ЖИДКАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НАФТИФИНА
LIQUID PHARMACEUTICAL NAFTIFINE COMPOSITION

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к медицине, а также к фармацевтическому производству, и касается средства в форме раствора, спрея или геля для местного применения для лечения грибка ногтей и кожи. Средство на водной основе содержит нафтифин в виде основания или фармацевтически приемлемой соли, жирную и молочные кислоту, диметилсульфоксид и хитозан.
Уровень техники
Микозы (происходит от греч. гриб) вызываются паразитическими грибами, поражают человека и животных. Грибковые поражения встречаются на коже и ногтях — дерматомикозы и даже на внутренних органах (кандидоз).
Эффективным средством для лечения микозов является МНН нафтифин ((E)-N-Метил-N-(3-фенил-2-пропенил)-1-нафталинметанамин) — противогрибковый агент, применяется наружно в виде гидрохлорида.
Нафтифина гидрохлорид — это синтетическое производное аллиламина, был разработан в 1974 году в Австрии компанией Сандоз Ресеч Институт. Исследования подтвердили активность нафтифина в борьбе с патогенными грибками человека, он оказывает противогрибковое, антибактериальное и противовоспалительное действие.
Нафтифин активен в отношении ряда грибков, в том числе дерматофитов, плесневых и дрожжевых грибков in vitro. Нафтифин оказывает в основном фунгицидное действие на дерматофиты и плесневые грибки; на дрожжевые грибки нафтифин — фунгистатическое или фунгицидное действие, в зависимости от штамма грибков. Причем, действие нафтифина зависит от рН: препарат наиболее активен при нейтральном диапазоне рН.
Нафтифин ингибирует скваленэпоксидазу, что ведет к уменьшению биосинтеза эргостерола — компонента клеточных мембран грибков, за счет чего рост грибковых клеток прекращается. Фунгистатическое действие нафтифина может объясняться недостатком эргостерола. Также накопление скваленов, вызванное ингибированием скваленэпоксидазы, ведет к дистрофическим внутриклеточным процессам, таких как отложению липидных капель. Подобное накопление сквалена происходит не только в клеточной мембране, но и в других мембранах грибка, в том числе в эндоплазматическом ретикулуме. Изменение свойств мембран и всех внутриклеточных процессов, связанных с липидными мембранами, может приводить к повреждению клеточной стенки грибка. Этим, соответственно, и объясняется фунгицидная активность нафтифина.
in vitro
Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton tonsurans, Epidermophyton floccosum, Microsporum canis, Microsporum audouinii, Microsporum gypseum
Candida
Candida albicans.
Таким образом, нафтифин ингибирует сквален-2,3-эпоксидазу, снижает биосинтез стеролов, особенно эргостерола, входящего в состав клеточной мембраны гриба, и способствует накоплению в клетке сквалена. В условиях  проявляет фунгицидную активность в отношении дерматофитов (включая ) и фунгистатическую активность в отношении дрожжеподобных грибов рода , включая Нафтифин способствует уменьшению проявлений воспаления на месте аппликации, уменьшает зуд. Особенно эффективен при лечении микозов волосистых участков кожи и кожи с гиперкератозом.
Нафтифин также обладает и местным бактерицидным действием в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий.
Согласно исследованиям, противовоспалительная активность нафтифина сопоставима с активностью комбинации азола с кортикостероидами 1 класса.
Epidermophyton floccosum
Trichophyton rubrum
Trichophyton mentagrophytes
Применяется нафтифин наружно для лечения грибковых поражений кожи и кожных складок (включая эпидермофитии кистей и стоп, особенно вызванные , трихофитии, в т.ч. вызванные  и ), онихомикоз, кандидоз кожи, отрубевидный (разноцветный) лишай, микозы со вторичной бактериальной инфекцией; микоз наружного слухового прохода (для раствора для наружного применения).
Нафтифин при наружном применении быстро проникает в кожу и ногти трансдермальным путём, создавая устойчивые противогрибковые концентрации в различных их слоях, что делает возможным его применение один раз в день. Системной абсорбции подвергается около 4,2-6 % нафтифина после аппликации на кожу крема, обнаруживается во всех слоях ногтевой пластинки.
Нафтифин хорошо переносится и не вызывает значимых побочных эффектов со стороны нервной системы и кровообращения, почти полностью метаболизируется, при этом образуется множество метаболитов. Метаболиты не обладают противогрибковым действием и выводятся с мочой и желчью. Период полувыведения препарата составляет 2-3 дня.
Несмотря на все перечисленные преимущества и достоинства уровень техники содержит немногочисленные примеры фармацевтических композиций нафтифина. Сложность разработки составов определяется тем, что действующее вещество – нафтифин - нерастворимо в воде, его растворимость в нетоксичных органических компонентах ограничена. В связи с этим получение геля или раствора на водной основе для нафтифина – очень трудоемкая задача.
Помимо указанной трудности, при создании композиции необходимо также гарантировать сопоставимое либо лучшее высвобождение действующего вещества для обеспечения эффективности препарата, поэтому более простым путём вывода на рынок препаратов нафтифина является воспроизведение качественного и количественного состава ранее разработанных составов. Так, по состоянию на июнь 2021 года в России зарегистрирован 21 препарат с нафтифином, из них
• 6 в форме крема 1% для наружного применения,
• 14 в форме раствора 1% для наружного применения,
• 1 в форме спрея 1% для наружного применения.
Однако все они воспроизводят два состава нафтифина, сводные данные по всем зарегистрированным в России лекарственным препаратам представлены в сводной Таблице 1.
Таблица 1. Сводные данные по препаратам на основе нафтифина гидрохлорида, зарегистрированным в РФ
Как видно из Таблицы 1, в пределах каждой формы выпуска для всех зарегистрированных препаратов используется одинаковый качественный и количественный состав.
Таким образом, недостатком представленных на фармацевтическом рынке составов нафтифина является отсутствие пролонгированного эффекта для растворов и ограниченная местная биодоступность для кремов, поскольку действующее вещество в них находится в виде эмульсии вместо истинного раствора.
