего Fcγ-рецептор, с сохранением рамки считывания, к полинуклеотиду, кодирующему GST в экспрессионном векторе, и проведение очистки на колонке с глутатионом осуществляют методом мечения Fcγ-рецептора ферментом GST. Полученные сигналы, предпочтительно, анализируют, например, путем приведения их в соответствие с односайтовой моделью конкуренции посредством нелинейного регрессионного анализа с помощью компьютерной программы, такой как GRAPHPAD PRISM (GraphPad Inc., San Diego).
При наблюдении взаимодействия, одно из веществ (лиганд) иммобилизуют на тонкой золотой пленке на сенсорном чипе, после чего, при облучении светом с обратной стороны сенсорного чипа так, чтобы на границе между тонкой золотой пленкой и стеклом наблюдалось полное отражение, в части отраженного света образуется участок с пониженной интенсивностью отражения (ППР-сигнал). При наблюдении взаимодействия, в случае, если другое вещество (аналит) наносят на поверхность сенсорного чипа, и если лиганд связывается с аналитом, то масса иммобилизованной лигандной молекулы повышается, что приводит к изменению показателя преломления растворителя на поверхности сенсорного чипа. В результате такого изменения показателя преломления происходит сдвиг положения ППР-сигнала (с другой стороны, при диссоциации такого связывания, сигнал возвращается в свое первоначальное положение). Система Biacore регистрирует величину вышеупомянутого изменения или, более конкретно, изменение массы в зависимости от времени путем построения кривой изменения массы на поверхности сенсорного чипа, отложенной на ординате по данным измерения (сенсорограммы). По этой сенсорограмме определяют количество аналита, связанного с лигандом, захваченным на поверхности сенсорного чипа. Кинетические параметры, такие как константы скорости ассоциации (ka) и константы скорости диссоциации (kd), определяют на кривых сенсорограммы, а константы диссоциации (KD) определяют как отношение этих констант. В анализе BIACORE, предпочтительно, применяется метод оценки ингибирования. Пример такого метода оценки ингибирования описан в Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11): 4005-4010.
Fc-область, в которой сохраняется FcγRIIb-связывающая активность, или полипептид, содержащий такую Fc-область, означает полипептид, который связывается с FcγRIIb с активностью связывания, эквивалентной активности связывания родительского полипептида, или с активностью связывания, почти не отличающейся от активности связывания родительского полипептида, где анализ осуществляют с использованием, в основном, одинаковых количеств полипептида, содержащего Fc-область нативного IgG (также называемого полипептидом, содержащим родительскую Fc-области, или родительским полипептидом), и полипептида, содержащего аминокислотные модификации согласно изобретению в Fc-области (полипептида, содержащего вариант Fc-области). В частности, этот термин означает вариант Fc-области, в котором сохранается по меньшей мере 55,5% FcγRIIb-связывающей активности полипептида, содержащего родительскую Fc-область.
Fc-область, которая обладает пониженной, уменьшенной или аттенюированной активностью связывания с активирующими FcγR, или полипептид, содержащий такую Fc-область, называется вариантом Fc-области или полипептидом, содержащим вариант Fc-области, который обладает, в основном, меньшей активностью связывания с активирующими FcγR по сравнению с полипептидами, содержащими родительскую Fc-область, при этом, анализ на такую активность осуществляют с использованием, в основном, одинаковых количеств полипептида, содержащего Fc-область нативного IgG (также называемого полипептидом, содержащим родительскую Fc-область, или родительским полипептидом) и полипептида, содержащего аминокислотные модификации согласно изобретению в Fc-области (полипептида, содержащего вариант Fc-области).
Способность варианта Fc-области согласно изобретению сохранять FcγRIIb-связывающую активность Fc-области нативного IgG может быть определена путем сравнения величины KD для FcγRIIb полипептида, содержащего вариант Fc-области согласно изобретению, и величины KD для FcγRIIb полипептида, содержащего Fc-область нативного IgG, и такое сравнение может быть осуществлено, например, как описано в вышеупомянутых примерах. В частности, если величина KD для полипептида, содержащего вариант Fc-области согласно изобретению, эквивалентна величине KD или меньше, чем величина KD для полипептида, содержащего родительскую Fc-область, то это означает, что полипептид, содержащий вариант Fc-области согласно изобретению, сохраняет FcγRIIb-связывающую активность полипептида, содержащего вариант родительской Fc-области. Снижение активности связывания варианта Fc-области согласно изобретению с активирующими FcγR по сравнению с активностью нативной Fc-области IgG может быть определено аналогичным образом, например, путем сравнения величины KD для связывания активирующих FcγR с полипептидом, содержащим вариант Fc-области согласно изобретению, с величиной KD для связывания активирующих FcγR с полипептидом, содержащим Fc-область нативного IgG, и такое сравнение может быть осуществлено как описано в вышеупомянутых примерах. В частности, если величина KD для полипептида, содержащего вариант Fc-области согласно изобретению, превышает величину KD для полипептида, содержащего родительскую Fc-область, то это означает, полипептид, содержащий вариант Fc-области согласно изобретению, имеет пониженную активность связывания с активирующими FcγR по сравнению с активностью полипептида, содержащего вариант родительской Fc-области. В частности, поскольку активность связывания с FcγRIIа (R-типа) лучше коррелирует с FcγRIIb-связывающей активностью, чем с активностью связывания с другими активирующими FcγR, то введение аминокислотных модификаций, которые могут снижать активность связывания с FcγRIIа (R-типа), но сохранять активность связывания с FcγRIIb, может оказаться затруднительным для осуществления селективного снижения активности связывания с активирующими FcγR по сравнению с FcγRIIb.
Под эквивалентной или сохраненной активностью связывания с FcγRIIb подразумевается, например, что при определении величин KD описанным выше методом измерения, отношение KD [величина KD для связывания FcγRIIb с полипептидом, содержащим родительскую Fc-область]/[величина KD для связывания FcγRIIb с полипептидом, содержащим вариант Fc-области], предпочтительно, составляет по меньшей мере 0,75, более предпочтительно, по меньшей мере 0,8, а еще более предпочтительно, по меньшей мере 0,9. Кроме того, для подтверждения того, что FcγRIIb-связывающая активность является эквивалентной или сохраненной, необходимо, чтобы величина отношения KD составляла приблизительно 5, причем, это значение является достаточным.
Под снижением, уменьшением или аттенюированием активности связывания с активирующими FcγR подразумевается, например, что при определении величины KD описанным выше методом измерения, отношение KD [величина KD для связывания активирующих FcγR с полипептидом, содержащим родительскую Fc-область]/[величина KD для связывания активирующих FcγR с полипептидом, содержащим вариант Fc-области], предпочтительно, составляет 0,2 или менее, более предпочтительно, 0,15 или менее, а еще более предпочтительно, 0,1 или менее.
В частности, поскольку последовательности внеклеточной области FcγRIIа и FcγRIIb являются идентичными на 93%, и их структуры являются почти одинаковыми, то для снижения FcγRIIаR-связывающей активности и сохранения FcγRIIb-связывающей активности, отношение величин KD [величина KD для связывания FcγRIIаR с полипептидом, содержащим родительскую Fc-область]/[величина KD для связывания FcγRIIаR с полипептидом, содержащим вариант Fc-области] должно составлять предпочтительно, 0,1 или менее, а более предпочтительно, 0,05.
Кроме того, активность связывания полипептидов согласно изобретению с различными FcγR, независимо от того, является ли она повышенной, постоянной или пониженной, может быть определена по увеличению или снижению активности связывания полипептидов согласно изобретению с различными FcγR, как описано выше в примерах. В настоящем изобретении, активность связывания полипептидов с различными FcγR означает величину, полученную путем определения разности относительных величин (RU) на сенсорограммах до и после взаимодействия различных FcγR, используемых в качестве аналита, с каждым полипептидом, и деления этой разности на разность величин RU на сенсорограммах до и после захвата полипептидов на сенсорных чипах.
Кроме того, фраза «Fc-область, имеющая повышенную селективность связывания с FcγRIIb, или полипептид, содержащий такую Fc-область, или Fc-область имеющая пониженную селективность связывания с активирующими FcγR, или полипептид, содержащий такую Fc-область» означает Fc-область, которая имеет пониженную, уменьшенную или аттенуированную активность связывания с активирующими FcγR, но сохраненную FcγRIIb-связывающую активность, или полипептид, содержащий такую Fc-область.
-6
-6
-6
-9
-9
-9
-5
Варианты Fc-области согласно изобретению могут иметь величины KD (моль/л) для FcγRIIb и активирующих FcγR без каких-либо конкретных ограничений, однако, например, величина для FcγRIIb может составлять 7,0×10или менее, предпочтительно, 6,0×10или менее, или более предпочтительно, 5,0×10или менее,а величины для активирующих FcγR могут составлять 2,5×10 или более, предпочтительно, 3,0×10 или более, или более предпочтительно, 3,5×10 или более, а в частности, величина для FcγRIIа (R-типа) предпочтительно, составляет 2,0×10или более.
Термин «Fc-область» означает фрагмент, состоящий из шарнирной области или ее части, и СН2- и СН3-доменов, присутствующих в молекуле антитела. В соответствии с Европейской нумерацией (также называемой здесь EU-индексом) (см. фиг. 18), например, Fc-область класса IgG, означает, например, область, которая простирается от цистеина в положении 226 до С-конца или от пролина в положении 230 до С-конца, но не ограничивается этими областями.
2
Fc-область может быть получена, предпочтительно, путем повторного элюирования фракции, адсорбированной на колонке с белком А и на колонке с G-белком, после частичного гидролиза моноклональных антител IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или т.п. с использованием протеазы, такой как пепсин. Такой протеазой может быть любая протеаза, при условии, что она может гидролизовать полноразмерное антитело так, чтобы фрагменты Fab и F(ab') продуцировались посредством рестрикционного гидролиза в ферментативной реакции, осуществляемой при соответствующем рН и посредством соответствующих ферментов, и примерами таких ферментов являются пепсин и папаин.
Настоящее изобретение относится к варианту Fc-области, имеющему аминокислотные модификации, которые представляют собой комбинацию модификаций, которые включают замену аминокислоты в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) другой аминокислотой и замену одной из аминокислот (а)-(k), указанных ниже, другой аминокислотой в Fc-области человеческого IgG (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4). Введение модификаций в Fc-область может приводить к продуцированию полипептида, содержащего вариант Fc-области, обладающий пониженной активностью связывания со всеми активирующими FcγR, а в частности, с FcγRIIа (R-типа), но сохраняющий FcγRIIb-связывающую активность по сравнению с активностью полипептида, содержащего Fc-область нативного IgG, где указанными модификациями являются:
(а) модификация аминокислоты в положении 235 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(b) модификация аминокислоты в положении 237 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(c) модификация аминокислоты в положении 241 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(d) модификация аминокислоты в положении 268 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(e) модификация аминокислоты в положении 295 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(f) модификация аминокислоты в положении 296 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(g) модификация аминокислоты в положении 298 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(h) модификация аминокислоты в положении 323 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(i) модификация аминокислоты в положении 324 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(j) модификация аминокислоты в положении 330 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией; и
(k) модификация по меньшей мере двух аминокислот, выбранных из (а)-(j);
Комбинация по меньшей мере двух аминокислот, выбранных как указано выше в (k), не имеет конкретных ограничений, при условии, что активности связывания со всеми активирующими FcγR будут снижаться по сравнению с активностью полипептида, содержащего Fc-область нативного IgG, а FcγRIIb-связывающая активность будет сохраняться, при этом, предпочтительными являются нижеследующие комбинации аминокислот (1)-(3):
(1) аминокислот в положениях 241, 268, 296 и 324 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(2) аминокислот в положениях 237, 241, 296 и 330 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией; и
(3) аминокислот в положениях 235, 237, 241 и 296 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией.
Аминокислоты, выбранные для замены, не имеют конкретных ограничений, при условии, что их активность связывания со всеми активирующими FcγR будет снижаться по сравнению с активностью полипептида, содержащего Fc-область нативного IgG, а FcγRIIb-связывающая активность будет сохраняться, где предпочтительными аминокислотами являются: аминокислота Asp в положении 238; аминокислота Phe в положении 235; аминокислота Gln или Asp в положении 237; аминокислота Met или Leu в положении 241; аминокислота Pro в положении 268; аминокислота Glu, His, Asn или Asp в положении 296; аминокислота Met или Val в положении 295; аминокислота Ala или Met в положении 298; аминокислота Ile в положении 323; аминокислота Asn или His в положении 324; и аминокислота His или Tyr в положении 330 в соответствии с Европейской нумерацией. Кроме того, аминокислотами, выбранными для замены в соответствии с настоящим изобретением, как описано выше, предпочтительно, являются аминокислоты (1)-(3):
(1) аминокислота Met в положении 241, аминокислота Pro в положении 268, аминокислота Glu в положении 296, и аминокислота His в положении 324 в Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(2) аминокислота Gln или Asp в положении 237, аминокислота Met в положении 241, аминокислота Glu в положении 296, и аминокислота His в положении 330 в Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией; и
(3) аминокислота Phe в положении 235, аминокислота Gln или Asp в положении 237, аминокислота Met в положении 241, и аминокислота Glu в положении 296 в Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией.
Кроме того, настоящее изобретение относится к варианту Fc-области, содержащему аминокислотные модификации, которые включают комбинации замен аминокислот в положениях 238 и 271 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией на другие аминокислоты, и замен любой одной из аминокислот (а)-(h), представленных ниже, на другую аминокислоту. Введение модификаций в Fc-область может приводить к продуцированию полипептида, содержащего вариант Fc-области, обладающий пониженной активностью связывания со всеми активирующими FcγR, а в частности, с FcγRIIа (R-типа), но сохраняющий FcγRIIb-связывающую активность по сравнению с активностью полипептида, содержащего Fc-область нативного IgG, где указанными модификациями являются:
(а) модификация аминокислоты в положении 234 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(b) модификация аминокислоты в положении 235 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(c) модификация аминокислоты в положении 236 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(d) модификация аминокислоты в положении 237 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(e) модификация аминокислоты в положении 239 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(f) модификация аминокислоты в положении 265 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(g) модификация аминокислоты в положении 267 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией; и
(h) модификация аминокислоты в положении 297 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией.
Комбинации модификаций аминокислот с модификациями аминокислот в положениях 238 и 271 в соответствии с Европейской нумерацией, то есть, с заменой на другие аминокислоты, могут также включать, помимо описанных выше модификаций (а)-(h), модификации других аминокислот. Такие комбинации аминокислот не имеют конкретных ограничений, но предпочтительной является комбинация модификаций аминокислот, выбранных из аминокислот (1)-(3), представленных ниже:
(1) аминокислот в положениях 233, 238, 264, 267, 268 и 271 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(2) аминокислот в положениях 233, 237, 238, 264, 267, 268, 271, 296, 297, 330 и 396 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией; и
(3) аминокислот в положениях 233, 238, 264, 267, 268, 271 и 296 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией.
Аминокислоты, выбранные для замены, не имеют конкретных ограничений, при условии, что их активность связывания со всеми активирующими FcγR будет снижаться по сравнению с активностью полипептида, содержащего Fc-область нативного IgG, а FcγRIIb-связывающая активность будет сохраняться, где предпочтительными аминокислотами являются: аминокислота Asp в положении 238; аминокислота Gly в положении 271; аминокислота Ala, His, Asn, Lys или Arg в положении 234; аминокислота Ala в положении 235; аминокислота Gln в положении 236; аминокислота Arg или Lys в положении 237; аминокислота Lys в положении 239; аминокислота Lys, Asn, Arg, Ser или Val в положении 265; аминокислота Lys, Arg или Tyr в положении 267; и аминокислота Ala в положении 297 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией.
Кроме того, аминокислотами, выбранными для замены в соответствии с настоящим изобретением, как описано выше, предпочтительно, являются аминокислоты (1)-(3):
(1) аминокислота Asp в положении 233, аминокислота Asp в положении 238, аминокислота Ile в положении 264, аминокислота Arg в положении 267, аминокислота Glu в положении 268 и аминокислота Gly в положении 271 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(2) аминокислота Asp в положении 233, аминокислота Asp в положении 237, аминокислота Asp в положении 238, аминокислота Ile в положении 264, аминокислота Ala в положении 267, аминокислота Glu в положении 268, аминокислота Gly в положении 271, аминокислота Asp в положении 296, аминокислота Ala в положении 297, аминокислота Arg в положении 330 и аминокислота Met в положении 396 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией; и
(3) аминокислота Asp в положении 233, аминокислота Asp в положении 238, аминокислота Ile в положении 264, аминокислота Arg в положении 267, аминокислота Pro в положении 268, аминокислота Gly в положении 271 и аминокислота Glu в положении 296 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией.
Кроме того, настоящее изобретение относится к варианту Fc-области, включающему замены аминокислот в положениях 238, 271, 327, 330 и 331 Fc-области человеческого IgG в соответствии с Европейской нумерацией на другие аминокислоты. Настоящее изобретение также относится к варианту Fc-области, содержащему аминокислотные модификации, где указанный вариант также включает комбинацию замен аминокислот по любому из пунктов (а)-(е), представленных ниже, на другие аминокислоты. Введение модификаций в Fc-область может приводить к продуцированию полипептида, содержащего вариант Fc-области, обладающий пониженной активностью связывания со всеми активирующими FcγR, а в частности, с FcγRIIа (R-типа), но сохраняющий FcγRIIb-связывающую активность по сравнению с активностью полипептида, содержащего Fc-область нативного IgG, где указанными модификациями являются:
(а) аминокислота в положении 233 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(b) аминокислота в положении 237 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(с) аминокислота в положении 264 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(d) аминокислота в положении 267 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией; и
(e) аминокислота в положении 268 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией.
Комбинации модификаций аминокислот с модификациями аминокислот в положениях 238 и 271 в соответствии с Европейской нумерацией, то есть, с заменой на другие аминокислоты, могут также включать, помимо описанных выше модификаций (а)-(е), модификации других аминокислот. Такие комбинации аминокислот не имеют конкретных ограничений, но предпочтительной является комбинация модификаций аминокислот, выбранных из аминокислот (1)-(4), представленных ниже:
(1) аминокислот в положениях 237, 238, 268, 271, 327, 330 и 331 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(2) аминокислот в положениях 233, 237, 238, 268, 271, 327, 330 и 331 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(3) аминокислот в положениях 238, 267, 268, 271, 327, 330 и 331 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией; и
(4) аминокислот в положениях 238, 264, 267, 271, 327, 330 и 331 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией.
Аминокислоты, выбранные для замены в соответствии с настоящим изобретением, не имеют конкретных ограничений, при условии, что их активность связывания со всеми активирующими FcγR будет снижаться по сравнению с активностью полипептида, содержащего Fc-область нативного IgG, а FcγRIIb-связывающая активность будет сохраняться, где предпочтительными аминокислотами являются: аминокислота Asp в положении 238; аминокислота Gly в положении 271, аминокислота Gly в положении 327, аминокислота Ser в положении 330, аминокислота Ser в положении 331, аминокислота Asp в положении 233, аминокислота Asp в положении 237, аминокислота Ile в положении 264, аминокислота Ala в положении 267 и аминокислота Asp или Glu в положении 268 в соответствии с Европейской нумерацией.
Кроме того, аминокислотами, выбранными для замены в соответствии с настоящим изобретением, как описано выше, предпочтительно, являются аминокислоты (1)-(4):
(1) аминокислота Asp в положении 237, аминокислота Asp в положении 238, аминокислота Asp или Glu в положении 268; аминокислота Gly в положении 271, аминокислота Gly в положении 327, аминокислота Ser в положении 330 и аминокислота Ser в положении 331 Fc-области соответствии с Европейской нумерацией;
(2) аминокислота Asp в положении 233, аминокислота Asp в положении 237, аминокислота Asp в положении 238, аминокислота Asp в положении 268, аминокислота Gly в положении 271, аминокислота Gly в положении 327, аминокислота Ser в положении 330 и аминокислота Ser в положении 331 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(3) аминокислота Asp в положении 238, аминокислота Ala в положении 267, аминокислота Glu в положении 268, аминокислота Gly в положении 271, аминокислота Gly в положении 327, аминокислота Ser в положении 330 и аминокислота 331 в положении Ser Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией; и
(4) аминокислота Asp в положении 238, аминокислота Ile в положении 264, аминокислота Ala в положении 267, аминокислота Gly в положении 271, аминокислота Gly в положении 327, аминокислота Ser в положении 330 и аминокислота Ser в положении 331 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией.
В настоящем изобретении, в Fc-область может быть введена, помимо указанных модификаций, по меньшей мере еще одна модификация. Такая модификация не имеет конкретных ограничений, при условии, что она будет приводить к снижению активности связываться с активирующими FcγR, но к сохранению FcγRIIb-связывающей активности.
Примерами таких модификаций являются модификации, приводящие к снижению активности связывания с комплементом. Конкретными примерами являются модификация аминокислот в положении 322 в Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией или комбинация модификаций аминокислот в положениях 327, 330 и 331 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией. Аминокислоты, выбранные для замены, не имеют конкретных ограничений, при условии, что их активность связывания с комплементом будет снижаться по сравнению с активностью полипептида, содержащего Fc-область нативного IgG, а также будет снижаться активность связывания со всеми активирующими FcγR, а FcγRIIb-связывающая активность будет сохраняться, при этом, предпочтительными аминокислотами являются: аминокислота Ala или Glu в положении 322, аминокислота Gly в положении 327, аминокислота Ser в положении 330 и аминокислота Ser в положении 331 в соответствии с Европейской нумерацией.
В настоящем изобретении, снижение комплемент-связывающей активности варианта Fc-области или полипептида, содержащего вариант Fc-области согласно изобретению, может быть подтверждено методом, аналогичным описанному выше методу подтверждения снижения FcγR-связывающей активности. В частности, например, такое подтверждение может быть осуществлено путем определения увеличения значения константы диссоциации (KD) по результатам анализа на сенсорограмме, где комплемент взаимодействует как аналит с оцениваемыми антителами, которые иммобилизуют или захватывают на сенсорных чипах с использованием белка А, белка L, белка А/G, G-белка, антител против цепи лямбда, антител против цепи каппа, антигенных пептидов, антигенных белков или т.п. с применением метода BIACORE, который представляет собой метод анализа взаимодействий на основе поверхностного плазмонного резонанса (ППР) как описано в примерах. Альтернативно, это может быть также подтверждено путем определения увеличения значения, полученного путем деления величины изменчивости резонансных единиц (РЕ) на сенсорограмме до и после взаимодействия комплемента как аналита с оцениваемыми антителами, которые иммобилизуют или захватывают на сенсорных чипах с использованием белка А, белка L, белка А/G, G-белка, антител против цепи лямбда, антител против цепи каппа, антигенных пептидов, антигенных белков или т.п., на величину изменчивости резонансных единиц (РЕ) до и после иммобилизации или захвата антител на сенсорном чипе. Кроме того, это может быть также подтверждено путем определения увеличения значения констант диссоциации (KD) по результатам анализа на сенсорограмме, где образец, такой как оцениваемое антитело, подвергают взаимодействию как аналит на сенсорном чипе, на котором был иммобилизован комплемент либо непосредственно, либо посредством антитела против метки. Альтернативно, это может быть также подтверждено путем определения увеличения величины изменчивости на сенсорограмме до и после взаимодействия образца, такого как оцениваемое антитело, как аналита, с сенсорным чипом, на котором был иммобилизован комплемент либо непосредственно, либо посредством антитела против метки. В другом случае, это может быть подтверждено путем оценки уровня связывания с помощью ELISA, который включает добавление комплемент а в планшет, на котором было либо иммобилизовано оцениваемое антитело непосредственно, либо посредством антигена, а затем добавление антитела против человеческого С1q, помеченного пероксидазой или т.п.
Аминокислотные модификации, применяемые для других целей, могут быть также объединены в полипептиде, содержащем вариант Fc-области согласно изобретению. Так, например, могут быть введены аминокислотные замены, повышающие активность связывания с FcRn (J. Immunol. 2006 Jan 1; 176 (1):346-56; J. Biol. Chem. 2006 Aug 18; 281 (33):23514-24; Int. Immunol. 2006 Dec., 18 (12):1759-69; Nat. Biotechnol. 2010 Feb. 28(2):157-9; WO2006/019447; WO2006/053301 и WO2009/086320), и аминокислотные замены, повышающие гетерогенность или стабильность антитела (WO2009/041613). Альтернативно, полипептиды, продуцируемые путем сообщения полипептидам, содержащим вариант Fc-области согласно изобретению, свойств, стимулирующих элиминацию антигенов, как описано в WO2011/122011 или PCT/JP2011/072550, и полипептиды, сообщающие способность повторно связываться с множеством антигенных молекул, как описано в WO2009/125825 или РСТ/JP2011/077619, также входят в объем настоящего изобретения. Альтернативно, для повышения способности полипептидов сохраняться в плазме, аминокислотные модификации, способствующие снижению рI константной области (WO2012/016227), могут быть объединены в полипептиде, содержащем вариант Fc-области согласно изобретению. В другом случае, для сообщения способности связываться с другими антигенами, аминокислотные модификации в СН3, описанные в EP1752471 и EP1772465, могут быть объединены в полипептиде, содержащем вариант Fc-области согласно изобретению.
Если полипептид, содержащий вариант Fc-области согласно изобретению, включает антигенсвязывающий домен, такой как домен антитела, то аминокислотные модификации, вводимые для изменения антигенсвязывающей активности в зависимости от концентрации ионов, могут быть объединены в целях усиления действия полипептида, направленного на элиминацию антигенов из плазмы.
Используемый здесь термин «антигенсвязывающий домен» может означать любую структуру, при условии, что она будет связываться с представляющим интерес антигеном. Такими доменами предпочтительно, являются, например:
вариабельные области тяжелой и легкой цепей антитела;
модуль приблизительно из 35 аминокислот, называемый доменом А, который содержится в белке клеточной мембраны in vivo, Avimer (WO2004/044011, WO2005/040229);
аднектин, содержащий домен 10Fn3, который связывается с белковой частью фибронектина, то есть, гликопротеина, экспрессируемого на клеточной мембране (WO2002/032925);
аффинное антитело, состоящее из трехспирального пучка из 58 аминокислот, находящихся на каркасе IgG-связывающего домена белка А (WO1995/001937);
сконструированные белки анкириновых повторов (DARPin), которые представляют собой область, находящуюся на поверхности молекулы анкириновых повторов (AR), имеющих структуру, в которой субъединица состоит из витка, содержащего 33 аминокислотных остатка, из двух антипараллельных спиралей и петли, имеющей «стэкинг-повторы» (WO2002/020565);
антикалины и т.п., которые представляют собой домены, состоящие из четырех петель, на одной стороне которых имеется структура типа «бочки», состоящая из восьми кольцевых антипараллельных цепей, которые являются в высокой степени консервативными у молекул липокалина, таких как липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов (NGAL) (WO2003/ 029462); и
2
вогнутая область, образованная параллельной складчатой структурой, внутри которой имеется структура в виде «подковы», состоящей из «стэкинг-повторов» богатого лейцином (LRR) модуля вариабельного лимфоцитарного рецептора (VLR), который не имеет иммуноглобулиновой структуры и используется в системе приобретенного иммунитета у бесчелюстных позвоночных, таких как минога и миксины (WO2008/016854). Предпочтительными антигенсвязывающими доменами согласно изобретению являются, например, домены, имеющие вариабельные области тяжелой и легкой цепей антитела. Предпочтительными примерами антигенсвязывающих доменов являются «одноцепочечный Fv (scFv)», «одноцепочечное антитело», «Fv», «одноцепочечный Fv2 (scFv2)», «Fab» и «F(ab')».
Используемый здесь термин «концентрация ионов» включает, например, концентрацию ионов металла. Термин «ионы металла» означает ионы элементов Группы I за исключением водорода, таких как щелочные металлы и медь; элементов Группы II, таких как щелочноземельные металлы и цинк; элементов Группы III, за исключением бора; элементов Группы IV, за исключением углерода и кремния; элементов Группы VIII, таких как железо и платина; элементов, принадлежащих к подгруппе А Групп V, VI и VII, и таких металлов, как сурьма, висмут и полоний. Атомы металлов обладают способностью высвобождать валентные электроны с образованием катионов. Такое свойство называется тенденцией к ионизации. Считается, что металлы, имеющие высокую тенденцию к ионизации, являются химически активными.
В настоящем изобретении, предпочтительными ионами металлов являются, например, ионы кальция. Ионы кальция участвуют в модуляции многих биологических процессов, включая сокращение мышц, таких как скелетные мышцы, гладкие мышцы и сердечные мышцы; активацию двигательных способностей, активацию фагоцитоза и активацию лейкоцитов; активацию изменения формы; активацию секреции и активацию тромбоцитов; активацию лимфоцитов; активацию тучных клеток, включая секрецию гистамина; клеточные ответы, опосредуемые рецептором α-катехоламина или рецептором ацетилхолина; экзоцитоз; высвобождение нейромедиаторов из нервных окончаний и стимуляцию потока аксоплазмы в нейронах. Известными внутриклеточными рецепторами ионов кальция являются тропонин С, кальмодулин, парвальбумин и легкая цепь миозина, которые имеют несколько сайтов, связывающихся с ионами кальция, и, очевидно, происходят от общего предшественника с точки зрения молекулярной эволиции. Также известно множество мотивов, связывающихся с кальцием. Такими хорошо известными мотивами являются, например, домены кадгерина, EF-ветвь кальмодулина, домен C2 протеинкиназы C, домен Gla белка свертывания крови, то есть, фактора IX, лектины рецептора ациларогликопротеина С-типа и рецептор, связывающийся с маннозой, домены А рецепторов ЛНП, аннексин, домен тромбоспонидина типа 3 и EGF-подобные домены.
В настоящем изобретении, если ионами металла являются ионы кальция, то концентрация ионов кальция может быть как низкой, так и высокой. Термин «изменение активности связывания в зависимости от концентрации ионов кальция» означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы варьируется в зависимости от низкой и высокой концентрации ионов кальция. Так, например, антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы может быть выше при высокой концентрации ионов кальция, чем при низкой концентрации ионов кальция. Альтернативно, антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы может быть выше при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция.
В настоящей заявке, высокая концентрация ионов кальция не ограничивается конкретной величиной, однако, предпочтительная концентрация может быть выбрана из величин в пределах 100 мкМ - 10 мM. В другом варианте осуществления изобретения, концентрация может быть выбрана из величин в пределах 200 мкМ - 5 мM. В альтернативном варианте осуществления изобретения, концентрация может быть выбрана из величин в пределах 400 мкМ - 3 мM. В еще одном варианте осуществления изобретения, концентрация может быть выбрана из величин в пределах 200 мкМ - 2 мM. Кроме того, концентрация может быть выбрана из величин в пределах 400 мкМ - 1 мM. В частности, предпочтительной является концентрация, выбранная из величин в пределах 500 мкМ - 2,5 мM, где указанная концентрация является близкой к концентрации ионов кальция в плазме (в крови) in vivo.
В настоящей заявке, низкая концентрация ионов кальция не ограничивается конкретной величиной, однако, предпочтительная концентрация может быть выбрана из величин в пределах 0,1 мкМ - 30 мкМ. В другом варианте осуществления изобретения, концентрация может быть выбрана из величин в пределах 0,2 мкМ - 20 мкМ. В еще одном варианте осуществления изобретения, концентрация может быть выбрана из величин в пределах 0,5 мкМ - 10 мкМ. В альтернативном варианте осуществления изобретения, концентрация может быть выбрана из величин в пределах 1 мкМ - 5 мкМ. Кроме того, концентрация может быть выбрана из величин в пределах 2 мкМ - 4 мкМ. В частности, предпочтительной является концентрация, выбранная из величин в пределах 1 мкМ - 5 мкМ, где указанная концентрация является близкой к концентрации ионизированного кальция в ранних эндосомах in vivo.
В настоящем изобретении, выражение «антигенсвязывающая активность ниже при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция» означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы ниже при концентрации ионов кальция, выбранной из величин в пределах 0,1 мкМ - 30 мкМ, чем при концентрации ионов кальция, выбранной из величин в пределах 100 мкМ - 10 мМ. Предпочтительно, это означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы ниже при концентрации ионов кальция, выбранной из величин в пределах 0,5 мкМ - 10 мкМ, чем при концентрации ионов кальция, выбранной из величин в пределах 200 мкМ - 5 мМ. В частности, предпочтительно, это означает, что антигенсвязывающая активность при этой концентрации ионов кальция в ранней эндосоме in vivo ниже, чем при концентрации ионов кальция в плазме in vivo, а более конкретно это означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы ниже при концентрации ионов кальция, выбранной из величин в пределах 1 мкМ - 5 мкМ, чем при концентрации ионов кальция, выбранной из величин в пределах 500 мкМ - 2,5 мМ.
Изменение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов металла может быть определено, например, с применением известных методов измерения, таких как методы, описанные выше в разделе «Активность связывания». Так, например, для подтверждения того, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы выше при высокой концентрации ионов кальция, чем при низкой концентрации ионов кальция, проводят сравнение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающей молекулы при низкой и при высокой концентрации ионов кальция.
В настоящем изобретении, выражение «антигенсвязывающая активность ниже при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция» может быть также записано как «антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы выше при высокой концентрации ионов кальция, чем при низкой концентрации ионов кальция». В настоящем изобретении, выражение «антигенсвязывающая активность ниже при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция» иногда можно записать иначе, а именно, «способность связывания с антигеном является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция». Кроме того, выражение «антигенсвязывающая активность при низкой концентрации ионов кальция ниже, чем при высокой концентрации ионов кальция» можно записать иначе, а именно, «способность связывания с антигеном при низкой концентрации ионов кальция становится более низкой, чем при высокой концентрации ионов кальция».
При определении антигенсвязывающей активности, условия, не относящиеся к концентрации ионов кальция, могут быть соответствующим образом выбраны самим специалистом и не имеют конкретных ограничений. Так, например, такая активность может быть определена при 37°C в буфере HEPES. Так, например, для определения такой активности может быть применен метод Biacore (GE Healthcare) или т.п. Если антигеном является растворимый антиген, то антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы может быть оценена путем нанесения антигена как аналита на поверхность чипа, на котором иммобилизована антигенсвязывающая молекула. Если антигеном является мембранный антиген, то активность связывания антигенсвязывающей молекулы с мембранным антигеном может быть оценена путем нанесения антигенсвязывающей молекулы как аналита на поверхность чипа, на котором иммобилизован этот антиген.
Если антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы согласно изобретению при низкой концентрации ионов кальция ниже, чем при высокой концентрации ионов кальция, то отношение антигенсвязывающей активности при низкой концентрации ионов кальция и при высокой концентрации ионов кальция не имеет конкретных ограничений, то есть, величина KD (Ca 3 мкМ)/KD (Ca 2 мМ), которая представляет собой отношение константы диссоциации (KD) для антигена при низкой концентрации ионов кальция к KD при высокой концентрации ионов кальция, предпочтительно, составляет 2 или более, а более предпочтительно, величина KD (Ca 3 мкМ)/KD (Ca 2 мМ) составляет 10 или более, а еще более предпочтительно, величина KD (Ca 3 мкМ)/KD (Ca 2 мМ) составляет 40 или более. Верхний предел величины KD (Ca 3 мкМ)/KD (Ca 2 мМ) не имеет конкретных ограничений и может составлять любую величину, такую как 400, 1000 или 10000, при условии, что такая молекула может быть получена известными методами.
Если антигеном является растворимый антиген, то KD (константа диссоциации) может быть использована для представления антигенсвязывающей активности. Кроме того, если антигеном является мембранный антиген, то для представления такой активности может быть использована кажущаяся KD (кажущаяся константа диссоциации). KD (константа диссоциации) и кажущаяся KD (кажущаяся константа диссоциации) могут быть определены известными методами, например, методом Biacore (GE healthcare), по графику Скэтчарда или на проточном цитометре.
Альтернативно, например, константа скорости диссоциации (kd) может быть также предпочтительно использована в качестве индекса для представления отношения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающей молекулы согласно изобретению при низкой и высокой концентрации кальция. Если константа скорости диссоциации (kd) используется вместо константы диссоциации (KD) в качестве индекса для представления отношения активности связывания, то отношение константы скорости диссоциации (kd) при низкой и высокой концентрации кальция, то есть, величина kd (при низкой концентрации кальция)/kd (при высокой концентрации кальция), предпочтительно, составляет 2 или более, более предпочтительно, 5 или более, еще более предпочтительно, 10 или более, а наиболее предпочтительно, 30 или более. Верхний предел величины kd (при низкой концентрации кальция)/kd (при высокой концентрации кальция) не имеет конкретных ограничений и может составлять любую величину, такую как 50, 100 или 200, при условии, что такая молекула может быть получена известными методами.
Если антигеном является растворимый антиген, то kd (константа скорости диссоциации) может быть использована для представления антигенсвязывающей активности. Кроме того, если антигеном является мембранный антиген, то для представления такой антигенсвязывающей активности может быть использована кажущаяся kd (кажущаяся константа скорости диссоциации). kd (константа скорости диссоциации) и кажущаяся kd (кажущаяся константа скорости диссоциации) могут быть определены известными методами, например, методом Biacore (GE healthcare) или на проточном цитометре. В настоящем изобретении, если антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы определяют при различных концентрациях ионов кальция, то такое определение осуществляют, предпочтительно, в тех же самых условиях, за исключением самих концентраций кальция.
Так, например, антигенсвязывающий домен или антигенсвязывающая молекула, антигенсвязывающая активность которых ниже при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция, что является одним из вариантов настоящего изобретения, могут быть получены путем скрининга антигенсвязывающих доменов или антител, включающего нижеследующие стадии (a)-(c):
(а) определение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы при низкой концентрации кальция;
(b) определение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы при высокой концентрации кальция; и
(c) отбор антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, антигенсвязывающая активность которых ниже при низкой концентрации кальция, чем при высокой концентрации кальция.
Кроме того, антигенсвязывающий домен или антигенсвязывающая молекула, антигенсвязывающая активность которых ниже при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция, что является одним из вариантов настоящего изобретения, могут быть получены путем скрининга антигенсвязывающих доменов или антигенсвязывающих молекул или их библиотек, включающего нижеследующие стадии (a)-(c):
(а) контактирование антигена с антигенсвязывающим доменом или антигенсвязывающей молекулой или с их библиотекой при высокой концентрации кальция;
(b) инкубирование антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, которые были связаны с антигеном в стадии (а), при низкой концентрации кальция; и
(c) выделение антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, диссоциированных в стадии (b).
Кроме того, антигенсвязывающий домен или антигенсвязывающая молекула, антигенсвязывающая активность которых ниже при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция, что является одним из вариантов настоящего изобретения, могут быть получены путем скрининга антигенсвязывающих доменов или антигенсвязывающих молекул или их библиотек, включающего нижеследующие стадии (a)-(d):
(а) контактирование антигена с библиотекой антигенсвязывающих доменов или антигенсвязывающих молекул при низкой концентрации кальция;
(b) отбор антигенсвязывающгео домена или антигенсвязывающей молекулы, которые не связывались с антигеном в стадии (а);
(c) связывание антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, отобранных в стадии (b), с антигеном при высокой концентрации кальция; и
(d) выделение антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, которые были связаны с антигеном в стадии (с).
Кроме того, антигенсвязывающий домен или антигенсвязывающая молекула, антигенсвязывающая активность которых ниже при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция, что является одним из вариантов настоящего изобретения, могут быть получены методом скрининга, включающим нижеследующие стадии (a)-(c):
(а) контактирование библиотеки антигенсвязывающих доменов или антигенсвязывающих молекул на колонке, на которой был иммобилизован антиген, при высокой концентрации кальция;
(b) элюирование антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, которые были связаны на колонке в стадии (а), с этой колонки при низкой концентрации кальция; и
(c) выделение антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, элюированных в стадии (b).
Кроме того, антигенсвязывающий домен или антигенсвязывающая молекула, антигенсвязывающая активность которых ниже при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция, что является одним из вариантов настоящего изобретения, могут быть получены методом скрининга, включающим нижеследующие стадии (a)-(d):
(а) пропускание библиотеки антигенсвязывающих доменов или антигенсвязывающих молекул через колонку, на которой был иммобилизован антиген, при низкой концентрации кальция;
(b) сбор антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, которые были элюированы, но не связывались на колонке в стадии (а);
(c) связывание антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, собранных в стадии (b), с антигеном при высокой концентрации кальция; и
(d) выделение антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, которые были связаны с антигеном в стадии (с).
Кроме того, антигенсвязывающий домен или антигенсвязывающая молекула, антигенсвязывающая активность которых ниже при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция, что является одним из вариантов настоящего изобретения, могут быть получены методом скрининга, включающим нижеследующие стадии (a)-(d):
(а) контактирование антигена с библиотекой антигенсвязывающих доменов или антигенсвязывающих молекул при высокой концентрации кальция;
(b) получение антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, которые связывались с антигеном в стадии (а);
(c) инкубирование антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, полученных в стадии (b), антигеном при низкой концентрации кальция; и
(d) выделение антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, антигенсвязывающая активность которых в стадии (с) была ниже величины, соответствующей критерию отбора, применяемому в стадии (b).
Вышеописанные стадии могут быть осуществлены два или более раз. Таким образом, настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим доменам или антигенсвязывающим молекулам, антигенсвязывающая активность которых ниже при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция, где указанные домены или молекулы могут быть получены методами скрининга, которые также включают повторение стадий (a)-(c) или (a)-(d) вышеописанных методов скрининга два или более раз. Число циклов стадий (a)-(c) или (a)-(d) не имеет конкретных ограничений, но обычно оно составляет 10 или менее.
В вышеупомянутых методах скрининга, антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы при низкой концентрации кальция не имеет конкретных ограничений, при условии, что эти домены или молекулы обладают антигенсвязывающей активностью при концентрации ионов кальция в пределах 0,1 мкМ - 30 мкМ, а предпочтительно, в пределах 0,5 мкМ - 10 мкМ. Более предпочтительно, эти домены или молекулы обладают антигенсвязывающей активностью в ранней эндосоме in vivo при концентрации ионов кальция, составляющей, в частности, от 1 мкМ до 5 мкМ. Кроме того, антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы при высокой концентрации кальция не имеет конкретных ограничений при условии, что эти домены или молекулы обладают антигенсвязывающей активностью при концентрации ионов кальция от 100 мкМ до 10 мМ, а предпочтительно, от 200 мкМ до 5 мМ. Более предпочтительно, эти домены или молекулы обладают антигенсвязывающей активностью в плазме in vivo при концентрации ионов кальция, составляющей, в частности, от 0,5 мМ до 2,5 мМ.
Метод, описанный в WO2012/073992 (например, в абзацах 0200-0213) и т.п., может быть представлен как метод скрининга на антигенсвязывающую молекулу или антигенсвязывающий домен, которые имеют более низкую антигенсвязывающую активность при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция, и которые являются одним из вариантов настоящего изобретения.
Антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы может быть измерена известными методами. Другие условия, не относящиеся к концентрации ионов кальция, могут быть определены самим специалистом. Антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы может быть выражена как константа диссоциации (KD), кажущаяся константа диссоциации (кажущаяся KD), константа скорости диссоциации (kd), кажущаяся константа скорости диссоциации (кажущаяся kd) и т.п. Эти константы могут быть определены известными методами, например, методом Biacore (GE healthcare), по графику Скэтчарда или методом FACS.
В настоящем изобретении, стадия отбора антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, антигенсвязывающая активность которых выше при высокой концентрации кальция, чем при низкой концентрации кальция, является синонимом стадии отбора антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, антигенсвязывающая активность которых ниже при низкой концентрации кальция, чем при высокой концентрации кальция.
Если антигенсвязывающая активность выше при высокой концентрации кальция, чем при низкой концентрации кальция, то различие антигенсвязывающих активностей при высокой и низкой концентрации кальция не имеет конкретных ограничений, однако, антигенсвязывающая активность при высокой концентрации кальция, предпочтительно, в два раза или более, более предпочтительно, в 10 раз или более, а еще более предпочтительно, в 40 раз или более превышает антигенсвязывающую активность при низкой концентрации кальция.
Антигенсвязывающими доменами или антигенсвязывающими молекулами согласно изобретению, подвергаемыми скринингу с применением описанных выше методов скрининга, могут быть любые антигенсвязывающие домены и антигенсвязывающие молекулы. Так, например, эти методы могут быть применены для скрининга вышеописанных антигенсвязывающих доменов или антигенсвязывающих молекул. Так, например, скринигу могут быть подвергнуты антигенсвязывающие домены или антигенсвязывающие молекулы, имеющие природные последовательности или замененные аминокислотные последовательности.
Так, например, в одном из вариантов осуществления изобретения, метод, описанный в WO2012/073992 (например, в абзацах 0200-0213) и т.п. может быть представлен как метод скрининга на антигенсвязывающую молекулу или антигенсвязывающий домен, которые имеют более низкую антигенсвязывающую активность при низкой концентрации ионов кальция.
Антигенсвязывающие домены или антигенсвязывающие молекулы согласно изобретению, антигенсвязывающая активность которых изменяется в зависимости от концентрации ионов кальция, как может быть определено путем проведения вышеописанных методов скрининга, могут быть получены любым способом. Так, например, если концентрация ионов металла означает концентрацию ионов кальция, то могут быть использованы уже существующие антигенсвязывающие домены или антигенсвязывающие молекулы, уже существующие библиотеки (фаговые библиотеки и т.п.), антитела или библиотеки, происходящие от гибридом, полученных путем иммунизации животных или из B-клеток иммунизованных животных; антитела или библиотеки, полученные путем введения аминокислот, способных образовывать хелатные комплексы с кальцием (например, путем введения аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты) или введения неприродных аминокислотных мутаций в вышеописанные антитела или библиотеки (библиотеки, созданные путем увеличения числа аминокислот, способных образовывать хелатные комплексы с кальцием (таких как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота) или неприродных аминокислот; и библиотеки, полученные путем введения аминокислот, способных образовывать хелатные комплексы с кальцием (таких как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота) или неприродных аминокислотных мутаций в конкретных положениях или т.п.
Примерами аминокислот, способных модифицировать антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул в зависимости от концентрации ионов, как описано выше, могут быть аминокислоты любого типа, при условии, что такие аминокислоты будут образовывать кальций-связывающий мотив. Кальций-связывающие мотивы хорошо известны специалистам и подробно описаны в литературе (например, Springer et al. (Cell (2000) 102, 275-277), Kawasaki and Kretsinger (Protein Prof. (1995) 2, 305-490), Moncrief et al. (J. Mol. Evol. (1990) 30, 522-562), Chauvaux et al. (Biochem. J. (1990) 265, 261-265), Bairoch and Cox (FEBS Lett. (1990) 269, 454-456), Davis (New Biol. (1990) 2, 410-419), Schaefer et al (Genomics (1995) 25, 638-643), Economou et al. (EMBO J. (1990) 9, 349-354), Wurzburg Luo (Structure. (2006) 14, 6, 1049-1058)). В частности, в антигенсвязывающие молекулы согласно изобретению могут быть включены любые известные кальций-связывающие мотивы, включая лектины типа С, такие как ASGPR, CD23, MBR и DC-SIGN. Предпочтительными примерами таких кальций-связывающих мотивов также являются, помимо вышеописанных мотивов, кальций-связывающий мотив, присутствующий в антигенсвязывающем домене SEQ ID NO: 45.
Кроме того, в качестве аминокислот, изменяющих антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих доменов, включенных в антигенсвязывающие молекулы согласно изобретению, в зависимости от концентрации ионов кальция, предпочтительно, могут быть также использованы аминокислоты, обладающие активностью, направленной на образование хелатных комплексов с металлом. Примерами таких аминокислот, образующих хелатные комплексы с металлом, являются серин (Ser (S)), треонин (Thr (T)), аспарагин (Asn (N)), глутамин (Gln (Q)), аспарагиновая кислота (Asp (D)) и глутаминовая кислота (Glu (E)).
