СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ТРОМБОЦИТОВ
METHOD OF DETERMINING PLATELET FUNCTIONAL ACTIVITY

Область применения:
Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано врачами других специальностей для оценки риска развития тромботических и геморрагических осложнений.
Описание изобретения
Уровень техники
Аналоги
Аналогом данного изобретения являются описанные в отечественной и иностранной литературе методы исследования функциональной активности тромбоцитов.
Применяемые в клинической практике исследования функциональной активности тромбоцитов на основании методологического подхода можно подразделить на две группы: ориентировочные и количественные. Ориентировочные методы - это прямая оценка (визуальная морфофункциональная дифференциация по внешнему виду клеток) и косвенная: о функциональном состоянии тромбоцитов можно судить по результатам исследования взаимодействия кровеносных сосудов in vivo при стандартизированных повреждениях микрососудов кожи. Методы трудоемки, субъективны, требуют специального оборудования, инвазивны и психологически травматичны для пациента. При применении количественных методов функциональная активность тромбоцитов оценивается по количественным характеристикам процесса образования агрегатов тромбоцитов под воздействием стимуляторов. Количественные методы более информативны как с точки зрения получаемой диагностической информации, так и с точки зрения корректности качества выполнения исследований. Требуют специфической пробоподготовки, реактивов и специальной аппаратуры для стимуляции тромбоцитов с помощью индукторов агрегации и для регистрации агрегационного процесса. Кроме этих методов, применяют электронно-микроскопические (изучение ультраструктуры тромбоцитов), радиоизотопные (продолжительность жизни «меченных» тромбоцитов), иммунологические (определение антитромбоцитарных антител). Методы не получили широкого применения [1, 2, 3, 4].
Все перечисленные выше методы по исследованию агрегационной активности тромбоцитов объединяет повышенная сложность в организации диагностического процесса и трудоемкость в исполнении. Методы дорогостоящи, требуют специфической аппаратуры, расходных материалов для пробоподготовки и регистрации агрегационного процесса.
Прототип
Прототипом предложенного способа является унифицированный рефересный метод определения функциональной активности тромбоцитов по флуктуации светопропускания тромбоконцентрата по Born [7] на агрегометре. Преимуществом этого метода является исследование агрегации в стандартизированных условиях.
Метод дорогостоящ и трудоемок в исполнении, требует наличия специфической аппаратуры для организации и регистрации агрегационного процесса: моделирования специальных условий реологии сосудистой стенке in vitro: выделения «живого» тромбоконцентрата, количественного приведения диагностических проб тромбоцитов в соответствии с требованиями производителей диагностической аппаратуры, приобретения диагностических наборов реагентов.
Сущность изобретения
Цель изобретения заключается в разработке способа определения функциональной активности тромбоцитов, не требующего специальных условий, а следовательно, и больших материальных затрат, способа простого и удобного в практическом применении, быстрого по времени исполнения.
Способ осуществляют следующим образом:
Материалом для исследования служит венозная кровь, полученная из локтевой вены пациента стандартизированным способом вакуумной венепункции для гемостазиологических лабораторных исследований с использованием первичных тест-систем с наполнителем (9 NC 0,129М) типа Vacuteiner, Monovette, Venoject в объеме, указанном производителем для данного типа тест-систем.
Для получения бедной тромбоцитами плазмы используют стандартный протокол проведения процедуры центрифугирования для данного типа плазмы крови (центрифугирование при 3000-4000 об/мин (1200 g) в течение 15 мин). Возможно использование центрифуги любой модели с достаточной величиной относительной центробежной силы центрифугирования конкретного ротора; с учетом соблюдения соответствия установки времени и условий центрифугирования [5, 6, 8].
Подготовленные таким образом анализируемые образцы исследуют для определения величины pH.
Для измерения pH может быть использован любой анализатор кислотно-щелочного состояния и газового состава крови третьего поколения.
Бедную тромбоцитами плазму в соответствии с инструкцией к прибору набирают в капилляры установленного производителем объема. (Объем капилляров зависит от количества пробы, необходимой для проведения pH-анализа, и указывается в Паспорте прибора; капилляры для исследования прилагаются к прибору). Процедуру pH-метрии производят в соответствии с инструкцией к прибору.
Интерпретацию результатов производят на основании подсчета диагностических индексов Д1 и Д2.
Диагностические индексы получены путем математической обработки результатов pH-метрии и степени агрегации тромбоцитов методом кластерного и пошагового дискриминантного анализа с помощью пакета прикладных программ «Квазар-Плюс».
1. Д1 вычисляют по формуле:
Д1=const1×РРР-const2,
где Д1 - диагностически значимый индекс,
РРР - значение показателя pH бедной тромбоцитами плазмы исследуемого пациента,
const1=18,877,
const2=139,381.
Если Д1<-0,25, у данного пациента диагностируют гиперфункцию тромбоцитов (при р<0,01), что свидетельствует об увеличении тромбогенного потенциала тромбоцитов и риске развития патологического процесса тромбообразования (тормбофилия, ангиотромбоз, тромбоэмболия).