Кроме того, из литературных источников известно, что нафтифин не обладает фунгицидной активностью в отношении дрожжеподобных грибов рода Candida, а лишь сдерживают их рост. В то время как грибы рода Candida, в частности, Candida albicans являются условно-патогенным микроорганизмом, присутствующим на коже человека и при различных нарушениях (включая, например, нарушения обмена веществ, различные соматические и инфекционные заболевания, нарушения иммунитета и т.д.) могут быть возбудителями дерматомикозов и онихомикозов, а в случае развития грибковой инфекции, вызванной другими микроорганизмами, их рост усиливается в отсутствии пролонгированного эффекта препаратов с нафтифином, что создает более благоприятную среду для роста патогенных грибов.
Из патентных источников известны некоторые составы аллиаминов и нафтифина в частности для лечения грибка. Патент RU2587064 (приоритет: 11.02.2011 г.) раскрывает фармацевтическую композицию для лечения грибковой инфекции ногтя, содержащую аллиламиновое противогрибковое соединение, присутствующее в количестве более 5%, C1-C8 карбоновую кислоту или ее C1-C4 алкиловый сложный эфир, диол, выбранный из пропандиола, бутандиола, пентандиола, гександиола или их смесей, и комплексообразующий агент аминоуксусного типа, и указанная фармацевтическая композиция, по существу, не содержит воды. Состав обеспечивает повышенное проникновение активного агента в ноготь, тем самым повышая эффективность терапии грибковой инфекции ногтя. Несмотря на преимущества изобретения согласно RU2587064, описанные композиции не обладают пролонгированным эффектом, а усиление противогрибкового действия достигается за счет увеличения содержания действующего вещества до 5-12%, что, в свою очередь, увеличивает нагрузку на организм пациента по сравнению с применением присутствующих на рынке препаратов, содержащих 1% действующего вещества.
В патенте RU2699653 (приоритет: 22.03.2019 г.) описывает средство для лечения грибка ногтей, которое содержит нафтифин гидрохлорид, спирт этиловый, полиэтиленгликоль-400, полиэтиленгликоль-1000, при следующем соотношении компонентов, мас. %: нафтифин гидрохлорид - 1.4%; спирт этиловый 95% - 20.3%; полиэтиленглоколь-400 - 63%; полиэтиленгликоль-1000 - 15.3%. Изобретение по RU2699653 обладает пролонгированным эффектом и обеспечивает сопоставимое со спиртовым раствором нафтифина проникновение действующего вещества в ногтевую пластину, его фунгицидные и фунгистатические свойства частично превышают таковые для представленных на рынке препаратов, однако в отношении грибов рода Candida выявлено лишь усиление фунгистатических свойств. Техническое решение из патента RU2699653 не обладает фунгицидными свойствами в отношении данного рода дрожжеподобных грибов.
Прототипом предлагаемого технического решения является композиция противогрибкового средства, описанная в заявке на изобретение ЕА201990025 «СИНЕРГИЧЕСКИЕ ПРОТИВОГРИБКОВЫЕ КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИХ ПРИГОТОВЛЕНИЯ» (приоритет 13.06.2016, 12.08.2016, 17.02.2017 г.), раскрывающей противогрибковую композицию, содержащую по меньшей мере один противогрибковый агент, по меньшей мере одну жирную кислоту или ее сложный эфир и необязательно одно или несколько вспомогательных веществ, где жирная кислота имеет длину углеродной цепи в диапазоне от С-1 до С-14, и где композиция обладает синергической противогрибковой активностью. Техническое решение из заявки ЕА201990025 раскрывает принципы синергизма противогрибковых средств и жирных кислот или их сложных эфиров в отношении тест-микроорганизмов, который обеспечивает усиление противогрибкового эффекта, в том числе в отношении резистентных штаммов, но не расширение данного эффекта применительно к тем штаммам, которые не чувствительны либо обладают низкой чувствительностью к действующему веществу. Таким образом, для расширения спектра противогрибкового действия необходимо не только ввести в состав препарата компонент-синергист, усиливающий действие основного вещества, но и дополнительный действующий или вспомогательный компонент, обладающий фунгицидной активностью в отношении нечувствительных к основному веществу штаммов.
Таким образом, технической проблемой, решение которой обеспечивается при осуществлении или использовании заявляемого технического решения, и которая не могла быть решена при осуществлении или использовании аналогов, заключается в необходимости расширения арсенала фармацевтических композиций противогрибковых препаратов на основе нафтифина, которые:
Candida
• проявляют фунгицидную активность в отношении всех типов возбудителей микозов кожи, в том числе дрожжеподобных грибов рода .
• обладают пролонгированным действием и обеспечивают более длительный контакт противогрибкового средства с пораженной поверхностью;
• обладают усиленным проникновением внутрь пораженных поверхностей (кожи, слизистых, ногтевых пластин) для более интенсивного воздействия на грибковые структуры, включая глубоко расположенный в слоях кожи и ногтей мицелий грибов.
Раскрытие сущности изобретения
Техническая проблема решается разработкой стабильной фармацевтической композиции нафтифина с пролонгированным действием и хорошей биодоступностью, а именно подбором оптимальной концентрации активного вещества, определения вспомогательных компонентов и их содержания в фармацевтической композиции для придания необходимых физико-химических, микробиологических свойств. Предпочтительными вариантами лекарственных форм жидкой фармацевтической композиции могут быть раствор, спрей или гель для местного применения.
Жидкие лекарственные формы – довольно популярные варианты исполнения фармацевтических композиций, однако трудность разработки жидкой лекарственной формы нафтифина определяется его нерастворимостью в воде и тем, что у жидких составов наблюдается неустойчивость при хранении, подверженность гидролизу и микробиологическому заражению, а также не все активные вещества эффективны в жидкой форме.
Candida albicans
Согласно фармакологическим данным, в отношении условно-патогенного микроорганизма  нафтифин не обладает фунгицидной активностью, только фунгистатической, т.е. нафтифин лишь временно сдерживает рост дрожжеподобных грибов, который возобновляется через некоторое время после окончания применения препарата. При грибковых поражениях кожи и ногтей данные микроорганизмы участвуют в развитии инфекции наряду с основным возбудителем заболевания. Следовательно, в препараты, содержащие нафтифин, для усиления его действия необходимо ввести ингредиент, обладающий фунгицидным или фунгистатическим действием.