Положения в антигенсвязывающих доменах, в которых присутствуют вышеописанные аминокислоты, не имеют конкретных ограничений, и такими положениями могут быть любые положения в вариабельной области тяжелой цепи или в вариабельной области легкой цепи, образующие антигенсвязывающий домен, при условии, что эти аминокислоты будут изменять антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул в зависимости от концентрации ионов кальция. В неограничивающем варианте осуществления изобретения, антигенсвязывающие домены согласно изобретению могут быть получены из библиотеки, состоящей, главным образом, из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга, и в которых антигенсвязывающие домены тяжелой цепи содержат аминокислоты, изменяющие антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул в зависимости от концентрации ионов кальция. В другом неограничивающем варианте осуществления изобретения, антигенсвязывающие домены согласно изобретению могут быть получены из библиотеки, состоящей, главным образом, из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга, и в которых антигенсвязывающие домены CDR3 тяжелой цепи содержат вышеупомянутые аминокислоты. В еще одном варианте осуществления изобретения, антигенсвязывающие домены согласно изобретению могут быть получены из библиотеки, состоящей, главным образом, из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга, и в которых антигенсвязывающие домены CDR3 тяжелой цепи содержат вышеупомянутые аминокислоты в положениях 95, 96, 100a и/или 101 в соответствии с системой нумерации Кэбата.
Кроме того, в неограничивающем варианте осуществления изобретения, антигенсвязывающие домены согласно изобретению могут быть получены из библиотеки, состоящей, главным образом, из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга, и в которых антигенсвязывающие домены легкой цепи содержат аминокислоты, изменяющие антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул в зависимости от концентрации ионов кальция. В другом неограничивающем варианте осуществления изобретения, антигенсвязывающие домены согласно изобретению могут быть получены из библиотеки, состоящей, главным образом, из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга, и в которых антигенсвязывающие домены CDR1 легкой цепи содержат вышеупомянутые аминокислоты. В еще одном варианте осуществления изобретения, антигенсвязывающие домены согласно изобретению могут быть получены из библиотеки, состоящей, главным образом, из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга, и в которых антигенсвязывающие домены CDR1 легкой цепи содержат вышеупомянутые аминокислоты в положениях 30, 31 и/или 32 в соответствии с системой нумерации Кэбата.
В другом неограничивающем варианте осуществления изобретения, антигенсвязывающие домены согласно изобретению могут быть получены из библиотеки, состоящей, главным образом, из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга, и в которых домены CDR2 легкой цепи содержат вышеупомянутые аминокислотные остатки. В другом своем неограничивающем варианте, настоящее изобретение относится к библиотекам, состоящим, главным образом, из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга, и в которых антигенсвязывающие домены CDR2 легкой цепи содержат вышеупомянутые аминокислотные остатки в положении 50 в соответствии с системой нумерации Кэбата.
В другом варианте осуществления изобретения, антигенсвязывающие домены согласно изобретению могут быть получены из библиотеки, состоящей, главным образом, из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга, и в которых антигенсвязывающие домены CDR3 легкой цепи содержат вышеупомянутые аминокислотные остатки. В альтернативном варианте осуществления изобретения, антигенсвязывающие домены согласно изобретению могут быть получены из библиотеки, состоящей, главным образом, из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга, и в которых домены CDR3 легкой цепи содержат вышеупомянутые аминокислотные остатки в положении 92 в соответствии с системой нумерации Кэбата.
Кроме того, в другом варианте осуществления изобретения, антигенсвязывающие домены согласно изобретению могут быть получены из библиотеки, состоящей, главным образом, из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга, и в которых две или три CDR, выбранных из вышеупомянутых CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, содержат вышеупомянутые аминокислотные остатки. Кроме того, антигенсвязывающие домены согласно изобретению могут быть получены из библиотеки, состоящей, главным образом, из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга, и в которых легкие цепи содержат вышеупомянутые аминокислотные остатки в любых одном или более положениях 30, 31, 32, 50 и/или 92 в соответствии с системой нумерации Кэбата.
В конкретном предпочтительном варианте осуществления изобретения, каркасные последовательности вариабельной области легкой цепи и/или тяжелой цепи антигенсвязывающей молекулы, предпочтительно, содержат каркасные последовательности человеческой зародышевой линии. Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения, если каркасными последовательностями являются полностью человеческие последовательности, то предполагается, что такая антигенсвязывающая молекула согласно изобретению, при ее введении человеку (например, для лечения заболевания), будет индуцировать незначительный иммунный ответ или вообще не будет индуцировать такой ответ. Исходя из указанного выше, термин «содержащий последовательность зародышевой линии», используемый в настоящем изобретении, означает, что часть каркасных последовательностей согласно изобретению идентична части любых каркасных последовательностей человеческой зародышевой линии. Так, например, если последовательность FR2 тяжелой цепи антигенсвязывающей молекулы согласно изобретению представляет собой комбинацию последовательностей FR2 тяжелой цепи, происходящих от различных каркасных последовательностей человеческой зародышевой линии, то такая молекула также представляет собой антигенсвязывающую молекулу согласно изобретению, «содержащую последовательность зародышевой линии».
Предпочтительными примерами каркасных последовательностей являются, например, полностью человеческие последовательности каркасной области, известные специалистам и имеющиеся на web-сайте V-Base (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) или т.п. Эти последовательности каркасной области могут быть соответствующим образом использованы в качестве последовательности зародышевой линии, содержащейся в антигенсвязывающей молекуле согласно изобретению. Последовательности зародышевой линии могут быть классифицированы по категориям исходя из их сходства (Tomlinson et al. (J. Mol. Biol. (1992) 227, 776-798), Williams and Winter (Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1456-1461), Cox et al. (Nat. Genetics (1994) 7, 162-168)). Соответствующие последовательности зародышевой линии могут быть выбраны из группы Vκ, которая подразделяется на семь подгрупп; группы Vλ, которая подразделяется на десять подгрупп; и группы VH, которая подразделяется на семь подгрупп.
Полностью человеческие последовательности VH включают, но не ограничиваются ими, например, последовательности VH:
последовательности подгруппы VH1 (например, VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58 и VH1-69);
последовательности подгруппы VH2 (например, VH2-5, VH2-26, VH2-70);
последовательности подгруппы VH3 (VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3 -13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73 и VH3-74);
последовательности подгруппы VH4 (VH4-4, VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59 и VH4-61);
последовательности подгруппы VH5 (VH5-51);
последовательности подгруппы VH6 (VH6-1); и
последовательности подгруппы VH7 (VH7-4 и VH7-81).
Эти последовательности также описаны в известных документах (Matsuda et al., J. Exp. Med. (1998) 188, 1973-1975) и т.п., и таким образом, специалист в данной области может сконструировать соответствующие антигенсвязывающие молекулы согласно изобретению исходя из информации об этих последовательностях. Также может оказаться предпочтительным использование других полностью человеческих каркасных областей или каркасных подобластей.
Полностью человеческие последовательности Vκ предпочтительно включают, но не ограничиваются ими, например:
последовательности A20, A30, L1, L4, L5, L8, L9, L11, L12, L14, L15, L18, L19, L22, L23, L24, O2, O4, O8, O12, O14 и O18, принадлежащие к подгруппе Vk1;
последовательности A1, A2, A3, A5, A7, A17, A18, A19, A23, O1 и O11, принадлежащие к подгруппе Vk2;
последовательности A11, A27, L2, L6, L10, L16, L20 и L25, принадлежащие к подгруппе Vk3;
последовательность B3, принадлежащую к подгруппе Vk4;
последовательность B2 (также называемую здесь Vk5-2), принадлежащую к подгруппе Vk5; и
последовательности A10, A14 и A26, принадлежащие к подгруппе Vk6; (Kawasaki et al. (Eur. J. Immunol. (2001) 31, 1017-1028), Schable and Zachau (Biol. Chem. Hoppe Seyler (1993) 374, 1001-1022) и Brensing-Kuppers et al. (Gene (1997) 191, 173-181)).
Полностью человеческие последовательности Vλ, предпочтительно, включают, но не ограничиваются ими, например:
последовательности V1-2, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7 и V1-9, V1-11, V1-13, V1-16, V1-17, V1-18, V1-19, V1-20 и V1-22, принадлежащие к подгруппе VL1;
последовательности V2-1, V2-6, V2-7, V2-8, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17 и V2-19, принадлежащие к подгруппе VL2;
последовательности V3-2, V3-3 и V3-4, принадлежащие к подгруппе VL3;
последовательности V4-1, V4-2, V4-3, V4-4 и V4-6, принадлежащие к подгруппе VL4; и
последовательности V5-1, V5-2, V5-4 и V5-6, принадлежащие к подгруппе VL5 (Kawasaki et al. (Genome Res. (1997) 7, 250-261)).
Обычно, эти каркасные последовательности отличаются друг от друга одним или более аминокислотными остатками. Эти каркасные последовательности могут быть использованы в комбинации «по меньшей мере с одним аминокислотным остатком, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов» согласно изобретению. Другими примерами подностью человеческих каркасных последовательностей, используемых в комбинации «по меньшей мере с одним аминокислотным остатком, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов» согласно изобретению, являются, но не ограничиваются ими, например, KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY и POM (например, Kabat et al. (1991) см. выше, и Wu et al. (J. Exp. Med. (1970) 132, 211-250)).
Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, авторы лишь отмечают, что одна из причин использования последовательностей зародышевой линии, которые предотвращают вырабатывание нежелательных иммунных ответов у большинства индивидуумов, заключается в следующем. В результате созревания аффинности в процессе вырабатывания нормальных иммунных ответов часто возникает соматическая мутация в вариабельных областях иммуноглобулина. Такие мутации возникают, главным образом, возле CDR, последовательности которых являются гипервариабельными, а также влияют на остатки каркасных областей. Такие мутации в каркасных областях отсутствуют в генах зародышевой линии, а поэтому, маловероятно, что они будут иммуногенными для пациента. С другой стороны, для здоровых людей большое значение имеют, главным образом, каркасные последовательности, экспрессируемые генами зародышевой линии. В результате вырабатывания иммунологической толерантности, эти каркасные области зародышевой линии, вероятно, будут иметь низкую иммуногенность у пациентов или вообще не будут обладать такой иммуногенностью. Для повышения вероятности развития иммунологической толерантности, гены, кодирующие вариабельную область, могут быть выбраны из группы наиболее распространенных функциональных генов зародышевой линии.
Для продуцирования антигенсвязывающих молекул согласно изобретению, в которых вышеописанные последовательности вариабельной области, последовательности вариабельной области тяжелой или легкой цепи, последовательности CDR или каркасные последовательности содержат аминокислоты, изменяющие антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул в зависимости от концентрации ионов кальция, могут быть применены соответствующие известные методы, такие как сайт-направленный мутагенез (Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) и ПЦР с перекрывающимся удлинением.
Так, например, библиотека, содержащая множество антигенсвязывающих молекул согласно изобретению, последовательности которых отличаются друг от друга, может быть сконструирована путем объединения вариабельных областей тяжелой цепи, полученных в виде рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельных областей, с вариабельной областью легкой цепи, выбранной как каркасная последовательность, которая по своей природе содержит по меньшей мере один аминокислотный остаток, изменяющий антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул в зависимости от концентрации ионов кальция. В неограничивающем примере, если концентрацией ионов является концентрация ионов кальция, то такими предпочтительными библиотеками являются, например, библиотеки, сконструированные путем объединения последовательности вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: An 45 (Vk5-2) и последовательности вариабельной области тяжелой цепи, продуцированной в виде рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области.
Альтернативно, последовательность вариабельной области легкой цепи, выбранная как каркасная область, которая, по своей природе содержит по меньшей мере один аминокислотный остаток, изменяющий антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов кальция, как упоминалось выше, может быть сконструирована так, чтобы она содержала различные аминокислотные остатки, не являющиеся аминокислотными остатками, упомынутыми выше. В настоящем изобретении, такие остатки называются гибкими остатками. Число и положение гибких остатков не ограничивается конкретными вариантами, при условии, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы согласно изобретению будет варьироваться в зависимости от концентрации ионов. В частности, последовательности CDR и/или последовательности FR тяжелой цепи и/или легкой цепи могут содержать один или более гибких остатков. Так, например, если концентрацией ионов является концентрация ионов кальция, то неограничивающими примерами гибких остатков, вводимых в последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 45 (Vk5-2), являются аминокислотные остатки, перечисленные в таблицах 1 или 2.
Таблица 1
CDR
Нумерация по Кэбату
30% всех аминокислот
CDR1
28
S: 100%
29
I: 100%
30
E: 72%
N: 14%
S: 14%
31
D: 100%
32
D: 100%
33
L: 100%
34
A: 70%
N: 30%
CDR2
50
E: 100%
51
A: 100%
52
S: 100%
53
H: 5%
N: 25%
S: 45%
Т: 25%
54
L: 100%
55
Q: 100%
56
S: 100%
CDR3
90
Q: 100%
91
H: 25%
S: 15%
R: 15%
Y: 45%
92
D: 80%
N: 10%
S: 10%
93
D: 5%
G: 10%
N: 25%
S: 50%
R: 10%
94
S: 50%
Y: 50%
95
P: 100%
96
L: 50%
Y: 50%
(Положения пронумерованы по Кэбату)
Таблица 2
CDR
Нумерация по Кэбату
70% всех аминокислот
CDR1
28
S: 100%
29
I: 100%
30
E: 83%
S: 17%
31
D: 100%
32
D: 100%
33
L: 100%
34
A: 70%
N: 30%
CDR2
50
E: 100%
51
A: 100%
52
S: 100%
53
H: 5%
N: 25%
S: 45%
Т: 25%
54
L: 100%
55
Q: 100%
56
S: 100%
CDR3
90
Q: 100%
91
H: 25%
S: 15%
R: 15%
Y: 45%
92
D: 80%
N: 10%
S: 10%
93
D: 5%
G: 10%
N: 25%
S: 50%
R: 10%
94
S: 50%
Y: 50%
95
P: 100%
96
L: 50%
Y: 50%
(Положения пронумерованы по Кэбату)
В настоящей заявке, гибкие остатки называются вариантами аминокислотных остатков, присутствующих в гипервариабельных положениях, в которых несколько различных аминокислот присутствуют в вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи, что соответствует аминокислотным последовательностям известных и/или нативных антител или антигенсвязывающих доменов, как это видно из их сравнения. Гипервариабельные положения обычно присутствуют в CDR. В одном из вариантов осуществления изобретения, данные, представленные в руководстве Кэбата (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health Bethesda Md.) (1987 and 1991)), могут быть использованы для определения гипервариабельных положений в известных и/или нативных антителах. Кроме того, в нескольких базах данных, имеющихся в Интернете (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/,http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html), содержится набор последовательностей многих человеческих легких цепей и тяжелых цепей и их положений. Информация о таких последовательностях и положениях может быть использована для определения гипервариабельных положений согласно изобретению. В соответствии с настоящим изобретением, если определенное положение аминокислоты имеет, предпочтительно, приблизительно от 2 до 20, более предпочтительно, приблизительно от 3 до 19, еще более предпочтительно, приблизительно от 4 до 18, еще более предпочтительно, от 5 до 17, еще более предпочтительно, от 6 до 16, еще более предпочтительно, от 7 до 15, еще более предпочтительно, от 8 до 14, еще более предпочтительно, от 9 до 13, а наиболее предпочтительно, от 10 до 12 возможных различных вариантов аминокислотных остатков, то такое положение является гипервариабельным. В некоторых вариантах осуществления изобретения, определенное положение аминокислоты может иметь, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 2, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 4, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 6, еще более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 8, еще более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 10, а наиболее предпочтительно, приблизительно 12 возможных различных вариантов аминокислотных остатков.
Альтернативно, библиотека, содержащая множество антигенсвязывающих молекул согласно изобретению, последовательности которых отличаются друг от друга, может быть сконструирована путем объединения вариабельных областей тяжелой цепи, полученных в виде рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельных областей, с вариабельными областями легкой цепи, в которые вводят по меньшей мере один аминокислотный остаток, изменяющий антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул в зависимости от концентрации ионов, как упоминалось выше. Если концентрацией ионов является концентрация ионов кальция, то неограничивающими примерами таких библиотек, предпочтительно, являются, например, библиотеки, в которых вариабельные области тяжелой цепи, продуцированные как рандомизированная библиотека последовательностей вариабельной области, объединяют с последовательностями вариабельной области легкой цепи, в которых конкретный(ые) остаток(остатки) последовательности зародышевой линии, такой как SEQ ID NO: 46 (Vk1), SEQ ID NO: 47 (Vk2), SEQ ID NO: 48 (Vk3) или SEQ ID NO: 49 (Vk4), был(и) заменен(ы) по меньшей мере одним аминокислотным остатком, изменяющим антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов кальция. Неограничивающими примерами таких аминокислотных остатков являются аминокислотные остатки в CDR1 легкой цепи. Кроме того, неограничивающими примерами таких аминокислотных остатков являются аминокислотные остатки в CDR2 легкой цепи. Кроме того, неограничивающими примерами других аминокислотных остатков также являются аминокислотные остатки в CDR3 легкой цепи.
Неограничивающими примерами таких аминокислотных остатков, содержащихся в CDR1 легкой цепи, являются остатки в положениях 30, 31 и/или 32 в CDR1 вариабельной области легкой цепи, пронумерованные в соответствии с Европейской нумерацией. Кроме того, неограничивающими примерами таких аминокислотных остатков, содержащихся в CDR2 легкой цепи, является аминокислотный остаток в положении 50 в CDR2 вариабельной области легкой цепи, пронумерованный по Кэбату. Кроме того, неограничивающими примерами таких аминокислотных остатков, содержащихся в CDR3 легкой цепи, является аминокислотный остаток в положении 92 в CDR3 вариабельной области легкой цепи, пронумерованный по Кэбату. Эти аминокислотные остатки могут присутствовать отдельно или в комбинации, при условии, что они будут образовыаать кальций-связывающий мотив, и/или при условии, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающих молекул будет варьироваться в зависимости от концентрации ионов кальция. Кроме того, поскольку тропонин С, кальмодулин, парвальбумин и легкая цепь миозина, которые имеют несколько сайтов, связывающихся с ионами кальция, и, очевидно, происходят от общего предшественника с точки зрения молекулярной эволиции, являются известными, то CDR1, CDR2 и/или CDR3 легкой цепи могут быть сконструированы так, чтобы они содержали связывающие мотивы. Так, например, домены кадгерина, EF-ветвь кальмодулина, домен C2 протеинкиназы C, домен Gla белка свертывания крови, то есть, фактора IX, лектины рецептора ациларогликопротеина С-типа и рецептор, связывающийся с маннозой, домен А рецепторов ЛНП, аннексин, домен тромбоспонидина типа 3 и EGF-подобные домены могут быть использованы соответствующии образом в вышеупомянутых целях.
Если вариабельные области тяжелой цепи, продуцированные в виде рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области, и вариабельные области легкой цепи, в которые был введен по меньшей мере один аминокислотный остаток, изменяющий антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул в зависимости от концентрации ионов, объединяют как описано выше, то последовательности вариабельных областей легкой цепи могут быть сконструированы так, чтобы они содержали гибкие остатки, аналогичные остаткам, описанным выше. Число и положение таких гибких остатков не ограничивается конкретными вариантами, при условии, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающих молекул согласно изобретению будет варьироваться в зависимости от концентрации ионов. В частности, последовательности CDR и/или последовательности FR тяжелой цепи и/или легкой цепи могут содержать один или более гибких остатков. Так, например, если концентрацией ионов является концентрация ионов кальция, то неограничивающими примерами гибких остатков, вводимых в последовательность вариабельной области легкой цепи, являются аминокислотные остатки, перечисленные в таблицах 1 и 2.
Предпочтительными объединяемыми вариабельными областями тяжелой цепи являются, например, рандомизированные библиотеки вариабельных областей. Для продуцирования рандомизированной библиотеки вариабельных областей применяют, если это необходимо, комбинацию известных методов. В неограничивающем варианте осуществления изобретения, иммунная библиотека, сконструированная на основе генов антител, происходящих от лимфоцитов животных, иммунизованных специфическим антигеном; пациентов с инфекциями; индивидуумов с повышенным титром антител в крови после вакцинации; раковых пациентов или пациентов с аутоиммунным заболеванием, может быть, предпочтительно, использована в виде рандомизированной библиотеки вариабельных областей.
В другом неограничивающем варианте осуществления изобретения, синтезированная библиотека, полученная путем замены последовательностей CDR генов V, присутствующих в геномной ДНК, или функциональных реконструированных генов V, серией последовательность-кодирующих кодонов синтетических олигонуклеотидов соответствующей длины, может быть также, предпочтительно, использована в виде рандомизированной библиотеки вариабельных областей. В этом случае, поскольку в CDR3 тяжелой цепи наблюдается разнообразие последовательностей, то может быть заменена только последовательность CDR3. Критерием присутствия разнообразия аминокислот в вариабельной области антигенсвязывающей молекулы является разнообразие аминокислотных остатков в положениях на поверхности антигенсвязывающей молекулы. Термин «положение на поверхности» означает положение, которое рассматривается как положение, которое может присутствовать на поверхности антигена и/или контактировать с антигеном, как может быть определено исходя из структуры, набора структур и/или моделированной структуры антигенсвязывающей молекулы. В основном, такими положениями являются положения в CDR. Такие положения на поверхности, предпочтительно, определяют по координатам трехмерной модели антигенсвязывающей молекулы с помощью компьютерной программы, такой как программа InsightII (Accelrys). Положения на поверхности могут быть определены с использованием алгоритмов, известных специалистам (см., например, Lee and Richards (J.Mol.Biol. (1971) 55, 379-400), Connolly (J. Appl. Cryst. (1983) 16, 548-558)). Определение положений на поверхности может быть осуществлено с помощью компьютерной программы, подходящей для моделирования белков, и на основе информации о трехмерной структуре антитела. Компьютерной программой, которая может быть использована в этих целях, предпочтительно, является программа SYBYL Biopolymer Module (Tripos Associates). Обычно или предпочтительно, если для использования данного алгоритма требуются параметры размера, вводимые пользователем, то «размер» зонда, используемого для вычислений, устанавливают приблизительно на величину радиуса в 1,4 ангстрем или менее. Кроме того, методы определения областей и площадей на поверхности с помощью компьютерной программы для персональных компьютеров описаны Pacios (Comput.Chem. (1994) 18 (4), 377-386; J. Mol. Model. (1995) 1, 46-53).
В другом неограничивающем варианте осуществления изобретения, не используемая ранее библиотека, которая была сконструирована из генов антител, продуцированных лимфоцитами здорового человека и имеющих репертуар, в который входят природные последовательности, то есть, немодифицированные последовательности антитела, может быть также, предпочтительно, использована как рандомизированная библиотека вариабельных областей (Gejima et al. (Human Antibodies (2002) 11,121-129); Cardoso et al. (Scand. J. Immunol. (2000) 51, 337-344)). В настоящем изобретении, аминокислотная последовательность, содержащая природную последовательность, называется аминокислотной последовательностью, полученной из такой не используемой ранее библиотеки.
В одном из вариантов осуществления изобретения, антигенсвязывающий домен согласно изобретению может быть получен из библиотеки, содержащей множество антигенсвязывающых молекул согласно изобретению, последовательности которых отличаются друг от друга, и которые были получены путем объединения вариабельных областей легкой цепи, сконструированных в виде рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельных областей, с вариабельной областью тяжелой цепи, выбранной в качестве каркасной последовательности, которая изначально содержала «по меньшей мере один аминокислотный остаток, изменяющий антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов». Если концентрацией ионов является концентрация ионов кальция, то неограничивающими примерами таких библиотек, предпочтительно, являются библиотеки, сконструированные путем объединения вариабельных областей легкой цепи, полученных в виде рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельных областей, с последовательностью вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NО: 50 (6RL#9-IgG1) или SEQ ID NO: 51 (6KC4-1#85-IgG1). Альтернативно, такая библиотека может быть сконструирована путем отбора соответствующих вариабельных областей легкой цепи из вариабельных областей, имеющих последовательности зародышевой линии, вместо вариабельных областей легкой цепи, сконструированных в виде рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельных областей. Такими предпочтительными библиотеками являются, например, библиотеки, в которых последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 50 (6RL#9-IgG1) или SEQ ID NO: 51 (6KC4-1#85-IgG1) объединена с вариабельными областями легкой цепи, имеющими последовательности зародышевой линии.
Альтернативно, последовательность вариабельной области тяжелой цепи, выбранная в качестве каркасной последовательности, которая изначально содержит «по меньшей мере один аминокислотный остаток, изменяющий антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул в зависимости от концентрации ионов», как упоминалось выше, может быть сконструирована так, чтобы она содержала гибкие остатки. Число и положение таких гибких остатков не имеет конкретных ограничений, при условии, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы согласно изобретению будет варьироваться в зависимости от концентрации ионов. В частности, последовательности CDR и/или последовательности FR тяжелой цепи и/или легкой цепи могут содержать один или более гибких остатков. Если концентрацией ионов является концентрация ионов кальция, то неограничивающими примерами гибких остатков, вводимых в последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 50 (6RL#9-IgG1), являются все аминокислотные остатки CDR1 и CDR2 тяжелой цепи и аминокислотные остатки CDR3 тяжелой цепи, за исключением остатков в положениях 95, 96 и/или 100а. Альтернативно, неограничивающими примерами гибких остатков, вводимых в последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 51 (6KC4-1#85-IgG1), являются все аминокислотные остатки CDR1 и CDR2 тяжелой цепи и аминокислотные остатки CDR3 тяжелой цепи, за исключением остатков в положениях аминокислот 95 и/или 101.
Альтернативно, библиотека, содержащая множество антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга, может быть сконструирована путем объединения вариабельных областей легкой цепи, полученных в виде рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельных областей, или вариабельных областей легкой цепи, имеющих последовательности зародышевой линии, с вариабельными областями тяжелой цепи, в которые вводят по меньшей мере один аминокислотный остаток, изменяющий антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов, как упоминалось выше. Если концентрацией ионов является концентрация ионов кальция, то неограничивающими примерами таких библиотек, предпочтительно, являются, например, библиотеки, в которых вариабельные области легкой цепи, продуцированные как рандомизированная библиотека последовательностей вариабельной области, или вариабельные области легкой цепи, имеющие последовательности зародышевой линии, объединяют с последовательностью вариабельной области тяжелой цепи, в которой конкретный(ые) остаток(остатки) был(и) заменен(ы) по меньшей мере одним аминокислотным остатком, изменяющим антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов кальция. Неограничивающими примерами таких аминокислотных остатков являются аминокислотные остатки в CDR1 тяжелой цепи. Другими неограничивающими примерами таких аминокислотных остатков являются аминокислотные остатки в CDR2 тяжелой цепи. Кроме того, неограничивающими примерами таких аминокислотных остатков также являются аминокислотные остатки в CDR3 тяжелой цепи. Неограничивающими примерами таких аминокислотных остатков CDR3 тяжелой цепи являются аминокислоты в положениях 95, 96, 100а и/или 101 в CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, пронумерованные по Кэбату. Кроме того, эти аминокислотные остатки могут присутствовать отдельно или в комбинации, при условии, что они будут образовывать кальций-связывающий мотив, и/или при условии, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы будет варьироваться в зависимости от концентрации ионов кальция.
Если вариабельные области легкой цепи, продуцированные в виде рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области, или вариабельные области легкой цепи, имеющие последовательность зародышевой линии, объединяют с вариабельной области тяжелой цепи, в которую был введен по меньшей мере один аминокислотный остаток, изменяющий антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов, как упоминалось выше, то последовательность вариабельных областей тяжелой цепи может быть также сконструирована так, чтобы она содержала гибкие остатки, аналогичные остаткам, описанным выше. Число и положение таких гибких остатков не имеет конкретных ограничений, при условии, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы согласно изобретению будет варьироваться в зависимости от концентрации ионов. В частности, последовательности CDR и/или последовательности FR тяжелой цепи могут содержать один или более гибких остатков. Кроме того, рандомизированные библиотеки вариабельных областей могут быть, предпочтительно, использованы как аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и/или CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, в которых аминокислотные остатки не являются аминокислотными остатками, изменяющими антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы. Если последовательности зародышевой линии используются как вариабельные области легкой цепи, то неограничивающими примерами таких последовательностей являются последовательности SEQ ID NO: 46 (Vk1), SEQ ID NO: 47 (Vk2), SEQ ID NO: 48 (Vk3) и SEQ ID NO: 49 (Vk4).
Могут быть использованы любые вышеописанные аминокислоты, а предпочтительно, аминокислоты, изменяющие антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов кальция, при условии, что они будут образовывать кальций-связывающий мотив. В частности, такими аминокислотами являются аминокислоты, которые служат в качестве доноров электронов. Предпочтительными примерами таких аминокислот, которые служат в качестве доноров электронов, являются серин, треонин, аспарагин, глутамин, аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота.
+
+
-3
+
-14
+
-7.
Примером «условий, требуемых для концентрации ионов» в соответствии с настоящим изобретением, являются «условия для pH». Такие условия для рН могут также называться требованиями к концентрации ионов водорода. В настоящем изобретении, термин «условия для концентрации протонов», то есть, ядер атомов водорода, является синонимом термина «условия для водородного показателя (рН)». Если активность ионов водорода в водном растворе представлена как aH, то pH определяют как -log10aH. Если ионная сила водного раствора является низкой (например, ниже, чем 10), то aH почти равен ионной силе водорода. Так, например, ионный водный продукт при 25°C под давлением в 1 атмосферу определяется как Kw=aH+aOH=10, а в чистой воде, aH=aOH=10 В этом случае, pH=7 является нейтральным; причем, водный раствор, в котором pH ниже 7, является кислотным, а если pH выше 7, то водный раствор является щелочным.
В настоящем изобретении, если условия для pH используются как условия для концентрации ионов, то такими условиями для рН являются высокая концентрация ионов водорода или низкий рН, то есть, кислотный рН, и низкая концентрация ионов водорода или высокий pH, то есть, нейтральный pH. Выражение «антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена, содержащегося в антигенсвязывающей молекуле согласно изобретению, варьируется в зависимости от рН» означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена, содержащегося в антигенсвязывающей молекуле, изменяется в результате различий в условиях для высокой концентрации ионов водорода или низкого рН (кислотного pH) и для низкой концентрации ионов водорода или высокого рН (нейтрального pH). В это понятие входит, например, случай, при котором антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы выше при нейтральном рН, чем при кислотном рН, и случай, при котором антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы выше при кислотном рН, чем при нейтральном рН.
В настоящем описании нейтральный рН не ограничивается конкретной величиной и может быть выбран, предпочтительно, из pH 6,7 - pH 10,0. В другом варианте осуществления изобретения, рН может быть выбран из pH 6,7 - pH 9,5. В еще одном варианте осуществления изобретения, рН может быть выбран из pH 7,0 - pH 9,0. В другом варианте осуществления изобретения, рН может быть выбран из pH 7,0 - pH 8,0. В частности, предпочтительным рH является рН 7,4, то есть, рН, близкий к рН плазмы (крови) in vivo.
В настоящем описании кислотный рН не ограничивается конкретной величиной, и может быть выбран, предпочтительно, из pH 4,0 - pH 6,5. В другом варианте осуществления изобретения, рН может быть выбран из pH 4,5 - pH 6,5. В еще одном варианте осуществления изобретения, рН может быть выбран из pH 5,0 - pH 6,5. В другом варианте осуществления изобретения, рН может быть выбран из pH 5,5 - pH 6,5. В частности, предпочтительным рH является рН 5,8, то есть, рН, близкий к концентрации ионов кальция в ранней эндосоме in vivo.
В настоящем изобретении выражение «антигенсвязывающая активность в условиях высокой концентрации ионов водорода или низкого рН (кислотного рН) ниже, чем в условиях низкой концентрации ионов водорода или высокого рН (нейтрального рН)» означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, содержащей домен согласно изобретению, при рН, выбранном из pH 4,0 - pH 6,5, ниже, чем при рН, выбранном из pH 6,7 - pH 10,0; а предпочтительно, это означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, содержащей домен согласно изобретению, при рН, выбранном из pH 4,5 - pH 6,5, ниже, чем при рН, выбранном из pH 6,7 - pH 9,5; более предпочтительно, это означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы при рН, выбранном из pH 5,0 - pH 6,5, ниже, чем при рН, выбранном из pH 7,0 - pH 9,0; еще более предпочтительно, это означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы при рН, выбранном из pH 5,5 - pH 6,5, ниже, чем при рН, выбранном из pH 7,0 - pH 8,0, а особенно предпочтительно, это означает, что антигенсвязывающая активность при рН в ранней эндосоме in vivo ниже, чем антигенсвязывающая активность при рН плазмы in vivo, а в частности, это означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы при рН 5,8 ниже, чем антигенсвязывающая активность при pH 7,4.
Изменение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, содержащей этот домен, в зависимости от рН может быть определено, например, с применением известных методов измерения, таких как методы, описанные выше в разделе «Активность связывания». Так, например, активность связывания измеряют при различных рН с применением описанных выше методов измерения. Так, например, антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, содержащей этот домен, сравнивают при кислотном рН и при нейтральном рН для подтверждения того, что активность связывания такого домена или такой молекулы выше при нейтральном рН, чем при кислотном рН.
Кроме того, в настоящем изобретении, выражение «антигенсвязывающая активность при высокой концентрации ионов водорода или при низком рН, то есть, при кислотном рН, ниже, чем при низкой концентрации ионов водорода или при высоком рН, то есть, при нейтральном рН» может также означать, что «антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, содержащей этот домен, при низкой концентрации ионов водорода или при высоком рН, то есть, при нейтральном рН выше, чем при высокой концентрации ионов водорода или при низком рН, то есть, при кислотном рН». В настоящем изобретении, выражение «антигенсвязывающая активность при высокой концентрации ионов водорода или при низком рН, то есть, при кислотном рН ниже, чем при низкой концентрации ионов водорода или при высоком рН, то есть, при нейтральном рН» можно записать как «антигенсвязывающая активность при высокой концентрации ионов водорода или при низком рН, то есть, при кислотном рН, ниже, чем антигенсвязывающая активность при низкой концентрации ионов водорода или при высоком рН, то есть, при нейтральном рН». Альтернативно, «антигенсвязывающая активность при высокой концентрации ионов водорода или при низком рН, то есть, при кислотном рН, ниже, чем антигенсвязывающая активность при низкой концентрации ионов водорода, или при высоком рН, то есть, при нейтральном рН» можно записать как «антигенсвязывающая активность при высокой концентрации ионов водорода или при низком рН, то есть, при кислотном рН, становится более низкой, чем антигенсвязывающая активность при низкой концентрации ионов водорода или при высоком рН, то есть, при нейтральном рН».
При определении антигенсвязывающей активности, условия, не относящиеся к концентрации ионов водорода, могут быть соответствующим образом выбраны самим специалистом и не имеют конкретных ограничений. Измерения могут быть осуществлены, например, при 37°C в буфере HEPES. Такие измерения могут быть осуществлены, например, с применением метода Biacore (GE Healthcare). Если антигеном является растворимый антиген, то антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, содержащей этот домен, может быть определена путем оценки активности связывания с растворимым антигеном посредством нанесения этого антигена как аналита на чип, на котором иммобилизованы антигенсвязывающий домен или антигенсвязывающая молекула, содержащая этот домен. Если антигеном является мембранный антиген, то активность связывания с мембранным антигеном может быть оценена путем нанесения антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, содержащей этот домен, как аналита, на чип, на котором иммобилизован этот антиген.
Если антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы согласно изобретению при высокой концентрации ионов водорода или при низком рН, то есть, при кислотном рН ниже, чем при низкой концентрации ионов водорода или при высоком рН, то есть, при нейтральном рН, то отношение антигенсвязывающей активности при высокой концентрации ионов водорода или при низком рН, то есть, при кислотном рН, к антигенсвязывающей активности при низкой концентрации ионов водорода или при высоком рН, то есть, при нейтральном рН, не имеет конкретных ограничений, то есть, величина KD (рН 5,8)/KD (рН 7,4), которая представляет собой отношение константы диссоциации (KD) для антигена при высокой концентрации ионов водорода или при низком рН, то есть, при кислотном рН, к KD при низкой концентрации ионов водорода или при высоком рН, то есть, при нейтральном рН, предпочтительно, составляет 2 или более, а более предпочтительно, величина KD (рН 5,8)/KD (рН 7,4) составляет 10 или более, а еще более предпочтительно, величина KD (рН 5,8)/KD (рН 7,4), составляет 40 или более. Верхний предел величины KD (рН 5,8)/KD (рН 7,4) не имеет конкретных ограничений и может составлять любую величину, такую как 400, 1000 или 10000, при условии, что такая молекула может быть получена известными методами.
Альтернативно, например, константа скорости диссоциации (kd) может быть также предпочтительно использована в качестве индекса для представления отношения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, содержащей этот домен, согласно изобретению при высокой концентрации ионов водорода или при низком рН, то есть, при кислотном рН и при низкой концентрации ионов водорода или при высоком рН, то есть, при нейтральном рН. Если kd (константа скорости диссоциации) используется в качестве индекса для представления отношения активности связывания вместо KD (константы диссоциации), то величина kd (при кислотном рН)/kd (при нейтральном рН), которая представляет собой отношение kd (константы скорости диссоциации) для антигена при высокой концентрации ионов водорода или при низком рН, то есть, при кислотном рН, к kd (константе скорости диссоциации) при низкой концентрации ионов водорода или при высоком рН, то есть, при нейтральном рН, предпочтительно, составляет 2 или более, более предпочтительно, 5 или более, еще более предпочтительно, 10 или более, а наиболее предпочтительно, 30 или более. Верхний предел величины kd (при кислотном рН)/kd (при нейтральном рН) не имеет конкретных ограничений и может составлять любую величину, такую как 50, 100 или 200, при условии, что такая молекула может быть получена известными методами.
Если антигеном является растворимый антиген, то константа скорости диссоциации (kd) может быть также использована в качестве величины для представления антигенсвязывающей активности, а если антигеном является мембранный антиген, то может быть использована кажущаяся константа скорости диссоциации (kd). Константа скорости диссоциации (kd) и кажущаяся константа скорости диссоциации (kd) могут быть определены известными методами, например, методом Biacore (GE healthcare), на проточном цитометре и т.п.. В настоящем изобретении, если антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, содержащей этот домен, определяют при различных концентрациях ионов водорода, то есть, рН, то такое определение осуществляют, предпочтительно, при других условиях, не относящихся к концентрации ионов водорода, то есть, предпочтительно, при тех же самых рН.
Так, например, антигенсвязывающий домен или антигенсвязывающая молекула, антигенсвязывающая активность которых при высокой концентрации ионов водорода или при низком рН, то есть, при кислотном рН, ниже, чем при низкой концентрации ионов водорода или при высоком рН, то есть, при нейтральном рН, что является одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, могут быть получены путем скрининга антигенсвязывающих доменов или антигенсвязывающих молекул, включающего нижеследующие стадии (a)-(c):
(а) определение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы при кислотном рН;
(b) определение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы при нейтральном рН; и
(c) отбор антигенсвязывающго домена или антигенсвязывающей молекулы, антигенсвязывающая активность которых при кислотном рН ниже, чем при нейтральном рН.
Альтернативно, антигенсвязывающий домен или антигенсвязывающая молекула, антигенсвязывающая активность которых при высокой концентрации ионов водорода или при низком рН, то есть, при кислотном рН, ниже, чем при низкой концентрации ионов водорода или при высоком рН, то есть, при нейтральном рН, что является одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, могут быть получены путем скрининга антигенсвязывающих доменов или антигенсвязывающих молекул или их библиотек, включающего нижеследующие стадии (a)-(c):
(а) контактирование антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы или их библиотеки при нейтральном рН с антигеном;
(b) помещение антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, которые были связаны с антигеном в стадии (а), в условия кислотного рН; и
(c) выделение антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, диссоциированных в стадии (b).
Антигенсвязывающий домен или антигенсвязывающая молекула, антигенсвязывающая активность которых при высокой концентрации ионов водорода или при низком рН, то есть, при кислотном рН, ниже, чем при низкой концентрации ионов водорода или при высоком рН, то есть, при нейтральном рН, что является другим вариантом осуществления настоящего изобретения, могут быть получены путем скрининга антигенсвязывающих доменов или антигенсвязывающих молекул или их библиотек, включающего нижеследующие стадии (a)-(d):
(а) контактирование антигена с библиотекой антигенсвязывающих доменов или антигенсвязывающих молекул при кислотном рН;
(b) отбор антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, которые не связывались с антигеном в стадии (а);
(c) связывание антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, отобранных в стадии (b), с антигеном при нейтральном рН; и
(d) выделение антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, которые были связаны с антигеном в стадии (с).
Антигенсвязывающий домен или антигенсвязывающая молекула, антигенсвязывающая активность которых при высокой концентрации ионов водорода или при низком рН, то есть, при кислотном рН, ниже, чем при низкой концентрации ионов водорода или при высоком рН, то есть, при нейтральном рН, что является другим вариантом осуществления настоящего изобретения, могут быть получены методом скрининга, включающим нижеследующие стадии (a)-(c):
(а) контактирование библиотеки антигенсвязывающих доменов или антигенсвязывающих молекул на колонке, на которой был иммобилизован антиген, при нейтральном рН;
(b) элюирование антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, которые были связаны на колонке в стадии (а), с этой колонки при кислотном рН; и
(c) выделение антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, элюированных в стадии (b).
Антигенсвязывающий домен или антигенсвязывающая молекула, антигенсвязывающая активность которых при высокой концентрации ионов водорода или при низком рН, то есть, при кислотном рН, ниже, чем при низкой концентрации ионов водорода или при высоком рН, то есть, при нейтральном рН, что является еще одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, могут быть получены методом скрининга, включающим нижеследующие стадии (a)-(d):
(а) пропускание библиотеки антигенсвязывающих доменов или антигенсвязывающих молекул через колонку, на которой был иммобилизован антиген, при кислотном рН;
(b) сбор антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, которые были элюированы, но не связывались на колонке в стадии (а);
(c) связывание антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, собранных в стадии (b), с антигеном при нейтральном рН; и
(d) выделение антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, которые были связаны с антигеном в стадии (с).
Антигенсвязывающий домен или антигенсвязывающая молекула, антигенсвязывающая активность которых при высокой концентрации ионов водорода или при низком рН, то есть, при кислотном рН, ниже, чем при низкой концентрации ионов водорода или при высоком рН, то есть, при нейтральном рН, что является другим вариантом осуществления настоящего изобретения, могут быть получены методом скрининга, включающим нижеследующим стадии (a)-(d):
(а) контактирование антигена с библиотекой антигенсвязывающих доменов или антигенсвязывающих молекул при нейтральном рН;
(b) получение антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, которые связывались с антигеном в стадии (а);
(c) помещение антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, полученных в стадии (а), в условия кислотного рН; и
(d) выделение антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, антигенсвязывающая активность которых в стадии (с) ниже стандарта, выбранного в стадии (b).
Вышеописанные стадии могут быть осуществлены два или более раз. Таким образом, настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим доменам и антигенсвязывающим молекулам, антигенсвязывающая активность которых при кислотном рН ниже, чем при нейтральном рН, где указанные домены или молекулы могут быть получены методом скрининга, который также включает повторение стадий (a)-(c) или (a)-(d) вышеописанных методов скрининга. Число циклов стадий (a)-(c) или (a)-(d) не имеет конкретных ограничений, но обычно оно составляет 10 или менее.
В вышеупомянутых методах скрининга согласно изобретению, антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы при высокой концентрации ионов водорода или при низком рН, то есть, при кислотном рН, не имеет конкретных ограничений, при условии, что эти домены или молекулы будут обладать антигенсвязывающей активностью при рН 4,0-6,5, а предпочтительно, при рН 4,5-6,6. Антигенсвязывающая активность также наблюдается при рН 5,0-6,5, а предпочтительно, рН 5,5-6,5. Антигенсвязывающая активность также наблюдается в ранней эндосоме in vivo, в частности, при рН 5,8, который является более предпочтительным. Кроме того, антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы при низкой концентрации ионов водорода или при высоком рН, то есть, при нейтральном рН, не имеет конкретных ограничений, при условии, что эти домены или молекулы будут обладать антигенсвязывающей активностью при рН 6,7-10, а предпочтительно, при рН 6,7-9,5. Антигенсвязывающая активность также наблюдается при рН 7,0-9,5, а предпочтительно, при рН 7,0-8,0. Антигенсвязывающая активность также наблюдается в плазме in vivo, в частности, при рН 7,4, который является более предпочтительным.
Антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы может быть измерена известными методами. Другие условия, не относящиеся к концентрации ионов кальция, могут быть определены самим специалистом. Антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы может быть выражена как константа диссоциации (KD), кажущаяся константа диссоциации (KD), константа скорости диссоциации (kd), кажущаяся константа скорости диссоциации (kd) и т.п. Эти константы могут быть определены известными методами, например, методом Biacore (GE healthcare), по графику Скэтчарда или методом FACS.
В настоящем изобретении, стадия отбора антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, антигенсвязывающая активность которых при низкой концентрации ионов водорода или при высоком рН, то есть, при нейтральном рН, выше, чем при высокой концентрации ионов водорода или при низком рН, то есть, при кислотном рН, является синонимом стадии отбора антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, антигенсвязывающая активность которых при высокой концентрации ионов водорода или при низком рН, то есть, при кислотном рН, ниже, чем при низкой концентрации ионов водорода или при высоком рН, то есть, при нейтральном рН.
Если антигенсвязывающая активность при низкой концентрации ионов водорода или при высоком рН, то есть, при нейтральном рН, выше, чем при высокой концентрации ионов водорода или при низком рН, то есть, при кислотном рН, то разность антигенсвязывающей активности при низкой концентрации ионов водорода или при высоком рН, то есть, при нейтральном рН, и при высокой концентрации ионов водорода или при низком рН, то есть, при кислотном рН, не имеет конкретных ограничений, однако, антигенсвязывающая активность при низкой концентрации ионов водорода или при высоком рН, то есть, при нейтральном рН, предпочтительно, в два раза или более, более предпочтительно, в 10 раз или более, а еще более предпочтительно, в 40 раз или более превышает антигенсвязывающую активность при высокой концентрации ионов водорода или при низком рН, то есть, при кислотном рН.
Антигенсвязывающий домен или антигенсвязывающая молекула согласно изобретению, антигенсвязывающая активность которых варьируется в зависимости от концентрации ионов водорода согласно изобретению, и которые подвергаются скринингу с применением описанных выше методов скрининга, могут быть получены любым способом. Так, например, этому скринигу могут быть подвергнуты стандартные антигенсвязывающие молекулы, стандартные библиотеки (фаговые библиотеки и т.п.), антитела или библиотеки, полученные из B-клеток иммунизованных животных или гибридом, полученных путем иммунизации животных; антитела или библиотеки (библиотеки с повышенным содержанием аминокислот с боковой цепью, имеющих рКа 4,0-8,0 (например, гистидина и глутаминовой кислоты или неприродных аминокислот); библиотеки, имеющие введенные в них аминокислоты с боковой цепью и имеющие рКа 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота или неприродные аминокислотные мутации в конкретных положениях и т.п.), которые были получены путем введения аминокислот с боковой цепью и с рКа 4,0-8,0 (например, гистидина и глутаминовой кислоты или неприродных аминокислотных мутаций) в вышеописанные антитела или библиотеки.
Методы получения антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, антигенсвязывающая активность которых при низкой концентрации ионов водорода или при высоком рН, то есть, при нейтральном рН, выше, чем при высокой концентрации ионов водорода или при низком рН, то есть, при кислотном рН, из антигенсвязывающих доменов или антигенсвязывающих молекул, полученных из гибридом, продуцированных путем иммунизации животных, или из В-клеток иммунизированных животных, включают, например, получение антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, в которых по меньшей мере одна из аминокислот антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы заменена аминокислотой, имеющей боковую цепь с рКа 4,0-8,0 (например, гистидином и глутаминовой кислотой), или неприродной аминокислотой, либо получение антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы, в которые была введена аминокислота, имеющая боковую цепь с рКа 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота), или неприродная аминокислота, как описано в WO2009/125825.
