Разработка новых флуоресцентных меток на основе производных 3-замещённых-4-гидроксикумаринов для биохимических исследований и молекулярной визуализации

Процессы коагуляции-пептизациии и вторичной поликонденсации зависят от размера частиц золя. Так, начальная мутность при введении KOH в золь с размером частиц 16 нм меньше, чем в случае золя с размером 12 нм (рис. 3).

Таким образом, коллоидно-химические свойства кремнезема необходимо рассматривать с учетом влияние природы катионов щелочных металлов на реакционную способность системы. Закономерности влияния катионов щелочных металлов на кинетику пептизации агрегированных частиц кремнезема и последующий процесс их растворения является симбатным и усиливается в ряду Li<Na+<K.

Работа выполняется при поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований, грант № 07-03-00720-а.

Список литературы

1. Шабанова, Н.А. Основы золь-гель технологии нанодисперсного кремнезема/ Н.А.Шабанова, П.Д. Саркисов. - М.: ИКЦ Академкнига.- 2004.- 208 с.

2. Сорбенты на основе силикагеля в радиохимии // Под ред. Ласкорина Б.Н. М.: Атом-издат. -1977. -303 с.

3. Шабанова, Н.А. / Н.А.Шабанова, О.Г.Айтжанова, В.И.Спорыхина, Н.Н. Романова //Коллоид. Журн. -1998.- Т. 60. -С. 705-708.

4. Шабанова, Н.А. // Коллоид. журн. 1999. Т. 61. № 4. С. 567-571.

5. Flávio A. Rodrigues/ Flávio A. Rodrigues, Paulo J. M. Monteiro, // Cement and Concrete Research. 2001. V. 31, №. 11. P. 1549-1552.

6. Yin Qi / Yin Qi, Zi-yun Wen // Construction and Building Materials,2007.- V. 21, №. 8.-P. 1656-1660.

УДК 543.426:547.587.51:577.1 Н.А. Кондратова, В.Ф. Травень

Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия

РАЗРАБОТКА НОВЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ МЕТОК НА ОСНОВЕ ПРОИЗВОДНЫХ 3-ЗАМЕЩЁННЫХ-4-ГИДРОКСИКУМАРИНОВ ДЛЯ БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ И МОЛЕКУЛЯРНОЙ ВИЗУАЛИЗАЦИИ

Biopolimers such as proteins and nucleic acids may be labeled with a fluorescent marker to allow their detection. A new fluorescent dyes on a base 3 -substituted-4hydroxycoumarines have been synthesized. The applications of these dyes as fluorescent labels for biochemical, medicine investigations and molecular visualization are proposed.

Биополимеры, такие как белки и нуклеиновые кислоты, можно помечать для их определения флуоресцентными маркерами. Синтезированы новые флуоресцентные красители на основе 3-замещённых-4-гидроксикумаринов. Планируется применение этих красителей в качестве флуоресцентных меток для биохимических, медицинских исследований и молекулярной визуализации.

Флуоресцентные метки широко применяются в биохимическом изучении мутагенеза, транскрипции и репликации ДНК, эпигенетики, а также в современных методах клинического анализа.

Активность фармацевтических препаратов зависит от многих факторов, в том числе от доставки их в нужные ткани. При их попадании биологически активных веществ в кровяное русло они связываются с сывороточным альбумином человека (HSA).

Если высвобождение активного вещества (субстрата) затруднено из-за образования прочного комплекса, то доступ его в ткани «мишени» также будет затруднён, и как следствие данное биологически активное вещество не сможет эффективно выполнять свою функцию.

Поэтому помимо изучения биологической активности необходимо исследовать величину сродства этого биологически активного вещества к сывороточному альбумину для определения эффективности его терапевтического действия.

Для определения величины этого сродства был разработан метод, основанный на образовании комплекса HAS с флуоресцентным красителем [1].

HSA ... краситель краситель

^ <S> > ^

краситель HSA разделение

электрофорезом

Ввиду того, что число центров связывания с белком невелико наблюдается конкуренция за это связывание.

HSA ... краситель HSA краситель HSA ... краситель ... лекарство

е О ^ Ф О

лекарство разделение

электрофорезом

И поскольку у флуоресцентного красителя интенсивность флуоресценции сильно зависит от связывания его с белком, то по способности его замещения этим биологически активным веществом можно оценить константу связывания последнего.

, „ HSA ... краситель ... лекарство

/"уЛ HSA ... краситель

о HSA ^ ^^ <S> .