Предложена жидкая фармацевтическая композиция, обладающая противогрибковым действием, содержащая нафтифин и вспомогательные вещества при следующем соотношении компонентов, мас. %:
нафтифин
0,1-10
ундециленовая кислота
или хлорнитрофенол
или бензилдиметил[3-миристоиламино)
пропил]аммония хлорид
0,1-50
диметилсульфоксид
0,1-50
хитозан
0,1-50
молочная кислота
0,1-50
вода
остальное
Все диапазоны концентраций ограничиваются активностью действующих компонентов, растворимостью и учитывают дозировки, соответствующие нетоксичным концентрациям для соответствующих компонентов.
Частные варианты фармацевтической композиции и форм выпуска лекарственного препарата на основе нафтифина, мас. %:
Технический результат заключается в создании новой фармацевтической композиции на основе нафтифина в форме раствора, спрея и геля, которая:
• обеспечивает длительный контакт с пораженным участком и пролонгированный терапевтический эффект;
• обеспечивает постепенное высвобождение и высокую биодоступность;
• воздействует на такие группы возбудителей микозов кожи и ногтей, как Aspergillus spp, Candida spp., Fusarium spp, Microsporum spp и Trichophyton spp;
• стабильна при хранении в течение заявленного срока годности.
Технический результат обусловлен разработкой качественного и количественного состава фармацевтической композиции, отличающейся от представленных на рынке композиций препаратов и известных из уровня техники составов на основе нафтифина. В предложенной фармацевтической композиции содержится нафтифин, жирная кислота, молочная кислота, хитозан, диметилсульфоксид и вода в заданных количествах.
Для усиления противогрибкового действия нафтифина в состав фармацевтической композиции вводится дополнительный компонент с умеренным противогрибковым действием из группы органических кислот, карбоновых кислот производных фенолов и органических спиртов, включая, но не ограничиваясь, хлорнитрофенол, бензилдиметил[3-миристоиламино)пропил]аммония хлорид моногидрат и ундециленовую кислоту.
В качестве частного примера в рамках данного технического решения рассматривается введения в состав ундециленовой кислоты для усиления противогрибкового эффекта препарата для наружного применения. Обнаружено, что в концентрациях свыше 5 мас. % ундециленовая кислота обладает противогрибковым действием в отношении дерматофитов Epidennophyton, Trichophyton, and Microsporumspp, и используется для лечения грибковых инфекций кожи, таких как микоз, стригущий лишай, опоясывающий лишай, дерматомикоз. Введение в состав композиции ундециленовой кислоты усиливает противогрибковое действие предлагаемой фармацевтической композиции.
В связи с тем, что нафтифин является практически нерастворимым в воде компонентом, в качестве растворителя в предлагаемую фармацевтическую композицию введен диметилсульфоксид (ДМСО), можно использовать и иной полярный растворитель, применяемый в фармацевтике. Однако обнаружено, что у ДМСО, помимо высокой солюбилизирующей способности, имеется свойство усиливать проникающую способность действующих веществ из растворов и гелей, кремов для наружного применения через кожные покровы в пораженные места, также диметилсульфоксид обладает умеренным антисептическим и противовоспалительным эффектом, таким образом дополняя терапевтический эффект действующих веществ.
Для обеспечения длительного контакта препарата с пораженной поверхностью и регулируемого высвобождения необходимо ввести в состав один или несколько загустителей, образующих на поверхности равномерную плёнку и препятствующих быстрому высыханию и стеканию раствора с места воздействия. В качестве загустителя для более продолжительного нахождения препарата в месте воздействия может быть использован хитозан или иные известные в фармацевтике загустители и корректоры вязкости. Хитозан представляет собой полусинтетический полисахарид на основе глюкозамина и N-ацетилглюкозамина, полученный из хитина путем частичного деацетилирования. Хитозан широко применяется в косметике и фармацевтической промышленности, является нетоксичным и не оказывающим раздражающего действия, а также биосовместимым при наружном применении, как со здоровой, так и с инфицированной и поврежденной кожей. Хитозан обладает умеренной противогрибковой активностью, в частности, в отношении дрожжеподобных грибов, включая грибы рода Candida за счет разрыхления их клеточных стенок.
Таким образом, хитозан способствует ослаблению защитных функций клеток грибов, облегчает проникновение действующих веществ к клеткам грибов и его введение в состав препарата в качестве вспомогательного вещества, усиливает активность состава в отношении данных микроорганизмов, расширяя спектр его противогрибкового действия. В рамках предложенной фармацевтической композиции допускается применение в составе препарата хитозана в диапазоне молекулярных масс от 500 до 1000000 Да, а также смеси низкомолекулярных и высокомолекулярных хитозанов со степенью деацетилирования до 100%.
Дополнительно в состав фармацевтической композиции вводится одна или несколько кислот, предпочтительно органических, для достижения значений рН, при которых достигается стабильность композиции выбранного качественного и количественного состава, а также, в случае использования хитозана в качестве загустителя – для достижения оптимальной вязкости / консистенции лекарственной формы. В частности, рекомендовано использовать молочную или уксусную кислоту в качестве загустителя хитозана и корректора рН для поддержания кислотности среды, препятствующей росту грибов или любую фармацевтически приемлемую кислоту либо комбинацию кислот.
Вспомогательные и действующие вещества могут (необязательно) находиться в водном растворе либо препарат может не содержать в составе воды.
Дополнительно в состав препарата могут быть включены подходящие солюбилизаторы, эмоленты, стабилизаторы, корректоры рН и вязкости, консерванты, антиоксиданты, ароматизаторы или отдушки, красители и иные вспомогательные ингредиенты.
Предложенная фармацевтическая композиция и ее варианты могут быть выполнены в лекарственной форме раствор, спрей или гель для местного применения.
Предлагаемый состав жидкой фармацевтической композиции является оптимальным, найден экспериментально и позволяет получить эффективную и стабильную жидкую лекарственную форму.
Для исследования предлагались несколько вариантов жидкой фармацевтической композиции нафтифина как на водной, так и на неводной основе.
Противогрибковая активность предлагаемой фармацевтической композиции определяется синергетическим взаимодействием входящих в ее состав компонентов, каждый из которых по отдельности также обладает противогрибковой активностью.