Положения введения мутаций аминокислот с боковой цепью и рКа 4,0-8,0 (например, гистидина и глутаминовой кислоты) или неприродных аминокислот не имеют конкретных ограничений, и такими положениями могут быть любые положения, при условии, что антигенсвязывающая активность при кислотном рН будет ниже, чем при нейтральном рН (с повышением величины KD (при кислотном рН)/ KD (при нейтральном рН) или kd (при кислотном рН)/kd (при нейтральном рН)) по сравнению с активностью до замены или инсерции. Так, например, если антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело, то подходящими являются вариабельная область и CDR антитела. Специалист в данной области может самостоятельно определить число аминокислот, которые могут быть заменены аминокислотами, имеющими боковую цепью и рКа 4,0-8,0 (например, гистидином и глутаминовой кислотой), или неприродными аминокислотами, или число вводимых аминокислот, имеющих боковую цепь и рКа 4,0-8,0 (например, гистидина и глутаминовой кислоты), или неприродных аминокислот. Аминокислота может быть заменена одной аминокислотой, имеющей боковую цепь и рКа 4,0-8,0 (например, гистидином и глутаминовой кислотой), или одной неприродной аминокислотой; либо может быть введена одна аминокислота, имеющая боковую цепь и рКа 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота), или одна неприродная аминокислота; либо аминокислота может быть заменена двумя или более аминокислотами, имеющими боковую цепь и рКа 4,0-8,0 (например, гистидином и глутаминовой кислотой), или двумя или более неприродными аминокислотами; либо могут быть введены две или более аминокислот, имеющих боковую цепь и рКа 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота), или две или более неприродных аминокислот. Альтернативно, помимо замены аминокислотами, имеющими боковую цепь и рКа 4,0-8,0 (например, гистидином и глутаминовой кислотой), или неприродными аминокислотами, либо помимо введения аминокислот, имеющих боковую цепь и рКа 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота), или неприродных аминокислот, могут быть делетированы, добавлены, введены и/или заменены другие аминокислоты. Замена аминокислотами, имеющими боковую цепь и рКа 4,0-8,0 (например, гистидином и глутаминовой кислотой), или неприродными аминокислотами, или введение этих аминокислот, может быть осуществлено рандомизированными методами, такими как гистидиновое сканирование, при котором аланин, в случае аланинового сканирования, известного специалистам, заменяют гистидином. Антигенсвязывающие молекулы, имеющие более высокую величину KD (при кислотном рН)/KD (при нейтральном рН) или kd (при кислотном рН)/kd (при нейтральном рН)) по сравнению с величиной KD до мутации, могут быть отобраны из антигенсвязывающих доменов или антител, в которые были введены рандомизированые инсерции или замены аминокислот, имеющих боковую цепь и рКа 4,0-8,0 (например, гистидина и глутаминовой кислоты), или неприродных аминокислот.
Предпочтительными примерами антигенсвязывающих молекул, в которых была осуществлена мутация с заменой аминокислот с боковой цепью и рКа 4,0-8,0 (например, гистидином и глутаминовой кислотой), или неприродными аминокислотами, как описано выше, и у которых антигенсвязывающая активность при кислотном рН ниже, чем при нейтральном рН, являются антигенсвязывающие молекулы, у которых антигенсвязывающая активность при нейтральном рН после замены аминокислотами с боковой цепью и рКа 4,0-8,0 (например, гистидином и глутаминовой кислотой) или неприродными аминокислотами, сравнима с антигенсвязывающей активностью до замены аминокислотами с боковой цепью и рКа 4,0-8,0 (например, гистидином и глутаминовой кислотой) или неприродными аминокислотами. Используемое здесь выражение «антигенсвязывающая молекула после замены аминокислотами с боковой цепью и рКа 4,0-8,0 (например, гистидином и глутаминовой кислотой) или неприродными аминокислотами имеет антигенсвязывающую активность, сравнимую с антигенсвязывающей активностью до замены аминокислотами с боковой цепью и рКа 4,0-8,0 (например, гистидином и глутаминовой кислотой) или неприродными аминокислотами» означает, что если антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы до замены аминокислотами с боковой цепью и рКа 4,0-8,0 (например, гистидином и глутаминовой кислотой), или неприродными аминокислотами принять за 100%, то антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы после замены аминокислотами с боковой цепью и рКа 4,0-8,0 (например, гистидином и глутаминовой кислотой) или неприродными аминокислотами будет составлять по меньшей мере 10% или более, предпочтительно, 50% или более, еще более предпочтительно, 80% или более, а наиболее предпочтительно, 90% или более. Антигенсвязывающая активность после замены аминокислотами с боковой цепью и рКа 4,0-8,0 (например, гистидином и глутаминовой кислотой) или неприродными аминокислотами при рН 7,4 может быть выше, чем антигенсвязывающая активность до замены аминокислотами с боковой цепью и рКа 4,0-8,0 (например, гистидином и глутаминовой кислотой) или неприродными аминокислотами при рН 7,4. Если антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы будет снижаться в результате введения аминокислот или замены аминокислотами с боковой цепью и рКа 4,0-8,0 (например, гистидином и глутаминовой кислотой) или неприродными аминокислотами, то антигенсвязывающая активность может быть доведена до уровня, сравнимого с уровнем антигенсвязывающей активности до введения аминокислот или замены аминокислотами с боковой цепью и рКа 4,0-8,0 (например, гистидином и глутаминовой кислотой) или неприродными аминокислотами, путем замены, делеции, добавления и/или инсерции одной или более аминокислот антигенсвязывающей молекулы. Настоящее изобретение также включает антигенсвязывающие молекулы, активность связывания которых может быть скорректирована путем замены, делеции, добавления и/или инсерции одной или более аминокислот до уровня, сравнимого с уровнем, наблюдаемым после замены аминокислотами с боковой цепью и рКа 4,0-8,0 (например, гистидином и глутаминовой кислотой) или неприродными аминокислотами, или после введения таких аминокислот.
В одном из вариантов осуществления изобретения, библиотека, содержащая множество антигенсвязывающих доменов или антигенсвязывающих молекул согласно изобретению, последовательности которых отличаются друг от друга, может быть также сконструирована путем объединения вариабельных областей тяжелой цепи, продуцированных как рандомизированная библиотека последовательностей вариабельной области, с вариабельными областями легкой цепи, в которые был введен «по меньшей мере один аминокислотный остаток, изменяющий антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов водорода».
Такими аминокислотными остатками являются, но не ограничиваются ими, например, аминокислотные твкже остатки в CDR1 легкой цепи. Такими аминокислотныма остатками являются, но не ограничиваются ими, например, аминокислотные остатки в CDR2 легкой цепи. Такими аминокислотными остатками также являются, но не ограничиваются ими, например, аминокислотные остатки в CDR3 легкой цепи.
Вышеописанными аминокислотными остатками, содержащимися в CDR1 легкой цепи, являются, но не ограничиваются ими, например, аминокислотный(е) остаток(остатки) в положении(ях) 24, 27, 28, 31, 32 и/или 34 в CDR1 вариабельной области легкой цепи, пронумерованные по Кэбату. Кроме того, аминокислотными остатками, содержащимися в CDR2 легкой цепи, являются, но не ограничиваются ими, например, аминокислотный(е) остаток(остатки) в положении(ях) 50, 51, 52, 53, 54, 55 и/или 56 в CDR2 вариабельной области легкой цепи, пронумерованные по Кэбату. Кроме того, аминокислотными остатками, содержащимися в CDR3 легкой цепи, являются, но не ограничиваются ими, например, аминокислотный(е) остаток(остатки) в положении(ях) 89, 90, 91, 92, 93, 94 и/или 95A в CDR3 вариабельной области легкой цепи, пронумерованные по Кэбату. Кроме того, аминокислотные остатки могут присутствовать отдельно или в комбинации из двух или более аминокислот, при условии, что они будут изменять антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов водорода.
Даже если вариабельную область тяжелой цепи, продуцированная в виде рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области, объединяют с вышеописанной вариабельной областью легкой цепи, в которую был введен «по меньшей мере один аминокислотный остаток, изменяющий антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов водорода», то такая последовательность вариабельной области легкой цепи может быть также сконструирована так, чтобы она содержала гибкие остатки, аналогичные остаткам, описанным выше. Число и положение таких гибких остатков не имеют конкретных ограничений, при условии, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы согласно изобретению будет варьироваться в зависимости от концентрации ионов водорода. В частности, последовательности CDR и/или последовательности FR тяжелой цепи и/или легкой цепи могут содержать один или более гибких остатков. Так, например, гибкими остатками, введенными в последовательности вариабельных областей легкой цепи являются, но не ограничиваются ими, например, аминокислотные остатки, перечисленные в таблицах 3 и 4. Кроме того, подходящими аминокислотными последовательностями вариабельных областей легкой цепи, не включающими гибкие остатки и аминокислотные остатки, изменяющие антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов водорода, являются, но не ограничиваются ими, последовательности зародышевой линии, такие как Vk1 (SEQ ID NO: 46), Vk2 (SEQ ID NO: 47), Vk3 (SEQ ID NO: 48) и Vk4 (SEQ ID NO: 49).
Таблица 4
CDR
Положение
Аминокислота
CDR1
28
S: 100%
29
I: 100%
30
H: 30%
N: 10%
S: 50%
R: 10%
31
N: 35%
S: 65%
32
H: 40%
N: 20%
Y: 40%
33
L: 100%
34
A: 70%
N: 30%
CDR2
50
A: 25%
D: 15%
G: 25%
H: 30%
K: 5%
51
A: 100%
52
S: 100%
53
H: 30%
K: 10%
N: 15%
S: 45%
54
L: 100%
55
Q: 100%
56
S: 100%
CDR3
90
Q: 100%
91
H: 30%
S: 15%
R: 10%
Y: 45%
92
G: 20%
H: 30%
N: 20%
S: 15%
Y: 15%
93
H: 30%
N: 25%
S: 45%
94
S: 50%
Y: 50%
95
P: 100%
96
L: 50%
Y: 50%
(Положения пронумерованы по Кэбату)
Любой аминокислотный остаток может быть соответствующим образом использован в качестве вышеописанных аминокислотных остатков, изменяющих антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена или антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов водорода. В частности, такими аминокислотными остатками являются аминокислоты с боковой цепью и с рКа 4,0-8,0. Такими аминокислотами, служащими в качестве доноров электронов, предпочтительно, являются природные аминокислоты, такие как гистидин и глутаминовая кислота, а также неприродные аминокислоты, такие как аналоги гистидина (US2009/0035836), m-NO2-Tyr (pKa 7,45), 3,5-Br2-Tyr (pKa 7,21) и 3,5-12-Tyr (pKa 7,38) (Bioorg. Med. Chem. (2003) 11 (17), 3761-3768). Особенно предпочтительными аминокислотными остатками являются, например, аминокислоты с боковой цепью и с рКа 6,0-7,0. Такими аминокислотами, служащими в качестве доноров электронов, предпочтительно, являются, например, гистидин.
Предпочтительными вариабельными областями тяжелой цепи, используемыми в комбинации, являются, например, рандомизированные библиотеки вариабельных областей. Для продуцирования рандомизированной библиотеки вариабельных областей применяют, если это необходимо, комбинацию известных методов. В неограничивающем варианте осуществления изобретения, иммунная библиотека, сконструированная на основе генов антител, происходящих от лимфоцитов животных, иммунизованных специфическим антигеном; пациентов с инфекциями или индивидуумов с повышенным титром антител в крови после вакцинации; раковых пациентов или пациентов с лимфоцитарными аутоиммунными заболеваниями, может быть, предпочтительно, использована в виде рандомизированной библиотеки вариабельных областей.
В другом неограничивающем варианте осуществления изобретения, синтезированная библиотека, полученная путем замены последовательностей CDR генов V, присутствующих в геномной ДНК, или функциональных реконструированных генов V, серией последовательность-кодирующих кодонов синтетических олигонуклеотидов соответствующей длины, может быть также, предпочтительно, использована в виде рандомизированной библиотеки вариабельных областей. В этом случае, поскольку в CDR3 тяжелой цепи наблюдается разнообразие генных последовательностей, то может быть заменена только последовательность CDR3. Критерием присутствия разнообразия аминокислот в вариабельной области антигенсвязывающей молекулы является разнообразие аминокислотных остатков в положениях на поверхности антигенсвязывающей молекулы. Положение на поверхности означает положение, где аминокислота может присутствовать на поверхности антигена и/или контактировать с антигеном, как может быть определено исходя из конформации, набора структур и/или моделированной структуры антигенсвязывающей молекулы, и такими положениями, в основном, являются положения в CDR. Такие положения на поверхности, предпочтительно, определяют по координатам трехмерной модели антигенсвязывающей молекулы с помощью компьютерной программы, такой как программа InsightII (Accelrys). Положения на поверхности могут быть определены с использованием алгоритмов, известных специалистам (см., например, Lee and Richards (J.Mol.Biol. (1971) 55, 379-400), Connolly (J. Appl. Cryst. (1983) 16, 548-558)). Положения на поверхности могут быть определены исходя из информации о трехмерной структуре антител с помощью компьютерной программы, подходящей для моделирования белков. Компьютерной программой, которая может быть использована в этих целях, предпочтительно, является программа SYBYL Biopolymer Module (Tripos Associates). Если для использования данного алгоритма требуются параметры размера, вводимые пользователем, то «размер» зонда, используемого для вычислений, устанавливают приблизительно на величину радиуса в 1,4 ангстрем или менее. Кроме того, метод определения областей и площадей на поверхности с помощью компьютерной программы для персональных компьютеров описан Pacios (Comput.Chem. (1994) 18 (4), 377-386 and J. Mol. Model. (1995) 1, 46-53).
В другом неограничивающем варианте осуществления изобретения, не используемая ранее библиотека, которая была сконструирована из генов антител, продуцированных лимфоцитами здорового человека и имеющих репертуар, в который входят природные последовательности, то есть, немодифицированные последовательности антитела, может быть также, предпочтительно, использована как рандомизированная библиотека вариабельных областей (Gejima et al. (Human Antibodies (2002) 11,121-129); и Cardoso et al. (Scand. J. Immunol. (2000) 51, 337-344)).
Кроме того, могут быть также введены комбинации аминокислотных модификаций для повышения активности связывания с человеческим FcRn при кислотном рН. Более конкретно, модификации, используемые для повышения активности связывания с человеческим FcRn при кислотных значениях рН, могут быть введены в антитело IgG, например, путем замены Met на Leu в положении 428 и замены Asn на Ser в положении 434 в соответствии с Европейской нумерацией (Nat. Biotechnol., 2010 28:157-159); путем замены Asn на Ala в положении 434 (Drug Metab Dispos 2010 Apr.; 38 (4):600-5); путем замены Met на Thr в положении 252, замены Ser на Thr в положении 254 и замены Thr на Glu в положении 256 (J. Biol. Chem., 2006, 281:23514-23524); путем замены Thr на Gln в положении 250 и замены Met на Leu в положении 428 (J. Immunol. 2006, 176 (1):346-56); путем замены Asn на His в положении 434 (Clinical Pharmacology & Therapeutics (2011) 89(2):283-290) или замен, описанных в WO2010106180, WO2010045193, WO2009058492, WO2008022152, WO2006050166, WO2006053301, WO2006031370, WO2005123780, WO2005047327, WO2005037867, WO2004035752, WO2002060919 или т.п.
Кроме того, недавно сообщалось, что молекула антитела, полученная путем замены Asn на His в положении 434 (в соответствии с Европейской нумерацией) в гуманизованном анти-CD4 антителе в целях повышения активности связывания с человеческим FcRn при кислотных значениях рН и улучшения свойств, таких как пролонгированное время присутствия в плазме, связывается с ревматоидными факторами (РФ) (Clin. Pharmacol. Ther. 2011 Feb.;. 89 (2):283-90). Было показано, что это антитело имеет Fc-область человеческого IgG1, которая, после замены Asn на His в положении 434 в сайте связывания с FcRn, связывается с ревматоидными факторами, распознающими сайт с указанными заменами.
Как описано выше, имеются сообщения о различных модификациях, способствующих повышению активности связывания с человеческим FcRn при кислотных значениях рН, но, при этом, введение этих модификаций в сайт связывания с FcRn в Fc-области, приводит к повышению аффинности связывания с ревматоидными факторами, которые распознают этот сайт.
Однако, при введении модификаций, которые не снижают активности связывания с FcRn, а снижают только активность связывания с ревматоидными факторами в этом сайте Fc-области, могут быть получены антигенсвязывающие молекулы, обладающие повышенной активностью связывания с человеческим FcRn при кислотных значениях рН, но не обладающие аффинностью по отношению к ревматоидным факторам.
Для введения модификаций, снижающих активность связывания с ревматоидными факторами, были сделаны замены в положениях 248-257, 305-314, 342-352, 380-386, 388, 414-421, 423, 425-437, 439 и 441-444 в соответствии с Европейской нумерацией. Предпочтительными являются модификации в положениях 387, 422, 424, 426, 433, 436, 438 и 440. Особенно предпочтительными являются замена Val на Glu или Ser в положении 422, замена Ser на Arg положении 424, замена His на Asp в положении 433, замена Tyr на Thr в положении 436, замена Gln на Arg или Lys в положении 438 и замена Ser на Glu или Asp в положении 440. Эти модификации могут быть использованы отдельно или в комбинации друг с другом во множестве положений.
Альтернативно, для снижения активности связывания с ревматоидными факторами, в этот сайт может быть введена последовательность гликозилирования N-типа. В частности, последовательность Asn-Xxx-Ser/Thr (Xxx представляет собой любую аминокислоту кроме Pro) известна как последовательность гликозилирования N-типа. Присоединение сахарной цепи N-типа путем введения этой последовательности в данный сайт Fc-области приводит к ингибированию связывания с РФ благодаря стерическому затруднению, вызываемому сахарной цепью N-типа. Модификациями, используемыми для присоединения сахарной цепи N-типа, предпочтительно, являются замена Lys на Asn в положении 248, замена Ser на Asn в положении 424, замена Tyr на Asn в положении 436, замена Gln на Thr в положении 438 и замена Gln на Asn в положении 438. Особенно предпочтительной модификацией является замена Ser на Asn в положении 424.
Предпочтительным примером полипептида, содержащего вариант Fc-области согласно изобретению, является по меньшей мере один полипептид, содержащий по меньшей мере два ассоциированных варианта Fc-области, подобных антителу IgG. При использовании антитела IgG в качестве антитела, тип константной области не имеет конкретных ограничений, и могут быть использованы IgG различных изотипов (подклассов), таких как IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Антителами IgG согласно изобретению, предпочтительно, являются человеческий IgG, а более предпочтительно, человеческий IgG1 и человеческий IgG4. Аминокислотные последовательности константных областей тяжелой цепи человеческого IgG1 и человеческого IgG4 являются известными. Множество последовательностей аллотипов со свойственным им генетическим полиморфизмом описаны в публикации «Sequences of proteins of immunological interest» NIH Publication No.91-3242 для константной области человеческого IgG1, и любая из этих последовательностей может быть использована в настоящем изобретении.
В настоящем изобретении, термин «аминокислотная модификация» означает любую замену, любую делецию, любое добавление, любую инсерцию и любую другую модификацию или их комбинации. Другими словами, в настоящем изобретении, аминокислотная модификация может называться аминокислотной мутацией, и эти термины могут быть использованы как синонимы.
При замене аминокислотных остатков, замена одного аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком может быть осуществлена в зависимости от различных факторов, таких как факторы, описанные ниже (a)-(c):
(а) структура полипептидного остова в области, имеющей складчатую или спиральную структуру;
(b) электрический заряд или гидрофобность в сайте-мишени; или
(с) размер боковой цепи.
Аминокислотные остатки могут быть подразделены на нижеследующие группы по их общим свойствам боковых цепей:
(1) гидрофобные остатки: норлейцин, met, ala, val, leu и ile;
(2) нейтральные гидрофильные остатки: cys, ser, thr, asn и gln;
(3) кислотные остатки: asp и glu;
(4) основные остатки: his, lys и arg;
(5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: gly и pro; и
(6) ароматические остатки: trp, tyr и phe.
Замена аминокислотных остатков, входящих в каждую из этих групп аминокислот, называется консервативной заменой, а замена аминокислотных остатков, входящих в другие группы, называется неконсервативной заменой. В настоящем изобретении, такими заменами могут быть консервативные замены или неконсервативные замены или комбинации консервативных замен и неконсервативных замен.
Модификации аминокислотной последовательности получают различными методами, известными специалистам. Такими методами являются, но не ограничиваются ими, метод сайт-направленного мутагенеза (Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275; Zoller, MJ and Smith, M. (1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW, Kramer, B, Pflugfelder, M and Fritz, HJ (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer W and Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367; и Kunkel, TA (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc. Natl. Acad. Sci. US It can be performed by a method A. 82, 488-492), ПЦР-мутагенез и кластерный мутагенез.
Модификация аминокислот согласно изобретению включает посттрансляционную модификацию. Специфическая посттрансляционная модификация может представлять собой присоединение или делецию сахарной цепи. Так, например, в константной области IgG1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 31, аминокислотный остаток в положении 297 (в соответствии с Европейской нумерацией, может быть модифицирован сахарной цепью. Структура сахарной цепи, используемая для модификации, не имеет конкретных ограничений. Вообще говоря, антитела, экспрессирующиеся в эукариотических клетках, содержат в своей константной области сайт гликозилирования. Поэтому, антитела экспрессирующиеся в клетках, таких как клетки, указанные ниже, обычно модифицируют сахарной цепью нескольких типов, где указанными клетками являются:
- антитело-продуцирующие клетки млекопитающих
- эукариотические клетки, трансформированные экспрессионным вектором, содержащим ДНК, кодирующую антитело.
описанными здесь эукариотическими клетками являются дрожжевые клетки и клетки животных. Так, например, репрезентативными клетками животных, используемыми для трансформации экспрессионным вектором, содержащим ДНК, кодирующую антитело, являются клетки CHO и клетки НЕК293Н. С другой стороны, в константную область согласно изобретению также включены последовательности, не гликозилированные в этом положении. Антитела, константная область которых не является гликозилированной, могут быть получены посредством экспрессии антитело-кодирующего гена в прокариотических клетках, таких как Escherichia coli.
В частности, например, к сахарной цепи Fc-области можкт быть присоединена сиаловая кислота (MAbs. 2010 Sep-Oct; 2(5):519-27).
Кроме того, настоящее изобретение относится к антителам, содержащим любой описанный выше вариант Fc-области.
В настоящем изобретении, термин «антитело/антитела» употребляется в самом широком смысле, при условии, что такое антитело обладает нужной биологической активностью, и этот термин включает любое антитело, такое как моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, варианты антител, фрагменты антител, полиспецифические антитела (мультиспецифические антитела)(например, биспецифические антитела (диантитела)), химерные антитела и гуманизованные антитела.
Что касается антител согласно изобретению, то тип и происхождение антител не имеет конкретных ограничений, и такими антителами могут быть антитела любого типа. Происхождение антител также не имеет конкретных ограничений, например, такими антителами являются человеческие антитела, мышиные антитела, крысиные антитела и кроличьи антитела.
Методы продуцирования антител хорошо известны специалистам, например, моноклональные антитела могут быть получены гибридобным методом (Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975) или рекомбинантным методом (патент США No. 4816567). Альтернативно, эти антитела могут быть выделены из фаговой библиотеки антител (Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)).
Гуманизованное антитело также называется реконструированным человеческим антителом. В частности, гуманизованные антитела получают путем присоединения CDR антитела животного, не являющегося человеком, такого как мышиное антитело, к человеческому антителу, и такие методы также известны специалистам. Также известны стандартные методы генной инженерии, применяемые для получения гуманизованных антител. В частности, например, метод ПЦР с перекрывающимся удлинением известен как метод присоединения CDR мышиного антитела к человеческим FR.
Вектор для экспрессии гуманизованного антитела может быть получен путем встраивания ДНК, кодирующей вариабельную область антитела, в которой три CDR и четыре FR лигированы друг с другом, и ДНК, кодирующей константную область человеческого антитела, в экспрессионный вектор так, чтобы эти ДНК были присоединены друг к другу с сохранением рамки считывания. После переноса этого интегрирующего вектора хозяину для получения рекомбинантных клеток, эти клетки культивируют, и ДНК, кодирующую гуманизованное антитело, подвергают экспрессии для продуцирования гуманизованного антитела в клеточной культуре (см. публикацию Европейской патентной заявки EP 239400, и публикацию Международной патентной заявки WO1996/002576).
При необходимости, аминокислотный остаток в FR может быть заменен так, чтобы CDR реконструированного человеческого антитела образовывали соответствующий антигенсвязывающий сайт. Так, например, мутация может быть введена в аминокислотную последовательность FR ПЦР-методом, применяемым для присоединения мышиных CDR к человеческим FR.
Нужное человеческое антитело может быть получено путем ДНК-иммунизации трансгенного животного, имеющего полный репертуар генов человеческого антитела (см. публикации Международных заявок WO1993/012227, WO1992/003918, WO1994/002602, WO1994/025585, WO1996/034096 и WO1996/033735), и это антитело может быть использовано для иммунизации.
Кроме того, методы получения человеческого антитела посредством пэннинга с использованием библиотеки человеческих антител известны специалистам. Так, например, V-область человеческого антитела экспрессируют на поверхности фага в виде одноцепочечного антитела (scFv) методом фагового представления. При этом, может быть отобран scFv-экспрессирующий фаг, который связывается с антигеном. Последовательность ДНК, кодирующая V-область связанного с антигеном человеческого антитела, может быть определена путем анализа генов выбранного фага. После определения последовательности ДНК scFv, который связывается с антигеном, экспрессионный вектор может быть получен путем присоединения, в той же рамке считывания, последовательности V-области к последовательности нужной С-области человеческого антитела и последующего встраивания полученной последовательности в подходящий экспрессионный вектор. Экспрессионный вектор вводят в клетки, подходящие для экспрессии, как описано выше, и человеческое антитело может быть получено посредством экспрессии гена, кодирующего человеческое антитело. Эти методы уже известны специалистам (см. публикации Международных заявок WO1992/001047, WO1992/020791, WO1993/006213, WO1993/011236, WO1993/019172, WO1995/001438 и WO1995/015388).
Вариабельными областями, входящими в состав антител согласно изобретению, могут быть вариабельные области, распознающие любой антиген.
В настоящем изобретении, антигенами могут быть любые антигены без каких-либо конкретных ограничений. Примерами таких антигенов, предпочтительно, являются лиганды (цитокины, хемокины и т.п.), рецепторы, раковые антигены, антигены МНС, антигены дифференцировки, иммуноглобулины и иммунные комплексы, частично содержащие иммуноглобулины.
Примерами цитокинов являются интерлейкины 1-18, колониестимулирующие факторы (G-CSF, M-CSF, GM-CSF и т.п.), интерфероны (IFN-α, IFN-β, IFN-γ и т.п.), факторы роста (EGF, FGF, IGF, NGF, PDGF, TGF, HGF и т.п.), факторы некроза опухоли (TNF-α и TNF-β), лимфотоксин, эритропоэтин, лептин, SCF, TPO, MCAF и BMP.
Примерами хемокинов являются хемокины CC, такие как CCL1-CCL28, хемокины СХС, такие как CXCL1-CXCL17, хемокины С, такие как XCL1-XCL2, и хемокины СХ3С, такие как CX3CL1.
Примерами рецепторов являются рецепторы, принадлежащие к таким семействам, как семейство рецепторов гемопоэтического фактора роста, семейство рецепторов цитокинов, семейство рецепторов тирозинкиназного типа, семейство рецепторов серин/треонин-киназного типа, семейство рецепторов TNF, семейство рецепторов, сопряженных с G-белком, семейство рецепторов GPI якорного типа, семейство рецепторов тирозин-фосфатазного типа, семейство рецепторов факторов адгезии и семейство рецепторов гормонов. Рецепторы, принадлежащие к этим семействам, и их свойства описаны во многих документах, таких как Cooke BA., King RJB., Van der Molen HJ. Ed. New Comprehesive Biochemistry Vol.18B "Hormones and their Actions Part II" pp.1-46 (1988) Elsevier Science Publishers BV., Patthy (1990) 61 (1), 13-14); Ullrich et al. (Cell (1990) 61(2), 203-212), Massague (Сеll (1992) 69 (6): 1067-1070); Miyajima, et al (Annu. Rev. Immunol. (1992) 10, 295-331), Taga et al. (FASEB J. (1992) 6, 3387-3396); Fantl et al (Annu. Rev. Biochem. (1993), 62: 453-481), Smith et al) (Cell (1994) 76(6) 959-962) и Flower DR. Flower (Biochim. Biophys. Acta (1999) 1422 (3): 207-234).
Примерами специфических рецепторов, принадлежащих к вышеупомянутым семействам рецепторов, предпочтительно, являются рецепторы человеческого или мышиного эритропоэтина (EPO) (Blood (1990) 76(1), 31-35 и Cell (1989) 57(2): 277-285); рецепторы человеческого или мышиного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1990), 87(22), 8702-8706; mG-CSFR (Cell (1990) 61(2): 341-350); рецепторы человеческого или мышиного тромбопоэтина (TPO) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1992) 89(12): 5640-5644, EMBO J. (1993) 12(7): 2645-53); рецепторы человеческого или мышиного инсулина (Nature (1985) 313 (6005): 756-761); рецепторы человеческого или мышиного лиганда Flt-3 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1994) 91(2): 459-463); рецепторы человеческого или мышиного тромбоцитарного фактора роста (PDGF) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1988) 85(10): 3435-3439); рецепторы человеческого или мышиного интерферона (IFN-α и β) (Cell (1990) 60(2): 225-234) и Cell (1994) 77(3): 391-400); рецепторы человеческого или мышиного лептина, рецепторы человеческого или мышиного гормона роста (GH), рецепторы человеческого или мышиного интерлейкина (IL)-10, рецепторы человеческого или мышиного инсулинподобного фактора роста (IGF)-I, рецепторы ингибирующего фактора человеческого или мышиного лейкоза (LIF) и рецепторы человеческого или мышиного цилиарного нейтротропного фактора (CNTF).
Раковые антигены представляют собой антигены, которые экспрессируются в процессе озлокачествования клеток, и такие антигены также называются опухолеспецифическими антигенами. Аномальные сахарные цепи, образующиеся на клеточных поверхностях или белковых молекулах раковых клеток, также называются раковыми антигенами, и такие антигены также являются раковыми антигенами с сахарной цепью. Примерами раковых антигенов, предпочтительно, является антиген GPC3, который представляет собой рецептор, принадлежащий к вышеупомянутому семейству рецепторов GPI якорного типа, и который также экспрессируется в некоторых раковых опухолях, включая рак печени (Int. J. Cancer (2003) 103 (4): 455-65); EpCAM, который экспрессируется в некоторых раковых опухолях, включая рак легких (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1989) 86 (1): 27-31); CA19-9, CA15-3 и сиалил-SSEA-1 (SLX).
Антигены MHC, грубо говоря, подразделяются на антигены MHC класса I и антигены MHC класса II. Антигенами MHC класса I являются HLA-A,-B,-C,-E,-F,-G и -H, а антигенами MHC класса II являются HLA-DR,-DQ и -DP.
Антигенами дифференцировки могут быть CD1, CD2, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33, CD34, CD35, CD38, CD40, CD41a, CD41b, CD42a, CD42b, CD43, CD44, CD45, CD45RO, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD51, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD64, CD69, CD71, CD73, CD95, CD102, CD106, CD122, CD126 и CDw130.
Иммуноглобулинами являются IgA, IgM, IgD, IgG и IgE. Иммунные комплексы включают компонент по меньшей мере любого из этих иммуноглобулинов.
Другими антигенами являются, например, нижеследующие молекулы: 17-1A, 4-1BB, 4Dc, 6-кето-PGF1a, 8-изо-PGF2a, 8-оксо-dG, аденозиновый рецептор A1, A33, ACE, ACE-2, активин, активин А, активин AB, активин B, активин C, активин RIA, активин RIA ALK-2, активин RIB ALK-4, активин RIIA, активин RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, адрессин, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, альфа-1-антитрипсин, антагонист альфа-V/бета-1, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, артемин, анти-Id антитело, аспарагиновая кислота, атриальный натриуретический пептид, интегрин av/b3, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, B-лимфоцитарный стимулирующий фактор (BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, остеогенин BMP-3, BMP-4, BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-1A (ALK-3), BMPR-1B (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, бомбезин, остеогенный нейротропный фактор, BPDE, BPDE-ДНК, BTC, фактор комплемента 3 (C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, кальцитонин, cAMP, канцероэмбриональный антиген (CEA), антиген, ассоциированный с раковой опухолью, катепсин A, катепсин B, катепсин C/DPPI, катепсин D, катепсин E, катепсин H, катепсин L, катепсин O, катепсин S, катепсин V, катепсин X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (белок p67), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, ботулинический токсин, токсины Clostridium perfringens, CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, антиген, ассоциированный с опухолевым цитокератином, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, фактор регуляции комплемента (фактор, ускоряющий разрушение опухоли), des(1-3)-IGF-1 (IGF-1 головного мозга), Dhh, дигоксин, DNAM-1, ДНКаза, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, рецептор эндотелина, энкефалиназа, eNOS, Eot, эотаксин 1, EpCAM, эфрин B2/EphB4, EPO, ERCC, E-селектин, ET-1, фактор IIa, фактор VII, фактор VIIIc, фактор IX, белок активации фибробластов (FAP), Fas, FcR1, FEN-1, ферритин, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, фибрин, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, фолликулостимулирующий гормон, фракталкин, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (миостатин), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-альфа 1, GFR-альфа 2, GFR-альфа 3, GITR, глюкагон, Glut4, гликопротеин IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, рилизинг-фактор гормона роста, гаптен (NP-кэп или NIP-кэп), HB-EGF, HCC, гликопртеин оболочки gB HCMV, гликопртеин оболочки gH HCMV, HCMV UL, гемопоэтический фактор роста (HGF), gp120 Hep B, гепараназа, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), гликопротеин gB вируса простого герпеса (HSV), гликопротеин gD HSV, HGFA, высокомолекулярный антиген, ассоциированный с меланомой (HMW-MAA), gp120 ВИЧ, V3-петля gp 120 ВИЧ IIIB, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HRG, Hrk, человеческий кардиомиозин, человеческий цитомегаловирус (HCMV), человеческий гормон роста (HGH), HVEM, I-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, рецептор IgA, IgE, IGF, IGF-связывающий белок, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL- 1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, интерферон (INF)-альфа, INF-β, INF-гамма, ингибин, iNOS, A-цепь инсулина, В-цепь инсулина, инсулиноподобный фактор роста 1, интегрин-альфа 2, интегрин-альфа 3, интегрин-альфа 4, интегрин-α4/β1, интегрин-альфа 4/бета 7, интегрин-альфа 5 (альфа V), интегрин-α5/β1, интегрин-альфа 5/бета 3, интегрин-альфа 6, интегрин-бета 1, интегрин-бета 2, интерферон-гамма, IP-10, I-TAC, JE, калликреин 2, калликреин 5, калликреин 6, калликреин 11, калликреин 12, калликреин 14, калликреин 15, калликреин L1, калликреин L2, калликреин L3, калликреин L4, KC, KDR, фактор роста кератиноцитов (KGF), ламинин 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), латентный TGF-1, латентный TGF-1 bp1, LBP, LDGF, LECT2, Lefty, антиген Lewis-Y, Lewis-Y-ассоциированный антиген, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, липопротеин, LIX, LKN, Lptn, L-селектин, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, поверхносный антиген легких, лютеинизирующий гормон, рецептор лимфотоксина-бета, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, металлопротеазы, рецептор MGDF, MGMT, MHC (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-альфа, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, муцин (Muc1), MUC18, мюллеровский ингибирующий фактор, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, адгерин NC, NCA 90, NCAM, NCAM, неприлизин, нейротропин-3, -4, или -6, нейротурин, фактор роста нервных клеток (NGF), NGFR, NGF-бета, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, паратиреоидный гормон, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-кадгерин, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, щелочная фосфатаза плаценты (PLAP), PlGF, PLP, PP14, проинсулин, прорелаксин, белок C, PS, PSA, PSCA, мембранный антиген, специфичный для предстательной железы (PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, A-цепь релаксина, В-цепь релаксина, ренин, респираторно-синцитиальный вирус (RSV)F, RSV Fgp, Ret, ревматоидный фактор, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, серин, сывороточный альбумин, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72 (опухолеассоциированный гликопротеин-72), TARC, TCA-3, T-клеточный рецептор (например, T-клеточный рецептор альфа/бета), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, PLAP-подобная щелочная фосфатаза яичек, TfR, TGF, TGF-альфа, TGF-бета, антиген, специфичный к TGF-бета всех типов, TGF-бета RI (ALK-5), TGF-бета RII, TGF-бета RIIb, TGF-бета RIII, TGF-бета 1, TGF-бета 2, TGF-бета 3, TGF-бета 4, TGF-бета 5, тромбин, Ck-1 тимуса, тиреотропный стимулирующий гормон, Tie, TIMP, TIQ, тканевый фактор, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-альфа, TNF-альфа,бета, TNF-бета 2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF1°C (TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD ), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (лиганд TRAIL Apo-2, TL2), TNFSF11 (лиганд TRANCE/RANK ODF, лиганд OPG), TNFSF12 (лиганд TWEAK Apo-3, лиганд DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (лиганд LIGHT HVEM, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (лиганд GITR AITR, лиганд TL6), TNFSF1A (коннектин TNF-α, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (лиганд OX40 gp34, TXGP1), TNFSF5 (лиганд CD40, CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (лиганд Fas, лиганд Apo-1, лиганд APT1), TNFSF7 (лиганд CD27, CD70), TNFSF8 (лиганд CD30, CD153), TNFSF9 (лиганд 4-1BB, лиганд CD137), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, рецептор трансферрина, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, опухолеассоциированный антиген CA125, опухолеассоциированный антиген, содержащий Lewis Y-ассоциированные углеводы, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, урокиназа, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-кадгерин, VE-кадгерин-2, VEFGR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, вирусный антиген, VLA, VLA-1, VLA-4, интегрин VNR, фактор фон Виллебранда, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, Aβ, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL-17R, IL-20/IL-20R, окисленный ЛНП, PCSK9, прекалликреин, RON, TMEM16F, SOD1, хромогранин A, хромогранин B, tau, VAP1, высокомолекулярный кининоген, IL-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, фактор B, фактор D, фактор H, пропердин, склеростин, фибриноген, фибрин, протромбин, тромбин, тканевый фактор, фактор V, фактор Va, фактор VII, фактор VIIa, фактор VIII, фактор VIIIa, фактор IX, фактор IXa, фактор X, фактор Xa, фактор XI, фактор XIa, фактор XII, фактор XIIa, фактор XIII, фактор XIIIa, TFPI, антитромбин III, EPCR, тромбомодулин, TAPI, tPA, плазминоген, плазмин, PAI-1, PAI-2, GPC3, синдекан-1, синдекан-2, синдекан-3, синдекан-4, LPA и S1P, а также рецепторы гормонов и факторов роста.
В аминокислотные последовательности, составляющие вариабельные области, могут быть введены одна или более модификаций аминокислотных остатков, при условии, что они будут сохранять антигенсвязывающую активность. При модификации аминокислотной последовательности вариабельной области, сайты модификации и число модифицируемых аминокислот не имеют конкретных ограничений. Так, например, аминокислоты, присутствующие в CDR и/или FR, могут быть соответствующим образом модифицированы. При модификации аминокислот в вариабельной области, активность связывания, предпочтительно, должна быть сохранена, но без каких-либо конкретных ограничений, например, она должна составлять 50% или более, предпочтительно, 80% или более, а более предпочтительно, 100% или более от активности до модификации. Кроме того, активность связывания может быть повышена путем модификации аминокислот. Так, например, активность связывания может в 2, 5, 10 или более раз превышать активность до модификации. В антителах согласно изобретению, модификацией аминокислотной последовательности могут быть по меньшей мере одна замена, по меньшей мере одно добавление, по меньшей мере одна делеция и по меньшей мере одна модификация аминокислоты.
Так, например, замена N-концевого глутамина вариабельной области на пироглутаминовую кислоту, осуществляемая посредством пироглутамилирования, представляет собой модификацию, хорошо известную специалистам. Таким образом, если у N-конца тяжелой цепи присутствует глутамин, то антитела согласно изобретению содержат вариабельные области, в которых глутамин заменен пироглутаминовой кислотой.
Вариабельные области антител согласно изобретению могут иметь любые последовательности, и такие вариабельные области антител могут присходить от любого источника, например, такими антителами могут быть мышиные антитела, крысиные антитела, кроличьи антитела, козьи антитела, верблюжьи антитела, гуманизованные антитела, полученные путем гуманизации не-человеческих антител, и человеческие антитела. «Гуманизованные антитела», также называемые «реконструированными человеческими антителами», представляют собой антитела, в которых гипервариабельные области (CDR) антитела, происходящего от млекопитающего, не являющегося человеком, например, от мышиного антитела, были заменены на CDR человеческого антитела. Методы идентификации CDR известны специалистам (Kabat et al, Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md; Chothia et al, Nature (1989) 342:877). Стандартные методы рекомбинации генов также известны специалистам (см., публикацию Европейской патентной заявки No. EP 125023 и WO 96/02576). Кроме того, эти антитела могут иметь различные аминокислотные замены, введенные в их вариабельные области для повышения уровня связывания с антигеном, для улучшения фармакокинетических свойств, для повышения стабильности и для снижения антигенности. Вариабельные области антител согласно изобретению могут обладать способностью связываться с антигенами повторно, что обусловлено зависимостью связывания антигена от рН (WO2009/125825).
Константные области легкой цепи антитела представляют собой константные области цепи κ-типа и λ-типа, однако, приемлемой может быть любая из константных областей легкой цепи. Кроме того, константные области легкой цепи согласно изобретению могуть представлять собой константные области легкой цепи с аминокислотными модификациями, такими как замены, делеции, добавления и/или инсерции.
Так, например, для конструирования константных областей тяжелой цепи антитела согласно изобретению могут быть использованы константные области тяжелой цепи человеческих антител IgG, при этом, предпочтительными являются константные области тяжелой цепи человеческих антител IgG1 и человеческих антител IgG4.
Кроме того, варианты Fc-области согласно изобретению могут быть получены в виде молекул гибридных белков Fc путем присоединения к другим белкам, физиологически активным пептидам и т.п. В настоящем изобретении, термин «гибридный белок» означает химерный полипептид, содержащий по меньшей мере два различных полипептида, которые в природе спонтанно не связываются друг с другом. Примерами таких других белков и биологически активных пептидов являются, но не ограничиваются ими, рецепторы, адгезивные молекулы, лиганды и ферменты.
Предпочтительными примерами молекул гибридных белков Fc согласно изобретению являются белки, содержащие Fc-область, присоединенную к рецепторному белку, который связывается с мишенью, и примерами таких белков являются гибридный белок TNFR-Fc, гибридный белок IL1R-Fc, гибридный белок VEGFR-Fc и гибридный белок CTLA4-Fc (Nat. Med. 2003 Jan; 9(1):47-52, BioDrugs 2006; 20(3):151-60). Кроме того, белком, присоединенным к полипептиду согласно изобретению, может быть любая молекула, при условии, что она будет связываться с молекулой-мишенью, и примерами таких молекул являются молекулы scFv (WO2005/037989), молекулы однодоменных антител (WO2004/058821; WO2003/002609), антитело-подобные молекулы (Current Opinion in Biotechnology 2006, 17:653-658; Current Opinion in Biotechnology 2007, 18:1-10; Current Opinion in Structural Biology 1997, 7:463-469 и Protein Science 2006, 15:14-27), такие как DARP-ины (WO2002/020565), аффинное антитело (WO1995/001937), авимер (WO2004/044011, WO2005/040229) и аднектин (WO2002/032925). Кроме того, молекулы антител и Fc-гибридных белков могут представлять собой мультиспецифические антитела, которые связываются с молекулами-мишенями или эпитопами многих типов.
Кроме того, антителами согласно изобретению являются модификации антител. Такими модификациями антител являются, например, антитела, связанные с различными молекулами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ) и цитотоксические вещества. Такие модифицированные антитела могут быть получены путем химической модификации антител согласно изобретению. Методы модификации антител хорошо известны специалистам в данной области.
Антителами согласно изобретению могут быть также биспецифические антитела. Термин «биспецифическое антитело» означает антитело, которое, в одной своей молекуле, имеет вариабельные области, распознающие различные эпитопы. Эпитопы могут присутствовать в одной молекуле или в различных молекулах.
Полипептиды согласно изобретению могут быть получены методами, известными специалистам. Так, например, антитела могут быть получены методами, описанными ниже, но не ограничивающимися ими.
Была экспрессирована ДНК, кодирующая тяжелую цепь антитела, в которой один или более аминокислотных остатков в Fc-области были заменены другими представляющими интерес аминокислотами, а также была экспрессирована ДНК, кодирующая легкую цепь антитела. ДНК, кодирующая тяжелую цепь, в которой один или более аминокислотных остатков в Fc-области были заменены другими представляющими интерес аминокислотами, может быть получена, например, путем конструирования ДНК, кодирующей природную тяжелую цепь Fc-области, и введения соответствующей замены так, чтобы кодон, кодирующий конкретную аминокислоту в Fc-области, кодировал другую представляющую интерес аминокислоту.
Альтернативно, ДНК, кодирующая тяжелую цепь, в которой один или более аминокислотных остатков в Fc-области были заменены другими представляющими интерес аминокислотами, может быть также получена путем конструирования и химического синтеза ДНК, кодирующей белок, в котором один или более аминокислотных остатков в природной тяжелой цепи Fc-области были заменены другими представляющими интерес аминокислотами. Положение и тип аминокислотной замены не имеют конкретных ограничений. Кроме того, модификациия не ограничивается только заменой, то есть, такой модификацией может быть любая делеция, любое добавление или любая инсерция или их комбинации.
Альтернативно, ДНК, кодирующая тяжелую цепь, в которой один или более аминокислотных остатков в Fc-области были заменены другими представляющими интерес аминокислотами, может быть получена в виде комбинации неполных ДНК. Такими комбинациями неполных ДНК являются, например, но не ограничиваются ими, комбинация ДНК, кодирующей вариабельную область, и ДНК, кодирующей константную область, и комбинация ДНК, кодирующей Fab-область, и ДНК, кодирующей Fc-область. Кроме того, ДНК, кодирующая легкую цепь, может быть аналогичнным образом получена в виде комбинации неполных ДНК.
Методы экспрессии вышеописанных ДНК включают методы, описанные ниже. Так, например, экспрессионный вектор для тяжелой цепи конструируют путем встраивания ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи, в экспрессионный вектор вместе с ДНК, кодирующей константную область тяжелой цепи. Аналогичнным образом, экспрессионный вектор для легкой цепи конструируют путем встраивания ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи, в экспрессионный вектор вместе с ДНК, кодирующей константную область легкой цепи. Альтернативно, эти гены тяжелой и легкой цепи могут быть встроены в один вектор.
ДНК, кодирующую представляющее интерес антитело, встраивают в экспрессионный вектор так, чтобы антитело экспрессировалось под контролем области регуляции экспрессии, такой как энхансер или промотор. Затем клетки-хозяева трансформируют этим экспрессионным вектором для экспрессии антитела. В таких случаях, может быть использована соответствующая комбинация хозяина и экспрессионного вектора.
Примерами векторов являются векторы M13, векторы pUC, pBR322, pBluescript и pCR-Script. Альтернативно, для субклонирования и вырезания кДНК, помимо вышеописанных векторов, могут быть использованы pGEM-T, pDIRECT, pT7 и т.п.
Экспрессионные векторы являются особенно подходящими для продуцирования полипептидов согласно изобретению. Так, например, если клеткой-хозяином является E. coli, такая как JM109, DH5α, HB101 и XL1-Blue, то экспрессионные векторы должны содержать промотор, обеспечивающий эффективную экспрессию в E. coli, например, промотор lacZ (см. публикации Ward et al, Nature (1989) 341: 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки), промотор araB (см. публикацию Better et al, Science (1988) 240: 1041-1043, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки), промотор T7 или т.п. Такими векторами, помимо вышеописанных векторов являются pGEX-5X-1 (Pharmacia), «QIAexpress system» (QIAGEN), pEGFP или pET (в этом случае, хозяином, предпочтительно, является BL21, который экспрессирует РНК-полимеразу Т7).
Векторы могут содержать сигнальные последовательности для секреции полипептида. В случае секреции полипептида в периплазму E. coli, в качестве сигнальной последовательности для такой секреции может служить сигнальная последовательность pelB (см. публикацию Lei, SP et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4397, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки). Вектор может быть встроен в клетки-хозяева методом с использованием липофектина, фосфата кальция и DEAE-дектрана.
Помимо экспрессионных векторов E. coli, векторами для продуцирования полипептидов согласно изобретению являются, например, экспрессионные векторы млекопитающих (например, pcDNA3 (Invitrogen), pEGF-BOS (см. публикацию Nucleic Acids. Res.1990, 18(17), p5322, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки), pEF и pCDM8); экспрессионные векторы, происходящие от клеток насекомых (например, «бакуловирусная экспрессионная система Bac-to-BAC» (GIBCO BRL) и pBacPAK8); экспрессионные векторы, происходящие от растений (например, pMH1 и pMH2); экспрессионные векторы, происходящие от вируса животного (например, pHSV, pMV и pAdexLcw); ретровирусные экспрессионные векторы (например, pZIPneo); дрожжевые экспрессионные векторы (например, «Набор для экспрессии в дрожжах Pichia» («Pichia Expression Kit» Invitrogen), pNV11 и SP-Q01); и экспрессионные векторы Bacillus subtilis (например, pPL608 и pKTH50).