Чувствительность алгоритма к наличию гиперфункции составляет 96,0%, специфичность 63,83%, эффективность 87,2%
2. Если Д1≥-0,25, вычисляют диагностический индекс Д2 по формуле:
Д2=const3×РРР-const4,
где: Д2 - диагностически значимый индекс,
РРР - значение показателя pH бедной тромбоцитами плазмы исследуемого пациента,
Const3=16,60
Const4=122,95.
Если Д2≥-0,42, диагностируют гипофункцию тромбоцитов (при p<0,01), что свидетельствует о снижении гемостатического потенциала, контрактильных свойств тромбоцитов, нарушениях формирования белого тромбоцитарного тромба и риске развития геморрагических осложнений.
Если Д2<-0,42 - судят о нормальной функциональной активности тромбоцитов.
Чувствительность метода к гипофункции = 58,2%, специфичность 81,8%, эффективность 66,1%.
Примеры
Пример 1. Мачихина Е.Б. (история болезни 3800/71.) Женщина находится в ПИТе НИИ ОММ на продленном ИВЛ (6 ч 25 м): 1 сутки, после операции кесарево сечение (беременность 34-35 нед., преждевременные оперативные роды, головное предлежание плода, центральное предлежание плаценты, массивная кровопотеря 4,5-4 л) Массивная трансфузия препаратов крови: №1 (начата в операционной): кристаллоиды 2250 мл, коллоиды (волувен 6%) - 1000 мл, эр. масса A(II)RH+ 1876 мл, СЗП A(II)RH+ 2980 мл (всего 8106,25 мл); №2 (в ПИТ): эр. масса - 633,0 мл, кристаллоиды - 2050,0 мл. Итого: СЗП - 2980,0 мл, эр. масса - 2509,0 мл, кристаллоиды - 4300,0 мл, коллоиды- 1000,0 мл. Получает диценон 500×2 р/сут.
Проведено исследование pH бедной тромбоцитами плазмы, которое составило 7,382. Диагностический индекс Д1, вычисленный по формуле Д1=const1×PPP-const2 (Д1=18,877×7,382-139,381), равен -0,031; что указывает на отсутствие гиперфункции тромбоцитов. Далее диагностический индекс Д2, вычисленный по формуле Д2=const3×PPP-const4(Д2=16,60×7,382-122,95), равен -0,40, что свидетельствует о гипофункции тромбоцитов.
Для верификации результата поведено исследование унифицированным методом по Born на агрегометре. При обследовании функции тромбоцитов на фоне лечения выявлена гипофункция тромбоцитов: агрегация тромбоцитов с АДФ: степень - 54,6%; скорость 40,4%/мин; время 8 мин; угнетена вторая волна агрегации; агрегация с коллагеном, адреналином - патологический тип кривой, степень агрегации снижена до 35%. 3аключение: присутствуют лабораторные признаки снижения функциональных свойств тромбоцитов (ретрактивных, агрегационных).
Исследование унифицированным методом по Born на агрегометре коррелирует с результатами, полученными при использовании способа подсчета диагностических индексов Д1 и Д2.
На 12 сутки после операции женщина в удовлетворительном состоянии переведена к ребенку в Детскую клинику НИИ ОММ.
Пример 2. Ланских Н.В. Поступила в клинику НИИ ОММ с целью родоразрешения (история 1645/225). Диагноз: хр.гастродуоденит (ремиссия), хр. гайморит (ремиссия), левосторонний сколиоз, остеохондроз дисков L4-L5, L5-S1. Врожденная деформация крестца. Беременность 39-40 нед. ОАА (сам. выкидыш, хламидиоз (санирован), ОРВИ в малом сроке беременности.) Тромбоцитопения умеренной степени тяжести в сочетании с тромбоцитопатией, ассоциированная с беременностью. (Пациентке проведено обследование в гематологическом центре ОКБ №1, нарушения тромбоцитарного звена гемостаза подтверждены гематологом, доцентом УрГМА Томиловым А.Ф.).
Проведено исследование pH бедной тромбоцитами плазмы, которое составило 7,385. Диагностический индекс Д1, вычисленный по формуле Д1=const1×PPP-const2 (Д1=18,877×7,385-139,381), равен 0,025; что указывает на отсутствие гиперфункции тромбоцитов. Далее диагностический индекс Д2, вычисленный по формуле Д2=const3×PPP-const4 (Д2=16,60×7,385-122,95), равен -0,359, что свидетельствует о снижении функциональной активности тромбоцитов.
Для верификации результата проведено исследование на агрегометре унифицированным методом по Born. Выявлены признаки снижения функциональной активности тромбоцитов (тромбопатия). Агрегация с АДФ: степень 51,7%; скорость 38%/мин; время 8 мин, агрегатограмма патологического типа (угнетена вторая волна агрегации). Агрегация с коллагеном - степень 30%, патологический тип кривой, удлинение lag-фазы; агрегация с ристомицином - без патологии (74,1%). Заключение: Присутствуют лабораторные признаки тромбопатии на уровне передачи сигнала между тромбоцитами (ориентировочно рецепторы Ia-IIa,YI; GPIIb-IIIa), нарушение реакции активации тромбоцитов предположительно иммунного генеза. Для уточнения диагноза рекомендовано обследование после родоразрешения.