Авторами настоящего технического решения были проведены исследования противогрибковой активности разработанной фармацевтической композиции на четырех различных составах (надо показать концентрации еще и мас.%).
Таблица 2. Вариации составов для исследования:
Изучение фунгицидного и фунгистатичного действия фармацевтической композиции проводили с помощью определения чувствительности микроорганизмов к антимикотикам методом серийных разведений. Данный метод позволяет определить минимальную подавляющую концентрацию (МПК) и минимальную биоцидную концентрацию (МБК)
6
Для определения чувствительности к антимикотику дрожжеподобных грибов использовали бульон Сабуро, который разливали в 8 пробирок - по 2 мл в каждую. Испытуемый раствор фармацевтической композиции в количестве 2 мл при помощи дозатора со стерильным наконечником вносили в первую пробирку, содержащую 2 мл бульона Сабуро. Тщательно перемешивали и новым стерильным наконечником переносили 2 мл во вторую пробирку. Эту процедуру повторяли, пока не будет приготовлен весь необходимый ряд разведений. В пустую пробирку вносили 2 мл стерильной воды для инъекций (ВДИ) – это контрольная пробирка. Далее приготовили в 0.9 % растворе натрия хлорида взвесь штамма Candida albicans в количестве 10 КОЕ\мл и в каждую пробирку вносили по 0,2 мл суспензии.
Пробирки закрывали ватно-марлевыми пробками и инкубировали в течение 24 часов. Рост культуры в присутствии антимикотика сравнивали с контрольной пробиркой. МПК определяли по наименьшей концентрации действующего вещества, которая подавляет видимый рост микроорганизма.
Для определения МБК делали высевы из пробирок на Агар Сабуро с декстрозой в чашки Петри и термостатировании их при (37 ± 1) °С в течение 48 часов. За МБК принимали наименьшую концентрацию антимикотика (в жидкой среде в пробирке), при высеве из которой рост на плотной среде отсутствует.
Fusarium spp.
Аналогичным образом проводили испытания для грибов рода
Испытуемые растворы во всех разведениях подавляли рост грибов Aspergillus brasiliensis, Fusarium spp, Microsporum canis и Trichophyton rubrum, поэтому для большей точности эксперимента перед постановкой метода серийных разведений для этих микроорганизмов испытуемые растворы разбавляли в 1000 раз очищенной водой. Для этого 1 мл каждого раствора отбирали в мерные колбы на 1000 мл и доводили очищенной водой до метки, затем перемешивали.
Результаты исследований приведены в таблицах 3-4. Все концентрации приведены по нафтифину, поскольку он входит в состав всех испытуемых растворов.
Таблица 3. МПК экспериментальных растворов в отношении тест-штаммов, мг/л.
<b>Тест-штамм</b>
<b>Номер экспериментального состава</b>
<b>№1</b>
<b>№2</b>
<b>№3</b>
<b>№4</b>
<i>Aspergillus brasiliensis</i> АТСС 16404
4,0
4,0
2,0
2,0
<i>Candida albicans </i>ATCC 10231
250
125
250
125
<i>Candida albicans </i>РКПГ Y 1244
250
125
250
62,5
<i>Candida albicans </i>РКПГ Y 1274
125
125
125
31,25
<i>Candida albicans </i>РКПГ Y 401
125
62,5
125
62,5
<i>Candida albicans </i>РКПГ Y 1369
125
62,5
125
31,25
<i>Candida albicans </i>РКПГ Y 1129
500
125
500
125
<i>Fusarium sp.</i> РКПГ F 1449
62,5
62,5
62,5
31,25
<i>Fusarium proliferatum</i> РКПГ F 1503
62,5
62,5
62,5
62,5
<i>Fusarium oxysporum</i> РКПГ F 1504
125
125
62,5
62,5
<i>Fusarium oxysporum</i> РКПГ F 1390
125
125
125
125
<i>Fusarium sp.</i> РКПГ F 1436
500
250
250
250
<i>Microsporum canis </i>352
0,063
0,031
0,031
0,031
<i>Trichophyton mentagrophytes granulosum </i>7/58
0,063
0,063
0,031
0,031
<i>Trichophyton rubrum</i> РКПГ F 1157
0,125
0,125
0,125
0,063
<i>Trichophyton rubrum</i> РКПГ F 1209
0,125
0,125
0,063
0,063
<i>Trichophyton rubrum</i> РКПГ F 1408
0,25
0,25
0,125
0,125
<i>Trichophyton rubrum</i> РКПГ F 1220
0,125
0,125
0,063
0,063
<i>Trichophyton rubrum</i> РКПГ F 1231
0,25
0,25
0,125
0,125
Таблица 4. МБК экспериментальных растворов в отношении тест-штаммов, мг/л.
<b>Тест-штамм</b>
<b>Номер экспериментального состава</b>
<b>№1</b>
<b>№2</b>
<b>№3</b>
<b>№4</b>
<i>Aspergillus brasiliensis</i> АТСС 16404
8,0
4,0
4,0
2,0
<i>Candida albicans </i>ATCC 10231
250
125
250
125
<i>Candida albicans </i>РКПГ Y 1244
250
125
250
62,5
<i>Candida albicans </i>РКПГ Y 1274
125
125
125
62,5
<i>Candida albicans </i>РКПГ Y 401
125
62,5
125
62,5
<i>Candida albicans </i>РКПГ Y 1369
125
125
125
62,5
<i>Candida albicans </i>РКПГ Y 1129
1000
250
500
125
<i>Fusarium sp.</i> РКПГ F 1449
125
125
62,5
62,5
<i>Fusarium proliferatum</i> РКПГ F 1503
62,5
62,5
62,5
62,5
<i>Fusarium oxysporum</i> РКПГ F 1504
125
125
62,5
62,5
<i>Fusarium oxysporum</i> РКПГ F 1390
250
250
125
125
<i>Fusarium sp.</i> РКПГ F 1436
500
250
250
250
<i>Microsporum canis </i>352
0,125
0,063
0,063
0,063
<i>Trichophyton mentagrophytes granulosum </i>7/58
0,063
0,063
0,031
0,031
<i>Trichophyton rubrum</i> РКПГ F 1157
0,125
0,125
0,125
0,063
<i>Trichophyton rubrum</i> РКПГ F 1209
0,125
0,125
0,063
0,063
<i>Trichophyton rubrum</i> РКПГ F 1408
0,25
0,25
0,125
0,125
<i>Trichophyton rubrum</i> РКПГ F 1220
0,125
0,125
0,063
0,063
<i>Trichophyton rubrum</i> РКПГ F 1231
1,0
0,25
0,5
0,25
Candida
Как видно из Таблиц №3-4, наличие в составе препарата ундециленовой кислоты усиливает противогрибковое (как фунгистатическое, так и фунгицидное) действие в отношении большинства дерматофитов и плесневых грибов. Наличие в составе хитозана усиливает фунгистатическое и фунгицидное действие препарата в отношении дрожжеподобных грибов рода . Наиболее выраженным противогрибковым действием обладает экспериментальный состав №4, содержащий оба компонента (ундециленовую кислоту и хитозан).