Векторы для экспрессии в клетках животных, таких как клетки CHO, COS и NIH3T3, должны иметь промоторы, необходимые для экспрессии в таких клетках, например, промотор SV40 (см. публикациию Mulligan et al, Nature (1979) 277, 108, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки); промотор MMTV-LTR, промотор EF1α (см. публикациию Mizushima et al, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки); промотор CAG (см. публикацию Gene. (1991) 108, 193, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки) и промотор CMV, а более предпочтительно, такие векторы должны содержать ген для отбора трансформированных клеток (например, ген резистентности к лекарственному средству, который позволяет проводить такой отбор с использованием агента (неомицина, G418 или т.п.)). Векторами, обладающими такими свойствами, являются, например, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV и pOP13.
Кроме того, для стабильной экспрессии гена и амплификации различных копий генов в клетках может быть применен описанный ниже метод, в котором клетки CHO, дефицитные по механизму синтеза нуклеиновой кислоты, вводят вместе с вектором, который несет ген DHFR, компенсирующий такой дефицит (например, pCHOI), а вектор амплифицируют с использованием метотрексата (MTX). Альтернативно, для временной экспрессии гена может быть применен описанный ниже метод, в котором клетки COS, имеющие ген, экспрессирующий Т-антиген SV40 на хромосоме этих клеток, трансформируют вектором, имеющим ориджин репликации SV40 (pcD и т.п.). Могут быть также использованы ориджины репликации, происходящие от полиомавируса, аденовируса, вируса бычьей папилломы (BPV) и т.п. Для амплификации ряда копий генов в клетках-хозяевах могут быть также использованы экспрессионные векторы, содержащие селективные маркеры, такие как ген аминогликозид-трансферазы (APH), ген тимидин-киназы (TK), ген ксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы E. coli (Ecogpt) и ген дигидрофолат-редуктазы (dhfr).
Антитела могут быть собраны, например, путем культивирования трансформированных клеток с последующим выделением антител из трансформированных клеток или из культуральной среды. Антитела могут быть выделены и очищены с применением соответствующих комбинированных методов, таких как центрифугирование, фракционирования сульфатом аммония, высаливание, ультрафильтрация, метод с использованием 1q, FcRn и колонки с белком A и G-белком, аффинная хроматография, ионообменная хроматография и гель-фильтрация.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способам стимуляции выведения вызывающего заболевание антигена из плазмы с использованием полипептида, содержащего вариант Fc-области согласно изобретению и антигенсвязывающий домен, обладающий активностью связывания с антигеном, где указанная активность связывания с антигеном изменяется в зависимости от концентрации ионов, и где указанный антиген присутствует в плазме в растворимой форме.
Как описано в WO2011/122011, сообщалось, что pH-зависимая антигенсвязывающая молекула, продуцированная путем дополнительной модификации pH-зависимой антигенсвязывающей молекулы в целях повышения уровня ее связывания с FcRn в нейтральных условиях (pH 7,4), обладает способность элиминировать антигены из плазмы после введения полипептида, содержащего такой антигенсвязывающий домен, поскольку указанная молекула обладает способностью повторно связываться с антигеном и удалять антигены из плазмы (WO2011/122011). Однако, до сих пор, кроме метода повышения уровня связывания с FcRn в нейтральных условиях, ничего не сообщалось о методах ускорения элиминиции антигена,.
В примерах показано, что полипептид, содержащий антигенсвязывающие домены, антигенсвязывающая активность которых изменяется в зависимости от рН, обладают способностью ускорять выведение антигенов из плазмы посредством связывания с FcγR, в отличие от тех случаев, когда присутствует только антиген, даже если полипептид содержит нативную Fc-область, происходящую от IgG1, у которой активность связывания с FcRn при нейтральном рН не была повышена. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, авторы лишь отмечают, что описанный ниже механизм может служить объяснением феномена, который наблюдается в клоне 278 и т.п.
Если сайтом, с которым может связываться антигенсвязывающий домен, является такой сайт, как sIL-6R (то есть, гомомономер), то две молекулы антигена связываются с одной молекулой антитела, содержащей двухвалентные антигенсвязывающие домены, и одна молекула анти-sIL-6R антитела и две молекулы антигена, содержащие две антигенсвязывающих единицы, образуют комплекс. Следовательно, комплекс «антиген - антитело» этого типа имеет только одну Fc-область (нативную Fc-область IgG1), показанную на фиг. 9. Поскольку этот комплекс связывается с двумя молекулами FcRn или с одной молекулой FcγR посредством одной Fc-области, то аффинности связывания с этими рецепторами, являются такими же как и аффинности связывания с нормальными антителами IgG, а поглощение этих молекул клетками может рассматриваться, в основном, как неспецифицеское.
С другой стороны, если эпитопы, с которыми связывается антигенсвязывающий домен, присутствуют в двух сайтах антигена, например, если антигеном является гетеродимерный комплекс тяжелой и легкой цепей, например, человеческого IgE, то связывание каждого двухвалентного антигенсвязывающего домена в одной молекуле анти-IgE антитела с каждой из двух единиц эпитопов в одной молекуле IgЕ может быть ограничено расположением эпитопа и т.п. Исходя из этого было высказано предположение, что комплекс «антиген - антитело» (иммунный комплекс), содержащий по меньшей мере четыре молекулы (то есть, две молекулы IgE, которые представляют собой молекулы антигена, и две молекулы анти-IgE антитела, которые представляют собой полипептид, содержащий антигенсвязывающий домен), образуется посредством связывания одной молекулы анти-IgE антитела с двумя антигенсвязывающими единицами, присутствующими в двух молекулах IgE, которые связываются с двухвалентным антигенсвязывающим доменом, присутствующим в одной молекуле анти-IgE антитела.
Если полипептид, содержащий антигенсвязывающий домен, такой как антитело, которое связывается с молекулой антигена, содержащей два или более сайтов, с которыми может связываться антигенсвязывающий домен, образует крупный иммунный комплекс, который представляет собой по меньшей мере тетрамер, то такой иммунный комплекс может эффективно связываться с высокой степенью авидности посредством по меньшей мере двух или более поливалентных Fc-областей с FcγR, с FcRn, с рецептором комплемента и т.п. С другой стороны, если молекула антигена имеет один сайт, с которым может связываться антигенсвязывающий домен, то опосредуемая Fc-областью аффинность иммунных комплексов, образованных между молекулой антигена и полипептидом, содержащим антигенсвязывающий домен для этих рецепторов, является недостаточной по сравнению с аффинностью вышеупомянутых иммунных комплексов. Более конкретно, иммунный комплекс с высокой степенью эффективности поглощается клетками, экспрессирующими эти рецепторы.
Если молекула антигена содержит два или более сайтов, которые связываются с антигенсвязывающим доменом, то полипептид согласно изобретению, в случае, если он является, например, антителом и образует комплексы «антиген - антитело» (иммунные комплексы), содержащие по меньшей мере четыре молекулы (две молекулы антигена и две молекулы антитела) в плазме, и если иммунные комплексы включены в клетки, то антигены диссоциируются из этих антител в эндосому, где концентрация ионов отличается от концентрации ионов в плазме, поскольку полипептид согласно изобретению имеет антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого варьируется в зависимости от концентрации ионов, то есть, от рН. Поэтому, образовавшиеся иммунные комплексы элиминируются в эндосоме клеток, в которые были введены иммунные комплексы. Поскольку диссоциированные антигены не могут связываться с FcRn в эндосоме, то они разлагаются после их транспортировки в лизосому. С другой стороны, антитела, которые диссоциируются из антигена, могут подвергаться рециклингу в плазму после связывания с FcRn в эндосоме. Аналогичный рециклинг может наблюдаться в том случае, если концентрация ионов отличается при различных рН, как описано в Примерах, и в Сравнительных примерах 3-6 показано, что элиминация антигенов в плазме может быть ускорена благодаря использованию антигенсвязывающого домена, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от концентрации кальция, но не рН.
Поэтому, если иммунный комплекс, образованный антигенами и полипептидами, содержащими антигенсвязывающий домен для антигена, представляет собой комплекс, содержащий два или более поливалентных Fc-областей для FcγR, FcRn, рецептора комплемента и т.п., то такой комплекс может способствовать ускорению элиминации антигенов.
Кроме того, исследования, описанные в Сравнительных примерах 7-9, показали, что среди FcγR, рецептор FcγRIIB, который представляет собой ингибирующий FcγR, вносит наибольший вклад в способность элиминировать антигены посредством FcγR. Более конкретно, даже при снижении уровня связывания с FcγR, способность антитела элиминировать антигены посредством FcγR может сохраняться, но при условии сохранения способности связываться с FcγRIIB.
Ранее сообщалось, что некоторые терапевтические антитела способны вызывать побочные эффекты, что обусловлено взаимодействиями между IgG и FcγR. Так, например, у группы пациентов, принимавших бевацизумаб, то есть, антитело против VEGF, число случаев развития тромбоэмболии увеличивалось (J. Natl. Cancer Inst. (2007) 99 (16), 1232-1239). Кроме того, тромбоэмболия также наблюдалась при проведении клинических исследований на продуцирование антител против лиганда CD40, а поэтому такие клинические испытания были прерваны (Arthritis. Rheum. (2003) 48 (3), 719-727). FcγRIIа, то есть, активирующий рецептор Fcγ экспрессируется на тромбоцитах, а FcγRIIb, то есть, ингибирующий рецептор Fcγ не экспрессируется на тромбоцитах (J. Exp. Med. (2006) 203 (9), 2157-2164), и последующие исследования, проводимые на животных-моделях и т.п., позволяют предположить, что введение обоих антител приводит к агрегации тромбоцитов посредством связывания с FcγRIIа на тромбоцитах и, тем самым, к образованию сгустков крови (J. Thromb. Haemost. (2009) 7 (1), 171-181, J. Immunol. (2010) 185 (3), 1577-1583). У пациентов с системной красной волчанкой, которая является аутоимунным заболеванием, тромбоциты активируются по FcγRIIа-зависимому механизму, а активация тромбоцитов, как сообщалось, коррелирует с тяжестью симптомов (Sci. Transl. Med. (2010) 2 (47), 47-63).
Кроме того, ранее сообщалось, что исследования, проводимые на животных-моделях, показали, что иммунный комплекс, образованный между антителом и поливалентным антигеном, индуцирует анафилаксию посредством активирующих FcγR (Bruhns P., Blood. (2012) 119 (24): 5640-9).
Сообщалось, что поглощение иммунных комплексов, образованных между поливалентным антигеном и антителом, посредством активирующего FcγR, способствует увеличению титра антител против антигена (Scand. J. Immunol. (2006) 64 (3): 177-84; J. Immunol. (1999) 163: 618-22). Это позволяет предположить, что антитела против самого терапевтического антитела, вероятно, продуцируются в ответ на введение терапевтических антител, распознающих поливалентные антигены. При продуцировании антител против терапевтического антитела, их кинетика в кровотоке замедляется, и действие терапевтического антитела может ослабляться.
Таким образом, в результате связывания антител с поливалентными антигенами с образованием иммунных комплексов, эти иммунные комплексы могут индуцировать развитие серьезных побочных эффектов, вызываемое взаимодействием с активирующими FcγR, и, тем самым, снижать эффективность антитела как фармацевтического средства. Примерами поливалентных антигенов (мультимерных антигенов) являются GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (миостатин), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), TNF, TNF-альфа, TNF-альфа/бета, TNF-бета 2, TNFSF10 (лиганд TRAIL Apo-2, TL2), TNFSF11 (лиганд TRANCE/RANK ODF, лиганд OPG), TNFSF12 (лиганд TWEAK Apo-3, лиганд DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (лиганд LIGHT HVEM, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (лиганд GITR, лиганд AITR, лиганд TL6), TNFSF1A (коннектин TNF-α, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-β LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (лиганд OX40 gp34, TXGP1), TNFSF5 (лиганд CD40, лиганд CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (лиганд Fas, лиганд Apo-1, лиганд APT1), TNFSF7 (лиганд CD27, CD70), TNFSF8 (лиганд CD30, CD153), TNFSF9 (лиганд 4-1BB, лиганд CD137), VEGF, IgE, IgA, IgG, IgM, RANKL, TGF-альфа, TGF-бета, мультиспецифический TGF-бета и IL-8.
Методами решения этих проблем могут быть методы аттенюирования связывания с FcγR. Однако, при аттенюировании связывания со всеми FcγR, ускорение элиминиции антигена посредством FcγR может оказаться невозможным при использовании антитела.
Как сообщалось ранее, поскольку из всех FcγR, FcγRIIВ играет главную роль в FcγR-опосредуемой элиминации антигена антителами, а побочные эффекты, обусловленные взаимодействиями с FcγR, вызываются взаимодействиями с активирующими FcγR, то могут быть продуцированы эффективные антитела с менее серьезными побочными эффектами, индуцируемыми активирующими FcγR, но при сохранении способности элиминировать антигены посредством селективного аттенюирования связывания с другими активирующими FcγR и с сохранением способности связываться с FcγRIIВ.
Следовательно, превосходный эффект, заключающийся в стимуляции выведения из плазмы растворимых антигенов, вызывающих заболевание, может быть достигнут с использованием полипептидов, содержащих вариант Fc-области согласно изобретению и антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от концентрации ионов.
Кроме того, с использованием полипептидов согласно изобретению, аналогичные эффекты могут быть достигнуты даже в том случае, если антигены, с которыми связываются полипептиды, имеют только один сайт (мономерные антигены), который может связываться с антигенсвязывающим доменом.
Таким примером является способ стимуляции выведения мономерных антигенов из плазмы с использованием смеси полипептидов, содержащих антигенсвязывающие домены.
Как описано выше, если антигеном является мультимерный антиген (неограничивающим примером которого являются иммуноглобулин, такой как IgA или IgE, или член суперсемейства TNF, такой как TNF или CD154), то может образовываться крупный иммунный комплекс, содержащий два или более антигенсвязывающих молекул и две или более антигенсвязывающих единиц. С другой стороны, даже если антигеном является мономерный антиген, то смесь полипептидов, содержащая два или более соответствующих антигенсвязывающих доменов, каждый из которых связывается с различными эпитопами, присутствующими в мономерном антигене, где связывание с этими эпитопами варьируется в зависимости от концентрации ионов (например, от рН или Ca), может также образовывать крупные иммунные комплексы, содержащие полипептид, имеющий два или более антигенсвязывающих доменов и два или более сайтов связывания с антигенсвязывающими доменами (мономерных антигенов). В настоящем изобретении, смесь полипептидов, содержащая два или более соответствующих антигенсвязывающих доменов, каждый из которых связывается с различными эпитопами, присутствующими в мономерном антигене, где связывание антигенсвязывающих молекул с эпитопами варьируется в зависимости от концентрации ионов (например, от рН или Ca), называется «коктейлем» антигенсвязывающих молекул. Из этих полипептидов, содержащих антигенсвязывающий домен, по меньшей мере один из полипептидов (содержащих антигенсвязывающие домены), образующих иммунный комплекс, имеет антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от концентрации ионов.
Другими примерами могут служить способы стимуляции выведения мономерных антигенов из плазмы с использованием полипептида, содержащего мультиспецифические или мультипаратопные антигенсвязывающие домены.
Альтернативно, даже если антигеном является мономерный антиген, то каждый антигенсвязывающий домен, присутствующий в полипептиде, содержащем антигенсвязывающие домены, каждый из которых связывается с различными эпитопами, присутствующими в мономерном антигене, и антигенсвязывающие молекулы, содержащие антигенсвязывающие домены, в которых связывание эпитопа с отельными антигенсвязывающими доменами варьируется в зависимости от концентрации ионов (например, от рН или Ca), могут также образовывать крупный иммунный комплекс, содержащий полипептид, имеющий два или более антигенсвязывающих доменов и два или более сайтов связывания с антигенсвязывающими доменами (мономерных антигенов). Неограничивающими примерами такого полипептида являются мультиспецифические или мультипаратопные антитела, содержащие соответствующие вариабельные области, каждая из которых связывается с различными эпитопами, присутствующими на мономерном антигене. Неограничивающим вариантом таких мультиспецифических или мультипаратопных антител являются антитела, вариабельные области которых обладают способностью к рН- или Са-зависимому связыванию (биспецифические антитела или бипаратопные антитела, содержащие вариабельную область правой ветви, которая распознает эпитоп А, и вариабельную область левой ветви, которая распознает эпитоп В, как показано на фиг. 19), и такие антитела также могут образовывать крупные иммунные комплексы, содержащие два или более антител и два или более антигенсвязывающих единиц (мономерных антигенов).
Антигенсвязывающая молекула, которая дополнительно ускоряет выведение мономерных антигенов из плазмы, может быть получена путем скрининга на комбинации антигенсвязывающих доменов, нацеленных на различные эпитопы мономерного антигена, где активность связывания с каждым эпитопом варьируется в зависимости от концентрации ионов, и где антигенсвязывающие домены могут связываться с вышеупомянутыми рецепторами с соответствующей авидностью. Концентрации ионов, которые изменяют активность связывания мультиспецифических или мультипаратопных антигенсвязывающих доменов с каждым из эпитопов, могут быть одинаковыми или различными. Так, например, антигенсвязывающая молекула, содержащая биспецифические или бипаратопные антигенсвязывающие домены, где эпитоп-связывающая активность одного из антигенсвязывающих доменов варьируется в зависимости от рН или от концентрации ионов металла, такой как концентрация ионов Са, может рассматриваться как неограничивающий вариант антигенсвязывающей молекулы согласно изобретению. Кроме того, например, антигенсвязывающая молекула, содержащая биспецифические или бипаратопные антигенсвязывающие домены, где эпитоп-связывающая активность одного из антигенсвязывающих доменов варьируется в зависимости от рН, а эпитоп-связывающая активность другого антигенсвязывающего домена варьируется в зависимости от концентрации ионов металла, такой как концентрация ионов Са, может рассматриваться как неограничивающий вариант антигенсвязывающей молекулы согласно изобретению. Антигенсвязывающая молекула, содержащая биспецифические или бипаратопные антигенсвязывающие домены, где эпитоп-связывающая активность одного из антигенсвязывающих доменов варьируется в зависимости от рН, а эпитоп-связывающая активность другого антигенсвязывающего домена также варьируется в зависимости от рН, может рассматриваться как неограничивающий вариант антигенсвязывающей молекулы согласно изобретению. Полипептидная антигенсвязывающая молекула, содержащая биспецифические или бипаратопные антигенсвязывающие домены, где эпитоп-связывающая активность одного из антигенсвязывающих доменов варьируется в зависимости от концентрации ионов металла, рН, такой как концентрация ионов Са, и эпитоп-связывающая активность другого антигенсвязывающего домена также варьируется в зависимости от концентрации ионов металла, такой как концентрация ионов Са, может также рассматриваться как неограничивающий вариант антигенсвязывающей молекулы согласно изобретению.
Что касается полипептида, содержащего мультиспецифические антигенсвязывающие домены, или полипептидной молекулы, содержащей мультипаратопные антигенсвязывающие домены согласно изобретению, то полипептид, содержащий по меньшей мере два антигенсвязывающих домена, где по меньшей мере один из этих антигенсвязывающих доменов связывается с первым эпитопом в молекуле антигена, а по меньшей мере другой антигенсвязывающий домен связывается со вторым эпитопом в молекуле антигена, называется мультиспецифической антигенсвязывающей молекулой с точки зрения специфичности реакции. Если одна антигенсвязывающая молекула связывается с двумя различным эпитопами посредством двух антигенсвязывающих доменов, содержащихся в антигенсвязывающей молекуле, то эта молекула называется биспецифической антигенсвязывающей молекулой. Если одна антигенсвязывающая молекула связывается с тремя различным эпитопами посредством антигенсвязывающих доменов трех типов, присутствующих в антигенсвязывающей молекуле, то эта молекула называется триспецифической антигенсвязывающей молекулой.
Паратоп, присутствующий в антигенсвязывающем домене, который связывается с первым эпитопом в молекуле антигена, и паратоп, присутствующий в антигенсвязывающем домене, который связывается со вторым эпитопом, структурно отличающимся от первого эпитопа, представляют собой паратопы, имеющие различные структуры. Следовательно, антигенсвязывающая молекула, содержащая по меньшей мере два антигенсвязывающих домена, где по меньшей мере один из этих антигенсвязывающих доменов связывается с первым эпитопом в молекуле антигена, а по меньшей мере другой антигенсвязывающий домен связывается со вторым эпитопом в молекуле антигена, называется мультипаратопной антигенсвязывающей молекулой с точки зрения специфичности ее структуры. Если одна антигенсвязывающая молекула связывается с двумя различным эпитопами посредством антигенсвязывающих доменов двух типов, содержащихся в антигенсвязывающей молекуле, то эта молекула называется бипаратопной антигенсвязывающей молекулой. Если одна антигенсвязывающая молекула связывается с тремя различным эпитопами посредством антигенсвязывающих доменов трех типов, присутствующих в антигенсвязывающей молекуле, то эта молекула называется трипаратопной антигенсвязывающей молекулой.
Поливалентные мультиспецифические или мультипаратопные антигенсвязывающие молекулы, содержащие один или более антигенсвязывающих доменов, и методы их получения описаны в непатентных документах, таких как публикации Conrath et (J.Biol.Chem. (2001) 276 (10) 7346-7350), Muyldermans (Rev. Mol. Biotech. (2001) 74, 277-302) и Kontermann RE (2011) Bispecific Antibodies (Springer-Verlag), и в патентных документах, таких как WO1996/034103 и WO1999/023221. Антигенсвязывающие молекулы согласно изобретению могут быть получены с использованием мультиспецифических или мультипаратопных антигенсвязывающих молекул с применением методов, описанных в этих документах.
Биспецифические антитела и методы их получения приводятся ниже в качестве примеров вышеупомянутых мультиспецифических или мультипаратопных антигенсвязывающих молекул и методов их получения. Биспецифическими антителами являются антитела, содержащие вариабельные области двух типов, которые специфически связываются с различными эпитопами. Биспецифические антитела Ig-типа могут секретироваться гибридной гибридомой (квадромой), полученной путем слияния гибридом двух типов, продуцирующих антитела IgG (Milstein et al., Nature (1983) 305, 537-540).
Для продуцирования биспецифического антитела рекомбинантными методами, такими как методы, описанные в вышеупомянутом разделе, относящемся к антителам, может быть применен метод введения генов, кодирующих тяжелые цепи, содержащие представляющие интерес вариабельные области двух типов, в клетки для совместной экспрессии этих генов. Однако, даже если рассматривается только комбинация тяжелых цепей, то такой метод совместной экспрессии позволяет продуцировать смесь (i) комбинации пары тяжелых цепей, в которых одна из тяжелых цепей содержит вариабельную область, связывающуюся с первым эпитопом, а другая тяжелая цепь содержит вариабельную область, связывающуюмя со вторым эпитопом, (ii) комбинации пары тяжелых цепей, в которых присутствуют только тяжелые цепи, содержащие вариабельную область, связывающуюся с первым эпитопом, и (iii) комбинации пары тяжелых цепей, в которых присутствуют только тяжелые цепи, содержащие вариабельную область, связывающуюся со вторым эпитопом, где указанные цепи присутствуют в молекулярном отношении 2:1:1. Антигенсвязывающие молекулы, содержащие нужную комбинацию тяжелых цепей, трудно поддаются очистке от смеси комбинаций тяжелых цепей трех типов.
При продуцировании биспецифических антител рекомбинантными методами, описанными выше, эти биспецифические антитела, содержащие гетерологичную комбинацию тяжелых цепей, могут быть преимущественно секретированы путем модификации домена СН3, который составляет тяжелую цепь, посредством введения соответствующих аминокислотных замен. В частности, этот метод представляет собой метод повышения уровня образования гетерогенных тяжелых цепей и ингибирования образования гомогенных тяжелых цепей путем замены аминокислотной боковой цепи в одном домене СН3 тяжелой цепи более крупной боковой цепью («узлом» (называемым «выступами»)), и замены аминокислотной боковой цепи в другом домене СН3 тяжелой цепи менее крупной боковой цепью («дыркой» (называемой «пустотами»)), где такой «узел» находится в «дырке» (WO1996/027011, Ridgway et al. (Protein Engineering (1996) 9, 617-621), Merchant et al. (Nat. Biotech. (1998) 16, 677-681)).
Кроме того, известными методами продуцирования биспецифических антител являются методы, в которых для ассоциации тяжелых цепей применяются средства, используемые для регуляции асссоциации полипептидов или ассоциации гетеромерных мультимеров, составляющих эти полипептиды. В частности, для продуцирования биспецифических антител могут быть применены методы регуляции ассоциации тяжелых цепей путем замены аминокислотных остатков, образующих граничную область между тяжелыми цепями, так, чтобы в результате этого образовывались две тяжелые цепи с различными последовательностями, но, при этом ингибировалась ассоциация тяжелых цепей, имеющих одинаковые последовательности (WO2006/106905). Такие методы могут быть применены для продуцирования биспецифических антител.
Кроме того, метод получения биспецифических антител путем отдельного продуцирования моноклональных антител двух типов с их последующим объединением in vitro в присутствии восстановителя описан в литературе (WO2008/119353). В этом методе, моноклональные антитела двух типов расщепляют на две молекулы под действием восстановителя, а затем их снова собирают и получают биспецифические антитела в определенном соотношении. Кроме того, в литературе (WO2011/131746) описаны методы более эффективного получения биспецифических антител путем замены аминокислот, присутствующих в домене СН3, для регуляции повторной сборки половинных молекул. Такие методы могут быть также применены для продуцирования биспецифических антител.
В настоящем изобретении, термин «стимуляция выведения антигенов из плазмы» означает повышение эффективности удаления антигенов из плазмы при введении in vivo полипептида, содержащего антигенсвязывающие домены (также называемые далее «антигенсвязывающей молекулой»), или при секреции in vivo антигенсвязывающей молекулы. В соответствии с вышесказанным, это означает, что при введении антигенсвязывающих молекул, скорость выведения антигенов из плазмы повышается по сравнению со скоростью, которая наблюдается при введении антигенсвязывающей молекулы, содержащей антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого не зависит от концентрации ионов; или при введении антигенсвязывающей молекулы, содержащей FcRn-связывающий домен, не обладающий FcRn-связывающей активностью при кислотном рН; или при введении антигенсвязывающей молекулы, содержащей домен, связывающийся с рецептором Fcγ, но не обладающий способностью селективно связываться с этим рецептором. Повышенная способность антигенсвязывающей молекулы удалять антигены из плазмы может быть подтверждена, например, путем введения растворимых антигенов и антигенсвязывающей молекулы in vivo с последующим измерением концентрации растворимого антигена в плазме после введения. Если концентрация растворимых антигенов в плазме будет снижаться после введения растворимых антигенов и антигенсвязывающих молекул, содержащих антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого варьируется в зависимости от концентрации ионов; после введения FcRn-связывающего домена, обладающего FcRn-связывающей активностью при кислотном рН; и после введения домена, связывающегося с рецептором Fcγ и обладающего селективной активностью связывания с рецептором Fcγ (селективного FcγR-связывающего домена), то способность антигенсвязывающих молекул стимулировать выведение антигенов из плазмы будет повышаться. Используемый здесь термин «селективный FcγR-связывающий домен» означает домен, у которого активность связывания с активирующими FcγR снижается, а активность связывания с FcγRIIb сохраняется. Растворимым антигеном может быть антиген, связанный с антигенсвязывающей молекулой, или антиген, не связанный с антигенсвязывающей молекулой в плазме, а концентрация этого антигена может быть определена как «концентрация антигена, связанного с антигенсвязывающей молекулой в плазме» или «концентрация антигена, не связанного с антигенсвязывающей молекулой в плазме», соответственно (последнее выражение является синонимом «концентрация свободного антигена в плазме»). Термин «концентрация общего антигена в плазме» означает сумму концентраций антигена, связанного с антигенсвязывающей молекулой в плазме, и антигена, не связанного с антигенсвязывающей молекулой, а термин «концентрация общего антигена в плазме» означает концентрацию антигена, не связанного с антигенсвязывающей молекулой. Таким образом, концентрация растворимого антигена может быть определена как «концентрация общего антигена в плазме». Различные методы измерения «концентрации общего антигена в плазме» или «концентрации свободного антигена в плазме» хорошо известными специалистам и описаны ниже.
В настоящем изобретении, термины «усиление фармакокинетики», «улучшение фармакокинетики» и «превосходная фармакокинетика» могут быть иначе определены как «повышение времени удерживания в плазме (в крови)», «удлинение времени удерживания в плазме (в крови)», «длительное время удерживания в плазме (в крови)» и «пролонгированное время удерживания в плазме (в крови)». Эти термины являются синонимами.
В настоящем изобретении, термин «улучшение фармакокинетики» означает не только удлинение периода времени до выведения антигена из плазмы (например, времени до внутриклеточного разложения антигенсвязывающей молекулы или т.п., и до того момента, когда она уже не может возвратиться в плазму) после введения антигенсвязывающей молекулы человеку или животному, не являющемуся человеком, такому как мыши, крысы, обезьяны, кролики и собаки, но также и удлинение времени удерживания антигенсвязывающей молекулы в плазме в форме, позволяющей связываться с антигеном (например, антигенсвязывающей молекулы в форме, не содержащей антигена), во время введения до элиминации посредством разложения. Человеческой IgG, имеющий нативную Fc-область, может связываться с FcRn животных, не являющихся человеком. Так, например, для подтверждения свойства антигенсвязывающей молекулы согласно изобретению, может оказаться предпочтительным использовать мышь, поскольку человеческий IgG, имеющий нативную Fc-область, может связываться с мышиным FcRn на более высоком уровне, чем с человеческим FcRn (Int. Immunol. (2001) 13 (12), 1551-1559). В качестве другого примера для подтверждения свойства антигенсвязывающей молекулы согласно изобретению, описанной ниже, также предпочтительно использовать мышь, у которой нативные гены FcRn были подвергнуты дизрупции, а вместо них экспрессируется трансгенный человеческий ген FcRn (Methods Mol. Biol. (2010) 602, 93-104). В частности, «улучшение фармакокинетики» также означает увеличение периода времени до элиминации посредством разложения антигенсвязывающей молекулы, не связанной с антигенами (антигенсвязывающей молекулы в форме, не содержащей антигена). Если антигенсвязывающая молекула уже связана с антигеном, то такая антигенсвязывающая молекула в плазме не может связываться с новым антигеном. Таким образом, чем дольше антигенсвязывающая молекула будет находиться в форме, не связанной с антигеном, тем больше период, в течение которого она может связываться с новым антигеном (что повышает ее шанс связывания с другим антигеном). Это позволяет снизить время присутствия антигена, не связанного с антигенсвязывающей молекулой in vivo и увеличит период времени, в течение которого антиген будет связываться с антигенсвязывающей молекулой. Концентрация антигенсвязывающей молекулы без антигена в плазме может быть увеличена, и период времени, в течение которого антиген будет связываться с антигенсвязывающей молекулой, может быть увеличен путем ускорения выведения антигена из плазмы после введения антигенсвязывающей молекулы. В частности, термин «улучшение фармакокинетики антигенсвязывающей молекулы» согласно изобретению включает улучшение фармакокинетического параметра антигенсвязывающей молекулы без антигена (любое увеличение времени полужизни в плазме, увеличение среднего времени удерживания в плазме и замедление клиренса из плазмы), удлинение периода связывания антигена с антигенсвязывающей молекулой после введения антигенсвязывающей молекулы и ускорение выведения антигена из плазмы, опосредуемого антигенсвязывающей молекулой. Улучшение фармакокинетики антигенсвязывающей молекулы может быть оценено путем определения любого одного из параметров, таких как время полужизни антигенсвязывающей молекулы или молекулы без антигена в плазме, среднее время удерживания этих молекул в плазме и их клиренс из плазмы («Рharmacokinetics: Enshu-niyoru Rikai (Understanding through practice)” (Nanzando)). Так, например, концентрацию антигенсвязывающей молекулы или антигенсвязывающей молекулы без антигена в плазме определяют после введения антигенсвязывающей молекулы мышам, крысам, обезьянам, кроликам, собакам или человеку. Затем определяют каждый параметр. При увеличении времени полужизни в плазме или среднего времени удерживания в плазме, фармакокинетика антигенсвязывающей молекулы может считаться улучшенной. Эти параметры могут быть определены известными методами. Эти параметры могут быть соответствующим образом оценены, например, с помощью некамерной модели анализа с использованием компьютерной программы для анализа фармакокинетических свойств WinNonlin (Pharsight), в соответствии с прилагаемыми инструкциями. Концентрация антигенсвязывающей молекулы без антигена в плазме может быть определена известными методами, например, с применением аналитического метода, описанного в публикации Clin. Pharmacol. (2008) 48 (4): 406-417.
В настоящем изобретении, термин «улучшение фармакокинетики» также включает увеличение периода сохранения антигена в форме, связанной с антигенсвязывающей молекулой, после введения антигенсвязывающей молекулы. Увеличение периода времени, в течение которого антиген связывается с антигенсвязывающей молекулой после введения антигенсвязывающей молекулы, может быть оценено путем определения концентрации свободного антигена в плазме. Такое увеличение периода времени может быть оценено после определения концентрации свободного антигена в плазме или определения периода времени, необходимого для увеличения отношения концентрации свободного антигена к концентрации общего антигена.
Концентрация свободного антигена, не связанного с антигенсвязывающей молекулой в плазме, или отношение концентрации свободного антигена к концентрации общего антигена в плазме могут быть определены известными методами, например, методом, применяемым как описано в публикации Pharm. Res. (2006) 23 (1), 95-103. Альтернативно, если антиген имеет конкретную функцию in vivo, то нейтрализация этой функции антигеном, связанным с антигенсвязывающей молекулой (молекулой-антагонистом), может быть оценена с помощью теста на нейтрализацию антигенной функции. Нейтрализация антигенной функции может быть оценена с помощью маркера in vivo, который является показателем наличия этой антигенной функции. Активация антигенной функции антигеном, связанным с антигенсвязывающей молекулой (молекулой-агонистом), может быть оценена с помощью маркера in vivo, который является показателем наличия этой антигенной функции.
Определение концентрации свободного антигена в плазме и отношения количества свободного антигена в плазме к количеству общего антигена в плазме, осуществлемое с помощью анализа с использованием маркера in vivo, и другие измерения не имеют конкретных ограничений, однако, эти анализы, предпочтительно, проводят через определенный период времени после введения антигенсвязывающей молекулы. В настоящем изобретении, период времени после введения антигенсвязывающей молекулы не имеют конкретных ограничений, и специалист в данной области может самостоятельно определить соответствующий период времени в зависимости от свойств вводимой антигенсвязывающей молекулы и т.п. Такими периодами времени являются, например, один день после введения антигенсвязывающей молекулы, три дня после введения антигенсвязывающей молекулы, семь дней после введения антигенсвязывающей молекулы, 14 дней после введения антигенсвязывающей молекулы и 28 дней после введения антигенсвязывающей молекулы. В настоящем изобретении, термин «концентрация антигена в плазме» включает «концентрацию общего антигена в плазме», которая представляет собой сумму концентраций антигена, связанного с антигенсвязывающей молекулой, и несвязанного антигена, или «концентрацию свободного антигена в плазме», которая представляет концентрацию антигена, не связанного с антигенсвязывающей молекулой.
Концентрация общего антигена в плазме после введения антигенсвязывающей молекулы согласно изобретению может быть снижена в 2 раза, 5 раз, 10 раз, 20 раз, 50 раз, 100 раз, 200 раз, 500 раз, 1000 раз или более по сравнению с концентрацией после введения антигенсвязывающей молекулы, содержащей антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого не зависит от концентрации ионов, или после после введения антигенсвязывающей молекулы, содержащей Fc-область с пониженной FcγR-связывающей активностью, либо по сравнению с концентрацией в отсутствии антигенсвязывающей молекулы, содержащей антигенсвязывающий домен согласно изобретению.
Молярное отношение антиген/антигенсвязывающая молекула может быть вычислено по формуле: С=А/В, где:
величина А: молярная концентрация антигена в каждый момент времени;
величина В: молярная концентрация антигенсвязывающей молекулы в каждый момент времени;
величина С: молярная концентрация антигена на молярную концентрацию антигенсвязывающей молекулы (молярное отношение антиген/антигенсвязывающая молекула) в каждый момент времени.
Меньшая величина С указывает на более высокую эффективность выведения антигена на антигенсвязывающую молекулу, а более высокая величина С указывает на меньшую эффективность выведения антигена на антигенсвязывающую молекулу.
Молярное отношение антиген/антигенсвязывающая молекула может быть вычислено как описано выше.
Путем введения антигенсвязывающей молекулы согласно изобретению может быть достигнуто 2-кратное, 5-кратное, 10-кратное, 20-кратное, 50-кратное, 100-кратное, 200-кратное, 500-кратное, 1000-кратное и т.п. снижение молярного отношения «антиген/антигенсвязывающая молекула» по сравнению с величиной молярного отношения, полученной после введения антигенсвязывающей молекулы, содержащей антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого не зависит от концентрации ионов, после введения антигенсвязывающей молекулы, содержащей FcRn-связывающий домен, не обладающий FcRn-связывающей активностью при кислотном рН, или после введения антигенсвязывающей молекулы, содержащей домен, связывающийся с рецептором Fcγ, но не обладающий селективной активностью связывания с рецептором Fcγ.
В настоящем изобретении, антигенсвязывающая молекула, содержащая антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого не зависит от концентрации ионов; антигенсвязывающая молекула, содержащая FcRn-связывающий домен, не обладающий FcRn-связывающей активностью при кислотном рН; или антигенсвязывающая молекула, содержащая домен, связывающийся с рецептором Fcγ, но не обладающий селективной активностью связывания с рецептором Fcγ, используются в качестве эталонной антигенсвязывающей молекулы для сравнения с антигенсвязывающими молекулами согласно изобретению.
При оценке эффекта FcRn-связывающего домена, обладающего FcRn-связывающей активностью при кислотном рН, снижение концентрации общего антигена в плазме или молярного отношения антиген/антитело в плазме может быть проанализировано путем одновременной инъекции антигена и антитела модели или путем непрерывного вливания антигена модели, такой как мышиная модель линии 32 или 276, трансгенной по человеческому FcRn (Jackson Laboratories, Methods Mol. Biol. (2010) 602, 93-104), где указанная антигенсвязывающая молекула не вступает в перекрестную реакцию с мышином антигеном-аналогом. Если антигенсвязывающая молекула перекрестно реагирует с мышиным аналогом, то такие концентрации и отношения могут быть оценены просто путем инъекции антигенсвязывающей молекулы мышиной модели линии 32 или 276, трансгенной по человеческому FcRn (Jackson Laboratories). В случае совместной инъекции, мышам-моделям вводили смесь антигенсвязывающей молекулы и антигена. В случае непрерывного вливания антигена мышиной модели, этой мыши имплантировали инфузионный насос, содержащий раствор антигена, для достижения постоянной концентрации антигена в плазме, а затем вводили антигенсвязывающую молекулу. Тестируемую антигенсвязывающую молекулу вводили в той же дозе. Концентрацию общего антигена в плазме, концентрацию свободного антигена в плазме и концентрацию антигенсвязывающей молекулы в плазме измеряли в соответствующие моменты времени методом, известным специалистам.
Для оценки эффектов домена, связывающегося с рецептором Fcγ, но не обладающего селективной активностью связывания с рецепторами Fcγ, в том случае, если антигенсвязывающая молекула не вступает в перекрестную реакцию с мышиным антигеном-аналогом, концентрация общего антигена в плазме или снижение молярного отношения антиген/антитело могут быть определены либо путем одновременной инъекции указанной модели смеси антиген/антитело, либо путем непрерывного вливания антигена этой модели, где указанными моделями обычно являются мыши C57BL/6J (Charles River Japan). Если антигенсвязывающая молекула перекрестно реагирует с мышиным аналогом, то для такой оценки, антигенсвязывающая молекула может быть просто введена этим обычно используемым мышам C57BL/6J (Charles River Japan).
В случае совместной инъекции, мышам-моделям вводили смесь антигенсвязывающей молекулы и антигена. В случае непрерывного вливания антигена мышам-моделям, этим мышам имплантировали инфузионный насос, содержащий раствор антигена, для достижения постоянной концентрации антигена в плазме, а затем вводили антигенсвязывающую молекулу. Тестируемые антигенсвязывающие молекулы вводили в той же дозе. Концентрацию общего антигена в плазме, концентрацию свободного антигена в плазме и концентрацию антигенсвязывающей молекулы в плазме измеряли в соответствующие моменты времени методом, известным специалистам.
Концентрация общего или свободного антигена в плазме и молярное отношение «антиген/антигенсвязывающая молекула» могут быть определены через 2 дня, 4 дня, 7 дней, 14 дней, 28 дней, 56 дней или 84 дня после введения для оценки длительного эффекта согласно изобретению. Другими словами, продолжительность присутствия антигена в плазме определяют путем измерения концентрации общего или свободного антигена в плазме и молярного отношения антиген/антигенсвязывающая молекула через 2 дня, 4 дня, 7 дней, 14 дней, 28 дней, 56 дней или 84 дня после введения антигенсвязывающей молекулы для оценки свойства антигенсвязывающей молекулы согласно изобретению. Снижение концентрации антигена в плазме или снижение молярного отношения антиген/антигенсвязывающая молекула под действием антигенсвязывающей молекулы, описанной в настоящем изобретении, может быть определено путем оценки такого снижения в любые один или более моментов времени, указанных выше.
Концентрация общего или свободного антигена в плазме и молярное отношение антиген/антигенсвязывающая молекула могут быть определены через 15 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 8 часов, 12 часов или 24 часа после введения для оценки кратковременного эффекта согласно изобретению. Другими словами, кратковременную продолжительность присутствия антигена в плазме определяют путем измерения концентрации общего или свободного антигена в плазме и молярного отношения антиген/антигенсвязывающая молекула через 15 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 8 часов, 12 часов или 24 часа после введения антигенсвязывающей молекулы для оценки свойства антигенсвязывающей молекулы согласно изобретению.
Способ введения антигенсвязывающей молекулы согласно изобретению может быть выбран из способов введения путем интрадермальной, внутривенной, интравитреальной, подкожной, внутрибрюшинной, парентеральной и внутримышечной инъекции.
В настоящем изобретении, предпочтительным является улучшение фармакокинетики антигенсвязывающей молекулы у человека. В случае возникновения проблем при определении времени удерживания в плазме у человека, такое время удерживания в плазме может быть предсказано исходя из времени удерживания в плазме у мышей (например, у нормальных мышей, у трансгенных мышей, экспрессирующих человеческий антиген, или у трансгенных мышей, экспрессирующих человеческий FcRn) или у обезьян (например, у собакоподобных обезьян).
Термин «улучшение фармакокинетики и увеличение времени удерживания антигенсвязывающей молекулы в плазме» согласно изобретению означает улучшение любого фармакокинетического параметра (любого из таких параметров, как увеличение времени полужизни в плазме, увеличение среднего времени удерживания в плазме, замедление клиренса из плазмы и биологическая доступность) после введения in vivo антигенсвязывающей молекулы, или увеличение антигенсвязывающей молекулы в плазме через определенный период времени после введения. Эти параметры могут быть определены путем оценки времени полужизни антигенсвязывающей молекулы в плазме, среднего времени ее удерживания в плазме, ее клиренса из плазмы и биологической доступности («Рharmacokinetics: Enshu-niyoru Rikai (Understanding thrrough practice)” (Nanzando)). Так, например, концентрацию антигенсвязывающей молекулы в плазме определяют после введения антигенсвязывающей молекулы мышам (нормальным мышам и мышам, трансгенным по человеческому FcRn), крысам, обезьянам, кроликам, собакам, человеку и т.п., а затем определяют каждый из этих параметров, где улучшение фармакокинетических свойств антигенсвязывающей молекулы оценивают по увеличению времени полужизни этой молекулы в плазме или среднего времени ее удерживания в плазме. Такие параметры могут быть определены известными методами. Так, например, эти параметры могут быть соответствующим образом оценены, например, с помощью некамерной модели анализа с использованием компьютерной программы для анализа фармакокинетических свойств WinNonlin (Pharsight), в соответствии с прилагаемыми инструкциями.
У мышей были идентифицированы FcγR четырех типов, а именно, FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII, FcγRIV. У человека были также идентифицированы соответствующие FcγR, а именно, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIIa, FcγRIIIb. FcγRIIb, который, как считается, относится только к ингибирующему типу FcγR, является консервативным у человека и мышей. Другие FcγR, за исключением FcγRIIIb, передают сигналы активации посредством активирующего иммунорецепторного мотива на основе тирозина (ITAM), а FcγRIIb передает сигналы ингибирования посредством ингибирующего иммунорецепторного мотива на основе тирозина (ITIM), присутствующего внутри клеток (Nat. Rev. Immunol. (2008) 8, 34-47).
Сообщалось, что FcγRIIb1 и FcγRIIb2 являются вариантами сплайсинга FcγRIIb. Как у человека, так и у мышей, FcγRIIb1 имеет более длинный внутриклеточный домен, чем FcγRIIb2. Было подтверждено, что FcγRIIb1 экспрессируется в В-клетках, а FcγRIIb2 экспрессируется в макрофагах, тучных клетках, дендритных клетках, базофилах, нейтрофилах и эозинофилах (J. Clin. Immunol. (2005) 25 (1), 1-18).
Ранее сообщалось, что у человека, дисфункция и снижение уровня экспрессии FcγRIIb коррелирует с развитием аутоимунных заболеваний. Так, например, сообщалось, что у некоторых пациентов с СКВ, связывание активаторов транскрипции подавляется в результате полиморфизма в области промотора гена, экспрессирующего FcγRIIb, что приводит к снижению уровней экспрессии FcγRIIb (Hum. Genet. (2005) 117, 220-227, J. Immunol. (2004) 172, 7192-7199, и J. Immunol. (2004) 172, 7186-7191). Кроме того, сообщалось, что у некоторых пациентов с СКВ присутствуют аллотипы двух типов, где аминокислотой в положении 233 FcγRIIb является Ile или Thr. Такое положение имеется в трансмембранной области FcγRIIb, и при этом, сообщалось, что существует небольшая вероятность присутствия FcγRIIb в липидном каркасе, если аминокислотой в положении 233 является Thr, по сравнению с тем случаем, когда такой аминокислотой является Ile, что приводит к снижению сигнал-передающей функции FcγRIIb (Nat. Med. (2005) 11, 1056-1058, Hum. Mol. Genet., (2005) 14, 2881-2892). Также сообщалось, что у мышей C57BL/6 с дизрупцией гена FcγRIIb наблюдаются СКВ-подобные симптомы, такие как продуцирование аутоантител и гломерулонефрит (Immunity 13 (2000) 277-285, J. Exp. Med. (2002) 195, 1167-1174). Кроме того, ранее сообщалось, что снижение уровня экспрессии FcγRIIb и т.п. наблюдается у моделей с предрасположенностью к СКВ (Immunogenetics (2000) 51, 429-435, Int. Immunol. (1999) 11, 1685-1691, Curr. Biol. (2000) 10, 227-230, J. Immunol. (2002) 169, 4340-4346). На основе этих сообщений был сделан вывод, что FcγRIIb регулирует гуморальный иммуннитет как у мышей, так и у человека.
Если антитело, несущее Fc согласно изобретению, способствует элиминации антигенов посредством FcγRIIb, то эндоцитозная функция FcγRIIb рассматривается как наиболее важная функция из всех функций FcγRIIb. Как описано выше, FcγRIIb1 и FcγRIIb2 существуют в виде вариантов сплайсинга FcγRIIb, а также сообщалось, что FcγRIIb2 участвует, главным образом, в эндоцитозе иммунного комплекса антитело и антигена (J. Immunol. (1994), 152 574-585, Science (1992) 256, 1808-1812, Cell (1989) 58, 317-327). Ранее сообщалось, что мышиный FcγRIIb2 участвует в образовании «ямки», покрытой клатрином, и подвергается эндоцитозу (Cell (1989) 58, 317-327). Кроме того, сообщалось, что дилейциновый мотив необходим для FcγRIIb2-опосредуемого эндоцитоза, и что такой дилейциновый мотив является консервативным как у человека, так и у мышей (EMBO J. (1994) 13 (13), 2963- 2969). Исходя из этого факта можно сделать вывод, что FcγRIIb2 может обладать эндоцитозной активностью у человека и у мышей.