После проведенного лечения (диценон 1 т.×4 р. в день, рутин 3 т.×4 р. в день) и оперативного родоразрешения способом операции кесарево сечение, на 10 сутки показатель pH бедной тромбоцитами плазмы составил - 7,375. Диагностический индекс Д1, вычисленный по формуле Д1=const1× PPP-const2 (Д1=18,877×7,375-139,381), равен -0,214; что указывает на отсутствие гиперфункции тромбоцитов. Далее диагностический индекс Д2 по формуле Д2=const3×PPP-const4 (Д2=16,60×7,375-122,95), равен -0,521, что свидетельствует о нормальной функции тромбоцитов.
Для верификации результата проведено исследование унифицированным методом по Born на агрегометре. Результаты агрегатограммы соответствуют норме. Агрегация с АДФ: степень - 82,5%; скорость - 68%/мин; время 6 мин; вид агрегационной кривой без патологии. Агрегация с коллагеном, ристомицином: агрегационная кривая в норме, степень - 75% и 90% соответственно, что подтверждает правильность предложенных диагностических индексов. Женщина в удовлетворительном состоянии выписана домой с ребенком.
Пример 3. Пациентка Слободчикова Т.В., 38 лет (история болезни №489/532). В анамнезе первичное бесплодие в течение 15 лет. Соматически хронический холецистопанкреатит, хронический бронхит, хронический пиелонефрит, мочекаменная болезнь, распространенный остеохондроз, поливалентная аллергия, хроническая никотиновая интоксикация. Обратилась на консультативный прием отделения ЭКО НИИ ОММ по поводу длительного бесплодия.
Проведено исследование pH бедной тромбоцитами плазмы, которое составило 7,359. Диагностический индекс Д1, вычисленный по формуле Д=const1×PPP-const2 (Д1=18,877×7,359-139,381), равен -0,465; что указывает на наличие гиперфункции тромбоцитов.
Для верификации результата проведено исследование унифицированным методом по Born на агрегометре. Агрегация тромбоцитов с АДФ: степень 123,5%; скорость 97%/мин; время 10 мин; монофазная кривая агрегации. Агрегация с коллагеном - 80,0%; ристомицином - 110%. Выявлена гиперфункция тромбоцитарного звена гемостаза, что подтверждает правильность диагностического индекса.
Пациентке было проведено лечение бесплодия методом вспомогательных репродуктивных технологий (ЭКО-ПЭ и ИКСИ). Для профилактики осложнений и исходов беременности женщин с тромбофилией пациентке была подобрана адекватная антикоагулянтная, антиагрегантная терапия с первого триместра беременности.
Таким образом, предлагаемый способ определения функциональной активности тромбоцитов позволяет с высокой точностью проводить оценку состояния тромбоцитарного звена гемостаза и выявлять группы риска на основе повышения или снижения функциональной активности тромбоцитов (тромбофилии и тромбопатии, различные виды кровоточивости как по микроциркуляторному типу, так и типу ДВС (диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови)); позволяет своевременно решить вопрос о необходимости проведения комплексного параклинического обследования с последующей терапевтической коррекцией выявленных нарушений, особенно на начальных стадиях заболевания.
Данный способ диагностики может быть предложен для широкого применения.
Способ не требует дорогостоящей материально-технической базы, специальных реактивов, удобен в исполнении при использовании минимального количества исследуемого материала, обеспечивает получение необходимой информации в течение часа с момента забора крови пациента, воспроизводим в лаборатории любого уровня.
Источники информации
1. Баркаган З.С., Мамот А.П. Диагностика и контролируемая терапия нерушений гемостаза. - М.: Ньюдиамед-АО, - 2001. С.296.
2. Иванов Е.П. Диагностика нарушений гемостаза (Практическое пособие для врачей). - Мн. Беларусь, - 1983. С.107-119.
3. Козловская Л.В., Николаев А.Ю. Учебное пособие по клиническим лабораторным методам исследования - 2-е изд. - М.: Медицина - 1984. С - 88-98.
4. Меньшиков В.В., Делекторская Л.Н., Золотницкая Р.П. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник под ред. В.В.Меньшикова - М.: Медицина - 1987. С.152-154.
5. Мошкин А.В., Долгов В.В. Обеспечение качества в клинической лабораторной диагностике - М. - 2004. С.14-23, 38-39.
6. ISO 151189:2003. Медицинские лаборатории - специфические требования к качеству и компетентности (проект русского варианта). Стандартизация в клинической лабораторной медицине. Организационные и метрологические аспекты - М. - 2005. С.37-105.
7. Born C.V.R. // Nature. - 1962. - Vol. 189, N1-2. P.927-929.
8. NCCLS, document H18-A2. Procedures for the Handing and processing of Blood Specimens, 2nd Ed, Approved Guideline, NCCLS, 1999.