2
С целью оценки продолжительности противогрибкового эффекта для растворов нафтифина и ундециленовой кислоты в присутствии хитозана и без него было проведено дополнительное исследование на образцах растворов №3 и №4. Для этого в пробирку с 1 мл исследуемого раствора вносили 0,1 мл взвеси штамма Candida albicans в концентрации 10КОЕ/мл и инкубировали при температуре (37 ± 1) °С в течение 6 суток. Из пробирки делали высевы на Агар Сабуро с декстрозой через определенные промежутки времени (см. Таблица 5).
Таблица 5. Результаты высевов
4 ч
8 ч
12 ч
24 ч
2 сутки
3 сутки
4 сутки
5 сутки
6 сутки
Раствор №3
Нет роста
Нет роста
Нет роста
Нет роста
Есть рост
Есть рост
Есть рост
Есть рост
Есть рост
Раствор №4
Нет роста
Нет роста
Нет роста
Нет роста
Нет роста
Нет роста
Есть рост
Есть рост
Есть рост
Как видно из таблицы 5, при исследованиях in vitro состав №4 с хитозаном сдерживает рост тест-культуры на 2 суток дольше по сравнению с составом №3 в котором хитозан отсутствует. Продолжительность противогрибкового действия выше в присутствии хитозана благодаря созданию пленочного слоя за счет влияния хитозана на вязкость раствора, а также благодаря синергетическому эффекту, связанному с собственным противогрибковым действием хитозана. Результаты эксперимента позволяют судить о том, что in vivo ожидаемая продолжительность противогрибкового эффекта средства с хитозаном в составе без повторного нанесения средства также будет выше по сравнению с составами без хитозана, хотя количественная характеристика продолжительности действия (в часах / в сутках) будет зависеть от ряда факторов, включая степень грибкового поражения, сопутствующие заболевания, уровень гигиены, тип и материал используемой одежды или обуви и т.д.
На основании полученных данных сделан вывод о том, что наличие в составе загустителя, предпочтительно, хитозана, позволяет добиться более длительного воздействия фармацевтической композиции, что позволяет уменьшить кратность нанесения средства на пораженный участок без снижения эффективности и без увеличения продолжительности лечения.
Для оценки влияния подобранной базы компонентов на спектр действия нафтифина других противогрибковых действующих веществ были приготовлены тест-составы с хлорнитрофенолом и бензилдиметил[3-миристоиламино)пропил]аммония хлорида моногидратом.
Таблица 6. Вариации составов для исследования:
Изучение фунгицидного и фунгистатичного действия фармацевтической композиции проводили с помощью определения чувствительности микроорганизмов к антимикотикам методом серийных разведений с определением МПК и МБК, как описано выше.
Результаты исследований приведены в таблицах 7-8. Все концентрации приведены по нафтифину, поскольку он входит в состав всех испытуемых растворов.
Таблица 7. МПК экспериментальных растворов в отношении тест-штаммов, мг/л.
<b>Тест-штамм</b>
<b>Номер экспериментального состава</b>
<b>№5</b>
<b>№6</b>
<b>№7</b>
<b>№8</b>
<i>Aspergillus brasiliensis</i> АТСС 16404
0,5
3,125
1,25
3,13
<i>Candida albicans </i>ATCC 10231
31,25
195,3
39,06
97,66
<i>Candida albicans </i>РКПГ Y 1244
31,25
97,66
156,25
97,66
<i>Candida albicans </i>РКПГ Y 1274
15,625
97,66
78,13
48,83
<i>Candida albicans </i>РКПГ Y 401
31,25
48,83
78,13
48,83
<i>Candida albicans </i>РКПГ Y 1369
15,625
195,3
78,13
97,66
<i>Candida albicans </i>РКПГ Y 1129
31,25
97,66
312,5
97,66
<i>Fusarium sp.</i> РКПГ F 1449
62,5
97,66
39,06
48,83
<i>Fusarium proliferatum</i> РКПГ F 1503
62,5
48,83
78,13
48,83
<i>Fusarium oxysporum</i> РКПГ F 1504
62,5
97,66
78,13
97,66
<i>Fusarium oxysporum</i> РКПГ F 1390
125
97,66
78,13
97,66
<i>Fusarium sp.</i> РКПГ F 1436
250
390,63
156,25
195,31
<i>Microsporum canis </i>352
0,0625
0,049
0,039
0,049
<i>Trichophyton mentagrophytes granulosum </i>7/58
0,0625
0,098
0,039
0,049
<i>Trichophyton rubrum</i> РКПГ F 1157
0,125
0,195
0,156
0,195
<i>Trichophyton rubrum</i> РКПГ F 1209
0,125
0,098
0,078
0,098
<i>Trichophyton rubrum</i> РКПГ F 1408
0,25
0,195
0,156
0,098
<i>Trichophyton rubrum</i> РКПГ F 1220
0,25
0,195
0,078
0,049
<i>Trichophyton rubrum</i> РКПГ F 1231
0,25
0,195
0,078
0,098
Таблица 8. МБК экспериментальных растворов в отношении тест-штаммов, мг/л.