С другой стороны, сообщалось, что FcγRIIb1, в отличие от FcγRIIb2, не вызывает эндоцитоза. FcγRIIb1 имеет последовательность, встроенную в его внутриклеточный домен, который отсутствует в FcγRIIb2. Считается, что эта последовательность ингибирует поглощение FcγRIIb1 в «ямке», покрытой клатрином, и тем самым ингибирует эндоцитоз (J. Cell. Biol. (1992) 116, 875-888, J. Cell. Biol. (1989) 109, 3291-3302). У человека, FcγRIIb1 имеет встроенную последовательность в сайте, аналогичном последовательности FcγRIIb2 у мышей, а поэтому, предполагается, что различие в эндоцитозной активности у FcγRIIb1 и FcγRIIb2 вызывается по одному и тому же механизму. Кроме того, сообщалось, что у человека и мышей, приблизительно 40% иммунных комплексов на клеточной поверхности поглощается клетками за 20 минут (Mol. Immunol. (2011) 49, 329-337, Science (1992) 256, 1808-1812). Следовательно, можно предположить, что у человека, FcγRIIb2 способствует поглощению иммунных комплексов клетками с такой же скоростью, как и у мышей.
Поскольку FcγRIIb является только одним из рецепторов семейства FcγR, который имеет внутриклеточный ITIM, и поскольку распределение этого рецептора в экспрессирующих его клетках является одинаковым как у человека, так и у мышей, то было высказано предположение, что этот рецептор имеет одинаковую регуляторную иммунную функцию как у человека, так и у мышей. Кроме того, учитывая тот факт, что иммунные комплексы поглощаются клетками человека и мышей с одинаковой скоростью, то можно сказать, что эффекты элиминации антигена под действием антител, опосредуемые FcγRIIb у человека, могут быть предсказаны с использованием мышей. Антигенсвязывающие молекулы mF44 и mF46 обладают способностью связываться с растворимыми антигенами в зависимости от рН и имеют повышенную аффинность связывания с мышиными FcγRIIb и FcγRIII по сравнению с mIgG1, который представляет собой антигенсвязывающую молекулу, способную связываться с растворимым антигеном в зависимости от рН. Действительно, как показано в Сравнительном примере 7, при введении нормальным мышам mF44 и mF46 наблюдалось увеличение клиренса антигена по сравнению с клиренсом, наблюдаемым при введении mIgG1.
Кроме того, в нижеописанном Сравнительном примере 8, аналогичный эксперимент был проведен на мышах, дефицитных по γ-цепи Fc-рецептора. Сообщалось, что FcγR, не являющиеся FcγRIIb, экспрессируются у мышей только в присутствии гамма-цепи. Таким образом, FcγRIIb экспрессируется только у мышей, дефицитных по γ-цепи Fc-рецептора. Введение mF44 или mF46By, которые представляют собой антигенсвязывающие молекулы, связывающиеся с растворимыми антигенами в зависимости от рН, мышам, дефицитным по γ-цепи Fc-рецептора, позволяет оценить эффекты ускорения элиминации антигена при селективном повышении FcγRIIb-связывающей активности. Результаты, описанные в Сравнительном примере 8, показали, что при введении mF44 или mF46 (которые представляют собой антигенсвязывающие молекулы, способные связываться с растворимыми антигенами в зависимости от рН) мышам, дефицитным по γ-цепи Fc-рецептора, клиренс антигенов повышается в отличие от клиренса антигенов, наблюдаемого при введении этим мышам антитела mIgG1 (которое представляет собой антигенсвязывающую молекулу, способную связываться с растворимыми антигенами в зависимости от рН). Кроме того, результаты, описанные в Сравнительном примере 8, показали, что при введении mF44 или mF46 мышам, дефицитным по γ-цепи Fc-рецептора, степень элиминации антигена была аналогичной степени элиминации антигена при введении этих молекул нормальным мышам.
Как описано в Сравнительном примере 8, аналогичный эксперимент был проведен на мышах, дефицитных по FcγRIII. Поскольку mIgG1, mF44 и mF46 связываются только с FcγRIIb2 и FcγRIII семейства mFcγR, то введение антител FcγRIII-дефицитным мышам позволяет оценить эффекты ускорения элиминации антигена при селективном повышении FcγRIIb-связывающей активности. Результаты, описанные в Сравнительном примере 8, показали, что при введении mF44 или mF46 FcγRIII-дефицитным мышам клиренс антигенов повышается в отличие от клиренса антигенов, наблюдаемого при введении этим мышам антитела mIgG1. Кроме того, результаты, описанные в Сравнительном примере 8, показали, что при введении mF44 и mF46 FcγRIII-дефицитным мышам, степень элиминации антигена была аналогичной степени элиминации антигена при введении этих молекул мышам, дефицитным по γ-цепи Fc-рецептора и нормальным мышам.
Эти результаты показали, что элиминация антигена может быть ускорена путем усиления селективного связывания только с FcγRIIb, но не с активирующими FcγR. Более конкретно, эти результаты показали, что FcγRIIb участвует, главным образом, в FcγR-опосредуемой элиминации иммунных комплексов, и что при сохранении активности связывания с FcγRIIb семейства FcγR также может сохраняться эффективность FcγR-опосредуемой элиминации иммунных комплексов под действием антитела.
Помимо данных, обсуждаемых в документах, в которых изложены результаты вышеописанных анализов, проводимых на мыщах, имеются также данные, указывающие на то, что поглощение иммунных комплексов клетками посредством FcγRIIb наблюдается in vivo как у человека, так и у мышей, а поэтому было обнаружено, что антитела, имеющие Fc с повышенной способностью селективно связываться с человеческим FcγRIIb, могут способствовать ускорению элиминации антигенов. Кроме того, как обсуждалось выше, поскольку поглощение иммунных комплексов клетками посредством FcγRIIb наблюдается у мышей и человека на одинаковом уровне, то эффекты ускорения элиминации антигена, сравнимые с эффектами, наблюдаемыми в случае антител, имеющих Fc с повышенной аффинностью связывания с мышиным FcγRIIb, могут быть достигнуты в равной степени у человека in vivo с использованием Fc, который обладает повышенной аффинностью связывания с человеческим FcγRIIb.
Настоящее изобретение также относится к способу продуцирования полипептида, содержащего вариант Fc-области антитела, обладающего пониженной активностью связывания с активирующими FcγR с сохранением FcγRIIb-связывающей активности, по сравнению с полипептидом, содержащим родительскую Fc-область, где указанный способ включает введение в вариант Fc-области полипептида, содержащего такой вариант по меньшей мере одной аминокислотной модификации.
Примерами способа продуцирования является способ, включающий следующие стадии:
(a) добавление по меньшей мере одной аминокислотной модификации в Fc-область полипептида, содержащего Fc-область;
(b) определение FcγRIIb-связывающей активности и активности связывания полипептидов, модифицированных в стадии (а), со всеми активирующими FcγR; и
(c) отбор полипептида, содержащего вариант Fc-области, обладающий пониженной активностью связывания с активирующими FcγR, но с сохранением FcγRIIb-связывающей активности, по сравнению с полипептидом, содержащим родительскую Fc-область.
Предпочтительным вариантом осуществления изобретения являются способ продуцирования полипептида, содержащего вариант Fc-области, где указанный способ включает стадии:
(a) модификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий родительскую Fc-область, для снижения активности связывания с активирующими FcγR, но с сохранением FcγRIIb-связывающей активности, по сравнению с активностью указанного полипептида;
(b) введения нуклеиновой кислоты в клетку-хозяена и культивирования этой клетки для экспрессии полипептида; и
(c) сбора полипептида из культуры клеток-хозяев.
Антитела и молекулы Fc-гибридного белка, полученные этим способом, также входят в объем настоящего изобретения.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способам снижения активности связывания со всеми активирующими FcγR, а в частности, с FcγRIIа (R-типа), но с сохранением FcγRIIb-связывающей активности, по сравнению с полипептидом, содержащим родительскую Fc-область, где указанный способ включает стадию введения по меньшей мере одной аминокислотной модификации в вариант Fc-области полипептида, содержащего вариант Fc-области антитела, или к способу продуцирования полипептида, содержащего вариант Fc-области согласно изобретению.
Примером такого способа является способ, включающий следующие стадии:
(a) добавления по меньшей мере одной аминокислотной модификации в Fc-область полипептидов, содержащих Fc-область;
(b) определения активности связывания полипептидов, модифицированных в стадии (а), с FcγRIIа и с FcγRIIb; и
(c) отбора полипептида, содержащего вариант Fc-области, обладающий пониженной активностью связывания с FcγRIIа (R-типа) но с сохранением FcγRIIb-связывающей активности, по сравнению с полипептидом, содержащим родительскую Fc-область.
Предпочтительным вариантом осуществления изобретения является способ снижения активности связывания со всеми FcγR, а в частности, FcγRIIа (R-типа), но с сохранением FcγRIIb-связывающей активности полипептида, содержащего родительскую Fc-область, или способ продуцирования полипептида, содержащего вариант Fc-области, где указанный способ включает стадии:
(a) модификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий родительскую Fc-область, для снижения активности связывания с FcγRIIа (R-типа), но с сохранением FcγRIIb-связывающей активности, по сравнению с указанным полипептидом;
(b) введения нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина и культивирования этой клетки для экспрессии полипептида; и
(c) сбора полипептида из культуры клеток-хозяев.
Кроме того, антитела и молекулы Fc-гибридного белка, полученные этим способом, также входят в объем настоящего изобретения.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу подавления продуцирования антител против полипептида по сравнению с полипептидом, содержащим родительскую Fc-область, при его введении in vivo, где указанный способ включает добавление по меньшей мере одной аминокислотной модификации в Fc-область полипептида, содержащего такую Fc-область, или к способу продуцирования полипептидов, который позволяет снижать уровень продуцирования антител против указанного полипептида.
Примером такого способа является способ, включающий следующие стадии:
(a) добавление по меньшей мере одной аминокислотной модификации в Fc-область полипептида, содержащего Fc-область; и
(b) подтверждение подавления продуцирования антитела при введении in vivo полипептида, содержащего Fc-область, модифицированную в стадии (а), по сравнению с полипептидом, содержащим родительскую Fc-область.
Такие полипептиды могут быть использованы в качестве фармацевтических средств, поскольку они могут подавлять продуцирование антитела без активации активирующих FcγR.
В вышеупомянутом способе, предпочтительно, чтобы активность связывания со всеми активирующими FcγR, а в частности, FcγRIIа (R-типа) была снижена при сохранении FcγRIIb-связывающей активности.
В предпочтительном варианте вышеупомянутого способа, например, в Fc-области человеческого IgG, Fc-область модифицируют так, чтобы аминокислота в положении 238, в соответствии с Европейской нумерацией, была заменена другой аминокислотой, и по меньшей мере одна аминокислота, выбранная из аминокислот в положениях 235, 237, 241, 268, 295, 296, 298, 323, 324 и 330 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией была заменена другой аминокислотой. Две или более аминокислот могут быть выбраны из вышеуказанных аминокислот и объединены с получением комбинаций модификаций других аминокислот с модификацией аминокислоты в положении 238 в соответствии с Европейской нумерацией.
Предпочтительными комбинациями являются комбинации нижеследующих аминокислот (1)-(3):
(1) аминокислот в положениях 241, 268, 296 и 324 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(2) аминокислот в положениях 237, 241, 296 и 330 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(3) аминокислот в положениях 235, 237, 241 и 296 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
Аминокислоты, выбранные для введения в качестве модификаций согласно изобретению, не имеют конкретных ограничений, при условии, что они будут обладать пониженной селективностью связывания со всеми активирующиеми FcγR, а в частности, FcγRIIа(R), но сохранять FcγRIIb-связывающую активность по сравнению с активностью до модификации, и такими аминокислотами, предпочтительно, являются аминокислота Asp в положении 238 в соответствии с Европейской нумерацией, аминокислота Phe в положении 235, аминокислота Gln или Asp в положении 237, аминокислота Met или Leu в положении 241, аминокислота Pro в положении 268, аминокислота Met или Val в положении 295, аминокислота Gly, His, Asn или Asp в положении 296, аминокислота Ala или Met в положении 298, аминокислота Ile в положении 323, аминокислота Asn или His в положении 324 и аминокислота His или Tyr в положении 330 в соответствии с Европейской нумерацией.
Кроме того, в предпочтительном варианте вышеописанного способа, например, Fc-область в человеческом IgG модифицируют так, чтобы аминокислотная(ые) модификация(и), которая(ые) увеличивает(ют) FcγRIIb-связывающую активность в два раза или более по сравнению с активностью нативной Fc-области IgG, была(и) введена(ы) в комбинации с аминокислотной(ыми) модификацией(ями), которая(ые) снижает(ют) активность связывания со всеми FcγR.
В настоящем изобретении, «аминокислотые модификации, повышающие FcγRIIb-связывающую активность в два раза или более по сравнению с активностью нативной Fc-области IgG» не имеют конкретных ограничений, однако, примерами таких аминокислотных модификаций являются модификации, представленные в таблице 11.
Кроме того, в настоящем изобретении, «аминокислотые модификации, снижающие активности связывания со всеми FcγR» не имеют конкретных ограничений, и примерами таких аминокислотных модификаций являются по меньшей мере одна аминокислота, выбранная из аминокислот в положениях 234, 235, 236, 237, 239, 265, 267 и 297 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией.
Предпочтительная комбинация включает, например, комбинацию модификаций аминокислот в положениях 238 и 271 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией, которые повышают FcγRIIb-связывающую активность в два раза или более по сравнению с активностью нативной Fc-области IgG, и модификации по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из аминокислот в положениях 234, 235, 236, 237, 239, 265, 267 и 297 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией, которые снижают активность связывания со всеми FcγR.
В частности, предпочтительными комбинациями модификаций являются комбинации нижеследующих аминокислот (1)-(3).
(1) аминокислот в положениях 233, 238, 264, 267, 268 и 271 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(2) аминокислот в положениях 233, 237, 238, 264, 267, 268, 271, 296, 297, 330 и 396 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией; и
(3) аминокислот в положениях 233, 238, 264, 267, 268, 271 и 396 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией.
Аминокислоты, выбранные для введения в качестве модификаций согласно изобретению, не имеют конкретных ограничений, при условии, что они будут обладать пониженной селективностью связывания со всеми активирующиеми FcγR, а в частности, FcγRIIа(R), но сохранять FcγRIIb-связывающую активность по сравнению с активностью до модификации, и такими аминокислотами, предпочтительно, являются аминокислота Asp в положении 238 в соответствии с Европейской нумерацией, аминокислота Gly в положении 271, аминокислота Ala, His, Asn, Lys или Arg в положении 234, аминокислота Ala в положении 235, аминокислота Gln в положении 236, аминокислота Arg или Lys в положении 237, аминокислота Lys в положении 239, аминокислота Lys, Asn, Arg, Ser или Val в положении 265, аминокислота Lys, Arg или Tyr в положении 267 и аминокислота Ala в положении 297 в соответствии с Европейской нумерацией.
Альтернативно, в предпочтительном варианте вышеописанного способа, например, Fc-область модифицируют так, чтобы в Fc-области человеческого IgG, аминокислоты в положениях 238, 271, 327, 330 и 331 в соответствии с Европейской нумерацией были заменены другими аминокислотами. Кроме того, Fc-область модифицируют так, чтобы по меньшей мере одна аминокислота, выбранная из аминокислот в положениях 233, 237, 264, 267 и 268, была заменена другими аминокислотами. Для получения комбинации модификаций с другими аминокислотами, могут быть выбраны и объединены одна или более аминокислот из числа вышеупомянутых аминокислот. Примерами предпочтительных комбинаций являются нижеследующие аминокислоты (1)-(4).
(1) аминокислоты в положениях 237, 238, 268, 271, 327, 330 и 331 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(2) аминокислоты в положениях 233, 237, 238, 268, 271, 327, 330 и 331 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(3) аминокислоты в положениях 238, 267, 268, 271, 327, 330 и 331 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
(4) аминокислоты в положениях 238, 264, 267, 271, 327, 330 и 331 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией;
Аминокислоты, выбранные для введения в качестве модификаций согласно изобретению, не имеют конкретных ограничений, при условии, что они будут обладать пониженной селективностью связывания со всеми активирующиеми FcγR, а в частности, FcγRIIа(R), но сохранять FcγRIIb-связывающую активность по сравнению с активностью до модификации, и такими аминокислотами, предпочтительно, являются аминокислота Asp в положении 238, аминокислота Gly в положении 271, аминокислота Gly в положении 327, аминокислота Ser в положении 330, аминокислота Ser в положении 331, аминокислота Asp в положении 233, аминокислота Asp в положении 237, аминокислота Ile в положении 264, аминокислота Ala в положении 267 и аминокислота Asp или Glu в положении 268 в соответствии с Европейской нумерацией.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способам модификации полипептидов для продуцирования полипептидов, обладающих пониженной активностью связывания с активирующими FcγR, а в частности, с FcγRIIа (R-типа), но с сохранением FcγRIIb-связывающей активности полипептида, содержащего родительскую Fc-область. Альтернативно, настоящее изобретение относится к способам модификации полипептидов для продуцирования полипептидов, обладающих пониженной активностью связывания с активирующими FcγR, а в частности, с FcγRIIа (R-типа), но с сохранением FcγRIIb-связывающей активности полипептида, содержащего родительскую Fc-область.
Настоящее изобретение также относится к способам модификации полипептидов для продуцирования полипептида, способствующего снижению уровня продуцирования антитела при введении этого полипептида in vivo по сравнению с полипептидом, содержащим родительскую Fc-область.
Пример предпочтительного варианта осуществления изобретения включает комбинацию аминокислотных модификаций, описанных выше в способе продуцирования полипептида, содержащего вариант Fc-области, обладающей пониженной активностью связывания с активирующими FcγR, а в частности, с FcγRIIа (R-типа), но с сохранением FcγRIIb-связывающей активности.
В методах описанного типа могут быть использованы комбинации других аминокислот, при условии, что активности связывания со всеми активирующими FcγR будут снижаться, но при этом будет сохраняться FcγRIIb-связывающая активность по сравнению с активностью нативной Fc-области IgG. Примерами таких модификаций являются модификации, которые снижают комплемент-связывающую активность. В качестве конкретных примеров могут служить модификации аминокислот в положении 322 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией, или комбинация модификаций аминокислот в положениях 327, 330 и 331 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией. Аминокислоты, выбранные для введения в качестве модификаций согласно изобретению, не имеют конкретных ограничений, при условии, что они будут обладать пониженной селективностью связывания со всеми активирующиеми FcγR, а в частности, FcγRIIа(R), но сохранять FcγRIIb-связывающую активность по сравнению с активностью полипептида, содержащего нативную Fc-область IgG, и такими аминокислотами, предпочтительно, являются аминокислота Ala или Glu в положении 322, аминокислота Gly в положении 327, аминокислота Ser в положении 330 и аминокислота Ser в положении 331 в соответствии с Европейской нумерацией.
Кроме того, настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, содержащий вариант Fc-области, имеющий пониженную активность связывания с активирующими FcγR, а в частности, с FcγRIIа(R), но сохраняющий FcγRIIb-связывающую активность по сравнению с активностью полипептида, содержащего родительскую Fc-область IgG, где указанный полипептид, содержащий Fc-область, имеет по меньшей мере одну модифицированную аминокислоту. Настоящее изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, содержащий вариант Fc-области, имеющий пониженную активность связывания с активирующими FcγR, а в частности, с FcγRIIа(R), но сохраняющий FcγRIIb-связывающую активность по сравнению с активностью полипептида, содержащего родительскую Fc-область IgG, где указанный полипептид, содержащий Fc-область, имеет по меньшей мере одну модифицированную аминокислоту. Такой нуклеиновой кислотой согласно изобретению может быть любая форма нуклеиновой кислоты, например, ДНК или РНК.
Настоящее изобретение также относится к векторам, содержащим описанные выше нуклеиновые кислоты согласно изобретению. Тип вектора может быть соответствующим образом выбран специалистом в зависимости от клеток-хозяев, в которые вводят этот вектор. Такими векторами являются, например, векторы, описанные выше.
Кроме того, настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, трансформированным вышеописанными векторами согласно изобретению. Соответствующие клетки-хозяева могут быть выбраны самим специалистом. Клетками-хозяевами являются, например, клетки-хозяева, описанные выше. Конкретными примерами являются нижеследующие клетки-хозяева.
Если в качестве клеток-хозяев используются эукариотические клетки, то такими клетками могут быть клетки животных, клетки растений или клетки грибов. В частности, клетками животных являются, например, следующие клетки:
(1) клетки млекопитающих: СНО (клеточная линия яичника китайского хомячка); COS (клеточная линия почек обезьян), клетки миеломы (Sp2/O, NS0 и т.п.), BHK (клеточная линия почек детеныша хомячка), клетки Hela, клетки Vero, клетки HEK293 (клеточная линия почек человеческого эмбриона, содержащая фрагментированную ДНК аденовируса (Ad5), клетки Freestyle 293, клетки PER.C6 (клеточная линия сетчатки человеческого эмбриона, трансформированная генами E1A и E1B аденовируса типа 5 (Ad5) и т.п. (Current Protocols in Protein Science (May, 2001, Unit 5.9, Table 5.9.1));
(2) клетки амфибий: ооциты Xenopus или т.п.; и
(3) клетки насекомых: sf9, sf21, Tn5 или т.п.
Кроме того, известно, что в качестве системы для экспрессии гена антитела могут быть использованы клетки растений, происходящие от растений рода Nicotiana, таких как Nicotiana tabacum. Для трансформации клеток растений могут быть соответствующим образом использованы культивированные клетки каллуса.
Кроме того, в качестве клеток грибов могут быть использованы следующие клетки:
- дрожжи рода Saccharomyces, такие как Saccharomyces serevisiae и рода Pichia, такие как Pichia pastoris; и
- нитчатые грибы рода Aspergillus, такие как Aspergillus niger.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу снижения активности связывания с активирующими FcγR, а в частности, с FcγRIIа (R-типа), но с сохранением FcγRIIb-связывающей активности по сравнению с активностью полипептида, содержащего родительскую Fc-область IgG, где указанный способ включает добавление в Fc-область полипептида, содержащего Fc-область, по меньшей мере одной аминокислотной модификации.
Настоящее изобретение относится к способу, включающему стадию добавления по меньшей мере одной аминокислотной модификации в Fc-область полипептида, содержащего эту Fc-область, где указанный способ приводит к подавлению продуцирования антител против указанного полипептида при введении этого полипептида in vivo, в отличие от введения полипептида, содержащего родительскую Fc-область.
Предпочтительный вариант осуществления изобретения включает, например, комбинацию аминокислотных модификаций, указанных выше в описании способа продуцирования полипептида, содержащего вариант Fc-области, который обладает пониженной активностью связывания с активирующими FcγR, а в частности, с FcγRIIа (R-типа), но сохраняет FcγRIIb-связывающую активность.
Полипептиды, полученные с применением любого из вышеупомянутых способов, также входят в объем настоящего изобретения.
Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим полипептид, включающий вариант Fc-области согласно изобретению.
Фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть приготовлены известными методами и, помимо вышеописанных молекул антитела или гибридного белка Fc согласно изобретению, содержат фармацевтически приемлемые носители. Так, например, если антитела приготовлены в виде стерильного раствора или суспензии для инъекции с использованием воды или любой другой фармацевтически приемлемой жидкости, то такие композиции могут быть введены парентерально. Так, например, такие композиции могут быть приготовлены путем соответствующего объединения молекул антител или гибридного белка Fc с фармацевтически приемлемыми носителями или средами, а в частности, со стерильной водой или физиологическим раствором, растительными маслами, эмульгаторами, суспендирующими агентами, поверхностно-активными веществами, стабилизаторами, ароматизаторами, наполнителями, носителями, консервантами, связывающими агентами и т.п., путем их смешивания с получением унифицированной дозы в форме, отвечающей общеизвестным фармацевтическим требованиям. Конкретными примерами таких носителей являются легкая безводная кремневая кислота, лактоза, кристаллическая целлюлоза, маннит, крахмал, кальций-содержащая кармелоза, натрий-содержащая кармелоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, диэтиламиноацетат поливинилацетала, поливинилпирролидон, желатин, триглицерид со средней длиной цепи, отвержденное полиоксиэтилен-содержащее касторовое масло 60, сахароза, карбоксиметилцеллюлоза, кукурузный крахмал, неорганическая соль и т.п. Содержание активного ингредиента в такой композиции, корректируют так, чтобы получить его соответствующую дозу в требуемом интервале.
Стерильные композиции для инъекции могут быть приготовлены с использованием носителей, таких как дистиллированная вода для инъекций, в соответствии со стандартными протоколами.
Водными растворами для инъекций являются, например, физиологический раствор и изотонические растворы, содержащие глюкозу или другие адъюванты, такие как D-сорбит, D-манноза, D-маннит и хлорид натрия. Эти растворы могут быть использованы в комбинации с подходящими солюбилизаторами, такими как спирт, а в частности, этанол, многоатомные спирты, такие как пропиленгликоль и полиэтиленгликоль, и неионные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбат 80(TM) и HCO-50.
Маслами являются кунжутное масло и соевое масло, и эти масла могут быть объединены с солюбилизаторами, такими как бензилбензоат или бензиловый спирт. Эти композиции могут быть также приготовлены с использованием буферов, например, фосфатных буферов и натрий-ацетатных буферов; аналгетиков, например, гидрохлорида прокаина; стабилизаторов, например, бензилового спирта или фенола; или антиоксидантов. Приготовленные инъекции обычно разделяют на аликвоты и разливают по соответствующим ампулам.
Предпочтительным способом введения является парентеральное введение, а в частности, введение путем инъекции, интраназальное введение, внутрилегочное введение и чрезкожное введение. Так, например, инъекции могут быть введены системно или местно путем внутривенной инъекции, внутримышечной инъекции, внутрибрюшинной инъекции или подкожной инъекции.
Кроме того, способ введения может быть соответствующим образом выбран в зависимости от возраста и симптомов пациента. Разовая доза фармацевтической композиции, содержащая антитело или полинуклеотид, кодирующий антитело, может быть выбрана, например, так, чтобы она составляла, например, в пределах от 0,0001 до 1000 мг/кг массы тела. Альтернативно, такая доза может, например, составлять в пределах от 0,001 до 100000 мг/пациента. Однако, эта доза не ограничивается указанными величинами. Доза и способ введения варьируются в зависимости от массы тела и возраста пациента, а также от симптомов его заболевания, и могут быть соответствующим образом выбраны самим специалистом.
Вышеупомянутые полипептиды, содержащие вариант Fc-области согласно изобретению, могут быть использованы в качестве активных ингредиентов фармацевтических средств, которые подавляют активацию В-клеток, тучных клеток, дендритных клеток и/или базофилов. Полипептиды, содержащие вариант Fc-области согласно изобретению, могут подавлять активацию В-клеток, тучных клеток, дендритных клеток и/или базофилов, посредством селективного воздействия на FcγRIIb без активации активирующего FcγR. Активация В-клеток включает пролиферацию, продуцирование IgЕ, продуцирование IgM и продуцирование IgA. Вышеупомянутые полипептиды, содержащие вариант Fc-области согласно изобретению, перекрестно связываются с FcγRIIb и IgЕ, что приводит к подавлению продуцирования IgЕ В-клетками; перекрестно связываются с FcγRIIb и IgМ, что приводит к подавлению продуцирования IgМ В-клетками; и перекрестно связываются с FcγRIIb и IgА, что приводит к подавлению продуцирования IgА В-клетками. Помимо этого, ингибирующее действие, аналогичное вышеупомянутому действию, осуществляется посредством прямого или опосредованного перекрестного связывания FcγRIIb с молекулами, которые экспрессируются на В-клетках и содержат внутриклеточный домен ITAM или взаимодействуют с доменом ITAM, таким как BCR, CD19 и CD79b. Кроме того, активация тучных клеток включает пролиферацию, активацию посредством IgE и т.п. и дегрануляцию. В тучных клетках, вышеупомянутые полипептиды, содержащие вариант Fc-области согласно изобретению, могут подавлять пролиферацию, активацию посредством IgE и т.п. и дегрануляцию посредством прямого или опосредованного перекрестного связывания FcγRIIb с молекулами рецептора IgЕ, которые экспрессируются на тучных клетках и содержат домен ITAM или взаимодействуют с доменом ITAM, таким как FcεRI, DAP12 и CD200R3. Активация базофилов включает их пролиферацию и дегрануляцию. В базофилах, вышеупомянутые полипептиды, содержащие вариант Fc-области согласно изобретению, могут подавлять пролиферацию, активацию и дегрануляцию посредством прямого или опосредованного перекрестного связывания FcγRIIb с молекулами на клеточной мембране, которые содержат внутриклеточный домен ITAM или взаимодействуют с доменом ITAM. Активация дендритных клеток включает их пролиферацию и дегрануляцию. В дендритных клетках, вышеупомянутые полипептиды, содержащие вариант Fc-области согласно изобретению, могут также подавлять активацию, дегрануляцию и пролиферацию посредством прямого или опосредованного перекрестного связывания FcγRIIb с молекулами на клеточной мембране, которые содержат внутриклеточный домен ITAM или взаимодействуют с доменом ITAM.
В настоящем изобретении, вышеупомянутые полипептиды, содержащие вариант Fc-области согласно изобретению, могут быть использованы в качестве активного ингредиента в терапевтических или профилактических средствах для лечения иммунных воспалительных заболеваний. Поскольку, как описано выше, полипептиды, содержащие вариант Fc-области согласно изобретению, могут подавлять активацию В-клеток, тучных клеток, дендритных клеток и/или базофилов, то введение полипептидов, содержащих вариант Fc-области согласно изобретению, может быть осуществлено для лечения или предупреждения иммунных воспалительных заболеваний. Термин «иммунные воспалительные заболевания» включает, но не ограничивается ими, ревматоидный артрит, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный тиреоидит, буллезные аутоиммунные заболевания, аутоиммунное заболевание коры надпочечника, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунную тромбоцитопеническую пурпуру, мегалоцитарную анемию, аутоиммунный атрофический гастрит, аутоиммунную нейтропению, аутоиммунный орхит, аутоиммунный энцефаломиелит, аутоиммунное заболевание, ассоциированное с рецепторными функциями, аутоиммунное бесплодие, хронический активный гепатит, гломерулонефрит, интерстициальный фиброз легких, рассеянный склероз, болезнь Пэджета, остеропороз, множественную миелому, увеит, острый и хронический спондилит, подагрический артрит, воспалительное заболевание кишечника, респираторный дистресс-синдром взрослых (РДСВ), псориаз, болезнь Крона, базедову болезнь, ювенильный диабет, болезнь Аддисона, тяжелую миастению, увеит, вызываемый поражением хрусталика, системную красную волчанку, аллергический ринит, аллергический дерматит, язвенный колит, гиперчувствительность, мышечную дегенерацию, кахексию, системную склеродермию, локализовнную склеродермию, синдром Сьегрена, болезнь Бехчета, синдром Рейтера, диабет типа I и типа II, расстройства, ассоциированные с резорбцией кости, реакицю «трансплантат против хозяина», ишемическое реперфузионное повреждение, атеросклероз, травму головного мозга, церебральную малярию, сепсис, септический шок, синдром токсического шока, лихорадку, миалгии, ассоциированные с окрашиванием, апластическую анемию, гемолитическую анемию, идиопатическую тромбоцитопению, синдром Гудпасчера, синдром Гийена-Барре, тиреоидит Хашимото, пузырчатку, IgA-нефропатию, поллиноз, антифосфолипидный синдром, полимиозит, гранулематоз Вегенера, нодозный артерит, смешанное заболевание соединительных тканей, фибромиалгию, астму, атопический дерматит, хронический атрофический гастрит, первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, аутоиммунный панкреатит, аортит, быстро прогрессирующий гломерулонефрит, мегабластомную анемию, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, первичный гипотиреоидит, идиопатическую болезнь Аддисона, инсулинзависимый сахарный диабет, хроническую дисковидную красную волчанку, пемфигоид, герпес беременных, буллезный дерматоз, вызываемый линейными цепями IgA, приобретенный буллезный эпидермолиз, гнездную аллопецию, вульгарное витилиго, центробежную приобретенную лейкодермию Саттона, болезнь Харады, аутоиммунную невропатию зрительного нерва, идиопатическую азооспермию, привычный выкидыш, гипогликемию, хроническую крапивницу, анкилозирующий спондилит, псориатический артрит, энтеропатический артрит, реактивный артрит, спонидилоартропатию, энтезопатию, синдром раздраженного кишечника, синдром хронической усталости, дерматомиозит, миозит, вызываемый тельцами включения, синдром Шмидта, болезнь Грэйвса, пернициозную анемию, волчаночный гепатит, пресенильную деменцию, болезнь Альцгеймера, демиелинизирующее расстройство, амиотрофический боковой склероз, гипопаратиреоидит, синдром Дресслера, синдром Итона-Ламберта, герпетиформный дерматит, алопецию, прогрессирующий системный склероз, синдром CREST (кальциноз, феномен Рейно, нарушение перистальтики пищевода, склеродактилия и телангиэктазия), саркоидоз, ревматическую лихорадку, мультиформную эритему, синдром Кушинга, заболевание, вызываемое переливанием крови, болезнь Хансена, артерит Такаясу, ревматическую полимиалгию, височный артерит, гигантоклеточный артрит, экзему, лимфоматозный гранулематоз, болезнь Кавазаки, эндокардит, фиброз эндомиокарда, эндофталамит, эритробластоз плода, эозинофильный фасцит, синдром Фэлти, пурпуру Геноха-Шенлейна, отторжение трансплантата, паротит, кардиомиопатию, гнойный артрит, наследственную средиземноморскую лихорадку, синдром Макла-Уэлса и гипер-IgD-синдром.
Кроме того, при аутоиммунных заболеваниях, которые могут быть вызваны продуцированием антител против аутоантигенов (аутоантител), полипептиды, содержащие вышеупомянутый вариант Fc-области согласно изобретению, могут быть использованы в качестве активного ингредиента в фармацевтических средствах для лечения или предупреждения аутоиммунных заболеваний посредством подавления продуцирования этих аутоантител. Сообщалось, что использование молекулы, продуцируемой путем присоединения Fc-части антитела к AchR (аутоантигену тяжелой миастении), позволяет ингибировать пролиферацию В-клеток, которые экспрессируют AchR-распознающий BCR и индуцируют апоптоз (J. Neuroimmunol, 227, 35-43, 2010). С использованием гибридного белка, образованного антигеном, распознаваемым аутоантителом и Fc-областью антитела согласно изобретению, можно осуществлять перекрестное связывание FcγRIIb с BCR на B-клетках, экспрессирующих BCR для этого аутоантигена, ингибировать пролиферацию В-клеток, экспрессирующих BCR для этого аутоантигена, и индуцировать их апоптоз. Такими аутоиммунными заболеваниями являются, но не ограничиваются ими, синдром Гийена-Барре, тяжелая миатения, хронический атрофический гастрит, аутоиммунный гепатит, первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, аутоиммунный панкреатит, аортит, синдром Гудпасчера, быстро прогрессирующий гломерулонефрит, мегабластомная анемия, аутоиммунная гемолитическая анемиа, аутоиммунная нейтропения, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, базедова болезнь, тиреоидит Хашимото, первичный гипотиреоидит, идиопатическая болезнь Аддисона, инсулинзависимый сахарный диабет, хроническая дисковидная красная волчанка, локализовнная склеродермия, пузырчатка, пемфигоид, герпес беременных, буллезный дерматоз, вызываемый линейными цепями IgA, приобретенный буллезный эпидермолиз, гнездная алопеция, вульгарное витилиго, центробежная приобретенная лейкодермия Саттона, болезнь Харады, аутоиммунная невропатия зрительного нерва, идиопатическая азооспермия, привычный выкидыш, диабет типа II, гипогликемия и хроническая крапивница.
Кроме того, вышеупомянутые полипептиды, содержащие вариант Fc-области согласно изобретению, могут быть использованы в качестве активного ингредиента в терапевтических средствах для лечения заболеваний, ассоциированный с дефицитом жизненно необходимых белков. Для лечения заболеваний, ассоциированных с дефицитом жизненно необходимых белков, могут быть применены методы терапии, включающие введение белка в качестве фармацевтического средства и в качестве добавки. Однако, поскольку у пациента изначально отсутствует такой белок, то экзогенно вводимый белок будет распознаваться как чужеродное вещество, в результате чего будут продуцироваться антитела против этого белка. Поэтому, такой белок становится легко удаляемым, что будет приводить к снижению эффекта фармацевтического средства. С использованием гибридного белка, содержащего указанный белок и Fc-область антитела согласно изобретению, можно осуществлять перекрестное связывание FcγRIIb с BCR на B-клетках, распознающих этот белок, и ингибировать продуцирование антитела против указанного белка. Белками, вводимыми в качестве добавки, являются фактор VIII, фактор IX, TPO, EPO, α-идуронидаза, идуронат-сульфатаза, гепаран-N-сульфатаза типа A, α-N-ацетилглюкозаминидаза типа В, ацетил-СоА-α-глюкозаминидаза-ацетилтрансфераза типа С, N-ацетилглюкозамин-6-сульфатаза типа D, галактозо-6-сульфатаза, N-ацетилгалактозамин-4-сульфатаза, β-глюкуронидаза, α-галактозидаза, кислотная α-галактозидаза и глюкоцереброзидаза. Эти белки могут быть введены в качестве добавок для лечения заболеваний, таких как, но не ограничивающихся ими, гемофилия, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, почечная анемия и заболевание, ассоциированное с лизосомами (мукополисаркоидоз, болезнь Фабри, болезнь Помпе и болезнь Гуше).
Кроме того, вышеупомянутые полипептиды, содержащие вариант Fc-области согласно изобретению, могут быть использованы в качестве активного ингредиента противовирусных средств. Антитела, содержащие Fc-область согласно изобретению, и антивирусные антитела могут ингибировать антитело-зависимое иммунологическое усиление, наблюдаемое при использовании антивирусных антител. Антитело-зависимое иммунологическое усиление представляет собой явление, при котором вирус вырабатывает нейтрализующие антитела против этого вируса и подвергается фагоцитозу посредством активирующих FcγR, что приводит к инфицированию FcγR-экспрессирующих клеток и к дальнейшему распространению этой инфекции. Сообщалось, что связывание нейтрализующих антител против вируса денге с FcγRIIb играет важную роль в ингибировании антитело-зависимого иммунологического усиления (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108, 12479-12484, 2011). Перекрестное связывание FcγRIIb с иммунным комплексом вируса денге, образованным нейтрализующми антителами против вируса денге, ингибирует FcγR-опосредуемый фагоцитоз и подавляет антитело-зависимое иммунологическое усиление. Примерами таких вирусов являются, но не ограничиваются ими, вирус денге (DENV1, DENV2 и DENV4) и ВИЧ.
Кроме того, вышеописанные полипептиды, содержащие вариант Fc-области согласно изобретению, могут быть использованы в качестве активного ингредиента в профилактических или терапевтических средствах для лечения артериосклероза. Антитела против окисленного ЛНП, вызывающего артериосклероз, то есть, антитела, содержащие Fc-область согласно изобретению, могут способствовать предупреждению FcγRIIа-зависимой адгезии воспалительных клеток. Сообщалось, что антитела против окисленного ЛНП ингибируют взаимодействие окисленного ЛНП с CD36 и связываются с эндотелиальными клетками, а моноциты распознают Fc-часть этих антител по FcγRIIа-зависимому или FcγRI-зависимому механизму, что приводит к адгезии моноцитов (Immunol. Lett., 108, 52-61, 2007). С использованием антител, содержащих Fc-область согласно изобретению, можно ингибировать FcγRIIа-зависимое связывание и подавлять адгезию моноцитов под действием FcγRIIb-опосредуемых ингибирующих сигналов.
В настоящем изобретении, вышеупомянутые полипептиды, содержащие варианты Fc-области согласно изобретению, могут быть использованы в качестве активных ингредиентов в терапевтических или профилактических средствах против рака. Как описано выше, снижение уровня связывания со всеми активирующими FcγR с сохранением уровня связывания с FcγRIIb может приводить к подавлению активации тромбоцитов по FcγRIIа-зависимому механизму с сохранением агонистической активности антител-агонистов, что будет способствовать снижению риска развития тромбоэмболии и т.п. Поэтому, антитела-агонисты, содержащие вариант Fc-области согласно изобретению, могут быть использованы для лечения или предупреждения рака. В частности, вариант Fc-области согласно изобретению усиливает агонистическую активность антител-агонистов, направленных, например, против рецепторов, принаждлежащих к семейству рецепторов TNF, таких как A-лиазы, CD120a, CD120b, рецептор лимфотоксина β, CD134, CD40, FAS, TNFRSF6B, CD27, CD30, CD137, TNFRSF10A, TNFRSF10B, TNFRSF10C, TNFRSF10D, RANK, остеопротегерин, TNFRSF12A, TNFRSF13B, TNFRSF13C, TNFRSF14, рецептор фактора роста нервных клеток, TNFRSF17, TNFRSF18, TNFRSF19, TNFRSF21, TNFRSF25 и рецептор эктодисплазина A2, и может быть использован для лечения или предупреждения рака. Кроме того, в дополнение к вышеописанному можно сказать, что наблюдается также усиление агонистической активности антител-агонистов против молекул, которым, для их агонистической активности, необходимо взаимодействие с FcγRIIb. Кроме того, при введении варианта Fc-области согласно изобретению в полипептид, обладающий активностью связывания с молекулой, такой как Kit, то есть, тирозинкиназный рецептор (RTK), который подавляет пролиферацию клеток после перекрестного связывания с FcγRIIb, ингибирующий эффект, направленный против клеток, экспрессирующих такую молекулу, может усиливаться. Раковыми заболеваниями являются, но не ограничиваются ими, рак легких (включая мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, аденокарциному легких и плоскоклеточную карциному легких), рак толстого кишечника, рак прямой кишки, рак толстой кишки, рак молочной железы, рак печени, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак почек, рак предстательной железы, рак яичника, рак щитовидной железы, холангиокарцинома, рак брюшной полости, мезотелиома, плоскоклеточная карцинома, рак шейки матки, рак эндометрия, рак мочевого пузыря, рак пищевода, рак головы и шеи, рак носоглотки, опухоль слюнных желез, тимома, рак кожи, базальноклеточная опухоль, злокачественная меланома, рак заднего прохода, рак пениса, рак яичек, опухоль Вильмса, острый миелоидный лейкоз (включая острый миелолейкоз, острый миелобластный лейкоз, острый промиелоцитарный лейкоз, острый миеломоноцитарный лейкоз и острый моноцитарный лейкоз), хронический миелогенный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфолейкоз, ходжкинская лимфома, неходжкинская лимфома (лимфома Беркитта, хронический лимфоцитарный лейкоз, грибовидный микоз, лимфома клеток коры головного мозга, фолликулярная лимфома, диффузная крупноклеточная лимфома, лимфома маргинальной зоны, пилоцитарная лейкоплазмацитома, лимфома периферических Т-клеток и Т-клеточный лейкоз/Т-клеточная лимфома взрослых), гистиоцитоз клеток Лангерганса, множественная миелома, миелодиспластический синдром, опухоль головного мозга (включая глиому, астроглиому, глиобластому, менингиому и эпендимому), нейробластома, ретинобластома, остеосаркома, саркома Капоши, саркома Юинга, ангиосаркома и гемангиоперицитома.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способам лечения или предупреждения иммунных воспалительных заболеваний, где указанные способы включают стадию введения индивидууму (пациенту) полипептида, содержащего вариант Fc-области согласно изобретению, или полипептида, содержащего вариант Fc-области и полученного способами продуцирования согласно изобретению.
Настоящее изобретение также относится к наборам, используемым в способах терапии или профилактики согласно изобретению, где указанные наборы содержат по меньшей мере полипептид, содержащий вариант Fc-области согласно изобретению, или полипептид, содержащий вариант Fc-области и полученный способами продуцирования согласно изобретению, или фармацевтическую композицию согласно изобретению. Кроме того, в набор могут быть включены фармацевтически приемлемые носители и среды, а также к нему могут прилагаться инструкции по применению такого набора. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению полипептида, содержащего вариант Fc-области согласно изобретению, или полипептида, содержащего вариант Fc-области и полученного способами продуцирования согласно изобретению, в целях приготовления средств для лечения или предупреждения иммунных воспалительных заболеваний. Настоящее изобретение также относится к полипептиду, содержащему вариант Fc-области согласно изобретению, или полипептиду, содержащему вариант Fc-области и полученному способами продуцирования согласно изобретению, где указанные полипептиды могут быть применены в способах терапии или профилактики согласно изобретению.
Используемые здесь аминокислоты имеют нижеследующие трехбуквенные и однобуквенные обозначения:
Аланин: Ala (A)
Аргинин: Arg (R)
Аспарагин: Asn (N)
Аспарагиновая кислота: Asp (D)
Цистеин: Cys (C)
Глутамин: Gln (Q)
Глутаминовая кислота: Glu (E)
Глицин: Gly (G)
Гистидин: His (H)
Изолейцин: Ile (I)
Лейцин: Leu (L)
Лизин: Lys (K)
Метионин: Met (M)
Фенилалание: Phe (F)
Пролин: Pro (P)
Серин: Ser (S)
Треонин: Thr (T)
Триптофан: Trp (W)
Тирозин: Tyr (Y)
Валин: Val (V)
Все цитируемые здесь предшествующие документы во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Примеры
Ниже приводятся конкретные примеры осуществления настоящего изобретения, которые не должны рассматриваться как ограничение объема настоящего изобретения.
[Пример 1] Получение pH-зависимого анти-IgE антитела
(1-1) Получение антитела против человеческого IgE
Для получения pH-зависимого антитела против человеческого IgE, человеческий IgE (тяжелая цепь, SEQ ID NO: 13; легкая цепь SEQ ID NO: 14) (с вариабельной областью, происходящей от антитела против человеческого глипикана 3) экспрессировали в качестве антигена с использованием FreeStyle293 (Life Technologies). Экспрессированный человеческий IgE получали и очищали общим методом колоночной хроматографии, известным специалистам.
Антитела, которые образуют крупные иммунные комплексы, содержащие две или более молекул анти-IgE антитела и две или более молекул IgE, которые, как было показано, обладают рН-зависимой активностью связывания с человеческим IgE, отбирали из множества полученных антител. Экспрессию и очистку отобранных антител против человеческого IgE осуществляли с использованием константных областей тяжелой цепи и константных областей легкой цепи человеческого IgE. Полученное антитело было названо клоном 278 (IgG1) (с тяжелой цепью SEQ ID NO: 10 и легкой цепью SEQ ID NO: 11).
(1-2) Оценка активности связывания и pH-зависимой активности связывания антител против человеческого IgE
Антитела, способные высвобождать антигены в эндосому, могут быть получены не только посредством pH-зависимого связывания с антигеном, но также и посредством Ca-зависимого связывания. В соответствии с этим, способность к pH-зависимому и рН/Са-зависимому связыванию с человеческим IgE (hIgE) оценивали для клона 278 и для антитела Xolair (омализумаба, Novartis), используемого в качестве контрольного антитела, которое не обладает pH-зависимой активностью связывания с IgE.
D
Более конкретно, hIgE-связывающую активность (константу диссоциации K (M)) клона 278 и Xolair оценивали методом Biacore T200 (GE Healthcare). Измерения осуществляли с использованием рабочего буфера трех типов:
2
- 1,2 ммоль/л CaCl/0,05% твина 20, 20 ммоль/л ACES, 150 ммоль/л NaCl, pH 7,4
2
- 1,2 ммоль/л CaCl/0,05% твина 20, 20 ммоль/л ACES, 150 ммоль/л NaCl, pH 5,8
2
- 3 мкмоль/л CaCl/0,05% твина 20, 20 ммоль/л ACES, 150 ммоль/л NaCl, pH 5,8.
Пептид, продуцированный путем присоединения биотина в соответствующем количестве к Lys, присутствующему на С-конце химически синтезированной последовательности, происходящей от человеческого белка глипикана 3 (SEQ ID NO: 12) (далее называемого «биотинилированным пептидом GPC3»), иммобилизовали на сенсорном чипе SA (GE Healthcare) посредством аффинного связывания стрептавидина и биотина. Затем вводили соответствующую концентрацию человеческого IgE, и биотинилированный пептид GPC3 захватывали для иммобилизации человеческого IgE на чипе. После этого добавляли соответствующую концентрацию клона 278, используемого в качестве аналита, и подвергали взаимодействию с человеческим IgE на сенсорном чипе. Затем впрыскивали 10 ммоль/л глицина-HCl (pH 1,5) для регенерации сенсорного чипа. Все анализы на взаимодействие проводили при 37°C. Результаты анализов, проводимых с помощью компьютерной программы Biacore T200 Evaluation (GE Healthcare), оценивали путем построения кривой для определения константы скорости связывания ka (1/Мс) и константы скорости диссоциации kd (1/с). Константу диссоциации KD (M) вычисляли исходя из вышеуказанных констант. Затем pH-зависимое связывание оценивали путем вычисления отношения KD для каждого антитела при pH 5,8/1,2 мM Ca и pH 7,4/1,2 мM Ca. pH/Ca-зависимое связывание оценивали путем вычисления отношения KD для каждого антитела при pH 5,8/3 мкM Ca и pH 7,4/1,2 мM Ca. Результаты представлены в таблице 5.