лекарство краситель

краситель

разделение электрофорезом

Задачей нашего исследования является поиск таких флуоресцентных красителей, которые способны связываться с HAS (сывороточным альбумином человека) и при этом показывать высокий рост интенсивности флуоресценции.

Для большинства производных кумарина характерна интенсивная флуоресценция. Благодаря этому свойству кумарины нашли широкое применение в качестве оптически отбеливающих веществ, для создания активных сред перестраиваемых лазеров, люминесцентных меток, как потенциальные фотохимиотерапевтические агенты. Гидрок-сикумарины - одна из наиболее распространенных групп флуорофоров. Они широко распространены в природе. Некоторые из них выделены из растений, на их основе синтезированы многие биологически активные препараты, обладающие противовоспалительными, противотуберкулезными и антикоагулирующими действиями [2,3].

Ряд 3-замещенных 4-гидроксикумаринов находит применение в медицине и сельском хозяйстве как антикоагулянты и дератициды (дикумарол, синкумар, фенпрокумон, варфарин).

В основе наших исследований лежит синтез флуоресцентных красителей - производных 3-ацетил-4-гидроксикумарина 2.

OH O

O ^O

Как показано на схеме 1 нами разработаны два направления получения флуоресцентных красителей.

В первом направлении из борных комплексов 3 а были получены соответствующие красители 4-6а [4,5]. По второму направлению 9,10а.

он о

2а, Ь

OH O

o^CDC^x!^

FvF

'O O 7a,b

O O 5a, b

OH N-N

i! '

O O 6a, b

O' O 9a, b

R: a = H, b = N(Et)2

Схема 1.

Все полученные соединения обладают ярко выраженной флуоресценцией. Часть образцов была исследована на взаимодействие с белком. Полученные результаты подтверждают увеличение флуоресценции при указанном взаимодействии. Так, например в соединениях:

о^о

O^O

O' no

N

I

наблюдается увеличение флуоресценции при взаимодействии с BSA (бычий сывороточный альбумин) соответственно в 312 и 2550 раз.

Из литературных данных известно, что введение в положение 7 кумаринового фрагмента диметиламино-группы, приводит к увеличению флуоресценции [6,7]. Поэтому в настоящее время ведётся синтез по указанным выше направлениям соединений типа b, которые, как предполагается, будут обладать ещё более ярко выраженными флуорофорными свойствами.

Также планируется провести исследование взаимодействия всех флуоресцентных красителей двух указанных выше серий с белками с целью получения новых флуоресцентных меток для перспективного использования их в биохимических исследованиях, как флуоресцентные метки, поскольку флуоресцентные метки позволяют не только визуализировать в живом организме органы, новообразования или места скопления определенных белков, но и оценить активность протекающих в них биохимических процессов.

В 2007 году массачусетская компания VisEn разработала систему молекулярной визуализации химической активности глубоких тканей организма [7].

3

3

О

O

1

2

F

о' чо

R

O

O

R

OO

3a, b

4a, b

R

OH O

R

H

R

F

F

Современные методы визуализации, такие как магнитно-резонансная томография, позволяют получить только размер и форму органа или опухоли. Предполагается, что предлагаемая компанией VisEn система молекулярной визуализации, предоставляющая информацию об активности тканей, повысит эффективность ранней диагностики заболеваний, мониторинга эффектов лечения и контроля результатов хирургического вмешательства [8].

Молекулярная визуализация осуществляется за счет крупных флуоресцирующих молекулярных зондов (меток), взаимодействующих с белками, специфическими для конкретной структуры - раковой опухоли, холестериновых бляшек и т.д., что позволяет исследователям выявлять их локализацию и концентрацию. Некоторые зонды постоянно испускают свечение, другие, обеспечивающие получение более четких изображений, начинают флуоресцировать только в комплексе с белками-мишенями. Один из предлагаемых разработчиками зондов выявляет фермент, с помощью которого опухоли «расплавляют» окружающие ткани, что необходимо им для роста и размножения. Разработана также метка, идентифицирующая белок, вовлеченный в процессы изменения костей при раке и артрите. Каждая метка испускает свет определенной длины волны, что позволяет одновременно выявлять несколько патологических механизмов.

В фармакологии молекулярная визуализация обеспечивает возможность наблюдения за процессом в живом организме и позволяет установить, действительно ли препарат влияет на механизмы развития заболевания либо только устраняет его симптомы.