<b>Тест-штамм</b>
<b>Номер экспериментального состава</b>
<b>№5</b>
<b>№6</b>
<b>№7</b>
<b>№8</b>
<i>Aspergillus brasiliensis</i> АТСС 16404
0,5
3,125
1,25
3,13
<i>Candida albicans </i>ATCC 10231
31,25
195,3
78,13
195,3
<i>Candida albicans </i>РКПГ Y 1244
31,25
390,63
156,25
97,66
<i>Candida albicans </i>РКПГ Y 1274
62,5
195,3
78,13
97,66
<i>Candida albicans </i>РКПГ Y 401
62,5
195,3
156,25
48,83
<i>Candida albicans </i>РКПГ Y 1369
31,25
195,3
156,25
97,66
<i>Candida albicans </i>РКПГ Y 1129
31,25
195,3
312,5
97,66
<i>Fusarium sp.</i> РКПГ F 1449
62,5
97,66
78,13
195,3
<i>Fusarium proliferatum</i> РКПГ F 1503
62,5
97,66
78,13
48,83
<i>Fusarium oxysporum</i> РКПГ F 1504
62,5
97,66
78,13
97,66
<i>Fusarium oxysporum</i> РКПГ F 1390
125
97,66
78,13
48,83
<i>Fusarium sp.</i> РКПГ F 1436
250
390,63
156,25
195,3
<i>Microsporum canis </i>352
0,125
0,049
0,039
0,049
<i>Trichophyton mentagrophytes granulosum </i>7/58
0,0625
0,098
0,039
0,049
<i>Trichophyton rubrum</i> РКПГ F 1157
0,125
0,195
0,313
0,098
<i>Trichophyton rubrum</i> РКПГ F 1209
0,125
0,098
0,078
0,098
<i>Trichophyton rubrum</i> РКПГ F 1408
0,25
0,195
0,156
0,195
<i>Trichophyton rubrum</i> РКПГ F 1220
0,25
0,195
0,156
0,098
<i>Trichophyton rubrum</i> РКПГ F 1231
0,25
0,195
0,078
0,098
Как видно из Таблиц №7-8, аналогично ундециленовой кислоте, хлорнитрофенол и бензилдиметил[3-миристоиламино)пропил]аммония хлорид моногидрат также усиливают действие нафтифина, т.е. оказывают синергический эффект. В случае с хлорнитрофенолом также наблюдается синергический эффект не только по отношению к нафтифину, но и усиление эффекта, выявленного для хитозана, поскольку противогрибковое действие активного компонента хлорнитрофенола в отношении Candida spp. значительно более выраженное в сравнении с таковым для вспомогательного компонента.
2
С целью оценки продолжительности противогрибкового эффекта для растворов №№5-8 в присутствии хитозана проведено дополнительное исследование со штаммом Candida albicans в концентрации 10КОЕ/мл (как описано выше).
Таблица 9. Результаты высевов растворов №№5-8
4 ч
8 ч
12 ч
24 ч
2 сутки
3 сутки
4 сутки
5 сутки
6 сутки
Раствор №5
Нет роста
Нет роста
Нет роста
Нет роста
Нет роста
Нет роста
Нет роста
Есть рост
Есть рост
Раствор №6
Нет роста
Нет роста
Нет роста
Нет роста
Нет роста
Нет роста
Есть рост
Есть рост
Есть рост
Раствор №7
Нет роста
Нет роста
Нет роста
Нет роста
Нет роста
Нет роста
Есть рост
Есть рост
Есть рост
Раствор №8
Нет роста
Нет роста
Нет роста
Нет роста
Нет роста
Нет роста
Есть рост
Есть рост
Есть рост
Как видно из таблицы 9, при исследованиях in vitro во всех составах сохраняется пролонгированный эффект, выявленный для растворов №3 и 4 с ундециленовой кислотой и хитозаном. Наиболее длительный эффект наблюдается для состава №5, содержащего наибольшее количество хитозана и хлорнитрофенола.
С целью подтверждения улучшенного высвобождения и проникновения композиции нафтифина согласно предложенному техническому решению через кожу были проведены сравнительные тестирования модельного раствора состава №9 и представленного на рынке состава раствора нафтифина с пропиленгликолем и этанолом (№10), а также геля состава №11 и представленного на рынке крема состава №12.
Таблица №10. Составы модельных растворов для сравнительного тестирования
Таблица №11. Составы модельного крема и геля для сравнительного тестирования
Сравнительное тестирование высвобождения и проникновения нафтифина проводили с применением ячейки вертикальной диффузии Франца объемом 12 мл на аппарате типа HDT1000 производства Copley Scientific Limited, Великобритания через комбинированную синтетическую многослойную мембрану типа Strat M диаметром 25 мм и толщиной 3 мм, моделирующую проницаемость кожных покровов человека.
Методику испытаний использовали следующую. Фланцы диффузионных ячеек закрывают мембраной и плотно герметизируют с помощью уплотнительного колпачка. Внутреннюю камеру ячеек заполняют физиологическим раствором с рН 7,4, избегая попадания пузырьков воздуха. В донорскую камеру ячеек вносят модельные растворы/гели №9, 10, 11, 12. Устанавливают все ячейки в термостат, устанавливают температуру 32 °С (естественная температура поверхности открытых участков кожи) и оставляют на экспозицию в течение 4 часов с отбором проб из внутренней камеры 1 раз в час и последующим контролем количественного содержания нафтифина в пробе методом ВЭЖХ, как описано в монографии USP 41 на нафтифина гидрохлорид.
Распределение нафтифина в % от заявленной дозы в течение 4 часов для модельных составов №№9-12 приведено на графике Фиг.1.
Как видно из графика Фиг.1, в обоих составах, предложенных в рамках изобретения (Состав раствора №9 и геля №11) наблюдается более быстрое и полное высвобождение нафтифина в сравнении с присутствующими на рынке составами в виде раствора (№10) и крема (№11) на 8-12%.
Вспомогательные вещества играют важную роль в фармакокинетике, эквивалентности, безопасности и стабильности фармацевтической композиции и влияют на физико-химические и микробиологические показатели.