Таблица 5
НазваниеАнтитела(сокращенно)
Буфер
ka (1/Мс)
kd (1/с)
KD(M)
pH-зависимость
pH/Ca-зависимость
KD (pH 5,8/1,2 мM Ca)/KD (pH 7,4/1,2 мM Ca)
KD (pH 5,8/3 мкM Ca)/KD (pH 7,4/1,2 мM Ca)
Клон 278
pH 7,4/1,2 мM Ca
1,5Е+06
3,6Е-03
2,4Е-09
842,5
1636,5
pH 5,8/1,2 мM Ca
1,2Е+05
2,3Е-01
2,0Е-06
pH 5,8/3 мкM Ca
6,2Е+04
2,4Е-01
3,9Е-06
Xolair
pH 7,4/1,2 мM Ca
2,5Е+06
1,1Е-02
4,4Е-09
2,3
2,9
pH 5,8/1,2 мM Ca
2,4Е+06
2,4Е-02
9,9Е-09
pH 5,8/3 мкM Ca
1,4Е+06
1,7Е-02
1,3Е-08
(1-3) Оценка образования иммунных комплексов с клоном 278 и антителом Xolair
2,
2,
2,
2,
Образование крупного иммунного комплекса, состоящего из клона 278 и человеческого IgE и содержащего две или более молекул анти-IgE антитела и две или более молекул IgE, в нейтральных условиях (pH 7,4), и диссоциацию этого иммунного комплекса в кислотных условиях (рН 5,8) оценивали с помощью гель-фильтрации. Клон 278, диализованный против 100 мМ NaCl, разводили буфером 20 мМ трис-HCl, 150 мМ NaCl, 1,2 мМ CaCl pH 7,4, с получением образцов в нейтральных условиях, или буфером 20 мМ бис-трис-HCl, 150 мМ NaCl, 1,2 мМ CaCl pH 5,8, с получением образцов в кислотных условиях. Смешанные растворы, полученные путем смешивания 100 мкг/мл (0,06 мкМ) hIgE (Asp6), который представляет собой человеческий IgE, и клона 278 в молярном отношении 1:1 и 1:6, оставляли на два часа или более при комнатной температуре или при 25°C в автоматическом аппликаторе образцов, после чего смесь анализировали с помощью гель-фильтрации. Для подвижной фазы использовали буферы 20 мМ трис-HCl, 300 мМ NaCl, 3 мкM CaCl pH 7,4, и бис-трис-HCl, 300 мМ NaCl, 3 мкМ CaCl pH 5,8, в нейтральных условиях и кислотных условиях, соответственно. После этого на колонку загружали G4000SWxl (TOSOH) и проводили анализы при скорости потока 0,5 мл/мин при 25°C. Результаты представлены на фиг. 1. Как показано на фиг. 1, было обнаружено, что клон 278 и человеческий IgE образуют крупные иммунные комплексы, содержащие тетрамер, имеющий кажущуюся молекулярную массу приблизительно 670 кДа (предполагается, что одна молекула антитела представляет собой мономер), и более крупные мультимеры в нейтральных условиях. Такие иммунные комплексы не образовывались в кислотных условиях. Таким образом, при проведении анализа, аналогичного вышеописанному анализу на связывание с помощью Biacore, было обнаружено, что эти иммунные комплексы диссоциируются в зависимости от рН.
[Пример 2] Оценка in vivo клона 278 и антитела Xolair
(2-1) Получение человеческого IgE (hIgE (Asp6)) для оценки in vivo
hIgE (Asp6) (с вариабельной областью, происходящей от антитела против человеческого глипикана 3), который представляет собой человеческий IgE, используемый для оценки in vivo и содержащий тяжелую цепь (SEQ ID NO: 15) и легкую цепь (SEQ ID NO: 14), получали методом, описанным в примере 1. hIgE (Asp6) представляет собой молекулу, в которой аспарагин был заменен аспарагиновой кислотой в шести сайтах N-гликозилирования в человеческом IgE так, чтобы зависимое от времени изменение концентрации человеческого IgE в плазме, используемого в качестве антигена, не влияло на гетерогенность N-связанных сахарных цепей человеческого IgE.
(2-2) Подтверждение влияния клона 278 и антитела Xolair на ускорение элиминации человеческого IgE у нормальных мышей
Мышам C57BL/6J (Charles river Japan) вводили только hIgE (Asp6) или одновременно вводили hIgE (Asp6) и анти-IgE антитело (клон 278 или Xolair), после чего оценивали кинетику in vivo hIgE (Asp6) и антител против человеческого IgE. В хвостовую вену мышей вводили hIgE (Asp6) (20 мкг/мл) или одновременно вводили смешанный раствор hIgE (Asp6) и антитела против человеческого IgE (концентрации указаны в таблице 6) в дозе 10 мл/кг. Поскольку в этом эксперименте каждое антитело было представлено в достаточном избытке по отношению к hIgE (Asp6), то предполагается, что почти все hIgE (Asp6) связывались с антителом. У мышей брали кровь через 5 минут, 2 часа, 7 часов, 1 день, 2 дня, 4 дня, 5 дней, 7 дней, 14 дней, 21 день и 28 дней после введения. Взятые пробы крови сразу подвергали центрифугированию при 15000 об/мин в течение 5 минут при 4°C с получением плазмы. Взятые пробы плазмы хранили в холодильнике, установленном на температуру -20°C или ниже до проведения измерений.
Таблица 6
Анти-hIgE антитело
Концентрация hIgE (Asp6) во введенном растворе (мкг/мл)
Концентрация анти-hIgE антитела во введенном растворе (мкг/мл)
Клон 278
20
100
Xolair
20
308
(2-3) Измерение концентрации hIgE (Asp6) в плазме нормальных мышей
Концентрации hIgE (Asp6) в плазме мышей определяли с помощью ELISA. Образцы для построения калибровочной кривой получали в концентрациях 192, 96, 48, 24, 12, 6 и 3 нг/мл в плазме. Для получения иммунных комплексов, образованных hIgE (Asp6) и гомогенным анти-hIgE антителом, к образцам для построения калибровочной кривой, и к образцам для измерения концентрации в мышиной плазме добавляли антитело Xolair (Novartis) при 10 мкг/мл, а затем смесь оставляли на 30 минут при комнатной температуре. После этого, образцы для построения калибровочной кривой и образцы для измерения концентрации в мышиной плазме распределяли по иммунопланшетам с иммобилизованным на них антителом против человеческого IgE (MABTECH) или по иммунопланшетам с иммобилизованным на них антителом против человеческого IgE (клон 107, MABTECH) (Nunc F96 MicroWell Plate (Nalge nunc International)), и эти планшеты оставляли на 2 часа при комнатной температуре или на ночь при 4°C. Затем проводили последовательные реакции взаимодействия человеческого корового белка GPC3 (SEQ ID NO: 16), анти-GPC3 антитела (полученного в лаборатории), биотинилированного NHS-PEG4-биотином (Thermo Fisher Scientific), и стрептавидина-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies), в течение одного часа. Концентрации в мышиной плазме определяли методом измерения оптической плотности на 450 нм на микропланшет-ридере для наблюдения развития окраски в процессе цветной реакции, в которой использовали субстрат TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories), с последующим прекращением реакции путем добавления 1н серной кислоты (Showa Chemical), или методом измерения интенсивности люминесценции на микропланшет-ридере при проведении люминесцентной реакции с использованием субстрата SuperSignal(r) ELISA Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Scientific). Концентрации в мышиной плазме вычисляли по калибровочной кривой интенсивности люминесценции или с использованием величин оптической плотности с помощью аналитической компьютерной программы SOFTmax PRO (Molecular Devices). Изменение концентрации hIgE (Asp6) в плазме после внутривенного введения определяли с применением этого метода, проиллюстрированного на фиг. 2. На этой фигуре, клон 278 обозначен 278-IgG1, а антитело Xolair обозначено Xolair-IgG1.
(2-4) Измерение концентрации антитела против человеческого IgE в плазме нормальных мышей
Концентрацию анти-hIgE антитела в плазме мышей определяли с помощью ELISA. Образцы для построения калибровочной кривой получали в концентрациях 0,4; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025; 0,0125 и 0,00625 мкг/мл в плазме. Для гомогенизации иммунных комплексов, образованных hIgE (Asp6) и анти-hIgE антителом, образцы для построения калибровочной кривой и образцы для измерения концентрации в мышиной плазме оставляли на 30 минут при комнатной температуре после добавления hIgE (Asp6) в концентрации 1 мкг/мл. После этого, образцы для построения калибровочной кривой и образцы для измерения концентрации в мышиной плазме распределяли по иммунопланшетам с иммобилизованным на них антителом против человеческой легкой цепи каппа (Bethyl Laboratories) (Nunc F96 MicroWell Plate (Nalge nunc International)), и эти планшеты оставляли на два часа при комнатной температуре или на ночь при 4°C. Затем проводили последовательные реакции взаимодействия «второго» кроличьего антитела против человеческого IgE (Fc), конъюгированого с биотином (Pierce Biotechnology), и стрептавидина-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) в течение одного часа. Концентрации в мышиной плазме определяли методом измерения оптической плотности на 450 нм на микропланшет-ридере для наблюдения развития окраски в процессе цветной реакции, в которой использовали субстрат TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories), с последующим прекращением реакции путем добавления 1н серной кислоты (Showa Chemical). Концентрации в мышиной плазме вычисляли по калибровочной кривой или с использованием величин оптической плотности с помощью аналитической компьютерной программы SOFTmax PRO (Molecular Devices). Изменение концентрации антитела hIgE в плазме после внутривенного введения определяли с применением этого метода, проиллюстрированного на фиг. 3. На этой фигуре, клон 278 обозначен 278-IgG1, а антитело Xolair обозначено Xolair-IgG1.
В результате было обнаружено, что при одновременном введении человеческого IgE и антитела Xolair, которое представляет собой контрольное анти-IgE антитело, элиминация человеческого IgE замедлялась по сравнению с элиминацией в случае введения только человеческого IgE. С другой стороны, было обнаружено, что при одновременном введении с клоном 278, который обладает рН-зависимой активностью связывания с человеческим IgE, элиминация человеческого IgE значительно ускорялась в отличие от элиминации при введении только человеческого IgE.
Как описано в WO2011/122011, эксперимент проводили с использованием человеческого рецептора IL-6 (hsIL-6R) и антител, которые связываются с hsIL-6R, однако, результаты этого эксперимента отличались от результатов, описанных в примерах настоящего изобретения. Как описано в примере 3 заявки WO2011/122011, при одновременном введении нормальным мышам антитела IgG1, которое представляет собой антитело (H54L28-IgG1), связывающееся с человеческим рецептором IL-6 (hsIL-6R) независимо от рН, вместе с антигеном, элиминация человеческого рецептора IL-6 (антигена) не ускорялась и фактически замедлялась по сравнению с элиминацией, наблюдаемой при введении только антигена. При одновременном введении антитела (Fv4-IgG1), которое связывается с антигеном в зависимости от рН, вместе с антигеном, элиминация антигена замедлялась по сравнению с элиминацией, наблюдаемой при введении только антигена, но ускорялась по сравнению с элиминацией, наблюдаемой при введении H54L28-IgG1. Это происходит потому, что введение антитела стимулирует связывание антитела с антигеном, который перемещается вместе с антителом и подвергается рециклингу посредством FcRn по такому же механизму, как рециклинг антитела, в результате чего элиминация антигена из крови затрудняется.
Полученные результаты, описанные в примерах настоящего изобретения, показали, что одновременное введение антигена с антителом ускоряет элиминацию антигена по сравнению с элиминацией, наблюдаемой в случае введения только антигена, что, вероятно, противоречит данным, представленным в предшествующих публикациях. Однако, IgE, используемый в примерах в качестве антигена, представляет собой двухвалентный антиген, а hsIL-6R отличается от этого антигена тем, что он является одновалентным антигеном. При добавлении анти-IgE антитела к IgE, один антиген может связываться с двумя антителами, что приводит к образованию иммунного комплекса, содержащего множество антигенов и антител, как описано в примере (1-3). Само антитело может подвергаться только одновалентному связыванию (аффинному связыванию) с FcγR, который представляет собой рецептор IgG, однако, в случае вышеописанного иммунного комплекса, содержащего множество антигенов и антител, это антитело может подвергаться поливалентному связыванию (авидному связыванию) с FcγR. С другой стороны, в случае hsIL-6R, один антиген может связываться только с одним антителом, а поэтому иммунный комплекс, содержащий этот антиген и это антитело, может подвергаться только одновалентному связыванию (аффинному связыванию) с FcγR, и такое взаимодействие будет очень слабым по сравнению с авидным связыванием. Более конкретно, иммунный комплекс, образованный IgE и антителом, подвергается сильному авидному связыванию с FcγR, а поэтому он быстро удаляется из крови печенью или другими органами, экспрессирующими FcγR.
Кроме того, при рН-зависимом связывании антитела с антигеном, то есть, IgE, иммунный комплекс «антиген - антитело» поглощается клетками, в результате чего антиген диссоциируется в эндосому. После этого, антиген уже не подвергается рециклингу вместе с антителом посредством FcRn, а поэтому диссоциированный антиген разлагается в лизосоме. В результате было обнаружено, что в данном случае, антиген будет элиминироваться быстрее, чем в том случае, когда связывание антигена с антителом не зависит от рН.
[Пример 3] Оценка in vivo антитела Xolair и клона 278, обладающего пониженной активностью связывания с FcγR
(3-1) Получение антител против человеческого IgE, обладающих пониженной активностью связывания с FcγR
Затем, для подтверждения того, что ускорение элиминации антигена, наблюдаемое как описано в примере 2, обусловлено взаимодействим иммунного комплекса и FcγR, вариант, обладающий пониженной активностью связывания с мышиными FcγR, был продуцирован из антитела 278-IgG1, которое связывается с человеческим IgE в зависимости от рН. Для снижения уровня связывания с мышиными FcγR, аминокислоту Leu в положении 235 заменяли аминокислотой Arg, а аминокислоту Ser в положении 239 заменяли аминокислотой Lys в 278-IgG1 в соответствии с Европейской нумерацией, в результате чего получали 278-F760 (легкая цепь, SEQ ID NO: 11). Последовательности ДНК, кодирующие эти гены, встраивали в плазмиды для экспрессии у животных методом, известным специалистам. Эти варианты антител, экспрессированные вышеупомянутым методом с использованием клеток животных, в которые вводили плазмиды, очищали и определяли их концентрации.
(3-2) Подтверждение влияния антитела Xolair и клона 278, обладающего пониженной активностью связывания с FcγR, на ускорение элиминации человеческого IgE у нормальных мышей
В методе, аналогичном методу (2-2), нормальных мышей использовали для подтверждения эффекта элиминации IgE при введении этим мышам антитела 278-F760 (легкая цепь, SEQ ID NO: 11), которое обладает пониженной активностью связывания с мышиным FcγR.
(3-3) Измерение концентрации hIgE (Asp6) в плазме нормальных мышей
Концентрации hIgE в плазме нормальных мышей измеряли методом, аналогичным методу (2-3). Изменение концентрации hIgE в плазме после внутривенного введения измеряли этим методом, проиллюстрированным на фиг. 4. Для сравнения, изменение концентрации hIgE в плазме после введения антитела 278-IgG1, полученного методом (2-3), также проиллюстрировано на фиг.4.
(3-4) Измерение концентрации антитела против человеческого IgE в плазме нормальных мышей
Концентрацию анти-hIgE антитела в плазме нормальных мышей измеряли методом, аналогичным методу (2-4).
Изменение концентрации антитела в плазме после внутривенного введения измеряли этим методом, проиллюстрированным на фиг. 5. Для сравнения, изменение концентрации антитела в плазме, а именно, 278-IgG1, полученного методом (2-3), также проиллюстрировано на фиг.5.
Результаты, представленные в примерах настоящего изобретения, показали, что при снижении уровня связывания антитела с FcγR, каких-либо значительных изменений концентрации антитела в плазме не наблюдалось, однако, эффект ускорения элиминации антигена под действием клона 278 после введения антитела IgG1, как описано в примере 2, заметно снижался. Более конкретно, было показано, что ускорение элиминации IgE, наблюдаемое после одновременного введения с анти-IgE антителом, как описано в примере 2, обусловлено взаимодействием введенного антитела с FcγR.
В соответствии с этим, для эффективного удаления антигенов-мишеней с использованием антител может оказаться необходимым получение иммунного комплекса, содержащего множество антигенов и антител; сохранение активности связывания антитела с FcγR на уровне, аналогичном уровню связывания натовного антитела IgG1, а предпочтительно, сохранение рН-зависимого связывания антитела с антигеном (уровень связывания антигена при кислотном рН ниже, чем при нейтральном рН).
[Пример 4] Продуцирование вариантов, у которых активность связывания с FcγRIIb сохраняется на уровне, аналогичном уровню связывания с нативным антителом, а активность связывания с другими FcγR снижается
(4-1) Исследование модификаций, объединенных с модификацией P238D, для сохранения активности связывания с FcγRIIb и снижения активности связывания с FcγRIIаR
При продуцировании антитела с пониженной активностью селективного связывания только с активирующими FcγR, но с сохраненной активностью связывания с FcγRIIb на уровне, аналогичном уровне связывания с нативным IgG1, самой серьезной проблемой для селективного снижения активности связывания является дифференциация между FcγRIIа и FcγRIIb, которые имеют очень высокую гомологию аминокислотных последовательностей. FcγRIIа имеет полиморфные формы, в одной из которых аминокислотой в положении 131 является Arg, а в другой из этих форм, такой аминокислотой является His. Остаток в FcγRIIb, соответствующий этому остатку, представляет собой Arg, а поэтому, последовательность FcγRIIb является более гомологичной последовательности FcγRIIа R-типа. Поэтому, FcγRIIа R-типа, принадлежащий к рецепторам FcγRIIа, очень трудно отдифференцировать от FcγRIIb. В качестве модификации, вводимой для улучшения селективности связывания с FcγRIIb, но не с FcγRIIаR, служит замена Pro на Asp в положении 238 в соответствии с Европейской нумерацией, описанная в WO2012/115241. Целью данных исследований является применение антитела, содержащего такую модификацию в качестве матрицы для продуцирования вариантов, у которых активность связывания с FcγRIIb сохраняется на уровне, аналогичном уровню связывания с нативным IgG1, а активность связывания с другими FcγR снижается насколько это возможно.
Исходя из результатов рентгенографических анализов кристаллической структуры комплекса, образованного между Fc (P238D) и внеклеточной областью FcγRIIb, полученного как описано в примере 5 заявки WO2012/115241, в модифицированную Fc было введено множество модификаций вместе с заменой Pro на Asp в положении 238 в соответствии с Европейской нумерацией в сайтах, которые, как было предсказано, влияют на взаимодействие с FcγRIIb (остатки в положениях 233, 234, 235, 236, 237, 239, 240, 241, 263, 265, 266, 267, 268, 271, 273, 295, 296, 298, 300, 323, 325, 326, 327, 328, 330, 332 и 334 в соответствии с Европейской нумерацией), а затем оценивали взаимодействие с каждым FcγR.
Вариабельную область IL6R-H (SEQ ID NO: 17), которая представляет собой вариабельную область антитела против рецептора человеческого интерлейкина 6, описанного в WO2009/125825, получали как вариабельную область Н-цепи антитела, а IL6R-G1d (SEQ ID NO: 3), содержащую G1d, полученную путем делеции С-концевых Gly и Lys человеческого IgG1, получали как константную область Н-цепи антитела. Затем осуществляли замену Pro на Asp в положении 238 в IL6R-G1d в соответствии с Европейской нумерацией методом, описанным в Сравнительном примере 1, в результате чего получали IL6R-F648. Н-цепи двух типов получали как матричную Н-цепь для введения множества модификаций: IL6R-F652 (SEQ ID NO: 1) получали путем введения M252Y и N434Y в IL6R-F648, а IL6R-ВF648 (SEQ ID NO: 2) получали путем введения K439E в IL6R-F648. Затем в вышеупомянутую область IL6R-F652 или IL6R-ВF648 вводили аминокислоты 18 типов, за исключением исходной аминокислоты и Cys. IL6R-L (SEQ ID NO: 6) использовали в качестве общей L-цепи антитела, и вместе с соответствующей Н-цепью, антитела экспрессировали и очищали методом, описанным в Сравнительном примере 1. Эти варианты антител экспрессировали и очищали методом, описанным в Сравнительном примере 1, и связывание с каждый из FcγR (FcγRIa, FcγRIIа H-типа, FcγRIIа R-типа, FcγRIIb, FcγRIIIa V-типа) подвергали тщательному анализу методом, описанным в Сравнительном примере 2.
В результате было обнаружено, что модификации L235F, G237Q, F241M, F241L, H268P, Q295M, Q295V, Y296E, Y296H, Y296N, Y296D, S298A, S298M, V323I, S324N, S324H, A330H и A330Y представляют собой модификации, которые снижают активность связывания с FcγRIIаR, но без существенного снижения активности связывания с FcγRIIb в том случае, если они используются в комбинации с модификацией P238D (таблицы 7 и 8).
В таблицах 7 и 8 показаны, соответственно, относительные FcγRIIаR- и FcγRIIb-связывающие активности вариантов, полученных путем введения множества модификаций в IL6R-F652/IL6R-L и в IL6R-BF648/IL6R-L. Эти величины получали путем деления количества каждого варианта, связанного с FcγRIIаR или FcγRIIb, на количество IL6R-F652/IL6R-L или IL6R-BF648/IL6R-L, связанного с соответствующим FcγR, и умножения полученного результата на 100.
Исходя из результатов, представленных в таблицах 7 и 8, было обнаружено, что все указанные модификации способствуют снижению активности связывания с FcγRIIаR с сохранением активности связывания с FcγRIIb по меньшей мере на 55,5% или более по сравнению с активностью до введения модификаций.
Поэтому, в настоящем исследовании оценивали продуцирование вариантов с точки зрения возможности снижения активности связывания с FcγRIIаR при сохранении уровня активности связывания с FcγRIIb, аналогичного уровню связывания IgG1, после введения комбинаций указанных модификаций. В частности, считается, что такие модификации будут селективно снижать активность связывания с активирующими FcγR по сравнению с активностью связывания, наблюдаемой до введения модификаций, указанных в таблицах 7 и 8, или их комбинаций, в IL6R-F648. Антитело IL6R-L (SEQ ID NO: 6) использовали в качестве общей L-цепи антитела, и вместе с соответствующей Н-цепью, антитела экспрессировали и очищали методом, описанным в Сравнительном примере 1. Связывание полученных вариантов с FcγRIa, FcγRIIаR, FcγRIIаH, FcγRIIb и FcγRIIIaV оценивали методом, описанным в Сравнительном примере 2. В таблице 9 указаны относительные активности связывания каждого варианта с FcγRIIаR и FcγRIIb. Эти величины получали путем деления количества каждого варианта, связанного с FcγRIIаR или FcγRIIb, на количество IL6R-G1d/IL6R-L, связанного с FcγRIIаR или FcγRIIb, и умножения полученного результата на 100.
Среди вариантов, указанных в таблице 9, варианты, у которых активность связывания с FcγRIIаR снижалась на 30% или менне, в активность связывания с FcγRIIb сохранялась на 80% или более по сравнению с активностью IL6R-G1d/IL6R-L, представлены в таблице 10, где указаны их величины KD для каждого из FcγR. Относительная активность связывания, указанная в таблице, означает величину, полученную путем деления величины KD для IL6R-G1d/IL6R-L, на величину KD для каждого варианта, и представляет собой относительную активность связывания для каждого варианта, если величину KD IL6R-G1d/IL6R-L для каждого FcγR принять за 1. Из величин KD, указанных в этой таблице, величины, показанные в заштрихованных серых ячейках, представляют собой величины, вычисленные по уравнению 2 Сравнительного примера 2, поскольку связывание FcγR с каждым вариантом является очень слабым и не может быть точно проанализировано с помощью кинетического анализа.
[Уравнение 2]
max
eq
KD=C • R/(R-RI)-C
Было показано, что из модификаций, вводимых в этом исследовании, P589, полученный путем введения Y296E; P590, полученный путем введения F241M; P594, полученный путем введения F241L; P595, полученный путем введения Q295V; P597, полученный путем введения Y296H; P600, полученный путем введения S298A; P601, полученный путем введения S298M; P718, полученный путем введения H268P; P719, полученный путем введения S324N; P720, полученный путем введения S324H; P721, полученный путем введения A330H; P722, полученный путем введения A330Y; P723, полученный путем введения L235F; P724, полученный путем введения G237Q; и P725, полученный путем введения Y296D, обладают пониженной активностью связывания с FcγRIIаR по сравнению с активностью связывания F648 до введения модификаций, но сохраняют активность связывания с FcγRIIb на уровне, аналогичном уровню связывания G1d или на более высоком уровне. Среди этих вариантов, P600, полученный путем введения S298A, обладал самой низкой активностью связывания с FcγRIIаR. FcγRIIаR-связывающая активность была в 0,026 раз ниже активности G1d, тогда как FcγRIIb-связывающая активность в 1,2 раза превышала активность G1d.
Результаты исследования с использованием комбинаций модификаций указывали на эффект селективного снижения активности связывания с активирующим FcγR, при этом, было обнаружено, что P727 обладает активностью связывания с FcγRIIb, которая в 1,0 или более раз выше активности связывания G1d, и значительно более низкой активностью связывания с FcγRIIаR. Для P727, активность связывания с FcγRIIb была в 1,1 раз выше, чем для G1d, а активность связывания с FcγRIIаR была в 0,012 раз ниже, чем для G1d. Кроме того, поскольку активность связывания с FcγRIа была в 0,014 раз выше, чем для G1d, активность связывания с FcγRIIаН была в 0,007 раз ниже, чем для G1d, а активность связывания с FcγRIIIaV была в 0,005 раз ниже, чем для G1d, то это указывает на то, что данный вариант обладает превосходными свойствами, то есть, он обладает очень низкой селективной активностью связывания с активирующими FcγR, но не с FcγRIIb.
(4-2) Оценка вариантов, обладающих пониженной активностью связывания с FcγRIIаR и повышенной активностью связывания с FcγRIIb
Кроме того, предполагается, что варианты, имеющие активность связывания с FcγRIIb на уровне, аналогичном уровню связывания IgG1, и более низкую активность связывания с FcγR, могут быть получены путем введения модификаций, которые способствуют снижению активности связывания со всеми FcγR, включая FcγRIIb, в матричный вариант, который обладет повышенной селективностью связывания с FcγRIIb, но не обладает повышенной селективностью или обладает пониженной селективностью связывания с другими FcγR.
Сначала получали IL6R-B3 (SEQ ID NO: 4) путем введения K439E в IL6R-G1d (SEQ ID NO: 3). Введение комбинации модификаций, способствующих селективному связыванию с FcγRIIb, в IL6R-B3, приводило к продуцированию вариантов, обладающих повышенной селективной активностью связывания с FcγRIIb. Антитело IL6R-L (SEQ ID NO: 6) использовали в качестве общей L-цепи антитела, и вместе с соответствующей Н-цепью, антитела экспрессировали и очищали методом, описанным в Сравнительном примере 1. Связывание полученных вариантов с FcγRIa, FcγRIIаR, FcγRIIаH, FcγRIIb и FcγRIIIaV оценивали методом, описанным в Сравнительном примере 2. В таблице 11 указаны активности связывания полученных вариантов с каждым из FcγR. Относительные активности связывания, указанные в таблице, означают величины, полученные путем деления величины KD для IL6R-В3/IL6R-L, на величину KD для каждого варианта, и представляют собой относительную активность связывания для каждого варианта, если величину KD IL6R-В3/IL6R-L для каждого FcγR принять за 1. «KD(IIaR)/KD(IIb)» означает величину, полученную путем деления величины KD каждого варианта для FcγRIIаR на величину KD этого варианта для FcγRIIb, причем, чем выше эта величина, тем выше селективность связывания с FcγRIIb. Из величин KD, указанных в этой таблице, величины, показанные в заштрихованных серых ячейках, представляют собой величины, вычисленные по уравнению 2 Сравнительного примера 2, поскольку связывание FcγR с каждым вариантом является очень слабым и не может быть точно проанализировано с помощью кинетического анализа.
[Уравнение 2]
max
eq
KD=C • R/(R-RI)-C
Все варианты в таблице 11 имели повышенную активность связывания с FcγRIIb по сравнению с активностью связывания IL6R-B3/IL6R-L, и уровень связывания с FcγRIIb в 2,6-3090 раз превышал уровень связывания IL6R-B3/IL6R-L. Кроме того, величина KD(IIaR)/KD(IIb) для IL6R-B3/IL6R-L составляла 0,3, а для вариантов, указанных в таблице 11, она составляла от 8,7 до 64,4, причем, селективности связывания (KD(IIaR)/KD(IIb)) с FcγRIIb для всех вариантов превышала селективность связывания IL6R-B3/IL6R-L.
Было предсказано, что введение модификаций, снижающих активность связывания со всеми FcγR, в эти варианты, обладающие повышенной селективностью связывания с FcγRIIb, будет приводить к продуцированию вариантов, у которых FcγRIIb-связывающая активность будет сохраняться на уровне, аналогичном уровню связывания IgG1, а активность связывания с другими активирующими FcγR будет селективно снижаться по сравнению с активностью связывания IgG1. Затем проводили исследование для того, чтобы подтвердить, можно ли фактически получить предсказанные варианты с использованием модификаций двух типов, вводимых в IL6R-BP568/IL6R-L и IL6R-BP489/IL6R-L, которые будут селективно повышать активность связывания с FcγRIIb. В частности, варианты, полученные путем введения двух вышеупомянутых модификаций. которые будут селективно повышать активность связывания с FcγRIIb, были использованы в качестве матриц для того, чтобы подтвердить, можно ли получить варианты, у которых FcγRIIb-связывающая активность будет сохраняться на уровне, аналогичном уровню связывания IgG1, а активность связывания с другими активирующими FcγR будет селективно снижаться по сравнению с активностью связывания IgG1. Более конкретно, путем введения в IL6R-G1d модификаций, повышающих активность связывания с FcγRIIb и используемых в IL6R-BP568/IL6R-L и IL6R-BP489/IL6R-L, были получены варианты двух типов, обладающие повышенной селективной активностью связывания с FcγRIIb, а именно, варианты IL6R-P577 и IL6R-P587. Антитело IL6R-L (SEQ ID NO: 6) использовали в качестве общей L-цепи антитела, и вместе с соответствующей Н-цепью, антитела экспрессировали и очищали методом, описанным в Сравнительном примере 1. Величины KD для связывания этих двух вариантов с каждым из FcγR представлены в таблице 12.
Активность связывания P577 с FcγRIIаR в 21,9 раза превышала активность связывания G1d, а активность связывания с FcγRIIb в 3370,7 раза превышала активность связывания G1d. Активность связывания P587 с FcγRIIаR в 1,4 раза превышала активность связывания G1d, а активность связывания с FcγRIIb в 255,6 раза превышала активность связывания G1d.
Путем введения модификаций, снижающих активность связывания со всеми FcγR, в полученные варианты двух типов, обладающие повышенной активностью связывания с FcγRIIb, были получены варианты, у которых FcγRIIb-связывающая активность сохранялась на уровне, аналогичном уровню связывания нативного IgG1, а активность связывания с другими FcγR, а в частности, с FcγRIIаR, была снижена настолько, насколько это было возможно. Модификации, которые значительно снижали активность связывания с FcγRIIаR, были выявлены путем исследования, включающего введение множества модификаций в положения остатков, взаимодействующих с FcγR. Помимо введения множества модификаций в положения 234, 235, 236, 237 и 239 IL6R-F652/IL6R-L в соответствии с Европейской нумерацией, как показано в примере 4-1, было введено множество модификаций в варианты, обладающие повышенной селективной активностью связывания с FcγRIIb.
Модификации, повышающие активность связывания с FcγRIIb (E233D/G237D/H268E/P271G) как описано в WO2012/115241, вводили в IL6R-BF648 (SEQ ID NO: 2) с получением IL6R-BP267 (SEQ ID NO: 5). Затем были получены варианты с заменами в положениях 265, 266, 267 и 269 IL6R-BP267 в соответствии с Европейской нумерацией, то есть, с заменами аминокислот 18 типов, за исключением исходной аминокислоты и Cys. IL6R-L (SEQ ID NO: 6) использовали в качестве общей L-цепи антитела, и вместе с соответствующей Н-цепью, антитела экспрессировали и очищали методом, описанным в Сравнительном примере 1. Эти варианты антител экспрессировали и очищали методом, описанным в Сравнительном примере 1, и связывание с каждым из FcγR (FcγRIa, FcγRIIа H-типа, FcγRIIа R-типа, FcγRIIb, FcγRIIIa V-типа) подвергали тщательному анализу методом, описанным в Сравнительном примере 2. Относительные активности связывания вариантов с FcγRIIаR и FcγRIIb, полученных путем введения множества модификаций в IL6R-F652/IL6R-L и IL6R-BP267/IL6R-L, представлены в таблице 13 и в таблице 14, соответственно. Эти величины получали путем деления количества каждого варианта, связанного с FcγRIIаR или FcγRIIb, на количество IL6R-F652/IL6R-L или IL6R-BР267/IL6R-L, связанного с соответствующим FcγR, и умножения полученного результата на 100.
Исходя из результатов, представленных в таблицах 13 и 14, было обнаружено, что все указанные модификации способствуют снижению активности связывания с FcγRIIаR по меньшей мере на 67% или менее по сравнению с активностью до введения модификаций, и что все указанные модификации могут приводить к полной потере активности связывания с FcγRIIаR.
Затем, эти модификации вводили в варианты, обладающие повышенной селективной активностью связывания с FcγRIIb, и проводили анализ этих модификаций. В частности, 17 модификаций, представленных в таблицах 13 и 14, были введены в IL6R-P577 и IL6R-P587 методом, описанным в Сравнительном примере 1. Сообщалось, что удаление сахарной цепи N-типа, присоединенной к Asn в положении 297 Fc-области в соответствии с Европейской нумерацией, приводит к значительному снижению активности связывания антител с FcγR (The Journal of Biological Chemistry, 2000, 276, 6591-6604). Поэтому, как описано в этом примере, в IL6R-P577 и IL6R-P587, помимо 17 модификаций, описанных выше, была введена модификация N297A методом, описанным в Сравнительном примере 1, для удаления сахарной цепи N-типа, связанной с Asn в положении 297. Антитело IL6R-L (SEQ ID NO: 6) использовали в качестве общей L-цепи антитела, и вместе с соответствующей Н-цепью, антитела экспрессировали и очищали методом, описанным в Сравнительном примере 1. Связывание полученных вариантов с FcγRIa, FcγRIIаR, FcγRIIаH, FcγRIIb и FcγRIIIaV оценивали методом, описанным в Сравнительном примере 2. В таблице 15 представлены относительные активности связывания каждого варианта с FcγRIIаR и FcγRIIb. Эти величины получали путем деления количества каждого варианта, связанного с FcγRIIаR или FcγRIIb, на количество IL6R-G1d/IL6R-L, связанного с FcγRIIаR или FcγRIIb, и умножения полученного результата на 100.
Как показано в таблице 15, варианты P606 и P607, полученные путем введения S239K; варианты P630 и P645, полученные путем введения D265K; варианты P632 и P647, полученные путем введения D265R; и варианты P634 и P649, полученные путем введения D265V, почти не связывались с FcγRIIаR и FcγRIIb. Это означает, что такие модификации приводят к значительному снижению активности связывания с FcγRIIb даже при их введении в варианты, обладающие повышенной активностью связывания с FcγRIIb. С другой стороны, вариант P636, полученный путем введения S267R в P587, и вариант P665, полученный путем введения N297A в P577, обладали почти такой же активностью связывания с FcγRIIb, как и G1d, но значительно более низкой активностью связывания с FcγRIIаR.
Среди вариантов, указанных в таблице 15, варианты, у которых активность связывания с FcγRIIb повышалась на 80% или более по сравнению с активностью G1d, а активность связывания с FcγRIIаR снижалась на 30% или менее по сравнению с активностью G1d, и величины KD для связывания этих вариантов с каждым из FcγR, представлены в таблице 16. Относительная активность связывания, указанная в таблице, означает величину, полученную путем деления величины KD для IL6R-G1d/IL6R-L, на величину KD для каждого варианта, и представляет собой относительную активность связывания для каждого варианта, если величину KD IL6R-G1d/IL6R-L для каждого FcγR принять за 1. Из величин KD, указанных в этой таблице, величины, показанные в заштрихованных серых ячейках, представляют собой величины, вычисленные по уравнению 2 Сравнительного примера 2, поскольку связывание FcγR с каждым вариантом является очень слабым и не может быть точно проанализировано с помощью кинетического анализа.
[Уравнение 2]
max
eq
KD=C • R/(R-RI)-C
Среди этих вариантов, вариант, обладающий самой низкой активностью связывания с FcγRIIаR, представляет собой вариант P636, который был получен путем введения S267R в P587. Величина KD для связывания P636 с FcγRIIаR, в 0,023 раза превышала величину для G1d, а величина KD для FcγRIIb в 1,8 раза превышала величину для G1d. Кроме того, активность связывания с FcγRIa была в 0,0007 раза ниже, чем для G1d, активность связывания с FcγRIIаН была в 0,006 раза ниже, а активность связывания с FcγRIIIaV была в 0,008 раза ниже, чем для G1d. Вышеупомянутые результаты показали, что варианты, у которых активность связывания с FcγRIIb сохранялась на уровне, аналогичном уровню IgG1, а активность связывания с другими FcγR была ниже, чем активность связывания IgG1, могут быть получены путем введения модификаций, способствующих снижению активности связывания со всеми FcγR, в вариант, обладающий повышенной селективной активностью связывания с FcγRIIb.
(4-3) Оценка комбинации модификаций, снижающих активность связывания с FcγRIIаR
Были проведены исследования на продуцирование лучших вариантов путем введения комбинаций модификаций, описанных в 4-1 и 4-2, которые способствуют сохранению активности связывания с FcγRIIb на уровне, аналогичном уровню связывания G1d, но снижению активности связывания с FcγRIIаR.
Результаты анализа этих комбинаций представлены в таблице 17. Относительные активности связывания, указанные в таблице, означают величины, полученные путем деления величины KD для IL6R-G1d/IL6R-L на величину KD для каждого варианта, и представляет собой относительную активность связывания для каждого варианта, если величину KD IL6R-G1d/IL6R-L для каждого FcγR принять за 1. Из величин KD, указанных в этой таблице, величины, показанные в заштрихованных серых ячейках, представляют собой величины, вычисленные по уравнению 2 Сравнительного примера 2, поскольку связывание FcγR с каждым вариантом является очень слабым и не может быть точно проанализировано с помощью кинетического анализа.
[Уравнение 2]
max
eq
KD = C • R/(R-RI)-C
Среди этих вариантов, представленных в таблице 17, вариант, обладающий самой низкой активностью связывания с FcγRIIаR, представляет собой вариант P712, который был получен путем введения S267R, H268P и Y296E в P587, который представляет собой вариант, обладающий повышенной селективностью связывания с FcγRIIb, где его активность связывания с FcγRIIb в 1,5 раза превышала активность G1d, а его активность связывания с FcγRIIаR была в 0,017 раза ниже, чем активность G1d. Кроме того, активность связывания с FcγRIa была в 0,0005 раза ниже, чем для G1d, активность связывания с FcγRIIаН была в 0,003 раза ниже, чем для G1d, а активность связывания с FcγRIIIаV была в 0,004 раза ниже, чем для G1d.
[Пример 5] Продуцирование вариантов, у которых активность связывания с FcγRIIb сохраняется на уровне, аналогичном уровню связывания нативного антитела, а активность связывания с другими FcγR и активность связывания с комплементом снижается
Аналогично ADCC, комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC) представляет собой эффекторную функцию, инициирующую вырабатывание иммунного ответа. Все варианты, продуцированные ранее, имеют значитеельно пониженную активность связывания с активирующиеми рецепторами, за исключением FcγRIIb, и предполагается, что такая ADCC-активность должна значительно снижаться. Однако, поскольку сайт связывания антитела и комплемента отличается от сайта связывания антитела и FcγR, то возможно, что комплемент-связывающая активность будет сохраняться. Поэтому была оценена комплемент-связывающая активность каждого варианта, и варианты с аттенюированной активностью связывания с комплементом, были получены путем объединения модификаций, снижающих активность связывания с комплементом.
Взаимодействие между антителом и человеческим C1q анализировали с использованием Biacore T200 (GE Healthcare). В качестве рабочего буфера использовали HBS-EP+ (GE Healthcare), а контрольную температуру устанавливали на 25°C. Были использованы чипы, полученные путем иммобилизации белка L (ACTIGEN или BioVision) на сенсорном чипе серии S CM4 (GE Healthcare) посредством реакции присоединения амина.
Представляющие интерес антитела захватывали на этих сенсорных чипах и оставляли для взаимодействия с человеческим комплементом C1q (PROSPEC или Calbiochem), разведенным в рабочем буфере. Затем определяли количество связанного антитела и проводили сравнение с другими антителами. Однако, поскольку количество связанного C1q зависит от количества захваченных антител, то проводили сравнение скорректированных величин, полученных путем деления количества связанного C1q на количество каждого захваченного антитела. Кроме того, после проведения реакции с 10 мМ глицином-HCl, антитела, захваченные на сенсорных чипах, промывали, и эти сенсорные чипы подвергали рециклингу и использовали повторно.
Для осуществления модификации в целях снижения активности связывания с C1q использовали K322A, описанный в предшествующем документе (J. Immunol, 2003, 164, 4178-4184). Кроме того, поскольку также предполоагается, что замена Lys на Glu с противоположным зарядом в положении 322 в соответствии с Европейской нумерацией будет приводить к снижению активности связывания с C1q, то также проводили оценку K322E. Кроме того, сообщалось, что значительное снижение CDC-активности IgG4 по сравнению с активностью IgG1 обусловлено различиями в С-концевых последовательностях CH2-доменов (J. Exp. Med., 1991, 173, 1025-1028). Поэтому, также оценивали снижение активности связывания с C1q путем замены Ala на Gly в положении 327, Ala на Ser в положении 330 и Pro на Ser в положении 331 IgG1 в соответствии с Европейской нумерацией с получением последовательности типа IgG4.
Связывание с человеческим C1q оценивали для вариантов с повышенной активностью связывания с FcγRIIb и для вариантов с сохраненной активностью связывания с FcγRIIb и с пониженной активностью связывания с другими FcγR. Эти варианты были получены путем объединения вышеописанных вариантов с модификациями, снижающими активность с C1q, а затем, эти варианты анализировали. Кроме того, связывание с каждым из FcγR оценивали для всех вариантов, полученных методом, описанным в Сравнительном примере 2. Человеческий IgG4 использовали в качестве негативного контроля для оценки связывания с C1q. Затем получали IL6R-G4d (SEQ ID NO: 52), содержащий G4d, продуцированный путем замены Ser на Pro в положении 228 в соответствии с Европейской нумерацией и удаления Gly и Lys у С-конца человеческого IgG4. IL6R-L (SEQ ID NO: 6) использовали в качестве общей L-цепи антитела.
В таблице 18 представлены результаты оценки связывания продуцированных вариантов с человеческим C1q. В этой таблице, «количество связывания с C1q, если связывание с G1d принимается за 100», означает величину, полученную путем деления количества C1q, связанного с каждым вариантом, на количество каждого захваченного варианта, а затем деления полученного результата на величину, полученную путем деления количества C1q, связанного с IL6R-G1d/IL6R-L, на количество захваченного IL6R-G1d/IL6R-L, и умножения полученного результата на 100. Более конкретно, такая величина указывает на уровень активности связывания с C1q по сравнению с активностью связывания IL6R-G1d/IL6R-L.
Если величина для G1d, имеющего нативную последовательность, принимается за 100, то величина для негативного контроля, G4d, равна 15,5. Величины связывания C1q с G1dK322A, G1dK322E и G1dGSS, которые были продуцированы путем введения в G1d модификаций, снижающих активность связывания с C1q, равны 20,5, 2,3 и 15,2, соответственно, и эти величины были эквивалентны величине для G4d или были ниже этой величины. Это указывает на то, что активность связывания с C1q значительно снижалась по сравнению с активностью до введения модификаций. Кроме того, было обнаружено, что F648, полученный путем введения модификации P238D, которая способствует селективному повышению активности связывания с FcγRIIВ, обладает активностью связывания с C1q, почти равной активности G4d даже без введения модификаций, снижающих активность связывания с C1q. C1q-связывающая активность P741, P742 и P743, полученных путем введения модификаций, снижающих активность связывания с C1q, во все эти варианты, имела величины, эквивалентные величинам для G4d, или более низкие величины.
Среди вариантов P600, P691, P727, P729, P733 и P737, представляющих собой варианты, у которых FcγRIIb-связывающая активность сохраняется на уровне, аналогичном уровню нативного IgG1, и которые обладают пониженной способностью связываться с другими FcγR, все варианты P600, P691, P729 и P733 обладали активностью связывания с C1q, эквивалентной активности G4d. С другой стороны, хотя P727 и P737 обладают значительно более низкой активностью связывания по сравнению с G1d, однако, их активность в два раза или более превышает активность G4d. Модификацию A330H обычно вводили в оба варианта, и при этом, считается, что такая модификация способствунт повышению активности связывания с C1q. При введении во все варианты модификаций K322A или K322E, которые снижают активность связывания с C1q, активность связывания с C1q снижалась до уровня ниже, чем для G4d.
Было обнаружено, что среди вариантов P587, P588, P769, P112, P555, P556, P559, P562, P763, P764 и P765, которые обладают повышенной активностью связывания с FcγRIIb, варианты P587 и P588 обладали активностью связывания с C1q, равной активности связывания G1d, или более высокой активностью. Кроме того, по сравнению с G1d, связывающие активности P769, P556, P559, P562, P763 и P765 были в значительной степени снижены, однако, они почти в два раза превышали активность G4d. С другой стороны, C1q-связывающие активности P112 и P764 были почти такими же, как и активность G4d. Кроме того, введение модификаций, снижающих активность связывания с C1q, приводило к подавлению активности связывания с C1q для всех вариантов до уровня, эквивалентного уровню активности G4d, или более низкого уровня.
В таблице 19 представлены относительные активности связывания каждого варианта с FcγRIIаR и FcγRIIb. Эти величины получали путем деления количества каждого варианта, связанного с FcγRIIаR или FcγRIIb, на количество IL6R-G1d/IL6R-L, связанного с FcγRIIаR или FcγRIIb, и умножения полученного результата на 100.
Варианты, содержащие модификации, которые способствуют снижению активности связывания с комплементом, как указано в таблице 19, имеют относительную FcγRIIаR-связывающую активность, составляющую 105% или менее по отношению к активности G1d, и относительную FcγRIIb-связывающую активность, составляющую 48% или более по отношению к активности G1d.
Связывание этих вариантов с каждым из FcγR проиллюстрировано в таблице 20. Относительная активность связывания, указанная в таблице, означает величину, полученную путем деления величины KD для IL6R-G1d/IL6R-L, на величину KD для каждого варианта, и представляет собой относительную активность связывания для каждого варианта, если величину KD IL6R-G1d/IL6R-L для каждого FcγR принять за 1. Из величин KD, указанных в этой таблице, величины, показанные в заштрихованных серых ячейках, представляют собой величины, вычисленные по уравнению 2 Сравнительного примера 2, поскольку связывание FcγR с каждым вариантом является очень слабым и не может быть точно проанализировано с помощью кинетического анализа.