Испускаемый зондами свет ближней инфракрасной части спектра регистрируют камерой одновременно под несколькими углами. Полученные снимки с помощью компьютера реконструируют в трехмерное изображение, которое проецируют на гологра-фическое изображение животного (на фото1 - одиночный снимок, фото - трехмерное изображение опухоли легкого, полученное на основе сотен таких «срезов»).

На фотоЗ представлен пример слежения за скоростью и распространением рака молочной железы мыши. Справа видна первичная опухоль, другие светящиеся пятна

метастазы

Фото1. Пояснение в тексте Фото 2. Пояснение в тексте Фото 3. Пояснение в тексте

представляют собой вторичные образования, метастазы в лёгких.

По глубине проникновения в организм эту методику можно сравнить с позитрон-эмиссионной томографией, недостатками которой являются необходимость использо-

вания радиоактивных меток и ускорителя заряженных частиц, а главное - невозможность определения уровня активности белков.

Ввиду перечисленных выше причин перспективным является разработка новых флуоресцентных красителей на основе производных 3-замещённых-4-гидроксикумаринов, которые будут исследованы в качестве флуоресцентных меток для изучения эпигенетики и молекулярной визуализации. Это, в свою очередь, позволит получить отечественную импортзаменяющую продукцию для биохимических и медицинских исследований.

Список литературы

1. G. Patonay Noncovalent labeling of biomolecules with red and near-infrared dyes/ G. Pa-tonay, J. Salon, J. Sowell, L. Strekowski // Molecules. 2004,9,.- Р. 40-49.

2. Eds. Farber E.M. and Cox A.J. Proceedings of the third international symposium. «Psoriasis». Stanford University. New York London. 1981. 135-444

3. Кузнецова, Н.А. / Н.А. Кузнецова, О.Л. Калия. //Усп. хим. 1992, 61(7).- С. 1243-1267

4. Манаев, А.В. / А.В. Манаев, Т.А. Чибисова, В.Ф. Травень //Изв. РАН, 2006, 12, 2144

5. Traven, V.F. / V.F.Traven, I.V.Ivanov, A.S.Pavlov ets.//Mendeleev Commun., 2007, 17, 345-346.

6. Y-S. Chen Structure, reactivity and application of some triketone derivatives/ Y-S. Chen, P-Y. Kuo, T-L. Shie, D-Y. Yang // Tetrahedron. 2006, 62.- Р. 9410-9416

7. Gerasov, A.O. Series of polymetine dyes derived from 2.2-difluoro-1,3,2-(2H)-dioxaborine of 3-acetyl-7-diethylamino-4-hydroxycoumarin/ A.O. Gerasov, M.P. Shandura, Yu.P. Kovtun. // Dyes and Pigments 2008, 77.- Р.598-607.

8. Интернет-журнал «Коммерческая биотехнология» http://www.cbio.ru/ по материалам TechnologyReview.

УДК 543:542.2

Н.Г. Новикова, Ю.В. Ермоленко, В.В. Кузнецов, Н.Г. Строкова, А.П. Соколовская

Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия; Московский государственный текстильный университет им. А.Н.Косыгина, Москва, Россия

ТЕСТ-ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОБАЛЬТА(П) И ЖЕЛЕЗА(Ш) С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ В ПОЛИМЕРНЫХ ГЕЛЯХ. ВОЗМОЖНОСТИ И ПЕРСПЕКТИВЫ ПРАКТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ

New express methods for determination of Fe(II) and Co (II) implementing nitroso-R-salt as a reagent immobilized on a polymeric gel are developed. A possibility of increasing sensitivity by concentrating analyte in a polymeric gel support is shown. Both spectrophotometry and coloristic approaches to getting analytical signal are carried out to elaborate color scales for visual test-indication of cobalt and iron. Approved is the usefulness of the methods in the analysis water of Moscow waterpipe and technological solutions (test-indication of iron and cobalt) and biological liquids (e.g. iron in the human blood plasma). A correctness of the determination is assessed on model solutions by a method "added - found" as well as on real objects by a method of additives. Prospects of practical application of the developed the test-methods are encouraging.

Разработаны методики тест-определения Fe(II) и Co(II) с использованием новых аналитических материалов на основе иммобилизации реагента нитрозо-Я-соль в полимерный гель. Показана возможность повышения чувствительности тест-определения при концентрировании аналита в полимерной гелевой подложке. Проведена сравнительная оценка спектрофотометрического и цветометрического вариантов индикации аналитического сигнала. Разработаны цветовые шкалы для визуальной тест-индикации при определении Fe(II) и Co(II). Показана возможность и перспективы практического

- 3 9 -