Заявляемый набор компонентов является оптимальным, найден экспериментально и обеспечивает стабильность препарата в течение не менее 2 лет. Благодаря заявленному соотношению компонентов, фармацевтическая композиция сохраняет физико-химическую и микробиологическую стабильность даже при многократном применении препарата. Стабильность составов оценивали по показателям «Внешний вид композиции», «Количественное определение», «Родственные примеси нафтифина» и «Микробиологическая чистота» в соответствии с внутренними спецификациями. Испытания проводили в течение 2 лет согласно рекомендациям ICH QIA (R2) Stability Testing of New Drug Substances and Products. Для всех экспериментальных составов значимых отклонений по качеству в процессе хранения выявлено не было. Основные тенденции изменений по нормируемым показателям сопоставимы с таковыми для составов №10 и №12, соответствующим составам представленных на рынке препаратов, что подтверждает отсутствие ухудшений по стабильности композиций при качественном изменении составов в сравнении с уже реализуемыми препаратами.
Данные по стабильности составов приведены в таблице 12.
Таблица 12. Исследование стабильности экспериментальных составов №№1-12
№состава
Срок хранения, мес
Контролируемые показатели
Внешний вид композиции
Микробиологическая чистота
Родственные примеси нафтифина
Количественное определениеОт 90 до 110% от номинального значения
Не должен значительно меняться при хранении
Категория 2 ГФ РФ(нестерильные ЛС для местного и наружного применения)
Любой единичной примеси – не более 1,0 %
Сумма примесей – не более 2 %
Нафтифина гидрохлорид
Ундециленовая кислота
Хлорнитрофенол
Бензилдиметил[3-миристоиламино)пропил]аммония хлорид
0 мес.
Прозрачный светло-желтый раствор
Выдерживает требования для Кат.2
0,12
0,25
102,4
<i>Компонент отсутствует</i>
<i>Компонент отсутствует</i>
<i>Компонент отсутствует</i>
3 мес.
0,19
0,36
101,9
6 мес.
0,26
0,47
101,1
9 мес.
0,39
0,64
100,4
12 мес.
0,47
0,83
99,6
18 мес.
0,63
1,13
98,9
24 мес.
0,78
1,44
97,7
0 мес.
Слегка опалесцирующий светло-желтый вязкий раствор
Выдерживает требования для Кат.2
0,09
0,17
101,5
<i>Компонент отсутствует</i>
<i>Компонент отсутствует</i>
<i>Компонент отсутствует</i>
3 мес.
0,16
0,23
101,1
6 мес.
0,22
0,31
100,6
9 мес.
0,27
0,49
100,2
12 мес.
0,34
0,53
99,4
18 мес.
0,41
0,71
98,7
24 мес.
0,55
0,94
97,9
0 мес.
Слегка опалесцирующий желтый раствор
Выдерживает требования для Кат.2
0,13
0,19
99,5
98,6
<i>Компонент отсутствует</i>
<i>Компонент отсутствует</i>
3 мес.
0,18
0,27
98,9
98,4
6 мес.
0,25
0,39
98,6
98,1
9 мес.
0,35
0,51
98,2
97,9
12 мес.
0,43
0,65
97,6
97,6
18 мес.
0,56
0,87
97,1
97,2
24 мес.
0,67
1,04
96,2
96,9
0 мес.
Непрозрачный светло-желтый вязкий раствор
Выдерживает требования для Кат.2
0,15
0,24
102,2
103,5
<i>Компонент отсутствует</i>
<i>Компонент отсутствует</i>
3 мес.
0,18
0,29
101,8
103,2
6 мес.
0,23
0,45
101,5
102,9
9 мес.
0,27
0,52
101,1
102,8
12 мес.
0,33
0,69
100,6
102,5
18 мес.
0,40
0,84
99,8
102,1
24 мес.
0,52
1,07
99,2
101,4
0 мес.
Непрозрачный гель светло-желто-зеленого цвета
Выдерживает требования для Кат.2
0,08
0,15
100,6
<i>Компонент отсутствует</i>
103,2
<i>Компонент отсутствует</i>
3 мес.
0,11
0,21
100,4
102,1
6 мес.
0,13
0,24
100,1
101,5
9 мес.
0,16
0,30
99,8
100,4
12 мес.
0,19
0,43
99,6
99,7
18 мес.
0,28
0,52
99,3
98,8
24 мес.
0,36
0,67
99,0
98,3
0 мес.
опалесцирующий вязкий раствор желтого цвета
Выдерживает требования для Кат.2
0,10
0,17
101,1
<i>Компонент отсутствует</i>
<i>Компонент отсутствует</i>
102,3
3 мес.
0,16
0,24
100,8
102,2
6 мес.
0,23
0,32
100,2
101,7
9 мес.
0,29
0,42
99,7
101,3
12 мес.
0,37
0,56
99,3
101,0
18 мес.
0,52
0,72
98,5
100,6
24 мес.
0,68
0,89
97,6
100,1
0 мес.
Опалесцирующий гель светло-желтого цвета
Выдерживает требования для Кат.2
0,12
0,19
102,0
<i>Компонент отсутствует</i>
101,3
<i>Компонент отсутствует</i>
3 мес.
0,16
0,26
101,7
101,1
6 мес.
0,20
0,38
101,4
100,8
9 мес.
0,25
0,47
101,1
100,6
12 мес.
0,34
0,59
100,8
100,3
18 мес.
0,43
0,76
100,3
99,7
24 мес.
0,52
0,88
99,6
99,3
0 мес.
Непрозрачный гель светло-желтого цвета
Выдерживает требования для Кат.2
0,14
0,22
100,1
<i>Компонент отсутствует</i>
<i>Компонент отсутствует</i>
99,7
3 мес.
0,18
0,29
99,8
99,6
6 мес.
0,21
0,37
99,5
99,4
9 мес.
0,25
0,44
99,1
99,3
12 мес.
0,33
0,58
98,6
99,1
18 мес.
0,42
0,78
98,2
98,6
24 мес.
0,49
0,93
97,3
98,3
0 мес.
Непрозрачный светло-желтый вязкий раствор
Выдерживает требования для Кат.2
0,08
0,15
103,1
102,3
<i>Компонент отсутствует</i>
<i>Компонент отсутствует</i>
3 мес.
0,13
0,24
102,8
102,1
6 мес.
0,26
0,37
102,4
101,7
9 мес.
0,38
0,52
102,0
101,4
12 мес.