[Уравнение 2]
max
eq
KD = C • R/(R-RI)-C
Сравнение эффектов модификаций, снижающих активность связывания с C1q, на способность к связыванию с FcγRIIb, показало, что связывающая активность варианта G1dK322A, продуцированного путем введения K322A в G1d, в 1,0 раза превышает активность G1d, связывающая активность варианта G1dK322E, продуцированного путем введения K322E, в 1,1 раза превышает активность G1d, а связывающая активность варианта G1dGSS, продуцированного путем введения A327G/A330S/P331S, в 0,9 раза превышает активность G1d, и все модификации, снижающие активность связывания с C1q, почти не влияли на активность связывания с FcγRIIb. В случае варианта P741, продуцированного путем введения K322E в F648, содержащий модификацию P238D, которая способствует повышению селективной активности связывания с FcγRIIb, или в случае варианта P742, продуцированного путем введения K322E в F648, активность связывания с hFcγRIIb почти не изменялась по сравнению с активностью F648 до введения модификации, тогда как в случае варианта P743, продуцированного путем введения A327G/A330S/P331S, активность связывания с FcγRIIb несколько снижалась, то есть, в 0,6 раза по сравнению с активностью G1d. Исходя из вышеупомянутых результатов можно сделать вывод, что при объединении модификации P238D с модификациями K322A и K322E, активность связывания с C1q снижалась, а активность связывания с FcγRIIb сохранялась, а в случае модификаций A327G/A330S/P331S, активность связывания с FcγRIIb немного снижалась. Аналогичные результаты были получены при введении этих модификаций в другие варианты, несущие модификацию P238D. Так, например, FcγRIIb-связывающая активность P744, продуцированного путем введения K322A в P600, снижалась в 0,7 раза по сравнению с активностью G1d; FcγRIIb-связывающая активность P745, продуцированного путем введения K322Е, снижалась в 0,7 раза по сравнению с активностью G1d; а FcγRIIb-связывающая активность P781, продуцированного путем введения A327G/A330S/P331S, снижалась в 0,2 раза по сравнению с активностью G1d, то есть, была немного ниже.
С другой стороны, с точки зрения иммуногенности, введение модификации A327G/A330S/P331S, которая представляет собой модификацию, вводимую в нативную человеческую последовательность IgG4, может оказаться более предпочтительным, чем введение модификации K322A или K322E. Поэтому, при введении модификаций, снижающих активность связывания с C1q, в вариант, полученный путем введения модификаций, повышающих активность связывания с FcγRIIb, модификация A327G/A330S/P331S может оказаться более предпочтительной. Так, например, введение модификации A327G/A330S/P331S в P787, который был получен путем введения комбинации модификаций E233D и G237D в P781, приводило к синижению активности связывания с C1q, и в то же самое время, не приводило к значительному повышению активности связывания с активирующими FcγR, но повышало активность связывания с FcγRIIb в 0,2-0,5 раза.
Все продуцированные в этом исследовании варианты, у которых активность связывания с FcγRIIb была повышена или сохранена, а активность связывания с комплементом была понижена, обладали FcγRIIb-связывающей активностью, которая составляла 0,2 или более от активности G1d, а их FcγRIIаR-связывающая активность снижалась в 1,0 раз или менее по сравнению с активностью G1d. Кроме того, FcγRIа-связывающая активность снижалась в 0,85 раз или менее по сравнению с активностью G1d, FcγRIIаН-связывающая активность снижалась в 0,036 раза или менее по сравнению с активностью G1d, а FcγRIIIаV-связывающая активность снижалась в 0,012 раза или менее по сравнению с активностью G1d. Среди этих вариантов, варианты, продуцированные путем введения модификации A327G/A330S/P331S, то есть, все варианты P756, P757, P758, P759, P760, P761, P762, P766, P767, P768, P770 и P784 обладали повышенной активностью связывания с FcγRIIb по сравнению с активностью G1d, а их FcγRIIаR-связывающая активность снижалась в 1,0 раз или менее по сравнению с активностью G1d.
Вышеупомянутые результаты показали, что могут быть получены варианты, обладающие превосходной селективностью связывания с FcγRIIb и аттенюированной активностью связывания с C1q, путем введения модификаций, снижающих активность связывания с комплементом, в варианты, FcγRIIb-связывающая активность которых превышала активность нативной молекулы или сохранялась на том же уровне, а активность связывания с другими FcγR снижалась.
[Пример 6] Оценка способности Fc-вариантов активировать дендритные клетки (ДК)
(6-1) Оценка способности Fc-вариантов активировать дендритные клетки (ДК)
Ранее сообщалось, что дендритные клетки, активируемые в резельтате перекрестного связывания с активирующими FcγR, а в частности, FcγRIIа, экспрессируются на клеточной поверхности посредством Fc-области антитела (The Journal of Clinical Investigation, 2005, 115, 2914-2923, The Journal of Immunology, 2003, 170, 3963-3970). Для того, чтобы определить, можно ли снизить активность дендритных клеток, опосредуемую Fc-областью антитела, был проведен анализ Fc-вариантов, которые были получены как описано в примере 4, и которые обладали пониженной селективной активностью связывания с активирующими FcγR.
(6-2) Получение Fc-вариантов
Антитело XolairH-G1d (SEQ ID NO: 18), XolairH-F648, в котором аминокислота Pro была заменена на Asp в положении 238 в XolairH-G1d в соответствии с Европейской нумерацией, и XolairH-P600, в котором аминокислота Pro была заменена на Asp в положении 238, и аминокислота Ser была заменена на Ala в положении 298 в XolairH-G1d в соответствии с Европейской нумерацией, получали методом, описанным в Сравнительном примере 1. Антитело XolairL-k0 (SEQ ID NO: 7) использовали в качестве общей L-цепи антитела, и вместе с соответствующей Н-цепью, антитела экспрессировали и очищали методом, описанным в Сравнительном примере 1. Fc-варианты были обозначены G1d, F648 и P600, соответственно.
(6-3) Выделение моноцитов и индуцирование дифференцировки в дендритные клетки
5
Эквивалентные количества человеческой цельной крови и среды RPMI смешивали друг с другом, и лейкоцитарный слой разделяли на фиколле. Моноциты выделяли из лейкоцитарного слоя с использованием набора для выделения моноцитов II (Miltenyi Biotec). Моноциты помещали в среду RPMI (10% FBS, 100 нг/мл hIL-4 (R & D systems), 250 нг/мл hGM-CSF (R & D systems)) при плотности 5×10клеток/мл, и эти клетки культивировали при 37°C в течение семи дней для индуцирования дифференцировки в ДК.
(6-4) Покрытие планшета и стимуляция ДК
5
Раствор, содержащий соответствующий Fc-вариант (G1d, F648, P600), разведенный PBS (50 мкг/мл), или PBS, добавляли в 96-луночный планшет (Maxisorp, Nunc) при плотности 100 мкл/лунку, и этот планшет встряхивали при комнатной температуре в течение одного часа. После трехкратной промывки PBS, в планшет высевали ДК при плотности 2×10 клеток/лунку. После инкубирования при 37°C в течение четырех часов, клетки собирали и экстрагировали РНК с использованием набора RNeasy 96 (QIAGEN).
(6-5) Оценка экспрессии IL-8
Уровни экспрессии мРНК GAPDH и IL-8 определяли с помощью ПЦР в реальном времени (Applied Biosystems 7900HT Fast Real Time PCR System) с использованием ОТ-ПЦР-зонда QuantiTect (QIAGEN). Уровень экспрессии IL-8 корректировали по уровню экспрессии GAPDH. В этой системе оценки, если в качестве позитивного контроля использовали G1d, то уровень экспрессии IL-8 увеличивался до 8,2, а если вместо раствора антитела использовали PBS, то уровень экспрессии IL-8, как было обнаружено, составлял 0,03.
В этой системе оценки, при сравнении уровней экспрессии IL-8 клетками ДК в случае отдельного добавления Fc-вариантов F648 и P600 были получены результаты, представленные на фиг. 6.
Эти результаты показали, что в варианте P600, уровень экспрессии IL-8 клетками ДК ниже, чем в варианте F648, или более конкретно, способность варианта P600 активировать ДК была ниже. По сравнению с F648, P600 обладает пониженной активностью связывания с FcγRIIа, который представляет собой активирующий FcγR. Следовательно, можно сделать вывод, что вариант P600 обладает пониженной способностью активировать ДК, что обусловлено снижением уровня экспрессии IL-8 в ДК, а в частности, снижением уровня связывания с FcγRIIа.
Более конкретно, это указывает на то, что антигенсвязывающие молекулы, содержащие Fc-область согласно изобретению, обладающую пониженной селективной активностью связывания с активирующими FcγR, включая FcγRIIа, могут оказаться превосходными вариантами, позволяющими решить проблему, связанную с активацией иммунных клеток, но без потери свойства нативного IgG1, заключающегося в быстром снижении концентрации антигена в плазме.
[Пример 7] Оценка способности к агрегации тромбоцитов антителами, содержащими Fc-область, в которую были введены модификации, повышающие активность связывания с FcγRIIb
(7-1) Основные данные, относящиеся к активации тромбоцитов и их агрегации антителами IgG1
Ранее сообщалось, что некоторые антитела IgG1 могут вызывать побочные эффекты в результате индуцирования активации тромбоцитов после их взаимодействия с FcγR. Так, например, известно, что риск развития тромбоэмболии у группы пациентов, которые принимали бевацизумаб, то есть, анти-VEGF антитело, повышался (J. Natl. Cancer Inst. (2007) 99 (16), 1232-1239). Кроме того, тромбоэмболия также наблюдалась при проведении клинических исследований на продуцирование антител против лиганда CD40 (СD154), а поэтому такие клинические испытания прерывали (Arthritis. Rheum. (2003) 48 (3), 719-727). FcγRIIа, то есть, активирующий рецептор Fcγ, экспрессируется на тромбоцитах, а FcγRIIb, то есть, ингибирующий рецептор Fcγ, не экспрессируется на тромбоцитах (J. Exp. Med. (2006) 203 (9), 2157-2164). Последующие исследования, проводимые на животных-моделях и т.п., позволяют предположить, что введение этих антител приводит к агрегации тромбоцитов посредством связывания с FcγRIIа на тромбоцитах и, тем самым, к образованию тромбов (J. Thromb. Haemost. (2009) 7 (1), 171-181, J. Immunol. (2010) 185 (3), 1577-1583). Сообщалось, что у пациентов с системной красной волчанкой, которая является аутоимунным заболеванием, тромбоциты активируются по FcγRIIа-зависимому механизму, а активация тромбоцитов, как сообщалось, коррелирует с тяжестью симптомов такого заболевания (Sci. Transl. Med. (2010) 2 (47), 47-63). Таким образом, даже нативные антитела IgG1 могут активировать тромбоциты и вызывать тяжелые побочные эффекты.
(7-2) Оценка активации тромбоцитов с использованием анти-CD154 антител
Сообщалось, что активация тромбоцитов обусловлена взаимодействием между FcγRIIа, экспрессируемым на тромбоцитах, и Fc IgG1, а поэтому было проведено исследование для того, чтобы определить, можно ли предотвратить активацию тромбоцитов с использованием антител, продуцированных путем снижения активности связывания IgG1 с FcγRIIа.
Антитело 5c8-G1d (тяжелая цепь SEQ ID NO: 8, легкая цепь SEQ ID NO: 9), которое представляет собой антитело IgG1 против CD40, получали методом, описанным в Сравнительном примере 2. Затем этот метод, описанный в Сравнительном примере 2, был применен для получения антитела 5c8-F648 (легкая цепь SEQ ID NO: 9), содержащего Fc-область, в которой аминокислота Pro была заменена на Asp в положении 238 в соответствии с Европейской нумерацией, где указанное антитело обладает пониженной активностью связывания с FcγRIIа. Кроме того, метод, описанный в Сравнительном примере 2, был применен для получения антитела 5c8-P600 (легкая цепь SEQ ID NO: 9), содержащего Fc-область, в которой аминокислота Pro была заменена на Glu в положении 238, а аминокислота Ser была заменена на Ala в положении 298 в соответствии с Европейской нумерацией, где указанная Fc-область антитела 5c8-G1d обладает более низкой активностью связывания с FcγRIIа. Антитела 5c8-G1d, 5c8-F648 и 5c8-P600 были обозначены ниже как G1d, F648 и P600, соответственно. Затем была оценена способность этих Fc-вариантов агрегировать тромбоциты.
3,
2
4,
2,
3,
2
4,
2,
2
Активацию тромбоцитов оценивали методом, описанным ниже. Сначала, приблизительно 50 мл собранной цельной крови, взятой у донора с полиморфизмом гена FcγRIIа (R131/R131), разделяли на аликвоты и помещали в 4,5-миллилитровые вакуумные пробирки для забора крови, содержащие 0,5 мл 3,2% цитрата натрия, а затем эти пробирки центрифугировали при 200×g в течение 15 минут, после чего собранный супернатант использовали в качестве плазмы, богатой тромбоцитами (PRP). После этого, PRP промывали буфером А (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 12 мМ NaHCO 0,42 мМ NaHPO2 мМ MgCl 5 мМ HEPES, 5,55 мМ декстрозы, 1,5 ед/мл апиразы и 0,35% BSA), а затем этот буфер заменяли буфером В (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 12 мМ NaHCO 0,42 мМ NaHPO2 мМ MgCl 5 мМ HEPES, 5,55 мМ декстрозы, 2 мМ CaCl и 0,35% BSA). В результате были получены промытые тромбоциты при плотности приблизительно 300000/мкл. 168 мкл промытых тромбоцитов распределяли по аналитическим кюветам, снабженным стержневой мешалкой, после чего их помещали в устройство для измерения способности к агрегации. Тромбоциты перемешивали стержневой мешалкой со скоростью 1000 об/мин в кюветах, поддерживаемых в этом устройстве при 37,0°C. Затем в кюветы добавляли 42 мкл раствора иммунного комплекса, содержащего соответствующее антитело и антиген, конечные концентрации которых составляли 120 мкг/мл антитела и 111 мкг/мл антигена, после чего тромбоциты и иммунный комплекс оставляли на пять минут для прохождения реакции. Кроме того, к рекционному раствору добавляли аденозиндифосфат (ADP, SIGMA) в концентрации, при которой не наблюдалась вторичная агрегация тромбоцитов, для того, чтобы определить, происходит ли повышение уровня такой активации.
Активация тромбоцитов может быть определена по повышению уровней экспрессии маркеров активации, таких как CD62p (р-селектин) или активированный интегрин (РАС-1) на мембранной поверхности тромбоцитов. 2 мкл иммунного комплекса добавляли к 8 мкл промытых тромбоцитов, полученных описанным выше методом, и оставляли на пять минут при комнатной температуре для прохождения реакции. Затем добавляли ADP в концентрации, позволяющей индуцировать небольшую активацию, после чего подтверждали усиление ADP-активации иммунным комплексом. В качестве негативного контроля, вместо иммунного комплекса, использовали образец, полученный путем добавления фосфатного буфера (pH 7,4) (Gibco). К каждому прореагировавшему образцу добавляли ФЭ-меченное анти-CD62 антитело (BECTON DICKINSON), PerCP-меченное анти-CD61 антитело и ФИТЦ-меченное антитело PAC-1 (BD bioscience) для окрашивания. Интенсивность флуоресценции каждого окрашивания измеряли на проточном цитометре (FACS CantoII, BD bioscience). Было подтверждено, что при добавлении в эту аналитическую систему антитела 5c8-G1d, используемого в качестве позитивного контроля, уровень экспрессии CD62p и РАС-1 в тромбоцитах повышался.
Способности вариантов F648 и P600 активировать тромбоциты сравнивали с использованием этой аналитической системы. Данные по экспрессии CD62p и активированного интегрина, полученные при добавлении каждого Fc-варианта, представлены на фигурах 7 и 8, соответственно. Экспрессия CD62p и активированного интегрина, индуцированная на мембранной поверхности тромбоцитов путем стимуляции ADP, повышалась при добавлении F648, но не P600.
Эти результаты показали, что более сильное ингибирующее действие наблюдалось у антител, содержащих Fc-область, которая была модифицирована для снижения активности связывания с человеческим FcγRIIа путем замены аминокислоты Pro на Asp в положении 238 и аминокислоты Ser на Ala в положении 298 в Fc-области IgG1 в соответствии с Европейской нумерацией, по сравнению с уже существующими Fc-вариантами, обладающими повышенной селективностью связывания с FcγRIIb.
Более конкретно, это указывает на то, что антигенсвязывающие молекулы, содержащие Fc-область согласно изобретению, обладающую пониженной селективной активностью связывания с FcγRIIа, могут оказаться превосходными вариантами, позволяющими решить проблему, связанную с активацией тромбоцитов, но без потери свойства нативного IgG1, заключающегося в быстром снижении концентрации антигена в плазме.
[Сравнительный пример 1] Конструирование антитело-экспрессирующих векторов; и экспрессия и очистка антител
Синтез полноразмерных генов, содержащих нуклеотидные последовательности Н-цепи и L-цепи вариабельных областей антитела, осуществляли методами продуцирования, известными специалистам, посредством ПЦР-сборки и т.п. Введение аминокислотных замен осуществляли методами, известными специалистам, с помощью ПЦР или т.п. Полученный плазмидный фрагмент встраивали в экспрессионный вектор клеток животных и получали экспрессионный вектор для Н-цепи и экспрессионный вектор для L-цепи. Нуклеотидную последовательность полученного экспрессионного вектора определяли методами, известными специалистам. Полученные плазмиды транзиентно вводили в клеточную линию HEK293H, происходящую от раковых клеток почек человеческого эмбриона (Invitrogen), или в клетки FreeStyle293 (Invitrogen) для экспрессии антитела. Полученный супернатант культуры собирали, а затем пропускали через 0,22 мкм-фильтр MILLEX (R)-GV (Millipore) или через 0,45 мкм-фильтр MILLEX (R)-GV (Millipore). Антитела очищали из полученного супернатанта культуры методами, известными специалистам, с использованием рекомбинантного белка А-сефарозы Fast Flow (GE Healthcare) или G-белка-сефарозы 4 Fast Flow (GE Healthcare). Концентрацию очищенных антител определяли по оптической плотности на 280 нм, измеренной на спектрофотометре. По полученному значению вычисляли коэффициент возбуждения методами, такими как PACE, а затем этот коэффициент использовали для оценки концентрации антитела (Protein Science 1995; 4: 2411-2423).
[Сравнительный пример 2] Метод получения FcγR и метод анализа взаимодействия между модифицированным антителом и FcγR
Внеклеточные домены FcγR получали следующим методом. Сначала, ген внеклеточного домена FcγR синтезировали методом, хорошо известным специалистам. Затем получали последовательность каждого FcγR на основе информации, имеющейся в NCBI. В частности, FcγRI продуцировали на основе последовательности NCBI рег. № NM_000566.3, FcγRIIа продуцировали на основе последовательности NCBI рег. № NM_001136219.1, FcγRIIb продуцировали на основе последовательности NCBI рег. № NM_004001.3, FcγRIIIа продуцировали на основе последовательности NCBI рег. № NM_001127593.1, а FcγRIIIb продуцировали на основе последовательности NCBI рег. № NM_000570.3, и к С-концу присоединяли His-метку. Кроме того, известно, что существует полиморфизм между FcγRIIа, FcγRIIIа и FcγRIIIb, и эти полиморфные сайты были получены как описано в публикациях J. Exp. Med, 1990, 172: 19-25, для FcγRIIа; J. Clin Invest 1997, 100 (5): 1059-1070, для FcγRIIIа; и J. Clin Invest, 1989, 84, 1688-1691, для FcγRIIIb.
Полученные генные фрагменты встраивали в экспрессионный вектор для клеток животных и получали нужные экспрессионные векторы. Полученные экспрессионные векторы транзиентно вводили в клетки FreeStyle293, происходящие от раковых клеток почек человеческого эмбриона (Invitrogen), для экспрессии представляющих интерес белков. В случае FcγRIIb, используемого для кристаллографического анализа, представляющий интерес белок экспрессировали в присутствии кифунезина в конечной концентрации 10 мкг/мл, так, чтобы сахарная цепь, присоединенная к FcγRIIb, имела высокое содержание маннозы. Клетки культивировали и после сбора полученного супернатанта культуры, его пропускали через 0,22 мкм-фильтр. В принципе, полученные супернатанты культуры были очищены за нижеследующие четыре стадии. Эти стадии проводили следующим образом, а именно, в первой стадии осуществляли катионообменную колоночную хроматографию (SP Sepharose FF), во второй стадии проводили аффинную колоночную хроматографию (HisTrap HP) для присоединения His-метки, в третьей стадии проводили колоночную гель-фильтрацию (Superdex200), а в четвертой стадии проводили хроматографию в асептических условиях. Однако, для FcγRI, анионообменную колоночную хроматографию, проводимую с использованием сефарозы (Q sepharose FF), осуществляли как описано в стадии 1. Очищенные белки оценивали путем измерения оптической плотности на 280 нм на спектрофотометре, и по полученным величинам вычисляли концентрации очищенных белков с использованием коэффициента поглощения, определенного таким методом, как PACE (Protein Science 1995; 4: 2411-2423).
Анализ взаимодействия между модифицированным антителом и Fcγ-рецептором, полученными как описано выше, осуществляли с использованием Biacore T100 (GE Healthcare), Biacore T200 (GE Healthcare), Biacore A100 и Biacore 4000. В качестве рабочего буфера использовали HBS-EP+ (GE Healthcare), а контрольную температуру устанавливали на 25°C. Были использованы чипы, полученные путем иммобилизации антигенного пептида, белка А (Thermo Scientific), белка А/G (Thermo Scientific) и белка L (ACTIGEN или BioVision), методом присоединения амина к сенсорным чипам серии S CM5 (GE Healthcare) или серии S CM4 (GE Healthcare), или альтернативно, были использованы чипы, полученные путем предварительно взаимодействия биотинилированных антигенных пептидов с сенсорным чипом серии S SA (сертифицированным) (GE Healthcare) и их иммобилизации на этом чипе.
После захвата представляющих интерес антител на этих сенсорных чипах, Fcγ-рецептор, разведенный рабочим буфером, оставляли для взаимодействия с антителом, после чего определяли количество рецептора, связанного с антителами, и антитела сравнивали. Однако, поскольку количество связанного Fcγ-рецептора зависит от количества захваченных антител, то количество связанного Fcγ-рецептора делили на количество каждого захваченного антитела и получали скорректированные величины, которые затем сравнивали. Кроме того, антитела, иммобилизованные на чипах, смывали путем реакции с 10 мМ глицина-HCl, pH 1,5, и эти чипы регенерировали и использовали повторно.
Кинетические анализы для вычисления величин KD для связывания каждого модифицированного антитела с FcγR осуществляли описанным ниже методом. Сначала, представляющие интерес антитела иммобилизовали на вышеупомянутых серсорных чипах, а затем Fcγ-рецептор, разведенный рабочим буфером, оставляли для взаимодействия. Для построения общей кривой зависимости использовали программу Biacore Evaluation Software, и по полученным результатам строили сенсорограмму с использованием лангмюровской модели связывания 1:1, а затем вычисляли константу скорости ассоциации ka (л/моль/с) и константу скорости диссоциации kd (1/с), и по этим величинам вычисляли константы диссоциации KD (моль/л).
Если взаимодействие каждого из модифицированных антител и FcγR было слабым, и если было установлено, что коррекция не может быть проведена с помощью вышеупомянутого кинетического анализа, то KD для таких взаимодействий вычисляли по нижеследующему уравнению модели связывания 1:1, как описано в руководстве Biacore T100 Software Handbook BR1006-48 Edition AE.
Характер взаимодействия молекул в соответствии с моделью связывания 1:1 на Biacore может быть представлен нижеследующим уравнением 1.
[Уравнение 1]
eq
max
R=C • R/(KD+C)+RI, где
eq
R: график зависимости устойчивых уровней связывания от концентрации аналита
С: концентрация
RI: вклад объемного показателя преломления в образце
max
R: способность аналита связываться с поверхностью чипа
При преобразовании этого уравнения, KD может быть вычислена по уравнению 2, представленному ниже.
[Уравнение 2]
max
eq
KD=C • R/(R-RI)-C
max,
max
max
KD может быть вычислена путем замены величин R RI, и C в этом уравнении. Величины RI и C могут быть определены из сенсорограммы, полученной по результатам и условиям измерений. R вычисляли следующим методом. В качестве объекта для сравнения были выбраны антитела, которые обнаруживали достаточно сильное взаимодействие, как было оценено одновременно в одном и том же раунде измерений, и величину R определяли путем построения общей кривой с использованием лангмюровской модели связывания 1:1, а затем полученную величину делили на количество сравниваемого антитела, иммобилизованного на сенсорном чипе, и результат умножали на оцениваемое количество иммобилизованного модифицированного антитела.
[Сравнительный пример 3] Получение антител, которые связываются с человеческим IgA в зависимости от кальция
(3-1) Получение человеческого IgA (hIgA)
Человеческий IgA (далее также обозначаемый hIgA), который представляет собой антиген, получали рекомбинантными методами, описанными ниже. hIgA, экспрессируемый путем культивирования клеток-хозяев, несущих рекомбинантный вектор, содержащий H(WT)-IgA1 (SEQ ID NO: 19) и L(WT) (SEQ ID NO: 20), очищали с помощью ионообменной хроматографии и гель-фильтрации методом, известным специалистам.
(3-2) Антитела с кальций-зависимой активностью связывания
H54/L28-IgG1, описанный в заявке WO2009/125825, представляет собой гуманизованное антитело против рецептора IL-6, а Fv4-IgG1 представляет собой гуманизованное антитело против рецептора IL-6, продуцированное путем сообщения антителу H54/L28-IgG1 способности связываться с растворимым человеческим рецептором IL-6 в зависимости от рН (способности связываться в нейтральных условиях и диссоциироваться в кислотных условиях). В тесте на мышах in vivo, описанном в WO2009/125825, было обнаружено, что элиминация растворимого человеческого рецептора IL-6 происходила гораздо быстрее у мышей в группе, которой вводили смесь Fv4-IgG1 и растворимого человеческого рецептора IL-6 (антигена), по сравнению с элиминацией у мышей в группе, которой вводили смесь H54/L28-IgG1 и растворимого человеческго рецептора IL-6 (антигена).
Растворимый человеческий рецептор IL-6, связанный с типичным антителом, которое связывается с растворимым человеческим рецептором IL-6, подвергали рециклингу в плазме под действием FcRn вместе с антителом. С другой стороны, антитело, которое связывается с растворимым человеческим рецептором IL-6 в зависимости от рН, диссоциирует растворимый человеческий рецептор IL-6, связанный с антителом, в кислотных условиях в эндосоме. Поскольку диссоциированный растворимый человеческий рецептор IL-6 разлагается в лизосомах, то элиминация растворимого человеческого рецептора IL-6 из плазмы может значительно ускоряться, а антитела, связанные с растворимым человеческим рецептором IL-6 в зависимости от рН, подвергаются рециклингу в плазме под действием FcRn после диссоциации растворимого человеческого рецептора IL-6, и эти подвергнутые рециклингу антитела могут снова связываться с растворимым человеческим рецептором IL-6. При повторении вышеупомянутого цикла (поглощения клетками антител, связанных с антигеном > диссоциации антигена из антитела > разложения антигена и рециклинга антитела в плазме), одна молекула антитела может несколько раз связываться с растворимым человеческим рецептором IL-6 (фиг. 9).
Кроме того, как описано в WO2011/122011, H54/L28-IgG1 представляет собой гуманизованное антитело против рецептора IL-6, Fv4-IgG1 представляет собой гуманизованное антитело против рецептора IL-6, продуцированное путем сообщения антителу H54/L28-IgG1 способности связываться с растворимым человеческим рецептором IL-6 в зависимости от рН (способности связываться в нейтральных условиях и диссоциироваться в кислотных условиях), а Fv4-IgG1-v2 представляет собой гуманизованное антитело против рецептора IL-6, продуцированное путем сообщения антителу Fv4-IgG1 повышенной активности связывания с FcRn при нейтральном рН. В тесте на мышах in vivo, описанном в WO2009/125825, элиминация растворимого человеческого рецептора IL-6 происходила гораздо быстрее у мышей в группе, которой вводили смесь Fv4-IgG1-v2 и растворимого человеческого рецептора IL-6 (антигена), по сравнению с элиминацией у мышей в группе, которой вводили смесь Fv4-IgG1 и растворимого человеческго рецептора IL-6 (антигена). Более конкретно, сообщалось, что повышение FcRn-связывающей активности антитела, которое связывается с антигеном рН-зависимым образом при нейтральном рН (pH 7,4), приводит к повышению способности модифицированного антитела к повторному связыванию с антигенами, к стимуляции элиминации антигенов из плазмы, и к сообщению этому антителу способности удалять антиген из плазмы (фиг. 10).
Как показано на фиг. 9 и 10, различия в действии антител, которые связываются с антигеном в зависимости от рН, а именно, различия сред плазмы и эндосомы, то есть, различия рН в этих средах (в плазме: pH 7,4, в эндозоме: pH 6,0), могут быть использованы для сообщения антителам способности к сильному связыванию с антигенами в плазме и к высвобождению антигенов в эндосомы. Для использования таких различий в способности антител связываться с антигеном в плазме и в эндосомах в зависимости от рН, важными факторами являются свойства среды в плазме и в эндосомах, а также степень различия этих свойств. Различия в рН означают различия в концентрациях ионов водорода. Более конкретно, если концентрация ионов водорода в плазме (при pH 7,4) составляет приблизительно 40 нM, а концентрация ионов водорода в эндосоме (при рН 6,0) составляет приблизительно 1000 нM, то концентрации ионов водорода в плазме и в эндосомах, которые могут служит одним из факторов окружающей среды, будут различаться приблизительно в 25 раз.
Кроме того, в другом варианте осуществления изобретения, для достижения эффектов, проиллюстрированных на фиг. 9 и 10, или для одновременного достижения этих эффектов, могут быть использованы антитела, которые связываются с антигеном в зависимости от факторов окружающей среды, не относящихся к концентрации ионов водорода и значительно отличающихся в плазме и в эндосоме. В результате поиска таких факторов окружающей среды было обнаружно, что этим фактором является кальций, концентрации которого в плазме и в эндосоме значительно отличаются. Концентрация ионов кальция в плазме составляет приблизительно 1,1-1,3 мМ, а концентрация ионов кальция в эндосоме составляет приблизительно 3 мкM, а поэтому, концентрации ионов кальция, которые рассматриваются как один из факторов окружающей среды в плазме и в эндосоме, отличаются приблизительно в 400 раз, и кроме того, было обнаружено, что такие концентрации превышают концентрации ионов водорода (в 25 раз). Более конкретно, с использованием антитела, которое связывается с антигеном в зависимости от концентрации ионов кальция, то есть, связывается с антигеном при высокой концентрации кальция (1,1-1,3 мМ) и диссоциирует антиген при низкой концентрации кальция (3 мкM), можно осуществлять диссоциацию антигенов из антитела в эндосомах на уровне, эквивалентном уровню диссоциации антигенов из антитела, обладающего способностью связываться с антигеном в зависимости от рН, или на более высоком уровне.
(3-3) Экспрессия и очистка антител, связывающихся с hIgA
6
TM
2
2,
Антитело GA1-IgG1 (тяжелая цепь, SEQ ID NO: 21, и легкая цепь, SEQ ID NO: 22) и антитело GA2-IgG1 (тяжелая цепь, SEQ ID NO: 23, и легкая цепь, SEQ ID NO: 24) представляют собой антитела, которые связываются с hIgA. Последовательности ДНК, кодирующие GA1-IgG1 (тяжелая цепь, SEQ ID NO: 21, и легкая цепь, SEQ ID NO: 22) и GA2-IgG1 (тяжелая цепь, SEQ ID NO: 23, и легкая цепь, SEQ ID NO: 24), встраивали в плазмиды для экспрессии антител в клетках животных известным методом. Антитела экспрессировали следующим методом. Клетки клеточной линии FreeStyle 293-F, происходящие от клеток почек человеческого плода (Invitrogen), суспендировали в среде для экспрессии FreeStyle 293 (Invitrogen). 3 мл клеточной суспензии высевали при плотности 1,33×10 клеток/мл в каждую лунку 6-луночного планшета. Затем полученную плазмиду вводили в клетки методом липофекции. Клетки культивировали в CO-инкубаторе (37°C, 8% CO 90 об/мин) в течение 4 дней. Антитело очищали от супернатанта культуры методом, известным специалистам, с использованием сефарозы, связанной с рекомбинантным белком А (Sepharose Fast Flow) (Amersham Biosciences). Оптическую плотность (на длине волны 280 нм) раствора очищенного антитела измеряли на спектрофотометре. Концентрацию антитела определяли с использованием коэффициента экстинкции, вычисленного исходя из полученной величины методом PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
(3-4) Оценка способности полученных антител связываться с hIgA в зависимости от концентрации кальция
D
2
2
hIgA-связывающие активности (константа диссоциации K (M)) антител, выделенных в стадии (1-3), оценивали с помощью Biacore T200 (GE Healthcare). Измерения проводили с использованием раствора 0,05% твина 20, 20 ммоль/л ACES, 150 ммоль/л NaCl (pH 7,4 или pH 5,8), содержащего 3 мкM или 1,2 мМ CaCl, или раствора 0,05% твина 20, 20 ммоль/л ACES, 150 ммоль/л NaCl (pH 8,0), содержащего 0,1 мкM или 10 мМ CaCl, в качестве рабочего буфера.
2+
2+
2+
Соответствующее количество рекомбинантного белка A/G (Thermo Scientific) иммобилизовали на сенсорном чипе CM5 (GE Healthcare) методом присоединения амина, а затем этот чип оставляли для связывания с антителом. После этого добавляли соответствующую концентрацию hIgA (описанного в стадии (1-1)) в качестве аналита, и подвергали взаимодействию с антителом на сенсорном чипе. Измерения проводили при 37°C. После измерения впрыскивали 10 ммоль/л глицина-HCl (pH 1,5) для регенерации сенсорного чипа. Исходя из результатов измерений вычисляли константу диссоциации KD(M) с помощью анализа методом построения кривой и анализа на равновесие с помощью компьютерной программы Biacore T200 Evaluation (GE Healthcare). Результаты представлены в таблице 21. Полученная сенсорограмма представлена на фиг. 11. Антитело GA2-IgG1 сильно связывалось с hIgA при концентрации Ca 1,2 мМ и слабо связывалось с hIgA при концентрации Ca 3 мкM. Кроме того, при концентрации Ca 1,2 мМ, антитело GA2-IgG1 сильно связывалось с человеческим IgA при pH 7,4 и слабо связывалось с человеческим IgA при pH 5,8. Таким образом, было продемонстрировано, что GA2-IgG1 связывается с человеческим IgA в зависимости от рН и концентрации кальция.
Таблица 21
Название антитела
Условия
Выбранная модель
ka
Kd
KD (M)
GA2-IgG1
pH 8,0, 10 мМ Са
Модель связывания 1:1
1,2Е+06
1,2Е-01
1,0Е-07
pH 8,0, 0,01 мкМ Са
Модель связывания 1:1
1,1Е+06
2,4Е-01
2,2Е-07
pH 7,4, 1,2 мМ Са
Модель связывания 1:1
5,7Е+05
8,4Е-02
1,5Е-07
pH 7,4, 3 мкМ Са
Модель связывания 1:1
6,4Е+05
1,2Е-01
1,9Е-07
pH 5,8, 1,2 мМ Са
Модель связывания 1:1
6,8Е+05
9,9Е-02
1,4Е-07
pH 5,8, 3 мкМ Са
Модель связывания 1:1
7,1Е+05
1,1Е-01
1,5Е-07
GA2-IgG1
pH 7,4, 1,2 мМ Са
Модель связывания 1:1
4,0Е+05
1,6Е-02
3,9Е-08
pH 7,4, 3 мкМ Са
Постоянная аффинность
-
-
6,7Е-06
pH 5,8, 1,2 мМ Са
Постоянная аффинность
-
-
4,0Е-06
pH 5,8, 3 мкМ Са
Постоянная аффинность
-
-
5,0Е-06
[Сравнительный пример 4] Получение вариантов антитела, которое связывается с hIgA в зависимости от концентрации кальция
Для дополнительного ускорения элиминации антигенов (hIgA) из плазмы получали антитело GA2-N434W (легкая цепь, SEQ ID NO: 24), путем введения в антитело GA2-IgG1 аминокислотной замены N434W для повышения активности связывания с мышиным FcRn при рН 7,4, где указанное антитело GA2-IgG1 связывалось с hIgA в зависимости от концентрации кальция. Кроме того, для устранения FcγR-связывающих свойств GA2-IgG1 получали антитело GA2-FcγR(-) (легкая цепь, SEQ ID NO: 24) путем введения аминокислотных замен L235R и S239K в GA2-IgG1. С использованием плазмид для экспрессии антител у животных, которым вводили последовательности ДНК, кодирующие GA2-N434W (легкая цепь, SEQ ID NO: 24) и GA2-FcγR(-) (легкая цепь, SEQ ID NO: 24), методом, известным специалистам, были экспрессированы варианты антител с применением вышеописанного метода, а затем, после очистки определяли концентрации этих вариантов антител. Оценка связывания GA2-FcγR(-) с каждым из мышиных FcγR (mFcγRI, mFcγRII, mFcγRIII и mFcγRIV) показала, что связывания с любыми этими рецепторами не происходило.
[Сравнительный пример 5] Получение вариантов антител, которые связываются с hIgA в зависимости от концентрации кальция
Затем, для дополнительного ускорения элиминации антигена (hIgA) из плазмы получали антитело GA2-F1087 путем замены Leu на Tyr в положении 328 (в соответствии с Европейской нумерацией) в GA2-IgG1 в целях повышения активности связывания антитела GA2-IgG1 с мышиным FcγR, где указанное антитело связывалось с hIgA в зависимости от концентрации кальция. Последовательность ДНК, кодирующую GA2-F1087 (легкая цепь, SEQ ID NO: 24), встраивали в плазмиду для экспрессии антител у животных методом, известным специалистам. Варианты антитела экспрессировали вышеописанным методом с использованием плазмиды. Концентрации этих вариантов измеряли после очистки. Антитела, содержащие вышеописанную модификацию, обладали значительно более высокой активностью связывания с мышиным FcγR, как показано в Сравнительном примере 5.
[Сравнительный пример 6] Оценка эффекта удерживания антигена в плазме у нормальных мышей, которым вводили антитела, обладающие Ca-зависимой активностью связывания с hIgA
(6-1) Тесты in vivo, проводимые на нормальных мышах
Нормальным мышам (мышам C57BL/6J, Charles River Japan) вводили hIgA (человеческий IgA, полученный как описано в Сравнительном примере (3-1)) отдельно или в комбинации с анти-hIgA антителом. После введения оценивали in vivo динамику связывания hIgA и анти-hIgA антител. Затем, в хвостовую вену сразу добавляли раствор hIgA (80 мкг/мл) или смешанный раствор hIgA и анти-hIgA антитела в дозе 10 мл/кг. Используемыми здесь анти-hIgA антителами являются антитела GA2-IgG1 и GA2-F1087, описанные выше.
Во всех смешанных растворах, концентрация hIgA составляла 80 мкг/мл, а концентрация анти-hIgA антитела составляла 2,69 мг/мл. В этом эксперименте, анти-hIgA антитела присутствовали в значительном избытке по отношению к hIgА, то есть, предполагается, что почти все hIgА связывались с антителами. У мышей в группе, которой вводили GA-IgG1, брали кровь через пять минут, семь часов, один день, два дня, три дня и семь дней после введения. С другой стороны, у мышей в группе, которой вводили GA2-F1087, брали кровь через пять минут, 30 минут, один час, два часа, один день, три дня и семь дней после введения. Взятую кровь сразу подвергали центрифугированию при 12000 об/мин в течение 15 минут при 4°C с получением плазмы. Выделенную плазму хранили в холодильнике при температуре -20°C или ниже до ее использования.
(6-2) Определение концентрации анти-hIgA антитела в плазме нормальных мышей методом ELISA
2
Концентрации анти-hIgA антитела в мышиной плазме определяли методом ELISA. Сначала, для приготовления планшета с иммобилизованным на нем антителом против человеческого IgG, F(ab')-фрагмент антитела против человеческого IgG (специфичного к γ-цепи) (SIGMA) разделяли на аликвоты и вносили в каждую лунку планшета Nunc-Immuno Plate, MaxiSorp (Nalge Nunc International), и этот планшет оставляли на ночь при 4°C. Калибровочную кривую строили с использованием образцов анти-hIgA антитела, полученного в виде стандартных растворов при соответствующих концентрациях в плазме (0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,03125, 0,01563 и 0,007813 мкг/мл), а затем разведенные 100-кратно или более аналитические пробы мышиной плазмы разделяли на аликвоты и вносили в вышеупомянутый планшет с иммобилизованным на нем антителом против человеческого IgG. После инкубирования плапншета в течение одного часа при 25°C, в каждую лунку планшета добавляли аликвоты козьего антитела против человеческого IgG (специфичного к γ-цепи), конъюгированного с биотином (BIOT) (Southern Biotechnology Associats Inc.). После этого, планшет инкубировали при 25°C в течение одного часа. Затем в каждую лунку планшета добавляли аликвоты стрептавидина-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies). Планшет инкубировали при 25°C в течение одного часа. Хромогенную реакцию осуществляли с использованием субстрата TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories). После завершения реакции путем добавления 1н серной кислоты (Showa Chemical), оптическую плотность реакционного раствора в каждой лунке измеряли на 450 нм на микропланшет-ридере. Концентрации анти-hIgA антитела в мышиной плазме определяли исходя из оптической плотности на стандартной кривой, построенной с использованием аналитической компьютерной программы SOFTmax PRO (Molecular Devices). Концентрации антител GA2-IgG1 и GA2-F1087 в зависимости от времени в плазме нормальных мышей после внутривенного введения, измеренные методом, описанным выше, представлены на фиг. 12. Полученные результаты показали, что клон GA2-IgG1 обладал сильной pH- и Ca-зависимой активностью связывания с hIgA, а концентрация этого клона антитела в плазме, в основном, не снижалась даже при повышении уровня связывания с FcγR.
(6-3) Определение концентрации hIgA в плазме методом ELISA
Концентрации hIgA в мышиной плазме определяли методом ELISA. Сначала, для приготовления планшета с иммобилизованным на нем антителом против человеческого IgА, козье антитело против человеческого IgА (BETHYL) разделяли на аликвоты и вносили в каждую лунку планшета Nunc-Immuno Plate, MaxiSorp (Nalge Nunc International), и этот планшет оставляли на ночь при 4°C. Калибровочную кривую строили с использованием образцов hIgA, полученного в виде стандартных растворов при соответствующих концентрациях в плазме (0,4; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025; 0,0125 и 0,00625 мкг/мл). 100 мкл каждой разведенной 100-кратно или более пробы для калибровочной кривой и аналитической пробы мышиной плазмы объединяли с 200 мкл 500 мг/мл hsIL6R. Эти пробы смешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа. Затем 100 мкл смесей разделяли на аликвоты и вносили в планшет с иммобилизованным на нем антителом против человеческого IgА. Этот планшет оставляли на один час при комнатной температуре. После этого, в каждую лунку планшета добавляли аликвоты биотинилированного антитела против человеческого IL-6R (R & D). После инкубирования при комнатной температуре в течение одного часа, в каждую лунку планшета добавляли аликвоты стрептавидина-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies). Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа. Хромогенную реакцию осуществляли с использованием субстрата TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories). После завершения реакции путем добавления 1н серной кислоты (Showa Chemical), оптическую плотность реакционного раствора в каждой лунке измеряли на 450 нм на микропланшет-ридере. Концентрации hIgA в мышиной плазме определяли исходя из оптической плотности на стандартной кривой, построенной с использованием аналитической компьютерной программы SOFTmax PRO (Molecular Devices). Концентрация hIgA в зависимости от времени в плазме нормальных мышей после внутривенного введения, измеренная методом, описанным выше, представлена на фиг. 13.
Полученный результат показал, что у мышей, которым вводили hIgA в комбинации с антителом GA2-IgG1, у которого Са-зависимая активность связывания с hIgA была выше в 100 раз или более, элиминация hIgA ускорялась по сравнению с элиминацией, наблюдаемой при введении только hIgA. С другой стороны, в плазме мышей, которым вводили антитело GA2-F1087 с повышенной активностью связывания с hIgA и FcγR, концентрация hIgA снижалась до уровня ниже измеримого предела (0,006 мкг/мл или более) через один день после введения, и таким образом, элиминация hIgA значительно ускорялась по сравнению с элиминацией из плазмы у мышей, которым вводили GA-IgG1. Вышеуказанные результаты показали, что у мышей, которым вводили hIgA и анти-hIgA антитело, образующее иммунные комплексы, эффект элиминации антигена (hIgA) из плазмы под действием антитела, обладающего повышенной активностью связывания с FcγR, повышался по сравнению с эффектом элиминации антигена (hIgA) из плазмы под действием антитела, от которого происходит антитело, обладающее повышенной активностью связывания с FcγR.
[Сравнительный пример 7] Эффекты элиминации антигена из плазмы под действием антигенсвязывающих молекул, у которых активность связывания с FcγR превышала активность связывания Fc-области нативного мышиного IgG
(7-1) Эффект элиминации антигена под действием мышиных антител, обладающих повышенной активностью связывания с FcγR
Влияние антигенсвязывающей молекулы, содержащей Fc-область мышиного антитела и обладающей способностью связываться с человеческим рецептором IL-6 в зависимости от рН, на ускорение элиминации растворимого человеческого рецептора IL-6 из плазмы нормальных мышей, несущих мышиный FcRn, оценивали методом, описанным ниже.
(7-2) Получение мышиных антител, обладающих повышенной активностью связывания с FcγR
VH3-mIgG1 (SEQ ID NO: 25) и VL3-mk1 (SEQ ID NO: 26) получали в виде тяжелой цепи и легкой цепи, соответственно, мышиного антитела IgG1. способного связываться с человеческим IL-6 в зависимости от рН, методом, описанным в Сравнительном примере 1. Кроме того, для повышения активности связывания VH3-mIgG1 с мышиным FcγR получали антитело VH3-mIgG1-mF44 путем замены Ala на Asp в положении 327 в соответствии с Европейской нумерацией. Аналогичнным образом, VH3-mIgG1-mF46 получали путем замены Ser на Asp в положении 239 и замены Ala на Asp в положении 327 в соответствии с Европейской нумерацией в VH3-mIgG1. VH3-mIgG1, VH3-mIgG1-mF44 или VH3-mIgG1-mF46, содержащие VH3-mIgG1, VH3-mIgG1-mF44 или VH3-mIgG1-mF46, соответственно, в качестве тяжелой цепи, и VL3-mk1 в качестве легкой цепи, получали методом, описанным в Сравнительном примере 1.
(7-3) Подтверждение активности связывания с мышиным FcγR
VH3/L(WT)-mIgG1, VH3/L(WT)-mIgG1-mF44 или VH3/L(WT)-mIgG1-mF46, содержащие VH3-mIgG1, VH3-mIgG1-mF44 или VH3-mIgG1-mF46, соответственно, в качестве тяжелой цепи, и L(WT)-CK (SEQ ID NO: 27) в качестве легкой цепи, получали методом, описанным в Сравнительном примере 1. Активности связывания этих антител с мышиными FcγR оценивали методом, описанным в Сравнительном примере 2. Результаты представлены в таблице 22. Кроме того, в таблице 23 показано значительное увеличиние наблюдаемой активности связывания каждого варианта с мышиными FcγR по сравнению с активностью mIgG1 до введения модификации. В этой таблице, VH3/L(WT)-mIgG1, VH3/L(WT)-mIgG1-mF44 и VH3/L(WT)-mIgG1-mF46 обозначены mIgG1, mF44 и mF46, соответственно.
Таблица 22
Название варианта
KD (М)
mFcγRI
mFcγRIIb
mFcγRIII
mFcγRIV
mIgG1
Не детектировали
1,1Е-07
2,1Е-07
Не детектировали
mF44
Не детектировали
8,9Е-09
6,7Е-09
Не детектировали
mF46
Не детектировали
1,2Е-09
3,6Е-09
Не детектировали
Таблица 23
Название варианта
Отношение связывания с mIgG1
mFcγRI
mFcγRIIb
mFcγRIII
mFcγRIV
mIgG1
Не детектировали
1,0
1,0
Не детектировали
mF44
Не детектировали
11,9
31,0
Не детектировали
mF46
Не детектировали
91,4
57,5
Не детектировали
Результаты оценки, полученные в примере 4, показали, что вариант VH3/L(WT)-mIgG1, имеющий Fc-область нативного мышиного антитела IgG1, связывается только с мышиным FcγRIIb и с мышиным FcγRIII, но не с мышиным FcγRI и мышиным FcγRIV, что позволяет предположить, что мышиными FcγR, играющими важную роль в снижении концентрации антигена, являются мышиный FcγRII и/или мышиный FcγRIII. Считается, что VH3/L(WT)-mIgG1-mF44 и VH3/L(WT)-mIgG1-mF46, в которые была введена модификация для повышения FcγR-связывающей активности VH3/L(WT)-mIgG1, обладают повышенной активностью связывания с мышиным FcγRIIb и мышиным FcγRIII.