0,54
0,89
101,6
101,1
18 мес.
0,67
1,15
100,8
100,9
24 мес.
0,83
1,57
100,1
100,6
0 мес.
Прозрачный светло-желтый раствор
Выдерживает требования для Кат.2
0,18
0,27
100,7
<i>Компонент отсутствует</i>
<i>Компонент отсутствует</i>
<i>Компонент отсутствует</i>
3 мес.
0,25
0,39
100,4
6 мес.
0,29
0,41
100,2
9 мес.
0,37
0,62
99,9
12 мес.
0,49
0,94
99,7
18 мес.
0,56
1,28
99,1
24 мес.
0,71
1,69
98,3
0 мес.
Опалесцирующий светло-желтый гель
Выдерживает требования для Кат.2
0,09
0,16
103,8
104,5
<i>Компонент отсутствует</i>
<i>Компонент отсутствует</i>
3 мес.
0,14
0,26
103,6
104,4
6 мес.
0,20
0,39
103,3
104,2
9 мес.
0,27
0,52
103,1
103,7
12 мес.
0,34
0,67
102,9
103,4
18 мес.
0,45
0,86
102,4
102,2
24 мес.
0,53
1,01
102,0
101,7
0 мес.
Светло-желтый непрозрачный крем
Выдерживает требования для Кат.2
0,08
0,14
100,1
<i>Компонент отсутствует</i>
<i>Компонент отсутствует</i>
<i>Компонент отсутствует</i>
3 мес.
0,17
0,25
99,8
6 мес.
0,24
0,43
99,5
9 мес.
0,36
0,59
99,4
12 мес.
0,49
0,88
99,1
18 мес.
0,61
1,07
98,6
24 мес.
0,76
1,29
98,2
Краткое описание чертежей
На Фиг. 1 приведено распределение нафтифина в % от заявленной дозы в течение 4 часов для модельных составов №№9-12.
Осуществление изобретения
Далее приводятся примеры осуществления предлагаемого технического решения, которые его иллюстрируют, но не охватывают все возможные варианты его осуществления. Специалисту в данной области техники понятно, что возможны и другие частные варианты осуществления изобретения, включающие иные жидкие фармацевтические композиции нафтифин в соответствии с предложенным техническим решением, не описанные в настоящих примерах (раствор, спрей или гель для местного применения и т.д.).
Для получения предложенной жидкой фармацевтической композиции берут следующие компоненты.
Нафтифина гидрохлорид – белый или почти белый кристаллический порошок без запаха, нерастворимый в воде, легко растворимый в метаноле и хлороформе. Используется в сухом виде, для получения раствора допускается использовать как микронизированную субстанцию, так и порошок без предварительного измельчения.
Молочная кислота – вязкая гигрокскопичная жидкость, практически без запаха и цвета, представляющая собой смесь 2-гидроксипропионовой кислоты, прод6уктов ее конденсации (лактоилмолочая кислота, полимолочная кислота и других) и воды. Смешивается с этанолом, эфиром, водой.
Ундециленовая кислота – белая или бледно-желтая масса либо бесцветная или слегка желтоватая жидкость, практически нерастворимая в воде и легко растворимая в этаноле, жирных и эфирных маслах.
Диметилсульфоксид – бесцветная вязкая жидкость (при температуре ниже 18 °С – бесцветные кристаллы) со слабым характерным запахом, очень гигроскопичная, смешивается во всех пропорциях с водой, эфиром, этанолом.
Хитозан – полимер, производное хитина, представляющее собой белый или кремовый порошок или хлопья, волокна, в зависимости от молекулярной массы.
Вода для инъекций или очищенная – универсальный и индифферентный растворитель, жидкость без цвета и запаха, основа большинства гидрофильных или комбинированных (многофазных) жидких и мягких композиций.
Предлагаемую фармацевтическую композицию получают следующим образом.
Пример 1
В реактор, оснащенный мешалкой, при температуре 25±5 °С загружают расчетное количество диметилсульфоксида и ундециленовой кислоты и перемешивают в течение 10-15 минут, затем вносят навеску нафтифина и перемешивают до полного растворения. В отдельную емкость отбирают навеску воды для инъекций или воду очищенную с температурой 25±5 °С, добавляют навеску молочной и/или уксусной кислоты, а затем, струйно при перемешивании вносят навеску хитозана до получения густого раствора.
Полученный раствор переносят к раствору в реакторе и тщательно перемешивают до получения однородного раствора.
При необходимости – проводят корректировку рН молочной или уксусной кислотой до значений 4,0-6,0.
Пример 2
В реактор, оснащенный мешалкой, при температуре 25±5 °С загружают расчетное количество воды для инъекций или воду очищенную с температурой 25±5 °С, добавляют навеску молочной и/или уксусной кислоты, а затем, струйно при перемешивании вносят навеску хитозана до получения густого раствора.
В отдельную емкость отбирают навеску расчетное количество диметилсульфоксида и ундециленовой кислоты и перемешивают в течение 10-15 минут, затем вносят навеску нафтифина.
Полученный раствор переносят к раствору в реакторе и тщательно перемешивают до получения однородного раствора.
При необходимости – проводят корректировку рН молочной или уксусной кислотой до значений 4,0-6,0.
Пример 3
Разработанную жидкую композицию нафтифин применяют для лечения грибковых заболеваний, вызванных Aspergillus spp, Candida spp., Fusarium spp, Microsporum spp и Trichophyton spp, наружно, нанося небольшое количество раствора или геля на сухие и чистые пораженные участки кожи или на ногтевую пластинку, слегка втирают и оставляют до впитывания либо до образования тонкой пленки. При необходимости процедуру повторяют.
Обработку производят 1 раз в сутки. В случае невозможности проводить обработку каждые сутки – повторную обработку допускается проводить не более чем через 2 суток.
Таким образом, новая фармацевтическая композиция для лечения микозов кожи и ногтей в жидкой форме, удачно сочетающая активные вещества, обладающие противогрибковым действием со вспомогательными веществами, обеспечивает создание стабильной композиции нафтифина, направленной на улучшение терапевтических свойств, имеющей пролонгированное действие при лечении грибка, увеличение биодоступности, стабильности получаемого препарата.