(7-4) Оценка эффекта снижения концентрации растворимого рецептора IL-6 в плазме нормальных мышей
Эффект элиминации растворимого рецептора IL-6 из плазмы нормальных мышей, которым вводили антитело против человеческого рецептора IL-6, а именно, Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44 или Fv4-mIgG1-mF46, оценивали как описано ниже.
В спинку нормальных мышей (мышей C57BL/6J, Charles River Japan), используемых в качестве моделей, у которых концентрация растворимого человеческого рецептора IL-6 в плазме поддерживалась на постоянном уровне, подкожно имплантировали инфузионный насос (миниосмотический нанос модели MODEL2004, alzet), содержащий растворимый человеческий рецептор IL-6. Затем, этим животным-моделям вводили антитела против человеческого рецептора IL-6 и оценивали фармакокинетику растворимого человеческого рецептора IL-6. Для снижения уровня продуцирования антител против растворимого человеческого рецептора IL-6, в хвостовую вену мышей сразу вводили моноклональные антитела против мышиного CD4 в дозе 20 мг/кг. После этого, в спинку мышей подкожно имплантировали инфузионный насос, содержащий 92,8 мкг/мл растворимого человеческого рецептора IL-6. Через три дня после имплантации инфузионного насоса, в хвостовую вену сразу вводили антитело против растворимого человеческого рецептора IL-6 в дозе 1 мг/кг. Затем у мышей брали кровь через 15 минут, 7 часов, 1 день, 2 дня, 4 дня, 7 дней, 14 дней (или 15 дней) и 21 день (или 22 дня) после введения антитела против человеческого рецептора IL-6. Взятую кровь сразу подвергали центрифугированию при 15000 об/мин в течение 15 минут при 4°C с получением плазмы. Выделенную плазму хранили в холодильнике при температуре -20°C или ниже до ее использования.
Концентрацию растворимого человеческого рецептора IL-6 в плазме и концентрации растворимого человеческого рецептора hsIL-6R в мышиной плазме определяли электрохемилюминесцентным методом. Пробы плазмы, содержащие 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5 и 31,25 пг/мл растворимого человеческого рецептора hsIL-6R и используемые для построения стандартной кривой, а также аналитические пробы мышиной плазмы с 50-кратным или более разведением смешивали с моноклональным антителом против человеческого IL-6R (R&D) и биотинилированным антителом против человеческого IL-6R (R&D), тоцилизумабом, к которому была присоединена метка, содержащая рутений и сульфо-NHS-эфир (Meso Scale Discovery). Смеси инкубировали при 37°C в течение ночи. Тоцилизумаб получали в конечной концентрации 333 мкг/мл. Затем реакционные смеси разделяли на аликвоты и помещали в планшет со стрептавидином MA400 PR (Meso Scale Discovery). Раствор, подвергнутый реакции при комнатной температуре в течение одного часа, промывали, добавляли буфер Read Buffer T (х 4) (Meso Scale Discovery), и разделяли на аликвоты. Затем сразу проводили измерения на ридере SECTOR PR 400 (Meso Scale Discovery). Концентрацию растворимого человеческого рецептора hsIL-6R определяли по стандартной кривой с помощью аналитической компьютерной программы SOFTmax PRO (Molecular Devices). Результаты представлены на фиг. 14.
Неожиданно было обнаружено, что у мышей, которым были введены модификации mF44 и mF46, способствующие повышению активности связывания mIgG1 (нативного мышиного IgG1) с мышиным FcγRIIb и мышиным FcγRIII, концентрация рецептора IL-6 в плазме значительно снижалась по сравнению с концентрацией этого рецептора у мышей, которым вводили mIgG1. В частности, даже на 21-й день после введения mF44, концентрация рецептора IL-6 в плазме у мышей в группе, которой вводили mF44, снижалась приблизительно в 6 раз по сравнению с концентрацией рецептора IL-6 в плазме у мышей в группе, которой не вводили антитело, и приблизительно в 10 раз по сравнению с концентрацией рецептора IL-6 в плазме у мышей в группе, которой вводили mIgG1. С другой стороны, даже на 7-й день после введения mF46, концентрация рецептора IL-6 в плазме у мышей в группе, которой вводили mF46, значительно снижалась, приблизительно в 30 раз, по сравнению с концентрацией рецептора IL-6 в плазме у мышей в группе, которой не вводили антитело, и приблизительно в 50 раз по сравнению с концентрацией рецептора IL-6 в плазме у мышей в группе, которой вводили mIgG1.
Вышеуказанные результаты показали, что элиминация растворимого рецептора IL-6 из плазмы также ускорялась у мышей, которым вводили антитела с повышенной активностью связывания антигенсвязывающей молекулы, имеющей Fc-области мышиного антитела IgG1, с мышиным FcγR, а также у мышей, которым вводили антитела с повышенной активностью связывания антигенсвязывающей молекулы, имеющей Fc-область человеческого антитела IgG1, с мышиным FcγR. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, авторы лишь отмечают, что наблюдаемый выше феномен можно объяснить следующим образом.
Антитела, которые связываются с растворимым антигеном в зависимости от рН, и которые обладают повышенной активностью связывания с FcγR, при их введении мышам, активно проникали, главным образом, в клетки, экспрессирующие FcγR на клеточной мембране. Иммобилизованные антитела диссоциировали растворимый антиген при кислотном рН в эндосому, а затем подвергались рециклингу в плазме посредством FcRn. Таким образом, фактором, который способствует элиминации растворимого антигена из плазмы посредством такого антитела, является FcγR-связывающая активность антитела. В частности, чем выше FcγR-связывающая активность, тем более эффективно происходит включение антитела в FcγR-экспрессирующие клетки, что способствует более быстрой элиминации раствормых антигенов из плазмы. Кроме того, при увеличении FcγR-связывающей активности, такой эффект может быть оценен тем же самым способом независимо от того, присутствует ли Fc-область в человеческом или в мышином антителе IgG1. В частности, такая оценка может быть проведена для Fc-области антитела животного любого вида, например, такого антитела, как человеческое IgG1, человеческое IgG2, человеческое IgG3, человеческое IgG4, мышиное IgG1, мышиное IgG2a, мышиное IgG2b, мышиное IgG3, крысиное IgG, обезьянье IgG и кроличье IgG, при условии, что активность связывания с FcγR животного любого вида, которому было введено это антитело, будет повышаться.
[Сравнительный пример 8] Эффект элиминации антигена под действием антител с повышенной способностью к селективному связыванию с FcγRIIb
(8-1) Эффект элиминации антигена под действием антител с повышенной способностью к селективному связыванию с FcγRIIb
У FcγRIII-дефицитных мышей (у мышей B6.129P2-FcgrR3tm1Sjv/J, Jackson Laboratories) экспрессировались мышиный FcγRI, мышиный FcγRIIb и мышиный FcγRIV, но не мышиный FcγRIII. С другой стороны, у мышей, дефицитных по γ-цепи Fc-рецептора (у мышей Fcer1g, Taconic, Cell (1994) 76, 519-529) экспрессировался только мышиный FcγRIIb, но не мышиные FcγRI, FcγRIIb и FcγRIV.
Как описано в Сравнительном примере 7, было продемонстрировано, что mF44 и mF46, обладающие повышенной активностью связывания с FcγR по сравнению с активностью нативного мышиного IgG1, обнаруживали повышенную селективность связывания с мышиным FcγRIIb и мышиным FcγRIII. Было высказано предположение, что с использованием антител с повышенной селективной активностью связывания, условие, при котором было введено антитело с повышенной селективной активностью связывания с мышиным FcγRIIb, может быть имитировано путем введения mF44 и mF46 мышам, которые являются дефицитными по мышиному FcγRIII или дефицитными по γ-цепи Fc-рецептора, и у которых не экспрессируется мышиный FcγRIII.
(8-2) Оценка эффекта элиминации антигена, достигаемого путем селективного повышения активности связывания с мышиным FcγRIIb у мышей, дефицитных по FcγRIII
Эффект элиминации растворимого рецептора IL-6 из плазмы у FcγRIII-дефицитных мышей, которым вводили антитело против человеческого рецептора IL-6, а именно, антитело Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44 или Fv4-mIgG1-mF46, оценивали методом, описанным в примере 5. Концентрации растворимого человеческого рецептора IL-6 в плазме мышей определяли методом, описанным выше в Сравнительном примере (7-4). Результаты представлены на фиг. 15.
Неожиданно было обнаружено, что концентрации рецептора IL-6 в плазме у FcγRIII-дефицитных мышей, которым вводили mF44 и mF46, в условиях, имитирующих селективное увеличение активности связывания мышиного FcγRIIb с mIgG1 (нативным мышиным IgG1), значительно снижались по сравнению с концентрацией рецептора IL-6 в плазме у мышей, которым вводили mIgG1. В частности, концентрация рецептора IL-6 в плазме у мышей в группе, которой вводили mF44, снижалась приблизительно в три раза по сравнению с концентрацией рецептора IL-6 у мышей в группе, которой вводили mIgG1, и аккумуляция концентрации антигена снижалась благодаря введению антитела. С другой стороны, на третий день после введения, концентрация рецептора IL-6 в плазме у мышей в группе, которой вводили mF46, значительно снижалась, то есть, приблизительно в шесть раз по сравнению с концентрацией рецептора IL-6 в плазме у мышей в группе, которой не вводили антитело, и приблизительно в 25 раз по сравнению с концентрацией рецептора IL-6 в плазме у мышей в группе, которой вводили mIgG1. Полученный результат показал, что по мере увеличения активности связывания антитела против человеческого рецептора IL-6 с мышиным FcγRIIb в зависимости от рН, концентрация рецептора IL-6 в плазме у мышей, которым вводили антитело, может снижаться еще больше.
(8-3) Оценка эффекта элиминации антигена, достигаемого путем селективного повышения активности связывания с мышиным FcγRIIb у мышей, дефицитных по γ-цепи Fc-рецептора
Эффект элиминации растворимого рецептора IL-6 из плазмы у мышей, дефицитных по γ-цепи Fc-рецептора, которым вводили антитело против человеческого рецептора IL-6, а именно, антитело Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44 или Fv4-mIgG1-mF46, оценивали методом, описанным в примере 6. Концентрации растворимого человеческого рецептора IL-6 в плазме мышей определяли методом, описанным выше в Сравнительном примере (7-4). Результаты представлены на фиг. 16.
Как и в случае введения mF44 и mF46 FcγRIII-дефицитным мышам, концентрация рецептора IL-6 в плазме у мышей, дефицитных по γ-цепи Fc-рецептора, которым вводили mF44 и mF46 в условиях, имитирующих селективное увеличение активности связывания мышиного FcγRIIb с mIgG1 (нативным мышиным IgG1), значительно снижались по сравнению с концентрацией рецептора IL-6 в плазме у мышей, дефицитных по γ-цепи Fc-рецептора, которым вводили mIgG1. В частности, концентрация рецептора IL-6 в плазме у мышей в группе, которой вводили mF44, снижалась приблизительно в три раза по сравнению с концентрацией рецептора IL-6 у мышей в группе, которой вводили mIgG1, и аккумуляция концентрации антигена снижалась благодаря введению антитела. С другой стороны, на третий день после введения, концентрация рецептора IL-6 в плазме у мышей в группе, которой вводили mF46, значительно снижалась, то есть, приблизительно в пять раз по сравнению с концентрацией рецептора IL-6 в плазме у мышей в группе, которой не вводили антитело, и приблизительно в 15 раз по сравнению с концентрацией рецептора IL-6 в плазме у мышей в группе, которой вводили mIgG1.
Результаты, описанные в Сравнительных примерах (8-2) и (8-3), показали, что концентрация растворимого антигена в плазме значительно снижалась у мышей в группе, которой вводили антитело, связывающееся с растворимым антигеном в зависимости от рН и обладающее повышенной способностью селективно связываться с мышиным FcγRIIb.
[Сравнительный пример 9] Эффект элиминации антигена под действием антител, обладающих повышенной способностью селективно связываться с FcγRIII
(9-1) Эффект элиминации антигена под действием антител с повышенной способностью к селективному связыванию с FcγRIII
У FcγRIIb-дефицитных мышей (у мышей Fcgr2b (FcγRII), Taconic) (Nature (1996) 379 (6563), 346-349) экспрессировались мышиный FcγRI, мышиный FcγRIII и мышиный FcγRIV, но не мышиный FcγRIIb. Как описано в примере 5, было продемонстрировано, что mF44 и mF46, обладающие повышенной активностью связывания с FcγR по сравнению с активностью нативного мышиного IgG1, обнаруживали повышенную селективность связывания с мышиным FcγRIIb и мышиным FcγRIII. Было высказано предположение, что с использованием антител с повышенной селективной активностью связывания, условие, при котором было введено антитело с повышенной селективной активностью связывания с мышиным FcγRIIb, может быть имитировано путем введения mF44 и mF46 мышам, которые являются дефицитными по мышиному FcγRIIb, и у которых не экспрессируется мышиный FcγRIIb.
Как описано в Сравнительном примере 8, концентрация растворимого антигена в плазме у FcγRIII-дефицитных мышей была снижена, и введение антитела с повышенной селективной активностью связывания с мышиным FcγRIIb имитировало условия, при которых наблюдалось такое снижение. С другой стороны, снижение концентрации растворимого антигена в плазме у FcγRIIb-дефицитных мышей оценивали в описанном ниже тесте, который проводили в условиях, имитирующих такое снижение, то есть, при введении антитела с повышенной селективной активностью связывания с мышиным FcγRIII.
(9-2) Оценка эффекта элиминации антигена, достигаемого путем селективного повышения активности связывания с мышиным FcγRIII у FcγRIIb-дефицитных мышей
Эффект элиминации растворимого рецептора IL-6 из плазмы у FcγRIIb-дефицитных мышей, которым вводили антитело против человеческого рецептора IL-6, а именно, антитело Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44 или Fv4-mIgG1-mF46, оценивали методом, описанным в примере 5. Концентрации растворимого человеческого рецептора IL-6 в плазме мышей определяли методом, описанным выше в Сравнительном примере (7-4). Результаты представлены на фиг. 17.
Неожиданно было обнаружено, что у мышей в группе, которой вводили mF44 и mF46, что имитировало условия селективного повышения активности связывания mIgG1 (нативного мышиного IgG1) с мышиным FcγRIII, концентрация рецептора IL-6 в плазме снижалась, но какого-либо заметного снижения по сравнению со снижением, наблюдаемым в Сравнительном примере 8, не подтверждалось.
Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, авторы лишь отмечают, что результаты, описанные в Сравнительных примерах 7, 8 и 9, могут послужить поводом для дальнейших обсуждений. Было обнаружено, что элиминация растворимого рецептора IL-6 из плазмы значительно ускорялась у нормальных мышей, у которых экспрессировались мышиный FcγRIIb и мышиный FcγRIII, и которым вводили mF44 и mF46, обладащие такой же повышенной селективной активностью связывания с мышиным FcγRIIb и с мышиным FcγRIII, как mIgG1 (нативный мышиный IgG1). Кроме того, было обнаружено, что при введении mF44 и mF46 мышам, у которых экспрессируется мышиный FcγRIIb, но не мышиный FcγRIII (то есть, FcγRIII-дефицитным мышам и мышам, дефицитным по γ-цепи Fc-рецептора), элиминация растворимого рецептора IL-6 из плазмы у этих мышей также значительно ускорялась. С другой стороны, при введении mF44 и mF46 мышам, у которых экспрессируется мышиный FcγRIII, но не мышиный FcγRIIb (то есть, FcγRII-дефицитным мышам), заметного ускорения элиминации растворимого рецептора IL-6 из плазмы у этих мышей не наблюдалось.
Исходя из полученных результатов можно сделать вывод, что антитела mF44 и mF46, имеющие такую же повышенную активность связывания с мышиным FcγRIIb и мышиным FcγRIII, как и mIgG1 (нативный мышиный IgG1), поглощались FcγR-экспрессирующими клетками, главным образом, под действием мышиного FcγRIIb, что приводило к элиминации растворимого антигена, связанного с антителами, из плазмы. С другой стороны, предполагается, что FcγRIII-опосредуемое поглощение комплексов «антитело/антиген» FcγR-экспрессирующими клетками не вносит значительного вклада в элиминацию растворимого антигена из плазмы.
Кроме того, концентрация растворимого рецептора IL-6 в плазме значительно снижалась у мышей, которым вводили антитело Fv4-IgG1-F1087 (тяжелая цепь, SEQ ID NO: 28, легкая цепь, SEQ ID NO: 29), обладающее повышенной активностью связывания с мышиным FcγRIIb и с мышиным FcγRIII. С другой стороны, было подтверждено, что эффект элиминации растворимого рецептора IL-6 из плазмы у мышей, которым вводили антитело Fv4-IgG1-F1182, обладающее повышенной активностью связывания с мышиным FcγRI и с мышиным FcγRIV, был менее заметным, чем в случае введения антитела Fv4-IgG1-F1087.
Антитело Fv4-IgG1-Fuc (продуцированное путем экспрессии Fv4-IgG1 (тяжелая цепь, SEQ ID NO: 30, легкая цепь SEQ ID NO: 29) в клетках СНО, не содержащих гена-переносчика фукозы (WO2006/067913) и используемых в качестве клеток-хозяев) обладало довольно высокой активностью связывания с мышиным FcγRIV, поскольку оно имеет низкое содержание сахарных цепей фукозного типа (Science (2005) 310 (5753) 1510-1512). Хотя концентрация растворимого рецептора IL-6 в плазме у мышей, которым вводили Fv4-IgG1-Fuc, снижалась по сравнению с концентрацией растворимого рецептора IL-6 у мышей, которым вводили Fv4-IgG1, однако, такой эффект снижения был приблизительно в два раза более низким, то есть, было подтверждено, что такое снижение было незначительным. Следовательно, поглощение антител FcγR-экспрессирующими клетками под действием мышиного FcγRIV не вносит значительного вклада в элиминацию растворимых антигенов из плазмы.
Исходя из вышесказанного можно сделать вывод, что из нескольких мышиных FcγR, важную роль в поглощении антитела FcγR-экспрессирующими клетками мышей играет мышиный FcγRIIb. Таким образом, можно предположить, что мутациями, вводимыми в домен, связывающийся с мышиным FcγR, предпочтительно, являются, но не ограничиваются ими, мутации, повышающие активность связывания с мышиным FcγRIIb.
Настоящее исследование показало, что введение антигенсвязывающей молекулы, которая связывается с растворимым антигеном в зависимости от рН и обладает повышенной активностью связывания с FcγR, может ускорять элиминацию растворимого антигена из плазмы в организме, в который было введено антитело. Было показано, что такая элиминация растворимых антигенов из плазмы под действием FcγR наблюдается, главным образом, в случае использования FcγRIIb, принадлежащего к семейству мышиных FcγR. Более конкретно, для ускорения элиминации растворимых антигенов из плазмы посредством взаимодействия FcγR с комплексом «антитело - антиген», особенно важную роль среди FcγR играет FcγRIIb, при условии, что, при этом, будет сохраняться активность связывания с FcγRIIb, то есть, будет сохраняться эффект элиминации. В соответствии с этим, было обнаружено, что при in vivo введении антигенсвязывающей молекулы, которая связывается с растворимыми антигенами в зависимости от рН и обладает повышенной активностью связывания с FcγRIIb, можно ускорить элиминацию растворимых антигенов из плазмы в целях эффективного снижения концентрации растворимых антигенов в плазме, и совершенно очевидно, что такое свойство является очень эффективным средством для достижения этой цели.
Промышленное применение
Настоящее изобретение относится к вариантам Fc-области, которые обладают пониженной активностью связывания со всеми активирующими FcγR, а в частности, с FcγRIIа (R-типа), но сохраняют активность связывания с FcγRIIb, в отличие от полипептида, содержащего нативную Fc-область IgG, а также к полипептидам, содержащим такие варианты Fc-области. Применение указанных полипептидов позволяет осуществлять передачу сигналов, ингибирующих воспалительный иммунный ответ, опосредуемый фосфорилированием ITIM FcγRIIb. Кроме того, в результате сообщения Fc-части антитела способности селективно связываться с FcγRIIb можно ингибировать продуцирование антиантитела благодаря FcγRIIb-опосредуемому иммуносупрессорному действию.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA
<120>  Вариант Fc-области
<130>  C1-A1302P
<150>  JP 2013-077239
<151>  2013-04-02
<160>  52
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  447
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35                  40                  45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Asp
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Ser
245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420                 425                 430
Ala Leu His Tyr His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
<210>  2
<211>  447
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  2
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35                  40                  45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Asp
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
<210>  3
<211>  447
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  3
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35                  40                  45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
<210>  4
<211>  447
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  4
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35                  40                  45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
<210>  5
<211>  447
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  5
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35                  40                  45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Asp Asp
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Glu Asp
260                 265                 270
Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
<210>  6
<211>  214
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  7
<211>  218
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  7
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20                  25                  30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His
85                  90                  95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100                 105                 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115                 120                 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145                 150                 155                 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165                 170                 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180                 185                 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195                 200                 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  8
<211>  446
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Ser Asp Gly Arg Asn Asp Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210                 215                 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225                 230                 235                 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245                 250                 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260                 265                 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275                 280                 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290                 295                 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305                 310                 315                 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325                 330                 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340                 345                 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355                 360                 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370                 375                 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385                 390                 395                 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405                 410                 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420                 425                 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
<210>  9
<211>  218
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  9
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser
20                  25                  30
Thr Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Val Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85                  90                  95
Glu Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100                 105                 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115                 120                 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145                 150                 155                 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165                 170                 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180                 185                 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195                 200                 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  10
<211>  443
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  10
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1               5                   10                  15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr His
20                  25                  30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35                  40                  45
Val Ile Asn Ser Ala Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50                  55                  60
Arg Phe Thr Val Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Asn Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Val
85                  90                  95
Phe Ser Ser Gly Ser His Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115                 120                 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130                 135                 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145                 150                 155                 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165                 170                 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180                 185                 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195                 200                 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210                 215                 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290                 295                 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325                 330                 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340                 345                 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405                 410                 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440
<210>  11
<211>  217
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  11
Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Glu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Gly Thr Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ile Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Glu Cys
65                  70                  75                  80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Glu Asp Asn
85                  90                  95
Ile Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg Thr
100                 105                 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115                 120                 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130                 135                 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165                 170                 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180                 185                 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195                 200                 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  12
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  12
Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro Lys Asp Asn
1               5                   10                  15
Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn Val His Ser Pro Leu Lys
20                  25                  30
<210>  13
<211>  543
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Gln Ser Pro Ser Val Phe Pro Leu Thr Arg
115                 120                 125
Cys Cys Lys Asn Ile Pro Ser Asn Ala Thr Ser Val Thr Leu Gly Cys
130                 135                 140
Leu Ala Thr Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Met Val Thr Trp Asp Thr
145                 150                 155                 160
Gly Ser Leu Asn Gly Thr Thr Met Thr Leu Pro Ala Thr Thr Leu Thr
165                 170                 175
Leu Ser Gly His Tyr Ala Thr Ile Ser Leu Leu Thr Val Ser Gly Ala
180                 185                 190
Trp Ala Lys Gln Met Phe Thr Cys Arg Val Ala His Thr Pro Ser Ser
195                 200                 205
Thr Asp Trp Val Asp Asn Lys Thr Phe Ser Val Cys Ser Arg Asp Phe
210                 215                 220
Thr Pro Pro Thr Val Lys Ile Leu Gln Ser Ser Cys Asp Gly Gly Gly
225                 230                 235                 240
His Phe Pro Pro Thr Ile Gln Leu Leu Cys Leu Val Ser Gly Tyr Thr
245                 250                 255
Pro Gly Thr Ile Asn Ile Thr Trp Leu Glu Asp Gly Gln Val Met Asp
260                 265                 270
Val Asp Leu Ser Thr Ala Ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu Ala Ser
275                 280                 285
Thr Gln Ser Glu Leu Thr Leu Ser Gln Lys His Trp Leu Ser Asp Arg
290                 295                 300
Thr Tyr Thr Cys Gln Val Thr Tyr Gln Gly His Thr Phe Glu Asp Ser
305                 310                 315                 320
Thr Lys Lys Cys Ala Asp Ser Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu
325                 330                 335
Ser Arg Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile
340                 345                 350
Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu
355                 360                 365
Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys
370                 375                 380
Glu Glu Lys Gln Arg Asn Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro
385                 390                 395                 400
Val Gly Thr Arg Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val
405                 410                 415
Thr His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr
420                 425                 430
Ser Gly Pro Arg Ala Ala Pro Glu Val Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu
435                 440                 445
Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu Ala Cys Leu Ile Gln Asn
450                 455                 460
Phe Met Pro Glu Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu His Asn Glu Val Gln
465                 470                 475                 480
Leu Pro Asp Ala Arg His Ser Thr Thr Gln Pro Arg Lys Thr Lys Gly
485                 490                 495
Ser Gly Phe Phe Val Phe Ser Arg Leu Glu Val Thr Arg Ala Glu Trp
500                 505                 510
Glu Gln Lys Asp Glu Phe Ile Cys Arg Ala Val His Glu Ala Ala Ser
515                 520                 525
Pro Ser Gln Thr Val Gln Arg Ala Val Ser Val Asn Pro Gly Lys
530                 535                 540
<210>  14
<211>  219
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  14
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20                  25                  30
Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn
85                  90                  95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  15
<211>  543
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Gln Ser Pro Ser Val Phe Pro Leu Thr Arg
115                 120                 125
Cys Cys Lys Asn Ile Pro Ser Asp Ala Thr Ser Val Thr Leu Gly Cys
130                 135                 140
Leu Ala Thr Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Met Val Thr Trp Asp Thr
145                 150                 155                 160
Gly Ser Leu Asp Gly Thr Thr Met Thr Leu Pro Ala Thr Thr Leu Thr
165                 170                 175
Leu Ser Gly His Tyr Ala Thr Ile Ser Leu Leu Thr Val Ser Gly Ala
180                 185                 190
Trp Ala Lys Gln Met Phe Thr Cys Arg Val Ala His Thr Pro Ser Ser
195                 200                 205
Thr Asp Trp Val Asp Asp Lys Thr Phe Ser Val Cys Ser Arg Asp Phe
210                 215                 220
Thr Pro Pro Thr Val Lys Ile Leu Gln Ser Ser Cys Asp Gly Gly Gly
225                 230                 235                 240
His Phe Pro Pro Thr Ile Gln Leu Leu Cys Leu Val Ser Gly Tyr Thr
245                 250                 255
Pro Gly Thr Ile Asp Ile Thr Trp Leu Glu Asp Gly Gln Val Met Asp
260                 265                 270
Val Asp Leu Ser Thr Ala Ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu Ala Ser
275                 280                 285
Thr Gln Ser Glu Leu Thr Leu Ser Gln Lys His Trp Leu Ser Asp Arg
290                 295                 300
Thr Tyr Thr Cys Gln Val Thr Tyr Gln Gly His Thr Phe Glu Asp Ser
305                 310                 315                 320
Thr Lys Lys Cys Ala Asp Ser Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu
325                 330                 335
Ser Arg Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile
340                 345                 350
Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val Asp Leu
355                 360                 365
Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asp His Ser Thr Arg Lys
370                 375                 380
Glu Glu Lys Gln Arg Asn Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro
385                 390                 395                 400
Val Gly Thr Arg Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val
405                 410                 415
Thr His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr
420                 425                 430
Ser Gly Pro Arg Ala Ala Pro Glu Val Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu
435                 440                 445
Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu Ala Cys Leu Ile Gln Asn
450                 455                 460
Phe Met Pro Glu Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu His Asn Glu Val Gln
465                 470                 475                 480
Leu Pro Asp Ala Arg His Ser Thr Thr Gln Pro Arg Lys Thr Lys Gly
485                 490                 495
Ser Gly Phe Phe Val Phe Ser Arg Leu Glu Val Thr Arg Ala Glu Trp
500                 505                 510
Glu Gln Lys Asp Glu Phe Ile Cys Arg Ala Val His Glu Ala Ala Ser
515                 520                 525
Pro Ser Gln Thr Val Gln Arg Ala Val Ser Val Asn Pro Gly Lys
530                 535                 540
<210>  16
<211>  545
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  16
Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser
1               5                   10                  15
Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro
20                  25                  30
Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys
35                  40                  45
Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn
50                  55                  60
Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile
65                  70                  75                  80
Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg
85                  90                  95
His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser
100                 105                 110
Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val
115                 120                 125
Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn
130                 135                 140
Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn
145                 150                 155                 160
Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly
165                 170                 175
Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met
180                 185                 190
Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala
195                 200                 205
Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe
210                 215                 220
Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr
225                 230                 235                 240
Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val
245                 250                 255
Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp
260                 265                 270
Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg
275                 280                 285
Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His
290                 295                 300
Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr
305                 310                 315                 320
Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala
325                 330                 335
Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala
340                 345                 350
His Val Glu His Glu Glu Thr Leu Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile
355                 360                 365
Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr
370                 375                 380
Ile Cys Ser His Ser Pro Val Ala Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn
385                 390                 395                 400
Gly Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly
405                 410                 415
Met Lys Asn Gln Phe Asn Leu His Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu
420                 425                 430
Pro Val Val Ser Gln Ile Ile Asp Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu
435                 440                 445
Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu
450                 455                 460
Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ala Gly Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu
465                 470                 475                 480
Cys Ile Gly Gly Ala Gly Asp Gly Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu
485                 490                 495
Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro
500                 505                 510
Gly Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe
515                 520                 525
His Asn Leu Gly Asn Val His Ser Pro Leu Lys His His His His His
530                 535                 540
His
545
<210>  17
<211>  119
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  17
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35                  40                  45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  18
<211>  449
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20                  25                  30
Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35                  40                  45
Val Ala Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His Trp His Phe Ala Val Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115                 120                 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130                 135                 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180                 185                 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195                 200                 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210                 215                 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225                 230                 235                 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245                 250                 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260                 265                 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275                 280                 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290                 295                 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305                 310                 315                 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325                 330                 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340                 345                 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355                 360                 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370                 375                 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385                 390                 395                 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405                 410                 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420                 425                 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435                 440                 445
Pro
<210>  19
<211>  464
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  19
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ser Leu Cys Ser Thr Gln Pro Asp Gly Asn Val Val Ile Ala
130                 135                 140
Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp
145                 150                 155                 160
Ser Glu Ser Gly Gln Gly Val Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln
165                 170                 175
Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro
180                 185                 190
Ala Thr Gln Cys Leu Ala Gly Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His
195                 200                 205
Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Ser
210                 215                 220
Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser
225                 230                 235                 240
Cys Cys His Pro Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu
245                 250                 255
Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg
260                 265                 270
Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser
275                 280                 285
Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val
290                 295                 300
Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr
305                 310                 315                 320
Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr Pro Glu Ser Lys Thr Pro Leu Thr Ala
325                 330                 335
Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu
340                 345                 350
Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr
355                 360                 365
Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu
370                 375                 380
Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser
385                 390                 395                 400
Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile
405                 410                 415
Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys
420                 425                 430
Met Val Gly His Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile
435                 440                 445
Asp Arg Leu Ala Gly Lys Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
450                 455                 460
<210>  20
<211>  214
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  21
<211>  450
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  21
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Val Ala Pro Gly Asn Trp Gly Ser Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115                 120                 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130                 135                 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145                 150                 155                 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165                 170                 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180                 185                 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195                 200                 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210                 215                 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225                 230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245                 250                 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260                 265                 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275                 280                 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290                 295                 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305                 310                 315                 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325                 330                 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340                 345                 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355                 360                 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370                 375                 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385                 390                 395                 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405                 410                 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420                 425                 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435                 440                 445
Ser Pro
450
<210>  22
<211>  214
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Glu Asp Asp
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Glu Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Asp Ser Ser Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  23
<211>  451
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Pro Arg Trp Glu Thr Ala Ile Ser Ser Asp Ala Phe Asp Ile
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115                 120                 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130                 135                 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145                 150                 155                 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165                 170                 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180                 185                 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195                 200                 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210                 215                 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225                 230                 235                 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245                 250                 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260                 265                 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275                 280                 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290                 295                 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305                 310                 315                 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325                 330                 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340                 345                 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355                 360                 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370                 375                 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385                 390                 395                 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405                 410                 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420                 425                 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435                 440                 445
Leu Ser Pro
450
<210>  24
<211>  214
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Asp
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Glu Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ser Ser Ser Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  25
<211>  443
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  25
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35                  40                  45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
195                 200                 205
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys
210                 215                 220
Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro
225                 230                 235                 240
Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr
245                 250                 255
Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser
260                 265                 270
Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg
275                 280                 285
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile
290                 295                 300
Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn
305                 310                 315                 320
Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
325                 330                 335
Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu
340                 345                 350
Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe
355                 360                 365
Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala
370                 375                 380
Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr
385                 390                 395                 400
Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly
405                 410                 415
Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His
420                 425                 430
Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435                 440
<210>  26
<211>  214
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Thr Asp Ile Ser Ser His
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Gly Ser His Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly Asn Arg Leu Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Glu Arg Ala Asp Ala Ala
100                 105                 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115                 120                 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130                 135                 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145                 150                 155                 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180                 185                 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210>  27
<211>  214
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  28
<211>  447
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  28
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35                  40                  45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Tyr Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
<210>  29
<211>  214
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Thr Asp Ile Ser Ser His
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Gly Ser His Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly Asn Arg Leu Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Glu Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  30
<211>  447
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  30
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35                  40                  45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
<210>  31
<211>  330
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  31
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225                 230                 235                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325                 330
<210>  32
<211>  326
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  32
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100                 105                 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115                 120                 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130                 135                 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165                 170                 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180                 185                 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195                 200                 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210                 215                 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225                 230                 235                 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245                 250                 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260                 265                 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275                 280                 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290                 295                 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305                 310                 315                 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210>  33
<211>  377
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  33
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
100                 105                 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
115                 120                 125
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys
130                 135                 140
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
145                 150                 155                 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165                 170                 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180                 185                 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
195                 200                 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210                 215                 220
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225                 230                 235                 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245                 250                 255
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
260                 265                 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
275                 280                 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290                 295                 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305                 310                 315                 320
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325                 330                 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
340                 345                 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
355                 360                 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370                 375
<210>  34
<211>  327
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  34
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210>  35
<211>  1125
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  35
atgtggttct tgacaactct gctcctttgg gttccagttg atgggcaagt ggacaccaca       60
aaggcagtga tcactttgca gcctccatgg gtcagcgtgt tccaagagga aaccgtaacc      120
ttgcactgtg aggtgctcca tctgcctggg agcagctcta cacagtggtt tctcaatggc      180
acagccactc agacctcgac ccccagctac agaatcacct ctgccagtgt caatgacagt      240
ggtgaataca ggtgccagag aggtctctca gggcgaagtg accccataca gctggaaatc      300
cacagaggct ggctactact gcaggtctcc agcagagtct tcacggaagg agaacctctg      360
gccttgaggt gtcatgcgtg gaaggataag ctggtgtaca atgtgcttta ctatcgaaat      420
ggcaaagcct ttaagttttt ccactggaat tctaacctca ccattctgaa aaccaacata      480
agtcacaatg gcacctacca ttgctcaggc atgggaaagc atcgctacac atcagcagga      540
atatctgtca ctgtgaaaga gctatttcca gctccagtgc tgaatgcatc tgtgacatcc      600
ccactcctgg aggggaatct ggtcaccctg agctgtgaaa caaagttgct cttgcagagg      660
cctggtttgc agctttactt ctccttctac atgggcagca agaccctgcg aggcaggaac      720
acatcctctg aataccaaat actaactgct agaagagaag actctgggtt atactggtgc      780
gaggctgcca cagaggatgg aaatgtcctt aagcgcagcc ctgagttgga gcttcaagtg      840
cttggcctcc agttaccaac tcctgtctgg tttcatgtcc ttttctatct ggcagtggga      900
ataatgtttt tagtgaacac tgttctctgg gtgacaatac gtaaagaact gaaaagaaag      960
aaaaagtggg atttagaaat ctctttggat tctggtcatg agaagaaggt aatttccagc     1020
cttcaagaag acagacattt agaagaagag ctgaaatgtc aggaacaaaa agaagaacag     1080
ctgcaggaag gggtgcaccg gaaggagccc cagggggcca cgtag                     1125
<210>  36
<211>  374
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  36
Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln
1               5                   10                  15
Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser
20                  25                  30
Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu
35                  40                  45
Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln
50                  55                  60
Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser
65                  70                  75                  80
Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile
85                  90                  95
Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg
100                 105                 110
Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys
115                 120                 125
Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe
130                 135                 140
Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile
145                 150                 155                 160
Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr
165                 170                 175
Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro
180                 185                 190
Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val
195                 200                 205
Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln
210                 215                 220
Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn
225                 230                 235                 240
Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly
245                 250                 255
Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg
260                 265                 270
Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Gln Leu Pro Thr Pro
275                 280                 285
Val Trp Phe His Val Leu Phe Tyr Leu Ala Val Gly Ile Met Phe Leu
290                 295                 300
Val Asn Thr Val Leu Trp Val Thr Ile Arg Lys Glu Leu Lys Arg Lys
305                 310                 315                 320
Lys Lys Trp Asp Leu Glu Ile Ser Leu Asp Ser Gly His Glu Lys Lys
325                 330                 335
Val Ile Ser Ser Leu Gln Glu Asp Arg His Leu Glu Glu Glu Leu Lys
340                 345                 350
Cys Gln Glu Gln Lys Glu Glu Gln Leu Gln Glu Gly Val His Arg Lys
355                 360                 365
Glu Pro Gln Gly Ala Thr
370
<210>  37
<211>  951
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  37
atgactatgg agacccaaat gtctcagaat gtatgtccca gaaacctgtg gctgcttcaa       60
ccattgacag ttttgctgct gctggcttct gcagacagtc aagctgctcc cccaaaggct      120
gtgctgaaac ttgagccccc gtggatcaac gtgctccagg aggactctgt gactctgaca      180
tgccaggggg ctcgcagccc tgagagcgac tccattcagt ggttccacaa tgggaatctc      240
attcccaccc acacgcagcc cagctacagg ttcaaggcca acaacaatga cagcggggag      300
tacacgtgcc agactggcca gaccagcctc agcgaccctg tgcatctgac tgtgctttcc      360
gaatggctgg tgctccagac ccctcacctg gagttccagg agggagaaac catcatgctg      420
aggtgccaca gctggaagga caagcctctg gtcaaggtca cattcttcca gaatggaaaa      480
tcccagaaat tctcccattt ggatcccacc ttctccatcc cacaagcaaa ccacagtcac      540
agtggtgatt accactgcac aggaaacata ggctacacgc tgttctcatc caagcctgtg      600
accatcactg tccaagtgcc cagcatgggc agctcttcac caatgggggt cattgtggct      660
gtggtcattg cgactgctgt agcagccatt gttgctgctg tagtggcctt gatctactgc      720
aggaaaaagc ggatttcagc caattccact gatcctgtga aggctgccca atttgagcca      780
cctggacgtc aaatgattgc catcagaaag agacaacttg aagaaaccaa caatgactat      840
gaaacagctg acggcggcta catgactctg aaccccaggg cacctactga cgatgataaa      900
aacatctacc tgactcttcc tcccaacgac catgtcaaca gtaataacta a               951
<210>  38
<211>  316
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  38
Met Thr Met Glu Thr Gln Met Ser Gln Asn Val Cys Pro Arg Asn Leu
1               5                   10                  15
Trp Leu Leu Gln Pro Leu Thr Val Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala Asp
20                  25                  30
Ser Gln Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp
35                  40                  45
Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly Ala
50                  55                  60
Arg Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu
65                  70                  75                  80
Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn
85                  90                  95
Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp
100                 105                 110
Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro
115                 120                 125
His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser
130                 135                 140
Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys
145                 150                 155                 160
Ser Gln Lys Phe Ser His Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala
165                 170                 175
Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr
180                 185                 190
Thr Leu Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro Ser
195                 200                 205
Met Gly Ser Ser Ser Pro Met Gly Val Ile Val Ala Val Val Ile Ala
210                 215                 220
Thr Ala Val Ala Ala Ile Val Ala Ala Val Val Ala Leu Ile Tyr Cys
225                 230                 235                 240
Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Asn Ser Thr Asp Pro Val Lys Ala Ala
245                 250                 255
Gln Phe Glu Pro Pro Gly Arg Gln Met Ile Ala Ile Arg Lys Arg Gln
260                 265                 270
Leu Glu Glu Thr Asn Asn Asp Tyr Glu Thr Ala Asp Gly Gly Tyr Met
275                 280                 285
Thr Leu Asn Pro Arg Ala Pro Thr Asp Asp Asp Lys Asn Ile Tyr Leu
290                 295                 300
Thr Leu Pro Pro Asn Asp His Val Asn Ser Asn Asn
305                 310                 315
<210>  39
<211>  876
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  39
atgggaatcc tgtcattctt acctgtcctt gccactgaga gtgactgggc tgactgcaag       60
tccccccagc cttggggtca tatgcttctg tggacagctg tgctattcct ggctcctgtt      120
gctgggacac ctgcagctcc cccaaaggct gtgctgaaac tcgagcccca gtggatcaac      180
gtgctccagg aggactctgt gactctgaca tgccggggga ctcacagccc tgagagcgac      240
tccattcagt ggttccacaa tgggaatctc attcccaccc acacgcagcc cagctacagg      300
ttcaaggcca acaacaatga cagcggggag tacacgtgcc agactggcca gaccagcctc      360
agcgaccctg tgcatctgac tgtgctttct gagtggctgg tgctccagac ccctcacctg      420
gagttccagg agggagaaac catcgtgctg aggtgccaca gctggaagga caagcctctg      480
gtcaaggtca cattcttcca gaatggaaaa tccaagaaat tttcccgttc ggatcccaac      540
ttctccatcc cacaagcaaa ccacagtcac agtggtgatt accactgcac aggaaacata      600
ggctacacgc tgtactcatc caagcctgtg accatcactg tccaagctcc cagctcttca      660
ccgatgggga tcattgtggc tgtggtcact gggattgctg tagcggccat tgttgctgct      720
gtagtggcct tgatctactg caggaaaaag cggatttcag ccaatcccac taatcctgat      780
gaggctgaca aagttggggc tgagaacaca atcacctatt cacttctcat gcacccggat      840
gctctggaag agcctgatga ccagaaccgt atttag                                876
<210>  40
<211>  291
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  40
Met Gly Ile Leu Ser Phe Leu Pro Val Leu Ala Thr Glu Ser Asp Trp
1               5                   10                  15
Ala Asp Cys Lys Ser Pro Gln Pro Trp Gly His Met Leu Leu Trp Thr
20                  25                  30
Ala Val Leu Phe Leu Ala Pro Val Ala Gly Thr Pro Ala Ala Pro Pro
35                  40                  45
Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Gln Trp Ile Asn Val Leu Gln Glu
50                  55                  60
Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg Gly Thr His Ser Pro Glu Ser Asp
65                  70                  75                  80
Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr His Thr Gln
85                  90                  95
Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr
100                 105                 110
Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His Leu Thr Val
115                 120                 125
Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu Phe Gln Glu
130                 135                 140
Gly Glu Thr Ile Val Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu
145                 150                 155                 160
Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Lys Lys Phe Ser Arg
165                 170                 175
Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser His Ser Gly
180                 185                 190
Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu Tyr Ser Ser Lys
195                 200                 205
Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Ala Pro Ser Ser Ser Pro Met Gly Ile
210                 215                 220
Ile Val Ala Val Val Thr Gly Ile Ala Val Ala Ala Ile Val Ala Ala
225                 230                 235                 240
Val Val Ala Leu Ile Tyr Cys Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Asn Pro
245                 250                 255
Thr Asn Pro Asp Glu Ala Asp Lys Val Gly Ala Glu Asn Thr Ile Thr
260                 265                 270
Tyr Ser Leu Leu Met His Pro Asp Ala Leu Glu Glu Pro Asp Asp Gln
275                 280                 285
Asn Arg Ile
290
<210>  41
<211>  765
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  41
atgtggcagc tgctcctccc aactgctctg ctacttctag tttcagctgg catgcggact       60
gaagatctcc caaaggctgt ggtgttcctg gagcctcaat ggtacagggt gctcgagaag      120
gacagtgtga ctctgaagtg ccagggagcc tactcccctg aggacaattc cacacagtgg      180
tttcacaatg agagcctcat ctcaagccag gcctcgagct acttcattga cgctgccaca      240
gttgacgaca gtggagagta caggtgccag acaaacctct ccaccctcag tgacccggtg      300
cagctagaag tccatatcgg ctggctgttg ctccaggccc ctcggtgggt gttcaaggag      360
gaagacccta ttcacctgag gtgtcacagc tggaagaaca ctgctctgca taaggtcaca      420
tatttacaga atggcaaagg caggaagtat tttcatcata attctgactt ctacattcca      480
aaagccacac tcaaagacag cggctcctac ttctgcaggg ggcttgttgg gagtaaaaat      540
gtgtcttcag agactgtgaa catcaccatc actcaaggtt tgtcagtgtc aaccatctca      600
tcattctttc cacctgggta ccaagtctct ttctgcttgg tgatggtact cctttttgca      660
gtggacacag gactatattt ctctgtgaag acaaacattc gaagctcaac aagagactgg      720
aaggaccata aatttaaatg gagaaaggac cctcaagaca aatga                      765
<210>  42
<211>  254
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  42
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1               5                   10                  15
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20                  25                  30
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35                  40                  45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
50                  55                  60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65                  70                  75                  80
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
85                  90                  95
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100                 105                 110
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
115                 120                 125
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130                 135                 140
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
145                 150                 155                 160
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
165                 170                 175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180                 185                 190
Gly Leu Ser Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
195                 200                 205
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210                 215                 220
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
225                 230                 235                 240
Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
245                 250
<210>  43
<211>  702
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  43
atgtggcagc tgctcctccc aactgctctg ctacttctag tttcagctgg catgcggact       60
gaagatctcc caaaggctgt ggtgttcctg gagcctcaat ggtacagcgt gcttgagaag      120
gacagtgtga ctctgaagtg ccagggagcc tactcccctg aggacaattc cacacagtgg      180
tttcacaatg agagcctcat ctcaagccag gcctcgagct acttcattga cgctgccaca      240
gtcaacgaca gtggagagta caggtgccag acaaacctct ccaccctcag tgacccggtg      300
cagctagaag tccatatcgg ctggctgttg ctccaggccc ctcggtgggt gttcaaggag      360
gaagacccta ttcacctgag gtgtcacagc tggaagaaca ctgctctgca taaggtcaca      420
tatttacaga atggcaaaga caggaagtat tttcatcata attctgactt ccacattcca      480
aaagccacac tcaaagatag cggctcctac ttctgcaggg ggcttgttgg gagtaaaaat      540
gtgtcttcag agactgtgaa catcaccatc actcaaggtt tggcagtgtc aaccatctca      600
tcattctctc cacctgggta ccaagtctct ttctgcttgg tgatggtact cctttttgca      660
gtggacacag gactatattt ctctgtgaag acaaacattt ga                         702
<210>  44
<211>  233
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  44
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1               5                   10                  15
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20                  25                  30
Gln Trp Tyr Ser Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35                  40                  45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
50                  55                  60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65                  70                  75                  80
Val Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
85                  90                  95
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100                 105                 110
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
115                 120                 125
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130                 135                 140
Gly Lys Asp Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe His Ile Pro
145                 150                 155                 160
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
165                 170                 175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180                 185                 190
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Tyr Gln
195                 200                 205
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210                 215                 220
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile
225                 230
<210>  45
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  45
Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Asp Lys Val Asn Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asp Asp Asp
20                  25                  30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Ala Ile Phe Ile Ile
35                  40                  45
Gln Glu Ala Thr Thr Leu Val Pro Gly Ile Ser Pro Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Ile Glu Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Gln His Asp Asn Phe Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  46
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  46
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100                 105
<210>  47
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  47
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asp Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Val
85                  90                  95
Leu Arg Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Gln
100                 105                 110
<210>  48
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  48
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  49
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  49
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Glu Ser Leu Val Leu Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Gly Thr Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20                  25                  30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Trp Ala Ser Ile Arg Asp Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Asp Leu Gln Ala Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85                  90                  95
Tyr Tyr Arg Ala Pro Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Lys
100                 105                 110
<210>  50
<211>  121
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  50
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Asp Pro Gly Gly Gly Glu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  51
<211>  126
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  51
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asp Ala Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Thr Asp Ala
100                 105                 110
Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210>  52
<211>  444
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственно синтезированная пептидная последовательность
<400>  52
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35                  40                  45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225                 230                 235                 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245                 250                 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260                 265                 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275                 280                 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290                 295                 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305                 310                 315                 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325                 330                 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340                 345                 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355                 360                 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370                 375                 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385                 390                 395                 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405                 410                 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420                 425                 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435                 440
<---